(57)【要約】  間葉系間質細胞から強力な細胞外小胞またはエクソソーム集団を単離する方法と、肺高血圧症、気管支肺異形成症を含めた血管障害、ならびにミトコンドリア機能障害と関連した疾患および状態の治療における単離細胞外小胞またはエクソソームの使用とを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺高血圧症を治療する方法であって、それを必要とする対象に間葉系間質細胞から得た単離細胞外小胞またはエクソソームを投与することを含み、前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、前記間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加している細胞外小胞またはエクソソームを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞外小胞またはエクソソームが、前記間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける同じ発現産物の平均量と比較して、少なくとも２０％高い発現産物の発現を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）解糖経路中の遺伝子がＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子がＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、（ｃ）電子伝達系中の遺伝子がＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がＰＫである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子がＡＴＰａｓｅである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象の肺組織におけるグルコース酸化を正常化する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが少なくとも０．１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬのＰＫ活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、３週間の慢性低酸素状態曝露を施しＰＢＳで処理した対照マウスと比較して少なくとも１０％、３週間の慢性低酸素状態曝露を施したマウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を下げることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、２４時間の低酸素状態曝露を施しＰＢＳ対照で処理した対照ＳＭＣ細胞溶解物と比較して少なくとも２０％、２４時間の低酸素状態曝露を施したＳＭＣ細胞溶解物によるＯ２消費を増大することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に間葉系間質細胞から得た単離細胞外小胞またはエクソソームを投与することを含み、前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、前記間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加した細胞外小胞またはエクソソームを含む、方法。
【請求項１１】
（ａ）解糖経路中の遺伝子がＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子がＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、かつ（ｃ）電子伝達系中の遺伝子がＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がＰＫである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが少なくとも０．１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬのＰＫ活性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子がＡＴＰａｓｅである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象の肺組織におけるグルコース酸化を正常化する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態が、前記対象におけるミトコンドリアのグルコース酸化の低減と関連している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態が、フリードライヒ運動失調症、レーベル遺伝性視神経症、カーンズセイヤー症候群、乳酸アシドーシスおよび脳血管発作様症状発現を伴うミトコンドリア脳筋症、リー症候群、肥満症、アテローム性動脈硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、がん、心不全、心筋梗塞（ＭＩ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、および慢性疲労症候群からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
肺高血圧症を治療または予防することができる細胞外小胞またはエクソソームを単離する方法であって、以下のステップ：
ａ．細胞外小胞またはエクソソームを含む間葉系間質細胞の培養培地を用意するステップ、
ｂ．前記培養培地の他の成分から前記細胞外小胞またはエクソソームの少なくとも一部分を分離するステップ、
ｃ．他の細胞外小胞またはエクソソーム集団から細胞外小胞またはエクソソーム集団を単離するステップであって、前記集団が、前記間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加している、ステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記細胞外小胞またはエクソソーム集団をリン脂質検出によって単離する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）解糖経路中の遺伝子がＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子がＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、かつ（ｃ）電子伝達系中の遺伝子がＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子がＰＫである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子がＡＰＴａｓｅである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
肺高血圧症を治療または予防することができる細胞外小胞またはエクソソームを単離する方法であって、以下のステップ：
ａ．細胞外小胞またはエクソソームを含む間葉系間質細胞の培養培地を用意するステップ、
ｂ．前記培養培地の他の成分から前記細胞外小胞またはエクソソームの少なくとも一部分を分離するステップ、
ｃ．分子量に基づき細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団を分離するステップ、
ｄ．前記細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団で低酸素状態曝露マウスを処理するステップ、
ｅ．酸素正常状態マウス、低酸素状態曝露マウス、および前記細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定するステップ、
ｆ．前記ＲＶＳＰに基づき細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団を同定するステップ
を含む方法。
【請求項２４】
細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰと低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰの比が０．８５以下である場合、細胞外小胞またはエクソソームの集団が強力である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
デルタＲＶＳＰが５未満であり、デルタＲＶＳＰが細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰマイナス酸素正常状態マウスのＲＶＳＰである場合、細胞外小胞またはエクソソームの集団が強力である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ステップｃにおいて、細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団をリン脂質検出によって分離する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団が、前記間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）解糖経路中の遺伝子がＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子がＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、かつ（ｃ）電子伝達系中の遺伝子がＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子がＰＫである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子がＡＴＰａｓｅである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
気管支肺異形成症を治療または予防することができる細胞外小胞またはエクソソームを単離する方法であって、以下のステップ：
ａ．細胞外小胞またはエクソソームを含む間葉系間質細胞の培養培地を用意するステップ、
ｂ．前記培養培地の他の成分から前記細胞外小胞またはエクソソームの少なくとも一部分を分離するステップ、
ｃ．分子量に基づき細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団を分離するステップ、
ｄ．前記細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団で低酸素状態曝露マウスを処理するステップ、
ｅ．酸素正常状態マウス、低酸素状態曝露マウス、および前記細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定するステップ、
ｆ．前記ＲＶＳＰに基づき細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団を同定するステップを
含む方法。
【請求項３２】
ステップｂにおける分離がサイズ排除クロマトグラフィーによる、請求項２３または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項２３または請求項３１に従って得られる単離細胞外小胞またはエクソソームを含む組成物。
【請求項３４】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが約１００ｎｍの平均直径を有する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームがＦＬＯＴおよび／またはＡＮＸＡ２を発現する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、前記間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソームにおけるｍｉｒ２０４の平均量と比較してｍｉｒ２０４の発現が増加している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、全間葉系間質細胞中のＣＤ１０５、ＧＡＰＤＨ、ＤＬＳＴ、および／またはＡＴＰ５Ａ１の平均量と比較してＣＤ１０５、ＧＡＰＤＨ、ＤＬＳＴ、および／またはＡＴＰ５Ａ１の増大した発現を含有するＭＳＣから分泌される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソームにおけるＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよび／またはＡＮＫＲＤ３０ＢＬの平均量と比較してＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよび／またはＡＮＫＲＤ３０ＢＬのＲＮＡ発現が増大している、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３９】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームがＭＨＣＩＩ汚染物質を実質的に含まない、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４０】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームがフィブロネクチンを実質的に含まない、請求項３３に記載の組成物。
【請求項４１】
気管支肺異形成症を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に請求項３１から４０のいずれか一項に記載の単離細胞外小胞またはエクソソームを投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象の免疫調節能力を増大させる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象におけるＩＬ−６および／またはＴＮＦαの発現を低減させる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象の血管形成を促進する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象における酸素過剰誘導型アポトーシスを低減させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象におけるシトクロムＣレベルを低減させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象のミトコンドリア代謝を増大させる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象における管形成を修復する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象におけるＧＬＵＤ１および／またはＰＤＨ遺伝子発現を上方制御する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象におけるＰＤＫ４遺伝子発現を下方制御する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記単離細胞外小胞またはエクソソームが前記対象におけるＳＩＲＴ４遺伝子発現を下方制御する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象にシルデナフィルを投与することをさらに含む、請求項１から１７および４１から５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５１，６２７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願は、エクソソームを含めた強力な細胞外小胞を単離する方法と、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）を含めた肺高血圧症、ならびにミトコンドリア機能障害と関連した状態および疾患の治療における細胞外小胞またはエクソソームの使用とに関する。
【背景技術】
【０００３】
肺高血圧症は進行性であり、肺血管の圧力の増大によって特徴付けられる致命的疾患であることが多い。肺循環の狭窄の増大は右心に対するストレスの増大をもたらし、これによって右心不全を発症する可能性がある。定義によって、慢性肺高血圧症の症例における平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）は、安静時＞２５ｍｍＨｇまたは作業時＞３０ｍｍＨｇ（正常値＜２０ｍｍＨｇ）である。例えば、未治療の肺動脈性肺高血圧症は、診断後平均２．８〜５年以内で死に至る（Keily et al. (2013) BMJ 346:f2028）。肺動脈性肺高血圧症の病態生理は、肺血管の血管収縮および再構築によって特徴付けられる。慢性ＰＡＨでは、当初は非筋肉形成状態であった肺血管の新たな筋肉形成があり、既に筋肉形成状態であった血管の血管筋肉は周径が増大する。この結果として生じる肺動脈圧の増大は右心に対する進行的ストレスをもたらし、これは右心からの心拍出量の減少につながり、最終的に右心不全に至る（M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S）。ＰＡＨは稀な障害であり、百万人あたり１〜２人の罹患率である。患者の平均年齢は３６才であると推定されており、患者のわずか１０％が６０才を超えていた。男性より女性が明らかに罹患している（G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349）。
【０００４】
数多くの機序がＰＡＨの病因に関係している。重要なことに、この疾患における異常なミトコンドリアのグルコース酸化の下流での全体代謝の抑制が記載されている。ミトコンドリア機能の低下によって、多数の細胞型の関与、肺血管細胞のがん様増殖、およびアポトーシスに対するこれらの細胞の耐性などの、多くの明らかに無関係なＰＡＨにおける異常が１つになる可能性がある。ＰＡＨにおけるミトコンドリア機能障害の役割を示す証拠があるにもかかわらず、ミトコンドリア機能の治療標的化は難しいことが証明されている。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、ミトコンドリア機能の標的化などにより肺高血圧症を治療するための、改良型治療用組成物および方法を開発する必要がある。
【０００６】
一態様では、本開示は、（予防を含めた）肺高血圧症を治療する方法であって、それを必要とする対象に間葉系間質細胞から得た単離細胞外小胞またはエクソソームを投与することを含み、単離細胞外小胞またはエクソソームが、間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加した細胞外小胞またはエクソソームを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける同じ発現産物の平均レベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、または１００％高い発現産物の発現を含む。
【０００７】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のタンパク質（複数可）の発現が増加している。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のＲＮＡ（複数可）の発現が増加している。
【０００８】
幾つかの実施形態では、（ａ）解糖経路中の遺伝子はＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子はＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、かつ（ｃ）電子伝達系中の遺伝子はＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される。
【０００９】
幾つかの実施形態では、遺伝子はＰＫである。幾つかの他の実施形態では、遺伝子はＡＴＰａｓｅである。
【００１０】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象におけるグルコース酸化を正常化する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象の肺組織におけるグルコース酸化を正常化する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは少なくとも０．１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬのＰＫ活性を有する。
【００１１】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、３週間の慢性低酸素状態曝露を施しＰＢＳで処理した対照マウスと比較して少なくとも１０％、３週間の慢性低酸素状態曝露を施したマウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を下げることができる。
【００１２】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、２４時間の低酸素状態曝露を施しＰＢＳ対照で処理した対照ＳＭＣ細胞溶解物と比較して少なくとも２０％、２４時間の低酸素状態曝露を施した平滑筋細胞（ＳＭＣ）細胞溶解物によるＯ２消費を増大することができる。
【００１３】
別の態様では、本開示は、ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に間葉系間質細胞から得た単離細胞外小胞またはエクソソームを投与することを含み、単離細胞外小胞またはエクソソームが、間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均レベルと比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加した細胞外小胞またはエクソソームを含む、方法を提供する。
【００１４】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のタンパク質（複数可）の発現が増加している。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のＲＮＡ（複数可）の発現が増加している。
【００１５】
幾つかの実施形態では、（ａ）解糖経路中の遺伝子はＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子はＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、かつ（ｃ）電子伝達系中の遺伝子はＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、遺伝子はＰＫである。幾つかの他の実施形態では、遺伝子はＡＴＰａｓｅである。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象の肺組織におけるグルコース酸化を正常化する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは少なくとも０．１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬのＰＫ活性を有する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態は、対象におけるミトコンドリアのグルコース酸化の低減と関連している。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態は、フリードライヒ運動失調症、レーベル遺伝性視神経症、カーンズセイヤー症候群、乳酸アシドーシスおよび脳血管発作様症状発現を伴うミトコンドリア脳筋症、リー症候群、肥満症、アテローム性動脈硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、がん、心不全、心筋梗塞（ＭＩ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、および慢性疲労症候群からなる群から選択される。
【００１８】
別の態様では、本開示は、肺高血圧症を治療または予防することができる細胞外小胞またはエクソソームを単離する方法であって、以下のステップ：（ａ）細胞外小胞またはエクソソームを含む間葉系間質細胞の培養培地を用意するステップ、（ｂ）培養培地の他の成分から細胞外小胞またはエクソソームの少なくとも一部分を分離するステップ、および（ｃ）他の細胞外小胞またはエクソソーム集団から細胞外小胞またはエクソソーム集団を単離するステップであって、集団が、間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加している、ステップを含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本開示は、肺高血圧症を治療または予防することができる細胞外小胞またはエクソソームを単離する方法であって、以下のステップ：（ａ）細胞外小胞またはエクソソームを含む間葉系間質細胞の培養培地を用意するステップ、（ｂ）培養培地の他の成分から細胞外小胞またはエクソソームの少なくとも一部分を分離するステップ、（ｃ）分子量に基づき細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団を分離するステップ、（ｄ）細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団で低酸素状態曝露マウスを処理するステップ、（ｅ）酸素正常状態マウス、低酸素状態曝露マウス、および細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定するステップ、および（ｆ）ＲＶＳＰに基づき細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団を同定するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰと低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰの比が０．８５以下である場合、細胞外小胞またはエクソソームの集団は強力である。
【００２１】
幾つかの実施形態では、デルタＲＶＳＰが５ｍｍＨｇ未満であり、デルタＲＶＳＰが細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰマイナス酸素正常状態マウスのＲＶＳＰである場合、細胞外小胞またはエクソソームの集団は強力である。
【００２２】
幾つかの実施形態では、ステップｃにおいて、細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団をリン脂質検出によって分離する。
【００２３】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、間葉系間質細胞から得た全細胞外小胞またはエクソソームにおける発現産物の平均量と比較して、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の発現産物の発現が増加している。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のタンパク質（複数可）の発現が増加している。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、（ａ）解糖経路中の遺伝子、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子、および（ｃ）電子伝達系中の遺伝子からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子のＲＮＡ（複数可）の発現が増加している。
【００２４】
幾つかの実施形態では、（ａ）解糖経路中の遺伝子はＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択され、（ｂ）ＴＣＡ回路中の遺伝子はＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択され、かつ（ｃ）電子伝達系中の遺伝子はＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、遺伝子はＰＫである。幾つかの実施形態では、遺伝子はＡＴＰａｓｅである。
【００２６】
別の態様では、本開示は、気管支肺異形成症を治療または予防することができる細胞外小胞またはエクソソームを単離する方法であって、以下のステップ：（ａ）細胞外小胞またはエクソソームを含む間葉系間質細胞の培養培地を用意するステップ、（ｂ）培養培地の他の成分から細胞外小胞またはエクソソームの少なくとも一部分を分離するステップ、（ｃ）分子量に基づき細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団を分離するステップ、（ｄ）細胞外小胞またはエクソソームの異なる集団で低酸素状態曝露マウスを処理するステップ、（ｅ）酸素正常状態マウス、低酸素状態曝露マウス、および細胞外小胞またはエクソソームで処理した低酸素状態曝露マウスの右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定するステップ、および（ｆ）ＲＶＳＰに基づき細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団を同定するステップを含む方法を提供する。
【００２７】
幾つかの実施形態では、方法のステップ（ｂ）は、サイズ排除クロマトグラフィーにより培養培地の他の成分から細胞外小胞またはエクソソームの一部分を分離する。
【００２８】
別の態様では、本開示は、本開示中に記載したいずれかの方法に従って得られる単離細胞外小胞またはエクソソームを含む組成物を提供する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは約１００ｎｍの平均直径を有する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームはＦＬＯＴおよび／またはＡＮＸＡ２を発現する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソームにおけるｍｉｒ２０４の平均量と比較してｍｉｒ２０４の発現が増加している。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソームにおけるＣＤ１０５、ＧＡＰＤＨ、ＤＬＳＴ、および／またはＡＴＰ５Ａ１の平均量と比較してＣＤ１０５、ＧＡＰＤＨ、ＤＬＳＴ、および／またはＡＴＰ５Ａ１の増大した発現を含有するＭＳＣから分泌されている。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソームにおけるＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよび／またはＡＮＫＲＤ３０ＢＬの平均量と比較してＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよび／またはＡＮＫＲＤ３０ＢＬのＲＮＡ発現が増大している。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームはＭＨＣＩＩ汚染物質を実質的に含まない。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームはフィブロネクチンを実質的に含まない。
【００２９】
別の態様では、本開示は、気管支肺異形成症を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に本開示中に記載したいずれかの方法に従って得られる単離細胞外小胞またはエクソソームを投与することを含む方法を提供する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象の免疫調節能力を増大させる。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、対象におけるＩＬ−６および／またはＴＮＦαの発現を低減させる。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象の血管形成を促進する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象における酸素過剰誘導型アポトーシスを低減させる。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象におけるシトクロムＣレベルを低減させる。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象のミトコンドリア代謝を増大させる。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象における管形成を修復する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象におけるＧＬＵＤ１および／またはＰＤＨ遺伝子発現を上方制御する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象におけるＰＤＫ４遺伝子発現を下方制御する。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは対象におけるＳＩＲＴ４遺伝子発現を下方制御する。
【００３０】
幾つかの実施形態では、肺高血圧症および／または気管支肺異形成症の治療または予防方法は、対象にシルデナフィルを投与することをさらに含む。
【００３１】
提供する図面は、開示する主題を例示するものであり、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】ＭＳＣ培養培地からのエクソソームの単離、およびマウスにおいて慢性低酸素状態誘導型ＰＡＨを予防する際のそれらの効能を示す図である。図１Ａは、サイズ排除クロマトグラフィーに基づき単離した異なるエクソソーム集団を示す。図１Ｂは、リン脂質濃度検出およびＡ２８０クロマトグラムによって単離したエクソソームのオーバーレイを示す。
【図１−２】ＭＳＣ培養培地からのエクソソームの単離、およびマウスにおいて慢性低酸素状態誘導型ＰＡＨを予防する際のそれらの効能を示す図である。図１Ｃは、低酸素状態誘導型ＰＡＨを有するマウスを治療した際の単離エクソソームの影響を示す。強力なエクソソーム集団（緑色ドットとして示すＥＸＭ２）はマウスにおいて慢性低酸素状態誘導型ＰＡＨを予防したが、一方で他のエクソソーム集団（赤色ドットとして示すＥＸＭ１）は予防しなかった。
【図２】強力なエクソソーム集団の同定を示す図である。図２Ａは、低酸素状態治療群と低酸素状態対照の間の、ＲＶＳＰ変化倍率に対してプロットしたエクソソーム集団のピルビン酸キナーゼ活性を示す。図２Ｂは、デルタＲＶＳＰに対してプロットしたエクソソーム集団のピルビン酸キナーゼ活性を示す。赤色ドットは、ＲＶＳＰの有意な改善を誘導した強力なエクソソーム集団を表す。青色ドットは、低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスの治療において強力ではないエクソソーム集団を表す。図２Ｃは、箱ひげ図でグラフ化した強力なエクソソーム集団のピルビン酸キナーゼ活性を示す。
【図３】異なるエクソソーム集団のプロテオーム解析を例証する図である。図３Ａは、強力なエクソソーム集団において、発現レベルが増加したタンパク質が解糖、ＴＣＡ回路、および電子伝達系に関与したことを示す。図３Ｂは、強力なエクソソーム集団（ＥＸＭ２）と非強力なエクソソーム集団（ＥＸＭ１）の両方のピルビン酸キナーゼのウエスタンブロット解析を示す。
【図４】異なるエクソソーム集団のＲＮＡｓｅｑ解析を示す図である。結果は、強力なエクソソーム集団が、解糖、ＴＣＡ回路、および電子伝達系に関与した富化遺伝子を含有していたことを実証し、これはグルコース酸化増大のための遺伝子リプログラミングに関する強力なエクソソーム集団の可能性を示唆する（ａ）。
【図５−１】酸素正常状態または４％Ｏ２低酸素状態のいずれかに２４時間曝露した後の、エクソソーム治療ＳＭＣ細胞溶解物におけるＯ２消費アッセイを示す図である。図５Ａは、ＰＢＳ対照に標準化した勾配として計算したＯ２消費を示す。
【図５−２】酸素正常状態または４％Ｏ２低酸素状態のいずれかに２４時間曝露した後の、エクソソーム治療ＳＭＣ細胞溶解物におけるＯ２消費アッセイを示す図である。図５Ｂは、ＰＢＳ対照に標準化した曲線下面積として計算したＯ２消費を示す。図５Ａおよび図５Ｂの結果は、エクソソームが、酸素正常状態曝露ＳＭＣにおける細胞Ｏ２消費を有意に変えることはないことを示す。他方で、エクソソーム治療は低酸素状態ストレス下でＯ２消費の増大を誘導し、これはミトコンドリア機能の増大を示す。
【図６−１】急性低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物のマイクロアレイ解析の結果を例証する図である。図６Ａは、エクソソーム治療によって標準化した、低酸素状態曝露後の解糖におけるＥＮＯ１遺伝子発現の増加を示す。
【図６−２】急性低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物のマイクロアレイ解析の結果を例証する図である。図６Ｂは、エクソソーム治療によって標準化した、低酸素状態曝露後のＴＣＡ回路におけるＰＤＨＢおよびＡＣＬＹ遺伝子発現の増加を示す。図６Ｃは、エクソソーム治療によって標準化した、低酸素状態曝露後の電子伝達系におけるＮＤＵＦＡＦ３、ＡＴＰ２Ｂ４、ＡＴＰ５Ｈ、ＡＴＰ９１遺伝子発現の増加を示す。
【図７−１】急性低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物のメタボロミクス解析を示す図である。図７Ａは、解糖における代謝産物レベルの変化倍率を示す。図７Ｂは、ＴＣＡ回路における代謝産物レベルの変化倍率を示す。
【図７−２】急性低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物のメタボロミクス解析を示す図である。図７Ｃは、電子伝達系における代謝産物レベルの変化倍率を示す。図７Ｄは、エクソソーム治療有りおよび無しで低酸素状態に曝露した生存ＳＭＣにおけるＡＴＰ生成の比較を示す（＃は酸素正常状態と比較してｐ≦０．０５を意味し、＄は低酸素状態と比較してｐ≦０．０５を意味し、＊は酸素正常状態と比較してｐ≦０．１、および低酸素状態と比較してｐ≦０．１を意味する）。結果は、解糖、ＴＣＡ回路における代謝産物の構築、およびこれらの経路を介した流動の低下による低酸素状態曝露後のエネルギー代謝を示した。エクソソーム治療によってこれらの経路を介した流動は増大し、これはエクソソーム治療がグルコース酸化を増大し急性低酸素状態に対するＳＭＣストレス応答を正常化することを示す。
【図８−１】低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の解析を示す図である。図８Ａは、２４時間の低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の培地ＬＤＨの活性を示す。図８Ｂは、２４時間の低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の培地クエン酸のレベルを示す。
【図８−２】低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の解析を示す図である。図８Ｃは、慢性的２週間の低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の培地ＬＤＨの活性を示す。図８Ｄは、慢性的２週間の低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の培地クエン酸のレベルを示す。
【図８−３】低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物の解析を示す図である。図８Ｅは、慢性的２週間の低酸素状態曝露後のＳＭＣ溶解物における、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性型サブユニット（ＰＤＨＥ１α）、ＰＤＨＥ１α阻害剤ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）、およびＡＴＰａｓｅのタンパク質発現を示す（＃は酸素正常状態と比較してｐ≦０．０５を意味し、＄は低酸素状態と比較してｐ≦０．０５を意味し、＊は酸素正常状態と比較してｐ≦０．１、および低酸素状態と比較してｐ≦０．１を意味する）。結果は、エクソソーム治療が、急性および慢性低酸素状態曝露後にミトコンドリア機能を正常化することを示す。
【図９】エクソソーム治療に関する提示モデルを示す図である。特に、肺高血圧症はミトコンドリアのグルコース酸化を抑制し、全身ミトコンドリア機能の低下をもたらす。エクソソーム治療はグルコース酸化を正常化し、解糖（１）およびミトコンドリア内のＴＣＡ回路と電子伝達系（２）における急性期タンパク質組み込みおよび／または酵素の慢性的遺伝子上方制御の両方によってミトコンドリア能力を改善する。
【図１０】ダイアフィルトレーションステップ無し（青色）およびダイアフィルトレーションステップ有り（オレンジ色）で生成したエクソソームのクロマトグラムの比較を示す図である。青色クロマトグラムはオレンジ色のそれよりはるかに高いＡ２８０読み取り値を有し、ダイアフィルトレーション試料と比較して多量の試料中のタンパク質を示唆する。ダイアフィルトレーションステップは、エクソソームの所望濃度に達した後、ＴＦＦカセットフィルターにポンプを動かし続けながら体積維持のため容器へのＰＢＳバッファーの添加を含む、バッファー交換と類似している。徐々に、ＰＢＳが順化培地と置き換わる。可能な限り交換を完了させるため、７合計体積のダイアフィルトレーションを保持液に実施した。このステップは、エクソソームに影響を与えずに、保持液中の一部の不純物を除去するのに役立つ。エクソソームの存在はＦＬＯＴ−１ウエスタンブロットによって確認した。この図は、エクソソーム保持中の少量の全体タンパク質とリン脂質によって示されるように、ダイアフィルトレーションステップが不純物を除去するのに役立つことを示す。
【図１１】エクソソーム生成解析を示す図である。図１１Ａは、１２の試料のＦＬＯＴ−１ウエスタンブロット解析を示す。図１１Ｂはエクソソームのサイズ分布を示し、約１００ｎｍの平均直径を有する。
【図１２】クロマトグラム、ＮＴＡ、ＦＬＯＴ−１ウエスタンブロットおよびＡＮＸＡ２ウエスタンブロットを含めた、例示的エクソソーム生成の補足解析および評価を示す図である。
【図１３】強力なエクソソームの解析を示す図である。図１３Ａは、ＣＯＭ１（大きく非強力なエクソソーム集団）とＣＯＭ２（小さく強力なエクソソーム集団）のクロマトグラムを示す。図１３Ｂは、低酸素状態対照と比較した各調製物由来の（低酸素状態誘導型肺高血圧症の動物モデルにおける）ＲＶＳＰに対する全体タンパク質のプロッティングを示す。結果は、大きく非強力な分画中に多くのタンパク質が存在するとき、生成する調製物は強力であることを示す。図１３Ｃは、餓死前の給餌日数に対する全体タンパク質のプロッティングを示す。結果は、（強力調製物と指定した）陽性デルタタンパク質を餓死１日前にいずれも連続的に給餌したことを示す。
【図１４】ｍｉｒ２０４（ＲＮＡサイレンシングおよび遺伝子発現の転写後制御中約２２のヌクレオチド官能基を含有する低分子非コードＲＮＡ分子）のプロッティングを示す図である。ＣＯＭ１は低分子ｍｉＲＮＡに相当する高いサイクル閾値（ＣＴ）の値、および低い効能を有する。対照的に、ＣＯＭ２はｍｉｒ２０４発現が増加している。
【図１５】エクソソームの効能は、親ＭＳＣ細胞において、ＣＤ１０５タンパク質発現（図１５Ａ）、ＧＡＰＤＨ遺伝子発現（図１５Ｂ）、ＤＬＳＴ遺伝子発現（図１５Ｃ）、およびＡＴＰ５Ａ１遺伝子発現（図１５Ｄ）とプラスの関係があることを示す図である。結果は、細胞の代謝健康状態はエクソソームの効能と直接関係があることを示す。
【図１６】気管支肺異形成症（ＢＰＤ）患者の肺発達障害を示す図である。図１６Ａは、異なるステージのＢＰＤのレントゲン写真を示す。図１６Ｂは、マウスモデルにおける肺胞傷害を示す。
【図１７】酸素過剰ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよびウネキシソーム（unexisome）媒介炎症抑制を示す図である。肺胞細胞を２４時間接種し、０．１％ＦＢＳ培地に移し、酸素正常状態インキュベーターにおいて３時間、強力なエクソソーム集団（ウネキシソーム）で初回抗原刺激し、酸素過剰インキュベーションチャンバー中で４８時間平板培養した。
【図１８】強力なエクソソーム集団（ウネキシソーム）が、酸素過剰ストレスに曝露した細胞においてＩＬ−６の発現低下に基づき免疫調節能力を増大させることを示す図である（酸素過剰状態はＩＬ−６の放出を引き起こす）。「＃」は酸素正常状態対照と比較したエクソソーム治療の有意性を示す。「＊」は酸素過剰状態対照と比較したエクソソーム治療の有意性を示す。
【図１９】強力なエクソソーム集団（ウネキシソーム）が、酸素過剰ストレスに曝露した細胞においてＴＮＦαの発現低下に基づき免疫調節能力を増大させることを示す図である（酸素過剰状態はＴＮＦαの放出を引き起こす）。「＊」は酸素過剰状態対照と比較したエクソソーム治療の有意性を示す。
【図２０】強力なエクソソーム集団（ウネキシソーム）が、細胞数の増大に相当する吸光度の増大によって示されるように、酸素過剰状態の下で抗アポトーシス効果を有することを示す図である。「＊」は酸素過剰状態対照と比較したエクソソーム治療の有意性を示す。
【図２１】強力なエクソソーム集団（ウネキシソーム）が、酸素過剰ストレスに曝露した細胞からのシトクロムＣ放出を減らすことを示す図であり、これは細胞アポトーシスの減少に相当する。＊は酸素過剰状態対照と比較したエクソソーム治療の有意性を示す。
【図２２】図２２Ａは、酸素正常状態細胞、酸素過剰ストレスに曝露した細胞、および強力なエクソソームで治療した細胞の蛍光イメージを示す図である。図２２Ｂは、エクソソーム（ＣＯＭ２）治療は酸素過剰状態で管形成を修復することを示す。
【図２３】平滑筋細胞（ＳＭＣ）慢性低酸素状態モデルの概略を示す図である。ＳＭＣはＰＡＨおよび低酸素状態で増殖、非アポトーシス表現型に変わり、肺中の血管および動脈の肥大をもたらし、高圧、および最終的に心臓に対するダメージ／ＰＡＨにおいて負の症状を引き起こす。ＳＭＣは酸素正常状態、４％酸素状態、および４％酸素＋エクソソームで培養した。培養期間中、２週間の間１週間に２回、強力なエクソソームで細胞を治療した。生成したＳＭＣは、マイクロアレイ遺伝子発現（ＩＰＡ）および／または全体的メタボロミクスによって解析した。
【図２４】経路内の中間代謝産物の全体的代謝産物解析により、エクソソームが慢性低酸素状態においてアミノ酸代謝を上方制御することを示す図である。
【図２５】エクソソームが、慢性低酸素状態においてピルビン酸およびグルタミン酸代謝を上方制御することを示す図である。
【図２６】エクソソームが、慢性低酸素状態においてＧＬＵＤ１遺伝子発現を上方制御することを示す図である。
【図２７】エクソソームが、慢性低酸素状態においてＰＤＫ４を下方制御することを示す図である。
【図２８】エクソソームが、慢性低酸素状態においてＳＩＲＴ４を下方制御することを示す図である。ＳＩＲＴ４遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＨモデルにおいて２つの代謝酵素、ＧＬＵＤ１およびＰＤＨを阻害する。ＳＩＲＴ４遺伝子はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＨモデルではエクソソーム治療により下方制御され、一方ＧＬＵＤ１およびＰＤＨはエクソソーム治療により上方制御される。ＳＩＲＴ４はエクソソーム治療の標的であると考えられる。
【図２９】エクソソームが、低酸素状態において下方制御された遺伝子を上方制御することにより、ＴＣＡ回路機能を修復することを示す図である（ＴＣＡ回路中９酵素のうち６酵素が下方制御される）。
【図３０】ＳＩＲＴ４とエクソソーム治療の間の関係を示す図である。
【図３１】ＴＣＡ回路を修復する際の、強力なエクソソームの提案された機序を示す図である。特に低酸素状態は、（１）ＴＣＡ回路中へのＰＤＨ、したがってピルビン酸の進入をいずれも阻害するＳＩＲＴ４とＰＤＫ４の上方制御、（２）ＴＣＡ回路中へのＧＬＵＤ１、したがってグルタミンの進入を阻害するＳＩＲＴ４の上方制御によってＴＣＡ回路機能を阻害する。強力なエクソソーム（ウネキシソーム）はＳＩＲＴ４とＰＤＫ４の両方を低減させ、それによってＴＣＡ回路中へのグルタミンとピルビン酸の流動を増大させる。
【図３２】非理想的サイズのエクソソームだけでなくタンパク質と非強力な微細小胞汚染物質も単離する超遠心分離または勾配分離と比較した、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した強力なエクソソーム集団（ＣＯＭ２）の単離を示す図である。
【図３３】エクソソームのＴＥＭイメージングを示す図である。結果は、単離した強力なエクソソームは、超遠心分離試料と比較してより均一なサイズと鮮明なイメージを有することを示す。
【図３４】単離した強力なエクソソームは、ＭＨＣＩＩ汚染物質を含まないことを示す図である。対照的に、ＺｅｎＢｉｏからの市販のエクソソームはＭＨＣＩＩ汚染物質を含有する。
【図３５】ポンソー染色に基づいて、単離した強力なエクソソームはフィブロネクチンおよび他のタンパク質汚染物質を含まないことを示す図である。図３５Ａは、単離エクソソームは汚染タンパク質フィブロネクチンを含まず、一方で市販のＺｅｎＢｉｏ超遠心分離調製物はフィブロネクチン汚染物質を有することを示す。図３５Ｂは、超遠心分離により単離したエクソソームは、濃縮細胞培養培地と同様にフィブロネクチン汚染物質を含有したことを示す。サイズ排除クロマトグラフィーにより単離したエクソソームは、ポンソーにより染色され得るフィブロネクチン汚染物質および他のタンパク質汚染物質を含まない。
【図３６】強力集団と微細小胞汚染物質のＲＮＡｓｅｑクラスタリング解析を示す図である。結果は、強力なエクソソーム（ＣＯＭ２）が微細小胞汚染物質から差次的に群がることを示す。それらはＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよびＡＮＫＲＤ３０ＢＬが富化状態である。
【図３７】強力なエクソソーム（ＣＯＭ２）対非強力なエクソソーム（ＣＯＭ１）におけるＧＡＰＤＨ発現を示す図である。結果は、強力なエクソソームが、ＧＡＰＤＨの高発現レベルに相当する低いＣＴ値を有することを示す。
【図３８】強力なエクソソーム（ウネキシソーム）で治療したＢＰＤマウスモデルのｉｎ  ｖｉｖｏ試験の手順を示す図である。
【図３９】ｉｎ  ｖｉｖｏ試験中で使用したエクソソームの特徴付けを示す図である。図３９Ａは、エクソソームの濃度が１．２×１０８粒子／ｍＬであることを示す。図３９Ｂは、ウエスタンブロット解析に基づき、ＦＬＯＴ１がエクソソーム中に存在することを示す。図３９Ｃは、エクソソームの代表的ＴＥＭイメージングを示す。
【図４０】エクソソームが、ＢＰＤ関連肺胞簡略化を低減したことを示す図である。図４０Ａは、強力なエクソソームでの治療は、酸素正常状態（ＮＲＭＸ）と比較した酸素過剰状態（ＨＹＲＸ）媒介の肺胞簡略化の増大を救済することを示す。図４０Ｂは、平均空間径の代わりを表す平均肺胞径の定量化を示す。
【図４１】強力なエクソソーム（ウネキシソーム）で治療したＢＰＤ後ＰＡＨのＢＰＤ誘導型ＰＡＨマウスモデルのｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関する手順を示す図である。
【図４２】エクソソームが、慢性的肺胞簡略化を救済したことを示す図である。図４２Ａは、酸素正常状態、低酸素状態下での細胞、ならびにホウォートンゼリー由来エクソソーム、および骨髄由来エクソソームで治療した細胞のイメージを示す。図４２Ｂは、エクソソームがＢＰＤ関連ＰＡＨマウスモデルにおいて肺胞簡略化を救済したことを示す。図４２Ｃは、ＢＰＤ関連ＰＡＨマウスモデルにおいて中隔野内のコラーゲン沈着によって示されたように、エクソソームが低度肺線維症を低減したことを示す。
【図４３】エクソソームがＰＡＨ肺血管再構築を救済したことを示す図であり、これはα−平滑筋アクチン染色（ＡとＢ）およびＰＡＨに関連した圧力変化（Ｃ）によって実証された。ＰＶ−ループは酸素過剰状態（ＨＹＲＸ）マウスにおける有意なシフトを実証し、酸素正常状態（ＮＲＭＸ）対照と比較したとき肺気腫のような肺疾患および空気捕捉の特徴を示す。エクソソームは、このシフトにおいて肺機能改善を示す有意な救済を示した。
【図４４】図４４Ａは、低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスモデル治療のｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関する手順を示す図である。図４４Ｂは、ＭＳＣエクソソームがマウスにおいてＰＡＨを予防することを示す。
【図４５】図４５Ａは、エクソソームとシルデナフィルの併用で治療したＳｕｇｅｎ（ＶＥＧＦ受容体アゴニスト）および低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスモデルのｉｎ  ｖｉｖｏ試験の手順を示す図である。図４５Ｂは、エクソソームとシルデナフィルの併用療法がマウスモデルにおいてＰＡＨを逆行させたことを示す。
【図４６】ＰＡＨにおけるエクソソーム媒介作用機序の同定に関する手順を示す図である。
【図４７】ＰＡＨのＳｕｇｅｎ／低酸素状態モデルにおいて、エクソソームがアミノ酸代謝を上方制御することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
幾つかのＭＳＣ細胞外小胞またはエクソソーム（例えば、骨髄ＭＳＣ細胞外小胞またはエクソソーム）はグルコース酸化を高め、ミトコンドリア機能を正常化することができる。したがって、これらの細胞外小胞またはエクソソームは、ＰＡＨおよびミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態において治療利点をもたらすことができる。本発明者らは、マウスにおいて低酸素状態誘導型ＰＡＨを効率よく予防した、強力な細胞外小胞またはエクソソーム集団を単離した。強力な細胞外小胞またはエクソソーム集団のプロテオミクスおよびＲＮＡｓｅｑ解析によって、それらが解糖経路、ＴＣＡ回路および電子伝達系において高発現レベルの遺伝子を含有することを示す。特に、強力な細胞外小胞またはエクソソームは、高発現レベルのピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ２）とＡＴＰａｓｅ、およびそれらの対応する酵素活性を有する。本発明者らは、急性低酸素状態への肺動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）の曝露は、解糖、ＴＣＡ回路、および電子伝達系に関与する多数の遺伝子の上方制御をもたらすことも発見した。低酸素状態刺激前の細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団でのＳＭＣの治療によって、これらの遺伝子シグネチャーを正常化した。さらに、全体的メタボロミクス解析に基づくと、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は低酸素状態曝露ＳＭＣにおいて解糖およびＡＴＰ生成を高める。理論によって拘束されたくないが、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、解糖経路、ＴＣＡ回路、および／または電子伝達系などの主要経路内の遺伝子リプログラミングとタンパク質組み込みの両方によって、標的細胞におけるミトコンドリア機能を改善する可能性がある（図９参照）。
【００３４】
幾つかの実施形態では、本発明の細胞外小胞またはエクソソームはＰＤＨとＧＬＵＤ１の発現を増加させ、したがってＴＣＡ回路への流動を増加させる。
【００３５】
理論によって拘束されたくないが、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、ＰＤＨとＧＬＵＤ１両方の周知の阻害剤であるＳＩＲＴ４の阻害によって、ＰＤＨとＧＬＵＤ１の発現を増加させる可能性がある。したがって幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームはＴＣＡ回路の機能を増大させる。
【００３６】
ＰＡＨを含めた肺高血圧症の治療、およびミトコンドリア機能障害と関連した疾患および状態の治療において、本発明を適用することができることは企図される。
【００３７】
Ａ．定義
他に指定しない限り、「ａ」または「ａｎ」は「１つまたは複数」を意味する。
【００３８】
他に具体的に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有するものと考えられたい。
【００３９】
他に示さない限り、本開示中で利用する組換えタンパク質、細胞培養、および免疫技法は、当業者によく知られている標準手順である。このような技法は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T. A. Brown（編集者）、Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press(1991),D. M. Glover and B. D. Hames（編集者）、DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996),and F. M. Ausubel et al.（編集者）、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience（１９８８、現在までの全ての最新版を含む）、Ed Harlow and David Lane（編集者）Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),and J. E. Coligan et al.（編集者）Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全ての最新版を含む）などのソース中の文献全体で記載され説明されており、これらは参照により本明細書に組み込まれている。
【００４０】
本明細書で使用する用語「対象」（本明細書では「患者」とも呼ぶ）は、恒温動物、好ましくはヒトを含めた哺乳動物を含む。好ましい実施形態では、対象は霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００４１】
本明細書で使用する用語「治療すること」、「治療する」または「治療」は、血管障害の少なくとも１つの症状の低減、緩和、または排除を含む。
【００４２】
本明細書で使用する用語「予防すること」、「予防する」または「予防」は、血管障害の少なくとも１つの症状の様相または存在の停止または妨害を含む。
【００４３】
本明細書で使用する用語「発現」は、１つまたは複数の遺伝子のＲＮＡ発現および／またはタンパク質発現レベルを意味する。言い換えると、用語「発現」はＲＮＡ発現またはタンパク質発現のいずれかを指すことができる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「低酸素状態」は、大気中Ｏ２濃度、２０％未満の酸素（Ｏ２）濃度を有する状態を指す。幾つかの実施形態では、低酸素状態は、０％と１０％の間、０％と５％の間のＯ２、５％と１０％の間、または５％と１５％の間にあるＯ２濃度を有する状態を指す。一実施形態では、低酸素状態は約１０％Ｏ２酸素の濃度を指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「酸素正常状態」は、正常大気中濃度の酸素、約２０％〜２１％Ｏ２を有する状態を指す。
【００４６】
本明細書で使用する用語「単離する」または「単離した」は、細胞培養または培地から単離した細胞外小胞またはエクソソームの文脈で使用するとき、人間の手作業によってその天然環境から離れて存在する細胞外小胞またはエクソソームを指す。
【００４７】
本明細書で使用する用語「細胞外小胞」は、エクソソームを包含する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「細胞外小胞またはエクソソームの集団」は、独自の特性を有する細胞外小胞またはエクソソームの集団を指す。用語「細胞外小胞またはエクソソームの集団」と「細胞外小胞またはエクソソーム」を同義で使用して、独自の特性を有する細胞外小胞またはエクソソームの集団を指すことができる。
【００４９】
本明細書で使用する用語「間葉系間質細胞」は、間葉系幹細胞を含む。間葉系幹細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靭帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜において見られる細胞である。
【００５０】
間葉系幹細胞は、中胚葉、内胚葉、および外胚葉などの異なる生殖系列に分化することができる。したがって間葉系幹細胞は、脂肪、骨、軟骨、弾性、筋肉、および線維性結合組織には限られないが、これらを含めた多数の細胞型に分化することができる。間葉系幹細胞によって進入される特異的系統関係および分化経路は、機械的影響を含めた様々な影響、および／または増殖因子、サイトカインなどの内在生体活性因子、および／または宿主組織によって確定する局所微小環境条件に依存する。したがって、間葉系幹細胞は非造血前駆細胞であり、それらは分裂して幹細胞または前駆細胞のいずれかである娘細胞になり、いずれ不可逆的に分化して１つの表現型の細胞となる。
【００５１】
本発明の幾つかの実施形態は、広義には、間葉系間質細胞の細胞外小胞またはエクソソームに関するものであり、これらは同義で間葉系間質細胞の細胞外小胞またはエクソソーム、またはＭＳＣの細胞外小胞またはエクソソーム、または細胞外小胞またはエクソソームを指す。
【００５２】
Ｂ．血管障害
血管障害には、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）などの肺高血圧症、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症下肢虚血（ＣＬＩ）、冠動脈疾患、および糖尿病性血管障害があるが、これらには限られない。
【００５３】
肺高血圧症、例えば肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）は、肺循環中の圧力が増大し、最終的に心不全および死を引き起こす状態を指す。多くの原因および条件がＰＡＨと関連することが分かっているが、それらの多くは幾つか共通の根本的な病態生理学的特徴を共有する。これらのプロセス間の１つの特徴は、血管状態を制御し血塊形成を修復および阻害する多くの物質群の生成と代謝を通常担う、内皮、全血管壁の内側細胞層の機能障害である。ＰＡＨの状態では、内皮機能障害が、有害物質の過剰生成および保護物質の生成障害をもたらす可能性がある。これがＰＡＨ発症または下流カスケードの一部における主要事象であるかどうかは依然知られていないが、いずれかの場合、それはこの疾患を特徴付ける進行性血管収縮および血管増殖における一因である。本発明は、単離細胞外小胞またはエクソソームを使用して、ＰＡＨを含めた肺高血圧症を治療する方法を提供する。
【００５４】
用語末梢血管疾患（ＰＶＤ）は、末梢動脈および静脈内の損傷、機能障害または閉塞を指す。末梢動脈疾患は最も一般的な型のＰＶＤである。末梢血管疾患は最も一般的な動脈の疾患であり、米国内では非常に一般的な状態である。それは大抵５０才を超える人々において発生する。末梢血管疾患は、５０才を超える人々の間、および糖尿病を有する人々において身体障害の主な原因である。米国内の約１千万人に末梢血管疾患があり、これは５０才を超える人々の約５％と換言できる。この状態を有する人々の数は人口の年齢と共に増大すると予想される。男性は女性よりわずかに末梢血管疾患を有する可能性が高い。
【００５５】
末梢動脈閉塞の進行が原因である重症下肢虚血（ＣＬＩ）は、安静時の血流および酸素送達の低下によって特徴付けられ、安静時の筋肉痛および非癒合性皮膚潰瘍または壊疽をもたらす（Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest. 31:651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31:S1-S296 (2000)）。重症下肢虚血は、１年間で個体百万人あたり５００〜１０００人において発症すると推定される（“Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia”, Circulation 84 (4Suppl.) IV 1-26 (1991)）。重症下肢虚血を有する患者では、その関連罹患率、死亡率および機能的関与にもかかわらず、身体障害症状に対する解決策として切断を勧められることが多い（M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)）。重症下肢虚血に最適な医療法は存在しない（Circulation 84 (4 Suppl.): IV 1-26 (1991)）。
【００５６】
冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）は、１つまたは複数の冠動脈がプラークの構築により徐々に閉塞状態になる、ヒトにおける進行性疾患である。この疾患を有する患者の冠動脈は、バルーン血管形成術またはステントの挿入により治療され、部分的に閉塞した動脈を適切に開放することが多い。最終的にこれらの患者は、多大な出費とリスクで冠動脈バイパス手術を受けることが必要となる。
【００５７】
気管支肺異形成症（ＢＰＤ）は未熟児の慢性肺疾患である。それは、持続的肺炎症、肺胞数の減少および肺胞隔膜の肥大、末端血管の「剪定」を伴う異常な血管増殖、ならびに限られた代謝および抗酸化能力によって特徴付けられる。米国では１年間あたり１４，０００のＢＰＤの新たな症例がある。重要なことに、ＢＰＤの診断は、ＰＡＨ、肺気腫、喘息、心臓血管疾患罹患率および出生後死亡率の増大、神経発達障害および脳性麻痺の増加、青少年肺気腫を含めた、他のさらなる状態につながることが多い。現在、ＢＰＤに関する標準療法は存在しない。一部のＢＰＤ患者は適度な換気とコルチコステロイドで治療されているが、これらの治療は神経系の成り行きまたは死に対して影響を示さない。ＢＰＤに関する主なリスクは、嚢発達の初期に相当する出生後２４〜２８週の幼児に存在する。高リスクの幼児は１．３〜２．２ポンドである。
【００５８】
一態様では、本発明のエクソソームを使用してＢＰＤを治療することができる。幾つかの実施形態では、エクソソームは肺の免疫調節能力を増大させる。幾つかの実施形態では、エクソソームは肺中の血管形成を促進する。幾つかの実施形態では、エクソソームは肺のミトコンドリア代謝を増大させる。
【００５９】
Ｃ．ミトコンドリア機能障害
ミトコンドリアは、幾つかの代謝形質転換および制御機能を担う細胞内オルガネラである。ミトコンドリアは、真核生物細胞によって利用されるＡＴＰの大部分を生成する。ミトコンドリアは、酸化ストレスを引き起こすフリーラジカルおよび活性酸素種の主要供給源でもある。結果として、ミトコンドリアの欠陥は、高いエネルギーレベルが要求される神経および筋肉組織に対して特に有害である。したがってエネルギーの欠陥は、運動障害、心筋症、筋症、失明、および難聴の形態に関係している（DiMauro et al. (2001) Am. J. Med. Genet. 106, 18-26; Leonard et al.(2000) Lancet. 355, 299-304）。ミトコンドリア機能障害は、乳酸生成の増大、呼吸およびＡＴＰ生成の低減に関与し得る。ミトコンドリア機能障害は、酸化ストレスの結果として現れる可能性がある。
【００６０】
本発明は、ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態を治療する方法を提供する。ミトコンドリア機能障害は、対象におけるミトコンドリアのグルコース酸化の低減と関連し得る。
【００６１】
幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能障害と関連した疾患または状態は、フリードライヒ運動失調症、レーベル遺伝性視神経症、カーンズセイヤー症候群、乳酸アシドーシスおよび脳血管発作様症状発現を伴うミトコンドリア脳筋症、リー症候群、肥満症、アテローム性動脈硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、がん、心不全、心筋梗塞（ＭＩ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、および慢性疲労症候群からなる群から選択される。
【００６２】
Ｄ．ミトコンドリアのエネルギー生成
真核生物における細胞は、細胞プロセスを行うのにエネルギーを必要とする。このようなエネルギーはアデノシン５’−三リン酸（「ＡＴＰ」）のリン酸結合内に主に蓄えられる。（１）解糖、（２）（クレブス回路またはクエン酸回路とも呼ばれる）ＴＣＡ回路、および（３）酸化的リン酸化を含めた、真核生物中でエネルギーを生成する特定の経路が存在する。合成されるＡＴＰに関して、炭水化物は最初に単糖（例えばグルコース）に加水分解され、脂質は脂肪酸とグリセロールに加水分解される。同様に、タンパク質はアミノ酸に加水分解される。これらの加水分解分子の化学結合中のエネルギーは次いで放出され、細胞によって利用され多数の異化作用経路を介してＡＴＰ分子が形成される。
【００６３】
生存生物の主要エネルギー源はグルコースである。グルコース分解中、グルコース分子の化学結合におけるエネルギーが放出され、細胞によって利用されＡＴＰ分子を形成し得る。これが起こるプロセスは数段階からなる。最初の段階は解糖と呼ばれ、その中ではグルコース分子が、ピルビン酸と呼ばれる２つの小分子に分解される。
【００６４】
解糖において、グルコースとグリセロールは解糖経路を介してピルビン酸に代謝される。このプロセス中、２つのＡＴＰ分子が生成する。２分子のＮＡＤＨも生成し、これらは電子伝達系を介してさらに酸化され、追加的ＡＴＰ分子の生成をもたらし得る。
【００６５】
解糖は、グルコース（および他の単糖）を２分子のピルビン酸に分解する多くの酵素触媒ステップを含む。引き換えに、この経路は合計２分子のＡＴＰの生成をもたらす。解糖経路から生じたピルビン酸分子はサイトゾルからミトコンドリアに入る。次いでこれらの分子は、ＴＣＡ回路への進入のためアセチルコエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）に転換される。ＴＣＡ回路は、アセチルコエンザイム−Ａとオキサロ酢酸が結合してクエン酸を形成することからなる。形成されたクエン酸は、次いで一連の酵素触媒ステップを介して分解され追加的ＡＴＰ分子が生成する。
【００６６】
ミトコンドリアマトリックス内のＴＣＡ回路から放出されたエネルギーは、ＮＡＤＨ（複合体Ｉ）およびＦＡＤＨ２（複合体ＩＩ）としてミトコンドリア電子伝達系に入る。これらは、ＡＴＰ生成に関与する５つのタンパク質複合体の最初の２つであり、いずれもミトコンドリア内膜中に局在する。（ＮＡＤＨ特異的デヒドロゲナーゼでの酸化により）ＮＡＤＨおよび（コハク酸デヒドロゲナーゼでの酸化により）ＦＡＤ３／４由来の電子は呼吸鎖に移動し、ミトコンドリアマトリックスから内膜空間への（すなわち、ミトコンドリア内膜を介した）プロトンの能動的輸送を誘導することによって、個別ステップにおいてそれらのエネルギーを放出する。呼吸鎖中の電子担体には、フラビン、タンパク質結合鉄−硫黄中心、キノン、シトクロムおよび銅がある。電子を複合体間で移動させる２分子が存在する：コエンザイムＱ（複合体Ｉ→ＩＩＩ、および複合体ＩＩ→ＩＩＩ）およびシトクロムｃ（複合体ＩＩＩ→ＩＶ）。呼吸鎖中の最終電子受容体は複合体ＩＶである（３／４、３／４０に転換される。
【００６７】
本発明の幾つかの実施形態は、解糖、ＴＣＡ回路、および／または電子伝達系における少なくとも１つの遺伝子またはタンパク質の発現が増加した細胞外小胞またはエクソソームに関する。幾つかの実施形態では、以下の表１によって表される遺伝子群から遺伝子が選択される。
【００６８】
【表１】
2019518049.tif 000002
【００６９】
幾つかの実施形態では、解糖経路中の遺伝子はＰＫ、ＡＧＩ、ＡＬＤＯ、ＡＬＤＯＡ、ＥＮＯ３、ＧＰＩ、ＨＫ２、ＨＫ３、ＰＦＫ、ＰＧＭ、ＴＰＩ、ＧＡＰＤＨ、ＥＮＯ、およびＰＧＡＭからなる群から選択される。
【００７０】
幾つかの実施形態では、ＴＣＡ回路中の遺伝子はＭＤＨ２、ＯＧＤＨ、ＰＣ、ＰＤＨＡ１、ＰＤＨＢ、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、およびＳＵＣＬＧ２からなる群から選択される。
【００７１】
幾つかの実施形態では、電子伝達系中の遺伝子はＥＴＦＡ、ＡＴＰａｓｅ、ＮＤＵＦＣ２、ＮＤＵＦＢ１、ＮＤＵＦＳ５、ＮＤＵＦＡ８、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ２、ＳＤＨＡ、ＳＤＨＣ、ＵＱＣＲＨ１、Ｃｏｘ６ｃ１、およびＣｏｘ１０からなる群から選択される。
【００７２】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームはＰＫの発現が増加している。
【００７３】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームはＡＴＰａｓｅの発現が増加している。
【００７４】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームはＰＫとＡＴＰａｓｅの発現が増加している。
【００７５】
Ｅ．間葉系間質細胞から単離した細胞外小胞
本発明の細胞外小胞またはエクソソームは、例えば間葉系間質細胞から切り離された膜（例えば、脂質二重層）小胞であり得る。それらは、例えば約３０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の直径を有し得る。電子顕微鏡によって、細胞外小胞またはエクソソームはカップ様形態を有し得るようである。それらは例えば約１００，０００×ｇで沈殿する可能性があり、約１．１０〜約１．２１ｇ／ｍｌのスクロース中ブイヨン密度を有する。
【００７６】
間葉系間質細胞は、骨髄、血液、骨膜、真皮、臍帯血および／またはマトリックス（例えば、ホウォートンゼリー）、および胎盤には限られないが、これらを含めた幾つかの供給源から採取することができる。間葉系間質細胞の採取法は実施例中でさらに詳細に記載する。本発明において使用することができる他の採取法に関しては、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，４８６，３５９号明細書を参照することもできる。
【００７７】
本発明の方法中での使用が企図される間葉系間質細胞、したがって細胞外小胞またはエクソソームは、治療する同一対象から得ることができ（したがって対象自家由来と言える）、またはそれらは異なる対象、好ましくは同種の対象から得ることができる（したがって対象と同種異系と言える）。
【００７８】
本明細書で使用するように、本発明の態様および実施形態は、他に示さない限り、細胞および細胞集団に関することを理解されたい。したがって他に示さない限り、細胞を列挙する場合、細胞集団も企図されることを理解されたい。
【００７９】
本発明の幾つかの態様は、単離細胞外小胞またはエクソソームを言及する。本明細書で使用するように、単離細胞外小胞またはエクソソームは、その天然環境から物理的に分離された細胞外小胞またはエクソソームである。単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞を含めて、それが本来存在した組織または細胞環境から、全部または一部を物理的に分離することができる。本発明の幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームの組成物は間葉系間質細胞などの細胞を含まない可能性があり、または組成物は順化培地を含まないもしくは実質的に含まない可能性がある。幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームを、未処理順化培地中に存在した細胞外小胞またはエクソソームより高い濃度で提供することができる。細胞外小胞またはエクソソームは順化培地から、間葉系間質細胞培養物から単離することができる。
【００８０】
一般に、磁気粒子、濾過、透析、超遠心分離、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および／またはクロマトグラフィーを含めた方法などの、細胞外小胞またはエクソソームの精製および／または富化に適した任意の方法を使用することができる。幾つかの実施形態では、遠心分離および／または超遠心分離によって細胞外小胞またはエクソソームを単離する。細胞外小胞またはエクソソームは、清浄順化培地の超遠心分離によって精製することもできる。それらは、スクロースクッション中への超遠心分離によって精製することもできる。そのプロトコールは、例えば参照により本明細書に組み込まれている、Thery et al. Current Protocols in Cell Biol. (2006) 3.22中に記載されている。幾つかの実施形態では、１ステップのサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞外小胞またはエクソソームを単離する。そのプロトコールは、例えば参照により本明細書に組み込まれている、Boing et al. Journal of Extracellular Vesicles (2014) 3:23430中に記載されている。間葉系間質細胞または間葉系幹細胞から細胞外小胞またはエクソソームを採取するための詳細な方法は、実施例中に提供する。
【００８１】
本発明は、細胞外小胞もしくはエクソソームの即時使用、または例えば使用前の低温保存状態における、代替的に細胞外小胞もしくはエクソソームの短期および／または長期保存も企図する。典型的にはプロテイナーゼ阻害剤が、それらが長期保存中に細胞外小胞もしくはエクソソームの完全性をもたらすので凍結培地中に含まれる。−２０℃での凍結は、それが細胞外小胞もしくはエクソソーム活性の多大な損失と関係するので好ましくない。−８０℃での急速凍結が、それが活性を保つのでより好ましい。例えば参照により本明細書に組み込まれている、Kidney International(2006)69,1471-1476を参照。凍結培地への添加剤を使用して、細胞外小胞もしくはエクソソームの生物学的活性の保存状態を高めることができる。このような添加剤は無傷細胞の低温保存に使用する添加剤と同様であり、ＤＭＳＯ、グリセロールおよびポリエチレングリコールには限られないが、これらを含み得る。
【００８２】
Ｆ．細胞外小胞またはエクソソームの効能の評価
本発明は、低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスモデルに対する細胞外小胞またはエクソソーム治療の影響を測定するため、および細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団を同定するための右室収縮期圧（ＲＶＳＰ）の使用を提供する。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、３週間の慢性低酸素状態曝露を施しＰＢＳバッファーで処理した対照マウスと比較して少なくとも約１０％、１２．５％、１５％、１７．５％、２０％、２２．５％、２５％、２７．５％、または３０％、３週間の慢性低酸素状態曝露を施したマウスのＲＶＳＰを下げることができる。
【００８３】
幾つかの実施形態では、デルタＲＶＳＰによって細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団を同定する。本明細書で使用するデルタＲＶＳＰは、細胞外小胞またはエクソソームで治療した低酸素状態曝露マウスのＲＶＳＰマイナス酸素正常状態マウスのＲＶＳＰとして定義する。幾つかの実施形態では、デルタＲＶＳＰが約６、５、４、３、または２ｍｍＨｇ未満である場合、細胞外小胞またはエクソソームの集団は強力である。
【００８４】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの集団の効能は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）溶解物によるＯ２消費を増大させるそれらの能力によって特徴付けられる。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、２４時間の低酸素状態曝露を施しＰＢＳ対照で処理した対照ＳＭＣ細胞溶解物と比較して少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％、２４時間の低酸素状態曝露を施したＳＭＣ溶解物によるＯ２消費を増大させることができる。
【００８５】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの集団の効能は、それらのＰＫ活性によって特徴付けられる。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの強力な集団は、少なくとも約０．１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．１６ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．１７ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．１８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．１９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．２０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．２１ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．２２ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．２３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．２４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．２５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、０．３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ、または０．４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌのＰＫ活性を有する。
【００８６】
幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの集団の効能は、それらのＬＤＨ活性によって特徴付けられる。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームの集団の効能は、低酸素状態曝露ＳＭＣにより分泌されるＬＤＨを少なくとも約１０％、２０％、３０％、または４０％減少させる、それらの能力によって特徴付けられる。
【００８７】
幾つかの実施形態では、本発明の細胞外小胞またはエクソソームを、以下の表中の１つまたは複数の基準に基づいて単離する：
【００８８】
【表２】
2019518049.tif 000003
【００８９】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソーム中の平均レベルのｍｉｒ２０４より少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、または１００％を超える量のｍｉｒ２０４を含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソーム中の平均レベルのＣＤ１０５、ＧＡＰＤＨ、ＤＬＳＴ、および／またはＡＴＰ５Ａ１より少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、または１００％を超える量のＣＤ１０５、ＧＡＰＤＨ、ＤＬＳＴ、および／またはＡＴＰ５Ａ１を含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは、間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソーム中のＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよび／またはＡＮＫＲＤ３０ＢＬの平均レベルのＲＮＡ発現より少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、または１００％を超える量のＲＮＡ発現のＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよび／またはＡＮＫＲＤ３０ＢＬを含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは少量のＭＨＣＩＩ汚染物質を有するか、またはＭＨＣＩＩ汚染物質をほぼもしくは全く含まず、例えば間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソーム中の平均レベルのＭＨＣＩＩ汚染物質より少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％少ない量のＭＨＣＩＩ汚染物質を含む。
【００９３】
幾つかの実施形態では、単離細胞外小胞またはエクソソームは少量のフィブロネクチン含有物を有するか、またはフィブロネクチンをほぼもしくは全く含まず、例えば間葉系間質細胞の全細胞外小胞またはエクソソーム中の平均レベルのフィブロネクチンより少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％少ない量のフィブロネクチンを含む。
【００９４】
Ｇ．細胞外小胞またはエクソソームを使用した治療
本開示の方法に有用な組成物は、特にカテーテル投与を含めた局所注射、全身注射、局所注射、静脈内注射、子宮内注射または非経口投与によって投与することができる。本明細書に記載する治療用組成物（例えば、医薬組成物）を投与するとき、それは一般に注射可能な単位剤形（例えば溶液、懸濁液、またはエマルジョン）に製剤化する。
【００９５】
本発明は、２、３、４、５回またはそれより多くの細胞外小胞またはエクソソームの投与を含めた、細胞外小胞またはエクソソームの１回または反復投与を企図する。幾つかの実施形態では、細胞外小胞またはエクソソームを連続的に投与することができる。反復または連続投与は、治療する状態の重症度に応じて、数時間（例えば、１〜２、１〜３、１〜６、１〜１２、１〜１８、または１〜２４時間）、数日間（例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６日間、または１〜７日間）、または数週間（例えば、１〜２週間、１〜３週間、または１〜４週間）の間にわたって行うことができる。投与が連続的でなく反復的である場合、投与間の時間は数時間（例えば、４時間、６時間、または１２時間）、数日間（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、または６日）、または数週間（例えば、１週間、２週間、３週間、または４週間）であってよい。投与間の時間は同じであってよく、またはそれらは異なってよい。一例として、疾患の症状が悪化する可能性がある場合、細胞外小胞またはエクソソームはより頻繁に投与することができ、次いで症状が安定化または低減した後、細胞外小胞またはエクソソームは低頻度で投与することができる。
【００９６】
本発明は、少量剤形の細胞外小胞またはエクソソームの反復投与、および多量剤形の細胞外小胞またはエクソソームの１回投与も企図する。少量剤形は非制限的に１キログラムあたり１〜５０マイクログラムの範囲であってよく、一方で多量剤形は非制限的に１キログラムあたり５１〜１０００マイクログラムの範囲であってよい。特に疾患の重症度、対象の健康状態、および投与の経路に応じて、低または高用量の細胞外小胞またはエクソソームの単回または反復投与が本発明によって企図されることは理解されよう。
【００９７】
細胞外小胞またはエクソソームは、典型的には薬学的に許容される担体と組合せたとき、薬学的に許容される調製物（または薬学的に許容される組成物）中で使用（例えば投与）することができる。語句「薬学的に許容される」は、正常な医学的判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症無しで人間および動物の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、物質、組成物、および／または剤形を指す。本明細書で使用する語句「薬学的に許容される担体」は、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固形充填剤、希釈剤、賦形剤、または溶媒、被包性物質を意味する。
【００９８】
このような調製物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合担体を通常含有することができ、他の（すなわち二次的）治療剤を任意選択で含むことができる。薬学的に許容される担体は、予防もしくは治療活性剤の担持または輸送に関与する、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固形充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または被包性物質などである。それぞれの担体は、製剤の他の成分と適合性があり対象に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として働くことができる数例の物質には、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなどのエステル、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、発熱因子を含まない水、等張生理食塩水、リンガー液、エチルアルコール、リン酸バッファー溶液、および医薬製剤において利用される他の無毒な適合物質がある。
【００９９】
本発明の調製物は有効量投与する。有効量とは、所望の結果を単独でもたらす作用物質の量である。絶対量は、投与に選択する物質、投与が１回または複数回投与であるかどうか、ならびに年齢、身体状態、サイズ、体重、および疾患のステージを含めた個々の患者のパラメーターを含めた様々な要因に依存する。これらの要因は当業者にはよく知られており、通常の実験を超えずに対処することができる。
【０１００】
本発明は、パッケージ付きおよびラベル付き医薬品も包含する。この製造品またはキットは、気密封止されたガラス製バイアル、またはプラスチック製アンプル、または他のコンテナなどの適切な容器またはコンテナ中に適切な単位剤形を含む。単位剤形は、例えばエアロゾルによる肺送達に適していなければならない。製造品またはキットは、医薬品の投与の仕方を含めた使用法に関する説明書を、さらに含むことが好ましい。説明書は、問題の疾患または障害の適切な予防または治療法を医療従事者、技術者または対象にアドバイスする情報資料をさらに含有し得る。言い換えると製造品は、実際用量、モニタリング手順、および他のモニタリング情報には限られないが、これらを含めた使用用量レジメンを示すまたは示唆する説明書を含む。
【０１０１】
任意の医薬品と同様に、パッケージ材料およびコンテナは、保存および出荷中に製品の安定性を保護するよう設計されている。キットは滅菌水性懸濁液に懸濁したＭＳＣ細胞外小胞またはエクソソームを含むことができ、これは直接使用することができ、または静脈内注射用もしくはネブライザー中での使用のため正常生理食塩水で希釈することができ、気管内投与用に界面活性剤で希釈する、またはそれと組合せることができる。したがってキットは、生理食塩水または界面活性剤などの希釈溶液または作用物質も含有し得る。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、本明細書に記載する方法および組成物の作製法と使用法の完全な開示と記載を当業者に提供することを意味するものであり、限定的であることは意味しない。
【０１０３】
[実施例１−エクソソーム集団の単離]
この実施例は、細胞培養培地からのエクソソームの単離を実証する。
【０１０４】
濾過：間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得た順化培地を、０．２ｕｍフィルターを有する５ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓ−ｓｔｅｄｉｕｍ  Ｆｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バッグ中に回収した。回収した順化培地は、フィルターラインを介してポンプで移動させ、任意の細胞、死細胞、および細胞残骸をすぐに排除した。順化培地には、１４０ｍｌのｌｕｅｒ−ｌｏｋシリンジを使用して２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭのＥＤＴＡバッファーを補充した。
【０１０５】
タンジェンシャルフロー濾過：順化培地を含有する５ＬのＦｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バッグを、Ｆｌｅｘｂｏｙバッグと結合しＴＦＦ容器の上部に連結した試料ラインにより、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムに連結させた。シングル１００ｋＤａＭＷＣＯ  ０．１ｍ２Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）カセットを有するＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  ＴＦＦを使用した。水中完全性試験を各ＴＦＦ実施の最初と最後に行い、カセットの完全性を測定した。次いでシステムを１ＬのＰＢＳで刺激した。次いで培地試料を容器に比重分離供給した。ＴＦＦは６００ＬＭＨで実施した。５Ｌ体積の初期培地を１００ｍＬまで濃縮した（５０倍濃縮）。保持液を回収し、０．２２ｕｍフィルターを使用して濾過した。濾過液は１０ｍＬアリコート試料に分け−８０℃で凍結させた。
【０１０６】
分画化：試料は３７℃で約１０分間解凍した。全ての試料は１５０ｍｌのコーニングボトル（corning bottle）中に１つにプールした。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ樹脂（ＧＥ）を使用してＸＫ５０／１００カラムを充填した。ＸＫ５０／１００カラムはＡＫＴＡ  Ａａｎｔ１５０（ＧＥ）に連結させた。試料ラインを介してカラム中に試料を導入した。全試料をカラムに導入した後、溶出ステップを開始した（設定：４．６ｍｌ／分の流速）。０．２ＣＶの空カラムから溶出させ、次いでフラクションコレクターで、分画あたり１分の割合で分画の回収を開始した（各分画において４．６ｍｌ）。０．６ＣＶが溶出するまで分画を回収した（エクソソームは０．３ＣＶと０．４ＣＶの間で溶出した）。実験全体でＰＢＳを使用した。分画試料はフード下においてキャップで覆い４℃で保存した。
【０１０７】
ダイアフィルトレーション：好ましくはＴＦＦステップ後および分画化ステップ前に、試料に任意選択で、バッファー交換と類似したダイアフィルトレーションステップを施すことができる。エクソソームの所望濃度に達した後、ＴＦＦカセットフィルターにポンプを動かし続けながら、容器を介してＰＢＳバッファーを試料に加え体積を維持した。徐々に、ＰＢＳが順化培地と置き換わった。可能な限り交換を完了させるため、７合計体積のダイアフィルトレーションを保持液に実施した。このステップは、エクソソームに影響を与えずに、保持液中の一部の不純物を除去するのに役立つ。少量の全体タンパク質とリン脂質を示すエクソソームの存在を、ＦＬＯＴ−１ウエスタンブロットによって確認した。
【０１０８】
リン脂質濃度の測定：エクソソーム検出用にリン脂質シグナル伝達を使用した。簡単に言うと、分画化後、２０ｕＬの各エクソソーム調製物および８０ｕＬの反応混合物（Ｓｉｇｍａ）を暗所の、透明底９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に移し、光から保護して室温で３０分間インキュベートした。ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）を使用し５３０／５８５ｎｍで蛍光強度を測定した。示したエクソソーム生成実験において、Ａ２８０クロマトグラムとリン脂質の両方をエクソソーム検出に利用した。
【０１０９】
図１Ｃ中に示したように、リン脂質シグナル伝達はエクソソーム検出に関するＡ２８０クロマトグラムと充分一致する。
【０１１０】
[実施例２−マウスモデルにおける肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）の治療]
マウスを３週間の慢性低酸素状態曝露に施し（右室収縮期圧の増大として示される）ＰＡＨを誘導した。エクソソーム治療は低酸素状態曝露前の１回の尾静脈注射からなっていた。
【０１１１】
[実施例３−強力なエクソソーム集団の同定]
強力なエクソソーム集団を同定するため、各エクソソーム調製物を、ＰＫＭ２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用しピルビン酸キナーゼタンパク質発現に関して解析した。キャピラリー電気泳動イムノアッセイを、製造者のプロトコールに従いＷＥＳ（商標）機器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して実施した。簡単に言うと、４．２ｕＬの試料をマスター蛍光混合物（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）と１：５で混合した。次いで試料を５分間９５℃で加熱し、氷上に置いた。一次ＰＫＭ２抗体は抗体希釈液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）中に１：１５で希釈し、専売抗ウサギ二次抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用した。専売ペルオキシドおよびルミノール−Ｓ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を１：１で混合して化学発光基質を作製した。試料、ブロッキング試薬、一次抗体、二次抗体、化学発光基質、および洗浄バッファーを、提供マイクロプレート中の指定ウエルに充填した。プレートは５分間１，０００ｇで回転させてウエル中の気泡を除去した。プレートとキャピラリーカートリッジをＷＥＳ機器に充填した。プレート充填後、完全自動式電気泳動および免疫学的検出をキャピラリーシステムにおいて行った。ＷＥＳ標準実験設定を使用してタンパク質を分離した。データは内蔵Ｃｏｍｐａｓｓソフトウエア（Ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｍｐｌｅ）で解析し、試料あたりのピーク分子量シグナルおよび曲線下面積値を得た。
【０１１２】
ピルビン酸キナーゼ活性：ピルビン酸キナーゼは、ピルビン酸１分子とＡＴＰ１分子をもたらすホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からＡＤＰへのリン酸の移動を触媒する、解糖中の酵素である。ピルビン酸キナーゼはａｂｃａｍキット（ａｂ８３４３２）によって測定し、ＰＥＰとＡＤＰはＰＫにより触媒されピルビン酸とＡＴＰが生成する。生成したピルビン酸はピルビン酸オキシダーゼにより酸化され（λ＝５７０ｎｍで）発色する。発色強度はピルビン酸量に比例するので、ＰＫ活性を測定することができる。ＰＫ活性はキネティックアッセイにおいて生じる。データ解析は、以下の等式を使用して行うことができる：
ＰＫ活性＝（ピルビン酸×希釈係数）／（Ｔ２−Ｔ１）×ウエル体積
【０１１３】
上式でＴ２−Ｔ１は、時点２−時点１における時間（分）である。ピルビン酸（ｎｍｏｌ）はピルビン酸標準曲線を使用して計算する（この場合ピルビン酸は、Ｔ２における最終ピルビン酸濃度マイナスＴ１における初期ピルビン酸濃度として計算する）。この数字はブランク補正される必要がある。活性測定値は直線範囲内に存在することが重要である。データセットは多数の時点で解析することができる。選択すべき最良の方法は、曲線を見て直線範囲内から少なくとも２分間離れたデータ地点を選択することである。プレート内のそれぞれの試料は同じ方法で解析する。この実験では、Ｔ１＝２分、Ｔ２＝４分を選択した。この２つの時点は充分直線範囲内にあったからである。
【０１１４】
次に、ピルビン酸キナーゼ活性を、低酸素状態対照を超える各エクソソーム調製物治療条件のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＲＶＳＰ変化倍率に対してプロットした。これによって、エクソソーム治療によるＲＶＳＰ改善倍率とピルビン酸キナーゼ活性の比較が可能である。図２Ａ参照。ピルビン酸キナーゼ活性はデルタＲＶＳＰに対してもプロットした。デルタＲＶＳＰはエクソソーム条件で治療した低酸素状態マイナス酸素正常状態対照である。図２Ｂ参照。赤色ドットは、ＲＶＳＰの有意な改善を誘導した強力なエクソソーム集団を表す。青色ドットは、低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスの治療において強力ではないエクソソーム集団を表す。これらの最も強力なエクソソーム集団のピルビン酸キナーゼ活性を次いで箱ひげ図にグラフ化した。図２Ｃ参照。したがって（Ｃ）中のグラフは、本発明の最も強力なエクソソーム調製物のピルビン酸キナーゼ活性範囲を表す。
【０１１５】
[実施例４−強力なエクソソーム集団のプロテオーム解析およびＲＮＡｓｅｑ解析]
プロテオーム解析のため、エクソソーム試料をＢｉｏｐｒｏｘｉｍｉｔｙ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）に送付した。非強力なエクソソーム集団と比較して強力なエクソソーム集団において発現レベルが増加したタンパク質を図３（ａ）中に示す。
【０１１６】
ＲＮＡｓｅｑ解析のため、エクソソーム試料をＳＢＩに送付した。非強力なエクソソーム集団と比較して強力なエクソソーム集団において発現レベルが増加した遺伝子を図４中に示す。
【０１１７】
[実施例５−細胞外Ｏ２消費の測定]
ａｂｃａｍ細胞外Ｏ２消費アッセイキット（ａｂ１９７２４３）を使用して、酸素正常状態または４％Ｏ２低酸素状態のいずれかに２４時間曝露した後、ＰＢＳ（対照）またはエクソソームで治療した平滑筋細胞（ＳＭＣ）溶解物の酸素消費を測定した。この細胞溶解物は電子伝達系を介して酸素を消費するので、酸素は周辺培養培地において枯渇し、これはリン光シグナルの増大として見られる。各ウエルに鉱油を加えることにより周辺空気の拡散から微小環境を保護し、製造者により供給されたＯ２プローブのクエンチング（quenching）としてリン光シグナルを測定する。これらのデータは、曲線下面積として、および時間に対する勾配として２つの方法で計算した（この勾配を使用したデータ解析が製造者により推奨されている）。図５Ａ〜図５Ｂは、エクソソームが、酸素正常状態曝露ＳＭＣにおける細胞Ｏ２消費を有意に変えることはないことを実証する。しかしながら、エクソソーム治療は低酸素状態ストレス下でＯ２消費の増大を誘導し、これはミトコンドリア機能の増大を示す。
【０１１８】
[実施例６−急性低酸素状態に曝露したＳＭＣのマイクロアレイ解析]
平滑筋細胞（ＳＭＣ）をＰＢＳ対照またはエクソソーム（ＥＸＳＭ）のいずれかで治療し、酸素正常状態または低酸素状態（４％Ｏ２）条件のいずれかで２４時間インキュベートした。ＳＭＣのＲＮＡを単離し、全体的マイクロアレイプラットホームを使用した解析用にＱｉａｇｅｎに送付した。図６Ａ〜図６Ｃは、急性低酸素状態曝露後に、グルコース代謝において遺伝子発現の増加があることを示す。ＥＸＳＭ治療は、（ａ）解糖、（ｂ）ＴＣＡ回路および（ｃ）電子伝達系においてこの応答を正常化した。これらのデータは、おそらくこれらの経路へのＥＸＳＭタンパク質または遺伝子取り込みが原因で、エクソソーム治療は、低酸素状態ストレス中のグルコース酸化遺伝子の遺伝子上方制御に関する必要性を低減または排除したことを示唆する。
【０１１９】
[実施例７−急性低酸素状態に曝露したＳＭＣのメタボロミクス解析]
平滑筋細胞（ＳＭＣ）をＰＢＳ対照またはエクソソーム（ＥＸＳＭ）のいずれかで治療し、酸素正常状態または低酸素状態（４％Ｏ２）条件のいずれかで２４時間インキュベートした。細胞溶解物をペレット状にして、全体的代謝産物解析のためＭｅｔａｂｏｌｏｎ（Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ）に送付した。図７中に示したように、ＳＭＣ溶解物は、急性低酸素状態曝露後に解糖、ＴＣＡ回路、およびエネルギー代謝経路において、これらの経路を介した流動の低下による代謝産物の構築を示した。エクソソーム治療によって、（ａ）解糖および（ｂ）ＴＣＡ回路を介した流動は増大した（代謝産物構築の減少によって表される）。これらのデータは、グルコース酸化の増大を示す。図７Ａ〜図７Ｄは、急性低酸素状態曝露が、ＡＴＰとＮＡＤの構成単位であるアデノシンとニコチンアミドリボシドの構築をもたらしたことを示す。おそらくＡＴＰ生成の増大のため、エクソソーム治療がアデノシンとニコチンアミドリボシド使用につながった（ｃ）。急性低酸素状態に曝露した生存ＳＭＣにおいてＡＴＰ生成を測定し（ｄ）、ＥＸＳＭ媒介のＡＴＰ生成増大を確認した。
【０１２０】
[実施例８−追加的方法]
マウスモデル：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、３週間１０％酸素に制御した酸素レベルで低酸素状態テントに収容して、肺高血圧症を誘導した。エクソソーム治療に関しては、低酸素状態曝露３時間前に尾静脈に１回用量を注射した。
【０１２１】
エクソソームの単離および解析：無血清順化培地を４０時間の間に融合ＭＳＣ培養物から回収した。タンジェンシャルフロー濾過を使用して順化培地を５０倍濃縮した。濃縮物は蛍光脂溶性色素、ＤｉＩとインキュベートし、次いでＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−２Ｂ樹脂を充填したＸＫ５０／１００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）を使用して分画化した。エクソソーム含有分画は、ＤｉＩの蛍光検出およびリン脂質定量化によって同定した（Ｓｉｇｍａ）。選択した分画に関するＲＮＡシークエンシングはＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＡ）によって行われた。選択した分画に関するプロテオミクスはＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してＢｉｏｐｒｏｘｉｍｉｔｙによって行われた（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）。ピルビン酸キナーゼタンパク質および酵素活性は、それぞれＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅイムノアッセイおよび比色キネティックアッセイ（Ａｂｃａｍ、ａｂ８３４３２）によって評価した。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル：平滑筋細胞（ＳＭＣ）を、酸素正常状態または低酸素状態（４％酸素）のいずれかにおいてＰＢＳまたはエクソソームで２４時間治療した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用しマイクロアレイ解析用に、またはＨＤ４プラットホーム（Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ、ＲＴＰ、ＮＣ）を使用しメタボロミクス解析用に実験用レプリカを処理した。酸素消費は、ａｂｃａｍ細胞外Ｏ２消費アッセイキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９７２４３）を使用して測定した。
【０１２３】
肺胞細胞を２４時間接種し、０．１％ＦＢＳ培地に移し、酸素正常状態インキュベーターにおいて３時間、強力なエクソソーム集団で初回抗原刺激し、酸素過剰インキュベーションチャンバー中で４８時間平板培養した（図１７）。
【０１２４】
ＳＭＣ慢性低酸素状態モデル：ＳＭＣはＰＡＨおよび低酸素状態で増殖、非アポトーシス表現型に変わり、肺中の血管および動脈の肥大をもたらし、高圧、および最終的に心臓に対するダメージ／ＰＡＨにおいて負の症状を引き起こすことが知られている。ＳＭＣは酸素正常状態、低酸素状態（４％酸素）、および低酸素状態（４％酸素）＋エクソソームで培養した。培養期間中、２週間の間１週間に２回、強力なエクソソームで細胞を治療した。生成したＳＭＣは、マイクロアレイ遺伝子発現（ＩＰＡ）および／または全体的メタボロミクスによって解析した。
【０１２５】
[実施例９−ウネキシソームを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ治療]
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって、ウネキシソームが免疫調節能力を有することが実証されている。図１８中に示したように、ウネキシソーム治療は、酸素過剰ストレスに曝露した細胞においてＩＬ−６の発現低下に基づき免疫調節能力を増大させた（酸素過剰状態はＩＬ−６の放出を引き起こす）。図１９中に示したように、ウネキシソーム治療は、酸素過剰ストレスに曝露した細胞においてＴＮＦαの発現低下に基づき免疫調節能力を増大させた（酸素過剰状態はＴＮＦαの放出を引き起こす）。
【０１２６】
ウネキシソームが抗アポトーシス効能を有することもｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって実証されている。図２０中に示したように、ウネキシソーム治療によって、細胞数の増大に相当する吸光度の増大によって示されたように、酸素過剰状態の下での抗アポトーシス効果を示した。図２１中に示したように、ウネキシソーム治療によって、酸素過剰ストレスに曝露した細胞からのシトクロムＣ放出を減らした。
【０１２７】
ウネキシソームを使用してＢＰＤにおける肺血管形成を促進できることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によってさらに実証されている。図２２Ａ中に示したように、ウネキシソーム治療によって急性酸素過剰曝露状態で管形成を修復することができる。
【０１２８】
ウネキシソームを使用してＢＰＤ関連ＰＡＨにおいてミトコンドリア代謝を改善することができることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって追加的に実証されている。図２４中に示したように、経路内の中間代謝産物の全体的代謝産物解析により、ウネキシソームは慢性低酸素状態においてアミノ酸代謝を上方制御した。図２５中に示したように、ウネキシソームは慢性低酸素状態においてピルビン酸およびグルタミン酸代謝を上方制御した。
【０１２９】
図２６中に示したように、ウネキシソームは慢性低酸素状態においてＧＬＵＤ１遺伝子発現を上方制御した。図２７中に示したように、ウネキシソームは慢性低酸素状態においてＰＤＫ４を下方制御した。図２８中に示したように、ウネキシソームは慢性低酸素状態においてＳＩＲＴ４を下方制御した。ＳＩＲＴ４遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＨモデルにおいて２つの代謝酵素、ＧＬＵＤ１およびＰＤＨを阻害する。ＳＩＲＴ４遺伝子はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＨモデルではウネキシソーム治療により下方制御され、一方ＧＬＵＤ１およびＰＤＨはエクソソーム治療により上方制御された。ＳＩＲＴ４はエクソソーム治療の標的であると考えられる。図２９中に示したように、ウネキシソームは、低酸素状態において下方制御された遺伝子を上方制御することにより、ＴＣＡ回路機能を修復した（ＴＣＡ回路中９酵素のうち６酵素が下方制御される）。
【０１３０】
[実施例１０−ウネキシソームを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ治療]
酸素過剰状態誘導型ＢＰＤの試験：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに出生後（ＰＮ）第１日から第７日まで７５％酸素を施し、出生後第７日から第１４日まで室内空気および正常酸素レベルに移した。ＰＮ４で、１回用量の強力なエクソソームを浅側頭静脈に注射した。ＰＮ７およびＰＮ１４で、ＲＮＡおよび組織学的解析を行った（図３８）。
【０１３１】
ＢＰＤ誘導型ＰＡＨの試験：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに出生後（ＰＮ）第１日から第７日まで７５％酸素を施し、出生後第７日から第４２日まで室内空気および正常酸素レベルに移した。ＰＮ４で、１回用量の強力なエクソソームを浅側頭静脈に注射した。ＰＮ７およびＰＮ１４で、ＲＮＡ、組織学的および血球計算解析を行った。ＰＮ４２で、組織学的および血球計算解析を行い、追加的生理学的測定、肺機能試験、およびＲＶ圧測定も行った（図３８）。
【０１３２】
併用療法：Ｃ５７ＢＬ／６マウスに第１日から第２９日まで１０％酸素を施し、第２９日から第５６日まで正常状態に移した。第１日に、マウスにセマキサニブを注射し、第２９日から第５６日まで、シルデナフィルを１日２回、およびエクソソームを３日に１回マウスに注射した。ＲＶＳＰレベルを測定した（図４５Ａ〜図４５Ｂ）。
【０１３３】
図４０中に示したように、ウネキシソーム治療はＢＰＤ関連肺胞簡略化を救済した。図４０Ａは、強力なエクソソームでの治療は、酸素正常状態（ＮＲＭＸ）と比較した酸素過剰状態（ＨＹＲＸ）媒介の肺胞簡略化の増大を救済することを示す。図４０Ｂは、平均空間径の代わりを表す平均肺胞径の定量化を示す。
【０１３４】
図４２Ａ〜図４２Ｃ中に示したように、ウネキシソーム治療は慢性的肺胞簡略化を救済した。図４２Ａは、酸素正常状態、低酸素状態下での細胞、ならびにホウォートンゼリー由来エクソソーム、および骨髄由来エクソソームで治療した細胞のイメージを示す。図４２Ｂは、エクソソームがＢＰＤ関連ＰＡＨマウスモデルにおいて肺胞簡略化を救済したことを示す。図４２Ｃは、ＢＰＤ関連ＰＡＨマウスモデルにおいて中隔野内のコラーゲン沈着によって示されたように、エクソソームが低度肺線維症を低減したことを示す。
【０１３５】
図４３Ａ〜図４３Ｄ中に示したように、ウネキシソーム治療がＰＡＨ肺血管再構築を救済したことを示す図であり、これはα−平滑筋アクチン染色（ＡとＢ）およびＰＡＨに関連した圧力変化（Ｃ）によって実証された。ＰＶ−ループは酸素過剰状態（ＨＹＲＸ）マウスにおける有意なシフトを実証し、酸素正常状態（ＮＲＭＸ）対照と比較したとき肺気腫のような肺疾患および空気捕捉の特徴を示す。エクソソームは、このシフトにおいて肺機能改善を示す有意な救済を示した。
【０１３６】
図４４Ａ〜図４４Ｂ中に示したように、ＭＳＣエクソソームは低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスモデルにおいてＰＡＨを予防した。図４５Ａ〜図４５Ｂ中に示したように、エクソソームとシルデナフィルの併用療法は、Ｓｕｇｅｎ／低酸素状態誘導型ＰＡＨマウスモデルにおいてＰＡＨを逆行させた。図４６中に示したように、エクソソームはＰＡＨのＳｕｇｅｎ／低酸素状態モデルにおいてアミノ酸代謝を上方制御した。
【０１３７】
[実施例１１−ウネキシソームの特徴付け]
図３２中に示したように、サイズ排除クロマトグラフィーを使用した強力なエクソソーム集団（ＣＯＭ２）の単離は、非理想的サイズのエクソソームだけでなくタンパク質と非強力な微細小胞汚染物質も単離する超遠心分離または勾配分離と比較して、有意に減少した汚染物質をもたらす。図３３中に示したように、単離した強力なエクソソームは、超遠心分離試料と比較してより均一なサイズと鮮明なイメージを有する。
【０１３８】
図３４中に示したように、単離した強力なエクソソームはＭＨＣＩＩ汚染物質を含まない。対照的に、ＺｅｎＢｉｏからの市販のエクソソームはＭＨＣＩＩ汚染物質を含有する。
【０１３９】
図３５Ａ〜図３５Ｂ中に示したように、ポンソー染色に基づいて、サイズ排除クロマトグラフィーにより単離した強力なエクソソームは、フィブロネクチンおよび他のタンパク質汚染物質を含まず、一方で市販のＺｅｎＢｉｏ超遠心分離調製物はフィブロネクチン汚染物質を有する。
【０１４０】
図３６中に示したように、強力集団と微細小胞汚染物質のＲＮＡｓｅｑクラスタリング解析において、強力なエクソソーム（ＣＯＭ２）が微細小胞汚染物質から差次的に群がり、それらはＳＯＲＣＳ１、ＦＨＩＴおよびＡＮＫＲＤ３０ＢＬが富化状態である。図３７中に示したように、強力なエクソソーム（ＣＯＭ２）は、ＧＡＰＤＨ発現の高発現レベルに相当するＣＯＭ１より低いＣＴ値を有する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月13日(2019.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
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【国際調査報告】
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