(57)【要約】  下記性質を有する乳由来の蛋白質を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤、及び、（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が９．０〜１１．０の蛋白質画分を溶出する工程、（ｃ）前記溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過して、下記性質を有する乳由来の蛋白質を調製する工程、を有することを特徴とする、当該抗菌活性増強剤を製造する方法：（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
2012015037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記性質を有する乳由来の蛋白質を有効成分とする、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤：
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
【請求項２】
前記乳由来の蛋白質は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を２．０質量％以下の量で含有する、請求項１に記載の抗菌活性増強剤。
【請求項３】
前記乳由来の蛋白質が、アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）及び／又はアンジオジェニン−２（Angiogenin-2）である、請求項１又は２に記載の抗菌活性増強剤。
【請求項４】
前記乳由来の蛋白質は、それ自体では大腸菌に対する抗菌活性を有さない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗菌活性増強剤。
【請求項５】
前記乳由来の蛋白質は、該蛋白質とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物とを併用することにより、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の大腸菌に対する抗菌活性を７倍以上に増強する性質を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗菌活性増強剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される１又は２以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比が１／８０以上である、抗菌剤組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の抗菌剤組成物を含有する抗菌用医薬品。
【請求項８】
請求項６に記載の抗菌剤組成物を含有する飲食品。
【請求項９】
請求項６に記載の抗菌剤組成物を含有する飼料。
【請求項１０】
ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤の製造における、下記性質を有する乳由来の蛋白質の使用：
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
【請求項１１】
前記乳由来の蛋白質は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を２．０質量％以下の量で含有する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記乳由来の蛋白質が、アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）及び／又はアンジオジェニン−２（Angiogenin-2）である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記乳由来の蛋白質が、それ自体では大腸菌に対する抗菌活性を有さない、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記乳由来の蛋白質は、該蛋白質とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物とを併用することにより、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の大腸菌に対する抗菌活性を７倍以上に増強する性質を有する請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、
（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が９．０〜１１．０の蛋白質画分を溶出する工程、
（ｃ）前記溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過して、下記性質を有する乳由来の蛋白質を調製する工程、
を有することを特徴とする、前記乳由来の蛋白質を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法：
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳由来の蛋白質を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトフェリン（ＬＦ）は、生体内では、涙、唾液、末梢血、乳等に含まれている鉄結合性蛋白質であり、大腸菌（エシェリヒア・コリ）、カンジダ属酵母、クロストリジウム属細菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られている（非特許文献１）。また、ブドウ球菌及び腸球菌に対して、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有することが知られている（非特許文献２）。【０００３】
また、ラクトフェリン分解物を含有する病原性大腸菌の消化管上皮細胞への付着阻害組成物が知られている（特許文献１）。
この他にも、ラクトフェリンのペプシン消化物から得られるラクトフェリン由来ペプチドであるラクトフェリシン（登録商標）が抗菌活性を有することが知られている（非特許文献３、４）。
さらには、上記ラクトフェリンやラクトフェリン分解物にラクトフェリン類以外の成分を組み合わせて、抗菌活性を増強する方法が検討されている。【０００４】
例えば、ラクトフェリン類の分解物、ラクトフェリン関連抗菌性ペプチド、またはこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、カゼイン分解物とを有効成分とする抗菌剤が知られている（特許文献２）。【０００５】
また、ラクトフェリン類の分解物、ラクトフェリン関連抗菌性ペプチド、及びこれらの任意の混合物からなる群より選択された化合物と、金属を結合する蛋白質とを有効成分とする抗菌剤が知られている（特許文献３）。金属を結合する蛋白質には、ラクトフェリン類、トランスフェリン、コンアルブミン、カゼインホスホペプチドが記載されている。【０００６】
また、ラクトフェリン類の分解物及び／またはこの分解物の抗菌性ペプチドと、リゾチームとを有効成分とする抗菌剤が記載されている（特許文献４）。【０００７】
また、ラクトフェリン類の酵素分解物、ラクトフェリン類の酵素分解物から得られる抗菌ペプチド、またはラクトフェリン類のアミノ酸配列の一部を含む化学合成したペプチドと脂肪酸の乳化物からなる組成物が知られている（特許文献５）。【０００８】
この他、ニューキノロン系抗菌剤及びラクトフェリン類の加水分解物又はラクトフェリン類の加水分解物由来の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤が知られている（特許文献６）。【０００９】
乳中等に含まれていることが知られているアンジオジェニン（Angiogenin）は、血管形成に関与すると考えられている蛋白質であるが、その機能は不明な点が多い。アンジオジェニンに分類される蛋白質には、抗菌活性を有するものがあることが報告されている。例えばヒトアンジオジェニンはCandida albicans、及びEnterococcus faecalisに、マウスアンジオジェニン−１はCandida albicans、及びStreptococcus pneumoniaeに、マウスアンジオジェニン−４は、Enterococcus faecalis、及びListeria monocytogeneに対して抗菌活性を有しているが、アンジオジェニンの種類、及び対象の微生物の種類によっては、抗菌活性を示さないことも少なくない（非特許文献５）。
上記のように、アンジオジェニンが限定的な抗菌活性を有することは知られているが、アンジオジェニンのような乳由来の蛋白質が、それ自身の抗菌活性以上にラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平１１−２９２７８９号公報
【特許文献２】特開平５−２５５１０９号公報
【特許文献３】特開平５−３２００６７号公報
【特許文献４】特開平６−１９９６９８号公報
【特許文献５】特開平９−１２４５０４号公報
【特許文献６】特開平１１−９２３７５号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ウェルシュ（Welsh, J.K.）ら、ジャーナル・オブ・ペディアトリクス（Journal of Pediatrics）、第９４巻、１９７９年、第１〜９頁
【非特許文献２】ノンネッケ（Nonnecke, B.J.）ら、ジャーナル・オブ・デイリー・サイエンス（Journal of Dairy Science）、第６７巻、１９８４年、第６０６〜６１３頁
【非特許文献３】ベラミー（Bellamy, W.）ら、バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）、第１１２１巻、１９９２年、第１３０〜１３６頁
【非特許文献４】ベラミー（Bellamy, W.）ら、ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology）、第７３巻、１９９２年、第４７２〜４７９頁
【非特許文献５】フーパー（Hooper, L.V.）ら、ネイチャー・イミュノロジー（Nature Immunology）、第４巻、２００３年、第２６９〜２７３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来、ラクトフェリンやラクトフェリン加水分解物（以下、「ラクトフェリン類」と記載することがある）には抗菌活性が知られていた。そして、ラクトフェリン類の抗菌活性をさらに向上させるために、ラクトフェリン類と各種化合物とを組み合わせる方法が検討されてきた。
しかしながら、ラクトフェリン類の抗菌効果を顕著な程度に高める組み合わせはほとんど知られていない。【００１３】
特に、ラクトフェリン類に添加する量が極めて少量であっても、ラクトフェリン類の抗菌活性を高める方法が求められていた。
さらには、日常的な摂取による副作用がなく、安全性の高い抗菌剤が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ラクトフェリンの製造工程で得られる精製途中の蛋白質画分が、ラクトフェリン類の抗菌活性を顕著に高めることに着目し、当該蛋白質成分について鋭意検討した。【００１５】
そして、上記成分の中から、自らが抗菌活性を有しないか、又は限られた抗菌スペクトルを有する乳由来の蛋白質が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を顕著に高めることを確認し、本発明を完成するに至った。【００１６】
前記課題を解決する本願第一の発明は、下記性質を有する乳由来の蛋白質を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤、である：
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。【００１７】
本願第一の発明は、乳由来の蛋白質が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を２．０質量％以下の量で含有することを好ましい態様としている。
また、本願第一の発明は、乳由来の蛋白質が、アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）及び／又はアンジオジェニン−２（Angiogenin-2）であることを好ましい態様としている。
さらに、本願第一の発明は、前記乳由来の蛋白質が、それ自体では大腸菌に対する抗菌活性を有さないことを好ましい態様としている。  さらに、本願第一の発明は、前記乳由来の蛋白質が、該蛋白質とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物とを併用することにより、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の大腸菌に対する抗菌活性を７倍以上に増強する性質を有することを好ましい態様としている。【００１８】
本願第二の発明は、本願第一の発明に係る抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される１又は２以上とを含有し、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比が１／８０以上である、抗菌剤組成物である。【００１９】
本願第三の発明は、本願第二の発明に係る抗菌剤組成物を含有する抗菌用医薬品である。【００２０】
本願第四の発明は、本願第二の発明に係る抗菌剤組成物を含有する飲食品である。【００２１】
本願第五の発明は、本願第二の発明に係る抗菌剤組成物を含有する飼料である。【００２２】
本願第六の発明は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤の製造における、下記性質を有する乳由来の蛋白質の使用である：
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
本願第六の発明は、前記乳由来の蛋白質が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を２．０質量％以下の量で含有することを好ましい態様としている。
また、本願第六の発明は、乳由来の蛋白質が、アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）及び／又はアンジオジェニン−２（Angiogenin-2）であることを好ましい態様としている。
さらに、本願第六の発明は、前記乳由来の蛋白質が、それ自体では大腸菌に対する抗菌活性を有さないことを好ましい態様としている。
さらに、本願第六の発明は、前記乳由来の蛋白質が、該蛋白質とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物とを併用することにより、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の大腸菌に対する抗菌活性を７倍以上に増強する性質を有することを好ましい態様としている。【００２３】
本願第七の発明は、（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が９．０〜１１．０の蛋白質画分を溶出する工程、（ｃ）前記溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過して、下記性質を有する乳由来の蛋白質を調製する工程、を有することを特徴とする、前記乳由来の蛋白質を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法、である：
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の抗菌活性増強剤の二次元電気泳動の結果を示す図（写真）である。
【図２】本発明の抗菌活性増強剤のデンシトメーター解析図（一部写真）を示す。
【図３】ヒト・ラクトフェリシンの一次構造（アミノ酸配列：配列番号１、配列番号２）を示す。
【図４】ウシ・ラクトフェリシンの一次構造（アミノ酸配列：配列番号３）を示す。
【図５】本発明の抗菌活性増強剤のゲル濾過クロマトグラフィー溶出曲線を示す図（一部写真）。
【図６】二次元電気泳動での同一スポットの測定から得られた、アンジオジェニン−１の質量分析による同定結果を示す。上段はウシ・アンジオジェニン−１（配列番号４）、中段は配列番号４の前に２３残基のアミノ酸が付加したウシ・アンジオジェニン−１前駆体（配列番号５）、下段は配列番号４の前に配列番号５と一部異なる２３残基のアミノ酸が付加したウシ・アンジオジェニン−１前駆体（配列番号６）のアミノ酸配列である。下線部は、質量分析の結果に基づくデータベース検索により、ウシ・アンジオジェニン−１の配列中でヒットした部分を示す。
【図７】二次元電気泳動での同一スポットの測定から得られた、アンジオジェニン−２の質量分析による同定結果を示す。上段はウシ・アンジオジェニン−２（配列番号７）、下段は配列番号７の前に２４残基のアミノ酸が付加したウシ・アンジオジェニン−２（配列番号８）のアミノ酸配列である。下線部は、質量分析の結果に基づくデータベース検索により、ウシ・アンジオジェニン−２の配列中でヒットした部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の実施可能な範囲内で自由に変更することができる。尚、本明細書において量比を示す百分率は特に断りのない限り、質量による表示である。
【００２６】
［抗菌活性増強剤］
本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が本来的に有する抗菌活性を増強する効果を有するものである。
本発明の抗菌活性増強剤は、以下に記載する乳由来の蛋白質のみからなるものであってもよいが、該乳由来の蛋白質を有効成分として含む限り、他の成分、例えば後述する製剤化に用いられる成分を含んでいてもよい。また、本発明の抗菌活性増強剤は、アンジオジェニン−１及び／又はアンジオジェニン−２を有効成分として含む限り、アンジオジェニン−１及び／又はアンジオジェニン−２以外の乳由来の蛋白質（但し、ラクトフェリンを除く）を含んでいてもよいが、抗菌活性増強剤中に含まれる蛋白質に対するアンジオジェニン−１及び／又はアンジオジェニン−２の純度は、好ましくは０．００２％以上、より好ましくは０．０１％以上、さらに好ましく０．１％以上、特に好ましくは１．０％以上である。ラクトフェリンの混在量については後述する。
また、本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と液体同士で混合してもよく、粉末同士で混合してもよい。粉末化して混合することで、錠剤、トローチ等の製剤化の際に操作が容易となる。
【００２７】
本発明の抗菌活性増強剤は、有効成分である乳由来の蛋白質が抗菌活性は有していないか、抗菌活性を有しているとしても、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物よりも抗菌活性が低いか、又は限られた抗菌スペクトルを有していることを特徴としている。そして、本発明の抗菌活性増強剤は、それ自体が抗菌活性を有していなくても、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と併用又は混合したときに、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を高める作用を有する。また、本発明の抗菌活性増強剤は、それ自体が抗菌活性を有している場合であっても、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と併用又は混合したときに、抗菌活性増強剤及びラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の各々の抗菌活性を合わせたよりも高い抗菌活性を示す。「抗菌活性の増強」には、前記のいずれの場合も含まれる。
【００２８】
本発明の一形態の抗菌活性増強剤を添加したラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の効果は、後記する本試験例において示されるとおり、前記抗菌活性増強剤を添加していないラクトフェリン又はラクトフェリン分解物と比較して、大腸菌の菌数を少なくとも１／７以下に低減することができる。換言すればＣＦＵ（colony forming unit）で表される大腸菌の量を１／７以下に低減することができるのである。
また、本発明の他の形態の抗菌活性増強剤を添加したラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の効果は、抗菌活性増強剤を添加していないラクトフェリン又はラクトフェリン分解物と比較して、大腸菌の菌数を少なくとも１／３５以下に低減することができる。
【００２９】
すなわち、本発明の抗菌活性増強剤における抗菌活性の増強とは、抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物とを併用することにより、特定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が有する大腸菌に対する抗菌活性を好ましくは７倍以上、より好ましくは３５倍以上に増強する性質を有するものである。
ある微生物に対して抗菌活性増強剤が抗菌活性を有さない場合は、特定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物により微生物の菌数が１／ｎに低減し、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物と抗菌活性増強剤を併用したときに微生物の菌数が1／ｍ（但しｍ＞ｎ）に低減すれば、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が有する抗菌活性はｍ／ｎに増強されたことになる。抗菌活性増強剤が前記微生物に対する抗菌活性を有している場合であっても、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が持つ抗菌活性よりも十分に低い場合は、増強の程度はｍ／ｎで近似される。
抗菌活性の増強の程度の評価は、一定量のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物に、本発明の抗菌活性増強剤を種々の量で加えたときに、最も高い抗菌活性を示す条件で行うことが好ましい。但し、抗菌活性増強剤が抗菌活性を有している場合は、抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を併用したときの抗菌活性が、各々同じ量の抗菌活性増強剤及びラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の各々の抗菌活性を合わせたよりも高いことが前提である。
なお、本発明の抗菌活性増強剤は、抗菌作用増強用医薬組成物、抗菌作用増強剤、及び抗菌作用増強用添加剤として使用することも可能である。
【００３０】
本発明において、「抗菌」とは微生物の増殖を抑制すること（抗菌）、対象物から微生物を除いて減らすこと（除菌）、微生物を殺すこと（殺菌）のいずれの概念も含んでいる。
従って、本発明の抗菌活性増強剤は、除菌補助剤又は殺菌補助剤と言い換えることができる。同様に、本発明の抗菌活性増強剤は、除菌組成物又は殺菌組成物と言い換えることができる。
【００３１】
本発明において、増強される抗菌活性の対象となる微生物は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物が抗菌作用を示す微生物であれば特に制限されないが、例えば、エシェリヒア属、サルモネラ属、リステリア属、バシラス属、クロノバクター属、クレブシエラ属、シュードモナス属等のグラム陰性細菌、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属等のグラム陽性細菌、カンジダ属酵母等の真菌、等が挙げられる。
【００３２】
［乳由来の蛋白質］
本発明の有効成分である乳由来の蛋白質は、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳を乳原料として用いて陽イオン交換処理や限外膜濾過処理によって調製することができるものである。
また、前記乳由来の蛋白質は、乳原料中にホエイ（乳清）蛋白質が含まれるものであれば特に制限なく調製することができる。
さらに、前記乳由来の蛋白質は、乳や乳製品を原料として得られる蛋白質に限られず、乳に含まれる蛋白質と同等の構造を有する限り、乳以外の動物の体液や組織から得られる蛋白質、又は、化学合成品もしくは組換え蛋白質であってもよい。また、アンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２又はそのフラグメントは、配列番号４〜８のいずれかのアミノ酸配列を有するものに限られず、それらの保存的バリアントであってもよい。保存的バリアントとしては、配列番号４〜８のアミノ酸配列において、１又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等を含む配列を有する蛋白質、又は、配列番号４〜８のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質であって、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する蛋白質が挙げられる。
【００３３】
［ラクトフェリン］
本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリンは、市販品の他、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の初乳、移行乳、常乳、末期乳等、これらの処理物である脱脂乳、ホエイ等からイオン交換クロマトグラフィー等の常法により分離したラクトフェリン、ラクトフェリンから常法により鉄を除去したアポラクトフェリン、アポラクトフェリンに鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属を一部又は完全にキレートさせた金属不飽和ラクトフェリン、または金属飽和ラクトフェリンのいずれであっても使用することができる。
また、組換えＤＮＡ技術により得られる組換え真菌、組換え乳牛（トランスジェニック・カウ）等により生産されるヒト・ラクトフェリン等も、同様に本発明に使用することができる。
【００３４】
［ラクトフェリン加水分解物］
本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリン加水分解物は、市販品の他、本発明のラクトフェリンを酸又は酵素で加水分解して得られる加水分解物を使用することができ、例えば特願平３−１７１７３６号の発明に記載された方法によって得ることができる。
なお、本発明において抗菌活性の増強の対象となるラクトフェリン加水分解物とは、当該ラクトフェリン加水分解物から単離又は精製されたラクトフェリン由来ペプチドも含まれるものである。
ラクトフェリン由来ペプチドとしては、例えば、ラクトフェリシン（登録商標）を例示することが可能である。
図３は、ヒト・ラクトフェリシン（ラクトフェリシンＨ）の一次構造（アミノ酸配列：配列番号１、２）、図４はウシ・ラクトフェリシン（ラクトフェリシンＢ）の一次構造（アミノ酸配列：配列番号３）をそれぞれ示す。
【００３５】
酸によりラクトフェリンの加水分解を行う場合は、ラクトフェリンを水溶液とし、これに無機酸又は有機酸を添加し、所定温度に所定時間加熱して加水分解する。酵素により加水分解を行う場合は、ラクトフェリンを水溶液とし、使用する酵素の至適ｐＨに調製し、これにペプシン、トリプシン等の酵素を加え、所定温度に所定時間保持して加水分解する。加水分解後は酵素を常法により失活させる。酸又は酵素による加水分解で得られた分解物は、抗菌性を有するペプチドを含有する、種々の分子量を有する分解物の混合物である。上記加水分解による分解度は、６〜２０％の範囲が望ましい。なお、上記分解度は、ケルダール法により試料の全窒素を、またホルモール滴定法により試料のホルモール態窒素を測定し、これらの値から次式により算出される。
【００３６】
分解度＝（ホルモール態窒素／全窒素数）×１００
【００３７】
上記、酸又は酵素によって加水分解して得られた反応液（ラクトフェリン分解物の溶液）は、常法により冷却し、必要に応じて常法により中和、脱塩、脱色し、更に必要に応じて分画し、得られた溶液をそのまま、又は濃縮した濃縮液で、あるいは濃縮後乾燥した粉末として使用する。また、前記のとおり、加水分解物からラクトフェリシンのような抗菌性ペプチドを単離してもよい。
【００３８】
［本発明の有効成分］
本発明における抗菌活性増強剤の有効成分は、乳由来の単一又は複数の蛋白質成分からなっており、これらの一成分または複数の成分が、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の抗菌活性を増強する作用効果を有している。
有効成分である「乳由来の蛋白質」は、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の抗菌活性を増強する作用を有する限り、単一の蛋白質であってもよく、２種以上の蛋白質の混合物であってもよい。
【００３９】
本発明者らは、抗菌活性を増強する成分である乳由来の蛋白質が、少なくとも１）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有すること、２）分子量が３０ｋＤａ以下であること、及び、３）等電点が９．０〜１１．０であること、を満たす成分であることを突き止めている。
【００４０】
そして、前記乳由来の蛋白質は、乳由来の蛋白質全量に対して２．０質量％以下の含有量で、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含んでいてもよい。ここで、本発明の有効成分となり得る前記乳由来の蛋白質は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を全く含まないことが好ましいが、有効成分の乳由来の蛋白質中に占めるラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の割合が、質量比で２．０％以下であれば、乳由来の蛋白質全体として抗菌活性は示さないものであることを確認している。
【００４１】
さらには、後記する実施例１において、二次元電気泳動で得られたスポットに含まれる成分のいずれか一成分または複数の成分の組み合わせによって抗菌活性が増強されるものと推定された。そして、アンジオジェニン−１、又は、アンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２の混合物が、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強することが確認されている。
【００４２】
本発明の抗菌活性増強剤の有効成分である乳由来の蛋白質として具体的には、アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）、アンジオジェニン−２（Angiogenin-2）、及びこれらの混合物が挙げられる。ウシ由来のアンジオジェニン−１、及びアンジオジェニン−２のアミノ酸配列から予想される等電点は、各々９．１、及び、９．８〜１０である。ウシ由来のアンジオジェニン−１、及びアンジオジェニン−２は、大腸菌に対しては抗菌活性を実質的に有していない。
乳由来の蛋白質は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する限り、アンジオジェニン−１及び／又はアンジオジェニン−２の二量体、もしくはフラグメント、又はそれらの混合物であってもよい。
【００４３】
［抗菌活性増強剤の使用量］
本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物に対して使用する場合、抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質：ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物（質量比）は、好ましくは１：８０〜１：１、より好ましくは１：８０〜１：１０、より好ましくは１：６０〜１：１０、さらに好ましくは１：４０〜１：１０である。
【００４４】
また、本発明の抗菌活性増強剤を、ラクトフェリン分解物の中でも特にラクトフェリン由来のペプチドであるラクトフェリシン（登録商標）に併用又は混合して使用するときは、抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質：ラクトフェリシン＝１：１〜４：１の割合で使用することが好ましく、抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質：ラクトフェリシン＝１．５：１〜２．５：１の割合で使用することがより好ましい。
【００４５】
［抗菌剤組成物］
本発明の抗菌剤組成物は、本発明の抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物からなる群から選択される１又は２以上とを含有し、ラクトフェリン、及び／又はラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比が１／８０以上であることを特徴としている。ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比は、１／８０以上であれば特に制限されないが、好ましくは１／４０以上、より好ましくは１／２０以上である。
ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物に対する抗菌活性増強剤中の乳由来の蛋白質の質量比の上限は特に制限されないが、例えば、１／１以下、１／２以下、１／５以下、又は１／１０以下でも高い抗菌活性が期待できる。
尚、通常のホエイ中に含まれるアンジオジェニンとラクトフェリンの質量比は、およそ１：２００である。
本発明の抗菌剤組成物は、医薬品、飲食品、飼料、化粧品、医薬部外品等に配合することができる。
【００４６】
［医薬品］
本発明の医薬品は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の医薬品の形態としては特に制限されず、公知の方法により種々の態様に製剤化して投与することができ、好適な実施の態様において経口投与することができる。製剤化する際には、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を混合した状態で使用される。
【００４７】
例えば、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を薬学的に許容され得る賦形剤等の任意の添加剤を用いて製剤化することにより製造できる。
製剤化する場合、製剤中のラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の含有量は特に限定されるものではない。基本的に本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物による副作用はほとんどないと考えられるが、医薬品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。そして、医薬品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン（登録商標）からなる組成物の含有量としては、通常０．０１〜６質量％、好ましくは１〜５質量％である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
【００４８】
製剤化にあたっては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用できる。具体的製剤として、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む。）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む。）、顆粒剤（コーティングしたものを含む。）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、又はこれらの製剤学的に許容され得る徐放製剤等を例示することができる。
【００４９】
これらの製剤に用いる担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等、結合剤としては例えば澱粉、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を例示することができる。
【００５０】
また、崩壊剤としては、澱粉、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等を、それぞれ例示することができる。
【００５１】
更に、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等、着色剤としては医薬品に添加することが許容されている赤色２号、黄色４号、及び青色１号等を、それぞれ例示することができる。
【００５２】
錠剤及び顆粒剤は、必要に応じ白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、及びメタアクリル酸重合体等により被膜することもできる。
【００５３】
また、併用する医薬組成物は、本発明の薬剤中に有効成分として含有させてもよいし、本発明の薬剤中には含有させずに別個の薬剤として組み合わせて商品化してもよい。
なお、抗菌用の医薬組成物としては、歯みがきや口腔内洗浄液等の医薬品又は医薬部外品等を例示することができる。
【００５４】
［飲食品］
本発明の飲食品は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の飲食品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。そして、飲食品中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン（登録商標）からなる組成物の含有量としては、通常０．０１〜６質量％、好ましくは１〜５質量％である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
【００５５】
本発明の飲食品の形態としては特に制限されず、例えば、ラクトフェリンやラクトフェリン加水分解物の粉末やこれらの水溶液（シロップ等）等を本発明の抗菌活性増強剤とともに配合した清涼飲料、乳飲料等又はこれらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末；加工乳、発酵乳等の乳製品；育児用調製粉乳；経腸栄養食；機能性食品等が挙げられ、さらに、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、餃子の皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物、パン等を挙げることができる。
【００５６】
このような飲食品は、例えば、ラクトフェリン（ラクトフェリン粉末やラクトフェリン水溶液（シロップ等）等の形態を含む）に、本発明の抗菌活性増強剤、及び、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等を配合することにより、製造することができる。
また、飲食品の好適な形状としては、液状、タブレット状のサプリメント等を例示することができる。
【００５７】
［飼料］
本発明の飼料は、本発明の抗菌剤組成物、又は、本発明の抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を含有することを特徴としている。
本発明の飼料中における抗菌活性増強剤とラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物からなる組成物の含有量としては、０．１〜６０質量％、好ましくは１０〜５０質量％である。そして、飼料中における抗菌活性増強剤とラクトフェリシン（登録商標）からなる組成物の含有量としては、通常０．０１〜６質量％、好ましくは１〜５質量％である。
抗菌活性増強剤と、ラクトフェリン、及びラクトフェリン加水分解物との量比は、抗菌剤組成物について記載したのと同様である。
【００５８】
本発明の飼料の形態としては特に制限されず、例えば、ラクトフェリンやラクトフェリン加水分解物の粉末やこれらの水溶液（シロップ等）等を本発明の抗菌活性増強剤とともに配合することができ、例えば、本発明の抗菌活性増強剤及びラクトフェリンに、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を配合することにより製造できる。飼料の形態としては、例えば、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
【００５９】
［抗菌活性増強剤の製造方法］
本発明の抗菌活性増強剤は、例えば、以下の工程を有する方法により製造することができる。
すなわち、（ａ）乳原料を陽イオン交換樹脂に接触させて乳原料中の蛋白質を陽イオン交換樹脂に吸着処理する工程、（ｂ）前記吸着処理後の陽イオン交換樹脂を洗浄処理し、溶出溶媒を通液して、等電点が９．０〜１１．０の蛋白質画分を溶出する工程、（ｃ）前記溶出した蛋白質画分を分画分子量３０ｋＤａの限外濾過膜により膜濾過して、下記性質を有する乳由来の蛋白質を調製する工程、を有することを特徴とする、前記乳由来の蛋白質を有効成分とするラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性増強剤を製造する方法である。
（Ａ）ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強する作用を有する。
（Ｂ）分子量が３０ｋＤａ以下である。
（Ｃ）等電点が９．０〜１１．０である。
【００６０】
さらに、本発明の製造方法は、前記（ｃ）工程に続いて、（ｄ）前記透過液を、分画分子量１０ｋＤａの限外濾過膜に通液して１０ｋＤａ以上の濃縮液を回収する工程、を含めることもできる。
【００６１】
本発明の抗菌活性増強剤の製造方法は、通常のラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼの製造方法と一部共通するが、（ｂ）〜（ｄ）の工程を有する点で相違するものである。
【００６２】
本発明の製造方法では、３０ｋＤａ以下の低分子蛋白質のみを回収するので、分子量約８万ダルトンのラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼは殆ど含まれない。
すなわち、本発明の抗菌活性増強剤は、分子量の点でラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼとは異なっている。
さらに、本発明の抗菌活性増強剤の製造方法について、以下に詳細に説明する。
【００６３】
まず、乳原料を陽イオン交換体に接触させて吸着処理を行う。
乳原料としては、前記抗菌活性増強作用を有する蛋白質を含む限り特に制限されず、哺乳類（例えば、ヒト、ウシ、水牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ等）の生乳の他、脱脂乳等の加工乳、ホエイ等の分画物、組換え乳牛（トランスジェニック・カウ）等により生産される乳等が挙げられる。乳は、初乳、移行乳、常乳、末期乳等のいずれであってもよい。
【００６４】
陽イオン交換体としては、イオン交換基として弱酸性基又は強酸性基を有するものが用いられる。弱酸性のイオン交換基又は強酸性基としては、イオン交換基としての目的とする働きを有する交換基を任意で選択することができる。弱酸性のイオン交換基の例としては、カルボキシル基、カルボキシメチル基等が挙げられる。強酸性のイオン交換基の例としては、スルホプロピル基等が挙げられる。
【００６５】
陽イオン交換体は特に限定されず、必要に応じて任意で選択可能である。好ましい陽イオン交換体の例としては、架橋型の多糖類（アガロース、デキストラン、セルロース等）、親水性シリカゲル、合成ポリマー等からなる多孔性粒子に弱酸性又は強酸性のイオン交換基を導入したもの等が挙げられる。弱酸性のイオン交換体の具体例としては、セパビーズＦＰ−ＣＭ１３（三菱化学社製、交換基：カルボキシメチル基）や、ＣＭ−セファデックスＣ−５０（ＧＥヘルスケア社製、交換基：カルボキシメチル基）、ＣＭ−セファロース−ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製、交換基：カルボキシメチル基）が挙げられる。また、強酸性のイオン交換体の具体例としては、ＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、ＳＰ−セファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア社製）が挙げられる。
【００６６】
陽イオン交換体の樹脂の形、サイズ、表面状態、材質等は任意であり必要に応じて選択可能である。使用形態の例としては、イオン交換体樹脂が既に充填されたプレパックカラムや、陽イオン交換体の樹脂ビーズをカラム等の媒体に充填したもの等が挙げられる。これらの場合、一種類の陽イオン交換体を１つの媒体と組み合わせて用いる事が簡便性の面から好ましい。しかしながら、必要に応じて複数の媒体のそれぞれに樹脂ビーズを詰めたものを直列または並列に接続してクロマトグラフィーを行ってもよい。媒体の形状は必要に応じて選択できるが、洗浄が容易で、かつ含まれる樹脂ビーズ等に多くの接触面を与える形状であることが好ましく、また内壁は凹凸の無い平らな表面であることが好ましい。
【００６７】
具体的には円筒形（円柱状、棒状）や円錐状等、円形面を有する形状が媒体の形状として好ましく使用できる。媒体の材質は任意で選択できるが、好ましくはステンレス、ガラス、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アクリル樹脂等が使用できる。媒体のサイズは、適宜処理スケールによって選択してよく、例えば数立方センチメートルから数立方メートルの規模まで任意に選択できる。
本発明に好ましく使用することができる市販のプレパックカラムとしては、Ｈｉｐｒｅｐ  ＣＭＦＦ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製、交換基：カルボキシメチル基）、Ｈｉｐｒｅｐ  ＳＰＦＦ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製、交換基：スルホプロピル基）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０シリーズ（東ソー社製、交換基：カルボキシメチル基）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０シリーズ（東ソー社製、交換基：スルホプロピル基）等が挙げられる。
【００６８】
乳原料と陽イオン交換体との吸着処理（接触）は任意で選択可能である。吸着処理は例えば、バッチ式攪拌法、カラム連続法等の方法で行うことができる。乳原料と陽イオン交換体を十分に接触させることができれば、いずれの処理も実施可能である。１つの処理で行っても、複数の吸着処理を組み合わせて行っても良い。
【００６９】
バッチ式の場合、一定量の乳原料から多くの収量を望む場合には多くの陽イオン交換体を用い、一定量の陽イオン交換体で多くの収量を望む場合には多くの乳原料を用いることが適当である。バッチ式における乳原料と陽イオン交換体の混合体積比率は、陽イオン交換体の吸着能や具体的な吸着処理方法に応じて任意に調整することができる。
【００７０】
ここで、陽イオン交換体の特性は、硬質タイプと軟質タイプの２つに大きく区分されるが、本発明ではいずれのタイプも使用可能である。
硬質タイプは、イオン強度またはｐＨによってイオン交換体自身の体積はほとんど変化せず、また流速の変化等により陽イオン交換体にかかる圧力が変化しても陽イオン交換体自体の体積はほとんど変わらない。したがって、硬質タイプは、陽イオン交換体をカラム内に保持して高流速で通液するカラム連続法により適している。
【００７１】
一方、軟質タイプの陽イオン交換体はイオン強度またはｐＨによってイオン交換体自身の体積が大きく変化し、また流速の変化等により陽イオン交換体にかかる圧力が変化すると陽イオン交換体自体の体積が容易に変化する。そのため、軟質タイプの陽イオン交換体をカラム内に保持して高流速で通液することは困難である。特に脱脂乳やホエイ等を通液する時は他の塩類溶液等を通液する時に比べて陽イオン交換体層内で大きな圧力損失が生じる。したがって、軟質タイプの陽イオン交換体は、もっぱらバッチ法に適している。
なお、前記のセパビーズＦＰ−ＣＭ１３（三菱化学社製）、ＣＭ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、ＳＰ−セファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、ＳＰ−セファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア社製）は硬質タイプであり、ＣＭ−セファデックスＣ−５０（アマシャム社製）は軟質タイプである。
【００７２】
乳原料と陽イオン交換体を吸着処理させる温度は、０℃未満では乳原料の凍結や、粘度上昇等が生じる恐れがあり、６０℃を超える場合は、乳中の蛋白質、例えば乳中の塩基性蛋白質が変性する可能性があるため、０〜６０℃の範囲で行われる事が好ましい。なお、２５〜６０℃であっても、吸着に長時間を要する場合等では、乳中の蛋白質、例えば乳中の塩基性蛋白質が少しずつ変性していく可能性があることから、特に０〜２５℃で行われることが好ましい。また、未殺菌の乳原料を使用する場合は、細菌の繁殖を防ぐため、０〜１０℃で実施することが望ましい。
【００７３】
乳原料と陽イオン交換体の吸着処理時間（接触時間）については、吸着処理時の温度、採用する吸着処理方式（バッチ式またはカラム連続法）等を勘案して適宜条件を選択することができる。例えば、バッチ式の場合は、乳原料と陽イオン交換体の吸着処理時間は１分以上２４時間以下が好ましく、１０分以上６時間以下がより好ましい。また、カラム連続法の場合は、線流速１０ｃｍ／ｈ以上１０００ｃｍ／ｈ以下であることが好ましい。
【００７４】
次に、吸着処理後の陽イオン交換体を洗浄処理する。このときの洗浄液としては、イオン強度が０．０７未満と低い塩類水溶液、又は中性若しくは弱酸性領域の緩衝液を用いることも可能であるが、製造コストの面から考慮すると水で洗浄することが好ましい。
【００７５】
吸着処理後の陽イオン交換体については、使用された乳原料をどのような方法で洗浄除去してもよい。たとえば乳原料と陽イオン交換体が入った容器から陽イオン交換体のみを移動して他の場所で洗浄しても良いし、前記容器から乳原料を移動させてその後陽イオン交換体を容器中で洗浄しても良い。
【００７６】
次いで、洗浄処理を終えた陽イオン交換体に溶出溶媒を接触させる。これにより、陽イオン交換体から該溶出溶媒中に目的とする蛋白質を溶出させて溶出液を得る。
この工程で使用する溶出溶媒は、イオン強度が０．０７以上１．７以下の範囲のものが好ましく、０．１６以上１．０以下の範囲のものがより好ましく、０．２５以上０．６以下の範囲のものが特に好ましい。これにより、等電点が９．０〜１１．０の溶出画分を得ることが可能である。
【００７７】
該溶出溶媒としては、イオン強度を上記の範囲に調整した中性又は弱酸性領域の緩衝液を用いることもできる。しかしながら、製造コストの面から考慮すると塩類のみを溶解した水溶液（塩類溶液）を用いることがより好ましい。本願で使用できる塩類は必要に応じて一種あるいは二種以上の組合せを任意で選択可能である。
【００７８】
好ましい塩類溶液は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び塩化マグネシウム等からなる群から選ばれる１種又は２種以上の混合物からなる塩類の水溶液であり、具体的には１〜５％の塩化ナトリウム溶液、好ましくは１．５〜３．５％の塩化ナトリウム溶液、等が例示される。
【００７９】
次に、得られた溶出液に対して、限外濾過膜を用いた膜分離法によって膜処理を行う。これによって溶出液を濃縮し、該溶出液中に沈澱を生成させる。
【００８０】
限外濾過膜の運転方法は、水及び分画分子量以下の分子量を有する成分を透過させて除去する通常の限外濾過法と、膜を透過した透過液と等量の水を、膜上の保持液に添加しながら連続運転する流水濾過法（ダイアフィルトレーション）の２つに区分されるが、本発明においてはいずれの方法も使用できる。特に、後者の流水濾過法は、濃縮と同時に脱塩処理を行うことができるとともに、保持液からの低分子量成分を高度に除去できる点でより好ましい。
なお、前者の通常の限外濾過法を用いた場合には、限外濾過の後に、透析やゲル濾過等の方法で脱塩処理を行うことが好ましい。
【００８１】
限外濾過膜は、一般に市販されている限外濾過膜であれば何れも使用できる。具体例としては、ＩＲＩＳ３０３８膜及びＩＲＩＳ３０７２膜（いずれもローヌ・プーラン社製）、あるいはＧＲ−６１ｐｐ膜（ＤＤＳ社製）等が挙げられ、いずれも分画分子量が３０ｋＤａ（分子量３０ｋＤａをカットオフ）である性質を有するものである。
限外濾過膜の材質は有機材料製又は無機材料製の何れであっても使用可能であり、コスト面、汎用性等を考慮して選択すればよい。
限外濾過処理時の溶出液の温度は、使用する膜の耐熱温度以下であれば（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら８０℃以下）実施可能であるが、蛋白質の変性を防ぐ観点からは、０〜６０℃、例えば２５〜６０℃、又は０〜２５℃が挙げられる。
【００８２】
限外濾過時の圧力は、使用する膜の耐圧限界以下であれば（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０．６ＭＰａ以下）いずれの圧力でも可能である。尚、耐圧限界値付近での使用は膜の寿命を縮める可能性があるため、耐圧限界の２／３以下（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０４ＭＰａ以下）で行うことが好ましい。
使用する限外濾過膜モジュールは、管型、中空糸型、平膜型、スパイラル型等いずれの形式でも可能である。ただし、中空糸型内圧式等のモジュールでは、中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、圧力等を考慮して行うことが好ましい。
【実施例】
【００８３】
次に実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
まず、実施例及び試験例で使用した手法及び試験法について記載する。【００８４】
［二次元電気泳動］
本発明の抗菌活性増強剤の成分組成の特定のために、ＺＯＯＭ  ＩＰＧ  Ｒｕｎｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen社製）を用いて二次元電気泳動を行った。第一次元目は、ｐＨ範囲３〜１０のＺＯＯＭ  Ｓｔｒｉｐ  ｐＨ３−１０ＮＬを用いた。第二次元目は、ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＺＯＯＭ  Ｇｅｌを用いた。そして、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen社製）で染色した。【００８５】
［質量分析］
二次元電気泳動により得られた染色後のゲルをデンシトグラフ（ＡＴＴＯ社製）で撮影し、解析ソフトによる相対的定量を行った。得られたスポットをゲルから切り出し、目的蛋白を脱色し、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（商品名：ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ、ＢＲＵＫＥＲ社製）にて質量分析し、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）検索により蛋白質を同定した。【００８６】
［抗菌活性増強試験］
抗菌活性増強試験は、本発明の抗菌活性増強剤をラクトフェリン又はラクトフェリン分解物に混合した試料について、抗菌活性を測定するものである。対照として、ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物のみの試料についても抗菌活性を測定した。
具体的な試験の手順は下記の通りである。【００８７】
（１）試料の調製
少なくとも下記の試料を調製した。ラクトフェリンの試験では、試料２について抗菌活性増強剤の濃度が異なる２種類を調製した。
試料１：ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等
試料２：ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物等、及び抗菌活性増強剤の混合物
試料３：抗菌活性増強剤【００８８】
（２）試験方法
１％のＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ培地を用い、５ｍＬのポリスチレンチューブに大腸菌Ｋ−１２株を植菌し、３７℃のインキュベーター内で６時間前培養し、試験用菌液とした。そして、９６穴プレート上にて、上記の試料と共に、前培養した大腸菌を１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう添加し、３７℃にて設定時間培養した。設定時間培養後に大腸菌を含む培養液を０．８５％生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地上にプレーティングした後、３７℃、設定時間培養後に生じたコロニー数（ＣＦＵ：Colony Forming Units）を測定した。
なお、上記試料の他、培地のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【００８９】
（３）結果
各試料のＣＦＵの値から抗菌活性を評価した。抗菌活性の増強の程度については、試験後に残存した大腸菌数（ＣＦＵ）同士を比較して算出した。例えば、試験後の試料１のＣＦＵが１００で、試料２のＣＦＵが１０のとき、試料２の抗菌活性は、試料１の１０倍であるとすることができる。【００９０】
［実施例１］
本実施例では、本発明の抗菌活性増強剤を製造した。
（１）試験方法
陽イオン交換樹脂としてＣＭ−セファデックス（CM-Sephadex） C-50（ＧＥヘルスケア社製）を用いた。陽イオン交換樹脂１７０ｍＬを充填したカラムに、未殺菌の脱脂乳２０リットルを通液して交換樹脂に乳蛋白質を吸着させた。
次いで、カラム内の陽イオン交換樹脂を脱イオン水で充分洗浄し、０．２７Ｍ塩化ナトリウム（国産化学株式会社製）を通液して、樹脂に吸着した蛋白質を溶出させた。
続いて、溶出溶媒として１．７Ｍ塩化ナトリウムを通液し、樹脂に吸着した蛋白質画分を溶出させた。この溶出液を分画分子量１０ｋＤａの限外濾過膜処理により脱塩し、常法にて濃縮し、凍結乾燥して蛋白質画分の粉末を得た。【００９１】
凍結乾燥した蛋白質粉末１６０ｍｇを０．５Ｍ塩化ナトリウム１０ｍＬに溶解し、分画分子量３０ｋＤａの遠心式限外濾過膜（商品名：Amicon Ultra、Millipore社製）を用いた遠心分離（４，０００×ｇ、１５分間）を行った後、透過液側の塩基性蛋白質画分を回収した。さらに、前記遠心式限外濾過膜に０．５Ｍ塩化ナトリウム１０ｍＬを添加して遠心分離（４，０００×ｇ、１５分間）を行った後、得られた透過液側の塩基性蛋白質画分を回収した。この塩基性蛋白質画分と先に得られた塩基性蛋白質画分を混合し、分画分子量１０ｋＤａの遠心式限外濾過膜（商品名：Amicon Ultra、Millipore社製）にて脱塩濃縮し、濃縮液側の画分を、本発明の抗菌活性増強剤として得た。
二次元電気泳動による、本発明の抗菌活性増強剤の分子量分布は、８〜３０ｋＤａであり、等電点は９．０〜１１．０であった。【００９２】
［実施例２］
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）９５ｇに対して、実施例１と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を５ｇ添加して均一混合し、ラクトフェリンの抗菌活性を増強した抗菌用医薬品を製造した。【００９３】
［実施例３］
ラクトフェリン分解物として、実施例２で使用したウシラクトフェリンをｐＨ５以下に調製し、３％ペプシンと反応させて酵素消化し、逆浸透膜にて濃縮した後、凍結乾燥して得られた、ラクトフェリン分解物粉末を用いた。
上記ラクトフェリン分解物粉末９５ｇに対して、実施例１と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を５ｇ添加して均一混合し、ラクトフェリン分解物の抗菌活性を増強した抗菌用医薬品を製造した。【００９４】
［実施例４］
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）９５ｇに対して、実施例１と同一の方法により製造した抗菌活性増強剤を５ｇ添加して均一混合し、混合物の添加量が１０質量％となるように発酵乳に添加して発酵乳食品を製造した。【００９５】
次に試験例を示して本発明の抗菌活性増強剤の作用を詳細に説明する。
［試験例１］
本実施例では、本発明の抗菌活性増強剤を製造し、成分の特定を行った。【００９６】
（１）試験方法
実施例１で得た抗菌活性増強剤の成分を特定するために、ＺＯＯＭ  ＩＰＧ  Ｒｕｎｎｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen社製）を用いて二次元電気泳動を行った。第一次元目は、ｐＨ範囲３〜１０のＺＯＯＭ  Ｓｔｒｉｐ  ｐＨ３−１０ＮＬを用いた。第二次元目は、ＮｕＰＡＧＥ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＺＯＯＭ  Ｇｅｌを用いた。そして、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen社製）で染色した。【００９７】
なお、本発明の抗菌活性増強剤の分子量分布は、８〜３０ｋＤａであり、等電点は９．０〜１１．０であった。
さらに、二次元電気泳動により得られた染色後のゲルをデンシトグラフ（ＡＴＴＯ社製）で撮影し、解析ソフトによる相対的定量を行った。得られたスポットをゲルから切り出し、目的蛋白を脱色し、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（商品名：ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ、ＢＲＵＫＥＲ社製）にて質量分析し、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）検索により蛋白質を同定した。【００９８】
（２）結果
二次元電気泳動の結果を図１に示す。図１において、縦軸が分子量を示し、横軸が等電点を示している。図１に示した各スポットの分子量と同定された蛋白質の種類は表１の通りである。図１に矢印とともに示した丸数字は、表１の「スポットＮｏ．」の数字および明細書中スポット［１］〜［７］に対応している。
スポット［１］はラクトフェリン由来の蛋白質であることが明らかになった。スポット［２］、［４］、［６］、［７］は、データベース検索により、図６において表されるとおり、アンジオジェニン−１（Angiogenin-1）として知られる蛋白質の単量体、二量体、断片等であった。また、スポット［３］は、データベース検索により、図７において表されるとおり、アンジオジェニン−２（Angiogenin-2）として知られる蛋白質に由来することが明らかになった。
しかし、スポット［５］については蛋白質の種類が同定されていない。【００９９】
これらの結果から、本発明の抗菌活性増強剤は、スポット［２］〜［７］の成分を含む分子量が３０ｋＤａ以下であって、等電点が９．０〜１１．０である乳蛋白質であることが明らかとなった。
また、本発明の抗菌活性増強剤におけるラクトフェリン又はラクトフェリン分解物に由来する物質の含有量を測定した。デンシトメーターによる解析図を図２に示し、解析結果を表２に示した。【０１００】
測定方法は、図１において、スポット［１］のラクトフェリン由来物質の他、大きいスポットである［２］、［３］、［４］について相対的な定量を行った。本発明の他の有効成分についてはピーク面積が非常に小さいために数値化しなかった。
図２において、［１］〜［４］のピーク面積の合計を１００とすると、本発明の抗菌活性増強剤に含まれるラクトフェリン由来物質の量は１．４４質量％であることが明らかになった。
なお、本発明の抗菌活性増強剤には［１］〜［４］以外にもスポットが存在することから、実際のラクトフェリンに由来する成分の含有量は１．４４質量％よりもさらに低いことが予想される。
従って、本発明の抗菌活性増強剤は、その成分中のラクトフェリン又はラクトフェリン分解物に由来する成分の含有量が２．０質量％以下のものである。【０１０１】
【表１】
2012015037.tif 000003
【０１０２】
【表２】
2012015037.tif 000004
【０１０３】
［試験例２］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリンの抗菌活性を増強することを確認することを目的とした。
（１）試料の調製
ラクトフェリンとしてウシラクトフェリン（森永乳業社製）を脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例１で得られた抗菌活性増強剤を脱イオン水で希釈して使用した。【０１０４】
上記のラクトフェリンと抗菌活性増強剤を用いて、下記の試料１〜４を調製した。
試料１：ウシラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）
試料２：ウシラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（１６０μｇ／ｍＬ）の混合物。
試料３：ウシラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）の混合物。
試料４：抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）【０１０５】
（２）試験方法
１％のＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ培地（Becton Dickinson社製）を用い、５ｍＬのポリスチレンチューブに大腸菌Ｋ−１２株（NBRC 3301）を１０6ＣＦＵ／ｍＬとなるよう植菌し、３７℃のインキュベーター内で６時間前培養し、試験用菌液とした。そして、９６穴プレート上にて上記の試料と共に前培養した大腸菌を１０6ＣＦＵ／ｍＬになるよう添加し、３７℃にて１７時間培養した。１７時間培養後に大腸菌を含む培養液を０．８５％生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地（ラピッドメディアRM-SPC、森永乳業社製）上にプレーティングした後、３７℃、１６時間培養後に生じたコロニー数（CFU: Colony Forming Units）を測定することにより、各試料の抗菌活性を評価した。
なお、試料１〜４の他、上記培地のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【０１０６】
（３）結果
表３に試験例２の結果を示す。表３において、有意差検定はＰ＜０．００１である。培地のみで培養したコントロールでは１７時間後に菌数が１．１×１０8ＣＦＵ／ｍＬに増加したのに対し、ラクトフェリンを含む試料１では、菌数が初菌数よりも低減して、３．６×１０5ＣＦＵ／ｍＬの範囲となった。【０１０７】
一方、ラクトフェリンに抗菌活性増強剤を添加した試料２では、２．５×１０2ＣＦＵ／ｍＬ以下となり、ラクトフェリンと比較して菌数が大きく減少した。さらに、抗菌活性増強剤の量を１／５に減量した試料３でも、２．５×１０2ＣＦＵ／ｍＬ以下となり、試料２と同程度に菌数が減少した。なお、試料１と試料３の菌数の比較によれば、試料３の抗菌活性は試料１の抗菌活性の約１４４０倍以上であった。【０１０８】
一方、抗菌活性増強剤を単独で使用した試料４では、菌数が１．１×１０8ＣＦＵ／ｍＬとなり、抗菌活性を有していないことが明らかになった。
本試験結果から、ラクトフェリンと本発明の抗菌活性増強剤の組み合わせにより、顕著な抗菌活性の増加が認められた。【０１０９】
【表３】
2012015037.tif 000005
【０１１０】
［試験例３］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を増強することを確認することを目的とした。
（１）試料の調製
ラクトフェリン分解物として、試験例２で使用したウシラクトフェリン（森永乳業社製）をｐＨ５以下に調製し、３％ペプシンと反応させて酵素消化し、逆浸透膜にて濃縮した後、凍結乾燥して得られた、ラクトフェリン分解物粉末を用いた。
ラクトフェリン分解物粉末は、脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例１で得られた抗菌活性増強剤を脱イオン水で希釈して使用した。【０１１１】
上記のラクトフェリン分解物と抗菌活性増強剤を用いて下記の試料５〜７を調製した。
試料５：ラクトフェリン分解物（４００μｇ／ｍＬ）
試料６：ラクトフェリン分解物（４００μｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）の混合物。
試料７：抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）【０１１２】
（２）試験方法
試験例２と同様の試験方法にて試験した。試料５〜７の他、培地のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【０１１３】
（３）結果
試験例３の結果を表４に示す。
培地のみで培養したコントロールでは１７時間後に菌数が６．７×１０7ＣＦＵ／ｍＬに増加した。ラクトフェリン分解物４００μｇ／ｍＬを含む試料５では菌数が８．６×１０4ＣＦＵ／ｍＬと減少したが、さらに抗菌活性増強剤を添加した試料７では菌数が２．５×１０2ＣＦＵ／ｍＬ以下となり、試料５と比較して顕著な菌数の減少が見られた。ここで、試料５と試料６の菌数の比較によれば、試料６の抗菌活性は試料５の抗菌活性の約３４０倍以上であった。【０１１４】
一方、抗菌活性増強剤のみを添加した試料７では菌数が９．０×１０7ＣＦＵ／ｍＬとなり、抗菌活性が見られなかった。
本試験結果から、ラクトフェリン分解物と本発明の抗菌活性増強剤の組み合わせにより、顕著な抗菌活性の増加が認められた。【０１１５】
【表４】
2012015037.tif 000006
【０１１６】
［試験例４］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリン加水分解物であるラクトフェリシン（登録商標）の抗菌活性を増強することを確認することを目的とした。
（１）試料の調製
試験例２で使用したウシラクトフェリン（森永乳業社製）をペプシンで加水分解し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、凍結乾燥して得られたウシ・ラクトフェリシン粉末を用いた。
ウシ・ラクトフェリシン粉末は、脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例１で得られた抗菌活性増強剤を脱イオン水で希釈して使用した。【０１１７】
上記のウシ・ラクトフェリシンと抗菌活性増強剤を用いて下記の試料８〜１０を調製した。
試料８：ウシ・ラクトフェリシン（１６μｇ／ｍＬ）
試料９：ウシ・ラクトフェリシン（１６μｇ／ｍＬ）及び抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）の混合物。
試料１０：抗菌活性増強剤（３２μｇ／ｍＬ）【０１１８】
（２）試験方法
培養時間を２時間に変更したことを除き、試験例２と同様の試験方法にて試験した。試料８〜１０の他、培地のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【０１１９】
（３）結果
試験例４の結果を表５に示す。その結果、培地のみで培養したコントロールでは２時間後に菌数が２．９×１０6ＣＦＵ／ｍＬに増加した。【０１２０】
ウシ・ラクトフェリシン１６μｇ／ｍＬを含む試料８では菌数が８．８×１０3ＣＦＵ／ｍＬに減少したが、さらに抗菌活性増強剤を添加した試料９では、菌数が２．５×１０2ＣＦＵ／ｍＬ以下となり、顕著に菌数の減少が見られた。
ここで、試料８と試料９の菌数の比較によれば、試料９の抗菌活性は試料８の抗菌活性の約３５倍以上であった。【０１２１】
一方、抗菌活性増強剤のみを添加した試料１０では菌数が１．４×１０6ＣＦＵ／ｍＬとなり、全く抗菌活性が見られなかった。
本試験結果から、ウシ・ラクトフェリシンと本発明の抗菌活性増強剤の組み合わせにより、顕著な抗菌活性の増加が認められた。【０１２２】
【表５】
2012015037.tif 000007
【０１２３】
［実施例５］
実施例１と同様にして、未殺菌の脱脂乳をＣＭ−セファデックスC-50カラムに通液し、カラム内の陽イオン交換樹脂を脱イオン水で充分洗浄し、０．２７Ｍ塩化ナトリウム、御及び、１．７Ｍ塩化ナトリウムを通液して、樹脂に吸着した蛋白質画分を溶出させた。【０１２４】
さらに、溶出させた蛋白質画分を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、ゲル濾過担体 ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにて分離し、図５に示される分子量約１７ｋＤ（α）、及び約１５ｋＤ（β）の２つのピークを分取した。なお、図５はゲル濾過ＨＰＬＣの溶出曲線を示している。
また、各々のピークα、βについて、ＳＤＳ電気泳動により分析した結果、図５に示されるとおり、ピークαには、分子量約１７ｋＤａのマイナーバンドと約１５ｋＤａのメジャーバンドの２成分が含まれていることが確認された。また、ピークβには、分子量約１５ｋＤａのメジャーバンドの１成分が含まれていることが確認された。
バンドをゲルから切り出し、脱色して、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（商品名：ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ、ＢＲＵＫＥＲ社製）にて質量分析し、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）検索により蛋白質を同定した結果、ピークα、βのいずれにも含まれる約１５ｋＤａの成分はアンジオジェニン−１であることが判明し、ピークαに含まれる約１７ｋＤａの成分はアンジオジェニン−２であることが判明した。【０１２５】
［試験例５］
本試験は、アンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２がラクトフェリンの抗菌活性を増強する作用を有することを確認するために行った。【０１２６】
（１）試料の調製
ラクトフェリンとしてウシ・ラクトフェリン（森永乳業社製）を脱イオン水で希釈して使用した。
一方、実施例５に記載された方法により分離したアンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２を脱イオン水で希釈して使用した。
前記のウシ・ラクトフェリンと分離したアンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２を用いて、以下の試料１１〜１５を調製した。
・試料１１：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）
・試料１２：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）及びアンジオジェニン−１（３２μｇ／ｍＬ）の混合物
・試料１３：ウシ・ラクトフェリン（２ｍｇ／ｍＬ）並びに、アンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２の混合物（各３２μｇ／ｍＬ）の混合物
・試料１４：アンジオジェニン−１（３２μｇ／ｍＬ）
・試料１５：アンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２の混合物（各３２μｇ／ｍＬ）の混合物
さらに、１％のＢａｃｔｏ ｐｅｐｔｏｎｅ培地（Becton Dickinson社製）を用い、５ｍＬのポリスチレンチューブに大腸菌Ｋ−１２株（NBRC 3301）を１０6ＣＦＵ／ｍＬとなるよう植菌し、３７℃のインキュベーター内で６時間前培養して、試験用菌液とした。【０１２７】
（２）試験方法
９６穴プレート上にて前記の試料とともに試験用菌液を１０6ＣＦＵ／ｍＬとなるよう添加し、３７℃にて１７時間培養した。
１７時間培養した後に、大腸菌を含む培養液を０．８５％生理食塩水にて段階希釈し、寒天培地（ラピッドメディアRM-SPC、森永乳業社製）上にプレーティングした後、３７℃で１６時間培養して、培地上に生じたコロニー数を測定することにより、各試料の抗菌活性（ＣＦＵ：Colony Forming Units）を評価した。
なお、試料１１〜１５の他に、前記培地溶液のみで大腸菌を培養したものをコントロールとした。【０１２８】
（３）試験結果
本試験の結果を表６に示す。
その結果、培地のみで培養したコントロールでは、１７時間後に菌数が１．３×１０8ＣＦＵ／ｍＬに増加したのに対し、ラクトフェリンを含む試料１１では、菌数が初菌数よりも低減して、２．９×１０5ＣＦＵ／ｍＬの範囲となった。【０１２９】
これに対して、ラクトフェリンに、アンジオジェニン−１、又はアンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２を添加した試料１２及び１３では、各々、２．５×１０4ＣＦＵ／ｍＬ以下、及び４．１×１０4ＣＦＵ／ｍＬとなり、ラクトフェリンと比較して菌数が大きく減少した。【０１３０】
試料１１と、試料１２及び試料１３の菌数の比較によれば、試料１２及び試料１３の抗菌活性は、各々試料１１の抗菌活性の約１２倍以上、及び約７倍以上であった。【０１３１】
一方、アンジオジェニン−１、又はアンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２のみを含む試料１４及び１５では、各々菌数が１．９×１０8ＣＦＵ／ｍＬ、及び１．５×１０8ＣＦＵ／ｍＬとなり、アンジオジェニン−１及びアンジオジェニン−２自体は抗菌活性を有していないことが明らかになった。【０１３２】
【表６】
2012015037.tif 000008
【０１３３】
［試験例６］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリンの種々の菌に対する抗菌活性を増強する作用を有することを確認するために行った。【０１３４】
（１）試料の調製
ラクトフェリンとして、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を脱イオン水にて希釈して使用した。一方、実施例１に記載された方法により製造された抗菌活性増強剤（Angiogenin-1, Angiogenin-2を含有）を脱イオン水で希釈して使用した。【０１３５】
前記のウシラクトフェリン用いて、下記の試料１６〜２２を調製した。
試料１６：ウシラクトフェリン（8mg/mL）
試料１７：ウシラクトフェリン（4mg/mL)
試料１８：ウシラクトフェリン（2mg/mL）
試料１９：ウシラクトフェリン（1mg/mL)
試料２０：ウシラクトフェリン（0.5mg/mL）
試料２１：ウシラクトフェリン（0.25mg/mL）
試料２２：ウシラクトフェリン（0.125mg/mL）
また、試料１６〜２２各々に抗菌活性増強剤（32μg/mL）を添加した、試料２３〜２９を調製した。
また、抗菌活性増強剤（32μg/mL）のみの試料３０を調製した。【０１３６】
さらに、１％のBacto peptone培地（Becton Dickinson社製）を用い、5mLのポリスチレンチューブに、Escherichia coli O111、Cronobacter sakazaki ATCC12868、Salmonella enteritidis IID604、Klebsiella pneumoniae JCM1662T、Pseudmonas aeruginosa MMI603、Staphylococcus aureus JCM2151、Staphylococcus epidermidis JCM2414Tを106cells/mLになるよう植菌し、37℃のインキュベーターにて6時間培養して、試験用菌液とした。
また、同様にＰＹＧ培地（１％Bacto peptone、0.05％yeast extract（Becton Dickinson社製）、１％Glucose（和光純薬社製））を用い、5mLのポリスチレンチューブに、Streptococcus mutans JCM5705Tを106cells/mLになるよう植菌し、37℃のインキュベーターにて6時間培養して、試験用菌液とした。また、Sabouraud培地（1% Bacto peptone、2% Glucose）を用い、5mLのポリスチレンチューブに、Candida albicans TIMM1768を106cells/mLになるよう植菌し、37℃のインキュベーターにて6時間培養して、試験用菌液とした。【０１３７】
（２）試験方法
９６穴プレート上にて前記の試料とともに、前記の試験用菌液を106cells/mLとなるようにそれぞれ添加し、37℃にて17時間培養した。
17時間培養した後に、マイクロプレートリーダー（コロナ電気社製）にて630nmの吸光度を測定した。なお、試料１６〜３０の他に、前記培地溶液のみで菌を培養したものをコントロールとした。菌の発育が有意に抑制され、コントロールの吸光度に対して50%以下の吸光度を示す最小のラクトフェリン濃度を、最小発育阻止濃度（MIC）とし、抗菌活性増強剤を添加したラクトフェリンと未添加のラクトフェリンのMIC濃度との比較から、種々の菌に対する抗菌活性増強剤による菌の発育抑制の増強作用を評価した。【０１３８】
（３）試験結果
本試験の結果を表７に示す。表７中、LFはラクトフェリンを、MICは最小阻止濃度を各々表す。【０１３９】
この結果、Escherichia coli O111において、ラクトフェリンを添加した場合（試料１６〜２２）のＭＩＣは２ｍｇ／ｍＬであった。これに対して、ラクトフェリンにさらに抗菌活性増強剤３２μｇ／ｍＬを添加した場合（試料２３〜２９）では、ＭＩＣは１ｍｇ／ｍＬとなり、ラクトフェリンと比較してＭＩＣの低下が見られた。
一方、抗菌活性増強剤のみ（試料３０）では菌の発育抑制は全く見られず、抗菌活性増強剤のＭＩＣは３２μｇ／ｍＬ以上であった。【０１４０】
同様にして、Cronobacter sakazaki ATCC12868 、Salmonella enteritidis IID604、Klebsiella pneumoniae JCM1662T、Pseudmonas aeruginosa MMI603、Staphylococcus aureus JCM2151、Staphylococcus epidermidis JCM2414T、Streptococcus mutans JCM5705T、Candida albicans TIMM1768においても、ラクトフェリン単独の試料（試料１６〜２２）と、ラクトフェリンにさらに抗菌活性増強剤３２μｇ／ｍＬを添加した試料（試料２３〜２９）とを比較した結果、ＭＩＣの明らかな低下が認められた。なお、グラム陰性細菌・グラム陽性細菌・真菌のいずれにおいても、ラクトフェリンに対しさらに抗菌活性増強剤を添加することで、ＭＩＣはラクトフェリン単独で作用させた場合の１／２以下に低下した。一方、抗菌活性増強剤のみを添加した試料（試料３０）では、いずれの菌においてもEscherichia coli O111と同様に、菌の発育阻止効果は認められなかった。【０１４１】
本試験結果から、ラクトフェリン等の抗菌物質と本発明を組み合わせた組成物を製造することにより、幅広い菌に対して従来の抗菌物質の活性を顕著に高めた抗菌用組成物を提供できることが明らかになった。【０１４２】
【表７】
2012015037.tif 000009
【０１４３】
［試験例７］
本試験は、本発明の抗菌活性増強剤がラクトフェリシンの種々の菌に対する抗菌活性を増強する作用を有することを確認するために行った。【０１４４】
（１）試料の調製
ラクトフェリシンとして、ウシラクトフェリン（森永乳業社製）をペプシンで加水分解し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、凍結乾燥して得られたラクトフェリシン粉末を用いた。ラクトフェリシン粉末は脱イオン水にて希釈して使用した。一方、実施例１に記載された方法により製造された抗菌活性増強剤（Angiogenin-1, Angiogenin-2を含有）を脱イオン水で希釈して使用した。【０１４５】
前記のウシラクトフェリシンを用いて、下記の試料３１〜３５を調製した。
試料３１：ウシラクトフェリシン（32μg/mL）
試料３２：ウシラクトフェリシン（16μg/mL）
試料３３：ウシラクトフェリシン（8μg/mL）
試料３４：ウシラクトフェリシン（4μg/mL）
試料３５：ウシラクトフェリシン（2μg/mL）
また、試料３１〜３５各々に抗菌活性増強剤（32μg/mL）を添加した、試料３６〜４０を調製した。
また、抗菌活性増強剤（32μg/mL）のみの試料４１を調製した。【０１４６】
さらに、１％のBacto peptone培地（Becton Dickinson社製）を用い、5mLのポリスチレンチューブに、Escherichia coli O111、Cronobacter sakazaki ATCC12868、Klebsiella pneumoniae JCM1662T、Pseudmonas aeruginosa MMI603、Staphylococcus aureus JCM2151を106cells/mLになるよう植菌し、37℃のインキュベーターにて6時間培養して、試験用菌液とした。また、同様にＰＹＧ培地（１％Bacto peptone、0.05％yeast extract（Becton Dickinson社製）、１％Glucose（和光純薬社製））を用い、5mLのポリスチレンチューブに、Streptococcus mutans JCM5705Tを106cells/mLになるよう植菌し、37℃のインキュベーターにて6時間培養して、試験用菌液とした。また、Sabouraud培地（1% Bacto peptone、2% Glucose）を用い、5mLのポリスチレンチューブに、Candida albicans TIMM1768を106cells/mLになるよう植菌し、37℃のインキュベーターにて6時間培養して、試験用菌液とした。【０１４７】
（２）試験方法
９６穴プレート上にて前記の試料とともに、前記の試験用菌液を106cells/mLとなるようにそれぞれ添加し、37℃にて17時間培養した。
17時間培養した後に、マイクロプレートリーダー（コロナ電気社製）にて630nmの吸光度を測定した。なお、試料３１〜４１の他に、前記培地溶液のみで菌を培養したものをコントロールとした。菌の発育が有意に抑制され、コントロールの吸光度に対して50%以下の吸光度を示す最小のラクトフェリン濃度を、最小発育阻止濃度（MIC）とし、抗菌活性増強剤を添加したラクトフェリンと未添加のラクトフェリンのMIC濃度との比較から、種々の菌に対する抗菌活性増強剤による菌の発育抑制の増強作用を評価した。【０１４８】
（３）試験結果
本試験の結果を表８に示す。表８中、LFcinはラクトフェリンを、MICは最小阻止濃度を各々表す。【０１４９】
この結果、Escherichia coli O111において、ラクトフェリシンを添加した場合（試料３１〜３５）のＭＩＣは８μｇ／ｍＬであった。これに対して、ラクトフェリシンにさらに抗菌活性増強剤３２μｇ／ｍＬを添加した場合（試料３６〜４０）では、ＭＩＣは２μｇ／ｍＬとなり、ラクトフェリンと比較してＭＩＣの低下が見られた。
一方、抗菌活性増強剤のみ（試料４１）では菌の発育抑制は全く見られず、抗菌活性増強剤のＭＩＣは３２μｇ／ｍＬ以上であった。【０１５０】
同様にして、Cronobacter sakazaki ATCC12868 、Klebsiella pneumoniae JCM1662T、Pseudmonas aeruginosa MMI603、Staphylococcus aureus JCM2151、Streptococcus mutans JCM5705T、Candida albicans TIMM1768においても、ラクトフェリシン単独の試料（試料３１〜３５）と、ラクトフェリシンにさらに抗菌活性増強剤３２μｇ／ｍＬを添加した試料（試料３６〜４０）とを比較した結果、ＭＩＣの明らかな低下が認められた。なお、グラム陰性細菌・グラム陽性細菌・真菌のいずれに対しても、ラクトフェリシンに対し、さらに抗菌活性増強剤を添加することで、ＭＩＣはラクトフェリン単独で作用させた場合の１／２以下に低下した。
一方、抗菌活性増強剤のみを添加した試料（試料４１）では、いずれの菌においてもEscherichia coli O111と同様に、明らかな菌の発育阻止は認められなかった。【０１５１】
本試験結果から、ラクトフェリシン等の抗菌物質と本発明を組み合わせた組成物を製造することにより、幅広い菌に対して従来の抗菌物質の活性を顕著に高めた抗菌用組成物を提供できることが明らかになった。【０１５２】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物を有効成分とする抗菌剤に添加することにより、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物の抗菌活性を顕著に向上させることができる。【０１５４】
また、本発明の抗菌活性増強剤は、ラクトフェリン又はラクトフェリン加水分解物に対して極めて少量を混合するだけで効果を発揮することから、製品の組成や物性に影響を与えずに、飲食品や飼料、医薬品、化粧品等に配合することができる。【０１５５】
さらに、本発明の抗菌活性増強剤は、乳由来の成分から得られることから、副作用の心配がほとんどなく、安心して日常的に摂取することができる。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月15日(2013.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
限外濾過時の圧力は、使用する膜の耐圧限界以下であれば（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０．６ＭＰａ以下）いずれの圧力でも可能である。尚、耐圧限界値付近での使用は膜の寿命を縮める可能性があるため、耐圧限界の２／３以下（例えばＧＲ−６１ｐｐ膜なら０．４ＭＰａ以下）で行うことが好ましい。
使用する限外濾過膜モジュールは、管型、中空糸型、平膜型、スパイラル型等いずれの形式でも可能である。ただし、中空糸型内圧式等のモジュールでは、中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、圧力等を考慮して行うことが好ましい。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
【表３】
2012015037.tif 000018
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
さらに、溶出させた蛋白質画分を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）に溶解し、ゲル濾過担体 ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷ（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにて分離し、図５に示される分子量約１７ｋＤａ（α）、及び約１５ｋＤａ（β）の２つのピークを分取した。なお、図５はゲル濾過ＨＰＬＣの溶出曲線を示している。
また、各々のピークα、βについて、ＳＤＳ電気泳動により分析した結果、図５に示されるとおり、ピークαには、分子量約１７ｋＤａのマイナーバンドと約１５ｋＤａのメジャーバンドの２成分が含まれていることが確認された。また、ピークβには、分子量約１５ｋＤａのメジャーバンドの１成分が含まれていることが確認された。
バンドをゲルから切り出し、脱色して、還元アルキル化及びトリプシン処理によるゲル内消化を行い、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ装置（商品名：ＡｕｔｏｆｌｅｘＩＩ、ＢＲＵＫＥＲ社製）にて質量分析し、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製のＭＡＳＣＯＴソフトウェアを使用して、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology information）のデ
ータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）検索により蛋白質を同定した結果、ピークα、βのいずれにも含まれる約１５ｋＤａの成分はアンジオジェニン−１であることが判明し、ピークαに含まれる約１７ｋＤａの成分はアンジオジェニン−２であることが判明した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
【表６】
2012015037.tif 000019
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
（２）試験方法
９６穴プレート上にて前記の試料とともに、前記の試験用菌液を106cells/mLとなるよ
うにそれぞれ添加し、37℃にて17時間培養した。
17時間培養した後に、マイクロプレートリーダー（コロナ電気社製）にて630nmの吸光
度を測定した。なお、試料３１〜４１の他に、前記培地溶液のみで菌を培養したものをコントロールとした。菌の発育が有意に抑制され、コントロールの吸光度に対して50%以下
の吸光度を示す最小のラクトフェリシン濃度を、最小発育阻止濃度（MIC）とし、抗菌活
性増強剤を添加したラクトフェリシンと未添加のラクトフェリシンMIC濃度との比較から
、種々の菌に対する抗菌活性増強剤による菌の発育抑制の増強作用を評価した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
（３）試験結果
本試験の結果を表８に示す。表８中、LFcinはラクトフェリシンを、MICは最小阻止濃度を各々表す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
この結果、Escherichia coli O111において、ラクトフェリシンを添加した場合（試料
３１〜３５）のＭＩＣは８μｇ／ｍＬであった。これに対して、ラクトフェリシンにさらに抗菌活性増強剤３２μｇ／ｍＬを添加した場合（試料３６〜４０）では、ＭＩＣは４μｇ／ｍＬとなり、ラクトフェリシンと比較してＭＩＣの低下が見られた。
一方、抗菌活性増強剤のみ（試料４１）では菌の発育抑制は全く見られず、抗菌活性増強剤のＭＩＣは３２μｇ／ｍＬ以上であった。
【国際調査報告】
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