(57)【要約】【課題】【解決手段】炭素源から少なくとも１種のアルコールを生成する方法であって、（ａ）好気的条件下、水性培地中でアルコールを生成することと、（ｂ）（ｂｉ）水性培地中のアルコールと、少なくとも１種の抽出媒体とを、水性培地から抽出媒体中にアルコールを抽出するために十分な時間接触させ、（ｂｉｉ）抽出媒体を、抽出したアルコールと共に水性培地から分離することにより、水性培地からステップ（ａ）のアルコールを抽出することと、を含み、抽出媒体はオレイルアルコール、又はポリプロピレングリコール及びアルカンを有し、アルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源から少なくとも１種のアルコールを生成する方法であって、
（ａ）好気的条件下、水性培地中でアルコールを生成することと、
（ｂ）（ｂｉ）前記水性培地中のアルコールと、少なくとも１種の抽出媒体とを、前記水性培地から前記抽出媒体中にアルコールを抽出するために十分な時間接触させ、（ｂｉｉ）前記抽出媒体を、抽出したアルコールと共に前記水性培地から分離することにより、前記水性培地からステップ（ａ）の前記アルコールを抽出することと、
を含み、
前記抽出媒体はオレイルアルコールを有し、
前記アルコールは少なくとも３つの炭素原子を有し、
前記炭素源はＣＯ及び／又はＣＯ２を有する、方法。
【請求項２】
前記アルコールはプロパノールであり、
（ａ）は、
（ａｉ）指数増殖期の第１の酢酸生成微生物と、遊離酸素と、定常期の第２の酢酸生成微生物とを含む反応混合物であって、前記第１及び第２の酢酸生成微生物は、前記炭素源をアセテート及び／又はエタノールに転換することができる、反応混合物と、前記炭素源とを接触させることと、
（ａｉｉ）水性培地中で、アセテート及び／又はエタノールをプロパノールに転換することができる第３の微生物と、（ａｉ）から得たアセテート及び／又はエタノールとを接触させることと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルコールは少なくとも１種の高級アルコールであり、
（ａ）は、
（ａ１）指数増殖期の第１の酢酸生成微生物と、遊離酸素と、定常期の第２の酢酸生成微生物とを含む反応混合物であって、前記第１及び第２の酢酸生成微生物は、前記炭素源をアセテート及び／又はエタノールに転換することができる、反応混合物と、前記炭素源とを接触させることと、
（ａ２）エタノールカルボキシレート発酵経路を有し、かつ、（ａ１）から得たアセテート及び／又はエタノールを転換することができる第４の微生物と、（ａ１）から得たアセテート及び／又はエタノールとを接触させ、酸を形成することと、
（ａ３）（ａ２）から得た酸を、ステップ（ａ１）の前記反応混合物と接触させることと、
を含み、
前記水性培地中において、前記第１及び／又は第２の酢酸生成微生物は、前記酸を対応する高級アルコールに転換することができ、
前記高級アルコールは、４〜１０の炭素原子を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１及び第２の微生物は、Clostridium autothenogenum DSMZ 19630、Clostridium ragsdahlei ATCC no. BAA-622、Clostridium autoethanogenum、Moorella sp HUC22-1、Moorella thermoaceticum、Moorella thermoautotrophica、Rumicoccus productus、Acetoanaerobum、Oxobacter pfennigii、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina acetivorans、Carboxydothermus、Desulfotomaculum kutznetsovii、Pyrococcus、Peptostreptococcus、Butyribacterium methylotrophicum ATCC 33266、Clostridium formicoaceticum、Clostridium butyricum、Lactobacillus delbrukii、Propionibacterium acidoproprionici、Proprionispera arboris、Anaerobierspirillum succiniproducens、Bacterioides amylophilus、Becterioides ruminicola、Thermoanaerobacter kivui、Acetobacterium woodii、Acetoanaerobium notera、Clostridium aceticum、Butyribacterium methylotrophicum、Moorella thermoacetica、Eubacterium limosum、Peptostreptococcus productus、Clostridium ljungdahlii、Clostridium ATCC 29797、及びClostridium carboxidivoransからなる群から選択される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
指数増殖期の前記第１の酢酸生成微生物の増殖速度は、０．０１〜２時間−１である、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記好気的条件は、酸素が気相中に０．０００００５〜１体積％の濃度で存在することである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第３の微生物はプロピオノゲンである、請求項２から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第３の微生物は、遺伝子組換え微生物であり、野生型細胞と比べて、プロピオン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（Ｅ１）、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（Ｅ２）、アクリロイル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｅ３）の発現が増大している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第３の微生物はClostridium neopropionicumである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１及び第２の微生物はClostridium autoethanogenumであり、前記第３の微生物はClostridium neopropionicumである、請求項２から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第４の微生物は、Clostridium kluyveri、及びC.Carboxidivoransからなる群から選択される、請求項３から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）及び（ｂ）は、単一の発酵槽内で行われる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、６−メチル−１−ヘプタノール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３から１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好気的条件下で炭素源から高級アルコールを含むアルコール類を生成するバイオテクノロジ方法に関する。具体的には、この方法は、酸素の存在下で水性溶液中で少なくとも１種のアルコールを生成するバイオテクノロジ生成と、水性溶液からアルコールを抽出する手段とに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール、特にエタノールを生成するバイオテクノロジ方法は、本分野で既知である。中でも、エタノール及び／又はアセテートを生成するために、様々な炭素源に酢酸生成菌を使用することはよく知られている。しかしながら、ほとんどの場合、無酸素の状況でなければ、アルコール類を成功的に生成することはできない。このような現象は、少なくともBrioukhanov, 2006、Imlay, 2006、Lan, 2013などにより確認されている。これらによると、酢酸生成菌は、好気的条件下ではエタノールを首尾よく生成することができないことが示されている。したがって、本分野で既知の現在の方法では、例えば製鋼所の排ガスのような酸素を含む炭素気質は、エタノール及び／又はアセテート生成に用いられる酢酸生成細胞への導入に先立って、まずは酸素を除去するために処理される。酸素分離ステップは、プロセスをより高価なものにし時間のかかるものにする。さらに、この分離ステップ中に原料にいくらかの損失があり得る。
【０００３】
故に、本分野は、酸素の存在下でエタノール及び／又はアセテートを生成する手段を必要としている。次いで、エタノールは、アルコール類や酸類などの高級炭素化合物の生成原料として使用してもよい。
【０００４】
例えば、ブタノール及び高級アルコール類は、燃料として使用されることを含む様々な用途を有する。例えば、ブタノールは、ガソリンとエネルギ含有量がほぼ同じであるため、将来的にはガソリンの代替燃料となり得る。さらに、ブタノールは、エタノールと比べ、代替燃料として他の様々な優れた特性を有する。これらは、より高いエネルギ含量を有するブタノールを含む。ブタノールは、エタノール又はガソリンよりも「蒸発性（evaporative）」が低く、エタノールと比べて容易に輸送可能である。これらの理由及びそれ以上の理由から、ブタノール及び／又は関連する高級アルコール類の潜在的な市場は既に存在している。ブタノール及び他の高級アルコール類は、工業用溶剤としても使用される。
【０００５】
同様に、プロパノールは、他の化合物の中でもとりわけ製薬業界で樹脂やセルロースエステルに使用する溶剤である。イソプロパノール又はイソプロピルアルコールとしてよりよく知られているこの溶剤は、印刷インキ及び印刷業界で幅広く使用されている。１−プロパノールは、様々な微生物による有機物の分解で自然に生成され、植物やフーゼル油に含まれている。１−プロパノールは、一酸化炭素及び水素との反応でプロピオンアルデヒドを生成することにより、石油化学的に由来したエテンから生成することもでき、次いで水素化される。１−プロパノールは、メタノール生成の副産物でもあり、アクロレインから直接又はプロパンから直接生成することができる。プロパノールはさらに他の潜在的な用途を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これら全てのアルコール類は、現在、環境に悪影響を及ぼすガソリンや石油を分解することにより生成されている。また、商業的に生成されるこれらのアルコール類のほとんどは、蒸留のような従来の方式により抽出されている。このような従来の手段を用いたアルコールの蒸留は、抽出したアルコールの出力エネルギ能力よりも多くのエネルギの入力を必要とする。
【０００７】
したがって、アルコールの石油系生成工程に代わる、環境に優しく高効率、且つ生物原料を用いる代替案、並びに、これらのバイオアルコールを抽出するエネルギ効率の高い手法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、好気的条件下で炭素源から少なくとも１種のアルコールを生成するバイオテクノロジ手段を提供する。炭素源は、二酸化炭素及び／又は一酸化炭素を有してもよい。具体的には、本方法は少なくとも２つの段階を含む。一つの段階では水性培地中で炭素源からアルコールを形成し、もう一つの段階では、水性培地からアルコールを抽出する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の一態様において、炭素源から少なくとも１種のアルコールを生成する方法であって、
（ａ）好気的条件下、水性培地中でアルコールを生成することと、
（ｂ）（ｂｉ）水性培地中のアルコールと、少なくとも１種の抽出媒体とを、水性培地から抽出媒体中にアルコールを抽出するために十分な時間接触させ、（ｂｉｉ）抽出媒体を、抽出したアルコールと共に水性培地から分離することにより、水性培地からステップ（ａ）のアルコールを抽出することとを含み、
抽出媒体はオレイルアルコール、あるいは、ポリプロピレングリコール及びアルケンを有し、
アルコールは少なくとも３つの炭素原子を有する、方法を提供する。
【００１０】
本発明のいずれかの態様による方法は、炭素源から少なくとも１種の単離されたアルコールを生成する好気的方法であってもよい。単離されたアルコールとは、アルコールが生成された培地から分離され得る少なくとも１種のアルコールを指す。一例では、アルコールは、水性培地（例えば、アルコールが炭素源からの特定の細胞により生成される発酵培地）中で生成される。単離されたアルコールとは、水性培地から抽出したアルコールを指す。具体的には、抽出ステップは、水性培地から過剰な水分を分離することを可能にし、したがって、抽出したアルコールを含有する混合物を形成する。
【００１１】
抽出媒体は、「抽出剤」とも呼ばれる。本発明の任意の方法によって生成したアルコールを、アルコールが生成された水性培地から抽出／単離するために抽出剤を用いてもよい。抽出ステップの最後に、水性培地による過剰な水分を取り除くことができ、したがって抽出アルコールを含有する抽出媒体が得られる。抽出媒体は、水性培地からアルコールを抽出する効率的な手段をもたらし得る化合物の組み合わせを含んでもよい。具体的には、抽出媒体は、（ｉ）少なくとも５〜１８個の炭素原子を含む少なくとも１つの炭化水素、並びに（ｉｉ）少なくとも１つのポリオキシアルキレンポリマーを含んでもよい。本発明のいずれかの態様による抽出剤は、発酵アルコールを炭化水素−ポリアルキレンポリマー抽出媒体に効率よく抽出することができる。具体的には、炭化水素−ポリオキシアルキレンポリマーを含む混合物中の炭化水素は、少なくとも１つのアルカンであってもよい。より具体的には、アルカンは少なくとも５個の炭素原子を含んでもよい。ポリプロピレングリコールと少なくとも１種のアルカンとの混合物のこの抽出媒体は、混合物が酸素の存在下で所望のアルコールを抽出するのに効率的に作用するので、本発明のいずれかの態様による方法に適していると見なすことができる。具体的には、オレイルアルコール中の二重結合は酸素の存在に敏感であると見なされるので、ポリプロピレングリコールと少なくとも１種のアルカンとの混合物は抽出媒体としてのオレイルアルコールよりも良好に作用すると考えられる。
【００１２】
さらに具体的には、アルカンは少なくとも５〜１８個の炭素原子を有してもよい。一例では、アルカンは、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカンからなる群から選択される。さらなる例では、抽出媒体はポリプロピレングリコールとヘキサデカンの混合物を含んでもよい。
【００１３】
より具体的には、ポリプロピレングリコールとヘキサデカンとの混合物は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０ｗ／ｗ％のポリプロピレングリコール、並びに５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０ｗ／ｗ％のヘキサデカンを含んでもよい。さらにより具体的には、ポリプロピレングリコールとヘキサデカンとの混合物は、７０ｗ／ｗ％のポリプロピレングリコールと約３０ｗ／ｗ％のヘキサデカンを含んでもよい。
【００１４】
本発明のいずれかの態様によるステップ（ｂｉ）において、水性培地中のアルコールは、水性培地から抽出媒体へアルコールを抽出するのに十分な時間、抽出媒体と接触してもよい。当業者は、実質的に全てのアルコールを抽出媒体中に抽出するのに要する時間を決めることができ得る。所要時間は約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、あるいは１０分であってもよい。いくつかの例では、所要時間は抽出され得るアルコールの量に依存し得る。具体的には、水性培地から抽出媒体へアルコール抽出するのに必要な所要時間は、約３分であってもよい。
【００１５】
抽出されるアルコールの量に対する抽出媒体の使用量の比率は、抽出がどのくらい迅速に行われるべきかに応じて変わることになる。一例では、抽出媒体の量はアルコールを含む水性培地の量に等しい。抽出媒体を水性培地と接触させるステップの後、２つの相（水性相と有機相）は本分野で既知の任意の手段を用いて分離される。一例では、２つの相分離漏斗を用いて分離してもよい。
【００１６】
一例では、アルコールはプロパノールであり、ステップ（ａ）は、
（ａｉ）
指数増殖期の第１の酢酸生成微生物と、
遊離酸素と、
定常期の第２の酢酸生成微生物と、
を含む反応混合物であって、第１及び第２の酢酸生成微生物は、炭素源をアセテート及び／又はエタノールに転換することができる、反応混合物と、炭素源とを接触させることと、
（ａｉｉ）水性培地中で、アセテート及び／又はエタノールをプロパノールに転換することができる第３の微生物と、（ａｉ）から得たアセテート及び／又はエタノールとを接触させることと、
を含む。
【００１７】
別の例では、アルコールは少なくとも１種の高級アルコールであり、（ａ）は、
（ａ１）
指数増殖期の第１の酢酸生成微生物と、
遊離酸素と、
定常期の第２の酢酸生成微生物と、
を含む反応混合物であって、第１及び第２の酢酸生成微生物は、炭素源をアセテート及び／又はエタノールに転換することができる、反応混合物と、炭素源とを接触させることと、
（ａ２）エタノールカルボキシレート発酵経路を有し、かつ、（ａ１）から得たアセテート及び／又はエタノールを転換することができる第４の微生物と、（ａ１）から得たアセテート及び／又はエタノールとを接触させ、酸を形成することと、
（ａ３）（ａ２）から得た酸を、ステップ（ａ１）の反応混合物と接触させることと、
を含み、
水性培地中において、第１及び／又は第２の酢酸生成微生物は、酸を対応する高級アルコールに転換することができる。
【００１８】
アセテート及び／又はエタノールを、プロパノール及びプロピオン酸に転換することができる第３の微生物は、プロパノールの発酵生成を行うことができる任意の微生物を指すことができる。この第３の微生物はプロピオノゲンであってもよい。プロピオノゲンは、Ｃ３生成微生物である。具体的には、プロピオノゲンは、エタノールやアセテートのような合成ガス中間体をプロピオン酸やプロパノールに転換することができる任意の微生物を指す。「プロピオノゲン」又は「Ｃ３生成微生物」という用語は、基質と接触したときに基質をプロパノールに転換する微生物を指す。これらの微生物は、細胞内及び／又は細胞外で適切な酵素を生成することができる。これらのプロパノール生成微生物は、廃棄物であってもよいプロパノール発酵用出発原料を利用してもよい。例えば、合成ガス由来のエタノール及び／又はアセテートをプロパノール生成に利用してもよい。もともとは廃棄物と考えられていたであろう安価な出発材料を利用することがきるので、特に有利といえる。これにより廃棄物の除去が可能となり、結果として環境汚染を減少させる。一例では、本発明のいずれかの態様によるプロピオノゲンは、少なくともメチルマロニル−コハク酸経路、又は乳酸−アクリレート経路を用いて、アセテート及び／又はエタノールからプロパノールを生成する。
【００１９】
具体的には、本発明のいずれかの態様によるプロピオノゲンは、Clostridium neopropionicum、Clostridium propionicum、Pelobacter propionicus、Desulfobulbus propionicus、Syntrophobacter wolinii、Syntrophobacter pfennigii、Syntrophobacter fumaroxidans、Syntrophobacter sulfatireducens、Smithella propionica、Desulfotomaculum thermobenzoicum subspecies thermosyntrophicum、Pelotomaculum thermopropionicum、Pelotomaculum schinkiiからなる群から選択されてもよい。より具体的には、プロピオノゲンは、Clostridium neopropionicumであってもよい。
【００２０】
一例では、第３の微生物は、遺伝子組換えであってもよい任意の真核微生物、又は原核微生物であってもよい。より具体的には、第３の微生物は、エスケリキア属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、レプトスピラ属、サルモネラ属、ブレビバクテリウム属、ヒフォモナス属、クロモバクテリウム属、ノカルディア属、真菌、酵母からなる群から選択された株であってもよい。さらに具体的には、第３の微生物は、エスケリキア属から選択されてもよい。例えば、本発明のいずれかの態様による第３の微生物は、大腸菌であってもよい。第３の微生物は、遺伝子組換え生物であって、野生型細胞と比べて、プロピオン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ（ＡＪ２７６５５３）（Ｅ１）、ラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＪＮ２４４６５１−３）（Ｅ２）、アクリロイル−ＣｏＡレダクターゼ（ＪＮ２４４６５４−６）（Ｅ３）の発現が増大したものであってもよい。Kandasamy V. (2013)は、そのような遺伝生物の生成方法を開示している。Kandasamy V.はさらに、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３酵素の発現を測定し、それらの酵素のうちいずれかの発現が野生型細胞と比べて増大しているか否かを判定する手段についても開示している。
【００２１】
一例では、エタノール及び／又はアセテートは、エタノール−カルボキシレート発酵経路を有する第４の微生物の存在下で、対応する高級酸に転換される。エタノール−カルボキシレート発酵経路は、少なくともSeedorf、H.et al., 2008に詳細に記載されている。具体的には、第４の生物は、Clostridium kluyveri、C.carboxidivoransなどからなる群から選択されてもよい。これらの第４の微生物には、野生型の形態ではエタノール−カルボキシレート発酵経路を有しないが、遺伝子組換えの結果としてこの形質を獲得した微生物が含まれる。具体的には、第４の微生物は、Clostridium kluyveriであってもよい。
【００２２】
別の例では、第４の微生物は、Ｅ４〜Ｅ１４からなる群から選択された少なくとも１つの酵素を発現する野生型生物である。ここで、Ｅ４はアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、Ｅ５はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）、Ｅ６はアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌ）、Ｅ７は３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）、Ｅ８は３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｃｒｔ）、Ｅ９はブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）、Ｅ１０は電子伝達フラビンタンパク質サブユニット（ｅｔｆ）、Ｅ１１はコエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、Ｅ１２はアセテートキナーゼ（ａｃｋ）、Ｅ１３はホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、Ｅ１４はトランスヒドロゲナーゼである。具体的には、本発明のいずれかの態様による野生型の第４の微生物は少なくともＥ５、Ｅ６、Ｅ７を発現してもよい。さらに具体的には、本発明のいずれかの態様による野生型の第４の微生物は少なくともＥ７を発現してもよい。
【００２３】
別の例では、本発明のいずれかの態様による第４の微生物は、野生型微生物と比べて、Ｅ４〜Ｅ１４から選択された少なくとも１つの酵素の発現が増大した遺伝子組換え生物である。ここで、Ｅ４はアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈ）、Ｅ５はアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄ）、Ｅ６はアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ｔｈｌ）、Ｅ７は３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｂｄ）、Ｅ８は３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ｃｒｔ）、Ｅ９はブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｂｃｄ）、Ｅ１０は電子伝達フラビンタンパク質サブユニット（ｅｔｆ）、Ｅ１１はコエンザイムＡトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、Ｅ１２はアセテートキナーゼ（ａｃｋ）、Ｅ１３はホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）、Ｅ１４はトランスヒドロゲナーゼである。具体的には、本発明のいずれかの態様による第４の遺伝子組換え微生物は少なくともＥ５、Ｅ６、Ｅ７を発現してもよい。さらに具体的には、本発明のいずれかの態様による第４の遺伝子組換え微生物は少なくともＥ７を発現してもよい。Ｅ４〜Ｅ１４酵素は、Clostridium kluyveriから単離してもよい。当業者であれば、本分野で既知の方法を使用し、これらの酵素のそれぞれの活性を測定してもよい。具体的には、Ｅ４及びＥ５酵素の活性は、少なくともHillmer P., 1972、Lurz R., 1979が教示している検定を用いて測定することができる。Ｅ５酵素の活性は、Smith L.T., 1980が教示している検定を用いても測定することができる。Ｅ６及びＥ７酵素の活性は、少なくともSliwkowski M.X., 1984が教示している検定を用いて測定することができる。Ｅ７酵素の活性は、Madan、V.K., 1972が教示している検定を用いても測定することができる。Ｅ８酵素の活性は、Bartsch,R.G., 1961が教示している検定を用いても測定することができる。Ｅ９及びＥ１０酵素の活性は、Li,F., 2008が教示している検定を用いて測定することができる。Ｅ１０酵素の活性は、Chowdhury, 2013が教示している検定を用いても測定することができる。Ｅ１１酵素の活性は、Stadman, 1953が教示している検定を用いて測定することができる。Ｅ１２酵素の活性は、Winzer,K., 1997が教示している検定を用いて測定することができる。Ｅ１３酵素の活性は、Smith L.T., 1976が教示している検定を用いて測定することができる。Ｅ１４酵素の活性は、Wang S, 2010が教示している検定を用いて測定することができる。
【００２４】
本明細書で用いられる「アセテート」という用語は、酢酸とその塩の両方を指し、本分野で知られているように、微生物は水性環境で作用し、存在する塩と酸の間には常に均衡がとれているため、必然的に生成される。
【００２５】
具体的に、後期指数期の第２の酢酸生成微生物は、細胞の定常期にあってもよい。対数期の酢酸生成細胞は、水性培地中の他の酢酸生成細胞が酸素の存在下でアセテート及び／又はエタノールを生成できるようにする。対数期における酢酸生成細胞の濃度は、反応混合物中で保持されてもよい。したがって、反応の任意の時点にて、反応混合物は指数増殖期の酢酸生成細胞、並びに、別の増殖期、例えば静止期の酢酸生成細胞を含む。
【００２６】
当業者でれば、微生物の異なる増殖期、並びにそれらを測定し同定する方法を理解するであろう。具体的には、バッチ培養中のほとんどの微生物は、少なくとも４つの異なる増殖期、つまり遅滞期（Ａ）、対数期、又は指数期（Ｂ）、定常期（Ｃ）、死滅期（Ｄ）から探し出すことができる。対数期はさらに、初期対数期と、中期〜後期対数／指数期に分けられる。定常期もまた、初期定常期と定常期とにさらに分けられる。例えば、Cotter,J.L., 2009、Najafpour.G., 2006、Younesi,H., 2005、Kopke,M., 2009は、酢酸生成菌の異なる成長期を開示している。具体的には、細胞の成長期を、少なくともShuler ML, 1992及びFuchs G., 2007が教示する方法を用いて測定してもよい。
【００２７】
遅滞期は、細胞を新鮮な培地に接種した直後の期であり、個体数は一時的に変化せずそのまま維持される。明らかな細胞分裂は生じないが、細胞の体積や質量が増大し、酵素、タンパク質、ＲＮＡなどが合成され、代謝活性が増大することがある。遅滞期の長さは、接種物の大きさ、移送中の物理的損傷や衝撃からの回復に必要な時間、必須補酵素又は分裂因子の合成に必要な時間、培地中に存在する基質の代謝に要する新しい（誘導性）酵素の合成に必要な時間、を含む多種多様な要因に依存し得る。
【００２８】
指数（対数）期は、全ての細胞が二分裂によって規則的に分裂し、幾何学的進行によって増殖している、均衡のとれた増殖のパターンである。細胞は増殖培地の組成、及びインキュベーション条件に応じて一定の速度で分裂する。細菌培養物の指数増殖速度は、生成時間、若しくは細菌集団の倍増時間として表される。世代時間（Ｇ）は、１世代あたりの時間（ｔ）として定義される（ｎ＝世代数）。したがって、Ｇ＝ｔ／ｎは生成時間の計算式から導き出される式である。指数期は、（ｉ）初期対数期及び（ｉｉ）中期〜後期対数／指数期に分けられる。当業者であれば、微生物、特に酢酸生成細菌が対数期に入る時点を容易に識別することができる。例えば、対数期であるか否かを判定するための酢酸生成細菌の増殖速度を計算する方法として、少なくともHenstra A.M., 2007が教示している方法を用いることができる。具体的には、本発明のいずれかの態様による指数増殖期の微生物は、初期対数期、及び中期〜後期指数／対数期の細胞を含んでもよい。
【００２９】
定常期は、バッチ培養（例えば、試験管やフラスコのような閉鎖系）において指数増殖が永久に継続することができないため、指数増殖が終わる段階である。個体数の増加は、次の３つの要因、つまり、１．利用可能な栄養素の枯渇、２．抑制性代謝産物又は最終産物の蓄積、３．空間の枯渇（この場合は「生物学的空間」の欠如）のいずれかにより制限される。定常期中に生存細胞を計数すると、一部の細胞が死滅したのか、等しい数の細胞が分裂しているか、単に細胞集団の増殖と分裂が停止しているかを定めることができない。遅滞期のように、定常期は必ずしも静止期である必要はない。抗生物質などの二次代謝産物を生成する細菌は、成長サイクルの定常期に生成を行う（二次代謝産物は、活発な成長段階の後に生成される代謝産物として定義される）。
【００３０】
死滅期は定常期に続く。死滅期の間、生存細胞の数は幾何学的に（指数的に）減少する。本質的には、対数期の増殖を反転したものである。
【００３１】
一例では、本発明のいずれかの態様による反応混合物中にＯ２が存在する場合、酢酸生成微生物のライフサイクルにおいて、第１の酢酸生成細菌は指数増殖期にあり、他の酢酸生成細菌は他の増殖期にある。具体的には、本発明のいずれかの態様によれば、反応混合物中の酢酸生成細菌は、指数増殖期にある１つの酢酸生成細菌と静止期にある別の酢酸生成細菌とを含んでもよい。対数増殖期に酢酸生成細菌が存在しない場合、酸素の存在下では、静止期の酢酸生成細菌は、アセテート及び／又はエタノールを生成できないことになる。この現象は、少なくともBrioukhanov, 2006、Imlay, 2006、Lan, 2013などにより確認されている。したがって、本発明者らは、指数増殖における酢酸生成細菌の存在下で、任意の増殖期の酢酸生成細菌が好気的に呼吸し、反応混合物に酸素が存在しない場合の生成量以上のアセテート及び／又はエタノールを生成するということに着目した。一例では、指数増殖期の酢酸生成細菌は反応混合物から遊離酸素を除去し、任意の増殖期の酢酸生成細菌が炭素基質を代謝してアセテート及び／又はエタノールを生成するのに適切な環境（遊離酸素なし）を提供することができる。
【００３２】
別の例では、水性培地は、炭素源の存在下で、任意の増殖期、特に静止期に既に酢酸生成細菌を既に含んでいる。この例では、水性培地に供給される炭素源中に、あるいは水性培地自体の中に酸素が存在する。酸素の存在下では、酢酸生成細菌は不活性となり、指数増殖期に酢酸生成細菌を添加する前はアセテート及び／又はエタノールを生成しない可能性がある。まさにこの例では、指数増殖期にある酢酸生成細菌を水性培地に添加することができる。水性培地中に既に存在する不活性酢酸生成細菌は、次いで活性化され、アセテート及び／又はエタノールの生成を開始する。
【００３３】
さらなる例では、任意の増殖期の酢酸生成細菌を最初に指数増殖期の酢酸生成細菌と混合し、次に炭素源及び／又は酸素を添加することができる。
【００３４】
本発明のいずれかの態様によれば、酸素の存在下で増殖する指数増殖期にある微生物は、順化により、酸素の存在下で増殖及び代謝するものであってもよい。具体的には、微生物は、微生物を取り囲む環境から酸素を取り除くことが可能であってもよい。この新たに得た順化により、指数増殖期にある酢酸生成細菌は酸素環境を除去でき、それによって炭素源からアセテートとエタノールとを生成できる。具体的には、酢酸生成細菌は、新たに得た順化により、炭素源をアセテート及び／又はエタノールに転換させることができる。
【００３５】
一例では、本発明のいずれかの態様による反応混合物中の酢酸生成細菌は、細胞、つまり対数増殖期の細胞と定常期の細胞との組み合わせを含む。本発明のいずれかの態様による方法では、対数増殖期の酢酸生成細胞は、０．０１〜２時間−１、０．０１〜１時間−１、０．０５〜１時間−１、０．０５〜２時間−１、０．０５〜０．５時間−１からなる群から選択される増殖速度を有してもよい。反応混合物中の対数期酢酸生成細胞の細胞のＯＤ６００は、０．００１〜２、０．０１〜２、０．１〜１、０．１〜０．５などからなる範囲から選択されてもよい。当業者は、本分野で既知の任意の方法によりＯＤ６００を測定して、反応混合物中の細胞の増殖速度、及び／又は反応混合物に添加すべき細胞の量を判定することができる。例えば、Ｋｏｃｈ（１９９４）を適用してもよい。具体的には、細菌増殖を、様々な方法を用いて判定及び監視することができる。最も一般的なものの一つは、懸濁液中の細菌の光学密度（ＯＤ）に依存し、分光光度計を使用する濁度測定が挙げられる。ＯＤを、ＵＶ分光計を用いて６００ｎｍにて測定してもよい。
【００３６】
反応混合物中の第１及び第２の酢酸生成細菌の濃度を維持するために、当業者は、一定の時点でサンプルを抽出し、ＯＤ６００、ｐＨ、酸素濃度、形成されたエタノール及び／又は高級アルコールの濃度を測定することができる。次いで当業者は、反応混合物中の第１及び第２の酢酸生成細菌の濃度を維持する一方、エタノール及び／又はアセテートの生成に最適な環境を確実に維持するために必要な成分を添加することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「酢酸生成細菌」という用語は、Wood-Ljungdahl経路を有し、それによってＣＯ、ＣＯ２及び／又は水素をアセテートに転換することができる微生物を指す。これらの微生物には、野生型ではWood-Ljungdahl経路を有しないが、遺伝子組換えの結果としてこの形質を獲得した微生物が含まれる。このような微生物は、大腸菌細胞を含むが、それに限定されない。これらの微生物は、カルボキシ栄養細菌としても知られている。現在、本分野において既知の酢酸生成細菌は２１属であり（Drake et al., 2006）、これらはいくらかのクロストリジウムも含む（Drake & Kusel, 2005）。これらの細菌は、エネルギ源として水素と共に炭素源として二酸化炭素又は一酸化炭素を使用することができる（Wood, 1991）。さらに、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、並びに多数のヘキソースも炭素源として使用することができる（Drake et al., 2004）。アセテートの形成をもたらす還元経路は、アセチル−ＣｏＡ又はWood-Ljungdahl経路と呼ばれる。
【００３８】
具体的には、酢酸生成細菌は、Acetoanaerobium notera(ATCC 35199)、Acetonema longum(DSM 6540)、Acetobacterium carbinolicum(DSM 2925)、Acetobacterium malicum(DSM 4132)、Acetobacterium種番号446(Morinaga et al., 1990、J.Biotechnol., Vol.14、p.187-194)、Acetobacterium wieringae(DSM 1911)、Acetobacterium woodii(DSM 1030)、Alkalibaculum bacchi(DSM 22112)、Archaeoglobus fulgidus(DSM 4304)、Blautia producta (DSM 2950、以前はRuminococcus productus、Peptostreptococcus productusとも呼ばれた)、Butyribacterium methylotrophicum(DSM 3468)、Clostridium aceticum(DSM 1496)、Clostridium autoethanogenum(DSM 10061、DSM 19630、DSM 23693)、Clostridium carboxidivorans(DSM 15243)、Clostridium coskatii(ATCC no.PTA-10522)、Clostridium drakei(ATCC BA-623)、Clostridium formicoaceticum(DSM 92)、Clostridium glycolicum(DSM 1288)、Clostridium ljungdahlii(DSM 13528)、Clostridium ljungdahlii C-01(ATCC 55988)、Clostridium ljungdahlii ERI-2(ATCC 55380)、Clostridium ljungdahlii O-52 (ATCC 55989)、Clostridium mayombei(DSM 6539)、Clostridium methoxybenzovorans(DSM 12182)、Clostridium ragsdalei(DSM 15248)、Clostridium scatologenes(DSM 757)、Clostridium species ATCC 29797(Schmidt et al., 1986、Chem.Eng.Commun., Vol.45、p.61-73)、Desulfotomaculum kuznetsovii(DSM 6115)、Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. thermosyntrophicum(DSM 14055)、Eubacterium limosum(DSM 20543)、Methanosarcina acetivorans C2A (DSM 2834)、Moorella sp.HUC22-1(Sakai et al., 2004)、Moorella thermoacetica(DSM 521、以前はClostridium thermoaceticumと呼ばれた)、Moorella thermoautotrophica(DSM 1974)、Oxobacter pfennigii(DSM 322)、Sporomusa aerivorans(DSM 13326)、Sporomusa ovata (DSM 2662)、Sporomusa silvacetica (DSM 10669)、Sporomusa sphaeroides(DSM 2875)、Sporomusa termitida(DSM 4440)、Thermoanaerobacter kivui(DSM 2030、以前はAcetogenium kivuiと呼ばれた)からなる群から選択されてもよい。より具体的には、Clostridium carboxidivoransのATCC BAA-624株を使用してもよい。さらに具体的には、例えば米国特許出願公開第2007/0275447号明細書、及び米国特許出願公開第２００８／００５７５５４号明細書に記載されているように、Clostridium carboxidivoransの「Ｐ７」及び「Ｐ１１」と表示された細菌株を使用してもよい。
【００３９】
特に適した細菌としては他にもClostridium ljungdahliiが挙げられる。具体的には、合成ガスのヘキサン酸への転換には、Clostridium ljungdahlii PETC、Clostridium ljungdahlii COL、Clostridium ljungdahlii O-52からなる群から選択された菌株を使用してもよい。これらの株は、例えば、ＷＯ９８／００５５８、ＷＯ００／６８４０７、ＡＴＣＣ４９５８７、ＡＴＣＣ５５９８８、ＡＴＣＣ５５９８９に記載されている。本発明のいずれかの態様によって用いられる第１及び第２の酢酸生成細菌は、同じ細菌であってもよく、異なる細菌であってもよい。例えば、ある反応混合物において、第１の酢酸生成細菌は対数期のClostridium ljungdahlii、第２の酢酸生成細菌は静止期のClostridium ljungdahliiである。別の例では、反応混合物において、第１の酢酸生成細菌は対数期のClostridium ljungdahlii、第２の酢酸生成細菌は静止期のClostridium carboxidivoransである。
【００４０】
本発明のいずれかの態様による反応混合物中には、酸素が存在してもよい（つまり、好気的条件が使用される）。合成ガスを含むほとんどの排ガスは少量、あるいは大量の酸素を含むので、反応混合物及び／又は反応混合物に供給されるガス流にＯ２を組み込むことは有益である。高級アルコール生成の炭素源として合成ガスを使用するに先立ってこの酸素を除去することは困難でありコストがかかる。本発明のいずれかの態様による方法では、炭素源から酸素を最初に除去する必要なしに少なくとも１種の高級アルコールを生成することが可能となる。よって、時間と資金を節約することができる。
【００４１】
より具体的には、ガス流中のＯ２濃度は、ガス流におけるガス総量の１体積％未満で存在してもよい。具体的には、酸素の濃度は、ガス流のガス相、及び／又は培地において、０．０００００５〜２体積％、０．００００５〜２体積％、０．０００５〜２体積％、０．００５〜２体積％、０．０５〜２体積％、０．００００５〜１．５体積％、０．０００５〜１．５体積％、０．００５〜１．５体積％、０．０５〜１．５体積％、０．５〜１．５体積％、０．００００５〜１体積％、０．０００５〜１体積％、０．００５〜１体積％、０．０５〜１体積％、０．５〜１体積％、０．５５〜１体積％、０．６０〜１体積％の範囲であってもよく、特に０．６０〜１．５体積％、０．６５〜１体積％、０．７０〜１体積％の範囲であってもよい。具体的には、酢酸生成微生物には、気相／ガス流におけるＯ２の割合が、ガス流のガス量に対して、約０．００００５体積％、０．０００５体積％、０．００５体積％、０．０５体積％、０．５体積％、０．６体積％、０．７体積％、０．８体積％、０．９体積％、１体積％、１．５体積％、２体積％である場合に特に適している。当業者であれば、本分野において既知の方法のうちのいずれか１つを使用し、ガス流における酸素の体積濃度を測定することができるはずである。具体的には、酸素の体積は、本分野において既知の任意の方法を使用して測定してもよい。一例では、酸素の気相濃度を、PreSens Precision Sensing GmbH製の微量酸素浸漬プローブによって測定する。酸素濃度は蛍光消光によって測定してもよく、消光の程度は、気相中の酸素分圧と相関関係にある。さらに具体的には、本発明のいずれかの態様による第１及び第２の微生物は、酸素が全体の１体積％未満、反応混合物に供給されるガス流におけるガスの全体積の約０．０１５体積％の酸素濃度を有するガス流によって供給される場合、水性培地において最適に作用することができる。
【００４２】
本発明のいずれかの態様によれば、炭素源が反応混合物中でエタノール及び／又はアセテートに転換される好気的条件とは、反応混合物を囲む気体を指す。ガスは、ガス全体の少なくとも１体積％の酸素と、ＣＯ、ＣＯ２などの炭素源を含む他のガスとを含んでもよい。
【００４３】
本発明のいずれかの態様による水性培地は酸素を含んでもよい。酸素は、本分野において既知の任意の手段によって培地に溶解することができる。具体的には、酸素は、細胞の不在下で、０．５ｍｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。具体的には、水性培地中の遊離酸素の溶解濃度は少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌであってもよい。別の例では、溶存酸素は、約０．０１ｍｇ／Ｌ、０．０２ｍｇ／Ｌ、０．０３ｍｇ／Ｌ、０．０４ｍｇ／Ｌ、０．０５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌである。具体的には、溶存酸素濃度は、０．０１〜０．５ｍｇ／Ｌ、０．０１〜０．４ｍｇ／Ｌ、０．０１〜０．３ｍｇ／Ｌ、０．０１〜０．１ｍｇ／Ｌであってもよい。具体的には、酸素を、連続ガス流において水性培地に供給してもよい。より具体的には、水性培地は、酸素と、ＣＯ及び／又はＣＯ２を含む炭素源とを含んでもよい。より具体的には、酸素と、ＣＯ及び／又はＣＯ２を含む炭素源とは、連続ガス流において水性培地に供給される。さらにより具体的には、連続ガス流は合成ガスと酸素とを含む。一例では、両方のガスは同じ流／流れ（flow/stream）の一部である。別の例では、各ガスは、水性培地に供給される別々の流／流れである。これらのガスは、例えば、水性培地中に開口する別々のノズル、フリット、ガスを水性培地中に供給するパイプ内部の膜などを使用して分割してもよい。酸素は、遊離酸素であってもよい。本発明のいずれかの態様によれば、「遊離酸素を含む反応混合物」とは、Ｏ２の形態の元素状酸素を含む反応混合物を意味する。Ｏ２は反応混合物中の溶存酸素であってもよい。具体的には、溶存酸素は５ｐｐｍ（０．０００００５％ｖｏｌ：５×１０−６）以上の濃度であってもよい。当業者は、溶存酸素の濃度を測定するために本分野において既知の任意の方法を使用してもよい。一例では、溶存酸素を、酸素浸漬プローブ（ドイツ国レーゲンスブルク、PreSens Precision Sensing GmbH製、PSt6型）により測定することができる。
【００４４】
本発明のいずれかの態様による方法のステップ（ａｉｉ）は、ステップ（ａｉ）から得たアセテート及び／又はエタノールを、アセテート及び／又はエタノールをプロパノールに転換することができる第３の微生物と接触させることを含む。具体的には、第３の微生物に遺伝子組換えを加え、メチルマロニル−コハク酸経路、あるいは乳酸−アクリレート経路を実行してアセテート及び／又はエタノールからプロパノールを生成するのに必要な酵素の発現を、野生型細胞に比べて増大させてもよい。
【００４５】
本発明のいずれかの態様によると、第１、第２、第３及び／又は第４の微生物は、遺伝子組換え微生物であってもよい。遺伝子組換え細胞又は遺伝子組換え微生物は、野生型細胞又は野生型微生物とは遺伝的に相違し得る。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え微生物と野生型微生物との間の遺伝的差異は、野生型微生物には存在し得ない完全な遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチドなどが、遺伝子組換え微生物には存在することであってもよい。一例では、本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え微生物は、微生物にプロパノール及び／又はプロピオン酸を生成させる酵素を含む。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え微生物に比べて野生型微生物は、遺伝子組換え微生物にプロパノール及び／又はプロピオン酸を生成させる酵素の活性を有していないか、あるいは検出できるほどの活性を有していない。本明細書において「遺伝子組換え微生物」という用語は、「遺伝子組換え細胞」という用語で代替可能に使用され得る。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換えは、微生物の細胞に対して行うことができる。
【００４６】
本明細書において、細胞又は微生物と組み合わせて用いられる「野生型」という語句は、野生で自然に見られる形態のゲノム構成を有する細胞を意味している。この用語は、全細胞及び個々の遺伝子の両方に適用可能である。したがって、「野生型」という用語は、他の態様において（つまり、１つ以上の遺伝子に対して）遺伝子組換えを行っているが、対象遺伝子に対しては遺伝子組換えを行っていない細胞も含まれてもよい。したがって「野生型」という用語は、組換え法を用いて対象となる特定の遺伝子の遺伝子配列を人の手により少なくとも部分的に書き換えている細胞は含まない。よって、本発明のいずれかの態様による野生型細胞とは、全ゲノム及び／又は特定の遺伝子に対して遺伝子変異が生じていない細胞を指す。したがって、一例では、Ｅ１酵素に対する野生型細胞は、細胞内でＥ１酵素の天然の／未変異の発現を示す細胞を意味する。Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４酵素などに対する野生型細胞に関しても同様に解釈してもよく、細胞内でＥ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、Ｅ９、Ｅ１０、Ｅ１１、Ｅ１２、Ｅ１３、Ｅ１４酵素などの天然の／未変異の発現をそれぞれ示す細胞を意味する。
【００４７】
当業者であれば、本分野で既知の任意の方法により、細胞又は微生物に対して遺伝子組換えを行うことができるであろう。本発明のいずれかの態様によると、遺伝子組換えを行った結果、遺伝子組換え細胞は、２時間以内、具体的には８時間又は２４時間以内という所定の時間間隔にて、野生型細胞よりも少なくとも１倍又は２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、あるいは、少なくとも１００００倍以上のプロパノール及び／又はプロピオン酸を有する。生成物形成の増加は、例えば、本発明のいずれかの態様による細胞と野生型細胞をそれぞれ別々に同様の条件（同じ細胞密度、同じ栄養培地、同じ培養条件）下で、特定の時間、適切な栄養培地を用いて培養し、栄養培地における目標生成物（少なくとも３個の炭素を有するアルコール）の生成量を測定して定める。
【００４８】
「第２の微生物」又は「第３の微生物」又は「第４の微生物」という用語は、本発明のいずれかの態様による「第１の微生物」とは異なる微生物を意味する。数字は、本発明のいずれかの態様による方法に関与し得る生物の数を意味しない。例えば、本発明のいずれかの態様よる高級アルコールの生成方法においては、「第１の微生物」、「第２の微生物」、「第４の微生物」が関与する。本発明のいずれかの態様による高級アルコールの生成方法に関与する「第３の微生物」は存在し得ない。したがって、微生物を指すための数字の使用は、本発明のいずれかの態様によって含まれる異なる微生物の区別を目的としており、含まれる有機体の数を指すためではない。例えば、本発明のいずれかの態様による方法における「第４の微生物」の使用は、その方法において４つの生物が用いられることを意味するわけではなく、特定の第４の微生物を使用するという意味である。
【００４９】
一例では、プロパノールが本発明のいずれかの態様によって生成されるアルコールである場合、第１、第２、第３の微生物は酸素の存在下で単一の発酵槽の中に存在する。次いで、プロパノールを含む水性培地を別の容器に移して、抽出媒体を用いて（ｂ）抽出を行ってもよい。
【００５０】
さらなる例では、プロパノールが本発明のいずれかの態様によって生成されるアルコールである場合、第１、第２、第３の微生物は酸素の存在下で単一の発酵槽の中に存在する。次いで、水性培地中の生成物、つまりプロパノールを、細胞を含む培地から直接抽出してもよい。その後、細胞を、プロパノールの生成にリサイクルしてもよい。
【００５１】
一例では、プロパノールが本発明のいずれかの態様によって生成されるアルコールである場合、第１及び第２の微生物は第１の発酵槽に存在し、第３の微生物は第２の発酵槽に存在する。発酵槽１では、第１及び第２の微生物が炭素源と接触してアセテート及び／又はエタノールを生成する。次いで、エタノール及び／又はアセテートを発酵槽２内で第３の微生物と接触させてプロパノールを生成してもよい。発酵槽１で生成されたアセテート及び／又はエタノールを定期的に発酵槽２に供給し、発酵槽２内のアセテート及び／又はエタノールをプロパノールに転換するサイクルを作り出してもよい。酸素を発酵槽２に添加し、第３の微生物により、アセテートをプロパノールに転換させてもよい。
【００５２】
同様に、発酵槽１では、第１及び第２の微生物がＣＯを含む炭素源と接触してアセテート及び／又はエタノールを生成してもよい。次いで、エタノール及び／又はアセテートを発酵槽２内で第３の微生物と接触させてプロパノールを生成してもよい。発酵槽１で生成されたアセテート及び／又はエタノールを定期的に発酵槽２に供給し、発酵槽２内のアセテート及び／又はエタノールをプロパノールに転換するサイクルを作り出してもよい。発酵槽１に供給されたＣＯは、アセテート及び／又はエタノールと共に発酵槽２に移送されてもよい。２つの発酵槽の間では、特別な抽出方法は特に必要ない。
【００５３】
一例では、高級アルコールが本発明のいずれかの態様によって生成される場合、第１、第２及び第４の微生物は第１発酵槽に存在してもよい。発酵槽において、第１及び第２の微生物は、最初に炭素源と接触してアセテート及び／又はエタノールを生成する。次いで、エタノール及び／又はアセテートは同じ発酵槽内の第４の微生物と接触して少なくとも１種の酸を生成する。次いで、酸は第１及び第２の微生物に再び接触したときに、少なくとも１種の対応高級アルコールを生成する。第４の微生物が、ＣＯの存在下でアセテート及び／又はエタノールを少なくとも１種の酸に転換することを見出したので、特別な抽出方法は必要ない。
【００５４】
さらになる例では、本発明のいずれかの態様によって高級アルコールが生成される場合、第１及び第２の微生物は第１の発酵槽に、第４の微生物は第２の発酵槽に存在する。発酵槽１では、第１及び第２の微生物が炭素源と接触してアセテート及び／又はエタノールを生成する。次いで、エタノール及び／又はアセテートを発酵槽２内で第４の微生物と接触させて少なくとも１種の酸を生成してもよい。次いで、酸を発酵槽１に戻して少なくとも１種の高級アルコールを生成してもよい。発酵槽１で生成されたアセテート及び／又はエタノールを定期的に発酵槽２に供給し、発酵槽２内のアセテート及び／又はエタノールを少なくとも１種の酸に転換して、発酵槽２内の酸を発酵槽１に戻すサイクルを作り出してもよい。同様に、発酵槽１では、第１及び第２の微生物がＣＯを含む炭素源と接触してアセテート及び／又はエタノールを生成してもよい。次いで、エタノール及び／又はアセテートを発酵槽２内で第４の微生物と接触させて少なくとも１種の酸を生成してもよい。次いで酸を任意に抽出し、発酵槽１に戻して酸を所望の高級アルコールに転換してもよい。発酵槽１で生成されたアセテート及び／又はエタノールを定期的に発酵槽２に供給し、発酵槽２内のアセテート及び／又はエタノールを少なくとも１種の酸に転換して、発酵槽２内の酸を発酵槽１に戻すサイクルを作り出してもよい。発酵槽１に供給されたＣＯは、アセテート及び／又はエタノールと共に発酵槽２に移送されてもよい。第４の微生物が、ＣＯの存在下でアセテート及び／又はエタノールを少なくとも１種の酸に転換することを見出したので、特別な抽出方法は必要ない。
【００５５】
また別の例では、本発明のいずれかの態様によって高級アルコールが生成される場合、培地は発酵槽１と発酵槽２の間でリサイクルされる。したがって、発酵槽１で生成されたエタノール及び／又はアセテートは発酵槽２に供給され、発酵槽２で生成された酸は発酵槽１に戻される。培地をリサイクルする工程において、発酵槽１からのＣＯを発酵槽２に導入してもよい。また、発酵槽２で生成された酸は、結果的に発酵槽１に再導入されることになる。発酵槽２内の第４の微生物は、発酵槽１から発酵槽２にリサイクルされるＣＯの存在下で、アセテート及びエタノールから酸を生成し続けることができる。発酵槽１及び２内に蓄積された高級アルコールは、本分野において既知の手段により抽出してもよい。
【００５６】
さらになる例では、３つの容器を用いて本発明のいずれかの態様による方法を実行する。第１及び第２の微生物は第１の発酵槽に存在し、第４の微生物は第２の発酵槽、及び第１及び第２の微生物と共に第３の発酵槽に存在してもよい。発酵槽１では、第１及び第２の微生物が炭素源と接触してアセテート及び／又はエタノールを生成する。次いで、エタノール及び／又はアセテートを発酵槽２内で第４の微生物と接触させて少なくとも１種の酸を生成してもよい。次いで、酸を発酵槽１に戻して少なくとも１種の高級アルコールを生成してもよい。
【００５７】
炭素源からの酸及び／又は高級アルコールの生成においては、細菌の組み合わせを用いてもよい。１つ以上の第４の微生物と組み合わせて１つ以上の酢酸生成細菌が存在してもよい。別の例では、２種以上の酢酸生成細菌及び１種のみの第４微生物が存在してもよい。また別の例では、２種以上の第４の微生物が１種のみの酢酸生成細菌と組み合わせて存在してもよい。
【００５８】
本明細書における「組換え細胞は、その野生型に比べて酵素活性の増大を現す」という語句は、それぞれの酵素の活性が、少なくとも２倍、具体的には少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも１００倍、さらに具体的には少なくとも１０００倍、また具体的には少なくとも１００００倍ほど増大することを意味する。
【００５９】
本明細書における「酵素の活性増大」という語句は、細胞内活性の増大と理解すべきである。基本的に、酵素活性の増大は、遺伝子配列又は酵素をコード化する遺伝子配列のコピー数の増加、強いプロモータ、あるいは活性が増大した対応する酵素をコード化する遺伝子又は対立遺伝子の使用、並びに、場合によってこれらの手段を組み合わせることによって得ることができる。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え細胞は、例えば、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子、あるいはその一部を含むベクタ、並びに遺伝子を発現させるベクタを用いて、形質転換、形質導入、接合やこれらの組み合わせにより生成することができる。異種発現は、具体的には、細胞の染色体あるいは染色体外複製ベクタに遺伝子又は対立遺伝子を組み込むことにより達成される。同様に、酵素の活性の減少は細胞内活性の低下を意味する。一例では、本発明のいずれかの態様による酵素の発現増大は、野生型細胞における酵素の発現と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％増大することである。同様に、本発明のいずれかの態様による酵素の発現減少は、野生型細胞における酵素の発現と比べて、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％減少することである。
【００６０】
使用される培地は、特定の株の要件に適していなければならない。様々な微生物に用いられる培地については、「Manual of Methods for General Bacteriology」を参照されたい。
【００６１】
全ての百分率（％）は、別途に定められていない限り、質量百分率である。
【００６２】
二酸化炭素及び／又は一酸化炭素を含む基質の供給源に関して、当業者であれば、炭素供給源としてＣＯ及び／又はＣＯ２を供給できる供給源候補が多く存在することを理解するであろう。実際には、本発明の炭素源として、十分な量の炭素を微生物に供給する任意のガス又は任意のガス混合物を使用することができるので、その結果、アセテート及び／又はエタノールは、ＣＯ及び／又はＣＯ２の発生源から形成されることになる。
【００６３】
一般的に本発明の細胞に関して、炭素源は少なくとも５０重量％、少なくとも７０重量％、特に少なくとも９０重量％のＣＯ２及び／又はＣＯを含む。ここで、重量百分率（％）は、本発明のいずれかの態様による細胞に利用できる全ての炭素源を表す。炭素材料源を用意してもよい。
【００６４】
ガス形態の炭素源の例として、合成ガス、煙道ガス、並びに酵母発酵やクロストリジウム発酵によって生成される石油精製ガスなどの排ガスが挙げられる。これらの排ガスは、セルロース含有材料のガス化又は石炭ガス化から形成される。一例では、これらの排ガスは、必ずしも他の工程の副生成物として生成されるわけではないが、本発明の混合培養物と共に使用するために生成される。
【００６５】
本発明のいずれかの態様によると、炭素源は合成ガスであってもよい。合成ガスは、例えば石炭ガス化の副産物として生成することができる。したがって、本発明のいずれかの態様による微生物は、老廃物である物質を貴重な資源に転換することができる。
【００６６】
別の例では、合成ガスは、広く入手可能で低コストの農業原料のガス化の副産物であり、本発明の混合培養物と共に使用することで置換及び非置換有機化合物を生成することができる。
【００６７】
ほぼ全ての形態の植生をこの目的に使用できるため、合成ガスに転換できる原料の例は数多く存在する。具体的には、原料は、ミカンサスのような多年生草、トウモロコシ残渣、おがくずのような加工廃棄物などからなる群から選択される。
【００６８】
一般に、合成ガスは、乾燥バイオマスのガス化装置内で、主に熱分解、部分酸化及び水蒸気改質によって得ることができる。合成ガスの一次生成物はＣＯ、Ｈ２及びＣＯ２である。合成ガスはまた、ＣＯ２の電気分解の生成物であってもよい。当業者であれば、ＣＯ２の電気分解を実施して所望量のＣＯを含む合成ガスを生成する適切な条件を理解するはずである。
【００６９】
通常、ガス化工程から得られた合成ガスの一部にまず処理をかけ、生成物収率を最適化し、さらにタールの形成を防止する。合成ガス中の望ましくないタールやＣＯの分解は、石灰及び／又はドロマイトを用いて実施することができる。これらの方法は、例えばReed, 1981に詳細に記載されている。
【００７０】
供給源の混合物を炭素源として使用することができる。
【００７１】
本発明のいずれかの態様によると、還元剤、例えば水素を炭素源と一緒に供給してもよい。具体的には、特にこの水素は、Ｃ及び／又はＣＯ２が供給及び／又は使用されるときに供給してもよい。一例では、水素ガスは、本発明のいずれかの態様によって存在する合成ガスの一部である。別の例では、合成ガス中の水素ガスが本発明の方法を行うには不十分である場合、追加の水素ガスを供給する。
【００７２】
当業者であれば、本発明のいずれかの態様による方法の実行に必要なその他の条件を理解するであろう。具体的には、容器（例えば、発酵槽）内の条件は、用いられる第１、第２及び第３の微生物に応じて変動する。微生物の最適な機能に適する条件を変えることは、当業者の知識の範囲内である。
【００７３】
一例では、本発明のいずれかの態様による方法を、５〜８、５．５〜７のｐＨを有する水性培地中で実施することができる。圧力は１〜１０バールの間であってもよい。本明細書における「接触」という用語は、本発明のいずれかの態様による細胞と、ステップ（ａ）にて炭素源を含む培地とを、本発明のいずれかの態様による方法にしたがって直接接触させること、及び／又はステップ（ｂ）にてステップ（ａ）から得たアセテート及び／又はエタノールを第３の微生物と直接接触させることを意味する。例えば、細胞と、炭素源を含む培地は、ステップ（ａ）において異なる区画にある。具体的には、炭素源はガス状態であってもよく、本発明のいずれかの態様による細胞を含む培地に添加されてもよい。
【００７４】
具体的には、水性培地は、細胞と、実施すべきステップ（ａ）に用いられるＣＯ及び／又はＣＯ２を含む炭素源とを含んでもよい。より具体的には、酸素と、ＣＯ及び／又はＣＯ２を含む炭素源とは、連続ガス流において水性培地に供給される。さらにより具体的には、連続ガス流は合成ガスを含む。これらのガスは、例えば、水性培地中に開口する別々のノズル、フリット、ガスを水性培地中に供給するパイプ内部の膜などを用いて供給されてもよい。
【００７５】
本発明の方法の全体的効率、アルコール生成性及び／又は全体的炭素捕捉は、連続ガス流におけるＣＯ２、ＣＯ、及びＨ２の化学量論に依存し得る。適用される連続ガス流は、ＣＯ２及びＨ２の組成であってもよい。具体的には、連続ガス流において、ＣＯ２の濃度範囲は約１０〜５０重量％、特に３重量％であり、Ｈ２は４４〜８４重量％以内であり、具体的には、６４〜６６．０４重量％であってもよい。別の例では、連続ガス流は、Ｎ２のような不活性ガスを、Ｎ２濃度が最大５０重量％となるまで含むこともできる。
【００７６】
本明細書における「約」という用語は、２０％以内の変動を指す。具体的には本明細書において「約」という用語は、所与の測定値又は数値の±２０％、より具体的には±１０％、さらに具体的には±５％を指す。
【００７７】
当業者であれば、相対間隔で流れの組成及び流速をモニタリングすることが必要であることを理解するであろう。流れの組成の制御は、目的の又は望ましい組成を得るために構成流の割合を変えることによって達成することができる。混合流の組成及び流速は、本分野において既知の任意の手段によってモニタリングすることができる。一例では、少なくとも２つの流れの流速及び組成を連続的にモニタリングし、それらを組み合わせて最適組成の連続ガス流中の単一の混合基質流を生成するように系を構成する。
【００７８】
ＣＯ２及び／又はＣＯをアセテート及び／又はエタノール、特にアセテートに転換する微生物、並びに、この代謝反応を実施する適切な手順及び処理条件は、本分野において既知である。例えば、ＷＯ９８００５５８、ＷＯ２００００１４０５２及びＷＯ２０１０１１５０５４に記載されている。
【００７９】
「水性溶液」又は「培地」という用語は、水を含む任意の溶液であって、本発明のいずれかの態様による細胞を、少なくとも一次的に、代謝活性状態及び／又は生存可能な状態に保つ溶媒として主に水を使用し、必要であれば追加の基質を含む、溶液を指す。当業者は、本発明のいずれかの態様による細胞を保持する培地（例えば、大腸菌の場合はＬＢ培地、C.ljungdahliiの場合はＡＴＣＣ１７５４培地）として、多数の水性溶液の調製に精通している。水性溶液を最少培地、つまり複合培地とは対照的に、細胞代謝活性状態及び／又は生存可能な状態に保つために必須不可欠な最小の塩及び栄養素のみを含む、合理的に単純な組成の培地として使用すると、望まない副産物により生成物が不要に汚染されることを回避することができる。例えば、Ｍ９培地は最少培地として使用することができる。細胞を、所望の生成物を生成するのに十分な時間、炭素源と共に培養する。培養時間は、例えば、少なくとも１時間、２時間、４時間、５時間、１０時間、又は２０時間となる。さらに、本発明のいずれかの態様による細胞が触媒活性又は代謝活性を維持できる温度を選ばなければならず、例えば１０〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃であり、具体的には、細胞がC.ljungdahlii細胞である場合、３２〜３８℃となる。
【００８０】
具体的には、本発明のいずれかの態様による反応混合物（つまり、対数期の第１微生物−酢酸生成生物、固定相の第２微生物−酢酸生成生物、酸素存在下の炭素源）を、任意の既知のバイオリアクタ、又は発酵槽で採用し、本発明のいずれかの態様を実施してもよい。反応混合物は、発酵槽内で高級アルコールが生成されるようにするための第４の微生物をさらに含んでもよい。別の例では、反応混合物は、発酵槽内でプロパノールが生成されるようにするための第３の微生物をさらに含む。
【００８１】
本明細書で用いられる「高級アルコール」とは、４〜１０個の炭素原子を含み、やや粘性又は油性であってもよく、より重厚なフルーティな臭いを有するアルコールを指す。高級アルコールとしては、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノールなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。より具体的には、高級アルコールは、１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソブタノール、３−メチル−１−ブタノール、１−ヘキサノール、１−オクタノール、１−ペンタノール、１−ヘプタノール、３−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−１−ヘキサノール、５−メチル−１−ヘプタノール、４−メチル−１−ペンタノール、５−メチル−１−ヘキサノール、６−メチル−１−ヘプタノール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００８２】
本発明のいずれかの態様によると、「対応する高級アルコール」とは、対応する高級アルコールが形成される酸と同じ数の炭素原子を有するアルコールを指す。例えば、ブタン酸は対応するアルコールつまりブタノールに転換し、ヘキサン酸は対応するアルコールつまりヘキサノールに転換し、ヘプタン酸は対応するアルコールつまりヘプタノールに転換し、オクタン酸は対応するアルコールつまりオクタノールに転換し、ノナン酸は対応するアルコールつまりノナノールに転換し、デカン酸は対応するアルコールつまりデカノールに転換する。
【実施例】
【００８３】
上記の好ましい実施形態は、当業者には理解されるように、特許請求の範囲から逸脱することなく、設計、構成又は動作における改良や修正を加えることができる。これらの改良は、例えば特許請求の範囲によって含まれることを意図している。
【００８４】
実施例１
水素及び二酸化炭素上の規定培地におけるClostridium ljungdahlii及びClostridium kluyveriの共培養によるブタノールの生成
第１の生物としてのC.ljungdahliiを、規定培地中で独立栄養的に培養して、アセテート及びエタノールを生成した。所定時間経過後、C.kluyveriを同じ反応器に接種し、アセテート及びエタノールを、ブチレート及びヘキサノエートに転換した。下記では、C.ljungdahliiがアセテートをブタノールに転換する。
【００８５】
（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  ２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．２ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１５ｇ／Ｌ、ＫＯＨ  １ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン−ＨＣｌ  ０．４ｇ／Ｌ、  Ｎａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／Ｌ、ホウ酸３ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ３  ０．１ｍｇ／Ｌ、ビオチン１０６μｇ／Ｌ、葉酸５μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  ２．５μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ２６６μｇ／Ｌ、リボフラビン１２．５μｇ／Ｌ、ニコチン酸１２．５μｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテン酸４１３μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １２．５μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸１２．５μｇ／Ｌ、リポ酸１５μｇ／Ｌを含む規定培地を使用し、両方の微生物の共培養を行った。
【００８６】
独立栄養培養は、６７％のＨ２及び３３％のＣＯ２を含む合成ガスを１Ｌ／ｈの速度で連続的に通気した血清瓶５００ｍＬ内の、規定培地２５０ｍＬ中で実施した。気孔径１０μｍのマイクロバブルディスペンサによりガスを液相に導入した。血清瓶を、New Brunswick Scientific製のオープンウォーターバスInnova 3100内で、３７℃にて１５０分−１の振盪速度で連続的に振盪させた。嫌気性原液のＫＯＨ（４０ｇ／Ｌ）を連続的に添加し、ｐＨを５．０〜６．５の範囲に保持した。
【００８７】
実験の開始時に、C.ljungdahliiをＯＤ６００  ０．１で、独立栄養的に増殖させた細胞と共に、接種した。続いて、C.ljungdahliiを、複合培地５００ｍＬを含む１Ｌの血清瓶内で、６７％のＨ２及び３３％のＣＯ２を含む合成ガスを用いた連続ガス処理を行うと共に、複合培地中で３Ｌ／ｈの速度で増殖させた。使用した複合培地は、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、Ｌ−システイン−ＨＣｌ  ０．４ｇ／Ｌ、Ｎａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ビオチン２０μｇ／Ｌ、葉酸２０μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸５０μｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテン酸５０μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸５０μｇ／Ｌ、リポ酸５０μｇ／Ｌを含む。気孔径１０μｍのマイクロバブルディスペンサによりガスを液相に導入した。血清瓶を、New Brunswick Scientific製のオープンウォーターバスInnova 3100内で、３７℃にて１５０分−１の振盪速度で連続的に振盪させた。嫌気性遠心分離（４５００分−１、４３００ｇ、２０℃、１０分）によって、後期対数期の細胞を収穫した。ＯＤ６００は０．６７、ｐＨは４．６９であった。上清を捨て、ペレットを上記の規定培地１０ｍＬに再度懸濁した。次に、この細胞懸濁液を用いて共培養実験に接種した。
【００８８】
一方、C.kluyveriを５００ｍＬの血清瓶内の複合培地２００ｍＬ中で、アセテート及びエタノールと共に従属栄養的に増殖させた。使用した複合培地は、ＮＨ４Ｃｌ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２３ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３  ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、Ｋ−アセテート１０ｇ／Ｌ、エタノール２０ｇ／Ｌ、Ｌ−システイン−ＨＣｌ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １．５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２×７  Ｈ２Ｏ  ７０μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １００μｇ／Ｌ、ホウ酸６μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  １９０μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２μｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２４μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ３６μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯＯ３×５  Ｈ２Ｏ  ３μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ４μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １００μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸８０μｇ／Ｌ、ビオチン２０μｇ／Ｌ、ニコチン酸２００μｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテン酸１００μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  ３００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ２００μｇ／Ｌを含む。血清瓶を、New Brunswick Scientific製のオープンウォーターバスInnova 3100内で、３７℃にて１００分−１の振盪速度で連続的に振盪させた。嫌気性遠心分離（４５００分−１、４３００ｇ、２０℃、１０分）によって、後期対数期の細胞を収穫した。ＯＤ６００は０．８１、ｐＨは５．９６であった。上清を捨て、ペレットを上記の規定培地１０ｍＬに再度懸濁した。次に、この細胞懸濁液を用いて共培養実験に接種した。次いで、この細胞懸濁液を用いて、９６時間の実験の後、共培養実験にＯＤ６００  ０．２で接種した。
【００８９】
実験中、サンプル５ｍＬをＯＤ６００、ｐＨ、生成物濃度を判定する目的で採取した。後者は定量的１Ｈ−ＮＭＲ分光法により測定した。
【００９０】
C.ljungdahliiの接種後、細胞は増殖し始め、連続的にアセテートを生成した。アセテートの生成に伴い、エタノールはアセテートの生成と比べてより低い速度で生成された。９６時間後、C.kluyveriを反応器に接種し、エタノール濃度の減少を下記の実験で測定した。その後１１３時間の実験で、アセテート（最大１１６３ｍｇ／Ｌ）とヘキサノエート（最大１３６ｍｇ／Ｌ）の同時生成量を測定した。C.kluyveriによりアセテートを生成する一方、C.ljungdahliiは実験の最終段階にてアセテートをブタノールに最大濃度２０ｍｇ／Ｌのブタノールに転換した。
【００９１】
【表１】
2019525761.tif 000002
【００９２】
実施例２
ＣＯ含有ガスとの複合培地におけるClostridium ljungdahlii及びClostridium kluyveriの共培養による、ブタノール及びヘキサノールの生成
第１の生物としてのC.ljungdahliiを、規定培地中で独立栄養的に培養して、アセテート及びエタノールを生成した。C.kluyveriを同じ反応器に接種し、アセテート及びエタノールを、ブチレート及びヘキサノエートに転換した。下記では、C.ljungdahliiがブチレートとブタノールに、ヘキサノエートをヘキサノールに転換する。
【００９３】
ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ２０ｍｇ／Ｌ、ＭＥＳ  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、Ｌ−システイン−ＨＣｌ  ０．４ｇ／Ｌ、Ｎａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ビオチン２０μｇ／Ｌ、葉酸２０μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸５０μｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテン酸５０μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸５０μｇ／Ｌ、リポ酸５０μｇ／Ｌを含む規定培地を使用し、両方の微生物の共培養を行った。
【００９４】
独立栄養培養は、Ｈ２  ５％、ＣＯ２  ２５％、ＣＯ  ２５％、Ｎ２  ４５％を含む合成ガスを〜１２Ｌ／ｈ（≧０．５ｐｐｍ）の速度で連続的に通気した血清瓶１Ｌ内の、規定培地５００ｍＬ中で実施した。気孔径１０μｍのマイクロバブルディスペンサによりガスを液相に導入した。血清瓶を、New Brunswick Scientific製のオープンウォーターバスInnova 3100内で、３７℃にて１２０分−１の振盪速度で連続的に振盪させた。本実験において、ｐＨの制御は行わなかった。
【００９５】
実験の開始時に、C.ljungdahliiをＯＤ６００  ０．１で、独立栄養的に増殖させた細胞と共に、接種した。続いて、C.ljungdahliiを、複合培地５００ｍＬを含む１Ｌの血清瓶内で、６７％のＨ２及び３３％のＣＯ２を含む合成ガスを用いた連続ガス処理を行うと共に、複合培地中で３Ｌ／ｈの速度で増殖させた。気孔径１０μｍのマイクロバブルディスペンサによりガスを液相に導入した。血清瓶を、New Brunswick Scientific製のオープンウォーターバスInnova 3100内で、３７℃にて１５０分−１の振盪速度で連続的に振盪させた。嫌気性遠心分離（４５００分−１、４３００ｇ、２０℃、１０分）によって、後期対数期の細胞を収穫した。ＯＤ６００は０．５１、ｐＨは５．０４であった。上清を捨て、ペレットを上記の規定培地１０ｍＬに再度懸濁した。次に、この細胞懸濁液を用いて共培養実験に接種した。
【００９６】
一方、C.kluyveriを５００ｍＬの血清瓶内の複合培地２００ｍＬ中で、アセテート及びエタノールと共に従属栄養的に増殖させた。使用した複合培地は、ＮＨ４Ｃｌ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ０．３１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２３ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３  ２．５ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、Ｋ−アセテート１０ｇ／Ｌ、エタノール２０ｇ／Ｌ、Ｌ−システイン−ＨＣｌ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １．５ｍｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２×７  Ｈ２Ｏ  ７０μｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １００μｇ／Ｌ、ホウ酸６μｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  １９０μｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２μｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２４μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ３６μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯＯ３×５  Ｈ２Ｏ  ３μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ４μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １００μｇ／Ｌ、ｐ−アミノ安息香酸８０μｇ／Ｌ、ビオチン２０μｇ／Ｌ、ニコチン酸２００μｇ／Ｌ、Ｃａ−パントテン酸１００μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  ３００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ２００μｇ／Ｌを含む。血清瓶を、New Brunswick Scientific製のオープンウォーターバスInnova 3100内で、３７℃にて１００分−１の振盪速度で連続的に振盪させた。嫌気性遠心分離（４５００分−１、４３００ｇ、２０℃、１０分）によって、後期対数期の細胞を収穫した。ＯＤ６００は０．５４、ｐＨは６．６０であった。上清を捨て、ペレットを上記の規定培地１０ｍＬに再度懸濁した。次に、２４０時間の実験の後、この細胞懸濁液を用いて共培養実験に接種した。
【００９７】
実験中、サンプル５ｍＬをＯＤ６００、ｐＨ、生成物濃度を判定する目的で採取した。後者は定量的１Ｈ−ＮＭＲ分光法により測定した。
【００９８】
C.ljungdahliiの接種後、細胞は増殖し始め、７１時間後、連続的にアセテートを濃度３ｇ／Ｌまで、エタノールを濃度０．５ｇ／Ｌまで生成した。実験の経時変化として、アセテートは２４０時間後に最大濃度４．８ｇ／Ｌのエタノールに完全に転換した。処理時間が２４０時間経過した時点で、C.kluyveriを反応器に接種した。この生物は基質としてエタノールの他にアセテートを必要とするので、C.kluyveriの接種と同時に約３ｇ／Ｌのアセテート（酢酸ナトリウム）を嫌気的に反応器に投入した。実験の経時変化として、アセテート及びヘキサノエートの生成量は、それぞれ１．６ｇ／Ｌの濃度と測定された。C.kluyveriによりブチレート及びヘキサノエートを生成する一方、C.ljungdahliiは、ブチレートを最大濃度６９０ｍｇ／Ｌのブタノールに転換し、ヘキサノエートを最大濃度１４７８ｍｇ／Ｌのブタノールに転換した。
【００９９】
【表２】
2019525761.tif 000003
【０１００】
実施例３
酸素を含む合成ガスを用いたClostridium autoethanogenumによるアセテート及びエタノールの増殖及び生成
水素及び二酸化炭素を、酢酸及びエタノールへ生物変換させるため、ホモ酢酸生成細菌のClostridium autoethanogenumを酸素を含む合成ガスを用いて培養した。培養の全てのステップは、ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中、嫌気性条件下で実施した。
【０１０１】
前培養の際には、培地（ＡＴＣＣ１７５４培地：ｐＨ＝６．０、ＭＥＳ  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．８ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ｄ−ビオチン２０μｇ／Ｌ、葉酸２０μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸５０μｇ／Ｌ、Ｃａ−パンテナート５０μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート５０μｇ／Ｌ、リポ酸５０μｇ／Ｌ、ＮａＯＨ約６７．５ｍｇ／Ｌ）５００ｍｌに、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌ、及びＮａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏを添加しC.autoethanogenumの凍結クライオ保存液（frozen cryo stock）５ｍＬを接種した。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％の予混合ガスを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、通気速度３Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で７２時間行われた。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。培養中にｐＨ制御は行わなかった。
【０１０２】
前培養の後、細胞懸濁液を遠心分離にかけ（１０分、４２００ｒｐｍ）、ペレットを新しい培地に再度懸濁した。本培養の際には、前培養からの得た細胞を、ＯＤ６００ｎｍを０．１と調整できるほどの量で、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌを加えた培地５００ｍＬに移した。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６６．９５％、ＣＯ２  ３３％、Ｏ２  ０．０５％の予混合ガスを用いて、３７℃、１５０ｒｐｍ、通気速度１Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で４１時間行われた。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。培養中にｐＨ制御は行わなかった。培養中、５ｍＬサンプルをいくつか、ＯＤ６００ｎｍ、ｐＨ、生成物形成を判定する目的で採取した。生成物の濃度は、半定量的１Ｈ−ＮＭＲ分光法により測定した。内部定量標準としてトリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（Ｔ（Ｍ）ＳＰ）を使用した。さらに、培養培地中の溶存酸素を、酸素浸漬プローブ（ドイツ国、PreSens製、Oxy4Trace付きPSt6型）によりオンラインで測定した。
【０１０３】
培養期間中、細胞増殖は、４１時間で０．００８〜０．７６にＯＤ６００ｎｍが増加したことにより観測されている。増殖速度μ＝０．０５４時間−１となる。アセテートの濃度は３７ｍｇ／Ｌから６６００ｍｇ／Ｌに、エタノールの濃度は４ｍｇ／Ｌから１２０ｍｇ／Ｌに増加した。全培養期間中の溶存酸素濃度は０．００ｍｇ／Ｌであった。
【０１０４】
培地に細胞が含まれていないことを除けば、同パラメータ（培地組成、瓶、ボトル、ガス、換気速度、温度、振盪頻度）と同様の技術的設定にて培養を行った結果、測定された溶存酸素濃度は０．０１ｍｇ／Ｌであった。
【０１０５】
実施例４
酸素０．１５％を含む合成ガスでのClostridium ljungdahliiによる増殖、及びアセテートの生成
水素及び二酸化炭素を、酢酸及びエタノールへ生物変換させるため、ホモ酢酸生成細菌のClostridium ljungdahliiを酸素を含む合成ガスを用いて培養した。培養の全てのステップは、ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中、嫌気性条件下で実施した。
【０１０６】
前培養の際には、培地（ＡＴＣＣ１７５４培地：ｐＨ＝６．０、ＭＥＳ  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．８ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ｄ−ビオチン２０μｇ／Ｌ、葉酸２０μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸５０μｇ／Ｌ、Ｃａ−パンテナート５０μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート５０μｇ／Ｌ、リポ酸５０μｇ／Ｌ、ＮａＯＨ約６７．５ｍｇ／Ｌ）５００ｍｌに、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌ、及びＮａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ／Ｌを添加し、C.ljungdahliiの凍結クライオ保存液５ｍＬを接種した。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％の予混合ガスを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、通気速度３Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で７２時間行われた。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。培養中にｐＨ制御は行わなかった。
【０１０７】
前培養の後、細胞懸濁液を遠心分離にかけ（１０分、４２００ｒｐｍ）、ペレットを培地１０ｍｌで洗浄し、再度遠心分離にかけた。本培養の際には、前培養からの得た細胞を、ＯＤ６００ｎｍを０．１と調整できるほどの量で、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌを加えた培地２００ｍＬに移した。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６６．８５％、ＣＯ２  ３３％、Ｏ２  ０．１５％の予混合ガスを用いて、３７℃、１５０ｒｐｍ、通気速度１Ｌ／時間にて、２５０ｍＬ耐圧ガラス瓶中で４７時間行われた。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。培養中にｐＨ制御は行わなかった。培養中、５ｍＬサンプルをいくつか、ＯＤ６００ｎｍ、ｐＨ、生成物形成を判定する目的で採取した。生成物の濃度は、半定量的１Ｈ−ＮＭＲ分光法により測定した。内部定量標準としてトリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（Ｔ（Ｍ）ＳＰ）を使用した。さらに、培養培地中の溶存酸素を、酸素浸漬プローブ（ドイツ国、PreSens製、Oxy4Trace付きPSt6型）によりオンラインで測定した。
【０１０８】
培養期間中、細胞増殖は、０．１０〜０．４５にＯＤ６００ｎｍが増加したことにより観測されている。増殖速度μ＝０．０３２時間−１となる。アセテートの濃度は７ｍｇ／Ｌから２３４７ｍｇ／Ｌに、エタノールの濃度は２ｍｇ／Ｌから３１９ｍｇ／Ｌに増加した。全培養期間中の溶存酸素濃度は０．００ｍｇ／Ｌであった。
【０１０９】
培地に細胞が含まれていないことを除けば、同パラメータ（培地組成、瓶、ボトル、ガス、換気速度、温度、振盪頻度）と同様の技術的設定にて培養を行った結果、測定された溶存酸素濃度は０．０３ｍｇ／Ｌであった。
【０１１０】
実施例５
酸素を含む合成ガスを用いたClostridium autoethanogenum及びClostridium neopropionicumによるプロピオン酸及びプロパノールの生成
水素及び二酸化炭素を、プロピオン酸及びプロパノールへ生物変換させるため、ホモ酢酸生成細菌のClostridium autoethanogenumを、共培養段階でClostridium neopropionicumと組み合わせ、合成ガスを用いて培養した。培養の全てのステップは、ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中、嫌気性又は微好気性条件下で実施した。
【０１１１】
C.autoethanogenumの培養の際には、培地（ＡＴＣＣ１７５４培地：ｐＨ＝６．０、ＭＥＳ  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．８ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ｄ−ビオチン２０μｇ／Ｌ、葉酸２０μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸５０μｇ／Ｌ、Ｃａ−パンテナート５０μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート５０μｇ／Ｌ、リポ酸５０μｇ／Ｌ、ＮａＯＨ約６７．５ｍｇ／Ｌ）５００ｍｌに、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌ、及びＮａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ／Ｌを添加し、凍結クライオ保存液５ｍＬを接種した。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％の予混合ガスを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、通気速度３Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で６４時間行われた。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．３６となった。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。次いで、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、新しいＡＴＣＣ１７５４培地で洗浄し、再度遠心分離にかけた。
【０１１２】
C.autoethanogenumの本培養の際には、ＡＴＣＣ１７５４培地５００ｍｌに、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌ、及びＮａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ／Ｌを添加し、一次前培養から得た細胞を洗浄して接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．１となった。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６６．８５％、ＣＯ２  ３３％、Ｏ２  ０．１５％の予混合ガスを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、通気速度１Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で５１時間行われた。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．１９、ｐＨは５．７となった。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。
【０１１３】
C.neopropionicumの一次前培養の際には、ＤＳＭＺ３１８培地（ｐＨ７．４、ＮａＣｌ  ０．６１ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  ０．０４７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３０ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １．００ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．０８１ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５ｇ／Ｌ、BBL Trypticaseペプトン０．５ｇ／Ｌ、ＫＨＣＯ３  ４ｇ／Ｌ、エタノール１．０２６ｇ／Ｌ、レサズリン０．５ｍｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸１２８ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３×６  Ｈ２Ｏ  １３５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２４ｍｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２  １ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２４ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  １．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ３×５  Ｈ２Ｏ  ０．２６ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．０２ｍｇ／Ｌ、葉酸０．０２ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  ０．１ｍｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ０．０５ｍｇ／Ｌ、リボフラビン０．０５ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０５ｍｇ／Ｌ、Ｄ−Ｃａ−パンテナート０．０５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート０．０５ｍｇ／Ｌ、リポ酸０．０５ｍｇ／Ｌ、システイン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ）２×１００ｍｌを２５０ｍｌ瓶に充填し、凍結クライオ培養物（frozen cryoculture）５ｍＬを接種して、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％を含む予混合ガスで過圧０．８バールまで洗浄した。３０℃、１００ｒｐｍで１９時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行った。その結果、ＯＤ６００ｎｍは＞０．１４となった。
【０１１４】
Clostridium neopropionicumの二次前培養の際には、新しいＤＳＭＺ３１８培地５×２００ｍｌを５００ｍｌ瓶に充填し、一次前培養から得た遠心分離細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．０２となった。続いて、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％を含む予混合ガスで過圧０．８バールまでフラッシュした。増殖培養物を３０℃、１００ｒｐｍで２４時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行った。その結果、ＯＤ６００ｎｍは＞０．２６となった。次いで、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、新しいＡＴＣＣ１７５４培地で洗浄し、再度遠心分離にかけた。
【０１１５】
共培養の際には、C.neopropionicumの二次前培養からの得た洗浄細胞を、ＯＤ６００ｎｍを０．２と調整できるほどの量で、５１時間の培養で得たC.autoethanogenumの連続通気主培養物に添加した。培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６６．８５％、ＣＯ２  ３３％、Ｏ２  ０．１５％の予混合ガスを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、通気速度１Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中でさらに４１時間行われた。開始段階にて、ＫＯＨ１４０ｇ／ＬでｐＨを６．７に調整し、共培養は、ｐＨを制御せず行った。
【０１１６】
培養中、５ｍＬサンプルをいくつか、ＯＤ６００ｎｍ、ｐＨ、生成物形成を判定する目的で採取した。生成物の濃度は、ＬＣＭＳと半定量的１Ｈ−ＮＭＲ分光法により測定した。内部定量標準としてトリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（Ｔ（Ｍ）ＳＰ）を使用した。
【０１１７】
共培養中、アセテートの濃度は０．７９ｇ／Ｌから１．８３ｇ／Ｌに、プロピオン酸塩の濃度は０．００ｇ／Ｌから０．２３ｇ／Ｌに、プロパノールの濃度は０から１９ｍｇ／Ｌに、ブチレートの濃度は０から１４ｍｇ／Ｌに、ギ酸塩の濃度は３２ｍｇ／Ｌから３３５ｍｇ／Ｌに増加した。この間、エタノールの濃度は４７ｍｇ／Ｌから２５ｍｇ／Ｌに減少した。
【０１１８】
実施例６
Clostridium autoethanogenum及びClostridium neopropionicumによる、合成ガスからのプロパノールの生成及び処理
水素及び二酸化炭素を、プロパノールへ生物変換させるため、ホモ酢酸生成細菌のClostridium autoethanogenumを、合成ガスを用いて培養し、続いてClostridium neopropionicumと共に培養した。培養の全てのステップは、ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中、嫌気性条件下で実施した。その後、生成物をポリプロピレングリコールとヘキサデカンの混合物（７０／３０ｗ／ｗ％）、又はオレイルアルコールで、２回に渡り別途抽出した。
【０１１９】
C.autoethanogenumの培養の際には、培地（ＡＴＣＣ１７５４培地：ｐＨ＝６．０、ＭＥＳ  ２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．８ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．１ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸２０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ｄ−ビオチン２０μｇ／Ｌ、葉酸２０μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ５０μｇ／Ｌ、リボフラビン５０μｇ／Ｌ、ニコチン酸５０μｇ／Ｌ、Ｃａ−パンテナート５０μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート５０μｇ／Ｌ、リポ酸５０μｇ／Ｌ、ＮａＯＨ約６７．５ｍｇ／Ｌ）５００ｍｌに、Ｌ−システイン−塩酸塩４００ｍｇ／Ｌ、及びＮａ２Ｓ×９  Ｈ２Ｏ  ４００ｍｇ／Ｌを添加し、凍結クライオ保存液５ｍＬを接種した。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％の予混合ガスを用いて、３７℃、１００ｒｐｍ、通気速度３Ｌ／時間にて、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で７３時間行われた。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．３９となった。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。次いで、細胞懸濁液を遠心分離にかけた。
【０１２０】
C.autoethanogenumの本培養の際には、ＬＭ３３鉱物培地（ｐＨ＝５．８、ＫＯＨ１．３ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  ０．５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．２１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．１３５ｇ／Ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ２．６５ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  ２．５ｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸１５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ３０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  ５ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ、Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２×６  Ｈ２Ｏ  ８ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ２００μｇ／Ｌ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２×１２  Ｈ２Ｏ  ２００μｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ３ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ３００μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ３  ２００μｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ２００μｇ／Ｌ、Ｎａ２ＷＯ４×６  Ｈ２Ｏ  ２００μｇ／Ｌ、ｄ−ビオチン２００μｇ／Ｌ、葉酸２００μｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  １００μｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ５００μｇ／Ｌ、リボフラビン５００μｇ／Ｌ、ニコチン酸５００μｇ／Ｌ、Ｃａ−パンテナート５００μｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ５００μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート５００μｇ／Ｌ、リポ酸５００μｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３  １０ｍｇ／Ｌ）に、５００ｍｇ／ＬのＬ−システイン−塩酸塩を添加して、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％を含む予混合ガスを３０分間分間通気した後、一次前培養から得た細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．１７となった。ケモリソオートトロピック培養は、オープンウォーターバスシェーカ内で、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％の予混合ガスを用いて、３７℃、１５０ｒｐｍ、通気速度１Ｌ／時間にて、ｐＨを自動的に５．５に調整し、１Ｌ耐圧ガラス瓶中で１８７時間行われた。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。養後、次のステップのために培地を滅菌濾過した。
【０１２１】
１８７時間中に、エタノール４．６ｇ／Ｌとアセテート１４．６ｇ／Ｌが生成された。
【０１２２】
C.neopropionicumの一次前培養の際には、ＤＳＭＺ３１８培地（ｐＨ６．７、ＮａＣｌ  ０．６１ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  ０．０４７ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３０ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １．００ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．０８１ｇ／Ｌ、酵母エキス０．５ｇ／Ｌ、BBL Trypticaseペプトン０．５ｇ／Ｌ、ＫＨＣＯ３  ４ｇ／Ｌ、エタノール１．０２６ｇ／Ｌ、レサズリン０．５ｍｇ／Ｌ、ニトリロ三酢酸１２８ｍｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ３×６  Ｈ２Ｏ  １３５ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×４  Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．２４ｍｇ／Ｌ、ＺｎＣｌ２  １ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．１ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２４ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  １．２ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＳｅＯ３×５  Ｈ２Ｏ  ０．２６ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．０２ｍｇ／Ｌ、葉酸０．０２ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン−ＨＣｌ  ０．１ｍｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ０．０５ｍｇ／Ｌ、リボフラビン０．０５ｍｇ／Ｌ、ニコチン酸０．０５ｍｇ／Ｌ、Ｄ−Ｃａ−パンテナート０．０５ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １μｇ／Ｌ、ｐ−アミノベンゾエート０．０５ｍｇ／Ｌ、リポ酸０．０５ｍｇ／Ｌ、システイン−ＨＣｌ×Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ）１００ｍｌを２５０ｍｌ瓶に充填し、凍結クライオ培養物５ｍＬを接種して、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％を含む予混合ガスで過圧０．８バールまでフラッシュした。３０℃、１００ｒｐｍで２０時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行った。その結果、ＯＤ６００ｎｍは＞０．１２となった。次いで、細胞懸濁液を遠心分離にかけた。
【０１２３】
Clostridium neopropionicumの二次前培養の際には、新しいＤＳＭＺ３１８培地２００ｍＬを５００ｍＬ瓶に充填し、一次前培養から得た遠心分離細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．０３となった。続いて、Ｈ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％を含む予混合ガスで過圧０．８バールまでフラッシュした。増殖培養物を３０℃、１００ｒｐｍで２５時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行った。その結果、ＯＤ６００ｎｍは＞０．２となった。次いで、細胞懸濁液を遠心分離にかけた。
【０１２４】
本培養の際に、C.autoethanogenumの本培養から得た滅菌濾過培地１５０ｍＬを、最初に窒素で、その後はＨ２  ６７％、ＣＯ２  ３３％を含む予混合ガスで過圧０．８バールまでフラッシュした。Ｌ−システイン−塩酸塩０．２５ｇ／Ｌを添加し、ＮａＯＨでｐＨを６．８に調整した。C.neopropionicumの二次前培養から得た細胞の半分を培地に添加して、ＯＤ６００ｎｍを０．１とした。培養は、３０℃、１００ｒｐｍ、通気速度１Ｌ／時間にて、ｐＨを自動的に６．８に調整し、
５００ｍＬ耐圧ガラス瓶中でさらに８８時間行われた。
【０１２５】
培養期間中にエタノール２ｇ／Ｌが消費され、プロピオネート２ｇ／Ｌとプロパノール４９ｍｇ／Ｌが生成された。
【０１２６】
両方を培養中、５ｍＬサンプルをいくつか、ＯＤ６００ｎｍ、ｐＨ、生成物形成を判定する目的で採取した。生成物の濃度は、ＨＰＬＣとＮＭＲ分光法により測定した。
【０１２７】
プロパノール抽出の際には、C.neopropionicumの本培養物の５０ｍＬサンプル２つを、抽出材を用いて分液漏斗中３０℃で３分間振盪し、その後、２相を分液漏斗で分離した。オレイルアルコール（ＭＳ−２９５、８５％、Ａｂｃｒ  ＧｍｂＨ）５０ｍＬ、あるいはのポリプロピレングリコール（ＭＳ−３４６、１３０〜１９０ｐｐｍのＡｌｄｒｉｃｈを含有）７０ｗ／ｗ％とヘキサデカン（ＭＳ−３０３、９９％、Ｓｉｇｍａ）３０ｗ／ｗ％との混合物を、異なる抽出材２種として使用した。
【０１２８】
両方の場合において、プロパノールは完全に有機相に抽出された。
【０１２９】
実施例７
ブタノールの抽出
ブタノール抽出の際には、（１）オレイルアルコール、（２）ポリプロピレングリコールとヘキサデカンの混合物（７０／３０ｗ／ｗ％）の異なる抽出媒体２種を使用した。
【０１３０】
ポリプロピレン７０ｗ／ｗ％及びヘキサデカン３０ｗ／ｗ％を用いた抽出の際には、０．５２２ｇ／ｋｇのブタノール溶液５０ｇを、抽出媒体４６ｇと共に、分離漏斗に入れて周囲温度（２０〜２５℃）で２分間振盪させた。２相を分離し、水相中のブタノール濃度を測定した。
【０１３１】
抽出後、水相中のブタノール濃度は０．２５１ｇ／ｋｇに減少した。質量平衡で算出した分配係数は１．１７であった。
【０１３２】
オレイルアルコールを用いた抽出の際には、５．９７ｇ／ｋｇのブタノール溶液４．８１ｇを、抽出材２．０２ｇを含む遠心分離管に入れて周囲温度（２０〜２５℃）で３０分間振盪させた。２相を分離し、水相中のブタノール濃度を測定した。
【０１３３】
抽出後、水相中のブタノール濃度は２．４０ｇ／ｋｇに減少した。質量平衡で算出した分配係数は２．９７であった。
【国際調査報告】
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