(57)【要約】  本発明は、１種類以上のデフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログを投与することによって腸内微生物叢を調節するための方法、ならびに１種類以上のデフェンシンの経口投与による消化管炎症の予防または治療のための方法に関する。リラグルチドなどのＧＬＰ−１アナログ、ならびに哺乳動物または家禽のα−およびβ−デフェンシンは腸における微生物叢およびメタボロームの組成の変化を引き起こすことができ、従って消化管炎症、結腸直腸癌、メタボリック症候群、肥満、前糖尿病および糖尿病を治療または予防するために、あるいは肉生産における赤肉成長促進物質として、使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病、メタボリック症候群、全身性低度炎症、肥満、インスリン耐性、または耐糖能障害の治療のための方法であって、それを必要とする被験体への哺乳動物のα−デフェンシン、β−デフェンシン、またはそれらの生物活性フラグメントの投与を含む、方法。
【請求項２】
前記治療が、２型糖尿病、メタボリック症候群、肥満、インスリン耐性、または耐糖能障害の治療である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体への前記デフェンシンまたは生物活性フラグメントの投与が、経口である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
肥満の前記治療が、被験体の脂肪割合を低下することまたは脂肪割合の増加を防止することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
肥満の前記治療が、内臓脂肪および／または肝臓脂肪の量を防止することまたは低下すること、および／または腹囲の低下を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記治療が、体重の低下または体重増加の防止を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記治療が、空腹時血糖を低下することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
家畜における赤肉成長の促進のための方法であって、それを必要とする被験体への哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む、方法。
【請求項９】
前記家畜が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、カモ、ガチョウ、ハト、シチメンチョウ、ウズラおよびニワトリから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＤ５、ｈＢＤ２、切断ｈＢＤ２、ＨＤ６、ｈＢＤ１、ｈＢＤ３、ｈＢＤ４、デフェンシンのフラグメントおよびグリコシル化デフェンシンからなる群から選択される哺乳動物デフェンシンの投与を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記デフェンシンが、ＨＤ５および／またはｈＢＤ２である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記デフェンシンが、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）、アルブミン結合部分（ＡＢＭ）、検出可能部分（Ｚ）、および半減期延長ペプチドからなる群から選択される少なくとも１つの追加部分をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記追加部分が、半減期延長ペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記半減期延長ペプチドが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、トランスフェリン、アルブミン（ＨＡＳ）、ＸＴＥＮ（登録商標）またはＰＥＧ、ホモ−アミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ）、またはエラスチン用ペプチド（ＥＬＰ）、ヒアルロン酸、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のカルボキシ端ペプチド（ＣＴＰ）などの負電荷を有する高度アシル化ペプチド、ヒトＩｇＧ、およびｎが８〜２２であるＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−に結合できる分子からなる群からから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体が、３０以上などの、例えば３５以上の、４０以上などの、２５以上のＢＭＩを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体が、例えば０．８０〜０．８４の、少なくとも０．８５（女性）または少なくとも０．９０などの、例えば０．９〜０．９９の、１．００超（男性）などの、少なくとも０．８０のウェスト／ヒップ比を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体が、例えば少なくとも７．０ｍｍｏｌ／Ｌの、少なくとも６．１ｍｍｏｌ／Ｌの空腹時血糖を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、４２〜４６ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなどの、少なくとも４８ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなどの、少なくとも４２ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂの糖化ヘモグロビン量を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体が、以下の徴候：
・高血圧：≧１４０／９０ｍｍＨｇ、
・脂質異常：トリグリセリド（ＴＧ）≧１．６９５ｍｍｏｌ／Ｌおよび高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）≦０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）、≦１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）、
・中心性肥満：ウェスト：ヒップ比＞０．９０（男性）；＞０．８５（女性）、もしくは肥満度指数＞３０ｋｇ／ｍ２、ならびに
・微量アルブミン尿：尿中アルブミン排泄比≧２０μｇ／分もしくはアルブミン：クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇ、
の１つまたは複数を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記デフェンシンが、０．１ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ〜１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇの１日投与量でそれを必要とする被験体に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記デフェンシンが、０．１ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ〜１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇの１日投与量でそれを必要とする被験体に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記デフェンシンが、インスリン／インスリンアナログおよび／またはグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログおよび／またはグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）／ＧＬＰ−２アナログおよび／またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤および／またはメトホルミンおよび／またはナトリウム・グルコース共輸送体−２（ＳＧＬＴ−２）阻害剤および／またはグルカゴン受容体拮抗剤および／または一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）拮抗剤またはこれらの混合物との組み合わせで投与される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＬＰ−１アナログが、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記インスリンアナログが、リスプロ、アスパルト、グルリシン、デテミルインスリン、デグルデクインスリン、およびグラルギンインスリンから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記デフェンシンが、１日１回、１日２回、または１日３回それを必要とする被験体に投与される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記インスリン／インスリンアナログ、またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの前記投与が、皮下または筋肉内である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
それを必要とする被験体への前記デフェンシンの前記投与が、動物食餌中に混合される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
先行請求項のいずれかに記載の治療の方法における使用のための哺乳動物のα−デフェンシン、β−デフェンシン、またはこれらの生物活性フラグメント。
【請求項２９】
腸における共生バランス失調化微生物叢の処置または正常化のための方法であって、それを必要とする被験体への哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの投与を含む、方法。
【請求項３０】
腸内微生物叢の遺伝子豊富さを増加するための方法であって、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの投与を含む、方法。
【請求項３１】
腸内微生物叢の門数を増加するための方法であって、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの投与を含む、方法。
【請求項３２】
腸内微生物叢／メタボローム由来の単鎖脂肪酸の産生を増加するための方法であって、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの投与を含む、方法。
【請求項３３】
腸におけるバクテロイデス、フェカリバクテリウム、ロゼブリア、ブラウチア、ルミノコッカス、コプロコッカス、ビフィドバクテリウム、メタノブレビバクター、ラクトバチルス、アッカーマンシア、アロプレボテラ、アロバキュラム、およびユーバクテリウムからなる群から選択される属に属する細菌の数を増加するための方法であって、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの投与を含む、方法。
【請求項３４】
前記属が、ラクトバチルス、アッカーマンシア、アロプレボテラ、およびアロバキュラムから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
腸におけるバクテロイデス・フラギリス、ステレラ・ワーズワーシア、ベイロネラ・パルブーラ、エシェリシア・コリ、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、フソバクテリウム・ヌクレアタム、エイケネラ・コロデンス、およびジェミラ・モリビラムからなる群から選択される細菌の数を低下するための方法であって、デフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む、方法。
【請求項３６】
前記デフェンシンが、経口投与され、かつ好ましくは前記デフェンシンが、ヒトＨＤ５またはヒトβ−デフェンシン２である、請求項２９〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記ＧＬＰ−１アナログが、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドから選択され、好ましくはリラグルチドである、請求項２９〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記被験体が、３０以上などの、例えば３５以上の、４０以上などの、２５以上のＢＭＩを有する、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験体が、例えば０．８０〜０．８４の、少なくとも０．８５（女性）または少なくとも０．９０などの、例えば０．９〜０．９９の、１．００超（男性）などの、少なくとも０．８０のウェスト／ヒップ比を有する、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記被験体が、例えば少なくとも７．０ｍｍｏｌ／Ｌの、少なくとも６．１ｍｍｏｌ／Ｌの空腹時血糖を有する、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体が、４２〜４６ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなどの、少なくとも４８ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなどの、少なくとも４２ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂの糖化ヘモグロビン量を有する、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体が、以下の徴候：
・高血圧：≧１４０／９０ｍｍＨｇ、
・脂質異常：トリグリセリド（ＴＧ）≧１．６９５ｍｍｏｌ／Ｌおよび高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）≦０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）、≦１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）、
・中心性肥満：ウェスト：ヒップ比＞０．９０（男性）；＞０．８５（女性）、もしくは肥満度指数＞３０ｋｇ／ｍ２、ならびに
・微量アルブミン尿：尿中アルブミン排泄比≧２０μｇ／分もしくはアルブミン：クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇ、
の１つまたは複数を有する、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２９〜４２のいずれかに記載の治療の方法における使用のための、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種類以上のデフェンシンを経口投与することによって腸内微生物叢を調節または安定化するための方法に関する。本方法は、消化管炎症、結腸直腸癌、メタボリック症候群、肥満、前糖尿病、糖尿病および心臓血管疾患を治療または予防するため、ならびに肉生産における赤身成長の促進のために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
腸内微生物叢
肥満および肥満関連疾患のような一般的な障害の罹患率の増加は、我々の西欧化した生活様式および食事と強く関連している。最も顕著な肥満関連病は、インスリン耐性、顕性２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）および特定の癌である（Ｆａｕｌｄｓ＆Ｄａｈｌｍａｎ−Ｗｒｉｇｈｔ，２０１２）。これらの疾患の病因論は複雑であるが、それらの多くは低度炎症の一般的な状態によって特徴付けられ、それは調節不全化した腸内微生物叢から生じ得る（Ｅｖｅｒａｒｄ＆Ｃａｎｉ，２０１３、Ｂｅｌｋａｉｄ＆Ｈａｎｄ，２０１４）。現代のヒトの生活様式と動物の肉の生産との関連する課題はかけ離れていると思われかもしれないが、損なわれた腸健康が共通の特徴であることが予測される。調節不全化した腸健康は、肥満（Ｒｉｄａｕｒａら，２０１３）、２型糖尿病（Ｑｉｎら，２０１２）、関節リウマチ（Ｚｈａｎｇら，２０１５）および結腸直腸癌（Ｆｅｎｇら，２０１５）のような一連の多様な疾患と実際に関連している。最近、腸内微生物叢、および特にバクテロイデス属由来の特定のリポポリサッカライドの存在と、フィンランドにおける近隣領域と比べて高い１型糖尿病発生率の間の関連が報告されている（Ｌｅｖｉｔｅｎ２０１６）。
【０００３】
肥満および付随する低度炎症は、調節不全化した代謝ホメオスタシスの強い推進力を形成する。Ｔｕｒｎｂａｕｇｈら（２００６）は、肥満関連微生物叢がエネルギー回収の増加した能力を有し、肥満マウスからの微生物叢の移植後２週間で、無菌マウスが痩せたマウスからの同様な移植に比べて脂肪量の有意な増加を示すことを発見した。Ｔｕr nｂａｕｇｈら（２００８）はさらにおよび重要なこととして、腸内微生物叢組成における変化が、高い脂肪／糖「西欧」食を一時的に与えられたマウスを当初の食餌に戻した後で完全に戻ったことを発見した。これらの発見は、Ｖｒｉｅｚｅら（２０１２）によってヒトで確認され（２０１２）、彼らは、痩せたヒトドナー由来の腸内微生物叢の移行が、メタボリック症候群を有する個体におけるインスリン感受性を増加させたことを実証した。
【０００４】
体重および体重増加率を高めるための腸内微生物叢の操作は、低用量抗生物質およびラクトバチルス・イングルビエイなどのプロバイオティックスの使用を通して、農業用家畜で長年使用されている。体重増加のための腸内微生物叢操作は、ニワトリ（Ｋｈａｎら，２００７）、カモ（Ａｎｇｅｌａｋｉｓ＆Ｒａｏｕｌｔ，２０１０）、およびマウス（Ａｎｇｅｌａｋｉｓら，２０１２）で実証されている。ヒトでは、抗生物質を受ける乳児はそれらの対照よりも大きいことも見出されており（Ｔｒａｓａｎｄｅら，２０１２）、一方、経口抗生物質への早期暴露は小児における過体重と関連している（Ａｊｓｌｅｖら，２０１４）。そして妊婦では、脂肪症の生理学的な増加および妊娠３ヶ月における妊娠性糖尿病の発症可能性が、腸内微生物叢における重大な変化と関連していると考えられる（Ｋｏｒｅｎｒａら，２０１２）。
【０００５】
腸内粘膜は外部環境に暴露される極めて広い最大の体表面（約２００ｍ２）である。そのため、腸表面は異物、我々の食事由来の代謝物、および我々の腸に生息する推定１０１４個の細菌−腸内微生物叢−と緊密に接触している。このため、腸内障壁は不断の強い免疫監視の下にあり、免疫系、食事成分、および腸内微生物叢の間の動的相互干渉を必要としている。食物介入は免疫調節（Ｍｏｗａｔ＆Ａｇａｃｅ，２０１４）および腸内微生物叢組成（Ｗａｌｔｅｒ，２０１５）に多大な影響を有し、これらはともに独立しておよび相乗的に代謝ホメオスタシスに影響を及ぼす。これに関して、２件のごく最近の論文が、微生物叢調節される変化における食物添加物の代謝ホメオスタシスに対する（有害な）潜在力を強調している。最近の論文（Ｃｈａｓｓａｉｎｇら，２０１５）は、食事がいかに耐糖能を損ない、そのため体重増加ならびに調節不全化した腸内微生物叢の誘発による大腸炎感受性を高めるかを説明した。観察結果は無菌（ＧＦ）マウスでは再現できず、腸内微生物叢についての重要な役割を示唆する。同様に、Ｓｕｅｚら（２０１４）は最近、ノンカロリー人工甘味料がどのように腸内微生物叢の変化を通して代謝機能不全を誘発するかを示した。この筆者らは、ＧＦマウスへの糞便移行によってこれらの結果を検証し、その後にＧＦマウスは直ちに耐糖能障害を発症した。これらの観察結果は、代謝健全性の維持における腸内微生物叢の役割を明確にした、ＧＦマウスにおける先駆的な研究（Ｂaｃｋｈｅｄら，２００７）を反映する。この研究は、共生微生物叢の不存在では、これによって不均衡な粘膜免疫ホメオスタシスが生じ、高脂肪食に応答して脂肪組織のサイズおよび機能が低下することを示した。健全な表現型として通常は現れる体重増加の欠如に関わらず、異所的な脂質蓄積（脂肪肝および血中トリグリセリド量の増加）は重篤な代謝障害をもたらした。ヒトでは、微生物叢の遺伝子豊富さが健全な表現型と関連し、一方で遺伝子不足（低い遺伝子数）は代謝障害のリスク増加と相互関連することが示されている（Ｌｅ  Ｃｈａｔｅｌｉｅｒら，２０１３）。
【０００６】
デフェンシン
デフェンシンは、健全なマイクロバイオームを維持し潜在的な病原体を取り除くように働く有力な生来のホスト防御の一つを代表する（Ｗｅｈｋａｍｐら，２００２およびＳａｌｚｍａｎら，２００７）。デフェンシンはグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、真菌、および古細菌に対する抗微生物活性、ならびに抗炎症性サイトカインを増加させ炎症性サイトカインを減少させる抗炎症活性を有するペプチドである。
【０００７】
ヒトデフェンシンは、小さなカチオン性ペプチドであり、それらの３つの分子内システインジスルフィド結合の位相に基づいてα−およびβ−デフェンシンに分けられる。ヒトα−デフェンシンはさらに、好中球顆粒（ＨＮＰ１−４）から最初に分離されたもの、および小腸の陰窩におけるパネート細胞によって発現される腸α−デフェンシン（ＨＤ５およびＨＤ６またはＤＥＦＡ５およびD E ＦＡ６）に細分化できる。β−デフェンシンは（ＤＥＦＢｎ）は皮膚、眼、中耳、口、気管、肺、胃腸管、肝臓、泌尿生殖器系、腎臓、膣、膵臓および乳腺を含む様々な組織および器官における上皮細胞によって主に産生される。最も特徴付けされているヒトβ−デフェンシンファミリーのメンバーはｈＢＤ１〜４である。ヒトデフェンシンのいくつかは構成的に産生されるが、一方、他は炎症促進性サイトカインまたは外因性微生物産物によって誘発される。ヒトデフェンシンのいくつかは、妊娠期間とともに増加する量で羊水中で既に発現され、子宮中で胎児を保護する。母乳および特に初乳である乳汁はα−およびβ−デフェンシンの両方を含むが、これらのいくつかのみが母乳に著しい濃度で認められる（Ａｒｍｏｇｉｄａら，２００４）。
【０００８】
Ｌｉｕら（２００８）は、ＨＮＰ−１およびＨＮＰ−２がともに白血球によって産生され、血液中のα−デフェンシンの下位グループに属しており、従来のインスリンシグナル化経路とは明確に異なる細胞内メカニズムによって、分離された肝細胞中でグリコーゲン分解および糖新生を阻害できたことを発見した。
【発明の概要】
【０００９】
本開示は、経口投与される哺乳動物の腸α−およびβ−デフェンシンが、高脂肪食を与えられたマウスの腸において正常な微生物叢を維持する能力を有することを実証する。例におけるデータは、哺乳動物α−および／またはβ−デフェンシンの経口投与が共生バランス失調化微生物叢の安定化および正常化をもたらすことを実証した。デフェンシンは従って、結腸直腸癌、内分泌、栄養、代謝、または心臓血管の疾患の治療または予防あるいは肉生産における赤肉の成長促進に有用である。
【００１０】
例１および３で示されるように、ヒトα−デフェンシン５（ＨＤ５）またはヒトβ−デフェンシン２（ｈＢＤ２）の経口投与は、高脂肪食で維持されたマウスにおける体重増加を防止または低下する。動物モデルは、メタボリック症候群および初期２型糖尿病のモデルである。処置されない場合、マウスは高脂肪食を与えられたとき、脂肪、特に腹部脂肪および肝脂肪を蓄積することによって肥満を発症する。マウスはインスリン耐性、および耐糖能障害などの、糖尿病の徴候をさらに発症する。
【００１１】
食餌中にＨＤ５またはｈＢＤ２がないと、動物は高脂肪食でかなり体重が増加し、最終的に糖尿病または肥満の徴候を発症する。体重増加の低下は脂肪量の蓄積の低下として生じた。ＨＤ５またはｈＢＤ２の投与を受ける動物は、高脂肪食の未処置動物と比べて、耐糖能の増加およびインスリン耐性の低下を示す。
【００１２】
同様に、例は、共生バランス失調化微生物叢を有する動物へのＨＤ５の経口投与が、微生物叢を少なくとも部分的に正常化できることを実証する。従って、ＨＤ５および他のデフェンシンは、共生バランス失調化微生物叢の正常化または微生物叢の正常化のために使用できる。高脂肪食および高い糖含量を有する食物は共生バランス失調化微生物叢を誘発することが知られている。このため、デフェンシンはこのような共生バランス失調化微生物叢を処置するために使用できる。デフェンシンはまた、例えば抗生物質治療、免疫抑制治療、化学療法、免疫療法、または放射線療法などの微生物叢に負の影響を及ぼすことが予測される治療を受ける被験体のために予防的にも使用できる。
【００１３】
一つの態様は非ヒト動物における消化管炎症の治療のための方法に関し、本方法は、それを必要とする被験体へのデフェンシン、哺乳動物または家禽のα−および／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。
【００１４】
一つの態様はヒトにおける消化管炎症の治療のための方法に関し、本方法は、それを必要とする被験体へのデフェンシン、哺乳動物または家禽のα−および／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。
【００１５】
一つの態様は消化管炎症の治療のための方法に関し、ここで炎症は動物の口、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、および／または肛門管に局在し、本方法は、それを必要とする被験体に、デフェンシン、哺乳動物または家禽α−および／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。
【００１６】
一つの態様は腸における正常な微生物叢組成を維持するための方法に関し、本方法は、それを必要とする被験体へのデフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００１７】
一つの態様は腸における共生バランス不調化微生物叢の処置のための方法に関し、本方法は、それを必要とする被験体へのデフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００１８】
一つの態様は腸内微生物叢の遺伝子豊富さを増加するための方法に関し、本方法は、デフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００１９】
一つの態様は腸内微生物叢の門数を増加するための方法に関し、本方法は、デフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００２０】
一つの態様は腸内微生物叢における単鎖脂肪酸の産生を増加するための方法に関し、本方法は、デフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００２１】
一つの態様は腸内微生物叢における酪酸産生を増加または酢酸産生を低下するための方法に関し、本方法は、デフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００２２】
一つの態様は、腸におけるバクテロイデス、フェカリバクテリウム、ロゼブリア、ブラウチア、ルミノコッカス、ビフィドバクテリウム、メタノブレビバクター、ラクトバチルス、コプロコッカス、クロストリジウム、アロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、ユーバクテリウムからなる群から選択される属に属する細菌の数を増加するための方法に関し、本方法は、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。好ましくは、細菌の属はアロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、およびラクトバチルスの１種類以上を含む。
【００２３】
一つの態様は、腸におけるバクテロイデス・フラギリス、ステレラ・ワーズワーシア、ベイロネラ・パルブーラ、エシェリシア・コリ、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、フソバクテリウム・ヌクレアタム、エイケネラ・コロデンス、ジェミラ・モリビラムからなる群から選択される細菌数を低下するための方法に関し、本方法は、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量の投与を含む。
【００２４】
一つの態様は、結腸直腸癌、内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患の治療のための方法に関し、本方法は、それを必要とする被験体へのデフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。デフェンシンが肥満および２型糖尿病の様々な徴候を治療するために使用できる、または微生物叢を正常化するために使用できるとき、これらはまた、上記の障害の１つまたは複数に罹患するリスクを低下できる。
【００２５】
一つの態様は、動物肉生産における赤肉成長の促進のための方法に関し、本方法は、それを必要とする被験体へのデフェンシン、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。本態様は、肥満マウスへのＨＤ５またはｈＢＤ２の投与が脂肪割合の低下をもたらす、すなわちデフェンシンが脂肪成長よりも赤肉成長に寄与するという証拠によって裏付けられる。
【００２６】
一つの態様は、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンを含む組成物に関する。
【００２７】
一つの態様は、少なくとも１種類の哺乳動物のα−またはβ−デフェンシンを、インスリン／インスリンアナログおよび／またはグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログおよび／またはグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）／ＧＬＰ−２アナログおよび／またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤および／またはメトホルミンおよび／またはナトリウム・グルコース共輸送体−２(S G L T-2)阻害剤および／またはグルカゴン受容体拮抗剤および／または一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）拮抗剤あるいはこれらの組み合わせのいずれかと組み合わせて含む組成物に関する。一つの態様では、デフェンシンはＨＤ５またはｈＢＤ２である。
【００２８】
一つの態様は、化学療法、免疫療法、放射線療法またはこれらの組み合わせと併用して使用するための少なくとも１種類の哺乳動物のα−またはβ−デフェンシンを含む組成物に関する。一つの態様では、デフェンシンはＨＤ５またはｈＢＤ２であり、好ましくはこのときデフェンシンは経口投与される。
【００２９】
ヒトβ−デフェンシン２を含むデフェンシンは強い抗炎症剤であることが、従来技術で知られている（ＷＯ２０１０／００７１６５）。本発明者らは、経口投与されたヒトβ−デフェンシン２の抗肥満および抗糖尿病効果を実証している。別の腸ホルモンであるＧＬＰ−１、およびリラグルチドなどのＧＬＰ−１アナログも同様に肥満および糖尿病を治療するために使用できる。本発明者らは例４において、非経口投与されたリラグルチドは、様々な炎症性および抗炎症性サイトカインに影響を有さないことを示す。従って、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アナログはデフェンシンと比べて異なる作用機序を有する。従って、本発明者らは、本明細書で説明される徴候を治療するために、少なくとも１種類のデフェンシンと少なくとも１種類のＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アナログの組み合わせを投与することを考えている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】マウス代謝における哺乳動物のα−および／またはβ−デフェンシンの効果を検討するための実験設定の概要を示す図である。−１週に、ケージあたり３匹および群あたりケージであるように、Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊマウスを群およびケージに分けた。−１〜０週の間、マウスを磁気共鳴スキャンによって臨床的に検査して脂肪分布を評価した。０、１、および４週目に、糞便のマイクロバイオームを分析した。４週目に、マイクロバイオームの分析に加えて、マウスをスキャンし、血中グルコースおよびインスリン量を測定した。６週目に、エネルギー消費を、糞便の窒素および脂質含量を分析することによって評価した。７週目に、インスリン耐性試験（ＩＴＴ）を実施した。８週目に、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）およびグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を実施した。９週目（終了時）に、いくつかの分析を実施し、特に、マウスの重量を測定してスキャンし、血漿成分ならびに結腸、盲腸、および小腸の微生物叢組成を評価した。さらに、組織学的分析およびタンパク質／ＲＮＡ分析を筋組織（四頭筋）、ｉＷＡＴ、ｅＷＡＴ、ｉＢＡＴ、肝臓、結腸、空腸、回腸、および十二指腸で実施した。
【図１Ｂ】マウス代謝における哺乳動物のα−および／またはβ−デフェンシンの効果を検討するための実験設定の概要を示す図である。−１週に、Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊマウスが届いた。０週に、糞便を収集した。０〜１２週の馴らし期間中、マウスに高脂肪食を与えた。１２週目に、マウスを磁気共鳴スキャンによって臨床的に検査して脂肪分布を評価し、糞便を収集し、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）およびグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を実施した。１３−０週目に、マウスをケージあたり４匹および群あたり３ケージで群およびケージに分けた。０、１２、および１３−１０週目に、糞便のマイクロバイオームを分析した。１３−２、１３−４、１３−６、１３−８および１３−１０週目（終了時）に、マウスをスキャンし、血糖およびインスリン量を測定した。１３−９週目に、インスリン耐性試験（ＩＴＴ）を実施した。１３−１０週目に、いくつかの分析を実施し、特にマウスの重量を測定しスキャンし、血漿成分ならびに結腸、盲腸、および小腸の微生物叢組成を評価した。さらに、ｉＷＡＴ、ｅＷＡＴおよび肝臓重量を測定した。
【図２】ヒトβ−デフェンシン１〜４のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（２．１）多重配列アラインメントを示す図である。
【図３】ヒトα−デフェンシン５および６のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（２．１）多重配列アラインメントを示す図である。
【図４】ヒト好中球ペプチド１〜３のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（２．１）多重配列アラインメントを示す図である。
【図５】ヒト、アカゲザル、マカク、チンパンジーおよびオランウータンのβ−デフェンシン２のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（２．１）多重配列アラインメントを示す図である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントにおいて、＊は単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、：は以下の「強い」グループの一つが完全に保存されることを示し：Ｓ，Ｔ，Ａ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｈ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ；Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｖ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｆ；Ｈ，Ｙ；Ｆ，Ｙ，Ｗ、．は以下の「より弱い」グループの一つが完全に保存されることを示す：Ｃ，Ｓ，Ａ；Ａ，Ｔ，Ｖ；Ｓ，Ａ，Ｇ；Ｓ，Ｔ，Ｎ，Ｋ；Ｓ，Ｔ，Ｐ，Ａ；Ｓ，Ｇ，Ｎ，Ｄ；Ｓ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｋ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ；Ｈ，Ｆ，Ｙ。
【図６】低脂肪食（ＬＦＤ）、高脂肪食（ＨＦＤ）またはＨＦＤおよびデフェンシンｈＢＤ２（ＨＦＤ＋Ｐ２）によるマウスの７週間処置における体重変化（Ａ）および体重発達（Ｂ）および累積食餌摂取（Ｃ）を示す図である。Ａ：体重変化。Ｎ＝１２。両ＨＦＤはＬＦＤ対照群と有意に異なる。アスタリスクはＨＦＤとＨＦＤ＋Ｐ２の間の差を示す。両ＨＦＤは週ｗからＬＦＤと有意に差がある（ｐ＜０．００１）。二元配置分散分析、テューキー事後検定。Ｂ：体重発達。Ｎ＝１２。両ＨＦＤはＬＦＤ対照群と有意に異なる。アスタリスクはＨＦＤとＨＦＤ＋Ｐ２の間の差を示す。両ＨＦＤは週ｗからＬＦＤと有意に差がある（ｐ＜０．００１）。二元配置分散分析、テューキー事後検定。Ｃ：累積食餌摂取：ＬＦＤ対照群はＨＦＤ群と比べて食餌ｇあたり同量のスクロースおよびタンパク質の両方を有する。
【図７】低脂肪食（ＬＦＤ）、高脂肪食（ＨＦＤ）またはＨＦＤおよびデフェンシンｈＢＤ２（ＨＦＤ＋Ｐ２）によるマウスの７週間処理における赤肉／脂肪量発達を示す図である。（Ａ）１週目および７週目での赤肉量発達。（Ｂ）１週目および７週目での脂肪量発達。Ａ：赤肉−１週目および７週目。Ｎ＝１２。一元配置分散分析。テューキー事後検定。Ｂ：脂肪−１週目および７週目。Ｎ＝１２。一元配置分散分析。テューキー事後検定。
【図８】低脂肪食（ＬＦＤ）、高脂肪食（ＨＦＤ）またはＨＦＤとデフェンシンｈＢＤ２（ＨＦＤ＋Ｐ２）によるマウスの７週間処理におけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（Ａ）インスリン耐性試験（ＩＴＴ）。（Ｂ）経口耐糖能試験。（Ｃ）グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。（Ｄ）５時間空腹インスリン試験。Ａ：食餌開始後７週でのインスリン耐性試験。群あたりＮ＝６。ＨＦＤをＬＦＤ対照群と比較する。統計学的に有意な変動のみを示す。上部曲線の上のアスタリスクはＨＦＤとＬＦＤの間の差を示す。Ｂ：食餌開始後７週での耐糖能試験。群あたりＮ＝１１〜１２。ＨＦＤをＬＦＤ対照群と比較する。統計学的に有意な変動のみを示す。上部曲線の上のアスタリスクはＨＦＤとＬＦＤの間の差を示し、中間の曲線の下のアスタリスクはＨF D＋２ＰとＬＦＤの間の差を示す。Ｃ：食餌開始後７週でのグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＴＴの期間中）。群あたりＮ＝１１〜１２。ＨＦＤをＬＦＤ対照群と比較する。統計学的に有意な変動のみを示す。上部曲線の上のアスタリスクはＨＦＤとＬＦＤの間の差を示す。ＨＦＤ＋Ｐ２およびＬＦＤはいずれの時点でも統計学的に有意でない。Ｄ：食餌開始後７週での５時間空腹試験。群あたりＮ＝１１〜１２。Ａ〜Ｃ：二元配置分散分析。ダネット事後検定。Ｄ：一元配置分散分析。テューキー事後検定。
【図９Ａ−９Ｃ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での予防的処置（高脂肪＋ｈＢＤ-２）によるマウスの１０週処置における、体重発達（ａ）、食餌効率（ｂ）およびエネルギー摂取（ｃ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ-２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ-２＝Ｃ。９Ａ．体重発達。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）９Ｂ．食餌効率（ケージにおける平均食物摂取で調整した増加体重のｇ）。テューキー補正による一元配置分散分析、注意！共ケージのためｎ＝４。９Ｃ．エネルギー摂取。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）
【図１０Ａ−１０Ｃ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での予防的処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によるマウスの１０週処置における、全体重の割合としての脂肪（ａ）、グラムでの肝臓重量（ｂ）、およびグラムでの精巣上体脂肪（ｅＷＡＴ）の重量（ｃ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ。１０Ａ．異なる週における全体重の脂肪割合。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１０Ｂ．終了時の精巣上体脂肪組織（内臓ＡＴ）の重量。テューキー補正による一元配置分散分析。１０Ｃ．終了時重量。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図１１Ａ−１１Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での予防的処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によって１０週間処置されたマウスにおけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（ａ）経口耐糖能試験。（ｂ）グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ。１１Ａ．７週目の経口耐糖能試験。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１１Ｂ．ＯＧＧＴの期間に得られた７週目のグルコース刺激性インスリン分泌。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図１２Ａ−１２Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での予防的処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によって１０週間処置されたマウスにおけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（ａ）インスリン耐性試験（ＩＴＴ）。（ｂ）ＨＯＭＡ−ＩＲ。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ１２Ａ．８週目のインスリン耐性試験。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１２Ｂ．９週目のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図１３Ａ−１３Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での介入処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によるマウスの１０週間処置における体重発達（ａ）および体重変化（ｂ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ。１３Ａ．体重発達。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１３Ｂ．馴らし期間の最後の１３週目から実験食での次の１０週における体重変化。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図１４Ａ−１４Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での介入処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によるマウスの１０週間処置における全体重の割合としての脂肪（ａ）およびグラムでの０〜４週の脂肪％の変化（ｂ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ１４Ａ．異なる週における全体重の脂肪割合。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１４Ｂ．馴らし期間の最後から実験食での４週における脂肪割合の変化。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図１５Ａ−１５Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での介入処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によるマウスの１０週間処置における、グラムでの肝臓重量（ａ）およびグラムでの精巣上体脂肪（ｅＷＡＴ）の重量（ｂ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ。１５Ａ．終了時の肝臓重量。テューキー補正による一元配置分散分析。１５Ｂ．終了時の精巣上体脂肪組織（内臓脂肪）の重量。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図１６Ａ−１６Ｃ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンｈＢＤ２での介入処置（高脂肪＋ｈＢＤ２）によって１０週間処置されたマウスにおけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（ａ）ケージ１からの経口耐糖能試験。（ｂ）マウスＤ１からの経口耐糖能試験。（ｃ）インスリン耐性試験（ＩＴＴ）。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ｈＢＤ２＝Ｃ。１６Ａ．馴らし期間の最後（１３−０週）から２週おきに繰り返された経口耐糖能試験であり、高脂肪＋ｈＢＤ２群の第一ケージを示す。１６Ｂ．馴らし期間の最後（１３−０週）から２週おきに繰り返された経口耐糖能試験であり、高脂肪＋ｈＢＤ２群のマウスＤ１のみを示す。１６Ｃ．９週目のインスリン耐性試験を示す。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図１７Ａ−１７Ｃ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での予防的処置（高脂肪＋ＨＤ５）によるマウスの１０週間処置における、体重発達（ａ）、食餌効率（ｂ）およびエネルギー摂取（ｃ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。１７Ａ．体重発達。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１７Ｂ．食餌効率（ケージにおける平均食物摂取で調整した増加体重のｇ）。テューキー補正による一元配置分散分析、注意！共ケージ飼育のためｎ＝４。１７Ｃ．エネルギー摂取。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図１８Ａ−１８Ｃ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での予防的処置（ＨＤ５）によるマウスの１０週間処置における、全体重の割合としての脂肪（ａ）、グラムでの肝臓重量（ｂ）、およびグラムでの精巣上体脂肪（ｅＷＡＴ）の重量（ｃ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。１８Ａ．異なる週における全体重の脂肪割合。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１８Ｂ．終了時の肝臓の重量。テューキー補正による一元配置分散分析。１８Ｃ．終了時の精巣上体脂肪組織（内臓ＡＴ）の重量。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図１９Ａ−１９Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での予防的処置（高脂肪＋ＨＤ５）によって１０週間処置されたマウスにおけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（ａ）経口耐糖能試験。（ｂ）グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。１９Ａ．７週目の経口耐糖能試験。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。１９Ｂ．ＯＧＴＴ期間中に得られた７週目のグルコース応答性インスリン分泌。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図２０Ａ−２０Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での予防的処置（高脂肪＋ＨＤ５）によって１０週間処置されたマウスにおけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（ａ）インスリン耐性試験（ＩＴＴ）。（ｂ）ＨＯＭＡ−ＩＲ。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。２０Ａ．８週目のインスリン耐性試験。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。２０Ｂ．９週目のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ）。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図２１Ａ−２１Ｂ】例１における４種の処置：ＨＤ５を伴う高脂肪食−ＨＦ  ＨＤ５；ｈＢＤ２を伴う高脂肪食−ＨＤ  ｈＢＤ２；高脂肪食−未処置：ＨＦ；低脂肪食：ＬＦについて１週（Ｗｋ１）〜１０週（Ｗｋ１０）の変化を示す図である。１週（２１Ａ）および１０週（２１Ｂ）での微生物叢のウェート付したｕｎｉｆｒａｃ分析、すなわち微生物種の相対量。Ｈ F D＋ＨＤ５給餌マウスからの微生物叢は徐々に、ＬＦＤ給餌マウスの微生物叢、すなわち微生物叢の正常化に近づいた。略号：Ｗｋ１−１週目、Ｗ１０−１０週目。
【図２１Ｃ】変化に寄与する微生物叢の種を示す図である。微生物叢の変化は主に、アロバキュラムおよびラクトバチルスの量の増加およびクロストリジウムの量の低下によって引き起こされた。アロバキュラムは単鎖脂肪酸を産生する種である。ラクトバチルスは抗炎症特性を有する細菌である。
【図２２Ａ−２２Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での介入処置（高脂肪＋ＨＤ５）によるマウスの１０週間処置における、体重発達（ａ）および体重変化（ｂ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。２２Ａ．体重発達。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。２２Ｂ．馴らし期間の最後の１３週から実験食での次の１０週における体重変化。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図２３Ａ−２３Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での介入処置（高脂肪＋ＨＤ５）によるマウスの１０週間処置における、全体重の割合としての脂肪（ａ）およびグラムでの０〜４週の脂肪％の変化（ｂ）を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。２３Ａ．異なる週における全体重の脂肪割合。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。２３Ｂ．馴らし期間の最後〜実験食での４週目の脂肪割合の変化。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図２４Ａ−２４Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での介入処置（高脂肪＋ＨＤ５）によるマウスの１０週間処置における、グラムで肝臓重量（ａ）およびグラムでの精巣上体脂肪（ｅＷＡＴ）の重量を示す図である。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。２４Ａ．終了時の肝臓重量。テューキー補正による一元配置分散分析。２４Ｂ．終了時の精巣上体脂肪組織（内臓ＡＴ）の重量。テューキー補正による一元配置分散分析。
【図２５Ａ−２５Ｂ】低脂肪食（低脂肪）、高脂肪食（高脂肪）または高脂肪食およびデフェンシンＨＤ５での介入処置（高脂肪＋ＨＤ５）によって１０週間処置されたマウスにおけるグルコースホメオスタシスを示す図である。（ａ）ケージ２からの経口耐糖能試験。（ｂ）インスリン耐性試験（ＩＴＴ）。有意性：低脂肪対高脂肪＝Ａ、低脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｂ、高脂肪対高脂肪＋ＨＤ５＝Ｃ。２５Ａ．馴らし期間の最後（１３−０週）から２週おきに繰り返された経口耐糖能試験であり、高脂肪＋ＨＤ５群の第二ケージを示す。２５Ｂ．９週目のインスリン耐性試験。テューキー補正による二元配置分散分析（層化した対応値）。
【図２６】マウス消化管炎症および微生物叢に対するＧＬＰ−１アナログ（リラグルチド）の効果を検討するための実験設定の概略を示す図である。−４０週にＣ５７／ＢＩ／６Ｊ  ＤＩＯマウスが到着した。マウスに高脂肪食である６０％脂肪のＳＳＮＩＦＦ（Ｄｉｅｔ  Ｎｏ．Ｄ１２４９２）またはｐｕｒｉｎａ  ｃｈｏｗを３８週間与え、平均体重が５５ｇに達した。−２週からマウスを単独で飼育した。糞便サンプルを１６Ｓ  ＲＮＡ分析用に−１日目および２７日目に収集した。腸骨由来のサンプルを２８日目に盲腸から２ｃｍで収集した。
【図２７Ａ】例４からのマイクロバイオーム分析の結果を示す図である。マウスをリラグルチドまたは賦形剤（ＤＩＯ賦形剤）で４週間処置した。−１日および２８日目の微生物叢のウェート付していないｕｎｉｆｒａｃ解析は、実験の開始から最後までの２つの処置群のマイクロバイオームにおける変化を説明する。ＨＦＤおよびリラグルチドが与えられたマウスからの微生物叢は徐々に、ＬＦＤが与えられたマウスの微生物叢に近づいたが、一方、賦形剤処置マウスの微生物叢は試験中に変化しなかった。
【図２７Ｂ】加えられた微生物叢の種による微生物叢の変化を示す図である。変化はアッカーマンシアおよびアロプレボテラの量の増加によって主に引き起こされた。アッカーマンシアは単鎖脂肪酸産生種である。
【図２８】雌ＮＭＲＩマウスへの４ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２経口投与後の薬理動態データを示す図である。Ｙ軸はｈＢＤ２をμｇ／ｇ組織で示す。結果を群平均±ＳＥＭで示す。
【図２９】それぞれ１ｍｇ／ｋｇの皮下（ＳＣ）および静脈内（ＩＶ）投与後のｈＢＤ２に関する薬理動態データを示す図である。Ｙ軸はｈＢＤ２をμｇ／ｍＬで示す。異なる曲線は、異なる実験および異なる方法（ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡ）を表す。
【図３０】それぞれ１６．５ｍｇ／ｋｇの皮下および静脈内投与後の「ｈＢＤ２−アルブミン融合Ｎ端」に関する薬物動態データを示す図である。Ｙ軸は融合タンパク質の濃度をμｇ／ｍＬで示す。結果は４匹のマウスの平均／サンプリング時間±ＳＤである。
【図３１】それぞれ１６．５ｍｇ／ｋｇの皮下および静脈内投与後の「ｈＢＤ２−アルブミン融合Ｃ端」に関する薬物動態データを示す図である。Ｙ軸は融合タンパク質の濃度をμｇ／ｍＬで示す。結果は４匹のマウスの平均／サンプリング時間±ＳＤである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
デフェンシン：本明細書で使用される用語「デフェンシン」は、抗微生物ペプチドのデフェンシン系に属すると従来技術の当業者によって認識されるポリペプチドを指す。デフェンシンはα−デフェンシン系またはβ−デフェンシン系に属する。デフェンシンの例は、すべてα−デフェンシン系に属する、ヒト腸α−デフェンシン５（ＨＤ５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ヒトα−デフェンシン６（ＨＤ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ヒト好中球ペプチド１（ＨＮＰ−１）、ヒト好中球ペプチド２（ＨＮＰ−２）、ヒト好中球ペプチド３（ＨＮＰ−３）；またはβ−デフェンシン系に属するヒトβ−デフェンシン１（ｈＢＤ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ヒトβ−デフェンシン２（ｈＢＤ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ヒトβ−デフェンシン３（ｈＢＤ３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ヒトβ−デフェンシン４（ｈＢＤ４、ＳＥＱ  ＩＤ：ＮＯ．７）、チンパンジーβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、マカクβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、オランウータンβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、マウスβ−デフェンシン３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）、ウマβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ブタβ−デフェンシン１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ヤギβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、ウシβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ニワトリβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ヒトカテリシジン由来のヒトＬＬ３７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、および切り詰められたｈＢＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を含む。デフェンシンはグリコシル化され得、かつデフェンシンはタンパク質分解によって、より小さい生物活性フラグメントに切断され得る。グリコシル化デフェンシンおよびデフェンシンフラグメントもまた、本開示の範囲内に含まれる。
【００３２】
デフェンシンは前駆体として発現され、シグナルペプチド、および場合によりプロペプチドの切断によってプロセスされ、その後細胞外空間へ分泌される。前述の特定配列は、予測される成熟生物活性デフェンシンを示す。プロセシングは細胞間で異なり得、かつ得られる分泌される成熟ペプチドは予測配列と１または２個のＣ−またはＮ−端アミノ酸によって異なるが依然として生物活性を保持し得ることが、従来技術の当業者によって理解されるであろう。
【００３３】
消化管：消化管は、食物を消化器官に移動するために動物により使用される管であり、消化器官自体を含む。本明細書で使用されるヒト消化管は、口、食道、胃、十二指腸、空調、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管からなる消化器系を指す。いくつかの実施形態は、ヒト消化管の一部、特に口、食道、胃、十二指腸、空調、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管を指す。他の実施形態は、結腸を除くこれらのすべての部分を指す。本明細書で言及される反芻動物消化管は、口、食道、胃、十二指腸、空調、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管からなる消化管であるが、胃が４つの区画である反芻胃、第二胃、第三胃、および皺胃に分けられるという事実によって特徴付けられる。本明細書で言及される家禽消化管は、食道、胃、十二指腸、空調、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管からなる消化管であるが、胃が前胃または真胃および砂嚢に分けられるという事実によって特徴付けられる。いくつかの例では、素嚢と呼ばれる食道に沿った筋肉嚢が存在する。
【００３４】
グルカゴン様ペプチド−１：ＧＬＰ−１は神経ペプチドでありプログルカゴン遺伝子の転写産物に由来するインクレチンである。末梢におけるＧＬＰ−１の主な起源は腸Ｌ細胞であり、それはＧＬＰ−１を腸ホルモンとして分泌する。ＧＬＰ−１の生物学的な活性型は、ＧＬＰ−１−（７〜３７）およびＧＬＰ−１（７〜３６）ＮＨ２である。これらのペプチドはプログルカゴン分子の選択的切断から生じる。
【００３５】
回腸Ｌ細胞によるＧＬＰ−１分泌は、小腸の腔での栄養物の存在に依存する。このホルモンの分泌促進物質（分泌を生じるまたは刺激する物質）は、炭水化物、タンパク質および脂質のような主栄養物を含む。循環血液中に入ると、ＧＬＰ−１は酵素ジペプチジルペプチダーゼ−４による急速な分解のため、２分未満の半減期を有する。
【００３６】
ＧＬＰ−１は有力な抗高血糖ホルモンであり、グルコースの上昇に応答して膵臓のβ細胞を誘発してホルモンインスリンを放出し、一方でグルカゴン分泌を抑制する。このようなグルコース依存性作用は特に魅力的であり、それは血漿グルコース濃度が正常な空腹時範囲にあるときのインスリンの無調節な放出、または好機を逸したインスリン注射が、血糖の危険な低下−低血糖を生じ得るためである。これはＧＬＰ−１の結果としては発生せず、なぜならＧＬＰ−１は血糖量が空腹時範囲にある場合、もはやより多くのインスリンを放出するようβ細胞を刺激しないからである。さらに、ＧＬＰ−１は胃液分泌および胃運動性を阻害する。これは炭水化物吸収を遅らせ延長し、満腹効果に寄与する。
【００３７】
同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「同一性」によって説明される。
２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルプログラム（Ｒｉｃｅら，２０００，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）、好ましくはバージョン３．０．０以降で実行されるようにニードルマン−ウンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ、０．５のｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（BＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバーション）置換マトリックスである。ニードル標識された「最長同一性」（−ｎｏｂｒｅｉｆオプションを用いて得られる）をパーセント同一性として使用し、
（同一残基×１００）／（アラインメント長−アラインメントにおけるギャップの全数）
として計算する。
【００３８】
赤肉成長促進：本明細書で使用される用語「赤肉成長促進」または「赤肉成長増強」は、体重の迅速だが赤肉増加が目的である肉生産業における、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、カモ、ガチョウ、ハト、シチメンチョウ、ウズラおよびニワトリなどの家畜または飼育動物の給餌を指す。
【００３９】
家畜：ウシ、ウマ、家禽、および飼育使用のために維持される同様の動物。
【００４０】
正常微生物叢：用語「正常微生物叢」は本明細書では、共生バランス失調性ではない微生物叢を示す。正常微生物叢は、多くの遺伝子および門の豊富さを有することによって特徴付けられる。正常微生物叢は、バクテロイデス、フェカリバクテリウム、ロゼブリア、ブラウチア、ルミノコッカス、コプロコッカス、ビフィドバクテリウム、メタノブレビバクター、ラクトバチルス、コプロコッカス、クロストリジウム、アッカーマンシア、ユーバクテリウム属に属する細菌を含むことによって特徴付けられる。
【００４１】
治療：本明細書で使用される用語「治療」および「治療する」は、症状、疾患または障害に対抗する目的のための患者の管理および看護を指す。本用語は患者が有する対象症状のための治療の全範囲を含むと意図され、症状または合併症を軽減または緩和する；症状、疾患または障害の進行を遅らす；症状、疾患または障害を治すまたは消失させる；および／または症状、疾患または障害を予防する目的のための活性化合物の投与などが挙げられ、ここで「予防する」または「予防」は症状、疾患または障害の発症を妨げる、低下するまたは遅延させる目的のための患者の管理および看護を指すと理解されるべきであり、徴候または合併症の発症のリスクを防止または低下する活性化合物の投与を含む。治療されるべき患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。治療されるべき患者は様々な年齢であってよい。
【００４２】
被験体、患者：被験体は本明細書で開示される哺乳動物または家禽の種の一つの個体である。患者は被験体であり、特定疾患が診断されている。
【００４３】
哺乳動物および家禽のα−デフェンシンならびに哺乳動物および家禽のβ−デフェンシン
本開示は、消化管炎症、または結腸直腸癌、あるいは内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患を含むが限定されない、本明細書で開示される徴候の治療における、デフェンシン、哺乳動物および家禽のα−および／またはβ−デフェンシン、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、サル、ウマ、およびニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ダチョウ、ウズラ、ハトなどの家禽の、マウス、サルまたはヒトのβ−デフェンシン、より好ましくはヒト科、より好ましくはヒトのα−および／またはβ−デフェンシンの使用に関する。
【００４４】
カテリシジンのＬＬ３７フラグメントも、本開示による使用のために考えられる。ＬＬ３７はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６の配列を有する。
【００４５】
特に好ましい実施形態により、デフェンシンはα−またはβ−デフェンシンである。
【００４６】
一つの実施形態では、ＬＬ３７、哺乳動物のα−および／またはβ−デフェンシンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７のアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。別の実施形態では、デフェンシンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜１７の１つと、８個未満など、例えば５個未満、４個未満など、例えば３個未満、２個未満など、１０個未満のアミノ酸が異なる。
【００４７】
好ましい実施形態では、ヒトα−デフェンシンは、α−デフェンシン５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）および／またはα−デフェンシン６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）からなる。好ましい実施形態では、哺乳動物のβ−デフェンシンは、ヒトβ−デフェンシン１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ヒトβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ヒトβ−デフェンシン３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ヒトβ−デフェンシン４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、および／または切り詰められたヒトβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）からなる。
【００４８】
好ましい実施形態では、ヒトα−デフェンシンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態では、ヒト哺乳動物のα−デフェンシンは、α−デフェンシン５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）からなる。好ましい実施形態では、ヒトβ−デフェンシンは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性の程度を有する。好ましい実施形態では、ヒトβ−デフェンシンは、ヒトβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からなる。別の好ましいヒトβ−デフェンシンは、切り詰められたヒトβ−デフェンシン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）である。切り詰められたｈＢＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）はｈＢＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）に匹敵する抗炎症性効果を有する（ＷＯ２０１３／０２６７９４）。
【００４９】
ヒト以外の種では、被験体は好ましくは、同一のまたは関連する種由来のデフェンシン、あるいはその同一種由来のデフェンシン（例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３および１０〜１５から選択されるアミノ酸配列を有するデフェンシン）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を共有するデフェンシンによって治療される。例えば、家禽は同一または別の鳥類種由来のオルソロガスなデフェンシンで治療されてよい。
【００５０】
さらに別の実施形態では、哺乳動物のα−デフェンシンは、ヒトα−デフェンシンおよび／またはマウスα−デフェンシン、ならびにそれらの機能的に同等な変異体からなる。好ましくは、哺乳動物のα−デフェンシンはヒトα−デフェンシンであり、それはヒトα−デフェンシン５、ヒトα−デフェンシン６およびそれらの機能的に同等な変異体からなり得る。より好ましくは、哺乳動物のα−デフェンシンはヒトα−デフェンシン５、およびその機能的に同等な変異体またはオルソログからなる。
【００５１】
よりさらなる実施形態では、哺乳動物のβ−デフェンシンはヒトβ−デフェンシンおよび／またはマウスβ−デフェンシン、ならびにそれらの機能的に同等な変異体からなる。好ましくは、哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンは、ヒトβ−デフェンシン１、ヒトβ−デフェンシン２、ヒトβ−デフェンシン３、ヒトβ−デフェンシン４、チンパンジーβ−デフェンシン２、マカクβ−デフェンシン２、マウスβ−デフェンシン３、オランウータンβ−デフェンシン２、ウマβ−デフェンシン２、ブタβ−デフェンシン１、ヤギβ−デフェンシン２、ウシβ−デフェンシン２、ニワトリβ−デフェンシン２およびそれらの機能的に同等な変異体からなる。より好ましくは、哺乳動物のβ−デフェンシンは、ヒトβ−デフェンシン１、ヒトβ−デフェンシン２、ヒトβ−デフェンシン３、ヒトβ−デフェンシン４およびそれらの機能的に同等な変異体からなる。さらにより好ましくは、哺乳動物のβ−デフェンシンは、ヒトβ−デフェンシン２、およびその機能的に同等な変異体またはオルソログからなる。
【００５２】
一つの実施形態では、本方法はこのような治療を必要とする被験体への、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。他の実施形態では、提供される方法は、このような治療を必要とする被験体への、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。さらなる実施形態では、提供される方法は、このような治療を必要とする被験体への、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。好ましい実施形態は、哺乳動物のα−デフェンシンＨＤ５および／または哺乳動物のβ−デフェンシンｈＢＤ２の投与を提供する。
【００５３】
哺乳動物（例えばヒト）または家禽のα−またはβ−デフェンシンの「機能的に同等な変異体」は、腸における微生物叢に対し親の哺乳動物（例えばヒト）または家禽のα−および／またはβ−デフェンシンとほとんど同一の効果を示す、改変された哺乳動物（例えばヒト）または家禽のαまたはβ−デフェンシンである。哺乳動物（例えばヒト）または家禽のデフェンシンの機能的に同等な変異体は、哺乳動物（例えばヒト）または家禽のデフェンシンアミノ酸配列と比べて、１〜５個のアミノ酸改変、好ましくは１〜４個のアミノ酸改変、より好ましくは１〜３個のアミノ酸改変、最も好ましくは１〜２個のアミノ酸改変、特に１個のアミノ酸改変を含み得る。好ましくは、哺乳動物β−デフェンシンについては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を有するヒトβ−デフェンシン２と比較される。
【００５４】
用語「改変」は本明細書において、哺乳動物（例えばヒト）または家禽のデフェンシンの任意の化学的改変を意味する。改変は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入、ならびにアミノ酸側鎖の交換であってよく、あるいはアミノ酸配列における同様な特性を有する非天然アミノ酸の使用であってよい。特に改変は、Ｃ端のアミド化などの、アミド化であってよい。
【００５５】
好ましくは、アミノ酸改変は些細な性質のものであり、ポリペプチドのフォールディングおよび／または活性にほとんど影響しない保存アミノ酸の置換または挿入；単一欠失；わずかなアミノ−またはカルボキシル−端伸長；あるいはポリ−ヒスチジンタグ、抗原エピトープまたは結合領域などの、正味荷電または別の機能を変化させることによって精製を容易にする、わずかな伸長である。一つの実施形態では、ポリ−ヒスチジンタグ、抗原エピトープまたは結合領域などのわずかな伸長は、最大で約２０〜２５個の残基の小リンカーペプチドによって哺乳動物（例えばヒト）または家禽のα−またはβ−デフェンシンに結合され、このリンカーは制限酵素切断部位を含み得る。図２〜５におけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを使用して、どのアミノ酸残基がタンパク質の生物学的活性に大きな影響を及ぼすことなく置換され得るか予測できる。配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏ，ｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）および以下の条件設定：Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１０、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：０，０５、Ｗｅｉｇｈｔ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ：ＮＯ、タンパク質の親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥ、親水性ギャップ：あり、ウェイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ（ＰＲＯＴＥＩＮ用）を用いて配列させた。以下のグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ，「強い」保存グループ）内の置換は保存的置換と考えられるべきである：
Ｓ，Ｔ，Ａ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｈ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ；Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｖ；Ｍ，Ｉ，Ｌ，Ｆ；Ｈ，Ｙ；Ｆ，Ｙ，Ｗ。
以下のグループ（Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ，「弱い」保存グループ）内の置換は半保存的置換と考えられるべきである：
Ｃ，Ｓ，Ａ；Ａ，Ｔ，Ｖ；Ｓ，Ａ，Ｇ；Ｓ，Ｔ，Ｎ，Ｋ；Ｓ，Ｔ，Ｐ，Ａ；Ｓ，Ｇ，Ｎ，Ｄ；Ｓ，Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｋ；Ｎ，Ｄ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｋ；Ｎ，Ｅ，Ｑ，Ｈ，Ｒ，Ｋ；Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｍ；Ｈ，Ｆ，Ｙ。
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニンおよびメチオニン）のグループ内でなされる置換である。一般的に比活性を変えないアミノ酸置換は、従来技術で知られており、例えば、ＮｅｕｒａｔｈおよびＨｉｌｌ（１９７９）によって報告されている。最も一般的に生じる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００５６】
２０種の標準アミノ酸に加え、非標準アミノ酸（４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソブチル酸、イソバリン、およびα−メチルセリンなど）が野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換され得る。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸が、アミノ酸残基と置換され得る。「非天然アミノ酸」はタンパク質合成後に改変されており、および／またはそれらの側鎖で標準アミノ酸のものとは異なる化学的構造を有する。非天然アミノ酸は化学的に合成でき、好ましくは市販されており、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、ならびに３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００５７】
哺乳動物または家禽のα−および／またはβ−デフェンシン中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発などの、従来技術で知られている手段によって特定できる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、単一アラニン変異が分子中のすべての残基で導入され、得られる変異分子を生物学的活性について試験して（すなわち、炎症性大腸疾患に対する活性および／またはＴＮＦ−α活性の抑制）、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を特定する。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８も参照する。必須アミノ酸の特定はまた、哺乳動物または家禽のα−および／またはβ−デフェンシンと関連するポリペプチドとの同一性の分析からも推測できる（図２〜５におけるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを参照）。
【００５８】
単一または複数アミノ酸置換は変異形成、組換え、および／またはシャフリング、それに続く関連スクリーニング手段の既知の方法を用いて作製および試験でき、方法はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：  ５３−５７、Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：２１５２−２１５６、ＷＯ９５／１７４１３、またはＷＯ９５／２２６２５によって公表されるものなどである。使用できる他の方法は、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７、米国特許第５，２２３，４０９号、ＷＯ９２／０６２０４）、および領域特異的変異形成（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ４６：１４５、Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ７：１２７）を含む。
【００５９】
所定の置換の結果が確信をもって予測できない場合、誘導体を本明細書における前述の方法に従って容易に測定して、生物学的活性の有無を決定し得る。
【００６０】
本明細書で開示されるデフェンシンはグリコシル化に供されてよい。さらに、自然に発生するデフェンシンは、タンパク質分解処理に供され、小さい生物活性フラグメントへと切断され得ることは従来技術で知られている。グリコシル化デフェンシンおよびデフェンシンの生物活性フラグメントは本開示内に含まれる。
【００６１】
さらに、デフェンシンの誘導物質が本開示の範囲内に含まれる。例えばビタミンＤおよび大腸菌Ｎｉｓｓｌｅはデフェンシンの分泌を誘発でき、そのため本明細書で説明される徴候を治療するために使用できることは従来技術で知られている。
【００６２】
α−およびβ−デフェンシンの組み合わせ
一つの態様では、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンを含む組成物が提供される。例１および３で実証されるように、α−およびβ−デフェンシンは経口によって投与できる。例示的なα−デフェンシンであるＨＤ５は、特に異所性脂質蓄積を低下し、例示的なβ−デフェンシンであるｈＢＤ２は、特に糖調節経路を改善する。従って、α−およびβ−デフェンシンの組み合わせは、本明細書で説明されるような肥満および内分泌徴候の特に効果的な治療をもたらし得る。
【００６３】
哺乳動物のα−デフェンシンは、ＨＤ５およびＨＤ６からなる群から選択され得、少なくとも１種類の哺乳動物のβ−デフェンシンは、ｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３およびｈＢＤ４から選択され得る。
【００６４】
好ましくは、本組成物はＨＤ５およびｈＢＤ２を含む。
【００６５】
本組成物はさらに医薬品として許容可能な賦形剤を含み、無菌であり、無菌の等張溶液として製剤化され得る。
【００６６】
α−およびβ−デフェンシン間の配分は、任意の配分であり得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、モル濃度ベースまたは重量ベースまたはｍｇ／ｍＬベースに基づいて、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンを基本的に等量で含む。
【００６７】
長期作用デフェンシン
α−またはβ−デフェンシンの半減期は、α−またはβ−デフェンシンを別の分子と融合または共役体化する、すなわちα−またはβ−デフェンシンのインビボでの血漿半減期を付与する医薬品として許容可能な分子に連結された長期作用性の生物学的に活性なα−またはβ−デフェンシンを構築することによって延長され得、それはα−またはβ−デフェンシンとして同様な方式で投与されるα−またはβ−デフェンシンのインビボでの血漿半減期と比べて著しく増加される。
【００６８】
長期作用性の生物学的に活性なα−またはβ−デフェンシンは、哺乳動物新生児Ｆｃ受容体、トランスフェリンまたはｎが８〜２２であるＣＨ３（ＣＨ２）ｎＣＯ−またはポリマーに結合する分子から選択される医薬品として許容可能な分子に連結された哺乳動物のα−デフェンシンまたはそのアナログあるいは哺乳動物のβ−デフェンシンまたはそのアナログを含む。α−またはβ−デフェンシン作用剤は非哺乳動物起源のものであってもよく、小さい有機分子、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質から選択され得る。α−またはβ−デフェンシン作用剤は従来技術の文献で報告されている様々な方法で、医薬品として許容可能な分子に連結され得、限定されないが、二官能性リンカーによる化学的結合、α−デフェンシンまたはβ−デフェンシンなどのデフェンシンのＮ端またはＣ端を、アルブミンまたはアルブミンアナログなどの医薬品として許容可能な分子に結合させることによる遺伝子技術的なものが挙げられる。特に、ヒトアルブミンなどのアルブミンまたはアルブミンアナログのＮ端は、α−デフェンシンまたはβ−デフェンシンのＣ端、あるいはα−デフェンシンまたはβ−デフェンシンのＮ端に結合でき；あるいはヒトアルブミンなどのアルブミンのＣ端は、α−デフェンシンまたはβ−デフェンシンのＣ端、あるいはα−またはβ−デフェンシンのＮ端に結合できる。リンカー配列は、アルブミンとα−またはβ−デフェンシン鎖の間に挿入できる。α−またはβ−デフェンシン作用剤は、安定なリンカーまたはより不安定なリンカーを介して医薬品として許容可能な分子に連結され得る。いくつかのリンカーは従来技術で知られており、二官能性ＰＥＧ分子（例えば、Ｐａｉｇｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１２，ｎｏ．１２，１９９５）、加水分解可能なリンカー（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６：９１３−  ９２０、およびＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏｓ．１−２，Ｊｕｎｅ  ２００７、ならびにＷ０２００９０９５４７９）、Ｗ０２０１００９２１３５などを参照するＰＤＰＨおよびＥＭＣＨを含む。α−またはβ−デフェンシン作用剤の医薬品として許容可能な分子への化学的共役体化（２つ以上の分子の連結）が機能的なα−またはβ−デフェンシン活性を強く低下させる特定の場合では、機能的なα−またはβ−デフェンシン作用剤を放出できる、より不安定なリンカーを使用することが好ましいことであり得る。
【００６９】
半減期延長はまた、リジンに対するγ−Ｌ−グルタミルスペーサーなどのスペーサーおよびＣ−１８脂肪二酸鎖によるペプチド骨格のアシル化によって実施され得る。脂肪二酸部位鎖およびスペーサーは、アルブミンへの強いが可逆的な結合を仲介し、注入部位からの放出を遅らせ、腎クリアランスを低下させる。
【００７０】
方法および使用
例４で実証されるように、ＧＬＰ−１アナログであるリラグルチドの投与は、高脂肪食を与えられた肥満マウスにおける微生物叢に変化をもたらす。変化は、より健全なまたは正常な微生物叢に向かい、なかんずく、単鎖脂肪酸の産生に都合が良い細菌種の増加を伴う。従って、本発明者らは、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アナログの投与による共生バランス失調化微生物叢の処置および本明細書で説明される他の使用を考えている。
【００７１】
好ましくは、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アナログは、皮下または筋肉内投与のいずれかによって非経口的に投与される。ＧＬＰ−１アナログは、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドから選択され得る。
【００７２】
ヒトα−デフェンシン５およびヒトβ−デフェンシン２は、腸における正常な微生物叢を維持または安定化でき、そしてさらに腸における共生バランス失調化微生物叢を処置または正常化できることが認められており、このため、結腸直腸癌、消化管炎症、内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患の治療用医薬品として、または赤肉成長促進物質として効能のある活性を示す。従って、一つの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量を投与することによる一般的に消化管炎症の治療のための、あるいは結腸直腸癌、内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患の治療のための方法を提供する。このような疾患の例は、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリック症候群、全身性低度炎症、肥満、インスリン耐性、グルコース不耐性および心臓血管疾患である。
【００７３】
特に、ＨＤ５およびｈＢＤ２がインスリン耐性を治療するために使用され、インスリン感受性および耐糖能を改善し、ならびに肥満を治療または予防できることが示されている。ＨＤ５は特に異所性脂質累積を低下し得、一方、ｈＢＤ２は特にグルコース調節効率を改善し得る。
【００７４】
肥満の予防または体重低下の誘発または体重増加の防止は好ましくは、内臓脂肪の蓄積の低下または防止、脂肪割合増加の低下または防止、あるいは腹囲増加の低下または防止を含む。
【００７５】
提供される方法は、細菌表現型を転写レベルでの変化を通して変えることにより、ならびに本明細書で説明される症状の一つに罹患している被験体の腸内細菌叢の構成および組成を変えることによって消化管炎症を治療または予防できる。
【００７６】
提供される方法は、腸内微生物叢の構成および組成、かつしたがって本明細書で説明される症状の一つに罹患している被験体のメタボロームを変えることによって、結腸直腸癌、内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患を治療できる。
【００７７】
一つの態様は、ヒトにおける消化管炎症の治療のための方法を提供し、ここで炎症は動物の口、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および／または肛門管に局在しており、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量を投与することによる。好ましくは、デフェンシンはヒトα−デフェンシンである。別の好ましい実施形態では、デフェンシンはヒトβデフェンシン、好ましくはｈＢＤ２であり、炎症は口、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、および／または肛門管で低下される。
【００７８】
一つの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよびβ−デフェンシンの効果的な量を投与することによる消化管炎症の治療のための方法を提供する。
【００７９】
一つの態様は、腸における正常な微生物叢を安定化または維持するための方法を提供する。別の態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸における共生バランス失調化微生物叢の処置または正常化のための方法を提供する。
【００８０】
さらなる態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸内微生物叢の遺伝子の豊富さを増加するための方法を提供する。
【００８１】
一つの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸内微生物叢の門数を増加するための方法を提供する。
【００８２】
一つの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸内微生物叢からのブチル酸産生を増加するおよび／または酢酸産生を低下するための方法を提供する。
【００８３】
一つの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸内微生物叢からの単鎖脂肪酸産生の産生を増加するための方法を提供する。
【００８４】
いくつかの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸内微生物叢におけるバクテロイデス、フェカリバクテリウム、ロゼブリア、ブラウチア、ルミノコッカス、コプロコッカス、ビフィドバクテリウム、メタノブレビバクター、ラクトバチルス、クロストリジウム、アロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、ユーバクテリウムからなる群から選択される属に属する細菌の数を増加するための方法を提供する。好ましくは、細菌はアロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、またはラクトバチルスである。
【００８５】
好ましい実施形態では、バクテロイデス・ブルガタス、バクテロイデス・カッカエ、フェカリバクテリウム・プラウスニッツイ、ロゼブリア・インテスチナリス、ブラウチア・ハンセニイ、ルミノコッカス・グナバス、コプロコッカス・コメス、クロストリジウム・ネキシレ、クロストリジウム・ボルテアエ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・デンタム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタルム、アッカーマンシア・ムシニフィラ、ユーバクテリウム・レクタレからなる群から選択される細菌の数を増加するための方法が提供される。提供される方法は、健全な消化管微生物叢の典型である細菌の数を増加する。
【００８６】
一つの態様は、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンおよび／またはＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの効果的な量を投与することによる腸内微生物叢におけるバクテロイデス・フラギリス、ステレラ・ワーズワーシア、ベイロネラ・パルブーラ、エシェリシア・コリ、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、フソバクテリウム・ヌクレアタム、エイケネラ・コロデンス、ジェミラ・モリビラムからなる群から選択される属に属する細菌の数を低下するための方法を提供する。提供される方法は、治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢の典型である細菌の数を低下する。
【００８７】
従って、好ましい実施形態において開示される方法を用いて治療できる、説明される腸炎症、結腸直腸癌、内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患は、治療を必要とする患者の腸における共生バランス失調化微生物叢によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢は、低い遺伝子豊富さを有する。他の実施形態では、開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢は、少ない門数を有する。他の実施形態では、開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢は、微生物叢による酢酸産生増加を有する。開示される方法によって、増加した酢酸産生はブチル酸産生を優先して低下され得る。
【００８８】
好ましい実施形態では、開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢は、バクテロイデス、フェカリバクテリウム、ロゼブリア、ブラウチア、ルミノコッカス、コプロコッカス、ビフィドバクテリウム、メタノブレビバクター、ラクトバチルス、クロストリジウム、アロバキュラム、アロプレボテラ、アッカーマンシア、およびユーバクテリウムからなる群から選択される属に属する細菌の少ない数を有する。さらに好ましい実施形態では、開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢は、バクテロイデス・ブルガタス、バクテロイデス・カッカエ、フェカリバクテリウム・プラウスニッツイ、ロゼブリア・インテスチナリス、ブラウチア・ハンセニイ、ルミノコッカス・グナバス、コプロコッカス・コメス、クロストリジウム・ネキシレ、クロストリジウム・ボルテアエ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・デンタム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタルム、アッカーマンシア・ムシニフィラ、ユーバクテリウム・レクタレからなる群から選択される細菌の少ない数を有する。さらなる実施形態では、治療を必要とする被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢は、バクテロイデス・フラギリス、ステレラ・ワーズワーシア、ベイロネラ・パルブーラ、エシェリシア・コリ、ヘモフィルス・パラインフルエンザ、フソバクテリウム・ヌクレアタム、エイケネラ・コロデンス、ジェミラ・モリビラムからなる群から選択される細菌の多い数を有する。
【００８９】
好ましい実施形態で開示される方法は、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／または少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンおよび／または少なくとも１種類のＧＬＰ−１／ＧＬＰ−１アナログの投与によって、共生バランス失調化微生物叢およびメタボロームを処置できる。
【００９０】
開示される方法は、抗生物質治療または化学療法または免疫療法または免疫抑制療法または腸内微生物叢に負の影響を有する別の治療が実施された、および／または実施されている被験体の腸における共生バランス失調化微生物叢および／またはメタボロームの処置、予防または正常化のために使用できる。
【００９１】
開示される方法はまた、歯肉炎を含む歯周炎を有する被験体などの被験体の口腔における共生バランス失調化微生物叢の処置、予防または正常化のために使用できる。歯周炎は喫煙およびストレスによって引き起こされかつ、例えば化学療法、免疫療法および免疫抑制療法による、薬物誘導性でもあり得る。
【００９２】
開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体は、消化管炎症または結腸直腸癌あるいは内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患に罹患している。一つの実施形態では、本治療を必要とする被験体は、３０以上などの、例えば３５以上など、４０以上などの、２５以上のＢＭＩを有する。別の実施形態では、本治療を必要とする被験体は、例えば０．８０〜０．８４、少なくとも０．８５（女性）または少なくとも０．９０など、例えば０．９〜０．９９、１．００（男性）を超えるなどの、少なくとも０．８０のウェスト／ヒップ比を有する。さらなる実施形態では、本治療を必要とする被験体は、例えば少なくとも７．０ｍｍｏｌ／Ｌの、少なくとも６．１ｍｍｏｌ／Ｌの空腹時血糖を有する。なおさらなる実施形態では、本治療を必要とする被験体は、４２〜４６ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなど、少なくとも４８ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなど、少なくとも４２ｍｍｏｌ／ｍｏｌＨｂなどの糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１Ｃ）量を有する。
【００９３】
開示される方法によって提供される治療を必要とする被験体は、以下の徴候：
・高血圧：≧１４０／９０ｍｍＨｇ、
・脂質異常：トリグリセリド（ＴＧ）≧１．６９５ｍｍｏｌ／Ｌおよび高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）≦０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）、≦１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）、
・中心性肥満：ウェスト：ヒップ比＞０．９０（男性）、＞０．８５（女性）、もしくは肥満度指数＞３０ｋｇ／ｍ２、ならびに
・微量アルブミン尿：尿中アルブミン排泄比≧２０μｇ／分もしくはアルブミン：クレアチニン比≧３０ｍｇ／ｇ、
の１つまたは複数を示し得る。
【００９４】
一つの実施形態では、開示される方法による、少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／または少なくとも１種類の哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンの投与は、一般的に経口である。
【００９５】
哺乳動物または家禽のα−またはβ−デフェンシンは、いずれかの標準的な経路による投与用に製剤化された組成物中で治療的に使用できる。一つの態様では、哺乳動物または家禽のα−および／またはβ−デフェンシンは経口によって投与される。ヒトβ−デフェンシン２は、結腸における炎症性大腸疾患を治療するために経口によって投与できることが知られている。本発明者らは驚くべきことに、ヒトα−デフェンシンであるＨＤ５も経口によって投与でき、酸性の胃を通るにも関わらず、それは消化管でその生物活性を維持することを実証した。経口投与は通常、腸内薬剤送達用であり、一方、薬剤は腸粘膜を通して送達される。しかし、本発明者らによって実証されるように、ｈＢＤ２は検出可能な程度には消化管から吸収されない。他のデフェンシンも消化管から吸収されないことが予想される。
【００９６】
一つの実施形態では、哺乳動物および家禽のα−またはβ−デフェンシンは皮下に投与される。特に、ｈＢＤ２およびＨＤ５は皮下に投与され得ると考えられる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、好ましい実施形態の組成物は、凍結乾燥品として、および再水和化の後に安定性をもたらす適切な賦形剤を使用して凍結乾燥品として製剤化されてよい。
【００９８】
ヒトα−デフェンシンおよび／またはヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物のα−デフェンシンおよび／または哺乳動物のβ−デフェンシンを含む医薬または動物食餌組成物は、従来の方法により、例えば、混合する、顆粒化する、コーティングする、溶解するまたは凍結乾燥する工程によって、製造できる。好ましい実施形態では、哺乳動物のα−および／または哺乳動物のβ−デフェンシンを含む医薬組成物は、無菌の等張溶液として製剤化される。
【００９９】
提供される医薬組成物は、一つの実施形態では、少なくとも１種類の哺乳動物のα−デフェンシンを含む。哺乳動物のα−デフェンシンの例はＨＤ５およびＨＤ６である。好ましい実施形態では、組成物は哺乳動物のα−デフェンシンＨＤ５を含む。医薬組成物は、別の実施形態では、少なくとも１種類の哺乳動物のβ−デフェンシンを含む。哺乳動物のβ−デフェンシンの例はｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３およびｈＢＤ４である。好ましい実施形態では、組成物は哺乳動物のβ−デフェンシンｈＢＤ２を含む。医薬組成物は、さらなる実施形態では、少なくとも１種類の哺乳動物のα−デフェンシンおよび少なくとも１種類の哺乳動物のβ−デフェンシンを含む。哺乳動物のα−デフェンシンの例はＨＤ５およびＨＤ６である。哺乳動物のβ−デフェンシンの例はｈＢＤ１、ｈＢＤ２、ｈＢＤ３およびｈＢＤ４である。好ましい実施形態では、組成物は哺乳動物のα−デフェンシンＨＤ５および哺乳動物のβ−デフェンシンｈＢＤ２を含む。他の実施形態では、組成物または食餌組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３および１０〜１７から選択されるアミノ酸配列ならびに本明細書で定められる配列変異体およびフラグメントを有するデフェンシンから選択される１種類以上の非ヒトデフェンシンを含む。
【０１００】
好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトα−デフェンシンおよびヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物のα−デフェンシンおよび／または哺乳動物のβ−デフェンシン、ならびに医薬品として許容可能な担体および／または希釈剤を含む。
【０１０１】
医薬品および動物食餌として許容可能な担体および／または希釈剤は、従来技術の当業者に良く知られている。液体溶液として製剤化される組成物については、許容可能な担体および／または希釈剤は生理食塩水および無菌水を含み、任意に抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および他の一般的な添加物を含み得る。
【０１０２】
開示される化合物は、経口投与用の幅広い様々な製剤で製剤化され得る。固体剤形調製物は、粉末、錠剤、ドロップ、カプセル、カシェ、舐剤、および分散可能な顆粒を含み得る。経口投与に適した他の剤形は、エマルション、シロップ、エリキシル、水性溶液、水性懸濁液、歯磨き粉、歯磨きゲル、チューインガムを含む液体剤形調製物、あるいは溶液、懸濁液、およびエマルションなどの、液体剤形調製物へと使用直前に変換されることが意図される固体剤形調製物を含み得る。
【０１０３】
開示される化合物は、皮下投与用の幅広い様々な剤形で製剤化され得る。
【０１０４】
製剤は、（哺乳動物のα−デフェンシンおよび／または哺乳動物のβ−デフェンシン、および他の任意の有効成分に加えて）担体、増量剤、崩壊剤、流動調整剤、糖および甘味料、香料、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝剤、希釈剤、分散化および界面活性剤、結合剤、滑剤、および／または他の従来技術で知られている医薬品用賦形剤を含んでよい。
【０１０５】
本技術の当業者はさらに、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンを適切な方式、ならびにＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの薬学），Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９０）に記載されるもののような容認された実施法に従って製剤化し得る。
【０１０６】
ヒトα−デフェンシンおよびヒトβ−デフェンシンなど、哺乳動物のα−デフェンシンおよび哺乳動物のβ−デフェンシンは、単独で、あるいは１種、２種、またはそれより多い他の医薬化合物または薬剤物質とともに、例えばインスリン／インスリンアナログおよび／またはグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）／ＧＬＰ−１アナログおよび／またはグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）／ＧＬＰ−２アナログおよび／またはジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤および／またはメトホルミンおよび／またはナトリウム・グルコース共輸送体−２（ＳＧＬＴ−２）阻害剤、および／またはグルカゴン受容体拮抗剤および／または一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（ＴＲＰＶ１）拮抗剤などと、および／または１種類以上の医薬品として許容可能な賦形剤とともに併用療法で使用できる。好ましくは、インスリンまたはインスリンアナログまたはＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１アナログは、皮下または筋肉内投与のいずれかによって非経口的に投与される。ＧＬＰ−１アナログはエキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドから選択され得、インスリンアナログはリスプロ、アスパルト、グルリシン、デテミルインスリン、デグルデクインスリン、およびグラルギンインスリンから選択され得る。
【０１０７】
ヒトα−デフェンシンおよびヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物のα−デフェンシンおよび哺乳動物のβ−デフェンシンはまた、化学療法、免疫療法、放射線療法またはこれらの組み合わせのいずれかとの併用療法で使用され得る。
【０１０８】
家畜における方法および使用
本明細書で開示される方法を家畜で使用してそれらの成長速度および食餌効率を改善できる。本方法は、例えば、抗生物質の代替として使用できる。
【０１０９】
一つの態様は、非ヒト動物における消化管炎症の治療のための方法を提供し、このような治療を必要とする被験体に哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量を投与することによる。
【０１１０】
別の態様は動物肉生産における赤肉成長の促進のための方法に関し、本方法は、この方法を必要とする被験体への哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／またはβ−デフェンシンの効果的な量の投与を含む。デフェンシンはホルモン、ステロイドおよび抗生物質の代替として使用できる。例１および３で実証されるように、高脂肪食で給餌されるマウスへのＨＤ５およびｈＢＤ２の投与は、脂肪量の蓄積を防止するので赤肉成長を促進する。
【０１１１】
インビトロ合成
哺乳動物および家禽のα−デフェンシンならびに哺乳動物および家禽のβ−デフェンシンは、従来技術で知られている標準的な方法を用いて、インビトロ合成によって調製し得る。様々な市販の合成装置が利用可能であり、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｃｋｍａｎなどの自動合成装置である。合成装置を用いることによって、天然由来アミノ酸を非天然アミノ酸で、特に、Ｄ−アラニンおよびＤ−イソロイシンなどのＤ−アイソマー（またはＤ−型）、ジアステレオアイソマー、異なる長さまたは官能性を有する側鎖などで置換できる。特定の配列および調製方法は、利便性、経済性、要求される純度などによって決定される。
【０１１２】
化学的連結は、アミドまたは還元的アミノ化などの置換アミン形成のためのアミノ基、チオエーテルまたはジスルフィド形成のためのチオール基、アミド形成のためのカルボキシル基などの、結合に都合がよい官能性を含む様々なペプチドまたはタンパク質に付与され得る。
【０１１３】
必要に応じて、様々な基が合成の際または発現の際にペプチドに導入され得、それは他の分子へのまたは表面への連結を可能にする。このためシステインがチオエーテルを得るために、ヒスチジンが金属イオン錯体への連結のために、カルボキシル基がアミドまたはエステルを形成するために、アミノ基がアミドを形成するために使用できる、などである。
【０１１４】
哺乳動物および家禽のα−デフェンシンならびに哺乳動物および家禽のβ−デフェンシン、あるいはこれらの機能的同等物はまた、組換え合成の標準的な技術によって分離および精製できる。組換え合成は、適切な発現ベクターおよび真核生物発現系を用いて実施し得る。溶液が発現ホストおよび培地から調製され、存在するデフェンシンがＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製され得る。大腸菌におけるヒトβ−デフェンシン２の組換え発現に関する方法がＷＯ２０１０／００７１６６（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に開示されている。
【０１１５】
投与量
ヒトα−デフェンシンおよびヒトβ−デフェンシンなどの哺乳動物のα−デフェンシンおよび哺乳動物のβ−デフェンシンは好ましくは、消化管炎症、結腸直腸癌、内分泌、栄養、代謝または心臓血管の疾患を治療するのに効果的である量で医薬組成物中で使用され、好ましくは患者に対する許容可能な毒性を有する。哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンは好ましくは、赤肉成長を促進するために動物食餌に加えられる。ヒトα−デフェンシンおよびヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび哺乳動物または家禽β−デフェンシンはまた、腸における正常微生物叢組成を維持するのに、あるいは腸における共生バランス失調化微生物叢を処置または正常化するのに効果的である量で医薬組成物中または動物食餌中で使用され、好ましくは治療を必要とする患者または動物に対し許容可能な毒性を有する。
【０１１６】
このような治療では、適切な投与量はもちろん、例えば、使用される化合物の化学的性質および薬理動態データ、個別ホスト、投与方式ならびに治療される症状の性質および重篤度に応じて変化する。本明細書で使用される用語「ｍｇ  ＨＤ５当量」は、ＨＤ５の濃度と比較したヒトα−およびβ−デフェンシンの等モル濃度を指す。用語「ｍｇ  ｈＢＤ２当量」は、ｈＢＤ２の濃度と比較したヒトα−およびβ−デフェンシンの等モル濃度を指す。開示されるデフェンシンの分子量が同等な場合、用語「ｍｇ  ＨＤ５当量」および「ｍｇ  ｈＢＤ２当量」は使用されるデフェンシンのｍｇを単に意味し得る。
【０１１７】
しかし一般的に、哺乳動物または家禽、例えばヒトにおける満足のいく結果では、ヒトα−デフェンシンの指示される一日投与量は、約０．１〜約１０ｍｇ  ＨＤ５当量／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ  ＨＤ５当量／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ  ＨＤ５当量／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２〜約１０ｍｇ  ＨＤ５当量／ｋｇ体重、好ましくは約１．２〜約５ｍｇ  ＨＤ５当量／ｋｇ体重、さらにより好ましくは１．２ｍｇ  ＨＤ５当量／ｋｇ体重であり、例えば、分割された用量で１日に最大１、２または３回投与される。
【０１１８】
一つの実施形態では、ヒトβ−デフェンシンの指示される一日投与量は、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、１〜１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、好ましくは約１．２〜約５ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、さらにより好ましくは１．２ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重であり、例えば、分割された用量で１日に最大１、２または３回投与される。
【０１１９】
一つの実施形態では、ヒトβ−デフェンシンと併用するヒトα−デフェンシンの指示される一日投与量は、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、１〜１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、好ましくは約１．２〜約５ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重、さらにより好ましくは１．２ｍｇ  ｈＢＤ２当量／ｋｇ体重であり、例えば、分割された用量で１日に最大１、２または３回投与される。
【０１２０】
一般的に、哺乳動物、例えばヒトでは、ヒトα−デフェンシンの指示される一日投与量は、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２〜約１０ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、好ましくは約１．２〜約５ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重、さらにより好ましくは１．２ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重であり、例えば、分割された用量で１日に最大１、２または３回投与される。同様な投与量が、他のα−デフェンシンについて使用できる。
【０１２１】
一つの実施形態では、ヒトβ−デフェンシンの指示される一日投与量は、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重、１〜１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２〜約１０ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重、好ましくは約１．２〜約５ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重、さらにより好ましくは１．２ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇ体重であり、例えば、分割された用量で１日に最大１、２または３回投与される。同様な投与量が、他のβ−デフェンシンについて使用できる。
【０１２２】
ヒトβ−デフェンシンと併用するヒトα−デフェンシンの指示される一日投与量は、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇデフェンシン／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇデフェンシン／ｋｇ体重、約１〜約１０ｍｇデフェンシン／ｋｇ体重など、より好ましくは約１．２〜約１０ｍｇデフェンシン／ｋｇ体重、好ましくは約１．２〜約５ｍｇデフェンシン／ｋｇ体重、さらにより好ましくは１．２ｍｇデフェンシン／ｋｇ体重であり、例えば、分割された用量で１日に最大１、２または３回投与される。
【０１２３】
２種の異なるデフェンシンが１回投与量で投与されるとき、投与量は重量ベースまたはモルベースで測定される等量のまたはほぼ等量の２種のデフェンシンを含み得る。比はまた、β−デフェンシンに対するα−デフェンシンの比が重量またはモルベースで測定されたときに５：１〜１：５など、例えば２：１〜１：２など、１０：１〜１：１０で変化するように異なり得る。
【０１２４】
一日投与量は、０．６ｍｇ  ＨＤ５／ｋｇ体重および０．６ｍｇ  ｈＢＤ２ｋｇ／体重に相当してよい。
【０１２５】
好ましい実施形態の化合物は、哺乳動物または家禽、例えば、ヒト、子ブタまたは子ウシに、従来の使用と同様な投与方式によって同様な投与量で投与できる。
【０１２６】
特定の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物または動物食餌組成物は、ヒトα−デフェンシンおよび／またはヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物または家禽のα−デフェンシンおよび／または哺乳動物または家禽のβ−デフェンシンを、単位投与量剤形あたり、約０．５ｍｇ以下〜約１５００ｍｇ以上、好ましくは約０．１、０．３、０．５、０．６、０．７、０．８、または０．９ｍｇ〜約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００ｍｇ以上、より好ましくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ｍｇ〜約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｍｇの量で含んでよい。しかし特定の実施形態では、上記のものよりも低いまたは高い投与量が好ましいことがあり得る。適切な濃度および投与量は、従来技術の当業者によって容易に決定され得る。特定の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトα−デフェンシンなどの、哺乳動物のα−デフェンシンを含む。他の実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物β−デフェンシンを含む。さらなる実施形態では、好ましい実施形態の医薬組成物は、ヒトα−デフェンシンおよびヒトβ−デフェンシンなどの、哺乳動物のα−デフェンシンおよび哺乳動物のβ−デフェンシンを含み、ここでα−およびβ−デフェンシンは、モル濃度ベースまたはｍｇ／ｍＬベースで等量で存在する。
【０１２７】
一つの実施形態では、哺乳動物または家禽のα−および／またはβ−デフェンシンは、少なくとも１日２回など、例えば少なくとも１日３回など、少なくとも１日１回投与される。
【０１２８】
本開示はさらに後述の例によって説明されるが、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０１２９】
例
例１．
デフェンシンを用いる予防的治療による消化管微生物叢の調節および消化管炎症およびメタボリック症候群の予防。
【０１３０】
材料および方法
マウス：マウスは群あたり４ケージで、３匹ずつ飼育した。食餌摂取は消灯（午後６時）直前に毎日記録した。個別マウスに群およびケージの両方の順序を変える方式で実験手順を実施した。マウスはＳＰＦ標準条件で、１２時間の明／暗サイクル下にて室温で維持した。
【０１３１】
食餌：投与のために、平均体重をマウスあたり２５グラムであると見積もった。マウスは１日に１匹あたり約３ｇの食餌を食する。
【０１３２】
処置方法（図１Ａ）：マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）または低脂肪（ＬＦ）対照食のいずれかを与えた。ＨＦＤは４つのサブ群：１．ｈＢＤ２、１．ＨＤ５、１．ｈＢＤ２／ＨＤ５、１．デフェンシン無添加の標準ＨＦＤを含む。デフェンシン濃度は、１，２ｍｇ  ｈＢＤ２／ｋｇマウス／日である。ＨＤ５はｈＢＤ２と等モルで与えられる。併用群には５０％ｈＢＤ２＋５０％ＨＤ５を与え、そのため、デフェンシンの全量は残りの試験群と同等である。
【０１３３】
試験：インスリン耐性試験（ＩＴＴ）、グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）および５時間空腹時インスリン試験を、１日に群あたり５０％のマウスで２日かけて実施し、そのため交絡要因としての日日変動を回避した。
【０１３４】
微生物分析を実施して腸の微生物叢を調査した。縦断的な１６Ｓの特徴付けを６０匹のマウスからの４対サンプルである合計２４０サンプルで実施した。各マウスについて食餌変更前、食餌変更１週後、食事変更４週後および終了時にサンプリングし、したがってデフェンシン処置の結果としての糞便微生物叢の完全な特徴付けを確実にした。さらに、小腸の内容物を終了時に分析し、したがって栄養摂取の主要部位での可能な変化に関する価値ある洞察を得た。
【０１３５】
盲腸内容物の全メタボロームプロファイルを実施して、微生物変化を全身代謝に変換し得る。十二指腸、空腸、回腸および結腸の詳細な組織学的および免疫組織化学的分析も実施され得る。
【０１３６】
ｈＢＤ２＋ＨＤ５処置からの結果は分析から除外した。
【０１３７】
結果
体重変化．食物摂取は３実験食群すべてで同様だったが（図６Ｃ）、両高脂肪食（ＨＦＤ）群は、１０週試験期間にわたって低脂肪食（ＬＦＤ）対照群よりも体重が有意により多く増加した（＊＊＊ｐ＜０．０００１  二元配置分散分析、テューキー事後検定）。しかし、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はＨＦＤ対照群よりも体重増加が有意に低かった（＊ｐ＝０．００２８）（図６ＡおよびＢ）。
【０１３８】
赤身／脂肪量発達．赤肉／脂肪量は、試験開始時に３実験群間で同等に分布した（図７ＡおよびＢ）。試験の最後では、両ＨＦＤ群は赤肉量が同量増加し（図７Ｂ）、これはＬＦＤ群よりも有意に高く（＊ｐ＜０．０００１  一元配置分散分析、テューキー事後検定）、おそらく体重増加のためだった。試験の最後で、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はＬＦＤ群と比べて脂肪量が増加する傾向を示した（図７Ｂ）。しかしこれは統計学的に有意ではなかった（＊ｐ＝０．２５）。ＨＦＤ群はＬＦＤ群と比べて脂肪量がほぼ４倍、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群と比べて脂肪量が２倍増加していた（それぞれ＊ｐ＜０．０００１および＊ｐ＝０．００５）（図７Ｂ）。
【０１３９】
インスリン耐性試験．ＬＦＤ群およびＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はともに、ＨＦＤ群よりもインスリンに対して有意により感受性であった（ｐ＜０．０５）（図８Ａ）。
【０１４０】
耐糖能試験．ＨＦＤ群は１５分でのピーク〜１２０分での半クリアランスのグルコースクリアランスの延長を有しグルコース不寛容であった。ＬＦＤ群は１５分でのピークからグルコースの急速なクリアランスを有した。ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はグルコースクリアランスのわずかな延長を有したが、ＨＦＤ群よりも有意に低いグルコース量に達した（ｐ＜０．０５）（図８Ｂ）。
【０１４１】
グルコース刺激性インスリン分泌．ＨＦＤ群は、グルコース投与後に有意に高くかつ持続するインスリン濃度を伴う、損なわれたグルコースホメオスタシスを有した（ｐ＜０．０0５）。ＬＦＤ群は、グルコース刺激後にほとんどインスリンが増加しなかった。ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群は、ＬＦＤ群より高いが有意差のないインスリン濃度を有した（図８Ｃ）。
【０１４２】
５時間空腹時インスリン．ＨＦＤ群は、ＬＦＤよりも有意に高い空腹時インスリン量（＊ｐ＝０．０００４）およびＨＦＤ＋ｈＢＤ２群よりも有意に高い空腹時インスリンの境界（＊ｐ＝０．０５７）を伴う深刻な糖尿病だった。ＬＦＤとＨＦＤ＋ｈＢＤ２群の間に有意差はなかった（＊ｐ＝０．１７）（図８Ｄ）。
＊テューキー事後検定、さもなければダネット事後検定。
【０１４３】
例１における試験の終了後、結果を再度分析し、後述のおよび添付の図で示す：
重量変化．食物摂取は３つの実験食群すべてで同様だったが、高脂肪食（ＨＦＤ）群は低脂肪食（ＬＦＤ）対照群よりも１０週の試験期間にわたって有意に高い重量を得た（＊ｐ＜０．０００１  二元配置分散分析、テューキー事後検定）。しかし、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はＨＦＤ対照群よりも有意に少ない重量を得た（＊ｐ＝０．００２８）（図９Ａ）。図９Ｂは食餌効率を示し、図９Ｃはエネルギー摂取を示す。
【０１４４】
赤肉／脂肪量発達．赤肉／脂肪量は試験開始時に３つの実験群間で同等に分布した。試験の最後で、両ＨＦＤ群は赤肉量が同量増加し、これはＬＦＤ群よりも有意に高く（＊ｐ＜０．０００１  一元配置分散分析、テューキー事後検定）、おそらく体重増加のためだった。試験の最後で、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はＬＦＤ群と比べて脂肪量が増加する傾向を示した。しかしこれは統計学的に有意ではなかった（＊ｐ＝０．２５）。ＨＦＤ群はＬＦＤ群と比べて全体重の脂肪量割合がほぼ３倍、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群と比べて全体重の脂肪量割合が２倍増加していた（それぞれｐ＊＜０．０００１および＊ｐ＝０．００５）（図１０Ａ）。肝臓重量に関して３群間に有意差はなかったが（図１０Ｂ）、一方、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はＨＦＤ群よりも有意に低い内臓脂肪（ｅＷＡＴ）を有した（図１０Ｃ）。
【０１４５】
耐糖能試験．ＨＦＤ群は１５分でのピーク〜１２０分での半クリアランスのグルコースクリアランスの延長を有しグルコース不寛容であった。ＬＦＤ群は１５分でのピークからグルコースの急速なクリアランスを有した。ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はグルコースクリアランスのわずかな延長を有したが、ＨＦＤ群よりも有意に低いグルコース量に到達した（ｐ＜０．０５）（図１１Ａ）。
【０１４６】
グルコース刺激性インスリン分泌．ＨＦＤ群は、グルコース投与後に有意に高くかつ持続するインスリン濃度を伴う、損なわれたグルコースホメオスタシスを有した（ｐ＜０．０５）。ＬＦＤ群は、グルコース刺激後にほとんどインスリンが増加しなかった。ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群は、ＬＦＤ群より高いが有意差のないインスリン濃度を有した（図１１Ｂ）。
【０１４７】
インスリン耐性試験．ＬＦＤ群およびＨＦＤ＋ｈＢＤ２群はともに、ＨＦＤ群よりもインスリンに対して有意により感受性であった（ｐ＜０．０５）（図１２Ａ）。ＬＦＤ対照群とＨＦＤ＋ｈＢＤ２群の間に統計学的に有意な差はなかった。
【０１４８】
ホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）．インスリン耐性と、ＨＯＭＡ−ＩＲインデックスによって評価されたβ細胞機能の間の関係は、ＨＦＤ群と比べてＨＦＤ＋ｈＢＤ２群で統計学的に有意に低かった（図１２Ｂ）。
【０１４９】
＊テューキー事後検定、さもなければ、ダネット事後検定。
【０１５０】
高脂肪食給餌マウスにおける糖尿病および肥満の発症に対する予防としてのｈＢＤ２の結論：
−均一な体重増加（低い群内ＳＤ）
−６０％ＨＦＤを給餌されたにも関わらず、ＨＦＤ-ｈＢＤ２給餌マウスの５０％は、ＬＦＤ対照マウスと類似した体脂肪割合を有した。数匹のマウスは最も低いＬＦＤ対照マウスよりもさらに低い脂肪％を有した。
−最も予防されたｈＢＤ２給餌マウスは、ＬＦＤ対照マウスと同等のまたはそれより低い内臓脂肪量を有し、これは６０％ＨＦＤでは非常に並はずれている！
−改善されたインスリン感受性！ｈＢＤ２給餌マウスはＬＦＤ対照マウスと有意差がなかった。インスリン耐性試験およびＨＯＭＡ−ＩＲの両方が改善されたインスリンシグナル伝達を示す。
−耐糖能はＨＦＤ対照マウスと比べて著しく改善された。重要なことに、グルコース負荷の際の耐糖能およびグルコース刺激性インスリン応答は共に改善された。このことは、ｈＢＤ２給餌マウスがＨＦＤ対照マウスよりもグルコース多量投与をよりよく扱うために少ない量のインスリンを必要としたことを意味する。
【０１５１】
高脂肪食給餌マウスにおける糖尿病および肥満の発症に対する予防としてのH Ｄ５の結論：
−ＨＤ５給餌マウスはＨＦＤ給餌対照マウスよりも体重増加が低かったが（図１７Ａ）、効果は統計学的に有意でなかった。また、低い食餌効率（図１７Ｂ）およびエネルギー摂取（図１７Ｃ）に向かう傾向があった。
−ＨＤ５給餌マウスは、ＨＦＤ給餌対照マウスよりも低い脂肪％境界（図１８Ａ）および低い内臓脂肪境界（図１８Ｃ）を有した。肝臓重量に関する統計学的に有意な差は認められなかった（図１８Ｂ）。
−耐糖能（図１９Ａ）、グルコース刺激性インスリン分泌（図１９Ｂ）、インスリン耐性（図２０Ａ）、およびＨＯＭＡ−ＩＲ（図２０Ｂ）に有意な改善はなかったが、ＨＤ５給餌マウスはＨＦＤ給餌対照マウスよりも優れていた。ｈＢＤ２およびH Ｄ５で得られた結果における差は、ｈＢＤ２およびH Ｄ５の間の作用機序の差を示唆する。
【０１５２】
微生物叢の調節に関して、試験の１週目からの図２１Ａ中の結果は、微生物叢の変化が試験の最初の週以内で既に生じていたことを示す。ＨＦＤの３群は、ＬＦＤ群の微生物叢と異なる類似の微生物叢を有する。
【０１５３】
１０週後の試験の終了時で、ＨＦＤ−ＨＤ５群の微生物叢は変化しており、ここではＬＦＤ群と未処置ＨＦＤ群の間の中間だった（図２１Ｂ）。結論として、ＨＤ５の経口投与は微生物叢の部分的な正常化をもたらし、これは非処置群よりもＬＦＤ群の微生物叢に類似している。
【０１５４】
ＨＦＤ群では、終了時に、α−デフェンシン（ＨＤ５）によって処置されたマウスは、処置されていないマウスよりも腸内微生物叢におけるアロバキュラムおよびラクトバチルスの増加した量およびクロストリジウムの低下した量を伴う微生物叢の正常化を示した（図２１Ｃ）。アロバキュラムは単鎖脂肪酸を産生する種である。ラクトバチルスは抗炎症特性を有する細菌である。
【０１５５】
結果は、ＨＦＤ群において、終了時に、α−、β−ならびにα−およびβ−デフェンシンで処置されたマウスが、処置されなかったマウスよりも腸内微生物叢における高い遺伝子豊富さおよび多い微生物数を示すことを意味すると解釈され得る。
【０１５６】
ＬＦＤ対照群では、終了時に、マウスは腸における健全な変化のない微生物叢を示す。
【０１５７】
例２．デフェンシンによる消化管微生物叢の調節。
無脊椎動物：概念のインビボ証明のため、未脊椎動物ハチミツガモデルであるハチノスツヅリガ（Ｇ．メロネラ）を使用し得る。α−および／またはβ−デフェンシンの強制給餌投与後に糞便を分析できる（Ｇｉａｎｎｏｕｌｉら，２０１４）（Ｆａｖｒｅ−Ｇｏｄａｌら，２０１４）。
【０１５８】
例３．肥満マウスでのデフェンシンを用いた介入治療による消化管微生物叢、消化管炎症、およびメタボリック症候群の調節。
【０１５９】
マウスおよび食餌．実験は、食餌誘発した肥満マウスでのメタボリック症候群（ＭｅｔＳ）の治療におけるｈＢＤ２およびＨＤ５の効果を明らかにする。マウスが高度ＨＦＤ（脂肪由来６０％エネルギー）を給餌された１３週の馴らし期間を、介入に先行させた。馴らし期間中の体重増加が最低１２ｇ（初期体重の約５０％）の基準に適合するマウスのみを最終分析に組み入れた。これらの基準に適合しなかったマウスは、「継続マウス」の分類としてそれぞれのケージで飼育した。これらはすべての実験的な試験に供されたが、分析から除外された。
【０１６０】
処置方法（図１Ｂ）：介入前に、すべてのマウスをＭＲスキャンし、ＯＧＴＴを実施した。マウスのケージをそれらの脂肪量に基づいて実験群に割り当てた。以後のすべての測定を、本介入前と同一マウスから得るデータと対にした。
ＬＦＤ（低脂肪食）対照群を並行して行った。介入の対照として、２つの追加群：１．高度ＨＦＤおよび１．ＬＦＤを含めた。実験マウスは介入の間、高度ＨＦＤで飼育した。マウスは１０週間、実験食を受けた。それらは実験の全期間を通して、ケージあたり４匹、群あたり３ケージで共飼育された。すべての試験は、１日に群あたり１ケージで、３日間にわたって実施した。
【０１６１】
試験．インスリン耐性試験（ＩＴＴ）、グルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）および５時間空腹時インスリン試験を、１日に群あたりマウスの１／３によって、３日かけて実施し、そのため交絡要因としての日日変動を回避した。
【０１６２】
微生物分析を実施して腸の微生物叢を調査した。縦断的な１６Ｓの特徴付けを６０匹のマウスからの７対サンプルである合計２４０サンプルで実施した。各マウスについて食餌変更前、食餌変更後２週、４週、６週、８週および終了時にサンプリングし、したがってデフェンシン処置の結果としての糞便微生物叢の完全な特徴付けを確実にした。
【０１６３】
さらに、小腸の内容物を終了時に分析し（１６Ｓまたはディープシークエンシングによる）、したがって栄養摂取の主要部位での可能な変化に関する価値ある洞察をもたらし得る。
【０１６４】
最後に、盲腸内容物の全メタボロームプロファイルを実施して、微生物変化を全身代謝に変換し得る。十二指腸、空腸、回腸および結腸の詳細な組織学的および免疫組織化学的分析も実施され得る。
【０１６５】
肥満高脂肪食給餌マウスにおけるメタボリック症候群の治療としてのｈＢＤ２：
結果
体重変化．標準高脂肪食（ＨＦＤ）給餌群は、全試験期間を通して同等な食物摂取を有し、最初の１３週で同等な脂肪および赤肉量で同じ体重発達を有し、そのため、食餌介入前に同一開始時点を有した。体重増加は低脂肪食給餌（ＬＦＤ）群より有意に高かった（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）（図１３Ａ）。食餌介入後、ＨＦＤ群は体重が増加し続けたが、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群は食餌介入後の最初の４週間で体重増加がより少ない傾向を示したが、有意ではなかった（＊ｐ＝０．０７  二元配置分散分析）。試験期間の４週目〜最後で、ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群は標準ＨＦＤ群と同様な体重を得た（＊ｐ＝０．８２  二元配置分散分析）（図１３Ｂ）。
【０１６６】
脂肪割合．全体重の脂肪割合は、試験期間の開始時にて３実験群間で同様だった。食餌介入の時点で、ＨＦＤ給餌の２群の脂肪割合は同様であり、ともにＬＦＤ食餌群よりも有意に高く、これは食餌介入後１０週の全期間を通して一貫していた（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）（図１４Ａ）。食餌介入後４週でＨＦＤ＋ｈＢＤ２群の約７５％は、介入前よりも低い脂肪割合を有し、すべてのマウスの脂肪割合が増加していた標準ＨＦＤ群とは極めて対比的だった（図１４Ｂ）。この時点で脂肪割合の変化は、標準ＨＦＤ群よりもＨＦＤ＋ｈＢＤ２群で有意に低かった（＊ｐ＝０．００３  二元配置分散分析）。終了時の肝臓重量は、ＬＦＤ群に比べてＨＦＤ給餌群で有意に高かった（＊ｐ＜０．０５  一元配置分散分析）（図１５Ａ）。終了時の内臓脂肪（ｅＷＡＴ）の量もまた、ＬＦＤと比べてＨＦＤ群で高かった（＊ｐ＜０．０５  一元配置分散分析）。ＨＦＤ給餌群間で内臓脂肪（ｅＷＡＴ）に有意差はなかった（図１５Ｂ）。
【０１６７】
耐糖能試験．耐糖能はＨＦＤ＋ｈＢＤ２群において食餌介入時点から急速に改善し、それは血糖の小さなピークならびに既に２週後でグルコースの迅速なクリアランスを示した（図１６Ａ）。試験におけて最大のグルコース不寛容マウスは、標準ＨＦＤからＨＦＤ＋ｈＢＤ２に切り替えられた後の最初の２週に劇的に良くなることが認められた。（図１６Ｂ）。
【０１６８】
インスリン耐性試験．ＬＦＤ群は両ＨＦＤ群よりもインスリンに対して有意により感受性であった（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）。ＨＦＤ＋ｈＢＤ２群は同時に、ＨＦＤ対照群に比べてよりインスリン感受性であり、食餌介入以後のインスリン耐性における改善を暗示した（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）（図１６Ｃ）。
【０１６９】
高脂肪食給餌マウスにおける糖尿病および肥満の発症に対する介入としてのｈＢＤ２の結論：
−全体として、ｈＢＤ２給餌マウスはＨＦＤ対照マウスよりも介入の最初の４週で体重増加が少なかった（図１４３）。
−８匹中７匹の肥満およびグルコース不寛容マウスが、介入のわずか２週後にそれらの耐糖能を有意に改善した（図１４Ａ）。１匹のマウスがベースラインで最もグルコース不寛容のマウスであり５０ｇの体重のうち約２０ｇの脂肪量を有した。この重度の不健全な表現型にも関わらず、マウスは介入の２週でグルコース不耐性に関して完全に救済された（図１６Ｂ）。
−全身レベルでは、ｈＢＤ２給餌マウスはＨＦＤ対照マウスよりも低いインスリン耐性だった（図１６Ｃ）。重度の全身性インスリン耐性は逆転させることが非常に困難であり、かつヒト疾患（例えば、他の中にあって糖尿病、ＣＶＤ、特定の癌）の治療における主たる制限であるので、このことは重要な意味がある。
【０１７０】
肥満高脂肪食給餌マウスにおけるメタボリック症候群の治療としてのＨＤ５：
体重変化．すべてのＨＦＤ給餌群は試験期間中に同一食物摂取を有し、１３週の馴らし期間に同等な重量増加を有した（図２２Ａ）。食餌介入後、ＨＦＤ＋ＨＤ５給餌群はＨＦＤ対照よりも体重増加が有意に少なかった（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）（図２２Ｂ）。さらに、ＨＦＤ＋ＨＤ５群で脂肪割合の低下傾向が認められ（図２３Ａ）、ＨＦＤ対照と比べてＨＦＤ＋ＨＤ５で有意に低い脂肪割合が食餌変更後４週で測定された。（＊ｐ＝０．００９  二元配置分散分析）（図２３Ｂ）。終了時の肝臓の重量は、ＨＦＤ対照と比べてＨＦＤ＋ＨＤ５で低下する傾向だった。具体的には、標準ＨＦＤ給餌マウスの約５０％が、最も高いＨＦＤ＋ＨＤ５給餌マウスよりも高い値を示した（図２４Ａ）。内臓脂肪の重量は、ＬＦＤ給餌群よりもＨＦＤ給餌群で高かった（＊ｐ＜０．０５  一元配置分散分析）（図２４Ｂ）。
【０１７１】
耐糖能試験．代表的なケージであるケージ２でＨＦＤ＋ＨＤ５で処置されたマウスにおける耐糖能は、介入開始（１３−０週）から１３．８週にわたって改善した（図２５Ａ）。
【０１７２】
インスリン耐性試験．ＬＦＤ群は、ＨＦＤ給餌群よりも有意によりインスリン感受性であった（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）。ＨＦＤ＋ＨＤ５群はＨＦＤ対照よりもインスリン感受性が高く、食餌介入以後のインスリン耐性における改善を暗示した（＊ｐ＜０．０５  二元配置分散分析）（図２５Ｂ）。
【０１７３】
高脂肪食給餌マウスにおける糖尿病および肥満の発症に対する介入としてのＨＤ５の結論：
−ＨＤ５給餌マウスはＨＦＤ給餌対照マウスと比べて有意に低い体重変化を有した（図２２Ｂ）。
−肥満ＨＦＤ−ＨＤ５給餌マウスの脂肪量低下の全般的な傾向があった（図２３ＡおよびＢ）。
−肝臓重量はＨＦＤ給餌対照マウスと比べてＨＤ５給餌マウスで低下する傾向だった（図２４Ａ）。内臓および皮下貯留は有意差がなかったので（図２４Ｂ）、この観察結果は、ＨＤ５マウスにおける中度に低下した脂肪％が、肝臓の脂質分解／脂質酸化に限定されることを示唆する。
−耐糖能はＨＤ５給餌マウスにおいて経過にともない改善した（図２５Ａ）。
−ＨＤ５給餌マウスはＨＦＤ給餌対照マウスよりもインスリン耐性が低かった（図２５Ｂ）。
【０１７４】
認められた変化は、処置されないマウスよりもデフェンシンによって処置されたＨＦＤ群における、腸内微生物叢中の高い遺伝子豊富さおよび多い門数と一致した。
【０１７５】
例４．グルカゴン様ペプチド−１アナログを用いた介入処置による消化管微生物叢の調節および消化管炎症の治療。
【０１７６】
材料および方法
マウス：４週齢Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ  ＤＩＯ雄マウスに高脂肪食（ＨＦＤ６０％脂肪、ＳＳＮＩＦＦ（ＤｉｅｔＮｏ．１２４９２）またはｐｕｒｉｎａ  ｃｈｏｗを３６週間給餌した。ＨＦＤ給餌群は介入開始までに約５５グラムの平均体重に達していた。マウスを−２週までケージあたり１０匹で集団飼育した。−２週からマウスを、試験期間全体を通して単独で飼育した。食餌摂取を午後３時の消灯直前に毎日記録した。個別マウスに群およびケージの両方の順序を変える方式で実験手順を実施した。マウスをＳＰＦ標準条件で、１２時間の明／暗サイクルにおいて室温で維持した。
【０１７７】
処置方法（図２６）：マウスに高脂肪食（ＨＦＤ）または低脂肪（ＬＦ）対照食のいずれかを与えた。ＨＦＤは２つのサブ群：１．ＧＬＰ−１および１．ＧＬＰ−１無添加の標準ＨＦＤを含んだ。ＧＬＰ−１をＰＢＳ中に溶解し、０．１％ＢＳＡを加えた。ＧＬＰ−１を０．２ｍｇ／ｋｇで１日２回皮下投与した。
分析．１６Ｓ  ＲＮＡマイクロバイオーム分析を試験の−１日目および２７日目に実施した。回腸由来サンプルを盲腸から約２ｃｍで採取して、サイトカインであるＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１０の濃度分析用に液体窒素中で急速凍結させた。
【０１７８】
結果
ウェート付していないｕｎｉｆｒａｃ解析、すなわち細菌種の相対量。試験の開始時（１日目）に、４群は予測されたように同等な微生物叢を有した。しかし、４週の処置に続いて高脂肪食およびＧＬＰ−１（リラグルチド）による仲介処置を与えられたマウスからの微生物叢は、対照（賦形剤処置）群からの微生物叢と著しく異なった（図２７Ａ）。
【０１７９】
消化管微生物叢の認められた変化は、アッカーマンシアおよびアロプレボテラの量の増加によって主に引き起こされた。アッカーマンシアは単鎖脂肪酸産生種である（図２７Ｂ）。これらの細菌量の増加は、より健全なまたは正常化された微生物叢の指標と考えられる。単鎖脂肪酸は内因性ＧＬＰ−１の誘発に有効な効果を有することが知られている。
【０１８０】
驚くべきことに、ＧＬＰ−１（リラグルチド）の抗炎症効果は認められず、３試験群間のサイトカインのいずれについても、回腸中のサイトカイン濃度に統計学的な差はなかった。
【０１８１】
例５．
ＮＭＲＩマウスへのｈＢＤ２の４ｍｇ／ｋｇ単回経口強制投与後の、経口による生物学的利用能を測定するためのおよび薬理動態プロファイルを確立するための薬理動態試験。
【０１８２】
材料および方法
処置方法：２１匹の雌ＮＭＲＩマウスに、投与日に得られた個別体重に従って、経口強制投与チューブおよび１ｍＬシリンジを用いて５ｍｇ／ｋｇを経口強制投与によって投与した。尿を、ランダムな時点に腹部の鼠径領域を優しくマッサージすることによって強制的にサンプリングした。最初の血液サンプルを、顎下サンプリング法を用いて採取した。２回目の血液サンプルを、イソフルラン麻酔したマウスから収集した。腸サンプルを、安楽死後に採取した。各マウスの腹部を開き、腸の３部分（空腸、十二指腸、および結腸）をサンプリングした。
【０１８３】
結果
ｈＢＤ２は、血清または尿サンプルのいずれでもＨＰＬＣによって検出されず値は＜１０ｐｇ／ｍＬの検出量未満であったので、健全な腸から吸収されるように思われなかった。このことは、ｈＢＤ２がマウスで４ｍｇ／ｋｇの経口投与後に全身的に利用可能ではないことを示す。経口投与されたｈＢＤ２は、投与後３６０分まで結腸内容物中で検出可能なままであった（図２８）。
【０１８４】
例６．
ヒト血清アルブミンのＣ端（融合後分子量７１．３３６Ｄａ）またはＮ端（融合後分子量７１．６６６Ｄａ）に融合されたｈＢＤ２の薬理動態プロファイルを、ＮＭＲＩ雌マウスへの１ｍｇ／ｋｇのｈＢＤ２（分子量６６４３７Ｄａ）のモル当量の皮下または静脈内投与後に、検討および比較する。
【０１８５】
材料および方法
処置方法：マウスに、個別体重に従ってストック濃度１．６５ｍｇ／ｍＬを１０ｍＬ／ｋｇ投与した（３０ｇマウスあたり３００μＬ）。最初の血液サンプルは下顎サンプリング法を用いて、２回目はイソフルラン麻酔および安楽死後に採取した。
【０１８６】
結果
ｈＢＤ２は１時間の半減期、および２種の融合タンパク質は１２時間の半減期を示した。ＡＵＣは劇的に変化した。腎クリアランスもまた、ｈＢＤ２について１０ｍＬ／分（図２９）から２種の融合分子について０．５〜２．２ｍＬ／分（図３０、３１）に変化した。例は、ｈＢＤ２の半減期がアルブミンへのＣ端またはＮ端共役体化によって著しく延長され得ることを示す。
【０１８７】
例７
マウスでの急性１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎モデルにおける「ｈＢＤ２−アルブミン融合Ｎ端」の抗炎症効果を測定および評価する。
【０１８８】
材料および方法
処置方法：「ｈＢＤ２−アルブミンＮ端」を、１０ｍＬ／ｋｇ体重の投与容量で、無菌２５Ｇ針を用いて尾静脈により静脈内にまたは皮下に投与した。マウスは１日１回投与を実行上１０日間受けた。活性な対照デキサメサゾン（ＤＥＸ）を、１０ｍＬ／ｋｇ体重ＯＤの投与容量にて、１ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に与えた。
【０１８９】
結果
「ｈＢＤ２−アルブミンＮ端」による処置は、静脈内経路によって１．６５ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与されたとき、疾患活動性指標（ＤＡＩ）の有意な阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。さらに、「ｈＢＤ２−アルブミンＮ端」が皮下にそれぞれ１．６５ｍｇ／ｋｇの用量、および１２５ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与されたとき、１０日目にＤＡＩスコアの有意な阻害も認められた（ｐ＜０．０５）。
【０１９０】
デキストラン硫酸ナトリウムの投与は、組織学的検査後に証明される結腸組織の重大な炎症および傷害をもたらした。「ｈＢＤ２−アルブミンＮ端」による処置は、この組織学的損傷の統計学的に有意な低下をもたらさなかったが、同様に、有効対照ＤＥＸは組織学的傷害を低下しなかった。
【０１９１】
結果は、「ｈＢＤ２−アルブミンＮ端」で処置されたマウスにおいて、２日および３日目の体重の一時的な低下に関わらず、７日目に体重の有意な増加をさらに示した。これに対して、ＤＥＸ処置マウスは５日目以降、体重の非常に有意な低下を示した（ｐ＜０．０１）。このことは、「ｈＢＤ２−アルブミンＮ端」が正常な微生物叢を維持し、これによって体重維持効果を有すること示す。
【０１９２】
例は、ｈＢＤ２−アルブミン融合Ｎ端が炎症症状の動物モデルにおいて生物学的に活性であることを実証する。
【０１９３】
例８．
マウスでの急性１０日間デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎モデルにおける「ｈＢＤ２−アルブミン融合Ｃ端」の抗炎症効果を測定および評価する。
【０１９４】
材料および方法
処置方法：「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」を、１０ｍＬ／ｋｇ体重の投与容量で、無菌２５Ｇ針を用いて尾静脈により静脈内にまたは皮下に投与した。マウスは１日１回投与を実行上１０日間受けた。活性な対照プレドニゾロン（Ｐｒｅｄ）を、１０ｍＬ／ｋｇ体重ＯＤの投与容量にて、１ｍｇ／ｋｇの用量で強制投与によって経口で与えた。
【０１９５】
結果
「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」による処置は、静脈内経路によって１．６ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与されたとき、ＤＡＩの有意な阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。さらに「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」は、静脈内経路によって１．６ｍｇ／ｋｇの用量で、選択した０、２、４、６、８および１０日目に投与されたとき、ＤＡＩの有意な阻害をもたらした（ｐ＜０．０５）。プレドニゾロンによる毎日の処置は、９日目にＤＡＩの有意な阻害をもたらした。（ｐ＜０．０５）。
【０１９６】
デキストラン硫酸ナトリウムの投与は、組織学的検査後に証明される結腸組織の重大な炎症および傷害をもたらした。１．６ｍｇ／ｋｇの用量での「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」による処置は、この組織学的損傷の統計学的に有意な低下をもたらした（ｐ＜０．０５）。同様に、０、２、４、６、８、および１０日目に１．６ｍｇ／ｋｇのおよび１６．５ｍｇ／ｋｇの用量での「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」による毎日の処置は、結腸に組織学的損傷の有意な低下をもたらした（ｐ＜０．０１）。活性対照プレドニゾロンによる処置は、結腸の近位部分での組織学的な傷害を有意に低下しなかったが、遠位結腸での傷害を低下した（ｐ＜０．０１）。
【０１９７】
結果は、「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」で処置された動物における体重の有意な増加をさらに示した（ｐ＜０．０５）。このことは、「ｈＢＤ２−アルブミンＣ端」が正常微生物叢を維続し、このため重量維持効果を有することを示す。例は、ｈＢＤ２−アルブミン融合Ｃ端が炎症症状の動物モデルにおいて生物学的に活性であることを実証する。
【０１９８】
例９．配列
【表１】
2019504122.tif 000002
【０１９９】
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Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ  ＰＪ，Ｂａｃｋｈｅｄ  Ｆ，Ｆｕｌｔｏｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＩ，２００８．Ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｍａｒｋｅｄ  ｂｕｔ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ（食餌誘発肥満はマウス遠位消化管マイクロバイオームにおける顕著だが可逆的な変化と関連する）．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ３（４）：２１３−２３．
Ｖｒｉｅｚｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ  ２０１２．Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｆｒｏｍ  ｌｅａｎ  ｄｏｎｏｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ（赤肉ドナーからの腸内微生物叢の移行はメタボリック症候群を有する個体におけるインスリン感受性を高める）．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ  １４３（４）：９１３−６．
Ｗａｌｔｅｒ，２０１５．Ｍｕｒｉｎｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−ｄｉｅｔ  ｔｒｕｍｐｓ  ｇｅｎｅｓ（ネズミ消化管微生物叢食餌は遺伝子に勝つ）．Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  １７（１）：３−５．
Ｗｅｈｋａｍｐ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ，２００２．Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｌｐｈａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ（先天免疫および結腸炎症：上皮性α−デフェンシンの増強された発現）．Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ．４７（６）：１３４９−５５．
Ｚｈａｎｇ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ，２０１５．Ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ａｎｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅｓ  ａｒｅ  ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｌｙ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（口腔および消化管マイクロバイオームは関節リウマチで撹乱され、治療後に部分的に正常化される）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２１（８）：８９５−９０５．
【０２００】
そして特許および特許出願を次に示す。
ＷＯ２０１０／００７１６６
ＷＯ９２／０６２０４
ＷＯ９５／１７４１３
ＷＯ９５／２２６２５
ＵＳ５，２２３，４０９
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2019504122.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月11日(2018.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2019504122.tif 000061
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