(57)【要約】  本発明は、ヒトα-ミオシンから少なくとも部分的に由来し得るペプチド、心筋炎における自己抗体形成を予防又は抑制するためのペプチド及びそのようなペプチドの使用を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)MLTFLHEPAVLFNLK (配列番号1)、
VNPYKWLPVYNAEVV (配列番号2)、
PHIFSISDNAYQYML (配列番号3)、
KRVIQYFASIAAIGD (配列番号4)、
YHIFYQILSNKKPEL (配列番号5)、
KSAYLMGLNSADLLK (配列番号6)、
KSSLKLMATLFSSYA (配列番号7)、
KGSSFQTVSALHREN (配列番号8)、
EATLQHEATAAALRK (配列番号9)及び
RVQLLHSQNTSLINQ (配列番号10)
から選択されるアミノ酸配列の全て若しくは一部；又は
(ii)配列番号1から10のうちのいずれかの配列に対し少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号1から10から選択される、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項1又は請求項2に規定されるペプチドを1つ以上含む組成物。
【請求項４】
配列番号2、3及び5のペプチドを含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
配列番号7、9及び10のペプチドを含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項６】
対象におけるα-ミオシン自己抗体の産生の抑制又は予防における使用のための、請求項1若しくは請求項2に記載のペプチド又は請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
対象における心筋炎の処置及び/又は予防における使用のための、請求項1若しくは請求項2に記載のペプチド又は請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
対象においてα-ミオシン自己抗体の産生を抑制又は予防するための医薬の製造における、請求項1若しくは請求項2に記載のペプチド又は請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
対象において心筋炎を処置及び/又は予防するための医薬の製造における、請求項1若しくは請求項2に記載のペプチド又は請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１０】
対象においてα-ミオシン自己抗体の産生を抑制又は予防する方法であって、前記対象に請求項1若しくは請求項2に記載のペプチド又は請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
対象において心筋炎を処置する方法であって、前記対象に請求項1若しくは請求項2に記載のペプチド又は請求項3から5のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項１２】
前記心筋炎が拡張型心筋症である、請求項6から11のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド若しくは組成物、使用又は方法。
【請求項１３】
前記対象がHLA-DR4陽性である、請求項6から11のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド若しくは組成物、使用又は方法。
【請求項１４】
請求項1又は請求項2に記載のペプチドをコードしている核酸分子。
【請求項１５】
心臓ミオシンで免疫化されたHLA-DR4tgマウスを含む、実験的自己免疫性心筋炎のマウスモデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[背景技術]
心筋炎は、40歳未満の人々における心不全の主要因である。急性発症した人の最大1/5が、拡張型心筋症(DCM)に至る慢性疾患へ進行することになる。急性心筋炎は、コクサッキーウイルス(coxsackevirus)B3(CVB3)を含めたウイルスによる感染に起因する場合があり、過去の感染の証拠が、DCM患者のおよそ50%に見られる。CVB3などのウイルスは、心臓組織に対して直接的な細胞変性効果を有する。しかしながら、強力な証拠が、慢性心筋炎に進行する個体は心筋の抗原に対して自己免疫反応を発症するのでそうなることを示唆している。
【０００２】
ミオシンを含めた心臓組織抗原に対する循環抗体は慢性心筋炎と関係しており、心臓疾患の重症度は、罹患組織における自己抗体のレベルと直接関係する。器官特異的IgG抗体が、DCM患者由来の生検に見られた。CD4+T細胞に依存してIgGを分泌するB細胞は、クラススイッチを助け、従って、心筋に特異的なT細胞が、心筋炎患者の生検中に見られることは意外でない。心筋炎患者から単離されたT細胞が、SCIDマウスにおいて疾患を誘導することが示されている。
【０００３】
ミオシンアルファ鎖は心筋に特異的であり、一方でベータ鎖は骨格筋においても発現する。DCM患者のうち41%がα-ミオシンに対する抗体を有することが示され、一方で20%の直系親族も類似の抗体を有していた。これは、疾患罹病性に対する遺伝的又は環境的いずれの関与も示唆する。心筋炎の一部の症例は、必ずしも心組織へのウイルス損傷の後に続くのでなく、自己免疫性起源を有し得るという可能性が残る。これは、心組織中にウイルスゲノムの証拠がない患者を免疫抑制薬で処置できるという、臨床的な証拠によって支持される。
【０００４】
一般に、急性又は慢性いずれの心筋炎の処置も、心不全における鬱血を減少させ、心臓血行動態を改善することを意図している。心不全の処置は、根本原因に関係なく、同じ処置レジメンに従う(即ち、血管拡張薬、利尿薬、ベータアドレナリン遮断薬、アンギオテンシン変換酵素阻害剤)。
【０００５】
慢性心筋炎に利用可能な治療は現在のところ存在せず、従って、今日の処置は、現れている症状を標的とすることを目的としている。従って、心筋炎を処置又は予防し、疾患の症状を軽減又は減少させるのに有効な、心筋炎に対する代替治療法が必要とされている。
【０００６】
本発明は、この必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００７】
本実施例に示すように、本発明者らは、α-ミオシンに対する自己抗体を減少させ、心臓ミオシンに特異的なT細胞の増殖を減少させ、左室心機能を改善するのに有効な、α-ミオシンに由来するいくつかのペプチドを同定した。本発明のペプチドは、自己免疫性心筋炎の予防及び/又は処置に有用である。
【０００８】
従って第1の態様において、本発明は、
(i)MLTFLHEPAVLFNLK (配列番号1)、
VNPYKWLPVYNAEVV (配列番号2)、
PHIFSISDNAYQYML (配列番号3)、
KRVIQYFASIAAIGD (配列番号4)、
YHIFYQILSNKKPEL (配列番号5)、
KSAYLMGLNSADLLK (配列番号6)、
KSSLKLMATLFSSYA (配列番号7)、
KGSSFQTVSALHREN (配列番号8)、
EATLQHEATAAALRK (配列番号9)及び
RVQLLHSQNTSLINQ (配列番号10)
から選択されるアミノ酸配列の全て若しくは一部;又は
(ii)配列番号1から10のうちのいずれかの配列に対し少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】クーマシーブルーで染色したヒト及びブタ心臓ミオシン抽出物のSDSゲルイメージを示す図である。ブタ心臓ミオシンは、最終のアクチン及びアクチノミオシン除去工程を伴わない粗摘出物である。ヒト心臓ミオシンはより純粋であり、ミオシン重鎖(MyHC)、必須軽鎖(ELC)及び調節軽鎖(RLC)バンドだけを与える。
【図２】DR4マウスにおける実験的自己免疫心筋炎(EAM)誘導のプロトコールを示す図である。CFA中に乳化した100μgのヒトミオシン抽出物を、6〜8週齢のマウスに皮下注射した。0日目及び2日目に百日咳毒素200ngの腹膜注射を2回行った。疾患の発症を3週間後に評価した。
【図３】EAMモデルにおける心臓ミオシンに対するT細胞増殖の増大を示す図である。心臓ミオシン注射は、抗ミオシンT細胞増殖を増大させ(ミオシン濃度0.2μg/mLの場合p=0.00015、2.0μg/mLの場合p=0.0037及び20μg/mLの場合p=0.0015、n=5)、全身的なT細胞刺激物質であるConAが、2μg/mLの終濃度で増大させたものより更に大きかった(対応のない両側スチューデントt検定を使用して、平均の間の差異を決定した。2群以上の平均を比較する場合には、ボンフェローニ補正検定後に一元配置分散分析を実行して、群間の有意差を評価した。)。
【図４】EAM誘導DR4マウスにおける抗ミオシン抗体レベルの増大を示す図である(4A)。循環IgG1レベルは、α-ミオシンで免疫化した群において有意に増大した(pmax=0.0008、n=5)(4B)。IgG2cレベルは、EAMモデルにおいても有意に増大した(pmax=0.02、n=5)。
【図５】マウス間の体重の有意な低下を示す図である。ミオシン接種した群は、平均に対してわずか0.5グラムしか増えず、一方で対照群は、3週間でほぼ3グラム増えた。体重の差異は、終了時に有意であった(p=0.04、n=5)。
【図６】EAM誘導DR4マウスにおける障害のある左室心機能を示す図である。(A)有意差は、左室拡張末期径間で顕著でなかった(B)左室収縮末期径において有意な増大が観察された(p=0.039、n=5)(C)駆出率のパーセンテージに有意な減少が起こった(p=0.003、n=5)(D)短縮率のパーセンテージに有意な減少(p=0.006、n=5)も見られた(E)代表的なイメージを、Mモードで撮像した対照群について示す(F)Mモードで撮像したEAM誘導群の代表的なイメージ。
【図７】心筋炎がある心臓において炎症を起こした領域を実証する代表的なH&E切片を示す図である。対照群のマウスは、全て明瞭であったが、一方でEAM誘導マウス由来の心臓の5/5が、免疫細胞により浸潤されていた(p=0.0079、フィッシャーの正確確率検定)。
【図８】それらの抗原性に対する候補エピトープのスクリーニングを示す図である。スクリーニングアッセイを3回繰り返し、有力なエピトープをその刺激指数に従って決定した。角括弧中の数は、細胞を刺激するために使用したペプチド又はα-ミオシンの濃度(μg/mL)を指す。
【図９】α-ミオシン特異的ペプチド治療プロトコールを示す図である。
【図１０】ペプチド治療によって得られた、抗ミオシンT細胞増殖の低下を示す図である。YL-PL-VVペプチド(ペプチド5、3及び2)は、有意な低下を誘導し(p=0.0007、n=15)、一方でRQ-EK-KAペプチド(ペプチド10、9及び7)は、統計的有意性はないが低下傾向を与えた(p=0.065、n=11)。
【図１１】RQ-EK-KA治療によって誘導された、ミオシン特異的抗体レベルの低下を示す図である。(A)全ての血清中濃度で、抗ミオシンIgG1レベルは、対照群と比較して、RQ-EK-KAペプチドで有意に低下した(pmax=0.036、n=11)。(B)抗ミオシンIgG2cレベルは、1/1000希釈でのRQ-EK-KAペプチドで有意に低下した(p=0.0072、n=11)。
【図１２】α-ミオシン特異的ペプチド治療により得られた、左室心機能の改善を示す図である。(A)左室拡張末期及び左室収縮末期寸法は、ペプチド治療による影響を受けなかった(B)駆出率(RQ-EK-KA治療の場合p=0.011、n=10、YL-PL-VV治療の場合p=0.041、n=13)及び短縮率(RQ-EK-KA治療の場合p=0.011、n=10、YL-PL-VV治療の場合p=0.044、n=13)のパーセンテージの有意な増大が、両方の治療により達成された(C)Mモードで撮像した対照群(治療なし)の代表的なイメージ(D)YL-PL-VV治療を受けた群の代表的なイメージ(E)RQ-EK-KA治療を受けた群の代表的なイメージ。
【図１３】RQ-EK-KA治療により得られた、心臓組織への炎症性細胞浸潤の低下を示す図である。(A)細胞浸潤により同定される心臓炎症のレベルは、RQ-EK-KA治療により有意に減少した(p=0.021、n=11)が、YL-PL-VV治療では、効果がなかった。(B)対照(C)YL-PL-VV治療及び(D)RQ-EK-KA治療群からの細胞浸潤(ヘマトキシリンで染色した濃縮した細胞核による青色領域)の比率を示す代表的なH&E切片。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ペプチド
第1の態様において、本発明はペプチドに関する。
【００１１】
用語「ペプチド」は、一般に隣接するアミノ酸のαアミノとカルボキシル基の間のペプチド結合により互いに接続されている一連の残基、一般にL-アミノ酸、を意味する通常の意識で使用される。本用語は、修飾されたペプチド及び合成ペプチド類似体を含む。
【００１２】
本発明のペプチドは、化学的方法(Peptide Chemistry、A practical Textbook. Mikos Bodansky、Springer-Verlag、ベルリン)を使用して作製することができる。例えば、ペプチドは、固相技術により合成し(Roberge JYら[1995年] Science 269: 202〜204頁)、樹脂から切断し、分取高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる(例えば、Creighton [1983年] Proteins Structures And Molecular Principles、WH Freeman and Co、New York NY)。自動化合成は、例えばABI 43 1A Peptide Synthesizer(パーキンエルマー)を使用して、製造業者により提供された指示に従って達成し得る。
【００１３】
あるいは、ペプチドは、組換え手段、又はより長いポリペプチドからの切断により作製することができる。例えば、ペプチドは、αミオシンタンパク質からの切断により得ることができ、その後に一方又は両方の端を修飾することもできる。ペプチドの組成物は、アミノ酸分析又は配列決定(例えば、エドマン分解手順)により確認することができる。
【００１４】
実際上は、ペプチドが示し得る他の様々な特徴がある。例えば、ペプチドが、治療上有用であるためにin vivoで十分に安定であることは重要である。in vivoでのペプチドの半減期は、少なくとも10分間、30分間、4時間又は24時間であり得る。
【００１５】
ペプチドは、in vivoで良好な生物学的利用能も示し得る。ペプチドは、相当な妨害なしに細胞表面でMHC分子に結合することを可能にする配置をin vivoで維持し得る。
【００１６】
本発明によるペプチドは、配列番号1から10のうちのいずれか1つから選択されるペプチドと少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、70%、81%、82%、83%、84、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくは100%同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなってよい。一態様において、ペプチドは、配列番号1から10のうちのいずれか1つに対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%配列同一性を有する。
【００１７】
好ましい態様において、ペプチドは、配列番号1から10のうちのいずれか1つを含む。更に好ましい態様において、ペプチドは、配列番号1から10、好ましくは配列番号2、3、5、7、9又は10のうちのいずれか1つからなる。
【００１８】
配列同一性は、任意の簡便な方法により評価することができる。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定する場合、配列の複数アライメントを作製するコンピュータプログラム、例えばClustal W(Thompsonら、[1994年] Nucleic Acids Res.、22: 4673〜4680頁)が有用である。ALIGN(Myersら、[1988年] CABIOS、4: 1〜17頁)、FASTA(Pearsonら、[1988年] PNAS、85:2444〜2448頁、Pearson [1990年]、Methods Enzymol.、183: 63〜98頁)、及びギャップありのBLAST(Altschulら、[1997年] Nucleic Acids Res.、25: 3389〜3402頁)のような、配列対を比較し、アライメントするプログラムも、この目的に有用である。更に、欧州バイオインフォマティクス研究所のDali serverは、タンパク質配列の構造に基づくアライメントを提供する(Holm [1993年] J.Mol.Biol.233: 123〜38頁; Holm [1995年] Trends Biochem. Sci.、20: 478〜480頁; Holm [1998年] Nucleic Acid Res.、26: 316〜9頁)。
【００１９】
複数配列アライメント及びパーセント同一性の算出は、標準的なBLASTパラメータ(利用可能な全ての生物の配列、マトリックスBlosum 62、ギャップコスト:存在11、伸長1を使用する)を使用して決定することができる。
【００２０】
これに代えて、以下のプログラム及びパラメータを使用することができる:プログラム: Align Plus 4、バージョン4.10(Sci Ed Central Clone Manager Professional Suite)。DNA比較:全体比較、標準線形スコアリング行列、ミスマッチペナルティ=2、開始ギャップペナルティ=4、伸長ギャップペナルティ=1。アミノ酸比較:全体比較、BLOSUM 62スコアリング行列。
【００２１】
従って記載された又は所与の配列のバリアントは、バリアントが親の機能的活性を保持する、即ちバリアントが機能的に等価である、換言すれば、それらが本明細書に定義した親ペプチドの活性(例えば、心筋炎における有益な効果)を有する又は呈する限り、本発明の範囲に含まれる。そのようなバリアントは、親配列の、例えば1つ以上、例えば1から14アミノ酸のアミノ酸置換、付加又は欠失(一端又は両端におけるトランケーションを含む)を含み得る。
【００２２】
アミノ酸の1つ以上が化学的に誘導体化されている、例えば化学基で置換されている機能的に等価の誘導体も含まれる。
【００２３】
従って、ペプチドが必要とする活性を保持する限り、本発明のペプチドは、配列番号1〜10の部分又は断片を含むことができる。配列番号1〜10の断片は、例えば、長さ7から14残基、例えば長さ7、8、9、10、11、12又は13残基であることができる。
【００２４】
更なる態様において、本発明は、本明細書に定義されるペプチド、即ち:
(i)MLTFLHEPAVLFNLK (配列番号1)、
VNPYKWLPVYNAEVV (配列番号2)、
PHIFSISDNAYQYML (配列番号3)、
KRVIQYFASIAAIGD (配列番号4)、
YHIFYQILSNKKPEL (配列番号5)、
KSAYLMGLNSADLLK (配列番号6)、
KSSLKLMATLFSSYA (配列番号7)、
KGSSFQTVSALHREN (配列番号8)、
EATLQHEATAAALRK (配列番号9)及び
RVQLLHSQNTSLINQ (配列番号10)
から選択されるアミノ酸配列の全て若しくは一部;又は
(ii)配列番号1から10のうちのいずれかの配列に対し少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する又は含むペプチド
をコードしている核酸分子を提供する。
【００２５】
そのような核酸分子の相補体も、提供される。
【００２６】
本発明の核酸分子は、好ましくは少なくとも30ヌクレオチド、好ましくは800ヌクレオチド以下、より好ましくは700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100又は50ヌクレオチド以下を含む。核酸分子は、好ましくは単離された分子である。
【００２７】
エピトープ
適応免疫反応において、Tリンパ球はタンパク質抗原の内部エピトープを認識することができる。抗原提示細胞(APC)はタンパク質抗原を取り込み、それを短いペプチド断片に分解する。ペプチドは、細胞内部で主要組織適合複合体(MHC)分子に結合し、細胞表面へ運ばれることができる。MHC分子と併せて細胞表面で提示されると、ペプチドは、T細胞(T細胞受容体[TCR]を介して)によって認識され得、その場合ペプチドは、T細胞エピトープである。
【００２８】
従って、エピトープは、MHC分子のペプチド結合溝に結合し、T細胞によって認識され得る抗原に由来し得るペプチドである。最小のエピトープは、エピトープに由来し得る最も短い断片であり、これは、MHC分子のペプチド結合溝に結合し、T細胞によって認識され得る。
【００２９】
本発明のペプチドは、MHC分子に結合することができる任意の長さであることができる。一般に、本発明のペプチドは、MHCクラスIIに結合することができる。
【００３０】
MHCクラスI分子に結合するペプチドは、一般に7から13、より通常には8から10のアミノ酸長である。ペプチドの結合は、ペプチドの主鎖にある原子と全てのMHCクラスI分子のペプチド結合溝にある不変部位との間の接触によりその2つの端で安定化される。ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端に結合する溝の両端に、不変部位がある。ペプチド長の変動は、しばしば、柔軟性を与えるプロリン又はグリシン残基におけるペプチド骨格のねじれにより適合される。
【００３１】
MHCクラスII分子に結合するペプチドは、一般に8から20のアミノ酸長、より通常には10から17のアミノ酸長であり、より長くなることもできる(例えば40アミノ酸まで)。これらのペプチドは、(MHCクラスIペプチド結合溝と異なり)両端で開放されているMHC IIペプチド結合溝に沿って延長された配置にある。ペプチドは主に、ペプチド結合溝に沿って並ぶ保存残基との主鎖原子接触により適所に保持される。
【００３２】
本発明のペプチドは、8から30の間のアミノ酸、例えば8から25アミノ酸、8から20アミノ酸、8から15アミノ酸又は8から12アミノ酸を含むことができる。一態様において、本発明のペプチドは、従って8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30のアミノ酸長であることができる。一実施形態において、ペプチドは、20、21又は22のアミノ酸長である。
【００３３】
本発明によるペプチドは、配列番号1から10のうちのいずれか1つに対して修飾を含むことができる。例えば、ペプチドが本明細書に記載のその機能を保持する限り、そのようなペプチドは、突然変異、挿入、欠失、付加及び/又は置換などの修飾を1つ以上含むことができる。一般に、修飾は、α-ミオシン由来配列内のアミノ酸置換であることができる。このアミノ酸は、グリシン、リジン又はグルタミン酸などのアミノ酸を置換し得る。ペプチドは、α-ミオシン由来配列から最高3、最高2又は1つのアミノ酸置換を含むことができる。
【００３４】
そのようなペプチドは、一方又は両方の端でα-ミオシン配列由来ではないアミノ酸を含むことができる。例えば、ペプチドは、一方又は両方の端で1つ以上のグリシン及び/又はリジン及び/又はグルタミン酸残基を有することができる。例えば、追加のアミノ酸は、一方又は両方の端でアミノ酸対KK、KE、EK又はEEが続くグリシン又はリジンスペーサーを含むことができる。
【００３５】
一実施形態において、ペプチドは、ペプチドのドラッガビリティを改善又は最適化し得る任意のアミノ酸を含むことができ、例えば、天然又は人工アミノ酸は、ペプチドの可溶性を改善することができる。
【００３６】
例えば、ペプチドは、以下の式を有することができる:
KKG-α-ミオシン由来ペプチド-GKK。
【００３７】
α-ミオシン
用語α-ミオシン及びミオシン重鎖(MyHC)-αは、本明細書において同義的に使用される。
【００３８】
慢性心筋炎は、心臓自己抗原、特にα-ミオシンを標的とする自己反応性T及びBリンパ球により引き起こされる自己免疫性疾患である。
【００３９】
心筋ミオシンは、2つの重鎖サブユニット、2つの軽鎖サブユニット及び2つの調節サブユニットからなる六量体である。重鎖は、α(アルファ)重鎖サブユニット(MyHC-α)及びβ(ベータ)重鎖サブユニット(MyHC-β)で構成されている。
【００４０】
MyHC-β及びMyHC-αの相対的存在量の変化は、心筋の収縮速度と相関する。胎児の初期発達において、MyHC-βは心室において主に発現されるが、MyHC-αは心房において主に発現される。健康な成人心臓において、MyHC-αは、心房において主に発現され(>90%)、一方でMyHC-β(約50%)は、機能不全の成人心臓の心房において発現される。in vitro研究により、新たに形成された心筋細胞が、MyHC-βを発現し、長期間(1〜5週間)の収縮活性の後にMyHC-αが検出可能になることが実証された。この遺伝子の対立遺伝子バリアントは、肥大型心筋症(HCM)の症例のおよそ40%と関係している。
【００４１】
前述の通り、心筋炎は、心臓筋肉に炎症性浸潤及び損傷を伴うが心筋梗塞を定義する冠状動脈の遮断を伴わない心臓の感染、又は他の一般的な感染以外の原因によって特徴付けられる。心筋炎は、40歳以下の人々における心不全の主要因である。心筋炎の定義に関する標準的なダラス病理学的基準は、関連する筋細胞壊死を伴う又は伴わない炎症性細胞浸潤が、従来通り染色された心組織切片に存在することを必要とする(Cooperら、N Engl J Med. 2009年、260:1526〜1538頁)。
【００４２】
急性相心筋炎は、パルボウイルスB19などの一般的なウイルスによる感染症に殆どの場合起因するウイルス心損傷、及びそれより一般的ではないがボレリアブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)(ライム病)若しくはクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)などの非ウイルス病原体、又は薬物に対する過敏反応により通常引き起こされる。
【００４３】
急性心筋炎の症例のおよそ1/3は回復するが、慢性鬱血性心不全を伴う拡張型心筋症(DCM)は、心筋炎の主要な長期転帰である(Cooperら、上記の通り)。DCMは、心臓が弱まり、拡張し、効率的に血液を送り出すことができない病態である。心臓機能の低下は、肺、肝臓及び他の体組織に影響を及ぼし得る。
【００４４】
慢性自己免疫が、心筋炎からDCMへの進行の根底にあると考えられている。胸腺は心臓ミオシンを発現しないので、心臓ミオシン、特にα-ミオシンに対する強力なT及びB細胞反応は、病原性(例えばウイルス)抗原の分子擬態により、又は内部心臓ミオシンの組織損傷に付随する曝露において存在する自己反応性免疫細胞の活性化によって起こり得る。
【００４５】
ヒトα-ミオシン(MyHC-α)のアミノ酸配列は、下記の通りである(配列番号11)。
MTDAQMADFG AAAQYLRKSE KERLEAQTRP FDIRTECFVP DDKEEFVKAK ILSREGGKVI        60
AETENGKTVT VKEDQVLQQN PPKFDKIEDM AMLTFLHEPA VLFNLKERYA AWMIYTYSGL       120
FCVTVNPYKW LPVYNAEVVA AYRGKKRSEA PPHIFSISDN AYQYMLTDRE NQSILITGES       180
GAGKTVNTKR VIQYFASIAA IGDRGKKDNA NANKGTLEDQ IIQANPALEA FGNAKTVRND       240
NSSRFGKFIR IHFGATGKLA SADIETYLLE KSRVIFQLKA ERNYHIFYQI LSNKKPELLD       300
MLLVTNNPYD YAFVSQGEVS VASIDDSEEL MATDSAFDVL GFTSEEKAGV YKLTGAIMHY       360
GNMKFKQKQR EEQAEPDGTE DADKSAYLMG LNSADLLKGL CHPRVKVGNE YVTKGQSVQQ       420
VYYSIGALAK AVYEKMFNWM VTRINATLET KQPRQYFIGV LDIAGFEIFD FNSFEQLCIN       480
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SEVEEAVQEC RNAEEKAKKA ITDAAMMAEE LKKEQDTSAH LERMKKNMEQ TIKDLQHRLD      1800
EAEQIALKGG KKQLQKLEAR VRELEGELEA EQKRNAESVK GMRKSERRIK ELTYQTEEDK      1860
KNLLRLQDLV DKLQLKVKAY KRQAEEAEEQ ANTNLSKFRK VQHELDEAEE RADIAESQVN      1920
KLRAKSRDIG AKQKMHDEE                                                 1939
【００４６】
本発明のペプチドは、α-ミオシンに少なくとも部分的に由来し得る。
【００４７】
寛容
寛容は、抗原に無反応の状態である。自己抗原に対する寛容は、免疫系の必須の特性であり、これが失われると、自己免疫性疾患が起こり得る。適応免疫系は、自身の組織内に含有される自己抗原の自己免疫攻撃を回避しながら、膨大な種類の感染因子に反応する能力を維持しなければならない。これは、胸腺におけるアポトーシス細胞死に対する未発達なTリンパ球の感受性により大部分が制御される(中枢性寛容)。しかしながら、全ての自己抗原が胸腺において検出されるわけではないので、自己反応性胸腺細胞の死は、不完全なままである。従って、寛容が、末梢組織において成熟した自己反応性Tリンパ球によって獲得され得る機序も存在する(末梢性寛容)。中枢性及び末梢性寛容の機序の総説は、Andertonら(1999年)(Immunological Reviews 169:123〜137頁)に示されている。
【００４８】
慢性心筋炎は、抗-α-ミオシン自己抗体により引き起こされると現在考えられている。本明細書において実証した通り、本発明によるペプチドは、対象に投与した場合に、α-ミオシン自己タンパク質に対する寛容を復帰させ、病原性免疫反応を削減できるように、α-ミオシンに対する寛容を誘導することができる。
【００４９】
寛容は、CD4+T細胞の少なくとも一部におけるアネルギーの誘導から生じる又はそれにより特徴付けることができる。T細胞を活性化するために、ペプチドは、T細胞に2つのシグナルを送達することができる「プロフェッショナル」APCと会合しなければならない。第1のシグナル(シグナル1)は、APCの細胞表面にあるMHCペプチド複合体により送達され、TCRを介してT細胞により受け取られる。第2のシグナル(シグナル2)は、CD80及びCD86など、APCの表面にある共刺激分子により送達され、T細胞表面のCD28により受け取られる。T細胞がシグナル2の非存在下でシグナル1を受け取る場合、T細胞は活性化されず、事実、アネルギー性になると考えられる。アネルギー性T細胞は、その後の抗原チャレンジに不応性であり、他の免疫反応を抑制することができ得る(Treg細胞)。アネルギー性T細胞/Treg細胞は、T細胞寛容の媒介に関係すると考えられる。
【００５０】
α-ミオシンに対するT細胞寛容の誘導は、当分野で公知の技術により
i)α-ミオシン自己抗体
ii)α-ミオシンに特異的なCD4+T細胞、及び/又は
iii)α-ミオシン自己抗体を分泌することができるB細胞
のレベルの減少を見ることによりin vivoでモニターすることができる。
【００５１】
従って、寛容の誘導は、
(a)CD4+T細胞におけるアネルギー/Tregの誘導(in vitroでの抗原によるその後の抗原接種により検出することができる)
(b)(i)増殖の減少
(ii)IL-2、IFN-γ及びIL-4産生の下方制御、及び
(iii)IL-10産生の増大
を含めたCD4+T細胞集団の変化
を含む様々な技術によりモニターすることもできる。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「寛容原性」は、寛容を誘導することができる、即ち抗原特異的免疫寛容を意味する。
【００５３】
組成物
本発明は、本発明による1つ以上のペプチドを含む医薬組成物などの組成物にも関する。
【００５４】
組成物は、複数のペプチド、例えば2、3、4、5又は6個のペプチドを含むことができる。
【００５５】
好ましい態様において、組成物は2つ以上の異なるペプチド、例えば2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10個又はより多くの異なるペプチドを含む。好ましい態様において、組成物は3個の異なるペプチド、好ましくは配列番号2、3及び5又は7、9及び10のペプチドを含む。
【００５６】
本発明の組成物は、予防的又は治療的使用のためのものであることができる。
【００５７】
予防的使用のために投与した場合、組成物は、α-ミオシンに対する免疫反応の生成を減少させる又は予防し得る。免疫反応のレベルは、患者が組成物で処置されなかった場合に得られることになるそれより低い。用語「減少する」は、患者が組成物で処置されなかった場合に観察されたであろう反応における(又は同じ期間にわたって無処置の患者において観察される反応における)50%、70%、80%又は90%の減少など、免疫反応の部分的な減少が観察されることを示す。用語「予防する」は、α-ミオシンに対して明白な免疫反応が観察されないことを示す。
【００５８】
対象は、任意のヒト又は非ヒト動物対象であることができるが、とりわけ哺乳動物であることができる。動物は、家畜（livestock又はdomestic animal）又は商品価値のある動物、例えば実験動物又は動物園若しくは動物保護区内の動物であることができる。従って、代表的な動物には、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット、ハムスター、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、鶏、七面鳥、ホロホロチョウ、カモ、ガチョウ、オウム、セキセイインコ、ハトがある。従って、本発明の獣医学的使用が、包含される。対象は、患者として見られ得る。好ましくは、対象はヒトである。
【００５９】
治療上の使用のために投与される場合、組成物は、α-ミオシンに対して既に進行中の免疫反応を抑制することができる。用語「抑制する」は、ペプチド処置前のレベル、又は処置を行わなかった同じ時点で観察されたであろうレベルと比較した、進行中の免疫反応のレベルの減少を示す。
【００６０】
本発明の組成物による処置は、以下：
i)α-ミオシン自己抗体
ii)α-ミオシンに特異的なCD4+T細胞、及び
iii)α-ミオシン自己抗体を分泌するB細胞
のいずれか又は全部のレベルの減少を引き起こし得る。
【００６１】
全ての因子の検出は、ELISA、フローサイトメトリーなどの、当分野で公知の技術により実施することができる。
【００６２】
本発明の組成物による処置は、これに加えて又はこれに代えて、CD4+T細胞にアネルギーを引き起こす又はα-ミオシンに特異的なTreg細胞を誘導し得る。アネルギーは、例えば、in vitroでのα-ミオシンによるその後の接種によって検出することができる。
【００６３】
2つ以上のペプチドがある場合、医薬組成物は、キットの形態であることができ、キットにおいてペプチドのいくつか又はそれぞれは、同時、個別若しくは連続投与のために別々に提供される。
【００６４】
これに代えて(又は加えて)、医薬組成物(又はその任意の部分)が、複数用量で投与される場合、各用量は別々に包装されてもよい。
【００６５】
また、本発明の医薬組成物において、その又は各ペプチドは、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤又は可溶化剤と混合し得る。
【００６６】
製剤
組成物は、注射可能な、溶液又は懸濁液のいずれかとして調製することができ、注射前の液体において溶液又は懸濁液にするのに適切な固体形態が、調製されてもよい。調製品は、乳化されてもよく、又はペプチドは、リポソーム中にカプセル化されてもよい。有効成分は、薬学的に許容され、有効成分に適合する賦形剤と混合されてもよい。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水(例えば、リン酸緩衝食塩水)、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど、及びその組合せである。
【００６７】
加えて、必要に応じて、組成物は、湿潤剤若しくは乳化剤及び/又はpH緩衝剤などの補助物質を少量含有し得る。緩衝塩の例としては、ホスフェート、シトレート、アセテート、塩酸があり、及び/又は水酸化ナトリウムをpH調整に使用することができる。安定化のために、スクロース又はトレハロースなどの二糖類を使用し得る。
【００６８】
組成物が複数のペプチドを含む場合、ペプチドの相対比率は、およそ等しくてもよい。これに代えて、1つのペプチドが、他のペプチド、特にHLA型より良く作用することが判明した場合、各ペプチドの相対比率を改変して、例えば、自己反応性T細胞の特定のサブセットに寛容原性反応を集中させることもできる。
【００６９】
製剤後に、組成物を無菌容器に組み込み、次いでこれを密閉し、低温、例えば4℃で保存してもよく、又は組成物を冷凍乾燥してもよい。好都合には、組成物は、凍結乾燥された(冷凍乾燥された)散剤として調製される。凍結乾燥により、安定形態での長期保存が可能になる。凍結乾燥手順は当分野で周知であり、例えばhttp://www.devicelink.com/ivdt/archive/97/01/006.htmlを参照のこと。マンニトール、デキストラン又はグリシンなどの増量剤が、冷凍乾燥する前に一般的に使用される。
【００７０】
医薬組成物は、当分野で公知の任意の形態、例えば錠剤、カプセル剤、コーティング錠、液剤、懸濁剤、タブレット剤（tab）、袋剤、植込錠、吸入剤、散剤、ペレット剤、乳剤、凍結乾燥剤(lyophilisate)、発泡剤、噴霧剤、軟膏剤、乳剤、バルム（balm）、硬膏剤又はその任意の混合物として提供され得る。それは、例えば、胃液耐性調製品として及び/又は持続的な作用形態で提供されてもよい。それは、経口、非経口、局所、直腸、生殖器、皮下、経尿道、経皮、鼻腔内、腹膜内、筋肉内及び/若しくは静脈内投与並びに/又は吸入による投与に適切な形態であり得る。
【００７１】
組成物は、経口、静脈(水溶性の場合)、筋肉内、皮下、舌下、鼻腔内、真皮内若しくは坐剤経路又は植込(例えば徐放分子を使用する)などによる簡便な手法で投与し得る。
【００７２】
組成物は、鼻腔内、皮下又は真皮内経路によって有利に投与され得る。
【００７３】
本発明のペプチド及び組成物は、ヒト対象を処置するために使用し得る。対象は、心筋炎を有し得る。対象は、慢性自己免疫性心筋炎を有し得る。対象は、拡張型心筋症を有し得る。対象は、α-ミオシン自己抗体を有し得る。
【００７４】
対象は、α-ミオシン自己抗体を発症する素因と関係するHLA-ハプロタイプであり得る。対象は、HLA-DR4を発現し得る。個体のHLAハプロタイプを決定する方法は、当分野で公知である。
【００７５】
一般に、医師が、個体対象に最も適することになる実際の投薬を決定するであろうし、その投薬は、個々の患者の年齢、体重及び反応によって変動するであろう。
【００７６】
好ましい実施形態において、複数の用量が、上昇濃度で患者に与えられる場合、「用量増加」プロトコールに従うことができる。そのような手法は、例えば、ハチ毒アレルギーに対する免疫療法適用におけるホスホリパーゼA2ペプチドに使用されてきた(Mullerら[1998年] J. Allergy Clin Immunol.  101:747〜754頁及びAkdisら[1998年] J. Clin. Invest. 102:98〜106頁)。
【００７７】
キット
好都合にも、組成物が複数のペプチドを含む場合、それらを、混合組成物又はカクテルの形態で一緒に投与し得る。しかしながら、同時、個別、連続又は併用投与のために、キットの形態でペプチドを別々に提供することが好ましい状況もあり得る。
【００７８】
キットは、混合及び/又は投与手段を含み得る(例えば鼻腔内投与のための気化器又は皮下/真皮内投薬のための注射器及び針)。キットは、使用のための説明書も含み得る。
【００７９】
本発明の医薬組成物又はキットは、疾患を処置及び/又は予防するために使用し得る。
【００８０】
特に、組成物/キットは、慢性心筋炎を処置及び/又は予防するために使用し得る。
【００８１】
実験動物モデル
実施例のセクションに記載の通り、本発明者らは、実験的自己免疫性心筋炎(EAM)を研究するのに使用するための実験モデルを成功裏に開発し使用し、それ故、この実験モデルは、心筋炎の研究に有用である。
【００８２】
従って、一態様において、本発明は、EAMの動物モデルを提供する。動物は、哺乳動物であることができる。例えば、動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット又は霊長類であることができる。好ましくは、動物はマウスである。
【００８３】
EAMのマウスモデルは、心臓ミオシン、好ましくは心臓α-ミオシン、より好ましくはヒト心臓α-ミオシンで免疫化されたHLA-DR4tgマウスを含む。DR4マウス系統は、Lars Fuggerら(PNAS 1994年、91巻: 6151〜55頁)により最初に創出され、そこではHLA-DRA*01:01/HLA-DRB1*04:01及びmCD3-huCD4c/g構築物を、(DBA/1xA/CA)F1交配由来の胚に同時微量注入し、生存能力のある胚を、期間中に発達のために偽妊娠の雌(BALB/c x 129)F1に移した。子孫を、マウスMHCクラスII分子発現を欠いているIA-bノックアウトC57BL/6遺伝的背景(AB0マウス)にその後交配した。従って、これらのDR4マウスにおいて発現されるMHCクラスII分子だけは、ヒトHLA DR4分子である。当業者は、そのようなマウスをどのようにして得るかを理解するだろう。
【００８４】
適切な免疫化方法は、当業技術者に公知であり、例えば本実施例に記載の通りである。心臓ミオシンの供給源は、当業者に公知であり、例えば、本明細書の実施例に記載の方法など、当分野で公知の方法によってヒト心臓組織から抽出し得る。
【００８５】
好ましい実施形態において、およそ100μgミオシン/マウス、例えば50〜150μgミオシン/マウス、例えば60〜140、70〜130、80〜120、90〜110μgミオシン/マウスが免疫化に使用される。好ましくは、100μgミオシン/マウスが使用される。
【００８６】
一態様において、ミオシンは完全フロイントアジュバント(CFA)中に乳化される。更なる態様において、例えば心臓ミオシンによる免疫化1週間後に、百日咳毒素もマウスに投与される。CFA及び百日咳毒素の供給源は、当分野で公知であり、市販されている。
【００８７】
以下の実施例に記載の通り、EAMは、百日咳毒素と一緒にCFA中に乳化されているヒト心臓α-ミオシンを注射することによりヒト化DR4マウスにおいて誘導された。CFAは、炎症誘発性経路の非特異的誘導によってバイスタンダー効果（bystandar effect）を生じさせるアジュバントとして適用された。百日咳毒素は、主に自己免疫性Th1細胞の分化に有利に働くことにより疾患の重症度を増強させ、それ故、潜在的自己免疫反応の開始に対する抗原性閾値を下げる第2のアジュバントとして投与された。
【００８８】
一態様において、本発明は、実験的自己免疫性心筋炎又は心筋炎を研究するための本明細書に記載のDR4マウスの使用を提供する。DR4マウスは、本明細書に記載のような本発明によるマウスであり得る。
【００８９】
更なる実施形態において、本発明は、心臓ミオシンでDR4マウスを免疫化する工程を含む、EAMの動物モデルを産生する方法を提供する。好ましい実施形態において、心臓ミオシンは、心臓α-ミオシン、より好ましくはヒト心臓α-ミオシンである。一態様において、ミオシンは完全フロイントアジュバント(CFA)中に乳化される。好ましい態様において、本方法は、およそ100μgミオシン/マウスを投与する工程を含む。更に好ましい態様において、本方法は、前記マウスに百日咳毒素を投与する工程も含む。本実施例に記載の通り、適切な方法は、当業者に公知であろう。
【００９０】
ここで、本発明について、実施例により更に説明するが、この実施例は、本発明を実施する際に当業者を支援するのに役立つことを意味し、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９１】
[実施例1]
材料及び方法
ヒト心臓からのミオシン抽出
適切な大きさの左室壁の塊を取り出し、解凍し、切り刻んだ。切り刻んだ心臓の各グラムを、10mLの溶液A(0.4M KCl、0.15M K2HPO4、0.01M Na4P2O7、0.001M MgCl2、0.002M DTT、pH:6.8 KH2PO4で調整した、本プロトコールにおいて使用した全ての化学物質は、Sigma Aldrichから入手した)中でホモジナイズし、150,000×gで1時間遠心分離して、筋肉残渣及び細胞残屑を取り除いた。上清を、>20容積の2mM DTTで希釈して糸状のミオシンを沈殿させ、その後50,000×gで20分間の遠心分離によりペレット化した。ペレットを、10mLの溶液B(0.3M KCl、0.004M MgCl2、0.025Mイミダゾール、0.01M DTT、0.001M EGTA、pH:7.4 HClで調整した)に再懸濁し、43,000×gで30分間遠心分離して、アクチンを除去した。上清を、>7容積の2mM DTTで希釈し、12,000×gで20分間遠心分離した。ペレットを、0.3M KCl、0.01Mイミダゾール緩衝液6mLに再懸濁し、43.000×gで30分間遠心分離して、アクトミオシンを除去した。上清を、>6容積の2mM DTTで再び希釈し、ミオシン沈殿物を、12,000×gで15分間の遠心分離により採取した。次いで、ペレットを、1mL PBS/切り刻んだ心臓1gに再溶解し、-20℃で保存した。タンパク質分解を防止するために、PMSF(0.1mM)を全ての工程で添加した。心臓ミオシン抽出物の純度を、4〜20%勾配トリスグリシンゲル上でSDSゲル電気泳動(SDS-PAGE)により確認した(Farm Fresh Gels、図1)。
【００９２】
ヒトミオシンによるDR4マウスの免疫化
適当な量のミオシン抽出物を、PBSで所望の容積に希釈し、次いで8mg/mLの熱殺菌したヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)(hkMTB、Difco)を含有する等容積の完全フロイントアジュバント(CFA, Difco)と混合した。混合物を20分間超音波処理し、次いで乳液が、非常に濁り、粘稠になるまで1mL注射器によってよく混合した。100μLの乳液を、100μgミオシン/マウス用量で尾部基部から皮下適用した。0及び2日目に、0.5mLのPBS中の百日咳毒素(Sigma Aldrich)200ngを、第2のアジュバントとして各マウスに腹膜内注射した。第1の試験において、ミオシン及び百日咳毒素注射を、1週間後に繰り返した。しかしながら、この2回目の注射セットは、ペプチド治療のあらゆる有益性を不明瞭にする恐れがある重度過ぎる疾患の誘導を回避するために後の実験では除外した。実験プロトコールを、図2に示す。対照群は、(ヒト心臓ミオシンを含まないが)hkMTBでブーストしたCFA中のPBS及び百日咳毒素を受けた。ミオシン注射から3週間後に、EAMの発症を心エコー及び組織病理測定により評価した。脾臓を採取して、心臓ミオシン応答性T細胞増殖を測定した。血液を採取して、循環抗ミオシン抗体レベルを測定した。
【００９３】
左室機能の心エコー分析
3週間の実験の終了時に、マウスを、250mg/kgの用量でのトリブロモエタノール(Avertin, Sigma Aldrich)の腹腔内注射により麻酔した。マウスを屠殺する直前に左室機能及び直径を、Vevo 770高周波、高解像度心臓エコー検査システム(Visual Sonics)を使用して分析した。麻酔したマウスを、仰向きで置き、サージカルテープストリップを用いて加温した台に押しつけた。胸の毛を、脱毛クリームを塗布することにより除去し、無毛の胸にAquasonic Clear超音波伝達ゲル(Parker Laboratories)を塗布した。
【００９４】
乳頭筋レベルで左室短軸視野を得て、M-モードで以下のパラメータを測定した:
-左室収縮末期径(LVESD)
-左室拡張末期径(LVEDD)
-短縮率(FS=LVEDD-LVESD)
-駆出率(EF)
【００９５】
イメージを、400〜500拍/分の心拍数で撮像した。測定を、Vevo 770 Software(Visual Sonics)を使用して行った。FSは単に、拡張末期及び収縮末期径の間の差異を拡張末期径で割ったものであり、EFに密接に相関する。EFは、各収縮で左室から送り出される血液の画分と定義される。
【００９６】
心筋炎の組織病理学的分析
心臓を解剖し、組織学的分析ためにPBS中の10%(v/v)ホルマリン中で24時間固定した。心臓を、鋭いかみそりの刃を使用して軸方向に半分に切断して、両方の心室を曝露させ、次いで処理するまでPBS中で保った。次いで組織を、Shandon Excelsior Tissue Processor(Thermo Electron Corporation)を使用して一連の段階的なアルコール溶液に通過させることにより常法通り処理して、脱水した。
【００９７】
次いで、心組織を、Shandon Histocentre 3 Embedding Center(Thermo Electron Corporation)を使用してパラフィンワックス中に封埋した。心臓の切断面を、型枠の底部に載せた。使用したワックスは、56℃の融点を持つFibro-wax(BDH Ltd)であった。組織を容易に同定するためにプラスチックカセットの正面を標識した。
【００９８】
心臓の1/2を含有するブロックを、Shandon Finesse 325 Manual Microtome(Thermo Electron Corporation)を使用してトリミングした。ホルダー内のブロックの角度を、必要に応じて調整して、刃ホルダーに対して適当な方向を得た。最初のトリミングの場合、切断切片の厚みは15μmに設定した。心臓全体の切片が見えるようになったら、組織をスライド上に置き、切片の解剖学的局在を顕微鏡下で確認した。次いで切断切片の厚みを5μmに変更し、3×4切片を、10セクションギャップ（section gap）で採取した。スライドを、ヘマトキシリン&エオシン(H&E)染色前に37℃でインキュベーター内に終夜保存して、乾燥させた。
【００９９】
あらゆる潜在的細胞浸潤を評価することができるようにするために、心臓切片を、1963年にCullingにより開発されたアッセイを使用してH&Eで染色した。簡潔には、切片を乗せたスライドをラックに置き、Shandon Varistain 24-4 Automatic Slide Stainer(Thermo Electron Corporation)を使用して、以下の染色プロトコールを適用した:
-Clearene(Leica Biosystems)中で2回脱ワックスする(各3分間)
-100%工業用メタノール変性アルコール(IMS, Genta Medical)へ2回移動させる(各3分間)
-水道水中で再水和する(5分間)
-ヘマトキシリン(Pioneer Research Chemicals Ltd)中で染色する(2分間)
-蒸留水へ移動させる(3分間)
-スコットの水道水代替物へ移動させる(1分間)
-流水道水中ですすぐ(3分間)
-0.5%エオシン(Pioneer Research Chemicals Ltd)中で染色する(1.2分間)
-流水道水中ですすぐ(3分間)
-100% IMS(Genta Medical)中で2回脱水する(各5分間)
-clearene(Leica Biosystems)中で2回取り除く(各5分間)。
【０１００】
切片を、DPX mounting medium(VWR Ltd)を使用して染色直後に封入した。
【０１０１】
組織病理学的分析のために、Aperioスライドスキャナ(Leica Biosystems)及び対応するソフトウェア(Aperio ImageScope)を使用して、画像を得た。全ての画像を、同じ対物レンズ(20×)で得、それによりAperio ImageScopeソフトウェアを使用して1×から20×の拡大縮小が可能になる。炎症細胞浸潤比率を、ImageJソフトウェアを使用して決定した。
【０１０２】
循環抗ミオシン抗体レベルのELISAに基づく決定
カスタムメイドの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を開発して、循環抗ミオシン抗体のレベルを測定した。血液を、終末麻酔下で腹大動脈から採取し、室温で30分間、次いで氷上で少なくとも2時間保って、血清を血液を十分な時間凝固させた後、8500×gで15分間の遠心分離により分離した。
【０１０３】
簡潔には、Nunc Immuno MaxiSorp 96ウェル平底プレートを、ウェル当たり200μLの炭酸水素塩緩衝液(pH 9.0)で一回洗浄した。次いでプレートを、0.05M炭酸水素塩緩衝液中10μg/mLの濃度の、100μLのヒト心臓ミオシン抽出物でコーティングし、4℃で終夜インキュベートした。次いでプレートを、PBS中の0.05%(v/v) Tween-20(PBST)で4回洗浄した。非特異的結合部位を、2% BSA(Sigma-Aldrich)100μLを添加し、その後37℃で1時間インキュベートすることによりブロッキングした。プレートを、PBSTで再び2回洗浄した。抗ミオシン抗体を検出するために、血清サンプルを、希釈緩衝液(PBS中の1% BSA、0.01% Tween-20)中に1:1000、1:2000及び1:4000希釈した。100μLの希釈したサンプルを対応するウェルに添加し、プレートをしっかりと包み、4℃で終夜インキュベートした。インキュベーション終了時に、サンプルをプレートから取り出し、ウェルをPBSTで4回洗浄した。アルカリホスファターゼにコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgG1又はIgG2c二次抗体(Abcam)を、希釈緩衝液中に1:1000希釈し、対応するウェルに100μLを添加し、その後37℃で2時間インキュベートした。
【０１０４】
アルカリホスファターゼコンジュゲートした抗体とインキュベートした後に、プレートをPBSTで再び4回洗浄した。最後に、100μlのp-ニトロフェニルリン酸液体基質システム(Sigma-Aldrich)を各ウェルに添加し、その後37℃で1時間インキュベートした。発色したら、反応を、50μLの2M NaOH(Sigma、UK)を添加することにより停止し、吸光度を、405nmの波長でLT-5000MS ELISA Reader(Labtech)を使用して測定した。
【０１０５】
抗ミオシンT細胞増殖レベルの評価
ミオシン免疫化したマウス(本明細書に記載の通り)から得られた脾臓細胞を、5×105個細胞/ウェルの濃度で、X-Vivo 15培地(Lonza)中で、96ウェルプレートで培養した。細胞を、ミオシン抽出物(20、2及び0.2μg/mLの終濃度)の存在又は非存在下で、5% CO2で、37℃で72時間インキュベートした。72時間の終わりに、X-Vivo 15に希釈した25μLの3Hチミジン溶液を各ウェルに添加する(終濃度0.5μCi/ウェル)ことにより、細胞を同じ条件で、3Hチミジンで18時間パルスした。最後に、回収する直前まで細胞を-20℃で少なくとも終夜保った。
【０１０６】
プレートを解凍した後、細胞を、Combo Cell Harvester(Skatron)を使用してガラス繊維フィルター(Cox Scientific)上に回収した。次いで、フィルターを、Betaplate Scint液体シンチレーションカクテル(Perkin Elmer)に浸漬し、サンプルバッグ(Perkin Elmer)に密封した。最後に、フィルターを含有する密封したバッグをカセット内に置き、シンチレーションの量を、1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter(Perkin Elmer)を使用して読み取って、3Hチミジン取り込みのレベルを決定した。
【０１０７】
α-ミオシン上のT細胞エピトープのin silico予測
異なる3つのオンラインMHC結合アルゴリズム(ProPred、NetMHCII及びIEDB)を使用して、α-ミオシンから最も有望なT細胞エピトープを予測した。15アミノ酸長の強い結合剤を、これらのオンライン予測ツールにより算出した。それらの予測を使用して、最も有望なT細胞エピトープ候補として10個のペプチド(長さ15aa)を定義した。ペプチドを、表1に示す。
【０１０８】
【表１】
2019511215.tif 000002
【０１０９】
T細胞エピトープの抗原性の試験
予測したペプチドの抗原性を評価した。ヒト心臓ミオシンに対するT細胞増殖を、3Hチミジン取り込みアッセイにより決定されるそれらの刺激指数の比較により測定した(手短に言えば:各ウェルにRPMIに希釈した25μLの3Hチミジン溶液を添加する(終濃度0.5μCi/ウェル)ことにより、細胞を同じ条件で、3Hチミジンで18時間パルスした。最後に、回収する直前まで細胞を-20℃で少なくとも一晩保った。プレートを解凍した後、細胞を、Combo Cell Harvester(Skatron)を使用してガラス繊維フィルター(Cox Scientific)上に回収した。次いで、フィルターを、Betaplate Scint液体シンチレーションカクテル(Perkin Elmer)に浸漬し、サンプルバッグ(Perkin Elmer)に密封した。最後に、フィルターを含有する密封したバッグをカセット内に置き、シンチレーションの量を、1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter(Perkin Elmer)を使用して読み取って、3Hチミジン取り込みのレベルを決定した。α-ミオシン感作した脾臓細胞に、各ペプチド(GenScript[USA]、ペプチド濃度は、30、3及び0.3μg/mLであった)又は全ミオシン(30μg/mL)を接種した。
【０１１０】
心臓ミオシン特異的ペプチド治療プロトコール
ペプチドの2つの異なる組合せを、治療に使用した。各カクテルは、その刺激指数に従って選択した3つのペプチドを含有した。ペプチドをPBS中で皮下注射した。マウスが6〜8週齢になったら、治療を、非常に低い用量(0.1μg/マウス−0.033μgの各ペプチド)で開始した。100μg/マウス(33.3μgの各ペプチド)の最高用量に達するまで、用量を、2日毎に10倍増大させた。最高用量を3回繰り返し、次いで前述の通りヒトミオシン免疫化及び百日咳毒素注射で心筋炎を誘導した。最高用量を4日毎に注射して、プロトコールの終了までα-ミオシンに対する寛容を維持した。プロトコールを、図9に示す。マウスを、ミオシン注射の3週間後に屠殺し、疾患発症及び心臓ミオシンに対する適応免疫応答を評価した。
【０１１１】
EAMの誘導
EAMは、百日咳毒素と一緒にCFA中に乳化されているヒト心臓α-ミオシンを注射することによりヒト化DR4マウスにおいて誘導された。CFAは、炎症誘発性経路の非特異的誘導によってバイスタンダー効果を生じさせるアジュバントとして適用された。百日咳毒素は、主に自己免疫性Th1細胞の分化に有利に働くことにより疾患の重症度を増強させ、それ故潜在的自己免疫反応の開始に対する抗原性閾値を下げる第2のアジュバントとして投与された。
【０１１２】
文献において、CFA及び百日咳毒素は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、及び実験的自己免疫性ブドウ膜炎(EAU)など他の実験的自己免疫疾患を誘導するために広く適用される。
【０１１３】
本発明者らの第1の試験において、3及び6週目に心臓エコー検査を使用して疾患の進行を追跡することを計画した。しかしながら、3週間後にα-ミオシン処置群において5匹のうち3匹のマウスに突然死が起こり、一方で対照群の動物は全て健康であり、心筋炎の徴候は、心エコー測定によってそれら心臓に全く検出されなかった(データ示さず)。不必要な死亡を回避するために、その後の実験の追跡は、常に3週間後に終えた。
【０１１４】
心臓ミオシンに対するT細胞増殖の増大
自己免疫反応が、T細胞レベルで心臓ミオシンに対して誘導され得るかどうかを調べた。様々な濃度のヒト心臓ミオシンの存在下でα-ミオシン免疫化又は対照マウスから得られる培養脾臓細胞において、CFA及び百日咳毒素も受けたがヒトミオシンを受けていない対照群と比較して、ヒトミオシンを注射した群は、マイトジェン、ConAにより達成される増大より更に強いT細胞増殖(5〜6倍増大)の有意な増大を示した(図3)。このことは、α-ミオシンが、本発明者らの免疫化プロトコールを使用してT細胞クローンを成功裏に感作することを証明した。α-ミオシンに対するTh1及びTh2細胞駆動抗体の両方は、疾患の発症の間に増大した。
【０１１５】
循環抗ミオシン抗体レベルの増大
本発明者らのEAMモデルにおいて、心臓α-ミオシンに対する液性免疫応答も誘導されたかどうかを調べるために、循環抗ミオシン抗体レベルを測定した。EAM誘導マウスにおいて抗体レベルは、1/4000希釈でも測定可能であったが、対照群において抗ミオシン抗体は検出不能であった。IgG1(図4A)とIgG2c(図4B)抗体の両方を測定して、自己反応性抗体の産生におけるTh1及びTh2細胞を意味付けた。
【０１１６】
体重増進の低下
マウスの体重を、EAMの誘導前及び屠殺時に測定した。開始時に有意な差異はなかった。EAMの誘導後に、マウスは、体重増進をほとんど止めたが、対照群は通常通りの体重増進を保った。終了時に、対照群は疾患群より有意に重かった(p=0.04、n=5、図5)。体重の減少は、他のEAMモデルにおいても観察される。
【０１１７】
障害のある左室心機能
EAMの発症を、左室心機能を測定することにより評価した。有意な増加(p=0.039、n=5)が、心臓拡大の徴候として疾患群の収縮期寸法に観察された(図6B)。CFA及び百日咳毒素に加えたミオシン接種も、CFA及び百日咳毒素だけを受けた対照群と比較して、駆出率(p=0.003、n=5)と短縮率(p=0.006、n=5)の両方のパーセンテージに有意な低下をもたらした(図6C及びD)。駆出率及び短縮率は、心筋炎を含めた心不全の指標の重要なパラメータである。これらの結果は、DR4マウスに適用した心筋炎誘導プロトコールが、左室機能不全を誘導することにより心能力を下げたことを明らかに実証する。
【０１１８】
心臓組織への炎症性細胞浸潤
EAMの発症を更に評価するために、組織病理学的分析を実行して、心臓組織における炎症性細胞浸潤の存在を調査した。筋細胞間に位置する青色に染色された細胞核の存在の増大は、炎症を起こした領域を表す(図7上で、矢印で指した)。損傷を受けた筋細胞は、図7にも見られ得る。細胞浸潤及び筋細胞損傷の徴候は、対照群内のマウスのいずれにもなかったが、EAM誘導群内のマウスの5匹中5匹が、幾らかのレベルの炎症及び組織損傷を示した(p=0.0079、フィッシャーの正確確率検定)。心エコー測定に加えて組織病理所見は、確立されたプロトコールでヒト心臓α-ミオシンを投与することにより、ヒト化DR4マウスにおいてEAMが誘導されることを臨床的に証明した。
【０１１９】
潜在的治療用エピトープ
本発明者らは、EAM誘導DR4マウスから得られるα-ミオシンで感作した脾臓細胞に対する候補ペプチドの刺激指数(図8において赤色のミオシン群)を、ミオシンで注射していないがCFA及び百日咳毒素で注射したマウスから採取した脾臓細胞において得られた刺激(図8においてオレンジ色の対照群)と比較することにより、候補ペプチドの結合効率を試験した。スクリーニングアッセイを3回繰り返し、最良の誘導物質を、潜在的な治療用の有力なエピトープとして選択した。全体で6つのペプチドを選び、ペプチド治療に適用される2つの群を作製した(図8おいて赤色及び紫色で囲んだ)。YL(配列番号5)は、一貫してペプチドの中で最も強い刺激を与えた(ときとして、全ミオシンタンパク質より更に強い)。PL(配列番号3)及びVV(配列番号2)は、それらの残りより強い刺激を与える他の2つのペプチドであった。そのため、これらのペプチド(YL、PL及びVV)の組合せを使用して、最初に開始した。RQ(配列番号10)、EK(配列番号9)及びKA(配列番号7)を、治療に使用する代替の組合せとして選択した。MKは、比較的良い刺激指数を持つ別のペプチドであった。しかしながら、可溶性の問題のため、ペプチドカクテルの調製の間のあらゆる潜在的沈殿を回避するため、本発明者らの選択からそれを除外した。
【０１２０】
全体の有効性は、第2のスクリーニングアッセイにおいて、より低かった。全ミオシンは2倍の刺激しか与えなかったが、YL及びPLペプチドは、最低濃度(0.3μg/mL)でも刺激を提供した。
【０１２１】
心臓ミオシン特異的免疫治療の効果
本発明者らのDR4マウスEAMモデルを使用して、選択したペプチドの組合せを、皮下経路による用量増加レジメで適用し(図9)、心臓α-ミオシン特異的T細胞増殖及び抗体レベル並びに左室心機能及び炎症性浸潤を測定することによりEAMの発症に対する治療の免疫学的及び臨床的効果の両方を評価した。
【０１２２】
心臓ミオシンに対するT細胞増殖の低下
ペプチド治療により、心臓ミオシンに対する自己反応性T細胞反応を下方調節することが可能であった。ミオシン反応性T細胞増殖の低下は、治療していない対照群と比較してYL-PL-VVペプチドで処置した群において非常に有意であった(5.6倍から3.1倍)(p=0.0007、n=15)が、RQ-EK-KAペプチドでは、境界線上の有意性での傾向のみであった(p=0.065、n=11)(図10)。
【０１２３】
循環抗ミオシン抗体レベルの低下
抗ミオシンIgG1及びIgG2c抗体は、RQ-EK-KAペプチドで実行した治療により、対照群と比較して有意に低下した(IgG1の場合、1/4000希釈でp=0.036、1/2000希釈でp=0.019、1/1000希釈でp=0.011、IgG2cの場合、1/1000希釈でp=0.0072、n=11、図11)。α-ミオシン特異的自己免疫に対するYL-PL-VV治療の減少効果は、T細胞反応に限定され得る。
【０１２４】
左室心機能の改善
左室の収縮期又は拡張期寸法のいずれかに対する治療の効果は全く観察されなかったが(図12A)、EAM誘導DR4マウスにおいてYL-PL-VVとRQ-EK-VV治療の両方が、駆出率(RQ-EK-KA治療の場合、p=0.011、n=10、YL-PL-VV治療の場合、p=0.041、n=13)、及び短縮率(RQ-EK-KA治療の場合、p=0.011、n=10、YL-PL-VV治療の場合、p=0.044、n=13)のパーセンテージを増大させることにより左室心機能を有意に改善した(図12B)。これらの結果は、寛容原性ペプチド治療が、EAMの発症を遅延させ得ることを実証する最初の機能的証拠を提供した。
【０１２５】
心臓組織への炎症性細胞浸潤の低下
心臓炎症のレベルを、心組織への免疫細胞浸潤のパーセンテージを観察することにより測定し、その浸潤は、H&E染色心臓切片における筋細胞間細胞核の存在の濃縮により生成された青色領域として見ることができる(図13B、C及びD)。本発明者らは、RQ-EK-YL治療を受けているEAM誘導マウスの心臓において細胞浸潤比率の有意な減少(p=0.021、n=11)を観察した(図13A)。この発見は、ペプチド治療によるα-ミオシンに対する寛容の誘導が、EAMに対する有効な処置に潜在的になり得ることを示唆する組織学的な補強証拠を提供した。
【０１２６】
上記の明細書に記載の出版物の全てを、参照により本明細書に組み込む。説明した本発明の方法並びにシステムの様々な改変及び変更は、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業技術者にとって明らかになろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、特許請求される本発明が、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、分子生物学、免疫学又は関連する分野の熟練者にとって明らかな、発明を実施するために説明した様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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