(57)【要約】  本発明は、以下を備える中央モジュール（１０４）を含むマイクロ流体細胞培養チップ関する：−中央ユニット（１０５）であって、−非吸収性膜から成る支持体（１）と、−少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、を含む、中央ユニット（１０５）と、−ベース（１０６）であって、前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する、ベース（１０６）と。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−中央ユニット（１０５）であって、
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）であって、前記支持体（１）が、特に、バイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ８から成る、支持体（１）と、
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し、前記突起が、特に、円形ベース（１３）を有する中空ドームの形状であり、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記下面（７）が、前記支持体（１）の前記上面（２）に固定されて位置付けられる、
又は、３Ｄナノ構造膜（５）の前記上面（６）が、前記支持体（１）の前記下面（３）に固定されて位置付けられ、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、
を含む、中央ユニット（１０５）と、
−ベース（１０６）であって、
前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する、ベース（１０６）と、
を備える中央モジュール（１０４）を含むマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項２】
−中央ユニット（１０５）であって、
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）であって、前記支持体（１）が、特に、バイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ８から成る、支持体（１）と、
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し、前記突起が、特に、円形ベース（１３）を有する中空ドームの形状であり、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記下面（７）が、前記支持体（１）の前記上面（２）に固定されて位置付けられ、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、
を含む、中央ユニット（１０５）と、
−ベース（１０６）であって、
前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する、ベース（１０６）と、
を備える中央モジュール（１０４）を含む、請求項１に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項３】
−中央ユニット（１０５）であって、
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）であって、前記支持体（１）が、特に、バイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ８から成る、支持体（１）と、
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し、前記突起が、特に、円形ベース（１３）を有する中空ドームの形状であり、
３Ｄナノ構造膜（５）の前記上面（６）が、前記支持体（１）の前記下面（３）に固定されて位置付けられ、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、
を含む、中央ユニット（１０５）と、
−ベース（１０６）であって、
前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する、ベース（１０６）と、
を備える中央モジュール（１０４）を含む請求項１に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項４】
支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が、
直径ｄ１（穿孔の上部直径ｄ１）、及び、穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）を有する、支持体（１）の上面での円形形状セクション（１１）（穿孔の上部セクション）と、
直径ｄ２（穿孔の下部直径ｄ２）、及び、穿孔の下部セクションの中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｗ）を有する、支持体（１）の下面（３）での円形形状セクション（１２）（穿孔の下部セクション）と、を有し、前記軸（ｘ）及び（ｗ）が組み合わされ、
直径ｄ１が１０μｍ以上の値から５００μｍ以下の値であり、直径ｄ２が１０μｍ以上の値から５００μｍ以下の値であり、
直径ｄ２の値が直径ｄ１の値以上であり、
前記突起（８）の前記円形ベース（１３）が直径ｄ３（突起の円形ベースの直径ｄ３）を有し、突起（８）の前記直径ｄ３が１０μｍの値から５００μｍの値であり、ｄ１未満、等しい又は大きい値からであり、前記突起が、１から６００μｍ、より具体的には１から３００μｍ、より具体的には５０から３００μｍ、より具体的には５０μｍの高さを有する、請求項１又は２に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項５】
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において又は部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しており、
特に全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面している、請求項２又は４に記載のマイクロ流体細胞培養チップ：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき。
【請求項６】
前記突起（８）の外面（９）が少なくとも１つの接着細胞を支え、前記少なくとも１つの接着細胞が、特に間質細胞であり、前記突起（８）の内面（１０）が少なくとも１つの接着細胞を支え、前記少なくとも１つの接着細胞が、特に上皮細胞であり、
より具体的には、前記突起（８）の前記外面（９）が合流の段階で第１のセットの接着細胞を支え、前記第１のセットが間質細胞のセットであり、前記突起（８）の前記内面（１０）が合流の段階で第２のセットの接着細胞を支え、前記第２のセットが上皮細胞のセットである、請求項１、２、４及び５の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項７】
少なくとも２つの突起（８）を備え、２つの隣接する突起間の距離が値ｌであり、前記値ｌが１０から１００μｍ、より具体的には５０から１００μｍであり、
１ｃｍ２の中央ユニットの表面に関する突起（８）の最大数が以下の式に等しく、
【数１】
2019518443.tif 000005
ｌが２つの隣接する突起（８）間の距離であり、前記値ｌが１０から１００μｍ、より具体的には５０から１００μｍであり、
ｄ３が前記突起（８）の円形ベース（１３）の直径である、請求項１、２及び４から６の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項８】
３Ｄナノ構造多孔質膜（５）がポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、ポリアネトールスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−ｃｏ−アクリロニトリル）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸）、水和４−スチレンスルホン酸ナトリウム塩の内から選択される高分子電解質の少なくとも１つの層から成り、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）が、少なくとも２つの連続する層から成り、正に帯電した高分子電解質から成る層が、負に帯電した高分子電解質から成る層と交互になっており、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）が特に、１から１５０個の連続する高分子電解質層から成り、
より具体的には、前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）が、互いに交互になっているポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）及び／又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）の１５個の連続する層から成る、請求項１から７の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項９】
−上面、下面及び少なくとも１つの側面を含む下部ユニット（１０８）であって、
上部オリフィスの中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）を有する直径ｄ４の上部オリフィス（１５）及び直径ｄ５の下部オリフィス（１６）を備える少なくとも１つの管状形状ダクト（１４）を備える、下部ユニット（１０８）と、
−ベース（１０９）であって、
前記下部ユニット（１０８）が前記ベース（１０９）において統合され、前記ベース（１０９）によって全体を形成し、前記下部ユニット（１０８）及び前記ベース（１０９）が特に、バイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック又はＳＵ８から成り、
前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値が前記ダクト（１４）の前記下部オリフィス（１６）の直径ｄ５の値以上であり、直径ｄ４の前記値が前記少なくとも１つの穿孔（４）の下部直径ｄ２の値以上であり、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面が少なくとも１つのダクトの前記上部オリフィス（１５）を備え、前記下部オリフィス（１６）が、それ自身で又は中間手段（１７）によって、前記ベース（１０９）の外側につながる、ベース（１０９）と、
を備える、固体の下部モジュール（１０７）を含む、請求項１、２、４から８の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項１０】
前記下部モジュール（１０７）及び前記中央モジュール（１０４）は、前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開くように組み立てられ、少なくとも１つのダクト（１４）の下部オリフィス（１６）が、チップの外側にそれ自身で、又は、液体を回収することが可能であり且つ前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にするリザーバ（１７）によって構成される中間手段を介して、つながり、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体の前記下面が互いに同一形状及び同一表面を有し、前記下部ユニット（１０８）及び前記中央ユニット（１０５）が下部モジュール（１０９）の及び中央モジュール（１０６）の各々のベース上にそれぞれ位置する取付要素（２０４）によって組み立てられて、前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（３）の前記下面を密封して組み立てる、請求項１、２及び４から９の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）が前記支持体（１）の１つの単一の穿孔（４）につながり、前記支持体（１）の前記穿孔（４）が全体において、前記少なくとも１つのダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、請求項１、２及び４から１０の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ：
−前記穿孔（４）の下部直径ｄ２の値が前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値と等しく、穿孔（４）の前記下部セクション（１２）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｗ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが組み合わされるとき；又は、
−前記穿孔（４）の下部直径ｄ２の値が前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値未満であり、穿孔（４）の前記下部セクション（１２）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｗ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが組み合わされる、若しくは、［（ｄ４の値−ｄ２の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき。
【請求項１２】
前記下部モジュール（１０７）が少なくとも２つのダクト（１４）を備え、
少なくとも２つのダクト（１４）の各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、
−少なくとも２つのダクト（１４）の少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が少なくとも２つの異なるサイトへそれぞれ、チップの外側につながる、
−又は、少なくとも２つのダクト（１４）の内のすべて、の少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が、液体を回収することが可能であり且つ前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にする、リザーバ（１７）によって構成される１つの同じ中間手段につながる、請求項１、２及び４から１１の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項１３】
−開放容積（チャンバ）（２０３）を画定する固体の表面から成る、固体の且つ中空の上部ユニット（１０２）であって、固体の表面の端が、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）と接触し且つ前記開放容積の開口部の表面を区切ることが可能である、固体の且つ中空の上部ユニット（１０２）と；
−ベース（１０３）であって、
前記上部ユニット（１０２）が、前記ベース（１０３）に統合され且つ前記ベース（１０３）によって全体を形成する、ベース（１０３）と、
を備える上部モジュール（１０１）を含み、
前記上部ユニット（１０２）及び前記ベース（１０３）が、特にバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック又はＳＵ８から成る、請求項１、２及び４から８の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項１４】
前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）及び前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）は、前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面が前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）上に位置付けられように組み立てられて、
前記上部ユニット（１０２）の前記固体の表面及び３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）によって区切られる閉鎖空間を形成し、
前記上面（６）及び開口部の前記表面が、互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）及び前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）が、上部モジュール（１０１）の及び中央モジュール（１０４）の各々のベース（１０３、１０６）上に位置する取付要素（２０１、２０４）によって組み立てられて、前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面及び前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）を密封して組み立て、
有利には前記上部ユニット（１０２）の前記少なくとも１つの固体面が、入口／出口ダクト（２０２）へそれぞれにつながる２つのオリフィスを有し、
前記閉鎖空間が、ベース（１０９）の外側につながる前記入口／出口ダクト（２０２）を介して前記マイクロ流体チップの外側と連通することを可能にする、請求項１、２、４から８及び１３の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ。
【請求項１５】
上部モジュール（１０１）、中央モジュール（１０４）及び下部モジュール（１０７）を備え、上記前記モジュールは、前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面が、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（２）の上に位置付けられ、
前記下部モジュール（１０７）の前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が、前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開いており、
前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面及び前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（２）が、互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（３）の前記下面が互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記上部モジュール（１０１）、前記中央モジュール（１０４）及び前記下部モジュール（１０７）が、各々の個別のベース（１０３、１０６、１０９）上に位置する取付要素（２０１、２０４）によって組み立てられ、
特に、前記突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、ように組み立てられる、請求項１、２、４から８、１３及び１４の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップ：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるようなとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように；
及び、前記支持体（１）の前記穿孔（４）が全体において、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面しているとき：
前記突起（８）の前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、組み合わされる、又は、ｄ４の値がｄ２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ３の値）／２］以下の距離によって互いに異なるように。
【請求項１６】
前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の製造が：
−前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）を通して、再吸収性高分子溶液（２２）を押し出して、前記支持体（１）の前記上面（２）の側上で少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２３）を形成するステップであって、前記少なくとも１つのナノ構造が特に、ドームの形状である、ステップと、その後
−前記再吸収性高分子溶液を重合して前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２３）を固くするステップであって、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２３）が重合後に前記支持体の前記上面の側上で再吸収性高分子モールド（２２）を形成する、ステップと、その後
−前記支持体（１）の上面（２）及び前記再吸収性高分子モールド（２２）の表面を覆う少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用して、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）を構成するステップと、よって、
−前記再吸収性高分子モールドを溶解させて、前記支持体（１）の前記上面（２）に固定されて位置付けられた前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記下面（７）、及び全体において前記少なくとも１つの穿孔（４）に面して位置付けられる少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）を得るステップであって、
前記再吸収性高分子（２２）が特に、キトサン、アガロース及びアルギン酸塩の内から選択される、ステップと、
を備える、請求項２及び４から８の何れか一項に記載のマイクロ流体細胞培養チップを製造するための方法。
【請求項１７】
中央ユニットを備える中央モジュールの製造が：
（ｉ）中央ユニットの形式においてサイドフレーム（２１３）、開いた上面（２１４）、及び、切断部（２１６）を備える固体の下面（２１５）、から成る支持体部分（Ｉ、ｉ）、並びに、上面（２０９）上に少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造（２０８）を備える、前記支持体部分（Ｉ、ｉ）の形状及び寸法におけるモールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）を組み立てるステップであって、前記モールドが特に、プラスチックで作製される、ステップと、
（ｉｉ）前記モールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）の前記上面（２０９）上に再吸収性高分子溶液（２２）を注ぐステップ（図６１）と、その後
（ｉｉｉ）前記再吸収性高分子溶液（２２）を重合して、前記再吸収性高分子溶液を固くし、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクス（２１０）を形成するステップと、その後
（ｉｖ）前記モールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）を除去して、前記支持体部分（Ｉ、ｉ）の固体の下面（２１５）の前記切断部（２１６）において形成される前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）を得るステップと、その後
（ｖ）ベース（１０６）において統合された少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた非吸収性膜（１）から成る支持体を備える、穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）によって、前記支持体部分（Ｉ、ｉ）を組み立てるステップであって、
前記穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）が前記支持体部分（Ｉ、ｉ）の形状及び寸法であり、前記穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）の穿孔（４）の数がステップ（ｉ）において用いられる前記モールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）における成形された３Ｄナノ構造（２１１）の数と同一であり、
前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の前記少なくとも１つの負のモールドと位置合わせされる、ステップと、その後
（ｖｉ）前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）で前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）の下面（２１２）と前記支持体（１）の下面（３）とから成る連続した表面上に少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用して、少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）を構成するステップと、その後
（ｖｉｉ）前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）を溶解させるステップと、
（ｖｉｉｉ）支持体部分（Ｉ、ｉ）を除去して、その下面（３）上で３Ｄナノ構造多孔質膜（５）を、その上面の側上で前記少なくとも１つの突起を備える前記穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）を得るステップと、
を備える、請求項３に記載のマイクロ流体細胞培養チップを製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、「モジュール」との用語によって各々参照され且つ２つずつ組み立てられる可能性のある、複数の部品を備えるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０００２】
本発明はまた、前記チップを製造するためのプロセス、及び、診断の分野におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
チップ上で臓器を真似る目的で発展した多数の現在のデバイスは、２Ｄ膜から成る。
【０００４】
２０１１年１０月１３日に出願されたＩｎｇｂｅｒ等による特許ＵＳ８６４７８６１Ｂ２において、著者は、組織／組織界面にて生体内で存在する機械的応力を再現するために、膜の周りで差圧を生成するし、そのためその膨張又は収縮を発生させること可能にさせる、手段を備えた、膜のいずれかの上で接着細胞の共培養を可能にさせる有機模倣デバイスを発展させた。このデバイスは、２つのマイクロ流体ダクトの界面で、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作製された柔軟な多孔質膜を備えるマイクロ流体システムに基づき、前記膜に沿って流体の循環を可能にさせ、特に呼吸の間の肺胞を真似ることを可能にさせる。
【０００５】
２０１２年２月２８日に出願されたＩｎｇｂｅｒ等による特許ＵＳ２０１４／００３８２７９Ａ１において、著者は、自然の腸上皮構造を再現しその挙動を真似ることを可能にさせる細胞共培養システムを提案する。マイクロ流体システムに基づいたこの有機模倣デバイスは、前記膜に沿った流体の循環を可能にさせる２つのマイクロ流体ダクトの界面に位置付けられたＰＤＭＳ多孔質膜を備え、その上で腸上皮細胞の層が側面の内の少なくとも１つの上で培養される。支持体要素による膜の結合は、少なくとも１つの寸法において膜を長くする動きにつながるので、生体内での組織の動きを再現することを可能にさせる。
【０００６】
これらのデバイスが組織／組織界面及び生体内に存在する機械的応力を再現することを可能にさせて、臓器の微細構造を真似る場合でさえ、細胞共培養物は、２Ｄ媒体上に残り、特定の臓器のトポグラフィーを再現することを可能にさせない。
【０００７】
２０１３年に、Ｋｉｍ等は、Ｉｎｔｅｇｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  １１３０、「Ｇｕｔ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｖｉｌｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」というタイトルの彼らの出版物において、有機模倣マイクロ流体チップを提案し、そのため、腸において生体内で形成されるもののような、３Ｄ腸絨毛を再現することを可能にさせる。マイクロ流体システムに基づいたこのチップは、前記膜に沿った流体の循環を可能にさせる２つのマイクロ流体ダクトの界面に位置付けられたＰＤＭＳ多孔質膜を備え、３０μＬの媒体の一定の流れの存在下で２日の培養超えて絨毛を自発的に形成するＣａｃｏ−２腸上皮細胞がその上で培養される。
【０００８】
しかしながらすべてのこれらのデバイスは、生体適合性（慣性、多孔性）の観点から最適でない、ＰＤＭＳ多孔質膜上で細胞共培養を提案する。ＰＤＭＳは、小さな有機成分、薬も吸収し得、特定の用途を妨げ得るガスに対する透過性有し得る。さらに、ＰＤＭＳ膜は、組織の自然の基底膜のようなものとは異なる固有の輸送、機械的及び構造的特性を有し得る。これらのタイプの界面を再現することによって、著者は、臓器の微細構造を再現することを好む。
【０００９】
２０１４年では、Ｍａｒｃｈ等は、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ３Ｄ  Ｎｉｃｈｅ」というタイトルの彼らの出版物において、Ｃａｃｏ−２及びＨＴ２９−ＭＴＸ腸上皮細胞の共培養等の、微絨毛の３Ｄ形態を有し且つその表面上で異なるタイプの上皮細胞の共培養を支持することが可能なポリ乳酸グリコール酸構造を用いる体外腸モデルを提案する。このモデルは、生体内で腸へ同様の方法において微絨毛の表面上で細胞分化を得ることを可能にさせる。
【００１０】
そのため、特定の現在のデバイスが、臓器の微絨毛を真似ることを可能にさせる、ＰＤＭＳで又はＰＧＬＡで作製された、構造を有する場合でさえ、これらの構造は、固体、つまり避けられず、それゆえ、これらの構造上の共培養における細胞によって分泌された流出物又は生体液の収集を可能にしない。これらの固体の構造の場合では、既知のマーカーの検出は、細胞の付着及び抗体を用いたマーキングの後で免疫蛍光によって行われるので、分析に関する細胞の溶解を意味する。
【００１１】
多数の出版物が、３Ｄ構造上での培養における細胞が、２Ｄにおいて培養された同じ細胞と同じ特性を有さないことに言及し；差異は、遺伝子及びタンパク質発現プロファイル、細胞の接着、増殖速度及び細胞分化において実際に観察される。加えて、Ｋｉｍ等がＩｎｔｅｇｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  １１３０「Ｇｕｔ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｇｏ  ｖｉｌｌｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」というタイトルの彼らの出版物において、２０１３年に示したように、細胞が２Ｄにおいてと３Ｄにおいて培養されるかにしたがって、細胞型の薬に対する代謝反応が異なる。彼らは、薬を代謝するシトクロム酵素Ｐ４５０の活性の、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）２Ｄ培養モデルと微絨毛を真似る３Ｄ構造を備える培養モデルとの間での比較を為し、２Ｄでは、培養の間に活性が変わらないままであり、一方で３Ｄでは、この活性は微絨毛の形成の間に増加しその後安定化することを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
細胞培地のトポグラフィーは細胞の挙動に大きな影響を有するので、細胞培養の信頼できるモデルを発展させるために、細胞の生体内条件を、可能な限り正確に、再現することが重要である。
【００１３】
本発明では、発明者は、腺房／管状構造を有する臓器の微絨毛及び内腔の微小環境を真似る、細胞共培養マイクロ流体チップを発展させた。
【００１４】
本発明によるマイクロ流体チップは、折りたたみを備えるので、突起で前記膜のいずれかの側上で接着細胞がその上で培養される３Ｄ中空突起を形成する多孔性材料で作製される膜を備える。マイクロ流体システムによるこの膜の結合は、その培養の間に細胞分泌物を回収して、その構成を分析することを可能にさせる。
【００１５】
そのため、マーカーが付着細胞上の免疫マーキングによって検出されるので細胞の死を意味する（Ｋｉｍ等、２０１３年）従来技術とは逆に、本発明によるチップは、マイクロ流体システムによって回収される、突起上で培養される細胞の分泌物におけるこれらの検出を実行することを可能にさせる。
【００１６】
そのため、本発明によるチップは、経時的に細胞の生存率及び機能性を維持しつつ、生細胞上の分泌物を収集し、その結果として、動力学的研究を実行するための、数日さえ超える、培養の間の異なる時間に分泌物を収集することを可能にさせる。
【００１７】
これらの分泌物は、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の細胞培養培地において分泌され得る分子すべてから成る。
【００１８】
これらの分泌物の分析プロファイルは、セクレトーム、つまり分泌物の成分の定性的及び定量的プロファイル、を得ることを可能にさせる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、以下を備える中央モジュール（１０４）を含むマイクロ流体細胞培養チップ関する：
−中央ユニット（１０５）であって、
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）と、
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し（図４０）、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記下面（７）が、前記支持体（１）の前記上面（２）に固定されて位置付けられる、
又は、３Ｄナノ構造膜（５）の前記上面（６）が、前記支持体（１）の前記下面（３）に固定されて位置付けられ、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、を含む、中央ユニット（１０５）と、
−ベース（１０６）であって、
前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する、ベース（１０６）と（図３９及び４０）。
【００２０】
「非吸収性膜」との表現は、膜が、物理的プロセスによっても水性溶媒における化学的プロセスによっても除去されないことがあることを意味する。
【００２１】
支持体に関する「穿孔」との表現は、一端から他へ支持体を通り抜ける開口部、つまり、下面と上面と間の支持体を通る開口部、を意味し、そのため、これらの２つの面間の連通を可能にさせる。
【００２２】
前記支持体のこの穿孔は、前記支持体を通る空き空間を生み出し、前記支持体の上面でのセクション及び前記支持体の下面でのセクションによって特徴付けられる。
【００２３】
３Ｄナノ構造多孔質膜に関する「突起」との表現は、前記３Ｄナノ構造多孔質膜の上面の側上で、レリーフ構造を形成する突出した突部を意味する。
【００２４】
３Ｄナノ構造多孔質膜に関する「多孔性」との表現は、前記膜が、前記膜の上面から下面へ伸びる、２と１０ｎｍとの間の直径の、互いに相互接続した連続した細孔を含むことを意味する。これらの細孔は、膜を通るガス交換、及び、小さな分子が培地に含まれること（成長因子、血清タンパク質、Ｃａ２＋，Ｋ＋，Ｎａ＋等のイオン等の細胞の生存率を確保する栄養素）を可能にさせる。これらの細孔はまた、阻害物質、又は抗癌性分子、小さなＲＮＡｓ（例えば、緩衝ＲＮＡｓ）、ホルモン（例えば、ジヒドロテストステロン）等の薬理学的分子を通り抜けさせることを可能にさせる。
【００２５】
多孔質膜に関する「３Ｄナノ構造」との表現は、前記多孔質膜の上面上の、３次元である、少なくとも１つのレリーフ構造の存在を意味し、前記構造のスケールは約１ナノメートルである。
【００２６】
前記支持体と前記膜との間の接続のタイプを意味する「固定された」との表現は、化学結合、並びに、疎水性及び静電相互作用が、密封された接続によって凝集して前記膜と前記支持体とを結合するために、前記支持体と前記膜との間で確立されることを意味する。
【００２７】
「ベース」との用語は、統合された前記ユニットである固体の部分を意味する。
【００２８】
ベースとユニットとの間の配置を特徴付けるために用いられる「全体を形成する」との表現は、ベース及びユニットが１つの単一の保持の一部を一緒に形成し、互いに分離されないことがあることを意味する。 
【００２９】
特定の実施形態によると、本発明は、以下を備える中央モジュール（１０４）を含むマイクロ流体細胞培養チップ関する：
−中央ユニット（１０５）であって、
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）と、
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し（図４０）、
前記３Ｄナノ構造膜（５）の前記下面（７）が、前記支持体（１）の前記上面（２）に固定されて位置付けられ、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、を含む、中央ユニット（１０５）と、
−ベース（１０６）であって、
前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する、ベース（１０６）と（図３９及び４０）。
【００３０】
特定の実施形態によると、本発明は、以下を備える中央モジュール（１０４）を含むマイクロ流体細胞培養チップ関する：
−中央ユニット（１０５）であって、
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）と、
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し、
前記３Ｄナノ構造膜（５）の前記上面（６）が、前記支持体（１）の前記下面（３）に固定されて位置付けられ、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）及び少なくとも１つの突起（８）が、２つの異なる細胞型の培養に適した材料から成る、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）と、を含む、中央ユニット（１０５）と、
前記中央ユニット（１０５）が、前記ベース（１０６）に統合され且つ前記ベース（１０６）によって全体を形成する。
【００３１】
特定の実施形態によると、本発明は、前記マイクロ流体細胞培養チップのナノ構造多孔質膜の前記少なくとも１つの突起（８）が中空ドームの形状であり且つ円形ベース（１３）を有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００３２】
突起の形状に関する「ドームの形状において」との表現は、前記突起が、前記支持体の上面の側上で凸部を形成する、円形ベースを有するアーチの形の、丸みを帯びた構造を有することを意味する。
【００３３】
他の１つの実施形態では、前記突起は、前記支持体の上面の側の凸部を形成する、楕円ベースを有するアーチの形状における丸みを帯びた構造を有し得る。
【００３４】
「中空ドームの形状において」との表現は、前記突起がその下面の側上で前記３Ｄナノ構造膜の強化に対応するので、前記突起の内面が、自由体積を区切ることを意味し、そのため前記強化は、前記膜の下面の側上で凹部、それゆえ自由体積を形成する。
【００３５】
中空ドームに関する「円形ベース」との表現は、前記突起の内面によって区切られ、その上にドームの形状における突起が置かれる自由下面を意味する。
【００３６】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の前記少なくとも１つの穿孔が、前記支持体の上面での円形セクション及び前記支持体の下面での円形セクションによって特徴付けられるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００３７】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が、
穿孔（４）の前記上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）を有する、支持体（１）の上面（２）でのセクション（１１）（穿孔の上部セクション）と、
穿孔（４）の前記下部セクション（１２）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｗ）を有する、支持体（１）の下面（３）でのセクション（１２）（穿孔の下部セクション）と、を有し、
前記軸（ｘ）及び（ｗ）が組み合わされる、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００３８】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の下面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ２が、支持体の上面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ１以上であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００３９】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が、
直径ｄ１（穿孔の上部直径ｄ１）、及び、穿孔（４）の前記上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）を有する、支持体（１）の上面での円形形状セクション（１１）（穿孔の上部セクション）と、
直径ｄ２（穿孔の下部直径ｄ２）、及び、穿孔の前記下部セクションの中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｗ）を有する、支持体（１）の下面（３）での円形形状セクション（１２）（穿孔の下部セクション）と、を有し、
直径ｄ１が５００μｍ以下の値で１０μｍ以上の値であり、好ましくは１５０μｍの値であり、直径ｄ２が５００μｍ以下の値であり、好ましくは１５０μｍの値であり、
直径ｄ２の値が直径ｄ１の値以上であり、
前記軸（ｘ）及び（ｗ）が組み合わされる（図１及び２）、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４０】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の下面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ２が、支持体の上面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ１より大きいマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４１】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の下面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ２が、支持体の上面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ１より大きく、比率（ｄ１の値／ｄ２の値）が０．３の値から１未満の値である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４２】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の下面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ２が、支持体の上面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ１より大きく、前記支持体の前記穿孔が円錐台の形状であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの穿孔（４）の下部直径ｄ２の値未満であり、前記穿孔（４）が円錐台形状である（図２）マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４４】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の下面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ２が、支持体の上面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ１に等しいマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４５】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体の下面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ２が、支持体の上面での前記穿孔の円形セクションの直径ｄ１に等しく、前記支持体の前記穿孔が円筒形状である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４６】
この実施形態では、そのため、前記支持体の穿孔は、規則的な形状であり、つまり、そのセクションの内のすべて、の直径は等しい長さであり、前記セクションは円形形状である。
【００４７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの穿孔（４）の下部直径ｄ２の値に等しく、前記穿孔（４）が円筒形状である（図１）マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）が円形ベース（１３）を有し、直径ｄ３を有し（突起の円形ベースの直径ｄ３）、突起（８）の前記直径ｄ３が１０μｍの値から５００μｍの値である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００４９】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値が、前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値に等しい（図１及び２）マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００５０】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値が、前記少なくとも１つの穿孔の上部直径ｄ１の値に等しく、前記少なくとも１つの穿孔（４）の下部直径ｄ２の値に等しい（図１及び３）マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００５１】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値が、前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値より大きい（図４、５及び６）マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００５２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値が、前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値未満である（図７、８、９、１０及び１１）マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００５３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において又は一部において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００５４】
少なくとも１つの突起及び少なくとも１つの穿孔によって穴のあいた支持体を備える３Ｄナノ構造膜は、前記突起の内面が全体において又は一部において、支持体の上面で前記穿孔の円形セクションに面しているように、位置付けられる。
【００５５】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているマイクロ流体細胞培養チップに関する：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるとき（図１、２、７及び９）；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき（図８及び１１）。
【００５６】
軸（ｘ）及び（ｙ）を特徴付けるために用いられる「組み合わされる」との用語は、これらの２つの軸間の距離がゼロに等しいことを意味する。
【００５７】
軸（ｘ）及び（ｙ）を特徴付けるために用いられる「異なる」との用語は、これらの２つの軸間の距離が厳密にゼロより大きいことを意味する。
【００５８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているマイクロ流体細胞培養チップに関する：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値未満であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるとき（図６）；又は、
−前記穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記突起（８）の直径ｄ３の値以下であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とがｄ３の値未満の値の距離によって互いに異なるとき（図３、４及び５）；又は、
−前記穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［［ｄ１の値＋ｄ３の値］／２］未満の値で［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］より大きい値の距離によって互いに異なるとき（図１０）。
【００５９】
特定の実施形態によると、本発明は、突起（４）が斜めの変形を有するマイクロ流体細胞培養チップに関し、前記斜めの変形が、
−前記支持体（１）の上面（２）で前記突起（８）によって及び前記突起（８）の頂部によって区切られた、直径ｄ３の円形ベース（１３）の中心を通り抜ける軸（ｚ）と、
−前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と、間で形成される角度αによって画定される（図１２）。
【００６０】
特定の実施形態によると、本発明は、軸（ｙ）と軸（ｚ）との間で形成された角度αが０と４５°との間であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００６１】
特定の実施形態によると、本発明は、軸（ｙ）と軸（ｚ）との間で形成された角度αが０と６０°との間であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００６２】
軸（ｙ）と軸（ｚ）との間で形成される角度αが４５°より大きい場合、突起の傾きは、分泌物の回収を部分的に妨げる。角度αを取り得る最大理論値は９０°であるが、この実施形態では、突起は、前記３Ｄナノ構造膜の上面に沿って完全に折りたたまれ、分泌物の回収は妨げられる。
【００６３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の外面（９）が前記外面上で少なくとも１つの接着細胞を支え、前記突起（８）の内面（１０）が前記内面（１０）上で少なくとも１つの接着細胞を支え、少なくとも２つの細胞が２つの異なる細胞型に属する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００６４】
「接着細胞」との用語は、その成長が支持体への接着を必要とし、それに関して前記支持体への脱離が機械的又は酵素処理（例えば、トリプシンによる）を必要とする任意のタイプの細胞を意味する。
【００６５】
「異なる細胞型」との用語は、異なる性質又は機能の、又は異なる組織に由来する細胞型を意味するために用いられる。
【００６６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記外面上の前記接着細胞が間質細胞であり、前記内面上の前記接着細胞が上皮細胞であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００６７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記外面（９）上の前記少なくとも１つの接着細胞が間質細胞、より具体的には線維芽細胞であり、前記内面（１０）上の前記少なくとも１つの接着細胞が上皮細胞であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００６８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記外面上の前記接着細胞が上皮細胞であり、前記内面上の前記接着細胞が間質細胞であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００６９】
上皮細胞は、前立腺、膀胱若しくは腎臓非腫瘍形成性市販の細胞株、又は市販の初代培養物であり得る。
【００７０】
間質細胞は、線維芽細胞（市販の初代培養物若しくは株）、間充織細胞（市販の培養若しくは株）、又は、内皮細胞等の他の間質細胞であり得る。
【００７１】
前記突起の内面及び外面上に培養される２つの細胞型は、「中立」又は正常細胞と呼ばれる。つまり、それらは非腫瘍形成性である。
【００７２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の外面（９）が合流の段階で第１のセットの接着細胞を支え、前記突起（８）の内面（１０）が合流の段階で第２のセットの接着細胞を支え、第１の及び第２のセットの接着細胞の細胞が２つの異なる細胞型に属する、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図１３）。
【００７３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の外面（９）が、有利には合流の段階で、第１のセットの接着細胞を支え、前記第１のセットは間質細胞の、より具体的には線維芽細胞のセットであり、前記突起（８）の内面（１０）は合流の段階で第２のセットの接着細胞を支え、前記第２のセットが上皮細胞のセットである、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図５２）。
【００７４】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の外面（９）が、第１のセットの接着細胞を支え、前記第１のセットは間質細胞の、より具体的には線維芽細胞のセットであり、前記突起（８）の内面（１０）は合流の段階で第２のセットの接着細胞を支え、前記第２のセットが上皮細胞のセットである、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００７５】
特定の実施形態によると、本発明は、突起の外面及び内面が、これらの表面上に細胞を導入する前、つまり細胞培養前に、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）調製（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、コラーゲン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸）によって覆われるマイクロ流体細胞培養チップに関する。より具体的には、前記ＥＣＭ調製は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）又はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）／コラーゲン混合物から成る。
【００７６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記３Ｄナノ構造多孔質膜が２から３００ｎｍ、より具体的には３０ｎｍの厚さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００７７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記３Ｄナノ構造多孔質膜が２から３００ｎｍの厚さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００７８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記３Ｄナノ構造多孔質膜が３０ｎｍの厚さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００７９】
突起はその円形形状ベースでセクションを有し、このセクションの表面は、半径に従って計算され得る。
【００８０】
特定の実施形態によると、本発明は、中空ドームの形状における前記突起が１から６００μｍ、より具体的には１から３００μｍ、より具体的には５０から３００μｍ、より具体的には５０μｍの高さを、及び、７８．５μｍ２から２０００００μｍ２、より具体的には２０００から７００００μｍ２、さらにより具体的には１７５００μｍ２の、さらにより具体的には７８５０μｍ２のドームのベースによって区切られた表面を有する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００８１】
「高さ」との用語は、突起の頂部の中心と直径ｄ３の開口部の中心との間の距離を意味する。
【００８２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記支持体が同一形状及び寸法の少なくとも２つの穿孔を備え、前記３Ｄナノ構造多孔質膜が同一形状及び寸法の少なくとも２つの突起を備え、穿孔の数が突起の数に等しい、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００８３】
前記膜が少なくとも２つの突起を備えるとき、距離は、これらの少なくとも２つの突起間で画定されなくてはならない。
【００８４】
「２つの隣接する突起間の距離」との表現の定義は、２つの隣接する突起の前記３Ｄナノ構造膜の外面の交差によって形成される円周上にそれぞれ位置し、且つ、２つの隣接する突起の前記円周上にそれぞれ位置する点の対の間のすべての可能な距離の内の最短距離を形成する、２つの点の間の距離であるとしなくてはならない（図３２）。
【００８５】
前記膜が少なくとも２つの突起を備えるとき、これらは適切な距離によって分離されなくてはならない。
【００８６】
特定の実施形態によると、本発明は、２つの隣接する突起間の距離が値ｌであり、前記値ｌが１０から１００μｍである、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００８７】
特定の実施形態によると、本発明は、２つの隣接する突起間の距離が値ｌであり、前記値ｌが１０から１００μｍ、より具体的には５０から１００μｍである、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００８８】
特定の実施形態によると、本発明は、２つの隣接する突起間の距離が値ｌであり、前記値ｌが５０から１００μｍである、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００８９】
各々の以下の段落では、「２つの隣接する突起間の距離」との表現は、上記で与えられた定義によって置き換えられ得る。
【００９０】
特定の実施形態によると、本発明は、前記支持体が少なくとも２つの穿孔を備え、前記ナノ構造多孔質膜が少なくとも２つの突起を備える、マイクロ流体細胞培養チップに関する。例えば比率
【００９１】
【数１】
2019518443.tif 000002
【００９２】
は１から
【００９３】
【数２】
2019518443.tif 000003
【００９４】
まで変化し、ｌは２つの隣接する突起間の距離の値であり、直径ｄ１が５００μｍ以下の値で１０μｍ以上の値であり、直径ｄ２が５００μｍ以下且つ１０μｍ以上の値である。
【００９５】
そのため、支持体の下面での前記穿孔の下部直径ｄ２は常に、支持体の上面での前記穿孔の上部直径ｄ１以上である。
【００９６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記３Ｄナノ構造多孔質膜が１ｃｍ２の中央ユニットの表面に関して１から１００個の突起を備えるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【００９７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記３Ｄナノ構造膜が、以下の式に等しい、１ｃｍ２の中央ユニットの表面に関する最大数の突起を備えるマイクロ流体細胞培養チップに関し、
【００９８】
【数３】
2019518443.tif 000004
【００９９】
ｌが２つの隣接する突起間の距離であり、前記値ｌが１０から１００μｍ、より具体的には５０から１００μｍであり、
ｄ３が前記突起の直径である。
【０１００】
３Ｄナノ構造多孔質膜は、層の連続性が少なくとも２つの層から適用されると理解される、１から１５０個までの高分子電解質の多数の連続する層から成る。
【０１０１】
層の数は、突起の機械的強度を変化させることを可能にさせる。実際、層の数の増加が大きいほど、突起の機械的抵抗の増加は大きくなり、これらの外面及び内面上で細胞培養を支えつつ、それのいずれかの側面上で（例えば培地の）流れに抵抗することによって、それらはその外形を保ち得るようになる。
【０１０２】
特定の実施形態によると、本発明は、高分子電解質の連続する層の数が１から１５０、特に１５であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１０３】
３Ｄナノ構造多孔質膜を構成するための高分子電解質の使用は、その上に接着細胞が組織において付着されるようになる基底膜を真似るための生体適合性且つ機能性代替物を提供する。
【０１０４】
３Ｄナノ構造多孔質膜は、高分子電解質の層から成り得る。
【０１０５】
特定の実施形態によると、本発明は、３Ｄナノ構造多孔質膜がポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、ポリアネトールスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン−ｃｏ−アクリロニトリル）酸、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸）、水和４−スチレンスルホン酸ナトリウム塩の内から選択される高分子電解質の層から成る、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１０６】
３Ｄナノ構造多孔質膜は、高分子電解質の少なくとも２つの連続する層から成り得る。
【０１０７】
前記膜が少なくとも２つの層を備えるとき、この膜の構造は、層ごとに、必要不可欠である。
【０１０８】
前記３Ｄナノ構造多孔質膜の不可欠な部分である少なくとも１つの突起、前記３Ｄナノ構造多孔質膜の構成は、前記少なくとも１つの突起の構成と同一であろう。
【０１０９】
特定の実施形態によると、本発明は、３Ｄナノ構造多孔質膜がポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、ポリアネトールスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン−ｃｏ−アクリロニトリル）酸、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸）、水和４−スチレンスルホン酸ナトリウム塩の内から選択される高分子電解質の連続する層から成る、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１１０】
前記膜が少なくとも２つの連続する層を備えるとき、前記層は、異なる性質の少なくとも２つの高分子電解質に対応し得る：少なくとも１つの負に帯電した高分子電解質及び少なくとも１つの正に帯電した高分子電解質。
【０１１１】
この場合では、この膜の構造は、層ごとに、正に帯電した高分子電解質層が負に帯電した高分子電解質層と交互になるようにされなくてはならない。
【０１１２】
そのため、膜は、正に帯電した高分子電解質層と負に帯電した高分子電解質層との間の静電相互作用のため高度に凝集性である。これは、約１キロパスカルであるヤング率を有する膜を得ることを可能にさせる。
【０１１３】
多孔質膜の下部層及び上部層が、互いに独立して、高分子電解質の内の任意の１つからなり得ることが留意されなくてはならない。
【０１１４】
しかしながら、最後の層から成る、それゆえ前記膜の上面から成る高分子電解質の電荷は、膜の疎水性に影響を有する。そのため、最後の層が負に帯電した高分子電解質から成るとき、膜の上面は、その上面が正に帯電した膜と比較して、比較的親水性の性質である。逆に、最後の層が正に帯電した高分子電解質から成るとき、膜の上面は、その上面が負に帯電した膜と比較して、比較的疎水性の性質である。
【０１１５】
膜の上面の粗さは、前記膜の上面から成る層である、膜の最後の層から成る高分子電解質によって担持される基によって管理される。例えば、それはＰＳＳ層であり、この高分子電解質は、宙ぶらりんの付着されたベンゼン環及び結合した硫酸基を有するので、任意の付着されたベンゼン環を有さない電解質に、ＰＡＨ層よりも粗い、表面を提供する。３Ｄナノ構造多孔質膜の粗さは、約１ナノメートルである。
【０１１６】
特定の実施形態によると、本発明は、正に帯電した高分子電解質及び負に帯電した高分子電解質の、連続する層の数が１から１５０、特に１５であり、負に帯電した高分子電解質層及び前記正に帯電した高分子電解質層が互いに交互になっている、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１１７】
特定の実施形態によると、本発明は、３Ｄナノ構造多孔質膜が少なくとも２つの高分子電解質の連続する層から成り、その少なくとも１つの高分子電解質が正に帯電し、少なくとも１つの高分子電解質が負に帯電し、
前記正に帯電した高分子電解質が、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ジアリルジメチルアンモニウムクロライドの内から選択され、
前記負に帯電した高分子電解質が、ポリ（アリルアミン塩酸塩）、ポリアネトールスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−ｃｏ−アクリロニトリル）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸）、水和４−スチレンスルホン酸ナトリウム塩の内から選択され、前記負に帯電した高分子電解質層及び前記正に帯電した高分子電解質層が互いに交互になっている、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１１８】
特定の実施形態によると、本発明は、３Ｄナノ構造多孔質膜が正に帯電した高分子電解質の及び負に帯電した高分子電解質の連続する層から成り、前記正に帯電した高分子電解質がポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）であり前記負に帯電した高分子電解質がポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）であり、前記負に帯電した高分子電解質層及び前記正に帯電した高分子電解質が互いに交互になっている、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１１９】
特定の実施形態によると、本発明は、ポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）の及び／又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）の連続する層の数が１から１５０、特に１５であるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２０】
特定の実施形態によると、本発明は、各高分子電解質層が２から３００ｎｍの、より具体的には約２ｎｍの厚さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２１】
特定の実施形態によると、本発明は、正に帯電した高分子電解質及び負に帯電した高分子電解質の、連続する層の数が１５であり、前記負に帯電した高分子電解質層及び前記正に帯電した高分子電解質層が互いに交互になっており、各層が２ｎｍの厚さを有する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２２】
特定の実施形態によると、本発明は、高分子電解質の連続する層の内のすべての、厚さの値が、層の厚さの値から前記突起の直径ｄ３の半分未満の値までから成る、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２３】
特定の実施形態によると、本発明は、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）がポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ポリ（アクリルアミド−ｃｏ−ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）、ジアリルジメチルアンモニウムクロライド、ポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）、ポリアネトールスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリ（スチレン−ａｌｔ−マレイン酸）、ポリビニル硫酸塩、ポリビニルスルホン酸、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸）、ポリ（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸−ｃｏ−アクリロニトリル）、ポリ（４−スチレンスルホン酸）、ポリ（４−スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸）、水和４−スチレンスルホン酸ナトリウム塩の内から選択される高分子電解質の少なくとも１つの層から成り、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）が、少なくとも２つの連続する層から成り、正に帯電した高分子電解質から成る層が、負に帯電した高分子電解質から成る層と交互になっているとき、
前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）が特に、高分子電解質の１から１５０個の連続する層から成り、
より具体的には、前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）が、互いに交互になっているポリ（４−スチレンスルホン酸ナトリウム）（ＰＳＳ）及び／又はポリ（アリルアミン塩酸塩）（ＰＡＨ）の１５個の連続する層から成る、ＲＸに従ったマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２４】
従って、３Ｄナノ構造多孔質膜は、高分子電解質の連続する層から成るので、可変パラメータとして：
−層の数と、
−各々の層の厚さと、
−用いられる高分子電解質の電荷と、を含む。
【０１２５】
層の数を変えることによって、前記膜、それゆえ前記突起の粗さ、厚さ及び剛性は、修正され得る。
【０１２６】
層の数又は用いられる高分子電解質の電荷のタイプを変えることによって、前記膜の及び前記突起の疎水性もまた修正され得る。
【０１２７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記支持体が２μｍから１０００μｍの、より具体的には２０μｍの厚さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記穿孔が７８．５μｍ２から２０００００μｍ２の、より具体的には２０００から７００００μｍ２の、さらにより具体的には１７５００μｍ２の、及びさらにより具体的には７８５０μｍ２の前記非吸収性膜によって区切られた表面を有する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１２９】
支持体は、少なくとも１つの穿孔を備える。前記支持体が少なくとも２つの穿孔を備えるとき、これらの少なくとも２つの穿孔間の距離は画定されなくてはならない。
【０１３０】
「２つの隣接する穿孔間の距離」は、前記隣接する穿孔の、各々の上部円形セクションの円周上にそれぞれ位置し、且つ、前記隣接する穿孔の、各々の上部円形セクションの円周上にそれぞれ位置する点の対の間のすべての可能な距離の内の、最短距離を形成する、２つの点の間の距離であるとして理解されなくてはならない。
【０１３１】
前記支持体が少なくとも２つの穿孔を備えるとき、これらは適切な距離によって分離されなくてはならない。
【０１３２】
特定の実施形態によると、本発明は、２つの隣接する穿孔間の前記距離が値Ｌであり、前記値Ｌが１０から１００μｍ、より具体的には５０から１００μｍである、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３２）。
【０１３３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記支持体が１ｃｍ２の中央ユニットの表面に関して１から１００個の穿孔を備えるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１３４】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１３５】
ＳＵ−８樹脂は、約８の平均エポキシド基官能性を有するノボラックエポキシド系負の感光性高分子樹脂である。ＳＵ−８樹脂は、当業者に良く知られており、マイクロシステムを製造することにおいて一般的に用いられる。「負の」との用語は、ＵＶへさらされた部分が架橋され、一方でフィルムの残りが可溶のままであり洗浄によって除去され得ることを意味する。
【０１３６】
バイオプリントプラスチックは、３Ｄ印刷装置に適切な且つ適合する（押出、温度制限）、当業者に知られるプラスチックに対応する。
【０１３７】
組織培養プラスチックは、ベース処理（親水性表面を為すための電気又はプラズマ放電によって、つまり明確な負の電荷によって、実行される処理）を備え、且つ、（細菌学に関して処理されない、プラスチック培養ボックスとは異なる）真核性接着細胞の付着及び成長を可能にさせる、モールドボックスから成る、プラスチックに対応する。
【０１３８】
特定の実施形態によると、本発明は、支持体がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、前記支持体が透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１３９】
下部モジュール
特定の実施形態によると、本発明は、
−上面、下面及び少なくとも１つの側面を含む下部ユニット（１０８）であって、上部オリフィス（１５）及び下部オリフィス（１６）を備える少なくとも１つの管状形状ダクト（１４）を備える、下部ユニット（１０８）と、
−ベース（１０９）であって、
前記下部ユニット（１０８）が、前記ベース（１０９）に統合され且つ前記ベース（１０９）によって全体を形成し、
前記下部ユニットの前記上面が少なくとも１つのダクトの前記上部オリフィス（１５）を備え、前記下部オリフィス（１６）が、それ自身で又は中間手段（１７）によって、前記ベース（１０９）の外側につながる、ベース（１０９）と、を備える固体の下部モジュール（１０７）を含むマイクロ流体細胞培養チップに関する（図４１及び４５）。
【０１４０】
少なくとも１つのダクトの上部オリフィスは下部ユニット内に位置し、少なくとも１つのダクトは下部ユニットを通って、その後下部モジュールのベースを通って伸び、前記ユニット及び前記ベースが１つの単一の保持の一部を形成し、少なくとも１つのダクトの下部オリフィスが前記ベースの外側につながるようになる。
【０１４１】
少なくとも１つのダクトの下部オリフィスは、それ自身が前記ベースの外側につながる、又は、それ自身が前記ベースの外側につながる、リザーバ等の中間手段内につながるかのいずれかである。
【０１４２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記下部モジュール（１０７）及び前記中央モジュール（１０４）は、前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開くように組み立てられ、少なくとも１つのダクト（１４）の下部オリフィス（１６）が、チップの外側につながり、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（３）の前記下面が互いに同一形状及び同一表面を有する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１４３】
「チップの外側」との表現は、「ベースの外側」として解釈されなくてはならない。逆もまた同様である。
【０１４４】
下部モジュールが中央モジュールへ組み立てられるとき、前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が、前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開いている。この少なくとも１つのダクトは、少なくとも１つの突起の内面上で、培養された細胞の分泌物を回収することを可能にさせる。
【０１４５】
この少なくとも１つのダクトはまた、培地、及び場合により、前記突起の内面上で培養される細胞を導入することを可能にさせる。
【０１４６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記下部モジュール（１０７）及び前記中央モジュール（１０４）は、前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開くように組み立てられ、少なくとも１つのダクト（１４）の下部オリフィス（１６）が、液体を回収することが可能なリザーバ（１７）から成る中間手段を介してチップの外側につながり、前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にし、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体の前記下面が互いに同一形状及び同一表面を有する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１４７】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも１つのダクト（１４）の前記下部オリフィス（１６）が、溶液において化合物を分析することを可能にさせるデバイス上でチップの外側につながる、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１４８】
分析デバイスは、質量分析計、ＲＭＮデバイス、（液体又は気体相における）クロマトグラフデバイス、免疫学的相互作用に基づいたデバイス（ＥＬＩＳＡ、免疫沈降）、ＰＣＴ又はＲＴ−ＰＣＲデバイス等の、当業者に知られた任意の分析デバイスから成り得る。
【０１４９】
実際、細胞の分泌物は、タンパク質及びペプチドの両方から、またＤＮＡ及びＲＮＡから成る。そのため、選択された分析デバイスは、これらの分子の内のすべてを分析することを可能にしなくてはならない。
【０１５０】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも１つのダクト（１４）の前記下部オリフィス（１６）が、溶液において化合物を分析することを可能にさせるデバイス上でチップの外側につながり、前記デバイスが質量分析計である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１５１】
本発明によるマイクロ流体チップは、分泌物のリアルタイム且つ連続した分析を実行するために、質量分析計を統合するチップと直接結合され得る。
【０１５２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記下部ユニット（１０８）及び前記中央ユニット（１０５）が下部モジュール（１０９）の及び中央モジュール（１０６）の、各々のベース上にそれぞれ位置する取付要素（２０４）によって組み立てられて、前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（３）の前記下面を密封したやり方で組み立てる、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１５３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値が前記ダクト（１４）の前記下部オリフィス（１６）の直径ｄ５の値より大きい、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１５４】
特定の実施形態によると、本発明は、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値が前記ダクト（１４）の前記下部オリフィス（１６）の直径ｄ５の値に等しく、前記少なくとも１つのダクトが円筒形状である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１５５】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つのダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）が直径ｄ４、及び、前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）を有し、直径ｄ４の値が前記少なくとも１つの穿孔（４）の下部直径ｄ２の値以上である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１５６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つのダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）が前記支持体（１）の１つの単一の穿孔につながる、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１５７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が全体において、前記少なくとも１つのダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
−前記穿孔（４）の下部直径ｄ２の値が前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値と等しく、穿孔（４）の前記上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが組み合わされるとき（図１４及び１５）；又は、
−前記穿孔（４）の下部直径ｄ２の値が前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値未満であり、穿孔（４）の前記上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが組み合わされる、若しくは、［（ｄ４の値−ｄ２の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき（図１６、１７及び１８）。
【０１５８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が、前記少なくとも１つのダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に部分的に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
−前記穿孔（４）の下部直径ｄ２の値が前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値に等しく、穿孔（４）の前記上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、［ｄ４の値／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき（図１９、２１、２２、２４、２９及び３０）、又は、
−前記穿孔（４）の下部直径ｄ２の値が前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の直径ｄ４の値未満であり、穿孔（４）の前記上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、［ｄ４の値／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき（図２０、２３、２５、２６、２７及び２８）。
【０１５９】
特定の実施形態によると、本発明は、前記下部モジュール（１０７）が少なくとも２つのダクト（１４）を備えるマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１６０】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも２つのダクト（１４）の、各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、少なくとも２つのダクト（１４）の少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が少なくとも２つの異なるサイトへそれぞれ、チップの外側につながる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３２）。
【０１６１】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも２つのダクト（１４）の、各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、少なくとも２つのダクト（１４）の少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が、液体を回収することが可能なリザーバ（１７）から成る中間手段にそれぞれつながり、前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にさせる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３１）。
【０１６２】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも２つのダクト（１４）の、各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、少なくとも２つのダクト（１４）の少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が、液体を回収することが可能なリザーバ（１７）から成る中間手段にそれぞれつながり、前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にさせ、各々の前記リザーバの前記出口ダクトが互いに接続されて同じサイトでチップの外側につながる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３４）。
【０１６３】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも２つのダクト（１４）が互いに接続されてネットワークを形成して、少なくとも２つのダクト（１４）の、各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、各々の少なくとも２つのダクト（１４）の下部オリフィス（１６）がそれら自身で、同じサイトでチップの外側に、又は、液体を回収することが可能なリザーバ（１７）から成る中間手段を介して、つながり、前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にさせる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３３及び３５）。
【０１６４】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも２つのダクト（１４）の、各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、少なくとも２つのダクト（１４）の第１のセットの少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が、リザーバ（１７）から成る第１の中間手段につながり、
少なくとも２つのダクト（１４）の、１つの第２のセットの少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が、リザーバ（１７）から成る少なくとも１つの第２の中間手段につながり、
前記第１の及び少なくとも第２のリザーバ（１７）が液体を回収することが可能であり、且つ、異なるサイトで、前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる個別の出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を各々可能にさせる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３７）。
【０１６５】
特定の実施形態によると、本発明は、少なくとも２つのダクト（１４）の各々の上部オリフィス（１５）が穿孔（４）につながり、少なくとも２つのダクト（１４）のセットの少なくとも２つの下部オリフィス（１６）が、液体を回収することが可能なリザーバ（１７）から成る１つの同じ中間手段につながり、且つ前記下部モジュール（１０７）のベース（１０９）の外側につながる出口ダクト（１８）を介してチップの外側への輸送を可能にさせる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３６）。
【０１６６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記下部モジュール（１０７）が１００μｍから２ｃｍの高さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１６７】
特定の実施形態によると、本発明は、下部モジュール（１０７）の前記ベース（１０９）が１００μｍから２ｃｍの高さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１６８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記下部ユニット（１０８）が１００μｍから２ｃｍの高さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１６９】
特定の実施形態によると、本発明は、下部モジュール（１０７）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、又はＳＵ８から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７０】
特定の実施形態によると、本発明は、下部モジュール（１０７）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、前記下部モジュール（１０７）が透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７１】
特定の実施形態によると、本発明は、下部モジュール（１０９）のベースがバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、又はＳＵ８から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７２】
特定の実施形態によると、本発明は、下部モジュール（１０９）のベースがバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、下部モジュール（１０９）の前記ベースが透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７３】
特定の実施形態によると、本発明は、下部ユニット（１０８）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、又はＳＵ８から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７４】
特定の実施形態によると、本発明は、下部ユニット（１０８）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、前記下部ユニット（１０８）が透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７５】
上部モジュール
特定の実施形態によると、本発明は、以下を備える上部モジュール（１０１）を含むマイクロ流体細胞培養チップ関する：
−開放容積（チャンバ）（２０３）を画定する固体の表面、及び、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）と接触して前記開放容積の開口部の表面を区切ることが可能な固体の表面の端から成る、固体の且つ中空の上部ユニット（１０２）と；
−ベース（１０３）であって、
前記上部ユニット（１０２）が、前記ベース（１０３）に統合され且つ前記ベース（１０３）によって全体を形成する、ベース（１０３）と、を備える上部モジュール（１０１）を含む、ベース（１０３）と。
【０１７６】
チャンバ（２０３）は、上部モジュール（１０１）のベース（１０３）において統合され、且つ、前記チャンバ（２０３）の開放容積の表面を除いて、前記ベース（１０３）によってその表面のすべての上でこのように囲まれて位置する。
【０１７７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）及び前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）は、前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面が前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）の上に位置付けられるように組み立てられ、開口部の前記表面及び前記上面（６）が互いに同一形状及び同一表面を有する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１７８】
特定の実施形態では、上部ユニットは、３Ｄナノ構造多孔質膜の外面及び少なくとも１つの突起の外面上で細胞培養を観察するために、顕微鏡観察に適合した、透明ガラス部品、好ましくは顕微鏡スライドを挿入することを可能にする前記チャンバから成る固体の表面で、外側上の開口部（窓）を備える。
【０１７９】
開口部は好ましくは、前記チャンバの固体の表面の場所に、位置して、それが突起の外面上で細胞培養の観察を垂直に可能にさせるようにする。
【０１８０】
前記透明ガラス部分は、前記チャンバから成る固体の表面の前記開口部上に位置付けられ、前記上部ユニットへ封止されて維持されて、上部ユニットと中央ユニットとの間で閉鎖空間を維持する。
【０１８１】
好ましくは、前記透明ガラス部分は、封止接着剤を用いて前記上部ユニットへ封止されて維持される。
【０１８２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）及び前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）が、上部モジュール（１０１）の及び中央モジュール（１０４）の、各々のベース（１０３、１０６）上に位置する取付要素（２０１、２０４）によって組み立てられて、前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面及び前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）を、密封したやり方で、組み立てる、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記固体の矩形面に隣接し且つ互いに隣接した、４つの固体面及び固体の矩形面を固体の表面が備える、前記固体の且つ中空上部ユニット（１０２）が前記チャンバ（２０３）を形成し、前記４つの固体面の自由端が前記チャンバ（２０６）の開口部の前記表面を区切る、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８４】
特定の実施形態によると、本発明は、上部モジュール（１０１）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、又はＳＵ８から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８５】
特定の実施形態によると、本発明は、上部モジュール（１０１）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、前記上部モジュール（１０１）が透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８６】
特定の実施形態によると、本発明は、上部モジュール（１０３）のベースがバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、又はＳＵ８から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８７】
特定の実施形態によると、本発明は、上部モジュール（１０３）のベースがバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、上部モジュール（１０３）の前記ベースが透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８８】
特定の実施形態によると、本発明は、上部ユニット（１０２）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、又はＳＵ８から成るマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１８９】
特定の実施形態によると、本発明は、上部ユニット（１０２）がバイオプリントプラスチック、ポリカーボネート、組織培養プラスチック、ガラス又はＳＵ−８樹脂から成り、前記上部ユニット（１０２）が透明である、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１９０】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部ユニット（１０２）の前記チャンバ（２０３）の開口部の前記表面が前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）の上に位置付けられて、前記上部ユニット（１０２）の前記固体の表面及び３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）によって区切られた閉鎖空間を形成する、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１９１】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部ユニット（１０２）の前記チャンバ（２０３）の開口部の前記表面が前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）の上に位置付けられ、前記上部ユニット（１０２）の前記少なくとも１つの固体面が入口／出口ダクト（２０２）にそれぞれつながる２つのオリフィスを有して、
ベース（１０９）の外側につながる前記入口／出口ダクト（２０２）を介して前記２つのオリフィスによってのみ、前記マイクロ流体チップの外側と連通し得る前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（６）と前記上部ユニット（１０２）の前記固体の表面とによって区切られた閉鎖空間を形成する、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図３８及び４３）。
【０１９２】
上部ユニットが、入口／出口ダクトにそれぞれつながる２つのオリフィスを備える。２つの入口／出口ダクトは上部モジュールのベースを通って伸び、前記ユニット及び前記ベースは１つの単一の保持の一部を形成し、前記２つの入口／出口ダクトは前記上部ベースの外側につながるようになる。
【０１９３】
上部モジュールが中央モジュールへ組み立てられるとき、３Ｄナノ構造多孔質膜上のチャンバのアセンブリは、前記入口／出口ダクトを介して前記２つのオリフィスによってのみ、前記マイクロ流体チップの外側と連通し得る閉鎖空間を画定することを可能にさせる。これらのダクトはまた、チャンバにおける培地の導入を、及び場合により、前記膜の上面又は少なくとも１つの突起の外面上で培養される細胞の導入を可能にさせる。
【０１９４】
これらの入口／出口ダクトはセンサーと結合され得て、培養条件及びパラメータ（ＣＯ２、Ｏ２、圧力、温度、グルコース、ｐＨセンサー）の連続したモニタリングを可能にさせる。代替実施形態では、これらのセンサーは、チャンバ（２０３）において直接統合され得る。
【０１９５】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部モジュール（１０１）が５０μｍから２ｃｍの、特に１ｃｍの高さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１９６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部モジュール（１０１）の前記ベース（１０３）が５０μｍから２ｃｍの、特に１ｃｍの高さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１９７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）が５０μｍから２ｃｍの、特に１ｃｍの高さを有するマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０１９８】
３つのモジュールのアセンブリ
特定の実施形態によると、本発明は、上部モジュール（１０１）、中央モジュール（１０４）及び下部モジュール（１０７）を備え、上記前記モジュールは、
前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面が、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（２）の上に位置付けられ、
前記下部モジュール（１０７）の前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が、前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開いており、
前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面及び前記中央ユニット（１０５）の３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記上面（２）が、互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（３）の前記下面が互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記上部モジュール（１０１）、前記中央モジュール（１０４）及び前記下部モジュール（１０７）が、各々の個別のベース（１０３、１０６、１０９）上に位置する取付要素（２０１、２０４）によって組み立てられる、ように組み立てられる、マイクロ流体細胞培養チップに関する（図４２、４６及び４７）。
【０１９９】
各々のモジュールのベース上に位置する取付要素は、モジュール２つずつロックして、中央モジュールによって上部モジュールを組み立て且つ下部モジュールによって中央モジュールを組み立てる、又は、第３のモジュール上に２つのモジュールをロックして、上部モジュール上で下部モジュール及び中央モジュールを組み立てる、のいずれかを可能にさせる。
【０２００】
これらの取付要素は、オス／メス取手又は要素、好ましくはオス／メス要素であり得る。
【０２０１】
特定の実施形態によると、上部モジュールのベースは、オス取付要素として高台（２０１）を備え、中央モジュール及び下部モジュールのベースは、メス取付要素として穿孔（２０４）を備えて、上部モジュールの前記高台上にロックされることを可能にする。
【０２０２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面しているマイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるようなとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように；
及び、前記支持体（１）の前記穿孔（４）が全体において、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面しているとき：
前記突起（８）の前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、組み合わされる、又は、ｄ４の値がｄ２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ３の値）／２］以下の距離によって互いに異なるように。
【０２０３】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるようなとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように。
及び
−前記突起（８）の前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、組み合わされる、若しくは、［（ｄ４の値／２）＋（ｄ３の値の４／１０）］以下距離によって互いに異なる。
【０２０４】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるようなとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように。
及び
−前記突起（８）の前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、組み合わされる、又は、［［（ｄ４の値＋ｄ４の値）／２］−１０μｍ］以下距離によって互いに異なるとき。
【０２０５】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるときのように；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように。
及び
−前記突起（８）の前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、組み合わされる、又は、［ｄ４の値／２］以下距離によって互いに異なる。
【０２０６】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値未満であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが、組み合わされる、又は、［（ｄ１の値／２）＋（ｄ３の値の４／１０）］以下の値によって互いに異なるように。
及び、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は、直径ｄ２の値が直径ｄ４の値以上であるとき組み合わされる、
又は、直径ｄ４の値が直径ｄ２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ１の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なる。
【０２０７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値未満であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが、組み合わされる、又は、［［（ｄ３の値＋ｄ１の値）／２］−１０μｍ］以下の値によって互いに異なるように。
及び、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は、直径ｄ２の値が直径ｄ４の値以上であるとき組み合わされる、
又は、直径ｄ４の値が直径ｄ２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ１の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なる。
【０２０８】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値未満であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが、組み合わされる、又は、［（ｄ３の値−ｄ１の値）／２］以下の値によって互いに異なるように、
且つ、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は、直径ｄ２の値が直径ｄ４の値以上であるとき組み合わされる、
又は、直径ｄ４の値が直径ｄ２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ１の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なる。
【０２０９】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記突起（８）の直径ｄ３の値に等しく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［ｄ１の値／２］より小さい値の距離によって互いに異なるように、
且つ、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は、直径ｄ２の値が直径ｄ４の値以上であるとき組み合わされる、
又は、直径ｄ４の値が直径ｄ２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ１の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なる。
【０２１０】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように、
且つ、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は組み合わされる、
又は、前記軸（ｘ）及び前記軸（ｙ）は組み合わされる。
【０２１１】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが以下の値によって互いに異なる、組み合わされる、又は、［（ｄ１の値／２）＋（ｄ３の値の４／１０）］以下の値の距離によって互いに異なるように、
且つ、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は、直径ｄ３の少なくとも１／１０が全体において直径ｄ４に面しているようにある距離によって互いに異なる。
【０２１２】
特定の実施形態によると、本発明は、前記突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している、マイクロ流体細胞培養チップに関する：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが以下の値によって互いに異なる、互いに組み合わされる、又は、［［（ｄ３の値＋ｄ１の値）／２］−１０μｍ］以下の値の距離によって互いに異なるように
且つ、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な前記軸（ｘ）及び軸（ｔ）は、直径ｄ３の少なくとも１０μｍが全体において直径ｄ４に面しているようにある距離によって互いに異なる。
【０２１３】
本発明の実施形態では、中央ユニットは以下を含む：
−少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた、上面（２）及び下面（３）を備える、非吸収性膜から成る支持体（１）と
−上面（６）及び下面（７）を備え且つ少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）であって、前記少なくとも１つの突起が、外面（９）及び内面（１０）を備え、且つ３Ｄナノ構造膜（５）の上面（６）の側上でレリーフ構造を形成し、前記突起が、特に、円形ベース（１３）を有する中空ドームの形状であり、
３Ｄナノ構造膜の前記上面（６）が前記支持体の前記下面（２）に固定されて位置付けられ、前記少なくとも１つの突起（８）が前記支持体（１）の上面（２）の側上である。
【０２１４】
そのため、特定の実施形態によると、本発明は、前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）及び前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）は、前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面が前記中央ユニット（１０５）の非吸収性膜（１）から成る支持体の前記上面（２）の上に位置付けられるように組み立てられて、
前記上部ユニット（１０２）の前記固体の表面、非吸収性膜（１）から成る支えの前記上面（２）及び突起の外面（９）によって区切られる閉鎖空間を形成し、
前記上面（２）及び開口部の前記表面が、互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）及び前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）が、上部モジュール（１０１）の及び中央モジュール（１０４）の、各々のベース（１０３、１０６）上に位置する取付要素（２０１、２０４）によって組み立てられて、前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面及び前記中央ユニット（１０５）の非吸収性膜（１）から成る支持体の前記上面（２）を、密封したやり方で組み立て、
有利には前記上部ユニット（１０２）の前記少なくとも１つの固体面が、入口／出口ダクト（２０２）へそれぞれにつながる２つのオリフィスを有し、
前記閉鎖空間が、ベース（１０９）の外側につながる前記入口／出口ダクト（２０２）を介して前記マイクロ流体チップの外側と連通することを可能にする、マイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０２１５】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において又は部分的に、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているマイクロ流体細胞培養チップに関する。
【０２１６】
少なくとも１つの突起及び少なくとも１つの穿孔によって穴のあいた支持体を備える３Ｄナノ構造膜は、前記突起の内面が全体において、又は部分的に、支持体の上面で前記穿孔の円形セクションに面しているように、互いに位置付けられる。
【０２１７】
特定の実施形態によると、本発明は、前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているマイクロ流体細胞培養チップに関する：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるとき。
【０２１８】
特定の実施形態によると、本発明は、上部モジュール（１０１）、中央モジュール（１０４）及び下部モジュール（１０７）を備え、上記前記モジュールは、
前記上部モジュール（１０１）の前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面が、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の前記少なくとも１つの突起（８）の外面（９）の、及び、非収性膜（１）から成る支持体の前記上面（２）の上に位置付けられ、
前記下部モジュール（１０７）の前記下部ユニット（１０８）の前記上面の、少なくとも１つのダクト（１４）の上部オリフィス（１５）が、前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（１）の前記穿孔（４）の内の少なくとも１つの上で開いており、
前記上部ユニット（１０２）の開口部の前記表面及び前記中央ユニット（１０５）の非吸収性膜（１）から成る支持体の前記上面（２）が、互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記下部ユニット（１０８）の前記上面及び前記中央ユニット（１０５）の前記支持体（３）の前記下面が互いに同一形状及び同一表面を有し、
前記上部モジュール（１０１）、前記中央モジュール（１０４）及び前記下部モジュール（１０７）が、各々の個別のベース（１０３、１０６、１０９）上に位置する取付要素（２０１、２０４）によって組み立てられ、
前記突起（８）の前記内面（１０）は全体において、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面している：
前記少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）が全体において、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）に面しているとき：
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（４）の直径ｄ３の値以上であり、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが組み合わされるようなとき；又は、
−前記少なくとも１つの穿孔（４）の上部直径ｄ１の値が前記少なくとも１つの突起（８）の直径ｄ３の値より大きく、前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記穿孔（４）の上部セクション（１１）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｘ）とが［（ｄ１の値−ｄ３の値）／２］以下の値の距離によって互いに異なるように；
及び、前記支持体（１）の前記穿孔（４）が全体において、前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）に面しているとき：
前記突起（８）の前記円形ベース（１３）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｙ）と前記ダクト（１４）の前記上部オリフィス（１５）の中心を通り抜け且つ前記支持体（１）に垂直な軸（ｔ）とが、組み合わされる、又は、ｄ４の値が２の値より大きいとき［（ｄ４の値−ｄ３の値）／２］以下の距離によって互いに異なるように。
【０２１９】
本発明はまた、本発明によるマイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の製造は以下を備える：
−前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）を通して再吸収性高分子溶液（２２）を押し出して、前記支持体（１）の前記上面（２）の側上で少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２３）を形成するステップと（図４８及び４９）、その後
−前記再吸収性高分子溶液を重合して前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２３）を固くするステップであって、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２３）が重合後に前記支持体の前記上面の側上で再吸収性高分子モールド（２２）を形成する、ステップと、その後
−前記支持体（１）の上面（２）及び前記再吸収性高分子モールド（２２）の表面を覆う少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用して、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）を構成するステップと（図５０）、よって、
−前記再吸収性高分子モールドを溶解させて、前記支持体（１）の前記上面（２）に固定されて位置付けられた前記３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の前記下面（７）及び全体において前記少なくとも１つの穿孔（４）に面して位置付けられる少なくとも１つの突起（８）の前記内面（１０）を得るステップと（図５１）。
【０２２０】
中央モジュールを製造する第１のステップは、非吸収性材料、つまり、物理的プロセスによって又は水性溶媒における化学的プロセスによって除去されないことがある材料から成る前記支持体の一以上の穿孔を通して再吸収性高分子溶液を押し出すステップである。
【０２２１】
溶液に関して用いられる再吸収性高分子材料は、最初は粘性液体の形であり、支持体の穿孔を通る押出を可能にさせる。
【０２２２】
「粘性の」との用語はここでは、剪断応力下での変形への抵抗を有する流体を認定するために用いられ、純水のものと少なくとも同じであり、好ましくは純水のものより実質的に大きい。言い換えると、押出に関して用いられる粘性液体は、純水よりも大きいその粘度特性に起因して、純水よりも遅く循環する。押出に関して用いられる液体の粘度特性は重要であり、例えば粘性液体は、純水の粘度を有する溶液よりも、押出プロセスの間に、突起の形状の優れた保存を可能にさせる。押出に関する液体の粘度の好ましい範囲は、１（純水）と１００Ｐａ．ｓとの間であり、好ましくは、液体の粘度は０．１Ｐａ．ｓと１Ｐａ・ｓとの間である。
【０２２３】
「押出」との用語は、粘性液体の形である材料が、マトリクスを通る力によって通されて、前記粘性材料へ、前記マトリクスによってあらかじめ定められる、形状を与えるステップを定義するために用いられる。本発明の範囲では、マトリクスは、少なくとも１つの穿孔を備える支持体から成り、粘性液体状態における前記材料は、再吸収性高分子から成る。少なくとも１つの穿孔を通る、前記支持体の外面への、前記支持体の下面からの、粘性状態におけるこの再吸収性高分子の押出は、前記支持体の上面の側上で前記再吸収性高分子へ３Ｄナノ構造形状を与えることを可能にさせる。
【０２２４】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）を通る前記再吸収性高分子溶液（２２）を押し出すステップは、ドームの形状において前記支持体（１）の前記上面（２）の側上で３Ｄナノ構造（２３）を形成することを可能にさせる。
【０２２５】
穿孔を通る押出及び前記再吸収性高分子溶液の重合後に得られる３Ｄナノ構造は、３Ｄナノ構造多孔質膜の突起の形成に関するモールドとして用いられるという技術的効果を有する。
【０２２６】
押出は、再吸収性高分子溶液が、所望の突起に関するモールドとして用いられることになる、所望の長さの３Ｄナノ構造を形成したときに停止される。
【０２２７】
再吸収性高分子溶液はこのように、ストレスなしで残されて、その重合又はゲル化を可能にさせるので、穿孔を通る前記支持体の上面の側を超える固体の３Ｄナノ構造を与える。
【０２２８】
重合は、非吸収性膜から成り且つ少なくとも１つの穿孔を備える支持体上で直接行われる。
【０２２９】
重合後、得られた３Ｄナノ構造は、モールドを構成して３Ｄナノ構造多孔質膜の突起を得ることを可能にさせる。
【０２３０】
穿孔を通る前記支持体の上面の側を超え且つ押出によって形成される３Ｄナノ構造及び支持体の上面によって形成される表面はその後、高分子電解質フィルムから成る多孔質膜によって覆われる。
【０２３１】
高分子電解質は、モールドとして用いられた３Ｄ構造の除去の間に、任意のタイプの材料（再吸収性さえ）から成る任意のタイプの３Ｄ構造の形状をとり、且つ、このように与えられた３Ｄ形状を保つことを可能にするという特性を有する。
【０２３２】
この高分子電解質フィルムは、レイヤーバイレイヤー技術を用いて作製される多層フィルムである。
【０２３３】
この技術の目的は、前記支持体の穿孔を通って超える３Ｄナノ構造及び支持体の上面によって形成される表面上の高分子電解質の連続する層を吸着して、複数の微細な高分子電解質層を生成することである。
【０２３４】
好ましくは、用いられる高分子電解質は、ＰＡＨ及びＰＳＳである。ＰＡＨ及びＰＳＳ溶液は、０．５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌによって１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。
【０２３５】
高分子電解質多層フィルムは、高分子電解質の内の１つによって等しく開始することによって、且つ高分子電解質の内の１つによって等しく終わることによって、しかし、逆に帯電した高分子電解質間の交互の層を考慮することによって、構成される。
【０２３６】
高分子電解質溶液の電荷の間で、表面は、ＭｉｌｌｉＱ  水（１８ＭΩ．ｃｍ）によって十分にすすがれる。
【０２３７】
このプロセスは、所望の数の高分子電解質層が得られるまで繰り返される。
【０２３８】
このプロセスは、前記支持体の穿孔を通って超える３Ｄナノ構造及び支持体の上面によって形成される表面のすべての上の連続したフィルムから成る連続した、最終的な高分子電解質多層フィルムを得ることを可能にさせる。
【０２３９】
そのため、この最終的な高分子電解質多層フィルムは、支持体の穿孔を通る押出に由来する３Ｄナノ構造上の高分子電解質の連続する層の適用の間に成形することによって得られる突起を有する。
【０２４０】
３Ｄナノ構造及び支持体の上面によって形成される表面が連続した高分子電解質多層フィルムによって覆われるとすぐに、再吸収性高分子材料で作製された３Ｄナノ構造によって形成されるモールドは溶解される。
【０２４１】
非吸収性材料、つまり、物理的プロセスによって、又は水性溶媒における化学的プロセスによって除去されないことがある材料から成る支持体の使用は、この溶解ステップに由来する前記無傷の支持体を保つことを可能にさせることに留意しなくてはならない。
【０２４２】
再吸収性高分子材料の溶解は、その上にそれらが成形された３Ｄナノ構造の形状を保つ突起を有する、支持体に固く結合する、連続した高分子電解質多層フィルムを与える。そのため、この連続したフィルムは、３Ｄナノ構造多孔質膜から成る。
【０２４３】
支持体上に付着された３Ｄナノ構造多孔質膜から成る最終的な構造は、容易に取り扱うことが可能であり、前記マイクロ流体細胞培養チップの中央モジュールを形成する。
【０２４４】
この中央モジュールは、７０％エタノールによって連続して３回洗浄することによって、その後、細胞培養培地によって連続して３から４回洗浄してエタノールの任意の残りの痕跡を除去することによって、消毒され得る。
【０２４５】
エチレンオキシドガスを用いることによって中央モジュールを殺菌することも可能である。
【０２４６】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）を通る前記再吸収性高分子溶液（２２）を押し出すステップは、ポンプシステムを用いることによって実行される。
【０２４７】
再吸収性高分子溶液の押出は、手動で又は（モーターによって）機械的に制御され得るポンプシステムを用いて行われる。
【０２４８】
ポンプシステムは、例えば、前記少なくとも１つの穿孔（４）を通る前記再吸収性高分子溶液（２２）の連続した流れを誘起するためのシリンジ又はピストンから成り得る。
【０２４９】
他の１つの実施形態では、前記再吸収性高分子溶液（２２）は、例えば、手動で、又は、モーターを用いて機械的に、の何れかで、互いに向かって動かされ得る２つの平行な平板を用いて少なくとも１つの穿孔（４）を通って押し出され得る。平板の内の１つは、上部モジュール（２０４）の外面上に位置付けられ、他の平板は、下部モジュール（１０１）の外面上に位置付けられるので、２つの平板は互いに対して平行に位置付けられる。そのため、互いに向かう、前記平坦且つ平行な板の動きは、前記再吸収性高分子溶液（２２）へ力を適用することを可能にさせる。このような場合では、再吸収性高分子溶液（２２）へ適用される力は、前記再吸収性高分子溶液（２２）が前記少なくとも１つの穿孔（４）を通って循環することを強制する。
【０２５０】
押出は、液体において又は空気において行われ得る。
【０２５１】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）を通る前記再吸収性高分子溶液（２２）を押し出すステップは、液体において実行される。
【０２５２】
液体における押出の場合では、液体は、突起を形成するために用いられる高分子の再吸収につながらないように選択される。
【０２５３】
液体において押し出される３Ｄナノ構造の場合では、液体が支持体の上面の上であるとき、これは、３Ｄナノ構造の長さを増加することに対して反対方向において向けられる力から成る静止流体圧力につながるので、３Ｄナノ構造の長さの増加に逆らう役目を果たす。静止流体圧力の大きさは、式ρｔｇの形である、支持体の上面の上の液体の深さ（ｔ）によって及び重力（ｇ）によって、液体の密度（ρ）を掛けることによって計算される。静止流体圧力の大きさは、３Ｄナノ構造の高さを減少させるような役目を果たす。例えば、希釈塩溶液（密度＝１）、体の細胞外液の真似の場合に用いられる溶液、の１ｍｍの深さに関して、３Ｄナノ構造の長さにおける形成に逆らう役目を果たす静止流体圧力の大きさは、９．８ミリパスカルである。
【０２５４】
押出に関する再吸収性高分子として用いられる高分子電解質溶液のヤング率は一般的に、約１００から４００メガパスカルであるので、押出の間に形成された３Ｄナノ構造の長さのわずかな（ｍａｒｇｉｎａｌ）減少が存在する（例えば、最悪の場合では、１００メガパスカルのヤング率に関して、長さの減少は、約１０−５％であろう）。
【０２５５】
そのため、液体において押し出される３Ｄナノ構造の場合では、液体が支持体の下面の下である場合、３Ｄナノ構造の長さにおける形成に逆らう役目を果たす静止流体抵抗力は存在しない。この場合では、突起は、空気において押し出された３Ｄナノ構造と同じ長さに達する。
【０２５６】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記支持体（１）の少なくとも１つの穿孔（４）を通る前記再吸収性高分子溶液（２２）を押し出すステップは、空気において実行される。
【０２５７】
空気において押し出される３Ｄナノ構造の場合では、３Ｄナノ構造の長さにおける形成に逆らう役目を果たす圧力は存在しない。
【０２５８】
本発明はまた、本発明によるマイクロ流体細胞培養物を製造するための代替プロセスに関し、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の製造は以下を備える：
−モールド（Ｈ）の上面（２０９）上に再吸収性高分子溶液（２２）を注ぐステップであって、前記モールドが特に、前記上面（２０９）上に少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造（２０８）を備える、プラスチックで作製される、ステップ（図５３及び５４）と、その後
−前記再吸収性高分子溶液（２２）を重合して、前記再吸収性高分子溶液を固くし、再吸収性高分子マトリクス（２１０）を形成するステップと、その後
−前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクス（２１０）を形成するために前記モールドを除去するステップと（図５５）、その後
−前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）の下面（２１２）上の少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用して、少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）から成るステップ（図５６）と、その後
−前記再吸収性高分子マトリクスを溶解させるステップと。
【０２５９】
特定の実施形態によると、本発明はまた、本発明によるマイクロ流体細胞培養チップを製造するための代替プロセスに関し、前記中央モジュール（１０４）の前記中央ユニット（１０５）の製造は以下を備える：
−モールド（Ｈ）の上面（２０９）上に再吸収性高分子溶液（２２）を注ぐステップであって、前記モールドが特に、前記上面（２０９）上に少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造（２０８）を備える、プラスチックで作製される、ステップ（図５３及び５４）と、その後
−前記再吸収性高分子溶液（２２）を重合して、前記再吸収性高分子溶液を固くし、再吸収性高分子マトリクス（２１０）を形成するステップと、その後
−前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクス（２１０）を形成するために前記モールド（Ｈ）を除去するステップと（図５５）、その後
−少なくとも１つの穿孔（４）を備える非吸収性膜（１）から成る支持体によって前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）を組み立てて、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドが、前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）と位置合わせされるようにするステップと、（図５７）、その後
−前記支持体（１）の穿孔（４）で前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）の下面（２１２）及び前記支持体（１）の下面（３）によって形成される連続した表面上の少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用して、少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）から成るステップ（図５８）と、その後
−前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）を溶解させるステップと（図５９）。
【０２６０】
本発明また、本発明によるマイクロ流体細胞培養チップを製造するための代替プロセスに関し、中央ユニットを備える中央モジュールの製造は以下を備える：
（ｉ）中央ユニットの形式でサイドフレーム（２１３）、開いた上面（２１４）、及び、切断部（２１６）を備える固体の下面（２１５）から成る支持体部分（Ｉ、ｉ）、並びに、上面（２０９）上に少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造（２０８）を備える、前記支持体部分（Ｉ、ｉ）の形状及び寸法におけるモールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）を組み立てるステップであって、前記モールドが特に、プラスチックで作製される、ステップと（図６０）、
（ｉｉ）前記モールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）の前記上面（２０９）上に再吸収性高分子溶液（２２）を注ぐステップ（図６１）と、その後
（ｉｉｉ）前記再吸収性高分子溶液（２２）を重合して、前記再吸収性高分子溶液を固くし、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクス（２１０）を形成するステップと、その後
（ｉｖ）前記モールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）を除去して、前記支持体部分（Ｉ、ｉ）の固体の下面（２１５）の前記切断部（２１６）において形成される前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）を得るステップと（図６２）、その後
（ｖ）ベース（１０６）において統合された少なくとも１つの穿孔（４）によって穴のあいた非吸収性膜（１）から成る支持体を備える、穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）によって、前記支持体部分（Ｉ、ｉ）を組み立てるステップ（図６３）であって、
前記穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）が前記支持体部分（Ｉ、ｉ）の形状及び寸法であり、前記穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）の穿孔（４）の数がステップ（ｉ）において用いられる前記モールド（Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）における成形された３Ｄナノ構造（２１１）の数と同一であり、
前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）が、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の前記少なくとも１つの負のモールドと位置合わせされる、ステップと、その後
（ｖｉ）前記支持体（１）の前記少なくとも１つの穿孔（４）で、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）の下面（２１２）と前記支持体（１）の下面（３）とから成る連続した表面上に少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用して、少なくとも１つの突起（８）を備える３Ｄナノ構造多孔質膜（５）から成るステップと（図６４）、その後
（ｖｉｉ）前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）を溶解させるステップと（図６５）、
（ｖｉｉｉ）支持体部分（Ｉ、ｉ）を除去して、その下面（３）上で３Ｄナノ構造多孔質膜（５）を、その上面の側上で前記少なくとも１つの突起を備える前記穿孔部分（Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）を得るステップと（図６６）。
【０２６１】
図６９に示されるように、上述したプロセスのステップ（ｉ）は、モールドＨ１を揃えるための穴（２１８）に挿入される支持体部分Ｉを揃えるためのピン（２１７）及び部品の平坦なセクションによって導かれる再現性がある特定のアライメントにおいて、モールドＨ、特に１００個の成形された３Ｄナノ構造（２０８）を備えるモールドＨ１、による支持体部分Ｉのアセンブリに対応する。
【０２６２】
支持体部分Ｉ及びモールドＨのアセンブリに関して、前記支持体部分Ｉの固体面（２１５）は、モールドＨの上面（２０９）上に配され、前記モールドＨの成形された３Ｄナノ構造（２０８）が支持体部分Ｉの前記固体面の切断部（２１６）で位置付けられるようになる。
【０２６３】
支持体部分ＩによるモールドＨの接続によってこのように形成されたチャンバはその後、ステップ（ｉｉ）に従って再吸収性高分子（２２）によって満たされる。
【０２６４】
再吸収性高分子の重合（ステップｉｉｉ）後、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクス（２１０）は、支持体部分Ｉの固体面（２１５）上の切断部（２１６）において形成される。
【０２６５】
その後、モールドＨは、ステップ（ｉｖ）に従って支持体部分Ｉから除去される。支持体部分Ｉのベースは、少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクス（２１０）によって切断部（２１６）でこのように形成される。
【０２６６】
支持体部分Ｉはその後、穿孔部分Ｇを揃えるための穴（２１８）に挿入される支持体部分Ｉを揃えるためのピン（２１７）及び部品の平坦なセクションによって導かれる再現性がある特定のアライメントにおいて、ステップ（ｖ）に従って、穿孔部分Ｇ、特に１００個の穿孔（４）を備える穿孔部分Ｇ１によって組み立てられる（図７０）。
【０２６７】
穿孔部分Ｇは、少なくとも１つの穿孔（４）を備える支持体（１）から成り、前記支持体（１）はベース（１０６）に挿入される。
【０２６８】
穿孔部分（Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）を選択することは、ステップ（ｉ）におけるモールド（Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）の選択に依存し、モールド（Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２）の３Ｄナノ構造の形状及び数は、穿孔部分（Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２）の形状と及び穿孔の数と同一である必要がある（図６７、６８、７２、７３）。
【０２６９】
穿孔部分Ｇの支持体（１）の上面（２）は、前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）の下面（２１２）と接触して位置付けられる。
【０２７０】
穿孔部分Ｇの穿孔（４）は、穿孔部分Ｇを揃えるための穴（２１８）において引き起こされる支持体部分Ｉを揃えるためのピン（２１７）を用いて前記マトリクス（２１０）の３Ｄナノ構造（２１１）の負のモールドとこのように位置合わせされる。
【０２７１】
組み立てられる部品Ｉ及びＧ１はその後、図７０−Ｅに示されるように戻されて、部品Ｇ１を支持体部分Ｉの上にする。
【０２７２】
部分Ｇ１の穿孔の壁は、チャンバの形成を可能にさせて、前記支持体（１）の穿孔（４）で、前記少なくとも１つの３Ｄナノ構造（２１１）の少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクス（２１０）の下面（２１２）及び支持体（１）の下面（３）によって形成される連続した表面上で、ステップ（ｖｉ）に従って少なくとも１つの高分子電解質の少なくとも１つの連続した層を適用することによって突起（８）の形成を促進する。
【０２７３】
少なくとも１つの突起（８）が形成されるとすぐに、負のモールド（２１１）の前記マトリクス（２１０）を形成する再吸収性高分子は、ステップ（ｖｉｉ）に従って溶解する。
【０２７４】
支持体部分Ｉは、穿孔部分Ｇ１からこのように除去される。
【０２７５】
穿孔部分Ｇ１は、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）を、支持体（１）の下面（３）の側上で、及び、穿孔部分Ｇ１の支持体の前記少なくとも１つの穿孔の延長において前記少なくとも１つの突起を、支持体（１）の上面（２）の側上で、このように備える（図６６）。
【０２７６】
この実施形態では、３Ｄナノ構造多孔質膜（５）の上面（６）は、非吸収性膜（１）から成る支持体の下面（５）に（接触して）固定される。
【０２７７】
突起（８）を備える３Ｄナノ構造膜（５）及び穿孔（４）を有する支持体（１）を備えるこのように得られた穿孔部分Ｇ１は、マイクロ流体チップの中央モジュールから成り、且つ、前記少なくとも１つの突起の各側の細胞の培養のために用いられる。
【発明を実施するための形態】
【０２７８】
円形形状部分Ｉ、Ｈ及びＧの例
特定の実施形態によると、前記支持体部分（Ｉ）、前記モールド（Ｈ１、Ｈ２）及び前記穿孔部分（Ｇ１、Ｇ２）は円形形状であり、特に３５ｍｍの直径を有する細胞培養ボックスへ適合されることを可能にさせる。
【０２７９】
図６７は、前記モールド（Ｈ１）及び前記穿孔部分（Ｇ１）がそれぞれ、１００個の成形された３Ｄナノ構造及び１００個の穿孔を備えるプロセスの特定の実施形態を与える。
【０２８０】
このようなプロセスは、１００個の突起を有する中央ユニットを得ることを可能にさせる。
【０２８１】
図６８は、前記モールド（Ｈ２）及び前記穿孔部分（Ｇ２）がそれぞれ、９個の成形された３Ｄナノ構造及び９個の穿孔を備えるプロセスの特定の実施形態を与える。
【０２８２】
このようなプロセスは、９個の突起を有する中央ユニットを得ることを可能にさせる。
【０２８３】
穿孔及び成形された３Ｄナノ構造の数のこれらの例は限定するものではない。
【０２８４】
モールド及び穿孔部分を選択することは、中央ユニットの３Ｄナノ構造膜に関する突起の所望の数に依存する。
【０２８５】
この特定の実施形態では、詳細に上述したプロセスから得られる突起を有する穿孔部分Ｇから成る中央モジュールは、図７１に示されるように、部品Ｆとして、培地を含む３５ｍｍの直径を有する細胞培養ボックス等の、細胞培養チャンバ上に配され得る。
【０２８６】
本発明の実施形態によると、上述したプロセスによって得られる中央モジュールは、少なくとも１つの突起からの分泌物を収集するための少なくとも１つのダクトを備える、本発明において説明されたような下部モジュール上に配される。
【０２８７】
下部モジュールは、前記中央モジュールと同一形状及び同一寸法である。
【０２８８】
下部モジュールは、中央モジュールを揃えるための穴に挿入される下部モジュールの部品を揃えるためのピン及び部品の平坦なセクションによって導かれる、再現性がある特定のアライメントにおいて中央モジュールへ組み立てられる。
【０２８９】
下部モジュールは、穿孔、それゆえ中央モジュールの突起の数と同一であるダクトの数を備え、前記下部モジュールによる前記中央モジュールのアセンブリは、穿孔それゆえ突起とダクトを揃えることを可能にさせて、マイクロ流体システムを介して細胞から分泌物を収集する。
【０２９０】
本発明によるこの他の特定の実施形態では、下部モジュールは、部品Ｆによって置き換えられる。図６７、６８及び７１に示されるような培養ボックス上の中央モジュールの支持体として用いられるこの部品Ｆは、前記少なくとも１つの突起の内面上の成長細胞へ栄養素を与えるための培地の循環を可能にさせる正方形開口部を備える。
【０２９１】
正方形形状部分Ｉ、Ｈ及びＧの例
特定の実施形態によると、前記支持体部分（ｉ）、前記モールド（ｈ１、ｈ２）及び前記穿孔部分（ｇ１、ｇ２）は、正方形形状である。
【０２９２】
図７２は、前記モールド（ｈ１）及び前記穿孔部分（ｇ１）がそれぞれ、１００個の成形された３Ｄナノ構造及び１００個の穿孔を備えるプロセスの特定の実施形態を与える。
【０２９３】
このようなプロセスは、１００個の突起を有する中央ユニットを得ることを可能にさせる。
【０２９４】
図７３は、前記モールド（ｈ２）及び前記穿孔部分（ｇ２）がそれぞれ、９個の成形された３Ｄナノ構造及び９個の穿孔を備えるプロセスの特定の実施形態を与える。
【０２９５】
このようなプロセスは、９個の突起を有する中央ユニットを得ることを可能にさせる。
【０２９６】
穿孔及び成形された３Ｄナノ構造の数のこれらの例は限定するものではない。
【０２９７】
モールド及び穿孔部分を選択することは、中央ユニットの３Ｄナノ構造膜に関する突起の所望の数に依存する。
【０２９８】
再吸収性高分子溶液は好ましくは、キトサン、アガロース又はアルギン酸塩で作製される。
【０２９９】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記再吸収性高分子溶液（２２）はキトサンである。
【０３００】
キトサンが用いられるとき、再吸収性モールドは、一晩の間２％酢酸において２％キトサンを溶解させることによって、その後、エタノールによって１．５％キトサンを希釈することによって調製され得る。キトサン溶液はその後、比率１：１でのＮａＯＨ：エタノールの５Ｍ温浴において重合される。
【０３０１】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記再吸収性高分子溶液（２２）を重合するステップであって、前記再吸収性高分子溶液（２２）がキトサンである、ステップは、２％酢酸溶液による培養によって為される。
【０３０２】
キトサンが再吸収性高分子材料として用いられるとき、溶解は、当業者に良く知られる慣習に従って、２％酢酸溶液による一晩中の培養によって行われる。
【０３０３】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記再吸収性高分子溶液（２２）はアガロースである。
【０３０４】
アガロースが用いられるとき、再吸収性モールドは、加熱することによって及びＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）において４０μｇ／ｍｌのアガロースを溶解させることによって調製され得る。アガロースは、そのゲル化点より下の温度で得られる溶液を配することによって重合される。
【０３０５】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記再吸収性高分子溶液（２２）を重合するステップであって、前記再吸収性高分子溶液（２２）がアガロースである、ステップは、アガロースのゲル化温度より高い温度での培養によって実行される。
【０３０６】
アガロースが再吸収性高分子材料として用いられるとき、溶解は、１２０分間、周囲温度から７０°Ｃの温度へゆっくり加熱することによって、その後アガロースの温度を一晩掛けて周囲温度へ戻させることによって行われる。
【０３０７】
この加熱は水浴において行われ得る。３Ｄナノ構造多孔質膜を損傷し得る熱的対流を最小化するために温度はゆっくり増加することが重要である。
【０３０８】
当業者に良く知られる、この加熱プロトコルの変形は、アガロースのゲル化特性を修正するために水浴の水におけるＤＭＳＯの追加を含む。
【０３０９】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記再吸収性高分子溶液（２２）はアルギン酸塩である。
【０３１０】
特定の実施形態によると、本発明は、マイクロ流体細胞培養チップを製造するためのプロセスに関し、前記再吸収性高分子溶液を重合するステップであって、前記再吸収性高分子溶液（２２）がアルギン酸塩である、ステップは、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ等の、加えられるＣａ２＋又はＣａ２＋イオン結合剤を有さない溶液による一晩中の培養によって実行される。
【０３１１】
高分子電解質多層フィルムは、可変パラメータとして：
−層の数と、
−各々の層の厚さと、
−用いられる高分子電解質の電荷と、を含む。
【０３１２】
層の数を変えることによって、最終的な多層フィルムの粗さ、厚さ及び剛性は、修正され得る。
【０３１３】
好ましくは、フィルムは、高分子電解質の、２ｎｍ厚さの、１５個の層から成る。
【０３１４】
層の数又は用いられる高分子電解質に関する電荷のタイプを変えることによって、最終的な多層フィルムの疎水性もまた修正され得る。
【０３１５】
３Ｄナノ構造の押出は、押出のために用いられるポンプシステムに起因して、以下の不良を発生し得る：
−支持体の穿孔と直接的に位置合わせされた、提供されたサイトを残すことに関する突起の移転が存在するときの、移転不良、
−例えばベースの厚化又は当業者に良く知られるであろう他の不良のような、突起の形状における不良が存在するときの、押出不良。
【０３１６】
移転不良又は押出不良によって３Ｄナノ構造からこのように形成された突起は、デバイス内で最初に設けられたその技術的機能を発揮し続け得るが、このように形成された突起がより最適でない形状を有するとき、デバイス内のその性能はまた、より最適でない。しかしながら、デバイスは、減少した性能を有してであるが、設けられたその機能を発揮し続け得る。
【０３１７】
突起は、以下のような異なる変化を有し得る：
−前記開口部の中心を通り抜け且つ前記支持体に垂直な軸（ｙ）に関する傾き、
−その高さの変動、
−支持体上の３Ｄナノ構造多孔質膜の移転に起因した、穿孔に関する移転。
【０３１８】
これらの変化は、中央モジュールを調製するためのプロセス、及び特に、前記支持体の穿孔を通って高分子溶液を押し出す段階に起因する。
【０３１９】
特定の変化はまた、デバイスにおける突起の使用の間に直接的に駆動される。
【０３２０】
Ｉ−共培養のためにチップを使用する例
１．前立腺上皮細胞及び間質細胞の細胞系を維持するための条件
すべての実験に関して用いられる培地は、５ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）及び５０μｇ／ｍＬの牛下垂体抽出物によって補われたケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  Ｒｅｆ．  １７００５−０７５）である。
【０３２１】
前立腺上皮細胞及び間質細胞の株は、培地において維持され、３７°Ｃ及び５％ＣＯ２での雰囲気において培養される。
【０３２２】
新鮮な培地における細胞の二次培養は、上皮細胞に関して３日ごとに、間質細胞に関して２日ごとに行われる。このために、細胞は、カルシウムなし且つマグネシウムなし（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｅｆ．  １４１９０）のＤｕｌｂｅｃｃｏ  （Ｄ−ＰＢＳ）からのリン酸緩衝食塩水によって洗浄され、その後、約７分間、３７°Ｃで、０．２５ｍｇ／ｍＬで１ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  ＣＨ，  Ｒｅｆ．  ＣＣ−５０１２）によって培養される。
【０３２３】
すべての実験に関して、細胞の培地は、新鮮な培地によって毎日補われた。
【０３２４】
２．中央ユニットにおける導入前の細胞の調製
細胞の化学的分離は、カルシウムなし且つマグネシウムなしのＰＢＳ培地において０．２５ｍｇ／ｍｌで１ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｅｆ．  ２５３００−０５４）によって３７°Ｃで５分の培養によって行われる。
【０３２５】
独立して、本発明によるマイクロ流体チップは、７０％エタノール（体積／体積）溶液を、ダクトを通して循環させることによって、その後、少なくとも３０分間３５°Ｃと４５°Ｃとの間の温度で炉においてマイクロ流体システムのすべてを乾燥させることによって、その後、それを紫外線照射へ及び４０分間オゾンにさらすことによって、殺菌される。
【０３２６】
３．中央ユニットの３Ｄナノ構造多孔質膜の調製
３Ｄナノ構造多孔質膜は、正に帯電した高分子電解質層と負に帯電した高分子電解質層とが交互である高分子電解質の連続する層から成る。製造プロセスによると、この同じ膜は突起から成る。
【０３２７】
高分子電解質多孔質膜から成る突起の外面及び内面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）及び／又はコラーゲン、フィブロネクチン又はヒアルロン酸から成る細胞外マトリクス（ＥＣＭ）調製によって覆われる。
【０３２８】
ここで用いられるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリクスは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）社によって製造される市販の製品である。それは、細胞外マトリクスタンパク質において豊富な腫瘍である、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出される、再構成基底膜調製である。一旦単離されると、この材料は、約６０％のラミニン、３０％のコラーゲンＩＶ及び８％のエンタクチンから成る。エンタクチンは、ラミニン及びコラーゲンＩＶと相互作用する架橋分子であり、細胞外マトリクスのこれらの分子の構造的構成に寄与する。
【０３２９】
Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）からのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）マトリクスはまた、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）の、上皮成長因子の、インスリンタイプ成長因子の、線維芽細胞成長因子の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）、プラスミノーゲン組織アクチベーター、及び、ＥＨＳ腫瘍に必然的に存在する他の成長因子を含む。それはまた、腫瘍細胞由来の残りのマトリクスメタロプロテイナーゼを含む。
【０３３０】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、６ｍｇ／ｍｌの濃度で、多孔質膜を機能的にするために単独で、又は、０．７５と２．５ｍｇ／ｍｌとの間の濃度でタイプＩコラーゲンによる混合物として、用いられ得る。
【０３３１】
４．中央ユニットにおける２つの細胞及び細胞共培養タイプの導入
４．１．上皮細胞の導入
最初に、上皮細胞が導入されて、細胞接合層、つまり合流の段階での細胞培養を形成する。
【０３３２】
特定の実施形態によると、上皮細胞は、中央ユニットの突起の内面上に導入される。
【０３３３】
細胞の接着を得るために３時間、細胞を接合するための、つまり細胞合流の段階での層の形成のために２４時間が必要とされる。これらの接着細胞及び増殖細胞は、それら自身の細胞外マトリクスを分泌するので、バリアの役割を果たす基底層を構築する。
【０３３４】
中央ユニットの突起の内面は、患者の尿から単離された、ヒト細胞の成長及び分化のための生理学的支持体として用いられる、上皮細胞の密な単一層によってこのように覆われる。
【０３３５】
突起の内面上の細胞の導入は、３つの方法に従って、行われ得る：
・穿孔の下部セクションを頂部へ向かわせるために中央モジュールへ戻し、細胞懸濁液を手動でピペッティングする。
・穿孔の下部セクションを頂部へ向かわせるために中央モジュールへ戻し、流体を取り扱うためのロボットを用いて細胞懸濁液を導入する。
・上部モジュール、中央モジュール及び下部モジュールを組み立てて、下部ユニットのマイクロ流体ダクトを用いて突起の内面の側上で中央ユニットを満たす。したがって、３つのモジュールのこの予備アセンブリの場合では、細胞は、下部モジュールのダクトを介して導入される。３つのモジュールの予備アセンブリ後に細胞を導入するこの方法は、２つの他の方法よりも好ましい。なぜならそれは、以前に殺菌したシステムが閉じられたままなので、任意の細菌汚染を防止するからである。
【０３３６】
特定の実施形態によると、上皮細胞は、シリンジによって穿孔（第１及び第２の方法）を介して直接的に、又は、自動化され且つ圧力及び流れ（Ｆｌｕｉｇｅｎｔ）によって制御された流体システム若しくはシリンジポンプを用いることによって下部ユニット（第３の方法）のダクトを介してのいずれかで、中央ユニットにおいて３．１０６細胞／ｍＬの濃度で導入される。
【０３３７】
細胞の滑らか且つ制御された導入を提供するために、調節可能な流れによるシリンジポンプを用いることが好ましい。
【０３３８】
安定した連続した流れは、圧力ポンプ（Ｆｌｕｉｇｅｎｔ、フランス）を用いることによって送達される。培地を含む加圧容器は、制御された温度及びＣＯ２レベルでチャンバにおいて保持される。流れは、約５−１０ｍＬ／時間（１０ｍｂａｒ）へ調節され、細胞の接着及び増殖は、経時的に観察される。すべてのサンプルは、３７°Ｃ及び５％ＣＯ２での加湿された培養器に保持される。
【０３３９】
特定の実施形態では、中央ユニットは、直径１５０μｍの円形ベースを有する３５０μｍの高さの突起を備える。そのため、突起の内面の面積は３２９７００μｍ２であり、その上に約５０個の上皮細胞が合流段階（接合細胞層）でカウントされ、６６μｍ２毎に約１個の細胞である。
【０３４０】
４．２．突起の外面上の細胞の導入
第２に、一旦接合（又は合流）上皮細胞の層が突起の内面上で形成されると、間質細胞は、突起の外面及び内面で多孔質膜上に分配される。
【０３４１】
突起の内面上の細胞の導入は、２つの方法に従って、行われ得る：
・突起の頂部を頂部へ向かわせるために中央モジュールへ戻し、細胞懸濁液を手動でピペッティングする。
・上部モジュール、中央モジュール及び下部モジュールを組み立てて、下部ユニットのマイクロ流体ダクトを用いて突起の内面の側上で中央ユニットを満たす。したがって、３つのモジュールのこの予備アセンブリの場合では、細胞は、上部ユニットの入口／出口ダクトを介して導入される。３つのモジュールの予備アセンブリ後に細胞を導入する方法は、他の方法よりも好ましい。なぜならそれは、以前に殺菌したシステムが閉じられたままなので、任意の細菌汚染を防止するからである。
【０３４２】
特定の実施形態によると、間質細胞は、シリンジを用いて直接的に中央ユニットにおいて３．１０６細胞／ｍＬの濃度で上部モジュールの入口／出口ダクトを介して（第１の方法）、また、自動化され且つ圧力及び流れ（Ｆｌｕｉｇｅｎｔ）によって制御された流体システム若しくはシリンジポンプを用いることによって上部モジュールのダクトを介して（第２の方法）、導入される。
【０３４３】
間質細胞は非常にすばやく付着する（１時間未満）。
【０３４４】
間質細胞が合流（又は接合）細胞の層を形成することは必要不可欠ではなく、この例では外面上のその単純な接着で充分である。
【０３４５】
一般的に、上皮細胞と間質細胞との間の比率は１：２である。
【０３４６】
そのため、特定の実施形態によると、０．７ｃｍ２の表面上の共培養に関して、突起の外面及び内面での多孔質膜は、６ｍｇ／ｍｌへ希釈された９０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）溶液によって機能的にされ、その後、７０００個の上皮細胞／ｃｍ２及び１４０００個の間質細胞（線維芽細胞）／ｃｍ２を最終的に得るために播種される。
【０３４７】
細胞培養を供給するために上部モジュールの入口／出口ダクトを介して及び下部モジュールのダクトを介して導入される培地は、突起のいずれかの側上で同一であり、且つ、５ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ＥＧＦ）によって及び５０μｇ／ｍＬの牛下垂体抽出物によって補われるＫＳＦＭ培地から成る。
【０３４８】
４．３．上皮細胞及び間質細胞の例
これらの上皮細胞は、非腫瘍形成性の市販の細胞株（前立腺若しくは膀胱若しくは腎臓）又は市販の初代培養物であり得る。
【０３４９】
これらの間質細胞は以下であり得る：
−いずれかの線維芽細胞（市販の初代培養物又は株）、
−又は間葉細胞（市販の培養又は株）、
−又は他の間質細胞（内皮等）。
【０３５０】
これらの細胞の単一層を形成するために用いられる２つの細胞型は、「中立」又は「正常」と呼ばれ、それらは非腫瘍形成性であり且つ基底層の役割を果たすのみである。これらの「中立」細胞は、免疫蛍光及びイメージング（Ｅ−カドヘリン部分の５つのマーキング）によって特徴付けられることが可能である、密な封止を確立する、突起の内面及び外面上の細胞の高度に隣接する層を、合流の段階で、形成する。
【０３５１】
４．４．突起の内面及び外面上の培養の互換性
特定の実施形態によると、上皮細胞は、突起の内面上に導入され、間質細胞は、突起の外面上に導入される。
【０３５２】
しかしながら、共培養は、交換可能な方法で確立され得る、つまり、間質細胞はまた、突起の内面上に、上皮細胞は突起の外面上に導入され得る。両方の場合では、２つの細胞型間に位置する高分子電解質層は、正に及び負に帯電したその高分子電解質メッシュを用いて、多孔質バリアを構成することを可能にさせる。
【０３５３】
５．中央ユニットにおける細胞の可視化（突起上の共培養の概念の証明）
中央ユニットの突起上の共培養の方法を有効にするために、免疫マーキング（ｉｍｍｕｎｏｍａｒｋ）が実行される。
【０３５４】
したがって、この免疫マーキングは、（ＰＦＡによって付着された）死細胞上で実行され、この可視化は、正しく所定の位置にある共培養を制御すること、及び、正しく細胞を導入する手法という唯一の目的を有する。
【０３５５】
細胞は、免疫マーキングによって中央モジュールにおいて可視化される。
・ファロイジンは、原形質膜の端をたどる皮質のアクチンフィラメントを識別し、その結果として、細胞及びその膜の範囲を区切るための手段を提供するために用いられる。
・Ｅ−カドヘリンは、細胞−細胞接点を検出するために用いられる。
免疫染色は、周囲温度でダクトを介してシリンジポンプによってＥ−カドヘリンを導入することによって実行される。
【０３５６】
上皮細胞の合流層の形成後、その導入後約２４時間、それらは、細胞骨格バッファーにおける１０％スクロースから成る溶液（溶液Ａ）において４％パーフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）（体積対体積）によって２０分間付着される。
【０３５７】
細胞はその後、溶液Ａによって洗浄され、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＸ−１００によって加えられた溶液Ａによって３分間透過処理される。ＴＢＳ溶液による洗浄が１０分間実行され、３０分間のＰＢＳ溶液による第２の洗浄が続く。ＰＦＡの自己蛍光は、ＴＢＳ溶液に含まれるＮＨ４Ｃｌによって不活性化される。非特異部位は、１０％ヤギ血清及び３％ＢＳＡを有するＰＢＳ溶液による培養によって妨げられる。細胞はその後、１時間の間一次抗体によって培養される。用いられる一次抗体は、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び１％ＢＳＡによってＰＢＳ溶液において１／５０へ希釈された抗Ｅ−カドヘリン抗体（Ａｂｃａｍ，  Ｒｅｆ．  ａｂ１４１６）である。培養物はその後、ＰＢＳ溶液によって３０分間洗浄され、その後、２０分間、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び１％ＢＳＡによってＰＢＳ溶液において１：１０００へ希釈されたファロイジンＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ，  Ｒｅｆ．  Ｐ５２８２）の１／１０００へ希釈された、シトクロムＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ，  Ｒｅｆ．  １１５−１６２−０６２）と結合された二次抗マウス抗体によって培養される。
・ＰＢＳ溶液による３０分の洗浄後、リングは、５分間、１：７０００へ希釈された、Ｈｏｅｃｈｓｔ着色剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｅｆ．  Ｈ−１３９９）によって対比染色される。細胞はその後、１０分間洗浄され、Ｄａｋｏ蛍光媒体が手動で導入される。
・結合焦点が、Ｖｉｎｃｕｌｉｎｅを用いることによるマーキングによって検出された。Ｖｉｎｃｕｌｉｎｅによる対比マーキングに関して、細胞は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって４０秒間予備透過処理され、２０分間、４％ＰＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＰＢＳ溶液によって付着され、その後ＰＢＳ溶液によって一度洗浄される。
【０３５８】
任意の非特異的抗体吸着を避けるために、細胞は、１時間、０．１％ＢＳＡ及び１０％ヤギ血清溶液によって培養される。
【０３５９】
細胞はその後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０及び５％のヤギ血清を有するＰＢＳ溶液において１：７００へ希釈されたＶｉｎｃｕｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ，  Ｒｅｆ．  Ｖ９１３１）に対する一次抗体によって１時間培養され、その後、ＰＢＳ溶液によって４５分間４回連続で洗浄される。
【０３６０】
細胞はその後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を有し且つ５％のヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ）を有するＰＢＳ溶液において１／５００へ希釈された、シトクロムＣｙ５と結合された、抗マウス抗体によって培養される。
【０３６１】
中央モジュールはその後、ＰＢＳ溶液によって１５分間４回洗浄される。リング及びアクチンは、上述のように染色される。
【０３６２】
共培養物は、蛍光顕微鏡法によって観察される、又は、位相差顕微鏡法、レンズなしイメージング、共焦点顕微鏡法、光シート顕微鏡法等の他の顕微鏡法によって観察され得る。
【０３６３】
画像は、細胞培養の間にキャプチャされる。
【０３６４】
デバイスの全幅の全体の像を提供するために、細胞画像は、レンズなしセンサーを用いて記録される。ＳＥＭ分析もまた実行される。
【０３６５】
特定の実施形態では、細胞の共培養物を含む中央モジュールの蛍光画像は、直径１５０ｍｍの、チューブに関する、軸ｚにおける３ｍｍ毎のショットを有する、ｚスタックフィールド深さによる取得に関する正しいＡｐｏｔｏｍｅモジュールを備えた２０倍レンズを有するＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｚ１顕微鏡を用いて得られる。画像は、顕微鏡上に取り付けられたデジタルＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍデジタルカメラを用いて記録される。
【０３６６】
６．リアルタイムでの中央ユニットにおける細胞の可視化
中央ユニットにおける細胞培養は、モジュールから成る材料の透明度のため、非マークの生きた細胞を可視化することを可能にさせる位相差顕微鏡観察によってリアルタイムでモニタリングされ得る。
【０３６７】
ＩＩ−診断のためにチップを用いる例
１．患者に由来する細胞の導入
特定の実施形態によると、上皮細胞は、突起の内面上に導入され、間質細胞は、突起の外面上に導入される。一旦細胞の単一層が各々の面上で得られると、つまり２４時間後、細胞がこのように設けられたマイクロ流体チップは、患者の診断のために用いられ得る。
【０３６８】
このために、細胞は、少なくとも５０ｍｌ、特に５０から１００ｍｌの患者の尿サンプルから単離される。単離は、低速、特に５分間８００ｇで尿サンプルを遠心分離することによって行われて、尿サンプルに含まれる細胞の沈降を可能にさせる。遠心分離ステップは、当業者に良く知られる。
【０３６９】
沈降した細胞の下部はその後、培地において再懸濁され、細胞懸濁液は、本発明によるマイクロ流体チップに直接的に導入され、細胞が、チップにおけるその導入前に任意の予備培養を必要としないことを意味する。
【０３７０】
尿サンプルから得られる細胞の濃度は、数百細胞から数千である、又は数百細胞から数千で変動する。
【０３７１】
患者の単離された尿細胞は、上皮細胞の培養を支える突起の面の側上で、又は、間質細胞の培養を支える突起の面の側上で導入され得る。言い換えると、これらの培養は突起のいずれかの側上で交換可能なであり、患者の尿の単離細胞は、内面上及び突起の外面上の両方で導入され得る。
【０３７２】
特定の実施形態によると、患者の尿の単離細胞は、上皮細胞の培養を支える突起の面の側上で導入される。そのため、上皮細胞の単一層が突起の内面の側上で形成されるとき、それらは下部ユニットのダクトを介して、また、上皮細胞の単一層が突起の外面の側上で形成されるとき上部モジュールの入口／出口ダクトを介して、導入される。
【０３７３】
患者の尿から単離された細胞は、膀胱、前立腺及び腎臓上皮細胞をすべて含む、剥離された尿道上皮（又は尿路上皮）細胞である。
【０３７４】
特定の実施形態では、突起の内面は、以前に培養された上皮細胞で予備形成された層によって覆われ、突起の外面は、線維芽細胞（間質細胞）で予備形成された層によって覆われ、単離細胞は、下部モジュールのダクトを介して分配される。
【０３７５】
これらの単離細胞は、正常線維芽細胞の層によって支えられた、突起の内面の側上で、正常上皮細胞で予備形成されたこの層において挿入される。
【０３７６】
２．患者に由来する細胞の増殖の観察
デバイスにおける単離細胞の増殖の進行を観察し、且つ、この増殖が正常基底細胞の置き換えをもたらし且つ組織の全体的な分泌プロファイルに影響を与えるかどうかを調査するために、単離細胞の増殖はこのようにモニタリングされる。
【０３７７】
３．分泌物の回収
一旦患者の尿から単離された細胞の導入が行われると、患者の上皮細胞は、突起の外面又は内面上に０．１ｎｇ／ｍｌのＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）を加えることによって刺激される。ＤＨＴによる細胞のこの刺激は、２４時間と４８時間との間続く。
【０３７８】
突起の外面及び内面から成る膜が多孔性であり、この刺激は、突起のいずれの側上で等しく為され得る。
【０３７９】
上皮細胞はまた、ミボレロン（非代謝ホルモン）を加えることによって刺激され得る。
【０３８０】
上皮細胞の刺激はこのように、突起のいずれかの側上の２つの細胞型の結合後、及び合流段階までのその成長後に為される。
【０３８１】
突起の外面の側上で正常線維芽細胞の層によって支えられた、突起の内面の側上で、正常上皮細胞で予備形成された、この層において挿入され且つ患者の単離細胞が結合するとき分泌物は回収され得る。患者の単離細胞の結合は約３時間続き、その統合は約６時間続く。
【０３８２】
十分な体積の分泌物の蓄積が次第に生じる。
【０３８３】
セクレトームの分析に関する分泌物の最終的な回収は、少なくとも１２時間放置した後で実行される。
【０３８４】
より具体的には、分泌物は、ＤＨＴによる２４から４８時間の刺激の終わりで回収される。
【０３８５】
それらはその後、溶液における化合物の分析を可能にさせるデバイスによって分析される。特定の実施形態によると、セクレトームは、質量分析法によって分析される。
【０３８６】
分泌物は、前記チップに組み込まれたセンサーによってインラインで分析され得る。
【０３８７】
前記チップを構成する異なるモジュールは、分泌物が回収されるとき又は分泌物がインラインでセンサーによって連続的に分析されるときに、影響されないことに留意しなくてはならない。
【０３８８】
免疫学的方法による特異的マーカーに関する探索はまた、回収された分泌物において行われ得る。
【０３８９】
例えば、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、前立腺癌の参照バイオマーカー、の検出が為され得る。
【０３９０】
３５０μｍの高さの突起及び１５０μｍの直径を有する円形ベースに関して、２４時間の終わりで回収された分泌物の体積は約２ｎＬである。
【０３９１】
ＰＳＡの検出及び定量化は、ＥＬＩＳＡ試験によって行われる。
【０３９２】
これに関して、いくつかの突起内部の約５０μｌの媒体が収集され、その後、４５分間３７°Ｃで配された、９６ウェルプレートに堆積される。抗ＰＳＡ一次抗体へ付着されないタンパク質を除去するために、蒸留水による５回の連続する洗浄は必要不可欠である。
【０３９３】
ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーザ）と結合された１００μＬの遊離抗ＰＳＡ二次抗体はその後、ＥＬＩＳＡプレートの３７°Ｃでの４５分の培養の前に各ウェルにおいて加えられる。最後に、１００μＬの基質（ＴＭＢ）が加えられ、基質酵素比色反応を生じさせる。
【０３９４】
３７°Ｃで１５分の後、１００μＬの硫酸を加えることによって反応は停止され、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて吸光度が検出される。
【０３９５】
ＩＩＩ−スクリーニング分子に関するチップを用いることの例
特定の実施形態では、本発明によるマイクロ流体細胞培養チップは、スクリーニング分子に関して用いられる。
【０３９６】
ＩＶ−患者における泌尿器癌の処置の効果を決定するためにチップを用いることの例
特定の実施形態では、本発明によるマイクロ流体細胞培養チップは、泌尿器癌に苦しむ患者における泌尿器癌に関する処置の効果を決定するために用いられる。
【０３９７】
この実施形態では、突起上の上皮細胞の培養物において挿入される、患者の尿の単離細胞のセクレトームの分析は、患者の処置の前後、及び／又は、処置の間に行われる。
【０３９８】
処置前に得られるセクレトームと、処置後に得られるもの、及び／又は処置の間に得られるものとの比較は、患者が苦しむ泌尿器癌上の処置の効果を決定することを可能にさせる。
【符号の説明】
【０３９９】
図面
１  非吸収性膜から成る支持体（中央ユニット）
２  非吸収性膜から成る支持体の上面（中央ユニット）
３  非吸収性膜から成る支持体の下面（中央ユニット）
４  非吸収性膜から成る支持体の穿孔（中央ユニット）
５  ３Ｄナノ構造多孔質膜（中央ユニット）
６  ３Ｄナノ構造多孔質膜の上面（中央ユニット）
７  ３Ｄナノ構造多孔質膜の下面（中央ユニット）
８  突起（中央ユニット）
９  突起の外面（中央ユニット）
１０  突起の内面（中央ユニット）
１１  支持体の上面での穿孔のセクション（中央ユニット）
１２  支持体の下面での穿孔のセクション（中央ユニット）
１３  突起の円形ベース（中央ユニット）
１４  ダクト（下部ユニット）
１５  ダクトの上部オリフィス（下部ユニット）
１６  ダクトの下部オリフィス（下部ユニット）
１７  リザーバ（下部ユニット）
１８  リザーバのダクト（下部ユニット）
１９  入口／出口ダクトにつながる上部ユニットのオリフィス（上部ユニット）
２０  ダクトの上部オリフィス（下部モジュール）
２１  ダクトの下部オリフィス（下部モジュール）
２２  再吸収性高分子
２３  ３Ｄナノ構造
２４  上皮細胞
１０１  上部モジュール
１０２  上部ユニット
１０３  上部モジュールのベース
１０４  中央モジュール
１０５  中央ユニット
１０６  中央モジュールのベース
１０７  下部モジュール
１０８  下部ユニット
１０９  下部モジュールのベース
２０１  取付要素
２０２  入口／出口ダクト（上部モジュール）
２０３  チャンバ（上部ユニット）
２０４  取付要素
２０５  ダクトの下部オリフィスのセット（下部モジュール）
２０６  ダクトの上部オリフィスのセット（下部モジュール）
２０７  突起のセット（中央モジュール）
２０８  成形された３Ｄナノ構造
２０９  モールドの上面
２１０  再吸収性高分子マトリクス
２１１  ３Ｄナノ構造の負のモールド
２１２  マトリクスの下面
Ｆ  中央モジュールの支持体部分
２１３  支持体部分のサイドフレーム
２１４  支持体部分の開いた上面
２１５  支持体部分の固体の下面
２１６  支持体部分の固体面の切断部
２１７  アライメントピン
２１８  アライメント穴
Ｈ、Ｈ１、Ｈ２、ｈ１、ｈ２  モールド
Ｉ、ｉ  支持体部分
Ｇ、Ｇ１、Ｇ２、ｇ１、ｇ２  穿孔部分
【図面の簡単な説明】
【０４００】
【図１】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、突起は全体において、穿孔に面している。
【図２】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値未満であり、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、突起は全体において、穿孔に面している。
【図３】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、突起は部分的に、穿孔に面している。
【図４】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値未満であり、突起は部分的に、穿孔に面している。
【図５】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値未満であり、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値未満であり、突起は部分的に、穿孔に面している。
【図６】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値未満であり、突起は部分的に、穿孔に面している。
【図７】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、突起は全体において、穿孔に面している。
【図８】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、突起は全体において、穿孔に面している。
【図９】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値未満であり、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、突起は全体において、穿孔に面している。
【図１０】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値未満であり、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、突起は部分的に、穿孔に面している。
【図１１】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値未満であり、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、突起は全体において、穿孔に面している。
【図１２】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、突起は垂直軸（ｙ）に関して軸（ｚ）に沿って傾けられる。
【図１３】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、突起の内面は、合流の段階で第１の細胞型のアセンブリによって覆われ、突起の外面は、合流の段階で第２の細胞型のアセンブリによって覆われる。
【図１４】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が全体において、ダクトに面している。
【図１５】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値より大きいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が全体において、ダクトに面している。
【図１６】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が全体において、ダクトに面している。
【図１７】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が全体において、ダクトに面している。
【図１８】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が全体において、ダクトに面している。
【図１９】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が全体において、ダクトに面している。
【図２０】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２１】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値未満であり、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２２】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値未満であり、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２３】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値未満であり、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２４】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２５】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２６】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２７】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２８】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値より大きく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図２９】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図３０】３Ｄナノ構造膜における突起、及び支持体における穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、前記穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ前記突起の円形ベースの直径ｄ３の値より大きく、前記中央ユニットは、その上部オリフィスの直径ｄ４の値が前記穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しいダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、突起が部分的にダクトに面している。
【図３１】３Ｄナノ構造膜における２つの突起、及び支持体における２つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しい２つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、２つのダクトの２つの下部オリフィスがそれぞれリザーバにつながり、出口ダクトを介して下部モジュールの外側につながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３２】３Ｄナノ構造膜における２つの突起、及び支持体における２つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しい２つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、２つのダクトの２つの下部オリフィスが、２つの異なるサイトにおいて下部モジュールの外側につながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３３】３Ｄナノ構造膜における２つの突起、及び支持体における２つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しい２つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、２つのダクトは互いに接続されて、２つのダクトの２つの下部オリフィスが、同じサイトにおいて下部モジュールの外側につながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３４】３Ｄナノ構造膜における２つの突起、及び支持体における２つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値に等しい２つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、２つのダクトの２つの下部オリフィスがそれぞれリザーバにつながり、各々のリザーバは、互いに接続された出口ダクトを介して、同じサイトにおいて下部モジュールの外側につながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３５】３Ｄナノ構造膜における２つの突起、及び支持体における２つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値より大きい２つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、２つのダクトは互いに接続されて、２つのダクトの２つの下部オリフィスが、出口ダクトを介して下部モジュールの外側につながるリザーバ上の同じサイトにつながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３６】３Ｄナノ構造膜における２つの突起、及び支持体における２つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく且つ下部オリフィスの直径ｄ５の値より大きい２つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、２つのダクトの２つの下部オリフィスはそれぞれ、出口ダクトを介して下部モジュールの外側につながる１つの同じリザーバ上の２つの異なるサイトにつながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３７】３Ｄナノ構造膜における４つの突起、及び支持体における４つの穿孔を備える中央ユニットの概略的な、断面図であり、各々の穿孔の上部セクションの直径ｄ１の値は、各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しく、且つ各々の突起の円形ベースの直径ｄ３の値に等しく、前記中央ユニットは、その各々のダクトの上部オリフィスの直径ｄ４の値が各々の穿孔の下部セクションの直径ｄ２の値に等しい４つのダクトを備える下部ユニット上に位置付けられ、第１のセットの２つのダクトの２つの下部オリフィスがそれぞれ、第１のリザーバ上の２つの異なるサイトにつながり、第２のセットの２つのダクトの２つの下部オリフィスがそれぞれ、第２のリザーバ上の２つの異なるサイトにつながり、第１の及び第２のリザーバがそれぞれ、異なるサイトにおいて下部モジュールの外側につながる（突起が全体において、ダクトに面している）。
【図３８】上部モジュールの概略的な、斜視図である。
【図３９】中央モジュールの概略的な、斜視図である。
【図４０】突起のセットを備える中央ユニットの、３Ｄナノ構造多孔質膜の上面の上から取られた概略的な、斜視図である。
【図４１】下部モジュールの概略的な、斜視図である。
【図４２】上部モジュールの、中央モジュールの、及び下部モジュールのアセンブリ備えるマイクロ流体チップの概略的な、斜視図である。
【図４３】上部モジュールの写真（チャンバの開口部の側面図）である。
【図４４】中央モジュールの写真である。突起のセットを備える３Ｄナノ構造多孔質膜の上面の上面図である。
【図４５】下部モジュールの写真である。ダクトの上部オリフィスのセットを備える下部ユニットの上面の上面図である。
【図４６】上部モジュールの、及び下部モジュールの写真である。
【図４７】解体された上部モジュールの、解体された中央モジュールの、及び解体された下部モジュールの写真である。
【図４８】穿孔を備える、中央ユニットの、非吸収性膜から成る支持体の概略的な、断面図である。
【図４９】それを通して再吸収性高分子が押し出されて前記支持体の上面の側上で３Ｄナノ構造を形成する穿孔を備える、中央ユニットの、非吸収性膜から成る支持体の概略的な、断面図である。
【図５０】それを通して再吸収性高分子が押し出されて前記支持体の上面の側上で３Ｄナノ構造を形成する穿孔を備える、中央ユニットの、非吸収性膜から成る支持体の概略的な、断面図であり、支持体はその上で高分子電解質層が適用されて前記３Ｄナノ構造上の成形された突起を備える３Ｄナノ構造多孔質膜を得る。
【図５１】その上で中空突起を備える３Ｄナノ構造膜に固定されて位置付けられる、中央ユニットの、非吸収性膜から成り且つ穿孔を備える支持体の概略的な、断面図である。
【図５２】合流の段階で上皮細胞の培養を支持する突起の内面の共焦点顕微鏡を用いる写真である。
【図５３】その上面の側上で少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造を備えるモールドの概略的な、断面図である。
【図５４】前記モールドの上面の側上で再吸収性高分子によって覆われたモールドの概略的な、断面図である。
【図５５】少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスの概略的な、断面図である。
【図５６】少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスの概略的な、断面図であり、前記マトリクスの下面が高分子電解質層によって覆われる。
【図５７】少なくとも１つの穿孔によって穴のあいた非吸収性膜から成る支持体を備える穿孔部分によって組み立てられ少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスの概略的な、断面図であり、前記マトリクスが前記支持体の上面によってその下面の側上で組み立てられて、３Ｄナノ構造の負のモールドが支持体の前記穿孔と位置合わせされる。
【図５８】少なくとも１つの穿孔によって穴のあいた非吸収性膜から成る支持体を備える穿孔部分によって組み立てられ少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスの概略的な、断面図であり、前記マトリクスが前記支持体の上面によってその下面の側上で組み立てられて、３Ｄナノ構造の負のモールドが支持体の前記穿孔と位置合わせされ、  前記支持体の前記少なくとも１つの穿孔で少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクスの下面及び前記支持体の下面によって構成される連続した表面は、高分子電解質層によって覆われて、少なくとも１つの突起を備える３Ｄナノ構造膜を形成する。
【図５９】３Ｄナノ構造多孔質膜を、支持体の下面の側上で、及び、穿孔部分の支持体の少なくとも１つの穿孔の延長において少なくとも１つの突起を、支持体の上面の側上で、備える穿孔部分に対応する中央モジュールの概略的な、断面図である。
【図６０】その下面において切断部を備える支持体部分によってその上面の側上で組み立てられ、その上面の側上で少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造を備えるモールドの概略的な、断面図である。
【図６１】その下面において切断部を備える支持体部分によってその上面の側上で組み立てられ、その上面の側上で少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造を備えるモールドの概略的な、断面図であり、前記モールドが、その上面の側上で再吸収性高分子によって覆われる。
【図６２】少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスの概略的な、断面図であり、前記マトリクスが支持体部分の切断部で形成される。
【図６３】その固体の下面の切断部で、少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスを含む支持体部分の概略的な、断面図であって、前記支持体部分は、少なくとも１つの穿孔を有する支持体を備える穿孔部分へ組み立てられて、少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の前記負のモールドが前記穿孔と位置合わせされるようになる。
【図６４】その固体の下面の切断部で、少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の少なくとも１つの負のモールドを備える再吸収性高分子マトリクスを含む支持体部分の概略的な、断面図であって、前記支持体部分は、少なくとも１つの穿孔を有する支持体を備える穿孔部分へ組み立てられて、少なくとも１つの成形された３Ｄナノ構造の前記負のモールドが前記穿孔と位置合わせされるようになり、  前記支持体の前記少なくとも１つの穿孔で少なくとも１つの負のモールドを備える前記再吸収性高分子マトリクスの下面及び前記支持体の下面によって構成される連続した表面は、高分子電解質層によって覆われて、少なくとも１つの突起を備える３Ｄナノ構造膜を形成する。
【図６５】３Ｄナノ構造多孔質膜を、その下面の側上で、及び、穿孔部分の支持体の少なくとも１つの穿孔の延長における少なくとも１つの高分子電解質突起を、その上面の側上で、備える穿孔部分の支持体、及び支持体部分Ｉの概略的な、断面図である。
【図６６】３Ｄナノ構造多孔質膜を、支持体の下面の側上で、及び、穿孔部分の支持体の少なくとも１つの穿孔の延長において少なくとも１つの突起を、支持体の上面の側上で、備える穿孔部分に対応する中央モジュールの概略的な、断面図である。
【図６７】円形形状支持体部分Ｉの、１００個の成形された３Ｄナノ構造を備える円形形状モールドＨ（Ｈ１）の、１００個の穿孔を備える円形形状穿孔部分Ｇ（Ｇ１）の、及び、中央モジュールの支持体部分Ｆの、概略的な、斜視図である。
【図６８】円形形状支持体部分Ｉの、９個の成形された３Ｄナノ構造を備える円形形状モールドＨ（Ｈ２）の、９個の穿孔を備える円形形状穿孔部分Ｇ（Ｇ２）の、及び、中央モジュールの支持体部分Ｆの、概略的な、斜視図である。
【図６９】Ｉのアライメントピン及びＨ１のアライメント穴を介した、１００個の成形された３Ｄナノ構造を備える円形形状モールドＨ（Ｈ１）上の円形形状支持体部分Ｉのアセンブリの概略的な、斜視図である。Ａ：２つの要素が組み立てられるときの上面図。Ｂ：要素が解体されるときの上面図。Ｃ：２つの要素が組み立てられるときの輪郭図。Ｄ：２つの要素が解体されるときの輪郭図。
【図７０】アライメントピンＩ及びＧ１のアライメント穴を介した、１００個の穿孔を備える円形形状穿孔部分Ｇ（Ｇ１）上の円形形状支持体部分Ｉのアセンブリの概略的な、斜視図である。Ａ：２つの要素が組み立てられるときの上面図。Ｂ：要素が解体されるときの上面図。Ｃ：２つの要素が組み立てられるときの底面図。Ｄ：２つの要素が解体されるときの底面図。Ｅ：Ｇ１が上に向いており且つＩが底に向いているように２つの組み立てられた要素が戻されるときの輪郭図。
【図７１】中央モジュールの支持体部分Ｆ上に、１００個の穿孔を備える円形形状穿孔部分Ｇ（Ｇ１）のアセンブリの概略的な、斜視図である。Ａ：２つの組み立てられた要素の底面図。Ｂ：２つの要素が解体されるときの底面図。Ｃ：２つの要素が組み立てられるときの輪郭図。Ｄ：２つの要素が組み立てられるときの輪郭図。
【図７２】正方形形状支持体部分ｉの、１００個の成形された３Ｄナノ構造を備える正方形形状モールドＨ（ｈ１）の、１００個の穿孔を備える正方形形状穿孔部分Ｇ（ｇ１）の、概略的な、斜視図である。
【図７３】正方形形状支持体部分ｉの、９個の成形された３Ｄナノ構造を備える正方形形状モールドＨ（ｈ２）の、９個の穿孔を備える正方形形状穿孔部分Ｇ（ｇ２）の、概略的な、斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
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【図６９Ｂ】
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【図６９Ｃ】
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【図６９Ｄ】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７０Ｃ】
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【図７０Ｄ】
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【図７０Ｅ】
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【図７１Ａ】
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【図７１Ｂ】
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【図７１Ｃ】
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【図７１Ｄ】
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【図７２】
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【図７３】
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【国際調査報告】
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