(57)【要約】  合成ゲノムデータセットを生成し、ゲノム解析のためのバイオインフォマティックパイプラインを検証するためのシステム、方法、および装置を開示する。好ましい実施形態では、既知の多様体を有する合成母方および父方データセットを、様々なバイオインフォマティックパイプラインを検証するために、マッチさせた正常合成データセットと共に使用する。バイオインフォマティックパイプラインを、設計の変更および改善を評価するために合成データセットを使用して評価する。合成データセットの多様体コールにおけるパイプラインの正確性、ＰＰＶ、特異性、感度、再現性、および検出限界を報告する。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成デジタルゲノムデータセットを生成するコンピュータ実装方法であって、
リファレンスゲノムを取得し、前記リファレンスゲノムの少なくとも１つの常染色体およびＸ染色体に所定の頻度および分布で複数のＳＮＰを導入して、合成母方ゲノムを調製するステップと、
前記リファレンスゲノムの少なくとも１つの常染色体およびＸ染色体またはＹ染色体に所定の頻度および分布で複数のＳＮＰを導入して、合成父方ゲノムを調製するステップと、
前記母方および父方合成ゲノムを、組み合わせたデータセットに統合するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記組み合わせたデータセットをサンプリングし、それによって複数の模擬リードを生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプリングステップが、少なくとも２５倍のリードカバレッジを模擬するために実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプリングステップが、凍結組織サンプルを表すリードエラーおよび塩基品質プロファイルを使用して実行される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプリングステップが、１００〜４００塩基の長さを有する模擬リードを生成するために実行される、請求項２、３、または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記既定の頻度および分布が、ＳＮＰの天然に存在する頻度および分布を表す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リファレンスゲノムと比較して前記ＳＮＰの種類および位置を同定するリストを、前記組み合わせたデータセットに含めるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記組み合わせたデータセットからの複数の模擬リードを前記組み合わせたデータセットに含めるステップをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＳＮＶ、インデル、およびコピー数変化からなる群から選択されるさらなるゲノム変化を、前記合成母方および父方ゲノムのうちの少なくとも１つに導入し、このことによって、合成腫瘍データセットを生成するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記合成腫瘍データセットが、前記合成母方ゲノムおよび前記父方ゲノムのうちの前記少なくとも１つと比較して前記さらなるゲノム変化の種類および位置を同定するリストをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成腫瘍データセットが、前記合成腫瘍データセットの複数の模擬リードをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＮＶが、ＣＯＳＭＩＣ突然変異、体細胞ＴＣＧＡ突然変異、および前記ゲノム内のランダムな位置のうちの少なくとも１つに基づく、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
２，５００〜２５，０００のＳＮＶが前記合成腫瘍データセットに導入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インデルが１〜１０塩基の長さを有する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１００〜１０００のインデルが、前記合成腫瘍データセット内に存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コピー数変化が、（ｉ）各々が、５，０００ｂｐ〜５００，０００ｂｐからランダムに選択されたサイズを有する２５個の小さい欠失、（ｉｉ）各々が、５，０００ｂｐ〜５００，０００ｂｐのランダムに選択されたサイズを有し、２〜５のランダムに選択されたコピー数を有する２５個の小さいタンデム増幅、（ｉｉｉ）サイズが５，０００〜５００，０００ｂｐであり、コピー数が１５〜３０のランダムに選択された、１０個の小さいタンデム過剰増幅、および（ｉｖ）それぞれが染色体の３０％〜１００％のサイズを有し、テロメアに固定されている、長腕／染色体の欠失からなる群から選択される、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプリングステップが、１００〜４００塩基の長さを有する模擬リードを生成するために実行される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１８】
前記既定の頻度および分布が、天然に存在するＳＮＰの頻度および分布を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記リファレンスゲノムと比較して前記ＳＮＰの種類および位置を同定するリストを、前記組み合わせたデータセットに含めるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記組み合わせたデータセットからの複数の模擬リードを前記組み合わせたデータセットに含めるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＮＶ、インデル、およびコピー数変化からなる群から選択されるさらなるゲノム変化を前記合成母方および父方ゲノムのうちの少なくとも１つに導入し、このことによって、合成腫瘍データセットを生成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記合成腫瘍データセットが、前記合成母方ゲノムおよび前記父方ゲノムのうちの前記少なくとも１つと比較して前記さらなるゲノム変化の種類および位置を同定するリストをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記合成腫瘍データセットが、前記合成腫瘍データセットの複数の模擬リードをさらに含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＮＶが、ＣＯＳＭＩＣ突然変異、体細胞ＴＣＧＡ突然変異、および前記ゲノム内のランダムな位置のうちの少なくとも１つに基づく、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
２，５００〜２５，０００のＳＮＶが前記合成腫瘍データセットに導入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記インデルが１〜１０塩基の長さを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
１００〜１０００のインデルが、前記合成腫瘍データセット内に存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記コピー数変化が、（ｉ）各々が、５，０００ｂｐ〜５００，０００ｂｐからランダムに選択されたサイズを有する２５個の小さい欠失、（ｉｉ）各々が、５，０００ｂｐ〜５００，０００ｂｐのランダムに選択されたサイズを有し、２〜５のランダムに選択されたコピー数を有する２５個の小さいタンデム増幅、（ｉｉｉ）サイズが５，０００〜５００，０００ｂｐであり、コピー数が１５〜３０のランダムに選択された、１０個の小さいタンデム過剰増幅、および（ｉｖ）それぞれが染色体の３０％〜１００％のサイズを有し、テロメアに固定されている、長腕／染色体の欠失からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の前記合成ゲノムデータセットを前記アルゴリズムへの入力として使用するステップ、および前記アルゴリズムの出力において前記合成ゲノムデータセットからの偏差を列挙する性能レポートを作成するステップを含む、ゲノム解析に関連するアルゴリズムを試験または検証する方法。
【請求項３０】
前記アルゴリズムが、複数のリードファイルをグループ化するアルゴリズムである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルゴリズムが、複数のリードファイルまたはリードファイルのグループにアノテーションを付けるアルゴリズムである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルゴリズムが、シーケンシング装置と下流の装置との間で複数のリードファイルを転送するアルゴリズムである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記アルゴリズムが、複数のリードファイルをアセンブルしてインデックス作成を行うアルゴリズムである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記アルゴリズムが、多様体コールアルゴリズムである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
互いに情報的に連結されている複数のコンピューティング装置の動作を検証する方法であって、前記装置の第１の装置への入力として、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の前記合成ゲノムデータセットを使用するステップと、前記装置の第２の装置への入力として、前記装置の前記第１の装置の出力を使用するステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３５７，２８２号の優先権を主張する。米国特許出願第６２／３５７，２８２号は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、特に全ゲノムデータのコンピュータ解析に関する、遺伝子多様性を検出するための検証システムおよび方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、もしくは現在請求されている発明と関連していること、または具体的もしくは暗示的に参照されているあらゆる出版物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００４】
本明細書中の全ての刊行物は、個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献において用語の定義または使用が、本明細書において提供されるその用語の定義と矛盾しているか、または定義に反する場合、本明細書において提供されるその用語の定義を適用し、参考文献内のその用語の定義は適用しないものとする。
【０００５】
全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）および次世代シーケンシングプラットフォームの出現により、現在、大量のデータを解析に利用できるようになっている。臨床的観点からは、データが豊富であることが確かに望ましいが、その一方で、様々な問題が生じている。例えば、ほとんどの臨床全ゲノム解析では、シーケンシング機器から得られる遺伝情報の大部分は、サイズ約１００〜４００塩基の断片に存在するが、腫瘍組織を３０〜１００倍オーバーサンプリングし、マッチさせた正常組織を少なくとも１０〜３０倍オーバーサンプリングすることは珍しいことではない。そのため、ゲノムを正確に再度アセンブリングし、かつゲノムの変化を同定するためには、かなりの計算能力が必要とされる。
【０００６】
たとえば、最近の論文（ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１４，１５：２４４）は、入力としてＢＡＭファイルを使用して、ＭｕＴｅｃｔ、単純なサブトラクションを伴うＧＡＴＫ  ＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒ、ＳｏｍａｔｉｃＳｎｉｐｅｒ、Ｓｔｒｅｌｋａ、ＶａｒＳｃａｎ２を含む様々な体細胞変異コーラーを比較した。本明細書では、ＮＩＳＴ−ＧＩＡＢ（ＮＩＳＴ主導の「Ｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  ａ  Ｂｏｔｔｌｅ」コンソーシアムによるリファレンス個体ＮＡ１２８７８の多様体セット）を評価のための標準として使用した。当然のことながら、いくつかのアルゴリズムの感度は、同じ標準を使用している他のアルゴリズムの感度よりも高かった。しかし、こうした解析は、いくつかの指針を提供する一方で、サンプルにおける変動、または固定された入力セットが提供されるときの検出限界の同定を考慮に入れることはできない。さらに、各アルゴリズムは、解析コンピューティングプラットフォームの有効性に影響を与え得る根本的な仮定を使用して設計されている。
【０００７】
ごく最近、逐次同期位置誘導アラインメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を使用して、腫瘍とマッチさせた正常との間の変化を検出できるＢＡＭＢＡＭが開発された（米国特許出願公開第２０１２／００５９６７０号および米国特許出願公開第２０１２／００６６００１号を参照されたい）。有利には、こうしたシステムおよび方法によって、対立遺伝子特異的変化の検出が可能になり、かつ小規模（例えば、ＳＮＰ）から大規模（例えば、染色体内および染色体間での再配列）事象の検出および特徴付けが可能となる。なおさらに、ＢＡＭＢＡＭにおける統計的塩基コーリングアプローチによって、対立遺伝子多様体、ならびにハイスループットシーケンシングにおいては珍しいことではないアーティファクトおよび低品質のリードに適応できるようになる。少なくとも理論上での統計的アプローチは、配列解析アルゴリズムにおいて最適化することができるが、様々なコンピュータ実装アルゴリズムまたは新規アルゴリズムを活用する既存の解析コンピューティングデバイスの変化を評価するため、または解析コンピューティングデバイスを検証するための公知のシステムおよび方法はない。
【０００８】
したがって、特に解析がゲノム解析である場合、特定の遺伝子解析ツールの性能を評価または検証するためのシステムおよび方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の主題は、ゲノム解析アルゴリズムにおける変異コールの品質および正確性を確保するために、ゲノム解析コンピューティング装置およびゲノム解析アルゴリズムのその実行を検証または較正するための様々なシステムおよび方法を対象とする。最も好ましくは、企図されるシステムおよび方法では、腫瘍組織ゲノムを模擬する規定の変異を有する第１の複数の仮想ゲノムおよびマッチさせた正常組織ゲノムを模擬する第２の複数の仮想ゲノムを使用する。デジタル仮想ゲノムは、多数のフォーマットで調製できることに留意すべきであり、特に好ましいフォーマットとしては、ゲノム全体（または１つ以上の染色体もしくはその一部分）を表すＢＡＭファイル、および仮想ゲノムから生成された模擬リードを表すファイルが挙げられる。
【００１０】
特に好ましい態様では、仮想ゲノムの調製は、既知のヒトリファレンスゲノム（例えば、ＵＳＣＳブラウザからのヒトリファレンスゲノムｒｇ１９）から始まり、次いでこれを、その各々のサイズおよび位置が異なり得るＳＮＰ多様性、ならびに挿入、欠失、およびコピー数多様性を使用して改変させる。次に、そのようにして生成された合成データセットまたは模擬データセットを使用して、ゲノム解析アルゴリズムの性能を評価する、および／または機能を検証する。
【００１１】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、好ましい実施形態の以下の詳細な説明によりさらに明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の主題は、コンピュータ実装ゲノム解析アルゴリズムの変化を評価するため、および患者ゲノムの変化を正確にコールする際のアルゴリズムの実行に関するゲノム解析コンピューティング装置の性能を試験／検証するために使用できる合成デジタル患者データセットの構築および使用を対象とする。最も好ましくは、企図されるシステムおよび方法は、男性および女性患者の複数の合成患者ゲノムを使用し、合成患者ゲノムの各々は、単一のリファレンスゲノムに基づくものであり、かつ合成患者ゲノムの各々は、腫瘍組織サンプルのデータセットを模擬するように既知の異なるゲノム改変（例えば、ＳＮＰ、インデル、コピー数の変化）を有する。さらに、腫瘍組織の各模擬データセットは、マッチさせた正常（疾患のない）組織サンプルのデータセットを模擬するために、対応するマッチさせた正常な合成患者ゲノムを有することを認識すべきである。いくつかの実施形態では、挿入された多様体（例えば、ＳＮＰ、ＳＮＶ、インデルなど）を含まないリファレンスゲノムを、マッチさせた正常な合成ゲノムとして使用する。しかし、ゲノム解析（ＢＡＭ  ＢＡＭなど）を可能にするために必要に応じて、他の合成患者ゲノム（例えば、追加の多様体との父方／母方の組み合わせ、データベースからのリファレンスゲノム、ｈｇ１９など）をマッチさせた正常セットとして使用できることも企図される。
【００１３】
なおさらに企図される態様では、ゲノム解析アルゴリズムの性能および検証を、１つより多く、かつ最も典型的には少なくとも１０の異なる腫瘍およびマッチさせた正常な合成患者ゲノムを用いて試験する。さらに、男性および女性患者の複数の合成患者ゲノムが様々なフォーマットで存在してもよいことが企図され、特に好ましいフォーマットとしては、ＢＡＭ、ＶＣＦ、ＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＱ、ＧＡＲ、およびＲＡＷフォーマットを挙げることができる。
【００１４】
概しておよび上記のように、本発明者らは、検出限界（「ＬｏＤ」）およびゲノム解析アルゴリズムによって検出された様々なクラスの多様体の再現性、ならびに場合によっては、検出の正確性、感度、および特異度の両方を実証するための較正ツールとして使用することができる合成データセットを構築した。典型的には、ゲノム解析アルゴリズムでは、腫瘍サンプル（全ゲノム配列）を５０倍のカバレッジ深度で、およびマッチさせた正常サンプル（全ゲノム配列）を２５倍のカバレッジ深度で入力する。当然のことながら、腫瘍およびマッチさせた正常についての代替のシーケンシング深度もまた好適であると考えられ、これには、１〜１０倍、１０〜２０倍、２０〜５０倍、５０〜１００倍、１００〜２００倍、さらにそれ以上が挙げられると認識すべきである。最も典型的には、データセットは、男性および女性患者を模擬し、マッチさせた正常データも含むものとする。
【００１５】
多様体コールの正確性を最大にするために、全ての入力データを統計モデルにおいて同時に使用して、多様体をコールする。最も典型的には、および試験する特定のアルゴリズムに応じて、報告される多様体は、以下を含む：（ａ）腫瘍サンプルに特異的であり、かつ典型的には腫瘍中に生じたものと考えられる体細胞一塩基多様体（ＳＮＶ）、（ｂ）腫瘍ＤＮＡおよび正常ＤＮＡの両方中に存在する生殖系列ＳＮＶ、（ｃ）小さいサイズ、典型的には１ダース未満の塩基の挿入および／または欠失を表す体細胞インデル、（ｄ）小さいサイズ、典型的には１ダース未満の塩基の挿入または欠失を表す生殖系列インデル、および（ｅ）体細胞コピー数増幅。腫瘍サンプルに特異的な多様体は、腫瘍中に生じたと考えられ、生殖系列に影響を与える可能性が低いことから、これらを体細胞性と呼ぶことを認識すべきである。さらに、生殖系列ＳＮＶは、腫瘍ＤＮＡおよび正常ＤＮＡの両方に存在すると予想される。
【００１６】
次に、ゲノム解析アルゴリズムの出力を、アルゴリズムにあらゆる変更を行って合成患者データにおいて評価し、これらの結果を要約したレポートを作成する。このレポートは、細胞純度が２５％である現在の臨床アッセイの検出限界で、好ましくは複数（例えば、１０、または２０、または３０またはそれ以上）の合成患者データのパネルを用いて、上記多様体についての検出の正確性および検出レベルを与える。当然のことながら、細胞純度はまた、より高くてもよく（例えば、３０〜４０％、または４０〜５０％、またはさらにより高い）、またはより低くてもよい（例えば、５〜１５％、または１５〜２５％）。また、アルゴリズムの再現性を評価するために、合成患者データのうちの少なくとも１つを、１００％の腫瘍純度で、繰り返し（例えば、少なくとも１０回、または少なくとも１５回、または少なくとも２０回）試行することができ、また、追加として、実質的に低い純度（例えば、５％、１０％、１５％、２５％、および５０％）で試行して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成された合成患者データについての検出下限を確立することができる。
【００１７】
合成患者データセットに関しては、複数の患者を模擬するために複数のデータセットを調製することが企図される。最も典型的には、企図されるシステムおよび方法は、少なくとも５名の異なる患者、または少なくとも１０名の異なる患者、または少なくとも２０名の異なる患者に対応するデータセットを含む。さらに、各模擬患者データセットは、体細胞（腫瘍）データセットおよびマッチさせた正常（生殖系列）データセットを含むことを認識すべきである。しかし、あまり好ましい態様ではないが、マッチさせた正常データセットは、複数の患者の単一の合成データセットであってもよく、または公知のリファレンスゲノムのデータセットでさえあってもよい。しかし、好ましい態様では、マッチさせた正常データセットは、合成の「マッチさせた正常」ゲノム配列、合成の「マッチさせた正常」ゲノム配列の基礎を形成しているリファレンスゲノム配列（例えば、ＵＣＳＣブラウザからのｈｇ１９）に対する改変、および合成ゲノム配列の模擬ＦＡＳＴＱリードを含んでもよい。同様に、腫瘍データセットは、合成「腫瘍ゲノム」配列、合成「腫瘍ゲノム」配列の基礎を形成している合成「マッチさせた正常」ゲノム配列に対する改変、および合成「腫瘍ゲノム」配列の模擬ＦＡＳＴＱリードを含み得る。ゲノム配列の改変がランダムである場合、乱数ジェネレータを、その合成ゲノム配列についての既知のシードから開始する。こうしたデータセットを使用することで、ゲノム解析アルゴリズム（合成「腫瘍ゲノム」配列および「マッチさせた正常」配列を使用する）による多様体コールの正確性、感度、特異性、および再現性の試験および検証が可能となるのみならず、（合成ゲノム配列の模擬ＦＡＳＴＱリードを使用する）模擬リードのグループ化、転送、アノテーション、およびインデックス作成に関係するを伴う全てのコンピューティングコンポーネントの試験および検証も可能となることを認識すべきである。開示のシステムは、ゲノム解析システム全体を検証または最適化することができる決定論的根拠を提供することを認識すべきである。
【００１８】
さらに、ゲノム解析アルゴリズムが一旦それぞれの出力ファイルを生成すると、それぞれの出力ファイルを入力パラメータとして用いて、下流のコンポーネントの性能を検証または評価することができる。例えば、企図される下流のコンポーネントとしては、国際公開第２０１１／１３９３４５号および国際公開第２０１３／０６２５０５号に記載されているＰＡＲＡＤＩＧＭなどのドラッガブル標的を同定するための経路解析エンジン、または米国特許第９２６２７１９号に開示されている、患者が適格であり得る臨床試験を同定する医学的推論エンジンが挙げられる。したがって、企図されるシステムおよび方法は、シーケンシング機器レベルでの配列リードの生成から転送、アノテーション、インデックス作成、および多様体コール、ならびに最終的にはゲノム解析アルゴリズムによって提供される出力データを使用する臨床解析エンジンに至るまでのゲノム解析エコシステム全体の試験および検証に使用できることを認識すべきである。
【００１９】
合成ＤＮＡデータセットの構築
【００２０】
例えば、模擬患者の合成のマッチさせた正常配列は、既知のリファレンスゲノムから導出してもよく、全てのリファレンスゲノムが本明細書での使用に適していると考えられることを認識すべきである。しかし、特に好ましいリファレンス遺伝子はヒトリファレンスゲノムであり、これに、人種、民族、家族のバックグラウンド、地理的位置、疾患の素因または疾患の診断などの特定の要因を用いてさらにバイアスを与えてもよく、またはバイアスを与えなくてもよい。例えば、ＵＣＳＣのヒトｈｇ１９またはｈｇ３８、またはゲノムリファレンスコンソーシアムのＧＲＣｈ３８をリファレンス配列として使用してもよい。最も典型的には、ＳＮＰ多様体を、最初にランダムに生成して保存した後、これを使用してリファレンスゲノムを改変して母方のリファレンスおよび父方のリファレンス（すなわち二倍体ゲノム）を作製する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、合成データセットの性質を、おそらく１つ以上の別々のデジタルファイルに格納されているメタデータを使用して説明する。メタデータは、他者が検証プロセスを再現できるようにする様々な値およびデータ構造を含む。メタデータの例としては、以下のうちの１つ以上を挙げることができる：合成データの生成に使用されるランダムシード、乱数のソースまたはジェネレータの名称およびバージョン番号、検証対象のアルゴリズムの名称およびバージョン番号、変異のソースまたはジェネレータの名称およびバージョン番号、生成された全ての変異（ＳＮＰ、インデルなど）およびその位置のリスト、ベースラインゲノムの名称およびバージョン番号、またはその他の因子。乱数ジェネレータのために使用されるシード（複数可）を含むメタデータを提供することによって、決定論的な乱数発生を介して、第三者が検証結果を正確に再現できることを認識すべきである。こうしたアプローチは、検証結果がシステムの認証、公開、またはゲノム解析コンピューティングプラットフォームの最適化のために利用されるときに特に有利であると考えられる。
【００２２】
ＳＮＰサンプリングに関して、全ゲノムシーケンシングからの腫瘍−正常遺伝子型解析により、典型的には約１ｘｅ６のホモ接合の非リファレンス部位および約７ｘｅ５ヘテロ接合の非リファレンス部位がもたらされることが企図される。このように観察された変動をおおよそマッチさせるために、本発明者らは、ｄｂＳＮＰデータベースから、観察された集団頻度を有する部位のサブセットをランダムに選択した。まず、ヘテロ接合部位をサンプリングする見込みを増加させるために、８０％を超える多数の対立遺伝子頻度を有する部位をフィルタにより除外する。次いで、各々のｄｂＳＮＰ部位を、繰り返し検討する。見込みが４０％である場合は、その部位を無視する。見込みが９％である場合、その部位を、集団対立遺伝子頻度からホモ接合型としてサンプリングする。見込みが５１％である場合、２つの異なる対立遺伝子を集団頻度から復元サンプリングする。この混合物は、約１ｘｅ６の非リファレンスホモ接合部位および７ｘｅ５のヘテロ接合非リファレンス部位をもたらす。ヘテロ接合部位は、母方または父方の半数体ゲノムにランダムに割り当てられる。
【００２３】
前のステップで作製したｄｂＳＮＰ多様体を使用して、母方ゲノムを、上記で生成したｄｂＳＮＰ多様体を用いて１〜２２番の染色体および染色体Ｘを改変すること、およびＦＡＳＴＡ配列を出力することによって作製する。父方ゲノムは、１〜２２番の染色体を改変し、次いでＸ染色体またはＹ染色体のうちの１つを正常シードに基づいて５０％の確率で改変することによって作製する。次に、これら２つのＦＡＳＴＡファイルを、名称に接尾辞＼＿ｍを有する母方の染色体と、接尾辞＼＿ｆを有する父方の染色体を有する単一のＦＡＳＴＡ配列に結合する。
【００２４】
合成のマッチさせた正常ゲノムを生成する模擬リードファイルを生成するために、ＦＡＳＴＱデータセット（例えば、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍超であり、好ましくは２５倍である）を、サンプル（凍結サンプル、ＦＦＰＥ、レーザー顕微解剖など）のシーケンシングラボからのシーケンシングデータから生成されたリードエラーおよび塩基品質プロファイルを使用して、ＳｉｍＳｅｑによって適切な深度で、模擬リードをサンプリングすることによって（例えば５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、またはそれ以上であり、好ましくは１５０ｂｐ）作製する。カバレッジレベル（好ましくは、２５ｘ）は、ラボによって生成される最低許容カバレッジに達するように模擬される。重複リードの割合（百分率）は１０％であり、このことは、重複リードの合計カバレッジが、約２７．８ｘであることを意味する。
【００２５】
模擬合成腫瘍ゲノム配列は、対応する模擬患者の合成のマッチさせた正常ゲノムの改変から生成することができる。最も典型的には、改変は、ＳＮＶ、インデル、およびコピー数多様性、ならびに他の公知の腫瘍関連遺伝子変化を含む。当然のことながら、これらの変化のいくつかまたは全ては、癌において生じる既知の多様性に基づいてもよく、または完全にランダムに生成され得ることを認識すべきである。
【００２６】
例えば、体細胞ＳＮＶは、以下のようにしてもたらされ得る：母方および父方の半数体ゲノムについて、一塩基の変化をゲノム全体においてランダムな位置に生成する。各半数体ゲノムについて、ＳＮＶを以下の３つのソースから得ることができる：１）ＣＯＳＭＩＣ変異、２）体細胞ＴＣＧＡ変異、および３）ゲノムにおけるランダムな位置。１つの例示的なアプローチでは、約５００の変異をＣＯＳＭＩＣから選択し、２０００をＴＣＧＡから選択し、前の変異の３００ｂｐ以内に存在する場合は選択を拒絶し、再試行する。最後に、２５００〜２５０００の乱数、およびゲノム内のその数のランダム部位を変異させる。遺伝子のコード領域における典型的な数のＳＮＶを模擬するように、ならびにイントロン領域および遺伝子間領域における変異を評価できるように、これらの相対的サイズを選択した。部位の選択は、母方ゲノムと父方ゲノムとの間で独立して実施し、これは、２つの半数体ゲノムの変異をみ合わせるとき、任意の最大２つの変異が互いの３００ｂｐ以内であり得ることを意味する。しかし、多数の代替方法を使用してもよく、また、単一のもしくは複数の患者からの実際の腫瘍配列情報をゲノムに移植することによって、またはＳＮＶをランダムに生成することによって導出してもよい。
【００２７】
体細胞インデルの生成については、母方ゲノムおよび父方ゲノムの両方において、一様に１〜１０ｂｐのランダムな長さの２５０の小さい欠失を作製することが企図される。同様に、母方および父方のゲノムの両方において、一様に１〜１０ｂｐのランダムな長さの２５０の小さい挿入を作製する。最も典型的には、これらのインデルのための部位は、エキソン領域内で、いかなる既存のＳＮＶまたはインデル多様体からも３００ｂｐ離れるように選択される。この結果、典型的なサンプルにおける場合よりもはるかに多いエキソンのインデルがもたらされ得るが、これにより、ゲノム解析アルゴリズムのインデルコーラーの性能の評価が良好になり得ることが企図される。当然のことながら、小さいインデルのサイズおよび数は変化してもよく、好適なインデル数は２０〜５０、５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、５００〜１，０００、さらにそれ以上であり得ることを認識すべきである。同様に、長さは、１〜１０、１０〜２０、２０〜５０、５０〜１００、さらにはそれ以上であってもよい。
【００２８】
同様に、体細胞コピー数の生成は、以下のようにしてもたらされ得る。父方および母方の半数体ゲノムの各々について、重複しないコピー数改変を生成することができる。事象は、典型的には、各半数体ゲノムに対して別々に生成される。以下の事象を染色体中でランダムに選択する：（ｉ）各々が、ランダムに選択された５，０００ｂｐ〜５００，０００ｂｐまでのサイズを有する２５個の小さい欠失、（ｉｉ）各々が、ランダムに選択された５，０００ｂｐ〜５００，０００ｂｐのサイズを有する２５個の小さいタンデム増幅。これらの増幅は、ランダムに選択された２〜５のコピー数を有する、（ｉｉｉ）サイズが５，０００〜５００，０００ｂｐであり、コピー数が１５〜３０でランダムに選択される、１０個の小さいタンデム過剰増幅、（ｉｖ）それぞれが染色体の３０％〜１００％のサイズを有し、テロメアに固定されている、長腕／染色体の欠失。「腕」欠失の数は、平均１のポアソン分布から導出される、（ｖ）それぞれが染色体の３０％〜１００％のサイズを有し、テロメアに固定されている、長腕／染色体タンデム増幅。「腕」欠失事象の数は、平均３のポアソン分布から導出される。タンデム複製の数は、２に平均１．０のポアソン分布から導出された値を加えたものである。最終的な腫瘍リファレンスゲノムは、小さい多型によって改変された腫瘍半数体ゲノムにコピー数変化を適用することによって生成される。前述のように、上記のパラメータは、単に例示的な指針を示すために提供されており、実際の数は、生成される腫瘍モデルの特定の種類に応じて変化し得る。
【００２９】
ＳｉｍＳｅｑを用いてデータセット（例えば、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７０倍、１００倍であり、好ましくは５０倍である）をサンプリングすることにより、模擬腫瘍ＤＮＡリードデータを、好ましくはＦＡＳＴＱフォーマットで生成し、リードのＸ％は、最終腫瘍リファレンス二倍体ゲノムに由来し、リードの（１００−Ｘ）％は、生殖系列二倍体ゲノムに由来し、Ｘは分子腫瘍の割合（百分率）である。このＸは、所望の細胞純度（例えば、１０％、２０％、２５％、３５％、４０％、５０％、および１００％の細胞純度）に基づいて選択されており、この細胞純度は、腫瘍ゲノムの倍数性の差により、病理学的スライドから推定される細胞純度とは異なる。これは、腫瘍ゲノムは、２の倍数性を有する正常なヒト細胞とは異なる量のＤＮＡを混合物に与えるためである。この分子純度（Ｘ）は、所望の細胞純度（ｃ）および腫瘍倍数性（ｐ）から、関係式：Ｘ＝ｐ＊ｃ／（ｐ＊ｃ＋２＊（１−ｃ））により、導出される。
【００３０】
ゲノムおよびリード生成プロセスの間、使用した全ての多様体を、さらなる解析に至適基準として使用するために保存する。広範な種類のゲノムについて、検出限界での性能を十分に評価するために、２０名の異なる合成患者を、例えば３０％の細胞純度で上記のように生成することが好ましいが、細胞密度は１０％〜９０％、２０％〜８０％、３０％〜７０％、または４０％〜６０％であってもよい。各患者のランダムシードを記録して、これらのシードを使用して、２５倍カバレッジ（または５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、もしくは２５０倍以上）の正常ゲノムおよび５０倍カバレッジ（または１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、もしくは２５０倍以上）の腫瘍ゲノムを生成する。全ての小さい改変および全てのコピー数改変を、多様体コーラーを評価するための至適基準として記録する。いくつかの多様体は、ランダムな見込みのためにゲノムのマッピング不能な領域に入り、これらの多様体を解析から除外することに留意されたい。さらに、１つのサンプルを検出限界試験のために使用し、５％、１５％、２５％、３０％、５０％、および１００％の細胞純度でサンプリングする。最後に、バイオインフォマティクスパイプラインの再現性を評価するために、１００％ＬｏＤサンプルを１０回パイプラインに通す。ＲＮＡデータセットの構築は、本質的には、上記ＤＮＡについて記載した同じプロトコールに準拠する。
実施例１−合成ＷＧＳバイオインフォマティクスの検証
【００３１】
本発明の主題の方法を使用して、患者のゲノム中の多様体を正確にコールする際のアルゴリズムの実行に関するゲノム解析コンピューティング装置（バイオインフォマティクスパイプライン）の性能を試験／検証した。合成ゲノムデータセットは、例えば本明細書に記載の方法によって構築した。有利には、こうしたデータセットは、パイプラインのＣＬＩＡ検証を裏付けるために使用できることが企図される。パイプラインへの入力には、（１）２５倍カバレッジ深度での正常サンプル全ゲノムシーケンシング、および（２）５０倍カバレッジ深度での腫瘍サンプル全ゲノムシーケンシングを含んだ。評価した多様体は、生殖系列および体細胞の両方のＳＮＶおよびインデル、ならびに体細胞コピー数増幅を含む。
【００３２】
体細胞ＳＮＶの評価
【００３３】
正確性、感度および特異性：体細胞一塩基多様体の正確性を、３０％の細胞腫瘍純度を有する２０名の合成患者を用いてヌクレオチドレベルで評価する。体細胞多様体は、ゲノム全体においてランダムに、おそらく決定論的に選択されることから、これらのランダムな位置の多くは、マッピングが不能である領域か、またはマッピングが不良な領域となる。各患者について、ＲｅｆＳｅｑエキソン内、好ましくはコード領域内の各塩基を、以下の３つのカテゴリーのうちの１つとして分類する：
【００３４】
（ｉ）マッピング可能な多様体：合成患者はその位置で体細胞多様体を有する。さらに、１００％純粋な腫瘍サンプルでは、対立遺伝子頻度は４５％を超え、かつその部位における全リード数は１０を超える。好ましくは、腫瘍サンプル中の少なくとも２０個のリードは、１０を超えるマッピング品質を有し、正常サンプル中の少なくとも１０個のリードは、５を超えるマッピング品質を有する。（ｉｉ）マッピング不能多様体：合成患者は、多様体を有するが、マッピング可能な多様体の基準を満たしていない。（ｉｉｉ）リファレンス部位：患者の合成ゲノムはこの部位でリファレンスである。
【００３５】
正確性を、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）として定義する。陽性的中率（ＰＰＶ）を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）として定義する。感度を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として定義する。特異性を、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義する。次に、下記の表１に示すように評価を実施する。
【表１】
2019525308.tif 000002
【００３６】
好ましい態様において、承認基準を、典型的には次のとおり定義する：全てのデータセットが、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、９９％以上の特異性、および９９％超の正確性を示さなければならない。非承認基準は、９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、９９％未満の特異性、または９９％未満の正確性を示す任意のデータセットである。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００３７】
再現性に関して、１００％の腫瘍純度を有する単一の合成患者サンプルを、再現性に関して１０回試行することが企図される。この比較では、初回試行を各再現性試験の至適基準として使用する。ここでは、承認基準を、典型的には次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならず、非承認基準は、典型的には、次のとおり定義する：実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意のその後の試行。以前と同様に、サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００３８】
検出限界：体細胞一塩基多様体の検出限界は、再現性サンプルを用いて評価する。腫瘍ＷＧＳの模擬リードには、「正常浸潤物」を含む。腫瘍リードの割合（百分率）を、典型的には、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、および５０％のレベルで試行する。検出限界は、そのビンおよび高い対立遺伝子頻度の全てのビンが、７５％以上のＰＰＶ、９９％以上の特異性、および９５％以上の感度を有するように最も低いビンである。
【００３９】
生殖系列ＳＮＶ検出の評価
【００４０】
正確性、感度および特異性に関して、ｈｇ１９リファレンスゲノムの各塩基を、以下の表２に従って評価することが企図される。生殖系列多様体は、ゲノム生成プロセスの間に正常ゲノムに関して選択される遺伝子型（ヘテロ接合性を含む）であると定義する。生殖系列多様体は、前述のように、マッピング可能な多様体、マッピング不能な多様体、またはリファレンス部位として分類される。いくつかの実施形態では、体細胞ＳＮＶ検出試験のために生成された比較的少数（例えば、１０、または２０、または３０）の合成患者をこの試験に使用する。
【表２】
2019525308.tif 000003
【００４１】
陽性的中率（ＰＰＶ）を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）として定義する。正確性を、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）として定義する。感度を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として定義する。特異性を、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義する。好ましい態様において、承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、または９９％未満の特異性を示す任意のデータセット。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００４２】
再現性に関して、１００％の腫瘍純度を有する単一の合成患者サンプルを、再現性に関して１０回試行することが企図される。承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならな。非承認基準は、次のとおり定義する：実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意の試行。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００４３】
検出限界：生殖系列多様体は、腫瘍純度による影響を受けないことから、検出限界を評価しなかった。
【００４４】
体細胞インデルの評価
【００４５】
計測値および予測評価に関して、予測の評価は、インデルが報告される可能性のある各々の位置に関する塩基レベルであり、陽性または陰性として分類されることを認識すべきである。ＳＮＶ評価と同様に、基準のセットは、前述のように、（ｉ）マッピング可能な多様体、（ｉｉ）マッピング可能な多様体、および（ｉｉｉ）リファレンス部位、の分類を用いて、マッピング可能なコード領域内にあるものによって限定される。評価対象のインデルは、５、１０、１５、２０、２５、５０、または７５ｂｐなどの様々な長さのインデルでありうると企図される。好ましい実施形態では、１５ｂｐ以下の長さのインデルのみを評価し、それより大きい長さのインデルはフィルタにより除外する。
【００４６】
正確性を、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）として定義する。陽性的中率（ＰＰＶ）を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）として定義する。感度を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として定義する。特異性を、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義する。計算は、以下の表３に示すとおりである。模擬されたインデルの数は、臨床サンプルに見られる数とうまく一致するが、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子に典型的に見られる事象の数は非常に少ない。そのような計測値は、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子領域からの結果をプールすることによって評価する。
【表３】
2019525308.tif 000004
【００４７】
正確性は、変動性サンプル全体において評価する。承認基準は、次のとおり定義する：プールされた結果は、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、または９９％未満の特異性を示す任意のデータセット。
【００４８】
再現性：１００％の腫瘍純度を有する単一の合成患者サンプル（例えば、正確性試験において使用される）を、再現性に関して１０回試行する。承認基準は、全てのデータセットが最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならない。非承認基準は、実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意のパイプライン試行である。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００４９】
検出限界：インデルの検出限界は、再現性サンプルを用いて評価する。腫瘍ＷＧＳの模擬リードには、「正常浸潤物」を含む。腫瘍リードの割合（百分率）を、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、および５０％のレベルで試行する。検出限界は、そのビンおよび高い対立遺伝子頻度の全てのビンが、７５％以上のＰＰＶ、９９％以上の特異性、および９５％以上の感度を有するように最も低いビンである。
【００５０】
生殖系列インデルの評価
【００５１】
好適な測定基準および予測評価に関して、予測の評価は、インデルが報告される可能性のある各々の位置に関する塩基レベルであり、陽性または陰性として分類されることが企図される。ＳＮＶ評価と同様に、基準のセットは、下記の分類を用いて、マッピング可能なコード領域にあるものによって限定される：（ｉ）マッピング可能な多様体：合成患者はその位置に体細胞多様体を有する。さらに、１００％純粋な腫瘍サンプルにおいて、対立遺伝子頻度は４５％を超え、かつその部位における全体的なリード数は２０を超える。（ｉｉ）マッピング不能多様体：合成患者は、多様体を有するが、マッピング可能な多様体の基準を満たしていない。（ｉｉｉ）リファレンス部位：患者の合成ゲノムはこの部位でリファレンスである。計算は、以下の表４に示すとおり行う。
【表４】
2019525308.tif 000005
【００５２】
正確性を、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）として定義する。陽性的中率（ＰＰＶ）を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）として定義する。感度を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として定義する。特異性を、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義する。体細胞インデルと同様に、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子で典型的に見られる事象の数は非常に少なく、測定基準は、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子領域からの結果をプールすることによって評価する。
【００５３】
正確性を、変動性サンプル全体において評価する。承認基準は、次のとおり定義する：プールされた結果は、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、または９９％未満の特異性を示す任意のデータセット。
【００５４】
再現性：１００％の腫瘍純度を有する単一の合成患者サンプル（正確性試験において使用される）を、再現性に関して１０回試行する。承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意のパイプライン試行。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００５５】
検出限界：生殖系列多様体は、純度の影響を受けないことから、検出限界の評価は行わない。
【００５６】
体細胞増幅の評価
【００５７】
いくつかの実施形態では、ゲノムのマッピング可能領域を、模擬正常ゲノム配列のうちの１つからのシーケンシングデータを使用して収集する。少なくとも１つのリードが、０を超えるマッピング品質で領域内にマッピングする場合、領域は「マッピング可能」であると定義され得る。しかし、「マッピング可能」は、（ｉ）２、５、１０、１５、２０、または５０のリードが、０を超えるマッピング品質で領域内にマッピングすること、（ｉｉ）１つのリードが、０、１、５、１０、１５、２０、または５０を超えるマッピング品質で領域内にマッピングすること、または（ｉｉ）いくつかの他の最小リード数が、最低マッピング品質を満たしていること、が必要とされ得ることが企図される。いくつかの実施形態では、２、４、１０、１５、または２０名の模擬患者を使用できるが、５名の模擬患者からの模擬正常ゲノム配列についてのマッピング可能なゲノム領域の和集合を生成することができる。一般に、このマッピング可能な和集合において表されていないゲノムの領域は、マッピング不能であると見なされ、報告されていない。
【００５８】
リファレンスゲノム中の各塩基を、以下の表５に従って評価する：
【表５】
2019525308.tif 000006
【００５９】
承認基準は、次のとおり定義する：純度３０％以上を有する全てのデータセットが、９５％以上の感度、および９５％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：純度２５％以上を有するデータセットは、９５％未満の感度または特異性を示す。サンプルが基準を満たさない場合には、全てを繰り返す必要がある。
【００６０】
検出限界：ＳＮＶ解析と同様に、検出限界（「ＬｏＤ」）サンプルの６つの異なる純度を用いて、コピー数増幅の検出限界を評価する。検出限界は、その腫瘍純度および全ての高い腫瘍純度が、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を有する最低値の腫瘍純度である。承認基準は、次のとおり定義する：検出限界は、２５％以下の腫瘍純度でなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：検出限界は、２５％を超える腫瘍純度である。
【００６１】
再現性：１００％の腫瘍純度を有する単一の合成患者サンプル（ＳＮＶ試験において使用される）を、再現性に関して１０回試行する。承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意のパイプライン試行。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【００６２】
以下の考察は、開示された本発明の主題に関連するさらなる検討事項を表す。開示された技術は、１つ以上の経験的に導出されるゲノム多様体確率分布を構築するために、既存の実世界のデータを活用するモンテカルロシステムと見なすことができることを認識すべきである。このシステムは、これらの多様体確率分布を利用して、腫瘍ＷＧＳならびにマッチさせた正常ＷＧＳを含む、１名以上の患者の合成ＷＧＳを生成するために構成可能である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、生成された合成データは、ゲノム解析コンピューティングエコシステムを最適化する手段への詳細な分析を提供する。合成データは、明確に定義された、おそらく決定論的な構造を有し、これらは、解析エコシステム内の各コンピューティング要素の性能を要素の役割または責任に関して解析するために使用できる。例えば、一旦合成データが生成されると、そのデータは標準的なワークフローを通過することができる。ワークフローの各段階での性能または正確性を、合成により生成された、特定の種類の多様体について測定することができる。このアプローチにより、研究者は、実際のデータに存在する予想される多様体の種類に関して、ワークフローの各ステップを特にアルゴリズムレベルで最適化させ得る方法についての洞察が得られる。
【００６４】
本発明の方法がゲノム解析装置およびバイオインフォマティックパイプラインの開発を著しく改善することを認識すべきである。実際に、本発明の方法は、直接的な技術的効果を有する。例えば、本発明の主題に記載されている合成デジタルゲノムデータセットを生成することにより、既知の変異を含む既知のデータセットに対してゲノム解析装置を確実に検証することが可能になる。本発明の主題の合成データセットがなければ、解析装置は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにおいて、バイオインフォマティックパイプラインを完全に検証することができない。逆に、こうした装置は、サンプルから導出した配列データの入力を必要とし、配列データの正確性または精度は制御されない。実際に、本発明の主題では、ゲノムおよびエキソームシーケンシングに対してデータのバイアスがなく、誤りがちでないバイオインフォマティックパイプラインの検証が可能になり、このため、ゲノム解析の分野における実質的な改善をもたらす。
【００６５】
さらに、合成デジタルゲノムデータセットを生成することにより、研究者が、合成データセット中の多様体の数、多様体の頻度、および多様体の種類をカスタマイズできるようになる。こうしたカスタマイズにより、バイオインフォマティックパイプラインは、特定の応用（例えば、高頻度ＳＮＶ、ＳＮＰ、インデルなどの同定、低頻度多様体の同定、特異性、選択性、正確性を高めたか、または低い検出下限を有する特定の種類の多様体の同定、など）に対して試験する、応力を与える、および設計することが可能になる。本発明の主題の合成データセットを生成することによって、コンピューティング装置がこれまで不可能であった機能（上述）を実行できるようにもなることを認識すべきである。
実施例２−ＲＮＡ−Ｓｅｑバイオインフォマティクス検証
【００６６】
本発明の主題の方法を使用して、ＲＮＡ−Ｓｅｑバイオインフォマティクスを用いて患者のゲノム中の多様体を正確にコールする際のアルゴリズムの実行に関する、ゲノム解析コンピューティング装置（ＲＮＡバイオインフォマティクスパイプライン）の性能を試験／検証した。合成ＲＮＡデータセットおよびＤＮＡデータセットを上記のように構築した。有利には、こうしたデータセットは、パイプラインのＣＬＩＡ検証を裏付けるために使用できることが企図される。入力は、（１）ＷＧＳ腫瘍および正常データセットからの多様体コール、および（２）２つの別々のライブラリ調製物にわたる総深度１億４０００万リードでの腫瘍ＲＮＡシーケンシングを含んだ。しかし、本発明の主題は、様々なライブラリ調製物（単一のライブラリ、２つ以上、５つ以上、１０以上、２０以上、３０以上のライブラリなど）にわたる様々なリード深度（例：少なくとも０．１億リード、０．５億リード、１，０億リード、１，５億リード、２億、３億リード）を企図すると認識すべきである。
【００６７】
この場合、報告された多様体は、（１）ＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて発現した体細胞ＳＮＶの存在、（２）ＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて発現した生殖系列ＳＮＶの存在、（３）ＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて発現した体細胞インデルの存在、（４）ＲＮＡ−Ｓｅｑにおいて発現した生殖系列インデルの存在、および（５）遺伝子転写産物レベルを含む。これらの出力結果を、合成データセットにおいて評価し、レポートを生成した。このレポートは、検出限界（腫瘍細胞純度２５％）に近い２０名の合成患者のパネルを使用して、多様体の特異性、選択性、正確性、および検出レベルを示す。当然のことながら、より多くの（例えば、３０以上）またはより少ない（例えば、１０以下）合成患者を、より高い（例えば、３０〜４０％、４０〜５０％、またはさらにそれ以上）またはより低い（例えば、５〜１５％、１５〜２５％）細胞純度で使用することができる。また、合成患者のうち１名を、パイプラインの再現性を評価するために、腫瘍純度１００％にて１０回試行し、さらにより低い検出下限を確立するために、実質的により低い純度（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、および５０％）で試行した。
【００６８】
本実施例において、生殖系列発現ＳＮＶのリファレンス多様体セットは、以下の条件の全てを満たす部位を含んだ：（１）入力実験ＤＮＡ対照では、その部位は予測生殖系列ＳＮＶであった（これには、その評価からの真陽性および偽陽性の両方を含むことに留意されたい）、（２）１００％腫瘍純度対照において、多様体を裏付ける２つ以上のリードが存在した、（３）その部位が、以下に示す基準に従ってフィルタにより除外されていない。実験的多様体セットは、以下の条件の全てを満たす部位を含んだ：（１）入力実験ＤＮＡ対照では、その部位は、生殖系列ＳＮＶ陽性である（これには、真の陽性および偽陽性の両方を含むことに留意されたい）、（２）実験データにおいて、多様体を裏付ける２つ以上のＲＮＡリードが存在した、（３）その部位が、以下に示す基準に従ってフィルタにより除外されていない。１００％リファレンスＲＮＡデータセットでは、２０未満の総リード数を有する部位は、フィルタにより除外した。さらに、多様体を裏付ける１つのみのリードを有する、リファレンスＲＮＡ中の部位を、フィルタにより除外した。こうしたフィルタによる除外により、構成的に発現されない遺伝子を排除することが企図される。
【００６９】
ゲノム解析アルゴリズムは、様々な改善された特徴を組み込むために改変できることがさらに企図される。例えば、本例では、ゲノム解析アルゴリズムは、以下の特徴を含む：（１）ＲＮＡ−ｓｅｑデータから融合遺伝子をコールするための操作、（２）「ローカル」アラインメントＲＮＡシーケンシングデータおよびｄｅ  Ｂｒｕｊｉｎグラフを使用してＳＮＶおよびインデル（生殖系列および体細胞の両方）の発現を決定するための操作、（３）トランスクリプトーム内の同じ位置に複数のコンセンサス配列が共存できるようにするためのソフトクリップコンセンサス決定を改善するための操作、ならびに（４）遺伝子対あたり１つより多い遺伝子融合体候補をすること。ゲノム解析アルゴリズムの改変および本発明の主題の方法による検証は、例えば模擬データにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩのコール性能の改善を含む、アルゴリズムの正確性、特異性、および選択性の改善を証明することを認識すべきである。
【００７０】
この実施例では、記載された多様体クラス（発現した体細胞ＳＮＶ、発現した生殖系列ＳＮＶ、発現した体細胞インデル、発現した生殖系列インデル、および遺伝子転写レベル）の各々について、ゲノム解析アルゴリズムの正確性、検出限界、および再現性を評価した。アルゴリズムの正確性は、２０名の合成患者サンプルで評価を行った。アルゴリズムの検出限界（非生殖系列多様体について）は、異なる腫瘍純度で試行した２０の合成患者サンプルの１つのサンプルを用いて評価を行った。アルゴリズムの結果の再現性を、アルゴリズムによるＬｏＤ評価から、サンプルを純度１００％でさらに９回試行することによって評価した。
【００７１】
検証結果の要約を、表６に報告する。特に明記しない限り、各多様体クラスに関するＰＰＶ、感度、特異性、および再現性の合格基準は、上記のとおりである。有利には、本発明の主題の方法は、ゲノム解析アルゴリズムが、体細胞多様体および遺伝子転写物レベルのＰＰＶ、感度、および特異性、ならびに再現性およびＬｏＤの基準を満たしていることを明らかにした。
【表６】
2019525308.tif 000007
【００７２】
発現した体細胞ＳＮＶの評価
【００７３】
様々なサンプルにおける発現した体細胞ＳＮＶの正確性：発現した体細胞ＳＮＶのコールに関するゲノム解析アルゴリズムのＰＰＶ、感度、および特異性を、細胞純度３０％を有する合成患者２０名を用いて評価し、詳細な結果を表７に示した。有利には、発現した体細胞ＳＮＶのコールに関して、全ての単一の合成患者について合格基準（ＰＰＶ９５％以上、感度９５％以上、および特異性９９％以上）を満たすことによってアルゴリズムを検証した。
【表７】
2019525308.tif 000008
【００７４】
発現した体細胞ＳＮＶアッセイの再現性：発現した体細胞ＳＮＶのコールに関するゲノム解析アルゴリズムの結果の再現性を、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（多様体２０）を１０回試行することによって評価した。結果の詳細を、表８に提示する。有利には、発現した体細胞ＳＮＶのコールに関して、再現性の合格基準（最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致）を満たすことによって、アルゴリズムを検証した。
【表８】
2019525308.tif 000009
【００７５】
発現した体細胞ＳＮＶ検出限界：発現した体細胞ＳＮＶのコールに関するゲノム解析アルゴリズムのＬｏＤは、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、および５０％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（多様体２０）を実行することによって評価した。詳細な結果を表９に示す。有利には、全てのサンプルが、発現した体細胞ＳＮＶのコールに関して、２０％の細胞純度検出限界で承認基準（ＰＰＶ７５％以上、特異性９９％以上、および感度９５％以上）に合格した。
【表９】
2019525308.tif 000010
【００７６】
発現した生殖系列ＳＮＶの評価
【００７７】
多様なサンプルにおいて発現した生殖系列ＳＮＶの正確性：発現した生殖系列ＳＮＶのコールに関するゲノム解析アルゴリズムのＰＰＶ、感度、および特異性を、細胞純度３０％で合成患者２０名を用いて評価し、詳細な結果を表１０に示した。有利には、発現した生殖系列ＳＮＶのコールに関して、全ての単一の合成患者について合格基準（ＰＰＶ９５％以上、感度９５％以上、および特異性９９％以上）を満たすことによってアルゴリズムを検証した。
【表１０】
2019525308.tif 000011
【００７８】
発現した生殖系列ＳＮＶアッセイの再現性：発現した生殖系列ＳＮＶのコールに関するゲノム解析アルゴリズムの結果の再現性を、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（多様体２０）を１０回実行することによって評価した。結果の詳細を、表１１に提示する。有利には、発現した生殖系列ＳＮＶのコールに関して、再現性の合格基準（最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致）を満たすことによって、アルゴリズムを検証した。
【表１１】
2019525308.tif 000012
【００７９】
発現した体細胞インデルの評価
【００８０】
様々なサンプルにおける発現した体細胞インデルの正確性：発現した体細胞インデルのコールに関するゲノム解析アルゴリズムのＰＰＶ、感度、および特異性を、細胞純度３０％で合成患者２０名を用いて評価し、詳細な結果を表１２に示した。有利には、発現した体細胞インデルのコールに関して、全ての単一の合成患者について合格基準（ＰＰＶ９５％以上、感度９５％以上、および特異性９９％以上）を満たすことによってアルゴリズムを検証した。
【表１２】
2019525308.tif 000013
【００８１】
発現した体細胞インデルアッセイの再現性：発現した体細胞インデルのコールに関するゲノム解析アルゴリズムの結果の再現性を、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（多様体２０）を１０回試行することによって評価した。結果の詳細を、表１３に提示する。有利には、発現した体細胞インデルのコールに関して、再現性の合格基準（最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致）を満たすことによって、アルゴリズムを検証した。
【表１３】
2019525308.tif 000014
【００８２】
発現した体細胞インデルの検出限界：発現した体細胞インデルのコールに関するゲノム解析アルゴリズムのＬｏＤを、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、および５０％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（多様体２０）を試行することによって評価した。詳細な結果を表１４に示す。有利には、全てのサンプルが、発現した体細胞インデルのコールに関して、２５％の細胞純度検出限界で承認基準（ＰＰＶ７５％以上、または特異性９９％以上、および感度９５％以上）を満たした。
【表１４】
2019525308.tif 000015
【００８３】
発現した生殖系列インデルの評価
【００８４】
様々なサンプルにおける発現した生殖系列インデルの正確性：発現した生殖系列インデルのコールに関するゲノム解析アルゴリズムのＰＰＶ、感度、および特異性を、細胞純度３０％で合成患者２０名を用いて評価し、詳細な結果を表１５に示した。有利には、発現した生殖系列インデルのコールに関して、全ての単一の合成患者について合格基準（ＰＰＶ９５％以上、感度９５％以上、および特異性９９％以上）を満たすことによってアルゴリズムを検証した。
【表１５】
2019525308.tif 000016
【００８５】
発現した生殖系列インデルアッセイの再現性：発現した生殖系列インデルのコールに関するゲノム解析アルゴリズムの結果の再現性を、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（多様体２０）を１０回試行することによって評価した。結果の詳細を、表１６に提示する。有利には、発現した生殖系列インデルのコールに関して、再現性の合格基準（最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致）を満たすことによって、アルゴリズムを検証した。
【表１６】
2019525308.tif 000017
【００８６】
遺伝子転写レベルの正確性の評価
【００８７】
様々なサンプルでの遺伝子転写レベルの正確性：
【表１７】
2019525308.tif 000018
【００８８】
遺伝子転写レベルの正確性  アッセイの再現性：結果を表１８に示す。いずれのサンプルも、承認基準に合格した。
【表１８】
2019525308.tif 000019
【００８９】
遺伝子転写レベルの正確性  検出限界：結果を、表１９に提示する。全てのサンプルが、承認基準に合格した。これが、２つの完全に相関のない発現プロファイル間における検出の理論的限界であることに留意されたい。これらは生物学的に現実的な条件ではないため、この評価は、主に、何よりも生物学的に関連する相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｒ）の動きを試験する。過剰発現または過少発現のレベルを評価するためのさらなる試験は、検出限界をより意図的に評価すると企図される。
【表１９】
2019525308.tif 000020
【００９０】
本発明の主題の方法を使用して、ＲＮＡ−ｓｅｑデータから、発現した融合遺伝子を正確にコールする際のアルゴリズムの実行に関するゲノム解析コンピューティング装置（バイオインフォマティクスパイプライン）の性能を試験／検証した。好ましくは、パイプラインへの入力は、ＲＮＡ−ｓｅｑサンプルおよび融合アンカーのコアセットである。パイプラインの出力は、融合体のリストを含み、各融合予測は、アンカー遺伝子、融合パートナー、および裏付けレベルからなることが企図される。パイプラインの性能を、（１）合成融合体データ、（２）細胞ペレットの形態の第三者融合体標準（研究所標準）、および（３）ホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）から配列決定された臨床サンプルについて評価する。陽性予測値、感度、および解析の検出限界についてのレポートを生成する。有利には、こうしたデータセットおよびレポートを、パイプラインのＣＬＩＡ検証を裏付けるために使用できることが企図される。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子融合体」とは、２つの異なるヒト転写物の上流部分および下流部分が単一の転写物中で発現している配列多様体を指す。上流および下流転写物の両方が２つの異なるヒト転写物ではなく、ＥＧＦＲ（同じヒト転写物）に属するＥＧＦＲｖＩＩＩの場合のように、この定義に例外を設けることができることが企図される。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、「ＴＰＭ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）」は、百万の転写物の集団における遺伝子の転写物の頻度または遺伝子の個々の転写物の頻度の尺度を指す。さらに、「ｌｏｇ２−ＴＰＭ」は、２を底とする１プラスＴＰＭの対数：ｌｏｇ２（１＋ｔｐｍ）を指す。こうした計算では、ゼロからゼロおよび１．０から１．０にマッピングされ、ダイナミックレンジを対数的に圧縮する。
【００９３】
合成全ゲノムシーケンシング検体およびエキソーム検体が構築され（、またはインポートされ）、使用されることが企図される。さらに、この手順に従って合成ＲＮＡ−ｓｅｑ検体を生成する。
【００９４】
データセット
【００９５】
表２０には、第三者の融合標準解析に使用されたサンプルを示す。様々な細胞純度（例えば、２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％など）および／または様々な融合体（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ１、ＡＦＦ１−ＫＭＴ２Ａ、ＷＷＴＲ１−ＣＡＭＴＡ１、ＥＷＳＲ１−ＦＬＩ１、ＥＷＳＲ１−ＦＬＩ−１、ＳＳ１８−ＳＳＸ２、ＢＣＡＳ４−ＢＣＡＳ３、ＮＵＰ２１４−ＸＫＲ３、ＲＰ２−ＢＲＡＦ、ＬＭＮＡ−ＮＴＲＫ１；ＦｕｓｉｏｎＣａｎｃｅｒデータベース（www.donglab.ecnu.edu.cn/databases/FusionCancer/）も参照されたい）を有する追加または異なるサンプルも適宜使用され得ることを認識すべきである。
【表２０】
2019525308.tif 000021
【００９６】
表２１には、ＦＦＰＥから配列決定された臨床サンプルの解析に使用したサンプルを記載する。上記のように、追加のまたは異なる融合体も使用できることを認識すべきである。接尾辞「−ｎｍｘ」は、１つのＣＬＩＡ研究所（ＣＬＩＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって配列決定されたサンプルを識別するために、場合によっては複製数を指定するための追加の数字と共に使用される。
【表２１】
2019525308.tif 000022
【００９７】
次の３つのサンプルセットについて、ゲノム解析アルゴリズムの性能を評価する：（１）合成データ（既知の至適基準を用いて構築された融合体データであり、遺伝子融合体のコールの感度、ＰＰＶ、特異性、および検出限界の推定値を提供するために用いられる）、（２）研究所標準（特定の融合体（かつ場合によっては他の融合体）を含み、遺伝子融合コールの感度を評価するために使用される細胞株）、および（３）臨床サンプル（臨床サンプルにおいて、遺伝子融合体コールの精度を推定するためにＦＦＰＥからシーケンシングしたサンプル）。
【００９８】
合成データの生成：合成患者由来のＲＮＡ−ｓｅｑを、上記のように合成ＤＮＡデータセットおよび合成ＲＮＡデータセットに加えて生成する。ランダムＲＮＡ融合転写物を、表２２に記載するように６３の下流融合パートナーについて作製する。
【表２２】
2019525308.tif 000023
【００９９】
各転写産物の上流融合パートナーを、非復元により他の正規のＲｅｆ−Ｓｅｑ転写産物からランダムに選択する。任意のエキソンにコピー数改変を受けた転写物はいずれも、選択から除外する。腫瘍リファレンス内の遺伝子の父方対立遺伝子および母方対立遺伝子の両方がコピー数改変を伴わない場合には、母方対立遺伝子または父方対立遺伝子のいずれかをランダムに選択する。上流および下流の融合パートナーを考慮して、エキソン境界部を、上流の融合パートナーからランダムに選択する。下流の融合エキソンを、適合可能な位相を有するエキソンからランダムに選択する。
【０１００】
融合転写物は、中断の有無にかかわらず、これらのエキソン境界部から作成される。中断がなければ、ゲノムＤＮＡは、５‘上流エキソンの開始部から上流のエキソン境界部までの体細胞リファレンスゲノムから選択され、下流遺伝子の３‘エキソンを通って下流のエキソン境界部に融合される。中断がある場合には、上流または下流のエキソンがランダムに選択され、次いでランダムな数のコドンがそのエキソン境界部から欠失する。ＥＧＦＲｖＩＩＩエキソンスキッピング事象の転写物は、ＴＰＭ１００で親対立遺伝子のうちの１つから作製され得ることもまた企図される。
【０１０１】
融合転写物レベルは、１０、２０、３０を超え、１００ＴＰＭを超えるが、好ましくは最大で１００ＴＰＭのレベルで生成されることが企図される。各レベルにおいて、最大３つの融合転写物が生成され、好ましくは、各レベルにおいて、最大２つが中断なく、最大１つは中断を有して生成される。
【０１０２】
遺伝子融合体検出の評価
【０１０３】
遺伝子融合体予測は、その非存在／存在の予測であり、ＤＮＡ多様体と同様に評価される。
【０１０４】
融合産物の報告可能範囲：バイオインフォマティクスパイプラインは、上流または下流のパートナーとして表２３の遺伝子のうちの１つとの融合産物を報告する可能性がある。これらの遺伝子は、少なくとも合成データを用いて評価されることが企図される。予測は、上流遺伝子または下流遺伝子のいずれかとして表２３のシード遺伝子のうちの１つ、および他の２５，４６４のＲｅｆＳｅｑ遺伝子のうちの別の１つを含む。ＥＧＦＲを、ＥＧＦＲｖＩＩＩ多様体の自己融合について試験できることも企図される。この結果として、サンプルあたり合計１＋２＊７４＊２５，４６４＝３，７６８，６７３個の可能な予測がもたらされることを認識すべきである。
【表２３】
2019525308.tif 000024
【０１０５】
実験およびリファレンス多様体セット：前述のように、遺伝子融合体予測は、上流および下流遺伝子の規則正しい対合である。相同性が高いことにより、上流遺伝子を相同性グループと呼ぶ。好ましくは、相同性グループは、融合において使用される遺伝子の部分において８０％を超えるＤＮＡ配列同一性を有する全ての遺伝子のセットではあるが、７５％超、７０％超、６５％超、６０％超、または５０％超のＤＮＡ配列同一性も含み得る。
【０１０６】
遺伝子融合体のリファレンス多様体セットは、以下の全ての条件（選択基準）により急増した遺伝子融合体のリストである：（１）融合体は機能的であった（例えばナンセンス媒介崩壊の標的ではない）、（２）腫瘍純度を乗じた後、２０以上のＴＰＭで融合体が急増した（例えば、１００％純度のサンプル中でＴＰＭが２０である場合は、３０％のサンプル中においてＴＰＭ６に相当する）、および（３）ＥＧＦＲｖＩＩＩ多様体のＥＧＦＲ−ＥＧＦＲを除いて、融合体は内部遺伝子融合体ではない。
【０１０７】
実験的な多様体セットは、以下のうちの全てが保持されている部位となる：（１）その部位が、ＶＣＦにおいてＰＡＳＳコールとして標識されている、（２）その部位が、８の最小リードサポート（パイプラインでの融合体コールの標準）を有する、および（３）その部位が、ＶＣＦにおいてＤＥＮＯＶＯと標識されていない（例えば、実験的融合方法に由来しない）。
【０１０８】
相同遺伝子は、融合体の一部として区別することが困難であるため、真の可能な予測空間は全ての可能な遺伝子、すなわち１９２７０×１９２６９より少ない。しかし、予測空間はまた、本試験において使用される可能性のある融合体のリストの６６＊６５以上でもある。１９２７０×１９２６９から６６×６５までの範囲が潜在的融合体として使用されることが企図されるが、好ましい実施形態では、６６×６５が予測のための特異性のより保守的な推定値として使用される。
【０１０９】
正確性試験：合成患者のパネル全体において、正確性を評価する。リファレンスデータは、上記の教示を使用して構築し、かつ上記の選択基準を満たす２０名の合成患者のＲＮＡ中における合成遺伝子融合体である。実験データは、全２０名の合成患者に関する１００％ＲＮＡサンプルからの予測融合体である。ＰＰＶ、感度、および特異性は、全ての検証サンプルにおいて９５％以上でなければならない。
【０１１０】
再現性試験：再現性を、１回の試行で９つの複製実験を用いて評価する。１００％純度検出限界サンプルからのＲＮＡ  ＦＡＳＴＱデータがリファレンスデータである。これらのデータは、ＲＮＡバイオインフォマティクスパイプラインを通して処理される。リファレンスとして使用されたものと同じＦＡＳＴＱデータを、さらに９回処理する。承認基準を満たすために、全ての再現性試行は、９９．９９％以上の正確性および過去の試行との一致を示さなければならない。正確性または過去の試行との一致が９９．９９％未満である実験的試行はいずれも、試行失敗である。
【０１１１】
検出限界試験：ＬｏＤを、遺伝子融合産物が検出可能である最小ＴＰＭレベルとして評価する。これは、腫瘍純度と合成腫瘍部分でのＴＰＭ発現レベルの両方の関数である。リファレンスサンプルデータは、１００％サンプルからのＲＮＡ  ＦＡＳＴＱデータである。実験データは、３０％および１００％の腫瘍純度でのＲＮＡ  ＦＡＳＴＱサンプルである。必要に応じて、様々な他の腫瘍純度（例えば、１５％、２０％、２５％、３５％、４０％など）を使用できることを認識すべきである。予測装置の感度は、真の融合体を０〜２０ＴＰＭ、２０〜５０ＴＰＭ、５０〜１００ＴＰＭ、および１００以上のＴＰＭのビンにビニングすることによって測定する。感度が９５％を超えるように、ＬｏＤは（ＴＰＭによる）最低のビンである。好ましくは、ＬｏＤは、２０ＴＰＭ超であるが、ＬｏＤは１５、１０、またはそれ未満のＴＰＭであり得ることが企図される。したがって、好ましい実施形態では、検出限界が２０ＴＰＭ未満である場合、検証は失敗であった。
【０１１２】
研究所標準融合体検出の評価
【０１１３】
表２０の研究所標準を使用して、融合体検出の感度を評価する。各サンプルについては、表２０（リファレンス多様体セット）に明記されているように、単一の多様体が存在する。ＲＮＡを細胞ペレットから抽出し、標準的なＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、ＲＮＡ  ＦＡＳＴＱを生成する。好ましい実施形態では、上記のＲＮＡバイオインフォマティクスパイプラインは、ＲＮＡ  ＦＡＳＴＱ上で試行されるが、追加のまたは異なるゲノム解析コンピューティング装置またはゲノム解析アルゴリズムも必要に応じて使用され得ることを認識すべきである。
【０１１４】
各サンプルの試行結果を、そのサンプルにおいて期待される融合体を予測するために正確である、または正確でないと評価する。承認基準を満たすために、各サンプルで行われる全ての試行は、期待される融合体を正確に予測しなければならないが、場合によっては、期待される融合体を予測する試行が１回または合計で十分であると見なされ得ることを認識すべきである。好ましい実施形態では、いずれかのサンプルが正しくない場合には、評価全体が失敗となる。
【０１１５】
臨床サンプルの評価
【０１１６】
表２１の臨床サンプルを使用して、ＦＦＰＥサンプル中のＰＰＶおよび検出限界を評価する。各サンプルについて、リファレンスセットの単一のメンバーは、表２１の最初の列に列挙されている遺伝子融合体である。好ましい実施形態では、各融合体は、外部のＣＬＩＡ研究所で検証されている。融合体コールの実験セットは、試験／検証されているパイプライン（例えば、ゲノム解析コンピューティング装置）のフィルタリングに合格したを通過した全てのセットである。
【０１１７】
正確性：利用可能なサンプル数が限られているため、パイプラインによって行われる全ての予測が各サンプルに関して正確でなければならない。表２１において特定された７名の患者由来のサンプルの正確性を評価する。
【０１１８】
再現性：中間精度（再現性）を評価するために、複製サンプルを使用する。たとえば、ＣＦ０７６７−ｎｍｘ２およびＣＦ０８４８−ｎｍｘ２は、元のサンプルと同じＦＦＰＥブロックから作製された複製物サンプルである。対照的に、ＩＴＯＭＩＣＳ  １５患者（１５−０−Ｂ１−ｎｍｘ、１５−１−Ｂ１−ｎｍｘ、１５−１−Ｂ２−ｎｍｘ、および１５−２−Ｂ１−ｎｍｘ）は、４つの異なる腫瘍由来のサンプルを有し、４つのサンプル全てに融合体が存在しているが、これらは、診断目的としては、複製物と見なすことはできない。中間精度を確認するためには、全ての予測が正確でなければならず、好ましくは、複製物サンプル間で一致していなければならない。
【０１１９】
検出限界：ＲＮＡの一般的な検出限界については、１５−１−Ｂ１およびＢ２、ならびにＣＦ０７６８−ｎｍｘおよびｎｍｘ２の元のＲＮＡデータを、３回の反復実験で元のＲＮＡ量の５０％、２５％、１５％、および１０％まで部分集合にする。これは、元の腫瘍が１００％純粋であると控えめに推定して、腫瘍純度をその量まで低下させる効果を有する。希釈サンプル中の各融合体については、融合体のＴＰＭをＬｏＤ実験のために推定する。例えば、好ましい実施形態では、１００％サンプルの推定融合体のＴＰＭは、ＲＳＥＭによって推定されるとおり、２つの構成的遺伝子の最大ＴＰＭである。有利には、このことは、これら２つの遺伝子由来の非融合転写物を考慮していない。非融合体転写物を考慮すれば、融合体産物の真のＴＰＭを減少させる。転写物のＴＰＭを過大評価することにより、本発明者らは、ＬｏＤのより控えめな推定を確立する。
実施例４−正常／ＦＦＰＥサンプルからのＷＥＳにおけるＳＮＶおよびインデル検出の検証
【０１２０】
本発明の主題の方法を使用して、ＦＦＰＥエキソームシーケンシングデータにおいて多様体を正確にコールする際のアルゴリズムの実行に関するゲノム解析コンピューティング装置（バイオインフォマティクスパイプライン）の性能を試験／検証した。バイオインフォマティクスのパイプラインは、シーケンシング機器からの非アライメントリードから始まる生殖系列および体細胞の両方の多様体に関して報告する。合成ゲノムデータセットを、（例えば、本明細書に記載の方法によって）構築し、これを使用してパイプラインによるＳＮＶおよびインデル多様体コールの検出限界および再現性の双方を証明する。有利には、こうしたデータセットおよび得られたレポートは、パイプラインのＣＬＩＡ検証を裏付けるために使用できることが企図される。
【０１２１】
パイプライン入力は、（１）７５倍カバレッジ深度での生殖系列（血液）全エキソームシーケンシングおよび（２）１５０倍カバレッジ深度での腫瘍全エキソームシーケンシングを含む。好ましい実施形態では、多様体をコールするために、統計モデルにおいて全ての入力データを同時に使用することにより、および各入力からの多様体の独立した評価を防止することによって、多様体コールの正確性を増大させる。報告される多様体は、（１）生殖系列ＳＮＶ、（２）生殖系列インデル、（３）体細胞ＳＮＶ、および（４）体細胞インデルを含む。これらの入力を、様々な臨床サンプルで評価する。好ましい実施形態では、少なくとも２つの異なるＣＬＩＡ研究所からの臨床サンプルデータを使用する。有利には、ＬｏＤを、癌細胞株の合成希釈によって決定する。
【０１２２】
表２４に、臨床サンプルに使用した検体を同定し、記載する。これらの検体からのサンプルは、より多くの情報を示す接尾辞を有し得る。接尾辞「−ｎｍｘ」は、１つのＣＬＩＡ研究所によってシーケンシングされたサンプルを同定するために、おそらく複製数を明記するための追加の数字と共に使用される。接尾辞「−ｒｄｘ」は、−ｎｍｘとは異なり、別のＣＬＩＡ研究所によってシーケンシングされたサンプルを明記する。接尾辞「−５０」および「−２５０」は、投入ＤＮＡ量５０ｎｇおよび２５０ｎｇを表す。
【表２４】
2019525308.tif 000025
【０１２３】
サンプル調製：ＣＯＬＯ８２９およびＣＯＬＯ８２９ＢＬに関して、細胞株を、供給元によって推奨される培養条件を用いて培養した。ＣＬＩＡ研究所により、サンプルの調製を実施し、かつＦＦＰＥブロックおよび切片を作製した。ＣＬＩＡ研究所により、ゲノムＤＮＡを、ＦＦＰＥ切片から単離し、エキソームＤＮＡを濃縮した。血液サンプルからのＤＮＡを、少なくとも７５倍のエキソームカバレッジ深度でシーケンシングし、腫瘍サンプルを、少なくとも１５０倍のエキソームカバレッジ深度でシーケンシングした。好ましくは、ＦＦＰＥ腫瘍および血液を、比較のために、独立したＣＬＩＡ研究所（例えば、ＲｅｓｅａｒｃｈＤＸ、ＬＬＣ）によっても処理する。検出限界サンプルは、コンピュータによる混合アプローチ、好ましくは分子混合と同等であることが検証されているアプローチを用いて生成された。細胞株ＣＯＬＯ８２９およびＣＯＬＯ８２９ＢＬのＦＦＰＥ腫瘍およびＦＦＰＥ血液からの複数のＤＮＡライブラリをシーケンシングして、様々な深度で混合した。
【０１２４】
好ましい実施形態では、４つの異なる検証試験を実施するが、場合によっては、単一の試験、記載された試験の部分的組み合わせ、または記載された試験のいくつかもしくは全てと追加の試験との組み合わせを行うことが有利であり得ることを理解されたい。
【０１２５】
検証試験１：外部ＣＬＩＡ研究所との比較。この試験のために、１つのＣＬＩＡ認可研究所（第１のＣＬＩＡ研究所）からの配列データに基づくバイオインフォマティックパイプラインの結果を、少なくとも１つのサンプルペアにおいて、追加のＣＬＩＡ認可研究所（例えばＲｅｓｅａｒｃｈＤＸ）から生成された配列データに基づく結果と比較する。好ましい実施形態では、２、３、５、１０、１５、またはそれ以上のペアのサンプルを比較することができる。追加のＣＬＩＡ研究所からのエキソームデータから生成されたＳＮＶコールを、リファレンスコールを生成するために使用する。第１のＣＬＩＡ研究所からのデータを実験セットとして使用する。好ましくは、承認基準を満たし、バイオインフォマティックパイプラインを検証するために、全てのデータセットが９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、９９％以上の特異性を示さなければならない。いくつかの実施形態では、体細胞腫瘍多様体および生殖系列多様体を、全部で４種類の多様体について、インデルおよびＳＮＶと同様に別々に評価するが、場合によっては、必ずしも全ての多様体を評価するものではないことを認識すべきである。
【０１２６】
検証試験２：再現性（中間精度）。この試験では、品質および結果の一貫性について、バイオインフォマティックパイプラインの再現性を評価する。好ましくは、これは、全エキソームシーケンシングについて３つの臨床サンプルの２つの複製物の結果を比較することによって行われる。しかしながら、３つ以上、少なくとも５つ、または少なくとも１０個のサンプルを使用でき、少なくとも３つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０個の複製物の結果を比較できることを理解されたい。さらに、複製物を、１、２、３、４、５、または１０日間隔を含む異なる日に解析してもよい。有利には、複製物を評価する際に、少なくとも３つのサンプルの少なくとも３つの複製物を使用することにより、再現性を評価する場合のバイオインフォマティックパイプラインの妥当性が高くなる。好ましい実施形態では、サンプルの各ペアを、２つの様式で比較する：至適基準としてのサンプルＡで１回、および至適基準としてのサンプルＢで１回。承認基準を満たすために、こうした各比較は、比較全体でプールしたとき、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％の特異性を示さなければならない。いくつかの実施形態では、体細胞腫瘍多様体および生殖系列多様体を、全部で４種類の多様体について、インデルおよびＳＮＶと同様に別々に評価するが、場合によっては必ずしも全ての多様体を評価するものではないことを認識すべきである。
【０１２７】
検証試験３：検出限界。一対の細胞株から様々な比率の腫瘍および正常なシーケンシングデータを生成し、これらの異なる比率の細胞の影響を評価する。例えば、ＣＯＬＯ８２９に関する腫瘍純度の混合物を、表２４に記載されるように調製することができる。好ましい実施形態では、１００％サンプルを、至適基準の多様体セットとして使用する。検出限界を、９５％以上の感度および９９％以上の特異性を有する、最も低いサンプル純度で評価する。好ましくは、バイオインフォマティックパイプラインのＬｏＤは、パイプラインを検証するために３０％以上でなければならない。いくつかの実施形態では、体細胞腫瘍多様体および生殖系列多様体を、全部で４種類の多様体について、インデルおよびＳＮＶと同様に別々に評価するが、場合によっては、必ずしも全ての多様体を評価するものではないことを認識すべきである。
【０１２８】
検証試験４：投入量。２つの異なるＤＮＡ投入量のバイオインフォマティックパイプラインの結果を比較する（例えば、１０ｎｇ、２０ｎｇ、３０ｎｇ、４０ｎｇ、５０ｎｇ、７５ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、２００ｎｇ、および２５０ｎｇから選択される２つの異なる量）。１つの好ましい実施形態では、５０ｎｇの量を使用する様々な複製物を試験データとして使用し、至適基準は、投入として２５０ｎｇのＤＮＡを使用する複製物である。好ましくは、サンプルの各ペアを、２つの様式で比較する：至適基準としてサンプルＡで１回、および至適基準としてサンプルＢで１回。承認基準を満たすために、こうした各比較は、比較全体でプールしたとき、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％の特異性を示さなければならない。いくつかの実施形態では、体細胞腫瘍多様体および生殖系列多様体を、全部で４種類の多様体について、インデルおよびＳＮＶと同様に別々に評価するが、場合によっては、必ずしも全ての多様体を評価するものではないことを認識すべきである。
【０１２９】
追加試験：場合によっては、異なる試験または追加試験を実施することが有利であり得る。例えば、低レベルのＤＮＡ投入を評価するために試験を行ってもよい。こうした試験は、バイオインフォマティックパイプラインが、予想外にも、業界標準、または推奨されるＤＮＡ投入レベルより少ないＤＮＡ投入でで、許容可能な結果に戻ることを有利にも証明することができる。さらに、品質が劣るデータから至適基準を得るよりも、真のセット（例えば、ＣＯＬＯ８２９コンセンサス多様体リスト）を使用して、バイオインフォマティックパイプラインの性能を評価することが有利であり得る。こうした試験は、十分に特徴付けられたリファレンスを用いてバイオインフォマティックパイプラインを検証することによって、臨床上のガイドラインをさらに満たす可能性がある。本発明の主題の方法およびデータセットは、１つ以上の規制当局または業界標準によって要求される、高められたまたは新しい検証閾値を満たすように適合させることを含む、バイオインフォマティックパイプラインの持続的な検証を有利に、しかも予想外に可能にすることを認識すべきである。
【０１３０】
計測値および性能評価
【０１３１】
至適基準多様体は、細胞株中のクローン多様体からコールのサブセットを選択することによって、各々の比較に関してリファレンスデータにおいて同定されることが企図される。例えば、ｈｇ１９リファレンスゲノム中の各コーディング塩基を、至適基準ＶＣＦにおいて以下の状態に従って分類する：（１）マッピング可能な多様体、（２）マッピング不能な多様体、および（３）リファレンス部位。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、マッピング可能な多様体は、以下を示すＶＣＦを有する；（１）バリアントが、サンプル不純物補正後に４５％を超える対立遺伝子頻度を有している、（２）腫瘍ＢＡＭ内の部位が、１０を超えるマッピング品質で少なくとも２０リードのリード深度を有している、（３）正常ＢＡＭ内の部位が、５を超えるマッピング品質を有する少なくとも１０リードのリード深度を有している、および（４）基準のサンプル内の多様体が、１５を超えるクオリティスコアを取得している。したがって、マッピング不能な多様体ＶＣＦは通常、マッピング可能な多様体の基準を満たしていない。好ましくは、リファレンス部位は、一般に、患者の合成ゲノムがその部位でリファレンスである部位である。
【０１３３】
有利には、場合によっては、ＦＰコールに対する低多様体対立遺伝子頻度フィルタを使用することができる。試験多様体対立遺伝子頻度の９５％信頼区間（Ｊｅｆｆｒｅｙの２項間隔）が基準の多様体対立遺伝子頻度の９５％信頼区間と重複する場合、偽陽性を真の擬陽性であると評価するのに十分な検定力がないことから、ＦＰを解析から除外する。
【０１３４】
好ましくは、バイオインフォマティックパイプラインからの出力が、真の陰性を生じる場合、計測値は、上記のように正確性、感度、および特異性を含む。さらに、基準の生殖系列多様体については、ＶＣＦにおいて標準フィルタリングに合格する基準サンプルからの任意のコールを使用することができることを認識すべきである。ＳＮＶおよびインデル予測については、評価領域は好ましくはＲｅｆＳｅｑ遺伝子のエキソン領域であるが、増幅については、ゲノム全体を評価領域として使用する。
【０１３５】
いくつかの癌サンプルでは、体細胞インデルは、比較的まれな事象であり、これにより、これらの事象の評価がより困難であることを認識すべきである。より高い信頼性を有するパイプラインおよびシーケンシングデータの正確性を推定するために、有利にも、正常サンプルと意図的にミスマッチである特定の対比を使用できる。例えば、典型的には、腫瘍内に体細胞インデルが存在する場合よりも、はるかに珍しい生殖系列コードインデルが存在する。対比の中で正常サンプルを入れ替えると、これらの生殖系列インデルの大部分は体細胞性であるように見えるが、それでもなお有利にも、現実的なデータに対して多様体コールを行う機会を提供する。
実施例５−合成エキソームデータ検証におけるＳＮＶおよびインデルの検出
【０１３６】
本発明の主題の方法を使用して、患者のエキソーム中の多様体を正確にコールする際のアルゴリズムの実行に関するゲノム解析コンピューティング装置（バイオインフォマティクスパイプライン）の性能を試験／検証した。合成ゲノムデータセットを、例えば本明細書に記載の方法によって構築した。有利には、こうしたデータセットは、パイプラインのＣＬＩＡ検証を裏付けるために使用できることが企図される。パイプラインへの入力は、（１）７５倍カバレッジ深度での生殖系列（血液）全エキソームシーケンシングおよび（２）１５０倍カバレッジ深度での腫瘍全エキソームシーケンシングを含む。場合によっては、生殖系列および腫瘍サンプルの両方の全エキソームのシーケンシングは、ゲノム解析アルゴリズムの結果を改善し得ることが企図される。
【０１３７】
多様体をコールするために、全ての入力データを統計モデルにおいて同時に使用すると、各入力からの多様体を独立して評価することはできない。こうしたアプローチは、多様体コールの正確性を増大させることが企図される。報告される多様体（出力）は、（１）生殖系列一塩基多様体、（２）生殖系列挿入および欠失、（３）体細胞一塩基多様体、ならびに（４）体細胞挿入および欠失を含む。これらの出力を、ゲノム解析アルゴリズムのあらゆる変更／修正について本発明の主題の方法を介して合成データ上で評価し、アルゴリズムを検証するためにレポートを作成することが企図される。このレポートは、検出限界（腫瘍細胞純度３０％）に近い２０名の合成患者のパネルを使用して、これらの多様体の検出の正確性およびレベルを示す。また、これらの患者のうちの１名は、パイプラインの再現性を評価するために腫瘍純度１００％で１０回、さらに検出下限を確立するために１０％、２０、２５％、３０％、４０％、および５０％で試行する。
【０１３８】
２０名の患者の合成ゲノムを、上述の教示に従って構築した。ゲノムおよびリード生成プロセスの間、使用した全ての多様体を、正確性を解析する間に至適基準の一部として使用するために保存した。エキソームリードデータは、エキソーム濃縮キット設計内のランダムな位置をサンプリングすることによって生成した。大部分のエキソーム濃縮キット（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔなど）が適切であると考えられるが、好ましい実施形態では、ＩＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）濃縮キットを使用する。しかし、エキソーム濃縮キット間の捕獲領域および捕獲効率の違いは、深度フィルターにより制御できることを認識すべきである。例えば、１０％の断片重複率について補正を行った後に、正常ゲノムでは７５倍、腫瘍ゲノムでは１５０倍のカバレッジ深度を使用することが企図される。次のサンプルを生成した：（１）様々な腫瘍純度での同じ模擬患者からの検出限界サンプル、および（２）３０％および１００％純度での変動性サンプル。合成多様体のマッピング可能性を決定するために、１００％サンプルを使用することが企図される。
【０１３９】
体細胞ＳＮＶの正確性の評価
【０１４０】
多数のサンプルにおけるＳＮＶのＰＰＶ、感度、および特異性：検出限界で様々な患者の正確性を評価するために、２０名の合成患者の体細胞多様体（上記のように構築された）を腫瘍細胞純度３０％でアッセイすることが企図される。
【０１４１】
正確性を、（ＴＰ＋ＴＮ）／（ＴＰ＋ＴＮ＋ＦＰ＋ＦＮ）として定義する。陽性予測値（ＰＰＶ）を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）として定義する。感度を、ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）として定義する。特異性を、ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）として定義する。好ましい態様において、承認基準は、典型的には次のとおり定義する：全てのデータセットが、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、９９％以上の特異性、および９９％を超える正確性を示さなければならない。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１４２】
再現性に関しては、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプルを、再現性のために１０回試行することが企図される。この比較では、最初の試行を、各再現性テストの至適基準として使用する。ここでは、承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならず、非承認基準は、典型的には、次のとおり定義する：実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意のその後の試行。以前と同様に、サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１４３】
検出限界：体細胞ＳＮＶの検出限界を、合成希釈による再現性サンプルを使用して評価する。腫瘍リードの割合（百分率）は、典型的には、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、および５０％のレベルで試行される。検出限界は、感度が９５％以上であるような最低純度の希釈度である。ＬｏＤが３０％以上の場合、ゲノム解析アルゴリズムは検証され（承認基準）、ＬｏＤが３０％未満の場合は拒絶される（非承認基準）。
【０１４４】
生殖系列ＳＮＶ検出の評価
【０１４５】
多数のサンプルでの生殖系列の正確性：生殖系列多様体コールの正確性を評価するために、ＳＮＶ試験で使用した２０名の異なる合成患者の遺伝子型を、マッチさせた正常データと共に３０％腫瘍サンプルを用いて評価する。好ましい態様において、承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、または９９％未満の特異性を示す任意のデータセット。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１４６】
再現性に関して、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプルを、再現性のために１０回試行することが企図される。承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：実測値と予測値との一致が９９．９９％未満を示す任意の試行。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１４７】
生殖系列検出限界：生殖系列多様体の対立遺伝子頻度は、腫瘍純度によって変化しないことから、検出限界を評価しなかった。
【０１４８】
体細胞インデルの評価
【０１４９】
多くのサンプルにおけるインデル感度、および特異性：検出限界における様々な患者の正確性を評価するために、２０名の異なる合成患者の体細胞多様体を３０％の腫瘍細胞純度でアッセイした。正確性を、変動性サンプル全体において評価する。承認基準は、次のとおり定義する：プールした結果は、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、または９９％未満の特異性を示す任意のデータセット。
【０１５０】
再現性：１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプル（例えば、正確性試験において使用するサンプル）を、再現性について、１０回試行する。承認基準は、全てのデータセットが最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならないことである。非承認基準は、実測値と予測値の間で９９．９９％未満の一致を示す任意のパイプライン試行である。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１５１】
インデル検出限界：体細胞ＳＮＶの検出限界を、合成希釈（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、および５０％の細胞純度）で評価を行う。検出限界は、感度が９５％以上であるような最低純度の希釈度である。ＬｏＤが３０％以上の場合、ゲノム解析アルゴリズムは検証され（承認基準）、ＬｏＤが３０％未満の場合は拒絶される（非承認基準）。
【０１５２】
生殖系列インデルの検出
【０１５３】
多数のサンプルでの生殖系列の正確性：生殖系列多様体コールの正確性を評価するために、インデル試験で使用する２０名の異なる合成患者の遺伝子型を、マッチさせた正常データと共に３０％腫瘍サンプルを用いて評価する。好ましい態様において、承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、９５％以上のＰＰＶ、９５％以上の感度、および９９％以上の特異性を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：９５％未満のＰＰＶ、９５％未満の感度、または９９％未満の特異性を示す任意のデータセット。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１５４】
再現性に関しては、１００％の腫瘍純度で単一の合成患者サンプルを、再現性に関して１０回試行することが企図される。承認基準は、次のとおり定義する：全てのデータセットが、最初の複製と次の複製との間で９９．９９％超の一致を示さなければならない。非承認基準は、次のとおり定義する：実測値と予測値との間で９９．９９％未満の一致を示す任意のデータセット。サンプルのうちのいずれかが承認基準を満たしていない場合は、全てを繰り返す必要がある。
【０１５５】
生殖系列検出限界：生殖系列多様体の対立遺伝子頻度は、腫瘍純度によって変化しないことから、検出限界を評価しなかった。
【０１５６】
いかなるコンピュータ向け言語も、サーバ、インタフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラ、または個別にもしくは集合的に動作する他のタイプのコンピューティングデバイスを含む、コンピューティングデバイスの任意の好適な組み合わせを含むように読みとるべきであることに留意すべきである。コンピューティングデバイスは、有形の一時的でないコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなど）に記憶されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを備えることを理解されたい。ソフトウェア命令は、開示の装置に関して以下に説明するように、役割、責任、または他の機能を提供するようにコンピューティングデバイスを構成することが好ましい。特に好ましい実施形態では、標準化プロトコールまたはアルゴリズムを使用する様々なサーバ、システム、データベース、インタフェース交換データは、おそらくＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公衆−秘密鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、既知の金融取引プロトコール、または他の電子情報交換法に基づく。データ交換は、好ましくは、パケット交換ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、または他の種類のパケット交換ネットワークを介して行われる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、通常の丸め技法を適用することによって解釈すべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、実施可能であり限り、正確に報告する。本発明のいくつかの実施形態において提示されている数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差に必然的に起因する特定の誤差を含み得る。さらに、かつ文脈がその反対を示さない限り、本明細書で説明する全ての範囲は、それらの終点を含むものと解釈すべきであり、かつ制限のない範囲は、商業的に実用的な値を含むものと解釈すべきである。同様に、文脈がその反対を示さない限り、値の全てのリストは中間値を含むものと考えるべきである。
【０１５８】
本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に記述した以外の多くのさらなる変更が可能であることは、当業者には明らかであるものとする。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈するにあたり、全ての用語を、文脈と一致する最も広い可能な様式で解釈すべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、要素、構成成分またはステップを非排他的な様式で参照するものと解釈され、参照された要素、構成成分またはステップが、明示的に参照されていない他の要素、構成成分、またはステップと共に存在してもよく、利用されてもよく、または組み合わせてもよいことを示す。本明細書および特許請求の全範囲で使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用されるとき、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。
【国際調査報告】
2019525308.tif 000026
2019525308.tif 000027
2019525308.tif 000028