(57)【要約】本明細書は、非ヒト霊長類(NHP)人工多能性幹細胞(IPSC)由来肝細胞およびこれを生成する方法に関する。さらに、本明細書は、薬物スクリーニングのため、薬物安全性評価のため、および感染モデルにおいて、NHP IPSC由来肝細胞を使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、
(a)フィーダーフリー培養で化学的に規定された培地中にNHP多能性幹細胞を提供する工程;
(b)多能性幹細胞をWntシグナル伝達アクチベーターと接触させて内胚葉細胞を生成する工程;
(c)内胚葉細胞をBMP4および線維芽細胞増殖因子と接触させて未熟NHP肝細胞を生成する工程;ならびに
(d)未熟NHP肝細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させてNHP肝細胞を生成する工程
を含む、方法。
【請求項２】
Wntシグナル伝達アクチベーターがCP21である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
工程(b)が、細胞をLy294002およびCP21と接触させて分化を誘導する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
工程(b)が、細胞をLDN193189と接触させる工程を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
工程(b)が、細胞をノックアウト血清代替物(knock-out serum replacement)(KSR)およびDMSOと接触させる工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
工程(c)の線維芽細胞増殖因子がFGF2またはFGF10である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
工程(c)が、細胞をBMP4、DMSO、およびFGF2またはFGF10と接触させる工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
工程(d)が、細胞をNOTCHシグナル伝達阻害剤と接触させる工程を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程(a)のNHP多能性幹細胞が人工多能性幹細胞(IPSC)である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
NHP多能性幹細胞が、カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis))およびアカゲザル(マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta))からなる群より選択される種に由来する、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
化学的に規定された培地中のフィーダーフリーNHP肝細胞培養物。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法によって得られたNHP肝細胞。
【請求項１３】
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法によって得られたNHP肝細胞のバイオバンク。
【請求項１４】
肝臓細胞の機能不全によって引き起こされる疾患のためのインビトロのモデルとしての、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法によって得られたNHP肝細胞または請求項13記載のバイオバンクの使用。
【請求項１５】
肝臓細胞感染のためのインビトロのモデルとしての、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法によって得られたNHP肝細胞または請求項13記載のバイオバンクの使用。
【請求項１６】
化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、
(i)請求項1〜10のいずれか一項記載の方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞を化合物に曝露する工程;および
(ii)毒性の徴候に対して1つまたは複数の成熟NHP肝細胞をモニタリングする工程
を含む、方法。
【請求項１７】
ウイルスの生活環を維持するためのインビトロの方法であって、
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞をウイルスに曝露する工程であって、該ウイルスが1つまたは複数のNHP肝細胞中で複製する、工程
を含む、方法。
【請求項１８】
化合物の毒性をインビトロで試験するための、請求項1〜10のいずれか一項記載のいずれかの細胞の使用。
【請求項１９】
インビトロのNHPアッセイを準備する方法であって、
(iii)請求項1〜10のいずれか一項記載の方法によって調製されたNHP肝細胞を提供する工程;
(iv)NHP肝細胞をアキュターゼ(Accutase)と約1時間〜約3時間接触させてNHP肝細胞を剥離させる工程;
(iii)剥離したNHP肝細胞を適切なアッセイ形式でリプレーティングする工程
を含む、方法。
【請求項２０】
剥離したNHP肝細胞は、リプレーティングの前にSCARBI陽性細胞について濃縮されている、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
本明細書に記載のように本質的に使用される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本明細書は、非ヒト霊長類(NHP)人工多能性幹細胞(IPSC)由来肝細胞およびこれを生成する方法に関する。さらに、本明細書は、薬物スクリーニングのため、薬物安全性評価のため、および感染モデルにおいて、NHP IPSC由来肝細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
非ヒト霊長類(NHP)は、薬物候補の作用機序および潜在的な毒性を分析するために薬剤開発にとって重要なインビボ系である。NHPはヒトとゲノム類似性および生理学的(例えば、薬物代謝、免疫応答)類似性があるために前臨床安全性評価とって特に妥当な種だと考えられている。残念なことに、NHP向けのインビトロ系は主に初代細胞に限定されている。初代細胞の使用は、倫理的制約があることと、初代細胞の入手が限られていること、ドナー間での大きなばらつきがあることで妨げられている。従って、多くの場合、インビボの研究が必要だと考えられている。
【０００３】
薬物性肝障害(DILI)は薬剤開発中止の主因の一つであるので、DILIを評価するインビトロ系は薬剤開発にとって決定的な影響を及ぼす。さらに、肝臓特異的病原体、例えば、肝炎ウイルスの生活環を効果的に研究するにはインビトロの肝臓モデルが必要である。現在のところ初代肝細胞がインビトロの肝臓系のゴールドスタンダードであるが、初代肝細胞の入手が限られていること、ドナー依存的に、薬物に対する反応性にばらつきがあることで、ある特定の用途に対する初代肝細胞の有用性は制限されている。
【０００４】
人工多能性幹細胞(IPSC)に基づくインビトロのモデルを用いると、遺伝的背景が明らかな細胞が無制限に供給される。多能性幹細胞(PSC)は無限の増殖能力と身体の全細胞に分化する能力を特徴とし、薬物有害反応(ADR)の影響を受けている組織のインビトロのモデルを確立するための細胞供給源として役立ち得る。ヒトIPSCに基づく肝臓モデルが開発されているが(Greenhough, Medine, Hay. Toxicology. 2010 Jul 12; 278: 250-255（非特許文献1）)、NHP IPSCに基づく肝臓モデルも依然として必要とされている。このような細胞モデルがあれば、インビトロでの発見をインビボでの応用に変える極めて有用なツールとなり、これは動物試験を潜在的に減らすことができるだろう。さらに、NHP-IPSCに基づく系と、対応するヒト細胞の組み合わせを用いると前臨床研究と臨床研究の隔たりを埋め、薬物候補をもっと早く、もっと詳しく評価することができる。
【０００５】
ヒト細胞ではIPSCから肝細胞を得る効率的な方法が開発されているが、非ヒト霊長類細胞では開発されていない。NHP胚性幹細胞の肝臓分化方法について述べた報告はごくわずかだがある(表1)。しかしながら、これらの方法は低効率を欠点としてもっている。重要なことに、以前に述べられたプロトコールは全て、ESCと、マウスフィーダー細胞および組成が規定されていない(non-defined)培地サプリメント、例えば、FCSとの同時培養を用いる培養条件に基づいている。マウスフィーダー細胞と培地サプリメントは、薬物スクリーニングへの、結果として生じる細胞の使用を制限する、大きなばらつきをもつパラメータである。
【０００６】
(表１)NHP幹細胞の肝細胞分化:公表された研究の概要
2019521693.tif 000002
【０００７】
従って、創薬、効力、および安全性試験にとってもっと妥当なモデルを作製するために、非ヒト霊長類IPSCを肝細胞に分化させる、さらに優れた方法が必要とされている。
【０００８】
具体的には、化学的に規定された条件下で、高効率および高純度のIPSC由来肝細胞が必要とされている。さらに、薬物スクリーニングおよび感染症モデリングに適した様々な小規模培養形式および大規模培養形式に合わせることができるインビトロのモデルにおいて、これらの細胞を使用する方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Greenhough, Medine, Hay. Toxicology. 2010 Jul 12; 278: 250-255
【非特許文献２】Ma, Duan, Jung, Wu, VandeVoort, Zern. Cloning Stem Cells. 2008 Dec 10;4:485-93
【非特許文献３】Tsukada, Takada, Shiomi, Torii, Tani. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2006 Mar Apr; 42(3-4):83-8
【非特許文献４】Kuai, Shao, Lu, Xiao, Zheng. J Dig Dis. 2014 Jan; 15(1):27-34
【発明の概要】
【００１０】
本明細書において開示される、NHP多能性幹細胞、特に、人工多能性幹細胞(IPSC)を肝細胞に分化させるための新規の方法は、NHP肝細胞を約28日以内に生成するための、結び付けられた、化学的に規定された培地での誘導工程を含む。
【００１１】
従って、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、
(a)フィーダーフリー培養で化学的に規定された培地中にNHP多能性幹細胞を提供する工程;
(b)多能性幹細胞をWntシグナル伝達アクチベーターと接触させて内胚葉細胞を生成する工程;
(c)内胚葉細胞をBMP4および線維芽細胞増殖因子と接触させて未熟NHP肝細胞を生成する工程;ならびに
(d)未熟NHP肝細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させてNHP肝細胞を生成する工程
を含む、方法が本明細書において提供される。
【００１２】
一態様において、化学的に規定された培地はMT培地である。MT培地は、ハムF12栄養混合物(Ham's F12 Nutrient Mixture)を加えたダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM/F12)と、2.5mM GlutaMAX(商標)、7μg/mlインシュリン、450μMモノチオグリセロール、1x脂質濃縮物(Lipid concentrate)、5mg/ml BSA、14ng/ml亜セレン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、2mg/mlヘパリン、15μg/mlトランスフェリン、および220μMアスコルビン酸-2-リン酸とを含む。
【００１３】
一態様において、NHP多能性細胞は、FGF2およびアクチビンAを含む化学的に規定された培地中に提供される。
【００１４】
一態様において、NHP多能性幹細胞は増殖因子低減(growth-factor reduced)MATRIGEL(登録商標)上で提供される。
【００１５】
一態様において、NHP多能性細胞は約45000細胞/cm2の密度で提供される。
【００１６】
一態様において、NHP多能性細胞は、15ng/ml FGF2、10ng/mlアクチビンA、および10μM Y-27632(Rock阻害剤)を加えたMT基本培地の増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)コーティングプレート上で45000細胞/cm2の密度で提供される。
【００１７】
一態様において、前記培地は1日目〜16日目に毎日交換され、その後は一日おきに交換される。
【００１８】
一態様において、工程(b)および(c)は、分化させて3日目〜10日目に、前記細胞を、B27およびNEAAを含むRPMI1640と接触させる工程を含む。
【００１９】
一態様において、Wntシグナル伝達アクチベーターはCP21である。一態様において、工程(b)が、前記細胞をCP21と接触させて分化を誘導する工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２０】
一態様において、工程(b)が、前記細胞をLy294002およびCP21と接触させて分化を誘導する工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２１】
一態様において、工程(b)が、1日目に、前記細胞を、100ng/mlアクチビンA、10μM Ly294002、および1μM CP21を含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２２】
一態様において、工程(b)が、前記細胞をLDN193189と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２３】
一態様において、工程(b)が、分化させて2日目および3日目に、前記細胞を、100ng/mlアクチビンA、0.25μM LDN193189、および1μM CP21を含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２４】
一態様において、工程(b)が、分化させて4日目に、前記細胞を、50ng/mlまたは100ng/mlアクチビンAを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２５】
一態様において、工程(b)が、前記細胞を、ノックアウト血清代替物(knock-out serum replacement)(KSR)およびDMSOと接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２６】
一態様において、工程(b)が、分化させて5日目および6日目に、前記細胞を、50ng/mlまたは100ng/mlアクチビンA、2％ノックアウト血清代替物(KSR)、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２７】
一態様において、工程(c)の線維芽細胞増殖因子がFGF2またはFGF10である、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２８】
一態様において、工程(c)が、前記細胞をBMP4、DMSO、およびFGF2またはFGF10と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００２９】
一態様において、工程(c)が、分化させて7日目〜10日目に、前記細胞を、2％KSR、10ng/ml BMP4、10ng/ml FGF2またはFGF10、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００３０】
一態様において、工程(d)が、分化させて11日目〜28日目に、前記細胞を、20ng/ml HGF、20ng/mlオンコスタチンM、100nMデキサメタゾン、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００３１】
一態様において、工程(d)が、前記細胞をDAPTと接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００３２】
一態様において、工程(d)が、分化させて11日目〜15日目に、前記細胞を、1μM DAPTを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００３３】
一態様において、工程(d)が、分化させて11日目〜28日目に、化学的に規定された培地を、SingleQuots(商標)(Lonza)を含むHBM培地に変える工程を含む、本明細書に記載の方法が提供される。
【００３４】
一態様において、前記細胞はリファンピシンを取り込み、放出し、これは、肝細胞特異的輸送体タンパク質が存在することを示す。
【００３５】
一態様において、NHP肝細胞は代謝酵素をアップレギュレートする。一態様において、代謝酵素はCYP450酵素である。
【００３６】
一態様において、NHP肝細胞は脂質小胞を含む。
【００３７】
一態様において、NHP肝細胞は、AFP、ALB、およびαIATからなる群より選択される少なくとも1種類の肝臓マーカーを発現する。一態様において、少なくとも1種類の肝臓マーカーの発現は免疫染色によって確かめられる。
【００３８】
一態様において、NHP肝細胞はインビトロのアッセイにおいてインドシアニングリーンを取り込み、放出する。
【００３９】
一態様において、NHP肝細胞はCYP450酵素を発現する。一態様において、CYP450酵素の発現はmRNA発現によって確かめられる。
【００４０】
一態様において、工程(a)のNHP多能性幹細胞は人工多能性幹細胞(IPSC)である。
【００４１】
一態様において、NHP多能性幹細胞は、カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis))およびアカゲザル(マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta))からなる群より選択される種に由来する。一態様において、NHP多能性幹細胞はカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)に由来する。
【００４２】
一態様において、化学的に規定された培地中のフィーダーフリーNHP肝細胞培養物が提供される。一態様において、種がカニクイザルである、化学的に規定された培地中のフィーダーフリーNHP肝細胞培養物が提供される。
【００４３】
一態様において、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞が提供される。一態様において、本明細書に記載の方法によって得られたカニクイザル肝細胞が提供される。
【００４４】
一態様において、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞のバイオバンクが提供される。
【００４５】
本発明のさらに別の局面は、肝臓細胞の機能不全によって引き起こされる疾患のためのインビトロのモデルとしての、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞または本明細書に記載のバイオバンクの使用である。
【００４６】
本発明のさらに別の局面は、肝臓細胞感染のためのインビトロのモデルとしての、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞または本明細書に記載のバイオバンクの使用である。本発明のさらに別の局面において、感染は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生生物感染からなる群より選択される。本発明のさらに別の局面において、ウイルス感染は、A型肝炎ウイルス感染、B型肝炎ウイルス感染、C型肝炎ウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス感染からなる群より選択される。本発明のさらに別の局面において、ウイルス感染はB型肝炎ウイルス感染である。
【００４７】
一態様において、化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、(i)本明細書に記載のように調製された1つまたは複数のNHP肝細胞を前記化合物に曝露する工程;および(ii)毒性の徴候に対して1つまたは複数の成熟NHP肝細胞をモニタリングする工程を含む、方法が提供される。
【００４８】
一態様において、化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、(i)本明細書に記載のように調製された1つまたは複数のNHP肝細胞を前記化合物に曝露する工程であって、前記化合物がNHP肝細胞によって代謝される、工程;(ii)結果として生じた前記化合物の代謝産物を1つまたは複数の非肝細胞と接触させる工程;および(iii)代謝産物によって誘導される変化があるかどうか1つまたは複数の非肝細胞をモニタリングする工程を含む、方法が提供される。
【００４９】
一態様において、ウイルスの複製を維持するためのインビトロの方法であって、本明細書に記載のように調製された1つまたは複数のNHP肝細胞をウイルスに曝露する工程であって、ウイルスが1つまたは複数のNHP肝細胞中で複製する、工程を含む、方法が提供される。
【００５０】
本発明の一局面は、化合物の毒性をインビトロで試験するための、本明細書に記載の任意の細胞の使用である。
【００５１】
本発明のさらなる局面は、ウイルスのインビトロの感染モデルとしての、本明細書に記載の任意の細胞の使用である。
【００５２】
一態様において、インビトロの非ヒト霊長類肝細胞アッセイを準備する方法であって、
(i)本明細書に記載の方法によって調製されたNHP肝細胞を提供する工程;
(ii)NHP肝細胞をアキュターゼ(Accutase)と約1時間〜約3時間接触させてNHP肝細胞を剥離させる工程;
(iii)剥離したNHP肝細胞を適切なアッセイ形式でリプレーティングする工程
を含む、方法が提供される。
【００５３】
さらなる態様において、剥離したNHP肝細胞は、リプレーティングの前にSCARB1陽性細胞について濃縮されている。なおさらなる態様において、前記細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングまたは磁気活性化細胞ソーティング(FACSまたはMACS)を用いて濃縮される。なおさらなる態様において、NHP肝細胞はラミニン上、コラーゲン上、またはマトリゲル上にリプレーティングされる。なおさらなる態様において、NHP肝細胞はマトリゲルサンドイッチ培養物としてリプレーティングされる。
【００５４】
上記の態様はいずれも単独で存在してもよく、組み合わせて存在してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】カニクイザルIPSCにおける多能性マーカーOCT4(図1A)、SOX2(図1B)、およびNANOG(図1C)、ならびに神経マーカーSOX1(図1D)の免疫蛍光染色を用いたNHP-IPSCの品質管理を示す。表(図1E)は陽性細胞のパーセントを示す。
【図２】肝細胞分化用の培地組み合わせを試験することを目的とした実験計画を示す。基本培地は、分化の場合はMT培地またはRPMI培地のいずれかを含有し、成熟の場合はMT培地またはHBM培地のいずれかを含有した。そのため、条件IはMT/MT、条件IIはMT/HBM、条件IIIはRPMI/HBM、条件IVはRPMI/MTとなった。サプリメントを灰色の囲みの中に示した。サプリメントは全ての基本培地について同じであった。
【図３Ａ】NHP-IPSCにおける内胚葉誘導に及ぼす様々な培地組成物の評価の結果を示す。(図3A)MT培地(上)およびRPMI培地(下)における、分化させて4日目および7日目での胚体内胚葉(definitive endoderm)マーカーFOXA2(緑色)およびSOX17(赤色)の免疫蛍光染色。
【図３Ｂ】NHP-IPSCにおける内胚葉誘導に及ぼす様々な培地組成物の評価の結果を示す。(図3B)FoxA2/Sox17陽性細胞の定量。
【図４Ａ】肝細胞の分化および成熟に及ぼす様々な培地組成物の影響を示す。(図4A)分化させて15日目でのα1ATおよびAFPに対する免疫蛍光染色、ならびに21日目でのALBに対する免疫蛍光染色。スケールバーは50μMである。
【図４Ｂ】肝細胞の分化および成熟に及ぼす様々な培地組成物の影響を示す。(図4B)分化させて21日目の肝細胞形態。全体像は幹細胞の広い範囲を示す。クローズアップ写真は、丸石形状と大きな丸い核がある細胞の特徴的な肝細胞形態を示す。MT/HBM培地またはRPMI/HBM培地中で分化させても肝細胞は生じなかった。全体像のスケールバーはMT/MT、RPMI/MT、およびRPMI/HBMについては100μM、MT/HBMについては50μM、クローズアップ画像のスケールバーはMT/MTおよびRPMI/MTについては20μMである。
【図５】肝細胞分化を最適化するために試験したパラメータの概略を示す。MT基本培地に、それぞれの時間枠の灰色の囲みに示した増殖因子および低分子を加えた。赤色で印をつけた物質を変更し、それにより8つの異なる培地組成物が得られた。ActA低は50ng/mlの濃度を示し、ActA高は100ng/mlの濃度を示す。
【図６Ａ】肝細胞分化の効率に対する様々なパラメータの効果を示す。(図6A)21日目でのALBに対する免疫染色。画像は各条件の3回の反復実験を示す。スケールバーは10mmである。
【図６Ｂ】肝細胞分化の効率に対する様々なパラメータの効果を示す。(図6B)肝細胞形成の定量。ALB染色領域または肝細胞形態をもつ細胞で覆われている領域を定量した。カラムは3回の生物学的反復実験(biological replicate)の平均+/-SDを示す。
【図７】NHP-IPSC由来肝細胞の特徴付けを示す。(図7A)BODIPY染色で視覚化した脂質貯蔵。(図7BおよびC)PAS染色で視覚化したグリコーゲン貯蔵。初代カニクイザル肝細胞を正の対照として使用した。(図7DおよびE)肝細胞特異的輸送体タンパク質の存在を示す、インドシアニングリーン(ICG)の取り込みおよび放出。スケールバー:100μM。
【図８Ａ】IPSC由来肝細胞および初代肝細胞におけるCYP-P450ファミリーの酵素の発現を示す。(図8A〜C)定量リアルタイムPCRによって確かめたmRNA発現レベル。グラフは、未分化IPSCに対する倍率調節(fold regulation)(図8A)またはDMSOで処理した細胞に対する倍率調節(図8BおよびC)を示す。バーは3回の技術的反復実験(technical triplicate)の平均を表す。発現をハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して規準化した。
【図８Ｂ】IPSC由来肝細胞および初代肝細胞におけるCYP-P450ファミリーの酵素の発現を示す。(図8A〜C)定量リアルタイムPCRによって確かめたmRNA発現レベル。グラフは、未分化IPSCに対する倍率調節(図8A)またはDMSOで処理した細胞に対する倍率調節(図8BおよびC)を示す。バーは3回の技術的反復実験の平均を表す。発現をハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して規準化した。
【図８Ｃ】IPSC由来肝細胞および初代肝細胞におけるCYP-P450ファミリーの酵素の発現を示す。(図8A〜C)定量リアルタイムPCRによって確かめたmRNA発現レベル。グラフは、未分化IPSCに対する倍率調節(図8A)またはDMSOで処理した細胞に対する倍率調節(図8BおよびC)を示す。バーは3回の技術的反復実験の平均を表す。発現をハウスキーピング遺伝子GAPDHに対して規準化した。
【図８Ｄ】IPSC由来肝細胞および初代肝細胞におけるCYP-P450ファミリーの酵素の発現を示す。(図8D)活性CYP酵素によって蛍光ルシフェリンに変換されるプロルシフェリン結合CYP3A4基質の発光によって測定したIPSC由来肝細胞および初代肝細胞のCYP-P450酵素活性。2回の生物学的反復実験を測定した。DMSOとインキュベートした細胞と比較してCYP-P450酵素の誘導を分析するために、細胞をリファンピシンまたはデキサメタゾンと24時間インキュベートした。バーは技術的反復実験の平均+/-標準偏差を表す。
【図９Ａ】分化した肝細胞のリプレーティングを可能にする決定的な条件を示す。(図9A)細胞を21日目にリプレーティングするための様々な解離試薬の実現可能性。分化させて23日目または25日目に撮影した明視野(BF)画像は細胞接着を示した。分化させて30日目でのALBに対する免疫蛍光染色(赤色)はリプレーティング後の肝細胞を示した。スケールバー:100μM。
【図９Ｂ】分化した肝細胞のリプレーティングを可能にする決定的な条件を示す。(図9B)リプレーティングのためのアキュターゼ処理の改善。DAPT添加あり/DAPT添加なしでIPSC由来細胞は分化した。
【図１０】NHP-IPSCが分化している間の肝細胞特異的細胞表面マーカーの発現を示す。分化させて22日目(上)および28日目のフローサイトメトリー分析。ASGR発現を検出できないという事実は、抗体の種交差反応性が無いことに起因するかもしれない。
【図１１Ａ】SCARB1陽性細胞を得るための、MACSソーティングを用いたNHP-IPSC由来肝細胞の濃縮を示す。(図11A)ソーティング前およびソーティング後のフローサイトメトリー分析。
【図１１Ｂ】SCARB1陽性細胞を得るための、MACSソーティングを用いたNHP-IPSC由来肝細胞の濃縮を示す。(図11B)ソーティングされていない細胞、SCARB1+細胞、およびSCARB1-細胞における肝細胞マーカーのmRNA発現。
【図１１Ｃ】SCARB1陽性細胞を得るための、MACSソーティングを用いたNHP-IPSC由来肝細胞の濃縮を示す。(図11C)ソーティングされた細胞の位相差画像から、SCARB1+画分における肝細胞が濃縮されたことが証明される。スケールバー:50μm。
【図１２】インビトロで肝毒性を評価することを目的としたNHP-IPSC由来肝細胞の適用を示す。細胞を肝毒性化合物トログリタゾンで24時間処理し、細胞生存率を、WST1アッセイを用いて評価した。カラムは、2回の生物学的反復実験の平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
詳細な説明
本明細書で使用する「規定された培地」または「化学的に規定された培地」という用語は、個々の全ての構成要素と各濃度が分かっている細胞培養培地を指す。規定された培地は、組換え構成要素および化学的に規定された構成要素を含有してもよい。
【００５７】
本明細書で使用する「分化させる」および「分化」という用語は、低分化細胞を体細胞に変換する、例えば、多能性幹細胞を肝細胞に変換する1つまたは複数の工程を指す。ヒトIPSCに由来する肝細胞は、当技術分野において公知のプロトコールに従って作製することができる(例えば、Hannan, Segeritz, Touboul, Ludovic. Nature Protocols. 2013; 8: 430-437を参照されたい)。NHP PSC、特に、NHP IPSCからNHP肝細胞への分化は、本明細書に記載の方法によって成し遂げられる。
【００５８】
「マーカーの発現」とは、ある特定の遺伝子がmRNAに転写され、通常、その後に、細胞において、ある特定の機能を発揮するタンパク質(その遺伝子産物)に翻訳されることを意味する。マーカーの発現は、当技術分野において公知の方法によってRNAレベルで、またはタンパク質レベルで検出および定量することができる。例えば、マーカーに結合する抗体を含む、ある特定のタンパク質が存在するかどうか試験することによって、マーカーの発現をタンパク質レベルで検出することが本明細書において好ましい。「発現マーカー」は、細胞タイプの同一性を確かめるのに使用することができる。PSC細胞マーカーは当技術分野において公知であり、例えば、Ecat1、Esg1、Nanog、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Cax1、Zfp296、Slc2a3およびNat1、Oct4およびSox2を含んでもよい。
【００５９】
本明細書で使用する「フィーダーフリー」という用語は、フィーダー培養の使用を利用しない細胞培養を指す。フィーダーは、培養細胞の栄養支持体および/または構造支持体を提供するのに役立つ、培養しようとする細胞とは異なる細胞タイプの細胞および/または培養しようとする細胞とは異なる種に由来する細胞である。フィーダー培養の例はマウス胚線維芽細胞(MEF)である。一例として、フィーダーフリーNHP肝細胞培養物はフィーダー細胞、例えば、MEFを含まない。フィーダー細胞が存在しないことは、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、リアルタイムPCRによってフィーダー細胞特異的遺伝子発現を測定することによって確かめることができる。
【００６０】
本明細書で使用する「肝細胞」または「HEP」という用語は、肝臓の主要な実質組織の細胞に類似する、または肝臓の主要な実質組織の細胞と同一の細胞を指す。同様に、「NHP肝細胞」または「NHP HEP」という用語は非ヒト霊長類肝細胞または非ヒトPSC由来肝細胞を指す。本明細書で使用する「未熟肝細胞」という用語は、そのマーカー発現(例えば、ALBの代わりにAFP発現)に関して胎児肝細胞に類似するが、本明細書に記載のように肝細胞の細胞機能および/または代謝機能に関連するマーカーを発現し、肝細胞細胞の形状をとる細胞を指す。
【００６１】
本明細書で使用する「肝細胞成熟培地」という用語は、20ng/ml HGF、20ng/mlオンコスタチンM、100nMデキサメタゾン、および0.5％DMSOを加えたMT培地を含む規定された培地を指す。
【００６２】
本明細書で使用する「ハイスループットスクリーニング」とは、比較的多数の異なる疾患モデル条件および/または化合物を、本明細書に記載の新規のアッセイを用いて分析および比較できることを意味すると理解されるものとする。典型的な、このようなハイスループットスクリーニングは、マルチウェルマイクロタイタープレート中で、例えば、96ウェルプレートもしくは384ウェルプレート、または1536ウェルもしくは3456ウェルのあるプレート中で行われる。
【００６３】
本明細書で使用する「MT培地」または「MT基本培地(basal medium)」または「MT基本培地(basic medium)」という用語は、ハムF12栄養混合物を加えたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM/F12)と、2.5mM GlutaMAX(商標)、7μg/mlインシュリン、450μMモノチオグリセロール、1x脂質濃縮物、5mg/ml BSA、14ng/ml亜セレン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、2mg/mlヘパリン、15μg/mlトランスフェリン、および220μMアスコルビン酸-2-リン酸とを含有する、規定された培地を指す。
【００６４】
本明細書で使用する「MT完全培地」という用語は、15ng/ml bFGF(FGF2)および10ng/mlアクチビンAを含有するMT培地を指す。
【００６５】
本明細書で使用する「非ヒト霊長類」または「NHP」という用語は、ヒト(Homo sapiens)を除く霊長目に属する種を指す。特に、本発明に開示される方法に従うNHP種には、チンパンジー(Pan troglodytes)、ボノボ(Pan paniscus)、シロテテナガザル(Hylobates lar)、ゴリラ(Gorilla gorilla)、スマトラオランウータン(Pongo abelii)、ボルネオオランウータン(Pongo pygmaeus)、ブルーモンキー(Cercopithecus mitis)、ブラッザモンキー(Cercopithicus neglectus)、グリベットモンキー(Chlorocebus aethiops)、グリーンモンキー(Chlorocebus sabaeus)、アビシニアコロブス(Colobus guereza)、クロカンムリマンガベイ(Lophocebus aterrimus)、ベニガオザル(Macaca arctoides)、アッサムモンキー(Macaca assamensis)、カニクイザル(Macaca fascicularis)、ニホンザル(Macaca fuscata)、アカゲザル、ミナミブタオザル(Macaca nemestrina)、シシオザル(Macaca silenus)、ドリル(Mandrillus leucophaeus)、マンドリル(Mandrillus sphinx)、チベットモンキー(Macaca thibetana)、アヌビスヒヒ(Papio anubis)、キイロヒヒ(Papio cynocephalus)、マントヒヒ(Papio hamadryas)、ギニアヒヒ(Papio papio)、チャクマヒヒ(Papio ursinus)、ハヌマンラングール(Presbytis entellus)、ゲラダヒヒ(Theropithecus gelada)、アザラヨザル(Aotus azarae)、ナンシーヨザル(Aotus nancymaae)、クロアタマヨザル(Aotus nigriceps)、フンボルトヨザル(Aotus trivirgatus)、スピックスヨザル(Aotus vociferans)、ケナガクモザル(Ateles belzebuth)、ケナガクモザル(Ateles fusciceps)、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ダスキーティティ(Callicebus moloch)、ピグミーマーモセット(Cebuella pygmaea)、フサオマキザル(Cebus apella)、ゴールデンライオンタマリン(Leontopithecus rosalia)、シロガオサキ(Pithecia pithecia)、セマダラタマリン(Saguinus fuscicollis)、ジェフロイタマリン(Saguinus geoffroyi)、ジェフロイタマリンムネアカタマリン(Saguinus labiatus)、クチヒゲタマリン(Saguinus mystax)、ワタボウシタマリン(Saguinus oedipus)、コモンリスザル(Saimiri sciureus)が含まれるが、これに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用する「多能性培地」は、多能性を維持しながら、NHP多能性幹細胞をシングル細胞として付着させるのに有用な任意の化学的に規定された培地を指し、当技術分野において周知である。
【００６７】
本明細書で使用する「幹細胞」という用語は、自己再生能と分化能をもつ幹細胞を指す。本明細書で使用する「未分化幹細胞」とは、分化を経ていない幹細胞を指す。本明細書で使用する「多能性幹細胞」または「PSC」とは、3種類の胚葉(内胚葉、外胚葉、中胚葉)の細胞タイプならびに生殖系列を生じることができる幹細胞を指す。多能性幹細胞(PSC)には、「NHP胚性幹細胞」(「NHP ESC」)および「NHP人工多能性幹細胞」(「NHP IPSC」)が含まれるが、これに限定されない。
【００６８】
本明細書で使用する「ソーティング」または「細胞ソーティング」という用語は、細胞表面マーカー発現などの特性に基づいて細胞集団の様々な細胞を分離することを指す。
【００６９】
本開示は、概して、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞由来肝細胞およびそれを生成する方法に関する。さらに、本開示は、インビトロの薬物スクリーニング、安全性評価のための、および感染モデルにおける、これらのNHP肝細胞の使用に関する。
【００７０】
先行研究においてNHP胚性幹細胞の肝細胞分化が報告された(表1)。概して、これらの戦略は、フィーダー培養された幹細胞と、胚様体形成および化学的に規定されていない培地を用いる分化方法に基づいている。これらのパラメータは全て、ばらつきが大きく、規定されていない因子が導入されるために、結果として生じる細胞を薬剤開発に不適切なものにする。さらに、NHP幹細胞を肝細胞に分化させる現行の試みは低効率を欠点としてもち、薬物候補スクリーニング用途に適した形式でNHP肝細胞を濃縮およびリプレーティングするための戦略を提供しない。
【００７１】
NHP多能性幹細胞(PSC)、特に、NHP人工多能性幹細胞(IPSC)から肝細胞を得るためのロバストかつ効率的な方法が本明細書において示される。さらに、本発明者らは、NHP肝細胞を薬剤開発におけるインビトロのスクリーニングモデルとして使用するための必要条件である、得られたNHP肝細胞をソーティングおよびリプレーティングするための戦略を開発した。さらに、本明細書において示されたデータから、本発明の方法によって得られるNHP肝細胞は、薬物性肝障害を評価するか、または霊長類特異的病原体の感染をモデル化するためのインビトロのモデルとして使用するのに適していることが証明される。
【００７２】
この系は、動物の屠殺を必要としない最初のNHPインビトロ系であるので、薬剤開発のための価値のあるツールを提供する。さらに、この系を用いると、インビボの研究の前に病原体または薬物に対するNHP反応性を分析することが可能になり、そのため、薬物候補の優先順位付けが可能になる。対応するヒト肝細胞が利用可能な時には、本明細書に記載の方法によって得られるNHP肝細胞は種間比較に使用することができ、前臨床所見のヒトへのもっと正確な橋渡し(translation)に使用することができる。
【００７３】
従って、本発明は、非ヒト霊長類(NHP)多能性細胞、具体的にはNHP人工多能性細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法を提供する。この方法は、
(a)フィーダーフリー培養で化学的に規定された培地中にNHP多能性幹細胞を提供する工程;
(b)多能性幹細胞をWntシグナル伝達アクチベーターと接触させて内胚葉細胞を生成する工程;
(c)内胚葉細胞をBMP4およびFGF2またはFGF10と接触させて未熟NHP肝細胞を生成する工程;および
(d)未熟NHP肝細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させてNHP肝細胞を生成する工程を含む。
【００７４】
NHP IPSCは、体細胞をリプログラミングすることによって、例えば、当技術分野において公知の方法で、規定された因子を形質導入することによって得ることができる。例えば、Oct3/4、Sox2、c-Myc、およびKlf4を形質導入し、ES細胞培養条件下で培養した体細胞は、形態、増殖速度、無制限の自己再生能力および多能性能力などのES細胞の特性を獲得し、ES細胞マーカー遺伝子を発現する(例えば、Takahashi, Yamanaka, Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76を参照されたい)。適切な体細胞供給源は、例えば、皮膚生検によって得られる線維芽細胞、ケラチノサイト、または脂肪細胞である。IPSC供給源として適した他の体細胞は、血液試料から得られた白血球もしくは上皮細胞、または血液もしくは尿試料から得られ、本明細書に記載のように当技術分野において公知の方法によってIPSCにリプログラミングされた他の細胞である。NHP体細胞は健常個体から得られてもよく、罹患個体から得られてもよい。NHP IPSCには、内胚葉系列、外胚葉系列、および中胚葉系列の細胞に発生する能力がある。一態様において、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(a)のNHP多能性幹細胞が人工多能性幹細胞(IPSC)である、方法が提供される。
【００７５】
一態様において、NHP多能性幹細胞は、カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)およびアカゲザル(マカカ・ムラッタ)からなる群より選択される種に由来する。好ましい一態様において、NHP多能性幹細胞はカニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)に由来する。
【００７６】
一態様において、工程(a)のNHP多能性幹細胞はシングル細胞として、および/または細胞単層で提供される。これは、様々な三次元構造をもつ、あまり規定されていない形成物を構成する細胞凝集塊または胚様体を培養するのとは対照的である。本明細書において提供される細胞単層は、付着性支持体上にある、規定された細胞薄膜である。本明細書に記載の規定された培地条件と組み合わせて、ロバストで再現可能な細胞培養系が提供される。
【００７７】
一態様において、NHP多能性幹細胞は増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)(BD Bioscience)上に提供される。MATRIGEL(登録商標)は、エンゲルブレス・ホルム・スワム(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS)マウス肉腫細胞が分泌するゼラチン状タンパク質の混合物であり、多くの組織において見出されるような、例えば、肝臓組織において見出されるような複雑な細胞外環境を模倣するための細胞培養支持体として用いられる。MATRIGEL(登録商標)は細胞培養表面をコーティングするか、または細胞を「サンドイッチ培養」に埋め込むのに適している。肝臓系列に由来する細胞を培養するのに適した他の細胞培養支持培地はコラーゲンおよびラミニンである。
【００７８】
一態様において、NHP多能性細胞は約10000〜80000細胞/cm2の密度で提供される。さらなる態様において、NHP多能性細胞は約20000〜70000細胞/cm2または約30000〜60000細胞/cm2の密度で提供される。一態様において、NHP多能性細胞は約40000〜50000細胞/cm2の密度で提供される。一態様において、NHP多能性幹細胞は約45000細胞/cm2の密度で提供される。一態様において、IPSCは約45000細胞/cm2の密度で、すなわち、高密度で提供される。本方法の本発明者らは、細胞を高密度で提供すると、内胚葉分化とその後の肝臓分化の効率が高まることを発見した。異なる細胞株について、最大肝細胞収率を得るためのNHP多能性幹細胞に最適な初期細胞プレーティング密度が求められる場合がある。
【００７９】
本明細書に記載のようにNHP肝細胞を分化させるための細胞培養条件は化学的に規定されている。化学的に規定されているとは、個々の全ての構成要素と各濃度が分かっていることを意味する。本明細書に記載の方法の異なる工程に従ってPSCの分化を誘導するために、規定された基本培地には、規定された化合物が加えられる。一態様において、基本培地は、本明細書に記載の方法の全工程について同じである。他の態様において、基本培地は、前記方法の一工程が完了した後に、および/または規定された時点の後に交換される。好ましい態様において、基本培地は、1〜50μg/mlインシュリン、100〜1000μMモノチオグリセロール、0.5〜2x脂質濃縮物、2〜20mg/ml BSA、10〜20ng/ml亜セレン酸ナトリウム、0.5〜2x非必須アミノ酸、1〜5mg/mlヘパリン、5〜50μg/mlトランスフェリン、および100〜500μMアスコルビン酸-2-リン酸を加えたハムF12栄養混合物を加えたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM/F12)およびGlutaMAX(商標)を含有する。一態様において、化学的に規定された培地はMT培地である。
【００８０】
本発明は、フィーダーフリー細胞培養形式で、かつ化学的に規定された培地中で、NHP PSCに由来するNHP肝細胞を生成する方法を提供する。
【００８１】
一態様において、NHP多能性細胞は、安定した増殖期間および/または複製期間を可能にする条件下で培養される。例えば、細胞は多能性培地中で増殖され、数回継代される。一態様において、多能性培地は、完全に規定された培地、すなわち、Rho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/トレオニンキナーゼ (Rho-associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase)(ROCK)プロテインキナーゼファミリーの低分子阻害剤(本明細書中ではROCKキナーゼ阻害剤と呼ぶ)を含む無血清培地である。
【００８２】
一態様において、ROCKキナーゼ阻害剤は、1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン)、N-ベンジル-2-(ピリミジン-4-イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド)、および(+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸)の群より選択される。本明細書において有用な、さらなるROCKキナーゼ阻害剤は、ファスジル(1-(5-イソキノリンスルホニル)ホモピペラジン)、チアゾビビン(N-ベンジル-2-(メチルピリミジン-4-10イルアミノ)チアゾール-4-カルボキサミド)、およびY27632((+)-(R)-トランス-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸、例えば、カタログ番号: 1254, Tocris bioscience)である。好ましい態様において、ROCKキナーゼ阻害剤はY27632である。一態様において、多能性培地は、2〜20μM Y27632、好ましくは、5〜10μM Y27632を含む無血清培地である。好ましい態様において、多能性培地は、10μM Rockキナーゼ阻害剤Y27632を含む無血清培地である。別の態様において、多能性培地は、2〜20μMファスジルを含む無血清培地である。別の態様において、多能性培地は、0.2〜10μMチアゾビビンを含む無血清培地である。
【００８３】
NHP PSCは無限に増やすことができ、薬剤開発および安全性試験に必要とされるハイスループットスクリーニング環境に適した大規模培養に合わせることができる。さらに、NHP PSCは疾患モデル化および再生医療に大きな可能性を秘めている。NHP PSCはヒトPSCと多くの生理学的類似性を共有し、神経変性障害、自己免疫疾患、および感染症を研究するのに使用することができる。重要なことに、NHP IPSCおよびヒトIPSCを、必要とされる疾患モデル細胞タイプに効率的に分化させることができれば、これらのIPSCを利用することでNHPとヒトとの間で疾患または治療モデルを直接比較することが可能になる。本明細書において開示される方法は、NHP PSC、特に、NHP IPSCをNHP肝細胞に効率的に分化させるのに使用することができる。
【００８４】
一態様において、NHP PSCは分化前にアクチビンAおよびFGF-2に曝露される。一態様において、NHP多能性細胞は、FGF2およびアクチビンAを含む化学的に規定された培地中に提供される。一態様において、前記方法の工程(a)の規定された培地は0.3〜15ng/mlアクチビンAおよび0.3〜20ng/ml FGF-2を含み、好ましくは、0.3〜10ng/mlアクチビンAおよび0.3〜15ng/ml FGF-2を含む。一態様において、NHP多能性細胞は、15ng/ml FGF2、10ng/mlアクチビンA、および10μM ROCKキナーゼ阻害剤Y-27632を加えたMT基本培地の増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)コーティングプレート上で約45000細胞/cm2の密度で提供される。
【００８５】
一態様において、死細胞を除去するために、NHP PSCは、分化を初期化する前に適切な緩衝液または培地で洗浄される。好ましくは、培地は各工程の間に交換される。例えば、培地は、吸引することで、または細胞を遠心分離し、上清を捨てることで交換され、次いで、後の工程において用いられる培地が細胞に添加される。一態様において、死細胞と、前の工程で適用された残存している培地または増殖因子またはサイトカインを除去するために、細胞は、後の工程の培地を添加する前に適切な緩衝液または培地で洗浄される。細胞の洗浄に有用な緩衝液または培地は当技術分野において公知である。細胞を洗浄するのに適した緩衝液の一例は、例えば、リン酸緩衝食塩水(PBS)である。
【００８６】
分化を初期化するために、細胞は、Wnt経路アクチベーターを含む規定された培地中でインキュベートされる。一態様において、Wnt経路アクチベーターは、本明細書において「化合物21」または「CP21」とも呼ばれる、化合物21(3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオンである。例えば、L. Gong et al; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20 (2010), 1693-1696)を参照されたい。異なる細胞密度(30000〜75000/cm2)と様々なCP21濃度(0〜2μM)を用いる、いくつかの並行分化実験において、45000/cm2の細胞密度と1μMのCP21濃度を使用すると、最も効率的に多能性幹細胞が肝細胞に分化することが見出された。CP21濃度が2μMを上回ると細胞生存率が減少した。先行技術プロトコールでは、効率的に分化させるために、もっと高い濃度の他のWnt経路モジュレーター(例えば、BIOまたはCHIR99021)が必要とされるので、このことは、CP21がWntシグナル伝達を誘導するのに非常に強い化合物であることを裏付けている。
【００８７】
一態様において、本明細書に記載のNHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法の工程(b)において用いられるWntアクチベーターは、式
2019521693.tif 000003
3-(3-アミノ-フェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-ピロール-2,5-ジオン(CP21)の化合物である。
【００８８】
一態様において、分化方法の工程(b)の規定された培地は、0.1〜10μM CP21、好ましくは、0.5〜5μM CP21を含む。好ましい一態様において、工程(b)の培地は1μM CP21を含む。
【００８９】
一態様において、工程(b)は、前記細胞を、CP21を含む規定された培地と12〜96時間、好ましくは、24〜72時間接触させる工程を含む。
【００９０】
好ましい一態様において、工程(b)は、前記細胞を、CP21を含む規定された培地と72時間接触させる工程を含む。
【００９１】
肝細胞または肝細胞様の同一性は、肝細胞の細胞機能および/または代謝機能に関連する発現マーカーを用いて評価することができる。PSC由来肝細胞において、肝細胞同一性に関連する発現マーカーは初代肝細胞または肝臓組織における発現レベルと比較して低レベルで発現することがある。PSC由来肝細胞における肝細胞発現マーカーの規準化された発現レベルは、初代肝細胞または肝臓組織における、それぞれのマーカーの発現レベルと比較して1/10000、または1/1000、または1/100、または1/10、または1/2になることがある。PSC由来肝細胞と初代肝細胞との間の肝細胞発現マーカー発現レベルの倍率変化は異なる発現マーカーについて異なる場合がある。規準化は、所定のマーカーの発現レベルの絶対値を適切なハウスキーピング遺伝子、例えば、GAPDHと関係付けることによって成し遂げることができる。発現マーカーには、代謝機能、タンパク質合成、タンパク質貯蔵、炭水化物の変換、コレステロールの合成、胆汁酸塩およびリン脂質の合成、解毒、外因性物質および内因性物質の修飾および排出に関連する、肝細胞に特異的なマーカーまたは肝細胞に特徴的なマーカーが含まれるが、これに限定されない。代表的なマーカーには、HNF4a、AFP、ALB、A1AT、SCARB1が含まれるが、これに限定されない。肝細胞および肝細胞様細胞は、類似の表現型マーカーを発現する同じ細胞系列に拘束された(committed)細胞だと見なされる。さらに、肝細胞同一性はまた、形態、グリコーゲン貯蔵および脂質貯蔵を含むが、これに限定されない機能的特徴付けによって評価することもできる。
【００９２】
一態様において、本明細書に記載のように非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(b)がLy294002を含む、方法が提供される。Ly294002はPI3K阻害剤であり、胚体内胚葉の分化を支持することが示されている。一態様において、本明細書において開示される方法の工程(b)の規定された培地は0.5〜100μM Ly294002、好ましくは、1〜20μM Ly294002を含む。好ましい一態様において、工程(b)の培地は10μM Ly294002を含む。
【００９３】
一態様において、本明細書に記載のようにNHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(b)が、前記細胞をLy294002およびCP21と接触させて分化を誘導する工程を含む、方法が提供される。
【００９４】
一態様において、工程(b)の培地は、100ng/mlアクチビンA、10μM Ly294002、および1μM CP21を含む。一態様において、分化を誘導するために、前記細胞は前記培地と3日間、2日間、優先的に、1日インキュベートされる。従って、本明細書に記載のようにNHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(b)が、前記細胞を、100ng/mlアクチビンA、10μM Ly294002、および1μM CP21を含む化学的に規定された培地と特に1日接触させる工程を含む、方法が提供される。
【００９５】
一態様において、工程(b)の培地はLDN193189を含む。LDN193189は、中胚葉形成を阻止する、BMPシグナル伝達をブロックするALK2/3阻害剤である。肝細胞に内胚葉系列に由来する。従って、中胚葉形成をブロックすると、内胚葉系列に拘束された細胞の収率が改善する。本発明の一局面において、LDN193189を規定された培地に添加すると肝細胞分化が改善する。一態様において、本明細書に記載の方法の工程(b)の規定された培地は、0.1〜10μM LDN193189、好ましくは、0.2〜2μM LDN193189を含む。好ましい一態様において、工程(b)の培地は0.25μM LDN193189を含む。
【００９６】
一態様において、工程(b)は、前記細胞を、Wntシグナル伝達アクチベーターCP21を含む化学的に規定された培地と24〜96時間、好ましくは72時間接触させる工程を含む。さらなる態様において、工程(b)は、前記細胞をアクチビンA、Ly294002、およびCP21と約24時間接触させた後に、前記細胞をアクチビンA、LDN193189、およびCP21と約48時間接触させる工程を含む。特定の態様において、本明細書に記載のように非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(b)が、分化させて2日目および3日目に、前記細胞を、100ng/mlアクチビンA、0.25μM LDN193189、および1μM CP21を含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、方法が提供される。
【００９７】
一態様において、工程(b)は、分化させて4日目に、前記細胞を、50ng/mlまたは100ng/mlアクチビンAを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む。
【００９８】
さらなる態様において、工程(b)は、前記細胞をノックアウト血清代替物(KSR)と接触させる工程を含む。KSRは、アミノ酸、ビタミン、微量元素、トランスフェリン、インシュリン、および脂質に富むアルブミンを含む、規定された無血清製剤であり、様々な細胞タイプのための栄養源として用いられる。特定の態様において、前記細胞は、0.1〜10％KSR、1〜5％KSR、優先的に、2％KSRと接触される。一態様において、工程(b)は、前記細胞を、2％ノックアウト血清代替物(KSR)を含む化学的に規定された培地と1〜6日間、または3〜5日間、好ましくは、5日間接触させる工程を含む。
【００９９】
さらなる態様において、前記細胞はDMSOと接触される。さらなる態様において、前記細胞は0.1〜2％DMSO、0.2〜1％DMSO、優先的に、0.5％DMSOと接触される。
【０１００】
さらなる態様において、工程(b)は、前記細胞を2％ノックアウト血清代替物(KSR)およびDMSOと接触させる工程を含む。一態様において、工程(b)は、前記細胞を、2％ノックアウト血清代替物(KSR)および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と24〜72時間、好ましくは、48時間接触させる工程を含む。
【０１０１】
さらなる態様において、工程(b)は、前記細胞を、アクチビンA、KSR、およびDMSOを含む化学的に規定された培地と約24〜72時間、好ましくは、約48時間接触させる工程を含む。特定の態様において、本明細書に記載のように非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(b)が、分化させて5日目および6日目に、前記細胞を、50ng/mlまたは100ng/mlアクチビンA、2％ノックアウト血清代替物(KSR)、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、方法が提供される。
【０１０２】
本発明は、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、第1の工程で、本明細書に記載のように、NHP多能性幹細胞を、規定された培地中にある規定された因子と接触させることによって、内胚葉細胞に分化させる、方法を開示する。本明細書に記載のように、内胚葉細胞を、規定された培地中にある規定された因子と接触させることによって、内胚葉細胞を肝内胚葉および未熟NHP肝細胞にさらに分化させることができる。
【０１０３】
一態様において、内胚葉細胞から肝内胚葉への分化は、前記細胞を、骨形成タンパク質、好ましくは、BMP4またはBMP2、および線維芽細胞増殖因子、好ましくは、FGF2と接触させることによって誘導される。BMP4は骨および軟骨の発達に関与する。一態様において、内胚葉細胞を肝臓系列に分化させるために、BMPおよびFGFシグナル伝達の活性化の組み合わせが用いられる。一態様において、FGFシグナル伝達は線維芽細胞増殖因子によって誘導される。一態様において、本明細書に記載のようにNHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(c)の線維芽細胞増殖因子がFGF2またはFGF10である、方法が提供される。一態様において、本明細書に記載のように非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(c)が、前記細胞をBMP4およびFGF2またはFGF10と接触させる工程を含む、方法が提供される。一態様において、工程(c)は、前記細胞を、BMP4およびFGF2またはFGF10を含む化学的に規定された培地と3〜5日間、好ましくは、4日間接触させる工程を含む。特定の態様において、前記細胞は、約1〜50ng/ml BMP4、約2〜20ng/ml BMP4、優先的に、10ng/ml BMP4と接触される。特定の態様において、前記細胞は、約1〜50ng/ml FGF2またはFGF10、約2〜20ng/ml FGF2またはFGF10、優先的に、約10ng/ml FGF2またはFGF10と接触される。さらなる態様において、前記細胞は、約0.1〜2％DMSO、約0.2〜1％DMSO、優先的に、0.5％DMSOと接触される。
【０１０４】
さらなる態様において、工程(c)は、前記細胞をKSR、BMP4、FGF2またはFGF10、およびDMSOと約24〜72時間、好ましくは、約48時間接触させる工程を含む。特定の態様において、NHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(c)が、分化させて7日目〜10日目に、前記細胞を、2％KSR、10ng/ml BMP4、10ng/ml FGF2またはFGF10、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、方法が提供される。
【０１０５】
従って、本発明は、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、一工程で、本明細書に記載のように肝内胚葉細胞を、規定された培地中にある規定された因子と接触させることによって、肝内胚葉細胞を未熟NHP肝細胞に分化させる工程を含む、方法を開示する。本明細書に記載のように未熟NHP肝細胞を、規定された培地中にある規定された因子と接触させることによって、NHP肝細胞にさらに分化させることができる。
【０１０６】
一態様において、未熟NHP肝細胞からNHP肝細胞への分化は、前記細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させることによって促進される。一態様において、NHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(d)が、前記細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させる工程を含む、方法が提供される。一態様において、工程(d)は、前記細胞を、HGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンを含む化学的に規定された培地と約3〜25日間、約4〜20日間、好ましくは、18日間接触させる工程を含む。
【０１０７】
特定の態様において、前記細胞は、約1〜100ng/ml HGFと、約5〜50ng/ml HGFと、優先的に、20ng/ml HGFと接触される。さらに特定の態様において、前記細胞は、約1〜100ng/mlオンコスタチンMと、約5〜50ng/mlオンコスタチンMと、優先的に、20ng/mlオンコスタチンMと接触される。さらに特定の態様において、前記細胞は、約5〜500ng/mlデキサメタゾンと、約20〜200ng/mlデキサメタゾンと、優先的に、100ng/mlデキサメタゾンと接触される。さらに特定の態様において、前記細胞は、約0.1〜2％DMSOと、約0.2〜1％DMSOと、優先的に、0.5％DMSOと接触される。
【０１０８】
さらなる態様において、工程(d)は、前記細胞をHGF、オンコスタチンM、デキサメタゾン、およびDMSOと約3〜25日間、約5〜20日間、好ましくは、18日間接触させる工程を含む。特定の態様において、NHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(d)が、分化させて11日目〜28日目に、前記細胞を、20ng/ml HGF、20ng/mlオンコスタチンM、100nMデキサメタゾン、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、方法が提供される。
【０１０９】
一態様において、工程(d)は、前記細胞をNOTCHシグナル伝達阻害剤と接触させる工程を含む。NOTCHシグナル伝達を阻害すると胆管細胞(cholangiocyte)(胆管細胞(bile duct cell))の形成が阻害される。特定の態様において、NOTCHシグナル伝達阻害剤は、N-[N-(3,5-ジフルオロフェンアセチル)-L-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT)である。DAPTはγ-セレクターゼ阻害剤であり、従って、NOTCHシグナル伝達を阻害する。一態様において、工程(d)は、前記細胞を、DAPTを含む化学的に規定された培地と約3〜7日間、約4〜6日間、好ましくは、5日間接触させる工程を含む。特定の態様において、前記細胞は、約0.1〜10μM DAPTと、約0.2〜2μM DAPTと、優先的に、1μM DAPTと接触される。特定の態様において、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(d)が、分化させて11日目〜15日目に、前記細胞を、1μM DAPTを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、方法が提供される。特定の態様において、NHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(d)が、分化させて11日目〜15日目に、前記細胞を、1μM DAPTを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、方法が提供される。
【０１１０】
一態様において、前記培地は1日目〜15日目に毎日交換され、その後は一日おきに交換される。さらなる態様において、化学的に規定された培地は、規定された時点で、例えば、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための提供される方法の工程(a)、(b)、(c)、または(d)のうちの1つが終了した後に、異なる化学的に規定された培地に交換される。一態様において、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための提供される方法の工程(a)、(b)、(c)、または(d)の化学的に規定された培地はMT培地である。一態様において、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための提供される方法の工程(a)、(b)、(c)、または(d)の化学的に規定された培地はMT完全培地である。一態様において、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(b)および(c)が、分化させて3日目〜10日目に、化学的に規定された培地を、B27および非必須アミノ酸を加えたRPMI1640に変える工程を含む、方法が提供される。一態様において、NHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、工程(d)が、分化させて11日目〜28日目に、化学的に規定された培地を、SingleQuots(商標)(Lonza)を含むHBM培地に変える工程を含む、方法が提供される。一態様において、化学的に規定された培地はMT基本培地である。別の態様において、化学的に規定された培地は、分化させて3日目〜10日目にRPMI1640に変えられる。
【０１１１】
非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法が本明細書において提供される。NHP肝細胞の分化状態は、酵素を誘導する薬物で処理した時に代謝酵素の発現および/または代謝活性をアップレギュレートする能力を試験することによって評価することができる。一態様において、リファンピシンで処理した時のCYP450酵素のアップレギュレーションが試験される。リファンピシンの取り込みと放出は肝細胞特異的輸送体タンパク質が存在することを示す。従って、一態様において、前記細胞の分化状態を評価するために、前記細胞はリファンピシンと接触される。さらなる態様において、NHP肝細胞の分化状態および/または肝細胞同一性は、代謝酵素、特に、CYP450酵素の発現レベルを測定することによって確認される。一態様において、NHP肝細胞は、mRNA発現によって確かめられた時にCYP450酵素を発現する。一態様において、CYP450酵素の発現レベルは定量リアルタイムPCRによって測定される。一態様において、NHP肝細胞は代謝酵素、特に、CYP450酵素をアップレギュレートする。さらなる態様において、CYP450酵素は、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A7、CYP3A5、およびCYP1A2からなる群より選択される。
【０１１２】
本明細書に記載の方法によって得られる細胞の分化状態はまた、肝細胞に特異的な細胞表面マーカーを測定することでも評価することができる。肝細胞に特異的な細胞表面マーカーは当技術分野において公知であり、本明細書において説明され、例えば、フローサイトメトリーまたは細胞の免疫細胞化学染色もしくは免疫蛍光染色を用いて測定することができる。一態様において、NHP肝細胞は、免疫蛍光染色によって確かめられた時に、AFP、ALB、AIATより選択される少なくとも1種類の肝臓マーカーを発現する。
【０１１３】
一態様において、肝細胞同一性は、脂質貯蔵を示す細胞内脂質小胞の存在によって確認される。従って、一態様において、NHP肝細胞は脂質小胞を含む。脂質小胞は、本明細書に記載のようにBodipy neutral lipid dyeを用いて染色することができる。一態様において、肝細胞同一性は、肝細胞におけるグリコーゲン貯蔵を示す本明細書に記載のPAS染色を用いて確認される。一態様において、グリコーゲン貯蔵を示すNHP肝細胞が提供される。さらなる態様において、肝細胞同一性は、本明細書に記載のように、肝細胞に特異的な輸送体の存在を示すインドシアニングリーンの取り込み能力を評価することによって評価される。一態様において、NHP肝細胞はインビトロのアッセイにおいてインドシアニングリーンを取り込み、放出する。
【０１１４】
本発明の革新的な方法は、NHP PSCに由来する、特に、NHP IPSCに由来するNHP肝細胞を提供した。NHP IPSCは、当技術分野において公知の方法によって健常NHP個体または罹患NHP個体から作製することができ、本明細書に記載の方法を用いてNHP肝細胞に分化される。本発明の一態様において、NHP個体に特異的な肝細胞を作製するための方法が提供される。
【０１１５】
一態様において、非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法は、(e)前記細胞を剥離させる工程および(f)前記細胞をリプレーティングする工程をさらに含む。インビトロでNHP多能性細胞から生成された肝細胞をリプレーティングする以前の試みは失敗に終わった。当業者は、特に、NHP肝細胞を薬物スクリーニングにおいて適用するために、これらの細胞をリプレーティングできる有利な効率を正しく認識することができる。その結果、本明細書に記載の方法によって生成されるNHP肝細胞は、本明細書に記載のように様々な形式の培養および様々なスケールのアッセイにおいて使用することができ、このことは、研究、開発、および商業的使用にとって重要である。
【０１１６】
従って、インビトロのNHP肝細胞アッセイを準備する方法であって、
(i)本明細書に記載の方法によって調製されたNHP肝細胞を提供する工程;
(ii)NHP肝細胞をアキュターゼと約1時間〜約3時間接触させてNHP肝細胞を剥離させる工程;
(iii)剥離したNHP肝細胞を適切なアッセイ形式でリプレーティングする工程
を含む、方法が本明細書において提供される。
【０１１７】
リプレーティングは、特に、本明細書に記載のように細胞ソーティングと併用されれば、NHP肝細胞の純度をさらに高めるのに使用することができる。一態様において、前記方法は、NHP肝細胞をソーティングする工程を含む。ソーティングの前に、前記細胞は、本明細書に記載のように酵素により解離される。表現型マーカー、例えば、細胞サイズ、酵素活性または1種類もしくは複数種のマーカーの細胞表面発現、あるいはその組み合わせに基づく細胞ソーティングの方法は当技術分野において周知であり、規定されたマーカーを細胞表面に発現する細胞、特に、肝細胞マーカーを細胞表面に発現する細胞を濃縮するための本明細書に記載の方法と組み合わせて使用することができる。従って、インビトロのNHP肝細胞アッセイを準備する方法であって、剥離したNHP肝細胞は、肝細胞マーカーを細胞表面に発現する細胞について濃縮されている、方法が本明細書において提供される。
【０１１８】
細胞ソーティング方法の例には、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)および磁気活性化細胞ソーティング(MACS)を含むフローサイトメトリーが含まれる。好ましい態様において、細胞表面マーカーSCARB1を発現するNHP肝細胞が濃縮される。別の好ましい態様において、本明細書において開示されるようにリプレーティング工程で用いられる肝細胞マーカーはSCARB1である。本明細書に記載の方法は、SCARB1が、NHP肝細胞を濃縮するのに適したマーカーだと初めて同定する。本明細書において示されるフローサイトメトリー分析によって、培養物中のSCARB1陽性細胞を、全細胞に対して40％未満から60％まで、またはそれより多く、特に、全細胞に対して20％未満から80％まで、またはそれより多く濃縮できることが証明された。SCARB1陽性画分にある細胞の大多数は典型的な肝細胞形態を示す。ソーティングされた細胞またはソーティングされていない細胞の遺伝子発現分析から、SCARB1陰性細胞と比較して、SCARB1陽性細胞の肝細胞特異的遺伝子の発現レベルの方が高いことが明らかになる。このことからSCARB1は肝細胞濃縮マーカーとして有用なことが確かめられる。
【０１１９】
従って、表面マーカーSCARB1を発現する細胞の磁気関連細胞ソーティング(magnetic associated cell sorting)(MACS)を用いて肝細胞を精製する方法が提供される。この方法は、肝細胞を、例えば、スクリーニング用途、例えば、ハイスループット候補薬物化合物スクリーニングに適した培養容器形式へのリプレーティングのために濃縮する。この目的のために、例えば、慢性薬物毒性を評価することを目的とした、肝細胞の長期培養を可能にするコーティングマトリックスが本明細書において提供される。本明細書に記載の方法によって得られた濃縮されたNHP肝細胞は、ラミニン上、コラーゲン上、または好ましくはマトリゲル上にリプレーティングすることができる。一態様において、NHP肝細胞は、本明細書に記載のようにマトリゲルサンドイッチ培養物としてリプレーティングされる。
【０１２０】
本発明の特定の態様では、NHP多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、
(a)フィーダーフリー培養で化学的に規定された培地中にNHP多能性幹細胞を提供する工程;
(b)多能性幹細胞をWntシグナル伝達アクチベーターと接触させて内胚葉細胞を生成する工程;
(c)内胚葉細胞をBMP4およびFGF2またはFGF10と接触させて未熟NHP肝細胞を生成する工程;ならびに
(d)未熟NHP肝細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させてNHP肝細胞を生成する工程;
(e)NHP肝細胞をアキュターゼと約1時間〜約3時間接触させてNHP肝細胞を剥離させる工程であって、剥離したNHP肝細胞はSCARBI陽性細胞について濃縮されている、工程;ならびに
(f)剥離したNHP肝細胞を適切なアッセイ形式でリプレーティングする工程
を含む、方法が提供される。
【０１２１】
重要なことに、本発明の方法は、本明細書に記載のように肝細胞同一性をもつ細胞を高収率でNHP肝細胞を提供する。肝細胞同一性は、本明細書に記載の方法を用いて評価することができる。本明細書において示される革新的な方法は、全細胞に対して10％超、20％超、30％超、40％超、50％超、60％超、70％超、好ましくは、80％超の収率で、NHP IPSCなどのNHP多能性幹細胞を肝細胞に分化させるのに適している。一態様において、本明細書に記載の方法によって生成されるNHP-IPSC由来肝細胞は、培養物中の全細胞に対して、10％超のSCARBI陽性細胞、20％超のSCARBI陽性細胞、30％超のSCARBI陽性細胞、40％超のSCARBI陽性細胞、50％超のSCARBI陽性細胞、60％超のSCARBI陽性細胞、70％超のSCARBI陽性細胞、好ましくは、80％超のSCARBI陽性細胞の収率で提供される。これらのNHP-IPSC由来肝細胞は、特徴的な肝細胞形態と、肝細胞特異的マーカー、特に、CYP酵素の遺伝子発現およびタンパク質発現を示す。機能レベルでは、脂質およびグリコーゲンの貯蔵、輸送体活性、ならびにCYP酵素発現の薬物誘導性アップレギュレーションを示す細胞が提供される。
【０１２２】
一態様において、化学的に規定された培地中のフィーダーフリーNHP肝細胞培養物が提供される。一態様において、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞が提供される。健常個体または罹患個体に由来するNHP肝細胞は、例えば、脂肪肝および肝硬変のような疾患の病態生理、ならびに/または、例えば、肝炎ウイルスのような霊長類特異的病原体を研究するための予測インビトロのモデルである。
【０１２３】
示された方法において用いられる培地は、完全に規定されている。規定されていない成分が存在しないことは、本明細書に記載の方法の再現性およびロバストネスを保証するのに重要である。従って、本発明の方法から得られるNHP肝細胞は化合物スクリーニングおよび疾患モデル化にかなり適している。
【０１２４】
さらなる局面において、NHP肝細胞のバイオバンクの作製が想定される。一態様において、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞のバイオバンクが提供される。一態様において、異なるNHP個体から得られた異なる肝細胞集団を含むバイオバンクが作製される。NHP個体は健常でもよく、罹患していてもよい。一局面において、異なるNHP個体から得られたNHP肝細胞のバイオバンクは、NHP集団間の遺伝的変異、特に、薬物代謝に関する遺伝的変異をモデル化するのに用いられる。本明細書で使用する「バイオバンク」という用語は、異なる個体または種から採取された生物学的試料のライブラリーを意味する。本明細書に記載の方法によって得られた肝細胞は、DMSOなどの凍結保護剤の存在下で液体窒素中で保管することによって凍結保存することができる。標本および関連データの保管されたコレクションは、疾患の病態生理を調べることをねらう研究を目的とするか、または本明細書に記載のように創薬および毒性スクリーニングを目的とする。
【０１２５】
NHP-PSC由来肝細胞は、研究および開発、例えば、創薬およびスクリーニングにおける様々な用途のための生理学的に妥当なインビトロの肝臓系を提供する。このインビトロの肝臓系は拡張可能であり、従って、動物を屠殺する必要なくハイスループットスクリーニングするのに適している。さらに、提供される方法は、適切な任意の数の肝細胞を生成するためにPSCの同じ系列または1クローンでさえ使用できるのでロバストであり、再現性がある。PSCは長期間にわたって容易に凍結および保管することができ、これもまた、この系に再現性があることを説明する。
【０１２６】
さらなる態様において、薬剤開発において使用するための本明細書に記載のNHP PSC由来肝細胞が提供される。一態様において、薬物毒性を評価するためのNHP PSC由来肝細胞の使用が提供される。本明細書に記載の方法に従って提供されるNHP肝細胞は、肝毒性について試験しようとする化合物と接触される。NHP肝細胞は、試験化合物との規定されたインキュベーション期間後に生存率について評価される。一態様において、化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、(i)本明細書に記載の方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞を前記化合物に曝露する工程;および(ii)毒性の徴候に対して1つまたは複数の成熟NHP肝細胞をモニタリングする工程を含む、方法が提供される。さらなる態様において、化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、(i)本明細書に記載の方法に従って調製された1つまたは複数の肝細胞を前記化合物に曝露する工程であって、前記化合物が肝細胞によって代謝される、工程;(ii)結果として生じた前記化合物の代謝産物を1つまたは複数の非肝細胞と接触させる工程;および(iii)代謝産物によって誘導される変化があるかどうか1つまたは複数の非肝細胞をモニタリングする工程を含む、方法が提供される。
【０１２７】
なおさらなる態様において、本明細書に記載のNHP PSC由来肝細胞は、アンチセンス療法(例えば、LNA)に基づく治療様式の毒性、オフターゲット、および/または効力を評価するためのモデルとして用いられる。特定のDNA配列に関連するか、または標的化される療法または療法戦略について、NHPは、ヒトと高い配列相同性(約98％)があるために唯一の妥当な種であることが多い。従って、ヒト療法における使用のためにLNAの毒性、オフターゲット、および/または効力を評価する方法であって、特定のLNAによって標的化されるNHP配列が、それぞれのヒト配列と少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列相同性をもつ、方法が提供される。
【０１２８】
一態様において、インビトロの感染モデルのためのNHP PSC由来肝細胞の使用が提供される。本明細書に記載の方法を用いて生成されるNHP肝細胞は、霊長類(ヒトおよび非ヒト霊長類)に対して高い宿主特異性をもつ病原体、または関連するヒト特異的病原体の代理モデルとして使用することができるNHP特異的病原体に感染することができる。特定の態様において、NHP肝細胞は、特に、肝臓感染のためのインビトロのモデルとして、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスからなる群より選択されるウイルスに感染する。
【０１２９】
一態様において、肝臓細胞の機能不全によって引き起こされる疾患のためのインビトロのモデルとしての、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞または本明細書に記載のバイオバンクの使用が提供される。さらなる態様において、肝臓細胞感染のためのインビトロのモデルとしての、本明細書に記載の方法によって得られたNHP肝細胞または本明細書に記載のバイオバンクの使用が提供される。一態様において、感染は、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生生物感染からなる群より選択される。特定の態様において、ウイルス感染は、A型肝炎ウイルス感染、B型肝炎ウイルス感染、C型肝炎ウイルス感染からなる群より選択される。好ましい態様において、ウイルス感染はB型肝炎ウイルス感染である。
【０１３０】
さらなる態様において、この方法によって得られる肝細胞は、ウイルスの生活環、例えば、ウイルスの侵入、ウイルスの複製、およびウイルスの放出をモデル化するための宿主系として使用することができる。ウイルスの生活環を維持するためのインビトロの方法であって、本明細書に記載の方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞をウイルスに曝露する工程であって、ウイルスが1つまたは複数のNHP肝細胞中で複製する、工程を含む、方法が提供される。従って、本発明の細胞はウイルスのインビトロの感染モデルとして使用することができる。
【０１３１】
別の態様において、この方法によって得られる肝細胞は、肝臓疾患、例えば、本明細書において述べられた肝臓疾患を処置するための新たな標的および化合物をスクリーニングおよび評価するのに用いられる。一態様において、本明細書に記載の方法によって得られる肝細胞は罹患対象に由来する。罹患対象に由来する肝細胞を分化させることは、非ヒト霊長類バックグラウンドパラダイムにおいて薬物安全性を早期に評価するための絶好の機会である。別の態様において、この方法によって得られる肝細胞は肝臓のインビトロのモデルとして用いられる。別の態様において、この方法によって得られる肝細胞は、ヒトにおける罹患状態に関連する1つもしくはいくつかの変異を導入することによって、または1つもしくは複数のヒト疾患関連変異を含むPSC系列を使用し、本明細書に記載のようにPSCをNHP肝細胞に分化させることによってヒト疾患をモデル化するのに用いられる。
【０１３２】
別の態様において、この方法によって得られる肝細胞はインビトロのNHP肝細胞アッセイを準備するのに用いられる。このインビトロのNHP肝細胞アッセイは拡張可能であり、従って、動物を屠殺する必要なくハイスループットスクリーニングするのに適している。さらに、アッセイが一致していること保証するために、同じPSCを再利用することができるか、または規定されたPSCの凍結アリコートを続けて使用することができるので、提供される方法はロバストであり、再現性がある。重要なことに、本明細書に記載の方法によって得られたIPSC由来肝細胞を用いて作成されたデータは、本明細書に記載のようにヒトIPSC由来肝細胞を用いて作成された結果と直接比較することができる。一態様において、同じインビトロのアッセイ系において種間で直接比較するための方法と、その後の種特異的反応の分析が提供される。
【０１３３】
上記の態様はいずれも単独で用いられてもよく、組み合わせて用いられてもよい。
【０１３４】
例示的な態様
1.非ヒト霊長類(NHP)多能性幹細胞をNHP肝細胞に分化させるための方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)フィーダーフリー培養で化学的に規定された培地中にNHP多能性幹細胞を提供する工程;
(b)多能性幹細胞をWntシグナル伝達アクチベーターと接触させて内胚葉細胞を生成する工程;
(c)内胚葉細胞をBMP4および線維芽細胞増殖因子と接触させて未熟NHP肝細胞を生成する工程;ならびに
(d)未熟NHP肝細胞をHGF、オンコスタチンM、およびデキサメタゾンと接触させてNHP肝細胞を生成する工程。
2.化学的に規定された培地がMT培地である、態様1の方法。
3.NHP多能性幹細胞が、FGF2およびアクチビンAを含む化学的に規定された培地中に提供される、態様1および2のいずれか一つの方法。
4.NHP多能性幹細胞が、増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)上で提供される、態様1〜3のいずれか一つの方法。
5.NHP多能性幹細胞が約45000細胞/cm2の密度で提供される、態様1〜4のいずれか一つの方法。
6.NHP多能性細胞が、15ng/ml FGF2、10ng/mlアクチビンA、および10μM ROCKキナーゼ阻害剤Y-27632を加えたMT基本培地の増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)コーティングプレート上で45000細胞/cm2の密度で提供される、態様1〜5のいずれか一つの方法。
7.前記培地が1日目〜16日目に毎日交換され、その後は一日おきに交換される、態様1〜6のいずれか一つの方法。
8.工程(b)および(c)が、分化させて3日目〜10日目に、細胞を、B27およびNEAAを含むRPMI1640と接触させる工程を含む、態様1〜7のいずれか一つの方法。
9.Wntシグナル伝達アクチベーターがCP21である、態様1〜8のいずれか一つの方法。
10.工程(b)が、細胞をLy294002およびCP21と接触させて分化を誘導する工程を含む、態様1〜9のいずれか一つの方法。
11.工程(b)が、1日目に、細胞を、100ng/mlアクチビンA、10μM Ly294002、および1μM CP21を含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜10のいずれか一つの方法。
12.工程(b)が、細胞をLDN193189と接触させる工程を含む、態様1〜11のいずれか一つの方法。
13.工程(b)が、分化させて2日目および3日目に、細胞を、100ng/mlアクチビンA、0.25μM LDN193189、および1μM CP21を含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜12のいずれか一つの方法。
14.工程(b)が、分化させて4日目に、細胞を、50ng/mlまたは100ng/mlアクチビンAを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜13のいずれか一つの方法。
15.工程(b)が、細胞をノックアウト血清代替物(KSR)およびDMSOと接触させる工程を含む、態様1〜14のいずれか一つの方法。
16.工程(b)が、分化させて5日目および6日目に、細胞を、50ng/mlまたは100ng/mlアクチビンA、2％ノックアウト血清代替物(KSR)、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜15のいずれか一つの方法。
17.工程(c)の線維芽細胞増殖因子がFGF2またはFGF10である、態様1〜16のいずれか一つの方法。
18.工程(c)が、細胞をBMP4、DMSO、およびFGF2またはFGF10と接触させる工程を含む、態様1〜17のいずれか一つの方法。
19.工程(c)が、分化させて7日目〜10日目に、細胞を、2％KSR、10ng/ml BMP4、10ng/ml FGF2またはFGF10、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜18のいずれか一つの方法。
20.工程(d)が、分化させて11日目〜28日目に、細胞を、20ng/ml HGF、20ng/mlオンコスタチンM、100nMデキサメタゾン、および0.5％DMSOを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜19のいずれか一つの方法。
21.工程(d)が、細胞をNOTCHシグナル伝達阻害剤と接触させる工程を含む、態様1〜20のいずれか一つの方法。
22.工程(d)が、分化させて11日目〜15日目に、細胞を、1μM DAPTを含む化学的に規定された培地と接触させる工程を含む、態様1〜21のいずれか一つの方法。
23.工程(d)が、分化させて11日目〜28日目に、化学的に規定された培地を、SingleQuots(商標)(Lonza)を含むHBM培地に交換する工程を含む、態様1〜22のいずれか一つの方法。
24.細胞がリファンピシンを取り込み、放出し、これが、肝細胞特異的輸送体タンパク質が存在することを示す、態様1〜23のいずれか一つの方法。
25.NHP肝細胞が代謝酵素をアップレギュレートする、態様1〜24の方法。
26.NHP肝細胞が脂質小胞を含む、態様1〜25のいずれか一つの方法。
27.NHP肝細胞が、AFP、ALB、およびαIATからなる群より選択される少なくとも1種類の肝臓マーカーを発現する、態様1〜26のいずれか一つの方法。
28.NHP肝細胞がインビトロのアッセイにおいてインドシアニングリーンを取り込み、放出する、態様1〜27のいずれか一つの方法。
29.NHP肝細胞がCYP450酵素を発現する、態様1〜28のいずれか一つの方法。
30.工程(a)のNHP多能性幹細胞が人工多能性幹細胞(IPSC)である、態様1〜29のいずれか一つの方法。
31.NHP多能性幹細胞が、カニクイザル(マカカ・ファシキュラリス)およびアカゲザル(マカカ・ムラッタ)からなる群より選択される種に由来する、態様1〜30のいずれか一つの方法。
32.化学的に規定された培地中のフィーダーフリーNHP肝細胞培養物。
33.態様1〜31のいずれか一つの方法によって得られたNHP肝細胞。
34.態様1〜31のいずれか一つの方法によって得られたNHP肝細胞のバイオバンク。
35.肝臓細胞の機能不全によって引き起こされる疾患のためのインビトロのモデルとしての、態様1〜31のいずれか一つの方法によって得られたNHP肝細胞または態様34のバイオバンクの使用。
36.肝臓細胞に感染させるためのインビトロのモデルとしての、態様1〜31のいずれか一つの方法によって得られたNHP肝細胞または態様34のバイオバンクの使用。
37.感染が、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、または寄生生物感染からなる群より選択される、態様36の使用。
38.ウイルス感染が、A型肝炎ウイルス感染、B型肝炎ウイルス感染、C型肝炎ウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス感染からなる群より選択される、態様37の使用。
39.ウイルス感染がB型肝炎ウイルス感染である、態様38の使用。
40.化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、(i)態様1〜31のいずれか一つの方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞を化合物に曝露する工程;および(ii)毒性の徴候に対して1つまたは複数の成熟NHP肝細胞をモニタリングする工程を含む、方法。
41.化合物の潜在的な毒性を試験するための方法であって、(i)態様1〜31のいずれか一つの方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞を化合物に曝露する工程であって、化合物がNHP肝細胞によって代謝される、工程;(ii)結果として生じた前記化合物の代謝産物を1つまたは複数の非肝細胞と接触させる工程;および(iii)代謝産物によって誘導される変化があるかどうか1つまたは複数の非肝細胞をモニタリングする工程を含む、方法。
42.ウイルスの生活環を維持するためのインビトロの方法であって、態様1〜31のいずれか一つの方法に従って調製された1つまたは複数のNHP肝細胞をウイルスに曝露する工程であって、ウイルスが1つまたは複数のNHP肝細胞中で複製する、工程を含む、方法。
43.化合物の毒性をインビトロで試験するための、態様1〜31のいずれか一つのいずれかの細胞の使用。
44.ウイルスのインビトロの感染モデルとしての、態様1〜31のいずれか一つのいずれかの細胞の使用。
45.インビトロのNHPアッセイを準備する方法であって、以下の工程を含む方法:
(i)態様1〜31のいずれか一つの方法によって調製されたNHP肝細胞を提供する工程;
(ii)NHP肝細胞をアキュターゼと約1時間〜約3時間接触させてNHP肝細胞を剥離させる工程;
(iii)剥離したNHP肝細胞を適切なアッセイ形式でリプレーティングする工程。
46.剥離したNHP肝細胞は、リプレーティングの前にSCARBI陽性細胞について濃縮されている、態様45の方法。
47.細胞が、蛍光活性化細胞ソーティングまたは磁気活性化細胞ソーティングを用いて濃縮される、態様46の方法。
48.NHP肝細胞がラミニン上、コラーゲン上、またはマトリゲル上でリプレーティングされる、態様45〜47のいずれか一つの方法。
49.NHP肝細胞がマトリゲルサンドイッチ培養物としてリプレーティングされる、態様45〜47のいずれか一つの方法。
50.本質的に本明細書に記載のように用いられる方法。
【実施例】
【０１３５】
以下は、本発明の組成物および方法の非限定的な例である。上記で提供された大まかな説明を考慮すれば、様々な他の態様が実施され得ることが理解される。
【０１３６】
一般的方法
細胞培養
カニクイザル線維芽細胞由来IPSCを、bFGF 15ng/mlおよびアクチビンA 10ng/mlを添加したMT基本培地(DMEM/F12+Glutamaxとインシュリン7μg/ml、モノチオグリセロール450μM、1x脂質濃縮物(Thermo Fisher)、BSA 5mg/ml、亜セレン酸ナトリウム14ng/ml、1x非必須アミノ酸、ヘパリン2mg/ml、トランスフェリン15μg/ml、220μMアスコルビン酸-2-リン酸)(MT完全培地)が入っているMATRIGEL(登録商標)(BD Bioscience)コーティングプレート上で37℃および5％CO2で培養した。細胞をジェントルセルディソシエーションリージェント(Gentle Cell Dissociation Reagent)(GCD)を用いてインキュベートして2〜4日ごとに継代した。
【０１３７】
継代のための細胞の剥離は、シングル細胞またはコロニー中の細胞が必要かどうかに応じて、アキュターゼ(StemCell Technologies)を用いて37℃で1〜3分間、またはジェントルセルディソシエーション(GCD, StemCell Technologies)を用いてRTで7分間行った。
【０１３８】
アキュターゼで解離する場合、細胞をPBSで洗浄し、アキュターゼを37℃で1〜3分間添加し、同じ体積のMT基本培地で不活化し、細胞を収集した。200gで5分間遠心分離した後に、細胞を、10μM Rock阻害剤Y-27632を含むMT完全培地に再懸濁し、播種した。
【０１３９】
GCDで解離する場合、細胞をPBSで洗浄し、GCDをRTで7分間添加し、その後に除去した。細胞をMT完全培地に注意深く再懸濁し、播種した。
【０１４０】
カニクイザルIPSCの肝細胞分化
カニクイザルIPSCを、d0に、MT基本培地 + 15ng/ml FGF2、10ng/mlアクチビンA、および10μM Rock阻害剤Y-27632の増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)(BD Bioscience)コーティングプレート上で45000細胞/cm2の密度で播種した。一般的に、培地を16日目までは毎日、その後は一日おきに交換した。分化用の基本培地はMT基本培地(DMEM/F12+Glutamaxと、インシュリン7μg/ml、モノチオグリセロール450μM、1x脂質濃縮物、BSA 5mg/ml、亜セレン酸ナトリウム14ng/ml、1x非必須アミノ酸、ヘパリン2mg/ml、トランスフェリン15μg/ml、220μMアスコルビン酸-2-リン酸)であるか、または分化させて3日目以後はRPMI1640培地+B27 1:50+非必須アミノ酸1:100に変えた。分化させて1日目に、培地を、100ng/mlアクチビンA、10μM Ly294002、および1μM CP21(Roche GSK3β阻害剤)を含むMT基本培地に変えた。次いで、細胞を100ng/mlアクチビンA、0.25μM LDN193189、および1μM CP21で2日間処理した。4日目に3日間、培地を、サプリメント50ng/mlアクチビンA、2％ノックアウト血清代替物(KSR)、および0.5％DMSOに変えた。このプロトコールを、分化させて4日目に、100ng/mlアクチビンAからなる高アクチビンAの長期工程に変更した。肝臓特異化(specification)を誘導するために、細胞を、2％KSR、10ng/ml BMP4、10ng/ml FGF2またはFGF10、および0.5％DMSOを加えた培地中で4日間維持した。11日目以後からは、肝細胞様細胞を、20ng/ml HGF、20ng/mlオンコスタチンM、100nMデキサメタゾン、および0.5％DMSOを加えたMT培地からなる肝細胞成熟培地中で培養した。変更には、11日目〜20日目の1μM DAPT添加が含まれた。さらなる変更には、11日目の成熟用の基本培地からHBM培地+SingleQuots(商標)(Lonza)への取り替えが含まれた。
【０１４１】
免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析
細胞を4％PFAで固定し、次いで、PBS(Ca2+およびMg2+を含む)に溶解した0.1％TritonXで透過処理した。SuperBlockに溶解した0.1％TritonXでブロックした後に、細胞を一次抗体でRTで1〜2時間または4℃で一晩染色した。使用した抗体を表2に示した。その後に、細胞を洗浄し、Alexa488結合二次抗体(1:1000)、Alexa555結合二次抗体(1:1000)、およびAlexa647結合二次抗体(1:200)(全てmolecular probesから入手)でRTで1〜2時間または4℃で一晩染色した。核をHoechst 1:1000(Molecular Probes)で5分間染色した。インキュベーションの間に、試料をPBS(Ca2+およびMg2+を含む)で洗浄した。Zeiss倒立顕微鏡を用いて細胞を画像化した。ImageJソフトウェアを用いて画像を解析した。OperettaイメージングシステムおよびHarmony画像解析ソフトウェア(PerkinElmer)を用いて染色の定量を行った。
【０１４２】
(表２)免疫蛍光染色に使用した一次抗体と希釈度のリスト
2019521693.tif 000004
【０１４３】
フローサイトメトリーのために、細胞をアキュターゼで剥離させ、0.5x106個の細胞につき、一次抗体(表3)を含有する100μlのMACSランニングバッファー(Miltenyi biotec):5μlの抗CXCR4、5μlの抗トロンボモジュリン、10μlの抗KDR、または2.5μlの抗CD238に入れて暗所、4℃で15分間染色し、0.5x106個を超える細胞については、二倍量の抗体を使用した。その後に、細胞をMACSランニングバッファーで洗浄し、500μlのMACSランニングバッファーに再懸濁した。BD FACS Cantoを用いてフローサイトメトリーを行い、FlowJoソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１４４】
(表３)フローサイトメトリー分析およびMACSソーティングに使用した抗体
2019521693.tif 000005
【０１４５】
リプレーティング
分化させて21日目に、未熟肝細胞を、図9Aに示した期間にわたって異なる試薬で解離し、コラーゲンコーティングウェル上にある、20ng/ml HGF、20ng/mlオンコスタチンM、100nMデキサメタゾン、および0.5％DMSOを加えたMT基本培地に播種し(10μg/cm2)、PBSで1回洗浄した後にプレートした。異なる解離条件は、EDTA/PBSを3時間、GCDを3時間、コラゲナーゼを一晩、ディスパーゼを3時間およびトリプシン0.25％を1時間、アキュターゼを3時間、アキュターゼを一晩、トリプシン0.05％を3時間、ならびにトリプシン0.25％を1時間であった。アキュターゼによる解離をMT基本培地で不活化し、トリプシンをトリプシン阻害剤1:1で阻害した。翌日、付着していない細胞の凝集塊を、125μlの冷肝細胞成熟培地+125μlの無希釈増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)(GFR-MG, BD Bioscience)に移した。4時間後に、凝集塊をMATRIGEL(登録商標)に埋め込むために100μlの培地を添加した。
【０１４６】
分化させて22日目に各解離試薬による剥離を行い、DAPT (Calbiochem)で高度に分化させたか、またはDAPTを添加しなかった。GFR-MG 1:40をコラーゲンコーティングウェル上にプレートする直前に培地に添加した。それぞれのウェルをトリプシン0.25％で15分間剥離し、500μlのPBS(Ca2+およびMg2+を含まない)添加後に再懸濁し、遠心分離し、リプレーティングした。同じ手順をアキュターゼで1時間行った。それぞれのウェルをアキュターゼで1時間剥離させ、500μlのPBS(Ca2+およびMg2+を含まない)添加後に再懸濁し、遠心分離し、コーティングされていない24ウェルプレート上にリプレーティングした。細胞を1時間付着させ、上清を採取し、細胞を、GFR-MGを添加したコラーゲンコーティングウェル上にプレートした。コーティングされていないウェルにある細胞も培養した。
【０１４７】
前述した全てのリプレーティング実験について、細胞を細胞培養皿の増殖面積について2:1の比で移した(例えば、2x6ウェルからの肝細胞を1 6ウェルに移した)。1日おきに培地の50％を肝細胞成熟培地と交換した。
【０１４８】
以下の分化をB6プレートで行った。細胞を以下の条件:アキュターゼを1時間、トリプシン0.25％を15分間、または肝細胞コロニーを手で単離する、のうちの1つを用いて解離した。細胞を前記のように2:1の比で移した。最初の培地交換についてはGFR-MGを培地に1:40で添加した。培地交換を毎日行った。
【０１４９】
磁気活性化細胞ソーティング
肝細胞を分化させて22日目または29日目に、SCARB1陽性細胞の磁気活性化細胞ソーティング(MACS)を行った。細胞をアキュターゼで剥離させ、100μMセルストレーナーで濾過し、遠心分離し、計数のために冷MACSランニングバッファーに再懸濁した。200rpmで5分間遠心分離した後に、細胞を、1x106個の細胞につき、5μlの抗SCARB1-PE抗体を加えた95μlの緩衝液に再懸濁し、4℃、暗所で15分間インキュベートした。細胞を、10x体積のMACSランニングバッファーを添加することによって洗浄し、遠心分離した。細胞を、1x107個の細胞につき80μlの冷MACSランニングバッファーおよび20μlの抗PEマイクロビーズ(Miltenyi Biotec)に再懸濁し、暗所で15分間インキュベートした。細胞を、10x体積のMACSランニングバッファーを添加することによって洗浄し、遠心分離し、500μlの緩衝液に再懸濁し、70μMセルストレーナーで濾過し、autoMACSpro separator(Miltenyi)を用いてMACSに供した。全画分を計数し、1試料につき1x105個の細胞をフローサイトメトリー分析に供し、SCARB1+細胞を、22/29日目の分化培地が入っているプレート上に100'000〜200'000細胞/cm2の密度で播種した。以下のコーティング手順:ラミニン521(20μg/ml)、コラーゲン(10μg/cm2)、および増殖因子低減MATRIGEL(登録商標)(1:20希釈)を使用した。細胞付着を高めるために、プレートを300rpmで3分間遠心分離した。播種して24時間後にMATRIGEL(登録商標)サンドイッチコーティングを行った。細胞から培地を除去し、1:20に希釈したGFR-MGを含有する冷肝細胞成熟培地と取り替えた。細胞を37℃、5％CO2で1時間インキュベートし、次いで、2x体積の予め温めた肝細胞成熟培地を添加した。
【０１５０】
分化肝細胞の染色
BODIPY染色
分化肝細胞中にある脂質滴をBodipy neutral lipid dye(Invitrogen, D3922)で染色した。Bodipy溶液を培地で1:1000に希釈し、細胞上で37℃で20分間インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、Bodipy蛍光を、蛍光顕微鏡を用いて分析した。
【０１５１】
PAS染色
分化させて28〜30日目の細胞を、水に溶解した4％パラホルムアルデヒドで10分固定し、二回蒸留水(double distilled water)で1回洗浄した。その後に、細胞をPAS染色キット(Sigma-Aldrich):1％過ヨウ素酸溶液で5分間染色し、二回蒸留水で5回洗浄し、シッフ溶液と15分間インキュベートし、水道水で5回洗浄した。
【０１５２】
インドシアニングリーンの取り込み
インドシアニングリーン粉末(ICG, Sigma)を100mg/mlでDMSOに新たに溶解し、次いで、1mg/mlの最終濃度で分化肝細胞の培養培地に添加した。37℃で60分間インキュベートした後に、ICGを含む培地を捨て、細胞をPBSで3回洗浄し、新たな培養培地を添加した。ICGの細胞取り込みを顕微鏡で調べた。ICGの放出をモニタリングするために、ウェルをさらに24時間培養した。
【０１５３】
CYP-P450酵素の遺伝子発現分析
アッセイを行う日の前日に、5％FBS、0.5％ペニシリン/ストレプトマイシン、ヒト組換えインシュリン6.25μg/ml、ヒトトランスフェリン6.25μg/ml、亜セレン酸6.25μg/ml、BSA 1.25mg/ml、リノール酸5.35μg/ml、GlutaMAX 2mM、HEPES pH7.4 15mM、DMSOに溶解した0.1μMデキサメタゾンを加えたWilliams E培地中で初代カニクイザル肝細胞を培養した。初代肝細胞およびカニクイザルIPSC由来肝細胞をDMSO、リファンピシン、デキサメタゾンで処理し、CYPアッセイおよびqRT-PCR用のRNA単離に供した。
【０１５４】
CYP-P450-Gloアッセイ
カニクイザルIPSCに由来する細胞のCYP-P450活性を確かめるために、正の対照として、細胞分化した細胞ならびに初代カニクイザル肝細胞を24ウェルプレート中で培養した。細胞を、培養培地(サプリメントを含まないMT基本)に溶解したDMSO 1:200、25μMリファンピシン、または50μMデキサメタゾンで24時間処理した。その後に、P450 Gloアッセイキット(Promega)を使用し、製造業者の説明書に従ってCYP3A4活性があるかどうかCYP活性を測定し、発光を測定した。細胞処理を2回繰り返して行い、2番目のプレートをRNA単離に供した。
【０１５５】
遺伝子発現分析
24ウェルプレートの1ウェルにつき350μlの、β-メルカプトエタノールを1:100で加えたRLT溶解緩衝液(Qiagen)中で細胞を溶解し、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いて、任意のDNアーゼ消化工程と、30μlの水を用いた溶出を含む製造業者の説明書に従ってRNAを単離した。トランスクリプターファーストストランドDNA合成キット(Transcriptor first strand DNA synthesis Kit)(Roche)を用いて、任意の変性工程を含むProcedure Bについての製造業者の説明書に従ってcDNAへの転写を行った。
【０１５６】
qRT-PCR用のプライマー(フォワードおよびリバース)ならびにプローブ(UPL)を表4に示した。UPLプローブは、Roche Diagnostics(lifescience.roche.com)からの市販のプローブである。
【０１５７】
qPCRを、10μl反応体積を含む384ウェルプレート中で行った。1試料につき、それぞれ5.6ngのcDNAまたは対照RNAを、それぞれ0.4μMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、0.2μM UPLプローブ、ならびに1x LightCycler 480 Probes Masterと組み合わせて使用した。実験を技術的に3回繰り返して(technical triplicate)行った。表5に示したプログラムを用いてRoche LightCycler-480システムを動かした。
【０１５８】
(表４)CYP-P450酵素の遺伝子発現分析に使用したTaqmanプライマーおよびプローブ
2019521693.tif 000006
【０１５９】
(表５)qRT-PCR分析用のLightCyclerプログラム
2019521693.tif 000007
【０１６０】
肝毒性アッセイ
NHP-IPSC由来肝細胞をMACSを用いて濃縮し、前記のようにマトリゲルサンドイッチ条件でリプレーティングした。肝毒性化合物に対する細胞反応を評価するために、細胞を100μMトログリタゾン(Sigma)で24時間処理した。細胞生存率をWST-1試薬(Sigma)を用いて測定した。10μlのWST-1試薬を培地に直接添加し(1:10希釈)、細胞を37℃、5％CO2で4時間インキュベートした。プレートを15秒間撹拌し、405nmでの吸光度を測定した。
【０１６１】
実施例1
NHP-IPSCから肝細胞を作製するためのプロトコールの確立
NHP-IPSCをフィーダーフリー培養するための培養条件
NHP-IPSCを肝細胞に分化させるために、本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から肝細胞を得るための標準的なプロトコールを試験した。このプロトコールは、フィーダーフリー条件で培養したヒト多能性幹細胞用に開発された(Cell Stem Cell. 2013 Feb 7;12(2):238-51. doi: 10.1016/j.stem.2012.11.011. Epub 2012 Dec 13. A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models. Ding Q1 & Cowan CA et al.)。しかしながら、これらの培養条件では、NHP-IPSCは内胚葉に拘束されず、神経系列に分化した。カニクイザルIPSCの神経拘束はまた、ヒト多能性幹細胞に用いられる標準的な培養条件でも既に観察された。従って、ヒトIPSC用に確立した分化用ならびに多能性細胞用の培養条件はNHP-IPSCに適しておらず、NHP細胞の分化プロトコールはヒト細胞とは異なる基準を満たす必要がある。まず最初に、本発明者らは、サル胚性幹細胞用に開発された培養系を改良することによってNHP-IPSC用のフィーダーフリー培養条件を開発した。Ono, T. et al. A single-cell and feeder-free culture system for monkey embryonic stem cells. PLoS One 9, e88346, doi:10.1371/journal.pone.0088346 (2014)。この研究では、規定された培地(「MT培地」)をコラーゲンコーティングと組み合わせて使用した。本発明者らは、多能性マーカーOCT4、SOX2、NANOGの多能性マーカーが免疫染色され、神経外胚葉性マーカーSOX1が陰性染色されることで示されたように、NHP-IPSCを多能性状態で培養するにはMT培地とMATRIGEL(登録商標)コーティングの組み合わせが最も適していると分かっていたので、MT培地をMATRIGEL(登録商標)コーティングと組み合わせた(図1)。従って、下記の分化アプローチについては、これらの条件下で培養したNHP-IPSCを使用した。
【０１６２】
NHP-IPSCにおける内胚葉誘導
インビボにおいて、肝細胞は、肝内胚葉に分化し、さらに肝細胞に分化する内胚葉系列から生じる。多能性幹細胞から肝細胞を得るためには、効率的な内胚葉誘導が重要な工程である。ヒトPSCでは、内胚葉形成は規定された培地条件で高濃度のアクチビンAによって誘導することができる。しかしながら、これらの条件はNHP-IPSCでは予想される効果を示さなかったので、本発明者らは、サル幹細胞において内胚葉拘束を誘導するために、増殖因子と基本培地と細胞密度の様々な組み合わせを試験した。重要なことに、サルIPSCには外胚葉拘束に向かう傾向があるので、本発明者らは、外胚葉を阻害し、内胚葉形成を強化するWntシグナル伝達の活性化を試験した。さらに、本発明者らは、ヒト細胞に用いられる標準的な培地(例えば、RPMI)がサル細胞では外胚葉形成を促進するように見えたので、内胚葉拘束に及ぼすMT基本培地の影響を分析した。
【０１６３】
分化させて4日目および7日目に、内胚葉マーカーFOXA2およびSOX17について陽性の細胞数を求めることによって内胚葉特異化を分析した。播種している細胞数に関して、最良の結果は45'000細胞/cm2を用いた時に得られ、基本培地としてRPMI培地中で分化した場合、約53％のSOX17・FOXA2二重陽性細胞があり、基本培地としてMT培地培地中で分化した場合、63％の二重陽性細胞があった。この細胞密度を、内胚葉形成に及ぼす様々な培地組成物の影響を評価する、さらなる実験において使用した(図2は、これらの実験の図で示した全体像を示す)。4日目に、本発明者らは、RPMI培地よりもMT培地で多くのFOXA2・SOX17陽性細胞を検出した。7日目でも同様の結果が観察されたが、7日目に観察された2種類の培養条件の違いは4日目に観察されたものほど大きくなかった(図3)。従って、NHP IPSCにおいて内胚葉拘束を誘導するための最適な条件として、基本培地であるMT培地と45000細胞/cm2の播種数の組み合わせが選択された。
【０１６４】
次に、本発明者らは、肝内胚葉特異化ならびに肝細胞分化に最適な条件を評価しようと努力した。これもまた、本発明者らは、NHP-IPSCに理想的な培地組成物を突き止めることに焦点を当てた。なぜなら、以前の実験から、ヒト細胞に確立した培地(例えば、HBM培地)は適していないと分かっていたからである。
【０１６５】
従って、分化をMT培地またはRPMI培地のいずれかで行い、成熟をMT培地またはHBM培地のいずれかで行った(図2)。
【０１６６】
分化させて15日目のα1ATおよびAFPの発現を肝細胞拘束マーカーとして使用し、21日目のALBの発現を肝細胞成熟マーカーとして使用した。様々な培地の組み合わせを比較することによって、条件MT/MTおよびRPMI/MTにおいて陽性細胞数が最も多いことが分かった。条件MT/HBMおよびRPMI/HBMにおいて染色された細胞はほとんどなかった。このことから、ヒト肝細胞に開発されたHBM培地はNHP細胞に適していないことが分かった(図4A)。
【０１６７】
このことは、分化させて28日目の分化細胞の形態を分析することでも確認された。広範囲の肝細胞がMT/MT条件およびRPMI/MT条件に存在し、その形態および脂質滴の存在によって認識することができた。MT/HBM条件およびRPMI/HBM条件では、肝細胞はほとんど生じず、その代わりに、形成した細胞は線維芽細胞様形態を示したか、または嚢胞様構造を形成した(図4B)。
【０１６８】
実施例2
肝細胞分化の最適化
肝細胞拘束に最良の条件として理想的な播種数と培地の組み合わせMT/MTが確かめられたので、本発明者らは、このプロトコールにおいて増殖因子と低分子の様々な組み合わせを試験することによって、このプロトコールをさらに最適化しようと努力した。
【０１６９】
従って、本発明者らは、内胚葉拘束のある細胞の量を増やすことが示されている高アクチビンAの長期添加の影響を試験した。第2に、FGF10が肝細胞分化を改善できると報告されていたので、FGF2添加ではなくFGF10処理を試験した。Ogawa, et al.. Development. 2013; 140: 3285-3296。第3に、Notchシグナル伝達が胆管形成に関与する(Jin, et al. Dongwuxue Yanjiu 2011; 32: 391-395; Wang, T. et al. Cell Tissue Res. 2014; 357: 173-184)。Notchシグナル伝達を阻害するためにDAPTが添加すると、胆管細胞様細胞の形成が阻止される可能性がある。従って、11日目〜20日目でのDAPT添加も試験した。
【０１７０】
3つ全ての改良の組み合わせを用いて細胞を分化させた(図5)。分化させて21日目に、分化の効率を、2つの異なる定量方法を用いて分析した。第1に、ALB陽性細胞で覆われた面積を求め、第2に、典型的な肝細胞形態をもつ細胞の面積を評価した(図6)。
【０１７１】
結果から、FGF2で処理すると、FGF10で処理するよりも多くのALB陽性細胞が生じたことが分かる。FGF2と組み合わせた高アクチビンA処理および低アクチビンA処理を比較することによって、長期の高アクチビンA処理には多くの肝細胞様細胞があることが分かった。分化させて11日目〜20日目でのDAPT処理によって、分化効率の大幅な増加は誘導されなかった。しかしながら、DAPT添加後に細胞はさらに均一に分布していることが観察された。ALB染色面積の分析から、Act100/FGF2/+DAPT条件は3つの反復実験の間で分散が最も小さいことが分かった。従って、この組み合わせは、約20％のSCARB1陽性細胞につながる、肝細胞分化に最も効率的なアプローチだと確かめられた。
【０１７２】
実施例3
NHP-IPSC由来肝細胞の特徴付け
実施例1において前述したように、NHP-IPSC由来肝細胞は肝細胞形態を示し、AFP、ALB、およびα1ATなどの特徴的なマーカーを発現した。この細胞をさらに特徴付けるために、本発明者らは典型的な肝臓機能の能力を分析した(図7)。Bodipy染色から、肝細胞形態をもつ細胞には、脂質貯蔵の能力を示す非常に多くの細胞内脂質小胞が存在することが分かった。同様に、PAS染色によってグリコーゲン貯蔵を視覚化することができた。これらの結果から、NHP-IPSC由来細胞は典型的な肝臓貯蔵機能を取り込んだたことが示唆される。さらに、細胞は、肝細胞に特徴的な特異的輸送体タンパク質の存在を必要とするプロセスであるインドシアニングリーンの取り込みと放出が可能であった。
【０１７３】
最後に、本発明者らは、CYP450酵素が肝細胞の非常に多くの代謝活性を担っているので、これらのタンパク質の発現を分析した。本発明者らは、この細胞を、CYP酵素発現を誘導することが知られているリファンピシンおよびデキサメタゾンで処理した。定量リアルタイムPCRから、分化した細胞におけるCYP mRNAは、発現レベルが初代肝細胞よりも低いが、未分化NHP-IPSCと比較してアップレギュレートされることが明らかになった(図8A)。このことは、IPSC由来細胞が、対応する初代細胞よりも成熟していないという事実に起因するかもしれない。または、培養物に存在する非肝細胞がシグナルを薄めた可能性があるので、幹細胞由来培養の不均一な組成物がCYP mRNAのシグナル低下の原因となったかもしれない。
【０１７４】
リファンピシンで処理されると初代肝細胞およびIPSC由来肝細胞の両方においてCYP mRNA発現が増加したが、これに対して、デキサメタゾンは初代細胞でしかCYP発現を誘導しなかった(図8B、C)。CYP活性分析の結果はmRNA発現と合致していた。IPSC由来細胞ではリファンピシンで処理されるとCYP活性は増加したのに対して、デキサメタゾンはCYP活性を誘導しなかった(図8D)。
【０１７５】
要約すると、これらの発見から、NHP-IPSC由来細胞は、脂質およびグリコーゲンの貯蔵、輸送体活性、ならびにCYP酵素の発現などの重要な肝細胞特徴を示すことが分かる。
【０１７６】
実施例4
リプレーティングおよびソーティング戦略
特に、肝細胞のように、対応する初代細胞タイプが入手できないか、または限られた量でしか入手できない場合に、幹細胞由来体細胞タイプは薬物スクリーニングのためのインビトロ系になるという大きな可能性を秘めている。しかしながら、薬物スクリーニングでは、適切なプレート形式において細胞を利用できることが必要である。この目的のために、本発明者らは、NHP-IPSCに由来する肝細胞をリプレーティングするための様々な戦略を試験した。成熟肝細胞は高密度のクラスターで増殖する敏感な細胞であるので、リプレーティングアプローチは生存率に影響を及ぼすことなく細胞を効率的に剥離できなければならない。様々な解離試薬を試験した後に、ほとんどの条件は、その後の細胞付着をもたらさないか、または他の細胞を付着させるが、肝細胞を付着させなかった。アキュターゼで3時間解離し、0.05％トリプシンで3時間解離しただけで、アルブミンを発現する肝細胞が付着した(図9A)。さらなる最適化によって、アキュターゼで1時間の処理が、細胞生存率に悪影響を及ぼすことなく効率に解離するのに適していると突き止められた(図9B)。
【０１７７】
薬物スクリーニングにおける細胞モデルの効率的な用途に必要な別の条件は、望ましい細胞タイプの純粋な培養物が作製されることである。この目的のために、本発明者らは、細胞ソーティング戦略に使用することができる肝細胞特異的表面タンパク質を特定しようと努力した。ヒト細胞については、ASGR1を、肝細胞を濃縮するための表面マーカーとして使用できることが示されている(Basma, H. et al. Gastroenterology. 2009; 136: 990-999)。しかしながら、NHP細胞では、分化させて22日目および28日目にASGR1陽性細胞を検出することができず、そのため、他の適切な表面抗原を特定することが必要であった(図10)。いくつかの潜在的な候補の分析から、SCARB1発現が、肝細胞分化プロトコールに供されたNHP細胞において見出されたが、NHP IPSCには存在しなかったので、SCARB1が細胞ソーティング用の潜在的なマーカーだと明らかになった。CD81と一緒にSCARB1は、C型肝炎ウイルスが肝臓細胞に侵入するための受容体であり、従って、成熟肝細胞を示している。
【０１７８】
従って、本発明者らは、NHP-IPSC由来細胞の磁気関連細胞ソーティングを行った。フローサイトメトリー分析から、この戦略はSCARB1陽性細胞を20％から80％まで濃縮することが明らかになった(図11A)。リプレーティングして24時間後に、SCARB1陽性画分中にある細胞の大多数は典型的な肝細胞形態を示した(図11C)。ソーティングされた細胞およびソーティングされていない細胞の遺伝子発現分析から、SCARB1陽性細胞における肝細胞特異的遺伝子の発現レベルの方が高いことが明らかになった。このことから、ソーティング手順によって肝細胞が濃縮されたことがさらに裏付けられた(図11B)。
【０１７９】
次に、本発明者らは、様々なアッセイへの、この細胞系の実現可能性を保証するために、少なくとも5〜7日間リプレーティングした後にIPSC-肝細胞の培養を可能にする条件を突き止めようと努力した。本発明者らは、肝臓細胞タイプに適していることが分かっている様々なコーティング戦略、すなわち、ラミニン、コラーゲン、およびMATRIGEL(登録商標)サンドイッチ培養を試験した(詳細については材料および方法を参照されたい)。細胞は、試験した全てのマトリックスに付着したが、MATRIGEL(登録商標)サンドイッチ培養において細胞形態は他のマトリックスより優れて比較された(図11C)。従って、MATRIGEL(登録商標)サンドイッチコーティングはNHP-IPSC-肝細胞を培養するのに最良の条件だと明らかになった。
【０１８０】
実施例5
インビトロ系としてのNHP-IPSC由来肝細胞の適用
幹細胞由来肝細胞は、基礎研究およびトランスレーショナルリサーチならびに薬剤開発にとって有望なインビトロ系である。重要な応用例は薬物性肝障害の分析、または肝臓特異的病原体の感染のモデル系である。現在のところ初代肝細胞が、この目的のために用いられるが、入手が限られ、異なるドナー/バッチ間でばらつきがあるように様々な欠点と結び付けられている。いくつかの研究では、ヒト幹細胞由来肝細胞をインビトロ系として実施するのに成功したと報告しているが、NHPについては現在のところ初代細胞が唯一の選択肢である。
【０１８１】
薬物性肝障害のモデル系としてのNHP IPSC由来肝細胞の実現可能性を評価するために、本発明者らは、肝細胞を、既知の肝毒性作用を有する低分子であるトログリタゾンで処理した。24時間後にトログリタゾン処理NHP IPSC由来肝細胞では対照細胞と比較して細胞生存率の減少が検出された(図12)。これらのデータから、NHP IPSC由来肝細胞を、肝毒性を評価するためのインビトロ系として使用できることが示唆される。
【０１８２】
次に、本発明者らは、アンチセンス療法用に開発されたオリゴヌクレオチドによって誘導される肝傷害のインビトロ系としてのNHP IPSC由来肝細胞の実現可能性を評価しようと努力した。オリゴヌクレオチドは肝臓に蓄積するので、オリゴヌクレオチド療法は重い肝細胞毒性を引き起こすことがある。インビボの研究の前にオリゴヌクレオチド候補を評価するために、これらの作用をモデル化するための妥当なインビトロ系が必要とされている。従って、NHP IPSC由来肝細胞を、マウスにおいて毒性があることが分かっているオリゴヌクレオチドで処理した。NHP IPSC由来肝細胞においてインビボの毒性を再現することができた。このことから、これらの細胞は、NHPにおいてオリゴヌクレオチド安全性を評価するための妥当なモデルであることが示唆される。重要なことに、おそらく、NHP初代肝細胞が培養中に急速に脱分化するという事実のために、これらの作用は、NHP初代肝細胞ではモデル化できなかった。このことは、IPSCに基づく肝細胞系を用いると、インビトロでオリゴヌクレオチド毒性に反応する細胞を無制限に供給することが可能になるので、この系の有利な点を強調している。
【０１８３】
前述の発明は、明確に理解できるようにするために例示および実施例によっていくらか詳細に説明されたが、説明および実施例が本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。本明細書において引用された全ての特許および科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月1日(2019.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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