(57)【要約】  本発明は、バイオテクノロジの分野に関し、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ、およびヒト炎症誘発性分子（特にＴＮＦα）に高い親和性で特異的に結合するモノクローナル三重特異的結合分子を提供する。本発明はまた、前記結合分子をコードするＤＮＡ構築体、関連する発現ベクターおよび生産方法、ならびに前記結合分子を用いる処置方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＩＬ−１７−Ｆに結合する第１の結合ドメイン、ならびにヒト炎症誘発性分子に結合する第２の結合ドメインを含む三重特異的結合分子。
【請求項２】
前記結合分子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の結合分子。
【請求項３】
前記第１の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項４】
前記第１の結合ドメインは、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項５】
前記第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメインと同じエピトープとの結合について競合し、または同エピトープに結合する、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項６】
前記第１の結合ドメインは、配列番号４と少なくとも９０％同一である、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項７】
前記第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の結合分子。
【請求項８】
前記第１の結合ドメインはヒト化されている、請求項１に記載の結合分子。
【請求項９】
前記第２の結合ドメインは、ヒトＴＮＦαに結合する、請求項１に記載の結合分子。
【請求項１０】
前記第２の結合ドメインは、
ａ）配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む軽鎖；
ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む結合ドメインと同じエピトープとの結合について競合し、または同エピトープに結合する、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１１】
前記第２の結合ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１２】
前記第２の結合ドメインは、配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１に記載の結合分子。
【請求項１３】
前記第２の結合ドメインは、配列番号８と少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、配列番号９と少なくとも９０％同一である可変ドメイン、またはそれらの双方を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１４】
前記第２の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそれらの双方を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１５】
前記第２の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン、および配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１６】
前記第２の結合ドメインは、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、または単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）である、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１７】
前記第２の結合ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一である重鎖、配列番号６と少なくとも９０％同一である軽鎖、またはそれらの双方を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１８】
前記第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖、またはそれらの双方を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項１９】
前記第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項９に記載の結合分子。
【請求項２０】
ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＩＬ−１７Ｆに結合する第１の結合ドメイン、およびヒトＴＮＦαに結合する第２の結合ドメインを含む三重特異的結合分子であって、前記第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、三重特異的結合分子。
【請求項２１】
ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ、およびヒトＴＮＦαに結合する三重特異的結合分子であって、配列番号５および７のアミノ酸配列を含む三重特異的結合分子。
【請求項２２】
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインは、５個を超えるアミノ酸のペプチドリンカーによって連結されている、請求項１、２０、および２１のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２３】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸残基が、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、およびＫから選択される、請求項２２に記載の結合分子。
【請求項２４】
前記ペプチドリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の結合分子。
【請求項２５】
前記結合分子は、アイソタイプＩｇＧの抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１、２０、および２１のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２６】
前記抗体は、アイソタイプサブタイプＩｇＧ１のものである、請求項２５に記載の結合分子。
【請求項２７】
前記結合分子は、突然変異のない同結合分子と比較して、前記抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または前記補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を軽減する少なくとも１つの突然変異を有するＦＣ領域を含む、請求項１、２０、２１のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２８】
前記結合分子は、以下の特性：
ａ）ＩＬ−１７ＡのＫＤが１０−１１Ｍ以下；
ｂ）ＩＬ−１７ＦのＫＤが１０−７Ｍ以下；
ｃ）ＴＮＦαのＫＤが１０−１１Ｍ以下；
ｄ）ＨＴ１０８０細胞におけるＩＬ−６アッセイにおいて、２００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度にて少なくとも５０％ＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦαの活性を阻害する；
ｅ）ＨＴ０８０細胞によるＩＬ−１７Ａ依存性ＩＬ−６放出を阻害する；
ｆ）ＨＴ１０８０細胞におけるＩＬ−６の産生を阻害する；
ｇ）ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞において１００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度にて少なくとも５０％ＴＮＦα依存性細胞毒性を阻害する；
ｈ）ウサギ、マウス、またはモルモットのＴＮＦαには結合しない；
ｉ）ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに同時に結合する；
ｊ）カニクイザルＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに結合する；
ｋ）ヒト血清における３７℃での７日のインキュベーション後、安定したままである；
ｌ）半減期が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、１２日を超える；
ｍ）ｉｎ  ｖｉｖｏ関節炎モデルにおいて炎症誘発性効果を有する；そして
ｌ）ＩＬ−１７およびＴＮＦαの活性をｉｎ  ｖｉｖｏ阻害する
の少なくとも１つを有する、請求項１、２０、２１のいずれか一項に記載の結合分子。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の結合分子、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項３〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３１】
請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第２の結合ドメインの、前記重鎖、前記軽鎖、またはそれらの双方をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３２】
ａ）請求項３〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第２の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列；
ｃ）請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第２の結合ドメインの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列；または
ｄ）ａ）〜ｃ）のあらゆる組合せ
を含む、単離された核酸分子。
【請求項３３】
請求項３〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第２の結合ドメインの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、場合によっては、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、単離された核酸分子。
【請求項３４】
配列番号１〜１５のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子。
【請求項３５】
請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むベクターであって、発現制御配列をさらに含むベクター。
【請求項３６】
ａ）請求項３〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列；
ｂ）請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第２の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の結合分子の前記第２の結合ドメインの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列
を含む宿主細胞。
【請求項３７】
配列番号５をコードするヌクレオチド配列、および配列番号７をコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３６または請求項３７に記載の宿主細胞を用意することと、前記宿主細胞を、前記結合分子の発現に適した条件下で培養することと、生じた前記結合分子を単離することとを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の結合分子の生産方法。
【請求項３９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の結合分子、または請求項２９に記載の医薬組成物を必要とする患者を処置する方法であって、前記結合分子または前記医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記患者は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、またはＴＮＦαによって媒介される障害を患っている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
患者の関節リウマチ、乾癬、または乾癬性関節炎を処置する方法であって、前記患者に、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の結合分子、または請求項２９に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記方法はさらに、抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者はヒトである、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫系の主な機能は、細菌またはウイルス等の感染、および癌病変から体を保護することである。免疫応答は、炎症、すなわち免疫細胞の蓄積を体系的に、または体の特定の部分に含む。免疫系の細胞として、いくつかのタイプの骨髄細胞およびリンパ系細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および好中球が挙げられる。感染または異物に応答して、免疫細胞は、サイトカインとして知られているシグナル伝達タンパク質を分泌し、これが次に、免疫細胞の増殖、発達、分化、および／または移動を調節する。いくつかの場合において、免疫応答は、病理学的過程、例えば自己免疫疾患をもたらす場合がある（例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２０００）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ａｎｄ  Ｆｅｌｄｍａｎｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．；ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｋａｙ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４３：１０２０−１０３４（２０００）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５：３４０−３５０（２００１）参照）。
【０００２】
ＣＤ４＋Т細胞は、免疫応答において中心的な役割を果たしており、適応免疫系または自然免疫系の他の細胞を補助している。初期の研究では、ＣＤ４＋Т細胞の２つのクラス（Ｔｈ１およびＴｈ２）が同定されていた。近年、ＣＤ４＋Ｔ細胞の新しいサブセット、Ｔｈ１７細胞が同定された。Ｔｈ１７細胞は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞が保護を実現しない細胞外細菌、ならびに一部の真菌および細菌からの宿主の保護を強化することに特化した、適応免疫系の支流として出現した。
【０００３】
Ｔｈ１７細胞は、現在６メンバー（ＩＬ−１７Ａ〜Ｆ）からなるサイトカインの新しいファミリ、ＩＬ−１７ファミリの発見の関連で同定された。ＩＬ−１７（以前はＣＴＬＡ−８と呼ばれていた）は実質的に、Ｔｈ１７細胞によって発現され、ＩＬ−１７サイトカインファミリにおける元分子として、ＩＬ−１７Ａと称されている。ＩＬ−１７ファミリメンバーの配列は、現在知られている他の哺乳動物タンパク質との相同性がない。ゆえに、ＩＬ−１７ファミリは、別個のサイトカインファミリを構成する。ＩＬ−１７Ｆの結晶構造に基づいて確立されたＩＬ−１７ファミリメンバーの構造的特徴は、多くのサイトカインに類似している；各ファミリメンバーはおそらく、ホモ二量体として産生されるが、構造分析によれば、ヘテロ二量体も存在し得ることが暗示されている。より最近では、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって発現されるヘテロ二量体ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆが、ＩＬ−１７Ｒ／ＩＬ−１７ＲＣの複合体を介してシグナルを伝達することが見出された（Ｗｒｉｇｈｔ  Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１：２７９９−２８０５（２００１））。
【０００４】
ヒトＩＬ−１７Ｆをコードする遺伝子は、ヒトＩＬ−１７Ａをコードする遺伝子に隣接して位置する（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０（１９）：５３３２−４１（２００１））。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆは、アミノ酸配列同一性が４４％であるが、ＩＬ−１７ファミリの他のメンバーは、配列同一性がより低い（１５〜２７％）。このことは、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆが、ＩＬ−１７ファミリの特別なサブグループを形成することを示唆している（Ｓｔａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７（８）：４１３７−４０（２００１）；Ａｇｇａｒｗａｌ  ａｎｄ  Ｇｕｒｎｅｙ，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７１（１）：１−８（２００２））。ＩＬ−１７Ｆの生物学的効果は、ＩＬ−１７Ａの生物学的効果、例えば、広範囲の細胞におけるＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＧ−ＣＳＦの産生を刺激する能力に類似することが見出された。ＩＬ−１７Ａと同様に、ＩＬ−１７Ｆは、軟骨基質の分泌を誘導し、かつ新しい軟骨基質の合成を阻害することができる（米国特許出願公開第２００２／０１７７１８８号明細書参照）。ゆえに、ＩＬ−１７Ａのように、ＩＬ−１７Ｆは、炎症性疾患の病理に寄与する可能性がある。最近、著者らは、インターロイキン２３（ＩＬ−２３）に曝露されたＴ細胞において、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの双方が誘導されることを観察した（Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（３）：１９１０−４（２００３））。ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの染色体局在化が類似し、かつ配列類似性が大きいという観察、ならびにＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆが、特定の刺激に応答して、同じ細胞集団内で誘導されるという事実により、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆの共有結合性のヘテロ二量体を含有する新しいヒトサイトカインの同定に至った。
【０００５】
さらに、ＩＬ−１７Ａは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）およびインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）と相乗的に作用して、重大な炎症誘発性状態を達成する。様々な炎症症状、免疫症状、および増殖症状（関節リウマチ（ＲＡ）、骨関節炎、関節リウマチ骨粗鬆症、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症、および硬変症）、歯肉炎、歯周症、または歯周病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患）、喘息（アレルギー性喘息が挙げられる）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、癌その他が挙げられる）を処置するために、ＩＬ−１７Ａの活性を、当該分子のアンタゴニストである抗体または抗原結合抗体フラグメントによって低下させることが提案された（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１６６８６２号明細書、国際公開第２００５／１０８６１６号、国際公開第２００５／０５１４２２号、および国際公開第２００６／０１３１０７号参照）。
【０００６】
ＴＮＦαアンタゴニストは、炎症を軽減し、かつ軟骨および骨の破壊の進行を阻害することによって、関節炎を処置することが知られている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ３：１８−２６（２００１））。しかしながら、かなりのパーセンテージの患者は、ＴＮＦαアンタゴニスト含有薬物に対する応答が不十分である。臨床前研究によれば、ＴＮＦαおよびＩＬ−１７Ａは、関節炎の病態生理学において同じ特性を示すことが示されている。ＴＮＦαおよびＩＬ−１７Ａは、単独では、炎症性遺伝子の発現に及ぼす影響がごく僅かであるが、それらを組み合わせると、強力な相乗的応答がもたらされる。ＴＮＦαおよびＩＬ−１７Ａの相互作用は、サイトカイン（ＬｅＧｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４４：２０７８−２０８３（２００１））および炎症誘発性ケモカイン（Ｃｈａｂａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：６０１５−６０２０（２００１））の発現を増大させ、かつ軟骨および骨の破壊をも誘導する（Ｖａｎ  Ｂｃｚｏｏｉｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｐｉｓ  ６１：８７０−８７６（２００２））。
【０００７】
現在、いくつかのＩＬ−１７Ａ二重特異的抗体および他の炎症誘発性分子、例えばＤＶＤ（Ａｂｂｏｔｔ）およびＣＯＶＡ３２２（Ｃｏｖａｇｅｎ−Ｊａｎｓｓｅｎ）が存在する。
【０００８】
国際公開第２０１５／０１４９７９号は、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαの四価二重特異的抗体を記載しており、これは、ＩＬ−１７Ａについて２つの結合部位を、そしてＴＮＦαについて２つの結合部位を含有する。当該抗体は、関節リウマチにおいて炎症および組織破壊を阻害する相乗効果を示した。
【０００９】
国際公開第２０１４／１３７９６１号は、２つのポリペプチドを含む、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαの二重特異的抗体を記載している。当該二重特異的抗体は、熱的および化学的に安定しており、低い凝集能を示し、そしてＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに同時に結合することができる。
【００１０】
米国特許第８４９６９３６号明細書は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−２３ｐ１９の三重特異的抗体を記載しており、これは、細胞アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、様々なリガンドに対して異なる活性を示すが、安定した製剤候補を作出するのに必須の物理化学的特性をなんら示さなかった。
【００１１】
ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＴＮＦαの活性を、炎症反応および自己免疫疾患との関連で効果的に中和することができる抗体、特に製剤中で安定なままである抗体の生産は、依然として関連性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および炎症誘発性分子、例えばＴＮＦαに対する三重特異的結合分子を提供する。そのような抗体は、自己免疫疾患および／または炎症性障害、例えば関節リウマチ、乾癬、および乾癬性関節炎の処置に用いられ得る。そのような障害に現在利用可能な、抗体処置が含まれる処置と比較して、本発明の三重特異的結合分子は、単独で、または他の抗炎症療法および／もしくは免疫抑制療法と組み合わせて、優れた臨床応答をもたらし得ると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様において、本発明は、ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＩＬ−１７−Ｆに結合する第１の結合ドメイン、ならびにヒト炎症誘発性分子に結合する第２の結合ドメインを含む三重特異的結合分子を提供する。特定の実施形態において、ヒト炎症誘発性分子は、ヒトＴＮＦαである。特定の実施形態において、結合分子は、抗体またはその抗原結合部分である。
【００１４】
一部の実施形態において、第１の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の結合ドメインは、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む結合ドメインと同じエピトープとの結合について競合し、または同エピトープに結合する。一部の実施形態において、第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列と、配列が少なくとも９０％同一である。特定の実施形態において、第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００１５】
一部の実施形態において、第１の結合ドメインは、ヒト化されている。特定の実施形態において、第１の結合ドメインは、ヒト化ＶＨＨである。
【００１６】
一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、以下を含む結合ドメインと同じエピトープとの結合について競合し、または同エピトープに結合する：
・配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む軽鎖；
・配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン；または
・配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖。
一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１３〜１５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列と、配列が少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の可変ドメイン、またはそれらの双方を含む。一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、またはそれらの双方を含む。特定の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン、および配列番号９のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメインを含む。
【００１７】
一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、または単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）である。一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、ヒト化Ｆａｂである。
【００１８】
一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列と、配列が少なくとも９０％同一の重鎖、配列番号６のアミノ酸配列と、配列が少なくとも９０％同一の軽鎖、またはそれらの双方を含む。一部の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖、またはそれらの双方を含む。特定の実施形態において、第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列からなる重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される第１の結合ドメインのいずれかを、本明細書中に記載される第２の結合ドメインのいずれかと組み合わせて含む三重特異的結合分子を提供する。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＩＬ−１７Ｆに結合する第１の結合ドメイン、およびヒトＴＮＦαに結合する第２の結合ドメインを含む三重特異的結合分子であって、前記第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、三重特異的結合分子を提供する。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＩＬ−１７Ｆに結合する第１の結合ドメイン、およびヒトＴＮＦαに結合する第２の結合ドメインを含む三重特異的結合分子であって、前記第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、前記第２の結合ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、三重特異的結合分子を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ、およびヒトＴＮＦαに結合する三重特異的結合分子であって、配列番号５および７のアミノ酸配列を含む三重特異的結合分子を提供する。
【００２３】
一部の実施形態において、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインは、５個を超えるアミノ酸のペプチドリンカーによって連結されている。特定の実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸残基は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、およびＫから選択される。特定の実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。第１の結合ドメインは、ペプチドリンカーを介して、第２の結合ドメインの重鎖または軽鎖のいずれかのＮ末端またはＣ末端に連結され得る。
【００２４】
一部の実施形態において、結合分子は、アイソタイプＩｇＧの抗体またはその抗原結合部分である。抗体は、例えば、アイソタイプサブタイプＩｇＧ１のものであってよい。
【００２５】
一部の実施形態において、結合分子は、突然変異のない同結合分子と比較して、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを軽減する少なくとも１つの突然変異を有するＦｃ領域を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、結合分子は、以下の特性の少なくとも１つを有する：
・ＩＬ−１７ＡのＫＤが１０−１１Ｍ以下；
・ＩＬ−１７ＦのＫＤが１０−７Ｍ以下；
・ＴＮＦαのＫＤが１０−１１Ｍ以下；
・ＨＴ１０８０細胞におけるＩＬ−６アッセイにおいて、２００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度にて少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、または９０％）ＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦαの活性を阻害する；
・ＨＴ０８０細胞によるＩＬ−１７Ａ依存性ＩＬ−６放出を阻害する；
・ＨＴ１０８０細胞におけるＩＬ−６の産生を阻害する；
・ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞において１００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度にて少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、または９０％）ＴＮＦα依存性細胞毒性を阻害する；
・ウサギ、マウス、またはモルモットのＴＮＦαには結合しない；
・ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに同時に結合する；
・カニクイザルＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに結合する。
・ヒト血清における３７℃での少なくとも３、４、５、６、または７日のインキュベーション後（例えば、７日のインキュベーション後）、安定したままである；
・半減期が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日を超える（例えば１２日）；
・ｉｎ  ｖｉｖｏ関節炎モデルにおいて抗炎症効果を有する；そして
・ＩＬ−１７およびＴＮＦαの活性をｉｎ  ｖｉｖｏ阻害する。
【００２７】
一態様において、本発明は、本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれか、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
一態様において、本発明は、本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００２９】
本発明はまた、本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第２の結合ドメインの、重鎖、軽鎖、またはそれらの双方をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００３０】
一部の態様において、本発明は、以下を含む単離された核酸分子を提供する：
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列；
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第２の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列；
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列；または
・上記のあらゆる組合せ。
一部の実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの、第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列、および第２の結合ドメインの軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、場合によっては、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。単離された核酸分子は、例えば、配列番号４をコードするヌクレオチド配列、および配列番号６をコードするヌクレオチド配列を含んでよく、場合によっては、ペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態において、ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、配列番号１６である。一実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号７をコードする。
【００３１】
一部の実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１〜１５のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする。
【００３２】
本発明はまた、先に記載される単離された核酸分子のいずれかを含むベクターであって、発現制御配列をさらに含むベクターを提供する。
【００３３】
本発明はまた、以下を含む宿主細胞を提供する：
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列；
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第２の結合ドメインの重鎖をコードするヌクレオチド配列；および
・本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかの第１の結合ドメインをコードするヌクレオチド配列。
特定の実施形態において、宿主細胞は、配列番号５をコードするヌクレオチド配列、および配列番号７をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
一態様において、本発明は、本明細書中に記載される三重特異的結合分子のいずれかを生産する方法であって、先に記載される宿主細胞を用意することと、前記宿主細胞を、結合分子の発現に適した条件下で培養することと、生じた結合分子を単離することとを含む方法を提供する。
【００３５】
一態様において、本発明は、必要とする患者を処置する方法であって、本明細書中に記載される三重特異的結合分子または医薬組成物のいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、患者は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、またはＴＮＦαによって媒介される障害を患っている。特定の実施形態において、本発明は、患者における関節リウマチ、乾癬、または乾癬性関節炎を処置する方法であって、本明細書中に記載される三重特異的結合分子または医薬組成物のいずれかを患者に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、当該方法はさらに、抗炎症剤または免疫抑制剤を投与することを含む。先の処置方法のいずれにおいても、患者はヒトであってよい。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα抗体の生産の概略を示す図である。
【図２】ＩＬ−１７Ａ−Ｈｉｓ６−ＦＬＡＧのタンパク質配列を示す図である。
【図３】精製したＩＬ−１７Ａ−Ｈｉｓ６−ＦＬＡＧタンパク質を示すゲルである。
【図４】精製した対照抗ＩＬ−１７Ａ抗体を示すゲルである。
【図５】ラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）の免疫化によって産生された抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体の力価を示すグラフである。
【図６】抗体Ｆａｂフラグメントのファージディスプレイ用のｐＨ５プラスミドを示すマップである。
【図７】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体Ｆａｂフラグメントの分泌発現用のｐＬＬ−Ｆａｂプラスミドを示すマップである。
【図８】免疫ファージライブラリからの抗ＩＬ１７−Ａフラグメントの選択後の、特異的抗原および非特異的抗原とのポリクローナルファージの結合を示すグラフである。
【図９】ヒトＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆに特異的な高親和性ＶＨＨドメイン（ＶＨＨ１７；配列番号４）およびその親ＶＨＨドメイン（ＶＨＨ；配列番号１７）のアミノ酸配列を示す図である。ヒト化プロセス中に置換されたアミノ酸を太字で示す。ＣＤＲを灰色で強調表示する。図９はまた、抗ヒトＴＮＦα抗体（ＲＵ２３０３６０４号明細書）の重鎖および軽鎖の可変ドメインアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８および９）を示す図である。
【図１０】抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα三重特異的抗体の一部として用いた抗ＴＮＦα抗体変異体のＣＤＲにおける突然変異の表を示す（上から下へ、配列番号１９〜３２）。
【図１１】異なる抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα三重特異的抗体変異体の一過性発現の結果を示す図である。
【図１２】ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を用いた細胞毒性ＴＮＦα依存性アッセイにおける、異なる抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα三重特異的抗体変異体の抗ＴＮＦα活性の比較分析を示す図である。阻害活性が最大である変異体を灰色で表示する。
【図１３】ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を用いる細胞毒性ＴＮＦα依存性アッセイにおける、３つの抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα三重特異的抗体改変体（Ｍａｂ１２、Ｍａｂ３１、およびＭａｂ３２）の抗ＴＮＦα活性を示すグラフである。
【図１４】ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を用いるＴＮＦα依存性細胞毒性アッセイにおける、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα三重特異的抗体ＢＣＤ−１２１、ならびに２つの市販の単一特異的抗ＴＮＦα抗体アダリムマブおよびインフリキシマブについての抗ＴＮＦα活性を示すグラフである。
【図１５】ＨＴ１０８０細胞におけるＩＬ−１７Ａ依存性ＩＬ−６産生の機能を阻害するＢＣＤ−１２１の能力を、陽性対照（単一特異的抗ＩＬ−１７Ａ抗体ＢＣＤ−０８５）および陰性対照（抗ＴＮＦα抗体アダリムマブ）と比較して示すグラフである。
【図１６】ＨＴ１０８０細胞における二重ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα依存性ＩＬ−６産生を阻害するＢＣＤ−１２１の能力を、陽性対照（単一特異的抗ＩＬ−１７Ａ抗体ＢＣＤ−０８５）および陰性対照（再生抗ＴＮＦα抗体アダリムマブ）と比較して示すグラフである。
【図１７】抗体ＢＣＤ−１２１由来の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を、Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍ  ＴＮＦα  ｃ１．８細胞培養体に基づいて、３つの市販の単一特異的抗ＴＮＦα抗体（アダリムマブ、インフリキシマブ、およびシムジア）と比較して示すグラフである。
【図１８】抗体ＢＣＤ−１２１由来の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を、Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍ  ＴＮＦα  ｃ１．８細胞培養体に基づいて、３つの市販の単一特異的抗ＴＮＦα抗体（アダリムマブ、インフリキシマブ、およびシムジア）と比較して示すグラフである。
【図１９】Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６を用いた、ＩＬ−１７ＡおよびヒトＴＮＦα双方へのＢＣＤ−１２１の同時「サンドイッチ」結合のセンソグラムである。
【図２０】ヒトＩＬ−１７ファミリの異なるリガンドに結合するＢＣＤ−１２１抗体についてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図２１】異なるオーソロガスＴＮＦαタンパク質に結合するＢＣＤ−１２１抗体についてのＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図２２】ＢＣＤ−１２１タンパク質凝集の熱安定性を、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて示すグラフである。グラフは、４つのバッファについて、平均粒径（Ｚ平均）対温度を示す。
【図２３】４つの異なるバッファ溶液中で熱ストレス５０℃を用いた長期間の曝露中のＢＣＤ−１２１の熱安定性を示すグラフである。
【図２４】最適化された精製スキームに従って、安定した細胞株プロデューサの培養培地から得た、ＢＣＤ−１２１の純度分析を示す図である。パネルＡ：還元条件（＋β−ＭＥ）。パネルＢ：非還元条件（−β−ＭＥ）。レーン２およびレーン３：それぞれ１０および４０μｇをアプライした。
【図２５】純粋なヒト血清中のＢＣＤ−１２１安定性を、ＥＬＩＳＡによって示すグラフである。
【図２６】カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおける、ＢＣＤ−１２１の薬力学的特性を示すグラフである。
【図２７】薬物動態プロファイルを、１０、５０、または１００ｍｇ／ｋｇの用量での単回ＳＣ投与後のサルにおけるＢＣＤ−１２１のＥＬＩＳＡによって示すグラフである。
【図２８】ＢＣＤ−１２１が、ＨＴ１０８０細胞におけるＩＬ−６の産生を誘導するＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαの能力を二重阻害することができることを示すグラフである。ＢＣＤ−１２１は、単一特異的抗ＴＮＦ  Ａｂ１、抗ＴＮＦ  Ｆａｂ−ＰＥＧ、または抗ＩＬ１７  Ａｂ（ＩＬ−１７に対するモノクローナル抗体）よりも強力にＩＬ−６放出を阻害し、ＩＣ５０は２０ｎｇ／ｍｌである。
【図２９】Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ  ＺＳＰによる振盪ストレス凝集アッセイ（５００ｒｐｍにて２０回）を示すグラフである。データは、ＢＣＤ−１２１が、皮下注射用の高濃度製剤（１００ｍｇ／ｍｌ超）に用いられ得る、高度に可溶性の三重特異的分子であることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義および一般的な技術
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。例示的な方法および材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載される方法および材料と類似の、または同等の方法および材料もまた、本発明の実行または試験に用いられ得る。本明細書中で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配することとなる。いくつかの文献が本明細書中に引用されているが、この引用は、これらの文献のいずれかが、当該技術における共通の一般的知識の一部を形成することの容認にはならない。
【００３８】
さらに、文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、そして複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書中に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、合成有機化学、薬化学および医薬化学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、ならびにそれらの技術は、当該技術において周知であり、かつ一般的に用いられるものである。酵素反応および精製技術は、当該技術において一般的に達成されるように、または本明細書中に記載されるように、製造者の仕様書に従って実行される。
【００３９】
本明細書および実施形態の全体を通して、文言「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載される完全体または完全体の群の包含を意味すると理解され、他のあらゆる完全体または完全体の群の除外を意味しない。
【００４０】
抗体関連の定義
特記されない限り、本明細書中で用いられる「ＩＬ−１７Ａ」、「ＩＬ−１７Ｆ」、および「ＴＮＦα」は、それぞれヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＴＮＦαを指す。
【００４１】
インターロイキン−１７（「ＩＬ−１７」）は、２０〜３０ｋＤのグリコシル化ホモ二量体タンパク質である。ＩＬ−１７Ａヒト遺伝子は、１５５個のアミノ酸のタンパク質をコードし、これは、１９個のアミノ酸のシグナル配列および１３６個のアミノ酸の成熟セグメントを有する。ＩＬ−１７Ｆヒト遺伝子は、１６３個のアミノ酸のタンパク質をコードし、これは、３０個のアミノ酸のシグナル配列および１３３個のアミノ酸の成熟セグメントを有する。ヒトＩＬ−１７Ａポリペプチド配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ１６５５２で入手可能である。ヒトＩＬ−１７Ｆポリペプチド配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｑ９６ＰＤ４で入手可能である。
【００４２】
本明細書中で用いられる用語「腫瘍壊死因子アルファ」または「ＴＮＦα」は、Ｐｅｎｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７２１（１９８４）またはＡｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２６０：２３４５（１９８５）に記載されるポリペプチド配列を有するヒトＴＮＦα分子を指す。
【００４３】
用語「免疫応答」、「自己免疫反応」、および「自己免疫性炎症」は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および先の細胞または肝臓によって産生される可溶性の巨大分子（侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫もしくは病的な炎症の場合、正常なヒト細胞またはヒト組織の選択的な損傷、破壊、または人体からの排除をもたらす抗体、サイトカイン、および補体が挙げられる）の作用を指す。
【００４４】
用語「結合分子」は、抗体および免疫グロブリンを包含する。本明細書中で用いられる用語「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ジスルフィド結合によって相互連結されている、２つの重（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤａ）および２つの軽（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）を含む四量体を指す。各重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に点在する、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割され得る。各ＶＨおよび各ＶＬは、３つのＣＤＲ（Ｈ−ＣＤＲは、本明細書中で、重鎖由来のＣＤＲを示し、Ｌ−ＣＤＲは、本明細書中で、軽鎖由来のＣＤＲを示す）および４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置されている。各領域へのアミノ酸の割当ては、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７（１）：５５−７７（２００３）；またはＫａｂａｔの定義、免疫学的に注目するタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７  ａｎｄ  １９９１））；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；またはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）に従うことができる。
【００４５】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される抗体または免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖に加えて、ＶＨＨドメインまたは「ナノボディ」を含み得る。当該単一ドメインは、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）の抗原結合部分であり、これは、軽鎖を欠いており、典型的にはラマおよびアルパカ等のラクダ科の種において見られる。
【００４６】
本明細書中で用いられる抗体の用語「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）は、抗原（例えば、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ＴＮＦα、またはその一部）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の部分またはフラグメントを指す。完全長抗体の特定のフラグメントが、抗体の抗原結合機能を実行し得ることが示されてきた。用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１のドメインからなる一価のフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント：ヒンジ領域にてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント；ならびに（ｖｉ）抗原に特異的に結合することができる、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされているが、これらを、組換え方法を用いて、単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって連結させることができ、この単一のタンパク質鎖では、ＶＬ領域およびＶＨ領域は対になって、一価の分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）。また、本発明の範囲内にあるのが、ＶＨおよび／またはＶＬを含む抗原結合分子である。また、ＶＨの場合、分子は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、またはＣＨ３の領域の１つまたは複数を含み得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」に包含されることが意図されている。一本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディもまた包含される。ダイアボディは、二価の二重特異的抗体であり、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つの当該ドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いることによって、当該ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を作出している。
【００４７】
ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体部分は、抗体全体から、抗体全体のパパイン消化またはペプシン消化等の従来技術を用いて調製され得る。さらに、抗体、抗体部分、およびイムノアドヘシン分子が、例えば本明細書中に記載される、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて得られ得る。
【００４８】
用語「組換え抗体」は、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む細胞または細胞株から発現されるが、前記ヌクレオチド配列は、天然では細胞と関係しない、抗体を指す。
【００４９】
本明細書中で用いられる用語「変異型」抗体は、親抗体の配列に対する１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失、および／または置換によって、「親」抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましい実施形態において、変異型抗体は、親抗体に対して少なくとも１つまたは複数（例えば、１から約１２個、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個；一部の実施形態において、１〜約１０個）のアミノ酸の付加、欠失、および／または置換を含む。一部の実施形態において、アミノ酸の付加、欠失、および／または置換は、変異型抗体のＣＤＲ内にある。変異型抗体配列に対する同一性または相同性は、本明細書において、最大パーセントの配列同一性を達成するために、必要であれば、配列をアラインしてギャップを導入した後に、親抗体の残基と同一である、変異型抗体配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。変異型抗体は、親抗体が結合するのと同じ抗原、好ましくはエピトープに結合する能力を保持しており、一部の実施形態において、親抗体の類似の特性よりも優れている少なくとも１つの特性または生物活性を有する。例えば、変異型抗体は、親抗体と比較して、例えば、結合親和性がより強く、半減期がより長く、ＩＣ５０がより低く、または抗原の生物学的活性を阻害する能力が高くてよい。本明細書中で特に注目する変異型抗体は、親抗体と比較して、生物活性の少なくとも約２倍（好ましくは少なくとも約５倍、１０倍、または２０倍）の増大を示す抗体である。
【００５０】
用語「キメラ抗体」は、その最も広い意味において、１つの抗体由来の１つまたは複数の領域、および１つまたは複数の他の抗体由来の１つまたは複数の領域を含有する抗体、典型的には、部分的にヒト起源であり、かつ部分的に非ヒト起源である、すなわち、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、もしくは他の齧歯類、またはラクダ科動物、例えばラマもしくはアルパカに部分的に由来する抗体を指す。ヒト抗−抗体応答、例えば、マウス抗体の場合のヒト抗−マウス抗体応答のリスクを引き下げるためには、キメラ抗体が、非ヒト抗体よりも好ましい。典型的なキメラ抗体の例として、可変領域配列がマウスのものである一方、定常領域配列がヒトのものであるものがある。キメラ抗体の場合、抗体をヒト化するために、非ヒト部分がさらに改変されてよい。
【００５１】
用語「ヒト化」は、抗体が完全に、または部分的に非ヒト起源である、例えばマウスもしくはラマの、注目する抗原による免疫化から得られたそれぞれマウス抗体もしくはラマ抗体、またはこのようなマウス抗体もしくはラマ抗体に基づくキメラ抗体である場合、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域および定常ドメインにおいて、特定のアミノ酸を置換して、ヒトにおいて免疫応答を回避し、または最小にすることができるという事実を指す。標的抗原との抗体の相互作用の特異性は、主に、重鎖および軽鎖の６つのＣＤＲ内に位置するアミノ酸残基内に存在する。したがって、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも、個々の抗体間ではるかに可変的である。ＣＤＲ配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用の原因となるため、天然に存在する特異的抗体、またはより一般的には、所与のアミノ酸配列を有するあらゆる特異的抗体の特性を模倣している組換え抗体を、例えば、異なる抗体由来のフレームワーク配列中に移植した特異的抗体由来のＣＤＲ配列を発現する発現ベクターを構築することによって、発現させることが可能である。結果として、非ヒト抗体を「ヒト化」することが、そしてなお、元の抗体の結合特異性および結合親和性を実質的に維持することが可能である。免疫原性を正確に予測することによって、特定の抗体のヒト抗−抗体応答を正確に予測することは不可能であるが、非ヒト抗体は、ヒト抗体よりも免疫原性が高い傾向がある。外来（例えば、齧歯類またはラクダ科動物）の定常領域が、ヒト起源の配列で置換されているキメラ抗体は、完全に外来起源の抗体よりも免疫原性が概して低いことが示されており、治療用抗体のトレンドは、ヒト化抗体または完全ヒト抗体に向かっている。ゆえに、キメラ抗体、または非ヒト起源の他の抗体をヒト化して、ヒト抗−抗体応答のリスクを引き下げることができる。
【００５２】
キメラ抗体について、ヒト化は典型的に、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を包含する。相補性決定領域（ＣＤＲ）の一部であるアミノ酸残基は、ほとんどの場合、ヒト化に関連して改変されないであろうが、特定の場合には、個々のＣＤＲアミノ酸残基を改変すること、例えば、グリコシル化部位、脱アミノ化部位、アスパルタート異性化部位、または不所望のシステイン残基もしくはメチオニン残基を除去することが所望され得る。Ｎ−結合型グリコシル化は、オリゴ糖鎖の、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、Ｘは、Ｐｒｏを除くあらゆるアミノ酸であり得る）中のアスパラギン残基への結合によって起こる。Ｎ−グリコシル化部位の除去は、好ましくは保存的置換によって、Ａｓｎ残基またはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を異なる残基に変異させることによって、達成され得る。ｐＨおよび表面曝露等の要因に応じて、アスパラギン残基およびグルタミン残基の脱アミド化が起こり得る。アスパラギン残基は、特に、主に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ中に存在する場合、脱アミノ化を受け易く、そしてＡｓｎ−Ａｌａ等の他のジペプチド配列中では、それほどではない。したがって、そのような脱アミノ化部位、特にＡｓｎ−Ｇｌｙが、ＣＤＲ配列中に存在する場合、典型的には保存的置換により、関与する残基の１つを除去することによって、当該部位を除去することが所望されてよい。
【００５３】
抗体配列のヒト化のための多数の方法が、当該技術において知られている。例えば、Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎによる総説、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）参照。一般的に用いられる一方法が、ＣＤＲ移植であり、これは、例えばマウス由来のキメラ抗体について、マウス可変領域の遺伝子に対するヒト生殖系列の遺伝子対応物の同定、およびこのフレームワーク中へのマウスＣＤＲ配列の移植を包含する。ＣＤＲ移植は、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義に基づくことができるが、より最近の刊行物（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．６４：２１０−２２５（２００７））は、ＩＭＧＴ（登録商標）の定義（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）が、ヒト化の結果を向上させ得る（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）参照）ことを示唆している。場合によっては、ＣＤＲ移植は、ＣＤＲが得られる親抗体と比較して、ＣＤＲ移植非ヒト抗体の結合特異性および結合親和性を、ゆえに生物学的活性を低下させる虞がある。復帰突然変異（「フレームワーク修復」と呼ばれることもある）を、典型的にはフレームワーク領域内の、ＣＤＲ移植抗体の選択位置に導入して、親抗体の結合特異性および結合親和性を再確立することができる。文献および抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて、可能性のある復帰突然変異のための位置の同定が実行され得る。復帰突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的には、抗体分子の表面に位置する残基である。一方、埋め込まれている、または表面曝露の程度が低い残基は、通常、改変されないであろう。ＣＤＲ移植および復帰突然変異の代替のヒト化技術は、非ヒト起源の非表面曝露残基が保持される一方、表面残基がヒト残基に改変される再表面化である。
【００５４】
また、ある場合には、１つまたは複数のＣＤＲアミノ酸残基を改変して、標的エピトープに対する結合親和性を向上させることが所望されてよい。これは、「親和性成熟」として知られており、場合によっては、例えば抗体のヒト化が結合特異性または結合親和性を低下させ、そして復帰突然変異単独によって結合特異性または結合親和性を十分に向上させることができない状況において、ヒト化と共に実行され得る。種々の親和性成熟方法が、当該技術において知られており、例えば、Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：４１２−４１７（１９９７）に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ走査飽和突然変異誘発法、およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：６０３７−６０４２（１９９８）の段階的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性成熟法がある。
【００５５】
用語「単離されたタンパク質」、「単離されたポリペプチド」、または「単離された抗体」は、その起源または由来源によって、（１）天然の状態で付随する天然付随成分を伴わない、（２）同じ種由来の他のタンパク質がない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、または（４）自然界に存在しない、タンパク質、ポリペプチド、または抗体を指す。ゆえに、天然に由来する細胞とは異なる細胞系において化学合成または合成されるポリペプチドは、その天然付随成分から「単離される」こととなる。タンパク質はまた、当該技術において周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然付随成分を実質的に含まないようにしてもよい。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「生殖系列」は、生殖細胞を介して親から後代に引き継がれる抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を指す。生殖系列配列は、成熟Ｂ細胞において抗体をコードするヌクレオチド配列とは区別され、成熟Ｂ細胞は、Ｂ細胞成熟過程の間に、組換え事象および超突然変異事象によって改変されている。特定の生殖系列配列を「利用する」抗体は、その生殖系列ヌクレオチド配列と、またはそれが特定するアミノ酸配列と、他のあらゆる生殖系列ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列とアラインするよりも厳密にアラインするヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。
【００５７】
用語「親和性」は、抗原と結合分子、例えば抗体との間の引力の尺度を指す。抗原に対する結合分子の固有の誘引性は、典型的には、特定の結合分子−抗原相互作用の結合親和性平衡定数（ＫＤ）として表される。結合分子は、ＫＤが≦１ｍＭ、好ましくは≦１００ｎＭである場合、抗原に特異的に結合すると言われる。ＫＤ結合親和定数は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標））またはＢｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ由来のＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６  ＳＰＲシステムまたはＯｃｔｅｔ（商標）システムを用いて、測定することができる。
【００５８】
用語「ｋｏｆｆ」は、特定の結合分子−抗原相互作用の解離速度定数を指す。ｋｏｆｆ解離速度定数は、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙによって、例えばＯｃｔｅｔ（商標）システムを用いて、測定することができる。
【００５９】
本明細書中で用いられる用語「エピトープ」は、結合分子（例えば、抗体または関連分子、例えば二重特異的結合分子）に特異的に結合する抗原の一部（決定因子）を指す。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸、または炭水化物側鎖もしくは糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、一般に、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。エピトープは、「直鎖状」または「立体配座」であり得る。直鎖状エピトープでは、タンパク質（例えば抗原）と、相互作用分子（例えば抗体）との間の相互作用点が全て、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体配座エピトープでは、相互作用点が、一次アミノ酸配列中で互いに分離されているタンパク質上のアミノ酸残基にわたって生じる。抗原上の所望されるエピトープが決定されると、そのエピトープに対する抗体を、当該技術において周知の技術を用いて生成することが可能である。さらに、抗体または他の結合分子の生成および特徴付けにより、所望されるエピトープに関する情報が解明され得る。この情報から、例えば、抗原への結合について競合する結合分子を見出すための競合研究を行うことによって、同じ、または類似のエピトープへの結合について、結合分子を競合的にスクリーニングすることが可能である。
【００６０】
抗体または他の結合分子が、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、またはＴＮＦαの同じエピトープに結合するか、これらへの結合について、本発明の三重特異的結合分子と交差競合するかを、当該技術において知られている方法を用いて判定することができる。一実施形態において、本発明の三重特異的結合分子を、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、またはＴＮＦαに飽和条件下で結合させてから、試験抗体が前記標的抗原に結合する能力を測定する。試験抗体が、参照三重特異的結合分子と同時に標的抗原に結合することができれば、試験抗体は、参照三重特異的結合分子とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が標的抗原に同時に結合することができなければ、試験抗体は、三重特異的結合分子によって結合されるエピトープと同じエピトープ、これと重複するエピトープ、またはこれに非常に近接したエピトープに結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、またはフローサイトメトリを用いて実行され得る。本発明の三重特異的結合分子が、別の結合分子と交差競合するかを試験するために、先に記載される競合法を二方向で用いてよい。すなわち、既知の結合分子が試験結合分子をブロックし、そしてその逆も同じであるかを判定する。そのような交差競合実験は、例えば、ＩＢＩＳ  ＭＸ９６  ＳＰＲ装置またはＯｃｔｅｔ（商標）システムを用いて実行され得る。
【００６１】
一実施形態において、本発明の結合分子は、モノクローナル抗体である。本明細書中で用いられる頭字語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体、すなわち、個々のクローン細胞集団によって合成かつ分泌された抗体を指す。クローン集団は、不死化細胞のクローン集団であってよい。一部の実施形態において、クローン集団中の不死化細胞は、典型的には、免疫化された動物由来の個々のＢリンパ球の、リンパ球腫瘍由来の個々の細胞との融合によって生産されたハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）である。ハイブリドーマは、操作された細胞型であり、自然界には存在しない。
【００６２】
抗体のクラス（アイソタイプ）およびサブクラスは、当該技術において知られているあらゆる方法によって判定され得る。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を用いて判定され得る。そのような抗体は市販されている。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、および他の技術によって判定され得る。これ以外にも、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全てまたは一部を配列決定して、そのアミノ酸配列を、免疫グロブリンの種々のクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較して、抗体のクラスおよびサブクラスを判定することによって、判定され得る。
【００６３】
用語「炎症誘発性分子」として、以下に限定されないが、リンフォカイン、モノカイン、従来のポリペプチドホルモン、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質ホルモン、例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝増殖因子、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、因子、および腫瘍壊死因子、ミュラー管抑制物質、ゴナドトロピン関連マウスペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子および血小板由来成長因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＣＳＦマクロファージ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ顆粒球マクロファージ（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＣＳＦ顆粒球（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、およびＩＬ−２３、腫瘍壊死因子、ならびに白血病抑制因子（ＬＩＦ）およびキットリガンド（ＫＬ）を誘導する他のポリペプチド因子が挙げられる。本明細書中で用いられる用語「炎症誘発性分子」は、天然源から、または組換え細胞培養物から単離されたタンパク質、および前記タンパク質の生物学的に活性な等価物を含む。
【００６４】
三重特異的抗ＴＮＦα／抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ結合分子
本発明は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＩＬ−１７ＡでもＩＬ−１７Ｆでもない炎症誘発性分子（例えばＴＮＦα）に対する三重特異的結合分子を提供する。特定の実施形態において、三重特異的結合分子は、三重特異的抗体またはその抗原結合部分である。結合分子は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および炎症誘発性分子（例えばＴＮＦα）に結合するドメインを含む。一部の実施形態において、結合分子は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆに結合する第１の結合ドメイン、ならびにＴＮＦαに結合する第２の結合ドメインを含む。一部の実施形態において、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆについての結合ドメインは、別個であってよい。
【００６５】
一実施形態において、本発明の三重特異的抗ＴＮＦα／抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ結合分子は、ヒトＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ｆへの結合について、以下を含むＶＨＨと競合するか、前記抗原の、当該ＶＨＨと同じエピトープに結合する：
・配列番号１〜３；または
・配列番号４。
【００６６】
一実施形態において、本発明の三重特異的抗ＴＮＦα／ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆ結合分子は、ヒトＴＮＦαへの結合について、以下を含む抗体と競合するか、前記抗原の、当該抗体と同じエピトープに結合する：
・配列番号１０〜１５；
・配列番号８および９；または
・配列番号５および６。
【００６７】
特定の実施形態において、本発明の三重特異的抗ＴＮＦα／ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆ結合分子は、ヒトＩＬ−１７Ａおよび／またはＩＬ−１７Ｆへの結合について、以下を含むＶＨＨと競合するか、前記抗原の、当該ＶＨＨと同じエピトープに結合し：
・配列番号１〜３；または
・配列番号４；
かつ、ヒトＴＮＦαへの結合について、以下を含む抗体と競合するか、前記抗原の、当該抗体と同じエピトープに結合する：
・配列番号１０〜１５；
・配列番号８および９；または
・配列番号５および６。
【００６８】
一実施形態において、三重特異的結合分子は、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨドメインを含む。特定の実施形態において、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態において、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨドメインは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１（Ｈ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２（Ｈ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列、またはそれらのあらゆる組合せを含む。一実施形態において、ＶＨＨドメインは、配列番号１〜３の、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＶＨＨドメインは、配列が、配列番号４と少なくとも６０％同一であり、例えば、配列番号４と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である。一部の実施形態において、ＶＨＨドメインは、配列が、配列番号４と少なくとも９０％同一であり、例えば、配列番号４と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態において、ＶＨＨドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。
【００６９】
一実施形態において、三重特異的結合分子は、抗ヒトＴＮＦα抗体またはその抗原結合部分を含む。特定の実施形態において、抗ヒトＴＮＦ−アルファ抗体は、ヒト化抗体またはその抗原結合部分（例えばヒト化Ｆａｂ）である。
【００７０】
一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の重鎖は、配列番号１０のＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１のＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１２のＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、またはそれらのあらゆる組合せを含む。一実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の重鎖は、配列番号１０〜１２の、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、およびＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の重鎖は、配列が、配列番号８と少なくとも６０％同一である、例えば、配列番号８と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の重鎖は、配列が、配列番号８と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号８と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。特定の実施形態において、ＶＨは、配列番号８のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。ＶＨは、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子の重鎖定常ドメイン（ＣＨ）に連結され得る。特定の実施形態において、ＣＨは、アイソタイプＩｇＧ、例えばアイソタイプサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａもしくはｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものである。特定の実施形態において、ＣＨは、アイソタイプサブタイプＩｇＧ１のものである。
【００７１】
一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の重鎖（ＨＣ）は、配列が、配列番号５と少なくとも６０％同一であり、例えば、配列番号５と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である。一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の重鎖（ＨＣ）は、配列が、配列番号５と少なくとも９０％同一であり、例えば、配列番号５と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態において、ＨＣは、配列番号５のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。
【００７２】
一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の軽鎖は、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ２（Ｌ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ３（Ｌ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列、またはそれらのあらゆる組合せを含む。一実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の軽鎖は、配列番号１３〜１５の、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、およびＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の軽鎖は、配列が、配列番号９と少なくとも６０％同一である、例えば、配列番号９と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の軽鎖は、配列が、配列番号９と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号９と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を有する。特定の実施形態において、ＶＬは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。
【００７３】
一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の軽鎖（ＬＣ）は、配列が、配列番号６と少なくとも６０％同一であり、例えば、配列番号６と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である。一部の実施形態において、抗ヒトＴＮＦα抗体の軽鎖（ＬＣ）は、配列が、配列番号６と少なくとも９０％同一であり、例えば、配列番号６と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態において、ＶＬは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、抗ＴＮＦα結合ドメインの重鎖または軽鎖に直接的に、またはリンカーを介して連結された抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ結合ドメイン（例えばＶＨＨドメイン）を含む（例えば、抗体またはその抗原結合部分）。一実施形態において、結合分子は、抗ＴＮＦα抗体の軽鎖にリンカーを介して連結されて融合分子を形成する、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨドメインを含む。一部の実施形態において、リンカーは、配列が、配列番号１６と少なくとも６０％同一であり、例えば、配列番号１６と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である。一部の実施形態において、リンカーは、配列が、配列番号１６と少なくとも９０％同一であり、例えば、配列番号１６と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態において、リンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。一部の実施形態において、融合分子は、配列が、配列番号７と少なくとも６０％同一であり、例えば、配列番号７と少なくとも６０％、７０％、または８０％同一である。一部の実施形態において、融合分子は、配列が、配列番号７と少なくとも９０％同一であり、例えば、配列番号７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態において、融合分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。
【００７５】
一部の実施形態において、三重特異的結合分子は、先に記載される重鎖のいずれか１つ、および先に記載される軽鎖のいずれか１つを含む抗ＴＮＦα結合ドメイン、またはその抗原結合部分を含む。特定の実施形態において、三重特異的結合分子はさらに、先に記載される抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ結合ドメインのいずれか１つを含む。特定の実施形態において、三重特異的結合分子は、先に記載される融合分子のいずれか１つを、先に記載される抗ＴＮＦα結合ドメイン重鎖のいずれかと組み合わせて含む。
【００７６】
本明細書中に記載される方法によって得られる三重特異的結合分子のクラスは、別のクラスまたはサブクラスとスイッチされ得る。本発明の一態様において、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子が、当該技術において周知の方法を用いて、ＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列を含まないように単離される。次に、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子は、異なるクラスの免疫グロブリン分子由来のＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列にそれぞれ作動可能に連結される。これは、先に記載されるように、ＣＬ鎖またはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を用いて達成され得る。例えば、元々ＩｇＭであった結合分子が、ＩｇＧにクラスがスイッチされてよい。さらに、クラススイッチングを用いて、一ＩｇＧサブクラスを別のものに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に変換してもよい。所望されるアイソタイプの本発明の結合分子を生産するための例示的な方法は、結合分子の重鎖をコードする核酸分子および結合分子の軽鎖をコードする核酸分子を単離する工程と、重鎖の可変ドメインを得る工程と、重鎖の可変ドメインを、所望されるアイソタイプの重鎖の定常ドメインとライゲーションする工程と、軽鎖およびライゲーションされた重鎖を細胞内で発現させる工程と、所望されるアイソタイプの結合分子を回収する工程とを含む。
【００７７】
本発明の三重特異的結合分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子であり得るが、典型的には、ＩｇＧアイソタイプのもの、例えば、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａもしくはｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものである。一実施形態において、結合分子は、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１の抗体である。
【００７８】
一実施形態において、三重特異的結合分子は、少なくとも１つの突然変異を有するＦｃ領域を含む。いくつかの異なるＦｃ突然変異が知られており、当該突然変異は、エフェクタ機能の改変を実現する。例えば、多くの場合、例えば、リガンド／受容体相互作用が不所望である場合、または抗体−薬物結合体の場合、エフェクタ機能を低下させ、または排除することが所望されるであろう。エフェクタ機能を低下させるように突然変異させるのに有利であり得るＦｃ領域のアミノ酸位置として、位置２２８、２３３、２３４、および２３５の１つまたは複数が挙げられる（アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングスキームに従って番号付けされている）。一部の実施形態において、三重特異的結合分子は、突然変異のない同結合分子と比較して、ＡＤＣＣまたはＣＤＣを軽減する１つまたは複数の突然変異を有するＦｃ領域を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、抗体または抗体部分の、１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合によって形成された、より大きなイムノアドヘシン分子の一部であってよい。そのようなイムノアドヘシン分子の例として、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１（１９９５））ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８（１９９４））が挙げられる。他の例として、抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを、共有結合または非共有結合のいずれかによって分子中に組み込んで、注目する抗原に特異的に結合するイムノアドヘシンとするものが挙げられる。そのような実施形態において、ＣＤＲは、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込まれてもよいし、別のポリペプチド鎖に共有結合されてもよいし、非共有結合的に組み込まれてもよい。
【００８０】
別の実施形態において、別のポリペプチドに連結された本発明の三重特異的結合分子の全てまたは一部を含む融合抗体またはイムノアドヘシンが作製され得る。特定の実施形態において、三重特異的結合分子の可変ドメインのみが、ポリペプチドに連結される。特定の実施形態において、三重特異的結合分子のＶＨドメインが、第１のポリペプチドに連結される一方、三重特異的結合分子のＶＬドメインが、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるように、第１のポリペプチドと結合する第２のポリペプチドに連結される。別の好ましい実施形態において、ＶＨドメインは、ＶＬドメインから、リンカーによって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように分離されている（例えば一本鎖抗体）。次に、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、注目するポリペプチドに連結される。また、２つの（またはそれを超える）一本鎖抗体が互いに連結された融合抗体が作出されてもよい。これは、二価抗体もしくは多価抗体を単一のポリペプチド鎖で作出したければ、または多特異的抗体を作出したければ、有用である。
【００８１】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を作出するために、ＶＨをコードするＤＮＡフラグメントおよびＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、可撓性リンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに、ＶＬ配列およびＶＨ配列が、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが可撓性リンカーによって連結されている連続した一本鎖タンパク質として発現され得るように、作動可能に連結される。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）参照。単一鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが用いられるのであれば、一価であり得；２つのＶＨおよびＶＬが用いられるのであれば、二価であり得；２つを超えるＶＨおよびＶＬが用いられるのであれば、多価であり得る。
【００８２】
他の実施形態において、他の修飾された抗体は、三重特異的結合分子をコードする核酸分子を用いて調製され得る。例えば、「カッパ体」（Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：９４９−５７（１９９７））、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：５３０３−９（１９９４））、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））、または「ジャヌシンズ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１−５２（１９９２））が、標準的な分子生物学的技術を用いて、本明細書の教示に従って調製され得る。
【００８３】
本発明の三重特異的結合分子は、誘導体化されていてもよいし、別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結されていてもよい。一般に、結合分子（例えば、抗体またはその抗原結合部分）は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／またはＴＮＦα結合が誘導体化または標識化によって悪影響を受けないように、誘導体化される。したがって、本発明の結合分子として、本明細書中に記載される三重特異的結合分子の無傷形態および修飾形態の双方が挙げられ得る。例えば、本発明の結合分子は、１つまたは複数の他の分子実体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔｉｔｙ）、例えば別の抗体、検出剤、医薬品、および／または結合分子の、別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との結合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドに、（化学結合、遺伝的融合、非共有結合、または他の方法によって）機能的に連結され得る。
【００８４】
誘導体化された結合分子の一タイプが、（例えば二重特異的抗体を作出するために、同じタイプまたは異なるタイプの）２つ以上の抗体を架橋することによって、生産される。適切な架橋剤として、適切なスペーサ（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能基（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）によって分離された、２つの明確に反応性の基を有するヘテロ二官能基であるものが挙げられる。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能である。
【００８５】
本発明の三重特異的結合分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチル基もしくはエチル基、または炭水化物基等の化学基で誘導体化されていてもよい。これらの基は、結合分子の生物学的特性を向上させるのに、例えば血清半減期を延長するのに、有用であり得る。
【００８６】
本発明に従う三重特異的結合分子は、標識されていてもよい。本明細書中で用いられる用語「標識」または「標識された」は、結合分子内への別の分子の組込みを指す。一実施形態において、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識アミノ酸の組込み、またはアビジンの標示（例えば、蛍光マーカーを含有するストレプトアビジン、または光学的方法もしくは比色分析法によって検出され得る酵素活性）によって検出され得るビオチニル部分の、ポリペプチドへの取付けである。別の実施形態において、標識またはマーカーは、治療薬、例えば、薬物結合体または毒素であってよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法が、当該技術において知られており、これらが用いられてよい。ポリペプチド用の標識の例として、以下に限定されないが：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポータによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体用の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、磁性剤、例えばガドリニウムキレート、毒素、例えば百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類縁体または相同体が挙げられる。一部の実施形態において、潜在的な立体障害を減らすために、種々の長さのスペーサアームによって標識が取り付けられる。
【００８７】
特定の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、中性形態（双性イオン形態を含む）で、または正もしくは負に帯電した種として存在してよい。一部の実施形態において、抗体は、対イオンと複合体形成されて、薬学的に許容可能な塩を形成してよい。
【００８８】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、１つまたは複数の三重特異的結合分子および１つまたは複数の対イオンを含む複合体を指し、対イオンは、薬学的に許容可能な、無機および有機の酸および塩基に由来する。
【００８９】
薬学的に許容可能な無機塩基として、金属イオンが挙げられ、以下に限定されないが、適切なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および他の生理学的に許容可能な金属イオンが挙げられる。無機塩基から誘導される塩として、例えば通常の原子価の、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、モリブデン、バナジウム、マンガン、クロム、セレン、スズ、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン塩または第一マンガン塩、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、および亜鉛が挙げられる。
【００９０】
本発明の三重特異的結合分子の薬学的に許容可能な酸付加塩は、以下に限定されないが、ギ酸、酢酸、アセトアミド安息香酸、アジピン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、プロピオン酸、安息香酸、樟脳酸、炭酸、シクラミン酸、デヒドロコール酸、マロン酸、エデト酸、エチル硫酸、フェンゾイック酸、メタリン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タンニン酸、クエン酸、硝酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、葉酸、フマル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リジン、イソクエン酸、トリフルオロ酢酸、パモ酸、プロピオン酸、アントラニル酸、メシル酸、オルト酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、オレイン酸、ステアリン酸、サリチル酸、アミノサリチル酸、ケイ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、ホスホン酸、エタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、アンモニウム、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、ナフタレンスルホン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、硫酸、硝酸、亜硝酸、硫酸モノメチルエステル、シクロヘキシルアミノスルホン酸、β−ヒドロキシ酪酸、グリシン、グリシルグリシン、グルタミン酸、カコジル酸、ジアミノヘキサン酸、カンファスルホン酸、グルコン酸、チオシアン酸、オキソグルタル酸、ピリドキサール５−リン酸、クロロフェノキシ酢酸、ウンデカン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸が挙げられる酸から調製され得る。
【００９１】
薬学的に許容可能な有機塩基として、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジベンジルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）、プロカイン、環状アミン、第四アンモニウムカチオン、アルギニン、ベタイン、カフェイン、クレミゾール、２−エチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタンジアミン、ブチルアミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、エチルグルカミン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イミダゾール、イソプロピルアミン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピリジン、ピリドキシン、ネオジム、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、メチルアミン、タウリン、コラート、６−アミノ−２−メチル−２−ヘプタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸、ストロンチウム、トリシン、ヒドラジン、フェニルシクロヘキシルアミン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン、４−モルホリンプロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−１−プロパンスルホン酸、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノブタンスルホン酸、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、およびトロメタモールが挙げられる。
【００９２】
一部の実施形態において、本開示の二重特異的抗体分子は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む抗ＴＮＦα抗体、またはその抗原結合部分、および当該抗体に（直接的に、またはリンカーを介して）連結された抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨを含む。抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨは、そのＮ末端またはＣ末端によって、抗ＴＮＦα抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端またはＣ末端に連結され得る。特定の実施形態において、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨは、抗ＴＮＦα抗体の軽鎖のＮ末端に連結される。本明細書中に記載されるそのようなあらゆる融合が、当該技術において知られている方法に従ってもたらされ得る。例えば、Ａｈｍａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１２，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９８０２５０（２０１２）参照。特定の実施形態において、抗ＴＮＦα抗体は、リンカーによって、より好ましくはペプチドリンカーによって、最も好ましくは、タンパク質分解開裂部位を欠くペプチドリンカーによって、抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ  ＶＨＨに連結される。一部の実施形態において、リンカーのアミノ酸残基は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、およびＫから選択される。一部の実施形態において、リンカーは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。
【００９３】
核酸分子およびベクター
本発明はまた、本明細書中に記載される本発明の三重特異的結合分子をコードする核酸分子および核酸配列を提供する。一部の実施形態において、異なる核酸分子が、三重特異的結合分子の第１のドメインおよび第２のドメインのアミノ酸配列をコードする。第１のドメインおよび／または第２のドメインが重鎖および軽鎖を含む場合、一部の実施形態において、異なる核酸が、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードする。他の実施形態において、同じ核酸分子が、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列をコードする。特定の実施形態において、一核酸分子が、第１のドメインおよび第２のドメインのアミノ酸配列（例えば、重鎖および軽鎖の配列）のあらゆる組合せをコードしてよい。特定の実施形態において、一核酸分子が、第１の結合ドメインのアミノ酸配列および第２の結合ドメインの軽鎖アミノ酸配列をコードしてよく、場合によってはこの２つを連結するあらゆるペプチドリンカー配列を含んでもよい。
【００９４】
ヌクレオチド配列への言及は、他に明記されない限り、その補体を包含する。ゆえに、特定の配列を有する核酸への言及は、その相補鎖を、その相補配列と共に包含するものと理解されるべきである。本明細書中で言及される用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０塩基長の、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態のヌクレオチドのポリマー形態を意味する。当該用語は、一本鎖の形態および二本鎖の形態を含む。
【００９５】
本発明はまた、上記のヌクレオチド配列の１つもしくは複数と、または配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を提供する。特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号４〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。核酸配列の文脈における用語「パーセント配列同一性」は、最大一致するようにアラインされた場合に、２つの配列中で同じである残基に言及する。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、一般には少なくとも約１８ヌクレオチド、より一般には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８、またはそれを超えるヌクレオチドのストレッチにわたってよい。当該技術において知られているいくつかの異なるアルゴリズムが、ヌクレオチド配列同一性を測定するのに用いられ得る。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを用いて、ポリヌクレオチド配列が比較され得る。例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、アライメント、およびクエリー配列とサーチ配列間の最良の重複領域の配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７６：７１−８４（１９９８）；参照によって本明細書中に組み込まれる）。特に明記されない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムについて、デフォルトパラメータが用いられる。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡを、そのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズ、そしてスコアリングマトリックスについてＮＯＰＡＭファクター）で用いて、またはＧａｐを、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１（参照によって本明細書に組み込まれる）で与えられるそのデフォルトのパラメータで用いて、判定され得る。
【００９６】
一態様において、本発明は、配列番号１〜１６から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子はまた、前記ヌクレオチド配列のあらゆる組合せを含み得る。一実施形態において、核酸分子は、配列番号４をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、配列番号４および６をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、配列番号４、６、および１６をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、配列番号７をコードするヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、核酸分子は、配列番号５をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００９７】
先の実施形態のいずれにおいても、核酸分子は単離されていてよい。
【００９８】
更なる態様において、本発明は、本明細書中に記載されるヌクレオチド配列のいずれかを発現させるのに適したベクターを提供する。本明細書中で用いられる用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一部の実施形態において、ベクターは、プラスミド、すなわち、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状の二本鎖ＤＮＡの断片である。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルスゲノム中に追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る。一部の実施形態において、ベクターは、これが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他の実施形態において、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されると直ぐに、宿主細胞のゲノム中に統合され、これによって、宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書で「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。
【００９９】
本発明は、本明細書中に記載される三重特異的結合分子またはその一部のアミノ酸配列（例えば、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインの重鎖配列および／または軽鎖配列）のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾された抗体、抗体フラグメントをコードする核酸分子を含むベクター、およびそのプローブを提供する。
【０１００】
本発明の核酸分子は、三重特異的結合分子またはその一部を生産するあらゆる源から単離することができる。特定の実施形態において、本発明の核酸分子は、単離されるのではなく合成することができる。
【０１０１】
一部の実施形態において、本発明の核酸分子は、あらゆる源由来の重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明の三重特異的結合分子の第１のドメインまたは第２のドメイン由来のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。同様に、本発明の核酸分子は、あらゆる源由来の軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで連結された、本発明の三重特異的結合分子の第１のドメインまたは第２のドメイン由来のＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
【０１０２】
本発明の更なる態様において、第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および／または軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をコードする核酸分子は、完全長抗体遺伝子に「変換」され得る。一実施形態において、ＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードする核酸分子は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を既にコードする発現ベクター中への挿入によって、それぞれ、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、かつ／またはＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、完全長抗体遺伝子に変換される。別の実施形態において、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を用いて、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を、ＣＨドメインおよび／またはＣＬドメインをコードする核酸分子に連結する、例えばライゲーションすることによって、完全長抗体遺伝子に変換される。次に、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子は、これが導入された細胞から発現され得る。
【０１０３】
核酸分子は、大量の三重特異的結合分子を、組換えにより発現するのに用いられ得る。核酸分子はまた、本明細書中に記載されるヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異的抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、突然変異抗体、および抗体誘導体を生産するのに用いられ得る。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明の核酸分子は、特定のアミノ酸配列についてのプローブまたはＰＣＲプライマーとして用いられる。例えば、核酸は、診断法におけるプローブとして、またはＰＣＲプライマーとして用いられて、使用可能なＤＮＡ領域を増幅することができ、例えば、三重特異的結合分子の一部（例えば可変ドメイン）をコードする追加の核酸分子を単離することができる。一部の実施形態において、核酸分子は、オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、三重特異的結合分子の高度に可変的なドメインに由来する。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載される本発明の三重特異的結合分子のＣＤＲの１つまたは複数の全てまたは一部をコードする。
【０１０５】
別の実施形態において、核酸分子およびベクターは、突然変異した三重特異的結合分子を作製するのに用いられ得る。抗体を、第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインの重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて突然変異させて、例えば、三重特異的結合分子の結合特性を改変してよい。例えば、突然変異を、ＣＤＲ領域の１つまたは複数において起こして、三重特異的結合分子のＫＤを増大または減少させてもよいし、ｋｏｆｆを増大または減少させてもよいし、抗体の、Ｌ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／またはＴＮＦαに対する結合特異性を改変してもよい。別の実施形態において、１つまたは複数の突然変異が、抗体中で、生殖系列と比較して変化することが知られている、本発明の三重特異的結合分子の第１の結合ドメインまたは第２の結合ドメインに対応するアミノ酸残基にて起こされる。突然変異は、可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内で起こされてもよいし、定常ドメイン内で起こされてもよい。好ましい実施形態において、突然変異は、可変ドメイン内で起こされる。一部の実施形態において、１つまたは複数の変異が、本発明の三重特異的結合分子の可変ドメインのＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内で、生殖系列と比較して変化することが知られているアミノ酸残基にて起こされる。
【０１０６】
別の実施形態において、フレームワーク領域を、結果として生じるフレームワーク領域が、対応する生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を有するように、突然変異させる。フレームワーク領域または定常ドメイン内に突然変異を起こして、三重特異的結合分子の半減期を延長することができる。例えば、国際公開第００／０９５６０号参照。また、フレームワーク領域または定常ドメイン中に突然変異を起こして、三重特異的結合分子の免疫原性を改変し、かつ／または別の分子への共有結合もしくは非共有結合のための部位を提供することができる。本発明に従えば、三重特異的結合分子は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれか１つまたは複数において突然変異を有してもよいし、定常ドメイン内に突然変異を有してもよい。
【０１０７】
一部の実施形態において、先に記載されるようにして得られた、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの部分配列または完全長配列（例えば、結合ドメインが重鎖および軽鎖の配列を含む、重鎖配列および軽鎖配列）をコードするＤＮＡを、発現ベクター中に、遺伝子が、必須の発現制御配列、例えば転写制御配列および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように挿入することによって、本発明の三重特異的結合分子は発現される。発現ベクターとして、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えば、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が挙げられる。ＤＮＡは、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、ＤＮＡの転写および翻訳を調節するその意図された機能を果たすように、ベクター中にライゲーションされ得る。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合するように選択され得る。第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインの部分配列または完全長配列をコードするＤＮＡ（例えば、結合ドメインが重鎖および軽鎖の配列を含む、重鎖配列および軽鎖配列）が、別々のベクター中に挿入されてよい。一実施形態において、上記ＤＮＡのあらゆる組合せが、同じ発現ベクター中に挿入される。ＤＮＡは、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合の平滑末端ライゲーション）によって、発現ベクター中に挿入され得る。
【０１０８】
好都合なベクターとして、機能的に完全なヒトＣＨ免疫グロブリン配列またはヒトＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、適切な制限部位が操作されて、あらゆるＶＨ配列またはＶＬ配列が、先に記載されるように、容易に挿入かつ発現され得るものがある。そのようなベクター中の、ＨＣをコードする遺伝子およびＬＣをコードする遺伝子は、関連するｍＲＮＡを安定化させることによって抗体タンパク質収量全体を高めることとなる、イントロン配列を含有してよい。イントロン配列は、ＲＮＡスプライシングが起こることとなる場所を決定するスプライスドナー部位およびスプライスアクセプタ部位に挟まれている。イントロン配列の位置は、抗体鎖の可変領域もしくは定常領域のいずれかに、または、複数のイントロンが用いられる場合、可変領域および定常領域の双方に、存在し得る。ポリアデニル化および転写終結が、コード領域の下流の天然の染色体部位にて生じ得る。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしてもよい。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングされてよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであっても、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってもよい。
【０１０９】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有してよい。当業者であれば、発現ベクターの設計（調節配列の選択を含む）は、形質転換されることとなる宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベル等の要因によって決まり得ることを理解するであろう。哺乳動物宿主細胞発現にとって好ましい調節配列として、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモータおよび／またはエンハンサ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモータ／エンハンサ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモータ／エンハンサ）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよび強力な哺乳動物プロモータ、例えば天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモータが挙げられる。ウイルス調節エレメントおよびその配列の更なる説明について、例えば、米国特許第５１６８０６２号明細書、米国特許第４５１０２４５号明細書、および米国特許第４９６８６１５号明細書参照。植物における抗体等の結合分子の発現方法（プロモータおよびベクター、ならびに植物の形質転換の記載を含む）が、当該技術において知られている。例えば、米国特許第６５１７５２９号明細書参照。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞におけるポリペプチドの発現方法もまた、当該技術において周知である。
【０１１０】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子等の追加の配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４３９９２１６号明細書、米国特許第４６３４６６５号明細書、および米国特許第５１７９０１７号明細書参照）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセート等の薬剤に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に付与する。例えば、選択マーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞での、メトトレキサート選択／増幅に使用）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子が挙げられる。
【０１１１】
本明細書中で用いられる用語「発現制御配列」は、ライゲーションされているコード配列の発現およびプロセシングに影響をもたらすのに必須のポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列として、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモータ配列、およびエンハンサ配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに、所望される場合、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物では、そのような制御配列として、一般に、プロモータ、リボソーム結合部位、および転写終結配列が挙げられる；真核生物では、一般に、そのような制御配列として、プロモータおよび転写終結配列が挙げられる。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセシングに必須である全ての成分を含むことが意図されており、そしてまた、例えば、リーダ配列および融合パートナー配列といった、その存在が有利である追加の成分を含んでもよい。
【０１１２】
宿主細胞、および三重特異的結合分子の生産方法
本発明の更なる態様が、本発明の三重特異的結合分子を生産する方法に関する。本発明のこの態様の一実施形態が、本明細書中で定義される三重特異的結合分子を生産する方法であって、三重特異的結合分子を発現することができる組換え宿主細胞を提供することと、前記宿主細胞を、三重特異的結合分子の発現に適した条件下で培養することと、生じた三重特異的結合分子を単離することとを含む方法に関する。そのような組換え宿主細胞におけるそのような発現によって産生される三重特異的結合分子は、本明細書中で、「組換え三重特異的結合分子」と呼ぶ。三重特異的結合分子が抗体である場合、「組換え抗体」と呼ぶ。本発明はまた、そのような宿主細胞の子孫細胞、およびこれによって産生される三重特異的結合分子を提供する。
【０１１３】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書中で用いられる場合、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。本発明は、例えば、先に記載される、本発明に従うベクターを含み得る宿主細胞を提供する。本発明はまた、例えば、本発明の三重特異的結合分子の第１の結合ドメインおよび／または第２の結合ドメインの、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの双方を含む宿主細胞を提供する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味すると理解されるべきである。次の世代で、突然変異または環境の影響に起因する特定の修飾が発生する場合があるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、それでもやはり、本明細書で用いられる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１１４】
本発明の三重特異的結合分子をコードする核酸分子、および当該核酸分子を含むベクターは、適切な哺乳動物、植物、細菌、または酵母宿主細胞の形質移入に用いられ得る。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する、知られているあらゆる方法によってよい。哺乳動物細胞中への異種ポリヌクレオチドの導入方法が、当該技術において周知であり、デキストラン媒介形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介形質移入、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核中へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。また、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞中に導入され得る。細胞を形質転換する方法は、当該技術において周知である。例えば、米国特許第４３９９２１６号明細書、米国特許第４９１２０４０号明細書、米国特許第４７４０４６１号明細書、および米国特許第４９５９４５５号明細書参照。植物細胞を形質転換する方法は、当該技術において周知であり、例として、アグロバクテリウム媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、直接注射、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換が挙げられる。細菌細胞および酵母細胞を形質転換する方法もまた、当該技術において周知である。
【０１１５】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が挙げられる。とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、２９３  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、新生ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、およびいくつかの他の細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株の発現レベルが高いかを判定することによって選択される。用いられ得る他の細胞株として、昆虫細胞株、例えばＳｆ９細胞またはＳｆ２１細胞がある。三重特異的結合分子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞における結合分子の発現を、またはより好ましくは、宿主細胞が増殖する培養培地中への結合分子の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、結合分子が生産される。三重特異的結合分子は、標準的なタンパク質精製法を用いて、培地から回収され得る。植物宿主細胞として、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が挙げられる。細菌宿主細胞として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属種が挙げられる。酵母宿主細胞として、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【０１１６】
さらに、生産細胞株からの、本発明の三重特異的結合分子の発現は、いくつかの知られている技術を用いて増強され得る。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号明細書、欧州特許第０２５６０５５号明細書、欧州特許第０３２３９９７号明細書、および欧州特許第０３３８８４１号明細書に関連して、全体的に、または部分的に考察されている。
【０１１７】
異なる細胞株によって、またはトランスジェニック動物において発現される三重特異的結合分子はおそらく、互いに異なるグリコシル化パターンを有する可能性が高い。しかしながら、本明細書中で提供される核酸分子によってコードされる、または本明細書中で提供されるアミノ酸配列を含む三重特異的結合分子は全て、結合分子のグリコシル化状態に拘らず、そしてより一般的には、翻訳後修飾の有無に拘らず、本発明の一部である。
【０１１８】
三重特異的結合分子は、種々の方法を用いて調製され得る。例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／もしくはＴＮＦα、またはそれらのあらゆる組合せに結合するドメインは、別個に（例えば、化学的タンパク質合成、組換え発現法、ハイブリドーマ技術等を用いて）調製されてから、直接的に、またはリンカーを介して、互いに化学的に結合され得る。分子（例えば、抗体またはその抗原結合部分）を化学的に結合する手段は、当業者に周知である。ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）基または遊離アミン（−ＮＨ２）基を含有し、これらは、対応するポリペプチド上の、またはリンカー上の適切な官能基との反応に利用可能である。抗体はまた、誘導体化されて、追加の反応性官能基に曝露されてもよいし、これを取り付けてもよく、１つまたは複数のリンカー分子、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  １１１から入手可能なものの取付けを包含し得る。本発明の三重特異的結合分子に用いられるリンカーは、当該技術において知られている種々の適切なリンカーのいずれであってもよい。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態において、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／もしくはＴＮＦα、またはそれらのあらゆる組合せに結合するドメインは、宿主細胞における組換え抗体または抗原結合部分の発現によって産生される。結合ドメインのあらゆる組合せをコードする配列は、（直接的に、またはリンカーを介して）連結され得る。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＴＮＦαに結合するドメインをコードする、生じた核酸分子は、発現ベクター中に挿入されて、宿主細胞中に導入される。次に、生じた三重特異的結合分子は、発現系から発現されて、単離されて、精製される。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態において、三重特異的結合分子の結合ドメインは、結合分子のタンパク質分解から保護するように設計された新規なリンカー分子と対形成されてよい。そのようなリンカーは、典型的には、タンパク質分解開裂部位を欠いている。
【０１２１】
医薬組成物
本発明の別の態様は、活性成分として（または唯一の活性成分として）本発明の三重特異的結合分子を含む医薬組成物である。医薬組成物は、本明細書中に記載されるあらゆる三重特異的結合分子を含み得る。一部の実施形態において、当該組成物は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＴＮＦαの活性によって影響され得る障害、および／または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の改善、予防、および／または処置が意図される。
【０１２２】
一般に、本発明の三重特異的結合分子は、例えば以下で説明される、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、製剤として投与されるのに適している。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの三特異的結合分子、および１つまたは複数の関連する細胞表面受容体、例えば、自己免疫応答または炎症応答に関与する細胞表面受容体を標的とする１つまたは複数の追加の結合分子（例えば抗体）を含んでよい。
【０１２４】
用語「賦形剤」は、本明細書中で、本発明の化合物以外のあらゆる成分を説明するのに用いられる。賦形剤の選択は、特定の投与様式、溶解性および安定性に及ぼす賦形剤の影響、ならびに剤形の性質等の要因に大きく依存することとなる。本明細書中で用いられる「薬学的に許容可能な賦形剤」として、生理学的に適合するあらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に許容可能な賦形剤の一部の例として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびそれらの組合せがある。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。薬学的に許容可能な物質の更なる例として、湿潤剤または少量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、またはバッファがあり、これらは抗体の貯蔵寿命または有効性を増強する。
【０１２５】
本発明の医薬組成物およびその調製方法は、当業者であれば容易に明らかとなろう。そのような組成物およびその調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）に見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ（適正製造基準（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓ））条件下で製造される。
【０１２６】
本発明の医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として調製、包装、または販売され得る。本明細書中で用いられる「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の離散的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されることとなる活性成分の投与量、またはそのような投与量の好都合な割合、例えば、そのような投与量の１／２もしくは１／３に等しい。
【０１２７】
当該技術において受け入れられている、ペプチド、タンパク質、または抗体を投与するあらゆる方法が、本発明の三重特異的結合分子に適切に使用され得る。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。本明細書中で用いられる、医薬組成物の「非経口投与」として、対象の組織の物理的な破壊（ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）によって特徴付けられる投与、および組織中の破れ目（ｂｒｅａｃｈ）を通しての医薬組成物の投与（ゆえに、概して、血流、筋肉、または内臓中への直接投与をもたらす）のあらゆる経路が挙げられる。ゆえに、非経口投与として、以下に限定されないが、組成物の注射、外科的切開を介した組成物の付与、組織を貫通する非外科的創傷を介した組成物の付与その他による、医薬組成物の投与が挙げられる。特に、非経口投与として、以下に限定されないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、脳室内、尿道内、頭蓋内、滑膜内の注射または注入；および腎臓透析注入技術が挙げられると考えられる。腫瘍内送達、例えば、腫瘍内注射もまた有利であり得る。局所灌流も考えられる。好ましい実施形態として、静脈内経路および皮下経路が挙げられる。
【０１２９】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、活性成分を、薬学的に許容可能な担体、例えば滅菌水または滅菌等張性生理食塩水と組み合わせて含む。そのような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で調製、包装、または販売され得る。注射用製剤が、防腐剤を含有するアンプルまたは多服用量容器等の単位剤形で、調製、包装、または販売され得る。非経口投与用の製剤として、以下に限定されないが、懸濁液、溶液、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト等が挙げられる。そのような製剤はさらに、懸濁化剤、安定化剤、または分散剤が挙げられるがこれらに限定されない１つまたは複数の追加の成分を含んでよい。非経口投与用の製剤の一実施形態において、活性成分は、適切なビヒクル（例えば、パイロジェンフリー滅菌水）で再構成される乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供されてから、再構成された組成物が非経口投与される。また、非経口製剤として、賦形剤、例えば塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくはｐＨ３〜９）を含有してもよい水溶液が挙げられるが、一部の用途のために、非経口製剤は、より適切には、滅菌された非水性溶液として、または適切なビヒクル、例えばパイロジェンフリー滅菌水と併用されることとなる乾燥形態として製剤化されてよい。例示的な非経口投与形態として、滅菌水溶液、例えば水性のプロピレングリコール溶液またはデキストロース溶液中の溶液または懸濁液が挙げられる。そのような剤形は、所望されるのであれば、適切に緩衝化され得る。有用な他の非経口投与可能製剤として、活性成分を微結晶形態で、またはリポソーム調剤中に含むものが挙げられる。非経口投与用の製剤は、放出が即時であり、かつ／または修飾されるように製剤化されてよい。製剤の修飾された放出として、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム化放出が挙げられる。
【０１３０】
例えば、一態様において、三重特異的結合分子を、必要な量で、必要に応じて、先で列挙された成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に組み込んでから濾過滅菌することによって、滅菌注射溶液が調製され得る。一般に、活性化合物を、基本的な分散媒体、および先で列挙されたもの由来の必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、分散液が調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分プラス所望される追加のあらゆる成分の粉末を、予め滅菌濾過されたその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には、必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによって、かつ／または修飾放出コーティング（例えば徐放性コーティング）を用いることによって、注射用組成物の持続吸収が達成され得る。
【０１３１】
本発明の三重特異的結合分子はまた、典型的には乾燥粉末の形態で（単独で、混合物として、または混合成分粒子として、例えば、適切な薬学的に許容可能な賦形剤と混合されて）、乾燥粉末吸入器から、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザ（好ましくは、電気流体力学を用いて霧状ミストを生成するアトマイザ）、もしくはネブライザからのエアロゾルスプレーとして（適切な噴射剤を使用し、または使用しない）、または点鼻薬として、鼻腔内投与されてもよいし、吸入によって投与されてもよい。
【０１３２】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザ、またはネブライザは、一般に、例えば、活性物質の分散、可溶化、または持続放出に適した剤、溶媒としての噴射剤を含む、本発明の結合分子の溶液または懸濁液を含有する。
【０１３３】
乾燥粉末または懸濁液製剤の使用に先立って、製剤は一般に、吸入による送達に適したサイズ（典型的には５ミクロン未満）に微粒状化される。これは、螺旋ジェットミリング、流動床ジェットミリング、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧ホモジナイゼーション、または噴霧乾燥等の適切なあらゆる粉砕方法によって達成され得る。
【０１３４】
吸入器または注入器に用いられるカプセル、ブリスター、およびカートリッジが、本発明の化合物、適切な粉末基剤、および性能修飾剤（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）の粉末混合物を含有するように製剤化され得る。
【０１３５】
電気流体力学を用いて霧状ミストを生成するアトマイザに用いるのに適した溶液製剤は、作動あたりの本発明の三重特異的結合分子の適切な用量を含有し得、作動容量は、例えば、１μＬ〜１００μＬまで変動し得る。
【０１３６】
メントールおよびレボメントール等の適切なフレーバ、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウム等の甘味料が、吸入／鼻腔内投与が意図される本発明の製剤に加えられてよい。
【０１３７】
吸入／鼻腔内用の製剤は、放出が即時であり、かつ／または修飾されるように製剤化されてよい。製剤の修飾された放出として、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム化放出が挙げられる。
【０１３８】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するバルブによって決定される。本発明に従う単位は、典型的には、本発明の結合分子の計量された用量または「パフ」を投与するように構成される。全１日用量は、典型的には、単回用量で、より一般的には、１日を通した分割用量として投与されることとなる。
【０１３９】
本発明の三重特異的結合分子は、経口経路投与用に製剤化されてもよい。経口投与は、化合物が消化管に入るような嚥下、および／または化合物が口から直接血流に入る口腔内投与、舌側（ｌｉｎｇｕａｌ）投与、もしくは舌下投与を含み得る。
【０１４０】
経口投与に適した製剤として、固体系、半固体系、および液体系、例えば錠剤；多粒子もしくはナノ粒子、液体、または粉末を含有する軟質カプセルまたは硬質カプセル；ロゼンジ（液体充填剤を含む）；チュー（ｃｈｅｗ）；ゲル；急速分散剤形；フィルム；胚珠（ｏｖｕｌｅ）；スプレー；および口腔／粘膜接着パッチが挙げられる。
【０１４１】
液体製剤として、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。そのような製剤は、軟質カプセル剤または硬質カプセル剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから製造）中の充填剤として使用され得、典型的には、担体、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油、ならびに１つまたは複数の乳化剤および／もしくは懸濁化剤を含む。液体製剤はまた、例えばサシェからの、固体の再構成によって調製されてもよい。
【０１４２】
一実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、ｐＨ５．０〜６．５のバッファ中に１〜１００ｍＭの濃度にてヒスチジンおよびアセタートを含む組成物中で製剤化される。
【０１４３】
本発明の三重特異的結合分子の治療的使用
一態様において、本発明の三重特異的結合分子は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／またはＴＮＦαの活性によって影響を受け得る障害の処置に用いられる。例えば、医師は、本発明の三重特異的結合分子を単独で、または他の治療剤と組み合わせて（連続的に、または同時に）投与することによって、自己免疫疾患または炎症性疾患を処置することができる。三重特異的結合分子は、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／またはＴＮＦαの活性を調節して、自己免疫応答または炎症応答の低下をもたらす。本発明の三重特異的結合分子および方法によって処置され得る疾患として、以下のいずれかが挙げられ得る：関節リウマチ、変形性関節症、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム変形性関節症、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性真性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、プラーク乾癬、アトピー性皮膚炎、強皮症、「移植片対宿主」臓器移植拒絶反応、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、顕微鏡的腎血管炎、慢性活動性肝炎、尿毒症、敗血性ショック、毒素ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、後天性免疫不全症候群、急性横脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、潰瘍性大腸炎の関節症に関連する乾癬性関節症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、シート様天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、関節炎、原発性硬化性Ａ型肝炎、潜在性自己免疫性肝炎、線維症肺疾患、原発性線維症肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、慢性好酸球性肺炎、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性Ｉ型肝炎（古典的自己免疫性肝炎またはルポイド）、自己免疫性ＩＩ型肝炎変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、Ｉ型乾癬、ＩＩ型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎ＮＯＳ疾患、糸球体腎炎、顕微鏡的腎血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性またはＮＯＳ−男性不妊症、精子に対する自己免疫、多発性硬化症（全てのサブタイプ）、交感神経性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、強直性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、Ｓｈｅｎｇｒｅｎａ症候群、シェーグレン症候群、高安動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、自己免疫性萎縮性甲状腺機能低下症、原発性粘液浮腫、白内障ぶどう膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アレルギー、喘息、精神障害（うつ病および統合失調症が挙げられる）、仲介型のＴｈ２型およびＴｈ１型疾患、結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー��鼻炎、アルファ−１−抗トリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、サイトカイン療法障害に関連する嚢胞性線維症、脱髄疾患、皮膚炎、虹彩網膜炎／ぶどう膜炎／視神経炎、虚血再灌流障害における損傷、虚血性脳卒中、若年性リウマチ様関節炎、自己免疫性腸障害、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性心筋炎、自己免疫早期卵巣不全、および眼瞼炎。三重特異的結合分子はまた、先の障害のあらゆる組合せを処置し得る。
【０１４４】
特定の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、（以下に限定されないが）関節リウマチ（ＲＡ）、骨関節炎、関節リウマチ骨粗鬆症、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症、および硬変症）、歯肉炎、歯周症、または歯周病、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、および炎症性腸疾患）、喘息（アレルギー性喘息が挙げられる）、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、および癌から選択される障害を処置するのに用いられる。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、関節リウマチ、乾癬、または乾癬性関節炎を処置するのに用いられる。
【０１４６】
「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、生物学的障害および／またはそれに付随する症状の少なくとも１つを緩和または排除する方法を指す。本明細書中で用いられる、疾患、障害、または症状を「軽減する」とは、疾患、障害、または症状の症候の重篤度および／または発生頻度を低下させることを意味する。さらに、「処置」への本明細書中での言及として、治癒的処置、緩和的処置、および予防的処置への言及が挙げられる。
【０１４７】
一態様において、処置の対象、または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト対象である。前記対象は、あらゆる年齢の男性または女性であり得る。
【０１４８】
「治療的に有効な量」とは、処置されることとなる障害の症候の１つまたは複数をある程度緩和することとなる、投与されることとなる治療剤の量を指す。
【０１４９】
本発明の三重特異的結合分子は、単独で、または１つもしくは複数の他の薬物もしくは抗体と組み合わせて（またはそれらのあらゆる組合せとして）投与されてよい。ゆえに、本発明の医薬組成物、方法、および使用はまた、以下で詳述される、他の活性剤との組合せ（共投与）の実施形態を包含する。
【０１５０】
本明細書中で用いられる用語「同時投与」、「同時投与される」、および「と組み合わせて」は、１つまたは複数の他の治療剤を伴う三重特異的結合分子に言及するものであり、以下を意味することが意図され、そして以下を指し、かつ以下を含む：
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への同時投与（そのような成分が、前記成分を実質的に同時に前記患者に放出する単一剤形に一緒に製剤化される場合）、
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への実質的に同時の投与（そのような成分が、前記患者によって実質的に同時に摂取されると直ぐに、前記成分が、前記患者に実質的に同時に放出される別個の剤形に、互いに別々に製剤化される場合）、
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への逐次投与（そのような成分が、前記患者によって、それぞれの投与間の時間間隔を長くして連続して摂取されると直ぐに、前記成分が、前記患者に実質的に異なる時点にて放出される別個の剤形に、互いに別々に製剤化される場合）、
・本発明の三重特異的結合分子、および治療剤のそのような組合せの、処置を必要とする患者への逐次投与（そのような成分が、前記成分を制御放出すると直ぐに、同じ時点および／または異なる時点にて、同時に、連続的に、かつ／または重複して前記患者に放出される単一剤形に一緒に製剤化される場合）（各部分が、同じ経路または異なる経路によって投与され得る）。
【０１５１】
本発明の三重特異的結合分子は、追加の治療的処置なしに、すなわちスタンドアロン療法として施されてよい。これ以外にも、本発明の三重特異的結合分子による処置は、少なくとも１つの追加の治療的処置（併用療法）を含んでよい。一部の実施形態において、三重特異的結合分子は、自己免疫疾患または炎症性障害の処置用の別の医薬品／薬物と同時投与されてもよいし、これと共に製剤化されてもよい。
【０１５２】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、抗炎症剤と組み合わせて投与される。本発明の三重特異的結合分子と共に投与され得る抗炎症剤として、以下に限定されないが、コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、およびトリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、バルサラジド、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナマート、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オルサラジン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、サルサラート、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、およびトルメチン）、ならびにアセトアミノフェン、抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘誘導体（例えば、スルファサラゾンおよびメサラミン）、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミクセトリン、ベンダザック、ベンジダミン、ブクロム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサール、ピポキシム、プロクァゾン、プロキサゾール、およびテニダップが挙げられる。
【０１５３】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、免疫抑制剤、例えば、以下に限定されないが、ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホスファミドメチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン、ナタリズマブ、および、応答性Ｔ細胞の機能を抑制することによって作用する他の免疫抑制剤と組み合わせて投与される。
【０１５４】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、免疫抑制剤、例えば、以下に限定されないが、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ（商標）（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（商標）／ＮＥＯＲＡＬ（商標）／ＳＡＮＧＤＹＡ（商標）（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（商標）（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（商標）（ミコフェノラート）、アザチオプリン、グルココルチコステロイド、ＡＶＯＮＥＸ（商標）（インターフェロン−ベータ１Ａ）、およびＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）（シロリムス）と組み合わせて投与される。一実施形態において、免疫抑制剤が、臓器移植または骨髄移植の拒絶を防ぐのに用いられてよい。
【０１５５】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、ＴＮＦアンタゴニストと組み合わせて投与される。本発明の結合分子と共に投与され得るＴＮＦアンタゴニストとして、以下に限定されないが、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））、セルトリズマブペゴル（ＣＩＭＺＩＡ（商標））、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、キサンチン誘導体（例えば、ペントキシフィリン）、およびブプロピオン（ＷＥＬＬＢＵＲＴＩＮ（商標）、ＺＹＢＡＮ（商標））が挙げられる。特定の実施形態において、ＴＮＦアンタゴニストは、ＴＮＦαアンタゴニストである。
【０１５６】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、以下に限定されないが、ＩＬ−６Ｒアンタゴニスト（例えば、トシリズマブおよびサリルマブ）、ＩＬ−６アンタゴニスト、ＩＬ−１ａまたはＩＬ−１ｂアンタゴニスト、ＩＬ−２３アンタゴニスト、ＩＬ−２２アンタゴニスト、およびＧＭ−ＣＳＦアンタゴニストが挙げられるリスト由来のアンタゴニストと組み合わせて投与される。
【０１５７】
一部の実施形態において、本発明の三重特異的結合分子は、ＩＬ−１７Ａアンタゴニストおよび／またはＩＬ−１７Ｆアンタゴニストと組み合わせて投与される。特定の実施形態において、前記アンタゴニストは、抗ＩＬ−１７Ａおよび／もしくは抗ＩＬ−１７Ｆ抗体、またはその抗原結合部分である。
【０１５８】
本発明の三重特異的結合分子および少なくとも１つの他の薬剤（例えば、免疫抑制剤または抗炎症剤）を含む医薬品が、自己免疫疾患または炎症性障害の処置における同時の投与、別々の投与、または連続した投与のための併用処置として用いられてよい。
【０１５９】
本発明の三重特異的結合分子は、先に記載される処置方法において用いられ得、先に記載される処置に用いられ得、かつ／または先に記載される処置用の医薬品の製造に用いられ得ることが理解される。
【０１６０】
用量および投与経路
本発明の三重特異的結合分子は、問題の症状の処置に有効な量で、すなわち、所望される結果を達成するのに必須の投与量で、かつそうするのに必須の期間、投与されることとなる。治療的に有効な量は、処置されることとなる特定の症状、患者の年齢、性別、および体重、そして三重特異的結合分子が、スタンドアロン処置として施されることとなるのか、１つまたは複数の追加の抗自己免疫処置または抗炎症処置と組み合わせて施されることとなるのか等の要因に従って、変動し得る。
【０１６１】
投薬レジメンが、所望される最適な応答を実現するように調整され得る。例えば、単回のボーラス投与がなされてもよいし、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよいし、用量が、治療状況の緊急性によって示されるのと比例して増減されてもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書中で用いられる投薬単位形態は、処置されることとなる患者／対象にとって単位投薬量として適した、物理的に離散的な単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と組み合わせて、所望される治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の投薬単位形態の仕様は、一般に、（ａ）化学療法剤の特有の特徴、および達成されることとなる特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の扱い（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）について、そのような活性化合物を配合する技術に固有の制限によって決定され、かつこれらに直接的に依存する。
【０１６２】
ゆえに、当業者であれば、本明細書中に記載される開示に基づいて、用量および投薬レジメンが、治療技術において周知の方法に従って調整されることを理解するであろう。すなわち、最大許容用量が容易に確立され得、そして、検出可能な治療利益を患者にもたらす有効量もまた、検出可能な治療利益を患者にもたらすための、各薬剤を投与するための時間的要件と同様に、決定され得る。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書中で例示されている一方、当該例示は、本発明を実施する際に患者に提供され得る用量および投与レジメンを決して制限しない。
【０１６３】
投与量の値は、緩和されるべき症状のタイプおよび重症度によって変動し得、そして単回投与または複数回投与を含み得ることに留意されるべきである。特定のあらゆる対象について、特定の投薬レジメンが、個々の必要性、および組成物の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書中に記載される投薬量範囲は、例示に過ぎず、具体化される組成物の範囲または実施を限定することは意図されていないとさらに理解されるべきである。さらに、本発明の組成物による投薬レジメンは、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、病状、症状の重症度、投与経路、および使用される特定の三重特異的結合分子が挙げられる種々の要因に基づき得る。ゆえに、投薬レジメンは、幅広く変動し得るが、標準的な方法を用いてルーチン的に決定され得る。例えば、臨床効果、例えば毒性作用および／またはラボ値を含み得る薬物動態パラメータまたは薬力学パラメータに基づいて、用量が調整され得る。ゆえに、本発明は、当業者によって決定される患者内用量漸増を包含する。適切な投薬量およびレジメンの決定は、関連技術において周知であり、本明細書中に開示される教示が与えられれば、当業者によって達成されると理解されよう。
【０１６４】
適切な投与経路の例が、先に記載されている。
【０１６５】
本発明の三重特異的結合分子の適切な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲にあると考えられる。三重特異的結合分子は、例えば、少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも４ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇ、そして例えば最大で５０ｍｇ／ｋｇ、例えば最大で３０ｍｇ／ｋｇ、例えば最大で２０ｍｇ／ｋｇ、例えば最大で１５ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されてよい。投与は、通常、適切な間隔で、例えば、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回、そして、場合によっては投薬量を必要に応じて増減させてよい責任医師によって適切であると考えられる限り、繰り返されることとなる。
【０１６６】
自己免疫疾患または炎症性障害の治療に有効な量は、患者において疾患進行を安定化させ、かつ／または症候を改善し、そして好ましくは疾患の進行を逆転させるその能力によって、測定され得る。自己免疫疾患または炎症性障害を阻害する本発明の三重特異的結合分子の能力は、例えば例に記載されるような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、およびそのような障害における有効性を予測するのに適した動物モデルによって評価され得る。適切な投薬レジメンは、特定の各状況において最適な治療応答をもたらすように選択されることとなり、例えば、単回ボーラスとして、または連続注入として投与されることとなり、各症例の緊急性によって示される投薬量の調整が可能である。
【０１６７】
診断用途および組成
本発明の三重特異的結合分子は、診断プロセス（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ）にも有用である。例えば、三重特異的結合分子は、患者由来のサンプル（例えば、組織サンプル、または体液サンプル、例えば、炎症性滲出液、血液、血清、腸液、唾液、もしくは尿）中のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、および／またはＴＮＦαのレベルを検出かつ／または測定するのに用いられ得る。適切な検出方法および測定方法として、免疫学的方法、例えば、フローサイトメトリ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が挙げられる。本発明はさらに、本明細書中に記載される三重特異的結合分子を含むキット（例えば診断キット）を包含する。
【０１６８】
本発明がよりよく理解され得るように、以下の例が記載される。これらの例は、説明目的で示されるに過ぎず、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１６９】
本明細書中で引用された刊行物、特許、および特許出願は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。上記の発明は、理解を明確にする目的で、説明および例示によって一部詳細に記載されたが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付の実施形態の精神または範囲から逸脱することなく、ある種の変更および修飾が上記の発明になされてよいことが容易に明らかとなろう。
【０１７０】
例
例１：三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα抗体の作出および最適化
図１に示すように、三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα抗体を作出し、かつ最適化した。
【０１７１】
例２：哺乳動物細胞の懸濁培養における組換え抗原および組換え抗体の生産
公開されているプロトコール（Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ５２９：２２７−２４０（２０１３））に従って、ＥＢＮＡ１（エプスタイン・バール・ウイルス核抗原１）を構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、抗体および抗原を産生させた。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって生産されている無血清培地を用いて、製造者の指示に従って、細胞を、オービタルシェーカ上で懸濁培養した。一過性発現のために、細胞を、２×１０Ｅ６／ｍｌの濃度にて、線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ  ＭＡＸ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）により形質移入した。ＤＮＡ／ＰＥＩ比は１：３であった。形質移入の５〜７日後に、培地を２０００ｇにて２０分間遠心分離して、０．２２μｍフィルタで濾過した。アフィニティクロマトグラフィによって、標的タンパク質を培養液から抽出した。
【０１７２】
Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ−ｃｈａｒｇｅｄ  ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、タンパク質のＣ末端に６個のアミノ酸を含有する組換えタンパク質ＩＬ−１７Ａ、およびＦＬＡＧ−ペプチド（図２）を、培養液から抽出して精製した。精製に先立って、ＮｉＣｌ２を培養液に加えて、１ｍＭの濃度にした。次に、５ｍｌのＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣ  Ｎｉ−ｃｈａｒｇｅｄ  ｒｅｓｉｎを培養液に加えて、シェーカ上で室温にて１時間撹拌した。吸着剤（５ｍｌ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃポリプロピレンカラムに移して、５カラム容量のＰＢＳで洗浄して、非特異的結合成分を除去した。結合した抗原を、０．３Ｍイミダゾール、рН８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて溶出した。次に、ＳｎａｋｅＳｋｉｎ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｉｎｇ技術を用いた透析によって、タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に移して、濾過して（０．２２μｍ）、チューブに移して、−７０℃にて保存した。生じたタンパク質溶液の純度を、ＳＤＳゲル電気泳動によって評価した（図３）。
【０１７３】
試験ＩｇＧ１抗体および対照ＩｇＧ１抗体を、ＩＬ−１７Ａ−Ｆｃ抗原について先に記載した手順に従って、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＦＦ  １ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。生じたタンパク質溶液の純度を、ＳＤＳゲル電気泳動によって評価した（図４）。
【０１７４】
変性条件下での電気泳動純度データに従えば、組換え抗原産物、ならびにＩＬ−１７Ａ−Ｈ６ＦおよびＩＬ−１７Ａ−Ｆｃは、免疫化および更なる研究に適している。さらに、満足のいく純度の対照調製物ＡＩＮ４５７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；再現されたもの（米国特許第７８０７１５５号明細書））を、研究に用いることができる。
【０１７５】
例３：ヒトＩｌ−１７ａによるラマの免疫化、およびラマＦａｂファージ抗体ライブラリの作成
ラマ（Ｌａｍａ  Ｇｌａｍａ）を、等容量の完全フロイントアジュバント（１回目の注射中）または不完全フロイントアジュバント（残りの注射用）と混合した抗原物質の皮下注射によって、連続して５回免疫化した。組換えタンパク質の混合物を、抗原（１回の注射につき各タンパク質０．２ｍｇ）として用い、そのうちの１つが、ヒトＩＬ−１７Ａ−Ｈ６Ｆ（例２）であった。１回目から３週間後に２回目の注射（免疫化工程）を実行してから、２週間おきにさらに３回免疫化を実行した。血液サンプル（５０ｍｌ）を、３回目からはじめて、各注射の５日後に採取した。
【０１７６】
免疫化後に採取したラマ血液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ溶液で２倍に希釈した。希釈した血液３５ｍｌを、１．０７７ｇ／ｍｌの密度、１５ｍｌの容量の、培地溶液Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ）上に重層してから、８００ｇにて２０分間遠心分離した。単核細胞（リンパ球および単球）を、血漿／Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ培地の相間ゾーンから選択してから、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ溶液で洗浄した。
【０１７７】
標準的なプロトコールに従って確認した、ＩＬ−１７Ａに対する血清免疫グロブリン力価は、１／１００００以上であった。これは、抗体ライブラリの構築に満足のいくものである（５）。
【０１７８】
ｌｌａｍａ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、提唱されているプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ）に従って、単核細胞の総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｖｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって判定して、抽出されたＲＮＡの品質を、１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって調べた。
【０１７９】
ＭＭＬＶ  ＲＴキット（Ｅｖｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写酵素、およびランダム−ＭＭｕＬＶ六量体オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる推奨プロトコールに従って、逆転写反応を実行した。
【０１８０】
逆転写産物を、２段階ＰＣＲにおける鋳型として用いて、オリゴヌクレオチドのセットおよび公開されているプロトコール（ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（２６）：１８２１８−３０（１９９９）；Ｄｅ  Ｇｅｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０（１−２）：１８７−９８（２００６））を用いて、制限部位に隣接して位置する可変ドメイン遺伝子を生成した。次に、一フラグメントの可変軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの遺伝子の合成を、制限、ライゲーション、および増幅によって順次実行した。重鎖の遺伝子を、カッパ遺伝子と、そして軽鎖のラムダ遺伝子と別々に組み合わせた。ゆえに、全反応におけるマトリックスの推定分子数は、１０１１以上であった。生じたＤＮＡ産物ＶＬ−ＣＫ−ＶＨを、制限酵素ＮｈｅＩ／Ｅｃｏ９１Ｉで処理して、元のファージミドｐＨ５中にライゲーションした。図６は、生じたプラスミド構造を示す。ライゲーション産物を、既知のプロトコール（Ｂｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３３２（３）：６４３−５５（２００３））に従って得たエレクトロコンピテントＳＳ３２０細胞中に形質転換した。それぞれ、Ｆａｂライブラリのカッパ誘導体のレパートリは、５．１×１０Ｅ８であり、Ｆａｂライブラリのラムダ誘導体のレパートリは、３．７×１０Ｅ８であった。
【０１８１】
例４：ファージ抗体のＦａｂライブラリの選択
特異的抗ＩＬ−１７ＡファージＦａｂを、先で記載した一連の選択サイクルを実行することによって、組換えヒトＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＦａｂディスプレイライブラリから単離した（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２（３）：５８１−５９７（１９９１）；ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（２６）：１８２１８−３０（１９９９））。パニングによる選択を実行するために、５０ｍＭ炭酸バッファ（ｐＨ９．５）中のヒトＩＬ−１７Ａを、吸着管Ｈｉｇｈ  Ｓｏｒｂ（Ｎｕｎｃ）の表面上に、４℃にて一晩吸着させた。管を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄してから、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）−スキムミルク（０．５％ｗｔ．／Ｖｏｌ．）で１時間ブロックした。次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）−スキムミルク（０．５％ｗｔ．／Ｖｏｌ．）中のファージ溶液２．４ｍｌ（１ｍｌ中１０１２ファージ粒子の濃度）を、抗原を入れた試験管に加えて、撹拌しながら１時間インキュベートした。非結合ファージを、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）−Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％ｖｏｌ．／ｖｏｌ）を用いて、一連の洗浄サイクルの間に除去した。洗浄回数は、第１ラウンドから第３ラウンドまで、それぞれ２０−３０−４０回まで増大させた。残りの結合ファージ粒子を、１００ｍｌのＧｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）溶液で１５分間、撹拌しながら溶出してから、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で中和した。細菌株、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１に、得られたファージを感染させてから、ファージを単離して、次の選択サイクルに用いた。
【０１８２】
第２および第３ラウンドの、ＩＬ−１７Ａの選択後、ポリクローナルファージ産物のＥＩＡ分析は、顕著な富化を示した（図８）。抗ＩＬ−１７Ａに特異的なヒトＦａｂによって富化された、生じたクローンプールを、重鎖ＣＨ１遺伝子のＣ末端にｍｙｃタグおよびＨｉｓ６タグを含有する発現プラスミドｐＬＬに再クローニングした（図７）。
【０１８３】
例５：ヒトＩＬ−１７ａへのＦａｂの特異的結合の分析
ＥＩＡ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、選択されたＦａｂフラグメントの、ヒトＩＬ−１７Ａとの結合を測定した。陽性対照として、公開されている配列（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を有するＦａｂ抗体ＡＩＮ４５７を用いた。特異的結合アッセイのために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）上のウェルを、５０μｌのＩＬ−１７Ａ（１Ｘコーティング炭酸バッファ中０．５μｇ／ｍｌ）でコーティングしてからシールして、４℃にて一晩インキュベートした。その後のステップは全て、ＧｅｎｅｔｉｘＱ−ｐｉｘ２ｘｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）ロボットシステムおよびＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００（Ｔｅｃａｎ）に基づく自動化高性能プラットフォームを用いる標準的なＥＩＡプロトコールによって実行した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキングバッファ（ＢＢ）を加えた（ＰＢＳ中０．５％スキムミルク２００μｌ）。プレートを、シェーカ上で室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによる洗浄後、分析されるＦａｂを含有する試験細胞上清を、ウェルあたり５０μｌ加えて、等容量のブロッキングバッファと混合した。プレートを再び室温にて１時間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで５回洗浄した。洗浄後、５０μｌ／ウェルのヒト抗Ｆａｂ  ＨＲＰ結合二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に、１：５０００の比率で加えた。プレートを、ロータリーシェーカ（５０分、室温）上で振盪して、先に記載したようにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで５回洗浄した。ＴＭＢ（１００μｌ／ウェル）を、飽和するまで（平均３〜５分）加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液（１００μｌ／ウェル、１０％硫酸）を加えることによって停止させた。色シグナルを、４５０ｎｍの波長にて、適したプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。抗体結合の程度は、色シグナル生成と比例した。シグナルがバックグラウンドカラーを５倍超上回ったクローンを、競合的ＥＩＡ分析で試験して、ＩＬ−１７Ａリガンドと受容体との相互作用を阻害するアンタゴニストＦａｂを検出した。
【０１８４】
例６：ＩＬ−１７ＡリガンドとＩＬ−１７Ｒ受容体との相互作用のブロッキングの競合的ＥＩＡ分析
競合ＥＬＩＳＡを用いて、以前に選択された抗ヒトＩＬ−１７Ａ  Ｆａｂのアンタゴニスト能力を分析した。陽性対照として、アンタゴニストＦａｂ抗体ＡＩＮ４５７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を用いた。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）のウェルに、５０μｌの受容体ＩＬ−１７ＡＲＡ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１Ｘコーティング炭酸バッファ中１ｍｇ／ｍｌの濃度にて固定して、４℃にて一晩インキュベートした。その後のステップは全て、ＧｅｎｅｔｉｘＱ−ｐｉｘ２ｘｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）ロボットシステムおよびＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００（Ｔｅｃａｎ）に基づく自動化高性能プラットフォームを用いる標準的なＥＩＡプロトコールによって実行した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキングバッファ（ＢＢ）を加えた（ＰＢＳ中０．５％スキムミルク２００μｌ）。プレートを、シェーカ上で室温にて１時間インキュベートした。
【０１８５】
同時に、分析されるＦａｂを含有する試験細胞上清の５０μｌを、９６ウェルプレート中で、１％ミルクＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中０．４μｇ／ｍｌの濃度の５０μｌのＩＬ−１７Ａ−Ｈｉｓ６−Ｆｌａｇと混合した。これを次に、シェーカ上で５００回転／分にて撹拌しながら、３７℃にて１時間インキュベートした。
【０１８６】
ＩＬ−１７ＡＲＡ−Ｆｃ受容体を含有するプレートからブロッキングバッファを洗い流した後、先に記載した反応混合物を、ウェルあたり９０μｌにて移した。プレートを再び室温にて４５分間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで５回洗浄した。５０μｌ／ウェルのマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）を、１μｇ／ｍｌの濃度にて加えた。プレートを室温にて４５分間インキュベートしてから、プレートの各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで５回洗浄した。５０μｌ／ウェルの抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ結合二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：５０００の比率にて希釈した）を加えた。プレートを、ロータリーシェーカ上で室温にて４５分間振盪して、先に記載したようにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで５回洗浄した。ＴＭＢ（１００μｌ／ウェル）を、飽和するまで（平均３〜５分）加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液（１０％硫酸、１００μｌ／ウェル）を加えることによって停止させた。色シグナルを、４５０ｎｍの波長にて、適したプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。抗体結合の程度は、色シグナル生成と比例した。
【０１８７】
対照Ｆａｂ抗体ＡＩＮ４５７のレベルにて阻害を示したクローンを陽性として注目して、更なる分析に用いた。陽性クローンの可変ドメインの遺伝子を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる標準的なプロトコールに従って配列決定して、分析した。ＶＨＨ可変ドメインを含有するクローンを、更なる研究のために選択した。また、一クローン、３ＶＨＨＦａｂが、２３の異なる軽鎖ドメイン配列と組み合わせされて現れることも見出され、このことは、その相対的な構造的耐性を示し得、かつ、軽鎖ではなくＶＨＨドメインが、ＩＬ−１７Ａとの相互作用に寄与していることを示唆し得る。
【０１８８】
例７：動態解離定数ｋｏｆｆ（ｋｄｉｓ）による、抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨＨＦａｂ候補の比較スクリーニング
抗ＩＬ−１７Ａ  Ｆａｂ候補についてのｋｏｆｆの比較スクリーニングを、装置Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６（Ｐａｌｌ−ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて実行した。抗ＦＡＢＣＨ１バイオセンサを、１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．１％ＢＳＡを含有するランニングバッファ中で３０分間再水和させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）１０ｘ作業バッファを試験サンプルに加えて、最終濃度を１ｘにした。次に、抗ＦＡＢＣＨ１バイオセンサを、候補Ｆａｂフラグメントのサンプルおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に、１２℃にて４時間浸漬した。Ｆａｂフラグメントが表面上に固定されたセンサを、ランニングバッファでウェル中に移して、ベースラインを特定した（６０秒）。次に、センサを、検体（ＩＬ−１７Ａ、３０μｇ／ｍｌ）の溶液が入ったウェル中に、抗原−抗体複合体の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）のために移した（３００秒）。次に、センサを、ランニングバッファを含有するウェルに、次の解離工程のために戻した（３００秒）。各実験の後、用いたセンサを、次の実験に用いるために、再生用の３倍バッファ（Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ１．７）に入れることによって、再生した。Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（バージョン７．０）を用いて、相互作用モデル１：１を用いる標準的な手順に従って、曲線の解析を実行した。
【０１８９】
抗ＩＬ−１７Ａ  Ｆａｂ候補のｋｏｆｆスクリーニングの結果を、表１に示す。ユニークなＶＨＨＦａｂは全て、ヒトＩＬ−１７Ａとの特異性が高い親和性結合を示した一方、３ＶＨＨＦａｂは、非常に速いｋｏｎおよび非常に遅いｋｄｉｓ（１／秒）を示した（機器の感度を超えていた）。
表１．ヒトＩＬ−１７Ａに対するＶＨＨＦａｂ親和性およびヒトＩＬ−１７Ｆに対する特異性。
【表１】
2019518473.tif 000003
ゆえに、解析データに基づいて、３ＶＨＨＶＫ４Ｂ１１のＶＨＨモノドメインは、他の２つの候補と比較して、最大の結合親和性を示した。
【０１９０】
例８：ヒトＩＬ−１７ＦへのＶＨＨＦａｂの特異的結合
ＥＬＩＳＡアッセイを、ヒトＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）についてではあるが、例５に記載した標準的なＥＬＩＳＡプロトコールに従って、３つの前述のＶＨＨＦａｂに実行した。Ｆａｂ抗体ＡＩＮ４５７（公開されている配列；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、陽性対照として用いた。３つのＶＨＨＦａｂ候補の相互作用の定性分析の結果を、表１に示す。以下に記載する突然変異を有する、以後ＶＨＨ１７（配列番号１；図９）と称するＶＨＨモノドメインを、３ＶＨＨＶＫ４Ｂ１１  Ｆａｂに対する親和性試験および交差反応性試験に基づいて、更なる研究のために選択した。
【０１９１】
例９：抗ＩＬ−１７Ａ  ＶＨＨ１７ドメインのＣＤＲの走査突然変異誘発
ＶＨＨ１７ドメインＣＤＲの個々の位置への突然変異を、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いたＮＮＫランダム化技術によって、製造者のプロトコールに従って挿入した。プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＶＨＨ１７を、マトリックスとして用いた。ＰＣＲ産物を、低融点アガロースゲル上で分画して、適切なカラム上で精製した。ライゲーション後、ＤＮＡを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。先に記載したように、個々のクローンを、９６ウェルプレート中での発現によって得た。突然変異体ＶＨＨ１７を含有する上清を、先に記載した条件下で、そして高性能Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑ−ｐｉｘ２ｘｔシステムおよびＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ２００システムを用いて、ＥＬＩＳＡによって分析した。固定化されたＩＬ−１７Ａの濃度は、０．２μｇ／ｍｌであった。結合したＶＨＨ１７モノドメインを、１：５０００希釈マウス抗ｍｙｃタグ９Ｅ１０、抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ）結合体（Ｐｉｅｒｃｅ）、およびＴＭＢ＋Ｈ２Ｏ２／Ｈ２ＳＯ４色素で染色した。４５０ｎｍの波長での吸収を測定した。
【０１９２】
走査突然変異誘発によって得られた結果を、表２に示す。この表は、野生型配列と比較した場合の、突然変異体ＶＨＨ１７／ヒトＩＬ−１７Ａ結合シグナルの≦３０％の低下に相当するＣＤＲ置換を示している。一態様において、本発明は、当該突然変異およびそのあらゆる組合せを含む三重特異的結合分子を提供する。
表２．ＶＨＨ１７走査突然変異誘発
【表２】
2019518473.tif 000004
【０１９３】
このスクリーニングにより、アミノ酸置換に耐性である、ＶＨＨ１７のＣＤＲ中のアミノ酸位置が同定された。本アミノ酸置換パネルは、ヒトＩＬ−１７Ａに対するＶＨＨ１７親和性の結合親和性を大幅に変化させないことが実証されている。ゆえに、この置換パネルは、候補の様々な特性を向上させるのに用いることができる。
【０１９４】
例１０：抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆおよび抗ＴＮＦα三重特異的抗体：ＶＨＨ−ＩｇＧ１（ＬＡＬＡ）の操作および生成
ヒトＴＮＦα（ＲＵ２３０３６０４号明細書）に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの遺伝子を、元のコドン組成内で合成して、重鎖および軽鎖についてそれぞれｐＥＥ−Ｈｃ（ＩｇＧ１）プラスミドおよびｐＥＥ−Ｌｃプラスミド中にクローニングした。これにより、ＣＨＯ−ＥＢＮＡ細胞における共同の（ｊｏｉｎｔ）一過性発現が、ＩｇＧ１アイソタイプモノクローナル抗体を産生し得る。これらの構築体を、配列決定によって検証し、重鎖についてはｐＥＥ−ａＴＮＦ−ＩｇＧ１Ｈｃと命名し、そして軽鎖についてはｐＥＥ−ａＴＮＦＬｃと命名した（図９は、可変ドメインのアミノ酸配列を示す）。
【０１９５】
図９に示す可変ドメインを有する抗ＴＮＦαＩｇＧ１の「効果なし」ＬＡＬＡ変異体を得るために（Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８（５）：６０８−１６（１９９９））、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（Ｋａｂａｔ命名法）を、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて、ｐＥＥ−ａＴＮＦ−ＩｇＧ１Ｈｃ構築体内に、ＰｆｕＵｌｔｒａＨＳポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を介して、公開されているプロトコール（Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ））に従って、導入した。ＰＣＲ産物を、低融点アガロースゲル上で分画して、カラム上で精製した。ライゲーション反応後、ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。標的配列を、配列決定によって確認し、以降、ｐＥＥ−ａＴＮＦ−ＩｇＧ１ＨｃＬＡＬＡと命名した。
【０１９６】
また、例８において検出したＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆに対する高親和性ＶＨＨ配列を基礎として用いて、ＶＨＨ１７遺伝子を合成した（配列番号４；図９）。ヒトＶＨ生殖系列に特異的な、突然変異の元のセットを導入した（Ｑ５Ｖ、Ｓ１１Ｌ、Ｄ６１Ａ、Ｙ７７Ｎ、Ｒ９３Ｖ）（同様に、突然変異Ｅ４４Ｇ／Ｒ４５Ｔの組合せを、重鎖と軽鎖の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）間のサブユニット間接触の部位に導入した）。以前に示されたように（ＲＵ２０１４１３８７４０号明細書）、これは、抗体軽鎖と組み合わせて、ＶＨＨ誘導体の安定性を実現する。
【０１９７】
さらに、標準的な遺伝子工学的手順に従って、特定の１３アミノ酸可撓性リンカー（融合分子内の双方のポリペプチドの正確な、独立した折畳み、および異なる抗原との独立した結合に必須）によって軽鎖から分離させた、軽鎖ｐＥＥ−ａＴＮＦＬｃ構築体のＮ末端に、ＶＨＨ１７遺伝子（配列番号１）をクローニングした。生じた構築体を、ｐＥＥ−ＶＨＨ１７−７７Ｎ−ａＴＮＦＬｃと命名した。
【０１９８】
重鎖ｐＥＥ−ａＴＮＦ−ＩｇＧ１ＨｃＬＡＬＡおよび軽鎖ｐＥＥ−ＶＨＨ１７−７７Ｎ−ａＴＮＦＬｃのＣＤＲ中の計算された位置におけるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発によって（図１０中の表参照）（Ｋａｂａｔ命名法）、ＰｆｕＵｌｔｒａＨＳポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、公開されているプロトコール（Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ））に従って、先で記載した手順に従って、様々なアミノ酸置換を導入した。更なる研究のために選択したクローン中の突然変異を、図１０に示す。
【０１９９】
重鎖突然変異および軽鎖突然変異を含有する構築体を、対で組み合わせて、種々の対組合せを得、そして、例２に記載するように、一過性の蓄積を保持した。これにより、抗ＴＮＦαドメインのＣＤＲ中に突然変異のない１つの変異体（ＭａｂＣ）、および三重特異的抗体の３２個の変異体（Ｍａｂ１〜３２；図１１）が生じた。全ての変異体の生産能は、１００ｍｇ／ｌに近いかそれを上回り、これは、変異体の特性の更なる研究に満足のいくものであった。
【０２００】
例１１：三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子による、腫瘍アルファ壊死因子の中和の比較分析
抗体の試験溶液を、９６ウェルプレート中で、５００ｎｇ／ｍｌの濃度から、１ウェルあたり溶液２，１００μｌきざみで滴定した。５００ｐｇ／ｍｌの濃度に組換えヒトＴＮＦαの溶液を調製してから、５０μｌを、試験サンプル入りの各ウェルに加えた。プレートを、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて１時間インキュベートした。
【０２０１】
ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を、１×１０６細胞／ｍｌの濃度に懸濁させて、試験溶液入りの各ウェル中に５０μｌ導入した。プレートを、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて２０〜２４時間インキュベートした。生存細胞の数を、生体染色Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを用いて測定した。インキュベーションの完了後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬２０μｌを、検体プレートの各ウェルに加えてから、プレートを、オービタルシェーカ上で室温にて５分間振盪した。プレートを、３７℃にて１６〜２０時間インキュベートした。蛍光読取りを、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ装置を用いて、５４４／５９０ｎｍの励起／発光波長にて、相対的蛍光単位で評価した。データ分析のために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて、蛍光シグナルと、試験サンプルおよび標準サンプルの濃度について、依存関係ダイアグラムをプロットした。
【０２０２】
図１２中の表は、突然変異していない変異体ＭａｂＣおよび単一特異的抗ＴＮＦα抗体アダリムマブと比較した、３２の突然変異体の三重特異的抗体のアンタゴニスト活性の比較分析の結果を示す。この分析に基づいて、６つの最良の変異体を選択かつ試験して、最良の３つを同定した：Ｍａｂ１２（ＥＤ５０＝４ｎｇ／ｍｌ）、Ｍａｂ３１（ＥＤ５０＝２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＭａｂ３２（ＥＤ５０＝４ｎｇ／ｍｌ）。図１３は、これらの変異体の、対照に対する比較分析のダイアグラムを示す。この分析に基づいて、Ｍａｂ１２変異体を、追跡調査に選択し、ＢＣＤ−１２１と命名した。
【０２０３】
さらに、同じ方法を用いて、三重特異的候補ＢＣＤ−１２１を、２つの抗ＴＮＦα単一特異的抗体インフリキシマブおよびアダリムマブと比較した。結果は、ＢＣＤ−１２１が、アダリムマブおよびインフリキシマブよりも大きなアンタゴニスト活性を示し（それぞれ５倍過剰および１０倍過剰）、ＥＣ５０が６ｎｇ／ｍｌであることを確認した（図１４）。
【０２０４】
例１２：三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子による、ＩＬ−１７Ａ依存的ＩＬ−６産生の阻害の比較分析
ヒト組換えＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαの存在下で、ヒトＨＴ１０８０細胞株（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１２１）によって、ＩＬ−６の産生を誘導するＩＬ−１７Ａの能力を用いて、三重特異的候補ＢＣＤ−１２１（例１０参照）の中和活性を分析した。１０％不活化胎児血清、グルタミン、およびゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で、細胞を増殖させた。細胞を、９６ウェル平底細胞培養プレートに、ウェルあたり５×１０４個加えて、５時間放置して付着させた。４０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−１７Ａの混合物を、抗体希釈液と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、サイトカイン／抗体混合物を、細胞に加えて、一晩放置した。ＨＴ１０８０細胞培養体におけるＩＬ−６の産生は、加えたＩＬ−１７Ａの量に比例した。細胞上清中に放出されたＩＬ−６の量を、ＥＬＩＳＡによって、「ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ６」（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ２０６）を用いて判定した。結果を図１５に示す。再生した抗ＴＮＦα単一特異的抗体アダリムマブを、陰性対照として用いて、抗ＩＬ−１７Ａ単一特異的抗体ＢＣＤ−０８５を、陽性対照（ＢＩＯＣＡＤ）として用いた。グラフから分かるように、アダリムマブはＩＬ−６の産生を阻害せず、ＢＣＤ−０８５は、ＩＬ−６の産生を約９．２ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０で阻害し、ＢＣＤ−１２１抗体は、ＩＬ−６の産生を３．５ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０で有利に阻害した。ゆえに、候補抗体ＢＣＤ−１２１は、このアッセイにおいて、ＩＬ−６産生の最も強力なアンタゴニストである。
【０２０５】
例１３：三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子ＢＣＤ−１２１による、二重ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦα依存的ＩＬ−６産生の阻害の比較分析
ヒト組換えＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαの存在下で、ヒトＨＴ１０８０細胞株（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１２１）によってＩＬ−６の産生を誘導するＩＬ−１７Ａまたは二重ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦαの能力を用いて、三重特異的結合分子候補ＢＣＤ−１２１（例１０参照）の中和活性を分析した。１０％不活化胎児血清、グルタミン、およびゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で、細胞を増殖させた。１ウェルあたり５×１０４個の細胞を、９６ウェル平底細胞培養プレートに加えた。細胞を、５時間放置して付着させた。４０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ−１７Ａおよび２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαの混合物を、抗体の希釈液と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。次に、サイトカインおよび抗体の混合物を、細胞に加えて、一晩放置した。ＨＴ１０８０細胞培養体におけるＩＬ−６の産生は、加えたＩＬ−１７Ａの量に比例した。細胞上清中に放出されたＩＬ−６の量を、ＥＬＩＳＡによって、「ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ６」（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ２０６）を用いて判定した。結果を図１６に示す。再生した抗ＴＮＦα単一特異的抗体アダリムマブおよび抗ＩＬ−１７Ａ単一特異的抗体ＢＣＤ−０８５（ＢＩＯＣＡＤ）を、対照として用いた。グラフから分かるように、ＢＣＤ−１２１三重特異的抗体は、単一特異的抗体と比較して、有利な効果を示し、約２５ｐＭのＩＣ５０値を、そしてより下部のプラトーでは、ほとんど検出不可能な量のＩＬ−６を示した。対照的に、対照抗体アダリムマブは、ＩＣ５０値が約１００ｐＭであった。ＢＣＤ−０８５は、約２５ｐＭの同様のＩＣ５０値を示したが、閾値プラトー（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｐｌａｔｅａｕ）がＢＣＤ−１２１よりも２０倍超低かった。ゆえに、ＢＣＤ−１２１は、用いたアッセイにおいて、ＩＬ−６産生の最も強力なアンタゴニストである。
【０２０６】
例１４：Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍＴＮＦα細胞における三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子ＢＣＤ−１２１の抗体依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）の分析
以下の定量アッセイに用いるために、Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍＴＮＦα  ｃｌ．８細胞培養体をフラスコから回収して、２００ｇにて５分間遠心分離した。定量のために、上清をデカントして、培地中でもう一回洗浄した。
【０２０７】
細胞ペレットを５ｍｌの培地中に懸濁させて、定量した。細胞の生存率および数を判定した。白色９６ウェル培養プレートに播種するための細胞懸濁液を、３×１０５細胞／ｍｌにて調製した。
【０２０８】
試験サンプルを、９６ウェルプレートのウェル中に希釈した。試験サンプルを含むウェル中に、Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍＴＮＦα  ｃｌ．８細胞懸濁液を加えて、プレートを、ＣＯ２インキュベータ内で１５〜３０分間インキュベートした。
【０２０９】
ＰＢＭＣ細胞の懸濁液を、７．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で調製して、試験サンプルと共にウェル中に加えた。プレートをＣＯ２インキュベータ内で３７℃にて４時間インキュベートした。
【０２１０】
Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを、セット「ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏｔｍ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ」由来のＡＡＦ−Ｇｌｏ（商標）Ｓｕｂｓｔｒａｔｅと混合してから、試験サンプルを含む各ウェルに加えた。プレートを、室温にて１５分間インキュベートした。発光を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ装置で測定した。この方法によって、細胞内プロテアーゼの活性を判定する。発光シグナルは、溶解した細胞の数に比例する。
【０２１１】
図１７に示すように、ＢＣＤ−１２１は、ＩｇＧ１由来の抗体アダリムマブおよびインフリキシマブと比較して、おおよそ１００倍低いＡＤＣＣ活性を示した。この活性のレベルは、シムジア（Ｆａｂ−ＰＥＧ）に匹敵する。
【０２１２】
例１５：Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍＴＮＦα細胞における三重特異的抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子ＢＣＤ−１２１の補体依存的細胞毒性（ＣＤＣ）の分析
抗体の試験溶液を、９６ウェルプレート中で、１５μｇ／ｍｌの濃度から、１ウェルあたり２５０μｌきざみで滴定した。ヒト補体を、分析用の冷却培地（１％ＢＳＡ入りＲＰＭＩ）中に１：３で溶解させて、５０μｌを、試験サンプル入りのウェル中に加えた。５０μｌのＪｕｒｋａｔ−ｔｍＴＮＦα細胞懸濁液を各ウェルに加えて、サンプルを、１×１０６細胞／ｍｌの濃度（１ウェルあたり５×１０４細胞）とした。プレートを、オービタルシェーカ上で室温にて３分間振盪して、３７℃のＣＯ２インキュベータ内に２〜３時間置いた。生存細胞数を、生存染色Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを用いて測定した。インキュベーションの完了後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬１５μｌを、検体プレートの各ウェルに加えてから、プレートを、オービタルシェーカ上で室温にて５分間振盪した。プレートを、３７℃にて１８〜２４時間インキュベートした。蛍光読取りを、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬ装置を用いて、５４４／５９０ｎｍの励起／発光波長にて、相対的蛍光単位で評価した。
【０２１３】
図１８に見られるように、ＢＣＤ−１２１は、ＩｇＧ１由来の抗体アダリムマブおよびインフリキシマブと比較して、Ｊｕｒｋａｔ−ｔｍＴＮＦα  ｃｌ．８細胞においてＣＤＣ活性を有していない。この活性のレベルは、シミジア（Ｆａｂ−ＰＥＧ）に匹敵する。
【０２１４】
例１６：ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６装置を用いた、ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＴＮＦαとのＢＣＤ−１２１の同時相互作用の分析
ヒトＩＬ−１７ＡおよびヒトＴＮＦαへのＢＣＤ−１２１の同時結合の分析を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６装置（Ｐａｌｌ−ＦｏｒｔｅＢｉｏ）による古典的な「サンドイッチ」分析法を用いて実行した（図１９）。ランニングバッファとして０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて、３０℃にて分析を実行した。実験中、第１の抗原（ＩＬ−１７Ａ−ビオチン）を、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサ上に、２０μｇ／ｍｌの濃度および２００μｌ／ウェルの容量にて固定化した。さらにセンサを、２０μｇ／ｍｌの濃度の抗体の２００μｌ／ウェルの抗体溶液中に浸漬した。その後、センサを、１ｍｇ／ｍｌの濃度の２００μｌ／ウェルのＴＮＦα溶液中に、そしてタンパク質を含有しない生理食塩水中に浸漬した。
【０２１５】
結合曲線マイナスベースラインシグナルを、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．０）を用いて、標準的な手順に従って分析した。
【０２１６】
図１９に示すセンソグラムは、三重特異的結合分子ＢＣＤ−１２１が、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦαに同時に結合することができることを示している。
【０２１７】
例１７：Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を用いた、オーソロガスＩＬ−１７ＡリガンドおよびＴＮＦαリガンドとのＢＣＤ−１２１結合の分析
分析を、サンドイッチアプローチを用いて、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって製造されているＩＬ−１７Ａ調製物およびＴＮＦα調製物を用いて行った。チップの活性化後、個々のリガンドを、非特異的に（ＮＨ２基によって）、バイオセンサ表面上に２０μｇ／ｍｌの濃度にて固定化した。次に、抗体の負荷（Ｌｏａｄｉｎｇ）を、１〜２５μｇ／ｍｌの濃度にて実行した。その後、複合体解離工程用のランニングバッファ中にセンサを浸漬した。流量は１０μｌ／分であった。
【０２１８】
得られたデータの分析を、ＢＩＡ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェアおよびＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｌｉｇａｎｄモデルを用いて実行した。
【０２１９】
表３は、ヒトおよび霊長類由来のオーソログＩＬ−１７ＡリガンドおよびＴＮＦαリガンドとのＢＣＤ−１２１の相互作用に関するデータを示す。ＢＣＤ−１２１は、全てのリガンドに対して非常に高い親和性（ｐＭ未満）を示す。
表３．ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、およびＴＮＦαに対するＢＣＤ−１２１の親和性
【表３】
2019518473.tif 000005
【０２２０】
例１８：ＢＣＤ−１２１と種々のＩＬ−１７ファミリ抗原（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＡ／Ｆ）との相互作用の酵素イムノアッセイ
ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＩＬ１７ファミリ抗原に対するＢＣＤ−１２１の比較結合を測定した。結合分析のために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ由来の結合培地）のウェルを、５０μｌのヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＬ−１７Ｆ、またはＩＬ−１７Ａ／Ｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、（１×コーティング炭酸バッファ中）１μｇ／ｍｌの濃度にて個々にコーティングして、密封して、４℃にて一晩インキュベートした。その後の全ての工程を、標準的なＥＩＡプロトコールによって実行した。非特異的結合を阻害するために、ブロッキングバッファＢＢを加えた（ＰＢＳ中０．５％スキムミルク２００μｌ）。プレートを、シェーカ上で室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、５０μｌの試験抗体を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中５μｇ／ｍｌの濃度にて、各ウェルに加えた。プレートを再び室温にて１時間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで３回洗浄した。洗浄後、ヒト抗Ｆａｂ  ＨＲＰ結合二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ由来）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に、１：５０００の比率にて加えた（５０μｌ／ウェル）。プレートを、ロータリーシェーカ（５０分、室温）上で振盪して、先に記載したようにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで３回洗浄した。ＴＭＢ（５０μｌ／ウェル）を、飽和するまで（平均３〜５分）加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液（３０μｌ／ウェル、１０％硫酸）を加えることによって停止させた。色シグナルを、４５０ｎｍにて、適したプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。抗体結合の程度は、色シグナル生成と比例した。
【０２２１】
ヒトＩＬ−１７ファミリのメンバーとのＢＣＤ−１２１の相互作用の結果を、図２０に示す。ＢＣＤ−１２１についての光吸収濃度の曲線から分かるように、三重特異的結合分子は、ＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆと高い親和性で特異的に相互作用し、そしてその天然ヘテロ二量体ＩＬ−１７Ａ／Ｆと低い親和性で特異的に相互作用する。ＢＣＤ−１２１は、ファミリの他のメンバーと交差反応しない。
【０２２２】
例１９：モルモット、ウサギ、およびマウスのＴＮＦαとのＢＣＤ−１２１の相互作用の酵素イムノアッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイを、例１６に記載したのと同様のプロトコールを用いて実施した。ヒト、モルモット、ウサギ、およびマウスのＴＮＦα抗原は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓに由来する。
【０２２３】
ヒト、モルモット、ウサギ、およびマウスのＴＮＦαとのＢＣＤ−１２１の相互作用の結果を、図２１に示す。ＢＣＤ−１２１の光吸収濃度についての曲線から分かるように、三重特異的結合分子は、特異的に、ヒトＴＮＦαにのみ高い親和性で反応する。ＢＣＤ−１２１は、ＴＮＦαオーソログ（例１７に示すように、霊長類ＴＮＦαオーソログを除く）と交差反応しない。
【０２２４】
例２０：動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いてタンパク質凝集点を評価することによる、熱安定性の判定
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ装置で、サンプル（１ｍｇ／ｍｌ）の凝集点（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）の判定を実行した。０．５ｍｌの溶液を、ダストフリーの石英キュベット内に入れ、これを装置内で１．５℃ずつ５０〜８５℃まで徐々に加熱した。各温度を３０秒間維持して、散乱光の強度を定数測定（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）した。散乱光の強度を、角度θ＝１７３°にて検出した。
【０２２５】
動的光散乱法を用いて得たデータを、４つの異なるバッファ中でのタンパク質凝集点について、図２２および表４に示す。
表４．動的光散乱によって測定したＢＣＤ−１２１凝集点
【表４】
2019518473.tif 000006
【０２２６】
例２１：熱ストレス５０℃法による長期間曝露中の熱安定性の測定
約５ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質サンプルを、それぞれ２００μｌの３つの部に分けて、別々のチューブ内に入れた：各組成物について１本のチューブを、＋４℃の冷蔵庫内で保存した。他の２本を試験管ヒータ内に入れて、５０℃にてそれぞれ６時間および２４時間インキュベートした。加温後、チューブをヒータから取り出して、室温にて１５分間静置して、８０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、上清を、ＵＶ検出器によるゲル濾過用に移した。
【０２２７】
サイズ排除クロマトグラフィ用の研究標準を用いた（Ｂｉｏ−ｒａｄ；ｃａｔ．ｎｕｍｂｅｒ  １５１−１９０１）。５０℃での長時間加熱下での種々のバッファ中のＢＣＤ−１２１安定性についてのデータを、図２３の表に示す。
【０２２８】
結果は、試験した全てのバッファが、満足のいくＢＣＤ−１２１熱ストレス安定性をもたらすことを示している。
【０２２９】
例２２：ＢＣＤ−１２１の生産用の安定した細胞株の作製
抗体の軽鎖および重鎖を最適な比率で含有するＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）スラリー親細胞株ＣＨＯ−Ｓベクター構築体を用いたエレクトロポレーションによる形質移入によって、ＢＣＤ−１２１の安定したプロデューサ細胞株を得た。ＣｌｏｎｅＰｉｘロボットプラットフォーム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、生産性が高い（１０００ｍｇ／Ｌ）クローン株を得た。ミニプール選択の準備段階を、抗生物質を用いて、種々の培養形式で実行した。生産性分析を、分析システムＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実行した。基本培地および培養スキームの選択に、自動化システムＢｉｏｍｅｋ  ＦＸロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＤＯＥを実行した。プロデューサ細胞を培養するために、動物性タンパク質を含有しない無血清培地およびフィッティング（ｆｉｔｔｉｎｇ）を用いた。前臨床研究用のＢＣＤ−１２１の蓄積を、使用容量が５０ｌのＨｙＣｌｏｎｅ単回使用バイオリアクタ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で実行した。
【０２３０】
例２３：生産が安定した細胞株環境からのＢＣＤ−１２１の単離
ＢＣＤ−１２１を含有する培養液の清澄化を、深層フィルタＭｉｌｌｉｓｔａｋ  Ｃ０ＨＣ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で実行した。一次抗体の精製を、プロテインＡによる親和性樹脂上で、特異的標的タンパク質を用いて実行して、抗体を、ｐＨ３．３〜３．８のグリシンバッファで溶出した。ウイルス不活化のために、溶出液を、酸性ｐＨにて３０〜６０分間インキュベートしてから、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＯＨ溶液で中和した。残留ＤＮＡ、タンパク質産生細胞、切断リガンド親和性吸着剤凝集体、および抗体フラグメントを除去するために、吸着剤ＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で最終のクロマトグラフィ精製を実行した。この方法について、タンパク質溶液を、ｐＨ７．５にて調製した吸着剤に、続いて塩化ナトリウムによる特定の溶出勾配にアプライした。精製したタンパク質を、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＰＲＯフィルタ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のセットを用いて、ウイルスについて濾過した。タンパク質を、カットオフ限界が５０ｋＤａであるテープ上での接線流中で濃縮し、続いて酢酸バッファ（ｐＨ５．０）、ソルビトール、およびポリソルベート−８０を含有する最終バッファに対して透析濾過した。最終溶液中のタンパク質濃度は、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌであった。
【０２３１】
精製結果を図２４に示す。ＳＤＳ入りポリアクリルアミドゲルを還元条件および非還元条件下で用いる直立電気泳動により、医薬組成物に用いるのに十分な生成物の純度が示された。
【０２３２】
例２４：純粋なヒト血清中でのＢＣＤ−１２１安定性を示す酵素イムノアッセイ
純粋なヒト血清中でのＢＣＤ−１２１の安定性を評価するために、三重特異的抗体を、２、１０、および５０μｇ／ｍｌの濃度にて、７人の健康なドナーから得た純粋なヒト血清混合物に加えて、０．０１％チメロサールで保存処理して、３７℃にて７日間保存した。７日後、ＢＣＤ−１２１の濃度を、ＥＬＩＳＡによって、２つのアッセイ形式で測定した：固定化したＴＮＦαおよびビオチン化したＩＬ１７（ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体の検出による）、ならびに固定化したＴＮＦα（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ結合体の検出による）。２、１０、および５０μｇ／ｍｌの濃度になるように、ＢＣＤ−１２１をＥＬＩＳＡ測定の直前に加えた血清サンプルを、対照として用いた。測定を、以下のように実行した：対照、および、２、１０、または５０μｇ／ｍｌのＢＣＤ−１２１を含む、保存した血清サンプルを、１００ｎｇ／ｍｌに希釈し（それぞれ２０倍、１００倍、および５００倍）、そして実際の濃度を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に溶解した標準較正曲線（６．２５〜２００ｎｇ／ｍｌ）に対して測定した。全てのＥＬＩＳＡ工程は、標準的なＥＩＡプロトコールによって実行した。１００μｌの希釈サンプルまたは較正標準を、ＴＮＦαによってプレコーティングしたマイクロウェルに加えた。コーティングしたＴＮＦαの濃度は、ｐＨ９．５の２０ｍＭ炭酸バッファ中２μｇ／ｍｌであった。次に、ブロッキングバッファ（ＢＢ：ＰＢＳ中０．５％スキムミルク２００μｌ）をプレートに加えた。プレートをシェーカ上で室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、１００μｌのビオチン化ＩＬ１７（３μｇ／ｍｌ）またはヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ、１：２００００の比率）を、ウェル単位で加えた（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の濃度）。プレートを再び室温にて１時間、振盪しながらインキュベートしてから、プレートの各ウェルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎバッファで３回洗浄した。１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体を、１：２００００（Ｓｉｇｍａ）の比率で、ビオチン化したＩＬ１７を予め加えたウェル中に追加的に加えた。その後の１時間のインキュベーションおよび洗浄の後、ＴＭＢ（１００μｌ／ウェル）を、飽和するまで（平均１０〜１５分）加えることによって比色シグナルを発色させてから、更なる発色を、停止溶液（５０μｌ／ウェル、１０％硫酸）を加えることによって停止させた。色シグナルを、４５０ｎｍにて、適したプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ）を用いて測定した。ＢＣＤ−１２１結合の量は、色シグナル生成と比例した。較正曲線濃度を、これに希釈係数を掛けて、理論的に加えた血清ＢＣＤ−１２１濃度％として表した。
【０２３３】
例２５：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＣＤ−１２１抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子の有効性の評価
以下の研究を、コラーゲン誘導性関節炎のモデルを用いて、雄のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に行った。実験における動物の総数は、それぞれ４頭のサルの５群で２０頭であった。実験では、産物の４用量：０．２ｍｇ／ｋｇ；１．０ｍｇ／ｋｇ；５．０ｍｇ／ｋｇ；１０．０ｍｇ／ｋｇを用いた。対照群の動物にはプラセボを与えた。産物およびプラセボの投与を、コラーゲンによる予備感作の後に開始した。この研究の間、全群の動物を測定して、ＡＰＷの関節面を算出した。研究の最後に、中手指節関節および中足指節関節をとって、破壊的変化の重篤度を評価した。実験群についての概略を、以下の表５に示す。
表５．
【表５】
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【０２３４】
関節炎誘導のために、ウシＩＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）のエマルジョンを、動物に３回投与した。
【０２３５】
コラーゲンの第１の投与：
投与したコラーゲンの総量は、実験動物あたり２ｍｇであった。この目的のために、２ｍｇのコラーゲンを、０．７ｍｌの０．１Ｍ酢酸中に溶解した。この溶液に、０．７ｍｌの完全フロイントアジュバントを加えた。
【０２３６】
コラーゲンの第１の投与後、動物を２８日間閉じ込めた（ｋｅｐｔ）。
【０２３７】
コラーゲンの第２の投与：
投与したコラーゲンの総量は、実験動物あたり３ｍｇであった。この目的のために、３ｍｇのコラーゲンを、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸中に溶解した。この溶液に、１ｍｌの完全フロイントアジュバントを加えた。
【０２３８】
コラーゲンの第２の投与後、動物を２１日間閉じ込めた。
【０２３９】
コラーゲンの第３の投与
投与したコラーゲンの総量は、実験動物あたり３ｍｇであった。この目的のために、３ｍｇのコラーゲンを、１ｍｌの０．１Ｍ酢酸中に溶解した。この溶液に、１ｍｌの完全フロイントアジュバントを加えた。
【０２４０】
関節のサイズの測定を、以下の時点にてデバイダによって実行した。
・コラーゲンの第１の投与前；
・コラーゲンの第２の投与時；そして
・第２の投与（コラーゲンの投与直前）の後、７週間毎週。
【０２４１】
測定プロセス中、関節の縦軸および横軸を推定した。この手順を、親指を除く全ての中手指節関節および中足指節関節に実行した。面積の計算は、以下の式によって実行した：
ＪＡ＝縦軸の値×横軸の値×３．１４×０．２５。
【０２４２】
各動物の１６関節についてのデータを用いて、炎症面積のパーセント（ＰＩＡ）を算出した。この計算は、以下の式によって実行した：
実験日のＪＡ値×１００
関節炎の誘発前のＪＡの平均値
【０２４３】
図２６に示す結果は、サルＣＩＡモデルにおけるＢＣＤ−１２１の用量依存的抗炎症効果を実証している。
【０２４４】
例２６：ＢＣＤ−１２１抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子の毒物動態の評価
毒物動態アッセイを、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）に実行した。この研究では、ＢＣＤ−１２１産物の３つの用量レベルを用いた。実験群の概略を、以下の表６に示す。
表６．
【表６】
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【０２４５】
研究の過程で、以下のパラメータを評価した：
−臨床検査の結果；
−動物の体重（投与前、ならびに実験の７、１４、２１、２８、３５、および４２日目）；
−体温（投与前、ならびに実験の７、１４、２１、２８、３５、および４２日目の投与後１、２、４、６、および２４時間）；
−尿検査（投与前、ならびに実験の７、１４、２１、２８、３５、および４２日目）；
−パラメータ：赤血球数、白血球数、ヘモグロビン濃度の臨床血液分析（投与前、ならびに実験の７、１４、２１、２８、３５、および４２日目）；
−血清比率：ＬＤＨ、総ビリルビン、総タンパク質、グルコース、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアラニンアミノトランスフェラーゼの生化学的分析（投与前、ならびに実験の７、１４、２１、２８、３５、および４２日目）；そして
−霊長類の血清中の薬物濃度（投与後０．５、１、３、６、２４、３０、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２６４、３３６、４０８、５０４、６２４、７２０、８１６、９１２、および１００８時間）。
【０２４６】
ＥＬＩＳＡ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼを指標酵素として用いて、血清中の薬物レベルを評価した。
【０２４７】
９６ウェルマイクロタイタープレート（「Ｃｏｓｔａｒ」、Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９０）のウェルを、２５０ｎｇ／１００μｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−НСＩバッファ溶液、рН９．０をベースとする組換えヒトＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ  Ｎ  ２１０−ＴＡ／ＣＦ）で、ウェル単位で感作させて、４℃にて１６〜１８時間インキュベートした。結合していない抗原を、ウェルから除去した。非特異的結合部位をブロックするために、１．０％ＢＳＡ、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ブロッキングバッファ（ＢＢ））を含有する２０ｍＭトリスНСＩバッファ溶液рН７．２〜７．４（ＴＢ）２００μｌを、各ウェル中に導入してから、ウェルを３７℃にて３０分間インキュベートした。ＢＢ溶液を除去して、ＢＢで１０００〜１０，０００倍希釈した１００μｌの試験血清を、各ウェル中に導入した。同時に、３．９〜２５０ｎｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度のＢＣＤ−１２１を含有する１００μｌのＢＢを、各ウェル中に導入した。プレートを、３７℃にて３０分間インキュベートした。ウェル内容物を除去して、各ウェルを、０．０５  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２００μｌのＴＢで３回洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識したヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントに対する抗体（「Ｓｉｇｍａ」、ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ０１７０、使用希釈のもの）を含有する１００μｌのＢＢを各ウェル中に導入して、ウェルを３７℃にて３０分間インキュベートした。ウェル内容物を除去して、各ウェルを、０．０５  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する２００μｌのＴＢで４回洗浄して、０．１ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンおよび０．００３％Н２О２を含有する１００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファ溶液、ｐＨ５．０を各ウェル中に導入した。反応を停止させるために、５０μｌの２Ｍ  Н２ＳＯ４を各ウェル中に導入してから、吸光度をウェル中で、プレート分光光度計を用いて４５０ｎｍにて測定した。
【０２４８】
試験サンプル中のＢＣＤ−１２１の濃度を判定するために、参照標準におけるＢＣＤ−１２１の吸光度と濃度との関係の較正曲線をプロットし、そして試験サンプルで得た吸光度の値を用いて、ＢＣＤ−１２１の濃度を判定した。
【０２４９】
信頼できるＢＣＤ−１２１検出の下限は、２ｎｇ／ｍｌであった。試験血清（Х）中のＢＣＤ−１２１の濃度（μｇ／ｍｌ）を、以下の式に従って算出した：
Х＝АхＦ
式中、Ａ−較正曲線を用いて判定した、試験サンプル中のＢＣＤ−１２１表の濃度（ｎｇ／ｍｌ）；
Ｆ−初期血清の希釈倍数；
【０２５０】
ＰＫプロファイルの結果は、ＢＣＤ−１２１の期待レベルを示した（図２７）。末端配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）半減期を、１２日を超えて算出した。サルにおいて得られたＢＣＤ−１２１のＰＫプロファイルは、天然のヒトＩｇＧ抗体のものと類似しており、典型的な用量依存特性を有していた。
【０２５１】
例２７：カニクイザルにおける１ヶ月間の反復皮下投与に続く、１ヶ月間の投与なし期間の毒性の評価
ＢＣＤ−１２１の１ヶ月間の反復皮下投与に続く、１ヶ月の回復期間の毒性アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。３つの用量レベルを実験に用いた。実験群の概略を、以下の表７に示す。
表７．
【表７】
2019518473.tif 000009
【０２５２】
研究の過程で、以下のパラメータを評価した：
−臨床検査の結果；
−動物の体重（投与前、そしてその後毎週）；
−体温（投与前、そしてその後、実験終了まで毎週）；
−心血管系に及ぼす影響、これについて、心臓の生体電気活性を、Ｐｏｌｙ−Ｓｐｅｃｔｒｕｍシステムを用いて評価した；投与前、そしてその後、実験の３、５、および７週目に評価した；
−尿検査（投与前、ならびに実験の３、５、および７週目）；
−パラメータ：赤血球数、白血球数、ヘモグロビン濃度、リンパ球数、単球、好中球、好酸球、および好塩基球の数、ならびに血小板数の臨床血液分析（投与前、その後、実験の第１週から開始して、週に１回）；
−以下に関して血液凝固系に及ぼす影響の評価：
活性化部分トロンボプラスチン時間、フィブリノーゲン濃度、およびプロトロンビン時間（投与前、その後、実験の３、５、および７週目）；
−血清比率の生化学的分析：ナトリウム、カリウム、クレアチニン、尿素、アルカリホスファターゼ、ＬＤＨ、総ビリルビン、総タンパク質、グルコース、トリグリセリド、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、総コレステロール（投与前、ならびに実験の３、５、および７週目）；
−投与期間の終わりに、群３＊のサテライト動物を、安楽死させてから病理学的に検査した；研究の終わりに、群３および対照群の動物に同じことをした；
−毒性研究の一部として、局所刺激性薬物の影響も評価し、これについて、注射部位の軟部組織を選択して、組織学的検査を実行した。
【０２５３】
例２８：ＢＣＤ−１２１抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子の免疫毒性の調査
１ヶ月間の反復皮下投与に続く、１ヶ月の回復期間の免疫毒性の調査毒性アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。３つの用量レベルを実験に用いた。実験群の概略を、以下の表８に示す。
表８．
【表８】
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【０２５４】
研究の過程で、以下のパラメータを評価した：
−リンパ球の亜集団組成。これは、投与前、そしてその後、実験の２、４、および６週目に評価した；
−免疫グロブリンのクラス比率。これは、投与前、そして実験の２、４、および６週目に評価した；
−食作用に及ぼす影響を、投与前に、そしてその後、実験の２、４、および６週目に評価した。
【０２５５】
例２９：ＢＣＤ−１２１抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子の反復皮下投与時の免疫原性の評価
１ヶ月間の反復皮下投与に続く、１ヶ月の回復期間の免疫毒性の調査毒性アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。３つの用量レベルを実験に用いた。実験群の概略を、以下の表９に示す。
表９．
【表９】
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【０２５６】
免疫原性アッセイを、抗体結合のレベルに実行し、これについて、血清を、投与前に、そしてその後、実験の３、５、および７週目に選択かつ単離する。
【０２５７】
例３０：ＢＣＤ−１２１抗ＩＬ−１７Ａ／抗ＩＬ−１７Ｆ／抗ＴＮＦα結合分子の反復皮下投与中の薬物動態アッセイ
１ヶ月間の反復皮下投与に続く、１ヶ月の回復期間の薬物動態アッセイを、ジャワのカニクイザルに実行した。３つの用量レベルを用いた。実験群の概略を、以下の表１０に示す。
表１０．
【表１０】
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【０２５８】
産物レベルを評価するために、実験の０、１、２、８、９、１５、１６、２２、２３、２９、３６、および４３日目に採血を実行した。
表１１：配列番号チャート
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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