(57)【要約】  ａ）宿主細胞を用意するステップであって、前記宿主細胞がエピソームレプリコンを含み、前記エピソームレプリコンがドナー核酸配列を含み、前記宿主細胞が標的核酸配列をさらに含む、ステップ、ｂ）前記宿主細胞における核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップ、ｃ）前記宿主細胞における核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡを用意するステップであって、前記ドナー核酸配列が順番に５’−相同組換え配列１−所望の配列−相同組換え配列２−３’を含み、前記所望の配列が陽性選択可能マーカーを含む、ステップ、ｄ）前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、ｅ）切除したドナー核酸と前記標的核酸の間の組換えを可能にするためにインキュベートするステップ、及びｆ）前記ドナー核酸を前記標的核酸に組み込んだ組換え体について選択するステップを含む方法に関する。核酸及び細胞についても記載する。
2019525755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）宿主細胞を用意するステップであって、
前記宿主細胞がエピソームレプリコンを含み、
前記エピソームレプリコンがドナー核酸配列を含み、
前記宿主細胞が標的核酸配列をさらに含む、ステップ、
ｂ）前記宿主細胞における核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップ、
ｃ）前記宿主細胞における核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡを用意するステップであって、
前記ドナー核酸配列が、順番に５’−相同組換え配列１−所望の配列−相同組換え配列２−３’を含み、
前記所望の配列が陽性選択可能マーカーを含む、ステップ、
ｄ）前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、
ｅ）切除したドナー核酸と前記標的核酸との間の組換えを可能にするためにインキュベートするステップ、及び
ｆ）前記ドナー核酸を前記標的核酸に組み込んだ組換え体について選択するステップ
を含む方法。
【請求項２】
標的核酸が、順番に５’−相同組換え配列１−陰性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ドナー核酸を標的核酸に組み込んだ組換え体について選択するステップが、前記ドナー核酸の陽性選択可能マーカーの獲得及び前記標的核酸の陰性選択可能マーカーの喪失についての選択を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ドナー核酸の陽性選択可能マーカーの獲得及び標的核酸の陰性選択可能マーカーの喪失についての選択が同時に実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
所望の配列が、陽性選択可能マーカー及び陰性選択可能マーカーの両方を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ｄii）標的核酸配列中に少なくとも１つの二本鎖切断を誘導するステップであって、前記二本鎖切断が、相同組換え配列１と相同組換え配列２との間にある、ステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの二本鎖切断を標的核酸配列に誘導し、前記二本鎖切断それぞれが、相同組換え配列１と相同組換え配列２との間にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
切除されたドナー核酸が、相同組換え配列１で開始し、相同組換え配列２で終了する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
エピソームレプリコンが、ドナー核酸配列と独立した陰性選択可能マーカーを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ドナー核酸配列と独立した陰性選択可能マーカーの喪失について選択することによって、エピソームレプリコンの喪失について選択するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エピソームレプリコンが順番に、切除切断部位１−ドナー核酸配列−切除切断部位２を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
標的核酸が、宿主細胞内で機能を果たすことができるそれ自体の複製開始点を所有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
エピソームレプリコンがプラスミド核酸である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸がプラスミド核酸である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
エピソームレプリコンが第１のプラスミド核酸であり、標的核酸が第２のプラスミド核酸である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
エピソームレプリコンが細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
標的核酸が細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
エピソームレプリコンが第１の細菌人工染色体（ＢＡＣ）であり、標的核酸が第２の細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸が宿主細胞ゲノムである、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
陰性選択可能マーカーが、ｓａｃＢ（スクロース感受性）及びｒｐｓＬ（Ｓ１２リボソームタンパク質−ストレプトマイシン感受性）からなる群から選択される、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
陽性選択可能マーカーが、ＣｍＲ（クロラムフェニコール耐性）及びＫａｎＲ（カナマイシン耐性）からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
組換え体について選択するステップが、陽性及び陰性マーカーについての順次選択又は前記陰性及び陽性マーカーについての順次選択を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
組換え体について選択するステップが、陽性及び陰性マーカーについての同時選択を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質／ＲＮＡを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質が、ラムダレッドタンパク質を含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
合成ゲノムを組み立てる方法であって、第１のドナー核酸配列を用いて請求項１〜２５のいずれかに記載のステップを実施すること、前記第１のドナー核酸配列と連続するさらなるドナー配列を選ぶこと、及び合成ゲノムが組み立てられるまで、前記さらなるドナー核酸配列を用いて前記ステップを反復することを含む、前記方法。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかに記載の方法によって得られる組換え核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝学の分野、特に、有用な組換え核酸の効率的な操作及び作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムの新規設計及び合成は、生物学を理解し改変するための強力なアプローチとなる。ゲノム合成は、同義コドンの役割についての調査を加速させ、異種経路をコードする遺伝子のゲノムへの導入を可能にすることによって代謝改変を加速させ、非天然ポリマー合成のためにセンスコドンの新しいモノマーへの再割当を促進し、潜在的に生物のバイオセイフティーを改善する可能性がある。
【０００３】
マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）ゲノムのインビトロでの合成及びＭ．カプリコルム（M.capricolum）への核移行は先行技術で実現したことがある。さらに詳細には、完全な合成ゲノムが産生されたことがある。これにより、マイコプラズマ・ミコイデスの合成ゲノムが宿主マイコプラズマ・カプリコルムに導入された。例えば、これはGibson, D. G. et al. Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome. Science 329, 5987号 52-56 (2010)に記載されている。これは完成するのにほぼ１０年かかる非常に労力を要する手法であった。これは当技術分野の問題である。ゲノムの根本的な再設計のためにこのアプローチを適用することに伴う課題は、合成ゲノムの配列全体が受け入れられなければならないこと、又はゲノム置換が起こらないことである。
【０００４】
ゲノムの反復部位特異的変異誘発を可能にする方法が開発され、大腸菌の３２１個のＴＡＧコドンをＴＡＡに編集するために使用されたことがあるが、変異誘発を促進するためにＤＮＡ修復経路に欠損のある株が必要で、標的化変異にはより多くの数（３５５個）の非特異的な変異が伴い、これは明らかに問題である。
【０００５】
さらに、部位特異的変異誘発をベースにしたアプローチは、大きな挿入を導入することができず、ゲノムにおいて望まれる変化の密度及び／又は数が増加するにつれて、実施することがますます厄介になり、これが先行技術の方法の不利な点である。
【０００６】
ゲノム合成は、ゲノムに大きな挿入及び削除を導入してゲノムを根本的に変化させ、任意の密度及び／又は数の変異を導入する可能性を有する。しかし、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）について最近報告されたように、区画内のゲノムを置換し、所与の設計が失敗した場所を正確にフィードバックする方法が、ゲノムにコードされた情報を操作し理解する能力を加速するために必要である。
【０００７】
形質転換効率が核操作における制限ステップとなり得ることは、当技術分野の問題である。これは、大きさが２ｋｂ〜９ｋｂ以上に増大する場合に特に当てはまる。９ｋｂを超える直鎖状ＤＮＡの形質転換効率は、このようなステップに依存する核酸操作の効率に厳しい制約を課すことがある。
【０００８】
当技術分野における問題は、公知の技術を使用すると１回当たりわずか数ｋｂの核酸しか操作することができないことである。
【０００９】
当技術分野における問題は、低効率の組換え及び／又は標的核酸内の不適切な位置での組換えが、先行技術における核酸操作を著しく妨げる可能性があることである。
【００１０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)によって開示されている。この文献の焦点は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を媒介したリコンビニアリングを使用し、多数の位置をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で切断することによって未編集細胞を排除することによって、これら多数の規定されたコドン（各コドンについて３ｂｐ）を編集しようとすることである。著者等は、ゲノムにおける切断部位で正確に変化させようと試みている。Jiangらは、ドナー核酸を送達するのにエピソームレプリコンを使用しない。彼らは一本鎖ＤＮＡを使用し、ｓｓＤＮＡリコンビニアリングによって変化を導入するが、これは基本的に変化の長さを２、３ヌクレオチドに制限してしまい、問題である。
【００１１】
Traver et al 2009（Traver, B. E., Anderson, M. A. E. & Adelman, Z. N. Homing endonucleases catalyze double-stranded DNA breaks and somatic transgene excision in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology 18, 623-633 (2009)）は、蚊における２つの切断部位の間のゲノム配列を削除又は切除するためにホーミングヌクレアーゼによるゲノムの「二重切断」を開示している。Traver et alは、真核生物（蚊）のシステムについて記載している。Traver et alは、削除については記載しているが、いかなる挿入についてもいかなる置換についても記載していない。Traver et alは、合成ＤＮＡなどのドナーＤＮＡを提供していない。Traver et alは、切除を行うエンドヌクレアーゼの位置によって本質的に制限され、これも不利な点である。
【００１２】
細胞における合成ゲノムの作製は、天然ゲノムＤＮＡと合成ＤＮＡとの効率の悪いインビボでの置換によって制限される。
【００１３】
大腸菌では、合成ＤＮＡの短い領域はゲノムに挿入することができるか、又は２ステップ法：ｉ）１本の合成ＤＮＡを有し、陽性選択マーカーと連結し、ゲノムの標的領域の各末端に相同領域（ＨＲ）が隣接した直鎖状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）による細胞の形質転換、及びii）相同領域によって媒介される組換えとその後の陽性選択マーカーによるゲノム組込みについての選択でゲノムＤＮＡを置換するために使用することができる。このアプローチ（大腸菌におけるラムダレッド（lambda red）が媒介する組換えによって例示される「古典的組換え」）は、ＨＲによって付与される特異性が限定されているために、常に標的遺伝子座での組込みを導くとは限らない。さらに、古典的組換えは、ｉ）誤りのない十分な量のインタクトな、剪断されていない、長い直鎖状ｄｓＤＮＡを調製することが困難で、ii）挿入されたＤＮＡの長さによってこの方法の効率は急速に低下するので、通常２〜３ｋｂのゲノムＤＮＡのみを挿入又は置換するために使用される。したがって、広い領域のゲノムを削除することは可能で、大腸菌の最小ゲノム株（ＭＤＳ４２）が作製されたことはあるが、長い合成ＤＮＡを挿入又は置換のようにゲノムに導入する方法は報告されたことがない。
【００１４】
Sakura et al 2016（Sakura, Nakade, Sakane, Suzuki and Yamamoto Nat Protoc. 2016 Jan;11(1):118-33）は、ＰＩＴＣｈシステムと共にＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用するＭＭＥＪ支援遺伝子ノックインを開示している。この文献は、「ノックイン」ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びカエル胚を形成する方法を開示している。Sakura et alは、エピソームレプリコンを使用しない。Sakura et alによって導入された環状ベクターは、彼等が使用した宿主中で複製することができず、したがって細胞分裂によって非常に急速に失われる。
【００１５】
本発明は、先行技術に関連する問題を克服しようとするものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Gibson, D. G. et al. Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome. Science 329, 52-56 (2010)
【非特許文献２】Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)
【非特許文献３】Traver, B. E., Anderson, M. A. E. & Adelman, Z. N. Homing endonucleases catalyze double-stranded DNA breaks and somatic transgene excision in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology 18, 623-633 (2009)
【非特許文献４】Sakura, Nakade, Sakane, Suzuki amd Yamamoto Nat Protoc. 2016 Jan;11(1):118-33
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ここでは、９０ｋｂの合成ＤＮＡの大腸菌ゲノムへの１ステップ挿入、及び１００ｋｂの大腸菌ゲノムと合成ＤＮＡとの１ステップ置換の方法を報告し、この方法は反復することができることを示す。このアプローチを使用して、明確に規定した同義書き換え（recoding）規則を用いて、必須遺伝子が豊富な大腸菌ゲノムの２０ｋｂ領域を合成する。結果によって、数多くの必須遺伝子に同時に受け入れられる、規定された同義書き換え規則が明らかになる。この方法は柔軟性があり、標的核酸中の１００Ｋｂを超える核酸を１回で導入又は置換することができるという技術的利点を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、一態様では、本発明は、
ａ）宿主細胞を用意するステップであって、
前記宿主細胞がエピソームレプリコンを含み、
前記エピソームレプリコンがドナー核酸配列を含み、
前記宿主細胞が標的核酸をさらに含む、ステップ、
ｂ）前記宿主細胞における核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップ、
ｃ）前記宿主細胞における核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡを用意するステップであって、
前記ドナー核酸配列が順番に５’−相同組換え配列１−所望の配列−相同組換え配列２−３’を含み、
前記所望の配列が陽性選択可能マーカーを含む、ステップ、
ｄ）前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、
ｅ）切除したドナー核酸と前記標的核酸との間の組換えを可能にするためにインキュベートするステップ、及び
ｆ）前記ドナー核酸を前記標的核酸に組み込んだ組換え体について選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１９】
適切には、前記標的核酸は順番に５’−相同組換え配列１−陰性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’を含む。
【００２０】
適切には、前記ドナー核酸を前記標的核酸に組み込んだ組換え体について選択するステップは、前記ドナー核酸の陽性選択可能マーカーの獲得及び前記標的核酸の陰性選択可能マーカーの喪失についての選択を含む。
【００２１】
適切には、ドナー核酸の陽性選択可能マーカーの獲得及び標的核酸の陰性選択可能マーカーの喪失についての選択は、同時に実施される。
【００２２】
適切には、所望の前記配列は陽性選択可能マーカー及び陰性選択可能マーカーの両方を含む。
【００２３】
適切には、上記の前記方法は、
標的核酸配列中に少なくとも１つの二本鎖切断を誘導するステップであって、前記二本鎖切断が前記相同組換え配列１と前記相同組換え配列２との間にあるステップｄii）をさらに含む。適切には、少なくとも２つの二本鎖切断は標的核酸配列中に誘導され、前記二本鎖切断それぞれが前記相同組換え配列１と前記相同組換え配列２との間にある。
【００２４】
適切には、前記切除されたドナー核酸は、前記相同組換え配列１で開始し、前記相同組換え配列２で終了する。
【００２５】
適切には、前記エピソームレプリコンはドナー核酸配列と独立した陰性選択可能マーカーを含む。
【００２６】
適切には、前記方法は、ドナー核酸配列と独立した前記陰性選択可能マーカーの喪失について選択することによってエピソームレプリコンの喪失について選択するステップをさらに含む。
【００２７】
適切には、前記エピソームレプリコンは、順番に切除切断部位１−ドナー核酸配列−切除切断部位２を含む。
【００２８】
適切には、前記標的核酸は、前記宿主細胞内で機能を果たすことができるそれ自体の複製開始点を所有する。
【００２９】
適切には、前記エピソームレプリコンはプラスミド核酸である。
適切には、前記標的核酸はプラスミド核酸である。
適切には、前記エピソームレプリコンは第１のプラスミド核酸であり、前記標的核酸は第２のプラスミド核酸である。
【００３０】
適切には、前記エピソームレプリコンは細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
適切には、前記標的核酸は細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
適切には、前記エピソームレプリコンは第１の細菌人工染色体（ＢＡＣ）であり、前記標的核酸は第２の細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
【００３１】
適切には、前記標的核酸は宿主細胞ゲノムである。
【００３２】
適切には、陰性選択可能マーカーは、ｓａｃＢ（スクロース感受性）又はｒｐｓＬ（Ｓ１２リボソームタンパク質−ストレプトマイシン感受性）からなる群から選択される。
【００３３】
適切には、陽性選択可能マーカーは、ＣｍＲ（クロラムフェニコール耐性）又はＫａｎＲ（カナマイシン耐性）からなる群から選択される。
【００３４】
適切には、組換え体について選択するステップは、前記陽性及び陰性マーカーについての順次選択又は前記陰性及び陽性マーカーについての順次選択を含む。
【００３５】
適切には、組換え体について選択するステップは、前記陽性及び陰性マーカーについての同時選択を含む。
【００３６】
適切には、核酸切除を支持することができる前記ヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質／ＲＮＡを含む。
【００３７】
適切には、核酸組換えを支持することができる前記ヘルパータンパク質は、ラムダレッドタンパク質を含む。
【００３８】
別の態様では、本発明は、合成ゲノムを組み立てる方法に関し、この方法は、第１のドナー核酸配列を用いて上記のようなステップを実施すること、前記第１のドナー核酸配列と連続するさらなるドナー配列を選ぶこと、及び合成ゲノムが組み立てられるまで、前記さらなるドナー核酸配列を用いて前記ステップを繰り返すことを含む。
【００３９】
別の態様では、本発明は、上記の方法によって得られる組換え核酸に関する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、上記のような組換え核酸を含む宿主細胞に関する。
【００４１】
ＤＯＳＥＲとは、陽性マーカー、及び陰性マーカーの喪失が関与するコンビナトリアル選択アプローチを意味する。この「二重選択」スキームの使用は実際にまた、部位特異性に役立つ。例えば、組換え事象が不適切な部位で起こる場合、陽性選択可能マーカーの取得が引き起こされ得る。しかし、陽性マーカー、及び陰性マーカーの喪失についての同時選択を使用することによって、核酸が標的核酸の不適切な部位に組み込まれたとしても（それによって陽性マーカーを付与したとしても）、それらが不適当な部位に組換えられた場合、同時に陰性マーカーの喪失が引き起こされることはないので、このような分子は依然として選択されることはない。したがって、それ自体で有用な選択であると同時に、これは実際に、ドナー配列の取得についてだけでなく、除去／置換される配列の同時削除についても選択することによって、部位特異性を支援するという技術的利益を増大させる。
【００４２】
組換えは即座に、又は非常に迅速に起こり得る。したがって、切除されたドナー核酸と前記標的核酸との間の組換えを可能にするインキュベーションのステップは短くてもよい。典型的な例は５時間のインキュベーション（例えばＲＥＸＥＲ／ＫＡＩＳＥＲプロトコル用）であり、これは組換えに必要な時間を含めて、タンパク質分解及び／又は細胞分裂によって陰性選択マーカーの希釈を可能にするのに有利である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
ここでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるエピソームレプリコンからの二本鎖ＤＮＡのプログラムされたインビボ切除によって誘発される、長さに依存しない効率的な挿入及び大腸菌ゲノムＤＮＡと合成ＤＮＡとの置換を報告する。９０ｋｂの合成ＤＮＡのゲノムへの挿入、１００ｋｂのゲノムＤＮＡと合成ＤＮＡとの置換、及び段階的なゲノム再合成を可能にするアプローチの反復を示す。標的化したゲノム領域に７２３個のプログラムされた変異を導入する明確に規定された同義書き換えスキームを使用して、１２個の必須遺伝子を含む１５個の遺伝子を同時に書き換える（recode）ためにこのアプローチを使用する。このアプローチは、成功しない書き換えスキームの失敗の形式を特定し、細胞において成功した同義書き換えスキームの同定を可能にする。コドンを選ぶことは、タンパク質の発現、折り畳み、及びｍＲＮＡ構造の制御において重要である。結果によって、同義的に書き換えられたゲノム全てをサンプリングすることは組み合わせ的に不可能であるにもかかわらず、ゲノム中の必須遺伝子の多くの位置で動作する同義書き換えスキームを設計することは可能であることが示される。
【００４４】
簡単に説明すると、ＫＡＩＳＥＲ２アプローチには、ＢＡＣなどのエピソームレプリコンの導入、エピソームレプリコンを有する細胞集団を拡大するためのインキュベーション、インビボでのドナー配列の切除、組換えを可能にするためのインキュベーション、及び適切な選択可能マーカーの獲得／喪失についての選択が含まれる。
【００４５】
簡単に説明すると、ＫＡＩＳＥＲ４は、ＫＡＩＳＥＲ２と同じ手法に従うが、さらに標的核酸に切断（二本鎖ＤＮＡ切断）を導入し、ドナー核酸（合成核酸など）を組換える。
【００４６】
二本鎖切断は大腸菌中では修復されないことに留意されたい。「修復されない」とは、二本鎖切断の修復が極めて稀な事象であることを意味する。これは、大腸菌中の二本鎖切断は自発的には再結合できないからである。大腸菌中の二本鎖切断を修復する唯一の方法は、組換えである。
【００４７】
さらに、天然に生じる修復機構を阻害して二本鎖修復が存在しないこと、又はその可能性が極めて低いことを確実にするために、大腸菌などの宿主生物を選ぶことができ、又は操作することができる。例えば、宿主細胞において核酸組換えを支持することができる適切なヘルパータンパク質が、ＲｅｃＢＣＤ、例えば、本明細書で記載したラムダレッドタンパク質又はその他の適切な組換え支持タンパク質の代わりに存在するという条件で、ＲｅｃＢＣＤシステムは変異又は阻害することができる。例えば、一実施形態では、ＲｅｃＢＣＤは、ラムダレッド成分を妨害し、ラムダレッド成分によって実施される短い相同領域（例えば、約５０ｂｐ）を有する二本鎖ＤＮＡを使用した組換えの効率を低下させることがあるので、（ＲｅｃＢＣＤシステムによって分解された）ＫＡＩＳＥＲプロトコルでは阻害してもよい。しかし、長い相同領域（例えば、約３〜５ｋｂ）を使用する場合、ＲｅｃＢＣＤは、組換え支持タンパク質としてのラムダレッド成分に対して代替の組換え支持タンパク質となり得る。
【００４８】
これらの効果のうちのいくつかは、例えば、ＫＡＩＳＥＲ２スキームと比較してＫＡＩＳＥＲ４スキームを使用すると大幅に効率が向上することを示した図２ｆを参照して例示される。
【００４９】
もちろん、産生すべき改変核酸を得るために、実際には単一の事象のみが必要であることは当業者に明らかであろう。しかし、図２ｆによって証明されるような効率の向上は極めて有益であり、推論することも可能で、例えば、うまく変化した核酸が得られない場合、導入された合成配列は宿主細胞にとって有害又は毒性であることが強く示唆される。低効率のシステムでは、望ましい核酸が得られないことは単にシステム内での失敗を示すが、効率が高いと、変化した核酸産物が最終的に産生されない場合でも意味のある推論を導き出すことができることが本発明の利点である。
【００５０】
核酸を変化させるための先行技術のアプローチには、標的配列中に二本鎖切断を形成することが含まれることがあることに留意されたい。例えば、古典的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９には、導入する合成配列と組換えられなかった標的配列を切断するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用することによって非組換え核酸に対して選択した短い合成ＤＮＡを導入することが含まれる。しかし、本発明とは対照的に、先行技術のアプローチでは典型的には、組換えが既に起こった後にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断事象を実施した。本発明者等が知る限りでは、本発明のように組換え事象の前に標的配列を切断するシステムに関連する先行開示はない。適切には、本発明の方法１回の間に、本発明の切除／切断ステップは組換えステップの前に実施する。適切には、本発明の方法の１回において、本発明の切除／切断ステップは組換えステップの後には実施しない。
【００５１】
特定の理論に拘束されることを望まないが、核酸組換えにおける初期の研究は２つの理論を発展させた−１つ目は、二本鎖切断は組換え事象を増加させることがあること、２つ目は二本鎖切断は組換え事象とは独立していることである。当技術分野における現在の考え方では、組換えは二本鎖切断とは独立している。当技術分野における見解では、二本鎖切断は組換えの増加を必ずしももたらすわけではない。
【００５２】
本発明の方法が効果的であることは非常に驚くべきことである。例えば、ラムダレッド組換えシステムの理論的理解では、この方法は一本鎖（ｓｓＤＮＡ）段階を介して働く。したがって、このシステムが最大で２、３ｋｂの置換／挿入合成ヌクレオチド配列に制限されるであろうことは、大いに予想される。しかし、非常に驚くべきことに、この制限は本発明の方法では全く認められない。
【００５３】
定義
プラスミドは、小さな環状核酸（一般的にはＤＮＡ、最も一般的には二本鎖ＤＮＡ）分子を意味する。細胞内のプラスミドは、ＤＮＡなどのいかなる染色体核酸とも物理的に分離されており、独立して複製することができる。プラスミドについて考えるとき、「小さい」とは、それらが典型的には１０ｋｂ以下であることを意味する。適切には、本発明において有用なプラスミドは、以下の遺伝子要素：宿主細胞とコグネイトの複製開始点及び少なくとも１つの選択マーカーを有する。
【００５４】
ＢＡＣは細菌人工染色体を意味する。適切には、ＢＡＣは、以下の遺伝子要素：宿主細胞とコグネイトの複製開始点及び少なくとも１つの選択マーカーを有する。
【００５５】
ＹＡＣは酵母の人工染色体を意味する。適切には、ＹＡＣは、以下の遺伝子要素：宿主細胞とコグネイトの複製開始点及び少なくとも１つの選択マーカーを有する。
【００５６】
ＢＡＣ及びプラスミドは、互いに複製開始点が異なる。ＢＡＣは、典型的には各細胞中にＢＡＣを１コピー形成し、ＢＡＣが大きなサイズ（最高数百ｋｂ）を維持するのに役立つ特殊な複製開始点を有する。プラスミドは、各細胞中に、典型的には最高約１０ｋｂのサイズのプラスミドを典型的には多数コピー（細胞当たり２、３コピーから２、３百コピーの範囲）形成するプラスミド複製開始点を有する。
【００５７】
本明細書では核酸は適切にはＤＮＡである。
【００５８】
相同組換え
理論的には、いかなるヌクレオチド配列も相同組換え配列用の部位として選択することができる。
【００５９】
適切には、相同組換え用のヌクレオチド配列は特有である。適切には、特有とは、ドナー配列が組換えられる標的配列内で特有であることを意味する。
【００６０】
適切には、相同組換え用の配列は非反復性である。
【００６１】
適切には、相同組換え用の配列は少なくとも３０ヌクレオチド長である。３０ヌクレオチド程度の短い相同組換え配列の効率は低くなることがあるので、高効率のためには、相同組換え配列は、少なくとも４０ヌクレオチド長、適切には少なくとも５０ヌクレオチド、適切には５０〜１００ヌクレオチド、最も適切には５０〜６５ヌクレオチドであることが適切である。
【００６２】
相同組換え用の配列は、標的配列に対して選択し、ドナー配列に導入する。したがって、ドナー配列のＨＲ１及びＨＲ２は、標的配列のＨＲ１及びＨＲ２と１００％配列同一性を示す。
【００６３】
ラムダレッド組換えの使用によって、上記で概略を示したように、相同組換えのために短いヌクレオチド配列を使用することが可能になる。その他の組換え支持システムを使用してもよい。例えば、ＲｅｃＢＣＤシステムを使用してもよい。ＲｅｃＢＣＤシステムを使用するとき、適切には、「前記宿主細胞中において核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質を提供する」ステップは、宿主細胞内でＲｅｃＢＣＤシステムの発現を誘導するか、又は可能にすることからなる。
ＲｅｃＢＣＤシステム又はその他の組換え支持システムを使用するとき、当業者であれば相同組換えのために選択した配列に対するそれらのシステムの必要条件に注意を払うであろう。例えば、ＲｅｃＢＣＤシステムは、３〜１０ｋｂ長などの長い相同組換え配列を必要とすることがある。
【００６４】
より詳細には、ＲｅｃＢＣＤは３つの成分、ＲｅｃＢ、ＲｅｃＣ及びＲｅｃＤからなる天然の大腸菌組換えシステムである。３つのサブユニットは、形質導入及び接合の過程における相同組換え並びに大腸菌における二本鎖切断の修復の両方に必須であるＡＴＰ依存性ヘリカーゼ／ヌクレアーゼ複合体を構成する。大腸菌ＤＮＡにおいて二本鎖切断がインビボで誘導される研究では、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）が２つの組換え経路のうちの１つを介して進行し得ることを示す。いずれの経路もＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＡを必要とするが、一方はリゾルバーゼ酵素ＲｕｖＡＢＣに依存し、もう一方は依存せず、代わりにＲｅｃＧに依拠する。ｒｅｃＢ及びｒｅｃＤ遺伝子はオペロンを形成し、一方ｒｅｃＣは近くに位置しているが、それ自体のプロモーターを有する。３つの遺伝子産物は、エキソヌクレアーゼＶとしても知られているヘテロ三量体を形成する。さらに指針が必要な場合、例えば、大腸菌のＫ１２−ＭＧ−１６５５株については、詳細は公的に利用可能なＥｃｏＣｙｃデータベース中に「ＲｅｃＢＣＤ」として見いだすことができる(Keseler et al. (2013), "EcoCyc: fusing model organism databases with systems biology", Nucleic Acids Research 41: D605-12)。
したがって、本発明に必要とされるような組換えを支持するために、少なくともＲｅｃＢＣＤを宿主細胞中で発現させるべきである。
ＲｅｃＡも必要である可能性があり、したがって、より適切には、本発明で必要とされるような組換えを支持するために、少なくともＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＡを宿主細胞中で発現させるべきである。最も適切には、本発明に必要とされるような組換えを支持するために、ＲｅｃＢＣＤ及びＲｅｃＡを宿主細胞中で発現させるべきである。
【００６５】
ラムダレッドシステムの別の代替物は、ＲｅｃＥＴシステムである。ＲｅｃＥ及びＲｅｃＴはファージ由来の大腸菌遺伝子である。ＲｅｃＥはラムダレッドアルファを模倣しており、ＲｅｃＴはラムダレッドベータを模倣している（Muyrers, J. P., Zhang, Y., Buchholz, F. & Stewart, A. F. RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners. Genes Dev. 14, 1971-1982 (2000))。ＲｅｃＥＴの組み合わせは、ラムダレッドアルファ／ベータの組み合わせと比較して実施する。ラムダレッドアルファ及びベータは組換えを実施する実際の成分であり、一方、ラムダレッドガンマはＲｅｃＢＣＤシステムの阻害剤である。
【００６６】
適切には、組換え支持物は、例えば、Gene Bridges社から市販されているpRed/ETプラスミド（Gene Bridges GmbH社、Im Neuenheimer Feld 584、69120 Heidelberg、Germanyの「Quick & Easy E. coli Gene Deletion Kit」）由来のラムダレッドシステムによって提供される。
この設定におけるこのシステムは最初、特にラムダレッドシステムの詳細について参照により本明細書に組み込んだDatsenko, K. A. & Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000)に記載された。
本発明者等は、pRed/ETプラスミドは（配列同一性によって判断されるように）Datsenkoら(2000)におけるpKD46プラスミドに基づいており、したがって、pKD46プラスミドはラムダレッドシステムを構築するためのＰＣＲを実施するための鋳型として使用することができることを教示する。
【００６７】
核酸組換えを支持することができる前記ヘルパータンパク質がラムダレッドタンパク質を含むとき、適切には、以下のタンパク質が前記宿主細胞内で発現する：
【００６８】
【表１】
2019525755.tif 000003
2019525755.tif 000004
【００６９】
相同組換え配列
相同組換え配列を選ぶために、
・細菌ゲノム又はプラスミド骨格などの変化させる核酸（標的核酸）の配列の望ましい位置において５０〜１００ヌクレオチドを選ぶステップ、
・標的核酸に対して選択した配列のＢＬＡＳＴ検索を実施するステップ、
・ＢＬＡＳＴ検索において最も近い一致と比較して上記選択した配列のＥ値を考慮するステップであって、典型的には、標的核酸中の他の場所の望ましくない標的部位と比較して１０−２０を超えるＥ値は高すぎ、これが発見された場合、適切には代替の相同組換え配列を選択するステップ
を使用することができる。
【００７０】
適切には、ＨＲ配列のＥ値を計算するために標準的ＢＬＡＳＴ手段を使用する。１つのこのようなオンライン手段は、http://biocyc.org/ECOLI/blast.htmlにある。適切には、Ｅ値によって判断して所与のＨＲ配列がいかに特有であるかに焦点を当てる。適切には、親和性を考慮／計算することは必要ない。原則として、古典的組換えで動作することができる配列は、本発明、例えば、ＫＡＩＳＥＲでより良好に動作する。
【００７１】
より詳細には、ＨＲ配列が古典的組換えで動作することができる場合、本発明においてより良好に動作する。適切には、ラムダレッドシステムを使用する古典的組換えに関する厳格な原理及び必要条件に従って、本発明用のＨＲ配列を選択する。例えば、典型的には、５０〜７０ｂｐ長のＨＲを設計し、１０−２０より低い期待値のために大腸菌ゲノムに対してＢＬＡＳＴを使用した（Ｅ値、所与の配列がいかに特有であるかの測定値であり、Ｅ値が低ければ低いほど、配列はより特有である。計算のために任意の適切な手段、例えば、ＨＲ配列のＥ値を計算するために標準的ＢＬＡＳＴ手段を使用することができる。１つのこのようなオンライン手段は、http://biocyc.org/ECOLI/blast.htmlにある）。１０−２０のＥ値よりも低い値が必要であるとは予想されないが、もちろん、より低い値を有する配列は本発明においてさらに有用である。
Ｅ値は、所与の配列がいかに特有であるかの測定値である。古典的組換えは相同領域の特異性にのみ依拠するので、１０−２０などの比較的厳密なＥ値カットオフが必要である。ＫＡＩＳＥＲは相同領域の特異性によってだけでなく同時の陰性選択マーカーの喪失及び陽性選択マーカーの獲得によっても遺伝子座特異性を高めるので、ＫＡＩＳＥＲは原則として厳密性の低いＥ値（例えば、厳密性の低い相同領域）を受け入れることができる。しかし、厳密なＥ値を有する相同領域を生成することが実際には非常に単純であり、したがって、適切には、１０−２０のＥ値カットオフが使用される。
【００７２】
選択可能マーカー
適切な選択可能マーカーを以下の表に示す。
【００７３】
【表２】
2019525755.tif 000005
2019525755.tif 000006
【００７４】
切除／二本鎖切断の導入
切除／二本鎖切断の導入の機構は本発明の重要な部分であることに注意されたい。このシステムには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが適切である。しかし、この機能を生じるその他のシステム、例えば、亜鉛フィンガーをベースにしたアプローチ及び／又はＴＡＬＥＮをベースにしたアプローチ及び／又はその他のアプローチも知られている。
例えば、元のストレプトコッカス・ピロゲネス（Streptococcus pyogenes）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の代替としての代替ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼについて最近３つの論文が発表された（Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191 (2015); Zetsche, B. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 163, 759-771 (2015); Lee, C. M., Cradick, T. J. & Bao, G. The Neisseria meningitidis CRISPR-Cas9 System Enables Specific Genome Editing in Mammalian Cells. Mol. Ther. 24, 645-654 (2016)）。これらは全て、ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４スキームの両方など、本発明においてインビボでの切除を誘導するために使用することができる。これらの参考文献は、本明細書で使用したような二本鎖切断／切除の導入のための代替システムを教示するために特に、本明細書に参照により明確に組み込まれる。
【００７５】
宿主細胞における核酸切除／二本鎖切断を支持するために使用することができる別の種類のシステムは、上記のようにＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとは全く異なるものであり、ホーミングエンドヌクレアーゼである。１つのこのような例は、大腸菌ゲノムには存在しない、３０ｂｐの認識配列（TATGTATCTTTTGCGTGTACCTTTAACTTC（配列番号９））を有する大腸菌ファージＲＢ３のＩ−ＴｅｖIIIである(Eddy, S. R. & Gold, L. The phage T4 nrdB intron: a deletion mutant of a version found in the wild. Genes Dev. 5, 1032-1041 (1991); Robbins, J. B. et al. Homing endonuclease I-TevIII: dimerization as a means to a double-strand break. Nucleic Acids Research 35, 1589-1600 (2007)）。Ｉ−ＴｅｖIIIの切断部位は認識配列の５’末端に非常に近いため、エピソームレプリコンからドナー核酸（例えば、合成ＤＮＡ）を切除する場合にＫＡＩＳＥＲ２スキームと適合性がある。
【００７６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配列
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)に記載されている。
【００７７】
概要では、ガイドＲＮＡとは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡの単一融合ＲＮＡを意味する。適切には、一定のｔｒａｃｒＲＮＡ及び多数の異なるスペーサーＲＮＡの組み合わせを本発明では使用する。これらのｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡの組み合わせは、多数の異なるガイドＲＮＡと置換されていてもよい。
当技術分野では、ガイドＲＮＡは単一ＲＮＡとしてのｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡの融合物のみを意味し、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡの二重ＲＮＡ複合体を意味しない。
【００７８】
ＰＡＭは、プロトスペーサー隣接モチーフを表す。これは、典型的には３ヌクレオチドモチーフである。典型的なガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド長である。ガイドＲＮＡは典型的には、標的配列の２７ヌクレオチド並びにＰＡＭ配列の３ヌクレオチドを含む。
【００７９】
適切には、Jiangら(2013)と同じような別々のｔｒａｃｒＲＮＡ／スペーサーＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ設定を本発明で使用することができる。
或いは、例えば、当技術分野で知られているように、シングルガイドＲＮＡＣＲＩＳＰＲ設定を使用することができる(Le Cong et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)を参照）。
【００８０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用するときに切除を支持するために、適切には核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質は最小限、関連するＲＮＡ（スペーサーＲＮＡガイド、ｔｒａｃｒＲＮＡ（下記参照））と一緒に、Ｃａｓ９（例えば、下記参照）及びＲＮＡｓｅＩＩＩ（例えば、ｒｎｃ、EcoCycの受託ＩＤＥＧ１０８５７）を含む。
【００８１】
配列例を以下に挙げる：
Ｃａｓ９（配列番号１０）
ATGGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGATATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGGACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTGGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTGA
ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１１）
AAAAAGTTTAAATTAAATCCATAATGATTTGATGATTTCAATAATAGTTTTAATGACCTCCGAAATTAGTTTAATATGCTTTAATTTTTCTTTTTCAAAATATCTCTTCAAAAAATATTACCCAATACTTAATAATAAATAGATTATAACACAAAATTCTTTTAAAAAGTAGTTTATTTTGTTATCATTCTATAGTATTAAGTATTGTTTTATGGCTGATAAATTTCTTTGAATTTCTCCTTGATTATTTGTTATAAAAGTTATAAAATAATCTTGTTGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGATACTTCTATTCTACTCTGACTGCAAACCAAAAAAACAAGCGCTTTCAAAACGCTTGTTTTATCATTTTTAGGGAAATTAATCTCTTAATCCTTTT
【００８２】
Ｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡの実際の配列は典型的には、全実験を通して一定のままである。
スペーサーＲＮＡ配列は、厳格なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断部位に応じて変化させる。
【００８３】
適切には、Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡは、切除が起こる細胞（すなわち、宿主細胞）に一緒にもたらされる。適切には、これらの要素３つは全て、効率的切除に必須である。
【００８４】
一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは宿主細胞中で構成的に発現させる。Ｃａｓ９は、核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質（ラムダレッドアルファ／ベータ／ガンマなど）と一緒に誘導される。スペーサーＲＮＡは、スペーサーＲＮＡを発現する小さなプラスミドで細胞を形質転換することによって宿主細胞に最後にもたらされる。この段階で、３つの成分全てが細胞内に存在し、切除が生じる。
【００８５】
別の実施形態では、Ｃａｓ９を発現させるための核酸（ＤＮＡなど）配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡを一緒に細胞にもたらすことができ、一方では３つの成分（のうちのいくつか）の実際の発現は抑制（誘導しない／サイレント）することができる。適切な時点で、発現を誘導し、したがって切除を誘導してもよい。
【００８６】
好ましい実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡを一定に（構成的に）発現させ、Ｃａｓ９の発現を誘導し、切除を誘発するためにスペーサーＲＮＡを最後にもたらす。
【００８７】
発現の誘導は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、所望の配列（Ｃａｓ９など）は誘導プロモーターの制御下に置かれる。このプロモーター活性は、所望するときに誘導される。例えば、よく知られているアラビノース（ｐＡｒａ）プロモーターを使用することができ、これはアラビノースの存在下で誘導される。同様に、当業者であれば、所望するならば構成的発現に適した膨大な数のよく知られているプロモーターから構成的プロモーターを選ぶことができる。さらなる指針については、以下の実施例を参照する。
【００８８】
ＣＲＩＳＰＲシステムの操作に関してよく知られているように、スペーサーＲＮＡの配列は、標的部位が異なると異なる。適切なスペーサーＲＮＡを選ぶことは、十分に当業者の範囲内である。
【００８９】
さらなる指針が必要とされる場合、以下はスペーサーＲＮＡ配列の一例である；
＞スペーサー１＿２＿３＿４（配列番号１２）
tatttcttaataactaaaaatatggtataatactcttaataaatgcagtaatacaggggcttttcaagactgaagtctagctgagacaaatagtgcgattacgaaattttttagacaaaaatagtctacgaggttttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaacCGCGGCTTAGCTACGGCTGAGCACGCCCCTgttttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaacGTGGGAATAAGGGGTGAGGCTGGCATGCCTgttttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaacCGCGAACAAAAATACGCGCCAGGTGAAAATgttttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaacCCACTTTGCCCCACAATTTCCCACTGACCGgttttagagctatgctgttttgaatggtcccaaaacttcagcacactgagacttgttgagtt
【００９０】
小文字の配列は、実際のスペーサーＲＮＡ遺伝子座の隣接配列、プロモーター、及びダイレクトリピート領域を構成し、これらは本明細書に提示した実施例全てを通して一定である。大文字の配列は、１つの特定の操作において使用される４つの異なるスペーサーＲＮＡ配列（スペーサー１、２、３、及び４）である。当業者であれば、それらの特定の標的核酸配列に応じて、大文字のスペーサーＲＮＡ配列を簡単に変化させる。
【００９１】
ｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡの組み合わせは、別々に提供することができるか、又はｔｒａｃｒＲＮＡ及びスペーサーＲＮＡの融合物であるシングルガイドＲＮＡとして提供することができる。
【００９２】
異なるモチーフがＣＲＩＳＰＲシステムの異なる要素のために必要であることに注意されたい。Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭはＮＧＧである。
より詳細には、ＣＲＩＳＰＲシステムの代替の実行、例えば使用される代替ＰＡＭを導く実行は、操作者の選択に応じて使用することができる。より詳細には、天然ではＰＡＭとしてＮＧＧを認識するストレプトコッカス・ピオゲネスＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、変化したＰＡＭを認識するように改変できることが示されたことがある（Kleinstiver, B. P. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature (2015). doi:10.1038/nature14592）。Ran 2015、Zetsche 2015、及びLee 2016（上記を参照）に記載されている３つの代替ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼシステムは、天然では異なるＰＡＭを有する。ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖIIIのみが特定の認識配列を有し、ＰＡＭは有さない。
【００９３】
ＣＲＩＳＰＲシステムの代替成分を本発明で使用する場合、対応する代替コグネイトＰＡＭ配列を使用するべきであることに当業者は気づくであろう。これは、十分に当業者の範囲内である。さらなる指針が必要な場合は、以下の表にＣＲＩＳＰＲシステムの代替要素をそのＰＡＭ配列と一緒に示す。
【００９４】
【表３】
2019525755.tif 000007
2019525755.tif 000008
2019525755.tif 000009
【００９５】
制御された切除のためのＰＡＭ部位の操作
本発明を操作するとき、標的配列のＰＡＭを標的に入るドナー核酸（例えば、ｓＤＮＡ）のＰＡＭと比較して、ＰＡＭ配列がドナー核酸（例えば、ｓＤＮＡ）及び標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）で一致する場合の二重切除問題（例えば、相同組換え配列を含む偶然の切除）を回避するために、必要ならば変異させるべきである。本明細書で教示した順番で要素を配置すれば、当業者にとってこれを行うのは容易である。
【００９６】
ＫＡＩＳＥＲ２及び類似法
より詳細には、ＫＡＩＳＥＲ２又は類似の実施形態を操作するとき、エピソームレプリコンのドナー核酸（例えば、合成ＤＮＡ）に隣接する相同領域にはさらにＡｖｒII部位（ＣＣＴＡＧＧ）が隣接していてもよい。ＴＧＧ又はＣＣＡは、ストレプトコッカス・ピオゲネスのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに必要なＮＧＧＰＡＭ配列（向きに依存する）に対応する、一方、相補的ＣＣＡ又はＴＧＧはプロトスペーサーの最後の３つのヌクレオチドを構成する。プロトスペーサーの最後の３つのヌクレオチド及び／又はＮＧＧＰＡＭのＧのいずれかを置換すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９認識及び／又は切断が無効になる。ＫＡＩＳＥＲ２スキームにおける２つのＡｖｒII部位はエピソームレプリコン骨格の一部を構成し、標的核酸（例えば、宿主ゲノム）の相同領域の対応する末端のすぐ隣になるのを容易に回避することができる（４ｋｂ当たり平均で１ＡｖｒII部位）。このようにして、挿入及び置換の両方について、エピソームレプリコンの２つの切断部位（切除部位）を、ＫＡＩＳＥＲ２スキームにおける標的核酸（例えば、ゲノム）の相同領域の対応する末端と容易に区別することができる。
【００９７】
ＫＡＩＳＥＲ４及び類似法
ＫＡＩＳＥＲ４実施形態によって本発明を操作する場合、変化させる核酸（標的核酸）に存在する配列で使用するＰＡＭを選ぶには注意が必要である。その理由は、ドナー核酸（標的核酸に導入されているＤＮＡなど）の配列が、標的核酸のＰＡＭと一致するべきではないからである。それらが一致すると、本発明の方法の切除ステップはまた、不適切な位置で標的核酸に二本鎖切断を導入する危険性がある。したがって、適切には、標的核酸（ドナーＤＮＡが付加／挿入されているゲノム又はプラスミド又はＢＡＣなど）のＰＡＭを、ドナー核酸を担持するエピソームレプリコンのＰＡＭと比較するべきで、ＰＡＭ配列が一致することが見いだされた場合、この起こり得る問題を回避するために、変化させる標的核酸上でそれらを変異させるべきである。これは、十分に当業者の範囲内である。より詳細には、ＫＡＩＳＥＲ４又は類似の実施形態では、エピソームレプリコンの２つの切断部位は、ＫＡＩＳＥＲ２スキームにおけるのと同じ方法で標的核酸の相同領域の対応する末端と区別される。標的核酸の相同領域の内側に追加した２つの切断部位は、ＮＧＧモチーフを探すことによって同定する必要があり、標的核酸の相同領域の境界が規定される。標的核酸の相同領域の内側に追加した２つの切断部位のＮＧＧＰＡＭもまた、「二重切除」を回避するために、ドナー核酸を担持するエピソームレプリコンの相同領域の対応する末端に存在しないことが必要である。これは、挿入のための配列が標的核酸（ゲノムなど）の切断部位とは天然では異なるので、ドナー核酸（合成ＤＮＡなど）の挿入にＫＡＩＳＥＲ４スキームを適用するときに非常に簡単に実現することができる。ドナー核酸（例えば合成ＤＮＡ）が標的核酸（野生型ゲノムＤＮＡなど）と類似の配列を有する場合、置換のためにＫＡＩＳＥＲ４スキームを適用するとき、これは注意深く配置するべきである。これは、ドナー核酸（例えば、合成ＤＮＡ）中の対応するＮＧＧ及び／又はＮＧＧのすぐ隣の別のプロトスペーサー中の最後の３つのヌクレオチドを変化させることによって置換によって実現される。このようにして、切断部位を標的核酸（例えば、ゲノム）の位置のみに印付ける。
【００９８】
したがって、適切には、ドナー核酸配列は、順番に５’−切除切断部位−相同組換え配列１−所望の配列−相同組換え配列２−切除切断部位−３’を含む。
【００９９】
一実施形態では、組換え体についての選択を支援するために標的核酸に切断を誘導することが望ましいことがあり、この実施形態では、ドナー核酸を切除するためにエピソームレプリコンに２つ及び選択を支援するために標的核酸上に１つの３つの切断があると適切なので、これは時々「ＫＡＩＳＥＲ３」と呼ばれる。したがって、適切には、前記標的核酸は、順番に５’−相同組換え配列１−切断部位−相同組換え配列２−３’を含む。
【０１００】
適切には、前記標的核酸は、順番に
ａ）５’−相同組換え配列１−切断部位−相同組換え配列２−３’
ｂ）５’−相同組換え配列１−陽性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）、
ｃ）５’−相同組換え配列１−陰性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）、
ｄ）５’−相同組換え配列１−陽性選択可能マーカー−陰性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）、
ｅ）５’−相同組換え配列１−陰性選択可能マーカー−陽性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）
を含む。
【０１０１】
本発明を複数回適用する場合、初回のドナー核酸は次回において標的核酸の一部に寄与する／一部になる。したがって、適切には、所望の配列は、順番に
ａ）５’−相同組換え配列１−切断部位−相同組換え配列２−３’
ｂ）５’−相同組換え配列１−陽性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）、
ｃ）５’−相同組換え配列１−陰性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）、
ｄ）５’−相同組換え配列１−陽性選択可能マーカー−陰性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに、前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）、
ｅ）５’−相同組換え配列１−陰性選択可能マーカー−陽性選択可能マーカー−相同組換え配列２−３’（さらに，前記相同組換え配列１と相同組換え配列２との間に切断部位を含む）
を含んでいてもよい。
【０１０２】
適切には、標的核酸又は所望の配列の切断部位は、エピソームレプリコン／ドナー核酸の切除部位とは異なる。
【０１０３】
前記切断部位は、前記陽性／陰性選択可能マーカーの間にあってもよく、又は前記陽性／陰性選択可能マーカー内にあってもよい。
適切には、前記標的核酸は２つのこのような切断部位を含む。
適切には、前記切断部位は前記相同組換え配列の１つに隣接する。
適切には、前記２つの切断部位は、前記相同組換え配列１に隣接する第１の切断部位及び前記相同組換え配列２に隣接する第２の切断部位を含む。
【０１０４】
適切には、切除部位は、ステップ（ｃ）の核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡによって認識される配列である。
【０１０５】
適切には、エピソームレプリコン／ドナー配列は２つの前記切除部位を含み、適切にはステップ（ｃ）の前記ヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡは前記切除部位とコグネイトである。
適切には、前記切除部位又は切断部位はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のプロトスペーサー及びＰＡＭコグネイトを含み、適切には、核酸切除を支持することができる前記ヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びコグネイトＲＮＡを含む。
【０１０６】
サイズの制限
本出願で提示したデータは、効率が導入するＤＮＡなどの合成核酸の長さとは独立していることを示す。したがって、特定の理論に拘束されることは望まないが、この新たな発明は、サイズの制限がないという利点を有するものと考えられる。
【０１０７】
実際に、サイズの制限は、操作することができる合成核酸のサイズによってのみ課せられる。例えば、当技術分野における現在の見解では、細菌人工染色体（ＢＡＣ）は２００〜３００ｋｂの核酸配列に有効である。ＢＡＣレプリコンは典型的には約１０ｋｂである。したがって、合計ＢＡＣサイズは最大約３１０ｋｂであり、レプリコンには１０ｋｂが可能なので、本発明では１回当たりＤＮＡなどの合成核酸約３００ｋｂを組み込むことができる。
【０１０８】
酵母の人工染色体（ＹＡＣ）はより長いことがある。ＹＡＣの典型的なサイズの制限は、２〜３Ｍｂ（メガベース）である。
【０１０９】
適用
本発明は、プラスミドの構築に有用である。
【０１１０】
本発明は、宿主ゲノムの操作に有用である。
【０１１１】
本発明は、ＢＡＣなどの人工的染色体の構築に有用である。
【０１１２】
形質転換が組換えと共役しないことは本発明の利点である。
【０１１３】
インビトロでの操作を回避できることが本発明の利点である。核酸操作をインビボで実施することが本発明の利点である。
【０１１４】
本発明をゲノムに適用する場合、適切には、ゲノムは非ヒトゲノムであり、適切には、非哺乳類ゲノムである。適切には、ゲノムは原核生物ゲノム、適切には細菌ゲノムである。
【０１１５】
本発明は、大型核酸コンストラクトの形成において特に適用される。
【０１１６】
本発明は、高多様性ライブラリーの作製において特に適用される。これに関して、現在の形質転換技術を使用して、約１０８の形質転換効率が実現可能である。しかし、１０１０又はそれを上回る形質転換効率は、極めて困難及び／又は問題である。本発明によれば、第１の半ライブラリー（half-library）を作製して、第１の宿主細胞（宿主細胞の集団）に形質転換してもよい。この第１の半ライブラリーは、次に第２の半ライブラリーをコードする核酸で形質転換する。本発明による組換えを使用することによって、次にこれらの２つの半ライブラリーをインビボで組み合わせて１０１０の多様性を有するライブラリーを生じ、これは有利なことに１０５の形質転換効率を使用することだけを必要として得ることができた。
【０１１７】
本発明によれば、エピソームレプリコン、インビボでの切除及び組換えを含む組み合わせ法を提供する。適切には、前記組み合わせ法はさらに２重選択を含む。
【０１１８】
「エピソーム」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、例えば、自律的に存在し得るか又は染色体に組み込むことができる任意の付属的な染色体外複製遺伝要素である。
【０１１９】
適切には、切除は直鎖状ドナー核酸を生成するために実施する。
【０１２０】
同じ細胞中で活性のある複製開始点が同じ単一核酸に多数あることは通常望ましくない。これは、例えば、プラスミドなどのマルチコピーエピソーム核酸がドナー核酸を有する場合に特に当てはまり、この場合、プラスミド複製開始点を（例えば）ＢＡＣ又は宿主ゲノムに組み込むことは明らかに望ましくない。したがって、適切には、前記切除した直鎖状ドナー核酸は複製開始点を含まない。適切には、標的核酸配列が複製開始点を含む。
【０１２１】
適切には、ドナー配列を含むエピソームレプリコンの複製開始点は、宿主、例えば、全原核生物と一致しなければならない。適切には、標的を含むエピソームレプリコン及びドナー配列を含むエピソームレプリコンの複製起点は、宿主、例えば、全原核生物と一致しなければならない。
【０１２２】
適切には、ドナー配列を含むエピソームレプリコンは原核生物の複製開始点を含む。
適切には、標的配列を含むレプリコンは原核生物の複製開始点を含む。適切には、標的配列を含むレプリコンはエピソームレプリコンであり、原核生物の複製開始点を含む。
適切には、宿主細胞は原核生物である。
【０１２３】
適切には、合成ゲノムは合成原核生物ゲノムである。
【０１２４】
本発明のさらなる説明
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は核酸のインビボでの切断をもたらす。先行技術では、このシステムは単一の切断を標的核酸に導入するために使用されたことがある。
【０１２５】
先行技術では、制限酵素システムは単一の切断を標的核酸に導入するために使用されたことがある。例えば、制限酵素は導入したプラスミドに単一の切断を形成し、それによってインビボにおいて直鎖状にするために使用されたことがある。これは、典型的には、組換えの研究において、直鎖状核酸が必要な場合に行われたことがある。これはまた、先行技術において、それらを切断することによって直鎖状核酸は典型的には宿主細胞中で持続せず失われるので、所望しないプラスミドを除去するために行われたことがある。
【０１２６】
例えば、ＫＡＩＳＥＲ４で達成されたように、組換えと標的核酸の切断との共役を初めて教示する。
【０１２７】
一実施形態では、本発明は従来技術によって実施される第1の組換えステップを含んでいてもよい。これは、標的部位に逆選択可能マーカーの導入を可能にする利点を有する。
【０１２８】
本発明は、ＫＡＩＳＥＲ技術又は従来の組換えのいずれかによって達成することができる最終組換えの最終ステップを含んでいてもよい。例えば、これは目的をかなえ、ＫＡＩＳＥＲ組換えを何回も必要としない選択可能マーカーを除去するのに有利であり得る。
【０１２９】
一実施形態では、最初の従来の相同組換え事象なしに、ＫＡＩＳＥＲ核酸編集方法を開始し継続することは可能であり得る−例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの切除機構を使用して組換え事象によって置換することを企図する部位で切断し、それによって、切断し（及び組換えていない）標的核酸に対する選択圧、すなわち、二本鎖切断による陰性選択を作製することは可能であり得る。別の実施形態では、標的配列における二本鎖切断によるこの陰性選択を使用して、３つのＤＳ切断実施形態によって選択を改善することが可能であり得る（ドナー核酸の切除のための２つのＤＳ切断及び標的核酸のＨＲ１とＨＲ２配列との間の１つのＤＳ切断は全部で３つのＤＳ切断（break）／切断（cut）を形成する−これは時々「ＫＡＩＳＥＲ３」と呼ばれる）。
【０１３０】
本発明者等は、本発明によって教示したように、先行技術において従来の組換えは二重選択を決して含まなかったと断定する。本発明者等は、従来の組換えは先行技術において陽性選択しか使用したことがないと断定する。
【０１３１】
先行技術では、１つの陽性選択及び１つの陰性選択を使用することが時折教示されたことがある。この種の先行技術の方法は、陽性マーカーの獲得を選択する。次に、それらを組換える。組換え後、陰性マーカーの喪失について選択を実施する。対照的に、本発明は、単一の組換え事象についての陽性及び陰性選択を教示する。
【０１３２】
エピソームレプリコンは、前記宿主細胞内で機能を果たすことができるそれ自体の複製開始点を所有するエピソーム核酸である。先行技術において組換え目的のために細胞にトランスフェクトされたＤＮＡセグメントなどの核酸セグメントは、前記宿主細胞のための複製起点を所有しないのでレプリコンではない。例えば、いくつかの先行技術では、細菌プラスミドは哺乳類細胞にトランスフェクトすることができる。このプラスミドは、前記宿主細胞内で機能を果たすことができる複製開始点を所有しないので、その宿主におけるレプリコンではない。先行技術のプラスミドが所有することができる唯一の複製開始点は細菌細胞中において活性を有し、さらなる手法のためにトランスフェクトされた宿主細胞では活性を有さない。
【０１３３】
組換えの支援
いかなる宿主機能にも依存しないことが本発明の利点である。
【０１３４】
適切には、組換え機能は外来から、例えば、標的核酸に導入するドナー核酸（合成核酸など）を有するレプリコンで提供される。
【０１３５】
適切には、組換えはラムダレッドシステムによって支持される。
【０１３６】
適切には、ＲｅｃＢＣＤなどの核酸修復システムは不活性化されている。適切には、ＲｅｃＢＣＤのラムダレッド阻害剤を与える。
【０１３７】
適切には、切除機能はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってもたらされる。
【０１３８】
宿主細胞
適切には、宿主細胞は原核生物細胞である。
適切には、宿主細胞は細菌細胞である。
一実施形態では、適切には、宿主細胞はインビトロ、すなわち研究室内にある。一実施形態では、適切には、本発明の方法はインビトロでの方法である。適切には、方法はインビボでは実施しない。適切には、宿主細胞は生きたヒト又は動物の体の一部ではない。
適切には、宿主細胞は以下の実施例で使用した宿主細胞の１つから選択する。
適切には、宿主細胞はいかなるグラム陰性細菌であってもよい。適切には、宿主細胞はいかなる大腸菌株（ＭＧ１６５５若しくはＢＬ２１など）、又はそれらに由来する細胞であってもよい。
ＭＧ１６５５は大腸菌の野生型株と考えられる。この株のゲノム配列のジェンバンクＩＤはＵ０００９６（提出日時点でＵ０００９６．３）である。
ＢＬ２１は広く市販されている。例えば、New England BioLabs社（240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723, USA）からカタログ番号Ｃ２５３０Ｈで購入することができる。
最も適切には、宿主細胞はScarabGenomics社の製品番号Ｅ−０７４２のＭＤＳ４２である。
【０１３９】
利点
操作できるヌクレオチド配列のサイズによって合成ゲノム全体を作製することが可能となることは本発明の利点である。これは時々「ＧＥＮＥＳＩＳ」と呼ばれる。
【０１４０】
著者がゲノム上の切断部位を正確に変化させようと試みるJiangら (2013)とは対照的に、本発明は部位間の核酸の変化を対象とする。例えば、ＫＡＩＳＥＲ４スキームでゲノム上に生成した２つの切断部位間の断片全体の置換を教示する。ＫＡＩＳＥＲ２スキームでは、ゲノムの切断を必要としない。
【０１４１】
本発明は、規定されたゲノム遺伝子座に合成ＤＮＡ（ｓＤＮＡ）などの非常に長いドナー核酸を挿入し、１００％の遺伝子座特異性及びｓＤＮＡの長さに依存しない信頼性のある高効率でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などの非常に長い鎖の標的核酸をｓＤＮＡで置換するのに有用である。ＲＥＸＥＲ／ＫＡＩＳＥＲなどの本発明は、代替技術である古典的な相同組換えよりも基本的に性能が優れている。古典的組換えは一度に２、３ｋｂのｓＤＮＡを限定された効率及び遺伝子座特異性でしか挿入／置換できないが、一方、ＲＥＸＥＲ／ＫＡＩＳＥＲなどの本発明は、１００ｋｂ又はそれを上回るｓＤＮＡを非常に高い効率で、長さに依存しない方法で１００％遺伝子座特異的に、確実にゲノムに挿入／置換することができることを示した。
本発明は、生物のゲノムを調節することができる方法を基本的に変化させ、代謝工学及び新規のゲノム合成における新たな可能性を開く。今までは、代謝工学又はゲノム合成のために数１００ｋｂの範囲の長いｓＤＮＡ鎖を、可能性からいけば数１００ステップの古典的組換えによって理論的にのみ導入することができたが、これは実際には不可能であり、したがって商業的に行われたことはなかった。本発明は、このような作業を非常に簡潔、特異的及び効率的に、日常的及び確実に実施することを可能にする。
【０１４２】
本発明は、長さに依存しないＤＮＡ挿入及び置換を提供し、大規模なゲノムの同義書き換えを可能にする。
【０１４３】
本発明は非常に急速に分裂する（例えば、１回の分裂が２０分）大腸菌などの原核生物に適用できることが利点である。真核宿主細胞における公知の操作（例えば、Sakura et al 2016）は、宿主細胞内で複製できないベクターを使用して非常にゆっくり分裂する（分裂するのに数日から数週間）宿主細胞を使用しているので、この技術を原核細胞に応用することは困難又は不可能となっている。
さらに、Sakura et al 2016は、真核生物宿主細胞の内在性組換え機構を用いて組換えを容易にしたが、これを原核生物に直接応用することはできない。本発明では、核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質、原核宿主において提供されるウイルス起源のラムダレッド成分などを提供するが、これは対応する内在性組換え機構を欠如している。Sakura et alでは、成分は全て一時的に宿主に導入されるが、本発明は、成分が宿主内で安定的に形質転換され維持され得ることを実現する。
Sakura et alは、ＫＡＩＳＥＲ２に相当するいかなる様式についても記載しておらず、ＫＡＩＳＥＲ２では、ドナー核酸配列を含むエピソームレプリコン（例えば、ドナー配列を含む環状ベクター）のみが切断される。したがって、一部の実施形態では、適切には、ドナー核酸配列を含むエピソームレプリコンのみが切断される。したがって、一部の実施形態では、適切には、標的配列は切断されない。
さらに、外来性環状ＤＮＡ及び真核生物ゲノムはいずれもSakura et al. 2016の図２ｃ及び図３において切断される。Sakuraの教示と本発明との間の根本的な違いは、Sakuraにおける外来ＤＮＡはそれらのシステムではエピソームレプリコンではないことである。さらに、Sakura et alは、合成ＤＮＡを獲得し同時に元のゲノム配列を喪失について選択するために同時二重選択を使用してない。適切には、本発明は、ドナー核酸の所望の配列にある陽性選択可能マーカーについてと、標的核酸の選択可能マーカー、適切には陰性選択可能マーカーの喪失についてとを同時に選択するステップを含む。
【０１４４】
切除を行うためのエンドヌクレアーゼの位置によって本質的に制限されるTraver et al 2009とは対照的に、本発明は、ある範囲の部位での切除を支持することができるヘルパータンパク質及び／又はＲＮＡ（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）を利用することによって、ドナー（例えば、ＢＡＣ）又は標的（例えば、ゲノム）いずれかの切除位置に関して非常に柔軟であることが有利である。
【０１４５】
さらなる適用及び実施形態
一態様では、本発明は、ドナー核酸を標的核酸に導入する方法であって、
宿主細胞を用意するステップであって、
前記宿主細胞がエピソーム核酸を含み、前記エピソーム核酸がドナー核酸配列を含み、
前記宿主細胞がさらに標的核酸を含む、ステップ、
前記宿主細胞における核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップ、
前記宿主細胞における核酸切除を支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップであって、
前記ドナー核酸配列が順番に５’−相同組換え配列１−所望の配列−相同組換え配列２−３’を含み、
所望の前記配列が陽性選択可能マーカーを含む、ステップ、
前記ドナー核酸配列の切除を誘導するステップ、
切除したドナー核酸と前記標的核酸との間の組換えを可能にするためにインキュベートするステップ、
前記ドナー核酸を前記標的核酸に組み込んだ組換え体について選択するステップ
を含む方法に関する。
【０１４６】
広義の態様では、本発明は、宿主細胞を用意するステップであって、前記宿主細胞がエピソーム核酸を含み、前記エピソーム核酸がドナー核酸配列を含み、前記宿主細胞がさらに標的核酸を含む、ステップ、前記宿主細胞における核酸組換えを支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップ、前記宿主細胞における核酸切断を支持することができるヘルパータンパク質を用意するステップであって、前記ドナー核酸配列が順番に５’−相同組換え配列１−所望の配列−相同組換え配列２−３’を含み、所望の前記配列が陽性選択可能マーカーを含む、ステップ、前記ドナー核酸配列の切断を誘導して直鎖状ドナー核酸を産生するステップ、直鎖状ドナー核酸と前記標的核酸との間の組換えを可能にするためにインキュベートするステップ、及び前記ドナー核酸が前記標的核酸に組み込まれた組換え体について選択するステップを含む方法に関する。
【０１４７】
一態様では、本発明はまた、合成ＤＮＡ上の有害な問題領域を単一ヌクレオチドまで分解して示すことができる方法に関する。これらの同定された問題領域を容易に修正することができる方法についても記載する。
【０１４８】
したがって、本発明は、合成ＤＮＡ内の別の有害配列を同定し、修正することができる。本発明者等は、ＫＡＩＳＥＲ／ＲＥＸＥＲがこの特性を備えた唯一の方法であると考える。これは、研究者がゲノムに組み込もうとしている合成ＤＮＡ配列をデバッグするのに有用である。
【０１４９】
これに関して、図１０、１１及び１２は、２０ｋｂのゲノムを書き換えるためにＫＡＩＳＥＲ／ＲＥＸＥＲを使用し、許容された及び許容されていない書き換えスキームを同定することを示す。図１３（また図１７（拡張データ図９））は、上記のような有害配列（以下の実施例では固有の位置／配列と呼ばれる）を同定し修正する能力を示す。
【０１５０】
さらなる特定の好ましい態様は、添付の独立請求項及び従属請求項に記載されている。従属請求項の特徴は、必要に応じて独立請求項の特徴と組み合わせてもよく、請求項に明示的に記載されているもの以外と組み合わせてもよい。
【０１５１】
装置の特徴が機能を提供するために動作可能であると記載されている場合、これはその機能を提供するか、又はその機能を提供するように適応若しくは構成されている装置の特徴を含むことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
添付の図面を参照して、本発明の実施形態をここでさらに記載する。
【図１】二重選択組換え（ＤＯＳＥＲ）が標的遺伝子座での組換えを増強することを示した図である。ａ．古典的組換え及びＤＯＳＥＲ。古典的組換え：相同領域１（ＨＲ１）及び相同領域２（ＨＲ２）が隣接した合成ＤＮＡ（ｓ．ＤＮＡ）配列及び陽性選択マーカー（＋、クロラムフェニコール耐性遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするＣｍＲ）を含む直鎖状二本鎖ＤＮＡを細胞に形質転換する。組換え体は陽性選択マーカーの発現によって選択する。ＤＯＳＥＲ：ｓ．ＤＮＡを陰性選択マーカー、−２（ｓａｃＢ、スクロースに対する感受性を付与する）及び陽性選択マーカー、＋２（ＣｍＲ）に連結させ、明確に区別できる陰性、−１（ｒｐｓＬ、必須リボソームタンパク質Ｓ１２をコードし、ストレプトマイシンに対する感受性を付与する）及び陽性、＋１（ＫａｎＲ、カナマイシン耐性遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードする）及び以前ゲノムに導入された選択マーカーの位置に組み込む。＋２の獲得及び−１の喪失についての二重選択は、標的ゲノム遺伝子座での組込みを保証する。ｂ．古典的組換えはＣｍＲの獲得のみを選択することによって実施されるが、ＤＯＳＥＲは同時のＣｍＲの獲得及びｒｐｓＬの喪失を選択することによって実施される。古典的組換え及びＤＯＳＥＲから多数のコロニーを採取し、コロニーＰＣＲによって分析する。ｃ．ＤＯＳＥＲによって単離されたクローンは全て、標的遺伝子座に組み込まれていた。データは、３つの独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。注：図１ａは先行技術のアプローチ「古典的組換え」を示しており、本発明の一部ではない。
【図２】Kaiの組換え増強（ＫＡＩＳＥＲ、Kai’s Enhanced Recombination）（時々、「ＲＥＸＥＲ」（レプリコン切除を増強する組換え）と呼ばれる):合成ＤＮＡの大腸菌ゲノムへの、長さに依存しない、効率的な遺伝子座特異的挿入を示した図である。ａ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４、エピソームで維持された細菌人工染色体（ＢＡＣ）から合成ｄｓＤＮＡをインビボで切除して、ＤＯＳＥＲを組み込むＫＡＩＳＥＲの２つの型。ＫＡＩＳＥＲ２では、ＢＡＣのＨＲ１／ＨＲ２には、それぞれ青及びオレンジ色で強調した２つのＣＲＩＳＰＲプロトスペーサー配列が隣接している。プロトスペーサーによって指定された位置でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断は、ＢＡＣのＨＲ１からＨＲ２までのｄｓＤＮＡの切除を引き起こし、このｄｓＤＮＡはラムダレッドが媒介する組換えを受け、ゲノムのＨＲ１からＨＲ２までの挿入を引き起こす。ＢＡＣは、その骨格中にー１の余分のコピーを保持しており、−１の喪失について選択することによって、ＢＡＣを有する生存細胞はないことは確実である。ＫＡＩＳＥＲ４は、ゲノムに結合した−１／＋１カセットに隣接する２つのプロトスペーサーを余分に追加することによってＫＡＩＳＥＲ２を増強する。次に、４つのプロトスペーサー（ＢＡＣ及びゲノム中にある）全てをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が媒介する切断及びラムダレッドが媒介する組換えのために標的化する。ｂ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び組換えに依存する。ｒｐｓＬ−ＫａｎＲカセットによって印付けられた特定のゲノム遺伝子座でのＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４によるｓａｃＢ−ＣｍＲの組込みは、カナマイシン耐性の喪失及びクロラムフェニコール耐性の獲得によって示され、コロニーＰＣＲによって裏付けられた。対照実験では、スペーサーＲＮＡ又はラムダレッドベータのいずれかを排除する。データは、３つの独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。ｃ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４は、標的遺伝子座での１００％組込みをもたらす。データは、３つの独立した実験の平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。実験は（ｂ）で記載したように実施した。ｄ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用した大腸菌ゲノムの標的遺伝子座への９ｋｂ合成ＤＮＡの効率的な組込み。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用して、ｓａｃＢ−ＣｍＲが連結した合成ｌｕｘオペロンをｒｐｓＬ−ＫａｎＲによって印付けられたゲノム遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）に組み込む。ＫＡＩＳＥＲ２用に１０倍希釈した二重選択プレート及びＫＡＩＳＥＲ４用の１０４倍プレートを白色光で撮像して、生存するコロニーを示した。生存するコロニーは全て生物発光を示す。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４からの１１コロニーそれぞれは、表現型、コロニーＰＣＲ及びＤＮＡ配列によって正しいことが示された。ｅ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用した大腸菌ゲノムの標的遺伝子座への９０ｋｂ合成ＤＮＡの効率的な組込み。合成ＤＮＡ９０ｋｂは、ＭＤＳ４２ゲノムから削除した大腸菌ＭＧ１６５５ＤＮＡの８０ｋｂを使用して構築した。ｌｕｘオペロンをこの８０ｋｂ領域の中間に組み込み、ｓａｃＢ−ＣｍＲカ���ットを一末端に付け加えた。９０ｋｂコンストラクトはＢＡＣにあり、（ｄ）と同じゲノム遺伝子座に組み込まれ、（ｄ）におけるように特徴付けられる。ｆ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４による、長さに依存しない効率的な組込み。反応当たりのコロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）の数を、ＤＯＳＥＲ、ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４のために組み込んだ合成ＤＮＡの長さに対してプロットする。同じ条件下で同じ二重選択プレートを使用して全実験を実施する。ＤＯＳＥＲの９０ｋｂ点は、それ自体の効率又は組換えではなく、インビトロにおいて９０ｋｂ直鎖状ｄｓＤＮＡ産物を得ることが不可能であることを反映している。古典的組換えの効率はＤＮＡの長さによって急速に低下することはよく立証されている。
【図３】ＫＡＩＳＥＲ２を介したゲノムＤＮＡの１００ｋｂと合成ＤＮＡとの効率的な置換を示した図である。ａ．ＫＡＩＳＥＲを介した、１００ｋｂゲノムＤＮＡとｌｕｘ遺伝子で透かし（watermarks）を入れた１００ｋｂのＤＮＡとの置換。この領域の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、灰色の２つの交互に網掛けした箱によって表し、各箱の長さはそのＯＲＦの長さに相当する。ｌｕｘオペロン（ピンク）の５つの遺伝子は、ＢＡＣの１００ｋｂを通して、合成ＤＮＡによるゲノム置換のための透かしとして間を置いて配置されている。完全な置換は、５つのｌｕｘ遺伝子全て（ｌｕｘＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）のゲノムへの安定した移行を引き起こし、生物発光細胞を生じる。部分的置換は、１つ又は２つ以上のｌｕｘ遺伝子の喪失を引き起こし、非生物発光細胞を生じる。ｂ．ＫＡＩＳＥＲ２を使用した１００ｋｂゲノムＤＮＡ全体の効率的置換。二重選択プレートの発光写真を白色光写真に重ね合わせることによって示されるように、ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４はいずれも生物発光細胞を生成する。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４による生物発光コロニーは、クロラムフェニコールに対して耐性で、カナマイシンに対して感受性であり、遺伝子型同定はゲノムＤＮＡと各透かしを含有する配列との置換を裏付ける。
【図４】必須遺伝子が豊富な大腸菌ゲノムの２０ｋｂ領域での体系立てられた同義コドン再割当の試験を示した図である。ａ．大腸菌セリンｔＲＮＡのコドン−アンチコドン相互作用及び３つの書き換えスキーム（ｒ．ｓ）。線はコドンアンチコドン相互作用を示す。灰色の線は標的領域において同義書き換えによって除去された解読事象を示す。除去のために標的化されたコドンは灰色で示し、それらの置換はピンクで示す。矢印は、置換で除去するために標的化されたコドンと結びつく。ゲノム全体にこれらの書き換えスキームの１つを適用すると、ＣＧＡアンチコドンを有するｔＲＮＡを使用した新たなアミノ酸へのＴＣＧコドンの再割当が可能となる。ｂ．８９０６２〜１０６５０７の領域は、５つの重複するリーディングフレーム配列を複製することによって改変され、複製領域（ｄ．ｒ．）１〜５を作製する。次に、遺伝子を同義書き換えスキーム（ｒ．ｓ．）１、２又は３によって書き換えし、３つのＢＡＣを作製する。＋２はＣｍＲであり、−２はｓａｃＢであり、＋１はＫａｎＲであり、−１はｒｐｓＬであり、ＫＡＩＳＥＲ２のために使用する。ｃ．ＨＲ１とＨＲ２との間の配列はピンクの棒によって示し、置換のために標的化した全コドンの位置は赤い線によって示す。各書き換えスキームのために、１０個のクローンを配列決定した。灰色の棒は、ｗｔゲノム配列を示し、ピンクの棒は示したスキームで書き換えられたゲノム配列を示す。
【図５】（拡張データ図１）ゲノム段階の交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ、Genome Stepwise Interchange Synthesis）を可能にするためのＫＡＩＳＥＲによる反復ゲノム変化を示した図である。ａ．ＫＡＩＳＥＲによる反復ゲノム変化。１つのカセットがゲノムの規定された遺伝子座に印付けられ、ＢＡＣのもう１つのカセットが合成ＤＮＡと連結している、２つの明確に区別できる二重選択カセット−１／＋１（ｒｐｓＬ−ＫａｎＲ）及び−２／＋２（ｓａｃＢ−ＣｍＲ）の交互使用は、１回のＫＡＩＳＥＲの結果が次回のＫＡＩＳＥＲの鋳型として作用することを可能にする。ｂ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用したゲノムｒｐｓＬ−ＫａｎＲとＢＡＣ結合ｓａｃＢ−ＣｍＲとの効率的置換。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用して、ｓａｃＢ−ＣｍＲをｒｐｓＬ−ＫａｎＲで印付けたゲノム遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）に組み込む。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４による１１コロニーそれぞれは、表現型、コロニーＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によって正しいことが示された。ｃ．ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用したゲノムｓａｃＢ−ＣｍＲとＢＡＣ結合ｒｐｓＬ−ＫａｎＲとの効率的な反復置換。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４を使用して、ｒｐｓＬ−ＫａｎＲを（ｂ）のクローンのゲノム遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）に組み込む。ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４からの１１コロニーそれぞれは、表現型、コロニーＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によって正しいことが示された。（ｃ）の産物はまた（ｂ）の鋳型として役立つことができる。ｄ．ゲノム段階の交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ）。ＫＡＩＳＥＲを使用した野生型断片と合成断片との１ステップでの１００ｋｂゲノム置換を実施する能力、及び次のステップの鋳型として前のステップの産物を使用する連続ＫＡＩＳＥＲステップを反復する能力を用いて、約４０ステップで大腸菌ゲノム全体を合成ＤＮＡで置換する、ゲノム段階交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ）を提案する。
【図６】（拡張データ図２）ＫＡＩＳＥＲを介した１００ｋｂのゲノムＤＮＡとｌｕｘ遺伝子透かしを有する合成ＤＮＡとの置換を示した図である。ａ．ＫＡＩＳＥＲを介した１００ｋｂのゲノムＤＮＡとｌｕｘ遺伝子で透かしを入れた１００ｋｂのＤＮＡとの置換。この領域の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、灰色の２つの交互に網掛けをした箱によって表し、各箱の長さは各ＯＲＦの長さに相当する。ｌｕｘオペロンの５つの遺伝子（ピンク）は、合成ＤＮＡによるゲノム置換のための透かしとして、ＢＡＣの１００ｋｂ全体に間を置いて配置される。完全な置換は、５つのｌｕｘ遺伝子全て（ｌｕｘＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）のゲノムへの安定した移行を引き起こし、生物発光細胞を生じる。部分的置換は、１つ又は２つ以上のｌｕｘ遺伝子の喪失を意味し、非生物発光細胞を生じる。ｂ．ｌｕｘ遺伝子透かしによる１００ｋｂゲノムＤＮＡの完全な、又は部分的な置換。ＫＡＩＳＥＲによる全コロニーは、生物発光していてもいなくても、クロラムフェニコールに耐性で、カナマイシンに感受性である。生物発光コロニーは全て５つのｌｕｘ透かし全てを含有することが確認され、１００ｋｂゲノムＤＮＡと透かしを入れた合成配列との置換を示している。非生物発光コロニーは全て最初の（ｌｕｘＡ）及び最後の（ｌｕｘＥ）の透かしを有するが、中央の透かし（ｌｕｘＢ、Ｃ、Ｄ）の少なくとも１つを失っている。非生物発光コロニーで第２の透かし（ｌｕｘＢ）を含有しているものはなく、合成ＤＮＡ中のこの領域の周りの配列が有害である可能性を示している。
【図７】（拡張データ図３）２０ｋｂ書き換え領域の選択及び書き換えられた合成配列の設計を示した図である。ａ．２０ｋｂ書き換え領域の選択。同義書き換えスキームを試験するために最良の候補領域を同定するために、多数の必須遺伝子、並びに書き換えのために標的化された多数のコドン、特にＴＣＡＳｅｒ及びＴＣＧＳｅｒ及びＴＡＧアンバーを含有する領域に注目した。まず、大腸菌における非必須遺伝子を個々に同定するＫＥＩＯコレクションにおいて、必須遺伝子の非存在に基づいて必須遺伝子を同定した。必須遺伝子の位置をＭＤＳ４２ゲノムに位置づけた。次に、スライディングウィンドウアプローチを適用し、ＭＤＳ４２ゲノムの１０ｋｂ領域内の全必須遺伝子内の標的コドンの数を計数した。ゲノム配列の最初の１０ｋｂから開始して、ウィンドウを１００ｎｔずつ反復シフトし、ＭＤＳ４２ゲノム配列の終わりまでコドン分析を実施した。スライディングウィンドウアプローチにおいて、ＭＤＳ４２ゲノムの最高スコア２０ｋｂの領域として、細胞分裂オペロンに対応するｍｒａＺからｆｔｓＺの領域を同定した。ｂ．新たな構造及び新たな解読規則による書き換えられた合成配列の設計。ｍｒａＺからｆｔｓＺの領域は１５遺伝子を含有し、そのうちの５つは明確に区別できるリーディングフレーム中で重複している。重複内の潜在的なシス調節領域をインタクトのまま残しながら、各遺伝子の独立した書き換えを可能にするために、重複しているＯＲＦそれぞれの開始コドンの２００ｎｔ上流が複製している（複製領域ｄ．ｒ．として示される）新しい構造を設計した。この新しい構造の１５個の遺伝子全ての内で書き換えスキーム１が実行されるＤＮＡ配列、及びその新しい構造内で書き換えスキーム２又は３が実行される配列を設計した。各スキームのためのＤＮＡを新規合成し、Ｓ．セレビシエのＢＡＣに組み込み、ＫＡＩＳＥＲ２を介して各スキームでゲノムの書き換えを試験した。
【図８】(拡張データ図４)同義的に書き換えたクローンの培養増殖を示した図である。ＫＡＩＳＥＲによる２０ｋｂ書き換えそれぞれから得られた個々のクローンの増殖をモニターした。各クローンについて、培養が飽和になるまで、１０分間隔でＯＤ６００を三連で測定した。対照として、ＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒ、ＭＤＳ４２ｒＫ、及びＭＤＳ４２ｓＣ１０６５０７（書き換えクローン中のｓａｃＢ−ＣｍＲの位置を模倣するために、ｓａｃＢ−ＣｍＲを１０６５０７〜１０６５０８の間に挿入した）を書き換えクローンと一緒に増殖させた。最大指数増殖速度の計算及び比較では、対照ＭＤＳ４２ｓＣ１０６５０７と試験した書き換えクローンのいずれとの間にも有意な差は示されなかった（二標本ｔ検定、ｐ値＞０．０１）。エラーバー：平均±標準偏差。
【図９】（補足図２）ＲＥＸＥＲを反復することによって、ゲノムの２２０ｋｂが合成ＤＮＡ２３０ｋｂで置換されることを示した図である。ａ．ＲＥＸＥＲによる反復ゲノム変化。ゲノムの規定された遺伝子座に印付けられた１つのカセット、及び合成ＤＮＡと連結したＢＡＣのもう１つのカセットによる、２つの明確に区別できる二重選択カセット−１／＋１（ｒｐｓＬ−ＫａｎＲ）及び−２／＋２（ｓａｃＢ−ＣｍＲ）の交互使用は、１回のＲＥＸＥＲの産物が次回のＲＥＸＥＲの鋳型として作用することを可能にする。ｂ．ＲＥＸＥＲ２及びＲＥＸＥＲ４を使用したゲノムｒｐｓＬ−ＫａｎＲとＢＡＣ結合ｓａｃＢ−ＣｍＲとの効率的置換。ＲＥＸＥＲ２及びＲＥＸＥＲ４を使用して、ｓａｃＢ−ＣｍＲをｒｐｓＬ−ＫａｎＲで印付けたゲノム遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）に組み込む。ＲＥＸＥＲ２からの１１コロニー及びＲＥＸＥＲ４からの１１コロニーは、表現型、コロニーＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によると正しかった。ｃ．ＲＥＸＥＲ２及びＲＥＸＥＲ４を使用したゲノムｓａｃＢ−ＣｍＲとＢＡＣ結合ｒｐｓＬ−ＫａｎＲとの効率的な置換。ＲＥＸＥＲ２及びＲＥＸＥＲ４を使用して、ｒｐｓＬ−ＫａｎＲを（ｂ）のクローンと同じゲノム遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）に組み込む。ＲＥＸＥＲ２及びＲＥＸＥＲ４からの１１コロニーそれぞれは、表現型、コロニーＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定によると正しかった。ｄ．ゲノムの２２０ｋｂと合成ＤＮＡの２３０ｋｂとを置換するためのＲＥＸＥＲの反復。ＬｕｘＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅはｌｕｘオペロンの５つの遺伝子であり（図１）、ｈｐｈはハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。ｅ．ＲＥＸＥＲを繰り返した細胞の表現型の追跡。親細胞株（ゲノムｗｔ）、１回目のＲＥＸＥＲからの２個の独立したクローン（クローンＡ及びＢ）並びに２回目のＲＥＸＥＲからの２個の独立したクローン（クローンＣ及びＤ）を、異なるマーカーの組み合わせの表現型を調べるために指示した抗生物質又はスクロースを補給したＬＢ寒天上に播種した。２回目のＲＥＸＥＲからのクローン（クローンＣ及びＤ）は、１回目のＲＥＸＥＲ（クローンＡ及びＢ）からの発光表現型を保持し、ｈｐｈ遺伝子によって付与されたハイグロマイシンＢ耐性の新たな表現型を獲得ていた。ｆ．ＲＥＸＥＲを繰り返した細胞の遺伝子型の追跡。１回目及び２回目のＲＥＸＥＲで導入されたゲノム成分それぞれに特異的であるか、又は隣接するプライマーを使用して、（ｅ）からの５つのクローン全てについてコロニーＰＣＲを実施した。
【図１０】（補足図３）相互作用するタンパク質を発現する必須遺伝子が豊富な大腸菌ゲノムのオペロンにおける体系立てられ規定された同義コドン再割当の設計を示した図である。ａ．大腸菌のセリン、ロイシン及びアラニン解読ボックスのコドン−アンチコドン相互作用、並びに同義のコドン再割当のための書き換えスキーム（ｒ．ｓ）。線は、コドン−アンチコドン相互作用を示す。灰色の線は標的領域において同義書き換えによって除去された解読事象を示す。除去のために標的化したコドンは灰色で示し（濃い灰色は除去前であり、薄い灰色は除去後である）、それらの置換はピンクで示す。矢印は、ｃＡｉ、ｔＡｉ又はｔ．Ｅによって測定したとき、最も合致した置換によって除去するために標的化されたコドンと結びつく。ゲノム全体へのこれらの書き換えスキームの１つの適用は、対応するアンチコドンが冗長なｔＲＮＡを形成する標的化コドンを、大腸菌ゲノムから完全に除去するのを可能にする。書き換えられたゲノム中においてこれらの冗長なｔＲＮＡを削除すると標的化コドンの天然の解読が排除され、その後非天然アミノ酸をきれいにコードするように規定し直すことができる。ｂ．標的コドン及び必須遺伝子の豊富な標的オペロンの同定。同義書き換えスキームを試験するために最良の候補領域を同定するために、多数の必須遺伝子及び書き換えのために標的化された多数のコドンを含有する領域に注目した。必須及び非必須遺伝子は、ＫＥＩＯノックアウトコレクションにおけるそれらの対応する非存在及び存在に基づいて同定した。必須遺伝子を黒色で、非必須遺伝子を白色で、全ての遺伝子の位置をＭＤＳ４２ゲノム上にマッピングした。ＭＤＳ４２ゲノムの１０ｋｂスライディングウィンドウ内の全必須遺伝子における標的化セリン、ロイシン、又はアラニンコドンの数は、ウィンドウを１００ｎｔだけ反復的にシフトし、ＭＤＳ４２ゲノム配列の最初の１０ｋｂから末端までコドン計数を実施することによって計数した。細胞分裂オペロンに対応するｍｒａＺからｆｔｓＺの領域（赤色で着色）は、全標的化コドン（セリンコドンＴＣＧ及びＴＣＡ、ロイシンコドンＴＴＧ及びＴＴＡ、又はアラニンコドンＧＣＧ及びＧＣＡ）のためのＭＤＳ４２ゲノムの最高スコア２０ｋｂ領域として同定した。ｃ．選んだｍｒａＺからｆｔｓＺの領域における標的化コドンの位置及び密度。上流の重複するオープンリーディングフレームの書き換えが下流のオープンリーディングフレームの書き換えに影響を及ぼすのを防ぐために、５つの重複するオープンリーディングフレーム配列を複製し（Chan, L. Y., Kosuri, S. & Endy, D. Refactoring bacteriophage T7. Molecular Systems Biology 1, 2005.0018-E10 (2005)）、複製領域（ｄ．ｒ．）１〜５を作製することによって、ｍｒａＺからｆｔｓＺの領域（８９０６２〜１０６５０７まで）をリファクタリングした。次に、各書き換えスキームによって規定され体系立てられた書き換えによって、リファクタリングした領域を新規合成した。全標的化センスコドン（赤で着色、８２セリンＴＣＣ及びＴＣＡコドン、１５６ロイシンＴＴＧ及びＴＴＡコドン、並びに３７３アラニンＧＣＧ及びＧＣＡコドン）の位置、領域中の唯一のＴＡＧアンバー終止コドン（ｍｕｒＦの終止コドン、ＴＡＡへの再割当のために標的化し、赤で着色）並びにｄ．ｒ．１〜５（赤の輪郭でピンク色で着色）は、ｍｒａＺからｆｔｓＺの領域（背景色灰色）にマッピングする。
【図１１】（補足図４）ＲＥＸＥＲが、相互作用するタンパク質を発現する必須遺伝子が豊富な大腸菌ゲノムのオペロンにおける体系立てられ規定された同義コドン再割当の試験を可能にすることを示した図である。ａ．必須のｍｒａＺからｆｔｓＺの領域を新規設計し合成した配列と置換するためのＲＥＸＥＲの使用。体系的に書き換えられたｍｒａＺからｆｔｓＺの領域の配列は、ＲＥＸＥＲ設計に従って、第２の二重選択カセット（−２はｓａｃＢであり、＋２はＣｍＲである）を用いて新規に設計して合成し、ＢＡＣで運んだ。最初の二重選択カセット（−１はｒｐｓＬであり、＋１はＫａｎＲである）をｍｒａＺの大腸菌染色体コピーと上流のｃｒａとの間に挿入した。ＲＥＸＥＲを実施し、＋２の獲得（クロラムフェニコールに対する耐性の獲得）及び−１の喪失（ストレプトマイシンに対する感受性の喪失）について同時に選択することによって、同時の、ＨＲ１とＨＲ２との間の合成配列の獲得及び元のゲノム配列の喪失についてクローンを選択した。ｂ．セリンｒ．ｓ．１からのＲＥＸＥＲ後の１６クローンの個々の書き換えランドスケープ。セリンｒ．ｓ．１（ＴＣＧ及びＴＣＡからＡＧＴ）からのＲＥＸＥＲ後の１６クローンのＨＲ１とＨＲ２との間のゲノム領域を完全に配列決定した。１６クローン全てがＨＲ１とｍｒａＺの間の第1の二重選択カセットを喪失し、ｆｔｓＺとＨＲ２の間の第２の二重選択カセットを獲得しており、５’及び３’末端の両方での１００％置換を示している。全クローンは、野生型配列と書き換えられた配列とのキメラであった。各クローンについて、８３個の企図した書き換え位置及びｄ．ｒ．１〜５の各々におけるコドンは、２進数の値が１であり赤で着色されている書き換えか、又は値が０で黒で着色されている野生型のいずれかに規定された。書き換えされ、リファクタリングされたｍｒａＺからｆｔｓＺの領域全体が野生型のままである標的化位置の分布は、個々のクローンについての「書き換えランドスケープ」をもたらす。ｃ．セリンｒ．ｓ．１の集約した書き換えランドスケープ。セリンｒ．ｓ１のＲＥＸＥＲ後のクローンの個々の書き換えランドスケープを組み合わせて、全領域にわたって各標的位置で書き換えされているクローンの画分を計数することによって、セリンｒ．ｓ．１の集約した書き換えランドスケープを作成した。所与の位置での書き換え画分が０より大きいとき（赤で着色）、この位置には書き換えされている配列決定したクローンが少なくとも１つあることを示す。書き換え画分が０のとき（黒で着色）、野生型コドンが常に残存し、書き換えられたコドンがこれらの位置で受け入れられないことを示す。セリンｒ．ｓ．１を使用して全標的化コドン位置について完全に書き換えられたクローンは１つもなかった。集約された書き換えランドスケープによって、野生型配列が常に維持される単一の位置、ｆｔｓＡのコドン４０７が明らかにされた。
【図１２】（補足図５）標的化したセリン、ロイシン及びアラニンコドンの集約された書き換えランドスケープが、規定され体系立てられた同義書き換えスキームの生存率における劇的な違いを明らかにすることを示した図である。ａ．標的化したセリンコドンの書き換えランドスケープ。ｒ．ｓ．１〜３によって再割当された標的化したセリンコドンの書き換えランドスケープは、１６個の個々のクローンのｍｒａＺからｆｔｓＺの領域の完全な配列決定に基づいて計算されている。セリンｒ．ｓ．１（ｃＡｉに基づく）は完全に書き換えられたクローンを生じず、野生型配列が維持される単一の位置、ｆｔｓＡのコドン４０７を明らかにした。セリンｒ．ｓ．２（ｔＡｉに基づく）及びｒ．ｓ．３（ｔ．Ｅに基づく）はいずれも生じた１６個のクローンのうち１４個（８８％）が完全に書き換えられた。ｂ．標的化したロイシンコドンの書き換えランドスケープ。ロイシンｒ．ｓ．４（ｃＡｉに基づく）、ｒ．ｓ．５（ｔＡｉに基づく）及びｒ．ｓ．６（ｔ．Ｅに基づく）は全て、完全に書き換えられたクローンを生じなかった。ロイシンｒ．ｓ．４及びｒ．ｓ．５はいずれも野生型配列が維持される長い鎖を有するが、ｒ．ｓ．６は、ｄ．ｒ．５及び下流の２つの標的化したコドン位置を包含する比較的短い書き換えの不十分な鎖を有する。ｃ．標的化したアラニンコドンの書き換えランドスケープ。アラニンｒ．ｓ．７（ｃＡｉに基づく）からの１６個のクローンのうちの１２個（７５％）は、２０ｋｂ領域の３７４個の位置全てにおいて完全に書き換えられた。しかし、アラニンｒ．ｓ．８（ｔＡｉ及びｔ．Ｅの両方と一致する）は大失敗で、完全に書き換えられたクローンは１つもなく、書き換えが不十分な鎖は最長であった。
【図１３】（補足図６）規定され体系立てられた同義書き換えにおける有害な配列の同定及び修正を示した図である。ａ．野生型ゲノムバックグラウンドにおけるｆｔｓＡの書き換えコドン４０７。ｆｔｓＡコドン位置４０７の野生型コドンは、セリンコドンＴＣＧであり、これは、セリンｒ．ｓ．１からのＲＥＸＥＲ後の１６クローン全てにおいて不変のままであった（ＴＣＧ及びＴＣＡからＡＧＴ）。ｆｔｓＡ４０７をＴＣＧからＡＧＴに変化させる試みも野生型バックグラウンドで失敗したが、ＴＣＧからＴＣＴへの書き換えは、２０個の特徴付けられたＲＥＸＥＲ後のクローン全てで動作した（１００％）。ｂ．有害なｆｔｓＡ４０７ＡＧＴをＡＧＣに修正すると、セリンｒ．ｓ．１が復活した。ｆｔｓＡ４０７をＡＧＴとして有するセリンｒ．ｓ．１の集約された書き換えランドスケープを赤でプロットしたところ、野生型配列が維持された単一の位置、ｆｔｓＡのコドン４０７が明らかになった。ｆｔｓＡ４０７ＡＧＴをＡＧＣに変化させたセリンｒ．ｓ．１の集約された書き換えランドスケープ（セリンｒ．ｓ．２及びｒ．ｓ．３におけるように）をオレンジ色でプロットしたところ、ｆｔｓＡ４０７ＡＧＴの悪影響は克服されている。ｃ．セリンｒ．ｓ．１バックグラウンドにおいてｆｔｓＡ４０７ＡＧＴをＡＧＣに変化させると、この特定の位置での書き換えが０％から１００％に劇的に改善した。ｄ．セリンｒ．ｓ．１バックグラウンドにおいてｆｔｓＡ４０７ＡＧＴをＡＧＣに変化させると、２０ｋｂ領域全体にわたって完全に書き換えられたクローンの画分が０％から９４％（１６クローンのうち１５）に劇的に改善した。ｅ．ｆｔｓＡ４０７ＡＧＣを有する修正されたセリンｒ．ｓ．１は、測定可能な増殖不良を有さないクローンを生じた。ｆｔｓＡ４０７ＡＧＣを有するセリンｒ．ｓ．１、セリンｒ．ｓ．２、セリンｒ．ｓ．３、及びアラニンｒ．ｓ．７から完全に書き換えられたクローンの倍加時間を測定し、同じゲノム遺伝子座に第２の二重選択カセットが組み込まれた野生型ＭＤＳ４２大腸菌対照と比較して、測定可能な増殖不良がないことを示す。
【図１４】（拡張データ図６）ゲノム段階の交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ）を示した図である。１ステップの産物を次のステップの直接鋳型として使用することによって、１回のＲＥＸＥＲで１００ｋｂのゲノムを合成ＤＮＡと置換する能力及びＲＥＸＥＲを反復する能力は、ゲノム段階の交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ）及び約４０ステップでの大腸菌ゲノム全体と合成ＤＮＡとの置換を可能にする。
【図１５】（拡張データ図７）相互作用する必須遺伝子の２０ｋｂにわたる規定された同義コドンによる除去及び体系的置換のために、この研究において標的化されたコドンを示す。ａ．コドン及びアンチコドンは大腸菌ゲノム中で相互作用する。２８個のセンスコドンはアンバー終止コドンに沿って灰色で強調されている。その他のセンスコドンではなく、これらのセンスコドンのゲノム全体の除去は、ゲノムに残存する１又は２以上のセンスコドンを解読する能力を除去することなく、それらのコグネイトｔＲＮＡ全ての削除を可能にする。これは、センスコドンを非天然のモノマーに再割当するために必要であるが、十分ではない。セリン、ロイシン及びアラニンのアミノ酸のための内在性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素はコグネイトｔＲＮＡのアンチコドンを認識しないので、セリン、ロイシン及びアラニンコドンボックスを強調する。これは、内在性合成酵素による誤ったアミノアシル化を導かないコグネイトアンチコドンを担持するｔＲＮＡを導入することによって、これらのボックス内のコドンの新しいアミノ酸への割当を容易にし得る。これらの考察によって、再割当のためにセリン、ロイシン及びアラニンコドンに注目した。ＭＤＳ４２ゲノム（ジェンバンク受託番号ＡＰ０１２３０６）における全６４トリプレットコドンの総コドン数、ワトソン−クリック塩基対形成及びゆらぎの両方による公知のコドン−アンチコドン相互作用全て、ｔＲＮＡアンチコドンの塩基修飾、ｔＲＮＡ遺伝子、並びにインビボで測定されたｔＲＮＡ相対存在量が報告されている。この分析によって、セリン、ロイシン、及びアラニン群（セリンコドンＴＣＧ、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ；ロイシンコドンＣＴＧ、ＣＴＡ、ＴＴＧ、ＴＴＡ；及びアラニンコドンＧＣＧ、ＧＣＡ）から１０個のコドンを同定し、コドン−アンチコドン相互作用及びコドン再割当のためのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素認識基準の両方を満たす。ｂ．４つのセリンコドン（ＴＣＧ、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ）は、規定された書き換えスキームに従ってそれらを代替セリン同義コドンに書き換えることによって、ゲノム全体を除去するために３つの異なる組み合わせで選択される。それらのゲノム全体を除去した後、一致するｔＲＮＡ全て（同じく灰色で強調表示されている）は、書き換えゲノムを有する新規に設計され合成された大腸菌において冗長になり、したがって削除され得る。一致するｔＲＮＡを削除した後、これらの標的化したコドンを認識してコードするための内在性成分はもう存在しなくなり、その後これらの標的化したコドンは再導入されて、ｕ．ａ．ａ．をきれいにコードするように再割当することができる。ｃ．４つのロイシンコドン（ＣＴＧ、ＣＴＡ、ＴＴＧ、ＴＴＡ）は、（ｂ）で４つのセリンを標的化したコドンについて論じたのと同じ論理に従って、規定された書き換えスキームを使用してそれらを代替ロイシン同義コドンに書き換えることによって、ゲノム全体を除去するために３つの異なる組み合わせで選択される。ｄ．２つのアラニンコドン（ＧＣＧ、ＧＣＡ）は、（ｂ）で４つのセリンを標的化したコドン及び（ｃ）で４つのロイシンを標的化したコドンについて論じたのと同じ論理に従って、規定された書き換えスキームを使用してそれらを代替アラニン同義コドンに書き換えることによってゲノム全体を除去するために選択される。
【図１６】（拡張データ図８）体系的に適用された明確に規定された書き換えスキームそれぞれを用いて、ＲＥＸＥＲによって生成された２０ｋｂの多数の個々の書き換えランドスケープからの集約された書き換えランドスケープの作成を示す。異なる書き換えスキームからの１６個の完全に配列決定されたクローンの個々の書き換えランドスケープは図３ｂで記載したように得られ、図３ｃで記載したような集約した書き換えスキームに集約された。パネル（ａ）は、ｒ．ｓ．２からのデータ、（ｂ）はｒ．ｓ．３からのデータ、（ｃ）はｒ．ｓ．４からのデータ、（ｄ）はｒ．ｓ．５からのデータ、（ｅ）はｒ．ｓ．６からのデータ、（ｆ）はｒ．ｓ．７からのデータ、（ｇ）はｒ．ｓ．８からのデータ及び（ｈ）はＡＧＴからＡＧＣに変化させたｆｔｓＡコドン４０７（オレンジ色で強調表示）を有するｒ．ｓ．１からのデータを反映する。
【図１７】（拡張データ図９）合成ＤＮＡの短い有害な配列を修正するために、ＲＥＸＥＲを一本鎖ＤＮＡリコンビニアリングと組み合わせることができることを示す。ａ．合成配列内の短い有害な鎖を修正するために、ＲＥＸＥＲと組み合わせて一本鎖ＤＮＡリコンビニアリングを使用する。合成配列のｆｔｓＡコドン位置４０７におけるＡＧＴの有害な配列を受け入れられる配列ＡＧＣに変化させるために、全長９０ｎｔの一本鎖オリゴを設計し合成した。オリゴ配列は、中央に位置する（ｎｔ５’末端から４５番目）単一ヌクレオチド変化を伴うフォワード鎖に結合するために、合成配列の逆向き鎖をベースにして設計された。オリゴの５’末端の最後の２つのヌクレオチドは、オリゴを非特異的なエキソヌクレアーゼ分解から保護するためにホスホロチオエート骨格で置換した。ＲＥＸＥＲ実験中にオリゴ０．２ｎｍｏｌを大腸菌に共形質転換し、通常のＲＥＸＥＲ手法をいかなる変更も加えずに実施した。ｂ．ＲＥＸＥＲ＋ｓｓＤＮＡリコンビニアリングによる合成ＤＮＡの短い有害配列の修正。ＲＥＸＥＲ二重選択プレートからの１６クローンを無作為に採取し、ｆｔｓＡコドン位置４０７における野生型配列（ＴＣＧ）又は修正された配列（ＡＧＣ）のいずれかに特異的なプライマーを使用して、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子型決定を行った。ｆｔｓＡコドン位置４０７（ＴＣＧ）の野生型配列に特異的なプライマーは、野生型ゲノム鋳型用に４３７ｂｐのＰＣＲ産物のみを生じ、野生型配列ＴＣＧがこのゲノム遺伝子座の修正された配列ＡＧＣに変化した場合、ＰＣＲ産物を生じない。ｆｔｓＡコドン位置４０７で修正された配列（ＡＧＣ）に特異的なプライマーは、修正されたゲノム鋳型用に３８５ｂｐのＰＣＲ産物のみを生じ、野生型配列ＴＣＧがこのゲノム遺伝子座上に残存する場合、ＰＣＲ産物を生じない。ＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒ／ｒＫを野生型対照として使用し、ｆｔｓＡ４０７ＡＧＣが検証されたセリンｒ．ｓ．３から完全に書き換えられたクローンを陽性対照として使用した。ｆｔｓＡコドン位置４０７でのＳＮＰ遺伝子型同定によって、修正された配列ＡＧＣで試験した全部で１６個のクローンの中から１個のクローン（クローン１２、オレンジで強調表示）が同定され、次いでこれを全２０ｋｂ書き換え領域にわたって完全に配列決定し、８３個の標的コドン位置全ておける完全な書き換えが確認された。全ＰＣＲ産物を、QIAxcel DNA Screening Kitを使用してＱＸアラインメントマーカー１５ｂｐ／５ｋｂ及びＱＸサイズマーカー２５０〜４０００ｂｐを用いてQIAGEN QIAxcel Advanced機で分析した。
【図１８】組換え及び選択スキームを示した図である。  拡張データ表１は、コドン最適化指数（ｃＡｉ）、ｔＲＮ最適化指数（ｔＡｉ）、及び翻訳効率（ｔ．Ｅ）による書き換え規則の定義を示す。コドン最適化指数（ｃＡｉ）、ｔＲＮＡ最適化指数（ｔＡｉ）、又はコドン存在量と測定したｔＲＮＡ濃度を組み合わせ、翻訳効率（ｔ．Ｅ）（方法参照）を推定する第３の測定基準のいずれかによって判断して、標的コドンの最も近い一致を同定することによって、標的セリンコドンの最良の同義置換を規定した（方法を参照のこと）。この表では、３つのコーディング測定基準を使用して、ＴＣＡＳｅｒとＴＣＧＳｅｒ（灰色）の同義語書き換えに最も近い置換（ピンク色）を割り当てる。太字の数は、所与のコーディング測定基準における最も一致する置換の値である。［実施例］
【０１５３】
方法
Ausubel et al(Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology by Frederick M. Ausubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston, David D. Moore (Editor) Published by John Wiley & Sons ISBN: 047132938X)及び／又はGreen and Sambrook(2012 Molecular Cloning - A Laboratory Manual by Michael R Green and Joseph Sambrook Published by Cold Spring Harbour Laboratory Press ISBN: 978-1-1936113-42-2)で教示された技術などの一般的な分子生物学的技術を参考にする。
【０１５４】
選択カセット、細胞株、及びプラスミドの構築
２つの二重選択カセットを構築した。−１／＋１は、必須リボソームタンパク質Ｓ１２をコードし、ｒｐｓＬＫ４３Ｒゲノムバックグラウンドにおいてストレプトマイシンに対する感受性を付与する−１としての陰性選択マーカーｒｐｓＬと、カナマイシン耐性遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードする＋１としての陽性選択マーカーＫａｎＲとの融合物である。ｒｐｓＬ−ＫａｎＲカセットは、野生型ｒｐｓＬプロモーターからの構成的転写によって動かされる単一ｍＲＮＡからの２つの別々のタンパク質として発現させた。−２／＋２は、スクロースに対する感受性を付与する−２としての陰性選択マーカーｓａｃＢと、クロラムフェニコール耐性遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする＋２としての陽性選択マーカーＣｍＲとの融合物である。ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットは、ＥＭ７プロモーターからの構成的転写によって動かされる単一ｍＲＮＡからの２つの別々のタンパク質として発現させる。両選択カセットは新規に合成される。
【０１５５】
最小限ゲノムの大腸菌株ＭＤＳ４２を開始株として使用した（Posfai, G. et al. Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli. Science 312, 1044-1046 (2006)）。古典的組換え及びストレプトマイシン耐性についての選択によって、ＭＤＳ４２のｒｐｓＬ遺伝子にＫ４３Ｒ変異を導入してＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒを作製した。得られたＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒは、さらにｒｐｓＬの野生型コピーが存在していなくてもストレプトマイシンに対して耐性であり、さらに野生型ｒｐｓＬのコピーが存在するとストレプトマイシンに対して感受性である。次いで、−１／＋１カセットｒｐｓＬ−ＫａｎＲをＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒゲノムの８９０６１〜８９５８７の間に挿入して古典的組換えによってＭＤＳ４２ｒＫを作製し、ゲノム位置８９０６１及び８９５８７に隣接するプライマーを使用したコロニーＰＣＲにより確認する。
【０１５６】
Gibson Assemblyを使用して、多数のＰＣＲ断片を組み立てることによってpCDFtet_pAraRedCas9_tracrRNAを構築した。プラスミド骨格及び複製開始点は、pCDFDuet-1プラスミド（Addgene社製）由来で、スペクチノマイシン耐性マーカーはpBR322プラスミドからのテトラサイクリン耐性マーカー（New England BioLab社製）と置換する。ａｒａＣ遺伝子、アラビノースプロモーター（ｐＡｒａ）及びラムダレッド（アルファ／ベータ／ガンマ）遺伝子を（GeneBridge社製）pRed/ETプラスミドでＰＣＲ増幅する。Ｃａｓ９のオープンリーディングフレームは、pCas9プラスミド（Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)）でＰＣＲ増幅し、ラムダレッドアルファの下流に配置し、したがって、ラムダレッドガンマ、ラムダレッドベータ、ラムダレッドアルファ及びＣａｓ９はアラビノースの存在下でｐＡｒａによって動かされる単一ｍＲＮＡからの４つの個々のタンパク質として発現させる。内在性プロモーターを備えたｔｒａｃｒＲＮＡは、pCas9プラスミドからＰＣＲ増幅され（Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)）、ａｒａＣ遺伝子の下流に同じ向きで配置される。完成したpCDFtet_pAraRedCas9_tracrRNAプラスミドを配列決定によって検証した。pCDFtet_pAraRed(Δβ)Cas9_tracrRNAは、ラムダレッドベータオープンリーディングフレームの３１４番目と３１５番目のヌクレオチドの間にＧＴＡＣを挿入することによってpCDFtet_pAraRedCas9_tracrRNAから得られ、翻訳におけるフレームシフト、したがってラムダレッドベータの不活性化を引き起こす。
【０１５７】
ｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサー０は、Gibson Assembly Master Mix（New England BioLab社製）を使用して２つのＰＣＲ断片を組み立てることによって構築した。ｐＭＢ１複製開始点及びアンピシリン耐性マーカーをpBR322プラスミド（New England BioLab社製）からＰＣＲ増幅した。BamHIとEcoRIとの間に機能的スペーサーＲＮＡを含まないＣＲＩＳＰＲアレイ（したがって命名０）をｐＣＲＩＳＰＲからＰＣＲ増幅した（Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)）。完成したｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサー０を配列決定によって検証した。間隔をあけてダイレクトリピートを有するＫＡＩＳＥＲ２又はＫＡＩＳＥＲ４それぞれを対象とするための２つ又は４つの異なるスペーサーＲＮＡ配列を有するＣＲＩＳＰＲアレイを合成ＤＮＡとして商業的に注文し、ｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサー０にクローニングしてBamHIとEcoRIとの間に空のＣＲＩＳＰＲアレイを置換して、異なる機能のｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサー×２又はｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサー×４プラスミドを作製した。最終ｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサープラスミドは、サンガー配列決定によって検証された配列であった。ｐＭＢ１ａｍｐ＿スペーサー中のアンピシリン耐性マーカーをエリスロマイシン耐性マーカーと置換して、ｐＭＢ１ｅｒｍ＿スペーサープラスミドの関連型を調製した。
【０１５８】
合成ＤＮＡを保有するＢＡＣは、多数の断片を組み立てることによって構築した。ＢＡＣ骨格は、二重選択カセット−２／＋２及び陰性選択マーカー−１を付加したヌクレオチド１５４２〜７０４１のpBeloBAC11（New England BioLab社製）をベースにしており、Gibson Assembly Master Mix（New England BioLab社製）を使用して組み立てる。代替の配置は、−２と連結した−１／＋１を利用する。長い合成ＤＮＡ（２０ｋｂ以上）を保有するためのＢＡＣ骨格はまた、Ｓ．セレビシエ中での組み立て、選択及び増幅のために、サッカロマイセス・セレビシエ複製セントロメアＣＥＮ及び選択マーカーＵＲＡ３（Ｓ．セレビシエベクターpRS316由来）が組み込まれている。合成ＤＮＡには常にＡｖｒII部位が隣接しており、ＰＡＭ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用のプロトスペーサーの一部としても機能し、ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４における合成ＤＮＡの切除を誘導する。
【０１５９】
Gibson Assemblyを使用した短い合成ＤＮＡのＢＡＣへの組み立て
pBAC_HR(89061)-sC-HR(89587)_rは、Gibson Assemblyを使用して３つのＰＣＲ断片を組み立てることによって構築した：第１の断片は、ＨＲ１（８９０１２〜８９０６１、番号付けは全てＭＧ１６５５参照配列に由来する）及びＨＲ２（８９５８７〜８９６３６）に隣接し、さらに２つのＡｖｒII部位が隣接した２．２ｋｂ長−２／＋２ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットで、第２の断片はｒｒｎＣターミネーターを有する−１ｒｐｓＬ遺伝子であり、第３の断片はヌクレオチド１５４２〜７０４１のｐBeloBAC11骨格である。組み立てに成功したpBAC_HR(89061)-sC-HR(89587)_rを、クロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上で選択し、配列をサンガー配列決定により検証した。ｐBAC_HR(89061)-rK-HR(89587)_sは、ＨＲ１（８９０１２〜８９０６１）及びＨＲ２（８９５８７〜８９６３６）に隣接し、さらに２つのＡｖｒII部位が隣接する−１／＋１ｒｐｓＬ−ＫａｎＲカセット、ｒｒｎＣターミネーターを有する−２ｓａｃＢ遺伝子、並びにpBeloBAC11骨格を使用して同様の方法で構築した。pBAC_HR(89061)-T5Lux-sC-HR(89587)_rは、pBAC_HR(89061)-sC-HR(89587)_r中のＨＲ１と−２／＋２ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットとの間に人工ｌｕｘオペロンのＰＣＲ産物を挿入することによって構築した。人工ｌｕｘオペロン及び−２／＋２ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットの全長は約９ｋｂである。
【０１６０】
Ｓ．セレビシエにおける組換えを使用した長い合成ＤＮＡのＢＡＣへの組み立て
長い合成ＤＮＡ断片（≧２０ｋｂ）は、Ｓ．セレビシエにおけるインビボでの組換えによって組み立てた。pBeloBAC11骨格は、Ｓ．セレビシエ複製セントロメアＣＥＮ及びＵＲＡ３選択マーカー（Addgene社製のＳ．セレビシエベクターpRS316由来）を導入することによって、ＢＡＣ／ＹＡＣシャトルベクターに変換した。長い合成ＤＮＡを保有するＢＡＣ／ＹＡＣシャトルベクターは、Ｓ．セレビシエにおけるインビボでの組換えによって５〜１６個のＤＮＡ断片から組み立てた（Kouprina, N., Noskov, V. N. & Larionov, V. Selective isolation of large chromosomal regions by transformation-associated recombination cloning for structural and functional analysis of mammalian genomes. Methods Mol. Biol. 349, 85-101 (2006)）。ＤＮＡ断片は、組換えのために３８〜４５ｂｐだけ互いに重複するように設計され、断片はＰＣＲ又は制限消化によって生成される。ウラシル栄養要求性Ｓ．セレビシエ（ＢＹ４７４１株）細胞をザイモリエイスで消化して、高度にコンピテントなスフェロプラストを得て、各ＤＮＡ断片６０ｆｍｏｌで形質転換した。細胞は、ウラシルを含まない寒天で３０℃で３日間回復させ、その後コロニーＰＣＲによって遺伝子型同定した。正しく組み立てられたＢＡＣ／ＹＡＣを含むクローンはウラシルを含まない培地で増殖し、コンストラクトをザイモリエイス及びＳＤＳで処理し、続いてイソプロパノールで沈殿させることによって抽出した（Kouprina, N., Noskov, V. N. & Larionov, V. Selective isolation of large chromosomal regions by transformation-associated recombination cloning for structural and functional analysis of mammalian genomes. Methods Mol. Biol. 349, 85-101 (2006)）。
【０１６１】
２０ｋｂゲノムの書き換えのためのpBAC_HR(89061)-20kb-sC-HR(106508)_rを５つの断片：ＵＲＡ３−ｐＢＡＣ−ＨＲ１（８９０６１）の７ｋｂのＰＣＲ断片、ｓａｃＢ−ＣｍＲ−ＨＲ２（１０６５０８）−ｒｐｓＬ−ＣＥＮの３．７ｋｂのＰＣＲ断片、並びにＴＣＡＳｅｒ、ＴＣＧＳｅｒ及びＴＡＧアンバー全てが同義に書き換えされているＭＤＳ４２ゲノム領域８９０６２〜１９２７４３に対応する２０ｋｂの書き換えられた配列を構成する合成ＤＮＡの３つのＡｖｒII消化断片（２〜９ｋｂ）から組み立てた。全部で８３コドン及び２４７ｎｔを各２０ｋｂ合成配列において書き換えた。５つの断片は全て、Ｓ．セレビシエにおける組換えのために互いに３８ｂｐが重複するように設計した。
【０１６２】
９０ｋｂ挿入のためのpBAC_HR(89061)-90kb/Lux-sC-HR(89587)_rを１３個の断片：ＵＲＡ３−ｐＢＡＣ−ＨＲ１の７ｋｂＰＣＲ断片（８９，０６１）、ｓａｃＢ−ＣｍＲ−ＨＲ２（１０６５０８）−ｒｐｓＬ−ＣＥＮの３．７ｋｂＰＣＲ断片、及び大腸菌ＤＨ１０ｂゲノムＤＮＡの８個の１０ｋｂＰＣＲ断片（１３９８２５１〜１４８０２３０）及びｌｕｘオペロンから上記のように組み立てた。
【０１６３】
１００ｋｂゲノム置換のためのpBAC_HR(89061)-100kb/Lux-sC-HR(192744)_rは、１７断片：ＵＲＡ３−ｐＢＡＣ−ＨＲ１（８９０６１）の７ｋｂＰＣＲ断片、ｓａｃＢ−ＣｍＲ−ＨＲ２（１０６，５０８）−ｒｐｓＬ−ＣＥＮの３．７ｋｂＰＣＲ断片、大腸菌ＭＤＳ４２ゲノムＤＮＡ（８９０６２〜１９２７４３）の１０個の１０ｋｂＰＣＲ断片及び組換えのために４５ｂｐ重複によって隣接したｌｕｘＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ遺伝子の５個のＰＣＲ断片から上記のように組み立てた。
【０１６４】
古典的組換え及びＤＯＳＥＲプロトコル
ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットは、５’末端に対応してＨＲ１及びＨＲ２が結合したプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。精製した直鎖状ｄｓＤＮＡは、中央にｓａｃＢ−ＣｍＲカセットを有し、各末端にＨＲ１及びＨＲ２が隣接している。
【０１６５】
古典的組換えでは、ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットを保有するこの直鎖状ｄｓＤＮＡ３μｇを、pRed/ETプラスミドで予め形質転換し、λレッド成分を発現するように誘導されたエレクトロコンピテントＭＤＳ４２ｒＫ細胞１００μｌに形質転換した。細胞はＳＯＢ培地４ｍｌ中で３７℃で１時間回復させ、その後ＬＢ１００ｍｌで希釈し、震盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。次に、培養物を遠心し、ＬＢ４ｍｌに再懸濁し、クロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天の選択プレートに系列希釈して広げた。
【０１６６】
ＤＯＳＥＲでは、ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットを保有する同じ直鎖状ｄｓＤＮＡ３μｇを、pRed/ETプラスミドで予め形質転換し、λレッド成分を発現するように誘導されたエレクトロコンピテントＭＤＳ４２ｒＫ細胞１００μｌに形質転換した。細胞はＳＯＢ培地４ｍｌ中で３７℃で１時間回復させ、その後ＬＢ１００ｍｌで希釈し、震盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。次に、培養物を遠心し、ＬＢ４ｍｌに再懸濁し、クロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天の選択プレートに系列希釈して広げた。
【０１６７】
古典的組換え及びＤＯＳＥＲによる多数のコロニーを、ゲノム遺伝子座８９０６１〜８９５８７に隣接するプライマー対（ｃｒａｆ及びｍｒａＺｒ）を使用してコロニー−ＰＣＲのために採取した。古典的組換えによる８個のコロニーのうち４個は、この規定したゲノム遺伝子座におけるゲノムｒｐｓＬ−ＫａｎＲとｓａｃＢ−ＣｍＲとの置換に対応するより高いバンドを示し、その他の４個はこの遺伝子座におけるゲノムｒｐｓＬ−ＫａｎＲに対応するＰＣＲバンドを示した。ＤＯＳＥＲによる８コロニーは全て、この遺伝子座においてｒｐｓＬ−ＫａｎＲを置換するゲノムｓａｃＢ−ＣｍＲに対応するＰＣＲバンドを示した。ＭＤＳ４２ｒＫ、ＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒ、及び再懸濁コロニーを含まないＭｉｌｌｉ−Ｑ濾過水によるコロニーＰＣＲを対照として含めた。ＰＣＲ産物は全て、NEB2-LogDNALadder（New England BioLab社製）と並行して実施した。コロニーＰＣＲ産物は全て、QIAGEN PCR精製カラムを使用して精製し、配列はサンガー配列決定によって検証した。
【０１６８】
ＫＡＩＳＥＲプロトコル
ＭＤＳ４２ｒＫ細胞をpCDFtet_pAraRedCas9_tracrRNA及びpBAC_HR(89061)-sC-HR(89587)_rで二重形質転換し、２％グルコース、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌを補給したＬＢ寒天プレート上に播種した。個々のコロニーを採取し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に接種し、振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。一晩培養物をテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地でＯＤ６００＝０．０５まで希釈し、ＯＤ６００が約０．３になるまで約３時間振盪しながら３７℃で増殖させた。アラビノース粉末を最終濃度０．５％に達するように培養物に添加し、培養物を振盪しながら３７℃でさらに１時間インキュベートした。ＯＤ６００約０．６で細胞を採取し、培養容量の１／５００でエレクトロコンピテントにした。
【０１６９】
pMB1amp_スペーサー×２又はpMB1amp_スペーサー×４プラスミドの３μｇを、pCDFtet_pAraRedCas9_tracrRNA及びpBAC_HR(89061)-ｓC-HR(89587)_rで予め誘導したＭＤＳ４２ｒＫ 細胞にエレクトロポレーションした。細胞はＳＯＢ培地４ｍｌで３７℃で１時間回復させ、その後アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを補給したＬＢ１００ｍｌで希釈し、震盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。培養物を遠心し、ＬＢ４ｍｌに再懸濁し、クロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天の選択プレートに系列希釈して広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、効率はプレート上の生存コロニーを計数することによって計算した。多数のコロニーを採取し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ濾過水に再懸濁し、ＬＢ寒天プレート又はクロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌを補給した、若しくはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを補給したＬＢ寒天プレート上に整列させた。ゲノム遺伝子座８９０６１〜８９５８７に隣接するプライマー対（ｃｒａｆ及びｍｒａＺｒ）を使用して再懸濁したコロニーからコロニーＰＣＲも実施した（図５（拡張データ図１ａ、ｂ））。
【０１７０】
ゲノム遺伝子座８９０６２〜８９５８６において−１／＋１ｒｐｓＬ−ＫａｎＲカセットを置換する−２／＋２ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットで得られたコロニーを、アンピシリンを含まないＬＢ中でインキュベートして、pMB1erm_スペーサー×２又はpMB1erm_スペーサー×４プラスミドを失わせた。得られた細胞をpCDFtet_pAraRedCas9_tracrRNA及びpBAC_HR(89061)-rK-HR(89587)_sで二重形質転換し、２％グルコース、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを補給したＬＢ寒天プレートで選択した。個々のコロニーを採取し、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００約０．３になるまで３７℃で増殖させた。アラビノース粉末を最終濃度０．５％になるまで培養物に添加し、培養物を振盪しながら３７℃でさらに１時間インキュベートした。細胞をＯＤ６００約０．６で採取し、培養容量の１／５００でエレクトロコンピテントにした。pMB1erm_スペーサー×２又はpMB1erm_スペーサー×４プラスミド３μｇを予め誘導した細胞にエレクトロポレーションした。細胞はＳＯＢ培地４ｍｌで３７℃で１時間回復させ、その後エリスロマイシン１００μｇ／ｍｌ及びテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを補給したＬＢ１００ｍｌで希釈し、震盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。培養物を遠心し、ＬＢ４ｍｌに再懸濁し、３％スクロース及びカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天の選択プレートに系列希釈して広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートして、プレート上の生存コロニーを計数することによって効率を計算した。多数のコロニーを採取し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ濾過水に再懸濁し、ＬＢ寒天プレート又はクロラムフェニコール１８μｇ／ｍｌ若しくはカナマイシン５０μｇ／ｍｌを補給したＬＢ寒天プレート上に整列させた。ゲノム遺伝子座８９０６１〜８９５８７に隣接するプライマー対（ｃｒａｆ及びｍｒａＺｒ）を使用して再懸濁コロニーからコロニーＰＣＲを実施した（図５（拡張データ図１ａ、ｃ））。ゲノムに組み込まれたＤＮＡにおいて陽性及び陰性選択マーカーを使用すると、１回のＫＡＩＳＥＲの結果を次回のＫＡＩＳＥＲの鋳型として作用させることができる（図５（拡張データ図１ａ））。これによって、ゲノム段階の交換合成（ＧＥＮＥＳＩＳ）と呼ばれる方法の少数のステップで反復性のゲノム変化及びゲノムの再合成が可能になると予測される（図５（拡張データ図１ｄ））。
【０１７１】
pMB1amp_スペーサー×２又はpMB1amp_スペーサー×４プラスミドが一致するpBAC_HR(89061)-T5Lux-sC-HR(89587)_r、pBAC_HR(89061)-90kb/Lux-sC-HR(89587)_r、pBAC_HR(89061)-100kb/Lux-sC-HR(192744)_r及びpBAC_HR(89061)-20kb-sC-HR(106508)_rを、同じプロトコルに従ってその他のＫＡＩＳＥＲ実験で使用した。ゲノム遺伝子座に隣接するプライマー対（ｃｒａｆ及びｍｒａＺｒ）を使用して、ゲノム遺伝子座８９０６１〜８９５８７に挿入されたｌｕｘオペロン及び連結した−２／＋２ｓａｃＢ−ＣｍＲカセットのコロニーＰＣＲは、挿入成功による９ｋｂのバンド及びＭＤＳ４２ｒＫ対照の１．５ｋｂのバンドを生成した。挿入又は置換された領域全体に隣接するコロニーＰＣＲは、９０ｋｂの挿入又は１００ｋｂの置換については実施することができない。代わりに、挿入／置換されたＤＮＡの５’又は３’末端に隣接するプライマー対を使用すると、正しい挿入／置換のＰＣＲバンドが生成し、ＭＤＳ４２ｒＫ対照ではバンドは生成されないか又は間違ったサイズのバンドが生成する。内部透かしのプライマーを使用したコロニーＰＣＲも実施し、挿入／置換した合成ＤＮＡの完全性を検証した。２０ｋｂの書き換え領域（８９０６２〜１０６５０７）は、QIAGEN DNeasyBlood&Tissue Kit及び全領域に隣接するプライマー対（ｃｒａｆ及びｌｐｘＣｒ）を使用して精製ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。２０ｋｂのＰＣＲ産物は、Bio-Rad PCR Kleenカラムを使用して精製し、サンガー配列決定によって完全に配列決定した。
【０１７２】
２０ｋｂ書き換え領域の選択
同義書き換えスキームを試験するために最良の候補領域を同定するために、多数の必須遺伝子、並びに書き換えのために標的化された多数のコドン、特にＴＣＡＳｅｒ及びＴＣＧＳｅｒ及びＴＡＧアンバーを含有する領域に注目した。スライディングウィンドウアプローチを適用し、ＭＤＳ４２ゲノムの１０キロベース領域内の全必須遺伝子内の標的コドンの数を計数した。ゲノム配列の最初の１０ｋｂから開始して、ウィンドウを１００ｎｔずつ反復シフトし、ＭＤＳ４２ゲノム配列の末端までコドン分析を実施した。ＫＥＩＯコレクションにおける非存在によって遺伝子必須性を規定し、大腸菌における非必須遺伝子を個々に同定する（Baba, T. et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology 2, 2006.0008-11 (2006)）。
【０１７３】
書き換え規則の選択
タンパク質翻訳に与える影響が最小限の同義変異を同定する目的で、標的コドンＴＣＡＳｅｒ及びＴＣＧＳｅｒの翻訳効率を分析した。したがって、コドン最適化係数（ｃＡｉ）（Sharp, P. M. & Li, W. H. The codon Adaptation Index--a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic Acids Research 15, 1281-1295 (1987)）及びｔＲＮＡ最適化係数（ｔＡｉ）（Reis, dos, M., Savva, R. & Wernisch, L. Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection. Nucleic Acids Research 32, 5036-5044 (2004)、Tuller, T., Waldman, Y. Y., Kupiec, M. & Ruppin, E. Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 3645-3650 (2010)）を使用して全セリンコドンを特徴付けた。ｃＡｉの場合、各コドンｉ（ｃＡｉｗｉとして表される）の相対的適応性を測定基準として使用した。ｔＡｉの場合、Reis, dos, M., Savva, R. & Wernisch, L. Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection. Nucleic Acids Research 32, 5036-5044 (2004)、Tuller, T., Waldman, Y. Y., Kupiec, M. & Ruppin, E. Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 3645-3650 (2010)による文献の表Ｓ２における各コドンｉ（ｔＡｉｗｉとして表される）の相対的適応性値を使用した。タンパク質翻訳への影響が最も少ないと予想される同義変異を同定するために、コドンＴＣＡＳｅｒ及びＴＣＧＳｅｒについてのｃＡｉｗｉ及びｔＡｉｗｉを、残りのセリンコドン全ての値と比較する。標的及び置換されたコドンのｃＡｉｗｉ及びｔＡｉｗｉの差が最小になるように、理想的な置換を規定した。全コドンについてｃＡｉｗｉとｔＡｉｗｉを比較すると、２つの測定基準がうまく相関していないことに気付き（ピアソンＲ２＝０．２４）、各コドンの翻訳効率に関する仮定を統合する第３の測定基準を提案することにした。特に、翻訳効率はイソ受容体ｔＲＮＡ濃度の増加に比例して増加し、同じイソ受容体ｔＲＮＡによって翻訳される競合コドンの数の増加に比例して減少することが推測された。これに基づいて、以下のようにコドンｉの翻訳効率（ｔ．Ｅ）を規定した：
【０１７４】
【数１】
2019525755.tif 000010
【０１７５】
式中、コドンｉはｔＲＮＡｊによって翻訳され、ｋｉｊはコドンｉとｔＲＮＡｊとの間の相互作用強度を表し、ｍはｔＲＮＡｊによって翻訳される各コドンを表し、ｋｍｊはコドンｍとｔＲＮＡｊとの間の相互作用強度を表す。相互作用強度は５つの群：ｉ）それぞれのｔＲＮＡアンチコドン及びＡＵＡＩｌｅ−ｋ２ＣＡＵｔＲＮＡに対して逆相補配列であるコドンについては「コグネイト」、ii）第３位Ｇ又はＵが（修飾された）ｔＲＮＡのＵ又はＧそれぞれと相互作用するコドンについては「ＧＵ／ＵＧゆらぎ」、iii）第３位Ｃ又はＵがｔＲＮＡアンチコドン中のｘｏ５修飾ウリジンと相互作用するコドンについては「Ｃ／Ｕ−ｘo５Ｕ」、iv）コドン中の第３位Ｃ又はＵがｔＲＮＡアンチコドン中のイノシンと相互作用するコドンについては「Ｃ／Ｕ−イノシン」（相互作用はＧＵゆらぎよりも３〜８倍弱いことが示されている（Grosjean, H. J., de Henau, S. & Crothers, D. M. On the physical basis for ambiguity in genetic coding interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 610-614 (1978)））、並びにｖ）コドン中の第３位ＡとｔＲＮＡアンチコドン中のイノシンとの間に報告されている弱い相互作用については「Ａ−イノシン」（Curran, J. F. Decoding with the A:I wobble pair is inefficient. Nucleic Acids Research 23, 683-688 (1995)）に規定された。大腸菌培養物で実施され報告された測定値から、ｔＲＮＡ濃度［ｔＲＮＡｊ］を得て、全ｔＲＮＡのうちのｔＲＮＡの割合としてパーセントで表した（Dong, H., Nilsson, L. & Kurland, C. G. Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at different growth rates. Journal of Molecular Biology 260, 649-663 (1996)）。各コドンｉについて相対的なトランスクリプトームコドン頻度ｑを決定するために、最初にコドンの絶対トランスクリプトーム頻度ｒｉを計算した。
【０１７６】
【数２】
2019525755.tif 000011
【０１７７】
式中、ｇｉｘは遺伝子ｘ中のコドンｉの頻度であり、ｔｘは経験的データ（０．５−１時間で増殖させた野生型大腸菌のＤＮＡアレイデータ）による遺伝子ｘの転写物存在量である（Ishii, N. et al. Multiple high-throughput analyses monitor the response of E. coli to perturbations. Science 316, 593-597 (2007)）。最終的に、ｒｉを全コドンのｒについて見いだされた最大値によって除することによって、ｒｉをｑｉに変換した：
【０１７８】
【数３】
2019525755.tif 000012
【０１７９】
３つのコード測定基準を使用して、ＴＣＡＳｅｒとＴＣＧＳｅｒ（灰色）の同義書き換えのために最も近い置換（ピンク色）を割り当てることによって拡張データ表１を作成した。
【０１８０】
増殖速度測定及び分析
アッセイした細菌クローンのグリセロールストックを使用して抗生物質の非存在下で５ｍＬのＬＢに接種し、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。一晩培養したものを使用して、ディープウェル前培養プレートにおいてＬＢ１ｍＬに１：１００の比で三連で接種し、続いて振盪しながら３７℃で６時間インキュベートした。前培養プレート上の各複製物を使用して、９６ウェル測定プレートにおいてＬＢ２００μＬに１：１００の比で接種する。測定プレートをM200Proプレートリーダー（Tecan社）において４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１６時間インキュベートした。各ウェルについて１０分間隔でＯＤ６００の読み取りを行った。プレートリーダーの吸光度データは、細菌培養物の希釈系列から測定値を収集し、プレートリーダーデータｙを多項式で分光光度計の値ｘ：ｙ＝２．０５３ｘ２＋２．２ｘ＋０．０６１に当てはめることによって、分光光度計の読み取りに対応するように調整した。平均及び標準偏差を三連で計算し、Ｍａｔｌａｂの関数プロット及びエラーバーを使用して表した。
【実施例１】
【０１８１】
標的としてのゲノム
大腸菌における古典的ラムダレッドが媒介する組換えのための標的遺伝子座での組込みを改善するために、最初に、二重選択カセット、−１／＋１、陰性選択マーカー（−１、ｒｐｓＬ、必須リボソームタンパク質Ｓ１２をコードし、ストレプトマイシンに対する感受性を付与する）と陽性選択マーカー（＋１、ＫａｎＲ、カナマイシン耐性遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩをコードする）との間の融合物を、ストレプトマイシンに非感受性の大腸菌ＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒに挿入した。このカセットの組込みによって、ｒｐｓＬ−ＫａｎＲがＭＤＳ４２ｒｐｓＬＫ４３Ｒの８９０６１〜８９５８７の間に組み込まれた大腸菌ＭＤＳ４２ｒＫを作製した。
【０１８２】
第２の二重選択カセット−２／＋２、陰性選択マーカー（−２、ｓａｃＢ、スクロースに対する感受性を付与する）と陽性選択マーカー（＋２、ＣｍＲ、クロラムフェニコール耐性遺伝子クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする）との間の融合物を含有する合成ＤＮＡを含むＰＣＲ産物を、ＭＤＳ４２ｒＫにおけるｒｐｓＬ−ＫａｎＲ挿入の領域を標的とするラムダレッドが媒介する組換えのために使用した（図１ａ）。クロラムフェニコールに対するＰＣＲ産物の組込みについての選択は標的遺伝子座で５０％の組込みを引き起こし、一方、ＰＣＲ産物の組込み及び標的遺伝子座の置換の両方から生じるクロラムフェニコール耐性及びストレプトマイシン耐性の両方についての選択は標的遺伝子座での１００％の組込みを引き起こした（図１ｂ、ｃ）。このアプローチをＤＯＳＥＲ（二重選択組換え）と称した（図１）。ＤＯＳＥＲにおける陽性及び陰性選択マーカー両方の使用は、組換えを介した標的遺伝子座での合成ＤＮＡの組込みを実質的に増大させることができると結論づけられる。単一の挿入のために、ゲノム中の陰性選択マーカー及び挿入された配列中の陽性選択マーカーで十分であることに注意されたい。しかし、ゲノムに組み込まれたＤＮＡにおいて陽性及び陰性選択マーカーを使用することで、１回の組換えの結果を次回の組換えの鋳型として作用させることができる（図５（拡張データ図１ａ））。これによって、反復的なゲノム変化が可能になり、本明細書で記載した開発と組み合わせて、少数のステップでのゲノムの再合成が可能になると予測される（図５（拡張データ図１ｄ））。
【０１８３】
古典的組換えプロトコルの効率は、ｄｓＤＮＡ長に応じて劇的に減少する。総合的効率は、直鎖状ｄｓＤＮＡの形質転換効率と直鎖状ｄｓＤＮＡが細胞内組換えを媒介する効率との積である。長い直鎖状ｄｓＤＮＡでの古典的組換え効率の低下は、ｄｓＤＮＡの細胞内への効率的な送達における問題から生じると仮定したので、インビボで組換えるための直鎖状ｄｓＤＮＡを生成するための経路を調査した。
【実施例２】
【０１８４】
ＢＡＣ
−２／＋２カセットがＨＲ１及びＨＲ２配列並びにＣａｓ９標的部位（プロトスペーサー−ＰＡＭ配列を含有する）に隣接している細菌人工染色体（ＢＡＣ）を作製し、このＢＡＣをラムダレッド（アルファ／ベータ／ガンマ）（Datsenko, K. A. & Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000)）、Ｃａｓ９（Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)）を発現する大腸菌ＭＤＳ４２ｒＫに形質転換し、各細胞がスペーサーＲＮＡの付加によって活性化されるように設定されたＢＡＣ及びＣａｓ９システムを含有する細胞集団を作製した（図２ａ）。ＢＡＣ標的部位内のプロトスペーサー（Jiang, W., Cox, D., Zhang, F., Bikard, D. & Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology 31, 233-239 (2013)）を標的化するスペーサーＲＮＡをコードするプラスミドの添加、並びにクロラムフェニコール（＋２の獲得）及びストレプトマイシン（ゲノムからの−１の喪失及びＢＡＣの骨格の喪失）の両方に対する耐性の獲得についての選択は、ゲノム中のＨＲ１とＨＲ２の間の配列の、ＢＡＣ由来のＨＲ１とＨＲ２の間の配列による置換を引き起こした（図５（拡張データ図１ｂ））。
【０１８５】
ゲノム置換は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びラムダレッド組換え機構の成分に専ら依存し（図２ｂ）、望ましいゲノム遺伝子座を標的化した（図２ｃ）。データは、ＢＡＣにおけるＨＲ１とＨＲ２との間のｄｓＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介切除、ゲノムにおけるＨＲ１とＨＲ２との間のこの配列のラムダレッド媒介組込みと一致する。このアプローチをＫＡＩＳＥＲ２（Kaiの高感度組換え、２カ所での切断）と称した。
【０１８６】
ゲノムに挿入されたＤＮＡの長さに対するＫＡＩＳＥＲ２の依存性を調査するために、ＨＲ１と−２／＋２との間に９ｋｂ又は９０ｋｂのＤＮＡが挿入されたＢＡＣを作製した（図２ｄ、ｅ、ｆ）。９ｋｂの挿入物は、フォトラブダス・ルミネセンス（Photorhabdus luminescens）（Bryksin, A. V. & Matsumura, I. Rational Design of a Plasmid Origin That Replicates Efficiently in Both Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria. PLoS ONE 5, e13244 (2010)）に由来する設計されたｌｕｘＡＢＣＤＥオペロンを含有し、これは大腸菌において生物発光を生じさせるのに必要かつ十分である。このＢＡＣを大腸菌ＭＤＳ４２ｒＫに形質転換し、ＫＡＩＳＥＲ２プロトコルを実行した。クロラムフェニコール及びストレプトマイシンで選択された細胞は全て、正しい遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）にｌｕｘオペロンを組み込み、生物発光性であった（図２ｄ）。さらに、ＤＯＳＥＲ及び古典的組換えの効率は、２ｋｂの挿入の１０４コロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）から９ｋｂの挿入の１０ｃ．ｆ．ｕ．未満まで劇的に低下するが（図２ｆ）、ＫＡＩＳＥＲ２の効率は一定で、２ｋｂ又は９ｋｂの挿入では１０４ｃ．ｆ．ｕ．である。
【実施例３】
【０１８７】
非常に大きな核酸の挿入
ＫＡＩＳＥＲ２を介した長いＤＮＡの組込みを試験するために、Ｐ．ルミネセンスのｌｕｘオペロンを大腸菌ＭＧ１６５５の８０ｋｂのＤＮＡ（１３９８２５１及び１４８０２３０、以前にＭＤＳ４２の作製において削除された（Posfai, G. et al. Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli. Science 312, 1044-1046 (2006)））の中央（１４３９００５〜１４３９００６の間）に配置した新しい挿入物を設計した。これによって、Ｓ．セレビシエにおける相同組換えを介した、ＨＲ１と−２／＋２との間でＢＡＣに組み立てられた９０ｋｂの挿入が引き起こされた（Kouprina, N., Noskov, V. N. & Larionov, V. Selective isolation of large chromosomal regions by transformation-associated recombination cloning for structural and functional analysis of mammalian genomes. Methods Mol. Biol. 349, 85-101 (2006)）。得られたＢＡＣを用いてＫＡＩＳＥＲ２を実行し、９０ｋｂの合成ＤＮＡをＭＤＳ４２ｒＫのゲノムに組み込んだ。正しい遺伝子座（８９０６１〜８９５８７の間）にｌｕｘオペロンを組み込み、クロラムフェニコール及びストレプトマイシンで選択された細胞は全て生物発光性であり、挿入物全体を含有していた（図２ｅ）。さらに、ＫＡＩＳＥＲ２の効率は９０ｋｂの挿入について１０４ｃ．ｆ．ｕで維持されている（図２ｆ）。ＫＡＩＳＥＲ２は、大腸菌の標的ゲノム遺伝子座への非常に長い合成ＤＮＡの、長さに依存しない効率的な挿入の第１の経路となると結論される。
【実施例４】
【０１８８】
ＫＡＩＳＥＲ４
次に、ゲノムのＨＲ１とＨＲ２の間に二本鎖切断を作製し（図２ａ）、合計４個の切断（ＢＡＣに２個、ゲノムに２個）を導くことによって、ＫＡＩＳＥＲ２の全体的な効率を改善できるかどうかを調べた。ＫＡＩＳＥＲ４と称したこの方法を実現するために、ＨＲ１とＨＲ２の間に−２／＋２を含有するＢＡＣをラムダレッド（アルファ／ベータ／ガンマ）、Ｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡを発現する大腸菌ＭＤＳ４２ｒＫに形質変換し、各細胞がスペーサーＲＮＡの添加によって活性化されるように設定されたＢＡＣ及びＣａｓ９システムを含有する細胞集団を作製した（図２ａ）。４つのスペーサーＲＮＡ、ＫＡＩＳＥＲ２におけるようにＢＡＣ標的部位を対象とする２つのスペーサーＲＮＡ、及びゲノム中のＨＲ１とＨＲ２との間を対象とする２つのさらなるスペーサーＲＮＡをコードするプラスミドを添加し、クロラムフェニコール（＋２の獲得）及びストレプトマイシン（ゲノムからの−１の喪失及びＢＡＣの骨格の喪失）の両方に対する耐性の獲得について選択した。この選択によって、ゲノム中のＨＲ１とＨＲ２の間の配列の、ＢＡＣ由来のＨＲ１とＨＲ２の間の配列との置換（拡張データ図１ｂ）及び４つのプロトスペーサー全ての破壊が引き起こされた。ＫＡＩＳＥＲ４で生じた１０７ｃ．ｆ．ｕは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及びラムダレッド組換え機構の両方に専ら依存し（図２ｂ）、正しい遺伝子座での組込みを引き起こした（図２ｃ）。ＫＡＩＳＥＲ４の長さ依存性を調査するために、ＫＡＩＳＥＲ４戦略を使用して９ｋｂ及び９０ｋｂの挿入を繰り返した（図２ｄ、ｅ）。ＫＡＩＳＥＲ４の効率は長さに依存せず、組込み全てについてＫＡＩＳＥＲ２よりも１０３倍多いｃ．ｆ．ｕを生じた（図２ｆ）。これらの結果は、ＫＡＩＳＥＲ４戦略におけるゲノム切断は、正しい遺伝子座での挿入を維持しながら、ＫＡＩＳＥＲ２に関する合成ＤＮＡ挿入の効率をさらに増加させることを示している。
【実施例５】
【０１８９】
１００Ｋｂの挿入／置換
次に、ＫＡＩＳＥＲ２及びＫＡＩＳＥＲ４では１００ｋｂの大腸菌ゲノムの効率的置換が可能であることを示した。置換のためにｍｒａＺからｐｙｒＨの領域（８９０６２〜１９２７４３の間）を標的化した。５０ヌクレオチドのＨＲ１配列（８９０１２〜８９０６１、標的領域のすぐ５’）を規定し、ゲノムのＨＲ１のすぐ３’（８９０６１〜８９０６２）に−１／＋１選択カセットを挿入した。ＨＲ２としてゲノムのこのＨＲ１の１００ｋｂ下流に６３ｎｔ配列（１９２７４４〜１９２８０６）を規定した。
【０１９０】
ＢＡＣのＨＲ１と−２／＋２との間の挿入のために、ｍｒａＺとｐｙｒＨとの間の１００ｋｂの領域がその長さに沿ったｌｕｘオペロン（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＣ、ｌｕｘＤ及びｌｕｘＥ）の個々の遺伝子の挿入によって透かしが入っているＢＡＣ用の挿入物を設計した（図３ａ）。望ましいＢＡＣは、Ｓ．セレビシエにおける断片組み立てによって組み立てられる（Kouprina, N., Noskov, V. N. & Larionov, V. Selective isolation of large chromosomal regions by transformation-associated recombination cloning for structural and functional analysis of mammalian genomes. Methods Mol. Biol. 349, 85-101 (2006)）。ＫＡＩＳＥＲ２は反応あたり４×１０３ｃ．ｆ．ｕを生じ、そのうちの５５％が生物発光性であり、一方ＫＡＩＳＥＲ４は反応あたり２×１０５ｃ．ｆ．ｕ．を生じ、そのうちの１０％が生物発光性であった（図３ｂ）。さらなる特徴付けによって、生物発光コロニー全てについて望ましい遺伝子座において合成オペロンが組み込まれていることが確認されたが、非生物発光コロニーは親配列のキメラ及びｌｕｘの透かしを含有していた（図３ｂ、図６（拡張データ図２）。これらの結果は、ＫＡＩＳＥＲがゲノム領域の長い合成ＤＮＡによる置換を可能にすることを示す。さらに、ｌｕｘ遺伝子を含有する置換は表現型的にはサイレントではないことがあり、わずかなクローンにおいて組換え可能であることが明らかである。ゲノムに一貫して移入されない合成ＤＮＡ中の領域、この場合、ｌｕｘＢをマッピングすることによって（図６拡張データ図２））、設計された合成ＤＮＡ中の有害な配列を規定することができる。
【実施例６】
【０１９１】
書き換え
特定のコドンの同義書き換え及びそれらのコグネイトｔＲＮＡのゲノムからの除去は、センスコドンに応じた新しい化学的構造ブロックの組込みを対象とし、インビボでの非天然ポリマーの合成のための遺伝コードの再プログラミングを容易にする、新しい直交アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素対へのこれらのコドンの再割当を可能にすることができる（Chin, J. W. Reprogramming the genetic code. Science 336, 428-429 (2012)）。任意の同義書き換えは、翻訳速度（Sorensen, M. A. & Pedersen, S. Absolute in vivo translation rates of individual codons in Escherichia coli. The two glutamic acid codons GAA and GAG are translated with a threefold difference in rate. Journal of Molecular Biology 222, 265-280 (1991)、Curran, J. F. & Yarus, M. Rates of aminoacyl-tRNA selection at 29 sense codons in vivo. Journal of Molecular Biology 209, 65-77 (1989)）、ｍＲＮＡ折り畳み（Kudla, G., Murray, A. W., Tollervey, D. & Plotkin, J. B. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science 324, 255-258 (2009)）、及び転写（Cho, B.-K. et al. The transcription unit architecture of the Escherichia coli genome. Nature Biotechnology 27, 1043-1049 (2009)）又は翻訳（Li, G.-W., Oh, E. & Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature 484, 538-541 (2012)）制御要素を変化させ、共翻訳折り畳み（Kimchi-Sarfaty, C. et al. A ‘Silent’ Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science 315, 525-528 (2007)、Zhang, G., Hubalewska, M. & Ignatova, Z. Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding. Nat Struct Mol Biol 16, 274-280 (2009)）及びタンパク質発現レベル（Kudla, G., Murray, A. W., Tollervey, D. & Plotkin, J. B. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science 324, 255-258 (2009)）の変化を引き起こす。ゲノムのあらゆる位置に可能なあらゆる同義を有する所与のコドンのコンビナトリアル書き換えは不可能である。例えば、ゲノム中のあらゆる位置（１４９１）における大腸菌の最も希少なセンスコドン（ＡＧＧ）の同義語のコンビナトリアル探査には、１０１０４２ゲノムの探査が必要で、観測宇宙（１０８０）で推定される原子の数を超える。このような考察は、ゲノムの多くの位置で可能な同義書き換えを規定する一般的な書き換え規則を発見することの重要性を強調する。
【０１９２】
数多くの実験によって、同義変異のライブラリーを用いた個々の遺伝子の書き換えが調査されたことがある（Kudla, G., Murray, A. W., Tollervey, D. & Plotkin, J. B. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science 324, 255-258 (2009)、Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）。しかし、明確に規定されたゲノムの書き換えが必要なので、明確に規定された同義書き換え規則を用いて、必須ゲノム領域において多数の必須遺伝子の同時書き換えの結果を調査した実験はない。ＫＡＩＳＥＲ２を使用してこの課題に取り組み、ゲノム全体に適用するならば、関連するｔＲＮＡ遺伝子を削除した後に、非天然モノマーに割り当てることができるコドンを作製する同義書き換え規則を調査する。
【０１９３】
セリンコドンは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がそのコグネイトｔＲＮＡのアンチコドン配列を認識しない３つのコドン組（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ）の１つであり、セリンアンチコドンを選出する直交ｔＲＮＡの導入によってセリルｔＲＮＡ合成酵素による誤ったアミノアシル化が引き起こされないので、セリンコドンを除去することに注目した（Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nature Chemistry 6, 393-403 (2014)）。ｉ）ゲノムから除去したときに解読するｔＲＮＡ全ての除去が可能で、ii）これらのｔＲＮＡを除去してもゲノム中の残りの同義コドンの解読を全て除去するわけではない標的セリンコドンを同定するが、これらは明白な再割当を可能にするためにゲノムからセンスコドンを除去するための最小限の基準である。
【０１９４】
次に、コドン最適化指数（ｃＡｉ）（Sharp, P. M. & Li, W. H. The codon Adaptation Index--a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic Acids Research 15, 1281-1295 (1987)）、ｔＲＮＡ最適化指数（ｔＡｉ）（Reis, dos, M., Savva, R. & Wernisch, L. Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection. Nucleic Acids Research 32, 5036-5044 (2004)、Tuller, T., Waldman, Y. Y., Kupiec, M. & Ruppin, E. Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 3645-3650 (2010)）、又はコドン存在量と測定したｔＲＮＡ濃度を組み合わせる提案した第３の測定基準（翻訳効率（ｔ．Ｅ）のいずれかによって判断して、標的コドンの最も近い一致を同定することによって、標的セリンコドンの最良の同義置換を規定した（拡張データ表、方法）。これらの考察によって、ｉ）ＴＣＧ及びＴＣＡコドンが両方ともＡＧＴコドン（ｃＡｉ、書き換えスキーム１）で置換され、ii）ＴＣＧ及びＴＣＡコドンが両方ともＡＧＣコドン（ｔＡｉ、書き換えスキーム２）で置換され、かつiii）ＴＣＧコドンがＡＧＣコドンで置換され、ＴＣＡコドンがＡＧＴコドンで置換される（ｔ．Ｅ、書き換えスキーム３）３つの書き換えスキーム（図４ａ）が導かれた。
【０１９５】
大腸菌の細胞分裂オペロン（８９０６２〜１０６５０７）をこれらの同義書き換えスキームを試験するための理想的な標的として同定したのは、ｉ）必須遺伝子が豊富である（領域中の１５個の遺伝子のうち１２個が必須である）（Baba, T. et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology 2, 2006.0008-11 (2006)）、ii）様々なレベルで発現したタンパク質を含有し（Pratviel-Sosa, F., Mengin-Lecreulx, D. & van Heijenoort, J. Over-production, purification and properties of the uridine diphosphate N-acetylmuramoyl-L-alanine:D-glutamate ligase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 202, 1169-1176 (1991)、Carson, M. J., Barondess, J. & Beckwith, J. The FtsQ protein of Escherichia coli: membrane topology, abundance, and cell division phenotypes due to overproduction and insertion mutations. J Bacteriol 173, 2187-2195 (1991)、Dai, K. & Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J Bacteriol 174, 6145-6151 (1992)、Dewar, S. J., Begg, K. J. & Donachie, W. D. Inhibition of cell division initiation by an imbalance in the ratio of FtsA to FtsZ. J Bacteriol 174, 6314-6316 (1992)、Weiss, D. S. et al. Localization of the Escherichia coli cell division protein Ftsl (PBP3) to the division site and cell pole. Mol Microbiol 25, 671-681 (1997)、Eraso, J. M. et al. The highly conserved MraZ protein is a transcriptional regulator in Escherichia coli. J Bacteriol 196, 2053-2066 (2014)）、iii）膜タンパク質を含み（Geis, A. & Plapp, R. Phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase of Escherichia coli K12. Properties of the membrane-bound and the extracted and partially purified enzyme. Biochim. Biophys. Acta 527, 414-424 (1978)、Pla, J., Dopazo, A. & Vicente, M. The native form of FtsA, a septal protein of Escherichia coli, is located in the cytoplasmic membrane. J Bacteriol 172, 5097-5102 (1990)、Nguyen-Disteche, M., Fraipont, C., Buddelmeijer, N. & Nanninga, N. The structure and function of Escherichia coli penicillin-binding protein 3. Cell. Mol. Life Sci. 54, 309-316 (1998)、Ha, S., Walker, D., Shi, Y. & Walker, S. The 1.9 A crystal structure of Escherichia coli MurG, a membrane-associated glycosyltransferase involved in peptidoglycan biosynthesis. Protein Sci. 9, 1045-1052 (2000)、Urbanus, M. L. et al. Sec-dependent membrane protein insertion: sequential interaction of nascent FtsQ with SecY and YidC. EMBO Rep 2, 524-529 (2001)、Fraipont, C. et al. The integral membrane FtsW protein and peptidoglycan synthase PBP3 form a subcomplex in Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 157, 251-259 (2011)、Khadria, A. S. & Senes, A. The transmembrane domains of the bacterial cell division proteins FtsB and FtsL form a stable high-order oligomer. Biochemistry 52, 7542-7550 (2013)）、iv）発現比が明確に区別でき、極めて重要ないくつかのタンパク質を含み（Dai, K. & Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J Bacteriol 174, 6145-6151 (1992)、Dewar, S. J., Begg, K. J. & Donachie, W. D. Inhibition of cell division initiation by an imbalance in the ratio of FtsA to FtsZ. J Bacteriol 174, 6314-6316 (1992)）、かつｖ）標的コドンが豊富であるからである（図７（拡張データ図３ａ））。これらの特徴によって、有害な同義書き換えが明らかな影響をもたらすこと、リボソーム遺伝子などの高度に発現した遺伝子よりも的確に、この遺伝子がプロテオームにおける発現レベル及びタンパク質存在位置の範囲を反映することが確実であると予測した（Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）。
【０１９６】
所望の２０ｋｂ領域（８９０６２〜１０６５０７）は１５個の遺伝子を含有し、そのうちの５つは明確に区別できるリーディングフレーム中で重複している。重複内の潜在的なシス調節領域をインタクトのまま残しながら各遺伝子の独立した書き換えを可能にするために、重複するＯＲＦそれぞれの開始コドンの２００ヌクレオチド上流が複製されている新しい構造を設計した（図４ｂ）。この新しい構造中の１５個の遺伝子全てで書き換えスキーム１が実行されるＤＮＡ配列、及びこの新しい構造内で書き換えスキーム２又は３が実行される配列を設計した。全体として３つのスキームは、７４１ヌクレオチド変化、各スキームについて２４７ヌクレオチド変化を導入する（図４ｃ）。各スキームのためにＤＮＡを新規合成し、Ｓ．セレビシエのＢＡＣに組み込んで、ＫＡＩＳＥＲ２を介して各スキームでゲノムの書き換えを試験した（図４ｂ）。
【０１９７】
ＫＡＩＳＥＲ２による書き換えの後、各スキームから１０個の独立したクローンを配列決定した（図４ｃ）。スキーム１では、組換え媒介交差と一致する、野生型ゲノムＤＮＡと書き換えられたたＤＮＡとの間のキメラが認められた。対照的に、スキーム２ではゲノム配列の書き換え配列への完全な変換が認められ、スキーム３では１０クローンのうち９クローンが完全に書き換えられた。全クローンの倍加時間は互いに、及び大腸菌ＭＤＳ４２と同程度で（図８（拡大データ図４））、増殖速度がゲノムの書き換えによって影響されなかったことを示している。データによって、スキーム１及びスキーム２の書き換えにおいて置換のために使用したコドンは単一塩基のみが異なり（ＡＧＴ対ＡＧＣ）、それぞれゆらぎ及びワトソンクリック解読を介して、同じｔＲＮＡ（アンチコドンＧＣＴを含む）によって解読されるとしても、スキーム２の書き換えは許容されるがスキーム１の書き換えは許容されないことが示される（図４ａ）。
【０１９８】
さらに、標的領域内の全コドンの書き換えが許容されない場合、このアプローチではキメラ配列がもたらされるので、問題のあるヌクレオチド変化の正確なゲノム位置に関する情報を提供することができる。実際に、スキーム１の１０個のキメラの整列によって、野生型配列が維持されている単一の位置、ｆｔｓＡのコドン４０７が明らかになる。この位置の野生型コドンはＴＣＧであり、これはスキーム１ではＡＧＴ、スキーム２及び３ではＡＧＣに変換される。この分析によって、失敗した書き換えの共通の特徴として、ｆｔｓＡのコドン４０７の３番目の位置における単一塩基変化（ＴからＣ）が同定される。
【０１９９】
さらに、本発明はライブラリーの形成に適用することができることに注意されたい。本発明によるスキームを示す図１８を記載する。本発明によるプラスミド及び／又はライブラリーの製造に関して、「ＫＡＩＳＥＲ４ｐ」によって１０５多様性の２つの半ライブラリーを組み合わせた、１０１０多様性を有するライブラリーの形成を示す図１８を参照する。
【０２００】
実施例１〜６の概要
結論として、エピソームレプリコンからのインビボ切除を介してインビボで直鎖状合成ｄｓＤＮＡなどのドナー核酸を生成し、大腸菌ゲノムへの９０ｋｂの合成ＤＮＡの挿入又は１００ｋｂの大腸菌ゲノムと合成ＤＮＡとの１ステップでの置換を可能にするアプローチを示した。このアプローチは反復することができ、各ステップに数日かけて、４０ステップ以下で大腸菌ゲノム全体を合成ＤＮＡで置換することが可能である（図５（拡張データ図１ｄ））。本発明（例えば、ＫＡＩＳＥＲ）は、ゲノム内の多数の必須遺伝子について同時に試験するための解読規則を初めて規定することができた。これらの実験は、ゲノムの完全で協調的な同義書き換えを可能にし得る、明確に規定された同義置換を発見することができることを明らかにしている。
【実施例７】
【０２０１】
効率的な単一ステップ置換
概要
以前の研究では、大腸菌において発現させた個々の遺伝子における同義コドン選択の役割を調査した。初期の実験では、ＧＦＰ遺伝子と同義のコドンを組み合わせて書き換え、タンパク質の発現レベルが書き換えられた遺伝子で変動することを示した（Kudla, G., Murray, A. W., Tollervey, D. & Plotkin, J. B. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science 324, 255-258 (2009)）。より最近では、大腸菌リボソームオペロン内の個々の遺伝子が、古典的組換えによる書き換えのために標的化された（Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）。これらの実験は、１つの遺伝子内のセンスコドンを同義コドンの無作為に重み付きされた分布で一度に置換することを目的とした（図５（拡張データ図１））。ある特定のコドンが書き換えられた遺伝子からの排除のために標的化されたが、これらのコドンの排除だけではコドンの再割当を可能にするのに十分ではなかった（図５（拡張データ図１））。１２個のリボソーム遺伝子を個別に書き換えして、標的化したコドンの全出現を除去することはできなかった。さらに、書き換えることができた株は実質的に増殖不良であった。
【０２０２】
以前のアプローチはコドンを無作為に選択した同義語で置換するので、遺伝子中の許容される、及び許容されない同義置換の正確な規則を規定するために必要なのだが、遺伝子内の多くの位置で特定の標的コドンを特定の同義置換で置換する効果を体系的に試験していない。さらに、以前の研究は個々の遺伝子が書き換えられていたので（Kudla, G., Murray, A. W., Tollervey, D. & Plotkin, J. B. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science 324, 255-258 (2009)、Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）、オペロン中の明確に区別できる遺伝子におけるコドン間のエピスタシス相互作用の結果を捉えていない。例えば、そのレベルがコドン選択によって規定されるオペロン内のタンパク質は、生物学的機能を果たすために正確に規定された比で相互作用し得るので、オペロン内の明確に区別できる遺伝子におけるコドン間のエピスタシスは重要となる。
【０２０３】
ここで、非常に長い合成ＤＮＡの効率的な挿入及び非常に長い合成ＤＮＡによるゲノムＤＮＡの置換を可能にする機構を大腸菌に与える。ＲＥＸＥＲ（組換えによるゲノム改変強化のためのレプリコン切除）と称するアプローチにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるエピソームレプリコンからの二本鎖ＤＮＡのプログラムされたインビボでの切除を誘発して、正確に標的化された遺伝子座でのラムダレッドが媒介する組換えを可能にする。９０ｋｂの合成ＤＮＡを単一ステップで大腸菌ゲノムに挿入し、１００ｋｂの大腸菌ゲノムを単一ステップで合成ＤＮＡと置換し、長いゲノム領域を段階的に置換するためにこの方法を反復することができることを示す。ゲノムＤＮＡの長い鎖を合成ＤＮＡで置換する能力は、細胞分裂に関与する１２個の必須遺伝子を含む１５個の遺伝子を含有する大腸菌ゲノム内のオペロンの書き換えを可能にする。８つの異なる明確に規定された同義書き換え規則を使用して、このオペロンの全遺伝子を同時に書き換える。各書き換え規則では、試験した各標的コドンの出現を全て除去し、規定した同義語で置換し、ゲノム全体に適用してコグネイトｔＲＮＡを削除した後で、明白なコドン再割当を可能にする。このアプローチを使用して、所望の領域における標的コドンの全出現を同時に除去し、３７４位までの標的コドンの除去を引き起こす。多くの位置で有害であり、十分に受け入れられない書き換えスキームを導く同義置換を規定し、全位置で許容される同じ標的コドンについてその他の同義置換を規定する。結果によって、相互作用するタンパク質をコードする一群の遺伝子では、同じ標的コドンについて異なる同義置換が許容される範囲の劇的な違いが明らかになる。アプローチによって、オペロンのその他の位置全てで許容される正確なコドン置換が許容されない特異な位置の同定が可能になる。さらに、特異な位置の代替書き換えが書き換えスキームを救うことができることを示す。
［実施例７Ａ］
【０２０４】
１００ｋｂの置換
次に、ＲＥＸＥＲ２及びＲＥＸＥＲ４では１００ｋｂの大腸菌ゲノムの単一ステップでの効率的置換が可能であることを示した（図３ａ）。望ましいＢＡＣは、Ｓ．セレビシエにおける断片組み立てによって組み立てられる（Kouprina, N., Noskov, V. N. & Larionov, V. Selective isolation of large chromosomal regions by transformation-associated recombination cloning for structural and functional analysis of mammalian genomes. Methods Mol. Biol. 349, 85-101 (2006)）。ＲＥＸＥＲ２は反応あたり２×１０４ｃ．ｆ．ｕを生じ、そのうちの８０％が生物発光性であり、一方ＲＥＸＥＲ４は反応あたり５×１０６ｃ．ｆ．ｕ．を生じ、そのうちの５０％が生物発光性であった（図３ｂ）。さらなる特徴付けにより、生物発光コロニー全てについて望ましい遺伝子座にｌｕｘ遺伝子透かしが組み込まれているが（図３ｂ）、非生物発光コロニーは親配列及びｌｕｘ透かしのキメラを含有していることが確認された。これらの結果は、ＲＥＸＥＲがゲノム領域と長い合成ＤＮＡとの置換を可能にすることを示す。さらに、ｌｕｘ遺伝子を含有する置換は表現型的にはサイレントではないことがあり、わずかなクローンにおいて組換え可能であることを明らかにしている。ゲノムに一貫して移入されない合成ＤＮＡ、この場合、ｌｕｘＢに領域をマッピングすることによって、設計された合成ＤＮＡ中の有害な配列を規定し、修復のために潜在的に標的化することができる。
［実施例７Ｂ］
【０２０５】
反復適用
次に、より大きなゲノム領域の段階的な置換を可能にするために、ゲノム改変のためのアプローチは反復することができることを示した（図５（拡大データ図１ａ）及び図９ａ（補足図２ａ））。陽性及び陰性選択マーカー＋２及び−２を導入する１回目のＲＥＸＥＲで作製されたゲノムが、明確に区別できるが互換性のある陽性及び陰性選択マーカー（＋１、−１）を含有するＢＡＣを使用して、２回目のＲＥＸＥＲのための直接鋳型となることを初めて示した（図９ｂ、ｃ（補足図２ｂ、ｃ））。２回目のＲＥＸＥＲの産物は、１回目で使用したのと同じマーカーの組み合わせを使用する３回目のＲＥＸＥＲのための鋳型であり、したがって、このアプローチは反復することができる（図９ａ（補足図２ｂ、ｃ））。
［実施例７Ｃ］
【０２０６】
長いゲノム領域の置換
ゲノムＤＮＡの長い領域と合成ＤＮＡとの段階的な置換のためにＲＥＸＥＲを反復できることを示すために、ＲＥＸＥＲの第２ステップのためにｍｒａＺとｐｙｒＨの間の１００ｋｂのゲノム領域をＲＥＸＥＲによって置換した細胞を使用した（図３ａ、ｂ及び図９ｄ（補足図）２ｄ）。第２ステップでは、ｆｒｒからｍｈｐＴ（１９２７４４〜３７６６７０）までを包含する１２４ｋｂの合成ＤＮＡ及びハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）を導入する。ＲＥＸＥＲを反復した後、細胞は予想した表現型及び遺伝子型を有し（図９ｅ、ｆ（補足図２ｅ、ｆ））、２ステップの２２０ｋｂのゲノムと２３０ｋｂの合成ＤＮＡとの置換に成功することを確認した。これは、天然において組換えを誘導するＳ．セレビシエにおける最大の置換（２７０ｋｂ、１１ステップ）と比較して優れている（Annaluru, N. et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science 344, 55-58 (2014)）。ゲノムの大きな区画を合成ＤＮＡで反復置換すると、全ゲノムと合成ＤＮＡとの段階的置換が可能になる（図１４（拡張データ図６））。
［実施例７Ｄ］
【０２０７】
書き換え−十分に受け入れられない／許容されない変異の同定
大腸菌ゲノムの大きな区画を置換する着実な方法を確立したので、ＲＥＸＥＲを使用して、許容されない、十分に受け入れられない同義置換及びゲノムの多くの位置で許容され実行することができる同義置換を経験的に規定した。実験的調査のためのシステムを規定するために、ｉ）除去のために標的とするコドンを同定し、ii）標的コドンを置換することができるコドンを同定することによって書き換え規則を規定し、iii）同定した書き換え規則を試験するゲノムの領域を同定した。
【０２０８】
ｉ）ゲノムから除去するとそれらを解読するｔＲＮＡ全ての除去を可能にし、ii）これらのｔＲＮＡの除去がゲノム中の残りの同義コドンの解読全てを除去するわけではない、除去のための標的コドンを選ぶが、これらは、明白な再割当を可能にするためにゲノムからセンスコドンを除去するための最小限の基準である（図１５（拡張データ図７））。セリン、ロイシン及びアラニンコドンは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がそれらのコグネイトｔＲＮＡのアンチコドン配列を認識しない３つのコドン組なので、これらの基準を満たすセリン、ロイシン及びアラニンコドンを除去することに注目した。これは、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ又はＡｌａをコードするために通常使用されるアンチコドンを選出する直交ｔＲＮＡを導入することによって、内在性合成酵素による直交ｔＲＮＡの誤ったアミノアシル化が引き起こさないことを意味する（Wang, K. et al. Optimized orthogonal translation of unnatural amino acids enables spontaneous protein double-labelling and FRET. Nature Chemistry 6, 393-403 (2014)）。コドン最適化指数（ｃＡｉ）（Sharp, P. M. & Li, W. H. The codon Adaptation Index--a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications. Nucleic Acids Research 15, 1281-1295 (1987)）、ｔＲＮＡ最適化指数（ｔＡｉ）（Reis, dos, M., Savva, R. & Wernisch, L. Solving the riddle of codon usage preferences: a test for translational selection. Nucleic Acids Research 32, 5036-5044 (2004)、Tuller, T., Waldman, Y. Y., Kupiec, M. & Ruppin, E. Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proceedings of the National Academy of Sciences 107, 3645-3650 (2010)）、又はｃＡｉ及び細胞内ｔＲＮＡレベルを組み合わせる規定した第３の測定基準（翻訳効率、ｔ．Ｅ）のいずれかによって判断して、標的コドンの最も近い一致を同定することによって、標的コドンの同義置換候補を規定した（拡張データ表１、方法）。これらの考察によって、８つの書き換えスキームの調査を行った（図１０ａ（補足図３ａ）。
【０２０９】
大腸菌の細胞分裂オペロン（８９０６２〜１０６５０７）をこれらの同義書き換えスキームを試験するための理想的な標的として同定したのは、ｉ）必須遺伝子が豊富で（領域中の１５個の遺伝子のうち１２個が必須である）（Baba, T. et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology 2, 2006.0008-11 (2006)）、ii）様々なレベルで発現したタンパク質を含有し（Pratviel-Sosa, F., Mengin-Lecreulx, D. & van Heijenoort, J. Over-production, purification and properties of the uridine diphosphate N-acetylmuramoyl-L-alanine:D-glutamate ligase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 202, 1169-1176 (1991)、Carson, M. J., Barondess, J. & Beckwith, J. The FtsQ protein of Escherichia coli: membrane topology, abundance, and cell division phenotypes due to overproduction and insertion mutations. J Bacteriol 173, 2187-2195 (1991)、Dai, K. & Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J Bacteriol 174, 6145-6151 (1992)、Dewar, S. J., Begg, K. J. & Donachie, W. D. Inhibition of cell division initiation by an imbalance in the ratio of FtsA to FtsZ. J Bacteriol 174, 6314-6316 (1992)、Weiss, D. S. et al. Localization of the Escherichia coli cell division protein Ftsl (PBP3) to the division site and cell pole. Mol Microbiol 25, 671-681 (1997)、Eraso, J. M. et al. The highly conserved MraZ protein is a transcriptional regulator in Escherichia coli. J Bacteriol 196, 2053-2066 (2014)）、iii）膜タンパク質（共翻訳折り畳み及び機能が同義コドン選択によって影響を受けることが知られているタンパク質の1種）を含み（Geis, A. & Plapp, R. Phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide-transferase of Escherichia coli K12. Properties of the membrane-bound and the extracted and partially purified enzyme. Biochim. Biophys. Acta 527, 414-424 (1978)、Pla, J., Dopazo, A. & Vicente, M. The native form of FtsA, a septal protein of Escherichia coli, is located in the cytoplasmic membrane. J Bacteriol 172, 5097-5102 (1990)、Nguyen-Disteche, M., Fraipont, C., Buddelmeijer, N. & Nanninga, N. The structure and function of Escherichia coli penicillin-binding protein 3. Cell. Mol. Life Sci. 54, 309-316 (1998)、Ha, S., Walker, D., Shi, Y. & Walker, S. The 1.9 A crystal structure of Escherichia coli MurG, a membrane-associated glycosyltransferase involved in peptidoglycan biosynthesis. Protein Sci. 9, 1045-1052 (2000)、Urbanus, M. L. et al. Sec-dependent membrane protein insertion: sequential interaction of nascent FtsQ with SecY and YidC. EMBO Rep 2, 524-529 (2001)、Fraipont, C. et al. The integral membrane FtsW protein and peptidoglycan synthase PBP3 form a subcomplex in Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 157, 251-259 (2011)、Khadria, A. S. & Senes, A. The transmembrane domains of the bacterial cell division proteins FtsB and FtsL form a stable high-order oligomer. Biochemistry 52, 7542-7550 (2013)）、iv）相互作用し、発現したタンパク質の比が明確に区別でき、極めて重要であるいくつかのタンパク質を含み（Dai, K. & Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J Bacteriol 174, 6145-6151 (1992)、Dewar, S. J., Begg, K. J. & Donachie, W. D. Inhibition of cell division initiation by an imbalance in the ratio of FtsA to FtsZ. J Bacteriol 174, 6314-6316 (1992)）（異なる遺伝子のコドン間のエピスタシス相互作用に有利である）、かつｖ）標的コドンが豊富である（図１０ｂ（補足図３ｂ）、拡張データ表２））からである。これらの特徴によって、非常に少数の標的コドンを含有し、高度に発現した遺伝子（拡張データ表２）を主に含有し、コドンの一部に対して大きく偏っているリボソームオペロン（Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）などのその他の領域よりも的確に、この遺伝子がプロテオーム中の発現レベルの範囲及びタンパク質の存在位置を反映していることは確実だろうと予測した。さらに、これらの特徴によって、オペロン内の有害な同義書き換えが明確な影響を及ぼすことは確実だろうと予測した。
【０２１０】
書き換えスキームそれぞれが１５個の遺伝子全ての中で同時に実行されるＤＮＡ配列を設計した。このスキームは最大３７４のコドン変化を導入し、全体で１４６８個のコドン変化及び２３４７個のヌクレオチド変化の結果を調査する（図１０ｃ（補足図３ｃ））。各スキームのためのＤＮＡを新規合成し、Ｓ．セレビシエのＢＡＣに組み込み、ＲＥＸＥＲを介したゲノムの書き換えを調査した（図１１ａ（補足図４ａ））。
【０２１１】
ＲＥＸＥＲ後に、各書き換えスキームから１６個の独立したクローンを配列決定した。書き換えられた配列と野生型ゲノムとの間の組換え媒介交差と一致した、野生型ゲノムＤＮＡと書き換えたＤＮＡとの間のキメラをいくつかの場合で観察し、これらのキメラによって書き換えランドスケープを規定した。個々の書き換えランドスケープを整列させて、許容される同義置換のピークとプラトー、及び一貫して許容されていない同義置換のバリー又はトラフを明らかにする「集約された書き換えランドスケープ」（図１１ｂ（補足図４ｂ））を作製した。異なる同義コドンによる同じコドンの置換が受け入れられる範囲で、明らかな違いが認められる（図１１ｂ（補足図４ｂ）、図１２（補足図５）、図１６（拡張データ図８））。
【０２１２】
最初に、セリン書き換えスキーム１〜３を調査した（図１２ａ（補足図５ａ））。スキーム１について、組換え媒介交差と一致し、クローンの０％が完全に書き換えられている、野生型ゲノムＤＮＡと書き換えられたＤＮＡとの間のキメラが認められた。全く対照的に、スキーム２及びスキーム３では、クローンの８８％が完全に書き換えされていた。対照的に、試験したロイシン書き換えスキーム（スキーム４〜６）は全く完全な書き換えを引き起こさず、スキーム４及び５では、書き換えは大失敗に終わり、同義置換がオペロンの多くの部位で表現型に影響を及ぼすことを示している（図１２ｂ（補足図５ｂ））。最後に、試験した２つのアラニン書き換えスキーム（スキーム７〜８）では結果が劇的に異なることを見いだした（図１２ｃ（補足図５ｃ））。書き換えスキーム７は、３７４個全ての位置で７５％にクローンの完全な書き換えを引き起こすが、スキーム８によって完全に書き換えられたクローンはない。完全に書き換えられたクローン全ての倍加時間は互い及び対照大腸菌株と同程度で（図１３（補足図６））、増殖速度がゲノムの書き換えによって影響されなかったことを示している。全体的に見て、この研究は単一株のオペロンから２０ｋｂにわたる最高３７４個のセンスコドンをうまく除去している。したがって、センスコドン除去の規模は、１．１ｋｂに及ぶ４６個のコドンが単一株で除去された、放出因子２遺伝子（ｐｒｆＢ）について以前に報告されたものよりはるかに大きい。リボソーム遺伝子（ｒｐｓＡ）から同時に除去されたコドンの最大数は、以前の研究では、１６個であった（Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）。
【０２１３】
データによって、相互作用する必須遺伝子のオペロンにおいて、正確に規定した書き換えスキームの間には大幅な差があることは明らかである。この情報は、同義置換の選択が単一遺伝子において無作為化されているときは得られない。セリン書き換えでは、スキーム１並びにスキーム２及び３書き換えにおいて置換のために使用したコドンは単一塩基のみが異なり（ＡＧＴ対ＡＧＣ）、それぞれゆらぎ及びワトソンクリック解読を介して同じｔＲＮＡ（アンチコドンＧＣＴを含む）によって解読されるとしても、スキーム２及び３の書き換えは許容されるが、スキーム１の書き換えは許容されない（図１０ａ（補足図３ａ））。アラニンコドンと同様に、スキーム７書き換えは許容され、スキーム８は大失敗する。これらの書き換えスキームでは、ＧＣＡが許容される、及び許容されない置換において、単一塩基（ＧＣＴ対ＧＣＣ）の変換のみが異なる。また、両方の新しいコドンは同じｔＲＮＡ組によって解読される（図１０ａ（補足図３ａ））。ｃＡＩ、ｔＡｉ、及びｔＥは全て少なくとも１つ書き換えを成功させるが、どの同義書き換えが成功するかを予測する単一の測定基準はない。これらの所見は、必須遺伝子が豊富なオペロン内の各コドンでは、最も体系立てられ明確に規定された同義書き換えスキームを経験的に決定することの重要性を強調している。
【０２１４】
書き換えスキーム１を用いたＲＥＸＥＲの実施から生じるキメラゲノム配列を整列させると、大腸菌がｆｔｓＡのコドン４０７での単一のコドン変異（ＴＣＧからＡＧＴ）を一貫して拒絶することが明らかである（図１２ａ（補足図５ａ））。ｆｔｓＡ４０７ＴＣＧからＡＧＴへの変異を導入する試み（ゲノムのその他の位置でのさらなる書き換えを含まない）は失敗した（図１３ａ（補足図６ａ））。対照的に、ｆｔｓＡ４０７ＴＣＧを同義ＴＣＴコドンに定量的に書き換えることができた（図１３ａ（補足図６ａ））。これらの結果は、ｆｔｓＡ４０７ＴＣＧからＡＧＴへの変異は有害であることを示す。
［実施例７Ｅ］
【０２１５】
代替変異の試験及び書き換えスキームの修復
次に、ｆｔｓＡの４０７位のコドンのＡＧＴからＡＧＣへの変異（書き換えスキーム２及び３においてこの位置に見いだされるコドン）が書き換えスキーム１を修復するのに十分であることを示した（図１３ｂ、ｃ、ｄ）（補足図６ｂ、ｃ、ｄ））。この変異はＲＥＸＥＲ媒介書き換えを劇的に変化させ、完全に書き換えられた配列の割合を０％から９４％へ、ｆｔｓＡのコドン４０７での書き換えの割合を０％から１００％へ増加させる（図１３ｂ、ｃ、ｄ（補足図６ｂ、ｃ、ｄ））。一本鎖ＤＮＡリコンビニアリングとＲＥＸＥＲとを組み合わせることによって、この変異を書き換えスキーム１に導入することにも成功した（図１７（拡張データ図９））。大腸菌の増殖は、書き換えスキームの成功によって影響を受けなかった（図１３ｅ（補足図６ｅ））。これらの結果は、書き換えスキーム１における主な欠点が、ｆｔｓＡの４０７位では許容されないＡＧＴに起因することを示している。ＴＣＧ、ＴＣＴ及びＡＧＣはｆｔｓＡの４０７位で許可されるが、ＡＧＴ（トリプレットの各位置で許容されるコドンとヌクレオチドを共有する）は許容されないので、このコドンにおける問題はトリプレット内の特定のヌクレオチド自体よりもトリプレット全体にあると結論する。これらの実験は、ｉ）他の点では十分に受け入れられる書き換えスキームによる書き換えに抵抗性であるゲノム内の特異的位置を同定し、ii）これらの特異的位置に代替コドンを導入することによって書き換えスキームを修復するために、ＲＥＸＥＲをどのように使用することができるかを例示する。
【０２１６】
結論として、大腸菌ゲノムへの大きな合成ＤＮＡ配列のプログラムされた挿入及び大腸菌ゲノムの区画と合成ＤＮＡとの置換の両方を可能にするためのアプローチを生み出した。このアプローチは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるエピソームレプリコンからのインビボでの切除を介した、直鎖状合成ｄｓＤＮＡカセットの作製と、標的遺伝子座での組込みを確実にする陽性及び陰性の同時選択と共役させたラムダレッドが媒介する組換えとを組み合わせる。このアプローチは非常に効率的で、反復することができ、各ステップに２、３日かけて、４０ステップ以下で全大腸菌ゲノムを合成ＤＮＡで置換することが可能である（図１４（拡張データ図６））。単一ステップで挿入することができるＤＮＡの長さは、天然の組換え生物に組み込まれる長さを超える。ＣＲＩＳＰＲシステム及びラムダレッドが媒介する組換えの両方がその他の生物において活性であるので、このアプローチは大腸菌を超えて適用することができ、その他の生物におけるゲノム改変を容易にすると予測する。
【０２１７】
８つの異なる明確に規定された同義書き換え規則を使用して、必須オペロンの遺伝子を同時に書き換えた。各書き換え規則では、試験した各標的コドンの出現を全て除去し、ゲノム全体に適用しコグネイトｔＲＮＡを削除した後で明白なコドンの再割当を可能にする規定した同義語で置換する。多くの位置で有害であり、十分に受け入れられない書き換えスキームを導く同義置換を規定し、調査した全位置で許容される、同じ標的コドンに対するその他の同義置換も規定した。結果によって、相互作用するタンパク質をコードする一群の遺伝子では、同じ標的コドンに対する異なる同義置換が許容される範囲の劇的な違いが明らかになる。このアプローチではまた、オペロンの多くのその他の位置では許容される正確なコドン置換が許容されない、「書き換えランドスケープ」内の特異的位置の同定及び修復が両方とも可能である。さらに、標的コドン除去を維持する特異的位置の代替書き換えが書き換えスキームを救うことができることが示された。多くの遺伝子におけるセンスコドン除去及び同義置換のための正確に規定されたスキームを調査することによって、ゲノムの書き換えに適用することができない書き換えスキームの排除、及びゲノム全体への適用に有望な書き換えスキームの同定が同時に可能である。
【０２１８】
【表４】
2019525755.tif 000013
【０２１９】
拡張データ表２。この研究で全て同時に書き換えされる必須細胞分裂オペロンにおける（ａ）、並びに以前に報告された個々に書き換えられたリボソーム遺伝子及び終止因子２遺伝子における（ｂ）、タンパク質機能、存在位置、発現レベル、及び遺伝子の長さ。より詳細には、この研究で同時に書き換えられた必須細胞分裂オペロンにおける（ａ）、並びに以前に報告された個々に書き換えられたリボソーム遺伝子及び終止因子２遺伝子における（ｂ）、タンパク質機能、存在位置、発現レベル（１００万分の１）、及び遺伝子の長さ（ｂｐでのＯＲＦ長及びアミノ酸数でのペプチド長）（Lajoie, M. J. et al. Probing the Limits of Genetic Recoding in Essential Genes. Science 342, 361-363 (2013)）。異なる書き換えスキームによる除去のために標的化されるコドンの数も報告した。発現レベルデータはwww.pax-db.orgから得た。
【０２２０】
【表５】
2019525755.tif 000014
【０２２１】
【表６】
2019525755.tif 000015
【０２２２】
（参考文献）
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【０２２３】
本発明の例示的な実施形態を添付の図面を参照して本明細書で詳細に開示したが、本発明は正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって規定されるように、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更及び修飾を行うことができることを理解されたい。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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