(57)【要約】  本発明は、改変ヒートショック７０タンパク質と融合された抗原結合ドメインを含む、融合タンパク質に関する。本発明は、さらに、抗原に対する免疫応答を誘導するために、および、抗原と関連する疾患を治療するために、融合タンパク質を用いる方法に関する。【選択図】  図２Ｂ
2019511246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００未満のアミノ酸のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質であって、
前記ＨＳＰ７０フラグメントは、最小ＨＳＰ７０配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１の融合タンパク質であって、
前記ＨＳＰ７０フラグメントは、前記最小ＨＳＰ７０配列からなる、
融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２の融合タンパク質であって、
前記最小ＨＳＰ７０配列は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０（配列番号１）のアミノ酸残基３６８〜４９５である、
融合タンパク質。
【請求項４】
請求項３の融合タンパク質であって、
配列番号３のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃１）。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項の融合タンパク質であって、
前記ＨＳＰ７０フラグメントは、改変ＣＤ９４ドメインを含む、
融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５の融合タンパク質であって、
前記改変ＣＤ９４ドメインは、
ＡＡＨＮＮＬＬＧＳＦＥＬＴＧ（配列番号１６）；
ＡＡＨＮＮＬＬＧＲＦＥＬＴＧ（配列番号１７）；
ＡＡＨＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１８）；
ＴＫＥＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１９）；または
ＴＲＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号２０）
から選択されるアミノ酸からなる、
融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６の融合タンパク質であって、
前記改変ＣＤ９４ドメインは、アミノ酸配列ＴＫＥＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１９）からなる、
融合タンパク質。
【請求項８】
請求項７の融合タンパク質であって、
配列番号５のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃２）。
【請求項９】
請求項６の融合タンパク質であって、
前記改変ＣＤ９４ドメインは、アミノ酸配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号２０）からなる、
融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９の融合タンパク質であって、
配列番号７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃５）。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項の融合タンパク質であって、
改変Ｖ４１０Ｆ（配列番号１に従ってナンバリング）をさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項の融合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインと前記ＨＳＰ７０フラグメントとの間にリンカーをさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１２の融合タンパク質であって、
前記リンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号２１）、（ＧＧＧＳＧＧＧ）４（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）、およびＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１３の融合タンパク質であって、
前記リンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）である、
融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４の融合タンパク質であって、
配列番号９のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃３）。
【請求項１６】
請求項１３の融合タンパク質であって、
前記リンカーは、ＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）である、
融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１６の融合タンパク質であって、
配列番号１１のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃４）。
【請求項１８】
少なくとも１００アミノ酸のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含み、配列番号１のアミノ酸１〜４９５を超えずに含む、
融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１８の融合タンパク質であって、
改変（配列番号１に従ってナンバリング）：
ａ）Ｒ３１８Ａ；
ｂ）Ｆ１７６Ａ；および
ｃ）Ｆ４１０Ｖ
の１つまたは複数をさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１８または１９の融合タンパク質であって、
改変ＣＤ９４ドメインをさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項２０の融合タンパク質であって、
前記改変ＣＤ９４ドメインは、
ＡＡＨＮＮＬＬＧＳＦＥＬＴＧ（配列番号１６）；
ＡＡＨＮＮＬＬＧＲＦＥＬＴＧ（配列番号１７）；
ＡＡＨＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１８）；
ＴＫＥＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１９）；または
ＴＲＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号２０）
から選択されるアミノ酸配列からなる、
融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか一項の融合タンパク質であって、
Ｔｒｅｇ領域内に改変をさらに含み、
前記Ｔｒｅｇ領域は、配列番号１のアミノ酸残基１４１〜１５５を含む、
融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１８から２２のいずれか一項の融合タンパク質であって、
リンカーをさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項２３の融合タンパク質であって、
前記リンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号２１）、（ＧＧＧＳＧＧＧ）４（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）、およびＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）からなる群より選択されるアミノ酸を含む、
融合タンパク質
【請求項２５】
請求項１９の融合タンパク質であって、
配列番号１２のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃６）。
【請求項２６】
請求項１９の融合タンパク質であって、
配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質（クローン＃７）。
【請求項２７】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質であって、
配列番号２６（仮（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）由来の配列）のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項２８】
キメラＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）にインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質であって、
前記キメラＨＳＰ７０は、ヒトＨＳＰ７０アミノ酸配列の主鎖を含み、
約アミノ酸残基３６７〜４７９（配列番号２９に基づくナンバリング）のβシートドメインは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０の約アミノ酸残基３９５〜５４１（配列番号１に基づくナンバリング）のβシートドメインによって置換される、
融合タンパク質。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項の融合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインは、改変された抗体またはそのフラグメントである、
融合タンパク質。
【請求項３０】
請求項１から２９のいずれか一項の融合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである、
融合タンパク質。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか一項の融合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインは、メソテリンに特異的に結合する、
融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか一項の融合タンパク質であって、
前記抗原結合ドメインは、メソテリンに特異的に結合するｓｃＦｖである、
融合タンパク質。
【請求項３３】
請求項３２の融合タンパク質であって、
前記ｓｃＦｖは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、
融合タンパク質。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか一項の融合タンパク質であって、
Ｎ末端上にリーダー配列をさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項３５】
請求項３４の融合タンパク質であって、
前記リーダー配列は、植物リーダー配列である、
融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか一項の有効量の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む、
医薬組成物。
【請求項３７】
請求項１から３５のいずれか一項の融合タンパク質を含む、
免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項３８】
請求項１から３５のいずれか一項の融合タンパク質およびそのパッケージング手段を含む、
キット。
【請求項３９】
請求項１から３５のいずれか一項の融合タンパク質をコードする、
単離された核酸。
【請求項４０】
請求項３９の単離された核酸であって、
ａ）配列番号２、４、６、８、および１０のいずれか１つのヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補のヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）に逆相補であるヌクレオチド配列；または
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
から選択される、
単離された核酸。
【請求項４１】
請求項３９または４０の単離された核酸であって、
宿主細胞における発現に関してコドン最適化されている、
単離された核酸。
【請求項４２】
請求項４１の単離された核酸であって、
植物細胞における発現に関してコドン最適化されている、
単離された核酸。
【請求項４３】
請求項４２の単離された核酸であって、
前記植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍである、
単離された核酸。
【請求項４４】
請求項３９から４３のいずれか一項の単離された核酸であって、
プロモーターに動作可能に連結された、
単離された核酸。
【請求項４５】
請求項４４の単離された核酸であって、
前記プロモーターは、植物プロモーターである、
単離された核酸。
【請求項４６】
請求項３９から４５のいずれか一項の核酸を含む、
発現ベクター。
【請求項４７】
請求項３９から４５のいずれか一項の単離された核酸または請求項４６の発現ベクターを含む、
細胞。
【請求項４８】
請求項４７の細胞であって、
植物細胞または細菌細胞である、
細胞。
【請求項４９】
請求項４８の細胞であって、
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍから選択される植物細胞である、
細胞。
【請求項５０】
対象において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、
前記抗原に特異的に結合する請求項１から３５のいずれか一項の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含み、それにより免疫応答を誘導する、
方法。
【請求項５１】
それを必要とする対象において抗原と関連する疾患を治療する方法であって、
前記抗原に特異的に結合する請求項１から３５のいずれか一項の治療的に有効量の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含み、それにより前記疾患を治療する、
方法。
【請求項５２】
請求項５０または５１の方法であって、
前記抗原は、疾患抗原である、
方法。
【請求項５３】
請求項５２の方法であって、
前記抗原は、癌抗原である、
方法。
【請求項５４】
請求項５３の方法であって、
前記癌抗原は、メソテリンである、
方法。
【請求項５５】
請求項５４の方法であって、
抗原と関連する前記疾患は、メソテリンを発現する癌である、
方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法であって、
前記癌は、卵巣癌、髄膜腫、グリオーマ、軟膜（ｌｅｐｔｏｍｉｎｉｎｇｅｓ）への転移、中皮腫、子宮腺癌、悪性中皮腫、膵癌、または肺腺癌である、
方法。
【請求項５７】
請求項５０から５６のいずれか一項の方法であって、
さらなる活性剤を前記対象に投与するステップをさらに含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦支援の陳述］
本発明は、国防総省により授けられた助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１４−１−０２０６の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
【０００２】
［優先権の陳述］
本出願は、２０１６年３月１０日に出願された米国仮出願番号６２／３０６，１６８の利益を主張し、その内容全体は本明細書中に参照により援用される。
【０００３】
［本発明の分野］
本発明は、改変ヒートショック７０タンパク質と融合された抗原結合ドメインを含む、融合タンパク質に関する。本発明は、さらに、抗原に対する免疫応答を誘導するために、および、抗原と関連する疾患を治療するために、融合タンパク質を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
メソテリンは、正常ヒト組織におけるその発現が、胸膜、心膜および腹膜に並んでいる中皮細胞に制限される、分化抗原である。しかしながら、メソテリンは、中皮腫、膵腺癌、卵巣癌および肺腺癌を含むいくつかのヒト癌において高度に発現される。メソテリンは、疾患予防または治療の方法のための適切な標的であり、メソテリンに特異的な抗体、および、メソテリンを含むワクチンは、予防的および治療的方法に有用である。
【０００５】
古典的なモノクローナル抗体は、現在のところ、哺乳類細胞において生産される。この生産方法の欠点は、適切なクローンを生産および選択する困難性、および、哺乳類細胞を培養する費用を含む。「次世代」のモノクローナル抗体は、大腸菌において改変されている。近年、ポリペプチドリンカーによって一緒に繋がれたＶＨおよびＶＬドメインの微生物発現は、改変された「ミニ抗体」を生産する可能性を作ってきた。これらのミニボディは、実質的に組み合わせの様式で大腸菌において生産され得る。これらの人工的に作られたＦａｂまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、一緒に連結されて、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディのような多量体を形成することができる。それらは、ほとんど抗体のような効率で抗原に結合することが可能であるが、これらの改変されたＦｃ欠損ミニ抗体は、抗原提示細胞と相互作用する能力を欠き、免疫原性が乏しい。改変された抗体の免疫原性の欠如に対する既存の解決方法は、免疫細胞と直接的に結合するように抗原結合部位の１つを指向させることを含む。このことはそれらに並置をもたらすが、モノクローナル抗体に関して観察されるのと同一のＭＨＣクラスＩプライミングをもたらさない。
【０００６】
ワクチンを用いた免疫付与は、疾患および感染の脅威に対する防御の基礎を維持している。ワクチン開発における重要な困難性は、ワクチンまたは抗毒素を、特定の脅威に急速にマッチさせることである。現行のワクチン開発戦略は、感染または疾患を成功的に根絶するために標的化され得る抗原を同定および特性化することに依拠する。現行のワクチン開発戦略は、時間および労働集約的であり、脅威が出現した時点で開始することができるだけである。そのような戦略は、標的抗原が個々の間で異なる疾患と戦うための個別化されたワクチンを生産するには非実用的でもある。現行のワクチン開発戦略は、したがって、新しくて重大な脅威が出現して、それに関して、そのような脅威が含まれ得る前に標的抗原を同定および特性化するために十分な時間が利用できない場合は、不十分である。現行のワクチン開発戦略は、一般集団のために個別化されたワクチンを生産するのにも不十分である。
【０００７】
米国特許第７，７４９，５０１号および第７，９４３，１３３号は、抗原に対する免疫応答を高めるために、ストレスタンパク質に融合された、改変された抗体を含む融合タンパク質を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、高められた免疫賦活性および治療的特性を有する改変された融合タンパク質を開示することにより、当該分野における以前の短所を対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、抗原に対する免疫応答を刺激するために、および、抗原と関連する疾患を治療するために、単独または組み合わせて、改変ＨＳＰ７０を含む抗原結合融合タンパク質の有効性を高める、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のいくつかの改変の開発に一部基づく。
【００１０】
したがって、本発明の一態様は、２００未満のアミノ酸のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関し、ＨＳＰ７０フラグメントは、最小ＨＳＰ７０配列を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、少なくとも１００アミノ酸のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含み、および配列番号１のアミノ酸１〜４９５を超えずに含む、融合タンパク質に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関し、配列番号２６（仮（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ）由来の配列）のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、キメラＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）にインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関し、ここで、キメラＨＳＰ７０は、ヒトＨＳＰ７０アミノ酸配列の主鎖を含み、約アミノ酸残基３６７〜４７９（配列番号２９に基づくナンバリング）のβシートドメインは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０の約アミノ酸残基３９５〜５４１（配列番号１に基づくナンバリング）のβシートドメインによって置換される。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、有効量の本発明の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明の融合タンパク質を含む免疫原性組成物またはワクチンに関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、本発明の融合タンパク質およびそのパッケージング手段を含むキットに関する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、本発明の融合タンパク質および発現ベクターをコードする単離された核酸、および、その核酸を含む細胞に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関し、抗原に特異的に結合する本発明の融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、それにより、免疫応答を誘導する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象において抗原と関連する疾患を治療する方法に関し、抗原に特異的に結合する治療的に有効量の本発明の融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、それにより疾患を治療する。
【００２０】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＶＩＣ−００７（配列番号２８）およびＶＩＣ−００８（配列番号２７）のアミノ酸配列を示す。ＶＩＣ−００８は、太字および斜体で示された余分のアミノ酸ＧＳＳ、ＳＧＩＬＥＱＱＧ、およびＡＡＡＭＲＳの除去、および、ＭｔｂＨｓｐ７０の４１０位において、単一アミノ酸突然変異、バリン（Ｖ）の代わりにフェニルアラニン（Ｆ）の導入によって、ＶＩＣ−００７から再構成された。
【図２Ａ−２Ｂ】腫瘍増殖を示す。生物発光シグナルの定量分析を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍを用いて、Ｌｕｃ−ＩＤ８腫瘍接種マウス（ｎ＝８または９）に対して腫瘍接種の１週間後およびその後に毎週行なった。（Ａ）それぞれの処置群由来の代表的なマウスの長手方向の画像を、処置前の腫瘍接種の１週間後から（Ｗ０）、およびその後の５週（Ｗ１−Ｗ５）、示した。（Ｂ）矢印は、腫瘍接種後１週間で開始して７日間隔での４つの処置を示した。合計光子は、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩＩによって計算された。統計的違いは、Ｔｗｏ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後にテューキー多重比較検定を用いて解析した。＊＊＊＊，ｐ＜０．０００１。データは、平均±ｓｅｍとして示した。
【図３】処置後のマウス生存を示す。マウスは、処置後１週間、毎日観察した。エンドポイントにおいて、マウスを安楽死させて、生存時間を腫瘍接種の日からの寿命として計算した。対数順位検定を用いてメジアン生存およびｐ値を決定した。
【図４】治療の開始（週０）後の最初の５週における卵巣癌腫瘍増殖を示す。ルシフェラーゼ発現ＩＤ８マウス卵巣癌細胞（５×１０６）を腹腔内注入された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス。生理食塩水処置コントロール群における１０匹のマウス；ＶＩＣ−００８処置群における１１匹のマウス。マウスは、腫瘍導入の１週間後に開始して、４回の毎週の処置を受けた。ＶＩＣ−００８の処置投与量は、マウスあたり２０μｇであった。ルシフェラーゼシグナルをＩＶＩＳによって監視した。統計的有意性を、Ｔｗｏ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を用いて実証した。
【図５】卵巣癌細胞の注入後のマウス生存を示す。ルシフェラーゼ発現ＩＤ８マウス卵巣癌細胞（５×１０６）を腹腔内注入された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス。生理食塩水処置コントロール群における１０匹のマウス；ＶＩＣ−００８処置群における１１匹のマウス。マウスは、腫瘍導入の１週間後に開始して、４回の毎週の処置を受けた。ＶＩＣ−００８の処置投与量は、マウスあたり２０μｇであった。統計的有意性は、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いて実証された。
【図６】腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示す。腫瘍サンプルを、生理食塩水またはＶＩＣ−００８のいずれかの４回目および最後の処置の２週間後に集めた。フローサイトメトリーを用いて腫瘍組織を集めてイムノプロファイルして、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。Ｔ細胞を、ゲートを通った（ｇａｔｅｄ）生細胞のパーセンテージとしてカウントした。
【図７】腫瘍内のＴｒｅｇ  Ｔ細胞浸潤を示す。腫瘍サンプルを、生理食塩水またはＶＩＣ−００８のいずれかの４回目および最後の処置の２週間後に集めた。フローサイトメトリーを用いて腫瘍組織を集めてイムノプロファイルして、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を検出した。制御性Ｔ細胞を、全てのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとしてカウントした。
【図８】腫瘍における制御性Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比を示す。腫瘍サンプルを、生理食塩水またはＶＩＣ−００８のいずれかの４回目および最後の処置の２週間後に集めた。フローサイトメトリーを用いて腫瘍組織を集めてイムノプロファイルして、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の両方を検出した。比を、観察された集団のパーセンテージに基づいて計算した。
【図９】腫瘍内のセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示す。腫瘍サンプルを、生理食塩水またはＶＩＣ−００８のいずれかの４回目および最後の処置の２週間後に集めた。フローサイトメトリーを用いて腫瘍組織を集めてイムノプロファイルして、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ２７＋セントラルメモリーＴ細胞を検出した。ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞を、全てのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージとしてカウントした。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明はここで、本発明の好ましい実施態様が示される、付随する図面に関してより詳細に説明される。しかしながら、本発明は異なる形態で実現され得て、本明細書において示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように、与えられる。
【００２３】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書において、本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の制限を意図しない。本明細書における全ての刊行物、特許出願、特許、特許文献および他の引用文献は、参考文献が示される文章および／または段落に関連のある教示に関して、それらの全体で参照により援用される。
【００２４】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。
【００２５】
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせが、除外または省略され得ることも検討する。
【００２６】
説明すると、複合体は構成要素Ａ、ＢおよびＣを含む、と明細書が述べる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独または任意の組み合わせで省略および放棄され得ることが明確に意図される。
【００２７】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で本明細書中に参照により援用される。
【００２８】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２および確立された使用に従って表される。
【００２９】
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数形も同様に含むことが意図される。
【００３０】
また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられた項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
【００３１】
本明細書において用いられる用語「約」は、測定可能な値、例えば、ポリペプチドの量、投与量、時間、温度、酵素活性または他の生物学的活性などを言及する場合、規定される量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３２】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに帰するオープンエンドの意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味する。
【００３３】
本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（および文法上の変形）は、挙げられた材料またはステップおよび特許請求の範囲に記載された発明の基礎および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等と解釈されるべきでない。
【００３４】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に加えられる用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（および文法上の変形）は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能が実質的に変更されないように、挙げられた配列（例えば、配列番号）、および、挙げられた配列のＮ末端および／またはＣ末端上の、合わせて１０以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のさらなるアミノ酸または５’および／または３’末端上のさらなるヌクレオチドの両方からなる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。合わせて１０以下の、さらなるアミノ酸またはヌクレオチドは、両末端上のさらなるアミノ酸またはヌクレオチドを一緒に合わせた合計数を含む。本発明のポリペプチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、挙げられた配列からなるポリペプチドの活性と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、免疫賦活性（例えば、メソテリン含有腫瘍に向かう）の増大または低減を指す。本発明のポリヌクレオチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、挙げられた配列からなるポリヌクレオチドの活性と比較して、少なくとも約５０％またはそれよりも高い、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。
【００３５】
用語「調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ」）」、「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅｓ）」、または、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、規定のレベルまたは活性の上昇（例えば増大）または阻害（例えば低減）を指す。
【００３６】
用語「上昇する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、または実に１５倍の、規定のパラメーターの増大を指す。
【００３７】
本明細書において用いられる用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」またはそれらの文法的変形は、少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれよりも高い、規定のレベルまたは活性の低減または縮減を指す。特定の実施態様では、阻害または減少は、検出可能な活性をほとんどまたは本質的にもたらさない（せいぜい、わずかな量、例えば、約１０％または実に５％未満）。
【００３８】
ポリペプチドおよびカルシウムチャネルに関して用いられる用語「接触する（ｃｏｎｔａｃｔ）」またはその文法的変形は、ポリペプチドおよびカルシウムチャネルを、一方が他方に生物学的効果を与えるように、互いに十分に極めて接近させることを指す。一部の実施態様では、用語「接触する」は、カルシウムチャネルへのポリペプチドの結合を意味する。
【００３９】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「〜の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ）」によって、対象の状態の重症度が減少され、または少なくとも部分的に改善され、または改変されること、および、少なくとも１つの臨床症候における一部の軽減、緩和または低減が達成されることが、意図される。
【００４０】
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびそれらの文法的変形）は、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の予防および／または遅延、および／または、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の重症度の減少を指す。予防は、完全、例えば、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の全体的な不存在であってよい。予防は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発生および／または発症の重症度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも低いように、部分的であってもよい。
【００４１】
本明細書において用いられる「治療的に効果的な」量は、何らかの改善または利益を対象に提供する量である。別の言い方をすると、「治療的に効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候の何らかの軽減、緩和、または低減を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。
【００４２】
本明細書において用いられる「予防的に効果的な」量は、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延させる、および／または、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を減少および／または遅延させるのに、十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。
【００４３】
本明細書において用いられる「メソテリン」は、正常ヒト組織における発現が、胸膜、心膜および腹膜に並んでいる中皮細胞に制限される、分化抗原を指す。しかしながら、メソテリンは、中皮腫、膵腺癌、卵巣癌および肺腺癌を含むいくつかのヒト癌において高度に発現される。メソテリン遺伝子は、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と呼ばれる３１ｋＤａのシェド（ｓｈｅｄ）タンパク質にプロセッシングされる７１ｋＤａの前駆タンパク質、および、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーによって細胞膜に付着した４０ｋＤａフラグメント、メソテリンをコードする。
【００４４】
メソテリンの３つの（三）変異体が存在する：可溶性メソテリン−１、独特のメソテリン−２転写産物、および、伸長されたＣ末端を有するメソテリン−３変異体。メソテリン−１は、胸膜、心膜および腹膜内、および、卵巣、扁桃、および卵管の表面上皮上に見られる（Ｏｒｄｏｎｅｚ，２００３）。メソテリンは、中皮腫、膵腺癌、および、頭部、頸部、肺、食道、頸部、および外陰部の扁平上皮細胞癌腫にも過剰発現される（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ  １９９２，１９９６；Ｆｒｉｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【００４５】
用語「投与」は、制限されないが、対象の系への、または対象内または対象上の特定の領域への、医薬組成物または治療剤を含む本発明の化合物の送達の任意の方法を含み、全身性または局所的投与を含む。本明細書において用いられる語句「全身投与」、「全身性に投与される」、「末梢投与」および「末梢に投与される」は、患者の系に入って、したがって代謝および他の同様のプロセスに供せられるような、中枢神経系への直接以外の、化合物、薬物または他の材料の投与、例えば、皮下投与を意味する。「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、通常は注入による、腸内および局所投与以外の投与モードを意味し、制限されずに、静脈内、筋肉内、病巣内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および胸骨内注入、経口、硬膜外、鼻腔内およびインフュージョンを含む。
【００４６】
用語「アミノ酸」は、天然または合成にかかわらず、アミノ官能基および酸官能基の両方を含み、天然起源アミノ酸のポリマー内に含まれることが可能な全ての分子を含むことが意図される。例示的なアミノ酸は、天然起源アミノ酸；それらのアナログ、誘導体および同類物；変異側鎖を有するアミノ酸アナログ；および、前述のいずれかの全ての立体異性体を含む。
【００４７】
用語「抗体」は、免疫グロブリン、特異的な結合能力を維持するその誘導体、および、免疫グロブリン結合ドメインと相同または大部分が相同である結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然起源に由来してよく、または、部分的または全体的に合成的に生産されてよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。抗体は、任意のヒトクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＹを含む任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであってよい。例示的な実施態様では、本明細書に記載の方法および組成物とともに用いられる抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。用語「抗体」は、本明細書において定義される抗体フラグメントも含む。
【００４８】
用語「抗体フラグメント」は、全長よりも短い抗体の任意の誘導体を指す。例示的な実施態様では、抗体フラグメントは、全長の抗体の特異的な結合能力の少なくとも重大な部分を保持する。抗体フラグメントの例は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、およびＦｄフラグメントを含む。抗体フラグメントは、任意の手段によって生産され得る。例えば、抗体フラグメントは、無傷の抗体のフラグメント化によって酵素的または化学的に生産されてよく、部分的抗体配列をコードする遺伝子から組み換え的に生産されてよく、または、全体的または部分的に合成的に生産されてよい。抗体フラグメントは、任意選択で、単鎖抗体フラグメントであってよい。あるいは、フラグメントは、例えばジスルフィド結合によって、一緒に連結される多数の鎖を含んでよい。フラグメントは、任意選択で、多分子の複合体であってもよい。機能性抗体フラグメントは、典型的に少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【００４９】
用語「Ｆａｂフラグメント」は、Ｈ鎖間ジスルフィド結合に対してＮ末端側にヒンジ領域で切断して、１つの抗体分子から２つのＦａｂフラグメントを生産する、酵素パパインを用いた抗体の切断によって生産された、抗原結合部位を含む抗体のフラグメントを指す。
【００５０】
用語「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、Ｈ鎖間ジスルフィド結合に対してＣ末端側にヒンジ領域で切断する酵素ペプシンを用いた抗体分子の切断によって生産された、２つの抗原結合部位を含む抗体のフラグメントを指す。
【００５１】
用語「Ｆｃフラグメント」は、その重鎖の定常ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
【００５２】
用語「Ｆｖフラグメント」は、その重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体のフラグメントを指す。
【００５３】
用語「改変された抗体」は、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインに由来する抗原結合部位を含む少なくとも抗体フラグメントを含む組み換え分子を指し、任意選択で、任意のＩｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹ）由来の抗体の可変および／または定常ドメインの全体または一部を含んでよい。改変された抗体の例は、高められた単鎖モノクローナル抗体および高められたモノクローナル抗体を含む。改変された抗体の例は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６１５５４にさらに記載されて、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。「改変された抗体」は、本発明の方法による、および本明細書において定義される、改変された抗体フラグメントを含む。
【００５４】
用語「単鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ」は、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインが連結されたＦｖフラグメントを指す。１つまたは複数のｓｃＦｖフラグメントは、他方の抗体フラグメント（例えば、重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に連結されて、１つまたは複数の抗原認識部位を有する抗体構築物を形成し得る。
【００５５】
用語「多価抗体」は、１つよりも多い抗原認識部位を含む抗体または改変された抗体を指す。例えば、「二価」抗体は、２つの抗原認識部位を有し、一方で、「四価」抗体は、４つの抗原認識部位を有する。用語「単一特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」「四重特異性」などは、（抗原認識部位の数とは対照的に）多価抗体内に存在する異なる抗原認識部位特異性の数を指す。例えば、「単一特異性」抗体の抗原認識部位は、全て、同一のエピトープに結合する。「二重特異性」抗体は、第一のエピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位および第一のエピトープとは異なる第二のエピトープに結合する少なくとも１つの抗原認識部位を有する。「多価単一特異性」抗体は、全てが同一エピトープに結合する多数の抗原認識部位を有する。「多価二重特異性」抗体は、多数の抗原認識部位を有し、その一部の数は第一のエピトープに結合して、その一部の数は、第一のエピトープとは異なる第二のエピトープに結合する。
【００５６】
用語「エピトープ」は、抗体が優先的および特異的に結合する抗原の領域を指す。モノクローナル抗体は、分子的に定義され得る分子の単一の特異的なエピトープに優先的に結合する。本発明では、多数のエピトープが多重特異性抗体によって認識され得る。
【００５７】
「抗原」は、本明細書に記載の組成物によって誘導される免疫応答の標的を指す。抗原はタンパク質抗原であってよく、全体的なタンパク質、ウイルスまたは対象の感染された、外来の、または腫瘍細胞の表面上に発現されたタンパク質のフラグメント、ならびに、例えば典型的なＭＨＣクラス１またはＩＩパスウェイを通したタンパク質のプロセッシングおよび提示の結果として、感染された、外来の、または腫瘍細胞によって表示されるペプチドを含むと理解される。そのような外来の細胞の例は、細菌、菌類、および原虫を含む。細菌抗原の例は、プロテインＡ（ＰｒＡ）、プロテインＧ（ＰｒＧ）、およびプロテインＬ（ＰｒＬ）を含む。
【００５８】
用語「抗原結合部位」は、抗原上のエピトープに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメントの領域を指す。
【００５９】
本明細書において用いられる用語「共刺激の分子」は、抗原特異的な一次Ｔ細胞刺激の刺激効果を高めること、または、細胞活性化に必要とされる閾値レベルを超えてその活性を上げて、ナイーブＴ細胞の活性化をもたらすことが可能な、任意の分子を含む。そのような共刺激の分子は、膜常在性の受容体タンパク質であってよい。
【００６０】
用語「有効量」は、所望の結果を発揮するのに十分な化合物、材料、または組成物の量を指す。有効量の化合物は、１または複数の投与で投与され得る。
【００６１】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、複合型ポリペプチドを指し、少なくとも２つの異なるポリペプチド由来のポリペプチド部分を含む。本明細書において定義される「融合タンパク質」は、メソテリンに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントまたはビオチン結合タンパク質を含む第二のアミノ酸配列に連結された、例えば本発明のストレスタンパク質を含む第一のアミノ酸配列（タンパク質）の融合である。融合タンパク質は、ストレスタンパク質を含む第一のアミノ酸配列、および、ビオチン結合タンパク質を含む第二のアミノ配列を含む、融合タンパク質も含む。融合タンパク質は、ストレスタンパク質を含む第一のアミノ酸配列、および、抗体結合タンパク質を含む第二のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質も含む。融合タンパク質は、メソテリンに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む第一のアミノ酸配列、および、ビオチン結合タンパク質または抗体結合タンパク質を含む第二のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質も含む。
【００６２】
部分は、同一生物のタンパク質由来であってよく、その場合、融合タンパク質は、「種間」、「遺伝子間」などと呼ばれる。様々な実施態様では、融合ポリペプチドは、第一のポリペプチドに連結された１つまたは複数のアミノ酸配列を含んでよい。１つよりも多いアミノ酸配列が第一のポリペプチドに融合される場合は、融合配列は、同一配列の多コピーであってよく、またはあるいは、異なるアミノ酸配列であってよい。第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端に融合され得る。さらに、第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドの配列内に挿入され得る。
【００６３】
用語「リンカー」は、分野で認識されていて（ａｒｔ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ）、２つの化合物、例えば２つのポリペプチドを連結する、分子（制限されないが、非改変または改変核酸またはアミノ酸を含む）または分子の群（例えば、２以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれよりも多い）を指す。リンカーは、単一の連結分子からなってよく、または、特定の距離によって連結分子および化合物を分離することを意図する少なくとも１つのスペーサー分子および連結分子を含んでよい。
【００６４】
「スペーサー分子」は、それが分離する２つのタンパク質セグメントに関連しない任意のアミノ酸セグメントを含む。例えば、ストレスタンパク質およびビオチンタンパク質からなる融合では、スペーサー分子は、融合タンパク質を含むタンパク質と関連しない一続きのアミノ酸からなる。本発明に係る有用な「スペーサー分子」は、酸性または塩基性アミノ酸、例えばそれぞれアスパラギン酸、またはアルギニンよりむしろ、中性アミノ酸、例えば、グリシン、ロイシン、バリン、アラニンを含む。
【００６５】
「遺伝子構築物」は、ポリペプチドに関する「コード配列」を含み、または、他の方法で生物学的に活性のＲＮＡ（例えば、アンチセンス、デコイ、リボザイムなど）に転写可能な、核酸、例えば、ベクター、プラスミド、ウイルスゲノムまたはそのようなものを指し、細胞に、例えば、特定の実施態様では哺乳類の細胞に、トランスフェクトされ得て、構築物でトランスフェクトされた細胞においてコード配列の発現を生じ得る。遺伝子構築物は、コード配列に動作可能に連結された１つまたは複数の調節エレメント、ならびに、イントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子などを含んでよい。
【００６６】
「宿主細胞」は、特定の導入ベクターによって形質導入され得る細胞を指す。細胞は、任意選択で、細胞培養に由来するもののようなインビトロ細胞、生物に由来するもののようなエクスビボ細胞、および、生物内のもののようなインビボ細胞から選択される。そのような用語は、特定の対象の細胞のみでなくそのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すことが理解される。突然変異または環境的影響のいずれかに起因して特定の改変が後世で生じ得るので、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一であり得ないが、本明細書において用いられる用語の範囲内になおも含まれる。
【００６７】
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、本明細書において、「制限されないが含む」を意味するために用いられる。「含む」および「制限されないが含む」は、相互交換可能に用いられる。
【００６８】
用語「免疫原性」は、免疫応答を引き起こす物質の能力を指す。「免疫原性組成物」または「免疫原性物質」は、免疫応答を引き起こす組成物または物質である。「免疫応答」は、抗原の存在に対する対象の反応を指し、以下：抗体産生、炎症、免疫進行、抗原に対する過敏性の進行、抗原に対する抗原特異的リンパ球の応答、耐性、および移植または移植片拒絶の少なくとも１つを含んでよい。
【００６９】
本明細書において用いられる「抗原に対する免疫応答」は、例えば、抗原に対する体液性または細胞性応答を意味する。
【００７０】
患者が抗原に対する体液性免疫応答をマウントしている場合は、抗−抗原抗体力価が測定される。典型的な免疫測定法は、免疫測定プレートのウェルを抗原で（例えば、組み換え抗原を加えることにより、または捕捉抗−抗原抗体を用いることにより）コーティングするステップ、およびそれから、患者血清の段階希釈をウェルに加えるステップからなる。血清を洗い流した後に、ヒト免疫グロブリンは、コンジュゲート抗ヒト免疫グロブリンを用いて検出される。
【００７１】
細胞の免疫応答は、細胞死滅アッセイを用いて測定される。患者末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が単離されて、抗原を発現しているＣＨＯ細胞株に異なる比で加えられる（トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞または非抗原構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞がネガティブコントロールとして用いられる）。抗原を発現しているＣＨＯ細胞は、抗原構築物によってトランスフェクトされて、それらの表面上に抗原を発現するように選択される。死滅は、放射能または特異的な色素の放出を用いて測定される。
【００７２】
本明細書において用いられる「疾患を治療する」は、患者の血漿中の可溶性抗原の量を減少させることを意味する。疾患を治療することは、臨床手段によって（例えば超音波検査または当技術分野で知られている他の方法によって測定される、腫瘍負荷を減少させることも指す。疾患を治療することは、腫瘍サイズ／体積の減少および／または転移の予防も指す。
【００７３】
本明細書に記載の高められたメソテリン抗体は、例えば、卵巣癌、髄膜腫、グリオーマおよび軟膜（ｌｅｐｔｏｍｉｎｉｎｇｅｓ）への転移、中皮腫、子宮腺癌、悪性中皮腫、膵癌、および肺腺癌と診断された患者における腫瘍負荷を減少させる（除去する）。
【００７４】
用語「単離されたポリペプチド」または「単離されたタンパク質」は、組み換えＤＮＡまたはＲＮＡから調製され得る、または合成起源、それらの一部の組み合わせ、または、天然起源ポリペプチドであり得るポリペプチドを指し、それは（１）天然では通常関連するタンパク質と関連しない、（２）通常生じる細胞から単離される、（３）同一の細胞起源由来の他のタンパク質から本質的にフリーである、（４）異なる種由来の細胞によって発現される、または（５）天然に存在しない。
【００７５】
ポリペプチドまたはタンパク質を「単離するステップ」は、組織、細胞、または、目的のポリペプチドまたはタンパク質ではないポリペプチドの任意の混合物から、ポリペプチドを除去するプロセスを指す。単離されたポリペプチドまたはタンパク質は、一般に、他のポリペプチドまたはタンパク質による汚染からフリーである。単離されたポリペプチドまたはタンパク質は、目的のポリペプチドまたはタンパク質の利用を妨げない他のポリペプチドまたはタンパク質の小画分の存在下で存在し得る。単離されたポリペプチドまたはタンパク質は、一般に、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％純粋である。一実施態様では、本発明に係る単離されたポリペプチドまたはタンパク質は、少なくとも９８％または９９％純粋である。
【００７６】
用語「単離された核酸」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、合成、または天然起源のポリヌクレオチドまたはそれらの一部の組み合わせを指し、それは、（１）「単離された核酸」が天然に見いだされる細胞と関連しない、または（２）天然に連結されないポリヌクレオチドに動作可能に連結される。
【００７７】
核酸を「単離するステップ」は、組織、細胞または目的の核酸でない核酸の任意の混合物から、核酸を除去するプロセスを指す。単離された核酸は、一般に、他の核酸による汚染からフリーである。単離された核酸は、目的の核酸の利用を妨げない他の核酸の小画分の存在下で存在し得る。単離された核酸は、一般に、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％純粋である。一実施態様では、本発明に係る単離された核酸は、少なくとも９８％または９９％純粋である。
【００７８】
遺伝子コードの縮退に起因して、本発明のポリペプチド（およびそのフラグメント）をコードするポリヌクレオチド内に可変性があってよいことが当業者によって理解されよう。異なる核酸配列が同一のポリペプチドをコードすることを許容する遺伝子コードの縮退は、文献においてよく知られている（例えば、表１を参照）。
【００７９】
当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
【００８０】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
【００８１】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
【００８２】
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。
【００８３】
アミノ酸配列同一性の値のパーセンテージは、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視する）。
【００８４】
同様の様式で、本明細書において開示されるポリペプチドのコード配列に関する核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
【００８５】
アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリペプチドよりも多いまたは少ないアミノ酸を含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、アミノ酸の合計数に対する、同一のアミノ酸の数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるアミノ酸の数を用いて決定される。同一性のパーセンテージの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な出現に割り当てられない。
【００８６】
一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。
【００８７】
本明細書において「ポリペプチド」を指す場合、当業者は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、タンパク質が代わりに用いられ得ることを認識するであろう。「タンパク質」は１つまたは複数のポリペプチドの関連性も指し得る。
【００８８】
用語「核酸」は、ヌクレオチドのポリマー形態、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、リボおよびデオキシリボヌクレオチドの組み合わせ、または、ヌクレオチドのいずれかのタイプの改変された形態を指す。その用語は、等価物として、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのアナログ、および、記載されている実施態様に適用可能なものとして、一本鎖（例えばセンスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むことも理解されるべきである。
【００８９】
文脈が明確に別段の指示をしない限り、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、コード配列によってコードされるアミノ酸配列のような遺伝子発現産物を指す場合、本明細書において相互交換可能に用いられる。「タンパク質」は、抗体のような、１つまたは複数のタンパク質の関連性を指してもよい。「タンパク質」は、タンパク質フラグメントを指してもよい。タンパク質は、グリコシル化タンパク質のような、翻訳後修飾タンパク質であってよい。
【００９０】
本発明に係る「タンパク質」は、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれよりも多い）アミノ酸が、対応する野生型タンパク質のアミノ酸と同一でないタンパク質を含む。本発明に係る「タンパク質」は１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれよりも多い）アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して欠失されているタンパク質を含む。本発明に係る「タンパク質」は、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多い）アミノ酸が、対応する野生型タンパク質と比較して付加および／または置換されているタンパク質を含む。
【００９１】
本明細書において具体的に開示されるポリペプチドは、典型的に、アミノ酸配列における置換（例えば、保存的置換）に耐容であり、実質的に生物学的活性を維持することが理解されよう。本明細書において具体的に開示されるもの以外の本発明のポリペプチドを特定するために、アミノ酸置換は、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどのアミノ酸側鎖置換基の違いまたは相対的類似性を含む、当技術分野で知られている任意の特徴に基づいてよい。
【００９２】
本明細書に開示されるもの以外のアミノ酸置換は、以下のコドン表に従ってＤＮＡ配列（またはＲＮＡ配列）のコドンを変更することによって達成され得る：
【００９３】
【表１】
2019511246.tif 000003
【００９４】
本明細書において具体的に開示されるもの以外のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の定義において、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮され得る。タンパク質に対する、相互作用の生物学的機能の提供におけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５（１９８２）を参照；その全体で参照により本明細書中に援用される）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それは順々に、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとタンパク質の相互作用を規定することが認められている。
【００９５】
それぞれのアミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づきハイドロパシー指標が割り当てられていて（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，同上）、それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００９６】
したがって、アミノ酸（またはアミノ酸配列）のハイドロパシー指標は、本明細書において具体的に開示されるポリペプチドを改変する場合に考慮され得る。
【００９７】
また、アミノ酸の置換は、親水性に基づいてなされ得ることも、当技術分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体で参照により本明細書中に援用される）は、その隣接アミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の最も高い局所的な平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。
【００９８】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（±３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±Ｉ）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００９９】
したがって、アミノ酸（またはアミノ酸配列）の親水性は、本明細書において具体的に開示されるものを超えるさらなるポリペプチドを特定する場合に考慮され得る。
【０１００】
本明細書において用いられる用語「ホモログ」は、天然起源ポリペプチドに対する微細な改変によって天然起源ポリペプチドとは異なるが、天然起源ポリペプチドの生物学的活性を大いに保持する分子を指すために用いられる。微細な改変は、制限されずに、１または数個のアミノ酸側鎖における変更、１または数個のアミノ酸に対する変更（欠失、挿入、および／または置換を含む）、１または数個の原子の立体化学の変更、および、制限されずに、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、およびグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を含む微細な誘導体化を含む。本明細書において用いられる用語「実質的に保持する」は、天然起源ポリペプチドの活性の少なくとも約５０％、例えば、約７０％、８０％、９０％またはそれよりも多くを保持する（例えば、カルシウムチャネルに結合または阻害する）、フラグメント、ホモログ、または、ポリペプチドの他の変異体を指す。他の生物学的活性は、ポリペプチドに応じて、ｐＨ感受性、酵素活性、受容体結合、リガンド結合、増殖因子の誘導、細胞シグナル伝達イベントなどを含んでよい。
【０１０１】
特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは、例えば分解に対してポリペプチドを保護するために、少なくとも１つの改変された末端を含む。一部の実施態様では、Ｎ末端はアセチル化されて、および／または、Ｃ末端はアミド化される。一部の実施態様では、ポリペプチドは、アミノ−および／またはカルボキシル末端に、１つまたは２つのＤ−アラニンを含む。
【０１０２】
特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸（例えば、１、２、３、またはそれよりも多い）、または、少なくとも１つの末端改変（例えば、１または２）を含む。一部の実施態様では、ペプチドは、少なくとも１つの非天然アミノ酸および少なくとも１つの末端改変を含む。
【０１０３】
「遺伝子発現産物」によって、遺伝子全体または遺伝子の一部の転写の結果として生産される分子を意味する。遺伝子産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子、ならびに、そのような転写産物から翻訳されたタンパク質を含む。タンパク質は、天然起源の単離されたタンパク質であってよく、または、組み換えまたは化学合成の産物であってよい。用語「タンパク質フラグメント」は、参照タンパク質自体と比較してアミノ酸残基が欠失されているが、残っているアミノ酸配列は、通常、参照タンパク質のものと同一または実質的に同一（例えば、１００％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、または６０％同一）であるタンパク質を指す。そのような欠失は、参照タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端、またはあるいは両方で生じ得る。欠失は内部でも生じ得る。
【０１０４】
フラグメントは典型的に、少なくとも約５、６、８または１０アミノ酸長、少なくとも約１４アミノ酸長、少なくとも約２０、３０、４０または５０アミノ酸長、少なくとも約７５アミノ酸長、または少なくとも約１００、１５０、２００、３００、５００またはそれよりも多いアミノ酸長である。フラグメントは、より長いタンパク質をフラグメント化するためのプロテイナーゼを用いて、または、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部のみの発現のような組み換え方法によって（単独または別のタンパク質をコードする核酸配列と融合される）、得てよい。様々な実施態様では、フラグメントは、例えば細胞受容体に対する参照タンパク質の酵素活性および／または相互作用部位を含んでよい。別の実施態様では、フラグメントは、免疫原性特性を有してよい。タンパク質は、不利に影響しないが本明細書において提供される方法でのそれらの使用を高め得る様々な公知の技術によって、特定の遺伝子座に導入された突然変異を含んでよい。フラグメントは、参照タンパク質の生物学的活性の１つまたは複数を保持することができる。
【０１０５】
本明細書において用いられる「機能性」ペプチドまたは「機能性フラグメント」は、通常はそのペプチドと関連する少なくとも１つの生物学的活性を実質的に保持するものである（例えば、カルシウムチャネルに結合または阻害する）。特定の実施態様では、「機能性」ペプチドまたは「機能性フラグメント」は、非改変ペプチドが保有する活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に保持する」によって、ペプチドが、ネイティブのポリペプチドの生物学的活性の、少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも多くを保持する（ネイティブペプチドよりも高い活性レベルを有することさえできる）ことを意味する。「非機能性」ペプチドは、通常はペプチドと関連する検出可能な生物学的活性をほとんどまたは本質的に示さないものである（例えば、せいぜい、ほんのわずかな量、例えば、約１０％または実に５％未満）。タンパク質結合およびカルシウムチャネル阻害活性のような生物学的活性は、当技術分野でよく知られていて本明細書に記載されるアッセイを用いて測定され得る。
【０１０６】
「患者」または「対象」または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。
【０１０７】
「対象」は、両方鳥類および哺乳類の両方を含み、哺乳類が好ましい。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、およびキジを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、少年、および成人を含む。
【０１０８】
語句「薬学的に許容できる」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、炎症、アレルギー応答、または他の問題または合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に見合った、人間および動物の組織と接触する使用に適切な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書において用いられる。
【０１０９】
本明細書において用いられる「薬学的に許容できる担体」は、一方の臓器、または体の一部から、別の臓器、または体の一部に、対象化合物を運搬または輸送するのに関与する、薬学的に許容できる材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒封入材料を意味する。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合して、患者に有害でないという意味で、「許容でき」なければならない。薬学的に許容できる担体としての役割を果たすことのできる材料の一部の例は：（１）糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末化されたトラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えば、カカオ脂および坐薬ワックス；（９）油類、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル類、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質フリーの水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；および（２２）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質を含む。
【０１１０】
「薬学的に許容できる塩」は、相対的に非毒性の、化合物の無機酸および有機酸付加塩類を指す。
【０１１１】
本明細書において用いられる「ストレスタンパク質」は、「ヒートショックタンパク質」または「Ｈｓｐ」としても知られ、ストレス遺伝子によってコードされて、したがって、典型的に生物へのストレス要因の接触または曝露の際に有意により多い量で生産される、タンパク質である。本明細書において用いられる用語「ストレスタンパク質」は、ストレスタンパク質のそのような部分およびペプチドを含むことが意図される。本明細書において用いられる「ストレス遺伝子」は、「ヒートショック遺伝子」としても知られて、ヒートショック、低酸素状態、グルコース欠乏、重金属塩類、エネルギー代謝および電子輸送の阻害剤、およびタンパク質変性剤のような、ストレス要因に対する、または、特定のベンゾキノンアンサマイシンに対する、生物（遺伝子を含む）の接触または曝露に起因して活性化または他の方法で検出可能に上方制御される遺伝子を指す。Ｎｏｖｅｒ，Ｌ．，Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９１）。「ストレス遺伝子」は、公知のストレス遺伝子ファミリー内の相同遺伝子、例えば、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ストレス遺伝子ファミリー内の特定の遺伝子も含むが、そのような相同遺伝子はそれ自体、ストレス要因によって誘導されない。本明細書において用いられるそれぞれの用語、ストレス遺伝子およびストレスタンパク質は、文脈が別段の指示をしない限り、互いを含んでよい。
【０１１２】
用語「ワクチン」は、免疫応答を引き起こして、対象に対して防御免疫も与える物質を指す。
【０１１３】
「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外の複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸の発現および／または自律的複製が可能なものである。それらが作動可能に結合している遺伝子の発現に向かうことが可能なベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、円形の二本鎖ＤＮＡループを一般に指す「プラスミド」の形態であり、それは、それらのベクター形態において、染色体に結合されない。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に用いられる形態なので、相互交換可能に用いられる。しかしながら、当業者によって理解されるように、本発明は、同等の機能を提供して、その後に当技術分野で知られるようになる、ウイルスベクターのような発現ベクターの他の形態を含むことが意図される。
【０１１４】
本明細書において用いられる「特異的に結合する」は、共有結合または水素結合を介すること、または静電引力を意味する。
【０１１５】
本明細書において用いられる「免疫応答」または「検出可能な応答」は、本明細書に記載のように本発明の融合タンパク質に曝されている対象において生じるが、本発明の融合タンパク質に曝されていない対象においては生じない、検出可能なレベルの応答を含む。検出される「応答」は、制限されないが、免疫応答の増大または免疫原性の増大を含む。
【０１１６】
「検出可能な応答」は、本発明の融合タンパク質に曝されていない対象の応答よりも、少なくとも０．０１％、０．５％、１％またはそれよりも多い応答を意味する。「検出可能な応答」は、本発明の融合タンパク質に曝されていない対象の応答よりも、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０００倍またはそれよりも大きい応答も意味する。
【０１１７】
本明細書において用いられる「免疫原性」は、本発明の融合タンパク質が体液性および／または細胞性免疫応答を誘導する能力のような、能力を指す。
【０１１８】
本明細書において用いられる「免疫応答」は、制限されないが、外来または自己のタンパク質を含む物質に対して生物の免疫系によってなされる応答を指す。制限されないが、粘膜、体液性および細胞性「免疫応答」を含む、３つの一般的なタイプの「免疫応答」が存在する。「粘膜免疫応答」は、呼吸器、消化管および泌尿生殖路の全ての粘膜表面を浸す分泌物および全ての分泌腺からの分泌物における、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）抗体の生産から生じる（ＭｃＧｈｅｅ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４０９）。これらのｓＩｇＡ抗体は、粘膜表面上の病原体のコロニー形成を防止する作用があり（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １７７，６９７（１９７２）；ＭｃＮａｂｂ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５，４７７（１９８１））、したがって、粘膜表面を通る侵襲またはコロニー形成を防止する防御の第一線として作用する。ｓＩｇＡの産生は、分泌腺または組織の局所的な免疫付与によって、または、消化管関連リンパ系組織（ＧＡＬＴまたはパイエル板）または気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ；Ｃｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４１，２１０（１９７６）；Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１０７，５３（１９７８）；Ｗｅｉｓｚ−Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１７０５（１９７９）；ＭｃＣａｕｇｈａｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８，１３１（１９８３））のいずれかに対する抗原の提示によって刺激され得る。膜状の小襞細胞（他にはＭ細胞として知られる）は、ＧＡＬＴおよびＢＡＬＴの表面を覆って、他の分泌粘膜表面と関連し得る。Ｍ細胞は、粘膜表面に隣接する管腔スペースから抗原をサンプリングするように作用して（ａｃｔ  ｔｏ  ｓａｍｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）、そのような抗原を抗原提示細胞（樹状細胞およびマクロファージ）に輸送して、それは順々に、抗原をＴリンパ球に提示して（Ｔ依存性抗原の場合）、それは、委任Ｂ細胞への提示のために抗原を処理する。Ｂ細胞は、それから、増殖、遊走するように刺激されて、最終的には、提示された抗原に対してＩｇＡを産生する抗体分泌血漿細胞に形質転換される。抗原が、ＧＡＬＴおよびＢＡＬＴを覆っているＭ細胞によって取り込まれる場合は、全身性の粘膜免疫は、体内の全ての分泌組織によって産生されている抗原に対するｓＩｇＡをもたらす（Ｃｅｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記；Ｗｅｉｎｚ−Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記；ＭｃＣａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。経口免疫付与は、したがって、全身性の粘膜免疫応答を刺激する重要な経路であり、加えて、口腔および消化管において分泌免疫応答の局所刺激をもたらす。
【０１１９】
「免疫応答」は、当業者に公知の技術を用いて測定され得る。例えば、血清、血液または他の分泌物が、「免疫応答」が存在すると思われる生物から得られてよく、酵素結合免疫吸着測定法アッセイ（ＥＬＩＳＡ；米国特許第５，９５１，９８８号；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５）を用いて上述の免疫グロブリンの存在について分析されてよい。当技術分野で知られている、制限されないがＡＮＯＶＡ、スチューデントＴ検定などを含む統計的検定が、測定された免疫グロブリンレベルの違いを決定するために用いられ得て、ここで、ｐ値は、少なくとも＜０．１、＜０．０５、＜０．０１、＜０．００５、＜０．００１、および実に＜０．０００１である。
【０１２０】
「免疫応答」は、「免疫応答」中に高められた免疫グロブリンの部分に特異的な標識抗体を用いた免疫組織化学のような他の技術を用いて測定され得る。免疫組織化学によって得られた顕微鏡的データは、免疫組織化学的に染色された組織サンプルをスキャンすることによって、および、制限されないがＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）を含む当業者に公知のコンピューターソフトウェアプログラムを用いて染色のレベルを定量化することによって、定量化され得る。本発明によれば、本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質によって治療された対象における免疫組織化学染色の定量的測定が、融合タンパク質によって治療されていない対象において検出される免疫組織化学染色の測定と統計的に異なる場合、「免疫応答」を刺激するということができる。制限されないがＡＮＯＶＡ、スチューデントＴ検定などを含む当技術分野で知られている統計的検定を用いて、測定された免疫組織化学染色レベルの違いが決定され得て、ここで、ｐ値は、少なくとも＜０．１、＜０．０５、＜０．０１、＜０．００５、＜０．００１、および実に＜０．０００１である。
【０１２１】
１．改変された融合タンパク質
改変Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）にインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質が提供される。
【０１２２】
抗原結合ドメインは、改変された抗体または抗体模倣物であってよく、例えば、少なくとも１つのｓｃＦｖ、少なくとも１つのＦａｂフラグメント、少なくとも１つのＦｖフラグメントなどを含んでよい。それは一価であってよく、または、多価であってよい。改変された抗体が多価である実施態様では、それは二価、三価、四価などであってよい。多価抗体は、単一特異性または多重特異性、例えば、二重特異性、三重特異性、四重特異性などであってよい。多価抗体は、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどのような任意の形態であってよい。特定の実施態様では、改変された抗体は、Ｔａｎｄａｂである。改変されたＨＳＰ７０は、例えば、天然配列のフラグメント、天然アミノ酸配列の改変（例えば、欠失、付加、および／または置換）またはそれらの任意の組み合わせであってよい。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０の全長ポリペプチド配列を配列番号１に示す。
【０１２３】
2019511246.tif 000004
【０１２４】
対象融合ポリペプチドに組み込まれ得る抗原結合ドメインおよび改変ＨＳＰ７０配列に関するさらなる詳細を以下に提供する。
【０１２５】
Ａ．抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原に特異的に結合して、融合タンパク質の一部として機能することができる、任意のペプチド配列である。抗原結合ドメインは、天然の配列、例えば、抗体またはそのフラグメント、フィコリン、コレクチンなどであってよい。抗原結合ドメインは、合成の配列、例えば、改変された抗体、抗体様ペプチド、抗体模倣物、アプタマーなどであってよい。
【０１２６】
抗原結合ドメインは、目的の抗原に特異的に結合し得る。抗原結合ドメインは、例えば、本発明の方法によって治療または予防される癌の腫瘍細胞抗原に、特異的に結合し得る。そのような抗原は、限定されないが、例えば、ヒト肉腫細胞または癌腫細胞の抗原、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、血管内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌腫、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型のマクログロブリン血症、または重鎖疾患細胞を含む。
【０１２７】
抗原結合ドメインは、疾患関連および／またはウイルス抗原を含む他の抗原に特異的に結合し得る。抗原結合ドメインは、それらの表面上に抗原を発現している疾患および／またはウイルス感染細胞に特異的に結合し得る。
【０１２８】
本発明の方法によって治療または予防され得る感染性疾患は、感染因子に起因する。本発明の抗原結合ドメインによって標的化され得るそのような感染因子またはそれに由来する抗原は、限定されないが、ウイルス、細菌、菌類、および原虫を含む。本発明は、細胞内病原体に起因する感染性疾患の治療または予防に制限されないが、細胞外病原体も含むことが意図される。多くの医学的に関連のある微生物が、文献に広く記載されていて、例えば、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照し、その全体的な内容は参照により本明細書中に援用される。
【０１２９】
ヒトおよび非ヒト脊椎動物の両方の感染性ウイルスは、抗原を発現しているレトロウイルス、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスを含む。ウイルス抗原の例は、限定されないが、以下の抗原を含む：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる、またはＨＩＶ−ＩＩＩ；および他の単離体、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミキソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタンウイルス、ブンガ（ｂｕｎｇａ）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｕｒｓｅｓ）およびロタウイルス）；ビマウイルス科（Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚熱ウイルス）；および分類されていないウイルス（例えば、海綿状脳症の病因学薬剤、デルタ肝炎の薬剤（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の薬剤（Ｉ型＝内部伝播型；２型＝非経口伝播型（すなわち、肝炎Ｃ）；ノーウォークおよび関連するウイルス、およびアストロウイルス）。
【０１３０】
標的化され得るレトロウイルス抗原は、単純レトロウイルスおよび複合レトロウイルスの両方の抗原を含む。単純レトロウイルスは、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルスおよびＤ型レトロウイルスのサブグループを含む。Ｂ型レトロウイルスの例は、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）である。Ｃ型レトロウイルスは、サブグループＣ型グループＡ（ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、鳥類白血病ウイルス（ＡＬＶ）、および鳥類骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）を含む）およびＣ型グループＢ（ミューリン白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ミューリン肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓ネクローシスウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）および猿人類肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）を含む。Ｄ型レトロウイルスは、マソン・ファイザー・サルウイルス（ＭＰＭＶ）および１型猿人類レトロウイルス（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロウイルスは、レンチウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルスおよび泡沫状ウイルスのサブグループを含む。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）も含む。Ｔ細胞白血病ウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、猿人類Ｔ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）を含む。泡沫状ウイルスは、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）およびウシ泡沫状ウイルス（ＢＦＶ）を含む。
【０１３１】
抗原結合ドメインによって結合され得るＲＮＡウイルスの抗原の例は、限定されないが、以下の抗原を含む：レオウイルス科のメンバー、以下を含む、オルトレオウイルス属（哺乳類および鳥類レトロウイルスの両方の多数の血清型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、ユーゲナンジー（Ｅｕｇｅｎａｎｇｅｅ）ウイルス、ケメロボウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ仔牛下痢症ウイルス、ミューリンロタウイルス、猿人類ロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、鳥類ロタウイルス）；ピコルナウイルス科、以下を含む、エンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｏｒｐｈａｎ（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、猿人類エンテロウイルス、ミューリン脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルスムリス（ｍｕｒｉｓ）、牛エンテロウイルス、豚エンテロウイルス、カルジオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少なくとも１１３個のサブタイプを含むヒトライノウイルス；他のライノウイルス）、アフトウイルス属（口蹄疫（ＦＭＤＶ）；カリシウイルス科、以下を含む、豚ウイルスの小水疱性発疹、サンミゲルアシカウイルス、ネコピコルナウイルスおよびノーウォークウイルス；トガウイルス科、以下を含む、アルファウイルス属（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラウイルス（Ｆｌａｖｉｒｕｓ）属（蚊媒介性黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニウイルス、極東ダニ媒介性ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病（Ｌｏｕｐｉｎｇ  ＩＩＩ）ウイルス、ポワッサン（Ｐｏｗａｓｓａｎ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜疾患ウイルス、豚コレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブニヤウイルス科、以下を含む、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙｖｉｒｕｓ）属（ブニヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎グループウイルス）、フレボウイルス属（シチリア型サシチョウバエ熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビ羊病ウイルス）、およびウクウイルス（Ｕｕｋｕｖｉｒｕｓ）属（ウークニエミおよび関連するウイルス）；オルソミキソウイルス科、以下を含む、インフルエンザウイルス属（Ａ型インフルエンザウイルス、多くのヒトサブタイプ）；豚インフルエンザウイルス、および鳥およびウマインフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザ（多くのヒトサブタイプ）、およびＣ型インフルエンザ（あり得る別の属）；パラミクソウイルス科、以下を含む、パラミクソウイルス属（１型パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、赤血球吸着ウィルス、２〜５型パラインフルエンザウイルス、ニューキャッスル���ウイルス、ムンプスウイルス）、モルビリウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスおよびマウスの肺炎ウイルス）；森林ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｒｉｕｓ）属（蚊媒介性黄熱病ウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニウイルス、極東ダニ媒介性ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、跳躍病ウイルス、ポワッサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜疾患ウイルス、豚コレラウイルス、ボーダー病ウイルス）；ブニヤウイルス科、以下を含む、ブニヤウイルス属（ブニヤムウェラおよび関連するウイルス、カリフォルニア脳炎グループウイルス）、フレボウイルス属（シチリア型サシチョウバエ熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビ羊病ウイルス）、およびウクウイルス属（ウークニエミおよび関連するウイルス）；オルソミキソウイルス科、以下を含む、インフルエンザウイルス属（Ａ型インフルエンザウイルス、多くのヒトサブタイプ）；豚インフルエンザウイルス、および鳥および馬インフルエンザウイルス；Ｂ型インフルエンザ（多くのヒトサブタイプ）、およびＣ型インフルエンザ（あり得る別の属）；パラミクソウイルス科、以下を含む、パラミクソウイルス属（１型パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、赤血球吸着ウィルス、２〜５型パラインフルエンザウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ムンプスウイルス）、モルビリウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性全脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスおよびマウスの肺炎ウイルス）；ラブドウイルス科、以下を含む、ベジクロウイルス属（ＶＳＶ）、チャンディプラウイルス（ＣｈａｎＢｉｐｕｒａ  ｖｉｒｕｓ）、フランダースーハート・パーク（Ｆｌａｎｄｅｒｓ−ＨａｒｔＰａｒｋ）ウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、魚ラブドウイルス、および２つのあり得るラブドウイルス（マールブルグウイルスおよびエボラウイルス）；アレナウイルス科、以下を含む、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、および、ラッサウイルス；コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎｏａｖｉｒｉｄａｅ）科、以下を含む、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒト腸溶性コロナウイルス、およびネコ伝染性腹膜炎（ネココロナウイルス）。
【０１３２】
例示的なＤＮＡウイルス抗原は、限定されないが、以下を含む：ポックスウイルス科の抗原、以下を含む、オルソポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サルポックスワクシニア、牛痘、水牛痘、家兎痘、欠肢症）、レポリポックスウイルス属（粘液腫、維腺腫）、アビポックスウイルス属（鶏痘、他の鳥類ポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘、山羊痘）、スイポックスウイルス属（Ｓｗｉｎｅｐｏｘ）、パラポックスウイルス属（伝染性膿胞性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）；イリドウイルス科（アフリカ豚熱ウイルス、カエルウイルス２および３、魚のリンホシスチス病ウイルス）；ヘルペスウイルス科、以下を含む、α−ヘルペスウイルス（１型および２型単純ヘルペス、水痘帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２および３、偽性狂犬病ウイルス、伝染性ウシ角結膜炎ウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス）β−ヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、および、ブタ、サルおよび齧歯類のサイトメガロウイルス）；γ−ヘルペスウイルス（エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、マレック病ウイルス、ヘルペスサイミリ、ヘルペスウイルスアテレス、ヘルペスウイルスワタオウサギ（ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ）、モルモットヘルペスウイルス、Ｌｕｃｋｅ腫瘍ウイルス）；アデノウイルス科、以下を含む、マストアデノウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび未グループ化；猿人類アデノウイルス（少なくとも２３個の血清型）、伝染性イヌ肝炎、および、ウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよび多くの他の種のアデノウイルス、アビアデノウイルス属（鳥類アデノウイルス）；および培養不可能なアデノウイルス；パポバウイルス科、以下を含む、乳頭腫ウイルス属（ヒト乳頭腫ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ショープ乳頭腫ウイルス、および、他の種の様々な病原乳頭腫ウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、猿人類空胞化剤（ＳＶ−４０）、ウサギ空胞化剤（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、および他の霊長類ポリオーマウイルス、例えば、リンパ増殖性の乳頭腫ウイルス）；パルボウイルス科、以下を含む、アデノ随伴ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルスなど）。最後に、ＤＮＡウイルス抗原は、クールー病およびクロイツフェルト‐ヤコブ病ウイルスのような上記のファミリーに合わないウイルスのウイルス抗原および慢性伝染性神経障害剤を含んでよい。
【０１３３】
Ｂ．改変された抗体
自然抗体は、それら自体が二量体であり、およびしたがって、二価である。異なる抗体を産生する２つのハイブリドーマ細胞が人為的に融合されると、複合型ハイブリドーマによって産生される抗体の一部は、異なる特異性を有する２つの単量体からなる。そのような二重特異性抗体は、２つの抗体を化学的にコンジュゲートすることによっても生産され得る。自然抗体およびそれらの二重特異性誘導体は、生産するのが相対的に大きくて高価である。マウス抗体の定常ドメインは、治療剤としてのそれらの広範囲の使用を妨げるヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の主な原因でもある。それらは、Ｆｃ−受容体のそれらの結合に起因して、不要な効果も引き起こし得る。これらの理由のため、分子免疫学者たちは、微生物における、よりいっそう小さなＦａｂ−およびＦｖ−フラグメントの生産に集中している。これらのより小さなフラグメントは、生産することがより容易であるだけでなく、それらは免疫原性もより低くて、エフェクター機能を有さず、それらの相対的に小さなサイズのため、それらは組織および腫瘍を貫通することがより可能である。Ｆａｂ−フラグメントの場合は、可変ドメインに隣接する定常ドメインが、重鎖および軽鎖の二量体の安定化において主な役割を果たす。したがって、全長またはほぼ全長の改変された抗体は、対象融合ポリペプチドを含み得るが、より小さな、単一ドメインの改変された抗体（多価および多重特異性であってよい）が、融合ポリペプチドでの使用に好ましい。
【０１３４】
Ｆｖ−フラグメントは、より一層安定性が低く、したがって、安定性を高めるために、ペプチドリンカーが重鎖および軽鎖可変ドメインの間に導入され得る。この構築物は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）−フラグメントとして知られる。ジスルフィド結合は、余剰の安定性のために２つのドメイン間に導入される場合がある。これまで、四価のｓｃＦｖに基づく抗体が、余剰の重合化ドメイン、例えば、四量体を形成するストレプトアビジン単量体に、および両親媒性αへリックスへの融合によって生産されている。しかしながら、これらの余剰のドメインは、四価分子の免疫原性を増大させ得る。
【０１３５】
二価および二重特異性抗体は、抗体可変ドメインのみを用いて構築され得る。かなり効率的で相対的に単純な方法は、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、とても短くて折り重なって互いに結合することができないリンカー配列を作ることである。リンカーの長さを３〜１２残基に減少させることは、ｓｃＦｖ分子の単量体構造を防止して、６０ｋＤａの非共有ｓｃＦｖ二量体「ダイアボディ」の形成での分子間ＶＨ−ＶＬペアリングを好む（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８）。ダイアボディ形式は、組み換え二重特異性抗体の生成にも用いることができ、それは、他方の抗体のＶＬドメインに短いリンカーによって連結された一方の抗体由来のＶＨドメインからなる２つの単鎖融合産物の非共有結合によって得られる。リンカーの長さを３つの残基より少なくさらにより小さく減少させると、三量体（「トリアボディ」約９０ｋＤａ）または四量体（「テトラボディ」約１２０ｋＤａ）の形成をもたらし得る（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５３，１６４−１６８）。改変された抗体、特に単一ドメインフラグメントの総説に関しては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６−１１３６を参照。そのような改変された抗体の全ては、本明細書において提供される融合ポリペプチドで用いられ得る。
【０１３６】
対象融合ポリペプチドを含み得る他の多価の改変された抗体は、Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７９：２１９−２３２（ジ−ダイアボディまたは四価二重特異性抗体）；米国特許出願２００５００７９１７０（多量体Ｆｖ分子または「フレキシボディ」）、およびＷＯ９９／５７１５０およびＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１−５６（タンデムダイアボディ、または「Ｔａｎｄａｂｓ」）に記載される。
【０１３７】
任意の上述の多価の改変された抗体は、例えば、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３，４９４；ＰＣＴ国際出願番号ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０；および、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，ｐｐ．２９３−９９（１９９１））に記載されるような、日常的な組み換えＤＮＡ技術を用いて当業者によって開発され得る。好ましくは、非ヒト抗体は、非ヒト抗原結合ドメインをヒト定常ドメインと連結することによって「ヒト化」される（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，ｐｐ．６８５１−５５（１９８４））。
【０１３８】
改変された抗体の抗原認識部位または可変領域全体は、メソテリンに対して向けられた１つまたは複数の親抗体に由来し得る。親抗体は、天然起源抗体または抗体フラグメント、天然起源抗体から適合された抗体または抗体フラグメント、目的の抗原に特異的であることが知られる抗体または抗体フラグメントの配列を用いて初めから構築された抗体を含んでよい。親抗体に由来し得る配列は、重鎖および／または軽鎖可変領域および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域またはそれらの他の部分を含む。
【０１３９】
多価、多重特異性抗体は、２以上の可変領域を含む重鎖および／または１以上の可変領域を含む軽鎖を含んでよく、可変領域の少なくとも２つは、同一抗原上の異なるエピトープを認識する。
【０１４０】
融合ポリペプチドに含まれる候補の改変された抗体、または融合ポリペプチド自体は、様々な公知のアッセイを用いて活性についてスクリーニングされ得る。例えば、結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイがよく知られていて、当該分野において日常的に実施される。そのようなアッセイの総合的な議論については、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ．），ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照。
【０１４１】
Ｃ．ストレスタンパク質
任意の適切なストレスタンパク質（ヒートショックタンパク質（ｈｓｐ））が、本発明の融合ポリペプチドにおいて用いられ得る。ストレスタンパク質は、好ましくは、例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＨＳＰ７０である。
【０１４２】
「ヒートショックタンパク質」は、「ヒートショック遺伝子」またはストレス遺伝子によってコードされて、ヒートショック、低酸素状態、グルコース欠乏、重金属塩類、エネルギー代謝および電子輸送の阻害剤、およびタンパク質変性剤のようなストレス要因に対する、または、特定のベンゾキノンアンサマイシンに対する、生物（遺伝子を含む）の接触または曝露に起因して活性化または他の方法で検出可能に上方制御される、遺伝子のタンパク質産物を指す。Ｎｏｖｅｒ，Ｌ．，Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９１）。「ヒートショックタンパク質」は、公知のストレス遺伝子ファミリー内の遺伝子によってコードされる相同タンパク質も含むが、そのような相同遺伝子は、それ自体はストレス要因によって誘導されない。「ヒートショックタンパク質融合」は、抗原結合ドメインに連結された、ヒートショックタンパク質またはその部分を指す。
【０１４３】
遺伝子群の発現を増大することによって、ストレス要因（典型的にヒートショック処置）に反応する細胞は、一般に、ストレス、またはヒートショック遺伝子と呼ばれる。ヒートショック処置は、細胞が適応される温度よりも１〜数度高いセ氏温度に、細胞または生物を暴露することを含む。そのような遺伝子の誘導と協調して、対応するストレスタンパク質のレベルは、ストレス付加細胞において増大する。
【０１４４】
例えば、ヒートショックタンパク質は、抗原特異的抗原結合ドメインにＣ末端またはＮ末端で連結され得て、ヒートショックタンパク質融合を生産する。ヒートショックタンパク質および抗原結合ドメインを含むヒートショックタンパク質融合は、抗原に対して、ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を含む体液性および／または細胞性免疫応答を刺激することが可能である。
【０１４５】
例えば、制限の目的ではないが、本発明によって用いられ得るヒートショックタンパク質は、ＢｉＰ（ｇｒｐ７８とも呼ばれる）、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ６０  ｈｓｐ７０、ｈｓｃ７０、ｇｐ９６（ｇｒｐ９４）、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ４０、およびＨｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、およびそれらのファミリーのメンバーを含む。特に好ましいヒートショックタンパク質は、以下に例示されるＢｉＰ、ｇｐ９６、およびｈｓｐ７０である。ヒートショックタンパク質の特定の群は、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０−３０、さらに好ましくはＨｓｐ７０およびＨｓｐ６０を含む。最も好ましいのは、ｈｓｐ７０ファミリーのメンバーである。
【０１４６】
細菌では、優勢ストレスタンパク質は、それぞれ約７０および６０ｋＤａの分子サイズを有するタンパク質であり、一般にそれぞれＨｓｐ７０およびＨｓｐ６０と呼ばれる。これらおよび他の特定のストレスタンパク質およびそれらをコードする遺伝子は、以下にさらに述べられる。細菌では、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ６０は、典型的に、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動および染料クーマシーブルーを用いた染色パターンに基づいて細胞タンパク質の約１〜３％を表わすが、ストレス条件下では２５％ものレベルまで蓄積する。ストレスタンパク質は、タンパク質合成、細胞内トラフィッキング、および、タンパク質複合体の集合および分解のような重要な細胞プロセスに関与すると考えられる。ストレスの間に合成された増大された量のストレスタンパク質は、誘導されたタンパク質アンフォールディングの結果を最小にする役割を主に果たすと考えられる。実際に、ストレスタンパク質の合成を誘導する少しのストレス条件に細胞を事前に曝露することは、後に続くより極端なストレスの有害効果からの保護を細胞に与える。
【０１４７】
主なストレスタンパク質は、これまでに試験された全ての生物および組織のタイプにおいて発現されると考えられる。また、ストレスタンパク質は、現在までに同定されたタンパク質の最も高度に保存されたグループを表わすと考えられる。例えば、広範な生物においてストレスタンパク質が比較された場合、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０は、アミノ酸レベルで５０％以上の同一性を示し、非同一位置において多くの類似性を共有する。種内の特定のストレスタンパク質ファミリーの異なるメンバー間に、類似性またはより高レベルの相同性が存在することに注意すべきである。
【０１４８】
ストレスタンパク質、特にＨｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０−３０およびＨｓｐ１０は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅによる感染に対する免疫応答において宿主免疫系によって認識される主な決定要因である。Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ．Ｔ．Ｊ．，Ｓｔｒｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｃｅｌｌ  ５０：５−８（１９８９）。さらに、一部のラット関節炎誘発性Ｔ細胞は、Ｈｓｐ６０エピトープを認識する。Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：１７１−１７３（１９８８）。しかしながら、マイコバクテリアの感染または自己免疫疾患の病歴がない、健康な個体を含む個体は、細菌およびヒトＨｓｐ６０エピトープの両方を認識するＴ細胞；自己および外来ストレスタンパク質の両方を認識するγ−δＴ細胞受容体の発現によって特徴付けられる健康な個体におけるＴ細胞のかなりの画分も保有する。Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５７：６６４−６７４（１９８９）。したがって、個体は、健康な個体でさえも、外来および自己ストレスタンパク質エピトープの両方を認識するＴ細胞集団を保有する。
【０１４９】
ストレスタンパク質エピトープを認識するこの系は、侵入生物に対する「早期防御系」を構成すると考えられる。Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４：４１９３−６（１９９２）。この系は、細菌およびウイルスによる頻繁な刺激によって維持され得る。以前に議論したように、健康な個体は、自己ストレスタンパク質を認識するＴ細胞集団を有する。したがって、自己反応性Ｔ細胞の存在は、正常な健康と適合して、自己免疫疾患を引き起こさず；このことは、個体内のストレスタンパク質の安全性を示す。ストレスタンパク質の安全性は、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ株）ワクチン接種の成功および相対的安全性によってさらに示され、それは、ストレスタンパク質に対する免疫応答を誘導し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対しても防御する。
【０１５０】
Ｈｓｐ７０の例は、哺乳類細胞由来のＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特にマイコバクテリア、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（例えばＢａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ：本明細書においてＨｓｐ７１と呼ばれる）由来のＤｎａＫ、大腸菌、酵母、および他の原核生物由来のＤｎａＫ、および、ＢｉＰおよびＧｒｐ７８を含む。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ、ならびに、解かれたポリペプチドおよびペプチドに特異的に結合することが可能であり、それにより、タンパク質フォールディングおよびアンフォールディングならびにタンパク質複合体の集合および分解に関与する。
【０１５１】
特定の実施態様では、本発明のストレスタンパク質は、腸内細菌、マイコバクテリア（特に、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）、大腸菌、酵母、ショウジョウバエ、脊椎動物、鳥類、ニワトリ、哺乳類、ラット、マウス、霊長類、またはヒトから得られる。
【０１５２】
ヒートショックタンパク質の天然起源または組み換えで得られる突然変異体は、本発明によって用いられ得て、フラグメントおよび改変配列を含む。例えば、制限の目的ではないが、本発明は、細胞からのそれらの分泌を促進するように突然変異されたヒートショックタンパク質の使用を提供する（例えば、ＫＤＥＬ（配列番号１４）またはそのホモログのような小胞体再補足を促進するエレメントの突然変異または欠失を有する；そのような突然変異体は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３２３３（ＷＯ９７／０６６８５）に記載されて、参照により本明細書中に援用される。
【０１５３】
特定の実施態様では、例えば、ストレスタンパク質と改変された抗体との間に化学的コンジュゲートを含む場合は、用いられるストレスタンパク質は、単離されたストレスタンパク質であり、それはつまり、ストレスタンパク質が、それらが生産された宿主細胞から選択および分離されていることを意味する。そのような単離は、本明細書に記載のとおりに、当技術分野で知られているタンパク質単離の常法を用いて行なわれ得る。ストレスタンパク質は、酸性または塩基性塩の形態、または中性形態であってよい。さらに、個々のアミノ酸残基は、酸化または還元によって改変されてよい。さらに、様々な置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸配列になされてよく、その正味の効果は、ストレスタンパク質の増大された生物学的活性を保持またはさらに増強することである。コドン縮退に起因して、例えば、同一アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変動が存在し得る。ストレスタンパク質から得られたストレスタンパク質またはペプチドの部分は、そのような部分またはペプチドが免疫応答を高めるのに関与するエピトープを含むという条件で、融合ポリペプチドにおいて用いられ得る。ストレスタンパク質の部分は、プロテイナーゼを用いたフラグメント化によって、またはストレスタンパク質をコードするヌクレオチド配列（単独または他のタンパク質をコードする核酸配列と融合される）の部分のみの発現のような組み換え方法によって得てよい。ペプチドは、そのような方法によって、または化学合成によって生産されてもよい。ストレスタンパク質は、様々な公知技術によって特定の遺伝子座に導入された突然変異を含んでよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３４０２−３４０６（１９８６）；Ｌｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，Ｇｅｎｅ  ８８：１０７−１１１（１９９０）：Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ３：１１２−１１７（１９８９）を参照。
【０１５４】
本明細書において提供される医薬組成物は、酸化または還元によって改変された個々のアミノ酸残基を有してよい。さらに、様々な置換、欠失、または付加が、アミノ酸または核酸配列になされてよく、その正味の効果は、ヒートショックタンパク質の増大された生物学的活性を保持またはさらに高めることである。コドン縮退に起因して、例えば、同一アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列においてかなりの変動が存在し得る。
【０１５５】
用語「ヒートショックタンパク質」は、そのようなフラグメントがメソテリンに対する免疫応答を高めるのに関与するエピトープを含むという条件で、ヒートショックタンパク質から得られたヒートショックタンパク質のフラグメントを包含することが意図される。ヒートショックタンパク質のフラグメントは、プロテイナーゼを用いて、または、ストレスタンパク質をコードするヌクレオチド配列（単独または別のタンパク質をコードする核酸配列と融合される）の部分のみの発現のような組み換え方法によって得てよい。ヒートショックタンパク質は、免疫系に対するその効果を高めるための様々な公知技術によって特定の遺伝子座に導入された突然変異を含んでよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｌｉｎｅｄｉｎｓｔ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３４０２−３４０６（１９８６）；Ｌｉａｏ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，Ｇｅｎｅ  ８８：１０７−１１１（１９９０）；Ｈｏｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ３：１１２−１１７  （１９８９）を参照。
【０１５６】
特定の実施態様では、本明細書において用いられるヒートショックタンパク質は、単離されたヒートショックタンパク質であり、それはつまり、ヒートショックタンパク質が、それらが生産された宿主細胞から選択および分離されていることを意味する。そのような単離は、本明細書に記載のとおりに、当技術分野で知られているタンパク質単離の常法を用いて行なわれ得る。Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）。
【０１５７】
Ｃ．融合タンパク質の実施態様
本発明の一態様は、２００未満のアミノ酸のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関し、ＨＳＰ７０フラグメントは、最小ＨＳＰ７０配列を含む。ＨＳＰ７０フラグメントは、最小ＨＳＰ配列を含んでよく、から本質的になってよく、またはからなってよい。
【０１５８】
最小ＨＳＰ７０配列は、本発明の融合タンパク質において所望される生物学的機能の全てを提供するＨＳＰ７０のフラグメントを指す。一部の実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列は、少なくとも４０アミノ酸の長さ、例えば、少なくとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０アミノ酸の長さである。一部の実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列は、４００未満のアミノ酸の長さ、例えば、約４００、３５０、３００、２５０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、または１３０未満のアミノ酸の長さである。特定の実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０（配列番号１）の約アミノ酸残基３６８（例えば、プラスまたはマイナス２０、１５、１０、または５残基）から、約アミノ酸残基４９５（例えば、プラスまたはマイナス２０、１５、１０、または５残基）までのフラグメントを含む、から本質的になる、またはからなる。一部の実施態様では、最小ＨＳＰ７０領域は、配列番号１の約アミノ酸残基３６８〜４９５または約３６８〜４７９である。
【０１５９】
一実施態様では、最小ＨＳＰ配列を含む融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。下線は、ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインの間のリンカーを示し、斜体は、ｓｃＦｖおよびＨＳＰ７０の間のリンカーを示し、太字はＣＤ９４ドメインを示す。
【０１６０】
2019511246.tif 000005
【０１６１】
一部の実施態様では、最小ＨＳＰ配列は、改変ＣＤ９４ドメインを含み、すなわち、ＣＤ９４ドメインのアミノ酸配列が改変されている。本明細書において用いられる用語「ＣＤ９４ドメイン」は、配列ＡＡＨＮＫＬＬＧＳＦＥＬＴＧ（配列番号１５）を有するＭｂｔ  ＨＳＰ７０（配列番号１）のアミノ酸残基４２２〜４３５または他のＨＳＰ７０タンパク質における同等配列を指す。
【０１６２】
一部の実施態様では、改変ＣＤ９４ドメインは、以下から選択されるアミノ酸配列からなる。
ＡＡＨＮＮＬＬＧＳＦＥＬＴＧ（配列番号１６）
ＡＡＨＮＮＬＬＧＲＦＥＬＴＧ（配列番号１７）
ＡＡＨＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１８）
ＴＫＥＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１９）
ＴＲＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号２０）
【０１６３】
特定の実施態様では、改変ＣＤ９４ドメインは、アミノ酸配列ＴＫＥＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１９）からなる。一実施態様では、ＣＤ９４ドメイン配列ＴＫＥＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号１９）とともに最小ＨＳＰ配列を含む融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１６４】
2019511246.tif 000006
【０１６５】
特定の実施態様では、改変ＣＤ９４ドメインは、アミノ酸配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号２０）からなる。一実施態様では、ＣＤ９４ドメイン配列ＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧ（配列番号２０）とともに最小ＨＳＰ配列を含む融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１６６】
2019511246.tif 000007
【０１６７】
特定の実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列は、本発明の融合タンパク質の有効性を高める１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失または置換を含んでよい。一実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列は、Ｖ４１０Ｆ置換（配列番号１に基づくナンバリング）を含み、それは、ＨＳＰ７０のペプチド結合活性を低減させて、それにより、非特異的な抗原送達を最小限にする。
【０１６８】
一部の実施態様では、融合タンパク質は、抗体結合ドメインとＨＳＰ７０フラグメントとの間にリンカーをさらに含む。特定の実施態様では、リンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号２１）、（ＧＧＧＳＧＧＧ）４（配列番号２２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）、およびＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１６９】
特定の実施態様では、リンカーは、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）である。一実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列およびリンカーＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）を含む融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１７０】
2019511246.tif 000008
【０１７１】
特定の実施態様では、リンカーは、ＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）である。一実施態様では、最小ＨＳＰ７０配列およびリンカーＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）を含む融合タンパク質は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１７２】
2019511246.tif 000009
【０１７３】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１００アミノ酸のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含み、配列番号１のアミノ酸１〜４９５を超えずに含む、融合タンパク質に関する。このフラグメントは、Ｃ末端のリッド（ｌｉｄ）配列を含まず、欠失は、本発明の融合タンパク質に関する高められた生物学的活性を与える。本発明のこの態様のＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントは、天然のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓアミノ酸配列のアミノ酸１で始まる４９５アミノ酸残基の最大長を有する。ＨＳＰリッド欠失フラグメントは、約４９５、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、または３００未満のアミノ酸残基の長さを有してよい。ＨＳＰフラグメントは、少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、または３００アミノ酸残基の長さを有してよい。
【０１７４】
特定の実施態様では、ＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントは、本発明の融合タンパク質の有効性を高める１つまたは複数のアミノ酸付加、欠失または置換を含んでよい。一実施態様では、ＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントは、１つまたは複数の改変（ａ）Ｆ１７６Ａまたはｂ）Ｒ３１８Ａ（ＬＰＳ結合を変更するためのサブドメインＩＩにおけるＬＰＳ結合部位内）またはｃ）Ｖ４１０Ｆ（ペプチド結合を変更するためのペプチド結合ドメイン内）を、任意の組み合わせで含む（配列番号１に基づくナンバリング）。一実施態様では、ＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントおよびさらなる改変を含む融合タンパク質は、配列番号１２、１３、または３１のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１７５】
2019511246.tif 000010
【０１７６】
2019511246.tif 000011
【０１７７】
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【０１７８】
一部の実施態様では、配列番号３１の配列を含む任意の改変ＨＳＰ７０において、Ｔｒｅｇドメイン（アミノ酸残基１４１〜１５５）は、例えば、ＶＬＲＩＶＮＥＰＭＡＡＡＬＡＹ（配列番号３２）、ＶＬＲＩＶＮＥＰＴＡＡＡＬＡＦ（配列番号３３）、またはＶＬＲＩＶＮＥＰＭＡＡＡＬＡＦ（配列番号３４）のうちの１つに改変され得る。
【０１７９】
一部の実施態様では、ＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントは、上述の改変ＣＤ９４ドメインをさらに含む。
【０１８０】
一部の実施態様では、ＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントを含む融合タンパク質は、上述のリンカーをさらに含む。
【０１８１】
一部の実施態様では、ＨＳＰ７０リッド欠失フラグメントは、Ｔｒｅｇドメインに対する改変をさらに含む。ＨＳＰ７０のＴｒｅｇドメインは、よく知られていて、配列番号１のアミノ酸残基１４１〜１５５または他のＨＳＰ７０タンパク質由来の同等ドメインに対応する。Ｔｒｅｇドメインは、例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ配列由来のドメインを、ヒトＨＳＰ７０タンパク質のような別のＨＳＰ７０由来のＴｒｅｇドメインによって置換することにより、または、１つまたは複数のアミノ酸残基、例えば、ＨＳＰ７０ファミリーのメンバー間で保存されている残基の１つまたは複数を欠失および／または置換することによって、改変され得る。
【０１８２】
本発明のさらなる態様は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）のフラグメントにインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関し、配列番号２６（仮由来のＶＩＣ−００８配列）のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１８３】
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【０１８４】
配列番号２６の改変ＨＳＰ７０配列は、配列番号２７を含む、から本質的になる、またはからなる融合タンパク質の一部であってよい。
【０１８５】
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【０１８６】
配列番号２６または配列番号２７の改変ＨＳＰ７０は、上述の１つまたは複数のさらなる改変、例えば、ＣＤ９４ドメインおよび／またはＴｒｅｇドメインおよびまたはＬＰＳドメインおよび／またはペプチド結合ドメインの改変および／または上述のリンカー配列を含んでよい。
【０１８７】
本発明の別の態様は、キメラＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０にインフレームで融合された抗原結合ドメインを含む融合タンパク質に関し、キメラＨＳＰ７０は、ヒトＨＳＰ７０アミノ酸配列の主鎖を含み、βシート構造（例えば、約残基３６７〜約残基４７９（例えば、プラスまたはマイナス２０、１５、１０、または５残基））（配列番号２９に基づくナンバリング））は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＨＳＰ７０のβシート構造（例えば、約残基３９５〜約残基５４１（例えば、プラスまたはマイナス２０、１５、１０、または５残基））（配列番号１に基づく）によって置換される。
【０１８８】
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【０１８９】
ヒトＨＳＰ７０主鎖は、任意の公知のヒトＨＳＰ７０ファミリーメンバー、例えば、ＨＳＰ７０−１ａ、ＨＳＰ７０−１ｂ、ＨＳＰ７０−１ｔ、ＨＳＰ７０−２、ＨＳＰ７０−５、ＨＳＰ７０−６、ＨＳＣ７０、およびＨＳＰ７０−９由来であってよい。
【０１９０】
上述の改変ＨＳＰ７０タンパク質は全て、抗原結合ドメインに融合されてよく、それは、改変された抗体またはそのフラグメントであってよい。一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０１９１】
抗原結合ドメインは、任意の目的の抗原に結合し得る。一部の実施態様では、抗原は癌抗原である。一部の実施態様では、抗原結合ドメインは、メソテリンに特異的に結合し、例えば、メソテリンに特異的に結合するｓｃＦｖである。メソテリン抗体の例は、ＷＯ２００９／０６８２０４に開示されるものを含み、その全体で参照により援用される。一実施態様では、メソテリンに特異的に結合するｓｃＦｖは、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０１９２】
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【０１９３】
本発明の融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質が、それが発現される宿主細胞から分泌されるように、Ｎ末端上にリーダー配列をさらに含んでよい。リーダー配列は、例えば、宿主にネイティブである分泌されたタンパク質由来の任意の適切なリーダー配列であってよい。一部の実施態様では、リーダー配列は、例えば、シロイヌナズナエクステンシン、ニコチアナエクステンシン、大麦αアミラーゼ、またはＰＲ１Ａ由来の、植物タンパク質リーダー配列である。
【０１９４】
本発明の融合タンパク質は、上記に開示される任意の配列の変異体、例えば、上記に開示される配列の１つと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を包含する。
【０１９５】
本発明のさらなる態様は、本発明の融合タンパク質の１つまたは複数を含む組成物に関する。一部の実施態様では、組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物である。一部の実施態様では、組成物は、本発明の融合タンパク質を含むワクチンまたは免疫原性組成物である。
【０１９６】
２．融合タンパク質を作製する方法
本発明に係る融合タンパク質を作製するための方法および組成物も提供される。本明細書に記載される任意の融合タンパク質は、組み換え手段によって生産され得る。例えば、ＨＳＰ７０タンパク質をコードする核酸は、タンパク質コード配列が、共通の翻訳リーディングフレームを共有して、例えば抗原結合ドメインおよびＨＳＰ７０タンパク質を含む融合タンパク質として発現され得るように、抗原結合ドメインをコードする核酸配列のいずれかの末端に連結され得る。
【０１９７】
組み合わされた配列は、所望の発現特性および宿主細胞の性質に基づいて選択された適切なベクター内に挿入される。以降に提供される実施例では、核酸配列は、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質発現に適切なベクター内に集められる。選択された宿主細胞における発現に続いて、融合タンパク質は、日常的な生化学的分離技術によって、または、融合タンパク質の構成要素の１つに対する抗体を用いた免疫親和性方法によって、精製され得る。あるいは、選択されたベクターは、融合タンパク質配列に、オリゴヒスチジンタグのようなタグを付加することができ、タグに関して適切に高い親和性を有する抗体または他の材料を用いた親和性方法によって精製され得るタグ付き融合タンパク質の発現を可能にする。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）。以下に議論されるベクターの１つのような哺乳類細胞における発現に適切なベクターが用いられる場合、融合タンパク質は、哺乳類細胞から発現および精製され得る。あるいは、哺乳類の発現ベクター（融合タンパク質コード配列を含む）は、対象の細胞における本発明の方法に係る融合タンパク質の発現に向かうために、対象に投与され得る。細菌、酵母、昆虫細胞、またはそのようなものにおける発現に適切なベクターが用いられる場合、融合タンパク質は、細胞の培養物から発現および精製され得る。植物における発現に適切なベクターが用いられる場合、融合タンパク質は、タンパク質を発現しているトランスジェニック植物から発現および精製され得る。本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、化学的に生産されてもよく、それから、融合タンパク質の生産および精製または対象への投与に適切なベクターに挿入される。最後に、融合タンパク質は、化学的に調製されてもよい。
【０１９８】
融合遺伝子を作製するための技術は、当技術分野でよく知られている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡフラグメントの連結は、ライゲーションのためのブラントエンドまたはスタッガーエンド末端、適切な末端を与えるための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の埋め合わせ、望ましくない連結を避けるためのアルカリフォスファターゼ処理、および、酵素的ライゲーションを用いた従来の技術に従って行われる。別の実施態様では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子フラグメント間に相補オーバーハングを引き起こすアンカープライマーを用いて行なわれてよく、それは、続いてアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生産し得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照）。したがって、少なくとも１つの改変された抗体をコードする遺伝子および少なくとも１つのストレスタンパク質をコードする遺伝子の融合遺伝子を含む、単離された核酸が提供される。単離された核酸は、宿主細胞における発現を最大化するためにコドン最適化され得る。
【０１９９】
核酸は、本発明に係る改変された融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクター内に提供されてよく、少なくとも１つの調節配列に動作可能に連結されてよい。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞および／または発現されることが望まれるタンパク質のタイプの選択のような因子に依存し得ることが理解されるべきである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および、ベクターによってコードされる任意の他のタンパク質の発現、例えば、抗生物質マーカーが考慮されるべきである。そのようなベクターは、任意の生物学的に効果的な担体、例えば、キメラポリペプチドをコードする遺伝物質によってエクスビボまたはインビボのいずれかで細胞を効率的にトランスフェクトすることが可能な任意の製剤または組成物において、投与され得る。アプローチは、組み換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１を含むウイルスベクターへの、核酸、または、組み換え細菌または真核生物プラスミドの挿入を含む。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェクトするために用いられ得て；プラスミドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体化（例えば、コンジュゲートされた抗体）、ポリリジンコンジュゲート、グラミシジンＳ、人工的ウイルスエンベロープまたは他のそのような細胞内担体の助けによって、単独で送達され得る。核酸は、直接注入されてもよい。あるいは、リン酸カルシウム沈殿が、細胞への核酸の侵入を促進するために行なわれ得る。
【０２００】
対象核酸は、培地中で繁殖された細胞における本発明の融合タンパク質の発現および過剰発現を引き起こすために、例えば、融合タンパク質またはポリペプチドを生産するために、用いられ得る。
【０２０１】
改変された融合タンパク質を発現するために組み換え遺伝子によってトランスフェクトされた宿主細胞も提供される。宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物細胞であってよい。例えば、ＨＳＰ７０融合は、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母、昆虫、植物、または哺乳類の細胞内に発現され得る。宿主細胞がヒトである場合は、生きた対象内であってよく、またはそうでなくてよい。他の適切な宿主細胞は、当業者に知られている。さらに、宿主細胞は、ポリペプチドの発現を最適化するように、宿主において典型的に見られないｔＲＮＡ分子で補充され得る。融合ポリペプチドの発現を最大にするのに適切な他の方法は、当業者に知られている。
【０２０２】
細胞培養は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当技術分野でよく知られている。融合ポリペプチドは、ポリペプチドを含む培地および細胞の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、融合ポリペプチドは、細胞質によって保持され得て、細胞が採取されて、溶解されて、タンパク質が単離される。融合ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、および、融合の特定のエピトープに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で知られている技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、または両方から単離され得る。
【０２０３】
したがって、本発明の融合タンパク質の全てまたは一部をコードするヌクレオチド配列は、微生物または真核生物細胞のプロセスを介してタンパク質の組み換え型を生産するために用いられ得る。発現ベクターのようなポリヌクレオチド構築物に配列をライゲーションすること、および、真核生物（酵母、鳥類、昆虫、植物、または哺乳類）または原核生物（細菌細胞）のいずれかの宿主に形質転換またはトランスフェクトすることは、標準的な手順である。同様の手順、またはそれらの改変は、対象発明に従った微生物手段または組織培養技術によって組み換え融合ポリペプチドを調製するために用いられ得る。
【０２０４】
組み換えタンパク質の生産のための発現ビヒクルは、プラスミドおよび他のベクターを含む。例えば、融合ポリペプチドの発現に適切なベクターは、大腸菌のような原核生物細胞における発現のための、ｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミドのタイプのプラスミドを含む。
【０２０５】
別の実施態様では、核酸は、細菌プロモーター、例えば、嫌気性大腸菌、ＮｉｒＢプロモーターまたは大腸菌リポタンパク質ｌｉｐプロモーター、例えば、Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１に記載；サルモネラｐａｇｃプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、赤痢菌ｅｎｔプロモーター（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ａｎｄ  Ｐａｙｎｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：８１６（１９９１））、Ｔｎ１０上のｔｅｔプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，上記）、または、ビブリオコレラのｃｔｘプロモーターに、動作可能に連結された融合タンパク質である。任意の他のプロモーターが用いられ得る。細菌プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。例示的な誘導性プロモーターは、鉄によって、または鉄制限条件において、誘導されるプロモーターである。実際に、一部の細菌、例えば、細胞内生物は、宿主細胞質において鉄制限条件に遭遇すると考えられる。ＦｅｐＡおよびＴｏｎＢの鉄制御プロモーターの例が当技術分野で知られていて、例えば、以下の参考文献において記載される：Ｈｅａｄｌｅｙ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：８１８；Ｏｃｈｓｎｅｒ，Ｕ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：７１９４；Ｈｕｎｔ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７６：３９４４；Ｓｖｉｎａｒｉｃｈ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｐａｌｃｈａｕｄｈｕｒｉ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：１３９；Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：２８２３；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７２：６８６３；ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：２６２４；および、Ｈａｎｔｋｅ，Ｋ．（１９８１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８２：２８８。
【０２０６】
プラスミドは、好ましくは、転写終結シグナルのような、細菌における核酸の適切な転写に必要とされる配列を含む。ベクターは、目的の核酸、例えば、抗生物質に対する耐性を提供するタンパク質をコードする遺伝子、核酸の増幅に必要とされる配列、例えば、細菌の複製起点を含む、細菌の選択を可能にする因子をコードする配列をさらに含んでよい。
【０２０７】
一実施態様では、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼによって認識される強力なファージＴ５プロモーターが、大腸菌において、厳密に調節された高レベルの発現または組み換えタンパク質を提供するためのｌａｃオペレーター抑制モジュールとともに用いられる。この系では、タンパク質発現は、高レベルのｌａｃリプレッサーの存在下でブロックされる。一実施態様では、ＤＮＡは、第一のプロモーターに動作可能に連結されて、細菌は、第一のプロモーターからの転写を仲介することが可能な第一のポリメラーゼをコードする第二のＤＮＡをさらに含み、ここで、第一のポリメラーゼをコードするＤＮＡは、第二のプロモーターに動作可能に連結される。好ましい実施態様では、第二のプロモーターは、上記に表示されるもののような細菌プロモーターである。さらにより好ましい実施態様では、ポリメラーゼは、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７ポリメラーゼのようなバクテリオファージポリメラーゼであり、第一のプロモーターは、それぞれ、ＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７プロモーターのようなバクテリオファージプロモーターである。バクテリオファージプロモーターを含むプラスミドおよびバクテリオファージポリメラーゼをコードするプラスミドは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から、商業的に得ることができ、または、標準的な組み換えＤＮＡ技術（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）を用いてバクテリオファージから直接得ることができる。バクテリオファージポリメラーゼおよびプロモーターは、例えば、以下の参考文献においてさらに説明される：Ｓａｇａｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ  １６８：３７；Ｃｈｅｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９１：４０３４；Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆ，Ｊ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１９：４５；Ｂｕｊａｒｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｐ．Ｋａｅｓｂｅｒｇ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３３７；および、Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：６０）。そのようなプラスミドは、発現されるべき融合ポリペプチドの特定の実施態様に従ってさらに改変され得る。
【０２０８】
別の実施態様では、細菌は、第二のプロモーターからの転写を仲介することが可能な第二のポリメラーゼをコードするＤＮＡをさらに含み、ここで、第二のポリメラーゼをコードするＤＮＡは、第三のプロモーターに動作可能に連結される。第三のプロモーターは、細菌プロモーターであってよい。しかしながら、高レベルの転写を得るために、２つよりも多い異なるポリメラーゼおよびプロモーターが細菌内に導入され得る。細菌における転写を仲介するための１つまたは複数のポリメラーゼの使用は、ＤＮＡが細菌プロモーターの直接制御下である細菌と比較して、細菌におけるポリペプチドの量の有意な増大を提供し得る。採用する系の選択は、特定の使用、例えば、生産を望むタンパク質の量に応じて変化する。
【０２０９】
一般に、本発明の融合タンパク質をコードする核酸は、例えばトランスフェクションによって宿主細胞に導入されて、宿主細胞は、融合ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。原核生物および真核生物に核酸を導入する方法は、細胞当技術分野でよく知られている。哺乳類および原核生物宿主細胞培養に適切な培地は、当技術分野でよく知られている。一般に、対象融合ポリペプチドをコードする核酸は、核酸を含む宿主細胞が特定の回数分裂した時点で誘導される、誘導性プロモーターの制御下である。例えば、核酸がβ−ガラクトースオペレーターおよびリプレッサーの制御下である場合は、細菌宿主細胞が約０．４５〜０．６０のＯＤ６００の密度に達したときにイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が培養に加えられる。培養はそれから、もうしばらくのあいだ増殖されて、ポリペプチドを合成する時間を宿主細胞に与える。培養はそれから、典型的に冷凍されて、ポリペプチドの単離よび精製の前に、しばらくのあいだ冷凍保存されてよい。
【０２１０】
原核生物宿主細胞を用いる場合、宿主細胞は、例えばプラスミドｐＬｙｓＳＬから発現される内部Ｔ７リゾチームを発現するプラスミドを含んでよい。そのような宿主細胞の溶解は、リゾチームを遊離させて、その結果、細菌膜を分解する。
【０２１１】
細菌または他の原核生物細胞における発現のためのベクターに含まれ得る他の配列は、合成のリボソーム結合部位；リードスルー転写を防止して発現されたポリペプチドの安定性を確保するための、強力な転写ターミネーター、例えば、大腸菌におけるｒｒｎＢオペロン由来のｔ４およびファージλ由来のｔ０；複製起点製、例えば、ＣｏｌＥ１；および、アンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。
【０２１２】
他の宿主細胞は、原核生物宿主細胞を含む。さらにより好ましい宿主細胞は、細菌、例えば大腸菌である。用いられ得る他の細菌は、シゲラ属菌、サルモネラ属菌、リステリア属菌、リケッチア属菌、エルシニア属菌、エシェリキア属菌、クレブシエラ属菌、ボルデテラ種、ナイセリア属菌、アエロモナス属菌、フランシセラ属菌、コリ根バクテリウム属菌、シトロバクター属菌、クラミジア種、ヘモフィルス属菌、ブルセラ属菌、マイクバクテリウム属菌、レジオネラ属菌、ロドコッカス属菌、シュードモナス属菌、ヘリコバクター属菌、ビブリオ属菌、バチルス属菌、およびエリシペロトリックス属菌を含む。これらの細菌の大部分は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９）から得ることができる。
【０２１３】
酵母には、組み換えタンパク質の発現に関する多くのベクターが存在する。例えば、ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５、ＹＥＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの遺伝構築物の導入に有用な、クローニングおよび発現ビヒクルである（例えば、Ｂｒｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．８３を参照）。これらのベクターは、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉの存在に起因してＥ．ｃｏｌｉにおいて、および、酵母２ミクロンプラスミドの複製決定因子に起因してＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、複製し得る。加えて、アンピシリンのような薬物耐性マーカーが用いられ得る。
【０２１４】
特定の実施態様では、哺乳類の発現ベクターは、細菌におけるベクターの増殖を促進する原核生物配列、および、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ＰＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳類の発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、ｐＢＲ３２２のような細菌プラスミド由来の配列によって改変されて、原核生物および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を促進する。あるいは、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体は、真核生物細胞におけるタンパク質の一過性発現のために用いられ得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる様々な方法が、当技術分野でよく知られている。原核生物および真核生物細胞の両方に関する、他の適切な発現系、ならびに、一般的な組み換え手順については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）第１６章および第１７章を参照。ある場合には、バキュロウイルス発現系を用いて組み換えタンパク質を発現することが望ましくあり得る。そのようなバキュロウイルス発現系の例は、ｐＶＬ由来ベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（例えばｐＡｃＵＷ１）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（例えば、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩを含むβ−ｇａｌ）を含む。
【０２１５】
別の変形では、タンパク質生産は、インビトロ翻訳系を用いて達成され得る。インビトロ翻訳系は、一般に、タンパク質へのＲＮＡ分子の翻訳に必要な少なくとも最小エレメントを含む無細胞抽出物である翻訳系である。インビトロ翻訳系は、典型的に、少なくとも、リボソーム、ｔＲＮＡ、イニシエーターメチオニル−ｔＲＮＡＭｅｔ、翻訳に関与するタンパク質または複合体、例えば、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３、キャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）および真核生物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）を含むキャップ結合（ＣＢ）複合体を含む。様々なインビトロ翻訳系が、当技術分野でよく知られていて、市販キットを含む。インビトロ翻訳系の例は、真核生物溶解物、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物、ウサギ卵母細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、昆虫細胞溶解物および小麦胚芽抽出物を含む。溶解物は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．；およびＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙのような製造業者から市販される。インビトロ翻訳系は、典型的に、高分子、例えば、酵素、翻訳、開始および伸長因子、化学試薬、およびリボソームを含む。さらに、インビトロ転写系が用いられ得る。そのような系は、典型的に、少なくともＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、リボヌクレオチドおよび任意の必要な転写開始、延長および終結因子を含む。インビトロ翻訳に関するＲＮＡヌクレオチドは、当技術分野で知られている方法を用いて生産され得る。インビトロ転写および翻訳は、１つまたは複数の単離されたＤＮＡからタンパク質を生産するためのワンポット反応において結び付けられ得る。
【０２１６】
ポリペプチドのカルボキシ末端フラグメントの発現、すなわち、トランケート突然変異体が所望である場合、発現されるべき所望の配列を含むオリゴヌクレオチドフラグメントに開始コドン（ＡＴＧ）を付加することが必要であり得る。Ｎ末端の位置におけるメチオニンは、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用によって酵素的に切断され得ることが当技術分野でよく知られている。ＭＡＰは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７５７）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍからクローニングされていて、そのインビトロ活性は、組み換えタンパク質に対して示されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：２７１８−１７２２）。したがって、必要に応じてＮ末端メチオニンの除去は、ＭＡＰを生産する宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣＭ８９またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてそのような組み換えポリペプチドを発現することによりインビボで、または、精製されたＭＡＰの使用によりインビトロで（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の手順）、達成され得る。
【０２１７】
植物発現ベクターが用いられる場合は、融合タンパク質の発現は、任意の多くのプロモーター、例えば、タバコにおける発現に適切なプロモーターによって駆動され得る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターのようなウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：５１１−５１４）、または、ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター（Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３０７−３１１）が用いられ得る；あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーター（Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：８３８−８４３）；またはヒートショックプロモーター、例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６：５５９−５６５）が用いられ得る。これらの構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター；直接ＤＮＡ形質転換；マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを用いて、植物細胞に導入され得る。そのような技術の概説については、例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３；および、Ｇｒｉｅｒｓｏｎ＆Ｃｏｒｅｙ，１９８８，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｉｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈ．７−９を参照。
【０２１８】
ポリペプチドタグまたはポリペプチドタグを含む融合タンパク質を発現するために用いられ得る代替の発現系は、昆虫系である。１つのそのような系では、キンウワバ科核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。ウイルスは、スポドプテラ・フルギペルダ細胞内で増殖する。ＰＧＨＳ−２配列は、ウイルスの非本質的な領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングされ得て、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。コード配列の成功的な挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組み換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性コートを欠くウイルス）の生産をもたらす。これらの組み換えウイルスは、それから、スポドプテラ・フルギペルダ細胞を感染するために用いられて、ここで、挿入された遺伝子が発現される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４，Ｓｍｉｔｈ，米国特許第４，２１５，０５１号を参照）。
【０２１９】
昆虫系の特定の実施態様では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ポリヘドリンプロモーターの下流のｐＢｌｕｅＢａｃｌｌｌ組み換え輸送ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）にクローニングされて、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトされて（スポドプテラ・フルギペルダスポドプテラ・フルギペルダ卵巣細胞に由来し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）、組み換えウイルスを生産する。組み換えウイルスのプラーク精製後に、高力価ウイルスストックが調製されて、それは順に、Ｓｆ９またはＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）（イラクサギンウワバ卵細胞ホモジネートに由来するＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）昆虫細胞を感染するために用いられて、大量の適切に翻訳後修飾された対象ポリペプチドを生産する。
【０２２０】
他の実施態様では、本発明の任意の融合タンパク質の構成要素は、別個に生産されて、それから、共有結合などで互いに結合される。
【０２２１】
例えば、抗原結合ドメインおよび改変ＨＳＰ７０タンパク質は、インビトロで別個に生産されて、精製されて、そして、タグ、例えば、ビオチンまたは抗体結合タンパク質が目的のポリペプチドに結合することが可能な条件下で一緒に混合される。例えば、ＨＳＰ７０タンパク質および／または抗原結合ドメインは、それらが生じることが知られる由来から得る（単離される）ことができて、細胞培養から生産および採取されることができて、所望のＨＳＰ７０タンパク質または抗原結合ドメインをコードする遺伝子をクローニングして発現することによって生産されることができて、または、化学的に合成されることができる。さらに、所望のＨＳＰ７０タンパク質または抗原結合ドメイン、または、本発明の融合タンパク質の任意の構成要素をコードする核酸配列は、化学的に合成され得る。コンジュゲートタンパク質のそのような混合物は、単一の融合タンパク質とは異なる特性を有し得る。
【０２２２】
リンカー（「リンカー分子」または「クロスリンカー」としても知られる）は、本発明に係る融合タンパク質の構成要素をコンジュゲートするために用いられ得る。リンカーは、いくつかの、通常は２つの分子の規定の化学基と反応することが可能な化学物質を含み、したがって、それらをコンジュゲートする。公知のクロスリンカーの大部分は、アミン、カルボキシル、およびスルフヒドリル基と反応する。標的化学基の選択は、その基が、コンジュゲートされるポリペプチドの生物学的活性に関与し得る場合、極めて重要である。例えば、スルフヒドリル基と反応するマレイミドは、標的に結合するのにＣｙｓを要するＣｙｓ含有ペプチドまたはタンパク質を、不活化し得る。リンカーは、ホモ官能性（同一タイプの反応基を含む）、ヘテロ官能性（異なる反応基を含む）、または光反応性（照射によって反応性になる基を含む）であってよい。
【０２２３】
リンカー分子は、コンジュゲートされた組成物の異なる特性に関与し得る。リンカーの長さは、コンジュゲートのステップ中の分子フレキシビリティ、および、その標的に関するコンジュゲートされた分子（細胞表面分子など）のアベイラビリティに照らして考慮されるべきである。より長いリンカーは、したがって、本発明の組成物の生物学的活性、ならびに、それらの調製し易さを改善し得る。リンカーの形状は、分子を標的との最適な反応に向かわせるために用いられ得る。柔軟な形状を有するリンカーは、クロスリンクされたポリペプチドが、それらが他のポリペプチドに結合するときに、立体構造的に適合するのを可能にし得る。リンカーの性質は、他の様々な目的のために変更され得る。例えば、ＭＢｕＳのアリール構造は、ＭＢＳの芳香族スペーサーよりも免疫原性が低いことが分かった。さらに、リンカー分子の疎水性および官能性は、構成要素分子の物理的特性によって制御され得る。例えば、多量体リンカーの疎水性は、ポリマー、例えば、疎水性モノマーのブロックに親水性モノマーのブロックが点在しているブロックポリマーに沿った、単量体ユニットの順番により制御され得る。
【０２２４】
本発明によって有用なリンカーまたはクロスリンカーは、融合タンパク質の正しいフォールディングを促進することができ、本発明の融合タンパク質の生物学的活性を改善し、本発明の融合タンパク質の調製を促進することなどができる。
【０２２５】
リンカーは、ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖セグメントの正しいフォールディングを与える働きもすることができる。本発明に係る「リンカー」は、標的認識にも寄与し得る。
【０２２６】
正しいタンパク質フォールディングおよび機能を妨げない任意の適切なアミノ酸リンカーは、本発明によって有用である。
【０２２７】
一実施態様では、リンカーは、融合タンパク質の正しいフォールディングを促進する一連の中性またはわずかに極性のアミノ酸を生じる核酸の組み合わせである。
【０２２８】
アミノ酸側鎖がイオン化され得ない場合、中性ではなく極性と考えられる。例えば、アスパラギン酸は、カルボキシ側鎖がイオン化され得るので極性および酸性である。チロシンは極性である。フェニル環上のヒドロキシル基は容易にイオン化されないので、中性ではなく極性と考えられる。
【０２２９】
一実施態様では、リンカーは、以下のアミノ酸配列：ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号２１）をコードする核酸からなる。別の実施態様では、リンカーは、以下のアミノ酸配列：（ＧＧＧＳＧＧＧ）Ｘ４（配列番号２２）をコードする核酸からなる。
【０２３０】
別の実施態様では、リンカー配列は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）配列番号２３）を含む。別の実施態様では、リンカー配列は、配列ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２４）またはＧＧＳＳＥＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２５）を含む。リンカー配列内にグリシンを含むことは、Ｈ−側鎖を有し、一方で、他のアミノ酸は全て、より嵩高い側鎖を有するので、好ましい。
【０２３１】
多種多様の分子リンカーを調製および利用する化学は、当技術分野でよく知られていて、分子をコンジュゲートするのに用いるための多くの事前に作られたリンカーが、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌなどの供給メーカーから市販される。
【０２３２】
Ａ．融合タンパク質生産の実施態様
本発明の一態様は、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸に関する。一部の実施態様では、核酸は、上記に開示される融合タンパク質配列のいずれかをコードする。
【０２３３】
特定の実施態様では、単離された核酸は：
ａ）配列番号２、４、６、８、または１０のいずれか１つのヌクレオチド配列；
ｂ）ａ）のヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一であるヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）または（ｂ）と相補のヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）または（ｂ）に逆相補であるヌクレオチド配列；または
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
から選択される核酸を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０２３４】
2019511246.tif 000017
【０２３５】
2019511246.tif 000018
【０２３６】
2019511246.tif 000019
【０２３７】
2019511246.tif 000020
【０２３８】
2019511246.tif 000021
【０２３９】
一部の実施態様では、単離された核酸は、配列番号２、４、６、８、または１０のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【０２４０】
特定の実施態様では、単離された核酸は、宿主細胞、例えば、細菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、または植物細胞における発現のためにコドン最適化される。一部の実施態様では、単離された核酸は、植物細胞における発現のためにコドン最適化されて、例えば、植物は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍである。
【０２４１】
単離された核酸は、目的の宿主細胞における発現に適切なプロモーターのような、プロモーターに動作可能に連結され得る。一部の実施態様では、プロモーターは、植物プロモーターである。
【０２４２】
本発明の別の態様は、本発明の核酸を含む発現ベクターに関する。
【０２４３】
本発明は、さらに、本発明の単離された核酸または発現ベクターを含む細胞に関する。細胞は、細菌細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、または植物細胞、例えば、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａおよびＮ．ｔａｂａｃｕｍから選択される植物細胞であってよい。
【０２４４】
本発明のさらなる態様は、本発明の単離された核酸を含む、トランスジェニック植物細胞、植物部分、または植物に関する。
【０２４５】
３．融合タンパク質を用いる方法
本明細書に記載の融合タンパク質は、抗原結合ドメインによって認識される抗原を発現している細胞に対する、その対象の免疫応答、特に細胞が仲介する細胞溶解応答を高めるために、対象に投与され得る。融合タンパク質は、免疫応答を単純に高め得て（したがって、免疫原性組成物として働く）、または、防御免疫を与え得る（したがって、ワクチンとして働く）。
【０２４６】
したがって、上述のように生産されるタンパク質融合ポリペプチドは、医薬組成物としての使用のために適切な純度に精製され得る。一般に、精製された組成物は、組成物内に存在する全ての種の約８５％よりも多く、存在する全ての種の約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％よりも多く、またはそれよりも多くを含む１つの種を有する。目的の種は、本質的な同種まで精製され得て（汚染種は、従来の検出方法によって組成物中に検出されない）、ここで、組成物は、単一の種から本質的になる。当業者は、本明細書における教示に照らして、タンパク質精製のための標準的な方法、例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどを用いて融合タンパク質を精製し得る。ポリペプチドの純度は、例えば、アミノ末端アミノ酸配列分析、ゲル電気泳動および質量分析を含む、当業者に公知の多くの方法によって決定され得る。
【０２４７】
したがって、上述の融合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。一態様では、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体（添加剤）および／または希釈剤と一緒に製剤化された、治療的に有効量の１つまたは複数の上記および下記の化合物を含む、薬学的に許容できる組成物が提供される。別の態様では、特定の実施態様では、化合物は、それ自体として、または、薬学的に許容できる担体との混合で投与されてよく、他の薬剤とともに投与されてもよい。接続的（組み合わせ）療法は、したがって、最初に投与されたものの治療的効果がその後のものが投与されたときに完全に消えていない方法での、活性化合物の連続、同時および別個、または共投与を含む。
【０２４８】
本明細書に記載の融合タンパク質は、様々な方法で対象に投与され得る。投与経路は、皮内、経皮（例えば、徐放ポリマー）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外および鼻腔内経路を含む。任意の他の便利な投与経路、例えば、インフュージョンまたはボーラス注入、または、上皮または皮膚粘膜ライニングを通した吸収が用いられ得る。加えて、本明細書に記載の組成物は、他の薬理学的に許容できる構成要素、例えば、生物学的に活性の薬剤（例えば、ミョウバンのようなアジュバント）、界面活性剤（例えば、グリセリド）、賦形剤（例えば、ラクトース）、担体、希釈剤およびビヒクルを含んでよく、それらとともに投与されてよい。さらに、組成物は、抗原特異的な免疫細胞をインビトロで誘発、拡張、および繁殖させるために、対象から得られた白血球を刺激する手段としてエクスビボで用いられ得て、それは続いて、対象へ再導入される。
【０２４９】
さらに、融合タンパク質は、そのようなタンパク質配列をコードする核酸の、ヒト対象へのインビボ発現によって投与され得る。そのような核酸の発現は、抗原特異的な免疫細胞をインビトロで誘発、拡張、および繁殖させるために、対象から得られた白血球を刺激する手段としてエクスビボで達成されてもよく、それは続いて、対象へ再導入される。目的の融合タンパク質の発現に向けるのに適切な発現ベクターは、当該分野で現在用いられている幅広い種類のベクターから選択され得る。高レベルの発現を産生するのが可能で、目的の遺伝子を形質導入するのに効果的なベクターが好ましい。例えば、組み換えアデノウイルスベクターｐＪＭ１７（Ａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：３６７−８４（１９９４）；Ｂｅｒｋｎｅｒ  Ｋ．Ｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−２４  １９８８）、二世代アデノウイルスベクターＤＥｌ／ＤＥ４（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｆｉｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７１４−６（１９９６））、または、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ／Ｎｅｏ（Ｍｕｒｏ−Ｃａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  １１：２３１−７（１９９２））が用いられ得る。さらに、組み換えレトロウイルスベクターＭＦＧ（Ｊａｆｆｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２２１−６（１９９３））または、ＬＮ、ＬＮＳＸ、ＬＮＣＸ、ＬＸＳＮ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９（１９８９））が用いられ得る。単純ヘルペスウイルスに基づくベクター、例えばｐＨＳＶ１（Ｇｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：８９５０−４（１９９０）、または、ワクシニアウイルスベクター、例えばＭＶＡ（Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：１０８４７−５１（１９９２））が、代替としての役割を果たし得る。
【０２５０】
プロモーターおよび３’配列を含む頻繁に用いられる特定の発現ユニットは、プラスミドｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プラスミドＡＨ５、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＭＵ  ＩＩ（Ｐａａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１９２１−１９２７（１９８６））、ｐＺｉｐ−Ｎｅｏ  ＳＶ（Ｃｅｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：１０５３−１０６２（１９８４））、および、ｐＳＲａ（ＤＮＡＸ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）に見られるものである。発現ユニットおよび／またはベクターへの遺伝子の導入は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９））のようなマニュアルに記載の遺伝子操作技術を用いて達成され得る。生じる発現可能な核酸は、例えば上述のようなウイルスベクターの一部として、ネイキッドプラスミドまたは他のＤＮＡとして、または、標的化リポソームまたは赤血球ゴースト内にカプセル化されて、発現可能な形態で細胞内に核酸を配置することが可能な任意の方法によってヒト対象の細胞に導入され得る（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，Ｎ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６５：１４０１−１４０４（１９９４））。形質導入の方法は、組織および腫瘍への直接注入、リポソームトランスフェクション（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：１１１−１１７（１９８０））、受容体が仲介するエンドサイトーシス（Ｚａｔｌｏｕｋａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：１３６−１５３（１９９２））、および、微粒子銃が仲介する遺伝子導入（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ＆Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：７９１−７９７（１９９３））を含む。
【０２５１】
本発明の組成物における融合ポリペプチドの量（以前に議論されたように融合、コンジュゲートまたは非共有結合される）は、本明細書に記載の方法によって決定される、対象において効果的な免疫賦活性応答を生じる量である。有効量は、投与された場合に免疫応答を誘導する量である。さらに、対象に投与される融合タンパク質の量は、用いられる改変された抗体およびストレスタンパク質、対象のサイズ、年齢、体重、健康全般、性別、および食事を含む様々な因子、ならびに、対象の全般的免疫学的反応性に応じて変化する。確立された投与量範囲の調節および操作は、十分に当業者の能力内である。例えば、本発明に係る改変された融合タンパク質、例えば、メソテリン抗体が仲介するＨＳＰ７０融合タンパク質の量は、約１マイクログラム〜約１グラム、好ましくは約１００マイクログラム〜約１グラム、および約１ミリグラム〜約１グラムであってよい。発現ベクターを含む組成物の有効量は、投与された場合に、抗原結合ドメインが向けられる抗原に対して免疫応答を誘導する量である。さらに、対象に投与される発現ベクターの量は、発現されるＨＳＰ７０タンパク質および抗原結合ドメイン、対象のサイズ、年齢、体重、健康全般、性別、および食事を含む様々な因子、ならびに、対象の全般的免疫学的反応性に応じて変化する。考慮される必要のあるさらなる因子は、適用経路および用いられるベクターのタイプである。例えば、予防的または治療的な治療が、本発明に係る改変された融合タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターを用いて行なわれる場合、有効量は、１０４〜１０１２のヘルパーフリー、複製欠損ウイルス／ｋｇ体重の範囲、好ましくは１０５〜１０１１ウイルス／ｋｇ体重の範囲、最も好ましくは１０６〜１０１０ウイルス／ｋｇ体重の範囲である。
【０２５２】
効果的な投与量は、初めにインビトロアッセイによって見積られ得る。例えば、投与量は、当技術分野でよく知られている技術を用いて免疫応答の誘導を達成するために、動物モデルで処方され得る。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。用量および間隔は、個々に調整され得る。例えば、ワクチンとして用いられる場合は、本発明のタンパク質および／または株は、１〜３６週の期間、約１〜３投与量で投与され得る。好ましくは、３投与量が約３〜４ヶ月の間隔で投与されて、その後に、ブースターワクチン接種が定期的に与えられ得る。代替のプロトコルは、個々の患者に適切であり得る。適切な投与量は、上述のように投与された場合に、少なくとも１〜２年間、症状または感染から患者を保護するのに十分に、免疫化された患者において免疫応答を引き起こすことが可能な、タンパク質または株の量である。
【０２５３】
組成物は、免疫応答を高めるためのアジュバントを含んでもよい。さらに、そのようなタンパク質は、油エマルション中にさらに懸濁され得て、注入の際にインビボで、タンパク質のより遅い放出を引き起こす。製剤中のそれぞれの構成要素の最適な比は、当業者によく知られた技術によって決定され得る。
【０２５４】
免疫応答を高めるために、任意の様々なアジュバントが本発明のワクチンにおいて用いられ得る。アジュバントの大部分は、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、および、免疫応答の特異的または非特異的な促進因子、例えば、リピドＡ、またはＢｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓを含む。適切なアジュバントは市販されていて、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＭｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を含む。他の適切なアジュバントは、ミョウバン、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルリピドＡ、ｑｕｉｌ  Ａ、ＳＢＡＳ１ｃ、ＳＢＡＳ２（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：１５６２−１５６７）、ＳＢＡＳ７、Ａｌ（ＯＨ）３およびＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＷＯ９６／０２５５５）を含む。
【０２５５】
本発明のワクチンでは、アジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答を誘導し得る。適切なアジュバント系は、例えば、アルミニウム塩とともに、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）の組み合わせを含む。高められた系は、モノホスホリルリピドＡおよびサポニン誘導体の組み合わせ、具体的には、ＷＯ９４／００１５３に開示されるサポニンＱＳ２１および３Ｄ−ＭＬＰの組み合わせ、または、ＷＯ９６／３３７３９に開示されるようにＱＳ２１がコレステロールによってクエンチングされる場合はより低い反応性組成物を含む。以前の実験は、体液性およびＴｈ１型細胞性免疫応答の両方の誘導において、３Ｄ−ＭＬＰおよびＱＳ２１の組み合わせの明らかな相乗効果を示している。水中油エマルションにおける、ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＬＰおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント形成は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されて、製剤を含んでよい。
【０２５６】
本発明の特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４、またはより多くの投与）が、治療的効果を達成するために、様々な時間間隔（例えば、毎時間、毎日、毎週、毎月など）にわたって用いられ得る。
【０２５７】
Ａ．使用方法の実施態様
本発明の一態様は、対象において抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関し、抗原に特異的に結合する本発明の融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、それにより、免疫応答を誘導する。
【０２５８】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において抗原と関連する疾患を治療する方法に関し、抗原に特異的に結合する治療的に有効量の請求項１から３１のいずれか一項の融合タンパク質を対象に投与するステップを含み、それにより、疾患を治療する。
【０２５９】
一部の実施態様では、抗原は疾患抗原である。抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、病原菌抗原、または上述の癌抗原であってよい。一部の実施態様では、抗原は癌抗原、例えば、メソテリンである。
【０２６０】
特定の実施態様では、抗原と関連する疾患は、病原菌感染、例えばウイルス感染である。一部の実施態様では、抗原と関連する疾患は、抗原、例えば、メソテリンを発現する癌である。一部の実施態様では、メソテリンを発現している癌は、卵巣癌、髄膜腫、グリオーマ、軟膜（ｌｅｐｔｏｍｉｎｉｎｇｅｓ）への転移、中皮腫、子宮腺癌、悪性中皮腫、膵癌、または肺腺癌である。
【０２６１】
一部の実施態様では、本発明の方法は、さらなる活性剤を対象に投与するステップをさらに含む。さらなる活性剤は、治療剤、例えば、抗病原菌剤または抗癌剤であってよい。
【０２６２】
抗癌剤は、制限されずに、１）ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）；２）エピポドフィロトキシン類（例えば、エトポシドおよびテニポシド）；３）抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ））；４）酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）；５）生物学的応答調節剤（例えば、インターフェロン−α）；６）プラチナ配位錯体（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；７）アントラセンジオン類（例えば、ミトキサントロン）；８）置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）；９）メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン；ＭＩＨ））；１０）副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミド）；１１）副腎皮質ステロイド類（例えば、プレドニゾン）；１２）プロゲスチン類（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；１３）エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）；１４）抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）；１５）アンドロゲン（例えば、テストステロンプロピオネートおよびフルオキシメステロン）；１６）抗アンドロゲン物質（例えば、フルタミド）：および１７）ゴナドトロピン放出ホルモンアナログ（例えば、リュープロリド）を含む。別の実施態様では、本発明の化合物は、抗血管新生剤、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ））および血管新生の他のプロモーター（例えば、ｂＦＧＦ、アンジオポエチン−１）、α−ｖ／β−３血管インテグリンに対する抗体（例えば、ＶＩＴＡＸＩＮ）、アンギオスタシン、エンドスタチン、ダルテパリン、ＡＢＴ−５１０、ＣＮＧＲＣペプチドＴＮＦαコンジュゲート、シクロホスファミド、コンブレタスタチンＡ４ホスフェート、酢酸ジメチルキサンテノン、ドセタキセル、レナリドマイド、エンザスタウリン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤（アブラキサン）、大豆イソフラボン（Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、タモキシフェンシトレート、サリドマイド、ＡＤＨ−１（ＥＸＨＥＲＩＮ）、ＡＧ−０１３７３６、ＡＭＧ−７０６、ＡＺＤ２１７１、ソラフェニブトシレート、ＢＭＳ−５８２６６４、ＣＨＩＲ−２６５、パゾパニブ、ＰＩ−８８、バタラニブ、エベロリムス、スラミン、スニチニブマレート、ＸＬ１８４、ＺＤ６４７４、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、およびセレコキシブとともに投与される。
【０２６３】
適切な抗ウイルス剤は、例えば、ウイルス不活化剤、例えば、非イオン性、アニオン性、およびカチオン性界面活性剤、およびＣ３１  Ｇ（アミンオキシドおよびアルキルベタイン）、ポリビグアニド、ドコサノール、アシルカルニチンアナログ、オクチルグリセロール、および、抗菌ペプチド、例えば、メガイニン、グラミシジン、プロテグリン、および、レトロサイクリン類を含む。穏やかな界面活性剤、例えば、ソルビタンモノラウレートが、本明細書に記載の組成物中の抗ウイルス剤として有利に用いられ得る。本明細書に記載の組成物中に有利に使用され得る他の抗ウイルス剤は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドアナログ、例えば、テノホビル、アシクロビル、アマンタジン、ジダノシン、ホスカルネット、ガンシクロビル、リバビリン、ビダラビン、ザルシタビン、およびジドブジンを含む。用いられ得るさらなる抗ウイルス剤は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えば、ＵＣ−７８１（チオカルボキシアニリド）、ピリジノン類、ＴＩＢＯ、ネビラピン（ｎｅｖａｒｉｐｉｎｅ）、デラビルジン、カラノリドＡ、カプラビリンおよびエファビレンツを含む。用いられ得る他の抗ウイルス剤は、ＨＩＶ侵入ブロッカーのカテゴリー内のもの、例えば、シアノビリン−Ｎ、シクロデキストリン、カラゲナン（ｃａｒｒｅｇｅｅｎａｎｓ）、硫酸化またはスルホン化ポリマー、マンデル酸濃縮ポリマー、モノクローナル抗体、ケモカイン受容体拮抗薬、例えば、ＴＡＫ−７７９、ＳＣＨ−Ｃ／Ｄ、およびＡＭＤ−３１００、および、融合阻害剤、例えば、Ｔ−２０および１２４９である。
【０２６４】
適切な抗菌剤は、抗生物質、例えば、アミノグリコシド類、一世代、二世代および三世代セファロスポリンを含むセファロスポリン類；エリスロマイシンを含むマクロライド、天然ペニシリン、ペニシリナーゼ耐性ペニシリン、アミノペニシリン、広スペクトルペニシリンを含むペニシリン類；スルホンアミド類、テトラサイクリン類、フルオロキノロン類、メトロニダゾールおよび尿路防腐剤を含む。
【０２６５】
適切な抗真菌剤は、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、グリセオフルビン、フルシトシン、フルコナゾール、ヨウ化カリウム、イトラコナゾール（ｉｎｔｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）、クロトリマゾール（ｃｌｏｒｔｒｉｍａｚｏｌｅ）、ミコナゾール、ケトコナゾール、およびトルナフテートを含む。
【０２６６】
適切な抗原虫剤は、抗マラリア剤、例えば、クロロキン、プリマキン、ピリメタミン、キニン、ファンシダール、およびメフロキン；抗アメーバ薬、例えば、ジオロキサミド（ｄｉｏｌｏｘａｍｉｄｅ）、エメチン、ヨードキノール、メトロニダゾール、パロモマイシンおよびキナクリン；ペンタミジンイセチオネート、アトバコン、およびエフロルニチンを含む。
【０２６７】
さらなる活性剤は、治療または疾患の症候または副作用に対する治療の効果を治療または高める薬剤であってよい。一実施態様では、さらなる活性剤は、抗炎症剤である。例は、制限されずに、Ｈ１−抗ヒスタミン剤（例えば、セチリジン）、Ｈ２−抗ヒスタミン剤（例えば、ラニチジン、ファモチジン）、抗ロイコトリエン薬（例えば、モンテルカスト、ジレウトン）、および非ステロイド性抗炎症剤を含む。
【０２６８】
さらなる活性剤は、本発明の融合タンパク質の免疫賦活性効果を高める免疫チェックポイント阻害剤および／または免疫賦活性剤であってよい。免疫賦活性剤は、制限されずに、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、サイトカイン受容体アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、Ｆｃ受容体アゴニスト、ＣｐＧ含有免疫賦活性核酸、相補受容体アゴニスト、アジュバント、またはＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４アクシス阻害剤、例えば、ＡＭＤ３１００、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、またはＴＮ１４００３、または、ＣＸＣＲ４の二量体化を妨げる抗体を含む。免疫チェックポイント阻害剤は、制限されずに、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、Ａ２ＡＲ、ＴＩＭ−３、およびＶＩＳＴＡの阻害剤、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、またはアテゾリズマブを含む。
【０２６９】
一部の実施態様では、本発明の方法は、さらなる治療を対象に施すステップをさらに含む。さらなる治療は、疾患を治療するのに効果的であることが知られる任意の治療、例えば、癌治療に効果的であることが知られる治療、例えば、外科的処置、放射線療法、陽子線療法、光に基づく治療などであってよい。
【０２７０】
４．キット
本発明は、本発明に係る改変された融合タンパク質を発現するためのキットを提供する。そのようなキットは、本発明の改変された融合タンパク質をコードする核酸からなってよい。核酸は、プラスミドまたはベクター、例えば、細菌プラスミドまたはウイルスベクター内に含まれてよい。他のキットは、改変された融合ポリペプチドを含む。さらに、本発明は、本発明に係る融合ポリペプチドを生産および／または精製するためのキットを提供する。
【０２７１】
本発明は、患者における、感染性、炎症性、自己免疫性または悪性疾患を予防または治療するためのキットを提供する。例えば、キットは、１つまたは複数の上述の医薬組成物および任意選択でそれらの使用のための説明書を含んでよい。さらに他の実施態様では、本発明は、もう１つの医薬組成物およびそのような組成物の投与を達成するための１つまたは複数のデバイスを含むキットを提供する。
【０２７２】
キットの構成要素は、前述の方法の手作業または部分的または完全に自動化されたプラクティスのためにパッケージされ得る。キットを含む他の実施態様では、それらの使用のための説明書が提供され得る。
【０２７３】
本発明は、以下の実施例においてより具体的に説明されて、その中の非常に多くの改変および変動は、当業者に明らかであるので、単に例示として意図される。
【実施例】
【０２７４】
［実施例１］
ＶＩＣ−００８の調製および治療的活性
新規の融合タンパク質、ＶＩＣ−００７（配列番号２８）は、広範に免疫を活性化するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来ヒートショックタンパク質７０（ＭｔｂＨｓｐ７０）、および、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）結合メソテリン（ＭＳＬＮ）、確証された免疫療法標的（４−６）の活性を標的化する腫瘍抗原からなる。ＭＳＬＮは、上皮悪性中皮腫および卵巣癌を含む一般的な上皮癌の表面上に高度に過剰発現されるが、一方で、健康な個体においては、胸膜、心膜、および腹膜に並んでいる中皮細胞でのみ、相対的に低レベルで発現される（７−１０）。ＭｔｂＨｓｐ７０は、よく特徴付けられていて、強力な免疫活性化アジュバントとして作用する。それは、単球および樹状細胞（ＤＣ）を刺激してＣＣ−ケモカインを生産して（１１、１２）、抗原を処理および提示しているマクロファージ、ＤＣ、およびエフェクターＴおよびＢ細胞を引き付ける（１３）。理論では、抗−ＭＳＬＮ  ｓｃＦｖおよびＭｔｂＨｓｐ７０の融合は、ｓｃＦｖの腫瘍標的化活性およびＭｔｂＨｓｐ７０の免疫活性化作用の利点を活かし、それは、腫瘍抗原の最も広範なプロファイルに対する抗腫瘍応答を生じる。
【０２７５】
我々の以前の試験は、ＶＩＣ−００７が、腫瘍特異的な細胞性免疫応答の増大を通して卵巣または悪性中皮腫腫瘍を有する免疫コンピテントマウスの生存を有意に高めることを示したが（１４）、融合タンパク質は、長期の寛解をもたらさなかった。この試験において、融合タンパク質の新バージョン、ＶＩＣ−００８（配列番号２７）が、ＶＩＣ−００７から再構築されて、余分のアミノ酸を除去してＭｔｂＨｓｐ７０の天然のペプチド結合部位の活性を最小限にした。ＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８は、同一セットのマウスにおいて並べて比較されて、ＶＩＣ−００８は、卵巣癌の、同一遺伝子、同所性および免疫コンピテントミューリンモデルにおいて、有意に改善された抗腫瘍性効能を与えることが見いだされた。
【０２７６】
［材料および方法］
細胞：Ｋａｔｈｙ  Ｒｏｂｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋａｎｓａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＫＳ）から寄贈されたＩＤ８卵巣癌細胞（１５）を、ルシフェラーゼレンチウイルスベクターによってトランスフェクトして、ルシフェラーゼ（ここではＬｕｃ−ＩＤ８と呼ぶ）が安定して発現された。細胞を、５％ＣＯ２での加湿雰囲気中で、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１０ユニット／ｍｌのペニシリン、１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で、３７℃で維持した。細胞を８０％コンフルエントまで培養して、動物注入のためにトリプシンＥＤＴＡ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を用いて採取した。
【０２７７】
動物モデルおよび処置：卵巣癌は、６週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス中への同一遺伝子の癌細胞Ｌｕｃ−ＩＤ８（５×１０６細胞／マウス）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって確立された。全てのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。卵巣腫瘍を有するマウスを、ＶＩＣ−００７（４μｇ／マウス）、ＶＩＣ−００８（４μｇ／マウス）、または通常の生理食塩水のｉ．ｐ．注入による腫瘍細胞接種の７日後に処置した。これの後に、７日間隔で３回のさらなる処置をした。全ての試験は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＳＲＡＣ）によって承認されたプロトコルの下で、観察者に見えない様式で行なわれた。
【０２７８】
腫瘍増殖のインビボイメージング：腹腔内腫瘍増殖を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によるインビボでのライブイメージングを用いて、腫瘍細胞接種後に毎週モニタリングした。マウスは、１５０ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ルシフェリンを１０分前に腹腔内注入されて、続いて、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍによってイメージングした。
【０２７９】
マウス生存：生存試験のために、我々は、腫瘍細胞の接種の１週間後、毎日マウスを観察した。腫瘍発生は、一貫して、最初に腹部の膨満、次に悪性腹水を介して明らかであり、腫瘍保有マウスは、前述とおり（１６）、毛皮の膨らみ（ｆｕｒ  ｒｕｆｆｌｉｎｇ）、速い呼吸速度、猫背の姿勢、低下した活性、および進行性の腹水形成を含む苦痛のサインがあるエンドポイントにおいて安楽死させた。
【０２８０】
統計分析：３以上の実験群間の統計的差異を、それぞれの群の平均が全ての他の群のものと比較される場合、Ｔｗｏ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後にテューキーの多重比較検定を用いて分析した。生存を、対数順位検定によって分析した。Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を、全ての統計分析に用いた。
【０２８１】
［結果および考察］
融合タンパク質ｓｃＦｖ−ＭｔｂＨｓｐ７０の再構築：融合タンパク質ｓｃＦｖ−ＭｔｂＨｓｐ７０を、我々の以前の研究（１４）において示されている、（Ｇ４Ｓ）３リンカーが間にある全長ＭｔｂＨｓｐ７０に融合された抗−ＭＳＬＮ  ｐ４  ｓｃＦｖ（１７）由来のＶＨおよびＶＬを用いて構築した。融合タンパク質ＶＩＣ−００７の以前のバージョンは、腫瘍増殖および腫瘍保有マウスの生存の延長の有意な制御を達成したが、使用された治療レジメンの抗腫瘍性効能は、改善される必要があった。非共有結合および遺伝子融合の両方によってＭｔｂＨｓｐ７０に連結された抗原性ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋およびＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の両方を引き起こすことができる（１８−２２）。この研究において、ｓｃＦｖ−ＭｔｂＨｓｐ７０融合タンパク質の新バージョンが開発されて（ＶＩＣ−００８）、それは、オリジナルのＶＩＣ−００７から、余分のアミノ酸の除去およびＭｔｂＨｓｐ７０の４１０位にフェニルアラニン（Ｆ）の代わりにバリン（Ｖ）の単一アミノ酸突然変異の導入によって改変された（図１）。この変更は、ＭｔｂＨｓｐ７０が偶発的に、オフターゲット効果または自己免疫または寛容の誘導をもたらし得る他の抗原を結合および送達する可能性を低減するために、タンパク質の免疫刺激能力を保持しながら、ペプチド結合を防ぐように設計される（２３）。
【０２８２】
融合タンパク質は、ＷｕＸｉ  Ａｐｐ  Ｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって、ＣＨＯ細胞において構築および発現されて、ＨＰＬＣによって９５％よりも高い純度および１．０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルで提供された。
【０２８３】
ＶＩＣ−００８は、腫瘍増殖の制御を高める：ミューリン卵巣癌は、免疫コンピテントＣ５７ＢＬ／６マウスにおける同一遺伝子の癌細胞Ｌｕｃ−ＩＤ８のｉ．ｐ．注入によって確立されて、材料および方法のセクションに説明されたＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８によって処置された。図２に示されるように、ＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８の両方とも、生理食塩水と比較した生物発光シグナルによって記録されるように、腫瘍増殖を有意に遅延させて（ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０００１）、一方で、ＶＩＣ−００８は、ＶＩＣ−００７と比較して腫瘍増殖をさらに有意に遅延させた（ｐ＜０．０００１）。
【０２８４】
ＶＩＣ−００８は、マウス生存の延長を高める：ＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８が、腫瘍保有マウスにおいて生存を延長する能力をさらに評価した。図３に示されるように、ＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８の両方とも、生理食塩水と比較して腫瘍保有マウスの生存を有意に高めて（ｐ＝０．０２５３およびｐ＝０．０００２）、生理食塩水による５５日のメジアン生存を、ＶＩＣ−００７によって６０日に、ＶＩＣ−００８によって６５日までさらに増大させた。ＶＩＣ−００８は、ＶＩＣ−００７と比較して、腫瘍保有マウスの生存をさらに有意に延長させた（ｐ＝０．０３０１）。
【０２８５】
合わせると、これらのデータは、融合タンパク質ＶＩＣ−００８の新バージョンは、有意に腫瘍増殖を遅延させて、卵巣癌の同一遺伝子のミューリンモデルにおける生存を延長することを示した。ＶＩＣ−００７と比較したＶＩＣ−００８の改善されたマウス生存は、タンパク質配列に対してなされた変更に関係していると考えられる。本研究は、卵巣癌のための治療剤としての、メソテリンを標的化した免疫活性化融合タンパク質の決定的な前臨床検証を提供する。
【０２８６】
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2019511246.tif 000024
【０２８７】
［実施例２］
ＶＩＣ−００８に関するさらなる試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ルシフェラーゼを発現しているＩＤ８マウス卵巣癌細胞（５×１０６）を腹腔内注入した。マウスは、腫瘍導入の１週間後に始めてＶＩＣ−００８（２０μｇ）の毎週の処置を４回受けた。結果を図４に示す。生存曲線を図５に示す。
【０２８８】
腫瘍サンプルを、生理食塩水またはＶＩＣ−００８のいずれかの４回目および最後の処置の２週間後に集めた。腫瘍組織を集めて、フローサイトメトリーを用いてイムノプロファイルして、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。結果を図６に示す。
【０２８９】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって検出した。制御性Ｔ細胞を、全てのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のパーセンテージとしてカウントした。結果を図７に示す。
【０２９０】
図８は、腫瘍における制御性Ｔ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比を示す。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによって検出した。比は、観察された集団のパーセンテージに基づいて計算された。
【０２９１】
図９は、腫瘍内のセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を示す。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ２７＋セントラルメモリーＴ細胞を検出した。ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞を、全てのＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージとしてカウントした。
【０２９２】
以上は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって、その中に含まれる特許請求の範囲の同等物とともに定義される。
【図１】
2019511246.tif 000025
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
2019511246.tif 000028
【図４】
2019511246.tif 000029
【図５】
2019511246.tif 000030
【図６】
2019511246.tif 000031
【図７】
2019511246.tif 000032
【図８】
2019511246.tif 000033
【図９】
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【配列表】
2019511246000001.app
【国際調査報告】
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2019511246.tif 000036
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