(57)【要約】網膜内注射に好適であるＡＡＶ８カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が本明細書において提供される。ｒＡＡＶは、カプシドにパッケージングされたベクターゲノムを含み、それは、抗ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗原結合抗体フラグメント（ａＶＥＧＦ）の発現を誘導する制御因子に作動可能に連結され、ａＶＥＧＦのコード配列を含み、コード配列は、眼内で抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を誘導する制御因子に作動可能に連結される。これらのｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを含む液体懸濁液、ならびに滲出型ＡＭＤ及び他の眼の障害の治療のためのそれの使用方法もまた本明細書において提供される。【選択図】図１
2019518427.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ８カプシドを有し、網膜下及び／または網膜内注射に好適である、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが前記カプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、
（ａ）ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）と；
（ｂ）抗ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）抗原結合抗体フラグメント（Ｆａｂ）のためのコード配列であって、外来性リーダー配列、免疫グロブリン重鎖、リンカー、及び外来性リーダー配列を有する免疫グロブリン軽鎖を有し、前記コード配列が、眼内における前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を誘導する制御因子へと作動可能に連結されている、前記コード配列と；
（ｃ）前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの前記免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の発現を誘導し、トリβアクチンプロモーターまたはユビキチンＣプロモーターより選択されるプロモーターを含む、制御因子と；
（ｄ）  ＡＡＶのＩＴＲと、
を含む、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項２】
前記リンカーがＦ２Ａリンカーである、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３】
前記異種性リーダー配列がＩＬ２のリーダーである、請求項１または請求項２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４】
前記制御因子が、ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項５】
前記制御因子が、エンハンサー及びイントロンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６】
前記制御因子が、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー、ＣＢ７プロモーター、及びトリβアクチンイントロンを含む、請求項５に記載のｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域の前記コード配列が、
（ａ）  ａＶＥＧＦｖ３（配列番号２４）；
（ｂ）  ａＶＥＧＦｖ２（配列番号３）；または
（ｃ）  ａＶＥＧＦｖ１（配列番号１９）；
（ｄ）  ａＶＥＧＦｖ４（配列番号３５）；
（ｅ）  ａＶＥＧＦｖ５（配列番号３６）；
（ｆ）  ａＶＥＧＦｖ６（配列番号３７）；
（ｇ）  ａＶＥＧＦｖ７（配列番号３８）；
（ｈ）  ａＶＥＧＦｖ８（配列番号３９）；
（ｉ）  ａＶＥＧＦｖ９（配列番号４０）；
（ｊ）  ａＶＥＧＦｖ１０（配列番号４１）；
（ｋ）  ａＶＥＧＦｖ１１（配列番号４２）；
（ｌ）  ａＶＥＧＦｖ１２（配列番号４３）；または
（ｍ）  ａＶＥＧＦｖ１３（配列番号４４）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
ＡＡＶ８カプシドを有し、網膜下及び／または網膜内注射に好適である、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが前記カプシド内にパッケージングされたベクターゲノムを含み、前記ベクターゲノムが、
（ａ）  ＩＴＲ−ＣＢ７−ＣＩ−ａＶＥＧＦｖ３−ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号１４）；
（ｂ）  ＩＴＲ−ＣＢ７−ＣＩ−ａＶＥＧＦｖ２−ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号３）；
（ｃ）  ＩＴＲ−ＵｂＣ−ＣＩ−ａＶＥＧＦｖ２−ＳＶ４０−ＩＴＲ（配列番号９）：
（ｄ）  ＩＴＲ−ＵｂＣ−ＰＩ−ａＶＥＧＦｖ３−ＳＶ４０−ＩＴＲ（配列番号１９）；
（ｅ）  ＩＴＲ−ＵｂＣ−ＰＩ−ａＶＥＧＦｖ１−ＳＶ４０−ＩＴＲ（配列番号２４）；
（ｆ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ４．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号３５）；
（ｇ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ５．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号３６）；
（ｈ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ６．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号３７）；
（ｉ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ７．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号３８）；
（ｊ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ８．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号３９）；
（ｋ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ９．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号４０）；
（ｌ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１０．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号４１）；
（ｍ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１１．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号４２）；
（ｎ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１３．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号４３）；
（ｏ）  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１４．ｒＢＧ−ＩＴＲ（配列番号４４）；
（ｐ）  配列番号４５；
（ｑ）  配列番号４６；または
（ｒ）  配列番号４７
からなる群より選択される、前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項９】
網膜下及び／または網膜内注射に好適な液体懸濁液であって、前記組成物が、水性液体及び請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、任意選択で１種以上の賦形剤、保存剤、及び／または界面活性剤を含む、前記液体懸濁液。
【請求項１０】
患者に網膜下投与することのできる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）または請求項９に記載の液体懸濁液。
【請求項１１】
前記患者が滲出型加齢性黄斑変性を有する、請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１２】
患者に網膜下投与するための医薬の調製における、請求項１〜８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは請求項９に記載の液体懸濁液の使用。
【請求項１３】
前記患者が滲出型加齢性黄斑変性を有する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
滲出型加齢性黄斑変性を有する患者に抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを投与する方法であって、前
記方法が、請求項９に記載の液体懸濁液を患者の眼に網膜下注射することを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記注射が、約１×１０８ゲノムコピー（ＧＣ）／眼〜約１．５×１０１２ＧＣ／眼を含み、ＧＣがデジタル液滴ＰＣＲを用いて測定される、請求項１０に記載の方法、請求項１０に記載のｒＡＡＶ、または請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
前記用量が約５×１０８ＧＣ／眼〜約２×１０１１ＧＣ／眼である、請求項１５に記載の方法、ｒＡＡＶ、または使用。
【請求項１７】
前記用量が約７×１０９ＧＣ／眼〜約２×１０１０ＧＣ／眼である、請求項１５に記載の方法、ｒＡＡＶ、または使用。
【請求項１８】
前記ｒＡＡＶが約７５μＬ〜約１５０μＬの懸濁液の容量で送達される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法、ｒＡＡＶ、または使用。
【請求項１９】
前記ｒＡＡＶが約１００μＬの懸濁液の容量で送達される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法、ｒＡＡＶ、または使用。
【請求項２０】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ及び水性液体を含む第１の容器と、（ｂ）希釈剤を含む任意選択の第２の容器と、（ｃ）注射のための針とを含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形態で提出される資料への参照による組み込み
出願人は、本明細書に添付する電子形態での配列表資料を、参照により本明細書に組み込む。このファイルは「ＵＰＮ−１６−７６８３ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベルされる。
【背景技術】
【０００２】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、最も高い視力（ＶＡ）の領域、すなわち黄斑を攻撃する進行性に変性する黄斑疾患であり、６０歳以上の米国人における失明の主な原因である（ＮＩＨ  Ｍｅｄｌｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  （２００８），  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ，  ＮＩＨ  Ｍｅｄｌｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  ３（２）１４−１５、ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｅｄｌｉｎｅｐｌｕｓ／ｍａｇａｚｉｎｅ／ｉｓｓｕｅｓ／ｓｕｍｍｅｒ０８／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓｕｍｍｅｒ０８ｐｇ１４−１５．ｈｔｍｌ）。新生血管の「滲出」型の疾患（ｎＡＭＤまたはｗｅｔ  ＡＭＤ）は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）のものを含む血管及び細胞の増殖が顕著である、脈絡膜血管新生を特徴とする（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：  ９３２−９３６）。最終的に、光受容体の死滅及び瘢痕形成が、中心視力の重篤な喪失をもたらし、かつ、読むこと、書くこと、及び顔を認識すること、または運転することが不可能になる。多くの患者は、もはや有給の雇用を維持できなくなり、日常活動を行えなくなり、結果として、減衰した生活の質を申告する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ  （２００６），  Ｈｅａｌｔｈ  Ｑｕａｌ  Ｌｉｆｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ４：  ９７）。予防的治療法はほとんど効果を示さず、治療戦略は主に血管新生病変の治療に焦点を当ててきている。
【０００３】
いくつかの現在使用可能な滲出型ＡＭＤの治療は、レーザー光凝固術、ベルテポルフィンによる光線力学的治療、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、またはアフリベルセプトなどの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤の硝子体内（ＩＶＴ）注射を含む（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｅｒｆｕｒｔｈ，  （２０１４）  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ
ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｔｉｎａ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ  （ＥＵＲＥＴＩＮＡ）  Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ９８：１１４４−１１６７）。これらの治療は、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）に対していくらかの効果を有するが、それらの効果は、視力の回復及び期間において限定的である（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｅｒｆｕｒｔｈ、上に引用される、２０１４，  ＡＡＯ  ＰＰＰ  （２０１５）  Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ：  Ａｇｅ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）。市場における、滲出型ＡＭＤを治療するのに使用されるいくつかの薬物は、ＶＥＧＦを阻害するメカニズムに依存し、硝子体内注射する必要がある。これらの治療は、疾患の進行を防ぐ点において成功することが報告されるが、それらは、薬物の頻繁な注射を必要とする。
【０００４】
具体的には、組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）であるラニビズマブは、ヒト（ＶＥＧＦ）の全ての活性型に結合し阻害するよう設計されている。ラニビズマブは、組換えＤＮＡ技術によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で産生されるヒト化モノクローナル抗体フラグメントである。ラニビズマブのＶＥＧＦ−Ａに対する結合は、ＶＥＧＦ−Ａと、その受容体である内皮細胞表面上のＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２との相互作用を阻止する。この結合は、その全てが新生血管の「滲出
」型の加齢性黄斑変性（Ｗｅｔ  ＡＭＤ）の進行に寄与すると考えられている、内皮細胞増殖及び血管新生、ならびに血管漏出を阻害する。ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））の安全性及び有効性は、確立されてきており、ラニビズマブは、血管新生ＡＭＤ、及び他の網膜疾患を有する患者におけるＩＶＴ注射治療について米国（ＵＳ）食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認するものである（２００６年に最初にＦＤＡが承認する）。毎月のラニビズマブまたは毎月／８週ごとのアフリベルセプトのいずれかによる長期間の治療は、視力喪失の進行を遅らせ、かつ視力を改善する場合があるが、これらの治療のいずれも血管新生の再帰を阻止しない（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５５：１４３２−４４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５：１４１９  ３１；Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｅｒｆｕｒｔｈ，２０１４，上に引用される）。疾患の悪化を阻止するために、各々は再度投与する必要がある。繰り返し治療への必要性は、患者に追加リスクが発生する可能性があり、患者と臨床医との両方にとって不便である。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本発明は、網膜下及び／または網膜内の注射に好適なＡＡＶ８カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＶＶ）を提供する。ＡＡＶ８カプシドは、ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）に結合し、阻害するヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の可溶性抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）の産生を提供するベクターゲノムをパッケージングし、発現産物は、しばしば「抗ｈＶＥＧＦ  Ｆａｂ」または「ａＶＥＧＦ」と本明細書において呼ばれる。
【０００６】
ｒＡＡＶ８カプシド中にパッケージングされるベクターゲノムは以下を含む：
（ａ）抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現コンストラクトに隣接する、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ（複数可））；（ｂ）抗ｈＶＥＧＦ  Ｆａｂをコードする導入遺伝子の眼における発現を導くトリβアクチンプロモーターまたはユビキチンＣプロモーターを含む制御性因子を有する発現コンストラクト；ならびに（ｃ）抗ｈＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖をコードする導入遺伝子であって、各々の鎖がそのアミノ末端へと付加された異種性リーダー配列を有し、ここで重鎖及び軽鎖のコード配列が、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの別個の産生を確かにするために、「切断可能」なペプチドリンカーのコード配列またはＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）によって分離されており、ポリアデニル化シグナルを有する、導入遺伝子。生じる導入遺伝子発現産物は、Ｆａｂ重鎖に通常見出されるものに加えて、アミノ酸残基を含んでもよい
【０００７】
特定の実施形態において、ヒト細胞における発現に最適化される、重鎖及び軽鎖のコドン配列が使用される。例に示すように、これらは、ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ２．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ３．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ４．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ５．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ６．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ７．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ８．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ＶＥＧＦｖ９．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１０．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１１．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１２．ｒＢＧ；ＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１３．ｒＢＧを含み得るが、これらに限定されない。
【０００８】
本明細書において使用されるとき、「ＡＡＶ２／８」及び「ＡＡＶ８」は、ＡＡＶ８カプシド及びＡＡＶ２のＩＴＲに隣接されるベクターゲノムを有する組換えＡＡＶを指すのに交換可能に使用される。
【０００９】
さらに別の態様において、網膜下及び／または網膜内の注射のための上述のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの任意の液体懸濁液が提供される。組成物は、水性液体及び本明細書において記載されるようなｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ、ならびに任意選択で１種以上の賦形剤、保存剤、及び／または界面活性剤を含む。
【００１０】
なおもさらなる態様において、滲出型加齢性黄斑変性を有する患者に対して抗ｈＶＥＧＦ  Ｆａｂを送達するための方法が提供される。方法は、抗ｈＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現コンストラクトを担持するｒＡＡＶ８ベクターを含む液体懸濁液を患者の眼に網膜下注射することを含む。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、患者に網膜下投与することのできる本明細書に記載されるようなｒＡＡＶ、または液体懸濁液を提供する。ある実施形態において、患者への網膜下投与のためのｒＡＡＶまたは液体懸濁液の使用が提供される。患者は、滲出型加齢性黄斑変性または本明細書で定義されるような他の眼の状態を有すると以前に診断されていてもよい。
【００１２】
なおもさらなる実施形態において、製品は以下を含む：（ａ）ｒＡＡＶ８．抗ｈＶＥＧＦ  Ｆａｂ及び水性液体を含む第１の容器、（ｂ）希釈剤を含む任意選択の第２の容器、ならびに（ｃ）注射のための針。ある実施形態において、製品は注射キットである。
【００１３】
本発明は、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域（網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」）の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究を考慮すると、この結果は驚くべきであり、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの単一投与が（ｉ）結果として、経時的に消散するＶＥＧＦ阻害剤の高用量ボーラスの繰り返されるＩＶＴ投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるＶＥＧＦ阻害剤の有効量の連続送達、ならびに（ｉｉ）患者に追加のリスク及び不便さを提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、ｎＡＭＲ治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
【００１４】
さらに他の態様及び本発明の利点は、以下の本発明の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＡＡＶ２の末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接され、かつヒト抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）抗原結合抗体フラグメント（Ｆａｂ）を発現する遺伝子カセットを含むＡＡＶ８ベクターゲノムの略図を提示する。制御因子はトリβアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーからなるＣＢ７プロモーター、トリβアクチン及びウサギβグロブリンのｐｏｌｙ  Ａシグナルを含む。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａリンカーによって分離されている。アルギニン−リジン−アルギニン−アルギニンのアミノ酸配列からなるフリン認識部位が使用された。さらに、軽鎖及び重鎖の各々は、宿主細胞の機構によって成熟タンパク質からリーダーペプチドを処理して除去する適切な細胞分画へと新生ペプチドを誘導する、異種性リーダーペプチドを含む。これら及び他の合成抗ＶＥＧＦコンストラクトは、本明細書においてＡＡＶ．ａＶＥＧＦと名付けられる。
【図２】左眼（ｏｓ）または右眼（ｏｄ）の投与後の様々な時点におけるＡＡＶ８．ＣＢ７．ａＶＥＧＦｖ１またはｒＡＡＶ８．ＵｂＣ．ａＶＥＧＦｖ１の発現のレベル及び動態を提示する。ＡＡＶ８．ＣＢ７．ａＶＥＧＦ−Ｒｖ１は、閉じた円を伴う頂上の線である。ＡＡＶ８．ＵＢＣ．ａＶＥＧＦ−Ｒｖ１は、閉じた円を伴う底部の線である。開いた円を伴う中間の線はＡＡＶ８．ＵＢＣ．ａＶＥＧＦ−Ｒｖ１である。
【図３】Ａ〜Ｄは、カニクイザルが、各々の眼の網膜下に１．００×１０１１ＧＣ／眼の単一用量のＡＡＶ２／８ベクターが投与された、実施例３に記載されるような群２及び群３の動物についての前房液及び血液における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を示す。前房液及び血液を事前に設定された時点で採取した。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は、酵素結合免疫吸着検査法を用いて測定された。Ａ及びＢは、群２の動物についての結果である。Ｃ及びＤは、群３の動物についての結果を提示する。Ｂ及びＤにおいて、血清中の結果を示すパネル中の灰色の領域は、ベースラインレベルを示す。円はメスを示し、正方形はオスを示す。試料は二重に分析された。結果は平均±標準偏差として表される。略称：Ｆａｂ＝フラグメント抗原結合；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＯＤ＝右眼；ＯＳ＝左眼；ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子。
【図４】Ａ〜Ｄは、カニクイザルが、各々の眼の網膜下に１．００×１０１１ＧＣ／眼の単一用量のＡＡＶ２／８ベクターが投与された、実施例３に記載されるような群５及び群６の動物についての前房液及び血液における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を示す。前房液及び血液を事前に設定された時点で採取した。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は、酵素結合免疫吸着検査法を用いて測定された。群５についての結果はＡ及びＢに示し、群６についての結果はＣ及びＤに示す。Ｂ及びＤにおいて、血清中の結果を示すパネル中の灰色の領域は、ベースラインレベルを示す。円はメスを示し、正方形はオスを示す。試料は二重に分析された。結果は平均±標準偏差として表される。略称：Ｆａｂ＝フラグメント抗原結合；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＯＤ＝右眼；ＯＳ＝左眼；ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子。
【図５】ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される網膜中のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターについてのｍＲＮＡレベルを提示する。カニクイザルは、右眼の網膜下に１．００×１０１２ＧＣ／眼の単一用量のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４が投与された。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターについてのｍＲＮＡレベルは、解剖した網膜の異なる部分において、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって定量された。左のパネルにおいて、注射部位の概要が描写される。真ん中のパネルにおいて、網膜の解剖体が提示される。右のパネルにおいて、網膜の４つの切片におけるＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターのｍＲＮＡ（１００ｎｇのＲＮＡ当たりのＧＣ）についてのｍＲＮＡレベルが描写される。略称：ＢＶ＝主要血管；Ｆ＝中心窩；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＩＢ＝注射ブレブ；ＩＤ＝識別；Ｏ＝視神経円板；ＵＤ＝検出されない
【図６】Ａ〜Ｄは、前房液、硝子体、及び網膜（群２、実施例６）における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現結果を提示する。カニクイザルは、網膜下に１．００×１０１１ＧＣ／眼の単一用量のＡＡＶ２／８ベクターが投与された。これらのデータは、図５Ａ〜５Ｄに示されるものと異なるＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの結果を表す。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度は、前房液、硝子体、及び網膜の４つの異なる部分において測定された。眼は図５Ａ〜５Ｄに記されるように解剖された。Ａ及びＣにおいて、注射部位の境界と共に網膜の赤外線スペクトル領域光干渉断層撮影画像が示される。Ｂ及びＤにおいて、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度のグラフが提示される。この図において、実施例６の群２の動物の結果が提示される。略称：ＡＣＦ＝前房液；ＢＶ＝主要血管；Ｆ＝中心窩；Ｆａｂ＝フラグメント抗原結合；ＦＯＶ＝中心窩を含む中間部；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＩＢ＝注射ブレブ；ＩＤ＝識別；ＩＮＦ＝下網膜切片；Ｏ＝視神経円板；ＯＤＩ＝視神経円板を含む中間部；ＳＵＰ＝上網膜切片；ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子；ＶＴ＝硝子体。
【図７】Ａ〜Ｄは、前房液、硝子体、及び網膜における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現結果を提示する（群３、実施例６）。カニクイザルは、網膜下に１．００×１０１１ＧＣ／眼の単一用量のＡＡＶ２／８ベクターが投与された。これらのデータは、図５Ａ〜５Ｄに示されるものと異なるＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの結果を表す。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度は、前房液、硝子体、及び網膜の４つの異なる部分において測定された。眼は図５Ａ〜５Ｄに記されるように解剖された。Ａ及びＣにおいて、注射部位の境界と共に網膜の赤外線スペクトル領域光干渉断層撮影画像が描写される。Ｂ及びＤのグラフにおいて、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度が提示される。この図において、実施例６の群３の動物の結果が提示される。略称：ＡＣＦ＝前房液；ＢＶ＝主要血管；Ｆ＝中心窩；Ｆａｂ＝フラグメント抗原結合；ＦＯＶ＝中心窩を含む中間部；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＩＢ＝注射ブレブ；ＩＤ＝識別；ＩＮＦ＝下網膜切片；Ｏ＝視神経円板；ＯＤＩ＝視神経円板を含む中間部；ＳＵＰ＝上網膜切片；ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子；ＶＴ＝硝子体。
【図８】Ａ〜Ｄは、前房液、硝子体、及び網膜における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現結果を提示する（群５、実施例６）。カニクイザルは、網膜下に１．００×１０１１ＧＣ／眼の単一用量のＡＡＶ２／８ベクターが投与された。これらのデータは、図５Ａ〜５Ｄに示されるものと異なるＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの結果を表す。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度は、前房液、硝子体、及び網膜の４つの異なる部分において測定された。眼は図５Ａ〜５Ｄに記されるように解剖された。Ａ及びＣにおいて、注射部位の境界と共に網膜の赤外線スペクトル領域光干渉断層撮影画像が描写される。Ｂ及びＤのグラフにおいて、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度が提示される。この図において、実施例６の群５の動物の結果が提示される。略称：ＡＣＦ＝前房液；ＢＶ＝主要血管；Ｆ＝中心窩；Ｆａｂ＝フラグメント抗原結合；ＦＯＶ＝中心窩を含む中間部；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＩＢ＝注射ブレブ；ＩＤ＝識別；ＩＮＦ＝下網膜切片；Ｏ＝視神経円板；ＯＤＩ＝視神経円板を含む中間部；ＳＵＰ＝上網膜切片；ＶＥＧＦ＝血管内皮増殖因子；ＶＴ＝硝子体。
【図９】製造プロセスのフローチャートを提示する。
【図１０】Ａ〜Ｄは、ＡＡＶ８についてのｒｃＡＡＶアッセイの結果を示す。ｗｔＡＡＶ８が異なるＧＣ数のＡＡＶベクター中にスパイクされ、細胞溶解物の新しい細胞に対する３代の連続的な継代の後に１μｇの２９３細胞のＤＮＡ当たりのｃａｐ遺伝子コピー数が測定される。ｗｔＡＡＶ８の３つの異なるスパイクレベル［パネル当たり１つのレベル：１×１０２ＧＣ、１×１０３ＧＣ、及び１×１０４ＧＣ］、４つの異なるベクター量［０ＧＣ（暗い正方形）、１×１０９ＧＣ（灰色の正方形）、１×１０１０ＧＣ（三角形）、及び１×１０１１ＧＣ（Ｘによって示す）］が示され、バックグランドレベルが示される（コントロール）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＡＡＶ８カプシドを有する組換えの、複製欠損アデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター及びそれを含む組成物は、抗ＶＥＧＦ抗体結合フラグメント（Ｆａｂ）を送達するための網膜下注射に好適である。それ、及び特に液体水性懸濁液を含む組成物もまた提供される。それらの組成物の使用もまた提供される。
【００１７】
ｒＡＡＶ８ベクターは、哺乳動物において、より詳細にヒト細胞において、抗ＶＥＧＦ抗体結合フラグメント（Ｆａｂ）を発現するよう設計される。これらの抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の治療に特によく適している。便宜上、これらのベクターをｒＡＡＶ８．ＡＭＤと呼ぶ。本明細書において記載されるように、高い収量、発現レベル、及び／または活性を実証している一連の新規のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦコンストラクトが開発されてきている。
【００１８】
本発明は、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域（網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」）の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究を考慮すると、この結果は驚くべきであり、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの単一投与が（ｉ）結果として、経時的に消散するＶＥＧＦ阻害剤の高用量ボーラスの繰り返されるＩＶＴ投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるＶＥＧＦ阻害剤の有効量の連続送達、ならびに（ｉｉ）患者に追加のリスク及び不便さを
提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、ｎＡＭＲ治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
【００１９】
本発明は、少なくとも配列番号１の重鎖アミノ酸配列及び配列番号２の軽鎖アミノ酸配列を有し、その各々が、重鎖及び軽鎖の各々に対する外来性リーダー配列を有するよう改変されている、新規の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂをコードするコンストラクトを提供する。本明細書において示されるあるコンストラクトにおいて、リーダー配列は、ヒトＩＬ２のリーダー由来である。さらに、実施例において示されるあるコンストラクトにおいて、重鎖及び軽鎖は、フリン／Ｆ２ａリンカーによって分離され、これは、重鎖［配列番号１］に対して付加される１つ以上の追加のアミノ酸をもたらす可能性がある。一実施形態において、単一のアルギニン［Ｒ］が重鎖に付加される。しかしながら、ある実施形態において、別のリンカーが選択されるか、及び／または異なるシステムが追加のアミノ酸をまったくもたらさないか、もしくは１つ以上の追加のアミノ酸をもたらす［例えば、とりわけ、Ｒ、Ｌｙｓ（Ｋ）、ＲＫ、ＲＫＲ、ＲＫＲＲ］。以前の仮出願において、生じるコンストラクトが明細書においてａＶＥＧＦ−Ｒと名付けられた。しかしながら、明確性のために、本明細書に記載される抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物をコードするこれらのコンストラクトを、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ、ａＶＥＧＦ、抗ｈＶＥＧＦ、抗ヒトＶＥＧＦ、または抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物と呼ぶ。この導入遺伝子産物をコードするコンストラクトにおいて、用語ａＶＥＧＦに続く数字表示、例えばａＶＥＧＦｖ１、ａＶＥＧＦｖ２、ａＶＥＧＦｖ３からａＶＥＧＦｖ１３までは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のオープンリーディングフレームのための配列をコードする異なる核酸を指す。
【００２０】
ある実施形態において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂのアミノ酸配列は、５１３アミノ酸を有し、抗ＶＥＧＦは、リンカーの結果として追加のアミノ酸によって分離された重鎖及び軽鎖を含む。例えば、以下の発現カセットの各々は、同一の抗ＶＥＧＦの重鎖及び軽鎖をコードするが、一実施形態において重鎖の最後の位置に付加される１つのアミノ酸が存在し得る。さらに他の実施形態において、重鎖に結合する２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の追加のアミノ酸が存在し得る。例えば、ある実施形態において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａリンカーによって分離されている。アルギニン−リジン−アルギニン−アルギニンのアミノ酸配列からなるフリン認識部位が使用されてもよい。フリン媒介性切断のメカニズムのために、ベクターが発現する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、重鎖［配列番号１］の最後の位置に付加される追加のアルギニン（Ｒ）残基を含み得る。他の実施形態において、ベクターが発現する抗ＶＥＧＦ
Ｆａｂは、重鎖の終端にジペプチド、アルギニン−リジン、重鎖の終端にトリペプチド、アルギニン−リジン−アルギニン、または重鎖の終端にポリペプチド、アルギニン−リジン−アルギニン−アルギニンを含み得る。ある実施形態において、ベクターが発現する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、２つ以上のこれらのＦａｂ産物の異種性の混合物である。他のフリン切断部位（アルギニン−Ｘ−Ｘ−アルギニン、またはアルギニン−Ｘ−リジン、またはアルギニン−アルギニン）もまた使用でき、これはまたＣ末端の不均一性を生じ得る。換言すると、他のベクターが発現する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、リンカー処理の結果として、重鎖がそのＣ末端に０、１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸を有する、Ｆａｂの異質性の集合であり得る。さらに、軽鎖及び重鎖の各々は、宿主細胞の機構によって成熟タンパク質からリーダーペプチドを処理して除去する適切な細胞分画へと新生ペプチドを誘導する、異種性リーダーペプチドを含む。ある実施形態において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、ＨＣまたはＬＣのリーダー配列をまったく含まない。例えば配列番号３３を参照。
【００２１】
ある実施形態において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖は、リーダー配列と共に配列番号３３の残基２１〜２５２のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの軽鎖は、リーダー配列と共に配列番号３３の残基３００〜５１３のアミノ酸配列を有する。例えば、リーダー配列は、約１５〜約２５のアミノ酸、好ましくは約２０のアミ
ノ酸であってよい。ある実施形態において、リーダーは、配列番号３３のアミノ酸１〜２０の配列を有する。
【００２２】
一実施形態において、抗ＶＥＧＦｖ１の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号２４に提示される。より詳細には、配列番号２４を参照して、重鎖可変領域のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がヌクレオチド（ｎｔ）１８４３〜２２１１に提示され、重鎖定常領域（ＣＨ１）のＯＲＦがｎｔ２２１２〜２５３２に提示される。したがって、リーダーを含まないａＶＥＧＦｖ１の重鎖は、ｎｔ１８４３〜２５３２の核酸配列を有する。軽鎖可変領域（ＶＬ）のＯＲＦが配列番号２４のｎｔ２６８０〜３０００に提示され、軽鎖定常領域（ＣＬ）が配列番号２４のｎｔ３００１〜３３２１に提示される。したがって、リーダーを含まないａＶＥＧＦｖ２の軽鎖は、配列番号２４のｎｔ２６８０〜３３２１の核酸配列を有する。
【００２３】
別の実施形態において、抗ＶＥＧＦｖ２の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号３に提示される。より詳細には、ＶＨのＯＲＦが配列番号３のｎｔ２０５９〜２４２７に提示され、ＣＨ１が配列番号３のｎｔ２４２８〜２７４８に提示され、リーダーを含まない重鎖が配列番号３のｎｔ２０５９〜２７４８の核酸配列を有する。ＶＬのＯＲＦが配列番号３のｎｔ２８９６〜３２１６に提示されＣＬが配列番号３のｎｔ３２１７〜３５３６に提示され、リーダーを含まない軽鎖が配列番号３のｎｔ２８９６〜３５３６の核酸配列を有する。
【００２４】
さらに別の実施形態において、ａＶＥＧＦｖ３の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号１９に提示される。ＶＨのＯＲＦが配列番号１９のｎｔ１８４２〜２２１０に提示され、ＣＨ１が配列番号１９のｎｔ２２１１〜２５３１に提示され、リーダーを含まない重鎖が配列番号１９のｎｔ１８４２〜２５３１の核酸配列を有する。ＶＬのＯＲＦが配列番号１９のｎｔ２６７９〜２９９９に提示され、ＣＬが配列番号１９のｎｔ３０００〜３３２０に提示され、リーダーを含まない軽鎖が配列番号１９のｎｔ２６７０〜３３２０の核酸配列を有する。
【００２５】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ４の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号３５に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号３５のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号３５のｎｔ２０５３〜２４２１にあり、ＣＨ１が配列番号３５のｎｔ２４２２〜２７４２にある。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がＶＨ鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号３５のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号３５のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号３５のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００２６】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ５の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号３６に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号３６のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号３６のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号３６のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がＶＨ鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号３６のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号３６のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号３６のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００２７】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ６の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号３７に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号３７のｎｔ１９９３〜２０５１にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号３７のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が
配列番号３７のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のアミノ酸をコードする配列がＶＨ鎖に残り得る。軽鎖のリーダー配列が配列番号３７のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号３７のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号３７のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００２８】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ７の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号３８に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号３８のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号３８のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号３８のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のＡｒｇのコドンがＶＨ鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号３８のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号３８のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号３８のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００２９】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ８の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号３９に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号３９のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号３９のｎｔ２０５〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号３９のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のＡｒｇのコドンがＶＨ鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号３９のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号３９のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号３９のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００３０】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ９の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号４０に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号４０のｎｔ１９９９〜２０５８にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号４０のｎｔ２０５９〜２４２７にコードされ、ＣＨ１が配列番号４０のｎｔ２４２８〜２７４８にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のＡｒｇのコドンがＶＨ鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号４０のｎｔ２８３６〜２８９５にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号４０のｎｔ２８９６〜３２１６に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号４０のｎｔ３２１７〜３６３７に位置する。
【００３１】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ１０の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号４１に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号４１のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号４１のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号４１のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位の配置の結果として、追加のＡｒｇのコドンがＶＨ鎖に残る。軽鎖のリーダー配列が配列番号４１のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号４１のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号４１のｎｔ３２１１〜３２３１に位置する。
【００３２】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ１１の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号４２に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号４２のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号４２のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号４２のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。本明細書に記載される他のコンストラクトにおけるように、Ｆ２Ａ切断部位が重鎖の終端と軽鎖の先頭の間に配置される。軽鎖のリーダー配列が配列番号４２のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号４２のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号４２のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００３３】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ１２の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号４３に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号４３のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号４３のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号４３のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。軽鎖のリーダー配列が配列番号４３のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号４３のｎｔ２８９０〜３２１０に提示され、ＣＬのＯＲＦが配列番号４３のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００３４】
さらなる実施形態において、ａＶＥＧＦｖ１３の重鎖及び軽鎖のコード配列は、配列番号４４に提示される。重鎖のリーダー配列が配列番号４４のｎｔ１９９３〜２０５２にコードされ、ＶＨのＯＲＦが配列番号４４のｎｔ２０５３〜２４２１にコードされ、ＣＨ１が配列番号４４のｎｔ２４２２〜２７４２にコードされる。軽鎖のリーダー配列が配列番号４４のｎｔ２８３０〜２８８９にコードされ、ＶＬのＯＲＦが配列番号４４のｎｔ２８９０〜３２１０であり、ＣＬのＯＲＦが配列番号４４のｎｔ３２１１〜３５３１に位置する。
【００３５】
ラニビズマブは、本明細書において陽性コントロールとして記載され、現在、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）の商品名で市販されている。それは、組換えヒト化モノクローナル抗体ｒｈｕＭＡｂ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の高親和性バージョンのＦａｂ部分として記載されている。それは、そのＣ末端において、２３１残基の重鎖のＮ末端部分へとジスルフィド結合により連結している２１４残基の軽鎖からなる。重鎖及び軽鎖の予測されるアミノ酸配列は、配列番号１及び２に提示される。ＣＡＳ番号３４７３９６−８２−１。
【００３６】
本明細書において使用されるとき、「免疫グロブリンドメイン」は、通常の全長の抗体を参照して定義されるような抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。より詳細には、全長の抗体は、４つのドメイン：１つのＮ末端可変（ＶＨ）領域、及び３つのＣ末端定常（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）領域を含む重（Ｈ）鎖ポリペプチド、ならびに２つのドメイン：１つのＮ末端可変（ＶＬ）領域、及び１つのＣ末端定常（ＣＬ）領域を含む軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを含む。Ｆｃ領域は２つのドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）を含み得る。Ｆａｂ領域は、重鎖と軽鎖の各々についての１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインを含む。
【００３７】
一実施形態において、ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦベクターは、ＡＡＶ８カプシドと、ＡＡＶ８に対して異種性の少なくとも１つの要素を含むそこにパッケージングされるベクターゲノムとを有する。一実施形態において、ベクターゲノムは、５’から３’に、（ａ）ＡＡＶの５’ＩＴＲ、（ｂ）エンハンサー、（ｃ）プロモーター、（ｄ）イントロン、（ｅ）リーダー配列及び抗ＶＥＧＦ重鎖コード配列、（ｆ）フリン−Ｆ２ａリンカー、（ｇ）リーダー配列及び抗ＶＥＧＦ軽鎖コード配列、（ｈ）ポリＡシグナル、ならびに（ｉ）ＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。
【００３８】
ある実施形態において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の処理は、ヒトＩＬ２タンパク質由来のリーダーペプチドによって誘導される。一実施形態において、リーダー配列はインターロイキン（ＩＬ）ＩＬ−２のリーダー配列であり、それは野生型ヒトＩＬ２ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ［配列番号２９］、またはＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ［配列番号３０］もしくはＭＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ［配列番号３１］のような変異したリーダーであってよい。別の実施形態において、ヒトセルピンＦ１の分泌シグナルがリーダーペプチドとして使用され得る。他のリーダー配列、または重鎖及び軽鎖にとって外来性である他のリーダーを使用することができる。
【００３９】
ベクターゲノムの以下の記載において使用されるとき、軽鎖または重鎖として他が指定されていない限り、コード配列（例えばａＶＥＧＦｖ２）に対する言及は、抗ＶＥＧＦの重鎖−フリン／Ｆ２ａリンカー−抗ＶＥＧＦの軽鎖を包含する。一実施形態において、フリン認識部位、アルギニン−リジン−アルギニン−アルギニンをコードする核酸配列が選択される。ある実施形態において、ＦＭＤＶ（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＣＡＡ２４３６．１）に由来する２４アミノ酸ペプチドであるＦ２Ａリンカーをコードする核酸が選択される。しかしながら、所望なら、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するようなＩＲＥＳ配列：配列番号３２：［ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＡＣＧＴＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡＡＴＡＴＴＡＡＧＧＴＡＣＧＧＧＡＧＧＴＡＴＴＧＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧＴＡＣＴＡＡＣＡＴＡＣＧＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴＡＧＣＡＡＡＡＴＡＧＧＣＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＡＧ］、ｃＭｙｃ［Ｎａｎｂｒｕ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ  （１９９７）．  Ｊ．
Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  ３２０６１−３２０６６；Ｓｔｏｎｅｌｅｙ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６，  ４２３−４２８．］、または口蹄疫（ＦＭＤ）に由来するものが選択され得る。
【００４０】
ＡＡＶ２に由来する末端逆位配列（ＩＴＲ）が選択され得る。そのカプシドとは異なる源由来のＩＴＲを有するベクターは、「偽型」と呼ばれる。ある実施形態において、ＡＡＶ２とは異なる源由来のＩＴＲを、別の偽型ＡＡＶを生成するためにこのコンストラクトについて選択され得る。代替的に、カプシドと同一の源由来のＩＴＲが選択され得る。ある実施形態において、以下に定義されるような自己相補型ＡＡＶを生成するようにＩＴＲが選択され得る。
【００４１】
ある実施形態において、プロモーターはＣＢ７、すなわち、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー（Ｃ４）とトリβアクチンプロモーターとのハイブリッドである。他の実施形態において、プロモーターはユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターである。例えばＷＯ２００１／０９１８００を参照。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ２３２３０５（ラット）及びＤ６３７９１（ヒト）をそれぞれ参照。さらに他のプロモーター及び／またはエンハンサーが選択され得る。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー（２６０ｂｐ、Ｃ４、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｋ０３１０４．１）、トリβアクチンプロモーター（２８１ｂｐ、ＣＢ、ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ００１８２．１）を参照。さらに他の実施形態において、多重エンハンサー及び／またはプロモーターが含まれ得る。
【００４２】
ある実施形態において、イントロンが含まれる。１つの好適なイントロンはトリβアクチンのイントロンである。一実施形態において、イントロンは８７５ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｘ００１８２．１）である。別の実施形態において、Ｐｒｏｍｅｇａより入手可能なキメライントロンが使用される。しかしながら、他の好適なイントロンも選択され得る。
【００４３】
本明細書において記載されるベクターゲノムは、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙＡ）を含む。様々な好適なｐｏｌｙＡが公知である。一例において、ｐｏｌｙＡは、１２７ｂｐのウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｖ００８８２．１）のようなウサギβグロビンである。他の実施形態において、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡシグナ
ルが選択される。さらに他の好適なｐｏｌｙＡ配列も選択され得る。
【００４４】
任意選択で、例えばＵＴＲ配列またはコザック配列を含み得る他の好適なベクター因子が選択され得る。
【００４５】
一実施形態において、ベクターゲノムはＩＴＲ−ＣＢ７−ＣＩ−ａＶＥＧＦｖ２−ｒＢＧ−ＩＴＲ［配列番号３］を含む。別の実施形態において、ベクターゲノムは、ＩＴＲ−ＵｂＣ−ＣＩ−ａＶＥＧＦｖ２−ＳＶ４０−ＩＴＲ［配列番号９］を含む。一実施形態においてベクターゲノムはＩＴＲ−ＣＢ７−ＣＩ−ａＶＥＧＦｖ３−ｒＢＧ−ＩＴＲ［配列番号１４］を含む。別の実施形態において、ベクターゲノムは、ＩＴＲ−ＵｂＣ−ＰＩ−ａＶＥＧＦｖ３−ＳＶ４０−ＩＴＲ［配列番号１９］を含む。別の実施形態において、ベクターゲノムは、ＩＴＲ−ＵｂＣ−ＰＩ−ａＶＥＧＦｖ１−ＳＶ４０−ＩＴＲ［配列番号２４］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ４．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号３５］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ５．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号３６］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ６．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号３７］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ７．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号３８］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ８．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号３９］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ９．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号４０］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１０．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号４１］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１１．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号４２］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２−ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１２．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号４３］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２  ＩＴＲ−ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ１３．ｒＢＧ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号４４を参照］を含む。さらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２  ＩＴＲ−ＣＭＶ．ＰＩ．ａＶＥＧＦｖ７．ｅＣＭＶＩｒｅｓ．ａＶＥＧＦ．ＳＶ４０−ＡＡＶ２  ＩＴＲ［配列番号４５］を含む。別の施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２  ＩＴＲ．ＣＭＶ．ＰＩ．ａＶＥＧＦ．ＦＭＤＶ１ＩＲＥＳ．ＳＶ４０−ＩＴＲ［配列番号４６］を含む。なおもさらなる実施形態において、ベクターゲノムはＡＡＶ２  ＩＴＲ．ＣＭＶ．ＰＩ．ａＶＥＧＦ．ｃＭｙｃＩＲＥＳ．Ｆａｂ．ＳＶ４０−ＩＴＲ［配列番号４７］を含む。
【００４６】
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の作製における使用のために、発現カセットを、パッケージング宿主細胞へと送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持し得る。本発明において有用なプラスミドは、原核細胞、哺乳動物細胞、またはその両方において複製及びパッケージングするのに好適なように改変し得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は、当業者に公知であり、及び／または当業者によって容易に設計できる。
【００４７】
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶの生成及び単離のための方法は、当該技術分野において公知である。概して、例えばＧｒｉｅｇｅｒ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，  ２００５，”Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．
，２００８，”Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３；及びいかに引用される参考文献を参照でき、その各々は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。導入遺伝子のビリオンへのパッケージングのために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同一のコンストラクトにおいて、シスで必要とされる唯一のＡＡＶの構成要素である。ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給できる。
【００４８】
一実施形態において、本明細書において記載される発現カセットは、ウイルスベクター産生のためにそこに担持する免疫グロブリンコンストラクト配列をパッケージング宿主細胞へと導入する遺伝因子（例えばシャトルプラスミド）に入るよう操作される。一実施形態において、選択される遺伝因子は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージング細胞へと送達され得る。安定的なＡＡＶパッケージング細胞もまた作製できる。代替的に、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを作製するために、またはインビトロにおいて抗体の混合物を作製するために、発現カセットを使用することもできる。そのようなコンストラクトを作製するのに使用される方法は、核酸操作における当業者に公知であり、遺伝子操作、組換え技術、及び合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。
【００４９】
本明細書において使用されるとき、「ＡＡＶ８カプシド」は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿００６２６１．１（配列番号４９）の核酸配列にコードされるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＹＰ＿０７７１８０（配列番号４８）のアミノ酸配列を有するＡＡＶ８カプシドを指し、その両方は参照により本明細書に組み込まれる。このコードされた配列のいくらかの変異は本発明によって包含され、これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション：ＹＰ＿０７７１８０、米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，７９０，４４９号、同第８，３１９，４８０号、同第８，９６２，３３０号、ＵＳ８，９６２，３３２における参照アミノ酸配列に対して約９９％の同一性を有する配列（すなわち、参照配列から約１％未満の変異）を含み得る。別の実施形態において、ＡＡＶ８カプシドは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１２４２８２に記載されるＡＡＶ８バリアントのＶＰ１配列を有し得る。カプシド、コード配列の生成方法、したがって、ｒＡＡＶウイルスベクターの作製方法は、記載されてきている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１−６０８６（２００３）、ＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１、及びＷＯ２０１４／１２４２８２を参照。ある実施形態において、所望の標的細胞、例えば光受容体、ＲＰＥ、または他の眼細胞に対する指向性を示すＡＡＶ８バリアントが選択される。例えば、ＡＡＶ８カプシドは、参照により本明細書に組み込まれるＫａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｖｉａ  Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ，Ｃａｐｓｉｄ−Ｍｕｔａｔｅｄ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（４）：ｅ６２０９７．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２０１３
Ａｐｒ  ２６に記載されるような、Ｙ４４７Ｆ、Ｙ７３３Ｆ、及びＴ４９４Ｖ変異（「ＡＡＶ８（Ｃ＆Ｇ＋Ｔ４９４Ｖ）」及び「ｒｅｐ２−ｃａｐ８（Ｙ４４７Ｆ＋７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）」とも呼ばれる）を有し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭｏｗａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｕｔａｎｔ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｒｅｔｉｎａ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，９６−１０５（Ｊａｎｕａｒｙ  
２０１４）を参照。別の実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシドであり、優先的に双極細胞を標的とする。参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／０２４２８２を参照。
【００５０】
本明細書において使用されるとき、用語「ＮＡｂ力価」は、その標的のエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理学的効果を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ  Ｎａｂ）がどれだけ産生されたかを測定するものである。抗ＡＡＶ  ＮＡｂ力価は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１−３９０において記載されるように測定され得る。
【００５１】
アミノ酸配列の文脈における用語「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」は、一致についてアラインメントするときに同一である２つの配列中の残基を指す。タンパク質、ポリペプチド、約３２アミノ酸、約３３０アミノ酸の全長、もしくはそれらのペプチドフラグメントのアミノ酸配列、または配列をコードする対応する核酸配列について、パーセント同一性は容易に決定できる。好適なアミノ酸フラグメントは、少なくとも８アミノ酸の長さであり得、約７００アミノ酸までであり得る。一般的に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」を指すとき、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、アラインメントされた配列を参照にして決定される。「アラインメントされた」配列または「アラインメント」は、参照配列と比較して、欠損または追加の塩基またはアミノ酸の修正をしばしば含む多重の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アラインメントは、任意の様々な公的または商業的に利用可能な多重配列アラインメントプログラムを用いて実施する。例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」のプログラムのような配列アラインメントプログラムが、アミノ酸配列について利用可能である。一般的に、任意のこれらのプログラムが、デフォールトの設定で利用されるが、当業者は必要に応じてこれらの設定を変えることができる。代替的に、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムによって提供されるもののレベルの同一性またはアラインメントを少なくとも提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを使用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照。本明細書において使用されるとき、用語「作動可能に連結」は、対象の遺伝子と隣接する発現制御配列と、トランスまたは遠位において対象の遺伝子を制御するように作用する発現制御配列との両方を指す。
【００５２】
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、対象の遺伝子を含む発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされている合成または人工のウイルス粒子であって、ここで同様にウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされている任意のウイルスゲノム配列が複製欠損である、すなわちそれらが子孫ビリオンを生成することができないが、標的細胞に感染する能力を残しているものを指す。一実施形態において、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要なシグナルに隣接された対象の導入遺伝子のみを含む「弱いもの」であるように改変され得る）、これらの遺伝子は作製の間供給され得る。したがって、子孫ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要なウイルス酵素の存在下を除いて起こらないので、それは遺伝子療法における使用について安全であるとみなされる。
【００５３】
略語「ｓｃ」は、自己相補型を指す。「自己相補型ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二重鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計されている発現カセットを有するプラスミドまたはベクターを指す。感染の際、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つよりもむしろ、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分は、直接の複製及び転写の準備ができるまで、１つの二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を形成するよう会合する。例えば、Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照。自己相補型ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載され、その各々は参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【００５４】
タンパク質または核酸を参照して使用されるとき、用語「異種性」は、タンパク質または核酸が、自然において、互いに対して同一の関係が見出されない２つ以上の配列または亜配列を含むことを示す。例えば、新規の機能の核酸を作製するよう配置される無関係の遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸が、典型的に組換えて作製される。例えば、一実施形態において、核酸が、他の遺伝子からのコード配列の発現を誘導するよう配置される１つの遺伝子からのプロモーターを有する。したがって、コード配列を基準にして、プロモーターは異種性である。
【００５５】
タンパク質または核酸配列を参照して使用するとき、用語「外来性」は、異なる源、例えばＡＡＶ及びヒトタンパク質に由来する２つ以上の配列または亜配列を指す。
【００５６】
用語「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を指すことは注意されたい。そのようなとき、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用される。
【００５７】
単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく包包含的に解釈されるべきである。単語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」及びその変形は、包含的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書における様々な実施形態が、他の状況において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて提示されるが、関連する実施形態はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という言葉を用いて解釈され、記載される。
【００５８】
本明細書において使用されるとき、用語「約」は、他が特定されない限り、与えられる基準からの１０％の可変性を意味する。
【００５９】
本明細書において他が特定されない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的な用語は、当業者によって、及び本願において使用される用語の多くについての一般的な解説を当業者に提供する出版された文献を参照することによって、通常理解されるのと同一の意味を有する
【００６０】
ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ製剤
ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ製剤は、水性溶液に懸濁された有効量のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターを含む懸濁液である。ある実施形態において、懸濁液は、任意選択の界面活性
剤及び／または他の賦形剤と共に、緩衝食塩水を含む。緩衝食塩水は、典型的には、生理学的に適合可能な塩または塩の混合物を含み、例えばリン酸緩衝生理食塩水、塩化ナトリウム、またはそれらの混合物である。
【００６１】
一実施形態において、製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４に記載されるように、ｏｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるとき、例えば、約１×１０８ＧＣ／眼〜約７×１０１２ＧＣ／眼、または約５×１０９ＧＣ／眼〜約１×１０１１ＧＣ／眼、または約１０１０ＧＣ／眼または約を含み得る。
【００６２】
例えば、本明細書において提供されるとき、懸濁液はＮａＣｌとＫＣｌとの両方を含み得る。ｐＨは、６．５〜８または７．２〜７．６の範囲であり得る。ｐＨは、任意の好適な方法、例えば、ＵＳＰ＜７９１＞［米国薬局方協会、参照標準］を用いて評価できる。好適な界面活性剤、または界面活性剤の組み合わせは、ポロキサマー、すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（酸化エチレン）の親水性鎖に隣接されるポリオキシプロピレン（ポリ（酸化プロピレン））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ  １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールの中から選択できる。一実施形態において、製剤はポロキサマーを含む。これらのコポリマーは、３桁の数字が後に続く字「Ｐ」（ポロキサマーに対して）によって一般的に名付けられ、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子量をもたらし、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含量のパーセンテージをもたらす。一実施形態において、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の約０．０００５％〜約０．００１％までの量で存在し得る。一実施形態において、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＭ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４に記載されるように、ｏｑＰＣＲまたはデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定されるとき、少なくとも１×１０１１またはそれ以上のゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ、例えば約１×１０１３ＧＣ／ｍＬを含む懸濁液である。一実施形態において、ベクターは、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．００１％のポリオキサマー１８８を含むｐＨ７．３の水性溶液中に懸濁される。製剤は、ヒト対象における使用に好適であり、網膜下に投与される。
【００６３】
空のカプシドが、患者に投与されるＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの用量から除去されることを確実にするために、ベクター精製プロセスの間に、空のカプシドをベクター粒子から分離する。一実施形態において、パッケージングされたゲノムを含むベクター粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７６、及びその優先権書類である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号及び、２０１５年１２月１１日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶ８」と題する同第６２／２６６，３４１号に記載されるプロセスを用いて空のカプシドから精製される。手短に、ｒＡＡＶ作製細胞培養の清澄にし、濃縮された上清から、ゲノム含有ｒＡＡＶベクター粒子を選択的に捕捉及び単離する２ステップの精製スキームが記載される。プロセスは、高塩濃度で実施する親和性捕捉法、続いて高ｐＨで実施するアニオン交換樹脂法を用い、ｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子をもたらす。
【００６４】
一実施形態において、使用されるｐＨは、１０〜１０．４（約１０．２）であり、ｒＡＡＶ粒子がＡＡＶ８の中間体から、少なくとも約５０％〜約９０％精製されるか、または１０．２のｐＨであり、ＡＡＶ８の中間体から約９０％〜約９９％精製される。一実施形態において、これはゲノムコピーによって測定される。ストック中のｒＡＡＶ８粒子は、ストック中のｒＡＡＶ８の少なくとも約７５％〜約１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％であるとき、かつ「空のカプシド」が、ストックまたは製剤中のｒＡＡＶ８の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満であるとき、ｒＡＡＶ８粒子（パッケージングされたゲノム）のストックまたは製剤は、ＡＡＶの空のカプシド（及び他の中間体）を「実質的に含まない」ものである。一実施形態において、製剤は、１未満、好ましくは０．７５未満、より好ましくは０．５未満、より好ましくは０．３未満の「空」の「完全」に対する比を有するｒＡＡＶストックを特徴とする。
【００６５】
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の平均収率は少なくとも約７０％である。これは、カラムに充填された混合物中の力価（ゲノムコピー）と最終的な溶離液中に存在する量とを測定することによって計算できる。さらに、これらは、本明細書において記載されるもの、または当該技術分野において記載されてきているもののような、ｑ−ＰＣＲ解析及び／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ技術に基づいて測定できる。
【００６６】
例えば、空及び完全な粒子の含量を計算するために、選択された試料に関するＶＰ３バンドの容量（例えば、イオジキサノール勾配精製調製物、ここでＧＣの数＝粒子の数である）が、充填されたＧＣ粒子に対してプロットされる。生じる線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）は、試験試料のピークのバンドの容量における粒子の数を計算するのに使用される。次いで、充填された２０μＬ当たりの粒子（ｐｔ）の数は、５０倍されて粒子（ｐｔ）／ｍＬをもたらす。ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬによって割ると、粒子のゲノムコピーに対する比（ｐｔ／ＧＣ）をもたらす。ｐｔ／ｍＬ−ＧＣ／ｍＬは空のｐｔ／ｍＬをもたらす。空のｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って×１００すると、空の粒子のパーセンテージをもたらす。
【００６７】
一般的に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを有するＡＡＶベクター粒子を分析する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０；Ｓｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照。変性カプシドについて試験するために、方法は、処理したＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することのできる任意のゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、例えば、緩衝液中に３〜８％のトリス酢酸塩を含む勾配ゲルに供することと、次いで試料物質が分離するまでゲルを泳動することと、ゲルをナイロンまたはニトロセルロースの膜上、好ましくはナイロンにブロットすることとを含む。次いで、変性カプシドタンパク質に結合する抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体が、一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体との結合を検出するための手段を含む二次抗体、より好ましくは、それに共有結合した検出分子を含む抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体が使用される。結合を検出する方法は、一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に測定するために使用され、好ましくは、放射性同位体放出、電磁放射、または比色変化を検出することのできる検出方法であり、最も好ましくは、化学発光検出キットである。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、カラム画分からの試料を採取でき、還元剤（例えばＤＴＴ）を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中で加熱でき、カプシドタンパク質は、プレキャストの勾配
ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で分析される。製造者の取扱説明書に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いる銀染色を実施してもよい。一実施形態において、カラム画分におけるＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈してＤＮａｓｅ  Ｉ（または別の好適なヌクレアーゼ）によって切断して外来性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの不活化後、試料をさらに希釈して、プライマーとプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅する。所定のレベルの蛍光に到達するのに必要とされるサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて各々の試料について測定される。ＡＡＶベクターに含まれるものと同一の配列を含むプラスミドＤＮＡは、Ｑ−ＰＣＲ反応において標準曲線を作成するのに利用される。試料から得られるサイクル閾値（Ｃｔ）の値は、それをプラスミド標準曲線のＣｔ値に対して標準化することによって、ベクターゲノムの力価を測定するのに使用される。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイもまた使用できる。
【００６８】
一態様において、広域スペクトラムのセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販されているものなど）を用いる最適化されたｑ−ＰＣＲ法が本明細書において提供される。より詳細には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ  Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈してプロテイナーゼＫによって処理し、続けて熱不活化することを除いて標準的なアッセイと同様である。好適な試料は、試料サイズと同量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈する。プロテイナーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮されていてもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであり、０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般的に約５５℃において１５分間で実施されるが、より低い温度（例えば約３７℃〜約５０℃）でより長い時間（例えば約２０分間〜約３０分間）を超えて実施してもよく、またはより高い温度（例えば約６０℃まで）でより短い時間（例えば約５〜１０分間）で実施してもよい。同様に、熱不活化は一般的に約９５℃で約１５分間であるが、温度はより低く（例えば約７０〜約９０℃）てもよく、延長した時間（例えば約２０分間〜約３０分間）である。次いで、試料は希釈され（例えば１０００倍）、標準アッセイに記載されるようなＴａｑＭａｎ解析に供される。
【００６９】
さらに、または代替的に、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用できる。例えば、一本鎖及び自己相補型のＡＡＶベクターゲノム力価をｄｄＰＣＲによって測定する方法は記載されてきている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４を参照。
【００７０】
製造
ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターは、図９に示されるフローチャートに示されるように製造できる。手短に、細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）は、好適な細胞培養系において増殖され、ベクター生成のためにトランスフェクトされる。次いで、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターは、採取され、濃縮され、精製され、バルクベクターを調製することができ、次いでこれは、下流のプロセスにおいて充填され、完成される。本明細書において記載される遺伝子療法ベクターを製造する方法は、遺伝子療法ベクターの作製に使用されるプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製などの当該技術分野において周知の方法を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子療法ベクターはＡＡＶベクターであり、生成されるベクターは、ＡＡＶゲノム及び対象の遺伝子をコードするＡＡＶシスプラスミド、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランスプラスミド、ならび
にアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡの細胞へのトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培地の採取などの方法のステップを含み得る。採取されたベクター含有細胞及び培地は、粗細胞採取物として本明細書において言及される。
【００７１】
その後、粗細胞採取物は、ベクター採取物の濃縮、ベクター採取物の透析ろ過、ベクター採取物の顕微溶液化、ベクター採取物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化中間体のろ過、クロマトグラフィーによる精製、超遠心分離法による精製、タンジェント流ろ過による緩衝液交換、ならびにバルクベクター調製のための製剤化及びろ過のような方法のステップに供し得る。
【００７２】
特定の実施形態において、遺伝子療法ベクターを製造するのに使用される方法は、本明細書の実施例に記載される。
【００７３】
患者集団
治療の候補である患者は、血管新生加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫（ＲＶＯ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、ＤＭＥを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病性網膜症を有するものを含む。これらの患者は、本明細書において記載されるようなＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ組成物による網膜下治療に特によく適している。
【００７４】
本明細書において記載されるようなＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの、例えば網膜下及び／または硝子体内投与を含む眼内投与のための候補である患者は、黄斑変性、血管新生／滲出型／滲出性加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫（ＲＶＯ）（網膜中心静脈閉塞（ＣＲＶＯ）及び網膜静脈分枝閉塞（ＢＲＶＯ）を含む）、網膜中心静脈／半側網膜静脈／網膜静脈分枝閉塞、網膜動脈閉塞、網膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、ＤＭＥを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ））、黄斑浮腫を伴わない糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症のための硝子体切除の前治療を含む）、活動性の高い光凝固化糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生、脈絡膜血管新生のまれな原因（色素線条、脈絡膜炎［眼のヒストプラスマ症に続発する脈絡膜炎を含む］、特発性変性近視、網膜ジストロフィー、虹彩血管新生、及び外傷）、特発性脈絡膜炎、角膜血管新生、未熟児網膜症、視神経乳頭灌流、後水晶体線維形成、網膜変性、硝子体黄斑牽引症候群、網膜剥離、糖尿病性牽引性網膜剥離、黄斑下血管新生色素上皮剥離、Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群、色素上皮剥離、色素上皮裂孔、増殖性硝子体網膜症、糖尿病性牽引性網膜剥離における硝子体網膜手術、ポリープ状脈絡膜血管症、点状脈絡膜内層症（ＰＩＣ）、多病巣性脈絡膜炎、中心性漿液性網脈絡膜症（ＣＳＣ）、匍行性脈絡膜炎、硝子体出血、硝子体出血に対する経毛様体扁平部硝子体切除術、活動性の高い血管結合組織増殖を伴う黄斑前出血、脈絡膜出血弱視、近視、近視性脈絡膜血管新生、高度近視における脈絡中心窩下／傍中心窩血管新生、脈絡膜悪性黒色腫、眼ヒストプラスマ症候群、テカルシトラント（ｔｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ）眼新血管新生（新生血管形成、結核、多巣性匍行性脈絡膜炎、ｈａｒａｄａトキソプラズマ症）、弾性線維性仮性黄色腫、遺伝性眼疾患、角膜内皮細胞減少、Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ症候群、前部虚血性視神経症、嚢胞様黄斑浮腫、難治性嚢胞様黄斑浮腫、特発性嚢胞様黄斑浮腫、特発性黄斑毛細血管拡張症、コーツ病（滲出性網膜炎もしくは網膜毛細血管拡張症としても知られるコーツ病）、緑内障、血管新生緑内障、ステロイド誘発緑内障、高眼圧症、緑内障手術、創傷治癒の制御、ブドウ膜黒色腫、ブドウ膜炎、放射線黄斑障害、模様ジストロフィー、放射線網膜症、放射線壊死、ヒッペル病、フォンヒッペル‐リンダウ症候群、眼内炎、視神経脊髄炎スペクトル障害、翼状片、原発性
翼状片（原発性翼状片手術のための補助的治療法を含む）、再発性翼状片、網膜ドルーゼン、眼腫瘍、眼球内黒色腫、白内障、角膜移植不全、線維柱帯切除術、脂肪性角膜症、全層角膜移植術、疱疹性角膜症、酒さ、網膜血管腫、腎血管性疾患、視覚障害、増殖性硝子体網膜症、虹彩血管新生（ＮＶ）、角膜ＮＶ、パンヌスを含む、毛様体扁平部炎サルコイド、またはイールズ病を有するものを含む。
【００７５】
ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ（抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物）による治療の候補である患者は、２４ＧｙＥプロトン、１６ＧｙＥ、キシロカイン、プロパラカイン、ヒドロクロリド、Ｔｅｔｒａｖｉｓｃ、Ａｃｕｖａｉｌ、Ｚｉｍｕｒａ、トリアムシノロンアセトニド、ラニビズマブ、またはＯｚｕｒｄｅｘとの組み合わせを含むが、これらに限定されないレジメンにおける治療の候補である。好適な適応症の例は、先行する段落にあるものを含む。例えば、１種以上の上に列挙される薬物を伴うＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを含む組み合わせレジメンは、滲出性加齢性黄斑変性、網膜中心静脈閉塞、特発性ポリープ状脈絡膜血管症、及び／または糖尿病性黄斑浮腫の治療に使用され得る。
【００７６】
本明細書に記載されるＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ組成物はまた、多くのがん、新生物、及びＶＥＧＦに関連する他の疾患における血管新生を阻止するのに有用である。そのような組成物は、例えばとりわけ、静脈内、病巣内、腫瘍または器官への直接的な送達を含む、任意の好適な経路で投与できる。そのような患者は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、副腎皮質癌、エイズ関連癌、カポジ肉腫、エイズ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、皮膚の基底細胞癌、膀胱癌、骨癌（ユーイング肉腫及び骨肉腫ならびに悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、心臓腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、子宮頸癌、小児にはまれながん、胆管細胞癌、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）、中枢神経系胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の線維性組織球腫、悪性骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、小児胃癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、小児中枢神経系胚細胞腫瘍、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、精巣癌、妊娠性絨毛性疾患、有毛状細胞性白血病、頭頚部癌、心臓腫瘍、肝細胞癌、組織球症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島腫瘍、膵内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、小児喉頭癌及び乳頭腫、白血病、口唇及び口腔癌、肝癌、肺癌（非小細胞及び小細胞）、小児肺癌、リンパ腫、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、黒色腫、眼球内黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、転移性癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中線癌、口こう癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成、骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、慢性（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、副鼻腔癌及び鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、口唇及び口腔癌ならびに中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵癌、膵内分泌腫瘍、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、再発癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、肉腫、小児横紋筋肉腫、小児血管腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、皮膚の扁平上皮癌、原発不明扁平上皮性頸部癌、転移性、胃癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌（腎臓（腎細胞）癌）、原発不明癌、小児原発不明癌、小児にはまれながん、尿管及
び腎盂、尿道癌、子宮内膜子宮癌、子宮肉腫、子宮平滑筋肉腫、腟癌、血管腫瘍、外陰癌、ウィルムス腫瘍及びその他の小児腎腫瘍、腹部腫瘍（腺癌、肝細胞、乳頭状漿液ミュラー、ラパチニブ、結腸直腸、卵巣、卵管、腹膜の癌／新生物／癌腫／腫瘍）、リンパ増殖性疾患、小腸癌、聴神経腫瘍（例えば、前庭神経鞘腫、神経線維腫症２型）、急性骨髄性白血病、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、頭頚部癌、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、肉腫、神経芽細胞腫、進行癌、女性性器の悪性新生物、転移性または切除不能な固形腫瘍、悪性星状細胞腫、結腸癌、転移性黒色腫、悪性腹水、腎細胞癌、神経膠芽腫、神経膠肉腫、結腸直腸癌の肝転移、進行性悪性腫瘍、骨髄腫、妊娠性トロホブラスト腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、類上皮性トロホブラスト腫瘍、胆道癌、悪性神経膠腫、子宮頸癌、子宮癌、中皮腫を有するものを含んでもよい。その候補は、前記組成物単独によって、または例えば、パクリタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、放射線、カペシタビン、イリノテカン、フルオロウラシル、塩酸ドキソルビシンリポソーム、塩酸エルロチニブ、塩酸イリノテカン、塩酸イリノテカン水和物（ＣＰＴ−１１）、塩酸ゲムシタビン、塩酸パゾパニブ、塩酸トポテカン、トリフルリジン／塩酸チピラシル、ペグ化リポソーム封入塩酸ドキソルビシン、塩酸エンザスタウリン、塩酸ミトキサントロン、塩酸エピルビシン、ドセタキセル、ゲムシタビン、エルロチニブ、シスプラチン、化学療法、セツキシマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ−セツキシマブ、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ＬＶ５ＦＵ２、シクロホスファミド、テモゾロミド、ペメトレキセド、レボホリナートカルシウム（ｌ−ＬＶ）、ロイコボリンカルシウム、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ６、ｍＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ドキソルビシン、リポソーム封入ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシンリポソーム、トシル酸ソラフェニブ、ソラフェニブ、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トラスツズマブ、エベロリムス、スニチニブ、デキサメタゾン、従来の手術、ゼローダ、放射線療法、テムシロリムス、パゾパニブ、ロイコボリン（ＬＶ）、ｌ−ＬＶ、アニツムマブ（ａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、エピルビシン、ベルテポルフィン、ＡＭＧ  ６５５、Ａｍｇｅｎ  ３８６、ＡＭＧ  ４７９、ＡＭＧ  ７０６、ＡＭＧ  ９５１、ＡＭＧ  １０２、ホリン酸、レボ−ホリン酸、エトポシド、ＢＡＹ  ４３−９００６、アテゾリズマブ、インターフェロンアルファ２ｂ、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ、γ−インターフェロン−１ｂ、光力学的治療、酒石酸ビノレルビン、ビノレルビン、トポテカン、タルセバ、ペメトレキセド二ナトリウム、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、イメテルスタットナトリウム、ＸＥＬＯＸ、ＲＡＤ００１、ペグフィルグラスチム、パクリタキセルアルブミン安定化小粒子製剤、イピリムマブ、定位放射線手術（ＳＲＳ）、定位放射線、オザルデックス、レトロゾール、ＡＧ−０１３７３６（アキシチニブ）、フィルグラスチム、クリゾチニブ、セジラニブマレイン酸塩、セジラニブ、ボルテゾミブ、アブラ��サン、ボリノスタット、ビンクリスチン、ＴＲＣ１０５、リツキシマブ、レゴラフェニブ、ペンブロリズマブ、メトトレキサート、イマチニブ、ハーセプチン、テセントリク、オキサリプラチン（ＯＸＡ）、ロムスチン、イクサベピロン、ＣＰＴ−１１、ＣＧＣ−１１０４７、酒石酸ビノレルビン、酒石酸塩、プレドニゾン、ニボルマブ、フルベストラント、エンザスタウリン、ドキシル、ＡＺＤ２０１４、ＡＺＤ２２８１、ＡＺＤ２１７１、ＡＺＤ４５４７、ＡＺＤ５３６３、ＡＺＤ８９３１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、バルプロ酸、マイトマイシンＣ、セジラニブマレイン酸塩、レナリドマイド、ラパチニブ、ＨＡＩアブラキサン、ＨＡＩイリノテカン、ＧＤＣ−０９４１、ＧＤＣ−０４４９、ＧＤＣ−０９８０、ビカルタミド、ＸＥＬＩＲＩ、バンデタニブ、サリドマイド、ラパマイシン、オラパリブ、ＮｏｖｏＴＴＦ１００Ａ、ナベルビン、ＭｅｔＭＡｂ、メシル酸イマチニブ（グリベック）、イホスファミド、ヒドロキシクロロキン、及びＧＭ−ＣＳＦであるが、これらに限定されない抗がん治療と組み合わせて治療される。
【００７７】
治療のためのさらに他の好適な状態は、例えば、血友病、滑膜炎、高血圧、ケロイド、炎症、放射線壊死、及び腫瘍性髄膜炎を含み得る。これら及び上述の状態は、網膜下また
は眼への投与のための別の型の投与が特定されている場合を除いて、任意の好適な経路によって送達され得る。
【００７８】
ある実施形態において、患者は、網膜下に投与される単一用量のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを投薬される。例えば、これは、血管新生加齢性黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫（ＲＶＯ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症（非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、ＤＭＥを有する患者における増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫を有する患者における糖尿病性網膜症の治療において特によく適している。
【００７９】
患者に投与されるｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの用量は、（ｏｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲによって測定されるとき）少なくとも１×１０９ＧＣ／眼〜１×１０１３ＧＣ／眼、または少なくとも１×１０１０ＧＣ／眼〜７．５×１０１２ＧＣ／眼である。しかしながら、他の用量も選択され得る。例えば、患者に対して治療的に有効なｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの網膜下の用量は、約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬ、好ましくは０．１〜０．１５ｍＬ（１００〜１５０μｌ）の範囲の注射容量において、約６．６×１０９ＧＣ／眼〜約６．６×１０１１ＧＣ／眼の範囲であり得、より好ましくは６．６×１０１０ＧＣ／眼である。さらに他の実施形態において、治療的に有効な濃度は、約１×１０５であってよく、濃度は１×１０５ＧＣ／μＬ〜１×１０９ＧＣ／μＬであり得、その範囲の任意のＧＣ濃度に対する注射容量は、１０μＬ〜３００μＬであり得る。
【００８０】
ある実施形態において、患者は、局所麻酔下で、網膜外科医による網膜下投与によってｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを投薬され得る。処置は、中心部硝子体切除術を伴う標準的な３ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み得、網膜下カニューレ（３６〜４１ゲージ）による網膜下腔への網膜下送達が後に続く。ある実施形態において、１００〜１５０ミリリットルのｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦが送達されるであろう。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、滲出型ＡＭＤまたは別の選択された障害の治療のための１種以上の療法と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦは、レーザー凝固法、ベルテポルフィンを伴う光線力学的治療、及び、硝子体内へのペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせて投与される。
【００８２】
ある実施形態において、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ療法のための患者は、従来の抗ＶＥＧＦ抗体（Ｆａｂ）治療に以前に反応しているものを含み得る。
【００８３】
本発明の遺伝子療法治療の目的は、網膜変性の進行を遅らせるか、または阻止すること、及び最小限の介入／侵襲的処置によって視力喪失を遅らせるか、または阻止することである。ある実施形態において、遺伝子療法治療の有効性は、標準治療、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射を用いる救援治療の排除またはその数の低減によって示され得る。
【００８４】
ある実施形態において、有効性は以下の１つ以上によって測定され得る：視覚変化、（ＢＣＶＡ）スコアによって測定される最良矯正視力、スネレンチャートまたは早期治療糖尿病性網膜症（ＥＴＤＲＳ）視力スコア、ＥＴＤＲＳによって測定される対象が喪失または獲得するパーセンテージ、遠方最良矯正視力、リーディング最良矯正視力、ＮＥＩ視覚機能アンケート−２５（ＶＦＱ−２５）スコアにおける変化、視覚関連の生活の質のアンケート、ペリーロブソンチャートによって測定されたコントラスト感度を含む視力、電子視力計における低コントラスト視力、ゴールドマン視野によって測定されるような周辺視野、ハイデルベルグスリットランプ光干渉断層写真術によって測定される角膜と虹彩の距
離及び線維柱帯と虹彩の距離、中心部及び中心傍の変視症、網膜感度（ｍｆＥＲＧ、Ｎｉｄｅｋ  ＭＰ−１マイクロ視野計測）を分析することによる加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の優先的超解像力視野計（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｈｙｐｅｒａｃｕｉｔｙ  Ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）（ＰＨＰ）試験、視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）、黄斑マッピング検査、網膜電図（ＥＲＧ）、パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）及び全視野（またはフラッシュ）網膜電図（ｆｆＥＲＧ）、多局所網膜電図（ｍｆＥＲＧ）、ｍｆＥＲＧ中心環振幅濃度を含む電気生理学的変化、３つの同心円状の輪（４°、８°、及び１２°）における平均網膜感度（ｄＢ）、視覚誘発電位（ＶＥＰ）：ＥＣＧパラメーターは、ＰＲインターバル、ＱＲＳインターバル、及びＦｒｉｄｅｒｉｃｉａの公式を用いる補正ＱＴインターバル（ＱＴｃＦ）を含む。ＮＶＥ（網膜血管新生）、ＣＮＶＭ（脈絡膜血管新生膜）の退縮、黄斑の容積、黄斑の厚さ、中心部黄斑亜領域の厚さ、網膜の容積（内部網膜容積及び外部網膜容積）、網膜の厚さ、中心部網膜の厚さ、中心部亜領域の網膜の厚さ（ＣＳＲＴ）、中心窩下網膜の厚さ（ＳＲＴ）、中心窩の厚さ、中心窩無血管域最大径、網膜層の完全性、外境界膜（ＥＬＭ）の完全性、楕円体線／バンドの完全性、レンズの状態、レンズの不透明度を含む光干渉断層写真術（ＯＣＴ）を用いて測定される変化、光干渉断層血管撮影（ＯＣＴＡ）によって測定される新血管膜の退縮パーセンテージ、中心窩を中心とする１ｍｍにおける内部／外部セグメント層の光受容体の完全性の度合いを含む解剖学的変化。任意選択で、治験の間、ＡＭＤ損傷サイズ及び漏出が蛍光眼底造影によるものであり得、蛍光眼底造影（ＦＡ）及びインドシアニングリーン眼底造影（ＩＣＧ）による全損傷サイズ及びＣＮＶ（脈絡膜血管新生）サイズ、網膜下液または出血を含み得る活性ＣＮＶ漏出、漏出の面積、黄斑漏出の面積、損傷出血のパーセンテージの変化、ドルーゼンサイズの変化、液体の量、網膜内嚢胞様変化（ＩＲＣ）容積、血管密度、網膜内／網膜下液の存在、網膜下液（ＳＲＦ）の高さ及び径、網膜内液の容積、前眼房反応、脈絡網膜還流（ＩＣＧ）、眼底撮影法（ＦＰ）及び／または眼底自発蛍光（ＡＦ）によって検出されるような地図状萎縮（ＧＡ）の進行、毛細管閉塞の存在及び拡張、周辺部網膜虚血、マイクロ視野測定を用いる黄斑感度、虹彩の血管新生、角の血管新生、糖尿病性網膜症であり得る。
【００８５】
ある実施形態において、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの網膜下及び／または網膜内注射は、ａＶＥＧＦを含まない血漿及び血清のレベルをもたらす。
【００８６】
ある実施形態において、有効性は、ＢＣＶＡ（最良矯正視力）、眼圧、スリットランプ生体顕微鏡検査法、間接検眼鏡検査、ＳＤ−ＯＣＴ（ＳＤ−光干渉断層写真術）を測定することによって観察され得る。視力喪失、感染、炎症、及び網膜剥離を含む他の安全性に関わる現象の徴候もまた観察され得る。
【００８７】
ＳＤ−ＯＣＴは有用な非侵襲的インビボ断面網膜顕微鏡技術である。好適な装置は市販される。例えば、Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＯＣＴ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡを参照。手短に、この技術は、瞳孔を散大することによって実施され得る。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外（ＮＩＲ）反射率（ＲＥＦ）及び／またはＮＩＲ眼底自発蛍光（ＦＡＦ）によって、正面網膜イメージングを実施することができる。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る９ｍｍの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる３０×２５ｍｍのラスタースキャンを重ね合わせて実施することができる。パラメーターは必要により変更することができ、または同等であると判定された他の好適なパラメーターであってもよい。
【００８８】
網膜機能は、全視野網膜電図（ＥＲＧ）によって評価することができる。ＥＲＧは、光刺激に応答する網膜によって生成される集合電位である。通常、それは、角膜表面と接触する電極によって記録される。網膜電図は、国際臨床視覚電気生理学会（ＩＳＣＥＶ；ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，Ｄｏｃ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１５  Ｆｅｂ；１３０（１）：
１−１２．２０１５）が設定した推奨に従って実施できる。まとめると、網膜電図（ＥＲＧ）は、通常、全網膜細胞がフラッシュ刺激（暗順応の動物、中程度から強烈な閃光）に能動的に応答するときに生成する。２つの構成要素は以下のものである：・ａ波：フラッシュ後の最初の角膜陰性シグナル。起源：光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。・ｂ波：大部分がオン型双極細胞（光受容体下流の二次ニューロン）によって生成されるａ波の後に続く角膜陽性シグナル。以下に記載される実施例において、国際臨床視覚電気生理学会（ＩＳＣＥＶ）に従う標準及び追加プロトコールが使用された。しかしながら、これらのパラメーターは、必要により、または要求により、調整され得る。暗順応桿状体のＥＲＧ：刺激強度：０．０１〜０．０２ｃｄ  ｓ  ｍ−２応答：ｂ波のみ、ａ波はなし。源：桿状体「オン型」双極細胞（桿状体からの入力に駆動される二次ニューロン）。意味：桿状体機能の測定。暗順応標準的なフラッシュＥＲＧ：刺激強度：３ｃｄ  ｓ
ｍ−２応答：桿体錐体のａ波とｂ波の混合；６０％〜７０％のシグナルは、桿状体駆動経路によって生成される。源：光受容体、桿状体と錐体の両方（ａ波）；桿状体と錐体の両方によって駆動される高次ニューロン。意味：大部分の桿状体の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗いフラッシュ」応答よりも低い可変性である。暗順応明るいフラッシュＥＲＧ：刺激強度：１０ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答及び意味：「標準的なフラッシュ」の応答についてと同一であるが、明るいフラッシュへの応答は、規模がより大きく、より可変性が低くあり得る。明順応標準的なフラッシュ錐体ＥＲＧ：刺激強度：５分間の明順応の後、３０ｃｄ  ｍ−２のバックグランド光の存在下で送達される３ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答：錐体駆動経路によって生成されるａ波及びｂ波。意味：錐体を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ＥＲＧが錐体及び錐体駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体の機能を測定する。明順応明るいフラッシュ錐体ＥＲＧ（ＩＳＣＥＶ標準に対して追加して）刺激強度：５分間の明順応の後、３０ｃｄ  ｍ−２のバックグランド光の存在下で送達される１０ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答及び意味：錐体駆動ＥＲＧは「標準的な錐体ＥＲＧ」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により低い可変性である。ＥＲＧ測定（ａ波振幅、ａ波潜時、ｂ波振幅、ｂ波潜時）が、処理した眼及びコントロールの眼について平均及び標準偏差（ＳＤ）を用いてまとめられた。
【００８９】
有効性の別の測定は、網膜厚の喪失を含み得る。
【００９０】
以下の実施例に示されるように、１×１０１０ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＦＧベクターの投与は、網膜機能の障害をまったく引き起こさない。この用量は投与することのできる治療的な有効量についての限定ではない。
【００９１】
治療目的の測定
投与後の遺伝子療法ベクターの安全性は、ベクター投与の後３６ヶ月までの複数の時点において評価される、有害事象の数、身体診察において注目された変化、及び／または臨床検査パラメーターによって評価することができる。生理学的効果は、例えば約１日〜１週間で早く観察され得るが、一実施形態において、定常状態レベルの発現レベルは約１２週間までに到達する。
【００９２】
ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦ投与によって生じる改善／有効性は、約１２週、１２ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月または他の所望の時点での視力のベースラインにおける所定の平均変化として評価することができる。他の改善／有効性は、１２、２４、及び３６ヶ月で、スペクトル領域光干渉断層写真術（ＳＤ−ＯＣＴ）によって測定されるときの中心網膜厚のベースラインからの平均変化として評価することができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦによる治療は、視力のベースラインからの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦによる治療は、例えば、中心網膜厚の約５％、約１０％、
約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％またはそれ以上の減少をもたらす。他の実施形態において、中心網膜厚は安定であり、すなわち中心網膜厚における増加がまったくない。ある実施形態において、有効性の測定は、網膜厚の安定化、及び／または、滲出液及び／またはドルーゼンの安定化／減少を含む。
【００９３】
一実施形態において、発現は、投与後約８時間〜２４時間という早期に観察され得る。上述の１つまたはそれ以上の所望の臨床効果は、投与後数日間から数週間以内で観察され得る。
【００９４】
．
本発明は、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの網膜下投与が、網膜全体にわたる遺伝子導入をもたらし、かつ網膜全体にわたる、ならびに硝子体及び前房液中における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現をもたらすことを実証する以下の例によって示される。遺伝子導入が元の注射ブレブの外側を水平方向に拡散するが、それらの拡張された境界に閉じ込められたままであり、この注射の拡張領域（網膜中の注射部位において形成される「ブレブ」）の外側における遺伝子導入及び導入遺伝子発現を達成しなかったということを実証する従来技術の遺伝子療法の研究の観点から、この結果は驚くべきであり、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターの単一投与が（ｉ）結果として、経時的に消散するＶＥＧＦ阻害剤の高用量ボーラスの繰り返されるＩＶＴ投与と比較して性能が向上し得るような網膜全体にわたるＶＥＧＦ阻害剤の有効量の連続送達、ならびに（ｉｉ）患者に追加のリスク及び不便さを提示する繰り返される眼内注射の回避をもたらす点において、ｎＡＭＲ治療のための標準治療を超える利点をもたらす。各々の態様は、治療成績を改善し得る。
【実施例】
【００９５】
以下の略語は本明細書において使用される。ＡＡＶはアデノ随伴ウイルスを指す。ＡＣＦは前房液を指す。Ａｄ５はアデノウイルス５型を指す。ＡＥは有害事象を指す。ＡＭＤは加齢性黄斑変性を指す。ＢＣＡはビシンコニン酸を指す。ＢＣＶＡは最良矯正視力を指す。ＢＨはバルク採取物を指す。ＢＩはバルク原薬中間体を指す。ＢＰは塩基対を指す。ＣＢはトリβアクチンプロモーターを指す。ＣＢ７はＣＭＶエンハンサー（Ｃ４）とトリβアクチンプロモーターとのハイブリッドを指す。ＣＢＣは全血球計算を指す。ＣＩはトリβアクチンイントロンを指す。ＣＭＣは、化学、製造及び品質管理を指す。ＣＭＯは、医薬品製造受託機関を指す。ＣＭＶはサイトメガロウイルスを指す。ＣＮＶは脈絡膜血管新生を指す。ＣＳ−１０はＣｏｒｎｉｎｇ１０層ＣｅｌｌＳＴＡＣＫｓ（登録商標）プレートを指す。ｄｄＰＣＲは液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＤＬＳは動的光散乱を指す。ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地を指す。ＤＮＡはデオキシリボ核酸を指す。ＤＰは製剤を指す。ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫吸着検査法を指す。ＥＲＧは網膜電図を指す。ＥＬＩＳＰＯＴは酵素結合免疫スポットアッセイを指す。Ｆａｂは抗原結合フラグメントを指す。ＦＢＳはウシ胎仔血清を指す。ＧＣはゲノムコピーを指す。ｇはグラムを指す。ＧＬＰは医薬品安全性試験実施基準を指す。ＧＭＰは医薬品製造管理及び品質管理基準を指す。ＨＥＫ２９３はヒト胚腎臓細胞を指す。ＨＣＰは宿主細胞タンパク質を指す。ＨＳ−３６はＣｏｒｎｉｎｇ３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）を指す。ＩＣＨは、調和国際会議を指す。ＩＮＤは治験薬を指す。ＩＰは工程内を指す。ＩＴＲは末端逆位配列を指す。ＩＵは感染単位を指す。ＩＶは静脈内を指す。ＩＶＴは硝子体内を指す。ＫＤａはキロダルトンを指す。Ｋｇはキログラムを指す。ＬＯＱは定量下限を指す。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）は、ラニビズマブの商品名である。ＭＣＢはマスター細胞バンクを指す。ＭＥＤは最小有効用量を指す。μｌはマイクロリットルを指す。ｍＬはミリリットルを指す。Ｍｍはミリメートルを指す。ｍＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡを指す。ＭＳは質量分析を指す。Ｎｇはナノグラムを指す。ＮＨＰは非ヒト霊長類を指す。ＯＣＴは光干渉断層写真術を指す。ｏｑＰＣＲは最適化定量性ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＰＣＲはポリメラーゼ連鎖反応を指す。ＰＤは薬力学を指す。ｐｏｐＰＫは母集団薬物動態を指す。ＰＥＩはポリエチレンイミンを指す。ＰＫは薬物動態を指す。ＰＯＣは概念
実証を指す。ＰＲＮは必要に応じて（必要に応じて）を指す。ＱＡは品質保証を指す。ｑＰＣＲは定量的ポリメラーゼ連鎖反応を指す。ｒＡＡＶは組換えアデノ随伴ウイルスを指す。ＲＢＧはウサギβグロビンを指す。ＰＲＥは網膜色素上皮を指す。Ｓ−３６はＨＹＰＥＲｓｔａｃｋ（登録商標）３６層を指す。ＳＥＮＤは非臨床試験データ交換のための標準を指す。ＳＯＣは標準治療を指す。ＳＯＰは標準操作手順を指す。ＴＣＩＤ５０は５０％組織培養感染価を指す。ＴＴＦはタンジェント流ろ過を指す。μＬはマイクロリットルを指す。ＶＡは視力を指す。ＶＥＧＦは血管内皮増殖因子を指す。ＷＡＭＤは滲出型加齢性黄斑変性を指す。ＹＡＧはイットリウム・アルミニウム・ガーネットを指す。
【００９６】
実施例１：ヒト対象を治療する
この実施例は、血管新生（滲出型）加齢性黄斑変性（ｎＡＭＤ）を有する患者の遺伝子療法治療に関する。この実施例において、可溶性抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂタンパク質のコード配列を担持する複製欠損アデノ随伴ウイルスベクター８（ＡＡＶ８）である遺伝子療法ベクター、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦがｎＡＭＤを有する患者に投与される。遺伝子療法治療の目的は、網膜変性の進行を遅らせるか、または阻止すること、及び最小限の介入／侵襲的処置によって視力喪失を遅らせるか、または阻止することである。
【００９７】
Ａ．遺伝子療法ベクター
いくつかのｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ遺伝子療法ベクターの生成は、本明細書において実施例２に記載される。さらに、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターゲノムの略図は図１に示される。ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、ヒト抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）抗原結合抗体フラグメント（Ｆａｂ）の産生をもたらす導入遺伝子を含む非複製組換えＡＡＶ８ウイルスベクターである。遺伝子カセットは、ＡＡＶ２末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接される。カセットからの発現は、サイトメガロウイルス最初期エンハンサーとトリβアクチンプロモーターとのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターに駆動される。このプロモーターからの転写はトリβアクチンイントロンの存在により増強される。発現カセットのためのポリアデニル化シグナルはウサギβグロビン遺伝子に由来する。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列は、自己切断フリン（Ｆ）／Ｆ２Ａリンカーによって分離されている。フリン−Ｆ２Ａリンカーの組み込みは、およそ等量の重鎖と軽鎖とのポリペプチドの発現を確かなものとする。
【００９８】
最終産物は、ラテックスを含まないゴムストッパー及びアルミニウムフィリップオフ（ｆｌｉｐ−ｏｆｆ）シールによって封入されるＣｒｙｓｔａｒｌ  Ｚｅｎｉｔｈ（登録商標）バイアル中の製剤緩衝液中のＡＡＶベクター活性成分の凍結溶液として供給される。バイアルは−６０℃以下で保存される。
【００９９】
Ｂ．投薬及び投与経路
２５０μＬの容量のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦが治療の必要のある対象の眼内に網膜下送達を介して単一用量として投与される。対象は、３×１０９ＧＣ／眼、１×１０１０ＧＣ／眼、または６×１０１０ＧＣ／眼の用量を投薬される。
【０１００】
ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、局所麻酔下で網膜外科医による単一の網膜下送達によって対象に投与される。処置は、中心部硝子体切除術を伴う標準的な３ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み、網膜下カニューレ（３８ゲージ）による網膜下腔へのｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの網膜下送達が後に続く。送達は、硝子体切除装置によって自動化され、２５０μＬを網膜下腔に送達する。
【０１０１】
ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、滲出型ＡＭＤの治療のための１つ以上の治療法と組み合わせて投与することができる。例えば、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、レーザー凝固法、ベルテポルフィンを伴う光線力学的治療、及び、硝子体内へのペガプタニブ、ラニビズマブ、
アフリベルセプト、またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせて投与される。
【０１０２】
ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの投与後約４週間から開始して、患者は罹患した眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を投薬され得る。
【０１０３】
Ｃ．患者亜集団
好適な患者は以下のものを含み得る：
ｎＡＭＤの診断を有するもの；
抗ＶＥＧＦ療法に応答性のもの；
抗ＶＥＧＦ療法の頻繁な注射を必要とするもの；
５０歳以上の男性もしくは女性；
罹患した眼において２０／１００以下かつ２０／４００以上のＢＣＶＡ（６５以下かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字）を有するもの；
２０／６３以下かつ２０／４００以上の間のＢＣＶＡ（７５以下かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字）を有するもの；
罹患した眼においてＡＭＤに続発する中心窩下ＣＮＶの確定診断を有するもの；
以下の：１０ディスク領域未満の損傷サイズ（典型的なディスク領域は２．５４ｍｍ２）、損傷サイズの５０％未満の血液、及び／または瘢痕のようなＣＮＶの損傷特性を有するもの；
治療の前に８ヶ月（またな未満）の間、罹患した眼においてｎＡＭＤの治療のための抗ＶＥＧＦ剤の少なくとも４回の硝子体内注射を投薬され、ＳＤ−ＯＣＴ上において確認された解剖学上の応答を有しているもの；及び／または
罹患した眼においてＳＤ−ＯＣＴ上において実証された網膜下もしくは網膜内液の存在を有するもの。
治療前に、患者は、スクリーニングされ、以下の基準の１つ以上がこの治療法が患者に好適でないことを示し得る：
・ＡＭＤ以外の任意の要因に続発する罹患した眼におけるＣＮＶまたは黄斑浮腫；
・罹患した眼において、血液がＡＭＤ損傷の５０％以上を占めるか、または血液が１．０ｍｍ２を超えて中心窩の下に存在する；
・罹患した眼におけるＶＡの改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔；
・罹患した眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴；
・罹患した眼における進行した緑内障；
・罹患した眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置または評価の試験と干渉する可能性のある任意の状態；
・スクリーニング前の１２週間以内に罹患した眼における眼内手術の履歴（スクリーニング来院の前の１０週間を超えて実施される場合、イットリウム・アルミニウム・ガーネットの嚢切開は容認され得る）；
・スクリーニング前の６ヶ月以内に罹患した眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗ＶＥＧＦ療法以外の治験薬の履歴；
・スクリーニング時の罹患した眼におけるインプラントの存在（眼内レンズを除外する）
・スクリーニング前の５年以内に化学療法及び／または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴（局在する基底細胞癌は容認され得る）；
・網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有する任意の薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴；
・罹患した眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染；
・過去６ヶ月間の治療における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作；
・最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧（１８０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧［ＢＰ］、１００ｍｍＨｇを超える拡張期血圧）；
・眼の外科手術または治癒過程を妨げ得る任意の付随する治療；
・ラニビズマブもしくはその任意の成分に対する既知の過敏性またはｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦに類似する剤に対する過去の過敏性；
・研究者の意見における、被験者の安全性または試験への成功裏の参加を損なうであろう任意の重篤なまたは不安定な医学的または心理的状態；
・正常上限（ＵＬＮ）の２．５倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；
・対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りＵＬＮの１．５倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの３５％未満であることを示す分画したビリルビン；
・ＵＬＮの１．５倍を超えるプロトロンビン時間（ＰＴ）；
・男性の対象について１０ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン、女性の対象について９ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン；
・１００×１０３／μＬ未満の血小板；
・３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満の推定糸球体ろ過率（ＧＦＲ）。
疾患活動性について以下の１以上の救援基準が適用される場合、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの投与後約４週間から開始して、患者は罹患した眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を投薬され得る：
・スペクトル領域光干渉断層写真術（ＳＤ−ＯＣＴ）上での網膜液の蓄積と関連する（最良矯正視力［ＢＣＶＡ］当たり）５文字以上の視力喪失；
・ＳＤ−ＯＣＴ上での新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と関連した上昇；
・新規の眼の出血；
以下の所見セットの１つが発生する場合、研究者の裁量によりさらなる救援注射を延期することができる：
・ＳＤ−ＯＣＴによって評価されるとき、視力が２０／２０もしくはそれより良好であり、中心網膜厚が「正常」である、または
・２回の連続した注射の後で視力及びＳＤ−ＯＣＴが安定である。
・注射が延期される場合、視力またはＳＤ−ＯＣＴが上記の基準に従って悪化する場合、それらは再開される。
【０１０４】
Ｄ．治療目的の測定
主な治療目的は、網膜変性の進行を遅らせるかまたは阻止こと、及び視力喪失を遅らせるかまたは阻止することを含む。治療目的は、標準治療、例えば、ペガプタニブ、ラニビズマブ、アフリベルセプト、またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射を用いる救援治療の排除及びその数の低減によって示される。治療目的はまた、視力喪失の減少もしくは阻止及び／または網膜剥離の減少もしくは阻止によって示される。
【０１０５】
治療目的は、ＢＣＶＡ（最良矯正視力）、眼圧、スリットランプ生体顕微鏡検査法、間接検眼鏡検査、及び／またはＳＤ−ＯＣＴ（ＳＤ−光干渉断層写真術）を測定することによって決定される。特に、治療目的は、ＢＣＶＡの経時的なベースラインからの平均変化を測定することによって、ＢＣＶＡに基づいたベースラインと比較して１５文字以上の獲得もしくは喪失を測定することによって、経時的にＳＤ−ＯＣＴによって測定されるときのＣＲＴのベースラインからの平均変化を測定することによって、経時的なラニビズマブ救援注射の平均数を測定することによって、１回目の救援ラニビズマブ注射までの時間を測定することによって、経時的にＣＮＶにおけるベースラインからの平均変化ならびにＦ
Ａに基づいた損傷サイズ及び漏出領域を測定することによって、経時的に水性ａＶＥＧＦタンパク質のベースラインからの平均変化を測定することによって、血清及び尿中のベクター脱落分析を実施することによって、及び／またはｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦの免疫原性を測定することによって、すなわちＡＡＶに対するＮａｂを測定することによって、ＡＡＶに対する結合抗体を測定することによって、ａＶＥＧＦに対する抗体を測定することによって、及び／またはＥＬＩＳｐｏｔを実施することによって、決定される。
【０１０６】
治療目的はまた、眼底自発蛍光（ＦＡＦ）に基づく地図状萎縮の面積の経時的なベースラインからの平均変化を測定することによって、ＦＡＦによって地図状萎縮の新規領域の発生（ベースラインにおいて地図状萎縮のまったくない対象で）を測定することによって、ＢＣＶＡによるベースラインと比較して、それぞれ、５以上及び１０以上の文字の獲得または喪失をした対象の割合を測定することによって、前の年と比較して、救援注射における５０％の低減を有する対象の割合を測定することによって、ＳＤ−ＯＣＴ上での液体を含まない対象の割合を測定することによって、決定される。
【０１０７】
ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦ投与によって生じる改善／有効性は、約４週、１２週、６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月、３６ヶ月または他の所望の時点での視力のベースラインにおける所定の平均変化として評価することができる。ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦによる治療は、視力のベースラインからの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の増加をもたらし得る。改善／有効性は、４週、１２週、６ヶ月、１２ヶ月、２４ヶ月、及び３６ヶ月で、スペクトル領域光干渉断層写真術（ＳＤ−ＯＣＴ）によって測定されるときの中心網膜厚（ＣＲＴ）のベースラインからの平均変化として評価することができる。ｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦによる治療は、中心網膜厚のベースラインからの５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の増加をもたらし得る。
【０１０８】
実施例２  ＡＡＶ８．ＣＭＶ．ａＶＥＧＦの生成
本明細書において記載されるａｖＥＧＦベクターの各々は、各々がＩＬ２のリーダー配列を有する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の発現を駆動するプロモーターを含む発現カセットを含む。試験組成物（懸濁液）中のｒＡＡＶに担持されるベクターゲノム中のＦａｂコード配列は、同一であるように設計された。発現カセットは、５’のＡＡＶ２のＩＴＲ及び３’のＡＡＶ２のＩＴＲに隣接される。試験されるベクターゲノムの各々は、同一の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（以前はａＶＥＧＦ−ＡｒｇまたはａＶＥＧＦ−Ｒと呼ばれた）のコード配列バリアントを含む。ある実施形態において、発現するａＶＥＧＦ  Ｆａｂは均一集団である。ある実施形態において、発現するａＶＥＧＦ  Ｆａｂは、重鎖のカルボキシル末端における不均一性を有する。ＩＬ２−ａＶＥＧＦの重鎖及びＩＬ２−ａＶＥＧＦの軽鎖のオープンリーディングフレームは、重鎖と軽鎖の両方の等モル発現を促進するためにコードされたフリン切断部位／Ｆ２Ａリンカーによって分離された。これは、任意選択で０、１、２、３または４個のアミノ酸をそのカルボキシル末端に含むａＶＥＧＦ重鎖の発現をもたらす。そのカルボキシル末端におけるアルギニン、アルギニン−リジン、アルギニン−リジン−アルギニン、またはアルギニン−リジン−アルギニン−アルギニン。
【０１０９】
様々なコード配列は、ａＶＥＧＦｖ１、ｖ２などと呼ばれる。これらのベクターゲノムは、参照により組み込まれる配列表示に提示される。
【０１１０】
マウスにおける抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現のためのＡＡＶ２／８ベクター中の導入遺伝子カセットに含まれる以下の要素が評価された。
・７個の異なるプロモーター（９８匹のオスＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、ＡＡ２／８から発現される従来の抗体（Ｆ１６）を用いて評価された。Ｆ１６ｍＡｂの発現はヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質に対するＥＬＩＳＡによって測定された。
・２個の異なるリーダーペプチド（２８匹のオスＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現がＶＥＧＦに対するＥＬＩＳＡによって測定された。
・３個の異なる軽−重鎖分離因子（４２匹のオスＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が以下のベクターを用いて評価された。
【０１１１】
【表１】
2019518427.tif 000003
【０１１２】
・１３個の異なるコード配列（１８２匹のオスＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現がＶＥＧＦに対するＥＬＩＳＡによって測定された。
【０１１３】
ベクターがマウスの眼の網膜下腔に送達された。レポーター遺伝子の発現は酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。
【０１１４】
７個の異なるプロモーターが別の試験において評価された：３個のウイルス（サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］、チミジンキナーゼ［ＴＫ］、シミアンウイルス［ＳＶ４０］）、３個の非ウイルス（ホスホグリセリン酸キナーゼ［ＰＧＫ］、ヒト伸長因子−１α［ＥＦ１ａ］、ユビキチンＣ［ＵｂＣ」）、及び１個のハイブリッド（チキンβアクチン［ＣＢ７］）のプロモーター。
【０１１５】
２個の異なるリーダーペプチドはまた、リーダー配列（インターロイキン対セルピンのリーダー）を除いて、同一のベクター因子及び同一のコード配列、すなわちｖ３、を有するｒＡＡＶ８ベクターを用いて評価された。ＡＡＶ２／８＝導入遺伝子に隣接するＡＡＶ末端逆位配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド８型；ａｍｄ２０１Ｌｅａｄ＝ＩＬ２のリーダー配列と軽−重鎖の分離因子としてのフリンＦ２Ａとを有する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ；ａｍｄ２０１ａｌｔＬｅａｄ＝ＳＦ１のリーダー配列と軽−重鎖の分離因子としてのフリンＦ２Ａとを有する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ；ＣＢ７＝トリβアクチンプロモーター；ＣＩ＝キメライントロン；ｒＢＧ＝ウサギβグロビンポリアデニル化配列。
【０１１６】
３個の異なる抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの重鎖と軽鎖を分離する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列が別の試験において評価された。これらのＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ｃＭｙｃ、及び口蹄疫ウイルス１（ＦＭＤＶ１）に由来した。この試験において、ベクターは、軽鎖と重鎖の分離因子（ＥＭＣ、ＦＭＤＶ１、及びｃＭｙｃ）を除いて同一であった。ＡＡＶ２／８＝導入遺伝子に隣接するＡＡＶ末端逆位配列を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド８型；ａｍｄ２０１＝ＩＬ２のリーダー配列を有する抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂのコドンバリアント：ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター；ＥＭＣＶ＝脳心筋炎ウイルス；Ｆａｂ＝フラグメント抗原結合領域；ＦＭＤＶ１＝口蹄疫ウイルス１；ＩＲＥＳ＝配列内リボソーム進入部位；ＰＩ＝Ｐｒｏｍｅｇａイントロン；ＳＶ４０＝シミアンウイルスポリアデニル化配列。
【０１１７】
別の試験において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの１３個の異なるコード配列が評価された。全体のコード配列の分散は約２０％〜３０％の間であった。ベクターは以下の表に記載される。
【０１１８】
使用された異なるコード配列を有するベクター。発現カセットの配列番号は以下の表に提示される。
【０１１９】
【表２】
2019518427.tif 000004
全ての試験においてベクターはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で希釈され
た。
【０１２０】
動物は処理群に割り当てられ、右眼に１．００×１０９または５．００×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／眼のＡＡＶ２／８ベクターを投与された。左眼は未処理コントロールとして使用された。ベクターは、全量１μＬで網膜下投与された。
【０１２１】
Ａ．網膜下注射
網膜下注射は無菌技術及び滅菌した解剖器具を用いて実施された。動物をケタミン／キシラジンまたは３〜５％イソフルランで麻酔し、メロキシカムを投与した。動物を、注射する眼を視野下にして解剖顕微鏡下に置いた（１５倍の倍率を使用する）。耳側結膜をジュエラー鑷子でつかみ、ヴァナス虹彩切開剪刀の先端を用いて慎重に強膜まで切った。結膜の角膜周囲切開術を、剪刀の下側のへりを、切開を通じて導入し、結膜の上方と下方の両方に円周方向に延ばすことによって実施した。全ての結膜の破片を強膜の表面から注意深く除去した。角膜に隣接する結膜を鉗子でつかみ、眼球を回転させるよう牽引力をもたらし、最適な外科的露出を可能にした。３０  １／２ゲージの針を用いて、鈍端針が通過できるのに十分な大きさの小切開をもたらした。
【０１２２】
Ｈａｍｉｌｔｏｎ自動注射シリンジに設置した３３ゲージ鈍端針の先端が、眼球表面の接戦方向で切開に導入された。先端を約１ｍｍ進入させて、針を強膜の内部表面に沿って通過させた。３３ゲージの針は、強膜及び脈絡膜を通過し、次いで、網膜下腔で終了した。１μＬまでのベクターを送達した。処置が完了すると、抗生物質眼軟膏を眼に適用した。
【０１２３】
Ｂ．アッセイ方法
採取した眼を、ステンレス鋼ビーズならびに２００μＬのタンパク質溶解及び抽出緩衝液（ＲＩＰＡ）及びｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ錠剤（１錠剤／１０ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液）を含むカクテルを有する円錐管に眼球全体を入れることによってホモジナイズした。眼は、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）中で、少なくとも２分間、または完全にホモジナイズされるまでホモジナイズした。ホモジネートは、低温室内で４℃において１２０００ＲＰＭで２０分間遠心した。上清を新しいチューブに移し、分析アッセイで使用した。
【０１２４】
眼のホモジネート中のタンパク質濃度の測定
眼のホモジネート中のタンパク質濃度は、製造者の指示書に従ってＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。全ての試料の等量のタンパク質をＥＬＩＳＡで使用した。
【０１２５】
酵素結合免疫吸着検査法
９６ウェル丸底プレートを、２μｇ／ｍＬのＨＡ  Ａ−北京または１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦで４℃において一晩でコーティングした。コーティングの後、プレートを、４０５  ＴＳ  Ｗａｓｈｅｒ  （ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、２００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。プレートを、２００μＬ／ウェルの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温（ＲＴ）において１時間ブロッキングした。洗浄（記載したように）後、１００μＬ／ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、３７℃において１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄（記載したように）し、次いで１％ＢＳＡで、ＲＴにおいて１時間ブロッキングした。洗浄（記載したように）後、１００μＬ／ウェルの一次抗体を添加し、ＲＴにおいて１時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄（記載したように）し、１００μＬ／ウェルの二次抗体で、Ｒ
Ｔにおいて１時間インキュベートした。最終的な洗浄（記載したように）に続いて、１５０μＬ／ウェルの検出基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジを添加し、遮光してＲＴにおいて３０分間インキュベートした。反応を５０μＬ／ウェルの２ＮのＨ２ＳＯ４で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍ／５４０ｎｍの励起／発光で読んだ。
【０１２６】
以下の一次抗体を使用した：ＰＢＳ中で１：１００００希釈、予め吸着させた１．０ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ビオチン）（Ａｂｃａｍ  ０．５ｍｇ／ｍＬ）；ＰＢＳ中で１：５０００希釈、予め吸着させた０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ビオチン）（Ａｂｃａｍ，  １ｍｇ／ｍＬ）。以下の二次抗体を使用した：ＰＢＳ中で１：３００００希釈、１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン（ＨＲＰ）。
【０１２７】
統計学的分析
ＥＬＩＳＡのためのレポーター遺伝子の濃度の平均及び標準偏差の値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を用いて計算された。
【０１２８】
Ｃ．結果
７個の異なるプロモーターを有するＡＡＶ２／８ベクターは、ＦＩ６  ｍＡｂの発現について評価された。プロモーターＥＦ  １−αを使用したとき、ＦＩ６  ｍＡｂの発現は、いずれの動物においても観察されなかった。プロモーターＳＶ４０．ＰＩ、ＰＧＫ．ＰＩ、及びＴＫ．ＰＩを使用したとき、ＦＩ６  ｍＡｂの発現は低かった。プロモーターＣＭＶ．ＰＩ、ＣＢ７．ＣＩ、及びＵｂＣ．ＰＩは、ＦＩ６  ｍＡｂの最も高い発現を実証した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった（データはファイル上にあり）。２個の異なるリーダーペプチドを有するＡＡＶ２／８ベクターは、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現について評価された。ＳＦ２リーダーを有するリーダーペプチドａＶＥＧＦｖ７を使用したとき、低用量での抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現が、ＩＬ２リーダーを有するａＶＥＧＦｖ７と比較して、より高かかった。高用量において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は両方のリーダーペプチドについて同様であった。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった（データはファイル上にあり）。３個の異なる軽−重鎖分離因子を有するＡＡＶ２／８ベクターは、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現について評価された。ｃＭｙｃ軽−重鎖分離因子が使用されたとき、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現はいずれの動物においても観察されなかた。ＥＭＣＶとＦＭＤＶ１の軽−重鎖分離因子を有するとき、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは低レベルで発現した。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった（データはファイル上にあり）。
【０１２９】
１３個の異なるコード配列を有するＡＡＶ２／８ベクターは、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの導入遺伝子産物の発現について評価された。コード配列、ａＶＥＧＦｖ４、ａＶＥＧＦｖ５、ａＶＥＧＦｖ６、ａＶＥＧＦｖ７、ａＶＥＧＦｖ８、及びａＶＥＧＦｖ９が使用されたとき、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は低かった。コード配列、ａＶＥＧＦｖ１３、ａＶＥＧＦｖ１０、ａＶＥＧＦｖ１１、及びａＶＥＧＦｖ１２を有するとき、発現はより高かった。コード配列、ａＶＥＧＦｖ１、ａＶＥＧＦｖ２、及びａＶＥＧＦｖ３が使用されたとき、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は最も高かった。いずれの動物においても、未処理の左眼においては発現が観察されなかった（データはファイル上にあり）。
【０１３０】
各々のベクターは、同一の抗ＶＥＧＦの導入遺伝子産物をコードする。部分的にこれらの結果に基づいて、単一の複製欠損組換えＡＡＶ８．ａＶＥＧＦがさらなる開発のために選択された。この試験ベクターは、ＡＡＶ８カプシド、ならびにＡＡＶ２のＩＴＲがＣＢ７プロモーター、イントロン、上述されたようなコード配列から選択された抗ＶＥＧＦコ
ード配列、及びｒＢＧのｐｏｌｙＡ配列に隣接するベクターゲノムを有する。これは、他を具体的に特定した場合を除き、以下の実施例において試験ベクター（代替的に、ＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター）と呼ぶ。
【０１３１】
実施例３：非ヒト霊長類における薬物動態（ＰＫ）試験
マカクは、網膜疾患を研究することに関してヒトに最も近い種であるため、この試験においてはマカクを使用した。カニクイザル及びヒトは、中心窩を含む眼の同様の解剖学的構造を有する。眼の寸法は同等であり、相対的な網膜領域に基づいてヒトの用量を決定することが可能である。
【０１３２】
この試験は、臨床開発のためにＡＡＶ２／８ベクターを選択するため、ならびに、カニクイザルにおいてＡＡＶ２／８ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの毒性及び免疫原性を評価するために実施された。試験は進行中である。提示される結果は、１０ヶ月時点で集められたデータに基づく。ＡＡＶ２／８ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの毒性の評価が記載される。動物はＡＡＶ２／８ベクターを網膜下投与された。毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。ＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに関連した唯一の有害な所見は、１．００×１０１１ＧＣ／眼のＡＡＶ２／８ベクターを投与された動物のいくつかの眼においてスペクトル領域光干渉断層写真術によって観察された注射部位に局在する外顆粒層におけるいくらかの菲薄化であった。
【０１３３】
動物は４つの処理群に割り当てられた。動物は、１．００×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）／眼の単一用量のＡＡＶ２／８ベクターを全量１００μＬで各々の眼に投与された。ベクターは、両方の眼に網膜下（顕微鏡下でドーム型の網膜剥離／網膜ブレブの外観によって肉眼で確認された）に投与された。以下の表は試験ベクターを列挙する。
【０１３４】
【表３】
2019518427.tif 000005
【０１３５】
網膜下注射
網膜下注射のために、２時または１０時の位置で、硬膜切開によって導入された外套針を通して針を挿入した。硝子体を通して針を進め、後極において網膜を貫通した。顕微鏡での制御下で、１００μＬの試験試料を網膜下腔に注射した。これは、ドーム型の網膜剥離／網膜ブレブの外観によって確認された。最初の注射の試みが網膜剥離をもたらさなか
った場合、カニューレを網膜内の別の部位に移動させた。注射部位は、一時的な盲点をもたらしている可能性がある。注射した溶液は、網膜によって数時間以内で再吸収された。網膜剥離は周辺部網膜で生じ、永続的な失明をもたらさなかった。硬膜切開の部位は、吸収性縫合糸で縫合し、ＰｒｅｄＧ軟膏または同等物によって眼を手当した。結膜下ケナログまたは同等物を投与した。動物は毎日観察され、必要に応じて鎮痛剤を非経口投与した。硝子体の炎症が現れた場合、症状が解消するまで、動物を、局所アトロピン及びＰｒｅｄＧ軟膏または同等物によって処理した。
【０１３６】
前房液の採取
動物を麻酔し、それらの頭部を固定した。ベタジン５％消毒液とプロパラカインまたは同等物を各々の眼に適用した。前房へのアクセスを可能にするために、開瞼器を配置した。処置は、２７〜３０ゲージ皮下針を取り付けたツベルクリンシリンジによって実施した。眼は、鼻側結膜上の鉗子または綿棒で安定して保持された。針を、虹彩面の前方にあるパラリンバル（ｐａｒａｌｉｍｂａｌ）周辺の透明角膜を通って斜角上方に挿入した。眼に進入したら、サンプラーは注射器のプランジャーをゆっくりと引き戻して房水を吸引する。最大で１００μＬの前房液を採取した。前房液を抜くと、針を眼から引き戻した。前房液は、使用または貯蔵するまで湿潤氷上に置いた。処置の後、局所フルルビプロフェン、ＰｒｅｄＧ軟膏、及び抗生物質点滴薬を各々の眼に適用した。前房液を以下の試験日（時折、週末、祝日、またはスケジュールの問題のために調整された）において採取した。０、１５、２９、４３、５７、７１、８５、１２０、１４９、１８３、２１２、２４７、２７４、及び３０２。
【０１３７】
スペクトル領域光干渉断層写真術
網膜の構造（ミクロンレベルの分解能で）をＳＤ−ＯＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＯＣＴ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いるインビボで非侵襲的な断面網膜顕微鏡により評価した。瞳孔は、フェニレフリン２．５％及びトロピカミド１％で散大された。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外（ＮＩＲ）反射率（ＲＥＦ）、及び動物の部分集合においてＮＩＲ眼底自発蛍光（ＦＡＦ）によって、正面網膜イメージングを実施した。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る９ｍｍの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる３０×２５ｍｍのラスタースキャンを重ね合わせて実施した。Ａｌｅｍａｎ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００７  Ｏｃｔ；４８（１０）：４７５９−６５を参照。
【０１３８】
酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡは、本質的に、上でマウス試験について記載したように実施した。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現のために、９６ウェル丸底プレートを、１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦでコーティングした。プレートを４℃において一晩コーティングした。コーティングの後、プレートを、４０５  ＴＳ  Ｗａｓｈｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて、２００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−Ｔ）で５回洗浄した。プレートを、２００μＬ／ウェルの１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温（ＲＴ）において１時間ブロッキングした。洗浄（記載したように）後、１００μＬ／ウェルのサンプルを二重のウェルに充填し、３７℃において１時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを洗浄（記載したように）し、次いで１％ＢＳＡで、ＲＴにおいて１時間ブロッキングした。洗浄（記載したように）後、１００μＬ／ウェルの一次抗体を添加し、ＲＴにおいて１時間インキュベートした。次いでウェルを洗浄（記載したように）し、１００μＬ／ウェルの二次抗体で、ＲＴにおいて１時間インキュベートした。
【０１３９】
最終的な洗浄（記載したように）に続いて、１５０μＬ／ウェルの検出基質である３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジを添加し、遮光してＲＴにおいて３０分間インキュベートした。反応を５０μＬ／ウェルの２ＮのＨ２ＳＯ４で停止した。次いでプレートを、分光光度計であるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍ／５４０ｎｍの励起／発光で読んだ。以下の一次抗体を使用した：ＰＢＳ中で１：１００００希釈、予め吸着させた１．０ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ビオチン）；ＰＢＳ中で１：５０００希釈、予め吸着させた０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ビオチン）。以下の二次抗体を使用した：ＰＢＳ中で１：３００００希釈、１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン（ＨＲＰ）。
【０１４０】
前房液及び血液中の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度の平均及び標準偏差の値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を用いて計算された。
【０１４１】
Ａ  薬理学的結果
この実施例において、異なるプロモーター及びコード配列を有する４個のＡＡＶベクターが、上述のように評価された。ベクターは網膜下に投与された。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は、酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
【０１４２】
前房液における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現
全ての群の動物の前房液において、同様の発現動態が観察された（図３Ａ〜３Ｄ、図４Ａ〜４Ｄ）。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現の始まりは迅速であり、概して７日以内であった。定常発現レベルは１ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、２匹の動物を除いて全てが定常レベルで抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを発現し続けた。
【０１４３】
群２（図３Ｂ）の１匹の動物及び群５（図４Ａ）の１匹の動物が抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を喪失した。発現の喪失は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する抗体の出現と一致した。オスとメスとの間で、及び右眼と左眼との間で、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現の差異はまったく観察されなかった。
【０１４４】
概して、ＣＢ７．ＣＩプロモーターに制御されるベクター（図４Ａ〜４Ｄ）は、ＵｂＣ．ＰＩプロモーターで制御されるベクター（図３）よりも高いレベルで抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを発現した。ベクターＡＡＶ２／８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ３ａＶＥＧＦｖ３．ｒＢＧは、臨床開発のための最重要なベクターとして選択された。この選択は、導入遺伝子の発現レベル、ａＶＥＧＦｖ３コード配列についての相対発現レベルのマウスからカニクイザルへのより良好な移行可能性、及びＣＢ７．ＣＩプロモーターによって経験するより優れたレベルに基づいた。
【０１４５】
血液における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現
Ｌｕｃｅｎｔｉｓの単一のＩＶＴ注射を投与されたいくらかの患者において、ラニビズマブが血清で観察された（Ｘｕ，２０１３）。ＡＡＶ２／８ベクターの網膜下投与が抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
【０１４６】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現は、全ての動物の血液においてベースラインレベル近辺であった（図３Ａ〜３Ｄ、図４Ａ〜４Ｄ）。
【０１４７】
Ｂ．毒性学
ＡＡＶ２／８ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの毒性の評価はこのサブパートＢに記載される。動物はＡＡＶ２／８ベクターを網膜下投与された。毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術（ＳＤ−ＯＣＴ）、血液学、凝固、臨床化
学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。
【０１４８】
各々の処理群における各々の変数について、ウィルコクソンの順位和検定を用いて各々の時点での測定が、対応するベースライン値と比較された。ウィルコクソンの順位和検定は、２標本ｔ検定のノンパラメトリックな代替法であり、これは２標本からの観測が含まれる順位にのみ基づいている。それは小さな試料サイズを有するデータセットに好ましい検定である。統計学的有意性は、複数の検定について調整なしに０．０５レベルで宣言された。分析は「ｗｉｌｃｏｘ．ｔｅｓｔ」の機能でＲプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３．１；ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）を用いて実施された。
【０１４９】
試験は進行中である。提示される結果は、１０ヶ月までに集められたデータに基づく。この試験において死亡はまったくなかった。ＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに関連する有害な臨床観察は、いずれの動物においてもまったく注目されなかった。いずれの動物についても試験中の体重の臨床的に意味のある変化が観察されなかった。間接眼底検査の間に、ＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに関連する有害所見は、いずれの動物においてもまったく注目されなかった。
【０１５０】
スペクトル領域光干渉断層写真術
群６の全部で４匹の動物（８個の眼）がＳＤ  ＯＣＴで撮像された。中間用量レベルのＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター（１．００×１０１１ＧＣ／眼）を投薬された眼の注射された領域は、実施例７（特にサブパートＢ）に記載される、１．００×１０１０及び１．００×１０１２用量レベルと比較して中間の結果を示した。２匹の動物（動物Ｃ７１８９６及び動物Ｃ６５９３６）において、ＯＮＬのいくらかの菲薄化が観察された（データはファイル上にあり）。さらに、２匹の動物（動物Ｃ７４４２２及び動物Ｃ７４４１４）において、最小限の変化が観察された（データはファイル上にあり）。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。
【０１５１】
ＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに関連する所見は１０ヶ月で犠牲にした２匹の動物においてまったく観察されなかった。動物Ｃ６５９３６において、肝重量が観察され、それは顕微鏡的に局所性慢性グレード３の炎症であった。動物Ｃ７４４１４において、両側性のグレード３リンパ組織過形成が観察された。これらの所見はＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂと関連していなかった。１．００×１０１１ＧＣ／眼のＡＡＶ２／８ベクターの用量レベルにおいて、ＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに関連した唯一の所見は、動物Ｃ６５９２６の右眼のレンズの最小限の空胞化であった。動物Ｃ７４４１４において、血管周囲の単核性細胞が右の視神経の脈管構造の周辺に最小限浸潤することが観察された。同一の動物で、左眼において最小限の単核性細胞の結膜下の浸潤、及び右眼において最小限の血管周囲眼球外の単核性細胞の浸潤が注目された。
【０１５２】
ＡＡＶ２／８ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに関連した唯一の有害な所見は、１．００×１０１１ＧＣ／眼のＡＡＶ２／８ベクターを投与された動物のいくつかの眼においてＳＤ−ＯＣＴによって観察された注射部位に局在するＯＮＬにおけるいくらかの菲薄化であった。
【０１５３】
Ｃ．免疫学
この節において、ＡＡＶ２／８ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの免疫原性の評価が記載される。ベクターは、この実施例において上記されたように、網膜下に投与された。免疫原性は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体、ＡＡＶ８カプシドに対する中和抗体、ならびにＡＡＶ２／８ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する細胞免疫応
答の存在によって評価された。
【０１５４】
要約すると、群２及び群５の各々における１匹の動物が、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する抗体、ＡＡＶ８カプシドに対する高レベルのＮａｂ、及びＴ細胞応答を有した。両方の動物は抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を喪失していた。予め存在したＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂを有する動物は概して、予め存在したＮａｂを有さない動物と比べたとき、ＡＡＶ２／８ベクターの投与後に増加した応答を有した。約３００日の試験日で犠牲にしたいくらかの動物において、ＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂは、硝子体液に観察された。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する抗体及びＴ細胞応答は群６の動物においてまったく観察されなかった。群６の動物において、ＡＡＶ２／８ベクターの投与後に、ＮＡｂレベルの緩やかな変動のみが観察された。
【０１５５】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、ＡＡＶ２／８ベクターを投与された全ての動物において発現した（この実施例のパートＡ）。２匹の動物（動物Ｃ７４４４０及び動物Ｃ６８１２７）は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を喪失していた。発現の喪失は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する抗体の出現と一致した。
【０１５６】
全体として、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＩｇＭ及びＩｇＧのレベルは、前房液及び血清のベースラインレベル未満であった。いくらかの動物でいくつかの時点において、ベースラインレベルを超える増加が観察された。群２（動物Ｃ７４４４０）及び群５（動物Ｃ６８１２７）の各々における１匹の動物において、前房液の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＩｇＧのレベルが、約６ヶ月においてベースラインレベルを超えて増加した。その後、レベルは概して増加した。両方の動物において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＩｇＧが、血清のベースラインレベルを超えて増加した。これらのＩｇＧにおける増加は、抗ＶＥＧＦ
Ｆａｂの発現の喪失と一致した。重要なことに、群６の動物における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＩｇＭ及びＩｇＧは、試験の期間中、検出されなかったか、またはベースラインレベル未満であった。
【０１５７】
手短に、動物の免疫系は、導入遺伝子産物がヒト抗体であるという事実にもかかわらず、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物の局所的な発現の継続を許容した。
【０１５８】
ＡＡＶ８カプシドに対する中和抗体の存在
ＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂのベースラインレベルは、０日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は１：５希釈であり、５未満の力価を検出不能とみなした。１６匹の動物のうちの２匹（動物Ｃ６３１１６及び動物Ｃ６６１２２）において、血清中に予め存在するＮＡｂが観察されなかった。ＡＡＶ２／８ベクターの投与に続いてこれら２匹の動物におけるＮＡｂのレベルは、検出限界未満に維持されたか、または低かった。１６匹の動物のうちの１４匹において、予め存在するＮＡｂが観察された。これらの動物のうちの１１匹において、ＮＡｂのレベルは、試験を通して変動した。群２（動物Ｃ７４４４０）及び群５（動物Ｃ６８１２７）の各々の１匹の動物において、ＡＡＶ２／８ベクターの投与に続いてＮＡｂのレベルは、２か月において、それぞれ２５６及び１２８まで、２倍希釈で増加した。これらのＮＡｂにおける増加は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現の喪失と一致した。群２、３、及び５からの６匹の犠牲にした動物において、硝子体液におけるＮＡｂの存在が評価された。犠牲時に血清中のＮＡｂが検出不能であった２匹の動物（動物Ｃ６３１１６及び動物Ｃ６６１２２）において、ＮＡｂは犠牲時に硝子体液中に存在しなかった。残りの動物において、犠牲時のＮＡｂのレベルは、犠牲時の血清中のレベルと相関しなかった。群６における全ての動物において、予め存在するＮＡｂが観察された。これらの動物におけるＮＡｂのレベルは、試験を通じて緩やかに変動した。
【０１５９】
ＡＡＶ２／８ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対するＴ細胞応答
群２の１匹の動物（動物Ｃ７４４４０）において、単一の時点において上昇したＴ細胞応答が観察された。この動物において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する抗体、及びＡＡＶ８カプシドに対する中和抗体もまた観察された。この動物は抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を喪失していた。群５の１匹の動物（動物Ｃ６５８７３）において、ＡＡＶ８カプシドのプールＢペプチドに対する提示された持続したＴ細胞応答は、あらかじめ注射されたベースライン試料を含んで観察された。同一の動物は、ＡＡＶ２／８ベクターの投与後、最も高いレベルのＮＡｂを有した。同一の群の別の動物（動物Ｃ６８１２７）は、ＡＡＶ８カプシドの全てのペプチドプールに対するＴ細胞を生じたが経時的に持続されなかった。この動物は抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂに対する抗体及び２番目に高いレベルのＮＡｂを有した。動物は抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現を喪失していた。
【０１６０】
この他の導入遺伝子産物に対する持続したＴ細胞応答は観察されなかった。群６の動物において、持続したＴ細胞応答はまったく観察されなかった。
【０１６１】
実施例４  ＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦ及び抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物を評価するために有用な動物モデル
ＶＥＧＦトランスジェニックマウスは、滲出型ＡＭＤの動物モデルとして使用した。２種のそのようなモデルは、Ｒｈｏ／ＶＥＧＦマウスモデル及びＴｅｔ／オプシン／ＶＥＧＦモデルを含む。
【０１６２】
Ａ．Ｒｈｏ／ＶＥＧＦマウスモデル
Ｒｈｏ／ＶＥＧＦマウスは、ロドプシンプロモーターが光受容体におけるヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ１６５）の発現を駆動し、出生後１０日目から新しい血管が網膜の深い毛細血管床から発芽し、網膜下腔に向けて成長する、トランスジェニックマウスである。ＶＥＧＦの産生は、持続し、したがって新しい血管は成長し続け、拡張し、加齢性黄斑変性を有するヒトにおいてみられるものと同様の網膜下腔における大きな網を形成する。Ｔｏｂｅ，Ｔａｋａｏ，ｅｔ  ａｌ．”Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ
ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９．１（１９９８）：１８０−１８８を参照。
【０１６３】
酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を以下のように実施できる。手短に、プレートを１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦで４℃において一晩コーティングする。１％ＢＳＡをブロッキング緩衝液として使用し、ウェル当たり２００μＬで室温において１時間インキュベートする。試料を、ウェル当たり１００μＬで二重で充填し、３７℃で１時間インキュベートし、二次ブロッキング緩衝液のインキュベーションが後に続く。一次抗体は、ビオチン結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌであり、ウェル当たり１００μＬで室温において１時間インキュベートするよう放置される。二次抗体は、１：３０，０００希釈のストレプトアビジンであり、ウェル当たり１００μＬで充填し、室温において１時間インキュベートする。ＴＭＢ溶液を検出基質（０．１ＭのＮａＯＡｃクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、過酸化水素、１００×ＴＭＢストック）として使用し、ウェル当たり１５０μＬで充填し、遮光して室温において３０分間インキュベートする。５０μＬの停止溶液（２ＮのＨ２ＳＯ４）を各々のウェルに添加し、次いで、各々のプレートを４５０ｎｍ−５４０ｎｍで読んだ。
【０１６４】
このモデルと先行する実施例に記載されるような試験ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦとを用いて実施した１つの試験において、ＥＬＩＳＡの結果は以下のとおりであった：
【０１６５】
【表４】
2019518427.tif 000006
【０１６６】
【表５】
2019518427.tif 000007
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂレベルはｎｇ／眼で示される。
【０１６７】
Ｂ．Ｔｅｔ／オプシン／ＶＥＧＦマウスモデル
Ｔｅｔ／オプシン／ＶＥＧＦマウスは、飲料水中のドキシサイクリンを与えるまでは正常であるトランスジェニックマウスである。ドキシサイクリンは、非常に高い血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の光受容体における発現を誘導し、大規模な血管漏出をもたらし、誘導の４日以内にマウスの８０〜９０％において、全滲出性網膜剥離を現出させる。Ｏｈｎｏ−Ｍａｔｓｕｉ，Ｋｙｏｋｏ，ｅｔ  ａｌ．”Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ
ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｉｃｅ  ｃａｕｓｅｓ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ．”Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １６０．２（２００２）：７１１−７１９を参照。
【０１６８】
ＥＬＩＳＡは、この実施例のパートＡに記載されるように実施できる。このモデルと先行する実施例に記載されるような試験ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦとを用いて実施した１つの試験において、ＥＬＩＳＡの結果は以下のとおりであった：結果は以下の表に平均±標準偏差（Ｓｔｄ）として示される。
【０１６９】
【表６】
2019518427.tif 000008
【０１７０】
【表７】
2019518427.tif 000009
【０１７１】
Ｃ．他の動物モデル
滲出型ＡＭＤの他の動物モデルを使用した。レーザー外傷モデルにおいて、ブルッフ膜において損傷を誘導するために高出力、集束レーザーエネルギーが使用される。マトリゲル、ＶＥＧＦ、マクロファージ、脂質ヒドロペルオキシド、及び／またはポリエチレングリコールの網膜下注射は、滲出型ＡＭＤの病態である脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を誘導する。Ｐｅｎｎｅｓｉ，Ｍａｒｋ  Ｅ．，Ｍａｒｔｈａ  Ｎｅｕｒｉｎｇｅｒ，ａｎｄ  Ｒ
ｏｂｅｒｔ  Ｊ．Ｃｏｕｒｔｎｅｙ．”Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｇｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３３．４（２０１２）：４８７−５０９を参照。
【０１７２】
最適化されたｒＡＡＶ．ａＶＥＧＦベクターが生成され、希釈され、トランスジェニックマウスの眼の網膜下腔に先行する実施例に記載される用量で送達される。眼及び／または血漿におけるレポーター遺伝子、ＶＥＧＦ、及び抗ＶＥＧＦ抗体の発現は、先行する実施例に記載されるように、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ｄｄＰＣＲ、ｏｑＰＣＲ、ウェスタンブロット、及びＥＬＩＳＡによって測定された。網膜血管新生を評価するために電子顕微鏡及び免疫組織化学解析もまた実施された。網膜当たりの損傷の数、損傷当たりの面積、網膜当たりの血管新生面積、及び牽引網膜剥離の網膜の組織病理学的評価が定量化される。
【０１７３】
実施例５  カニクイザルにおける抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（導入遺伝子産物）の発現の評価
この試験は、カニクイザルにおける投与に続いて、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ（導入遺伝子産物）の発現を評価し、かつ抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂを発現するＡＡＶ８ベクターの毒性、免疫原性、及び生体内分布を評価するために実施された。この報告において、導入遺伝子産物の発現及びベクターの免疫原性が記載される。動物は、これらの実施例において記載されるようなＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦベクターまたはＦＦＢ−３１４（コントロール試料）を網膜下に投与された。前房液及び血液における導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。免疫原性は、投与の前後で、ＡＡＶ８カプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）の存在によって評価された。導入遺伝子産物は、ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現している。導入遺伝子産物は、血液において発現していない。ＮＡｂのレベルにおける増加は、１匹のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを投与された動物（Ｃ７３７２３）において観察され、この動物は予め存在するＮＡｂを有した。
【０１７４】
この試験における動物は、１．００×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）／眼の単一用量のＡＡＶ８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ３．ｒＢＧまたは製剤緩衝液、ＦＦＢ−３１４を投与された。
【０１７５】
ＡＡＶ８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｖ３．ＲＢＧ及びＦＦＢ−３１４は、１００μＬの全量で右眼において網膜下に投与された（顕微鏡下でドーム型の網膜剥離／網膜ブレブの外観によって肉眼で確認された）。
【０１７６】
動物はｗｗｗ．ｊａｍｅｓｔｅａｓｅ．ｃｏ．ｕｋ／ｔｅａｍ−ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いてランダム化された。ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ／を用いて４匹の動物のうち１匹がランダムで選択され、群２に割り得てられた。残りの３匹の動物は群１に割り当てられた。この試験のための群の設計及び用量レベルは、以下の表に提示される。
【０１７７】
【表８】
2019518427.tif 000010
【０１７８】
動物は７日の試験日で安楽死させた。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現及び／またはＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂの存在を決定するために、前房液及び血液の試料を採取した。
【０１７９】
先行する実施例に記載されるように網膜下注射は実施された。前房液の採取は先行する実施例に記載されるようであった。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェル丸底プレートが、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現のために１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦで、または抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＭ及びＩｇＧの発現のために０．５μｇ／ｍＬの市販の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂでコーティングされた。ＥＬＩＳＡの方法は、先行する実施例に記載されるとおりであった。
【０１８０】
以下の一次抗体を使用した：ＰＢＳ中で１：１００００希釈、予め吸着させた１．０ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ビオチン）；ＰＢＳ中で１：５０００希釈、予め吸着させた０．５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ビオチン）。以下の二次抗体を使用した：ＰＢＳ中で１：３００００希釈、１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン（ＨＲＰ）。
【０１８１】
中和抗体アッセイ
ＡＡＶ８カプシドに応答する中和抗体は以下のように分析された。ポリＤリシンコーティングされた９６ウェル黒色壁／透明底プレートは、１×１０５細胞／ウェルでヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を播種され（細胞プレートと呼ぶ）、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。次の日に、血清試料を５６℃で３０分間熱不活化した。熱不活化した試料及び組換えベクター（１×１０９ＧＣ／ウェルの、Ｐｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって提供されたＡＡＶ８．ＣＭＶ．ＬａｃＺ）を血清−ベクタープレートを構成するために使用した。組換えベクターを無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で希釈し、２倍系列希釈（１：５で開始）の熱不活化試料と共に３７℃で１時間インキュベートした。血清ベクタープレートと細胞プレートとを組み合せる前に、ＨＥＫ２９３細胞（ここで２×１０５細胞／ウェル）を野生型ＨＡｄＶ５（９０粒子／細胞）によって感染させ、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、血清−ベクタープレート及び細胞プレートを組み合せて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、等量の２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とＤＭＥＭを各々のウェルに添加し、組み合わせたプレートを３７℃でさらなる１８〜２２時間培養した。次の日に、組み合わせたプレートをＰＢＳで洗浄し、ＨＥＫ２９３細胞を溶解し、製造者の取扱説明書に従って溶解物を、哺乳動物βガラクトシダーゼ生物発光アッセイキットを用いて発色させた。コントロールとして、血清試料の代わりにマウス血清を使用した。生じる発光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３マイクロプレートルミノメーターを用いて測定した。生じるＮＡｂの力価は、マウス血清と比較して少なくとも５０％ベクターの形質導入を阻害する血清希釈として報告された。
【０１８２】
統計学的分析
前房液及び血液中の抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の濃度の平均及び標準偏差の値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を用いて計算された。
【０１８３】
結果
前房液における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物は、ＦＦＢ−３１４を投与された動物の前房液において発現していなかった。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物の右眼から採取した前房液において発現していた。左眼において発現はまったく観察されなかった。オスとメスの間で抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導
入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
【０１８４】
血液における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現
Ｌｕｃｅｎｔｉｓの単一のＩＶＴ注射を投与されたいくらかの患者において、ラニビズマブが血清で観察された（Ｘｕ，  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，５４：１６１６−２４（２０１３））。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの網膜下投与が抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。
【０１８５】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現は、ＦＦＢ−３１４を投与された動物及びＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターを投与された全ての動物の血液において、対応する注射前のレベルと比較して、非特異的なバックグランドレベル未満であった。
【０１８６】
ＡＡＶ８カプシドに対する中和抗体の存在
ＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂのベースラインレベルは、０日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は１：５希釈であり、５未満の力価を検出不能とみなした。
【０１８７】
【表９】
2019518427.tif 000011
注意：報告されるＮＡｂ力価の値は、相対発光単位（ＲＬＵ）がコントロールウェル（試料を含まない）と比べて５０％低減した血清の逆の希釈度である。検出限界は、試料の１：５希釈であった。
【０１８８】
ＦＦＢ−３１４を投与された動物は、ＡＡＶ８カプシドに対す予め存在するＮＡｂを有した（先行する表を参照）。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された１匹の動物（Ｃ７４４３１）は検出可能なＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂを有さなかった。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された２匹の動物（Ｃ７３７２３、Ｃ６５０２７）は、予め存在するＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂが観察され、７日目に持続した（先行する表を参照）。
【０１８９】
毒性は、臨床観察、体重、間接眼底検査、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見に基づいて評価された。この試験において死亡またはスケジュール外の犠牲はまったくなかった。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に関連する有害な臨床観察は、いずれの動物に対してまったく注目されなかった。いくらかの動物は、体重が安定したままであったために動物の福祉に影響を与えないで、間欠性の一過性の下痢を示した。いずれの動物についても試験中の体重の臨床的に意味のある変化が観察されなかった。間接眼底検査の間に、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたは抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に関連する有害所見は、いずれの動物においてもまったく注目されなかった。血液学的、凝固または臨床化学的パラメーターにおいて臨床的に意味のある変化は、いずれの動物においても観察されなかった。全ての動物において、全て
の臨床病理学的パラメーターが正常範囲にあった。動物Ｃ６４９５６及びＣ７４４３１において肉眼的な所見はまったく存在しなかった。Ｃ７３７２３の右腎及び左腎の表面は青白かった。Ｃ６５０２７の肝臓において巣状病変が存在した。結論として、主要な毒物学的所見は存在しなかった。
【０１９０】
実施例６〜１１における試験ベクターは、ｒＡＡＶ８．ＣＢ７．ＣＩ．ａＶＥＧＦｒｖ３．ｒＢＧである。
【０１９１】
実施例６  カニクイザルにおけるＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦベクターの発現
この試験は、カニクイザルにおいて、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物の発現を評価するため、ならびにＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦ及び抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物、及びＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの脱落の、毒性、免疫原性、及び正常な網膜機能に対する影響を評価するために実施された。試験は進行中である。
【０１９２】
実施例において上述されるＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦをこの試験において使用した。ベクターを０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に希釈する。コントロール試料として、ＦＦＢ−３１４（０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含むＤＰＢＳ）を使用した。試験は進行中である。提示される結果は、３ヶ月時点で集められたデータに基づく。
【０１９３】
マカクは、網膜疾患を研究することに関してヒトに最も近い種であるため、マカクを使用した。これらのサル及びヒトは、中心窩を含む眼の同様の解剖学的構造を有する。眼の寸法は匹敵するものであり、相対的な網膜領域に基づいてヒトの用量を決定することが可能である。
【０１９４】
この実施例における動物は、１．００×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／眼の単一用量のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ、または１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦもしくはＦＦＢ−３１４を投与された。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ及びＦＦＢ−３１４は、１００μＬの全量で右眼において網膜下に投与された（顕微鏡下でドーム型の網膜剥離／網膜ブレブの外観によって肉眼で確認された）。
【０１９５】
動物は、ｗｗｗ．ｊａｍｅｓｔｅａｓｅ．ｃｏ．ｕｋ／ｔｅａｍ−ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いてセット当たり４匹の動物の６セットにランダムに割り当てられた。セットに割り当てられた後、６セットの各々から４匹の動物のうちの１匹をｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ／を用いてランダムに選択し、それぞれの所与の投与日に、ＦＦＢ−３１４を投与される群に割り当てた（群２、４、６、８、１０、及び１２）。残りの３匹の動物を、１×１０１２ＧＣ／眼または１×１０１０ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを投与される群に割り当てた（群１、３、５、７、９、及び１１）。実施例６及び７に対する群の称号及び用量レベルは、以下に提示される。
【０１９６】
【表１０】
2019518427.tif 000012
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現を決定するために、前房液及び血液の試料を採取した。先行する実施例に記載されるように網膜下注射は実施された。
【０１９７】
Ａ．薬理学
提示される結果は、３ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現が記載される。
【０１９８】
１．方法
動物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４（コントロール試料）を網膜下に投与された。前房液及び血液における抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物の発現は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって測定され、これは上述の実施例に記載されるように実施された。
【０１９９】
２．薬理学的結果
（ａ）前房液における導入遺伝子産物の発現
導入遺伝子産物は、ＦＦＢ−３１４を投与されたいずれの動物の前房液においても発現していなかった。導入遺伝子産物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全
ての動物の前房液において発現していた。発現の始まりは迅速であり、概して７日以内であった。定常発現レベルは１ヶ月以内に達成された。最後に評価された時点まで、全ての動物が定常レベルで導入遺伝子産物を発現し続けた。しかしながら、抗導入遺伝子産物の全体の発現レベルは、１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された動物においてより高かった。オスとメスの間で導入遺伝子産物の発現の差異はまったく観察されなかった。
【０２００】
（ｂ）血液における導入遺伝子産物の発現
Ｌｕｃｅｎｔｉｓの単一のＩＶＴ注射を投与されたいくらかの患者において。ラニビズマブが血清で観察された（Ｘｕ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１３  Ｍａｒ  ５，５４（３）：１６１６−２４）。これらの実施例において記載されるＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの網膜下投与が抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の全身曝露をもたらすかどうかを見極めるために、その血清における濃度を測定した。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物の血液において、対応する注射前のレベルと比較して、非特異的なバックグランドレベル未満であった。
【０２０１】
３．結論
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物の前房液において発現していた。
【０２０２】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物の血液において発現していない。
【０２０３】
Ｂ．毒性学
この報告において、ＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの毒性の評価が記載される。動物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４（コントロール試料）を網膜下に投与された。毒性は、臨床観察、体重、眼圧、間接眼底検査、スペクトル領域光干渉断層写真術、血液学、凝固、臨床化学、及び肉眼病理所見、及び病理組織学的所見に基づいて評価された。
【０２０４】
眼圧はリバウンド眼圧測定（ＴｏｎｏＶｅｔ）を介して評価した。この方法は、使用が簡単であり局所麻酔を必要としない。リバウンド眼圧測定は、角膜に対して発射される小さなプラスチックの先端の金属プローブを磁化するための誘導コイルを用いることによってＯＰを推定する。プローブが装置にリバウンドして戻るとき、誘導電流を生成し、そこからＯＰを計算する。２回までのデータ読み取りを実施し、そこから平均ＯＰを決定し、結果の正確さが示された。装置の適用は、製造者の取扱説明書に従って実施した。
【０２０５】
網膜の構造（ミクロンレベルの分解能で）をＳＤ−ＯＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＯＣＴ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いるインビボで非侵襲的な断面網膜顕微鏡により評価した。瞳孔は、フェニレフリン２．５％及びトロピカミド１％で散大された。このイメージングシステムの走査型レーザー検眼鏡を使用して、近赤外（ＮＩＲ）反射率（ＲＥＦ）、及び動物の部分集合においてＮＩＲ眼底自発蛍光（ＦＡＦ）によって、正面網膜イメージングを実施した。スペクトル領域光干渉断層写真術スキャンは、中心窩を通る９ｍｍの長さの水平及び垂直断面、ならびにほぼ中間の領域に延びる３０×２５ｍｍのラスタースキャンを重ね合わせて実施した。
【０２０６】
唯一のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの関連した有害所見は、１．００×１０１２ＧＣ／眼の試験ベクターを投与された動物におけるスペクトル領域光干渉断層写真術によって観察された重大な網膜の菲薄化及び光受容体の喪失であった。
【０２０７】
Ｃ．網膜電図（ＥＲＧ）
このサブパートにおいて、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４（コントロール試料）を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図（ＥＲＧ）によって評価された。全視野ＥＲＧは、広く使用される網膜機能の電気生理学試験である。網膜電図は、光刺激に応答する網膜によって生成される集合電位である。通常、それは、角膜表面と接触する電極によって記録される。この試験における網膜電図は、国際臨床視覚電気生理学会（ＩＳＣＥＶ；ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ，  Ｄｏｃ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  ２０１５  Ｆｅｂ；１３０（１）：１−１２．  ２０１５）が設定した推奨に従って実施された。提示される結果は、３ヶ月時点で集められたデータに基づく。この報告において、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の正常な網膜機能に対する影響の評価が記載される。動物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４（コントロール試料）を網膜下に投与された。網膜機能は、全視野網膜電図によって評価された。要約すると、１．００×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの投与は網膜機能を損なわない。対照的に、１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの投与は網膜機能を損なう。
【０２０８】
１．網膜電図（ＥＲＧ）のパラメーター
網膜電図（ＥＲＧ）は、通常、全網膜細胞がフラッシュ刺激（暗順応の動物、中程度から強烈な閃光）に対し能動的な応答であるときに生成する。２つの構成要素は以下のものである：
・ａ波：フラッシュ後の最初の角膜陰性シグナル。起源：光受容体光電流、光受容体機能の最も直接的な特徴。
・ｂ波：大部分がオン型双極細胞（光受容体下流の二次ニューロン）によって生成されるａ波の後に続く角膜陽性シグナル。
この試験において、国際臨床視覚電気生理学会（ＩＳＣＥＶ）に従う標準及び追加プロトコールが使用された：
・暗順応桿状体のＥＲＧ：刺激強度：０．０１〜０．０２ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答：ｂ波のみ、ａ波はなし。源：桿状体「オン型」双極細胞（桿状体からの入力に駆動される二次ニューロン）。意味：桿状体機能の測定。データシートにおける称号：「薄暗いフラッシュ」
・暗順応標準的なフラッシュＥＲＧ：刺激強度：３ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答：桿体錐体のａ波とｂ波の混合；６０％〜７０％のシグナルは、桿状体駆動経路によって生成される。源：光受容体、桿状体と錐体の両方（ａ波）；桿状体と錐体の両方によって駆動される高次ニューロン。意味：大部分の桿状体の機能の測定、暗順応の状態に対して感度が低く、「薄暗いフラッシュ」応答よりも低い可変性である。データシートにおける称号：「標準的なフラッシュ」。
・暗順応明るいフラッシュＥＲＧ：刺激強度：１０ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答及び意味：「標準的なフラッシュ」の応答についてと同一であるが、明るいフラッシュへの応答は、規模がより大きく、より可変性が低くあり得る。データシートにおける称号：「明るいフラッシュ」
・明順応標準的なフラッシュ錐体ＥＲＧ：刺激強度：５分間の明順応の後、３０ｃｄ  ｍ−２のバックグランド光の存在下で送達される３ｃｄ  ｓ  ｍ−２。応答：錐体駆動経路によって生成されるａ波及びｂ波。意味：錐体を完全に非感光性にするバックグランド光の存在下で、ＥＲＧが錐体及び錐体駆動二次網膜ニューロンによって排他的に作成され、錐体の機能を測定する。データシートにおける称号：「標準的な錐体ＥＲＧ」
・明順応明るいフラッシュ錐体ＥＲＧ（ＩＳＣＥＶ標準に対して追加して）刺激強度：５分間の明順応の後、３０ｃｄ  ｍ−２のバックグランド光の存在下で送達される１０ｃ
ｄ  ｓ  ｍ−２。応答及び意味：錐体駆動ＥＲＧは「標準的な錐体ＥＲＧ」の場合のようであったが、より大きな規模であり、潜在的により低い可変性である。
【０２０９】
各々の処理（ＦＦＢ−３１４（ビヒクル）群、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター１．００×１０１０ＧＣ／眼群、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター１．００×１０１２ＧＣ／眼群）に対して、ＥＲＧ測定（ａ波振幅、ａ波潜時、ｂ波振幅、ｂ波潜時）が、処理した眼及びコントロールの眼について平均及び標準偏差（ＳＤ）を用いてまとめられた。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター（処理）眼とＦＦＢ−３１４（コントロール眼）との間のＥＲＧ測定を比較するため、及び注射後対注射前の比較のために、ペアｔ検定が使用された。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター１．００×１０１０ＧＣ／眼群対ＦＦＢ−３１４（ビヒクル）群、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター１．００×１０１２ＧＣ／眼群対ＦＦＢ−３１４（ビヒクル）群、及びＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター１．００×１０１２ＧＣ／眼群対ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター１．００×１０１０ＧＣ／眼群についてＥＲＧ測定を比較するために、２標本ｔ検定が使用された。ｔ検定は、標本サイズが小さいとき［Ｗｉｎｔｅｒ  ＪＣＦ．Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ  ｓｍａｌｌ  ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅｓ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．２０１３；１８（１０）。オンラインで入手可能：ｐａｒｅｏｎｌｉｎｅ．ｎｅｔ／−ｇｅｔｖｎ．ａｓｐ？ｖ＝１８＆ｎ＝１０］や、データが正規分布していないときでも適切である。Ｓｈｕｓｔｅｒ  ＪＪ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｌａｒｇｅ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ：  ｄｏ  ｔｈｅｙ  ｒｅａｌｌｙ  ｈｅｌｐ？  Ｓｔａｔｉｓｔ．Ｍｅｄ．２００５；２４：２４３１−２４３８；Ｇａｎｊｕ  Ｊ．Ｄ．“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｄｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｌａｒｇｅ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ：ｄｏ  ｔｈｅｙ  ｒｅａｌｌｙ  ｈｅｌｐ？”に対するコメントＳｔａｔｉｓｔ．Ｍｅｄ．２００６；２５：１７９８−１８００を参照。全ての統計学的分析はＳＡＳ  ｖ９．４（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）で実施され、０．０５以下の両側Ｐ値は統計学的に有意であるとみなされる。
【０２１０】
２．結果
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物において発現した（この実施例のパートＡの薬理学的結果を参照）。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４の投与に続いて３か月の網膜機能（注射後）を、処理された眼及び未処理の眼について投与前（注射前）の網膜機能と比較した。群８の動物は、ＦＦＢ−３１４の投与後の取得できないＥＲＧのためにデータ分析から排除された。
【０２１１】
【表１１】
2019518427.tif 000013
【０２１２】
ａ．処理群間の網膜機能の比較
処理した眼について、注射後の網膜機能は、低用量群（１．００×１０１０ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター）とＦＦＢ−３１４群との動物間で同等であった（先行する表を参照）。処理した眼について、高用量群（１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター）の動物における注射後の網膜機能は、ＦＦＢ−３１４群の動物と比較して有意に低減していた（先行する表を参照）。処理した眼について、高用量群の動物における注射後の網膜機能は、低用量群の動物と比較して有意に低減していた（先行する表を参照）。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、全ての群について、注射前と同等であった。
【０２１３】
ｂ．処理群内の網膜機能の比較
処理した眼について、低用量群及びＦＦＢ−３１４群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。処理した眼について、高用量群において、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと比較して低減していた。未処理の眼について、注射後の網膜機能は、対応する注射前のベースラインと同等であった。
【０２１４】
Ｅ．ウイルスの脱落
ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの脱落は、涙、鼻分泌物、血清、唾液、尿、及び糞便の試料中で導入遺伝子特異的配列を標的とする定量的ＰＣＲ解析によって測定された。試料は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４の投与の前後で採取された。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターＤＮＡは、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された動物から採取された多くの試料において容易に検出可能であった。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦのＤＮＡの存在は、用量依存的であり、一過性であり、経時的に低下した。
【０２１５】
Ｆ．免疫原性
この試験において、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の免疫原性が記載される。免疫原性は以下によって評価された：
・酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いる、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＭ及びＩｇＧ抗体の存在；
・ＮＡｂアッセイを用いるＡＡＶ８カプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）の存在；
・酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いる、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクター及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答。
【０２１６】
この実施例において上述されるように、動物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターまたはＦＦＢ−３１４（コントロール試料）を網膜下に投与された。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対する持続するＩｇＭ、ＩｇＧ、またはＴ細胞の応答は、いずれの動物においてもまったく観察されなかった。１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された動物は、１．００×１０１０ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された動物よりも高い、ＡＡＶ８カプシドに応答する中和抗体（ＮＡｂ）を生じた。ＮＡｂ応答は、予め存在するＮＡｂを有する動物においてより高かった。１．００×１０１２ＧＣ／眼の試験ベクターを投与された６匹の動物のうちの２匹において、少し増加したＡＡＶ８カプシドに対するＴ細胞応答が観察された。
【０２１７】
結果
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物は、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物において発現した（実施例６）。ＦＦＢ−３１４を投与された動物の血清または前房液において抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＭは多くは存在しなかった。ベースラインレベルを超える抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＧは、ＦＦＢ−３１４を投与された動物において観察されなかった。
【０２１８】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＭは、１．００×１０１０ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された１匹の動物の前房液においてベースラインレベルを超えた。しかしながら、血清においては対応する上昇が存在せず、したがってこの観察は、臨床的に意味はなかった。ベースラインレベルを超える抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＧは、この処理群において観察されなかった。
【０２１９】
ベースラインレベルを超える抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＭは、１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された１匹の動物の前房液において観察された。しかしながら、血清においては対応する上昇が存在せず、この観察は、臨床的に意味はなかった。ベースラインレベルを超える抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対するＩｇＧは、この処理群において、別の動物からの血清及び前房液において、ならびに第３の動物の前房液のみにおいて観察された。しかしながら、いずれの検出可能なＩｇＭが先行しなかったので、これらの観察は、臨床的に意味はなかった。これらの動物におけるＩｇＧの存在は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物の発現の喪失と関連しなかった。
【０２２０】
ＡＡＶ８カプシドに対するＮＡｂのベースラインレベルは、０日の試験日で採取した血液試料由来の血清中で測定された。検出限界は１：５希釈であり、５未満の力価を検出不能とみなした。
【０２２１】
ＦＦＢ−３１４が投与された６匹の動物のうちの４匹において、予め存在するＮＡｂが観察されなかった。９０日の試験日まで追跡された２匹の動物はＮＡｂを生じなかった。ＦＦＢ−３１４が投与された２匹の動物において、予め存在するＮＡｂが観察された。これら２匹の動物におけるＮＡｂのレベルは、試験中に２倍希釈系列において２未満で変動した。
【０２２２】
１．００×１０１０ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された９匹の動物のうちの２匹において、予め存在するＮＡｂが観察されなかった。９０日の試験日まで追跡された１匹の動物において、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの投与に続いてＮＡｂが観察されなかった。予め存在するＮＡｂを有する動物において、それらのレベルは、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの投与に続いて２倍希釈系列において４未満で増加した。
【０２２３】
１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された９匹の動物のうちの４匹において、予め存在するＮＡｂが観察されなかった。予め存在するＮＡｂの状態にもかかわらず、多くの動物において、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの投与に続いて２倍希釈系列で９までのＮＡｂ応答における増加が観察された。この応答は、９０日の試験日を通じて持続した。
【０２２４】
ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターに対するＴ細胞応答は、単一の時点で、ＦＦＢ−３１４を投与された１匹の動物において観察された。１匹の動物において、非特異的なＴ細胞応答が全ての時点において観察された。
【０２２５】
ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターに対する持続するＴ細胞応答は、１．００×１０１０ＧＣ／眼の試験ベクターを投与された動物において、観察されなかった。
【０２２６】
１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された６匹の動物のうちの４匹において、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターに対する低いレベルの免疫応答が観察された。低いレベルの免疫応答を有する４匹の動物のうちの２匹において、持続した（２回を超えて連続する時点）応答が観察された。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対する持続するＴ細胞の応答は、いずれの動物においても観察されなかった。
【０２２７】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物に対する持続するＩｇＭ、ＩｇＧ、またはＴ細胞の応答は、いずれの動物においてもまったく観察されなかった。
【０２２８】
１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された動物は、１．００×１０１０ＧＣ／眼の同一の試験ベクターを投与された動物よりも高い、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターに対するＮＡｂ応答を生じた。ＮＡｂ応答は、予め存在するＮＡｂを有する動物においてより高かった。１．００×１０１２ＧＣ／眼のＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された６匹の動物のうちの２匹において、少し増加したこのＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターに対するＴ細胞応答が観察された。
【０２２９】
実施例７  カニクイザルにおけるＡＡＶ２／８ベクターの網膜下投与に続く、ＡＡＶ２／８ベクターのｍＲＮＡ及び抗ＶＥＧＦフラグメント抗原結合の分布の評価
この試験は、ＡＡＶ２／８ベクターの網膜下投与に続く、実施例３、実施例５、及び実
施例６からの組織を用いて、ＡＡＶ２／８ベクターのｍＲＮＡの網膜の分布及び抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの眼全体にわたる分布を評価するために実施された。網膜の異なる部分におけるｍＲＮＡのレベルは、定量的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応及びインサイチューハイブリダイゼーションによって評価された。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度は、網膜の切片、前房液、及び硝子体液において酵素結合免疫吸着検査法によって測定された。
【０２３０】
ＡＡＶ２／８ベクターのｍＲＮＡは、網膜下投与に続き、網膜全体にわたって分布する。同様に、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、網膜全体にわたって分布し、硝子体と前房液の両方において検出される。
【０２３１】
【表１２】
2019518427.tif 000014
【０２３２】
網膜下投与の部位は、網膜ブレブによって示され、これはＳＤ−ＯＣＴによって可視化できる。全てのＳＤ−ＯＣＴの画像において、網膜ブレブは可視化されている。
【０２３３】
ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定される網膜におけるＡＡＶ２／８．ａＶＥＧＦ試験ベクターのｍＲＮＡのレベル
ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターのｍＲＮＡは、ＦＦＢ−３１４を投与された動物の網膜において検出されなかった。ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターのｍＲＮＡは、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターを投与された全ての動物の網膜において検出された。網膜下注射の部位を含む網膜の切片において最も高いｍＲＮＡのレベルが検出された。しかしながら、ＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターのｍＲＮＡは、注射ブレブの外側の切片においても検出された。これらの切片のｍＲＮＡレベルは、ブレブにおけるものよりも低かった。レベルは、注射ブレブに対して最も辺縁のセクションにおいて４ｌｏｇまで低かった。注射ブレブにすぐ隣接する切片において、ｍＲＮＡのレベルは中間であった。
【０２３４】
インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって決定される網膜におけるＡＡＶ２／８ベクターのｍＲＮＡの発現
ＩＳＨによって決定されるＡＡＶ２／８ベクターのｍＲＮＡの発現は、注射部位で高かった。網膜層内の形質導入された細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体、及び神経節細胞を含んだ。注射部位から離れるとき、ｍＲＮＡの発現は低く、注射部位から最も遠位の領域においてほとんど完全に消失した。
【０２３５】
前房液、硝子体、及び網膜における抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの濃度
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、ＡＡＶ２／８ベクターを投与された全ての動物の眼の網膜、硝子体、及び硝子体において発現していた（図６〜８）。硝子体における発現は、前房液おけるものよりも３〜９倍高かった。群５（図８）において１匹の動物（Ｃ６５８７３）を除いて、網膜部分における最大発現は、硝子体におけるものよりも１．２〜３．６倍高か
った。この濃度勾配は、恐らく抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの分布のメカニズムを反映している。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂは、形質導入された網膜によって硝子体に分泌され、次いで、硝子体から前房液へと分散する。注目すべきことは、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの網膜全体にわたっての発現は、ｍＲＮＡの発現よりも均一である。
【０２３６】
全体として、機能的なＡＡＶ２／８ベクターは、驚くべきことに、注射ブレブに限定される代わりに、形質導入した細胞によるベクターｍＲＮＡの発現によって証明されるように、網膜下投与に続き、網膜全体にわたって分布する。抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂはまた、驚くべきことに、注射ブレブに対して辺縁である網膜部分を含む網膜全体にわたって分布し、硝子体と前房液の両方において検出される。
【０２３７】
実施例８  抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物の組換えヒトＶＥＧＦに対する結合の親和性の測定
この試験は、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の産物の組換えヒトＶＥＧＦに対する結合の親和性を測定するために実施された。結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術に基づくＢｉａｃｏｒｅ  ３０００システムを用いて測定された。この技術は、全内部反射の条件下でセンサーチップに当たる平面偏光に基づいている。センサーチップ上の固相化したリガンド（例えばＶＥＧＦ）と相互作用する分子（例えば抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物）との相互作用は、平面偏光の反射率における変化を引き起こす。この変化は、リアルタイムでセンサーグラムによって、応答単位としてすぐに検出される（Ｄａｇｈｅｓｔａｎｉ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｍｉｒｒｏｒ，ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  ｇｒａｔｉｎｇ，ａｎｄ  ｄｕａｌ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１０；１０（１１）：  ９６３０−４６．）。抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物の結合のための平衡結合親和定数は、ラニビズマブの公開された範囲と一致する。
【０２３８】
実施例９  組織交差反応性試験
この試験の目的は、ヒト組織の選択されたパネル由来の組織学的に調製された凍結切片と共に免疫組織化学技術を用いて、スポンサーに提供された抗体ＦａｂフラグメントａＶＥＧＦ導入遺伝子産物の可能性のある交差反応性を評価することであった。
【０２３９】
抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ導入遺伝子産物（１ｍｇ／ｍＬ）（「試験産物」）及びラニビズマブ（０．９７ｍｇ／ｍＬ）をこの試験に使用した。天然ヒトＩｇＧ  Ｆａｂフラグメントタンパク質（「コントロール試料」）は、１４．６４ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で提供された。試験遺伝子産物の免疫組織化学的検出を促進するために、天然ヒトＩｇＧ  Ｆａｂフラグメントタンパク質及びラニビズマブをビオチンと結合した。それぞれのタンパク質濃度は、２．７９ｍｇ／ｍＬ、２．８８ｍｇ／ｍＬ、及び２．８９ｍｇ／ｍＬであった。試験のためのコントロール材料及びヒト組織からの凍結切片を調製した。組織生存性の評価は、ヒト組織のパネルが生存可能であることを示した。コントロール用量設定のスライド評価に続いて、以下の３つの濃度の試験導入遺伝子産物−ビオチン：５、２．５、及び１．２５μｇ／ｍＬ、ならびに以下の濃度のラニビズマブ−ビオチン：２．５μｇ／ｍＬが組織用量設定における使用のために選択された。組織用量設定において、特異的陽性染色が、試験された組織のいずれにおいても、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子産物−ビオチンまたはラニビズマブ−ビオチンにおいてまったく観察されなかった。全ての他の観察された染色は可変であり、非特異的であるとみなされた。
【０２４０】
この試験の条件において、試験導入遺伝子産物−ビオチン及びラニビズマブ−ビオチンの抗原特異的結合が、陽性コントロール材料（ヒト神経膠芽腫及びＶＥＧＦタンパク質スポット）において実証された。組織用量設定において試験された濃度において、天然ヒトＩｇＧ  Ｆａｂフラグメントタンパク質−ビオチンまたは抗体希釈物において同様の染色
がまったく観察されなかった。
【０２４１】
実施例１０  臨床治験
単一の網膜下投与の利点を提供し、それによって繰り返し注射の負担を低減するｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターがさらなる試験のために選択された。６ヶ月をこえて継続するＮＨＰにおける抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂの発現及びｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦベクターで処理されたＷＡＮＤの動物モデルにおける血管新生の低減が、前臨床試験において実証されてきており、網膜下注射の安全性が非ヒト霊長類において評価される。最初の臨床治験は、上述されるようなｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの単一の網膜下注射の後の安全性及び導入遺伝子の発現を評価する。網膜下に注射されると、これらのベクターは、抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂ遺伝子産物を放出し続け、血管新生シグナルを阻止し、それによって網膜をさらなる損傷から防御すると予想される。
【０２４２】
各々の用量コホートは３対象を含む。登録された最初の３対象は、最小の用量で開始し、各々の群は段階的に上昇する。各々の最初のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ投与の後、次の患者に投与する前に安全性のための４週間の観察期間がある。主要安全性評価項目はｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの投与後６週の時点である
【０２４３】
主要評価項目
処置後６週、２４週、６ヶ月及び１２ヶ月の眼及び非眼の安全性評価
【０２４４】
副次評価項目
・１０６週間を超える眼及び非眼の安全性
・水性ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦタンパク質の経時的なベースラインからの平均変化
・ＢＣＶＡの経時的なベースラインからの平均変化
・２６週、５４週、及び１０６週でのＢＣＶＡによるベースラインと比較して１５文字以上を獲得または喪失する対象の割合
・ＳＤ−ＯＣＴによって測定されるときのＣＲＴの経時的なベースラインからの平均変化・ラニビズマブ救援注射の経時的な平均数
・１回目の救援ラニビズマブ注射までの時間
・経時的な、ＣＮＶ及び損傷サイズならびにＦＡに基づく漏出領域におけるベースラインからの平均変化
・免疫原性測定（ＡＡＶ８に対するＮＡｂ、ＡＡＶ８に対する結合抗体、ａＶＥＧＦタンパク質に対する抗体、及び酵素結合免疫スポット［ＥＬＩＳｐｏｔ］）。
・血清及び尿におけるベクター脱落分析
【０２４５】
探索的評価項目：
・眼底自発蛍光（ＦＡＦ）による地図状萎縮領域における経時的なベースラインからの平均変化、ＦＡＦによる地図状萎縮の新しい領域の発生（ベースラインにおいて地図状萎縮がまったくない対象において）
・ＢＣＶＡによるベースラインと比較してそれぞれ１０文字以上を獲得または喪失する対象の割合
・前年と比較して救援注射における５０％の低減を有する対象の割合
・ＳＤ−ＯＣＴにおいてまったく液体を有さない対象の割合
【０２４６】
この試験のために、患者は血管新生加齢性黄斑変性（滲出型ＡＭＤ）の診断を有し、以下の基準に合致する必要がある。
組み入れ基準：
この研究に参加する資格を得るためには、対象は以下の基準の全てを満たす必要がある。１つ以上のこれらの基準はさらなる試験、及び他の集団の治療のために必要とされない
場合があることは理解されよう。
１．５０歳以上の男性もしくは女性；
２．各用量コホートのセンチネル対象は、試験する眼において２０／１００以下かつ２０／４００以上のＢＣＶＡ（６５以下かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字）を有する必要がある；
センチネル対象の評価に続いて、用量コホートにおける残りの対象は、２０／６３以下かつ２０／４００以上のＢＣＶＡ（７５以下かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字）を有する必要がある。
３．両方の眼が適格である場合において、研究者に決定されるとき、試験する眼は対象のより悪い目である必要がある。
４．試験する眼においてＡＭＤに続発する中心窩下ＣＮＶの確定診断を有する必要がある。
ａ．以下の：１０ディスク領域未満である必要のある損傷サイズ（典型的なディスク領域は２．５４ｍｍ２）、損傷サイズの５０％未満の血液、及び／または瘢痕のようなＣＮＶの損傷特性。
５．来院１の８ヶ月（または未満）前に、試験する眼においてｎＡＭＤの治療のための抗ＶＥＧＦ剤の少なくとも４回の硝子体内注射を投薬され、ＳＤ−ＯＣＴ上において確認された解剖学上の応答を有する必要がある。
６．試験する眼において来院１の時点でＳＤ−ＯＣＴ上において実証された網膜下もしくは網膜内液の存在を有する必要がある。
７．試験する眼において偽性（白内障手術後の状態）である必要がある。
８．全ての試験処置に従うことを自発的に受け入れることができ、試験の期間中対応可能でなければならない。
９．妊娠の可能性のある女性は、スクリーニング来院の時点で陰性の尿の妊娠検査を有するべきであり、８日目までに陰性の血清の結果を有するべきであり、試験中に追加の妊娠検査をする意思があるべきである。
１０．性的に活発な対象（女性と男性の両方）は、スクリーニング来院からベクター投与後２４週間まで、医学的に許容可能なバリアー避妊法（例えば、コンドーム、ペッサリー、または禁欲）を使用する意思があるべきである。この時点以降の避妊の停止は、主治医と話し合うべきである。
１１．署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
【０２４７】
除外基準：
以下の除外基準のいずれかに合致する対象は試験に参加する資格がない。これらの基準のいずれかまたは全ては、さらなる試験、及び他の患者集団の治療では含まれない場合があることは理解されよう。
１．ＡＭＤ以外の任意の要因に続発する試験する眼におけるＣＮＶまたは黄斑浮腫。
２．試験する眼において、血液がＡＭＤ損傷の５０％以上を占めるか、または血液が１．０ｍｍ２を超えて中心窩の下に存在する。
３．試験する眼におけるＶＡの改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
４．試験する眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
５．試験する眼における進行した緑内障。
６．研究者の意見において、試験する眼における対象のリスクを増加させる可能性があるか、試験期間中に視力喪失を阻止または治療する医学的または外科的介入のいずれかを必要とする可能性があるか、または処置または評価の試験と干渉する可能性のある任意の状態。
７．スクリーニング来院の前の１２週間以内に試験する眼における眼内手術の履歴。スクリーニング来院の前の１０週間を超えて実施される場合、イットリウム・アルミニウム・
ガーネットの嚢切開は容認される。
８．スクリーニング前の６ヶ月以内に試験する眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗ＶＥＧＦ療法以外の治験薬の履歴。
９．スクリーニング時の試験する眼におけるインプラントの存在（眼内レンズを除外する）
１０．スクリーニング前の５年以内に化学療法及び／または放射線を必要とする悪性腫瘍の病歴。局在する基底細胞癌は容認される。
１１．登録３０日以内または治験薬の半減期の５倍のいずれか長い方の期間内にいずれかの治験薬を投薬される。
１２．他のいずれかの遺伝子療法試験への参加。
１３．網膜毒性を引き起こすことの知られている治療法、または視力に影響を及ぼし得るかもしくは既知の網膜毒性を有する任意の薬物との併用療法、例えばクロロキンまたはヒドロキシクロロキンの履歴。
１４．試験する眼における外科手技と干渉し得る眼または眼周囲の感染；
１５．過去６ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
１６．最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧（１８０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧［ＢＰ］、１００ｍｍＨｇを超える拡張期血圧）。
１７．研究者の意見における、眼の外科手術または治癒過程を妨げ得る任意の付随する治療。
１８．ラニビズマブもしくはその任意の成分に対する既知の過敏性またはｒＡＡＶ８．ａＶＥＦＧ試験ベクターに類似する剤に対する（研究者の意見における）過去の過敏性。
１９．研究者の意見における、被験者の安全性または試験への成功裏の参加を損なうであろう任意の重篤なまたは不安定な医学的または心理的状態。
【０２４８】
ラニビズマブを投薬された後に試験を継続する基準
来院２において、対象は、ラニビズマブに対する最初の抗ＶＥＧＦ応答について評価される。対象はＳＤ−ＯＣＴとＢＣＶＡの両方を受け、それは、研究者によって来院１の値と比較される。
１．応答性（対象は試験を継続する）：応答性は、ＳＤ−ＯＣＴによる、５０ミクロンを超えるＣＲＴの低減、または液体における３０％を超える改善によって定義される。
２．非応答性（対象は早期撤退として試験から出る）：非応答性は、上述の基準に合致しないとして定義される。各々のコホートにおいて６までの対象のさらなる対象が登録され続け、単一用量のｒＡＡＶ８．ａＶＥＦＧ試験ベクターを投薬される。
この来院の時点において、中央検査室の結果がレビューされる。以下の値を有する全ての対象は撤退する：
３．正常上限（ＵＬＮ）の２．５倍を超えるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）。
４．対象が以前に知られているギルバート症候群の病歴を有していない限りＵＬＮの１．５倍を超える総ビリルビン、及び結合ビリルビンが総ビリルビンの３５％未満であることを示す分画したビリルビン。
５．ＵＬＮの１．５倍を超えるプロトロンビン時間（ＰＴ）。
６．男性の対象について１０ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン、女性の対象について９ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビン；
７．  １００×１０３／μＬ未満の血小板；
８．  ３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満の推定糸球体ろ過率（ＧＦＲ）。
【０２４９】
最初の試験において、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの網膜下送達の前の１４日の来院１において、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）０．５ｍｇを硝子体内注射によって投与する。ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、網膜外科医によって、局所麻酔下で網膜下投与により与えられる。処置は、中心部硝子体切除術を伴う標準的な３
ポートの経毛様体扁平部硝子体切除術を含み、網膜下カニューレ（３６〜４１ゲージ）による網膜下腔への単一の網膜下投与が後に続く。１００〜１５０マイクロリットルのｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦが送達される。患者は３、４、または５の用量の１を投薬される。３つの用量レベル：３×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／眼、１×１０１０ＧＣ／眼、及び６×１０１０ＧＣ／眼。疾患活動性について以下の１以上の救援基準が適用される場合、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ試験ベクターの投与後４週間から開始して、対象は試験する眼において、硝子体内ラニビズマブ救援治療を投薬され得る。スペクトル領域光干渉断層写真術（ＳＤ−ＯＣＴ）上での網膜液の蓄積と関連する（最良矯正視力［ＢＣＶＡ］当たり）５文字以上の視力喪失。ＳＤ−ＯＣＴ上での新規または持続する、網膜下または網膜内液の、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と関連した上昇。新規の眼の出血。
【０２５０】
以下の所見セットの１つが発生する場合、臨床医の裁量によりさらなる救援注射を延期することができる。ＳＤ−ＯＣＴによって評価されるとき、視力が２０／２０もしくはそれより良好であり、中心網膜厚が「正常」である、または視力及びＳＤ−ＯＣＴが２回の連続する注射の後で安定である。注射が延期される場合、視力またはＳＤ−ＯＣＴが上記の基準に従って悪化する場合、それらは再開される。
【０２５１】
実施例１１  用量段階的増加試験
このフェーズＩ、非盲検、多重コホート、用量段階的増加試験は、予め治療された血管新生ＡＭＤ（ｎＡＭＤ）を有する対象におけるｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ遺伝子療法の安全性及び忍容性を評価するよう設計される。これらの用量は約１８の対象において試験される。選択／除外基準に合致し、最初の抗ＶＥＧＦ注射に対する解剖学的な応答性を有する対象は、網膜下送達によって投与される単一用量のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを投薬される。ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦは、ＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦ活性を中和するモノクローナル抗体フラグメントをコードする遺伝子を含むＡＡＶ８ベクターを使用する。安全性は、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ投与後の最初の２４週間（最初の試験期間）を最初の焦点とする。ある実施形態において、試験は抗ＶＥＧＦ抗体、例えばラニビズマブを投与することを含み、応答性はＳＤ−ＯＣＴによって１週目（来院２）において測定される。抗ＶＥＧＦ抗体投与後、この治療に応答性である患者に対して、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを来院３（２週目）に投与でき、次いで安全性は、２６週（ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ投与後２４週）を通じて評価される。最初の試験期間の完了に続き、対象はｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦによる投与に続く１０４週まで評価され続ける。
【０２５２】
選択／除外基準に合致する対象は、登録され、試験する眼において０．５ｍｇのラニビズマブの硝子体内注射を受ける（来院１）。来院２（ラニビズマブ注射の７日後）の時点で、対象はＳＤ−ＯＣＴによって評価され、それらのベースライン評価と比較して、ラニビズマブ注射と関連する最初の抗ＶＥＧＦ活性に対する解剖学的な応答性を確かめる。解剖学的な応答性を有さない対象は試験から撤退する。撤退した対象に関して、来院１におけるラニビズマブ注射と関連するＡＥを有する全ての者は、ＡＥが解消するまで（注射後３０日まで）追跡される。来院３（２週目）において、対象は、網膜下送達によって手術室において投与される単一用量のｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦを投薬される。各々のコホートにおけるセンチネル対象は、２０／１００以下、かつ２０／４００以上（６５以下かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字）の視力を有する。センチネル対象に対するｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ  Ｆａｂ投与の後、安全性のために４週間の観察期間がある。５までの追加の対象（２０／６３以下かつ２０／４００以上［７５以下かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字］の拡張した視力基準）が、各々の登録の間が最小１日で並行して登録され得る。安全審査トリガー（ＳＲＴ）がまったく観察されない場合、４週間後最後の対象が投与される。対象は、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ  Ｆａｂの治療後、最初の４週以内に３回の来院を有する。ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ  Ｆａｂの投与後４週間で開始し、対象は、それらが予め規定された救援注射基準に合致する場合、硝子体内ラニビズマブ救援療法を投薬され得る。ｒＡＡＶ
８．ａＶＥＧＦのベクター及び導入遺伝子に対する免疫原性が、試験期間にわたって評価される。
【０２５３】
安全性は、ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦ投与後の最初の２４週間（最初の試験期間）を最初の焦点とする。最初の試験期間の完了に続き、対象はｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦによる投与に続く１０４週まで評価され続ける（１０６週）。試験の最後に、対象は、長期フォローアップ研究に参加するように求められる。ｒＡＡＶ８．ａＶＥＧＦの安全性及び忍容性が各々の用量の対象において評価され、眼及び非眼のＡＥ及びＳＡＥ、化学、血液学、凝固、尿検査、免疫原性、眼の検査及び撮像（ＢＣＶＡ、眼圧、スリットランプ生体顕微鏡、間接眼底検査、及びＳＤ−ＯＣＴ）、ならびに生命兆候の評価を通じて観察される。
【０２５４】
Ａ．  群と介入
【表１３】
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【０２５５】
Ｂ．評価項目
主要評価項目測定：
１．安全性：２６週間を超えての、眼の有害事象（ＡＥ）及び非眼の重篤な有害事象（ＳＡＥ）の発生
【０２５６】
副次評価項目測定：
２．安全性：１０６週間を超えての、眼及び非眼のＡＥ及びＳＡＥの発生。
３．  １０６週間を超えての最良矯正視力（ＢＣＶＡ）における変化。
４．  １０６週間を超えての、ＳＤ−ＯＣＴによって測定されるときの中心網膜厚（ＣＲＴ）における変化。
５．救援注射：１０６週間を超えての救援注射の平均数。
６．  １０６週間を超えてのＦＡによって測定されるときの、脈絡膜血管新生及び損傷サイズにおける変化ならびに漏出領域ＣＮＶの変化。
【０２５７】
基準：組み入れ基準：
１．以前に硝子体内抗ＶＥＧＦ療法を受けている試験する眼におけるＡＭＤに続発する中心窩下ＣＮＶの診断を有する５０歳以上の患者。選択された患者集団は、性別に基づかない（男性及び女性が含まれる）。
２．各々のコホートの最初の患者に対して２０／１００以下、かつ２０／４００以上の間のＢＣＶＡ（６５以下、かつ３５以上の糖尿病網膜症の早期治療研究［ＥＴＤＲＳ］文字）、続いてコホートの残りに対して、２０／６３以下、かつ２０／４００以上の間のＢＣＶＡ（７５以下、かつ３５以上のＥＴＤＲＳ文字）。
３．抗ＶＥＧＦ療法の必要性及び応答の履歴。
４．試験登録時の抗ＶＥＧＦに対する応答性（１週目（来院２）においてＳＤ−ＯＣＴによって評価される）
５．試験する眼において偽性（白内障手術後の状態）である必要がある。
６．正常上限（ＵＬＮ）の２．５倍未満のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；ＵＬＮの１．５倍未満の総ビリルビン（ＴＢ）；ＵＬＮの１．５倍未満のプロトロンビン時間（ＰＴ）；１０ｇ／ｄＬを超えるヘモグロビン（Ｈｂ）（男性）、９ｇ／ｄＬを超えるヘモグロビン（女性）；１００×１０３／μＬを超える血小板；３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を超える推定糸球体ろ過率（ｅＧＦＲ）
７．署名された書面によるインフォームドコンセントを提供する意思と能力があるべきである。
【０２５８】
除外基準：
１．ＡＭＤ以外の任意の要因に続発する試験する眼におけるＣＮＶまたは黄斑浮腫。
２．試験する眼における視力の改善を阻止する任意の状態、例えば、線維症、萎縮、または中心窩の中心における網膜上皮裂孔。
３．試験する眼における活動性の高い網膜剥離または網膜剥離の病歴。
４．試験する眼における進行した緑内障。
５．スクリーニング前の６ヶ月以内に試験する眼における硝子体内療法、例えば硝子体内ステロイド注射、または抗ＶＥＧＦ療法以外の治験薬の履歴。
６．スクリーニング時の試験する眼におけるインプラントの存在（眼内レンズを除外する）
７．過去６ヶ月間における心筋梗塞、脳血管障害、または一過性虚血発作。
８．最大限の治療にもかかわらず制御不能の高血圧（１８０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧［ＢＰ］、１００ｍｍＨｇを超える拡張期血圧）。
【０２５９】
実施例１２  ベクター作製及び製造
Ａ．製造プロセスの記載
細胞播種：正規のヒト胚腎臓２９３細胞株が作製プロセスのために使用される。ベクター作製に使用される細胞培養は、単一の解凍したＭＣＢバイアルから開始し、マスターバッチ記録文書（ＭＢＲ）に従って拡張する。細胞はＣｏｒｎｉｎｇのＴ−フラスコ及びＣＳ−１０を用いて５×１０９〜５×１０１０の細胞まで拡張し、これは、ＢＤＳロットごとのベクター作製のための５０までのＨＳ−３６への播種を生成するのに十分な細胞量をもたらす。細胞は、１０％のガンマ線照射した、米国起源の、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地で培養する。細胞は、足場依存性であり、細胞解離は動物由来成分不含の細胞解離試薬であるＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを用いて達成される。細胞播種は、滅菌、単回使用の、使い捨てバイオプロセスバッグ及びチューブセットを用いて達成される。細胞は、３７℃（±２℃）で、５％（±０．５％）ＣＯ２空気中に維持される。
【０２６０】
一過性トランスフェクション：約３日の増殖（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）に続き、ＨＳ−３６細胞培養培地を新しい無血清ＤＭＥＭ培地と交換し、最適化されたＰＥＩに基づくトランスフェクション法を用いて３つの作製プラスミドでトランスフェクトする。作製プロセスにおいて使用される全てのプラスミドは、トレーサビリティ、文書管理、材料の分離を確実にするための制御を利用するＣＭＯ品質システム及びインフラストラクチャーに照らして作製される。
【０２６１】
５０のＨＳ−３６（ＢＤＳバッチごとに）をトランスフェクトするのに十分なＤＮＡプラスミドトランスフェクション複合体が、ＢＳＣ中で調製される。最初に、７．５ｍｇの関連するベクターゲノムプラスミド、１５０ｍｇのｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）、７５ｍｇのｐＡＡＶ２／８Ｋａｎ  ＡＡＶヘルパープラスミド、及びＧＭＰグレードのＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ，ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳＡ）を含むＤＮＡ／ＰＥＩ混合物が調製される。このプラスミドの比率は、小規模最適化試験においてＡＡＶ作製のために最適化されるよう決定されている。よく混合した後、溶液を室温において２５分間放置し、次いで、反応を停止するために無血清培地に添加し、次いで、ＨＳ−３６に添加する。トランスフェクション混合物は、ＨＳ−３６の全ての３６層間で均質化され、細胞は３７℃（±２℃）で、５％（±０．５％）ＣＯ２空気中に５日間インキュベートされる。
【０２６２】
細胞培地採取：トランスフェクトされた細胞及び培地は、使い捨てバイオプロセスバッグを用いて、無菌的に培地をユニットから流出させることによって、各々のＨＳ−３６から採取される。培地の採取に続いて、約２００リットルの容量がＭｇＣｌ２で２ｍＭの最終濃度まで補充され（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅの補因子）、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（Ｃａｔ＃：１．０１６７９７．０００１，Ｍｅｒｃｋ  Ｇｒｏｕｐ）が２５単位／ｍＬの最終濃度まで添加される。産物（使い捨てバイオプロセスバッグ中）が、トランスフェクション処理の結果として採取物中に存在する残留する細胞及びプラスミドＤＮＡの酵素的消化に十分な時間を提供するために３７℃で２時間インキュベーターの中でインキュベートされる。このステップは、最終ベクターＤＰ中の残留するＤＮＡ量を最小化するために実施される。インキュベーション期間の後、ろ過及び下流のタンジェント流ろ過の間の産物の回復を助けるために、ＮａＣｌを５００ｎＭの最終濃度まで添加する。
【０２６３】
浄化：細胞及び細胞残屑は、ペリスタポンプで駆動される、滅菌の閉鎖されたチューブ及びバッグセットとして連続的に接続されるデプスフィルターカプセル（１．２／０．２２μｍ）を用いて産物から除去される。浄化は、下流のフィルター及びクロマトグラフィーカラムが汚染から防御されることを保証し、バイオバーデン低減ろ過は、フィルターの連なりの最後に、下流の精製の前に上流の作製プロセス中に潜在的に導入された全てのバイオバーデンが除去されることを確実にする。採取された物質はＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＰＥＳカプセルフィルター（１．２／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）を通過させる。
【０２６４】
大規模タンジェント流ろ過：浄化産物の容量低減（１０倍）は、カスタムの滅菌、閉鎖されたバイオプロセスチューブ、バッグ及び膜のセットを用いるタンジェント流ろ過（ＴＦＦ）によって達成される。ＴＦＦの原理は、好適な多孔度（１００ｋＤａ）の膜と平行の圧の下、溶液を流すことである。圧力差は、より小さいサイズの分子を駆動して膜を通らせ、廃棄ストリームに効果的に移動させる一方で、膜の孔よりも大きな分子を保持する。溶液を再循環させることによって、平行流が膜表面を掃引して膜孔の汚染を防止する。適切な膜の孔径及び表面積を選択することによって、液体試料は迅速に用量を低減でき、一方で所望の分子を保持して濃縮する。ＴＦＦの適用における透析ろ過は、液体が膜を通って廃棄ストリームに移動するのと同一の速度で再循環試料に新しい緩衝液を添加することを含む。透析ろ過の容量の増加に伴って量を増加する小分子は、再循環試料から除去さ
れる。これは浄化産物の適度な精製をもたらすが、後に続くアフィニティーカラムクロマトグラフィーステップと適合する緩衝液交換をも達成する。したがって、１００ｋＤａのＰＥＳ膜が濃縮に使用され、次いで、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ７．５及び４００ｍＭのＮａＣｌからなる緩衝液の最小で４の透析容量で透析ろ過がされる。透析ろ過された産物は、４℃において一晩保存され、次いで、１．２／０．２２μｍのデプスフィルターカプセルを用いて浄化され、全ての沈殿した物質を除去する。
【０２６５】
アフィニティークロマトグラフィー：透析ろ過された産物は、効果的にＡＡＶ８セロタイプを捕捉するＰｏｒｏｓ（商標）Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８親和性樹脂（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと適用される。これらのイオン条件において、相当の割合の残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質はカラムを通過し、一方でＡＡＶ粒子は効果的に捕捉される。適用に続いて、カラムを追加の供給不純物を除去するために洗浄し、１／１０容量の中和緩衝液（Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓプロパン、２００ｍＭ、ｐＨ１０．２）中への回収によって即座に中和される低ｐＨステップ溶離（４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム；ｐＨ  ２．５）が後に続く。
【０２６６】
アニオン交換クロマトグラフィー：空のＡＡＶ粒子を含む工程内不純物のさらなる低減を達成するために、Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ８溶離プールを５０倍に希釈し（２０ｍＭのＢｉｓ  Ｔｒｉｓプロパン、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８；ｐＨ１０．２）、イオン強度を低下させ、ＣＩＭｕｌｔｕｓ（商標）ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄に続いて、ベクター産物を６０ＣＶ  ＮａＣｌ線状塩勾配（１０〜１８０ｍＭのＮａＣｌ）を用いて溶離する。この浅い塩勾配は、ベクターゲノム（完全な粒子）を含む粒子からベクターゲノム（空の粒子）含まずにカプシド粒子を効果的に分離し、完全なカプシドの濃縮された調製物をもたらす。それぞれがチューブへの非特異的結合を最小化し、高ｐＨへの曝露時間を最小化する、１／１００容量の０．１％のｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８と１／２７容量のＢｉｓ  Ｔｒｉｓ
ｐＨ６．３を含むチューブに画分を回収する。適切なピーク画分を回収し、ピーク面積を評価し、適切なベクター収量決定のための以前のデータと比較する。
【０２６７】
最終的な製剤及びＢＤＳを得るためのバイオバーデン低減ろ過：プールされたＡＥＸ画分で最終的な製剤を達成するために１００ｋＤａ膜によるＴＦＦを用いる。これは、製剤緩衝液（安定性試験の完了に続いて選択されるＮａＣｌ及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃを含むＰＢＳまたは０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃを含むＰＢＳ）の透析ろ過によって達成され、所望の標的でＢＤＳ中間体を得るよう濃縮される。試料はＢＤＳ中間体試験（以下の節に記載される）のために回収される。ＢＤＳ中間体は、滅菌ポリプロピレンチューブに貯蔵され、最終的な充填のためのリリースまで−６０℃以下で隔離された場所で凍結される。安定性試験は、−６０℃未満での貯蔵に続く安定性を評価するために進行中である。
【０２６８】
最終的な充填：凍結されたＢＤＳは解凍され、プールされ、最終的な製剤緩衝液（安定性試験の完了に続いて選択されるＮａＣｌ及び０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃを含むＰＢＳまたは０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃを含むＰＢＳ）を用いて目的の濃度に調整（希釈またはＴＦＦによる濃縮ステップ）される。次いで、産物は０．２２μｍフィルターを通して最終的なろ過をされ、バイアル当たり０．１ｍＬ以上から０．５ｍＬ以下の充填容量で、Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ’ｓ  “Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ”（予め滅菌された）ガラスバイアルまたはＣｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ（ポリマー）バイアル（バイアルのタイプは比較試験の結果を待つ）いずれかとクリンプシール付きストッパーとで充填される。バイアルは、以下の仕様に従って個別にラベルされる。ラベルされたバイアルは−６０℃以下で保存される。投与前に全ての用量は製剤緩衝液における希釈を必要とする。希釈は、投与時に薬局により実施される。
【０２６９】
Ｂ．アッセイ方法
無菌性及び静菌性／真菌性：この手順は、試料マトリックスがアッセイの阻害を引き起こさないことを確実にするために、米国薬局方（ＵＳＰ）＜７１＞に従って１回行われる。試験に含まれるのは適合性試験である。
【０２７０】
粒子凝集：製剤粒子の凝集は、動的光散乱（ＤＬＳ）アッセイを用いて評価された。ＤＬＳは、分散粒子による散乱光強度の変動を測定し、試料中の様々な粒子のサイズを分析するために使用される。ＤＬＳ装置ソフトウェアは、典型的には異なる直径の粒子集団を示す。系が単分散である場合、１つの集団のみが検出され、粒子の平均有効直径を決定することができる。凝集の場合のような多分散系では、ＣＯＮＴＩＮ分析を用いて複数の粒子集団が検出され、サイズ決定される。
【０２７１】
残留プラスミドＤＮＡ：プラスミドＤＮＡ配列の検出は、プラスミドバックボーンに存在するがベクターゲノムに存在しないカナマイシン遺伝子に特異的なｑＰＣＲとプライマープローブセットとを用いて達成される。ＤＮａｓｅ消化の存在下と非存在下の両方においてアッセイを実施し、遊離したプラスミドの量と、ベクター粒子にパッケージングされた量とを決定できるようにする。
【０２７２】
Ｅ１  ＤＮＡ：アデノウイルスＥ１  ＤＮＡは宿主細胞の混入物質であり、遺伝子に特異的なｑＰＣＲによって検出される。ＤＮａｓｅ消化の存在下と非存在下の両方においてアッセイを実施し、遊離したＥ１  ＤＮＡとパッケージングされたＥ１  ＤＮＡとを定量化できるようにする。
【０２７３】
残留宿主細胞ＤＮＡ：残留する宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）のレベルは、高コピー数ＤＮＡ配列であり、したがって感度をもたらす、ヒト１８ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子に対するｑＰＣＲを用いて定量化される。全体の残留ＨＣＤＮＡレベルに加えて、様々なサイズ範囲のＤＮＡの量も測定される。
【０２７４】
残留宿主細胞タンパク質：残留する２９３宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに販売されるような、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて検出される。
【０２７５】
Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ８浸出性リガンド：Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ８樹脂の製造者であるＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって供給される、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）キットを、製剤中に滲出したラクダ抗体を検出するのに使用する。
【０２７６】
マイコプラズマ検出：マイコプラズマ試験はＵＳＰ＜６３＞に従って実施する。
【０２７７】
バイオバーデン試験：この試験はＵＳＰ＜６１＞に従って実施する。
【０２７８】
エンドトキシン試験：この試験はＵＳＰ＜８５＞に従って実施する。
【０２７９】
外来性の物質のためのインビトロアッセイ：ウイルス混入物質のためのインビトロアッセイの目的は、ＡＡＶ８．ＡＭＤベクター作製中に導入される可能性のある外来性のウイルスを検出することであり、ＣＢＥＲ’ｓ  １９９３  Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ及びＩＣＨ  Ｑ５Ａに基づく。インビトロアッセイは３つの指標細胞株：ヒト二倍体肺（ＭＲＣ−５）細胞、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞、及びヒト包皮線維芽細胞（Ｈｓ６８）細胞を使用する。アッセイ評価項目は、広範囲のウイルスの検出を促進する、アッセイ期間の終了時における少なくとも２８日間の過程における細胞変性効果
（ＣＰＥ）の観察及び血球吸着である。
【０２８０】
ベクターゲノム識別：ＤＮＡシーケンシング：ウイルスベクターゲノムＤＮＡは単離され、プライマーウォーキングを用いた２倍の配列カバー率によって配列決定される。配列のアラインメントが実施され、予想される配列と比較される。
【０２８１】
ベクターカプシド識別：ＶＰ１のＡＡＶカプシド質量分析：製剤のＡＡＶ２／８セロタイプの確認は、ＡＡＶカプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイによって達成される。
【０２８２】
ゲノムコピー（ＧＣ）力価：ＡＡＶベクターのゲノムコピー（ＧＣ）力価を測定するための液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）に基づく技術はＬｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：１１５−１２５に記載される。用いられるアッセイは、ＤＮａｓｅ  Ｉによる消化、後に続くカプセルに包まれたベクターゲノムコピーを測定するデジタルＰＣＲ解析を含む。ＤＮＡ検出は、ＲＢＧのｐｏｌｙＡ領域を標的とする配列特異的プライマーを、この同じ領域にハイブリダイズする蛍光標識されたプローブと組み合わせて用いて達成される。標準の数、評価試料、及びコントロール（バックグランド及びＤＮＡ混入のための）がアッセイに導入されている。
【０２８３】
空対完全な粒子の比：製剤の全粒子含量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって測定される。イオジキサノール勾配において精製された参照ベクター製剤が様々な方法（分析的超遠心、電子顕微鏡、及び２６０／２８０ｎｍの吸光度）によって解析され、製剤中の完全な粒子のパーセンテージを確立する。この参照物質は、既知のゲノムコピー数（従って外延により、粒子数）に系列希釈され、各々の希釈は、同様の希釈系列の製剤と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動される。参照物質と製剤のＶＰ３タンパク質のバンドのピーク領域の容量は、デンシトメトリーで測定され、参照物質の容量が粒子数に対してプロットされる。製剤の全粒子濃度は、この曲線から外挿によって測定され、ゲノムコピー（ＧＣ）力価が差し引かれて空の粒子の力価を得る。空対完全な粒子の比は、空の粒子の力価対ＧＣ力価の比である。
【０２８４】
感染力価：感染単位（ＩＵ）アッセイは、ＲＣ３２細胞（ｒｅｐ２発現ＨｅＬａ細胞）においてＡＡＶ８．ＡＭＤベクターの生産的な取り込みと複製とを測定するのに使用される。以前に公開されたものと同様に、９６ウェルエンドポイント型が使用されている。手短に、ＲＣ３２細胞を系列希釈のＡＡＶ８．ＡＭＤ．ＢＤＳと統一希釈のＡｄ５とで、ｒＡＡＶの各々の希釈について１２の重複で、共感染する。感染の７２時間後に細胞を溶解し、入力したものを超えるｒＡＡＶベクター増幅を検出するためにｑＰＣＲを実施する。エンドポイント希釈組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）計算（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）を実施してＩＵ／ｍＬとして表される複製力価を決定する。「感染」値は、細胞と接触する粒子、受容体結合、インターナリゼーション、核への移行、及びゲノム複製に依存するので、それらは、アッセイの幾何学的配置ならびに使用される細胞株における適切な受容体及び結合後の経路の存在に影響を受ける。受容体及び結合後の経路は、通常、不死化細胞株において維持されないため、感染性アッセイ力価は、存在する「感染性」粒子の数の絶対的な尺度ではない。しかし、「感染性単位」に対するカプシド化されたＧＣの比（ＧＣ／ＩＵ比として記載される）は、ロットからロットへの製品一貫性の尺度として使用することができる。
【０２８５】
宿主細胞ＤＮＡ：残留するヒト２９３ＤＮＡを検出するためにｑＰＣＲアッセイが使用される。「関連性のないＤＮＡ」でスパイクした後、全ＤＮＡ（関連性のないベクター及び残留するゲノム）を約１ｍＬの産物から抽出する。宿主細胞ＤＮＡは１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子を標的としてｑＰＣＲを用いて定量化される。検出されるＤＮＡの量は、スカイく
された関連性のないＤＮＡの回復に基づいて標準化される。
【０２８６】
宿主細胞タンパク質：ＥＬＩＳＡは、混入する宿主ＨＥＫ２９３細胞タンパク質のレベルを測定するために実施される。Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＨＥＫ２９３  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２ｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡキットが説明書に従って使用される。
【０２８７】
複製可能なＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）アッセイ：試料は、作製プロセスにおいて生じる可能性があり得る複製可能なＡＡＶ２／８（ｒｃＡＡＶ）の存在について分析される。
【０２８８】
このタイプのアッセイの例は（図１０Ａ〜１０Ｄ）に示され、そこではｗｔＡＡＶ８が異なるＧＣ数のＡＡＶ８ベクター中にスパイクされ、細胞溶解物の新しい細胞に対する３代の連続的な継代の後に１μｇの２９３細胞のＤＮＡ当たりのｃａｐ遺伝子コピー数が測定される。アッセイ開発の詳細はＣＴＡ提出資料に含まれる。これらの結果は、このアッセイを用いる最小限検出可能なｗｔＡＡＶ８の量は１０４ＧＣであることを示す。この数は、１ＴＣＩＤ５０ＩＵとほぼ同等であり、ＡＡＶ８の２９３細胞に対する感染性の欠失を反映し、ＡＡＶ２と比較して得られる高いＧＣ：ＩＵ比によって実証される。低い感度は、現在のアッセイ系においては避けられないが、将来的に未だ発見されていないＡＡＶの細胞受容体または進入後の経路に重要な他のタンパク質を有する細胞株を作出することによって克服できるかもしれない。ｗｔＡＡＶ８の、１０１１ＧＣまでの濃度のＡＡＶ８ベクターへのスパイクは、検出にほとんど影響を及ぼさず、このベクターのレベルにおける、ベクターのｗｔＡＡＶ８の複製に対する干渉の欠如を示す。野生型ＡＡＶが、過去においてｒｃＡＡＶ２に対する代替物として、及び我々自身のｒｃＡＡＶアッセイ開発の努力においてＡＡＶ８に対する代替物として、過度に使用されてきている一方で、最良の代替物は、ＡＡＶ２のＩＴＲを含むＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子、及びＡＡＶ８のｃａｐ遺伝子である。
【０２８９】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０２９０】
臨床的に好適な界面活性剤、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８をＡＡＶ８．ＡＭＤの最終的な製剤緩衝液に添加し、このタイプの損失を最小限に抑えることを期待する。製剤と貯蔵バイアル及び臨床送達装置との間の相互作用は、表面への結合を通じてベクターの損失量を決定するために調査された。エンジニアリングラン製剤のＧＣ力価（ｏｑＰＣＲ）を、バイアル化及び−６０℃以下での貯蔵の前後で測定する。送達装置に関して、ＤＰは解凍され、適切な臨床希釈剤で正しい用量濃度へと希釈され、装置を通過させる。ＧＣ力価決定は解凍直後、希釈後、及び装置を通過した後にＤＰにおいて実施し、適切な数の重複が統計学的有意性を保証するために含められた。この方法におけるＧＣ力価の比較は、貯蔵及び
患者への投与の最中のＤＰ喪失の評価を可能にする。送達装置を通過した後の製剤の活性を評価するために、平行した試験もまた同様の方法で実施した。この目的のためにインビトロラニビズマブ発現に基づく効力検定が使用される。
【配列表フリーテキスト】
【０２９１】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、識別番号＜２２３＞下のフリーテキストを含む配列のために提供される。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【表１５−１３】
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【表１５−１４】
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【表１５−１５】
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【表１５−１６】
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【表１５−１７】
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【表１５−１８】
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【表１５−１９】
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【表１５−２０】
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【表１５−２１】
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【表１５−２２】
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【表１５−２３】
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【表１５−２４】
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【表１５−２５】
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【表１５−２６】
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【表１５−２７】
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【表１５−２８】
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【表１５−２９】
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【表１５−３０】
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【表１５−３１】
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【表１５−３２】
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【表１５−３３】
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【表１５−３４】
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【表１５−３５】
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【表１５−３６】
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【表１５−３７】
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【０２９２】
本明細書において引用される全ての刊行物は、参照によりそれらの内容が本明細書に組み込まれ、２０１７年３月３日に出願された米国特許仮出願第６２／４６６，７２１号、２０１７年２月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／４６０，５１５号、２０１７年１月５日に出願された米国特許仮出願第６２／４４２，９４６号、２０１６年５月３日に出願された米国特許仮出願第６２／３３１，１００号、及び、２０１６年４月１５日に出願された米国特許仮出願第６２／３２３，１８４号も同様である。同様に、本願と共に提出される配列表も参照により本明細書によって組み込まれる。本発明は特定の実施形態を参照して説明されてきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変をなし得ることは理解されよう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019518427.tif 000063
【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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