(57)【要約】  本発明は、家禽におけるコクシジウム症に対する改良されたワクチンに関する。このワクチンは０．３から１．５％ｗ／ｖの間のキサンタンガムを含むことから、比較的高粘度である組成物中に生きたアイメリアのオーシストを含む。スプレーワクチン接種の際、この新たなワクチンは鳥に迅速に摂取されるビーズを形成し、これは迅速なワクチン接種をもたらし、チャレンジ感染の際のコクシジウム症の徴候の迅速かつ有効な改良につながる。また、本発明は、ある濃度の金属塩を含ませることによるキサンタンガムを含む組成物の加熱滅菌方法に関し、不可逆かつ劇的な粘度低減を大部分防ぐことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）の生きたオーシストを含む、家禽のためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンに２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むことを特徴とする、前記ワクチン。
【請求項２】
少なくとも１種のアイメリアが、Ｅ．アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、Ｅ．マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、Ｅ．ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、Ｅ．ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、Ｅ．プレコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）、Ｅ．ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、Ｅ．ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）およびＥ．ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）よりなる群から選択される１以上または全てであることを特徴とする、請求項１に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項３】
ワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のコクシジウム症ワクチン。
【請求項４】
薬学的に許容される担体中の少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを、０．３〜１．５％ｗ／ｖまでのキサンタンガムと混合するステップを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のコクシジウム症ワクチンの調製方法。
【請求項５】
キサンタンガムが、混合後に得られるワクチンが０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むような濃度で組成物中に提供されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
キサンタンガムを含む組成物が、付加的に少なくとも約０．１％ｗ／ｖの濃度の金属塩を含有し、前記組成物中の金属塩の濃度が、得られるワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むようなものであることを特徴とする、請求項３に記載のコクシジウム症ワクチンの調製のための、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの容器：即ち、薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む組成物を含む１つの容器、およびキサンタンガムを含む組成物を含む１つの容器を含み、それによりキサンタンガムを含む組成物の濃度が、両容器の組成物を合わせた後に得られるワクチンが０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むようなものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコクシジウム症ワクチンを調製するためのパーツキット。
【請求項８】
キサンタンガムを含む容器が、加えて少なくとも約０．１％ｗ／ｖの濃度の金属塩を含有し、金属塩の濃度が、得られるワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むようなものであることを特徴とする、請求項７に記載のパーツキット。
【請求項９】
家禽のためのコクシジウム症ワクチンとしての使用のための、薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む組成物であって、前記組成物が、前記組成物に２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むことを特徴とする、前記組成物。
【請求項１０】
家禽のためのコクシジウム症ワクチンの製造のための薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む組成物の使用であって、前記組成物が、前記組成物に２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むことを特徴とする、前記使用。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコクシジウム症ワクチンまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法により得ることができるコクシジウム症ワクチン、または、請求項７もしくは８に記載のパーツキットの使用により得ることができるコクシジウム症ワクチンを、前記家禽にボディースプレーとして投与することを含むことを特徴とする、コクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法。
【請求項１２】
ボディースプレーが粗粒スプレーとして適用されることを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン接種方法。
【請求項１３】
家禽におけるアイメリアの感染または関連する疾患の徴候の予防または低減方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコクシジウム症ワクチンまたは請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法により得ることができるコクシジウム症ワクチンまたは請求項７もしくは８に記載のパーツキットの使用により得ることができるコクシジウム症ワクチンの、前記家禽への投与を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医寄生生物学および獣医ワクチン学の分野に関し；より詳細には、本発明は、生きたアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）のオーシストを含む家禽のためのコクシジウム症ワクチン；コクシジウム症ワクチンの調製方法；パーツキット；およびコクシジウム症ワクチンの投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アイメリアは、アピコンプレックス門（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）コクシジウム綱（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）の原生動物性寄生生物であり、世界中で見出される。家禽に感染すると、それらはコクシジウム症と呼ばれる、中程度から重度の腸疾患症候群（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｃｏｍｐｌｅｘ）を引き起こす。アイメリアは複数のステージを有する複雑な生活環を持ち、いくつかは宿主の外部で発生する。アイメリアの感染は、胞子形成したオーシストの摂取により生じ、第１日齢から起こることもある。腸管内でスポロゾイトが放出され、次いで腸管上皮細胞に侵入することにより鳥の腸の部分に定着する。複製は、宿主からのメロゾイトステージの放出および腸管上皮細胞の破裂を導く。次に、メロゾイトはさらなる上皮細胞に再感染し、これが４〜６日間のサイクルを最大でさらに４サイクルまで継続する。最終的に有性ステージになり、ここでオーシストを生み出して、これが糞便と共に放出される。環境中での胞子形成の後、サイクルが新たに始まる（Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｐａｒａｓ．，ｖｏｌ．６０，ｐ．２８５）。
【０００３】
家禽に感染するアイメリアの主要な種は、多数の方法で、ルーチン的にはコクシジウムの顕微鏡的サイズおよび外観により同定することができる。また、異なるアイメリアの種は、鳥類の腸の異なる領域に定着する傾向がある。
【０００４】
家禽におけるアイメリア感染の症状は、食欲不振から腸内の壊死性組織の発達が原因となる血を含む下痢および臓器不全まで多様である。結末は、飼料転換効率の低下、成長速度の低減、産卵の低減および二次感染への感受性であり、全てが罹患した鳥に大きな不快感をおよび商業的家禽運用への深刻な経済的損失を引き起こす。
【０００５】
アイメリア感染およびコクシジウム症に対する防御は、飼料を介して抗コクシジウム薬（抗コクシジウム剤（ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔ））を投与することに基づくことができるが、抵抗性の発達および動物製品中での薬物残留の存在が不変の懸念事項である。したがって、家禽におけるアイメリア感染およびそれに続く疾患は、好ましくはワクチン接種により対抗される。サブユニット組換え型ＤＮＡワクチンの次に最も多く使用されるのが、１以上の種のアイメリアからの胞子形成したオーシストを含む生ワクチンである。鳥におけるそれらの自然の複製は、免疫系の液性および細胞性の両方の経路により強い免疫を誘導する。一般的に、若い時期の単回ワクチン接種は、時折の野生型ブースター感染により助けられて、鳥をその生涯の間防御するのに十分である。
【０００６】
生きたコクシジウムは、野生型または弱毒化された病原型のものであることができる。弱毒化アイメリアの特別な分類は、いわゆる早熟株であり、これは、正常なサイクル数よりも少ない回数で鳥におけるその生活環を完了するアイメリアである。これらは、オーシストの産出数がより少なく、また標的の腸へのダメージもより少ない。家禽コクシジウム症の概要については、“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ  ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）または：Ｓｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．：“Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ”，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ａｍｅｓ，ＩＡ．，ＵＳＡを参照されたい。
【０００７】
アイメリアワクチンの効力は、通常、病原性のアイメリア株でのチャレンジ感染の後、感染および疾患についての主要な判断基準：腸管病変スコア、オーシスト産出の低減および体重増加に対する効果を比較することにより決定される。アイメリアワクチン効力を評価するためのこれらの判断基準の妥当性を記載している論文は：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ（２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１８，ｐ．１１７８−１１８５）である。
【０００８】
免疫は種特異的であることから、典型的にアイメリア生ワクチンは、いくつかのアイメリア種からの胞子形成コクシジウムを含有する。例えば、家禽のためのいくつかの商業的コクシジウム症ワクチンは：ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈからのワクチンライン：Ｃｏｃｃｉｖａｃ（商標）、Ｐａｒａｃｏｘ（商標）またはＦｏｒｔｅｇｒａ（商標）であり、これらは最大８種までのアイメリアの異なる株からの生きた胞子形成コクシジウムを含有する。他の商業的アイメリアワクチンは、Ｉｍｍｕｃｏｘ（商標）（Ｃｅｖａ）およびＩｎｏｖｏｃｏｘ（商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）である。
【０００９】
かかるワクチンは、コストを低減するため、いくつかの集団ワクチン接種方法により例えば身体もしくは飼料への噴霧または飲料水を介して一般的に投与される。第１日齢から野外感染のプレッシャーが存在するため、したがって、ワクチン接種は好ましくはできるだけ若いうちに適用される。これは、ひな鳥が孵化したばかりで開放トレーの中で飼育されている時に孵化場でのスプレー投与により好都合に行うことができる。この経路は、鳥の身体に並びにそれらの直接的な周辺環境に達する。ワクチンは次いで、液滴をくちばしでつまんで持ち上げて羽をつくろうという鳥の傾向により、口、鼻または眼の経路を介して鳥に摂取される。
【００１０】
コクシジウムアイメリア生ワクチン接種における主な関心事は、コクシジウムが鳥の腸内で迅速に感染を成立させ、それゆえに防御免疫応答を誘導することを可能にするため、ワクチン接種（ｔａｋｅ）、すなわち鳥による迅速かつ包括的な摂取を最適化することである。それゆえに、この分野には、コクシジウムアイメリアワクチンの摂取および有効性をさらに改良する切迫したニーズがある。
【００１１】
いくつかの改良が既になされている。例えば、摂取を刺激するため、スプレーワクチンは一般的に明るい色、例えば緑色（クロロフィル）または赤色（カルミン）などが与えられる。明るい色は視認性を高めて鳥の好奇心に訴えかけ、これがくちばしでつまんで持ち上げることおよび羽づくろいを刺激する。
【００１２】
アイメリアスプレーワクチンの１つの問題は、コクシジウムが比較的大きくて重たい微生物であり（直径１５〜３０μｍの卵形形状）、したがって、重力の影響下、液体担体中で沈む傾向があることである。これは、適用されるワクチンが異なる種のアイメリアを用いて、異なる大きさのコクシジウムを持ち得るときに、特に不利であり；重い（ｈｅａｖｅｒ）種ほどより迅速に沈む傾向があり、必要とされる全量まで摂取されない可能性がある。これを克服するため、現存するワクチンは、レオロジー調節剤を懸濁助剤として含有し得る。例えばＰａｒａｃｏｘ（商標）  ８ワクチンは、１回の動物用量あたり０．３％ｗ／ｖのキサンタンガムを含有する。これは、投与の間、異なるコクシジウムを一様に懸濁されて混合された状態で維持する。しかしながら、このワクチンの粘度は低い。
【００１３】
キサンタンガムは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属の細菌により生産される高分子量の多糖である。昨今、これは、例えばホエイ上でのＸ．カンペストリス（Ｘ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の工業的発酵により生産される。キサンタンガムは、種々の製品、例えば医薬および食品などにおいて、エマルションの安定化剤として、または製品の粘度に影響する増粘剤として用いられる。キサンタンガムは擬塑性であり、すなわちずり減粘性を持つ。これは、異なる供給業者から入手可能であり、例としてＣＰ  ＫｅｌｃｏからＫｅｌｔｒｏｌ（商標）として入手可能である。キサンタンガムの詳細および性質は、例えば‘Ｘａｎｔｈａｎ  ｂｏｏｋ’，８ｔｈ  ｅｄ．，２００８，ｃｐｋｅｌｃｏ．ｃｏｍ．中に記載されている。
【００１４】
コクシジウムアイメリアワクチンの摂取を改良するため、他の適合、例えばワクチン組成物を高度に粘稠なゲルとして製剤化することなどが適用されている。例えばＷＯ２００５／０９９．６１７は、約１％のカラギーナンを含有するソフトゲルとして提供されるコクシジウムアイメリアワクチンを記載しており、カラギーナンは海藻由来の多糖で、そのゲル化の性質のために食品産業において一般的に用いられる。しかしながら、ニワトリ上へのこのゲルの投与のため、特別な送達システムである、ゲル液滴の流れを生み出す特別な多岐管を有する「ゲルディスペンサー」が必要とされる。
【００１５】
ウイルスまたは細菌ワクチンのスプレー投与のためのこのカラギーナンソフトゲル製剤のさらなる開発がＷＯ２０１１／０１１．８７３中に記載されており：１回の用量あたり約０．１％ｗ／ｖのキサンタンガムを加えることにより、ソフトゲル液滴はより粘着性であった。しかしながら、特別な送達装置が依然として必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０９９．６１７
【特許文献２】ＷＯ２０１１／０１１．８７３
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｄｖ．  ｉｎ  Ｐａｒａｓ．，ｖｏｌ．６０，ｐ．２８５
【非特許文献２】“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ  ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ
【非特許文献３】Ｓｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．：“Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ”，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ａｍｅｓ，ＩＡ．，ＵＳＡ
【非特許文献４】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ，２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１８，ｐ．１１７８−１１８５
【非特許文献５】‘Ｘａｎｔｈａｎ  ｂｏｏｋ’，８ｔｈ  ｅｄ．，２００８，ｃｐｋｅｌｃｏ．ｃｏｍ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の目的は、従来技術における不利な点を克服し、そして改良されたワクチン効力を与え慣用的な噴霧装置により送達させることができる、生きたコクシジウムアイメリアのスプレーワクチンを提供することにより、当該技術分野におけるニーズに適応させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、ワクチンに比較的高い粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む生きたアイメリアコクシジウムベースのコクシジウム症ワクチンを提供することにより、この目的が満たされ、その結果として従来技術の１以上の不利な点を克服して改良することができることが見出された。この新たなワクチンは、この濃度のキサンタンガムを持たない類似したワクチンと比較して顕著に改良された効力を実証した。
【発明の効果】
【００２０】
有利な結果は、新たなコクシジウム症ワクチンが迅速かつ包括的に鳥に摂取され、ワクチン接種（腸管内でのワクチンコクシジウムの複製レベル）の改良につながることである。これは、摂取から初回の複製開始までの時間が顕著に低減されたことが理由である。さらに、新たなワクチンは、慣用的な噴霧装置、例えば標準的な孵化場スプレーキャビネットまたは背負式噴霧器などを使って送達させることができる。また、ワクチン組成物は、スプレー投与の間絶え間なく撹拌する必要はない。加えて、新たなワクチンから形成される液滴は、スプレーワクチン接種の際にひな鳥を濡らさず、特に１日齢のひな鳥について冷えることのネガティブな副作用を防ぐ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者は、これらの知見を説明し得る何らかの理論またはモデルに拘束されることを望まないが、このワクチン組成物はスプレーとして適用されると鳥がくちばしでつまんで持ち上げることへの誘引性があるサイズのビーズの形成を可能にする粘度を持ち、これにより従来技術のより粘稠でないアイメリアスプレーワクチンよりもワクチンの摂取が迅速かつ包括的であると推測する。加えて、コクシジウムは腸管通過時間の低減および感染の成立を呈したが、これはおそらくキサンタンガム多糖によるカプセル化の効果として、摂取されたコクシジウムがより容易にそれら自身を鳥の腸内で根付かせることを助けることでより早い免疫の発生を導くものである。
【００２２】
この組成のコクシジウム症ワクチンは、約２００から約４０００ｍＰａ．ｓの間の比較的高い粘度を持ち、粗粒スプレーとして投与すると直径が約１から約４ｍｍの間のサイズのビーズを生み出すのに申し分なく適していることが見出された。このサイズのビーズは、（特に着色料から高い視認性があるときに）鳥にとって大いに訴求力があるように見え、迅速かつ効果的に摂取された。
【００２３】
より高いまたはより低いキサンタンガム濃度は、噴霧しても的確なビーズ形成をもたらさず：約１．５％ｗ／ｖより高いキサンタンガム濃度では、分離したビーズは生産されず、約０．３％ｗ／ｖより低いキサンタンガム濃度では、スプレーは湿り過ぎていて、良好なビーズを与えず鳥の濡れおよび冷えを引き起こした。
【００２４】
比較的高い粘度にもかかわらず、新しいワクチンは、特殊な噴霧機器の使用を必要としない。これは、おそらく、キサンタンガムの擬塑性の結果である。
【００２５】
したがって、１つの態様において、本発明は、薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む、家禽のためのコクシジウム症ワクチンであって、前記ワクチンに２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むことを特徴とする、前記ワクチンに関する。
【００２６】
「コクシジウム症」は、コクシジウム寄生生物、例えばアイメリアなどにより引き起こされる腸疾患症候群（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｃｏｍｐｌｅｘ）として周知である。
【００２７】
「ワクチン」は、固有の医学的効果を持つ組成物であることが周知である。ワクチンは、免疫学的活性成分および薬学的に許容される担体を含む。「免疫学的活性成分」は、標的の免疫系により認識され、防御性の免疫学的応答を誘導する１以上の抗原性分子（類）、ここでは生きたアイメリアコクシジウムである。応答は、標的の自然免疫系および／または獲得免疫系を起源とし得て、細胞型および／または液性型のものであり得る。
【００２８】
ワクチンは、概して例えば宿主動物における寄生の負荷を低減させるまたは寄生生物の複製期間を短くすることにより、感染のレベルまたは程度の低減において効き目がある。
【００２９】
またその結果としてまたはおそらくその結果として、ワクチンは、概してかかる感染もしくは複製により、またはその感染もしくは複製への動物の応答により引き起こされ得る疾患の（臨床的）症状の低減または寛解において有効である。
【００３０】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの効果は、アイメリアによる感染の、および／またはかかる感染もしくは複製に関連したコクシジウム性疾患の１以上の徴候の、家禽における予防または低減である。ここで、かかる（臨床的）徴候は：腸病変、体重増加およびオーシスト産出である。
【００３１】
かかるコクシジウム症ワクチンは、口語表現で、アイメリアもしくはコクシジウム症「に対する」ワクチンとも、または「アイメリアワクチン」とも呼ばれ得る。
【００３２】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの詳細および好ましいものは、本明細書中で下に記載される。
【００３３】
「家禽」は、農業に関連する鳥類、例えば：ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ヤマウズラ、クジャク、ウズラ、ハト、キジ、ホロホロチョウまたはダチョウなどを指す。
【００３４】
本明細書中で用いられる用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などのバリエーション）は、この用語が用いられるテキスト部分、段落、特許請求の範囲などによりカバーされるまたはこれらの中に包含される全ての要素、および本発明に関して考えられる任意の可能な組み合わせを、かかる要素または組み合わせが明示的に挙げられていない場合でも指すことが意図され；およびかかる要素（類）または組み合わせのいずれも排除しないことが意図される。
【００３５】
したがって、任意のかかるテキスト部分、段落、特許請求の範囲などはまた、したがって、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（またはその変形）が例えば用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などにより置き換えられる１以上の実施形態（類）に関する。
【００３６】
「オーシスト」は、アピコンプレクサ類の寄生生物、例えばアイメリアなどの生活環ステージのうちの１つである、周知の微生物である。
【００３７】
オーシストは、適切な条件下、例えば鳥の腸内などでアイメリアの複製サイクルを開始する能力を持つ場合、「生きて」いる。
【００３８】
「アイメリア」は、アイメリア（Ｅｉｍｅｒｉｉｄａｅ）科に属する寄生生物として当該技術分野において周知である。これらの寄生生物およびそれらが誘導する疾患は、周知のハンドブック（上記）中に記載される。アイメリアは、その分類学的なグループメンバーを特徴づける特徴、例えば形態的、ゲノム的および生化学的な特性など、並びに例えば生理学的、免疫学的または病理学的挙動などの生物学的特性などを呈する。
【００３９】
当該技術分野で公知であるように、特定の「種」としての微生物の分類は、かかる特徴の組み合わせに基づく。本発明はまた、したがって、何らかの方法でそれらから亜種、株、単離株、遺伝子型、変異株、亜型または下位グループなどとして下位分類されるアイメリアを包含する。
【００４０】
本発明に関するアイメリアは、家禽の種において複製することができ、例えば、限定されるものではないが、アイメリア属種：Ｅ．アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、Ｅ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、Ｅ．マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、Ｅ．ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、Ｅ．ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、Ｅ．ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、Ｅ．ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、Ｅ．プレコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）、Ｅ．ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）、Ｅ．メレアグリミチス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）（１型および２型）、Ｅ．アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、Ｅ．ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）、Ｅ．ディスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）、Ｅ．イノキュア（Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ）、Ｅ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ（Ｅ．スブロツンダ）およびＥ．メレアグリジス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を含む。
【００４１】
本発明に関する特定のアイメリアには、現在具体的な種および属が割り当てられ得るが、それは、新たな見識が新たなまたは異なる分類学的グループへの再分類を導くことがあることから、時間と共に変化することができる分類学的分類であることは当業者に明らかである。しかしながら、これは微生物自体またはその抗原性レパトアを変えるものではなく、その科学的名称または分類のみを変えるものであることから、かかる再分類された微生物は依然として本発明の範囲内にある。
【００４２】
本発明における使用のためのアイメリア寄生生物は、種々の供給源から、例えば家禽舎からのオリジナルの野外株としてまたは様々な研究室および（寄託）機関からの参考株もしくは実験室株として得ることができる。
【００４３】
「少なくとも１種」は、幅広い免疫防御をもたらすために１種より多くのアイメリアをコクシジウムアイメリアワクチンの中に包含する慣行を指す。加えて、ワクチンは、蔓延性の差をカバーするために特定種の１以上の株を含むことができる。
【００４４】
本発明に関する「薬学的に許容される担体」は、高い純度および滅菌品質の液体、例えば水、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水である。より複雑な形態において、担体は、例えばさらなる添加物、例えば安定化剤または保存料などを含むバッファーであることができる。しかしながら、本発明に関し、最終ワクチン中に含ませることができる塩の濃度には限界がある。これは、味のよい組成物の維持を理由とする。詳細は、下に記載されるキサンタンガムの調製および滅菌方法との関係で記載される。
【００４５】
「キサンタンガム」は、商業的に広く入手可能ないくつかの品質および純度がある周知の多糖であり、例えばＣＰ  ＫｅｌｃｏからのＫｅｌｔｒｏｌ（商標）、Ｘａｎｔｕｒａｌ（商標）またはＫｅｌｚａｎ（商標）である。
【００４６】
本発明に関して、キサンタンガムの濃度は、「％ｗ／ｖ」、すなわち重量／体積でのパーセンテージとして決定される。これは、鳥への投与のために準備された動物用量であることから、最終ワクチン組成物に基づいて決定されることになる。
【００４７】
このことは、本発明によるワクチンまたはその一部が、より濃縮された形態、例えば２倍またはそれより高い倍率の濃縮の形態で生産され、販売されまたは保存され得て、これが次いで投与直前に最終使用濃度まで希釈されることを排除するものではない。このことは、容積を低減させて梱包および輸送のためのコストを抑えるため、安定性または物流上の理由で有利であり得る。
【００４８】
０．３から１．５％ｗ／ｖの間の濃度のキサンタンガムの組み込みにより、得られるワクチン組成物はそれぞれ２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の比較的高い粘度を獲得する。
【００４９】
粘度は、種々の好適な機器を用いて測定することができ；本発明に関して、粘度測定の好ましい方法は、回転スピンドル技術を用いることによるものであり、これにより一定温度、例えば２５℃で平衡化したときの試料が測定される。詳細は実施例セクション中に記載される。
【００５０】
好ましくは、ワクチン組成物は、キサンタンガムのほかには、水性ワクチン組成物の粘度を実質的に上昇させることができる何らかの他のレオロジー調節剤、例えば多糖、ガム、ゲル化剤または増粘剤などを含有しない。明白に、このことは、他のワクチン成分、例えば塩、バッファー、抗原性タンパク質、アジュバントなどにより引き起こされ得る粘度に対する何らかのマイナーな効果とは別のものである。
【００５１】
したがって、本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、キサンタンガムは、ワクチン組成物中で唯一のレオロジー調節剤である。
【００５２】
ある実施形態において、本発明によるコクシジウム症ワクチンは、０．４〜１．２％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。好ましくは、ワクチンは、好ましい順に、０．５〜１％ｗ／ｖのキサンタンガム、０．５〜０．９％ｗ／ｖ、０．５〜０．８％ｗ／ｖあるいは０．５〜０．７％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【００５３】
ある実施形態において、本発明によるコクシジウム症ワクチンは、約０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【００５４】
本発明に関して、「約」は、数がその指示された値の前後±２５％の間で変わることができることを示す。好ましい順に、好ましくは「約」はその値の前後±２０％を意味し、より好ましくは「約」はその値の前後±１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２％を意味し、あるいは「約」はその値の前後±１％を意味する。
【００５５】
ある実施形態において、本発明によるコクシジウム症ワクチンのための標的家禽は、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウよりなる群から選択される。好ましい実施形態において、家禽は、ニワトリまたはシチメンチョウであり、その理由はこれらの家禽種の場合、家禽部門（ｐｏｕｌｔｒｙ  ｓｅｃｔｏｒ）に対するアイメリア感染の経済的影響が最も大きいためである。最も好ましいものはニワトリである。
【００５６】
標的の鳥は、任意のタイプのものであり得て、例えば産卵鳥、種鳥、ブロイラー、組み合わせ品種（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｒｅｅｄ）またはかかる品種の任意の親系統などである。好ましいタイプはブロイラーである。
【００５７】
本発明によるワクチンは、家禽における感染または複製の能力がある任意のアイメリアコクシジウムを原理的に含むことができる。
【００５８】
本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、生きたアイメリアコクシジウムはアイメリアの弱毒化株からのものである。
【００５９】
弱毒化されたアイメリアは、病原性が異なる天然起源のアイメリアの選抜により得ることができる。あるいは弱毒化されたアイメリアは、インビトロ継代および選抜により、または組換えＤＮＡ技術を介して得ることができ、全ては当該技術分野で周知である。
【００６０】
好ましい実施形態において、弱毒化されたアイメリアは早熟性である。
【００６１】
好ましくは、本発明によるコクシジウム症ワクチンは、現存する商業的な生きたコクシジウムベースのアイメリアワクチンと同じコクシジウムの種を含み；より好ましくは：ワクチンライン：Ｃｏｃｃｉｖａｃ、ＰａｒａｃｏｘおよびＦｏｒｔｅｇｒａよりなる群の中のものと同じコクシジウムを含む。
【００６２】
したがって、ニワトリのための本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、少なくとも１種のアイメリアは、Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ブルネッティ、Ｅ．ミチス、Ｅ．プレコックス、Ｅ．ミバティ、Ｅ．ハガニおよびＥ．ネカトリクスよりなる群から選択される１以上または全てである。
【００６３】
同様に、シチメンチョウのための本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、少なくとも１種のアイメリアは、Ｅ．アデノエイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ）、Ｅ．メレアグリミチス１型、Ｅ．メレアグリミチス２型、Ｅ．ガロパボニスおよびＥ．ディスペルサよりなる群から選択される１以上または全てである。
【００６４】
コクシジウムは容易に複製して宿主の腸に定着するため、本発明によるワクチンの１回の用量あたりのアイメリアコクシジウムの正確な量はそれほど決定的ではない。ワクチン用量は、かかる生産的な感染を開始するのに十分であることを必要とするのみである。より高い接種用量は、それが宿主中で最適な定着に達するのにかかる時間をほとんど短縮せず；非常に高い用量は、経済的理由のために魅力的ではない。加えて、高すぎる用量のワクチンコクシジウムは、それら自身によるいくらかの病原性を引き起こし得る。明白に、低すぎる用量はおそらくアイメリア感染を成立させる能力はあるが、適当な免疫の始まりのための時間がかかりすぎるであろう。
【００６５】
好ましい接種用量は、したがって、好ましい順に、１回の動物用量あたり約１×１０＾１から約１×１０＾５個の間のアイメリア種の胞子形成したオーシスト、より好ましくは１回の用量あたり１×１０＾２から１×１０＾４個の間のオーシスト、１００から５０００個の間、あるいは１００から１０００個の間のオーシスト／動物用量である。
【００６６】
当業者に明らかであるように、最適なワクチン用量は、標的の動物種ならびに用いられるアイメリア株の種および病原性に依存し、したがって１つの組み合わせワクチン中で様々なアイメリア種について異なったものであり得る。
【００６７】
本発明によるコクシジウム症ワクチンにおける使用のためのアイメリアコクシジウムを計数し定量する方法は、当該技術分野で周知である。
【００６８】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの１回の動物用量あたりの液量は、意図される適用経路に応じて最適化することができ、ボディースプレー（ｂｏｄｙ  ｓｐｒａｙ）ワクチン接種の場合、用量は、鳥１羽あたり約１０μｌから１ｍｌの間であり得る。好ましくは、鳥１羽あたりのスプレーワクチンの液量は、鳥１羽あたり０．１から０．５ｍｌの間、より好ましくは鳥１羽あたり０．２から０．３ｍｌの間である。
【００６９】
あるいは、ワクチンは、飼料上への噴霧によりまたは飲料水への液体として投与することができる。
【００７０】
本発明によるワクチンの１回の動物用量あたりのアイメリアコクシジウムの免疫学的有効量が何であるかを決定することにより様々な投与経路のための最適な液量および用量を見つけることは、十分に当業者のルーチン能力の範囲内である。
【００７１】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの有効性の決定は、例えば、ワクチン接種後またはチャレンジ感染の後の免疫学的応答をモニターすることにより、例えば標的の疾患徴候、臨床スコア、血清パラメーターをモニターすること、または、病原体の再分離、およびこれらの結果をモックワクチン接種動物において見られるワクチン接種−チャレンジ応答と比較することにより、行うことができる。
【００７２】
病原性アイメリアによる早期感染（の結果）を予防するため、健康な標的にワクチン接種することおよびできるだけ早くワクチン接種することが明白に好都合であるが、本発明によるコクシジウム症ワクチンの標的家禽の齢、体重、性別、免疫学的ステータスおよび他のパラメーターは決定的ではない。
【００７３】
したがって、本発明によるコクシジウム症ワクチンは、好ましくは孵化の日に（すなわち１日齢で）投与される。
【００７４】
時折、家禽は、生涯のより遅い時期にブースターワクチン接種を与えられ得る。
【００７５】
本発明によるワクチンを組み合わせワクチンとして製剤化することは高度に効率的であり、その理由は、このようにして複数の免疫剤を一度に投与することで、ワクチン接種された標的の鳥の不快感の低減並びに時間および労働コストの低減をもたらすことができるからである。組み合わせワクチンは、本発明によるコクシジウム症ワクチンに加えて、別の免疫学的活性化合物を含む。原理的に、これはアイメリアコクシジウムの安定性または複製能力を低減させないという条件で、任意の生きているもしくは死滅させた微生物またはサブユニット産物であることができる。また、追加の免疫活性成分（類）は、コクシジウム症ワクチン適用の意図された経口経路に適合性がなければならない。追加の免疫学的活性化合物は、抗原、免疫増強物質、サイトカインおよび／またはワクチンであり得る。
【００７６】
あるいは、本発明によるコクシジウム症ワクチンは、それ自体がワクチンに加えられ得る。
【００７７】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの特定の形態の特性に応じて、さらなる組み合わせを作る方法は慎重に選択される必要がある。かかる選択は、当業者のルーチン能力の範囲内にある。
【００７８】
したがって、ある実施形態において、本発明によるワクチンは、１以上の追加の免疫活性成分（類）を含むことを特徴とする。
【００７９】
ある実施形態において、本発明によるワクチンは、家禽に病原性である微生物に由来する少なくとも１つの追加の抗原を含む組み合わせワクチンである。追加の抗原は、生きている、生きていて減弱化された、もしくは死滅させた微生物、またはその部分抗原もしくはサブユニット抗原である。
【００８０】
好ましくは、家禽に病原性である微生物に由来する追加の抗原は、以下よりなる群から選択される１以上である：
−  ウイルス：伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（すなわちガンボロウイルス）、ニワトリ貧血ウイルス、鳥脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、ハトポックスウイルス、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、鳥白血病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、鳥ニューモウイルス、鳥インフルエンザウイルス（ＡＩＶ）およびレオウイルス；
−  細菌：エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、オルニトバクテリウム・リノトラケアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィリス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリシペロスリクス・ルシオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）；
−  寄生生物：ヒストモナス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ）、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）およびデルマニスス（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ）；ならびに
−  真菌：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）。
【００８１】
最も好ましい追加の抗原は：ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＴＲＴ、ＡＩＶ、ＭＤＶ、マイコプラズマおよびサルモネラから選択される。
【００８２】
本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、追加の免疫活性成分はアジュバントである。
【００８３】
「アジュバント」は、周知のワクチン成分であり、概して標的の鳥の免疫応答を非特異的に刺激する物質である。多くの異なるアジュバントが当該技術分野で公知である。明白に、アジュバントは、生きたアイメリアコクシジウムの安定性または複製潜在能力に影響しないほどに十分に軽度のものでなければならない。
【００８４】
好ましい実施形態において、アジュバントはサイトカインである。
【００８５】
本発明によるコクシジウム症ワクチンは、医薬成分、例えば抗生物質、ホルモン、および／または抗炎症薬などと好都合に組み合わせることができる。
【００８６】
ワクチン中のアイメリアコクシジウムがその特定の薬剤に感受性でないという条件で、抗コクシジウム化合物の使用もまた可能である。
【００８７】
本発明によるコクシジウム症ワクチンは、本発明における使用のための生きたアイメリアコクシジウムの生存力および品質を助け、それによって標的家禽の腸における生産的複製および定着の成立を促進する１以上の成分を含有し得る。
【００８８】
添加物は、保存、操作、投与または摂取の間、本発明に関するアイメリアコクシジウムの量および質を安定化させるための安定化剤であり得る。概して安定化剤は、高分子量の大きい分子、例えば脂質、炭水化物またはタンパク質；例えば粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、トレハロース、スペルミジン、デキストラン（ｄｅｘｔｒａｎｅ）またはポリビニルピロリドンなどである。
【００８９】
また、好適な保存料、例えばチメロサール、メルチオレート、フェノール化合物またはゲンタマイシンを加え得る。
【００９０】
本発明によるコクシジウム症ワクチンは、アイメリアによる感染の成立および進行の両方を妨げることから、予防的処置もしくは治療的処置、またはその両方として用いることができる。
【００９１】
下に非常に詳細に記載されるように：本発明によるコクシジウム症ワクチンの製造プロセスにおけるある選択の結果として、ワクチン組成物は、ある一定の濃度の金属塩を含有し得る。簡潔に言うと：これは、加熱により滅菌することが必要であるときに、キサンタンガムを安定化させるために必要とされることがある。しかしながら、本発明によるコクシジウム症ワクチンのビーズの嗜好性を維持するため、塩濃度は最終ワクチン組成物中で０．４％ｗ／ｖのレベルを超えてはならない。
【００９２】
したがって、本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、ワクチンは、約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含む。
【００９３】
本発明によるコクシジウム症ワクチンのある実施形態において、以下よりなる群から選択される１以上または全ての条件が当てはまる：
−  ワクチンは、アジュバント、好ましくは免疫刺激性のオリゴデオキシヌクレオチドを含む；
−  ワクチンは、家禽に病原性である微生物からの追加の抗原、好ましくは：ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＴＲＴ、ＡＩＶ、ＭＤＶ、マイコプラズマおよびサルモネラから選択される１以上を含む；
−  少なくとも１種のアイメリアは：Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ブルネッティ、Ｅ．ミチス、Ｅ．プレコックス、Ｅ．ハガニおよびＥ．ネカトリクスよりなる群から選択される１以上または全てである；
−  アイメリアは弱毒化されている；
−  アイメリアは早熟性である；
−  ワクチンはニワトリのためである；
−  家禽は１日齢である；
−  ワクチンは約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含む；および
−  ワクチンは約０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【００９４】
本発明によるコクシジウム症ワクチンは、生きたアイメリアコクシジウムから、当業者に周知でありかつ容易に適用可能な方法により調製することができる。例えば：アイメリア寄生生物は、ドナーの家禽動物の中で工業的に生産され、それらの糞便から周知の技術、例えば遠心分離および塩浮上分離などにより分離され、その後に胞子形成および滅菌、および最後に光学顕微鏡により計数される。胞子形成は例えば二クロム酸カリウムを用いて実施することができ、滅菌は次亜塩素酸ナトリウムまたはベータ−プロピオラクトンを用いて行うことができる。アイメリアの胞子形成したオーシストは次いで医薬担体と共にワクチンへと製剤化され、最終生成物は適切な大きさの容器内に分配されて包装される。
【００９５】
製造プロセスの様々なステージは、適当な試験により、例えばコクシジウムまたは他の抗原の質および量についての免疫学的試験により；不活化（適用可能な場合）、滅菌および外来性の剤の不存在についての微生物学的試験により；ならびに最終的にワクチンの効力および安全性を決定するためのインビトロまたはインビボの実験により、モニターされる。これらの全ては当業者に周知であり、行政規則、例えば薬局方などの中に、およびハンドブック、例えば：“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および：“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）などの中に規定される。
【００９６】
したがって、さらなる態様において、本発明は、薬学的に許容される担体中で、少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを、０．３〜１．５％ｗ／ｖまでのキサンタンガムと混合するステップを含むことを特徴とする、本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製方法に関する。
【００９７】
キサンタンガムは、粉末としてコクシジウムと混合され得る。しかしながら好ましくは、キサンタンガムは溶液として混合される。そのことは、キサンタンガムを有する組成物がアイメリアコクシジウムを含む組成物と別々に調製されることを可能にする。同様に、コクシジウムを含む組成物は、使用直前にキサンタンガムと混ぜられることになる濃縮された形態で別々に調製されて保存され得る。このことは、生産計画および物流において柔軟性をもたらし、コクシジウムの安定性維持の助けとなることができる。
【００９８】
効果的に、キサンタンガムを含む組成物は、今度はコクシジウムの濃縮組成物のための希釈剤として働く。しかしながら、当業者に明らかであるように、２つの組成物、例えばコクシジウムを有するものとキサンタンガムを有するものとを混合すると、これらの両方の組成物の希釈が起こる。その結果として、得られる本発明によるコクシジウム症ワクチン中でコクシジウムおよびキサンタンガムの具体的な最終濃度に達するために、混ぜられる組成物はこの希釈を可能にするように最終濃度よりも高いものであることが必要である。
【００９９】
例えば、２つのタイプの組成物を等体積で混ぜるとき、両方ともそれらの成分の所望の最終濃度の２倍であることが必要であり；例えばこの場合のキサンタンガムを含む組成物は、０．６から３．０％ｗ／ｖの間のキサンタンガムを含む必要がある。
【０１００】
したがって、ある実施形態において、本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製方法は、キサンタンガムが、混合後に得られるワクチンが０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むような濃度で組成物中に提供されることを特徴とする。
【０１０１】
有利な応用において、このことは、本発明によるワクチンが本発明によるコクシジウム症ワクチンを調製するためのパーツキットとして供給されることを可能にし、ここでキットは生きたコクシジウムを有する１つの容器、および、コクシジウムのための希釈剤として用いられることになるキサンタンガムを有する１つの容器である別々の容器を含み、この組み合わされた容器は本発明によるワクチンを調製するために用いることができる。
【０１０２】
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つの容器：薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む組成物を含む１つの容器、およびキサンタンガムを含む組成物を含む１つの容器を含み、キサンタンガムを含む組成物の濃度は、両容器の組成物を合わせた後に結果として得られるワクチンが０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むようなものであることを特徴とする、本発明によるコクシジウム症ワクチンを調製するためのパーツキットに関する。
【０１０３】
好ましい実施形態において、本発明によるパーツキットは、前記キットの使用および／または本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製に関する説明書を含む。
【０１０４】
本発明によるパーツキットに含まれる使用のための説明書は、例えば、１つもしくは全ての容器（類）の上に記載されるもしくはこれらに取り付けられる情報、または１つもしくは全ての容器（類）を含有する箱の上に記載される情報として提供され得る。また、説明書は、１つまたは全ての容器（類）と共に梱包されるリーフレット上に、例えば患者情報リーフレットまたは添付文書の上に存在し得る。また、使用のための説明書は、電子形態の説明書、例えばキットの販売会社からのインターネットウェブサイト上で閲覧可能なまたはこれからダウンロード可能な情報などへの参照として提供され得る。
【０１０５】
本発明によるパーツキットはまた、本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製方法における組み合わせ使用のための、例えばインターネットウェブサイト上での（商業的販売に関係する）言及された部品の提案であり得る。
【０１０６】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの商業的形態の調製の実行において、解決すべきさらなる問題があった。これは、販売承認を得るため、商業的ワクチンは一般に滅菌で調製されなければならないからであった。
【０１０７】
ワクチン成分（明白にあらゆる生きたワクチン微生物を除外する）の大規模滅菌についてはいくらかの可能性が存在し、これらは一般に、ワクチンの試料に異なる指標微生物をスパイクして、滅菌方法の後にそれらの完全な不活化を検出することにより確かめられる。
【０１０８】
一般的な方法は、精密ろ過またはガンマ線照射である。本発明に関して、パーツキットにおけるワクチン成分の分離は、キサンタンガムを含む組成物の別々の滅菌を可能にする。
【０１０９】
しかしながら、ろ過および放射線照射は比較的高価な方法であり、家禽ワクチンの場合、重大な不利益である。したがって、別の一般的なワクチン成分滅菌方法：加熱滅菌（オートクレーブ）が好ましい。これは大規模において効率的かつ安価である。しかしながら、本発明によるコクシジウム症ワクチンを調製するとき、本発明者は、キサンタンガムそれ自体が加熱滅菌したときに不活化されることを見出して最初は失望した：実施例セクション中に記載されるように、ワクチン製造において標準的な加熱滅菌プロトコールに供したとき、０．６％ｗ／ｖのキサンタンガム水溶液はその粘度の、６００ｍＰａ．ｓ超から２５ｍＰａ．ｓまでの劇的かつ不可逆な喪失を呈した。低粘度のこのオートクレーブしたキサンタンガム溶液を使って調製されたコクシジウム症ワクチンは、もはやスプレー投与の際に必要とされるワクチンビーズを生み出すことはできなかった。
【０１１０】
この発見に伴って、ここに、商業的ワクチンＰａｒａｃｏｘ  ８は１回の動物用量あたり０．３％ｗ／ｖのキサンタンガムを含有するにもかかわらず低い粘度しか持たない理由：このワクチンの成分（コクシジウム以外のもの）はそれらの最終の組み合わせの前に加熱滅菌されることを理解することができる。このことは、意図されない、かつ以前に気づかれていないキサンタンガムの不活化を引き起こす。回顧すると、このことはまた、Ｐａｒａｃｏｘ  ８  ワクチンのボディースプレーとしての適用が、有効な摂取のために好都合なワクチンのビーズを生み出さず、鳥の濡れを引き起こす理由を説明する。
【０１１１】
本発明者は、次いで、キサンタンガムを含む組成物をその粘度を壊さずに加熱滅菌することを可能にする方法を見出した。驚くべきことに、キサンタンガムを少なくとも約０．１％ｗ／ｖの濃度の金属塩と共に含む組成物を提供することにより、この目的が満たされ、その結果として従来技術の１以上の不利な点を克服することができることが見出された；この場合、％ｗ／ｖは、キサンタンガムおよび金属塩を含む組成物の体積に対して計算されることになる。
【０１１２】
金属塩は、キサンタンガムを含む組成物を、加熱滅菌の間、重度の（１５％より多い）かつ不可逆な粘度喪失に対して効果的に保護することができることが見出された。
【０１１３】
したがって、さらなる態様において、本発明は、キサンタンガムを含む組成物の加熱滅菌方法であって、前記組成物を少なくとも０．１％ｗ／ｖの金属塩と混合することを含むことを特徴とする、前記方法に関する。
【０１１４】
本発明に関して、「加熱滅菌」は、少なくとも１００℃で少なくとも１５分間のインキュベーションを伴う。
【０１１５】
金属塩は原理的に任意の金属塩であることができるが、好ましくは金属塩は一価または二価の金属カチオンからの塩である。より好ましくは、カチオンはアルカリ金属である。
【０１１６】
金属塩のアニオンは、好ましくはハロゲン、スルフェート、ホスフェート、ナイトレートまたはアセテートである。より好ましいのは塩素である。
【０１１７】
なおより好ましくは、金属塩はアルカリ金属のハロゲン塩であり；なおより好ましくはナトリウムまたはカリウム塩であり；なおより好ましくは、金属塩は：塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【０１１８】
加熱滅菌の間のキサンタンガムの金属塩による安定化のため、金属塩の濃度には、約５％ｗ／ｖを上回る濃度が結晶形成および腐食性のために非実用的なことがある以外は、明瞭な上限はない。
【０１１９】
加えて、本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製が適用された時、スプレー投与の際に生産される比較的高い塩濃度を持つビーズはもはや容易に鳥に摂取されなかったが；これはおそらく嗜好性を欠くためである。ワクチンビーズの金属塩含量についての許容の限界は、最終ワクチン組成物の約０．４％ｗ／ｖであることが見出された。
【０１２０】
したがって、ある態様において、本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製方法は、キサンタンガムを含む組成物が、付加的に少なくとも約０．１％ｗ／ｖの濃度の金属塩を含有することを特徴とする。
【０１２１】
好ましくは、キサンタンガムを含む組成物中の金属塩の濃度は、得られるワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むようなものである。
【０１２２】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの調製方法のある態様において、以下よりなる群から選択される１以上または全ての条件が当てはまる：
−  金属塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである；
−  キサンタンガムおよび金属塩を含む組成物中、金属塩の濃度は得られるワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むようなものである；
−  ワクチンは、アジュバント、好ましくは免疫刺激性のオリゴデオキシヌクレオチドを含む；
−  ワクチンは、家禽に病原性である微生物からの追加の抗原、好ましくは：ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＴＲＴ、ＡＩＶ、ＭＤＶ、マイコプラズマおよびサルモネラから選択される１以上を含む；
−  少なくとも１種のアイメリアは：Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ブルネッティ、Ｅ．ミチス、Ｅ．プレコックス、Ｅ．ハガニおよびＥ．ネカトリクスよりなる群から選択される１以上または全てである；
−  アイメリアは弱毒化されている；
−  アイメリアは早熟性である；
−  ワクチンはニワトリのためである；
−  家禽は１日齢である；および
−  得られるワクチンワクチンは、約０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【０１２３】
同様に、本発明によるパーツキットの成分は、この実施形態に適合させることができる。
【０１２４】
したがって、ある態様において、本発明によるパーツキットは、キサンタンガムを含む組成物が、付加的に少なくとも約０．１％ｗ／ｖの濃度の金属塩を含有し、前記組成物中の金属塩の濃度は、得られるワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むようなものであることを特徴とする。
【０１２５】
本発明によるパーツキットのある態様において、以下よりなる群から選択される１以上または全ての条件が当てはまる：
−  金属塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである；
−  キサンタンガムおよび金属塩を含む組成物中、金属塩の濃度は、キットの成分の組み合わせの後に結果として得られるワクチンが約０．４％ｗ／ｖ未満の金属塩を含むようなものである；
−  ワクチンは、アジュバント、好ましくは免疫刺激性のオリゴデオキシヌクレオチドを含む；
−  ワクチンは、家禽に病原性である微生物からの追加の抗原、好ましくは：ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＴＲＴ、ＡＩＶ、ＭＤＶ、マイコプラズマおよびサルモネラから選択される１以上を含む；
−  少なくとも１種のアイメリアは：Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．テネラ、Ｅ．マキシマ、Ｅ．ブルネッティ、Ｅ．ミチス、Ｅ．プレコックス、Ｅ．ハガニおよびＥ．ネカトリクスよりなる群から選択される１以上または全てである；
−  アイメリアは弱毒化されている；
−  アイメリアは早熟性である；
−  ワクチンはニワトリのためである；
−  家禽は１日齢である；および
−  得られるワクチンワクチンは、約０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【０１２６】
本発明によるワクチンの投与環境、例えば経路および標的家禽種に応じて、ワクチン組成物をさらに適合させる必要があり得る。このことは十分に当業者の能力の範囲内であり、概してワクチンの効力または安全性の微調整を伴う。これは、ワクチンの用量、量、頻度または経路を適合させることにより、ワクチンを別の形態もしくは製剤で用いることにより、またはワクチンの他の構成成分（例えば安定化剤、担体、アジュバント、希釈剤）を適合させることにより、行うことができる。典型的に、粗粒スプレーとして適用されるとき、コクシジウムアイメリアワクチンは、着色剤と混ぜられ得る。
【０１２７】
安定性または経済性の理由のため、本発明によるコクシジウム症ワクチンは凍結乾燥形態に調製され得る。概して、それは、０℃を上回る温度、例えば４℃で長期保存ができるようにする。凍結乾燥手法は当業者に公知であり、異なる規模での凍結乾燥機器が商業的に入手可能である。明白に、アイメリア寄生生物は、凍結、乾燥、保存および解凍期間を生き残るために比較的頑強な形態であるべきである。したがって、好都合な実施形態は、本発明における使用のためにアイメリアのスポロゾイト形態を凍結乾燥することである。
【０１２８】
したがって、本発明によるワクチンの調製方法のある実施形態において、ワクチンは凍結乾燥形態に調製される。
【０１２９】
本発明によるコクシジウム症ワクチンおよび本発明によるその調製方法はまた、それらの全ての有利な意味合いと共に、ワクチン組成物の驚くべきかつ有利な医学的使用に注目して代わりの表現で記載することもできる：
したがって、さらなる態様において、本発明は、家禽のためのコクシジウム症ワクチンとしての使用のための、薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む組成物であって、前記組成物に２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むことを特徴とする、前記組成物に関する。
【０１３０】
また：
さらなる態様において、本発明は、家禽のためのコクシジウム症ワクチンの製造のための、薬学的に許容される担体中に少なくとも１種のアイメリアの生きたオーシストを含む組成物の使用であって、前記組成物が、前記組成物に２００から４０００ｍＰａ．ｓの間の粘度を与える０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含むことを特徴とする、前記使用に関する。
【０１３１】
本発明によるコクシジウム症ワクチンは、好ましくは、その用量、液量、経路および製剤の観点で最適な方法で並びに標的の齢、性別または健康状態に関して最適な方法で標的の鳥に投与される。当業者は、ワクチン投与のためのかかる最適条件を決定する能力を完璧に持つ。
【０１３２】
ある態様において、本発明によるコクシジウム症ワクチンは、集団適用方法、例えば身体もしくは飼料への噴霧などを介して、または飲料水を介して適用される。これは、標的の鳥にとってのワクチン接種の不快感並びに労働コストの両方を低減する。
【０１３３】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの集団投与に適した方法は、もちろん、生きたアイメリアコクシジウムに適合性であるべきであり、腸に到達することを狙うべきである。好ましい方法は：スプレーもしくは飲料水によるもの、または卵の中への（自動化）注入、いわゆる卵内ワクチン接種によるものである。家禽ワクチンの大量投与に適した機器は商業的に入手可能である。
【０１３４】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明によるコクシジウム症ワクチンを前記家禽にボディースプレーとして投与することを含むことを特徴とする、コクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法に関する。
【０１３５】
ワクチンが「ボディースプレー」であるとの指示は、鳥の身体の全てを覆うことを必要とせず、身体の特定の部分が具体的に標的とされる必要がないことを示すに過ぎない。加えて、このようにして送達されるワクチンのかなりの部分は鳥の身体の上に乗らずまたは留まらず、床の上で終わり得る。鳥はかかる液滴を迅速についばみ始めてそれらを摂取することから、これは良いことである。
【０１３６】
本発明によるコクシジウム症ワクチンの鳥の身体に送達されたときの有利な性質は、粗粒スプレーとして適用されたときに最も顕著である。その場合、それを形成するワクチンビーズは、羽または床から鳥により迅速に摂取される。
【０１３７】
したがって、ある態様において、本発明による家禽のワクチン接種方法は、噴霧が粗粒スプレーとして適用されることを特徴とする。
【０１３８】
概して、粗粒スプレーは、直径５０μｍを超えるサイズの液滴を適用する。本発明に関して、液滴は好ましくは１から４ｍｍの間のサイズである。用いられる機器、例えばノズルなど、および用いられる圧力を選択することにより、当業者は、かかるサイズの液滴に好都合に達することができる。
【０１３９】
かかる粗粒スプレーは、孵化トレー内において１日齢のひな鳥を免疫するときに例えば孵化場噴霧器を用いて適用することができ、または床飼い環境においてより齢をとった鳥を免疫するときに例えば背負式噴霧器を用いて適用することができる。
【０１４０】
本発明によるワクチンを標的の鳥に適用するための投与レジメンは、ワクチンの製剤および畜産の実務面に適合性のある様式で、単回または複数回の用量であることができる。
【０１４１】
好ましくは、本発明による家禽のワクチン接種方法のためのレジメンは、動物へのストレスを低減させ、労働コストを低減させるため、標的の鳥が必要とし得る他のワクチンの現存のワクチン接種スケジュール中に組み込まれる。これらの他のワクチンは、同時に、併用で、または逐次的に、それらの登録された使用に適合するように投与することができる。
【０１４２】
したがって、本発明による家禽のワクチン接種方法のある態様において、ワクチンは別の家禽ワクチンと組み合わせて投与される。
【０１４３】
本明細書中に記載される本発明によるコクシジウム症ワクチンの有利な医学的効果はまた、異なる表現を用いてカバーすることもできる。
【０１４４】
さらなる態様において、本発明は、家禽におけるアイメリアの感染または関連した疾患の徴候の予防または低減方法であって、前記家禽への本発明によるコクシジウム症ワクチンの投与を含むことを特徴とする、前記方法に関する。
【０１４５】
本発明は、ここに、次の限定されない例によりさらに記載される。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：キサンタンガム組成物の粘度の比較
キサンタンガム水溶液の粘度を異なる条件下で決定し、ある濃度の金属塩を含ませてまたは含ませずに加熱滅菌の効果を試験した。
【０１４７】
試料のうちいくつかを、１１５℃で３０分間のインキュベーションによりオートクレーブした。
【０１４８】
粘度測定は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標）回転粘度計を使って、製造業者の説明書に従って実施した。この機器は、液体の粘度を、規定された体積のその液体の中で規定された毎分回転数で回転するスピンドル上のトルクから決定する。全ての試料は、２５℃の水浴中で平衡化しながら測定した。
【０１４９】
表１：キサンタンガム水溶液の粘度
【表１】
2019504044.tif 000002
【０１５０】
これらの結果は、特定濃度の金属塩の添加はキサンタンガムの水希釈物の加熱滅菌の際に起こる粘度の劇的な減少をほぼ完全に防ぐことができることを実証する。オートクレーブ＋塩の試料とオートクレーブなし＋塩の試料との間の粘度の差（ここでは：約１１％）は、深刻なものではないと考えられる。
【０１５１】
実施例２：複数種の生きたコクシジウムアイメリアワクチンの効力に対するキサンタンガムの効果
２．１．  導入：
生きたコクシジウム症ワクチンの１日齢への粗粒ボディースプレー投与の送達性を改良するため、本発明者は、コクシジウムが水中に希釈されたより慣例的なワクチンの次に、キサンタンガムワクチン製剤を試験した。ワクチンが、ワクチンの視認性を増加させてより良好なワクチン摂取および最小限の鳥の濡れを導く鳥の上に「ビーズ状となる」かを試験した。
【０１５２】
２．２．  実験デザイン
１２０羽の１日齢のニワトリを、４０羽の３群に分けた。群１の全ての鳥に、Ｐａｒａｃｏｘ（商標）  ８ワクチンのそれに相当する水中のコクシジウムを；群２の鳥に、同じタイプのコクシジウムであるが０．１％ｗ／ｖのカルミン（Ｅ１２０）を含む０．６％ｗ／ｖのキサンタンガム／０．２％ｗ／ｖのＮａｃｌ中のものを、いずれも粗粒スプレーによりワクチン接種した。群３の鳥はワクチン接種しなかった（表２を参照されたい）。全ての鳥を、群れで、別々の床飼い囲い内でワクチン接種後２１日間飼育した。（ワクチンの）オーシスト排出をモニターするため、糞便試料を床飼い囲いから：ワクチン接種した鳥（群１および２）についてはワクチン接種後（ｐｖ）４日目から１４日目まで、および２０日目に；対照の鳥（群３）については７、１４および２０日目に収集した。
【０１５３】
ｐｖ２１日目に、１群あたり３０羽の鳥をナンバリングタグにより一意に個体識別し、次いで各鳥に、病原性Ｅ．テネラ野生型株の１５，０００個のオーシストをチャレンジした。次に、チャレンジした鳥を、格納室内の集合ケージ（１群あたり１０羽の３ケージ）に移した。群１および２の残った鳥を安楽死させて処分した。群３の残った鳥を床飼い囲い内でそのままにして２１、２８および３５日目に体重測定した。２羽の鳥は、何らかの非実験的な感染の検出を可能にするため、ワクチン接種せずチャレンジしなかった。
【０１５４】
チャレンジ後（ｐｃ）５日目に、合計で１０羽のチャレンジした鳥（最初の２群の各ケージから３羽、および３番目の群から４羽）を安楽死させ、死後に（処置群を知らずに）Ｅ．テネラ感染に関連した病変を調べた。
【０１５５】
ｐｃ７日目に全ての残った鳥を体重測定し、オーシスト産生の数え上げのために全てのケージからかたまりになった糞便収集物を取った。ｐｃ１４日目に、全ての鳥を体重測定した後、安楽死させた。
【０１５６】
試験の間ずっと、全ての鳥を、毎日、アイメリア感染に関連した臨床的徴候、例えば下痢もしくは血便、抑うつまたは食欲不振などについて観察し；非実験的な感染を観察した。
【０１５７】
２．３．  材料と方法
２．３．１．  試験動物
用いられたニワトリは性別混合のＳＰＦであって、実験開始時に１日齢であった。ワクチン接種前に、全ての鳥を、外見上良好な健康状態および大きさであることについて確認した。初回の捕獲を基礎として、鳥をランダムに群に配分した。水道水および標準飼料を自由摂取させた。チャレンジ接種は強制経口投与によるものであった。
【０１５８】
２．３．２．  試験材料
ワクチンコクシジウム（Ｐａｒａｃｏｘ  ８中のもの）およびチャレンジ材料（Ｅ．テネラの滅菌された胞子形成オーシスト）は使用するまで２〜８℃で保管され、実験時には十分に使用期限内であった。
【０１５９】
Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチンコクシジウムを希釈し、０．２１ｍｌ中に１回の動物用量を与え；群１および２のためのワクチンを、３，０００回の用量を含有するように作った。群１の場合は３１５ｍｌの滅菌水であり、または群２の場合は：３１５ｍｌの（加熱滅菌された）１．２％ｗ／ｖのキサンタンガム（Ｘａｎｔｕｒａｌ  １１Ｋ，ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ）および０．４％ｗ／ｖのＮａＣｌであり、いずれも０．２％ｗ／ｖのカルミンを含有する希釈剤を別々の滅菌ガラスＤｕｒａｎボトルの中に入れた。２つの５０００回用量の小袋を１分間勢いよく振ってマッサージし、オーシストの再懸濁を確実にした。これらの小袋の内容物をプールした。プールしたワクチンから３１５ｍｌを取り、各々の希釈剤に加えた。両製剤を次いで、使用前の少なくとも１０分間、群１の場合はフレア（ｆｌｅａ）およびマグネチックスターラーを使って徹底的に混ぜ、または群２の場合は手で振った。
【０１６０】
チャレンジ材料中のオーシストの濃度は、改変Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ計数チャンバーを用いて決定した。これから希釈物を作って、０．５ｍｌの動物用量あたり１５．０００個のオーシストを与えた。
【０１６１】
２．３．３．  スプレーワクチン接種
Ｓｐｒａｙｃｏｘ（商標）  ＩＩ機械装置を製造業者の説明書に従って用いて、粗粒スプレーワクチンをニワトリの幼体に適用した。この機械は１つのトレイあたり１００羽のひな鳥にワクチン接種するように設計されていることから、ここで用いられる１群あたり４０羽のひな鳥の場合、トレイ面積を６０％低減させた。紙のトレーライナーを用いて、鳥が自由に動いて自分自身および互いに羽づくろいすることを可能にする良好な表面を与えた。
【０１６２】
標的は鳥１羽あたり０．２１ｍｌのワクチンを投与されることになっており、したがって、１つのトレイあたり２１ｍｌのワクチンが適用された。ワクチン接種の前に、Ｓｐｒａｙｃｏｘ機械の設定を数回のモック運転により較正し、実験中の群のワクチン接種の前に、トレイの内部表面領域全体にわたって正しい用量（２１ｍｌ）が分配されることを確実にした。調製したワクチンをＳｐｒａｙｃｏｘ機械に移す前に１０分間振って、ワクチンの徹底的な混合を確実にした。ワクチン接種し、十分に明るく暖かい区域内で鳥を少なくとも３０分間ワクチン接種したトレイの中でそのままにした後、床飼いの囲いに移した。この時間の間鳥をモニターし、どのくらい迅速にワクチンが取り入れられるかを見た。各ワクチン接種の間噴霧機械の設定を再確認し、機械を温水で徹底的にすすぎ流した。群は順番に、すなわち群２の前に群１がワクチン接種された。
【０１６３】
２．３．４．  糞便試料
チャレンジの後に、かたまりになった糞便試料を、チャレンジしたケージからチャレンジ後４日目から７日目の間収集した。各ケージからの試料をプラスチックシート上に別々に収集し、チャレンジ後の総オーシスト産生量を決定した。糞便に少なくとも毎日水を噴霧し、それらが湿った状態を保つことを確実にした。各試料を２重に袋に入れ、内容物を同定できるようにラベルし、処理するまで２〜８℃で保存した。オーシストを標準的慣行により回収し、ＭｃＭａｓｔｅｒ計数技術を用いて数を算出した。
【０１６４】
２．３．５．  データ解析
ワクチン接種してチャレンジした鳥（群１および２）の囲いからの病変スコア、体重増加およびオーシスト産出に関するデータは、統計学的検定を用いて相互におよび対照群（ワクチン接種せずチャレンジした群３）と比較した。全ての解析は、統計家により、ＳＡＳ（商標）  ９．３を用いて、５％の有意レベルで実施された。
【０１６５】
２．４．  結果
２．４．１．  病変スコア
Ｅ．テネラに関連した病変を、ｐｃ５日目の死後に調べることにより決定した。結果を群（ｎ＝１０）ごとに表２中にまとめる。スコア付けは、ヨーロッパ薬局方モノグラフ２３２６中に記載されるように実施した。簡潔に言うと：スコア０は肉眼的病変がないことを意味し、スコア１〜４は腸壁肥厚の重症度の増加、血液量の増加および正常な糞便量の減少を意味する。病変スコア４においてはいくらかの死亡数さえもあり得る。
【０１６６】
結果は、群１および３の病変スコアは群２のそれよりも有意に高く（Ｐ＜０．０００１）、スコア２で重なるのみであったことを示す。群１および３の鳥のみがスコアが高く（２またはそれより大きい）、群１の鳥についてのスコアは群３の鳥のスコアよりも概して低かったが、これらは互いに有意な差はなかった（Ｐ＝０．６９１７）。
【０１６７】
表２：病変スコアに対するワクチン接種およびチャレンジの効果
【表２】
2019504044.tif 000003
【０１６８】
２．４．２．  体重増加
個々の体重を、チャレンジの２１日前、ならびにｐｃ７および１４日目に、安楽死前に記録した。１群（ｎ＝２０）ごとの体重測定結果の概要を表３中に表す。
【０１６９】
データは、ｐｃ７日目（Ｐ＜０．００１−両群）およびｐｃ１４日目（Ｐ＜０．００１−両群）において、両ワクチン接種群（１および２）の鳥が群３のそれよりも有意に体重が増加したことを示す。群２もまた両時点（チャレンジ＋７日目：Ｐ＝０．０１７；チャレンジ＋１４日目：Ｐ＝０．０３４）において群１よりも有意な体重増加がある。
【０１７０】
表３：体重に対するワクチン接種およびチャレンジの効果
【表３】
2019504044.tif 000004
【０１７１】
２．４．３．  オーシスト産出
糞便収集物中で検出されたオーシストの量を、表４（ワクチン接種後に取られたもの）および表５（チャレンジ後）中にまとめる。ワクチン接種後、ワクチン接種が成功したことを示す良好なオーシスト産出がある。また、オーシスト産出のパターンは予想されたとおりであり：オーシスト産出の最初のピークはワクチン接種に直接的に起因し、その後に産出の低下、その後にオーシストが２回目のサイクルを経ることから、初回の後６日間で２回目のピークがある。群２において、オーシスト産出の最初のピークは、群１におけるそれよりも小さいものであるが、３日早く、より大きな２回目のピークとなる。
【０１７２】
コクシジウムアイメリアワクチンへの免疫はオーシストの循環と強い関連があるため、したがって、群２（キサンタンガム中のワクチン）の鳥は、群１（水中のワクチン）と比較してチャレンジ感染時により強い免疫を持っていた。キサンタンガム含有ワクチンのワクチン初期摂取の改良および腸管通過時間の低減は、それゆえにコクシジウム症に対する免疫のより良好で早期の発生を導く。
【０１７３】
表４：ワクチン接種後のオーシスト産出に対するワクチン接種の効果
【表４】
2019504044.tif 000005
【０１７４】
チャレンジ後、群間にオーシスト産出の明らかな数的な差があり、これらの差は、他の２群よりも有意に少ないオーシストを排出した群２で統計的に有意である（Ｐ＜０．０００１）。群１および３による排出の間に統計的有意差はない（Ｐ＝０．０６５１）。
【０１７５】
表５：チャレンジ後のオーシスト産出に対するワクチン接種およびチャレンジの効果
【表５】
2019504044.tif 000006
【０１７６】
２．５．  結論
データは、キサンタンガムの使用は現存する複数種の生きたコクシジウムアイメリアワクチンの効力を顕著に改良するという結論を支持する。キサンタンガム製剤中で送達されたワクチンは、同じワクチンであるが水中で送達されたものと比較して、ワクチン接種後２１日目においてチャレンジに対してより大きな免疫を鳥にもたらした。ワクチン接種効力を評価するため用いられた３つのパラメーターの全て：病変スコア、体重増加量の向上およびオーシスト産出の低減が、水中の慣例的ワクチン群およびワクチン非接種対照群と比較して、キサンタンガム中のワクチンを受けた群について顕著に改良された。
【０１７７】
ワクチンは加熱滅菌したキサンタンガムを用いて調製されたが、加熱の間これを安定化するようにある濃度の金属塩が与えられた。
【０１７８】
強く改良されたワクチン効力は、キサンタンガム中で送達されたワクチンの摂取の改良のためであり、ワクチンオーシストのより早期の産出および再循環の改良により実証された。これは、病変スコアおよびオーシスト産出の印象的な低減、同様に経済的に高度に関連のあるチャレンジ後の体重増加量の向上を導いた。
【０１７９】
実施例３：ワクチン接種の改良
より小規模であるが、その他の点は実施例２中に記載された実験とデザインおよび実施が高度に類似した実験において、本発明によるコクシジウム症ワクチンのワクチン接種の効力を、キサンタンガムを含まない標準的なワクチンと比較した。
【０１８０】
かかる実験に関して、「ワクチン接種」は、ワクチン接種後５〜７日目に、死後に、腸壁から掻き取ったものを顕微鏡で調べることにより決定する。様々な種のアイメリアを検出するため、腸管の異なる領域をモニターする必要がある。
【０１８１】
０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを用いた本発明によるコクシジウム症ワクチンおよびＰａｒａｃｏｘ  ８（すなわち水中のコクシジウム）に基づくワクチンと比較したとき、ワクチン接種の改良が観察され：水中のコクシジウムの場合は約４０〜６０％の接種で、キサンタンガム中のコクシジウムの場合はほぼ８０％までの接種であった。
【０１８２】
実施例４：異なるスプレー製剤の効果
早期の実験において、生きたコクシジウム症ワクチンの１日齢ひな鳥への粗粒スプレー投与の送達について、異なるゲル製剤を試験した。実験は、３％のタイプＫ−９０ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）または０．６％のキサンタンガムを含む水溶液を比較した。陰性対照は単なる水中のコクシジウムを有していた。３つ全ての製剤がカルミン着色料（Ｅ１２０）を０．１％ｗ／ｖの最終濃度で含有した。製剤は加熱滅菌せず、その結果として塩を加えなかった。
【０１８３】
４．１．  実験の構成
実験の構成は、実施例２中に記載された実験とデザインおよび実施が高度に類似していた。簡潔に言うと：７５羽の１日齢のＳＰＦニワトリを２５羽の３群にランダムに分配した。各群にＥ．テネラを、粗粒スプレーにより０．２１ｍｌの用量レベルで、すなわち鳥１羽あたり約５００個のコクシジウムを商業的なＳｐｒａｙｃｏｘ  ＩＩ機械装置を用いてワクチン接種した。用いられたワクチンコクシジウムは、Ｐａｒａｃｏｘ製品中に存在するＥ．テネラ株のものであった。
【０１８４】
ワクチン接種後、鳥を羽づくろいさせてワクチンを取り入れさせ；それらを次いでアイソレーターに、１つのアイソレーターあたり１群を移し、７日間育雛した。鳥は毎日観察した。ｐ．ｖ．７日目において、鳥を安楽死させ、オーシストの存在またはそれらの腸管内での発生ステージを死後に調べた。
【０１８５】
ワクチンの摂取は、両方の盲腸の袋（ｐｏｕｃｈ）からの湿スメアを顕微鏡で調べることにより決定した。スコアは、寄生ステージの存在または不存在に応じて陽性または陰性のいずれかであった。表６を参照されたい。
【０１８６】
４．２．  結果
得られた結果は、キサンタンガムを有する製剤が試験した他の２つの製剤に対して明らかに有利であることを示した。
【０１８７】
表６：ワクチン摂取に対するゲル製剤の効果：
【表６】
2019504044.tif 000007
【０１８８】
４．３．  結論
ワクチンの摂取は、湿盲腸スメア中に見られる寄生ステージの存在を通じて確認されるように、それが適用された製剤により影響される。０．６％キサンタンガムの使用（群２）は、ワクチンの摂取を３０％、すなわち慣例的な水媒体（群１）での５４．５％から７０．８％まで改良した。逆に、３％ＰＶＰの使用（群３）は、水群と比較したときにワクチンの摂取を２０％、すなわち５４．５から４３．５％まで実際に低減させた。
【０１８９】
その結果として、アイメリアオーシストのスプレーワクチン製剤中での０．６％キサンタンガムの使用は、媒体としての３％ＰＶＰの使用または慣用的な単なる水の使用と比較して、オーシストの摂取に対して明らかなプラスの効果を持つ。
【０１９０】
試験した全ての製剤がカルミンを含有したため、この実験はまた、キサンタンガムのプラスの効果は着色料のそれと明確に区別されることを実証した。
【０１９１】
同様に、塩を加えなかったため、これは、加熱滅菌がないときに塩の存在が必要とされないことを証明する。
【国際調査報告】
2019504044.tif 000008
2019504044.tif 000009
2019504044.tif 000010