(57)【要約】  肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するための末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＤＮＡメチル化シグネチャーであって、ＣＧ−ＩＤである、ＤＮＡメチル化シグネチャーが開示される。本発明は、ＤＮＡメチル化シグネチャーのためのキットおよび使用も開示する。
2019518480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを予測するための、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるがんのＤＮＡメチル化シグネチャーであって、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化マッピング法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋまたは８５０Ｋアレイ、ゲノムワイドなバイサルファイトシークエンシング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）シークエンシングまたはオリゴヌクレオチドアレイでのハイブリダイゼーションなどを使用して得られる、前記ＤＮＡメチル化シグネチャー。
【請求項２】
前記ＤＮＡメチル化シグネチャーが、以下にリストされるＰＢＭＣのＤＮＡ由来のＣＧ−ＩＤ：
【表１Ａ】
2019518480.tif 000023
【表１Ｂ】
2019518480.tif 000024
であり、前記ＣＧ−ＩＤのＰＢＭＣまたはＴ細胞のＤＮＡメチル化レベルのいずれかを使用して肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するためのものである、請求項１に記載のＤＮＡメチル化シグネチャー。
【請求項３】
前記ＤＮＡメチル化シグネチャーが、以下にリストされるＴ細胞由来のＣＧ−ＩＤ：
【表２Ａ】
2019518480.tif 000025
【表２Ｂ】
2019518480.tif 000026
であり、前記ＣＧ−ＩＤのＰＢＭＣまたはＴ細胞のＤＮＡメチル化レベルを使用してＨＣＣステージおよび慢性肝炎を予測するためのものである、請求項１に記載のＤＮＡメチル化シグネチャー。
【請求項４】
前記ＤＮＡメチル化シグネチャーが、以下にリストされるＣＧ−ＩＤ：
ＨＣＣステージ１を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ１４９８３１３５、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１４７６２４３６、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４４２６６６０、ｃｇ１８８８２４４９、ｃｇ０２９１４６５２、
ＨＣＣステージ２を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１５１８８９３９、ｃｇ１２３４４６００、ｃｇ０３４９６７８０、ｃｇ１２０１９８１４、
ＨＣＣステージ３を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ２７２８４３３１、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ２３９８１１５０、
ＨＣＣステージ４を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４９１４５５２、ｃｇ２１１６４０５０、ｃｇ２３９８１１５０、
ＨＣＣステージ１をＢ型肝炎と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１１７６７７５７、ｃｇ０４３９８２８２、ｃｇ１１１５１２５１、ｃｇ２４７４２５２０、ｃｇ１４７１１７４３、
ＨＣＣステージ１をステージ２〜４と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０３２５２４９９、ｃｇ０３４８１４８８、ｃｇ０４３９８２８２、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１１７８３４９７、ｃｇ１３７１０６１３、ｃｇ１４７６２４３６、ｃｇ２３４８６７０１、
ＨＣＣステージ２をステージ３〜４と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２９１４６５２、ｃｇ０３２５２４９９、ｃｇ１１７８３４９７、ｃｇ１１９１１７６９、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４７１１７４３、ｃｇ１５６０７７０８、ｃｇ２０９５６５４８、ｃｇ２２８７６４０２、ｃｇ２４９５８３６６、
ＨＣＣステージ１〜３をステージ４と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ１１１５１２５１、ｃｇ２４９５８３６６、ｃｇ０６８７４６４０、ｃｇ２７２８４３３１、ｃｇ１６４７６３８２、ｃｇ１４７１１７４３
であり、罰則付き回帰解析またはクラスタリング解析などの統計モデルを使用することによって得られる、Ｔ細胞またはＰＢＭＣにおける前記ＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を使用してＨＣＣの異なるステージを予測するためのものである、請求項１に記載のＤＮＡメチル化シグネチャー。
【請求項５】
前記ＤＮＡメチル化シグネチャーが、以下にリストされるＣＧ−ＩＤ：
【表３】
2019518480.tif 000027
であり、罰則付き回帰解析またはクラスタリング解析などの統計モデルを使用することによって得られた、Ｔ細胞またはＰＢＭＣにおける前記ＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を使用してＨＣＣのステージを予測するためのものである、請求項１に記載のＤＮＡメチル化シグネチャー。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡメチル化シグネチャーのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、がんを予測するためのキット。
【請求項７】
請求項２に記載のＤＮＡメチル化シグネチャーのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するためのキット。
【請求項８】
請求項３に記載のＤＮＡメチル化シグネチャーのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、ＨＣＣステージおよび慢性肝炎を予測するためのキット。
【請求項９】
請求項４に記載のＤＮＡメチル化シグネチャーのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、ＨＣＣの異なるステージを予測するためのキット。
【請求項１０】
請求項５に記載のＤＮＡメチル化シグネチャーのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、ＨＣＣのステージを予測するためのキット。
【請求項１１】
末梢免疫系におけるがんにおいてエピジェネティックに制御される遺伝子経路。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項にリストされるＤＮＡメチル化シグネチャーを使用することによって、例えば、以下に開示されるプライマー：
ＡＨＮＡＫのためのプライマー（外側フォワード  ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＡＧＴＡＧＧＧＴ、外側リバース  ＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＡＡＣＧＣＴ、ネステッドフォワード  ＴＧＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧ、ネステッドリバース  ＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＣＴＡＴＣＴＴ、およびシークエンシングプライマー  ＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ）、
ＳＬＦＮ２Ｌのためのプライマー（外側フォワード  ＧＴＧＡＴＹＴＴＧＧＴＹＡＹＴＧＴＡＡＹＹＴ、外側リバース  ＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＲＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＲ、フォワードネステッド  ＡＧＧＧＴＴＴＹＡＹＴＡＴＡＴＴＡＧＹＹＡＧＧＴＴＧＧ、リバースネステッド  ＡＴＲＣＡＡＡＣＣＡＴＲＣＡＲＣＣＣＴＴＴＴＲＣ、シークエンシングプライマー  ＹＹＹＡＡＡＡＴＡＹＴＧＡＧＡＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴ）、
ＡＫＡＰ７のためのプライマー（外側フォワード  ＴＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴ、外側リバース  ＡＣＡＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡ、ネステッドフォワード  ＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧ、ネステッドリバース  ＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＣ、シークエンシングプライマー  ＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡ）、および
ＳＴＡＰ１のためのプライマー（外側フォワード  ＡＧＴＹＡＴＧＴＹＴＴＹＴＧＹＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＹＡＹＹ、外側リバース、ＴＴＲＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣ  ネステッドフォワード  ＹＹＧＴＴＴＹＴＴＴＹＡＴＹＴＴＹＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡ、ネステッドリバース  ＡＲＡＲＲＲＣＡＡＴＣＴＣＴＲＲＲＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＲＴＲ、シークエンシングプライマー  ＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＹＴＴＹＴＧＴＴＴＡ）
を使用することによってＨＣＣを予測するための、ＤＮＡピロシークエンシングメチル化アッセイの使用。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡメチル化シグネチャー、例えば、ＳＴＡＰ１（ｃｇ０４３９８２８２）を使用することによってＨＣＣを予測するための、受診者動作特性（ＲＯＣ）アッセイの使用。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＧ−ＩＤを使用することによってＨＣＣを予測するための、階層的クラスタリング解析の使用。
【請求項１５】
試料から得られたＤＮＡメチル化測定値における統計解析を行うステップを含む、疾患を予測するためのＤＮＡメチル化シグネチャーを同定するための方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡメチル化測定値が、試料から抽出されたＤＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａビーズチップ４５０Ｋまたは８５０Ｋアッセイを行うことによって得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡメチル化測定値が、試料から抽出されたＤＮＡの、ＤＮＡピロシークエンシング、質量分析に基づく（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（商標））またはＰＣＲに基づくメチル化アッセイを行うことによって得られる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記統計解析が、ピアソン相関を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記統計解析が、受診者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記統計解析が、階層的クラスタリング解析アッセイを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＤＮＡにおけるＤＮＡメチル化シグネチャー、詳細には、分子診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中で５番目に一般的ながんである（１）。これは特にアジアで流行しており、その発症は、Ｂ型肝炎が流行している地域で最も多いことから、可能性がある因果関係が示唆される（２）。慢性肝炎患者のような高リスク集団の追跡、および慢性肝炎からＨＣＣへの移行の早期診断は、治癒率を向上させるはずである。現在、肝細胞癌はほぼ常に後期ステージで診断されるため、その生存率はきわめて低い。肝臓がんは、早期に診断されれば、＞８０％の治癒率で効果的に治療することができる１。イメージングにおける進歩は、ＨＣＣの非侵襲性の検出を向上させてきた（３、４）。しかし、アルファ−フェトプロテインなどの単一のタンパク質を用いたイメージングおよびイムノアッセイを含む、現在の診断法は、早期にＨＣＣを診断できないことが多い（２）。これらの課題は、ＨＣＣに限定されないが、他のがんにも共通している。がんの分子診断は、血漿中の、腫瘍および腫瘍ＤＮＡを含む、腫瘍由来のバイオマテリアル（５、６）、循環腫瘍細胞（７）、ならびに腫瘍−宿主の微小環境（８、９）に焦点が定められている。一般的にかつ広く受け入れられている仮説は、がんの開始および進行を引き起こす分子的変化が主に腫瘍自体の中で生じることならびに宿主における関連した変化が主に腫瘍微小環境中で生じることである。したがって、腫瘍微小環境中の免疫細胞の同一性は、顕著な注目を引きつけている（１０、１１）。
【０００３】
ゲノム機能のエピジェネティックな制御の主な機序である、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡの共有結合的修飾は、ＨＣＣ（１６）を含む腫瘍（１２〜１５）において広範に変化する。腫瘍のＤＮＡメチル化プロファイルは、腫瘍進行の異なるステージを区別し、腫瘍の分類、予後および化学療法に対する反応の予測のための潜在的に強力なツールである（１７）。早期診断において腫瘍ＤＮＡメチル化を使用することについての主な欠点は、それが、侵襲性の処置および疑われる腫瘍の解剖学的可視化を必要とすることである。循環腫瘍細胞は、腫瘍ＤＮＡの非侵襲性の源であり、腫瘍抑制遺伝子におけるＤＮＡメチル化の測定に使用される（１８）。ＨＣＣのＤＮＡの低メチル化は、患者の血液において検出可能であり（１９）、ゲノムワイドなバイサルファイトシークエンシングは、最近、ＨＣＣ患者からの血漿中の低メチル化ＤＮＡの検出に適用された（２０）。しかし、この源は、特に、がんの早期のステージに限定され、ＤＮＡメチル化プロファイルは、宿主のＤＮＡメチル化プロファイルによって混同される。
【０００４】
宿主の免疫監視が、腫瘍発生において腫瘍細胞を排除することおよび腫瘍増殖を抑制することによって重要な役割を果たしているという考えは、Ｐａｕｌ  Ｅｈｒｌｉｃｈ（２１、２２）によって１世紀以上前に提唱されており、その後支持されなくなっていた。しかし、動物およびヒトの両方の臨床試験からの蓄積しているデータは、宿主免疫系が、排除、平衡および逃避の３つのステージを含む「免疫編集」を通じて腫瘍発生において重要な役割を果たしていることを示唆する（２３〜２５）。腫瘍浸潤性細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、ヒトの退行性黒色腫（２６〜３１）、食道がん（３２）、卵巣がん（３３、３４）、および大腸がん（３５〜３７）のいくつかの臨床試験においてより良好な予後に関連した。免疫系は、臨床症状の非存在下で循環がん細胞が検出可能であるときのがん休眠の現象の原因であると考えられている（１５、３８）。興味深いことに、腫瘍のＤＮＡメチル化およびトランスクリプトームの最近の解析は、浸潤性リンパ球の腫瘍ステージ特異的免疫シグネチャーを明らかにした（３９、４０）。しかし、これらのシグネチャーは、腫瘍微小環境中の標的化された免疫細胞を表し、早期診断のためのこうしたシグネチャーの利用は、侵襲性の処置を必要とする。腫瘍浸潤性免疫細胞は、末梢血液細胞のマイナーな画分のみを表す（４１〜４４）。全体的なＤＮＡメチル化変化は、白血球において以前に報告されており、ＥＷＡＳ調査は、膀胱、頭頸部、および卵巣のがんからの白血球におけるＤＮＡメチル化における差異を明らかにし、これらの差異は、白血球分布における差異とは独立していた（４５）。これらの調査は、腫瘍内のＤＮＡメチル化における変化についての代替マーカーとして役立ちうるがん遺伝子において基礎となっているＤＮＡメチル化変化を同定することを主に目的としていた。しかし、宿主の末梢免疫系が、がん進行と相関するがん段階に対して異なるＤＮＡメチル化反応を示すかどうかの疑問は、対処されていなかった。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、がん進行が、宿主の末梢免疫細胞における異なるＤＮＡメチル化プロファイルと関連していることを見出している。本発明は、これらのＤＮＡメチル化マーカーが、がんと基礎となっている慢性炎症性肝臓疾患とを区別することも示す。
【０００６】
本発明は、中国の北京地域からの６９人の個体の発見対象集団（１０名の対照ならびにＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＣＣのためのＥＡＳＬ−ＥＯＲＴＣ臨床診療ガイドラインを使用してステージ分類された、ＨＣＣのステージ１〜３の群のそれぞれについての１０名の患者およびステージ４についての９名の患者）におけるこれらのＤＮＡメチル化プロファイルを例示する（表１）。本発明は、関与しうる遺伝子の種類における予想されたバイアスなしでＤＮＡメチル化プロファイルを詳細に描写するために全ゲノムアプローチ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０ｋアレイ）を使用した。本発明は、ＨＣＣと異なるＢ型およびＣ型肝炎の特異的ＤＮＡメチル化プロファイルならびに末梢血単核細胞におけるＨＣＣの異なるステージのそれぞれについてのＤＮＡメチル化プロファイルを初めて実証する。これらのプロファイルは、以前に記載されているＨＣＣ腫瘍のＤＮＡメチル化プロファイル（１６）との顕著な重複を示さず、これらが、末梢血単核細胞ゲノム機能における変化を反映することおよび腫瘍ＤＮＡメチル化における変化の代替でないことが示唆される。したがって、本発明は、がんにおける宿主免疫系におけるＤＮＡメチル化変化を明らかにする。本発明は、がんを患う人における宿主Ｔ細胞におけるＤＮＡメチル化シグネチャーも明らかにする。本発明は、ＰＢＭＣおよびＴ細胞において詳細に描写されたＤＮＡメチル化プロファイルの間に顕著な重複があることも示す。本発明は、患者（ｎ＝７９）の別々のコホートにおけるＴ細胞ＤＮＡのピロシークエンシングによって発見コホートにおけるＨＣＣ患者からのＴ細胞において差異的にメチル化された４つの遺伝子を検証する。
【０００７】
本発明は、これらのＤＮＡメチル化シグネチャーに基づいた統計モデルを使用して、未知試料のがんおよびがんのステージを予測する際の本発明の有用性を実証する。本発明は、疾患およびその治療の機序の理解のために重要な意味を有し、末梢血単核細胞ＤＮＡにおけるがんの非侵襲性の診断を提供する。本発明は、当業者が利用可能であるゲノムワイドなメチル化マッピングのためのあらゆる方法、例えば、ゲノムワイドなバイサルファイトシークエンシング、キャプチャーシークエンシング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）シークエンシングなど、および利用可能になるゲノムワイドなメチル化マッピングの他のあらゆる方法を使用して、あらゆるがんの免疫系におけるＤＮＡメチル化シグネチャーを得るためにいかなる当業者によっても使用されうる。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態は、以下の通りである。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、がんを予測するための、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるがんのＤＮＡメチル化シグネチャーを提供し、前記ＤＮＡメチル化シグネチャーは、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化マッピング法、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋまたは８５０Ｋアレイ、ゲノムワイドなバイサルファイトシークエンシング、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）シークエンシングまたはオリゴヌクレオチドアレイでのハイブリダイゼーションなどを使用して得られる。
【００１０】
一実施形態では、ＤＮＡメチル化シグネチャーは、以下にリストされるＰＢＭＣのＤＮＡ由来のＣＧ−ＩＤであり、前記ＣＧ−ＩＤのＰＢＭＣまたはＴ細胞のＤＮＡメチル化レベルのいずれかを使用して肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するためのものである。
【００１１】
【表１Ａ】
2019518480.tif 000003
【表１Ｂ】
2019518480.tif 000004
【００１２】
一実施形態では、ＤＮＡメチル化シグネチャーは、以下にリストされるＴ細胞由来のＣＧ−ＩＤであり、前記ＣＧ−ＩＤのＰＢＭＣまたはＴ細胞のＤＮＡメチル化レベルを使用してＨＣＣステージおよび慢性肝炎を予測するためのものである。
【００１３】
【表２Ａ】
2019518480.tif 000005
【表２Ｂ】
2019518480.tif 000006
【００１４】
一実施形態では、ＤＮＡメチル化シグネチャーは、以下にリストされるＣＧ−ＩＤであり、罰則付き回帰解析またはクラスタリング解析などの統計モデルを使用することによって得られた、Ｔ細胞またはＰＢＭＣにおける前記ＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を使用してＨＣＣの異なるステージを予測するためのものである。
ＨＣＣステージ１を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ１４９８３１３５、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１４７６２４３６、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４４２６６６０、ｃｇ１８８８２４４９、ｃｇ０２９１４６５２；
ＨＣＣステージ２を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１５１８８９３９、ｃｇ１２３４４６００、ｃｇ０３４９６７８０、ｃｇ１２０１９８１４；
ＨＣＣステージ３を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ２７２８４３３１、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ２３９８１１５０；
ＨＣＣステージ４を対照と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４９１４５５２、ｃｇ２１１６４０５０、ｃｇ２３９８１１５０；
ＨＣＣステージ１をＢ型肝炎と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０５９４１３７６、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１１７６７７５７、ｃｇ０４３９８２８２、ｃｇ１１１５１２５１、ｃｇ２４７４２５２０、ｃｇ１４７１１７４３；
ＨＣＣステージ１をステージ２〜４と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０３２５２４９９、ｃｇ０３４８１４８８、ｃｇ０４３９８２８２、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１１７８３４９７、ｃｇ１３７１０６１３、ｃｇ１４７６２４３６、ｃｇ２３４８６７０１；
ＨＣＣステージ２をステージ３〜４と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２９１４６５２、ｃｇ０３２５２４９９、ｃｇ１１７８３４９７、ｃｇ１１９１１７６９、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４７１１７４３、ｃｇ１５６０７７０８、ｃｇ２０９５６５４８、ｃｇ２２８７６４０２、ｃｇ２４９５８３６６；
ＨＣＣステージ１〜３をステージ４と分別するための標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ１１１５１２５１、ｃｇ２４９５８３６６、ｃｇ０６８７４６４０、ｃｇ２７２８４３３１、ｃｇ１６４７６３８２、ｃｇ１４７１１７４３。
【００１５】
一実施形態では、ＤＮＡメチル化シグネチャーは、以下にリストされるＣＧ−ＩＤ
【表３】
2019518480.tif 000007
であり、罰則付き回帰解析またはクラスタリング解析などの統計モデルを使用することによって得られた、Ｔ細胞またはＰＢＭＣにおける前記ＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を使用してＨＣＣのステージを予測するためのものである。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、ＤＮＡメチル化シグネチャーのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、がんを予測するためのキットを提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、実施形態中の表３のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するためのキットを提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、実施形態中の表６のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、ＨＣＣステージおよび慢性肝炎を予測するためのキットを提供する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、実施形態中の表４のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、ＨＣＣの異なるステージを予測するためのキットを提供する。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、実施形態中の表５のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、ＨＣＣのステージを予測するためのキットを提供する。
【００２１】
第３の態様では、本発明は、末梢免疫系におけるがんにおいてエピジェネティックに制御される遺伝子経路を提供する。
【００２２】
第４の態様では、本発明は、本発明に開示されるＣＧ−ＩＤの使用を提供する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、上記にリストされるＣＧ−ＩＤを使用することによって、例えば、以下に開示されるプライマー：
ＡＨＮＡＫのためのプライマー（外側フォワード  ＧＧＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＡＧＴＡＧＧＧＴ、外側リバース  ＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＡＡＣＧＣＴ、ネステッドフォワード  ＴＧＴＴＡＧＧＧＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＡＧＧ、ネステッドリバース  ＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＣＣＴＡＡＣＴＡＴＣＴＴ、およびシークエンシングプライマー  ＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ）；
ＳＬＦＮ２Ｌのためのプライマー（外側フォワード  ＧＴＧＡＴＹＴＴＧＧＴＹＡＹＴＧＴＡＡＹＹＴ、外側リバース  ＴＣＴＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＲＡＣＡＴＴＴＡＴＴＴＡＲ、フォワードネステッド  ＡＧＧＧＴＴＴＹＡＹＴＡＴＡＴＴＡＧＹＹＡＧＧＴＴＧＧ、リバースネステッド  ＡＴＲＣＡＡＡＣＣＡＴＲＣＡＲＣＣＣＴＴＴＴＲＣ、シークエンシングプライマー  ＹＹＹＡＡＡＡＴＡＹＴＧＡＧＡＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴ）；
ＡＫＡＰ７のためのプライマー（外側フォワード  ＴＡＧＧＡＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＧＴ、外側リバース  ＡＣＡＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＴＴＴＴＣＡＣＴＣＣＡ、ネステッドフォワード  ＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＴＧＧＴＴＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧ、ネステッドリバース  ＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＣＣ、シークエンシングプライマー  ＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡ）；および
ＳＴＡＰ１のためのプライマー（外側フォワード  ＡＧＴＹＡＴＧＴＹＴＴＹＴＧＹＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＹＡＹＹ、外側リバース、ＴＴＲＣＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣＣ  ネステッドフォワード  ＹＹＧＴＴＴＹＴＴＴＹＡＴＹＴＴＹＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡ、ネステッドリバース  ＡＲＡＲＲＲＣＡＡＴＣＴＣＴＲＲＲＴＡＡＴＣＣＡＣＡＴＲＴＲ、シークエンシングプライマー  ＧＧＴＧＡＴＧＴＴＡＡＴＹＴＴＹＴＧＴＴＴＡ）
を使用することによってＨＣＣを予測するための、ＤＮＡピロシークエンシングメチル化アッセイの使用を提供する。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、上記にリストされるＣＧ−ＩＤ、例えば、ＳＴＡＰ１（ｃｇ０４３９８２８２）を使用することによってＨＣＣを予測するための、受診者動作特性（ＲＯＣ）アッセイの使用を提供する。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、上記にリストされるＣＧ−ＩＤを使用することによってＨＣＣを予測するための、階層的クラスタリング解析の使用を提供する。
【００２６】
第５の態様では、本発明は、試料から得られたＤＮＡメチル化測定値における統計解析を行うステップを含む、疾患を予測するためのＤＮＡメチル化シグネチャーを同定するための方法を提供する。
【００２７】
一実施形態では、該方法は、試料から得られたＤＮＡメチル化測定値における統計解析を行うステップを含み、前記ＤＮＡメチル化測定値は、試料から抽出されたＤＮＡのＩｌｌｕｍｉｎａビーズチップ４５０Ｋまたは８５０Ｋアッセイを行うことによって得られる。
【００２８】
一実施形態では、前記ＤＮＡメチル化測定値は、試料から抽出されたＤＮＡの、ＤＮＡピロシークエンシング、質量分析に基づく（Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（商標））またはＰＣＲに基づくメチル化アッセイを行うことによって得られる。
【００２９】
一実施形態では、該方法は、試料から得られたＤＮＡメチル化測定値における統計解析を行うステップを含む；前記統計解析は、ピアソン相関を含む。
【００３０】
一実施形態では、前記統計解析は、受診者動作特性（ＲＯＣ）アッセイを含む。
【００３１】
一実施形態では、前記統計解析は、階層的クラスタリング解析アッセイを含む。
【００３２】
［定義］
本明細書中で使用される場合、「ＣＧ」という用語は、シトシンおよびグアノシン塩基を含む、ＤＮＡ中のジヌクレオチド配列を指す。これらのジヌクレオチド配列は、ヒトおよび他の動物のＤＮＡにおいてメチル化されるようになりうる。ＣＧ−ＩＤは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋマニフェストによって定義されるようにヒトゲノム内のその位置を明らかにする（（本明細書中にリストされるＣＧのアノテーションは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｒｅｌｅａｓｅ／ｄａｔａ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｈｔｍｌ／ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ｋ．ｄｂ．ｈｔｍｌにおいて一般公開されており、Ｔｒｉｃｈｅ  ＴおよびＪｒ．に記載のようにＲ  ｐａｃｋａｇｅ  ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ｋ．ｄｂとしてインストールされる。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ｋ．ｄｂ：  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０ｋアノテーションデータ。Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  バージョン２．０．９．）。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、「罰則付き回帰」という用語は、例えば、Ｇｏｅｍａｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｌ１  ｐｅｎａｌｉｚｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｘ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｈａｚａｒｄｓ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５２（１），７０〜８４に記載のような「罰則付き」Ｒ統計パッケージにおいて実施されるように、バイオマーカーのより大きなリストから結果を予測するために必要とされる最も少ない数の予測因子を同定することを目的とする統計的方法を指す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、「クラスタリング」という用語は、（クラスターと呼ばれる）同じ群内の対象が（一部の意味または別の意味において）他の群（クラスター）内の対象よりも互いに類似しているような方法における一組の対象のグループ分けを指す。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「階層的クラスタリング」という用語は、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｌ．；Ｒｏｕｓｓｅｅｕｗ，Ｐ．Ｊ．（１９９０）．Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｄａｔａ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（第１版）．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ．ＩＳＢＮ０−４７１−８７８７６−６．に記載されているように、クラスターが互いとどのくらい類似しているか（近い）または異なっているか（遠い）どうかに基づき「クラスター」の階層を構築する統計的方法を指す。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子経路」という用語は、生理学的な経路または過程において互いに相互作用することが知られているタンパク質をコードする一群の遺伝子を指す。これらの経路は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｐａのようなバイオコンピューター使用の方法を使用して特徴付けされる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「受診者動作特性（ＲＯＣ）アッセイ」という用語は、予測因子の性能を図示するグラフィカルプロットを作成する統計的方法を指す。予測の真陽性率は、例えば、Ｈａｎｌｅｙ，Ｊａｍｅｓ  Ａ．；ＭｃＮｅｉｌ，Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．（１９８２）．「Ｔｈｅ  Ｍｅａｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ａ  Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）Ｃｕｒｖｅ」．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １４３（１）：２９〜３６に記載されているように、予測因子についての多様な閾値設定（すなわち、異なる％のメチル化）において偽陽性率に対してプロットされる。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「多変量線形回帰」という用語は、メチル化の百分率、年齢、性別などのような複数の「独立変数」または「予測因子」と、がんまたはがんのステージのような「結果」または「従属変数」との間の関係を評価する統計的方法を指す。この方法は、いくつかの「独立変数」がこのモデルに含まれるときに、「結果」（従属変数）の予測におけるそれぞれの「予測因子」（独立変数）の統計的有意性を決定する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】末梢血単核細胞におけるがん特異的ＤＮＡメチル化シグネチャーのゲノムワイドな分布を示した図である。図１Ａ．健常対照（参照）、慢性Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）およびＣ型肝炎（ＨｅｐＣ）、および進行性ステージのＨＣＣ（ＣＡＮ１、ＣＡＮ２、ＣＡＮ３、ＣＡＮ４）からのＤＮＡメチル化における拡大している差異のゲノムワイドビュー（ＩＧＶゲノムブラウザ）；図１Ｂ．上のボックスプロットは、ＨＣＣが進行するにつれてメチル化を失う部位のＤＮＡメチル化のベータ値を表す。下のボックスプロットは、ＨＣＣの進行中にＤＮＡメチル化を得る部位のＤＮＡメチル化のベータ値を表す。
【図２】正常、慢性肝炎および各ステージのＨＣＣの状態にある６９名の個人におけるＨＣＣ進行のＤＮＡメチル化シグネチャーを示した図である。各カラムは対象を表し、各列はＣＧ部位を表し、メチル化のレベルは灰色のレベルによって示されている。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図３Ａ】ＨＣＣのステージ（ＣＡＮ１、ＣＡＮ２、ＣＡＮ３、ＣＡＮ４）間で差異的にメチル化されているＣＧ部位の数における重複を示した図である。
【図３Ｂ】ＨＣＣ進行中（ＣＡＮ１、ＣＡＮ２、ＣＡＮ３、ＣＡＮ４）に低または高メチル化のいずれかにされるようになるＣＧの数を示した図である。
【図４】ステージ１のＨＣＣ（２０名の患者）について導かれたＤＮＡメチル化シグネチャーを使用した４９名の慢性肝炎およびＨＣＣの患者の予測を示した図である。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図５】ステージ２のＨＣＣ（２０名の患者）について導かれたＤＮＡメチル化シグネチャーを使用した４９名の慢性肝炎およびＨＣＣの患者の予測を示した図である。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図６】ステージ３のＨＣＣ（２０名の患者）について導かれたＤＮＡメチル化シグネチャーを使用した４９名の慢性肝炎およびＨＣＣの患者の予測を示した図である。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図７】ステージ４のＨＣＣ（２０名の患者）について導かれたＤＮＡメチル化シグネチャーを使用した４９名の慢性肝炎およびＨＣＣの患者の予測を示した図である。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図８】３５０ヵ所のＣＧのＤＮＡメチル化シグネチャー（表３）を使用した６９名の対照、慢性肝炎およびＨＣＣの患者の予測を示した図である。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図９】３１ヵ所のＣＧのＤＮＡメチル化シグネチャー（表５）を使用した６９名の対照、慢性肝炎およびＨＣＣの患者の予測を示した図である。黒色は最も多くメチル化されていることを表し、白色は最も少なくメチル化されていることを表し、灰色は中程度にメチル化されていることを表す。
【図１０Ａ】本発明に記載されている以下の予測的ＣＧのＤＮＡメチル化の測定値を使用してステージＨＣＣ２〜４をステージ１と区別する予測（０から１の確率）を示した図である。標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０３２５２４９９、ｃｇ０３４８１４８８、ｃｇ０４３９８２８２、ｃｇ１０２０３９２２、ｃｇ１１７８３４９７、ｃｇ１３７１０６１３、ｃｇ１４７６２４３６、ｃｇ２３４８６７０１。
【図１０Ｂ】本発明に記載されている以下の予測的ＣＧのＤＮＡメチル化の測定値を使用してステージＨＣＣ３〜４をステージ１および２と区別する予測（０から１の確率）を示した図である。標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２９１４６５２、ｃｇ０３２５２４９９、ｃｇ１１７８３４９７、ｃｇ１１９１１７６９、ｃｇ１２０１９８１４、ｃｇ１４７１１７４３、ｃｇ１５６０７７０８、ｃｇ２０９５６５４８、ｃｇ２２８７６４０２、ｃｇ２４９５８３６６。
【図１０Ｃ】本発明に記載されている予測的ＣＧにおけるＤＮＡメチル化の測定値を使用してステージＨＣＣ４をステージ１から３と区別する予測（０から１の確率）を示した図である。標的ＣＧ−ＩＤ：ｃｇ０２７８２６３４、ｃｇ１１１５１２５１、ｃｇ２４９５８３６６、ｃｇ０６８７４６４０、ｃｇ２７２８４３３１、ｃｇ１６４７６３８２、ｃｇ１４７１１７４３。
【図１１】健常対照（ｎ＝１０；ＴＣＴＲＬ−１からＴＣＴＲＬ−１０）およびＨＣＣステージ（ｎ＝１０；ＴＣＡＮ１、ＴＣＡＮ２、ＴＣＡＮ３、ＴＣＡＮ４）からのＴ細胞の間のＤＮＡメチル化プロファイルにおける差異を示した図である。
【図１２】ＰＢＭＣのＤＮＡにおける、Ｔ細胞由来の３７０ヵ所のＣＧ（表６）のＤＮＡメチル化の測定値を使用したＨＣＣの予測を示した図である。
【図１３Ａ】Ｔ細胞ＤＮＡにおける、ＰＢＭＣのＤＮＡ由来の３５０ヵ所のＣＧ（表３）のＤＮＡメチル化の測定値を使用したＨＣＣの予測を示した図である。
【図１３Ｂ】異なるステージのＨＣＣ（ＴＣＡＮ１〜４）からのＴ細胞ＤＮＡおよび異なるステージのＨＣＣ（ＰＢＭＣＣＡＮ１、ＰＢＭＣＣＡＮ２、ＰＢＭＣＣＡＮ４）からのＰＢＭＣからのＤＮＡにおける差異的にメチル化されたＣＧの間の重複を示した図である。
【図１３Ｃ】Ｔ細胞ＤＮＡにおける、ＰＢＭＣのＤＮＡ由来の３１ヵ所のＣＧ（表５）のＤＮＡメチル化の測定値を使用したＨＣＣの予測を示した図である。
【図１４】複製セットからのＴ細胞ＤＮＡにおける、すべての対照試料および早期ステージのＨＣＣの間での４つの遺伝子内のＤＮＡメチル化における差異のピロシークエンシングによる検証を示した図である。
【図１５】Ｔ細胞ＤＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋデータ）を使用して健常対照からＨＣＣを識別するため（図１５Ａ）またはＰＢＭＣにおいてすべての対照（健常および慢性肝炎）からＨＣＣを識別するため（図１５Ｂ）のバイオマーカーとしてのＳＴＡＰ１メチル化の特異度（真陽性の画分）（Ｙ軸）および感度（偽陽性のないこと）（Ｘ軸）を測定する受診者動作特性（ＲＯＣ）を示した図である。
【図１６】健常対照（図１６Ａ）およびすべての対照（図１６Ｂ）からＨＣＣを識別するためのバイオマーカーとしてのＴ細胞における（ピロシークエンシングを使用して測定された）ＳＴＡＰ１メチル化の特異度（Ｙ軸）および感度（Ｘ軸）を測定する受診者動作特性（ＲＯＣ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
［実施形態１．ＨＣＣがんステージと相関する、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＤＮＡメチル化シグネチャー］
＜患者の試料＞
ＨＣＣステージ分類を、ＥＡＳＬ−ＥＯＲＴＣ臨床診療ガイドライン：肝細胞癌の管理によって診断した。患者を、ステージ０（１）、ステージＡ（２）、ステージＢ（３）およびステージＣ＋Ｄ（４）を含む、４つの群に分類した。説明を簡単にするために、本発明では、図面および実施形態においてステージ１〜４と呼称する。慢性Ｂ型肝炎の診断は、慢性Ｂ型肝炎用のＡＡＳＬＤ診療ガイドラインを使用して確認し、慢性Ｃ型肝炎の診断は、Ｃ型肝炎の検査、管理および治療用のＡＡＳＬＤ推奨基準に従った。厳格な除外判定基準は、Ｔ細胞および単球の特性を変化させ得る他のあらゆる既知の炎症性疾患（Ｂ型またはＣ型肝炎を除く細菌またはウイルス感染、糖尿病、喘息、自己免疫疾患、進行中の甲状腺疾患）であった。患者の臨床特性を表１および２に示している。この治験における参加者は、Ｃａｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌの規則に従って同意を示した。この治験は、北京にあるＣａｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、およびＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから倫理的な承認を受けた（ＩＲＢ治験番号Ａ０２−Ｍ３４−１３Ｂ）。
【００４１】
【表４】
2019518480.tif 000008
【００４２】
【表５】
2019518480.tif 000009
【００４３】
＜Ｉｌｌｕｍｉｎａビーズチップ４５０Ｋ解析＞
患者から血液をＥＤＴＡコーティング付きチューブ内に採取して、標準的なプロトコールを使用して末梢血単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配上での遠心分離によって単離し、単核細胞はより低い密度を有するので研究室の慣例の手順を使用してそれらをＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ層の最上部に集め、洗浄によって単核細胞を血小板から分離した（４６）。市販のヒトＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞からＤＮＡを抽出して、ＤＮＡをバイサルファイト転換させ、製造業者によって推奨される標準的なプロトコールを使用してＩｌｌｕｍｉｎａヒトメチル化４５０ｋビーズチップハイブリダイゼーションおよびスキャニングを行った。アレイ上のスライドおよび位置に関して試料を無作為化し、ＭｃＧｉｌｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃイノベーションセンターによって推奨されるようにＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｆｉｎｕｍ  ＨＤ技術ユーザーガイドに従ってすべての試料をハイブリダイズさせ、同時にスキャンしてバッチエフェクトを軽減させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａアレイハイブリダイゼーションおよびスキャニングは、製造業者のガイドラインに従ってＭｃＧｉｌｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃイノベーションセンターによって行われた。Ｒ（４７）の中のＣｈＡＭＰ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用してＩｌｌｕｍｉｎａアレイを解析した。ｍｉｎｆｉ品質管理および正規化オプションを使用してｃｈａｍｐ．ｌｏａｄ機能においてＩＤＡＴファイルをインプットとして使用した。生データを、少なくとも１つの試料においてＰ＞０．０１の検出値を有するプローブについてフィルター処理した。ＸまたはＹ染色体上のプローブをフィルター処理で除外して性別の影響を軽減し、（４８）において同定されたようなＳＮＰを有するプローブ、ならびに（４８）において同定されたような複数の位置にアラインメントされるプローブをフィルター処理で除外した。正規化されていないデータ上でｃｈａｍｐ．ｓｖｄ機能を使用してバッチエフェクトを解析した。最初の６つの主な構成要素からの５つは、群およびバッチ（スライド）に関連した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍタイプ２プローブ設計によって導入されたバイアスについてデータを調整するためのアレイ内正規化を、ｃｈａｍｐ．ｎｏｒｍ機能（ｎｏｒｍ＝「ＢＭＩＱ」）を用いたベータ混合分布正規化（ＢＭＩＱ）（４７）を使用して行った。ＢＭＩＱ正規化後にｃｈａｍｐ．ｒｕｎｃｏｍｂａｔ機能を使用してバッチエフェクトを修正する。
【００４４】
本発明の試料における末梢血単核細胞分布についての細胞計数解析を、Ｈｏｕｓｅｍａｎアルゴリズム（４９）に従ってｅｓｔｉｍａｔｅＣｅｌｌＣｏｕｎｔｓ機能および参照としてＦｌｏｗＳｏｒｔｅｄ．Ｂｌｏｏｄ．４５０ｋデータを使用して行った。バッチ修正された正規化データのベータ値を下流の統計解析のために使用する。
【００４５】
ＨＣＣステージと４５０ＫのＣＧ部位におけるＤＮＡメチル化の定量的分布との間の線形相関をコンピューターで計算するために、正規化されたＤＮＡメチル化値と（対照についての０、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎それぞれについての１および２、ならびにＨＣＣの４つのステージについての３〜６のステージコードでの）ＨＣＣのステージとの間のピアソン相関は、Ｒの中のｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒ機能を使用して行われ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇの方法「ｆｄｒ」（調整された＜０．０５のＰ値（Ｑ））ならびに保存的ボンフェローニ補正（Ｑ＜１×１０−７）を使用して多重検定のために補正して行われる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ８５０Ｋアレイのような新世代のＩｌｌｕｍｉｎａアレイを利用して、同様のアプローチを使用することができる。
【００４６】
＜部位特異的ＤＮＡメチル化レベルの定量的分布とＨＣＣの進行との間の相関＞
この解析は、ＨＣＣの進行と相関するＤＮＡメチル化の広範なシグネチャー（１６０，９０４部位）を明らかにする。本発明のこの解析は、最も強い変化（ｒ＞０．８；ｒ＜−０．８；デルタベータ＞０．２／、デルタベータ＞−０．２、ｐ＜１０−７）を有する３９２４部位に焦点を定めている。ＨＣＣ進行中にこれらの部位のＤＮＡメチル化において慢性Ｂ型およびＣ型肝炎ならびに対照に対して相対的に強まっている変化のゲノムワイドなビューを図１Ａに示している。ＨＣＣの間にメチル化が増加または減少する部位のＤＮＡメチル化レベルのボックスプロットは、ＨＣＣの進行に伴うＤＮＡメチル化における変化の進行を確認し、ＨＣＣの進行に伴い低メチル化の程度が増加する（図１Ｂ）。Ｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソン相関を使用したクラスタリングは、これらの部位が、ＨｅｐＣおよびＨＣＣの間の境界上にクラスター化された患者ＣＡＮ１〜５を除き、すべての個々のＨＣＣ患者を、対照ならびにＢ型およびＣ型肝炎の個体から離してクラスター化し、異なる群の個々のメンバーにわたって強い一貫性を示すことを明らかにする（図２）。
【００４７】
＜がん試料を対照と区別するための、末梢血単核細胞におけるＨＣＣのＤＮＡメチル化シグネチャーの有用性＞
これらのＤＮＡメチル化シグネチャーは、したがって、患者試料においてＨＣＣのステージを分類する有用性を有する。図２にあるヒートマップは、ＨＣＣの進行と共にＤＮＡメチル化差異における変化が強まることを明らかにする。重要なことに、本発明の解析の組合せにより、ＤＮＡメチル化シグネチャーは、ＨＣＣの早期診断におけるきわめて重要な課題である、最も早期のステージにある個々のＨＣＣ患者をＢ型およびＣ型肝炎と区別することが示される。さらに、本発明の解析により、ＨＣＣ患者からのＰＢＭＣにおけるＤＮＡメチル化における変化が、ウイルスによって引き起こされた慢性炎症によって誘発される変化と区別されうることが示される。本発明の明細書に基づき、いかなる当業者も他のがんについての同様のＤＮＡメチル化シグネチャーを得ることができる。
【００４８】
［実施形態２．固有でありかつ重複している差異的にメチル化される部位は、異なるＨＣＣステージと関連し、ＨＣＣをＢ型およびＣ型肝炎と区別する。］
本発明者らは、ＣｈＡＭＰにおいて実施されるようなＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＬｉｍｍａ（５０）を独立に使用して、健常対照とＨＣＣステージのそれぞれとの間で差異的にメチル化されるＣＧを詳細に描写した。各ステージのＨＣＣと健常対照との間で差異的にメチル化されるＣＧ部位（ｐ＜１×１０−７）の数は、ステージの進行と共に増加する；ステージ１についての１４３７５ヵ所、ステージ２  ２２０１８ヵ所、ステージ３、３０７０９ヵ所、およびステージ４についての５４５８０ヵ所。Ｒの中の超幾何フィッシャーの正確検定を使用して２つの群の間の重複の有意性を決定した。がんのステージ間で有意な重複があり（図３Ａ）、共通のマーカーはすべてのＨＣＣステージにおいて影響を受けることが示唆される（ｐ＜１．９ｅ−２９７）。
【００４９】
ＨＣＣにおいて高メチル化される部位に対して相対的に低メチル化される部位の画分は、同様にステージ１における２６％からステージ４における５７％まで増加する（図３Ｂ）。ＨＣＣの進行に伴う低メチル化部位の数におけるこの増加は、ピアソン相関分析の結果において同様に観察された（図１、２）。各ＨＣＣステージについて、ＨＣＣステージ１にはｐ＜１×１０−７の閾値（ボンフェローニ補正後のゲノムワイドな有意性）および＋／−０．３のデルタベータならびにステージ２〜４にはｐ＜１０−１０、＋／−０．３のデルタベータ（より後期のステージでは、解析に使用する部位の数を減少させるために、より厳密な閾値を使用する）を使用することによって一組のきわめて強力なＣＧメチル化マーカーを導き、これらをさらなる解析（ステージ１についての７４ヵ所、ステージ２についての１４ヵ所、ステージ３についての５８ヵ所、およびステージ４についての２９８ヵ所）のために使用した。各ステージについて独立に導かれたマーカーのリストを組合せることおよびステージ間で重複するＣＧ部位を除外することにより、３５０ヵ所のＣＧの重複しない組合せリスト（表３）が導かれる。
【００５０】
【表６Ａ】
2019518480.tif 000010
【表６Ｂ】
2019518480.tif 000011
【００５１】
この治験および臨床設定におけるＨＣＣ患者は、アルコール、喫煙（５２〜５５）、性別（５６）および年齢（５７）に関して不均一な群であり、これらの因子のそれぞれが、ＤＮＡメチル化に影響を及ぼすことが知られている。さらに、末梢単核細胞は細胞の不均一な混合物であり、細胞分布における個体間での変化も同様にＤＮＡメチル化に影響しうる。本発明は、最初に、Ｈｏｕｓｅｍａｎアルゴリズム（４９）を使用して各症例についての細胞計数分布を決定した。二元配置ＡＮＯＶＡ後のペアワイズ比較、および多重検定のための補正では、群の間で細胞計数における有意差は見出されなかった。多重検定のためのボンフェローニ調整を用いてｌｏｏｐ＿ａｎｏｖａ  ｌｍＦｉｔ機能を使用して、補助因子として群、性別および年齢を用いた多因子ＡＮＯＶＡを、ＨＣＣとの関連について候補にされたＣＧについて行った。Ｒの中のｌｍＦｉｔ機能を使用した線形回帰モデルにおいて細胞計数、性別、年齢、およびアルコール乱用が共変量として使用される場合に、これらの関連が残存することになるかどうかを検定するために、ＨＣＣに関連することが見出された、候補にされたＣＧ部位において多変量線形回帰を行った。Ｖｅｎｎｙ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｇｐ．ｃｎｂ．ｃｓｉｃ．ｅｓ／ｔｏｏｌｓ／ｖｅｎｎｙ／）を使用して、異なる群における、（対照に対して相対的に）差異的にメチル化される遺伝子リストの比較を行った。Ｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソン相関を使用して階層的クラスタリングを行い、Ｂｒｏａｄ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＧｅｎｅＥアプリケーション（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＧＥＮＥ−Ｅ／）においてヒートマップを作成した。
【００５２】
次いで、群（ＨＣＣ対非ＨＣＣ）、性別、アルコール、喫煙、年齢、および細胞計数を共変量として使用して、ＨＣＣを他のすべての群と区別する、３５０ヵ所のＣＧ部位の正規化されたベータ値における多変量線形回帰を行った。すべてのＣＧ部位は、モデル内に他の共変量を含めた後でも、群の共変量についてきわめて有意なままであった。３５０個の測定値についてのボンフェローニ補正後に、３４２ヵ所のＣＧ部位は、群（ＨＣＣ対非ＨＣＣ）についてきわめて有意なままであった。性別と群、年齢と群とのいずれかの間ならびに性別＋年齢とＤＮＡメチル化における群との間に可能な相互作用があるかどうかを決定するために、従属変数としての３５０部位のベータ値ならびに独立変数としての群（ＨＣＣ対非ＨＣＣ）、性別および年齢において多因子ＡＮＯＶＡ解析を行う。
【００５３】
群は、３５０ヵ所すべてのＣＧについて有意なままであったのに対して、ボンフェローニ補正後に、性別または年齢との有意な相互作用は見出されなかった。要約すると、これらのデータは、ＨＣＣ患者とＢ型肝炎およびＣ型肝炎を含む他の非ＨＣＣ患者との間のＰＢＭＣのＤＮＡにおける強いＤＮＡメチル化の差異を示す。
【００５４】
［実施形態３．Ｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソンクラスター分析を使用して患者からの未知試料を予測し、早期ステージのＨＣＣがんを検出し、かつ、それらを慢性肝炎と区別するための、がんステージ特異的ＤＮＡメチル化マーカーの有用性。］
ＨＣＣステージのそれぞれについての差異的にメチル化される部位は、１０名の健常対照および１０名のステージ特異的ＨＣＣを比較することによって導かれた。他のステージならびにＢ型およびＣ型肝炎の試料は、これらの差異的にメチル化されるＣＧについて「トレーニングされ」ておらず（「トレーニングされる（ｔｒａｉｎｅｄ）」は、差異的にメチル化される部位を導くためのモデルによって使用される）、以下の疑問に対処するための「未知」試料の「交差検証」セットとしての役目を果たした：第一に、１つのステージのがん用に導かれたマーカーが、それらのマーカーによって「トレーニングされ」ていないＨＣＣ試料を正確にクラスター化することになるか？第二に、ＨＣＣを健常対照と区別するように「トレーニングされた」ＤＮＡメチル化マーカーが、ＨＣＣをＢ型肝炎およびＣ型肝炎とも区別することになるか。注目すべき割合のＨＣＣ患者が慢性肝炎からＨＣＣに進行するので、ＨＣＣを慢性肝炎と区別することは、ＨＣＣの早期診断のためにきわめて重要な課題である。
【００５５】
ＨＣＣの１つのステージのみおよび対照を検査することによって「発見された」一組のＣＧメチル化マーカーを各個の解析のために使用して、すべてのＨＣＣおよび肝炎試料についてｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソン相関によって階層的クラスタリングを行う。他のすべてのステージは、これらのマーカーに対して「ナイーブ」であって、「交差検証」としての役目を果たした。交差検証とは、それによってこの治験における試料の小さなサブセットが、２つの群（すなわち、「がん」および「対照」）を互いと区別するマーカー（予測因子）のリストを「発見する」ために使用される統計的戦略を指す。これらの「発見した」マーカーを、次いで、この治験における他の「新しい」試料において予測因子として試験する。図４から７に示しているように、特定のステージのＨＣＣについての独立して導かれたマーカーのセットのそれぞれを「交差検証した」；それらは、「新しい」ＨＣＣおよび非ＨＣＣの症例を含む一群の試料においてＨＣＣを正確に予測した（図４はステージ１マーカーを使用し、図５はステージ２マーカーを使用し、図６はステージ３マーカーを使用し、図７はステージ４マーカーを使用する）。注目すべきことに、ＨＣＣの１つのステージのみを健常対照とただ比較することによって発見されたＣＧマーカーは、ＨＣＣおよび慢性肝炎の症例を含んだ別の一組の試料においてＨＣＣを正確に予測した。これは、患者が依然として慢性肝炎を有しているかどうかまたは患者がＨＣＣに移行したかどうかを予測するために利用することができる、慢性肝炎およびがんについての異なるＤＮＡメチル化プロファイルのさらなる証拠を提供する。興味深いことに、同じマーカーは、同様にＢ型およびＣ型肝炎の症例を正確に予測した（図４〜７）。
【００５６】
ＨＣＣステージのそれぞれを区別する、独立して導かれたＣＧマーカー間の重複（図３Ａ）は、ステージ間のすべての可能な重複についてフィッシャーの超幾何検定を使用して有意である（ｐ＜１．９２１７１８ｅ−２９７）。１０症例のみおよび対照を使用してそれぞれのステージについて独立して導かれたマーカー間のきわめて有意な重複は、これらのマーカーの強力さを強く検証し、早期の検出のために使用することができるＨＣＣの末梢マーカーとしてのこれらの差異的にメチル化されるＣＧの有用性を例示する。
【００５７】
異なるステージのがんにおいて差異的にメチル化されるＣＧ間に大きな重複があるが、その重複は部分的である。本発明は、ＨＣＣステージを互いと区別するために（上記（表３）の）３５０ヵ所のＣＧのリストを利用できることをここで実証している。これらの３５０ヵ所のＣＧを使用した、すべての試料のｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソン相関による階層的クラスタリングは、ＨＣＣの症例をステージによって正確にクラスター化したのに対して、Ｂ型およびＣ型肝炎の症例は、健常対照と共にクラスター化された。ＨＣＣの異なるステージにおいて健常対照からの差異的にメチル化される部位の間に大きな重複があるが、差異的なメチル化の強度は、ＨＣＣの進行と共に増強される。したがって、これらの３５０ヵ所のＣＧ部位のメチル化のレベルは、ＨＣＣのステージを区別するためにも使用することができた。表３のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、キットは、肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するために使用することができる。ＤＮＡメチル化マーカーリストは、健常対照および単一ステージのＨＣＣのみを比較することによって導かれたにもかかわらず、このリストは、他の「新しい」Ｂ型およびＣ型肝炎の症例を非ＨＣＣとして正確に予測することができることに留意されたい（図８）。
【００５８】
本発明の開示は、ＨＣＣの特定のステージを対照および慢性肝炎患者と区別するために使用されうる、ＨＣＣ患者からのＰＢＭＣにおいて差異的にメチル化されているＣＧを明らかにする。
【００５９】
［実施形態４．罰則付き回帰を使用してＨＣＣの早期ステージを後期ステージと区別するステージ特異的ＣＧメチル化マーカー。］
データにより、ＰＢＭＣのＤＮＡメチル化マーカーは、ＨＣＣのステージを区別することが示唆される。本発明は、次いで、ＨＣＣのステージを互いと区別するために必要とされる最も少ない数のＣＧ部位のリストを定義した。罰則付き回帰モデルに適合させるための「罰則付き」Ｒパッケージ（５１）を使用して３５０ヵ所のＣＧ部位の「罰則付き回帰」をステージ試料間で行う。罰則付きＲパッケージは、尤度交差検証を使用し、残されたそれぞれの対象において予測を行う。適合したモデルは、ステージ１を対照に対して予測する８ヵ所のＣＧ、ステージ２を対照に対して予測する５ヵ所のＣＧ、ステージ３を対照に対して区別する５ヵ所のＣＧ、ステージ４を対照に対して区別する７ヵ所のＣＧ、およびステージ１をＢ型肝炎と区別するのに十分である７ヵ所のＣＧを同定した（表４）。ステージ１とより後期のステージ２〜４とを区別する８ヵ所のＣＧ、ステージ１および２をより後期のステージ３〜４と区別する１０ヵ所のＣＧ、ステージ４をより早期のすべてのステージ（ステージ１〜３）と区別する７ヵ所のＣＧを選択する（表４）。（重複を除外した後の）３１ヵ所のステージ分別ＣＧの組み合わせリスト（表５）のＰＢＭＣにおけるＤＮＡメチル化測定値は、Ｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソンクラスタリングを使用してすべてのＨＣＣ症例およびそれらのステージを正確に予測した（図９）。表４または５のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、キットは、肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージを予測するために使用することができる。
【００６０】
【表７】
2019518480.tif 000012
【００６１】
【表８】
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【００６２】
［実施形態５．未知試料を異なるステージのがんとして１００％の特異度および感度で予測するためのＣＧ罰則付き回帰モデルの有用性。］
表４にリストされるＣＧを使用して特定のステージを区別するために導かれた罰則付きモデルを、次いで、他の「ナイーブな」（マーカーの発見のために使用されなかった新しい試料）ＨＣＣ症例ならびにＢ型およびＣ型肝炎対照において使用して、それぞれの症例がＨＣＣの異なるステージにある可能性を予測した。これらの解析の結果を図１０に示している。罰則付きモデルは、すべてのステージ試料を１００％の感度および１００％の特異度で予測した。
【００６３】
［実施形態６．Ｔ細胞から抽出されたＤＮＡを使用してＨＣＣと健常対照とを区別するＤＮＡメチル化マーカー。］
多変量解析により、ＨＣＣと他の群（対照および慢性肝炎）との間のＰＢＭＣのＤＮＡメチル化における差異は、細胞計数における差異が考慮に入れられるときでも残ることが示唆される。さらに、（Ｔ細胞サブタイプにおける不均一性が残っているにもかかわらず）特定の細胞型の単離によって細胞組成物の複雑性が一度低減されるとがんと対照との間のＤＮＡメチル化における差異がなくなるかどうかを決定するために、治験に含まれていた３９名のＨＣＣ患者のうちの１０名（表１に対する説明文の中に表示されている、ＨＣＣステージのそれぞれからの試料）およびすべての健常対照（ｎ＝１０）から単離されたＴ細胞の間のＤＮＡメチル化プロファイルにおける差異を解析して、特定の細胞型の単離によって細胞組成物の複雑性が一度部分的に低減されるとがんと対照との間のＤＮＡメチル化における差異がなくなるかどうかを決定した。
【００６４】
抗ＣＤ３免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅｄ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＴ細胞を単離し、ＣｈＡＭＰパッケージを使用した、ＨＣＣと健常対照との間の正規化されたＤＮＡメチル化値における線形（混合効果）回帰により、ｐ＜１×１０−７の閾値において差異的にメチル化された２４８６３ヵ所の部位を明らかにした。３７０ヵ所の強力な差異的にメチル化されるＣＧを、ｐ＜１×１０−７の閾値およびデルタベータ＞０．３、＜−０．３において候補にし（表６）、Ｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソン相関による、健常対照およびＨＣＣのＴ細胞ＤＮＡの階層的クラスタリングを行った（図１１）。これらの３７０ヵ所のＣＧは、すべての試料をＨＣＣおよび対照の２つの群に正確にクラスター化する。表３のＣＧ−ＩＤのＤＮＡメチル化測定値を検出するための手段および試薬を含む、キットは、肝細胞癌（ＨＣＣ）ステージおよび慢性肝炎を予測するために使用することができる。
【００６５】
【表９Ａ】
2019518480.tif 000014
【表９Ｂ】
2019518480.tif 000015
【００６６】
［実施形態７．「トレーニングされていない」ＨＣＣおよび慢性肝炎患者を予測するための、Ｔ細胞において発見されたＤＮＡメチル化マーカーの有用性］
ＨＣＣおよび健常対照からのＴ細胞を区別するこれらの３７０ヵ所のＣＧ部位（表６）を使用して、「トレーニングされていない」異なる慢性肝炎および健常対照のＰＢＭＣ試料（ｎ＝６９）をクラスター化することができた。図１２に示しているクラスタリング解析は、Ｔ細胞ＤＮＡにおいて差異的にメチル化される３７０ヵ所のＣＧ部位が、個々のＨＣＣ、肝炎および健常対照のＰＢＭＣからのＤＮＡを１００％の精度でクラスター化することを示す。したがって、Ｔ細胞ＤＮＡを使用して発見された差異的にメチル化されたＣＧを、異なる患者（ＨＣＣを有する異なる２９名の患者、および慢性肝炎を有する２０名の患者）において、ＰＢＭＣにおけるＤＮＡメチル化測定値を使用して「交差検証した」。
【００６７】
［実施形態８．Ｔ細胞ＤＮＡを使用したＨＣＣがんの予測における、ＰＢＭＣのＤＮＡの解析から導かれた３５０ヵ所のＣＧ部位（表３）および３１ヵ所のＣＧ部位（表５）の有用性。］
ＰＢＭＣのＤＮＡの解析によって導かれた３５０ヵ所のＣＧは、Ｔ細胞健常対照およびＨＣＣの試料を正確にクラスター化した（図１３Ａ）。Ｔ細胞ＤＮＡを使用して健常対照をＨＣＣと区別する有意なＣＧ（フィッシャー、ｐ＜１×１０−７）と、ＰＢＭＣのＤＮＡを使用して異なるＨＣＣステージおよび対照を区別するＣＧとの間にきわめて有意な重複がある（図１３Ｂ）。
【００６８】
本発明は、ＰＢＭＣのＤＮＡメチル化測定から罰則付き回帰によって導かれた、候補にされた３１ヵ所のＣＧ（表５）が、ＨＣＣ患者および対照からのＴ細胞ＤＮＡメチル化測定値も、Ｏｎｅ  ｍｉｎｕｓピアソン相関を使用して正確にクラスター化およびステージ分類したことも示す（図１３Ｃ）。これらのデータにより、ＨＣＣと他の試料との間のＤＮＡメチル化における差異は、特定の細胞型の単離によって細胞型の複雑性が低減されるときでも残り、ＨＣＣおよびそれらの予測値とのこれらのＣＧの関連についてのさらなる「交差検証」を可能にすることが実証される。
【００６９】
［実施形態９．ＨＣＣにおけるＰＢＭＣにおいて差異的にメチル化された遺伝子は、免疫に関連した正準経路に濃縮されている］
ＨＣＣの進行は、メチローム（ゲノムワイドなＤＮＡメチル化プロファイル）における広いフットプリントを有する（図１）。ＨＣＣ患者からのＰＢＭＣおよびＴ細胞において差異的にメチル化された遺伝子の機能的フットプリントに対する洞察を得るために、差異的なメチル化解析から作製された遺伝子リストに、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用して遺伝子セット濃縮解析を行った。本発明者らは、最初に、ＣＧに関連した遺伝子に遺伝子セット濃縮解析を行った。前記ＣＧは、ピアソン相関分析においてＨＣＣのステージとの線形相関を示す（図１）（ｒ＞０．８；ｒ＜−０．８；デルタベータ＞０．２、デルタベータ＜−０．２）。注目すべきことに、これらのＣＧに関連した遺伝子の最上流制御因子は、免疫系の主要な免疫性炎症およびストレス制御因子である、ＴＧＦベータ（ｐ＜１．０９×１０−１７）、ＴＮＦ（ｐ＜７．３２×１０−１５）、デキサメタゾン（ｐ＜７．７４×１０−１２）およびエストラジオール（ｐ＜４×１０−１２）である。同定された上位の疾患は、がん（ｐ値１×１０−５から２×１０−５１）および肝疾患（ｐ＜１．２４×１０−５から１．１１×１０−２５）であった。強いシグナルは、肝過形成（ｐ＜６．１９×１０−１から１．１１×１０−２５）および肝細胞癌（ｐ＜５．２×１０−１から３．７６×１０−２５）について認められた。差異的にメチル化されている遺伝子の検査は、免疫制御分子の多数の代表、例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１６、ＩＬ７、Ｉｌ１０、ＩＬ１８、Ｉｌ２４、Ｉｌ１Ｂおよびインターロイキンレセプター、例えば、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡなど；ケモカイン、例えば、ＣＣＬ１、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ２４など、ならびにケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７およびＣＣＲ９など；細胞受容体、例えば、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ１４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ８０およびＣＤ８３など；ＴＧＦベータ３およびＴＧＦベータＩ、ＮＦＫＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３ならびにＴＮＦａなどを明らかにする。
【００７０】
ＰＢＭＣおよびＴ細胞の間の差異的にメチル化された遺伝子の比較ＩＰＡ解析は、一般的な上流制御因子として、ＮＦＫＢ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦおよびＩＬ４ならびにＮＦＡＴを明らかにした。全体として、ＨＣＣのＰＢＭＣおよびＴ細胞におけるＤＮＡメチル化変化は、免疫変調機能における強いシグネチャーを示す。ＨＣＣおよび非がん性の肝組織の間で差異的にメチル化されたプロモーターは、以前に詳細に描写されている（１６、５８）。本発明は、ＨＣＣにおいてがん生検（１９８３個のプロモーター）および末梢血単核細胞（５４５個のプロモーター）において差異的にメチル化されているプロモーター間に重複があったかどうかを決定し、フィッシャーの超幾何検定（ｐ＝０．７６）によって決定されるように統計的には有意でなかった４４個のプロモーターの重複を見出した。これらのデータは、末梢血単核細胞において認められたＤＮＡメチル化における変化がＨＣＣにおける免疫系における変化を反映すること、および、これらの差異的にメチル化されたＣＧは腫瘍からの循環ＤＮＡのフットプリントまたは腫瘍内で生じるＤＮＡメチル化変化の「代替」ではない可能性が最も高いことを示す。これらの経路の有用性は、末梢免疫系におけるがん療法のための新しい標的を提供することによる。
【００７１】
［実施形態１０．差異的にメチル化されるＣＧのピロシークエンシングによってＨＣＣおよびがんを予測する］
ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４装置を使用してピロシークエンシングを行い、結果をＰｙｒｏＭａｒｋ（登録商標）Ｑ２４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で解析した。すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表された。Ｒを使用して統計解析を行った。この解析のために使用したプライマーを表７にリストしている。
【００７２】
【表１０】
2019518480.tif 000016
【００７３】
本発明は、複製セットには、細胞組成物の問題を減少させるためにＴ細胞ＤＮＡを使用する。複製セットには、７９名の人、１０名の健常対照、ならびにＢ型およびＣ型肝炎ならびに３つのがんステージのそれぞれからの１０名の個体、ならびに１９名のステージ１の試料が含まれていた（表２）。発見セットにおいてＨＣＣと比較してＴ細胞において有意に差異的にメチル化されることが見出された以下の遺伝子を調査する：ＳＴＡＰ１（ｃｇ０４３９８２８２）（表６にも含まれている）、ＡＫＡＰ７（ｃｇ１２７０００７４）、ＳＬＦＮＬ２（ｃｇ００９７４７６１）、およびＨＣＣにおいて低メチル化されている含まれる１つのさらなる遺伝子である神経芽細胞分化関連タンパク質（ＡＨＮＡＫ）（ｃｇ１４１７１５１４）。すべての対照（健常ならびにＢ型およびＣ型肝炎）とＨＣＣステージ１、２（０＋Ａ）との間の線形回帰により、多重検定のための補正後の４つすべてのＣＧについてＨＣＣステージ１、２との有意な関連が明らかにされた（ＳＴＡＰ１  ｐ＝４．０４×１０−７；ＡＫＡＰ７  ｐ＝０．０４６；ＳＬＦＮＬ２  ｐ＝０．０１２；ＡＨＮＡＫ  ｐ＝０．００３４３６）。すべての対照とすべてのステージのＨＣＣとの間の線形回帰により、多重検定のための補正後のＳＴＡＰ１（ｐ＝６．６×１０−６）およびＡＨＮＡＫ（ｐ＝０．０２６）についてＨＣＣとの有意な関連が明らかにされた。
【００７４】
ＡＮＯＶＡ解析により、検証した４つすべてのＣＧにおいて対照群（健常対照ならびにＢ型およびＣ型肝炎）と早期のＨＣＣ（ステージ０＋Ａ；１、２）の群との間のメチル化における有意な差異が明らかにされた。すべての対照とすべてのＨＣＣとの間の群の比較により、ＳＴＡＰ１（ｐ＝１．７×１０−６）、ＡＫＡＰ７（ｐ＝０．０４２）、ＡＨＮＡＫ（ｐ＝０．００６２）についてのメチル化における有意な差異が明らかにされたが、ＳＬＦＮＬ２についての差異は、傾向はみられたが有意ではなかった（ｐ＝０．０７１）。ＡＮＯＶＡにより、ＳＴＡＰ１メチル化における診断についての有意な効果（Ｆ＝１０．０１７；ｐ＝７．４９×１０−６）が明らかにされた。
【００７５】
異なる５つの対照の診断サブグループ（健常対照、慢性Ｂ型肝炎および慢性Ｃ型肝炎）および早期のＨＣＣ（ステージ１および２または０およびＡ）における多重検定のための補正後のペアワイズ解析により、ステージ１（ＢＣＬＣ  ０）のＨＣＣと、健常対照（ｐ＝０．０００３７）、慢性Ｂ型肝炎（ｐ＝０．００８４９）またはＣ型肝炎（ｐ＝０．００６９８）のいずれかとの間ならびにステージ２（ＢＣＬＣ  Ａ）と、健常対照（ｐ＝０．０００１８）、Ｂ型肝炎（ｐ＝０．００６７０）またはＣ型肝炎（ｐ＝０．００５３４）のいずれかとの間の有意な差異が明らかにされた。ＳＬＦＮ２Ｌメチル化（Ｆ＝３．９３７６；ｐ＝０．００８１０）、ＡＨＮＡＫ（Ｆ＝３．０２１９；ｐ＝０．０２８０９）およびＡＫＡＰ７（Ｆ＝３．４；ｐ＝０．０１６３３）に対する診断の効果もあったのに対して、異なる診断サブグループ間でのペアワイズ比較は有意でなかった。
【００７６】
これらのデータにより、早期ステージのＨＣＣを予測し、それらを対照と区別するために、これらの４ヵ所のＣＧ部位を使用できることが例示される（図１４）。
【００７７】
［実施形態１１．受診者動作特性（ＲＯＣ）解析によってＨＣＣを予測するための、発見された差異的にメチル化されるＣＧのリストの有用性；ＳＴＡＰ１の例］
バイオマーカーの診断の値の測定は、「特異度」（偽の発見の割合）の関数として「感度」（真の発見の割合）を測定する受診者動作特性（ＲＯＣ）である。ＲＯＣ試験は、最も正確な予測（最も高い割合の「真の発見」および最も少ない数の「偽の発見」）を提供する閾値（すなわち、特定のＣＧにおけるメチル化の百分率）を決定する（５９）（図１５）。各試料のＤＮＡメチル化レベルを、閾値のＤＮＡメチル化値と比較し、次いで、対照またはＨＣＣのいずれかとして分類する。本発明は、最初に、健常対照およびＨＣＣからのＴ細胞についての正規化されたＩｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋベータ値についてのＲＯＣ特性を決定する（図１５Ａ）。ＳＴＡＰ１遺伝子ｃｇ０４３９８２８２は、完全なバイオマーカーとしての挙動を示す。０．７５７の閾値ＤＮＡメチル化ベータ値（より高い値を有する試料はいずれもＨＣＣとして、０．７５７より低い値を有する試料はいずれも対照として分類される）では、ＨＣＣ試料を名指しする精度は１００％であって、ＡＵＣは１であり、感度および特異度は１００％である。ＳＴＡＰ１バイオマーカーは、ＨＣＣおよび健常対照からのＴ細胞ＤＮＡメチル化を比較することによって発見された。したがって、本発明者らは、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎患者ならびにＴ細胞ＤＮＡメチル化解析に含まれていなかった２９名のさらなるＨＣＣ患者を含むＰＢＭＣのＤＮＡ試料からの正規化されたベータ値を使用してＲＯＣ特性を調査することによってＳＴＡＰ１  ｃｇ０４３９８２８２のバイオマーカー特性を交差検証することができた（図１５Ｂ）。ＰＢＭＣのＤＮＡを使用してすべてのＨＣＣ試料（すべてのステージ）を予測する精度は、０．６７２９の閾値ベータ値を使用して９６％であって、ＡＵＣは０．９７４１３７９であった（感度０．９７５および特異度０．９７３）。Ｔ細胞ＤＮＡの複製セットにおいてＳＴＡＰ１のピロシークエンシング値を使用してＲＯＣ特性を調査する（図１６）。ピロシークエンシング部位によって定量化されるようなこのＳＴＡＰ１のＣＧメチル化値は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ４５０Ｋ値よりも全体的に低かった。ＳＴＡＰ１  ｃｇ０４３９８２８２についての４０．２％のＤＮＡメチル化の閾値において、他のすべての対照（健常ならびにＢ型およびＣ型肝炎）からＨＣＣを名指しする精度は、８２．２％である。ＨＣＣとすべての対照との間の識別のための曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．８（８５％の感度および７３％の特異度）である（図１６Ａ）。ＳＴＡＰ１  ｃｇ０４３９８２８２の５０．１２％のメチル化の閾値において、すべての対照からＨＣＣステージ１を名指しする精度は８３．６％であり、ＡＵＣは０．８９である（８４％の感度および８３％の特異度）。ＨＣＣステージ１を健常対照と区別する精度（図１６Ａ）は、４７．２の閾値メチル化レベルにおいて９３％であり、ＡＵＣは０．９４である（９４％の感度および９４％の特異度）（図１６Ｂ）。要約すると、ＳＴＡＰ１により、ＨＣＣ末梢血単核細胞におけるＤＮＡメチル化バイオマーカーは、肝臓がんの早期診断におけるきわめて重要なハードルである、ステージ１を慢性肝炎および健常対照と識別するために使用できることが例示される。ＳＴＡＰ１は、Ｔ細胞Ｄ��Ａを使用して同定され、複製セットにおいて検証された（図１４）。
【００７８】
ＤＮＡメチル化を測定するためにここで使用する方法は、例のみを示すものであり、他の許容される方法によるＤＮＡメチル化の測定を排除するものではない。いかなる当業者も、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ８５０Ｋアレイ、質量分析に基づく方法、例えば、Ｅｐｉｔｙｐｅｒ（Ｓｅｑｅｎｏｍ）など、メチル化特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅（ＭＳ−ＰＣＲ）、高解像度融解（ＨＲＭ）、ＤＮＡメチル化感受性制限酵素およびバイサルファイトシークエンシングを含む、パブリックドメインにおいて十分に報告されている、承認され利用可能ないくつかの方法を使用して、ＳＴＡＰ１および他の差異的にメチル化される部位のＤＮＡメチル化を測定できることに留意しなければならない。
【００７９】
［本発明の適用］
本発明の適用は、一般に、ＨＣＣおよびがんの分子診断の分野にある。いかなる当業者も、他のがんのための同様のバイオマーカーを得るために本発明を使用することができる。さらに、実施形態９にリストされる標的を使用して、これらの遺伝子およびこれらの遺伝子由来の経路により、末梢免疫系に焦点を定める新しい薬物が導かれうる。がんにおけるＤＮＡメチル化研究における焦点は、これまでのところ、腫瘍、腫瘍微小環境（８、９）および循環腫瘍ＤＮＡ（５、６）に定められており、この点において大きな進歩がなされた。しかし、システムワイドな疾患の機序について知らせる、および／またはがんの非侵襲性予測因子としての役目を果たしうる、宿主系におけるＤＮＡメチル化の変化があるかどうかの疑問が残る。ＨＣＣは、既存の慢性肝炎および肝硬変から進行することが多い（２）ので、きわめて興味深い例であり、この疑問に対処するための扱いやすい臨床的なパラダイムを提供しうる。本発明は、宿主免疫系の質が、がんの臨床的な発生および軌跡を定めうることを明らかにする。
【００８０】
重要なことに、本発明は、本発明の実施形態に例示しているように、慢性肝炎からＨＣＣへの早期の移行を診断するために使用することができる、ＨＣＣのステージ１と慢性Ｂ型およびＣ型肝炎との間の鮮明な境界を示す。本発明は、がんのステージを互いと分別するために本発明をどのように使用することができるかも明らかにする。すべてのアッセイは、階層的クラスタリング、ＲＯＣまたは罰則付き回帰を使用してモデルをトレーニングするために、本発明に開示されるＣＧ−ＩＤについてのメチル化値を有する一組の既知の試料を必要とすることになり、次いで、それらのモデルを使用して、本発明の実施形態に例示しているように未知の試料を解析することになる。
【００８１】
本発明が異なる従属請求項に言及しているという事実は、がんを予測するためにこれらの請求項の組合せを使用できないことを意味するものではない。がん、がんのステージおよび慢性肝炎の測定および統計的解析ならびに予測のためにここに開示される例は、限定するものとみなされるべきではない。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ８５０Ｋアレイ、キャプチャーアレイシークエンシング、次世代シークエンシング、メチル化特異的ＰＣＲ、ｅｐｉｔｙｐｅｒ、制限酵素に基づく解析、およびパブリックドメインにおいて見出される他の方法のように、がん患者においてＤＮＡメチル化を測定するための他の様々な変更形態が当業者には明らかであろう。同様に、患者の試料におけるがんの予測のために本発明を使用するためにここにリストされるものに加えて、パブリックドメインに多数の統計的方法がある。
【００８２】
参考文献
【表１１Ａ】
2019518480.tif 000017
【表１１Ｂ】
2019518480.tif 000018
【表１１Ｃ】
2019518480.tif 000019
【表１１Ｄ】
2019518480.tif 000020
【表１１Ｅ】
2019518480.tif 000021
【表１１Ｆ】
2019518480.tif 000022
【図１】
2019518480.tif 000028
【図２】
2019518480.tif 000029
【図３Ａ】
2019518480.tif 000030
【図３Ｂ】
2019518480.tif 000031
【図４】
2019518480.tif 000032
【図５】
2019518480.tif 000033
【図６】
2019518480.tif 000034
【図７】
2019518480.tif 000035
【図８】
2019518480.tif 000036
【図９】
2019518480.tif 000037
【図１０Ａ】
2019518480.tif 000038
【図１０Ｂ】
2019518480.tif 000039
【図１０Ｃ】
2019518480.tif 000040
【図１１】
2019518480.tif 000041
【図１２】
2019518480.tif 000042
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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