(57)【要約】【解決手段】  本発明は、標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドであって特定の部位で糖タンパク質Ｂに融合又は挿入された異種ポリペプチドリガンドを備える組み換えヘルペスウイルスに関する。ヘルペスウイルスは２つ以上のリガンドを備えていてよく、追加的な１つ以上のリガンドは、改変糖タンパク質Ｄ及び／又は改変糖タンパク質Ｈにより備えられていてよい。これにより、ヘルペスウイルスは、治療目的のための細胞を標的とすることができ、またウイルス産生のための細胞を標的とすることができる。本発明は、更に、ヘルペスウイルスを備える医薬組成物、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療における使用のためのヘルペスウイルス、ｇＢをコードする核酸及びベクター、ｇＢを備えるポリペプチド、並びにヘルペスウイルス、核酸、ベクター又はポリペプチドを備える細胞を含む。また、細胞にヘルペスウイルスを感染させる方法又はヘルペスウイルスを産生する方法が開示される。【選択図】図１ＥＦＧ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドであってヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に融合又は挿入された異種ポリペプチドリガンドを備える組み換えヘルペスウイルスであって、
前記リガンドがｇＢに融合され、又は
前記リガンドが、ｇＢの不規則領域内における任意のアミノ酸に挿入されているが、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内若しくは相同ｇＢの対応領域内におけるいずれのアミノ酸にも挿入されていない、又は
前記リガンドが、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸３１〜７７若しくは８８〜１８４、好ましくはアミノ酸３１〜７７若しくは８８〜１３６、若しくはより好ましくは３１〜７７若しくは８８〜１０８にわたる領域内、及び／若しくはアミノ酸４０９〜５４５、好ましくはアミノ酸４５９〜５４５、より好ましくはアミノ酸４５９〜４９７、若しくは更に好ましくはアミノ酸４６０〜４９１にわたる領域内若しくは相同ｇＢの対応領域内における任意のアミノ酸に挿入されている、組み換えヘルペスウイルス。
【請求項２】
標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドであってヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に挿入された異種ポリペプチドリガンドを備える組み換えヘルペスウイルスであって、
前記リガンドが、５〜１２０アミノ酸の長さを有し且つ配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内における任意のアミノ酸に挿入されている、組み換えヘルペスウイルス。
【請求項３】
前記ヘルペスウイルスが、前記標的分子を発現させ又は結合させている細胞に結合する能力、好ましくは当該細胞膜と融合する能力、より好ましくは前記細胞に侵入する能力、最も好ましくは前記細胞を死滅させる能力を有する、請求項１又は２のヘルペスウイルス。
【請求項４】
前記標的分子が疾患細胞上にあり、好ましくは前記疾患細胞が腫瘍細胞、感染細胞、変性障害関連細胞若しくは老化細胞であり、又は
前記標的分子が細胞培養物中に存在する細胞上にあり、好ましくは前記細胞がヘルペスウイルスの増殖に適した培養細胞であり、より好ましくはヘルペスウイルス増殖のために認められた細胞株であり、更に好ましくはＶｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ若しくはＲＳ細胞であり、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞である請求項１〜３のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項５】
疾患細胞上にある前記標的分子が、腫瘍関連受容体であり、好ましくはＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＩＩＩ若しくはＥＧＦＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー、若しくはＭＥＴ、ＦＡＰ、ＰＳＭＡ、ＣＸＣＲ４、ＣＥＡ、ＣＡＤＣ、ムチン、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＶＥＧＦ受容体１及び２、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５５、インテグリンファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、エフリン受容体ファミリー、タンパク質‐チロシンキナーゼ（ＴＫ）ファミリー、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＩＬ１３Ｒアルファ、ＵＰＡＲ、テネイシン、若しくはＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＣＴＬ‐Ａ４、ＴＩＭ‐３、ＬＡＧ３を含む免疫チェックポイントファミリー制御因子のメンバー、若しくはＩＤＯ、腫瘍関連糖タンパク質７２、ガングリオシドＧＭ２、Ａ３３、ルイスＹ抗原、若しくはＭＵＣ１であり、最も好ましくはＨＥＲ２であり、又は
細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子が、人工分子であり、好ましくは抗体、抗体誘導体若しくは抗体模倣物であり、より好ましくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖであり、更に好ましくは配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖであり、更に好ましくは配列ＩＤ番号３９に含まれるｓｃＦｖであり、最も好ましくは配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子である請求項１〜４のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項６】
前記リガンドが天然ポリペプチド又は人工ポリペプチドであり、
好ましくは前記リガンドが細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子又は疾患細胞上にある標的分子に結合可能であり、
より好ましくは前記リガンドが、細胞上でアクセス可能な標的分子の天然リガンド、前記標的分子に結合可能な前記天然リガンドの一部、天然ポリペプチドの一部、抗体、抗体誘導体、抗体模倣物であり、
より好ましくは前記リガンドが、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子又はｓｃＦＶに結合可能な前記天然ポリペプチドの一部であり、
更に好ましくは前記リガンドが、配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部等のＧＣＮ４酵母転写因子の一部、又は腫瘍細胞上にある標的分子、好ましくはＨＥＲ２に結合可能なｓｃＦｖであり、
最も好ましくは前記リガンドが、配列ＩＤ番号３７の配列により特定される分子又は配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖである請求項１〜５のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項７】
前記標的分子がＨＥＲ２であり、前記リガンドが配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖであり、前記疾患細胞がＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、若しくは唾液腺腫瘍細胞であり、及び／又は
前記標的分子が配列ＩＤ番号４１の配列を有する分子であり、前記リガンドが配列ＩＤ番号３７の配列により特定される分子であり、前記細胞が細胞培養物中に存在すると共に配列ＩＤ番号４１の配列により特定される前記分子を発現する請求項４〜６のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項８】
１つ以上のリガンドがｇＢに融合又は挿入され、
好ましくは前記ｇＢが細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドと疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドとを備える請求項１〜７に記載のヘルペスウイルス。
【請求項９】
前記ヘルペスウイルスが改変ｇＤ及び／又は改変ｇＨを備え、
好ましくは前記ｇＢが細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、前記改変ｇＤ及び／又は前記改変ｇＨが疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、
最も好ましくは前記ｇＢが配列ＩＤ番号３７により特定される配列を備え、前記標的分子が配列ＩＤ番号４１により特定される配列を有する分子であり、前記細胞が細胞培養物中に存在すると共に配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を発現し、前記改変ｇＤ及び／又は前記改変ｇＨが配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖを備え、前記標的分子がＨＥＲ２であり、前記細胞が、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、又は唾液腺腫瘍細胞である請求項１〜８のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項１０】
配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域に関して、前記ｇＤがｇＤのアミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの欠失を有するように改変され、好ましくは前記ｇＤがアミノ酸３０及び／又はアミノ酸３８の欠失を有するように改変され、より好ましくは前記ｇＤがアミノ酸３０及びアミノ酸３８の欠失を有するように改変されている請求項９に記載のヘルペスウイルス。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域に関して、異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの代わりにｇＤに挿入され、好ましくは前記異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３０又はアミノ酸３８の代わりに挿入され、より好ましくは前記異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３８の代わりに挿入されると共にアミノ酸３０が欠失している請求項１０に記載のヘルペスウイルス。
【請求項１２】
前記ヘルペスウイルスが、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子をコードする請求項１〜１１のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のヘルペスウイルスと薬学的に許容可能な担体とを備える医薬組成物であって、随意的に、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子を追加的に備える医薬組成物。
【請求項１４】
腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療における使用のために、随意的に、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子と組み合わされて投与される請求項１〜１２のいずれかに記載のヘルペスウイルス。
【請求項１５】
前記リガンドを融合又は挿入した請求項１〜９のいずれかに記載のｇＢをコードする核酸を備える核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を備えるベクター。
【請求項１７】
前記リガンドを融合又は挿入した請求項１〜９のいずれかに記載のｇＢを備えるポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載のヘルペスウイルス、請求項１５に記載の核酸分子、請求項１６に記載のベクター、又は請求項１７に記載のポリペプチドを備える細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかに記載のヘルペスウイルスを用いて細胞を感染させるための方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれかに記載のヘルペスウイルスを用いて細胞培養物中に存在する細胞において組み換えヘルペスウイルスを産生するためのインビトロな方法であって、好ましくは前記細胞が標的分子として人工分子を発現又は結合し、より好ましくは前記標的分子が、抗体、抗体誘導体又は抗体模倣物、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号３９に含まれるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を備える方法。
【請求項２１】
前記組み換えヘルペスウイルスが細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドと疾患細胞上にある標的分子に結合可能な追加的リガンドとを備え、
好ましくは前記ｇＢが細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、改変ｇＤ及び／又はｇＨが疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、
最も好ましくは前記ｇＢが配列ＩＤ番号３７により特定される配列を備え、前記標的分子が配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子であり、前記細胞が細胞培養物中に存在すると共に配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を発現し、前記改変ｇＤ及び／又はｇＨが配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖを備え、前記標的分子がＨＥＲ２であり、並びに前記細胞が、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、又は唾液腺腫瘍細胞である請求項２０に記載のインビトロな方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に至る研究は、欧州連合第７次フレームワーク計画（ＦＰ７／２００７‐２０１３）／ＥＲＣ助成契約第３４００６０号の下に欧州研究会議からの資金提供を受けたものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘルスケアの着実な発展にもかかわらず、治療することができない又は十分に治療することができない疾患及び病変の負担は依然として高まっている。これらの中でも種々の形態の腫瘍が抜きん出ているが、特に化学放射線療法や生物学的薬剤あるいはそれらの組み合わせで治療される転移性形態の腫瘍に対する成果は限定的である。
【０００３】
腫瘍治療への代替的なアプローチは腫瘍溶解性ウイルス療法(oncolytic virotherapy)であり、それによると、増殖型ウイルス(replication competent virus)が腫瘍細胞に感染し、腫瘍の細胞から細胞に広がり、それらを破壊する。
【０００４】
腫瘍溶解性ウイルス療法は、癌の免疫療法と組み合わせることができる。従って、患者は腫瘍溶解性ウイルス及び免疫療法薬の両方を投与されることがあり、あるいは腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍に対する宿主の免疫応答を高める、サイトカイン(cytokine)、ケモカイン(chemokine)、又は免疫チェックポイント制御因子(immune checkpoint regulators)等の分子を発現するように操作されてきた。免疫チェックポイント制御因子は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＢＴＬＡに対する抗体又は一本鎖抗体を含む。それらは、単独で又は組み合わせて投与することができる。腫瘍に対する免疫応答を生じさせることが可能なこのカテゴリーの組み換え腫瘍溶解性ウイルスには、タリモジェンラヘルパレプベク(Talimogene laherparepvec)（商用名イムリジック(Imlygic)）とも命名され、ＧＭ‐ＣＳＦをコードするＨＳＶであって、ＦＤＡによって転移性黒色腫の治療に対して認可されたＴ‐ＶＥＣが含まれる。
【０００５】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒトに対する病原体ウイルスである。培養においては、ＨＳＶは多数の哺乳動物細胞に感染する。ＨＳＶは、標的細胞の種類に応じて、原形質膜にて又はエンドサイトーシスを通してのいずれかで、膜融合によって細胞に侵入するエンベロープウイルスである。ＨＳＶの標的細胞への侵入は、ウイルス糖タンパク質ｇＤ、ｇＨ／ｇＬ、ｇＣ及びｇＢの複雑な相互作用及び立体構造変化を必要とする多段階プロセスである。これらの糖タンパク質は、ＨＳＶ粒子の最も外側の構造であり膜からなるウイルスエンベロープを構成する。細胞への侵入のために、ｇＣ及びｇＢが、細胞表面ヘパラン硫酸へのＨＳＶ粒子の最初の付着を媒介する。その後、ｇＤが、ネクチン１(Nectin-1)及びＨＶＥＭ又はＨＶＥＡである少なくとも２つの代替的細胞受容体(alternative cellular receptors)に結合し、ビリオン‐細胞膜融合を引き起こす事象の連鎖を開始するｇＤにおける立体構造変化をもたらす。これにより、中間タンパク質ｇＨ／ｇＬ（ヘテロ二量体）が活性化され、膜融合を触媒するようにｇＢをトリガーする。結果として、ｇＢは膜結合性であり、ウイルス融合因子(viral fusogen)として機能する。
【０００６】
腫瘍溶解性ＨＳＶｓ（ｏ‐ＨＳＶ）は、近年、腫瘍溶解剤として使用されてきている。野生型ＨＳＶウイルスは非常に毒性が高いので、ｏ‐ＨＳＶｓは弱毒化される必要がある。臨床試験に達したＴ‐ＶＥＣ／イムリジック及びそのウイルスは、１つ以上のＨＳＶ遺伝子の欠失を担持し、これらの遺伝子は、感染細胞におけるタンパク質合成の遮断を妨げる役割を果たすＩＣＰ３４．５タンパク質をコードするガンマγ１３４．５遺伝子と、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットをコードするＵＬ３９遺伝子と、を含む。子孫ウイルスの高い収量を産生することができない等、これらのウイルスによって示される幾つかの欠点に加えて、それらは更に、それらの天然受容体を有する任意の細胞に結合してしまう保存された能力を有する。従って、腫瘍細胞死滅の治療効果は減少し、上記ウイルスは医療用途において限界を有する可能性がある。
【０００７】
これらの限界を克服する１つのアプローチは、腫瘍細胞に対して高い特異的親和性(specific tropism)を示し、そうでなければ弱毒化されないｏ‐ＨＳＶｓの遺伝子操作であった。このアプローチは、腫瘍特異的受容体に対するＨＳＶ親和性の再標的化として定義されてきた。
【０００８】
癌特異的受容体へのＨＳＶの再標的化は、特異的リガンドをコードする異種配列を有するようなｇＤの遺伝子改変を伴う。組み換えウイルスによる感染によって、エンベロープ内にキメラｇＤ‐リガンド糖タンパク質を担持する子孫ウイルスが、野生型ｇＤの代わりに形成される。リガンドは、選択された細胞上に特異的に発現した分子と相互作用し、選択された細胞内への組み換えｏ‐ＨＳＶの侵入を可能にする。ＨＳＶの再標的化に成功裏に使用されたリガンドの例は、ＩＬ１３α、ｕＰａＲ、ＨＥＲ２に対する一本鎖抗体、及びＥＧＦＲに対する一本鎖抗体である。
【０００９】
また、糖タンパク質の改変による再標的化もｇＣで試みられてきた。挿入されたリガンドは、ＥＰＯ及びＩＬ１３であった。ｇＣ‐ＥＰＯポリペプチドを担持しているウイルスは、ＥＰＯ受容体を発現する細胞に付着した。しかし、この付着は感染性の侵入にはつながらなかった。加えて、ｇＣ‐ＩＬ１３ポリペプチドは、ｇＤ遺伝子内にＩＬ１３の第２のコピーを担持するウイルス内に存在した。従って、これらの研究からは、ｇＣ‐ＩＬ１３がＩＬ１３アルファ２受容体への再標的化に寄与したのか否かは推論することはできない。
【００１０】
また、ｇＨの遺伝子改変による再標的化も達成されてきた。挿入されたリガンドは、ｇＨ遺伝子内の欠失を伴い又は伴わないＨＥＲ２に向けられた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であった。ウイルスは、ＨＥＲ２受容体を担持している細胞に成功裏に再標的化された（Gatta et al., 2015）。加えて、ｇＨ内のＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖと成熟ｇＤタンパク質内のＥＧＦＲに向けられたｓｃＦｖとを含有する組み換えウイルスが構築された。その結果、受容体を担持している細胞への二重再標的化がもたらされた。更に、ｇＨ内のＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖと成熟ｇＤタンパク質内のＨＥＲ２に向けられたｓｃＦｖとを含有する組み換えウイルスが構築された。その結果、ＨＥＲ２受容体への二重再標的化がもたらされた（ＰＣＴ出願）(Abstract # P-28, 9th International conference on Oncolytic virus Therapeutics, Boston 2015)。
【００１１】
ｇＢによるウイルスの再標的化はこれまで全く報告されていない。保存された膜融合活性を有する生存できるウイルス変異体を結果としてもたらすｇＢ遺伝子内の挿入部位が特定されたが（Gallagher et al., 2014; Lin and Spear, 2007; Potel et al., 2002）、ポリペプチド‐ｇＢ融合体を分析するために用いられたアッセイは、挿入されたポリペプチドが標的受容体に結合することが可能な異種ペプチドである場合に、その後の組み換え体が、ｇＢの融合活性に寄与し、リガンドによって標的化された受容体に再アドレス（再標的化）された親和性を示し得るかどうかを予測しなかった。先ず、当該分野における経験に基づく予測によれば、ＨＳＶを含むウイルスの親和性を再標的化するいかなる努力も、改変のために選択された糖タンパク質、例えば異種リガンドの挿入のために選択された糖タンパク質がウイルス親和性の決定因子である場合に限って成功する。ＨＳＶｇＢに対して主張されてきた受容体は、ｇＢ及びｇＣが結合したへパラン硫酸プロテオグリカン、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ペア型免疫グロブリン様２型受容体アルファ（paired immunoglobulin-like type 2 receptor alpha）（ＰＩＬＲアルファ）、ＤＣ-ＳＩＧＮ、及び非筋肉性ミオシン重鎖９ＭＹＨ９／ＮＭＨＣ-ＩＩＡである。いずれの場合も、これらの分子とのｇＢの相互作用がＨＳＶ親和性を決定することは示されなかった。このように、ＰＩＬＲアルファは、単球細胞内へのＨＳＶの侵入、ＨＳＶによって通常は標的化されない細胞タイプ、優先的に表皮細胞及び神経細胞に感染するウイルスに関与する。他の受容体については、それらがＨＳＶ感染において果たす役割は調査されなかった。従って、当該分野における専門家は、ｇＢに対する適切な改変が、最適な標的受容体に対して再標的化された親和性をもたらし得ることを予測することはできない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当該分野においては、幾つかの代替的な再標的化戦略を提供する必要がある。この必要性は、同じ腫瘍における癌細胞の異質性により細胞が異なる受容体を発現すること、癌細胞の受容体とは異なる受容体のレパートリーを発現し得る癌幹細胞を除去する必要性、又は標的療法に耐性を示す細胞の抵抗(insurgence)に起因する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、除去される必要のある細胞の受容体にウイルスを再標的化する改変ｇＢタンパク質を有する組み換えＨＳＶを表現する。
【００１４】
本発明者らは、ｇＢとの融合タンパク質としての特異的細胞受容体に向けられたポリペプチドリガンドを備える組み換えＨＳＶを構築することが可能であり、これにより、リガンドの存在に起因してＨＳＶが、受容体を担持している細胞に再標的化されることを示した。更に、ＨＳＶが感染性を維持し、受容体を担持している細胞への侵入をもたらし、感染細胞を死滅させることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の特徴は個々の段落で説明される。しかし、これは、ある段落で説明されるある特徴が、他の段落で説明される１つ以上の特徴から分離して存在することを意味するものではない。むしろ、ある段落で説明されるある特徴は、他の段落で説明される１つ以上の特徴と組み合わせることができる。
【００１６】
ここで用いられる「備える／備えている(comprise/es/ing)」の用語は、開示された特徴及び特に言及されていない更なる特徴を「含む又は包含する(include or encompass)」ことを意味する。また、「備える／備えている」の用語は、示された特徴「からなる(consist/s/ing of)」という意味、従って示された特徴以外の更なる特徴を含まないという意味であることも意図されている。従って、本発明の製品は、示された特徴に加えて追加的な特徴によって特徴付けられてもよい。
【００１７】
第１の側面においては、本発明は、標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドであってヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に融合又は挿入された異種ポリペプチドリガンドを備える組み換えヘルペスウイルスであって、リガンドがｇＢに融合され、又はリガンドが、ｇＢの不規則領域（disordered region）内における任意のアミノ酸に挿入されているが、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内若しくは相同ｇＢ(homologous gB)の対応領域内におけるいずれのアミノ酸にも挿入されていない、又はリガンドが、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸３１〜７７若しくは８８〜１８４、好ましくはアミノ酸３１〜７７若しくは８８〜１３６、若しくはより好ましくは３１〜７７若しくは８８〜１０８にわたる領域内、及び／若しくはアミノ酸４０９〜５４５、好ましくはアミノ酸４５９〜５４５、より好ましくはアミノ酸４５９〜４９７、若しくは更に好ましくはアミノ酸４６０〜４９１にわたる領域内若しくは相同ｇＢの対応領域内における任意のアミノ酸に挿入されている、組み換えヘルペスウイルスを提供する。
【００１８】
更に、本発明は、標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドであってヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に挿入された異種ポリペプチドリガンドを備える組み換えヘルペスウイルスであって、リガンドが、５〜１２０アミノ酸の長さを有し且つ配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内における任意のアミノ酸に挿入されている、組み換えヘルペスウイルスを提供する。
【００１９】
本発明の実施形態においては、ヘルペスウイルスは、標的分子を発現させ又は結合させている細胞に結合する能力、好ましくはその細胞と融合する能力、より好ましくはその細胞に侵入する能力、最も好ましくはその細胞を死滅させる能力を有する。
【００２０】
本発明の実施形態においては、標的分子は疾患細胞上にあり、好ましくは疾患細胞は腫瘍細胞、感染細胞、変性障害関連細胞(degenerative disorder-associated cell)若しくは老化細胞であり、又は標的分子は細胞培養物中に存在する細胞上にあり、好ましくは細胞はヘルペスウイルスの増殖に適した培養細胞であり、より好ましくはヘルペスウイルス増殖のために認められた細胞株であり、更に好ましくはＶｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ若しくはＲＳ細胞であり、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞である。
【００２１】
本発明の実施形態においては、疾患細胞上にある標的分子は、腫瘍関連受容体であり、好ましくはＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＩＩＩ若しくはＥＧＦＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー、若しくはＭＥＴ、ＦＡＰ、ＰＳＭＡ、ＣＸＣＲ４、ＣＥＡ、ＣＡＤＣ、ムチン、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＶＥＧＦ受容体１及び２、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５５、インテグリンファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、エフリン受容体ファミリー、タンパク質‐チロシンキナーゼ（ＴＫ）ファミリー、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＩＬ１３Ｒアルファ、ＵＰＡＲ、テネイシン、若しくはＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＣＴＬ‐Ａ４、ＴＩＭ‐３、ＬＡＧ３を含む免疫チェックポイントファミリー制御因子のメンバー、若しくはＩＤＯ、腫瘍関連糖タンパク質７２、ガングリオシドＧＭ２、Ａ３３、ルイスＹ抗原、若しくはＭＵＣ１であり、最も好ましくはＨＥＲ２であり、又は細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子は、人工分子であり、好ましくは抗体、抗体誘導体若しくは抗体模倣物であり、より好ましくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖであり、更に好ましくは配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖであり、更に好ましくは配列ＩＤ番号３９に含まれるｓｃＦｖであり、最も好ましくは配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子である。
【００２２】
本発明の実施形態においては、リガンドは天然ポリペプチド又は人工ポリペプチドであり、好ましくはリガンドは細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子又は疾患細胞上にある標的分子に結合可能であり、より好ましくはリガンドは、細胞上でアクセス可能な標的分子の天然リガンド、標的分子に結合可能な天然リガンドの一部、天然ポリペプチドの一部、抗体、抗体誘導体、抗体模倣物であり、更に好ましくはリガンドは、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子又はｓｃＦＶに結合可能な天然ポリペプチドの一部であり、更に好ましくはリガンドは、配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部等のＧＣＮ４酵母転写因子の一部、又は腫瘍細胞上にある標的分子、好ましくはＨＥＲ２に結合可能なｓｃＦｖであり、最も好ましくはリガンドは、配列ＩＤ番号３７の配列により特定される分子又は配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖである。
【００２３】
本発明の実施形態においては、標的分子はＨＥＲ２であり、リガンドは配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖであり、疾患細胞はＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、若しくは唾液腺腫瘍細胞であり、及び／又は標的分子は配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子であり、リガンドは配列ＩＤ番号３７の配列により特定される分子であり、細胞は細胞培養物中に存在すると共に配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を発現する。
【００２４】
本発明の実施形態においては、１つ以上のリガンドはｇＢに融合又は挿入され、好ましくはｇＢは細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドと疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドとを備える。
【００２５】
本発明の実施形態においては、ヘルペスウイルスは改変ｇＤ及び／又は改変ｇＨを備え、好ましくはｇＢは細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、改変ｇＤ及び／又は改変ｇＨは疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、最も好ましくはｇＢは配列ＩＤ番号３７により特定される配列を備え、標的分子は配列ＩＤ番号４１により特定される配列を有する分子であり、細胞は細胞培養物中に存在すると共に配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を発現し、改変ｇＤ及び／又は改変ｇＨは配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖを備え、標的分子はＨＥＲ２であり、細胞は、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、又は唾液腺腫瘍細胞である。
【００２６】
本発明の実施形態においては、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域に関して、ｇＤはｇＤのアミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの欠失を有するように改変され、好ましくはｇＤはアミノ酸３０及び／又はアミノ酸３８の欠失を有するように改変され、より好ましくはｇＤはアミノ酸３０及びアミノ酸３８の欠失を有するように改変されている。
【００２７】
本発明の実施形態においては、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域に関して、異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの代わりにｇＤに挿入され、好ましくは異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３０又はアミノ酸３８の代わりに挿入され、より好ましくは異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３８の代わりに挿入されると共にアミノ酸３０が欠失している。
【００２８】
本発明の実施形態においては、ヘルペスウイルスは、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子をコードする。
【００２９】
糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）は、ヘルペスウイルス科の外表面上に存在しウイルスの細胞への結合及び細胞への侵入に関与するエンベロープタンパク質である。細胞への侵入に関与する糖タンパク質の中でも、ｇＢは、ｇＤ及びｇＨ／ｇＬによる刺激下で融合促進構造変化(fusion-promoting conformational rearrangement)を受ける融合因子である。ｇＢは、３０アミノ酸のシグナルペプチド、６９６アミノ酸の細胞外ドメイン、６９アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び１０９アミノ酸のＣ尾部を含む９０４アミノ酸から構成される。ｇＢは、ヘルペスウイルス科ファミリーのうちで最も高度に保存された糖タンパク質に属する。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型ｇＢの結晶構造は、その融合後の立体構造において、５つの構造ドメイン（Ｉ〜Ｖ）を有する三量体であることが解明された。ドメインＩはアミノ酸１５４からアミノ酸３６３まで伸び、ドメインＩＩはアミノ酸１４２からアミノ酸１５３まで及びアミノ酸３６４からアミノ酸４５９まで伸び、アミノ酸４６０〜４９１の不規則領域がそれに続き、ドメインＩＩＩはアミノ酸１１７からアミノ酸１３３まで、アミノ酸５００からアミノ酸５７２まで、及びアミノ酸６６１からアミノ酸６６９まで伸び、ドメインＩＶはアミノ酸１１１からアミノ酸１１６まで及びアミノ酸５７３からアミノ酸６６０まで伸び、ドメインＶはアミノ酸６７０からアミノ酸７２５まで伸びている（Heldwein et al., 2006）。不規則構造を有するＮ末端領域は、アミノ酸３１からアミノ酸１０８まで伸びる。ＥＢＶ及びＨＣＭＶの結晶構造も解明されており、ＨＳＶ１型のものと本質的に類似している（Backovic et al., 2009; Burke and Heldwein, 2015）。その特異構造により、ヘルペスウイルスｇＢはウイルス膜融合糖タンパク質の新たなクラス、クラスＩＩＩに属する。異なるヘルペスウイルスの種々のｇＢのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が当該分野において知られている。例示のみの目的で、これに限定されないが、配列ＩＤ番号１としてここに開示されるヒトヘルペスウイルス１のｇＢのアミノ酸配列を参照する。対応するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、アセッション番号「ゲノム(Genome)」、ＧＵ７３４７７１．１、座標５２９９６〜５５７１０の下でＮＣＢＩ(National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Bethesda, MD20894, USA; www.ncbi.nlm.nih.gov)から利用可能である。
【００３０】
1   MRQGAPARGC RWFVVWALLG LTLGVLVASA APSSPGTPGV AAATQAANGG PATPAPPAPG
61  PAPTGDTKPK KNKKPKNPPP PRPAGDNATV AAGHATLREH LRDIKAENTD ANFYVCPPPT
121 GATVVQFEQP RRCPTRPEGQ NYTEGIAVVF KENIAPYKFK ATMYYKDVTV SQVWFGHRYS
181 QFMGIFEDRA PVPFEEVIDK INAKGVCRST AKYVRNNLET TAFHRDDHET DMELKPANAA
241 TRTSRGWHTT DLKYNPSRVE AFHRYGTTVN CIVEEVDARS VYPYDEFVLA TGDFVYMSPF
301 YGYREGSHTE HTSYAADRFK QVDGFYARDL TTKARATAPT TRNLLTTPKF TVAWDWVPKR
361 PSVCTMTKWQ EVDEMLRSEY GGSFRFSSDA ISTTFTTNLT EYPLSRVDLG DCIGKDARDA
421 MDRIFARRYN ATHIKVGQPQ YYLANGGFLI AYQPLLSNTL AELYVREHLR EQSRKPPNPT
481 PPPPGASANA SVERIKTTSS IEFARLQFTY NHIQRHVNDM LGRVAIAWCE LQNHELTLWN
541 EARKLNPNAI ASATVGRRVS ARMLGDVMAV STCVPVAADN VIVQNSMRIS SRPGACYSRP
601 LVSFRYEDQG PLVEGQLGEN NELRLTRDAI EPCTVGHRRY FTFGGGYVYF EEYAYSHQLS
661 RADITTVSTF IDLNITMLED HEFVPLEVYT RHEIKDSGLL DYTEVQRRNQ LHDLRFADID
721 TVIHADANAA MFAGLGAFFE GMGDLGRAVG KVVMGIVGGV VSAVSGVSSF MSNPFGALAV
781 GLLVLAGLAA AFFAFRYVMR LQSNPMKALY PLTTKELKNP TNPDASGEGE EGGDFDEAKL
841 AEAREMIRYM ALVSAMERTE HKAKKKGTSA LLSAKVTDMV MRKRRNTNYT QVPNKDGDAD
901 EDDL
配列ＩＤ番号１
【００３１】
ｇＢ相同体(gB homolog)は、ヘルペスウイルス科の全メンバーにおいて見出される。従って、ここで参照される「糖タンパク質Ｂ」の用語は、ヘルペスウイルス科において見出される任意のｇＢ相同体を参照する。あるいは、ここで参照されるｇＢは、配列ＩＤ番号１の配列の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％に対してアミノ酸同一性を有する任意のｇＢを参照する。あるいは、ここで参照されるｇＢは、配列ＩＤ番号１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％に対してアミノ酸相同性を有する任意のｇＢを参照する。ここで参照されるｇＢはまた、ｇＢの断片(fragment)を含む。好ましくは、ここで参照されるｇＢは、ヘルペスウイルス科において見出される任意のｇＢと、上記で定義された配列ＩＤ番号１の配列に対してアミノ酸同一性を有する任意のｇＢと、ｇＢの任意の断片と、を含み、配列ＩＤ番号１に係るｇＢと同じ活性を有する。より好ましくは、細胞へのウイルスの侵入プロセスの間、ｇＢは細胞の膜とのウイルスの融合を促進する立体構造変化を受け、更に好ましくは、細胞膜とのウイルスの融合を媒介する融合因子として作用する。
【００３２】
ここで用いられる「配列同一性」のパーセンテージは、２つの最適に整列された配列における対応する位置において同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを参照する。このパーセンテージは、２つの最適に整列された配列を比較ウインドウにおいて比較することによって決定され、比較ウインドウ内のアミノ酸配列の断片は、２つの配列の最適な整列のための参照配列、配列ＩＤ番号１（付加又は欠失を備えていない）との対比において、付加又は欠失（例えば、ギャップ又はオーバーハング）を備えていてよい。パーセンテージは、一致位置を生じさせる同一のアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定し、一致位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることによって計算される。比較のための配列の最適な整列は、スミス及びウォーターマン(Smith and Waterman)、１９８１の局所的相同性アルゴリズムによって、ニードルマン及びブンシュ(Needleman and Wunsch)、１９７０の相同性整列アルゴリズムによって、ピアソン及びリップマン(Pearson and Lipman)、１９８８の類似性検索法（search for similarity method）によって、カーリン及びアルツシュール(Karlin and Altschul)、１９９３により修正されたカーリン及びアルツシュール、１９９０のアルゴリズムによって、若しくはこれらのアルゴリズムのコンピュータ実装（GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI）によって、又は検査によって、実施されてよい。最適な整列を決定するためにギャップ(GAP)及びベストフィット(BESTFIT)が好ましく採用される。典型的には、ギャップウェイトに対しては５．００、ギャップウェイト長に対しては０．３０のデフォルト値が用いられる。
【００３３】
ここで用いられる「相同性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列における対応する位置において相同であるアミノ酸残基のパーセンテージを参照する。２つの配列の間の「相同性のパーセンテージ」は、計算において同一位置だけでなく相同位置も考慮されているという事実を除き、「同一性のパーセンテージ」の決定を参照して上述したものと実質的に同一の方法で確立される。２つの相同アミノ酸は、２つの同一又は相同のアミノ酸を有する。相同アミノ酸残基は類似した化学物理的特性を有しており、例えば、アミノ酸は、同じグループ、即ち芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、極性（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、脂肪族（Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｌｉｅ、ＶａＩ）、水酸基含有（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、又は短側鎖含有（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）、に属する。そのような相同アミノ酸の間での置換はタンパク質表現型(protein phenotype)を変化させないことが期待されている（同類置換(conservative substitutions)）。
【００３４】
ｇＢは、配列ＩＤ番号１の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％に対して同一性を有する場合、配列ＩＤ番号１の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％に対してアミノ酸相同性を有する場合、又は配列ＩＤ番号１に係るｇＢと同じ活性を有する場合、「相同(homologous)」又は「相同体(homolog)」である。好ましくは、「同じ活性」は、ｇＢが細胞受容体に結合するという意味で理解されてよく、より好ましくは、細胞へのウイルスの侵入プロセスの間、ｇＢが細胞の膜とのウイルスの融合を促進する立体構造変化を受け、更に好ましくは、ｇＢが融合因子として作用するという意味で理解されてよい。相同体は、上述した活性を有する完全長ｇＢの断片であってもよい。
【００３５】
本発明のキメラｇＢ（配列ＩＤ番号２によって例示される）は、異種ポリペプチドリガンドを担持し、これにより、ｇＢ部分が野生型（ｗｔ）ウイルスに対して達成する活性に加え、ウイルスに対し新たな活性をもたらす。キメラｇＢは、一旦組み換えウイルスのエンベロープの一部になると、組み換えウイルスの標的分子への結合を可能にし、リガンドの標的分子を担持している細胞に組み換えウイルスの親和性を再標的化する。好ましくは、キメラｇＢは細胞の膜とのウイルスの融合を促進する立体構造変化を受け、更に好ましくは、キメラｇＢは融合因子として作用する。リガンドの標的分子を担持している細胞との融合の後、組み換えヘルペスウイルスは細胞に侵入し、組み換えヘルペスウイルスが感染した細胞は、異種ポリペプチドリガンドを有するキメラｇＢを含む、ウイルスゲノムによってコードされたタンパク質を産生する。感染細胞は細胞を溶解する子孫ウイルスを産生し、これにより細胞が死滅する。
【００３６】
ここで用いられる「再標的化」の用語は、本発明の組み換えヘルペスウイルスがリガンドの標的分子を標的とすることを意味する。しかし、組み換えヘルペスウイルスは、依然として非改変ヘルペスウイルス(unmodified herpesvirus)の天然受容体を標的とすることが可能である。再標的化は「脱標的化(detargeting)」とは異なり、脱標的化は、組み換えヘルペスウイルスがもはや非改変ヘルペスウイルスの天然受容体を標的とすることができないことを意味する。「脱標的化」は、組み換えウイルスがリガンドの標的分子のみを標的とすることを意味する。
【００３７】
ここで用いられる場合、ｇＢの特定のアミノ酸番号又は領域の表示は、最初の３０アミノ酸を備えるＮ末端シグナル配列を含む配列ＩＤ番号１において例示されるようなｇＢの「前駆体(precursor)」形態を参照する。ｇＢの「成熟(mature)」形態は、配列ＩＤ番号１のアミノ酸３１から始まりアミノ酸９０４まで伸びる。配列ＩＤ番号１とは異なるアミノ酸配列を有するｇＢ糖タンパク質も本発明に含まれるので、配列ＩＤ番号１に関連する特定のアミノ酸番号又は特定のアミノ酸領域の表示はまた、相同ｇＢのアミノ酸番号又は領域を意味し、これは配列ＩＤ番号１のそれぞれのアミノ酸番号又は領域に対応する。
【００３８】
ここで用いられる「組み換え」ヘルペスウイルスの用語は、異種ポリペプチドをコードする追加の核酸配列を含むように遺伝子組み換えによって遺伝子操作されたヘルペスウイルスを参照する。組み換えヘルペスウイルスを産生する方法は、当該分野において周知である（例えばSandri-Goldin et al., 2006を参照）。しかし、本発明は遺伝子工学的方法に限定されない。他の方法を用いて、異種ポリペプチドリガンドをｇＢに融合又は挿入したヘルペスウイルスを産生してもよい。
【００３９】
ここで用いられる「キメラ糖タンパク質Ｂ」若しくは「キメラｇＢ」の用語又は「キメラｇＢ」は、異種ポリペプチドリガンドをｇＢに融合又は挿入したｇＢを意味する。キメラｇＢは、組み換えウイルスによってコードされ、組み換えウイルスを産生する細胞で合成され、ビリオンのエンベロープ内に組み込まれる。遺伝子工学によって組み換えウイルスを産生する方法は、当該分野において知られている。キメラ糖タンパク質Ｂを産生する方法は、当該分野において知られている。
【００４０】
ここで参照される「ヘルペスウイルス」の用語は、潜伏感染又は溶解感染を引き起こす二本鎖ＤＮＡウイルスのヘルペスウイルス科ファミリーのメンバーを参照する。全てのヘルペスウイルスは共通構造を共有し、それらのゲノムは、カプシド(capside)と呼ばれる二十面体タンパク質ケージ内に包み込まれた８０〜２００遺伝子をコードする比較的大きな（約１００，０００〜２００，０００塩基対）二本鎖の直線状ＤＮＡからなり、カプシドそれ自体は、ウイルスタンパク質及びウイルスｍＲＮＡｓの両方を含むテグメント(tegument)と呼ばれるタンパク質層とエンベロープと呼ばれる脂質二重層膜とによって包まれている。この全体粒子はビリオンとしても知られる。「ヘルペスウイルス」の用語はまた、例えば実験室で改変されたヘルペスウイルス等の１つ以上の変異遺伝子を備える変異させられたヘルペスウイルス科ファミリーのメンバーを参照する。
【００４１】
好ましい実施形態において、ヘルペスウイルスは、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ‐１）、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ‐２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ヒトヘルペスウイルス３（ＨＨＶ‐３））、ブタアルファヘルペスウイルス亜科仮性狂犬病ウイルス(swine alphaherpesvirus Pseudorabiesvirus)（ＰＲＶ）、チンパンジーアルファ１ヘルペスウイルス（ＣｈＨＶ）、ヒヒヘルペスウイルス２(Papiine herpesvirus 2)（ＨＶＰ２）、オナガザルヘルペスウイルス２(Cercopithecine herpesvirus 2)（ＣｅＨＶ２）、マカシンヘルペスウイルス１(Macacine herpesvirus 1)（ＭＨＶ１）、リスザルヘルペスウイルス１(Saimiriine herpesvirus 1)（ＨＶＳ１）、カリトリシンヘルペスウイルス３(Callitrichine herpesvirus 3)（ＣａｌＨＶ３）、リスザルヘルペスウイルス２(Saimiriine herpesvirus 2)（ＨＶＳ２）、ウシヘルペスウイルス１（ＢｏＨＶ‐１）、ウシヘルペスウイルス５（ＢｏＨＶ‐５）、ウマヘルペスウイルス１（ＥＨＶ‐１）、ウマヘルペスウイルス２（ＥＨＶ‐２）、ウマヘルペスウイルス５（ＥＨＶ‐５）、イヌヘルペスウイルス１（ＣＨＶ）、ネコヘルペスウイルス１（ＦＨＶ‐１）、ダック腸炎ウイルス（ＤＥＶ）、オオコウモリアルファヘルペスウイルス１（ＦＢＡＨＶ１）、ウシヘルペスウイルス２（ＢｏＨＶ‐２）、ウサギヘルペスウイルス４（ＬＨＶ４）、ウマヘルペスウイルス３（ＥＨＶ‐３）、ウマヘルペスウイルス４（ＥＨＶ‐４）、ウマヘルペスウイルス８（ＥＨＶ‐８）、ウマヘルペスウイルス９（ＥＨＶ‐９）、オナガザルヘルペスウイルス９（ＣｅＨＶ９）、ブタヘルペスウイルス１(Suid herpesvirus 1)（ＳｕＨＶ‐１）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、マレック病ウイルス血清型２（ＭＤＶ２）、ハヤブサヘルペスウイルス１型(Falconid herpesvirus type 1)（ＦａＨＶ‐１）、トリヘルペスウイルス３(Gallid herpesvirus 3)（ＧａＨＶ‐３）、トリヘルペスウイルス２（ＧａＨＶ‐２）、肺‐眼‐気管疾患関連ヘルペスウイルス(Lung-eye-trachea disease-associated herpesvirus)（ＬＥＴＶ）、トリヘルペスウイルス１（ＧａＨＶ‐１）、オウムヘルペスウイルス１（ＰｓＨＶ‐１）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ‐８）、ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ‐４）、ウミガメヘルペスウイルス５（ＣｈＨＶ５）、クモザルヘルペスウイルス３（ＡｔＨＶ３）又はシチメンチョウヘルペスウイルス１（ＭｅＨＶ‐１）からなる群から選択される。より好ましい実施形態においては、ヘルペスウイルスはＨＳＶ‐１又はＨＳＶ‐２であり、最も好ましくはＨＳＶ‐１である。
【００４２】
ここで用いられる「異種」という用語は、ヘルペスウイルスゲノム又は他のいかなるヘルペスウイルスのゲノムによってもコードされていないポリペプチドを参照する。好ましくは、「異種」という用語は、リガンドの標的分子を担持する細胞であって本発明の組み換えヘルペスウイルスが感染する細胞に結合するポリペプチドを参照する。異種ポリペプチドは、天然ポリペプチド、又はその一部、あるいは天然に見出されない人工ポリペプチドであってよい。
【００４３】
ここで用いられる「ポリペプチド」の用語は、ペプチド結合によって連結された複数のアミノ酸からなる連続的で非分岐のペプチド鎖である。ポリペプチド鎖の長さは無制限であり、５アミノ酸等の幾つかのアミノ酸から数百又は数千アミノ酸の範囲にあってよい。本発明においては、ポリペプチドは、リガンドとして又は標的分子として用いられてよい。鎖の長さは、リガンド又は標的分子の始点分子(starting molecule)である分子に依存する。２つ以上のポリペプチド鎖が抗体等の複合体に会合してよい。ここで用いられる「ポリペプチド」の用語はまた、ポリペプチド鎖の会合体を含む。ここで用いられる「ペプチド」の用語は、通常は約５０アミノ酸残基未満からなり、好ましくは約４０アミノ酸残基未満からなり、より好ましくは約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸からなる短いポリペプチド鎖である。最小長は５アミノ酸残基である。
【００４４】
「相同ｇＢの対応領域」の用語は、スミス‐ウォーターマン(Smith-Waterman)アルゴリズム及び整列パラメータＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＧＡＰ  ＯＰＥＮ：１０、ＧＡＰ  ＥＸＴＥＮＤ：０．５を用いた場合に、配列ＩＤ番号１に係るｇＢの所与の領域と整列するｇＢの領域を参照する。このアルゴリズムは、ペアワイズ配列比較(pairwise sequence comparisons)を行う場合に当該分野において知られ用いられており、当業者はそれをどのように適用するのかを知っている。配列ＩＤ番号１の所与の領域の単一又は複数の部分のみが上記のアルゴリズム及びパラメータを用いて相同ｇＢの配列と整列する場合、「対応領域」の用語は、配列ＩＤ番号１の所与の領域の単一又は複数の部分と整列する領域を参照する。この場合、リガンドが挿入されている相同ｇＢ内の領域は、配列ＩＤ番号１の所与の領域の単一又は複数の部分と整列するアミノ酸のみを備える。「対応領域」の用語はまた、対応する隣接配列(flanking sequences)が隣接する領域を参照し、隣接配列は、上記のアルゴリズム及びパラメータを用いて、配列ＩＤ番号１の領域に隣接する配列と整列する。これらの隣接配列は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０又は５０アミノ酸長である。用いられてよい他のアルゴリズムは、ニードルマン及びブンシュ(Needleman and Wunsch)、１９７０のアルゴリズム、ピアソン及びリップマン(Pearson and Lipman)、１９８８の類似法、若しくはカーリン及びアルツシュール(Karlin and Altschul)、１９９３により修正されたカーリン及びアルツシュール、１９９０のアルゴリズム、又はこれらのアルゴリズムのコンピュータ実装である。
【００４５】
「対応アミノ酸」の用語は、対応領域内にあるアミノ酸であって、整列内において配列ＩＤ番号１の所与のアミノ酸のカウンターパートであるアミノ酸を参照する。対応アミノ酸は、対応領域内にある限り、整列において配列ＩＤ番号１のカウンターパートと同一であってはならない。
【００４６】
ここで参照されるリガンドは、細胞の表面上でアクセス可能な標的分子に結合し又は結合可能である。好ましくは、リガンドは、細胞の表面上でアクセス可能な標的分子に特異的に結合し又は特異的に結合可能であり、これにより、「特異的に結合する」という用語は、対象となる特定の標的分子にリガンドが結合する結合反応を参照するが、リガンドは、相当量（１０％未満）においては、細胞上にある他の分子又はリガンドが生体(organism)内において接触する可能性のある他の分子には結合しない。一般に、標的分子を「特異的に結合する」リガンドは、その標的分子に対して約１０５（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２又はそれ以上）モル／リットルを超える平衡親和定数(equilibrium affinity constant)を有する。好ましくは、リガンドは、ウイルスが細胞と融合する能力を媒介するので、より好ましくはウイルスは次いで細胞に侵入し、更に好ましくは細胞を死滅させる。リガンドはヒトに有害ではないことが理解される。また、リガンドはヘルペスウイルスタンパク質ではないか、又はヘルペスウイルスタンパク質から改変によって誘導されない。
【００４７】
リガンドは、細胞上でアクセス可能な標的分子に特異的に結合することができる天然又は人工のポリペプチドリガンドであってよく、好ましくは異種ポリペプチドリガンドは、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子又は疾患細胞上にある標的分子に結合可能である。天然ポリペプチドリガンドは、標的分子に結合可能な天然ポリペプチドである。このように、リガンドは、細胞上でアクセス可能な受容体分子等の天然標的分子の天然リガンドであってよい。そのようなリガンドの例は、サイトカイン、ケモカイン、免疫チェックポイントブロッカー、又は成長因子であってよい。既知の例は、ＥＧＦ及びＩＬ１３である。あるいは、リガンドは、標的分子に結合する抗体である。あるいは、リガンドは、人工標的分子に結合するように選択された天然ポリペプチドであり、これにより、標的分子はリガンドに結合可能に設計される。天然ポリペプチドは、任意の生体に由来してよく、好ましくはヒトに有害でない生体に由来してよい。例えば、天然ポリペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス（Saccharomyces）属からのポリペプチドのような真菌性又は細菌性のポリペプチドである。天然ポリペプチドの例は、ＧＣＮ４酵母転写因子である。人工ポリペプチドリガンドは、特定の標的分子を結合するように機能する天然には生じないアミノ酸配列を有する。人工ポリペプチドリガンドの配列は、アミノ酸の挿入、欠失、置換及び／又は付加を含む改変された天然ポリペプチドに由来してよく、これにより、対応する天然ポリペプチドの結合能力が保持される。例えば、リガンドは、対応する全長ポリペプチドが結合する標的分子に結合可能である限り、上記で参照された天然ポリペプチドの一部であってよい。あるいは、天然ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドの少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％に対してアミノ酸同一性を備えるように改変されたものであり、これにより、改変ポリペプチドは、標的分子への結合等、対応する天然ポリペプチドの活性を保持する。あるいは、人工ポリペプチドリガンドは、２７４アミノ酸残基以下、好ましくは２００アミノ酸残基未満、より好ましくは５０アミノ酸残基未満、更に好ましくは４０アミノ酸残基未満、更に好ましくは１０〜３０アミノ酸の間、最も好ましくは２０アミノ酸を有していてよく、天然ポリペプチドの一部又は（ランダム）ペプチドライブラリーからのペプチド等である。あるいは、ポリペプチドは、標的分子に結合する抗体誘導体又は抗体模倣物である。抗体、抗体誘導体又は抗体模倣物は、単一特異的（即ち、細胞の表面上でアクセス可能な１つの標的分子に特異的）であってよく、又は多重特異的（即ち同じ又は異なる細胞の表面上でアクセス可能な２つ以上の標的分子に特異的）、例えば二重特異的又は三重特異的（例えば、Castoldi et al., 2013, Castoldi et al., 2012）であってよい。ウイルスの特異性は、同じ細胞上の２つ以上の標的分子を同時に標的化することによって増大する。異なる細胞上にある２つ以上の標的分子が標的化される場合、腫瘍の異種性に対処することができる。
【００４８】
ここで参照される「抗体誘導体」の用語は、少なくとも１つの抗体可変ドメインを備えているが、抗体の全体構造を備えているわけではない分子を参照する。抗体誘導体は、依然として標的分子に結合可能である。好ましくは、抗体誘導体は、ウイルスが細胞と融合する能力を媒介するので、より好ましくはウイルスは細胞に侵入し、更に好ましくは細胞を死滅させる。前記誘導体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ等の抗体断片、若しくはその一部、又はナノボディ(nanobodies)、ダイアボディ(diabodies)、ミニボディ(minibodies)、ラクダ科単一ドメイン抗体(camelid single domain antibodies)、単一ドメイン若しくはＦａｂ断片等の免疫グロブリンの他の誘導体若しくは組合せ、可変領域の重鎖及び軽鎖のドメイン（Ｆｄ、Ｖラムダ及びＶカッパを含むＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ等）、その他少なくとも２つの構造ループによって連結された免疫グロブリンドメインの２つのベータストランドからなるミニドメインであってよい。好ましくは、抗体誘導体は、単鎖抗体、より好ましくは、短いリンカーペプチドで連結した免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であるｓｃＦｖである。ＶＨのＮ末端はＶＬのＣ末端に連結されるか、又はＶＬのＮ末端はＶＨのＣ末端に連結される。
【００４９】
ここで参照される「抗体模倣物」の用語は、抗体と同様に、抗原を特異的に結合することができるが、抗体と構造的には関連していない有機化合物を参照する。それらは、通常、約３〜２０ｋＤａのモル質量を有する人工のペプチド又はタンパク質である。それらは、治療効果又は診断効果を有していてよい。抗体模倣物の限定されない例は、アフィボディ(affibodies)、アフィリン(affilins)、アフィマー(affimers)、アフィチン(affitins)、アンチカリン(anticalins)、アビマー(avimers)、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー(fynomers)、クニッツドメインペプチド(Kunitz domain peptides)、モノボディ(monobodies)、タンパク質ＡのＺドメイン、ガンマＢ結晶、ユビキチン(ubiquitin)、シスタチン(cystatin)、スルフォロブスアシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)からのＳａｃ７Ｄ、リポカリン(lipocalin)、膜受容体のＡドメイン、アンキリン反復モチーフ(ankyrin repeat motive)、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン、プロテアーゼ抑制剤のクニッツドメイン、フィブロネクチンの１０番目のＩＩＩ型ドメイン(the 10th type III domain of fibronectin)、合成ヘテロ二価又はヘテロ多価リガンド(Josan et al., 2011, Xu et al., 2012, Shallal et al., 2014)である。
【００５０】
ここで参照される「異種ポリペプチドリガンド」又は「リガンド」の用語は、２、３、又は４リガンド等の１つ以上のリガンドを含む。このことは、組み換えヘルペスウイルスが１つのリガンドを備えていてよく又は２つ以上のリガンドを備えていてもよいことを意味する。１つのリガンドの存在は、１つの標的細胞タイプの標的化を可能にする。２つ以上のリガンドが存在する場合、それらのリガンドは、１つのｇＢにおいて当該ｇＢ分子内の異なる部位上又は同じ部位上に位置するように融合又は挿入されていてよく、即ち逐次的に融合又は挿入されていてよく、あるいはそれらのリガンドは、異なるｇＢｓに融合又は挿入されていてもよい。あるいは、２つ以上のリガンドが存在する場合、２番目のリガンド又は更なる１つ以上のリガンドは、ｇＤ及び／又はｇＨ等のｇＢ以外のヘルペスウイルスの糖タンパク質に含まれていてもよい。異なるリガンドは、同じ標的細胞上又は異なる標的細胞上、好ましくは異なる標的細胞上に存在する、異なる標的分子を標的化してよい。上記に類似して、ここで用いられる「標的分子」の用語は、２、３、又は４標的分子等の１つ以上の標的分子を含む。結果として、組み換えヘルペスウイルスは、１つの標的細胞に結合してよく、あるいは２つ、３つ、又は４つの異なる細胞等の２つ以上の標的細胞に結合してもよい。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態においては、異種ポリペプチドリガンドは、疾患細胞上、好ましくは腫瘍細胞上、より好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、又は唾液腺腫瘍細胞等のＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞上の天然受容体に結合可能な人工ポリペプチド、好ましくはｓｃＦｖである。より好ましい実施形態においては、異種ポリペプチドリガンドは、ＨＥＲ２に結合可能なｓｃＦｖである。最も好ましい実施形態においては、異種ポリペプチドリガンドは、配列ＩＤ番号３２によって特定されるｓｃＦｖである。
【００５２】
本発明の付加的又は代替的に好ましい実施形態においては、異種ポリペプチドリガンドは、細胞培養物中に存在する細胞上にある人工標的分子に結合可能な人工ポリペプチド、好ましくは天然ポリペプチドの一部である。リガンドの長さは、より好ましくは約５０アミノ酸残基未満、更に好ましくは約４０アミノ酸残基未満、更に好ましくは約１０〜約３０アミノ酸、又は最も好ましくは２０アミノ酸である。リガンド及び標的分子は、互いに結合するように特異的に構築される。より好ましくは、異種ポリペプチドリガンドは、ＧＣＮ４酵母転写因子の一部である。更に好ましくは、異種ポリペプチドリガンドは、配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部であり、最も好ましくはリガンドは、配列ＩＤ番号３７の配列によって特定される分子である。代替的な実施形態においては、リガンドは、配列ＩＤ番号３８の配列によって特定される分子であってもよい。
【００５３】
本発明のより好ましい実施形態においては、上述した好ましい実施形態及び代替的実施形態が組み合わされる。即ち、本発明の組み換えヘルペスウイルスは２つの異種ポリペプチドリガンドを同時に備え、一方は疾患細胞に結合可能であり、他方は細胞培養物中に存在する細胞に結合可能である。
【００５４】
ｇＢに融合又は挿入されたポリペプチドリガンドとして使用されるＧＣＮ４酵母転写因子は先端技術である（例えば、Arndt and Fin, 1986; Hope and Struhl, 1987参照）。例示的なＧＣＮ４酵母転写因子は、ＡＪ５８５６８７．１（配列ＩＤ番号４２）によってコードされた配列ＩＤ番号４３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ-Ｐ０３０６９（ＧＣＮ＿ＹＥＡＳＴ））によって特定されるものである。ここで参照される「ＧＣＮ４酵母転写因子」の用語は、天然に存在する任意のＧＣＮ４酵母転写因子を参照する。あるいは、ここで参照されるＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号４３の配列の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％に対してアミノ酸同一性を有する任意のＧＣＮ４酵母転写因子を参照する。あるいは、ここで参照されるＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号４３の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％に対してアミノ酸相同性を有する任意のＧＣＮ４酵母転写因子を参照する。ＧＣＮ４酵母転写因子は、配列ＩＤ番号４３の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％に対して同一性を有する場合、配列ＩＤ番号４３の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％に対してアミノ酸相同性を有する場合、又は配列ＩＤ番号４３に係るＧＣＮ４酵母転写因子と同じ活性を有する場合、「相同」又は「相同体」である。好ましくは、「同じ活性」は、ＧＣＮ４酵母転写因子が配列ＩＤ番号４３に係るＧＣＮ４酵母転写因子と同じように転写因子として働くという意味で理解されてよい。用語「その一部」は、「その一部」が結合可能な標的分子がＧＣＮ４酵母転写因子の任意の部分に対して生成され得る場合のその部分を含む。従って、好ましくは、「その一部」の長さは、２７４アミノ酸以下、好ましくは２００アミノ酸残基未満、より好ましくは５０アミノ酸残基未満、更に好ましくは４０アミノ酸残基未満、更に好ましくは１０〜３０アミノ酸の間、更に好ましくは２０アミノ酸のリガンド長がもたらす長さであり、これによりリガンドはリンカー配列等の追加の配列を含んでいてよい。最も好ましい「その一部」は、２つの隣接ｗｔ（野生型）ＧＣＮ４残基が各側に付加されてよいＧＣＮ４酵母転写因子の配列YHLENEVARLKK（配列ＩＤ番号３８）である。ｇＢへの融合又は挿入のために、ペプチドの各側にＧＳリンカーが追加的に存在していてよい。この構築物は、ここではＧＣＮ４ペプチド（配列ＩＤ番号３７）と命名される。この２０アミノ酸ペプチドは、ヘルペスウイルスに対して、「その一部」が結合する標的分子を有する細胞株に感染してそこで複製する能力を付与する。
【００５５】
本発明の組み換えヘルペスウイルスにおいて、リガンドは、成熟ｇＢ（配列ＩＤ番号２）のアミノ酸１３及び１４に対応するｇＢのアミノ酸４３及び４４の間のｇＢに融合又は挿入されていてよい。この文脈において、ここで用いられる「融合された」又は「融合」の用語は、直接的に又はペプチドリンカーを介して間接的に、ペプチド結合によるｇＢのＮ末端アミノ酸へのポリペプチドリガンドの付加を参照する。「融合された」又は「融合」がｇＢの末端への付加を意味する限りにおいて、Ｎ末端領域に対する「融合された」又は「融合」は「挿入」とは異なる一方で、「挿入」はｇＢへの組み込みを意味する。
【００５６】
ここで参照されるペプチドリンカーは、ポリペプチド内で、異なる供給源に由来するポリペプチド配列を連結するように機能する。このようなリンカーは、連結するように機能すると共に異種ポリペプチドリガンドの糖タンパク質Ｂ配列との適切な折り畳みを可能にし又は異種ポリペプチドリガンド内のリガンド部分を連結するように機能する。リンカーはまた、リガンド配列をｇＢ以外の糖タンパク質配列と連結するように機能してよい。リンカーは、典型的には１及び３０アミノ酸の間の長さ、好ましくは５〜２５アミノ酸の長さ、より好ましくは８、１２又は２０アミノ酸等の８〜２０アミノ酸の長さを有し、任意のアミノ酸を備えていてよい。好ましくは、リンカーは、１つ以上のアミノ酸Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒ及び／又はＴｈｒを含み、より好ましくは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ及び/又はＴｈｒからなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸を備える。最も好ましくは、リンカーは、アミノ酸Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒからなる。Ｇｌｙ及び／又はＳｅｒに基づくリンカーは、柔軟性、良好な溶解性及びタンパク質分解に対する耐性を提供する。あるいは、リンカーは、グリシン、セリン及び／又はトレオニンを主に備えていなくてもよいが、グリシン、セリン及び／又はスレオニンは存在しなくてもよく又は僅かしか存在しなくてもよい。
【００５７】
本発明の組み換えヘルペスウイルスにおいては、リガンドは、ｇＢの不規則領域(disordered region)内の任意のアミノ酸に代替的に挿入されていてよく、これにより、リガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内におけるいずれのアミノ酸にも挿入されていない。しかし、１２０アミノ酸を超えない短い長さのリガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内において挿入されていてよい。ここで参照される場合、不規則領域は、固定された三次構造を欠き、構造化されておらず、結果として結晶構造内で解くことのできない領域を備えていることを意味する。しばしば、不規則領域は拡張され、即ちランダムコイル状に拡張され、あるいはつぶれている、即ちモルテングロビュール(molten globule)状につぶれている。ｇＢ内の不規則領域は、ガラハーら、２０１４、ヘルドワインら、２００６、及びリンら、２００７(Heldwein et al., 2006, and Lin et al., 2007)において参照されており、ＨＳＶｇＢのＮ末端領域（アミノ酸３１からアミノ酸１０８まで伸びる）内、中央領域（アミノ酸４６０からアミノ酸４９１まで伸びる）内及びＣ末端領域（アミノ酸７９６からアミノ酸９０４まで伸びる）内に存在していてよい（Heldwein et al., 2006）。不規則であると言及される位置は、ＨＳＶ‐１ｇＢのアミノ酸３１〜１０８（Ｎ末端領域）(Lin et al., 2007)、アミノ酸４６０〜４９１（中央領域）(Heldwein et al., 2006)及びアミノ酸７９６〜９０４（Ｃ末端領域）(Heldwein et al., 2006, Lin et al. 2007)である。好ましくは、リガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸３１〜１０８又は４６０〜４９１にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内の任意のアミノ酸に挿入されていてよい。リガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内において挿入されていない。しかし、１２０アミノ酸を超えない短い長さのリガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内において挿入されていてよい。
【００５８】
あるいは、リガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸３１〜７７若しくは８８〜１８４、好ましくはアミノ酸３１〜７７若しくは８８〜１３６若しくはより好ましくは３１〜７７若しくは８８〜１０８にわたる領域内、若しくはアミノ酸４０９〜５４５、好ましくはアミノ酸４５９〜５４５、より好ましくはアミノ酸４５９〜４９７、若しくは更に好ましくはアミノ酸４６０〜４９１にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内における任意のアミノ酸に挿入されていてよい。また、１２０アミノ酸を超えない短い長さのリガンドは、配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内において挿入されていてよい。これらの領域は、ｇＢの不規則領域内に位置するアミノ酸を含むが、不規則領域の近傍に位置するアミノ酸をも含む。上述したそれらの領域は、ポリペプチド挿入を受け入れることにより、ｇＢ及び受容体を担持している細胞の膜融合を媒介する融合因子として機能するｇＢの能力を維持することが分かっている(Gallagher et al., 2014; Lin and Spear, 2007; Potel et al., 2002)。
【００５９】
リガンドがｇＢに挿入されるという意味でここで参照される「挿入された」又は「挿入」という用語は、ｇＢ内へのポリペプチドリガンドの組み込みを参照し、組み込まれたポリペプチドは、直接的に、又は１つ以上のペプチドリンカー、より具体的には挿入部分に関して上流側及び／又は下流側に位置するペプチドリンカーを介して間接的に、ペプチド結合によって、ｇＢの２つのアミノ酸の間に導入される。リンカーはポリペプチドリガンドに直接連結される。ｇＢへのポリペプチドリガンドの融合はまた、配列ＩＤ番号１又は相同ｇＢによって例示されるｇＢ前駆体の、ｇＢのアミノ酸１の直前へのポリペプチドリガンド配列の挿入としても見ることができ、このような挿入をここでは融合と称する。融合又は挿入されたポリペプチドを担持しているｇＢは、ここではキメラｇＢと称される。キメラｇＢは、ビリオンエンベロープの一部である。「リンカー」の定義は上述したとおりである。
【００６０】
挿入及び融合は、好ましくは、ＨＳＶのゲノム中のｇＢ遺伝子の遺伝子操作によって実施される。ＨＳＶゲノムの遺伝子操作は当該分野において既知であり、限定はされないが、ＢＡＣ技術が例示される。
【００６１】
本発明者らは、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖがアミノ酸８１〜８２の間に挿入される、配列ＩＤ番号３により例示されるｇＢのアミノ酸７７〜８８の領域内でのアミノ酸への異種ポリペプチドリガンドの挿入が、リガンドの受容体を担持している細胞に対する組み換えヘルペスウイルスの再標的化をもたらさないことを見出した。本発明者らは、この再標的化の欠如の理由が、この領域内の高プロリン領域(proline-rich region)（ＰＰＰＰＸＰ）及び予測されるＮグリコシル化部位（ＮＡＴ）の存在であると考えている。プロリンは、タンパク質二次構造を破壊し、及び／又はそれ自身の種類の二次構造であって、二次構造の他の形態を無効にする(overrides)制限されたファイ角(confined phi angle)を有する二次構造を課し(Morgan and Rubistein, 2013)、またポリプロリンヘリックスが局所的形状において急な屈曲を誘発し得るので、この領域におけるポリプロリンストレッチは、リガンドによって採用された立体構造を制限した可能性がある。加えて、この領域内のＮグリコシル化部位は、リガンドを遮蔽していた可能性がある。結果として、リガンドは、細胞表面上のその受容体との相互作用に対して十分には利用可能でない可能性がある。また、本発明者らは、異種ポリペプチドリガンドが短い長さのものである場合に、ｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内の任意のアミノ酸への異種ポリペプチドリガンドの挿入が、リガンドの受容体を担持している細胞に対する組み換えヘルペスウイルスの再標的化をもたらしていることも見出した。従って、本発明は、標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドであってヘルペスウイルスのエンベロープ内に存在する糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に挿入された異種ポリペプチドリガンドを備える組み換えヘルペスウイルスであって、リガンドが、短い長さを有し且つ配列ＩＤ番号１に係るｇＢのアミノ酸７７〜８８にわたる領域内又は相同ｇＢの対応領域内における任意のアミノ酸に挿入されている、組み換えヘルペスウイルスを提供する。「短い長さ」は、５〜１２０アミノ酸、５〜１１０、５〜１００、５〜９０、５〜８０、５〜７０、５〜６０、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２５、１０〜３０、１０〜２０、２０又は１２アミノ酸等の１２０アミノ酸を超えない長さを意味する。好ましくは、リガンドは１０〜３０アミノ酸の長さを有し、より好ましくはリガンドは１２〜２０アミノ酸の長さを有し、更に好ましくはリガンドは１２又は２０アミノ酸である。挿入は、アミノ酸７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、又は８７の後ろ等のアミノ酸７７〜８８の間の任意のアミノ酸におけるものであってよい。好ましくは、リガンドは、アミノ酸８１及び８２の間に挿入される。上述した任意のアミノ酸の後ろで挿入された上述の長さのリガンドの任意の組み合わせは、リガンドの標的分子に対するヘルペスウイルスの再標的化をもたらす。好ましくは、異種ポリペプチドリガンドは、配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部のようなＧＣＮ４酵母転写因子の一部等の、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能な天然のポリペプチドの一部であってよい。最も好ましくは、リガンドは、配列ＩＤ番号３７の配列によって特定される���子である。このようなリガンドは、アミノ酸７７〜８８にわたる領域内の任意のアミノ酸に挿入されてよく、好ましくはアミノ酸８１〜８２の間に挿入される。最も好ましくは、リガンドは、ｇＢのアミノ酸８１及び８２の間に挿入された配列ＩＤ番号３７の配列によって特定される分子である。アミノ酸番号は、配列ＩＤ番号１又は相同ｇＢの対応アミノ酸を参照する。
【００６２】
ここで用いられる場合、標的分子は、細胞の表面上でアクセス可能な任意の分子であって、異種ポリペプチドリガンドによって結合され得る任意の分子であってよい。標的分子は、ポリペプチド若しくはタンパク質等の天然分子、糖脂質又はグリコシドであってよい。例えば、標的分子は、タンパク質受容体等の受容体であってよい。受容体は、リガンドの結合を介して外部から化学信号を受け取り、何らかの形態の細胞応答を生じさせる、細胞の膜に埋め込まれた分子である。あるいは、標的分子は、細胞の表面上に存在する酵素、輸送体又はイオンチャネル等の薬物標的である分子であってよい。好ましくは、標的分子は、疾患細胞上又は細胞培養物中に存在する細胞上にある。好ましい標的分子は、生体の疾患細胞上に以下に述べるような特異的な又は異常な様式(specific or abnormal manner)で自然に存在するものである。「特異的な様式」は、標的分子が疾患細胞上で過剰に発現しているという意味で理解されてよいが、標的分子は、正常細胞上では発現していないか、発現していても僅かな程度、即ち標的分子がそれぞれの正常細胞上に通常存在するほどの程度でしかない。「異常な様式」は、標的分子が、それぞれの非疾患細胞のそれぞれの分子との対比において、疾患細胞上に変異形態で存在するという意味で理解されてよい。従って、特異的に発現又は変異した標的分子等の標的分子にヘルペスウイルスを再標的化すると、結果として、標的分子を担持していない又は標的分子をより低いレベルで担持している又は野生型（変異していない）標的分子を担持している細胞と比較して、標的分子を担持している細胞の感染率及び根絶率がより高くなる。
【００６３】
あるいは、標的分子は人工分子であってよい。ここで参照される「人工標的分子」の用語は、天然に存在しない分子、即ち非天然アミノ酸配列を有する分子である。このような人工分子は、例えばダグラスら、１９９９及びナカムラら、２００５(Douglas et al., 1999; and Nakamura et al., 2005)に記載されているように、その表面上の細胞によって発現するように構築されてよく、あるいは細胞表面によって結合されてよい。人工標的分子は、特定のリガンドを結合するように機能する天然には生じないアミノ酸配列を有する。人工標的分子の例は、抗体誘導体又は抗体模倣物である。人工標的分子は、好ましくは、組み換えヘルペスウイルスを産生するために使用されてよい細胞培養物中に存在する細胞の表面上にある。細胞培養物中に存在する細胞上にある好ましい人工標的分子はｓｃＦｖである。人工標的分子との関連で、抗体は、抗体が天然には産生されない細胞培養物中に存在する細胞上にあってよい「人工標的分子」という用語に含まれる。
【００６４】
好ましい実施形態においては、標的分子は、、腫瘍関連受容体であり、好ましくはＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＩＩＩ若しくはＥＧＦＲ３（ＥＲＢＢ３）、ＥＧＦＲｖＩＩＩを含むＥＧＦ受容体ファミリーのメンバー、ＭＥＴ、ＦＡＰ、ＰＳＭＡ、ＣＸＣＲ４、ＣＥＡ、ＣＡＤＣ、ムチン、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＶＥＧＦ受容体１及び２、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５５、インテグリンファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、エフリン受容体ファミリー、タンパク質‐チロシンキナーゼ（ＴＫ）ファミリー、ＲＡＮＫＬ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＩＬ１３Ｒアルファ、ＵＰＡＲ、テネイシン、ＰＤ‐１、ＰＤ‐Ｌ１、ＣＴＬ‐Ａ４、免疫チェックポイントファミリー制御因子の追加メンバー、腫瘍関連糖タンパク質７２、ガングリオシドＧＭ２、Ａ３３、ルイスＹ抗原、又はＭＵＣ１であり、最も好ましくはＨＥＲ２である。好ましくは、標的分子は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、若しくは唾液腺腫瘍細胞等の何らかの腫瘍細胞によって過剰発現されるが、非悪性組織においては非常に低いレベルでしか発現されないＨＥＲ２である。腫瘍関連受容体は、腫瘍細胞によって特異的又は異常な様式で発現される受容体である。あるいは、標的分子は、細胞に感染した病原体（例えば、ウイルス、バクテリア又はパラサイト）等の感染因子に由来する分子である。標的分子は、感染細胞（ＨＢＶからのＨＢｓＡｇ、ＨＩＶからのｇｐｌ２０、ＨＣＶからのＥ１又はＥ２、ＥＢＶからのＬＭＰ１又はＬＭＰ２等）の表面上で発現される。病原体は、慢性感染性疾患等の感染性疾患をもたらすことがある。あるいは、標的分子は、ＣＸＣＲ２若しくはＩＬ‐１受容体等のように、変性障害関連細胞(degenerative disorder-associated cell)によって又は老化細胞によって発現される。他の好ましい実施形態においては、標的分子は、抗体誘導体、より好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖであり、更に好ましくは配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖであり、更に好ましくは配列ＩＤ番号３９に含まれるｓｃＦｖであり、最も好ましくは配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子である。
【００６５】
ここで用いられる「細胞」の用語は、標的分子を担持する任意の細胞であって、本発明の組み換えヘルペスウイルスが感染し得る任意の細胞である。細胞は、疾患細胞等の望ましくなく排除されるべき自然発生の細胞であってよい。疾患細胞の例を以下に示す。好ましい疾患細胞は、ＨＥＲ２を備えるものである。あるいは、細胞は、組み換えヘルペスウイルスを産生するように機能する細胞であってよい。そのような細胞は、本発明の組み換えヘルペスウイルスが感染し得る任意の細胞であって、ヘルペスウイルスを産生することができる任意の細胞であってよい。また、ヒトにおける腫瘍細胞のような疾患細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質等の物質の導入を避けるために、疾患細胞においてヘルペスウイルスの増殖を回避すべきである。従って、ヘルペスウイルスを産生する細胞は、ヒトに存在する場合に有害でない細胞、例えば非疾患細胞である。細胞は細胞株として存在してもよい。組み換えヘルペスウイルスを産生するために、細胞は細胞培養物中に存在する。従って、組み換えヘルペスウイルスを産生するように機能する細胞は、ここでは「細胞培養物中に存在する細胞」と称する。このように、細胞は、ヘルペスウイルスの増殖に適した培養細胞であってよく、好ましくは、細胞はヘルペスウイルス増殖のために認められた細胞株である。そのような細胞の例は、Ｖｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞であり、好ましくはＶｅｒｏ細胞である。好ましくは、細胞培養物中に存在する細胞は、対応する親細胞によっては自然に発現されない標的分子を発現するように改変されており、あるいは細胞培養物中に存在する細胞が改変され、その表面上の標的分子を結合する。より好ましくは、細胞は、標的分子として抗体誘導体を備え、更に好ましくはｓｃＦｖを備え、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖを備え、更に好ましくは配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖを備え、更に好ましくは配列ＩＤ番号３９に含まれるｓｃＦｖを備え、最も好ましくは配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を備える。
【００６６】
「培養」細胞は、当該分野で知られているように、維持及び増殖されたインビトロ細胞培養物中に存在する細胞である。培養細胞は、一般にそれらの自然環境の外で、制御された条件下で増殖する。通常、培養細胞は、多細胞真核生物、特に動物細胞に由来する。「ヘルペスウイルスの増殖のために認められた細胞株」は、ヘルペスウイルスが感染し得ることが既に示されている、即ちウイルスが細胞に侵入し増殖してウイルスを産生できることが既に示されている任意の細胞株を含むことを意味する。細胞株は、単一細胞に由来し、同じ遺伝子組成を含む細胞の集団である。組み換えヘルペスウイルスの増殖及び産生のための好ましい細胞は、Ｖｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞である。
【００６７】
ここで用いられる「疾患細胞」の用語は、生体に悪影響を及ぼし、従って望ましくない細胞を参照する。このような細胞を死滅させることは、生命を守ることができ、あるいは生体の健康を増強するので、そのような細胞の根絶が望まれている。好ましい実施形態においては、疾患細胞は異常増殖を特徴とし、より好ましくは細胞は腫瘍細胞である。代替的な実施形態においては、細胞は、慢性感染細胞等の感染細胞、変性疾患関連細胞又は老化細胞である。
【００６８】
腫瘍細胞の場合、基礎疾患は腫瘍であり、好ましくは副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、未知の一次治療の癌、キャッスルマン疾患、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイングファミリーの腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン疾患、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭及び下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体部腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、唾液腺癌、成人の軟組織肉腫癌、皮膚癌、小腸癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される腫瘍である。好ましい腫瘍疾患は、ＨＥＲ２陽性癌（乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、骨肉腫及び多形性膠芽腫など）、ＥＧＦＲ陽性癌（頭頸部癌、多形性膠芽腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸及び膵臓癌など）、ＥＧＦＲ‐ｖＩＩＩ陽性癌（多形性膠芽腫など）、ＰＳＭＡ陽性癌（前立腺癌など）、ＣＤ２０＋陽性リンパ腫、並びにバーキットリンパ腫等のＢ細胞リンパ増殖障害、古典的ホジキンリンパ腫、及び免疫障害を持つ個体に生じるリンパ腫（移植後及びＨＩＶ関連リンパ増殖性障害）のようなＥＢＶ関連腫瘍、Ｔ細胞リンパ増殖性障害、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、鼻型節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫である。
【００６９】
感染細胞の場合、基礎疾患は慢性感染性疾患等の感染性疾患であり、感染因子はウイルス、バクテリア又はパラサイトであってよい。例は、結核、マラリア、慢性ウイルス性肝炎（ＨＢＶ、Ｄ型肝炎ウイルス及びＨＣＶ）、後天性免疫不全症候群（ＨＩＶ、ヒト免疫不全ウイルスによって引き起こされるＡＩＤＳ）、ＥＢＶ関連障害、又はＨＣＭＶ関連障害である。
【００７０】
変性疾患関連細胞の場合、基礎疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ルーゲーリック病、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、シャルコーマリーツース病（ＣＭＴ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性脳症、糖尿病、エーラーダンロス症候群、本態性振戦(essential tremor)、フリードライヒ失調症、ハンチントン病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、円錐角膜、球状角膜、黄斑変性症、マルファン症候群、多発性硬化症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、ニーマンピック病、骨粗しょう症、パーキンソン病、進行性核上麻痺、前立腺炎、網膜色素変性症、関節リウマチ、又はテイサックス病であってよい。「変性疾患関連細胞」の用語は、疾患と関連する細胞を参照し、細胞の変化が疾患の進行に寄与するか、あるいは疾患の結果として細胞が変化することを意味する。その細胞を破壊すると、その疾患の治療がもたらされる。
【００７１】
老化細胞の場合、基礎疾患は、（ｉ）早期老化を特徴とする早老症候群と呼ばれる希少遺伝的疾患：ウェルナー症候群（ＷＳ）、ブルーム症候群（ＢＳ）、ロスムンドトムソン症候群（ＲＴＳ）、コケーン症候群（ＣＳ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、硫黄欠乏性毛髪発育異常症(trichothiodystrophy)若しくはハッチンソンギルフォードプロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）又は（ｉｉ）肥満、２型糖尿病、サルコペニア、変形性関節症、特発性肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、白内障、神経変性疾患、全身性自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、又はシェーグレン症候群）、若しくは多発性硬化症等の共通年齢関連疾患、等の老化関連疾患である。
【００７２】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、キメラｇＢに加えて、ＷＯ２００９／１４４７５５に開示されるような改変ｇＤ糖タンパク質を備えていてよいが、改変の種類には限定されない。改変ｇＤは、成熟ｇＤのアミノ酸部分６〜３８の欠失を担持していてよい（配列ＩＤ番号５によって例示される；例示的なｇＤ野生型前駆体配列が配列ＩＤ番号４において示される）。あるいは、改変ｇＤは、ヘルペスウイルス親和性を天然受容体ネクチン１及びＨＶＥＭから脱標的化する(detarget)他の改変を担持していてもよい。ｇＤは、ヘルペスウイルス親和性を脱標的化とする改変に代えて、又はそれに加えて、選択された最適な受容体にヘルペスウイルスの親和性を再アドレスする追加的な配列をコードし、ここでいう選択された最適な受容体は、組み換えＲ‐ＬＭ１１３（配列ＩＤ番号６）に記載されているように、ＨＥＲ２受容体等の疾患細胞上の受容体である。ｇＤの改変は、ここで定義されるような異種ポリペプチドリガンドをｇＤに融合させ又は挿入することによって生じる。本発明の組み換えヘルペスウイルスは、キメラｇＢに加えて、標的受容体分子にｇＨを再標的化することが可能な改変ｇＨ糖タンパク質であって、ここで定義されるような異種ポリペプチドリガンドを備える改変ｇＨ糖タンパク質を備えていてよい。本発明の組み換えヘルペスウイルスは、キメラｇＢに加えて、ガッタら、２０１５(Gatta et al., 2015)に開示されるような改変ｇＤ及び改変ｇＨ糖タンパク質を備えていてよいが、それらの記載には限定されない。両文献は参照によりここに組み込まれる。ｇＤ及び／又はｇＨの改変は、ここに定義される疾患細胞に対してヘルペスウイルスの親和性を再アドレスするのに役立つ。
【００７３】
このように、本発明の実施形態においては、本発明の組み換えヘルペスウイルスは、疾患細胞等の細胞、例えばＨＥＲ２を発現する細胞、又は細胞培養物中に存在する細胞等の細胞上でアクセス可能な標的分子に結合するリガンドを備えるキメラｇＢと、改変ｇＤとを備え、それにより、改変はアミノ酸６〜３８の欠失であってよい。ｇＤは、代替的に又は加えて、ヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化することが可能なここで定義される異種ポリペプチドリガンドの挿入によって改変されていてよい。加えて又は代替的に、組み換えヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスを疾患細胞に再標的化することが可能なここで定義される異種ポリペプチドリガンドを備える改変ｇＨを備えていてよい。
【００７４】
また、本発明者らは、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域に関するｇＤからのアミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの欠失が、非改変ｇＤの天然受容体から脱標的化される組み換えヘルペスウイルスをもたらすことを見出した。このように、本発明の実施形態においては、組み換えヘルペスウイルスは、ここで定義されるｇＢに融合又は挿入されリガンドの標的分子に再標的化されるここで定義される異種ポリペプチドリガンドとｇＤとを備え、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域に関して、ｇＤのアミノ酸３０〜３８又はそのサブセット、好ましくはアミノ酸３０及び／又は３８、より好ましくはアミノ酸３０及びアミノ酸３８が、組み換えペルペスウイルスから欠失している。
【００７５】
欠失アミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの代わりに、ここで定義される異種ポリペプチドリガンドが挿入されてよく、それにより、非改変ｇＤの天然受容体からの組み換えヘルペスウイルスの脱標的化及びリガンドの標的分子への再標的化がもたらされる。異種ポリペプチドリガンドによるサブセットの置換に加えて、アミノ酸３０〜３８内の追加のアミノ酸又は追加の範囲のアミノ酸が欠失していてよい。このように、好ましい実施形態においては、アミノ酸３０及び３８が欠失し、異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３０又は３８の代わりに挿入される。より好ましくは、アミノ酸３０及び３８が欠失し、異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３８の代わりに挿入される。
【００７６】
「そのサブセット」という用語は、アミノ酸３０〜３８からなる領域のうちの１つのアミノ酸又は２、３、４、５、６、７、又は８等の少なくとも２つの隣接アミノ酸を意味する。従って、「そのサブセット」は、アミノ酸３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、又は３８、３０〜３１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３１〜３２、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３２〜３３、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３３〜３４、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３４〜３５、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３５〜３６、３５〜３７、３５〜３８、３６〜３７、３６〜３８、３７〜３８を意味してよい。「サブセット」という用語は、２、３、４、又は５サブセット等の１つ以上のサブセットを備えていてよい。例えば「サブセット」は、アミノ酸３０及びアミノ酸３８を備えていてよく、その欠失は、アミノ酸３０及び３８を備えていないｇＤをもたらす。アミノ酸３０〜３８のサブセット又は全体の欠失は、ネクチン１に対するｇＤの結合能力を低下させるｇＤのネクチン１結合部位の不活性化及び／又はＨＶＥＭに対するｇＤの結合能力を低下させるｇＤのＨＶＥＭ結合部位の不活性化をもたらす。例えば、アミノ酸３０が欠失すると、ｇＤのＨＶＥＭ結合部位が不活性化され、アミノ酸３８の欠失は、ネクチン１結合部位の不活性化をもたらす。アミノ酸３０及び３８の両方の欠失は、ＨＶＥＭ結合部位及びネクチン１結合部位の不活性化をもたらす。
【００７７】
アミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの代わりに挿入される異種ポリペプチドリガンドは、疾患細胞上に存在する標的分子に結合可能なリガンド、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、又は唾液腺腫瘍細胞等の癌細胞上に存在するＨＥＲ２等の標的分子に結合可能なｓｃＦｖ、より好ましくは配列ＩＤ番号３２によって特定されるｓｃＦｖであってよく、それにより、標的分子は、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞上に存在するＨＥＲ２である。
【００７８】
本発明の特に好ましい実施形態においては、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドは、アミノ酸４３〜４４の間のｇＢに挿入され、疾患細胞上に存在する標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドは、ｇＤのアミノ酸３８の代わりに挿入され、ｇＤからアミノ酸３０が更に欠失する。最も好ましくは、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドは、配列ＩＤ番号３７によって特定される配列を備え、標的分子は、配列ＩＤ番号４１によって特定される配列を有する分子であり、細胞培養物中に存在する細胞は、配列ＩＤ番号４１の配列によって特定される分子を発現し、疾患細胞上に存在する標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドは、配列ＩＤ番号３２によって特定されるｓｃＦｖを備え、標的分子はＨＥＲ２であり、細胞は、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞、好ましくは乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形性膠芽腫細胞、又は唾液腺腫瘍細胞である。
【００７９】
また、ｇＤを備える組み換えヘルペスウイルスが開示され、そこからは、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応領域若しくは対応アミノ酸に関するアミノ酸３０〜３８又はそのサブセット、好ましくはアミノ酸３０及び／又は３８、より好ましくはアミノ酸３０及びアミノ酸３８が欠失している。欠失アミノ酸３０〜３８又はそのサブセットの代わりに、ここで定義される異種ポリペプチドリガンドが挿入されてよく、それにより、非改変ｇＤの天然受容体からの組み換えヘルペスウイルスの脱標的化及びリガンドの標的分子への再標的化がもたらされる。異種ポリペプチドリガンドによる欠失アミノ酸又は欠失アミノ酸の範囲の置換に加えて、アミノ酸３０〜３８内の追加のアミノ酸又は追加の範囲のアミノ酸が欠失していてよい。このように、例えば、アミノ酸３０及び３８が欠失し、異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３０又は３８の代わりに挿入される。例えば、アミノ酸３０及び３８が欠失し、異種ポリペプチドリガンドがアミノ酸３８の代わりに挿入される。
【００８０】
ｇＤに関するアミノ酸番号は、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤ又は相同ｇＤの対応アミノ酸を参照する。従って、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤに関するアミノ酸３０はアミノ酸５５に対応し、配列ＩＤ番号６２に係る成熟ｇＤに関するアミノ酸３８は配列ＩＤ番号４（前駆体形態）に係るアミノ酸６３に対応する。ｇＢに関するアミノ酸番号は、配列ＩＤ番号１（前駆体形態）に係るｇＢ又は相同ｇＢの対応アミノ酸を参照する。
【００８１】
ｇＤ相同体は、ヘルペスウイルス科のアルファサブファミリーの幾つかのメンバーにおいて見出される。従って、ここで参照される「相同ｇＤ」の用語は、ヘルペスウイルス科のｇＤコード化メンバー(gD-encoding members)において見出される任意のｇＤ相同体を参照する。あるいは、ここで参照される相同ｇＤは、それぞれ配列ＩＤ番号４又は６２の配列の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％に対してアミノ酸同一性を有する任意のｇＤ、前駆体又は成熟体を参照する。あるいは、ここで参照される相同ｇＤは、それぞれ配列ＩＤ番号４又は６２の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％に対してアミノ酸相同性を有する任意のｇＤ、前駆体又は成熟体を参照する。ここで参照される相同ｇＤは、ｇＤの断片をも含む。好ましくは、それぞれ配列ＩＤ番号４又は６２の配列に対して上述したアミノ酸同一性又は相同性を有する、ヘルペスウイルス科で見出される任意のｇＤ、任意のｇＤ、前駆体又は成熟体を含む、ここで参照される相同ｇＤ、及びｇＤの任意の断片は、配列ＩＤ番号４又は６２に係るｇＤの同じ活性を有する。より好ましくは、細胞へのウイルスの侵入プロセスの間、ｇＤはその受容体の１つに結合し、それにより更に好ましくはｇＨ／ｇＬヘテロ二量体と相互作用し、更に好ましくは結果としてｇＤのプロフュージョンドメイン(profusion domain)を除去する。
【００８２】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、更に、上記で定義した細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子をコードしてよい。宿主免疫応答を刺激する分子は、「免疫療法分子(immunotherapy molecule)」とも称される。従って、本発明の組み換えヘルペスウイルスは、組合わされた腫瘍溶解性及び免疫療法ウイルス(combined oncolytic and immunotherapeutic virus)であってよい。免疫療法ウイルスは、細胞に対する宿主免疫応答を増強する分子をコードするウイルス、即ち細胞に対して向けられるように宿主免疫応答を刺激する分子をコードするウイルスである。そのようなウイルスの例は、Ｔ‐ＶＥＣである（Liu et al., 2003）。
【００８３】
キメラｇＢに加えて、免疫療法分子は、組み換えウイルスが、異種ポリペプチドリガンドを介した細胞の特異的な標的化及び死滅に加えて、特異的又は非特異的な様式で被験体の免疫系を刺激することを可能にする。被験体における組み換えウイルスによる免疫療法分子の発現は、最終的に疾患細胞の死滅をもたらす免疫応答を引き起こすことができる。免疫療法は特異的に作用してよく、免疫療法分子は、１つ以上の細胞上に存在する１つ又は幾つかの特異抗原に対する被験体の免疫系を刺激する。例えば、免疫療法分子は、特異的細胞表面受容体、例えばＣＤ２０、ＣＤ２７４、及びＣＤ２７９に対して向けられる抗体であってよい。一旦抗原に結合すると、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)を引き起こすことができ、補体系を活性化することができ、あるいは受容体がそのリガンドと相互作用するのを防ぐことができる。その全てが細胞死をもたらすことができる。好ましい細胞は腫瘍細胞である。この技術は当該分野において既知であり認められている。アレムツズマブ(Alemtuzumab)、イピリムマブ(Ipilimumab)、ニボルマブ(Nivolumab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、及びリツキシマブ(Rituximab)を含む、癌を治療するために認められた複数の抗体がある。あるいは、免疫療法分子は、被験体の免疫系を刺激することによって非特異的に作用することができる。免疫療法分子の例は、なかでもサイトカイン、ケモカイン又は免疫チェックポイント制御因子である。例えば、幾つかのサイトカインは、抗腫瘍活性を増強する能力を有し、受動的癌治療として使用することができる。サイトカインの免疫療法分子としての使用は、当該分野において既知である。サイトカインの例は、ＧＭ‐ＣＳＦ、インターロイキン２(interleukin-2)、インターロイキン１２、又はインターフェロンαである。ＧＭ‐ＣＳＦは、例えば、ホルモン抵抗性前立腺癌(hormone-refractory prostate cancer)又は白血病の治療に使用される。インターロイキン２は、例えば、悪性黒色腫及び腎細胞癌の治療に使用される。ＩＬ‐１２は、膠芽細胞腫の実験的治療に使用される。インターフェロンαは、例えば、有毛細胞白血病、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病及び悪性黒色腫の治療に使用される。
【００８４】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、例えば、ウイルス遺伝子ｙ１３４．５、ＵＬ３９、及び／又はＩＣＰ４７等の、ウイルス毒性を弱毒化するものとして知られている遺伝子の欠失又は変化によって弱毒化されてよい。「弱毒化された」という用語は、弱められた又は毒性がより小さくされたヘルペスウイルスを参照する。条件付き弱毒化が好ましく、弱毒化は非疾患細胞のみに影響する。より好ましくは、腫瘍細胞等の疾患細胞のみが、ヘルペスウイルスの完全な毒性によって影響を受ける。条件付き弱毒化は、例えば、ｙ１３４．５、ＵＬ３９及び／又はＩＣＰ４７遺伝子のプロモーター領域を疾患細胞においてのみ発現されるヒト遺伝子のプロモーター（例えば、腫瘍細胞中のサバイビンプロモーター）で置換することによって達成される。条件付き弱毒化のための更なる改変は、ＩＣＰ‐４プロモーター領域のようなＩＥ遺伝子（前初期遺伝子）の転写に関与する制御領域を疾患細胞においてのみ発現される遺伝子のプロモーター領域（例えばサバイビンプロモーター）で置換することを含んでいてよい。この変更の結果、条件的複製型ＨＳＶ(replication conditional HSV)がもたらされ、これは疾患細胞内では複製し得るが、正常細胞内では複製し得ない。ウイルスの追加的な改変は、正常細胞内では豊富であるが腫瘍細胞内では豊富ではないマイクロＲＮＡｓ（ｍｉＲｓ）に応答する配列要素をＩＣＰ４のような必須ＨＳＶ遺伝子の３´非翻訳領域(3´ untranslated region)内に挿入することを含んでいてよい。その結果も、正常細胞内でのみ複製能力のないウイルスとなる。
【００８５】
第２の側面においては、本発明は、本発明の組み換えヘルペスウイルスと薬学的に許容可能な担体とを備える医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、随意的には、細胞、好ましくは上述したような疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子を追加的に備える。本発明の組み換えヘルペスウイルスは、薬剤として使用することができる。薬剤の製造のために、ヘルペスウイルスは、本発明の組み換えヘルペスウイルスと、所望の特性を提供する薬学的に許容可能な担体等の含有物(ingredients)の混合物と、を備える薬学的投薬形態(pharmaceutical dosage form)である必要がある。医薬組成物は、当業者に知られている１つ以上の適切な薬学的に許容可能な担体を備える。医薬組成物は、細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子を追加的に備えていてよい。細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子の定義は、本発明の第１の側面において上記で参照されている。
【００８６】
医薬組成物は、全身、鼻、非経口、膣、局所(topic)、膣、腫瘍内投与のために製造することができる。非経口投与(parental administration)は、皮下、皮内、筋肉内、静脈内又は腹腔内投与を含む。
【００８７】
医薬組成物は、カプセル、タブレット、ピル、粉末及び顆粒等の経口投与のための固形投与形態、医薬的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシル剤等の経口投与のための液体投与形態、注射用製剤、例えば無菌注射剤又は油性懸濁液、直腸又は膣投与のための組成物、好ましくは座薬、並びに軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入又はパッチ等の局所又は経皮投与のための投薬形態を含む種々の投薬形態として処方することができる。
【００８８】
任意の特定の被験体に対する特異的な治療上有効な用量レベルは、本発明の組み換えヘルペスウイルスの活性、投与形態、被験体の年齢、体重及び性別、医学分野において周知の治療期間及び同様の要因を含む種々の要因に依存する。
【００８９】
単回又は複数回の用量で被験体に投与される本発明の化合物の総用量は、例えば１０３〜１０１０の量であってよい。単回用量組成物は、１日用量を準備するような量又はその約数を含有していてよい。組み換えヘルペスウイルスの投与量は、プラーク形成単位（ｐｆｕ）の数として定義されてよい。投与量の例は、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１０１０を含む。
【００９０】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、疾患細胞がそれらの表面上に特異的な標的分子を発現する疾患を治療するのに役立ち、それらの標的分子は、細胞の外側からアクセス可能であり、正常細胞によっては産生されることがなく、あるいは正常細胞によって産生されたとしてもより低い程度である。正常細胞は、それぞれの正常細胞であってもよい。「それぞれの」は、疾患細胞と正常細胞が同じ起源であることを意味するが、疾患発生の影響により疾患細胞内には細胞が発現する一方で、同じ起源の他の細胞は健康なままである。
【００９１】
第３の側面においては、本発明は、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療における使用のための本発明の組み換えヘルペスウイルスを提供し、この組み換えヘルペスウイルスは、随意的に、細胞、好ましくは上述したような疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子と組み合わされる。本発明の組み換えヘルペスウイルス、及び細胞に対する宿主免疫応答を刺激する分子は、同じ医薬組成物内又は異なる医薬組成物内に存在することができる。それらが異なる医薬組成物内に存在する場合には、それらは、同時に投与されてよく、あるいはその分子の前にヘルペスウイルス又はヘルペスウイルスの前にその分子というように続けて投与されてもよい。ヘルペスウイルス又はその分子は、異なる頻度及び／又は時点で投与されてよい。しかし、併用治療は、ヘルペスウイルス及びその分子が、疾患の同時治療を可能にする時間間隔及び／又は時点で投与されることを備える。
【００９２】
また、本発明は、本発明の組み換えヘルペスウイルスの薬学的に効果的な量を投与することによって、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患を有する被験体を治療する方法を開示する。
【００９３】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、細胞、好ましくは疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する更なる治療及び／又は被験体の特異的疾患を治療するために役立つ更なる治療と組み合わせて被験体に投与されてよい。このような更なる治療は、他の薬物、化学療法、放射線療法、免疫療法、併用ウイルス療法等を含んでいてよい。
【００９４】
また、本発明は、腫瘍、感染、変性疾患又は老化関連疾患の治療用の医薬組成物の調製のための本発明の組み換えヘルペスウイルスの使用を開示し、この組み換えヘルペスウイルス又はその使用は、随意的に、細胞、好ましくは上述したような疾患細胞に対する宿主免疫応答を刺激する１つ以上の分子と組み合わされる。
【００９５】
本発明の組み換えヘルペスウイルスによって治療される被験体は、好ましくはヒトである。
【００９６】
第４の側面においては、本発明は、リガンドを融合又は挿入した本発明のキメラｇＢをコードする核酸を備える核酸分子を提供する。核酸分子は、本発明の組み換えヘルペスウイルスのゲノム又はその一部であってよい。好ましくは、核酸分子は、ｇＢ糖タンパク質のシグナル配列を含むキメラｇＢの前駆体形態をコードする。キメラｇＢがそのＮ端アミノ酸にリガンドを保持するように操作された場合、対応する核酸は、シグナル配列の最後のアミノ酸と成熟タンパク質の最初のアミノ酸との間に挿入されたリガンドの核酸配列を有する。
【００９７】
第５の側面においては、本発明は、核酸分子を備えるベクターを提供する。適切なベクターは当該分野で既知であり、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えばバクテリア、酵母又はヒト）、バクテリオファージ、ウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）、特にバキュロウイルスベクター、又はナノ操作物質(nano-engineered substances)（例えば、オルモシル(ormosils)）を含む。一実施形態においては、ベクターは、特に１以上の核酸塩基の欠失、挿入及び／又は変異によって、その毒性が好ましくはウイルスベクターの場合に弱毒化されるように、又はベクターが疾患細胞内では条件的に複製するが、非疾患細胞内では複製しないように、改変される。例えば、γ１３４．５遺伝子、ＵＬ３９遺伝子、ＩＣＰ４７遺伝子の１つ又は両方のコピーの欠失は、ウイルスの弱毒化をもたらす。「弱毒化」又は「弱毒化された」は、弱められた又は毒性がより小さくされた毒性ウイルスを参照する。
【００９８】
また、疾患細胞、例えば腫瘍細胞においてのみ発現されるヒト遺伝子のプロモーター（例えば、腫瘍細胞中のサバイビンプロモーター）によるγ１３４．５遺伝子のプロモーター領域の置換も含まれ、これにより、非疾患細胞における弱毒化表現型(attenuated phenotype)及び疾患細胞における非弱毒化表現型がもたらされる。更なる改変は、ＩＣＰ‐４プロモーター領域のようなＩＥ遺伝子の転写に関与する制御領域を疾患細胞においてのみ発現される遺伝子のプロモーター（例えばサバイビンプロモーター）で置換することを含んでいてよい。この変更により、疾患細胞内では複製し得るが、正常細胞内では複製し得ない条件的複製型ヘルペスウイルス(replication conditional herpesvirus)が産生される。ウイルス子孫の増殖のための細胞培養細胞は、高レベルの特異的プロモーター活性化タンパク質(specific promoter activating proteins)をもたらし、高いウイルス収量の産生を可能にする。
【００９９】
第６の側面においては、本発明は、リガンドを融合又は挿入したキメラｇＢを備えるポリペプチドを提供する。
【０１００】
第７の側面においては、本発明は、組み換えヘルペスウイルス、リガンドを融合若しくは挿入した本発明のキメラｇＢをコードする核酸を備える核酸分子、核酸分子を備えるベクター、又はリガンドを融合若しくは挿入したキメラｇＢを備えるポリペプチドを備える細胞を提供する。好ましくは、この細胞は細胞培養細胞である。適切な細胞培養及び培養技術は当該分野において既知である(Peterson and Goyal, 1988)。
【０１０１】
第８の側面においては、本発明は、本発明の組み換えヘルペスウイルスを用いて細胞を感染させるための方法を提供する。本発明の目的は、被験体において望ましくない細胞に感染し、その中で増殖し、細胞を溶解させ、それにより細胞を死滅させる組み換えヘルペスウイルスの提供である。また、感染のための方法は、細胞培養物中に存在する細胞における組み換えヘルペスウイルスの増殖に役立つ。「感染する(infecting)」は、ウイルスがウイルス表面膜と細胞膜の融合を介して細胞に侵入し、ウイルスゲノム等のウイルス成分が細胞内に放出されることを意味する。細胞をウイルスで感染させる方法は当該分野において既知であり、例えば感染させる細胞と共にウイルスを培養することによる(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988)。「死滅(killing)」は、本発明のヘルペスウイルスの感染、細胞内でのウイルス粒子の産生、及び最終的に細胞を溶解させることによる新しいウイルス粒子の放出に起因して細胞が完全に除去されることを意味する。例えば細胞培養物中の細胞であって、それらの表面上にリガンドの標的分子を担持する細胞を用いて、組み換えヘルペスウイルスの溶解効率(lytic efficacy)を試験することができる。例えば、細胞は、被験体から得られた疾患細胞、例えば腫瘍細胞であってよい。この細胞は感染され、それにより組み換えヘルペスウイルスによって死滅させられる。成功した細胞の死滅は、被験体からの腫瘍細胞等の細胞を除去する治療の成功を評価するために、組み換えヘルペスウイルスの細胞特異性を指標する。更なる実施形態においては、非疾患細胞が同じ被験体又は疾患に罹患していない対照被験体から得られてもよく、即ち細胞は、それらの表面上にリガンドの標的分子を担持してしないか、あるいは担持していたとしてもより低い程度である。これにより、非疾患細胞が組み換えヘルペスウイルスによる感染の影響を受け易いかどうか及び／又は非疾患細胞が組み換えヘルペスウイルスによる感染の影響をどの程度受け易いのかを試験することができる。他の実施形態においては、非疾患細胞及び疾患細胞（例えば白血病細胞等の腫瘍細胞）を備える細胞集団（例えば血液等の組織）に含まれる疾患細胞は、被験体からの細胞集団の隔離（例えば白血球除去輸血(leukapheresis)）の後に死滅させられる。これは、疾患細胞を含まない細胞集団を得るのに役立ち、例えば、特に被験体、好ましくは細胞集団がそこから隔離された同じ被験体への細胞集団の後の移植のための、白血病細胞等の疾患細胞を含まない血液を得るのに役立つ。この方法は、例えば血液及び白血病の場合、腫瘍細胞を含まない血液の再輸血を提供する。本発明の組み換えヘルペスウイルスを用いて細胞を死滅させるための方法は、インビトロ(in-vitro)又はインビボ(in-vivo)の方法であってよい。
【０１０２】
第９の側面においては、本発明は、請求項１〜９のいずれかに記載のヘルペスウイルスを用いて細胞培養物中に存在する細胞において組み換えヘルペスウイルスを産生するためのインビトロな方法を提供し、好ましくは細胞は標的分子として人工分子を発現又は結合し、より好ましくは標的分子は、抗体、抗体誘導体又は抗体模倣物、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号３７に含まれるＧＣＮ４酵母転写因子の一部に結合可能なｓｃＦｖ、更に好ましくは配列ＩＤ番号３９に含まれるｓｃＦｖ、最も好ましくは配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を備えている。
【０１０３】
本発明の組み換えヘルペスウイルスは、ヒトの疾患細胞に感染して死滅させる目的に役立つ。これにはヘルペスウイルスの供給が必要であり、従ってその増殖及び産生が必要である。ヘルペスウイルスの増殖は、ヒトにおける腫瘍細胞のような疾患細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質等の物質の導入を避けるために、疾患細胞において回避されるべきであるので、組み換えヘルペスウイルスは、非疾患細胞にも感染可能に操作される必要がある。これは、組み換えヘルペスウイルスの、疾患細胞への死滅のための再標的化及び非疾患細胞への増殖のための再標的化を必要とする。従って、本発明の第９の側面は、２つ、３つ又は４つ等の２つ以上の異種ポリペプチドリガンド、好ましくは２つの異種ポリペプチドリガンドでの組み換えヘルペスウイルスの改変を備える。リガンドはｇＢのみで構成されてよいが、ｇＢ及びｇＤ、随意的にはｇＢ、ｇＤ及びｇＨによって構成されてもよい。
【０１０４】
結果として、第９の側面の一実施形態においては、組み換えヘルペスウイルスは、ｇＢに融合又は挿入された異種ポリペプチドリガンドであって、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドと、ｇＢ、ｇＤ及び／又はｇＨに融合又は挿入された追加的異種ポリペプチドリガンドであって、疾患細胞上にある標的分子に結合可能な追加的異種ポリペプチドリガンドと、を備える。好ましくは、キメラｇＢは、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドを備え、改変ｇＤ及び／又はｇＨは、疾患細胞上にある標的分子に結合可能な異種ポリペプチドリガンドを備える。
【０１０５】
細胞内でヘルペスウイルスを増殖させるための適切な技術及び条件は、当該分野において既知であり(Florence et al., 1992; Peterson and Goyal, 1988)、ヘルペスウイルスを細胞と共に培養することと感染した細胞培養物の培地からヘルペスウイルスを回収することとを含む。組み換えヘルペスウイルスが産生される細胞は、組み換えヘルペスウイルスが異種ポリペプチドリガンドを介して結合する標的分子を担持する。好ましくは、標的分子は人工標的分子である。人工標的分子は、異種ポリペプチドリガンドに結合するように特異的に構築される。逆に、リガンドは、人工標的分子に結合するように特異的に選択され、構築される。従って、標的分子は、標的細胞によっては天然に産生されない抗体、抗体誘導体又は抗体模倣物、好ましくはｓｃＦｖであってよい。異種ポリペプチドリガンドは、天然ポリペプチド、好ましくはサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス（Saccharomyces）属からのポリペプチドのような真菌性又は細菌性のポリペプチド、あるいは標的分子に結合可能な天然ポリペプチドの一部等の人工ポリペプチドであってよい。細胞は、ヘルペスウイルスの増殖に適した任意の培養細胞であってよい。好ましくは、細胞は非疾患細胞である。細胞は細胞株として存在してよく、あるいは単離された細胞であってもよく、好ましくは細胞は細胞株として存在する。細胞株は、ヘルペスウイルス増殖のために認められていてよい。適切な細胞株は、Ｖｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞であり、最も好ましくはＶｅｒｏ細胞である。
【０１０６】
「培養」細胞は、当該分野で知られているように、維持及び増殖されたインビトロ細胞培養物中に存在する細胞である。培養細胞は、一般にそれらの自然環境の外で、制御された条件下で増殖する。通常、培養細胞は、多細胞真核生物、特に動物細胞に由来する。「ヘルペスウイルスの増殖のために認められた細胞株」は、ヘルペスウイルスが感染することが既に示されている、即ちウイルスが細胞に侵入し増殖してウイルスを産生できることが既に示されている任意の細胞株を含むことを意味する。細胞株は、単一の細胞に由来し、同じ遺伝子組成を含む細胞の集団である。組み換えヘルペスウイルスの増殖及び産生のための好ましい細胞は、Ｖｅｒｏ、２９３、２９３Ｔ、ＨＥｐ‐２、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、又はＲＳ細胞である。
【０１０７】
インビトロな方法の好ましい実施形態においては、リガンドは天然ポリペプチドの一部であり、好ましくは２７４アミノ酸残基以下の長さ、好ましくは２００アミノ酸残基未満の長さ、より好ましくは５０アミノ酸残基未満の長さ、更に好ましくは４０アミノ酸残基未満の長さ、更に好ましくは２０アミノ酸等の１０〜３０アミノ酸の間の長さを有し、それにより、その部分は、標的分子の構築、及びそれぞれの標的分子を担持している細胞に対するヘルペスウイルスの再標的化を可能にする。標的分子は、天然ポリペプチドの一部に結合可能な抗体誘導体である。より好ましくは、異種ポリペプチドリガンドはＧＣＮ４酵母転写因子の一部であり、標的分子はリガンドに結合可能な抗体誘導体であり、細胞は標的分子を発現するように改変された細胞である。最も好ましくは、異種ポリペプチドリガンドは配列ＩＤ番号３７の配列によって特定される分子であり、標的分子は配列ＩＤ番号４１の配列によって特定される分子であり、細胞は、配列ＩＤ番号４１の配列によって特定される分子を発現するように改変されたＶｅｒｏ細胞株であり、これをここではＶｅｒｏＧＣＮ４細胞株と称する。
【０１０８】
Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株は、ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖである人工受容体を発現する。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株は、ＨＥＲ２陽性細胞に再標的化され天然ヘルペスウイルス受容体に対しては脱標的化されたヘルペスウイルス組み換え体の培養を可能にする目的に役立つ。ＨＥＲ２は腫瘍遺伝子であり、ＨＥＲ２陽性細胞は癌細胞であるので、ヒトにおける腫瘍由来物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）の偶発的な導入の可能性を避けるために、ヒトの使用に供される腫瘍溶解性組み換えヘルペスウイルスの癌細胞における増殖及び産生は避けるべきである。同時に、ヘルペスウイルスは、疾患細胞に感染することが可能であるべきである。従って、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株及びＨＥＲ２再標的化ヘルペスウイルスが構築された。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株は、ネクチン１の細胞外ドメイン２及び３、膜貫通部(transmembrane)（ＴＭ）並びにＣ尾部に融合したＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖから作られた人工受容体を発現する。ＨＥＲ２再標的化ヘルペスウイルスは、ｇＢ内でＧＣＮ４ペプチドを発現する。結果として、組み換えヘルペスウイルスは、癌細胞に感染するためにＨＥＲ２に、及びウイルスの増殖及び産生を目的としてＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株に感染するためにＧＣＮ４ペプチドに、同時に再標的化される。
【０１０９】
第９の側面の特に好ましい実施形態においては、ｇＢは、細胞培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、それにより、リガンドは、人工ポリペプチド、より好ましくは天然ポリペプチドの一部、更に好ましくはＧＣＮ４酵母転写因子の一部であってよく、改変ｇＤ及び／又は改変ｇＨは、疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、それにより、標的分子は、抗体、抗体誘導体又は抗体模倣物、更に好ましくはｓｃＦｖ、更に好ましくはＨＥＲ２に結合可能なｓｃＦｖであってよい。最も好ましい実施形態においては、組み換えヘルペスウイルスは、配列ＩＤ番号３７の配列により特定される分子を含むキメラｇＢを備え、改変ｇＤ及び／又はｇＨは、配列ＩＤ番号３２により特定されるｓｃＦｖを備える。そのようなヘルペスウイルスは、増殖のために、配列ＩＤ番号４１の配列により特定される分子を発現するＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株に感染することが可能であり、腫瘍細胞を死滅させるために、腫瘍細胞上に存在するＨＥＲ２を介して腫瘍細胞に感染することが可能である。
【０１１０】
他の特に好ましい実施形態及び最も好ましい実施形態においては、ｇＢは、疾患細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備え、ｇＤは、培養物中に存在する細胞上にある標的分子に結合可能なリガンドを備える。リガンド、標的分子及び細胞の定義は上述したとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】組み換え体Ｒ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐ＢＰ９０９、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９のゲノム配置。（Ａ‐Ｇ）ＨＳＶ‐１ゲノムは、内部繰返し配列（ＩＲ）で囲われた(bracketed)線として表される。Ｌｏｘ‐Ｐ‐ブラケットＢＡＣ配列（Lox-P-bracketed BAC sequence）及びｅＧＦＰ蛍光マーカーは、遺伝子間領域ＵＬ３〜ＵＬ４に挿入される。（Ａ）Ｒ‐ＢＰ９０３は、下流１２Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入をｇＢのＡＡ４３〜４４の間に担持する。（Ｂ）Ｒ‐ＢＰ９０９はＲ‐ＢＰ９０３と同じであるが、加えて脱標的化目的で成熟ｇＤからのＡＡ６〜３８の欠失を担持する。（Ｃ）Ｒ‐ＢＰ９０１は、Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入をｇＢのＡＡ８１〜８２の間に担持する。（Ｄ）Ｒ‐３１３は、１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及び１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するＧＣＮ４ペプチドの挿入を未成熟ｇＢのＡＡ４３〜４４の間に担持し、下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙ、１１アミノ酸長リンカーを有するｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を成熟ｇＤのＡＡ６〜３８に代えて担持する。Ｅ）Ｒ‐３１５は、１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及び１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するＧＣＮ４ペプチドの挿入を未成熟ｇＢのＡＡ８１〜８２の間に担持し、下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙ、１１アミノ酸長リンカーを有するｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を成熟ｇＤのＡＡ６〜３８に代えて担持する。Ｆ）Ｒ‐３１７は、１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及び１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するＧＣＮ４ペプチドの挿入を未成熟ｇＢのＡＡ７６〜７７の間に担持し、下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙ、１１アミノ酸長リンカーを有するｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を成熟ｇＤのＡＡ６〜３８に代えて担持する。Ｇ）Ｒ‐３１９は、１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及び１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するＧＣＮ４ペプチドの挿入を未成熟ｇＢのＡＡ９５〜９６の間に担持し、下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙ、１１アミノ酸長リンカーを有するｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を成熟ｇＤのＡＡ６〜３８に代えて担持する。
【図２】Ｒ‐ＢＰ９０１及びＲ‐ＢＰ９０９は、キメラｓｃＦｖ‐ｇＢ糖タンパク質を発現する。Ｒ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０９又はＲ‐ＬＭ５に感染したＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の溶解物を入力感染多重度(input multiplicity of infection)３ＰＦＵ／細胞でＰＡＧＥに付した。ｇＢは、ＭＡｂＨ１８１７を用いたイムノブロットにより検出された。左側の数字は２５０Ｋ、１３０Ｋ及び９５ＫＭＷマーカーの泳動位置を表す。
【図３】単一受容体を発現するＪ細胞の、組み換え体Ｒ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０３及びＲ‐ＢＰ９０９による感染。Ｊ細胞はｗｔ‐ＨＳＶに対して受容体を発現しない。Ｊ‐ＨＥＲ２、Ｊネクチン１、Ｊ‐ＨＶＥＭは、示された受容体のみを発現する。示された細胞をＲ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＢＰ９０１により感染させ、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。（Ａ）Ｒ‐ＢＰ９０３は、この組み換え体がｗｔ‐ｇＤをコードするとして予想されたとおり、Ｊ‐ＨＥＲ２細胞、Ｊネクチン及びＪ‐ＨＶＥＭに感染した。このウイルスはＨＥＲ２に再標的化され、自然親和性(natural tropism)を保持する。（Ｂ）Ｒ‐ＢＰ９０９は、ＨＥＲ２を唯一の受容体（Ｊ‐ＨＥＲ２）として発現する細胞に感染し、ＡＡ６〜３８のｇＤ欠損の結果としてＪネクチン及びＪ‐ＨＶＥＭに感染しない。Ｒ‐ＢＰ９０９はＨＥＲ２に再標的化され、ＨＳＶ‐１ｇＤ天然受容体から脱標的化される。（Ｃ）Ｒ‐ＢＰ９０１はＪ‐ＨＥＲ２に感染しない；このウイルスはＨＥＲ２に再標的化されない。
【図４】Ｒ‐ＢＰ９０９はＨＥＲ２＋癌細胞に特異的に感染する。示されたＨＥＲ２−及びＨＥＲ２＋癌細胞株に、Ｒ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＢＰ９０３を感染させた。感染２４時間後に蛍光顕微鏡で画像を撮影した。Ｒ‐ＢＰ９０９は、ＨＥＲ２陽性癌細胞に感染し、ＨＥＲ２陰性癌細胞に感染していない。Ｒ‐ＢＰ９０３は、脱標的化の欠如と一致して、ＨＥＲ２の発現に関係なく細胞に感染する。
【図５】Ｊ‐ＨＥＲ２（Ａ）及びＳＫ‐ＯＶ‐３（Ｂ）細胞におけるＲ‐ＢＰ９０９侵入経路の特徴。示されたウイルスをＨＤ１、５２Ｓ、Ｈ１２６ＭＡｂと共にプレインキュベートし、次いでＪ‐ＨＥＲ２又はＳＫ‐ＯＶ‐３細胞に感染させた。記載がある場合、細胞をトラスツズマブ(trastuzumab)又は対照ＩｇＧｓと共に前処理した。感染を２４時間後にフローサイトメトリーにより定量化した。（Ａ）Ｊ‐ＨＥＲ２細胞のＲ‐ＢＰ９０９感染は、トラスツズマブによって又はｇＢに対するＭＡｂＨ１２６によって殆ど消失している。（Ｂ）ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞のＲ‐ＢＰ９０９感染は、トラスツズマブによって又はｇＢに対するＭＡｂＨ１２６、ｇＨに対する５２Ｓによって抑制されるが、ｇＤに対するＭＡｂＨＤ１によっては抑制されない。Ｒ‐ＬＭ１１３、即ちｇＤにおけるＨＥＲ２に対するｓｃＦｖの挿入を介してＨＥＲ２に再標的化された組み換え体は、Ｒ‐ＢＰ９０９と同様に挙動した。
【図６】Ｒ‐ＢＰ９０９並びに対照組み換え体Ｒ‐ＶＧ８０９（ｇＨを介してＨＥＲ２に再標的化）及びＲ‐ＬＭ１１３（ｇＤを介してＨＥＲ２に再標的化）の成長曲線。ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞で、示された組み換え体により感染させ、感染後の指定時間（時間）に採取した。子孫ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。成長曲線は、Ｒ‐ＢＰ９０９がＲ‐ＶＧ８０９と同程度で複製し、Ｒ‐ＬＭ１１３より約１桁少なかったことを示している。
【図７】感染したＳＫ‐ＯＶ‐３及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３細胞を死滅させるＲ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＶＧ８０９の能力並びにＨＥＲ２−癌細胞の死滅能力の欠如。ＨＥＲ２陽性ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３並びにＨＥＲ２−ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１癌細胞を２ＰＦＵ／細胞（ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞については０．１ＰＦＵ／細胞）でそれぞれ示されたウイルスにより感染させた。生存率はアラマーブルー(Alamar-Blue)アッセイにより定量化した。Ｒ‐ＢＰ９０９は、Ｒ‐ＶＧ８０９と同様の効率でＳＫ‐ＯＶ‐３及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３を死滅させた。どちらのウイルスも、ＨＥＲ２−陰性ＭＤＡ‐ＭＤ‐２３１癌細胞を死滅させておらず、それらの細胞に感染する能力がないことと一致していた。
【図８】組み換え体Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の感染のパターン。ｗｔ‐Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ＳＫ‐ＯＶ‐３、親Ｊ、並びにｗｔ‐ＨＳＶに対する受容体を発現するＪ細胞  Ｊ‐ＨＶＥＭ及びＪネクチンを、示されたウイルスにより感染させ、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９は、ＨＥＲ２（ヒト及びサルの両方）及びＧＣＮ４を受容体として発現する細胞に感染し、ｇＤのＡＡ６〜３８の欠失の結果、ネクチン及びＨＶＥＭを介しては感染しない。操作されたウイルスの全ては、ＨＥＲ２及びＧＣＮ４に再標的化され、ＨＳＶ‐１ｇＤ天然受容体から脱標的化される。トラスツズマブ（別名ハーセプチン）に曝露されたＨＥＲ２陽性細胞株における感染の抑制は、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９がＨＥＲ２をこれらの細胞における侵入のポータルとして用いていることを確認する。
【図９】Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９並びに対照組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３（ｇＤを介してＨＥＲ２に再標的化）及びＲ‐ＬＭ５（ＨＳＶ糖タンパク質のｗｔであって、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７、Ｒ‐３１９及びＲ‐ＬＭ１１３に存在する他のゲノム改変を有する）の成長曲線。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞（それぞれの細胞株において滴定）で、示された組み換え体により感染させ、感染後の指定時間（時間）に採取した。子孫ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。
【図１０】異なる細胞株におけるＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９並びに対照組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５のコロニー形成率(plating efficiency)。組み換えウイルスの複製分量(replicate aliquots)をＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３に播種した。感染後３日目に、蛍光顕微鏡下でプラークを数えた。
【図１１】異なる細胞株におけるＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の相対的なプラークサイズ。Ａ）Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７、Ｒ‐３１９、Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５の複製分量をＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３に播種した。感染の３日後、蛍光顕微鏡でプラークの写真を撮影した。代表的なプラークを示す。Ｂ）プラーク面積の定量化をｐｘＥ２で示す。
【図１２】ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖ‐ネクチン受容体のキメラの概略図。受容体は、Ｎ末端リーダーペプチド(N-terminal leader peptide)及びＨＡタグ配列(HA tag sequence)を提示し、２つの短いリンカー、即ちＧＡ及びＧＳＧＡリンカーの間に位置する、ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖがそれに続く。分子の第２の部分は、ネクチン１細胞外ドメイン２及び３とＴＭセグメントと細胞内細胞質尾部(intracellular cytoplasmic tail)とを備えるヒトネクチン１（ＰＶＲＬ１）残基Ｍｅｔ１４３〜Ｖａｌ５１７に対応する。
【図１３】Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４陽性細胞の安定性。ｓｃＦｖＧＣＮ４‐ネクチン受容体の発現をＨＡタグに対するＭＡｂによるＦＡＣＳによって分析した。これらの図は、１０、１５、３０、４０継代でのＶｅｒｏＧＣＮ４クローン１１．２細胞からの陽性細胞のパーセンテージを示す。結果：人工受容体の発現が連続４０継代後も安定したままであった。
【図１４】組み換え体Ｒ‐３２１のゲノム配置。ＨＳＶ‐１ゲノムは、内部反復（ＩＲ）で囲われた線として表される。Ｌｏｘ‐Ｐ‐ブラケットＢＡＣ配列及びｅＧＦＰ蛍光マーカーは、遺伝子間領域ＵＬ３〜ＵＬ４に挿入される。Ｒ‐３２１は、成熟ｇＤのＡＡ３０及び３８の欠失とｇＤのＡＡ３７の後のｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入とを担持する。Ｒ‐３２１は、１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及び１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有するＧＣＮ４ペプチドの挿入を未成熟ｇＢのＡＡ４３〜４４の間に担持する。
【図１５】組み換え体Ｒ‐３２１の感染のパターン。ｗｔ‐Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ＳＫ‐ＯＶ‐３、親Ｊ、並びにｗｔ‐ＨＳＶ  Ｊ‐ＨＶＥＭ及びＪネクチンに対する受容体を発現するＪ細胞を、示されたウイルスにより感染させ、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。Ｒ‐３２１は、ＨＥＲ２（ヒト及びサルの両方）及びＧＣＮ４を受容体として発現する細胞に感染し、ＡＡ３０及び３８の欠失の結果、ネクチン及びＨＶＥＭを介しては感染しない。Ｒ‐３２１は、ＨＥＲ２及びＧＣＮ４に再標的化され、ＨＳＶ‐１ｇＤ天然受容体から脱標的化される。トラスツズマブ（別名ハーセプチン）に曝露されたＨＥＲ２陽性細胞株における感染の抑制は、Ｒ‐３２１がＨＥＲ２をこれらの細胞における侵入のポータルとして用いていることを確認する。
【図１６】Ｒ‐３２１並びに対照組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３（ｇＤを介してＨＥＲ２に再標的化）及びＲ‐ＬＭ５（ＨＳＶ糖タンパク質のｗｔであって、Ｒ‐３２１に存在する他のゲノム改変を有する）の成長曲線。Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞（対応する細胞株において滴定）で、示された組み換え体により感染させ、感染後の指定時間（時間）に採取した。子孫ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。
【０１１２】
配列
配列ＩＤ番号１：ＨＳＶ‐１ｇＢ野生型前駆体（ヒトヘルペスウイルス１  Ｆ株、ジェンバンク(GenBank)アセッション番号：ＧＵ７３４７７１．１；位置５２９９６〜５５７１０によりコードされたｇＢ）のアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号２：構築物Ｒ‐ＢＰ９０３及びＲ‐ＢＰ９０９によりコードされた、アミノ酸４３及び４４の間にトラスツズマブｓｃＦｖを挿入したｇＢ（配列ＩＤ番号１）の前駆体のアミノ酸配列。リンカーSSGGGSGSGGSG（配列ＩＤ番号３０）は、ｓｃＦＶ挿入部分のＣ末端アミノ酸配列とｇＢのアミノ酸４４との間に導入される。
配列ＩＤ番号３：構築物Ｒ‐ＢＰ９０１によりコードされた、アミノ酸８１及び８２の間にトラスツズマブｓｃＦｖを挿入したｇＢ（配列ＩＤ番号１）の前駆体のアミノ酸配列。リンカーHSSGGGSG（配列ＩＤ番号２９）は、ｇＢのアミノ酸８１とｓｃＦＶ挿入部分のＮ末端アミノ酸配列との間に導入される。リンカーSSGGGSGSGGSG（配列ＩＤ番号３０）は、ｓｃＦＶ挿入部分のＣ末端アミノ酸配列とｇＢのアミノ酸８２との間に導入される。
配列ＩＤ番号４：ＨＳＶ‐１ｇＤ野生型前駆体（ヒトヘルペスウイルス１  Ｆ株、ジェンバンクアセッション番号：ＧＵ７３４７７１．１；位置１３８２８１〜１３９４６５によりコードされたｇＤ）のアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号５：ＨＳＶ‐１ｇＤ野生型前駆体（配列ＩＤ番号４）のアミノ酸配列であって、Ｒ‐ＢＰ９０９によってコードされた、成熟ｇＤのアミノ酸６〜３８の欠失を有するアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号６：構築物Ｒ‐ＬＭ１１３によりコードされた、アミノ酸３０及び６４の間にトラスツズマブｓｃＦｖを挿入したＨＳＶ‐１欠損ｇＤ（配列ＩＤ番号５）のアミノ酸配列。組み換え及びスクリーニングの容易さのために、アミノ酸ＥＮを導入して制限部位を挿入した。
配列ＩＤ番号７：Ｒ‐ＢＰ９０１におけるのと同様に、ｐＳＧ‐ｓｃＦｖＨＥＲ２‐ＳＧと命名されたプラスミド内に存在し、配列ＩＤ番号３の挿入をコードする、Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーにより挟まれたトラスツズマブｓｃＦｖカセット。
配列ＩＤ番号８：配列ＩＤ番号７によりコードされたアミノ酸配列；アミノ酸１〜８は上流のＳｅｒ‐Ｇｌｙリンカー（配列ＩＤ番号２９）であり、アミノ酸９〜１１６はＶＬ領域であり、アミノ酸１１７〜１３６はＶＬ及びＶＨ領域を連結するリンカー（配列ＩＤ番号３１）であり、アミノ酸１３７〜２５５はＶＨ領域をコードし、アミノ酸２５６〜２６７は下流の１２Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー（配列ＩＤ番号３０）をコードする。
配列ＩＤ番号９：ｐ‐ＳＧ‐ｓｃＦｖＨＥＲ２‐ＳＧと命名されたプラスミド内に存在するが、Ｒ‐ＢＰ９０３及びＲ‐ＢＰ９０９の８残基長の上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを欠き、配列ＩＤ番号２において挿入部分をコードするトラスツズマブｓｃＦｖカセット。
配列ＩＤ番号１０：配列ＩＤ番号９によりコードされたアミノ酸配列；アミノ酸１〜１０８はＶＬ領域であり、アミノ酸１０９〜１２８はＶＬ及びＶＨ領域を連結するリンカー（配列ＩＤ番号３１）であり、アミノ酸１２９〜２４７はＶＨ領域をコードし、アミノ酸２４８〜２５９は下流の１２Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー（配列ＩＤ番号３０）をコードする。
配列ＩＤ番号１１：ｇＢ４３ＧａｌＫｆｏｒ
配列ＩＤ番号１２：ｇＢ４３ＧａｌＫｒｅｖ
配列ＩＤ番号１３：ｇＢ４３＿ｓｃ４Ｄ５＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号１４：ｇＢ４３＿ｓｃ４Ｄ５＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号１５：ｇＢ８１ｆＧＡＬＫ
配列ＩＤ番号１６：ｇＢ８１ＧＡＬＫｒｅｖ
配列ＩＤ番号１７：ｇＢ８１ｓｃ４Ｄ５ｆ
配列ＩＤ番号１８：ｇＢ８１ＳＧｒ
配列ＩＤ番号１９：ｓｃＦｖ４Ｄ５＿３５８＿ｒ
配列ＩＤ番号２０：ｓｃＦｖ４Ｄ５＿３１５＿ｆ
配列ＩＤ番号２１：ｇＤ５＿ｇａｌＫ＿ｆ
配列ＩＤ番号２２：ｇＤ３９＿ｇａｌＫ＿ｒ
配列ＩＤ番号２３：ｇＤ＿ａａ５＿３９＿ｆ
配列ＩＤ番号２４：ｇＤ＿ａａ５＿３９＿ｒ
配列ＩＤ番号２５：ｇａｌＫ＿１２９＿ｆ
配列ＩＤ番号２６：ｇａｌＫ＿４１７＿ｒ
配列ＩＤ番号２７：ｇＢ＿ｅｘｔ＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号２８：ｇＢ＿４３１＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号２９：８Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー
配列ＩＤ番号３０：１２Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー
配列ＩＤ番号３１：ＶＬ及びＶＨ領域を連結するリンカー
配列ＩＤ番号３２：トラスツズマブｓｃＦｖ
配列ＩＤ番号３３：ＧＣＮ４ｇＢ＿４３＿４４＿ｆＢ
配列ＩＤ番号３４：ＧＣＮ４ｇＢ＿４３＿４４＿ｒＢ
配列ＩＤ番号３５：構築物Ｒ‐３１３によってコードされた、アミノ酸４３及び４４の間にＧＣＮ４ペプチドを挿入したｇＢの前駆体（配列ＩＤ番号１）のアミノ酸配列。ＧＣＮ４ペプチドはＳｅｒ‐Ｇｌｙリンカーに隣接している。
配列ＩＤ番号３６：ｇＢへの組み換えのための上流及び下流リンカーを有するＧＣＮ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列。
配列ＩＤ番号３７：ＧＣＮ４ペプチド
配列ＩＤ番号３８：ＧＣＮ４エピトープ
配列ＩＤ番号３９：ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖのアミノ酸配列
配列ＩＤ番号４０：ｓｃＦｖ‐ＧＣＮ４‐ネクチン１キメラをコードするヌクレオチド配列
配列ＩＤ番号４１：配列ＩＤ番号４０によりコードされたアミノ酸配列；Ｎ末端リーダーペプチド、ＨＡタグ配列、短いＧＡリンカー、アミノ酸３３〜２７５のｓｃＦｖ配列、短いＧＳＧＡリンカー、及びヒトネクチン１（ＰＶＲＬ１）残基Ｍｅｔ１４３〜Ｖａｌ５１７を備えるＧＣＮ４ペプチドに結合可能なｓｃＦｖのアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号４２：ジェンバンクアクセッション番号ＡＪ５８５６８７．１（ＧＣＮ４酵母転写因子をコードする遺伝子
配列ＩＤ番号４３：ＧＣＮ４酵母転写因子ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ‐Ｐ０３０６９（ＧＣＮ＿ＹＥＡＳＴ）のアミノ酸配列
配列ＩＤ番号４４：ｇＢ＿７６＿ｇａｌＫ＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号４５：ｇＢ＿７６＿ｇａｌＫ＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号４６：ｇＢ＿７６＿ＧＣＮ４＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号４７：ｇＢ＿７６＿ＧＣＮ４＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号４８：構築物Ｒ‐３１７によりコードされた、アミノ酸７６及び７７の間にＧＣＮ４ペプチドを挿入したｇＢの前駆体（配列ＩＤ番号１）のアミノ酸配列。ＧＣＮ４ペプチドはＳｅｒ‐Ｇｌｙリンカーに隣接している。
配列ＩＤ番号４９：ｇＢ＿８１＿ＧＣＮ４＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号５０：ｇＢ＿８１＿ＧＣＮ４＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号５１：構築物Ｒ‐３１５によってコードされた、アミノ酸８１及び８２の間にＧＣＮ４ペプチドを挿入したｇＢの前駆体（配列ＩＤ番号１）のアミノ酸配列。ＧＣＮ４ペプチドはＳｅｒ‐Ｇｌｙリンカーに隣接している。
配列ＩＤ番号５２：ｇＢ＿９５＿ｇａｌＫ＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号５３：ｇＢ＿９５＿ｇａｌＫ＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号５４：ｇＢ＿９５＿ＧＣＮ４＿ｆｏｒ
配列ＩＤ番号５５：ｇＢ＿９５＿ＧＣＮ４＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号５６：構築物Ｒ‐３１９によりコードされた、アミノ酸９５及び９６の間にＧＣＮ４ペプチドを挿入したｇＢの前駆体（配列ＩＤ番号１）のアミノ酸配列。ＧＣＮ４ペプチドはＳｅｒ‐Ｇｌｙリンカーに隣接している。
配列ＩＤ番号５７：ｇＤ５＿ｇａｌＫ＿ｆ
配列ＩＤ番号５８：ｓｃＦｖ＿ｇａｌＫ＿ｒｅｖ
配列ＩＤ番号５９：ｇＤｄｅｌ３０＿３８ｆｏｒ
配列ＩＤ番号６０：ｇＤｄｅｌ３０＿３８ｒｅｖ
配列ＩＤ番号６１：構築物Ｒ‐３２１によりコードされた、成熟ｇＤに関してアミノ酸３０及び３８を欠失しアミノ酸３７の後にトラスツズマブｓｃＦｖを挿入したｇＤの前駆体（配列ＩＤ番号４）のアミノ酸配列。
配列ＩＤ番号６２：ＨＳＶ‐１ｇＤ野生型成熟形態（ヒトヘルペスウイルス１  Ｆ株、ジェンバンクアセッション番号：ＧＵ７３４７７１．１）のアミノ酸配列。
【実施例】
【０１１３】
実施例１
ｇＤＨＳＶ遺伝子における欠失を有し若しくは有しておらずレポーター遺伝子(reporter gene)としてのｅＧＦＰをコードする、ＨＥＲ２に向けられた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（ｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２）を担持している遺伝子操作ｇＢｓ（Ｒ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐ＢＰ９０９）又はＧＣＮ４ペプチドを担持している遺伝子操作ｇＢ（Ｒ‐３１３）を発現するＨＳＶ組み換え体の構築。
【０１１４】
Ａ）Ｒ‐ＢＰ９０３：ＨＳＶｇＢのＡＡ（アミノ酸）４３及び４４の間へのｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入。
【０１１５】
本発明者らは、ＡＡ１〜３０を包含するシグナル配列の切断(cleavage)後の成熟ｇＢにおけるＡＡ１３及び１４に対応する、非成熟ｇＢのＡＡ４３及び４４の間に、トラスツズマブｓｃＦｖ(trastuzumab scFv)をコードする配列を挿入することによって、Ｒ‐ＢＰ９０３―このクローンはＲ‐９０３という名称も有する―（図１Ａ）を操作した。開始ゲノムは、ＨＳＶ‐１ゲノムのＵＬ３及びＵＬ４の間に挿入されたＬＯＸ‐ＰブラケットｐＢｅｌｏＢＡＣ１１(LOX-P-bracketed pBeloBAC11)及びｅＧＦＰ配列を担持するＢＡＣＬＭ５５であった(Menotti et al., 2008)。組み換えは、ｇａｌＫ組み換え技術(galK recombineering)により行った。簡潔に説明すると、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ４３ＧａｌＫｆｏｒ  GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号１１）及びｇＢ４３ＧａｌＫｒｅｖ  GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号１２）により、ｇＢへの相同アームを有するｇａｌＫカセットを増幅した。このカセットを、ＬＭ５５ＢＡＣを担持しているＳＷ１０２バクテリア内で電気穿孔した。ｇａｌＫカセットを担持している組み換えクローンを、１ｍｇ／ＬのＤビオチン、０．２％ガラクトース、４５ｍｇ／ＬのＬロイシン、１ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したＭ６３培地（１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．８μｇのＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ｐＨ７に調整）を含むプレート上で選択した。ｇａｌＫ偽陽性バクテリアコロニーを除外するために、１％ガラクトース及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したマッコンキー(MacConkey)寒天ベースプレートにもストリークし、プライマーｇａｌＫ＿１２９＿ｆ  ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG（配列ＩＤ番号２５）及びｇａｌＫ＿４１７＿ｒ  CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC（配列ＩＤ番号２６）を用いたコロニーＰＣＲによりチェックした。次いで、以下に説明する下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー（配列ＩＤ番号９；配列ＩＤ番号１０をコードする）を有しｇＢへの相同アームにより挟まれたトラスツズマブｓｃＦｖカセットを、プライマーｇＢ４３＿ｓｃ４Ｄ５＿ｆｏｒ  GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGTCCGATATCCAGATGACCCAGTCCCCG（配列ＩＤ番号１３）及びｇＢ４３＿ｓｃ４Ｄ５＿ｒｅｖ  GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC（配列ＩＤ番号１４）のアニーリング及び伸長を介して生成した。組み換えゲノムは、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖと、配列SSGGGSGSGGSG（配列ＩＤ番号３０）を有する１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーと、配列SDMPMADPNRFRGKNLVFHS（配列ＩＤ番号３１）を有するＶＬ及びＶＨ領域間の１つリンカーと、を担持するキメラｇＢをコードする。ｇａｌＫカセットの切除及び好ましい配列ｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入を担持している組み換えクローンを、１ｍｇ／ＬのＤビオチン、０．２％デオキシ‐２‐ガラクトース、０．２％グリセロール、４５ｍｇ／ＬのＬロイシン、１ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したＭ６３培地（上記参照）を含むプレート上で選択した。また、プライマーｇＢ＿ｅｘｔ＿ｆｏｒ  GAGCGCCCCCGACGGCTGTATCG（配列ＩＤ番号２７）及びｇＢ＿４３１＿ｒｅｖ  TTGAAGACCACCGCGATGCCCT（配列ＩＤ番号２８）を用いたコロニーＰＣＲにより、好ましい配列の存在についてバクテリアコロニーをチェックした。
【０１１６】
Ｂ）Ｒ‐ＢＰ９０９（図１Ｂ）：Ｒ‐ＢＰ９０３の成熟ｇＤからのＡＡ６〜３８の欠失。Ｒ‐ＢＰ９０９―このクローンはＲ‐９０９という名称も有する―は、Ｒ‐ＢＰ９０３と同一であり、加えてｇＤにおけるＡＡ６〜３８に対応する配列の欠失を担持している。出発物質はＲ‐ＢＰ９０３ＢＡＣゲノムであった。ｇＤにおいてＡＡ６〜３８欠失を生成するために、ｇＤに対する相同アームに隣接するｇａｌＫカセットを、プライマーｇＤ５＿ｇａｌＫ＿ｆ  TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号２１）及びｇＤ３９＿ｇａｌＫ＿ｒ  ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号２２）で増幅した。次いで、本発明者らは、ｇａｌＫ配列を、ｇＤ＿ａａ５＿３９ｆ  TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGAT（配列ＩＤ番号２３）及びｇＤ＿ａａ５＿３９ｒ  ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGCGCCAAGGCATATTTGCCGCGGACCCCATGGAGGCCCACTATGACGACAA（配列ＩＤ番号２４）からなる合成二本鎖オリゴヌクレオチドで置換した。
【０１１７】
Ｃ）Ｒ‐ＢＰ９０１―このクローンはＲ‐９０１という名称も有する―（図１Ｃ）：ＨＳＶｇＢのａａ８１及び８２の間へのｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入。
【０１１８】
手順は、以下の相違点を除き、Ｒ‐ＢＰ９０３のｇＢにおいてｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を操作する上述したものと同じである。先ず、ｇａｌＫカセットを、プライマーｇＢ８１ｆＧＡＬＫ  CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号１５）及びｇＢ８１ＧＡＬＫｒｅｖ  CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号１６）により増幅した。次いで、以下に説明するＳｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及びｇＢへの相同アームにより挟まれたトラスツズマブｓｃＦｖカセットを、ｐＳＧ‐ＳｃＦｖＨＥＲ２‐ＳＧからの断片＃１及び断片＃２と名付けられた２つの別個の断片として増幅した。ｐＳＧ‐ＳｃＦｖＨＥＲ２‐ＳＧは、Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー（配列ＩＤ番号７、配列ＩＤ番号８をコードする）によって挟まれたトラスツズマブｓｃＦｖカセットを担持する。断片＃１は、ｐ‐ＳＧ‐ＳｃＦｖ‐ＨＥＲ２‐ＳＧをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ８１ｓｃ４Ｄ５ｆ  CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGATCCG（配列ＩＤ番号１７）及びｓｃＦｖ４Ｄ５＿３５８＿ｒ  GGAAACGGTTCGGATCAGCCATCGG（配列ＩＤ番号１９）により増幅した。断片＃２は、ｐＳＧ‐ＳｃＦｖＨＥＲ２‐ＳＧをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ８１ＳＧｒ  CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC（配列ＩＤ番号１８）及びｓｃＦｖ４Ｄ５＿３１５＿ｆ  GGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG（配列ＩＤ番号２０）により増幅した。断片＃１及び＃２をアニーリング及び伸長に付すことにより、Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカー及びｇＢへの相同アームにより挟まれたｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２カセットを生成した。組み換えゲノムは、配列HSSGGGSG（配列ＩＤ番号２９）を有する上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーと配列SSGGGSGSGGSG（配列ＩＤ番号３０
）を有する下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーとにより挟まれた、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖを担持する。ＶＬとＶＨとの間のリンカーはSDMPMADPNRFRGKNLVFHS（配列ＩＤ番号３１）である。
【０１１９】
Ｄ）Ｒ‐３１３：ｇＤ内のＡＡ６〜３８の欠失において既にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を発現しているＨＳＶ組み換え体におけるＨＳＶｇＢのＡＡ４３及び４４の間へのＧＣＮ４ペプチドの挿入。
【０１２０】
本発明者らは、ＡＡ１〜３０を包含するシグナル配列の切断後の成熟ｇＢにおけるＡＡ１３及び１４に対応する、非成熟ｇＢのＡＡ４３及び４４の間に、ＧＣＮ４ペプチドをコードする配列を挿入することによって、Ｒ‐３１３（図１Ｄ）を操作した。開始ゲノムは、ｇＤのＡＡ６〜３８の代わりのｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２と、ＨＳＶ‐１ゲノムのＵＬ３及びＵＬ４の間に挿入されたＬＯＸ‐ＰブラケットｐＢｅｌｏＢＡＣ１１及びｅＧＦＰ配列とを担持するＢＡＣＬＭ１１３であった(Menotti et al., 2008)。組み換えは、ｇａｌＫ組み換え技術により行った。簡潔に説明すると、ＧＣＮ４ペプチドをｇＢに挿入するために、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ４３ＧａｌＫｆｏｒ  GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号１１）及びｇＢ４３ＧａｌＫｒｅｖ  GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号１２）により、ｇＢへの相同アームを有するｇａｌＫカセットを増幅した。このカセットを、ＢＡＣＬＭ１１３ＢＧを担持しているＳＷ１０２バクテリア内で電気穿孔した。ｇａｌＫカセットを担持している組み換えクローンを、１ｍｇ／ＬのＤビオチン、０．２％ガラクトース、４５ｍｇ／ＬのＬロイシン、１ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したＭ６３培地（１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．８μｇのＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ｐＨ７に調整）を含むプレート上で選択した。ｇａｌＫ偽陽性バクテリアコロニーを除外するために、１％ガラクトース及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したマッコンキー寒天ベースプレートにもストリークし、プライマーｇａｌＫ＿１２９＿ｆ  ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG（配列ＩＤ番号２５）及びｇａｌＫ＿４１７＿ｒ  CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC（配列ＩＤ番号２６）を用いたコロニーＰＣＲによりチェックした。次いで、下流及び上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有しｇＢへの相同アームにより挟まれたＧＣＮ４ペプチドカセット（配列ＩＤ番号３６、配列ＩＤ番号３７をコードする）を、制限分析によるコロニーのスクリーニングに有用なＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのためのサイレント制限部位(silent restriction site)を導入するプライマーＧＣＮ４ｇＢ＿４３＿４４＿ｆＢ  GGTGGCGTCGGCGGCTCCGAGTTCCCCCGGCACGCCTGGGGTCGCGGCCGCGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC（配列ＩＤ番号３３）及びＧＣＮ４ｇＢ＿４３＿４４＿ｒＢ  GGCCAGGGGCGGGCGGCGCCGGAGTGGCAGGTCCCCCGTTCGCCGCCTGGGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC（配列ＩＤ番号３４）のアニーリング及び伸長を介して生成した。組み換えゲノムは、配列ＧＳを有する１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーと１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーとを含むＧＣＮ４ペプチドを担持するキメラｇＢ（配列ＩＤ番号３５）をコードする。ｇａｌＫカセットの切除及び好ましい配列ＧＣＮ４ペプチドの挿入を担持している組み換えクローンを、１ｍｇ／ＬのＤビオチン、０．２％デオキシ‐２‐ガラクトース、０．２％グリセロール、４５ｍｇ／ＬのＬロイシン、１ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ及び１２μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補給したＭ６３培地（上記参照）を含むプレート上で選択した。プライマーｇＢ��ｅｘｔ＿ｆｏｒ  GAGCGCCCCCGACGGCTGTATCG（配列ＩＤ番号２７）及びｇＢ＿４３１＿ｒｅｖ  TTGAAGACCACCGCGATGCCCT（配列ＩＤ番号２８）を用いたコロニーＰＣＲにより、好ましい配列の存在についてバクテリアコロニーをチェックした。
【０１２１】
組み換えウイルスＲ‐ＢＰ９０９を再構成するために、５００ｎｇの組み換えＢＡＣＤＮＡを、リポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ(Life Technologies)）により、Ｒ６と命名されたｇＤ相補細胞株(gD-complementing cell line)（ＨＳＶ後期ＵＬ２６．５プロモーター(HSV late UL26.5 promoter)の制御下でｗｔ‐ｇＤを発現しているウサギ皮膚細胞株(Zhou et al., 2000)）にトランスフェクトし、次いでＳＫ‐ＯＶ‐３細胞内で増殖させた。ウイルス増殖は緑色の蛍光によってモニタリングした。組み換え体の構造は、全ｇＢ、並びにＲ‐ＢＰ９０９についてｇＤ及びｇＨＯＲＦｓ、Ｒ‐ＢＰ９０３及びＲ‐ＢＰ９０１のｓｃＦｖＨＥＲ２及びｇＢにおける挿入部位を配列決定することにより検証した。ウイルスストックを生成し、ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。
【０１２２】
組み換えウイルスＲ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐３１３を再構成するために、５００ｎｇの組み換えＢＡＣＤＮＡをリポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ）によりＳＫ‐ＯＶ‐３細胞にトランスフェクトした。ウイルス増殖は緑色の蛍光によってモニタリングした。Ｒ‐３１３ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３内で６回継代し、凍結／融解してＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を溶解し、続いてＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞内で増殖させた。ウイルスストックをＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４において生成し、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。組み換えＲ‐３１３の構造は、ＧＣＮ４及びｇＢにおける挿入部位の配列決定によって検証した。
【０１２３】
実施例２：Ｒ‐ＢＰ９０１及びＲ‐ＢＰ９０９のキメラｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２‐ｇＢの発現の検証
【０１２４】
ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞をＲ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０９、及び比較用のＲ‐ＬＭ５により入力感染多重度(input multiplicity of infection)３ＰＦＵ／細胞で感染させ、感染７２時間後に採取した。細胞溶解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ＰＶＤＦ膜に移し、ｇＢに対するモノクローナル抗体（Ｈ１８１７）でイムノブロットした。図２は、Ｒ‐ＢＰ９０１及びＲ‐ＢＰ９０９からのキメラｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２‐ｇＢが、Ｒ‐ＬＭ５からのｗｔ‐ｇＢよりも遅い電気泳動移動度及び１３０Ｋダルトンの見かけ上Ｍｒで移動したことを示している。矢印は、キメラ及びｗｔｇＢの泳動位置を示す。左側の数値は分子量マーカーの泳動位置をＫダルトンで示す。
【０１２５】
実施例３：単一受容体を発現するＪ細胞の、組み換え体Ｒ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＢＰ９０１による感染
【０１２６】
既に示したように、ｇＤにおけるｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入は、組み換えウイルスＲ‐ＬＭ１１３に、ＨＥＲ２受容体を介して細胞に侵入する能力を付与する。ｇＢの位置４３〜４４又は８１〜８２でのｓｃＦＶ‐ＨＥＲ２の挿入が、ＨＥＲ２受容体を介して細胞に侵入する能力を付与するという証拠を提供するために、本発明者らは、ＨＥＲ２を唯一の受容体として発現する細胞を用いた。親Ｊ細胞はｇＤに対する受容体を発現せず、従ってｇＤを活性化することができず、ｗｔ‐ＨＳＶが感染しない。Ｊ‐ＨＥＲ２細胞は、唯一の受容体としてＨＥＲ２をトランスジェニック的に発現する。対照として、本発明者らは、受容体としてネクチン１又はＨＶＥＭをトランスジェニック的に発現しｗｔ‐ＨＳＶが感染するＪネクチン細胞及びＪ‐ＨＶＥＭ細胞を含ませた。示された細胞にＲ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＢＰ９０１を感染させ、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。
【０１２７】
図３Ａに示すように、Ｒ‐ＢＰ９０３はＪ‐ＨＥＲ２細胞に感染した。Ｒ‐ＢＰ９０３はｗｔ‐ｇＤをコードするので、Ｊネクチン、Ｊ‐ＨＶＥＭの感染は驚くべきことではなかった。このウイルスはＨＥＲ２に再標的化され、自然親和性(natural tropism)を保持する。
【０１２８】
本発明者らは、ｇＢの位置４３〜４４にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を担持し、ｇＤからの受容体結合部位の部分の欠失を担持する組み換え体を操作した。ｇＤの２つの主要受容体はネクチン１及びＨＶＥＭである。ｇＤにおけるＨＶＥＭの結合部位はＡＡ１〜３２に位置する。成熟ｇＤにおけるネクチン１の結合部位はより広範であり、Ｉｇ折り畳みコア(Ig-folded core)とＡＡ３５〜３８、１９９〜２０１、２１４〜２１７、２１９〜２２１の間に位置する部分とを含む。本発明者らは、Ｒ‐ＢＰ９０３成熟ｇＤからＡＡ６〜３８領域、即ちＲ‐ＬＭ１１３から以前に欠失された同じ領域を欠失させ、ＨＳＶが、成熟ｇＤのＡＡ５及び３９の間へのｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入によって、ＨＥＲ２に再標的化された。この欠失は、ＨＶＥＭ結合部位全体及び、ＡＡ３５〜３８の間に位置する部分を含むネクチン１との相互作用に関与する幾つかの残基を除去する。ネクチン１との相互作用に関与する少数のＡＡが欠失しているにもかかわらず、Ｒ‐ＬＭ１１３がネクチン１及びＨＶＥＭの両方から脱標的化されることが示された。Ｒ‐ＢＰ９０９と命名された組み換えウイルスは、Ｊ‐ＨＶＥＭ細胞だけでなくＪネクチン細胞にも感染せず、Ｊ‐ＨＥＲ２細胞に効率的に感染する能力を維持した（図３Ｂ）。Ｒ‐ＢＰ９０９親和性は、Ｒ‐ＢＰ９０３のそれとは著しく異なる（図３Ａを図３Ｂと比較されたい）。本発明者らは、ＨＥＲ２再標的化ｇＢを介したＲ‐ＢＰ９０９感染が、ｇＤにおけるＨＶＥＭ及びネクチン１に対する結合部位、従って受容体を介したｇＤ活性化を必要としないと結論する。要約すると、Ｒ‐ＢＰ９０９は、ｇＢを介してＨＥＲ２受容体に再標的化されｇＤ受容体から脱標的化される、完全にリダイレクトされた親和性を示す。
【０１２９】
ｇＢのＡＡ８１及び８２の間にｓｃＦｖＨＥＲ２を担持しｗｔｇＤを有する組み換え体Ｒ‐ＢＰ９０１は、Ｊ‐ＨＥＲ２細胞に感染せず、このウイルスはＨＥＲ２に再標的化されない（図３Ｃ）。
【０１３０】
実施例４：ＨＥＲ２＋及びＨＥＲ２−癌細胞の感染
【０１３１】
ＳＫ‐ＯＶ‐３、ＢＴ‐４７４及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３のＨＥＲ２＋癌細胞、ＨＥＲ２−のＨｅＬａ及びＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１癌細胞、並びにＨＥＲ２−非癌ＨａＣａＴ細胞を、Ｒ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＢＰ９０３により、３７℃で９０分間、入力感染多重度５ＰＦＵ／細胞（ＳＫ‐ＯＶ‐３において滴定）で感染させた。感染２４時間後に蛍光顕微鏡で画像を撮影した。Ｒ‐ＢＰ９０９は、ＨＥＲ２陽性癌細胞に感染し、ＨＥＲ２陰性細胞に感染していない。Ｒ‐ＢＰ９０３は、脱標的化の欠如と一致して、ＨＥＲ２の発現に関係なく細胞に感染する（図４）。
【０１３２】
実施例５：Ｊ‐ＨＥＲ２及びＳＫ‐ＯＶ‐３におけるＲ‐ＢＰ９０９侵入経路の特徴
【０１３３】
Ｊ‐ＨＥＲ２細胞へのＲ‐ＢＰ９０９の侵入が細胞受容体としてのＨＥＲ２を介して起こることを証明するため、及びＲ‐ＢＰ９０９のＳＫ‐ＯＶ‐３細胞への侵入経路におけるｇＤの役割を調べるために、本発明者らは、一連のブロッキングアッセイを行った。
【０１３４】
また、ｗｔ‐ｇＤ並びにＲ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＬＭ１１３内に存在する他のゲノム改変、即ちＢＡＣ配列の挿入及びＧＦＰマーカーの挿入を担持するＲ‐ＬＭ５を対照として使用した。先ず、本発明者らは、Ｒ‐ＢＰ９０９の感染がＨＥＲ２受容体を介して起こることを確認した。１２ウェルプレート中のＪ‐ＨＥＲ２細胞又はＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の複製単層を、ｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２が由来するＨＥＲ２に対するＭＡｂであるトラスツズマブと共に又は非免疫マウスＩｇＣ（最終濃度２８μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。抗体との３７℃で１時間のプレインキュベートの後、Ｒ‐ＢＰ９０９及び比較としてのＲ‐ＬＭ１１３又はＲ‐ＬＭ５により入力感染多重度５ＰＦＵ／細胞（ＳＫ‐ＯＶ‐３において滴定）で細胞を感染させた。両細胞タイプのＲ‐ＢＰ９０９感染はトラスツズマブによってほとんど消失しており、Ｒ‐ＢＰ９０９は、ＨＥＲ２を侵入のポータル(portal of entry)として用い、侵入のオフターゲット経路(off-target pathway of entry)を用いていないことが示された。Ｒ‐ＢＰ９０９がＨＥＲ２を受容体として利用することができるという発見は、ＨＳＶの親和性が、ｇＢにおける異種リガンドを操作することによって改変され得るという証拠を提供する。更に、ｇＢ再標的化ＨＳＶＲ‐ＢＰ９０９のＪ‐ＨＥＲ２細胞への感染は、ｇＤ受容体を欠き、その同種受容体(cognate receptors)によっては活性化され得ず、活性化をｇＢに伝達することができない細胞において生じ得る。本発明者らは、Ｒ‐ＢＰ９０９の感染が、機能的受容体結合部位を有するｇＤを必要としないと結論付けた。これは、再標的化Ｒ‐ＢＰ９０９がＨＥＲ２細胞をＪ‐ＨＥＲ２細胞における侵入のポータルとして利用するという結論を立証している。
【０１３５】
必須糖タンパク質、ｇＤ、ｇＨ／ｇＬの他、遺伝子操作により改変されなかったのｇＢの部分の寄与を解明するために、ビリオンをｇＤＨＤ１に対するＭＡｂｓ（１．５μｇ／ｍｌ）、ｇＢＨ１２６に対するＭＡｂｓ（１：２０００）、ｇＨに対するＭＡｂ５２Ｓ（腹水１：２５）と共に前述の３７℃で１時間プレインキュベートし、次いで９０分間細胞に吸着させた。ＭＡｂＨＤ１の場合、ＨＤ１とトラスツズマブ（別名ハーセプチン）の組み合わせも試験した。次いで、ウイルス接種物(viral inocula)を除去し、示された抗体を含む培地で細胞を覆った。
【０１３６】
感染は、蛍光活性化セルソーター(fluorescent activated cell sorter)（ＦＡＣＳ）によって定量化した（図５）。ｇＢに対するＭＡｂＨ１２６は、Ｔｙｒ３０３に必須残基を有する、ｇＢのドメインＩ内の直線状エピトープ(linear epitope)を認識する。ｇＨに対するＭＡｂ５２Ｓは、ｇＬとは無関係に、Ｓｅｒ５３６及びＡｌａ５３７に必須残基を有する連続エピトープを認識する。ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＪ‐ＨＥＲ２細胞の両方のＲ‐ＢＰ９０９感染は、ＭＡｂＨ１２６（１：２０００）によって消失し（図５Ａ及びＢ）、ｗｔ‐ｇＢ中の重要な機能的ドメインは、キメラ内に保存され、ｇＨ／ｇＬに対する役割であったことが示された。ＭＡｂＨＤ１は、以前の知見（Gatta et al, 2015）と一致して、Ｒ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＬＭ１１３感染を抑制しなかった。この結果は、Ｒ‐ＢＰ９０９がｇＢによってＨＥＲ２に再標的化され、成熟ｇＤにおけるＡＡ６〜３８欠失の影響でネクチン１／ＨＶＥＭから脱標的化されるという結論を支持する。
【０１３７】
実施例６：組み換え体の複製の程度
【０１３８】
本発明者らは、Ｒ‐ＢＰ９０９の複製の程度を、それぞれｇＤ及びｇＨにおけるｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入を介してＨＥＲ２に再標的化された組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＶＧ８０９の複製の程度と比較した。複製は、受容体としてＨＥＲ２及びネクチン１／ＨＶＥＭを発現するＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において測定した。
【０１３９】
細胞を３７℃で９０分間、入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞で感染させ、未吸着ウイルスを酸性洗浄（４０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ［ｐＨ３］）によって不活性化した。複製培養物を感染後の指定時間（３、２４及び４８時間）に凍結させ、その子孫をＳＫ‐ＯＶ‐３において滴定した。図６の結果は、Ｒ‐ＢＰ９０９がＲ‐ＶＧ８０９と同程度で複製し、Ｒ‐ＬＭ１１３より約１桁少なかったことを示している。
【０１４０】
実施例７：ＨＥＲ２陽性癌細胞を死滅させるためのＲ‐ＢＰ９０９及び比較用のＲ‐ＶＧ８０９の能力並びにＨＥＲ２癌細胞の死滅能力の欠如
【０１４１】
ＨＥＲ２陽性ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３並びにＨＥＲ２陰性ＭＤＡ‐ＭＢ‐２３１細胞を９６ウェルプレートに８×１０Ｅ３細胞／ウェルで播種し、３７℃で９０分間、組み換え体Ｒ‐ＢＰ９０９、比較用のＲ‐ＶＧ８０９に曝露し又は偽感染させた(mock-infected)。入力感染多重度（対応細胞株において滴定）は、ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３については２ＰＦＵ／細胞、ＭＤＡ‐２３１細胞については０．１ＰＦＵ／細胞であった。アラマーブルー(Alamar-Blue)（１０μｌ／ウェル、ライフテクノロジーズ）をウイルス曝露後の指定時間に培地に添加し、３７℃で４時間培養した。グロマックスディスカバーシステム（プロメガ）(GloMax Discover System（Promega）)を用いてプレートを５６０及び６００ｎｍで読み取った。各時点について、細胞生存率は、各サンプルについての培地単独の寄与を除外して、非感染細胞に対する感染細胞におけるアラマーブルー減少の百分率として表した。ＨＥＲ２陽性ＳＫ‐ＯＶ‐３及びＭＤＡ‐ＭＢ‐４５３においてＲ‐ＢＰ９０９及びＲ‐ＶＧ８０９によって引き起こされる細胞毒性は、感染後７日で７０〜９０％の範囲であった。どちらのウイルスも、ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ‐ＭＤ‐２３１癌細胞を死滅させておらず、それらの細胞に感染する能力がないことと一致していた（図７）。
【０１４２】
実施例８  Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４及び癌細胞株ＳＫ‐ＯＶ‐３においてＲ‐３１３が複製する能力
【０１４３】
既に示したように、ｇＤのＡＡ６〜３８の代わりにｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を挿入すると、ＨＥＲ２受容体への再標的化並びにネクチン１及びＨＶＥＭの両方からの脱標的化が組み換えウイルスＲ‐ＬＭ１１３に付与される。本発明において、本発明者らは、ｇＢのＡＡ４３〜４４の間にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を担持するＲ‐ＢＰ９０９が、ｇＢを介してＨＥＲ２受容体に再標的化された、完全にリダイレクトされた親和性を呈する証拠を提供する。
【０１４４】
本発明者らは、更に、短いペプチド、ここではＧＣＮ４ペプチドと命名された２つの隣接ｗｔＧＣＮ４残基及び２つのリンカーを有するＧＣＮ４酵母転写因子のエピトープYHLENEVARLKK（配列ＩＤ番号３８）によりここでは例示される短いペプチドによってＨＳＶを再標的化するために、ｇＢが適切なタンパク質であるかどうかを調査した。２０アミノ酸ペプチドは、ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖがネクチン１の細胞外ドメイン２、３、ＴＭ及びＣ尾部に融合してできた人工的受容体(Zahnd et al., 2004)を発現するＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株に感染してそこで複製する能力をＲ‐３１３に付与するはずである。
【０１４５】
Ｒ‐３１３の親和性を試験するために、本発明者らは、サルｗｔ‐Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４、ＳＫ‐ＯＶ‐３、及びｇＤに対する受容体を発現し又は発現しない前述のＪ細胞を使用した。示された細胞をＲ‐３１３により感染させ、そのような記載がある場合には、細胞をトラスツズマブ（別名ハーセプチン）（最終濃度２８μｇ／ｍｌ）で前処理した。感染は、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。
【０１４６】
図８に示すように、Ｒ‐３１３は、未処理Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４及びＶｅｒｏ‐ｗｔの両方に感染したが、トラスツズマブの存在下では、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４の感染のみが観察された。この結果は、Ｒ‐３１３がＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４に感染できたことを示す。Ｒ‐３１３によるｗｔ‐Ｖｅｒｏ細胞の感染とは対照的に、この感染はハーセプチンによっては抑制されず、実際にｇＢに挿入されたＧＣＮ４ペプチドによって媒介されたことが示された。Ｒ‐３１３によるｗｔ‐Ｖｅｒｏ細胞の感染は、実際に細胞のハーセプチンへの曝露により抑制されるので、Ｖｅｒｏ細胞内に存在するＨＥＲ２のサルオルソログ(simian ortholog)を介して生じる。
【０１４７】
ｇＤに融合したｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２は、ハーセプチンによる抑制によって立証されたように、ＨＥＲ２を介したＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の感染を依然として可能にした。Ｊ、Ｊネクチン及びＪ‐ＨＶＥＭの感染の欠如は、ｇＤのＡＡ６〜３８の欠失に起因してＲ‐ＬＭ１１３によって既に示された脱標的化プロファイルを確認した。累積的に、この一連の結果は、Ｒ‐３１３が、ｇＢに融合したＧＣＮ４ペプチドを介してＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞に感染し、ｇＤにおいてＨＥＲ２を介してＳＫ‐ＯＶ‐３細胞に感染する能力を有することを示している。
【０１４８】
実施例９：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐３１３の複製の程度
【０１４９】
本発明者らは、Ｒ‐３１３の複製の程度を、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞における組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５の複製の程度と比較した。細胞を３７℃で９０分間、入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞（対応細胞株において滴定）で感染させ、未吸着ウイルスを酸性洗浄（４０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ［ｐＨ３］）によって不活性化した。複製培養物を感染後の指定時間（３、２４及び４８時間）に凍結させ、その子孫をＳＫ‐ＯＶ‐３において滴定した。図９の結果は、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４においてはＲ‐ＬＭ１１３よりも高い程度で且つＲ‐ＬＭ５と同程度でＲ‐３１３が複製したことを示している。Ｒ‐３１３は、ＳＫ‐ＯＶ‐３においてＲ‐ＬＭ１１３と同程度で複製することができ、Ｒ‐ＬＭ５よりも１桁ほど低い。
【０１５０】
累積的に、結果は、Ｒ‐３１３がＧＣＮ４及びＨＥＲ２を介して同時に再標的化されることを示している。
【０１５１】
実施例１０：異なる細胞株におけるＲ‐３１３のコロニー形成率(plating efficiency)
【０１５２】
コロニー形成率実験のために、示された細胞単層をＲ‐３１３の連続希釈物（１０−５〜１０−１０）の複製分量(replicate aliquots)により感染させた。感染及び接種物の除去後、寒天を含む培地をプレートに添加し、単層を３７℃で３日間培養してプラーク形成(plaque formation)を可能にした。３日目に、蛍光顕微鏡下でプラークを数えた。数値は、ＳＫ‐ＯＶ‐３におけるＲ‐３１３コロニー形成率がＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４におけるそれと非常に類似していることを示しており、両者は、ｗｔ‐Ｖｅｒｏにおいて観測されたものよりも僅かに高く、Ｒ‐３１３が、ｇＢにおいて操作されたＧＣＮ４ペプチドとｇＤに挿入されたｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２とを二者択一的にそれぞれＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞に侵入するために利用できることが確認された。Ｊ‐ＨＥＲ２細胞におけるＲ‐３１３のコロニー形成率は、同じ細胞におけるＲ‐ＬＭ１１３と区別することができず、ＧＣＮ４ペプチドの挿入が有害ではないことが示された（図１０）。
【０１５３】
実施例１１：異なる細胞株におけるＲ‐３１３の相対的なプラークサイズ
【０１５４】
プラークサイズアッセイを行うために、Ｒ‐３１３、Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５の１０倍希釈物を、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３単層に播種した。感染した単層に、寒天を含む培地を重ねた。３日後、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。代表的な写真は、試験したいずれの細胞株においてもＲ‐３１３がＲ‐ＬＭ１１３よりも大きなプラークを形成していることを示す。同様に、Ｒ‐ＬＭ５によって形成されたプラークは、Ｒ‐３１３によって形成されたプラークよりも更に大きかった（図１１）。
【０１５５】
実施例１２
Ａ）Ｒ‐３１５：ｇＤ内のＡＡ６〜３８の欠失において既にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を発現しているＨＳＶ組み換え体におけるＨＳＶｇＢのＡＡ８１及び８２の間へのＧＣＮ４ペプチドの挿入。
【０１５６】
手順は、以下の相違点を除き、Ｒ‐３１３のｇＢにおいてＧＣＮ４ペプチドを操作するために上述したものと同じである。先ず、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ８１ｆＧＡＬＫ  CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号１５）及びｇＢ８１ＧＡＬＫｒｅｖ  CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号１６）により、ｇａｌＫカセットを増幅した。次いで、下流及び上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有しｇＢへの相同アームにより挟まれたＧＣＮ４ペプチドカセット（配列ＩＤ番号３６、配列ＩＤ番号３７をコードする）を、制限分析によるコロニーのスクリーニングに有用なＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのためのサイレント制限部位(silent restriction site)を導入するプライマーｇＢ＿８１＿ＧＣＮ４＿ｆｏｒ  CGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAAACCCACCGCCGCCGGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC（配列ＩＤ番号４９）及びｇＢ＿８１＿ＧＣＮ４＿ｒｅｖ  CGCAGGGTGGCGTGGCCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC（配列ＩＤ番号５０）のアニーリング及び伸長を介して生成した。組み換えゲノムは、配列ＧＳを有する１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーと１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーとを含むＧＣＮ４ペプチドを担持するキメラｇＢ（配列ＩＤ番号５１）をコードする。
【０１５７】
Ｂ）Ｒ‐３１７：ｇＤ内のＡＡ６〜３８の欠失において既にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を発現しているＨＳＶ組み換え体におけるＨＳＶｇＢのＡＡ７６及び７７の間へのＧＣＮ４ペプチドの挿入。
【０１５８】
手順は、以下の相違点を除き、Ｒ‐３１５のｇＢにおいてＧＣＮ４ペプチドを操作するために上述したものと同じである。先ず、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ＿７６＿ｇａｌＫ＿ｆｏｒ  GGCCCCGCCCCAACGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAACCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号４４）及びｇＢ＿７６＿ｇａｌＫ＿ｒｅｖ  CCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGCGGCGGCGGTGGGTTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号４５）により、ｇａｌＫカセットを増幅した。次いで、下流及び上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有しｇＢへの相同アームにより挟まれたＧＣＮ４ペプチドカセット（配列ＩＤ番号３６、配列ＩＤ番号３７をコードする）を、制限分析によるコロニーのスクリーニングに有用なＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのためのサイレント制限部位を導入するプライマーｇＢ＿７６＿ＧＣＮ４＿ｆｏｒ  GGCCCCGCCCCAACGGGGGACACGAAACCGAAGAAGAACAAAAAACCGAAAGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC（配列ＩＤ番号４６）及びｇＢ＿７６＿ＧＣＮ４＿ｒｅｖ  CCCGCGGCGACGGTCGCGTTGTCGCCGGCGGGGCGCGGCGGCGGTGGGTTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC（配列ＩＤ番号４７）のアニーリング及び伸長を介して生成した。組み換えゲノムは、配列ＧＳを有する１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーと１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーとを含むＧＣＮ４ペプチドを担持するキメラｇＢ（配列ＩＤ番号４８）をコードする。
【０１５９】
Ｃ）Ｒ‐３１９：ｇＤ内のＡＡ６〜３８の欠失において既にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を発現しているＨＳＶ組み換え体におけるＨＳＶｇＢのＡＡ９５及び９６の間へのＧＣＮ４ペプチドの挿入。
【０１６０】
手順は、以下の相違点を除き、Ｒ‐３１７のｇＢにおいてＧＣＮ４ペプチドを操作するために上述したものと同じである。先ず、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＢ＿９５＿ｇａｌＫ＿ｆｏｒ  CGCCGCCGCGCCCCGCCGGCGACAACGCGACCGTCGCCGCGGGCCACGCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号５２）及びｇＢ＿９５＿ｇａｌＫ＿ｒｅｖ  GTTTGCATCGGTGTTCTCCGCCTTGATGTCCCGCAGGTGCTCGCGCAGGGTTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号５３）により、ｇａｌＫカセットを増幅した。次いで、下流及び上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーを有しｇＢへの相同アームにより挟まれたＧＣＮ４ペプチドカセット（配列ＩＤ番号３６、配列ＩＤ番号３７をコードする）を、制限分析によるコロニーのスクリーニングに有用なＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼのためのサイレント制限部位を導入するプライマーｇＢ＿９５＿ＧＣＮ４＿ｆｏｒ  CGCCGCCGCGCCCCGCCGGCGACAACGCGACCGTCGCCGCGGGCCACGCCGGATCCAAGAACTACCACCTGGAGAACGAGGTGGCCAGACTGAAGAAGCTGGTGGGCAGC（配列ＩＤ番号５４）及びｇＢ＿９５＿ＧＣＮ４＿ｒｅｖ  GTTTGCATCGGTGTTCTCCGCCTTGATGTCCCGCAGGTGCTCGCGCAGGGTGCTGCCCACCAGCTTCTTCAGTCTGGCCACCTCGTTCTCCAGGTGGTAGTTCTTGGATCC（配列ＩＤ番号５５）のアニーリング及び伸長を介して生成した。組み換えゲノムは、配列ＧＳを有する１つの下流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーと１つの上流Ｓｅｒ‐Ｇｌｙリンカーとを含むＧＣＮ４ペプチドを担持するキメラｇＢ（配列ＩＤ番号５６）をコードする。
【０１６１】
組み換えウイルスＲ‐ＢＰ９０９を再構成するために、５００ｎｇの組み換えＢＡＣＤＮＡを、リポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ）により、Ｒ６と命名されたｇＤ相補細胞株（ＨＳＶ後期ＵＬ２６．５プロモーターの制御下でｗｔ‐ｇＤを発現しているウサギ皮膚細胞株(Zhou et al., 2000)）にトランスフェクトし、次いでＳＫ‐ＯＶ‐３細胞内で増殖させた。ウイルス増殖は緑色の蛍光によってモニタリングした。組み換え体の構造は、全ｇＢ、並びにＲ‐ＢＰ９０９についてｇＤ及びｇＨＯＲＦｓ、Ｒ‐ＢＰ９０３及びＲ‐ＢＰ９０１のｓｃＦｖＨＥＲ２及びｇＢにおける挿入部位を配列決定することにより検証した。我々は、組み換えウイルスＲ‐９０９のｇＢについて、操作ＢＡＣ‐ＤＮＡには存在しない１つの変異（Ｙ２７６Ｓ）を特定した。ウイルスストックを生成し、ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。
【０１６２】
組み換えウイルスＲ‐ＢＰ９０１、Ｒ‐ＢＰ９０３、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９を再構成するために、５００ｎｇの組み換えＢＡＣＤＮＡをリポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ）によりＳＫ‐ＯＶ‐３細胞にトランスフェクトした。ウイルス増殖は緑色の蛍光によってモニタリングした。Ｒ‐３１３ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３内で６回継代し、凍結／融解してＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を溶解し、続いてＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ細胞内で増殖させた。ウイルスストックをＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒにおいて生成し、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した。組み換えＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９のゲノムは、ｇＢ全体の配列決定によって部分的に検証した。
【０１６３】
実施例１３：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及び癌細胞株ＳＫ‐ＯＶ‐３においてＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９が複製する能力
【０１６４】
既に示したように、ｇＤのＡＡ６〜３８の代わりにｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を挿入すると、ＨＥＲ２受容体への再標的化並びにネクチン１及びＨＶＥＭの両方からの脱標的化が組み換えウイルスＲ‐ＬＭ１１３に付与される。本発明において、本発明者らは、ｇＢのＡＡ４３〜４４の間にｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を担持するＲ‐ＢＰ９０９が、ｇＢを介してＨＥＲ２受容体に再標的化された、完全にリダイレクトされた親和性を呈する証拠を提供する。
【０１６５】
本発明者らは、更に、短いペプチド、ここではＧＣＮ４ペプチドと命名された２つの隣接ｗｔＧＣＮ４残基及び２つのリンカーを有するＧＣＮ４酵母転写因子のエピトープYHLENEVARLKK（配列ＩＤ番号３８）によりここでは例示される短いペプチドによってＨＳＶを再標的化するために、ｇＢが適切なタンパク質であるかどうかを調査した。２０アミノ酸ペプチドは、ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖがネクチン１の細胞外ドメイン２、３、ＴＭ及びＣ尾部に融合してできた人工的受容体(Zahnd et al., 2004)を発現するＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ細胞株に感染してそこで複製する能力をＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９に付与するはずである。
【０１６６】
Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の親和性を試験するために、本発明者らは、サルｗｔ‐Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ＳＫ‐ＯＶ‐３、及びｇＤに対する受容体を発現し又は発現しない前述のＪ細胞を使用した。示された細胞を示された組み換え体により感染させ、そのような記載がある場合には、細胞をトラスツズマブ（別名ハーセプチン）（最終濃度２８μｇ／ｍｌ）で前処理した。感染は、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。
【０１６７】
図８に示すように、Ｒ‐３１３（パネルＡ）、Ｒ‐３１５（パネルＢ）、Ｒ‐３１７（パネルＣ）及びＲ‐３１９（パネルＤ）は、未処理Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＶｅｒｏ‐ｗｔの両方に感染したが、トラスツズマブ（別名ハーセプチン）の存在下では、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒの感染のみが観察された。この結果は、ｇＢの異なる位置にＧＣＮ４ペプチドの挿入を担持する全ての組み換え体が、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒに感染できたことを示す。ｗｔ‐Ｖｅｒｏ細胞の感染とは対照的に、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒの感染はハーセプチンによっては抑制されず、実際にｇＢに挿入されたＧＣＮ４ペプチドによって媒介されたことが示された。Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９によるｗｔ‐Ｖｅｒｏ細胞の感染は、実際に細胞のハーセプチンへの曝露により抑制されるので、Ｖｅｒｏ細胞内に存在するＨＥＲ２のサルオルソログを介して生じる。
【０１６８】
ｇＤに挿入されたｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２は、ハーセプチンによる抑制によって立証されたように、ＨＥＲ２を介したＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の感染を依然として可能にした。Ｊ、Ｊネクチン及びＪ‐ＨＶＥＭの感染の欠如は、ｇＤのＡＡ６〜３８の欠失に起因してＲ‐ＬＭ１１３によって既に示された脱標的化プロファイルを確認した。累積的に、この一連の結果は、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９が、ｇＢに挿入されたＧＣＮ４ペプチドを介してＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ細胞に感染し、ｇＤにおいてＨＥＲ２を介してＳＫ‐ＯＶ‐３細胞に感染する能力を有することを示している。
【０１６９】
実施例１４：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の複製の程度
【０１７０】
本発明者らは、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の複製の程度を、ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞（図９Ａ）及びＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ細胞（図９Ｂ）における組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５の複製の程度と比較した。細胞を３７℃で９０分間、入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞（対応細胞株において滴定）で感染させ、未吸着ウイルスを酸性洗浄（４０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ［ｐＨ３］）によって不活性化した。複製培養物を感染後の指定時間（２４及び４８時間）に凍結させ、その子孫をＳＫ‐ＯＶ‐３において滴定した。図９Ａから、Ｒ‐３１５及びＲ‐３１７は、ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐ＬＭ５及びＲ‐ＬＭ１１３と同様の力価(titters)まで増殖したことが分かる。対照的に、Ｒ‐３１３及びＲ‐３１９は、Ｒ‐３１５及びＲ‐３１７よりも１〜２桁ほど少なく増殖した。図９Ｂの結果は、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５及びＲ‐３１７が、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４ＲにおいてはＲ‐ＬＭ１１３と同程度で且つＲ‐ＬＭ５よりも１桁低く複製したことを示している。同様に、Ｒ‐３１９は、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９よりも１〜２桁ほど少なく増殖した。
【０１７１】
累積的に、結果は、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９がＧＣＮ４及びＨＥＲ２を介して同時に再標的化されることを示している。
【０１７２】
実施例１５：異なる細胞株におけるＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９のコロニー形成率
【０１７３】
本発明者らは、異なる細胞株においてＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９がプラークを形成する能力を、数値（図１０）に関して比較した。ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において滴定した同量のウイルス（５０ＰＦＵ）を含むＲ‐ＬＭ５、Ｒ‐ＬＭ１１３、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の複製分量をｗｔ‐Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＳＫ‐ＯＶ‐３上に播種した。寒天を含む培地を感染した単層に重ね、プラークの数を３日後に数えた。
【０１７４】
実験の結果は、ｇＢ内にＧＣＮ４ペプチド挿入を担持している全ての組み換えウイルス（Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９）のコロニー形成率が、ｗｔ‐Ｖｅｒｏと比較してＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ細胞上でより高かったが、対照ウイルスについてはそうではなかった。全てのｇＢ組み換え体は、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞において同様のコロニー形成率を示した。
【０１７５】
実施例１６：異なる細胞株におけるＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の相対的なプラークサイズ
【０１７６】
プラークサイズアッセイを行うために、Ｒ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９の１０倍希釈物を、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ｗｔ‐Ｖｅｒｏ及びＳＫ‐ＯＶ‐３単層に播種した。感染した単層に、寒天を含む培地を重ねた。３日後、蛍光顕微鏡で写真を撮影した。代表的な写真は、試験したいずれの細胞株においてもＲ‐３１３、Ｒ‐３１５、Ｒ‐３１７及びＲ‐３１９がＲ‐ＬＭ１１３よりも大きなプラークを形成していることを示す。Ｒ‐ＬＭ５によって形成されたプラークは更に大きかった（図１１）。プラークサイズの決定（図１１Ｂ）のために、各ウイルスについて５つのプラークの写真を撮った。プラーク面積（ｐｘＥ２）をＮｉｓエレメントイメージングソフトウェア（ニコン）(Nis Elements-Imaging Software（Nikon）)で測定した。各結果は平均面積±ＳＤを表す。
【０１７７】
実施例１７：Ｒ‐３２１：ｇＤにおけるＡＡ６〜３８の欠失においてｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を既に発現しており、ｇＢのＡＡ４３及び４４の間にＧＣＮ４ペプチドを既に発現しているＨＳＶ組み換え体におけるｇＤのＡＡ６〜２９及び３１〜３７の再導入。
【０１７８】
先ず、ｐＧａｌＫをテンプレートとして用い、プライマーｇＤ５＿ｇａｌＫ＿ｆ  TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA（配列ＩＤ番号５７）及びｓｃＦｖ＿ｇａｌＫ＿ｒｅｖ  GAGGCGGACAGGGAGCTCGGGGACTGGGTCATCTGGATATCGGAATTCTCTCAGCACTGTCCTGCTCCTT（配列ＩＤ番号５８）により、ｇａｌＫカセットを増幅した。ｇａｌＫカセットは、ｇａｌＫ組み換え技術によりＲ‐３１３バックボーンに挿入した。次いで、
プライマーｇＤｄｅｌ３０＿３８ｆｏｒ  TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGATGCCTCTCTCAAGATGGCCGACCCCAATCGCTTTCGCGGCAAAGACCTTCCGGTCC（配列ＩＤ番号５９）及びｇＤｄｅｌ３０＿３８ｒｅｖ  GAGGCGGACAGGGAGCTCGGGGACTGGGTCATCTGGATATCGGAATTCTCCACGCGCCGGACCCCCGGAGGGGTCAGCTGGTCCAGGACCGGAAGGTCTTTGCCGCGA（配列ＩＤ番号６０）のアニーリング及び伸長を介して、ｇＤのＡＡ６〜２９及び３１〜３７を備えるオリゴを生成した。組み換えゲノムは、ｇＤのＡＡ３０及び３８の欠失並びにｇＤのＡＡ３７の後におけるｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入を担持するキメラｇＤ（配列ＩＤ番号６１）をコードする。配列ＩＤ番号３５は、アミノ酸４３及び４４の間にＧＣＮ４ペプチドを挿入したキメラｇＢを示す。組み換えＢＡＣの構造は、ｇＤの領域６〜３７の上流及び下流の配列決定によって検証した。
【０１７９】
組み換えウイルスＲ‐３２１を再構成するために、５００ｎｇの組み換えＢＡＣＤＮＡをリポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ）によりＳＫ‐ＯＶ‐３細胞にトランスフェクトした。ウイルス増殖は緑色の蛍光によってモニタリングした。Ｒ‐３２１ウイルスをＳＫ‐ＯＶ‐３内で６回継代し、凍結／融解してＳＫ‐ＯＶ‐３細胞を溶解し、続いてＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ細胞内で増殖させた。
【０１８０】
実施例１８：Ｒ‐３２１をＨＧＶ‐１天然受容体から再標的化する。
【０１８１】
既に示したように、ｇＤのＡＡ６〜３８の代わりにｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２を挿入すると、ＨＥＲ２受容体への再標的化並びにネクチン１及びＨＶＥＭの両方からの脱標的化が組み換えウイルスＲ‐ＬＭ１１３に付与される。本発明において、本発明者らは、ｇＤのＡＡ３０〜３８のみの欠失及びｇＤのＡＡ３７の後のｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２の挿入を担持するＲ‐３２１が、それがＨＳＶ‐１天然受容体を介して感染する能力を失っていることにより、完全に脱標的化されたプロファイルを呈する証拠を提供する。また、Ｒ‐３２１は、Ｒ‐３１３と同様に、ｇＢのＡＡ４３及び４４の間にＧＣＮ４ペプチドを担持する。
【０１８２】
Ｒ‐３２１の親和性を試験するために、本発明者らは、サルｗｔ‐Ｖｅｒｏ、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ、ＳＫ‐ＯＶ‐３、及びｇＤに対する受容体を発現し又は発現しない前述のＪ細胞を使用した。示された細胞をＲ‐３２１により感染させ、そのような記載がある場合には、細胞をトラスツズマブ（別名ハーセプチン）（最終濃度２８μｇ／ｍｌ）で前処理した。感染は、感染２４時間後に緑色蛍光顕微鏡でモニタリングした。
【０１８３】
Ｊ、Ｊネクチン及びＪ‐ＨＶＥＭの感染の欠如（図１５）は、Ｒ‐３２１が、ｇＤのＡＡ３０及び３８の欠失に起因してＨＳＶ‐１天然受容体から脱標的化されることを示す。ｇＤに融合したｓｃＦｖ‐ＨＥＲ２は、ハーセプチンによる抑制によって立証されたように、ＨＥＲ２を介したＳＫ‐ＯＶ‐３細胞の感染を可能にした。図１５に示すように、Ｒ‐３２１は、未処理Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＶｅｒｏ‐ｗｔの両方に感染したが、トラスツズマブ（別名ハーセプチン）の存在下では、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒの感染のみが観察された。この結果は、Ｒ‐３２１が、Ｒ‐３１３と同様に、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒに感染できることを示す。ｗｔ‐Ｖｅｒｏ細胞の感染とは対照的に、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒの感染はハーセプチンによっては抑制されず、実際にｇＢに挿入されたＧＣＮ４ペプチドによって媒介されたことが示された。Ｒ‐３２１による感染は、実際に細胞のハーセプチンへの曝露により抑制されるので、Ｖｅｒｏ細胞内に存在するＨＥＲ２のサルオルソログを介して生じる。
【０１８４】
累積的に、これらの結果は、Ｒ‐３２１が、ｇＤにおけるａａ３０及び３８の欠失の影響で、ＧＣＮ４を介して及びＨＥＲ２を介して同時に再標的化され、またＨＳＶ天然受容体から脱標的化されることを示している。
【０１８５】
実施例１９：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ及びＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐３２１の複製の程度
【０１８６】
本発明者らは、Ｒ‐３２１の複製の程度を、ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞（図１６Ａ）及びＶｅｒｏ‐ＧＣＮ４Ｒ（図１６Ｂ）における組み換え体Ｒ‐ＬＭ１１３及びＲ‐ＬＭ５の複製の程度と比較した。細胞を３７℃で９０分間、入力感染多重度０．１ＰＦＵ／細胞（対応細胞株において滴定）で感染させ、未吸着ウイルスを酸性洗浄（４０ｍＭのクエン酸、１０ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ［ｐＨ３］）によって不活性化した。複製培養物を感染後の指定時間（２４及び４８時間）に凍結させ、その子孫をＳＫ‐ＯＶ‐３において滴定した。図１６Ａから、Ｒ‐３２１は、ＳＫ‐ＯＶ‐３細胞におけるＲ‐ＬＭ５及びＲ‐ＬＭ１１３と同様の力価まで増殖したことが分かる。図１６Ｂの結果は、Ｒ‐３２１が、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４ＲにおいてはＲ‐ＬＭ１１３よりも１桁高く且つＲ‐ＬＭ５と同程度で複製したことを示している。
【０１８７】
実施例２０：Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株
【０１８８】
ＶｅｒｏＧＣＮ４細胞株は、ＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖ(Zahnd et al., 2004)から作られ、配列ＩＤ番号３９において報告されているようなヒトコドン使用(human codon usage)に最適化された配列を有し、ネクチン１に融合した人工キメラ受容体を発現する。ＧＣＮ４ペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ転写因子ＧＣＮ４の一部であり、その部分的ｍＲＮＡ配列は配列ＩＤ番号４２において報告されている。より詳細には、ｐＤＩＳＰＬＡＹ（インビトロジェン）(pDISPLAY (Invitrogen))ベクターにおけるのと同様に、Ｎ末端リーダーペプチド(N-terminal leader peptide)及びＨＡタグ配列(HA tag sequence)が存在する。これは、リーダーペプチドの効率的で適切なプロセシングを確実にするはずである。ＨＡタグの後に、短いＧＡリンカーがｓｃＦｖの上流に存在する。ＧＣＮ４に対するｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号３９において報告されている。ｓｃＦｖのＣ末端に短いＧＳＧＡリンカーが存在する。残りの分子は、ネクチン１細胞外ドメイン２及び３とＴＭセグメントと細胞内細胞質尾部(intracellular cytoplasmic tail)とを備えるヒトネクチン１（ＰＶＲＬ１）残基Ｍｅｔ１４３〜Ｖａｌ５１７に対応する（図１２）。キメラを遺伝子技術(Gene Art)によりインビトロで合成し、ｐｃＤＮＡ３．１‐Ｈｙｇｒｏ＿（＋）へとクローン化させた結果、プラスミドｓｃＦｖ＿ＧＣＮ４＿ネクチン１キメラがもたらされ、その挿入部分(insert)は、配列ＩＤ番号４０により特定されるヌクレオチド配列を有し、これはｓｃＦｖ＿ＧＣＮ４ネクチン１キメラ配列ＩＤ番号４１のアミノ酸配列をコードする。
【０１８９】
プラスミドｓｃＦｖ＿ＧＣＮ４＿ネクチン１キメラからのＤＮＡをリポフェクタミン２０００によりＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ‐８１（商標））にトランスフェクトした。ＧＣＮ４ペプチドに対する人工受容体を発現するＶｅｒｏ細胞をハイグロマイシン（２００μｇ／ｍｌ）により選択し、次いでＨＡタグに対するＭＡｂと組み合わされた磁気ビーズ（ミルテニー（Miltenyi））によりソートした。ソートした細胞を９６ウェル（０．５細胞／ウェル）で単一細胞クローニングに付した。
【０１９０】
ＨＡタグに対するＭＡｂによるＧＣＮ４ペプチドに対するｓｃＦｖの発現の検出のためのＦＡＣＳにより単一クローンを分析した。選択されたクローンは１１．２であった。我々は、Ｖｅｒｏ‐ＧＣＮ４細胞株の連続継代中に人工受容体の発現が連続４０継代後も安定したままであることを確認した（図１３）。
【０１９１】
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【図１ＡＢ】
2019520817.tif 000003
【図１ＣＤ】
2019520817.tif 000004
【図１ＥＦＧ】
2019520817.tif 000005
【図２】
2019520817.tif 000006
【図３】
2019520817.tif 000007
【図４】
2019520817.tif 000008
【図５】
2019520817.tif 000009
【図６】
2019520817.tif 000010
【図７】
2019520817.tif 000011
【図８ＡＢ】
2019520817.tif 000012
【図８ＣＤ】
2019520817.tif 000013
【図９】
2019520817.tif 000014
【図１０】
2019520817.tif 000015
【図１１Ａ】
2019520817.tif 000016
【図１１Ｂ】
2019520817.tif 000017
【図１２】
2019520817.tif 000018
【図１３】
2019520817.tif 000019
【図１４】
2019520817.tif 000020
【図１５】
2019520817.tif 000021
【図１６】
2019520817.tif 000022
【配列表】
2019520817000001.app
【国際調査報告】
2019520817.tif 000023
2019520817.tif 000024
2019520817.tif 000025
2019520817.tif 000026