(57)【要約】  本発明は、生存生体物質（２）の培養のための装置（２００）に関し、上記装置は、縦方向Ｘに、横方向Ｙに、並びに縦方向及び横方向に対して垂直な方向Ｚに伸長を有するハウジング（４）を備え、上記ハウジングが、生体物質（２）を有する１つ又は複数の培養皿（８）を収容するように各々適合される、２つ以上の培養皿区画（６）を備え、上記装置が、画像取得デバイス（１０）を備え、上記装置が、その動作を制御するための制御ユニット（１２）を備え、上記画像取得デバイスの少なくとも一部が、２つ以上の培養皿区画（６）に対して移動できるように構成され、それによって上記１つ又は複数の培養皿（８）に収容される上記生体物質（２）の１つ又は複数の画像の取得を可能にし、且つ上記装置が、ＦＬＩＭユニット（１１）（蛍光寿命撮像顕微鏡）を備え、上記ＦＬＩＭユニット（１１）の少なくとも一部が、２つ以上の培養皿区画（６）に対して移動できるように構成され、それによって上記１つ又は複数の培養皿（８）に収容される上記生体物質（２）の１つ又は複数のＦＬＩＭスペクトルの取得を可能にする。
2019520077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存生体物質（２）の培養のための装置（２００）であって、
前記装置が、
縦方向Ｘに、横方向Ｙに、並びに前記縦方向及び前記横方向に対して垂直な方向Ｚに伸長を有するハウジング（４）を備え、前記ハウジングが、
生体物質（２）を有する１つ又は複数の培養皿（８）を収容するように各々適合される、２つ以上の培養皿区画（６）を備え、
前記装置が、画像取得デバイス（１０）を備え、
前記装置が、その動作を制御するための制御ユニット（１２）を備え、
前記画像取得デバイスの少なくとも一部が、前記２つ以上の培養皿区画（６）に対して移動できるように構成され、それによって前記１つ又は複数の培養皿（８）に収容される前記生体物質（２）の１つ又は複数の画像の取得を可能にし、且つ
前記装置が、ＦＬＩＭユニット（１１）（蛍光寿命撮像顕微鏡）を備え、
前記ＦＬＩＭユニット（１１）の少なくとも一部が、前記２つ以上の培養皿区画（６）に対して移動できるように構成され、それによって前記１つ又は複数の培養皿（８）に収容される前記生体物質（２）の１つ又は複数のＦＬＩＭスペクトルの取得を可能にする、装置。
【請求項２】
個々の培養皿区画（６）の数が、２〜２５個、例えば３〜２４個、さらには４〜２３個などであり、例えば５〜２２個、さらには６〜２１個などであり、例えば７〜２０個若しくは８〜１９個、例えば９〜１８個、さらには１０〜１７個などであり、例えば１１〜１６個、さらには１２〜１５個又は１３〜１４個などである個々の培養皿区画である、請求項１に記載の装置（２００）。
【請求項３】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数、好ましくは全ての前記培養皿区画が、それ自身の個々の蓋（１４）を備え、各前記蓋が、前記対応する培養皿区画（６）へのアクセスを提供する開放形態と前記対応する培養皿区画が周囲から密閉されている閉鎖形態との間で移行することが可能であるように構成される、請求項１又は２に記載の装置（２００）。
【請求項４】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数における温度の個々の且つ独立した調整のための温度調整手段（１６）を、好ましくは前記個々の培養皿区画の各々に更に備える、請求項１から３までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項５】
前記温度調整手段（１６）が、１つ若しくは複数の電熱体などの加熱手段（１８）、及び／又は１つ若しくは複数のペルチェ素子などの冷却手段（２０）を独立して備える、請求項４に記載の装置（２００）。
【請求項６】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数における酸素、二酸化炭素及び／又は窒素の濃度などのガス組成を個々に調整するためのガス組成調整手段（２２）を、好ましくは前記個々の前記培養皿区画の各々に更に備える、請求項１から５までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項７】
前記装置が、ガス・ボンベからなど、外部源から１つ又は複数の種類の異なるガスを供給するための手段を備える、請求項１から６までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項８】
前記手段が、前記装置へのガス流を調整するためのバルブ（４８、５０）である、請求項７に記載の装置（２００）。
【請求項９】
前記１つ又は複数のガスのためのガス混合ボックス（４０）を備える、請求項８に記載の装置（２００）。
【請求項１０】
前記ガス混合ボックスが、ＮＤＩＲ  ＣＯ２センサなどのＣＯ２センサ（５８）、及び医療グレードの化学Ｏ２センサなどのＯ２センサ（６０）を備え、且つ前記ガス混合ボックス（４０）から前記別々の培養皿区画（６）の１つ又は複数へガスを導くための１つ又は複数の導管（４２）を更に備える、請求項９に記載の装置（２００）。
【請求項１１】
２つ以上の培養皿区画（６）が、同じガス混合ボックス（４０）を共有する、又は各培養皿区画（６）に、それ自身の個々のガス混合ボックス（４０）が割り当てられる、請求項１０に記載の装置（２００）。
【請求項１２】
前記装置が、前記１つ又は複数のガス又はガスの混合気をＵＶ−Ｃ照射などのＵＶ照射にさらすための手段（５２）を備え、前記手段が、１８０〜１９０ｎｍの波長を有するＵＶ照射といった、１７５〜１９５ｎｍの波長を有するＵＶ照射など、オゾンの生成に至り得るＵＶ照射をフィルタリングするためのフィルタを任意選択で備える、請求項７から１１までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１３】
前記培養皿区画（６）に入る前のＨＥＰＡフィルタ及び／又はカーボン・フィルタなどの、ガス又はガスの混合気をフィルタリングするための手段（４４）を更に備える、請求項７から１２までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１４】
前記装置が、前記培養皿区画の１つ又は複数に関して、前記培養皿区画（６）からガス混合ボックス（４０）へガスを導くための１つ又は複数の導管（６６）を備える、請求項７から１３までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１５】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数に関して、好ましくは各個々の培養皿区画に関して、前記個々の培養皿区画が、培養皿を保持するための透明な棚（２４）を備え、且つ前記画像取得デバイス（１０）及び前記ＦＬＩＭユニット（１１）、又は少なくとも電磁放射線を送信及び受信するその一部が、前記棚の下に配置され、且つ前記培養皿区画（６）のいずれかに収容されている前記培養皿（８）のいずれかに収容された前記生体物質（２）に／から前記棚（２４）を通して電磁放射線を送信及び／又は取得することを可能にするように移動できるように適合されている、請求項１から１４までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１６】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数に関して、好ましくは各個々の培養皿区画に関して、前記個々の培養皿区画が、ｐＨセンサ（２６）、温度センサ（２８）、酸素センサ（３０）、二酸化炭素センサ（３０）の中の１つ又は複数を独立して備える、請求項１から１５までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１７】
前記装置の動作を制御するための前記制御ユニット（１２）が、前記培養皿区画の１つ又は複数に関する前記温度調整手段（１６、１８、２０）、前記培養皿区画の１つ又は複数に関する前記ガス組成調整手段（２２）、前記画像取得デバイス（１０）、前記ＦＬＩＭユニットの中の１つ又は複数を独立して制御するように構成される、請求項１から１６までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１８】
前記制御ユニット（１２）が、ユーザが前記装置によって従われることになる所定の動作プロトコルを入力できるようにするように構成され、且つ前記制御ユニットが、前記プロトコルに従って前記装置を制御するように構成されている、請求項１から１７までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１９】
前記装置が、ユーザが前記装置によって従われることになる１つ若しくは複数の動作プロトコルをプログラム及び選択できるようにするための、且つ／又はユーザが前記装置によって従われることになる特定のプロトコルをプログラムできるようにするための、英数字キーボードなどの入力手段（３２）を備える、請求項１から１８までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項２０】
前記装置が、前記装置の動作の状況及び進行に関する詳細をオペレータに表示するためのディスプレイ（３４）を備える、請求項１から１９までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項２１】
前記装置が、前記画像取得デバイス（１０）によって取得された画像を処理するための画像処理ユニット（３６）を更に備え、且つ／又は前記ＦＬＩＭユニット（１１）によって取得された電磁放射線に関する情報を処理するためのスペクトル・データ処理ユニットを更に備える、請求項１から２０までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項２２】
前記画像処理ユニット（３６）が、前記画像取得デバイスによって取得された画像から、前記培養されている生体物質の１つ又は複数の特定の生体物質（２）のタイムラプス画像系列を提供するように構成されている、請求項２１に記載の装置（２００）。
【請求項２３】
前記スペクトル・データ処理ユニットが、前記ＦＬＩＭユニット（１１）によって取得された２つの特定されたスペクトル間の差の解析を行うことが可能であるように構成されている、請求項２１に記載の装置（２００）。
【請求項２４】
前記ＦＬＩＭユニットが、
−  ダイオード・レーザ又は多光子励起レーザといった、パルス・レーザ源などのレーザ源、
−  単一光子感応検出器、
−  ダイクロイック・ミラー（励起光からの蛍光信号の分離のため）、
−  対物レンズ（試料へ励起光を焦束させるため及び／又は蛍光信号を収集するため）、
−  前記ＦＬＩＭユニットを制御するための制御システム、
の中の１つ又は複数の要素を独立して備える、請求項１から２３までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項２５】
前記レーザ源が、１つ又は複数の光ファイバなどの、電磁放射線を伝達するための光学手段に連結され、前記光学手段が、電磁放射線を送信によって伝達するために、前記生体物質の近くに向けられるように構成されている遠位端を備える、請求項２４に記載の装置（２００）。
【請求項２６】
前記単一光子感応検出器が、１つ又は複数の光ファイバなどの、電磁放射線を伝達するための光学手段に独立して連結され、前記光学手段が、電磁放射線を受信によって伝達するために、前記生体物質に向けられるように構成されている遠心端を備える、請求項２４又は２５に記載の装置（２００）。
【請求項２７】
前記ＦＬＩＭユニットが、ニコチン・アミド・アデニン（ＮＡＤＨ）の自己蛍光のために及び／又は前記生体物質の代謝に関わるフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ）の自己蛍光のために構成される、請求項１から２６までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項２８】
前記装置が、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）モードで動作するために構成される、請求項１から２７までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項２９】
前記装置が、ＦＲＥＴモードで又はＦＲＡＰモードで又はＰＬＩＭモード（燐光寿命撮像顕微法）で動作するために構成される、請求項１から２８までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項３０】
前記レーザが、３５０〜８００ｎｍ、さらには４００〜７５０ｎｍなどであり、例えば４５０〜７００ｎｍ、例えば５００〜６５０ｎｍ、さらには５５０〜６００ｎｍなどである波長範囲で動作している、請求項２４から２９までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項３１】
前記レーザが、３０〜１００ピコ秒（ｐｓ）、さらには４０〜９０ピコ秒（ｐｓ）などであり、例えば５０〜８０ピコ秒（ｐｓ）、さらには６０〜７０ピコ秒（ｐｓ）などであるパルス幅で動作している、請求項２４から３０までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項３２】
前記装置が、蛍光動作の間、時間領域で又は周波数領域で動作するように構成されている、請求項１から３１までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項３３】
前記装置が、卵母細胞又は胚の形態の２つ以上の生体物質を培養するように構成され、前記装置が、前記２つ以上の生体物質の各特定のものに関して、前記画像取得デバイス（１０）によって取得された画像に基づいて、前記特定の生体物質の所定の形態学的状態を識別するように構成され、且つ前記装置が、特定の生体物質に関して所定の形態学的状態が達された場合に、前記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得するように構成されている、請求項１から３２までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項３４】
前記装置が、前記２つ以上の生体物質の各特定のものに関して、前記画像取得デバイス（１０）によって取得された前記画像に基づいて、その特定の生体物質の２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態を識別するように構成され、且つ特定の生体物質に関して各そのような異なり且つ所定の形態学的状態が達された場合に、前記装置が、各そのような所定の形態学的状態に関して前記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得するように構成されている、請求項３３に記載の装置（２００）。
【請求項３５】
前記装置が、前記２つ以上の生体物質の各々に関して、同じ生体物質の２つ以上の異なる形態学的状態に対応するＦＬＩＭスペクトルの差を解析するために構成されている、請求項３４に記載の装置（２００）。
【請求項３６】
前記装置が、２つの異なり且つ特定の形態学的状態に帰属するＦＬＩＭスペクトルの最小差を呈する特定の生体物質を、最も安定な生体物質、したがって女性の子宮への挿入ための最善の候補として特定するように構成されている、請求項３５に記載の装置（２００）。
【請求項３７】
前記１つ又は複数の形態学的状態が、ｔ０（授精の時間）、ｔＰＢ２（授精から第２極体の出現までの時間）、ｔＰＮａ（授精から前核出現までの時間）、ｔＰＮｆ（授精から前核消失までの時間）、ｔ２〜ｔ９（授精から対応する分裂（２〜９）までの時間）、ｔＭ（授精から桑実期へのコンパクションまでの時間）、ｔ５Ｂ（授精から胞胚形成の開始までの時間）、ｔＢ（授精から胚盤胞形成完了までの時間）、ｔＥＢ（授精から拡張胚盤胞までの時間）、ｔＨＢ（授精から孵化胚盤胞までの時間）、ｃｃ１（第１次の卵割）、ｃｃ２（第２次の卵割）、ｃｃ３（第３次の卵割）、ｃｃ４（第４次の卵割）、ｓ１（第１同期パラメータ）、ｓ２（第２同期パラメータ）、ｓ３（第３同期パラメータ）、ｔ２＿ｉｎｔ（第１分裂後の時期）、ｔ４＿ｉｎｔ（第２分裂後の時期）、ｔ８＿ｉｎｔ（第３分裂後の時期）と関連付けられた事象を含む群から選択される、請求項３３から３６までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項３８】
生存生体物質の培養のためのシステム（３００）であって、
前記システムが、
−  請求項１から３７までのいずれかに記載の装置（２００）と組み合わせて
−  １つ又は複数の培養皿（８）を備える、システム。
【請求項３９】
前記１つ又は複数の培養皿が、幾つかの培養ウェルを含む物質を有する、請求項３８に記載のシステム（３００）。
【請求項４０】
前記培養ウェルの数が、２〜２１個、さらには３〜２０個などであり、例えば４〜１９個、さらには５〜１８個などであり、例えば６〜１７個、さらには７〜１６個などであり、例えば８〜１５個、例えば９〜１４個、さらには１０〜１３個又は１１〜１２個などである、請求項３９に記載のシステム（３００）。
【請求項４１】
生存生体物質（２）の培養のための請求項１から４０までのいずれかに記載の装置（２００）の又は請求項３８から４０までのいずれかに記載のシステム（３００）の使用法。
【請求項４２】
前記生体物質（２）が、卵母細胞又は胚である、請求項４１に記載の使用法。
【請求項４３】
前記生存生体物質（２）の代謝状態の品質の評価のための、請求項４１又は４２に記載の使用法。
【請求項４４】
生体物質（２）の培養の間のその物理的及び／又は化学的条件に関する最適プロトコルを経験的に決定するための、請求項４１から４３までのいずれかに記載の使用法。
【請求項４５】
生存生体物質のための最適培養条件を評価するための方法であって、
ｉ）請求項１から３７までのいずれかに記載の装置（２００）又は請求項３８若しくは３９に記載のシステム（３００）を提供するステップと、
ｉｉ）前記装置の別々の培養皿区画に、１つ又は複数の生存生体物質を各々有する、少なくとも２つの培養皿を収容するステップと、
ｉｉｉ）前記生体物質を培養条件で培養し、１つの培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件が別の培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件と１つ又は複数のパラメータだけ異なるステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の間に、ＦＬＩＭスペクトルを取得するために前記装置の前記ＦＬＩＭユニットを使用するステップと、
ｖ）前記ＦＬＩＭスペクトルに基づく前記生体物質の品質の評価のステップとを含む、方法。
【請求項４６】
ステップｉｖ）で取得される前記ＦＬＩＭスペクトルが、各前記生体物質に関して所定の且つ同様の形態学的時期に取得される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記所定の且つ同様の形態学的時期が、前記画像取得デバイス（１０）によって取得された画像から決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ステップｉｉ）〜ｖ）が繰り返され、１つの培養皿に収容されている生体物質に関する少なくとも一組の物理的及び／又は化学的培養条件が変更される、請求項４５から４７までのいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ＦＬＩＭスペクトルに基づいて、最も最適な物理的及び／又は化学的培養条件が決定される、請求項４５から４８までのいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
生体物質のアレイの中で、最高品質を有する特定の生体物質を選択するための方法であって、
ａ）請求項１から３７までのいずれかに記載の装置（２００）を提供することと、
ｂ）前記装置で前記生体物質のアレイを培養することと、
ｃ）前記生体物質のアレイの各特定のものに関して、前記画像取得デバイス（１０）を使用して前記特定の生体物質の所定の形態学的状態を識別することと、
ｄ）特定の生体物質に関して所定の形態学的状態が達された場合に、前記ＦＬＩＭユニット（１１）を使用して前記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得することと、
ｅ）前記生体物質のアレイに関して得られ且つ前記物質の同じ形態学的状態と関連付けられたＦＬＩＭスペクトルを比較することと、
ｆ）ステップｅ）でなされた比較に基づいて、１つ又は複数の所定の基準に基づいて、最高品質を有する前記特定の生体物質を選択することとを含む、方法。
【請求項５１】
各前記生体物質が、卵母細胞又は胚である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ステップｃ）で、前記画像取得デバイス（１０）が使用されて２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態を識別し、且つ
ステップｄ）で及び各特定の生体物質に関して、前記ＦＬＩＭユニット（１１）が使用されて前記２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態の各々で前記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得する、請求項５０又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記生体物質のアレイの前記生体物質の各々に関して、同じ生体物質の２つの異なる形態学的状態に対応するＦＬＩＭスペクトルの差が解析される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
２つの異なり且つ特定の形態学的状態に帰属するＦＬＩＭスペクトルの最小差を呈する前記特定の生体物質を、最も安定な生体物質、したがって女性の子宮への挿入ための最善の候補として特定するステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記所定の形態学的状態の１つ又は複数が、ｔ０（授精の時間）、ｔＰＢ２（授精から第２極体の出現までの時間）、ｔＰＮａ（授精から前核出現までの時間）、ｔＰＮｆ（授精から前核消失までの時間）、ｔ２〜ｔ９（授精から対応する分裂（２〜９）までの時間）、ｔＭ（授精から桑実期へのコンパクションまでの時間）、ｔ５Ｂ（授精から胞胚形成の開始までの時間）、ｔＢ（授精から胚盤胞形成完了までの時間）、ｔＥＢ（授精から拡張胚盤胞までの時間）、ｔＨＢ（授精から孵化胚盤胞までの時間）、ｃｃ１（第１次の卵割）、ｃｃ２（第２次の卵割）、ｃｃ３（第３次の卵割）、ｃｃ４（第４次の卵割）、ｓ１（第１同期パラメータ）、ｓ２（第２同期パラメータ）、ｓ３（第３同期パラメータ）、ｔ２＿ｉｎｔ（第１分裂後の時期）、ｔ４＿ｉｎｔ（第２分裂後の時期）、ｔ８＿ｉｎｔ（第３分裂後の時期）と関連付けられた事象を含む群から選択される、請求項５０から５４までのいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外受精の分野に関する。より詳細には、本発明は、第１の態様において、生体物質の培養のための装置に関する。第２の態様において、本発明は、生体物質の培養のためのシステムに関した。第３の態様において、本発明は、生体物質の培養のための第１の態様に係る装置の又は第２の態様に係るシステムの使用法に関する。第４の態様において、本発明は、生存生体物質のための最適培養条件を評価するための方法に関する。第５の態様において、本発明は、生体物質のアレイの中で、最高品質を有する特定の生体物質を選択するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外受精（ＩＶＦ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）の進展は、ここ数十年の間で、相当に改善された方法及び技術に結びついており、したがって、そのような技術に由来する出産成功の高められた率の観点から、改善された成功率に至っている。
【０００３】
体外受精は、女性の卵巣から成熟卵を取得し、卵巣を精子と受精させ、受精卵を制御環境下で培養し、その後、受精及び培養卵を女性の子宮に挿入することを伴う。
【０００４】
体外受精が、自然に妊娠することに明らかに問題を有している女性又は夫妻によって最も一般的に使用されており、したがって、夫婦の男性若しくは女性方、又は両者による或る程度の生殖能力低下を暗示しているので、且つ体外受精法がかなり高価な手順を伴うので、これらの体外受精法は、妊娠成功に遭遇するためには、しばしば、女性の子宮への２回以上の受精卵の挿入が必要であろうという事実に特に鑑みて、効率を最適化しようとする仕方で通例行われる。
【０００５】
したがって、体外受精法を効率的にするために、女性には、彼女の卵巣から卵子を採取する前に、ホルモン治療が典型的に提供される。
【０００６】
そのようなホルモン治療は、女性の卵巣に、１つの卵子だけでなく、多数の卵子を同時に排卵させることになる。
【０００７】
妊娠実現及び成功の可能性を高めるために、したがって、同じ女性からの２つ以上の卵子が培養器で並行して受精及び培養されることになる。
【０００８】
先行技術の培養器は、雰囲気の温度、湿度及び組成に関して制御されてもよい区画を含む。大抵の培養器の区画は、受精卵を有する２つ以上の培養皿を収容することを可能にする。
【０００９】
しかしながら、卵子の体外受精及び培養を成功させることは簡単な作業ではない。
【００１０】
体外受精のかなり低い成功率の大きな理由の１つは、移植のために最高品質の胚を選択するための信頼できる方法が存在しないことである。
【００１１】
胚の品質を評価するための方法の欠如は、胚の生存性の改善された分析を進展させる相当な努力に至っている。胚の品質を予測するための現在の最も信頼できる方法は、標準的な透過光顕微鏡システムを使用して移植前に胚の形態を調査することである。
【００１２】
胚の形態品質の調査のための方法では、先行技術の培養器内にカメラ手段が備わっており、これらには、正常又は健康な発育を呈する卵子を選択するだけの及びそれらの卵子を女性の子宮へ挿入するだけの目的で各受精卵の近接画像を取得することを可能にする顕微鏡光学系が装備されてもよい。
【００１３】
近年、子宮へのその後の挿入のためのふさわしい受精卵の選択をより良く可能にするためのタイム・ラプス画像処理手段をカメラ手段に装備することが常識となっている。
【００１４】
タイム・ラプス撮像は、異なる時期の細胞の分裂の時間、細胞の分裂全体の速度などの、可視物理現像の視覚研究を提供する。紡錘体の研究が、胚でのそのようなものの発育の時期を評価する別の様式を表してもよい。
【００１５】
しかしながら、選択基準が一般に主観的なままであり、結果として約３５％の成功率になるだけである。
【００１６】
新たに提案された非顕微鏡ベースの方法は、ゲノム、トランスクリプトーム又はプロテオーム・ベースの分析を使用しており、胚の生検を必要とし、したがって、侵襲的であり且つ胚の生存率を著しく低下させる。有望性を最初に示したメタボローム手法は、胚培地における代謝産物の変化を測定することによって胚の代謝状態を分析することであった。しかしながら、前向き無作為試験は、最近、そのようなメタボローム評価の活用が形態学的評価だけに比べて選択を改善することを示すことができなかった。
【００１７】
母体及び胎児の安全を改善するために、並びに妊娠するために体内移植を試みなければならない回数を低減させることによって及び多胎妊娠を低減させることによっても生殖補助技術の費用を低減させるためにも、胚又は卵母細胞の生存性を評価するための低侵襲で、単純で且つ信頼できる方法を利用することが好まれる。
【００１８】
可視スペクトルでの画像取得を使用するタイム・ラプス画像取得が、体外受精法で生体試料の発育を観察する分野内の或る用途にとって有用であると判明したかもしれないが、そのような画像取得デバイスは重大な欠点を抱える。
【００１９】
そのような欠点は、可視スペクトルで機能するタイム・ラプス画像取得デバイスを使用すると、実際には画像取得デバイスの光学系の対物レンズに最も近い生体物質の一部だけが画像取得デバイスによって見え、それ故、取得されることになるという事実に帰する。
【００２０】
換言すれば、画像取得デバイスの光学系の対物レンズに最も近い生体物質は、生体試料のより下に存在する物質が見えず、それ故、生体物質の発育に関する重要で且つ興味深い情報を提供しないような仕方で光学系にとって陰になることになる。
【００２１】
結果は、生体試料の発育を観察するときに可視スペクトルで機能するタイム・ラプス画像取得デバイスを使用する際に、画像取得デバイスの光学系の対物レンズのごく近傍にない領域で起こる生体試料の重要な物理変化が検出されないことがあり、それ故、生体試料を観察するためのタイム・ラプス画像取得デバイスで可視スペクトルの光を使用して取り出される情報がかなり制限されることがあるということである。
【００２２】
近年、代替の顕微鏡技術が開発されている。この技術は蛍光寿命撮像顕微法（ＦＬＩＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と表される。
【００２３】
蛍光寿命撮像顕微法では、生体試料を超短パルスの電磁放射線にさらすことによって、生体物質の蛍光体が退出状態にされる。その後、或る遅延時間内に、蛍光体はそのエネルギー基底状態に戻り、電磁放射線を放出する結果となる。
【００２４】
一方で短パルスの電磁放射線と他方で蛍光体からの電磁放射線の放出との間の時間帯は、生体物質の代謝に関わる自然発生する物質の数が蛍光体であるという点で生存生体物質の代謝状態を示すことになる。そのような蛍光体の実例はニコチン・アミド・アデニン（ＮＡＤＨ：Ｎｉｃｏｔｉｎｅ  Ａｍｉｄｅ  Ａｄｅｎｉｎｅ）及びフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ：Ｆｌａｖｉｎｅ  Ａｄｅｎｉｎｅ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。
【００２５】
したがって、蛍光寿命撮像では、蛍光試料から励起状態減衰速度の差に基づいて、画像が生成される。したがって、ＦＬＩＭは、コントラストが個々の蛍光体の発光スペクトルよりもむしろそれらの寿命に基づく蛍光撮像技術である。蛍光寿命は、分子が光子を放出することによって基底状態に戻る前に励起状態のままである平均時間として定義される。
【００２６】
蛍光寿命を決定するために、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ、Ｔｉｍｅ−Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ）が使用される。ＴＣＳＰＣでは、パルス・レーザによる試料励起と検出器への放出光子の到達との間の時間を測定する。ＴＣＳＰＣは、レーザ・パルスを操向する電子部品又はフォトダイオードによって提供される所定の「開始」、及び単一光子感応検出器（例えば単一光子アバランシェ・ダイオード、ＳＰＡＤ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ａｖａｌａｎｃｈｅ  Ｄｉｏｄｅ）での検出によって実現される所定の「停止」信号を必要とする。この時間遅延の測定は、蛍光体放出の統計的性質を考慮にいれるために何度も繰り返される。遅延時間は、励起パルス後の時間経過に伴い放出の発生をプロットするヒストグラムへソートされる。蛍光寿命画像を獲得するために、光子は異なる画素に帰されなければならず、これは、レーザ・パルスに対する相対到達時間に対して付加的に光子の絶対到達時間を記憶することによってなされる。光子の時間流れを異なる画素へソートするために、共焦点顕微鏡のスキャナからのライン及びフレーム・マーカ信号が付加的に記録される。
【００２７】
蛋白結合及び／若しくは遊離ＮＡＨＤ又は蛋白結合及び／若しくは遊離ＦＡＤの蛍光寿命によって示される、客観的に測定された十分な代謝状態を持つ細胞が、体外受精又は体内移植のために選択されることができる卵母細胞又は胚を示し、代謝状態が不十分である場合、卵母細胞／胚は体外受精又は体内移植から排除されることができる。
【００２８】
したがって、蛍光体がさらされている放射線のパルスを与えた時間に対して、蛍光体からの電磁放射線の放出の遅延を登録することによって、生体物質の地図が得られることができ、それによって生体物質の表面内に又は表面に位置しない領域でさえ研究されることができる。
【００２９】
そのような地図作成は、１つの生体物質の代謝状態を別の生体物質の代謝状態と比較するために使用されることができる。しかしながら、そのような比較を行うときに、信頼できる結果を得ることに関して、比較されている生体物質が比較できる発育期であることが重要である。即ち、例えば２つの異なる生存生体物質に関してＦＬＩＭスペクトルを用いて比較解析を提供するために、２つの生存生体物質が発育の比較期にあることを保証する必要がある−さもなければ、ＦＬＩＭスペクトルによって表される生体物質の代謝期は、本当に比較されることはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明は、周囲の雰囲気の温度及び組成に関してなどの、厳密に制御された環境条件下で生体試料の発育の研究を改善することを可能にするための装置、使用法及び方法を提供することを意図する。
【００３１】
特に、本発明は、人間の女性の子宮へ挿入されることになる胚又は卵母細胞の形態の生存生体物質のための最適培養条件の決定のための装置、使用法及び方法を提供することを意図する。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
この目的は本発明の各種の態様で遂げられる。したがって、本発明は、第１の態様において、生存生体物質の培養のための装置に関し、
上記装置は、
縦方向に、横方向に、並びに縦方向及び横方向に対して垂直な方向に伸長を有するハウジングを備え、上記ハウジングが、
生体物質を有する１つ又は複数の培養皿を収容するように各々適合される、２つ以上の培養皿区画を備え、
上記装置が、画像取得デバイスを備え、
上記装置が、その動作を制御するための制御ユニットを備え、
上記画像取得デバイスの少なくとも一部が、２つ以上の培養皿区画に対して移動できるように構成され、それによって上記１つ又は複数の培養皿に収容される上記生体物質の１つ又は複数の画像の取得を可能にし、且つ
上記装置が、ＦＬＩＭユニット（蛍光寿命撮像顕微鏡）を備え、
上記ＦＬＩＭユニットの少なくとも一部が、２つ以上の培養皿区画に対して移動できるように構成され、それによって上記１つ又は複数の培養皿に収容される上記生体物質の１つ又は複数のＦＬＩＭスペクトルの取得を可能にする。
【００３３】
その第２の態様において、本発明は、生存生体物質の培養のためのシステムに関し、
上記システムは、
−  本発明の第１の態様に係る装置と組み合わせて
−  １つ又は複数の培養皿を備える。
【００３４】
その第３の態様において、本発明は、生存生体物質の培養のための本発明の第１の態様に係る装置の又は本発明の第２の態様に係るシステムの使用法に関する。
【００３５】
その第４の態様において、本発明は、生存生体物質のための最適培養条件を評価するための方法に関し、上記方法が、
ｉ）本発明の第１の態様に係る装置を提供する又は本発明の第１の態様に係るシステムを提供するステップと、
ｉｉ）上記装置の別々の培養皿区画に、１つ又は複数の生存生体物質を各々有する、少なくとも２つの培養皿を収容するステップと、
ｉｉｉ）上記生体物質を培養条件で培養し、１つの培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件が別の培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件と１つ又は複数のパラメータだけ異なるステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の間に、ＦＬＩＭスペクトルを取得するために上記装置のＦＬＩＭユニットを使用するステップと、
ｖ）上記ＦＬＩＭスペクトルに基づく生体物質の品質の評価のステップとを含む。
【００３６】
第５の態様において、本発明は、生体物質のアレイの中で、最高品質を有する特定の生体物質を選択するための方法に関し、上記方法は、
ａ）本発明の第１の態様に従う装置を提供することと、
ｂ）上記装置で上記生体物質のアレイを培養することと、
ｃ）上記生体物質のアレイの各特定のものに関して、上記画像取得デバイスを使用して上記特定の生体物質の所定の形態学的状態を識別することと、
ｄ）特定の生体物質に関して所定の形態学的状態が達された場合に、上記ＦＬＩＭユニットを使用して上記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得することと、
ｅ）上記生体物質のアレイに関して得られ且つその物質の同じ形態学的状態と関連付けられたＦＬＩＭスペクトルを比較することと、
ｆ）ステップｅ）でなされた比較に基づいて、１つ又は複数の所定の基準に基づいて、最高品質を有するその特定の生体物質を選択することとを含む。
【００３７】
本発明は、その各種の態様において、ＦＬＩＭユニットが生体物質の組織をより深く調べることを可能にするので、生存生体物質などの生体物質の発育の改善された観察することを提供する。
【００３８】
これは、−試行錯誤によって−生体物質のための最も最適な培養環境及び／又は培養条件及び／又は培養プロトコルを見つけるために、異なる培養環境及び／又は培養条件及び／又は培養プロトコルの巨大な配列が試される研究目的にとって特に重要である。特定実施例において、そのような最適化は、卵母細胞又は胚のための最適培養環境及び／又は培養条件及び／又は培養プロトコルを見つけることに関する。
【００３９】
本発明に係る装置、システム、使用法及び方法により、幾つかのほぼ同一の生体物質の培養を実行することが可能であり、２つの生体物質に関する条件間で、物理的及び／又は化学的培養条件に関する１つのパラメータだけが異なる。
【００４０】
それによって、物理的及び／又は化学的培養条件に関する１つのパラメータだけを変更する効果が求められてもよい。これは、次いで、物理的及び／又は化学的培養条件に関する集団最適パラメータを決定するために活用されてもよい。
【００４１】
そのような最適化は、本発明の装置が、生体物質を有する１つ又は複数の培養皿を収容するように各々適合される、２つ以上の培養皿区画を含むので、可能である。
【００４２】
ほとんど全ての蛍光体にとって、環境へのエネルギー伝達速度は、イオンの濃度、酸素、ｐＨ値、又は細胞でのタンパク質の結合に依存する。蛍光消光剤と呼ばれるこれらのイオンの濃度と蛍光体の蛍光寿命との間に直接の関係がある。
【００４３】
それ故、ＦＬＩＭは、異なる蛍光体間を（それらの分光特性よりもむしろ）それらの特性寿命を基礎として区別するためだけでなく、蛍光消光剤の濃度変化を含む局所環境に存在する場合、同じ蛍光体の寿命の変化に基づいて細胞内の異なる環境の中で区別するためにも使用されることができる。
【００４４】
これは、生存生体物質の代謝が、極性、ｐＨ、温度、イオン濃度などといった、各種の蛍光体環境の影響に基づいて本発明により研究されてもよいことを意味する。
【００４５】
また、本発明を使用して、ナノメートル範囲の距離測定を可能にする分子相互作用の検出が可能であろう。ここでも、これは、各種の培養条件を参照しつつなされてもよい。
【００４６】
本発明を使用して研究されてもよい更に別の概念は、分子モータの折りたたみ又は作用による配座の分子内変化の検出である。
【００４７】
本発明を使用して研究されてもよいなお更なる概念は、利用された蛍光体を区別し、そしてそれらのスペクトル特性を求める他に、生存生体物質の蛍光バックグラウンドからラベル蛍光を識別し、したがって改善された検出効率及びより正確なマーカ局在化を可能にする能力である。
【００４８】
本発明を使用して研究されてもよいまた更なる概念は、蛍光ラベル又は量子ドットを介する新物質の特性評価及び品質管理である。
【００４９】
研究に本発明の装置を使用することは、生存生体物質のＦＬＩＭ顕微法から取り出されるデータを含むデータベースを構築することを提供する。各種の異なる生体物質の実際の生存性を比較することによって及びこれらの物質のＦＬＩＭスペクトルを比較することによって、「健康な」生存生体物質に対応するＦＬＩＭスペクトルにおけるポインタ又は特徴を予測することを可能にする。
【００５０】
それ故、統計解析に基づいて、本発明に係る装置を使用して、卵母細胞又は胚などの特定の生存生体物質の品質を評価することが可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明に係るデバイスの実施例を斜視図で図示する。
【図２】本発明に係るデバイスの原理を概略的に図示する。
【図３】本発明に係るデバイスを制御するための制御システムの詳細を概略的に例示する。
【図４】蛍光寿命測定のための単純なＴＣＳＰＣ構成を例示する。
【図５】図４の構成で得られたＴＣＳＰＣヒストグラムを例示する。
【図６】光ケーブルを使用した一実施例レーザ・ダイオード／検出器構成を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、第１の態様において、生存生体物質の培養のための装置に関し、
上記装置は、
縦方向に、横方向に、並びに縦方向及び横方向に対して垂直な方向に伸長を有するハウジングを備え、上記ハウジングが、
生体物質を有する１つ又は複数の培養皿を収容するように各々適合される、２つ以上の培養皿区画を備え、
上記装置が、画像取得デバイスを備え、
上記装置が、その動作を制御するための制御ユニットを備え、
上記画像取得デバイスの少なくとも一部が、２つ以上の培養皿区画に対して移動できるように構成され、それによって上記１つ又は複数の培養皿に収容される上記生体物質の１つ又は複数の画像の取得を可能にし、且つ
上記装置が、ＦＬＩＭユニット（蛍光寿命撮像顕微鏡）を備え、
上記ＦＬＩＭユニットの少なくとも一部が、２つ以上の培養皿区画に対して移動できるように構成され、それによって上記１つ又は複数の培養皿に収容される上記生体物質の１つ又は複数のＦＬＩＭスペクトルの取得を可能にする。したがって、本発明の第１の態様の装置は、生存生体物質の培養のための装置であり、そしてそれは、画像取得デバイスの他にＦＬＩＭユニットを備える。
【００５３】
これによって、卵母細胞又は胚などの生体物質の培養の間、生体物質の形態学的状態が画像取得デバイスを用いて観察されることができる一方、生体物質の代謝状態は、ＦＬＩＭユニットを使用することによって観察されることができることが達成される。これが可能であるのは、一つには、画像取得デバイス及びＦＬＩＭユニット、又は少なくともその一部が培養皿区画に対して移動できるからである。画像取得デバイス及びＦＬＩＭユニットは、一組の共通移動手段で個々に又は集合的に移動できてもよい。
【００５４】
集合的に、これは、女性の子宮へ挿入されたときに妊娠成功に至る最高の見込みを有する種を選択する目的で、特に卵母細胞又は胚の場合に、生体物質の品質を決定するための改善された基礎を提供する。
【００５５】
本発明の第１の態様の一実施例において、個々の培養皿区画の数は、２〜２５個、例えば３〜２４個、さらには４〜２３個などであり、例えば５〜２２個、さらには６〜２１個などであり、例えば７〜２０個若しくは８〜１９個、例えば９〜１８個、さらには１０〜１７個などであり、例えば１１〜１６個、さらには１２〜１５個又は１３〜１４個である培養皿区画である。
【００５６】
そのような数の個々の且つ／又は別々の培養皿区画は、研究状況で、各プロトコルが１つの培養皿区画から別の１つへ１つのパラメータによってだけ異なる幾つかの並列プロトコルを実行することを可能にする。それによって、特定の種類の生存生体物質のプロトコルの最適化が決定されてもよい。
【００５７】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記個々の培養皿区画の１つ又は複数、好ましくは全ての上記培養皿区画は、それ自身の個々の蓋を備え、各上記蓋は、対応する培養皿区画へのアクセスを提供する開放形態と対応する培養皿区画が周囲から密閉されている閉鎖形態との間で移行することが可能であるように構成される。
【００５８】
個々の且つ別々の培養皿区画にそれ自身の個々の蓋を設けることによって、１つの培養皿区画の環境がその他の培養皿区画の環境から独立した所定の条件に保たれることができることが確実にされる。
【００５９】
本発明の第１の態様の一実施例において、装置は、上記個々の培養皿区画の１つ又は複数における温度の個々の且つ独立した調整のための温度調整手段を、好ましくは上記個々の培養皿区画の各々に更に備える。
【００６０】
個々の且つ別々の培養皿区画に温度を個々に調整するためのそれ自身の個々の温度調整手段を設けることによって、１つの培養皿区画の環境がその他の培養皿区画の環境から独立した所定の条件に保たれることができることが確実にされる。
【００６１】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記温度調整手段は、１つ若しくは複数の電熱体などの加熱手段、及び／又は１つ若しくは複数のペルチェ素子などの冷却手段を独立して備える。
【００６２】
本発明の第１の態様の一実施例において、装置は、上記個々の培養皿区画の１つ又は複数における酸素、二酸化炭素及び／又は窒素の濃度などのガス組成を個々に調整するためのガス組成調整手段を、好ましくは上記個々の上記培養皿区画の各々に更に備える。
【００６３】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、ガス・ボンベからなど、外部源から１つ又は複数の種類の異なるガスを供給するための手段を備える。
【００６４】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記手段は、装置へのガス流を調整するためのバルブである。
【００６５】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、上記１つ又は複数のガスのためのガス混合ボックスを備える。
【００６６】
個々の且つ別々の培養皿区画にガス組成を個々に調整するためのそれ自身の個々のガス組成調整手段を設けることによって、１つの培養皿区画の環境がその他の培養皿区画の環境から独立した所定の条件に保たれることができることが確実にされる。
【００６７】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記ガス混合ボックスは、ＮＤＩＲ  ＣＯ２センサなどのＣＯ２センサ、及び医療グレードの化学Ｏ２センサなどのＯ２センサを備え、且つ上記ガス混合ボックスから上記別々の培養皿区画の１つ又は複数へガスを導くための１つ又は複数の導管を更に備える。
【００６８】
そのようなセンサは、特定の培養皿区画に供給されることになる環境を観察することを可能にする。
【００６９】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記２つ以上の培養皿区画は、同じガス混合ボックスを共有する、又は代替的に、各培養皿区画には、それ自身の個々のガス混合ボックスが割り当てられる。
【００７０】
本発明の第１の態様の一実施例において、装置は、上記１つ又は複数のガス又はガスの混合気をＵＶ−Ｃ照射などのＵＶ照射にさらすための手段を備え、上記手段は、１８０〜１９０ｎｍの波長を有するＵＶ照射といった、１７５〜１９５ｎｍの波長を有するＵＶ照射など、オゾンの生成に至り得るＵＶ照射をフィルタリングするためのフィルタを任意選択で備える。
【００７１】
本発明の第１の態様の一実施例において、装置は、培養皿区画に入る前のＨＥＰＡフィルタ及び／又はカーボン・フィルタなどの、ガス又はガスの混合気をフィルタリングするための手段を更に備える。
【００７２】
そのようなＵＶ照射手段及び／又はフィルタ手段は、培養皿区画に供給されることになるガスを浄化することを提供する。
【００７３】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、上記培養皿区画の１つ又は複数に関して、上記培養皿区画からガス混合ボックスへガスを導くための１つ又は複数の導管を備える。
【００７４】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記個々の培養皿区画の１つ又は複数に関する、好ましくは各個々の培養皿区画に関する上記個々の培養皿区画は、培養皿を保持するための透明な棚を備え、且つ上記画像取得デバイス及び上記ＦＬＩＭユニット、又は少なくとも電磁放射線を送信及び受信するその部品は、上記棚の下に配置され、且つ上記培養皿区画のいずれかに収容されている上記培養皿のいずれかに収容された上記生体物質に／から上記棚を通して電磁放射線を送信及び／又は取得することを可能にするように移動できるように適合されている。
【００７５】
これによって、ＦＬＩＭユニット又は少なくともそれの送光及び受光部が培養皿の下に配置されてもよく、それによって１つのＦＬＩＭユニットが、異なる培養皿区画に収容されている培養皿と関連付けられた画像を取得することが可能であることが達成される。
【００７６】
本発明の第１の態様の一実施例において、個々の培養皿区画は、上記個々の培養皿区画の１つ又は複数に関して、好ましくは各個々の培養皿区画に関して、以下の１つ又は複数のセンサを独立して備える：ｐＨセンサ、温度センサ、酸素センサ、二酸化炭素センサ。
【００７７】
そのようなセンサは、特定の培養皿区画における環境を観察することを可能にする。
【００７８】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置の動作を制御するための上記制御ユニットは、以下の１つ又は複数を独立して制御するように構成される：培養皿区画の１つ若しくは複数に関する上記温度調整手段、培養皿区画の１つ若しくは複数に関する上記ガス組成調整手段、上記画像取得デバイス、又は上記ＦＬＩＭユニット。
【００７９】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記制御ユニットは、ユーザが上記装置によって従われることになる所定の動作プロトコルを入力できるようにするように構成され、且つ上記制御ユニットは、上記プロトコルに従って上記装置を制御するように構成されている。
【００８０】
これによって、装置が所定のプロトコルに従って完全に自動的に動作されることができることが達成される。
【００８１】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、ユーザが上記装置によって従われることになる１つ若しくは複数の動作プロトコルをプログラム及び選択できるようにするための、且つ／又はユーザが上記装置によって従われることになる特定のプロトコルをプログラムできるようにするための、英数字キーボードなどの入力手段を備える。
【００８２】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、装置の動作の状況及び進行に関する詳細をオペレータに表示するためのディスプレイを備える。
【００８３】
そのような表示手段は、オペレータが装置の動作を制御及び観察できるようにする。
【００８４】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、上記画像取得デバイスによって取得された画像を処理するための画像処理ユニットを更に備え、且つ／又は上記ＦＬＩＭユニットによって取得された電磁放射線に関する情報を処理するためのスペクトル・データ処理ユニットを更に備える。
【００８５】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記画像処理ユニットは、上記画像取得デバイスによって取得された画像から、培養されている生体物質の１つ又は複数の特定の生体物質のタイムラプス画像系列を提供するように構成される。
【００８６】
タイム・ラプス撮像は、特定の生存生体物質の発育を、更なる処理ステップのために特定の生体物質を選択する目的でそのような物質の品質を評価する目的で観察できるようにする。
【００８７】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記スペクトル・データ処理ユニットは、上記ＦＬＩＭユニットによって取得された２つの特定されたスペクトル間の差の解析を行うことが可能であるように構成されている。
【００８８】
これによって、生体物質の代謝状態の品質の客観的評価が得られることができることが達成される。
【００８９】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記ＦＬＩＭユニットは、以下の要素の１つ又は複数を独立して備える：
−  ダイオード・レーザ又は多光子励起レーザといった、パルス・レーザ源などのレーザ源、
−  単一光子感応検出器、
−  ダイクロイック・ミラー（励起光からの蛍光信号の分離のため）、
−  対物レンズ（試料へ励起光を焦束させるため及び／又は蛍光信号を収集するため）、
−  上記ＦＬＩＭユニットを制御するための制御システム。
【００９０】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記レーザ源は、１つ又は複数の光ファイバなどの、電磁放射線を伝達するための光学手段に連結され、上記光学手段は、電磁放射線を送信によって伝達するために、生体物質の近くに向けられるように構成されている遠位端を備える。
【００９１】
これによって、電磁放射線を送信及び受信する役割を果たすＦＬＩＭユニットの部分が調査中の生体物質に対して容易に移動されることができることが達成される。
【００９２】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記単一光子感応検出器は、１つ又は複数の光ファイバなどの、電磁放射線を伝達するための光学手段に独立して連結され、上記光学手段は、電磁放射線を受信によって伝達するために、生体物質に向けられるように構成されている遠心端を備える
【００９３】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記ＦＬＩＭユニットは、ニコチン・アミド・アデニン（ＮＡＤＨ）の自己蛍光のために及び／又は生体物質の代謝に関わるフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ）の自己蛍光のために構成される。
【００９４】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）モードで動作するために構成される。
【００９５】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、ＦＲＥＴモードで又はＦＲＡＰモードで又はＰＬＩＭモード（燐光寿命撮像顕微法：Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で動作するために構成される。
【００９６】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記レーザは、３５０〜８００ｎｍ、さらには４００〜７５０ｎｍなどであり、例えば４５０〜７００ｎｍ、例えば５００〜６５０ｎｍ、さらには５５０〜６００ｎｍなどである波長範囲で動作している。
【００９７】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記レーザは、３０〜１００ピコ秒（ｐｓ）、さらには４０〜９０ピコ秒（ｐｓ）などであり、例えば５０〜８０ピコ秒（ｐｓ）、さらには６０〜７０ピコ秒（ｐｓ）などであるパルス幅で動作している。
【００９８】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、蛍光動作の間、時間領域で又は周波数領域で動作するように構成されている。
【００９９】
そのような動作モード及びパラメータの範囲は、生体物質の意図された研究のために有益であると判明した。
【０１００】
本発明の第１の態様の一実施例において、上記装置は、卵母細胞又は胚の形態の２つ以上の生体物質を培養するように構成され、上記装置は、上記２つ以上の生体物質の各特定のものに関して、上記画像取得デバイスによって取得された画像に基づいて、上記特定の生体物質の所定の形態学的状態を識別するように構成され、且つ上記装置は、特定の生体物質に関して所定の形態学的状態が達された場合に、上記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得するように構成されている。
【０１０１】
これによって、２つ以上の卵母細胞又は胚の代謝状態及び品質が同じ形態学的状態で比較されることができることが達成される。
【０１０２】
本実施例の一実施例において、上記装置は、上記２つ以上の生体物質の各特定のものに関して、上記画像取得デバイスによって取得された上記画像に基づいて、その特定の生体物質の２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態を識別するように構成され、且つ特定の生体物質に関して各そのような異なり且つ所定の形態学的状態が達された場合に、上記装置は、各そのような所定の形態学的状態に関して上記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得するように構成されている。
【０１０３】
これによって、２つ以上の卵母細胞又は胚の発育又は代謝状態及び品質の変化が、１つの形態学的状態から別のへの遷移において比較されることができることが達成される。
【０１０４】
本実施例の一実施例において、上記装置は、上記２つ以上の生体物質の各々に関して、同じ生体物質の２つ以上の異なる形態学的状態に対応するＦＬＩＭスペクトルの差を解析するために構成されている。
【０１０５】
そのような解析は上記装置によって自動的に行われてもよく、又はそのような解析を行うように装置が命令されるという意味で、それは手動で行われてもよい。
【０１０６】
本実施例の一実施例において、上記装置は、２つの異なり且つ特定の形態学的状態に帰属するＦＬＩＭスペクトルの最小差を呈する特定の生体物質を、最も安定な生体物質、したがって女性の子宮への挿入ための最善の候補として特定するように構成されている。
【０１０７】
１つの形態学的状態から次のへ移行するときに、ＦＬＩＭスペクトルの出現に関して、最小変化を呈する卵母細胞又は胚が、女性の子宮へ挿入されたときに最も妊娠成功に至りやすいということが発見されている。
【０１０８】
これらの実施例の一実施例において、上記１つ又は複数の形態学的状態は、以下と関連付けられた事象を含む群から選択される：ｔ０（授精の時間）、ｔＰＢ２（授精から第２極体の出現までの時間）、ｔＰＮａ（授精から前核出現までの時間）、ｔＰＮｆ（授精から前核消失までの時間）、ｔ２〜ｔ９（授精から対応する分裂（２〜９）までの時間）、ｔＭ（授精から桑実期へのコンパクションまでの時間）、ｔ５Ｂ（授精から胞胚形成の開始までの時間）、ｔＢ（授精から胚盤胞形成完了までの時間）、ｔＥＢ（授精から拡張胚盤胞までの時間）、ｔＨＢ（授精から孵化胚盤胞までの時間）、ｃｃ１（第１次の卵割）、ｃｃ２（第２次の卵割）、ｃｃ３（第３次の卵割）、ｃｃ４（第４次の卵割）、ｓ１（第１同期パラメータ）、ｓ２（第２同期パラメータ）、ｓ３（第３同期パラメータ）、ｔ２＿ｉｎｔ（第１分裂後の時期）、ｔ４＿ｉｎｔ（第２分裂後の時期）、ｔ８＿ｉｎｔ（第３分裂後の時期）。
【０１０９】
これらの事象は、画像取得デバイスによって容易に認識でき且つ卵母細胞又は胚の発育の明確な遷移を表す事象である。その第２の態様において、本発明は、生存生体物質の培養のためのシステムに関し、
上記システムは、
−  本発明の第１の態様に係る装置と組み合わせて
−  １つ又は複数の培養皿を備える。
【０１１０】
本発明の第２の態様の一実施例において、上記１つ又は複数の培養皿は、幾つかの培養ウェルを含む物質を有する。
【０１１１】
本発明の第２の態様の一実施例において、上記培養ウェルの数は、２〜２１個、さらには３〜２０個などであり、例えば４〜１９個、さらには５〜１８個などであり、例えば６〜１７個、さらには７〜１６個などであり、例えば８〜１５個、例えば９〜１４個、さらには１０〜１３個又は１１〜１２個などである。
【０１１２】
そのような数の培養ウェルは、研究状況で、各プロトコルが１つの培養ウェルから別の１つへ１つのパラメータによってだけ異なる幾つかの並列プロトコルを実行することを可能にする。それによって、特定の種類の生存生体物質の培養のためのプロトコルの最適化が決定されてもよい。
【０１１３】
その第３の態様において、本発明は、生存生体物質の培養のための本発明の第１の態様に係る装置の又は本発明の第２の態様に係るシステムの使用法に関する。
【０１１４】
本発明の第３の態様の一実施例において、生体物質は、卵母細胞又は胚である。
【０１１５】
本発明の第３の態様の一実施例において、使用法は、上記生存生体物質の代謝状態の品質の評価のためである。
【０１１６】
本発明の第３の態様の一実施例において、使用法は、生体物質の培養の間のその物理的及び／又は化学的条件に関する最適プロトコルを経験的に決定するためである。
【０１１７】
その第４の態様において、本発明は、生存生体物質のための最適培養条件を評価するための方法に関し、上記方法が、
ｉ）本発明の第１の態様に係る装置を提供する又は本発明の第１の態様に係るシステムを提供するステップと、
ｉｉ）上記装置の別々の培養皿区画に、１つ又は複数の生存生体物質を各々有する、少なくとも２つの培養皿を収容するステップと、
ｉｉｉ）上記生体物質を培養条件で培養し、１つの培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件が別の培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件と１つ又は複数のパラメータだけ異なるステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の間に、ＦＬＩＭスペクトルを取得するために上記装置のＦＬＩＭユニットを使用するステップと、
ｖ）上記ＦＬＩＭスペクトルに基づく生体物質の品質の評価のステップとを含む。
【０１１８】
第４の態様の一実施例において、ステップｉｖ）で取得されるＦＬＩＭスペクトルは、各上記生体物質に関して所定の且つ同様の形態学的時期に取得される。
【０１１９】
これによって、同じ形態学的時期に達した異なる生体物質の代謝状態を比較することが可能である。
【０１２０】
本実施例の一実施例において、上記所定の且つ同様の形態学的時期は、上記画像取得デバイスによって取得された画像から決定される。
【０１２１】
本発明の第４の態様の一実施例において、ステップｉｉ）〜ｖ）が繰り返され、１つの培養皿に収容されている生体物質に関する少なくとも一組の物理的及び／又は化学的培養条件が変更される。
【０１２２】
本発明の第４の態様の一実施例において、上記ＦＬＩＭスペクトルに基づいて、最も最適な物理的及び／又は化学的培養条件が決定される。第５の態様において、本発明は、生体物質のアレイの中で、最高品質を有する特定の生体物質を選択するための方法に関し、上記方法は、
ａ）本発明の第１の態様に係る装置を提供することと、
ｂ）上記装置で上記生体物質のアレイを培養することと、
ｃ）上記生体物質のアレイの各特定のものに関して、上記画像取得デバイスを使用して上記特定の生体物質の所定の形態学的状態を識別することと、
ｄ）特定の生体物質に関して所定の形態学的状態が達された場合に、上記ＦＬＩＭユニットを使用して上記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得することと、
ｅ）上記生体物質のアレイに関して得られ且つ前記物質の同じ形態学的状態と関連付けられたＦＬＩＭスペクトルを比較することと、
ｆ）ステップｅ）でなされた比較に基づいて、１つ又は複数の所定の基準に基づいて、最高品質を有するその特定の生体物質を選択することとを含む。
【０１２３】
これによって、卵母細胞又は胚などの２つ以上の生体物質の代謝状態及び品質が同じ形態学的状態で比較されることができ、そしてＦＬＩＭスペクトルの出現を基礎として、最高品質を有する生体物質が選択されることができることが達成される。
【０１２４】
本発明の第５の態様の一実施例において、上記画像取得デバイスがステップｃ）で使用されて２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態を識別し、且つステップｄ）で及び各特定の生体物質に関して、上記ＦＬＩＭユニットが使用されて２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態の各々で上記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得する。
【０１２５】
これによって、２つ以上の卵母細胞又は胚の発育又は代謝状態及び品質の変化が、１つの形態学的状態から別のへの遷移において比較されることができることが達成される。
【０１２６】
本発明の第５の態様の一実施例において、及び上記生体物質のアレイの上記生体物質の各々に関して、同じ生体物質の２つの異なる形態学的状態に対応するＦＬＩＭスペクトルの差が解析される。
【０１２７】
異なる生体物質に関しては、その特定の生体物質の２つの異なる形態学的状態に対応するＦＬＩＭスペクトルを解析することが、１つの生体物質の代謝の安定性を、別の生体物質の代謝の安定性と比較して評価することを可能にする。
【０１２８】
本発明の第５の態様の一実施例において、上記方法は、２つの異なり且つ特定の形態学的状態に帰属するＦＬＩＭスペクトルの最小差を呈する特定の生体物質を、最も安定な生体物質、したがって女性の子宮への挿入ための最善の候補として特定するステップをさらに含む。
【０１２９】
本発明の第５の態様の一実施例において、上記所定の形態学的状態の１つ又は複数は、以下と関連付けられた事象を含む群から選択される：ｔ０（授精の時間）、ｔＰＢ２（授精から第２極体の出現までの時間）、ｔＰＮａ（授精から前核出現までの時間）、ｔＰＮｆ（授精から前核消失までの時間）、ｔ２〜ｔ９（授精から対応する分裂（２〜９）までの時間）、ｔＭ（授精から桑実期へのコンパクションまでの時間）、ｔ５Ｂ（授精から胞胚形成の開始までの時間）、ｔＢ（授精から胚盤胞形成完了までの時間）、ｔＥＢ（授精から拡張胚盤胞までの時間）、ｔＨＢ（授精から孵化胚盤胞までの時間）、ｃｃ１（第１次の卵割）、ｃｃ２（第２次の卵割）、ｃｃ３（第３次の卵割）、ｃｃ４（第４次の卵割）、ｓ１（第１同期パラメータ）、ｓ２（第２同期パラメータ）、ｓ３（第３同期パラメータ）、ｔ２＿ｉｎｔ（第１分裂後の時期）、ｔ４＿ｉｎｔ（第２分裂後の時期）、ｔ８＿ｉｎｔ（第３分裂後の時期）。
【０１３０】
これらの事象は、画像取得デバイスによって容易に認識でき且つ卵母細胞又は胚の発育の明確な遷移を表す事象である。ここで本発明の好適な実施例を例示する目的で図面を参照すると、図１は、本発明の第１の態様に係るデバイス２００の実施例を斜視図で図示する。図１は、デバイス２００のハウジング２を図示する。図１に図示される実施例において、デバイスは６つの別々の培養皿区画６を備え、各々それ自身の蓋１４を有する。ハウジングは、縦方向Ｘに並びに横方向Ｙに並びに縦方向及び横方向に対して垂直な方向Ｚに伸長する。６つの別々の培養皿区画６はＸ方向に沿って整列される。
【０１３１】
図２は、本発明の第１の態様に係るデバイス２００を概略的に図示する。図２は、デバイス２００のハウジング４が６つの別々の培養皿区画６を備え、各培養皿区画が区画壁によって隣接する培養皿区画６から分離されていることを例示する。図２に、各培養皿区画６に培養皿８が収容されることが図示される。培養皿８は、図２で単純に培養皿区画の底である棚３４に置かれる。培養皿区画の底の少なくとも一部が透明であり、したがって画像取得デバイス１０及びＦＬＩＭユニット１１（又はその光学部品）が培養皿区画６の下の領域から培養皿８の１つ又は複数のウェルに収容される生体物質２に／から電磁放射線を送信及び取得できるようにする。図２では、培養皿区画の透明な底が透明な棚２４の形態である。
【０１３２】
画像取得デバイス１０及びＦＬＩＭユニット１１（又はその一部）は、画像取得デバイス及びＦＬＩＭユニット（又はその一部）を移動させるための移動手段３８に取り付けられ、それによって、画像取得デバイス及びＦＬＩＭユニットが、培養皿区画の１つ又は複数に配置される１つ又は複数の培養皿の培養ウェルで培養されている生体物質の画像を取得する目的で及びそのような生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得する目的でも、縦方向Ｘに沿って移動できるようにする。
【０１３３】
画像取得デバイス１０及びＦＬＩＭユニット１１（又はその一部）は、一般の場合、横方向Ｙ並びに方向Ｘに対して及び方向Ｙに対して垂直である方向Ｚに沿って移動するようにも構成される。
【０１３４】
単純さのために、図２で及び図３でも、画像取得デバイス１０及びＦＬＩＭユニット１１は、共通の一組の移動手段３８に配置される部材１０、１１として集合的に略図とされる。
【０１３５】
しかしながら、画像取得デバイス１０及びＦＬＩＭユニット１１には、各々それ自身の個々の一組の移動手段３８が同様に設けられてもよい。
【０１３６】
図２に、各培養皿区画が、雰囲気の組成を変更する又はその他の培養皿区画６のいずれかの雰囲気の温度を変更するなど、いかなる悪影響も課すことなく特定の区画に収容される培養皿を投入、除去及び検査することを可能にするそれ自身の専用の蓋１４を有していることが見られる。その上、このように、点検を受ける特定のもの以外のいかなる他の区画における培養皿８の内容も汚染の危険性が存在しないであろう。
【０１３７】
ほとんどの場合、各培養皿区画に所望のガス雰囲気を提供するための手段をデバイス２００に設けることが有利であろう。更にほとんどの場合、各培養皿区画における温度を調整するための加熱手段及び温度センサをデバイス２００に設けることが望ましいであろう。
【０１３８】
好ましくは、デバイス２００には、そのようなパラメータを制御するための制御手段も設けられるであろう。これは以下で更に詳述される。
【０１３９】
図３は、本発明の第１の態様に係るデバイス２００のためのそのような制御システムの詳細を概略的に例示する。図３は、ハウジング４を備えるデバイス２００を図示する。ハウジングは２つ以上の別々の培養皿区画を備える（単純さのために図３では１つの培養皿区画だけが図示される）。培養皿区画にはガスが提供される。ガスは、ガスのためのフィルタ手段４４を通して、そして培養皿区画６の内部へ、導管４２におけるガス混合ボックス４０から流れている。
【０１４０】
図３では、制御システム及びガス混合ボックスの各種の部分がデバイスのハウジング外に位置することが示される。この設計が可能でもよい。しかしながら、そのような部分をデバイスのハウジング内に配置することも望ましくてもよい。ガス混合ボックスはガスのための入口４４、４６を備える。供給されることになるガスは、好ましくは図３に図示されるようにＣＯ２及びＮ２でもよい。ガス混合ボックスに供給されるガスの流れの量は、バルブ４８、５０によって調整されてもよい。ＵＶ波長範囲の電磁放射線を放出するための手段５２がガス浄化目的で提供されてもよい。
【０１４１】
デバイスには、デバイスの動作の各種のパラメータを制御するための制御ユニット１２が設けられてもよい。そのような制御ユニットが図３に図示される。制御ユニット１２は、ユーザが所望の動作モードに関するデータを入力できるようにする英数字キーボード又はポインティング・デバイスなどの、入力手段３２に連結される。更には、制御ユニットは、ユーザがデバイスの動作の各種の設定を観察できるようにする表示手段３４に連結されてもよい。
【０１４２】
図３には、ＣＯ２センサ５８及びＯ２センサ６０も図示される。センサは、ワイヤ６２、６４を介して制御ユニット１２に連結されてもよく、そして制御ユニットは、ガスの入口を調整するためのバルブ４８、５０に連結されてもよい。このように、各別々の培養皿区画４に所望のガス混合気のかなり一定の雰囲気を維持することが可能であろう。
【０１４３】
各培養皿区画はそれ自身の専用のガス混合ボックスに接続されてもよい、又は代替的に、２つ以上の培養皿区画が同じガス混合ボックスを共有してもよい。
【０１４４】
通常、大気における通常の酸素レベルを越える培養皿区画の内部における酸素含量を提供することは望ましくないであろう。この理由で、酸素レベルは、変動する量のＣＯ２及びＮ２を供給することによって調整されてもよい。ＣＯ２レベルは次に、Ｎ２による「希釈」によって調整されてもよい。培養皿区画の内部から設けられるのは、区画の内部からガス混合ボックスへガスを再循環させるための導管６６である。
【０１４５】
培養皿区画には、温度センサ６８並びに加熱手段１８及び／又は冷却手段２０が装備されてもよい。温度センサ６８及び加熱手段１８及び冷却手段２０は、温度センサ６８の表示に基づいて、制御ユニット１２から加熱手段１８及び冷却手段２０にフィードバックが提供されるような仕方でワイヤ７４、７４’、７４”を介して制御ユニット１２に連結される。
【０１４６】
画像取得デバイス１０及びＦＬＩＭユニット、又はその送信及び受信部分など、少なくともその一部は、培養皿区画のアレイの下で少なくとも縦方向Ｘに沿って移動できる。この移動は、ワイヤ７６を介して制御ユニット１２によって制御される移動手段３８によってもたらされる。
【０１４７】
画像取得デバイス１０自体の動作に関する送信及び／又は受信情報に関する情報は、ケーブル７８を通じて送信される。
【０１４８】
図４は、ＴＣＳＰＣによる蛍光寿命測定のための単純な構成を図示する。ピコ秒ダイオード・レーザ１００がその内部クロックで動作している。ドライバ・ボックス１０２は、可撓リード線を介して取り付けられる実際のレーザ・ヘッドと物理的に別々である。これは、光学構成のどこにでも小型レーザ・ヘッドを都合よく配置することを許容する。
【０１４９】
典型的に５０ｐｓ  ＦＷＨＭの光パルスが、キュベットに収容されている生体物質２の試料に向けられる。光パルスは、好ましくは、適切な光学系を使用して生体物質に向けられている。光レベルを減衰させて検出器で単一光子統計を維持するために、ニュートラル・デンシティ・フィルタ１０４が使用される。励起に応じて、蛍光生体物質又は試料は、励起光のそれより長い波長で光を放出することになる。蛍光は、光学カット・フィルタ１０６を用いて散在する励起光に対してフィルタリングされる。
【０１５０】
その後、蛍光は、何らかの適切な収集光学系、例えば、顕微鏡対物レンズ又はただのレンズを介して光子に向けられる。２００ｐｓ  ＦＷＨＭのタイミング精度のためには、非高コストの光電子増倍管１０８で充分である。検出器から得られる電気信号、例えば、−２０ｍＶの小負パルスが前置増幅器に、次いで標準的な５０オーム同軸ケーブルを介してＴＣＳＰＣエレクトロニクス１１０に送られる。
【０１５１】
レーザ・ドライバも、光子到着時間計測のために必要とされる電気同期信号１１２を提供する。この信号（ＮＩＭ標準、−８００ｍＶの狭パルス）は、標準的な５０オーム同軸ケーブルを介してＴＣＳＰＣエレクトロニクスに送られる。
【０１５２】
図５は、図４に例示されたＴＣＳＰＣエレクトロニクスを含む構成で得られたＴＣＳＰＣヒストグラムを図示する。励起源は、１０ＭＨｚ繰返し率で動作する４７０ｎｍレーザ・ヘッドを有するＰＤＬ８００−Ｂであった。ＭＰＤからのＰＤＭ  ＳＰＡＤが検出のために使用された。左手側の狭い最高ピークが、ここではレーザ及び検出器によって支配される、システム機器応答関数（ＩＲＦ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を表す。他方の曲線は、Ａｔｔｏ４８８の水溶液からの蛍光減衰に対応する。
【０１５３】
Ａｔｔｏ４８８は、かなり短い蛍光寿命（約３．８ｎｓ）を有する蛍光色素である。計数率はレーザ率の＜１％に調節されて、パイルアップを防止した。対数目盛のプロットは、予想され得るように、減衰曲線の完全な指数性質を図示する。
【０１５４】
図６は、本発明に係る装置と共に使用されることになるＦＬＩＭユニットの一部の一実施例を例示する。図６は、レーザ・ダイオード１００が、その電磁放射線を光ケーブル１２８及び光学ケーブル・コネクタ１２６を介して、調査されることになる生体物質２に伝達していることを図示する。同様に、試料から放出される蛍光信号は、光ケーブル１２８及び光学ケーブル・コネクタ１２６を介して検出器１０８に伝達されている。
【０１５５】
第１の態様に係る機構が画像取得デバイスの他にＦＬＩＭユニットを備えるので、卵母細胞又は胚などの１つ又は複数の生存生体物質を観察し、そして画像取得デバイスを使用することによって明らかにされる特定の形態学的出現を用いて決定される、１つの生体物質から他方へ比較できる発育時期での、ＦＬＩＭスペクトルを用いて決定される、１つ又は複数の生体物質の代謝状態を比較することが可能である。
【０１５６】
したがって、本発明の第１の態様の装置において、画像取得デバイスは、生体物質の関心の特定の形態学的時期（細胞分裂の数など）を決定するために使用される。ＦＬＩＭユニットは、他方で、生体物質の代謝期を現すために使用される。
【０１５７】
それによって、各種の生体物質の代謝期及び品質が、比較できる形態学的時期に比較されることができる。
【０１５８】
これに基づいて、培養された生体物質の品質の客観的評価が、他の生体培養された生体物質と比較して、生体物質の同じ形態学的時期に関して（時間フレームの点で異なってもよい）行われることができる。
【０１５９】
そのような客観的評価は、女性の子宮への挿入のために生存卵母細胞又は胚を選択する目的に限らず、極めて高い価値がある。
【０１６０】
本発明が主に人間の受精技術に関して記載されたとはいえ、本発明がその各種の態様において、獣医学内の生殖技術を含め、獣医学を含む多くの他の技術分野で同様に適用できることが明らかである。
【０１６１】
本発明の一態様及びその実施例に関して上記及び添付の請求の範囲に記載した全ての特徴及び業績が本発明のその他の態様及びその実施例に十分に等しく当てはまることが理解されるべきである。
【符号の説明】
【０１６２】
２  生体物質
４  装置のハウジング
６  培養皿区画
８  培養皿
１０画像取得デバイス
１１  ＦＬＩＭユニット又はその一部
１２  制御ユニット
１４  培養皿区画の蓋
１６  温度調整手段
１８  加熱手段
２０  冷却手段
２２  ガス組成調整手段
２４  透明な棚
２６  ｐＨセンサ
２８  酸素センサ
３０  二酸化炭素センサ
３２  入力手段
３４  表示手段
３６  画像処理ユニット
３８  移動手段
４０  ガス混合ボックス
４２  導管
４４  ガスのための入口
４６  ガスのための入口
４８  バルブ
５０  バルブ
５２  ＵＶ照射手段
５８  ＣＯ２センサ
６０  Ｏ２センサ
６２  ワイヤ
６４  ワイヤ
６６  導管
６８  温度センサ
７４、７４’、７４”  ワイヤ
７６  ワイヤ
７８  ケーブル
１００  レーザ・ダイオード
１０２  ドライバ・ボックス
１０４  ニュートラル・デンシティ・フィルタ
１０６  カット・フィルタ
１０８  検出器
１１０  ＴＣＳＰＣエレクトロニクス
１１２  同期信号を伝達するためのケーブル
１２０  ヒストグラム
１２２  ヒストグラムのピーク
１２４  減衰曲線
１２６  光ファイバ・コネクタ
１２８  光ケーブル
２００  装置
３００  システム
Ｘ  縦方向
Ｙ  横方向
Ｚ  縦及び横方向に対して垂直な方向
【図１】
2019520077.tif 000003
【図２】
2019520077.tif 000004
【図３】
2019520077.tif 000005
【図４】
2019520077.tif 000006
【図５】
2019520077.tif 000007
【図６】
2019520077.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月28日(2019.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存生体物質（２）の培養のための装置（２００）であって、
前記装置が、
縦方向Ｘに、横方向Ｙに、並びに前記縦方向及び前記横方向に対して垂直な方向Ｚに伸長を有するハウジング（４）を備え、前記ハウジングが、
生体物質（２）を有する１つ又は複数の培養皿（８）を収容するように各々適合される、２つ以上の培養皿区画（６）を備え、
前記装置が、画像取得デバイス（１０）を備え、
前記装置が、その動作を制御するための制御ユニット（１２）を備え、
前記画像取得デバイスの少なくとも一部が、前記２つ以上の培養皿区画（６）に対して移動できるように構成され、それによって前記１つ又は複数の培養皿（８）に収容される前記生体物質（２）の１つ又は複数の画像の取得を可能にし、且つ
前記装置が、ＦＬＩＭユニット（１１）（蛍光寿命撮像顕微鏡）を備え、
前記ＦＬＩＭユニット（１１）の少なくとも一部が、前記２つ以上の培養皿区画（６）に対して移動できるように構成され、それによって前記１つ又は複数の培養皿（８）に収容される前記生体物質（２）の１つ又は複数のＦＬＩＭスペクトルの取得を可能にし、
前記ＦＬＩＭユニットが、
−  ダイオード・レーザ又は多光子励起レーザの形態のパルス・レーザ源などのレーザ源を備え、更に、付加的に、
−  単一光子感応検出器、
−  ダイクロイック・ミラー（励起光からの蛍光信号の分離のため）、
−  対物レンズ（試料へ励起光を焦束させるため及び／又は蛍光信号を収集するため）、
−  前記ＦＬＩＭユニットを制御するための制御システム、
の中の１つ又は複数の要素を独立して備え、
前記レーザ源が、１つ又は複数の光ファイバとなって、電磁放射線を伝達するための光学手段に連結され、前記光学手段が、電磁放射線を送信によって伝達するために、前記生体物質の近くに向けられるように構成されている遠位端を備える、装置（２００）。
【請求項２】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数、好ましくは全ての前記培養皿区画が、それ自身の個々の蓋（１４）を備え、各前記蓋が、前記対応する培養皿区画（６）へのアクセスを提供する開放形態と前記対応する培養皿区画が周囲から密閉されている閉鎖形態との間で移行することが可能であるように構成される、請求項１に記載の装置（２００）。
【請求項３】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数における温度の個々の且つ独立した調整のための温度調整手段（１６）を、好ましくは前記個々の培養皿区画の各々に更に備える、請求項１から２までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項４】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数における酸素、二酸化炭素及び／又は窒素の濃度などのガス組成を個々に調整するためのガス組成調整手段（２２）を、好ましくは前記個々の前記培養皿区画の各々に更に備え、且つ前記ガス混合ボックス（４０）から前記別々の培養皿区画（６）の１つ又は複数へガスを導くための１つ又は複数の導管（４２）を更に備える、請求項１から３までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項５】
前記個々の培養皿区画（６）の１つ又は複数に関して、好ましくは各個々の培養皿区画に関して、前記個々の培養皿区画が、培養皿を保持するための透明な棚（２４）を備え、且つ前記ＦＬＩＭユニット（１１）、又は少なくともその光送信部及び光受信部が、前記棚の下に配置され、且つ前記培養皿区画（６）のいずれかに収容されている前記培養皿（８）のいずれかに収容された前記生体物質（２）から前記棚（２４）を通して電磁放射線を取得することを可能にするように移動できるように適合されている、請求項１から４までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項６】
前記ＦＬＩＭユニットが、
−  ダイオード・レーザ又は多光子励起レーザといった、パルス・レーザ源の形態のレーザ源、
−  ダイクロイック・ミラー（励起光からの蛍光信号の分離のため）、
−  対物レンズ（試料へ励起光を焦束させるため及び／又は蛍光信号を収集するため）、
−  前記ＦＬＩＭユニットを制御するための制御システム、
の中の１つ又は複数の要素を独立して備える、請求項１から５までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項７】
前記ＦＬＩＭユニットが、ニコチン・アミド・アデニン（ＮＡＤＨ）の自己蛍光のために及び／又は前記生体物質の代謝に関わるフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ）の自己蛍光のために構成される、請求項１から６までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項８】
前記装置が、時間相関単一光子計数（ＴＣＳＰＣ）モードで動作するために構成される、請求項１から７までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項９】
前記装置が、ＦＲＥＴモードで又はＦＲＡＰモードで又はＰＬＩＭモード（燐光寿命撮像顕微法）で動作するために構成される、請求項１から８までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１０】
前記装置が、蛍光動作の間、時間領域で又は周波数領域で動作するように構成されている、請求項１から９までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１１】
生存生体物質の培養のためのシステム（３００）であって、
前記システムが、
−  請求項１から１０までのいずれかに記載の装置（２００）と
−  １つ又は複数の培養皿（８）と
を備える、システム。
【請求項１２】
前記装置が、卵母細胞又は胚の形態の２つ以上の生体物質を培養するように構成され、前記装置が、前記２つ以上の生体物質の各特定のものに関して、前記画像取得デバイス（１０）によって取得された画像に基づいて、前記特定の生体物質の所定の形態学的状態を識別するように構成され、且つ前記装置が、特定の生体物質に関して所定の形態学的状態が達された場合に、前記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得するように構成されている、請求項１から１１までのいずれかに記載の装置（２００）。
【請求項１３】
前記装置が、前記２つ以上の生体物質の各特定のものに関して、前記画像取得デバイス（１０）によって取得された前記画像に基づいて、その特定の生体物質の２つ以上の異なり且つ所定の形態学的状態を識別するように構成され、且つ特定の生体物質に関して各そのような異なり且つ所定の形態学的状態が達された場合に、前記装置が、各そのような所定の形態学的状態に関して前記特定の生体物質のＦＬＩＭスペクトルを取得するように構成されている、請求項１２に記載の装置（２００）。
【請求項１４】
前記装置が、前記２つ以上の生体物質の各々に関して、同じ生体物質の２つ以上の異なる形態学的状態に対応するＦＬＩＭスペクトルの差を解析するために構成されている、請求項１３に記載の装置（２００）。
【請求項１５】
生存生体物質（２）の培養のための請求項１から１０までのいずれかに記載の装置（２００）の又は請求項１１に記載のシステム（３００）の使用法。
【請求項１６】
生体物質（２）の培養の間のその物理的及び／又は化学的条件に関する最適プロトコルを経験的に決定するための、請求項１５に記載の使用法。
【請求項１７】
生存生体物質のための最適培養条件を評価するための方法であって、
ｉ）請求項１から１０までのいずれかに記載の装置（２００）又は請求項１１に記載のシステム（３００）を提供するステップと、
ｉｉ）前記装置の別々の培養皿区画に、１つ又は複数の生存生体物質を各々有する、少なくとも２つの培養皿を収容するステップと、
ｉｉｉ）前記生体物質を培養条件で培養し、１つの培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件が別の培養皿区画に収容されている生体物質に関する物理的及び／又は化学的培養条件と１つ又は複数のパラメータだけ異なるステップと、
ｉｖ）ステップｉｉｉ）の間に、ＦＬＩＭ画像を取得するために前記装置の前記ＦＬＩＭユニットを使用するステップと、
ｖ）前記ＦＬＩＭ画像に基づく前記生体物質の品質の評価のステップとを含む、方法。
【請求項１８】
前記ＦＬＩＭ画像に基づいて、最も最適な物理的及び／又は化学的培養条件が決定される、請求項１７に記載の方法。
【国際調査報告】
2019520077.tif 000009
2019520077.tif 000010
2019520077.tif 000011
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