(57)【要約】  本発明は組換えポリペプチド、該組換えポリペプチドを含むホモ二量体蛋白及びヘテロ二量体蛋白、該組換えポリペプチドをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター及び宿主細胞を提供する。また、本発明は該組換えポリペプチドを含む組成物、該組換えポリペプチドの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1のドメインと、
SEQ ID NO：47及びSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2のドメインと、
SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3のドメインとを含み、
且つ、前記第2のドメインが1つの分子内ジスルフィド結合(intramolecular disulfide bond)を有する組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記第2のドメインが前記第2のドメインの23番目のアミノ酸と前記第2のドメインの27番目のアミノ酸との間に1つの分子内ジスルフィド結合を有する、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
前記組換えポリペプチドがアルカリホスファターゼ活性を誘発し得る、請求項１又は請求項２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
前記第3のドメインが第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)及び第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、前記第3のドメインが前記第１アミノ酸配列と前記第2アミノ酸配列との間に2つの分子内ジスルフィド結合を有する、請求項１〜3のいずれか1項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に第１分子内ジスルフィド結合を有し、且つ、前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子内ジスルフィド結合を有する、
又は、
（ｂ）前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に第１分子内ジスルフィド結合を有し、且つ、前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子内ジスルフィド結合を有する、
請求項4に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348からなる群より選ばれる１種のアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか1項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜6のいずれか1項に記載の2つの同一の組換えポリペプチドを有し、且つ、前記2つの組換えポリペプチドの前記第１のドメイン同士の間に1つの分子間ジスルフィド結合を有する、ホモ二量体蛋白。
【請求項８】
一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する、請求項7に記載のホモ二量体蛋白。
【請求項９】
それぞれの前記組換えポリペプチドは、前記第3のドメインが第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第3のドメインの前記第１アミノ酸配列ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第3のドメインの前記第2アミノ酸配列との間に、2つの分子間ジスルフィド結合を有する、請求項7又は請求項8に記載のホモ二量体蛋白。
【請求項１０】
（ａ）一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に、第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子間ジスルフィド結合を有する、
又は、
（ｂ）一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に、第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に、第2分子間ジスルフィド結合を有する、
請求項9に記載のホモ二量体蛋白。
【請求項１１】
請求項１〜6のいずれか1項に記載の2つの異なる組換えポリペプチドを有し、且つ、前記2つの異なる組換えポリペプチドの前記第１のドメイン同士の間に1つの分子間ジスルフィド結合を有する、ヘテロ二量体蛋白。
【請求項１２】
一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する、請求項11に記載のヘテロ二量体蛋白。
【請求項１３】
請求項１〜6のいずれか1項に記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項13に記載の単離された核酸分子と操作可能に結合される発現制御領域を有する、組換え核酸分子。
【請求項１５】
請求項13に記載の単離された核酸分子又は請求項14に記載の組換え核酸分子を有する、単離された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項13に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入するステップを含む、組換えベクターの製造方法。
【請求項１７】
請求項13に記載の単離された核酸分子又は請求項14に記載の組換え核酸分子を宿主細胞に導入するステップを含む、組換え宿主細胞の製造方法。
【請求項１８】
請求項17に記載の単離された宿主細胞を培養するステップ及び組換えポリペプチドを単離するステップを含む、組換えポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜6のいずれか1項に記載の組換えポリペプチド、請求項7〜10のいずれか1項に記載のホモ二量体蛋白、又は請求項11若しくは請求項12に記載のヘテロ二量体蛋白を有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法、特にアルカリホスファターゼ活性を誘発し得る組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨は独特な機械的性質を有し脊髄骨格の一部分を構成する高剛性組織である。この独特な機械的性質はその広範な基質構造に由来する。動物は一生の間、骨組織が絶え間なく再生される。
【０００３】
骨の形成及び再生の過程はそれに特化された細胞により行われる。骨形成（osteogenesis、骨の形成又は骨の成長）は骨芽細胞（osteoblasts、骨形成細胞）により行われる。骨リモデリング（Bone remodeling）は破骨細胞（osteoclasts）と呼ばれる骨吸収細胞及び骨を形成する骨芽細胞との相互作用によりなされる。これらの過程は特定の生細胞により行われるため、化学的（例えば薬物的及び／又はホルモン的）、物理的及び物理化学的な変化は骨組織の質、数量及び形状に影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
各種成長因子（例えばPDGF）及びサイトカインが骨形成の過程に関わっていることから、所定の位置に骨形成を誘導でき且つ生理的許容可能な化学物質（例えばホルモン、薬、成長因子及びサイトカイン）を特定することは非常に価値がある。しかし、化学物質を治療用具として有効に使用するためには、克服すべき障害がいくつかある。一に、骨誘導活性（osteoinductive activity）を有する組換えポリペプチドの開発である。例えば、組換えヒト血小板由来成長因子−BBにおける骨誘導活性は未だ証明されていない。二に、化学物質における骨誘導の変異性である。例えば、脱灰骨基質（demineralized bone matrix、DBM）は化学物質であり、加工骨由来の骨誘導性同種異系移植片である。商業的に利用可能なDBMを基礎とした製品は増えてきているが、異なる製品間及び異なる製造ロットの同一製品間において骨誘導の変異性が見られる。このため、組換えポリペプチド及びそれに関連した組成物のような一貫した骨誘導活性を示す化学物質が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記従来技術の事情に鑑みてなされたものであり、組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法を提供することを目的とする。特に、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は、SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1のドメインと、SEQ ID NO：47及びSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2のドメインと、SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3のドメインとを含み、且つ、前記第2のドメインが1つの分子内ジスルフィド結合(intramolecular disulfide bond)を有する、組換えポリペプチドを開示した。
【０００７】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの前記第2のドメインは前記第2のドメインの23番目のアミノ酸と前記第2のドメインの27番目のアミノ酸との間に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【０００８】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る。
【０００９】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの前記第3のドメインは第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)及び第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、前記第3のドメインは前記第１アミノ酸配列と前記第2アミノ酸配列との間に2つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【００１０】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に第１分子内ジスルフィド結合を有し、且つ、前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子内ジスルフィド結合を有する。
【００１１】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に第１分子内ジスルフィド結合を有し、且つ、前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子内ジスルフィド結合を有する。
【００１２】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348からなる群より選ばれる１種である。
【００１３】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の2つの同一の組換えポリペプチドを有し、且つ、前記2つの組換えポリペプチドの前記第１のドメイン同士の間に1つの分子間ジスルフィド結合を有することを特徴とする、ホモ二量体蛋白を開示した。
【００１４】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
【００１５】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白のそれぞれの前記組換えポリペプチドは、前記第3のドメインが第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第3のドメインの前記第１アミノ酸配列ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第3のドメインの前記第2アミノ酸配列との間に、2つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2のアミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に、第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に、第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に、第2分子間ジスルフィド結合を有する。
【００１６】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の2つの異なる組換えポリペプチドを有し、且つ、当該2つの組換えポリペプチド同士の前記第１のドメインの間に1つの分子間ジスルフィド結合を有することを特徴とする、ヘテロ二量体蛋白を開示した。
【００１７】
ある実施形態において、該ヘテロ二量体は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有することを特徴とする、単離された核酸分子を開示した。
【００１９】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子と操作可能に結合される発現制御領域を有することを特徴とする、組換え核酸分子を開示した。
【００２０】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子又は上記組換え核酸分子を有することを特徴とする、単離された宿主細胞を開示した。
【００２１】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子をベクターに挿入するステップを含むことを特徴とする、組換えベクターの製造方法を開示した。
【００２２】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子又は上記組換え核酸分子を宿主細胞に導入するステップを含むことを特徴とする、組換え宿主細胞の製造方法を開示した。
【００２３】
さらに、本発明は、上記単離された宿主細胞を培養するステップ及び、組換えポリペプチドを単離するステップを含むことを特徴とする、組換えポリペプチドの製造方法を開示した。
【００２４】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の組換えポリペプチド、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白又は上記いずれかに記載のヘテロ二量体蛋白を有することを特徴とする、組成物を開示した。
【００２５】
さらに、本発明は、ある部位に骨量を形成するように骨形成を誘導できるホモ二量体蛋白、及び担体の全体に孔がある生分解性リン酸カルシウム担体を含み、
前記ホモ二量体蛋白の有効量は、生分解性リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜約3.2mg/gであり、
且つ、前記生分解性リン酸カルシウム担体は、孔径が300μm〜600μm程度で、多孔率が70％以上である、
ことを特徴とする生分解性組成物を開示した。
ある実施形態において、該生分解性組成物は、鼻唇溝、眉間しわ、中顔面組織、下顎の輪郭、オトガイ、頬、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種の組織増強に好適である。ある実施形態において、前記部位は、長骨骨折欠損、隣接する椎体の間、骨癒合不全欠損、上顎骨骨切り術切開、、下顎骨骨切り術切開、枝矢状骨切り術切開、オトガイ形成術切開、急速口蓋拡大術切開、隣接する2つの椎体横突起の縦方向に延びる空間、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。ある実施形態において、該ホモ二量体蛋白の単回投与量は0.006mg〜15mg程度である。ある実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、ホモ二量体蛋白を体内から流出させないように硬化し、形成した骨量を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限る。
【００２６】
さらに、本発明は、リン酸カルシウム担体、生分解性マトリックス及び上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白を含有することを特徴とする徐放性組成物を開示した。ある実施形態において、該リン酸カルシウム担体は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、二相リン酸三カルシウム（ＢＣＰ）、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。ある実施形態において、生分解性マトリックスは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸-グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。ある実施形態において、該徐放性組成物は、(a)リン酸カルシウム担体約2〜11% (w/w) 程度；(ｂ) 生分解性マトリックス約88〜97% (w/w) ；(c) ホモ二量体蛋白約0.017〜0.039% (w/w)を含む。
【００２７】
さらに、本発明は、骨空胴を充填する成型性組成物であって、
該成型性組成物に対して90〜99.5重量%程度の成型性マトリックス、及び上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白を含有し、
該成型性組成物から25％程度未満の該ホモ二量体蛋白を、移植後1時間、24時間、48時間、72時間、168時間、240時間、もしくは336時間ほど放出する、ことを特徴とする成型性組成物を開示した。
【００２８】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の生分解性組成物、及び生分解性リン酸カルシウム担体を保つように構成され脊椎融合ケージを含有する脊椎融合装置を開示した。
【００２９】
さらに、本発明は、治療を必要とする対象における長骨骨折の癒合を促進する方法において、
組成物を調製するステップ及び骨折が発生した部位に該組成物を移植するステップを含み
該組成物において、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白含有し、生分解性リン酸カルシウム担体が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、長骨骨折の治癒を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限って、
且つ、該ホモ二量体蛋白の量が、リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜約3.2mg/gである、
ことを特徴とする長骨骨折の癒合を促進する方法を開示した。ある実施形態において、該長骨骨折の癒合を促進する方法は、リン酸カルシウム担体の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出することをさらに含み、且つ、リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は約0.4〜約1.8である。
【００３０】
さらに、本発明は、
上側椎骨と下側椎骨を露出させる、
上側椎骨と下側椎骨を融合する位置を特定する、
上側椎骨と下側椎骨それぞれの骨面を前記融合する位置に露出させる、
該位置に、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白及び生分解性リン酸カルシウム担体を投与する、という工程を含む
ことを特徴とする脊椎融合促進方法を開示した。ある実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は非圧縮性送達ビヒクルであり、且つ、該非圧縮性送達ビヒクルは、2つの骨面の間に骨形成が望まれるが自然には発生しない位置に適用される。ある実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、少なくとも１つの移植棒を含有し、且つ、該移植棒は上側椎骨と下側椎骨の間に縦方向に延びるような位置に適用される。ある実施形態において、該位置は隣接する椎骨体の間、及び隣接する椎骨体横突起の縦方向に延びる間から選ばれる。
【００３１】
さらに、本発明は、奇形又は退化した関節に、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白と生分解性リン酸カルシウム担体を投与することを特徴とする関節固定促進方法を開示した。ある実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、奇形もしくは退化した関節にホモ二量体蛋白を0.006 mg〜10.5 mg程度投与することを含む。
【００３２】
さらに、本発明は、必要とする対象の脊椎に隣接する2つの椎骨体を融合させるための骨量を形成する方法に関し、
骨量骨量を形成するための組成物を調製するステップ及び隣接する2つの椎骨体の間に該組成物を導入するステップを含み、
該組成物において、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白を連行し含有して、緩効性生分解性担体が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、骨量の形成を該緩効性生分解性担体の大きさに限って、緩効性生分解性担体が自身の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出し、
さらに、該ホモ二量体蛋白の量が、該部位に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteである、
ことを特徴とする方法を開示した。ある実施形態において、該緩効性生分解性担体は多孔質構造を有し、隣接する2つの椎骨体の細胞がその多孔質構造に移行して骨量骨量を形成する。ある実施形態において、該緩効性生分解性担体は初期体積を有し、緩効性生分解性担体が吸収されるにつれて、骨量骨量が緩効性生分解性担体の該初期体積を置換する。
【００３３】
さらに、本発明は、後方固定法もしくは経椎間孔融合法であって、
隣接する椎骨体の椎間スペースに、椎間板インプラントを受容するための板空間を準備する、
椎間板インプラントに緩効性担体を導入する、
該緩効性担体において、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白の量が、該緩効性担体に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteであって、
且つ、骨量骨量を形成するように該椎間板インプラントを該板空間に導入する、
ことを特徴とする、必要とする対象の隣接する椎骨体を融合する方法を開示した。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法を提供することを可能とする。本発明により、所定の位置に骨形成を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実験グループＡ〜Ｇの雌ウサギ（ＮＺＷ種）の尺骨の代表的なＸ線画像を示す図である。各実験グループの尺骨は、外科的に形成された20 mmの円周状の欠損（すなわち、欠損部位）を有する。グループＡ〜Ｆでは、該欠損部位にインプラントを移植した。グループＡ〜Eでは、200 mgのβ−ＴＣＰインプラントを移植した。グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄにおいて、該β−ＴＣＰはそれぞれ、2μｇ、6μｇ、20μｇ、60μｇの組換ポリペプチド（C44-C48分子内ジスルフィド結合を含むSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白の担体となっていた。グループEのβ−ＴＣＰでは、組換ポリペプチドを担持してなかった。グループFでは、自体移植片インプラントとして腸骨骨片を受容した。また、グループＧでは、欠損部位に何のインプラントも受容してなかった。グループＡ〜Ｇは、0週（手術直後は０Ｗで示す）、術後２週間、術後4週間、術後６週間、術後８週間（それぞれ2Ｗ、4Ｗ、6Ｗ、8Ｗで示す）の時点で、それぞれＸ線画像を撮影した。尺骨の移植部位（グループＡ〜Ｆ）及び欠損部位（グループＧ）は、各図に白星印で示す。
【００３６】
【図２】実験グループＡ〜Ｇの代表的なコンピュータ断層撮影(CT)走査画像を示す図である。移植部位（グループＡ〜Ｆ）又は欠損部位（グループＧ）の中心における断面画像の経時変化を、0週（手術直後は０Ｗで示す）、術後4週間、術後８週間（それぞれ4Ｗ、8Ｗで示す）の時点で示す。実験グループＡ〜Ｇの構成に関する説明は図1と同様である。
【００３７】
【図３】外科的に改造されていない無傷尺骨及び実験グループＡ〜Ｇ（「Ａ」〜「Ｇ」で示す）の尺骨の捻におけるねじり強度測定の結果を示す図である。最大トルクは、ニュートンメートル(Newton-meters)を単位して「N-m」で示す。実験グループＡ〜Ｇの構成に関する説明は図1と同様である。
【００３８】
【図４−９】実験グループ1〜6のヒツジの脊椎の代表的なＸ線画像を示す図である。グループ1〜3では、3.5 gのβ−ＴＣＰインプラントを受容した。該β−ＴＣＰはそれぞれ10.5 mg、3.5 mg、1.05 mgの組換ポリペプチド（C44-C48、C80-C112、及びC79-C114分子内ジスルフィド結合を含むSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白を担持した。グループ4では、ホモ二量体蛋白を含まない3.5 gのβ−ＴＣＰインプラントを受容した。グループ5では、自体移植片インプラントを受容した。グループ6では、3.15mgのrhBMP-2を含む吸収性コラーゲンスポンジのインプラントを受容した。図4〜9は、右から左へ、各グループを術後4週間及び術後８週間の時点で撮影したＸ線写真を示す。「2179」、「2192」、「2187」、「2160」、「2162」及び「2166」はグループ1〜6をそれぞれ指す。
【００３９】
【図１０】5つの実験グループにおける雌イヌ（ビーグル種）の尺骨の代表的なＸ線画像を示す図である。5つの実験グループは対照グループ、Hp 35グループ、Hp 140グループ、Hp560グループ、Hp 2240グループである。Ｘ線画像は、術後1週間、術後２週間、術後4週間、術後８週間、術後12週間（それぞれ1Ｗ、2Ｗ、4Ｗ、8Ｗ、12Ｗで示す）の時点で撮影された。各実験グループの尺骨は、外科的に形成された25mmの円周状の欠損（すなわち、欠損部位）を有する。インプラントは各実験グループの欠損部位に移植された。対照グループ、Hp 35グループ、Hp 140グループ、Hp560グループ及びHp 2240グループのインプラントは、それぞれ0μg、35μg、140μg、560μg、2240μgの組換ポリペプチド（C44-C48分子内ジスルフィド、C80-C112分子間ジスルフィド、及びC79-C114分子間ジスルフィド結合を含んだSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白を担持した、β−ＴＣＰ800mgである。
【００４０】
【図１１】椎間ケージを示す図である。左の列の画像は、椎間ケージの上面視画像を示す。そして、右の列の画像は、椎間ケージの側面視画像を示す。拡大倍率について、上の行はx0.67、真ん中の行はx2、下の行はx4である。ケージの大きさは8 mm x 24 mm x 10 mmである。
【００４１】
【図１２】下記の実験と測定における、可動範囲測定の結果を示す図である。150 mgのβ−ＴＣＰをインプラントとして受容したヒツジの脊椎を、０週（手術直後）の時点で測定した。0 mg、0.1 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg、4.0mgの組換ポリペプチド（C44-C48分子内ジスルフィド、C79-C112分子間ジスルフィド、及びC80-C114分子間ジスルフィド結合を含んだSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白を担持したβ−ＴＣＰ150 mgをインプラントとして受容したヒツジ脊椎を、12週間の時点で測定した。自体移植片をインプラントとして受容したヒツジ脊椎を、12週間の時点で測定した。ヒツジはメスEwe種である。図１２では各試験条件で各方向の可動範囲測定平均値と標準偏差値を示す。
【００４２】
【図１３】図12で説明したホモ二量体蛋白インプラントを0.1mg/siteで受容したヒツジ脊椎のマイクロコンピュータ断層撮影像(μCT)のアキシャル画像、コロナル画像及びサジタル画像を示す図である。「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及び「I」は、それぞれ腹面(ventral)、背面(dorsal)、右、左、上面及び下面を指す。部位に形成した骨はケージのスペースを大幅に充填したが、両方の終板には透き（lucency）が示された。
【００４３】
【図１４】図12で説明したホモ二量体蛋白インプラントを0.5mg/siteで受容したヒツジ脊椎のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)のアキシャル画像、コロナル画像及びサジタル画像を示す図である。「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及び「I」に関する説明は図13と同様である。該部位には良好な骨質が示されたが、多少の透き線も示された。
【００４４】
【図１５】図12で説明した自体移植片を0.5mg/siteで受容したヒツジ脊椎のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)のアキシャル画像、コロナル画像及びサジタル画像を示す図である。「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及び「I」に関する説明は図13と同様である。該時点で部位に形成した骨は、ケージのスペースを埋め尽くしていなかった。また、終板には透き（lucency）が示された。
【００４５】
【図１６】14日の放出期間に微粒子から放出されたホモ二量体蛋白の相対量（図16A）と累積百分率（図16B）を示す図である。
【００４６】
【図１７】-20℃、4℃、25℃で6か月間それぞれ保存された乳酸-グリコール酸共重合体/ホモ二量体蛋白−ベータ−リン酸三カルシウム（PLGA/Hp-β-TCP）の代表的な走査型電子顕微鏡法画像を示す図である。
【００４７】
【図１８】異なる剤量のホモ二量体蛋白及び図1で説明したPLGA/Hp-β-TCPを移植されたBalb/C系マウスの脛骨における、移植から０週及び４週間後の代表的なＸ線画像を示す図である。各図の白矢印は骨欠損を指す。（C：壊死骨対照グループ、スキャフォールド（scaffold）を一切移植してない骨片。PT: PLGA/β-TCP（ホモ二量体蛋白をが含まない）。POT-0.2：PLGA/0.2μg Hp-β-TCP。POT-0.8：PLGA/0.8μg Hp-β-TCP。POT-1.6：PLGA/1.6μg Hp-β-TCP。POT-3.2：PLGA/3.2μg Hp-β-TCP。
【００４８】
【図１９】図18で説明したグループにおける、移植から４週間後の新骨形成/領域の百分率を示す図である。
【００４９】
【図２０】本発明が開示する製剤例の横断面画像を示す図である。図20Ａは、組換ポリペプチド/蛋白を担持した担体（例、β-TCP）の粒を示す。図20Ｂは、組換ポリペプチド/蛋白を担持した粒と混ざったパテを示す。図20Ｃは、開示した組換ポリペプチド/蛋白を有するパテ（putty）を示す。図20Ｄは、組換ポリペプチド/蛋白を担持した粒がパテの外側層に均一に分布したパテを示す。
【００５０】
【図２１】所定の持続時間に放出されたホモ二量体蛋白の累積百分率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、組換ポリペプチド、該組換ポリペプチドを有するホモ二量体蛋白及びヘテロ二量体蛋白、該組換ポリペプチドをコードする核酸分子及びベクター、並びに該組換ポリペプチドを発現するための宿主細胞を提供する。本発明はさらに、該組換ポリペプチドの組成物及び該組換ポリペプチドの製造、使用方法を提供する。
【００５２】
本明細書に引用される全ての刊行物、雑誌記事、書籍、マニュアル、特許出願、及び特許は、そのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。個々の刊行物も具体的かつ個別に同程度に参考として入れる。
【００５３】
特に説明しない限り、本明細書で用いる技術的又は科学的な用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されることと同じ意味を有する。本発明について、下記の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００５４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる、単数形で記載されたものであっても、前後関係から明らかでない限り、複数の場合も含めて意味する。例えば、「一つのドメイン」に対する言及は，１以上の該ドメインに対する言及を含む。また，「一つの組換ポリペプチド」に対する言及は，１つ以上の組換ポリペプチドに対する言及を含む。「一つ（ａ、ａｎ）」、「ｔｈｅ」、「１つ以上」、「少なくとも1つ」という用語は、同じ意味で使われる。
【００５５】
「又は（or）」は、特に明示しない限り、「及び／又は（and/or）」を意味する。同様に、「含む（comprise、comprises、comprising）」、「含有する（include、includes、including）」などは、同じ意味で使われ、限定を意図しないこととして理解される。
【００５６】
更に、ここでいう「及び／又は」は、2つの特定された特徴又は組成物において、その中の一つ又は両方を特定的に開示するために使われる。そのため、例えば、「Ａ及び／又はＢ」というように使われる「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Aのみ」、「Bのみ」を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」というように使われる「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ及びＣ」、「Ａ、Ｂ又はＣ」、「Ａ又はＣ」、「Ａ又はＢ」、「Ｂ又はＣ」、「Ａ及びＣ」、「Ａ及びＢ」、「Ｂ及びＣ」、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「Ｃのみ」を含むことを意図する。
【００５７】
記載したあらゆる態様に使われる「含む、有する、含有する(comprising)」は、「consisting of（から構成される）」及び／又は「consisting essentially of（から実質的に構成される）」という類似記載の意味も含む。
【００５８】
「アミノ酸」は、水素原子に結合している中心炭素原子(α-炭素原子)、カルボン酸基(本明細書における炭素原子は"カルボキシル炭素原子"と称する)、アミノ基(本明細書における窒素原子は"アミノ窒素原子"と称する)及び側鎖群Rを含む構造を有する分子である。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に組み込まれた場合には、アミノ酸を別のアミノ酸に結合させる脱水縮合において、アミノ酸はカルボン酸基の1個以上の原子を失う。その結果、タンパク質に取り込まれたアミノ酸は「アミノ酸残基」と称される。
【００５９】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して2つ以上の個々のアミノ酸が連結された(自然に生じるか否か)ポリマーを意味する。また、その結合は、アミノ酸(又はアミノ酸残基)のα-炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸の非α-炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合するときに起こる。ここで、「タンパク質」という用語は、「ペプチド」及び「ポリペプチド」の意味も含めて理解される（同じ意味として使われる場合がある）。また、本明細書において、複数のポリペプチドサブユニット（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼ)又は他の成分（例えば、テロメラーゼに存在するＲＮＡ分子)を含んだタンパク質も「タンパク質」として理解される。同様に、タンパク質及びポリペプチドの断片も本明細書に開示した「タンパク質」の範囲内である。本開示の一態様では、ポリペプチドは、2つ以上の親ペプチドセグメントのキメラを含む。用語「ポリペプチド」は、翻訳後修飾(「PTM」)の産物を指すことや、翻訳後修飾(「PTM」)の産物を包含することも意図する。翻訳後修飾(「PTM」)について、特にこれらに限定されるものではないが、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、カルバモイル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、非天然に存在するアミノ酸による修飾、標識成分との結合といった他の任意の操作又は修飾、を挙げることもできる。ポリペプチドは、天然生物源から由来する又は組換え技術によって製造することができる。ただし、指定された核酸配列からの翻訳である必要はない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。「単離された」ポリペプチド、そのフラグメント、変異体又はその誘導体は、自然の環境には存在しないポリペプチドを指し、特定程度の精製は必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、単に原初の又は天然の環境から取り外されたものであってもよい。本開示について、宿主細胞で発現されて生産された組換えポリペプチドやタンパク質は単離されたものに該当し、任意の適切な技術によって分離され、分画され、又は部分的に若しくは十分に精製された天然若しくは組換えポリペプチドである。
【００６０】
本明細書で使用される「ドメイン」は、用語「ペプチドセグメント」と交換可能に使用することができ、より大きなポリペプチド若しくはタンパク質の一部又は断片を指す。ドメインは、自身の機能活性を有することは必要ではないが、場合によっては、ドメインが自身の機能活性を有するものであっでもよい。
【００６１】
所与のタンパク質の特定のアミノ酸配列(すなわち、アミノ末端からカルボキシル末端まで書き込まれたときのポリペプチドの「一次構造」)は、mRNAのコード化部分の塩基配列により決定される。そしてこのmRNAのコード化部分の塩基配列は遺伝子情報により順に決定される。遺伝子情報は、典型的にはゲノムＤＮＡ(例えばミトコンドリアや葉緑体のＤＮＡのようなオルガネラＤＮＡも含む) を挙げることができる。従って、遺伝子の配列を決定することは、対応するポリペプチドの一次配列と、その遺伝子もしくはポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド又はタンパク質のより具体的な役割若しくは活性の予測に役立つ。
【００６２】
本明細書で使用される「Ｎ末端」は、ポリペプチドのアミノ末端に関連して、アミノ酸、ドメイン、又はポリペプチド内のペプチドセグメントの位置や場所を意味する。例えば、「ドメインＡは、ドメインＢ及びＣに対してＮ端末である」という記載は、ドメインＡがドメインＢ及びＣよりもアミノ末端に近い場所に位置していることを意味する。このように、ドメインＢ及びＣの場所が特に言及されない限り、アミノ末端側からのポリペプチドのドメインの順序は、A-B-C又はA-C-Bの何れかで理解される。また、Ｎ末端であるドメインと他のドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。同様に、ポリペプチドのＮ末端と、他のドメインに対してＮ末端であるドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。
【００６３】
本明細書で使用される「Ｃ末端」は、ポリペプチドのカルボキシル末端に関連して、アミノ酸、ドメイン、又はポリペプチド内のペプチドセグメントの位置や場所を意味する。例えば、「ドメインＡは、ドメインＢ及びＣに対してＣ端末である」という記載は、ドメインＡがドメインＢ及びＣよりもカルボキシル末端側に近い場所に位置していることを意味する。このように、ドメインＢ及びＣの場所が特に言及されない限り、アミノ末端側からのポリペプチドのドメインの順序は、B-C-A又はC-B-Aの何れかで理解される。また、Ｃ末端であるドメインと他のドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。同様に、ポリペプチドのＣ末端と、他のドメインに対してＮ末端であるドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。
【００６４】
本明細書での「融合」、「動作可能に連結され」、及び「動作可能に結合され」は、本明細書に開示される組換えポリペプチドの形成における2つ以上のドメインの任意の化学的又は物理的結合について広く指す際は、交換的に使用される。一実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドは、2つ以上の異なるポリペプチドからなるドメインを複数含むキメラポリペプチドである。
【００６５】
本明細書に開示される2つ以上のドメインを含む組換えポリペプチドは、各ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む単一のコーディング配列によってコードされ得る。特に明記しない限り、各ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は「インフレーム（in frame）」であり、ポリヌクレオチド配列をを含む一本鎖ｍRNAを翻訳し、各ドメインを含む一本鎖ポリペプチドとなる。一般に、本明細書に記載の組換えポリペプチド中のドメインは、互いに直接融合されるか、又はペプチドリンカーにより分離される。ペプチドリンカーをコードする種々のポリヌクレオチド配列は、本分野では公知である。
【００６６】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー形態を意味する。場合によって、ポリヌクレオチドは、その由来生物の自然に生じるゲノムのコーディング配列とすぐに隣接(5'末端又は3'末端に)する、又はすぐには隣接しない配列を含む。したがって、該用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換えDNA、自律複製するプラスミド若しくはウイルスに組み込まれた組換えDNA、原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、又は他の配列と関連がない別個の配列（例えば、cDNA)を含む。ここで開示するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの修飾型であってもよい。本明細書で使用されるポリヌクレオチドはとりわけ、一本鎖若しくは二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物のDNA、一本鎖若しくは二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物のRNA、又はDNA及びRNAを含むのハイブリッド分子を指す。ここで、前記ハイブリッド分子は、一本鎖、より典型的には二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域との混合物のDNA及びRNAを含むことが可能である。「ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNAもしくはRNA（生物体によること、例えば、ウイルスのゲノムRNA）、ゲノムDNAによりコードされるmRNA、及びcDNAを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合（例えば、ペプチド核酸(PNA)に見出されるアミド結合）を含む。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドは、天然の環境から取り除かれた核酸分子（例えば、DNAもしくはRNA）を指す。例えば、本開示の適用上、ベクターに含まれる組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、「単離された」ものとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例として、異種性宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の他のポリヌクレオチドから(部分的又は十分に)精製された組換えポリヌクレオチドも含む。単離されたRNA分子は、本開示のポリヌクレオチドのin vivo又はin vitroのRNA転写物を含む。さらに、本開示により単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産したポリヌクレオチド又は核酸（例えば、核酸分子）も含む。
【００６７】
本明細書で使用される「コーディング領域」又は「コーディング配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA))は通常、アミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部としてみなされる可能性がある。ただし、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、及びイントロンなどのフランキング配列は、コーディング領域の一部ではない。コーディング領域の境界は、一般的に、得られたポリペプチドのアミノ末端をコードする5'末端の開始コドンと、得られたポリペプチドのカルボキシル末端をコードする3'末端の翻訳終止コドンによって決定される。
【００６８】
本明細書で使用される「発現制御領域」という用語は、コーディング領域と動作可能に結合され、コーディング領域によってコードされた産物の発現を配向する若しくは制御する転写制御因子を指す。例としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、及び転写終止シグナル等を挙げることができる。例えば、プロモーター機能の誘導が産物をコードする発現制御領域を含むmRNAの転写を起こし、且つプロモーターとコーディング領域との間の結合の性質が、コーディング領域によってコードされた産物の発現を配向するポロモーターの能力に干渉しなければ、又は、DNAテンプレートの転写に干渉しなければ、コーディング領域とプロモーターは「動作可能に結合される」と考えられる。発現制御領域は、コーディング領域の上流(5'非コード配列)、内部、若しくは下流に(3'非コード配列)位置するヌクレオチド配列、又は関連するコーディング領域の転写、RNAプロセシング、安定性若しくは翻訳に影響を与えるものを含む。一般的に、コード領域を真核生物での発現を対象とする場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列はコード領域の3'に位置する。
【００６９】
「核酸セグメント」、「オリゴヌクレオチドセグメント」又は「ポリヌクレオチドセグメント」は、より大きなポリヌクレオチド分子の一部を意味する。ポリヌクレオチドセグメントはコードされたタンパク質の機能ドメインに対応する必要はないが、場合によって、該セグメントはタンパク質の機能ドメインをコードする。ポリヌクレオチドセグメントの長さは、ヌクレオチド数が約6個以上(例えば、6-20、20-50、50-100、100-200、200-300、300-400又はそれ以上の長さ) とすることができる。
【００７０】
「ベクター」は、宿主細胞への核酸分子のクローニング及び/又は転写のための任意のビヒクルを意味する。「ベクター」という用語は、in vitro、exvivo又はin vivoで核酸を細胞内に導入するためのウイルスビヒクル及び非ウイルス性ビヒクル(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス)を両方含む。
【００７１】
本明細書で使用される「宿主細胞」及び「細胞」という用語は、互いに交換可能に使用することができ、核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を担持又は担持可能な任意のタイプの細胞又は細胞集団を意味する。例えば、初代細胞、培養中の細胞、細胞株からの細胞等を挙げることができる。宿主細胞は原核細胞であってもよい、また、真核細胞であってもよい。例えば、酵母細胞のような真菌細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞のような種々の動物細胞等を挙げることができる。
【００７２】
本明細書で使用される「培養」は、細胞の成長、分裂又は細胞を生きた状態で維持することを可能するin  vitro環境に細胞をインキュベートすることを意味する。本明細書で使用される「培養細胞」は、in  vitroで増殖される細胞を意味する。
【００７３】
本明細書で使用される「骨誘導性」とは、骨及び/又は軟骨の形成若しくは成長の誘導を指し、例えば、骨及び/又は軟骨の形成若しくは成長に関連するマーカーの誘導（例えば、アルカリホスファターゼ活性の誘導）等を含む。
【００７４】
本明細書において「酵母ツーハイブリッドアッセイ」又は「酵母ツーハイブリッドシステム」は交換可能に使用され、タンパク質ペア間の相互作用の検出のためのアッセイ又はシステムを意味する。典型的なツーハイブリッドスクリーニングアッセイ/システムにおいて、転写因子は、結合ドメイン(BD)と活性化ドメイン(AD)という2つの断片に分割され、それぞれが別個のプラスミドに設けられ、それぞれが所望のタンパク質に融合する。酵母ツーハイブリッドアッセイシステムは、(i) ベイトタンパク質及びシステムに利用される転写因子のBDを含む「ベイト」ベクター、（ii）プレイタンパク質（又は、ベイトタンパク質との相互作用をスクリーニングするためのプレイタンパク質のライブラリー）及び転写因子のADを含む「プレイ」ベクター、（iii）システムに利用される転写因子のBDに対する結合配列を含む好適なレポーター酵母株を有する。ベイト-プレイ相互作用が起こると、転写因子のADが1つ以上のレポータータンパク質の発現を駆動することになる。ベイトベクター及びプレイベクターは、レポーター酵母株中に導入され、そこで、発現されたベイト及びプレイタンパク質は相互作用することができる。また、ベイトベクター及びプレイベクターの何れかを含む別個の一倍体酵母株を交配させることで、両方のタンパク質を発現する二倍体酵母株を得ることが可能である。相互作用するベイト及びプレイタンパク質は、転写因子の再構成及び活性化を起こし、その転写因子は次いでレポーター酵母株が提供した親和活性化ドメインに結合し、レポーター遺伝子を検出可能な発現を誘発する。
組換えポリペプチド及び組成物
【００７５】
本開示は、SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び355からなる群より選ばれる2つ以上のドメインを含む組換えポリペプチドに関し、表3に開示された2つのドメインの組合せのいずれかを含むことができるが、これに限定されない。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは任意の3つの上記ドメインを含み、表3に開示された3つのドメインの組合せのいずれかを含むことができるが、これに限定されない。
【００７６】
本明細書に記載の組換えポリペプチドの任意のドメインは、組換えポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に対応する任意の位置に配置されることができる。例えば、本明細書に開示される組換えポリペプチドの任意のドメインを、組換えポリペプチド中の任意の1つ以上の他のドメインに対してＮ端末の位置に配置することができる。同様に、本明細書に開示される組換えポリペプチドの任意のドメインを、組換えポリペプチド中の任意の1つ以上の他のドメインに対してＣ端末の位置に配置することもできる。
【００７７】
本開示は、SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び355からなる群より選ばれる2つ以上のドメインを含む組換えポリペプチドに関し、組換えポリペプチドは組換えポリペプチドにおける個々のドメインのいずれよりも、アクチビン受容体IIBタンパク質（即ち、ActRIIBecd）の細胞外ドメインに対して高い親和性を有する。ActRIIB及び天然に存在する変異体の核酸配列及びポリペプチド配列は公知である。例えば、本明細書に開示されるActRIIBecdは、本明細書に開示されるSEQ ID NO：8の残基27-117に相当するSEQ ID NO：9とすることができる。上記親和性は、例えば、放射免疫アッセイ(RIA)、BIAcore（商標）のような表面プラズモン共鳴又は当該技術分野で公知である任意の他の結合アッセイによって測定することができる。幾つかの実施形態において、該組み換えポリペプチドは、2つのドメインの組合せを含み、且つ、該2つのドメインの任意の一方はもう一方のドメインに対してＮ端末又はＣ端末の位置に配置され、以下のドメインの組み合わせからなる群より選ばれる：SEQ ID NO：39及びSEQ ID NO：49、SEQ ID NO：49及びSEQ ID NO：61、SEQ ID NO：61及びSEQ ID NO：39、SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：35、SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：47。幾つかの実施形態において、該2つのドメインの組み合わせは、SEQ ID NO：188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248及び254からなる群より選ばれる配列を含む組み換えポリペプチドを生成する。幾つかの実施形態において、該組み換えポリペプチドは、3つのドメインの組合せを含み、該3つのドメインの任意の一方は、他のドメインに対してＮ端末又はＣ端末の位置に配置され、以下のドメインの組み合わせからなる群より選ばれる：SEQ ID NOs: 39、49及び61；SEQ ID NOs:35、47及び57；SEQ ID NOs:39、47及び61；SEQ ID NOs:35、49及び57；SEQ ID NOs:39、57及び47； SEQ ID NOs:35、61及び49。幾つかの実施形態において、該3つのドメインの組み合わせは、SEQ ID NO：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及び348からなる群より選ばれる配列を含む組み換えポリペプチドを生成する。
【００７８】
本開示は、SEQ ID NO：39の第1ドメイン、SEQ ID NO：49の第2ドメイン及びSEQ ID NO：61の第3ドメインを含む組み換えポリペプチドに関し、且つ、前記第1ドメインは第2ドメインに対してＣ端末に位置し、前記第3ドメインは第2ドメインに対してＮ端末に位置する、又はこれらの組み合わせである。特定の実施形態において、該組み換えポリペプチドは、SEQ ID NO：35及びとSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1ドメイン、SEQ ID NO：47及びとSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2ドメイン、SEQ ID NO：57及びとSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3ドメインを含み、前記第1ドメインは第2ドメインに対してＣ端末に位置し、前記第3ドメインは第2ドメインに対してＮ端末に位置する、又は第1、2、3ドメインが、それぞれSEQ ID NO：39、49、61である際の組み合わせである。
【００７９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組み換えポリペプチドは翻訳後修飾(「PTM」)を含む、当該翻訳後修飾(「PTM」)はジスルフィド結合形成、グリコシル化、カルバモイル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、非天然に存在するアミノ酸による修飾、又は標識成分との結合などの任意の他の操作修飾を含むが、これに限定されない。
【００８０】
特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、生理的条件下又は任意の他の標準条件(例えば、精製条件若しくは保存条件)において1つ以上のジスルフィド結合の形成に関与し得る1つ以上のシステインを含むことができる。特定の実施形態において、ジスルフィド結合は、組換えポリペプチド中の2つのシステイン残基の間に形成された分子内ジスルフィド結合である。特定の実施形態において、ジスルフィド結合は、二量体中の2つの組換えポリペプチドの間の分子間ジスルフィド結合である。特定の実施態様において、分子間ジスルフィド結合は、本明細書に記載の2つの同一の組換えポリペプチドの間に形成され、且つ、その2つの同一の組換えポリペプチドはホモ二量体を形成する。特定の態様において、ホモ二量体は、少なくとも1つ又は3つ以上の分子間ジスルフィド結合を含む。特定の態様において、分子間ジスルフィド結合は、本明細書に記載の2つの異なる組換えポリペプチドの間に形成されし、且つ、その2つの異なる組換えポリペプチドがヘテロ二量体を形成する。特定の態様において、ヘテロ二量体は、少なくとも1つ又は3つ以上の分子間ジスルフィド結合を含む。
【００８１】
本開示は、SEQ ID NO：35及びとSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1ドメイン、SEQ ID NO：47及びとSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2ドメイン、SEQ ID NO：57及びとSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3ドメイン含む組換えポリペプチドに関し、当該含む組換えポリペプチドは1つの分子内ジスルフィド結合を含む。
【００８２】
特定の実施形態において、第1ドメイン、第2ドメイン、第3ドメイン又はこれらの組み合わせは、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、1つ以上の分子内ジスルフィド結合は、単一ドメイン内、一方のドメインともう一方のドメインとの間、2つ以上のシステインを有するドメインと他の1つ以上のドメインとの間にあるか、又はそれらの組合せである。特定の実施形態において、第1ドメインは1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、第2ドメインは1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、第3ドメインは1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、各ドメインはそれぞれ1つのジスルフィド結合を有する。本明細書において分子内ジスルフィド結合について言及する際に使用される「ドメインは1つのジスルフィド結合を有する」とは、1つ以上のシステインが存在するドメインにおける2つのシステインの間にある分子内ジスルフィド結合、又は一方のドメインの中のシステインともう一方のドメインの中のシステインとの間にいるジスルフィド結合を指す。
【００８３】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチドの第2ドメインは、第2ドメインの23番目のアミノ酸と第2ドメインの27番目のアミノ酸との間に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第1ドメインと第3ドメインの間、第3ドメインの中に、又はこの両方に、更に1つ以上の分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、第3ドメインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、第3メインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、又は第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、第3ドメインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、更に1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第3ドメインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、更に1つのジスルフィド結合を有する。
【００８４】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの第3ドメインは、第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、該第3のドメインは、第１アミノ酸配列と第2アミノ酸配列の間に2つの分子内ジスルフィド結合若しくは2つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に、第１分子内又は分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と第2アミノの酸配列第4番目のアミノ酸の間に第2分子内又は分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に、第１分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と第2アミノ酸配列の第4番目のアミノ酸の間に第2分子内又は分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第2ドメインの23番目のアミノ酸と第2ドメインの27番目のアミノ酸の間に、更に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【００８５】
本開示は、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる１種であるアミノ酸配列を有し、且つ1つの分子内ジスルフィド結合を有す組換えポリペプチドに関する。
【００８６】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン15、システイン44、システイン48、システイン79、システイン80、システイン112、システイン114及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324及びSEQ ID NO：332からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン44、システイン48、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324及びSEQ ID NO：332からなる群より選ばれる。
【００８７】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン15、システイン29、システイン30、システイン62、システイン64、システイン88、システイン92及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88、システイン92、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる。
【００８８】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン23、システイン27、システイン65、システイン79、システイン80、システイン112、システイン114及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：268及びSEQ ID NO：300からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン23、システイン27、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：268及びSEQ ID NO：300からなる群より選ばれる。
【００８９】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン8、システイン9、システイン41、システイン43、システイン59、システイン88、システイン92及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：284及びSEQ ID NO：308からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88、システイン92、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：284及びSEQ ID NO：308からなる群より選ばれる。
【００９０】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン8、システイン9、システイン41、システイン43、システイン67、システイン71、システイン109及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：276及びSEQ ID NO：316からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン67、システイン71、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：276及びSEQ ID NO：316からなる群より選ばれる。
【００９１】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324及びSEQ ID NO：332からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン44とシステイン48との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を含む。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に、システイン80とシステイン114との間に、システイン80とシステイン112との間に、又はシステイン79とシステイン114との間に、更に1つの分子内若しくは分子間（二量体の）ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に更に1つの分子内又は分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン80とシステイン114との間にも更に1つの分子内又は分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン80とシステイン112との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン79とシステイン114との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９２】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88とシステイン92との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン29とシステイン62との間に、システイン30とシステイン64との間に、システイン30とシステイン62との間に、又はシステイン29とシステイン64との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン29とシステイン62との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン30とシステイン64との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン30とシステイン62との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン29とシステイン62との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９３】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：268及びSEQ ID NO：300からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン23とシステイン27との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に、システイン80とシステイン114との間に、システイン80とシステイン112との間に、又はシステイン79とシステイン114との間に、更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン80とシステイン114との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン80とシステイン112との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン79とシステイン114との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９４】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：284及びSEQ ID NO：308からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88とシステイン92との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に、システイン9とシステイン43との間に、システイン9とシステイン41との間に、又はシステイン8とシステイン43との間に、更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン9とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン9とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン8とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９５】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：276及びSEQ ID NO：316からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン8とシステイン71との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に、システイン9とシステイン43との間に、システイン9とシステイン41との間に、又はシステイン8とシステイン43との間に、更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン9とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン9とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン8とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９６】
本開示は、本明細書に記載の2つの同一の組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白を対象とする。
【００９７】
本開示は、本明細書に記載の2つの異なる組換えポリペプチドを有するヘテロ二量体蛋白を対象とする。
【００９８】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、該2つの組換えポリペプチド同士の第１ドメインの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第2ドメインの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第3ドメインの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第１ドメインと第2ドメインとの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第１ドメインと第3ドメインとの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第2ドメインと第3ドメインとの間に、又はこれらの組み合わせに、1つ以上の分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９９】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第１ドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の組換えポリペプチドの第１ドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、又は一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、及び一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、及び一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有する。
【０１００】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドともう一方の組換えポリペプチドとの間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。ここで、ホモ二量体蛋白である場合、一方の組換えポリペプチドともう一方の組換えポリペプチドは同一の配列を有する。ヘテロ二量体蛋白である場合、一方の組換えポリペプチドともう一方の組換えポリペプチドは異なる配列を有する。ここで、一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：260、292、324、332、340、若しくは348の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン15に位置する。一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：268若しくは300の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン65に位置する。一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：284若しくは308の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン59に位置する。また、一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：276若しくは316の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン109に位置する。上記のシステイン番号は、一方及び/又はもう一方の組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたものである。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)、（b）、(c)又は(d)の（1）と（2）との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
(c)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
(d)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
【０１０１】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、又は一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、1つのジスルフィド結合を有する。
【０１０２】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)、（b）、(c)又は(d)の（1）と（2）との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
(c)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
(d)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
【０１０３】
特定の実施形態において、各組換えポリペプチドのホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の第3ドメインは、第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの第１アミノ酸配列ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの第2アミノ酸配列との間に、2つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノの酸配列の4番目のアミノ酸の間に第2分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノの酸配列の4番目のアミノ酸の間に第2分子間ジスルフィド結合を有する。
【０１０４】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドは、本明細書に記載のいずれかの又は複数の分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０５】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドの第2ドメインは、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドは、第2ドメインの23番目のアミノ酸と第2ドメインの27番目のアミノ酸との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドは、SEQ ID NOs: 260、292、324若しくは332である組換えポリペプチドのシステイン44とシステイン48との間に、SEQ ID NOs:284、308、340若しくは348である組換えポリペプチドのシステイン88とシステイン92との間に、SEQ ID NOs:268若しくは230である組換えポリペプチドのシステイン23とシステイン27との間に、又はSEQ ID NOs:276若しくは316である組換えポリペプチドのシステイン67とシステイン71との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。上記のシステイン番号は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたものである。
【０１０７】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白は、2つの組換えポリペプチドを有し、且つ、この2つの組換えポリペプチドは同一の配列を有し、配列はSEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348から選ばれる。場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の同一の分子内ジスルフィド結合を有する。また、場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の異なる分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０８】
特定の実施形態において、本明細書に記載のヘテロ二量体蛋白は、2つの異なる組換えポリペプチドを有し、且つ、この2つの組換えポリペプチドはそれぞれ、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348から選ばれる異なる配列を有する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体蛋白の一方の組換えポリペプチドはSEQ ID NO：260の配列を有し、且つ、もう一方の換えポリペプチドはSEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348から選ばれる配列を有する。場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の同一の分子内ジスルフィド結合を有する。また、場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の異なる分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、表4又は表5に記載のシステインペアの間に、1つ又は複数のジスルフィド結合を有する。
【０１１０】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、骨誘導活性を有する。骨誘導活性は、この活性を測定するための任意の条件（即ち、骨誘導条件）下で測定されることができる。
【０１１１】
例えば、C2C12細胞は筋ジストロフィーマウス筋由来の筋芽細胞株である。骨誘導活性を有するポリペプチドへC2C12細胞を暴露することで、C2C12細胞分化を筋肉から骨へ移すこと（例えば、アルカリホスファターゼのような骨関連タンパク質の発現を特徴とする骨芽形成を誘導すること）ができる。アルカリホスファターゼは広く受け入れられている骨マーカーであり、アルカリホスファターゼ活性の検出用アッセイは骨誘導活性を証明するものとして受け入れられている。（Peel et al., J. Craniofacial Surg. 14: 284-291 (2003); Hu et al., Growth Factors 22: 29033 (2004); and Kim et al., J. Biol. Chem. 279: 50773-50780 (2004)等を参照）
【０１１２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る。
【０１１３】
特定の実施形態において、骨誘導活性は、医用画像技術、骨サンプルの組織学的検査、又は骨の形成若しくは成長を測定するため日常的に実施される任意の方法によって検出される。特定の実施形態において、該検出はＸ線画像のような放射線画像を含む。特定の実施形態において、該検出はコンピュータ断層撮影(CT)走査を含む。場合によって、該検出は分子イメージング又は核イメージング(即ち、陽電子放射断層撮像、（PET)）を含む。特定の実施形態において、該検出は組織学的検査を含む。特定の実施形態において、該検出はヘマトキシリン‐エオジン（HE）染色を含む。
【０１１４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、フラグメント、変異体又は誘導体分子を含むことができるが、これに限定されない。あるポリペプチドに言及する際の「フラグメント」、「変異体」、「誘導体分子」、「類似体」という用語は、言及されるポリペプチドの少なくともいくつかの特性又は生物活性を保持する任意のポリペプチドを含んで意味する。ポリペプチドフラグメントは、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメント、又は動物に移植した際により容易に作用部位に到達するフラグメントを含むことができる。ポリペプチドフラグメントは変異体領域を有することができ、該変異体領域は上記のフラグメント、又はアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド含むことができる。非天然に存在する変異体は、該技術分野において周知の変異誘発技術で製造することができる。本開示のポリペプチドフラグメントは、保存的若しくは非保存的アミノ酸置換、欠失若しくは付加を含むことができる。本明細書に記載の変異体ポリペプチドは、「ポリペプチド類似体」を指すこともできる。本開示のポリペプチドフラグメントは、誘導体分子を含むこともできる。本明細書に記載のポリペプチド若しくはポリペプチドフラグメントの「誘導体」は、機能性側基の反応により化学的に誘導体化された1個以上の残基を有する主体ポリペプチドを指す。「誘導体」は、20種類の標準アミノ酸に天然に存在するアミノ酸誘導体を1つ以上含有するペプチドも含む。例えば、4-ヒドロキシプロリンはプロリンに置換されていてもよい；5-ヒドロキシリジンはリジンに置換されていてもよい；3-メチルヒスチジンはヒスチジンに置換されていてもよい；ホモセリンはセリンに置換されていてもよい；オルニチンはリジンに置換されていてもよい。
【０１１５】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、標識を含むことができる。特定の実施形態において、該標識は、基質化合物若しくは組成物の化学的変化を触媒し得る酵素標識、放射性標識、蛍光団、発色団、画像形成剤、又は金属である。前記金属は、金属イオンも含む。
【０１１６】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチドは、1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸を類似の側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置換することである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において既に定義されている。これらのファミリーは、リジン、アルギニン、ヒスチジンのような塩基性側鎖；アスパラギン酸、グルタミン酸のような酸性側鎖；グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、システインのような非荷電極性側鎖；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンのような無極性側鎖；トレオニン、バリン、イソロイシンのようなベタラン側鎖；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンのような芳香族側鎖等を含む。そのため、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸と置換される場合、置換は保存的であると認められる。もう一つの実施形態において、アミノ酸の鎖は、順序及び/又は側鎖の組成が異なるが構造的に類似した鎖と保存的に置換することができる。
【０１１７】
特定の実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、本明細書に開示の核酸分子又はベクターによってコードされる、又は本明細書に記載の宿主細胞によって発現される。
核酸分子、ベクター及び宿主細胞
【０１１８】
本開示は、本明細書に記載の組換えポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に関する。
【０１１９】
特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、本明細書に記載のドメインをコードする任意の2つ以上のポリヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、SEQ ID NOs: 32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78からなる群より選ばれる2つ以上のポリヌクレオチド配列を有する。上記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NOs: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、355にそれぞれ対応するドメインをコードする。特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、本明細書の表3に記載の2つ若しくは3つのドメインに対応する組み合わせをコードする2つ若しくは3つのポリヌクレオチド配列を有する。
【０１２０】
特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、SEQ ID NOs: 115、157、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、267、275、283、291、299、307、315、323、331、339、347からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列を有する。上記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NOs: 116、158、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340、348に対応する組換えポリペプチドをそれぞれコードする。
【０１２１】
特定の実施形態において、該ポリヌクレオチド配列はコドン最適化される。
【０１２２】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子に作動可能に連結された発現制御領域を有する組換え核酸分子に関する。特定の実施形態において、該発現制御領域は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、転写終結シグナル、又はこれらの組合せである。特定の実施形態において、該発現制御領域はプロモーターである。発現制御領域は、転写制御領域及び/又は翻訳制御領域とすることができる
【０１２３】
様々な転写制御領域が当業者に知られている。例えば、、サイトメガロウィルスからのプロモーター若しくはエンハンサー（イントロン-Aに関連した前初期プロモーター）、シミアンウイルス40（初期プロモーター）、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）など（これらに限定されない）の脊椎動物細胞に機能する転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、ウサギβ-グロビンなどの脊椎動物遺伝子由来もの、又は真核細胞における遺伝子発現を制御し得る他の配列が含まれる。それに加えて好適な転写制御領域には、組織特異的プロモーター若しくはエンハンサー、又はリンホカイン誘導性プロモーター（インターフェロン又はインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。
【０１２４】
同様に、様々な翻訳制御領域が当業者に知られている。例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始若しくは終止コドン、ピコルナウイルス由来因子（特に内部リボソームエントリー部位、即ちＩＲＥＳ、またＣＩＴＥと呼ばれることもある）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
特定の実施形態において、該組換え核酸分子は組換えベクターである。
【０１２６】
ベクターは、核酸の宿主細胞へのクローニング及び/又は転写のための任意のビヒクルとすることができる。当該技術分野では多数のベクターが知られ使用されている、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス、改変真核ウイルス、改変細菌ウイルス等を挙げることができる。ポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターは、相補的な付着端を有する選択されたベクターに適切なポリヌクレオチド断片を連結することによって達成することができる。
【０１２７】
ベクターは、ベクターを組み込んだ細胞の選択若しくは識別のための選択マーカー又はレポーターをコードするように設計することができる。選択マーカー又はレポーターの発現は、ベクターに含まれた他のコード領域を組み込んで発現する宿主細胞の選択及び/又は識別をすることを可能する。当該技術分野に知られており使用されている選択マーカーとして、例えば、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに耐性を提供する遺伝子；アントシアニン調節遺伝子、イソペンテニル転移酵素遺伝子など表現型標識用遺伝子を挙げることができる。当該技術分野に知られており使用されているレポーターとして、例えば、ルシフェラーゼ(Ｌuc)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベタ-ガラクトシダーゼ(LacZ)、ベターグルクロニダーゼ(Gus) などを挙げることができる。選択マーカーをレポーターとして認めることもできる。
【０１２８】
「プラスミド」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子をしばしば担持し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を意味する。そのような要素は、任意源に由来する自律複製可能な配列、ゲノム統合配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線形、円形若しくはスーパーコイル状である一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。また、選択された遺伝子産物のために、適切な3'端非翻訳配列と共にプロモーター断片若しくはＤＮＡ配列を導入することができるよう、多数のヌクレオチド配列を連結し又は組み換えて特定の構築とすることがもてきる。
【０１２９】
使用可能な真核生物ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスのベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されない。非ウイルス性ベクターには、プラスミド、リポソーム、帯電脂質(サイトフェクチン)、ＤＮＡ-タンパク質複合体、生体高分子等が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点のような非転写要素、発現される遺伝子に連結する適切なプロモーター及びエンハンサー、他の5'端若しくは3'端隣接非転写性配列、5'端又は3'端隣非翻訳配列等を含むことができる。例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、アクセプター部位、転写終結配列等を挙げることができる。
【０１３０】
組換えベクターは、挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳のために必要な要素を有する任意の核酸構築を意味する、「組換え発現ベクター」とすることができる。ＲＮＡウイルスベクターの場合、該必要な要素は、適切な宿主細胞に導入する際の複製及び翻訳のために必要な要素である。
【０１３１】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入することを含む組換えベクターの製造方法方法に関する
【０１３２】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子又は組換え核酸分子を含む単離された宿主細胞に関する。特定の実施形態において、該単離された宿主細胞は、本明細書に記載の組換えベクターを含む。
【０１３３】
核酸分子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質転換、ＤＡＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、ＤＮＡクタートランスポーターなど当該技術分野に周知の方法によって宿主細胞に導入することができる。
【０１３４】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子又は組換え核酸分子を宿主細胞に導入することを含む組換え宿主細胞の製造方法に関する。特定の実施形態において、該方法は、本明細書に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することを含む。
【０１３５】
本明細書に記載の宿主細胞は、本明細書に記載の単離された核酸分子又は組換え核酸分子のいずれかを発現することができる。宿主細胞の核酸分子の発現について用いられる「発現」という用語は、ＲＮＡ又はポリペプチドのような生化学な産物が遺伝子によって生産される方法ことを指す。該方法は、細胞内の遺伝子の機能を呈示する任意の表現を含む、例えば、一過性の発現又は安定した発現等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、メッセンジャーＲＮＡへの遺伝子の転写及びそのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】
宿主細胞には、、原核生物又は真核生物が含まれるが、これに限定されない。好適な宿主細胞の代表例は、細菌細胞、酵母などの真菌細胞、昆虫細胞、単離された動物細胞等を含む。細菌細胞は、例えば、大腸菌のようなグラム陰性若しくは陽性細菌を含む。また、宿主細胞として乳酸菌種若しくはバチルス種を代わりに用いることもできる。真核細胞は、哺乳動物由来の確立された細胞株を含むが、これらに限定されない。哺乳動物由来の確立された細胞株の例としては、COS-7、L、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＢＨＫ細胞株等を挙げることができる。
【０１３７】
宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は本開示の核酸分子の増幅のため適切に改良された従来の栄養培地に培養することができる。温度、phなどの培養条件は、当業者に対して明らかであり、発現のために選択された宿主細胞を使用する際に、既知の任意の使用条件又は改良された条件とすることができる。
【０１３８】
本開示は、本明細書に記載の単離された宿主細胞を培養し、宿主細胞から組換えポリペプチドを単離することを含む、組換えポリペプチドの製造方法に関する。培養された宿主細胞からポリペプチドを単離するための技術は、当業者に対して明らかであり、宿主細胞からポリペプチドを単離する際に、既知の任意の使用条件又は改良された条件とすることができる。
組成物と装置
【０１３９】
本開示は、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、又はヘテロ二量体タンパク質を含む組成物に関する。
【０１４０】
特定の実施形態において、組成物は、生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤をさらに含む(文献Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照)。上記生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、対象に対して非毒性であるものを含むことができる。特定の実施形態において、組成物又は組成物の1つ以上の成分は無菌である。無菌成分は、例を挙げると、濾過(例えば、無菌濾過膜)又は照射(例えば、ガンマ線照射)により調製することができる。
【０１４１】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、骨若しくは骨片の同種異系移植片又は自体移植片をさらに含む。
【０１４２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、骨移植片代用品をさらに含む。
【０１４３】
特定の実施形態において、該骨移植片代用品はバイオセラミック材料である。「バイオセラミック材料」及び「バイオセラミック」という用語は、本明細書において交換可能に使用することができる。特定の実施形態において、バイオセラミックは体内に対して生体適合性であり、再吸収可能である。特定の実施形態において、バイオセラミックは任意のリン酸カルシウム塩系バイオセラミックである。特定の実施形態において、バイオセラミックは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、水酸アパタイト、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムからなる群より選ばれる。
【０１４４】
特定の実施形態において、該骨移植片代用品は生体活性ガラスである。特定の実施形態において、生体活性ガラスは、二酸化ケイ素(SiO2)、酸化ナトリウム(Na2O)、酸化カルシウム(CaO)又は酸化白金(Pt2O5)を含む。
【０１４５】
本開示は、本明細書に記載のホモ二量体蛋白と生分解性リン酸カルシウム担体（例えば、β−ＴＣＰ）を含む生分解性組成物を関する。前記ホモ二量体蛋白は、ある部位に骨量骨量を形成するように骨形成を誘導できる。前記ホモ二量体蛋白の有効量は、生分解性リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜3.2mg/gである。前記生分解性リン酸カルシウム担体は、担体の全体に孔があり、且つ、孔径が300μm〜600μm程度で、空孔率が70％以上程度である。
【０１４６】
特定の実施形態において、該生分解性組成物は、鼻唇溝、眉間しわ、中顔面組織、アゴ、オトガイ、頬、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる組織を増強することに好適である。
【０１４７】
特定の実施形態において、前記部位は、長骨骨折欠損、隣接する椎骨体の間、非癒合性骨欠損、上顎骨骨切り術切開、上顎骨骨切り術切開、下顎骨骨切り術切開、枝矢状骨切り術切開、オトガイ形成術切開、急速口蓋拡大術切開、隣接する椎骨体横突起の縦方向に延びる間、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。
【０１４８】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白の単回投与量は0.006 mg〜15 mg程度である。
【０１４９】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、形成した骨量骨量を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限る。
【０１５０】
本開示は、リン酸カルシウム担体、生分解性マトリックス及び本明細書に記載のホモ二量体蛋白を有する徐放性組成物に関する。
【０１５１】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、二相リン酸三カルシウム（ＢＣＰ）及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。
【０１５２】
特定の実施形態において、該生分解性マトリックスは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸-グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。
【０１５３】
特定の実施形態において、該徐放性組成物は、(a)リン酸カルシウム担体約2〜11% (w/w) 程度；(ｂ) 生分解性マトリックス約88〜97% (w/w) ；(c) ホモ二量体蛋白約0.017〜0.039% (w/w)を含む。
【０１５４】
本開示は、骨空胴を充填する成型性組成物であって、該成型性組成物に対して90〜99.5重量%程度の成型性マトリックス、及び本明細書に記載のホモ二量体蛋白を含有する成型性組成物に関する。該成型性組成物において、25％程度未満の該ホモ二量体蛋白は、移植後1時間、24時間、48時間、72時間、168時間、240時間、もしくは336時間ほど該成型性組成物から放出される。
【０１５５】
本開示は、本明細書に記載の分解性組成物、及び生分解性リン酸カルシウム担体を保つように構成される脊椎融合ケージ（例えば、PEEKケージ）を含有する脊椎融合装置に関する。
方法
【０１５６】
本開示は、治療を必要とする対象における長骨骨折の癒合を促進する方法において、
組成物を調製することを含んで、
該組成物において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白を連行し含有して、生分解性リン酸カルシウム担体（例えば、β−ＴＣＰ）が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、長骨骨折の治癒を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限って、
骨折が発生した部位に該組成物を移植することを含んで、
且つ、該ホモ二量体蛋白の量が、リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜約3.2mg/gである
ことを特徴とする長骨骨折の癒合を促進する方法に関する。
【０１５７】
特定の実施形態において、該長骨骨折の癒合を促進する方法は、リン酸カルシウム担体の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出することをさらに含み、且つ、リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は約0.4〜約1.8である。
【０１５８】
本開示は、上側椎骨と下側椎骨を露出させる、
上側椎骨と下側椎骨を融合する位置を特定する、
上側椎骨と下側椎骨それぞれの骨面を前記融合する位置に露出させる、
該位置に、本明細書に記載のホモ二量体蛋白及び生分解性リン酸カルシウム担体（例えば、β−ＴＣＰ）を投与する、という工程を含む
ことを特徴とする脊椎融合促進方法に関する。
【０１５９】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、非圧縮性送達ビヒクルであり、且つ、該非圧縮性送達ビヒクルは、2つの骨面の間に骨形成が望まれるが自然には発生しない位置に適用される。
【０１６０】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、少なくとも１つの移植棒を含有し、且つ、該移植棒は上側椎骨と下側椎骨の間に縦方向に延びるような位置に適用される。
【０１６１】
特定の実施形態において、選択された位置は隣接する椎骨体の間、及び隣接する椎骨体横突起の縦方向に延びる間である。
【０１６２】
本開示は、奇形又は退化した関節に、本明細書に記載のホモ二量体蛋白と生分解性リン酸カルシウム担体を投与することを特徴とする関節固定促進方法を開示した。
【０１６３】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、奇形もしくは退化した関節にホモ二量体蛋白を0.006 mg〜10.5 mg程度投与することを含む。
【０１６４】
さらに、本発明は、必要とする対象の脊椎に、隣接する２つの椎骨体を融合させるための骨量骨量を形成する方法に関し、
骨量骨量を形成するための組成物を調製する、
該組成物において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白を連行し含有して、緩効性生分解性担体が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、骨量骨量の形成を該緩効性生分解性担体の大きさに限って、
隣接する２つの椎骨体の間に該組成物を導入する、
緩効性生分解性担体が自身の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出する、
さらに、該ホモ二量体蛋白の量が、該部位に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteである
ことを特徴とする方法に関する。
【０１６５】
特定の実施形態において、該緩効性生分解性担体は多孔質構造を有し、隣接する２つの椎骨体の細胞がその多孔質構造に移行して骨量骨量を形成する。
【０１６６】
特定の実施形態において、該緩効性生分解性担体は初期体積を有し、緩効性生分解性担体が吸収されるにつれて、骨量が緩効性生分解性担体の該初期体積を置換する。
【０１６７】
本発明は、後方固定法もしくは経椎間孔融合法であって、
隣接する椎骨体の椎間スペースに、椎間板インプラントを受容するための板空間を準備する、
椎間板インプラントに緩効性担体を導入する、
該緩効性担体において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白の量が、該緩効性担体に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteであって、
且つ、骨量を形成するように該椎間板インプラントを該板空間に導入する、
ことを特徴とする、必要とする対象の隣接する椎骨体を融合する方法
【０１６８】
以下の実施例は、例示のためのものであり、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【０１６９】
[実施例1]   プラスミドの構築
【０１７０】
pQE-80L-Kanaプラスミドの構築のために、BspHI（BioLab社製）によって、カナマイシン耐性遺伝子をpET-24a(+) (Novagen社製)から切断し、875-bpのカナマイシン耐性遺伝子(+3886 から+4760まで)フラグメント(SEQ ID NO：1)を生成した。pQE-80Lベクター(Qiagen社製)は、BspHIで消化され消化、アンピシリン耐性遺伝子(+3886から+4760まで)フラグメント(SEQ ID NO：2)を除去した。そして、pQE-80Lベクターに前記カナマイシン耐性遺伝子フラグメントを結合させ、4513-bpのプラスミド（pQE-80L-Kana、SEQ ID NO：3）を生成した。
[実施例2]   酵母ツーハイブリッドスクリーニング
A. ベイトプラスミドの構築
【０１７１】
酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、市販のシステムを用いて行った(Matchmaker Two-Hybrid System 2; 米国カリフォルニア州パロアルト市CLONTECH社製)。ベイトプラスミド構築のために、pCRII/ActRIIB (Hilden., et al. (1994) Blood 83(8):2163-70)を鋳型として、PCRによって、アクチビン受容体IIB型(ActRIIB)の細胞外ドメインのコード領域(+103 bpから+375bpまで、SEQ ID NO:4)を生成した。ActRIIBの細胞外ドメイン(ActRIIBecd)を増幅するために使用されるプライマー（XmaI: 5'- CCCGGGACGGGAGTGCATCTACAACG-3'(SEQ ID NO: 5); SalI: 5'-GTCGACTTATGGCAAATGAGTGAAGCGTTC-3'(SEQ ID NO: 6)）は、XmaI及びSalI制限部位をそれぞれ5'端に含むように設計された。総量５０μＬに10ngの鋳型DNA、0.2μmの各プライマー、0.2 mMの各dNTP、1X PCRバッファ(10 mM Tris-HCl、 pH8.3、50 mM KCl 及び 1.5 mM MgCl2)、及び1.25 U  DNAポリメラーゼ(Promega)を用いて、PCRを行った。PCRは、95℃で３０秒の変性、4５℃で1分のアニーリング、そして68℃で5分の伸長反応を、30サイクルのプログラムで行った。PCR産物は、XmaI及びSalIで消化消化されて、pAS2-1ベクター(CLONTECH社製、GenBank Accession No. U30497)におけるGAL4のDNA結合ドメインにいる同じ制限部位にインフレームでサブクローンされ、pAS-ActRIIBecdプラスミドを生成した。
【０１７２】
ActRIIBと天然に存在する変異体の核酸配列及びリペプチド配列が知られている。例えば、野生型ActRIIBの核酸配列はSEQ ID NO: 7であって、対応するポリペプチド配列はSEQ ID NO: 8である。ActRIIBの細胞外ドメイン(ActRIIBecd)はSEQ ID NO: 9であって、SEQ ID NO: 8における27から117までの残基に対応し、SEQ ID NO: 4の核酸配列によりコードされている。
B. pACT2/MC3T3 cDNA ライブラリーの構築
【０１７３】
pACT2/MC3T3 cDNA ライブラリー構築のために、cDNAライブラリーインサートが1.5kb未満になるようにTu Q., et al. (2003, J Bone Miner Res. 18(10):1825-33)により記載されたMC3T3-E1マウス骨芽細胞cDNAライブラリーのクローン約7×106個を、pACT2ベクター(CLONTECH社製、GenBank  Accession No.U29899)に構築した。s1ヌクレアーゼ (Invitrogen  Life  Technologies社製、cDNA Synthesis System 、CAT. No. 18267-013) の処理後、二本鎖cDNAはpACT2ベクター内にクローン化された。且つ、前記pACT2ベクターは、GAL4活性化ドメインを有する融合蛋白を発現するように、SmaIにより消化消化された。そして、pACT2/MC3T3イブラリーは、製造者からのプロトコルに従って、「HIS3 Jump-Start」(米国カリフォルニア州パロアルト市CLONTECH社製)の手順によってクリーニングされた。別の実施形態において、pACT2 cDNAライブラリーは、市販品から得られた。
Ｃ.酵母株の選抜
【０１７４】
Saccharomyces cerevisiae Y190細胞(MATa, ura3-52, his3-D200, lys2-801,ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4D, gal80D, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, cyhr2,LYS2::GALUAS-HIS3TATA-HIS3;米国カリフォルニア州パロアルト市CLONTECH社製)をベイトプラスミドで形質転換し、トリプトファン欠如合成デキストロース培地(SD-Trp)より選択した。SD-Trp培地で生長した該形質転換体は、後にpACT2/MC3T3 cDNAライブラリーで形質転換され、トリプトファン及びロイシンが欠如している培地(SD-Trp-Leu)より選択された。ベイト及びライブラリーで共形質転換されたクローンは回収され、リーク(Leak)の成長を抑制するように、トリプトファン、ロイシン及びヒスチジンが欠如し且つ30mM  3-アミノ-1、2、4-トリアゾール(米国ミズーリ州セントルイス市Sigma-Aldrich,社製)を有する培地(SD-Trp-Leu-His)に再培養された。さらに、この段階で選択されたクローンの、βガラクトシダーゼ活性を測定した。プレートは30℃で3日間培養した後、撮像された。この実験を独立して3回以上行ったところ、同様の結果が得られた。そして、個別の陽性クローンから、pACT2ライブラリープラスミドを精製し、大腸菌によって増幅した。表1に示された陽性クローンにおけるcDNAインサートの配列決定(プライマー  5'-AATACCACTACAATGGAT-3'、SEQ ID NO:10)は、Perkin-Elmer ABI Automated DNA  Sequencerによって行った。
【表１】
2019525767.tif 000002
2019525767.tif 000003
[実施例3] 誤りがちな(Error-prone) PCR ランダム変異誘発
A. プラスミドから設計されたプライマーを用いた突然変異誘発
【０１７５】
実施例2の陽性クローンのDNA配列を、変異誘発した。
【０１７６】
一つの実施形態において、配列決定された陽性クローンはpQE-80L-Kanaにサブクローンされて、PCRランダム変異誘発を行った。先ず、表1に示された陽性クローンDNA配列増幅のためのプライマーは、5'端にMseI又はBamHI制限部位を含むように設計された。PCR条件は、実施例2に記載した通りであった。PCR産物は、MseI-BamHIにより消化消化され、インフレームでpQE-80L-Kanaベクターの同一制限部位へサブクローンされた。そして、Leung et al. (1989, Technique, 1, 11-15)が記載した誤りがちなPCRに基づき、いくつかの修正を伴い、サブクローンされたpQE-80L-Kanaプラスミドにランダム変異を導入した。線状化pQE-80L-Kana (XhoI消化済)は鋳型DNAとして使用された。変異誘発PCR増幅に用いたプライマー(MseI: 5'-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAA (SEQ ID NO: 29); BamHI: 5'-CCGGGGTACCGAGCTCGCATGCGGATCCTTA (SEQ ID NO: 30))は、それぞれ5'端にMseI又はBamHI制限部位を含むように設計された。総量５０μＬに10ngの鋳型DNA、40pMの各プライマー、、0.2 mMの各dNTP、1X PCRバッファ(10 mM Tris-HCl、pH8.3、50 mM KCl 及び 1.5 mM MgCl2)、0.2-0.3 mMのMnCl2、1%ジメチルスルホキシド、及び1.25 U Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社製, Carlsbad, Calif.) を用いて、変異誘発PCRを行った。変異誘発PCRは、94℃で３０秒の変性、55℃で2分のアニーリング、そして72℃で3分の伸長反応を、30サイクルのプログラムで行いた。PCR産物は、MseI及びBamHIにより消化消化された。該フラグメントは、MseI及びBamHIにより消化消化されたpQE-80L-Kanaの4.5-kbフラグメントに結合させた。生成したpQE-80L-Kanaの誘導体で、E. coli BL21 (Novagen社製) を形質転換した。そのコロニーは、37℃でLTB-アガー培地(1%v/vトリブチニン、0.1%v/v Tween 80、100mg/Lカナマイシン、0.01μMイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド、1.5% アガーを添加したＬＢ)で生長させた。
B.表1のプライマーを用いた突然変異誘発
【０１７７】
もう一つの実施形態において、前述したLeung et al. (1989, Technique, 1, 11-15)が記載した誤りがちなPCRに基づいて、いくつかの修正を伴い、ランダム変異を陽性クローン由来のpACT2ライブラリープラスミドに導入した。線状化pQE-80L-Kana (XbaI消化済)は鋳型DNAとして使用された。表1に示されたMseI 及びBamHI制限部位を有する合成オリゴヌクレオチドを、変異誘発PCR増幅のために用いた。総量５０μＬに10ngの鋳型DNA、40pMの各プライマー、0.2 mMの各dNTP、1X PCRバッファ(10 mM Tris-HCl、pH8.3、50 mM KCl 及び 1.5 mM MgCl2)、0.2-0.3 mMのMnCl2、1%ジメチルスルホキシド、及び1.25 U Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社製, Carlsbad, Calif.) を用いて、変異誘発PCRを行った。変異誘発PCRは、94℃で３０秒の変性、55℃で1.5分のアニーリング、そして72℃で4分の伸長反応を、30サイクルのプログラムで行った。PCR産物は、MseI及びBamHIにより消化消化された。該フラグメントは、MseI及びBamHIにより消化消化されたpQE-80L-Kanaの4.5-kbフラグメントに結合させた。生成したpQE-80L-Kanaの誘導体で、E. coli BL21 (Novagen社製) を形質転換した。そのコロニーは、37℃でLTB-アガー培地(1%v/vトリブチニン、0.1%v/v Tween 80、100mg/Lカナマイシン、0.01μMイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド、1.5% アガーを添加したＬＢ)で生長させた。
[実施例4] ActRIIBecd関連ポリペプチドの発現
【０１７８】
実施例3に記載した安定的に形質転換されたE. coli細胞を、実施例2の変異誘発したDNA由来のActRIIBecd関連ポリペプチド（即ち、ドメイン）を発現するのために用いた。
A.形質転換体の発酵
【０１７９】
一つの実施形態において、pQE-80L-Kanaの誘導体を有するE. coli  BL21形質転換体は、65 mL 培地(10g/L BBL PhytonePeptone、5g/L BactoYeast エキス及び10g/L NaClを含む)及び25-32μg/mLのカナマイシンを含んだ500 mL三角フラスコの中に、30℃〜37℃で180±20 rpmの攪拌で一晩（約10時間）培養した。5-50 L発酵槽の中に、37-420 mLの一晩培養した培養物を、23.8-38.5 μg/mLのカナマイシン及び1-3 mmol/Lイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含んだ3.7-42 LのTB 培地(1 L水に18 gのBBL  Phytone Peptone、36gのBactoYeast エキス、18.81gの KH2PO4、6 mLのGlycerolを含む培地)に入れて、37℃〜42℃温度調節範囲において260-450 rpmの攪拌で10〜24時間培養した。そして、GSAローター (Sorvall)に8，０００ｒｐｍで10分間遠心分離を行いた後、氷水浴で細胞を回収した。
【０１８０】
もう一つの実施形態において、新たに培養したコロニー（pQE-80L-Kanaの誘導体を有するE. coli  BL21形質転換体）を1つ又は新たに培養した培養物の10ｍLを、1LのLB液体培地(100 mg/Lカナマイシンを含む)に、OD600値が0.4-0.8.に到達するまで培養する。そして、40 又は 400 μMのIPTGを入れて、37℃で3〜5時間の反応によってポリペプチドの発現を誘導する。約8，０００ｒｐｍで遠心分離を行いた後、細胞を回収する。
B. E. coli由来ポリペプチドの回収及び精製
【０１８１】
E. coli  BL21/pQE-80L-Kana誘導体細胞は、実施例4Ａに記載したように発酵させた。一つの実施形態において、それらの誘導体細胞の細胞破砕及びポリペプチド回収は、4℃で行った。18ｇの湿潤細胞は、0.1M TRIS/HCl、10 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、1 mM PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)を含む総量６０mμＬの細胞破砕バッファー(pH 8.3)に懸濁させた。メーカーの指示に従って該細胞を細胞破砕装置Frenchpress (SLM Instruments Inc社製)に2回通過させた後、細胞破砕バッファーを加えて総量を200 mLとした。懸濁液を、15，000ｒｐｍで20分間遠心分離させた。得られたペレットを、1M NaCl を含む100mlの細胞破砕バッファーに懸濁させて、上記のように10分間遠心分離を行った。そして、得られたペレットを、1% Triton X- 100 (Pierce社製) を含む100mlの細胞破砕バッファーに懸濁させて、もう一度上記のように10分間遠心分離を行った。洗浄されたペレットは、20 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1% DTT(ジチオスレイトール)を含む総量５０mLの溶液に懸濁させて、テフロン組織グラインダーにより同質にされた。得られた懸濁液は、非溶解型粗ポリペプチドを含んだ。
【０１８２】
上記の実施形態で得られたポリペプチド懸濁液10ｍLを、10%酢酸によりｐＨを２.5の酸性に調整し、エッペンドルフ型遠心機により室温で遠心分離を行った。上清液を流速1.4 mL/minの10%酢酸で、Sephacryl S-100 カラム (Pharmacia社製, 2.6×78cm)を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な期間に溶出したポリペプチドを含む画分をプールした。該材料は、生物活性を有するポリペプチドを得るリフォールディングのため、又は精製のために使用された。
【０１８３】
上記の実施形態で得られた5 mgのポリペプチドを、50 mM Tris/HCl pH 8.0、 1M NaCl、 5 mM EDTA、 2 mM還元型グルタチオン、1 mM 酸化型グルタチオン及び33 mM Chaps (Calbiochem社製)を含む総量140mLの溶液に溶解させた。4℃で72時間後、塩酸で溶液のpHをpH 2.5に調整し、Amicon stirred cellsの中のYM 10膜(米国マサチューセッツ州ダンバース町Amicon社製)によって、混合液を10倍に濃縮するように限外濾過した。濃縮された混合液は、10 mM塩酸で元の体積に希釈され、同じ方法によって最終容量10 mLに濃縮された。形成した沈殿物は、5000gで30分間遠心分離することにより除去した。非還元条件下で、SDS-PAGEによって、上清液がジスルフィド結合ポリペプチドを有することを判定した。製剤の生物活性は、BIAcore（商標）アッセイより測定された(実施例5)。
【０１８４】
上記の実施形態により濃縮された溶液は、1mL/minの流速でMono S HR 5/5 カラム(Pharmacia社製)に注入された。該カラムは、85% バッファーA (20 mM 酢酸ナトリウム、30%イソプロパノール、 pH 4.0)及び15% バッファーB(1M 塩化ナトリウムを含むバッファーA)の混合液で平衡化された。バッファー混合液の組成恒常を保つように、280nm波長での吸光度読取数値がベースラインレベルに達するまで同じ流速で該カラムを洗浄した。そして、20分間以上の線形勾配になるように、平衡状態で注入を続けて、50% バッファーA/50% バッファーBで終了させた。非還元条件下のSDS-PAGEと生物活性測定によると、生物活性ポリペプチドは、勾配開始から約9分後に溶出され、回収された。
【０１８５】
もう一つの実施形態において、該ポリペプチドは、実施例4Aで回収した細胞の封入体により調製された。室温で一晩に抽出され(pH 5の50 mM 酢酸ナトリウム、8 M 尿素、14 mM  ２−メルカプトエタノール)、水に対して徹底的に透析した後、該ポリペプチドは、流速1.8 mL/minで、1%酢酸又は5 mM塩酸によってSephacryl S-100 HRカラム(Pharmacia社製)により富化させて、リフォールディングして濃縮させた。最後に、FPLC (Fractogel EMD SO3- 650、 50 mM 酢酸ナトリウム、pH 5、30% 2-プロパノール)によって、0 〜1.5 Mの NaCl勾配で溶出された。適切な期間に溶出したポリペプチドを含む画分をプールした。水に対して透析した後、ポリペプチドは凍結乾燥されて、-20℃で保存された。ポリペプチドの純度は、クーマシーブリリアントブルー染色に伴って、SDS-PAGEにより分析された。
【０１８６】
もう一つの実施形態において、実施例4A各サンプルの細胞ペレット1ｇを、10 mM TRIS/HCl、150 mM NaCl、1mM EDTA、及び5 mM DTTを含む pH 8.0の 細胞破砕バッファー10-20 mLで再懸濁させ、装置(Misonix S4000)とEnhance Booster #1 probeを用いて、30 A(装置度盛)の条件で5分間、超音波細胞破砕処理を行った。必要に応じ、細胞ライセート混合物を遠心分離(18,000 x gで20分間遠心分離、又は15,000 x gで30分間遠心分離)により清澄化し、1 v/v % Triton X-100を含む10-20 mLの細胞破砕バッファーでペレットを数回洗浄し、上記のように10分間遠心分離した。細胞ライセートは、6 M尿素を含む100-200 mLの細胞破砕バッファーで溶解させて、上記のように10分間遠心分離させた。ポリペプチドを含む上清液は、更に精製するのために保存された。
【０１８７】
上記上清液は、リフォールディングバッファー(100 mL Tris/HCl pH 8.0、500 mM アルギニン-HCl、5 mM EDTA、25 mM Chaps、2 mM酸化型グルタチオン、及び1 mM 還元型グルタチオン)により溶解させた。室温で4-7日後、ポリペプチドは、FPLC (Fractogel EMD SO3- 650、 20mM 酢酸ナトリウム、pH 4-5、30% 2-プロパノール及び25 mM Chaps)によって、0 〜3 Mの NaCl勾配で溶出されて精製された。適切な期間に溶出したポリペプチドを含む画分をプールした。ポリペプチドの純度は、クーマシーブリリアントブルー染色に伴って、SDS-PAGEにより分析された。
【０１８８】
特定の実施形態において、実施例3に記載した一過性発現システムの共発現によって本開示のヘテロ二量体を調製することができる。且つ、該ヘテロ二量体を、培養培地から単離し、実施例5のアッセイでスクリーニングすることができる。
[実施例5] 生体外BIAcore（商標） アッセイ
【０１８９】
バイオセンサー実験。一つの実施形態において、BIAcore（商標） T100/T200装置((Pharmacia Biosensor AB社製)でマルチチャンネルモード（フローセル1+2+3+4を含むシリアル流路）により実験を行った。流量は10μl /分で、温度は25℃、データは2.5ポイント/sで記録された。アミンカップリングにより、センサチップCM5の4つ全てのセグメントを密度が2000 pg/mm2(2000共鳴ユニット)となるようにストレプトアビジン(Sigma社製)で被覆した。ActRIIBecd (10mg)及びamine-PEG3-Biotin (10 mg, 米国イリノイ州ロックフォード市Pierce社製) を200μlのH2Oに溶解させ、10mgのNaCNBH3を添加して、ビオチン化されたNaCNBH3を調製した。反応混合物を70℃で24時間加熱し、その後、さらに10mgのNaCNBH3を添加し、もう一度反応物を70℃で4時間加熱した。混合物を室温まで冷却した後、スピンカラム(分画分子量3000、molecular weight cut off、ＭＷＣＯ)で脱塩した。ビオチン化ActRIIBecdを収集し、凍結乾燥し、ストレプトアビジン(SA)チップの調製に使用した。アミノビオチニル化されたActRIIBecdを50-250共鳴ユニット(RU)の密度で、フローセル2-4に、10mM酢酸ナトリウム(pH 4.0)の中で20μmの濃度、5μL/分の流速で10分間固定化した。。保存されたポリペプチドをグリシンバッファー（100mlの水に 2.5gのグリシン、0.5gのスクロース、37m gのLグルタミン酸塩、10mgの塩化ナトリウム、10 mg のTween 80 を含む、ph4.5）に溶解して10 mg/mLの溶液を調製し、上記のグリシンバッファーで希釈して各濃度の分析物を調製した。分析物(前記ActRIIBecd 関連ポリペプチド、即ち、ドメイン)の流れが最初にフローセル1(コントロール)を通り、次いでフローセル2（ビオチン化ActRIIBecd）を通る間に、センソグラムを記録した。フローセル2に得られたセンソグラムから、フローセル1に得られたセンソグラムを減じた。
装置により供給されたプログラム(BIA evaluation 2.1; ソフトウェアハンドブック1995; Pharmacia  Biosensor AB)を用いて、1.11 nM、3.33 nM、10 nM、30 nM及び90nMの分析物で得られたセンソグラムの平衡結合、会合速度、及び解離速度を評価した。分析物及びウシ血清アルブミン(陰性コントロール)を表2に列挙した。上記のPerkin-Elmer ABI Automated DNA Sequencerを用いて、アルブミンよりも高い親和性を有する分析物に関連するクローンにおけるpQE-80L-Kana誘導体の配列決定(プライマー 5'-CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTG-3' (SEQID NO: 31))を行った。
【表２】
2019525767.tif 000004
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[実施例6] 組換えポリペプチドの製造
【０１９０】
親和性定数を向上させることができるか否かを判定するため、いくつかの修正を伴い、Atanassov et al. (2009, Plant Methods,5:14)に記載されたPCR-融合の手順を用いて表2の個々のドメインを互いに融合させ、組換えポリペプチドを製造した。Phusion DNAポリメラーゼ(フィンランドFinnzymes 社製)及び標準サーマルサイクラーを用いて、PCR-融合を行った。Gateway組換え反応をBP Clonase II及びLR Clonase II酵素混合物(Invitrogen)で行った。Nojima et al.(1990, Gene, 96 (1): 23-28)に基づいて、コンピテントE. coli DH5α 細胞を用意した。そして、QIAprep（商標） Spin Miniprep Kit 及びQIAquick（商標） Gel Extraction and PCR purification kits(ドイツQiagen社製)を用いて、プラスミドDNA及びPCR断片を精製した。
【０１９１】
DNA鋳型、PCRプライマー、及び得られた組換えポリペプチドのDNA/ポリペプチド配列を表3に示す。PCR融合は、プラスミド鋳型由来の2つ又は3つの並行PCR増幅を含む。これらの並列反応に得られたゲル精製PCRフラグメントで、シングルオーバーラップエクステンションによって、増幅したフラグメントのPCR融合を行った。ここで、Phusion DNAポリメラーゼガイドライン(NewEnglandBiolabs: Phusion（商標）High-Fidelity DNA  Polymerase. Manual) に従った反応混合物及び条件を使用した全てのPCR増幅は、サイクルパラメータが同一であった。プラスミドテンプレートのアニーリング温度は55℃であった。
【０１９２】
16 μlの2つのPCRフラグメント混合物（通常フラグメントが各8 μl、約200-800ng DNA）、6 μlの5× Phusion HFバッファー、3 μlの2 mM dNTP mix、0.3μlのPhusion DNA（商標）ポリメラーゼガイドライン(2 U/μl)を含む総量30 μlのオーバーラップエクステンション反応液を用いて、2つPCRフラグメントの融合を行った。オーバーラップエクステンション反応液にプライマーは添加されなかった。3つのPCRフラグメントを融合した場合には、18個のPCRフラグメント混合物（通常フラグメントが各6 μl）を使用した。一般には、正確なDNA濃度を確認することなく、等体積の精製されたPCR断片を使用した。増幅されたPCR断片のモル比が実質的に異なっていると思われる場合には（アガロース電気泳動後のDNAバンド強度の推定により5〜7倍を越える）、それに応じて増幅されたPCR断片の体積を調整した。反応液は、98℃で３０秒間、60℃で1分間、そして72℃で7分間反応させた。オーバーラップエクステンション反応後に得られたDNAを、PCR精製キットを用いて精製した。PCR産物は消化され、上記のタンパク質/ポリペプチド発現のためにpQE-80L-Kanaベクター中にクローニングされた。ActRIIBecdに対する精製されたタンパク質/ポリペプチドの親和性は、上記に開示したBIAcore（商標） T100/T200 (GE Healthcare)によって評価され、実施例5のBIAevaluation software ver. 4.1 (GE Healthcare)によって分析された。
【表３】
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【０１９３】
上記データは、下記の2つのクローンの組み合わせから形成された組換えポリペプチドの親和性定数(KD)が各単一クローンの個々のポリペプチドより低かったことを示した：クローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:188)、クローン番号10に作動可能に連結されたクローン番号15(SEQ ID NO:194)、クローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号15(SEQ ID NO:200)、クローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号21(SEQ ID NO:206)、クローン番号10に作動可能に連結されたクローン番号21(SEQ ID NO:212)、クローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:218 )、クローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:224)、クローン番号8に作動可能に連結されたクローン番号14(SEQ ID NO:230)、クローン番号8に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:236)、クローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:242)、クローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:248)、クローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号14(SEQ ID NO:254)。即ち、上記の組み合わせから生成した組換えポリペプチドはActRIIBecdに対して、クローン番号8(SEQ ID NO: 35)、クローン番号10(SEQ ID NO: 39)、クローン番号14(SEQ ID NO: 47)、クローン番号15(SEQ ID NO: 49)、クローン番号19(SEQ ID NO: 57)、クローン番号21(SEQ ID NO: 61)を含む各単一クローンから生成した個々のポリペプチドよりも高い親和力を有した。
【０１９４】
さらに、クローン番号8(SEQ ID NO: 35)、クローン番号10(SEQ ID NO: 39)、クローン番号14(SEQ ID NO: 47)、クローン番号15(SEQ ID NO: 49)、クローン番号19(SEQ ID NO: 57)、クローン番号21(SEQ ID NO: 61)から3つのクローンを組み合わせて組換えポリペプチドを生成した。驚くべきことに、下記の3つのクローンの組み合わせから形成された組換えポリペプチドの親和性定数(KD)は、単一クローンの個々のポリペプチド又は2つのクローンの組み合わせより低かった:クローン番号15及びクローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号10 (SEQ ID NO: 260)、クローン番号10及びクローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号15 (SEQ ID NO: 268)、クローン番号15及びクローン番号10に作動可能に連結されたクローン番号21 (SEQ ID NO: 276)、クローン番号10及びクローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号21 (SEQ ID NO: 284)、クローン番号14及びクローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:292)、クローン番号8及びクローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号14(SEQ ID NO:300)、クローン番号8及びクローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:308)、クローン番号14及びクローン番号8に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:316)、クローン番号14及びクローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:324)、クローン番号15及びクローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:332)、クローン番号19及びクローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:340)、クローン番号21及びクローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:348)。
[実施例7] 翻訳後修飾
【０１９５】
組換えポリペプチドのKD値に対する翻訳後修飾(PTM)の効果を検討した。PTMの一例はジスルフィド結合の連結である。ジスルフィド結合の位置と結合親和性の関係を示すデータは、表4に示された。該データは、PTMが組換えポリペプチドの対ActRIIBecd結合親和性に影響を与えることを示す。PTMアッセイは、以下の実験に従って実施された。
Ａ．酵素消化とジメチル標識化
【０１９６】
実施例4及び実施例6と同様にポリペプチドを調製した。標準タンパク質はSigma（米国ミズーリ州市セントルイス市）から購入した。必要に応じ、pH6の5 mM NEM (N-エチルマレイミド、Sigma)を含む100 mM酢酸ナトリウム(米国ニュージャージー州Phillipsburg市J. T. Baker社製)を使用して、室温で30分間遊離システインをブロックした。酵素消化は、1:50比率でトリプシン（ウィスコンシン州マディソン市Promega社製）により直接的に37℃で酢酸ナトリウム中で一晩行った。ジメチル標識化の前に、100 mM酢酸ナトリウム(pH 5) でタンパク質消化物を3倍に希釈した。
【０１９７】
特定の実施形態において、実施例4及び実施例6と同様に調製されたポリペプチドは、pH7の50 mM TEABC (重炭酸トリエチルアンモニウム, T7408, Sigma-Aldrich社製) バッファーで希釈されて、異なる酵素消化用の2管に分けられた。最初は、最終濃度の5mMとなるまでNEM(N-エチルマレイミド、E3876, Sigma-Aldrich社製)を添加して、遊離システインをブロックした。室温で30分間アルキル化反応を行った。NEMアルキル化した後、1管に1:65比率でトリプシン(V5111, Promega社製)を添加し、37℃で18時間反応し、そして37℃で一晩Glu-C (P8100S, New England BioLabs社製、1:50比率) 消化を行った。もう1管のチューブには、Glu-C (1:50比率) を添加し、37℃で18時間反応し、そして37℃で一晩キモトリプシン(1:50比率) 消化を行った。
【０１９８】
ジメチル標識化を行うために、50μLのタンパク質に2.5 μL の 4% (w/v) ホルムアルデヒド-H2(J. T. Baker社製)又は2.5 μL の 4% (w/v) ホルムアルデヒド-D2を添加して、そして2.5 μLの600 mMシアノホウ水素化ナトリウム(Sigma)を添加し、pH 5-6で30分間反応を行った。
B. 質量分析
【０１９９】
毛細管カラム(75 μm i.d.,長さ10cm、台湾Csun社製)を用いたCapLC systemを備えたESI Q-TOF (米国マサチューセッツ州ミルフォード町Waters社製)を使用して、、測量スキャン(MS, m/z 400-1600; MS/MS, m/z 50-2000)を行った。アルキル化及びジメチル標識化したタンパク質消化物は、45分間０．１％ギ酸に5%-50%のアセトニトリルを含有する直線勾配で、LC-MS/MS分析を行った。
【０２００】
特定の実施形態において、消化した及びジメチル標識化したタンパク質消化物は、Ultimate 3000 RSLCシステムに結合したQ-Exactive Plus質量分析システムにより分析された。液体クロマトグラフィー分離は、下記の勾配に従って、C18 カラム(Acclaim PepMapRSLC, 75 μm x 150 mm, 2 μm, 100 オングストローム)により行った。
2019525767.tif 000027
【０２０１】
m/z300-2000の範囲で全MSスキャンを行った。MSスキャンから強度が最も高い10個のイオンは、MS/MSスペクトラ用の断片化対象とされた。
C.データ解析
【０２０２】
MassLynx 4.0を用いて、生データからピークリストを生成した（30%減し、Savitzky-Golay平滑化、中心３チャネル80% 重心）比較的高い減算を用いてバックグラウンドノイズを除去した。真a1イオンをピークリストに残すため、真a1イオンは通常に主要なピークとして表される。
D.逆相クロマトグラフィー
【０２０３】
バイナリポンプを有するAgilent 1100 HPLCシステムに、UV検出器及びオートサンプラを装備した。75℃で操作されたZorbax 300SB C8 カラム(150 ± 2.1 mm，5 μm，300 オングストローム )に、タンパク質を注入した。流速は0.5ml/ minであった。移動相Ａは、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水であった。移動相Ｂは、70%イソプロピルアルコール、20%アセトニトリル、及び0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水溶液であった。10%Ｂの充填条件でサンプルを注入し、そして2分間19%Ｂまで増加させ。2分から1%Ｂ/ minの線形溶出勾配を開始して、24分で終了した。そして、95%Ｂで5分間カラムをフラッシュした。充填条件でカラムを平衡化した。この方法は、ジスルフィドアイソフォームを部分的に分離することを可能する。
【表４】
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【０２０４】
表4に示すように、異なるシステイン位置間にいるジスルフィド結合は、親和性定数(KD)値に影響を与える。二量体中の2つの組換えポリペプチドの間にいるジスルフィド結合がKDを著しく減少させることも、データに示された。言い換えると、二量体化が組換えポリペプチドの二量体とActRIIBecdとの体外分子結合を補助している可能性がある。
【０２０５】
いくつかの組換えポリペプチドが表4に記載の二量体を自発的に形成したことが観察された。すべての二量体蛋白は、実施例4Ｂに記載のゲル濾過によって組換えポリペプチド単量体から分画することが可能である。この実施形態においてモノマーが同じであるために、二量体蛋白はホモ二量体蛋白であった。他の実施形態において、実施例4に記載の安定的に形質転換されたE. coli細胞が、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348からなる群より選ばれる2つの異なる組換えポリペプチドを共発現する場合、二量体蛋白はヘテロ二量体蛋白になる。
[実施例8] アルカリホスファターゼ生理活性アッセイ
【０２０６】
既知のC2C12細胞におけるアルカリホスファターゼ誘導の分析によって、組換えポリペプチドについて細胞受容体に結合する能力及びシグナル伝達経路を誘導する能力を調査した。文献Peel et al. JCraniofacial Surg. 2003; 14:284-291 及びHu et al. Growth Factors 2004; 22:29033を参照)
【０２０７】
C2C12細胞(ATCC 受託番号 CRL-1772、米国バージニア州マナサス市)をコンフルエント前に継代し、1×105 cells/mLとなるように10%の熱不活性化ウシ胎児血清を添加したDMEMで再懸濁した。96ウェル組織培養プレート(Corning社製、 Cat #3595)に、ウェル当たり100μlの細胞懸濁液を播種した。段階希釈した標準液及びサンプルのアリコートを添加して、37℃且つＣＯ２ 濃度５％の条件で培養を維持した。サンプルは、馴化培地、精製された組換えポリペプチド、陽性対照としての市販の精製した組換えヒトBMP-2「rhBMP-2」（米国ミネアポリス市R&D Systems社製）を含む。Mundy GR., et al. (2004, GrowthFactors. 22 (4): 233-41)等の文献によって、rhBMP-2が骨及び軟骨の開発において重要な役割を果たすことが示された。陰性対照培養物(サンプル又はrhBMP-2が無添加の培地に細胞を培養した)は、2〜7日間培養した。培地交換を二日ごとに行った。
【０２０８】
収集された培養物を生理食塩水(0.90% NaCl, pH 7.4)でリンスして、その後リンス済の食塩水を破棄した。50 μLの抽出用液(Takara Bio, catalogue #MK301)を培養物に加えて、室温で10分間超音波処理行った。Peel et al. J Craniofacial Surg. 2003; 14:284-291の記載に基づいて、アルカリバッファー(Sigma-Aldrich, St. Louis Mo., catalog P5899)中のニトロフェノールリン酸塩の加水分解をモニターすることで、アルカリホスファターゼ活性(ALP)を分析した。また、アルカリホスファターゼ活性(ALP)の分析について、メーカーの指示に従ってTRACP & ALP assaykit (Takara Bio社製, catalogue #MK301)を使用することもできる。405 nmにおける吸光度を記録することでアルカリホスファターゼ活性を決定した。多反復サンプルの平均ALP活性により、1つの活性スコアを計算した。各組換えポリペプチドのEC50濃度を計算するために、段階希釈したサンプル試料とその関連活性スコアを4パラメーター曲線(4-parameter curve fit)で作成した。データは表5に示された。場合によって、各ウェル内の蛋白質含有量に対するALP活性は、Coomasie (Bradford) Protein Assay (Pierce Biotechnology Inc., catalogue#23200)の使用により正規化された。各ウェルのALP活性を蛋白質含有量で割ることにより、各サンプルの正規化したALP活性値を計算した。
【０２０９】
もう一つの実施形態において、Katagiri, T., et al. (1990, Biochem. Biophys. Res. Cornrnun. 172, 295-299)に記載したアルカリホスファターゼ活性分析を行う。1-mL 10%ウシ胎仔血清を添加したBME-Earle培地にいる1 x 105 cells/mLのC3H10T1/2細胞株マウス繊維芽細胞を、24ウェル培養プレートに37℃且つＣＯ２濃度５％の条件で24時間培養した。上清液を除去し、様々な濃度のサンプルを有する新鮮な培地1-mLを添加した。さらに4日間培養した後に、0.2 mLのバッファー(pH 9.6の0.1 M グリセロール、1 % NP-40、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2）で細胞を溶解して、基質として150μLの0.3mM p-nitrophenyl phosphate含むバッファー(pH 9.6)を用いて、50 μLの澄清ライセートアリコートでアルカリホスファターゼ活性をを決定する。37℃で20分間培養後に、405 nmにおける吸光度を記録する。活性は、各サンプルにおける蛋白質含有量(BCA protein assay, Pierce Chemical Co.)に関連する。
【表５】
2019525767.tif 000040
2019525767.tif 000041
2019525767.tif 000042
2019525767.tif 000043
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【０２１０】
表5に示すように、特定のジスルフィド結合を有する組換えポリペプチドの大部分は、rhBMP-2よりも低いEC50値を有する。即ち、特定のジスルフィド結合を有する組換えポリペプチドの大部分は、骨若しくは軟骨の形成又は骨形成(osteogenesis) に関連するシグナル伝達経路を誘導し得る。
【０２１１】
[実施例9]体内骨誘導活性
ウサギの尺骨軸欠損に対して、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(すなわち、分子内ジスルフィド結合C44-C48を有するSEQ ID NO: 260)を2つ有するホモ二量体蛋白の骨誘導活性、及び多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体としての評価を評価した。リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は0.4〜1.65である
【０２１２】
メスウサギ（ＮＺＷ種、日本エスエルシー株式会社）40匹の外科的に露出された右尺骨及び左尺骨の軸に、20 mmの円周状の欠損（すなわち、欠損部位）が形成された。併用麻酔は、簡潔に言えば、塩酸ケタミン(ケタラール、第一三共製)とキシラジン(Selactar 2%注射溶液, Bayer Medical製)を 3：1の割合で併用して行った。長時間の手術の追加麻酔でも同一溶液を使用した。術前に、抗生物質としてFlumarin (flomoxef sodium、シオノギ製薬)を皮下投与した。前腕の全領域の毛皮は、電動シェーバで剃毛され、ヒビタンアルコールで消毒した(0.5%  グルコン酸クロルヘキシジン−エタノール溶液, 大日本住友製薬株式会社)。各尺骨の肢の尾側正中部において、縦方向の切開を形成した。筋肉組織を上げて尺骨を露出させた。メス(25mm)で露出した尺骨の手関節からマークを作成した。直径15mmのドリルを用いて、骨を破壊しないように注意しながら、縦方向及び垂直方向に適切な孔をマークに穿孔した。骨鉗子（luer bone rongeurs）で骨を分割した。近位方向に20mm離れた所にもマークを作成し、同様に分割した。分割の際に、尺骨を覆う骨膜を除去して、骨片を生理食塩水で充分に洗浄した。
【０２１３】
下記表6に示されたグループＡ−Ｇのいずれかに従って、各尺骨はそれぞれのインプラントを受容した（又は受容しなかった）。グループＡ−Ｄの尺骨は、特定量のホモ二量体蛋白を担持するβ−ＴＣＰのインプラントを1つ受容した。グループEの尺骨は、β−ＴＣＰのみのインプラントを1つ受容した。グループＦの尺骨は、自体移植片を1つ受容した。グループＧの尺骨は、インプラントを受容しなかった。その後、筋肉及び皮膚組織を迅速に縫合した。
【表６】
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【０２１４】
グループＡ−Eで使用されたβ−ＴＣＰは、1-3 mmの顆粒の形態であって、空孔率が75%且つ孔径が50μm〜350μmであった(骨移植片代用品Superpore（商標）、ＰＥＮＴＡＸ、HOYA株式会社)。
【０２１５】
もう一つの実施形態において、グループＡ−Eで使用されたβ−ＴＣＰは、1-3 mmの顆粒の形態であって、空孔率が70%以上且つ孔径が300μm〜600μmであった(骨移植片代用品Wiltrom、台湾ウィルトロム)
【０２１６】
グループＡ−Ｄの組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白（即ち、SEQ ID NO: 260）は、各動物に移植直前に塩酸0.5m (注射溶媒で希釈した標準溶液、大塚製藥)を用いて冷凍ロットから調製された。片側移植に対する流体容積を180μlに設定して、滅菌されたペトリ皿内の200mgのβ−ＴＣＰ顆粒に均一に滴下した。流体の滴下が完了した後に、スパチュラでβ−ＴＣＰ顆粒を穏やかに攪拌し、そして室温で15分間以上静置した後に移植した。
【０２１７】
グループＦについては、骨鉗子（luer bone rongeurs）を使用して、腸骨の右翼又は左翼のいずれかから自体移植片を得た。骨はチップに加工されて、グループＡ−Eと同じ量で移植された。
Ｘ線による評価
【０２１８】
移植直後、及び移植後8週間後まで２週に一度、横方向及び正面のx線画像（即ち、放射線写真)を撮影した。放射線写真を用いて移植位置の状態及び骨形成の程度を評価した。各グループのx線画像の代表例は、図1Ａ（グループＡ−Ｄ）及び図1Ｂ（グループＥ−Ｇ）に示された。
【０２１９】
2週間後、全てのグループにおいて、インプラント材料の顆粒のコントラストと受容床（recipient bed）の境界とのコントラストが、明確に見られた。4週間後、ホモ二量体蛋白グループ（即ち、グループＡ−Ｄ）のＴＣＰ顆粒が不鮮明になって、前記顆粒の吸収及び骨形成の進行を示した。また、ホモ二量体蛋白投与量が高いグループＣとＤにおいて、いくつかのサンプルの移植位置と受容床との境界が不鮮明になった。6週間後、グループＢにいる移植位置と受容床との境界が不鮮明になった。また、グループＣ及びＤのいくつかのサンプルにおいて、受容床連続性及び骨形成の向上が観察された。8週間後、グループＡとＢにおいて、受容床にいる境界が更に不鮮明になった。グループＣにおいて、受容床連続性及び骨形成が向上した。6週間後の図に示すように、グループＤにおいて、尺骨欠損の領域に再構成が観察された。
【０２２０】
TCPのみを有するグループＥにおいて、骨形成は経時的に観察された。しかし、残ったＴＣＰ顆粒が8週間の時点でも明確に見られ、軸における不十分な骨形成及び劣悪な連続性が示された。
【０２２１】
自体移植片を有するグループＦにおいて、骨形成の進行は経時的に観察され、且つ、受容床との融合は8週間で達成された。しかし、形成均一ではなかった。
【０２２２】
欠損のみを有し、移植片の無いグループＧにおいて、橈骨にわずかな骨形成が観察されたが、欠陥の修復はそれ以外には全くなかった。
コンピュータ断層撮影(CT)走査
【０２２３】
移植直後、移植後４週間後、及び移植後8週間後に、CT走査を用いて1mm間隔で軸配向を行った。主に移植位置の画像を撮影した。代表例として、移植位置の中心の横断面画像経時変化は、図2A（グループＡ−Ｄ）及び図1Ｂ（グループＥ−Ｇ）に示された。
【０２２４】
ホモ二量体蛋白を有するグループ（即ち、グループＡ−Ｄ）について、移植直後に明確に見られる顆粒が、移植後４週間後横断面断面画像において部分的に分解し、骨形成を示唆した。投与量が60 μgであったホモグループＤついて、骨形成の更なる進展が観察され、また、いくつかのサンプルに骨髄腔の形成が観察された。8週間後、投与量が6μg以上であったグループにおいて、骨髄腔及び骨皮質の形成の進行が観察された。TCPのみを有するグループＥにおいて、顆粒の凝集塊は8週間後も残っていた。自体移植片を有するグループＦにおいて、8週間後に、再構成の進行のような骨髄腔の形成が観察された。欠損のみを有するグループＧにおいて、わずかな骨形成しか観察されなかった。
捻り強度測定
【０２２５】
移植8週間後のウサギを安楽死させ、インプラント材料を除去し、各グループの尺骨から橈骨を分離して、捻り強度測定を行った。測定については858 Mini Bionix II (MTS Systems Corporation)を使用して行った。50mm長の領域で試験を行った。具体的には該領域は、中央の尺骨軸における20mm長の再構成領域、及び再構成領域の基端側と遠位側の両方における15mm長の領域であった。各辺の端部を歯科用樹脂で固定した。樹脂部分を測定装置内にチャックした。失敗した時の最大トルク（torque）を決定するため、30°/分の回転速度で、左尺骨を反時計回りに回転させ、右尺骨を時計回りに回転させた。。別々に得られた健全なウサギの尺骨に対しても試験を行い比較した。該健全な尺骨は日本白色種ウサギから得られたものであり、グループＡ−Eで使用されたものとは異なるタイプであった。ただし、該日本白色種ウサギは26週齢（安楽死の際に）の雌であったため、グループＡ−Eとは同じ年齢及び性別であった。
【０２２６】
捻り強度測定によって得られた各グループの最大トルクは、図3に示された。ホモ二量体蛋白を有するグループＡ−Ｄにおいて、最大トルクは、投与量依存的に高くなった。
【０２２７】
TCPのみを有するグループEに比べ著しく高い測定値が、投与量が2μg以上のホモ二量体蛋白を有するグループＡ−Ｄに見出された。
【０２２８】
無傷の尺骨、自体移植片又はホモ二量体蛋白を有するグループ間では、著しい相違は観察されなかった。
【０２２９】
グループＥ及びＧにおいて、骨形成が不十分であったため、橈骨が分離された後、いくつかのサンプルでは確実な支持を確保することが困難であった。そのため、サンプルについて、グループＥでは2つのみ、グループＧでは4つのみのサンプルが測定で用いられた。一方で、グループＡ−Ｄ及びＦについて、使用したサンプルは6つであった。
【０２３０】
下記の表7に示されたように、本試験とKokubo et al., Biomaterials 24:1643-1651 (2003)の記載における同じ動物モデルを使用したCHO-derived BMP-2に対する評価間で、試験条件及び結果を比較した。Kokubo et al.,による報告と比べ、本研究はより大きな骨欠損、より少ない投与量の活性剤、捻り強度測定前により短い移植持続時間などのより困難な条件で行った。しかしながら、この研究において、尺骨の修復が成功したことが示されており、且つ最大トルクは類似していた。
【表７】
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組織評価
【０２３１】
全ての動物について、4週間後と8週間後の標本を作成した。剖検の際に得られた組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に保存し、10%EDTAで脱灰した。その後、組織をパラフィンで包埋した。橈骨の長軸に平行する平面に薄切片サンプルを作成し、ヘマトキシリン‐エオジン（HE）で染色し、組織評価した。骨形成及び受容床との融合を判定した。
【０２３２】
ホモ二量体蛋白を有するグループＡ−Ｄにおいて、4週間後、骨形成は小柱パターンで進んだ。高い投与量のホモ二量体蛋白を有するサンプルには活発な骨形成が観察された。投与量が60μgであったグループＤにおいて、著しく大量の新しい骨及び血管新生が観察された。投与量が低いグループＡ及びＢにおいて、残存材料が観察されたが、グループＣ及びＤにおいてはほとんど観測されなかった。グループＡ及びＢにおいて、いくつかのサンプルの受容床との境界付近には、軟骨形成が観察された。全てのサンプルにおいて、受容床は小柱パターンで新たに形成された骨に直接接続した。投与量が2μgであったグループＡにおいて、小柱パターン及び残存材料は、8週間後も観察された。受容床との境界付近に軟骨も観察された。再構成が不十分であっても、骨形成の進行が観察された。いくつかのサンプルにおいて、橈骨の中には骨皮質の形成が観察された。投与量が6μg以上であったグループＢ―Ｄにおいて、骨皮質及び骨髄は再構成により形成された。投与量がより高いグループにおいて、進展がより著しく、また、受容位置における連続性も向上した。
【０２３３】
TCPのみを有するグループEについて、橈骨におけるインプラント材料上の骨形成は観察されたが、残存材料は8週間後も明確に見られたため、軸の不十分な骨形成及び劣悪な連続性が示された。
【０２３４】
自体移植片を有するグループＦにおいて、良好な骨形成が４週間後に観察され、新しい骨は受容床と接触していた。受容床との境界付近には軟骨形成が見られた。8週間後、新しい骨の再構成及び骨皮質の形成ついての進展が観察されたが、残った移植骨の断片も観察された。
【０２３５】
欠損のみを有するグループＧにおいて、骨形成は橈骨のみに観察され、且つ、欠損の修復は達成されなかった。
[実施例10]ヒツジ脊椎後側方固定研究
骨誘導活性
【０２３６】
ヒツジ脊椎後側方固定モデルにおいて、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド("Rcp")を有するホモ二量体蛋白(即ち、分子内ジスルフィド結合C44-C48、C80-C112、及びC79-C114を有するSEQ ID NO: 260)の骨誘導活性、及び多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体材料としての評価を評価した。リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は1.2〜1.8である。
【０２３７】
ヒツジ脊椎後側方固定モデルについて、Zoletil（商標） (8-12  mg/kg, IM)で鎮静させたヒツジと、ガス化イソフルオラン(2%)及び酸素(1分間当たり2リットル)を使用した。気管内チューブを動物に挿入しガスを通して、イソフルオラン(2-3%)及び酸素(2-4リットル/分)で麻酔を維持した。抗生物質(Keflin（商標）: 1 gm IV; Benacillin 5 ml IM)を与えた。手術前にカルプロフェン(NSAIDの一種である、4 ml IM)及びTemgesic（商標） (Burprenorphine 0.324 mg SC)を注射した。必要に応じて手術前及び手術中に、晶体輸液を静脈内に投与した。
【０２３８】
L3-L4レベルに15cmの正中切開を腰部横突起と平行に形成させた。後腹膜鈍解剖により腰部脊椎の前外側面を露出した。これによって横隔膜が邪魔されない状態にした。軟組織は後退した。空気バー(pneumatic burr 、Midas Rex)を使用して、全ての動物のレベルの間の横突起(側部15 mm)及び隣接する椎体を皮質剥離した。
【０２３９】
下記表8に示された各グループの条件に従って、横突起及び隣接する椎体の皮質剥離された表面(傍脊柱床、paraspinal bed)の間にインプラント材料を置いた。グループ1−3は、特定量のホモ二量体蛋白を担持するβ−ＴＣＰのインプラントを1つ受容した。グループ4は、ホモ二量体蛋白のないβ−ＴＣＰだけのインプラントを1つ受容した。グループ6は、陽性対照として、特定量のrhBMP-2という確立骨誘導因子を有する吸収性コラーゲンスポンジ(ACS) のインプラントを1つ受容した。グループ5は、骨自体移植片を1つ受容した。自体移植片は、自体移植片グループの動物の腸骨稜から収集された。骨鉗子を用いて骨を粉砕（morcelized）して、5.0 gの移植骨を融合の各辺に使用した。2-0縫合糸で切開を閉鎖して、3-0縫合糸で付近の皮膚を閉鎖した。
【表８】
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【０２４０】
グループ1−4に使用したβ-TCPは、2-4 mmの顆粒の形態であって、空孔率が70%以上且つ孔径が50-350μmであった(骨移植片代用品Superpore（商標）、ＰＥＮＴＡＸ、日本HOYA株式会社)。
【０２４１】
特定の実施形態において、グループ1−4に使用したβ-TCPは、2-8 mmの顆粒の形態であって、空孔率が65%以上且つ孔径が250-730μmであった(骨移植片代用品Osteocera、台湾ウィルトロム)
【０２４２】
グループ1では、10mgのホモ二量体蛋白を有する各バイアルに2mlの注射水を添加することによって、Rcpを含むホモ二量体蛋白保存液Ｈ(すなわち、SEQ ID NO: 260)を調製した。3:1の容積比率で保存液Ｈと注射水を混合して、ホモ二量体蛋白高投与量溶液(10.5mgホモ二量体タンパク質を含有する2.8ml溶液)を作った。2.8mlのホモ二量体蛋白高投与量溶液は、3.5gβ-TCP顆粒に均一に滴下することにより送達された。
【０２４３】
グループ2では、10mgのホモ二量体蛋白を有する各バイアルに4mlの注射水を添加することによって、ホモ二量体蛋白保存液ML(2.5 mg/ml)を調製した。1:1の容積比率で保存液MLと注射水を混合して、ホモ二量体蛋白中投与量溶液(3.5mgホモ二量体タンパク質を含有する2.8ml溶液)を作った。2.8mlのホモ二量体蛋白中投与量溶液は、3.5gβ-TCP顆粒に均一に滴下することにより送達された。
【０２４４】
グループ3では、10mgのホモ二量体蛋白を有する各バイアルに4mlの注射水を添加することによって、ホモ二量体蛋白保存液ML(2.5 mg/ml)を調製した。17:3の容積比率で保存液MLと注射水を混合して、ホモ二量体蛋白低投与量溶液(1.05mgホモ二量体タンパク質を含有する2.8ml溶液)を作った。2.8mlのホモ二量体蛋白低投与量溶液は、3.5gβ-TCP顆粒に均一に滴下することにより送達された。
【０２４５】
グループ6は、市販品Infuse（商標）及びMastergraft（商標）(二者ともメドトロニック社製)をグラフト材料として比較するために行った。Infuse（商標）は、CHO発現システムより用意したrh-BMP及び吸収性コラーゲンスポンジ(ACS) からなる。Mastergraft（商標）は、85% β-TCP及び15%ヒドロキシアパタイトからなる粒状リン酸カルシウム骨代用品である。Infuse（商標）とMastergraft（商標）を組み合わせて使用することが腰部後側方固定に対して効力を示すことは、E. Dawson et. al.のエビデンスレベル2を有する臨床研究に報告されている(J Bone Joint Surg Am. 2009; 91: 1604-13)。グループ6のインプラント材料は、各位置に3.15 mg rh-BMP-2、4cc ACS、5cc Mastergraft（商標）を含み、インプラント材料調製の手順についてはE. Dawsonの報告に従った。Infuse（商標）及びMastergraft（商標）のロット番号は、手術記録に記録された。
【０２４６】
手術後最初の7日間、動物を毎日モニターし、観察結果を各動物の手術後のモニタリングシートに記録した。
【０２４７】
4週間後、全ての動物の前後方向(posteroanterior)の放射線写真を撮影した。該動物はZoletil（商標） (8-12  mg/kg, IM)で鎮静させて、イソフルオラン(2%)と酸素(2リットル/分)でガス麻酔した。新しい骨の存在及びTCP材料の吸収について、放射線写真と術後のx線写真とを比較した。手術後12週後、全ての動物を、致死量のLethabarbの心臓注射で犠牲にした。
【０２４８】
骨形成の時点をモニターするために、下記表9に示された3つの時点に3つの異なる蛍光色素を静脈内に注射した。
【表９】
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Ｘ線による評価
【０２４９】
腰脊椎(L1-L6)を採取し、デジタルカメラを用いて撮影した。採取された脊椎を、Faxitron（商標） Machine (24 kV で45秒間に設定した)で照射した。後前方（posterior-anterior 、PA）に撮ったデジタル放射線写真を、右側及び左側の3名盲検観測者によって、新しい骨の形成及び融合についてのエビデンスを等級付けした。定性的採点システムを用いて、放射線写真を評価した（表10）。融合は、1つの横突起がら次のレベルまての骨の連続パターンによって評価した(0=非連続、1=連続)。融合塊の各側の横突起の間にある骨の量は、表10が概要したようにパーセンテージに基づいて等級付けされた。TCP再吸収量は、同じ量の材料を有する0時点の放射線写真との比較に基づいて記された。
【表１０】
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【０２５０】
手術後、4週間後及び12週間後で且つ採取前に、全ての動物の前後方向の放射線写真を撮影した。各グループの代表的なX線イメージは、図4〜図9に示された。グループ1、2、3、4、5、6の手術後X線イメージにおいて、顆粒は明らかであった。4週間後の時点において、グループ1、2において見える顆粒はほとんどなかったが、存在を記すことができる。グループ3、4には明らかな顆粒がより多く見られた、グループ6には残りの細粒又は顆粒が明確に示された。12週間後、グループ1、2、3において、細粒又は顆粒は骨と区別ができなかった。グループ4において、少量の骨形成と不鮮明な細粒が示された。グループ6において、12週間後もまだ細粒が明らかであった。
【０２５１】
放射線写真を3名盲検観測者によって評価した。等級付けは、融合の二項評価と、融合塊にいる骨の量の5級評価を含んだ。結果は表11に示された。各動物の個体等級の平均値を先に計算して、そして各グループの平均値及び標準偏差を計算した。
【表１１】
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[実施例11] In  Vivoイヌ分節性尺骨欠損研究
【０２５２】
イヌ分節性尺骨欠損モデルにおいて、実施例6に従って製造した組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白(Hp) (即ち、分子内ジスルフィド結合C44-C48、C80-C112、及びC79-C114を有するSEQ ID NO: 260)の骨誘導活性、及び多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体材料としての評価を評価した。リン酸カルシウム担体（即ち、β−ＴＣＰ）のカルシウム/リン比は約0.7〜約1.5であり、β−ＴＣＰ空孔率が70％以上であって、孔径が300μm〜600μm程度であった。
実験計画
【０２５３】
この研究のプロトコルは、日本獣医生命科学大学動物実験委員会によって認可された。動物実験は、米国国立健康研究所（National Institutes of Health）の実験動物の管理と使用のためのガイドラインに従って行った。8匹のイヌの15本の前脚に、2.5-cmの重症サイズ分節性尺骨欠損を形成させた。全てのケースにおいて、切除された尺骨の直径は7-8mmであり、骨切断された尺骨の体積は、約0.96-1.26 cm3であった。各欠損部位に、ホモ二量体蛋白と共に700mgの人工骨（β−ＴＣＰ）を移植した。ホモ二量体蛋白の量（0、35、140、560、又は2240μg）は、5つの実験グループにより異なる（それぞれ対照、Hp35、Hp140、Hp560及びHp 2240であった）。各グループは3つの前脚から成る。手術後、１週間おきに放射線検査行い、また、4週間おきに (CT) コンピュータ断層撮影を行った。
【０２５４】
代替的な実施形態において、各欠損部位に、ホモ二量体蛋白と共に800mgの人工骨（β−ＴＣＰ）を移植した。ホモ二量体蛋白の量（160、480、640、又は1600μg）は、4つの実験グループにより異なる（それぞれHp160、Hp480、Hp640及びHp 1600であった）。各グループは3つの前脚から成る。手術後、１週間おきに放射線検査行い、また、4週間おきに (CT) コンピュータ断層撮影を行った。
インプラント材料の調製
【０２５５】
インプラント材料は、ホモ二量体タンパク質及びβ-TCP(日本東京都、HOYA株式会社) から構成された。凍結乾燥したホモ二量体蛋白粉末を、使用前に滅菌蒸留水(日本東京都、大塚製薬)で水戻させた。移植前に、4分の1の量のホモ二量体蛋白を含有する0.63mlの滅菌蒸留水に、室温で700mgのβ-TCP(約1.89ml)を浸漬した。対照としては、0.5mlの純蒸留水に浸された700mgのβ-TCPを用いた。個々のβ-TCP顆粒は直径が2-4 mmであって、連通する多孔質構造(孔径50-300μm、空孔率75%)を有する。顆粒のこのサイズは、操作及び緊密な移植のために最も便利である。
【０２５６】
実験の前に実施されたパイロット研究の結果に基づいて、インプラント体積、β-TCP顆粒のサイズ、及びホモ二量体蛋白溶液の体積を選択した。β-TCP顆粒のインプラント最大体積は800mgに決めたが、個体間のばらつきのため、この研究には700mgのβ-TCPを使用した。さらに、本発明者らのパイロットデータは、1.0gのβ-TCP顆粒が1.0mlの蒸留水を吸い込めることを示した。残留液体の蓄積を回避するために、1.0gのβ-TCP顆粒当たりに0.9mlのホモ二量体蛋白溶液を使用した。700mgのβ-TCP顆粒当たりに0.63mlのホモ二量体蛋白を含有する滅菌蒸留水を処理した。
動物モデル
【０２５７】
この研究で使用した全ての8匹のイヌは、体重が9.5〜11.3の健康な1歳メスビーグルであった。イヌをプロポフォール(7 mg/kg)の静脈内注射により麻酔して、挿管後、酸素中のイソフルラン(1.5-2.0%)で麻酔を維持した。犬が全身麻酔された間、それらの前脚を用意し、無菌環境下でドレープ(drape)した。側面の皮膚を縦方向に切開し、外側趾伸筋（lateral digital extensor muscle）と外側尺骨筋（ulnaris lateralis muscle）の間にいる軟組織を分けて、尺骨及び骨間靭帯を露出させた。振動鋸（oscillating saw）を使用して、骨間靭帯から遠位側に2.5cmの分節性骨骨膜欠損を形成させた。骨欠損周辺の骨膜を完全に除去して、β-TCPを緊密に移植した。欠損の縦方向の長さは、垂直方向の長さの約3倍であって、自発的に治癒しない重症サイズ欠損を代表した。β-TCP顆粒を移植した後、3-0吸収性モノフィラメント縫合糸を用いて筋肉を縫合した。3-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を用いて、皮膚を閉鎖じた。手術前及び手術後のブプレノルフィン(0.02mg/kg)皮下投与により、周術期の鎮痛を維持し、且つ、手術後3日間は、1日に2回投与した。手術から7日後、25mg/kgのアンピシリンを1日に2回経口投与した。
X線及びCT検査
【０２５８】
手術前、手術直後、及び手術後のそれぞれにおいて、12週間に１週間の割合で犬の前脚の側面視X線を撮影した。前脚と共にアルミニウム板(25mm×74mm)を露光することにより、各x線画像における倍率及びコントラスト差を標準化した。再生された骨の幅は、中央部分で測定された。
【０２５９】
再生骨の横断面面積及びミネラル密度を測定するために、手術の直後、及び手術後4、8、12週間後、全身麻酔下でCTイメージング(Asteion、日本栃木東芝医療システム社)を行った。検査には多面再構成(MPR)モードを使用した。25個の1mm厚のスライスを、正確に位置合わせして欠陥において再構成し、且つ、第13スライスを、測定用の対象センタースライスとして定義した。ウィンドウ幅及びウィンドウレベルは、1500及び300HU（ハウンズフィールド単位)に設定された。横断面面積は、再生骨の輪郭を手動で囲むことによって測定した。定量CT (QCT)を用いて、横断面内の骨ミネラル密度を測定した。QCTは、骨組織の立方センチメートル当たりのヒドロキシアパタイトのミリグラムを推定する体積法である。スライス厚さを1mmに維持して、前脚と共に校正ファントムを走査した。再生骨の中心及び校正ファントム(B-MAS200、日本京都科学)に、特定された関心領域(ROI、直径=5.5mm)における平均CT数値(HU)を決定して、続いて平均骨ミネラル密度を算出した。
【０２６０】
結果を平均(SD)で示した。二元配置反復測定分散分析を用いて、異なるホモ二量体蛋白投与量処理の効果を調査した。テューキー=クレーマー（Tukey-Kramer）のテューキーの事後検定 (post hoc test)により、平均間の差異を分析した。有意性の閾値は、Ｐ<0.05と定義された。
【０２６１】
図10a-yは、各グループにおける術後の変化を示す放射線写真である。手術後1週間後、2ケース（Hp 2240及びHp 560処理グループからそれぞれ1ケース）のみにおいて、放射線不透過カルス線（radiopaque callus lines）がドナー部位の周りに示された。手術後2週間後、Hp2240及びHp560処理グループにおけるすべてのケースにおいて、顕著なカルス形成が観察された。前者において、塊状カルスは不規則な外形を有し、尺骨の遠位部分及び近位部分を亘った(図10b)。後者において、放射線不透過カルス線は、ドナー部位の周りに観察された(図10g)。Hp140グループからの1つのケースにおいて、わずかな放射線不透過カルス線がドナー部位の周りに示された。Hp35及び対照グループにおいて、カルス形成は観察されなかった(図10q、10v)。
【０２６２】
手術後4週間後、Hp2240及びHp560処理グループの全てのケースは、放射線不透過性のよく区別し得るカルス形成を有し、且つ、インプラント材料と宿主骨との間の境界線がほとんど不鮮明となった。また、両方の処理グループの全てのケースにおいて、インプラントの粒度が消えた(図10c、10h)。Hp2240のケース間のカルス拡張領域は、Hp560よりも大きかった。Hp140グループにおいて、1ケースのみにおいて、わずかなカルス形成がインプラント材料の周りにみられた。しかし、全てのケースにおいて、インプラント材料の粒度は消えていた(図10m)。Hp35グループにおいて、カルス形成は観察されず、且つ、2つのケースのみ、インプラント材料の粒度が消えていた(図10r)。対照グループの全てのケースにおいて、中央領域には可視的な変化は観察されなかったが、ミネラル密度のわずかな減少が移植材料の近位部分及び遠位部分に見えた。これらのケースにおいて、近位尺骨と移植材料との間の隙間の広がりも観察された(図10w)。
【０２６３】
手術後8週間後、Hp2240及びHp560グループにおいて、再構成が進行し、カルスの外形が宿主骨の形状に合わせて変化した(図10d、10i)。Hp2240グループにおいて、2つのケースにおける近位側及び全てのケースにおける遠位側で、再生骨と宿主骨との間の境界線が消失した(図10d)。Hp560グループにおいて、全てのケースの遠位側だけで、境界線が消失した(図10i)。Hp140グループにおいて、1つのケースのみ遠位側の境界線の消失を示したが、他の全てのケースでは、骨の両側によく区別し得る隙間線を有した(図10n)。Hp35グループにおいて、いずれかの側にも、再生骨と宿主骨との間の接続がなかった(図10s)。対照グループにおいて、β-TCP顆粒が再吸収され、放射線透過領域が顕著に増加した(図10 x)。
【０２６４】
手術後12週間後、Hp2240グループの全てのケースはより大きく広い骨再生(図10n)を示した。2つのケースにおいて両側における再生骨と宿主骨との間の放射線透過境界線が消えたが、1つのケースにおいて、わずかな境界線が近位側に残っていた。Hp560グループの全てのケースにおいて、境界線は遠位側で消失した（図10j）。近位側には狭い境界線があったが、カルスで覆われていた。再生骨の幅は、尺骨の近位端の幅よりも大きかった（図10j）。Hp140グループの1つのケースにおいて、遠位側の境界線は消失したが、近位側には残っていた。また、他の2つのケースの両側において、境界線があった（図10ｏ）。再生骨の幅は、尺骨の近位端の幅の以下であった（図10ｏ）。Hp35グループにおいて、再生骨が宿主骨に接続したケースはなく、且つ、全てのケースにおいて、可視できる放射線透過隙間線は骨の両側に沿っていた（図10t）。再生骨の幅は、尺骨の近位端の幅よりずっと小さかった（図10t）。対照グループのドナー部位において、骨組織は再生しておらず、且つ、β-tcp顆粒はさらに前回の検査より再吸収された（図10y）。
[実施例12] 羊椎体間融合モデルにおける体内骨誘導活性
【０２６５】
羊の椎体間融合モデルにおいて、実施例6に従って製造した組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白(即ち、分子内ジスルフィド結合C44-C48、分子間ジスルフィド結合C79-C114及びC80-C114を有するSEQ ID NO: 260)の骨誘導活性、多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体材料としての評価、PEEKケージの収容体（accommodator）として評価を評価した。リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は約0.7〜約1.7であった。
術前準備
【０２６６】
標準的な操作手順に従って、手術のための動物(種：Ovis Aries；品種：Border LeicesterMerino Cross；供給者：UNSW approved supplier - Hay Field Station, Hay, NSW；購入は動物の管理及び倫理委員会（UNSW Animal Care and Ethics Committee）によって認可された；年齢：4歳齢；性別：メス、即ちEwe）を用意した。手術の24時間前に、右前脚（左前脚は静脈内輸送に使用した）に経皮フェンタニル張り付け剤(100mg - 2mcg/kg/hr)を用いて、先制の鎮痛を与えた。用いる前には、十分な吸収を確保するためにウールをクリップし、皮膚をアルコールスワブ（alcohol swabs）で清潔した。動物は手術前に最低12時間以内絶食・断水させた。
手術
【０２６７】
この研究に割り当てられたヒツジは、手術の日にランダムに選択された。ヒツジが選択されると、番号を割り当て、標準的な操作手順に従って耳にタグを付けた。識別番号を、研究記録に記録した。
【０２６８】
手術の日及び開始前に、研究獣医は各動物を検査し、疾患又はこの研究の目的若しくは実施を妨げる可能性がある状態にないことを確認した。各動物の状態及び内含させたもの対しての適合性を、動物番号に対応して研究記録に記録した。
【０２６９】
標準的な操作手順に従って、手順において動物を導入し、麻酔し、維持し、モニターした。左前脚は頭部静脈内接続のために使用された。ハルトマン溶液（Hartman’s solution）を静脈投与する前に、標準的な操作手順に従って、手術前分析のために血液を採取した。血液サンプルに対して、研究ID、動物番号及び日付と共に「PRE-OP」を付し、ルーティン生化学(4ml)及び血液学(4ml)のためにIDEXX Australiaへ送った。
【０２７０】
手術は、標準的な手術手順の変更されたバージョンに従って実施された。
手術手順-L45 XLIF及び椎弓根スクリュー
【０２７１】
手術の前に、全ての動物を48時間食制限(NPO)し、隔離用ペン管理施設内に収容した。麻酔薬の投与及び全身麻酔の導入に続いて、後腰部領域、腸骨稜及び近位脛骨を無菌的に用意した。
移植片混合手順
【０２７２】
0.3mlの蒸留水にホモ二量体蛋白(10 mg/vial)を溶解して、33.3 mg/mLのHP保存液Ａを調製した。椎体間ケージ内に一塊のβ-TCP(約150mg) を配置した。各グループにおいて、滅菌されたペトリ皿に置いたβ-TCP(約150mg) の塊に、HP保存液Ａから希釈し又は取った「HP溶液」を均一に滴下し通させた。液体を完全に滴下した後、移植前に該β-TCPの塊を室温で15分以上放置した。
【０２７３】
グループA-Fは、β-TCP担体と結合した上記ホモ二量体蛋白を移植材料として使用した。部位あたりのホモ二量体蛋白投与量は、表12に示された。混合手順の調製は以下の通りであった。
【表１２】
2019525767.tif 000051
【０２７４】
Hp 4mg/部位のグループAでは、10mgのホモ二量体蛋白を有する各ガラスバイアルに0.3mlの注射水を添加することによって、Hp保存液A(33.3 mg/mL)を調製した。Peekケージ内に一塊のβ-TCP(約150mg) を置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Aを送達した。
【０２７５】
ホモ二量体蛋白 2mg /部位のグループBでは、水とHp保存液Aを1：1体積比で混合してHp保存液B (16.7 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Bを送達した。
【０２７６】
ホモ二量体蛋白 1mg /部位のグループCでは、水とHp保存液Bを1：1体積比で混合してHp保存液C (8.3 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Cを送達した。
【０２７７】
ホモ二量体蛋白 0.5mg /部位のグループDでは、水とHp保存液Cを1：1体積比で混合してHp保存液C (4.2 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Dを送達した。
【０２７８】
ホモ二量体蛋白 0.1mg /部位のグループEでは、水とHp保存液Cを1：4体積比で混合してHp保存液C (0.8 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Eを送達した。
【０２７９】
ホモ二量体蛋白 0 mg /部位のグループFでは、β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いて、150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlの水を送達した。
椎体間Peekケージ
【０２８０】
適切な脊柱レベルを同定するために横突起を触診した。該レベルを、蛍光透視法によって検証した。L4及びL5椎体にカスパルピン（Caspar pins）を置き、カスパルレトラクター（Caspar retractor）を使用して椎間板腔を伸延した。鋭利な切開、キュレット及び用意した終板によって、椎間板を除去した。椎間板腔に、移植材料で充填された椎間体装置を配置し、リトラクタを解放した。軟組織を再並置し、層で皮膚を閉鎖した。
【０２８１】
椎体間ケージの外観は、図11に示された。
椎弓根スクリュー
【０２８２】
XLIF完了後、動物を腹臥位に再配置し、無菌技術を用いてドレープして、L3-S1レベルの中心を越えた背下部中央線に初期皮膚切開を形成した。必要に応じてコブエレベータ及び電気焼灼を使用して、L45ファセット及び横突起を露出させるように、神経弓に沿って矢状面で鈍的解剖を行った。そして、レベルに椎弓根スクリュー及びロッドを挿入した。
【０２８３】
移動式x線機械((POSKO)及びデジタルカセット(AGFA)を使用して、手術直後に前後方向で放射線写真を撮影した。DICOMフォーマットでデータを保存し、ezDICOM医療ビューアソフトウェアを使用してJPG画像へ輸出した。標準的な操作手順に従って行った。
手術後のモニター
【０２８４】
最初の7日間毎日動物をモニターし、記録した。研究の間、獣医技術者が毎日少なくとも1回動物を検査し、毎週記録した。技術者によって確認した健康上のいずれかの懸念を、獣医スタッフに報告し、PIによって更に評価し管理した。
【０２８５】
標準操作手順に従って、ヒツジの各試験部位をモニターした。手術後初週の毎日及びその後は1 週 1 回、手術切開、食欲、皮膚及び毛の変化、目及び粘膜、呼吸系、循環系、姿勢/歩容、行動パターン(トレモス(tremors)の発生、痙攣、過剰な唾液分泌、及び無気力)をモニターした。その後モニターされた兆候は機敏さ/注意力、食欲、手術部位、目の外観、歩行、及び頭部を上げさせる能力であった。介在の基準は感染症の兆候であった。
【０２８６】
動物は、術後の最初の3日間、抗生物質(Kelfex)及び鎮痛薬(ブプレノルフィン, 0.005-0.01 mg/kg IM)を経口投与された。術後の最初の7日間は、毎日神経学的評価を行った。その後、臨床的モニターに基づいて、術後疼痛軽減を提供した。
外植体
【０２８７】
指定された時点で、標準的な操作手順に従って誘導し麻酔する前に、各動物の所有する識別番号を確認した。
【０２８８】
麻酔導入後、標準的な操作手順に従って、頚静脈又は頭静脈のいずれかから血液を採取した。サンプルに研究番号、動物番号、及び日付を付した。サンプルは、密封されたバイオハザードバッグ中でSORLに輸送され、30℃未満に維持され、ルーティン生化学(4mls)及び血液学(4mls)のためにIDEXX Australiaへ送られた。輸送時間をノートに記載した。
【０２８９】
麻酔されている間に、標準的な操作手順に従って、Lethobarbの致死量の注射により動物を安楽死させた。死体を30℃未満に維持して、直ちにSORLへ輸送した。
【０２９０】
標準的な操作手順に従って各動物を検査し、解剖した。腰部脊椎を採取し、デジタルカメラを用いて撮影した。手術部位に副作用及び感染の兆候について検査し、結果を記録し、撮影した。
【０２９１】
収穫直後に、すべての動物(12週間)において、手の触診によって融合塊の安定性を評価した。訓練され、経験を持った2人の盲検観測者の力を合わせて、無傷又は除去されたままの椎弓根ロッドと共に、融合塊の横曲げ及び屈曲−伸展を評価した。
【０２９２】
左右側の横曲げ及び処理されたレベルの屈曲−伸展についての手の触診評価によって、融合(剛体、動きがない)又は未融合(非剛体、動きが発見さた)で等級付けした。左右側の横曲げ及び屈曲−伸展の手の触診評価において、未処理レベルの可動性を相対的な比較として用いた。
運動範囲(ROM)の測定
【０２９３】
脊椎から慎重にL45セグメントを採取した。4mm×15mmのスクリューを椎体に挿入し、試料のポッティングを助けるように使用した。
【０２９４】
ROM評価用の樹脂中にセグメントを慎重にポッティングした。Denso Robotで屈曲−伸展(FE)、横曲げ(LB)、軸回転(AR)の運動範囲を決定した。ロッドは、測定前に除去された。FE、LB、AR中の脊椎に7.5Nmのピュアモーメントを適用し角変形生成し、測定装置で記録した。各負荷プロフィールを3回繰り返し、図12に示す各処理されたレベルのFE、LB、ARの平均値を求めた。下記に概説するように、融合の一方の側のパラフィンヒストロジー、もう一方の側のPMMAヒストロジーを機械測定した後、サンプルをリン酸バッファーホルマリンで固定した。ROMデータは、SPSSを用いてANOVAで分析した。
【０２９５】
表13に示されるように、手動触診によって、0.5mg未満の投与量について、セグメントは非剛体運動を示したが、0.5mg以上の投与量及び自体移植片について、セグメントは剛体運動を示した。
【表１３】
2019525767.tif 000052
【０２９６】
図12に示すように、各処理の軸回転の運動範囲はほとんど変化しなかった。しかしながら、無傷と比べれば、全ての処理の屈曲−伸展は減少したが、ホモ二量体蛋白投与量が増えるに伴い、安定性の向上傾向が示された。自体移植及び1.0mgホモ二量体蛋白が、最も同等であった。全ての処理において横曲げも減少し、無傷の値の<50%までになった。横曲げについても、ホモ二量体蛋白投与量が増えるに伴い、ROMが減少することが示された。投与量の影響は0.1mg-0.5mg段階で最も顕著であった。
マイクロコンピュータ断層撮影−脊椎
【０２９７】
Inveon Scanner (米国Siemens)を用いてマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を行った。すべてのスキャンにおいて、スライス厚さを約50ミクロンに設定した。CTスキャンをDICOMフォーマットで保存した。アクシャル、コロナル及びセジタル面を検査して、それらに基づいて3次元モデルを再構成した。追加分析のために、DICOMスタックを研究スポンサーに送った。
【０２９８】
各動物のアクシャル、コロナル及びセジタル画像並びに前後の3Dモデルを提供した。処理されたレベル間の融合を検査するために、コロナル及びセジタル面を再検討してmicro-CT再構成を評価した。訓練され、経験を持った2人の盲検観測者は、全体micro-CTスタックを検討する同一の放射線写真採点スコア(表14)を用いて、処理グループに対して等級付けした。定性的にレベルの骨の量を表す1〜4のスケールで、各融合を等級付けした：1:25%、2:26-50%、3:51-75%、4:76-100%。
【表１４】
2019525767.tif 000053
【０２９９】
3つの直交するの面及び3次元モデルの前後の像において、各動物のmicro-CTの代表的な画像を用意した。3つの面における脊柱融合の高解像度放射線画像を得るために、Siemens Inveon体内マイクロコンピュータ断層撮影スキャナを用いてすべての動物にマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を行い、放射線撮影した。これは、標準的な操作手順に従って実施された。また、500ミクロン加算画像技術（500 micron summation image technique）を使用して、加えてより厚い再構成を行って検査した。なお、3D再構築を再検討して全体的な融合状態を評価し、全ての動物のレポート及び付録に代表的な画像を提供した。これは、いくつかの変更を伴って標準的な操作手順に従って実施された。セジタル及びコロナル画像を再検討して、表14に基づいて、全体的に融合を等級付けした (図13-図15参照) 。
融合の等級付け
【０３００】
0 Hp mg/部位において、残留TCP及び終板にあるいくつかの骨形成が示された。0.1 Hp mg/部位において、新生骨が生成し、最小限の残留TCPは示されたが、堅い骨ブリッジは示されなかった。0.5 Hp mg/部位において、良好な骨質が生成されたが、移植片内には多少の透き線が存在した。1.0 Hp mg/部位及び2.0 Hp mg/部位の投与量において、最小限の透き領域を伴って、良質な骨がケージ間空間を充填した。4.0 Hp mg/部位において、体積に基づいて高等級な骨が生成されたが、骨の中には、いくつかの大小の空洞を含む透きがあった。自体移植（腸骨稜）において、かなり良い又は良好な骨の形成や、非癒合領域もみられ、不定の結果が示された。下表において、各部位の等級をサマライズした。
【０３０１】
マイクロCT分析に基づた融合等級付けは、表15に示された。全体の骨等級及び融合等級について、1.0及び2.0mg Hpがピークであった。骨等級は、定性的に骨の量（1:25%、2:26-50%、3:51-75%、4:76-100%）を表す1〜4のスケールで等級付けされた。融合等級は、0-3(0-新生骨なし、1-新生骨の形成が見られが、連続的な骨なし、2-透きを伴った可能な融合3-ブリッジ骨を伴った確実な融合)で付けられた。
【表１５】
2019525767.tif 000054
[実施例13] コントロールドリリース系(Controlled Release System)製剤(ダブルエマルション法/塩基性物質/親水性薬物)
【０３０２】
一つの態様において、2.5 mLのジクロロメタン(Merck)に溶解した0.25gのPLGA(乳酸/グリコール酸比65/35、MW 40000-75000, Sigma-Aldrich)をシェーカーで5分振盪(1000 rpm)して、10% PLGA溶液 (10%油相溶液)を形成した。2.5 mLの二重蒸留水(DDW)と10%のPLGA溶液とを混合し、1000rpmで15分間攪拌して、第1エマルジョン(w/o)を形成した。第1エマルジョンを10 mLの0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)MW ~130000,Fluka) 第2水油相溶液に添加し、500rpmで攪拌し、5分間排気して第2エマルジョン(w/o/w)を形成した。2エマルジョンを4時間連続的に攪拌した後、1分間放置した。4000rpmで5分間遠心分離することにより、ペレット中の粒子を収集した。5mlのDDWで数分間粒子を洗浄した。3回遠心分離し洗浄した後、遠心分離した粒子を収集し、3日間凍結乾燥してPLGA微粒子を形成した。2mg及び/又は4mgのβ−ＴＣＰ粉末(Sigma-Aldrich)と50μLのDDWと10 μgの実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(即ち、SEQ ID NO: 260)を有するホモ二量体蛋白(Hp)を混合して、スラリー(Slurry)を形成した。スラリーと50mg  PLGA微粒子とを混合し（又は表面に塗布し）、3日間凍結乾燥してPLGA微粒子をコントロールドリリース系として形成した。特定の実施形態において、凍結乾燥したコントロールドリリース系を押圧して、平坦な片を形成することができる。
【０３０３】
代替的な実施形態において、2.5 mLのジクロロメタンと乳酸-グリコール酸共重合体
(PLGA、65:35、Sigma製)とを混合し、5分攪拌(1000 rpm)して、10%油相溶液(P1)を形成した。P1に0.25mlの二重蒸留水(DDW) を添加し、15分間攪拌(1000 rpm)して、第1エマルジョン(w/o、P2)を形成した。10 mLの0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA,MW ~130000,Fluka)にP2を入れ、4時間攪拌(500 rpm)した(P3)。P3を4000rpmで5分間遠心分離した後、上清液を除去し、残った溶液を収集した。P3に5mlのPBSを添加し、3回繰り返し、残った溶液を回収後、凍結乾燥した。PLGA微粒子の凍結乾燥粉末を秤量し、産率(%)を計算した。0.06mlのDDWと2mgのβ−ＴＣＰ粉末(Sigma-Aldrich)とを混合し、20 μgのホモ二量体蛋白をβ−ＴＣＰに添加して5分間攪拌した。その後、50mgのPLGA微粒子を該混合物中に添加し、均一に攪拌した。該微粒子を凍結乾燥し、押圧してΦ10 mmサイズの錠剤を得った(適当な圧力は5~10kg)。
【０３０４】
場合によっては、2mg及び/又は4mgのβ−ＴＣＰ粉末を4mgのリン酸三カルシウム(TCP)又は1mgのアルファ-リン酸三カルシウム(α-TCP)に置換することができる。特定の実施形態において、PLGA65/35をPLGA50/50、ポリ乳酸(PLA) 又はポリグリコール酸(PGA) に置換することができる。
PLGA/Hp-β-TCPから放出したホモ二量体蛋白(Hp)の評価
【０３０５】
1 mLのヒト血清に100mgのPLGA/Hp-β-TCPを浸漬し、37℃に60rpmで振盪した。放出したホモ二量体蛋白を含むヒト血清溶液を1時間、1日目、2日目、3日目、7日目、10日目、14日目の各時点で収集し、800μlの新鮮なヒト血清に置換した。収集したヒト血清を-80℃で保存し、direct ELISAアッセイですべてのサンプルを同時に分析した。
【０３０６】
β-TCP及びホモ二量体蛋白で被覆されたPLGA微粒子の放出プロフィールは、図16a及び16bに示された。PLGA微粒子の表面に物理的に吸着したホモ二量体蛋白が、拡散及びPLGA水解によってin-vitro溶液に連続的に放出することが示された。ELISAキットから得た結果によって、15分及び1時間において、17%及び31.5%の相対量のホモ二量体蛋白が放出された。ホモ二量体蛋白の相対的な放出百分率は、14.5%(60分から1日目まで)、14.3%(1日目から2日目まで)、7.6%(2日目から3日目まで)、9.3%(3日目から7日目まで)、5.4%(7日目から10日目まで)、0.4%(10日目から14日目まで)であって、徐放性パターンを示していた。PLGA/Hp-β-TCPの該配合は、急激放出の共通課題を軽減した[Giteau et al., Int J Pharm 350:14 (2008)]；大部分の送達システムは、最初の数時間の間に急激に放出して送達し、封入された/表面結合された製品の60%以上を放出することが多い。[Woodruff et al., J Mol Histol 38:425 (2007) and Sawyer et al., Biomaterials 30:2479 (2009)].
【０３０７】
図17は、電子顕微鏡によるPLGA微粒子の形態及び直径分布を示す。PLGA微粒子は球状であり、直径分布の範囲が100μm〜150μmであった。
【０３０８】
もう一つの実施形態において、20mLのジクロロメタンに2gのPLGAを溶解して、10% PLGA/DCM溶液を形成した。水中に二相リン酸三カルシウム（ＢＣＰ）を分散させて、水相溶液を形成した。水相溶液とPLGA/DCM溶液とを混合し、マグネチックスターラーで30分間攪拌してエマルションを形成した。そして、造粒機にエマルションを供給し、スプレー造粒法を行ってPLGA微粒子を形成した。
Balb/Cマウス骨壊死モデルにおけるPLGA/Hp-β-TCPの新骨形成の評価
手術手順
【０３０９】
動物骨壊死モデルにおいて、現実の骨壊死状況を模擬するために、全脛骨骨膜を剥離した。長さ2mmのマウスの右側の脛骨の中軸を鋸で切り出し、液体窒素を用いて骨の切断面を凍結し、壊死性骨を模擬した。そして、該フラグメントを逆にして脛骨の元の部位に戻し、髄内固定として注射針(No. 26)を用いて、両端を脛骨の他の部分に固定した。骨折の周りに試験品を配置した後、絹縫合糸で創傷を閉鎖した。マウスを、壊死性骨対照(C)、PLGA/β-TCP(PT)、PLGA/0.2 μg Hp-β-TCP (POT-0.2)、PLGA/0.8 μg Hp-β-TCP (POT-0.8)、 PLGA/1.6μg Hp-β-TCP (POT-1.6)及びPLGA/3.2 μg Hp-β-TCP (POT-3.2)を含む6つのグループに分けた。各グループにいる3〜6匹のマウスを、手術後4週間観察した。
軟Ｘ線観察
【０３１０】
操作後の4週間、軟Ｘ線(SOFTEX, Model M-100, Japan)によって、43 KVP、2 mA に1.5 sの条件で、脛骨骨折を放射線的に検査した。観察期に適切な倍率を使用し、得られた顕微鏡写真において、全ての担体と対照との間で比較した。
【０３１１】
異なるホモ二量体蛋白用量を含有するPLGA/Hp-β-TCPの移植後4週間のマウス脛骨骨壊死断片カルスの形成のx線写真を、対照(C)又はPLGA/β-TCP (PT)グループと比較して、図18に示した。対照グループにおいて、不完全な融合が認められた。PTグループにおいて、小さな隙間が存在していた。POT-0.2、POT-0.8、POT-1.6、及びPOT-3.2グループにおいて、明瞭な融合塊は観察された。該結果は、PLGA/Hp-β-TCPグループにおける骨修復の効能が対照及びPTグループよりも高かったことを示した。
骨組織の組織学的分析
【０３１２】
組織化学分析を同時に用いて、骨組織における微視的な変化を評価した。ヘマトキシリン‐エオジン（H&E）染色の前に、0.5% EDTAを用いて骨組織の全てのサンプルを脱灰した。得られたサンプルをパラフィンワックスに包埋し、5μmの切片を用意した。H&Eで切片を普段染色し、顕微鏡で観察した。400Xの倍率で、カルス領域と対照グループとを比較した。
【０３１３】
図19に示すように、PLGA/Hp-β-TCP (POT)の移植後4週間後、新生骨の形成を評価した。対照グループと比較すると、PLGA/β-TCP(PT)の骨形成速度はほぼ同様の結果を示した。PT及び対照グループと比較すると、POTグループにおける骨形成速度は増強され、POT-3.2用量を除いて依存的増加した。該結果は、Balb/Cマウス骨壊死モデルにおける骨再生を誘導し得るホモ二量体蛋白コントロールドリリース担体の潜在的な利点を示した。
[実施例14]持続放出系パテの調製
【０３１４】
表16の式に従って、粉末を混合して調製した。4℃で粉末を一晩保存した。パテを調製した日に、すべての材料（即ち、粉末、β-tcp、グリセロール及び脱イオン水）をUV光で20分間照射した。2x0.5x0.5cmの動物実験骨欠損範囲に応じるように、表16に示した式に従って、約0.9gのパテ重量を調製した
【表１６】
2019525767.tif 000055
【０３１５】
式A：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに160マイクロリットルの0.125mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させた。
【０３１６】
式B：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0.5mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させた。粉末及び液体(表16の式B)と予め調製したβ-TCPと一緒に混合して成形した。
【０３１７】
式C：粉末及び液体(表16の式C)を均一にに混合した。
【０３１８】
式D：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0. 25mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させてHp/β-TCP顆粒を形成させた。粉末及び液体(表16の式D) を一緒に混合してマトリックスを形成し、マトリックスを特定の形状に成形した。Hp/β-TCP顆粒は、マトリックスの外層に均一に分散された。
【０３１９】
式Ｅ：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0.5mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させてHp/β-TCP顆粒を形成させた。粉末及び液体(表16の式Ｅ) を一緒に混合してマトリックスを形成し、マトリックスを特定の形状に成形した。Hp/β-TCP顆粒は、マトリックスの外層に均一に分散された。
【０３２０】
式Ｆ：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0. 25mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させてHp/β-TCP顆粒を形成させた。粉末及び液体(表16の式F) を一緒に混合してマトリックスを形成し、マトリックスを特定の形状に成形した。Hp/β-TCP顆粒は、マトリックスの外層に均一に分散された。
【０３２１】
式G：粉末及び液体(表16の式G)を均一にに混合した。
サンプルの調製
【０３２２】
表16に示した式パテを15mlの管に入れた。Hpに浸漬したβ-TCPを含み又は含まないパテを3mlのヒト血清中に置いて、37℃で5%CO2下で静置した。放出したHpを含むヒト血清溶液を1時間、1日目、2日目、3日目、7日目、10日目、14日目、21日目の各時点で収集し、2500μlの新鮮なヒト血清に置換した。収集されたヒト血清を-80℃で保存し、1日以内にdirect ELISAアッセイですべてのサンプルを同時に分析した。
OIF定量
【０３２３】
ホモ二量体蛋白の総濃度を定量するために、インビトロ放出試験を採用した。ELISA法（米国inVentive Health臨床システムから得ったアッセイ）を用いてヒト血清中のホモ二量体蛋白の濃度を定量した。製造業者の指示に従って行った。簡潔に言えば、I07捕捉抗体(株式会社ファーマフーズ製)がコーティングした96ウェルプレートに、サンプル、QCサンプル、標準サンプルを添加した。インキュベーション及び未結合物質を除去後、HRP-I07検出抗体を添加した。この工程に続いて、さらなる洗浄工程及び基材とのインキュベーションを行った。色反応を停止させ、適切な波長で吸光度を測定した。ホモ二量体蛋白の濃度を、標準偏差の非線形回帰から算出した。
【０３２４】
目的は、ベタ-TCP又はパテなどの生体再吸収性骨伝導性複合体からのホモ二量体蛋白の放出を評価し、その骨再生の適合性を分析する。式Aから放出されたホモ二量体蛋白について、図21に示すように、開始時の急激放出プロフィール及び急激放出（0-1時間程度）後の徐放性パターンが観察された。式Aと比較すると、式B及びCにおけるホモ二量体蛋白はパテ又はマトリックスで巻かれたため、開始時には放出できなっかた。これに対して、β-TCPに含まれるホモ二量体蛋白がパテ又はマトリックスの表面に分散した場合（例えば、式D）において、持続放出効果が達成された。パテは、骨再生を促進する能力を有する骨移植代用品であったことがわかった。パテの組成は、可塑性、硬化性、治癒を決定する。そのため、調製式の異なる割合、例えば、パテを調製するための硫酸カルシウム二水和物又は硫酸カルシウムの選択は、剤形の持続放出を達成することができる。
【０３２５】
骨代替材料の開発は、生体吸収性、骨伝導性、骨誘導性、及び生体適合性である材料に向かって傾向する。換言すれば、複合性骨欠損充填材料の開発の方向は、多機能性の材料である。設計されたパテにおいて、骨細胞の内部成長のために骨代替物中に細孔を生成することができ、且つ、材料分解の遅い過程において、破骨細胞の誘導及び骨細胞(osteocytes)の活性化のために、ホモ二量体蛋白の放出を長期間に亘ることもできる。そのため、骨欠損の治癒を効果的に促進することができる。
[実施例15] 臨床試験デザイン
試験デザイン1
【０３２６】
骨移植を必要とする開放脛骨骨折の治療において、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(即ち、SEQ ID NO: 260)を有するホモ二量体蛋白(Hp)/ β-TCPの3つの投与レベルの有効性及び安全性について、ランダム化盲検評価比較試験行って調査する。約35人の初期開放脛骨骨折(Gustilo type IIIA 又はIIIB) 患者を該試験に参加させ、４つのグループと1つの対照グループ（約5人の患者）にランダムに分けた。各グループは、約10人の患者を含む（下記参照）。1つのバイアルには、5.5mgのホモ二量体蛋白の凍結乾燥した粉末を含む。水戻し（所望濃度を得るために使用した水の確かな量は、表17に記載された）後、水戻したホモ二量体蛋白とβ-TCPとを混合して、最終濃度が1.5 mg/g (グループ2)、2m g/g (グループ3)、又は3 mg/g (グループ4)であるHp/β-TCPを作成し、骨折が発生した後3ヶ月以内、所定量のこれらの混合物を骨折部位に与えた。対照グループ(グループ1)の患者は、ホモ二量体蛋白又はβ-TCPを欠いた自体骨移植片を受容する。有効性及び安全性のために、被験者に対して30週間の主要試験期間に経過観察し、また、安全性のために期間延長し、決定的治療後の52週間まで経過観察した。場合によって、使用するβ-TCPの総量は、医師の判定及び調整に基づいて決定する。
【表１７】
2019525767.tif 000056
患者の算入/除外基準
【０３２７】
以下の包含基準の全てが当てる場合には、被験者を算入する。
【０３２８】
被験者は20歳以上である;
【０３２９】
非出産可能、若しくは術前72時間の妊娠テストに陰性結果を有する女性、又は男性;
【０３３０】
初期開放脛骨骨折(Gustilo type IIIA又はIIIB)、且つ、骨折の3ヶ月以内の骨移植;
【０３３１】
両側開き脛骨骨折では、ランダム治療を右脛骨に指定する;
【０３３２】
初期傷害後3ヶ月以内に決定的治療を行う;また、
【０３３３】
出産可能な女性被験者（外科的に滅菌されていない、又は閉経となってから1年経っていない）及び男性被験者の出産可能な伴侶は、試験期間中に医学的に許容される避妊方法を使用することに同意しなければならない。医学的に許容される避妊方法は、ホルモンパッチ、移植若しくは注射型子宮内装置、又は二重バリア法(泡状又は膣殺精剤を有するコンドーム、殺精剤を有するダイアフラム)を含む。完全な禁欲は、許容可能な避妊方法と考えることができる。経口避妊薬は、研究の前に対して許容可能な避妊方法であるが、研究中には代替的な方法が必要とされる。
【０３３４】
以下の除外基準のいずれかが当てる場合には、被験者を除外する。
【０３３５】
初期の意識損失を有する頭部損傷;
【０３３６】
骨折からの膿排出、又は活性な骨髄炎の徴候;
【０３３７】
コンパートメント症候群;
【０３３８】
病理性骨折、ページェット病若しくは他の骨芽腫の病歴、又は異所性骨化症の病歴;
【０３３９】
骨形成に影響を及ぼす内分泌又は代謝障害(例えば、副甲状腺若しくは甲状腺機能の低下症若しくは亢進症、腎性骨異栄養症、エーラス・ダンロス症候群又は骨形成不全症) ;
【０３４０】
異常な腎臓及び/又は肝機能を有し、通常値の上限の5倍のクレアチニン又はALT値を有する;
【０３４１】
この5年以内に悪性腫瘍、放射線治療、又は任意の悪性腫瘍のための化学治療の病歴;
【０３４２】
自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス又は皮膚筋炎);
【０３４３】
以前のrhBMP-2への暴露;
【０３４４】
モノクローナル抗体、ガンマグロブリンなどのタンパク質医薬品及びリン酸三カルシウムに対する過敏性;
【０３４５】
移植手術の28日以内にの任意の試験中治療法を用いた治療;
【０３４６】
7日間以上のプレドニゾン (6ヶ月以内の累積用量>150mg、又は等量の他のステロイド、Appendix 1参照)又はカルシトニン(6ヶ月以内)を用いた治療。ビスホスホネート(30日間以上、12ヶ月以内)を用いた治療、治療用量のフッ化物(12ヶ月以内に30日間);
【０３４７】
授乳期の女性被験者；及び
【０３４８】
医師の判断に基づいて、該試験の参加に適さない任意の状態。
有効性の評価
主要エンドポイント：
【０３４９】
主要試験有効性エンドポイントは、決定的な創傷閉鎖後30週間以内に二次介入を受けた被験者の割合。
副次エンドポイント：
【０３５０】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、42週間、52週間以内に二次介入を受けた被験者の割合;
【０３５１】
決定的な創傷閉鎖から二次介入までの時間;
【０３５２】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、30週間、42週間、52週間以内に臨床骨折治癒の速度;
【０３５３】
決定的な創傷閉鎖から臨床骨折治癒までの時間;
【０３５４】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、30週間、42週間、52週間以内に放射線的な治癒;
【０３５５】
決定的な創傷閉鎖から放射線的な治癒までの時間;
【０３５６】
「二次介入」という用語は、骨折治癒を刺激する可能性を有する手続き又は事件の発生を指す、これらに限定されるものではないが、骨移植、釘交換(exchange nailing)、プレート固定、ネイルダイナマイゼーション(nail dynamization)、超音波、電気刺激、磁場刺激、又は治癒を促進する他のことを含む。
【０３５７】
「臨床骨折治癒」という用語は、骨折部位に手動の触診の下で柔らかさ(tenderness)の欠如を意味する。場合によって、「臨床骨折治癒」という用語は、体重負荷の下で、骨折部位において疼痛の欠如又は軽度であること(疼痛スコア0-3)を意味する。疼痛を、視覚的アナログスケールを用いて記録した。
【０３５８】
「放射線的な治癒」という用語は、前後方向及び横方向の放射線写真のビューについて、試験者及び/又は独立の(independent)放射線科医により、4つの皮質において、3つの皮質に皮質ブリッジ及び/又は骨折線の消失が確認された状態を指す。
評価方法
安全性評価方法
【０３５９】
有害事象(Adverse effect、AE)：タイプ、重症度、管理とアウトカム。
【０３６０】
系統的有害事象(Systematic AE): 因果関係を問わず、任意の系統的なサイン、症状、疾患、臨床試験結果、X線所見、又は治療後発生した若しくは悪化した生理的な所見。
【０３６１】
局部有害事象(Local AE):炎症、感染(軟組織若しくは骨において、疑似若しくは確認された表在性若しくは深部の感染、細菌学的確認を有するか又は有しない)、ハードウエア障害、疼痛(新規又は増加)、末梢浮腫、異所性骨化症/軟組織石灰化、及び創傷治癒に関連する合併症。
有効性評価方法
【０３６２】
主要よび副次有効性のアウトカムを、最大の解析対象集団(Full Analysis Set、FAS)及び治験実施計画書に適合した対象(Per Protocol、PP)集団に基づいて分析した。FAS集団おいて主要分析を行った。
【０３６３】
主要有効性エンドポイントは、決定的な創傷閉鎖後30週間以内に二次介入を受けた被験者の割合であった。FAS集団において、コクランアーミテージの傾向検定(Cochran-Armitage trend test)によって主要分析を行って、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。治験実施計画書に適合した対象集団において、主要有効性エンドポイントのために支持分析(supportive analysis)を行った。
【０３６４】
加えて、以下のように副次有効性のエンドポイントを分析又はサマライズする。
【０３６５】
コクランアーミテージの傾向検定によって、決定的な創傷閉鎖後30週間以内に臨床骨折治癒を有する被験者の割合と放射線的な治癒を有する被験者の割合を別々に比較し、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。
【０３６６】
決定的な創傷閉鎖から二次介入までの時間、決定的な創傷閉鎖から臨床骨折治癒までの時間、決定的な創傷閉鎖から放射線的な治癒までの時間の評価を、記述統計(平均、SD).使用して、グループごとに別々にサマライズした。
【０３６７】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、42週間、52週間以内に二次介入を受けた被験者の割合、臨床骨折治癒であった被験者の割合、放射線的な治癒であった被験者の割合を記述統計(n、%).使用して、グループごとに別々にサマライズした。適用可能の場合は、single binomial proportion のために、Clopper-Pearson正確信頼区間（CI）に基づいて、各グループの95%CIを計算した。
試験デザイン2
【０３６８】
腰部椎体間融合のための後方開放アプローチを使用する単一レベル(L1-S1の間)の変性椎間板疾患(DDD)患者において、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(即ち、SEQ ID NO: 260)を有するホモ二量体蛋白(Hp)/ β-TCPの3つの投与レベルと、ケージ及び後方追加固定と組み合わせて、その有効性及び安全性について評価するランダム化盲検評価比較試験。24人の被験者を4つのグループ(1つの対照グループと3つの異なる投与量のグループ)にランダムに分けた(1:1:1:1)。各グループの治療のための臨床試験調査装置は以下の通りである。
【０３６９】
対照グループ（6人の被験者）: 標準治療(ケージを有する腰部椎体間融合のための後方開放アプローチ)及び自体骨移植片移植(β-TCP有し又はない)。
【０３７０】
1mg Hp/部位（6人の被験者）: 標準治療及び部位当たり1mgのホモ二量体蛋白
【０３７１】
2mg Hp/部位（6人の被験者）: 標準治療及び部位当たり2mgのホモ二量体蛋白
【０３７２】
3mg Hp/部位（6人の被験者）: 標準治療及び部位当たり3mgのホモ二量体蛋白
【０３７３】
ホモ二量体蛋白として、注射用水と共に5.5 mgのHp/バイアル凍結乾燥粉末を供給する。水戻し後、最終濃度が1mg、2mg、3mgHp/部位になるようにホモ二量体蛋白とβ-TCPとを混合した。ケージの中に、使用したケージの大きさによって決定した所定量の混合物を与えた。
【０３７４】
ホモ二量体蛋白を、3つの異なる濃度の保存溶液となるように水戻し（所望濃度を得るために使用した水の確かな量は、表18に記載された）。ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)ケージウィルコム、xxxシリーズ)において、必要とされた0.24mlの各保存溶液とブロックβ-TCPとを混合した。
【０３７５】
DDD部位に与えたホモ二量体蛋白の最終濃度は1.0; 2.0;3.0 mg Hp/部位であった。
【０３７６】
ホモ二量体蛋白の保存溶液: 5.5(mg) /1.32 (ml) = 4.2 (mg/ml)
【０３７７】
ホモ二量体蛋白の最終濃度(mg)/部位: 4.2 (mg/ml) ×0.24 (ml) = 1.0 mg
【表１８】
2019525767.tif 000057
【０３７８】
自対移植片の供給源は、後上腸骨棘(PSIS)又は後椎弓切除から得った骨の破片(bone chips)とすることができる。自体移植片の量が不十分の場合は、自体移植片とβ-TCPと混合することができる。局所移植及び後方追加固定に伴った片側又は両側の後側融合(1側又は２側とすることができる)は、試験者の判断に基づいて全てのグループに使用することができる。術前に静脈内バンコマイシン(毎6時間に500mg) を与えて、且つ3日間連続で与えた。
【０３７９】
有効性及び安全性のために、被験者に対して24週間の主要試験期間に経過観察し、また、安全性のために期間を延長して、指標手術後の24月間まで経過観察した。場合によって、臨床試験者及び独立評価者は、試験中の放射線撮影結果を評価することにより、有効性を評価する。
算入基準
【０３８０】
以下の包含基準の全てが当てる場合には、被験者を算入する。
【０３８１】
被験者は20歳以上である;
【０３８２】
足若しくは臀部に広まる痛み、感覚異常、麻痺、虚弱、又は神経性跛行の病歴によって現れた、（神経根圧迫続発にする神経障害が有し又はなくて）椎間板由来源の背中の痛みによって注意れたL1-S1の単一レベルDDD。
【０３８３】
椎間板高さの減少、髄核ヘルニア（herniated nucleus pulposus）、黄色靱帯(ligamentum flavum)の肥大化又は肥厚化、線維輪(annulus fibrosis)、面関節嚢(facet joint capsule)、肥大した面関節、面関節間隔狭窄、関節周囲骨増殖体(facet periarticular osteophyte)形成、レフォイル管形状(trefoil canal shape)、又は外側陥凹部(subarticular) 狭窄、脊椎端板骨増殖体(vertebral endplate osteophyte) 形成などの重症変性腰仙部疾患のx線像証拠を有し、且つ
【０３８４】
下側(尾側) 椎体の前又は後の上側(頭部) 椎体のセジタル面並進(ずれ)が4mmよりも大きく、若しくは角度が10°よりも大きく、又は、下側(尾側) 椎体の前又は後の上側(頭部) 椎体のコロナル面並進(ずれ)が4mmよりも大きく、又は腰部脊柱管及び/又は椎間孔の狭窄(狭窄症)について、少なくとも1つを有する。
【０３８５】
少なくとも6ヶ月以上、非手術的な治療に非応答性;
【０３８６】
非出産可能、若しくは術前72時間の妊娠テストに陰性結果を有する女性、又は男性;
【０３８７】
出産可能な女性被験者（外科的に滅菌されていない、又は閉経となってから1年経っていない）及び男性被験者の出産可能な伴侶は、試験期間中に医学的に許容される避妊方法を使用することに同意しなければならない。医学的に許容される避妊方法は、ホルモンパッチ、移植若しくは注射型子宮内装置、又は二重バリア法(泡状又は膣殺精剤を有するコンドーム、殺精剤を有するダイアフラム)を含む。完全な禁欲は、許容可能な避妊方法と考えることができる。経口避妊薬は、研究の前に対して許容可能な避妊方法であるが、研究中には代替的な方法が必要とされる;
【０３８８】
女性であれば、授乳していない被験者;
【０３８９】
研究関連の任意の手順に参加する前に、署名された同意説明文書(ICF)の提供に同意し、且つ試験の期間の研究要件に適格する。
除外基準
【０３９０】
以下の除外基準のいずれかが当てる場合には、被験者を除外する:
【０３９１】
グレード1を超えた脊椎すべり症(Meyerdingの分類、付録1に参照);
【０３９２】
関連するレベルにおける脊椎器具の移植若しくは椎体間融合術の病歴、又は椎弓根スクリューが挿入したレベルにおける椎体骨折;
【０３９３】
確立された骨軟化症;
【０３９４】
過去5年間における活性悪性腫瘍又は以前の悪性腫瘍履歴（皮膚基底細胞癌及び子宮頸上皮癌を除く）;
【０３９５】
活性局所又は全身感染;
【０３９６】
全般的な肥満; BMI≧30として定義する;
【０３９７】
> 38℃の発熱;
【０３９８】
精神的に機能不全。疑わしい場合は、精神医学的な調査を得る;
【０３９９】
機能がない行動（Inorganic Behavior）のWaddell Signs≧3(Appendix2参照)
【０４００】
アルコール及び/又は薬物の乱用に対する現行治療中に定義したアルコール及び/又は薬物の乱用。アルコール乱用は、人の健康、個人間の関係、又は作業する能力に危害する飲用パターンである。
【０４０１】
自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス又は皮膚筋炎);
【０４０２】
モノクローナル抗体、ガンマグロブリンなどのタンパク質医薬品に対する過敏性;
【０４０３】
以前のrhBMP-2への暴露;
【０４０４】
骨形成に影響を及ぼす内分泌又は代謝障害(例えば、副甲状腺若しくは甲状腺機能の低下症若しくは亢進症、腎性骨異栄養症、エーラス・ダンロス症候群又は骨形成不全症) ;
【０４０５】
7日間以上のプレドニゾン (6ヶ月以内の累積用量>150mg、又は等量の他のステロイド、Appendix3参照)又はカルシトニン(6ヶ月以内)を用いた治療。ビスホスホネート(30日間以上、12ヶ月以内)を用いた治療、治療用量のフッ化物(12ヶ月以内に30日間)、及び所定治療の移植前の30日以内に抗悪性腫瘍、免疫刺激性、免疫抑制薬剤の使用。
【０４０６】
移植手術の28日以内にの任意の試験中治療法を用いた治療;
【０４０７】
30度を超えた脊柱側弯症
【０４０８】
有意なCNS、心臓血管の、肝臓の、腎臓の、代謝の、胃腸の、泌尿器科の、内分泌の、若しくは血液学的疾患の病歴又は臨床症状を有する被験者；
【０４０９】
脱力(motor weakness)、感覚脱失などのこの研究における治療の安全性及び有効性の正確な臨床評価を妨げる医学疾患又は状態、又は通常の歩行若しくは日常生活における他の活動を妨げる痛み状態。
【０４１０】
異常な腎臓及び/又は肝機能を有し、通常値の上限の5倍のクレアチニン、ALT、AST値を有する;
【０４１１】
記録したPEEKに対するアレルギー又は不耐性;
【０４１２】
バンコマイシンに対する過敏症又はアレルギーの病歴;
【０４１３】
医師の判断に基づいて、該試験の参加に適さない任意の状態。
予定試験継続期間
【０４１４】
スクリーニング期間：14日間。被験者がICFに署名していることを確認し、研究に適格であるかどうかを評価する。該評価は、身体検査、生命徴候、心電図、血液若しくは尿妊娠検査、実験検査、術前臨床、及び放射線学評価を含む。人口統計学、医療履歴、併用医薬、有害事象象のデータを収集することが必要である。
【０４１５】
治療期間：1日。被験者が試験に適格であるかどうかを確認し、ベースラインサンプル/データを取得し、試験産物を投与する。該評価は、身体検査、生命徴候、及び放射線学評価を含む。手術情報、併用医薬、有害事象象のデータを収集することが必要である。
【０４１６】
経過観察期間： 24週間の主要試験期間、及び延長安全性経過観察として移植後の24月間まで被験者を経過観察した。治療後の6週目、12週目、18週目、24週目、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に評価を行う。該評価は、併用治療、身体検査、試験評価、生命徴候、放射線検査(前/後及び側面視、屈曲/伸展フィルム)。24週目及び24ヶ月に高解像度薄切りCTスキャン(アクシャル、コロナル及びセジタル再建における1mmの指数を有する1mmスライス) を行う。
主要エンドポイント：
【０４１７】
主要試験有効性エンドポイントは、術後24週間に融合成功を有する被験者の割合。
副次エンドポイント：
【０４１８】
術後12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に融合成功を有する被験者の割合。
【０４１９】
ベースラインから放射線的な融合までの時間。
【０４２０】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に追加的な外科手続き/介入を有する被験者の割合;手術時間(皮膚切開から創傷閉鎖まで)、失血(手術中)、病院滞在を記録する。
【０４２１】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月のオスウェストリー障害指数(Oswestry Disability Index、ODI、Appendix4参照)における成功率; 患者の背部の機能を分析するためにODI質問事項を使用した。ODIスコアの範囲は0-100であった。最良スコアは0(障害無し)であり、最悪は100(最大障害)である。ODIの成功率は、ODIスコアが「術前スコア-術後スコア≧15」に満たされた被験者の百分率として報告される。
【０４２２】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月の視覚的アナログスケール(VAS、Appendix5参照)における改善の成功率。背部の痛みの成功率は、背部の痛みおける改善が「術前スコア-術後スコア>0」に満たされた被験者の百分率として報告される。下肢痛における成功率は、下肢痛における改善が「術前スコア-術後スコア>0」に満たされた被験者の百分率として報告される。
有効性評価方法
【０４２３】
主要よび副次有効性のアウトカムを、最大の解析対象集団(Full Analysis Set、FAS)及び治験実施計画書に適合した対象(Per Protocol、PP)集団に基づいて分析した。FAS集団おいて主要分析を行った。
【０４２４】
主要試験有効性エンドポイントは、術後24週間に融合成功を有する被験者の割合。FAS集団において、コクランアーミテージの傾向検定によって主要分析を行って、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。主要有効性エンドポイントのために支持分析(supportive analysis)を行った。
【０４２５】
加えて、以下のように副次有効性のエンドポイントを分析又はサマライズする。
【０４２６】
コクランアーミテージの傾向検定によって、術後12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に融合成功を有する被験者の割合と術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に追加的な外科手続き/介入を有する被験者の割合を別々に比較し、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。
【０４２７】
ベースラインから放射線的な融合までの時間を評価し、記述統計(平均、SD)を使用して、グループごとに別々にサマライズした。
【０４２８】
手術時間(皮膚切開から創傷閉鎖まで)、失血(手術中)、病院滞在を評価し、記述統計(平均、SD)を使用して、腕ごとに別々にサマライズした。
【０４２９】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月のODIの成功率及び術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月のVASの成功率を、記述統計(n、%)を使用して、腕ごとに別々にサマライズした。適用可能の場合は、single binomial proportion のために、Clopper-Pearson正確信頼区間（CI）に基づいて、各グループの95%CIを計算した。
【０４３０】
本開示は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきものではない。実際、当業者にとって、以上の説明及び添付図面により、記載されたものに加えて開示に対する様々な修正は明らかである。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に該当する。
【０４３１】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内であること。
【図１Ａ】
2019525767.tif 000058
【図１Ｂ】
2019525767.tif 000059
【図２Ａ】
2019525767.tif 000060
【図２Ｂ】
2019525767.tif 000061
【図３】
2019525767.tif 000062
【図４】
2019525767.tif 000063
【図５】
2019525767.tif 000064
【図６】
2019525767.tif 000065
【図７】
2019525767.tif 000066
【図８】
2019525767.tif 000067
【図９】
2019525767.tif 000068
【図１０】
2019525767.tif 000069
【図１１】
2019525767.tif 000070
【図１２】
2019525767.tif 000071
【図１３】
2019525767.tif 000072
【図１４】
2019525767.tif 000073
【図１５】
2019525767.tif 000074
【図１６Ａ】
2019525767.tif 000075
【図１６Ｂ】
2019525767.tif 000076
【図１７】
2019525767.tif 000077
【図１８】
2019525767.tif 000078
【図１９】
2019525767.tif 000079
【図２０】
2019525767.tif 000080
【図２１】
2019525767.tif 000081
【配列表】
2019525767000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月20日(2018.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法、特にアルカリホスファターゼ活性を誘発し得る組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨は独特な機械的性質を有し脊髄骨格の一部分を構成する高剛性組織である。この独特な機械的性質はその広範な基質構造に由来する。動物は一生の間、骨組織が絶え間なく再生される。
【０００３】
骨の形成及び再生の過程はそれに特化された細胞により行われる。骨形成（osteogenesis、骨の形成又は骨の成長）は骨芽細胞（osteoblasts、骨形成細胞）により行われる。骨リモデリング（Bone remodeling）は破骨細胞（osteoclasts）と呼ばれる骨吸収細胞及び骨を形成する骨芽細胞との相互作用によりなされる。これらの過程は特定の生細胞により行われるため、化学的（例えば薬物的及び／又はホルモン的）、物理的及び物理化学的な変化は骨組織の質、数量及び形状に影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
各種成長因子（例えばPDGF）及びサイトカインが骨形成の過程に関わっていることから、所定の位置に骨形成を誘導でき且つ生理的許容可能な化学物質（例えばホルモン、薬、成長因子及びサイトカイン）を特定することは非常に価値がある。しかし、化学物質を治療用具として有効に使用するためには、克服すべき障害がいくつかある。一に、骨誘導活性（osteoinductive activity）を有する組換えポリペプチドの開発である。例えば、組換えヒト血小板由来成長因子−BBにおける骨誘導活性は未だ証明されていない。二に、化学物質における骨誘導の変異性である。例えば、脱灰骨基質（demineralized bone matrix、DBM）は化学物質であり、加工骨由来の骨誘導性同種異系移植片である。商業的に利用可能なDBMを基礎とした製品は増えてきているが、異なる製品間及び異なる製造ロットの同一製品間において骨誘導の変異性が見られる。このため、組換えポリペプチド及びそれに関連した組成物のような一貫した骨誘導活性を示す化学物質が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上記従来技術の事情に鑑みてなされたものであり、組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法を提供することを目的とする。特に、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明は、SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1のドメインと、SEQ ID NO：47及びSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2のドメインと、SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3のドメインとを含み、且つ、前記第2のドメインが1つの分子内ジスルフィド結合(intramolecular disulfide bond)を有する、組換えポリペプチドを開示した。
【０００７】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの前記第2のドメインは前記第2のドメインの23番目のアミノ酸と前記第2のドメインの27番目のアミノ酸との間に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【０００８】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る。
【０００９】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの前記第3のドメインは第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)及び第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、前記第3のドメインは前記第１アミノ酸配列と前記第2アミノ酸配列との間に2つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【００１０】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に第１分子内ジスルフィド結合を有し、且つ、前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子内ジスルフィド結合を有する。
【００１１】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に第１分子内ジスルフィド結合を有し、且つ、前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子内ジスルフィド結合を有する。
【００１２】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348からなる群より選ばれる１種である。
【００１３】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の2つの同一の組換えポリペプチドを有し、且つ、前記2つの組換えポリペプチドの前記第１のドメイン同士の間に1つの分子間ジスルフィド結合を有することを特徴とする、ホモ二量体蛋白を開示した。
【００１４】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
【００１５】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白のそれぞれの前記組換えポリペプチドは、前記第3のドメインが第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第3のドメインの前記第１アミノ酸配列ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第3のドメインの前記第2アミノ酸配列との間に、2つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2のアミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に、第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に第2分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸との間に、第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の前記組換えポリペプチドの前記第2アミノ酸配列の4番目のアミノ酸との間に、第2分子間ジスルフィド結合を有する。
【００１６】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の2つの異なる組換えポリペプチドを有し、且つ、当該2つの組換えポリペプチド同士の前記第１のドメインの間に1つの分子間ジスルフィド結合を有することを特徴とする、ヘテロ二量体蛋白を開示した。
【００１７】
ある実施形態において、該ヘテロ二量体は、一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の前記組換えポリペプチドの前記第１のドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
【００１８】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有することを特徴とする、単離された核酸分子を開示した。
【００１９】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子と操作可能に結合される発現制御領域を有することを特徴とする、組換え核酸分子を開示した。
【００２０】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子又は上記組換え核酸分子を有することを特徴とする、単離された宿主細胞を開示した。
【００２１】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子をベクターに挿入するステップを含むことを特徴とする、組換えベクターの製造方法を開示した。
【００２２】
さらに、本発明は、上記単離された核酸分子又は上記組換え核酸分子を宿主細胞に導入するステップを含むことを特徴とする、組換え宿主細胞の製造方法を開示した。
【００２３】
さらに、本発明は、上記単離された宿主細胞を培養するステップ及び、組換えポリペプチドを単離するステップを含むことを特徴とする、組換えポリペプチドの製造方法を開示した。
【００２４】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の組換えポリペプチド、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白又は上記いずれかに記載のヘテロ二量体蛋白を有することを特徴とする、組成物を開示した。
【００２５】
さらに、本発明は、ある部位に骨量を形成するように骨形成を誘導できるホモ二量体蛋白、及び担体の全体に孔がある生分解性リン酸カルシウム担体を含み、
前記ホモ二量体蛋白の有効量は、生分解性リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜約3.2mg/gであり、
且つ、前記生分解性リン酸カルシウム担体は、孔径が300μm〜600μm程度で、多孔率が70％以上である、
ことを特徴とする生分解性組成物を開示した。
ある実施形態において、該生分解性組成物は、鼻唇溝、眉間しわ、中顔面組織、下顎の輪郭、オトガイ、頬、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種の組織増強に好適である。ある実施形態において、前記部位は、長骨骨折欠損、隣接する椎体の間、骨癒合不全欠損、上顎骨骨切り術切開、、下顎骨骨切り術切開、枝矢状骨切り術切開、オトガイ形成術切開、急速口蓋拡大術切開、隣接する2つの椎体横突起の縦方向に延びる空間、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。ある実施形態において、該ホモ二量体蛋白の単回投与量は0.006mg〜15mg程度である。ある実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、ホモ二量体蛋白を体内から流出させないように硬化し、形成した骨量を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限る。
【００２６】
さらに、本発明は、リン酸カルシウム担体、生分解性マトリックス及び上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白を含有することを特徴とする徐放性組成物を開示した。ある実施形態において、該リン酸カルシウム担体は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、二相リン酸三カルシウム（ＢＣＰ）、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。ある実施形態において、生分解性マトリックスは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸-グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。ある実施形態において、該徐放性組成物は、(a)リン酸カルシウム担体約2〜11% (w/w) 程度；(ｂ) 生分解性マトリックス約88〜97% (w/w) ；(c) ホモ二量体蛋白約0.017〜0.039% (w/w)を含む。
【００２７】
さらに、本発明は、骨空胴を充填する成型性組成物であって、
該成型性組成物に対して90〜99.5重量%程度の成型性マトリックス、及び上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白を含有し、
該成型性組成物から25％程度未満の該ホモ二量体蛋白を、移植後1時間、24時間、48時間、72時間、168時間、240時間、もしくは336時間ほど放出する、ことを特徴とする成型性組成物を開示した。
【００２８】
さらに、本発明は、上記いずれかに記載の生分解性組成物、及び生分解性リン酸カルシウム担体を保つように構成され脊椎融合ケージを含有する脊椎融合装置を開示した。
【００２９】
さらに、本発明は、治療を必要とする対象における長骨骨折の癒合を促進する方法において、
組成物を調製するステップ及び骨折が発生した部位に該組成物を移植するステップを含み
該組成物において、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白含有し、生分解性リン酸カルシウム担体が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、長骨骨折の治癒を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限って、
且つ、該ホモ二量体蛋白の量が、リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜約3.2mg/gである、
ことを特徴とする長骨骨折の癒合を促進する方法を開示した。ある実施形態において、該長骨骨折の癒合を促進する方法は、リン酸カルシウム担体の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出することをさらに含み、且つ、リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は約0.4〜約1.8である。
【００３０】
さらに、本発明は、
上側椎骨と下側椎骨を露出させる、
上側椎骨と下側椎骨を融合する位置を特定する、
上側椎骨と下側椎骨それぞれの骨面を前記融合する位置に露出させる、
該位置に、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白及び生分解性リン酸カルシウム担体を投与する、という工程を含む
ことを特徴とする脊椎融合促進方法を開示した。ある実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は非圧縮性送達ビヒクルであり、且つ、該非圧縮性送達ビヒクルは、2つの骨面の間に骨形成が望まれるが自然には発生しない位置に適用される。ある実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、少なくとも１つの移植棒を含有し、且つ、該移植棒は上側椎骨と下側椎骨の間に縦方向に延びるような位置に適用される。ある実施形態において、該位置は隣接する椎骨体の間、及び隣接する椎骨体横突起の縦方向に延びる間から選ばれる。
【００３１】
さらに、本発明は、奇形又は退化した関節に、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白と生分解性リン酸カルシウム担体を投与することを特徴とする関節固定促進方法を開示した。ある実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、奇形もしくは退化した関節にホモ二量体蛋白を0.006 mg〜10.5 mg程度投与することを含む。
【００３２】
さらに、本発明は、必要とする対象の脊椎に隣接する2つの椎骨体を融合させるための骨量を形成する方法に関し、
骨量骨量を形成するための組成物を調製するステップ及び隣接する2つの椎骨体の間に該組成物を導入するステップを含み、
該組成物において、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白を連行し含有して、緩効性生分解性担体が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、骨量の形成を該緩効性生分解性担体の大きさに限って、緩効性生分解性担体が自身の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出し、
さらに、該ホモ二量体蛋白の量が、該部位に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteである、
ことを特徴とする方法を開示した。ある実施形態において、該緩効性生分解性担体は多孔質構造を有し、隣接する2つの椎骨体の細胞がその多孔質構造に移行して骨量骨量を形成する。ある実施形態において、該緩効性生分解性担体は初期体積を有し、緩効性生分解性担体が吸収されるにつれて、骨量骨量が緩効性生分解性担体の該初期体積を置換する。
【００３３】
さらに、本発明は、後方固定法もしくは経椎間孔融合法であって、
隣接する椎骨体の椎間スペースに、椎間板インプラントを受容するための板空間を準備する、
椎間板インプラントに緩効性担体を導入する、
該緩効性担体において、上記いずれかに記載のホモ二量体蛋白の量が、該緩効性担体に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteであって、
且つ、骨量骨量を形成するように該椎間板インプラントを該板空間に導入する、
ことを特徴とする、必要とする対象の隣接する椎骨体を融合する方法を開示した。
【発明の効果】
【００３４】
本発明は、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る組換えポリペプチド、核酸分子、それらを含む組成物及びそれらの製造、使用方法を提供することを可能とする。本発明により、所定の位置に骨形成を誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】実験グループＡ〜Ｇの雌ウサギ（ＮＺＷ種）の尺骨の代表的なＸ線画像を示す図である。各実験グループの尺骨は、外科的に形成された20 mmの円周状の欠損（すなわち、欠損部位）を有する。グループＡ〜Ｆでは、該欠損部位にインプラントを移植した。グループＡ〜Eでは、200 mgのβ−ＴＣＰインプラントを移植した。グループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄにおいて、該β−ＴＣＰはそれぞれ、2μｇ、6μｇ、20μｇ、60μｇの組換ポリペプチド（C44-C48分子内ジスルフィド結合を含むSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白の担体となっていた。グループEのβ−ＴＣＰでは、組換ポリペプチドを担持してなかった。グループFでは、自体移植片インプラントとして腸骨骨片を受容した。また、グループＧでは、欠損部位に何のインプラントも受容してなかった。グループＡ〜Ｇは、0週（手術直後は０Ｗで示す）、術後２週間、術後4週間、術後６週間、術後８週間（それぞれ2Ｗ、4Ｗ、6Ｗ、8Ｗで示す）の時点で、それぞれＸ線画像を撮影した。尺骨の移植部位（グループＡ〜Ｆ）及び欠損部位（グループＧ）は、各図に白星印で示す。
【００３６】
【図２】実験グループＡ〜Ｇの代表的なコンピュータ断層撮影(CT)走査画像を示す図である。移植部位（グループＡ〜Ｆ）又は欠損部位（グループＧ）の中心における断面画像の経時変化を、0週（手術直後は０Ｗで示す）、術後4週間、術後８週間（それぞれ4Ｗ、8Ｗで示す）の時点で示す。実験グループＡ〜Ｇの構成に関する説明は図1と同様である。
【００３７】
【図３】外科的に改造されていない無傷尺骨及び実験グループＡ〜Ｇ（「Ａ」〜「Ｇ」で示す）の尺骨の捻におけるねじり強度測定の結果を示す図である。最大トルクは、ニュートンメートル(Newton-meters)を単位して「N-m」で示す。実験グループＡ〜Ｇの構成に関する説明は図1と同様である。
【００３８】
【図４−９】実験グループ1〜6のヒツジの脊椎の代表的なＸ線画像を示す図である。グループ1〜3では、3.5 gのβ−ＴＣＰインプラントを受容した。該β−ＴＣＰはそれぞれ10.5 mg、3.5 mg、1.05 mgの組換ポリペプチド（C44-C48、C80-C112、及びC79-C114分子内ジスルフィド結合を含むSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白を担持した。グループ4では、ホモ二量体蛋白を含まない3.5 gのβ−ＴＣＰインプラントを受容した。グループ5では、自体移植片インプラントを受容した。グループ6では、3.15mgのrhBMP-2を含む吸収性コラーゲンスポンジのインプラントを受容した。図4〜9は、右から左へ、各グループを術後4週間及び術後８週間の時点で撮影したＸ線写真を示す。「2179」、「2192」、「2187」、「2160」、「2162」及び「2166」はグループ1〜6をそれぞれ指す。
【００３９】
【図１０】椎間ケージを示す図である。左の列の画像は、椎間ケージの上面視画像を示す。そして、右の列の画像は、椎間ケージの側面視画像を示す。拡大倍率について、上の行はx0.67、真ん中の行はx2、下の行はx4である。ケージの大きさは8 mm x 24 mm x 10 mmである。
【００４０】
【図１１】下記の実験と測定における、可動範囲測定の結果を示す図である。150 mgのβ−ＴＣＰをインプラントとして受容したヒツジの脊椎を、０週（手術直後）の時点で測定した。0 mg、0.1 mg、0.5 mg、1.0 mg、2.0 mg、4.0mgの組換ポリペプチド（C44-C48分子内ジスルフィド、C79-C112分子間ジスルフィド、及びC80-C114分子間ジスルフィド結合を含んだSEQ ID NO:260）２つを含むホモ二量体蛋白を担持したβ−ＴＣＰ150 mgをインプラントとして受容したヒツジ脊椎を、12週間の時点で測定した。自体移植片をインプラントとして受容したヒツジ脊椎を、12週間の時点で測定した。ヒツジはメスEwe種である。図１１では各試験条件で各方向の可動範囲測定平均値と標準偏差値を示す。
【００４１】
【図１２】図11で説明したホモ二量体蛋白インプラントを0.1mg/siteで受容したヒツジ脊椎のマイクロコンピュータ断層撮影像(μCT)のアキシャル画像、コロナル画像及びサジタル画像を示す図である。「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及び「I」は、それぞれ腹面(ventral)、背面(dorsal)、右、左、上面及び下面を指す。部位に形成した骨はケージのスペースを大幅に充填したが、両方の終板には透き（lucency）が示された。
【００４２】
【図１３】図11で説明したホモ二量体蛋白インプラントを0.5mg/siteで受容したヒツジ脊椎のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)のアキシャル画像、コロナル画像及びサジタル画像を示す図である。「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及び「I」に関する説明は図12と同様である。該部位には良好な骨質が示されたが、多少の透き線も示された。
【００４３】
【図１４】図11で説明した自体移植片を0.5mg/siteで受容したヒツジ脊椎のマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)のアキシャル画像、コロナル画像及びサジタル画像を示す図である。「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及び「I」に関する説明は図12と同様である。該時点で部位に形成した骨は、ケージのスペースを埋め尽くしていなかった。また、終板には透き（lucency）が示された。
【００４４】
【図１５】14日の放出期間に微粒子から放出されたホモ二量体蛋白の相対量（図15A）と累積百分率（図15B）を示す図である。
【００４５】
【図１６】-20℃、4℃、25℃で6か月間それぞれ保存された乳酸-グリコール酸共重合体/ホモ二量体蛋白−ベータ−リン酸三カルシウム（PLGA/Hp-β-TCP）の代表的な走査型電子顕微鏡法画像を示す図である。
【００４６】
【図１７】異なる剤量のホモ二量体蛋白及び図16で説明したPLGA/Hp-β-TCPを移植されたBalb/C系マウスの脛骨における、移植から０週及び４週間後の代表的なＸ線画像を示す図である。各図の白矢印は骨欠損を指す。（C：壊死骨対照グループ、スキャフォールド（scaffold）を一切移植してない骨片。PT:PLGA/β-TCP（ホモ二量体蛋白をが含まない）。POT-0.2：PLGA/0.2μg Hp-β-TCP。POT-0.8：PLGA/0.8μg Hp-β-TCP。POT-1.6：PLGA/1.6μg Hp-β-TCP。POT-3.2：PLGA/3.2μg Hp-β-TCP。
【００４７】
【図１８】図17で説明したグループにおける、移植から４週間後の新骨形成/領域の百分率を示す図である。
【００４８】
【図１９】本発明が開示する製剤例の横断面画像を示す図である。図19Ａは、組換ポリペプチド/蛋白を担持した担体（例、β-TCP）の粒を示す。図19Ｂは、組換ポリペプチド/蛋白を担持した粒と混ざったパテを示す。図19Ｃは、開示した組換ポリペプチド/蛋白を有するパテ（putty）を示す。図19Ｄは、組換ポリペプチド/蛋白を担持した粒がパテの外側層に均一に分布したパテを示す。
【００４９】
【図２０】所定の持続時間に放出されたホモ二量体蛋白の累積百分率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、組換ポリペプチド、該組換ポリペプチドを有するホモ二量体蛋白及びヘテロ二量体蛋白、該組換ポリペプチドをコードする核酸分子及びベクター、並びに該組換ポリペプチドを発現するための宿主細胞を提供する。本発明はさらに、該組換ポリペプチドの組成物及び該組換ポリペプチドの製造、使用方法を提供する。
【００５１】
本明細書に引用される全ての刊行物、雑誌記事、書籍、マニュアル、特許出願、及び特許は、そのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。個々の刊行物も具体的かつ個別に同程度に参考として入れる。
【００５２】
特に説明しない限り、本明細書で用いる技術的又は科学的な用語は、本発明が属する分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解されることと同じ意味を有する。本発明について、下記の用語は、以下の意味を有するものとする。
【００５３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる、単数形で記載されたものであっても、前後関係から明らかでない限り、複数の場合も含めて意味する。例えば、「一つのドメイン」に対する言及は，１以上の該ドメインに対する言及を含む。また，「一つの組換ポリペプチド」に対する言及は，１つ以上の組換ポリペプチドに対する言及を含む。「一つ（ａ、ａｎ）」、「ｔｈｅ」、「１つ以上」、「少なくとも1つ」という用語は、同じ意味で使われる。
【００５４】
「又は（or）」は、特に明示しない限り、「及び／又は（and/or）」を意味する。同様に、「含む（comprise、comprises、comprising）」、「含有する（include、includes、including）」などは、同じ意味で使われ、限定を意図しないこととして理解される。
【００５５】
更に、ここでいう「及び／又は」は、2つの特定された特徴又は組成物において、その中の一つ又は両方を特定的に開示するために使われる。そのため、例えば、「Ａ及び／又はＢ」というように使われる「及び／又は」は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Aのみ」、「Bのみ」を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」というように使われる「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ及びＣ」、「Ａ、Ｂ又はＣ」、「Ａ又はＣ」、「Ａ又はＢ」、「Ｂ又はＣ」、「Ａ及びＣ」、「Ａ及びＢ」、「Ｂ及びＣ」、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「Ｃのみ」を含むことを意図する。
【００５６】
記載したあらゆる態様に使われる「含む、有する、含有する(comprising)」は、「consisting of（から構成される）」及び／又は「consisting essentially of（から実質的に構成される）」という類似記載の意味も含む。
【００５７】
「アミノ酸」は、水素原子に結合している中心炭素原子(α-炭素原子)、カルボン酸基(本明細書における炭素原子は"カルボキシル炭素原子"と称する)、アミノ基(本明細書における窒素原子は"アミノ窒素原子"と称する)及び側鎖群Rを含む構造を有する分子である。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に組み込まれた場合には、アミノ酸を別のアミノ酸に結合させる脱水縮合において、アミノ酸はカルボン酸基の1個以上の原子を失う。その結果、タンパク質に取り込まれたアミノ酸は「アミノ酸残基」と称される。
【００５８】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して2つ以上の個々のアミノ酸が連結された(自然に生じるか否か)ポリマーを意味する。また、その結合は、アミノ酸(又はアミノ酸残基)のα-炭素に結合したカルボン酸基のカルボキシル炭素原子が、隣接するアミノ酸の非α-炭素に結合したアミノ基のアミノ窒素原子に共有結合するときに起こる。ここで、「タンパク質」という用語は、「ペプチド」及び「ポリペプチド」の意味も含めて理解される（同じ意味として使われる場合がある）。また、本明細書において、複数のポリペプチドサブユニット（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼ)又は他の成分（例えば、テロメラーゼに存在するＲＮＡ分子)を含んだタンパク質も「タンパク質」として理解される。同様に、タンパク質及びポリペプチドの断片も本明細書に開示した「タンパク質」の範囲内である。本開示の一態様では、ポリペプチドは、2つ以上の親ペプチドセグメントのキメラを含む。用語「ポリペプチド」は、翻訳後修飾(「PTM」)の産物を指すことや、翻訳後修飾(「PTM」)の産物を包含することも意図する。翻訳後修飾(「PTM」)について、特にこれらに限定されるものではないが、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、カルバモイル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、非天然に存在するアミノ酸による修飾、標識成分との結合といった他の任意の操作又は修飾、を挙げることもできる。ポリペプチドは、天然生物源から由来する又は組換え技術によって製造することができる。ただし、指定された核酸配列からの翻訳である必要はない。化学合成を含む任意の方法で生成することができる。「単離された」ポリペプチド、そのフラグメント、変異体又はその誘導体は、自然の環境には存在しないポリペプチドを指し、特定程度の精製は必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドは、単に原初の又は天然の環境から取り外されたものであってもよい。本開示について、宿主細胞で発現されて生産された組換えポリペプチドやタンパク質は単離されたものに該当し、任意の適切な技術によって分離され、分画され、又は部分的に若しくは十分に精製された天然若しくは組換えポリペプチドである。
【００５９】
本明細書で使用される「ドメイン」は、用語「ペプチドセグメント」と交換可能に使用することができ、より大きなポリペプチド若しくはタンパク質の一部又は断片を指す。ドメインは、自身の機能活性を有することは必要ではないが、場合によっては、ドメインが自身の機能活性を有するものであっでもよい。
【００６０】
所与のタンパク質の特定のアミノ酸配列(すなわち、アミノ末端からカルボキシル末端まで書き込まれたときのポリペプチドの「一次構造」)は、mRNAのコード化部分の塩基配列により決定される。そしてこのmRNAのコード化部分の塩基配列は遺伝子情報により順に決定される。遺伝子情報は、典型的にはゲノムＤＮＡ(例えばミトコンドリアや葉緑体のＤＮＡのようなオルガネラＤＮＡも含む) を挙げることができる。従って、遺伝子の配列を決定することは、対応するポリペプチドの一次配列と、その遺伝子もしくはポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチド又はタンパク質のより具体的な役割若しくは活性の予測に役立つ。
【００６１】
本明細書で使用される「Ｎ末端」は、ポリペプチドのアミノ末端に関連して、アミノ酸、ドメイン、又はポリペプチド内のペプチドセグメントの位置や場所を意味する。例えば、「ドメインＡは、ドメインＢ及びＣに対してＮ端末である」という記載は、ドメインＡがドメインＢ及びＣよりもアミノ末端に近い場所に位置していることを意味する。このように、ドメインＢ及びＣの場所が特に言及されない限り、アミノ末端側からのポリペプチドのドメインの順序は、A-B-C又はA-C-Bの何れかで理解される。また、Ｎ末端であるドメインと他のドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。同様に、ポリペプチドのＮ末端と、他のドメインに対してＮ末端であるドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。
【００６２】
本明細書で使用される「Ｃ末端」は、ポリペプチドのカルボキシル末端に関連して、アミノ酸、ドメイン、又はポリペプチド内のペプチドセグメントの位置や場所を意味する。例えば、「ドメインＡは、ドメインＢ及びＣに対してＣ端末である」という記載は、ドメインＡがドメインＢ及びＣよりもカルボキシル末端側に近い場所に位置していることを意味する。このように、ドメインＢ及びＣの場所が特に言及されない限り、アミノ末端側からのポリペプチドのドメインの順序は、B-C-A又はC-B-Aの何れかで理解される。また、Ｃ末端であるドメインと他のドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。同様に、ポリペプチドのＣ末端と、他のドメインに対してＮ末端であるドメインとの間には、任意の数のアミノ酸を存在させる又は1個も存在させないことができる。
【００６３】
本明細書での「融合」、「動作可能に連結され」、及び「動作可能に結合され」は、本明細書に開示される組換えポリペプチドの形成における2つ以上のドメインの任意の化学的又は物理的結合について広く指す際は、交換的に使用される。一実施形態において、本明細書に開示される組換えポリペプチドは、2つ以上の異なるポリペプチドからなるドメインを複数含むキメラポリペプチドである。
【００６４】
本明細書に開示される2つ以上のドメインを含む組換えポリペプチドは、各ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む単一のコーディング配列によってコードされ得る。特に明記しない限り、各ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は「インフレーム（in frame）」であり、ポリヌクレオチド配列をを含む一本鎖ｍRNAを翻訳し、各ドメインを含む一本鎖ポリペプチドとなる。一般に、本明細書に記載の組換えポリペプチド中のドメインは、互いに直接融合されるか、又はペプチドリンカーにより分離される。ペプチドリンカーをコードする種々のポリヌクレオチド配列は、本分野では公知である。
【００６５】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー形態を意味する。場合によって、ポリヌクレオチドは、その由来生物の自然に生じるゲノムのコーディング配列とすぐに隣接(5'末端又は3'末端に)する、又はすぐには隣接しない配列を含む。したがって、該用語は、例えば、ベクターに組み込まれた組換えDNA、自律複製するプラスミド若しくはウイルスに組み込まれた組換えDNA、原核生物若しくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、又は他の配列と関連がない別個の配列（例えば、cDNA)を含む。ここで開示するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はこれらの修飾型であってもよい。本明細書で使用されるポリヌクレオチドはとりわけ、一本鎖若しくは二本鎖DNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物のDNA、一本鎖若しくは二本鎖RNA、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物のRNA、又はDNA及びRNAを含むのハイブリッド分子を指す。ここで、前記ハイブリッド分子は、一本鎖、より典型的には二本鎖、又は一本鎖領域と二本鎖領域との混合物のDNA及びRNAを含むことが可能である。「ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノムDNAもしくはRNA（生物体によること、例えば、ウイルスのゲノムRNA）、ゲノムDNAによりコードされるmRNA、及びcDNAを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合（例えば、ペプチド核酸(PNA)に見出されるアミド結合）を含む。「単離された」核酸又はポリヌクレオチドは、天然の環境から取り除かれた核酸分子（例えば、DNAもしくはRNA）を指す。例えば、本開示の適用上、ベクターに含まれる組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、「単離された」ものとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例として、異種性宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の他のポリヌクレオチドから(部分的又は十分に)精製された組換えポリヌクレオチドも含む。単離されたRNA分子は、本開示のポリヌクレオチドのin vivo又はin vitroのRNA転写物を含む。さらに、本開示により単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、合成的に生産したポリヌクレオチド又は核酸（例えば、核酸分子）も含む。
【００６６】
本明細書で使用される「コーディング領域」又は「コーディング配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA))は通常、アミノ酸に翻訳されないが、コーディング領域の一部としてみなされる可能性がある。ただし、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、及びイントロンなどのフランキング配列は、コーディング領域の一部ではない。コーディング領域の境界は、一般的に、得られたポリペプチドのアミノ末端をコードする5'末端の開始コドンと、得られたポリペプチドのカルボキシル末端をコードする3'末端の翻訳終止コドンによって決定される。
【００６７】
本明細書で使用される「発現制御領域」という用語は、コーディング領域と動作可能に結合され、コーディング領域によってコードされた産物の発現を配向する若しくは制御する転写制御因子を指す。例としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、RNAプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、及び転写終止シグナル等を挙げることができる。例えば、プロモーター機能の誘導が産物をコードする発現制御領域を含むmRNAの転写を起こし、且つプロモーターとコーディング領域との間の結合の性質が、コーディング領域によってコードされた産物の発現を配向するポロモーターの能力に干渉しなければ、又は、DNAテンプレートの転写に干渉しなければ、コーディング領域とプロモーターは「動作可能に結合される」と考えられる。発現制御領域は、コーディング領域の上流(5'非コード配列)、内部、若しくは下流に(3'非コード配列)位置するヌクレオチド配列、又は関連するコーディング領域の転写、RNAプロセシング、安定性若しくは翻訳に影響を与えるものを含む。一般的に、コード領域を真核生物での発現を対象とする場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終止配列はコード領域の3'に位置する。
【００６８】
「核酸セグメント」、「オリゴヌクレオチドセグメント」又は「ポリヌクレオチドセグメント」は、より大きなポリヌクレオチド分子の一部を意味する。ポリヌクレオチドセグメントはコードされたタンパク質の機能ドメインに対応する必要はないが、場合によって、該セグメントはタンパク質の機能ドメインをコードする。ポリヌクレオチドセグメントの長さは、ヌクレオチド数が約6個以上(例えば、6-20、20-50、50-100、100-200、200-300、300-400又はそれ以上の長さ) とすることができる。
【００６９】
「ベクター」は、宿主細胞への核酸分子のクローニング及び/又は転写のための任意のビヒクルを意味する。「ベクター」という用語は、in vitro、exvivo又はin vivoで核酸を細胞内に導入するためのウイルスビヒクル及び非ウイルス性ビヒクル(例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルス)を両方含む。
【００７０】
本明細書で使用される「宿主細胞」及び「細胞」という用語は、互いに交換可能に使用することができ、核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を担持又は担持可能な任意のタイプの細胞又は細胞集団を意味する。例えば、初代細胞、培養中の細胞、細胞株からの細胞等を挙げることができる。宿主細胞は原核細胞であってもよい、また、真核細胞であってもよい。例えば、酵母細胞のような真菌細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞のような種々の動物細胞等を挙げることができる。
【００７１】
本明細書で使用される「培養」は、細胞の成長、分裂又は細胞を生きた状態で維持することを可能するin  vitro環境に細胞をインキュベートすることを意味する。本明細書で使用される「培養細胞」は、in  vitroで増殖される細胞を意味する。
【００７２】
本明細書で使用される「骨誘導性」とは、骨及び/又は軟骨の形成若しくは成長の誘導を指し、例えば、骨及び/又は軟骨の形成若しくは成長に関連するマーカーの誘導（例えば、アルカリホスファターゼ活性の誘導）等を含む。
【００７３】
本明細書において「酵母ツーハイブリッドアッセイ」又は「酵母ツーハイブリッドシステム」は交換可能に使用され、タンパク質ペア間の相互作用の検出のためのアッセイ又はシステムを意味する。典型的なツーハイブリッドスクリーニングアッセイ/システムにおいて、転写因子は、結合ドメイン(BD)と活性化ドメイン(AD)という2つの断片に分割され、それぞれが別個のプラスミドに設けられ、それぞれが所望のタンパク質に融合する。酵母ツーハイブリッドアッセイシステムは、(i) ベイトタンパク質及びシステムに利用される転写因子のBDを含む「ベイト」ベクター、（ii）プレイタンパク質（又は、ベイトタンパク質との相互作用をスクリーニングするためのプレイタンパク質のライブラリー）及び転写因子のADを含む「プレイ」ベクター、（iii）システムに利用される転写因子のBDに対する結合配列を含む好適なレポーター酵母株を有する。ベイト-プレイ相互作用が起こると、転写因子のADが1つ以上のレポータータンパク質の発現を駆動することになる。ベイトベクター及びプレイベクターは、レポーター酵母株中に導入され、そこで、発現されたベイト及びプレイタンパク質は相互作用することができる。また、ベイトベクター及びプレイベクターの何れかを含む別個の一倍体酵母株を交配させることで、両方のタンパク質を発現する二倍体酵母株を得ることが可能である。相互作用するベイト及びプレイタンパク質は、転写因子の再構成及び活性化を起こし、その転写因子は次いでレポーター酵母株が提供した親和活性化ドメインに結合し、レポーター遺伝子を検出可能な発現を誘発する。
組換えポリペプチド及び組成物
【００７４】
本開示は、SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び355からなる群より選ばれる2つ以上のドメインを含む組換えポリペプチドに関し、表3に開示された2つのドメインの組合せのいずれかを含むことができるが、これに限定されない。特定の実施形態において、組換えポリペプチドは任意の3つの上記ドメインを含み、表3に開示された3つのドメインの組合せのいずれかを含むことができるが、これに限定されない。
【００７５】
本明細書に記載の組換えポリペプチドの任意のドメインは、組換えポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に対応する任意の位置に配置されることができる。例えば、本明細書に開示される組換えポリペプチドの任意のドメインを、組換えポリペプチド中の任意の1つ以上の他のドメインに対してＮ端末の位置に配置することができる。同様に、本明細書に開示される組換えポリペプチドの任意のドメインを、組換えポリペプチド中の任意の1つ以上の他のドメインに対してＣ端末の位置に配置することもできる。
【００７６】
本開示は、SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び355からなる群より選ばれる2つ以上のドメインを含む組換えポリペプチドに関し、組換えポリペプチドは組換えポリペプチドにおける個々のドメインのいずれよりも、アクチビン受容体IIBタンパク質（即ち、ActRIIBecd）の細胞外ドメインに対して高い親和性を有する。ActRIIB及び天然に存在する変異体の核酸配列及びポリペプチド配列は公知である。例えば、本明細書に開示されるActRIIBecdは、本明細書に開示されるSEQ ID NO：8の残基27-117に相当するSEQ ID NO：9とすることができる。上記親和性は、例えば、放射免疫アッセイ(RIA)、BIAcore（商標）のような表面プラズモン共鳴又は当該技術分野で公知である任意の他の結合アッセイによって測定することができる。幾つかの実施形態において、該組み換えポリペプチドは、2つのドメインの組合せを含み、且つ、該2つのドメインの任意の一方はもう一方のドメインに対してＮ端末又はＣ端末の位置に配置され、以下のドメインの組み合わせからなる群より選ばれる：SEQ ID NO：39及びSEQ ID NO：49、SEQ ID NO：49及びSEQ ID NO：61、SEQ ID NO：61及びSEQ ID NO：39、SEQ ID NO：35及びSEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：35、SEQ ID NO：57及びSEQ ID NO：47。幾つかの実施形態において、該2つのドメインの組み合わせは、SEQ ID NO：188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248及び254からなる群より選ばれる配列を含む組み換えポリペプチドを生成する。幾つかの実施形態において、該組み換えポリペプチドは、3つのドメインの組合せを含み、該3つのドメインの任意の一方は、他のドメインに対してＮ端末又はＣ端末の位置に配置され、以下のドメインの組み合わせからなる群より選ばれる：SEQ ID NOs: 39、49及び61；SEQ ID NOs:35、47及び57；SEQ ID NOs:39、47及び61；SEQ ID NOs:35、49及び57；SEQ ID NOs:39、57及び47； SEQ ID NOs:35、61及び49。幾つかの実施形態において、該3つのドメインの組み合わせは、SEQ ID NO：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及び348からなる群より選ばれる配列を含む組み換えポリペプチドを生成する。
【００７７】
本開示は、SEQ ID NO：39の第1ドメイン、SEQ ID NO：49の第2ドメイン及びSEQ ID NO：61の第3ドメインを含む組み換えポリペプチドに関し、且つ、前記第1ドメインは第2ドメインに対してＣ端末に位置し、前記第3ドメインは第2ドメインに対してＮ端末に位置する、又はこれらの組み合わせである。特定の実施形態において、該組み換えポリペプチドは、SEQ ID NO：35及びとSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1ドメイン、SEQ ID NO：47及びとSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2ドメイン、SEQ ID NO：57及びとSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3ドメインを含み、前記第1ドメインは第2ドメインに対してＣ端末に位置し、前記第3ドメインは第2ドメインに対してＮ端末に位置する、又は第1、2、3ドメインが、それぞれSEQ ID NO：39、49、61である際の組み合わせである。
【００７８】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組み換えポリペプチドは翻訳後修飾(「PTM」)を含む、当該翻訳後修飾(「PTM」)はジスルフィド結合形成、グリコシル化、カルバモイル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、非天然に存在するアミノ酸による修飾、又は標識成分との結合などの任意の他の操作修飾を含むが、これに限定されない。
【００７９】
特定の実施形態において、組換えポリペプチドは、生理的条件下又は任意の他の標準条件(例えば、精製条件若しくは保存条件)において1つ以上のジスルフィド結合の形成に関与し得る1つ以上のシステインを含むことができる。特定の実施形態において、ジスルフィド結合は、組換えポリペプチド中の2つのシステイン残基の間に形成された分子内ジスルフィド結合である。特定の実施形態において、ジスルフィド結合は、二量体中の2つの組換えポリペプチドの間の分子間ジスルフィド結合である。特定の実施態様において、分子間ジスルフィド結合は、本明細書に記載の2つの同一の組換えポリペプチドの間に形成され、且つ、その2つの同一の組換えポリペプチドはホモ二量体を形成する。特定の態様において、ホモ二量体は、少なくとも1つ又は3つ以上の分子間ジスルフィド結合を含む。特定の態様において、分子間ジスルフィド結合は、本明細書に記載の2つの異なる組換えポリペプチドの間に形成されし、且つ、その2つの異なる組換えポリペプチドがヘテロ二量体を形成する。特定の態様において、ヘテロ二量体は、少なくとも1つ又は3つ以上の分子間ジスルフィド結合を含む。
【００８０】
本開示は、SEQ ID NO：35及びとSEQ ID NO：39からなる群より選ばれる第1ドメイン、SEQ ID NO：47及びとSEQ ID NO：49からなる群より選ばれる第2ドメイン、SEQ ID NO：57及びとSEQ ID NO：61からなる群より選ばれる第3ドメイン含む組換えポリペプチドに関し、当該含む組換えポリペプチドは1つの分子内ジスルフィド結合を含む。
【００８１】
特定の実施形態において、第1ドメイン、第2ドメイン、第3ドメイン又はこれらの組み合わせは、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、1つ以上の分子内ジスルフィド結合は、単一ドメイン内、一方のドメインともう一方のドメインとの間、2つ以上のシステインを有するドメインと他の1つ以上のドメインとの間にあるか、又はそれらの組合せである。特定の実施形態において、第1ドメインは1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、第2ドメインは1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、第3ドメインは1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、各ドメインはそれぞれ1つのジスルフィド結合を有する。本明細書において分子内ジスルフィド結合について言及する際に使用される「ドメインは1つのジスルフィド結合を有する」とは、1つ以上のシステインが存在するドメインにおける2つのシステインの間にある分子内ジスルフィド結合、又は一方のドメインの中のシステインともう一方のドメインの中のシステインとの間にいるジスルフィド結合を指す。
【００８２】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチドの第2ドメインは、第2ドメインの23番目のアミノ酸と第2ドメインの27番目のアミノ酸との間に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第1ドメインと第3ドメインの間、第3ドメインの中に、又はこの両方に、更に1つ以上の分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、第3ドメインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、第3メインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、又は第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、第3ドメインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、更に1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第3ドメインの8番目のアミノ酸と第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、第3ドメインの9番目のアミノ酸と第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、更に1つのジスルフィド結合を有する。
【００８３】
特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの第3ドメインは、第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、該第3のドメインは、第１アミノ酸配列と第2アミノ酸配列の間に2つの分子内ジスルフィド結合若しくは2つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に、第１分子内又は分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と第2アミノの酸配列第4番目のアミノ酸の間に第2分子内又は分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸と第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に、第１分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸と第2アミノ酸配列の第4番目のアミノ酸の間に第2分子内又は分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、第2ドメインの23番目のアミノ酸と第2ドメインの27番目のアミノ酸の間に、更に1つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【００８４】
本開示は、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる１種であるアミノ酸配列を有し、且つ1つの分子内ジスルフィド結合を有す組換えポリペプチドに関する。
【００８５】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン15、システイン44、システイン48、システイン79、システイン80、システイン112、システイン114及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324及びSEQ ID NO：332からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン44、システイン48、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324及びSEQ ID NO：332からなる群より選ばれる。
【００８６】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン15、システイン29、システイン30、システイン62、システイン64、システイン88、システイン92及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88、システイン92、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる。
【００８７】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン23、システイン27、システイン65、システイン79、システイン80、システイン112、システイン114及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：268及びSEQ ID NO：300からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン23、システイン27、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：268及びSEQ ID NO：300からなる群より選ばれる。
【００８８】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン8、システイン9、システイン41、システイン43、システイン59、システイン88、システイン92及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：284及びSEQ ID NO：308からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88、システイン92、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：284及びSEQ ID NO：308からなる群より選ばれる。
【００８９】
特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン8、システイン9、システイン41、システイン43、システイン67、システイン71、システイン109及びこれらの組み合わせを含む1つ以上のジスルフィド結合を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：276及びSEQ ID NO：316からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、分子内ジスルフィド結合は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン67、システイン71、又はこの両方を含み、且つ、前記組換えポリペプチドは、SEQ ID NO：276及びSEQ ID NO：316からなる群より選ばれる。
【００９０】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324及びSEQ ID NO：332からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン44とシステイン48との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を含む。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に、システイン80とシステイン114との間に、システイン80とシステイン112との間に、又はシステイン79とシステイン114との間に、更に1つの分子内若しくは分子間（二量体の）ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に更に1つの分子内又は分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン80とシステイン114との間にも更に1つの分子内又は分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン80とシステイン112との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン79とシステイン114との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９１】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：340及びSEQ ID NO：348からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88とシステイン92との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン29とシステイン62との間に、システイン30とシステイン64との間に、システイン30とシステイン62との間に、又はシステイン29とシステイン64との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン29とシステイン62との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン30とシステイン64との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン30とシステイン62との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン29とシステイン62との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９２】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：268及びSEQ ID NO：300からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン23とシステイン27との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に、システイン80とシステイン114との間に、システイン80とシステイン112との間に、又はシステイン79とシステイン114との間に、更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン79とシステイン112との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン80とシステイン114との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン80とシステイン112との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン79とシステイン114との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９３】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：284及びSEQ ID NO：308からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン88とシステイン92との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に、システイン9とシステイン43との間に、システイン9とシステイン41との間に、又はシステイン8とシステイン43との間に、更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン9とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン9とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン8とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９４】
特定の実施形態において、SEQ ID NO：276及びSEQ ID NO：316からなる群より選ばれる組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたシステイン8とシステイン71との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に、システイン9とシステイン43との間に、システイン9とシステイン41との間に、又はシステイン8とシステイン43との間に、更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン8とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン9とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、システイン9とシステイン41との間に更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、システイン8とシステイン43との間にも更に1つの分子内若しくは分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９５】
本開示は、本明細書に記載の2つの同一の組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白を対象とする。
【００９６】
本開示は、本明細書に記載の2つの異なる組換えポリペプチドを有するヘテロ二量体蛋白を対象とする。
【００９７】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、該2つの組換えポリペプチド同士の第１ドメインの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第2ドメインの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第3ドメインの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第１ドメインと第2ドメインとの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第１ドメインと第3ドメインとの間に、該2つの組換えポリペプチド同士の第2ドメインと第3ドメインとの間に、又はこれらの組み合わせに、1つ以上の分子間ジスルフィド結合を有する。
【００９８】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第１ドメインの15番目のアミノ酸と、もう一方の組換えポリペプチドの第１ドメインの15番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、又は一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、及び一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、及び一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、更に1つのジスルフィド結合を有する。
【００９９】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドともう一方の組換えポリペプチドとの間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。ここで、ホモ二量体蛋白である場合、一方の組換えポリペプチドともう一方の組換えポリペプチドは同一の配列を有する。ヘテロ二量体蛋白である場合、一方の組換えポリペプチドともう一方の組換えポリペプチドは異なる配列を有する。ここで、一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：260、292、324、332、340、若しくは348の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン15に位置する。一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：268若しくは300の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン65に位置する。一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：284若しくは308の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン59に位置する。また、一方の組換えポリペプチド及び/又はもう一方の組換えポリペプチドがSEQ ID NO：276若しくは316の何れかである場合、該ジスルフィド結合はシステイン109に位置する。上記のシステイン番号は、一方及び/又はもう一方の組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたものである。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)、（b）、(c)又は(d)の（1）と（2）との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
(c)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
(d)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
【０１００】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に、又は一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、1つのジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの8番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの43番目のアミノ酸との間に1つのジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの9番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの41番目のアミノ酸との間にも、1つのジスルフィド結合を有する。
【０１０１】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)、（b）、(c)又は(d)の（1）と（2）との間に、1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
(c)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
(d)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、下記(a)及び（b）の（1）と（2）との間に、それぞれに更に1つの分子間ジスルフィド結合を有する。
(a)
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン80、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン30、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン9。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン112、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン62、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン41。
（b）
(1) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン79、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン29、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかである一方の組換えポリペプチドのシステイン8。
(2) SEQ ID NOs: 260、292、324、332、268、若しくは300の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン114、SEQ ID NOs:340若しくは348の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン64、又はSEQ ID NOs:284、308、276若しくは316の何れかであるもう一方の組換えポリペプチドのシステイン43。
【０１０２】
特定の実施形態において、各組換えポリペプチドのホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の第3ドメインは、第１アミノ酸配列PKACCVPTE (SEQ ID NO：356)と第2アミノ酸配列GCGCR (SEQ ID NO：357)を有し、且つ、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの第１アミノ酸配列ともう一方の組換えポリペプチドの第3ドメインの第2アミノ酸配列との間に、2つの分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノの酸配列の4番目のアミノ酸の間に第2分子間ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白は、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の5番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノ酸配列の2番目のアミノ酸の間に第１分子間ジスルフィド結合を有し、且つ、一方の組換えポリペプチドの第１アミノ酸配列の4番目のアミノ酸ともう一方の組換えポリペプチドの第2アミノの酸配列の4番目のアミノ酸の間に第2分子間ジスルフィド結合を有する。
【０１０３】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドは、本明細書に記載のいずれかの又は複数の分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０４】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドの第2ドメインは、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドは、第2ドメインの23番目のアミノ酸と第2ドメインの27番目のアミノ酸との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０５】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白若しくはヘテロ二量体蛋白の一方若しくは両方の組換えポリペプチドは、SEQ ID NOs: 260、292、324若しくは332である組換えポリペプチドのシステイン44とシステイン48との間に、SEQ ID NOs:284、308、340若しくは348である組換えポリペプチドのシステイン88とシステイン92との間に、SEQ ID NOs:268若しくは230である組換えポリペプチドのシステイン23とシステイン27との間に、又はSEQ ID NOs:276若しくは316である組換えポリペプチドのシステイン67とシステイン71との間に、1つの分子内ジスルフィド結合を有する。上記のシステイン番号は、組換えポリペプチドのアミノ末端から番号が付されたものである。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白は、2つの組換えポリペプチドを有し、且つ、この2つの組換えポリペプチドは同一の配列を有し、配列はSEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348から選ばれる。場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の同一の分子内ジスルフィド結合を有する。また、場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の異なる分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０７】
特定の実施形態において、本明細書に記載のヘテロ二量体蛋白は、2つの異なる組換えポリペプチドを有し、且つ、この2つの組換えポリペプチドはそれぞれ、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348から選ばれる異なる配列を有する。特定の実施形態において、ヘテロ二量体蛋白の一方の組換えポリペプチドはSEQ ID NO：260の配列を有し、且つ、もう一方の換えポリペプチドはSEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348から選ばれる配列を有する。場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の同一の分子内ジスルフィド結合を有する。また、場合によって、該組換えポリペプチド同士は、本明細書に記載の異なる分子内ジスルフィド結合を有する。
【０１０８】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、表4又は表5に記載のシステインペアの間に、1つ又は複数のジスルフィド結合を有する。
【０１０９】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、骨誘導活性を有する。骨誘導活性は、この活性を測定するための任意の条件（即ち、骨誘導条件）下で測定されることができる。
【０１１０】
例えば、C2C12細胞は筋ジストロフィーマウス筋由来の筋芽細胞株である。骨誘導活性を有するポリペプチドへC2C12細胞を暴露することで、C2C12細胞分化を筋肉から骨へ移すこと（例えば、アルカリホスファターゼのような骨関連タンパク質の発現を特徴とする骨芽形成を誘導すること）ができる。アルカリホスファターゼは広く受け入れられている骨マーカーであり、アルカリホスファターゼ活性の検出用アッセイは骨誘導活性を証明するものとして受け入れられている。（Peel et al., J. Craniofacial Surg. 14: 284-291 (2003); Hu et al., Growth Factors 22: 29033 (2004); and Kim et al., J. Biol. Chem. 279: 50773-50780 (2004)等を参照）
【０１１１】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、アルカリホスファターゼ活性を誘発し得る。
【０１１２】
特定の実施形態において、骨誘導活性は、医用画像技術、骨サンプルの組織学的検査、又は骨の形成若しくは成長を測定するため日常的に実施される任意の方法によって検出される。特定の実施形態において、該検出はＸ線画像のような放射線画像を含む。特定の実施形態において、該検出はコンピュータ断層撮影(CT)走査を含む。場合によって、該検出は分子イメージング又は核イメージング(即ち、陽電子放射断層撮像、（PET)）を含む。特定の実施形態において、該検出は組織学的検査を含む。特定の実施形態において、該検出はヘマトキシリン‐エオジン（HE）染色を含む。
【０１１３】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、フラグメント、変異体又は誘導体分子を含むことができるが、これに限定されない。あるポリペプチドに言及する際の「フラグメント」、「変異体」、「誘導体分子」、「類似体」という用語は、言及されるポリペプチドの少なくともいくつかの特性又は生物活性を保持する任意のポリペプチドを含んで意味する。ポリペプチドフラグメントは、タンパク質分解フラグメント、欠失フラグメント、又は動物に移植した際により容易に作用部位に到達するフラグメントを含むことができる。ポリペプチドフラグメントは変異体領域を有することができ、該変異体領域は上記のフラグメント、又はアミノ酸置換、欠失、若しくは挿入によって改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチド含むことができる。非天然に存在する変異体は、該技術分野において周知の変異誘発技術で製造することができる。本開示のポリペプチドフラグメントは、保存的若しくは非保存的アミノ酸置換、欠失若しくは付加を含むことができる。本明細書に記載の変異体ポリペプチドは、「ポリペプチド類似体」を指すこともできる。本開示のポリペプチドフラグメントは、誘導体分子を含むこともできる。本明細書に記載のポリペプチド若しくはポリペプチドフラグメントの「誘導体」は、機能性側基の反応により化学的に誘導体化された1個以上の残基を有する主体ポリペプチドを指す。「誘導体」は、20種類の標準アミノ酸に天然に存在するアミノ酸誘導体を1つ以上含有するペプチドも含む。例えば、4-ヒドロキシプロリンはプロリンに置換されていてもよい；5-ヒドロキシリジンはリジンに置換されていてもよい；3-メチルヒスチジンはヒスチジンに置換されていてもよい；ホモセリンはセリンに置換されていてもよい；オルニチンはリジンに置換されていてもよい。
【０１１４】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、若しくはヘテロ二量体蛋白は、標識を含むことができる。特定の実施形態において、該標識は、基質化合物若しくは組成物の化学的変化を触媒し得る酵素標識、放射性標識、蛍光団、発色団、画像形成剤、又は金属である。前記金属は、金属イオンも含む。
【０１１５】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組換えポリペプチドは、1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸を類似の側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置換することである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において既に定義されている。これらのファミリーは、リジン、アルギニン、ヒスチジンのような塩基性側鎖；アスパラギン酸、グルタミン酸のような酸性側鎖；グリシン、アスパラギン、セリン、トレオニン、チロシン、システインのような非荷電極性側鎖；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンのような無極性側鎖；トレオニン、バリン、イソロイシンのようなベタラン側鎖；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンのような芳香族側鎖等を含む。そのため、ポリペプチド中のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸と置換される場合、置換は保存的であると認められる。もう一つの実施形態において、アミノ酸の鎖は、順序及び/又は側鎖の組成が異なるが構造的に類似した鎖と保存的に置換することができる。
【０１１６】
特定の実施形態において、本開示の組換えポリペプチドは、本明細書に開示の核酸分子又はベクターによってコードされる、又は本明細書に記載の宿主細胞によって発現される。
核酸分子、ベクター及び宿主細胞
【０１１７】
本開示は、本明細書に記載の組換えポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子に関する。
【０１１８】
特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、本明細書に記載のドメインをコードする任意の2つ以上のポリヌクレオチド配列を有する。特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、SEQ ID NOs: 32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78からなる群より選ばれる2つ以上のポリヌクレオチド配列を有する。上記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NOs: 33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、355にそれぞれ対応するドメインをコードする。特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、本明細書の表3に記載の2つ若しくは3つのドメインに対応する組み合わせをコードする2つ若しくは3つのポリヌクレオチド配列を有する。
【０１１９】
特定の実施形態において、該単離された核酸分子は、SEQ ID NOs: 115、157、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、267、275、283、291、299、307、315、323、331、339、347からなる群より選ばれるポリヌクレオチド配列を有する。上記ポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NOs: 116、158、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340、348に対応する組換えポリペプチドをそれぞれコードする。
【０１２０】
特定の実施形態において、該ポリヌクレオチド配列はコドン最適化される。
【０１２１】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子に作動可能に連結された発現制御領域を有する組換え核酸分子に関する。特定の実施形態において、該発現制御領域は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、リボソーム結合部位、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、ステムループ構造、転写終結シグナル、又はこれらの組合せである。特定の実施形態において、該発現制御領域はプロモーターである。発現制御領域は、転写制御領域及び/又は翻訳制御領域とすることができる
【０１２２】
様々な転写制御領域が当業者に知られている。例えば、、サイトメガロウィルスからのプロモーター若しくはエンハンサー（イントロン-Aに関連した前初期プロモーター）、シミアンウイルス40（初期プロモーター）、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）など（これらに限定されない）の脊椎動物細胞に機能する転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、ウサギβ-グロビンなどの脊椎動物遺伝子由来もの、又は真核細胞における遺伝子発現を制御し得る他の配列が含まれる。それに加えて好適な転写制御領域には、組織特異的プロモーター若しくはエンハンサー、又はリンホカイン誘導性プロモーター（インターフェロン又はインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。
【０１２３】
同様に、様々な翻訳制御領域が当業者に知られている。例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始若しくは終止コドン、ピコルナウイルス由来因子（特に内部リボソームエントリー部位、即ちＩＲＥＳ、またＣＩＴＥと呼ばれることもある）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
特定の実施形態において、該組換え核酸分子は組換えベクターである。
【０１２５】
ベクターは、核酸の宿主細胞へのクローニング及び/又は転写のための任意のビヒクルとすることができる。当該技術分野では多数のベクターが知られ使用されている、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス、改変真核ウイルス、改変細菌ウイルス等を挙げることができる。ポリヌクレオチドの挿入に好適なベクターは、相補的な付着端を有する選択されたベクターに適切なポリヌクレオチド断片を連結することによって達成することができる。
【０１２６】
ベクターは、ベクターを組み込んだ細胞の選択若しくは識別のための選択マーカー又はレポーターをコードするように設計することができる。選択マーカー又はレポーターの発現は、ベクターに含まれた他のコード領域を組み込んで発現する宿主細胞の選択及び/又は識別をすることを可能する。当該技術分野に知られており使用されている選択マーカーとして、例えば、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ビアラフォス除草剤、スルホンアミドなどに耐性を提供する遺伝子；アントシアニン調節遺伝子、イソペンテニル転移酵素遺伝子など表現型標識用遺伝子を挙げることができる。当該技術分野に知られており使用されているレポーターとして、例えば、ルシフェラーゼ(Ｌuc)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベタ-ガラクトシダーゼ(LacZ)、ベターグルクロニダーゼ(Gus) などを挙げることができる。選択マーカーをレポーターとして認めることもできる。
【０１２７】
「プラスミド」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子をしばしば担持し、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を意味する。そのような要素は、任意源に由来する自律複製可能な配列、ゲノム統合配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線形、円形若しくはスーパーコイル状である一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。また、選択された遺伝子産物のために、適切な3'端非翻訳配列と共にプロモーター断片若しくはＤＮＡ配列を導入することができるよう、多数のヌクレオチド配列を連結し又は組み換えて特定の構築とすることがもてきる。
【０１２８】
使用可能な真核生物ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスのベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が含まれるが、これらに限定されない。非ウイルス性ベクターには、プラスミド、リポソーム、帯電脂質(サイトフェクチン)、ＤＮＡ-タンパク質複合体、生体高分子等が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点のような非転写要素、発現される遺伝子に連結する適切なプロモーター及びエンハンサー、他の5'端若しくは3'端隣接非転写性配列、5'端又は3'端隣非翻訳配列等を含むことができる。例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、アクセプター部位、転写終結配列等を挙げることができる。
【０１２９】
組換えベクターは、挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳のために必要な要素を有する任意の核酸構築を意味する、「組換え発現ベクター」とすることができる。ＲＮＡウイルスベクターの場合、該必要な要素は、適切な宿主細胞に導入する際の複製及び翻訳のために必要な要素である。
【０１３０】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子をベクター中に挿入することを含む組換えベクターの製造方法方法に関する
【０１３１】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子又は組換え核酸分子を含む単離された宿主細胞に関する。特定の実施形態において、該単離された宿主細胞は、本明細書に記載の組換えベクターを含む。
【０１３２】
核酸分子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質転換、ＤＡＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、ＤＮＡクタートランスポーターなど当該技術分野に周知の方法によって宿主細胞に導入することができる。
【０１３３】
本開示は、本明細書に記載の単離された核酸分子又は組換え核酸分子を宿主細胞に導入することを含む組換え宿主細胞の製造方法に関する。特定の実施形態において、該方法は、本明細書に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することを含む。
【０１３４】
本明細書に記載の宿主細胞は、本明細書に記載の単離された核酸分子又は組換え核酸分子のいずれかを発現することができる。宿主細胞の核酸分子の発現について用いられる「発現」という用語は、ＲＮＡ又はポリペプチドのような生化学な産物が遺伝子によって生産される方法ことを指す。該方法は、細胞内の遺伝子の機能を呈示する任意の表現を含む、例えば、一過性の発現又は安定した発現等を挙げることができるが、これらに限定されない。また、メッセンジャーＲＮＡへの遺伝子の転写及びそのｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
宿主細胞には、、原核生物又は真核生物が含まれるが、これに限定されない。好適な宿主細胞の代表例は、細菌細胞、酵母などの真菌細胞、昆虫細胞、単離された動物細胞等を含む。細菌細胞は、例えば、大腸菌のようなグラム陰性若しくは陽性細菌を含む。また、宿主細胞として乳酸菌種若しくはバチルス種を代わりに用いることもできる。真核細胞は、哺乳動物由来の確立された細胞株を含むが、これらに限定されない。哺乳動物由来の確立された細胞株の例としては、COS-7、L、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＢＨＫ細胞株等を挙げることができる。
【０１３６】
宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は本開示の核酸分子の増幅のため適切に改良された従来の栄養培地に培養することができる。温度、phなどの培養条件は、当業者に対して明らかであり、発現のために選択された宿主細胞を使用する際に、既知の任意の使用条件又は改良された条件とすることができる。
【０１３７】
本開示は、本明細書に記載の単離された宿主細胞を培養し、宿主細胞から組換えポリペプチドを単離することを含む、組換えポリペプチドの製造方法に関する。培養された宿主細胞からポリペプチドを単離するための技術は、当業者に対して明らかであり、宿主細胞からポリペプチドを単離する際に、既知の任意の使用条件又は改良された条件とすることができる。
組成物と装置
【０１３８】
本開示は、本明細書に記載の組換えポリペプチド、ホモ二量体蛋白、又はヘテロ二量体タンパク質を含む組成物に関する。
【０１３９】
特定の実施形態において、組成物は、生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤をさらに含む(文献Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PAを参照)。上記生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、対象に対して非毒性であるものを含むことができる。特定の実施形態において、組成物又は組成物の1つ以上の成分は無菌である。無菌成分は、例を挙げると、濾過(例えば、無菌濾過膜)又は照射(例えば、ガンマ線照射)により調製することができる。
【０１４０】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、骨若しくは骨片の同種異系移植片又は自体移植片をさらに含む。
【０１４１】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、骨移植片代用品をさらに含む。
【０１４２】
特定の実施形態において、該骨移植片代用品はバイオセラミック材料である。「バイオセラミック材料」及び「バイオセラミック」という用語は、本明細書において交換可能に使用することができる。特定の実施形態において、バイオセラミックは体内に対して生体適合性であり、再吸収可能である。特定の実施形態において、バイオセラミックは任意のリン酸カルシウム塩系バイオセラミックである。特定の実施形態において、バイオセラミックは、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、水酸アパタイト、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムからなる群より選ばれる。
【０１４３】
特定の実施形態において、該骨移植片代用品は生体活性ガラスである。特定の実施形態において、生体活性ガラスは、二酸化ケイ素(SiO2)、酸化ナトリウム(Na2O)、酸化カルシウム(CaO)又は酸化白金(Pt2O5)を含む。
【０１４４】
本開示は、本明細書に記載のホモ二量体蛋白と生分解性リン酸カルシウム担体（例えば、β−ＴＣＰ）を含む生分解性組成物を関する。前記ホモ二量体蛋白は、ある部位に骨量骨量を形成するように骨形成を誘導できる。前記ホモ二量体蛋白の有効量は、生分解性リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜3.2mg/gである。前記生分解性リン酸カルシウム担体は、担体の全体に孔があり、且つ、孔径が300μm〜600μm程度で、空孔率が70％以上程度である。
【０１４５】
特定の実施形態において、該生分解性組成物は、鼻唇溝、眉間しわ、中顔面組織、アゴ、オトガイ、頬、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる組織を増強することに好適である。
【０１４６】
特定の実施形態において、前記部位は、長骨骨折欠損、隣接する椎骨体の間、非癒合性骨欠損、上顎骨骨切り術切開、上顎骨骨切り術切開、下顎骨骨切り術切開、枝矢状骨切り術切開、オトガイ形成術切開、急速口蓋拡大術切開、隣接する椎骨体横突起の縦方向に延びる間、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。
【０１４７】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白の単回投与量は0.006 mg〜15 mg程度である。
【０１４８】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、形成した骨量骨量を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限る。
【０１４９】
本開示は、リン酸カルシウム担体、生分解性マトリックス及び本明細書に記載のホモ二量体蛋白を有する徐放性組成物に関する。
【０１５０】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、アルファ−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、二相リン酸三カルシウム（ＢＣＰ）及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。
【０１５１】
特定の実施形態において、該生分解性マトリックスは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸-グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びこれらの組合せからなる群より選ばれる１種である。
【０１５２】
特定の実施形態において、該徐放性組成物は、(a)リン酸カルシウム担体約2〜11% (w/w) 程度；(ｂ) 生分解性マトリックス約88〜97% (w/w) ；(c) ホモ二量体蛋白約0.017〜0.039% (w/w)を含む。
【０１５３】
本開示は、骨空胴を充填する成型性組成物であって、該成型性組成物に対して90〜99.5重量%程度の成型性マトリックス、及び本明細書に記載のホモ二量体蛋白を含有する成型性組成物に関する。該成型性組成物において、25％程度未満の該ホモ二量体蛋白は、移植後1時間、24時間、48時間、72時間、168時間、240時間、もしくは336時間ほど該成型性組成物から放出される。
【０１５４】
本開示は、本明細書に記載の分解性組成物、及び生分解性リン酸カルシウム担体を保つように構成される脊椎融合ケージ（例えば、PEEKケージ）を含有する脊椎融合装置に関する。
方法
【０１５５】
本開示は、治療を必要とする対象における長骨骨折の癒合を促進する方法において、
組成物を調製することを含んで、
該組成物において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白を連行し含有して、生分解性リン酸カルシウム担体（例えば、β−ＴＣＰ）が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、長骨骨折の治癒を該生分解性リン酸カルシウム担体の大きさに限って、
骨折が発生した部位に該組成物を移植することを含んで、
且つ、該ホモ二量体蛋白の量が、リン酸カルシウム担体に対して約0.03mg/g〜約3.2mg/gである
ことを特徴とする長骨骨折の癒合を促進する方法に関する。
【０１５６】
特定の実施形態において、該長骨骨折の癒合を促進する方法は、リン酸カルシウム担体の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出することをさらに含み、且つ、リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は約0.4〜約1.8である。
【０１５７】
本開示は、上側椎骨と下側椎骨を露出させる、
上側椎骨と下側椎骨を融合する位置を特定する、
上側椎骨と下側椎骨それぞれの骨面を前記融合する位置に露出させる、
該位置に、本明細書に記載のホモ二量体蛋白及び生分解性リン酸カルシウム担体（例えば、β−ＴＣＰ）を投与する、という工程を含む
ことを特徴とする脊椎融合促進方法に関する。
【０１５８】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、非圧縮性送達ビヒクルであり、且つ、該非圧縮性送達ビヒクルは、2つの骨面の間に骨形成が望まれるが自然には発生しない位置に適用される。
【０１５９】
特定の実施形態において、該生分解性リン酸カルシウム担体は、少なくとも１つの移植棒を含有し、且つ、該移植棒は上側椎骨と下側椎骨の間に縦方向に延びるような位置に適用される。
【０１６０】
特定の実施形態において、選択された位置は隣接する椎骨体の間、及び隣接する椎骨体横突起の縦方向に延びる間である。
【０１６１】
本開示は、奇形又は退化した関節に、本明細書に記載のホモ二量体蛋白と生分解性リン酸カルシウム担体を投与することを特徴とする関節固定促進方法を開示した。
【０１６２】
特定の実施形態において、該ホモ二量体蛋白は、奇形もしくは退化した関節にホモ二量体蛋白を0.006 mg〜10.5 mg程度投与することを含む。
【０１６３】
さらに、本発明は、必要とする対象の脊椎に、隣接する２つの椎骨体を融合させるための骨量骨量を形成する方法に関し、
骨量骨量を形成するための組成物を調製する、
該組成物において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白を連行し含有して、緩効性生分解性担体が該ホモ二量体蛋白の体内からの流出を十分に通さないように硬化して、骨量骨量の形成を該緩効性生分解性担体の大きさに限って、
隣接する２つの椎骨体の間に該組成物を導入する、
緩効性生分解性担体が自身の分解につれて、連行したホモ二量体蛋白を該部位に次第に放出する、
さらに、該ホモ二量体蛋白の量が、該部位に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteである
ことを特徴とする方法に関する。
【０１６４】
特定の実施形態において、該緩効性生分解性担体は多孔質構造を有し、隣接する２つの椎骨体の細胞がその多孔質構造に移行して骨量骨量を形成する。
【０１６５】
特定の実施形態において、該緩効性生分解性担体は初期体積を有し、緩効性生分解性担体が吸収されるにつれて、骨量が緩効性生分解性担体の該初期体積を置換する。
【０１６６】
本発明は、後方固定法もしくは経椎間孔融合法であって、
隣接する椎骨体の椎間スペースに、椎間板インプラントを受容するための板空間を準備する、
椎間板インプラントに緩効性担体を導入する、
該緩効性担体において、本明細書に記載のホモ二量体蛋白の量が、該緩効性担体に対して約0.2 mg/site〜約10.5 mg/siteであって、
且つ、骨量を形成するように該椎間板インプラントを該板空間に導入する、
ことを特徴とする、必要とする対象の隣接する椎骨体を融合する方法
【０１６７】
以下の実施例は、例示のためのものであり、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例】
【０１６８】
[実施例1]   プラスミドの構築
【０１６９】
pQE-80L-Kanaプラスミドの構築のために、BspHI（BioLab社製）によって、カナマイシン耐性遺伝子をpET-24a(+) (Novagen社製)から切断し、875-bpのカナマイシン耐性遺伝子(+3886 から+4760まで)フラグメント(SEQ ID NO：1)を生成した。pQE-80Lベクター(Qiagen社製)は、BspHIで消化され消化、アンピシリン耐性遺伝子(+3886から+4760まで)フラグメント(SEQ ID NO：2)を除去した。そして、pQE-80Lベクターに前記カナマイシン耐性遺伝子フラグメントを結合させ、4513-bpのプラスミド（pQE-80L-Kana、SEQ ID NO：3）を生成した。
[実施例2]   酵母ツーハイブリッドスクリーニング
A. ベイトプラスミドの構築
【０１７０】
酵母ツーハイブリッドスクリーニングは、市販のシステムを用いて行った(Matchmaker Two-Hybrid System 2; 米国カリフォルニア州パロアルト市CLONTECH社製)。ベイトプラスミド構築のために、pCRII/ActRIIB (Hilden., et al. (1994) Blood 83(8):2163-70)を鋳型として、PCRによって、アクチビン受容体IIB型(ActRIIB)の細胞外ドメインのコード領域(+103 bpから+375bpまで、SEQ ID NO:4)を生成した。ActRIIBの細胞外ドメイン(ActRIIBecd)を増幅するために使用されるプライマー（XmaI: 5'- CCCGGGACGGGAGTGCATCTACAACG-3'(SEQ ID NO: 5); SalI: 5'-GTCGACTTATGGCAAATGAGTGAAGCGTTC-3'(SEQ ID NO: 6)）は、XmaI及びSalI制限部位をそれぞれ5'端に含むように設計された。総量５０μＬに10ngの鋳型DNA、0.2μmの各プライマー、0.2 mMの各dNTP、1X PCRバッファ(10 mM Tris-HCl、 pH8.3、50 mM KCl 及び1.5 mM MgCl2)、及び1.25 U  DNAポリメラーゼ(Promega)を用いて、PCRを行った。PCRは、95℃で３０秒の変性、4５℃で1分のアニーリング、そして68℃で5分の伸長反応を、30サイクルのプログラムで行った。PCR産物は、XmaI及びSalIで消化消化されて、pAS2-1ベクター(CLONTECH社製、GenBank Accession No. U30497)におけるGAL4のDNA結合ドメインにいる同じ制限部位にインフレームでサブクローンされ、pAS-ActRIIBecdプラスミドを生成した。
【０１７１】
ActRIIBと天然に存在する変異体の核酸配列及びリペプチド配列が知られている。例えば、野生型ActRIIBの核酸配列はSEQ ID NO: 7であって、対応するポリペプチド配列はSEQ ID NO: 8である。ActRIIBの細胞外ドメイン(ActRIIBecd)はSEQ ID NO: 9であって、SEQ ID NO: 8における27から117までの残基に対応し、SEQ ID NO: 4の核酸配列によりコードされている。
B. pACT2/MC3T3 cDNA ライブラリーの構築
【０１７２】
pACT2/MC3T3 cDNA ライブラリー構築のために、cDNAライブラリーインサートが1.5kb未満になるようにTu Q., et al. (2003, J Bone Miner Res. 18(10):1825-33)により記載されたMC3T3-E1マウス骨芽細胞cDNAライブラリーのクローン約7×106個を、pACT2ベクター(CLONTECH社製、GenBank  Accession No.U29899)に構築した。s1ヌクレアーゼ (Invitrogen  Life  Technologies社製、cDNA Synthesis System 、CAT. No. 18267-013) の処理後、二本鎖cDNAはpACT2ベクター内にクローン化された。且つ、前記pACT2ベクターは、GAL4活性化ドメインを有する融合蛋白を発現するように、SmaIにより消化消化された。そして、pACT2/MC3T3イブラリーは、製造者からのプロトコルに従って、「HIS3 Jump-Start」(米国カリフォルニア州パロアルト市CLONTECH社製)の手順によってクリーニングされた。別の実施形態において、pACT2 cDNAライブラリーは、市販品から得られた。
Ｃ.酵母株の選抜
【０１７３】
Saccharomyces cerevisiae Y190細胞(MATa, ura3-52, his3-D200, lys2-801,ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4D, gal80D, URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ, cyhr2,LYS2::GALUAS-HIS3TATA-HIS3;米国カリフォルニア州パロアルト市CLONTECH社製)をベイトプラスミドで形質転換し、トリプトファン欠如合成デキストロース培地(SD-Trp)より選択した。SD-Trp培地で生長した該形質転換体は、後にpACT2/MC3T3 cDNAライブラリーで形質転換され、トリプトファン及びロイシンが欠如している培地(SD-Trp-Leu)より選択された。ベイト及びライブラリーで共形質転換されたクローンは回収され、リーク(Leak)の成長を抑制するように、トリプトファン、ロイシン及びヒスチジンが欠如し且つ30mM  3-アミノ-1、2、4-トリアゾール(米国ミズーリ州セントルイス市Sigma-Aldrich,社製)を有する培地(SD-Trp-Leu-His)に再培養された。さらに、この段階で選択されたクローンの、βガラクトシダーゼ活性を測定した。プレートは30℃で3日間培養した後、撮像された。この実験を独立して3回以上行ったところ、同様の結果が得られた。そして、個別の陽性クローンから、pACT2ライブラリープラスミドを精製し、大腸菌によって増幅した。表1に示された陽性クローンにおけるcDNAインサートの配列決定(プライマー  5'-AATACCACTACAATGGAT-3'、SEQ ID NO:10)は、Perkin-Elmer ABI Automated DNA  Sequencerによって行った。
【表１】
2019525767.tif 000082
2019525767.tif 000083
[実施例3] 誤りがちな(Error-prone) PCR ランダム変異誘発
A. プラスミドから設計されたプライマーを用いた突然変異誘発
【０１７４】
実施例2の陽性クローンのDNA配列を、変異誘発した。
【０１７５】
一つの実施形態において、配列決定された陽性クローンはpQE-80L-Kanaにサブクローンされて、PCRランダム変異誘発を行った。先ず、表1に示された陽性クローンDNA配列増幅のためのプライマーは、5'端にMseI又はBamHI制限部位を含むように設計された。PCR条件は、実施例2に記載した通りであった。PCR産物は、MseI-BamHIにより消化消化され、インフレームでpQE-80L-Kanaベクターの同一制限部位へサブクローンされた。そして、Leung et al. (1989, Technique, 1, 11-15)が記載した誤りがちなPCRに基づき、いくつかの修正を伴い、サブクローンされたpQE-80L-Kanaプラスミドにランダム変異を導入した。線状化pQE-80L-Kana (XhoI消化済)は鋳型DNAとして使用された。変異誘発PCR増幅に用いたプライマー(MseI: 5'-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAA (SEQ ID NO: 29); BamHI: 5'-CCGGGGTACCGAGCTCGCATGCGGATCCTTA (SEQ ID NO: 30))は、それぞれ5'端にMseI又はBamHI制限部位を含むように設計された。総量５０μＬに10ngの鋳型DNA、40pMの各プライマー、、0.2 mMの各dNTP、1X PCRバッファ(10 mM Tris-HCl、pH8.3、50 mM KCl 及び1.5 mM MgCl2)、0.2-0.3 mMのMnCl2、1%ジメチルスルホキシド、及び1.25 U Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社製, Carlsbad, Calif.) を用いて、変異誘発PCRを行った。変異誘発PCRは、94℃で３０秒の変性、55℃で2分のアニーリング、そして72℃で3分の伸長反応を、30サイクルのプログラムで行いた。PCR産物は、MseI及びBamHIにより消化消化された。該フラグメントは、MseI及びBamHIにより消化消化されたpQE-80L-Kanaの4.5-kbフラグメントに結合させた。生成したpQE-80L-Kanaの誘導体で、E. coli BL21 (Novagen社製) を形質転換した。そのコロニーは、37℃でLTB-アガー培地(1%v/vトリブチニン、0.1%v/v Tween 80、100mg/Lカナマイシン、0.01μMイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド、1.5% アガーを添加したＬＢ)で生長させた。
B.表1のプライマーを用いた突然変異誘発
【０１７６】
もう一つの実施形態において、前述したLeung et al. (1989, Technique, 1, 11-15)が記載した誤りがちなPCRに基づいて、いくつかの修正を伴い、ランダム変異を陽性クローン由来のpACT2ライブラリープラスミドに導入した。線状化pQE-80L-Kana (XbaI消化済)は鋳型DNAとして使用された。表1に示されたMseI 及びBamHI制限部位を有する合成オリゴヌクレオチドを、変異誘発PCR増幅のために用いた。総量５０μＬに10ngの鋳型DNA、40pMの各プライマー、0.2 mMの各dNTP、1X PCRバッファ(10 mM Tris-HCl、pH8.3、50 mM KCl 及び1.5 mM MgCl2)、0.2-0.3 mMのMnCl2、1%ジメチルスルホキシド、及び1.25 U Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen社製, Carlsbad, Calif.) を用いて、変異誘発PCRを行った。変異誘発PCRは、94℃で３０秒の変性、55℃で1.5分のアニーリング、そして72℃で4分の伸長反応を、30サイクルのプログラムで行った。PCR産物は、MseI及びBamHIにより消化消化された。該フラグメントは、MseI及びBamHIにより消化消化されたpQE-80L-Kanaの4.5-kbフラグメントに結合させた。生成したpQE-80L-Kanaの誘導体で、E. coli BL21 (Novagen社製) を形質転換した。そのコロニーは、37℃でLTB-アガー培地(1%v/vトリブチニン、0.1%v/v Tween 80、100mg/Lカナマイシン、0.01μMイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド、1.5% アガーを添加したＬＢ)で生長させた。
[実施例4] ActRIIBecd関連ポリペプチドの発現
【０１７７】
実施例3に記載した安定的に形質転換されたE. coli細胞を、実施例2の変異誘発したDNA由来のActRIIBecd関連ポリペプチド（即ち、ドメイン）を発現するのために用いた。
A.形質転換体の発酵
【０１７８】
一つの実施形態において、pQE-80L-Kanaの誘導体を有するE. coli  BL21形質転換体は、65 mL 培地(10g/L BBL PhytonePeptone、5g/L BactoYeast エキス及び10g/L NaClを含む)及び25-32μg/mLのカナマイシンを含んだ500 mL三角フラスコの中に、30℃〜37℃で180±20 rpmの攪拌で一晩（約10時間）培養した。5-50 L発酵槽の中に、37-420 mLの一晩培養した培養物を、23.8-38.5 μg/mLのカナマイシン及び1-3 mmol/Lイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含んだ3.7-42 LのTB 培地(1 L水に18 gのBBL  Phytone Peptone、36gのBactoYeast エキス、18.81gの KH2PO4、6 mLのGlycerolを含む培地)に入れて、37℃〜42℃温度調節範囲において260-450 rpmの攪拌で10〜24時間培養した。そして、GSAローター (Sorvall)に8，０００ｒｐｍで10分間遠心分離を行いた後、氷水浴で細胞を回収した。
【０１７９】
もう一つの実施形態において、新たに培養したコロニー（pQE-80L-Kanaの誘導体を有するE. coli  BL21形質転換体）を1つ又は新たに培養した培養物の10ｍLを、1LのLB液体培地(100 mg/Lカナマイシンを含む)に、OD600値が0.4-0.8.に到達するまで培養する。そして、40 又は 400 μMのIPTGを入れて、37℃で3〜5時間の反応によってポリペプチドの発現を誘導する。約8，０００ｒｐｍで遠心分離を行いた後、細胞を回収する。
B. E. coli由来ポリペプチドの回収及び精製
【０１８０】
E. coli  BL21/pQE-80L-Kana誘導体細胞は、実施例4Ａに記載したように発酵させた。一つの実施形態において、それらの誘導体細胞の細胞破砕及びポリペプチド回収は、4℃で行った。18ｇの湿潤細胞は、0.1M TRIS/HCl、10 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸）、1 mM PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)を含む総量６０mμＬの細胞破砕バッファー(pH 8.3)に懸濁させた。メーカーの指示に従って該細胞を細胞破砕装置Frenchpress (SLM Instruments Inc社製)に2回通過させた後、細胞破砕バッファーを加えて総量を200 mLとした。懸濁液を、15，000ｒｐｍで20分間遠心分離させた。得られたペレットを、1M NaCl を含む100mlの細胞破砕バッファーに懸濁させて、上記のように10分間遠心分離を行った。そして、得られたペレットを、1% Triton X- 100 (Pierce社製) を含む100mlの細胞破砕バッファーに懸濁させて、もう一度上記のように10分間遠心分離を行った。洗浄されたペレットは、20 mM Tris/HCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1% DTT(ジチオスレイトール)を含む総量５０mLの溶液に懸濁させて、テフロン組織グラインダーにより同質にされた。得られた懸濁液は、非溶解型粗ポリペプチドを含んだ。
【０１８１】
上記の実施形態で得られたポリペプチド懸濁液10ｍLを、10%酢酸によりｐＨを２.5の酸性に調整し、エッペンドルフ型遠心機により室温で遠心分離を行った。上清液を流速1.4 mL/minの10%酢酸で、Sephacryl S-100 カラム (Pharmacia社製, 2.6×78cm)を用いてクロマトグラフィーを行った。適切な期間に溶出したポリペプチドを含む画分をプールした。該材料は、生物活性を有するポリペプチドを得るリフォールディングのため、又は精製のために使用された。
【０１８２】
上記の実施形態で得られた5 mgのポリペプチドを、50 mM Tris/HCl pH 8.0、 1M NaCl、 5 mM EDTA、 2 mM還元型グルタチオン、1 mM 酸化型グルタチオン及び33 mM Chaps (Calbiochem社製)を含む総量140mLの溶液に溶解させた。4℃で72時間後、塩酸で溶液のpHをpH 2.5に調整し、Amicon stirred cellsの中のYM 10膜(米国マサチューセッツ州ダンバース町Amicon社製)によって、混合液を10倍に濃縮するように限外濾過した。濃縮された混合液は、10 mM塩酸で元の体積に希釈され、同じ方法によって最終容量10 mLに濃縮された。形成した沈殿物は、5000gで30分間遠心分離することにより除去した。非還元条件下で、SDS-PAGEによって、上清液がジスルフィド結合ポリペプチドを有することを判定した。製剤の生物活性は、BIAcore（商標）アッセイより測定された(実施例5)。
【０１８３】
上記の実施形態により濃縮された溶液は、1mL/minの流速でMono S HR 5/5 カラム(Pharmacia社製)に注入された。該カラムは、85% バッファーA (20 mM 酢酸ナトリウム、30%イソプロパノール、 pH 4.0)及び15% バッファーB(1M 塩化ナトリウムを含むバッファーA)の混合液で平衡化された。バッファー混合液の組成恒常を保つように、280nm波長での吸光度読取数値がベースラインレベルに達するまで同じ流速で該カラムを洗浄した。そして、20分間以上の線形勾配になるように、平衡状態で注入を続けて、50% バッファーA/50% バッファーBで終了させた。非還元条件下のSDS-PAGEと生物活性測定によると、生物活性ポリペプチドは、勾配開始から約9分後に溶出され、回収された。
【０１８４】
もう一つの実施形態において、該ポリペプチドは、実施例4Aで回収した細胞の封入体により調製された。室温で一晩に抽出され(pH 5の50 mM 酢酸ナトリウム、8 M 尿素、14 mM  ２−メルカプトエタノール)、水に対して徹底的に透析した後、該ポリペプチドは、流速1.8 mL/minで、1%酢酸又は5 mM塩酸によってSephacryl S-100 HRカラム(Pharmacia社製)により富化させて、リフォールディングして濃縮させた。最後に、FPLC (Fractogel EMD SO3- 650、 50 mM 酢酸ナトリウム、pH 5、30% 2-プロパノール)によって、0 〜1.5 Mの NaCl勾配で溶出された。適切な期間に溶出したポリペプチドを含む画分をプールした。水に対して透析した後、ポリペプチドは凍結乾燥されて、-20℃で保存された。ポリペプチドの純度は、クーマシーブリリアントブルー染色に伴って、SDS-PAGEにより分析された。
【０１８５】
もう一つの実施形態において、実施例4A各サンプルの細胞ペレット1ｇを、10 mM TRIS/HCl、150 mM NaCl、1mM EDTA、及び5 mM DTTを含む pH 8.0の 細胞破砕バッファー10-20 mLで再懸濁させ、装置(Misonix S4000)とEnhance Booster #1 probeを用いて、30 A(装置度盛)の条件で5分間、超音波細胞破砕処理を行った。必要に応じ、細胞ライセート混合物を遠心分離(18,000 x gで20分間遠心分離、又は15,000 x gで30分間遠心分離)により清澄化し、1 v/v % Triton X-100を含む10-20 mLの細胞破砕バッファーでペレットを数回洗浄し、上記のように10分間遠心分離した。細胞ライセートは、6 M尿素を含む100-200 mLの細胞破砕バッファーで溶解させて、上記のように10分間遠心分離させた。ポリペプチドを含む上清液は、更に精製するのために保存された。
【０１８６】
上記上清液は、リフォールディングバッファー(100 mL Tris/HCl pH 8.0、500 mM アルギニン-HCl、5 mM EDTA、25 mM Chaps、2 mM酸化型グルタチオン、及び1 mM 還元型グルタチオン)により溶解させた。室温で4-7日後、ポリペプチドは、FPLC (Fractogel EMD SO3-650、 20mM 酢酸ナトリウム、pH 4-5、30% 2-プロパノール及び25 mM Chaps)によって、0 〜3 Mの NaCl勾配で溶出されて精製された。適切な期間に溶出したポリペプチドを含む画分をプールした。ポリペプチドの純度は、クーマシーブリリアントブルー染色に伴って、SDS-PAGEにより分析された。
【０１８７】
特定の実施形態において、実施例3に記載した一過性発現システムの共発現によって本開示のヘテロ二量体を調製することができる。且つ、該ヘテロ二量体を、培養培地から単離し、実施例5のアッセイでスクリーニングすることができる。
[実施例5] 生体外BIAcore（商標） アッセイ
【０１８８】
バイオセンサー実験。一つの実施形態において、BIAcore（商標）T100/T200装置((Pharmacia Biosensor AB社製)でマルチチャンネルモード（フローセル1+2+3+4を含むシリアル流路）により実験を行った。流量は10μl /分で、温度は25℃、データは2.5ポイント/sで記録された。アミンカップリングにより、センサチップCM5の4つ全てのセグメントを密度が2000 pg/mm2(2000共鳴ユニット)となるようにストレプトアビジン(Sigma社製)で被覆した。ActRIIBecd (10mg)及びamine-PEG3-Biotin (10 mg, 米国イリノイ州ロックフォード市Pierce社製) を200μlのH2Oに溶解させ、10mgのNaCNBH3を添加して、ビオチン化されたNaCNBH3を調製した。反応混合物を70℃で24時間加熱し、その後、さらに10mgのNaCNBH3を添加し、もう一度反応物を70℃で4時間加熱した。混合物を室温まで冷却した後、スピンカラム(分画分子量3000、molecular weight cut off、ＭＷＣＯ)で脱塩した。ビオチン化ActRIIBecdを収集し、凍結乾燥し、ストレプトアビジン(SA)チップの調製に使用した。アミノビオチニル化されたActRIIBecdを50-250共鳴ユニット(RU)の密度で、フローセル2-4に、10mM酢酸ナトリウム(pH 4.0)の中で20μmの濃度、5μL/分の流速で10分間固定化した。。保存されたポリペプチドをグリシンバッファー（100mlの水に 2.5gのグリシン、0.5gのスクロース、37m gのLグルタミン酸塩、10mgの塩化ナトリウム、10 mg のTween 80 を含む、ph4.5）に溶解して10 mg/mLの溶液を調製し、上記のグリシンバッファーで希釈して各濃度の分析物を調製した。分析物(前記ActRIIBecd 関連ポリペプチド、即ち、ドメイン)の流れが最初にフローセル1(コントロール)を通り、次いでフローセル2（ビオチン化ActRIIBecd）を通る間に、センソグラムを記録した。フローセル2に得られたセンソグラムから、フローセル1に得られたセンソグラムを減じた。
装置により供給されたプログラム(BIA evaluation 2.1; ソフトウェアハンドブック1995; Pharmacia  Biosensor AB)を用いて、1.11 nM、3.33 nM、10 nM、30 nM及び90nMの分析物で得られたセンソグラムの平衡結合、会合速度、及び解離速度を評価した。分析物及びウシ血清アルブミン(陰性コントロール)を表2に列挙した。上記のPerkin-Elmer ABI Automated DNA Sequencerを用いて、アルブミンよりも高い親和性を有する分析物に関連するクローンにおけるpQE-80L-Kana誘導体の配列決定(プライマー 5'-CTCGAGAAAT CATAAAAAAT TTATTTG-3' (SEQID NO: 31))を行った。
【表２】
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[実施例6] 組換えポリペプチドの製造
【０１８９】
親和性定数を向上させることができるか否かを判定するため、いくつかの修正を伴い、Atanassov et al. (2009, Plant Methods,5:14)に記載されたPCR-融合の手順を用いて表2の個々のドメインを互いに融合させ、組換えポリペプチドを製造した。Phusion DNAポリメラーゼ(フィンランドFinnzymes 社製)及び標準サーマルサイクラーを用いて、PCR-融合を行った。Gateway組換え反応をBP Clonase II及びLR Clonase II酵素混合物(Invitrogen)で行った。Nojima et al.(1990, Gene, 96 (1): 23-28)に基づいて、コンピテントE. coli DH5α 細胞を用意した。そして、QIAprep（商標） Spin Miniprep Kit 及びQIAquick（商標） Gel Extraction and PCR purification kits(ドイツQiagen社製)を用いて、プラスミドDNA及びPCR断片を精製した。
【０１９０】
DNA鋳型、PCRプライマー、及び得られた組換えポリペプチドのDNA/ポリペプチド配列を表3に示す。PCR融合は、プラスミド鋳型由来の2つ又は3つの並行PCR増幅を含む。これらの並列反応に得られたゲル精製PCRフラグメントで、シングルオーバーラップエクステンションによって、増幅したフラグメントのPCR融合を行った。ここで、Phusion DNAポリメラーゼガイドライン(NewEnglandBiolabs: Phusion（商標）High-Fidelity DNA  Polymerase. Manual) に従った反応混合物及び条件を使用した全てのPCR増幅は、サイクルパラメータが同一であった。プラスミドテンプレートのアニーリング温度は55℃であった。
【０１９１】
16 μlの2つのPCRフラグメント混合物（通常フラグメントが各8 μl、約200-800ng DNA）、6 μlの5× Phusion HFバッファー、3 μlの2 mM dNTP mix、0.3μlのPhusion DNA（商標）ポリメラーゼガイドライン(2 U/μl)を含む総量30 μlのオーバーラップエクステンション反応液を用いて、2つPCRフラグメントの融合を行った。オーバーラップエクステンション反応液にプライマーは添加されなかった。3つのPCRフラグメントを融合した場合には、18個のPCRフラグメント混合物（通常フラグメントが各6 μl）を使用した。一般には、正確なDNA濃度を確認することなく、等体積の精製されたPCR断片を使用した。増幅されたPCR断片のモル比が実質的に異なっていると思われる場合には（アガロース電気泳動後のDNAバンド強度の推定により5〜7倍を越える）、それに応じて増幅されたPCR断片の体積を調整した。反応液は、98℃で３０秒間、60℃で1分間、そして72℃で7分間反応させた。オーバーラップエクステンション反応後に得られたDNAを、PCR精製キットを用いて精製した。PCR産物は消化され、上記のタンパク質/ポリペプチド発現のためにpQE-80L-Kanaベクター中にクローニングされた。ActRIIBecdに対する精製されたタンパク質/ポリペプチドの親和性は、上記に開示したBIAcore（商標） T100/T200 (GE Healthcare)によって評価され、実施例5のBIAevaluation software ver. 4.1 (GE Healthcare)によって分析された。
【表３】
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【０１９２】
上記データは、下記の2つのクローンの組み合わせから形成された組換えポリペプチドの親和性定数(KD)が各単一クローンの個々のポリペプチドより低かったことを示した：クローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:188)、クローン番号10に作動可能に連結されたクローン番号15(SEQ ID NO:194)、クローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号15(SEQ ID NO:200)、クローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号21(SEQ ID NO:206)、クローン番号10に作動可能に連結されたクローン番号21(SEQ ID NO:212)、クローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:218 )、クローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:224)、クローン番号8に作動可能に連結されたクローン番号14(SEQ ID NO:230)、クローン番号8に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:236)、クローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:242)、クローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:248)、クローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号14(SEQ ID NO:254)。即ち、上記の組み合わせから生成した組換えポリペプチドはActRIIBecdに対して、クローン番号8(SEQ ID NO: 35)、クローン番号10(SEQ ID NO: 39)、クローン番号14(SEQ ID NO: 47)、クローン番号15(SEQ ID NO: 49)、クローン番号19(SEQ ID NO: 57)、クローン番号21(SEQ ID NO: 61)を含む各単一クローンから生成した個々のポリペプチドよりも高い親和力を有した。
【０１９３】
さらに、クローン番号8(SEQ ID NO: 35)、クローン番号10(SEQ ID NO: 39)、クローン番号14(SEQ ID NO: 47)、クローン番号15(SEQ ID NO: 49)、クローン番号19(SEQ ID NO: 57)、クローン番号21(SEQ ID NO: 61)から3つのクローンを組み合わせて組換えポリペプチドを生成した。驚くべきことに、下記の3つのクローンの組み合わせから形成された組換えポリペプチドの親和性定数(KD)は、単一クローンの個々のポリペプチド又は2つのクローンの組み合わせより低かった:クローン番号15及びクローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号10 (SEQ ID NO: 260)、クローン番号10及びクローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号15 (SEQ ID NO: 268)、クローン番号15及びクローン番号10に作動可能に連結されたクローン番号21 (SEQ ID NO: 276)、クローン番号10及びクローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号21 (SEQ ID NO: 284)、クローン番号14及びクローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:292)、クローン番号8及びクローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号14(SEQ ID NO:300)、クローン番号8及びクローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:308)、クローン番号14及びクローン番号8に作動可能に連結されたクローン番号19(SEQ ID NO:316)、クローン番号14及びクローン番号21に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:324)、クローン番号15及びクローン番号19に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:332)、クローン番号19及びクローン番号14に作動可能に連結されたクローン番号10(SEQ ID NO:340)、クローン番号21及びクローン番号15に作動可能に連結されたクローン番号8(SEQ ID NO:348)。
[実施例7] 翻訳後修飾
【０１９４】
組換えポリペプチドのKD値に対する翻訳後修飾(PTM)の効果を検討した。PTMの一例はジスルフィド結合の連結である。ジスルフィド結合の位置と結合親和性の関係を示すデータは、表4に示された。該データは、PTMが組換えポリペプチドの対ActRIIBecd結合親和性に影響を与えることを示す。PTMアッセイは、以下の実験に従って実施された。
Ａ．酵素消化とジメチル標識化
【０１９５】
実施例4及び実施例6と同様にポリペプチドを調製した。標準タンパク質はSigma（米国ミズーリ州市セントルイス市）から購入した。必要に応じ、pH6の5 mM NEM (N-エチルマレイミド、Sigma)を含む100 mM酢酸ナトリウム(米国ニュージャージー州Phillipsburg市J. T. Baker社製)を使用して、室温で30分間遊離システインをブロックした。酵素消化は、1:50比率でトリプシン（ウィスコンシン州マディソン市Promega社製）により直接的に37℃で酢酸ナトリウム中で一晩行った。ジメチル標識化の前に、100 mM酢酸ナトリウム(pH 5) でタンパク質消化物を3倍に希釈した。
【０１９６】
特定の実施形態において、実施例4及び実施例6と同様に調製されたポリペプチドは、pH7の50 mM TEABC (重炭酸トリエチルアンモニウム, T7408, Sigma-Aldrich社製) バッファーで希釈されて、異なる酵素消化用の2管に分けられた。最初は、最終濃度の5mMとなるまでNEM(N-エチルマレイミド、E3876, Sigma-Aldrich社製)を添加して、遊離システインをブロックした。室温で30分間アルキル化反応を行った。NEMアルキル化した後、1管に1:65比率でトリプシン(V5111, Promega社製)を添加し、37℃で18時間反応し、そして37℃で一晩Glu-C (P8100S, New England BioLabs社製、1:50比率) 消化を行った。もう1管のチューブには、Glu-C (1:50比率) を添加し、37℃で18時間反応し、そして37℃で一晩キモトリプシン(1:50比率) 消化を行った。
【０１９７】
ジメチル標識化を行うために、50μLのタンパク質に2.5 μL の4% (w/v) ホルムアルデヒド-H2(J. T. Baker社製)又は2.5 μL の 4% (w/v) ホルムアルデヒド-D2を添加して、そして2.5 μLの600 mMシアノホウ水素化ナトリウム(Sigma)を添加し、pH 5-6で30分間反応を行った。
B. 質量分析
【０１９８】
毛細管カラム(75 μm i.d.,長さ10cm、台湾Csun社製)を用いたCapLC systemを備えたESI Q-TOF (米国マサチューセッツ州ミルフォード町Waters社製)を使用して、、測量スキャン(MS, m/z 400-1600; MS/MS, m/z 50-2000)を行った。アルキル化及びジメチル標識化したタンパク質消化物は、45分間０．１％ギ酸に5%-50%のアセトニトリルを含有する直線勾配で、LC-MS/MS分析を行った。
【０１９９】
特定の実施形態において、消化した及びジメチル標識化したタンパク質消化物は、Ultimate 3000 RSLCシステムに結合したQ-Exactive Plus質量分析システムにより分析された。液体クロマトグラフィー分離は、下記の勾配に従って、C18 カラム(Acclaim PepMapRSLC, 75 μm x 150 mm, 2 μm, 100 オングストローム)により行った。
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【０２００】
m/z 300-2000の範囲で全MSスキャンを行った。MSスキャンから強度が最も高い10個のイオンは、MS/MSスペクトラ用の断片化対象とされた。
C.データ解析
【０２０１】
MassLynx 4.0を用いて、生データからピークリストを生成した（30%減し、Savitzky-Golay平滑化、中心３チャネル80% 重心）比較的高い減算を用いてバックグラウンドノイズを除去した。真a1イオンをピークリストに残すため、真a1イオンは通常に主要なピークとして表される。
D.逆相クロマトグラフィー
【０２０２】
バイナリポンプを有するAgilent 1100 HPLCシステムに、UV検出器及びオートサンプラを装備した。75℃で操作されたZorbax 300SB C8 カラム(150 ± 2.1 mm，5 μm，300 オングストローム )に、タンパク質を注入した。流速は0.5ml/ minであった。移動相Ａは、0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水であった。移動相Ｂは、70%イソプロピルアルコール、20%アセトニトリル、及び0.1%トリフルオロ酢酸を含有する水溶液であった。10%Ｂの充填条件でサンプルを注入し、そして2分間19%Ｂまで増加させ。2分から1%Ｂ/ minの線形溶出勾配を開始して、24分で終了した。そして、95%Ｂで5分間カラムをフラッシュした。充填条件でカラムを平衡化した。この方法は、ジスルフィドアイソフォームを部分的に分離することを可能する。
【表４】
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【０２０３】
表4に示すように、異なるシステイン位置間にいるジスルフィド結合は、親和性定数(KD)値に影響を与える。二量体中の2つの組換えポリペプチドの間にいるジスルフィド結合がKDを著しく減少させることも、データに示された。言い換えると、二量体化が組換えポリペプチドの二量体とActRIIBecdとの体外分子結合を補助している可能性がある。
【０２０４】
いくつかの組換えポリペプチドが表4に記載の二量体を自発的に形成したことが観察された。すべての二量体蛋白は、実施例4Ｂに記載のゲル濾過によって組換えポリペプチド単量体から分画することが可能である。この実施形態においてモノマーが同じであるために、二量体蛋白はホモ二量体蛋白であった。他の実施形態において、実施例4に記載の安定的に形質転換されたE. coli細胞が、SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：348からなる群より選ばれる2つの異なる組換えポリペプチドを共発現する場合、二量体蛋白はヘテロ二量体蛋白になる。
[実施例8] アルカリホスファターゼ生理活性アッセイ
【０２０５】
既知のC2C12細胞におけるアルカリホスファターゼ誘導の分析によって、組換えポリペプチドについて細胞受容体に結合する能力及びシグナル伝達経路を誘導する能力を調査した。文献Peel et al. JCraniofacial Surg. 2003; 14:284-291 及びHu et al. Growth Factors 2004; 22:29033を参照)
【０２０６】
C2C12細胞(ATCC 受託番号 CRL-1772、米国バージニア州マナサス市)をコンフルエント前に継代し、1×105 cells/mLとなるように10%の熱不活性化ウシ胎児血清を添加したDMEMで再懸濁した。96ウェル組織培養プレート(Corning社製、 Cat #3595)に、ウェル当たり100μlの細胞懸濁液を播種した。段階希釈した標準液及びサンプルのアリコートを添加して、37℃且つＣＯ２ 濃度５％の条件で培養を維持した。サンプルは、馴化培地、精製された組換えポリペプチド、陽性対照としての市販の精製した組換えヒトBMP-2「rhBMP-2」（米国ミネアポリス市R&D Systems社製）を含む。Mundy GR., et al. (2004, GrowthFactors. 22 (4): 233-41)等の文献によって、rhBMP-2が骨及び軟骨の開発において重要な役割を果たすことが示された。陰性対照培養物(サンプル又はrhBMP-2が無添加の培地に細胞を培養した)は、2〜7日間培養した。培地交換を二日ごとに行った。
【０２０７】
収集された培養物を生理食塩水(0.90% NaCl, pH 7.4)でリンスして、その後リンス済の食塩水を破棄した。50 μLの抽出用液(Takara Bio, catalogue #MK301)を培養物に加えて、室温で10分間超音波処理行った。Peel et al. J Craniofacial Surg. 2003; 14:284-291の記載に基づいて、アルカリバッファー(Sigma-Aldrich, St. Louis Mo., catalog P5899)中のニトロフェノールリン酸塩の加水分解をモニターすることで、アルカリホスファターゼ活性(ALP)を分析した。また、アルカリホスファターゼ活性(ALP)の分析について、メーカーの指示に従ってTRACP & ALP assaykit (Takara Bio社製, catalogue #MK301)を使用することもできる。405 nmにおける吸光度を記録することでアルカリホスファターゼ活性を決定した。多反復サンプルの平均ALP活性により、1つの活性スコアを計算した。各組換えポリペプチドのEC50濃度を計算するために、段階希釈したサンプル試料とその関連活性スコアを4パラメーター曲線(4-parameter curve fit)で作成した。データは表5に示された。場合によって、各ウェル内の蛋白質含有量に対するALP活性は、Coomasie (Bradford) Protein Assay (Pierce Biotechnology Inc., catalogue#23200)の使用により正規化された。各ウェルのALP活性を蛋白質含有量で割ることにより、各サンプルの正規化したALP活性値を計算した。
【０２０８】
もう一つの実施形態において、Katagiri, T., et al.(1990, Biochem. Biophys. Res. Cornrnun. 172, 295-299)に記載したアルカリホスファターゼ活性分析を行う。1-mL 10%ウシ胎仔血清を添加したBME-Earle培地にいる1 x 105 cells/mLのC3H10T1/2細胞株マウス繊維芽細胞を、24ウェル培養プレートに37℃且つＣＯ２濃度５％の条件で24時間培養した。上清液を除去し、様々な濃度のサンプルを有する新鮮な培地1-mLを添加した。さらに4日間培養した後に、0.2 mLのバッファー(pH 9.6の0.1 M グリセロール、1 % NP-40、1 mM MgCl2、1 mM ZnCl2）で細胞を溶解して、基質として150μLの0.3mM p-nitrophenyl phosphate含むバッファー(pH 9.6)を用いて、50 μLの澄清ライセートアリコートでアルカリホスファターゼ活性をを決定する。37℃で20分間培養後に、405 nmにおける吸光度を記録する。活性は、各サンプルにおける蛋白質含有量(BCA protein assay, Pierce Chemical Co.)に関連する。
【表５】
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【０２０９】
表5に示すように、特定のジスルフィド結合を有する組換えポリペプチドの大部分は、rhBMP-2よりも低いEC50値を有する。即ち、特定のジスルフィド結合を有する組換えポリペプチドの大部分は、骨若しくは軟骨の形成又は骨形成(osteogenesis) に関連するシグナル伝達経路を誘導し得る。
【０２１０】
[実施例9]体内骨誘導活性
ウサギの尺骨軸欠損に対して、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(すなわち、分子内ジスルフィド結合C44-C48を有するSEQ ID NO: 260)を2つ有するホモ二量体蛋白の骨誘導活性、及び多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体としての評価を評価した。リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は0.4〜1.65である
【０２１１】
メスウサギ（ＮＺＷ種、日本エスエルシー株式会社）40匹の外科的に露出された右尺骨及び左尺骨の軸に、20 mmの円周状の欠損（すなわち、欠損部位）が形成された。併用麻酔は、簡潔に言えば、塩酸ケタミン(ケタラール、第一三共製)とキシラジン(Selactar 2%注射溶液, Bayer Medical製)を 3：1の割合で併用して行った。長時間の手術の追加麻酔でも同一溶液を使用した。術前に、抗生物質としてFlumarin (flomoxef sodium、シオノギ製薬)を皮下投与した。前腕の全領域の毛皮は、電動シェーバで剃毛され、ヒビタンアルコールで消毒した(0.5%  グルコン酸クロルヘキシジン−エタノール溶液, 大日本住友製薬株式会社)。各尺骨の肢の尾側正中部において、縦方向の切開を形成した。筋肉組織を上げて尺骨を露出させた。メス(25mm)で露出した尺骨の手関節からマークを作成した。直径15mmのドリルを用いて、骨を破壊しないように注意しながら、縦方向及び垂直方向に適切な孔をマークに穿孔した。骨鉗子（luer bone rongeurs）で骨を分割した。近位方向に20mm離れた所にもマークを作成し、同様に分割した。分割の際に、尺骨を覆う骨膜を除去して、骨片を生理食塩水で充分に洗浄した。
【０２１２】
下記表6に示されたグループＡ−Ｇのいずれかに従って、各尺骨はそれぞれのインプラントを受容した（又は受容しなかった）。グループＡ−Ｄの尺骨は、特定量のホモ二量体蛋白を担持するβ−ＴＣＰのインプラントを1つ受容した。グループEの尺骨は、β−ＴＣＰのみのインプラントを1つ受容した。グループＦの尺骨は、自体移植片を1つ受容した。グループＧの尺骨は、インプラントを受容しなかった。その後、筋肉及び皮膚組織を迅速に縫合した。
【表６】
2019525767.tif 000125
【０２１３】
グループＡ−Eで使用されたβ−ＴＣＰは、1-3 mmの顆粒の形態であって、空孔率が75%且つ孔径が50μm〜350μmであった(骨移植片代用品Superpore（商標）、ＰＥＮＴＡＸ、HOYA株式会社)。
【０２１４】
もう一つの実施形態において、グループＡ−Eで使用されたβ−ＴＣＰは、1-3 mmの顆粒の形態であって、空孔率が70%以上且つ孔径が300μm〜600μmであった(骨移植片代用品Wiltrom、台湾ウィルトロム)
【０２１５】
グループＡ−Ｄの組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白（即ち、SEQ ID NO: 260）は、各動物に移植直前に塩酸0.5m (注射溶媒で希釈した標準溶液、大塚製藥)を用いて冷凍ロットから調製された。片側移植に対する流体容積を180μlに設定して、滅菌されたペトリ皿内の200mgのβ−ＴＣＰ顆粒に均一に滴下した。流体の滴下が完了した後に、スパチュラでβ−ＴＣＰ顆粒を穏やかに攪拌し、そして室温で15分間以上静置した後に移植した。
【０２１６】
グループＦについては、骨鉗子（luer bone rongeurs）を使用して、腸骨の右翼又は左翼のいずれかから自体移植片を得た。骨はチップに加工されて、グループＡ−Eと同じ量で移植された。
Ｘ線による評価
【０２１７】
移植直後、及び移植後8週間後まで２週に一度、横方向及び正面のx線画像（即ち、放射線写真)を撮影した。放射線写真を用いて移植位置の状態及び骨形成の程度を評価した。各グループのx線画像の代表例は、図1Ａ（グループＡ−Ｄ）及び図1Ｂ（グループＥ−Ｇ）に示された。
【０２１８】
2週間後、全てのグループにおいて、インプラント材料の顆粒のコントラストと受容床（recipient bed）の境界とのコントラストが、明確に見られた。4週間後、ホモ二量体蛋白グループ（即ち、グループＡ−Ｄ）のＴＣＰ顆粒が不鮮明になって、前記顆粒の吸収及び骨形成の進行を示した。また、ホモ二量体蛋白投与量が高いグループＣとＤにおいて、いくつかのサンプルの移植位置と受容床との境界が不鮮明になった。6週間後、グループＢにいる移植位置と受容床との境界が不鮮明になった。また、グループＣ及びＤのいくつかのサンプルにおいて、受容床連続性及び骨形成の向上が観察された。8週間後、グループＡとＢにおいて、受容床にいる境界が更に不鮮明になった。グループＣにおいて、受容床連続性及び骨形成が向上した。6週間後の図に示すように、グループＤにおいて、尺骨欠損の領域に再構成が観察された。
【０２１９】
TCPのみを有するグループＥにおいて、骨形成は経時的に観察された。しかし、残ったＴＣＰ顆粒が8週間の時点でも明確に見られ、軸における不十分な骨形成及び劣悪な連続性が示された。
【０２２０】
自体移植片を有するグループＦにおいて、骨形成の進行は経時的に観察され、且つ、受容床との融合は8週間で達成された。しかし、形成均一ではなかった。
【０２２１】
欠損のみを有し、移植片の無いグループＧにおいて、橈骨にわずかな骨形成が観察されたが、欠陥の修復はそれ以外には全くなかった。
コンピュータ断層撮影(CT)走査
【０２２２】
移植直後、移植後４週間後、及び移植後8週間後に、CT走査を用いて1mm間隔で軸配向を行った。主に移植位置の画像を撮影した。代表例として、移植位置の中心の横断面画像経時変化は、図2A（グループＡ−Ｄ）及び図1Ｂ（グループＥ−Ｇ）に示された。
【０２２３】
ホモ二量体蛋白を有するグループ（即ち、グループＡ−Ｄ）について、移植直後に明確に見られる顆粒が、移植後４週間後横断面断面画像において部分的に分解し、骨形成を示唆した。投与量が60 μgであったホモグループＤついて、骨形成の更なる進展が観察され、また、いくつかのサンプルに骨髄腔の形成が観察された。8週間後、投与量が6μg以上であったグループにおいて、骨髄腔及び骨皮質の形成の進行が観察された。TCPのみを有するグループＥにおいて、顆粒の凝集塊は8週間後も残っていた。自体移植片を有するグループＦにおいて、8週間後に、再構成の進行のような骨髄腔の形成が観察された。欠損のみを有するグループＧにおいて、わずかな骨形成しか観察されなかった。
捻り強度測定
【０２２４】
移植8週間後のウサギを安楽死させ、インプラント材料を除去し、各グループの尺骨から橈骨を分離して、捻り強度測定を行った。測定については858 Mini Bionix II (MTS Systems Corporation)を使用して行った。50mm長の領域で試験を行った。具体的には該領域は、中央の尺骨軸における20mm長の再構成領域、及び再構成領域の基端側と遠位側の両方における15mm長の領域であった。各辺の端部を歯科用樹脂で固定した。樹脂部分を測定装置内にチャックした。失敗した時の最大トルク（torque）を決定するため、30°/分の回転速度で、左尺骨を反時計回りに回転させ、右尺骨を時計回りに回転させた。。別々に得られた健全なウサギの尺骨に対しても試験を行い比較した。該健全な尺骨は日本白色種ウサギから得られたものであり、グループＡ−Eで使用されたものとは異なるタイプであった。ただし、該日本白色種ウサギは26週齢（安楽死の際に）の雌であったため、グループＡ−Eとは同じ年齢及び性別であった。
【０２２５】
捻り強度測定によって得られた各グループの最大トルクは、図3に示された。ホモ二量体蛋白を有するグループＡ−Ｄにおいて、最大トルクは、投与量依存的に高くなった。
【０２２６】
TCPのみを有するグループEに比べ著しく高い測定値が、投与量が2μg以上のホモ二量体蛋白を有するグループＡ−Ｄに見出された。
【０２２７】
無傷の尺骨、自体移植片又はホモ二量体蛋白を有するグループ間では、著しい相違は観察されなかった。
【０２２８】
グループＥ及びＧにおいて、骨形成が不十分であったため、橈骨が分離された後、いくつかのサンプルでは確実な支持を確保することが困難であった。そのため、サンプルについて、グループＥでは2つのみ、グループＧでは4つのみのサンプルが測定で用いられた。一方で、グループＡ−Ｄ及びＦについて、使用したサンプルは6つであった。
【０２２９】
下記の表7に示されたように、本試験とKokubo et al., Biomaterials 24:1643-1651 (2003)の記載における同じ動物モデルを使用したCHO-derived BMP-2に対する評価間で、試験条件及び結果を比較した。Kokubo et al.,による報告と比べ、本研究はより大きな骨欠損、より少ない投与量の活性剤、捻り強度測定前により短い移植持続時間などのより困難な条件で行った。しかしながら、この研究において、尺骨の修復が成功したことが示されており、且つ最大トルクは類似していた。
【表７】
2019525767.tif 000126
組織評価
【０２３０】
全ての動物について、4週間後と8週間後の標本を作成した。剖検の際に得られた組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に保存し、10%EDTAで脱灰した。その後、組織をパラフィンで包埋した。橈骨の長軸に平行する平面に薄切片サンプルを作成し、ヘマトキシリン‐エオジン（HE）で染色し、組織評価した。骨形成及び受容床との融合を判定した。
【０２３１】
ホモ二量体蛋白を有するグループＡ−Ｄにおいて、4週間後、骨形成は小柱パターンで進んだ。高い投与量のホモ二量体蛋白を有するサンプルには活発な骨形成が観察された。投与量が60μgであったグループＤにおいて、著しく大量の新しい骨及び血管新生が観察された。投与量が低いグループＡ及びＢにおいて、残存材料が観察されたが、グループＣ及びＤにおいてはほとんど観測されなかった。グループＡ及びＢにおいて、いくつかのサンプルの受容床との境界付近には、軟骨形成が観察された。全てのサンプルにおいて、受容床は小柱パターンで新たに形成された骨に直接接続した。投与量が2μgであったグループＡにおいて、小柱パターン及び残存材料は、8週間後も観察された。受容床との境界付近に軟骨も観察された。再構成が不十分であっても、骨形成の進行が観察された。いくつかのサンプルにおいて、橈骨の中には骨皮質の形成が観察された。投与量が6μg以上であったグループＢ―Ｄにおいて、骨皮質及び骨髄は再構成により形成された。投与量がより高いグループにおいて、進展がより著しく、また、受容位置における連続性も向上した。
【０２３２】
TCPのみを有するグループEについて、橈骨におけるインプラント材料上の骨形成は観察されたが、残存材料は8週間後も明確に見られたため、軸の不十分な骨形成及び劣悪な連続性が示された。
【０２３３】
自体移植片を有するグループＦにおいて、良好な骨形成が４週間後に観察され、新しい骨は受容床と接触していた。受容床との境界付近には軟骨形成が見られた。8週間後、新しい骨の再構成及び骨皮質の形成ついての進展が観察されたが、残った移植骨の断片も観察された。
【０２３４】
欠損のみを有するグループＧにおいて、骨形成は橈骨のみに観察され、且つ、欠損の修復は達成されなかった。
[実施例10]ヒツジ脊椎後側方固定研究
骨誘導活性
【０２３５】
ヒツジ脊椎後側方固定モデルにおいて、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド("Rcp")を有するホモ二量体蛋白(即ち、分子内ジスルフィド結合C44-C48、C80-C112、及びC79-C114を有するSEQ ID NO: 260)の骨誘導活性、及び多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体材料としての評価を評価した。リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は1.2〜1.8である。
【０２３６】
ヒツジ脊椎後側方固定モデルについて、Zoletil（商標） (8-12  mg/kg, IM)で鎮静させたヒツジと、ガス化イソフルオラン(2%)及び酸素(1分間当たり2リットル)を使用した。気管内チューブを動物に挿入しガスを通して、イソフルオラン(2-3%)及び酸素(2-4リットル/分)で麻酔を維持した。抗生物質(Keflin（商標）: 1 gm IV; Benacillin 5 ml IM)を与えた。手術前にカルプロフェン(NSAIDの一種である、4 ml IM)及びTemgesic（商標） (Burprenorphine 0.324 mg SC)を注射した。必要に応じて手術前及び手術中に、晶体輸液を静脈内に投与した。
【０２３７】
L3-L4レベルに15cmの正中切開を腰部横突起と平行に形成させた。後腹膜鈍解剖により腰部脊椎の前外側面を露出した。これによって横隔膜が邪魔されない状態にした。軟組織は後退した。空気バー(pneumatic burr 、Midas Rex)を使用して、全ての動物のレベルの間の横突起(側部15 mm)及び隣接する椎体を皮質剥離した。
【０２３８】
下記表8に示された各グループの条件に従って、横突起及び隣接する椎体の皮質剥離された表面(傍脊柱床、paraspinal bed)の間にインプラント材料を置いた。グループ1−3は、特定量のホモ二量体蛋白を担持するβ−ＴＣＰのインプラントを1つ受容した。グループ4は、ホモ二量体蛋白のないβ−ＴＣＰだけのインプラントを1つ受容した。グループ6は、陽性対照として、特定量のrhBMP-2という確立骨誘導因子を有する吸収性コラーゲンスポンジ(ACS) のインプラントを1つ受容した。グループ5は、骨自体移植片を1つ受容した。自体移植片は、自体移植片グループの動物の腸骨稜から収集された。骨鉗子を用いて骨を粉砕（morcelized）して、5.0 gの移植骨を融合の各辺に使用した。2-0縫合糸で切開を閉鎖して、3-0縫合糸で付近の皮膚を閉鎖した。
【表８】
2019525767.tif 000127
【０２３９】
グループ1−4に使用したβ-TCPは、2-4 mmの顆粒の形態であって、空孔率が70%以上且つ孔径が50-350μmであった(骨移植片代用品Superpore（商標）、ＰＥＮＴＡＸ、日本HOYA株式会社)。
【０２４０】
特定の実施形態において、グループ1−4に使用したβ-TCPは、2-8 mmの顆粒の形態であって、空孔率が65%以上且つ孔径が250-730μmであった(骨移植片代用品Osteocera、台湾ウィルトロム)
【０２４１】
グループ1では、10mgのホモ二量体蛋白を有する各バイアルに2mlの注射水を添加することによって、Rcpを含むホモ二量体蛋白保存液Ｈ(すなわち、SEQ ID NO: 260)を調製した。3:1の容積比率で保存液Ｈと注射水を混合して、ホモ二量体蛋白高投与量溶液(10.5mgホモ二量体タンパク質を含有する2.8ml溶液)を作った。2.8mlのホモ二量体蛋白高投与量溶液は、3.5gβ-TCP顆粒に均一に滴下することにより送達された。
【０２４２】
グループ2では、10mgのホモ二量体蛋白を有する各バイアルに4mlの注射水を添加することによって、ホモ二量体蛋白保存液ML(2.5 mg/ml)を調製した。1:1の容積比率で保存液MLと注射水を混合して、ホモ二量体蛋白中投与量溶液(3.5mgホモ二量体タンパク質を含有する2.8ml溶液)を作った。2.8mlのホモ二量体蛋白中投与量溶液は、3.5gβ-TCP顆粒に均一に滴下することにより送達された。
【０２４３】
グループ3では、10mgのホモ二量体蛋白を有する各バイアルに4mlの注射水を添加することによって、ホモ二量体蛋白保存液ML(2.5 mg/ml)を調製した。17:3の容積比率で保存液MLと注射水を混合して、ホモ二量体蛋白低投与量溶液(1.05mgホモ二量体タンパク質を含有する2.8ml溶液)を作った。2.8mlのホモ二量体蛋白低投与量溶液は、3.5gβ-TCP顆粒に均一に滴下することにより送達された。
【０２４４】
グループ6は、市販品Infuse（商標）及びMastergraft（商標）(二者ともメドトロニック社製)をグラフト材料として比較するために行った。Infuse（商標）は、CHO発現システムより用意したrh-BMP及び吸収性コラーゲンスポンジ(ACS) からなる。Mastergraft（商標）は、85% β-TCP及び15%ヒドロキシアパタイトからなる粒状リン酸カルシウム骨代用品である。Infuse（商標）とMastergraft（商標）を組み合わせて使用することが腰部後側方固定に対して効力を示すことは、E. Dawson et. al.のエビデンスレベル2を有する臨床研究に報告されている(J Bone Joint Surg Am. 2009; 91: 1604-13)。グループ6のインプラント材料は、各位置に3.15 mg rh-BMP-2、4cc ACS、5cc Mastergraft（商標）を含み、インプラント材料調製の手順についてはE. Dawsonの報告に従った。Infuse（商標）及びMastergraft（商標）のロット番号は、手術記録に記録された。
【０２４５】
手術後最初の7日間、動物を毎日モニターし、観察結果を各動物の手術後のモニタリングシートに記録した。
【０２４６】
4週間後、全ての動物の前後方向(posteroanterior)の放射線写真を撮影した。該動物はZoletil（商標） (8-12  mg/kg, IM)で鎮静させて、イソフルオラン(2%)と酸素(2リットル/分)でガス麻酔した。新しい骨の存在及びTCP材料の吸収について、放射線写真と術後のx線写真とを比較した。手術後12週後、全ての動物を、致死量のLethabarbの心臓注射で犠牲にした。
【０２４７】
骨形成の時点をモニターするために、下記表9に示された3つの時点に3つの異なる蛍光色素を静脈内に注射した。
【表９】
2019525767.tif 000128
Ｘ線による評価
【０２４８】
腰脊椎(L1-L6)を採取し、デジタルカメラを用いて撮影した。採取された脊椎を、Faxitron（商標） Machine (24 kV で45秒間に設定した)で照射した。後前方（posterior-anterior 、PA）に撮ったデジタル放射線写真を、右側及び左側の3名盲検観測者によって、新しい骨の形成及び融合についてのエビデンスを等級付けした。定性的採点システムを用いて、放射線写真を評価した（表10）。融合は、1つの横突起がら次のレベルまての骨の連続パターンによって評価した(0=非連続、1=連続)。融合塊の各側の横突起の間にある骨の量は、表10が概要したようにパーセンテージに基づいて等級付けされた。TCP再吸収量は、同じ量の材料を有する0時点の放射線写真との比較に基づいて記された。
【表１０】
2019525767.tif 000129
【０２４９】
手術後、4週間後及び12週間後で且つ採取前に、全ての動物の前後方向の放射線写真を撮影した。各グループの代表的なX線イメージは、図4〜図9に示された。グループ1、2、3、4、5、6の手術後X線イメージにおいて、顆粒は明らかであった。4週間後の時点において、グループ1、2において見える顆粒はほとんどなかったが、存在を記すことができる。グループ3、4には明らかな顆粒がより多く見られた、グループ6には残りの細粒又は顆粒が明確に示された。12週間後、グループ1、2、3において、細粒又は顆粒は骨と区別ができなかった。グループ4において、少量の骨形成と不鮮明な細粒が示された。グループ6において、12週間後もまだ細粒が明らかであった。
【０２５０】
放射線写真を3名盲検観測者によって評価した。等級付けは、融合の二項評価と、融合塊にいる骨の量の5級評価を含んだ。結果は表11に示された。各動物の個体等級の平均値を先に計算して、そして各グループの平均値及び標準偏差を計算した。
【表１１】
2019525767.tif 000130
【０２５１】
[実施例11] 羊椎体間融合モデルにおける体内骨誘導活性
【０２５２】
羊の椎体間融合モデルにおいて、実施例6に従って製造した組換えポリペプチドを有するホモ二量体蛋白(即ち、分子内ジスルフィド結合C44-C48、分子間ジスルフィド結合C79-C114及びC80-C114を有するSEQ ID NO: 260)の骨誘導活性、多孔質ベータ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）の担体材料としての評価、PEEKケージの収容体（accommodator）として評価を評価した。リン酸カルシウム担体のカルシウム/リン比は約0.7〜約1.7であった。
術前準備
【０２５３】
標準的な操作手順に従って、手術のための動物(種：Ovis Aries；品種：Border LeicesterMerino Cross；供給者：UNSW approved supplier - Hay Field Station, Hay, NSW；購入は動物の管理及び倫理委員会（UNSW Animal Care and Ethics Committee）によって認可された；年齢：4歳齢；性別：メス、即ちEwe）を用意した。手術の24時間前に、右前脚（左前脚は静脈内輸送に使用した）に経皮フェンタニル張り付け剤(100mg - 2mcg/kg/hr)を用いて、先制の鎮痛を与えた。用いる前には、十分な吸収を確保するためにウールをクリップし、皮膚をアルコールスワブ（alcohol swabs）で清潔した。動物は手術前に最低12時間以内絶食・断水させた。
手術
【０２５４】
この研究に割り当てられたヒツジは、手術の日にランダムに選択された。ヒツジが選択されると、番号を割り当て、標準的な操作手順に従って耳にタグを付けた。識別番号を、研究記録に記録した。
【０２５５】
手術の日及び開始前に、研究獣医は各動物を検査し、疾患又はこの研究の目的若しくは実施を妨げる可能性がある状態にないことを確認した。各動物の状態及び内含させたもの対しての適合性を、動物番号に対応して研究記録に記録した。
【０２５６】
標準的な操作手順に従って、手順において動物を導入し、麻酔し、維持し、モニターした。左前脚は頭部静脈内接続のために使用された。ハルトマン溶液（Hartman’s solution）を静脈投与する前に、標準的な操作手順に従って、手術前分析のために血液を採取した。血液サンプルに対して、研究ID、動物番号及び日付と共に「PRE-OP」を付し、ルーティン生化学(4ml)及び血液学(4ml)のためにIDEXX Australiaへ送った。
【０２５７】
手術は、標準的な手術手順の変更されたバージョンに従って実施された。
手術手順-L45 XLIF及び椎弓根スクリュー
【０２５８】
手術の前に、全ての動物を48時間食制限(NPO)し、隔離用ペン管理施設内に収容した。麻酔薬の投与及び全身麻酔の導入に続いて、後腰部領域、腸骨稜及び近位脛骨を無菌的に用意した。
移植片混合手順
【０２５９】
0.3mlの蒸留水にホモ二量体蛋白(10 mg/vial)を溶解して、33.3 mg/mLのHP保存液Ａを調製した。椎体間ケージ内に一塊のβ-TCP(約150mg) を配置した。各グループにおいて、滅菌されたペトリ皿に置いたβ-TCP(約150mg) の塊に、HP保存液Ａから希釈し又は取った「HP溶液」を均一に滴下し通させた。液体を完全に滴下した後、移植前に該β-TCPの塊を室温で15分以上放置した。
【０２６０】
グループA-Fは、β-TCP担体と結合した上記ホモ二量体蛋白を移植材料として使用した。部位あたりのホモ二量体蛋白投与量は、表12に示された。混合手順の調製は以下の通りであった。
【表１２】
2019525767.tif 000131
【０２６１】
Hp 4mg/部位のグループAでは、10mgのホモ二量体蛋白を有する各ガラスバイアルに0.3mlの注射水を添加することによって、Hp保存液A(33.3 mg/mL)を調製した。Peekケージ内に一塊のβ-TCP(約150mg) を置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Aを送達した。
【０２６２】
ホモ二量体蛋白 2mg /部位のグループBでは、水とHp保存液Aを1：1体積比で混合してHp保存液B (16.7 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Bを送達した。
【０２６３】
ホモ二量体蛋白 1mg /部位のグループCでは、水とHp保存液Bを1：1体積比で混合してHp保存液C (8.3 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Cを送達した。
【０２６４】
ホモ二量体蛋白 0.5mg /部位のグループDでは、水とHp保存液Cを1：1体積比で混合してHp保存液C (4.2 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Dを送達した。
【０２６５】
ホモ二量体蛋白 0.1mg /部位のグループEでは、水とHp保存液Cを1：4体積比で混合してHp保存液C (0.8 mg/mL)を得た。β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いた。150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlのHp保存液Eを送達した。
【０２６６】
ホモ二量体蛋白 0 mg /部位のグループFでは、β-TCPの塊(約150mg) をPeekケージ内に置いて、150mgβ-TCPの塊に均一に滴下することにより120μlの水を送達した。
椎体間Peekケージ
【０２６７】
適切な脊柱レベルを同定するために横突起を触診した。該レベルを、蛍光透視法によって検証した。L4及びL5椎体にカスパルピン（Caspar pins）を置き、カスパルレトラクター（Caspar retractor）を使用して椎間板腔を伸延した。鋭利な切開、キュレット及び用意した終板によって、椎間板を除去した。椎間板腔に、移植材料で充填された椎間体装置を配置し、リトラクタを解放した。軟組織を再並置し、層で皮膚を閉鎖した。
【０２６８】
椎体間ケージの外観は、図10に示された。
椎弓根スクリュー
【０２６９】
XLIF完了後、動物を腹臥位に再配置し、無菌技術を用いてドレープして、L3-S1レベルの中心を越えた背下部中央線に初期皮膚切開を形成した。必要に応じてコブエレベータ及び電気焼灼を使用して、L45ファセット及び横突起を露出させるように、神経弓に沿って矢状面で鈍的解剖を行った。そして、レベルに椎弓根スクリュー及びロッドを挿入した。
【０２７０】
移動式x線機械((POSKO)及びデジタルカセット(AGFA)を使用して、手術直後に前後方向で放射線写真を撮影した。DICOMフォーマットでデータを保存し、ezDICOM医療ビューアソフトウェアを使用してJPG画像へ輸出した。標準的な操作手順に従って行った。
手術後のモニター
【０２７１】
最初の7日間毎日動物をモニターし、記録した。研究の間、獣医技術者が毎日少なくとも1回動物を検査し、毎週記録した。技術者によって確認した健康上のいずれかの懸念を、獣医スタッフに報告し、PIによって更に評価し管理した。
【０２７２】
標準操作手順に従って、ヒツジの各試験部位をモニターした。手術後初週の毎日及びその後は1 週 1 回、手術切開、食欲、皮膚及び毛の変化、目及び粘膜、呼吸系、循環系、姿勢/歩容、行動パターン(トレモス(tremors)の発生、痙攣、過剰な唾液分泌、及び無気力)をモニターした。その後モニターされた兆候は機敏さ/注意力、食欲、手術部位、目の外観、歩行、及び頭部を上げさせる能力であった。介在の基準は感染症の兆候であった。
【０２７３】
動物は、術後の最初の3日間、抗生物質(Kelfex)及び鎮痛薬(ブプレノルフィン, 0.005-0.01 mg/kg IM)を経口投与された。術後の最初の7日間は、毎日神経学的評価を行った。その後、臨床的モニターに基づいて、術後疼痛軽減を提供した。
外植体
【０２７４】
指定された時点で、標準的な操作手順に従って誘導し麻酔する前に、各動物の所有する識別番号を確認した。
【０２７５】
麻酔導入後、標準的な操作手順に従って、頚静脈又は頭静脈のいずれかから血液を採取した。サンプルに研究番号、動物番号、及び日付を付した。サンプルは、密封されたバイオハザードバッグ中でSORLに輸送され、30℃未満に維持され、ルーティン生化学(4mls)及び血液学(4mls)のためにIDEXX Australiaへ送られた。輸送時間をノートに記載した。
【０２７６】
麻酔されている間に、標準的な操作手順に従って、Lethobarbの致死量の注射により動物を安楽死させた。死体を30℃未満に維持して、直ちにSORLへ輸送した。
【０２７７】
標準的な操作手順に従って各動物を検査し、解剖した。腰部脊椎を採取し、デジタルカメラを用いて撮影した。手術部位に副作用及び感染の兆候について検査し、結果を記録し、撮影した。
【０２７８】
収穫直後に、すべての動物(12週間)において、手の触診によって融合塊の安定性を評価した。訓練され、経験を持った2人の盲検観測者の力を合わせて、無傷又は除去されたままの椎弓根ロッドと共に、融合塊の横曲げ及び屈曲−伸展を評価した。
【０２７９】
左右側の横曲げ及び処理されたレベルの屈曲−伸展についての手の触診評価によって、融合(剛体、動きがない)又は未融合(非剛体、動きが発見さた)で等級付けした。左右側の横曲げ及び屈曲−伸展の手の触診評価において、未処理レベルの可動性を相対的な比較として用いた。
運動範囲(ROM)の測定
【０２８０】
脊椎から慎重にL45セグメントを採取した。4mm×15mmのスクリューを椎体に挿入し、試料のポッティングを助けるように使用した。
【０２８１】
ROM評価用の樹脂中にセグメントを慎重にポッティングした。Denso Robotで屈曲−伸展(FE)、横曲げ(LB)、軸回転(AR)の運動範囲を決定した。ロッドは、測定前に除去された。FE、LB、AR中の脊椎に7.5Nmのピュアモーメントを適用し角変形生成し、測定装置で記録した。各負荷プロフィールを3回繰り返し、図11に示す各処理されたレベルのFE、LB、ARの平均値を求めた。下記に概説するように、融合の一方の側のパラフィンヒストロジー、もう一方の側のPMMAヒストロジーを機械測定した後、サンプルをリン酸バッファーホルマリンで固定した。ROMデータは、SPSSを用いてANOVAで分析した。
【０２８２】
表13に示されるように、手動触診によって、0.5mg未満の投与量について、セグメントは非剛体運動を示したが、0.5mg以上の投与量及び自体移植片について、セグメントは剛体運動を示した。
【表１３】
2019525767.tif 000132
【０２８３】
図11に示すように、各処理の軸回転の運動範囲はほとんど変化しなかった。しかしながら、無傷と比べれば、全ての処理の屈曲−伸展は減少したが、ホモ二量体蛋白投与量が増えるに伴い、安定性の向上傾向が示された。自体移植及び1.0mgホモ二量体蛋白が、最も同等であった。全ての処理において横曲げも減少し、無傷の値の<50%までになった。横曲げについても、ホモ二量体蛋白投与量が増えるに伴い、ROMが減少することが示された。投与量の影響は0.1mg-0.5mg段階で最も顕著であった。
マイクロコンピュータ断層撮影−脊椎
【０２８４】
Inveon Scanner (米国Siemens)を用いてマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を行った。すべてのスキャンにおいて、スライス厚さを約50ミクロンに設定した。CTスキャンをDICOMフォーマットで保存した。アクシャル、コロナル及びセジタル面を検査して、それらに基づいて3次元モデルを再構成した。追加分析のために、DICOMスタックを研究スポンサーに送った。
【０２８５】
各動物のアクシャル、コロナル及びセジタル画像並びに前後の3Dモデルを提供した。処理されたレベル間の融合を検査するために、コロナル及びセジタル面を再検討してmicro-CT再構成を評価した。訓練され、経験を持った2人の盲検観測者は、全体micro-CTスタックを検討する同一の放射線写真採点スコア(表14)を用いて、処理グループに対して等級付けした。定性的にレベルの骨の量を表す1〜4のスケールで、各融合を等級付けした：1:25%、2:26-50%、3:51-75%、4:76-100%。
【表１４】
2019525767.tif 000133
【０２８６】
3つの直交するの面及び3次元モデルの前後の像において、各動物のmicro-CTの代表的な画像を用意した。3つの面における脊柱融合の高解像度放射線画像を得るために、Siemens Inveon体内マイクロコンピュータ断層撮影スキャナを用いてすべての動物にマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)を行い、放射線撮影した。これは、標準的な操作手順に従って実施された。また、500ミクロン加算画像技術（500 micron summation image technique）を使用して、加えてより厚い再構成を行って検査した。なお、3D再構築を再検討して全体的な融合状態を評価し、全ての動物のレポート及び付録に代表的な画像を提供した。これは、いくつかの変更を伴って標準的な操作手順に従って実施された。セジタル及びコロナル画像を再検討して、表14に基づいて、全体的に融合を等級付けした (図12-図14参照) 。
融合の等級付け
【０２８７】
0 Hp mg/部位において、残留TCP及び終板にあるいくつかの骨形成が示された。0.1 Hp mg/部位において、新生骨が生成し、最小限の残留TCPは示されたが、堅い骨ブリッジは示されなかった。0.5 Hp mg/部位において、良好な骨質が生成されたが、移植片内には多少の透き線が存在した。1.0 Hp mg/部位及び2.0 Hp mg/部位の投与量において、最小限の透き領域を伴って、良質な骨がケージ間空間を充填した。4.0 Hp mg/部位において、体積に基づいて高等級な骨が生成されたが、骨の中には、いくつかの大小の空洞を含む透きがあった。自体移植（腸骨稜）において、かなり良い又は良好な骨の形成や、非癒合領域もみられ、不定の結果が示された。下表において、各部位の等級をサマライズした。
【０２８８】
マイクロCT分析に基づた融合等級付けは、表15に示された。全体の骨等級及び融合等級について、1.0及び2.0mg Hpがピークであった。骨等級は、定性的に骨の量（1:25%、2:26-50%、3:51-75%、4:76-100%）を表す1〜4のスケールで等級付けされた。融合等級は、0-3(0-新生骨なし、1-新生骨の形成が見られが、連続的な骨なし、2-透きを伴った可能な融合3-ブリッジ骨を伴った確実な融合)で付けられた。
【表１５】
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[実施例12] コントロールドリリース系(Controlled Release System)製剤(ダブルエマルション法/塩基性物質/親水性薬物)
【０２８９】
一つの態様において、2.5 mLのジクロロメタン(Merck)に溶解した0.25gのPLGA(乳酸/グリコール酸比65/35、MW 40000-75000, Sigma-Aldrich)をシェーカーで5分振盪(1000 rpm)して、10% PLGA溶液 (10%油相溶液)を形成した。2.5 mLの二重蒸留水(DDW)と10%のPLGA溶液とを混合し、1000rpmで15分間攪拌して、第1エマルジョン(w/o)を形成した。第1エマルジョンを10 mLの0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)MW ~130000,Fluka) 第2水油相溶液に添加し、500rpmで攪拌し、5分間排気して第2エマルジョン(w/o/w)を形成した。2エマルジョンを4時間連続的に攪拌した後、1分間放置した。4000rpmで5分間遠心分離することにより、ペレット中の粒子を収集した。5mlのDDWで数分間粒子を洗浄した。3回遠心分離し洗浄した後、遠心分離した粒子を収集し、3日間凍結乾燥してPLGA微粒子を形成した。2mg及び/又は4mgのβ−ＴＣＰ粉末(Sigma-Aldrich)と50μLのDDWと10 μgの実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(即ち、SEQ ID NO: 260)を有するホモ二量体蛋白(Hp)を混合して、スラリー(Slurry)を形成した。スラリーと50mg  PLGA微粒子とを混合し（又は表面に塗布し）、3日間凍結乾燥してPLGA微粒子をコントロールドリリース系として形成した。特定の実施形態において、凍結乾燥したコントロールドリリース系を押圧して、平坦な片を形成することができる。
【０２９０】
代替的な実施形態において、2.5 mLのジクロロメタンと乳酸-グリコール酸共重合体
(PLGA、65:35、Sigma製)とを混合し、5分攪拌(1000 rpm)して、10%油相溶液(P1)を形成した。P1に0.25mlの二重蒸留水(DDW) を添加し、15分間攪拌(1000 rpm)して、第1エマルジョン(w/o、P2)を形成した。10 mLの0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA,MW ~130000,Fluka)にP2を入れ、4時間攪拌(500 rpm)した(P3)。P3を4000rpmで5分間遠心分離した後、上清液を除去し、残った溶液を収集した。P3に5mlのPBSを添加し、3回繰り返し、残った溶液を回収後、凍結乾燥した。PLGA微粒子の凍結乾燥粉末を秤量し、産率(%)を計算した。0.06mlのDDWと2mgのβ−ＴＣＰ粉末(Sigma-Aldrich)とを混合し、20 μgのホモ二量体蛋白をβ−ＴＣＰに添加して5分間攪拌した。その後、50mgのPLGA微粒子を該混合物中に添加し、均一に攪拌した。該微粒子を凍結乾燥し、押圧してΦ10 mmサイズの錠剤を得った(適当な圧力は5~10kg)。
【０２９１】
場合によっては、2mg及び/又は4mgのβ−ＴＣＰ粉末を4mgのリン酸三カルシウム(TCP)又は1mgのアルファ-リン酸三カルシウム(α-TCP)に置換することができる。特定の実施形態において、PLGA65/35をPLGA50/50、ポリ乳酸(PLA) 又はポリグリコール酸(PGA) に置換することができる。
PLGA/Hp-β-TCPから放出したホモ二量体蛋白(Hp)の評価
【０２９２】
1 mLのヒト血清に100mgのPLGA/Hp-β-TCPを浸漬し、37℃に60rpmで振盪した。放出したホモ二量体蛋白を含むヒト血清溶液を1時間、1日目、2日目、3日目、7日目、10日目、14日目の各時点で収集し、800μlの新鮮なヒト血清に置換した。収集したヒト血清を-80℃で保存し、direct ELISAアッセイですべてのサンプルを同時に分析した。
【０２９３】
β-TCP及びホモ二量体蛋白で被覆されたPLGA微粒子の放出プロフィールは、図15a及び15bに示された。PLGA微粒子の表面に物理的に吸着したホモ二量体蛋白が、拡散及びPLGA水解によってin-vitro溶液に連続的に放出することが示された。ELISAキットから得た結果によって、15分及び1時間において、17%及び31.5%の相対量のホモ二量体蛋白が放出された。ホモ二量体蛋白の相対的な放出百分率は、14.5%(60分から1日目まで)、14.3%(1日目から2日目まで)、7.6%(2日目から3日目まで)、9.3%(3日目から7日目まで)、5.4%(7日目から10日目まで)、0.4%(10日目から14日目まで)であって、徐放性パターンを示していた。PLGA/Hp-β-TCPの該配合は、急激放出の共通課題を軽減した[Giteau et al., Int J Pharm 350:14 (2008)]；大部分の送達システムは、最初の数時間の間に急激に放出して送達し、封入された/表面結合された製品の60%以上を放出することが多い。[Woodruff et al., J Mol Histol 38:425 (2007) and Sawyer et al., Biomaterials 30:2479 (2009)].
【０２９４】
図16は、電子顕微鏡によるPLGA微粒子の形態及び直径分布を示す。PLGA微粒子は球状であり、直径分布の範囲が100μm〜150μmであった。
【０２９５】
もう一つの実施形態において、20mLのジクロロメタンに2gのPLGAを溶解して、10% PLGA/DCM溶液を形成した。水中に二相リン酸三カルシウム（ＢＣＰ）を分散させて、水相溶液を形成した。水相溶液とPLGA/DCM溶液とを混合し、マグネチックスターラーで30分間攪拌してエマルションを形成した。そして、造粒機にエマルションを供給し、スプレー造粒法を行ってPLGA微粒子を形成した。
Balb/Cマウス骨壊死モデルにおけるPLGA/Hp-β-TCPの新骨形成の評価
手術手順
【０２９６】
動物骨壊死モデルにおいて、現実の骨壊死状況を模擬するために、全脛骨骨膜を剥離した。長さ2mmのマウスの右側の脛骨の中軸を鋸で切り出し、液体窒素を用いて骨の切断面を凍結し、壊死性骨を模擬した。そして、該フラグメントを逆にして脛骨の元の部位に戻し、髄内固定として注射針(No. 26)を用いて、両端を脛骨の他の部分に固定した。骨折の周りに試験品を配置した後、絹縫合糸で創傷を閉鎖した。マウスを、壊死性骨対照(C)、PLGA/β-TCP(PT)、PLGA/0.2 μg Hp-β-TCP (POT-0.2)、PLGA/0.8 μg Hp-β-TCP (POT-0.8)、 PLGA/1.6μg Hp-β-TCP (POT-1.6)及びPLGA/3.2 μg Hp-β-TCP (POT-3.2)を含む6つのグループに分けた。各グループにいる3〜6匹のマウスを、手術後4週間観察した。
軟Ｘ線観察
【０２９７】
操作後の4週間、軟Ｘ線(SOFTEX, Model M-100, Japan)によって、43 KVP、2 mA に1.5 sの条件で、脛骨骨折を放射線的に検査した。観察期に適切な倍率を使用し、得られた顕微鏡写真において、全ての担体と対照との間で比較した。
【０２９８】
異なるホモ二量体蛋白用量を含有するPLGA/Hp-β-TCPの移植後4週間のマウス脛骨骨壊死断片カルスの形成のx線写真を、対照(C)又はPLGA/β-TCP (PT)グループと比較して、図17に示した。対照グループにおいて、不完全な融合が認められた。PTグループにおいて、小さな隙間が存在していた。POT-0.2、POT-0.8、POT-1.6、及びPOT-3.2グループにおいて、明瞭な融合塊は観察された。該結果は、PLGA/Hp-β-TCPグループにおける骨修復の効能が対照及びPTグループよりも高かったことを示した。
骨組織の組織学的分析
【０２９９】
組織化学分析を同時に用いて、骨組織における微視的な変化を評価した。ヘマトキシリン‐エオジン（H&E）染色の前に、0.5% EDTAを用いて骨組織の全てのサンプルを脱灰した。得られたサンプルをパラフィンワックスに包埋し、5μmの切片を用意した。H&Eで切片を普段染色し、顕微鏡で観察した。400Xの倍率で、カルス領域と対照グループとを比較した。
【０３００】
図18に示すように、PLGA/Hp-β-TCP (POT)の移植後4週間後、新生骨の形成を評価した。対照グループと比較すると、PLGA/β-TCP(PT)の骨形成速度はほぼ同様の結果を示した。PT及び対照グループと比較すると、POTグループにおける骨形成速度は増強され、POT-3.2用量を除いて依存的増加した。該結果は、Balb/Cマウス骨壊死モデルにおける骨再生を誘導し得るホモ二量体蛋白コントロールドリリース担体の潜在的な利点を示した。
[実施例13]持続放出系パテの調製
【０３０１】
表16の式に従って、粉末を混合して調製した。4℃で粉末を一晩保存した。パテを調製した日に、すべての材料（即ち、粉末、β-tcp、グリセロール及び脱イオン水）をUV光で20分間照射した。2x0.5x0.5cmの動物実験骨欠損範囲に応じるように、表16に示した式に従って、約0.9gのパテ重量を調製した
【表１６】
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【０３０２】
式A：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに160マイクロリットルの0.125mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させた。
【０３０３】
式B：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0.5mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させた。粉末及び液体(表16の式B)と予め調製したβ-TCPと一緒に混合して成形した。
【０３０４】
式C：粉末及び液体(表16の式C)を均一にに混合した。
【０３０５】
式D：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0. 25mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させてHp/β-TCP顆粒を形成させた。粉末及び液体(表16の式D) を一緒に混合してマトリックスを形成し、マトリックスを特定の形状に成形した。Hp/β-TCP顆粒は、マトリックスの外層に均一に分散された。
【０３０６】
式Ｅ：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0.5mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させてHp/β-TCP顆粒を形成させた。粉末及び液体(表16の式Ｅ) を一緒に混合してマトリックスを形成し、マトリックスを特定の形状に成形した。Hp/β-TCP顆粒は、マトリックスの外層に均一に分散された。
【０３０７】
式Ｆ：滅菌状態で約50mgのβ-TCPpに40マイクロリットルの0. 25mg/ml Hp溶液を滴下し、15分間吸着させてHp/β-TCP顆粒を形成させた。粉末及び液体(表16の式F) を一緒に混合してマトリックスを形成し、マトリックスを特定の形状に成形した。Hp/β-TCP顆粒は、マトリックスの外層に均一に分散された。
【０３０８】
式G：粉末及び液体(表16の式G)を均一にに混合した。
サンプルの調製
【０３０９】
表16に示した式パテを15mlの管に入れた。Hpに浸漬したβ-TCPを含み又は含まないパテを3mlのヒト血清中に置いて、37℃で5%CO2下で静置した。放出したHpを含むヒト血清溶液を1時間、1日目、2日目、3日目、7日目、10日目、14日目、21日目の各時点で収集し、2500μlの新鮮なヒト血清に置換した。収集されたヒト血清を-80℃で保存し、1日以内にdirect ELISAアッセイですべてのサンプルを同時に分析した。
OIF定量
【０３１０】
ホモ二量体蛋白の総濃度を定量するために、インビトロ放出試験を採用した。ELISA法（米国inVentive Health臨床システムから得ったアッセイ）を用いてヒト血清中のホモ二量体蛋白の濃度を定量した。製造業者の指示に従って行った。簡潔に言えば、I07捕捉抗体(株式会社ファーマフーズ製)がコーティングした96ウェルプレートに、サンプル、QCサンプル、標準サンプルを添加した。インキュベーション及び未結合物質を除去後、HRP-I07検出抗体を添加した。この工程に続いて、さらなる洗浄工程及び基材とのインキュベーションを行った。色反応を停止させ、適切な波長で吸光度を測定した。ホモ二量体蛋白の濃度を、標準偏差の非線形回帰から算出した。
【０３１１】
目的は、ベタ-TCP又はパテなどの生体再吸収性骨伝導性複合体からのホモ二量体蛋白の放出を評価し、その骨再生の適合性を分析する。式Aから放出されたホモ二量体蛋白について、図20に示すように、開始時の急激放出プロフィール及び急激放出（0-1時間程度）後の徐放性パターンが観察された。式Aと比較すると、式B及びCにおけるホモ二量体蛋白はパテ又はマトリックスで巻かれたため、開始時には放出できなっかた。これに対して、β-TCPに含まれるホモ二量体蛋白がパテ又はマトリックスの表面に分散した場合（例えば、式D）において、持続放出効果が達成された。パテは、骨再生を促進する能力を有する骨移植代用品であったことがわかった。パテの組成は、可塑性、硬化性、治癒を決定する。そのため、調製式の異なる割合、例えば、パテを調製するための硫酸カルシウム二水和物又は硫酸カルシウムの選択は、剤形の持続放出を達成することができる。
【０３１２】
骨代替材料の開発は、生体吸収性、骨伝導性、骨誘導性、及び生体適合性である材料に向かって傾向する。換言すれば、複合性骨欠損充填材料の開発の方向は、多機能性の材料である。設計されたパテにおいて、骨細胞の内部成長のために骨代替物中に細孔を生成することができ、且つ、材料分解の遅い過程において、破骨細胞の誘導及び骨細胞(osteocytes)の活性化のために、ホモ二量体蛋白の放出を長期間に亘ることもできる。そのため、骨欠損の治癒を効果的に促進することができる。
[実施例14] 臨床試験デザイン
試験デザイン1
【０３１３】
骨移植を必要とする開放脛骨骨折の治療において、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(即ち、SEQ ID NO: 260)を有するホモ二量体蛋白(Hp)/ β-TCPの3つの投与レベルの有効性及び安全性について、ランダム化盲検評価比較試験行って調査する。約35人の初期開放脛骨骨折(Gustilo type IIIA 又はIIIB) 患者を該試験に参加させ、４つのグループと1つの対照グループ（約5人の患者）にランダムに分けた。各グループは、約10人の患者を含む（下記参照）。1つのバイアルには、5.5mgのホモ二量体蛋白の凍結乾燥した粉末を含む。水戻し（所望濃度を得るために使用した水の確かな量は、表17に記載された）後、水戻したホモ二量体蛋白とβ-TCPとを混合して、最終濃度が1.5 mg/g (グループ2)、2m g/g (グループ3)、又は3 mg/g (グループ4)であるHp/β-TCPを作成し、骨折が発生した後3ヶ月以内、所定量のこれらの混合物を骨折部位に与えた。対照グループ(グループ1)の患者は、ホモ二量体蛋白又はβ-TCPを欠いた自体骨移植片を受容する。有効性及び安全性のために、被験者に対して30週間の主要試験期間に経過観察し、また、安全性のために期間延長し、決定的治療後の52週間まで経過観察した。場合によって、使用するβ-TCPの総量は、医師の判定及び調整に基づいて決定する。
【表１７】
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患者の算入/除外基準
【０３１４】
以下の包含基準の全てが当てる場合には、被験者を算入する。
【０３１５】
被験者は20歳以上である;
【０３１６】
非出産可能、若しくは術前72時間の妊娠テストに陰性結果を有する女性、又は男性;
【０３１７】
初期開放脛骨骨折(Gustilo type IIIA又はIIIB)、且つ、骨折の3ヶ月以内の骨移植;
【０３１８】
両側開き脛骨骨折では、ランダム治療を右脛骨に指定する;
【０３１９】
初期傷害後3ヶ月以内に決定的治療を行う;また、
【０３２０】
出産可能な女性被験者（外科的に滅菌されていない、又は閉経となってから1年経っていない）及び男性被験者の出産可能な伴侶は、試験期間中に医学的に許容される避妊方法を使用することに同意しなければならない。医学的に許容される避妊方法は、ホルモンパッチ、移植若しくは注射型子宮内装置、又は二重バリア法(泡状又は膣殺精剤を有するコンドーム、殺精剤を有するダイアフラム)を含む。完全な禁欲は、許容可能な避妊方法と考えることができる。経口避妊薬は、研究の前に対して許容可能な避妊方法であるが、研究中には代替的な方法が必要とされる。
【０３２１】
以下の除外基準のいずれかが当てる場合には、被験者を除外する。
【０３２２】
初期の意識損失を有する頭部損傷;
【０３２３】
骨折からの膿排出、又は活性な骨髄炎の徴候;
【０３２４】
コンパートメント症候群;
【０３２５】
病理性骨折、ページェット病若しくは他の骨芽腫の病歴、又は異所性骨化症の病歴;
【０３２６】
骨形成に影響を及ぼす内分泌又は代謝障害(例えば、副甲状腺若しくは甲状腺機能の低下症若しくは亢進症、腎性骨異栄養症、エーラス・ダンロス症候群又は骨形成不全症) ;
【０３２７】
異常な腎臓及び/又は肝機能を有し、通常値の上限の5倍のクレアチニン又はALT値を有する;
【０３２８】
この5年以内に悪性腫瘍、放射線治療、又は任意の悪性腫瘍のための化学治療の病歴;
【０３２９】
自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス又は皮膚筋炎);
【０３３０】
以前のrhBMP-2への暴露;
【０３３１】
モノクローナル抗体、ガンマグロブリンなどのタンパク質医薬品及びリン酸三カルシウムに対する過敏性;
【０３３２】
移植手術の28日以内にの任意の試験中治療法を用いた治療;
【０３３３】
7日間以上のプレドニゾン (6ヶ月以内の累積用量>150mg、又は等量の他のステロイド、Appendix 1参照)又はカルシトニン(6ヶ月以内)を用いた治療。ビスホスホネート(30日間以上、12ヶ月以内)を用いた治療、治療用量のフッ化物(12ヶ月以内に30日間);
【０３３４】
授乳期の女性被験者；及び
【０３３５】
医師の判断に基づいて、該試験の参加に適さない任意の状態。
有効性の評価
主要エンドポイント：
【０３３６】
主要試験有効性エンドポイントは、決定的な創傷閉鎖後30週間以内に二次介入を受けた被験者の割合。
副次エンドポイント：
【０３３７】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、42週間、52週間以内に二次介入を受けた被験者の割合;
【０３３８】
決定的な創傷閉鎖から二次介入までの時間;
【０３３９】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、30週間、42週間、52週間以内に臨床骨折治癒の速度;
【０３４０】
決定的な創傷閉鎖から臨床骨折治癒までの時間;
【０３４１】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、30週間、42週間、52週間以内に放射線的な治癒;
【０３４２】
決定的な創傷閉鎖から放射線的な治癒までの時間;
【０３４３】
「二次介入」という用語は、骨折治癒を刺激する可能性を有する手続き又は事件の発生を指す、これらに限定されるものではないが、骨移植、釘交換(exchange nailing)、プレート固定、ネイルダイナマイゼーション(nail dynamization)、超音波、電気刺激、磁場刺激、又は治癒を促進する他のことを含む。
【０３４４】
「臨床骨折治癒」という用語は、骨折部位に手動の触診の下で柔らかさ(tenderness)の欠如を意味する。場合によって、「臨床骨折治癒」という用語は、体重負荷の下で、骨折部位において疼痛の欠如又は軽度であること(疼痛スコア0-3)を意味する。疼痛を、視覚的アナログスケールを用いて記録した。
【０３４５】
「放射線的な治癒」という用語は、前後方向及び横方向の放射線写真のビューについて、試験者及び/又は独立の(independent)放射線科医により、4つの皮質において、3つの皮質に皮質ブリッジ及び/又は骨折線の消失が確認された状態を指す。
評価方法
安全性評価方法
【０３４６】
有害事象(Adverse effect、AE)：タイプ、重症度、管理とアウトカム。
【０３４７】
系統的有害事象(Systematic AE): 因果関係を問わず、任意の系統的なサイン、症状、疾患、臨床試験結果、X線所見、又は治療後発生した若しくは悪化した生理的な所見。
【０３４８】
局部有害事象(Local AE):炎症、感染(軟組織若しくは骨において、疑似若しくは確認された表在性若しくは深部の感染、細菌学的確認を有するか又は有しない)、ハードウエア障害、疼痛(新規又は増加)、末梢浮腫、異所性骨化症/軟組織石灰化、及び創傷治癒に関連する合併症。
有効性評価方法
【０３４９】
主要よび副次有効性のアウトカムを、最大の解析対象集団(Full Analysis Set、FAS)及び治験実施計画書に適合した対象(Per Protocol、PP)集団に基づいて分析した。FAS集団おいて主要分析を行った。
【０３５０】
主要有効性エンドポイントは、決定的な創傷閉鎖後30週間以内に二次介入を受けた被験者の割合であった。FAS集団において、コクランアーミテージの傾向検定(Cochran-Armitage trend test)によって主要分析を行って、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。治験実施計画書に適合した対象集団において、主要有効性エンドポイントのために支持分析(supportive analysis)を行った。
【０３５１】
加えて、以下のように副次有効性のエンドポイントを分析又はサマライズする。
【０３５２】
コクランアーミテージの傾向検定によって、決定的な創傷閉鎖後30週間以内に臨床骨折治癒を有する被験者の割合と放射線的な治癒を有する被験者の割合を別々に比較し、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。
【０３５３】
決定的な創傷閉鎖から二次介入までの時間、決定的な創傷閉鎖から臨床骨折治癒までの時間、決定的な創傷閉鎖から放射線的な治癒までの時間の評価を、記述統計(平均、SD).使用して、グループごとに別々にサマライズした。
【０３５４】
決定的な創傷閉鎖後術後6週間、12週間、18週間、24週間、42週間、52週間以内に二次介入を受けた被験者の割合、臨床骨折治癒であった被験者の割合、放射線的な治癒であった被験者の割合を記述統計(n、%).使用して、グループごとに別々にサマライズした。適用可能の場合は、single binomial proportion のために、Clopper-Pearson正確信頼区間（CI）に基づいて、各グループの95%CIを計算した。
試験デザイン2
【０３５５】
腰部椎体間融合のための後方開放アプローチを使用する単一レベル(L1-S1の間)の変性椎間板疾患(DDD)患者において、実施例6に従って製造した組換えポリペプチド(即ち、SEQ ID NO: 260)を有するホモ二量体蛋白(Hp)/ β-TCPの3つの投与レベルと、ケージ及び後方追加固定と組み合わせて、その有効性及び安全性について評価するランダム化盲検評価比較試験。24人の被験者を4つのグループ(1つの対照グループと3つの異なる投与量のグループ)にランダムに分けた(1:1:1:1)。各グループの治療のための臨床試験調査装置は以下の通りである。
【０３５６】
対照グループ（6人の被験者）: 標準治療(ケージを有する腰部椎体間融合のための後方開放アプローチ)及び自体骨移植片移植(β-TCP有し又はない)。
【０３５７】
1mg Hp/部位（6人の被験者）: 標準治療及び部位当たり1mgのホモ二量体蛋白
【０３５８】
2mg Hp/部位（6人の被験者）: 標準治療及び部位当たり2mgのホモ二量体蛋白
【０３５９】
3mg Hp/部位（6人の被験者）: 標準治療及び部位当たり3mgのホモ二量体蛋白
【０３６０】
ホモ二量体蛋白として、注射用水と共に5.5 mgのHp/バイアル凍結乾燥粉末を供給する。水戻し後、最終濃度が1mg、2mg、3mgHp/部位になるようにホモ二量体蛋白とβ-TCPとを混合した。ケージの中に、使用したケージの大きさによって決定した所定量の混合物を与えた。
【０３６１】
ホモ二量体蛋白を、3つの異なる濃度の保存溶液となるように水戻し（所望濃度を得るために使用した水の確かな量は、表18に記載された）。ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)ケージウィルコム、xxxシリーズ)において、必要とされた0.24mlの各保存溶液とブロックβ-TCPとを混合した。
【０３６２】
DDD部位に与えたホモ二量体蛋白の最終濃度は1.0; 2.0;3.0 mg Hp/部位であった。
【０３６３】
ホモ二量体蛋白の保存溶液: 5.5(mg) /1.32 (ml) = 4.2 (mg/ml)
【０３６４】
ホモ二量体蛋白の最終濃度(mg)/部位: 4.2 (mg/ml) ×0.24 (ml) = 1.0 mg
【表１８】
2019525767.tif 000137
【０３６５】
自対移植片の供給源は、後上腸骨棘(PSIS)又は後椎弓切除から得った骨の破片(bone chips)とすることができる。自体移植片の量が不十分の場合は、自体移植片とβ-TCPと混合することができる。局所移植及び後方追加固定に伴った片側又は両側の後側融合(1側又は２側とすることができる)は、試験者の判断に基づいて全てのグループに使用することができる。術前に静脈内バンコマイシン(毎6時間に500mg) を与えて、且つ3日間連続で与えた。
【０３６６】
有効性及び安全性のために、被験者に対して24週間の主要試験期間に経過観察し、また、安全性のために期間を延長して、指標手術後の24月間まで経過観察した。場合によって、臨床試験者及び独立評価者は、試験中の放射線撮影結果を評価することにより、有効性を評価する。
算入基準
【０３６７】
以下の包含基準の全てが当てる場合には、被験者を算入する。
【０３６８】
被験者は20歳以上である;
【０３６９】
足若しくは臀部に広まる痛み、感覚異常、麻痺、虚弱、又は神経性跛行の病歴によって現れた、（神経根圧迫続発にする神経障害が有し又はなくて）椎間板由来源の背中の痛みによって注意れたL1-S1の単一レベルDDD。
【０３７０】
椎間板高さの減少、髄核ヘルニア（herniated nucleus pulposus）、黄色靱帯(ligamentum flavum)の肥大化又は肥厚化、線維輪(annulus fibrosis)、面関節嚢(facet joint capsule)、肥大した面関節、面関節間隔狭窄、関節周囲骨増殖体(facet periarticular osteophyte)形成、レフォイル管形状(trefoil canal shape)、又は外側陥凹部(subarticular) 狭窄、脊椎端板骨増殖体(vertebral endplate osteophyte) 形成などの重症変性腰仙部疾患のx線像証拠を有し、且つ
【０３７１】
下側(尾側) 椎体の前又は後の上側(頭部) 椎体のセジタル面並進(ずれ)が4mmよりも大きく、若しくは角度が10°よりも大きく、又は、下側(尾側) 椎体の前又は後の上側(頭部) 椎体のコロナル面並進(ずれ)が4mmよりも大きく、又は腰部脊柱管及び/又は椎間孔の狭窄(狭窄症)について、少なくとも1つを有する。
【０３７２】
少なくとも6ヶ月以上、非手術的な治療に非応答性;
【０３７３】
非出産可能、若しくは術前72時間の妊娠テストに陰性結果を有する女性、又は男性;
【０３７４】
出産可能な女性被験者（外科的に滅菌されていない、又は閉経となってから1年経っていない）及び男性被験者の出産可能な伴侶は、試験期間中に医学的に許容される避妊方法を使用することに同意しなければならない。医学的に許容される避妊方法は、ホルモンパッチ、移植若しくは注射型子宮内装置、又は二重バリア法(泡状又は膣殺精剤を有するコンドーム、殺精剤を有するダイアフラム)を含む。完全な禁欲は、許容可能な避妊方法と考えることができる。経口避妊薬は、研究の前に対して許容可能な避妊方法であるが、研究中には代替的な方法が必要とされる;
【０３７５】
女性であれば、授乳していない被験者;
【０３７６】
研究関連の任意の手順に参加する前に、署名された同意説明文書(ICF)の提供に同意し、且つ試験の期間の研究要件に適格する。
除外基準
【０３７７】
以下の除外基準のいずれかが当てる場合には、被験者を除外する:
【０３７８】
グレード1を超えた脊椎すべり症(Meyerdingの分類、付録1に参照);
【０３７９】
関連するレベルにおける脊椎器具の移植若しくは椎体間融合術の病歴、又は椎弓根スクリューが挿入したレベルにおける椎体骨折;
【０３８０】
確立された骨軟化症;
【０３８１】
過去5年間における活性悪性腫瘍又は以前の悪性腫瘍履歴（皮膚基底細胞癌及び子宮頸上皮癌を除く）;
【０３８２】
活性局所又は全身感染;
【０３８３】
全般的な肥満; BMI≧30として定義する;
【０３８４】
> 38℃の発熱;
【０３８５】
精神的に機能不全。疑わしい場合は、精神医学的な調査を得る;
【０３８６】
機能がない行動（Inorganic Behavior）のWaddell Signs≧3(Appendix2参照)
【０３８７】
アルコール及び/又は薬物の乱用に対する現行治療中に定義したアルコール及び/又は薬物の乱用。アルコール乱用は、人の健康、個人間の関係、又は作業する能力に危害する飲用パターンである。
【０３８８】
自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス又は皮膚筋炎);
【０３８９】
モノクローナル抗体、ガンマグロブリンなどのタンパク質医薬品に対する過敏性;
【０３９０】
以前のrhBMP-2への暴露;
【０３９１】
骨形成に影響を及ぼす内分泌又は代謝障害(例えば、副甲状腺若しくは甲状腺機能の低下症若しくは亢進症、腎性骨異栄養症、エーラス・ダンロス症候群又は骨形成不全症) ;
【０３９２】
7日間以上のプレドニゾン (6ヶ月以内の累積用量>150mg、又は等量の他のステロイド、Appendix3参照)又はカルシトニン(6ヶ月以内)を用いた治療。ビスホスホネート(30日間以上、12ヶ月以内)を用いた治療、治療用量のフッ化物(12ヶ月以内に30日間)、及び所定治療の移植前の30日以内に抗悪性腫瘍、免疫刺激性、免疫抑制薬剤の使用。
【０３９３】
移植手術の28日以内にの任意の試験中治療法を用いた治療;
【０３９４】
30度を超えた脊柱側弯症
【０３９５】
有意なCNS、心臓血管の、肝臓の、腎臓の、代謝の、胃腸の、泌尿器科の、内分泌の、若しくは血液学的疾患の病歴又は臨床症状を有する被験者；
【０３９６】
脱力(motor weakness)、感覚脱失などのこの研究における治療の安全性及び有効性の正確な臨床評価を妨げる医学疾患又は状態、又は通常の歩行若しくは日常生活における他の活動を妨げる痛み状態。
【０３９７】
異常な腎臓及び/又は肝機能を有し、通常値の上限の5倍のクレアチニン、ALT、AST値を有する;
【０３９８】
記録したPEEKに対するアレルギー又は不耐性;
【０３９９】
バンコマイシンに対する過敏症又はアレルギーの病歴;
【０４００】
医師の判断に基づいて、該試験の参加に適さない任意の状態。
予定試験継続期間
【０４０１】
スクリーニング期間：14日間。被験者がICFに署名していることを確認し、研究に適格であるかどうかを評価する。該評価は、身体検査、生命徴候、心電図、血液若しくは尿妊娠検査、実験検査、術前臨床、及び放射線学評価を含む。人口統計学、医療履歴、併用医薬、有害事象象のデータを収集することが必要である。
【０４０２】
治療期間：1日。被験者が試験に適格であるかどうかを確認し、ベースラインサンプル/データを取得し、試験産物を投与する。該評価は、身体検査、生命徴候、及び放射線学評価を含む。手術情報、併用医薬、有害事象象のデータを収集することが必要である。
【０４０３】
経過観察期間： 24週間の主要試験期間、及び延長安全性経過観察として移植後の24月間まで被験者を経過観察した。治療後の6週目、12週目、18週目、24週目、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に評価を行う。該評価は、併用治療、身体検査、試験評価、生命徴候、放射線検査(前/後及び側面視、屈曲/伸展フィルム)。24週目及び24ヶ月に高解像度薄切りCTスキャン(アクシャル、コロナル及びセジタル再建における1mmの指数を有する1mmスライス) を行う。
主要エンドポイント：
【０４０４】
主要試験有効性エンドポイントは、術後24週間に融合成功を有する被験者の割合。
副次エンドポイント：
【０４０５】
術後12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に融合成功を有する被験者の割合。
【０４０６】
ベースラインから放射線的な融合までの時間。
【０４０７】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に追加的な外科手続き/介入を有する被験者の割合;手術時間(皮膚切開から創傷閉鎖まで)、失血(手術中)、病院滞在を記録する。
【０４０８】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月のオスウェストリー障害指数(Oswestry Disability Index、ODI、Appendix4参照)における成功率; 患者の背部の機能を分析するためにODI質問事項を使用した。ODIスコアの範囲は0-100であった。最良スコアは0(障害無し)であり、最悪は100(最大障害)である。ODIの成功率は、ODIスコアが「術前スコア-術後スコア≧15」に満たされた被験者の百分率として報告される。
【０４０９】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月の視覚的アナログスケール(VAS、Appendix5参照)における改善の成功率。背部の痛みの成功率は、背部の痛みおける改善が「術前スコア-術後スコア>0」に満たされた被験者の百分率として報告される。下肢痛における成功率は、下肢痛における改善が「術前スコア-術後スコア>0」に満たされた被験者の百分率として報告される。
有効性評価方法
【０４１０】
主要よび副次有効性のアウトカムを、最大の解析対象集団(Full Analysis Set、FAS)及び治験実施計画書に適合した対象(Per Protocol、PP)集団に基づいて分析した。FAS集団おいて主要分析を行った。
【０４１１】
主要試験有効性エンドポイントは、術後24週間に融合成功を有する被験者の割合。FAS集団において、コクランアーミテージの傾向検定によって主要分析を行って、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。主要有効性エンドポイントのために支持分析(supportive analysis)を行った。
【０４１２】
加えて、以下のように副次有効性のエンドポイントを分析又はサマライズする。
【０４１３】
コクランアーミテージの傾向検定によって、術後12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に融合成功を有する被験者の割合と術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月に追加的な外科手続き/介入を有する被験者の割合を別々に比較し、ホモ二量体蛋白投与量の増加に応答する線形傾向を示す。
【０４１４】
ベースラインから放射線的な融合までの時間を評価し、記述統計(平均、SD)を使用して、グループごとに別々にサマライズした。
【０４１５】
手術時間(皮膚切開から創傷閉鎖まで)、失血(手術中)、病院滞在を評価し、記述統計(平均、SD)を使用して、腕ごとに別々にサマライズした。
【０４１６】
術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月のODIの成功率及び術後24週間、12ヶ月、18ヶ月、24ヶ月のVASの成功率を、記述統計(n、%)を使用して、腕ごとに別々にサマライズした。適用可能の場合は、single binomial proportion のために、Clopper-Pearson正確信頼区間（CI）に基づいて、各グループの95%CIを計算した。
【０４１７】
本開示は、本明細書に記載された特定の実施形態によって範囲が限定されるべきものではない。実際、当業者にとって、以上の説明及び添付図面により、記載されたものに加えて開示に対する様々な修正は明らかである。そのような修正は、添付の特許請求の範囲内に該当する。
【０４１８】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内であること。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2019525767.tif 000138
【図１Ｂ】
2019525767.tif 000139
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2019525767.tif 000141
【図３】
2019525767.tif 000142
【図４】
2019525767.tif 000143
【図５】
2019525767.tif 000144
【図６】
2019525767.tif 000145
【図７】
2019525767.tif 000146
【図８】
2019525767.tif 000147
【図９】
2019525767.tif 000148
【図１０】
2019525767.tif 000149
【図１１】
2019525767.tif 000150
【図１２】
2019525767.tif 000151
【図１３】
2019525767.tif 000152
【図１４】
2019525767.tif 000153
【図１５Ａ】
2019525767.tif 000154
【図１５Ｂ】
2019525767.tif 000155
【図１６】
2019525767.tif 000156
【図１７】
2019525767.tif 000157
【図１８】
2019525767.tif 000158
【図１９】
2019525767.tif 000159
【図２０】
2019525767.tif 000160
【国際調査報告】
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2019525767.tif 000162
2019525767.tif 000163
2019525767.tif 000164