(57)【要約】  本開示は、一般に、組換え宿主細胞において目的の分子を産生するのに適したウイルス系の発現系に関する。本開示は、特に、元々のウイルス配列の少なくとも一部を欠く、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む核酸構築物（例えば発現ベクター）に関する。本開示には、異種ポリペプチドをコードする１つまたは複数の発現カセットを含むウイルス系発現ベクターも含まれる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、異種ポリペプチドの調整可能な様式での発現を可能にするように、ウイルスゲノム上の規定された位置に構成され、配置される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子であって、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、核酸分子。
【請求項２】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、さらに、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａおよびＯＲＦ５のうち１つまたは複数をコードする配列の少なくとも一部を欠いている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記配列フラグメントが、ＯＲＦ７のＡＴＧ開始コドンを欠いている、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、さらに、ＯＲＦ６をコードする配列の一部を欠いている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ６のＡＴＧ開始コドンを欠いている、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、さらに、ＴＲＳ７を欠いているか、または変異ＴＲＳ７を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、非ネイティブ部位に位置する１つまたは複数のサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含み、１つまたは複数のｓｇプロモーターはそれぞれ、転写制御配列（ＴＲＳ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、ｓｇプロモーター１、ｓｇプロモーター２、ｓｇプロモーター３、ｓｇプロモーター４、ｓｇプロモーター５、ｓｇプロモーター６、ｓｇプロモーター７およびこれらの変異体からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列を含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、改変ｓｇプロモーターである、請求項７〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、それぞれのネイティブ部位に位置する１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターを含み、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターはそれぞれ、ＴＲＳを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、改変ｓｇプロモーター７である、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、それぞれのｓｇプロモーター配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造の形成に必要な一次配列内に位置する１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、ＴＲＳの配列内に位置するヌクレオチド改変を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、リーダーＴＲＳまたはその変異体を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、ボディＴＲＳまたはその変異体を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のＴ７変異転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、Ｇ３１８８Ａおよびこれら任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド置換を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、またはこれらの変異体である、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが不活性化されている、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つに隣接して操作可能に配置された１つまたは複数のスペーサー領域をさらに含む、請求項７〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つが、前記ｓｇプロモーターに対してすぐ横の３’に配置されている、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つが、前記ｓｇプロモーターに対してすぐ横の５’に配置されている、請求項２１〜２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のスペーサー領域は、約２０〜４００ヌクレオチド長である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２５】
１つまたは複数の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットはそれぞれ、異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したｓｇプロモーターを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
前記ｓｇプロモーターが、ＴＲＳと、ＴＲＳに対してすぐ横の５’に配置された第１のフランキング領域と、ＴＲＳに対してすぐ横の３’に配置された第２のフランキング領域とを含み、前記第１のフランキング領域は、約５〜４００ヌクレオチド長であり、前記第２のフランキング領域は、約１５〜１１５ヌクレオチド長である、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
２個、３個、４個、５個または６個の発現カセットを含む、請求項２５〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２８】
前記異種ヌクレオチド配列が、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２９】
ＧＯＩのコード配列が、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現のために最適化されている、請求項２８に記載の核酸分子。
【請求項３０】
ＧＯＩのコード配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造が、改良されたＲＮＡ複製のために最適化されている、請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記アルテリウイルスが、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）からなる群から選択される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記アルテリウイルスが、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ＥＡＶ毒性ビューサイラス株（ＶＢＳ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
核酸であって、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、
さらに、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、核酸。
【請求項３４】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、配列番号３に対して少なくとも約８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の核酸分子。
【請求項３６】
請求項１〜３５および７４〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項３７】
前記組換え細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項３６に記載の組換え細胞。
【請求項３８】
前記組換え細胞が、動物細胞である、請求項３６に記載の組換え細胞。
【請求項３９】
前記動物細胞が、脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞である、請求項３８に記載の組換え細胞。
【請求項４０】
前記組換え細胞が、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ウサギ腎臓細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト類表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞およびマウス３Ｔ３細胞からなる群から選択される、請求項３６に記載の組換え細胞。
【請求項４１】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物。
【請求項４２】
目的のポリペプチドを産生するための方法であって、核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、前記核酸が、
ｉ．改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードし、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、ヌクレオチド配列と、
ｉｉ．それぞれが目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、１つまたは複数の発現カセットとを含む、方法。
【請求項４３】
被験体において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、核酸を前記被験体に投与することを含み、前記核酸が、
ｉ．改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードし、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、ヌクレオチド配列と、
ｉｉ．それぞれが目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、１つまたは複数の発現カセットとを含む、方法。
【請求項４４】
前記被験体が、脊椎動物または無脊椎動物である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｓｇプロモーターが、ＴＲＳと、ＴＲＳに対してすぐ横の５’に配置された第１のフランキング領域と、ＴＲＳに対してすぐ横の３’に配置された第２のフランキング領域とを含み、前記第１のフランキング領域は、約５〜４００ヌクレオチド長であり、前記第２のフランキング領域は、約１５〜１１５ヌクレオチド長である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、さらに、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａおよびＯＲＦ５のうち１つまたは複数をコードする配列の一部を欠いている、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記配列フラグメントが、ＯＲＦ７のＡＴＧ開始コドンを欠いている、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、さらに、ＯＲＦ６をコードする配列の一部を欠いている、請求項４２〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ６のＡＴＧ開始コドンを欠いている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、さらに、ＴＲＳ７を欠いているか、または変異ＴＲＳ７を含む、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つが、ｓｇプロモーター配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造の形成に必要な一次配列内に導入された少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む改変ｓｇプロモーターを含む、請求項４２〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つが、ＴＲＳの配列内に導入された少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む改変ｓｇプロモーターを含む、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つが、リーダーＴＲＳまたはその変異体を含む、請求項４２〜５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つが、ボディＴＲＳまたはその変異体を含む、請求項４２〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列を含む、請求項４２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、Ｇ３１８８Ａおよびこれら任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド置換を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列を含む、請求項４２〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、またはこれらの変異体である、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
前記１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つに隣接して操作可能に配置された１つまたは複数のスペーサー領域をさらに含む、請求項４２〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つが、前記ｓｇプロモーターに対してすぐ横の３’に配置されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つが、前記ｓｇプロモーターに対してすぐ横の５’に配置されている、請求項５９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つまたは複数のスペーサー領域は、それぞれ約２０〜４００ヌクレオチド長である、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸が、２個、３個、４個、５個または６個の発現カセットを含む、請求項４２〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
目的の遺伝子のコード配列が、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現のために最適化されている、請求項４２〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
目的の遺伝子のコード配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造が、改良されたＲＮＡ複製のために最適化されている、請求項４２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記アルテリウイルスが、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）からなる群から選択される、請求項４２〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記アルテリウイルスが、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ＥＡＶ毒性ビューサイラス株（ＶＢＳ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記核酸が、
改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号１に対して少なくとも８０％以上の配列同一性、配列番号２に対して少なくとも８０％以上の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、請求項４２〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、配列番号３に対して少なくとも約８０％以上の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記目的の遺伝子（ＧＯＩ）が、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４２〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補給用ポリペプチド、工業用酵素およびレポーターポリペプチドからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調整剤およびサイトカインからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
請求項４２〜７３のいずれか一項に記載の方法によって産生される組換えポリペプチド。
【請求項７５】
請求項７４に記載の組換えポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７６】
請求項１〜３５および７８〜８０のいずれか一項に記載の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７７】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の組換え細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項７８】
核酸であって、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４０に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、
さらに、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、核酸。
【請求項７９】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、配列番号４２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む、請求項７８に記載の核酸分子。
【請求項８０】
前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む、請求項７８に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／３２２，１４９号に対する優先権を主張し、その開示内容は、全体的に本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の援用
添付の配列表の資料は、この出願に参照により組み込まれる。添付の配列表のテキストファイル（ファイル名「ＳＧＩ０１０ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ」）は、２０１７年３月１３日に作成され、２４０ＫＢである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用するコンピュータで、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用して評価することができる。
【背景技術】
【０００３】
近年、動物ウイルスのいくつかの異なる群に対し、相同組換えによって、またはそれぞれのゲノムの直接的な操作によって、遺伝子操作が行われてきた。ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルス両方のための逆遺伝学的な系の利用可能性は、ワクチン、発現ベクター、抗腫瘍薬、遺伝子治療ベクターおよび薬物送達ビヒクルとしての組換えウイルスの使用のための新たな展望を生み出した。
【０００４】
例えば、培養された組換え細胞における異種タンパク質の発現のために多くのウイルス系の発現ベクターが用いられてきた。例えば、宿主細胞における遺伝子発現のための改変ウイルスベクターの適用は、拡大し続けている。この点に関する最近の進歩としては、マルチサブユニットタンパク質複合体を産生し、異種タンパク質産生を改善するためのタンパク質改変酵素を同時発現させるための技術およびシステムのさらなる開発が含まれる。ウイルス発現ベクター技術に関する他の最近の進歩には、遺伝子発現を制御するための多くの高度なゲノム工学用途、ウイルスベクターの調製、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療用途、ワクチン送達ベクターの作成が挙げられる。
【０００５】
しかし、依然として、細胞および／または宿主生物において複数の異種ポリペプチドを同時に産生するための多遺伝子発現系を含む異種発現系において目的の遺伝子を発現させるためのさらに効率的な方法およびシステムが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この章は、本開示の一般的な概要を与えるものであり、その全範囲またはその全ての特徴を網羅していない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本明細書には、核酸分子であって、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、前記改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、前記改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、核酸分子が開示されている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらに、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａおよびＯＲＦ５のうち１つまたは複数をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＯＲＦ７のＡＴＧ開始コドンを欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらに、ＯＲＦ６をコードする配列の一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ６のＡＴＧ開始コドンを欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらに、ＴＲＳ７を欠いているか、または変異ＴＲＳ７を含む。
【０００８】
本明細書に開示される種々の実施形態では、核酸分子は、非ネイティブ部位に１つまたは複数のサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含んでいてもよく、１つまたは複数のｓｇプロモーターはそれぞれ、転写制御配列（ＴＲＳ）を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター１、ｓｇプロモーター２、ｓｇプロモーター３、ｓｇプロモーター４、ｓｇプロモーター５、ｓｇプロモーター６、ｓｇプロモーター７およびこれらの変異体からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、改変ｓｇプロモーターである。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、それぞれのネイティブ部位に位置する１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターを含み、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターはそれぞれ、ＴＲＳを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、改変ｓｇプロモーター７である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、それぞれのｓｇプロモーター配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造の形成に必要な一次配列内に位置する１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つが、ＴＲＳの配列内に位置するヌクレオチド改変を含む。いくつかの例示的な実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、リーダーＴＲＳまたはその変異体を含む。いくつかの例示的な実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ボディＴＲＳまたはその変異体を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列を含む。いくつかの例示的な実施形態によれば、１つまたは複数のＴ７変異転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つは、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、Ｇ３１８８Ａおよびこれら任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つは、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、またはこれらの変異体である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが不活性化されている。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、さらに、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つに隣接して操作可能に配置された１つまたは複数のスペーサー領域を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーターに対してすぐ横の３’に配置されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーターに対してすぐ横の５’に配置されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域は、約２０〜４００ヌクレオチド長である。
【００１１】
本開示のこの態様および他の態様の種々の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、さらに、１つまたは複数の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットはそれぞれ、異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したｓｇプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、ＴＲＳと、ＴＲＳに対してすぐ横の５’に配置された第１のフランキング領域と、ＴＲＳに対してすぐ横の３’に配置された第２のフランキング領域とを含み、第１のフランキング領域は、約５〜４００ヌクレオチド長であり、第２のフランキング領域は、約１５〜１１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、２個、３個、４個、５個または６個の発現カセットを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される異種ヌクレオチド配列は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現のために最適化されている。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造が、改良されたＲＮＡ複製のために最適化されている。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、アルテリウイルスは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルテリウイルスは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ＥＡＶ毒性ビューサイラス株（ＶＢＳ）またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である。
【００１４】
本出願のいくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、さらに、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号３に対して少なくとも約８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。本出願のいくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４０に対して少なくとも８０％の配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、さらに、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４２に対して少なくとも約８０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸分子を含む組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、脊椎動物細胞または無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ウサギ腎臓細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト類表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞およびマウス３Ｔ３細胞からなる群から選択される。関連する態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物に関する。
【００１６】
一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、目的のポリペプチドを産生するための方法であって、核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、前記核酸分子が、（ｉ）改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードし、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）それぞれが目的の遺伝子をコードする異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、１つまたは複数の発現カセットとを含む、方法に関する。
【００１７】
さらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、被験体において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、核酸分子を前記被験体に投与することを含み、前記核酸分子が、（ｉ）改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードし、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、前記改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）それぞれが目的の遺伝子をコードする異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、１つまたは複数の発現カセットとを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、被験体は、脊椎動物または無脊椎動物である。
【００１８】
本開示の方法の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、ＴＲＳと、ＴＲＳに対してすぐ横の５’に配置された第１のフランキング領域と、ＴＲＳに対してすぐ横の３’に配置された第２のフランキング領域とを含み、第１のフランキング領域は、約５〜４００ヌクレオチド長であり、第２のフランキング領域は、約１５〜１１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらに、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５ａおよびＯＲＦ５のうち１つまたは複数をコードする配列の一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ７のＡＴＧ開始コドンを欠いた配列フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらに、ＯＲＦ６をコードする配列の一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ６のＡＴＧ開始コドンを欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらに、ＴＲＳ７を欠いているか、または変異ＴＲＳ７を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造の形成に必要な一次配列内に導入された少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む、改変ｓｇプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つは、ＴＲＳの配列内に導入された少なくとも１つのヌクレオチド改変を含む、改変ｓｇプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の発現カセットのうち少なくとも１つは、リーダーＴＲＳまたはその変異体を含む。
【００２０】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つは、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、Ｇ３１８８Ａおよびこれら任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つは、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、またはこれらの変異体である。
【００２１】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つに隣接して操作可能に配置された１つまたは複数のスペーサー領域を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーターに対してすぐ横の３’に配置されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーターに対してすぐ横の５’に配置されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域はそれぞれ、約２０〜４００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法の核酸分子は、２個、３個、４個、５個または６個の発現カセットを含む。
【００２２】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、発現カセットの１つの中の目的の遺伝子のコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現のために最適化されている。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子のコード配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造は、改良されたＲＮＡ複製のために最適化されている。
【００２３】
本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、核酸分子は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性、配列番号２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、さらに、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、核酸分子は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４０に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性、配列番号４１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、さらに、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列を含み、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号４２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号３または配列番号４２のヌクレオチド配列からなる。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、配列番号３または配列番号４２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きな配列同一性を示すヌクレオチド配列からなる。
【００２４】
さらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による方法によって産生される組換えポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補給用ポリペプチド、工業用酵素およびレポーターポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調整剤およびサイトカインからなる群から選択される。
【００２５】
関連する態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組換えポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００２６】
なおさらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００２７】
なおさらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される組換え細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【００２８】
前述の概要は例示的なものに過ぎず、決して限定することを意図するものではない。本明細書に記載された例示的な実施形態および特徴に加えて、本出願のさらなる態様、実施形態、目的および特徴は、図面、詳細な説明および請求項から完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａは、元々のＥＡＶレプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶ中の潜在Ｔ７終結部位に対する変異によって、全長ＲＮＡレプリコン転写が可能になることを示すために行われたルシフェラーゼアッセイおよびフローサイトメトリー実験の結果をグラフによってまとめたものである。ＥＡＶゲノムに内在する、Ｔ７ポリメラーゼ終結配列の候補を変異させると、全長ＲＮＡ転写が可能になった。赤色ホタルの複製およびタンパク質発現について、変異Ｔ９００１Ｇ（ｒＥ）、Ｔ９００１ＧおよびＧ３１８８Ａ（ｒＥ２）、Ｔ９００１ＧおよびＴ３１８５Ａ（ｒＥ３）を、初期レプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶと比較した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、元々のＥＡＶレプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶ中の潜在Ｔ７終結部位に対する変異によって、全長ＲＮＡレプリコン転写が可能になることを示すために行われたルシフェラーゼアッセイおよびフローサイトメトリー実験の結果をグラフによってまとめたものである。ＥＡＶゲノムに内在する、Ｔ７ポリメラーゼ終結配列の候補を変異させると、全長ＲＮＡ転写が可能になった。緑色ウミシイタケの複製およびタンパク質発現について、変異Ｔ９００１Ｇ（ｒＥ）、Ｔ９００１ＧおよびＧ３１８８Ａ（ｒＥ２）、Ｔ９００１ＧおよびＴ３１８５Ａ（ｒＥ３）を、初期レプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶと比較した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、元々のＥＡＶレプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶ中の潜在Ｔ７終結部位に対する変異によって、全長ＲＮＡレプリコン転写が可能になることを示すために行われたルシフェラーゼアッセイおよびフローサイトメトリー実験の結果をグラフによってまとめたものである。ＥＡＶゲノムに内在する、Ｔ７ポリメラーゼ終結配列の候補を変異させると、全長ＲＮＡ転写が可能になった。赤色ホタルの複製およびタンパク質発現について、変異Ｔ９００１Ｇ（ｒＥ）、Ｔ９００１ＧおよびＧ３１８８Ａ（ｒＥ２）、Ｔ９００１ＧおよびＴ３１８５Ａ（ｒＥ３）を、初期レプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶと比較した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、元々のＥＡＶレプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶ中の潜在Ｔ７終結部位に対する変異によって、全長ＲＮＡレプリコン転写が可能になることを示すために行われたルシフェラーゼアッセイおよびフローサイトメトリー実験の結果をグラフによってまとめたものである。ＥＡＶゲノムに内在する、Ｔ７ポリメラーゼ終結配列の候補を変異させると、全長ＲＮＡ転写が可能になった。緑色ウミシイタケの複製およびタンパク質発現について、変異Ｔ９００１Ｇ（ｒＥ）、Ｔ９００１ＧおよびＧ３１８８Ａ（ｒＥ２）、Ｔ９００１ＧおよびＴ３１８５Ａ（ｒＥ３）を、初期レプリコン系Ｒｅｐ−ＥＡＶと比較した。
【００３０】
【図２】図２は、レプリコンベクターである、基礎となる一価ＥＡＶレプリコン設計Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＷＴ）の構造を図によって示し、含まれる配列の詳細のために、ＴＲＳ２と、緑色ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子の開始との間の領域を拡大した。ＴＲＳ７要素に隣接するＥＡＶ配列は、灰色であり、下線が引かれている。ＸｂａＩは、ＯＲＦ１ｂ停止コドンの下流に操作された固有の制限部位であり、１個のヌクレオチド「Ｃ」によって、ＸｂａＩ配列がＯＲＦ１ｂ停止コドンと分離している。Ｌ：リーダー配列；ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ：ＥＡＶ非構造遺伝子。
【００３１】
【図３】図３は、２種類の初期の二価ＥＡＶレプリコン設計の構造を図によって示す。この二価レプリコンベクターの模式図は、Ａ設計とＢ設計の違いを示す。２／７ブロックは、Ｂ設計で強調表示されている。
【００３２】
【図４Ａ】図４Ａは、初期の二価レプリコン設計に含まれる異種ポリペプチドの発現を評価するために行われるルシフェラーゼアッセイの結果をグラフにまとめたものである。バルク細胞ルシフェラーゼアッセイを、エレクトロポレーションされた細胞で行った。ＡおよびＢの二価レプリコン設計からの赤色ホタルルシフェラーゼ発現の分析。
【図４Ｂ】図４Ｂは、初期の二価レプリコン設計に含まれる異種ポリペプチドの発現を評価するために行われるルシフェラーゼアッセイの結果をグラフにまとめたものである。バルク細胞ルシフェラーゼアッセイを、エレクトロポレーションされた細胞で行った。ＡおよびＢの二価レプリコン設計からの緑色ウミシイタケルシフェラーゼ発現の分析。
【００３３】
【図５】図５は、伸長した３’ヌクレオチド領域を含む例示的なＥＡＶレプリコン設計の構造を図によって示したものである。Ｌ：リーダー配列；ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ：ＥＡＶ非構造遺伝子領域；ｍＴＲＳ７：変異ＴＲＳ７配列。
【００３４】
【図６Ａ】図６Ａは、さらなる３’配列を一価基本ベクターｒＥ２−ｒＦＦに組み込む効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ＥＡＶ配列の８０１ヌクレオチドを、基本ベクターｒＥ２−ｒＦＦの３’領域に組み込むと、トランスフェクション効率が増加する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、さらなる３’配列を一価基本ベクターｒＥ２−ｒＦＦに組み込む効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ＥＡＶ配列の８０１ヌクレオチドを、基本ベクターｒＥ２−ｒＦＦの３’領域に組み込んでも、発現レベルは変化しない。
【００３５】
【図７】図７は、伸長した３’ヌクレオチド領域を含む３種類の二価ＥＡＶレプリコン設計の構造を図によって示したものである。Ｌ：リーダー配列；ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ：ＥＡＶ非構造遺伝子領域；ｍＴＲＳ７：変異ＴＲＳ７配列。
【００３６】
【図８Ａ】図８Ａは、さらなる３’ＵＴＲ配列を二遺伝子基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦに組み込むと、目的の遺伝子の発現が増強されることを示す実験の結果をグラフにまとめたものである。基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦの３’ＵＴＲ領域にＥＡＶ配列の８０１ヌクレオチドを導入すると、トランスフェクション効率が増加する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、さらなる３’ＵＴＲ配列を二遺伝子基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦに組み込むと、目的の遺伝子の発現が増強されることを示す実験の結果をグラフにまとめたものである。基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦの３’ＵＴＲ領域にＥＡＶ配列の８０１ヌクレオチドを導入すると、トランスフェクション効率が増加する。
【図８Ｃ】図８Ｃは、さらなる３’ＵＴＲ配列を二遺伝子基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦに組み込むと、目的の遺伝子の発現が増強されることを示す実験の結果をグラフにまとめたものである。基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦの３’ＵＴＲ領域にＥＡＶ配列の８０１ヌクレオチドを導入すると、赤色ホタルについて、ルシフェラーゼ産生が高まる。
【図８Ｄ】図８Ｄは、さらなる３’ＵＴＲ配列を二遺伝子基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦに組み込むと、目的の遺伝子の発現が増強されることを示す実験の結果をグラフにまとめたものである。基本ベクターｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦの３’ＵＴＲ領域にＥＡＶ配列の８０１ヌクレオチドを導入すると、緑色ウミシイタケについて、ルシフェラーゼ産生が高まる。
【００３７】
【図９Ａ】図９Ａは、さらなる３’配列を有するレプリコンにおける複製および発現に対する種々のＴＲＳ７変異の効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂおよびｒＥｘｂ二価レプリコンの複製に対する例示的なＴＲＳ７変異の影響。
【図９Ｂ】図９Ｂは、さらなる３’配列を有するレプリコンにおける複製および発現に対する種々のＴＲＳ７変異の効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂおよびｒＥｘｂ二価レプリコンの複製に対する例示的なＴＲＳ７変異の影響。
【図９Ｃ】図９Ｃは、さらなる３’配列を有するレプリコンにおける複製および発現に対する種々のＴＲＳ７変異の効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂおよびｒＥｘｂ二価レプリコンからのレポーター遺伝子発現に対する例示的なＴＲＳ７変異の影響。
【図９Ｄ】図９Ｄは、さらなる３’配列を有するレプリコンにおける複製および発現に対する種々のＴＲＳ７変異の効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂおよびｒＥｘｂ二価レプリコンからのレポーター遺伝子発現に対する例示的なＴＲＳ７変異の影響。
【００３８】
【図１０Ａ】図１０Ａは、さらなる３’配列を有するｒＥｘｂ二価レプリコンにおいてＴＲＳ７エレメントを回復させる効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂ二価レプリコンと比較して、ｒＥｘｂの複製に対するＴＲＳ７エレメントの回復の影響。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、さらなる３’配列を有するｒＥｘｂ二価レプリコンにおいてＴＲＳ７エレメントを回復させる効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂ二価レプリコンと比較して、ｒＥｘｂの複製に対するＴＲＳ７エレメントの回復の影響。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、さらなる３’配列を有するｒＥｘｂ二価レプリコンにおいてＴＲＳ７エレメントを回復させる効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂ二価レプリコンと比較して、ｒＥｘｂからの遺伝子発現に対するＴＲＳ７エレメントの回復の影響。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、さらなる３’配列を有するｒＥｘｂ二価レプリコンにおいてＴＲＳ７エレメントを回復させる効果を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。ｒＥｎｂ二価レプリコンと比較して、ｒＥｘｂからの遺伝子発現に対するＴＲＳ７エレメントの回復の影響。
【００３９】
【図１１Ａ】図１１Ａは、単遺伝子および二遺伝子のレプリコン対照に対する、ｇＲｅｎ、ｒＦＦおよびＣｙｐｒを含有するＥＡＶ三遺伝子発現設計の機能性を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。２種類のデータが示されている。図の上段は、各レプリコンを用いてトランスフェクトされた細胞の割合（％）を示す。これは、各ＲＮＡについての複製の尺度である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、単遺伝子および二遺伝子のレプリコン対照に対する、ｇＲｅｎ、ｒＦＦおよびＣｙｐｒを含有するＥＡＶ三遺伝子発現設計の機能性を評価する実験の結果をグラフにまとめたものである。２種類のデータが示されている。図の下段は、エレクトロポレーションされた細胞溶解物からの各ルシフェラーゼ構築物についてのタンパク質発現を、アッセイに使用した溶解物の量で正規化したものを示す。各遺伝子を作動させるために使用されるＴＲＳを三価構築物について示す。ＲＬＵ：相対光単位。
【００４０】
【図１２Ａ】図１２Ａは、本明細書に記載されるいくつかの例示的な実施形態の種々のスペーサーレプリコン構築物の設計を図によって示したものである。ＴＲＳ７サブゲノムプロモーターの上流および下流のＥＡＶ配列のアラインメント。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本明細書に記載されるいくつかの例示的な実施形態の種々のスペーサーレプリコン構築物の設計を図によって示したものである。新しいスペーサーレプリコン構築物に含まれるヌクレオチド。
【００４１】
【図１３Ａ】図１３Ａは、ｒＥ２−ｒＦＦ基本ベクターと比較して、ＴＲＳ７領域を隔離するためのスペーサー配列の付加が、複製およびタンパク質産生に影響を与えることを示すために行われた実験の結果をグラフにまとめたものである。Ｓ１：スペーサー１  ｒＥ２−ｒＦＦ。Ｓ２：スペーサー２  ｒＥ２−ｒＦＦ、Ｓ３：スペーサー３  ｒＥ２−ｒＦＦ、Ｓ４：スペーサー４  ｒＥ２−ｒＦＦ、ＷＴ：ｒＥ２−ｒＦＦ。ＴＲＳ７（Ｓ１、Ｓ２）の上流および領域（Ｓ３、Ｓ４）の下流の配列の導入は、複製能力およびタンパク質発現を変えた。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ｒＥ２−ｒＦＦ基本ベクターと比較して、ＴＲＳ７領域を隔離するためのスペーサー配列の付加が、複製およびタンパク質産生に影響を与えることを示すために行われた実験の結果をグラフにまとめたものである。Ｓ１：スペーサー１  ｒＥ２−ｒＦＦ。Ｓ２：スペーサー２  ｒＥ２−ｒＦＦ、Ｓ３：スペーサー３  ｒＥ２−ｒＦＦ、Ｓ４：スペーサー４  ｒＥ２−ｒＦＦ、ＷＴ：ｒＥ２−ｒＦＦ。ＴＲＳ７（Ｓ１、Ｓ２）の上流および領域（Ｓ３、Ｓ４）の下流の配列の導入は、タンパク質発現を変えた。
【００４２】
【図１４Ａ】図１４Ａは、付加されたスペーサー１配列を含む二価ＥＡＶレプリコンの発現に対する影響を評価する実験の結果をグラフに示したものである。Ｓ１：スペーサー１領域。異なるスペーサー１の二価レプリコンにおける緑色ウミシイタケルシフェラーゼの発現分析。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、付加されたスペーサー１配列を含む二価ＥＡＶレプリコンの発現に対する影響を評価する実験の結果をグラフに示したものである。Ｓ１：スペーサー１領域。異なるスペーサー１の二価レプリコンにおける赤色ホタルルシフェラーゼの発現分析。
【００４３】
【図１５Ａ】図１５Ａは、複製および発現に対するＨＡ一次配列の影響を示す実験の結果をグラフに示したものである。異なる一次配列を有するＨＡ遺伝子をコードするｒＥ２レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。異なる一次配列を有するＨＡ遺伝子を含むレプリコンから検出された、ｄｓＲＮＡおよびＨＡタンパク質二重陽性細胞集団。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、複製および発現に対するＨＡ一次配列の影響を示す実験の結果をグラフに示したものである。異なる一次配列を有するＨＡ遺伝子をコードするｒＥ２レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。異なる一次配列を有するＨＡ遺伝子を含むＥＡＶレプリコンのＨＡタンパク質発現ＭＦＩ分析（平均蛍光強度）。
【００４４】
【図１６Ａ】図１６Ａは、複製および発現に対するＦ一次配列の影響を示す実験の結果をグラフに示したものである。異なる一次配列を有するＦ遺伝子をコードするｒＥ２レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。異なる一次配列を有するＦ遺伝子を含むレプリコンから検出された、ｄｓＲＮＡおよびＦタンパク質二重陽性細胞集団。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、複製および発現に対するＦ一次配列の影響を示す実験の結果をグラフに示したものである。異なる一次配列を有するＦ遺伝子をコードするｒＥ２レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。異なる一次配列を有するＦ遺伝子を含むレプリコンのＦタンパク質発現ＭＦＩ分析。
【００４５】
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＥＡＶレプリコンから作動された安定した緑色ウミシイタケタンパク質発現を示す実験の結果をグラフにまとめたものである。ｇＲＥＮルシフェラーゼをコードするｒＥ２（ＥＡＶ）およびアルファウイルス（α）レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。検出されたｄｓＲＮＡおよびｇＲＥＮタンパク質二重陽性細胞集団。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＥＡＶレプリコンから作動された安定した緑色ウミシイタケタンパク質発現を示す実験の結果をグラフにまとめたものである。ｇＲＥＮルシフェラーゼをコードするｒＥ２（ＥＡＶ）およびアルファウイルス（α）レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。エレクトロポレーションされた細胞のｇＲＥＮタンパク質発現ＭＦＩ分析。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＥＡＶレプリコンから作動された安定した緑色ウミシイタケタンパク質発現を示す実験の結果をグラフにまとめたものである。ｇＲＥＮルシフェラーゼをコードするｒＥ２（ＥＡＶ）およびアルファウイルス（α）レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析。エレクトロポレーションされた細胞のバルク細胞ルシフェラーゼアッセイ分析。
【００４６】
【図１８】図１８は、ＥＡＶレプリコンから作動された安定したＧＦＰタンパク質発現を示す実験の結果をグラフにまとめたものである。ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するｒＥ２（ＥＡＶ）およびアルファウイルス（α）レプリコンを用いてエレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリーＭＦＩ分析。
【００４７】
【図１９Ａ】図１９Ａは、ｒＥ２−ｒＦＦ  ＲＮＡを注射したマウスにおけるＩＶＩＳ分析の一例を示す。ＥＡＶレプリコンからの発現の分析は、ｒＦＦルシフェラーゼ発現を検出するための全身撮像分析を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏで行った。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ｒＥ２−ｒＦＦ  ＲＮＡを注射したマウスにおけるＩＶＩＳ分析の一例を示す。ＥＡＶレプリコンからの発現の分析は、ｒＦＦルシフェラーゼ発現を検出するための全身撮像分析を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏで行った。
【００４８】
【図２０】図２０は、ＥＡＶゲノム構造およびゲノム発現戦略を模式的に示す。レプリカーゼ遺伝子および構造タンパク質遺伝子の名称が与えられている（遺伝子およびタンパク質の命名法に関する参照は、Ｓｎｉｊｄｅｒら、２００５に見出すことができる）。ゲノム組織化の下に、ゲノムとｓｇ  ｍＲＮＡの構造的関係が示されている。ＥＡＶ  ｍＲＮＡの５’末端に見出されるリーダー配列およびＴＲＳは、それぞれ青色およびオレンジ色の四角として示されている。ゲノム長ｍＲＮＡ１に見出されるリボソームフレームシフトエレメント（ＲＦＳ）が示されており、各ｍＲＮＡの翻訳領域は、緑色の線で強調されており、一方、翻訳サイレント領域は、赤色の線で示されている。翻訳されたオープンリーディングフレームのみが各ｍＲＮＡについて示されている。右側のパネルは、ゲノムの３’末端に相補的なプローブとのハイブリダイゼーションによって視覚化され、したがって全てのウイルスｍＲＮＡ種を認識する、感染性細胞から単離されたＥＡＶ  ｍＲＮＡの典型的なパターンを示す。
【００４９】
【図２１】図２１は、ＢＨＫ細胞におけるＥＡＶ  ＴＲＳ１レプリコンベクターからのルシフェラーゼ発現を分析する実験の結果をまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇのレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。ＴＲＳ１レプリコンベクターは、ＴＲＳ７サブゲノムプロモーターを用いてＥＡＶレプリコンから検出された発現よりも強い、安定した発現を示した。
【００５０】
【図２２】図２２は、ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ構築物のプラスミドマップである。
【００５１】
【図２３】図２３は、ＶＢＳ−ＩＣ構築物のプラスミドマップである。
【００５２】
【図２４】図２４は、ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ構築物のプラスミドマップである。
【００５３】
【図２５】図２５は、ＢＨＫ細胞におけるＶＢＳ  ＩＣ構築物の機能性を実証するために行った実験の結果の概略図である。ＢＨＫ細胞を、ＥＡＶ株０３０  ＩＣ  ＲＮＡ（ＥＡＶ０３０）、ＥＡＶ株ＶＳ  ＩＣ  ＲＮＡ（ＥＡＶ−ＶＢＳ）またはＲＮＡなし（Ｍｏｃｋ）のいずれか３μｇを用いてエレクトロポレーションした。細胞を、エレクトロポレーションから２４時間後および４８時間後のＣＰＥの存在について調べた。ＥＡＶ０３０およびＥＡＶ−ＶＢＳによってエレクトロポレーションされた細胞の両方で４８時間までにＣＰＥが認められ、両ＩＣが機能性であることが実証された。
【００５４】
【図２６】図２６は、ＢＨＫ細胞におけるＶＢＳ系レプリコンベクターからのｅＧＦＰ発現を分析するために行われた実験の結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、ＥＡＶ株ＥＡＶ０３０  ｅＧＦＰレプリコンＲＮＡ（ｒＥ２−ＧＦＰ）またはＥＡＶ株ＶＢＳ  ｅＧＦＰレプリコンＲＮＡ（ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ２−ｅＧＦＰ）のいずれか３μｇをエレクトロポレーションした。細胞を、ＦＡＣＳ分析により、ＧＦＰの相対的発現について調べた。ＥＡＶ  ＶＢＳ系のレプリコンは、ＥＡＶ０３０系のレプリコンと同じレベルでＧＦＰタンパク質を発現することが判明した。
【００５５】
【図２７】図２７は、ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦ構築物のプラスミドマップである。
【００５６】
【図２８】図２８は、ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦ構築物のプラスミドマップである。
【００５７】
【図２９】図２９は、ＢＨＫ細胞におけるＶＢＳ系レプリコンベクターからのｒＦＦ発現を分析するために行われた実験の結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、ＥＡＶ株０３０  ｒＦＦレプリコンＲＮＡ（ｒＥ２−ＧＦＰ）またはＥＡＶ株ＶＢＳ−ｒＦＦレプリコンＲＮＡ（ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ２−ｒＦＦもしくはＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦ）のいずれか３μｇをエレクトロポレーションした。細胞を、ＦＡＣＳ分析およびバルクルシフェラーゼアッセイにより、ｒＦＦの発現について調べた。ＥＡＶ  ＶＢＳ系のレプリコンはそれぞれ、互いに比較した場合、同様のレベルでｒＦＦタンパク質を発現することが観察された。
【００５８】
【図３０】図３０は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＢＳ系レプリコンベクターからのｒＦＦ発現を分析するために行われた実験の結果を模式的にまとめたものである。この実験では、マウスに、リンガー乳酸塩中の３０、６０または９０μｇのＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ２−ｒＦＦを筋肉内注射した。動物を、ＲＮＡ注射から１日後および３日後に、全身撮像によって検査された。
【００５９】
【図３１】図３１は、ｐＷ７０＋ＳＨＦＶ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦ構築物のプラスミドマップである。
【００６０】
【図３２】図３２は、ＢＨＫ細胞におけるＳＨＦｖ系レプリコンベクターからのｒＦＦ発現を分析するために行われた実験の結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇのＳＨＦｖ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。細胞を、ＦＡＣＳ分析およびバルクルシフェラーゼアッセイにより、ｒＦＦの発現について調べた。ＳＨＦｖ系のレプリコンは、ＢＨＫ細胞においてｒＦＦタンパク質を発現することが観察された。
【００６１】
【図３３Ａ】図３３Ａは、ＢＨＫ細胞におけるＥＡＶ二価レプリコンベクターからの抗体発現を分析するために実施された実験の結果を図式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇのｒＥｘ−ハーセプチン（ＳＧＩ−ＲＮＡ−Ａｂ）レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。図３３Ａは、分析したｒＥｘ−ハーセプチンレプリコンの分子設計を模式的に示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ＢＨＫ細胞におけるＥＡＶ二価レプリコンベクターからの抗体発現を分析するために実施された実験の結果を図式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇのｒＥｘ−ハーセプチン（ＳＧＩ−ＲＮＡ−Ａｂ）レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。図３３Ｂは、エレクトロポレーションから約２４時間後に、エレクトロポレーションされた細胞から分泌された抗体のＥＬＩＳＡ分析の結果をまとめたものであり、ＤＮＡおよびＥＡＶレプリコン発現抗体を比較して行った（ｍｇ／Ｌ）。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、ＢＨＫ細胞におけるＥＡＶ二価レプリコンベクターからの抗体発現を分析するために実施された実験の結果を図式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇのｒＥｘ−ハーセプチン（ＳＧＩ−ＲＮＡ−Ａｂ）レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。図３３Ｃは、ｒＥｘ−ハーセプチン発現抗体がＨｅｒ２抗原を検出することができることを実証するために行った実験の結果をまとめたものである。
【００６２】
【図３４】図３４は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＨＦｖ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦレプリコンをさらに分析するために行われた実験の結果を図式的にまとめたものである。この実験では、３０μｇのＲＮＡをマウスに注射し、全身撮像を行った。これらのデータは、ＳＨＦｖレプリコンベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示し、ＥＡＶレプリコンと同等であることを示す。
【００６３】
【図３５Ａ】図３５Ａは、ＢＨＫ細胞における一価および二価のレプリコンベクターからのマウスＩＬ−１２およびＲＳＶ  Ｆ発現を分析するために実施された実験結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇの各レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。タンパク質特異的抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、細胞をＩＬ−１２またはＲＳＶ  Ｆの発現について調べた。ｄｓＲＮＡ特異的抗体を用い、トランスフェクションされた細胞の割合（％）を決定した。二価のＩＬ−１２−ＲＳＶ  ＦまたはＩＬ−１２  ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞の割合（％）。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、ＢＨＫ細胞における一価および二価のレプリコンベクターからのマウスＩＬ−１２およびＲＳＶ  Ｆ発現を分析するために実施された実験結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇの各レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。タンパク質特異的抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、細胞をＩＬ−１２またはＲＳＶ  Ｆの発現について調べた。ｄｓＲＮＡ特異的抗体を用い、トランスフェクションされた細胞の割合（％）を決定した。ＩＬ−１２特異的タンパク質発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、ＢＨＫ細胞における一価および二価のレプリコンベクターからのマウスＩＬ−１２およびＲＳＶ  Ｆ発現を分析するために実施された実験結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇの各レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。タンパク質特異的抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、細胞をＩＬ−１２またはＲＳＶ  Ｆの発現について調べた。ｄｓＲＮＡ特異的抗体を用い、トランスフェクションされた細胞の割合（％）を決定した。二価のＩＬ−１２−ＲＳＶ  ＦまたはＲＳＶ  Ｆ  ＲＮＡを用いてトランスフェクトされた細胞の割合（％）。
【図３５Ｄ】図３５Ｄは、ＢＨＫ細胞における一価および二価のレプリコンベクターからのマウスＩＬ−１２およびＲＳＶ  Ｆ発現を分析するために実施された実験結果を模式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇの各レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。タンパク質特異的抗体を用いたＦＡＣＳ分析により、細胞をＩＬ−１２またはＲＳＶ  Ｆの発現について調べた。ｄｓＲＮＡ特異的抗体を用い、トランスフェクションされた細胞の割合（％）を決定した。ＲＳＶ  Ｆ特異的タンパク質発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）。
【００６４】
【図３６Ａ】図３６Ａは、ＥＡＶレプリコンからのｃａｓ９発現および切断活性を分析するために実施された実験の結果を図式的にまとめたものである。ＥＡＶ  ｃａｓ９レプリコンベクターの模式図。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、ＥＡＶレプリコンからのｃａｓ９発現および切断活性を分析するために実施された実験の結果を図式的にまとめたものである。ＢＨＫ細胞に、３μｇの各レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。ｄｓＲＮＡ特異的抗体を用い、トランスフェクションされた細胞の割合を決定した。ｃａｓ９遺伝子は、２つの異なるコドン使用を利用して合成された。
【図３６Ｃ】図３６Ｃは、ＥＡＶレプリコンからのｃａｓ９発現および切断活性を分析するために実施された実験の結果を図式的にまとめたものである。プラスミドＤＮＡおよびプラスミド配列に特異的なｇＲＮＡと組み合わせた、エレクトロポレーションされた細胞溶解物を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣａｓ９機能性を決定した。特定のＤＮＡ開裂は、ｃａｓ９  ＥＡＶレプリコンＲＮＡによってエレクトロポレーションされた細胞溶解物から作成されたサンプルで検出された。
【００６５】
【図３７】図３７は、概略的なＥＡＶゲノムである。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本開示の前述の特徴および他の特徴は、添付の図面と併せて以下の説明および添付の特許請求の範囲から、より完全に明らかになるであろう。これらの図面は、本開示に従ったいくつかの実施形態のみを示しており、その範囲を限定するものではないと理解されたい。本開示は、添付の図面を使用することにより、さらなる具体性および詳細とともに記載される。
【００６７】
本開示は、一般に、組換え細胞において複数の異種遺伝子を調整可能な様式で発現させるのに適したアルテリウイルス発現系の開発に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む核酸分子に関する。例えば、いくつかの実施形態は、１つまたは複数の構造タンパク質をコードするその元々のヌクレオチド配列の少なくとも一部が除去されているか、および／または例えば目的のポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列と置き換わった、組換えアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む核酸分子に関する。
【００６８】
本明細書に開示されるように、単一遺伝子または多重遺伝子のアルテリウイルス発現系は、ＥＡＶのサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の１つまたは複数の構造タンパク質のコード領域の一部または全体を除去し、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列とそれぞれ置き換えることによって作成することができる。ＥＡＶのそれぞれのｓｇＲＮＡは、天然で異なるレベルで発現されるため、本明細書に開示されるアルテリウイルス発現系は、単一遺伝子または多重遺伝子のいずれかの設計でＧＯＩを調整可能に発現することができる。例えば、以下にさらに詳細に記載されるように、複数のＧＯＩを発現することができ、それぞれを互いに相対的に同じレベルまたは異なるレベルで産生することができる単一のＲＮＡ発現プラットフォームの開発は、顕著な有用性および実用性を示す。とりわけ、本明細書に開示する発現プラットフォームを調整することができるという利点は、有利なことに、同じ細胞内で複数のタンパク質の調整可能な発現を可能にする。一例として、免疫学的用途において、同じ宿主細胞における複数タンパク質のクローナル発現は、多くの実用的な有用性を提供し、限定されないが、（１）ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏで、立体配座的に正確なエピトープを補助するために、複雑なタンパク質相互作用を起こすことができる、（２）ワクチンおよび／または腫瘍関連抗原と共に（例えば、同時に）免疫調節タンパク質の同時発現を補助し、ひいては安定した免疫応答を誘発し、および／または作動させ得る、ならびに（３）複数のタンパク質発現を必要とする高度な治療手法を補助する。いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、ウイルス発現ベクターとしてアルテリウイルスを使用する別の非限定的な利点は、このウイルスが組換え宿主細胞中で多量の異種タンパク質の合成を指示し得ることであると考えられる。
【００６９】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面において、類似の記号は、文脈で別途指示しない限り、典型的には同様の構成要素を特定する。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載された例示的な代替物は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の代替が使用されてもよく、他の変更が行われてもよい。本明細書で一般的に説明され、図に示された態様は、広範囲の異なる構成で配置され、置換され、結合され、設計されてもよく、これらの全てが明示的に想定され、本出願の一部をなすことは容易に理解されるであろう。
【００７０】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記および他の科学用語または専門用語は、本出願が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。ある場合には、一般的に理解される意味を有する用語が、明瞭化および／または参照の容易さのために本明細書で定義され、このような定義が本明細書に含まれることは、必ずしも当該技術分野で一般的に理解される意味を超えて実質的な差を表すと解釈すべきではない。本明細書に記載されるか、または参照される技術および手順の多くは、当業者による従来の方法論を使用してよく理解され、一般に採用されている。
【００７１】
いくつかの定義
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明白に指示されない限り、複数の対象物を含む。例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」との用語は、１つまたは複数の細胞を含み、その混合物を含んでいる。本開示および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「および／または」との用語は、どちらか１つであってもよく、または全てを含んだものであってもよい。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「ＡまたはＢ」および「ＡおよびＢ」の全ての選択肢を含むように本明細書で使用される。
【００７２】
「約」との用語は、本明細書で使用される場合、おおよそというその通常の意味を有する。近似値の程度が文脈から明らかではない場合、「約」は、与えられている値の±１０％以内であるか、または最も近い有効数字に丸められていることを意味し、全ての場合に、その与えられている値を含む。範囲が与えられている場合、その範囲は、境界値を含む。
【００７３】
「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「組換え宿主細胞」、「レシピエント細胞」および「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、移入回数によらず、初代の被験体細胞およびその子孫を含む。全ての子孫が、親細胞と正確に同一であるわけではない（意図的または偶然の変異または環境の差異のため）ことは理解すべきである。しかし、そのような変化した子孫は、子孫が元々の形質転換された細胞と同じ機能性を保持する限り、これらの用語に含まれる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「構築物」との用語は、任意の供給源に由来し、ゲノム組み込みまたは自律複製が可能な任意の組換え核酸分子、例えば、発現カセット、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製ポリヌクレオチド分子、ファージ、または線状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド分子を意味することを意図しており、１つまたは複数の核酸配列が、機能的に操作可能な様式で連結している（例えば、操作可能に連結している）核酸分子を含む。
【００７５】
「遺伝子」との用語は、タンパク質をコードするか、または機能性ＲＮＡに転写され得る核酸分子の任意のセグメントを指すために広く用いられる。遺伝子は、転写されるが、最終的な成熟した、および／または機能的なＲＮＡ転写物の一部ではない配列を含んでいてもよく、タンパク質をコードする遺伝子は、さらに、転写されるが翻訳されない配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、イントロンなど）を含んでいてもよい。さらに、遺伝子は、場合により、それらの発現に必要な制御配列をさらに含んでいてもよく、このような配列は、例えば、転写または翻訳されない配列であってもよい。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または既知配列情報または予測配列情報から合成することを含む種々の供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでいてもよい。
【００７６】
「異種」との用語は、ポリヌクレオチド、遺伝子または核酸分子に言及する際に使用されるときは、宿主種に由来しないポリヌクレオチド、遺伝子または核酸分子を指す。例えば、本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」または「異種核酸配列」は、これらが導入される宿主生物の種とは異なる種からの遺伝子または核酸配列を指す。遺伝子制御配列または遺伝子配列の発現を操作するために使用される補助核酸配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列など）、またはタンパク質ドメインをコードする核酸配列またはタンパク質局在化配列について言及する場合、「異種」とは、制御配列または補助配列、またはタンパク質ドメインをコードする配列または局在化配列が、制御核酸配列または補助核酸配列、またはタンパク質ドメインをコードする配列または局在化配列がゲノム内に並置される遺伝子とは異なる供給源に由来することを意味する。したがって、天然の状態では（例えば、遺伝子操作されていない生物のゲノムには）操作可能に接続していないような遺伝子に操作可能に接続したプロモーターは、本明細書では、そのプロモーターが、接続する遺伝子と同じ種（またはある場合には、同じ生物）に由来している場合であっても、「異種プロモーター」と呼ばれる。例えば、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、異種の目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列は、その天然の状態ではＥＡＶレプリコン配列に接続していない。いくつかの実施形態では、コードＧＯＩ配列は、別のウイルス、細菌、真菌、ヒト細胞（腫瘍Ａｇ）、寄生虫（マラリア）などのような別の生物に由来する。
【００７７】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」との用語は、本明細書で相互に置き換え可能に用いられ、ＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子の両方を指し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、核酸類似体を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含む核酸分子を含む。核酸分子は、任意の三次元構造を有していてもよい。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖）であってもよい。核酸分子の非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、核酸プローブおよび核酸プライマーが挙げられる。核酸分子は、従来には存在しないヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書で使用する「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」との用語は、ポリヌクレオチド分子の配列を相互に置き換え可能に指す。本明細書では、米国特許規則の§１．８２２に記載のヌクレオチド塩基の命名法が使用される。
【００７８】
本開示の核酸分子は、任意の長さの核酸分子であってもよく、好ましくは、約５Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、例えば約５Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約３０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約２０Ｋｂ、または約１０Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、例えば、約１５Ｋｂ〜３０Ｋｂ、約２０Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、約２０Ｋｂ〜約４０Ｋｂ、約５Ｋｂ〜約２５Ｋｂ、または約３０Ｋｂ〜約５０Ｋｂの核酸分子を含む。
【００７９】
本開示のポリヌクレオチドは、構造的属性（例えば、核酸が別の核酸にハイブリダイズする能力、またはポリヌクレオチド配列が転写因子および／または核酸ポリメラーゼによって認識され、結合する能力）に関し、「生物学的に活性」であってもよい。
【００８０】
本明細書で使用される「組換え」または「操作された」核酸分子との用語は、ヒトの介入によって改変された核酸分子を指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって作られた任意の核酸分子と同様に、またはこれにリンカーが接続しているか、またはベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に組み込まれた、組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、（１）例えば、化学技術または酵素技術（例えば、化学的な核酸合成の使用によって、または複製、重合、エキソヌクレアーゼによる消化、エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含む）、または核酸分子の組換え（相同組換えおよび部位特異的な組換えを含む））を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されるか、または改変され、（２）天然では結合していないヌクレオチド配列の結合を含み、（３）天然に存在する核酸分子配列について１つまたは複数のヌクレオチドを欠くような分子クローニング技術を用いて操作され、および／または（４）天然に存在する核酸配列について１つまたは複数の配列の変化または再編成を有するような分子クローニング技術を用いて操作されている。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって作られた任意の核酸分子と同様に、またはこれにリンカーが接続しているか、またはベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に組み込まれた、組換えＤＮＡ分子である。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「レプリコン」との用語は、それ自体の複製物の作成を指示することが可能なウイルス核酸を指す。本明細書で使用される場合、「レプリコン」との用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む。例えば、アルテリウイルスゲノムの二本鎖ＤＮＡ態様を用い、アルテリウイルスレプリコンを構成する一本鎖ＲＮＡ転写物を作成することができる。一般に、ウイルスレプリコンは、ウイルスの完全ゲノムを含む。「サブゲノムレプリコン」は、本明細書で使用される場合、遺伝子の全相補体に満たない何らかのものと、ウイルスゲノムの他の特徴とを含み、それ自体の複製物の作成を指示することは依然として可能なウイルス核酸を指す。例えば、以下に記載するアルテリウイルスのサブゲノムレプリコンは、ウイルスの非構造タンパク質のための遺伝子の大部分を含むが、構造タンパク質をコードする遺伝子の大部分を欠いている。サブゲノムレプリコンは、ウイルス粒子の産生を伴わずに、ウイルスサブゲノムの複製（サブゲノムレプリコンの複製）に必要な全てのウイルス遺伝子の発現を指示することができる。
【００８２】
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸を宿主細胞に移入するための任意の手段を指す。ベクターは、別のＤＮＡセグメントが付着して、付着したセグメントの複製を引き起こし得るレプリコンであってもよい。「ベクター」との用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に核酸を導入するためのウイルス手段および非ウイルス手段の両方を含む。非ウイルスベクターとしては、限定されないが、プラスミド、リポソーム、電荷を帯びた脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体および生体高分子が挙げられる。核酸に加え、ベクターは、１つまたは複数の制御領域、および／または核酸移入結果（どの組織に移入するか、発現期間など）を選択し、測定し、監視するのに有用な選択可能なマーカーも含んでいてもよい。
【００８３】
当業者には理解されるように、記載された説明を提供することなど、あらゆる目的および全ての目的のために、本明細書に開示された全ての範囲は、可能な任意または全ての可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせも包含する。列挙された範囲は、十分に記述されており、同じ範囲を少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解できると容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で説明する各範囲は、下３分の１、中３分の１および上３分の１などに容易に分解することができる。当業者であれば理解するであろうように、「〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などの全ての言葉は、列挙されている数字を含み、後で上述のような部分範囲に分けることができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、ある範囲は、それぞれの個々の数字を含む。したがって、例えば、１〜３個の項目を含む群は、１個、２個または３個の項目を含む群を指す。同様に、１〜５個の項目を含む群は、１個、２個、３個、４個または５個の項目などを含む群を指す。
【００８４】
本明細書に記載の方法またはプロセスのいくつかの実施形態では、時間的または操作的な順序が明示的に記載されている場合を除いて、これらの工程は、任意の順序で実行することができる。さらに、いくつかの実施形態では、明示的な特許請求の範囲の言語が、それらが別々に実行されることを暗示しているのではない限り、特定の工程を同時に実行することができる。例えば、いくつかの実施形態では、クレームされているＸをする工程と、クレームされているＹをする工程は、１回の操作内で同時に実行することができ、得られるプロセスは、クレームされている方法の文言通りの範囲に入るだろう。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「〜によって特徴づけられる」と同義語であり、包括的であるか、または制限がなく、さらなる列挙されていない要素または方法工程を除外しない。本明細書で使用される場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲に記載の組成物または方法において特定されていない要素、工程または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「〜から本質的になる」とは、特許請求の範囲に記載の組成物または方法の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を与えない材料または工程を排除するものではない。特に、ある組成物の構成要素の記載、またはある方法の工程の記載において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語の本明細書での引用は、引用されている構成要素または工程から本質的になる組成物および方法、これらの構成要素または工程からなる組成物および方法を包含するものと理解される。
【００８６】
本明細書に示された一般的方法の考察は、単なる説明の目的であることを意図している。他の代替の方法および代替物は、本出願を検討すると当業者には明らかであり、本出願の精神および範囲内に含まれるべきである。
【００８７】
アルテリウイルス
アルテリウイルスは、ニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目に含まれるアルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）のアルテリウイルス属に属しており、家畜および野生動物に感染するエンベロープ化された一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスの重要な群を包含している。
【００８８】
ニドウイルス目は、ゲノムの大きさに応じて、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）およびロニウイルス科（Ｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ）（大きなニドウイルス）を含む大きなゲノム（２６．３〜３１．７キロベース）を有するものと、あまり近縁ではないアルテリウイルス科を含むクレード（１２．７〜１５．７ｋｂ）である、小さなゲノムを有するもの（小さなニドウイルス）の２つのクレードに分けることができる。大きなニドウイルスは、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよび３’−５’エキソリボヌクレアーゼ（ＥｘｏＮ）の両方をコードし、後者はＲＮＡウイルスでは非常に珍しい。大きなニドウイルスは、スーパーファミリー１ヘリカーゼ、ウリデラート特異的エンドヌクレアーゼ（ニドウイルスに特有の酵素）およびいくつかのプロテアーゼもコードする。
【００８９】
アルテリウイルスは、コロナウイルス科（コロナウイルス属およびトロウイルス属）のメンバーと同様のゲノム組織化および複製戦略を共有しているが、アルテリウイルスは、その遺伝学的複雑性、ゲノム長、生物物理学的特性、大きさ、アーキテクチャおよびウイルス粒子の構造タンパク質の組成（例えば、ビリオン）がかなり異なっていることが十分に示されてきた。現在、アルテリウイルス属は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、マウスの乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）およびウォブリーポッサム病（ｗｏｂｂｌｙ  ｐｏｓｓｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス（ＷＰＤＶ）を含むと考えられる。最近の研究では、新たに特定されたウォブリーポッサム病ウイルス（ＷＰＤＶ）もアルテリウイルス属に属することが報告されている。
【００９０】
典型的なアルテリウイルスゲノムは、長さが１２．７〜１５．７ｋｂの間で様々であるが、そのゲノム組織化は、ある程度の小さな変動はあるものの、比較的一致している。アルテリウイルスの例示的なゲノム組織化およびビリオンアーキテクチャを図２０に示す。アルテリウイルスゲノムは、多シストロン性＋ＲＮＡであり、１０〜１５の既知のＯＲＦのアレイに隣接する５’および３’の非翻訳領域（ＮＴＲ）を有している。大きなレプリカーゼＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂは、このゲノムの５’に近位の４分の３を占めており、ＯＲＦ１ａの大きさは、ＯＲＦ１ｂの大きさよりもかなり変動する。ＯＲＦ１ａの翻訳は、レプリカーゼポリプロテイン（ｐｐ）１ａを産生し、一方、ＯＲＦ１ｂは、−１のプログラムされたリボソームフレームシフト（ＰＲＦ）によって発現し、Ｃ末端に向かってｐｐ１ａからｐｐ１ａｂへと延びる。これに加え、短いトランスフレームＯＲＦは、＋１フレームでＯＲＦ１ａのｎｓｐ２コード領域と重複し、−２ＰＲＦによって発現することが報告されている。３’に近位のゲノム部分は、小さな組織化を有しており、８〜１２の比較的小さな遺伝子を含み、その大部分が、隣接する遺伝子と重複している。これらのＯＲＦは、構造タンパク質をコードし、ｓｇ  ｍＲＮＡの３’共有末端を有するネスティドセット（３’−ｃｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）から発現する。これらのＯＲＦの組織化は保存されているが、ＯＲＦ１ｂの下流は、ＳＨＦＶおよび全ての最近特定されたＳＨＦＶ様ウイルスは、ＯＲＦ２〜４の従来からある複製から誘導され得る３個または４個のさらなるＯＲＦ（約１．６ｋｂ）を含んでいる。ＯＲＦ１ａの大きさが変動すると共に、この推定される複製は、アルテリウイルス間のゲノムサイズの差を説明する。
【００９１】
ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）に関し、野生型ＥＡＶゲノムは、約１２．７ｋｂの大きさである。このゲノムの５’の４分の３は、２つの大きなレプリカーゼタンパク質１ａおよび１ａｂをコードし、この２つのタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端では同一であるが、リボソームフレームシフトに起因して、１ａｂのＣ末端領域のアミノ酸配列は、固有である。ＥＡＶゲノムの３’の４分の１は、ウイルスの構造タンパク質遺伝子をコードし、その全てがサブゲノムＲＮＡから発現する。サブゲノムＲＮＡは、３’共有末端を有するＲＮＡのネスティドセットを形成し、これは不連続な転写機構によって作られる。サブゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡとは連続していない配列で構成されている。全てのＥＡＶサブゲノムＲＮＡは、ゲノム５’配列と同一である、共通の５’リーダー配列（１５６〜２２１ｎｔ長）を共有する。サブゲノムＲＮＡのリーダー部分およびボディ部分は、転写制御配列（ＴＲＳ）と呼ばれる保存された配列によって接続する。ＴＲＳは、リーダーの３’末端（リーダーＴＲＳ）と、それぞれの構造タンパク質遺伝子の上流に位置するサブゲノムプロモーター領域（ボディＴＲＳ）とに見出される。ネガティブストランド複製中間体ＲＮＡが転写されると、サブゲノムＲＮＡが作製される。転写が起こるにつれて、複製複合体は、それぞれのボディＴＲＳまで来ると停止し、次いで、新生ネガティブストランドＲＮＡが、相補的なポジティブストランドリーダーＴＲＳと会合し、ネガティブストランドＲＮＡの転写が続く。この不連続な転写機構によって、５’および３’のＥＡＶ保存配列を両方とも含むサブゲノムＲＮＡが得られる。次いで、ネガティブストランドサブゲノムＲＮＡは、サブゲノムポジティブセンスｍＲＮＡを産生するためのテンプレートとなる。
【００９２】
ＥＡＶの全ゲノムを代表する感染性ｃＤＮＡクローンが報告されており（ｖａｎ  Ｄｉｎｔｅｎ  １９９７；ｄｅ  Ｖｒｉｅｓら、２０００、２００１；Ｇｌａｓｅｒら、１９９９）、これらのクローンが、ほぼ２０年間にわたり、ＥＡＶ  ＲＮＡ複製および転写を試験するために使用されてきた（ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９、ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９ａ、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００ａ、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２０００、Ｔｉｊｍｓ  ２００１、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００１、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００３、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００４、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  ２００５、Ｂｅｅｒｅｎｓ  ＆  Ｓｎｉｊｄｅｒ  ２００７、Ｔｉｊｍｓ  ２００７、Ｋａｓｔｅｒｅｎ  ２０１３）。これに加え、ＯＲＦ２およびＯＲＦ７の代わりに挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む感染性クローンが作成され、これらのＲＮＡがエレクトロポレーションされた細胞において、ＣＡＴタンパク質が発現することが示された（ｖａｎ  Ｄｉｎｔｅｎ  １９９７、ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９）。部位特異的突然変異誘発および構造タンパク質遺伝子領域の欠失による感染性クローンの改変を使用し、ＲＮＡ複製を補助する各構造遺伝子の必要性を決定した（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００）。Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００によって報告されたこの研究は、構造遺伝子がＲＮＡ複製を補助するのに必要ではないと結論付けた。サブゲノムＲＮＡ産生におけるＴＲＳ活性のための配列相同性要件の分析を実施し、これを使用し、不連続な転写がどのようにして機構的に起こるのかをより明確にし（ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２０００、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００１、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００３、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  ２００５）、ＲＮＡの複製およびウイルス粒子へのパッケージングに必要な最小限のゲノム配列を理解するために、欠陥干渉ＲＮＡを使用した（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００ａ）。しかし、異種遺伝子を効率的に発現することができ、そのように特異的に設計されたＥＡＶからレプリコンベクターを構築しようとする試みは、報告されていない。
【００９３】
異種遺伝子の発現のためのＥＡＶレプリコンベクターの開発は、ほとんどの他のレプリコン系がウイルス粒子に基づく手法に焦点を当てているため、本明細書に記載された本発明の研究に先立っては行われていない。すなわち、欠損した構造タンパク質をトランス型に戻すことにより、レプリコンＲＮＡをウイルス様粒子にパッケージングすることである。ＥＡＶには、２つの主要な構造タンパク質と５つの小さな構造タンパク質があり、それぞれの発現レベルが効率的なウイルス粒子産生の鍵となるため、ＥＡＶからウイルス粒子に基づく系を開発するのは困難すぎると考えられている。少なくともこの理由から、ＥＡＶレプリコンＲＮＡをベクターとして開発しようとする試みは、本明細書に記載された本発明の研究に先立っては行われていない。
【００９４】
本明細書に記載される本発明の研究は、主にＥＡＶ  ＲＮＡレプリコンに基づいており、組換えウイルス様粒子の形成に依存しない。したがって、ここに開示されている組成物および方法は、ウイルス様粒子を産生するためにＥＡＶ構造タンパク質を戻す際の複雑さによって制限されない。これに加え、各サブゲノムＲＮＡは、固有のレベルで天然で発現するので、その系も、単遺伝子または多遺伝子のいずれかの設計においてＧＯＩの調整可能な発現を可能にする。互いに同一レベルまたは異なるレベルでそれぞれ複数のＧＯＩを発現することができる単一のＲＮＡの有用性は顕著である。この能力は、同じ細胞内の複数のタンパク質の発現を可能にする。ＥＡＶレプリコンの独創的な設計に加えて、ベクターからのタンパク質発現を調整（例えば、調節）するために使用することができる方法の開発には、発明性がある。本明細書で使用される場合、「調整可能な発現」との用語は、本明細書に記載の組成物および方法が、本開示のアルテリウイルスレプリコンに操作可能に接続したＧＯＩの発現レベルを制御することができる能力を指す。この能力は、例えば、いくつかの方法によって達成することができる。ある細胞の核からのＤＮＡプラスミドから発射された系を使用する手法では、レプリコンＲＮＡの転写は、誘発性ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによって制御／調整され得る。例えば、形質転換細胞からのレプリコンＲＮＡの産生を誘発するために、Ｔｅｔ技術を用いてＲＮＡの転写を制御することができる。レプリコンＲＮＡが細胞の細胞質に入ると（ＲＮＡを細胞にトランスフェクトするか、またはその細胞が、系の統合されたＤＮＡ態様からＲＮＡを産生することによって）、系からの発現を調整するために、多くのさらなる技術を使用することができる。第１の例（１）は、ＴＲＳエレメント周囲の二次構造を理解するために、ＲＮＡ構造配列および次世代配列決定（ＮＧＳ）を利用することができる。いくつかの実施形態では、この情報は、ＴＲＳの活性を調整（例えば、調節）し、ＥＡＶレプリコンからの調整可能なＧＯＩ発現を知らせるための配合手法への洞察を与えることができる。この情報を、（２）ＧＯＩが配置されるゲノムＲＮＡに対する相対的な位置、（３）一次遺伝子配列の配列最適化を利用することによって、各ＧＯＩの二次構造を制御すること、（４）レプリコンの最適な複製にとって重要な３’配列を最適化することと合わせる。例えば、レプリコンに含まれる３’ＥＡＶ配列を最適化することと、さらに長いポリＡ領域を含めることによって達成される。これらの全ての手法を採用することにより、調整可能なタンパク質発現が可能になる。本明細書に記載の方法、組成物および系を、調整可能なタンパク質発現に使用することができ、例えば、それらを用いて様々な発現レベルで１つまたは複数のタンパク質を発現させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法、組成物および系は、１つまたは複数のタンパク質を、そのタンパク質の参照発現レベルの約０．１％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０���、またはより多く発現させるために使用することができる。
【００９５】
以下にさらに詳細に記載するように、本開示は、本発明者らによって設計および評価された様々なアルテリウイルス発現ベクターと関連する、予期せぬ結果の有意な表示にも関する。Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら（２０００）によって発表された研究では、強力なＴＲＳ２サブゲノム転写活性を保持するために、ＥＡＶのオープンリーディングフレームＯＲＦ２ａをコードする配列が必要であることが示されている（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００）。実際に、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐらは、ＯＲＦ２ａ配列のわずか５塩基しか保持していない、ヌクレオチド残基９，７５６−１２，３５１が欠失したＥＡＶ感染性クローンが、サブゲノムＲＮＡ合成の有意な減少を示したことを示した。この特性は、異なるＥＡＶ感染性クローンから示されたサブゲノムＲＮＡ合成とは対照的なものであった（変異体０３０−２３１９；ＥＡＶ０３０変異体とも呼ばれる）。変異体０３０−２３１９は、変異２ａ−２５９４と同じ３’配列を含んでいたが、インタクトなＯＲＦ２ａを維持しており、この構築物は、野生型の強力なサブゲノムＲＮＡ合成を示した（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００）。
【００９６】
驚くべきことに、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐらのこれらの教示とは対照的に、本明細書に開示するレプリコン設計（例えばＲｅｐ−ＥＡＶ（ＷＴ））およびこのレプリコンの全ての誘導体態様において、ＯＲＦ２ａ配列はまったく存在しないが、この各レプリコンは、それでも、１つまたは複数のＧＯＩの強力なサブゲノム転写と高い発現を示す。さらに、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００は、同様に変異体０３０−２３１９を用いた効果的な複製のために維持すべき最適な３’末端配列を定義している。Ｍｏｌｅｎｋａｍｐらは、ＥＡＶの３’末端３５４ｎｔが、野生型複製を補助することができることを教示している。驚くべきことに、本明細書に記載され、実証されるように、少なくとも２つのＧＯＩをコードするレプリコンベクターは、有意な３’末端配列が含まれていない限り、効果的に複製しなかった。これに加え、同じタンパク質をコードするが、異なる一次ＧＯＩ配列を有するレプリコンから、複製およびタンパク質発現の両方における有意な差が示された。同じＧＯＩをコードするが、異なる一次ヌクレオチド配列を有するレプリコンにおいて、複製活性において５０倍を超える差、タンパク質発現において２〜４倍の差が観察された。本明細書に記載のタンパク質発現のための方法、組成物および系の別の非限定的な予想外の態様は、それらが可能なタンパク質発現の規模である。ＲＮＡレプリコン分野では、アルファウイルス系のレプリコン系が、細胞の総タンパク質含量の２０％までを発現することができることがよく知られている（Ｐｕｓｈｋｏら、１９９７）。したがって、本明細書に記載の方法、アルテリウイルス系の組成物および系が、アルファウイルスレプリコンよりも細胞当たりの発現レベルをさらに高くすることができることは、驚くべきことである。
【００９７】
本開示の核酸分子
一態様では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む新規核酸分子が開示される。例えば、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、親アルテリウイルスゲノムのゲノム領域の１つまたは複数（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））に欠失、置換および／または挿入を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡにおいて、アルテリウイルスＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち１つまたは複数が存在しないか、および／または改変されている。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％の同一性を示す配列フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードするヌクレオチド配列に対して１００％の配列同一性を示す配列フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち１つまたは複数をコードする配列の少なくとも一部を欠いている。例えば、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち１つまたは複数をコードする配列の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはより多くを欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち１つまたは複数をコードする配列全体を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち１つをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち２つをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち３つをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａのうち４つをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５およびＯＲＦ５ａの全てをコードする配列の一部または全体を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４およびＯＲＦ５を欠いている。いくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ６の少なくとも一部分、例えば、ＯＲＦ６の最初の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはより多くのヌクレオチドを欠いている。「フラグメント」は、ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される場合、クローンまたはポリヌクレオチド分子の任意の部分、特に、使用可能な機能的特徴を保持するポリヌクレオチドの一部を指す。例えば、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、ポリヌクレオチドの任意の部分配列、典型的には、本明細書で与えられる任意の配列の少なくとも約９個の連続したヌクレオチドの部分配列、例えば、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチドの部分配列を指す。例示的なポリヌクレオチドフラグメントは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドの最初の６０個の連続したヌクレオチド（例えば、５’−末端から、または３’−末端から開始する）である。
【００９８】
目的のアルテリウイルスのオープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して高度な配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％）を有する核酸フラグメントは、本明細書で特定される配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４０、配列番号４１および配列番号４２）または当該技術分野で知られている任意の他の配列、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＣ＿００２５３２（ＥＡＶ）、ＮＣ＿００１９６１．１（ＰＲＲＳＶ）、ＮＣ＿００３０９２（ＳＨＦＶ）およびＮＣ＿００１６３９．１  （ＬＤＶ）を用いることによって、ゲノム配列分析、ハイブリダイゼーションおよび／またはそれぞれのアルテリウイルスゲノムにおいて特定された配列に由来する変性プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって、特定および／または単離することができる。本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされたポリヌクレオチドが、構成要素（例えば、ヌクレオチド）のアラインメントのウィンドウ全体で不変である程度を指す。試験配列と参照配列のアラインメントされたセグメントについての「同一性率（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」は、２つのアラインメントされた配列に共通の同一構成要素の数を、参照配列のセグメント中の構成要素の合計数（例えば、全参照配列または参照配列のより小さな所定の部分）で割ったものである。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、アルテリウイルスのオープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする核酸配列、この核酸配列の相補体、いずれかのフラグメントに、低ストリンジェンシー条件、中程度ストリンジェンシー条件、または高ストリンジェンシー条件のいずれかで特異的にハイブリダイズする１つまたは複数の核酸フラグメントを含む。特定の実施形態では、本出願の核酸分子は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件で、アルテリウイルスのオープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする核酸配列、この核酸配列の相補体、いずれかのフラグメントにハイブリダイズする核酸配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、オープンリーディングフレームＯＲＦ２ａの一部または全体をコードする配列を欠いた、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列のＡＴＧ開始コドンを欠いた、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、オープンリーディングフレームＯＲＦ６をコードする配列の一部または全体を欠いた、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む。例えば、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＯＲＦ６のＡＴＧ開始コドンを欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ６の約１％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはより多くが、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡには存在しない。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ６中のＴＲＳ７は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡにおいて欠失しているか、または改変され、その活性を低下させるか、または消失させる。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ７の約１％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはより多くが、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡには存在しない。
【０１０１】
これらの新しい核酸分子が構築され、特性決定される分子技術および方法は、本明細書の実施例に、さらに完全に記載される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、組換え核酸分子である。本明細書で使用される場合、組換えとの用語は、ポリヌクレオチドのヒト操作に由来するか、間接的に生じる任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を意味する。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって作られた任意の核酸分子と同様に、またはこれにリンカーが接続しているか、またはベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）に組み込まれた、組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、（１）例えば、化学技術または酵素技術（例えば、化学的な核酸合成の使用によって、または複製、重合、エキソヌクレアーゼによる消化、エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含む）、または核酸分子の組換え（相同組換えおよび部位特異的な組換えを含む）を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されるか、または改変され、（２）天然では結合していないヌクレオチド配列の結合を含み、（３）天然に存在するヌクレオチド配列について１つまたは複数のヌクレオチドを欠くような分子クローニング技術を用いて操作され、および／または（４）天然に存在するヌクレオチド配列について１つまたは複数の配列の変化または再編成を有するような分子クローニング技術を用いて操作されている。
【０１０３】
好ましくは、本明細書に開示される核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングなど）または化学合成を用いて作られる。本明細書に開示される核酸分子は、天然の核酸分子およびその相同体を含み、天然の核酸分子およびその相同体としては、限定されないが、天然の対立遺伝子変異体、このような改変によって本明細書に記載するような生物学的活性を達成する際に望ましい特性を与えるような様式で１つまたは複数のヌクレオチド残基が挿入され、欠失し、および／または置換された改変核酸分子が挙げられる。
【０１０４】
核酸分子は、天然に存在する核酸配列の変異体を含め、当業者に公知の多くの方法を用いて製造することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照）。核酸分子の配列は、天然に存在する配列に対して、改変することができ、天然に存在する配列から、限定されないが、伝統的な突然変異誘発技術および組換えＤＮＡ技術を含む種々の技術（例えば、限定されないが、部位特異的突然変異誘発、変異を誘発するための核酸分子の化学処理、核酸フラグメントの制限酵素による開裂、核酸フラグメントのライゲーション、核酸配列の選択した領域のＰＣＲ増幅および／または突然変異誘発、組換えクローニング、オリゴヌクレオチド混合物の化学合成および核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーションを含む化学合成、およびこれらの組み合わせ）を用いて誘導される。核酸分子相同体は、改変核酸分子の混合物から、その核酸分子によってコードされるタンパク質またはレプリコンの機能についてスクリーニングすることによって、および／または野生型遺伝子またはそのフラグメントとのハイブリダイゼーションによって、または標的または野生型の核酸分子または配列に対して相同性を有するプライマーを用いたＰＣＲによって、選択することができる。
【０１０５】
本明細書に開示される種々の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、以下の特徴のうち１つまたは複数を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、非ネイティブ部位に１つまたは複数のサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含み、１つまたは複数のｓｇプロモーターはそれぞれ、転写制御配列（ＴＲＳ）を含む。
【０１０６】
「サブゲノムプロモーター」との用語は、本明細書で使用される場合、ウイルス核酸のサブゲノムｍＲＮＡのプロモーターを指す。本明細書で使用される場合、「アルテリウイルスサブゲノムプロモーター」は、アルテリウイルス複製プロセスの一部としてサブゲノムメッセンジャーＲＮＡの転写を指示する、野生型アルテリウイルスゲノム中で元々定義されたプロモーターである。アルテリウイルスサブゲノム（ｓｇ）プロモーターは、典型的には、５’および３’のフランキング配列と共に、保存された転写制御配列（ＴＲＳ）を含む。発現を作動させる特定のアルテリウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に基づき、本開示のサブゲノムプロモーターは、例えば、ｓｇプロモーター１（アルテリウイルスＴＲＳ１またはその変異体を含む）、ｓｇプロモーター２（アルテリウイルスＴＲＳ２またはその変異体を含む）、ｓｇプロモーター３（アルテリウイルスＴＲＳ３またはその変異体を含む）、ｓｇプロモーター４（アルテリウイルスＴＲＳ４またはその変異体を含む）、ｓｇプロモーター５（アルテリウイルスＴＲＳ５またはその変異体を含む）、ｓｇプロモーター６（アルテリウイルスＴＲＳ６またはその変異体を含む）、ｓｇプロモーター７（アルテリウイルスＴＲＳ７またはその変異体を含む）、またはこれらの変異体であってもよい。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本出願の核酸分子は、５’−フランキング配列および／または３’フランキング配列を本質的に欠くｓｇプロモーターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、保存された転写制御配列（ＴＲＳ）からなるｓｇプロモーターを含むことができ、すなわち、このようなｓｇプロモーターは、フランキング配列を含まない。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、野生型配列を有していてもよく、または野生型配列から改変されているがプロモーター活性を保持している配列を有していてもよい。
【０１０７】
したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター１、ｓｇプロモーター２、ｓｇプロモーター３、ｓｇプロモーター４、ｓｇプロモーター５、ｓｇプロモーター６、ｓｇプロモーター７およびこれらの変異体からなる群から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、またはより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター１に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター２に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター３に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター４に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター５に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーター６に対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を示す配列を含む。ｓｇプロモーターのこのような変異体は、同じ種または異なる種に由来する同種ポリヌクレオチドを含め、天然に存在していてもよく、または非天然変異体、例えば、化学合成方法を用いて合成されるか、または組換えＤＮＡ技術を用いて作製されるポリヌクレオチドであってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、改変ｓｇプロモーターである。改変ｓｇプロモーターは、一般的に、任意の改変ｓｇプロモーターであってもよく、例えば、改変ｓｇプロモーター１、改変ｓｇプロモーター２、改変ｓｇプロモーター３、改変ｓｇプロモーター４、改変ｓｇプロモーター５、改変ｓｇプロモーター６、改変ｓｇプロモーター７であってもよい。いくつかの特定の実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、改変ｓｇプロモーター７である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、それぞれのネイティブ部位に位置する１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターを含む、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含んでいてもよく、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターはそれぞれ、ＴＲＳを含む。これに加えて、またはこれに代えて、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ＴＲＳの配列内に位置するヌクレオチド改変を含む。いくつかの例示的な実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、リーダーＴＲＳまたはその変異体を含む。いくつかの例示的な実施形態では、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つは、ボディＴＲＳまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、リーダーＴＲＳまたはその変異体と、ボディＴＲＳまたはその変異体は、同じ配列を有していない。いくつかの実施形態では、リーダーＴＲＳのヌクレオチド配列は、改変されていない。
【０１０８】
これに代えて、またはこれに加えて、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、それぞれのｓｇプロモーター配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造の形成に必要な一次配列内に位置する１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、１つまたは複数の改変ｓｇプロモーターのうち少なくとも１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物の二次構造は、ヘアピン構造を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド改変は、リーダーＴＲＳヘアピン（ＬＴＨ）内に位置する。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造の一次配列内に位置するヌクレオチド改変は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡの５’近位領域の立体配座ＲＮＡスイッチに関与する。いくつかの実施形態では、ヘアピン構造の一次配列内に位置するヌクレオチド改変は、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡの１つまたは複数または全てのｓｇ  ｍＲＮＡの産生を調節する。
【０１０９】
さらに、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数の変異Ｔ７転写終結シグナル配列を含んでいてもよい。「転写終結シグナル」、「ターミネーター」または「ターミネーター配列」または「転写ターミネーター」との用語は、本明細書で相互に置き換え可能に使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが転写を停止させる遺伝子配列の制御部分を指す。いくつかの例示的な実施形態によれば、１つまたは複数のＴ７変異転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つは、Ｔ９００１、Ｔ３１８５、Ｇ３１８８およびこれらの組み合わせからなる群から選択される位置にヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｔ９００１のヌクレオチド置換には、Ｔ９００１Ｇが含まれる。いくつかの実施形態では、位置Ｔ３１８５のヌクレオチド置換には、Ｔ３１８５Ａが含まれる。いくつかの実施形態では、位置Ｇ３１８８のヌクレオチド置換には、Ｇ３１８８Ａが含まれる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＴ７変異転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つは、Ｔ９００１Ｇ、Ｔ３１８５Ａ、Ｇ３１８８Ａおよびこれら任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される位置にヌクレオチド置換を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列を含む。異種転写終結シグナル配列は、一般に、任意の異種転写終結シグナル配列であってよく、例えば、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、またはこれらの変異体であってもよい。したがって、本開示のいくつかの実施形態の核酸分子は、ＳＰ６終結シグナル配列、Ｔ３終結シグナル配列、またはこれらの変異体からなる群から選択される１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の異種転写終結シグナル配列のうち少なくとも１つが不活性化されている。
【０１１１】
本明細書に開示される種々の実施形態では、核酸分子は、１つまたは複数のスペーサー領域を含んでいてもよい。スペーサー領域は、一般に、任意のスペーサー領域であってもよく、例えば、１つまたは複数のｓｇプロモーターのうち少なくとも１つに隣接して操作可能に配置されたスペーサー領域であってもよい。本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーターに対してすぐ横の３’に配置されている。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のスペーサー領域のうち少なくとも１つは、ｓｇプロモーターに対してすぐ横の５’に配置されている。原理的には、スペーサー領域の配列は任意の長さであってもよく、例えば、約２０〜４００ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、スペーサー領域の配列は、約１８〜４２０ヌクレオチド長、約２０〜３５０ヌクレオチド長、約３０〜２００ヌクレオチド長、約５０〜２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域の配列は、約１００〜３００ヌクレオチド長、約２００〜３５０ヌクレオチド長、約３００〜３５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域の配列は、約２３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域の配列は、約９８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域の配列は、約２２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、スペーサー領域の配列は、約３４３ヌクレオチド長である。
【０１１２】
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、１個以上の発現カセットを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「発現カセット」との用語は、コード配列と、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてコード配列の適切な転写および／または翻訳を指示するのに十分な制御情報とを含む、遺伝物質の構築物を指す。発現カセットは、所望の宿主細胞に標的化するためのベクターに挿入されてもよく、および／または被験体に挿入されてもよい。さらに、発現カセットとの用語は、「発現構築物」との用語と相互に置き換え可能に使用されてもよい。本明細書で使用される「発現カセット」との用語は、発現制御因子（例えば、プロモーターと、場合により、遺伝子の転写または翻訳に影響を与える他の任意の核酸配列または組み合わせ）に操作可能に接続するタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする核酸構築物を指す。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、１つまたは複数の発現カセットを含んでいてもよく、それぞれが、異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したｓｇプロモーターを含む。「操作可能に接続した」との用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上の配列間の機能的な連結を示す。例えば、目的のポリヌクレオチドと制御配列（例えば、プロモーター）との間の操作可能な接続は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。この意味において、「操作可能に接続した」との用語は、制御領域が、目的のコード配列の転写または翻訳を制御するのに効果的であるように、制御領域と、転写されるコード配列とを配置することを指す。本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、「操作可能に接続した」との用語は、制御配列が、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチドおよび／または機能性ＲＮＡの発現または細胞局在化を指示するか、または調節するような、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする配列に対して制御配列が適切な位置に配置される構成を示す。したがって、核酸配列の転写に介在し得る場合には、プロモーターは、核酸配列と操作可能に接続した状態である。操作可能に接続した要素は、連続していてもよく、または不連続であってもよい。
【０１１４】
２つ以上のＤＮＡ配列を操作可能に接続するための基本的な技術は、当業者によく知られており、このような方法は、標準的な分子生物学的操作のための多数のテキストに記載されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＧｉｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３４３−４５，２００９を参照）。
【０１１５】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、転写制御配列（ＴＲＳ）と、場合により、１つまたは複数のフランキング領域を含んでいてもよい。フランキング領域は、一般に、任意の長さであってもよく、例えば、約５〜４００ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、約５〜３５０ヌクレオチド長、約１０〜３００ヌクレオチド長、約２０〜２００ヌクレオチド長、約５０〜１５０ヌクレオチド長、約５０〜１００ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、約５〜１００ヌクレオチド長、約１０〜１５０ヌクレオチド長、約１５〜１１５ヌクレオチド長、約２０〜３００ヌクレオチド長、約５０〜３５０ヌクレオチド長、約１００〜３５０ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、１７ヌクレオチド長であってもよく、または約１７ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、１７、２３、２５、５６、７３または１１２ヌクレオチド長であってもよく、または約１７、２３、２５、５６、７３または１１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、２５ヌクレオチド長であってもよく、または約２５ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、５６ヌクレオチド長であってもよく、または約５６ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、７３ヌクレオチド長であってもよく、または約７３ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、フランキング領域は、１１２ヌクレオチド長であってもよく、または約１１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、ＴＲＳに対して５’に位置するフランキング領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、ＴＲＳに対してすぐ横の５’に位置するフランキング領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、ＴＲＳに対して３’に位置するフランキング領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、ＴＲＳに対してすぐ横の３’に位置するフランキング領域を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーターは、５’フランキング領域と、３’フランキング領域とを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、５’フランキング領域と、３’フランキング領域は、同じ長さであってもよい。いくつかの実施形態では、５’フランキング領域と、３’フランキング領域は、それぞれの長さが異なっていてもよい。いくつかの特定の実施形態では、５’フランキング領域は、２３ヌクレオチド長であってもよく、または約２３ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、３’フランキング領域は、１７、２５、５６、７３または１１２ヌクレオチド長であってもよく、または約１７、２５、５６、７３または１１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの特定の実施形態では、ｓｇプロモーター３の３’フランキング領域は、７３ヌクレオチド長であってもよく、または約７３ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーター４の３’フランキング領域は、１７ヌクレオチド長であってもよく、または約１７ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの特定の実施形態では、ｓｇプロモーター５の３’フランキング領域は、１１２ヌクレオチド長であってもよく、または約１１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、ｓｇプロモーター６の３’フランキング領域は、２５ヌクレオチド長であってもよく、または約２５ヌクレオチド長であってもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、１個より多い発現カセットを含んでいてもよい。原理的には、本明細書に開示される核酸分子は、一般に、任意の数の発現カセットを含むことができる。いくつかの特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸分子は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個の発現カセットを含んでいてもよい。
【０１１７】
したがって、本明細書で提供されるような核酸分子は、例えば、異種核酸配列に操作可能に接続した場合、異種核酸配列の発現に影響を及ぼすことができる発現ベクターとしての用途を見出すことができる。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現のために最適化されている。いくつかの実施形態では、参照コード配列は、最適化されていない配列である。いくつかの実施形態では、ＧＯＩコード配列の最適化は、コドンの最適化を含んでいてもよい。ヌクレオチド配列のコドン最適化に関し、遺伝子コードの縮重は、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく、ある遺伝子の配列をコードするタンパク質の少なくとも１個の塩基を異なる塩基で置換する可能性を与える。したがって、本出願の核酸分子は、遺伝コードの縮重による置換によって、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列から変化した任意の塩基配列も有していてもよい。コドン使用を説明する参考文献は、容易に公的に入手可能である。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、種々の理由のために、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するために（例えば、アルテリウイルスｍＲＮＡ中のコドンを、ヒト、ハムスター、マウスまたはサルなどの他の生物に好ましいものに変えることによって）、ポリヌクレオチド配列の変異体を作成することができる。
【０１１８】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることができる。ポリペプチドは、一般に、任意のポリペプチドであってもよく、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補給用ポリペプチド、工業用酵素またはレポーターポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調整剤およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【０１１９】
ＧＯＩをコードすることができるポリペプチドの非限定的な例としては、血液因子、例えば、β−グロビン、ヘモグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子および凝固因子；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９など；増殖因子、例えば、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、例えば塩基性ＦＧＦおよび酸性ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、肝細胞腫由来成長因子（ＨＤＧＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）など；可溶性受容体、例えば、可溶性ＴＮＦ−α受容体、可溶性ＶＥＧＦ受容体、可溶性インターロイキン受容体（例えば、可溶性ＩＬ−１受容体および可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体）、可溶性γまたはδＴ細胞受容体、可溶性受容体のリガンド結合フラグメントなど；酵素、例えば、α−グルコシダーゼ、イミグルセラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼおよびアルグルセラーゼ；酵素活性化因子、例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子；ケモカイン、例えば、ＩＰ−１０、インターフェロン−γ（Ｍｉｇ）によって誘発されるモノカイン、Ｇｒｏα／ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＰＦ−４など；血管新生因子、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子−β、塩基性線維芽細胞増殖因子、神経膠腫由来増殖因子、アンギオゲニン、アンギオゲニン−２など；抗血管新生剤、例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体；タンパク質ワクチン；神経活性ペプチド、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）、ブラジキニン、コレシストキニン、ガスチン、セクレチン、オキシトシン、ゴナドトロピン放出ホルモン、β−エンドルフィン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ソマトスタチン、プロラクチン、ガラニン、成長ホルモン放出ホルモン、ボンベシン、ダイノルフィン、ワルファリン、ニューロテンシン、モチリン、チロトロピン、ニューロペプチドＹ、黄体形成ホルモン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、バソプレッシン、アンギオテンシンＩＩ、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、睡眠ペプチドなど；血栓溶解剤；心房性ナトリウム利尿ペプチド；リラキシン；グリア細胞繊維性酸性タンパク質；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；ヒトα−１アンチトリプシン；白血病阻止因子（ＬＩＦ）；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；組織因子、黄体形成ホルモン；マクロファージ活性化因子；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；好中球化学走性因子（ＮＣＦ）；神経成長因子；メタロプロテイナーゼの組織阻害剤；血管作動性腸管ペプチド；アンギオゲニン；アンギオトロピン；フィブリン；ヒルジン；ＩＬ−１受容体アンタゴニスト��どが挙げられる。目的のタンパク質のいくつかの他の非限定的な例としては、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン３および４／５（ＮＴ−３および４／５）；グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）；血友病関連凝固タンパク質、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子；ジストロフィンまたはニニジストロフィン；リソソーム酸リパーゼ；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；グリコーゲン貯蔵疾患に関連する酵素、例えば、グルコース−６−ホスファターゼ、酸マルターゼ、グリコーゲンデブランチング酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ（例えばＰＨＫＡ２）、グルコーストランスポーター（例えばＧＬＵＴ２）、アルドラーゼＡ，β−エノラーゼおよびグリコーゲンシンターゼ；リソソーム酵素（例えば、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＡ）；およびこれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１２０】
ＧＯＩによってコードされるペプチドは、複数サブユニットを有するタンパク質または単一サブユニットを有するタンパク質であってもよい。ペプチドは、例えば、ルシフェラーゼ；蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）；成長ホルモン（ＧＨ）およびその変異体；インスリン様成長因子（ＩＧＦ）およびその変異体；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびその変異体；エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびその変異体；インスリン、例えば、プロインスリン、プレプロインスリン、インスリン、インスリン類似体など；抗体およびその変異体、例えば、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体；抗体の抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメント）；抗体の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶフラグメント）；ジストロフィンおよびその変異体；凝固因子およびその変異体；嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）およびその変異体；ならびにインターフェロンおよびその変異体が挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造は、所望な特性のために最適化されている。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列を含むＲＮＡ転写物の二次構造は、改良されたＲＮＡ複製のために最適化されている。
【０１２２】
本明細書に開示される改変されたゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、好ましくは、アルテリウイルスのゲノムまたはレプリコンＲＮＡであり、例えば、アルテリウイルス科アルテリウイルス属のウイルス種のゲノムまたはレプリコンＲＮＡである。
【０１２３】
適切なアルテリウイルス種としては、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）およびウォブリーポッサム病（ｗｏｂｂｌｙ  ｐｏｓｓｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス（ＷＰＤＶ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ＥＡＶ毒性ビューサイラス株（ＶＢＳ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される改変ゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である。有毒および無毒のアルテリウイルス株が両方とも適している。好ましいアルテリウイルス株の非限定的な例としては、限定されないが、ＥＡＶ毒性ビューサイラス株（ＶＢＳ）、ＬＤＶ−Ｐｌａｇｅｍａｎｎ、ＬＤＶ−Ｃ、ＰＲＲＳＶ−１型およびＰＲＲＳＶ−２型が挙げられる。例示的な好ましいＥＡＶ株としては、限定されないが、ＥＡＶ  ＶＢ５３、ＥＡＶ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９６、ＥＡＶ  ＨＫ２５、ＥＡＶ  ＨＫ１１６、ＥＡＶ  ＡＲＶＡＣ  ＭＬＶ、ＥＡＶ  Ｂｕｃｙｒｕｓ株（オハイオ）、改変ＥＡＶ  Ｂｕｃｙｒｕｓ、無毒株ＣＡ９５、Ｒｅｄ  Ｍｉｌｅ（ケンタッキー）、８４ＫＹ−Ａ１（ケンタッキー）、Ｗｒｏｃｌａｗ−２（ポーランド）、Ｂｉｂｕｎａ（スイス）およびＶｉｅｎｎａ（オーストラリア）が挙げられる。ＰＲＲＳＶ株の非限定的な好ましい例としては、ＰＲＲＳＶ  ＬＶ４．２．１、ＰＲＲＳＶ  １６２４４Ｂ、ＰＲＲＳＶ  ＨＢ−１（ｓｈ）／２００２、ＰＲＲＳＶ  ＨＢ−２（ｓｈ）／２００２、ＰＲＲＳＶ  ＨＮ１、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ  ０１−０８、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０８０２、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０８０３、ＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３３２が挙げられる。ＳＨＦＶ株および変異体の非限定的な好ましい例としては、ＳＨＦＶ変異体ＳＨＦＶ−ｋｒｔｇ１ａおよび−ｋｒｔｇ１ｂ（ＳＨＦＶ−ｋｒｔｇ１ａ／ｂ）、ＳＨＦＶｋｒｔｇ２ａ／ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＪＸ４７３８４７〜ＪＸ４７３８５０）、ＳＨＦＶ−ＬＶＲ、ＳＨＦＶプロトタイプ変異体ＬＶＲ  ４２−０／Ｍ６９４１（ＮＣ＿００３０９２）；キバレ赤色コロブス由来のＳＨＦＶ−ｋｒｃ１およびＳＨＦＶｋｒｃ２（それぞれＨＱ８４５７３７およびＨＱ８４５７３８）が挙げられる。好ましいアルテリウイルスの他の非限定的な例としては、ＰＲＲＳＶ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ヨーロッパ（１型）型株（Ｍ９６２６２）；ＰＲＲＳＶＶＲ２３３２，北アメリカ（２型）型株（Ｕ８７３９２）；ＥＡＶ−Ｂｕｃｙｒｕｓ（ＮＣ＿００２５３２）；ＥＡＶ−ｓ３６８５（ＧＱ９０３７９４）；ＬＤＶ−Ｐ，Ｐｌａｇｅｍａｎｎ株（Ｕ１５１４６）；およびＬＤＶ−Ｃ，神経毒性Ｃ型株（Ｌ１３２９８）が挙げられる。
【０１２４】
組換え細胞
一態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、動物細胞などの宿主細胞に本明細書で提供される核酸分子を導入することと、形質転換細胞を選択またはスクリーニングすることとを含む、細胞を形質転換する方法に関する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーション手順またはバイオリスティック手順によって真核細胞に導入される。
【０１２５】
関連する態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、組換え宿主細胞、例えば、本明細書に記載の核酸分子を含む組換え動物細胞に関する。核酸分子は、宿主ゲノムに安定して組み込むことができ、またはエピソームによって複製することができ、または安定な発現または一過性の発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在してもよい。したがって、本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、核酸分子は、エピソーム単位として組換え宿主細胞内に維持され、複製される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、組換え細胞のゲノムに安定に組み込まれる。安定した組込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術を使用するか、またはガイドＲＮＡ指向性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮゲノム編集などのより正確なゲノム編集技術を用いて完了させることができる。いくつかの実施形態では、安定な発現または一過性の発現のためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞中に存在する核酸分子。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えば、本出願のベクター構築物で、遺伝子操作（例えば、形質導入または形質転換またはトランスフェクト）されてもよく、本出願のベクター構築物は、例えば、宿主細胞のゲノムの一部に相同性の核酸配列を含む相同組換えのためのベクターであってもよく、または目的の任意の遺伝子または目的の遺伝子の組み合わせを発現するための発現ベクターであってもよい。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってもよい。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの発現のためのベクターを、例えば相同組換えによって宿主に組み込むために設計することもできる。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを含む核酸分子、および場合により、選択可能なマーカーまたはレポーター遺伝子を用い、適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【０１２７】
原理的には、本明細書中に開示される方法および組成物は、限定されないが原核生物種および真核生物種を含む任意の種の遺伝子操作のために使用されてもよい。本開示による組成物および方法を使用して改変される適切な宿主細胞としては、限定されないが、藻類細胞、細菌細胞、不等毛植物、真菌細胞、ツボカビ細胞、微小菌類、微細藻類および動物細胞を挙げることができる。いくつかの実施形態では、動物細胞は、無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、形質転換されていない細胞、または少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクションされた細胞のいずれかであってもよい。
【０１２８】
本明細書に開示される方法および組成物は、好ましくは、ワクチン、医薬品、工業製品、化学薬品などの製造において使用されるポリペプチドの製造を含め、養殖、農業、畜産および／または治療用途および医療用途にとって重要であるか、または興味深い宿主細胞と共に使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの組織、器官または細胞培養物（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ）中の細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、生きている被験体または生物（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）中の細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、本出願の組成物および方法は、ウマ、ブタ、マウス、サルおよび類人猿などのアルテリウイルスの天然宿主である種由来の宿主細胞とともに適切に用いることができる。特に好ましい種は、本出願のいくつかの実施形態では、脊椎動物種および無脊椎動物種である。原則として、任意の動物種を一般に使用することができ、例えば、ヒト、イヌ、鳥、魚、ウマ、ブタ（ｐｉｇ）、霊長類、マウス、ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ヒツジ、ウサギ、ネコ、ヤギ、ロバ、ハムスターまたはバッファローであってもよい。適切な鳥種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ダチョウ、エミュー、白鳥、クジャク、キジ、パートリッジおよびホロホロチョウが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、魚種は、サーモン種である。適切な動物宿主細胞の非限定的な例としては、限定されないが、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ウサギ腎臓細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト類表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞およびマウス３Ｔ３細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベビーハムスター腎臓細胞である。いくつかの実施形態では、ベビーハムスター腎臓細胞は、ＢＨＫ−２１細胞である。
【０１２９】
上述の多種多様な宿主細胞および種の形質転換のための技術は、当該分野で公知であり、技術文献および科学文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成し、維持するのに適した方法およびシステムは、当技術分野で公知である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法を使用して、組織に特異的な発現を達成することができ、これにより治療アルテリウイルスベクターを患者に全身的に送達することができる。ベクターが、適切なＲＮＡ種を発現しない細胞に感染する場合、ベクターは非構造タンパク質のみを発現することができ、目的の遺伝子は発現しない。最終的に、アルテリウイルスベクターは、無害に分解される。
【０１３１】
非限定的な一例では、本明細書に記載の組成物および方法の使用は、例えば様々な種類の癌の治療のための標的ベクターを含む、様々な治療用途に実質上の組織特異的発現を可能にする。この理論的根拠は、癌胎児性腫瘍特異抗原（ＣＥＡ）およびα−フェトプロテイン腫瘍マーカーのような腫瘍特異的マーカーの特異的発現に依存する。簡潔には、このような腫瘍特異的ＲＮＡを利用して特異的腫瘍を標的とすることにより、以下に説明する毒性分子、サイトカインまたはプロドラッグの腫瘍特異的発現が可能になる。そのような方法は、例えば、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌を含む広範囲の腫瘍に対して、これらの腫瘍の全てがＣＥＡを発現するため、利用され得る。
【０１３２】
簡単に説明すると、ＣＥＡは、α−フェトプロテイン腫瘍マーカーとともに、記述される最初の腫瘍特異的マーカーの１つであった。ＣＥＡは、胎児発育の最初の２つの妊娠初期の間の腸、膵臓および肝臓の胚組織における正常な糖タンパク質である（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  １９８４，Ｒｏｂｂｉｎｓら（編集））。以前は、ＣＥＡは結腸の腺癌に特異的であると考えられていたが、その後、より感度の高いラジオイムノアッセイが開発され、ＣＥＡが多くの内胚葉由来の癌、特に膵臓、胃および気管支の癌を伴う血漿中に存在していた。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、ウイルス感染した細胞種の標的化された治療のためのウイルス抗原、リボザイム、アンチセンス配列、またはγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）、ＩＬ−２またはＩＬ−５などの免疫刺激因子を発現するように構築されてもよい。特に、アルテリウイルスベクターを特定の外来生物または病原体感染細胞に標的化するために、アルテリウイルスベクターの逆方向反復は、任意の病原体特異的ＲＮＡにハイブリダイズし、例えば、ＨＩＶ、ＣＭＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶおよびＨＳＶなどの病原体に感染した細胞を標的化するように選択されてもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、特定の臓器組織は、遺伝子置換療法を利用して組織特異的代謝疾患の治療の標的とされ得る。例えば、肝臓は身体の代謝機能の多くに関与し、多くの代謝性遺伝疾患に関連するため、肝臓は重要な標的組織である。このような疾患には、グリコーゲン貯蔵疾患、フェニルケトン尿症、ゴーシェ病および家族性高コレステロール血症の多くが含まれる。現在のところ、アルテリウイルスベクターのための適切な逆方向反復を操作するために使用され得る、配列決定された多くの肝臓特異的酵素およびマーカーが存在する。このような肝臓特異的ｃＤＮＡとしては、Ｓ−アデノシルメチオン合成酵素をコードする配列（Ｈｏｒｉｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２５：８１，１９９１）；レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（Ｒｏｇｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４８：１６１，１９８７）；および他の肝臓特異的ｃＤＮＡ（Ｃｈｉｎら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４７８：１２０，１９８６）が挙げられる。このような肝臓特異的アルテリウイルスベクターを用いて、家族性高コレステロール血症の治療のために低密度リポタンパク質受容体（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ３９：２７，１９８４）を肝細胞に送達することができた（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７：２２３，１９９０）。
【０１３５】
本明細書中に開示されるアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡを使用し、１つまたは複数の異種コード配列または目的の機能性ＲＮＡ（本明細書では、異種ＲＮＡまたは異種配列とも呼ばれる）を発現させることができ、これらは、ウイルス、原核生物および真核生物に由来の多種多様な配列から選択することができる。異種配列のカテゴリーの例としては、限定されないが、免疫原（天然、改変または合成抗原タンパク質、ペプチド、エピトープまたは免疫原性フラグメントを含む）、サイトカイン、毒素、治療タンパク質、酵素、アンチセンス配列および免疫応答調整剤をコードする配列が挙げられる。
【０１３６】
異種ヌクレオチド配列
【０１３７】
本開示のいくつかの実施形態によれば、多種多様なヌクレオチド配列を、本開示の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡによって運ぶことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、さらなる異種ヌクレオチド配列を含まない。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、１つまたは複数のさらなる異種または外来のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、少なくとも約１００塩基、２ｋｂ、３．５ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂの異種ヌクレオチド配列、または少なくとも約８ｋｂの異種配列の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１３８】
多種多様な異種ヌクレオチド配列が、本開示の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡに含まれていてもよく、多種多様な異種ヌクレオチド配列は、苦痛緩和剤、例えば、サイトカイン、毒素、プロドラッグ、免疫応答を刺激する抗原、リボザイム、免疫応答を補助するか、または抑制するタンパク質をコードする配列、アンチセンス配列（または「アンチセンス用途」ではセンス配列）を含む。上述のように、本開示の様々な実施形態では、本明細書で提供される改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡは、２つ以上の異種ヌクレオチド配列を含んでいてもよい（特定の実施形態では発現してもよい）。
【０１３９】
（１）サイトカイン
【０１４０】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、サイトカインをコードする。簡潔には、サイトカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化または分化させるように作用する。サイトカインの代表例としては、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、内皮細胞、線維芽細胞、γインターフェロンなどのリンホカイン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１およびＧ−ＣＳＦが挙げられる。
【０１４１】
いくつかの関連する実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、免疫制御補因子をコードする。簡潔には、本開示の文脈内で利用されるように、「免疫制御補因子」は、免疫応答に関与する細胞のうち１つまたは複数によって製造されるとき、または細胞に対して外因的に添加される場合、補因子が存在しない状態で起こるであろうものとは質または効力が異なる免疫応答を生じる因子を指す。応答の質または効力は、例えば、例えば、細胞増殖（例えば、３Ｈチミジン取り込み）を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ（例えば、５１Ｃｒ放出を測定する）を含め、当業者に公知の種々のアッセイによって測定されてもよい。（Ｗａｒｎｅｒら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７：６４５−６５５，１９９１を参照）。
【０１４２】
免疫制御補因子の代表例としては、αインターフェロン（Ｆｉｎｔｅｒら、Ｄｒｕｇｓ  ４２（５）：７４９−７６５，１９９１；米国特許第４，８９２，７４３号；米国特許第４，９６６，８４３号；ＷＯ  ８５／０２８６２号；Ｎａｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８４：３１６−３２０，１９８０；Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．７８：３８７−３９４，１９８１；Ｔｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２０４６−２０５０，１９８９；Ｆａｋｔｏｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：８６７−８７２，１９９０）、βインターフェロン（Ｓｅｉｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１，１９９１）、γインターフェロン（Ｒａｄｆｏｒｄら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ：２００８−２０１５，１９９１；Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９４５６−９４６０，１９８９；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０：７８２０−７８２５，１９９０；Ｍａｉｏら、Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２，１９８９；米国特許第４，７６２，７９１号および同第４，７２７，１３８号）、Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号および同第４，８１０，６４３号）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＷＯ８５／０４１８８）、ＴＮＦ（Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：９４２−９５１，１９９０）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｋａｒｕｐｉａｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４４：２９０−２９８，１９９０；Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１７１６−１７３３，１９８７；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４，１９９０；米国特許第４，７３８，９２７号）、ＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら、Ｃｅｌｌ  ５７：５０３−５１２，１９８９；Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７１３−７１６，１９９１；米国特許第５，０１７，６９１号）、ＩＬ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１１６−４１２１，１９８７；ＷＯ  ９０／０６３７０号）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６５−９６８，１９９４；Ｇｅｎｂａｎｋ−ＥＭＢＬ寄託番号Ｖ０３０９９）、ＩＣＡＭ−１（Ａｌｔｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５１２−５１４，１９８９）、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、２−ミクログロブリン、シャペロン、ＣＤ３、Ｂ７／ＢＢ  １、ＭＨＣ結合トランスポータータンパク質、またはこれらの類似体が挙げられる。
【０１４３】
本開示の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡ内にどの免疫制御補因子が含まれるかの選択は、補因子の公知の治療効果に基づいてもよく、または実験的に決定されてもよい。例えば、慢性Ｂ型肝炎感染において、αインターフェロンは、患者の免疫学的欠損を補償し、それにより疾患からの回復を助けるのに有効であることが見出されている。または、適切な免疫制御補因子を実験的に決定してもよい。簡潔に述べると、まず、血液サンプルを肝臓病患者から採取する。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、自己またはＨＬＡ適合細胞（例えば、ＥＢＶ形質転換細胞）で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激され、肝炎抗原の免疫原性部分および免疫制御補因子の発現を指示する本開示の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡで形質導入される。刺激されたＰＢＬは、標的としてＢＬＡ適合形質導入細胞を用いたＣＴＬアッセイにおいてエフェクターとして使用される。ＨＬＡ適合刺激因子および抗原単独をコードするベクターで形質導入された標的細胞を用いて実施された同じアッセイでみられるものに対するＣＴＬ応答の増加は、有用な免疫制御補因子であることを示す。いくつかの実施形態では、免疫制御補因子であるγインターフェロンが特に好ましい。
【０１４４】
免疫制御補因子の別の非限定的な例は、Ｂ７／ＢＢ１共刺激因子である。簡潔には、Ｔ細胞の完全な機能的活性の活性化には、２つのシグナルが必要である。１つのシグナルは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターと主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとの相互作用によって提供され、補助刺激と呼ばれる第２のシグナルは抗原提示細胞によってＴ細胞に送達される。簡単に言うと、第２のシグナルは、Ｔ細胞によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生に必要であり、抗原提示細胞上のＢ７／ＢＢ１分子とＴリンパ球上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４受容体との相互作用を伴うようである（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３：７２１−７３０，１９９１ａおよびＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−５７０，１９９１）。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、増殖して完全に活性化するのに十分なＩＬ−２を産生するように、Ｂ７／ＢＢ１をＣＤ８＋Ｔ細胞の共刺激を引き起こすために腫瘍細胞に導入することができる。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらなるＣＴＬ機能のために共刺激がもはや必要とされないので、Ｂ７を発現しない腫瘍細胞を殺すことができる。共刺激Ｂ７／ＢＢ１因子および例えば免疫原性ＨＢＶコアタンパク質の両方を発現するベクターは、本明細書に記載の方法を利用して作製することができる。これらのベクターで形質導入された細胞は、より有効な抗原提示細胞になる。ＨＢＶコア特異的ＣＴＬ応答は、完全に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞から補助刺激リガンドＢ７／ＢＢ１を介して増強されるであろう。
【０１４５】
（２）毒素
【０１４６】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、毒素をコードする。簡単に言えば、毒素は、細胞の増殖を直接的に阻害するように作用する。毒素の代表例としては、リシン（Ｌａｍｂら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８：２６５−２７０，１９８５）、アブリン（Ｗｏｏｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：７２３−７３２，１９９１；Ｅｖｅｎｓｅｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：６８４８−６８５２，１９９１；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８６６５−８６６９，１９９０；Ｃｈｅｎら、Ｆｅｄ．ｏｆ  Ｅｕｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．３０９：１１５−１１８，１９９２）、ジフテリア毒素（Ｔｗｅｔｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１０３９２−１０３９４，１９８５）、コレラ毒素（Ｍｅｋａｌａｎｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：５５１−５５７，１９８３；Ｓａｎｃｈｅｚ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，ＰＮＡＳ  ８６：４８１−４８５，１９８９）、ゲロニン（Ｓｔｉｒｐｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：６９４７−６９５３，１９８０）、アメリカヤマゴボウ（Ｉｒｖｉｎ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２１：３７１−３８７，１９８３）、抗ウイルス性タンパク質（Ｂａｒｂｉｅｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０３：５５−５９，１９８２；Ｉｒｖｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２００：４１８−４２５，１９８０；Ｉｒｖｉｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１６９：５２２−５２８，１９７５）、トリチン、シゲラ毒素（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄら、ＰＮＡＳ  ８４：４３６４−４３６８，１９８７；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈ．２：１４７−１５３，１９８７）、シュードモナス外毒素Ａ（ＣａｒｒｏｌｌおよびＣｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８７０７−８７１１，１９８７）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）（Ｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．４９：１１５−１２４，１９８０）および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０１４７】
（３）プロドラッグ
【０１４８】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、「プロドラッグ」をコードする。簡潔には、本開示の文脈内で利用されるように、「プロドラッグ」とは、毒性のある生成物への細胞傷害性がほとんどないか、またはまったくない化合物を活性化する遺伝子産物をいう。そのような遺伝子産物の代表例としては、特定のプリンアラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的に一リン酸化し、これらを細胞毒性または細胞増殖抑制性の代謝物に変換するＨＳＶＴＫおよびＶＺＶＴＫ（ならびにそれらの類似体および誘導体）が挙げられる。より具体的には、薬物ガンシクロビル、アシクロビル、またはそれらの類似体のいずれか（例えば、ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ）をＨＳＶＴＫに暴露すると、薬物がその対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態にリン酸化される。
【０１４９】
本開示の文脈内で利用され得る他のプロドラッグの代表例としては、チオキサンチンを有毒なチオキサンチン一リン酸に変換する大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｂｅｓｎａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：４１３９−４１４１，１９８７）；リン酸ミトマイシンおよびリン酸ドキソルビシンのような不活性なリン酸化化合物を毒性のある脱リン酸化化合物に変換するアルカリホスファターゼ；５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロウラシルに変換する真菌（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）または細菌シトシンデアミナーゼ（Ｍｕｌｌｅｎ，ＰＮＡＳ  ８９：３３，１９９２）；パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を切断して毒性安息香酸マスタードを生成するカルボキシペプチダーゼＧ２；およびドキソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセタビド誘導体を毒性化合物に変換するペニシリン−Ｖアミダーゼ（一般に、Ｖｒｕｄｈｕｌａら、Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６（７）：９１９−９２３，１９９３；Ｋｅｒｎら、Ｃａｎｃ．Ｉｍｍｕｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３１（４）：２０２−２０６，１９９０を参照）が挙げられる。
【０１５０】
（４）アンチセンス配列
【０１５１】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、アンチセンス配列である。簡潔には、アンチセンス配列は、ＲＮＡ転写物に結合し、それによって特定のタンパク質の細胞合成を妨げるか、または細胞によるそのＲＮＡ配列の使用を妨げるように設計される。このような配列の代表例としては、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭａｈｅｒおよびＤｏｌｎｉｃｋ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５３：２１４−２２０，１９８７；Ｂｚｉｋら、ＰＮＡＳ  ８４：８３６０−８３６４，１９８７）；アンチセンスＨＥＲ２（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−１１３９，１９８５）、アンチセンスＡＢＬ（Ｆａｉｎｓｔｅｉｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：１４７７−１４８１，１９８９）、アンチセンスＭｙｃ（Ｓｔａｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：４２３−４２５，１９８４）およびアンチセンスｒａｓ、およびヌクレオチド生合成経路中のいずれかの酵素をブロックするアンチセンス配列が挙げられる。これに加えて、本明細書中に開示されるいくつかの実施形態によれば、免疫応答を低下させるためにインターフェロンおよび２ミクログロブリンに対するアンチセンス配列を利用することができる。
【０１５２】
これに代えて、またはこれに加えて、いくつかの実施形態では、強力なクラスＩ制限応答を誘発するため、アンチセンスＲＮＡを抗腫瘍剤として利用してもよい。簡潔には、ＲＮＡを結合し、それによって特異的ｍＲＮＡの翻訳を妨げることに加えて、高レベルの特異的アンチセンス配列は、大量の二本鎖ＲＮＡの形成に起因して、インターフェロン（γ−インターフェロンを含む）の発現の増加を誘発すると考えられる。γインターフェロンの発現の増加は、ひいては、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現を高める。これに関して、使用するのに好ましいアンチセンス配列としては、アクチンＲＮＡ、ミオシンＲＮＡ、およびヒストンＲＮＡが挙げられる。アクチンＲＮＡとミスマッチを形成するアンチセンスＲＮＡが特に好ましい。
【０１５３】
（５）リボザイム
【０１５４】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、宿主細胞の感染時にリボザイムを産生する改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが提供される。簡潔には、リボザイムは特定のＲＮＡを切断するために使用され、１つの特定のＲＮＡ配列にのみ影響を及ぼすように設計される。一般的に、リボザイムの基質結合配列は、１０〜２０ヌクレオチド長である。この配列の長さは、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションと、開裂したＲＮＡからのリボザイムの解離を可能にするのに十分なものである。リボザイムを作製するための代表例としては、米国特許第５，１１６，７４２号；第５，２２５，３３７号および第５，２４６，９２１号に記載されるものが挙げられる。
【０１５５】
（６）タンパク質および他の細胞構成成分
【０１５６】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、多種多様なタンパク質または他の細胞構成要素を、本開示の改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡによって運ぶことができる。そのようなタンパク質の代表的な例には、例えばウイルス、細菌、寄生虫、真菌または哺乳類などの動物に見出される、天然または改変された細胞構成要素、および外来タンパク質または細胞構成要素が含まれる。
【０１５７】
ポリペプチドを産生するための方法
別の態様では、本出願は、１つまたは複数の目的のポリペプチドを産生するための方法を提供する。本開示による目的のポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであってもよく、例えば、医薬組成物、栄養補助食品組成物および／または工業用組成物に適した組換えタンパク質およびペプチドであってもよい。適切な組換えポリペプチドの非限定的な例としては、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補給用ポリペプチド、工業用酵素およびレポーターポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示に従って製造される目的のポリペプチドは、限定されないが、ワクチンおよび他の治療様化合物としての使用、診断剤としての使用、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生における抗原としての使用を含め、種々の用途を有する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、培養物中の組換え細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ）であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、生きている被験体中の組換え細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ）であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のこの態様による目的のポリペプチドを産生するための方法は、上述の態様および実施形態のいずれか１つの核酸分子を含む組換え宿主細胞（例えば、組換え哺乳動物細胞）の培養を含むことができる。本開示に従って目的の１つまたは複数のポリペプチドを産生するために、上述のように産生した組換え細胞を、当該分野で公知の細胞培養技術のいずれかを用いて、有効な培地で培養する。本明細書で使用される場合、有効な培地とは、トランスフェクトされた細胞が、本開示に従って目的の１つまたは複数のポリペプチドを産生し得る任意の培地を指す。有効な培地は、典型的には、同化可能な炭水化物、窒素およびリン酸源、および適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養素、例えばビタミン、成長因子および他のホルモンを含む水性媒体である。培地は、複雑な栄養素を含んでいてもよく、または規定の培地であってもよい。本開示の組換え細胞は、従来の発酵バイオリアクターで培養することができ、従来の発酵バイオリアクターとしては、限定されないが、バッチ式、供給バッチ式、セルリサイクル式および連続式の発酵槽が挙げられる。培養は、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿およびペトリ皿で行うこともできる。培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素含量で行う。このような培養条件は、十分に当業者の専門知識の範囲内にある。好ましい有効な培地および培養条件の非限定的な例は、実施例の章に含まれる。
【０１５９】
発現から、シグナルセグメントを有するかまたは欠いている目的のポリペプチドが得られるかどうかに依存して、得られたポリペプチドは、培地中に分泌されてもよく、または組換え細胞内に残存していてもよい。「タンパク質を回収する」という語句は、単にポリペプチドを含む発酵培地（細胞を含む）全体を回収することを指し、分離または精製のさらなる工程を伴っていてもよいが、必ずしもそうする必要はない。本開示の目的のポリペプチドは、種々の標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができ、この技術としては、限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）が挙げられる。
【０１６０】
本開示の目的の単離されたポリペプチドは、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」とは、治療組成物または診断薬としての化合物の有効な使用を可能にする純度を指す。例えば、動物用のワクチンは、好ましくは実質的な毒性を示さず、ワクチン接種動物において抗体の産生を刺激することができなくてはならない。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本開示の目的のポリペプチドを産生するための方法は、本明細書に記載の核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、（ｉ）改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードし、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）それぞれが目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、１つまたは複数の発現カセットとを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示の目的のポリペプチドを産生するための方法は、本明細書に記載の核酸を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、（ｉ）改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡをコードし、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、オープンリーディングフレームＯＲＦ７をコードする配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す配列フラグメントを含み、改変されたアルテリウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡが、ＯＲＦ２ａをコードする配列を欠いている、ヌクレオチド配列と、（ｉｉ）それぞれが目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする異種ヌクレオチド配列に操作可能に接続したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、１つまたは複数の発現カセットとを含む。
【０１６３】
したがって、先の態様および実施形態のいずれか１つによる組換え細胞の生物学的サンプル、バイオマスおよび子孫もまた、本出願の範囲内である。したがって、本出願のこの態様による方法によって産生されたポリペプチドも、本出願の範囲内である。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、この態様の方法は、好ましくは、ワクチン、医薬品、工業製品、化学薬品などの製造において使用されるポリペプチドの製造を含め、養殖、農業、畜産および／または治療用途および医療用途にとって重要であるか、または興味深い宿主細胞で使用される。いくつかの実施形態では、この態様の方法は、動物細胞に適切に使用することができる。動物細胞で産生されたタンパク質は、一般に、適切なプロセシング、翻訳後修飾を有すると考えられ、したがって、生理学的状態の治療に十分な活性を有するため、小スケールおよび大スケールでの治療用タンパク質の製造は、製薬産業における開発の重要な分野である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ウマ、ブタ、マウス、サルおよび類人猿などのアルテリウイルスの天然宿主である動物種の細胞であってもよい。特に好ましい種は、本出願のいくつかの実施形態では、脊椎動物種および無脊椎動物種である。原則として、任意の動物種を一般に使用することができ、例えば、ヒト、イヌ、鳥、魚、ウマ、ブタ（ｐｉｇ）、霊長類、マウス、ウシ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ヒツジ、ウサギ、ネコ、ヤギ、ロバ、ハムスターまたはバッファローであってもよい。適切な鳥種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥、ダチョウ、エミュー、白鳥、クジャク、キジ、パートリッジおよびホロホロチョウが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、魚種は、サーモン種である。適切な動物宿主細胞の非限定的な例としては、限定されないが、ウマ肺動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ウサギ腎臓細胞、マウス筋細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト類表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞およびマウス３Ｔ３細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、実施例１０〜１３および１７〜１８にさらに詳細に記載されるように、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ベビーハムスター腎臓細胞は、ＢＨＫ−２１細胞である。
【０１６５】
組換えポリペプチド
さらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つまたは複数の実施形態による方法によって産生される組換えポリペプチドに関する。
【０１６６】
本開示による組換えポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであってもよく、例えば、医薬組成物、栄養補助食品組成物および／または工業用組成物に適した組換えタンパク質およびペプチドであってもよい。適切な組換えポリペプチドの非限定的な例としては、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補給用ポリペプチド、工業用酵素およびレポーターポリペプチドが挙げられる。
【０１６７】
「治療用ポリペプチド」との用語は、本明細書中で使用される場合、治療的有用性を有する生物活性ポリペプチドを示す。この用語は、患者の生物学的標的分子に結合し、および／またはその機能を変更することによって、有益な治療効果または診断効果を生じるように患者に投与することができる任意のポリペプチドを包含する。標的分子は、患者のゲノムによってコードされる内因性標的分子（例えば、酵素、受容体、成長因子、患者のゲノムによってコードされるサイトカイン）、または病原体のゲノムによってコードされる外因性標的分子（例えば、ウイルス、細菌、真菌、線虫または他の病原体のゲノムによってコードされる酵素）であってもよい。本開示の組成物および方法の実施に適した治療用ペプチドの例示的なカテゴリーは、ホルモン、モノクローナル抗体、ワクチン、酵素、サイトカイン、毒素などである。治療用ポリペプチドという用語は、治療用ポリペプチドの機能的フラグメントを含む。
【０１６８】
本明細書で使用される「栄養補給用ポリペプチド」という用語は、望ましくない状態に対して利益を予防、改善または他の方法で与え、その関連する健康上の利益のために使用され、消費者の健康状態を維持し得る任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用される「栄養補給」という用語は、栄養分野および医薬分野両方の応用における有用性を意味する。したがって、本開示の栄養補給用ポリペプチドおよび組成物は、食品および飲料のサプリメントとして、個々に消費するのに適した、通常は、カプレット、錠剤、カプセル、軟質ゲルカプセル、ゲルキャップなどの固体製剤、または溶液または懸濁物などの液体製剤であってもよい医薬形態で販売される、食品に関連しない医薬製剤としての用途を見出すことができる。このように、栄養補給用組成物との用語は、本明細書に開示される栄養補給用ポリペプチド、例えばトリペプチドが豊富なタンパク質加水分解物を含有する食品および飲料を含む。
【０１６９】
「レポーターポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、検出可能な、または検出可能な生成物を産生する活性を有するポリペプチドである。レポーターポリペプチドは、検出可能なシグナルを生成する視覚的マーカーまたは酵素を含むことができる。レポーターポリペプチドの非限定的な例としては、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ｕｉｄＡ、ｘｙｌＥ、アルカリホスファターゼ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、α−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、セイヨウワサビペルオキシダーゼ遺伝子、ルシフェリン／ルシフェラーゼ遺伝子、Ｒ座位遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子（限定されないが、青色、シアン、緑色、赤色、または黄色の蛍光タンパク質を含む）、光変換性、光交換性、または光強調可能な蛍光タンパク質、またはこれらの任意の変異体が挙げられ、限定されないが、コドン最適化されたもの、迅速にフォールディングするもの、モノマー性、安定性が高いもの、蛍光が増強された変異体を含む。
【０１７０】
医薬組成物
さらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組換えポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【０１７１】
なおさらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【０１７２】
なおさらなる態様では、本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、本明細書に開示される組換え細胞と、薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【０１７３】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本出願の組成物は、保護組成物（例えば、ワクチン）または治療組成物としての使用のためにさらに配合されてもよい。特に、本開示に従って製造される保護組成物は、限定されないが、ワクチンおよび他の治療剤としての使用、診断剤としての使用、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生における抗原としての使用を含め、種々の用途を有する。したがって、ワクチンの場合、本出願の組成物は、被験体、粒子に対する免疫原となる量での組成物の核酸において免疫応答を誘発するための方法を提供することができ、この方法は、集合および／または組成物を標的に投与することを含む。
【０１７４】
ワクチンとして使用する場合、組成物は、一般に、低温で保存しなければならず、または凍結乾燥形態でなければならない。凍結乾燥されたワクチンは、中程度の冷却条件下または室温でさえ維持することができる。しばしば、ワクチンを、例えば、タンパク質変性を受けやすいタンパク質が変性するのを防ぎ、ワクチンの貯蔵寿命を延ばし、または凍結乾燥効率を改善するために、安定剤と混合する。有用な安定剤としては、限定されないが、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース）、タンパク質（例えば、アルブミンまたはカゼイン）またはその分解生成物、バッファー（例えば、アルカリ金属リン酸塩）が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のワクチンは、凍結乾燥形態である。これに代えて、またはこれに加えて、ワクチンは、生理学的に許容される希釈剤および／またはバッファーに懸濁されていてもよい。
【０１７５】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、本出願の組成物は、さらに、組成物を有効量で動物に投与したときに、動物を、寄生虫によって引き起こされる疾患から保護することができる治療組成物に配合することができる。いくつかの実施形態では、治療組成物は、複数の標的および／または複数の寄生虫を標的とする複数の防御ポリペプチドを含む多価治療組成物である。このような多価治療組成物は、産生後に１つまたは複数の保護ポリペプチドを合わせることによって、培養反応において、１種類より多い組換え細胞を培養することによって、または例えば、動物細胞を１つまたは複数の組換え分子でトランスフェクトすることによって、および／または動物細胞を、本明細書に開示されるような１種類以上の保護ポリペプチドをコードする１種類より多い核酸配列を含む組換え分子でトランスフェクトすることによって、組換え細胞において、１種類より多い保護ポリペプチドを産生することによって、製造することができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療組成物は、免疫賦活剤、例えばアジュバントまたは担体を含むこともできる。適切なアジュバントまたは担体としては、本開示の組換えポリペプチドの投与に適したアジュバントおよび担体が含まれる。本開示の治療組成物は、投与されるべき動物が許容し得るように賦形剤中に配合することができる。そのような賦形剤の例には、水、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、および他の生理学的にバランスのとれた塩溶液が含まれる。非水性ビヒクル、例えば、固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドも使用することができる。他の有用な製剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの増粘剤を含む懸濁物が含まれる。賦形剤は、等張性および化学的安定性を高める物質などの少量の添加物を含むことができる。バッファーの例としては、リン酸バッファー、重炭酸バッファーおよびトリスバッファーが含まれ、防腐剤の例には、チメロサール、ｍまたはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが含まれる。標準的な製剤は、注射用の懸濁物または溶液として好適な液体中に組み込むことができる、液体注射剤または固体のいずれかである。したがって、非液体製剤において、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、防腐剤などを含んでいてもよく、投与前に滅菌水または生理食塩水を添加することができる。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」との用語は、一般に安全であり、無毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物または製剤を調製する際に有用な担体を意味し、ヒトの薬学的使用と同様に、獣医学にも許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、水などの単純な薬学的に許容される担体であるが、例えば、生理的塩濃度の溶液も含むことができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、安定剤、希釈剤およびバッファーであってもよく、またはこれらを含んでいてもよい。適切な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、乾燥乳、血清アルブミンまたはカゼイン）またはそれらの分解生成物である。適切なバッファーは、例えば、アルカリ金属リン酸塩である。希釈剤には、水、水性バッファー（例えば緩衝化生理食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えばグリセロール）が含まれる。動物またはヒトへの投与のために、本出願の組成物は、特に、鼻腔内、噴霧、皮内、皮下、経口、エアロゾルまたは筋肉内投与によって与えることができる。
【０１７８】
本開示で述べられる全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
本明細書に引用された参考文献はいずれも先行技術を構成することを容認したわけではない。参考文献の議論は、著者が主張するものを述べており、発明者らは、引用された文書の正確性および妥当性に反論する権利を留保している。本明細書では、科学雑誌論文、特許文書および教科書を含む多くの情報源が参照されているが、これらの文献のいずれかが当該分野における共通の一般知識の一部を形成することの容認を構成するものではないことは明確に理解されるだろう。
【０１８０】
本明細書に示された一般的方法の考察は、単なる説明の目的であることを意図している。他の代替の方法および代替物は、本開示を検討すると当業者には明らかであり、本出願の精神および範囲内に含まれるべきである。
【実施例】
【０１８１】
以下の実施例に、さらなる代替例がさらに詳細に開示されており、いかなる様式にも特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
【０１８２】
実施例１
基本ベクターの構築
この実施例は、基本となるアルテリウイルス発現ベクターの生成を記載し、その後、さらに改変し、一価、二価および三価のベクターの構築に使用した。
【０１８３】
基本ベクターＲＥＰ−ＥＡＶ（ＷＴ）の構築
Ｒｅｐ−ＥＡＶ−Ｒｅｎ（１Ｇ）ｖ２−Ｎ−ｓｅｑベクターを以下のように構築した。  ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と、３種類のＥＡＶフラグメント（ＥＡＶ  Ｆ１〜Ｆ３）を合成した。
【０１８４】
この３種類の合成したフラグメントＥＡＶ  Ｆ１（配列番号４）、ＥＡＶ  Ｆ２（配列番号５）およびＥＡＶ  Ｆ３（配列番号６）の配列コンティグは、（１）レポーターウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流部分と、（２）ＥＡＶリーダー配列と、（３）非構造ポリペプチドｐｐ１ａｂのコード配列とを含んでおり、ＥＡＶゲノムのヌクレオチド残基１〜９７５１に対応していた（ＮＣＢＩ寄託番号ｇｉ｜１４５７１７９６）。ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（配列番号７）は、５’ＸｂａＩ部位と、３’ＰｓｉＩ部位とを含んでいた。４０ヌクレオチドのポリＡテールを含めるために、ＥＡＶ＿ｕｌｔｒａｍｅｒと命名された合成核酸設計を設計し（配列番号８）、これは中央にポリＡ配列と、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に対するフランキング領域と、直鎖ベクター配列の一部とをそれぞれ含んでいる。最終的なレプリコンにおいて、合成されたフラグメントの各々の配列は、以下の順序で、その隣接するフラグメントと５０ｂｐ重複していた。５’−直鎖ベクター−ＥＡＶ  Ｆ１フラグメント−ＥＡＶ  Ｆ２フラグメント−ＥＡＶ  Ｆ３フラグメント−ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子−ＥＡＶ＿ｕｌｔｒａｍｅｒ−直鎖ベクター−３’。この最終的なレプリコンの概略図を本開示の図２に示す。上述のように構築された最終的なレプリコンのヌクレオチド配列から、ウミシイタケルシフェラーゼレポーターをコードする配列を差し引いたものは、配列表の配列番号３として提供される。さらに、５’リーダー、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂを含む配列コンティグは、配列表の配列番号１として提供される。
【０１８５】
変異Ｔ７終結配列を含む骨格プラスミドの構築
いくつかの実験では、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造業者の指示に従って、Ｔ７ターミネーター配列中の変異を種々のベクターに導入した。突然変異誘発プライマーは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌを用い、製造業者の指示に従って設計した（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）。
【０１８６】
以下の変異を、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＷＴ）ベクターに導入し（Ｔ９００１Ｇ、Ｔ９００１ＧおよびＧ３１８８Ａ、Ｔ９００１ＧおよびＴ３１８５Ａ）、新しい構築物ｒＥ（ＷＴ）−Ｒｅｎ（Ｔ９００１Ｇ）、ｒＥ２（ＷＴ）−Ｒｅｎ（Ｔ９００１ＧとＧ３１８８Ａの変異を含む）、ならびにｒＥ３（ＷＴ）−Ｒｅｎ（Ｔ９００１ＧとＴ３１８５Ｃの変異を含む）をそれぞれ得た。これに加え、将来のクローニングの必要のために、ＸｈｏＩ制限酵素部位を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発によって、ウミシイタケ遺伝子の配列に対してすぐ横の３’に加えた。
【０１８７】
ＴＲＳ変異
遺伝子発現の調整可能な制御系の設計に向けて、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＷＴ）骨格に存在するリーダーＴＲＳおよびボディＴＲＳ７の両方に６種類の変異が導入された。野生型ＴＲＳの配列はＴＣＡＡＣＴであり、変異ＴＲＳ１〜６の配列は、以下の通りであった。ＴＲＳ１−ＣＴＡＡＣＣ、ＴＲＳ２−ＣＣＡＡＣＣ、ＴＲＳ３−ＣＣＡＡＧＣ、ＴＲＳ４−ＣＣＡＧＧＣ、ＴＲＳ５−ＣＣＡＧＧＴ、ＴＲＳ６−ＧＧＴＴＡＧ。得られたベクターをそれぞれＲｅｐ−ＥＡＶ（ＴＲＳ１）、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＴＲＳ２）、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＴＲＳ３）、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＴＲＳ４）、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＴＲＳ５）、Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＴＲＳ６）と命名した。
【０１８８】
スペーサーを含むベクター構築物
以下に記載するいくつかの実験では、スペーサー１〜４と呼ばれる４種類の異なるスペーサー配列を、ＴＲＳ７領域を隔離させるために様々なベクターに導入した（図１１）。スペーサー配列は、配列表の配列番号９〜１２として提供される。スペーサー１（配列番号９）は、ＯＲＦ６全体を含むように設計され、２つの開始コドンと天然のＸｂａＩ部位を除去するために変異も導入された。スペーサー２（配列番号１０）は、ＴＲＳ７配列の上流に、保存されたＡＴを豊富に含む領域を含んでいた。スペーサー３（配列番号１１）は、ＴＲＳ７の下流にさらなる配列を含み、ＴＲＳ７の第２の開始コドン３’の近くで終結する。スペーサー４（配列番号１２）は、スペーサー１を含むようにＴＲＳ７から５’方向に、スペーサー３を含むように３’方向に伸長された配列を表す。これらのスペーサーは、４種の異なるレポーター遺伝子であるウミホタル（Ｃｙｐｒ；配列番号１３）、緑色ウミシイタケ（ｇＲｅｎ；配列番号１４）、赤色ホタル（ｒＦＦ；配列番号１５）およびウミシイタケ（Ｒｅｎ；配列番号７）がｒＥ２（ＷＴ）骨格レプリコンにアセンブリされた。
【０１８９】
二価発現構築物
以下に記載されるいくつかの実験では、二価発現構築物の２種類の異なる基本設計が構築された。態様「Ａ」の二価構築物の構築は、ＴＲＳ２とＴＲＳ７との間のＸｂａＩ制限部位を利用し、別のレポーター遺伝子をｒＥ２（ＷＴ）−レポーター構築物に導入した。態様「Ｂ」の二価構築物の構築は、レポーター遺伝子のすぐ下流に位置するＰｓｉＩ制限部位を使用し、別のレポーター遺伝子を含むＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントと、ＴＲＳ２とＴＲＳ７を両方とも含む上流のフラグメントとを導入した（以下、２／７ブロックとも呼ばれる）。本実施例に従って作成し、その後、以下のいくつかの実施例で評価した二価構築物には、ｒＥ２（ＷＴ）−ｇＲｅｎ−ｒＦＦ−Ａ、ｒＥ２（ＷＴ）−ｇＲｅｎ−ｒＦＦ−Ｂ、ｒＥ２（ＷＴ）−ｒＦＦ−ｇＲｅｎ−Ａ、ｒＥ２（ＷＴ）−ｒＦＦ−ｇＲｅｎ−Ｂが含まれる。
【０１９０】
３’ＵＴＲ修飾
本明細書に記載のいくつかの実験では、３’ＵＴＲ配列を改変し、レプリコンにコードされた目的の遺伝子の発現を増強した。初期の基本ベクターは、目的の遺伝子の停止コドンからポリＡ鎖までの３６６ｂｐを含んでいたが、ＥＡＶゲノムの８０１ｂｐの３’末端領域を含むように、２つの異なる改変３’ＵＴＲ配列を設計した（配列番号４１）。このさらなる３’ＵＴＲ領域をクローニングするために、ｒＥ２（ＷＴ）ベクターをＸｈｏＩを用いて消化し、カラム精製し、感染性クローン配列から挿入物を増幅させ、ゲル精製し、次いで、両ＤＮＡフラグメントを、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を用いることによって、一緒にアセンブリした。このレプリコンの一価の態様は、ｒＥｎａ構築物と呼ばれる。ＧＯＩを作動させるために使用されるＴＲＳ７と、８０１−ｎｔ  ３’領域中のＴＲＳ７の両方を不活性化させるために、この骨格の別の一価の態様が作製された。以下、これらのベクターは、ｒＥｘａ構築物と呼ばれる。ｒＥｘａレプリコンの二価ベクター形態を作製し、このベクターは、ｒＥｘｂと呼ばれる。二価のｒＥｘｂ構築物は、機能的なＴＲＳ７配列を有していなかったので、８０１−ｎｔ領域中のＴＲＳ７のみが不活性化されるように、この構築物の別の態様を作製し、これらのベクターは、ｒＥｘｃ構築物と呼ばれる。
【０１９１】
非レポーターレプリコン構築物
ｒＥ２レプリコンにクローニングされたルシフェラーゼレポーター遺伝子以外の遺伝子は、以下の通りである。ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＲＳＶ  Ｆ０前駆体タンパク質ＥＧＦＰ（配列番号２４）、Ｃａｓ９（配列番号２５および配列番号２６）、Ｃｓｙ４（配列番号２７）、ネオマイシン耐性遺伝子（配列番号２８）、ピューロマイシン耐性遺伝子（配列番号２９）、抗−ＮＰ抗体（軽鎖−ＩＲＥＳ−重鎖；配列番号３０および配列番号３１）、ヒュミラ（抗−ＴＮＦ抗体；配列番号３３）、ハーセプチン（抗−Ｈｅｒ２抗体；配列番号３２）およびＧＦＰ−ＡｐｏＡＩ融合遺伝子（配列番号３４）。上の遺伝子のいくつかと、以下の遺伝子をｒＥｎレプリコンにクローニングした。インターロイキン１２（ＩＬ１２；配列番号３５）、ＥｐＣａｍ（配列番号３６）およびＨｉｓ６またはｍｙｃ−タグ化ペプチド鎖（ＣＴ２６；配列番号３７）。ＨＡタンパク質およびＦ０タンパク質について、４種類の異なる配列最適化された遺伝子をそれぞれ試験した（それぞれ、配列番号１６〜１９および２０〜２３）。Ｃａｓ９について、２種類の配列最適化遺伝子を試験した（配列番号２５および配列番号２６）。上述の遺伝子を全てｒＥ２基本プラスミドに構築するために、ｒＥ２レポーター構築物をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化して既存のレポーター遺伝子を除去し、次いで、骨格ベクターをゲル抽出した。非レポーター遺伝子は、フランキング配列と、骨格ベクターと重複する配列４０〜６０ｂｐとを含むプライマーを用いて増幅され、これをゲル精製し、次いで、以下に記載するように、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）を用い、骨格ベクターとアセンブリした。ｒＥｎａプラスミドにクローニングするために、ｒＥｎａ−ｒＦＦプラスミドをＸｂａＩで消化し、骨格ベクターをゲル抽出して元々の挿入物を除去した。ネオマイシン耐性遺伝子およびＥＧＦＰ二価（Ａ）設計もｒＥｎａ基本ベクターにクローニングした。この二価構築物について、ＥＧＦＰのコード配列は、配列最適化された（配列番号２４）。
【０１９２】
Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）プロトコル
ＳＧＩのＡｒｃｈｅｔｙｐｅ（登録商標）ソフトウェアを使用し、目的のＤＮＡ配列を包含する６０ｂｐ長の重複するオリゴヌクレオチドを設計した。この６０ｂｐオリゴヌクレオチドは、隣接するオリゴヌクレオチドと３０ｂｐ重複していた。オリゴヌクレオチドを、１００μＭの濃度で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （ＩＤＴ）から注文し、次いで、その後の遺伝子アセンブリのために目標濃度である２５ｎＭに達するようにこれをプールした。
【０１９３】
遺伝子アセンブリは、Ｇｉｂｓｏｎら（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６、３４３−３４５、２００９）に記載される方法に従って行われた。エラー修正は、９８℃で２分間インキュベート、２℃／秒の速度で８５℃まで、２分間インキュベート、０．１℃／秒の速度で２５℃まで、２分間インキュベートによる、エラーを含むＰＣＲ産物のヘテロ二本鎖を作製することによって行われた。次いで、２．７μＬの各ＰＣＲ反応物を５．３μＬの水、２μＬのＳｕｒｖｅｙｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅおよび１μＬの１：４０００希釈したＮＥＢ  ＥｘｏＩＩＩに添加し、その後、４２℃で１時間インキュベートすることによって、得られたヘテロ二本鎖を開裂させた。回復ＰＣＲ反応（ＰＣＲ２）は、２．５μＬのエラーを修正したＤＮＡを４７．４μＬのマスターミックスに添加する以外は、第１の増幅と同一であった。これに加え、ウミシイタケルシフェラーゼ挿入物を作成するために、ＰＣＲ２に０．１２μＬのＥＡＶ＿ｕｌｔｒａｍｅｒ（１０ｎＭ）を加えた。
【０１９４】
ＤＮＡテンプレートの調製
５０ｎｇ／ｍｌのカルバミシリン（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号ＮＣ９７３０１１６）を追加したＬＢブロス培地（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｌ８０００  ０６）中で成長させた３００ｍＬの飽和Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ  Ｅｐｉ３００（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＥＣ３００１０５）培養物から、プラスミドＤＮＡテンプレートを精製した（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２１６３）。プラスミドＤＮＡを、３７℃で１時間Ｎｏｔ−Ｉ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１８９Ｓ）することによって線状化した。次いで、線状化されたテンプレートＤＮＡを再び精製し（Ｚｙｍｏカタログ番号Ｄ４００３）、市販の２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥＢカタログ番号Ｎ３２００Ｓ）に対し、０．８％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｇ５０１８−０８）によって分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を進める前に、上述の線状ＤＮＡテンプレートの予想フラグメントサイズに対応し、各サンプル中の単一バンドの存在を確認した。
【０１９５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
上述のように調製したＤＮＡテンプレート１μｇを用い、２０μｌ反応で、３７℃で１時間インキュベートし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応を行った（ＮＥＢカタログ番号Ｅ２０６５Ｓ）。次いで、供給業者から提供された１ＵのＤＮａｓｅｌをＩＶＴ反応に直接加え、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。次いで、反応物を氷上に置き、製造業者が示唆する方法（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）を用いて精製した。次いで、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用い、精製したＲＮＡを定量した。０．８％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｇ５０１８−０８）による電気泳動によりＲＮＡを可視化し、エレクトロポレーションを行う前に、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ７１５０）と比較した。
【０１９６】
トランスフェクションおよび分析
典型的な細胞トランスフェクション実験では、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）用のＳＦ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットを使用して、エレクトロポレーションによりＢＨＫ−２１細胞にレプリコンＲＮＡを導入した。０．２５％トリプシンを用いてＢＨＫ−２１細胞を採取し、冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬエレクトロポレーション反応あたり１×１０６細胞の細胞密度でＳＦバッファーに再懸濁させた。３マイクログラムのＲＮＡを、１６ウェルキュベットストリップ中で三重に細胞にエレクトロポレーションし、室温で１０分間インキュベートした。エレクトロポレーションした細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含むプレートに回収し、その後、標準的な細胞培養条件で１６〜１８時間インキュベートした。
【０１９７】
レプリコントランスフェクション効率およびタンパク質産生の細胞内分析を、フローサイトメトリーによって行った。トランスフェクションされたＢＨＫ−２１細胞を、固定／透過濃縮物および透過化バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定し、透過処理した。Ｒ−フィコエリトリン（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合した二本鎖ＲＮＡ産生用抗体（Ｊ２抗ｄｓＲＮＡ  ＩｇＧ２Ａモノクローナル抗体、Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）と共に細胞をインキュベートした。ＰＥ−Ｃｙ５（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（例えば、緑色ウミシイタケ、赤色ホタル、ＨＡ、またはＲＳＶ−Ｆ０（Ａｂｃａｍ）に対する抗体）とコンジュゲートした抗原特異的抗体との追加のインキュベーションによって抗原産生を評価した。次いで、細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）融合細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。補正コントロールのために単一色で染色されたトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞をサンプル採取の前に行った。ＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてさらに分析した。前方側方散乱散布図を使用して死細胞および破片を除外するために、初期ゲーティングを行った。ｄｓＲＮＡ（Ｒ−ＰＥ陽性）およびタンパク質発現（ＰＥ−Ｃｙ５陽性またはＧＦＰ発現のＦＩＴＣ陽性）の両方について陽性であった細胞集団を同定するためにさらなるゲーティングを行った。周波数および平均蛍光強度を収集し、構築物の比較および最適化に利用した。
【０１９８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
ＩＶＩＳ（登録商標）Ｓｐｅｃｔｒｕｍ光学イメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物発光イメージングを行った。典型的な実験では、２％イソフルランガス麻酔下で、動物を一度に３匹まで撮像した。各マウスに２００ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンおよびＲＯを５ｍｇ／ｋｇのセレンテラジンで腹腔内（ＩＰ）注射し、基質注射直後に仰臥位で撮像した。全ての時点で、Ｄ−ルシフェリンの直前にセレンテラジンを注射した。最初の２つの時点で、５２０、５４０、５６０、６２０、６４０および６６０ｎｍの波長でスキャン結果を得た。他の全ての時点では、スキャン中に５４０ｎｍおよび６４０ｎｍの波長しか使用されなかった。８日目に、動物を１０分間スキャンし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの基質注入後、ＣＯ２の過剰暴露により安楽死させ、動物を切開し、胸腔を開けて肺を露出させ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＢＬＩ撮像を行った。ＣＣＤチップの大きなビニングを使用し、画像中の各マウスの後肢から少なくとも数百カウントを得るように暴露時間を調整し（１０分〜１０秒）、ＣＣＤチップの飽和を回避した。
【０１９９】
実施例２
Ｔ７終結配列の改変
この実施例は、ＥＡＶ非構造ポリペプチドのコード配列において同定されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写終結シグナルの配列に導入された種々の点突然変異の影響を評価する実験の結果を記載する。
【０２００】
ＥＡＶゲノムの非構造遺伝子コード領域で同定された潜在性Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写終結シグナルを除去するために、初期レプリコン設計を改変した。これらの実験において、レプリコンベクター態様を含むＴ７ターミネーターをＲｅｐ−ＥＡＶ（ＷＴ）、ｒＥ、ｒＥ２およびｒＥ３と命名した；これらのレプリコンの各々は、上述の手順を使用することにより、様々なＴ７ターミネーター修飾を含む。続いて、改変Ｔ７ターミネーター配列ｒＥ−ｒＦＦおよびｒＥ２−ｒＦＦを含む２つの例示的なレプリコンベクターに由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡのアガロース寒天ゲル電気泳動分析を行い、Ｔ７ターミネーター部位の改変が、全長ではないＲＮＡバンドの消失をもたらした。
【０２０１】
次いで、これらのレプリコンベクターそれぞれにルシフェラーゼレポーター遺伝子をクローニングした。細胞を個々のレプリコンＲＮＡでエレクトロポレーションし、バルク細胞ルシフェラーゼアッセイおよびフローサイトメトリー技術の両方によって分析した。フローサイトメトリー分析は、タンパク質発現の尺度としての細胞トランスフェクションの決定率および平均蛍光強度（ＭＦＩ）評価の両方を可能にした。ｒＦＦまたはｇＲＥＮルシフェラーゼ遺伝子のいずれかを発現するレプリコンを用いたフローサイトメトリー分析の一例を図１Ａ〜１Ｄに示す。両方のレポーター遺伝子レプリコンの全ての態様は、細胞ごとに同様のレベルのルシフェラーゼを発現した（図１Ｃおよび１Ｄ）。レプリコンベクターの態様に基づいてトランスフェクションされた細胞の割合において、ある程度の変動が観察された（図１Ａおよび１Ｂ）。ＥＡＶレプリコンベクターｒＥ２を、その後のレプリコン構築および最適化の実験において、基本ベクターとして選択した。
【０２０２】
実施例３
一価ＥＡＶレプリコンの設計
この実施例は、一価ＥＡＶレプリコンを構築し、評価するために実施された実験を記載し、このレプリコンは、その後、組換え細胞における単一ポリペプチドの発現に使用した。
【０２０３】
上述のように、本開示は、一部には、本発明者らによって設計および評価された様々なアルテリウイルス発現ベクターと関連する、予期せぬ結果の有意な表示に基づく。最初の予想外の結果は、公開された文献に基づいてＴＲＳ２活性を維持するためにレプリコンに保持されるべき構造タンパク質遺伝子ＯＲＦ２ａの量に関する。特に、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら（２０００）によって発表された研究では、強力なＴＲＳ２サブゲノム転写活性を保持するために、ＯＲＦ２ａ配列が必要であると結論付けた（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００）。この結論は、ヌクレオチド残基９，７５６−１２，３５１が欠失したＥＡＶ感染性クローン（変異体２ａ−２５９４と呼ばれる）が、ＯＲＦ２ａ配列のわずか５塩基しか保持しておらず、サブゲノムＲＮＡ合成の有意な減少を示したという観察結果に基づいて導き出された。この観察は、異なるＥＡＶ感染性クローン（変異体０３０−２３１９）によって示されるサブゲノムＲＮＡ合成とは対照的であった。変異体０３０−２３１９は、変異体２ａ−２５９４と同じ３’配列を含有していたが、インタクトなＯＲＦ２ａ配列を維持しており、この構築物は、野生型の強固なサブゲノムＲＮＡ合成を示した（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００）。
【０２０４】
驚くべきことに、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら２０００の上述の教示とは対照的に、本開示（Ｒｅｐ−ＥＡＶ（ＷＴ））およびその後の全ての態様に記載された本発明の研究の基本的なレプリコン設計は、いずれのＯＲＦ２ａ配列も完全に欠いており、それぞれが、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の安定なサブゲノム転写および発現をそれでも示していた。本開示のいくつかの実施形態に係る基本レプリコン設計の概略図を図２に示す。目的の遺伝子（ＧＯＩ、この例ではｇＲｅｎであった）の発現を作動させるＴＲＳ７カセットは、ＯＲＦ１ｂ停止コドンのすぐ下流にクローニングされている。
【０２０５】
実施例４
二価ＥＡＶレプリコンの設計
この実施例は、いくつかの二価ＥＡＶレプリコンを構築し、評価するために実施された実験を記載し、このレプリコンは、その後、組換え細胞における２種類の異なるポリペプチドの発現に使用した。これらの実験では、２種類の初期二価設計が作成され、それらは上述のｒＥ２骨格を使用する反復に基づいていた。態様「Ａ」の二価レプリコンの構築は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を導入するために、ＴＲＳ２とＴＲＳ７との間に存在するユニークなＸｂａＩ制限部位を利用した。態様「Ｂ」の二価構築物は、ＧＯＩコード配列のクローニングのためのタンデムカセットとしてＴＲＳ２およびＴＲＳ７の両方を維持する（２／７ブロックとも呼ばれる）。ＡおよびＢの二価設計の概略図を図３に示す。
【０２０６】
レポーター遺伝子のそれぞれを、二価レプリコンの第１または第２の位置のいずれかで試験することができるように、各設計の２つの態様を構築した。細胞を両方の設計でエレクトロポレーションし、ルシフェラーゼ発現レベルを単遺伝子レプリコンベクターと比較した。上述のように生成された全ての二価の態様について実施された代表的なバルク細胞ルシフェラーゼアッセイの結果を、図４Ａ〜４Ｂに示す。二価ベクターからのレポーター遺伝子発現のレベルは、それぞれのレポーター遺伝子がどの位置にクローン化されたかに関係なく、一価の態様から検出されたものよりも低いことが観察された。それにもかかわらず、単一のＲＮＡからの両方のレポーター遺伝子の発現が検出され、この実施例に記載されるように構築された二価ＥＡＶレプリコンが機能性であることが実証された。さらに、ＴＲＳ２単独から作動する５’最大遺伝子の発現は、上述のＭｏｌｅｎｋａｍｐら２０００のＯＲＦ２ａ配列教示の要件とは直接矛盾するＴＲＳ  ２／７ブロックとして作動した場合と変わらなかった。
【０２０７】
第２の予想外の結果は、ＥＡＶの複製および転写に重要な３’ＥＡＶ配列の要件に関する。具体的には、Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００は、変異体０３０−２３１９を用いた効果的な複製のために維持すべき最適な３’末端配列を定義している。Ｍｏｌｅｎｋａｍｐら、２０００は、ＥＡＶゲノムの３’末端３５４ヌクレオチドが野生型レベルの複製を補助することができることを教示している。しかし、驚くべきことに、予想外に、本発明者らは、有意に多くの３’末端配列がレプリコンベクターに含まれていない限り、本明細書中に記載されたレプリコンベクター（特に、１個より多い目的の遺伝子を発現するベクター）は効率的に複製しないことを見出した。
【０２０８】
特に、いくつかの実験では、３’末端配列のさらなる８０１ｎｔが、本明細書に記載するいくつかのＥＡＶレプリコンベクターに含まれていた。このさらなる３’末端配列は、ＯＲＦ６、ＴＲＳ７配列の全てであるが、最初の２つのヌクレオチドを含んでおり、ＯＲＦ７遺伝子の全てと、ＥＡＶゲノムの３’ＵＴＲ配列を含んでいた。したがって、ＯＲＦ６のＡＴＧ開始コドンは、この特定の設計では存在しない。ｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子を発現する一価のＥＡＶレプリコンの２つの態様を構築した。第１レプリコンは、機能性ＴＲＳ２、レポーター遺伝子を作動させるためのＴＲＳ７、８０１ｎｔ領域中の機能性ＴＲＳ７配列（ｒＥｎａと呼ばれるベクター）を維持していた。第２レプリコンは、両方のＴＲＳ７エレメントが不活性化されるように改変されたことを除いて、ｒＥｎａベクターと同じであった（ｒＥｘａと呼ばれるベクター）。各ベクターの略図を図５に示す。
【０２０９】
両方ともｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子を発現するレプリコンｒＥｘａ−ｒＦＦおよびｒＥｎａを用いたフローサイトメトリー分析の一例を図６Ａ〜７Ｂに示す。さらなる３’配列の取り込みは、さらなる３’配列を含む両方のレプリコンの複製に有意な正の影響を及ぼすが、発現レベルは影響を受けないことが観察された。さらに、機能性ＴＲＳ２エレメントのみを有するｒＥｘａベクターは、ｒＥｎａベクターに対して同等の量のタンパク質を発現し、これらのレプリコンの強力な複製または転写のためにＯＲＦ２ａ構造遺伝子の局面が必要でないことを示している。
【０２１０】
ｇＲＥＮおよびｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子を発現する二価レプリコンとの関連で、このレプリコンベクターの３つの態様も構築した。第１レプリコンは、第１のレポーター遺伝子を作動させるための機能性ＴＲＳ２、第２のレポーター遺伝子を作動させるためのＴＲＳ７、８０１ｎｔ領域中の機能性ＴＲＳ７配列（ｒＥｎｂと呼ばれるベクター）を維持していた。第２レプリコンは、両方のＴＲＳ７エレメントが不活性化されるように改変されたことを除いて、ｒＥｎｂベクターと同じであった（ｒＥｘｂと呼ばれるベクター）。第３レプリコンは、第１のレポーター遺伝子を作動させるための機能性ＴＲＳ２、第２のレポーター遺伝子を作動させるためのＴＲＳ７、８０１ｎｔ領域中の不活性化されたＴＲＳ７配列（ｒＥｘｃと呼ばれるベクター）を維持していた。これらの各ベクターの略図を図７に示す。
【０２１１】
本発明者らは、さらに、１つより多いＧＯＩを有するレプリコンの安定した複製には８０１−ｎｔ  ３’領域の付加が必要であることを実証した。さらなる８０１−ｎｔ  ３’領域を含むか、または含まないベクター（それぞれｒＥｎｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦおよびｒＥ２−ｇＲｅｎ−ｒＦＦ）から、ｒＦＦおよびｇＲＥＮルシフェラーゼ遺伝子の両方を発現するレプリコンを用いたフローサイトメトリー分析の一例を図８Ａ〜８Ｄに示す。８０１−ｎｔ  ３’配列の付加は、複製において約４倍の増加をもたらし（図８Ａおよび９Ｂ）、ＧＯＩ発現において約１０倍の増加をもたらした（図８Ｃおよび８Ｄ）。
【０２１２】
次に、ｒＥｎｂおよびｒＥｘｂ二価レプリコンの比較を行った。この比較のためのフローサイトメトリー分析の例を図９Ａ〜９Ｄに示す。このデータは、示された転写効率は、ｒＥｎｂ設計と比較した場合に、ｒＥｘｂ設計に影響を与えなかったため（図９Ａおよび９Ｂ）、複製の増加には、８０１−ｎｔ配列に機能性ＴＲ７を有することは必要ではないことを示す。ｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子（ｒＥｘｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦ）を制御するＴＲＳ７を変異させると、ｒＦＦレポーターの発現が有意に減少し、一方、ｇＲＥＮ発現（ＴＲＳ２エレメントによって制御される）は、いずれのレプリコン設計でも影響を受けなかった（図９Ｃおよび９Ｄ）。
【０２１３】
第２のレポーター遺伝子（ｒＦＦ）からの発現を回復させるために、第１の遺伝子を作動させる機能性ＴＲＳ２エレメント、第２の遺伝子を作動させる機能性ＴＲＳ７エレメント、変異ＴＲＳ７エレメントを含む８０１−ｎｔ領域を含むベクターを構築し（ｒＥｘｃ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦ）、これをｒＥｎｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦレプリコン設計と比較した。この比較のためのフローサイトメトリー分析の一例を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。ｒＥｘｃ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦにおけるＴＲＳ７エレメントの修復は、ｒＥｎｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦでみられるものに匹敵する強いｒＦＦ発現をもたらした（図１０Ｄ）。
【０２１４】
実施例５
三価ＥＡＶレプリコンの設計
３種類の異なるルシフェラーゼ遺伝子を含むレプリコンベクターを以下のように構築した。一価のｒＥ２−Ｃｙｐｒ骨格からＣｙｐｒｉｄｉｎａ遺伝子を増幅させるようにオリゴヌクレオチドを設計することによって、二価のベクターｒＥｎｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦを、第３のルシフェラーゼ遺伝子（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ（Ｃｙｐｒ））を含むように改変した。ＰＣＲ産物は、ＴＲＳ７およびそのフランキング配列を含み、ＴＲＳ７  Ｃｙｐ発現カセットを生成するように設計された。ｒＦＦレポーター遺伝子の下流のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を使用することにより、ＰＣＲ産物をｒＥｎｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦベクターに導入し、それにより、三遺伝子のｒＥｎｂ−ｇＲｅｎ−ｒＦＦ−Ｃｙｐベクターを作製した。
【０２１５】
細胞を個々の三遺伝子レプリコンＲＮＡでエレクトロポレーションし、バルク細胞ルシフェラーゼアッセイおよびフローサイトメトリー技術の両方によって分析した。これらの実験の結果は、図１１Ａ〜図１１Ｂに示されており、ここには２種類のデータが示されている。（図１１Ａ）図の上段は、各レプリコンを用いてトランスフェクトされた細胞の割合（％）を示す。これは、各ＲＮＡレプリコン構築物についての複製活性の尺度である。  （図１１Ｂ）図の下段は、エレクトロポレーションされた細胞溶解物からの各ルシフェラーゼ構築物についてのタンパク質発現を、アッセイに使用した溶解物の量で正規化したものを示す。各遺伝子を作動させるために使用されるＴＲＳを三価構築物についても示す。ＲＬＵ：相対光単位。
【０２１６】
実施例６
ＥＡＶ  ＴＲＳスペーサーの設計
さらなる３’ＵＴＲ配列の組み込みは、ＲＮＡレプリコン設計において目的の遺伝子の発現を調節するための１つの手法を表す。より短い３’ＵＴＲ（例えば、ｒＥ２ベクター）を有するＥＡＶベクターは、さらなる３’ＵＴＲ配列（例えば、ｒＥｎまたはｒＥｘベクター）を有するＥＡＶベクターよりも少ない量のタンパク質を発現する。ＥＡＶレプリコンからのＧＯＩ発現レベルを減弱または改変するための複数の方法の開発は、本明細書に記載された本発明の仕事の別の重要な態様である。タンパク質発現を調整するための別の手法は、ボディＴＲＳエレメントを取り囲む天然配列の量を増加または減少させることを含む。この戦略を採用する例を以下に説明する。様々な量のＥＡＶ配列を含む４種類の異なる単遺伝子のスペーサーレプリコンを設計した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。基本ｒＥ２ベクターは、改変の開始点を表す。組み込まれたスペーサーは、ＡＴを豊富に含む試行で分離された高相同性の領域によって区切られた。ＴＲＳ７のこのような５’領域が２つあり、３４３ｂｐおよび２２０ｂｐのＯＲＦ６スペーサー（それぞれスペーサー１およびスペーサー２）が得られた。さらに９８ｂｐのＯＲＦ７配列が含まれていた。ＯＲＦ７野生型ＡＴＧは、不活性化されており、３’スペーサー構築物（スペーサー３）には、さらなるＡＴＧは存在しなかった。第４の構築物（スペーサー４）は、スペーサー１配列およびスペーサー３配列の両方を含んでいた。
【０２１７】
上述のスペーサー含有レプリコンの各々にｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子をクローニングし、得られた各ＲＮＡレプリコンを細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞のフローサイトメトリー分析の結果を図１３Ａ〜１３Ｂに示す。スペーサー領域の導入は発現レベルに影響を及ぼし、ｒＥ２−ｒＦＦ基本ベクターと比較して、ある範囲の活性を示すことが観察された。これらの結果は、サブゲノム転写に使用されるＴＲＳの５’または３’のいずれかに含まれる配列の量を変えることによってＧＯＩ発現を調節する効果的な手法を実証している。
【０２１８】
その後の実験では、上述のスペーサー領域を用い、二遺伝子のＥＡＶレプリコンを作製した。この目的のために、スペーサー領域は、最も５’側の遺伝子の上流、最も３’側の遺伝子の上流または両方の遺伝子の上流に導入された。ｇＲＥＮおよびｒＦＦレポーター遺伝子の両方を発現するＥＡＶレプリコンにスペーサー１を含むことの影響の一例を図１４Ａ〜１４Ｂに示す。結論として、二価レプリコン中のスペーサー配列、例えばスペーサー１の位置は、ＥＡＶレプリコンベクターにおけるタンパク質発現調節の別の例を表すルシフェラーゼ発現レベルに影響を与えた。
【０２１９】
実施例７
ＲＮＡ構造配列
ＲＮＡ構造配列分析（Ｔｉｊｅｒｉｎａ  ２００７；Ｄｉｎｇ  ２０１４）を野生型ＥＡＶおよび本明細書に記載の本発明の組成物および方法のＲＮＡレプリコンについて実施した。その分析は、サブゲノム転写レベルに有意な影響を与える重要な非ＴＲＳ配列エレメントを明らかにした。この新規な手法の結果は、ＧＯＩ発現レベルを合理的に調整するために使用可能な方法を開発したことである。
【０２２０】
実施例８
目的の遺伝子（ＧＯＩ）の一次配列の影響。
この実施例は、ＥＡＶレプリコンからのＧＯＩ発現を調節する第４の手法を説明する。  この手法の開発は、ＧＯＩのコドン使用頻度の変更がＲＮＡ二次構造に影響を与える可能性があるという理解に基づいていた。
【０２２１】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／０４ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）遺伝子の４つの異なるコドン使用態様が生成された。コドン最適化融合糖タンパク質Ｆ０およびＨＡ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列表（配列番号１６〜１９および２０〜２４）に示されている。
【０２２２】
異なるＨＡおよびＦコドン最適化遺伝子を、それぞれｒＥ２ベクターにクローニングした。細胞は、各構築物から生成されたＲＮＡでエレクトロポレーションされ、次いで、細胞は、タンパク質特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって分析された。異なるＨＡレプリコンのフローサイトメトリー分析の結果を図１５Ａ〜１５Ｂに示す。同じタンパク質をコードするが、異なる一次配列を有するレプリコンから、複製およびタンパク質発現における有意な差が示された。異なるＨＡ態様間で、複製において５０倍を超える差が認められた（図１５Ａ）。タンパク質発現における調節（２〜４倍）も、異なるＨＡ遺伝子の態様で実証された（図１５Ｂ）。
【０２２３】
さらに、異なるＦレプリコンのフローサイトメトリー分析の結果を図１６Ａ〜１６Ｂに示す。ＨＡを用いて示したのと同様に、同じＦタンパク質をコードするが、異なる一次配列を有するレプリコンから、複製およびタンパク質発現における差が示された。興味深いことに、複製は、レプリコンよりも多く、またはより多くのＦタンパク質として発現されたｒＥ２−Ｆ（ＧＡ）レプリコンが最も低いトランスフェクション率を示したので、常にタンパク質発現を予測するものではなかった。
【０２２４】
実施例９
ＥＡＶレプリコンベクターからのＧＯＩ発現の分析
本開示に記載される本発明の仕事の別の非限定的な予想外の態様は、本明細書に記載のＲＮＡレプリコンが可能であるタンパク質発現の大きさである。ＲＮＡレプリコン分野では、アルファウイルス系のレプリコン系が、細胞の総タンパク質含量の２０％までを発現することができることが既に報告されている（Ｐｕｓｈｋｏ、１９９７）。したがって、本明細書に記載される本発明の研究は、アルファウイルスがＥＡＶよりも２〜３桁高い力価で増殖するという事実に基づいて、アルファウイルスレプリコンよりも細胞当たりの発現レベルをさらに高くすることができることは驚くべきことである（Ｃａｓｔｉｌｌｏ−Ｏｌｉｖａｒｅｓ  ２００３）。ＥＡＶレプリコンのＧＯＩ発現可能性の２つの例を以下に記載する。ｇＲＥＮルシフェラーゼ遺伝子または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、ｒＥ２ベクターにクローニングした。この２つの遺伝子はまた、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのＴＣ−８３株に基づくアルファウイルスレプリコンベクターにクローニングされた（Ｈｏｏｐｅｒ  ２００９）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで各レプリコンから転写された同量のＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションした。フローサイトメトリーにより細胞を分析して、トランスフェクションされた細胞の割合（％）と、タンパク質発現の評価としてのＧＯＩ平均蛍光強度（ＭＦＩ）の両方を決定した。代表的な実験の結果を図１７Ａ〜１７Ｃおよび図１８に示す。ｇＲＥＮを発現するレプリコンでトランスフェクトした細胞では（図１７Ａ〜１７Ｃ）、ｒＥ２−ｇＲＥＮ  ＲＮＡよりも約３倍多くの細胞にアルファウイルスｇＲＥＮ  ＲＮＡをトランスフェクトしたが（図１７Ａ）、ｒＥ２−ｇＲＥＮエレクトロポレーションされた細胞のＭＦＩは、アルファウイルスｇＲＥＮ細胞よりも１．５倍大きかった（図１７Ｂ）。並行して細胞に対して実施されたバルクルシフェラーゼアッセイは、たとえ３倍少ない細胞がレプリコンＲＮＡを受け入れたとしても、ｒＥ２−ｇＲＥＮが同量のルシフェラーゼを産生したことを示している。
【０２２５】
同様のより高い発現レベルが、ＧＦＰを発現するレプリコンでトランスフェクトした細胞で検出された（図１８）。これらの実験において、ｒＥ２−ＧＦＰでエレクトロポレーションされた細胞は、アルファウイルスＧＦＰレプリコンでエレクトロポレーションされた細胞よりも１．５倍を超えて多いＧＦＰレポータータンパク質を発現した（図１８）。
【０２２６】
実施例１０
特定の表現型に対するＥＡＶレプリコンの分子進化
この実施例は、レプリコンベクターが、系の意図された用途に特異的なさらなる特徴を有するように改変された場合に、タンパク質発現レベルを調整する能力を実証する。延長されたＧＯＩ発現時間が特定の適応症に必要とされる場合、長期のタンパク質発現を有するベクターが理想的であろう。最終的に、細胞におけるＥＡＶレプリコンＲＮＡ複製の影響は、細胞死を引き起こすだろう。それがＥＡＶレプリコンでいつ起こるかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞毒性がいつ起こるかの分析が行われた。異なる細胞型をｒＥ２−ＧＦＰ  ＲＮＡでトランスフェクトし、その後、細胞変性作用（ＣＰＥ）の存在について細胞を監視した。ＣＰＥが緑色細胞の存在を除去する前に、異なる細胞型（ＢＨＫ−２１、ＣＨＯおよびＨＥＫ−２９３）がＥＡＶレプリコンをどれくらい長く維持できるかを決定するために、時間経過試験を行った。ＧＦＰは、ＣＰＥが試験された全ての細胞において完了する４日前まで細胞内で検出された。
【０２２７】
細胞内でＧＯＩを４日を超えて発現させることができるＥＡＶレプリコンを作製するために、選択マーカー（ネオマイシンまたはピューロマイシン）をｒＥ２レプリコンベクター（それぞれｒＥ２−ｎｅｏまたはｒＥ２−ｐｕｒ）にクローニングすることによって、分子進化実験を行った。細胞をｒＥ２−ｎｅｏレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションから２４時間後、細胞を４００〜６００μｇ／ｍｌのジェネテシン抗生物質選択下に置いた。抗生物質処理から７２時間後までに、対照ウェル中の全ての細胞は死滅したが、ｒＥ２−ｎｅｏ  ＲＮＡでトランスフェクトされたサンプルからの増殖細胞のパッチは１２日間まで残っていた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで目的の遺伝子（ＧＯＩ）の長期にわたる発現のためのＥＡＶレプリコンベクターの分子進化を評価するために実施された典型的な実験では、ｒＥ２−ｎｅｏ  ＲＮＡでエレクトロポレーションされたＢＨＫ−２１細胞をジェネテシン抗生物質選択下に置き、５日目および６日目の細胞のパッチの選択下での増殖を調べた。この実験では、ＢＨＫ−２１細胞のパッチが、選択圧下で５日目から６日目に著しく拡大することが見出された。対照的に、全ての対照細胞は３日目までに死亡した。ｒＥ２−ｎｅｏベクターは、ｒＥ２−ＧＦＰで可能であったよりも３倍まで長く細胞内でタンパク質を発現させるために、抗生物質選択によって分子進化した。結論として、この実験の結果は、分子進化したＥＡＶレプリコンがより長期のタンパク質発現能力を有する新しいベクターを表すことを示している。
【０２２８】
実施例１１
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＡＶレプリコン発現分析
この実施例は、ＥＡＶレプリコンからの発現を評価する実験の結果をまとめたものであり、ｒＦＦルシフェラーゼ発現を検出するための全身イメージング分析を用い、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われた。３０μｇのｒＥ２−ｒＦＦ  ＲＮＡを注射したマウスにおけるＩＶＩＳ（登録商標）分析の一例を図１９Ａ〜１９Ｂに示す。注射および画像分析と、代表的なＩＶＩＳ全身分析研究のスケジュールを、それぞれ図１９Ａおよび１９Ｂに示す。ルシフェラーゼ活性は、注射から４日後から７日後までの間に、全てのｒＥ２−ｒＦＦ注射マウス（１５匹中１５匹）の肺で検出された。このデータは、ＥＡＶレプリコンベクターからのｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質発現を示す。
【０２２９】
実施例１２
ＥＡＶレプリコン発現系における抗体の発現
ＳＧＩのＡｒｃｈｅｔｙｐｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して、ＣＨＯＫ１細胞での発現のためのハーセプチンコドン最適化ＤＮＡ配列を作製した。次いで、これらの配列をオリゴヌクレオチドからｄｅ  ｎｏｖｏで合成し、プラスミドにクローニングし、それらの配列を確認した。ハーセプチンを発現するＥＡＶレプリコンのアセンブリを以下のように行った。ＴＲＳ２と、開始コドンを除くＯＲＦ６の５’末端を含むｐｐ１ａｂの３’末端に特異的なプライマーを用いて、ＥＡＶレプリコン骨格をＰＣＲ増幅させた。ハーセプチン軽鎖（ＬＣ）順プライマーおよび重鎖（ＨＣ）逆プライマーは、遺伝子特異的増幅領域と、ＥＡＶ骨格に相補的なさらなる３０ｂｐ配列を用いて設計させた。ＨＣの発現を制御するＴＲＳ７配列（８４ｂｐ）をＬＣ逆プライマーおよびＨＣ順プライマーに導入した。これらの２つのプライマーは、遺伝子特異的増幅領域および６５ｂｐのＴＲＳ７プロモーター領域を用いて設計された。相同性を有する４６ｂｐの部分は、ＬＣとＨＣ  ＰＣＲ産物との間で共有され、重複する伸長ＰＣＲ増幅により、この２つの産物が一緒に結合し、ハーセプチンＬＣとＴＲＳ７の配列を含む単一フラグメントを生成し、その後に、ハーセプチンＨＣの配列が続いていた。実施例１に記載される２段階のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を、ＥＡＶレプリコン骨格と、ハーセプチンＬＣ−ＴＲＳ７−ＨＣ遺伝子フラグメントを用いて実施した。アセンブリ反応物を大腸菌ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ  ＥＰＩ３００細胞（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号ＥＣ３００１０５）に形質転換し、選択的ＬＢ寒天プレート上に播種した。大腸菌クローンを、アセンブリ接合部のすぐ外側のＥＡＶ骨格内でアニーリングするプライマーを用いたコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。ハーセプチン遺伝子カセットを含む大腸菌クローンは、予想されるＰＣＲフラグメントサイズに基づき、容易に同定することができた。次いで、陽性大腸菌クローンを、ＳａｎｇｅｒおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームを用いた配列決定によって確認した。
【０２３０】
ＥＡＶレプリコン発現系から発現した抗体の分析
【０２３１】
本開示に記載のＥＡＶレプリコン発現系から発現された抗体を、固相結合アッセイを用いて分析した。ＢＨＫ−２１細胞からの培地を、レプリコンを用いたトランスフェクションから２４時間後に回収し、プロテアーゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理した。ハーセプチン発現を測定するために、定量的な全ＩｇＧ捕捉ＥＬＩＳＡを実施した。抗ヒトＩｇＧ重鎖（マウス抗ヒトＩｇＧ非標識、９０４０−０１番、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で、マイクロタイターウェルを一晩かけて被覆した。ウェルを１００μｌの培地と共にインキュベートし、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ軽鎖（マウス抗ヒトκ−ＨＲＰ、９２３０−０５番、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でプローブし、ＴＭＢ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で発色させた。ヒトＩｇＧ１抗体（ＩｇＧ１κ−ＵＮＬＢ、０１５１Ｋ−０１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびハーセプチンの標準曲線を用いて、ＢＨＫ−２１細胞によって発現される抗体の量をｐｇ／細胞／日で概算した。同様のアッセイを、組換えＥｒｂ２受容体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞培養培地中に存在するハーセプチン抗体を捕捉する、特異的抗原結合に使用した。この実験では、標準曲線は、ハーセプチンに基づいており、総ＩｇＧ量と相関関係にあった。
【０２３２】
実施例１３
ＴＲＳ１サブゲノムプロモーターの制御下でＧＯＩ発現を伴うＥＡＶレプリコンベクターの構築
この実験において、ＥＡＶレプリコンは、ＴＲＳ１サブゲノムプロモーターを使用して赤色ホタル（ｒＦＦ）ルシフェラーゼレポーターを発現するように操作された。別のＥＡＶレプリコンからのｒＦＦ発現レベルの比較を図２１Ａおよび２１Ｂに示す。この実験では、ＢＨＫ細胞に、３μｇのレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。ＴＲＳ１レプリコンベクターは、ＴＲＳ７サブゲノムプロモーターを用いてＥＡＶレプリコンから検出された発現よりも強い、安定した発現を示した。図２１Ａ〜２１Ｂにおいて、点線は、ｒＦＦレポーターの発現を作動させるためにＴＲＳ７サブゲノムプロモーターを使用するように操作されたレプリコンから検出された発現量を表す。図２１Ａ〜２１Ｂに示すように、トランスフェクション効率（図２１Ａ）およびルシフェラーゼ発現レベル（図２１Ｂ）によって示されるように、ＴＲＳ１レプリコンから強い発現が検出された。
【０２３３】
実施例１４
ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰおよびＶＢＳ−ＩＣの構築
ベクターの開発をさらなるＥＡＶ株にまで拡大するために、毒性Ｂｕｃｙｒｕｓ株（ＶＢＳ）を選択した。ＶＢＳ株は高度に弱毒化されたＥＡＶ０３０株より毒性が強いので、それに基づくレプリコンはＥＡＶ０３０株に基づくレプリコンとは異なる発現特性を有し得る。この目的のために、ＶＢＳ株の完全なゲノム配列をＧｅｎｂａｎｋ（寄託番号ＤＱ８４６７５１）からダウンロードした。ポリプロテインｐｐ１ｂ遺伝子（ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ）内のＴＲＳ２サブゲノムプロモーターによって作動するｅＧＦＰレポーター遺伝子を含むＶＢＳレプリコンの配列と、ｐＷ７０、Ｔ７プロモーター、１２５Ａを含むポリＡテールに対する重複領域を含むＶＢＳ感染性クローン（ＶＢＳ−ＩＣ）は、それぞれ配列表の配列番号４６および配列番号４７に提供されている。
【０２３４】
ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰおよびＶＢＳ−ＩＣ構築物は、大腸菌−酵母シャトルベクターｐＷ７０を用いて出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において相同組換えを介して構築されることを意図した。ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ構築物は７つのフラグメント（ベクターを除く）に分割され、そのうちの最初の６つは、図２２および図２３にそれぞれ示すように２つのさらなるフラグメントを含むＶＢＳ−ＩＣによって共有される。
【０２３５】
フラグメントのためのｇブロックは、アセンブリのためにＩＤＴから注文した。ベクターとして使用するために、ｐＷ７０を制限酵素ＡｈｄＩ／ＮｏｔＩで消化した。適切なプライマーセットを用いてポリＡテールを付加するために、各構築物の最後のフラグメントをＰＣＲ増幅させた。
【０２３６】
酵母コロニーは、両構築物（ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰおよびＶＢＳ−ＩＣ）について、１００μＬの播種から得た。各構築物についてコロニーをプールし、プラスミドを各プールから単離した。
【０２３７】
次いで、各構築物の単離されたプラスミドプールを細菌中でのスクリーニングのために大腸菌（ＥｐｉｃｅｎｔｅｒからのＥＰＩ３００）に形質転換した。形質転換された培養物（１０〜１００μＬ）を播種した。
【０２３８】
酵母コロニーから単離したプラスミドプールの形質転換からの大腸菌コロニーを、５’および３’末端についてスクリーニングした。
【０２３９】
複数の「陽性」クローンが発見された。サンガーの配列決定の結果、ＶＢＳ−ＩＣ（クローン３３および３６）およびＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰの４つの陽性クローン（クローン６、３０、３３および４７）について、２つの完全に配列が正しいクローンが明らかになった。ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰの模式的なマップを図２４に示す。
【０２４０】
ＶＢＳ  ＩＣおよびＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰレプリコンの機能の実証
ＶＢＳ  ＩＣは、ＶＢＳ  ＩＣ  ｃ３３プラスミドＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを産生し、その後、転写されたＲＮＡをＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションすることによって、機能性を実証するために試験された。陽性対照として、ＥＡＶ株ＥＡＶ０３０の感染性クローンから生成されたＲＮＡを別個のエレクトロポレーションに含めた。ＩＣ  ＲＮＡをエレクトロポレーションした細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生は、ＩＣ  ＲＮＡが機能性であることを示した。図２５に示すように、エレクトロポレーションの４８時間後にＶＢＳおよびＥＡＶ０３０株の両方にＣＰＥが認められた（例えば、図２５参照）。このデータは、ＶＢＳ  ＩＣ  ＲＮＡが機能性であることを実証した。
【０２４１】
ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ  ｃ３０プラスミドＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを産生し、その後、転写されたＲＮＡをＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションすることにより、機能性を実証するためにＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰベクターを試験した。陽性対照として、ｅＧＦＰを発現するＥＡＶ株ＥＡＶ０３０レプリコンから生成されたＲＮＡを別個のエレクトロポレーションに含めた。ＢＨＫ細胞に、ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ  ＲＮＡ（ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ２−ｅＧＦＰ）またはＥＡＶ０３０  ｅＧＦＰレプリコンＲＮＡ（ｒＥ２−ＧＦＰ）のいずれか３μｇをエレクトロポレーションした。この比較のためのフローサイトメトリー分析の一例を図２６に示す。両方のベクター骨格から発現されたＧＦＰの平均蛍光強度の分析は、ＥＡＶ株ＶＢＳおよびＥＡＶ株ＥＡＶ０３０レプリコン系が非常に類似したレベルでタンパク質を発現しており、ＶＢＳレプリコン系が完全に機能性であることを示した。
【０２４２】
実施例１５
ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦレプリコンの構築
代替骨格としてＩＶＩＳ（登録商標）分析について、マウスにおけるＶＢＳ−Ｒを評価するために、ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦを作製する必要があった。したがって、プライマーは、ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰ中のｅＧＦＰを置換するように設計され、指示された。ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦの模式的なマップを図２７に示す。
【０２４３】
２つのフラグメントを、それぞれの適切なテンプレートから、それぞれプライマーＲＰ５２およびＰＲ５３およびプライマーＲＰ５４およびＲＰ２０を用いてＰＣＲ増幅させ、これをゲル抽出し、ＲＰ５５およびＲＰ６をプライマーとして使用した融合ＰＣＲによりアセンブリした。次いで、得られたアセンブリしたフラグメントを再びゲル抽出し、制限酵素ＰｍｅＩおよびＮｏｔＩであらかじめ消化しておいたベクターｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰにクローニングした。１つのクローン（クローン７）は、ＭｉＳｅｑ手順を介し、完全に正しいことが配列で確認された。得られた構築物ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦの配列は、Ｔ７プロモーターと、１２５Ａを有するポリＡテールを含み、配列番号４８として配列表に記載されている。
【０２４４】
実施例１６
ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦレプリコンの構築
ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦ（ｃ７）では、ｒＦＦレポーターの発現はｐｐ１ｂ遺伝子に組み込まれたＴＲＳ２によって作動する。ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦを作製するために、ｒＦＦ発現がｐｐ１ｂ遺伝子の下流に位置するＴＲＳ７によって作動する場合、以下の配列からなるｇブロックを挿入物として使用し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により制限酵素ＰｍｅＩ／ＥｃｏＲＩであらかじめ消化しておいたベクターｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｒＦＦ（ｃ７）にクローニングした。クローン１１は、ＭｉＳｅｑを介し、完全に正しいことが配列で確認された。ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦの構築のためのｇブロックの配列は、配列番号４９として配列表に提供される。
【０２４５】
ｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦの模式的なマップを図２８に示す。
【０２４６】
ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦの配列は、配列表に配列番号５０として提供され、Ｔ７プロモーターと、１２５Ａを有するポリＡテールを含んでいる。
【０２４７】
ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ２−ｒＦＦ（上述のｐＢＲ３２２＋ＶＢＳ−Ｒ−ｅＧＦＰとして以前に同定された）およびＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦベクターを試験し、各プラスミドＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを生成し（それぞれクローン７およびクローン１１）、その後、転写されたＲＮＡをＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションすることによって、その機能性を実証した。陽性対照として、ｒＦＦ（ｒＥ２−ｒＦＦ）を発現するＥＡＶ株ＥＡＶ０３０レプリコンから生成されたＲＮＡを別個のエレクトロポレーションに含めた。ＢＨＫ細胞に３μｇの各ＲＮＡをエレクトロポレーションし、細胞をＦＡＣＳにより分析した。この比較のためのフローサイトメトリー分析の一例を図２９に示し、両方のＶＢＳ−ｒＦＦベクターがルシフェラーゼタンパク質を発現することが観察された。これらのデータは、本明細書に記載のＶＢＳレプリコンがｒＦＦレポーター遺伝子を発現することができ、これらのベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ発現分析に使用することができることを実証する。
【０２４８】
ＶＢＳ−Ｒ−ＴＲＳ２−ｒＦＦレプリコンを、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらに分析した。この実験では、ある範囲のＲＮＡ用量を試験し、筋肉内注射の１〜３日後に全身撮像を行った。興味深いことに、最高用量を受けた動物は、最低用量を受けた動物よりもルシフェラーゼをあまりうまく発現しないことが観察された。これらの実験の結果のまとめを図３０に示す。これらのデータは、ＶＢＳレプリコンベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示す。
【０２４９】
実施例１７
ＳＨＦｖ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦの構築
ＥＡＶ株ＥＡＶ０３０およびＥＡＶ株ＶＢＳレプリコン系に加えて、代替的な骨格を、アルテリウイルス属の中の別のウイルスに基づいて構築した。これは、ウイルスのアルテリウイルス科の中の他の種に基づくアルテリウイルスレプリコン系の開発を拡張することであった。サル出血熱ウイルス（ＳＨＦｖ）由来のレプリコンベクター系を開発した。ＳＨＦｖの完全なゲノム配列をＧｅｎｅｂａｎｋからダウンロードした（寄託番号ＡＦ１８０３９１  Ｌ３９０９１  Ｕ２０５２２  Ｕ６３１２１）。完全なＳＨＦｖ非構造遺伝子配列および３’の大部分の構造領域の一部を、ｒＦＦを含む９つのフラグメントに分け、ｒＦＦを除く対応するｇ−ブロックおよび各フラグメントを増幅させるための各プライマーを並べた。この設計において、ｒＦＦの発現は、独立したＴＲＳ７サブゲノムプロモーターによって作動する。
【０２５０】
レポーターｒＦＦ遺伝子をＰＣＲ増幅させた。次いで、ＰＣＲ増幅させたフラグメントを、既に記載した形質転換プロトコルにしたがって、出芽酵母においてアセンブリした。
【０２５１】
ｐＷ７０＋ＳＨＦＶ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦ構築物の模式的なマップを図３１に示す。これに加え、ＴＲＳ７（ＳＨＦＶ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦ）によって作動するｒＦＦ発現を伴うＳＨＦＶレプリコンの配列は、配列番号５１として配列表に提供され、これは、ベクターｐＷ７０、Ｔ７プロモーター、１２５Ａを有するポリＡテールに対する重複領域を含む。
【０２５２】
ｐＷ７０＋ＳＨＦＶ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦ構築物のアセンブリ形質転換から生じる酵母コロニー由来のプラスミドをプールとして単離し、形質転換して大腸菌に戻した。得られた大腸菌コロニーの合計１２個をＭｉＳｅｑを介して配列決定した。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を介して任意の突然変異を修正するために、クローンのエラー修正およびアセンブリを実施した。
【０２５３】
その領域に特異的なＲＰ７７を用いてサンガー配列決定により補正変換から得られた大腸菌クローンをスクリーニングした。クローン２は、正しいヌクレオチドを含むと同定され、その後のＭｉＳｅｑ配列決定の結果から、レプリコン配列全体もまた完全に正しいことが判明した。
【０２５４】
ＳＨＦｖ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦプラスミドＤＮＡからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡを産生し、その後、転写されたＲＮＡをＢＨＫ細胞にエレクトロポレーションすることにより、機能性を実証するためにＳＨＦｖ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦベクターを試験した。ＢＨＫ細胞に３μｇの各ＲＮＡをエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションされた細胞をＦＡＣＳにより分析した。この比較のためのフローサイトメトリー分析の一例を図３２Ａ〜３２Ｂに示す。これらのデータは、ＳＨＦｖレプリコンがｒＦＦレポーター遺伝子を発現することができ、これらのベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ発現分析に使用することができることを実証する。
【０２５５】
その後、ＳＨＦｖ−Ｒ−ＴＲＳ７−ｒＦＦレプリコンを、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでさらに分析した。この実験では、３０μｇのＲＮＡをマウスに注射し、全身撮像を行った。これらの実験の結果のまとめを図３４に示す。これらのデータは、ＳＨＦｖレプリコンベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を示し、ＥＡＶレプリコンと同等であることを示す。
【０２５６】
実施例１８
ＥＡＶレプリコン発現系を用いた抗体発現
ＥＡＶレプリコンも、同様に抗体構築物を発現することが示されている。これらの実験に用いたベクターは、ｒＥｘ−ハーセプチンであった。ハーセプチンモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖遺伝子を、レプリコン内の第１または第２の位置のいずれかにクローニングした。代表的なｒＥｘ−ハーセプチン構築物由来の３μｇの精製ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞から収集したデータを図３３Ａに示す。産生された抗体の量は、重鎖捕捉および軽鎖検出のみが完全な抗体構造を測定するＥＬＩＳＡ手順によって決定した（図３３Ｂ）。ＥＡＶレプリコンからの抗体の収率は、同等のＤＮＡ構築物から発現される量の約１０倍である。発現された抗体はまた、抗体の活性を実証するためにＥＬＩＳＡによってＨｅｒ２抗原を検出するために用いられた（図３３Ｃ）。
【０２５７】
実施例１９
ＥＡＶ  ＲＳＶおよびｃａｓ９発現
いくつかのさらなる遺伝子が、ＥＡＶレプリコンにクローニングされている。これらのさらなる遺伝子には、マウスＩＬ−１２、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆおよびｃａｓ９が含まれる。ＩＬ−１２およびＲＳＶ  Ｆを発現する二価ＥＡＶレプリコンは、それぞれの一価態様と共に構築された。これらのレプリコンＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞にエレクトロポレーションし、ＩＬ−１２およびＲＳＶ  Ｆ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって、タンパク質発現について調べた。その分析の結果を図３５Ａ〜３５Ｄに示す。エレクトロポレーションされた細胞において、ＩＬ−１２タンパク質およびＲＳＶ  Ｆタンパク質が両方とも、容易に検出された。
【０２５８】
２つの異なるコドン使用を使用するように最適化されたｃａｓ９遺伝子をＥＡＢレプリコンベクターにクローニングした。ｃａｓ９レプリコンベクターの両方からＲＮＡを作成し、ＢＨＫ−２１細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションから１８時間後に細胞溶解物を生成し、異なる量の細胞溶解物を用いてプラスミドＤＮＡを処理した。プラスミド中の標的配列に特異的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞溶解物に加え、インキュベーション後にＤＮＡをアガロースゲル上で分析した。代表的な実験の結果を図３６Ａ〜３６Ｃに示す。ＥＡＶレプリコンから発現されたｃａｓ９タンパク質は、ｇＲＮＡと合わせたプラスミドＤＮＡを開裂することができ、この酵素が活性であることを示している。
【０２５９】
この開示を通して、様々な情報源が参照され、参照により組み込まれる。情報源には、例えば、科学雑誌記事、特許文書、教科書、およびワールドワイドウェブブラウザ非アクティブページアドレスが含まれる。そのような情報源への言及は、出願時の一般的な技術水準の表示を提供する目的のみのためである。本明細書に開示された実施形態を作成および使用するために、情報源のそれぞれおよび全ての内容および教示が当業者によって信頼され使用され得るが、特定の情報源における議論およびコメントは、そのようなコメントがこの分野の一般的な意見として広く受け入れられたことを認めるものとして、決して考慮されるべきではない。
【０２６０】
本開示の特定の代替形態が開示されているが、添付の特許請求の範囲の真の精神および範囲内で、様々な変更および組み合わせが可能であり、意図されることが理解されるべきである。したがって、ここに提示された実際の要約および開示内容には、限定することは意図されていない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７】
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【国際調査報告】
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