(57)【要約】本発明は、効率の良い高コストな方法による核酸の精製に関する。特に、本発明は、核酸精製のための単一洗浄溶出バッファーを使用することにより、複数の精製ステップの間に異なる洗浄溶出バッファー溶液を使用する、骨が折れ、時間のかかる側面に対処する。単一洗浄溶出バッファーの使用は、特に小型化された環境において、多量の精製された核酸を得る簡易的な方法を提示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、前記核酸を前記核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）前記核酸結合相に結合した前記核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）≦５０μｌのステップ（ｉｉ）の前記バッファー溶液を使用して、前記核酸結合相から前記核酸を溶出させるステップ、
を含む、核酸を精製するための方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の前記バッファー溶液が、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度により特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の前記バッファー溶液が、≧７．５のｐＨにより、好ましくは≧９のｐＨにより特徴付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の前記バッファー溶液中の前記バッファー剤が、トリス−ＨＣｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉ）を、≦４０μｌの、好ましくは≦３０μｌの、より好ましくは≦２５μｌの、および最も好ましくは≦２０μｌの前記バッファー溶液中で行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉｉ）を、≦１５μｌの、好ましくは≦１０μｌの、最も好ましくは≦５μｌの前記バッファー溶液中で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉ）において、前記核酸結合相に結合した前記核酸を、少なくとも１回、好ましくは２回前記バッファー溶液で洗浄する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが、真核生物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくは上皮細胞を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが、ステップ（ｉ）の前に溶解された細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが、細菌および／またはウイルスをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸結合相が、シリカを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸結合相が、磁性粒子を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法を、マイクロ流体デバイスにより行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法を、マグネトキャピラリーバルブにより行う、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を室温で行い、ステップ（ｉｉｉ）を≧摂氏４０°の、好ましくは摂氏５０°〜７０°の、より好ましくは摂氏６０°〜７０°の、最も好ましくは摂氏６５°の温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
核酸を精製するためのバッファー剤を含むバッファー溶液の使用であって、前記溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨ、好ましくは≧９のｐＨを有するを有する、使用。
【請求項１８】
前記バッファー溶液が、核酸を洗浄して溶出するために使用される、請求項１７に記載のバッファー溶液の使用。
【請求項１９】
前記バッファー剤が、トリス−ＨＣｌである、請求項１７または１８に記載のバッファー溶液の使用。
【請求項２０】
トリス−ＨＣｌの濃度が、１０ｍＭである、請求項１９に記載のバッファー溶液の使用。
【請求項２１】
前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のバッファー溶液の使用。
【請求項２２】
≦５０μｌの溶出体積に核酸を精製するためのキットであって、以下：
−  核酸結合相、
−  前記核酸の洗浄および溶出のためのバッファー剤を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態、
−  前記精製された核酸を検出するための手段、
を含む、キット。
【請求項２３】
前記キットが、小型化されたラブオンチップ形式の環境をさらに含む、請求項２２に記載の核酸を精製するためのキット。
【請求項２４】
前記キットが、溶解剤をさらに含む、請求項２２または２３に記載の核酸を精製するためのキット。
【請求項２５】
診断試験としての使用のための、好ましくは分子診断のための携帯用総合試験としての使用のための、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を行うためのカートリッジであって、以下：
−  核酸結合相を含む第１チャンバ、
−  前記第１チャンバに接続された第２チャンバであって、前記チャンバは、前記核酸の洗浄および溶出のためのバッファー剤を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、第２チャンバ、
−  前記第２チャンバに接続された第３チャンバであって、前記チャンバは、前記第２チャンバの前記バッファー溶液を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、第３チャンバ、
を含む、カートリッジ。
【請求項２７】
前記核酸結合相が、磁性粒子を含む、請求項２６に記載のカートリッジ。
【請求項２８】
前記カートリッジが、マイクロ流体デバイス中での使用に適合されている、請求項２６または２７に記載のカートリッジ。
【請求項２９】
前記カートリッジが、マグネトキャピラリーバルブを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【請求項３０】
前記カートリッジが、前記第３チャンバに接続された第４チャンバを含み、前記チャンバが、前記第２チャンバの前記バッファー溶液を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国防高等研究計画局により授与されたＨＲ００１１−１２−Ｃ−０００７の下、米国政府のサポートによってなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、単一洗浄溶出バッファー溶液を使用して核酸を精製するための方法またはキットに、より具体的には小型化された環境におけるものに関する。本発明はさらに、核酸を精製するのに比較的高いｐＨおよび低塩濃度を有するバッファー溶液の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
核酸は、多くの異なる研究分野において重要な役割を担う。工業環境において、核酸は製品品質管理内で検出され得、臨床環境においては、核酸は診断のためにおよび／または治療のために使用され得る。上記の用途の多くにおけるそれらの使用の前に、核酸を精製する必要がある。
【０００４】
核酸精製は、通常、例えば核酸を含むサンプルを曝露し、核酸を核酸結合相に選択的に結合させ、結合した核酸を不純物から精製して、精製された核酸を得るなどのいくつかのステップを含む。異なるバッファーがサンプル調製、核酸結合、洗浄および溶出ステップの間で広く使用されている。
【０００５】
最も広く使用される精製方法は、結合／洗浄および、異なるバッファーを使用することによる塩濃度の変化に基づくか、またはｐＨ変化に基づく、いずれかの核酸の後続の溶出を達成する。
【０００６】
ＱｉａｇｅｎのＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術は、例えば核酸結合相上で負に帯電した核酸を結合して洗浄などするものに基づくものであり、これは、ｐＨ＜６．５のバッファー溶液中に浸漬される場合には正に帯電する。核酸の溶出のために、ｐＨ  ８．５のバッファー溶液が使用され、ｐＨの上昇および核酸結合相の正の電荷の中性化をもたらし、これにより、結合した核酸の放出をもたらす。
【０００７】
Ｂｏｏｍら（ＥＰ  ０  ３８９  ０６３）により開発された別の広く使用される方法は、核酸の溶解と、例えば正に帯電したイオンが負に帯電した核酸および負に帯電した結合相間で塩橋を形成することができるグアニジニウムチオシアネートなどの高濃度のカオトロピック塩の存在下での、例えば珪藻、ガラスまたはシリカなどの核酸結合相への結合に基づくものである。結合した核酸を、最初に高塩濃度バッファー溶液の存在下で洗浄し、次いでアルコール−水溶液で洗浄して、例えばＴＥバッファーなどの低塩濃度非アルコールバッファー溶液に切り替えることにより溶出する。
【０００８】
上記の概説のとおり、現在の核酸精製方法は、異なる塩濃度および／または異なるｐＨにより特徴付けられる多数のバッファーを使用する、複数の洗浄ステップ、その後の溶出ステップを含み、これは、これらの方法を時間のかかる高コストなものにする。
さらに、結合および洗浄バッファー溶液の残部は、時に、最終溶出ステップの間に除去し難く、それに続く、例えばＰＣＲ分析またはシーケンス反応などの下流の手順に干渉し得る。
【発明の概要】
【０００９】
発明の要約
よって、簡易化され、迅速で、低コストで効率の良い核酸の精製のための改善された手段および方法に対する必要性が存在する。
核酸精製のための存在する方法は、それらが、しばしば異なる洗浄バッファー溶液を使用する複数の洗浄ステップ、その後の溶出バッファーを使用する結合した核酸を溶出する最終ステップを含むので、骨が折れ、時間のかかるものである。
【００１０】
本発明は、以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、核酸を核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）核酸結合相に結合した核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用して、核酸結合相から核酸を溶出させるステップ、
を含む核酸を精製するための方法を提供することによりこの問題を解決する。
【００１１】
本発明の目的は、多量の核酸の簡易化されて迅速な精製を達成することである。特に、これらの多量により、一般的に、特定の用途には不利であり得る大容量（≧５０μｌの溶出体積）で実行するように設計された、存在する核酸精製方法が一般的に改善される。
本発明によれば、これを、核酸結合相に結合した核酸を洗浄して、続いてこれらの核酸を核酸結合相から溶出するための単一バッファー溶液を用いる方法により達成することができる。
【００１２】
本発明による方法の利点は、従来技術において記載されるとおり、サンプルを洗浄するための、および溶出するための異なるバッファーとは反対に、前記方法を実行するために、１種のバッファーのみが提供される必要があることである。これにより次いで、従来技術とは反対に、より簡易化された方法がもたらされ、よって、より経済的でより再現性が高いものとなる。
【００１３】
本発明によれば、これをまた、核酸を洗浄して溶出するための単一バッファー溶液を使用することにより達成することができ、これは、≦１００ｍＭの比較的低塩濃度および比較的高いｐＨ≧７．５により特徴付けられる。
本発明による単一バッファーの利点は、極めて小さな体積の該バッファーを用いることにより高溶出効率を達成することが可能なことであり；さらには、１種の単一バッファーを使用することにより、核酸のより迅速なプロセシングを達成することが可能なことであり、これは特に小型化された環境において有利である。
【００１４】
本発明によれば、この簡易化されて迅速な核酸の精製を、以下：
−  核酸結合相、
−  核酸の洗浄および溶出のためのバッファー剤を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態、
−  精製された核酸を検出するための手段、
を含むキットによりさらに達成することができる。
【００１５】
本発明によれば、この簡易化されて迅速な核酸の精製を、以下：
−  核酸結合相を含む第１チャンバ、
−  第１チャンバに接続された第２チャンバであって、前記チャンバは、核酸の洗浄および溶出のためのバッファー剤を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、第２チャンバ、
−  第２チャンバに接続された第３チャンバであって、前記チャンバは、第２チャンバのバッファー溶液を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、第３チャンバ、
を含むカートリッジによりさらに達成することができる。
【００１６】
本発明のキットおよびカートリッジは、従来技術と比較して、それらがより容易に調製されて、それにより、特に大規模製造のためにより経済的である点で有利である。さらに、キットにまたはカートリッジに含まれる、異なる成分の数を減らすことにより、相互変動性（intervariability）がまたかなり減少する。
【００１７】
本発明の目的は、本発明のバッファー溶液を使用して、核酸結合相からの核酸洗浄および溶出を達成することであり、これにより、例えば増幅またはシーケンス反応におけるなどの、溶出後の直接的および即座の精製された核酸のさらなるプロセシングが可能になるであろう。
核酸精製のための存在する方法をスケールダウンして、例えばマイクロ流体デバイスなどの小型化された環境において実行することは困難である。
【００１８】
したがって、本発明の目的は、例えばマイクロ流体デバイスにより、またはマグネトキャピラリーバルブなどにより、小型化された環境において効率の良い核酸精製を達成することであり、ここで、洗浄および溶出ステップを、それぞれ≦５００μｌまたは≦５０μｌで行う。
本発明のこれらおよび他の側面は、以下で記載される態様（単数または複数）を参照して明らかとなり、説明されるであろう。
図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、マグネトキャピラリーバルブカートリッジであり、左：分解されたマグネトキャピラリーバルブカートリッジのスキーム（上側）および組立図（下側）であり、番号１〜４は、異なるチャンバを描き；右：組み立てられたカートリッジである。
【図２】図２は、ＭＣＶを使用したｉｖＲＮＡ収率比較であり、黒色カラム：参照法によって得られたＲＮＡ収率；灰色カラム：単一バッファー溶液法により得られたＲＮＡ収率である。
【図３】図３は、エッペンドルフ管を使用したｉｖＲＮＡ収率比較であり、（ａ）黒色カラム：ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズを使用して参照法によって得られたＲＮＡ収率；灰色カラム：ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズを使用して単一バッファー溶液法により得られたＲＮＡ収率；（ｂ）異なる画分で検出されたＲＮＡのパーセンテージであり、参照法（黒色カラム）または単一バッファー法（灰色カラム）によりＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズを使用する場合がｘ軸上に示される；（ｃ）黒色カラム：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子を使用して参照法により得られたＲＮＡ収率；灰色カラム：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子を使用して単一バッファー溶液法により得られたＲＮＡ収率；（ｄ）異なる画分で検出されたＲＮＡのパーセンテージであり、参照法（黒色カラム）または単一バッファー法（灰色カラム）によりＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子を使用する場合がｘ軸上に示される；
【００２０】
態様の詳細な説明
本発明は、バッファー溶液および、核酸分子を洗浄して溶出するための、これによる核酸分子の高効率な精製のための単一バッファー溶液を使用する方法およびキットを記載する。
本発明は、特定の態様に関して記載されるが、この記載は限定の意味に解釈されてはならない。
詳細に本発明の例示的態様を説明する前に、本発明を理解するのに重要な定義を提供する。
【００２１】
本明細書においておよび特許請求の範囲において使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」はまた、文脈が明確に指示しない限り、それぞれの複数形を含む。
さらに、用語「含む（comprising）」、「例えば／例えば（for  example／e．g．）」および「例えば〜などの」は限定するものではないことが理解されなければならない。用語「してもよい」は、必須のものとしてもまたは限定するものとしても、いずれにも理解されてはならない。
用語「任意に」は、代替物または明確化するものとして理解されなければならない。用語「特に」は、本発明の好ましい態様とみなされなければならない。
【００２２】
本願において使用される用語「単一バッファー溶液」または「単一洗浄溶出バッファー」は、同一組成、構成成分の比および特性を有するバッファー溶液を指す。
用語「曝露／曝露している（expose／exposing）」および「結合／結合している（bind／binding）」は、サンプルの核酸が核酸結合相に結合できる条件下でサンプルを核酸結合相に接触させることを指す。本発明の特定の態様において、「結合／結合している」は、サンプル中に存在する≧２５％の核酸が結合され、またはサンプル中に存在する≧５０％の、または≧７５％の、または≧８５％の、または≧９５％の核酸が結合されていることを意味する。
【００２３】
用語「洗浄／洗浄している」または「洗浄／洗浄するステップ」は、結合後の状況を指し、ここで、例えばオルガネラ、細胞壁の一部または細菌またはウイルス粒子、タンパクなどの残骸および／または例えば溶解または結合手順からの塩または洗浄剤などの残存物などの不純物は、核酸結合相に結合した核酸から大部分が除去される。本発明の特定の態様において、「洗浄／洗浄している」または「洗浄／洗浄するステップ」は、核酸結合相に結合している≦２５％の核酸が除去され、または核酸結合相に結合している≦２０％の、または≦１５％の、または≦１０％の、または≦５％の核酸が除去されることを意味する。
【００２４】
用語「溶出／溶出している」または「溶出ステップ」は、結合した核酸が最終的に核酸結合相から放出される状況を指す。本発明の特定の態様において、「溶出／溶出している」または「溶出ステップ」は、最初に核酸結合相に結合していた≧２５％の核酸が溶出され、または最初に核酸結合相に結合していた≧３５％の、または≧４５％の、または≧５５％の、または≧６５％の、または≧７５％の、または≧８５％の、または≧９５％の核酸が溶出されることを意味する。
【００２５】
本発明の特定の態様において、「洗浄／洗浄している」または「洗浄／洗浄するステップ」は、核酸結合相に結合していた≦２５％の核酸が除去され、または核酸結合相に結合していた≦２０％の、または核酸結合相に結合していた≦１５％の、または≦１０％の、または≦５％の核酸が除去されることを意味し、「溶出／溶出している」または「溶出ステップ」は、最初に核酸結合相に結合していた≧２５％の核酸が溶出され、または最初に核酸結合相に結合していた≧３５％の、または≧４５％の、または≧５５％の、または≧６５％の、または≧７５％の、または≧８５％の、または≧９５％の核酸が溶出されることを意味する。
【００２６】
本願において使用される「室温」は、摂氏１８°〜２６°、好ましくは摂氏２０°〜２３°の温度を指す。
本願において使用される記号「≒」は、典型的には、示された数値の±２０％、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、なおより好ましくは±５％の偏差を示す。
【００２７】
本発明は、以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、核酸を核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）核酸結合相に結合した核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用して、核酸結合相から核酸を溶出させるステップ、
を含む核酸を精製するための方法を提供する。
【００２８】
本発明の一態様において、核酸を精製するための方法は、以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、核酸を核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）核酸結合相に結合した核酸を少なくとも１回バッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用して、核酸結合相から核酸を溶出させるステップ、
を含み、
ここで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の間では、１つまたは２つ以上のさらなるステップは行われない。
【００２９】
本発明の別の態様において、核酸を精製するための方法は、以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、核酸を核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）核酸結合相に結合した核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用して、核酸結合相から核酸を溶出させるステップ、
を含み、
ここで、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の間では、１つまたは２つ以上のさらなるステップは行われない。
【００３０】
本発明のさらなる態様において、核酸を精製するための方法は、以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、核酸を核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）核酸結合相に結合した核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用して、核酸結合相から核酸を溶出させるステップ、
を含み、
ここで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）の間およびステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）では、さらなるステップは行われない。
【００３１】
本発明の一態様において、核酸を精製するための方法は、以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、核酸を核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）核酸結合相に結合した核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用して、核酸結合相から核酸を溶出させるステップ、
からなる。
【００３２】
本発明の意味において、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）においてステップ（ｉｉ）のバッファー溶液を使用することは、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）における同一組成、構成成分の比および特性を有するバッファー溶液を使用することを意味する。物事を簡易化するために、用語「単一バッファー溶液」または「単一洗浄溶出バッファー溶液」を、本願を通して、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液を描写するために使用する。
【００３３】
任意に、本発明の態様において記載されるとおりの方法において、または本発明のキットにより提供されるとおり、核酸を洗浄して溶出させるための単一バッファー溶液を使用することは、核酸の精製を迅速で単純で低コストなものにする。
【００３４】
核酸を含むサンプルを曝露し、核酸を核酸結合相に結合させることは、サンプルを核酸結合相に添加して、任意にサンプルを核酸結合相中を通過させるか、または流すことにより達成され得る。曝露をまた、サンプルを核酸結合相に浸漬するか、サンプルを核酸結合相に再懸濁させるか、またはサンプルを核酸結合相と混合することにより達成してもよい。核酸結合相上で、または核酸結合相と、１〜３０分間、室温で、およびｐＨ  ４〜８で、あらゆる好適な結合のためのバッファー溶液とサンプルをインキュベートしてもよい。核酸を、例えばグアニジニウム（イソ）チオシアネート、グアニジンヒドロクロリド、ナトリウムヨージド、カリウムヨージド、ナトリウム（イソ）チオシアネート、尿素またはこれらの組み合わせなどのカオトロピック物質の存在下で、またはカオトロピック物質なしで、結合させてもよい。
【００３５】
本発明の一態様において、核酸結合相上で、または核酸結合相と、１〜３０分間、室温で、およびｐＨ≒４で、サンプルをインキュベートする。
本発明の別の態様において、グアニジニウムイソチオシアネートを含むバッファー溶液を使用して、核酸を核酸結合相に結合させる。
本発明のさらなる態様において、グアニジニウムイソチオシアネートを含むバッファー溶液を使用して、１〜３０分間、室温で、およびｐＨ  ４で、核酸を核酸結合相に結合させる。
【００３６】
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉ）を、例えばモルから高ミリモル範囲（in  the  molar  and  high  millimolar  range）などの高塩濃度の存在下で行う。
本発明の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉ）を、１Ｍ〜６Ｍの高塩濃度の存在下で行う。
理想的には、洗浄バッファー溶液は、所望されない、例えば細胞、細菌、ウイルスの残骸などの細胞構成成分；以前の溶解または結合ステップ由来であり得る、タンパクおよび例えば洗浄剤およびカオトロピック塩などの残留量などを除去する。
【００３７】
結合した核酸を、≦５００ｍＭ、≦４００ｍＭ、≦３００ｍＭ、≦２００ｍＭ、≦１００ｍＭ、≦７５ｍＭ、≦５０ｍＭ、≦４０ｍＭ、≦３０ｍＭ、≦２０ｍＭ、≦１０ｍＭ、≦７．５ｍＭ、≦５ｍＭ、≦２．５ｍＭの塩濃度を有するバッファー溶液を使用して、洗浄して溶出してもよい。
本発明の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
結合した核酸を、≧７．５、≧８、≧８．５、≧９、≧９．５または≧１０のｐＨを有するバッファー溶液を使用して、さらに洗浄して溶出してもよい。
本発明の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨ値を有する。
【００３８】
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度および≧７．５のｐＨを有する。
【００３９】
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
本発明のさらなる態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
【００４０】
本発明のより好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度およびｐＨ  ９を有する。
【００４１】
結合した核酸を、例えばシトレート、マレート、ホルメート、シトレート、スクシネート、アセテート、プロピオネート、マレート、ピリジン、カコジレート、スクシネート、ヒスチジン、ビス−トリス、エタノールアミン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＰ、イミダゾール、ビス−トリスプロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＢＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ピロホスフェート、ＨＥＰＰＳＯ、トリス−ＨＣｌ、ＰＯＰＳＯ、トリシン、ヒドラジン、グリシルグリシン、Ｔｒｉｚｍａ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ  ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ボレート、ＣＨＥＳ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、グリシン、アンモニウムヒドロキシド、ＣＡＰＳＯ、カーボネート、メチルアミン、ピペラジン、ＣＡＰＳおよびホスフェートなどのバッファー剤を含むバッファー溶液を使用して、さらに洗浄して溶出してもよい。
【００４２】
結合した核酸を、例えば、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ピロホスフェート、ＨＥＰＰＳＯ、トリス−ＨＣｌ、ＰＯＰＳＯ、トリシン、ヒドラジン、グリシルグリシン、Ｔｒｉｚｍａ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ  ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ボレート、ＣＨＥＳ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、グリシン、アンモニウムヒドロキシド、ＣＡＰＳＯ、カーボネート、メチルアミン、ピペラジン、ＣＡＰＳおよびホスフェート、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）またはＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）などのバッファー剤を含むバッファー溶液を使用して、好ましく洗浄して溶出してもよい。
【００４３】
結合した核酸を、最も好ましくは、ｐＨ  ７〜１１のバッファー範囲を有する、例えば、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ピロホスフェート、ＨＥＰＰＳＯ、トリス−ＨＣｌ、ＰＯＰＳＯ、トリシン、ヒドラジン、グリシルグリシン、Ｔｒｉｚｍａ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ  ＨＥＰＢＳ、ＴＡＰＳ、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ボレート、ＣＨＥＳ、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰ）、グリシン、アンモニウムヒドロキシド、ＣＡＰＳＯ、カーボネート、メチルアミン、ピペラジン、ＣＡＰＳ、ホスフェートおよびＴＥなどのバッファー剤を含むバッファー溶液を使用して、洗浄して溶出してもよい。
【００４４】
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液中のバッファー剤は、ＴＥまたはトリス−ＨＣｌである。
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液中のバッファー剤は、トリス−ＨＣｌである。
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度を有する。
【００４５】
本発明のさらなる態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液のバッファー剤はトリス−ＨＣｌであり、バッファー溶液は、≧７．５または好ましくは≧９のｐＨを有する。
本発明の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５または好ましくは≧９のｐＨを有する。
【００４６】
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明のさらに好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧９のｐＨを有する。
【００４７】
本発明のより好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明のなおより好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧９のｐＨを有する。
【００４８】
本発明の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の最高に好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）において用いられるバッファー溶液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、およびｐＨ  ９を有する。
【００４９】
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌのバッファー溶液中で行う。
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５０μｌまたは≦２０μｌのバッファー溶液中で行う。
本発明のさらなる態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５０μｌまたは≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
【００５０】
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５０μｌまたは≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨを有する。
好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５０μｌまたは≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００５１】
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌのバッファー溶液中で行う。
本発明のさらに好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【００５２】
本発明の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の別の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【００５３】
本発明の最高に好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度、およびｐＨ  ９を有する。
本発明の一態様によれば、すぐ上の態様のバッファー溶液のバッファー剤は、トリス−ＨＣｌである。
本発明の一態様において、結合した核酸を、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において少なくとも１回洗浄する。
【００５４】
好ましい態様において、結合した核酸を、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において少なくとも２回、好ましくは２回洗浄する。
本発明のより好ましい態様において、結合した核酸を、前記方法のステップ（ｉｉ）において２回洗浄し、ここで、ステップ（ｉｉ）を≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
本発明の最も好ましい態様において、結合した核酸を、ステップ（ｉｉ）において２回洗浄し、ここで、ステップ（ｉｉ）を≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度およびｐＨ  ９を有する。
【００５５】
本発明の別の最も好ましい態様において、結合した核酸を、ステップ（ｉｉ）において２回洗浄し、ここで、ステップ（ｉｉ）を≦２０μｌのバッファー溶液中で行い、前記バッファー溶液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度およびｐＨ  ９を有する。
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
【００５６】
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌ、≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
【００５７】
本発明の別の態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
本発明のさらなる態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００５８】
本発明の一態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００５９】
本発明の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００６０】
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
【００６１】
本発明の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧７．５のｐＨを有する。
【００６２】
本発明の別の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
【００６３】
本発明の最高に好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度およびｐＨ  ９を有する。
本発明のさらに好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度および≧７．５のｐＨを有する。
【００６４】
本発明の別の好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度および≧９のｐＨを有する。
本発明の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度および≧７．５のｐＨを有する。
【００６５】
本発明の別の最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度および≧９のｐＨを有する。
本発明の最高に好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度およびｐＨ  ９を有する。
【００６６】
本発明の一態様によれば、結合した核酸を、本発明のすぐ上の態様のいずれかのステップ（ｉｉ）において少なくとも２回、好ましくは２回洗浄する。
本発明の一態様によれば、本発明の方法のステップ（ｉ）を高塩濃度の存在下で行ってもよく、ここで、上記の態様において記載されたとおりに結合した核酸を洗浄して溶出する。
【００６７】
本発明の一態様において、少なくとも２５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の、核酸を含むサンプル中に存在する核酸が、本発明のバッファー溶液を使用して、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）の溶出液において、または本発明のキットにより、得られる。
本発明の別の態様において、異なる核酸が同時に精製される。例えばＲＮＡまたはＤＮＡなどを得る一般的な方法は、ＲＮＡｓｅｓまたはＤＮＡｓｅｓを精製された核酸にそれぞれ加えることである。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、核酸を含むサンプルを、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解する。細胞溶解についての既知の方法は、本発明の範囲内の使用に好適であり、それらは、例えばブレンドによるもの、すりつぶし、せん断力を介するもの、超音波処理によるもの、超音波、加圧、ビーズ破砕または凍結および解凍などによる物理的破壊；および例えばカオトロピックまたはコスモトロピック塩、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ、ＮＰ４０、ＴｗｅｅｎまたはＳＤＳなどの洗浄剤などによる化学的破壊；または例えばリソチーム、プロテイナーゼ  Ｋまたはサブチリシンによる酵素的破壊である。
【００６９】
本発明の一態様において、核酸を含むサンプルは、カオトロピック塩または洗浄剤により溶解されない。
本発明の別の態様において、核酸を含むサンプルは、コスモトロピック塩により溶解される。
【００７０】
本発明の好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
【００７１】
本発明の別の好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
【００７２】
本発明のさらに好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００７３】
本発明のより好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００７４】
本発明のより好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度および≧７．５のｐＨを有する。
【００７５】
本発明の別のより好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
【００７６】
本発明の最も好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧７．５のｐＨを有する。
【００７７】
本発明の別の最も好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度および≧９のｐＨを有する。
【００７８】
本発明の最高に好ましい態様において、核酸を含むサンプルは、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解され；本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度およびｐＨ  ９を有する。
本発明の一態様によれば、すぐ上の態様のバッファー溶液中のバッファー剤は、トリス−ＨＣｌである。
【００７９】
本発明の別の態様によれば、結合した核酸を、本発明のすぐ上の態様のいずれかにおける本発明の方法のステップ（ｉｉ）において少なくとも２回、好ましくは２回洗浄する。
本発明のなお別の態様によれば、本発明の方法のステップ（ｉ）を高塩濃度の存在下で行い、ここで、上記の態様において記載したとおり、結合した核酸を洗浄して（ステップ（ｉｉ））溶出する（ステップ（ｉｉｉ））。
【００８０】
本願において使用される核酸を含むサンプルは、例えば細菌、酵母、ウイルス、真核生物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、全血、血清、多血小板血漿、バフィーコート、鼻腔、口腔、膣または直腸綿棒からのサンプル、鼻咽頭または気管支吸引物および洗浄液、脳脊髄液、唾液、糞便、尿、精液および組織などの生物学的サンプルを含む。核酸を含むサンプルはまた、例えば増幅反応混合物および（融解）アガロースゲルプローブなどの実験サンプルであってもよい。核酸を含むサンプルはさらに、食品または土壌サンプルであってもよい。可能な場合には、サンプルを溶解し、例えば遠心分離、沈殿および／またはろ過などにより部分的に清浄化するかまたは精製したものであってもよい。
【００８１】
本発明の態様において、核酸を含むサンプルは、真核生物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくは上皮細胞を含む。
本発明の好ましい態様において、核酸を含むサンプルは上皮細胞を含む。
本発明の別の態様において、核酸を含むサンプルは細菌および／またはウイルスをさらに含む。
【００８２】
例えば、細菌は、バチルス、バルトネラ、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア、クロストリジウム、コリネバクテリウム、例えばコリネバクテリウム  ジフテリア、エンテロコッカス、エシェリキア、フランシェラ、ヘモフィルス、ヘリオバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、スタフィロコッカス、サルモネラ、シガエラ、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ウレアプラズマ、ビブリオまたはエルシニアなどを含む。ウイルスは、例えばエプスタイン−バーウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、フィロウイルス、インフルエンザウイルスまたは狂犬病ウイルスなどを含んでもよい。
【００８３】
本発明の方法により精製される核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖または二本鎖で存在してもよい。
ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは例えば超らせん、らせんおよび弛緩プラスミドＤＮＡなどの環状形態として存在してもよく、さらにＡ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡまたはＺ−ＤＮＡとして存在してもよい。
【００８４】
用語「ＲＮＡ」には、細菌ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、レトロウイルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、アプタマ―、リボスイッチ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩタンパク質群と結合する小分子ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡおよび免疫賦活性ＲＮＡが含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えば≦０．０５ｋｂ〜≧１００ｋｂなどの異なる長さで存在してもよい。
【００８５】
精製される核酸はまた、糖部位、ホスフェート骨格またはベース部位が修飾された核酸を含む。
精製される核酸はさらに、例えば、任意に蛍光または放射性標識されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ）などの合成核酸を含む。
本発明の好ましい態様において、精製される核酸は、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである。
【００８６】
本発明の方法内で使用される核酸結合相は、核酸を結合させることができる可溶性または固体の、多孔性のまたは非多孔性の基材を含む。
上記基材は、例えばアミン基またはアミン官能化基などの化学官能基を含んでもよい。好ましい基材は、珪藻、ガラス、シリコーン、シリカおよび任意に例えばポリエチレングリコール、アミン、エポキシド、イソチオシアネートなどの官能基を含むシランでコーティングされた基材、ならびにポリ−Ｌ−リシンまたは例えばニトロセルロース、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはポリカーボネートでコーティングされた基材である。官能化されたシランは、分岐状または非分岐状であってもよい。
【００８７】
本発明の一態様により、シリカを含む核酸結合相が提供される。
本発明のさらなる態様により、シランを含む核酸結合相が提供される。
【００８８】
少量で使用でき、容易におよび定量的に回収できるので、固体核酸結合基材についての例は、取扱いに関して特に有利な磁性粒子である（ＵＳ  １４／０２７２９９９）。磁性粒子は、鉄、鉄酸化物、シリカ、アモルファスシリコン酸化物を含むシリコン酸化物、ガラス粉末、石英、珪藻土、アルキルシリカ、ゼオライト、ラテックス粒子または例えばニトロセルロース、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはポリカーボネートまたは任意に例えばポリエチレングリコール、アミン、エポキシド、またはイソチオシアネートなどの官能基を含むシランでコーティングされたもの、またはポリ−Ｌ−リシンでコーティングされたものからなってもよい。
【００８９】
本発明の一態様において、磁性粒子は、鉄、鉄酸化物、シリカ、アモルファスシリコン酸化物を含むシリコン酸化物、ガラス粉末、石英、珪藻土、アルキルシリカ、ゼオライト、ラテックス粒子または任意に例えばポリエチレングリコール、アミン、エポキシド、またはイソチオシアネートなどの官能基を含むシランでコーティングされたもの、またはポリ−Ｌ−リシンでコーティングされたものを含んでもよい。
【００９０】
磁性粒子サイズは、０．０５μｍ〜５００μｍの範囲であってもよい。好ましい粒径は、１μｍ〜２００μｍの範囲である。
本発明の好ましい態様において、核酸結合相は、磁性粒子を含む。本発明のなおより好ましい態様において、それらの磁性粒子はシリカでコーティングされている。本発明の等しく好ましい態様において、磁性粒子はシランでコーティングされている。
【００９１】
本発明の好ましい態様において、核酸結合相は、負に帯電した粒子、より好ましくは負に帯電した磁性粒子を含み、ここで、粒子は、ガラス、シリカ、シリカの誘導体またはシリカでコーティングされたものを含んでもよく、核酸は、カオトロピック塩の高濃度の存在下で核酸結合相に結合している。
【００９２】
本発明の意味における小型化された環境は、サブミリリットル空間を指す。かかる小型化された環境についての例は、マイクロ流体デバイスであり、これは、これらの流体の正確な制御および操作を可能にするサブミリリットル空間において液体の工学的（engineered）操作により特徴付けられる。典型的には、マイクロ流体デバイスは、例えばμｌ範囲などの小体積で導入され、および／または全体として小さなサイズで導入されてもよい。さらに、本発明のマイクロ流体デバイスは、使い捨てまたは再利用可能なものであってもよく、低エネルギー消費のものであってもよい。マイクロ流体デバイスにおいて、例えば層流、特定の表面張力、撥水性誘電、迅速な熱的緩和、表面電荷（electrical  surface  charge）の存在および拡散などの効果を付与してもよい。特定の態様において、マイクロ流体デバイスは、再利用の目的のための例えば分離器またはリザーバまたは容器などの外部要素または外部ソースとの連結部を有してもよい。さらにマイクロ流体デバイスは、デバイス中の作用の制御および操作、および反応結果物または生成物の検出または決定を可能にする、電子的またはコンピュータインターフェースを含んでもよい。マイクロ流体デバイスは、例えば全ての試薬が既にデバイス中に存在するラブオンチップ（lab−on−chip）アプローチの一部などとして手動でまたは自動で操作されてもよい。
【００９３】
マイクロ流体デバイスは、用語「マグネトキャピラリーバルブ」または「マグネトキャピラリーバルブカートリッジ」を含み、これは、液体の離散ユニットが毛管力（capillary  force）によりデバイス中で固定位置に制限され得るような相互距離の２つの平坦な表面からなる。デバイスの内側の液体ユニットを、気体または適用される温度で融解して固化し得る例えばパラフィンなどの相変化材料により分離してもよい。磁気粒子は、例えば１つの液体ユニットから別のものへ磁力により輸送されるなどしてもよい（ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１３）。
本発明の一態様は、本発明の方法をマイクロ流体デバイスにより行うことを想定する。
【００９４】
本発明のさらなる態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
【００９５】
本発明の別の態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
【００９６】
本発明のさらなる態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００９７】
本発明の好ましい態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【００９８】
本発明のさらに好ましい態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
【００９９】
本発明の別のさらに好ましい態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１００】
本発明の最も好ましい態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
【０１０１】
本発明の別の最も好ましい態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１０２】
本発明の最高に好ましい態様において、マイクロ流体デバイスにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度、およびｐＨ  ９を有する。
本発明の一態様によれば、すぐ上の態様のバッファー溶液中のバッファー剤は、トリス−ＨＣｌである。
【０１０３】
本発明の一態様によれば、本発明の方法は、上記の態様のいずれかにおいて、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解ステップを含む。
本発明の一態様によれば、結合した核酸を、少なくとも２回、好ましくは本発明のすぐ上の態様のいずれかにおいて、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において２回洗浄する。
【０１０４】
本発明の好ましい態様において、本発明の方法をマグネトキャピラリーバルブにより行う。
本発明のさらなる態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、結合した核酸の本発明の方法のステップ（ｉｉ）を（bound  nucleic  acids  step  （ii）  of  the  method  of  the  invention）、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
【０１０５】
本発明の別の態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、結合した核酸は、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を（bound  nucleic  acids  are  step  （ii）  of  the  method  of  the  invention  is）、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
【０１０６】
本発明のさらなる態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨを有する。
本発明の好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【０１０７】
本発明の好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【０１０８】
本発明のさらに好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の別のさらに好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１０９】
本発明の最も好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の別の最も好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１１０】
本発明の最高に好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度、およびｐＨ  ９を有する。
本発明の好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【０１１１】
本発明のさらに好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の別の好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１１２】
本発明の最も好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
本発明の別の最も好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１１３】
本発明の最高に好ましい態様において、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、およびｐＨ  ９を有する。
本発明の一態様によれば、本発明の方法は、上記の態様のいずれかにおいて、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解ステップを含む。
【０１１４】
本発明の一態様によれば、結合した核酸を、少なくとも２回、好ましくは本発明のすぐ上の態様のいずれかにおいて、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において２回洗浄する。
本発明のさらなる態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌのバッファー溶液中で行う。
【０１１５】
本発明の別の態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度を有する。
【０１１６】
本発明のさらなる態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦５００μｌ、≦４００μｌ、≦３００μｌ、≦２００μｌ、≦１００μｌ、≦５０μｌまたは≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５０μｌ、≦４０μｌ、≦３０μｌ、≦２０μｌ、≦１５μｌ、≦１０μｌまたは≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【０１１７】
本発明の好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５または≧９のｐＨを有する。
【０１１８】
本発明のさらに好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
【０１１９】
本発明の別の好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１２０】
本発明の最も好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
【０１２１】
本発明の別の最も好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１２２】
本発明の最高に好ましい態様において、シリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度、およびｐＨ  ９を有する。
【０１２３】
本発明のさらに好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
【０１２４】
本発明の別の好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１２５】
本発明の最も好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧７．５のｐＨを有する。
【０１２６】
本発明の別の最も好ましい態様において、核酸はシリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、≦１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１２７】
本発明の最高に好ましい態様において、シリカコーティングされた磁性粒子に結合され、マグネトキャピラリーバルブにより、本発明の方法のステップ（ｉｉ）を、≦２０μｌの中で行い、ステップ（ｉｉｉ）を、≦５μｌの中で行い、ここで、ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）において使用されるバッファー溶液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ濃度、およびｐＨ  ９を有する。
【０１２８】
本発明の一態様によれば、本発明の方法は、すぐ上の態様のいずれかにおいて、本発明の方法のステップ（ｉ）の前に溶解ステップを含む。
【０１２９】
本発明の一態様によれば、結合した核酸を、少なくとも２回、好ましくは本発明のすぐ上の態様のいずれかにおいて、本発明の方法のステップ（ｉｉ）において２回洗浄する。
本発明の一態様によれば、本発明の方法のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を室温で行う。
【０１３０】
本発明の別の態様によれば、本発明の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）を室温で行い、ステップ（ｉｉｉ）を≧摂氏４０°の温度で行う。
好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）を室温で行い、ステップ（ｉｉｉ）を摂氏５０°〜７０°の温度で行う。
【０１３１】
より好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）を室温で行い、ステップ（ｉｉｉ）を摂氏６０°〜７０°の温度で行う。
最も好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）を室温で行い、本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）を摂氏６５°で行う。
【０１３２】
本発明のさらなる態様により、本発明の方法を使用して精製された核酸を検出する追加のステップが提供される。本願において使用される精製された核酸の検出は、精製された核酸の酵素限定分析（enzymatic  restriction  analysis）、例えば定量リアルタイムＰＣＲ、ネスティッド（nested）ＰＣＲおよび当業者に既知の他の増幅変形などの例えばＰＣＲを介するものなどの増幅、逆転写、ハイブリダイゼーション、例えばサザン、ノーザンブロット、マイクロアレイ分析またはシーケンシグなど、例えばピロシーケンス、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＳｏｌｅｘａシーケンシング、ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ技術（Ｈｅｌｉｃｏｓ）またはＦＴＩＲ（Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ）によるものなどを含む。
【０１３３】
本発明の別の側面は、核酸を精製するためのバッファー溶液の使用7に関し、ここでバッファー剤を含むバッファー溶液は、≦５００ｍＭ、≦４００ｍＭ、≦３００ｍＭ、≦２００ｍＭ、≦１００ｍＭ、≦７５ｍＭ、≦５０ｍＭ、≦４０ｍＭ、≦３０ｍＭ、≦２０ｍＭ、≦１０ｍＭ、≦７．５ｍＭ、≦５ｍＭ、≦２．５ｍＭの塩濃度、および≧７．５、≧８、≧８．５、≧９、≧９．５または≧１０のｐＨを有する。
【０１３４】
本発明の一態様において、使用するバッファー溶液は、≦１００ｍＭ、好ましくは≦５０ｍＭ、より好ましくは≦３０ｍＭ、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度、および≧７．５、≧８、≧８．５、≧９、≧９．５または≧１０のｐＨを有する。
本発明のより好ましい態様において、使用するバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１３５】
本発明のより好ましい態様において、使用するバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度、およびｐＨ  ９を有する。
本発明のさらなる態様において、上記のバッファー溶液は、核酸を洗浄して溶出するために使用される。
本発明の別の態様において、上記のバッファー溶液中のバッファー剤は、トリス−ＨＣｌである。
本発明の好ましい態様において、使用するトリス−ＨＣｌバッファー溶液は、≦１０ｍＭの塩濃度、および≧９のｐＨを有する。
【０１３６】
本発明のより好ましい態様において、使用するトリス−ＨＣｌバッファー溶液は、１０ｍＭの塩濃度、およびｐＨ  ９を有する。
本発明のさらなる態様において、上記のバッファー溶液で精製される核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
本発明の別の態様において、核酸は、細菌ＤＮＡまたは細菌ＲＮＡである。
本発明の好ましい態様において、精製される核酸は、ウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである。
【０１３７】
本発明のさらなる側面は、核酸を精製するためのキットに関し、以下：
−  核酸結合相、
−  バッファー剤を含む、核酸の洗浄および溶出のためのバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態、
−  精製された核酸を検出するための手段、
を含む。
キットのバッファー溶液は、好ましくは本発明の上記の態様において記載されたとおりの本発明のバッファー溶液である。
【０１３８】
本願において使用される精製された核酸の検出は、精製された核酸の酵素限定分析、例えば定量リアルタイムＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲおよび当業者に既知の他の増幅変形などの例えばＰＣＲを介するものなどの増幅、逆転写、ハイブリダイゼーション、例えばサザン、ノーザンブロット、マイクロアレイ分析またはシーケンシングなど、例えばピロシーケンス、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＳｏｌｅｘａシーケンシング、ＳＯＬｉＤ技術（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ技術（Ｈｅｌｉｃｏｓ）またはＦＴＩＲ（Ｍａｇｎｏｔｅｃｈ）によるものなどを含む。
【０１３９】
本発明の別の態様において、キットは、上記で定義したとおりの小型化された環境をさらに含む。
【０１４０】
本発明のさらなる態様において、小型化された環境は、
−  核酸結合相、
−  バッファー剤を含む、核酸の洗浄および溶出のためのバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態、
−  精製された核酸を検出するための手段、
を含む。
本発明の別の態様において、小型化された環境はカートリッジ中に含まれる。
【０１４１】
本発明の好ましい態様において、キットは、マイクロ流体デバイスをさらに含む。
本発明の別の態様において、キットは、カートリッジを含む。
本発明のより好ましい態様において、キットは、マグネトキャピラリーバルブカートリッジを含む。
本発明のさらなる態様において、キットは、例えばカオトロピックまたはコスモトロピック塩などの溶解剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ、ＮＰ４０、ＴｗｅｅｎまたはＳＤＳなどの洗浄剤、または例えばリソチーム、プロテイナーゼ  Ｋまたはサブチリシンなどの酵素などをさらに含む。
【０１４２】
本発明の別の態様において、キットは、カオトロピック塩または洗浄剤ではない溶解剤をさらに含む。
本発明のなお別の態様において、キットは、アンモニウムスルフェートまたはリチウムクロリドである溶解剤をさらに含む。
本発明のさらなる態様において、本発明のキットは、キットの構成要素を使用して核酸精製を行うための使用説明書を含んでもよい。
【０１４３】
一態様により、キットが入れられた容器の別々の区画に保管されるか、または別々に包装されたキットの構成要素を有する本発明のキットが提供される。
本発明の別の態様は、診断試験として使用するための本発明のキットを提供する。診断試験は、例えば細菌、酵母またはウイルスなどの病原体により引き起こされるか、またはこれらに関連する疾患、または例えば遺伝性疾患、出生前検査または親子鑑定などについての遺伝学的検査を検出するための試験を含んでもよい。
【０１４４】
本発明の好ましい態様において、本発明のキットは、分子診断のための携帯用総合（handheld，integrated）試験として使用される。分子診断のための携帯用試験は、小さい使い捨てのキットまたは器具であってもよく、これは携帯可能で患者の近くでの試験に好適である。
【０１４５】
例
核酸を精製するための本発明の方法は、以下の例を参照することによりサポートされ、例示される。これらの例により、いかなる意味においても本発明の範囲が限定されるとみなされてはならないことが強調されなければならない。
例１：参照法またはマグネトキャピラリーバルブ（ＭＣＶ）による単一バッファー溶液法による精製後の核酸収率の比較
核酸／ＲＮＡ収率を比較するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを、参照法または本発明の単一バッファー溶液法のいずれかにより精製した。参照法または単一バッファー溶液法のそれぞれについて以下のプロトコルを使用した（概要については表１を参照）。
【０１４６】
【表１】
2019504640.tif 000002
【０１４７】
ＭＣＶ中での参照法
５μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを、２ｍｌのエッペンドルフ管中に３．３Ｍ  グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）、トリス−ＨＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００およびＥＤＴＡを含む９９５μｌの溶解バッファーに添加した。溶解のために、１０秒間サンプルをボルテックスで（on  vortex）混合した。混合ステップの後に２０μｌのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）をサンプルに添加し、エッペンドルフ管を上向きおよび下向きに一度反転して、室温で３〜５分間インキュベートして、核酸を磁性ビーズに結合させた。
【０１４８】
溶解バッファーおよび磁性ビーズを有するサンプルのインキュベートの後、ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３に記載のとおり、および図１に示されるとおり、サンプルをピペットでマグネトキャピラリーバルブ（ＭＣＶ）カートリッジ中へ移した。第１および第２洗浄チャンバ中で、ＭＣＶカートリッジに予め２０μｌの洗浄バッファー２で満たした。第３チャンバを２０μｌの洗浄バッファー３で満たし、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌの低塩濃度を含み、高ｐＨ  ９を含む３．５μｌで溶出チャンバを満たした。
【０１４９】
ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３により記載のとおり、磁石を使用して磁性ビーズを回収して移動させた。まず、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズをサンプルが位置された濃縮部で回収した。次いで磁石は、バルブを通って第１洗浄チャンバへ磁性ビーズを移動させる。そのチャンバ中で、磁石を使用して磁性ビーズを洗浄した。このプロセスを、第２および第３チャンバ中で繰り返した。溶出チャンバ中で、２分間温度を６５℃まで上昇させて、続いて磁石を使用して混合することにより、核酸をビーズから溶出させた。
【０１５０】
ＭＣＶ中での単一バッファー溶液法
前記方法は、上記のとおりの「ＭＣＶ中での参照法」と同様だった。唯一の違いは、洗浄ステップおよび最終溶出ステップの両方については同一だった、バッファー溶液の組成であった（ｐＨ  ９での１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ）。
【０１５１】
図２から導かれるとおり、ＭＣＶを使用する単一バッファー溶液法により得られたＲＮＡ収率は、参照法により得られる収率より有意に高く、平均ＲＮＡ収率は、単一バッファー溶液法により得られる最初に磁性ビーズに結合したＲＮＡの６４％であり、これに対して、参照法により得られる最初に磁性ビーズに結合したＲＮＡの２６％であった。
【０１５２】
例２：エッペンドルフ管による参照法または単一バッファー溶液法による精製後の核酸収率の比較
核酸／ＲＮＡ収率を比較するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを、参照法または本発明の単一バッファー溶液法のいずれかにより精製した。参照法または単一バッファー溶液法のそれぞれについて以下のプロトコルを使用した（概要については表２を参照）。
【表２】
2019504640.tif 000003
【０１５３】
参照法：
５μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを、２ｍｌのエッペンドルフ管中に３．３Ｍ  グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）、トリス−ＨＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００およびＥＤＴＡを含む９９５μｌの溶解バッファーに添加した。溶解のために、１０秒間サンプルをボルテックスで混合した。混合ステップの後に２０μｌのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズまたは８μｌのＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子（同一の最終濃度）をサンプルに添加し、エッペンドルフ管を上向きおよび下向きに一度反転して、室温で３〜５分間インキュベートして、核酸をビーズまたは粒子にそれぞれ結合させた。
【０１５４】
溶解バッファーおよび磁性ビーズまたは粒子でのサンプルのインキュベートの後、管を磁性ラック上に置き、結合した核酸を有するビーズまたは粒子を管側に引き付けた。ピペットを使用して液体を除去することにより、例えば残骸およびタンパクなどの不純物を除去した。
【０１５５】
続いて、核酸を磁性ビーズまたは粒子に結合させた状態を維持しながら、磁性粒子を、室温で、ｐＨ  ４のＭＥＳ水和物塩を含む５０μｌの洗浄バッファー２で洗浄し、ＧＩＴＣの量を希釈した／置き換えた。各洗浄ステップにおいて、洗浄液体を管に加え、続いて磁性ビーズまたは粒子を液体と混合し、管を磁性ラックに置いて、結合した核酸を有するビーズまたは粒子を管側に引き付け、最後に液体を除去した。
【０１５６】
第２洗浄ステップを、室温で、ｐＨ  ７のトリス−ＨＣｌを含む５０μｌの洗浄バッファー３を使用して行い、ＭＥＳ水和物塩の量を希釈して／置き換えて、より良好な溶出のためにｐＨを上昇させた。
最後に、ｐＨ  ７のトリス−ＨＣｌを含む５０μｌの溶出バッファー溶液を添加し、エッペンドルフサーモヒータ上で５分間、摂氏６５℃で磁性ビーズまたは粒子と共にインキュベートし、続いて１０秒間ボルテックスして、磁性ビーズまたは粒子から核酸を溶出させた。
【０１５７】
単一バッファー溶液法：
５μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡを、２ｍｌのエッペンドルフ管中に３．３Ｍ  グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）、トリス−ＨＣｌ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００およびＥＤＴＡを含む９９５μｌの溶解バッファーに添加した。溶解のために、１０秒間サンプルをボルテックスで混合した。混合ステップの後に２０μｌのＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズまたは８μｌのＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子（同一の最終濃度）をサンプルに添加し、エッペンドルフ管を上向きおよび下向きに一度反転して、室温で３〜５分間インキュベートして、核酸をビーズまたは粒子にそれぞれ結合させた。
【０１５８】
溶解バッファーおよび磁性ビーズまたは粒子でのサンプルのインキュベートの後、管を磁性ラック上に置き、結合した核酸を有するビーズまたは粒子を管側に引き付けた。ピペットを使用して液体を除去することにより、例えば残骸およびタンパクなどの不純物を除去した。
【０１５９】
続いて、核酸を磁性ビーズまたは粒子に結合させた状態をなお維持しながら、磁性粒子を、室温で、ｐＨ  ９のトリス−ＨＣｌを含む５０μｌのバッファー溶液で２回洗浄し、ＧＩＴＣの量を希釈して／置き換えて、後続の溶出のためにｐＨを上昇させた。各洗浄ステップにおいて、洗浄液体を管に加え、続いて磁性ビーズまたは粒子を液体と混合し、管を磁性ラックに置いて、結合した核酸を有するビーズまたは粒子を管側に引き付け、液体を除去した。
【０１６０】
最後に、ｐＨ  ９のトリス−ＨＣｌを含む５０μｌのバッファー溶液を添加し、エッペンドルフサーモヒータ上で５分間、摂氏６５℃で磁性ビーズまたは粒子と共にインキュベートし、続いて１０秒間ボルテックスして、磁性ビーズまたは粒子から核酸を溶出させた。
【０１６１】
図３ａおよび図３ｃから導かれ得るとおり、５０μｌの洗浄溶出体積を使用して、参照法（黒色カラム）および単一バッファー法（灰色カラム）により得られたＲＮＡ収率は類似している。ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズを使用する場合には、精製前にサンプル中に存在するＲＮＡ量のおよそ９９％が精製形態で得られ（図３ａ）、ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子を使用する場合には、精製前にサンプル中に存在するＲＮＡ量のおよそ８２％が精製形態で得られた（図３ｃ）。
図３ｂおよび３ｄにおいて、精製前にサンプル中に存在するＲＮＡ量のパーセンテージを、異なる画分で検出した（Ｓｕｐ  ＬＢ、第１回洗浄、第２回洗浄および溶出画分）。
【０１６２】
溶解して磁性ビーズまたは粒子に結合した後の上澄み画分中で検出され得たＲＮＡのパーセンテージ（Ｓｕｐ  ＬＢ）は、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズ（図３ｂ）およびＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子（図３ｄ）の両方を使用する、参照法および単一バッファー溶液法を使用するものと同様であった。したがって、未結合ＲＮＡのパーセンテージ量は、異なる核酸結合相を使用する場合に両方の方法についてほぼ同一である。
【０１６３】
いずれかの方法を使用する第１および第２洗浄ステップの間に、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズ（図３ｂ）またはＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子から、結合したいかなるＲＮＡもほとんど失なわれないことも示された（図３ｂおよび図３ｄの中間のカラムを参照）。
結果として、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ビーズについておよそ９９％、およびＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ粒子についておよそ８０％の、最初に磁性ビーズまたは粒子に結合したＲＮＡのほとんどが、溶出画分中に見出された（図３ｂおよび図３ｄの一番右のカラムを参照）
【０１６４】
要約すると、上記の結果は、単一洗浄溶出バッファーを使用する一方で、エッペンドルフ管における単一バッファー溶液法により、同一の小さな洗浄溶出体積が用いられる場合に参照法と同様の核酸収率が達成されることを示す。
【０１６５】
参照文献符号の一覧：
１．  Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  “Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２８，  ４９５−５０３
２．  ＥＰ  ０  ３８９  ０６３
３．  ＵＳ  １４／０２７２９９９
４．  ｄｅｎ  Ｄｕｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  “Ｍａｇｎｅｔｏ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，  １３，  １０６−１１８
【図１ａ】
2019504640.tif 000004
【図１ｂ】
2019504640.tif 000005
【図２】
2019504640.tif 000006
【図３】
2019504640.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月28日(2018.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
（ｉ）核酸を含むサンプルを核酸結合相に曝露し、前記核酸を前記核酸結合相に結合させるステップ、
（ｉｉ）前記核酸結合相に結合した前記核酸を少なくとも１回バッファー剤を含むバッファー溶液で洗浄するステップ、
（ｉｉｉ）≦５０μｌのステップ（ｉｉ）の前記バッファー溶液を使用して、前記核酸結合相から前記核酸を溶出させるステップ、
を含む、核酸を精製するための方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の前記バッファー溶液が、≦１００ｍＭの、好ましくは≦５０ｍＭの、より好ましくは≦３０ｍＭの、最も好ましくは≦１０ｍＭの塩濃度により特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の前記バッファー溶液が、≧７．５のｐＨにより、好ましくは≧９のｐＨにより特徴付けられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｉｉ）およびステップ（ｉｉｉ）の前記バッファー溶液中の前記バッファー剤が、トリス−ＨＣｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉ）を、≦２００μｌの、好ましくは≦１００μｌの、より好ましくは≦５０μｌの、および最も好ましくは≦２０μｌの前記バッファー溶液中で行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉｉ）を、≦１５μｌの、好ましくは≦１０μｌの、最も好ましくは≦５μｌの前記バッファー溶液中で行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ステップ（ｉ）の前に溶解された細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸結合相が、シリカを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸結合相が、磁性粒子を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法を、マイクロ流体デバイスにより行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法を、マグネトキャピラリーバルブにより行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を室温で行い、ステップ（ｉｉｉ）を≧摂氏４０°の、好ましくは摂氏５０°〜７０°の、より好ましくは摂氏６０°〜７０°の、最も好ましくは摂氏６５°の温度で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
≦５０μｌの溶出体積に核酸を精製するためのキットであって、以下：
−  核酸結合相、
−  洗浄のためのバッファー剤を含むバッファー溶液、
−  前記核酸の溶出のための≦５０μｌのバッファー溶液であって、ここで、洗浄のためのおよび溶出のための前記バッファー溶液は同一の溶液である、バッファー溶液、
−  前記精製された核酸を検出するための手段、
を含む、キット。
【請求項１４】
前記キットが、溶解剤をさらに含む、請求項１３に記載の核酸を精製するためのキット。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を行うためのカートリッジであって、以下：
−  核酸結合相を含む第１チャンバ、
−  前記第１チャンバに接続された第２チャンバであって、前記チャンバは、洗浄のためのバッファー剤を含むバッファー溶液を含み、前記核酸の溶出のための≦５０μｌの同一のバッファー溶液を含む、第２チャンバ、
−  前記第２チャンバに接続された第３チャンバであって、前記チャンバは、前記第２チャンバの前記バッファー溶液を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、第３チャンバ、
を含む、カートリッジ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明によれば、これをまた、核酸を洗浄して溶出するための単一バッファー溶液を使用することにより達成することができ、これは、≦１００ｍＭの比較的低塩濃度および比較的高いｐＨ≧７．５により特徴付けられる。
本発明による単一バッファーの利点は、極めて小さな体積の該バッファーを用いることにより高溶出効率を達成することが可能なことであり；さらには、１種の単一バッファーを使用することにより、核酸のより迅速なプロセシングを達成することが可能なことであり、これは特に小型化された環境において有利である。
ステップ（ｉｉ）の態様において、核酸結合相に結合した核酸を、少なくとも１回、好ましくは２回バッファー溶液で洗浄する。
態様において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはウイルスＤＮＡまたはウイルスＲＮＡである。
さらに態様において、サンプルは、真核生物細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくは上皮細胞を含む。
態様において、サンプルは、細菌および／またはウイルスをさらに含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明によれば、この簡易化されて迅速な核酸の精製を、以下：
−  核酸結合相、
−  洗浄のためのバッファー剤を含むバッファー溶液、
−  核酸の溶出のための≦５０μｌのバッファー溶液であって、ここで、洗浄のためのおよび溶出のためのバッファー溶液は同一の溶液である、バッファー溶液、
−  精製された核酸を検出するための手段、
を含むキットによりさらに達成することができる。
態様において、核酸を精製するためのキットは、小型化されたラブオンチップ形式の環境を含む。
態様において、キットは、診断試験としての使用のための、好ましくは分子診断のための携帯用総合試験としての使用に適合されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明によれば、この簡易化されて迅速な核酸の精製を、以下：
−  核酸結合相を含む第１チャンバ、
−  第１チャンバに接続された第２チャンバであって、前記チャンバは、洗浄のためのバッファー剤を含むバッファー溶液を含み、核酸の溶出のための≦５０μｌの同一のバッファー溶液を含む、第２チャンバ、
−  第２チャンバに接続された第３チャンバであって、前記チャンバは、第２チャンバのバッファー溶液を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む、第３チャンバ、
を含むカートリッジによりさらに達成することができる。
態様において、核酸結合相は、磁性粒子を含む。
態様において、カートリッジは、マイクロ流体デバイスにおける使用に適合されている。
さらに態様において、カートリッジは、マグネトキャピラリーバルブを含む。
態様において、カートリッジは、第３チャンバに接続された第４チャンバを含み、前記チャンバは、第２チャンバのバッファー溶液を含むバッファー溶液、または該バッファー溶液の乾燥形態を含む。
【国際調査報告】
2019504640.tif 000008
2019504640.tif 000009
2019504640.tif 000010