(57)【要約】  ペプチド、タンパク質、酵素およびそれらの機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを開示する。本開示のポリヌクレオチドは、肺などの器官に有効に送達され、器官の細胞内で発現され得る。ＤＮＡＩ１またはＤＮＡＨ５などの、本開示のポリリボヌクレオチドは、繊毛の維持および機能、軸糸の機能障害に関連する疾患または状態を治療するために使用することができる。【選択図】図3
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療する方法であって、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードする核酸構築物を含む組成物を前記被験体に投与することを含み、前記核酸構築物が、前記被験体の細胞内での前記軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含み、それによって原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある前記被験体を治療する、方法。
【請求項２】
前記核酸構築物が相補的デオキシリボ核酸構築物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸構築物が、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードする前記コドンを含まない核酸構築物を含む組成物に曝露された細胞内のレベルと比較して、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体を少なくとも約１．５倍増加したレベルでコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記倍数が少なくとも約５である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記構築物の前記コドンが、哺乳動物の軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡと少なくとも７０％相同である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記構築物の前記コドンが、ヒトの軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡと少なくとも７０％相同である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記構築物が、前記軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記コドン配列に隣接する３’または５’非コード領域を含み、前記非コード領域が前記被験体の細胞内での前記タンパク質の発現を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記構築物が、前記軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記コドン配列に隣接する３’非コード領域を含み、前記３’非コード領域が３’キャップ非依存性翻訳エンハンサー（３’−ＣＩＴＥ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コドン配列と前記３’非コード領域または前記５’非コード領域との間に少なくとも１つの中間配列領域をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記コドン配列がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記構築物が、前記軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記コドン配列に隣接する３’非コード領域を含み、前記３’非コード領域がヒストンタンパク質の前記ヌクレオチド配列に由来する３’ステムループ領域を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記コドン配列に隣接する前記３’非コード領域がポリアデノシン尾部を含み、前記ポリアデノシン尾部におけるアデノシンの数が前記軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質の前記翻訳効率を改善する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記コドン配列に隣接する前記３’非コード領域がポリアデノシン尾部を含み、前記ポリアデノシン尾部におけるアデノシンの数が前記軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡの前記半減期を延長させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記コドン配列がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリアデノシン尾部の長さが多くとも２００アデノシンである、請求項１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリアデノシン尾部のある割合がヌクレオチド類似体を含む、請求項１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリアデノシン尾部のヌクレオチドの２０％未満がヌクレオチド類似体である、請求項１２、１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記構築物が非標準的ヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードするヌクレオチドの３０％未満がヌクレオチド類似体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド類似体が、プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジンおよび５−メトキシウリジンからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド類似体がプソイドウリジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド類似体が１−メチルプソイドウリジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヌクレオチド類似体が５−メトキシウリジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヌクレオチド類似体がプソイドウリジンおよび１−メチルプソイドウリジンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）からなる群より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの追加の核酸構築物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、少なくとも４の、前記修飾ポリリボヌクレオチドのリン酸基のモル数に対するカチオン性ポリマーのアミン基のモル数の比を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物が、ナノ粒子またはナノカプセルに製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたはナノエマルジョンに製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物であって、前記核酸構築物が軸糸ダイニン中間鎖１をコードする相補的デオキシリボ核酸を含み、前記組成物が被験体への投与用に製剤化される、組成物。
【請求項３０】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物であって、前記核酸構築物が、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体の細胞内での前記軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含む、組成物。
【請求項３１】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物であって、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記ヌクレオチドの３０％未満がヌクレオチド類似体である、組成物。
【請求項３２】
前記構築物の前記コドンが、哺乳動物ヒト軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質と少なくとも７０％相同である、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記構築物の前記コドンが、ヒト軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質と少なくとも７０％相同である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記構築物が、前記軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記コドン配列に隣接する３’または５’非コード領域を含み、前記非コード領域が前記被験体の細胞内での前記タンパク質の発現を増強する、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記構築物が、前記軸糸ダイニン中間鎖１をコードするコドン配列に隣接する３’非コード領域を含み、前記３’非コード領域が３’キャップ非依存性翻訳エンハンサー（３’−ＣＩＴＥ）を含む、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記構築物が、前記軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記コドン配列に隣接する３’非コード領域を含み、前記３’非コード領域がヒストンタンパク質の前記ヌクレオチド配列に由来する３’ステムループ領域を含む、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記コドン配列に隣接する前記３’非コード領域がポリアデノシン尾部を含み、前記ポリアデノシン尾部におけるアデノシンの数が前記軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質の前記翻訳効率を改善する、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項３８】
前記コドン配列に隣接する前記３’非コード領域がポリアデノシン尾部を含み、前記ポリアデノシン尾部におけるアデノシンの数が前記軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡの前記半減期を改善する、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリアデノシン尾部の長さが多くとも２００アデノシンである、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ポリアデノシン尾部のある割合がヌクレオチド類似体を含む、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ポリアデノシン尾部の核酸の２０％未満がヌクレオチド類似体である、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項４２】
前記構築物がある割合のヌクレオチド類似体を含む、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項４３】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードするヌクレオチドの３０％未満がヌクレオチド類似体である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードするヌクレオチドの２０％未満がヌクレオチド類似体である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ヌクレオチド類似体がプソイドウリジンである、請求項３１または４２に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ヌクレオチド類似体が１−メチルプソイドウリジンである、請求項３１または４２に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ヌクレオチド類似体が５−メトキシウリジンである、請求項３１または４２に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ヌクレオチド類似体がプソイドウリジンおよび１−メチルプソイドウリジンである、請求項３１または４２に記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物が少なくとも１つの追加の核酸構築物をさらに含む、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項５０】
少なくとも１つの追加の核酸構築物が、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸構築物が、被験体への投与用にさらに製剤化される、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記製剤が、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする前記核酸構築物の治療有効量を含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記核酸構築物が、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードするｃＤＮＡを含む、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項２９、３０または３１に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項５５】
請求項２９、３０または３１に記載の核酸構築物を含む単離された核酸。
【請求項５６】
被験体において外因性にコードされたタンパク質を生成するための方法であって、前記被験体の細胞内の、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）からなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸構築物を含む組成物を前記被験体に投与することを含み、前記核酸構築物のコドンが前記被験体の細胞内での前記タンパク質の発現のために最適化されており、翻訳時に前記構築物が前記被験体を治療するポリペプチドを生成する、方法。
【請求項５７】
軸糸ダイニン中間鎖１をコードし、配列番号１４〜１６のいずれか１つを含む核酸構築物を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本発明者らが３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の下で優先権を主張する、２０１６年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３４２，７８４号の継続出願である。
【背景技術】
【０００２】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、各々が糖、リン酸塩および塩基からなる多数の連結したヌクレオチドを含むポリマーである。各ｍＲＮＡポリマーは、ヌクレオチド鎖に沿って遺伝情報を保管する。メッセンジャーＲＮＡポリマーは、遺伝情報を細胞の核内のＤＮＡからタンパク質が作られる細胞質へと伝達する。ｍＲＮＡ中のヌクレオチドの各トリプレットはコドンと呼ばれ、各々のコドンは翻訳されたタンパク質中のアミノ酸の同一性を規定する。
【０００３】
細胞はまた、外因性ＲＮＡを取り込んで翻訳することもできるが、効率的な取込みと翻訳には多くの因子が影響を及ぼす。例えば、免疫系は、多くの外因性ＲＮＡを異物として認識し、それらのＲＮＡを不活性化することを目的とする応答を誘発する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、選択されたタンパク質をコードすることができるポリリボヌクレオチドおよびそれを含む組成物を提供する。一部の場合には、本開示は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療する方法を提供し、この方法は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードする核酸構築物を含む組成物を被験体に投与し、それによって原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療することを含み、この核酸構築物は、被験体の細胞内での軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含む。核酸構築物は、例えば相補的デオキシリボ核酸ＤＮＡ鋳型であり得る。核酸構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードするコドンを含まない核酸構築物を含む組成物に曝露された細胞内のレベルと比較して、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体を少なくとも約１．５倍、少なくとも約５倍または別の適切な量の倍数だけ高いレベルでコードし得る。一部の場合には、構築物のコドンは、ヒトなどの哺乳動物の軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡと少なくとも７０％相同である。
【０００５】
一部の場合には、構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするコドン配列に隣接する５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、この（１または複数の）非翻訳領域は、被験体の細胞内でのタンパク質の発現を増強する。３’非コード領域は、３’キャップ非依存性翻訳エンハンサー（３’−ＣＩＴＥ）を含み得る。一部の場合には、３’非コード領域はまた、コドン配列と３’非コード領域もしくは５’非コード領域との間の少なくとも１つの中間配列領域、またはヒストンタンパク質のヌクレオチド配列に由来する３’ステムループ領域も含み得る。一部の場合には、コドン配列はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。コドン配列（例えばＯＲＦ）に隣接する３’非コード領域は、ポリアデノシン尾部を含んでもよく、ポリアデノシン尾部のアデノシンの数は、軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡの翻訳効率を改善し、半減期を延長させる。一部の場合には、ポリアデノシン尾部の長さは多くとも２００のアデノシンである。ポリアデノシン尾部は、ある割合の化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、ポリアデノシン尾部のヌクレオチドの２０％未満が化学修飾されている。一部の場合には、構築物中の軸糸ダイニン中間鎖１をコードするヌクレオチドの３０％未満が化学修飾されている。ヌクレオチドが化学修飾されたヌクレオチドを含む場合、化学修飾されたヌクレオチドは、プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン、２−チオウリジン、５−ヨードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルシチジンおよび５−ヨードシチジンからなる群より選択され得る。一部の場合には、化学修飾されたヌクレオチドは１−メチルプソイドウリジンである。一部の場合には、修飾されたヌクレオチドはプソイドウリジンである。別の場合には、修飾ヌクレオチドは、１−メチルプソイドウリジンとプソイドウリジンの組み合わせである。原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療するためのポリリボヌクレオチドを含む組成物に加えて、一部の場合には、本開示は、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６���ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ））（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）からなる群より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの追加核酸構築物を含む組成物をさらに提供する。
【０００６】
本開示は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物を提供し、この核酸構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体の細胞内での軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含む。本明細書に記載の組成物は、少なくとも４の、修飾ポリリボヌクレオチドのリン酸基のモル数に対するカチオン性ポリマーのアミン基のモル数の比を含み得る。一部の場合には、組成物は、ナノ粒子またはナノカプセルに製剤化される。別の場合には、組成物は、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーまたはナノエマルジョンに製剤化される。組成物は、被験体への投与用に製剤化され得る。組成物中の核酸構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体の細胞内での軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含み得る。一部の場合には、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするリボヌクレオチドの３０％未満が化学修飾されたヌクレオチドである。一部の場合には、構築物のコドンは、ヒトなどの哺乳動物の軸糸ダイニン中間鎖１  ｍＲＮＡと少なくとも７０％相同である。一部の場合には、構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするコドン配列に隣接する５’または３’非コード領域を含み、この非コード領域は、被験体の細胞内でのタンパク質の発現を増強する。別の場合には、構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするコドン配列に隣接する３’非コード領域を含み、この３’非コード領域は、３’キャップ非依存性翻訳エンハンサー（３’−ＣＩＴＥ）を含む。３’非コード領域は、ヒストンタンパク質のヌクレオチド配列に由来する３’ステムループ領域を含み得る。３’非コード領域は、転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）のヌクレオチド配列に由来する３’三重らせん構造を含み得る。コドン配列に隣接する３’非コード領域は、ポリアデノシン尾部を含んでもよく、ポリアデノシン尾部のアデノシンの数は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質の翻訳効率を改善する。一部の場合には、ポリアデノシン尾部のアデノシンの数は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質の半減期を改善する。一部の場合には、ポリアデノシン尾部の長さは多くとも２００のアデノシンである。一部の場合には、ある割合のポリアデノシン尾部は、化学修飾されたヌクレオチドを含む。一部の場合には、ポリ（Ａ）尾部のアデノシンの２０％未満が修飾されている。一部の場合には、構築物は、ある割合の化学修飾されたヌクレオチドを含む。一部の場合には、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするヌクレオチドの３０％未満が化学修飾されている。化学修飾されたヌクレオチドが存在する場合、それらは、プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン、５−メトキシウリジン、２−チオウリジン、５−ヨードウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジンおよび５−ヨードシチジンからなる群より選択され得る。一部の場合には、化学修飾されたヌクレオチドは、プソイドウリジンまたは１−メチルプソイドウリジンである。一部の場合には、���成物は、少なくとも１つの追加の核酸構築物をさらに含む。この少なくとも１つの追加の核酸構築物は、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）からなる群より選択されるタンパク質をコードする。
【０００７】
本開示はまた、被験体への投与用に製剤化される核酸構築物、ベクターまたは単離された核酸も提供する。一部の場合には、製剤は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物の治療有効量を含む。核酸構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質もしくはその変異体、または上記の追加の核酸構築物のいずれか１つをコードするｃＤＮＡ構築物であり得る。一部の場合には、本開示は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物を提供し、この核酸構築物は、配列番号１４〜１６のいずれか１つを含む。一部の場合には、本開示は、軸糸ダイニン重鎖５をコードする核酸構築物を含む組成物を提供し、この核酸構築物は、配列番号１７〜１８のいずれか１つを含む。
【０００８】
本開示のさらなる態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し、説明する、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、種々の明白な点において変更することができる。したがって、図面および説明は、本質的に例示的であるとみなされるべきであり、限定的とみなされるべきではない。
【０００９】
参照による組み込み
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的および個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１０】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良い理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、キャップされたおよびキャップされていないＤＮＡＩ１  ＲＮＡの産生を示すアガロースゲルである。
【図２】図２は、トランスフェクションの６時間後、２４時間後および４８時間後のＨＥＫ−２９３細胞におけるＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの翻訳を示すウェスタンブロットである。
【図３】図３は、軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）をコードする転写後にポリアデニル化されたＲＮＡ転写物のフラグメントアナライザデータを示す。
【図４】図４は、軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）をコードする転写後にポリアデニル化されたＲＮＡ転写物のフラグメントアナライザデータを示す。
【図５】図５は、軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）をコードするプラスミドのポリアデニル化尾部のサイズのＰＡＧＥデータを示す。
【図６】図６は、非修飾ヌクレオチドを含むインビトロで転写されたＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡのフラグメントアナライザデータを示す。
【図７】図７は、５０％プソイドウリジン（Ψ）を含むインビトロで転写されたＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡのフラグメントアナライザデータを示す。
【図８】図８は、１００％プソイドウリジン（Ψ）を含むインビトロで転写されたＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡのフラグメントアナライザデータを示す。
【図９】図９は、転写後にポリアデニル化された１００％１−メチルプソイドウリジンを含む、インビトロで転写されたＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡのフラグメントアナライザデータを示す。
【図１０】図１０は、ドットブロットによって検出された二本鎖ＲＮＡ含量を示す。
【図１１】図１１は、非修飾ヌクレオチドで転写された、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするインビトロ転写された核酸構築物のＨＰＬＣに基づくヌクレオチド組成分析を示す。
【図１２】図１２は、５０％Ψで転写された、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするインビトロ転写された核酸構築物のＨＰＬＣに基づくヌクレオチド組成分析を示す。
【図１３】図１３は、１００％Ψで転写された、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするインビトロ転写された核酸構築物のＨＰＬＣに基づくヌクレオチド組成分析を示す。
【図１４】図１４は、ＨＥＫ−２９３、Ａ５４９およびＭＬＥ−１５細胞におけるＤＮＡＩ１タンパク質の相対発現レベルを示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＩＬ−６の誘導を示す。
【図１６】図１６は、ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡ変異体でトランスフェクトしたＡ５４９細胞におけるＩＬ−６の誘導を示す。
【図１７】図１７は、ＨＥＫ−２９３、Ａ５４９およびＭＬＥ−１５細胞におけるＤＮＡＩ１タンパク質の相対発現を示すグラフである。
【図１８】図１８は、ＤＮＡＩ１転写物による、Ａ５４９細胞におけるＩＬ−６の誘導を示す。
【図１９】図１９は、ＤＮＡＩ１転写物による、Ａ５４９細胞におけるＩＬ−６の誘導を示す。
【図２０】図２０は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いて測定した様々な量の各ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡによるトランスフェクション後のＡ５４９細胞の細胞生存率を示す。
【図２１】図２１は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いて測定した様々な量の各ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡによるトランスフェクション後のＡ５４９細胞の細胞生存率を示す。
【図２２】図２２は、ＤＮＡＩ１転写物による、ＨｅｐＧ２細胞におけるＩＰ−１０の誘導を示す。
【図２３】図２３は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いて測定した様々な量の各ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡによるトランスフェクション後のＨｅｐＧ２細胞の細胞生存率を示す。
【図２４】図２４は、ＨＥＫ−２９３細胞における軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）タンパク質または他の対照のピーク発現を示す。
【図２５】図２５は、完全に分化したヒト気道上皮細胞におけるＤＮＡＩ１の発現を示す。
【図２６】図２６は、配列番号１４のポリリボヌクレオチド（Ａ）と比較した、配列番号１５のポリリボヌクレオチド（Ｂ）を発現するＤＮＡＩ１における全体的な品質改善を示す。
【図２７】図２７は、配列番号１４のポリリボヌクレオチド（Ａ）と比較した、配列番号１５のポリリボヌクレオチド（Ｂ）のＡ５４９細胞における翻訳効率の全体的な改善を示す。
【図２８】図２８は、既知の濃度のポリ−ＩＣと比較した、配列番号１５のポリリボヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ含量の分析を示す。
【図２９】図２９は、非修飾ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡおよび１００％ｍ１Ψ含有ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡのＨＰＬＣ精製を示す。
【図３０】図３０は、ＨＰＬＣ精製を用いて、Ａ５４９細胞における完全長の非修飾ｍＲＮＡ転写物が富化された画分についての例示的翻訳活性および免疫原性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の様々な実施形態を本明細書で示し、説明しているが、そのような実施形態が単なる例示として提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更および置換が当業者に想起され得る。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替物を使用し得ることが理解されるべきである。
【００１３】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、一般にヒトを指す。一部の場合には、被験体は、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギおよび他の様々な動物などの動物であってもよい。被験体は任意の年齢であってよく、例えば、被験体は、乳児、幼児、小児、青年前期個体、青年期個体、成体または高齢個体であり得る。
【００１４】
本明細書で使用される「疾患」という用語は、一般に、疾病（例えば原発性繊毛機能不全症）または、例えば気道（下気道および上気道、洞、エウスタキオ管、中耳）の内層、様々な肺細胞、ファローピウス管における繊毛の活動、もしくは精子細胞の鞭毛の活動に欠陥を引き起こす別の異常などの、被験体の一部または全部に影響を及ぼす異常な生理学的状態を指す。
【００１５】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、プリンおよびピリミジン塩基、プリンおよびピリミジン類似体、化学的にもしくは生化学的に修飾された、天然もしくは非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドには、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはリボ核酸のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）の配列が含まれ、これらは全て、組換え生産する、人工的に合成する、または天然源から単離および精製することができる。ポリヌクレオチドおよび核酸は、一本鎖または二本鎖として存在し得る。ポリヌクレオチドの骨格は、典型的にはＲＮＡもしくはＤＮＡに見出され得るように、糖類およびリン酸基を含み得るか、または類似体または置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの、天然または非天然のヌクレオチドを含み得る。
【００１６】
本明細書で使用される「ポリリボヌクレオチド」という用語は、一般に、リボ核酸を含むポリヌクレオチドポリマーを指す。この用語はまた、化学的に修飾されたリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチドポリマーを指す。ポリリボヌクレオチドは、天然に見出され得るｄ−リボース糖で形成され得る。
【００１７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、一般に、アミド結合（ペプチド結合）を介して一緒に連結されたアミノ酸残基モノマーからなるポリマー鎖を指す。ポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸の鎖、タンパク質、組換えタンパク質、抗原、エピトープ、酵素、受容体もしくは構造類似体、またはそれらの組み合わせであり得る。本明細書で使用される場合、ポリペプチドを形成するＬ−エナンチオマーアミノ酸の略語は以下の通りである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。ＸまたはＸａａは任意のアミノ酸を示し得る。
【００１８】
本明細書で使用される「操作された」という用語は、一般に、細胞内でポリヌクレオチドを提供するように遺伝的に設計され、操作されたポリヌクレオチド、ベクターおよび核酸構築物を指す。操作されたポリヌクレオチドは、インビトロで部分的または完全に合成することができる。操作されたポリヌクレオチドは、クローニングすることもできる。操作されたポリリボヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ中に天然では存在しないリボヌクレオチドなどの、１つ以上の塩基または糖類似体を含むことができる。操作されたポリリボヌクレオチドは、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ＳｍＹ  ＲＮＡ、スプライストリーダーＲＮＡ（ＳＬ  ＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または別の適切なＲＮＡとして存在するヌクレオチド類似体を含み得る。
【００１９】
概要
本開示は、タンパク質または（１もしくは複数の）タンパク質フラグメントをコードする核酸を用いて、繊毛の維持および機能に関連する状態を治療するための組成物および方法を提供する。多数の真核細胞は、しばしば繊毛または鞭毛と称される付属器を担持し、その内部コアは、軸糸と呼ばれる細胞骨格構造を含む。軸糸は、細胞骨格構造の骨格として機能することができ、構造を支持し、および一部の場合には、構造を屈曲させる。通常、軸糸の内部構造は、繊毛および鞭毛の両方に共通である。繊毛は、気道、生殖器系ならびに他の器官および組織の内層にしばしば認められる。鞭毛は、繊毛と同様に、精子細胞などの細胞を前方に推進することができる尾状構造である。
【００２０】
気道で繊毛が正常に機能しなければ、細菌が気道内に留まり、感染を引き起こし得る。気道において、繊毛は、粘液を咽喉の方へ動かすために協調的な方法で前後に動く。この粘液の動きは、流体、細菌および粒子を肺から排除するのに役立つ。繊毛および鞭毛の機能不全に罹患した多くの乳児は出産時に呼吸の問題を経験し、これは、繊毛が肺から胎児液を除去する上で重要な役割を果たすことを示唆する。幼児期から始まって、繊毛機能不全に罹患した被験体は頻繁な呼吸器感染症を発症し得る。
【００２１】
原発性繊毛機能不全症は、慢性気道感染症、異常な位置の内臓器官、および子供を持つことができないこと（不妊症）を特徴とする状態である。この状態の徴候および症状は、異常な繊毛および鞭毛によって引き起こされる。原発性繊毛機能不全症に罹患している被験体は、しばしば一年中鼻詰まりおよび慢性の咳を有する。慢性気道感染症は、気管支拡張症と呼ばれる状態をもたらす可能性があり、これは、気管から肺に至る気管支と呼ばれる通路に損傷を与え、生命を脅かす呼吸障害を引き起こし得る。
【００２２】
一部の場合には、本開示の核酸構築物、ベクターまたは組成物は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含み、この配列は、被験体の細胞内での軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供する。一部の場合には、核酸構築物、ベクターまたは組成物は、以下に示すように、配列番号１〜９の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’ＵＴＲの遺伝暗号も含む。
【表１】
2019520422.tif 000003
2019520422.tif 000004
【００２３】
原発性繊毛機能不全症、関連状態およびその治療
本開示の方法、構築物および組成物は、原発性繊毛機能不全症候群またはカルタゲナー症候群としても知られる、原発性繊毛機能不全症（ＰＣＤ）を治療する方法を提供する。ＰＣＤは、典型的には、気道（下気道および上気道、洞、エウスタキオ管、中耳）およびファローピウス管の内層の繊毛の活動において、ならびに精子細胞の鞭毛においてしばしば欠陥を引き起こす、まれな、繊毛病性の常染色体劣性遺伝性障害であると考えられている。
【００２４】
原発性繊毛機能不全症を有する一部の個体は、胸部および腹部内に異常な位置を占める器官を有する。これらの異常は、身体の左右の側の相違が確立される胚発生の初期に生じる。原発性繊毛機能不全症を有する人々の約５０％は、内臓の鏡像反転（完全内臓逆位）を有する。例えば、これらの個人では、心臓が体の左側ではなく右側にある。原発性繊毛機能不全症に罹患している人が完全内臓逆位を有する場合、しばしばカルタゲナー症候群を有すると言われる。
【００２５】
原発性繊毛機能不全症を有する人々の約１２％は、心臓、肝臓、腸または脾臓の異常を特徴とする、内臓錯位症候群または内臓錯位として知られる状態を有する。これらの器官は、構造的に異常であるかまたは不適切な位置に存在し得る。さらに、罹患した個人は、脾臓を持たない（無脾症）かまたは複数の脾臓を有し得る（多脾症）。内臓錯位症候群は、胚発生の間に身体の左右の側を確立する問題から生じる。内臓錯位の重症度は、罹患した個人によって大きく異なる。
【００２６】
原発性繊毛機能不全症はまた、不妊症につながる可能性がある。精子細胞を雌性の卵細胞へと前進させるためには、鞭毛の激しい運動が必要となり得る。原発性繊毛機能不全症に罹患した被験体の精子は適切に動かないため、原発性繊毛機能不全症を有する男性は通常、子供の父親になることができない。不妊症は一部の罹患女性で起こり、通常はファローピウス管内の異常な繊毛に関連する。
【００２７】
原発性繊毛機能不全症のもう１つの特徴は、特に幼児における再発性耳感染症（中耳炎）である。中耳炎は、治療しなければ永続的な聴力損失をもたらし得る。耳の感染症は、内耳の異常な繊毛に関連する可能性が高い。
【００２８】
まれに、原発性繊毛機能不全症を有する個人は、おそらく脳内の異常な繊毛のために、脳に液体の蓄積がある（水頭症）。
【００２９】
本開示のポリリボヌクレオチドは、例えば、原発性繊毛機能不全症またはその機能が繊毛の維持および機能に結びつく遺伝子の欠陥もしくは機能不全に関連する任意の他の状態を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療するために使用することができる。原発性繊毛機能不全症に関連する遺伝子の非限定的な例には、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）が含まれる。
【００３０】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＩ１遺伝子は、ダイニンと呼ばれるタンパク質の群（複合体）の一部であるタンパク質を作製するための指示を提供することができる。この複合体は繊毛内で機能する。繊毛の協調的な前後運動は、細胞または細胞周囲の液体を動かすことができ、ダイニンは繊毛が動くのに必要な力を生成する。繊毛のコア（軸糸）内で、ダイニン複合体は、それらの位置に依存してダイニン内腕（ＩＤＡ）およびダイニン外腕（ＯＤＡ）として知られる構造の一部である。ダイニンアームの協調運動は、軸糸全体を前後に屈曲させる。ＩＤＡおよびＯＤＡは、重量によって重鎖、中間鎖または軽鎖として分類されるタンパク質成分（サブユニット）の種々の組み合わせを有する。ＤＮＡＩ１遺伝子は、ＯＤＡに見出される中間鎖１を作製するための指示を提供する。他のサブユニットは、同じかまたは別個の組成物中で被験体に投与される種々の遺伝子から生成され得る。あるいは、他のサブユニットは、ダイニン内腕またはダイニン外腕の機能性成分をコードする単一の核酸構築物によって生成され得る。
【００３１】
ＤＮＡＩ１遺伝子の少なくとも２１の突然変異が、気道感染症、異常な器官配置および子供を持つことができないこと（不妊症）を特徴とする状態である、原発性繊毛機能不全症を引き起こすことが判明している。ＤＮＡＩ１遺伝子突然変異は、中間鎖１の欠落または異常な中間鎖１をもたらす。このサブユニットの正常なバージョンがなければ、ＯＤＡは適切に形成することができず、短縮され得るかまたは欠落し得る。結果として、繊毛は、前後に屈曲するのに必要な力を生成することができない。繊毛の欠陥は原発性繊毛機能不全症の特徴を導く。一部の場合には、本開示は、ＩＶＳ１＋２＿３ｉｎｓＴ（２１９＋３ｉｎｓＴ）突然変異を含む内因性ＤＮＡＩ１タンパク質の機能に取って代わるかまたはこれを補うように操作された核酸を提供する。一部の場合には、本開示は、２番目に最も一般的なＡ５３８Ｔ突然変異を含む内因性ＤＮＡＩ１タンパク質の機能に取って代わるかまたはこれを補うように操作された核酸を提供する。
【００３２】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＩ２遺伝子は、呼吸器繊毛および精子鞭毛のダイニン複合体の一部である。この遺伝子の突然変異は、運動性繊毛の異常、慢性炎症および気管支拡張症をもたらす呼吸器感染、ならびに精子尾部の異常を特徴とする障害である、原発性繊毛機能不全症９型に関連する。
【００３３】
一部の場合には、組成物は、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＡＲＭＣ４遺伝子によってコードされるタンパク質は、アルマジロリピートモチーフ（ＡＲＭ）１０個とＨＥＡＴリピート１個を含み、繊毛軸糸および呼吸細胞の繊毛基部に局在することが示されている。ＡＲＭＣ４遺伝子の突然変異は、呼吸器繊毛の部分的なダイニン外腕（ＯＤＡ）欠損を引き起こし得る。
【００３４】
一部の場合には、組成物は、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。Ｃ２１ｏｒｆ５９遺伝子によってコードされるタンパク質は、ダイニン腕アセンブリおよび運動性繊毛機能において重要な役割を果たすことができる。この遺伝子の突然変異は原発性繊毛機能不全症をもたらし得る。
【００３５】
一部の場合には、組成物は、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＣＣＤＣ１０３遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛の運動性に必要なダイニン結合因子として機能することができる。
【００３６】
一部の場合には、組成物は、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＣＣＤＣ１１４遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛細胞におけるダイニン外腕ドッキング複合体の構成要素として機能することができる。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２０型を引き起こし得る。
【００３７】
一部の場合には、組成物は、コイルドコイルドメイン３９（ＣＣＤＣ３９）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＣＣＤＣ３９遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛拍動を調節する、ダイニン調節およびダイニン内腕複合体のアセンブリとして機能することができる。この遺伝子の欠損は、原発性繊毛機能不全症１４型（ＣＣＤＣ３９）の原因である。
【００３８】
一部の場合には、組成物は、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＣＣＤＣ４０遺伝子によってコードされるタンパク質は、９６ナノメートル（ｎｍ）のリピート長ならびに繊毛および鞭毛における成分の配置（類似性による）を決定する分子定規を形成するためにＣＣＤＣ３９と共に機能することができる。ＣＣＤＣ４０は、ダイニン外腕複合体のアセンブリには必要ないが、ＣＣＤＣ３９の軸糸動員に必要とされ得る。一部の場合には、ＣＣＤ４０およびＣＣＤ３９は、同じかまたは別個の組成物中で被験体に投与される種々の遺伝子から生成され得る。あるいは、ＣＣＤ４０およびＣＣＤ３９は、ダイニン内腕またはダイニン外腕の機能性成分をコードする単一の核酸構築物によって生成され得る。ＣＣＤ４０遺伝子の欠損は、原発性繊毛機能不全症１４型（ＣＩＬＤ１４）の原因である。
【００３９】
一部の場合には、組成物は、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＣＣＤＣ６５遺伝子によってコードされるタンパク質は、精子細胞タンパク質として機能することができる。ＣＣＤＣ６５は、成体精巣、精母細胞および精子細胞において高発現されることが示されている。このタンパク質は、ネキシン−ダイニン調節複合体のアセンブリにおいて重要な役割を果たす。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２７型に関連している。
【００４０】
一部の場合には、組成物は、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。
【００４１】
一部の場合には、組成物は、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＡＦ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛特異的であると考えられ、繊毛構造の安定性のために必要とされ得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１３型に関連している。
【００４２】
一部の場合には、組成物は、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＡＦ２遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛を賦活するダイニン腕複合体のプレアセンブリに関与し得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１０型（ＣＩＬＤ１０）に関連している。
【００４３】
一部の場合には、組成物は、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）をコードする核酸構築物を含み、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＡＦ３遺伝子によってコードされるタンパク質は、軸糸ダイニンの内腕および外腕のアセンブリに必要とされ得、繊毛への輸送のためのダイニン複合体のアセンブリに役割を果たすことができる。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２型（ＣＩＬＤ２）に関連している。
【００４４】
一部の場合には、組成物は、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＡＦ５遺伝子によってコードされるタンパク質は、軸糸ダイニン腕のプレアセンブリまたは安定性のために必要であると考えられ、運動性繊毛および鞭毛を有する生物においてのみ見出される。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１８型に関連している。
【００４５】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＨ１１遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛ダイニン外腕タンパク質を生成することができる。ＤＮＡＨ１１は、呼吸器繊毛の運動に関与する微小管依存性モーターＡＴＰアーゼであると考えられる。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症７型（ＣＩＬＤ７）および内臓錯位症候群に関連している。
【００４６】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＨ５遺伝子は、ダイニンと呼ばれるタンパク質の群（複合体）の一部であるタンパク質を作製するための指示を提供することができる。繊毛の協調的な前後運動は、細胞または細胞周囲の液体を動かすことができる。ダイニンは、繊毛が動くのに必要な力を生成することができる。ＤＮＡＨ５の８０を超える突然変異が原発性繊毛機能不全症に関連している。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症および内臓錯位症候群に関連している。
【００４７】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。
【００４８】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＨ８遺伝子によってコードされるタンパク質は、呼吸器繊毛の力生成タンパク質として機能することができる。ＤＮＡＨ８は、微小管のマイナス端に向かって力を生成することができる。ダイニンはＡＴＰアーゼ活性を有する；力を生成するパワー拍動はＡＤＰの放出時に起こると考えられる。ＤＮＡＨ８は、精子運動性および精子鞭毛アセンブリに関与し得る。ＤＮＡＨ８は、ＡＴＰアーゼおよびｈｄｈｃ９としても知られる。
【００４９】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＮＡＬ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、呼吸器繊毛の力生成タンパク質として機能することができる。ＤＮＡＬ１は、ダイニン外腕複合体の成分として機能することができる。この複合体は、繊毛をＡＴＰ依存的に動かす力を提供する分子モーターとして働く。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１６型（ＣＩＬＤ１６）に関連している。
【００５０】
一部の場合には、組成物は、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＲＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、呼吸器繊毛の力生成タンパク質として機能することができる。ＤＲＣ１は、繊毛ダイニンのアセンブリを調節するネキシン−ダイニン複合体（Ｎ−ＤＲＣ）の中心成分をコードすることができる。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２１型（ＣＩＬＤ２１）に関連している。
【００５１】
一部の場合には、組成物は、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＤＹＸ１Ｃ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、呼吸器繊毛の力生成タンパク質として機能することができる。ＤＹＸ１Ｃ１は、テトラトリコペプチドリピートドメイン含有タンパク質をコードすることができる。コードされるタンパク質は、エストロゲン受容体ならびに熱ショックタンパク質、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０と相互作用することができる。この遺伝子の突然変異は、読み書きの欠損にも関連しており、この遺伝子を含む染色体転座は、発達性失読症に対する感受性に関連する。
【００５２】
一部の場合には、組成物は、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。
【００５３】
一部の場合には、組成物は、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＨＹＤＩＮ遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛運動性において機能し得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症５型（ＣＩＬＤ５）に関連している。
【００５４】
一部の場合には、組成物は、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＬＲＲＣ６遺伝子によってコードされるタンパク質は、いくつかのロイシンリッチリピートドメインを含み、繊毛の運動性に関与すると考えられる。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１９型（ＣＩＬＤ１９）に関連している。
【００５５】
一部の場合には、組成物は、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＮＭＥ８遺伝子によってコードされるタンパク質は、呼吸器繊毛の力生成タンパク質として機能することができる。ＮＭＥ８タンパク質は、Ｎ末端チオレドキシンドメインおよび３つのＣ末端ヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ＮＤＫ）ドメインを含む。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症６型（ＣＩＬＤ６）に関連している。
【００５６】
一部の場合には、組成物は、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＯＦＤ１遺伝子によって生成されるタンパク質の機能はよく理解されていないが、脳、顔、四肢および腎臓を含む身体の多くの部分の初期発生に重要な役割を果たす可能性がある。ＯＦＤ１遺伝子の約１００の突然変異が、この障害の最も一般的な形態である口・顔・指症候群Ｉ型の人々において見出されている。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症およびジュベール症候群に関連している。
【００５７】
一部の場合には、組成物は、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＲＰＧＲ遺伝子によってコードされるタンパク質は、正常な視力および繊毛の機能にとって重要であり得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症、Ｘ連鎖性網膜色素変性症、進行性視力喪失、慢性呼吸器および副鼻腔感染症、再発性耳感染（中耳炎）および難聴に関連している。
【００５８】
一部の場合には、組成物は、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（ＲＳＰＨ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＲＳＰＨ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、雄性減数分裂ならびに軸糸中心対およびラジアルスポークの構築において重要な役割を果たし得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２４型（ＣＩＬＤ２４）に関連している。
【００５９】
一部の場合には、組成物は、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（ＲＳＰＨ４Ａ）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＲＳＰＨ４Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質は、ラジアルスポークヘッドの成分であり得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１１型（ＣＩＬＤ１１）に関連している。
【００６０】
一部の場合には、組成物は、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（ＲＳＰＨ９）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＲＳＰＨ９遺伝子によってコードされるタンパク質は、運動性繊毛および鞭毛におけるラジアルスポークヘッドの成分であり得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症１２型（ＣＩＬＤ１２）に関連している。
【００６１】
一部の場合には、組成物は、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＳＰＡＧ１遺伝子によってコードされるタンパク質は、繊毛ダイニン腕の細胞質アセンブリにおいて役割を果たし得る。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２８型（ＣＩＬＤ２８）に関連している。
【００６２】
一部の場合には、組成物は、ジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）をコードする核酸構築物を含み、被験体の細胞内で翻訳されると、この構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性のある被験体を治療するポリペプチドを生じる。ＺＭＹＮＤ１０によってコードされるタンパク質は、繊毛運動性のための適切な軸糸構築のために、ダイニン内腕および外腕（それぞれＩＤＡおよびＯＤＡ）の軸糸アセンブリにおいて機能することができる。この遺伝子の突然変異は、原発性繊毛機能不全症２２型（ＣＩＬＤ２２）に関連している。
【００６３】
治療は、被験体（例えば疾患を有する患者および／または状態を有する実験動物）を治療することを含み得る。一部の場合には、状態は、原発性繊毛機能不全症（ＰＣＤ）またはカルタゲナー症候群である。一部の場合には、状態は、繊毛として知られる細胞構造内で機能する１つ以上のタンパク質の欠陥に広く関連する。一部の場合には、被験体はヒトである。治療は、疾患の臨床的発症前に被験体に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後に被験体に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症の１分後もしくはそれ以降、５分後もしくはそれ以降、１０分後もしくはそれ以降、３０分後もしくはそれ以降、１時間後もしくはそれ以降、２時間後もしくはそれ以降、３時間後もしくはそれ以降、４時間後もしくはそれ以降、５時間後もしくはそれ以降、６時間後もしくはそれ以降、１２時間後もしくはそれ以降、１日後もしくはそれ以降、１週間後もしくはそれ以降、６ヶ月後もしくはそれ以降、１２ヶ月後もしくはそれ以降、または２年後もしくはそれ以降に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後１分以上、１０分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、１２時間以上、１日以上、１週間以上、１ヶ月以上、６ヶ月以上、１２ヶ月以上、２年以上の期間、被験体に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後２年以内、１２ヶ月以内、６ヶ月以内、１ヶ月以内、１週間以内、１日以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１０分以内または１分以内の期間、被験体に提供され得る。治療はまた、臨床試験においてヒトを治療することを含み得る。
【００６４】
本明細書に記載の操作されたポリリボヌクレオチドを含有する組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。治療適用では、核酸構築物またはベクターは、原発性繊毛機能不全症などの疾患に既に罹患している被験体に、疾患の症状を治癒するまたは少なくとも改善するコードされたポリペプチドの量を提供するのに十分な量で投与することができる。核酸構築物、ベクター、操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物は、疾患を発症する、疾患に罹患するまたは疾患を悪化させる可能性を低減するために投与することもできる。この使用に有効な量は、疾患または状態の重症度および経過、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは（１もしくは複数の）組成物のトランスフェクションの効率、コードされるポリペプチドの標的分子に対する親和性、以前の治療、被験体の健康状態、体重、薬剤に対する応答、ならびに治療する医師の判断に基づいて異なり得る。
【００６５】
一部の場合には、本開示のポリヌクレオチドは、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）などの、原発性繊毛機能不全症に関連するタンパク質に少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％相同であるポリペプチドをコードすることができる。
【００６６】
複数の核酸構築物、ベクター、操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物を、任意の順序でまたは同時に投与することができる。核酸構築物、ベクター、操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物は、同じ標的分子を標的とするポリリボヌクレオチドを含む単一包装中にまたは複数の包装中に、一緒にまたは別々に包装することができる。核酸構築物、ベクター、操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物の１つまたは全部を複数回で投与することができる。同時でない場合、複数の投与の間のタイミングは異なっていてもよい。
【００６７】
核酸構築物、ベクター、操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物は、症状の発症後できるだけ早く被験体に投与することができる。（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物は、疾患または状態の発症が検出されたまたは疑われた後実際的な範囲でできるだけ早く、疾患の治療に必要な期間、例えば約１ヶ月間、約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、または任意の適切な期間、投与することができる。治療期間の長さは各被験体によって異なり得る。
【００６８】
転写物治療のためのｍＲＮＡの安定性を高めるためのコード領域における変化したヌクレオチド使用頻度
オリゴヌクレオチドの加水分解は、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ中の２つのリボヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合の反応性がそれらのヌクレオチドの性質に依存することを示唆する。ｐＨ８．５では、ｓｓＲＮＡドデカマーに包埋された場合のジヌクレオチド切断感受性は、１桁程度変動し得る。ほぼ生理的条件下では、ＲＮＡの加水分解は、通常、５’−オキシアニオン脱離基の反対側の隣接するリン標的中心上の２’−酸素求核試薬によるＳＮ２型攻撃を伴い、２’，３’−環状リン酸および５’−ヒドロキシル末端を有する２つのＲＮＡフラグメントを生じる。これらの段階での骨格は、隣接するホスホジエステル結合上の２’−ＯＨによるＳＮ２型求核攻撃に必要とされる「インライン」コンフォメーションを最も容易にとることができるので、より反応性の高い切断可能なホスホジエステル結合は、５’−ＵｐＡ−３’（Ｒ１＝Ｕ１、Ｒ２＝Ａ）および５’−ＣｐＡ−３’（Ｒ１＝Ｃ、Ｒ２＝Ａ）を含み得る。さらに、インターフェロン調節ｄｓＲＮＡ活性化抗ウイルス経路は、ＲＮアーゼＬエンドリボヌクレアーゼの活性化をもたらすアンキリンリピートに結合する２’−５’オリゴアデニル酸を生成する。ＲＮアーゼＬは、ＵＡおよびＵＵジヌクレオチドにおいてｓｓＲＮＡを効率的に切断する。最後に、Ｕリッチ配列は、Ｔｏｌｌ様受容体７および８ならびにＲＩＧ−Ｉを含むＲＮＡセンサーの強力な活性化剤であり、全体的なウリジン含量の低減を、治療用ｍＲＮＡの免疫原性を低下させるための潜在的に魅力的なアプローチにする。
【００６９】
修飾ｍＲＮＡのコドン内でおよびコドンを越えて、より反応性の５’−Ｕ（Ｕ／Ａ）−３’ジヌクレオチドの数を減少させることを目的とする変化したヌクレオチド使用頻度のスキームは、ＲＮＡの固有の化学的不安定性によって課される制限を部分的に緩和する。同時に、ＲＮＡ転写物中のＵ含量を減少させることは、その免疫原性を低下させる。本開示は、変化したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むＲＮＡ転写物に関する。特に、安定化された治療用ｍＲＮＡをもたらすタンパク質コード領域内の５’−Ｕ（Ｕ／Ａ）−３’ジヌクレオチドの実質的な減少を含む方法を提案する。
【表２】
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【００７０】
核酸構築物、ベクターおよび操作されたポリリボヌクレオチド
本開示は、関心対象の１つ以上のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドなどの核酸分子を提供する。核酸という用語には、ヌクレオチドのポリマーを含有する任意の化合物および／または物質が含まれる。５０％を超えるリボース塩基またはリボヌクレオチド類似体を含むヌクレオチドポリマーは、ポリリボヌクレオチドと称される。ヌクレオチドポリマーは、ＤＮＡＩ１またはＤＮＡＨ５などのタンパク質またはその機能性フラグメントをコードする変化したヌクレオチド使用頻度を使用し得る。操作されたポリヌクレオチドの配列は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ転写物、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、または関心対象の遺伝子の遺伝情報を含む別の適切な核酸に由来し得る。核酸構築物、ベクター、操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物は、変異した遺伝子および多型を保有する核酸に由来し得る。
【００７１】
４つの標準的なリボヌクレオチド、すなわちアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンに加えて、いくつかの細胞ＲＮＡはまた、多くの構造的に多様なリボヌクレオチドを含む。約１００種類の構造的に異なるヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）において同定されている。ｔＲＮＡでは、いくつかのヌクレオチドが、アミノアシル化およびコドン認識の特異性および効率の重要な決定因子であり得る。そのような構造的に多様なリボヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であり得る。一部の場合には、本開示のポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド類似体を含むように操作される。
【００７２】
一部の場合には、核酸構築物、ベクターまたはポリヌクレオチドは、４つの古典的リボヌクレオチドを含むように操作され、被験体に投与された後、転写後修飾され得る。例えば、一部の場合には、本開示は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸の３０％未満がヌクレオチド類似体である、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物、ベクターまたは核酸構築物を提供する。別の場合には、軸糸ダイニン中間鎖１をコードするヌクレオチドの２７．５％未満、２５％未満、２２．５％未満、２０％未満、１７．５％未満、１５％未満、１２．５％未満、１０％未満、７．５％未満、５％未満または２．５％未満がヌクレオチド類似体である。
【００７３】
本開示のポリヌクレオチドを形成することができる例示的な核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの雑種が含まれるが、これらに限定されない。本開示のポリヌクレオチドの少なくとも一部分を形成することができる例示的な修飾ヌクレオチドには、プソイドウリジン（Ψ）および１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
化学修飾は、１つ以上のヌクレオシド上または核酸分子の骨格上に位置し得る。それらは、ヌクレオシド上および骨格結合上の両方に位置することができる。修飾は、インビトロでポリヌクレオチドに組み込むことができる。修飾リボヌクレオチドおよび核酸類似体は、古典的リボヌクレオチドの共有結合修飾によって転写後に導入することもできる。
【００７５】
本開示の核酸構築物、ベクターまたは操作されたポリリボヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン類似体を含み得る。一部の場合には、本開示のポリリボヌクレオチドは、修飾されたウリジンなどの修飾されたピリミジンを含む。一部の場合には、ウリジン類似体は、プソイドウリジン（Ψ）、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、５−メトキシウリジン（ｍｏ５Ｕ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−ブロモウリジン（Ｂｒ５Ｕ）、２’Ｏ−メチルウリジン（Ｕ２’ｍ）、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン（Ｕ２’ＮＨ２）、２’−アジド−２’−デオキシウリジン（Ｕ２’Ｎ３）および２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン（Ｕ２’Ｆ）から選択される。
【００７６】
一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは（１もしくは複数の）組成物は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体を、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードするコドンを含まない核酸構築物を含む組成物に曝露された細胞内のレベルと比較して、少なくとも約１．５倍増加したレベルでコードする。一部の場合には、倍数は、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０または少なくとも約１００である。
【００７７】
ポリリボヌクレオチドは、同じヌクレオチド類似体もしくは修飾ヌクレオチド、または異なるヌクレオチド類似体もしくは修飾ヌクレオチドの混合物を有し得る。ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡにおいて天然に存在するまたは天然には存在しない構造変化を有し得る。様々な類似体または修飾ヌクレオチドの混合物を使用することができる。例えば、ポリヌクレオチド内の１つ以上の類似体は天然の修飾を有することができ、また別の部分はｍＲＮＡ中に天然では見出されない修飾を有する。さらに、いくつかの類似体または修飾リボヌクレオチドは塩基修飾を有することができ、一方他の修飾リボヌクレオチドは糖修飾を有する。同様に、全ての修飾が塩基修飾であるか、または全ての修飾が糖修飾であるもしくはそれらの任意の適切な混合物であることが可能である。
【００７８】
ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドは、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシンおよびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンを含む群から選択され得る。
【００７９】
一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物の少なくとも約５％は、本明細書に記載のヌクレオチドのような天然には存在しない（例えば修飾された、類似体または操作された）ウリジン、アデノシン、グアニンまたはシトシンを含む。一部の場合には、組成物中の修飾ヌクレオチドの１００％が、１−メチルプソイドウリジンまたはプソイドウリジンのいずれかである。一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％は、天然には存在しないウラシル、アデニン、グアニンまたはシトシンを含む。一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物の多くとも約９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％は、天然には存在しないウラシル、アデニン、グアニンまたはシトシンを含む。
【００８０】
本開示の（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプロモーター配列および任意の関連する調節配列を含み得る。プロモーター配列および／または関連する調節配列は、任意の数の修飾または非修飾ヌクレオチド、および任意の数の核酸類似体を含み得る。プロモーター配列および／または任意の関連する調節配列は、例えば少なくとも２塩基または塩基対、３塩基または塩基対、４塩基または塩基対、５塩基または塩基対、６塩基または塩基対、７塩基または塩基対、８塩基または塩基対、９塩基または塩基対、１０塩基または塩基対、１１塩基または塩基対、１２塩基または塩基対、１３塩基または塩基対、１４塩基または塩基対、１５塩基または塩基対、１６塩基または塩基対、１７塩基または塩基対、１８塩基または塩基対、１９塩基または塩基対、２０塩基または塩基対、２１塩基または塩基対、２２塩基または塩基対、２３塩基または塩基対、２４塩基または塩基対、２５塩基または塩基対、２６塩基または塩基対、２７塩基または塩基対、２８塩基または塩基対、２９塩基または塩基対、３０塩基または塩基対、３５塩基または塩基対、４０塩基または塩基対、５０塩基または塩基対、７５塩基または塩基対、１００塩基または塩基対、１５０塩基または塩基対、２００塩基または塩基対、３００塩基または塩基対、４００塩基または塩基対、５００塩基または塩基対、６００塩基または塩基対、７００塩基または塩基対、８００塩基または塩基対、９００塩基または塩基対、１０００塩基または塩基対、２０００塩基または塩基対、３０００塩基または塩基対、４０００塩基または塩基対、５０００塩基または塩基対、少なくとも１００００塩基または塩基対以上を含み得る。プロモーター配列および／または関連する調節配列は、任意の数の修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば多くとも１００００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、１００塩基もしくは塩基対、７５塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、４０塩基もしくは塩基対、３５塩基もしくは塩基対、３０塩基もしくは塩基対、２９塩基もしくは塩基対、２８塩基もしくは塩基対、２７塩基もしくは塩基対、２６塩基もしくは塩基対、２５塩基もしくは塩基対、２４塩基もしくは塩基対、２３塩基もしくは塩基対、２２塩基もしくは塩基対、２１塩基もしくは塩基対、２０塩基もしくは塩基対、１９塩基もしくは塩基対、１８塩基もしくは塩基対、１７塩基もしくは塩基対、１６塩基もしくは塩基対、１５塩基もしくは塩基対、１４塩基もしくは塩基対、１３塩基もしくは塩基対、１２塩基もしくは塩基対、１１塩基もしくは塩基対、１０塩基もしくは塩基対、９塩基もしくは塩基対、８塩基もしくは塩基対、７塩基もしくは塩基対、６塩基もしくは塩基対、５塩基もしくは塩基対、４塩基もしくは塩基対、３塩基もしくは塩基対、または２塩基もしくは塩基対を含み得る。
【００８１】
一部の場合には、プロモーター配列または関連する調節領域中のヌクレオチドの全てよりも少ないヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体または修飾ヌクレオチドである。例えば、一部の場合には、プロモーターまたは関連調節領域中のヌクレオチドの９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％以下。一部の場合には、プロモーターまたは関連調節領域中のヌクレオチドの全てが核酸類似体または修飾ヌクレオチドである。
【００８２】
本開示の（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクター、（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドまたは組成物は、操作された５’キャップ構造を含み得るか、または５’キャップが細胞内でポリリボヌクレオチドに付加され得る。ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）への結合に関与することができ、成熟擬似環状ｍＲＮＡ種を形成するためにＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との結合を介して細胞におけるｍＲＮＡの安定性および翻訳能力の一因となる。５’キャップ構造はまた、核輸送、ｍＲＮＡ安定性の増加、およびｍＲＮＡスプライシングの間の５’近位イントロンの除去を助けることにも関与し得る。
【００８３】
（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、５’末端でキャップされ得、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５’末端の転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’−ＧｐｐｐＮ−３’−三リン酸結合を生成する。キャップ構造は、５’−５’三リン酸架橋を介して第１のヌクレオチドに連結された修飾または非修飾７−メチルグアノシンを含み得る。次いで、この５’−グアニル酸キャップは、メチル化されてＮ７−メチル−グアニル酸残基（キャップ０構造）を生成することができる。ｍＲＮＡの５’末端の末端および／または末端前の転写されたヌクレオチドのリボース糖は、２’−Ｏ−メチル化されていてもよい（キャップ１構造）。グアニル酸塩キャップ構造の加水分解および切断による５’キャップ除去は、分解のためにｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的とし得る。
【００８４】
一部の場合には、キャップは、ｍＲＮＡの５’末端の最初の２つのリボース糖の２’ヒドロキシ基のメチル化を含む、さらなる修飾を含み得る。例えば、真核生物のキャップ１は、第１のリボース糖上にメチル化された２’−ヒドロキシ基を有し、一方キャップ２は、最初の２つのリボース糖上にメチル化された２’−ヒドロキシ基を有する。５’キャップは、ＲＮＡ分子の３’末端と化学的に類似し得る（キャップリボースの５’炭素が結合し、ならびにキャップされた転写物の５’および３’の両末端の遊離３’−ヒドロキシル。そのような二重修飾は、５’エキソヌクレアーゼに対する顕著な耐性を提供し得る。操作されたポリリボヌクレオチドと共に使用できる５’キャップ構造の非限定的な例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（’キャップ０）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮｐ（’キャップ１）およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１ｍｐＮ２ｍｐ（’キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
本開示の修飾ｍＲＮＡに対する修飾は、キャップ除去を防止する非加水分解性キャップ構造を生成し、それにより、効率的な翻訳を促進しながらｍＲＮＡの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解は５’−ｐｐｐ−５’三リン酸結合の切断を必要とするので、修飾されたヌクレオチドをキャッピング反応の間に使用し得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってグアノシンα−チオリン酸ヌクレオチドと共に使用して、５’−ｐｐｐ−５’キャップにおけるホスホロチオエート結合を作製し得る。α−メチルホスホン酸およびセレノリン酸ヌクレオチドなどのさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを使用し得る。さらなる修飾には、糖環の２’−ヒドロキシル基上のｍＲＮＡの５’末端および／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化が含まれるが、これに限定されない。複数の異なる５’キャップ構造を用いてポリリボヌクレオチドの５’キャップを生成することができる。
【００８６】
修飾ｍＲＮＡは、転写後にキャップされ得る。本開示によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本開示によれば、５’末端キャップはグアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシンおよび２−アジド−グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８７】
さらに、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＩＲＥＳ配列は、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始することができる。ＩＲＥＳ配列はまた、唯一のリボソーム結合部位であり得るか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能し得る。２つ以上の機能性リボソーム結合部位を含む操作されたポリリボヌクレオチドは、リボソームによって翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチド（「ポリシストロン性またはマルチシストロン性ポリヌクレオチド」）をコードし得る。本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＩＲＥＳ配列、２つのＩＲＥＳ配列、３つのＩＲＥＳ配列、４つのＩＲＥＳ配列、５つのＩＲＥＳ配列、６つのＩＲＥＳ配列、７つのＩＲＥＳ配列、８つのＩＲＥＳ配列、９つのＩＲＥＳ配列、１０のＩＲＥＳ配列を含み得るか、または別の適切な数が、操作されたポリリボヌクレオチド中に存在する。本開示に従って使用できるＩＲＥＳ配列の例には、限定されることなく、タバコエッチウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）（ＴＥＶ）、ピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（例えばＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＥＭＣＶ）、口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＨＣＶ）、古典的ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ｃｒｉｃｋｅｔ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＣｒＰＶ）由来のものが含まれる。ＩＲＥＳ配列は、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（商標）またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）から入手可能なＩＲＥＳ配列などの市販のベクターから誘導することができる。ＩＲＥＳ配列は、例えば少なくとも１５０塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、または１００００塩基もしくは塩基対であり得る。ＩＲＥＳ配列は、多くとも１００００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、９００塩基も���くは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、１００塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、または１０塩基もしくは塩基対であり得る。
【００８８】
本開示の（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、１つ以上の非翻訳領域を含み得る。非翻訳領域は、任意の数の修飾または非修飾ヌクレオチドを含み得る。遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ポリペプチドに転写されるが翻訳されない。一部の場合には、非翻訳配列は、核酸分子の安定性および翻訳の効率を高めることができる。ＵＴＲの調節特徴は、例えば分子の安定性を高めるために、本開示の修飾ｍＲＮＡ分子に組み込むことができる。特定の特徴は、それらが望ましくない器官部位に誤って差し向けられた場合に、転写物の制御された下方調節を確実にするために組み込むこともできる。一部の５’ＵＴＲは翻訳開始において役割を果たす。５’ＵＴＲは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始する工程に関与するコザック配列を含み得る。コザック配列は、コンセンサスＧＣＣ（Ｒ）ＣＣＡＵＧＧを有することができ、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流に位置するプリン（アデニンまたはグアニン）である。５’ＵＴＲは、翻訳伸長因子の結合に関与する二次構造を形成し得る。一部の場合には、特定の標的器官の豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することによって、本開示の操作されたポリヌクレオチド分子の安定性およびタンパク質産生を増加させることができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリスロポエチンまたは第ＶＩＩＩ因子などの肝臓で発現されるｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入は、肝臓における操作されたポリヌクレオチドの発現を増加させるために用いることができる。同様に、筋タンパク質（ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ハーキュリン）からの５’ＵＴＲの、内皮細胞（Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄細胞（Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１  ｌｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）および肺上皮細胞（ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）のための使用を、所望の細胞または組織における操作されたポリヌクレオチドの発現を増加させるために用いることができる。
【００８９】
他の非ＵＴＲ配列を、本開示のポリリボヌクレオチドの５’（または３’ＵＴＲ）ＵＴＲに組み込むことができる。５’および／または３’ＵＴＲは、ポリリボヌクレオチドの安定性および／または翻訳効率を提供することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を、操作されたポリリボヌクレオチドの隣接領域に組み込むことができる。イントロン配列の組み込みも、ポリリボヌクレオチドの翻訳速度を高めることができる。
【００９０】
３’ＵＴＲは、その中に埋め込まれた一続きのアデノシンおよびウリジンを有し得る。これらのＡＵリッチシグネチャーは、代謝回転速度の高い遺伝子において特に広く認められる。ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、それらの配列特徴および機能特性に基づき、クラスに分類することができる：クラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散したコピーを含む。Ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤはクラスＩ  ＡＲＥを含む。クラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。このタイプのＡＲＥを含有する分子には、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αが含まれる。クラスＩＩＩのＡＲＥはあまり明確には定義されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ｃ−Ｊｕｎおよびミオゲニンは、このクラスの２つのよく研究された例である。ＡＲＥに結合するタンパク質はメッセンジャーを不安定化し得るが、ＨｕＲなどのＥＬＡＶファミリーのメンバーはｍＲＮＡの安定性を高め得る。ＨｕＲは、３つのクラス全てのＡＲＥに結合し得る。ＨｕＲ特異的結合部位を操作によって核酸分子の３’ＵＴＲに組み込むことにより、ＨｕＲ結合、したがってインビボでのメッセージの安定化をもたらすことができる。
【００９１】
３’ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の操作は、操作されたポリリボヌクレオチドの安定性を調節するために使用することができる。ＡＲＥの１つ以上のコピーを操作によってポリリボヌクレオチドに導入し、ポリリボヌクレオチドの安定性を調節することができる。ＡＲＥは、細胞内の安定性を高め、それによって得られるタンパク質の翻訳および産生を増加させるために同定する、除去するまたは変異させることができる。トランスフェクション実験は、操作されたポリリボヌクレオチドを用いて、関連する細胞株において実施することができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、種々のＡＲＥ操作分子で細胞をトランスフェクトすることができ、関連するタンパク質に対してＥＬＩＳＡキットを用いて、トランスフェクション後６時間、１２時間、２４時間、４８時間および７日目に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
【００９２】
非翻訳領域は任意の数のヌクレオチドを含み得る。非翻訳領域は、約１〜約１０塩基もしくは塩基対、約１０〜約２０塩基もしくは塩基対、約２０〜約５０塩基もしくは塩基対、約５０〜約１００塩基もしくは塩基対、約１００〜約５００塩基もしくは塩基対、約５００〜約１０００塩基もしくは塩基対、約１０００〜約２０００塩基もしくは塩基対、約２０００〜約３０００塩基もしくは塩基対、約３０００〜約４０００塩基もしくは塩基対、約４０００〜約５０００塩基もしくは塩基対、約５０００〜約６０００塩基もしくは塩基対、約６０００〜約７０００塩基もしくは塩基対、約７０００〜約８０００塩基もしくは塩基対、約８０００〜約９０００塩基もしくは塩基対、または約９０００〜約１００００塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。非翻訳領域は、例えば少なくとも１塩基もしくは塩基対、２塩基もしくは塩基対、３塩基もしくは塩基対、４塩基もしくは塩基対、５塩基もしくは塩基対、６塩基もしくは塩基対、７塩基もしくは塩基対、８塩基もしくは塩基対、９塩基もしくは塩基対、１０塩基もしくは塩基対、２０塩基もしくは塩基対、３０塩基もしくは塩基対、４０塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、６０塩基もしくは塩基対、７０塩基もしくは塩基対、８０塩基もしくは塩基対、９０塩基もしくは塩基対、１００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、６０００塩基もしくは塩基対、７０００塩基もしくは塩基対、８０００塩基もしくは塩基対、９０００塩基もしくは塩基対、または１００００塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。
【００９３】
本開示の操作されたポリリボヌクレオチドは、１つ以上のイントロンを含み得る。イントロンは、任意の数の修飾または非修飾ヌクレオチドを含み得る。イントロンは、例えば少なくとも１塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、１００塩基もしくは塩基対、１５０塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、または５０００塩基もしくは塩基対を含み得る。一部の場合には、イントロンは、例えば多くとも１００００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、または１００塩基もしくは塩基対を含み得る。
【００９４】
一部の場合には、イントロン中のある割合のヌクレオチドが修飾されている。例えば、一部の場合には、イントロン中のヌクレオチドの９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満が修飾されている。一部の場合には、イントロン中のヌクレオチドの全てが修飾されている。
【００９５】
本開示の操作されたポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含み得る。ポリＡ配列（例えばポリＡ尾部）は、任意の数のヌクレオチドを含み得る。ポリＡ配列は、約１〜約１０塩基もしくは塩基対、約１０〜約２０塩基もしくは塩基対、約２０〜約５０塩基もしくは塩基対、約５０〜約１００塩基もしくは塩基対、約１００〜約５００塩基もしくは塩基対、約５００〜約１０００塩基もしくは塩基対、約１０００〜約２０００塩基もしくは塩基対、約２０００〜約３０００塩基もしくは塩基対、約３０００〜約４０００塩基もしくは塩基対、約４０００〜約５０００塩基もしくは塩基対、約５０００〜約６０００塩基もしくは塩基対、約６０００〜約７０００塩基もしくは塩基対、約７０００〜約８０００塩基もしくは塩基対、約８０００〜約９０００塩基もしくは塩基対、または約９０００〜約１００００塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。一部の例では、ポリＡ配列は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ヌクレオチド長である。ポリＡ配列は、例えば少なくとも１塩基もしくは塩基対、２塩基もしくは塩基対、３塩基もしくは塩基対、４塩基もしくは塩基対、５塩基もしくは塩基対、６塩基もしくは塩基対、７塩基もしくは塩基対、８塩基もしくは塩基対、９塩基もしくは塩基対、１０塩基もしくは塩基対、２０塩基もしくは塩基対、３０塩基もしくは塩基対、４０塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、６０塩基もしくは塩基対、７０塩基もしくは塩基対、８０塩基もしくは塩基対、９０塩基もしくは塩基対、１００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、６０００塩基もしくは塩基対、７０００塩基もしくは塩基対、８０００塩基もしくは塩基対、９０００塩基もしくは塩基対、または１００００塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。ポリＡ配列は、多くとも１００塩基もしくは塩基対、９０塩基もしくは塩基対、８０塩基もしくは塩基対、７０塩基もしくは塩基対、６０塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、４０塩基もしくは塩基対、３０塩基もしくは塩基対、２０塩基もしくは塩基対、１０塩基もしくは塩基対、または５塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。
【００９６】
一部の場合には、ポリＡ配列中のある割合のヌクレオチドが修飾されている。例えば、一部の場合には、ポリＡ配列中のヌクレオチドの９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満が修飾されている。一部の場合には、ポリＡ中のヌクレオチドの全てが修飾されている。
【００９７】
リンカー配列は、任意の数のヌクレオチドを含み得る。リンカーは、Ｎ−３またはＣ−５位置で修飾ヌクレオ塩基に結合され得る。ヌクレオ塩基に結合されるリンカーは、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、テトラエチレングリコール、二価アルキル、アルケニル、アルキニル部分、エステル、アミドまたはエーテル部分であり得る。リンカー配列は、約１〜約１０塩基もしくは塩基対、約１０〜約２０塩基もしくは塩基対、約２０〜約５０塩基もしくは塩基対、約５０〜約１００塩基もしくは塩基対、約１００〜約５００塩基もしくは塩基対、約５００〜約１０００塩基もしくは塩基対、約１０００〜約２０００塩基もしくは塩基対、約２０００〜約３０００塩基もしくは塩基対、約３０００〜約４０００塩基もしくは塩基対、約４０００〜約５０００塩基もしくは塩基対、約５０００〜約６０００塩基もしくは塩基対、約６０００〜約７０００塩基もしくは塩基対、約７０００〜約８０００塩基もしくは塩基対、約８０００〜約９０００塩基もしくは塩基対、または約９０００〜約１００００塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。リンカー配列は、例えば少なくとも１塩基もしくは塩基対、２塩基もしくは塩基対、３塩基もしくは塩基対、４塩基もしくは塩基対、５塩基もしくは塩基対、６塩基もしくは塩基対、７塩基もしくは塩基対、８塩基もしくは塩基対、９塩基もしくは塩基対、１０塩基もしくは塩基対、２０塩基もしくは塩基対、３０塩基もしくは塩基対、４０塩基もしくは塩基対、５０塩基もしくは塩基対、６０塩基もしくは塩基対、７０塩基もしくは塩基対、８０塩基もしくは塩基対、９０塩基もしくは塩基対、１００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、６０００塩基もしくは塩基対、７０００塩基もしくは塩基対、８０００塩基もしくは塩基対、９０００塩基もしくは塩基対、または少なくとも１００００塩基もしくは塩基対の長さを含み得る。多くとも１００００塩基もしくは塩基対、５０００塩基もしくは塩基対、４０００塩基もしくは塩基対、３０００塩基もしくは塩基対、２０００塩基もしくは塩基対、１０００塩基もしくは塩基対、９００塩基もしくは塩基対、８００塩基もしくは塩基対、７００塩基もしくは塩基対、６００塩基もしくは塩基対、５００塩基もしくは塩基対、４００塩基もしくは塩基対、３００塩基もしくは塩基対、２００塩基もしくは塩基対、または１００塩基もしくは塩基対の長さのリンカー。
【００９８】
一部の場合には、リンカー配列中のある割合のヌクレオチドが修飾されている。例えば、一部の場合には、リンカー配列中のヌクレオチドの９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満が修飾されている。一部の場合には、リンカー配列中のヌクレオチドの全てが修飾されている。
【００９９】
一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも１つの終止コドンを含み得る。一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、複数の終止コドンを含む。終止コドンは、ＴＧＡ、ＴＡＡおよびＴＡＧから選択され得る。終止コドンは、修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、終止コドンＴＧＡおよび１つのさらなる終止コドンを含む。一部の場合には、（１もしくは複数の）核酸構築物、（１もしくは複数の）ベクターまたは（１もしくは複数の）操作されたポリリボヌクレオチドは、ＴＡＡ終止コドンの付加を含む。
【０１００】
コードされるポリペプチド
一部の場合には、本開示は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療する方法であって、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質（ＤＮＡＩ１）、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）、または前記のいずれかの変異体をコードする核酸構築物を含む組成物を被験体に投与することを含み、この核酸構築物が、被験体の細胞内での（１または複数の）前記タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含み、それによって原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体を治療する方法を提供する。
【０１０１】
コードされるポリペプチドは、アミド結合（ペプチド結合）を介して一緒に連結されたアミノ酸残基モノマーからなるポリマー鎖である。アミノ酸は、ｌ−光学異性体、ｄ−光学異性体またはそれらの組み合わせであり得る。ポリペプチドは、少なくとも３つのアミノ酸の鎖、ペプチドミメティック、タンパク質、組換えタンパク質、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗原、エピトープ、酵素、受容体、ビタミンまたは構造類似体またはそれらの組み合わせであり得る。被験体の体内で翻訳されたポリリボヌクレオチドは、被験体の細胞内、組織内または多くの細胞および組織にわたって、特定のペプチドまたはタンパク質の十分な供給をもたらし得る。一部の場合には、ポリリボヌクレオチドは、（１もしくは複数の）特定の標的細胞型または標的組織の細胞質ゾル内でインビボで翻訳され得る。一部の場合には、ポリリボヌクレオチドをインビボで翻訳して、その遺伝子が原発性繊毛機能不全症に関連するタンパク質、その機能性フラグメント、またはヒトＤＮＡＩ１もしくはヒトＤＮＡＨ５タンパク質と少なくとも７０％相同であるタンパク質を提供することができる。一部の場合には、ポリリボヌクレオチドは、様々な非標的細胞型または（１もしくは複数の）標的組織においてインビボで翻訳され得る。標的細胞または非標的細胞である細胞の非限定的な例には、ａ）皮膚細胞、例えばケラチノサイト、メラノサイト、尿路上皮細胞；ｂ）神経細胞、例えばニューロン、シュワン細胞、乏突起膠細胞、星状細胞；ｃ）肝細胞、例えば肝実質細胞；ｄ）腸細胞、例えば杯細胞、腸細胞；ｅ）血球、例えばリンパ系細胞または骨髄細胞；ならびにｆ）生殖細胞、例えば精子および卵が含まれる。組織の非限定的な例には、結合組織、筋肉組織、神経組織または上皮組織が含まれる。一部の場合には、標的細胞または標的組織は、癌性細胞、組織または器官である。
【０１０２】
ポリヌクレオチド配列は、１つ以上の種に由来し得る。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ヒト（ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、マウス（例えばムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、ラット（例えばラッツス・ノルベルジクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）もしくはラッツス・ラッツス（Ｒａｔｔｕｓ  ｒａｔｔｕｓ））、微生物（例えばクラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｎｕｓ））、または任意の他の適切な生物に由来し得る。ポリヌクレオチド配列は、１つ以上の種の配列のキメラの組み合わせであり得る。
【０１０３】
一部の場合には、内因性翻訳機構は、コードされるペプチドに翻訳後修飾を加えることができる。翻訳後修飾には、膜局在化のためのポリペプチドを標的とすることができる疎水性基の付加、酵素活性の増加のための補因子の付加、またはより小さな化学基の付加が含まれ得る。コードされるポリペプチドはまた、他のペプチドまたはタンパク質部分の付加を受けるように翻訳後修飾され得る。例えば、ユビキチン化は、ユビキチンとコードされるポリペプチドとの共有結合をもたらすことができ、ＳＵＭＯ化は、ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン関連修飾因子（Ｓｍａｌｌ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＭＯｄｉｆｉｅｒ））とコードされるポリペプチドとの共有結合をもたらすことができ、ＩＳＧ化はＩＳＧ１５（インターフェロン刺激遺伝子１５（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｇｅｎｅ  １５））の共有結合をもたらし得る。
【０１０４】
一部の場合には、コードされるポリペプチドは、他のタイプの構造変化を受けるように翻訳後修飾され得る。例えば、コードされるポリペプチドは、タンパク質分解的に切断され得、１つ以上のタンパク質分解フラグメントは、細胞内経路の活性を調節することができる。コードされるポリペプチドは、細胞内で折りたたまれ得る。一部の場合には、コードされるポリペプチドは、補因子および分子シャペロンの存在下で折りたたまれる。折りたたまれたポリペプチドは、二次構造および三次構造を有することができる。折りたたまれたポリペプチドは、他の折りたたまれたペプチドと結合して四次構造を形成することができる。折りたたまれたペプチドは、四量体四次構造を有する抗体分子などの機能性マルチサブユニット複合体を形成することができる。抗体のクラスまたはアイソタイプを形成する様々なポリペプチドをポリリボヌクレオチドから発現させることができる。
【０１０５】
コードされるポリペプチドは、コードされるアミノ酸の化学的性質を変化させるように翻訳後修飾され得る。例えば、コードされるポリペプチドは、アルギニンのシトルリンへの変換である、翻訳後シトルリン化または脱イミノ化を受けることができる。コードされるポリペプチドは、グルタミンのグルタミン酸への変換またはアスパラギンのアスパラギン酸への変換である、翻訳後脱アミド化を受けることができる。コードされるポリペプチドは、脱離、すなわちホスホトレオニンおよびホスホセリンのβ脱離、またはトレオニンおよびセリンの脱水ならびにシステインの脱カルボキシル化によるアルケンの変換を受けることができる。コードされるペプチドはまた、リシンのホモシトルリンへの変換であるカルバミル化を受けることもできる。コードされるペプチドは、ラセミ化、例えばプロリルイソメラーゼによるプロリンのラセミ化またはプロテイン−セリンエピメラーゼによるセリンのラセミ化を受けることもできる。一部の場合には、コードされるペプチドは、セリン、トレオニンおよびチロシンのリン酸化を受けることができる。
【０１０６】
ポリリボヌクレオチドによってコードされる分子によって、複数の生体分子の活性を調節することができる。コードされるポリヌクレオチドによって活性を調節することができる分子の非限定的な例には、アミノ酸、ペプチド、ペプチドミメティック、タンパク質、組換えタンパク質、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、抗体フラグメント、抗原、エピトープ、炭水化物、脂質、脂肪酸、酵素、天然産物、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む）、栄養素、受容体およびビタミンが含まれる。
【０１０７】
本開示のポリヌクレオチドの一部であり得るヌクレオチド配列の非限定的な例を表３に開示する。
【表３】
2019520422.tif 000019
【０１０８】
ポリペプチド配列は、配列番号１５〜１６の変化したコドン使用頻度または配列番号１７〜１８の変化したコドン使用法などの、所望の変化したコドン使用を有するように操作され得る。例えば、コンピュータソフトウェアを使用して、配列番号１４のコドン使用頻度を生じさせることができる。ポリペプチド配列は、内因性ポリペプチドのアミノ酸配列と％相同性を共有することができる。ポリペプチド配列は、内因性ポリペプチドのアミノ酸配列と多くとも１０％の相同性、多くとも２０％の相同性、多くとも３０％の相同性、多くとも４０％の相同性、多くとも５０％の相同性、多くとも６０％の相同性、多くとも７０％の相同性、多くとも８０％の相同性、多くとも９０％相同性、または多くとも９９％の相同性を共有し得る。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅまたは別の適切な方法またはアルゴリズムなどの、様々な方法およびソフトウェアプログラムを使用して、２つ以上のペプチド間の相同性を決定することができる。
【０１０９】
免疫原性
様々なサイズの分子（ポリヌクレオチド、タンパク質または酵素）を含む組成物を含有する多くの薬剤は、被験体に投与された場合、免疫応答を引き起こし得る。多くの場合、免疫系は組成物を異物として認識し、その薬学的作用を中和する。本開示のポリリボヌクレオチドおよび組成物は、低い免疫原性を有し得るかまたは非免疫原性であり得、それにより免疫系による小さな応答を誘発するかまたは全く免疫応答を誘発しない。
【０１１０】
免疫原性は、例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−８レベルならびにＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびヘリカーゼＲＩＧ−１への結合能の測定によっても決定することができる。ポリリボヌクレオチドが所望の低い免疫原性を有するかどうかを確認するために、ポリリボヌクレオチドの被験体への投与後に１つ以上の因子の量を測定することができる。ポリペプチドの免疫原性は、被験体へのポリペプチドの投与の際の白血球数の増加に関連して決定することができる。一部の場合には、被験体への組成物の投与の際に、被験体は、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、または１０％未満の白血球の数の増加を示す。本開示のポリリボヌクレオチドは、最小限のまたは有意でない炎症反応または免疫学的反応を誘発し得る。
【０１１１】
ポリリボヌクレオチドの免疫原性を決定するために、様々な方法を用いることができる。非常に適切な方法は、ポリリボヌクレオチドの投与に対する反応としての、細胞中の炎症マーカーの測定または単純な白血球数の測定である。そのような方法を実施例に記載する。例えばＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＰ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２などの炎症に関連するサイトカインを測定することができる。樹状細胞活性化マーカーの発現も、免疫原性の評価に使用することができる。免疫学的反応のさらなる指標は、Ｔｏｌｌ様受容体ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７およびＴＬＲ−８ならびにヘリカーゼＲＩＧ−１への結合の検出であり得る。
【０１１２】
ポリリボヌクレオチドの免疫原性は、ポリリボヌクレオチドの投与前のレベルと比較して、炎症マーカーまたは白血球数のレベルの全体的な増加として測定することができる。例えば、修飾されていないまたは修飾されている操作されたポリリボヌクレオチドを細胞または被験体に投与することができ、ポリリボヌクレオチドの投与に対する反応として規定された時間間隔での炎症マーカーの分泌を測定することができる。
【０１１３】
組成物
一部の場合には、本開示は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物を提供し、この核酸構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする相補的デオキシリボ核酸を含み、組成物は、被験体への投与のために製剤化される。一部の場合には、本開示は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物を提供し、この核酸構築物は、原発性繊毛機能不全症を有しているまたは有する危険性がある被験体の細胞内での軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体の異種発現または増強された発現を提供するコドンを含む。一部の場合には、本開示は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物を含む組成物を提供し、ここで、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸の３０％未満は、プソイドウリジンまたは１−メチルプソイドウリジンなどの核酸類似体である。一部の場合には、これらの構築物のコード配列は、その安定性を高めるために、タンパク質コード領域における変化したヌクレオチド使用頻度を有するように操作される。
【０１１４】
一部の場合には、構築物のコドンは、哺乳動物またはヒトの軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質と少なくとも７０％相同である。この構築物はまた、軸糸ダイニン中間鎖１などの関心対象のタンパク質をコードするコドン配列に隣接する３’または５’非コード領域を含み得、この非コード領域は、被験体の細胞内でのタンパク質の発現を増強する。コドンに隣接する３’非コード領域は、３’キャップ非依存性翻訳エンハンサー（３’−ＣＩＴＥ）またはヒストンタンパク質のヌクレオチド配列に由来する３’ステムループ領域または転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１）のヌクレオチド配列に由来する３’三重らせん構造を含み得る。コドンに隣接する３’非コード領域はポリアデノシン尾部を含むことができ、ここで、ポリアデノシン尾部におけるアデノシンの数は、軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質などの関心対象のタンパク質の翻訳効率または半減期を改善する。一部の場合には、ポリアデノシン尾部の長さは多くとも２００のアデノシンである。一部の場合には、ある割合のポリアデノシン尾部は、核酸類似体を含む。ポリアデノシン尾部における核酸の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％または５％未満は、核酸類似体であり得る。
【０１１５】
組成物がある割合のヌクレオチド類似体を含む場合、ヌクレオチド類似体は、プソイドウリジン、１−メチルプソイドウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、５−メチルシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジンからなる群より選択され得る。一部の場合には、核酸類似体はプソイドウリジンまたは１−メチルプソイドウリジンである。一部の場合には、核酸類似体は５−メトキシウリジンである。
【０１１６】
一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン中間鎖１コードする核酸および／または核酸類似体を含む。組成物は、少なくとも１つの追加の核酸構築物をさらに含んでいてもよい。この少なくとも１つの追加の核酸構築物は、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）からなる群より選択されるタンパク質をコードし得る。
【０１１７】
組成物は、操作されたポリリボヌクレオチド、ベクターまたは核酸構築物を含み得る。「裸の」ポリヌクレオチド組成物は、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤および／または賦形剤の助けを借りずに被験体に成功裏に投与され、被験体の細胞によって取り込まれ得る（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８）。しかし、多くの場合、エンドサイトーシス取込みを増加させ得る製剤を用いたポリヌクレオチドのカプセル化は、本開示の組成物の有効性を高めることができる。この課題を克服するために、一部の場合には、組成物は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物、ベクターまたは単離された核酸を含み、核酸構築物は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする相補的デオキシリボ核酸を含み、組成物は、被験体への投与のために製剤化される。
【０１１８】
多細胞生物へのポリリボヌクレオチドの送達の基礎となる別の技術的課題は、被験体の細胞または組織内で翻訳されるポリリボヌクレオチドの高効率送達を提供する組成物を同定することである。裸の核酸の投与は極めて非効率的であり得、多細胞生物へのポリヌクレオチドの投与のための適切なアプローチを提供し得ないことが認識されている。
【０１１９】
この課題を解決するために、操作されたポリリボヌクレオチドを含む組成物を医薬担体と共にカプセル化または製剤化することができる。製剤は、ナノ粒子、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリノーゲン、トロンビン、急速排除脂質ナノ粒子（ｒｅＬＮＰ）およびそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。本明細書で開示される操作されたポリリボヌクレオチドを含む組成物は、約１重量／体積％〜約９９重量／体積％の担体系を含み得る。担体系に存在する担体の量は、製剤者によってなされるいくつかの異なる因子または選択、例えばポリリボヌクレオチドの最終濃度および可溶化剤の量に基づく。様々な担体が、種々のクラスの治療薬の送達において有用であることが示されている。これらの担体の中で、生体適合性ポリマーであるポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリラクチド（ＰＬＡ）から製剤化された生分解性ナノ粒子は、種々の治療薬の持続的細胞内送達の潜在的可能性を示している。
【０１２０】
組成物中の操作されたポリヌクレオチドの負荷重量パーセントは、少なくとも０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％であり得る。ＰＬＧＡミクロスフェアにおける修飾ｍＲＮＡのカプセル化効率は、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり得る。
【０１２１】
本開示は、ポリヌクレオチド、一部の場合には操作されたポリリボヌクレオチドを細胞または組織に送達するために有用な、交互の非同一アルキレンアミン単位を含むオリゴ（アルキレンアミン）を含むナノ粒子、オリゴマー、ポリマーまたはリピドイドを記載する。本明細書に開示される組成物は、少なくとも約１分間、５分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、２週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間または１年間安定であり得る。本明細書に開示される製剤は、例えば少なくとも約０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃、７０℃または８０℃の温度で安定であり得る。本開示の組成物は、所望の密度を有することができる。組成物の密度は、組成物のレオロジーなどの、組成物の特性を改善することができる。
【０１２２】
ナノ粒子
本開示はまた、被験体への投与後に転移することができる、核酸構築物、操作されたポリリボヌクレオチドまたはベクターのナノ粒子に基づく製剤を提供する。一部の場合には、投与は肺経路であり、操作されたポリリボヌクレオチドは、投与部位から全身の血液供給へと能動的または受動的に無傷で移動し、その後、例えば乳房などの種々の細胞または組織に沈着することができる。例えば、軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）、アルマジロリピート含有４（ＡＲＭＣ４）、２１番染色体オープンリーディングフレーム５９（Ｃ２１ｏｒｆ５９）、コイルドコイルドメイン含有１０３（ＣＣＤＣ１０３）、コイルドコイルドメイン含有１１４（ＣＣＤＣ１１４）、コイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）、コイルドコイルドメイン含有６５（ＣＣＤＣ６５）、サイクリンＯ（ＣＣＮＯ）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子１（ＤＮＡＡＦ１）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子２（ＤＮＡＡＦ２）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子３（ＤＮＡＡＦ３）、ダイニン（軸糸）アセンブリ因子５（ＤＮＡＡＦ５）、軸糸ダイニン重鎖１１（ＤＮＡＨ１１）、軸糸ダイニン重鎖５（ＤＮＡＨ５）、軸糸ダイニン重鎖６（ＤＮＡＨ６）、軸糸ダイニン重鎖８（ＤＮＡＨ８）、軸糸ダイニン中間鎖２（ＤＮＡＩ２）、軸糸ダイニン軽鎖１（ＤＮＡＬ１）、ダイニン調節複合体サブユニット１（ＤＲＣ１）、失読症感受性１候補物１（ＤＹＸ１Ｃ１）、成長停止特異的８（ＧＡＳ８）、軸糸中心対装置タンパク質（ＨＹＤＩＮ）、ロイシンリッチリピート含有６（ＬＲＲＣ６）、ＮＭＥ／ＮＭ２３ファミリーメンバー８（ＮＭＥ８）、口・顔・指症候群１（ＯＦＤ１）、網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）、ラジアルスポークヘッド１ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ１）、ラジアルスポークヘッド４ホモログＡ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ４Ａ）、ラジアルスポークヘッド９ホモログ（クラミドモナス）（ＲＳＰＨ９）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）およびジンクフィンガーＭＹＮＤ型含有１０（ＺＭＹＮＤ１０）またはその機能性フラグメントなどの治療用タンパク質をコードする操作されたポリリボヌクレオチドを含むナノ粒子のこの転移は、肺を越える活性医薬成分の非侵襲的全身送達を構成し、全身的にアクセス可能な非肺細胞または組織に機能性タンパク質の産生をもたらす。
【０１２３】
ナノ粒子は、約１０ナノメートル（ｎｍ）〜５０００ｎｍ、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ、または６０ｎｍ〜５００ｎｍ、または７０ｎｍ〜３００ｎｍの粒径の粒子であり得る。一部の例では、ナノ粒子は、約６０ｎｍ〜２２５ｎｍの粒径を有する。ナノ粒子は、操作されたポリリボヌクレオチドであり得る、１つ以上のポリリボヌクレオチドをカプセル化するカプセル化剤（例えばコーティング）を含み得る。ナノ粒子は、操作されたおよび／または天然に存在するポリリボヌクレオチドを含み得る。カプセル化剤は、ＰＥＩまたはＰＥＧなどのポリマー材料であり得る。
【０１２４】
送達剤として使用し得るリピドイドまたは脂質ナノ粒子には、Ｃ１２−２００、ＭＤ１、９８Ｎ１２−５、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質およびそれらの類似体からなる群より選択され得る脂質が含まれ得る。適切なナノ粒子は、１つ以上の脂質を様々な比率で含むことができる。例えば、本発明の組成物は、４０：３０：２５：５の比率のＣ１２−２００：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００または４０：２０：３５：５の比率のＨＧＴ５００１：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を含み得る。ナノ粒子は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種の脂質または別の適切な数の脂質を含むことができる。ナノ粒子は、Ｃ１２−２００、ＭＤ１、９８Ｎ１２−５、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧからなる群から選択される任意の適切な比率の脂質で形成され得る。
【０１２５】
ナノ粒子製剤の平均サイズは、６０ナノメートル（ｎｍ）〜２２５ｎｍの修飾ｍＲＮＡを含み得る。修飾ｍＲＮＡを含むナノ粒子製剤の多分散指数ＰＤＩは、０．０３〜０．１５であり得る。ナノ粒子製剤のζ電位は、ｐＨ７．４で−１０〜＋１０であり得る。修飾ｍＲＮＡの製剤は、融合誘導性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ脂質を含み得る。製剤は、モル比５０：１０：３８．５：１．５−３．０（カチオン性脂質：融合誘導性脂質：コレステロール：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質）を有し得る。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得るが、これらに限定されない。融合誘導性脂質はＤＳＰＣであり得る。本開示の脂質ナノ粒子は、フィブリンシーラントなどの、しかしこれに限定されないシーラント中に製剤化することができる。
【０１２６】
オリゴ（アルキレンアミン基）
いくつかの製剤を用いたポリヌクレオチドのカプセル化は、組成物のエンドサイトーシス取込みを増加させることができるが、細胞によって取り込まれたポリヌクレオチドは細胞内で有効に翻訳されない可能性があることも認識されている。いくつかの製剤は、プラスミドＤＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡ送達のために有効に使用され得るが、ポリリボヌクレオチドの送達における使用には実用的でない。本開示は、被験体へのポリリボヌクレオチド組成物の有効な送達および翻訳のために使用することができる製剤を提供する。
【０１２７】
本開示の組成物は、細胞内で有効に翻訳されるポリリボヌクレオチドを提供するように設計することができる。本開示の組成物は、３単位以上の基における交互の長さのアルキレンアミン単位の配置を含み、細胞を任意のポリヌクレオチド、例えば操作されたポリリボヌクレオチドでトランスフェクトするために組成物中にエチレンアミン単位を含む。本開示の組成物は、非交互長のアルキレンアミン単位の類似の配置よりも、細胞へのポリリボヌクレオチドのより有効な送達を提供することができる。
【０１２８】
式（Ｉ）：
【化１】
2019520422.tif 000020
【０１２９】
に示す共通の構造実体を共有するオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドが提供され得る。
【０１３０】
本開示の組成物は、以下から選択されるオリゴ（アルキレンアミン）を含み得る：
ａ）式（ＩＩ）の複数の基を側鎖および／または末端基として含むオリゴマーまたはポリマー：
【化２】
2019520422.tif 000021
【０１３１】
［式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、複数のそのような基における式（ＩＩ）の各々の基について独立して、以下のように定義される：
ａは１であり、ｂは２〜４の整数であるか、またはａは２〜４の整数であり、ｂは１であり；
ｐは１または２であり；
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上であり；ならびに
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択され；
Ｒ６は、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ；ポリ（エチレングリコール）鎖；および受容体リガンドから選択され；
ならびに式（ＩＩ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されて式（ＩＩ）のカチオン性基を提供し得る］。
【０１３２】
ｂ）式（ＩＩＩ）の複数の基を繰り返し単位として含むオリゴマーまたはポリマー：
【化３】
2019520422.tif 000022
【０１３３】
［式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、複数のそのような基における式（ＩＩＩ）の各々の基について独立して、以下のように定義される：
ａは１であり、ｂは２〜４の整数であるか、またはａは２〜４の整数であり、ｂは１であり；
ｐは１または２であり；
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上であり；ならびに
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７、−ＣＨ２−Ｒ７または−ＣＨ２−基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択され；
ならびに式（ＩＩＩ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されて式（ＩＩＩ）のカチオン性基を提供し得る］。
【０１３４】
ｃ）式（ＩＶ）の構造を有するリピドイド：
【化４】
2019520422.tif 000023
【０１３５】
［式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、以下のように定義される：
ａは１であり、ｂは２〜４の整数であるか、またはａは２〜４の整数であり、ｂは１であり；
ｐは１または２であり；
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上であり；ならびに
Ｒ２〜Ｒ６は、互いに独立して、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；ポリ（エチレングリコール）鎖；および受容体リガンドから選択され、ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）であり；
ならびに式（ＩＶ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されて式（ＩＶ）のカチオン性基を提供し得る］。
【０１３６】
アルケニル基およびアルケニレン基の非限定的な例には、直鎖、分枝鎖および環状アルケニル基が含まれる。アルケニル基の１または複数のオレフィンは、例えばＥ、Ｚ、シス、トランス、末端またはエキソメチレンであり得る。アルケニレン基は、例えば、置換または非置換のＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２、Ｃ４３、Ｃ４４、Ｃ４５、Ｃ４６、Ｃ４７、Ｃ４８、Ｃ４９またはＣ５０基であり得る。
【０１３７】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のオリゴ（アルキレンアミン）構造は、より短い（説明のために「Ｓ」とも称される）エチレンアミン単位（すなわちａまたはｂが１である）とより長い（説明のために「Ｌ」とも称される）アルキレンアミン単位（すなわちａまたはｂの他方が２〜４の整数である）とを交互に組み合わせることができることを特徴とする。プロトン化可能単位のそのような配置は、ポリリボヌクレオチドを細胞内に送達するためのビヒクルを提供するための得られた基の適合性に関して利点を提供することができる。
【０１３８】
本開示の組成物は、式（ＩＩ）の複数のオリゴ（アルキレンアミン）基を側鎖または末端基として含み得る：
−ＮＲ２｛ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４］ｐ｝ｍ−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５］ｎ−Ｒ６（ＩＩ）
［式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、複数のそのような基における式（ＩＩ）の各々の基について独立して、以下のように定義される：
ａは１であり、ｂは２〜４の整数であるか、またはａは２〜４の整数であり、ｂは１であり；
ｐは１または２であり；
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上であり；ならびに
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２−；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択され；
Ｒ６は、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１６アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１６アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ；ポリ（エチレングリコール）鎖；および受容体リガンドから選択される］。
【０１３９】
一部の場合には、Ｒ２〜Ｒ５は水素であり、Ｒ６は、水素、アミノ基の保護基、−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択される。一部の場合には、Ｒ２〜Ｒ６は水素である。一部の場合には、Ｒ７は、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルもしくは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１８アルケニル、またはＣ８−Ｃ１２アルキルもしくは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８−Ｃ１２アルケニル、またはＣ１０〜Ｃ１２アルキルもしくは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ１０〜Ｃ１２アルケニルから選択される。本開示の組成物は、式（ＩＩ）〜（ＩＶ）の１つまたは複数のアルキレン基を含み得る。
【０１４０】
一部の場合には、本開示に従う組成物において使用できるオリゴマーまたはポリマーは、式（ＩＩＩ）の複数のオリゴ（アルキレンアミン）基を繰り返し単位として含む：
ＮＲ２｛ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４］ｐ｝ｍ−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５］ｎ−（ＩＩＩ）
［式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、複数のそのような基における式（ＩＩＩ）の各々の基について独立して、以下のように定義される：
ａは１であり、ｂは２〜４の整数であるか、またはａは２〜４の整数であり、ｂは１であり；
ｐは１または２であり；
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上であり；ならびに
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７、−ＣＨ２−Ｒ７または−ＣＨ２−基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２；ポリ（エチレングリコール）鎖；およびエンドソームエスケープエフェクターおよび受容体リガンドから選択される］。一部の場合には、Ｒ２〜Ｒ５は水素である。一部の場合には、Ｒ７は、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃを有するＣ８〜Ｃ１８アルケニルから選択される。Ｒ７は、Ｃ８〜Ｃ１２アルキルまたは１つのＣ−Ｃを有するＣ８〜Ｃ１２アルケニルから選択され得る。別の方法として、Ｒ７は、Ｃ１０〜Ｃ１２アルキルまたは１つのＣ−Ｃを有するＣ１０〜Ｃ１２アルケニルから選択され得る。
【０１４１】
式（ＩＩＩ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されて式（ＩＩＩ）のカチオン性基を提供し得る。
【０１４２】
式（ＩＩＩ）の複数の基を繰り返し単位として含むオリゴマーまたはポリマーは、さらに、式（ＩＩ）の１または複数のオリゴ（アルキレンアミン）基を側鎖および／または末端基として含んでいてもよい。
【０１４３】
繰り返し単位としての式（ＩＩＩ）の複数の基において、式（ＩＩＩ）の基の２つ、３つまたはそれ以上をオリゴマーまたはポリマー中に含めることができる。一般に、２〜９の繰り返し単位を含む物質を本明細書ではオリゴマーと称し、１０以上の繰り返し単位を含む物質をポリマーと称する。したがって、式（ＩＩＩ）の複数の基を繰り返し単位として含むポリマーには、１０以上の式（ＩＩＩ）の基が存在し得る。式（ＩＩＩ）の基は、ポリマーまたはオリゴマー内に同じ構造を有し得るか、または式（ＩＩＩ）の範囲内で２つ以上の異なる構造を有し得ることが理解される。一部の場合には、式（ＩＩＩ）の複数の基を繰り返し単位として含むオリゴマーまたはポリマーは、式（ＩＩＩ）の異なる基から制御された段階的な重合において調製される配列決定されたポリマーのライブラリの形態で提供され得る。
【０１４４】
上記の式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に従って、アルキレンアミン単位は、−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−または−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−型のオリゴ（アルキレンアミン）部分が得られるように交互の鎖において１回繰り返されてもよく、ここで、Ｓはより短いエチレンアミン単位を表し、Ｌはより長いアルキレンアミン単位を表す。一部の場合には、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の基は、より短いまたはより長い単位が対で現われないように、繰り返しが起こらないもの、すなわちｐが１であるものである。式（ＩＩ）の基は式（ＩＩａ）のオリゴ（アルキレンアミン）基であり得、式（ＩＩＩ）の基は（ＩＩＩａ）のオリゴ（アルキレンアミン）基であり得る：
−ＮＲ２｛ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４｝ｍ−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５］ｎ−Ｒ６（ＩＩａ）
［式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は式（ＩＩ）のように定義され、ならびに式（ＩＩａ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供し得る］；
−ＮＲ２｛ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４｝ｍ−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５］ｎ−（ＩＩＩａ）
［式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は式（ＩＩＩ）のように定義され、ならびに式（ＩＩｉａ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供し得る］。
【０１４５】
さらに、一部の場合には、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のオリゴ（アルキレンアミン）基は、１のｎを有し得る。一部の場合には、ｍは１であり、ｎは１である。一部の場合には、式（ＩＩ）の基は式（ＩＩｂ）のオリゴ（アルキレンアミン）基であり、式（ＩＩＩ）の基は式（ＩＩＩｂ）のオリゴ（アルキレンアミン）基である：
−ＮＲ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−（ＮＲ５）−Ｒ６（ＩＩｂ）
［式中、ａ、ｂおよびＲ２〜Ｒ６は式（ＩＩ）のように定義され、ならびに式（ＩＩｂ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供し得る］；
−ＮＲ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５−（ＩＩＩｂ）
［式中、ａ、ｂおよびＲ２〜Ｒ５は式（ＩＩＩ）のように定義され、ならびに式（ＩＩＩｂ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供し得る］。
【０１４６】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）のオリゴ（アルキレンアミン）基におけるアルキレンアミン単位の長さに関して、交互の単位の１つはエチレンアミン単位であり得る（すなわちａまたはｂのいずれかが１である）。他方の交互単位は、プロピレンアミン単位、ブチレンアミン単位またはペンチレンアミン単位であり得る（すなわちａまたはｂの他方が２〜４の整数であり得る）。一部の場合には、ａまたはｂの他方は２または３であり得、一部の場合には、ａは１であり、ｂは２であるか、またはａは２であり、ｂは１である。一部の場合には、式（ＩＩｃ）のオリゴ（アルキレンアミン）基が、基（ＩＩ）の代わりにもしくはそれに加えて使用され、および／または式（ＩＩＩｃ）のオリゴ（アルキレンアミン）基が、基（ＩＩＩ）の代わりにもしくはそれに加えて使用される。基（ＩＩｃ）および基（ＩＩＩｃ）の式は以下の通りである：
−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５−Ｒ６（ＩＩｃ）
［式中、Ｒ２〜Ｒ６は式（ＩＩ）で定義された通りであり、Ｒ２〜Ｒ６は水素であり、および式（ＩＩｃ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供し得る］；
−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５−（ＩＩＩｃ）
［式中、Ｒ２〜Ｒ５は式（ＩＩＩ）で定義された通りであり、および式（ＩＩＩｃ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供し得る］。
【０１４７】
一部の場合には、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）におけるＲ２〜Ｒ６の基または式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）におけるＲ２〜Ｒ５の基は、アミノ基の保護基であり得る。保護基の非限定的な例には、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）が含まれる。
【０１４８】
一部の場合には、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）におけるＲ１〜Ｒ６の基または式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）におけるＲ２〜Ｒ５の基は、Ｐｈｉｌｉｐｐ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ  ｉｎ「Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ」，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２００９に記載されている受容体リガンドなどの受容体リガンドである。肺組織を標的とする受容体リガンドの例は、Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．１（１）：１３３−４８に記載されている。受容体リガンドには、特定の細胞表面構造もしくは特定の細胞型への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングすることに誘導されるような合成環状もしくは線状ペプチド、環状もしくは線状ＲＧＤペプチド、シアル酸、ガラクトースもしくはマンノースなどの合成もしくは天然炭水化物、または、例えばペプチドと炭水化物とを反応させることに由来する合成リガンド、細胞表面構造を特異的に認識する抗体、葉酸、上皮増殖因子およびそれに由来するペプチド、トランスフェリン、抗トランスフェリン受容体抗体、ナノボディおよび抗体フラグメント、細胞表面分子（例えば細胞表面受容体）に結合し得る承認された薬剤等が含まれ得る。
【０１４９】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）におけるＲ１〜Ｒ６の基または式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）におけるＲ２〜Ｒ５の基のいずれかがポリ（エチレングリコール）鎖である限り、ポリ（エチレングリコール）鎖の分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌまたは約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜５，０００ｇ／ｍｏｌであり得る。
【０１５０】
一部の場合には、基（ＩＩ）は、式（ＩＩｄ）のオリゴ（アルキレンアミン）基であり得る：
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｈ（ＩＩｄ）
［ここで、式（ＩＩｄ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性ポリマーまたはデンドリマー構造を提供し得る］。一部の場合には、基（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）のオリゴ（アルキレンアミン）基である：
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−（ＩＩＩｄ）
［ここで、式（ＩＩＩｄ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性ポリマーまたはデンドリマー構造を提供し得る］。
【０１５１】
リピドイド
操作されたポリリボヌクレオチドは、リピドイド製剤中にカプセル化することができる。リピドイド製剤は、脂肪、ワックス、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質などのような脂質の特性を有する任意の物質であり得る。例えば、脂質またはリピドイド製剤は、科学文献中でヘルパー脂質と称されるコレステロール、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣもしくはＤＳＰＣなどの脂質および／またはＰＥＧ化脂質またはリポプレックスを調製するのに有用な任意の他の脂質を含み得る。操作されたポリリボヌクレオチドを含む製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子であり得る。リピドイド製剤は、脂質ナノ粒子であり得る。脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧおよびＰＥＧ化脂質から選択され得るが、これらに限定されない。別の態様では、脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＤＯＤＭＡなどのカチオン性脂質であり得るが、これらに限定されない。
【０１５２】
リピドイドを含む組成物は、約４０〜６０％のリピドイド、約４０〜６０％のコレステロール、および約５〜２０％のＰＥＧ−脂質（組成物の総重量に基づく重量パーセント）であり得る。リピドイドを含む組成物は、約５０〜６０％のリピドイド、約４０〜５０％のコレステロール、および約５〜１０％のＰＥＧ−脂質であり得る。リピドイドを含む組成物は、約５０〜７５％のリピドイド、約２０〜４０％のコレステロール、および約１〜１０％のＰＥＧ−脂質であり得る。リピドイドを含む組成物は、約６０〜７０％のリピドイド、約２５〜３５％のコレステロール、および約５〜１０％のＰＥＧ−脂質であり得る。組成物は、例えば、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２６，５６１−５６９；Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７，８７２−９；Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，ＰＮＡＳ，１０７，１８６４−９；米国特許第８，４５０，２９８号、国際公開第Ｏ２００６／１３８３８０号に記載されている技術を用いて提供され得る。ＲＮＡ／リピドイド複合体は、一本鎖ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡの細胞への送達に有用な粒子を形成し得る。
【０１５３】
本開示の組成物は、式（ＩＶ）のリピドイドによってカプセル化された、操作されたポリリボヌクレオチドであり得る：
Ｒ１−ＮＲ２｛ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４］ｐ｝ｍ−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５］ｎ−Ｒ６（ＩＶ）
［式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は以下のように定義される：
ａは１であり、ｂは２〜４の整数であるか、またはａは２〜４の整数であり、ｂは１であり；
ｐは１または２であり；
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり、ｍ＋ｎは２以上であり；ならびに
Ｒ１〜Ｒ６は、互いに独立して、水素；−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ２；ポリ（エチレングリコール）鎖；および受容体リガンドから選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７、−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である］。
【０１５４】
一部の場合には、Ｒ１〜Ｒ６は、独立して、水素；−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−Ｒ７または−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、−ＣＨ２−Ｃ（ＯＨ）Ｈ−Ｒ７または−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である。一部の場合には、Ｒ１〜Ｒ６は、独立して、水素；および−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７または−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１６アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１６アルケニルから選択される）から選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７または−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である。一部の場合には、Ｒ１およびＲ６は、独立して、水素；および−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７または−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）から選択され；ならびにＲ２〜Ｒ５は、全て−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−Ｒ７または−ＣＨ（Ｒ７）−ＣＨ２−ＯＨ基（ここで、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である。一部の場合には、Ｒ７は、Ｃ８〜Ｃ１６アルキルもしくは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１８アルケニル、またはＣ８−Ｃ１２アルキルもしくは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１２アルケニル、またはＣ１０〜Ｃ１２アルキルもしくは１つのＣ−Ｃ二重結合を有するＣ１０〜Ｃ１２アルケニルから選択される。
【０１５５】
式（ＩＶ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されて式（ＩＶ）のカチオン性リピドイドを提供し得る。
【０１５６】
上記の式（ＩＶ）に従って、アルキレンアミン単位は、−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−または−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−型のオリゴ（アルキレンアミン）部分が得られるように交互の鎖において１回繰り返されてもよく、ここで、Ｓはより短いエチレンアミン単位を表し、Ｌはより長いアルキレンアミン単位を表す。一部の場合には、式（ＩＶ）のリピドイドは、より短いまたはより長い単位が対で現われないように、繰り返しが起こらないもの、すなわちｐが１であるものである。式（ＩＶ）のリピドイドは、（ＩＶａ）のリピドイドであり得る：
Ｒ１−ＮＲ２｛ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ｝ｍ−［ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５］ｎ−Ｒ６（ＩＶａ）
［式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は式（ＩＶ）のように定義され、ならびに式（ＩＶａ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性リピドイドを提供し得る］；
一部の場合には、リピドイドは式（ＩＶ）のリピドイドである。一部の場合には、「ｎ」は、式（ＩＶ）のリピドイドにおいて１である。一部の場合には、式（ＩＶ）のリピドイドにおいて「ｍ」は１であり、ｎは１である。一部の場合には、式（ＩＶ）のリピドイドは、式（ＩＶｂ）のリピドイドである：
Ｒ−ＮＲ２−ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−（ＣＨ２）ａ−ＮＲ５−Ｒ６（ＩＶｂ）
［式中、ａ、ｂおよびＲ１〜Ｒ６は式（ＩＶ）のように定義され、式（ＩＶｂ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性リピドイドを提供し得る］。
【０１５７】
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）のリピドイド中のアルキレンアミン単位の長さに関して、交互の単位の１つはエチレンアミン単位である（すなわちａまたはｂのいずれかが１である）必要があることが理解される。他方の交互単位は、プロピレンアミン単位、ブチレンアミン単位、ペンチレンアミン単位、または別の適切な単位であり得る（すなわちａまたはｂの他方が２〜４の整数である）。一部の場合には、式（ＩＶ）のリピドイドは、式（ＩＶｃ）のリピドイドである：
Ｒ１−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５−ＲＳ（ＩＶｃ）
［式中、Ｒ１〜Ｒ６は式（ＩＶ）で定義された通りであり、および式（ＩＶｃ）に示す窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性リピドイドを提供し得る］。
【０１５８】
一部の場合には、式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）におけるＲ１〜Ｒ６の基は、アミノ基の保護基である。保護基の非限定的な例には、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）が含まれる。
【０１５９】
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）におけるＲ１〜Ｒ６の基が、Ｐｈｉｌｉｐｐ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ  ｉｎ「Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ」，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ２００９に記載されている受容体リガンドなどの受容体リガンドである限り。肺組織を標的とする受容体リガンドの例は、Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．１（１）：１３３−４８に記載されている。受容体リガンドには、特定の細胞表面構造もしくは特定の細胞型への結合についてペプチドライブラリをスクリーニングすることに誘導されるような合成環状もしくは線状ペプチド、環状もしくは線状ＲＧＤペプチド、シアル酸、ガラクトースもしくはマンノースなどの合成もしくは天然炭水化物、または、例えばペプチドと炭水化物とを反応させることに由来する合成リガンド、細胞表面構造を特異的に認識する抗体、葉酸、上皮増殖因子およびそれに由来するペプチド、トランスフェリン、抗トランスフェリン受容体抗体、ナノボディおよび抗体フラグメント、細胞表面分子（例えば細胞表面受容体）に結合し得る承認された薬剤等が含まれ得る。
【０１６０】
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）におけるＲ１〜Ｒ６の基がポリ（エチレングリコール）鎖である限り、ポリ（エチレングリコール）鎖の分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００ｇ／ｍｏｌまたは約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜５，０００ｇ／ｍｏｌであり得る。一部の場合には、ＰＥＧ鎖の分子量は、所望の密度を有する組成物を提供することができる。
【０１６１】
複数のリピドイド分子を、操作されたポリリボヌクレオチドと結合することができる。例えば、組成物は、１つの操作されたポリリボヌクレオチド対１００のリピドイド分子、１つの操作されたポリリボヌクレオチド対１，０００のリピドイド分子、１０の操作されたポリリボヌクレオチド対１，０００のリピドイド分子、または１００の操作されたポリリボヌクレオチド対１０，０００のリピドイド分子を含むことができる。操作されたポリリボヌクレオチドとリピドイドとの複合体は、粒子を形成することができる。粒子の直径は、例えば１０ナノメートルから１２００ナノメートルの範囲であり得る。一部の場合には、粒子の直径は１０ナノメートルから５００ナノメートルの範囲である。一部の場合には、粒子の直径は２０ナノメートルから１５０ナノメートルである。
【０１６２】
被験体への投与
ポリヌクレオチド（例えばポリリボヌクレオチド、核酸構築物またはベクター）を被験体に投与するための方法をここでさらに説明する。ポリリボヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチドをカプセル化するカプセル化剤を有する粒子またはカプセルなどの送達剤を介して被験体に提供することができる。送達剤は治療薬であり得る。被験体は、疾患または状態（例えば原発性繊毛機能不全症（ＰＣＤ）、カルタゲナー症候群または癌）に罹患したヒトなどのヒトであり得る。送達剤は、所定の投与量で被験体に投与することができ（例えば自己投与または医療提供者などの第三者による投与）、投与量は、時間と共に増加させる、時間と共に減少させる、または一定に維持することができる。投与量は、希少疾患または癌などの、被験体における疾患の進行または後退に基づいて変更することができる。
【０１６３】
本開示のポリリボヌクレオチドは、被験体に投与される１つまたは複数の薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。一部の場合には、ポリリボヌクレオチドは、標的細胞または細胞集団への標的化送達のために製剤化することができる。一部の場合には、ポリリボヌクレオチドは、細胞または細胞集団への非標的化送達のために製剤化することができる。次いで、ポリリボヌクレオチドのコードされたポリペプチド産物が転写され、レシピエント細胞内に蓄積する。
【０１６４】
組成物は、本明細書に記載の任意の操作されたポリリボヌクレオチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤および／または賦形剤などの他の化学成分との組み合わせであり得る。組成物は、生物への化合物の投与を容易にする。医薬組成物は、例えば静脈内、皮下、筋肉内、経口、直腸、エアロゾル、非経口、眼、肺、経皮、膣、耳、鼻および局所投与を含む様々な形態および経路によって、医薬組成物として治療有効量で投与することができる。
【０１６５】
組成物は、局所的または全身的に、例えば臓器への化合物の直接注射によって投与することができ、デポー製剤または徐放製剤として投与してもよい。医薬組成物は、急速放出製剤の形態、持続放出製剤の形態、または中間放出製剤の形態で提供することができる。急速放出製剤は、即時放出を提供することができる。持続放出製剤は、制御放出または遅延持続放出を提供することができる。
【０１６６】
吸入による投与の場合、活性化合物は、エアロゾル、ミスト、蒸気、スプレーまたは粉末の形態であり得る。医薬組成物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザからエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。例えば、吸入器または注入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤を含有して製剤化することができる。
【０１６７】
眼は、視力の維持に重要な眼成分を供給するいくつかの構造的および機能的に異なる血管床を含む。これらの床は、それぞれ網膜の内側および外側部分を供給する網膜および脈絡膜血管系、ならびに角膜の周辺に位置する角膜縁血管系を含む。
【０１６８】
操作されたポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物は、例えば局所、経口、全身、硝子体内、前房内、結膜下、結膜下、テノン嚢下、眼球後、眼内、後強膜近傍、眼周囲、網膜下および脈絡膜上投与を含む任意の適切な形態または経路によって眼に投与することができる。組成物は、前眼房、後眼房、硝子体腔（硝子体内）、網膜固有腔および／または網膜下腔を含む眼の任意の部分に製剤を注射することによって投与できる。組成物はまた、非侵襲的方法によって送達することもできる。製剤を投与する非侵襲的な方法には、無針注射装置を使用することが含まれ得る。医薬組成物の効率的な送達のために複数の投与経路を用いることができる。
【０１６９】
本開示の操作されたポリヌクレオチドは、例えば血管内皮細胞などの内皮細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）などの網膜の細胞、角膜細胞、線維芽細胞、星状細胞、グリア細胞、周皮細胞、虹彩上皮細胞、神経起源の細胞、毛様体上皮細胞、ミュラー細胞、外側直筋の細胞などの眼を取り囲む、眼に結合した筋肉細胞、眼窩脂肪細胞、強膜および上強膜の細胞、小柱網の細胞ならびに結合組織細胞を含む任意の適切な眼細胞に送達することができる。
【０１７０】
本明細書に開示される組成物は、被験体に投与されると、被験体の細胞による少なくとも約８０％、９０％または９５％のトランスフェクション効率を有し得る。一部の場合には、カプセル化組成物のトランスフェクション効率は、被験体に投与されると、非カプセル化ポリリボヌクレオチドと比較して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４５０％または５００％である。一部の状況では、修飾ポリリボヌクレオチドを含む（一部の場合には非修飾ポリリボヌクレオチドも含む）組成物のトランスフェクション効率は、被験体に投与されると、非修飾ポリリボヌクレオチドだけを含む組成物と比較して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４５０％または５００％である。組成物のトランスフェクション効率は、組成物の外層に細胞浸透性ペプチドまたはカチオンコーティングなどの担体を添加することによって高めることができる。組成物のトランスフェクション効率は、組成物の密度によって調節することができる。
【０１７１】
本明細書に記載の操作されたポリリボヌクレオチドを含む組成物を調製するための方法は、固体、半固体または液体組成物を形成するために１つ以上の不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて化合物を製剤化することを含む。固体組成物には、例えば散剤、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤および坐剤が含まれる。液体組成物には、例えば、化合物が溶解している溶液、化合物を含むエマルジョン、または本明細書で開示される化合物を含むリポソーム、ミセルもしくはナノ粒子を含有する溶液が含まれる。半固体組成物には、例えばゲル、懸濁液およびクリームが含まれる。組成物は、液体溶液もしくは懸濁液、使用前には液体中の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態、またはエマルジョンであり得る。これらの組成物はまた、少量の非毒性の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の薬学的に許容される添加剤も含み得る。
【０１７２】
薬学的に許容される賦形剤の非限定的な例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
ポリヌクレオチド（例えばポリリボヌクレオチド）を含む組成物は、様々な用量で提供することができる。ポリヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの用量は、約１μｇ〜約１０００μｇ、約１μｇ〜約５００μｇ、約１μｇ〜約１０００μｇ、約１０μｇ〜約５００μｇ、約２０μｇ〜約５００μｇ、約２５μｇ〜約５００μｇ、約３０μｇ〜約５００μｇ、約４０μｇ〜約５００μｇ、約５０μｇ〜約５００μｇ、約１０μｇ〜約２５０μｇ、約２０μｇ〜約２５０μｇ、約３０μｇ〜約２５０μｇ、約４０μｇ〜約２５０μｇ、約５０μｇ〜約２５０μｇ、約１μｇ〜約２００μｇ、約１０μｇ〜約２００μｇ、約２０μｇ〜約２００μｇ、約３０μｇ〜約２００μｇ、約４０μｇ〜約２００μｇ、約５０μｇ〜約２００μｇ、約２５μｇ〜約５０μｇ、約２５μｇ〜約１００μｇ、約２５μｇ〜約１５０μｇ、約２５μｇ〜約２００μｇ、約２５μｇ〜約２５０μｇ、約２５μｇ〜約３００μｇ、約２５μｇ〜約３５０μｇ、約２５μｇ〜約４００μｇ、約２５μｇ〜約４５０μｇ、約２５μｇ〜約５００μｇ、約５０μｇ〜約７５０μｇ、または約２５μｇ〜約１０００μｇの操作されたポリリボヌクレオチドであり得る。一部の場合には、ポリヌクレオチドの用量は、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約３０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約４０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約２５ｍｇ、約２ｍｇ〜約２５ｍｇ、約３ｍｇ〜約２５ｍｇ、約４ｍｇ〜約２５ｍｇ、約５ｍｇ〜約２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、約２ｍｇ〜約２０ｍｇ、約３ｍｇ〜約２０ｍｇ、約４ｍｇ〜約２０ｍｇ、または約５ｍｇ〜約２０ｍｇの操作ポリリボヌクレオチドである。
【０１７４】
組成物中（例えばカプセル化剤の中）のポリリボヌクレオチドの割合は、０．２５重量％ポリリボヌクレオチド、０．５重量％ポリリボヌクレオチド、０．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１重量％ポリリボヌクレオチド、１．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１．５重量％ポリリボヌクレオチド、１．７５重量％ポリリボヌクレオチド、２重量％ポリリボヌクレオチド、２．２５重量％ポリリボヌクレオチド、２．５重量％ポリリボヌクレオチド、２．７５重量％ポリリボヌクレオチド、３重量％ポリリボヌクレオチド、３．２５重量％ポリリボヌクレオチド、３．５重量％ポリリボヌクレオチド、３．７５重量％ポリリボヌクレオチド、４重量％ポリリボヌクレオチド、４．２５重量％ポリリボヌクレオチド、４．５重量％ポリリボヌクレオチド、４．７５重量％ポリリボヌクレオチド、５重量％ポリリボヌクレオチド、５．２５重量％ポリリボヌクレオチド、５．５重量％ポリリボヌクレオチド、５．７５重量％ポリリボヌクレオチド、６重量％ポリリボヌクレオチド、６．２５重量％ポリリボヌクレオチド、６．５重量％ポリリボヌクレオチド、６．７５重量％ポリリボヌクレオチド、７重量％ポリリボヌクレオチド、７．２５重量％ポリリボヌクレオチド、７．５重量％ポリリボヌクレオチド、７．７５重量％ポリリボヌクレオチド、８重量％ポリリボヌクレオチド、８．２５重量％ポリリボヌクレオチド、８．５重量％ポリリボヌクレオチド、８．７５重量％ポリリボヌクレオチド、９重量％ポリリボヌクレオチド、９．２５重量％ポリリボヌクレオチド、９．５重量％ポリリボヌクレオチド、９．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１０重量％ポリリボヌクレオチド、１０．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１０．５重量％ポリリボヌクレオチド、１０．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１１重量％ポリリボヌクレオチド、１１．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１１．５重量％ポリリボヌクレオチド、１１．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１２重量％ポリリボヌクレオチド、１２．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１２．５重量％ポリリボヌクレオチド、１２．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１３重量％ポリリボヌクレオチド、１３．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１３．５重量％ポリリボヌクレオチド、１３．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１４重量％ポリリボヌクレオチド、１４．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１４．５重量％ポリリボヌクレオチド、１４．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１５重量％ポリリボヌクレオチド、１５．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１５．５重量％ポリリボヌクレオチド、１５．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１６重量％ポリリボヌクレオチド、１６．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１６．５重量％ポリリボヌクレオチド、１６．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１７重量％ポリリボヌクレオチド、１７．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１７．５重量％ポリリボヌクレオチド、１７．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１８重量％ポリリボヌクレオチド、１８．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１８．５重量％ポリリボヌクレオチド、１８．７５重量％ポリリボヌクレオチド、１９重量％ポリリボヌクレオチド、１９．２５重量％ポリリボヌクレオチド、１９．５重量％ポリリボヌクレオチド、１９．７５重量％ポリリボヌクレオチド、２０重量％ポリリボヌクレオチド、２０．５重量％ポリリボヌクレオチド、２１重量％ポリリボヌクレオチド、２１．５重量％ポリリボヌクレオチド、２２重量％ポリリボヌクレオチド、２２．５重量％ポリリボヌクレオチド、２３重量％ポリリボヌクレオチド、２３．５重量％ポリリボヌクレオチド、２４重量％ポリリボヌクレオチド、２４．５重量％ポリリボヌクレオチド、または２５重量％ポリリボヌクレオチド以上であり得る。あるいは、製剤中（例えばカプセル化剤の中）のポリリボヌクレオチドの割合は、約２５％未満のポリリボヌクレオチド、２４．５％ポリリボヌクレオチド、２４％ポリリボヌクレオチド、２３．５％ポリリボヌクレオチド、２３％ポリリボヌクレオチド、２２．５％ポリリボヌクレオチド、２２％ポリリボヌクレオチド、２１．５％ポリリボヌクレオチド、２１％ポリリボヌクレオチド、２０．５％ポリリボヌクレオチド、２０％ポリリボヌクレオチド、１９．５％ポリリボヌクレオチド、１９％ポリリボヌクレオチド、１８．５％ポリリボヌクレオチド、１８％ポリリボヌクレオチド、１７．５％ポリリボヌクレオチド、１７％ポリリボヌクレオチド、１６．５％ポリリボヌクレオチド、１６％ポリリボヌクレオチド、１５．５％ポリリボヌクレオチド、１５％ポリリボヌクレオチド、１４．５％ポリリボヌクレオチド、１４％ポリリボヌクレオチド、１３．５％ポリリボヌクレオチド、１３％ポリリボヌクレオチド、１２．５％ポリリボヌクレオチド、１２％ポリリボヌクレオチド、１１．５％ポリリボヌクレオチド、１１％ポリリボヌクレオチド、１０．５％ポリリボヌクレオチド、１０％ポリリボヌクレオチド、９．５％ポリリボヌクレオチド、９％ポリリボヌクレオチド、８．５％ポリリボヌクレオチド、８％ポリリボヌクレオチド、７．５％ポリリボヌクレオチド、７％ポリリボヌクレオチド、６．５％ポリリボヌクレオチド、６％ポリリボヌクレオチド、５．５％ポリリボヌクレオチド、５％ポリリボヌクレオチド、４．５％ポリリボヌクレオチド、４％ポリリボヌクレオチド、３．５％ポリリボヌクレオチド、３％ポリリボヌクレオチド、２．５％ポリリボヌクレオチド、２％ポリリボヌクレオチド、１．５％ポリリボヌクレオチド、１％ポリリボヌクレオチド、０．５％ポリリボヌクレオチド、または０．１％ポリリボヌクレオチドであり得る。
【０１７５】
一部の場合には、本開示のカプセル化組成物は、被験体におけるポリリボヌクレオチド、医薬担体、カプセル化剤またはポリマー材料（例えばポリエチレングリコールもしくはポリエチレンイミン）の血漿、血清または血中濃度を、装置の使用の約１秒〜約３０分、約１秒〜２０分、約１秒〜１０分、約１秒〜５分、約１秒〜２分、約１秒〜１分、約１秒〜約３０秒、約３０秒〜３０分、約３０秒〜２０分、約３０秒〜１０分、約３０秒〜５分、約３０秒〜２分、約３０秒〜約１分、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約１分〜約２０分、約１分〜約１５分、約１分〜約１０分、約５分〜約３０分、約５分〜約２５分、約５分〜約２０分、約５分〜約１５分、約５分〜約１０分、約１０分〜約３０分、約１０分〜約２５分、約１０分〜約２０分、または約１０分〜約１５分以内に生じさせることができる。ポリリボヌクレオチド、医薬担体、カプセル化剤またはポリマー材料（例えばポリエチレングリコールもしくはポリエチレンイミン）濃度の血漿、血清または血中濃度は、ピーク濃度または平均濃度であり得る。
【０１７６】
［実施例］
［実施例１］
ＤＮＡＩ１  ＲＮＡ含有の作製
この実験は、ＤＮＡＩ１相補的デオキシリボ核酸構築物の作製を実証する。
【０１７７】
方法：ＤＮＡＩ１をＧｅｎＳｃｒｉｐｔで合成した。ｐＵＣ５７／ＤＮＡＩ１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ  ＨＦ制限酵素で消化した。さらに、消化したｐＶＡＸ１２０ベクターおよびＤＮＡＩ１  ｃＤＮＡをゲル精製し、連結した（ＤＮＡＩ１のＯＲＦはコドン最適化されている）。修飾されていないヌクレオチドを利用したＲＮＡ生成のために、標準的なインビトロ翻訳手順を用いた。ワクシニアウイルスキャッピングシステムおよびキャップ２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを用いてキャッピング反応を実施した。図１は、キャップされたおよびキャップされていないＤＮＡＩ１  ＲＮＡの生成を示すアガロースゲルである。この実験では、ＤＮＡＩ１  ｃＤＮＡをｐＶＡＸ１２０に連結して、ポリ（Ａ）尾部を含む構築物を提供したことに留意されたい。
【０１７８】
［実施例２］
哺乳動物細胞におけるＤＮＡＩリボ核酸の発現
この実験は、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＤＮＡＩ１の発現（翻訳）を実証する。図２は、トランスフェクションの６時間後、２４時間後および４８時間後の２９３細胞におけるＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの翻訳を示すウェスタンブロットである。この実験のために、６ウェルプレート中の５×１０５２９３細胞／ウェルに、ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｍａｘトランスフェクション試薬３．７５μｌを用いてＤＮＡＩ１  ＲＮＡ  ２．５μｇをトランスフェクトした。トランスフェクションの６、２４および４８時間後、細胞をウェルから掻き取り、ペレット化し、ペレットをＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。このブロットを、Ａｂｃａｍの抗ＤＮＡＩ１  ａｂ１６６９１２でプローブした。Ｃ末端ＦＬＡＧ標識ＤＮＡＩ１プラスミドＤＮＡを対照としてトランスフェクトし、プラスミドとｍＲＮＡとのＭＷの差は、おそらくｐＥＮＴＲＹベクター中のＦＬＡＧタグによるものである。
【０１７９】
［実施例３］
原発性繊毛機能不全症に罹患したヒト被験者の治療のための操作されたポリリボヌクレオチドを含む組成物の製剤化。
【０１８０】
組成物を以下のように製剤化する：
ＤＮＡＩ１遺伝子配列であるＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１２１４４をコードする核酸構築物を、実施例１に記載したように調製する。分枝鎖ポリエチレンイミンをＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）から購入する。直鎖インビボｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン）をＰｏｌｙｐｌｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（登録商標）（Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、さらに精製することなく使用する。製造業者のプロトコルに従って、ｊｅｔＰＥＩを、製造業者によって提供された滅菌１０％グルコース溶液およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入したＨＰＬＣグレードの水を用いて５％グルコース（最終濃度）に希釈する。核酸構築物を５％グルコース（最終濃度）に希釈した後、ＲＮＡおよびｊｅｔＰＥＩ溶液を１：１の比率で組み合わせ／混合し、最終Ｎ／Ｐ比８とする。次いで、ｍＲＮＡを鼻腔内滴下によって投与する。あるいは、核酸構築物を、リポプレックス製剤を噴霧するまたは嗅ぐことによる投与用に製剤化することもできる。
【０１８１】
［実施例４］
ＲＮＡ品質への転写後ポリアデニル化反応時間の影響
ＲＮＡ品質への転写後ポリアデニル化反応時間の影響を試験した。インビトロ転写（ＩＶＴ）後のポリアデニル化反応時間は、典型的には６０〜９０分の長さであり、通常、多くとも約〜２００ＡｓのポリＡ長を提供する。ｍＲＮＡは加水分解を受けやすいため、転写後ポリアデニル化反応の間に経時的に分解されることが多い。ＤＮＡＩ１ポリＡ尾部の最適長を維持し、ＲＮＡ品質を最大にするために、鋳型に既に含まれているポリＡ尾部を有する軸糸ダイニン中間鎖１タンパク質またはその変異体をコードする核酸構築物を構築した。
【０１８２】
ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡを作製するために使用した、ポリＡ配列を有するおよび有さないＤＮＡＩ１遺伝子配列をコードする核酸構築物の概要を以下に示す：
【表４】
2019520422.tif 000024
【０１８３】
図３は、０〜６０分の反応時間で転写後にポリアデニル化されたＤＮＡＩ１−ｐＣＭＶ６Ｅｎｔｒｙプラスミドから生成されたＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの長さを決定するためのフラグメントアナライザデータを示す。これは、より長いポリアデニル化反応時間で転写物の長さが増加することを実証する。図４は、０〜６０分の反応時間で転写後にポリアデニル化されたこれらのＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの品質を調べるためのフラグメントアナライザデータを示す。これらの結果は、より長い反応時間でのピーク％の減少およびプレピークスメア％の増加によって示されるように、ポリアデニル化反応が進行するにつれてＲＮＡが分解を受けることを示す。図５は、８％ＰＡＧＥによって決定したＤＮＡＩ１−ｐＶＡＸプラスミド鋳型中のポリＡ配列の長さを示す。
【０１８４】
［実施例５］
インビトロでのＲＮＡ作製および品質管理
種々の細胞型および免疫原性における翻訳効率への、様々な比率で特異的化学修飾ヌクレオチドを組み込むことの影響を比較するために、以下の実験を行った。
【０１８５】
実験は、１）核酸構築物のインビトロ転写；２）核酸構築物のインビトロキャッピング；３）転写されたＲＮＡの完全性の分析；４）ｄｓＲＮＡのイムノドットブロットアッセイ；および５）転写されたＲＮＡのヌクレオチド組成の分析を含んだ。いくつかの修正を加えて、インビトロ転写（ＩＶＴ）およびＲＮＡのキャッピングのための一般的なプロトコルに従った。ＤＮＡＩ１遺伝子をコードする核酸構築物のＩＶＴ反応を、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および７．５ｍＭの各リボヌクレオチドの存在下に３７℃で６時間実施した。
【０１８６】
表５は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物からインビトロ転写された様々な特異的化学修飾ヌクレオチドを示す。
【表５】
2019520422.tif 000025
【０１８７】
結果：
ＵＶ測定
【表６】
2019520422.tif 000026
【０１８８】
鋳型ポリ（Ａ）長−フラグメントアナライザ
インビトロ転写のための鋳型として用いたＤＮＡＩ１核酸構築物（配列番号５）のポリ（Ａ）尾部の長さの分析は、元のクローニングベクター（ｐＶＡＸ−Ａ１２０）と比較してＡ残基の数が維持されていることを示した。最初のベクターは１２０個のアデノシンヌクレオチドを含み、１００〜１５０ｂｐのバンドがこの核酸構築物で検出された（図５）。鋳型をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化してポリ（Ａ）フラグメントを除去した：１２個の非ポリ（Ａ）ヌクレオチドがフラグメントの一部であると予想される。Ｇ＊ＡＡＴＴＣｔｇｃａｇ−ポリ（Ａ）−ＧＣ＊ＧＧＣＣＧＣ＝１２ヌクレオチド＋ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ生成フラグメント中のポリ（Ａ）。
【０１８９】
ＲＮＡスメア分析−フラグメントアナライザ
ＤＮＡＩ１のために生成した全ての転写物について、約２，０００ヌクレオチドのピークを検出した。フラグメントアナライザでのインビトロ生成転写物の評価は、キャップされた転写物が良好な完全性を維持することを示した：繰り返し実験においてスメア含量（ＲＮＡ分解および／または加水分解の指標）の限られた検出を認めた。簡単に述べると、２００ｎｇ／μＬの試料２μＬをフラグメントアナライザ（ＤＮＦ−４７１標準感度ＲＮＡ分析キット（１５ヌクレオチドの下部マーカー））で分析した。データ解析はＰＲＯＳｉｚｅ  ２．０ソフトウェアを用いて行った。サイジング精度はおよそ±５％以内であり、サイジングの再現性は約５％ＣＶ以内であり、定量精度はおよそ±２０％以内であり、および定量の再現性は約１０％ＣＶである。図６は、標準的なヌクレオチドのみ、すなわちアデノシン５’−三リン酸、グアノシン５’−三リン酸、シチジン５’−三リン酸およびウリジン５’−三リン酸のみを含むインビトロ反応についてのフラグメントアナライザデータを示す。図７は、プソイドウリジンとウリジン５’−三リン酸の５０％／５０％混合物を含むインビトロ反応についてのフラグメントアナライザデータを示す。図８は、１００％プソイドウリジン５’−三リン酸を含むインビトロ反応についてのフラグメントアナライザデータを示す。図９は、１００％１−メチル−プソイドウリジン５’−三リン酸を含むインビトロ反応についてのフラグメントアナライザデータを示す。表７は、ＲＮＡスメア分析の結果をまとめたものである：
【表７】
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【０１９０】
ドットブロットによって検出された二本鎖ＲＮＡ含量は、Ｊ２抗体との反応性を示した。図１０は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物からのインビトロ転写ＲＮＡのドットブロット分析によって検出された二本鎖ＲＮＡ含量、ならびに表５に示す様々な特異的修飾を有する転写されたＤＮＡＩ１構築物の二本鎖ＲＮＡ含量を示す。
【０１９１】
ヌクレオシド組成分析
表８〜１０は、軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物からのインビトロ転写ＲＮＡのヌクレオチド組成分析を示す。様々な特異的ヌクレオチド修飾を表５に示す。図１１〜１３は、転写物のヌクレアーゼ消化およびそれに続く脱リン酸化の後に得られた個々のリボヌクレオチドの対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０１９２】
表８は、非修飾ヌクレオチドを有する転写された軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物からのインビトロ転写ＲＮＡのヌクレオチド組成分析を示す。図１１は、対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【表８】
2019520422.tif 000028
【０１９３】
表９は、５０％プソイドウリジンを有する転写された軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物からのインビトロ転写ＲＮＡのヌクレオチド組成分析を示す。図１２は、対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。同一の逆相ＨＰＬＣ条件を用いた疎水性１−メチル−プソイドウリジンの保持時間は、平均すると約９．５分であり、検討した他の全てのリボヌクレオチドから十分に分離されている（データは示していない）。
【表９】
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【０１９４】
表１０は、１００％プソイドウリジンを有する転写された軸糸ダイニン中間鎖１をコードする核酸構築物からのインビトロ転写ＲＮＡのヌクレオチド組成分析を示す。図１３は、対応するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【表１０】
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【０１９５】
［実施例６］
翻訳効率
上記ＤＮＡＩ１転写物の翻訳効率を３種の細胞株：１）ＨＥＫ−２９３ヒト胚性腎細胞；２）Ａ５４９腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞；および３）ＭＬＥ−１５マウス肺上皮細胞において評価した。各細胞株を３組重複して各ＤＮＡＩ１転写物でトランスフェクトし、得られた細胞抽出物をウェスタンブロット法でＤＮＡＩ１タンパク質発現について分析した。簡単に述べると、ウェル当たり１×１０６（ＨＥＫ−２９３、ＭＬＥ−１５）または２×１０６（Ａ５４９）の細胞をプレーティングし、１８時間後に６ウェルプレートでトランスフェクトした。１：３７．５のＲＮＡ：ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ比でＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬を使用して、約１００ｎｇの各ＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に細胞を採取し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％タウロコール酸ナトリウム）中で全細胞抽出物を調製した。各抽出物からの総タンパク質３．５μｇを、２．５％β−メルカプトエタノールを含有する１×ＬＤＳ試料緩衝液中で調製し、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した。次いで、ゲルを３０Ｖの定電圧で３０分間、続いて１５０Ｖで１時間泳動させた。タンパク質を、１０％メタノールを含有する１×ＮｕＰＡＧＥ転移緩衝液中２５Ｖで１時間、ＰＶＤＦ膜に移した。転移後、抗ＤＮＡＩ１抗体を用いたウェスタンブロットによってＤＮＡＩ１タンパク質を検出し、アルカリホスファターゼ化学発光基質を用いて発色させた。ウェスタンブロット値を、Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ全タンパク質染色を負荷対照として用いて正規化し、非修飾ＲＮＡに対する相対的発現として表している。各データ点は、３つの生物学的（トランスフェクション）複製物の平均±標準偏差である。
【０１９６】
図１４、１５および１６は、それぞれ、ＨＥＫ−２９３、Ａ５４９およびＭＬＥ−１５細胞におけるＤＮＡＩ１タンパク質の発現を示す。ＤＮＡＩ１は、６９９アミノ酸、７９．３ｋＤａのタンパク質として発現された。プソイドウリジン（Ψ）含有転写物は、非修飾ＲＮＡまたはそれ以上の発現レベルで、３種の細胞型全てにおいて良好に発現する。同様に、１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）含有転写物は、Ａ５４９およびＭＬＥ１５細胞において非修飾ＲＮＡまたはそれ以上の発現レベルを生じた（ＨＥＫ−２９３細胞における発現は、この転写物については試験しなかった）。重要な点として、各転写物の発現レベルおよびそれらの相対的順位は各細胞株において同様であり、ＤＮＡＩ１翻訳への細胞型特異的影響がないことを示した。図１７は、ＨＥＫ−２９３、Ａ５４９およびＭＬＥ−１５細胞におけるＤＮＡＩ１タンパク質の相対的発現を示すグラフである。ウェスタンブロットのシグナル値を、全タンパク質染色を用いて正規化し、非修飾ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡと比較して平均発現±標準偏差としてプロットした。
【０１９７】
表１１は、上記の各細胞株におけるＤＮＡＩ１タンパク質の相対的発現の要約である。
【表１１】
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【０１９８】
［実施例７］
インビトロでのヒトＤＮＡＩ１をコードする核酸構築物の免疫原性
上記転写物の免疫原性を、２種の細胞株、すなわちＡ５４９腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞およびＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞において、サイトカイン産生を測定することによって試験した。転写物に応答したＩＬ−６の産生をＡ５４９細胞で測定し、ＩＰ−１０の産生をＨｅｐＧ２細胞で測定した。各細胞株を、３組重複して、ある力価の各ＲＮＡでトランスフェクトした。簡単に述べると、ウェル当たり２０，０００（Ａ５４９）または４０，０００（ＨｅｐＧ２）細胞のいずれかをプレーティングし、２４時間後に９６ウェルプレートでトランスフェクトした。次いで、細胞をある力価の各転写物でトランスフェクトした：ＲＮＡ：ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ比１：１．５でＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ試薬を用いて、非修飾、５０％Ψおよび１００％Ψ転写物についてはウェル当たり２５０ｎｇ〜７ｎｇならびに１００％ｍ１Ψ  ｍＲＮＡについてはウェル当たり１０００ｎｇ〜３２ｎｇ。
【０１９９】
トランスフェクションの１８時間後に培養上清を採取した。代謝的に活性な細胞の指標としてＡＴＰレベルを測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、上清採取直後に細胞生存率を測定した。ＩＬ−６検出のために、Ａ５４９細胞培養上清をアッセイ緩衝液で１：２０に希釈し、ＩＬ−６高感度ヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ  ａｂ４６０４２）を用いてＩＬ−６レベルを測定した。ヒトＩＰ−１０  ＥＬＩＳＡキットＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７３１９４）を用いて、希釈していないＨｅｐＧ２細胞培養上清中でＩＰ−１０を検出した。
【０２００】
図１８および１９は、ＤＮＡＩ１転写物で処理したＡ５４９細胞におけるＩＬ−６の誘導を示す。図１８に示すアッセイのために、細胞をＲＮＡ−ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ複合体に１８時間曝露し、図１９に示すアッセイでは、ＲＮＡ−ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ複合体をトランスフェクションの２時間後に除去した。両方の場合に、ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６の検出のために細胞培養上清を１８時間で採取した。図２０および２１は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いて測定した、図１８および１９に示すアッセイの細胞生存率を示す。図２２は、ＤＮＡＩ１転写物によるＨｅｐＧ２細胞におけるＩＰ−１０の誘導を示す。このアッセイのために、細胞をＲＮＡ−ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ複合体に１８時間曝露した。次いで、様々な量の各ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡによって誘導されたＩＰ−１０発現をＥＬＩＳＡによって測定した。図２３は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイを用いて測定した、図２２に示すアッセイの細胞生存率を示す。
【０２０１】
［実施例８］
ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの翻訳
図２４は、ＨＥＫ２９３細胞における、軸糸ダイニン中間鎖１（ＤＮＡＩ１）をコードする核酸または核酸対照のピーク発現を示す。図２４に示すように、ＨＥＫ２９３細胞では、ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＮＡＩ１核酸構築物の翻訳は６時間でピークに達するが、４８時間でもまだ存在する。
【０２０２】
［実施例９］
リポプレックス製剤化した１００％ｍ１Ψ含有ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの投与後の、未分化および完全分化ヒト気道上皮細胞（ＨＡＥＣ）およびマウス気管上皮細胞（ＭＴＥＣ）におけるＤＮＡＩ１タンパク質の発現。
【０２０３】
リポプレックス製剤化したＤＮＡＩ１−ＨＡ  ｍＲＮＡでの処理後の初代ヒト気道上皮細胞およびマウス気管上皮細胞におけるＤＮＡＩ１タンパク質の発現をウェスタンブロットによって評価した。この実験に用いた１００％ｍ１Ψ含有転写物は、ＨＡエピトープタグを含むＤＮＡＩ１の交互のコドン使用鋳型（配列番号１５）から作製した。初代ヒト上皮細胞は、未分化培養物のために液内培養物中に維持するかまたは気−液界面で維持し、約３週間かけて完全に分化した繊毛上皮に分化させた。次に、１２または２４μｇのリポプレックス製剤化ＤＮＡＩ１−ＨＡ  ｍＲＮＡを、完全に分化した培養の頂端側に適用するか、または未分化の液体培養物に直接適用した。細胞を、１回または２日連続して１日１回処理した。次いで、最終処理の２４または４８時間後に細胞を採取し、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％タウロコール酸ナトリウム）中で全細胞抽出物を調製した。各抽出物からの全タンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。ＤＮＡＩ１−ＨＡタンパク質を、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットによって検出し、増強化学発光基質を用いて発色させた。図２５に示すように、ＤＮＡＩ１−ＨＡタンパク質は、未分化および完全に分化した繊毛を有するヒト気道上皮細胞およびマウス気管上皮細胞の両方において高レベルで発現された。
【０２０４】
［実施例１０］
コード領域における変化したヌクレオチド使用頻度は、転写物治療のためのｍＲＮＡの安定性を高める。
【０２０５】
修飾ｍＲＮＡのコドン内でおよびコドンを越えて、より反応性のジヌクレオチドの数を減少させることを目的とする変化したヌクレオチド使用頻度のスキームは、ＲＮＡの固有の化学的不安定性によって課される制限を部分的に緩和する。同時に、ＲＮＡ転写物中のＵ含量を減少させることは、その免疫原性を低下させる。伝統的なコドン最適化（ＣＯ）を、（＋）反応性ジヌクレオチドの除去および（＋）Ｕ減少の前に実施することができ、一般的にＣＯ＋＋と称されるＯＲＦを生じる。
【０２０６】
図２６は、配列番号１４のポリリボヌクレオチド（Ａ）と比較した、配列番号１５のポリリボヌクレオチド（Ｂ）を発現するＤＮＡＩ１における全体的な品質改善を示す。全体的な品質の改善は、変化したコドン使用頻度戦略で操作されたポリリボヌクレオチドにおけるフラグメントアナライザトレースの主要ＲＮＡピーク％の増加によって判断される。さらに、ＣＯ＋＋最適化オープンリーディングフレーム、すなわち変化したコドン使用頻度を特徴とするＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡは、伝統的に最適化された転写物（ＣＯ）と比較した場合、トランスフェクトされたＡ５４９細胞における翻訳効率の改善を示す（図２７参照）。ここでは、ウェル当たり１．２５ｘ１０６細胞をプレーティングし、１８時間後に６ウェルプレートでトランスフェクトした。１：１２のＲＮＡ：ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ比でＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬を用いて、細胞を約１００ｎｇの各ＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後に採取した。抗ＤＮＡＩ１抗体を用いたウェスタンブロット法によって、６９９アミノ酸、７９．３ｋＤａのタンパク質としてのＤＮＡＩ１タンパク質の発現が明らかになった。相対的翻訳効率を３つの生物学的（トランスフェクション）複製物の平均として示す。
【０２０７】
図２８に示すように、Ｊ２抗体センシング二本鎖ＲＮＡ含量との反応性の変化が観察された。既知の濃度のポリ−ＩＣとの比較に基づき、ＣＯ＋＋ＯＲＦを特徴とする、ＤＮＡＩ１をコードするｍＲＮＡのｄｓＲＮＡ含量は平均３９ｎｇであり、一方ＣＯ  ＯＲＦを有するＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡ  ２００ｎｇをドットした場合、６８ｎｇのｄｓＲＮＡ夾雑物を含むと推定された。
【０２０８】
［実施例１１］
非修飾および１００％ｍ１Ψ含有ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡのＨＰＬＣ精製。
【０２０９】
ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡの逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて、完全長ＲＮＡを精製し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写の間に生成された長いｄｓＲＮＡなどの夾雑物を除去した。イオン対形成剤としての酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）および漸増アセトニトリル含量を含む移動相と共に、非多孔性ＲＮＡＳｅｐ  Ｃ１８セミプレップ（１００ｍｍ×２１．２ｍｍ、カラム容積（ＣＶ）約２．４ｍＬ）カラムを用いて得られた分画および精製結果を図２９に示す。精製画分のフラグメントアナライザ評価によって判断すると、セミプレップＲＮＡＳｅｐカラムを用いて全体的な品質改善および完全長ＲＮＡ濃縮が観察された。この品質改善は、非修飾（Ａ、Ｂ）および１００％ｍ１Ψ含有ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡ種（Ｃ、Ｄ）の両方で達成された。
【０２１０】
図３０に示すように、翻訳活性の中等度の改善が、Ａ５４９細胞における完全長非修飾ｍＲＮＡ転写物濃縮画分で観察された（ＡおよびＢ）。ここでは、ウェル当たり１×１０６のＡ５４９細胞をプレーティングし、１８時間後に６ウェルプレートでトランスフェクトした。１：１２のＲＮＡ：ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ比でＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬を用いて、細胞を約１００ｎｇの各ＲＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクションの６時間後に採取した。１：２０００のウサギ抗ＤＮＡＩ１（ＡｂＣａｍ  ａｂ１６６９１２、組換えＤＮＡＩ１フラグメントに対するウサギモノクローナル抗ＤＮＡＩ１）抗体を用いたウェスタンブロット法によって、６９９アミノ酸、７９．３ｋＤａタンパク質としてのＤＮＡＩ１タンパク質の発現が明らかになった（Ｃ）。相対的翻訳効率を、３つの生物学的（トランスフェクション）複製物の平均±標準偏差として示す。
【０２１１】
重要な点として、ＨＰＬＣは、セミプレップ規模で遅く溶出するドットブロット反応種を容易に除去する。Ｊ２抗体と反応する検出可能な二本鎖ＲＮＡ含量は、もっぱら、遅く溶出する画分Ｆ７および未精製対照転写物内でのみ観察されたが、他の全てのＨＰＬＣ精製ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡ画分Ｆ１〜Ｆ６では検出できなかった（Ｄ）。非修飾のＨＰＬＣ精製転写物の免疫原性を、トランスフェクトされたｍＲＮＡに応答したＩＬ−６の産生を観測することによって、Ａ５４９細胞においてさらに試験した。各細胞株を、３組重複して、ある力価の各ＲＮＡでトランスフェクトした。簡単に述べると、ウェル当たり２０，０００細胞をプレーティングし、１８時間後に９６ウェルプレートでトランスフェクトした。次いで、１：１．５のＲＮＡ：ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ比でＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ試薬を用いて、ウェル当たり２５０ｎｇ〜７ｎｇで、細胞をある力価の各転写物でトランスフェクトした。最も高い相対的ＤＮＡＩ１タンパク質レベルを生じるＨＰＬＣ精製画分Ｆ３について、ＩＬ−６応答の減少が観察された（ＲＮＡ  １２５ｎｇでトランスフェクトした細胞について、未精製参照ＤＮＡＩ１  ｍＲＮＡ：（７２７±１０９ｐｇ／ｍＬ）＞Ｆ３（７３±３０ｐｇ／ｍＬ））（Ｅ）。
【０２１２】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、説明したが、そのような実施形態が単なる例示として提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書中で提供される特定の実施例によって限定されるものではない。本発明を上述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書の実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図しない。本発明から逸脱することなく、当業者には数多くの変形、変更および置換が想起されるであろう。さらに、本発明の全ての態様は、様々な条件および変数に依存する、本明細書に記載の特定の表現、形状または相対的比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物を本発明の実施において使用し得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、そのような代替物、修正、変形または等価物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がそれによって包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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