(57)【要約】  本明細書では、インビトロでのペプチド交換のために、哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子の使用が提供される。例えば、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生する方法であって、本方法は、（ａ）既存のペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供すること、（ｂ）既存のペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を予め選択されたペプチドと共にインビトロでインキュベートすることであって、予め選択されたペプチドは、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生するために、既存のペプチドを置換するのに十分な濃度である、インキュベートすることと、を含み、ＨＬＡクラスＩ分子は、α１、α２、α３、およびβ２ｍドメインを含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生する方法であって、
（ａ）既存のペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供することと、
（ｂ）前記既存のペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子を前記予め選択したペプチドとインビトロでインキュベートすることであって、
前記予め選択されたペプチドは、前記予め選択されたペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子を産生するために前記既存のペプチドを置換するのに十分な濃度である、インキュベートすることと、を含み、
前記ＨＬＡクラスＩ分子が、α１、α２、α３およびβ２ｍドメインを含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＬＡクラスＩ分子が可溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記既存のペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子が、可溶性ＨＬＡクラスＩ分子をトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって産生され、前記β２ｍドメインは内因性または外因性であってもよく、好ましくは外因性であり、第２のベクトルでコードされる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記可溶性ＨＬＡクラスＩ分子が、前記ＨＬＡクラスＩ分子の分泌を前記哺乳動物細胞の外側に向けるシグナルペプチドを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記既存のペプチドに複合された前記可溶性ＨＬＡクラスＩ分子が、前記哺乳動物細胞の培養上清中にもたらされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＬＡクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、またはＨＬＡ−Ｇである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ａであり、配列番号２、４、６、８、１０、または１２のいずれかのα１、α２およびα３ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ｂであり、配列番号１４、１６、１８、２０、または２２のいずれかのα１、α２およびα３ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＬＡクラスＩ分子がＨＬＡ−Ｃであり、配列番号２４、２６、２８、または３０のいずれかのα１、α２およびα３ドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＬＡクラスＩ分子の前記α３ドメインが前記マウスＫｂα３ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＬＡクラスＩ分子の前記α２ドメインにおいて、Ｇｌｎが１１５位でＧｌｕに置換されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＬＡクラスＩ分子が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０、およびβ２ｍドメインを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＬＡクラスＩ分子を、好ましくは二量体、三量体、四量体および五量体のうちの１つに多量体化することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＬＡクラスＩ分子が、ＨＬＡクラスＩ分子上の対応するタグを認識する抗体を用いて二量体化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タグが、前記α３ドメインの前記Ｃ’末端にある６ｘＨｉｓタグであり、好ましくは、ＧＳリンカーなどのフレキシブルリンカーによって連結されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生するためのキットであって、既存のペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子および請求項１に記載の方法に対応する指示書を含む、キット。
【請求項１７】
前記予め選択されたペプチドをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＨＬＡクラスＩ分子のα１、α２およびα３ドメイン、Ｎ末端にシグナルペプチド、およびＣ末端にＧＳリンカーによって接合された６×Ｈｉｓタグを含む、ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０である、請求項１８に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターをトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項２３】
β２ｍをコードする第２のベクターをさらに含む、請求項２２に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２４】
β２ｍドメインと複合された、請求項１８または１９に記載のポリペプチドを含む、化合物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の少なくとも２つの化合物の多量体。
【請求項２６】
前記６ｘＨｉｓタグを認識する抗体が、前記少なくとも２つの化合物を二量体化する、請求項２５に記載の多量体。
【請求項２７】
Ｔ細胞集団において、予め選択されたペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞をスクリーニング／選択する方法であって、
前記予め選択されたペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供することと、
前記予め選択されたペプチドに複合された前記哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原特異的Ｔ細胞のＴ細胞の集団をスクリーニングすることと、を含む方法。
【請求項２８】
ホルダーペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を最初に提供することと、
前記予め選択されたペプチドにより前記ホルダーペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子をインビトロでインキュベートすることであって、
前記予め選択されたペプチドは、前記予め選択されたペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子を産生するために、前記既存のペプチドを置換するのに十分な濃度である、インキュベートすることと、をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記予め選択されたペプチドに複合された前記哺乳動物由来ＨＬＡクラスＩ分子が、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法を用いて調製される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記スクリーニングがフローサイトメトリーを含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ホルダーペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のうちのいずれか１つを含み、好ましくはβ２ｍドメインを有する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ホルダーペプチドに複合された前記ＨＬＡクラスＩ分子が、請求項１８または１９のポリペプチド、好ましくはβ２ｍドメインを含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
予め選択されたペプチド抗原を認識する前記抗原特異的Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球である、請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記予め選択されたペプチド抗原が癌に関連している、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ分子の分野、より具体的には、ペプチドと複合させたＨＬＡクラスＩ分子の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）多量体を用いたフローサイトメトリーを用いた抗原特異的Ｔ細胞の解析は、免疫学の標準技術として確立されている（非特許文献１，２）。これらの試薬は、感染、自己免疫、ＧＶＨＤ、および癌に関連する免疫応答の間に抗原特異的Ｔ細胞の追跡および表現型分析を可能にする。
【０００３】
Ｔ細胞におけるαβＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって提示されるペプチド抗原を細胞表面上で認識する（非特許文献３，４）。ＴＣＲとｐＭＨＣとの間の相互作用は非常に弱く、単量体可溶性ｐＭＨＣは、一般に、同族ＴＣＲを有するＴ細胞の細胞表面と安定に会合することができない。アビジン−ビオチンベースのｐＭＨＣ四量体の形態であるｐＭＨＣ多量体は、１９９６年にＭａｒｋ  Ｄａｖｉｓらのグループによって最初に導入され、即座に抗原特異的Ｔ細胞の分析を変換させた（非特許文献５）。ｐＭＨＣ多量体は多くの研究で使用されており、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（商標）、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（商標）、Ｉｍｍｕｄｅｘ（商標）、およびＴＣ  ｍａｔｒｉｘ（商標）など一部の商用ベンダーは、様々な形態のｐＭＨＣ多量体を販売している。ｐＭＨＣ多量体は、他の細胞表面分子に特異的な抗体の組み合わせに関連して使用することができる（非特許文献６）。従って、ＴＣＲ分子および免疫修飾分子（ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を同時に染色することにより、抗原特異的Ｔ細胞を様々な表現型的に異なるサブセットに分類することが可能になる。そのような表現型を用いて、抗原曝露、エフェクター機能、および状態に関して抗原特異的Ｔ細胞を特徴付けることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
大腸菌の発現は、ＭＨＣクラスＩタンパク質の生産に好ましい方法であり、高度に精製されたタンパク質を大量に提供することができる（ｈｔｔｐ：／／ｔｅｔｒａｍｅｒ．ｙｅｒｋｅｓ．ｅｍｏｒｙ．ｅｄｕ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）。クラスＩＩ分子とは異なり、ほとんどのクラスＩ分子は、溝内にペプチドのない空であるため、不安定である（非特許文献７）。したがって、事実上すべての場合において、ＭＨＣクラスＩ分子に目的の合成ペプチドを結合し、クラスＩ発現プロセスをペプチド結合プロセスに連結させて、完全なｐＭＨＣ複合体を産生する。細菌系にはいくつかの既知の問題がある。ＨＬＡ−Ｂ対立遺伝子などの一部のＨＬＡクラスＩ遺伝子では、細菌を用いたｐＨＬＡ産生の一部は、リフォールディングが乏しいために困難である（非特許文献８，９）。クラスＩタンパク質でのグリコシル化は、ｐＭＨＣと同族ＴＣＲとの間の相互作用には必要ではないが、細菌により発現したＭＨＣクラスＩタンパク質上での糖部分の欠如は、それらの安定性に悪影響を有する恐れがある。さらに、細菌により発現され、インビトロでリフォールディングされたｐＭＨＣタンパク質は、哺乳動物で産生され、インビボでリフォールディングされたものと全く同じ高次構造を有することはあり得ない。生成された完全なｐＭＨＣタンパク質のペプチド交換がインビトロにおいて可能であるが、それには複数の複雑なステップを必要とする（非特許文献１０〜１２）。したがって、ｐＭＨＣタンパク質の高スループット産生は、大きな労働力を必要とし、扱いにくく、広く利用可能ではない。最終的に、ｐＭＨＣ多量体の結合に必要なｐＭＨＣ−ＴＣＲ親和性は、Ｔ細胞の活性化に必要な親和性を上回ることが示されている（非特許文献１３）。観察された親和性閾値の差異は、特に低親和性のものでは、現在のｐＭＨＣ四量体染色によりすべての抗原特異的Ｔ細胞を検出できないことを意味する。自己免疫および癌において免疫応答に関連する自己抗原特異的Ｔを染色するためにｐＭＨＣ多量体が使用される場合、広範囲の親和性を有するＴＣＲを発現するすべての同族Ｔ細胞を染色できないことは深刻な問題である可能性が高く、低親和性ＴＣＲを発現する傾向にある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様によれば、既存のペプチドに最初に複合させた哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供することにより、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生する方法が提供される。次いで、既存のペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を、既存のペプチドを置換するのに十分な濃度で予め選択されたペプチドと共にインビトロでインキュベートし、それにより、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生する。ＨＬＡクラスＩ分子は、α１、α２、α３およびβ２ｍドメインを含む。
【０００６】
さらなる態様によれば、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生するためのキットが提供される。このキットには、既存のペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子および上記の方法に対応する指示書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、予め選択されたペプチドをさらに含む。
【０００７】
さらなる態様によれば、ＨＬＡクラスＩ分子のα１、α２、α３ドメイン、ＨＬＡクラスＩ分子のＮ末端にシグナルペプチド、およびＣ末端にＧＳリンカーによって接合された６ｘＨｉｓタグを含むポリペプチドが提供される。
【０００８】
さらなる態様によれば、上記のポリペプチドをコードする核酸が提供される。
【０００９】
さらなる態様によれば、上記の核酸を含むベクターが提供される。
【００１０】
さらなる態様によれば、上記のベクターをトランスフェクトされた哺乳動物細胞が提供される。
【００１１】
さらなる態様によれば、β２ｍドメインに複合された上記ポリペプチドを含む化合物が提供される。
【００１２】
さらなる態様によれば、上記の化合物の少なくとも２つの多量体が提供される。
【００１３】
一態様では、予め選択されたペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞についてＴ細胞の集団をスクリーニング／選択する方法であって、この方法には、予め選択されたペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供することと、予め選択されたペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原特異的Ｔ細胞についてＴ細胞の集団をスクリーニングすることと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の実施形態は、以下の説明および添付の図面を参照することによって最もよく理解され得る。図面は以下のとおりである：
【図１】ペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子の一般構造を示す概略図である。
【図２】インビトロでのペプチド交換によって目的のペプチドを提示する単量体ｐＨＬＡの産生を示す図である。
【図３】抗原特異的Ｔ細胞を染色するための収穫、ペプチド結合、およびｐＨＬＡの二量化のタイムラインチャートを示す図である。
【図４】上清試料中に生じるペプチド交換を示す染色データを示す図である。
【図５】高結合力Ａ２／ＭＡＲＴ１Ｔ細胞が染色されているが、Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｔ細胞は染色されていない、Ａ２／ＭＡＲＴ１モノマーを示す染色データを示す図である。
【図６】高結合力Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｔ細胞が染色されているが、Ａ２／ＭＡＲＴ１Ｔ細胞は染色されていないＡ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１単量体を示す染色データを示す図である。
【図７】Ａ２／ＭＡＲＴ１Ｔ細胞が染色されているが、Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｔ細胞は染色されていないＡ２／ＭＡＲＴ１二量体を示す染色データを示す図である。
【図８】Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｔ細胞が染色されているが、Ａ２／ＭＡＲＴ１Ｔ細胞は染色されていないＡ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１二量体を示す染色データを示す図である。
【図９】既知の五量体よりも低親和性のＡ２／ＭＡＲＴ１  ＴＣＲをよく染色する二量体の実施形態を示す染色データを示す図である。
【図１０】従来技術のＡ２４／ＷＴ１四量体よりもよく低親和性Ａ２４／ＷＴ１  ＴＣＲを染色するＡ２４Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ二量体を示す染色データを示す図である。
【図１１】Ｂ＊３５：０１／ＥＢＮＡ−１４０７−４１７ＴＣＲ（クローンＴＫ３）が染色されているＢ３５Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ二量体を示す染色データを示す図である。
【図１２】ＴＩＬが染色されている高スループットＡ２二量体を示す染色データを示す図である。
【図１３】Ｂ＊４４：０５／ＥＢＮＡ−６２８１−２９０ＴＣＲが染色されているＢ＊４４：０５二量体を示す図である。
【図１４】それぞれのＴＣＲが染色されているＣ＊０７：０２／ＭＡＧＥ−Ａ１２８９−２９７およびＣ＊０７：０２／ＭＡＧＥ−Ａ１２１７０−１７８二量体を示す図である。
【図１５】Ａ２＋メラノーマＴＩＬを示す図である。
【図１６】ＴＩＬ（ＴＩＬ：Ｍ２５  ＴＩＬ１６  ＲＥＰ１  ２Ｅ７  ２０１６−９−１５）が染色されている高スループットＡ２二量体を示す図である。
【図１７】ＴＩＬ（ＴＩＬ：Ｍ３１  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０３）が染色されている高スループットＡ２二量体を示す図である。
【図１８】ＴＩＬ（ＴＩＬ：Ｍ３７  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ｂ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０３）が染色されている高スループットＡ２二量体を示す図である。
【図１９】ＴＩＬ（ＴＩＬ：Ｍ４０  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０４）が染色されている高スループットＡ２二量体を示す図である。
【図２０】ＴＩＬ（ＴＩＬ：Ｍ６６  ＹＴ  ＲＥＰ１Ａ  Ｄ１４  ２Ｅ７  ２０１２−０２−０１）が染色されている高スループットＡ２二量体を示す図である。
【図２１】ＴＩＬ（ＴＩＬ：Ｍ９６  ＹＴ  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０４）が染色されている高スループットＡ２二量体を示す図である。
【図２２】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＴＩＬ：Ｍ２５  ＴＩＬ１６  ＲＥＰ１  ２Ｅ７  ２０１６−９−１５）を示す図である。
【図２３】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＴＩＬ：Ｍ３１  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０３）を示す図である。
【図２４】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＴＩＬ：Ｍ３７  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ｂ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０３）を示す図である。
【図２５】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＴＩＬ：Ｍ４０  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０４）を示す図である。
【図２６】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＴＩＬ：Ｍ６６  ＹＴ  ＲＥＰ１Ａ  Ｄ１４  ２Ｅ７  ２０１２−０２−０１）を示す図である。
【図２７】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＴＩＬ：Ｍ９６  ＹＴ  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０４）を示す図である。
【図２８】Ａ２二量体染色の概要を示す図である。
【図２９】二量体陽性ＴＩＬの濃縮を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明者らは、低親和性ＴＣＲを染色することができる哺乳動物由来ペプチド／ＨＬＡクラスＩ（ｐＨＬＡ）多量体の高スループット産生を可能にする新規技術を開発した。この技術の１つの応用例は、癌患者における抗腫瘍Ｔ細胞応答の高スループット測定を可能にする個人化ｐＨＬＡ試薬を生成することである。
【００１６】
一態様によれば、既存のペプチドに最初に複合させた哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供することにより、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生する方法が提供される。次いで、既存のペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を、既存のペプチドを置換するのに十分な濃度で予め選択されたペプチドと共にインビトロでインキュベートし、それにより、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生する。ＨＬＡクラスＩ分子は、α１、α２、α３およびβ２ｍドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は可溶性である。
【００１７】
ヒト白血球抗原
ＨＬＡ系は、ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトにおける免疫系の調節に関与している。ＨＬＡ遺伝子は高度に多型であり、異なるクラスは異なる機能を有する。ＭＨＣクラスＩ分子をコードするＨＬＡクラスＩ遺伝子は、細胞内から細胞傷害性Ｔ細胞への非自己または自己タンパク質のペプチド断片を表示または提示するように機能する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ＨＬＡクラスＩ分子」という表現は、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする野生型ＨＬＡクラスＩまたは変異ＨＬＡクラスＩ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。ＨＬＡクラスＩ分子の一般構造の概略図であり、そのα１、α２、α３、およびβ２ｍドメインが図１に示されている。
【００１９】
また、概略図には、ＨＬＡクラスＩ分子に複合されたペプチドも例解している。本明細書中で使用される場合、「ペプチド」という表現は、ＨＬＡクラスＩ分子と複合体を形成することができ、ＨＬＡクラスＩ分子によって表示または提示されるペプチド断片を指す。このようなペプチドは当技術分野において十分に記述されている。一般に、これらの特定のペプチドは、長さが約８〜１５個のアミノ酸であるが、長さが８〜１０個、７〜１１個、または６〜１２個のアミノ酸の間で変化してもよい。
【００２０】
いくつかのＨＬＡクラスＩ遺伝子について、細菌を用いたｐＨＬＡの産生は、不十分なリフォールディングのために一部困難である。さらに、細菌により発現され、インビトロでリフォールディングされたｐＭＨＣタンパク質は、哺乳動物で産生され、インビボでリフォールディングされたものと全く同じ高次構造を有することはあり得ない。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物由来の」という表現は、ヒト細胞株（例えば、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔおよびそれらの誘導体）、サル細胞株（例えば、ＣＶ−１、ＣＯＳおよびそれらの誘導体）、マウス細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３およびその誘導体、ＮＳ−１およびその誘導体）、ハムスター細胞株（例えば、ＢＨＫ、ＣＨＯおよびそれらの誘導体）など、当該分野で周知である哺乳動物細胞系を使用した分子の産生を指す。一実施形態では、ヒト細胞株が使用される。一例では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を使用することができる。既存のペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子は、可溶性ＨＬＡクラスＩ分子をトランスフェクトされた哺乳動物細胞によって産生されており、この中でβ２ｍドメインは内因性または外因性であり得る。好ましい実施形態では、β２ｍドメインは外因性であり、第２のベクター上でコードされる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、可溶性ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡクラスＩ分子の分泌を哺乳動物細胞の外側に向けるシグナルペプチドを含む。他の実施形態では、既存のペプチドに複合された可溶性ＨＬＡクラスＩ分子は、哺乳動物細胞の培養上清中にもたらされる。
【００２２】
ＨＬＡクラスＩ遺伝子
ＨＬＡクラスＩ遺伝子は遺伝子ファミリーである。ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、またはＨＬＡ−Ｇであり得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＨＬＡ−Ａ」は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ−Ｂ」は、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ−Ｃ」は、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ−Ｄ」は、ＨＬＡ−Ｄ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ−Ｅ」は、ＨＬＡ−Ｅ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ−Ｆ」は、ＨＬＡ−Ｆ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。「ＨＬＡ−Ｇ」は、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子の発現に由来するタンパク質分子を指す。すべての遺伝子ＨＬＡ−Ａ〜ＨＬＡ−Ｇは、ＨＬＡクラスＩファミリーの遺伝子の一部である。
【００２４】
ＨＬＡクラスＩ分子のアミノ酸配列
ＨＬＡクラスＩ分子は、多くのアミノ酸配列多様体を有し得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子のα３ドメインは、マウスＫｂα３ドメイン（Ｋｂと表記される）である。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子のα２ドメインにおいて、Ｇｌｎは１１５位でＧｌｕで置換されている（Ｑ１１５Ｅと表記されている）。
【００２６】
例示的なＨＬＡクラスＩ分子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａであってもよく、配列番号６または１２のいずれかのα１、α２およびα３ドメインを含む。他の実施形態では、ＨＬＡ−Ａα１、α２およびα３ドメインは、それぞれ、配列番号２または１４などの野生型であってもよい。さらに、他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、それぞれ、配列番号４または１０にあるように、α１ドメインおよびα２ドメインは野生型であり、α３ドメインはマウスＫｂα３ドメインである。上記の任意の組み合わせも可能である。
【００２８】
ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｂであってもよく、かつ配列番号１４、１６、１８、２０、または２２のいずれかのα１、α２およびα３ドメインを含む。例示的なＨＬＡ−Ａ分子と同様に、α１、α２およびα３ドメインは野生型であってもよく、またはＫｂおよびＱ１１５Ｅなどの選択多様体、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００２９】
ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ｃであってもよく、かつ配列番号２４、２６、２８、または３０のいずれかのα１、α２およびα３ドメインを含む。例示的なＨＬＡ−Ａ分子と同様に、α１、α２およびα３ドメインは野生型であってもよく、またはＫｂおよびＱ１１５Ｅなどの選択多様体、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００３０】
さらに他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、本明細書に記載されるβ２ｍドメインを有するα１、α２およびα３ドメインを含む。
【００３１】
多量体
ＨＬＡクラスＩ分子は多量体化されていてもよい。さらなる態様によれば、上記の方法は、ＨＬＡクラスＩ分子を好ましくは二量体、三量体、四量体、および五量体のうちの１つに多量体化することをさらに含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡクラスＩ分子上の対応するタグを認識する抗体を用いて二量体化される。さらなる実施形態では、タグは、好ましくはフレキシブルリンカー、より好ましくはＧＳリンカーによって連結されているα３ドメインのＣ’末端の６ｘＨｉｓタグである。抗体結合のための他の適切なタグは、当技術分野で公知である。許容されるタグの例は数多くあり、ＡｖｉＴａｇ、カルモジュリンタグ、ポリグルタマートタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、およびＶＳＶタグが挙げられる。許容されるフレキシブルリンカーの例は数多くあり、例えばＣｈｅｎら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１３  Ｏｃｔ  １５；６５（１０）：１３５７−１３６９が挙げられる。
【００３３】
キットおよび試薬
さらなる態様によれば、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生するためのキットが提供される。このキットには、既存のペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子および上記の方法に対応する指示書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、予め選択されたペプチドをさらに含む。
【００３４】
さらなる態様によれば、ＨＬＡクラスＩ分子のα１、α２、α３ドメイン、ＨＬＡクラスＩ分子のＮ末端にシグナルペプチド、およびＣ末端にＧＳリンカーによって接合された６ｘＨｉｓタグを含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のいずれかである。
【００３５】
さらなる態様によれば、上記のポリペプチドをコードする核酸が提供される。
【００３６】
さらなる態様によれば、上記の核酸を含むベクターが提供される。
【００３７】
さらなる態様によれば、上記のベクターをトランスフェクトされた哺乳動物細胞が提供される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、β２ｍをコードする第２のベクターをさらに含む。
【００３８】
さらなる態様によれば、β２ｍドメインと複合された上記ポリペプチドを含む化合物が提供される。
【００３９】
さらなる態様によれば、上記の化合物の少なくとも２つの多量体が提供される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの化合物は、６ｘＨｉｓタグを認識する抗体によって二量体化される。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の様々な態様の例示であり、本明細書に開示される本発明の広範な態様を限定するものではない。
【００４１】
腫瘍浸潤リンパ球を含むＴ細胞のスクリーニングおよび選択
予め選択されたペプチドに複合させたＨＬＡクラスＩ分子を使用して、Ｔ細胞をスクリーニング／選択することができることが知られている。ペプチド抗原は、このＴ細胞レセプターを介して認識される。好都合なことに、本明細書に記載の哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子は、当業者が既存の（またはホルダー）ペプチドを予め選択した目的のペプチドに置き換える（ｓｗａｐ  ｏｕｔ）ことができるようになる。これは、既存の細菌由来のＨＬＡクラスＩ分子では不可能であった。むしろ、既存の細菌由来のＨＬＡクラスＩ分子を産生し、変性させ、次に目的のペプチド抗原でリフォールディングする必要があった。
【００４２】
したがって、本発明の哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子は、ペプチド抗原を提示することができる分子を容易に産生するための能率化されたより柔軟な手順を示す。例えば、本発明の哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を予め産生し、使用前にホルダーペプチドと置き換えることができる。さらに、本発明の哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子は、リフォールディングする必要がなく、グリコシル化されるので、天然のＨＬＡクラスＩ分子を代表することが多いようである。
【００４３】
したがって、一態様では、予め選択されたペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞についてＴ細胞の集団をスクリーニング／選択する方法であって、この方法には、予め選択されたペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を提供することと、予め選択されたペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原特異的Ｔ細胞についてＴ細胞の集団をスクリーニングすることと、を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、この方法は、ホルダーペプチドに複合された哺乳動物由来のＨＬＡクラスＩ分子を最初に提供することと、予め選択されたペプチドによりホルダーペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子をインビトロでインキュベートすることであって、予め選択されたペプチドは、予め選択されたペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子を産生するために、既存のペプチドを置き換えるのに十分な濃度である、インキュベートすることと、をさらに含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、予め選択されたペプチドと複合体を形成する哺乳動物由来ＨＬＡクラスＩ分子は、本明細書に記載の方法を用いて調製される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、スクリーニングはフローサイトメトリーを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＨＬＡクラスＩ分子は、ホルダーペプチドと複合体を形成し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のうちのいずれか１つを含み、好ましくはβ２ｍドメインを有する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ホルダーペプチドに複合されたＨＬＡクラスＩ分子は、好ましくはβ２ｍドメインを有する本明細書に記載のポリペプチドを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この方法を用いて、癌に関連するＴ細胞集団をスクリーニング／選択することができる。癌としては、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ｃｎｓ腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮体癌、食道癌、腫瘍の家族、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎癌、咽頭癌および下咽頭癌、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、慢性骨髄単球性）、肝癌、肺癌（非小細胞、小細胞、肺カルチノイド腫瘍）、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫−成人軟部組織癌、皮膚癌（基底細胞および扁平上皮細胞、メラノーマ、メルケル細胞）、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍を挙げることができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、予め選択されたペプチド抗原を認識する抗原特異的Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。
いくつかの実施形態では、予め選択されたペプチド抗原は癌と関連している。
【００５１】
実施例
材料および方法
ペプチド
合成ペプチドは、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、およびＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した。使用したペプチドは、Ａ２制限ヘテロクリティックＭＡＲＴ１２６−３５（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）、ヘテロクリティックＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）、Ａ２４−制限ヘテロクリティックＷＴ１２３５−２４３（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）、Ｂ３５−制限野生型ＥＢＮＡ−１４０７−４１７（ＨＰＶＧＥＡＤＹＦＥＹ）ペプチド、Ｂ４４−制限野生型ＥＢＮＡ−６２８１−２９０（ＥＥＮＬＬＤＦＶＲＦ）、Ｃ７−制限野生型ＭＡＧＥ−Ａ１２８９−２９７（ＲＶＲＦＦＦＰＳＬ）、およびＣ７−制限野生型ＭＡＧＥ−Ａ１２１７０−１７８（ＶＲＩＧＨＬＹＩＬ）ペプチドであった。ＴＩＬを染色するために用いたＡ２ペプチドを以下の表１に列挙する。
【００５２】
表１
【表１】
2019521080.tif 000003
【表２】
2019521080.tif 000004
【表３】
2019521080.tif 000005
【００５３】
細胞およびｃＤＮＡ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。転移性メラノーマを有するＨＬＡ−Ａ２＋患者から単離したＴＩＬを、先に報告したようにインビトロで増殖させた（非特許文献１４）。適切なインフォームドコンセントおよび施設内審査委員会の承認が得られた。すべてのクローン型ＴＣＲ遺伝子を、以前に記載されているようにＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８細胞または初代Ｔ細胞で再構成した。内部リボソーム進入部位を介してｃＤＮＡをピューロマイシン耐性遺伝子と融合させた（非特許文献１５，１６）。形質導入された細胞は、ピューロマイシン選択によって単離された。すべてのｃＤＮＡをｐＭＸベクターにクローニングし、２９３ＧＰＧ細胞ベースのレトロウイルス系を用いて形質導入した（非特許文献１６〜１９）。
【００５４】
フローサイトメトリー分析
以下の表面抗原を認識するｍＡｂを使用した：β２ｍ（５５１３３７、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｈｉｓ（ａｂ７２４６７、Ａｂｃａｍ）。マウスアイソタイプ対照は、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓから得た。表面分子染色は、他の文献に記載されているように行った（非特許文献１６，２０）。
【００５５】
イムノブロッティング
イムノブロッティングのために、細胞を氷冷Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）抽出緩衝液（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβグリセロリン酸、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で抽出した。細胞抽出物を１０，０００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気泳動転写させた。５％脱脂粉乳の入った０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝生理食塩水でブロッキングした後、メンブレンを４℃で一晩、示されたマウス抗Ｈｉｓ  ｍＡｂ（ｓｃ−５３０７３、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とともにインキュベートし、洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて室温で１時間インキュベートした。シグナルは、増強化学発光（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって検出された。
【００５６】
結果と考察
可溶性単量体ペプチド／ＨＬＡクラスＩ（ｐＨＬＡ）複合体の構造
ＨＬＡクラスＩ分子は、非共有結合により連結された２つのポリペプチド鎖、αおよびβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体である。α鎖は高度に多型であるが、β２ｍサブユニットは単型である。ＨＬＡクラスＩα１およびα２ドメインは、８〜１０個のアミノ酸長のペプチドの溝を構成する。膜貫通ドメインを含むα３ドメインは、β２ｍに結合する。細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＴＣＲは、抗原性を調べるため、ＨＬＡクラスＩα２およびα２ドメインによって提示されるペプチドを認識し、ＣＤ８コレセプターはα２およびβ３ドメインに結合して、ＴＣＲおよびｐＨＬＡ間の相互作用を安定化させる。したがって、ＣＤ８およびＨＬＡクラスＩの相互作用を増強することが、ｐＨＬＡと同族ＴＣＲとの間の相互作用の強度を改善することとなる。
【００５７】
ＨＬＡクラスＩα３ドメインのマウスＫｂα３ドメインによる置換（以降、クラスＩ−Ｋｂと称する）は、クラスＩとＣＤ８間の相互作用を１０倍増加させることが示されている。α２ドメインの１１５位のＧｌｎ（Ｑ）残基を、Ｇｌｕ（Ｅ）残基で置換する（以降、クラスＩＱ１１５Ｅと称する）ことにより、相互作用をさらに１．５倍向上させる（非特許文献２１，２２）。野生型（ｗｔ）ＨＬＡクラスＩの細胞外ドメインをＧｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）フレキシブルリンカーと融合させ、続いて６ｘＨｉｓタグを融合させることにより、可溶性クラスＩ−ｗｔを生成した。可溶性クラスＩ−ＫｂおよびクラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂも同様に産生した。本研究で使用した可溶性クラスＩ−ｗｔ、クラスＩ−ＫｂおよびクラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂ遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に列挙する。
【００５８】
哺乳動物細胞を用いた可溶性単量体ｐＨＬＡ複合体の産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、最初にｐＭＸベクターおよび２９３ＧＰＧ細胞ベースのレトロウイルス系を用いて、β２ｍ遺伝子、続いて可溶性ＨＬＡクラスＩ−ＫｂまたはＨＬＡクラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂ遺伝子をトランスフェクトされた（非特許文献１６〜１９）。
【００５９】
遺伝子導入によるβ２ｍ発現の増強
β２ｍ特異的ｍＡｂ染色後のフローサイトメトリー解析では、可溶性形態のＨＬＡ−Ａ２−ＫｂまたはＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂとともに、β２ｍ遺伝子を安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、β２ｍの発現の増強が実証された。最も頻度の高いＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の１つであるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１（Ａ２）遺伝子を、代表的なＨＬＡクラスＩ遺伝子として使用した。同じ戦略を用いて、可溶性形態の他のクラスＩ遺伝子を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ由来細胞株を生成した。
【００６０】
ＨＥＫ２９３Ｔ形質転換体における可溶性単量体ペプチド／ＨＬＡ（ｐＨＬＡ）の細胞発現
β２ｍ遺伝子とコンジュゲート結合しているか、またはβ２ｍ遺伝子を含まない、可溶性ＨＬＡ−Ａ２−ＫｂまたはＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全細胞溶解物を、上述のとおり抗Ｈｉｓ  ｍＡｂでブロットした（非特許文献２３〜２５）。可溶性ＨＬＡ−Ａ２−ＫｂおよびＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂの細胞発現は、タンパク質レベルで実証された。
【００６１】
可溶性単量体ｐＨＬＡ複合体の上清への分泌
可溶性ＨＬＡ−Ａ２−ＫｂまたはＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ遺伝子をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清をβ２ｍ遺伝子の有無にかかわらず収穫し、Ｈｉｓ特異的ｍＡｂでブロットした。細菌により発現させた６ｘＨｉｓタグ付きＨＬＡ−Ａ２／ヘテロクリティックＭＡＲＴ１２６−３５単量体（ＮＩＨ四量体コアファシリティー）の指示された量を対照として結合させた。各上清の１０μｌは、濃縮することなくレーンごとに添加した。単量体ＨＬＡ−Ａ２−ＫｂおよびＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂの培地への分泌が確認された。
単量体のｐＨＬＡ複合体は、β２ｍが過剰発現したときにのみ分泌された。
【００６２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にβ２ｍ遺伝子を含まない可溶性ＨＬＡ−Ａ２−ＫｂまたはＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ遺伝子のみを形質導入した場合、可溶性Ａ２−ＫｂおよびＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂの培地への分泌は検出されなかった。これは、内在性β２ｍ発現レベルが、異所的に発現された可溶性Ａ２−ＫｂおよびＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂの分泌を可能にするには不十分であったことを示唆している。
【００６３】
インビトロでのペプチド交換により目的のペプチドを結合させた単量体ｐＨＬＡの産生
ＨＥＫ２９３Ｔ形質転換体によって産生された可溶性ＨＬＡ−Ａ２−ＫｂおよびＡ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ含有上清は、インビトロでのペプチド交換のために、指示された濃度の目的のＡ２制限ペプチドと室温で単純に混合した（図２参照）。
【００６４】
単量体ｐＨＬＡ複合体の二量化
ＨＥＫ２９３Ｔ馴化培地中の可溶性ＨＬＡクラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂ単量体は、２：１のモル比でフィコエリトリン（ＰＥ）などの蛍光色素とコンジュゲート結合した抗Ｈｉｓ  ｍＡｂを用いて二量体化された。可溶性タンパク質は、Ｃ末端で６ｘＨｉｓタグと融合したことに留意されたい。
【００６５】
抗原特異的Ｔ細胞を染色するための二量体ｐＨＬＡ複合体の産生のための全プロトコール
可溶性単量体クラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂおよびβ２ｍを異所的に発現する安定なＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、上記のように確立された。安定な細胞株をコンフルエントになるまで増殖させ、培地を交換した。４８時間後、馴化培地を採取し、直ちに使用するか、または使用するまで凍結した。インビトロでのペプチド交換のために、目的のクラスＩ制限ペプチドを上清に３７℃で２４時間結合させた。このペプチドを結合させた可溶性単量体クラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂを、４℃で、２４時間、蛍光色素コンジュゲート結合抗Ｈｉｓ  ｍＡｂを用いて二量化した（図３参照）。
単純な混合によって上清中でペプチド交換が起こる。
【００６６】
単純に混合することにより、可溶性Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ単量体に、Ａ２／ＭＡＲＴ１２６−３５（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）またはＡ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５（ＳＬＬＭＷＩＴＱＶ）ペプチドを結合させ、ＰＥコンジュゲート結合抗Ｈｉｓ  ｍＡｂで二量体化し、クローン型同族ＴＣＲを発現するヒトＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８Ｔ細胞を染色するのに使用した（図４参照）。内因性ＴＣＲの発現を持たないＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８細胞では、ＣＤ８α／β−遺伝子を安定に発現する（非特許文献２６，２７）。
可溶性単量体Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂは、高結合力抗原特異的Ｔ細胞を染色する。
【００６７】
単純混合によって可溶性Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ単量体に、Ａ２／ＭＡＲＴ１２６−３５またはＡ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５ペプチドを結合させ、二量体化させることなく、クローン型同族ＴＣＲを発現しているＪｕｒｋａｔ７６／ＣＤ８  Ｔ細胞を染色するために直接使用した。結合力は高いが、低親和性を有するＴＣＲを発現するＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８細胞を、同族ペプチドを結合させた単量体可溶性Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂによって染色した（図５および６参照）（非特許文献２７）。
可溶性二量体Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂは、高結合力および低結合力の抗原特異的Ｔ細胞を染色する。
【００６８】
可溶性単量体Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ含有上清を、単純混合によりＡ２／ＭＡＲＴ１２６−３５またはＡ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５ペプチドを結合させ、ＰＥコンジュゲート結合抗Ｈｉｓ  ｍＡｂで二量体化し、クローン型同族ＴＣＲを発現しているＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８Ｔ細胞を染色するために利用した（図７および８参照）。Ｊｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８細胞で発現した高親和性ＴＣＲおよび低親和性ＴＣＲの両方を、それぞれのペプチドを結合させた可溶性二量体Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂによって染色した（非特許文献２７）。
可溶性二量体クラスＩＱ１１５Ｅ−Ｋｂは、五量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）または四量体（ＮＩＨ）よりも良好に低親和性のＴＣＲを染色する。
【００６９】
ＰＥコンジュゲート結合可溶性二量体Ａ２Ｑ１１５Ｅ−ＫｂおよびＡ２４Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂに、それぞれＡ２／ＭＡＲＴ１２６−３５およびＡ２４／ＷＴ１２３５−２４３（ＣＹＴＷＮＱＭＮＬ）ペプチドを結合させた。結合された二量体を用いて、様々な親和性を有するクローン型同族ＴＣＲを発現しているＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８  Ｔ細胞を染色した（非特許２６，２７）。本発明者らの二量体は、五量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）およびＮＩＨの四量体よりも良好に低親和性ＴＣＲを染色した（図９および１０参照）。五量体は、ベンダーによって提供されたプロトコールに従って使用された（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ．ｃｏｍ／ｅｃｏｍｍｅｒｃｅ／ｐａｇｅ．ｐｈｐ？ｐａｇｅ＝ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）。四量体染色は、他に公開されている標準プロトコールに従って行った（非特許文献２６，２７）。
可溶性二量体ＨＬＡ−ＢＱ１１５Ｅ−Ｋｂも同様に作用する。
【００７０】
可溶性単量体ＨＬＡ−Ｂ３５Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂに、Ｂ３５／ＥＢＮＡ−１４０７−４１７（ＨＰＶＧＥＡＤＹＦＥＹ）ペプチドを結合し、ＰＥ結合抗Ｈｉｓ  ｍＡｂで二量体化し、クローン型同族ＴＣＲを発現しているＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８  Ｔ細胞を染色した（図１１を参照されたい）。
【００７１】
可溶性単量体ＨＬＡ−Ｂ４４Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂは、Ｂ４４／ＥＢＮＡ−６２８１−２９０（ＥＥＮＬＬＤＦＶＲＦ）が結合され、ＰＥコンジュゲート結合抗Ｈｉｓ  ｍＡｂで二量体化され、クローン型同族ＴＣＲを発現しているＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８  Ｔ細胞を染色するのに使用された（図１３）。
可溶性二量体ＨＬＡ−ＣＱ１１５Ｅ−Ｋｂも同様に作用する。
【００７２】
可溶性単量体ＨＬＡ−Ｃ７Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂは、Ｃ７／ＭＡＧＥ−Ａ１２８９−２９７（ＲＶＲＦＦＦＰＳＬ）ペプチドおよびＣ７／ＭＡＧＥ−Ａ１２１７０−１７８（ＶＲＩＧＨＬＹＩＬ）ペプチドが結合され、ＰＥコンジュゲート結合抗Ｈｉｓ  ｍＡｂで二量体化され、クローン型同族ＴＣＲを発現しているＪｕｒｋａｔ  ７６／ＣＤ８  Ｔ細胞を染色するのに使用された（図１４）。
可溶性Ａ２二量体のパネルを用いたインビトロでの拡大腫瘍浸潤リンパ球の染色。
【００７３】
末梢Ｔ細胞は、癌患者において起こる腫瘍に対する免疫応答を常に反映しているとは限らず、末梢における抗腫瘍細胞性免疫は、多くの場合予後と相関していない。対照的に、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は腫瘍細胞と密接に相互作用し、腫瘍宿主の相互作用を高い適合度で反映する可能性が高い。癌を治療するための養子細胞移植療法の移植片としてのＴＩＬの使用は、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）グループによって開拓されている（非特許文献２８）。
【００７４】
ＴＩＬは、様々な抗原特異性を有するＴ細胞のポリクローナル集団であると考えられている（非特許文献２９）。本発明者らの可溶性二量体ｐＨＬＡ技術を用いたＴＩＬの腫瘍特異性を調べるために、転移性メラノーマを有する９名のＨＬＡ−Ａ２＋患者からＴＩＬを単離し、先に報告したようにインビトロで増殖させた（非特許文献１４）。自己腫瘍細胞により高度に発現されるタンパク質由来の８〜１１ｍｅｒのペプチドの大きなパネルを、以前に報告された公的に利用可能なアルゴリズムを用いて予測した（表１を参照されたい）（非特許文献１８，２３，３０）。予測されたＡ２ペプチドを結合させた可溶性二量体Ａ２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂのライブラリーを上記のように産生し、ＴＩＬの染色に使用した（図１２および図１５〜２１を参照されたい）。Ａ２／ＨＩＶ  ｐｏｌ４７６−４８４およびＡ２／ＭＡＲＴ１２６−３５五量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）をそれぞれ陰性対照および陽性対照として利用した。その結果、インビトロで増殖したＴＩＬは、定着したメラノーマ関連抗原の１つであるＭＡＲＴ１に対する反応性を有することが示された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ１６６５５）。
【００７５】
二量体＋Ｔ細胞の機能アッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて、二量体染色が陽性であった６つのすべてのＴＩＬ試料では、Ａ２制限ペプチド特異的ＩＦＮ−γ分泌が確認された。ＰＶＤＦプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を捕捉ｍＡｂ（１Ｄ１Ｋ；ＭＡＢＴＥＣＨ、Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ、ＯＨ）でコーティングした。ＴＩＬを、各ペプチドの存在下において、２×１０４ウェルのＴ２細胞で、２０〜２４時間、３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチンコンジュゲート結合検出ｍＡｂ（７−Ｂ６−１；ＭＡＢＴＥＣＨ）と共にインキュベートした。その後、ＨＲＰコンジュゲート結合ＳＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、ＩＦＮ−γスポットを作製した。冷たい水道水で十分にすすいで反応を停止させた。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをスキャンし、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔプレートリーダーおよびＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔバージョン５．０ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）を用いて計数した（図２２〜２７）。
【００７６】
二量体染色およびＴＩＬのＥＬＩＳＰＯＴアッセイの概要を図２８に示す。
【００７７】
二量体陽性ＴＩＬの濃縮
２つのＴＩＬ試料（Ｍ３７  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ｂ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０３およびＭ４０  ＴＩＬ３  ＲＥＰ１Ａ  ２Ｅ７  ２０１５−０６−０４）を、Ａ２／ＳＳＸ−２４１−４９二量体で染色し、Ａ２／ＳＳＸ−２４１−４９Ｔ細胞を、フローサイトメトリー誘導ソーティングを用いて精製した（図２９）。
【００７８】
考えられる利点
本方法の多くの可能な利点がある。本発明のＨＬＡクラスＩ分子は、より自然なフォールディングおよび／またはタンパク質のグリコシル化を表し得る。本発明のＨＬＡ分子は、比較的迅速な方式で（約２日に対して従来の方法を用いた場合４〜１０日）産生され得る。ペプチドは、インビトロで比較的簡単に交換され得る。より自然な産物をもたらすより簡単なプロトコールはまた、大幅にコスト削減をもたらす可能性がある。
配列
可溶性Ａ＊０２：０１−ｗｔ、ヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）
【００７９】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  α１ドメイン（下記の下線）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  α２ドメイン（以下の太字）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  α３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号１：
【化１】
2019521080.tif 000006
配列番号２：
【化２】
2019521080.tif 000007
可溶性Ａ＊０２：０１−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）
【００８０】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  α１ドメイン（下記の下線）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  α２ドメイン（以下の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号３
【化３】
2019521080.tif 000008
配列番号４
【化４】
2019521080.tif 000009
可溶性Ａ＊０２：０１Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）
【００８１】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号５
【化５】
2019521080.tif 000010
配列番号６
【化６】
2019521080.tif 000011
可溶性Ａ＊２４：０２−ｗｔ、ヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）
【００８２】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  α１ドメイン（下記の下線）
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  α２ドメイン（下記の太字）
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  α３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号７
【化７】
2019521080.tif 000012
配列番号８
【化８】
2019521080.tif 000013
可溶性Ａ＊２４：０２−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）
【００８３】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  α１ドメイン（下記の下線）
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号９
【化９】
2019521080.tif 000014
配列番号１０
【化１０】
2019521080.tif 000015
可溶性Ａ＊２４：０２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）
【００８４】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ａ＊２４：０２α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号１１
【化１１】
2019521080.tif 000016
配列番号１２
【化１２】
2019521080.tif 000017
可溶性Ｂ＊３５：０１Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）
【００８５】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号１３
【化１３−１】
2019521080.tif 000018
【化１３−２】
2019521080.tif 000019
配列番号１４
【化１４】
2019521080.tif 000020
可溶性Ｂ＊４０：０２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）
【００８６】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号１５
【化１５】
2019521080.tif 000021
配列番号１６
【化１６】
2019521080.tif 000022
可溶性Ｂ＊４４：０５Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）
【００８７】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０５  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｂ＊４４：０５α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号１７
【化１７】
2019521080.tif 000023
配列番号１８
【化１８】
2019521080.tif 000024
可溶性Ｂ＊０７：０２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号１９）およびアミノ酸配列（配列番号２０）
【００８８】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号１９
【化１９】
2019521080.tif 000025
配列番号２０
【化２０】
2019521080.tif 000026
可溶性Ｂ＊０８：０１Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２）
【００８９】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号２１
【化２１】
2019521080.tif 000027
配列番号２２
【化２２】
2019521080.tif 000028
可溶性Ｃ＊０５：０１Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号２３）およびアミノ酸配列（配列番号２４）
【００９０】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｃ＊０５：０１  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｃ＊０５：０１α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号２３
【化２３】
2019521080.tif 000029
配列番号２４
【化２４】
2019521080.tif 000030
可溶性Ｃ＊０７：０１Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号２６）およびアミノ酸配列（配列番号２６）
【００９１】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号２５
【化２５】
2019521080.tif 000031
配列番号２６
【化２６】
2019521080.tif 000032
可溶性Ｃ＊０７：０２Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号２７）およびアミノ酸配列（配列番号２８）
【００９２】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０２  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｃ＊０７：０２α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号２７
【化２７】
2019521080.tif 000033
配列番号２８
【化２８】
2019521080.tif 000034
可溶性Ｃ＊１６：０１Ｑ１１５Ｅ−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号２９）およびアミノ酸配列（配列番号３０）
【００９３】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｃ＊１６：０１  α１ドメイン（下記の下線）
Ｑ１１５Ｅ変異を有するＨＬＡ−Ｃ＊１６：０１α２ドメイン（下記の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号２９
【化２９】
2019521080.tif 000035
配列番号３０
【化３０】
2019521080.tif 000036
【００９４】
上述の配列と同様に、本出願は、同様に以下の配列に向けられ得る：
可溶性Ｂ＊３５：０１−ｗｔ、ヌクレオチド配列（配列番号３１）およびアミノ酸配列（配列番号３２）
【００９５】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１  α１ドメイン（下記の下線）
ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１α２ドメイン（以下の太字）
ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１  α３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号３１
【化３１】
2019521080.tif 000037
配列番号３２
【化３２】
2019521080.tif 000038
可溶性Ｂ＊３５：０１−Ｋｂ、ヌクレオチド配列（配列番号３３）およびアミノ酸配列（配列番号３４）
【００９６】
配列は、次の順序で列挙される：
フィブロイン−Ｌ由来のシグナルペプチド（下記の通常のＡｒｉａｌフォント）
ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１  α１ドメイン（下記の下線）
ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１α２ドメイン（以下の太字）
マウスＫｂα３ドメイン（下記のイタリック体）
フレキシブルＧＳリンカー（下記の太字および下線付き）
６ｘＨｉｓタグ（下記の太字とイタリック体）
配列番号３３
【化３３】
2019521080.tif 000039
配列番号３４
【化３４】
2019521080.tif 000040
【００９７】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されているが、当業者には、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、変形が可能であることが理解されるであろう。以下の参考文献リストのものを含む、本明細書に開示されたすべての文献は、参考として援用される。
【００９８】
先行技術文献
非特許文献１
Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  Ｌ，Ｌｉｓｓｉｎａ  Ａ，Ｃｏｌｅ  ＤＫ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＨＡ，Ｐｒｉｃｅ  ＤＡ，Ｓｅｗｅｌｌ  ＡＫ．Ｔｒｉｃｋｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ：ｈｏｗ  ｔｏ  ｇｅｔ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１２６（２）：１４７−１６４
【００９９】
非特許文献２
Ｄｏｌｔｏｎ  Ｇ，Ｔｕｎｇａｔｔ  Ｋ，Ｌｌｏｙｄ  Ａ，Ｂｉａｎｃｈｉ  Ｖ，Ｔｈｅａｋｅｒ  ＳＭ，Ｔｒｉｍｂｙ  Ａ，Ｈｏｌｌａｎｄ  ＣＪ，Ｄｏｎｉａ  Ｍ，Ｇｏｄｋｉｎ  ＡＪ，Ｃｏｌｅ  ＤＫ，Ｓｔｒａｔｅｎ  ＰＴ，Ｐｅａｋｍａｎ  Ｍ，Ｓｖａｎｅ  ＩＭ，Ｓｅｗｅｌｌ  ＡＫ．Ｍｏｒｅ  ｔｒｉｃｋｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１５；１４６（１）：１１−２２
【０１００】
非特許文献３
Ｒｏｓｓｊｏｈｎ  Ｊ，Ｇｒａｓ  Ｓ，Ｍｉｌｅｓ  ＪＪ，Ｔｕｒｎｅｒ  ＳＪ，Ｇｏｄｆｒｅｙ  ＤＩ，ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ  Ｊ．Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；３３：１６９−２００
【０１０１】
非特許文献４
Ｍａｒｒａｃｋ  Ｐ，Ｓｃｏｔｔ−Ｂｒｏｗｎｅ  ＪＰ，Ｄａｉ  Ｓ，Ｇａｐｉｎ  Ｌ，Ｋａｐｐｌｅｒ  ＪＷ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＴＣＲ−ＭＨＣ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；２６：１７１−２０３
【０１０２】
非特許文献５
Ａｌｔｍａｎ  ＪＤ，Ｍｏｓｓ  ＰＡ，Ｇｏｕｌｄｅｒ  ＰＪ，Ｂａｒｏｕｃｈ  ＤＨ，ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＭＧ，Ｂｅｌｌ  ＪＩ，ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  ＡＪ，Ｄａｖｉｓ  ＭＭ．Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９６；２７４（５２８４）：９４−９６
【０１０３】
非特許文献６
Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ  Ｐ，Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ  Ｖ，Ｄｕｎｂａｒ  ＰＲ．Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ：ｎｅｗ  ｔａｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；２（４）：２６３−２７２
【０１０４】
非特許文献７
Ｊａｎｅｗａｙ  Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  （ｅｄ  ６ｔｈ）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００５
【０１０５】
非特許文献８
Ｍｉｇｕｅｌｅｓ  ＳＡ，Ｓａｂｂａｇｈｉａｎ  ＭＳ，Ｓｈｕｐｅｒｔ  ＷＬ，Ｂｅｔｔｉｎｏｔｔｉ  ＭＰ，Ｍａｒｉｎｃｏｌａ  ＦＭ，Ｍａｒｔｉｎｏ  Ｌ，Ｈａｌｌａｈａｎ  ＣＷ，Ｓｅｌｉｇ  ＳＭ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｄ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｊ，Ｃｏｎｎｏｒｓ  Ｍ．ＨＬＡ  Ｂ＊５７０１  ｉｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０００；９７（６）：２７０９−２７１４
【０１０６】
非特許文献９
Ｋａｗａｓｅ  Ｔ，Ａｋａｔｓｕｋａ  Ｙ，Ｔｏｒｉｋａｉ  Ｈ，Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｓ，Ｏｋａ  Ａ，Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ  Ａ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｍ，Ｔｓｕｊｉｍｕｒａ  Ｋ，Ｍｉｙａｍｕｒａ  Ｋ，Ｏｇａｗａ  Ｓ，Ｉｎｏｋｏ  Ｈ，Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ  Ｙ，Ｋｏｄｅｒａ  Ｙ，Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ＳＮＰ  ｉｎ  ＨＭＳＤ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｉｎｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０（３）：１０５５−１０６３
【０１０７】
非特許文献１０
Ｒｏｄｅｎｋｏ  Ｂ，Ｔｏｅｂｅｓ  Ｍ，Ｈａｄｒｕｐ  ＳＲ，ｖａｎ  Ｅｓｃｈ  ＷＪ，Ｍｏｌｅｎａａｒ  ＡＭ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｏｖａａ  Ｈ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＵＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１１２０−１１３２
【０１０８】
非特許文献１１
Ｂａｋｋｅｒ  ＡＨ，Ｈｏｐｐｅｓ  Ｒ，Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ  Ｃ，Ｔｏｅｂｅｓ  Ｍ，Ｒｏｄｅｎｋｏ  Ｂ，Ｂｅｒｋｅｒｓ  ＣＲ，Ｈａｄｒｕｐ  ＳＲ，ｖａｎ  Ｅｓｃｈ  ＷＪ，Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ＭＨ，Ｏｖａａ  Ｈ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＨＬＡ−Ａ１，−Ａ３，−Ａ１１，ａｎｄ  −Ｂ７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００８；１０５（１０）：３８２５−３８３０
【０１０９】
非特許文献１２
Ｓａｉｎｉ  ＳＫ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  Ｈ，Ｒａｍｎａｒａｙａｎ  ＶＲ，Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ，Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ  Ｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓ．Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃａｔａｌｙｚｅ  ｒａｐｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｏｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１５；１１２（１）：２０２−２０７
【０１１０】
非特許文献１３
Ｌａｕｇｅｌ  Ｂ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＨＡ，Ｇｏｓｔｉｃｋ  Ｅ，Ｃｏｌｅ  ＤＫ，Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  Ｌ，Ｂｏｕｌｔｅｒ  Ｊ，Ｍｉｌｉｃｉｃ  Ａ，Ｐｒｉｃｅ  ＤＡ，Ｓｅｗｅｌｌ  ＡＫ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ａｎｄ  ＣＤ８  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｇｏｖｅｒｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７；２８２（３３）：２３７９９−２３８１０
【０１１１】
非特許文献１４
Ｎｇｕｙｅｎ  ＬＴ，Ｙｅｎ  ＰＨ，Ｎｉｅ  Ｊ，Ｌｉａｄｉｓ  Ｎ，Ｇｈａｚａｒｉａｎ  Ｄ，Ａｌ−Ｈａｂｅｅｂ  Ａ，Ｅａｓｓｏｎ  Ａ，Ｌｅｏｎｇ  Ｗ，Ｌｉｐａ  Ｊ，ＭｃＣｒｅａｄｙ  Ｄ，Ｒｅｅｄｉｊｋ  Ｍ，Ｈｏｇｇ  Ｄ，Ｊｏｓｈｕａ  ＡＭ，Ｑｕｉｒｔ  Ｉ，Ｍｅｓｓｎｅｒ  Ｈ，Ｓｈａｗ  Ｐ，Ｃｒｕｍｐ  Ｍ，Ｓｈａｒｏｎ  Ｅ，Ｏｈａｓｈｉ  ＰＳ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  （ＴＩＬｓ）．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０；５（１１）：ｅ１３９４０
【０１１２】
非特許文献１５
Ｋａｇｏｙａ  Ｙ，Ｎａｋａｔｓｕｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｙ，Ｏｃｈｉ  Ｔ，Ｇｕｏ  Ｔ，Ａｎｃｚｕｒｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｓａｓｏ  Ｋ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ  ＣＨ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．ＢＥＴ  ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１６；１２６（９）：３４７９−３４９４
【０１１３】
非特許文献１６
Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｘｉａ  Ｚ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｖｏｎ  Ｂｅｒｇｗｅｌｔ−Ｂａｉｌｄｏｎ  ＭＳ，Ｎｅｕｂｅｒｇ  Ｄ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＧＪ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ．Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ８３  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（４）：１５２８−１５３６
【０１１４】
非特許文献１７
Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｌｅｅ  ＪＳ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｎｅｕｂｅｒｇ  Ｄ，Ｈｏｄｉ  ＦＳ，Ｍｕｒｒａｙ  ＡＰ，Ｄｒｕｒｙ  Ｌ，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  Ａ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．Ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ＣＤ８＋  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；１３（６）：１８５７−１８６７
【０１１５】
非特許文献１８
Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｘｉａ  Ｚ，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  Ａ，Ｍｕｒｒａｙ  ＡＰ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｋｏｊｉｍａ  Ｓ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇａｍｍａ−ｇｌｏｂｉｎ，ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｏｒ  ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８（８）：２６６２−２６６８
【０１１６】
非特許文献１９
Ｉｍａｔａｋｉ  Ｏ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｍ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  Ａ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ＭＩ，Ｋｕｚｕｓｈｉｍａ  Ｋ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．ＩＬ−２１  ｃａｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ  Ｌｃｋ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＭＡＰＫ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ＳＴＡＴ−３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ８（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８（４）：１６０９−１６１９
【０１１７】
非特許文献２０
Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｔａｎａｋａ  Ｍ，Ｉｍａｔａｋｉ  Ｏ，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  Ａ，Ｍｏｏｎｅｙ  ＭＭ，Ｍｅｔｚｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ＭＩ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．Ａ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＡＰＣ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ＨＬＡ−ＤＲ  ａｌｌｅｌｅｓ．Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；２２（１１）：８６３−８７３
【０１１８】
非特許文献２１
Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  Ｌ，Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｍ，Ｌｉｓｓｉｎａ  Ａ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＥＳ，Ｌａｄｅｌｌ  Ｋ，Ｅｋｅｒｕｃｈｅ  Ｊ，Ｈｅｗｉｔｔ  ＲＥ，Ｌａｕｇｅｌ  Ｂ，Ｇｏｓｔｉｃｋ  Ｅ，Ｃｏｌｅ  ＤＫ，Ｄｅｂｅｔｓ  Ｒ，Ｂｅｒｒｅｖｏｅｔｓ  Ｃ，Ｍｉｌｅｓ  ＪＪ，Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＳＲ，Ｐｒｉｃｅ  ＤＡ，Ｓｅｗｅｌｌ  ＡＫ．ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｐｅｒｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＤ８  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｂｙｐａｓｓ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｇｎａｔｅ  ＴＣＲ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ＣＴＬｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８４（７）：３３５７−３３６６
【０１１９】
非特許文献２２
Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  Ｌ，Ｌｉｓｓｉｎａ  Ａ，Ｖｅｒｎａｚｚａ  Ｊ，Ｇｏｓｔｉｃｋ  Ｅ，Ｌａｕｇｅｌ  Ｂ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ＳＬ，Ｍｉｒｚａ  Ｆ，Ｄｕｎｂａｒ  ＰＲ，Ｂｏｕｌｔｅｒ  ＪＭ，Ｇｌｉｃｋ  Ｍ，Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ  Ｖ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＨＡ，Ｐｒｉｃｅ  ＤＡ，Ｓｅｗｅｌｌ  ＡＫ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＴＬ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ８  ｂｉｎｄｉｎｇ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；３７（５）：１３２３−１３３３
【０１２０】
非特許文献２３
Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｖｏｎ  Ｂｅｒｇｗｅｌｔ−Ｂａｉｌｄｏｎ  ＭＳ，Ｍａｅｃｋｅｒ  Ｂ，Ｓｃｈｕｌｔｚｅ  ＪＬ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＫＣ，Ｓｃｈｕｒ  ＰＨ，Ｋｏｊｉｍａ  Ｓ，Ｇｕｉｎａｎ  ＥＣ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ．Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２（１３）：４５６７−４５７５
【０１２１】
非特許文献２４
Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｘｉａ  Ｚ，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  Ａ，Ｍｕｒｒａｙ  ＡＰ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；１２（１０）：２９６７−２９７５
【０１２２】
非特許文献２５
Ｔａｎａｋａ  Ｍ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｉｍａｔａｋｉ  Ｏ，Ｂｅｒｅｚｏｖｓｋａｙａ  Ａ，Ｎａｄｌｅｒ  ＬＭ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−ＤＰ４−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｓｕｒｖｉｖｉｎ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ２  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１；１７（１６）：５３９２−５４０１
【０１２３】
非特許文献２６
Ｏｃｈｉ  Ｔ，Ｎａｋａｔｓｕｇａｗａ  Ｍ，Ｃｈａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｙ，Ｇｕｏ  Ｔ，Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｈ，Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｍ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ＴＣＲ  Ｃｈａｉｎ  Ｃｅｎｔｒｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ＴＣＲ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１５；３（９）：１０７０−１０８１
【０１２４】
非特許文献２７
Ｎａｋａｔｓｕｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｙ，Ｏｃｈｉ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，Ｃｈａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｇｕｏ  Ｔ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＯ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｅａｃｈ  ＴＣＲ  ｈｅｍｉｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｉｎ−ｃｅｎｔｒｉｃ  ＴＣＲ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（７）：３４８７−３５００
【０１２５】
非特許文献２８
Ｆｅｌｄｍａｎ  ＳＡ，Ａｓｓａｄｉｐｏｕｒ  Ｙ，Ｋｒｉｌｅｙ  Ｉ，Ｇｏｆｆ  ＳＬ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ−−Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１５；４２（４）：６２６−６３９
【０１２６】
非特許文献２９
Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ，Ｌｕ  ＹＣ，Ｅｌ−Ｇａｍｉｌ  Ｍ，Ｌｉ  ＹＦ，Ｇｒｏｓｓ  Ｃ，Ｇａｒｔｎｅｒ  Ｊ，Ｌｉｎ  ＪＣ，Ｔｅｅｒ  ＪＫ，Ｃｌｉｆｔｅｎ  Ｐ，Ｔｙｃｋｓｅｎ  Ｅ，Ｓａｍｕｅｌｓ  Ｙ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．Ｍｉｎｉｎｇ  ｅｘｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１３；１９（６）：７４７−７５２
【０１２７】
非特許文献３０
Ｐａｒｋｅｒ  ＫＣ，Ｂｅｄｎａｒｅｋ  ＭＡ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ＪＥ．Ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｒａｎｋｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ＨＬＡ−Ａ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；１５２（１）：１６３−１７５
【図１】
2019521080.tif 000041
【図２】
2019521080.tif 000042
【図３】
2019521080.tif 000043
【図４】
2019521080.tif 000044
【図５】
2019521080.tif 000045
【図６】
2019521080.tif 000046
【図７】
2019521080.tif 000047
【図８】
2019521080.tif 000048
【図９】
2019521080.tif 000049
【図１０】
2019521080.tif 000050
【図１１】
2019521080.tif 000051
【図１２】
2019521080.tif 000052
【図１３】
2019521080.tif 000053
【図１４】
2019521080.tif 000054
【図１５】
2019521080.tif 000055
【図１６】
2019521080.tif 000056
【図１７】
2019521080.tif 000057
【図１８】
2019521080.tif 000058
【図１９】
2019521080.tif 000059
【図２０】
2019521080.tif 000060
【図２１】
2019521080.tif 000061
【図２２】
2019521080.tif 000062
【図２３】
2019521080.tif 000063
【図２４】
2019521080.tif 000064
【図２５】
2019521080.tif 000065
【図２６】
2019521080.tif 000066
【図２７】
2019521080.tif 000067
【図２８】
2019521080.tif 000068
【図２９】
2019521080.tif 000069
【配列表】
2019521080000001.app
【国際調査報告】
2019521080.tif 000070
2019521080.tif 000071