【手続補正書】
【提出日】令和3年11月19日(2021.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドバイオマーカーを同定する方法であって、
疾患血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、疾患ペプチドフラグメントを得ること；
前記疾患ペプチドフラグメントを第１の重同位元素で標識して、標識された疾患ペプチドフラグメントを得ること；
参照血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、参照ペプチドフラグメントを得ること；
前記参照ペプチドフラグメントを第２の重同位元素で標識して、標識された参照ペプチドフラグメントを得ること；および
前記標識された疾患ペプチドフラグメント及び前記標識された参照ペプチドフラグメントを質量分析に供してペプチドバイオマーカーを同定すること
を含み、ここで、前記ペプチドバイオマーカーのレベルは、前記標識された参照ペプチドフラグメントと比較して、前記標識された疾患ペプチドフラグメントにおいて上昇している、同定方法。
【請求項２】
前記疾患血液試料が、疾患を有する１以上の哺乳動物由来の血液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照血液試料が、１以上の健康な哺乳動物由来の血液を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各試料から１つ以上の非常に豊富な血液タンパク質を枯渇させることをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記非常に豊富な血液タンパク質が、アルブミン、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｂ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
各消化工程の前に、各試料中の糖タンパク質を濃縮することをさらに含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記質量分析が、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して行われる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドバイオマーカーのバリデーション方法であって、
前記ペプチドバイオマーカーを含む複数のペプチドを塩基性ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）に供して、複数の画分を得ること；
前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い、編成すること；
酸性ｐＨで直交高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により各画分群のペプチドバイオマーカーを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ること；および
前記ペプチドバイオマーカーの強度を決定するために、前記ペプチドバイオマーカーの事前最適化された遷移及び事前最適化された滞留時間を含む選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析すること
を含み、ここで、前記ペプチドバイオマーカーは、前記ペプチドバイオマーカーが、前記ＳＲＭ法を使用して参照試料と比較した疾患試料における上昇したレベルで検出及び定量化される場合に確認される、バリデーション方法。
【請求項９】
ペプチドバイオマーカーの同定及びバリデーション方法であって、
(Ａ)．  候補ペプチドバイオマーカーを同定することであって、前記同定することが：
(ｉ)．  疾患血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、疾患ペプチドフラグメントを得ること；
(ｉｉ)．  前記疾患ペプチドフラグメントを第１の重同位元素で標識して、標識された疾患ペプチドフラグメントを得ること；
(ｉｉｉ)．  参照血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、参照ペプチドフラグメントを得ること；
(ｉｖ)．  前記参照ペプチドフラグメントを第２の重同位元素で標識して、標識された参照ペプチドフラグメントを得ること；および
(ｖ)．  前記標識された疾患ペプチドフラグメント及び前記標識された参照ペプチドフラグメントを質量分析に供して候補ペプチドバイオマーカーを同定すること、を含み、
ここで、前記候補ペプチドバイオマーカーのレベルは、前記標識された参照ペプチドフラグメントと比較して、前記標識された疾患ペプチドフラグメントにおいて上昇している、
前記同定すること、
(Ｂ)．  ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を構築することであって、前記構築することが：
(ｉ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーを合成すること；
(ｉｉ)．  前記合成候補ペプチドバイオマーカーを質量分析に供して、候補ペプチドバイオマーカーの遷移を決定することであって、前記遷移が、最も強い強度を有する前駆体プロダクトイオンのペアを同定し、前記前駆体プロダクトイオンのペアを生成する衝突エネルギー（ＣＥ）を同定することによって決定される、前記決定すること；
(ｉｉｉ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーを含む複数のペプチドを塩基性ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）に供して、複数の画分を得ることであって、前記複数が本質的に等量の各ペプチドからなる、前記得ること；
(ｉｖ)．  前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い前記編成すること；
(ｖ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーの遷移及び固定滞留時間を使用して、前記画分群のそれぞれにおける前記候補ペプチドバイオマーカーの強度を決定すること：および
(ｖｉ)．  高ｐＨでのそれらの疎水性に従って前記遷移を再構築することにより、前記滞留時間を最適化すること、
を含む、前記構築すること、
(Ｃ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーを確認することであって、前記確認することが：
(ｉ)．  前記疾患血液試料中の前記候補ペプチドバイオマーカーを定量化することであって、前記定量化することが：
(ａ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーを含む前記疾患ペプチドフラグメントをｂＲＰＬＣに供して、複数の画分を得ること；
(ｂ)．  前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い、前記編成すること；
(ｃ)．  酸性ｐＨで直交ＨＰＬＣにより各画分群のペプチドを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ること；および
(ｄ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーの遷移及び前記最適化された滞留時間を含むＳＲＭ法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析すること；を含む、前記定量化することと、
(ｉｉ)．  前記参照血液試料中の前記候補ペプチドマーカーを定量化することであって、前記定量化することが：
(ａ)．  前記参照ペプチドフラグメントをｂＲＰＬＣに供して、複数の画分を得ること；
(ｂ)．  前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い、前記編成すること；
(ｃ)．  酸性ｐＨで直交ＨＰＬＣにより各画分群のペプチドを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ること；および
(ｄ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーの遷移及び前記最適化された滞留時間を含む前記ＳＲＭ法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析すること；を含む、前記定量化することと、
(ｉｉｉ)．  前記候補ペプチドバイオマーカーが、前記参照試料と比較して、前記疾患試料において上昇したレベルで定量化された場合に、前記候補ペプチドバイオマーカーを確認すること、
を含む、前記確認すること、
を含む、ペプチドバイオマーカーの同定及びバリデーション方法。
【請求項１０】
前記合成候補ペプチドバイオマーカーが重同位元素で標識されていない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドバイオマーカーの前記最適化された滞留時間が、対象から得られた試料にスパイクされて存在する合成バイオマーカーペプチドを使用して決定される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記最適化されたペプチドバイオマーカーの滞留時間が、前記ペプチドバイオマーカーの強度に反比例する、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＰＬＣが、質量分析計に結合された装置で行われる、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記質量分析計がトリプル四重極質量分析計である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記衝突エネルギーが、データセットＳ５に示す衝突エネルギーのうちのいずれか１つである、請求項９から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記滞留時間が、データセットＳ５に示す滞留時間のうちのいずれか１つである、請求項９から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物から得られた血液試料中のペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ポリペプチドに由来するペプチドフラグメントを含む１つ以上のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出することを含む、該哺乳動物における卵巣癌の検出方法。
【請求項１８】
哺乳動物における卵巣癌の診断を補助する方法であって、
前記哺乳動物から得られた血液試料中のペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ポリペプチドに由来するペプチドフラグメントを含む１つ以上の血液ペプチドバイオマーカーのレベルを検出すること；および
参照レベルと比較して、前記１つ以上の血液ペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが前記血液試料で検出された場合に、前記哺乳動物が卵巣癌を有すると同定すること
を含む、診断補助方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液試料が血漿試料である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＰＩＡペプチドフラグメントがアミノ酸配列ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）を含む、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＰＩＡペプチドフラグメントがアミノ酸配列ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）を含む、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。