(57)【要約】Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド、ならびに診断および治療のための使用方法が本明細書において提供される。これらのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体等は、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態の処置において使用してもよい。これらの抗体等は、リシン残基１８０においてジメチル化リシンを含むヒストンＨ１．０タンパク質またはその断片（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）の検出および定量化のためにも使用されてよく、このような組成物および方法は、複製老化、ＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス、放射線曝露、アルツハイマー病を検出するのに有用であり、治療レジメン、患者の階層化、薬物スクリーニングをモニタリングするのに有用であり、系内の生物学的老化のマーカーとしての役割を果たす場合がある。
2019521953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチル化抗原に特異的に結合する抗体であって、前記ジメチル化抗原がジメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０のＫ１８０に対応し、前記ジメチル化リシン残基が結合のために必要とされる抗体。
【請求項２】
前記ジメチル化抗原が、メチル化されたいずれの他のリシン残基も含まない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、および／またはＫ１７７に対応するリシン残基においてジメチル化リシン残基を含む場合、結合しないか、または最小限に結合するにすぎない、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、および／またはＫ１８０に対応するリシン残基においてモノメチル化リシン残基を含む場合、結合しないか、または最小限に結合するにすぎない、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、および／またはＫ１８０に対応するリシン残基においてトリメチル化リシン残基を含む場合、結合しないか、または最小限に結合するにすぎない、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
モノメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記モノメチル化抗原がモノメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
トリメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記トリメチル化抗原がトリメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
標識を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ビオチン化されている、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
固体表面に付着されている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
ビーズ、カラム、樹脂、またはマイクロプレートに付着されている、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体からなる群から選択される少なくとも１種の治療剤にコンジュゲートされている、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を取り除くことができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含む細胞を取り除くことができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
老化細胞を取り除くことができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
ジメチル化リシン残基を含む合成ヒストンＨ１．０ペプチド、またはジメチル化リシン残基を含む合成ヒストンＨ１．０タンパク質であって、前記ジメチル化リシン残基がヒトヒストンＨ１．０のＫ１８０に対応する、合成ヒストンＨ１．０ペプチドまたは合成ヒストンＨ１．０タンパク質。
【請求項１７】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１８】
前記タンパク質またはペプチドが、ビオチン化されている、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項１９】
前記タンパク質またはペプチドが、ジメチル化されたいずれの他のリシン残基も含まない、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２０】
前記タンパク質またはペプチドが、メチル化されたいずれの他のリシン残基も含まない、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２１】
前記タンパク質またはペプチドが、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２２】
配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２３】
配列番号３の配列を含む、請求項２２に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記タンパク質またはペプチドが、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体からなる群から選択される少なくとも１種の治療剤にコンジュゲートされている、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記タンパク質またはペプチドが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体を取り除くかまたは遮断することができる、請求項１６に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記タンパク質またはペプチドが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体を取り除くかまたは遮断することができる、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
前記タンパク質またはペプチドが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体を取り除くかまたはブロックすることができる、請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２９】
個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｂ）前記抗体に結合する前記試料中のジメチル化抗原の濃度を決定するステップであって、対照に対する前記濃度の低下が、前記個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあることを示すステップと
を含む方法。
【請求項３０】
ヒストンＨ１．０タンパク質の血清濃度が５．６１ｎｍｏｌ／ｍｌ未満である、またはそれより低い場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記低下が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を下回る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＬＲ（ＬＲ＋）が３．６である、またはそれより大きい場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＮＬＲ（ＬＲ−）が０．２６である、またはそれより小さい場合、前記個体がアルツハイマー病を発症するリスクを有さない、請求項４４に記載の方法。
【請求項３４】
前記個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあると決定された場合、アルツハイマー病薬またはレジメンで前記個体を処置するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病と診断され、前記アルツハイマー病に対する処置を受けている個体が、前記処置から利益を得るかまたは前記処置から利益を得続けるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｂ）前記抗体に結合する前記試料中のジメチル化抗原の濃度を決定するステップと、
（ｃ）対照に対する前記濃度の上昇が存在する場合、前記個体が前記処置から利益を得るかまたは前記処置から利益を得続けると決定するステップと
を含む方法。
【請求項３６】
前記上昇が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記個体が前記処置から利益を得るかまたは利益を得続けると決定された場合、アルツハイマー病薬またはレジメンで前記個体を処置するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定する方法であって、前記個体が前記処置をまだ開始しておらず、前記方法が、
（ａ）候補処置を前記個体に投与するステップと、
（ｂ）前記候補処置の投与後の前記個体由来の生体試料を請求項１に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｃ）前記抗体に結合する前記試料中のジメチル化抗原の濃度および／または細胞内局在を決定するステップと、
（ｄ）対照に対する前記濃度の上昇または細胞質への細胞内局在の低下が存在する場合、前記個体が前記候補処置から利益を得ると決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
前記濃度の前記上昇が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記個体が前記処置から利益を得ると決定された場合、アルツハイマー病薬またはレジメンで前記個体を処置するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定する方法であって、前記個体が前記処置をまだ開始しておらず、前記方法が、
（ａ）前記個体由来の生体試料を候補処置と接触させるステップと、
（ｂ）前記生体試料を請求項１に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｃ）前記抗体に結合する前記試料中のジメチル化抗原の濃度および／または細胞内局在を決定するステップと、
（ｄ）対照に対する前記濃度の上昇または対照に対する細胞質への細胞内局在の低下が存在する場合、前記個体が前記候補処置から利益を得ると決定するステップと
を含む、方法。
【請求項４２】
前記上昇が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記個体が前記処置から利益を得ると決定された場合に、アルツハイマー病薬またはレジメンで前記個体を処置するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記処置が、ＡＰＰ合成阻害剤、ベータ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター、Ａβ凝集阻害剤、Ａβ免疫療法、コレステロール降下薬、抗タウ薬、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、非定型抗精神病薬、タンパク質のＳ−ニトロシル化のブロッカー、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ラパマイシン、ラパログ、内在性カンナビノイド、カンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤、抗炎症薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモン、ホルモン調節剤、スタチン、インスリン、インスリン担体、多機能ナノキャリア、ビタミン、栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、および超音波療法からなる群から選択される、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記個体が、６０歳またはそれより高い年齢である、請求項２９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が、標識を含む、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項２９から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記濃度が、ＥＬＩＳＡによって決定される、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が、モノメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記モノメチル化抗原がモノメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、トリメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記トリメチル化抗原がトリメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中の自己抗体の濃度を決定するステップであって、対照に対する前記濃度の上昇が、前記個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあることを示すステップと
を含む方法。
【請求項５３】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
総ＩｇＧレベルに対して正規化したＩｇＧ自己抗体の血清濃度が、９．６９ｕｇ／ｍｌより高いかまたはそれに等しい場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
血清体積に対して正規化したＩｇＧ自己抗体の血清濃度が、８．２３ｕｇ／ｍｌより高いかまたはそれに等しい場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
血清体積に対して正規化したＩｇＭ自己抗体の血清濃度が、４０９ｆＭｏｌ／ｍｌより高いかまたはそれに等しい場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
総ＩｇＭ濃度に対するＩｇＭ自己抗体の濃度の比が２６．６×１０−６より大きい場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記上昇が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
ＰＬＲ（ＬＲ＋）がＩｇＧ自己抗体について２．４もしくはそれより大きいか、またはＰＬＲ（ＬＲ＋）がＩｇＭ自己抗体について３．５もしくはそれより大きい場合、前記個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある、請求項５２に記載の方法。
【請求項６１】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップと、その測定値を前記試料中の総ＩｇＭ濃度と比較するステップとを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６２】
前記個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあると決定された場合に、アルツハイマー病薬またはレジメンで前記個体を処置するステップをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６３】
アルツハイマー病と診断され、前記アルツハイマー病に対する処置を受けている個体が、前記処置から利益を得るかまたは前記処置から利益を得続けるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、
（ｃ）対照に対する前記濃度の低下が存在する場合、前記個体が前記処置から利益を得るかまたは前記処置から利益を得続けると決定するステップと
を含む方法。
【請求項６４】
前記低下が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を下回る、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定する方法であって、前記個体が前記処置をまだ開始しておらず、前記方法が、
（ａ）候補処置を前記個体に投与するステップと、
（ｂ）前記個体由来の生体試料を請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドと接触させるステップと、
（ｃ）前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、
（ｄ）対照に対する前記濃度の低下が存在する場合、前記個体が前記候補処置から利益を得ると決定するステップと
を含む、方法。
【請求項６８】
前記低下が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を下回る、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記処置が、ＡＰＰ合成阻害剤、ベータ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター、Ａβ凝集阻害剤、Ａβ免疫療法、コレステロール降下薬、抗タウ薬、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、非定型抗精神病薬、タンパク質のＳ−ニトロシル化の遮断剤、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ラパマイシン、ラパログ、内在性カンナビノイド、カンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤、抗炎症薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモン、ホルモン調節剤、スタチン、インスリン、インスリン担体、多機能ナノキャリア、ビタミン、栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、および超音波療法からなる群から選択される、請求項６３から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される、請求項５２から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記個体が、６０歳またはそれより高い年齢である、請求項５２から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項５２から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記タンパク質またはペプチドが、ビオチン化されている、請求項５２から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記タンパク質またはペプチドが、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項５２から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項５２から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ペプチドが、配列番号３の配列を含む、請求項５２から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項５２から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的な自己抗体の濃度が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
ＩｇＧ自己抗体の濃度が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
総ＩｇＧおよび／またはＩｇＭの濃度が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
総ＩｇＧの濃度に対するＩｇＧ自己抗体の濃度の比が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
総ＩｇＭの濃度に対するＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される、請求項５２から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｂ）前記抗体に結合する前記試料中のジメチル化抗原の濃度を決定するステップであって、対照に対する前記濃度の上昇が、前記個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたことを示すステップと
を含む方法。
【請求項８８】
前記上昇が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＤＮＡ損傷剤が、放射線である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体が、標識を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗体が、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
前記濃度が、ＥＬＩＳＡによって決定される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗体が、モノメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記モノメチル化抗原がモノメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗体が、トリメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記トリメチル化抗原がトリメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中の自己抗体の濃度を決定するステップであって、対照に対する前記濃度の上昇が、前記個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたことを示すステップと
を含む方法。
【請求項９７】
前記上昇が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＤＮＡ損傷剤が、放射線である、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０２】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０３】
前記タンパク質またはペプチドが、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０４】
前記濃度がＥＬＩＳＡにより決定される、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ペプチドが、配列番号３の配列を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０８】
ラパログによる処置を受けている個体がこのような処置に応答性であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１に記載の抗体と接触させるステップと、
（ｂ）前記抗体に結合する前記試料中のジメチル化抗原の濃度を決定するステップと、
（ｃ）前記個体が処置に応答性であるかどうかを決定するステップであって、対照に対する前記濃度の低下が、前記個体が応答性であることを示すステップと
を含む方法。
【請求項１０９】
前記低下が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を下回る、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ラパログが、ラパマイシン、シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ、エベロリムス、ＲＡ  ００１、Ａｆｉｎｉｔｏｒ、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ、テムシロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｔｏｒｉｓｅｌ、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３、ＭＫ−８６６９、デフォロリムス、ゾタロリムス、ＡＢＴ−５７８、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＯＳＩ−０２７、ＭＬＮ０１２８、ＷＹＥ−１３２、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＩ−１０３、Ｐ７１７０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７、ＧＮＥ４７７、ＰＫＩ−１８０、ＷＪＤ００８、ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＧＳＫ２１２６４５８、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０５２１２３８４、ＸＬ７６５、Ｔｏｒｉｎ  ２、ＷＹＥ−１２５１３２、およびＯＳＩ−０２７からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記抗体が、標識を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記抗体が、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
前記濃度が、ＥＬＩＳＡによって決定される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１５】
前記抗体が、モノメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記モノメチル化抗原がモノメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１６】
前記抗体が、トリメチル化抗原よりも前記ジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、前記トリメチル化抗原がトリメチル化リシン残基を含み、前記リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１７】
ラパログによる処置を受けている個体がこのような処置に応答性であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記個体由来の生体試料を請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドと接触させるステップと、
（ｂ）前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、
（ｃ）前記個体が処置に応答性であるかどうかを決定するステップであって、対照に対する自己抗体の濃度の変化が、前記個体が応答性であることを示すステップと
を含む方法。
【請求項１１８】
前記変化が、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記タンパク質またはペプチドに結合する前記試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ラパログが、ラパマイシン、シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ、エベロリムス、ＲＡ  ００１、Ａｆｉｎｉｔｏｒ、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ、テムシロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｔｏｒｉｓｅｌ、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３、ＭＫ−８６６９、デフォロリムス、ゾタロリムス、ＡＢＴ−５７８、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＯＳＩ−０２７、ＭＬＮ０１２８、ＷＹＥ−１３２、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＩ−１０３、Ｐ７１７０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７、ＧＮＥ４７７、ＰＫＩ−１８０、ＷＪＤ００８、ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＧＳＫ２１２６４５８、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０５２１２３８４、ＸＬ７６５、Ｔｏｒｉｎ  ２、ＷＹＥ−１２５１３２、およびＯＳＩ−０２７からなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記生体試料が、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記タンパク質またはペプチドが、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記濃度がＥＬＩＳＡにより決定される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ペプチドが、配列番号３の配列を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２９】
請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドを含む診断キット。
【請求項１３０】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５からなる群から選択される配列を含む、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３１】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３２】
前記タンパク質またはペプチドが、ビオチン化されている、請求項１３１に記載のキット。
【請求項１３３】
前記タンパク質またはペプチドが、固体表面に付着されている、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３４】
前記タンパク質またはペプチドが、ビーズ、マイクロプレート、カラム、または樹脂に付着されている、請求項１３３に記載のキット。
【請求項１３５】
前記タンパク質またはペプチドが、試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の検出のために提供される、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３６】
前記タンパク質またはペプチドが、参照標準として提供される請求項１３０に記載のキット。
【請求項１３７】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体をさらに含む、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３８】
アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性物質への曝露、またはＤＮＡ損傷剤への曝露の検出のために使用される、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３９】
薬物スクリーニングのために使用される、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１４０】
患者の階層化のために使用される、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１４１】
処置選択のために使用される、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１４２】
皮下組織標的分子の濃度を測定するための経皮吸収パッチであって、
（ａ）（１）請求項１に記載の抗体、または（２）請求項１６に記載のタンパク質もしくはペプチドのいずれかを含む基質、および
（ｂ）複数のマイクロニードル
を含む経皮吸収パッチ。
【請求項１４３】
前記基質が、請求項１に記載の抗体を含む、請求項１４２に記載のパッチ。
【請求項１４４】
前記抗体が、標識を含む、請求項１４３に記載のパッチ。
【請求項１４５】
前記基質が、請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドを含む、請求項１４２に記載のパッチ。
【請求項１４６】
前記ペプチドが、標識を含む、請求項１４５に記載のパッチ。
【請求項１４７】
前記ペプチドが、ビオチン化されている、請求項１４６に記載のパッチ。
【請求項１４８】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１４５に記載のパッチ。
【請求項１４９】
前記ペプチドが、配列番号３の配列を含む、請求項１４８に記載のパッチ。
【請求項１５０】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項１４２に記載のパッチ。
【請求項１５１】
経皮吸収マイクロニードルアレイパッチである、請求項１４２に記載のパッチ。
【請求項１５２】
前記基質が、弾性伸縮性である、請求項１４２に記載のパッチ。
【請求項１５３】
個体が、放射線またはＤＮＡ損傷剤に曝露されたかどうかを決定するためのポータブルな装置であって、
（ａ）試料採取装置、
（ｂ）読み取り機、
（ｃ）（１）請求項１に記載の抗体、または（２）請求項１６に記載のタンパク質もしくはペプチドのいずれかを含むアッセイモジュール、および
（ｄ）複数のマイクロニードル
を含む装置。
【請求項１５４】
基質が、請求項１に記載の抗体を含む、請求項１５３に記載の装置。
【請求項１５５】
前記抗体が、標識を含む、請求項１５４に記載の装置。
【請求項１５６】
基質が、請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドを含む、請求項１５３に記載の装置。
【請求項１５７】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項１５３に記載の装置。
【請求項１５８】
前記タンパク質またはペプチドが、ビオチン化されている、請求項１５７に記載の装置。
【請求項１５９】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１５３に記載の装置。
【請求項１６０】
前記ペプチドが、配列番号３の配列を含む、請求項１５３に記載の装置。
【請求項１６１】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項１５３に記載の装置。
【請求項１６２】
分析物のラテラルフローアッセイに適する試験片であって、試料受容ゾーンを含み、前記試料受容ゾーンが、（１）請求項１に記載の抗体、または（２）請求項１６に記載のタンパク質もしくはペプチドのいずれかを含む、試験片。
【請求項１６３】
前記受容ゾーンが、請求項１に記載の抗体を含む、請求項１６２に記載の試験片。
【請求項１６４】
前記抗体が、標識を含む、請求項１６３に記載の試験片。
【請求項１６５】
前記受容ゾーンが、請求項１６に記載のタンパク質またはペプチドを含む、請求項１６２に記載の試験片。
【請求項１６６】
前記タンパク質またはペプチドが、標識を含む、請求項１６２に記載の試験片。
【請求項１６７】
前記タンパク質またはペプチドが、ビオチン化されている、請求項１６２に記載の試験片。
【請求項１６８】
前記ペプチドが、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１６２に記載の試験片。
【請求項１６９】
前記ペプチドが、配列番号３の配列を含む、請求項１６８に記載の試験片。
【請求項１７０】
前記タンパク質が、配列番号２の配列を含む、請求項１６２に記載の試験片。
【請求項１７１】
個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体を前記個体に投与するステップを含む方法。
【請求項１７２】
前記疾患または状態が、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、老化細胞の蓄積を含む疾患または状態、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドのレベル上昇が伴う疾患または状態からなる群から選択される、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の請求項１６から２８に記載のタンパク質またはペプチドのうちのいずれか１つを前記個体に投与するステップを含む方法。
【請求項１７４】
前記疾患または状態が、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、老化細胞の蓄積を含む疾患もしくは状態、またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体のレベル上昇が伴う疾患もしくは状態からなる群から選択される、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
個体のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を取り除く方法であって、治療有効量の請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体を前記個体に投与するステップを含む方法。
【請求項１７６】
前記個体が、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性物質への曝露、ＤＮＡ損傷剤への曝露、および老化細胞の蓄積を含む状態からなる群から選択される疾患または状態に罹患している、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
個体のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体を取り除くか、ブロックするか、または中和する方法であって、治療有効量の請求項１６から２８に記載のタンパク質またはペプチドのうちのいずれか１つを前記個体に投与するステップを含む方法。
【請求項１７８】
前記個体が、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、老化細胞の蓄積を含む疾患または状態、ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体のレベル上昇が伴う疾患および状態からなる群から選択される疾患または状態に罹患している、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
請求項１から２８に記載の抗体、タンパク質またはペプチドのうちのいずれか１つ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１８０】
無菌である、請求項１７９に記載の組成物。
【請求項１８１】
請求項１から２８または１７９から１８０に記載の抗体、タンパク質、ペプチド、または組成物のいずれか１つを含むキット。
【請求項１８２】
請求項１から２８または１７９から１８１に記載の組成物のいずれか１つを含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月２０日に出願された米国仮出願番号第６２／３２５，３９２号、２０１６年４月２０日に出願された米国仮出願番号第６２／３２５，３６２号、２０１６年４月２０日に出願された米国仮出願番号第６２／３２５，４０８号、２０１６年６月２７日に出願された米国仮出願番号第６２／３５５，２６５号、および２０１６年６月２７日に出願された米国仮出願番号第６２／３５５，２７７号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々はそれらの全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞のクロマチンは、多くの立体構造を可能とし、生理学的に関連するインプットを受けるようにリモデリングおよび再構成される傾向がある動的高分子である。ヒストンタンパク質はクロマチンの主要なタンパク質構成成分であり、二本鎖ＤＮＡはヒストンタンパク質に絡みつく。ヒストンタンパク質が変化すると、他の遺伝子へのアクセスはインタクトなまま、一部の遺伝子への転写装置のアクセスを差次的に変更することが可能となる。ヒストンの翻訳後修飾（ＰＴＭ）によって達成される差次的なクロマチン凝縮は、クロマチンのパッケージングの基礎となる（LunyakおよびRosenfeld  ９２００８）Hum.  Mol.  Genet.、１７巻：Ｒ２８〜３６頁；JenuweinおよびAllis（２００１年）Science、２９３巻：１０７４〜１０８０頁）。ヒストンＰＴＭ、例えば、メチル化は、エピジェネティックコードとして作用し、発生、傷害、疾患および老化に密接に関連する細胞応答の多くの態様で重要な役割を果たしうる。
【０００３】
ヒストンの５つの主要なファミリーとして、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４が存在する。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４は、コアヒストンとして知られているが、ヒストンＨ１およびＨ５はリンカーヒストンとして知られている。近年、複数の研究によって特定された多数のＨ１．０結合タンパク質によって、Ｈ１．０のタンパク質−タンパク質相互作用の重要な役割が示され、クロマチンの構造へのその作用を超えて拡大する、Ｈ１．０の構造および機能の新たなパラダイムが示唆される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】LunyakおよびRosenfeld（２００９年）Hum.  Mol.  Genet.、１７巻：Ｒ２８〜３６頁
【非特許文献２】JenuweinおよびAllis（２００１年）Science、２９３巻：１０７４〜１０８０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
Ｈ１．０のメチル化は疾患の発症、傷害への応答、および治療レジメンへの応答に関するため、種々の細胞状況においてＨ１．０のメチル化を検出する必要性が存在し、感度がよいアッセイは種々の種類の細胞状況同士を識別する必要がある。また、メチル化Ｈ１．０関連疾患および状態を治療の対象とする必要性も存在する。この目的のための方法および組成物が本明細書において提供される。
【０００６】
簡単な要旨
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドならびに診断および治療のための使用方法が本明細書において提供される。これらのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態の処置において使用されてもよい。これらのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドはまた、リシン残基１８０においてジメチル化リシンを含むヒストンＨ１．０タンパク質またはその断片（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）の検出および定量化のために使用され、このような組成物および方法は、複製老化、ＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス、放射線曝露、アルツハイマー病を検出するのに有用であり、治療レジメン、患者の階層化、薬物スクリーニングをモニタリングするのに有用であり、系内の生物学的老化のマーカーとしての役割を果たす場合がある。
【０００７】
一態様では、ジメチル化抗原に特異的に結合する抗体であって、ジメチル化抗原がジメチル化リシン残基を含み、リシン残基がヒトヒストンＨ１．０のＫ１８０に対応し、ジメチル化リシン残基が結合するのに必要である抗体（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体）が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ジメチル化抗原は、メチル化されたいずれの他のリシン残基も含まない。一部の実施形態では、抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、および／またはＫ１７７に対応するリシン残基においてジメチル化リシン残基を含む場合、抗体は結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。一部の実施形態では、抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、および／またはＫ１８０に対応するリシン残基においてモノメチル化リシン残基を含む場合、抗体は結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。一部の実施形態では、抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、および／またはＫ１８０に対応するリシン残基においてトリメチル化リシン残基を含む場合、抗体は結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。一部の実施形態では、抗体は、モノメチル化抗原よりもジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、モノメチル化抗原はモノメチル化リシン残基を含み、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、抗体は、ビオチン化されている。一部の実施形態では、抗体は、固体表面に付着されている。一部の実施形態では、抗体は、ビーズ、カラム、樹脂、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、抗体は、細胞透過性抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体からなる群から選択される少なくとも１種の治療剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、抗体は、試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を取り除くことができる。一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含む細胞を取り除くことができる。一部の実施形態では、抗体は、老化細胞を取り除くことができる。
【０００８】
別の態様では、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体のうちのいずれか１つを個体に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態は、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、老化細胞の蓄積を含む疾患または状態、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドのレベル上昇が伴う疾患または状態からなる群から選択される。別の関連する態様では、個体のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を取り除く方法であって、例えば、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性物質への曝露、ＤＮＡ損傷剤への曝露、および老化細胞の蓄積を含む状態からなる群から選択される疾患または状態に罹患している個体を処置するために、治療有効量の本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体のうちのいずれか１つの抗体を個体に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。関連する態様では、本明細書に記載されているＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体のうちのいずれか１つを含む医薬組成物、キット、および他の製品が本明細書において提供される。
【０００９】
別の態様では、ジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０ペプチド、またはジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０タンパク質であって、ジメチル化リシン残基がヒトヒストンＨ１．０のＫ１８０に対応するヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドおよびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質）が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３〜３５からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３〜５からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号３の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、メチル化されたいずれの他のリシン残基も含まない。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、標識されている。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、ビオチン化されている。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、固体表面に付着されている。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、ビーズ、カラム、樹脂、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体からなる群から選択される少なくとも１種の治療剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体を取り除くかまたはブロックすることができる。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体を取り除くかまたはブロックすることができる。一部の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体を取り除くかまたはブロックすることができる。
【００１０】
別の態様では、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を処置する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されているＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのうちのいずれか１つを個体に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態は、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、老化細胞の蓄積を含む疾患または状態、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体のレベル上昇が伴う疾患または状態からなる群から選択される。関連する態様では、個体のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体を取り除くか、ブロックするか、または中和する方法であって、治療有効量の本明細書に記載されているＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのうちのいずれか１つを個体に投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、個体は、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、老化細胞の蓄積を含む疾患もしくは状態、またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体のレベル上昇が伴う疾患もしくは状態からなる群から選択される疾患または状態に罹患している。関連する態様では、本明細書に記載されているＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドまたはタンパク質のうちのいずれか１つを含む医薬組成物、キット、および他の製品が本明細書において提供される。
【００１１】
別の態様では、個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップであって、対照に対する濃度の低下が、個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあることを示すステップとを含む方法が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒストンＨ１．０タンパク質の血清濃度が５．６１ｎｍｏｌ／ｍｌ未満またはそれより低い場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、ＰＬＲ（ＬＲ＋）が３．６である、またはそれより大きい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、ＮＬＲ（ＬＲ−）が０．２６である、またはそれより小さい場合、個体はアルツハイマー病を発症するリスクを有さない。一部の実施形態では、個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあると決定された場合、方法は、アルツハイマー病薬またはレジメンで個体を処置するステップをさらに含む。したがって、上記方法によって決定されるように、ヒストンＨ１．０タンパク質の血清濃度が５．６１ｎｍｏｌ／ｍｌ未満もしくはそれより低い場合、および／またはＰＬＲ（ＬＲ＋）の測定値が３．６である場合、アルツハイマー病薬またはレジメンで個体を処置する方法が本明細書において提供される。
【００１２】
別の態様では、個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドと接触させるステップと、（ｂ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップであって、対照に対する濃度の上昇が、個体が、アルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあることを示すステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、タンパク質またはペプチドに結合する試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、タンパク質またはペプチドに結合する試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む。一部の実施形態では、総ＩｇＧレベルに対して正規化したＩｇＧ自己抗体の血清濃度が、９．６９ｕｇ／ｍｌより高いかまたはそれに等しい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、血清体積に対して正規化したＩｇＧ自己抗体の血清濃度が、８．２３ｕｇ／ｍｌより高いかまたはそれに等しい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、血清体積に対して正規化したＩｇＭ自己抗体の血清濃度が、４０９ｆＭｏｌ／ｍｌより高いかまたはそれに等しい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、総ＩｇＭ濃度に対するＩｇＭ自己抗体の濃度の比が２６．６×１０−６より大きい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、ＰＬＲ（ＬＲ＋）がＩｇＧ自己抗体について２．４もしくはそれより大きいか、またはＰＬＲ（ＬＲ＋）がＩｇＭ自己抗体について３．５もしくはそれより大きい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、方法は、タンパク質またはペプチドに結合する試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップと、その測定値を試料中の総ＩｇＭ濃度と比較するステップとを含む。一部の実施形態では、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあると決定された場合、方法は、アルツハイマー病薬またはレジメンで個体を処置するステップを含む。
【００１３】
別の態様では、アルツハイマー病と診断され、アルツハイマー病に対する処置を受けている個体が、処置から利益を得るかまたは処置から利益を得続けるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップと、（ｃ）対照に対する濃度の上昇が存在する場合、個体が処置から利益を得るかまたは処置から利益を得続けると決定するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、個体が処置から利益を得るかまたは利益を得続けると決定された場合、方法は、アルツハイマー病薬またはレジメンで個体を処置するステップをさらに含む。
【００１４】
別の態様では、アルツハイマー病と診断され、アルツハイマー病に対する処置を受けている個体が、処置から利益を得るかまたは処置から利益を得続けるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｃ）対照に対する濃度の低下が存在する場合、個体が処置から利益を得るかまたは処置から利益を得続けると決定するステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、方法は、タンパク質またはペプチドに結合する試料中のＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、タンパク質またはペプチドに結合する試料中のＩｇＧ自己抗体の濃度を決定するステップを含む。
【００１５】
別の態様では、アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定する方法であって、個体は処置をまだ開始しておらず、方法が、（ａ）候補処置を個体に投与するステップと、（ｂ）候補処置の投与後の個体由来の生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｃ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度および／または細胞内局在を決定するステップと、（ｄ）対照に対する濃度の上昇または細胞質への細胞内局在の低下が存在する場合、個体が候補処置から利益を得ると決定するステップとを含む、方法が本明細書において提供される。
【００１６】
別の態様では、アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定する方法であって、個体は処置をまだ開始しておらず、方法が、（ａ）個体由来の生体試料を候補処置と接触させるステップと、（ｂ）生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｃ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度および／または細胞内局在を決定するステップと、（ｄ）対照に対する濃度の上昇または対照に対する細胞質への細胞内局在の低下が存在する場合、個体が候補処置から利益を得ると決定するステップとを含む、方法が本明細書において提供される。
【００１７】
別の態様では、アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定する方法であって、個体は処置をまだ開始しておらず、方法が、（ａ）候補処置を個体に投与するステップと、（ｂ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドと接触させるステップと、（ｃ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｄ）対照に対する濃度の低下が存在する場合、個体が候補処置から利益を得ると決定するステップとを含む、方法が本明細書において提供される。
【００１８】
アルツハイマー病の方法に関する方法に関係するため、一部の実施形態では、測定される変化（上昇、低下、または変化なし）は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される。一部の実施形態では、個体は、６０歳またはそれより高い年齢である。抗体を利用する一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、ビーズ、カラム、樹脂、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、標識されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、ビーズ、樹脂、カラム、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、配列番号３の配列を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に特異的な自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。一部の実施形態では、ＩｇＧ自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、ＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される。
【００１９】
アルツハイマー病と診断された個体が候補処置から利益を得るかどうかを決定すること、およびアルツハイマー病と診断され、アルツハイマー病に対する処置を受けている個体が、処置から利益を得るかまたは処置から利益を得続けるかどうかを決定することに関する種々の態様では、処置は、ＡＰＰ合成阻害剤、ベータ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター、Ａβ凝集阻害剤、Ａβ免疫療法、コレステロール降下薬、抗タウ薬、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、非定型抗精神病薬、タンパク質のＳ−ニトロシル化のブロッカー、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ラパマイシン、ラパログ、内在性カンナビノイド、カンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤、抗炎症薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモン、ホルモン調節剤、スタチン、インスリン、インスリン担体、多機能ナノキャリア、ビタミン、栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、および超音波療法からなる群から選択される。
【００２０】
別の態様では、個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップであって、対照に対する濃度の上昇が、個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたことを示すステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、この上昇は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、放射線である。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、抗体は、ビーズ、樹脂、カラム、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。一部の実施形態では、抗体は、モノメチル化抗原よりもジメチル化Ｋ１８０抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、モノメチル化抗原はモノメチル化リシン残基を含み、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する。一部の実施形態では、抗体は、トリメチル化抗原よりもジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、トリメチル化抗原はトリメチル化リシン残基を含み、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する。一部の実施形態では、抗体は抗原結合性断片である。
【００２１】
別の態様では、個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドと接触させるステップと、（ｂ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップであって、対照に対する濃度の上昇が、個体がＤＮＡ損傷剤に曝露されたことを示すステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、この上昇は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を超える。一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷剤は、放射線である。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、標識を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、ビーズ、樹脂、カラム、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。一部の実施形態では、ペプチドは配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、タンパク質は配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは配列番号３の配列を含む。
【００２２】
別の態様では、ラパログによる処置を受けている個体がこのような処置に応答性であるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を本明細書において提供されるいずれかのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップと、（ｃ）個体が処置に応答性であるかどうかを決定するステップであって、対照に対する濃度の低下が、個体が応答性であることを示すステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、低下は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値を下回る。一部の実施形態では、ラパログは、ラパマイシン、シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ、エベロリムス、ＲＡ  ００１、Ａｆｉｎｉｔｏｒ、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ、テムシロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｔｏｒｉｓｅｌ、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３、ＭＫ−８６６９、デフォロリムス、ゾタロリムス、ＡＢＴ−５７８、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＯＳＩ−０２７、ＭＬＮ０１２８、ＷＹＥ−１３２、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＩ−１０３、Ｐ７１７０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７、ＧＮＥ４７７、ＰＫＩ−１８０、ＷＪＤ００８、ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＧＳＫ２１２６４５８、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０５２１２３８４、ＸＬ７６５、Ｔｏｒｉｎ  ２、ＷＹＥ−１２５１３２、およびＯＳＩ−０２７からなる群から選択される。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、抗体は、ビーズ、樹脂、カラム、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。一部の実施形態では、抗体は抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗体は、モノメチル化抗原よりもジメチル化Ｋ１８０抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、モノメチル化抗原はモノメチル化リシン残基を含み、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する。一部の実施形態では、抗体は、トリメチル化抗原よりもジメチル化抗原に対して少なくとも２倍特異的であり、トリメチル化抗原はトリメチル化リシン残基を含み、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する。
【００２３】
別の態様では、ラパログによる処置を受けている個体がこのような処置に応答性であるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドまたはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質と接触させるステップと、（ｂ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｃ）個体が処置に応答性であるかどうかを決定するステップであって、対照に対する自己抗体の濃度の変化が、個体が応答性であることを示すステップとを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。一部の実施形態では、ラパログは、ラパマイシン、シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ、エベロリムス、ＲＡ  ００１、Ａｆｉｎｉｔｏｒ、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ、テムシロリムス、ＣＣＩ−７７９、Ｔｏｒｉｓｅｌ、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３、ＭＫ−８６６９、デフォロリムス、ゾタロリムス、ＡＢＴ−５７８、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＯＳＩ−０２７、ＭＬＮ０１２８、ＷＹＥ−１３２、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＩ−１０３、Ｐ７１７０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７、ＧＮＥ４７７、ＰＫＩ−１８０、ＷＪＤ００８、ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＧＳＫ２１２６４５８、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０５２１２３８４、ＸＬ７６５、Ｔｏｒｉｎ  ２、ＷＹＥ−１２５１３２、およびＯＳＩ−０２７からなる群から選択される。一部の実施形態では、生体試料は、全血、血漿、血清、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、およびリンパ液からなる群から選択される。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、標識を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、ビーズ、樹脂、カラム、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３の配列を含む。
【００２４】
別の態様では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドまたはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質を含む診断キットが本明細書において提供される。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、配列番号３〜３５からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、標識を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、固体表面に付着されている。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、ビーズ、樹脂、カラム、またはマイクロプレートに付着されている。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の検出のために提供される。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、参照標準として提供される。一部の実施形態では、キットは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性物質への曝露、またはＤＮＡ損傷剤への曝露の検出のために使用される。一部の実施形態では、キットは、薬物スクリーニングのために使用される。一部の実施形態では、キットは、患者の階層化のために使用される。一部の実施形態では、キットは、処置選択のために使用される。
【００２５】
別の態様では、皮下組織標的分子の濃度を測定するための経皮吸収パッチであって、（ａ）（１）Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、または（２）Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質もしくはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのいずれかを含む基質、および（ｂ）複数のマイクロニードルを含む経皮吸収パッチが本明細書において提供される。一部の実施形態では、基質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含む。一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性断片である。一部の実施形態では、基質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、標識されている。一部の実施形態では、ペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３の配列を含む。一部の実施形態では、パッチは、経皮吸収マイクロニードルアレイパッチである。一部の実施形態では、基質は、弾性伸縮性である。
【００２６】
別の態様では、個体が、放射線またはＤＮＡ損傷剤に曝露されたかどうかを決定するためのポータブルな装置であって、（ａ）試料採取装置、（ｂ）読み取り機、（ｃ）（１）Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、または（２）Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質もしくはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのいずれかを含むアッセイモジュール、および（ｄ）複数のマイクロニードルを含む装置が本明細書において提供される。一部の実施形態では、基質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含む。一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、抗体は抗原結合性断片である。一部の実施形態では、基質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、標識を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号２の配列を含む。
【００２７】
別の態様では、分析物のラテラルフローアッセイに適する試験片であって、試料受容ゾーンを含み、試料受容ゾーンが、（１）Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、または（２）Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質もしくはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのいずれかを含む、試験片が本明細書において提供される。一部の実施形態では、受容ゾーンは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含む。一部の実施形態では、抗体は、標識されている。一部の実施形態では、抗体は、抗原結合性断片である。一部の実施形態では、受容ゾーンは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、標識を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３〜３５の配列のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３の配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号２の配列を含む。
【００２８】
別の態様では、特異的にジメチル化されたタンパク質またはペプチドを生成する条件下で、タンパク質またはペプチドをメチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップを含む、ヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質をジメチル化するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、タンパク質またはペプチドがヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するリシン残基で特異的にジメチル化され、メチルトランスフェラーゼ酵素がＧ９ＡメチルトランスフェラーゼまたはＧＬＰメチルトランスフェラーゼである方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４２〜７４からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドをＧ９Ａメチルトランスフェラーゼと接触させる。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドをＧＬＰメチルトランスフェラーゼと接触させる。一部の実施形態では、メチルドナーは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンである。一部の実施形態では、接触させるステップは、メチル化緩衝液中で実施される。一部の実施形態では、生成物の５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、８０％より多く、９０％より多く、９５％より多く、またはさらに９９％より多く、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するリシン残基でジメチル化される。関連する態様では、提供されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって生成されたジメチル化タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体が本明細書において提供される。
【００２９】
別の態様では、特異的なジメチル化を可能にする条件下で、Ｈ１．０タンパク質またはＨ１．０ペプチドをメチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップを含む方法によって生成された、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するリシン残基で特異的にジメチル化されたヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質であって、メチルトランスフェラーゼ酵素がＧ９ＡメチルトランスフェラーゼまたはＧＬＰメチルトランスフェラーゼであるヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質が本明細書において提供される。一部の実施形態では、Ｈ１．０ペプチドは、配列番号４２〜７４からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０タンパク質は、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、生成された特異的にジメチル化されたＨ１．０タンパク質は、配列番号２の配列を含む。一部の実施形態では、生成された特異的にジメチル化されたＨ１．０ペプチドは、配列番号３〜３５の配列を含む。関連する態様では、提供されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって生成されたジメチル化タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体が本明細書において提供される。
【００３０】
別の態様では、Ｈ１．０タンパク質またはＨ１．０ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化のためのキットであって、（ａ）Ｈ１．０タンパク質またはＨ１．０ペプチド、（ｂ）Ｇ９ＡメチルトランスフェラーゼまたはＧＬＰメチルトランスフェラーゼ酵素、およびメチルドナーを含むキットが本明細書において提供される。一部の実施形態では、キットは、Ｈ１．０タンパク質を含み、Ｈ１．０タンパク質は、配列番号１の配列を含む。一部の実施形態では、キットは、Ｈ１．０ペプチドを含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０ペプチドは、配列番号４２〜７４からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、キットは、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、キットは、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、メチルドナーは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンである。一部の実施形態では、キットは、メチル化緩衝液をさらに含む。
【００３１】
別の態様では、ヒストンＨ１．０ペプチドおよびメチルトランスフェラーゼ酵素を含む複合体であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏである複合体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、Ｈ１．０ペプチドは、配列番号４２〜７４からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ酵素は、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素である。一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ酵素はＧＬＰメチルトランスフェラーゼ酵素である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、発見ベースの質量分析法を使用するｈＡＤＳＣの細胞老化後の翻訳後修飾として、残基１８０にジメチル化リシンを含むヒストンＨ１．０タンパク質（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）の特定を示す。図１Ａは、質量分析による発見パイプラインを示す。図１Ｂは、非修飾ジメチル化ペプチドに対する質量分析スペクトル全体を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、発見ベースの質量分析法を使用するｈＡＤＳＣの細胞老化後の翻訳後修飾として、残基１８０にジメチル化リシンを含むヒストンＨ１．０タンパク質（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）の特定を示す。図１Ａは、質量分析による発見パイプラインを示す。図１Ｂは、非修飾ジメチル化ペプチドに対する質量分析スペクトル全体を示す。
【００３３】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、ＳＲ（自己再生）およびＲＥＰ−ＳＥＮ（複製老化）ｈＡＤＳＣのＨ１．０からのヒストンＨ１（図２Ａ）およびＲＮＡｓｅｑリード（図２Ｂ）の６つの別個のバリアントの発現レベルを示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、ＳＲ（自己再生）およびＲＥＰ−ＳＥＮ（複製老化）ｈＡＤＳＣのＨ１．０からのヒストンＨ１（図２Ａ）およびＲＮＡｓｅｑリード（図２Ｂ）の６つの別個のバリアントの発現レベルを示す。
【００３４】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜Ｄは、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の特異性を示す。図３Ａは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ３．０タンパク質の他のリシン残基の異なるメチル化部位と比較したアミノ酸隣接ヒストンＨ１．０Ｋ１８０を示す。図３Ｂおよび図３Ｃは、スロットブロットアッセイの結果を示し、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する抗体の特異性を実証する。図３Ｄは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する抗体の特異性を実証する。図３Ｅは、他のＨ１バリアントに存在しないアミノ酸の特有の配列におけるＨ１．０Ｋ１８０の埋め込みを示す、ヒストンＨ１バリアントタンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌＷ２アラインメントを示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｄは、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の特異性を示す。図３Ａは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ３．０タンパク質の他のリシン残基の異なるメチル化部位と比較したアミノ酸隣接ヒストンＨ１．０Ｋ１８０を示す。図３Ｂおよび図３Ｃは、スロットブロットアッセイの結果を示し、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する抗体の特異性を実証する。図３Ｄは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する抗体の特異性を実証する。図３Ｅは、他のＨ１バリアントに存在しないアミノ酸の特有の配列におけるＨ１．０Ｋ１８０の埋め込みを示す、ヒストンＨ１バリアントタンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌＷ２アラインメントを示す。
【図３Ｅ】図３Ａ〜Ｄは、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の特異性を示す。図３Ａは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ３．０タンパク質の他のリシン残基の異なるメチル化部位と比較したアミノ酸隣接ヒストンＨ１．０Ｋ１８０を示す。図３Ｂおよび図３Ｃは、スロットブロットアッセイの結果を示し、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する抗体の特異性を実証する。図３Ｄは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する抗体の特異性を実証する。図３Ｅは、他のＨ１バリアントに存在しないアミノ酸の特有の配列におけるＨ１．０Ｋ１８０の埋め込みを示す、ヒストンＨ１バリアントタンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌＷ２アラインメントを示す。
【００３５】
【図４】図４は、体液試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の検出のための標識したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを使用する間接ＥＬＩＳＡの使用を示す。
【００３６】
【図５Ａ】図５Ａは、体液試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに対する抗体を使用する、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の直接検出に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの使用を示す。図５Ｂは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験に対する標準曲線を示す。
【図５Ｂ】図５Ａは、体液試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに対する抗体を使用する、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の直接検出に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの使用を示す。図５Ｂは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験に対する標準曲線を示す。
【００３７】
【図６】図６は、Ｈ１．０ｍＲＮＡ発現が、急性ＤＮＡ損傷および遺伝毒性ストレスに誘導される老化後に増加することを示す。
【００３８】
【図７Ａ】図７Ａは、ウエスタンブロット分析による、ＤＮＡ損傷直後のクロマチンにおけるＨ１．０Ｋ１８０のジメチル化（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）を示す。図７Ｂは、ＤＮＡ損傷後からのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の分泌について示す。
【図７Ｂ】図７Ａは、ウエスタンブロット分析による、ＤＮＡ損傷直後のクロマチンにおけるＨ１．０Ｋ１８０のジメチル化（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）を示す。図７Ｂは、ＤＮＡ損傷後からのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の分泌について示す。
【００３９】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、Ｈ１．０Ｋ１８０のジメチル化がＰＡＲＰ−１活性の上流で起こることを示す。図８Ａは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用するウエスタンブロット分析を示し、Ｈ１．０Ｋ１８０のメチル化が、ＤＮＡ損傷修復経路のＰＡＲＰ−１機能活性の上流で起こることを明らかにする。図８Ｂは、ＰＡＲＰ−１阻害剤であるＡＧ１４３６１によるＰＡＲＰ活性の阻害について評価し、Ｈ１．０Ｋ１８０のメチル化がＤＮＡ損傷修復経路のＰＡＲＰ−１機能活性の上流で起こることを支持する。
【００４０】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＳＲのｈＡＤＳＣ、急性ＤＮＡ損傷、および遺伝毒性ストレスに誘導される老化に関するＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（図９Ａ）およびスロットブロット分析（図９Ｂ）を示し、ジメチル化されたＨ１．０Ｋ１８０（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）が、遺伝毒性ストレスに誘導される老化後にクロマチンから放出され（図９Ａ）、細胞から細胞外マトリックス／細胞培地へと分泌される（図９Ｂ）ことを明らかにする。
【００４１】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルに関するイオン化放射線の効果を示す。図１０Ａは、イオン化放射線への曝露によってマウス血清中の循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの上昇が誘導されることを示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的な抗体を使用する、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の存在（図１０Ａ）および定量化（図１０Ｂ）のスロットブロット分析を示す。図１０Ｃは、Ｘ線照射（７Ｇｙ）後のマウス血清中の、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的な抗体を使用する、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープレベルの存在についてのウエスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｂ−Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルに関するイオン化放射線の効果を示す。図１０Ａは、イオン化放射線への曝露によってマウス血清中の循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの上昇が誘導されることを示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的な抗体を使用する、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の存在（図１０Ａ）および定量化（図１０Ｂ）のスロットブロット分析を示す。図１０Ｃは、Ｘ線照射（７Ｇｙ）後のマウス血清中の、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的な抗体を使用する、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープレベルの存在についてのウエスタンブロット分析を示す。
【００４２】
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、脳組織および血清中の循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の年齢に関連する蓄積を示す。マウス（図１１Ａ）およびヒト（図１１Ｂ）の脳組織中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のウエスタンブロット分析が示され、その存在量は生物年齢と共に増加することが明らかにされている。図１１Ｃは、総ＩｇＧ血清レベルによって正規化したヒト血清試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、脳組織および血清中の循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の年齢に関連する蓄積を示す。マウス（図１１Ａ）およびヒト（図１１Ｂ）の脳組織中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のウエスタンブロット分析が示され、その存在量は生物年齢と共に増加することが明らかにされている。図１１Ｃは、総ＩｇＧ血清レベルによって正規化したヒト血清試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを示す。
【００４３】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしての血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の測定の有用性を実証する。図１２Ａは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（血清体積によって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。図１２Ｂは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（総血清ＩｇＧレベルによって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。図１２Ｃは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（総血清タンパク質濃度によって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしての血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の測定の有用性を実証する。図１２Ａは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（血清体積によって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。図１２Ｂは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（総血清ＩｇＧレベルによって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。図１２Ｃは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（総血清タンパク質濃度によって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしての血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の測定の有用性を実証する。図１２Ａは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（血清体積によって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。図１２Ｂは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（総血清ＩｇＧレベルによって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。図１２Ｃは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、年齢を一致させた対照と比較した場合（総血清タンパク質濃度によって正規化して）、アルツハイマー病を有する個体において減少することを示す。
【００４４】
【図１３Ａ】図１３Ａは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して生じたヒトＩｇＧ自己抗体は、間接ＥＬＩＳＡ法を使用して様々なヒト生体液（血漿、尿、唾液）において検出することができることを示す。図１３Ｂは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体の測定の有用性を実証する。
【図１３Ｂ】図１３Ａは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して生じたヒトＩｇＧ自己抗体は、間接ＥＬＩＳＡ法を使用して様々なヒト生体液（血漿、尿、唾液）において検出することができることを示す。図１３Ｂは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体の測定の有用性を実証する。
【００４５】
【図１４Ａ】図１４Ａは、試験および正規化条件下で、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＭ抗体を測定する概略図を示す。
【００４６】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、総ＩｇＭの測定結果および４５０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）に対する抗ＩｇＭモル濃度の標準曲線を示す。ＩｇＭ濃度は、この曲線から推測される。ボックスプロットは総ＩｇＭ濃度を示し、総ＩｇＭレベルがアルツハイマー病（ＡＤ）を有する個体と有さない個体を識別しないことを実証する。
【００４７】
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の測定および定量化のための間接ＥＬＩＳＡアッセイの使用の概略図である。
【００４８】
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、４５０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）に対する抗ＩｇＧモル濃度の標準曲線を示す。ＩｇＭ濃度は、この曲線から推測されうる。
【００４９】
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を対象とするＩｇＭ自己抗体の測定の有用性を実証する（図は、正規化されていない生データを示す）。
【００５０】
【図１５Ａ】図１５Ａは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＭ自己抗体の測定の有用性を実証する（図は、総ＩｇＭレベルに対して正規化したデータを示す）。
【００５１】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、異なる操作者と異なる実験室設定の間のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の測定および定量化のための血清学的間接ＥＬＩＳＡの診断特性の安定性および再現性を実証する。
【００５２】
【図１６Ａ】図１６Ａは、総ＩｇＭとＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の間の相関がアルツハイマー病と神経学的対照患者の両方において有意でない（Ｒ２値に対して）ことを実証する。
【００５３】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、総非修飾Ｈ１．０タンパク質レベル（左のグラフ）および総Ｈ１．０  ＩｇＭ自己抗体レベル（右のグラフ）は、アルツハイマー病を有する個体と有さない個体を識別しないことを実証する。
【００５４】
【図１７】図１７は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体を測定すること、ならびに２つの測定値の相関を調べることによって、アルツハイマー病を有する患者を別個の亜集団に階層化することができることを実証する。
【００５５】
【図１８】図１８は、ブレオマイシン処置後のＳＲ  ｈＡＤＳＣにおけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のウエスタンブロット分析を示し、ラパマイシンの誘導体であるエベロリムスが、ＤＮＡ損傷の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現をブロックするよう作用することができることを明らかにする。
【００５６】
【図１９】図１９は、ブレオマイシンまたはテモゾロミド処置後のＳＲ  ｈＡＤＳＣにおけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のウエスタンブロット分析を示し、塩基除去修復経路を誘発することができる化学療法薬であるテモゾロミドもＨ１．０Ｋ１８０のメチル化を導くことを明らかにする。
【００５７】
【図２０−１】図２０は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２動態に対するｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を示す。
【図２０−２】図２０は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２動態に対するｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を示す。
【００５８】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧ９Ａメチルトランスフェラーゼによるメチル化アッセイの結果を示す。Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼは、Ｈ１．０ペプチドをメチル化することが可能であり（図２１Ａ）、全長Ｈ１．０タンパク質をメチル化することが可能である（図２１Ｂ）。
【００５９】
【図２２Ａ】図２２Ａは、非メチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼが、特異的かつ多量にＨ１．０Ｋ１８０をジメチル化する（全ペプチドの９９．９％）ことを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、Ｇ９およびＧＬＰメチルトランスフェラーゼのメチル化効率の表形式の表示（ｔａｂｕｌａｒ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）である。
【００６０】
【図２３】図２３は、ジメチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、最小限のさらなるメチル化が起こる（ペプチドの２．６４％のみがさらにメチル化される）ことを示す。
【００６１】
【図２４】図２４は、組換え全長Ｈ１．０の存在下で、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含むＣ末端リシン残基をメチル化することを示す。
【００６２】
【図２５】図２５は、非メチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼがＨ１．０Ｋ１８０を特異的にジメチル化し（全ペプチドの９６．６％）、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を生成することを示す。
【００６３】
【図２６】図２６は、Ｋ１８０ジメチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼが、Ｈ１．０Ｋ１８０およびＨ１．０Ｋ１７４のみを、非常に低い効率でのみわずかにさらにメチル化することを示す（ペプチドの１．０２％がさらにメチル化される）。
【００６４】
【図２７】図２７は、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼによる組換え全長Ｈ１．０タンパク質のメチル化を示す。
【００６５】
【図２８Ａ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ヒト脂肪細胞由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）におけるＧ９ＡのｓｉＲＮＡノックダウンにより、ブレオマイシン処置（図２８Ａ）の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの低減（図２８Ｂ）が導かれたことを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ａ〜２８Ｂは、ヒト脂肪細胞由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）におけるＧ９ＡのｓｉＲＮＡノックダウンにより、ブレオマイシン処置（図２８Ａ）の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの低減（図２８Ｂ）が導かれたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
詳細な説明
ジメチル化抗原に特異的に結合する抗体であって、ジメチル化抗原がジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質であり、リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応し、ジメチル化リシン残基が結合するのに必要である抗体（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体）が本明細書において提供される。
【００６７】
ジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０ペプチド、またはジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０タンパク質であって、ジメチル化リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドおよびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質）も本明細書において提供される。
【００６８】
これらのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、治療および診断用途のために本明細書において提供される。これらのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態の処置において使用してもよい。これらのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、複製老化、ＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス、放射線曝露、アルツハイマー病を検出し、治療レジメン、患者の階層化、薬物スクリーニングをモニタリングするために使用されてもよく、系内の生物学的老化のマーカーとしての役割を果たす場合がある。
【００６９】
これらおよび関連する組成物および方法が本明細書に記載されている。
Ｉ．ジメチル化タンパク質およびペプチド
Ａ．ジメチル化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチド
【００７０】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸の高分子を指し、他に明示されていなければ、天然に存在するアミノ酸と同様の方式で機能する異常アミノ酸を含む。
【００７１】
ジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０タンパク質およびヒストンＨ１．０ペプチドであって、リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するタンパク質およびペプチドが、本明細書において提供される。ヒトＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する残基にジメチル化リシンを含むヒストンＨ１．０タンパク質は、本明細書において、「Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質」と称される。ヒトＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する残基にジメチル化リシンを含むヒストンＨ１．０ペプチドは、本明細書において、「Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド」と称される。これらは、単に、「Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２」と総称する場合もある。
【００７２】
本明細書で議論されるＨ１．０タンパク質の残基の位置は、参照アミノ酸配列に関して特定される。残基の位置を特定するために使用されるヒトＨ１．０ヒストンタンパク質は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５３０９．１であり、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_005309.1でアクセスすることができる。この場合には、「Ｈ１．０残基リシン１８０」または「Ｈ１．０Ｋ１８０」または「Ｋ１８０」への言及は、ヒトヒストンＨ１．０において、メチオニンが最初の残基であるＮ末端から１８０番目のアミノ酸である残基を特定する。１８０番目の残基は、ヒトＨ１．０のリシン（Ｋ）である。当業者は、Ｋ１８０残基は、異なる種に由来するＨ１タンパク質または異なるアイソフォームにおいて、異なる位置を有する場合があることを認識する。
【００７３】
本明細書において、用語「Ｋ１８０」の使用は、ヒトＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する残基を指す。同様に、用語「Ｋ１７２」は、ヒトＨ１．０タンパク質などのＫ１７２に対応する残基を指す。
【００７４】
表１は、連続して１〜１９４と付番した全長ヒトＨ１．０タンパク質の１９４−アミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５３０９．１）を提供する。Ｋ１８０残基はＫ＊として示される。
【表１】
2019521953.tif 000003
【００７５】
表２は、連続して１〜１９４と付番したＫ１８０でジメチル化された全長ヒトＨ１．０タンパク質の１９４−アミノ酸配列を提供する。Ｋ１８０ｍｅ２残基はＫ（ｍｅ２）として示される。
【表２】
2019521953.tif 000004
【００７６】
ある特定の実施形態では、ジメチル化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド（本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体によって認識されるＫ１８０ｍｅ２エピトープを含む）は、表３Ａに提示される配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【表３Ａ−１】
2019521953.tif 000005
【表３Ａ−２】
2019521953.tif 000006
【００７７】
本明細書のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドは、種々の目的で、例えば、これらに限定されないが、治療、検出、診断、可視化、定量化、選別において使用するため、およびこれらの治療用途に関する生物学的アッセイにおいて使用するためにさらにコンジュゲートされていてもよい。
【００７８】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドは、標識、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または磁気標識を含む（例えば、標識にコンジュゲートされている）。例示的実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、固体表面、例えば、ビーズ（例えば、磁気、ガラスまたはプラスチックビーズ）、カラム、樹脂、またはマイクロプレートにコンジュゲートされているかまたは付着されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、マイクロプレート上にコーティングされている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、エフェクター分子、例えば、これらに限定されないが、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体にコンジュゲートされているかまたはこれらを含んでいる。
【００７９】
一部の実施形態では、アミノ酸配列は、例えば、コンジュゲーションを目的として、追加の末端残基をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｃ末端残基をさらに含む。このような実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号３６）、ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫＣ（配列番号３７）、ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫＣ（配列番号３８）、ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号３９）、ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫＣ（配列番号４０）、またはＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫＣ（配列番号４１）を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのうちのいずれか１つの断片を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＣ（バクテリアセルロース）またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）にコンジュゲートされている。
【００８０】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドは、病態生理の検出において、またＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の存在の定量的評価を組み込む方法において参照標準として含めるのにも有用である。
【００８１】
タンパク質またはペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化は、従来より、特異性（例えば、メチル化される基質に対する特異性、およびその制御）を課題とする。Ｇ９ＡメチルトランスフェラーゼまたはＧＬＰメチルトランスフェラーゼを使用するＨ１．０タンパク質（またはそのペプチド断片）のＫ１８０残基の選択的ジメチル化を可能とする方法が本明細書に記載されている。
【００８２】
ヒストンＨ１．０タンパク質をリシン残基１８０（Ｋ１８０）で特異的にジメチル化すること（Ｋ１８０ｍｅ２を有するＨ１．０）およびヒストンＨ１．０タンパク質のペプチド断片をＫ１８０に対応するリシンで特異的にジメチル化することに関する組成物および方法が本明細書において提供される。
Ｂ．Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの生成
【００８３】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、病態生理の間接的検出において、またこれらに限定されないが（１）少なくともＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス（例えば、環境曝露に関連する）、放射線曝露、化学療法およびＤＮＡ損傷ペイロードを有する抗体を用いる免疫療法、放射線療法およびアルツハイマー病の分子診断、（２）治療レジメンおよび患者の階層化のモニタリング、（３）薬物スクリーニングならびに（４）治療用途を含む方法におけるデータの定量化のための参照標準として含めるのにも有用である。
【００８４】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、５〜１９３アミノ酸（ａａ）長の範囲である。種々の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの長さは、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、１５ａａ、１６ａａ、１７ａａ、１８ａａ、１９ａａ、２０ａａ、２１ａａ、２２ａａ、２３ａａ、２４ａａ、２５ａａ、２６ａａ、２７ａａ、２８ａａ、２９ａａ、または３０ａａである。ある特定の例示的実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの長さは、１５ａａ、１６ａａ、１７ａａ、１８ａａ、１９ａａ、または２０ａａである。
【００８５】
本明細書に記載されている方法および組成物を使用して合成により生成することができる例示的Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドが表３Ａに列挙されている。一部の実施形態では、本発明のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、表３Ａに提示されているものから選択される配列のうちの１つを含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、表３Ａに提示されているものから選択される配列のうちの１つからなる。例示的実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列を含む。例示的実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列からなる。表３Ａにおいて提供されるペプチドは、標識、例えば、ビオチンをさらに含む場合がある。
【００８６】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成（合成により生成したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド）のための方法が本明細書において提供される。一般的に、方法は、ヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するリシン残基の特異的ジメチル化（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化）を可能にする条件下で、基質ペプチドをＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素またはＧ９Ａ様タンパク質（ＧＬＰ）メチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップを含む。種々の実施形態では、基質Ｈ１．０ペプチドは、表３Ｂに提示される配列の群から選択される配列を含む。関連する実施形態では、ペプチドは、表３Ｂに提示される配列の群から選択される配列である。
【００８７】
メチル化のために使用されるペプチドは、合成により生成されうるかまたは当業者が精通する方法を使用して生成されうる。
【表３Ｂ−１】
2019521953.tif 000007
【表３Ｂ−２】
2019521953.tif 000008
【００８８】
一般的に、ヒストンＨ１．０ペプチドをジメチル化するための方法は、特異的にジメチル化されたペプチドを生成する条件下で、ペプチドをメチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップであって、ペプチドが、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するリシン残基で特異的にジメチル化され、メチルトランスフェラーゼ酵素がＧ９ＡメチルトランスフェラーゼまたはＧＬＰメチルトランスフェラーゼであるステップを含む。
【００８９】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態では、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼは、組換えＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ、精製Ｇ９Ａ哺乳動物メチルトランスフェラーゼ、ヒトＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ、マウスＧ９Ａメチルトランスフェラーゼなどであってもよい。Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼは、酵素として活性なオルソログ、キメラおよび酵素ドメインを含有する人工的にまたは天然に生成されたアイソフォームを含む。
【００９０】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態では、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼは、組換えＧＬＰメチルトランスフェラーゼ、精製ＧＬＰ哺乳動物メチルトランスフェラーゼ、ヒトＧＬＰメチルトランスフェラーゼ、マウスＧＬＰメチルトランスフェラーゼなどであってもよい。ＧＬＰメチルトランスフェラーゼは、酵素として活性なオルソログ、キメラおよび酵素ドメインを含有する人工的にまたは天然に生成されたアイソフォームを含む。
【００９１】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態では、メチルドナーは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）であってもよい。
【００９２】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態では、接触させるステップは、メチル化緩衝液中でなされてもよい。
【００９３】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態では、ペプチドは、メチル化に先立って、標識（例えば、ビオチン）を含んでもよい。
【００９４】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態では、ペプチドは、メチル化後に、標識（例えば、ビオチン）にコンジュゲートされていてもよい。
【００９５】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化のための方法の実施形態では、生成物の５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはさらに９９．９％超は、Ｋ１８０ｍｅ２を含む。同様に、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の実施形態において、種々の実施形態では、生成物の５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満、または０．３５％未満は、他のメチル化残基（例えば、Ｋ１７２ｍｅ１、Ｋ１７２ｍｅ２、Ｋ１７２ｍｅ３、Ｋ１７４ｍｅ１、Ｋ１７４ｍｅ２、Ｋ１７４ｍｅ３、Ｋ１７５ｍｅ１、Ｋ１７５ｍｅ２、Ｋ１７５ｍｅ３、Ｋ１７７ｍｅ１、Ｋ１７７ｍｅ２、Ｋ１７７ｍｅ３、Ｋ１６６ｍｅ１、Ｋ１６６ｍｅ２、Ｋ１６６ｍｅ３、Ｋ１８０ｍｅ１、および／またはＫ１８０ｍｅ３）も含有する。例示的実施形態では、Ｋ１８０ｍｅ２を有する生成物の０．３５％未満は、Ｋ１７４ｍｅ３、Ｋ１７５ｍｅ３、およびＫ１７７ｍｅ１も含み、Ｋ１８０ｍｅ２を有する生成物の１．２５％未満は、Ｋ１６６ｍｅ１も含み、Ｋ１８０ｍｅ２を有する生成物の１．０４％未満は、Ｋ１７４ｍｅ１およびＫ１８０ｍｅ３を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に特異的である抗体（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体）に結合する。ジメチル化抗原に特異的に結合する抗体であって、ジメチル化抗原がジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０ペプチドであり、リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する抗体が本明細書において提供される。
【００９７】
ある特定の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、約０．０００１ｎＭ〜約１μＭの解離定数（Ｋｄ）でＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に結合する。例えば、ペプチドのＫｄは、約１μＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０００５ｎＭ、またはさらに約０．０００１ｎＭであってもよい。
【００９８】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、抗ヒトＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に特異的である。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、他の種由来のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と交差反応性である。
【００９９】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対して選択的であり、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ３抗体に対してほとんどまたは全く結合性を示さない。
【０１００】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対する結合優先性（例えば、親和性）は、一般的に、非特異的標的抗体（例えば、無作為に生じた抗体）に対して、少なくとも約２倍、約５倍、または少なくとも約１０、２０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、もしくは１０６倍である。
【０１０１】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、ペイロード（例えば、これらに限定されないが、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、アンタゴニスト、アゴニストまたは受容体デコイを含む）を有する抗体に等しく特異的／選択的でありうる。
【０１０２】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、種々の目的で、例えば、これらに限定されないが、検出、診断、可視化、定量化、選別、治療において使用するため、および生物学的アッセイにおいて使用するためにさらにコンジュゲートされていてもよい。
【０１０３】
一部の実施形態では、Ｈ１．０ペプチドまたはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、標識（例えば、メチル化の前または後のいずれかにコンジュゲートされた）、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、磁気標識などを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、ヒストンＨ１．０ペプチドおよびメチルトランスフェラーゼ酵素を含む複合体であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ中（例えば、試験管、チューブ、反応チャンバー、反応容器など）にある複合体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、Ｈ１．０ペプチドは、配列番号４２〜７４からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ酵素は、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素である。一部の実施形態では、メチルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼ酵素である。
Ｃ．Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質の生成
【０１０５】
本明細書に記載されている全長Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、病態生理の検出において、またこれらに限定されないが（１）少なくともＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス（例えば、環境曝露に関連する）、放射線曝露、化学療法およびＤＮＡ損傷ペイロードを有する抗体を用いる免疫療法、放射線療法、およびアルツハイマー病の分子診断、（２）治療レジメンおよび患者の階層化のモニタリング、（３）薬物スクリーニングならびに（４）治療薬としての使用を含む方法において参照標準として含めるのにも有用である。
【０１０６】
一部の実施形態では、特異的にジメチル化されたタンパク質を生成する条件下で、タンパク質をメチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップを含む、ヒストンＨ１．０タンパク質をジメチル化するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、タンパク質がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応するリシン残基で特異的にジメチル化され、メチルトランスフェラーゼ酵素がＧ９ＡメチルトランスフェラーゼまたはＧＬＰメチルトランスフェラーゼである方法が本明細書において提供される。
【０１０７】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法が本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、Ｋ１８０残基の特異的ジメチル化を可能とする条件下で、全長Ｈ１．０タンパク質をＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップを含む。Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼは、酵素として活性なオルソログ、キメラおよび酵素ドメインを含有する人工的にまたは天然に生成されたアイソフォームを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法が本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、Ｋ１８０残基の特異的ジメチル化を可能とする条件下で、全長Ｈ１．０タンパク質をＧＬＰメチルトランスフェラーゼ酵素およびメチルドナーと接触させるステップを含む。ＧＬＰメチルトランスフェラーゼは、酵素として活性なオルソログ、キメラおよび酵素ドメインを含有する人工的にまたは天然に生成されたアイソフォームを含む。
【０１０９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化のために使用される全長Ｈ１．０非メチル化タンパク質基質は、当業者が精通する方法を使用して、単離、合成により生成、または組換えにより生成されてもよい。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質をコードする核酸が本明細書において提供される。本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質をコードする核酸のいずれかを含むベクターも本明細書において提供される。
【０１１０】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼは組換えＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ、精製Ｇ９Ａ哺乳動物メチルトランスフェラーゼ、ヒトＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ、マウスＧ９Ａメチルトランスフェラーゼなどであってもよい。
【０１１１】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、ＧＬＰメチルトランスフェラーゼは、組換えＧＬＰメチルトランスフェラーゼ、精製ＧＬＰ哺乳動物メチルトランスフェラーゼ、ヒトＧＬＰメチルトランスフェラーゼ、またはマウスＧＬＰメチルトランスフェラーゼであってもよい。
【０１１２】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、タンパク質は、メチル化に先立って、標識（例えば、ビオチン）を含んでもよい。
【０１１３】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、タンパク質は、メチル化後に、標識（例えば、ビオチン）にコンジュゲートされていてもよい。
【０１１４】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、メチルドナーは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンである。
【０１１５】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、接触させるステップは、メチル化緩衝液中でなされる。
【０１１６】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化のための方法の実施形態では、生成物の５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらに９９．９％超は、Ｋ１８０ｍｅ２を含んでもよい。同様に、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための方法の一部の実施形態では、生成物の５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満、または０．３５％未満は、他のメチル化残基（例えば、Ｋ１７２ｍｅ１、Ｋ１７２ｍｅ２、Ｋ１７２ｍｅ３、Ｋ１７４ｍｅ１、Ｋ１７４ｍｅ２、Ｋ１７４ｍｅ３、Ｋ１７５ｍｅ１、Ｋ１７５ｍｅ２、Ｋ１７５ｍｅ３、Ｋ１７７ｍｅ１、Ｋ１７７ｍｅ２、Ｋ１７７ｍｅ３、Ｋ１６６ｍｅ１、Ｋ１６６ｍｅ２、Ｋ１６６ｍｅ３、Ｋ１８０ｍｅ１、および／またはＫ１８０ｍｅ３）も含有する。例示的実施形態では、Ｋ１８０ｍｅ２を有する生成物の０．３５％未満は、Ｋ１７４ｍｅ３、Ｋ１７５ｍｅ３、およびＫ１７７ｍｅ１も含み、Ｋ１８０ｍｅ２を有する生成物の１．２５％未満は、Ｋ１６６ｍｅ１も含み、ならびに／またはＫ１８０ｍｅ２を有する生成物の１．０４％未満は、Ｋ１７４ｍｅ１およびＫ１８０ｍｅ３を含む。
【０１１７】
ジメチル化抗原に特異的に結合する抗体であって、ジメチル化抗原がジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０タンパク質に見られ、リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する抗体が本明細書において提供される。
【０１１８】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的である抗体（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体）に対して選択的である。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に非特異的である抗体に結合する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、約０．０００１ｎＭ〜約１μＭの解離定数（Ｋｄ）でＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に結合する。例えば、Ｋｄは、約１μＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０００５ｎＭ、またはさらに約０．０００１ｎＭであってもよい。
【０１２０】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、抗ヒトＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に特異的である。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、他の種由来のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と交差反応性である。
【０１２１】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対して選択的であり、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ３抗体に対してほとんどまたは全く結合性を示さない。
【０１２２】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対する結合優先性（例えば、親和性）は、一般的に、非特異的標的抗体（例えば、無作為に生じた抗体）に対して、少なくとも約２倍、約５倍、または少なくとも約１０、２０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、もしくは１０６倍である。
【０１２３】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、種々の目的で、例えば、これらに限定されないが、検出、診断、可視化、定量化、選別、治療において使用するため、および生物学的アッセイにおいて使用するためにさらにコンジュゲートされていてもよい。
【０１２４】
一部の実施形態では、Ｈ１．０タンパク質（Ｈ１．０基質）またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、標識（メチル化の前または後のいずれかに）、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、磁気標識などにコンジュゲートされている。
ＩＩ．ジメチル化ヒストンＨ１．０タンパク質およびペプチドに結合する抗体
Ａ．Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体
【０１２５】
ジメチル化抗原に特異的に結合する抗体であって、ジメチル化抗原がジメチル化リシン残基を含むヒストンＨ１．０ペプチドまたはヒストンＨ１．０タンパク質であり、リシン残基がヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応する抗体が本明細書において提供される。このジメチル化抗原は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原であり、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープとも称される。これらの抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的に結合する。これらの抗体は、ジメチル化抗原に特異的に結合し（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的に結合し）、結合するのにＫ１８０にジメチル基の存在を必要とする。用語「抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２」または「Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体」または「抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体」は、互換的に、これらの抗体を指す。
【０１２６】
用語「抗体」は、本明細書全体を通して使用する場合、最も広い意味においてであり、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多機能抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’２断片、ＣＤＲまたはＳｃＦｖ）、抗体−薬物コンジュゲート、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に対する特異性を保持する他の抗体断片を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に対する特異性を保持する単鎖抗体である。
【０１２７】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の模式的結合が図５Ａに示されている。
【０１２８】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、診断抗体である。
【０１２９】
一部の実施形態では、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、治療用抗体である。
【０１３０】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、高力価で存在する。
【０１３１】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、親和性精製抗体である。
【０１３２】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、種々の目的で、例えばこれらに限定されないが、検出、診断、可視化、定量化、選別、治療において使用するため、および生物学的アッセイにおいて使用するためにさらにコンジュゲートされていてもよい。
【０１３３】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、標識、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または磁気標識を含む（例えば、標識にコンジュゲートされている）。
【０１３４】
一部の実施形態では、抗体は、固体表面、例えば、ビーズ（例えば、磁気、ガラスまたはプラスチックビーズ）、カラム、樹脂またはマイクロプレートにコンジュゲートされているかまたは付着されている。一部の実施形態では、抗体は、マイクロプレートにコーティングされている。
【０１３５】
一部の実施形態では、抗体は、エフェクター分子、例えば、これらに限定されないが、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体にコンジュゲートされているかまたはこれらを含んでいる。
【０１３６】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２バイオマーカーは、クロマチン結合される場合があるか、またはクロマチンから核、細胞質、もしくは細胞外のスペースへと放出される場合があることが認識される。本明細書において提供される抗体は、細胞外Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２および／または細胞内Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に結合することができる。細胞内である場合、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原は、クロマチンにさらに結合されるか、または核中で放出されるか、核から細胞質スペースへと放出されるか、もしくは細胞質の下位構造中にさらに局在化してもよい。
【０１３７】
一部の実施形態では、抗体（例えば、治療用抗体）は中和抗体であり、抗体はＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の１種または複数の生体活性を中和する。例えば、抗体は、細胞外Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に結合し、抗体が有しうるあらゆる結合またはシグナル伝達活性を中和する。
【０１３８】
本明細書において提供される抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンタイプのものであってもよい。一部の実施形態では、抗体はＩｇＧサブタイプのものであり、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。
【０１３９】
任意の種に由来するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的な抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、ヒトＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的である。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、他の種に由来のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２と交差反応性である。
【０１４０】
本明細書において提供される抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２と特異的に結合する。一部の実施形態では、これらの抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２と特異的かつ選択的に結合する。
【０１４１】
本明細書において提供される抗体は、ジメチル化抗原に特異的に結合し、ジメチル化Ｈ１．０抗原はジメチル化リシン残基を含み、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１８０に対応し（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原）、一部の実施形態では、ジメチル化抗原は、メチル化されたいずれの他のリシン残基も含まない。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗原がジメチル化リシン残基を含む場合、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は結合しないか、または最小限に結合するにすぎず、リシン残基はヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、および／またはＫ１７７に対応する。
【０１４３】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、以下の残基：Ｋ１７２ｍｅ１、Ｋ１７２ｍｅ２、Ｋ１７２ｍｅ３、Ｋ１７４ｍｅ１、Ｋ１７４ｍｅ２、Ｋ１７４ｍｅ３、Ｋ１７５ｍｅ１、Ｋ１７５ｍｅ２、Ｋ１７５ｍｅ３、Ｋ１７７ｍｅ１、Ｋ１７７ｍｅ２、Ｋ１７７ｍｅ３、Ｋ１６６ｍｅ１、Ｋ１６６ｍｅ２、Ｋ１６６ｍｅ３、Ｋ１８０ｍｅ１、および／またはＫ１８０ｍｅ３の１つまたは複数を含む抗原に結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。
【０１４４】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、ジメチル化Ｋ１８０残基を含むが、以下の残基：Ｋ１７２ｍｅ１、Ｋ１７２ｍｅ２、Ｋ１７２ｍｅ３、Ｋ１７４ｍｅ１、Ｋ１７４ｍｅ２、Ｋ１７４ｍｅ３、Ｋ１７５ｍｅ１、Ｋ１７５ｍｅ２、Ｋ１７５ｍｅ３、Ｋ１７７ｍｅ１、Ｋ１７７ｍｅ２、Ｋ１７７ｍｅ３、Ｋ１６６ｍｅ１、Ｋ１６６ｍｅ２、Ｋ１６６ｍｅ３、Ｋ１８０ｍｅ１、および／またはＫ１８０ｍｅ３の１つまたは複数も含む抗原に結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。
【０１４５】
一部の実施形態では、抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、および／またはＫ１８０に対応するリシン残基においてモノメチル化リシン残基を含む場合、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。
【０１４６】
一部の実施形態では、抗原が、ヒトヒストンＨ１．０タンパク質のＫ１６６、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、および／またはＫ１８０に対応するリシン残基においてトリメチル化リシン残基を含む場合、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は結合しないか、または最小限に結合するにすぎない。
【０１４７】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、残基Ｋ１８０におけるジメチル化に対して選択的であり、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１エピトープまたはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ３エピトープについてほとんどまたは全く結合性を示さない。
【０１４８】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、任意の培地で、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに結合する。
【０１４９】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、Ｋ１８０のモノメチル化抗原（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１抗原）よりも、Ｋ１８０のジメチル化抗原（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原）に対して、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、２．７倍、５倍、またはさらに１０倍高い特異性（結合優先性、親和性）を呈する。（図３Ｄ）一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に対する特異性は、一般的に、非特異的標的分子（例えば、特異的に認識される部位を欠く、無作為に生じた分子）に対して、モノメチル化Ｋ１８０残基に対して、トリメチル化Ｋ１８０残基に対して、または任意の他の残基でメチル化されたＨ１．０タンパク質に対して、少なくとも約２倍、約５倍、または少なくとも約１０、２０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、もしくは１０６倍である。
【０１５０】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の結合効率は、ＥＬＩＳＡアッセイによってモニターされる。一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１ペプチドよりも、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドに少なくとも２．７倍効率的に結合する。一部の実施形態では、抗体１分子は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの１１７分子のうちの１つを認識するが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１ペプチドの３１６分子のうちの１つしか認識しない。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、０．０００１ｎＭ〜１μＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。例えば、抗体のＫｄは、約１μＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０００５ｎＭ、またはさらに約０．０００１ｎＭであってもよい。
Ｂ．Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の生成
【０１５２】
様々なイムノアッセイフォーマットを使用して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２と特異的に免疫反応性である抗体を選択してよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的なモノクローナル抗体を選択してよい（例えば、特異的な免疫反応性を決定するために使用されてよいイムノアッセイフォーマットおよび条件についての記載として、HarlowおよびLane（１９８８年）Antibodies、A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Publications、New  Yorkを参照のこと）。
【０１５３】
本明細書において提供される抗体の産生は、当業者に公知の任意の方法によるものであってもよい。例えば、一部の実施形態では、抗体は、所望の抗体の所望のＶＨ、ＶＬおよび定常ドメインを発現するよう工学的に操作された組換え細胞によって産生される。一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマによって産生される。
【０１５４】
一部の実施形態では、任意選択で免疫原性担体に連結したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原を含む任意のペプチドが、標準プロトコールを使用して免疫化に使用される。一部の実施形態では、任意選択で免疫原性担体に連結した表３Ａに提示したものに由来する配列を含むペプチドが、標準プロトコールを使用して免疫化に使用される。例示的実施形態では、任意選択で免疫原性担体に連結したＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫｍｅ２ＰＫ（配列番号３）を含むペプチドが、標準プロトコールを使用して免疫化に使用される。生じた抗体の質および力価は、当業者に公知の技術を使用して評価されてよい。
【０１５５】
本明細書に記載されている本発明の組成物は、抗体をコードする核酸、抗体をコードする核酸のいずれかを含むベクター、およびいずれかのこのようなベクターを含む宿主細胞も含む。
【０１５６】
当業者が容易に認識するように、抗体は、いくつかの商用サービスのいずれかによって調製することもできる。
ＩＩＩ．診断
Ａ．Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的および間接的検出
【０１５７】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、種々の診断目的に有用である。
【０１５８】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度の直接的および間接的検出および定量化の両方に対するアッセイが本明細書において提供される。このような定量化は、複製老化、ＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス、放射線曝露、アルツハイマー病、および生物学的老化を検出するのに有用である場合がある。定量化は、治療レジメン、薬物スクリーニング、ならびに細胞生存率を回復させ、ＤＮＡ損傷を予防し、細胞代謝およびオートファジーを増加させ、細胞老化を阻害し、かつ細胞の細胞質における不溶性タンパク質老廃物の蓄積をブロックすることを目的とする薬物処置に対するレスポンダーまたは非レスポンダーとしての患者の階層化をモニタリングするのにも有用である場合がある。用途に応じて、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、または無細胞系で検出および定量化されてもよい。
【０１５９】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用してＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を検出することを含む。
【０１６０】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の存在に応答して生じる自己抗体に結合するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを使用することを含む。この文脈では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体結合タンパク質と称することができ、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体結合ペプチドと称することができる。
【０１６１】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、当業者に周知の任意の数の方法によって検出されてもよい。本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、様々なイムノアッセイにおいて容易に使用される。これらのイムノアッセイとして、これらに限定されないが、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、ラテラルフローイムノアッセイ、スロットブロット、磁気イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、間接免疫蛍光測定法、直接免疫蛍光測定法、周囲光ファイバーイムノアッセイ（ＳＯＦＩＡ）、分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動法、免疫電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、免疫拡散、分光法、質量分析法、定量的質量分析法、あらゆるタイプの多重アッセイ、およびあらゆるタイプの微小流体アッセイが挙げられる。
【０１６２】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、標識、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または磁気標識を含んでもよい（例えば、標識にコンジュゲートされていてもよい）。
【０１６３】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパクおよびペプチドは、検出可能な標識を含んでもよい。検出可能な群は、検出可能な物理的または化学的特性を有する、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、蛍光的、電気的、光学的または化学的方法によって検出可能な任意の材料であってもよい。本発明において有用な標識として、これらに限定されないが、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、レッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、マーカー遺伝子産物としてまたはＥＬＩＳＡにおいてのいずれかで、通常検出可能な酵素として使用されるＬａｃＺ、ＣＡＴ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンおよびコロイダルゴールド着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ、およびナノ粒子などの比色標識が挙げられる。例示的実施形態では、ビオチンは標識である。
【０１６４】
本明細書において提供される標識は、当技術分野で周知の方法に従うアッセイの所望の成分に直接的または間接的にカップリングしてもよい。上記で示したように、必要とされる感度、化合物のコンジュゲーションの容易性、安定性要件、利用可能な器具類、および使い捨て設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に応じて標識を選択して、幅広い標識を使用してもよい。標識は、間接的な方法によって付着されることが多い。一般的に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いで、リガンドは、本質的に検出可能であるかまたは検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合されるかのいずれかである抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合する。いくつかのリガンドおよび抗リガンドを使用してもよい。リガンドが、天然の抗リガンド、例えば、ビオチンを有する場合、リガンドは、標識された天然に存在する抗リガンドと併せて使用されてもよい。あるいは、任意のハプテンまたは抗原性化合物は、抗体と組み合わせて使用されてもよい。成分はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲーションによって、シグナル生成化合物に直接コンジュゲートされうる。標識としての目的の酵素として、これらに限定されないが、加水分解酵素、ホスファターゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、またはｏｘｉｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、およびペルオキシダーゼが挙げられる。蛍光化合物として、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。化学発光化合物として、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。
【０１６５】
標識を検出する方法は当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出のための方法は、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、標識は、蛍光色素を適当な光の波長で励起させ、例えば、顕微鏡検査によって、目視検査によって、写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器の使用によって、得られた蛍光を検出することによって検出されてもよい。同様に、酵素標識は、酵素に適当な基質を提供し、得られた反応生成物を検出することによって検出してもよい。最後に、簡単な比色標識は、標識に関連する色を単に観察することによって検出されてもよい。このように、種々のディップスティックアッセイでは、様々なコンジュゲートしたビーズはビーズの色に見えるが、コンジュゲートしたゴールドはピンクに見えることが多い。
【０１６６】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的な自己抗体を検出するイムノアッセイでは、特異的な二次抗体を利用して、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ自己抗体タイプ間を識別することができる。
【０１６７】
検出の際に、特定の画分におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度が定量化されてもよく、例えば、細胞内画分における、可溶性かつクロマチン結合画分における、または細胞質画分におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の定量化がある。例えば、細胞質画分におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度の上昇は、細胞の老化状態を示す。一部の実施形態では、インタクト細胞、培養中の細胞、または切片培養における細胞を画像化して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の局在を可視化する。例えば、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の核外での細胞内局在の増大は、老化状態を示す。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の細胞質ゾルまたは細胞外マトリックスへの放出は、老化状態を示す。
【０１６８】
検出は、任意の生体試料に関して行われてもよい。生体試料としては、これらに限定されないが、個体に由来する全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便、滑液、脳脊髄液、気管支洗浄、腹水液、骨髄穿刺液、胸水、組織、細胞、生検材料、間質液、リンパ液、またはそれらの画分が挙げられる。一部の実施形態では、生体試料は細胞を含み、細胞は、培養中、懸濁液中、スライド上、インタクト組織中、またはＦＡＣ分析用に準備された調製物中にある。
【０１６９】
生体試料は、個体から得られる。本明細書で使用する場合、個体は、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園の動物、スポーツ用動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。個体は、雄であっても雌であってもよい。一実施形態では、個体は雌である。一実施形態では、個体は雄である。
【０１７０】
一部の実施形態では、個体は、５０歳を超える。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は、５０歳未満である。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は、少なくとも５０歳であり、少なくとも５５歳であり、少なくとも６０歳であり、少なくとも６５歳であり、少なくとも７０歳であり、少なくとも７５歳であり、または少なくとも８０歳である。例示的実施形態では、個体は、少なくとも６０歳である。
【０１７１】
生体試料は、当業者に周知の標準方法によって得られる。試料は、所望の場合、適当な緩衝溶液中での希釈または濃縮によって、必要な場合、任意選択で前処置される。生理学的ｐＨで、リン酸塩、トリスなどの様々な緩衝液のうちの１つを用いるいくつかの標準緩衝水溶液のいずれかを使用してもよい。
【０１７２】
本明細書に記載されている直接的検出方法を使用して、生体試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を定量化してもよい。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、例えば、陽性対照としてまたは競合イムノアッセイの競合者として、協力して使用してもよく、実行されるアッセイのフォーマットに応じて標識されてもされなくてもよい。
【０１７３】
本明細書に記載されている間接的検出方法を使用して、生体試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の濃度を定量化してもよい。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、例えば、陽性対照としてまたは競合イムノアッセイの競合者として、協力して使用してよく、実行されるアッセイのフォーマットに応じて標識されてもされなくてもよい。
【０１７４】
当業者は、一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原または自己抗体の決定された濃度を対照（すなわち、参照対照）と比較することが必要でありうることを認識する。相対比較により、例えば、個体が疾患（例えば、アルツハイマー病）を有するか、もしくは発症するリスクがあるかどうか、または個体が特定の処置（例えば、アルツハイマー病処置またはラパログによる処置）に応答性であるか、もしくは応答性である場合があるかどうかの決定が可能となる場合がある。対照は、年齢を一致させた対照、性別を一致させた対照、年齢および性別を一致させた対照、健康な対照、操作されていない対照、または諸参照標準を集めたものに相当する参照標準であってもよい。例えば、処置（例えば、アルツハイマー病処置またはラパログによる処置での）に先立って、または遺伝毒性物質、ＤＮＡ損傷剤、もしくは放射線への曝露に先立って、同一個体由来の試料と比較することもできる。罹患していない領域、例えば、罹患していない組織に由来する同一個体由来の試料と比較することもできる。
【０１７５】
当業者は、イムノアッセイにおいて、および分析物の検出の間に、非特異的結合を低減することが望ましいことが多いことを認識する。アッセイが、固体基質に固定されたＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドに関する場合、基質への非特異的結合量を最小限にすることが望ましい場合がある。このような非特異的結合を低減する方法は、当業者に公知である。典型的には、これは、タンパク性組成物で基質をコーティングするステップを含む。一部の実施形態では、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、およびゼラチンなどのタンパク質組成物が利用されてもよい。
【０１７６】
感度、特異性、陽性および陰性適中率（ＰＰＶおよびＮＰＶ）ならびに陽性および陰性尤度比（ＰＬＲおよびＮＬＲ）を各診断試験設計について計算することができる。統計方法は、患者の疾患の有無を予測する助けとなる。
【０１７７】
感度は、一般的に、疾患が存在する場合に試験結果が陽性となる確率（有病正診率）である。
【０１７８】
特異性は、一般的に、疾患が存在しない場合に試験結果が陰性となる確率（無病正診率）である。
【０１７９】
陽性適中率（ＰＰＶ）は、一般的に、試験が陽性である場合に疾患が存在する確率であり、疾患の試験前有病率を説明する（例えば、アルツハイマー病に対する試験前有病率は１０％である）。
【０１８０】
陰性適中率（ＮＰＶ）は、一般的に、試験が陰性である場合に疾患が存在しない確率であり、ＡＤの試験前有病率が１０％であることを説明する（Prince,  M.  J．、Am  J  Epidemiol、１９９６年）。
【０１８１】
陽性尤度比（ＬＲ＋またはＰＬＲ）は、一般的に、疾患試験陽性を有さないヒトの確率で割った疾患試験陽性を有するヒトの確率である。陽性尤度比（ＰＬＲ）は、一般的に、試験が陽性である場合、疾患の確率がどの程度増加するかを示す。ＰＬＲが１より大きいことは、標的障害が存在する確率の増加を示し、ＰＬＲが１より小さいことは、標的障害が存在する確率の低下を示し、ＰＬＲが１であることは、試験によって疾患の確率が変化しないことを意味する。
【０１８２】
陰性尤度比（ＬＲ−またはＮＬＲ）は、一般的に、疾患試験陰性を有さないヒトの確率で割った疾患試験陰性を有するヒトの確率である。陰性尤度比（ＮＬＲ）は、一般的に、試験が陰性である場合、疾患の確率がどの程度低下するかを示す。
【０１８３】
一部の実施形態では、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値レベルに対する比較がなされる。ＲＯＣ曲線、閾値および曲線下面積（ＡＵＣ）は、本明細書において提供される試験設計のそれぞれに対して示される。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書において提供される診断方法は、例えば、個体が疾患、例えば、アルツハイマー病を有することを最終的に確認するために、確認試験として使用されてもよい。
【０１８５】
他の実施形態では、本明細書において提供される診断方法は、例えば、個体が疾患、例えば、アルツハイマー病を発症する可能性を決定するために、その予測値として（試験、スクリーニングのための）使用されてもよい。このような実施形態では、診断は尤度比の計算を含む場合がある。
【０１８６】
他の実施形態では、本明細書において提供される診断方法は、コンパニオン診断として使用されてもよい。このような実施形態では、診断は、陽性適中率（ＰＰＶ）および陰性適中率（ＮＰＶ）の計算を含む場合がある。
【０１８７】
一部の実施形態では、本明細書において提供される診断方法を使用して、診断オッズ比（ＯＲ）を確立してもよい。このような実施形態では、診断は、感度および特異性の計算を含んでいてもよく、診断試験の有効性の尺度である。
Ｂ．診断のためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体  −  Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出および定量化
【０１８８】
診断に有用な、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に特異的に結合する抗体が本明細書において提供される。本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、結合するためにＫ１８０残基のジメチル化を必要とする。
【０１８９】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、標識、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または磁気標識を含む（例えば、標識にコンジュゲートされている）。
【０１９０】
一部の実施形態では、抗体は、固体表面、例えば、ビーズ（例えば、磁気、ガラスまたはプラスチックビーズ）、カラム、樹脂またはマイクロプレートにコンジュゲートされているかまたは付着されている。一部の実施形態では、抗体は、マイクロプレート上にコーティングされている。
【０１９１】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、先行するセクションＩＩでより詳細に議論されている。
【０１９２】
直接的検出は、図５Ａに模式的に示されている。
Ｃ．診断のためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチド  −  Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出および定量化
【０１９３】
試料中の天然に存在するＨ１．０ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の検出のためのＨ１．０ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ１．０ｋ１８０ｍｅ２ペプチドが本明細書において提供される。
【０１９４】
ある特定の刺激に応答する生物におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の産生は、抗原に特異的な、天然に存在する自己抗体の生成を生じさせる場合があることが認識される。したがって、本発明の一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するこれらの天然に存在する自己抗体についてのアッセイが望ましい場合がある。自己抗体の検出および測定によって、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の生成に対する代替測定が提案される。
【０１９５】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に特異的な天然に存在する自己抗体の検出および測定のための方法および組成物が本明細書において提供される。本明細書で使用する場合、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはその断片に特異的な自己抗体は、互換的に、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体と称される場合がある。
【０１９６】
測定される自己抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡなどの任意の免疫グロブリンタイプのものであってもよい。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体が測定される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＭ自己抗体が測定される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する１種を超える自己抗体が測定され、例えば、一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体が測定される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する１種を超える自己抗体が測定され、比が計算され、例えば、一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体が測定され、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体：Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＭ自己抗体の比が計算される。他の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体：総ＩｇＭ（例えば、血清ＩｇＭ）の比が測定される。他の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体：総ＩｇＭ（例えば、血清ＩｇＭ）の比が測定され、関数としてＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体：総ＩｇＧ（例えば、血清ＩｇＧ）の比に関連付けられる。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する１種を超える自己抗体が測定され、トランスフェリン、フェリチンまたは血清アルブミン含量と比較される。他の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する１種を超える自己抗体が測定され、試料中のタンパク質の総量に対して正規化されるか、または試料の体積に対して正規化される。
【０１９７】
例示的実施形態では、アルツハイマー病に対するスクリーニング試験は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体：総ＩｇＭの比を測定することを含む（図１７）。別の例示的実施形態では、アルツハイマー病に対するスクリーニング試験は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体：総ＩｇＧの比を測定することを含む（図１７）。一部の実施形態では、これらを互いに比較して、患者集団を階層化する。（図１７）。
【０１９８】
略図に目を向けると、図４および１４Ｃは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを間接的に測定する方法を示す。図４および図１４Ｃが例示するように、標識したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを試料と接触させ、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に応答して生じた試料中の自己抗体を標識したペプチドに結合させ、二次的に標識した抗体を添加して試料中の自己抗体に結合させ、続いて検出および定量化を行う。図４では、試料中の自己抗体は任意のタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＡ）のものでありうる。このアッセイでは、自己抗体に結合させるために使用した二次抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ抗体の間で識別することができ、その結果、各タイプは、そのように望まれる場合、独立に定量化することができる。一部の実施形態では、二次抗体は抗ＩｇＧ抗体であり、アッセイを使用してＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体を定量化する。一部の実施形態では、二次抗体は抗ＩｇＭ抗体であり、アッセイを使用してＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＭ自己抗体を定量化する（図１４Ｃ）。一部の実施形態では、２種の二次抗体を利用して、１種を超える自己抗体を定量化し、例えば、一部の実施形態では、抗ＩｇＧおよび抗ＩｇＭ二次抗体の両方を利用して、アッセイを使用してＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体を定量化する。
【０１９９】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、表３Ａ（配列番号３〜３５）に提供されるものから選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、アミノ酸配列ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号３）を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、例えば、コンジュゲーションを目的として、追加の末端残基をさらに含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、Ｃ末端残基をさらに含む。このような実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、アミノ酸配列ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号３６）、ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫＣ（配列番号３７）、ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫＣ（配列番号３８）、ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号３９）、ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫＣ（配列番号４０）、またはＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫＣ（配列番号４１）を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのうちのいずれか１つの断片を含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ＯＶＡ（卵白アルブミン）、ＢＣ（バクテリアセルロース）またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）にコンジュゲートされている。
【０２００】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、合成であり、例えば、Ｋ１８０残基の特異的ジメチル化（本明細書に記載されている）を可能にする条件下で、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素またはＧ９Ａ様タンパク質（ＧＬＰ）メチルトランスフェラーゼ酵素を使用する、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化の産物である。
【０２０１】
本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、検出、診断、可視化、定量化、選別、治療、および生物学的アッセイにおいて使用するためにさらにコンジュゲートされていてもよい。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、標識、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または磁気標識を含む（例えば、標識にコンジュゲートされている）。例示的実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、固体表面、例えば、ビーズ（例えば、磁気、ガラスまたはプラスチックビーズ）、カラム、またはマイクロプレートにコンジュゲートされているかまたは付着される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、マイクロプレートにコーティングされている。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、これらに限定されないが、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体を含むエフェクター分子にコンジュゲートされているか、またはこれを含む。
【０２０２】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して特異的である自己抗体に対して選択的である。一部の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して非特異的である自己抗体に結合する。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、標的自己抗体に結合し、０．０００１ｎＭ〜１μＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。例えば、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドのＫｄは、約１μＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０００５ｎＭ、またはさらに約０．０００１ｎＭであってもよい。
【０２０４】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、ヒトＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に特異的である。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、他の種由来のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体と交差反応性である。
【０２０５】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に対して選択的であり、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ３自己抗体に対してほとんどまたは全く結合性を示さない。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に結合するが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１および／または抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ３自己抗体に対しても結合性を示す。
【０２０６】
一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に対する結合優先性（例えば、親和性）は、一般的に、非特異的自己抗体（例えば、別の標的を対象とする自己抗体）に対して、少なくとも約２倍、約５倍、または少なくとも約１０、２０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、もしくは１０６倍である。
【０２０７】
当業者が精通する方法を使用して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体タンパク質またはペプチドがＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対して特異性および／または選択性を有するかどうかを決定するために、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体タンパク質またはペプチドを評価することも可能である。
【０２０８】
本明細書に記載されているＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドをコードする核酸が本明細書において提供される。本明細書に記載されているＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドをコードする核酸のいずれかを含むベクターも本明細書において提供される。
Ｄ．アルツハイマー病の検出
【０２０９】
アルツハイマー病に対する個体のスクリーニングにおいて使用するため、個体がアルツハイマー病を発症するリスクがあるかどうかを特定するのに使用するため、個体がアルツハイマー病を発症するかどうかの可能性を推定するのに使用するため、アルツハイマー病の診断に使用するため、アルツハイマー病の早期検出において使用するため、アルツハイマー病の予後において使用するため、アルツハイマー病薬もしくはレジメンによるアルツハイマー病処置に応答する可能性がある個体を選択するため、アルツハイマー病と診断されたものに対する処置選択／処置選択肢の決定において使用するため、アルツハイマー病と診断され、アルツハイマー病薬もしくはレジメンによる進行中の処置を受けているものの処置をモニタリングするのに使用するため、またはアルツハイマー病薬およびレジメンに対するスクリーニングに使用するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを決定するため）ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチド（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベルを決定するため）が本明細書において提供される。
【０２１０】
患者を別個の集団へと階層化するのに使用するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドも本明細書において提供される（抗または自己抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよび抗  自己抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭとも称されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体レベルを決定するため）。一実施形態では、これらの別個の集団は、アルツハイマー病の免疫療法に基づく処置に応答する可能性が低いかまたは全く有さないものに対して、アルツハイマー病の免疫療法に基づく処置に応答する可能性が高いものであってもよい。
【０２１１】
図１７は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよび抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体レベルを同時に測定することにより、患者血清中の総ＩｇＭによって正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭと総ＩｇＧによって正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧとの間の相関に基づく、アルツハイマー病を有するものの別個の亜集団への階層化が可能となることを実証する。
【０２１２】
これらの使用は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体のレベルが、アルツハイマー病を有する患者において変化するという観察に基づいて提供される（図１２Ａ〜１２Ｃ、図１３Ｂ、図１４Ａ〜１４Ｅ、および図１５Ａ〜１５Ｂ）。
【０２１３】
アルツハイマー病患者は、健康な、年齢を一致させた健康な対照よりも低いＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を示し、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度によって、アルツハイマー病を有する患者を健康な個体から有効に分離できることを示す（図１２Ａ）。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の血清濃度は、アルツハイマー病患者の特定に十分であったが、総ＩｇＧ（図１２Ｂ）または総タンパク質（図１２Ｃ）による血清試料の正規化を使用することによって、血清を得るために使用されるプロトコール、操作者の変化、患者の水分補給状態および患者の活動状態などの、全体の血清濃度を変える可能性がある変数にかかわらず、個体間の直接的な比較を可能とした。例えば、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２血清レベルは、健康な若齢個体に対して健康な老齢個体において上昇し、一方、アルツハイマー病を有する患者は、健康な老齢個体（６０歳を超える）に対して有意により低い、正規化したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の血清レベルを示したことが観察された（図１２Ｂ、１２Ｃ）。
【０２１４】
アルツハイマー病患者は、年齢を一致させた健康な対照と比較して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体のレベルの変化も示し、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ血清濃度（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ自己抗体の濃度）によって、アルツハイマー病を有する患者を健康な個体から有効に分離できることを示す。アルツハイマー病患者は、健康な、年齢を一致させた対照よりも高濃度の血清抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧを示した（図１３、１４Ａ〜Ｅ、１５Ａ、１５Ｂ）。ヒト血清中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＩｇＭレベルは、ビオチン化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２捕捉ペプチド（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド）、それに続く適当な二次抗体（ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体のいずれかを対象とする）を使用する間接的ＥＬＩＳＡ分析によって定量化した。３０〜４０歳（ｎ＝７）のまたは６０歳を超える（ｎ＝９）健康な個体、および６０歳を超える臨床的に診断されたアルツハイマー病を有する個体（ｎ＝１０）に由来する等しい体積の血清を分析した。
【０２１５】
図１３Ｂは、アルツハイマー病患者および年齢を一致させた対照における間接的ＥＬＩＳＡによって決定した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルの定量化を示す。各血清試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの濃度は、ＥＬＩＳＡ実験に含まれるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２特異的抗体の連続希釈で作成した標準曲線を使用して計算した。
【０２１６】
図１４Ｅは、アルツハイマー病（ＡＤの存在）患者および年齢を一致させた対照（ＡＤの非存在、神経学的対照）における間接的ＥＬＩＳＡによって決定した、生の正規化していない抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルの定量化を示す。
【０２１７】
図１５ＡおよびＢは、アルツハイマー病患者（ＡＤの存在）および年齢を一致させた対照（ＡＤの非存在、神経学的対照）における間接的な血清学的ＥＬＩＳＡによって決定した、正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルの定量化を示す。図１５Ｂは、診断特性が、異なる操作者および実験室設定にかかわらず変化しないことを実証した。
【０２１８】
例示的方法、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベル：より具体的には、一実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用して、アルツハイマー病に対して個体をスクリーニングするため、個体がアルツハイマー病を発症するリスクがあることを特定するため、個体がアルツハイマー病を発症するかどうかの可能性を推定するため、個体がアルツハイマー病を有するかどうかを決定するため、個体におけるアルツハイマー病の早期徴候を検出するため、および個体におけるアルツハイマー病の予後に使用するための、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の低下が、個体がアルツハイマー病を有するか、アルツハイマー病を発症するリスクがあるか、またはアルツハイマー病を発症するより大きな可能性を有することを示し、対照に対する濃度の上昇または濃度の変化がないことが、個体がアルツハイマー病を有さないか、アルツハイマー病を発症するリスクがないか、またはアルツハイマー病を発症するより大きな可能性を有さないことを示す場合がある方法が本明細書において提供される。対照として、これらに限定されないが、健康な対照（例えば、年齢を一致させた、性別を一致させた）、健康な対照を集めたものに相当する参照標準、または早期に単離された同一個体由来の対照試料が挙げられる。一部の実施形態では、循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度が決定される。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。一部の実施形態では、方法は、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあると決定された場合、個体をアルツハイマー病薬またはレジメンで処置するステップをさらに含む。
【０２１９】
方法を実践する一実施形態では、血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の５．６１ｎｍｏｌ／ｍｌ未満またはこれに等しい濃度は、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症する可能性があることを示す。一実施形態では、血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の５．６１ｎｍｏｌ／ｍｌ未満またはこれに等しい濃度は、個体がアルツハイマー病を有するか、または７８％の特異性、８０％の感度および３．６の陽性尤度比でアルツハイマー病を発症する可能性があることを示す。一実施形態では、これは、試験前の確率と比較して、アルツハイマー病の確率（試験後の確率）の２４％の増加を表す。試験後の確率は、以下の式：試験前オッズ×ＬＲ／（１＋試験前オッズ×ＬＲ）（式中、試験前オッズは、試験前の疾患の存在の臨床上の疑いである）に基づいて計算される。試験後の確率は、通常、Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒａｔｉｏ  ＮｏｍｏｇｒａｍまたはＦａｇａｎ  Ｎｏｍｏｇｒａｍ（NEJM  １９７５年；２９３巻：２５７頁）から計算される。
【０２２０】
方法を実践する別の実施形態では、血清中の総タンパク質に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の４．７６×１０−４未満またはこれに等しい比は、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症する可能性があることを示す。一実施形態では、血清中の総タンパク質に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の４．７６×１０−４未満またはこれに等しい濃度は、個体がアルツハイマー病を有するか、または７０％の特異性、９０％の感度および３．００の陽性尤度比でアルツハイマー病を発症する可能性があることを示す。一実施形態では、これは、試験前の確率と比較して、アルツハイマー病の確率の１４．８％の増加を表す。
【０２２１】
例示的方法、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベル：別の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを使用して、アルツハイマー病に対して個体をスクリーニングするため、個体がアルツハイマー病を発症するリスクがあることを特定するため、個体がアルツハイマー病を発症するかどうかの可能性を推定するため、個体がアルツハイマー病を有するかどうかを決定するため、個体におけるアルツハイマー病の早期徴候を検出するため、および個体におけるアルツハイマー病の予後に使用するための（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベル、例えば、ＩｇＧ自己抗体レベルまたはＩｇＭ自己抗体レベルを決定する）方法であって、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）ペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇が、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあることを示し、対照に対する濃度の低下または濃度の変化がないことが、個体がアルツハイマー病を有さないか、または発症するリスクがないことを示す場合がある方法が本明細書において提供される。対照として、これらに限定されないが、健康な対照（例えば、年齢を一致させた、性別を一致させた）、健康な対照を集めたものに相当する参照標準、または早期に単離された同一個体由来の対照試料を挙げることができる。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。一部の実施形態では、方法は、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがあると決定された場合、個体をアルツハイマー病薬またはレジメンで処置するステップをさらに含む。
【０２２２】
一実施形態では、血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体の９．６９ｕｇ／ｍｌ（総ＩｇＧレベルに対して正規化した）より高いまたはこれに等しい濃度は、個体がアルツハイマー病を有するか、または発症する可能性があることを示す。一実施形態では、血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体の９．６９ｕｇ／ｍｌより高いまたはこれに等しい濃度は、個体がアルツハイマー病を有するか、または８９％の特異性、６０％の感度および５．４の陽性尤度比でアルツハイマー病を発症する可能性があることを示す。一実施形態では、これは、試験前の確率と比較して、アルツハイマー病の確率の３０％の増加を表す。
【０２２３】
一部の実施形態では、ＩｇＧ自己抗体の血清濃度が、血清体積に対して正規化して８．２３ｕｇ／ｍｌより高いかまたはこれに等しい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、ＩｇＭ自己抗体の血清濃度が、血清体積に対して正規化して、４０９ｆＭｏｌ／ｍｌより高いかまたはこれに等しい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一部の実施形態では、総ＩｇＭ濃度に対するＩｇＭ自己抗体の濃度の比が、２６．６×１０−６より大きい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。一実施形態では、ＰＬＲ（ＬＲ＋）がＩｇＧ自己抗体に対して２．４もしくはこれより大きいか、またはＰＬＲ（ＬＲ＋）がＩｇＭ自己抗体に対して３．５もしくはこれより大きい場合、個体はアルツハイマー病を有するか、または発症するリスクがある。
【０２２４】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、観察研究において使用される。観察研究の例として、これらに限定されないが、（ａ）横断的研究（単一時点研究（single  time-point  design）または遅延断面（delayed  cross-sectional））−単一時点で採取した患者当たり１または数種の検体／試料についての試験、（ｂ）縦断的研究−長期間（例えば、数週間、数カ月、数年）にわたって採取した患者当たりの複数の検体／試料についての試験、（ｃ）遡及的研究−研究の開始に先立って、分析物のステータスおよび患者の臨床ステータスが知られている、以前に採取した検体（特徴付けられた検体）についての試験、（ｄ）前向き研究−分析物のステータスおよび患者の臨床ステータスの両方が研究中に確立されることを除き、研究前または研究中に採取した検体についての試験、ならびに（ｅ）前向き−遡及的研究−臨床ステータスが知られているが、分析物のステータスが知られておらず研究中に確立されることになる、以前に採取した検体についての試験が挙げられる。
【０２２５】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病の診断を意図するものであり、唯一の決定要因として、患者の臨床状態を決定し、検証し、または確認するために使用されてもよい。これらの実施形態では、この種の試験はまた、唯一の確認アッセイ（以前の試験結果を検証するため）および唯一の排除アッセイ（特定の条件を除外するため）を含む。
【０２２６】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病の「診断への助け（aid-to-diagnostic）」を提供することを意図し、患者の臨床ステータスの決定または検証を援助する追加情報を提供するために使用されてもよい。この試験は、必ずしも唯一の決定要因ではないが、患者の現在の状態を評価するために使用されてもよい。
【０２２７】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病のスクリーニングを意図するものであり、無症状の個体の疾患、障害、または他の生理学的状態のステータスを決定するために使用されてもよい。状態および標的患者集団の性質に応じて、スクリーニング方法は、日常的に使用されてもよく、または「リスクがある」患者に制限されてもよい。この文脈では、本明細書に記載されている方法は、患者の現在の状態を評価するために使用される。
【０２２８】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病の素質を決定することを意図し、本明細書に記載されている方法を使用して、症状が出る前の患者の疾患発生の可能性を決定してもよく（例えば、将来、疾患を発症するリスクを評価すること）、十分なリスクがある患者（試験結果によって決定される）に対しては、予防的介入がとられてもよい。
【０２２９】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病の予後を意図し、本明細書に記載されている方法を使用して、処置と無関係に、臨床帰結に関連する因子を測定してもよい。本明細書に記載されている方法を使用して、疾患の自然進行（例えば、処置がない場合の帰結）を推定してもよく、または本明細書に記載されている方法は、患者の将来の状態を評価するために設計される。
【０２３０】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、老齢集団の生理学的ステータス（「老化時計」）の決定を意図するものであり、本明細書に記載されている方法を使用して、老化についてのヒトの状態もしくは特徴、または老化に伴うアルツハイマー病のリスクを特定することを目的として、個体の生理学的状態を評価してもよい。
【０２３１】
関連する実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の定量化および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の定量化を使用して、アルツハイマー病のスクリーニング、診断、または検出の信頼度を増加させてもよい。
【０２３２】
関連する実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の定量化および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の定量化を、これらに限定されないが、Ａβ４２、Ｔ−ｔａｕ、ｐ−ｔａｕ、Ａβ４２／Ｔ−ｔａｕ比、およびＡβ４２／ｐ−ｔａｕの測定を含む他の脳脊髄液（ＣＳＦ）試験と併せて使用してもよい。
【０２３３】
関連する実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の定量化および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の定量化を、認知ステータス試験、例えば、ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）、ＧＤＳ（グローバル劣化率（ｇｌｏｂａｌ  ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ））、およびＣＤＲ（臨床的認知症尺度）試験の評価と併せて使用してもよい。
【０２３４】
関連する実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の定量化および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の定量化を、神経画像処理と併せて使用してもよい。
【０２３５】
本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のレベルは、生体試料中の総ＩｇＧに対して正規化されるか、または生体試料中の総タンパク質に対して正規化されてもよい。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度は、メチル化されていない、標識された、合成Ｈ１．０ペプチドに対する相対比として決定されてもよい。
【０２３６】
本明細書に記載されている方法の実施形態では、個体は５０歳を超えている。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は５０歳未満である。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は少なくとも５０歳であるか、少なくとも５５歳であるか、少なくとも６０歳であるか、少なくとも６５歳であるか、少なくとも７０歳であるか、少なくとも７５歳であるか、または少なくとも８０歳である。例示的実施形態では、個体は少なくとも６０歳である。
Ｅ．アルツハイマー病のコンパニオン診断
【０２３７】
アルツハイマー病薬もしくはレジメンによるアルツハイマー病処置に応答する可能性がある個体を選択するための方法において使用するため、アルツハイマー病と診断されたものに対する処置選択／処置選択肢の決定において使用するため、アルツハイマー病と診断され、アルツハイマー病薬もしくはレジメンによる進行中の処置を受けているものの処置のモニタリングにおいて使用するため、またはアルツハイマー病薬およびレジメンに対するスクリーニングにおいて使用するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを決定するため）ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチド（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体のレベル、例えば、ＩｇＧ自己抗体のレベルまたはＩｇＭ自己抗体のレベルを決定するため）も本明細書において提供される。
【０２３８】
これらの実施形態では、これらのアルツハイマー病薬およびレジメン／処置として、これらに限定されないが、ＡＰＰ合成阻害剤、ベータ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター、Ａβ凝集阻害剤、Ａβ免疫療法、コレステロール降下薬、抗タウ薬、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、非定型抗精神病薬、タンパク質のＳ−ニトロシル化のブロッカー、グルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト、ラパマイシン、ラパログ、内在性カンナビノイド、カンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤、抗炎症薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモン、ホルモン調節剤、スタチン、インスリン、インスリン担体、多機能ナノキャリア、ビタミン、栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、または超音波療法による処置が挙げられる。より具体的には、ＡＰＰ合成阻害剤（＋フェンセリン）、ベータ−セクレターゼ阻害剤（ＭＫ−８９３１、Ｅ２６０９、ＬＹ２８１１３７６、ＬＹ２８８６７２１、ＰＦ−０５２９７９０９）、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター（セマガセスタットＬＹ４５０１３９、アバガセスタットＢＭＳ−７０８１６３、ＰＦ−３０８４０１４、ＥＬＮＤ００６、タレンフルルビル、ＣＨＦ５０７４）、Ａβ凝集阻害剤（トラミプロセート（３ＡＰＳ）、クリオキノール（ＰＢＴ１）、ＰＢＴ２、ＥＬＮＤ００５（ｓｃｙｌｌｏ−イノシトール）、ＰＱ９１２）、Ａβ免疫療法（ＧＳＫ９３３７７６、ＡＮ１８０２＋ＱＳ２１、ＡＣＣ−００１、アルツハイマー病−１０６、バピネオズマブ、ソラネズマブ、ガンテネルマブ（ＲＯ４９０９８３２）、ポネズマブ（ＰＦ−０４３６０３６５）、ＭＡＢＴ５１０２Ａ（クレネズマブ）、ＢＡＮ２４０１、静注用免疫グロブリン、ガンテネルマブ（Ｒ１４５０またはＲＯ４９０９８３２））、抗タウ薬（リチウム、タイドグルーシブ（ＮＰ０３１１１２）、ＬＭＴＸ（メチレンブルー））、コリンエステラーゼ阻害剤（Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）、およびＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル））、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト（Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標）およびＮａｍｚａｒｉｃ（登録商標）、Ｎａｍｅｎｄａ（登録商標）とドネペジルの組合せ）、非定型抗精神病薬（オランザピン、クエチアピン、リスペリドン）、タンパク質のＳ−ニトロシル化のブロッカー、グルカゴン様ペプチド１受容体のアゴニスト、ラパマイシンおよびラパログ、内在性カンナビノイドおよびカンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤（ビタミンＥ、ビタミンＣ、α−リポ酸、コエンザイムＱ）、抗炎症分子および薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモンおよびホルモン調節剤、スタチン、インスリンおよび鼻腔内インスリン、長時間作用型インスリンおよびサリドマイドを含むインスリン担体、ラミプリル、レスベラトロール、多機能ナノキャリア、ビタミンおよび栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、なら��に超音波療法。一部の実施形態では、アルツハイマー病薬およびレジメンは、ＦＤＡ承認が未決定であり、米国食品医薬品局のワールドワイドウェブアドレスで入手できる薬物承認のためのＦＤＡ登録臨床試験のリストから選択される。
【０２３９】
例示的方法、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベル：一実施形態では、アルツハイマー病と診断され、進行中の処置を受けている個体が、進行中の処置から利益を得るかまたは利益を得続けるかどうかを決定するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用する方法であって、（ａ）進行中の処置を受けている個体由来の生体試料を準備するステップと、（ｂ）生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｃ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を決定するステップと、（ｄ）処置から利益を得るかまたは利益を得続ける個体を選択するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇が、個体が処置から利益を得るかまたは利益を得続けることを示し、対照に対する濃度の低下または濃度の変化がないことが、個体が処置から利益を得る傾向にないかもしくは利益を受け続けないか、または処置に応答性でないことを示す場合がある方法が本明細書において提供される。対照として、これらに限定されないが、アルツハイマー病を有し処置を受けていない個体由来の試料、または処置開始に先立って早期に単離された同一個体由来の対照試料が挙げられる。一部の実施形態では、循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度が決定される。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２４０】
アルツハイマー病と診断された個体に対する処置選択において使用するため、アルツハイマー病と診断された個体に対する処置選択肢を決定するため、およびどの個体が特定の処置から利益を得る可能性があるのかを決定するための、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用する方法も本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、（ａ）個体がアルツハイマー病に対して処置される前に、個体由来の生体試料を準備するステップと、（ｂ）生体試料を候補処置と接触させるステップと、（ｃ）生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｄ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度および／または細胞内局在を決定するステップと、（ｅ）処置から利益を得る可能性がある個体を選択するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇、または細胞質への細胞内局在の低下は、個体が処置から利益を得る可能性があることを示し、対照に対する濃度の低下もしくは濃度の変化がないこと、または細胞質への細胞内局在の増加もしくは細胞内局在の変化がないことは、個体が処置から利益を得ないことを示す場合がある。別の実施形態では、方法は、（ａ）個体に候補処置を投与するステップと、（ｂ）処置の投与後に、個体由来の生体試料を準備するステップと、（ｃ）生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｄ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度および／または細胞内局在を決定するステップと、（ｅ）処置から利益を得る可能性がある個体を選択するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇、または細胞質への細胞内局在の低下は、個体が処置から利益を得る可能性があることを示し、対照に対する濃度の低下もしくは濃度の変化がないこと、または細胞質への細胞内局在の増加もしくは細胞内局在の変化がないことは、個体が処置から利益を得ないことを示す場合がある。対照として、これらに限定されないが、健康な個体由来の試料、または生体試料をプラセボ処置と接触させることを含むことができる。一部の実施形態では、循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度が決定される。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２４１】
例示的方法、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベル：別の実施形態では、アルツハイマー病と診断され、進行中の処置を受けている個体が、進行中の処置から利益を得るかまたは利益を得続けるかどうかを決定するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを使用する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料を準備するステップと、（ｂ）生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｃ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｄ）処置から利益を得るかまたは利益を得続ける個体を選択するステップとを含み、対照に対する自己抗体の濃度の低下が、個体が処置から利益を得るかまたは利益を得続けることを示し、対照に対する自己抗体の濃度の変化がないことまたは濃度の上昇が、個体が処置から利益を得ないかまたは利益をもはや得続けないことを示す可能性がある方法が本明細書において提供される。対照として、これらに限定されないが、アルツハイマー病を有し処置を受けていない個体由来の試料、または処置開始に先立って早期に単離された同一個体由来の対照試料が挙げられる。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。一部の実施形態では、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される。
【０２４２】
アルツハイマー病と診断された個体に対する処置選択において使用するため、アルツハイマー病と診断された個体に対する処置選択肢を決定するため、および個体が特定の処置から利益を得る可能性があるかどうかを決定するための、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを使用する方法も本明細書において提供される。一実施形態では、方法は、（ａ）個体に候補処置を投与するステップと、（ｂ）投与後に、個体由来の生体試料を準備するステップと、（ｃ）試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｄ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中の自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｅ）処置から利益を得る可能性がある個体を選択するステップとを含んでもよく、対照に対する自己抗体の濃度の低下は、個体が特定の処置から利益を得ることを示し、対照に対する自己抗体の濃度の変化がないことまたは濃度の上昇は、個体が特定の処置から利益を得ないことを示す可能性がある。参照対照として、これらに限定されないが、健康な個体由来の試料、または生体試料をプラセボ処置と接触させることを挙げることができる。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。一部の実施形態では、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される。一部の実施形態では、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体の濃度が決定される。
【０２４３】
アルツハイマー病患者を別個の群：任意のタイプのアルツハイマー病処置に応答する傾向にある１つの群と任意のタイプのアルツハイマー病処置に応答しない傾向にある１つの群（おそらく、より限定的である）へと階層化するのに使用するための、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを使用する方法も本明細書において提供される。一実施形態では、任意のタイプのアルツハイマー病処置に応答する傾向にある群は、アルツハイマー病に対する免疫療法および非免疫療法に基づく処置の両方に応答する場合がある。一実施形態では、任意のタイプのただのアルツハイマー病処置に応答する傾向にない群は、アルツハイマー病に対する非免疫療法に基づく処置にのみ応答する場合がある。一部の実施形態では、本明細書において提供される場合、このような階層化は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体の濃度と抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ抗体の濃度の比を計算するおよび／またはこれらを相互に関連付けて、統計モデルにフィットさせることによって行ってもよい。このような方法は、アルツハイマー病と診断された個体に対し、および個体が特定の処置から利益を得る可能性があるかどうかを決定するために、実行可能な処置の選択肢を提供することができる。一実施形態では、方法は、（ａ）個体由来の生体試料を準備するステップと、（ｂ）試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｃ）タンパク質またはペプチドに結合する試料中のＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｄ）アルツハイマー病に対する免疫療法に基づく処置から利益を得る可能性がある個体を選択するステップとを含んでもよい。
【０２４４】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベルが、生理学的レベル内または確立された治療薬の範囲内にあることを保証するのに有用である。
【０２４５】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病のモニタリングに有用であり、記載されている方法を使用して、必要に応じて処置／介入を調整することを目的として、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベルを測定してもよい。関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、このような処置を受けている個体における、アルツハイマー病薬もしくは栄養レジメンの効果または生活様式の調整をモニタリングするのに有用である。
【０２４６】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病に対する任意の観察または介入臨床研究における臨床成績をモニタリングするのに有用であり、（ａ）観察研究は、研究中に得られた試験結果が患者の管理に使用されず、処置の決定に影響を与えない研究であり、（ｂ）介入研究は、研究中に得られた試験結果が患者の管理の決定に影響を及ぼしてもよく、処置を導くのに使用されてもよい研究である。
【０２４７】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、一連の測定に有用であり、それによって、多数の決定が経時的に得られる。これらのタイプのモニタリング方法を、疾患進行／退行の検出／評価、疾患の再発、最小残存疾患、処置への応答／抵抗性、および／または処置による有害作用に対して使用してもよい。これらのタイプのモニタリング方法は、個体の状態の変化を評価するために設計してもよい。
【０２４８】
関連する実施形態では、本明細書において提供される方法は、アルツハイマー病処置への応答または反応の予測に有用であり、本明細書に記載されている方法を使用して、特定の療法に対する患者の応答または有害反応の可能性を決定する因子を測定してもよい。特にコンパニオン診断として使用するために設計された予測方法が本明細書に記載されている。
【０２４９】
本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のレベルは、生体試料における総ＩｇＧに対して正規化してもよく、または生体試料における総タンパク質に対して正規化してもよい。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度は、メチル化されていない、標識された、合成Ｈ１．０ペプチドに対する相対比として決定されてもよい。
【０２５０】
本明細書に記載されている方法の実施形態では、個体は５０歳を超えている。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は５０歳未満である。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は少なくとも５０歳であるか、少なくとも５５歳であるか、少なくとも６０歳であるか、少なくとも６５歳であるか、少なくとも７０歳であるか、少なくとも７５歳であるか、または少なくとも８０歳である。例示的実施形態では、個体は少なくとも６０歳である。
【０２５１】
関連する実施形態では、方法は、新たなアルツハイマー病薬およびレジメンに対するスクリーニングに使用されてもよい。
Ｆ．老化の検出
【０２５２】
老化を検出するのに使用するための、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドが本明細書において提供される。本明細書において提供される場合、老化は、複製老化（ＲＥＰ−ＳＥＮ）、遺伝毒性ストレスに誘導される老化および放射線に誘導される老化に関連する。
【０２５３】
一般的に、老化の検出のための方法は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出を含む。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、生体試料が老化細胞を含むことを示す。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）ペプチドに結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、生体試料が老化細胞を含むことを示す。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２５４】
一部の実施形態では、方法は、遺伝毒性物質によって誘導される老化を経験した個体を特定するために使用されてもよい。一部の実施形態では、遺伝毒性ストレスに誘導される老化は、個体のＤＮＡ損傷剤、薬物または毒素、例えば、放射線、ＵＶ光、ブレオマイシンおよび、これらに限定されないが、トラゾドン、Ｅｔｏｔｉｆｅｎ、セファレキシン、ニソルジピン（Nisoldipme）、ＣＧＳ  １５９４３、クロトリマゾール、５−ノニルトリプタミン、ドキセピン、ペルゴリド、パロキセチン、レスベラトロール、ケルセチン、ホノキオール、７−ニトロインダゾール、メゲストロール、フルボキサミン、エトポシド、ベリパリブ、ルカパリブ、オラパリブ、カンプトテシン、またはテルビナフィンを含む任意の他の遺伝毒性薬および一般的な化学療法薬への曝露の結果である。
【０２５５】
一部の実施形態では、方法は、化学療法が有効であることを保証するために、化学療法処置を受けている個体における老化を特定するのに有用である。これらの実施形態における化学療法剤は、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、アリトレチノイン（Ｐａｎｒｅｔｉｎ）、アロプリノール（Ｚｙｌｏｐｒｉｍ）、アルトレタミン、（Ｈｅｘａｌｅｎ）、アミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ）、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）、亜ヒ酸（Ｔｒｉｓｅｎｏｘ）、アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）、ＢＣＧ  Ｌｉｖｅ（ＴＩＣＥ  ＢＣＧ）、ベキサロテン（Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）、静脈内ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ）、経口ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）、カルステロン（Ｍｅｔｈｏｓａｒｂ）、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ）、テール（Ｓｃｌｅｒｏｓｏｌ）、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）、テニポシド、ＶＭ−２６（Ｖｕｍｏｎ）、テストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）、チオグアニン、６−ＴＧ（Ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）、およびトポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）からなる群から選択されてもよい。
Ｇ．ＤＮＡ損傷の検出
【０２５６】
ＤＮＡ損傷、例えば、急性ＤＮＡ損傷を検出するのに使用するための、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドが本明細書において提供される。
【０２５７】
一般的に、ＤＮＡ損傷の検出のための方法は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出を含む。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、生体試料がＤＮＡ損傷を受けたことを示す。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）ペプチドに結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、生体試料がＤＮＡ損傷を受けたことを示す。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２５８】
一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷は、細胞または個体のＤＮＡ損傷剤、薬物または毒素、例えば、放射線、ブレオマイシンまたは他のＤＮＡ損傷剤（例えば、上記された化学療法薬）への曝露の結果である。
【０２５９】
一部の実施形態では、方法は、遺伝毒性物質またはＤＮＡ損傷剤へのこのような曝露から５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、２４時間、４８時間、３日、４日、または最長５日以内にＤＮＡ損傷を決定するのに有用である。
【０２６０】
一部の実施形態では、ＤＮＡ損傷の検出のためのポータブルな装置が本明細書において提供される。装置は、試料採取装置、読み取り機、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含むアッセイモジュールを含むことができる。装置は、試料採取装置、読み取り機、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを含むアッセイモジュールも含むことができる。
Ｈ．放射線曝露の検出
【０２６１】
放射線曝露を検出するのに使用するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドが本明細書において提供される。
【０２６２】
一般的に、放射線曝露の検出のための方法は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出を含む。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、放射線曝露が生じたことを示す。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）ペプチドに結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、放射線曝露が生じたことを示す。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。例示的な一実施形態では、７ＧｙのＸ線曝露の後の２時間後のＨ１．０Ｋ１７０ｍｅ２抗原の濃度の変化は、１２ｕｍｏｌ／Ｌから２１ｕｍｏｌ／Ｌまで、４８時間後では２６ｕｍｏｌ／Ｌから３５ｕｍｏｌ／Ｌまでである。
【０２６３】
一部の実施形態では、方法は、このような曝露から５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、２４時間、４８時間、３日、４日、または最長５日以内に放射線曝露を決定するのに有用である。
【０２６４】
一部の実施形態では、方法は、野外の状況下、例えば戦闘区域で、軍人が、このような曝露を決定するのに有用である。
【０２６５】
一部の実施形態では、放射線損傷の検出のためのポータブルな装置が本明細書において提供される。装置は、試料採取装置、読み取り機、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含むアッセイモジュールを含むことができる。装置は、試料採取装置、読み取り機、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを含むアッセイモジュールも含むことができる。
Ｉ．Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２およびラパログ
【０２６６】
ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）は、有望な治療標的として出現した。ラパマイシンおよびいくつかのラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、および他のｍＴＯＲ阻害剤は、ある特定の疾患状態の処置のためにＦＤＡに承認された薬物である。
【０２６７】
本発明者らは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の検出が、「ラパログ」と総称されるラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体、および他のｍＴＯＲ阻害剤に対する個体の応答性のスクリーニングに有用である可能性があり、ラパログをベースとする治療レジメンをモニタリングするのに有用である可能性があることを見出した。本発明者らは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の検出が、薬物スクリーニングを目的として、追加のラパログのスクリーニングに有用である可能性があることも見出した。具体的には、ラパマイシン誘導体および免疫抑制剤、エベロリムスは、ＤＮＡ損傷の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現をブロックすることが、ここで示される（図１８）。遺伝毒性ストレスへの曝露に先立つ、またはそれと並行したラパログによる処置が、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度および／または細胞内局在の変化によって証明されるように、遺伝毒性ストレス要因の作用を低減させる可能性があることも観察された。
【０２６８】
本明細書で使用する場合、ラパログは、ＦＤＡに承認されたラパログおよび現在臨床試験が進行中のラパログを含む。ＦＤＡに承認されたラパログとして、ラパマイシン、シロリムス、ラパミューン、エベロリムス、ＲＡＤ００１、アフィニトール、Ｚｏｒｔｒｅｓｓ、テムシロリムス、ＣＣＩ−７７９、トーリセル、リダフォロリムス、ＡＰ２３５７３、ＭＫ−８６６９、デフォロリムス、ゾタロリムス、およびＡＢＴ−５７８が挙げられる。他のラパログとして、ＡＺＤ８０５５、ＡＺＤ２０１４、ＯＳＩ−０２７、ＭＬＮ０１２８、ＷＹＥ−１３２、Ｔｏｒｉｎ１、ＰＩ−１０３、Ｐ７１７０、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７、ＧＮＥ４７７、ＰＫＩ−１８０、ＷＪＤ００８、ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＢＧＴ２２６、ＳＦ１１２６、ＧＳＫ２１２６４５８、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＹＥ−３５４、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、ＰＦ−０５２１２３８４、ＸＬ７６５、Ｔｏｒｉｎ  ２、ＷＹＥ−１２５１３２、およびＯＳＩ−０２７が挙げられる。
【０２６９】
一般的に、がん、免疫不全、糖尿病、関節炎、アルツハイマー病および他の神経変性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、および他の年齢に関連する病理と診断された個体において進行中のラパログベースの処置の効果をモニタリングするための方法が本明細書において提供される。
【０２７０】
したがって、一実施形態では、ラパログによる処置を受けている個体がこのような処置に応答性であるかどうかを決定する方法であって、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度および／または局在を決定するステップと、（ｃ）個体が処置に応答性であるかどうかを決定するステップとを含み、対照に対する確立された濃度の低下または局在の変化が、個体がラパログに応答性であることを示す方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の細胞外濃度の上昇が存在する場合、ラパログによる処置は有効でないか、または修正される必要があることが決定される。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の細胞質局在の増加が存在する場合、ラパログによる処置は有効でないか、または修正される必要があることが決定される。一部の実施形態では、低下は、ラパログが投与されている関連疾患と診断されていない、年齢を一致させた対照に対するものである。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質の細胞外または細胞質濃度の低下が存在する場合、処置は有効であり、継続されるべきであることが決定される。一部の実施形態では、方法は、処置のタイプ、過程、期間、および／または投薬量を修正する情報を使用するステップをさらに含む。一部の実施形態では、循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度が決定される。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２７１】
同様に、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する自己抗体が測定に使用される場合、方法は、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）タンパク質またはペプチドに結合する自己抗体の濃度を決定するステップと、（ｃ）個体が処置に応答性であるかどうかを決定するステップとを含み、対照に対する自己抗体の濃度の変化が、個体がラパログに応答性であることを示す。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の濃度の変化が存在しない場合、ラパログによる処置は有効でないか、または修正される必要があることが決定される。一部の実施形態では、低下は、ラパログが投与されている関連疾患と診断されていない、年齢を一致させた対照に対するものである。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の濃度の変化が存在する場合、処置は有効であり、継続されるべきであることが決定される。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２７２】
一部の実施形態では、がん、免疫不全、糖尿病、アルツハイマー病または他の神経変性疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、関節炎、および他の年齢に関連する病理と診断されたか、またはこれらを有する疑いがあり、ラパログによる処置から利益を得る可能性がある個体を選択するため、すなわち、個体がラパログによる処置に応答する可能性があるかどうかを決定するための方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、この方法は、個体由来の生体試料を準備するステップと、試料を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、切片培養で、または組織培養で、ラパログにより処置するステップと、試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度および／または細胞内局在を決定するステップとを含む。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用して試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を測定することによって決定される。一部の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度は、試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の濃度を測定することによって決定される。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の細胞質内または細胞外濃度の上昇が存在する場合、ラパログによる処置が有効でない可能性があることが決定される。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の細胞質内局在の増加が存在する場合、ラパログによる処置が有効でない可能性があることが決定される。一部の実施形態では、低下は、個体がラパログによる処置を受ける可能性がある疾患と診断されていない、年齢を一致させた対照に対するものである。一部の実施形態では、対照に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質の細胞質内または細胞外濃度の低下が存在する場合、処置は有効である可能性があることが決定される。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
【０２７３】
一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、処置のタイプ、過程、期間、および／または投薬量を修正する情報を使用するステップをさらに含む。
【０２７４】
他の実施形態では、特定される新たなラパログの能力をモニターするためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の検出の使用（薬物スクリーニング用途）が本明細書において提供される。
Ｊ．生物学的老化の検出
【０２７５】
生物学的老化を検出するのに使用するためのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドが本明細書において提供される。本明細書において提供される場合、老化はほとんどの生物の基本的性質であるため、生物学的老化マーカーまたは老化のバイオマーカーは、生物学的調査において多くの用途を見出すことが期待される。
【０２７６】
暦年齢と生物学的年齢の間に差が存在しうる。一部の個体はより急速に老化するが、他の個体は、良い習慣、遺伝子および／または環境ストレス要因の欠如により、よりゆっくり老化し、より長く健康かつ「若々しく」する。その生物学的年齢を追跡することができることにより、生活様式を修正するのに役立つか（肥満度指数を追跡することに類似する）、またはアンチエイジングの手順を展開するのに役立つ場合がある。
【０２７７】
老化マーカーによる生物学的年齢の正確な測定は、（ｉ）種々の年齢に関連する疾患を診断すること、およびがんのサブタイプを定義するために、（ｉｉ）種々の疾患の発生を予測すること／予見すること、ならびに（ｉｉｉ）若返りのアプローチを含む治療介入を評価するための代用マーカーとしての役割を果たすことなどの、生物学的老化についての年齢に関連する疾患の理論を試験するのに有用である。
【０２７８】
一般的に、生物学的老化の検出のための方法は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出を含む。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の直接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体と接触させるステップと、（ｂ）抗体に結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、生体試料が生物学的老化を経験した個体に由来することを示す。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の間接的検出として、方法は、一般的に、（ａ）個体由来の生体試料をＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドと接触させるステップと、（ｂ）ペプチドに結合する試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度を決定するステップとを含み、対照に対する濃度の上昇は、生体試料が生物学的老化を経験した個体に由来することを示す。一部の実施形態では、濃度の変化は、最適な特異性および感度に対する受診者動作特性曲線分析によって確立された閾値に対するものである。
Ｋ．診断キットおよび製品
【０２７９】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の検出に有用なキットが本明細書において提供される。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されている１種または複数のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、抗体またはペプチドは、標識されている。さらに、キットは、本明細書に記載されている方法のいずれかを実行するための説明材料を任意選択で含むことができる。説明材料は、典型的には、書面または印刷材料を含むが、このようなものに限定されない。このような説明書を保存し、これらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が本明細書において企図される。このような媒体として、これらに限定されないが、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられる。このような媒体は、このような説明材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含むことができる。
【０２８０】
キットは、キットが設計される特定の適用を容易にするために、さらなる構成成分を含む場合もある。したがって、例えば、キットが標識されている抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含有する場合、キットは、標識を検出するための試薬（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適当な二次標識など）をさらに含有してもよい。キットは、特定の方法の実践のために日常的に使用される緩衝液および他の試薬をさらに含んでもよい。
【０２８１】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に加えて、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を検出するためのイムノアッセイにおいて有用な例示的キットは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを含んでもよい。このペプチドは、例えば、陽性対照としてまたは競合イムノアッセイの競合者として用いられてもよく、実行されるアッセイのフォーマットに応じて、標識されてもされなくてもよい。
【０２８２】
抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドに加えて、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を検出するためのイムノアッセイにおいて有用な別の例示的キットは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含むことになる。この抗体は、例えば、陽性対照としてまたは競合イムノアッセイの競合者として用いられてもよく、実行されるアッセイのフォーマットに応じて、標識されてもされなくてもよい。
【０２８３】
皮下組織の標的Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびペプチドの濃度を測定するための経皮吸収パッチであって、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含む基質、および複数のマイクロニードルを含む経皮吸収パッチが本明細書において提供される。別の実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の濃度を測定するための経皮吸収パッチであって、基質、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の検出に特異的なＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２結合タンパク質またはペプチドを含む経皮吸収パッチが本明細書において提供される。一部の実施形態では、パッチは、経皮マイクロニードルアレイパッチである。一部の実施形態では、パッチの基質は、弾性的に伸縮可能である。一部の実施形態では、本明細書において提供される抗体またはペプチドを含むパッチ、および任意選択で、使用説明書を含むキットが本明細書において提供される。一部の実施形態では、パッチは、複製老化、ＤＮＡ損傷、遺伝毒性ストレス、放射線曝露、およびアルツハイマー病を検出することを目的として、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を検出し、その濃度を測定するのに有用であるか、または生体試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を検出し、その濃度を測定するのに有用であり、治療レジメンをモニタリングするのに有用であり、薬物スクリーニングに有用である。
【０２８４】
検出、例えば、ＤＮＡ損傷または放射線曝露の検出のためのポータブルな装置も本明細書において提供される。装置は、試料採取装置、読み取り機、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を含むアッセイモジュールを含んでもよい。装置は、試料採取装置、読み取り機、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドを含むアッセイモジュールも含んでもよい。
【０２８５】
分析物のラテラルフローアッセイに適するラテラルフロー片または試験片であって、試料受容ゾーンを含み、試料受容ゾーンが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体または抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２結合ペプチドのいずれかを含むラテラルフロー片または試験片も本明細書において提供される。一部の実施形態では、抗体またはペプチドは標識を含む。
ＩＶ．治療薬
Ａ．メチル化Ｈ１．０関連疾患および状態の処置
【０２８６】
メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態の処置のための、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドが本明細書において提供される。
【０２８７】
本明細書で使用する場合、「メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態」は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のレベルの上昇、Ｋ１８０のＨ１．０タンパク質／ペプチド基質の内因性ジメチル化の増加、クロマチンからのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の放出の増加、核から細胞質へのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の放出の増加、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の細胞質内沈着の増加、細胞外スペースにおけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のレベルの上昇、体液（例えば、血清、尿、唾液、脳脊髄液など）中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の循環レベルの上昇、および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に特異的な自己抗体のレベルの上昇が存在するものである。
【０２８８】
メチル化Ｈ１．０関連疾患および状態として、これらに限定されないが、老化細胞の増加が伴う、年齢に関連する病理、アルツハイマー病、放射線曝露、遺伝毒性ストレス要因への曝露、外部および内部ストレス要因に関連する老化細胞の蓄積を含む状態、ならびにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する高レベルの自己抗体に関連する疾患および状態の自己免疫群が挙げられる。
【０２８９】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に結合して取り除くことによって、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を処置する方法であって、個体に治療有効量の治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。
【０２９０】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に結合して取り除くために、個体のメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を処置する方法であって、個体に治療有効量の治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質または治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。
【０２９１】
本明細書で使用する場合、個体は、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園の動物、スポーツ用動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどを含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。個体は、雄または雌でありうる。
【０２９２】
本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は５０歳を超えている。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は５０歳未満である。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態では、個体は少なくとも５０歳であるか、少なくとも５５歳であるか、少なくとも６０歳であるか、少なくとも６５歳であるか、少なくとも７０歳であるか、少なくとも７５歳であるか、または少なくとも８０歳である。例示的実施形態では、個体は少なくとも６０歳である。
【０２９３】
老化の間のメチル化Ｈ１．０関連疾患および状態により具体的に目を向けると、ヒトの脳組織における細胞質内Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の蓄積の増加がある  図１１Ｂ。これらの観察は、血清学試験で観察された循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の年齢に関連する増加と相関する（図１１Ｃ）。
【０２９４】
しかし、アルツハイマー病と診断された個体において、対照集団（アルツハイマー病の病理がない）を参照対照（診断されたアルツハイマー病患者）と比較すると（図１２Ａ〜１２Ｃ）、血清学的ＥＬＩＳＡ試験で観察されたＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の循環レベルの降下が存在する（図１１Ｃ）。
【０２９５】
病理を有さない年齢を一致させた個体と比較した場合、アルツハイマー病群におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の循環レベルのこの降下には、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに対するＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体のレベルの上昇が伴う（図１３Ｂ、１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｅ、１５Ａ、１６Ａ、１６Ｂ）。
【０２９６】
したがって、アルツハイマー病の文脈では、治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体（例えば、細胞透過性抗体または細胞除去抗体）による処置が提供される。
【０２９７】
さらに、年齢を一致させた対照と比較した場合、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に応答して生じた天然に存在する血清ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体は、アルツハイマー病を有する個体で増加し（図１３Ｂ、１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｅ、１５Ａ、１６Ａ、１６Ｂ）、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を発現する細胞を攻撃および破壊するという意味で、有害である可能性がある。したがって、この文脈では、タンパク質またはペプチドに結合する（中和する）治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体による処置が提供される。
【０２９８】
ＤＮＡ損傷剤の文脈では、Ｈ１．０Ｋ１８０のジメチル化（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２）は、化学療法剤であるブレオマイシンによる急性のＤＮＡ損傷後にクロマチンで観察される（図７Ａ）。したがって、この文脈では、治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体（例えば、細胞透過性抗体または細胞除去抗体）による処置が提供される。さらに、Ｈ１．０タンパク質のジメチル化におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の増加に応答して生じた天然に存在する自己抗体は、タンパク質またはペプチドに結合する（中和する）治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体による処置にとっての標的となる。
【０２９９】
遺伝毒性ストレスの文脈では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は、遺伝毒性ストレスに誘導される老化に際して（ＤＮＡ損傷剤による処置の数日後）クロマチンから放出され（図９Ａ）、細胞から細胞外スペースへと分泌される（図９Ｂ）。したがって、この文脈では、治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体による処置が提供される。さらに、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の増加に応答して生じる天然に存在する自己抗体は、タンパク質またはペプチドに結合する（中和する）治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体による処置にとっての標的となる。
【０３００】
放射線曝露の文脈では、イオン化放射線への曝露は、血清中の循環Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のレベルの上昇を誘導する（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。したがって、この文脈では、治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体による処置が提供される。さらに、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の増加に応答して生じる天然に存在する自己抗体は、タンパク質またはペプチドに結合する（中和する）治療有効量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体による処置にとっての標的となる。
【０３０１】
一部の実施形態では、処置される個体が、メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態に実際に苦しんでいるかどうかを決定するための診断方法が実行される。メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態を示すＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の存在、局在、クロマチン画分、細胞質内蓄積、血清レベル、自己抗体レベルについて試験するアッセイは、処置に先立って実行されてもよい。
Ｂ．治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体
【０３０２】
上記セクション（ＩＩ）（Ａ）において議論されたように、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープを認識し、これに特異的に結合し、治療のために使用されてもよい抗体が本明細書において提供される。
【０３０３】
ジメチル化Ｋ１８０抗原を認識するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に加えて、一部の実施形態では、治療用抗体は、抗イディオタイプ抗体である。このようなイディオタイプ抗体は、アルツハイマー病を有する患者の疾患関連ＩｇＧ自己抗体もしくは疾患関連ＩｇＭ自己抗体、または他のメチル化Ｈ１．０関連疾患もしくは状態を認識する。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩｇＭ（ＩＶＩｇＭ）はアルツハイマー病患者ドナーの血漿から生じ、アルツハイマー病に対する予防的治療またはワクチン接種として使用されてもよい。このようなＩＶＩｇＭは、患者の疾患関連自己抗体を認識する抗イディオタイプ抗体を含有してもよい。したがって、一部の実施形態では、ＩＶＩｇＭは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧおよび／またはＩｇＭ自己抗体を不活性化する可能性があるイディオタイプ抗体を有することができる。
【０３０４】
本明細書において提供される治療用抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンタイプのものであってもよく、またはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＭに対する抗イディオタイプ抗体であってもよい。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧサブタイプのものであり、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体であってもよい。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＭサブタイプのものである。
【０３０５】
本明細書において提供される抗体は、様々な目的で、例えば、これらに限定されないが、検出、可視化、定量化、選別、治療において使用するため、およびその治療用途に関連する生物学的アッセイにおいて使用するためにさらにコンジュゲートされていてもよい。
【０３０６】
一部の実施形態では、治療用抗体は中和抗体であり、抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の１種または複数の生物学的活性を中和する。例えば、抗体は、細胞外Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に結合し、それが有する可能性がある任意の結合性またはシグナル伝達活性を中和することができる。一部の実施形態では、抗体は、細胞または試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を取り除くか、またはブロックする場合がある。一部の実施形態では、抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含む細胞を取り除く場合がある。
【０３０７】
一部の実施形態では、治療用抗体は、老化細胞を取り除く場合がある。一部の実施形態では、抗体は、アルツハイマー病の症状を生じさせる細胞／組織またはタンパク質産物を取り除く場合がある。一部の実施形態では、抗体は、放射線による損傷、ＤＮＡ損傷剤、および他の遺伝毒性物質によって損傷した細胞を取り除く場合がある。一部の実施形態では、抗体は、細胞透過性抗体である。他の実施形態では、罹患細胞の膜が含まれ、本明細書において提供される治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の侵入が可能である。
【０３０８】
一部の実施形態では、本明細書において提供される治療用抗体は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）活性を有する。細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、または単球を含む、その細胞表面にＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲまたはＦＣＧＲ）を有するエフェクター細胞は、標的細胞に結合した抗体のＦｃ領域を認識し、結合する。このような結合は、細胞死を導く細胞内シグナル伝達経路の活性化を誘発する場合がある。
【０３０９】
一部の実施形態では、治療用抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。抗体に誘導されるＣＤＣは、古典的な補体カスケードのタンパク質を介して媒介され、補体タンパク質Ｃｌｑを抗体に結合させることによって誘発される。Ｃｌｑに結合する抗体Ｆｃ領域は、補体カスケードの活性化を誘導する場合がある。
【０３１０】
一部の実施形態では、治療用抗体は、抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）活性を有する。単球およびマクロファージを含む、その細胞表面にＦｃ受容体を有する食細胞は、標的細胞に結合する抗体のＦｃ領域を認識し、結合する。抗体結合標的細胞に対するＦｃ受容体の結合に際し、標的細胞の食作用が開始される場合がある。
【０３１１】
一部の実施形態では、治療用抗体は、免疫複合体を形成してもよい。例えば、免疫複合体は、抗体によって覆われるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原を発現するかまたは出す（ｅｘｔｒｕｄｅ）細胞であってもよい。
Ｃ．治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド
【０３１２】
メチル化Ｈ１．０関連疾患または状態に苦しむ個体のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の産生は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に特異的な天然に存在する自己抗体の生成を生じさせる。したがって、これらの天然に存在する自己抗体に結合し、これらを取り除く治療アプローチが本明細書において提供される。この目的のために、一部の実施形態では、細胞中または循環中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに応答して生じる天然に存在する自己抗体に結合し、それらをさらに中和する可能性がある、Ｋ１８０に対応するジメチル化リシンを保持する治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドが本明細書において提供される。
【０３１３】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、個体の血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の生体作用をブロックする場合がある。このような自己抗体レベルのブロックは、免疫応答を減らす場合があり、メチル化Ｈ１．０疾患または状態の有害症状を軽快させる場合がある。
【０３１４】
一実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２全長タンパク質（配列番号１）である。本明細書において提供される治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、ジメチル化Ｋ１８０残基を保持する全長Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質の任意の断片であってもよい。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、５〜１９３アミノ酸（ａａ）長の範囲である。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの長さは、５ａａ、６ａａ、７ａａ、８ａａ、９ａａ、１０ａａ、１１ａａ、１２ａａ、１３ａａ、１４ａａ、１５ａａ、１６ａａ、１７ａａ、１８ａａ、１９ａａ、２０ａａ、２１ａａ、２２ａａ、２３ａａ、２４ａａ、２５ａａ、２６ａａ、２７ａａ、２８ａａ、２９ａａ、またはさらに３０ａａである。ある特定の例示的実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの長さは、１５ａａ、１６ａａ、１７ａａ、１８ａａ、１９ａａ、または２０ａａである。表３Ａは、本明細書において提供される治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの例示的配列を提供する。したがって、一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、表３Ａに提示されるものから選択される配列のうちの１つを含む。関連する実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、表３Ａに提示されるものから選択される配列のうちの１つからなる。例示的実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列を含む。例示的実施形態では、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体結合ペプチドは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の配列からなる。
【０３１５】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは合成である。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドは、例えば、本明細書においてより詳細に説明されている、Ｋ１８０残基の特異的ジメチル化を可能とする条件下で、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼ酵素またはＧ９Ａ様タンパク質（ＧＬＰ）メチルトランスフェラーゼ酵素を使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化反応の産物である。
【０３１６】
セクションＩで提供されるように、本明細書において提供される治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、様々な目的のため、例えば、これらに限定されないが、治療において使用するため、およびその治療用途に関連する生物学的アッセイにおいて使用するために、さらにコンジュゲートされていてもよい。
【０３１７】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、標識、例えば、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または磁気標識を含む（例えば、標識にコンジュゲートされている）。例示的実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、ビオチン化されている。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、固体表面、例えば、ビーズ（例えば、磁気、ガラスまたはプラスチックビーズ）、カラム、またはマイクロプレートにコンジュゲートされているかまたは付着されている。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、マイクロプレートにコーティングされている。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、これらに限定されないが、放射性核種、細胞毒素、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、イムノモジュレーター、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、および二次抗体を含むエフェクター分子にコンジュゲートされているか、またはこれを含む。
【０３１８】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して特異的である自己抗体に対して選択的である。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して非特異的である自己抗体に結合する。
【０３１９】
ある特定の実施形態では、本明細書において提供される治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、０．０００１ｎＭ〜１μＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。例えば、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２結合ペプチドのＫｄは、約１μＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０００５ｎＭ、またはさらに約０．０００１ｎＭであってもよい。
【０３２０】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、ヒトＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に特異的である。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、他の種由来のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体と交差反応性である。
【０３２１】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に対して選択的であり、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ３に結合する自己抗体に対してほとんどまたは全く結合性を示さない。一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体に結合するが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ３自己抗体に対しても結合性を示す。
【０３２２】
一部の実施形態では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対する結合優先性（例えば、親和性）は、一般的に、非特異的標的抗体（例えば、無作為に生じた抗体）に対して、少なくとも約２倍、約５倍、または少なくとも約１０、２０、５０、１０２、１０３、１０４、１０５、もしくは１０６倍である。
【０３２３】
当業者が精通する方法を使用して、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドがＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体に対して特異性および／または選択性を有するかどうかを決定するために、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドを評価することも可能である。
【０３２４】
本明細書に記載されている治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドをコードする核酸が本明細書において提供される。本明細書に記載されている治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドをコードする核酸のいずれかを含むベクターも本明細書において提供される。
Ｄ．併用療法
【０３２５】
本明細書において提供される治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドのいずれかの投与は、Ｈ１．０メチル化に現れる疾患に対する他の公知の薬物／処置と組み合わせて投与してもよい。
【０３２６】
アルツハイマー病予防の文脈では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体のいずれかは、これらに限定されないが、ＡＰＰ合成阻害剤、ベータ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター、Ａβ凝集阻害剤、Ａβ免疫療法、コレステロール降下薬、抗タウ薬、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、非定型抗精神病薬、タンパク質のＳ−ニトロシル化のブロッカー、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ラパマイシン、ラパログ、内在性カンナビノイド、カンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤、抗炎症薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモン、ホルモン調節剤、スタチン、インスリン、インスリン担体、多機能ナノキャリア、ビタミン、栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、および超音波療法を含むアルツハイマー病予防薬またはレジメンの投与と組み合わせて投与されてもよい。
【０３２７】
アルツハイマー病処置の文脈では、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドのいずれかは、これらに限定されないが、ＡＰＰ合成阻害剤、ベータ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤およびモジュレーター、Ａβ凝集阻害剤、Ａβ免疫療法、コレステロール降下薬、抗タウ薬、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、非定型抗精神病薬、タンパク質のＳ−ニトロシル化のブロッカー、グルカゴン様ペプチド−１受容体アゴニスト、ラパマイシン、ラパログ、内在性カンナビノイド、カンナビノイド、神経保護物質、カルシウム流入を制御する分子、抗酸化剤、抗炎症薬、グルタミン酸ホメオスタシスの制御を制御する薬物、オートファジー誘導物質、ホルモン、ホルモン調節剤、スタチン、インスリン、インスリン担体、多機能ナノキャリア、ビタミン、栄養補助剤、小ＲＮＡ分子、ペプチド、および超音波療法を含むアルツハイマー病薬またはレジメンの投与と組み合わせて投与されてもよい。
Ｅ．治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体および治療用抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２結合タンパク質／ペプチドの投与
【０３２８】
本明細書に記載されている治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、移植により、吸入により、髄腔内に、脳質内に、または鼻腔内に実行されてもよい。治療の有効量は、Ｈ１．０メチル化において出現する疾患もしくは状態、またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体レベルの上昇を現す疾患もしくは状態の処置のために投与されてもよい。治療の適当な投薬量は、処置される疾患または状態のタイプ、治療用抗体、タンパク質、またはペプチドのタイプ、疾患または状態の重症度および過程、個体の臨床状態、処置への個体の臨床歴および応答、ならびに担当医の裁量に基づいて決定されてもよい。
【０３２９】
本明細書に記載されている治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与として、通常の投与量は、投与経路に応じて、１日当たり、個体の体重の約１ｎｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇまたはそれより多い量まで変更してもよい。数日またはそれより長い日数にわたる繰り返し投与として、処置されるメチル化Ｈ１．０関連疾患または状態の重症度に応じて、症状の所望の抑制が達成されるまで処置が持続されてもよい。医師が達成することを望む薬物動態学的崩壊のパターンに応じて、投薬レジメンが有用である場合がある。例えば、個体に１週間に１から２１回まで投与することが本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、投与頻度は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、１日おきに１回、週に１回、２週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回、８週毎に１回、９週毎に１回、１０週毎に１回、または月に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回、もしくはそれより長い間隔である。治療の進行は、従来の技術およびアッセイによりモニターされてもよい。投与レジメンは、使用される用量とは独立して、経時的に変更してもよい。
Ｆ．医薬組成物
【０３３０】
本出願は、本明細書に記載されている治療用抗体、タンパク質またはペプチドの任意の１種または複数と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を含む、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質／ペプチドを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は無菌である。医薬組成物は、一般的に、有効量の治療用抗体、タンパク質、またはペプチドを含む。
Ｇ．キットおよび製品
【０３３１】
本出願は、本明細書に記載されている治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体、治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質、および治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド組成物を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、二次抗体、免疫組織化学分析用の試薬、薬学的に許容される賦形剤および取扱説明書ならびにそれらの任意の組合せのいずれかから選択される構成成分をさらに含有する。一実施形態では、キットは、本明細書に記載されている治療用組成物の任意の１種または複数と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【０３３２】
本出願は、本明細書に記載されている治療用組成物またはキットのいずれか１つを含む製品も提供する。製品の例としてバイアル（密封バイアルを含む）が挙げられる。
【０３３３】
以下の例は、例示的目的で含まれ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０３３４】
（実施例１）
材料および方法
以降の実施例で使用される材料および方法がここで提供される。
Ｈ１．０タンパク質およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化  −  放射標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイ
【０３３５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＧ９ＡメチルトランスフェラーゼによるＨ１．０ペプチドのメチル化を可視化するために、オートラジオグラフィー曝露後にゲル上にメチル化ペプチドの可視化を可能とする、放射標識されたメチルドナーを組み入れるメチル化アッセイを実施した。以下のメチル化反応を１．５ｍｌチューブ中においてセットアップした：１×  ＨＭＴ反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのジチオトレイトール、ｐＨ９．０）、１０ＵのＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２３５Ｓ、ロット番号００３１２０１）、３．２ｍＭのアデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｓ−［メチル−３Ｈ］（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＮＥＴ１５５Ｈ、ロット番号１６６４７２０）、１０μｇのＨ１．０ペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ビオチン−ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号７５））、最終体積１０μｌ。Ｈ１．０ペプチドを含まない点以外は上記と同様の対照反応液も創出した。反応液をサーモサイクラー中で、３７℃で１時間インキュベートした。氷上で５分間インキュベートすることにより反応を停止させ、次に、１６．５％のトリシンゲル（ＢｉｏＲａｄ、４５６３０６３）上で分離した。ゲルを３０％のメタノール、５％のグリセロールに３０分間浸漬した後、室温で２４時間真空乾燥した。次いで、ホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて乾燥ゲルのオートラジオグラフィー分析を実施し、Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼによるメチル−３Ｈ基を有するＨ１．０ペプチドの有効なメチル化を評価した。
液体クロマトグラフィーおよび高分解能質量分析（ＬＣ−ＭＳ）
【０３３６】
ヒストンＨ１．０におけるＧ９ＡおよびＧＬＰメチルトランスフェラーゼによるメチル化の正確な部位を特定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを実施し、次に、液体クロマトグラフィーおよび高分解能質量（ＬＣ−ＭＳ）分析によって分析した。Ｇ９Ａメチルトランスフェラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２３５Ｓ、ロット番号００３１２０１）またはＧＬＰメチルトランスフェラーゼ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１０７５５）のいずれかを使用してメチル化反応をセットアップした。各反応のメチルドナーは、標識されていないＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＮＥＢ、Ｂ９００３Ｓ）であった。各反応のＨ１．０基質は、ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ビオチン−ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号７５））、ジメチル化Ｈ１．０ペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ビオチン−ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号７６））、または全長組換えヒトＨ１．０（ＮＥＢ、Ｍ２５０１Ｓ）で標識した非修飾Ｈ１．０ペプチドのいずれかであった。メチル化反応を以下のように各条件に対して三連でセットアップした：１×  ＨＭＴ反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのジチオトレイトール、ｐＨ９．０）；１０ＵのＧ９ＡもしくはＧＬＰメチルトランスフェラーゼ；３．２ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン；５００ｎｇの非修飾もしくは修飾Ｈ１．０ペプチド、または１μｇの全長タンパク質；最終体積１０μｌ。対照として、いずれのメチルトランスフェラーゼも存在しないが上記のような反応液をセットアップした。すべての反応液をサーモサイクラー中で、３７℃で１時間インキュベートし、次に、氷上で５分間インキュベートすることにより停止させた。試料は、ＬＣ−ＭＳ分析に先立って−８０℃で凍結させた。
【０３３７】
液体クロマトグラフィーおよび高分解能質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による分析のために、試料を上述のように調製し、約１μｇの生成物を、１０ｃｍ×１００ｕｍのトラップカラムおよび２５ｃｍ×１００ｕｍのＩＤ分解カラムで構成されたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅａｓｙ  ｎＬＣシステムに注入した。緩衝液Ａは、９８％の水、２％のメタノール、および０．２％のギ酸であった。緩衝液Ｂは、１０％の水、１０％のイソプロパノール、８０％のアセトニトリル、および０．２％のギ酸であった。試料を４ｕＬ／分で１０分間ローディングし、３７５ｎＬ／分で０〜４５％のＢの勾配を１３０分間かけて実行し、実行時間の合計は１５０分間であった（再生および試料のローディングを含む）。より高い切替限界値（２０Ｋ）を使用して、ＭＳ２がフルスキャンデューティーサイクルを妨害しないことを保証したこと以外は標準Ｔｏｐ−１０データ依存構造で、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計を実行した。これにより、定量化のための最適なフルスキャンデータが保証された。イオントラップ質量分析計でＭＳ２の断片化および分析を実施した。試料は三連で実行した。
ＬＣ−ＭＳデータ分析
【０３３８】
ＲｅｆＳｅｑＨｕｍａｎ配列データベースを使用し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒバージョン１．４（ＳｅｑｕｅｓｔおよびＰｅｒｃｏｌａｔｏｒのアルゴリズムを含む）を使用して、タンパク質の特定を実施した。これらの検索は、いずれのメチルトランスフェラーゼ酵素も欠く対照反応液に関して実施した。Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒのペプチド信頼度フィルターを「高」に設定した。Ｐｉｎｐｏｉｎｔバージョン１．４ソフトウェアを使用して、タンパク質の定量化を実施した。Ｐｉｎｐｏｉｎｔ定量化ワークフローには、スペクトルライブラリーとしてＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ．ｍｓｆファイルをインポートすることが含まれた。次に、特定されたペプチドを、Ｐｉｎｐｏｉｎｔピーク検出、クロマトグラムのアラインメントおよび面積計算アルゴリズムを使用するＭＳ．ｒａｗファイルで定量化した。
【０３３９】
非修飾Ｈ１．０ペプチド（ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号４２））でのＧ９Ａメチル化の正確な位置を特定するために、メチル化反応をセットアップし、生成物をＬＣ−ＭＳにより特定した。メチル化反応は、組換えＧ９Ａ、標識されていないメチルドナー（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、および非修飾Ｈ１．０ペプチドを含んだ。次に、メチル化反応をＬＣ−ＭＳによって分析し、各スペクトルピーク（最終反応におけるペプチド種に対応する）を特定し、スペクトルカウントを使用して定量化した。図２２Ａにおける「ｍｅ」の円の数は、リシン残基のメチル化状態（モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）を表す。図２２Ａは、非メチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、Ｇ９Ａが特異的かつ多量にＨ１．０Ｋ１８０をジメチル化する（すべてのペプチドの９９．９％）ことを示す。
ｈＡＤＳＣの培養
【０３４０】
ヒト脂肪細胞由来間葉系幹細胞（ｈＡＤＳＣ）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒ７７８８−１１５）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ（ＰＣＳ−５００−０１１）から商業的に入手した。すべての細胞株は、日常的に脂肪吸引法を受けている年齢が３８、４５および４９歳の３名の健康な成人女性白色人種ドナーから得られたヒト脂肪組織から単離した。フローサイトメトリー分析および免疫染色分析により確認された細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、およびＣＤ１６６に対して陽性であり、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＣＤ４５に対して陰性であった。細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で、脂肪生成、軟骨形成および骨形成分化が可能であることが確認された。
【０３４１】
単離された脂肪由来幹細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および５０Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１３３０−０５７）中にて、３７℃／５％のＣＯ２で増殖させた。累積集団倍加（ＰＤ）を、培養における増殖日数の関数として、複数継代にわたって、ＰＤ＝ｌｏｇ（Ｎ／Ｎ０）×３．３３（式中、Ｎ０はフラスコにプレーティングされた細胞数であり、Ｎはこの継代で回収された細胞数である）として計算した。自己再生集団（ＳＲ）に対するｈＡＤＳＣのＰＤ４〜１０および複製老化集団（ＲＥＰ−ＳＥＮ）に対するＰＤ４１〜４６をすべての実験で使用した。
老化の誘導および評価
【０３４２】
複製老化として、複製枯渇に達するまでｈＡＤＳＣを培養中で増殖させた（ＰＤ４１〜４６）。急性ＤＮＡ損傷条件として、ＳＲ  ｈＡＤＳＣ（ＰＤ４〜１０）を、増殖培地において、５０μｇ／ｍｌの硫酸ブレオマイシンで２時間処理した（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１３８７７）。遺伝毒性ストレスに誘導される老化として、ＳＲ  ｈＡＤＳＣ（ＰＤ４〜１０）を、増殖培地において、５０μｇ／ｍｌの硫酸ブレオマイシン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１３８７７）で２時間処理し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、ブレオマイシンを含まない新鮮な増殖培地に与えた。次いで、採取前に、細胞を３日間増殖させた。
【０３４３】
細胞の老化を評価するために、細胞を、増殖停止、ＳＡ−β−ｇａｌ活性、および持続性のＤＮＡ損傷フォーカスの存在を含む老化マーカーに対して採点した。ｐＨ依存性老化関連β−ガラクトシダーゼ活性（ＳＡ−β−Ｇａｌ）の発現をモニタリングするためのアッセイを、製造業者のキット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）に記載されているように実施した。培養したｈＡＤＳＣを固定溶液で、室温で１５分間固定させ、ＰＢＳで２回洗浄し、染色サプリメントを含有するＸ−Ｇａｌを用いて３７℃で終夜染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、光学顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ、ＤＭｉＬ）を使用して画像を取り込んだ。ＤＮＡ損傷フォーカスを、以下に記載するように、γＨ２Ａ．Ｘフォーカスに対する免疫染色によって評価した。γＨ２Ａ．Ｘフォーカスの出現は、ＤＮＡの二重鎖切断またはＤＮＡ損傷を示す。γＨ２Ａ．Ｘフォーカスは、二重鎖切断の広く受け入れられている分子マーカーである。
抗体
【０３４４】
使用した一次抗体：抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２、１：１００希釈、ウサギポリクローナル、Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ。抗Ｈ１．０全体、１：５００希釈、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢＥ４４６。抗γＨ２Ａ．Ｘ（Ｓｅｒ１３９Ｐｈ）、１：５００〜１０００希釈、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０５−６３６。抗ベータ−アクチン、１：２０００、Ａｂｃａｍ  ａｂ６２７６。抗ポリ−（ＡＤＰ）−リボース、１：５００、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＬＸ−８０４−２２０−Ｒ１００。抗Ｇ９Ａ、１：５００、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａ３００−９３３Ａ。抗ＧＬＰ、１：５００、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ａ３０１−６４３Ａ。抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、１：１０００、Ａｂｃａｍ  Ａ３０１−６４３Ａ。
【０３４５】
二次抗体：ヤギ−抗マウス−ＨＲＰ、１：４０００、Ｂｉｏｒａｄ  １７０６５１６。ヤギ−抗ウサギ−ＨＲＰ、１：４０００、Ｂｉｏｒａｄ  １７０６５１５。ヤギ−抗ヒト−ＨＲＰ、１：４０００、Ｂｉｏｒａｄ  １７２１０５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８−ロバ抗マウス、１：５０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−２１２０２、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８−ロバ抗ウサギ、１：５０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−２１２０６、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５５５−ロバ抗マウス、１：５０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−３１５７０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５５５−ロバ抗ウサギ、１：５０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−３１５７２、および抗ＩｇＭ  ＨＲＰ（ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｍｕ鎖）（ＨＲＰ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７２１０、ロット番号ＧＲ１６９２２７−１０））。
ＥＬＩＳＡ
【０３４６】
以下のプロトコールは、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルの直接的または間接的検出に対する一般化された酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）について記載する。
【０３４７】
図４は、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの間接的検出に対する（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭレベルの間接的検出に対する）サンドイッチＥＬＩＳＡの使用を示す。ＥＬＩＳＡは、体液試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドエピトープに対する抗体の検出のために使用される。以下のプロトコールは、血清試料中の特異的抗体を捕捉するためにビオチン化ペプチドを使用する、一般化された酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧまたはＩｇＭレベルの間接的検出のための）と、それに続く、ＨＲＰにコンジュゲートされた二次抗体による検出、およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とのインキュベーションについて記載する。ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートのウェル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５５０１）を洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓで緩衝された生理食塩水（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．６）と０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。５０ｐｍｏｌのカスタムビオチン化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を洗浄緩衝液中で希釈し、穏やかに振盪しながら各ウェルに室温で２時間結合させた。結合していないペプチドを洗浄緩衝液で３回洗浄して洗い流した。洗浄緩衝液におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の連続希釈液を標準液として創出した（１：２５０００、１：５００００、１：１０００００、１：２０００００、１：４０００００、保存濃度０．５４ｍｇ／ｍｌ）。血清試料を洗浄緩衝液中で希釈した（１：１０００）。１００μＬの標準液および試料を二連でウェルに添加した。穏やかに振盪しながらウェルを室温で１時間インキュベートした。結合していない標準液または試料を洗浄緩衝液で３回洗浄して洗い流した。ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体（抗ＩｇＧ二次抗体または抗ＩｇＭ二次抗体のいずれか）を洗浄緩衝液中で希釈した（１：１０００）（血清試料として、ヤギ−抗ヒト−ＨＲＰ、Ｂｉｏｒａｄ  １７２１０５０；標準液として、ヤギ−抗ウサギ−ＨＲＰ、ＢｉｏＲａｄ  １７０６５１５）。１００μＬの二次抗体希釈液をウェルに添加した。穏やかに振盪しながらウェルを室温で１時間インキュベートした。結合していない二次抗体を洗浄緩衝液で３回洗浄して洗い流した。１００μＬのＴＭＢ溶液（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。１００μＬのストップ溶液（０．１８ＭのＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で５分間インキュベートした。酸化すると、ＴＭＢは、６５０ｎｍで分光光度的に測定される可能性がある水溶性の青色反応生成物を形成する。ストップ溶液で酸性化すると、反応生成物は、４５０ｎｍに吸光度のピークを有する黄色となる。各ウェルの吸光度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで測定した。各試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧまたはＩｇＭの濃度は、標準曲線から外挿法によって決定し、以下にさらに記載した。図１４Ｃは、体液中の自己抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルの間接的検出に対するＥＬＩＳＡの使用を示す。
【０３４８】
図５Ａは体液試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドエピトープの直接的検出に対するサンドイッチＥＬＩＳＡの使用を示す。一般的に、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープに特異的な抗体が提供され、マイクロプレートに固定されている（コーティングされている）。定量化のためにＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープを含有する臨床試料が提供される。試料をマイクロプレートに添加し、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープは固定した抗体に結合する。結合していない材料を洗い流す。次いで、検出抗体、例えば、ＨＲＰまたは任意の他の標識抗体を添加する。これらの検出抗体は捕捉エピトープに結合する。結合していない検出抗体を洗い流す。検出基質溶液を添加し、フルオロフォアまたは色の変化を測定する。次いで、これを、標準曲線に対して定量化し、臨床試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２エピトープのレベルを報告する。
【０３４９】
図５Ｂは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験に対する標準曲線を示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化された全長Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を、５０ｎｇ／ｍｌから３．１２５ｎｇ／ｍｌの２倍希釈系列の標準として使用した。標準濃度を４５０ｎｍで測定したＯ．Ｄ．に対してプロットする。線形の傾向線は、検出限界を超える点の間でプロットし、直線の方程式を計算した（プロットで示される）。挿入は生データを示す。ＥＬＩＳＡは二連で実施し、平均Ｏ．Ｄ．値は曲線作成のために使用した。
ウエスタンブロット
【０３５０】
ウエスタンブロット分析のための材料（培養細胞または組織）を、氷冷したＲＩＰＡ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ８９９００）に溶解し、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２超音波処理器を使用して超音波処理した（１０％のデューティーサイクル、強度５、１分当たりのバースト１００、１２０秒）。各試料中の総タンパク質濃度を、製造業者のプロトコールに従い、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  １倍染色試薬（ＢｉｏＲａｄ、５０００２０５）を使用して定量化した。次いで、試料をＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料ローディング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＰ０００７）およびＮｕＰＡＧＥ試料還元緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＰ０００４）と混合し、７０℃で１０分間加熱変性させた。タンパク質は、電気泳動により、４〜１２％のプレキャストポリアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＮＰ０３２１）上で分離し、０．４５μｍのニトロセルロース膜に移した。膜は、ＰＢＳ−Ｔ中の５％の無脂肪乳で、室温で３０分間ブロックし、次いで、上記一次抗体で、４℃にて終夜、免疫ブロットした。タンパク質を、上記に列挙したＨＲＰ二次抗体で、室温で１時間、続いて、製造業者の説明書を使用してＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３２１０６）で検出した。ステップ間のすべての洗浄は、ＰＢＳ−Ｔを用いた。膜は、Ｏｍｅｇａ  ＬＵＭ−Ｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で画像化した。
免疫蛍光法
【０３５１】
免疫蛍光法として、細胞を培養し、チャンバースライドにおいて処理し、中性の１０％のホルマリンで固定し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで透過処理した。洗浄後、スライドを、１％のＢＳＡおよび４％のロバ血清を含有するＰＢＳを使用してブロックした。洗浄後、スライドを、上記に列挙した一次抗体とインキュベートし、再度洗浄し、上記に列挙したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ二次抗体と共にインキュベートし、ＤＡＰＩを含有するスローフェードゴールド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をマウントした（核を可視化するため）。細胞は、蛍光顕微鏡法で観察し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用する分析のためにイメージを獲得した。
スロットブロット分析
【０３５２】
０．５μｌの血清試料または既知の量の合成ペプチドを２００μｌのＴＢＳ中で希釈した。次いで、試料を７０℃で１０分間熱変性させた後、真空マニフォールドスロットブロット装置（ＢｉｏＲａｄ、１７０６５４２）を使用してニトロセルロース膜に移した。膜は、ＰＢＳ−Ｔ中の５％の無脂肪乳で、室温で３０分間ブロックし、次いで、上記一次抗体で、４℃にて終夜、免疫ブロットした。タンパク質を、上記に列挙したＨＲＰ二次抗体で、室温で１時間、続いて、製造業者の説明書を使用してＥＣＬ  ＷＥＳＴＥＲＮ  ＢＬＯＴＴＩＮＧ  ＳＵＢＳＴＲＡＴＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３２１０６）で検出した。ステップ間のすべての洗浄は、ＰＢＳ−Ｔを用いた。膜は、Ｏｍｅｇａ  ＬＵＭ−Ｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｅｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で画像化した。次いで、各試料に対するスロットブロットバンドを、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
ＲＮＡｓｅｑの分析
【０３５３】
全ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して自己複製および複製老化細胞培養試料から単離した。２種の異なるｈＡＤＳＣ細胞株由来の試料を関連がある条件に対して一緒に合わせ、ＲＮＡ  ＨＳアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するＱｕｂｉｔ  ２．０蛍光光度計で、ＲＮＡ濃度を測定した。ＥＲＣＣ  ＲＮＡ  Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、品質管理分析のために全ＲＮＡに添加した。次に、ｒＲＮＡ枯渇をＬｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｒｉｂｏｍｉｎｕｓ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｖ２（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施した。ｃＤＮＡライブラリーをＩｏｎ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｋｉｔ  ｖ２（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて構築し、Ｉｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｂａｒｃｏｄｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてバーコードを付けた。ライブラリーのサイズ分布および定量化は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ＤＮＡ  ＨＳバイオアナライザーキットを用いて実施した。Ｐ１チップ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで、ライブラリーのシークエンシングを実施し、各ライブラリーを３回シークエンシングした。
【０３５４】
個々のＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによるシークエンシングの実行からのＲＮＡｓｅｑのリードを各ライブラリーのために組み合わせた。Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＴＭＡＰ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する参照ヒトゲノムアッセンブリーｈｇ１９（ＧＲＣｈ３７）に対して、配列リードをマッピングした。各条件に対するＲＮＡｓｅｑ実行の品質は、製造業者のウェブサイトから得られた、ＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  ＲＮＡ配列の予測カウントを同じ配列にマッピングするＲＮＡｓｅｑタグの実測カウントに対して比較することによって評価した。初期の遺伝子発現レベルは、個々のＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ遺伝子モデル（ｃ）に対するエクソンにマッピングしたリードの合計として得て、あまり発現しなかった遺伝子（百万当たりのリードカウント＜１）は次の分析から除去された。各ライブラリーについて、個々の遺伝子発現レベルは、各遺伝子当たりのベータ−アクチン（ＡＣＴＢ）発現レベル（ｃＡＣＴＢ）およびエクソンの長さの合計ｌを使用して正規化した。ライブラリーｊについて、ベータ作用正規化因子ｓｊは、
【数１】
2019521953.tif 000009
のように計算した。
【０３５５】
ライブラリーｊにおける遺伝子ｉに対する最終正規化発現値は、
【数２】
2019521953.tif 000010
のように計算した。
薬物処置
【０３５６】
ブレオマイシン処理：細胞増殖培地に、５０μｇ／ｍｌのブレオマイシン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １３８７７）を２時間補充し、ＤＮＡ二重鎖切断を誘導した。細胞は、ブレオマイシン処理の直後に採取したか（急性ＤＮＡ損傷）、またはブレオマイシン処理後３日間増殖させた（遺伝毒性ストレスに誘導される老化）。ＰＡＲＰ−１阻害剤：細胞増殖培地に、１μＭの有効なＰＡＲＰ−１阻害剤  ＡＧ１４３６１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ  Ｓ２１７８）を下流分析に先立って２４時間補充した。ラパマイシン処置：細胞増殖培地に、５００ｎＭのラパマイシン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １１３４６）を下流の分析または処置に先立って２４時間補充した。エベロリムス処置：細胞増殖培地に、５００ｎＭのエベロリムス（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １１５９７）を下流の分析または処置に先立って２４時間補充した。テモゾロミド処置：細胞増殖培地に、５０μｇ／ｍｌのテモゾロミド（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １４１６３）を下流分析に先立って２時間補充した。
照射後のマウスにおけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の分析
【０３５７】
血液を、頬穿刺により、２頭の１３カ月齢のマウスから採取し、血清を、ＳＳＴ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＢＤ、３６５９５６）を有するＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  Ｔｕｂｅｓ（登録商標）を使用して分離した。次いで、同一のマウスを７Ｇｙのイオン化放射線（Ｘ線の形態で）に曝露した。血液を、照射の２時間後に一方のマウスから、照射の４８時間後に他方のマウスから再度抜き取った。Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  Ｔｕｂｅｓ（登録商標）を使用して、血清を血液から再度分離した。次いで、照射前後の各マウス由来の血清を、スロットブロットおよびウエスタンブロットによって分析した。
マウスからの脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の単離
【０３５８】
マウスの脂肪由来幹細胞を、野生型マウスから単離した。皮下または腎周囲の白色脂肪組織を採取し、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）、３．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１％のコラゲナーゼ、ＩＩ型（Ｓｉｇｍａ）中に、１：３ｗ／ｖの比で懸濁させ、３７℃で５０分間振盪した。細胞を、７０μｍメッシュの細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  番号３５２３５０）を通して濾過し、赤血球溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）で処理し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、１０％のＣＯ２にて３７℃でｅｘ  ｖｉｖｏに拡大し、８０％のコンフルエンシーで継代し、７２〜９６時間毎に培地を変えた。次いで、細胞を、他の場所で記載されているように、ウエスタンブロット分析に使用した。
（実施例２）
老化におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの発見
【０３５９】
自己再生（ＳＲ）ｈＡＤＳＣおよび複製老化（ＲＥＰ−ＳＥＮ）ｈＡＤＳＣを、実施例１に記載されている方法に従って入手した。ヒストンの新たな老化に関連する翻訳後修飾（ＰＴＭ）を特定するために、ＳＲおよびＲＥＰ−ＳＥＮ  ｈＡＤＳＣ由来の溶解物を、図１Ａの発見パイプラインに従って、Ｍ／Ｚ  Ｐａｉｒ  Ｔａｇ  ＬＣ−ＭＳによって評価した。自己再生および複製老化ｈＡＤＳＣ溶解物の５回の技術的反復注入を、フルスキャン最適化設定で処理した。最適なフルスキャン定量的測定のためのクロマトグラフィーおよび機器による方法は、最適な断片化スキャンの方法と競合することが決定された。したがって、質量分析計の正確な質量および広いダイナミックレンジの能力を、データ測定の２つの別個のパスを分析に組み入れることによって利用した。第１のパスは、妥協せず、最適化したフルスキャン（ＭＳ）データを、再現性の高い定量化のために獲得することに焦点を当てた。この第１のフルスキャン定量的パスを使用して、潜在的に興味深い特徴の包含リストを作成した。次いで、包含リストを、データ試料のサブセットとして、第２のパスの間に、標的とした断片化スキャンの獲得のために使用した。図１Ｂに示すように、質量スペクトルによって、ＳＲ  ｈＡＤＳＣの非修飾（ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号４２））ペプチドおよびＲＥＰ−ＳＥＮ  ｈＡＤＳＣのジメチル化（ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫｍｅ２ＰＫ（配列番号３））ペプチドが明らかとなった。
【０３６０】
ＳＲとＲＥＰ−ＳＥＮのｈＡＤＳＣの発現プロファイルを比較するＲＮＡｓｅｑ実験を、実施例１に記載されている方法に従って実行した。図２Ａに示されるように、ＳＲ（黒いバー）およびＲＥＰ−ＳＥＮ（灰色のバー）のｈＡＤＳＣの両方には、ヒストンＨ１の６個の別個のバリアント：Ｈ１．０、Ｈ１．１、Ｈ１．２、Ｈ１．３、Ｈ１．４、およびＨ１．５が存在する。ｙ軸の値は、各試料における相対的なベータ−アクチンの発現によって正規化され、各遺伝子に対するエクソンの全長によってさらに正規化された、各遺伝子に対するエクソンのマッピングされたリードの合計を表す。ヒストンＨ１．０は、遺伝子発現レベルで、Ｈ１の４番目に多いバリアントであることが見出された。Ｈ１．０ｍＲＮＡは、ＳＲ  ｈＡＤＳＣにおけるＨ１発現全体の８％およびＲＥＰ−ＳＥＮ  ｈＡＤＳＣにおけるＨ１発現全体の１４％に相当したのである。しかし、他のバリアントと異なり、その発現は、複製老化の間一定のままである。ＲＮＡｓｅｑ分析によって特定されたヒストンＨ１．０遺伝子に対するすべてのリードの特有のマッピングのゲノムブラウザ図（図２Ｂ）は、ＲＥＰ−ＳＥＮ  ｈＡＤＳＣ（下のトラック）におけるよりもＳＲ  ｈＡＤＳＣ（上のトラック）において高いＨ１．０の発現を示した。リードカウントは、各試料の相対的なベータ−アクチン発現によって正規化した。
【０３６１】
公知のメチル化リシン残基を中心とする種々のペプチド配列のアラインメントにより、Ｈ１．０Ｋ１８０の周囲のアミノ酸配列が特有であり、他のメチル化リシン残基と類似していないことが明らかとなった（図３Ａ）。
（実施例３）
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体
【０３６２】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原に特異的なポリクローナル抗体は、以下のように作製した：２頭のニュージーランドウサギを抗体産生のために免疫化した。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド（ペプチド：ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号３９））にコンジュゲートしたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のエマルジョンとして、注射を皮下に（ＳＱ）投与した；コンジュゲートしたペプチド：（ＫＬＨ−ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号７７））、ここで、Ｃ末端のＣは、ＫＬＨに対する共有結合による連結を生成するために、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中で、ペプチドの配列に人工的に加えた。ＣＦＡ中０．５ｍｇの抗原を用いて、１０ＳＱ部位で、初期免疫化を実施した。６回のその後の追加免疫化を、７〜８週の期間にわたって、日常的な間隔で実施した。ブースターは、４ＳＱ部位で、ＩＦＡ中０．２５ｍｇの抗原からなった。ウサギは、５週目（ウサギ１頭当たり約２５ｍｌの血液）および８週目（ウサギ１頭当たり約５０ｍｌの血液）に採血した。免疫の力価は、免疫化の前後の血液を比較することによって、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。次いで、抗原アフィニティークロマトグラフィーを使用して、抗体を精製した。精製に使用した抗原は、ビオチンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がコンジュゲートしたＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド（ビオチン−ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号７８））またはＢＳＡ−ＣＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号７９））のいずれかであった。本明細書において提供されるｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化方法を使用して、ペプチドをジメチル化した。
【０３６３】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を以下のように試験した。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の特異性をチェックするために、Ｋ１７２、Ｋ１７４、Ｋ１７５、Ｋ１７７、またはＫ１８０でメチル化されたヒストンＨ１．０ペプチドを、希釈系列で真空マニフォールドスロットブロットを使用して膜に移した。次いで、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用して膜を免疫ブロットし、他のメチル−リシン基との潜在的な交差反応性を特定した。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体は、低濃度においても、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対して非常に特異的である（図３Ｂ）。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の特異性をさらにチェックするために、Ｋ４、Ｋ９、Ｋ２７、Ｋ３６またはＫ７９でメチル化されたヒストンＨ３ペプチドを、希釈系列で真空マニフォールドスロットブロットを使用して膜に移した。次いで、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用して膜を免疫ブロットし、他のメチル−リシン基との潜在的な交差反応性を特定した。この抗体は、分析したいずれのメチル化Ｈ３ペプチドとも交差反応性を示さなかった（図３Ｃ）。実施例１に記載した方法に従って、スロットブロット分析プロトコールを実行した。
【０３６４】
ウサギ抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体の特異性は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ試験を使用して決定した。６．２５ｐｍｏｌから７８１ｆｍｏｌの２倍希釈系列で、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１ペプチド、または非修飾ペプチドのいずれかで、ウェルをコーティングした。１００ｕｌの緩衝液中６．６７ｆｍｏｌのウサギ抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体を各ウェルに添加し、抗体結合の効率をＥＬＩＳＡによってモニターした。４５０ｎｍで測定したＯ．Ｄ．に対するペプチド量をプロットすることにより、各ペプチドに対する曲線を作成した。ＥＬＩＳＡの生データは、２回繰り返した実験について、表と図に示す（図３Ｄ）。
【０３６５】
ウサギ抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ１ペプチドよりもＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドに、２．７倍効率的に結合する。最適な線形範囲内で、ウサギ抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体１分子は、１１７分子のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドのうちの１つを認識するが、３１６分子のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ１ペプチドのうちの１つしか認識しない。非修飾ペプチドは、この範囲で認識されない。
【０３６６】
ヒストンＨ１バリアントタンパク質配列のＣｌｕｓｔａｌＷ２アラインメントにより、Ｈ１．０Ｋ１８０は、他のＨ１バリアントに存在しないアミノ酸の特有の配列に埋め込まれることが明らかとなった（図３Ｅ）。初期発見実験で特定したペプチドを灰色で強調する。３つのα−ヘリックスを含む球状ドメイン領域も示す。
（実施例４）
ＥＬＩＳＡにおいてＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを使用する血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体レベルの間接的検出
血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体の間接的検出
【０３６７】
以下の例は、血清試料中の特異的自己抗体を捕捉するためにビオチン化された治療用Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを使用する酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）と、それに続く、ＨＲＰにコンジュゲートされた二次抗体による検出、およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）によるインキュベーションについて記載する。ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５５０１）のウェルを、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．６）と０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。５０ｐｍｏｌのカスタムビオチン化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を洗浄緩衝液中で希釈し、穏やかに振盪しながら各ウェルに室温で２時間結合させた。結合していないペプチドを洗浄緩衝液で３回洗浄して洗い流した。洗浄緩衝液におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の連続希釈液を標準液として創出した（１：２５０００、１：５００００、１：１０００００、１：２０００００、１：４０００００、保存濃度０．５４ｍｇ／ｍｌ）。血清試料を洗浄緩衝液中で希釈した（１：１０００）。１００μＬの標準液および試料を二連でウェルに添加した。穏やかに振盪しながらウェルを室温で１時間インキュベートした。結合していない標準液または試料を洗浄緩衝液で３回洗浄して洗い流した。ＨＲＰにコンジュゲートした二次抗体（図４のステップ３に示した二次標識抗体）を洗浄緩衝液中で希釈した（１：１０００）（血清試料として、ヤギ−抗ヒト−ＨＲＰ、Ｂｉｏｒａｄ  １７２１０５０；標準液として、ヤギ−抗ウサギ−ＨＲＰ、Ｂｉｏｒａｄ  １７０６５１５）。１００μＬの二次抗体希釈液をウェルに添加した。穏やかに振盪しながらウェルを室温で１時間インキュベートした。結合していない二次抗体を洗浄緩衝液で３回洗浄して洗い流した。１００μＬのＴＭＢ溶液（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。１００μＬのストップ溶液（０．１８ＭのＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、穏やかに振盪しながら室温で５分間インキュベートした。酸化すると、ＴＭＢは、６５０ｎｍで分光光度的に測定される可能性がある水溶性の青色反応生成物を形成する。ストップ溶液で酸性化すると、反応生成物は、４５０ｎｍに吸光度のピークを有する黄色となる。各ウェルの吸光度をプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４５０ｎｍで測定した。各試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの濃度は、標準曲線から外挿法によって決定した。
【０３６８】
ＥＬＩＳＡを使用する血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルの間接的検出は、一般的に、図４に示す。
血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の間接的検出
【０３６９】
血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の検出は、３つのステップを含んだ。試験は、市販のサンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用する患者の血清中の総ＩｇＭの測定（ステップ１）、それに続く、間接的ＥＬＩＳＡアッセイを使用する同一試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの測定（ステップ２）を含む。最終ステップとして、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルを試料中の総ＩｇＭによって正規化した（ステップ３）。
【０３７０】
ステップ１：患者の血清中の総ヒトＩｇＭを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した市販のサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ヒトＩｇＭ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！、パーツ番号８８−５０６２０、ロット番号１２３６２０１１１）を使用して測定した。
【０３７１】
ステップ２：カスタマイズした間接的ＥＬＩＳＡアッセイを使用する患者の血清中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの測定。ビオチン標識したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２捕捉ペプチドを９６ウェルのストレプトアビジンをコーティングしたマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５５０１、ロット番号ＱＨ２１８７００）にコーティングした。過剰な遊離ペプチドを洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．６）と０．１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で洗い流した。マイクロプレートの非特異的結合部位をｄ−ビオチン（ＶＷＲ、９７０６１−４４４、ロット番号１４０５Ｃ０８０；プレート表面上の結合していないストレプトアビジンをブロックするため）を含有するブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３７５３６、ロット番号ＱＪ２２２１９１）を使用してブロックし、バックグラウンドノイズを低減した。希釈した患者の血清を、三連でマイクロプレートウェルに添加した。患者の試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体は、プレート表面の捕捉ペプチドを認識し、結合した。並行して、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体標準液の希釈系列を同一のプレートで処理した。次いで、ウェルを洗浄緩衝液で洗浄し、結合していない試料または標準液を除去した。次いで、結合した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体は、各試料ウェルに添加した抗ＩｇＭ  ＨＲＰ検出抗体（図４、ステップ３に示される二次標識抗体；ウサギ抗ヒトＩｇＭ（Ｍｕ鎖）（ＨＲＰコンジュゲート）（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７２１０、ロット番号ＧＲ１６９２２７−１０））を使用して検出した。標準液は、各標準液ウェルに添加した抗ＩｇＧ  ＨＲＰ検出抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰコンジュゲート）（ＢｉｏＲａｄ、１７０６５１５、ロット番号３５０００３０８０））を使用して検出した。次いで、過剰な、結合していない検出抗体を洗浄緩衝液で洗い流した。次いで、結合したＨＲＰの活性を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬ、５２−００−０１、ロット番号１０１６４３３６）をウェルに添加することによって決定した。この反応は、ストップ溶液（（０．１８ＭのＨ２ＳＯ４）（ＫＰＬ、５０−８５−０４、ロット番号１０１６４３２８））を添加して停止させ、ウェルの内容物の吸光度を４５０ｎｍで読み取った。吸光度は、試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの濃度に直接比例する。次いで、各試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭのモル濃度を、標準曲線からの外挿法および最初の希釈係数による乗算によって決定した。
【０３７２】
標準曲線は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ウサギポリクローナルＩｇＧ抗体を利用した。この抗体は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に非常に特異的であることを確認した。この抗体は、Ｈ１．０の任意の他のリシンのメチル化を認識せず、メチル化の程度に特異的であり、例えば、リシンＫ１８０のモノ（ｍｅ１）、ジ（ｍｅ２）、およびトリ（ｍｅ３）の間を識別することができる（図３Ａ）。この抗体は、他の一般のヒストンタンパク質のメチル化部位と交差反応しない（図３Ａ）。標準曲線は、固定濃度のビオチン化エピトープ（合成ペプチドＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫｍｅ２ＰＫ（配列番号３））または固定量の二次抗ＩｇＭ抗体をそれぞれ用いて、この抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの希釈系列（７２、３６、１８、１２、９、４．５ｆｍｏｌ／ｍｌ）または総ＩｇＭ抗体の希釈系列（５５６、４４４、２２２、１１１、５６、２８、１８または０ｆｍｏｌ／ｍｌ）から作成した。各試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭのモル濃度は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧのモル濃度の曲線から推測した。
【０３７３】
ステップ３：総ＩｇＭ血清濃度による抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ血清濃度の正規化。患者の血清中の総ＩｇＭの測定を三連で実施した。次いで、各試料中の総ＩｇＭ濃度の平均を３回の繰り返しから計算した。患者の血清中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの測定を三連で実施した。次いで、各試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ濃度の平均を３回の繰り返しから計算した。最終試験値を得るために、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ濃度の平均を、各患者の試料に対する総ＩｇＭ濃度の平均で割った。
【数３】
2019521953.tif 000011
【０３７４】
ＥＬＩＳＡを使用する血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルの間接的検出は、一般的に、図４に示す。
患者の血清中の抗Ｈ１．０（非修飾Ｈ１．０）ＩｇＭレベルの測定
【０３７５】
手順は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭに対する間接的ＥＬＩＳＡと同一であったが、捕捉ペプチドは異なった。この場合には、ペプチドは、Ｋ１８０ｍｅ２を欠く非修飾ペプチド（非修飾Ｈ１．０）であった。また、使用した標準物質は、非修飾ペプチドに対して生じたウサギポリクローナルＩｇＧであった（図１６Ｂ、右のパネル）。
（実施例５）
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の使用は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２が急性ＤＮＡ損傷に関連することを示す
【０３７６】
図６は、実施例１に記載した方法に従って、Ｈ１．０ｍＲＮＡの発現が、ＤＮＡ損傷および遺伝毒性ストレスに誘導される老化後に増加することを示す。ヒストンＨ１．０のｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を、自己複製ｈＡＤＳＣ、ブレオマイシンで２時間処理したｈＡＤＳＣ（急性ＤＮＡ損傷）およびブレオマイシンで処理して３日間老化させたｈＡＤＳＣ（遺伝毒性ストレスに誘導される老化）に由来する総ＲＮＡに関して実施した。Ｈ１．０ｍＲＮＡ発現は、急性ＤＮＡ損傷後に２倍を超えて増加し、遺伝毒性ストレスに誘導される老化後、高いままである（ＳＲに対して１．５倍）。
【０３７７】
Ｈ１．０Ｋ１８０のメチル化とＤＮＡ損傷の間の関係を評価するために、ＤＮＡ損傷剤であるブレオマイシンで２時間処理した（実施例１に記載した方法に従って）ＳＲ  ｈＡＤＳＣおよびｈＡＤＳＣを溶解させ、分画して、クロマチン結合画分を得た。α−Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を用いるウエスタンブロット分析（実施例１に記載した方法に従って実施した）は、ＤＮＡ損傷の際のクロマチンのＨ１．０Ｋ１８０のメチル化を示す（図７Ａ）。ＤＮＡの二重鎖切断を誘導するブレオマイシンによるＳＲ  ｈＡＤＳＣの処理に際して（実施例１に記載した方法に従って）、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２は細胞質に局在した。
【０３７８】
スロットブロットイムノアッセイにより、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の存在が、ブレオマイシンによって課された遺伝毒性傷害の後に、時間経過に依存する様式で、ｈＡＤＳＣの馴化培地中で検出されたことが見出され、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の分泌の最大値は４８時間以内に検出された（図７Ｂ）。これは、細胞からの分泌を示す。ＧＳＩ−ＳＥＮに関するＤＮＡ断片化因子（ＤＦＦＢ／ＤＦＦ４０／ＣＡＤ）の分泌の増加は、処置の４８時間後に開始するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２と同様の様式で見られた（図７Ｂ）。タンパク質は、急性ＤＮＡ損傷（ＡＤＤ）の発生に際して、測定可能な量で分泌されない。
（実施例６）
Ｈ１．０Ｋ１８０のメチル化は、ＤＮＡ損傷修復経路のタンパク質ＰＡＲＰ−１活性と無関係であり、その上流で生じる
【０３７９】
Ｈ１．０Ｋ１８０のメチル化がＤＮＡ損傷修復経路のタンパク質ＰＡＲＰ−１活性に依存するかどうかをさらに評価するために、実施例１に記載した方法に従ってウエスタンブロット分析を実施し、ブレオマイシンによる処理の際のクロマチン結合Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２およびγＨ２Ａ．Ｘを調査した。ＤＮＡ損傷応答経路の早期プレーヤーであるＰＡＲＰ−１は、実施例１に記載した方法に従って、有効な阻害剤であるＡＧ１４３６１を使用して阻害された。図８Ａに示すように、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２はＤＮＡ損傷の際にクロマチンに出現し、その出現はＰＡＲＰ−１活性とは無関係であった。実際に、ＰＡＲＰ−１の阻害は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２およびγＨ２Ａ．Ｘの蓄積の増加をもたらした（図８Ａ）。細胞溶解物全体におけるＰＡＲＰ−１阻害活性のウエスタンブロット分析により、ブレオマイシンによる処理に際し、ＰＡＲＰ−１活性は細胞内のポリ−（ＡＤＰ）−リボース（ＰＡＲ）レベルの上昇をもたらしたことが明らかになり、これはＰＡＲＰ−１阻害剤により消失し、効率的なＰＡＲＰ−１阻害を示唆した（図８Ｂ）。したがって、Ｈ１．０Ｋ１８０のメチル化は、ＤＮＡ損傷修復経路のタンパク質ＰＡＲＰ−１活性と無関係であることが決定された。
（実施例７）
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の使用は、遺伝毒性ストレスに誘導される老化に際して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２がクロマチンから放出され、細胞外マトリックスへと分泌されることを示す
【０３８０】
ＳＲ  ｈＡＤＳＣ、ブレオマイシンで２時間処理したｈＡＤＳＣ（急性ＤＮＡ損傷）およびブレオマイシンで処理して３日間老化させたｈＡＤＳＣ（遺伝毒性ストレスに誘導される老化）を溶解させ、可溶性およびクロマチン結合画分に分画した。次いで、これらの画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。ペプチドの発現レベルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの相対強度曲線下の総面積として得て、個々のペプチドは、Ｐｉｎｐｏｉｎｔソフトウェア、バージョン１．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質へと明確に割り当てた。個々のタンパク質に割り当てたすべてのペプチドの面積を合計して、タンパク質発現レベルを得て、これを、各試料に対する総タンパク質ライブラリーサイズに対して正規化した。各細胞画分に対して、Ｈ１．０ペプチドの存在量を、各条件で観察された総Ｈ１．０ペプチドのパーセンテージとして表す。各画分におけるＨ１．０ペプチドレベルの正規化した絶対値も示した。図９Ａに示すように、クロマチンに結合したＨ１．０は、ＳＲおよび急性ＤＮＡ損傷における合計の約６０％から遺伝毒性ストレスに誘導される老化の際の合計の約３０％まで低下した。ブレオマイシンで処理したＳＲ  ｈＡＤＳＣ由来の培養培地を、α−Ｈ１．０およびα−Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を用いるスロットブロット分析のために採取して、Ｈ１．０の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）への分泌を評価した。実施例１に記載した方法に従って、実験を実行した。分泌されたＨ１．０は、細胞培養培地中で検出可能であり、ブレオマイシン処理の２４時間後に、分泌されたＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２も容易に検出された（図９Ｂ）。これらの結果により、メチル化Ｈ１．０Ｋ１８０は、遺伝毒性ストレスに誘導される老化の際にクロマチンから放出され、ＥＣＭへと分泌されることが確認された。
（実施例８）
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の使用はイオン化放射線への曝露が血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のレベルの上昇を誘導することを示す
【０３８１】
血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルに関するイオン化放射線の効果を調査した。実施例１に記載した方法に従って、７Ｇｙのイオン化放射線への曝露前および２時間後または４８時間後のいずれかに、血清を野生型マウスから採取した。照射の２時間後（マウス１）または４８時間後（マウス２）のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の血清レベルを、α−Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を用いるスロットブロットおよび免疫ブロットを使用して処置前の初期レベルと比較した（図１０Ａ）。各血清試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を、各分析に含まれるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの標準曲線を使用して計算した。ローディング対照としてマウス血清アルブミンを使用した。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のドットブロットバンドを定量化し、血清アルブミンによって正規化した。照射後のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の相対的増加を示す（図１０Ｂ）。α−Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を有するマウス血清の等しい体積のウエスタンブロット分析により、照射後のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の増加も示された（図１０Ｃ）。
（実施例９）
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体および標識したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの使用は、脳および血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルがアルツハイマー病の指標であることを示す
【０３８２】
１カ月（若齢）および２４カ月（老齢）のマウス由来のマウス脳試料の細胞溶解物全体を、実施例１に記載した方法に従って、α−Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２、α−Ｈ１．０、α−γＨ２Ａ．Ｘおよびα−β−アクチン抗体を用いるウエスタンブロット分析によって比較した。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルは、２４カ月のマウスで上昇し、γＨ２Ａ．Ｘレベルの上昇と相関した（図１１Ａ）。
【０３８３】
さらなる研究をヒトの臨床試料で実行した。
【０３８４】
Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）およびＮｕｃｌｅａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＮＣＢ）からヒト血清を入手した。血清は３つの群に由来した：１）重要な医学的状態を有さない中年の健康なドナー（ｎ＝７、年齢の範囲＝３２〜３８歳）  ２）重要な医学的状態を有さない老齢の健康なドナー（ｎ＝９、年齢の範囲＝６３〜７６歳）  ３）臨床的に診断されたアルツハイマー病を有する老齢ドナー（ｎ＝１０、年齢の範囲＝７５〜１０３歳）。各ドナーのさらなる詳細は表４にある。
【表４】
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【０３８５】
２３歳（若齢）および／または６０歳を超える（老齢）健康な個体由来のヒト脳試料の細胞溶解物全体も、上述の抗体および方法を用いてウエスタンブロットにより分析した。表４は、脳組織ドナーの特性を提供する。図１１Ｂに示すように、年齢の高い個体はＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の発現の増加を示す。これらの結果は、生物年齢と共にＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２が増加することを示した。
【０３８６】
この研究の目的は、アルツハイマー病の予測性能のバイオマーカーとしての、血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の測定値および／またはＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対する血清抗体の測定値の有用性を実証することであった。新たな診断バイオマーカーの正しい予測能を保証するために、患者の階層化方法を開発し、その診断精度について試験した。試験の性能は、登録された参照標準（例えば、ＡＤの確定診断のために、アメリカ国立老化研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ）−アルツハイマー病協会（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）（ＮＩＡ−ＡＡ）によって推奨されるいくつかの試験の組合せ）と比較することによって評価した。この研究は、Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｃｃｕｒａｃｙ（ＳＴＡＲＤ）に従って設計し、実行した。統計分析は、診断精度パラメーター、交差検定、およびＹｏｕｄｅｎ指数の最適化を含んだ。患者の階層化戦略に従い、かつ分析の予測力を用いて、患者は、アルツハイマー病の発症の可能性を有する患者のカテゴリーとして階層化されうる。感度、特異性、陽性および陰性適中率（ＰＰＶおよびＮＰＶ）ならびに陽性および陰性尤度比（ＰＬＲおよびＮＬＲ）を各試験設計について示す。図１２Ａ〜１２Ｃ、図１３Ｂ、図１４Ｂ、図１４Ｅ、図１５Ａおよび図１５Ｂにおいて、ボックスプロットの中心線はメジアンを示し；ボックスの端はＲソフトウェアにより決定した２５および７５パーセンタイルを示し；ひげは２５および７５パーセンタイルから四分位範囲の１．５倍伸び、外れ値はドットで表し；データ点を白丸でプロットする。破線は、ＲＯＣ曲線（受診者動作特性曲線）分析によって計算される閾値を示す。感度、特異性、陽性および陰性適中率（ＰＰＶおよびＮＰＶ）ならびに陽性および陰性尤度比（ＰＬＲおよびＮＬＲ）を各試験設計について示す。統計方法は、患者の疾患の有無を予測する助けとなる。試験結果が疾患の試験前の確率を修正する程度は、ベイズの定理に基づく「尤度比」によって表現される。陽性尤度比（ＰＬＲ）は、試験が陽性である場合、疾患の確率がどの程度増加するかを表す。陰性尤度比（ＮＬＲ）は、試験が陰性である場合、疾患の確率がどの程度低下するかを表す。ＰＬＲが１より大きいことは、標的障害が存在する確率の増加を示し、ＰＬＲが１より小さいことは、標的障害が存在する確率の低下を示し、ＰＬＲが１であることは、試験によって疾患の確率が変化しないことを意味する。ＲＯＣ曲線、閾値および曲線下面積（ＡＵＣ）は、試験設計のそれぞれに対して示される。２×２マトリックス（ＴＰ、ＦＮ、ＦＰ、ＴＮ）における０という値は、比の計算を不可能にする可能性がある。これを制御するために０．５の「疑似カウント」を加えた。「疑似カウント」はどの値にも加えるため、相対値に影響を与えない。図１２Ａ〜１２Ｃ、図１３Ｂ、図１４Ｂ、図１４Ｅ、図１５Ａおよび図１５Ｂのボックスプロットの中心線はメジアンを示し；ボックスの端はＲソフトウェアにより決定した２５および７５パーセンタイルを示し；ひげは２５および７５パーセンタイルから四分位範囲の１．５倍伸び、外れ値はドットで表し；データ点���白丸でプロットする。
【０３８７】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルがアルツハイマー病の診断指標としての役割を果たすことができるかどうかを試験するために、ヒト血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを、実施例１に記載した方法に従って、α−Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を使用するスロットブロット分析によって定量化した。３０〜４０歳の（ｎ＝７）または６０歳を超える（ｎ＝９）健康な個体、および臨床的に診断されたアルツハイマー病を有する６０歳を超える個体（ｎ＝１０）由来の等しい体積の血清を分析した（表４は血清ドナーの特性を提供する）。
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベル
【０３８８】
図１２Ａ〜Ｃは、ヒト血清におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の検出（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）、天然に存在するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体の検出（図１３Ｂ）、および天然に存在するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体の検出（図１４Ａ〜Ｅ、図１５Ａ〜Ｂ）が、アルツハイマー病の早期診断に対するツールとして作用する可能性があることを示す。
【０３８９】
図１２Ａは、アルツハイマー病患者および年齢を一致させた対照における、スロットブロット分析によって決定したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの定量化を示す。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの定量化は、アルツハイマー病患者および年齢を一致させた対照においてスロットブロット分析によって決定した。各血清試料中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を、各分析に含まれるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドの標準曲線を使用して計算した。図１２Ａに示すように、アルツハイマー病患者は、健康な、年齢を一致させた対照よりも血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の低い濃度を示し、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の血清濃度は、健康な個体からアルツハイマー病を有する患者を有効に分離する可能性があり、アルツハイマー病検出の診断ツールとして作用できることを示した。表５に示すように、５．６１ｎｍｏｌ／ｍｌまたはそれ未満の血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の濃度の測定値は、試験前の確率と比較して、２４％の可能性で疾患の存在を示し、陽性尤度比（ＰＬＲまたはＬＲ＋）は３．６である。試験後の確率は、以下の式に基づいて計算される：試験前オッズ×ＬＲ／（１＋試験前オッズ×ＬＲ）（式中、試験前オッズは、試験前の疾患の存在の臨床上の疑いである）。試験後の確率は、通常、Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒａｔｉｏ  ＮｏｍｏｇｒａｍまたはＦａｇａｎ  Ｎｏｍｏｇｒａｍ（NEJM  １９７５年；２９３巻：２５７頁）から計算される。
【表５】
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【０３９０】
図１２Ｂは、総ＩｇＧ血清レベルによって正規化したヒト血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを示す。ヒト血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを総ＩｇＧ血清レベルによって正規化するために、総ＩｇＧレベルを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して、各血清試料についてスロットブロット分析によって決定した。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度は、各試料において実測したＩｇＧレベルによって正規化した。図１２Ｂにおいて示すように、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルは、健康な若齢個体（３０〜４０歳）に対して、健康な６０歳を超える個体で上昇したが、アルツハイマー病を有する患者は、健康な老齢個体（６０歳を超える）に対して、有意に低いＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の正規化レベルを示す。箱グラフの左の部分は、前駆アルツハイマー病の診断または軽度認知障害（ＭＣＩ）を有さない患者である。箱グラフの右の部分は、アルツハイマー病病理の死亡後の確認を有する患者を示す。表６は、ＲＯＣ分析に由来する値を示す。
【表６】
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【０３９１】
図１２Ｃは、総タンパク質レベルによって正規化したヒト血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを示す。ヒト血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルを総タンパク質レベルによって正規化するために、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、各試料について、総血清タンパク質を測定した。次いで、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を、各試料中の測定したタンパク質濃度によって正規化した。図１２Ｃに示すように、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルは、健康な６０歳を超える老齢個体で上昇したが、アルツハイマー病を有する患者は、健康な老齢個体（６０歳を超える）に対して、有意に低いＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の正規化レベルを示した。図１２Ｃは、血清の総タンパク質組成に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の血清学的定量化を示す。表７は、４．７６×１０−４未満の血清中の総タンパク質に対するＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗原の比が、試験前の確率と比較して、２４．８％の可能性で疾患の存在を示し、ＰＬＲは３．００である。
【表７】
2019521953.tif 000015
【０３９２】
Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の血清濃度は、アルツハイマー病患者の特定に十分であるが、総ＩｇＧ（図１２Ｂ）または総タンパク質（図１２Ｃ）による血清試料の正規化の使用は、血清を得るために使用されるプロトコール、操作者の変化、患者の水分補給状態および患者の活動状態などの、全体の血清濃度を変える可能性がある変数にかかわらず、個体間の直接的な比較を可能とする。ＩｇＧはヒト血清中に非常に豊富に存在し、血清タンパク質の約１１％に相当する。したがって、ＩｇＧは、血清濃度の指標として作用することができ、患者間を正規化するために使用されてもよい。総血清タンパク質は、血清濃度の直接的指標を与え、患者間のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の濃度を正規化するために使用されてもよい。それぞれの例では、正規化したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルが、健康に老化すると（６０歳を超える）増加することが観察された。アルツハイマー病の血清Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルは、年齢を一致させた対照よりも有意に低く、通常の正規化手順を用いると、観察される傾向は変わらないが、血清採取および処理の手順、または患者の血清の基礎濃度レベルの差異にかかわらず、患者間のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの直接的な比較が可能となることが示された。
抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体）レベル
【０３９３】
図１３Ａは、ヒト抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧが、間接的ＥＬＩＳＡ法を使用して様々なヒトの生体液中で検出される可能性があることを示す。ヒトの血漿、尿、および唾液は、それぞれ、間接的ＥＬＩＳＡ試験および標識したＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを使用して、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ自己抗体に対して試験した。血漿濃度と４５０ｎｍで測定したＯ．Ｄ．の間の線形関係を、血漿をローディング緩衝液中で５００倍、１０００倍、および２０００倍に希釈した際に検出した。同様に、尿および唾液の濃度と４５０ｎｍで測定したＯ．Ｄ．の間の線形関係を、これらの流体をローディング緩衝液中で８０倍および１６０倍に希釈した際に検出した。このことは、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの間接的ＥＬＩＳＡ試験が多様なヒトの生体液中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧを検出する有用性を有することを示唆する。
【０３９４】
関連する実験では、ヒト血清中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルを、ビオチン化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２捕捉ペプチド（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体結合ペプチド）、続いて、ＩｇＧ自己抗体に特異的な二次抗体を使用する間接的ＥＬＩＳＡ分析によって定量化した。３０〜４０歳の（ｎ＝７）または６０歳を超える（ｎ＝９）健康な個体、および６０歳を超える、臨床的に診断されたアルツハイマー病を有する個体（ｎ＝１０）由来の等しい体積の血清を分析した（図１３Ｂ）。
【０３９５】
図１３Ｂは、アルツハイマー病患者および年齢を一致させた対照における間接的ＥＬＩＳＡによって決定した自己抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルの定量化を示す。各血清試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの濃度（間接的ＥＬＩＳＡによって決定した自己抗体ＩｇＧレベル）を、図１２Ｅに示すＥＬＩＳＡ実験に含まれるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２特異的抗体の連続希釈により作成した標準曲線を使用して計算した。アルツハイマー病患者は、健康な、年齢を一致させた対照よりも血清抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの高い濃度を示す。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの血清濃度は、健康な個体からアルツハイマー病を有する患者を有効に分離する可能性があり、アルツハイマー病検出の診断ツールとして作用できる。表８に示すように、８．２３ｕｇ／ｍｌに等しいまたはそれより高い濃度の自己抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の測定値は、試験前の確率と比較して、３０％の可能性で疾患の存在を示し、ＰＬＲは５．４である。図１３Ｂは、ヒト血清中のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体の定量化のための標準曲線を示す。総血清タンパク質は、ブラッドフォードアッセイを使用して各試料について測定した。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ濃度は、各試料中の測定したタンパク質濃度によって正規化した。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルは、健康な若齢個体（３０〜４０歳）に対して、健康な６０歳を超える個体で低下する。アルツハイマー病を有する患者は、健康な老齢個体（６０歳を超える）に対して、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧの正規化レベルの上昇を示す。
【表８】
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抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ自己抗体）レベル
【０３９６】
別の関連する実験では、ヒト血清中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルを、ビオチン化Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２捕捉ペプチド（Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２自己抗体結合ペプチド）、続いて、ＩｇＭ抗体に特異的な二次抗体を使用する間接的ＥＬＩＳＡ分析によって定量化した（体積によって正規化した）。６０歳を超える健康な個体（ｎ＝９）、および６０歳を超える、臨床的に診断されたアルツハイマー病を有する個体（ｎ＝１０）由来の等しい体積の血清を分析した（図１４Ｅの生データ；図１５Ａの総ＩｇＭレベルに対して正規化したデータ）。
【０３９７】
以下の表９は、間接的ＥＬＩＳＡ分析に由来し、図１４Ｄ〜１４Ｅでさらに分析された生データを示す。ＥＬＩＳＡは、各患者試料について三連で実施した。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ濃度を、図１４Ｄに示す標準曲線から、各複製について計算した。各試料に対する抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの濃度の平均は、３つの技術的複製から計算した。３つの技術的複製間の試料の標準偏差も計算した。複製間の実施形態の係数は、ＣＶ％＝標準偏差／平均×１００％として計算した。
【０３９８】
抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の標準曲線は利用可能でなかったため、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧ抗体を使用して標準曲線を創出した（図１４Ｄ）。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧのモル濃度を、４５０ｎｍでＯＤに対してプロットした。次いで、曲線を使用して、各試料中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭのモル濃度を推測した。
【表９】
2019521953.tif 000017
【０３９９】
図１４Ｅは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＧ自己抗体の測定値の有用性を実証する（図は生データを示す）。左のパネルは、全体的な予測性能を評価し、最適閾値のカットオフ値を選ぶために使用して、陽性および陰性の試験結果を区別するＲＯＣ曲線分析を示す。各可能な閾値におけるパーセント特異性と感度の間の関係を示すようにプロットして、経験上のＲＯＣ曲線（実線）を創出する。経験上のＲＯＣ曲線を使用して、右のパネルに描写した最適閾値のカットオフ値を計算した。最適閾値は、経験上のＲＯＣ曲線に灰色のドットとして示す。図１４Ｅの右のパネルは、アルツハイマー病を有する患者と有さない患者（神経学的対照）の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの濃度のボックスプロット分布を示す。すべての試料に対する個々の測定値をドットで示し、ボックスプロットは、上位四分位数、下位四分位数、ならびに上位四分位数および下位四分位数から、外れ値でない最大および最小の点までの距離と共に、それぞれの分布について示されている。閾値のカットオフ（破線）より上の試料は、試験に対して陽性であるとみなされる。閾値のカットオフより下の試料は、試験に対して陰性であるとみなされる。図１４Ｅの下の２×２のマトリックスは、分布が４つの群に分割される場合があることを示す：真の陽性（ＴＰ；指数が正であり、ＡＤが存在する）；偽陽性（ＦＰ；指数が正であるが、ＡＤは存在しない）；真の陰性（ＴＮ；指数が負であり、ＡＤが存在しない）；および偽陰性（ＦＮ；指数が負であるが、ＡＤが存在する）。各群内にある試料数を２×２マトリックスにプロットした。
【０４００】
以下の表１０は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの試験性能の評価を生データとして示す。
【表１０】
2019521953.tif 000018
【０４０１】
以下の表１１は、間接的ＥＬＩＳＡ分析に由来し、図１５Ａ、図１５Ｂでさらに分析された正規化データ（総ＩｇＭレベルによって正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ）を示す。ＥＬＩＳＡは、各患者の試料に対して三連で実施した。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの濃度を、図１４Ｄに示す標準曲線から各複製について計算し、試料中で測定した総ＩｇＭ濃度の平均によって正規化した（図１４Ｂ）。各試料に対する平均の、正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの濃度は、３つの技術的複製から計算した。３つの技術的複製の間の試料の標準偏差も計算した。複製間の実施形態の係数は、ＣＶ％＝標準偏差／平均×１００％として計算した。
【表１１】
2019521953.tif 000019
【０４０２】
図１５Ａは、アルツハイマー病のバイオマーカーとしてのＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２に対するＩｇＭ自己抗体の測定値の有用性を実証する（図は正規化したデータを示す）。左のパネルは、全体的な予測性能を評価し、最適閾値のカットオフ値を選ぶために使用して、陽性および陰性の試験結果間を区別するＲＯＣ曲線分析を示す。各可能な閾値におけるパーセント特異性と感度の間の関係を示すようにプロットして、経験上のＲＯＣ曲線（実線）を創出する。経験上のＲＯＣ曲線を使用して、右のパネルに描写した最適閾値のカットオフ値を計算した。最適閾値は、経験上のＲＯＣ曲線に灰色のドットとして示す。図１５Ａの右のパネルは、アルツハイマー病を有する患者および有さない患者（神経学的対照）の正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭの濃度のボックスプロット分布を示す。すべての試料に対する個々の測定値をドットで示し、ボックスプロットを各分布について示す。ボックスプロットは、上位四分位数、下位四分位数、ならびに上位四分位数および下位四分位数から、外れ値でない最大および最小の点までの距離と供に、中央値を示す。閾値のカットオフ（破線）より上の試料は、試験に対して陽性であるとみなされる。閾値のカットオフより下の試料は、試験に対して陰性であるとみなされる。図１５Ａの下の２×２のマトリックスは、分布が４つの群に分割される場合があることを示す：真の陽性（ＴＰ；指数が正であり、ＡＤが存在する）；偽陽性（ＦＰ；指数が正であるが、ＡＤは存在しない）；真の陰性（ＴＮ；指数が負であり、ＡＤが存在しない）；および偽陰性（ＦＮ；指数が負であるが、ＡＤが存在する）。各群内にある試料数を２×２マトリックスにプロットした。図１５Ｂは、試験の特徴が、実験室の設定および異なる操作者によって変動しないことを実証する。
【０４０３】
以下の表１２は、抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ／総ＩｇＭの試験性能の評価を示す。
【表１２】
2019521953.tif 000020
【０４０４】
この試験の結果は、疾患の確率を、試験前の１０％から試験後の６３％まで修正する。陽性尤度比（ＬＲ＋）は１５．０（９５％ＣＩ：０．９８、２２９）であり、陽性適中率（ＰＰＶ）は９４％（９５％ＣＩ：５３、１００）である。陰性尤度比（ＬＲ−）は０．２６（９５％ＣＩ：０．０９、０．７８）であり、陰性適中率は７９％（９５％ＣＩ：４７、９５）である。
対照
【０４０５】
図１４Ｂは、標準曲線を示す：ヒトＩｇＧ希釈系列のモル濃度を、４５０ｎｍのＯＤに対してプロットした。次いで、曲線を使用して、各試料中の総ＩｇＭのモル濃度を外挿法により推定した。
【０４０６】
以下の表１３は、総ＩｇＭのＥＬＩＳＡからのデータを示す。ＥＬＩＳＡは、各患者の試料に対して三連で実施した。総ＩｇＭのモル濃度は、図１４Ｂに示した標準曲線から、各複製について計算した。各試料に対する総ＩｇＭのモル濃度の平均を３つの技術的複製から計算した。３つの技術的複製の間の試料の標準偏差も計算した。複製間の実施形態の係数は、ＣＶ％＝標準偏差／平均×１００％として計算した。
【表１３】
2019521953.tif 000021
【０４０７】
図１４Ｂは、総ＩｇＭレベルが、アルツハイマー病を有する個体と有さない個体を識別しないことを実証する。すべての試料に対する個々の測定値をドットで示し、ボックスプロットは各分布について示す。ボックスプロットは、上位四分位数、下位四分位数、ならびに上位四分位数および下位四分位数から、外れ値でない最大および最小の点までの距離と共に、中央値を示す。
【０４０８】
図１６Ａは、患者の試料中の総ＩｇＭレベルと抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルの間に相関がないことを実証する。すべての患者の試料を、測定した総ＩｇＭ濃度に対する測定した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭ濃度に基づく散布図に分布させた。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルは、低いＲ２値によって証明されるように、患者の血清中の総ＩｇＭレベルに影響されない。
【０４０９】
図１６Ｂは、総非修飾Ｈ１．０タンパク質レベル（左のグラフ）と総抗Ｈ１．０  ＩｇＭレベルがアルツハイマー病を有する個体と有さない個体を識別しないことを実証する。左のパネルでは、カスタム化学発光スロットブロットイムノアッセイを使用して、アルツハイマー病および対照患者の血清試料における総Ｈ１．０（非修飾）レベルを測定した。右のパネルでは、間接的ＥＬＩＳＡを使用して、患者の血清中のＨ１．０の非修飾ペプチドに対するＩｇＭ自己抗体を測定した。非修飾Ｈ１．０ペプチドに対するＩｇＭ自己抗体のレベルに統計的に有意な差は存在せず（ｐ＝０．７２）、アルツハイマー病に対する診断の有用性が、患者の血清中の抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭに特有であることを示した。すべての試料に対して、両方のパネルに対する相対的な測定値をドットで示し、ボックスプロットは各分布について示す。ボックスプロットは、上位四分位数、下位四分位数、ならびに上位四分位数および下位四分位数から、外れ値でない最大および最小の点までの距離と共に、中央値を示す。
抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＩｇＭレベルの相関
【０４１０】
図１７は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧおよびＩｇＭ自己抗体を測定することにより、アルツハイマー病を有する患者を別個の集団へと階層化できることを実証する。抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルをアルツハイマー病患者の試料中で測定し、これらを総ＩｇＧレベルによって正規化した。次いで、散布図によって、アルツハイマー病患者の試料中の正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＭレベルの、これらの正規化した抗Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２  ＩｇＧレベルとの相関を調べた。この分析により、アルツハイマー病患者を別個の集団へと階層化することが可能となる。図１７で７５、７７、９４、および７８とマークした患者は、任意のアルツハイマー病処置に応答する傾向がある。図１７で９０、９１、９３、８３、および１０３とマークした患者は、特定のアルツハイマー病処置にのみ、例えば、非免疫調節性アルツハイマー病処置にのみ応答する傾向がある。
（実施例１０）
ラパマイシンおよびその誘導体が、ＤＮＡ損傷後の細胞質内におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の蓄積をブロックする
【０４１１】
ラパマイシン誘導体がＤＮＡ損傷の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現をブロックする可能性があるかどうかを試験するために、ＳＲ  ｈＡＤＳＣを、ラパマイシンまたはエベロリムス（ラパマイシンの誘導体）による２４時間の前処理ありまたはなしで、ブレオマイシンで２時間処理した。次いで、実施例１に記載した方法に従って、細胞を溶解させて、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２、γＨ２Ａ．Ｘおよびβ−アクチンについてウエスタンブロットにより分析した。図１８に示すように、ラパマイシンとエベロリムスの両方がブレオマイシン処理の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現を低減し、エベロリムスもＤＮＡ損傷の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現をブロックする可能性があることを示唆する。
【０４１２】
ＳＲ  ｈＡＤＳＣを、塩基除去修復経路を誘発する化合物である、ブレオマイシンまたはテモゾロミドにより２時間処理した。次いで、細胞を溶解させて、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２、γＨ２Ａ．Ｘおよびβ−アクチンについてウエスタンブロットにより分析した。図１９に示すように、ブレオマイシンとテモゾロミドの両方が、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のメチル化を誘導することができた。
（実施例１１）
ｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＤＮＡ損傷後のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の蓄積をブロックする
【０４１３】
図２０は、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２動態に対するｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋ阻害剤の効果を示す。ＳＲ  ｈＡＤＳＣを、化学阻害剤であるｍＴＯＲ１、ｍＴＯＲ２および／またはＰＩ３Ｋによる２４時間の前処理ありまたはなしで、ブレオマイシンで２時間処理した。細胞を溶解させ、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２、Ｈ１．０全体、γＨ２Ａ．ＸおよびヒストンＨ４全体についてのウエスタンブロットによる分析のためにクロマチン抽出した。使用した薬物濃度、および各薬物に対する特異的な阻害標的を薬物名の次に与える。試験したすべての阻害剤は、ブレオマイシン処理の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現を低減することができた。
（実施例１２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧ９Ａによるメチル化および生成物の分析
【０４１４】
図２１Ａ〜２１Ｂは、このｉｎ  ｖｉｔｒｏＧ９Ａメチル化アッセイの結果を示す。
【０４１５】
Ｈ１．０ペプチドをメチル化することができるＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ（図２１Ａ）。次に、メチル化反応をゲル上で分解し、オートラジオグラフィーにより可視化した。４ｋＤａでのバンドの出現は、トリチウム標識したメチル基がペプチドに移行することにより、Ｇ９ＡメチルトランスフェラーゼがＨ１．０ペプチドをメチル化でき、これにより可視化が可能となることを示す。Ｈ１．０ペプチドを欠く対照反応は、トリチウム標識した生成物を生じなかった。
【０４１６】
全長組換えＨ１．０をメチル化することができるＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ（図２１Ｂ）。Ｇ９Ａの量の増加を伴う組換え全長ヒストンＨ１．０のｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化アッセイを図２１Ｂに示す。Ｇ９Ａは、Ｋ１８０において全長Ｈ１．０をジメチル化することができる。
【０４１７】
非修飾Ｈ１．０ペプチド（ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号３６））に関するＧ９Ａメチル化の正確な位置を特定するために、メチル化反応をセットアップし、ＬＣ−ＭＳにより生成物を特定した。メチル化反応は、組換えＧ９Ａ、標識されていないメチルドナー（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、および非修飾Ｈ１．０ペプチドを含んだ。次に、メチル化反応をＬＣ−ＭＳにより分析し、各スペクトルピーク（最終反応のペプチド種に対応する）を特定し、スペクトルカウントを使用して定量化した。図２２Ａにおける「ｍｅ」の円の数は、リシン残基のメチル化状態（モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）を表す。図２２Ａは、非メチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、Ｇ９Ａが特異的かつ多量にＨ１．０Ｋ１８０をジメチル化する（すべてのペプチドの９９．９％）ことを示す。
【０４１８】
より具体的には、データは、Ｇ９Ａは、リシンＫ１８０をジメチル化するが、同一のペプチド断片に存在する他のリシン（Ｋ１６６、Ｋ１７４、Ｋ１７５またはＫ１７７）をジメチル化しないことを実証し、メチル化の効率は約９９％と推定された（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。Ｈ１．０ペプチドのリシン１８０に対する、Ｇ９Ａによるメチル化の感受性および特異性をさらに対象とするために、Ｋ１８０ｍｅ２ペプチド（Ｈ１．０  ＡＡ１６５〜１８２）を、同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化実験の基質として使用した。図２２Ｂ、図２３に示すように、さらにメチル化されたペプチドはごくわずかの量しか検出されなかった：Ｈ１．０Ｋ１６６ｍｅ１Ｋ１８０ｍｅ２（反応における全ペプチドの１．２７％）、Ｈ１．０Ｋ１７４ｍｅ１Ｋ１８０ｍｅ３（反応における全ペプチドの１．０６％）およびＨ１．０Ｋ１７４ｍｅ３Ｋ１７５ｍｅ３Ｋ１７７ｍｅ１Ｋ１８０ｍｅ２（反応における全ペプチドの０．３５％）。
【０４１９】
全長Ｈ１．０タンパク質に関するＧ９Ａメチル化の正確な位置を特定するために、メチル化反応をセットアップし、ＬＣ−ＭＳにより生成物を特定した。メチル化反応は、組換えＧ９Ａ、標識されていないメチルドナー（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、および組換えヒトＨ１．０タンパク質を含んだ。次に、メチル化反応をＬＣ−ＭＳにより分析し、メチル化の部位を特定した。図２４における「ｍｅ」の円の数は、リシン残基のメチル化状態（モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）を表す。図２４は、組換え全長Ｈ１．０の存在下で、Ｇ９Ａが、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含むＣ末端リシン残基をメチル化することを示す。
（実施例１３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＬＰによるメチル化および生成物の分析
【０４２０】
非修飾Ｈ１．０ペプチド（ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫＰＫ（配列番号３６））でのＧＬＰメチル化の正確な位置を特定するために、メチル化反応をセットアップし、生成物をＬＣ−ＭＳにより特定した。メチル化反応は、組換えＧＬＰ、標識されていないメチルドナー（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、および非修飾Ｈ１．０ペプチドを含んだ。次に、メチル化反応をＬＣ−ＭＳによって分析し、各スペクトルピーク（最終反応におけるペプチド種に対応する）を特定し、スペクトルカウントを使用して定量化した。図２５における「ｍｅ」の円の数は、リシン残基のメチル化状態（モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）を表す。図２５は、非メチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、ＧＬＰがＨ１．０Ｋ１８０を特異的にジメチル化する（すべてのペプチドの９６．６％）ことを示す。
【０４２１】
Ｋ１８０ジメチル化Ｈ１．０ペプチド（ＡＫＰＶＫＡＳＫＰＫＫＡＫＰＶＫ（ｍｅ２）ＰＫ（配列番号３））でのＧＬＰメチル化の正確な位置を特定するために、メチル化反応をセットアップし、生成物をＬＣ−ＭＳにより特定した。メチル化反応は、組換えＧＬＰ、標識されていないメチルドナー（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、およびＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２ペプチドを含んだ。次に、メチル化反応をＬＣ−ＭＳによって分析し、各スペクトルピーク（最終反応におけるペプチド種に対応する）を特定し、スペクトルカウントを使用して定量化した。図２６における「ｍｅ」の円の数は、リシン残基のメチル化状態（モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）を表す。図２６は、Ｋ１８０ジメチル化Ｈ１．０ペプチドの存在下で、ＧＬＰはＨ１．０Ｋ１８０およびＨ１．０Ｋ１７４をさらにメチル化するだけであり、さたその効率は非常に低い（ペプチドの１．０２％がさらにメチル化される）ことを示す。
【０４２２】
全長Ｈ１．０タンパク質でのＧＬＰメチル化の正確な位置を特定するために、メチル化反応をセットアップし、生成物をＬＣ−ＭＳにより特定した。メチル化反応は、組換えＧＬＰ、標識されていないメチルドナー（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）、および組換えヒトＨ１．０タンパク質を含んだ。次に、メチル化反応をＬＣ−ＭＳによって分析し、メチル化の部位を特定した。図２７における「ｍｅ」の円の数は、リシン残基のメチル化状態（モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）を表す。図２７は、組換え全長Ｈ１．０の存在下で、本明細書に記載されている条件下で、ＧＬＰが全長Ｈ１．０をメチル化しないことを示す。ＧＬＰは、本明細書において提供される条件下で、Ｇ９Ａの特異性を欠く、Ｈ１．０のＣ末端テールの多数のリシン残基をメチル化する。
（実施例１４）
ｈＡＤＳＣにおけるＧ９ＡのｓｉＲＮＡノックダウン
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
【０４２３】
Ｇ９Ａを標的とするよう設計したｓｉＲＮＡプールはＱｉａｇｅｎ（ＧＳ１０９１９）から入手し、無作為にスクランブルしたｓｉＲＮＡプールはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（４３９０８４３）から入手した。ｓｉＲＮＡプールは、製造業者のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、自己複製ｈＡＤＳＣにトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間後に細胞を採取し、ｑＰＣＲまたはウエスタンブロットによって分析した。
ｑＰＣＲ
【０４２４】
細胞培養物をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡはＱｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｒｔｏｇｅｎ）で定量化し、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩを使用して逆転写した。定量的ＰＣＲ分析を、製造業者のプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従い、約５ｎｇのｃＤＮＡ、１μＭの指定されたプライマー対およびＦａｓｔ−ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒミックスを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７７００配列検出器を使用して三連で実施した。プライマー対は以下に列挙する。各遺伝子に対する平均サイクル閾値（Ｃｔ）を、同一試料中のベータ−アクチンのレベル（デルタＣｔ）に対して正規化した。対合していない２つの試料のｔ検定を使用して、処置群間の平均デルタＣｔ値の差を決定した。該当する場合、デルタ−デルタＣｔ方法により倍数変化を計算した（倍数＝２ΔΔＣｔ）。
【表１４】
2019521953.tif 000022
結果
【０４２５】
自己再生（ＳＲ）ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＤＳＣ）にスクランブルした対照ｓｉＲＮＡまたはＧ９Ａを標的とするｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。次いで、細胞を２時間のブレオマイシン処理に供した。ウエスタンブロット分析により、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧ９ＡノックダウンによりＤＮＡ損傷の際のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の出現の低減が生じることが示された。Ｇ９Ａの公知のメチル化生成物であるＨ３Ｋ９ｍｅ２を使用して、ノックダウンの際のＧ９Ａ活性の損失をモニターした（図２８Ａ）
【０４２６】
ｈＡＤＳＣにおけるＧ９ＡのｓｉＲＮＡノックダウンにより、Ｇ９Ａによってもたらされる公知のＰＴＭであるＨ３Ｋ９ｍｅ２の低減に付随して、２時間のブレオマイシン処理の際（ＡＤＤ）のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２レベルの有意な低減がもたらされた（図２８Ｂ）。
（実施例１５）
バルクでのｉｎ  ｖｉｔｒｏでメチル化されたＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２タンパク質またはペプチドの生成
【０４２７】
図２１Ｂおよび図２４で観察されたように、Ｇ９Ａは、全長組換えヒトＨ１．０のＫ１８０を効率的かつ特異的にジメチル化することができる。生体試料におけるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２の検出のための参照標準として、ＥＬＩＳＡキット（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡキット）に組み込むことができる多量のＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２全長タンパク質を創出するために、このプロセスを利用してもよい。このプロセスは、１×ＨＭＴ反応緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのジチオトレイトール、ｐＨ９．０）、組換えヒトまたはマウスＧ９Ａメチルトランスフェラーゼ、３．２ｍＭのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、およびＮ末端タグ（ＨＡ、Ｈｉｓ、ＧＳＴ、ＦＬＡＧまたは下流での精製に適切な他のタグ）で標識した組換え全長ヒトＨ１．０を含むバルクメチル化反応をセットアップすることを含む場合がある。反応は、Ｇ９Ａにより媒介されるＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のメチル化が可能となるように、３７℃で１時間インキュベートされうる。
【０４２８】
次いで、Ｋ１８０ｍｅ２を含有する全長Ｈ１．０は、１または２ステッププロセスで濃縮され、精製される。第１に、反応におけるすべての全長組換えＨ１．０種は、Ｎ末端タグを利用して、親和性精製により、反応混合物から精製される。一例では、Ｈ１．０はＨＡタグで標識され、カラムまたは樹脂に固定されたＨＡ抗体で精製されうる。精製後、必要であれば、タンパク質分解による切断を介して、タグを除去できる。このプロセスは、最終生成物中の全長Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２のみを濃縮し、捕捉および検出エピトープの両方が存在したことを保証する。第２のステップは、Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２を含有する全長Ｈ１．０種のみをさらに精製するために、カラムまたは樹脂に固定されたＨ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体を利用する。次いで、この最終生成物を濃縮し（例えば、凍結乾燥を使用して）、定量化して、参照標準としてＥＬＩＳＡキットに含めるか、または治療薬として使用することができる。Ｈ１．０Ｋ１８０ｍｅ２抗体の精製のみを利用するワンステップ精製アプローチで十分な場合もある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ−Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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