(57)【要約】本開示は、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＳＬＡＭ）ポリペプチドを用いて、細菌細胞のサイトゾルから細胞外表面へ標的タンパク質（例えば、表面リポタンパク質）を運び出すための方法に関する。細菌感染性疾患の予防において有用なワクチンを調製する方法における、ＳＬＡＭポリペプチドの使用も教示される。2019504636.tif 000003
2019504636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質を含む宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法であって、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）前記宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）前記宿主細胞に前記キメラポリヌクレオチドを導入し及び前記宿主細胞を増殖させて、前記ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ、それによって前記宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への前記標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、前記方法。
【請求項２】
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）前記宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第一のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）前記宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む第二のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）前記宿主細胞に前記第一及び第二のキメラポリヌクレオチドを導入し及び前記宿主細胞を増殖させて、前記ＳＬＡＭポリペプチド及び前記標的タンパク質を産生させ、サイトゾルから細胞外表面への前記標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が病原性細菌細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する細菌細胞より選択される細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞が、以下の種に属する細菌細胞より選択される、請求項５に記載の方法：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、クレブシエラ・デニトリフィカンス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）。
【請求項７】
前記ＳＬＡＭポリペプチドが、前記宿主細胞に天然には存在しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的タンパク質が、前記宿主細胞に天然に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的タンパク質が、前記宿主細胞に天然には存在せず、かつ前記キメラポリヌクレオチドが、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的タンパク質が、前記ＳＬＡＭポリペプチドに非共有結合により結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的タンパク質が、前記ＳＬＡＭポリペプチドに共有結合により連結している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的タンパク質が、宿主生物において免疫応答を誘発し得る免疫原である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的タンパク質が、病原性微生物の外表面に天然に呈示される免疫原性ポリペプチドまたはその免疫原性部分である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫原が表面リポタンパク質（ＳＬＰ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記表面リポタンパク質（ＳＬＰ）が、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つ、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８より選択される配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面リポタンパク質（ＳＬＰ）が、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）、ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、及びラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）が、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４、及び配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８のうちの１つより選択される配列を含み；前記ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）が、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１０のうちの１つより選択される配列を含み；前記Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）が、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３６のうちの１つより選択される配列を含み；ならびに前記ラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）が、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７０、または配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４６のうちの１つより選択される配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＬＡＭポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、本明細書に記載されている、配列番号が奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９３のうちの１つより選択される配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的タンパク質が、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１００；配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８のうちの１つ；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８より選択される配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、ワクチン製剤を調製するために用いられる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）免疫原を産生し得る宿主細胞を選択すること、
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）前記宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び前記宿主細胞を増殖させて、前記ＳＬＡＭポリペプチド及び前記免疫原を産生させること、
（ｄ）前記宿主細胞を弱毒化して、弱毒化した宿主細胞を調製すること、ならびに
（ｅ）前記弱毒化した宿主細胞を用いてワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法。
【請求項２２】
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）前記宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第一のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）前記宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）免疫原をコードするポリヌクレオチド
を含む第二のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）前記宿主細胞に前記第一及び第二のキメラポリヌクレオチドを導入し及び前記宿主細胞を増殖させて、前記ＳＬＡＭポリペプチド及び前記免疫原を産生させること
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫原が、病原性微生物の外表面に天然に呈示される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫原が表面リポタンパク質（ＳＬＰ）である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記表面リポタンパク質（ＳＬＰ）が、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つより選択される配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記表面リポタンパク質が、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）、ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、及びラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）が、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４、及び配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８のうちの１つより選択される配列を含み；前記ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）が、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１０のうちの１つより選択される配列を含み；前記Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）が、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３６のうちの１つより選択される配列を含み；ならびに前記ラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）が、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７０、または配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４６のうちの１つより選択される配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＳＬＡＭポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、本明細書に記載されている、配列番号が奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９３のうちの１つより選択される配列を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
標的タンパク質が、前記ＳＬＡＭポリペプチドに非共有結合により結合する、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
標的タンパク質が、前記ＳＬＡＭポリペプチドに共有結合により連結している、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法に従って獲得された宿主細胞を用いて作製された、ワクチン調製物。
【請求項３２】
宿主生物を免疫化するための、請求項３１に記載の作製されたワクチン調製物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２９３，４９１号の利益を主張するものである。米国仮特許出願６２／２９３，４９１の全内容は、参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒポリペプチド、つまりＳＬＡＭポリペプチドとして知られるポリペプチドのクラス、及びＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらの基質である表面リポタンパク質（ＳＬＰ）に関する。ＳＬＡＭポリペプチドは、グラム陰性細菌種から得ることができる。ＳＬＡＭポリペプチド及びポリヌクレオチドは、病原性細菌種（例えばナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する細菌種を含む）によって引き起こされる感染性疾患の予防及び治療において有用である。
【背景技術】
【０００３】
本開示の背景
以下の段落は、本開示の特許請求される主題に従うより詳細な説明に読者を導くこと、及びそれを規定しないまたは限定しないことを意図している。
【０００４】
ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する細菌種を含めた病原性細菌種は、大流行性疾患の原因因子である。ゆえに、例えば髄膜炎は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）によって引き起こされ、淋病は淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）によって引き起こされる。世界保健機関（ＷＨＯ）は、いわゆる「髄膜炎ベルト」であるサハラ砂漠以南のアフリカ内の１４ヶ国で２００９年に８８，０００件を超える髄膜炎の疑いがある症例を報告し、そのうちの５，３００件を上回る数が死に至った（ＷＨＯファクトシート第１４１号、２０１２年１１月（非特許文献1））。散発性髄膜炎の大発生は、同じように、北アメリカを含む各地で生じる。淋病は、世界中で１億人を超える人々に影響を及ぼすことが見積もられており、８２０，０００件の新たな症例が米国のみで年間ベースで報告されている。アンピシリン、テトラサイクリン、及びキノロンなどの抗生物質は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）感染症に対する治療選択肢を与えるものの、これらの抗生物質に対する耐性がますます重大な懸念事項である。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）感染症に対する防御を与えるワクチンが開発されているが、しかしながら、血清型に応じてワクチンの効力は変動するため、付加的なワクチンに対する継続的な必要性が存在する。ゆえに、例えば髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂに対する４成分ワクチンである４ＣＭｅｎＢとして知られるワクチンの効力はまだ確立されておらず、カナダにおける小児科での使用は、侵襲的な髄膜炎菌性疾患の危険性が最も高い個体に対してのみ推奨されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＪＬ，Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ，２０１４  １９（２）：９１−９４（非特許文献2））。淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に対して使用可能なワクチンは依然としてない。
【０００５】
それゆえ、病原性ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種及び他の病原性細菌種によって引き起こされる感染症に対するさらなる治療及び予防の選択肢を開発する必要性が当技術分野において存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＷＨＯファクトシート第１４１号、２０１２年１１月
【非特許文献２】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＪＬ，Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ，２０１４  １９（２）：９１−９４
【発明の概要】
【０００７】
本開示の概要
一態様において、本開示は、Ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＳＬＡＭ）ポリペプチドとして知られるポリペプチドのクラスに関する。
【０００８】
別の態様において、本開示は、病原性または非病原性の細菌細胞を含めた宿主細胞におけるＳＬＡＭポリペプチドの産生に関する。
【０００９】
別の態様において、本開示は、細胞のサイトゾルから細胞外表面領域への、細胞内の特定の標的タンパク質の輸送に関する。
【００１０】
したがって、一態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、標的タンパク質を含む宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法を提供し、当該方法は、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ、それによって宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む。
【００１１】
一部の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。
【００１２】
一部の実施形態において、宿主細胞は病原性細菌細胞である。
【００１３】
一部の実施形態において、宿主細胞は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マンヘミア属（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する細菌細胞より選択される細胞である。
【００１４】
一部の実施形態において、宿主細胞は、以下の種に属する細菌細胞より選択される：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、クレブシエラ・デニトリフィカンス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）。
【００１５】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドは、宿主細胞に天然には存在しない。
【００１６】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、宿主細胞に天然に存在する。
【００１７】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、宿主細胞に天然には存在しない。
【００１８】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、ＳＬＡＭポリペプチドに非共有結合により結合する。
【００１９】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、ＳＬＡＭポリペプチドに共有結合により連結している。
【００２０】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、宿主生物において免疫応答を誘発し得る免疫原である。
【００２１】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、病原性微生物の外表面に天然に呈示される免疫原性ポリペプチドまたはその免疫原性部分である。
【００２２】
一部の実施形態において、標的タンパク質は表面リポタンパク質（ＳＬＰ）である。
【００２３】
一部の実施形態において、表面リポタンパク質（ＳＬＰ）は、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１００；配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８より選択される配列を含むかまたはそれからなる。
【００２４】
一部の実施形態において、表面リポタンパク質は、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）、ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、及びラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）より選択される。
【００２５】
一部の実施形態において、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４、及び配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８のうちの１つより選択される配列を含むかまたはそれからなり；ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１０のうちの１つより選択される配列を含むかまたはそれからなり；Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）は、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３６のうちの１つより選択される配列を含むかまたはそれからなり；ならびにラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７０、または配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４６のうちの１つより選択される配列を含むかまたはそれからなる。
【００２６】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている、配列番号が奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９３のうちの１つより選択される配列を含むかまたはそれからなる。
【００２７】
一部の実施形態において、標的タンパク質は、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１００；配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８より選択される配列を含むかまたはそれからなる。
【００２８】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）細胞に天然に存在する標的タンパク質を含む宿主細胞を選択すること、
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ及びサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法を提供する。
【００２９】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ及びサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法を提供する。
【００３０】
別の態様において、本開示は、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第一のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む第二のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞に第一及び第二のキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を産生させ、サイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法を提供する。
【００３１】
別の態様において、本開示は、ＳＬＡＭポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドに関する。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８３を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドを提供する。
【００３２】
一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドはＳＬＡＭポリペプチドをコードし、ＳＬＡＭポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるＳＬＡＭポリペプチドの発現を促すように改変されている。
【００３３】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化されている。
【００３４】
一部の実施形態において、コドン最適化されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１３に明示される配列を含むかまたはそれからなる。
【００３５】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、シグナル配列をさらに含む。
【００３６】
別の態様において、本開示は、新規なポリペプチドに関する。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８４を含むかまたはそれからなるポリペプチドを提供する。
【００３７】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）免疫原を産生し得る宿主細胞を選択すること、
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び免疫原を産生させること、
（ｄ）宿主細胞を弱毒化して、弱毒化した宿主細胞を調製すること、ならびに
（ｅ）弱毒化した宿主細胞を用いてワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
【００３８】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第一のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む第二のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞に第一及び第二のキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を産生させること、ならびに
（ｄ）（ｃ）の細胞を用いてワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
【００３９】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を産生させること、ならびに
（ｃ）（ｂ）の細胞を用いてワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
【００４０】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードする核酸配列を含む病原性細菌株を提供すること、
（ｂ）病原性株におけるＳＬＡＭ産生を欠如させて、ＳＬＡＭを欠如した病原性細菌株を獲得すること、及び
（ｃ）ＳＬＡＭを欠如した病原性株を用いて、ワクチンを製剤化すること
を含む、病原性細菌感染症に対するワクチンを調製する方法を提供する。
【００４１】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、本開示の方法のいずれかに従って作製されたワクチン調製物を提供する。
【００４２】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、宿主生物を免疫化するための、本開示の方法のいずれかに従って作製されたワクチン調製物の使用を提供する。
【００４３】
一部の実施形態において、ワクチン調製物は、細菌性生物によって媒介される感染性疾患に対する防御を提供する。
【００４４】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、病原性細菌種に感染した患者の治療に使用するための化合物候補を同定するためのスクリーニング方法を提供し、当該方法は、
（ａ）試験化合物を提供すること、
（ｂ）機能アッセイにおいて、病原性細菌種におけるＳＬＡＭポリペプチドの機能に対する試験化合物の効果を、対照と比較すること、及び
（ｃ）ＳＬＡＭポリペプチドの天然機能に対して効果を呈する試験化合物を同定すること
を含む。
【００４５】
一部の実施形態において、病原性細菌種はナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する。
【００４６】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、細胞のサイトゾルから細胞外表面へＳＬＡＭポリペプチドによって輸送され得る標的タンパク質を同定するための方法を提供し、当該方法は、
（ａ）（ｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）ポリペプチドをコードするのに十分に長くかつ第一のヌクレオチド配列に天然に付着している第二のヌクレオチド配列
を含む、ゲノムヌクレオチド配列を提供すること、
（ｂ）第二のヌクレオチド配列を評価して、第二のヌクレオチド配列内のポリペプチドコード配列を同定すること、ならびに
（ｃ）ポリペプチドコード配列を用いて、ＳＬＡＭポリペプチドを含む宿主細胞において当該ポリペプチドを発現させて、タンパク質が宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面へ輸送されるかどうかを判定し、それによって当該タンパク質が標的タンパク質であるかどうかを同定すること
を含む。
【００４７】
一部の実施形態において、第一のヌクレオチド配列は、本明細書に記載されている、配列番号が奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９５のうちのいずれか１つより選択される配列を含む。
【００４８】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、本開示の精神及び範囲の内にある様々な変更及び改変が、詳細な説明から当業者に明白になるであろうため、詳細な説明は、本開示の好ましい実施形態を示すと同時に、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本開示は、以下で提供される段落において、その図との関連で記載される。本明細書において提供される図は、例示目的のために提供されるものであり、本開示を限定することを意図されるものではない。
【００５０】
【図１】図１は、ＳＬＡＭの精製のための方法論を概説した略図を示している。ステップ１：５Ｈ３を含有するプラスミドを形質転換された細胞を、所望の光学密度に達するまで３７℃で増殖させる。この時点で、ＩＰＴＧの添加により、発現を誘導する。ステップ２：一晩増殖後、細胞を遠心分離によって収穫する。次いで、リゾチーム及びＤＮＡｓｅの存在下で、細胞を超音波処理によって溶解する。ステップ３：溶解物の膜画分を超遠心分離により単離する。ステップ４：膜ペレットを再懸濁し、膜タンパク質を、５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５、３％Ｅｌｕｇｅｎｔ及びＰＭＳＦ）中に膜から一晩抽出する。ステップ５：抽出液をニッケル−ＮＴＡカラムにロードする。５Ｈ３がカラムから溶出される前に、カラムを漸増量のイミダゾールで洗浄し、すべてのバッファーは０．６＾Ｃ８Ｅ４を含有する。ステップ６：５Ｈ３を含有する濃縮画分を、さらなる精製及び界面活性剤交換のためにゲル濾過カラムにロードする。ステップ７：５Ｈ３を含有する画分をプールし及び濃縮し、当該タンパク質を後続の結晶スクリーニングにおいて用いる。
【図２】図２は、ＳＬＡＭ１の精製及び結晶化の様々な段階の概観を示している。図２Ａ：Ｓ２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。図２Ｂ：ＳＬＡＭ１を含有するピークを、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、さらに濃縮し、及び市販のスクリーニングを用いた結晶化試験に用いた。図２Ｃ：初回の結晶ヒットがＳＬＡＭ１に対して示されている。
【図３】図３は、様々な細菌種における様々なＳＬＡＭポリペプチドホモログの系統樹及び系統発生関係を示している。群１（ライトボックス、上）におけるＳＬＡＭホモログは、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）及びカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）に属し、一方で群２（ミディアムグレー、中間）は、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のパスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）ファミリーとは異なるメンバーを含有する。群３（ダークグリーン、下）は、ナイセリア・シャエガニ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｈａｙｅｇａｎｉｉ）のみを含有する。
【図４】図４は、ＳＬＡＭ２の精製及び結晶化の様々な段階の概観を示している。図４Ａ：精製に用いられた構築物は、Ｎ末端ｐｅｌＢ配列（タンパク質局在化のための）及び６×Ｈｉｓタグ（ＮｉＮＴＡ精製のための）を含有する。図４Ｂ：ＮｉＮＴＡ精製の後に収集された種々の画分は、溶出画分がＳＬＡＭ２を含有することを示している。図４Ｃ：画分のウェスタンブロットは、ＳＬＡＭ２の予想モル重量を有するＨｉｓタグの存在を裏付けている。煮沸された画分及び煮沸されていない画分を試験した。図４Ｄ：ＮｉＮＴＡ精製の後、Ｓ２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、サンプルをさらに精製した。図は、ＳＥＣランから獲得されたプロファイルを示している。ＳＬＡＭ２を含有するピークをさらに濃縮し、市販のスクリーニングを用いた結晶化試験に用いた。図４Ｅ：初回の結晶ヒットがＳＬＡＭ２に対して示されている。
【図５】図５は、ＳＬＡＭ１ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端部分（図５Ａ）、ならびにＳＬＡＭ１及びその一部分を形質転換された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ノックアウト株を用いた表面リポタンパク質のトランスロケーションについての評価において得られた結果、ならびにフローサイトメトリー（図５Ｂ）及びプロテイナーゼＫ消化の結果（図５Ｃ）を示している。
【図６】図６は、ＳＬＰと併せた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＳＬＡＭ１の発現後に得られた結果を示している。トランスロケーションを示した定量的蛍光（ヒストグラム）及びウェスタンブロットが示されている。ＴｂｐＢ（図６Ａ）、ＬｂｐＢ（図６Ｂ）、及びｆＨｂｐ（図６Ｃ）を用いて得られた結果が示されている。ヒストグラムは、ヒトトランスフェリンまたはＳＬＰ特異的抗体のいずれかとのインキュベーション、それに続く二次蛍光分子とのインキュベーションの後に、各サンプルに対して測定された平均蛍光強度を呈示している。
【図７】図７は、ＳＬＡＭを欠如したナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株についての評価において得られた結果を示している。図７Ａは、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定されまたはＳＤＳで溶解され、ニトロセルロース上にスポットされ、及びα−ＴｂｐＢ抗体でプローブされた、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細胞からなる固相結合アッセイを示している。ΔＳＬＡＭ／ｔｎ５は、トランスポゾン挿入により獲得されたＳＬＡＭ欠損細胞の元の株を指す。ΔＳＬＡＭは、ＳＬＡＭオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をカナマイシン耐性カセットで置き換えることによって獲得された髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）におけるＳＬＡＭのノックアウトを記載する。図７Ｂは、Ｎｍ細胞がＳＬＡＭ欠損（ΔＳＬＡＭ）である場合のみの、ＴｂｐＢ、ＬｂｐＢ、及びｆＨｂｐの分解を示したプロテイナーゼＫ消化アッセイを示している。単独で及びＳＬＡＭとともに個々のＳＬＰを発現する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）細胞をプロテイナーゼＫとともにインキュベートし、ウェスタンブロットを用いて、プロテアーゼ消化の有無（＋／−）での３種すべてのＳＬＰレベルのレベルを検出した。フローサイトメトリーを用いて、ΔＳＬＡＭ細胞が、細胞表面にＴｂｐＢ（図７Ｃ）またはｆＨｂｐ（図７Ｄ）を呈示し得ないことを確認した。ＴｂｐＢ及びｆＨｂｐに対する抗体を用いて、表面曝露されたＳＬＰに結合させ、その後にフィコエリスリンに連結されたα−ウサギ二次抗体とのインキュベーションが続いて、蛍光を提供した。各サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒのＦＬ２検出器を用いて測定した。野生型細胞から獲得されたシグナルを、ノックアウト細胞からのシグナルとの比較のために１００％に設定した。エラーバーは、３回の実験からの平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。様々な株を用いた、マウス感染の結果が図７Ｅに示されている。マウスに、１×１０６ＣＦＵの野生型髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｂ１６Ｂ６、ＴｂｐＢのノックアウト（ΔｔｂｐＢ）と合わせたＢ１６Ｂ６、またはｎｍｂ０３１３  Δｓｌａｍのノックアウトと合わせたＢ１６Ｂ６を腹腔内注射により感染させ、感染前４８時間から始まり感染後４８時間まで、１２時間ごとに生存及び疾患症状についてモニターし、ならびに感染後３時間の時点でさらにモニターした。生存の統計的な差を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５）によって査定した（＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．有意でない）。
【図８】図８は、本開示に従って用いられ得る例示的な微生物を含む系統樹を示している。有名な細菌種におけるＳＬＡＭタンパク質の予想数が丸括弧内に示されている。
【図９】図９は、グラム陰性細菌種にわたるＳＬＡＭファミリータンパク質の存在を示している。図９Ａは、２つのドメイン：テトラトリコペプチド反復を含有するペリプラズムＮ末端ドメイン（Ｎｔｄ）、及びＤＵＦ５６０と称される膜結合型１４本鎖バレルドメイン、を有する髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＳＬＡＭ１のドメイン構造を示している。図９Ｂは、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）におけるＳＬＡＭタンパク質の分布を示している。プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）における主要な細菌ファミリーを表す５５の種由来の１６Ｓ−ＲＮＡ配列を用いて、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）の系統樹を作製した。ＳＬＡＭホモログを有する少なくとも１つの種を含有するファミリーは、黒点によって強調されている。ＳＬＡＭホモログは、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のすべてのクレード内に見出された。
【図１０】図１０は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のＳＬＡＭ及びＴｂｐＢペアのトランスロケーションを示している。図１０Ａは、カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）におけるＳＬＡＭ及びＴｂｐＢ遺伝子クラスターを示している。実施されたバイオインフォマティクス分析から、ＳＬＡＭは、両方のヒト病原体における公知のトランスフェリン結合表面リポタンパク質ＴｂｐＢに近接して見出された。図１０Ｂは、本調査において用いられた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トランスロケーションアッセイの概略図を示している。簡潔には、ＳＬＡＭ及びＴｂｐＢ遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｃ４３（ＤＥ３）細胞において発現させた。当該細胞を、ビオチン化ヒトトランスフェリン、及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）に連結されたストレプトアビジンで標識した。ＴｂｐＢの表面呈示を、フローサイトメトリーを用いて定量した。図１０Ｃは、ＳＬＡＭありで（黒色で示されている）またはＳＬＡＭなしで（グレーで示されている）獲得されたカタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）  ＴｂｐＢ（ＭｃＴｂｐＢ）及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）  ＴｂｐＢ（ＨｉＴｂｐＢ）のフローサイトメトリープロファイルを示している。ＳＬＡＭの存在下でより高いシグナルが観察され、ＳＬＰの有効な表面発現のためのＳＬＡＭの依存度を示した。図１０Ｄは、平均蛍光強度を用いた、カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のＴｂｐＢホモログに対する平均蛍光ブロットを示している。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて判定され、＊＊＊はｐ≦０．００１を表す。
【図１１】図１１は、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）におけるＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質の同定を示している。図１１Ａは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）株Ｐｍ７０におけるＳＬＡＭ遺伝子クラスターを示している。本発明者らのバイオインフォマティクス検索において、ＰＭ１５１５（黒色で示されている）がＳＬＡＭホモログとして同定された。ＰＭ１５１４（グレーで示されている）は、仮想タンパク質として注釈を付された。ＰＭ１５１４は、推定リポボックス（ＩＴＡＣ）モチーフで終わるシグナルペプチダーゼＩＩ切断部位を含有する。図１１Ｂは、ＰＭ１５１４がＳＬＡＭ依存的ＳＬＰであるかどうかを調べるトランスロケーションアッセイのために作製されたパスツレラ・マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）遺伝子構築物を示している。簡潔には、ＰＭ１５１４をＣ末端Ｆｌａｇタグを有してクローニングし（ＰＭ１５１４−Ｆｌａｇ）、ＰＭ１５１５をＮ末端Ｈｉｓタグ及びｐｅｌＢシグナル配列を有してクローニングし、ならびにＰＭ１５１５−ＰＭ１５１４−ＦｌａｇをＰＭ１５１５及びＰＭ１５１４領域の両方を有してクローニングした。図１１Ｃは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）構築物のフローサイトメトリープロファイルを示しており、図１１Ｂに詳説される３つすべての構築物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３（ＤＥ３）細胞において発現させ、ならびにα−Ｆｌａｇ抗体、及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）に連結されたマウス二次抗体で標識した。ＰＭ１５１４−Ｆｌａｇ（ライトグレー）、ＰＭ１５１５及びＰＭ１５１４−Ｆｌａｇ（黒）、ならびにＰＭ１５１５−ＰＭ１５１４−Ｆｌａｇ（ダークグレー）のフローサイトメトリープロファイルが示されている。図１１Ｄは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）構築物の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて定量された平均蛍光強度ブロットを示している。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて判定され、＊＊＊はｐ≦０．００１を表す。
【図１２】図１２は、トランスロケーションモチーフがＴｂｐＢ上にある場所についての同定を示している。図１２Ａは、野生型ＴｂｐＢ、野生型ＨｐｕＡ、ＴｂｐＢ  Ｎローブ、ＴｂｐＢ  Ｃローブ、及びＨｐｕＡに融合したＴｂｐＢ  Ｎローブ（Ｎローブ＿ＨｐｕＡ）を含めた、本調査において用いられた髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  ＴｂｐＢ及びＨｐｕＡ構築物を示している。図１２Ｂは、α−ＴｂｐＢ及びウサギＦＩＴＣ抗体で標識した後の、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  ＴｂｐＢ及び髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  ＳＬＡＭ１の全長または個々のローブを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３（ＤＥ３）細胞のフローサイトメトリーによって定量された、ＴｂｐＢのＮ及びＣローブのトランスロケーション効率を示している。図１２Ｃ、１２Ｄ、及び図１２Ｅは、それぞれα−ＴｂｐＢ、α−ＨｐｕＡ、及びビオチン化ヒトトランスフェリンを用いた、Ｎローブ＿ＨｐｕＡのトランスロケーション効率を示している。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面へのＮローブ＿ＨｐｕＡのトランスロケーションを強化するＳＬＡＭ１及びＳＬＡＭ２の能力を、フローサイトメトリーを用いて試験した。α−ＴｂｐＢ及びビオチン化ヒトトランスフェリンを用いてＴｂｐＢ  Ｎローブを検出し、一方でα−ＨｐｕＡを用いてＨｐｕＡを検出した。平均蛍光強度ブロットが示されており、ＴｂｐＢ  ＣローブをＨｐｕＡと入れ替えることは、構築物の特異性をＳＬＡＭ１からＳＬＡＭ２へ入れ替えることを強調している。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて判定され、＊＊＊はｐ≦０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１を表し、及びｎ．ｓ．は有意でないことを表す。
【図１３−１】図１３は、ＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質のＣ末端鎖の２本は保存され、表面呈示に必要であることを示している。図１３Ａは、ＳＬＡＭ依存的ＳＬＰに見出されたタンパク質ドメインの一般的構造を示している。このタンパク質のファミリーは、柔軟性のあるハンドルドメイン及び８本鎖バレルドメインを含有する。バレルドメインは、すべての推定ＳＬＡＭ依存的ＳＬＰの間で保存されている。図１３Ｂは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  ＴｂｐＢからのバレルドメインの概略を示しており、鎖は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｂ１６Ｂ６（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＱＱ１）由来のＴｂｐＢの構造に従って番号付けされている。ポリアラニン変異によって変異した鎖は、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ３０、及びＢ３１で表される。図１３Ｃ及び図１３Ｄは、ＴｂｐＢ野生型のみ、ＳＬＡＭ１及びＴｂｐＢ野生型、またはＳＬＡＭ１及び４本の異なるβバレル鎖にポリアラニン変異を含有するＴｂｐＢ変異体のうちの１つを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３（ＤＥ３）細胞のトランスロケーション効率を示している。細胞をα−ＴｂｐＢ及びビオチン化ヒトトランスフェリンで標識し、平均蛍光強度ブロットにより、ＴｂｐＢ  Ｃローブバレルの最後の２本の鎖における変異は、ＴｂｐＢの表面呈示を妨げることが判定された。α−ＴｂｐＢ及びα−Ｈｉｓを用いたウェスタンブロット分析を行って、それぞれＴｂｐＢ  Ｃローブ変異体及びＳＬＡＭ１の発現を確認した。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて判定され、＊＊＊はｐ≦０．００１を表し、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１を表し、及びｎ．ｓ．は有意でないことを表す。
【図１３−２】図１３Ｅは、グレーで強調された保存された残基を有するＳＬＡＭ依存的ＳＬＰのＣ末端βバレルの最後の２本の鎖についての多重配列アライメントを示している。図１３Ｆは、ＴｂｐＢのＣローブ構造における最後の２本のβバレル鎖上の保存された残基の重ね合わせを示している。２本の鎖は、互いに向き合うバレルドメインの内側の残基と互いに向き合うことが示されており、一方でバレルの外側の残基は、互いから離れている。保存された残基は、バレルドメインの中心で一緒にクラスター形成する。
【図１４】図１４は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）におけるＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質の同定を示している。図１４Ａは、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）株ＬＡＣ４におけるＳＬＡＭ遺伝子クラスターを示している。バイオインフォマティクス検索において、ＡｂＳＬＡＭ（グレーで示されている）がＳＬＡＭホモログとして同定された。ＡｂＳＬＰ（黒色で示されている）は、仮想タンパク質として注釈を付された。図１４Ｂは、ＡｂＳＬＰがＳｌａｍ依存的ＳＬＰであるかどうかを調べるトランスロケーションアッセイのために作製されたアシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）遺伝子構築物を示している。簡潔には、ＡｂＳＬＰをＣ末端Ｆｌａｇタグを有してクローニングし（ＡｂＳＬＰ−Ｆｌａｇ）、ＡｂＳＬＡＭをＮ末端Ｈｉｓタグ及びｐｅｌＢシグナル配列を有してクローニングした。図１４Ｂ（右）は、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）構築物のフローサイトメトリープロファイルを示しており、詳説される両構築物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３（ＤＥ３）細胞において発現させ、α−Ｆｌａｇ抗体、及びＲ−フィコエリスリン（ＰＥ）に連結されたマウス二次抗体で標識した。図１４Ｃは、形成されたＡｂＳＬＰ結晶（左）、及びＡｂＳＬＰの同定された結晶構造のマンガ図を示している。図１４Ｄは、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）におけるＰＫシェービングアッセイを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本開示の詳細な説明
それぞれの請求される主題の実施形態の例を提供するために、様々な組成物及び方法が下で記載される。下で記載される実施形態は、いかなる請求される主題をも限定せず、任意の請求される主題は、下で記載されるものとは異なる方法、工程、組成物、またはシステムを網羅し得る。請求される主題は、下で記載されるいずれか１つの組成物、方法、システム、もしくは工程の特徴のすべてを有する組成物もしくは方法に、または下で記載される組成物、システム、もしくは方法の複数もしくはすべてに共通した特徴に限定されるわけではない。下で記載される組成物、システム、方法、または工程は、いかなる請求される主題の実施形態でもない可能性がある。本文書において請求されない、下で記載される組成物、システム、方法、または工程において開示される任意の主題は、別の保護的法律文書の主題であり得る。例えば、継続特許出願、及び出願人、発明者、または所有者は、本文書におけるその開示によって任意のそのような主題を棄却する、放棄する、または公に捧げることを意図するわけではない。すべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物であるかと同程度に、参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【００５２】
用語及び定義
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的及び科学的な用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有するものとする。以下の用語は、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００５３】
「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ」、「ＳＬＡＭ」、「ＳＬＡＭタンパク質」、及び「ＳＬＡＭポリペプチド」という本明細書において互換可能に用いられる用語は、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９４及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８４のうちのいずれか１つに明示されるもの、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意のＳＬＡＭタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意のＳＬＡＭタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、または少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意のＳＬＡＭタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものを含めた、ありとあらゆるＳＬＡＭタンパク質を指す。当該用語は、任意のＳＬＡＭ前駆体ポリペプチドをさらに含む。
【００５４】
「表面リポタンパク質」という用語は、、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１００、及び配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８に明示されるもの、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、または少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものを含めた、ありとあらゆる表面リポタンパク質を指す。表面リポタンパク質という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７４に明示される表面リポタンパク質ボックス配列モチーフを含むポリペプチド、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ボックス配列モチーフを構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ボックス配列モチーフをコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ボックス配列モチーフをコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものをさらに指し得る。
【００５５】
「トランスフェリン結合タンパク質Ｂ」、「ＴｂｐＢタンパク質」、「ＴｂｐＢポリペプチド」、及び「ＴｂｐＢ」という本明細書において互換可能に用いられる用語は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４、及び配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８のうちの１つより選択される配列に明示されるもの、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意のＴｂｐＢタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意のＴｂｐＢタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、または少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意のＴｂｐＢタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものを含めた、ありとあらゆるＴｂｐＢタンパク質を指す。
【００５６】
「ラクトフェリン結合タンパク質」、「ＬｂｐＢタンパク質」、「ＬｂｐＢポリペプチド」、及び「ＬｂｐＢ」という本明細書において互換可能に用いられる用語は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７０、または配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３８〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４６のうちの１つより選択される配列に明示されるもの、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意のＬｂｐＢタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意のＬｂｐＢタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、または少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意のＬｂｐＢタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものを含めた、ありとあらゆるＬｂｐＢタンパク質を指す。
【００５７】
「Ｈ因子結合タンパク質」、「ｆＨｂｐタンパク質」、「ｆＨｂｐポリペプチド」、及び「ｆＨｂｐ」という本明細書において互換可能に用いられる用語は、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３６のうちの１つより選択されるそうした配列、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意のｆＨｂｐタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意のｆＨｂｐタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、または少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意のｆＨｂｐタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものを含めた、ありとあらゆるｆＨｂｐタンパク質を指す。
【００５８】
「ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ」、「ＨｐｕＡタンパク質」、「ＨｐｕＡポリペプチド」、及び「ＨｐｕＡ」という本明細書において互換可能に用いられる用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３２、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１０に明示されるもの、ならびに（ｉ）本明細書に記載されている任意のＨｐｕＡタンパク質を構成するアミノ酸配列と実質的に同一である；（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている任意のＨｐｕＡタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る、または少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、本明細書に記載されている任意のＨｐｕＡタンパク質をコードする任意の核酸配列にハイブリダイズし得る核酸配列によってコードされる、アミノ酸残基の配列を含むものを含めた、ありとあらゆるＳＬＡＭタンパク質を指す。
【００５９】
「Ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒをコードするポリヌクレオチド」；「ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」；及びＳＬＡＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドという本明細書において互換可能に用いられる用語は、任意のＳＬＡＭポリペプチドを含めたＳＬＡＭポリペプチドをコードするありとあらゆるポリヌクレオチド、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に明示されるポリヌクレオチドを含めた、ＳＬＡＭ前駆体をコードする任意の核酸配列を指す。本明細書において使用するとき、「ＳＬＡＭ前駆体」とは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他のグラム陰性細菌種の細胞質膜を横断してポリペプチド鎖の運び出しを促すＮ末端シグナル配列をさらに含むＳＬＡＭ分子を指す。ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、（ｉ）本明細書に記載されているＳＬＡＭポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチドをコードする；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されている任意のＳＬＡＭポリヌクレオチドにハイブリダイズする、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、それにハイブリダイズするであろう、ありとあらゆるポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００６０】
「表面リポタンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９５〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８１、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７７を含む奇数の配列番号にて規定されるポリヌクレオチドを含む、表面リポタンパク質（任意の表面リポタンパク質を含む）をコードするありとあらゆるポリヌクレオチドを指す。表面リポタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（ｉ）本明細書に記載されている表面リポタンパク質配列と実質的に同一であるタンパク質をコードする；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、それにハイブリダイズするであろう、ありとあらゆるポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００６１】
本明細書において互換可能に用いられ得る「ＴｂｐＢをコードするポリヌクレオチド」、「ＴｂｐＢタンパク質をコードするポリヌクレオチド」、及び「ＴｂｐＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４７に明示されるポリヌクレオチドを含めた、任意のＴｂｐＢタンパク質を含めたＴｂｐＢタンパク質をコードするありとあらゆるポリヌクレオチドを指す。表面リポタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（ｉ）本明細書に記載されている表面リポタンパク質配列と実質的に同一であるタンパク質をコードする；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、それにハイブリダイズするであろう、ありとあらゆるポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００６２】
本明細書において互換可能に用いられ得る「ＬｂｐＢをコードするポリヌクレオチド」、「ＬｂｐＢタンパク質をコードするポリヌクレオチド」、及び「ＬｂｐＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６９に明示されるポリヌクレオチドを含めた、任意のＬｂｐＢタンパク質を含めたＬｂｐＢタンパク質をコードするありとあらゆるポリヌクレオチドを指す。表面リポタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（ｉ）本明細書に記載されている表面リポタンパク質配列と実質的に同一であるタンパク質をコードする；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、それにハイブリダイズするであろう、ありとあらゆるポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００６３】
本明細書において互換可能に用いられ得る「ｆＨｂｐをコードするポリヌクレオチド」、「ｆＨｂｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド」、及び「ｆＨｂｐポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１５に明示されるポリヌクレオチドを含めた、任意のｆＨｂｐタンパク質を含めたｆＨｂｐタンパク質をコードするありとあらゆるポリヌクレオチドを指す。表面リポタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（ｉ）本明細書に記載されている表面リポタンパク質配列と実質的に同一であるタンパク質をコードする；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、それにハイブリダイズするであろう、ありとあらゆるポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００６４】
本明細書において互換可能に用いられ得る「ＨｐｕＡをコードするポリヌクレオチド」、「ＨｐｕＡタンパク質をコードするポリヌクレオチド」、及び「ＨｐｕＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３１に明示されるポリヌクレオチドを含めた、任意のＨｐｕＡタンパク質を含めたＨｐｕＡタンパク質をコードするありとあらゆるポリヌクレオチドを指す。表面リポタンパク質をコードするポリヌクレオチドには、（ｉ）本明細書に記載されている表面リポタンパク質配列と実質的に同一であるタンパク質をコードする；または（ｉｉ）少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載されている任意の表面リポタンパク質ポリヌクレオチドにハイブリダイズする、もしくは少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、ただし同義コドンの使用に対して、それにハイブリダイズするであろう、ありとあらゆるポリヌクレオチドがさらに含まれる。
【００６５】
「実質的に同一の」という用語によって、２つのポリペプチド配列が、好ましくは少なくとも５０％同一である、及びより好ましくは少なくとも８５％同一である、及び最も好ましくは少なくとも９５％同一である、例えば９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることが意味される。２つのポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージを判定するために、そのような２つの配列のアミノ酸配列を、当該２つの配列間で最高位の一致が獲得され、当該２つの配列間で同一アミノ酸の数が判定されるように、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦａＭＳＷ．１９８１．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９）によって修正された、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアライメント法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＳＢ，Ｗｕｎｓｃｈ  ＣＤ．１９７０．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：４４３−４５３）を用いて並べる。好ましい、広く適用可能な、２つのポリペプチドを精確に並べるための方法は、１０のギャップオープンペナルティ及び０．１のギャップ伸長ペナルティを用いた、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ，Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＪＧ．１９９２．Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９：１０９１５−１０９１９）とともに採用される、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＤ，Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＪ．１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０．）を伴う。これは、２つの配列のうちの一方の全長の少なくとも５０％がアライメントに関与する、２つの配列間の高いスコアアライメントの同定を可能にする。並べられた２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージを算出する方法は、一般的に当技術分野において認められており、例えばＣａｒｉｌｌｏ及びＬｉｐｔｏｎによって記載されたもの（Ｃａｒｒｉｌｌｏ  Ｈ，ａｎｄ  Ｄ．Ｌｉｐｍａｎ．１９８９．Ｔｈｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｂｌｅｍ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＳＩＡＭ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ４８：１０７３−１０８２）、及びＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，ｅ．ｄ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８��Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓに記載されたものを含む。一般的に、そのような算出のために、コンピュータープログラムが採用される。これに関して用いられ得るコンピュータープログラムには、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ，Ｈａｅｂｅｒｌｉ  Ｐ，Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ．１９８４．Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＶＡＸ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７−３９５）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｇｉｓｈ  Ｗ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．１９９０．Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１５：４０３−４１０）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６６】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、溶液中での２つの相補的な核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることが意味される。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子のすべてまたは一部分に対して生じ得る。ハイブリダイズする部分は、典型的に長さが少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０、または５０）ヌクレオチドである。当業者であれば、核酸二重鎖、つまり混成物の安定性は、ナトリウム含有バッファー中でのナトリウムイオン濃度及び温度の関数であるＴｍによって判定される（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または同様の方程式）ことを認識するであろう。したがって、混成物安定性を判定する洗浄条件におけるパラメーターは、ナトリウムイオン濃度及び温度である。公知の核酸分子と類似しているが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチは、Ｔｍの約１℃減少をもたらすと推測され得、例えば核酸分子が＞９５％の同一性を有することを求められる場合、最終洗浄温度は約５℃低下するであろう。これらの検討事項に基づき、当業者であれば、適当なハイブリダイゼーション条件を容易に選択し得るであろう。好ましい実施形態において、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件を採用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成し得る：Ｔｍ（上記の方程式に基づく）−５℃で、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、それに続く６０℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃で３×ＳＳＣにおける洗浄ステップが含まれる。しかしながら、代替的なバッファー、塩、及び温度を用いて、同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関する付加的なガイダンスは、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２（３２）に見出され得る。
【００６７】
ポリヌクレオチドの文脈で本明細書において用いられる「キメラ」という用語は、天然には連結していない少なくとも２種の連結したポリヌクレオチドを指す。キメラ核酸ポリヌクレオチドには、異なる天然起源の連結したポリヌクレオチドが含まれる。例えば、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結した、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌プロモーターを構成するポリヌクレオチドは、キメラと見なされる。加えて、キメラポリヌクレオチドは、同じ天然起源を有し得るが、天然には連結していない。さらには、天然に存在しないポリヌクレオチドベクターはキメラである。例えば、特定の細胞タイプから獲得されるプロモーターを構成するポリヌクレオチドは、その同じ細胞タイプから獲得されるポリペプチドをコードするが、当該プロモーターを構成するポリヌクレオチドに通常では連結していないポリヌクレオチドに連結され得る。キメラポリヌクレオチドには、任意の天然に存在しないポリヌクレオチドに連結した任意の天然に存在するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも含まれる。
【００６８】
本明細書において用いられる「サイトゾル」という用語は、細胞、例えば細菌細胞の内部、一般的には水性部分を指し、サイトゾル内に存在し得るすべての細胞成分を含むが、細胞の細胞外表面を特異的に排除する。
【００６９】
本明細書において用いられる「細胞外表面」という用語は、細胞のサイトゾル部分をその外因的環境から分離する、細胞の細胞表面構造を指すことを意図される。細胞表面構造は、タンパク質を有する１つもしくは複数のリン脂質膜及び／またはその中に埋め込まれたリポ多糖を含み得る。
【００７０】
本明細書において用いられる「宿主生物」という用語は、限定することなく、ウシ、ブタ、ウマ、ネズミ、イヌ、ネコ、サカナ、ヒツジ、ヤギ、サル、及びトリ動物を含めた、ヒト及び非ヒト脊椎動物を指す。
【００７１】
本明細書において互換可能に用いられる「免疫原」及び「免疫原性組成物」という用語は、それらの最も広い意味において用いられて、宿主生物において免疫応答を刺激して、細胞性免疫原特異的免疫応答または液性抗体応答を生み出すであろう１種または複数種のエピトープを含有する分子を指す。免疫原には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及び免疫原性タンパク質フラグメントが含まれる。
【００７２】
本明細書において互換可能に用いられる「ワクチン」及び「ワクチン組成物」という用語は、免疫原を含有する任意の薬学的組成物を指し、その組成物を用いて、宿主生物における疾患または病状を予防し得るまたは治療し得る。ゆえに、当該用語は、サブユニットワクチン、すなわち免疫原が天然に結び付いている生物全体から分離し及び離散している免疫原を含有するワクチン組成物を包含し、ならびに生ワクチンをさらに含む。
【００７３】
留意すべきは、本明細書において用いられる「実質的に」、「本質的に」、「約」、及び「およそ」などの程度の用語は、最終結果が有意に変化しないような、修飾された用語の妥当な量の偏差を意味することである。これらの程度の用語は、この偏差がそれが修飾する用語の意味を否定しない場合、修飾された用語の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００７４】
本明細書において使用するとき、「及び／または」という文言は、包含的またはを表すことを意図される。つまり、「Ｘ及び／またはＹ」とは、例えば、ＸもしくはＹ、またはその両方を意味することを意図される。さらなる例として、「Ｘ、Ｙ、及び／またはＺ」とは、ＸもしくはＹもしくはＺ、またはそれらの任意の組み合わせを意味することを意図される。
【００７５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、内容に別様にはっきりと述べられていない限り、複数形の指示対象を含む。ゆえに、例えば、「免疫原（ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）」への言及は、２以上のそのような作用物質の混合物を含み、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２以上のポリペプチドの混合物への言及を含み、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２以上のそのような細胞を含む、等。
【００７６】
全般的な実施態様
上述のように、本開示は、グラム陰性細菌種から得ることができるまたは獲得されるポリペプチド及びポリヌクレオチド、とりわけＳｕｒｆａｃｅ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒまたはＳＬＡＭタンパク質として知られるタンパク質のクラスに属するポリペプチドに関する。
【００７７】
本開示のＳＬＡＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるＳＬＡＭタンパク質の発現及び産生に用いられ得る。宿主細胞におけるＳＬＡＭタンパク質のそのような発現は、驚くべきことに、宿主細胞のサイトゾル部分から宿主細胞の細胞外表面への、宿主細胞に存在している本明細書において標的タンパク質と称される別のタンパク質のトランスロケーションをもたらし得る。
【００７８】
さらには、ＳＬＡＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、病原性細菌種、例えばナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する細菌種による感染症の予防に有用なワクチン製剤を調製し得る。
【００７９】
さらには、ＳＬＡＭタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びＳＬＡＭタンパク質をアッセイにおいて用いて、病原性細菌種に感染した患者の治療において有用な化学的化合物を同定し得る。
【００８０】
したがって、一態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、標的タンパク質を含む宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法を提供し、当該方法は、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ、それによって宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む。
【００８１】
本明細書に従ったＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特に任意のグラム陰性細菌種を含めた、プロテオバクテリア門に属する任意の細菌種を含めた、ならびにアルファプロテオバクテリア綱（ａｌｐｈａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベータプロテオバクテリア綱（ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びデルタプロテオバクテリア綱（ｄｅｌｔａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する任意の細菌種をさらに含めた、ＳＬＡＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む任意の細菌の種または株から獲得され得る。
【００８２】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、アルファプロテオバクテリア綱（ａｌｐｈａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）におけるファミリー、例えばスフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）、及びロドバクター科（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）のファミリーに属する細菌種から獲得され得る。これらのファミリーのそれぞれの中の例示的な細菌の属及び種は、図８及び図９に提供される種のすべてである。
【００８３】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベータプロテオバクテリア綱（ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）におけるファミリー、例えばナイセリア科（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）、バークホルデリア目（Ｂｕｒｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）、及びロドシクルス科（Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ）のファミリーに属する細菌種から獲得され得る。これらのファミリーのそれぞれの中の例示的な細菌の属及び種は、図８及び図９に提供される種のすべてである。
【００８４】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）におけるファミリー、例えばパスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）、シュードモナス目（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｄａｌｅｓ）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、キサントモナス科（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、カルジオバクテリウム科（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、及びメチロファーガ属（ｍｅｔｈｙｌｏｐｈａｇａ）のファミリーに属する細菌種から獲得され得る。これらのファミリーのそれぞれの中の例示的な細菌の属及び種は、図８及び図９に提供される種のすべてである。
【００８５】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、デルタプロテオバクテリア綱（ｄｅｌｔａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）におけるファミリー、例えばデスルホビブリオ科（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）のファミリーに属する細菌種から獲得され得る。このファミリーの中の例示的な細菌の属及び種は、図８及び図９に提供される。
【００８６】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下の種に属する細菌種から獲得され得る：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、クレブシエラ・デニトリフィカンス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。
【００８７】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１から始まりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９３で終わり及びそれを含む、本明細書に記載されている配列番号が奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか１つを含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドである。
【００８８】
一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２から始まりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９４で終わりかつそれを含む偶数の配列番号のうちのいずれかを含むかまたはそれからなるポリペプチドである。
【００８９】
本開示の一部の態様に従って、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるＳＬＡＭポリペプチドの発現を制御し得るポリヌクレオチドに連結される。宿主細胞は、動物細胞または植物細胞、または真菌細胞もしくは細菌細胞などの微生物細胞を含めた、任意の真核細胞を含む任意の細胞であり得る。
【００９０】
一部の実施形態において、宿主細胞は細菌細胞である。
【００９１】
一部の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。
【００９２】
一部の実施形態において、宿主細胞は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マンヘミア属（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する細菌細胞より選択される細胞である。
【００９３】
一部の実施形態において、宿主細胞は、以下の種に属する細菌細胞より選択される：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、クレブシエラ・デニトリフィカンス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。
【００９４】
好ましい実施形態において、宿主細胞は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）及び淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）を含めたナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に属する細菌細胞より選択される。
【００９５】
本開示の一態様に従って、宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに連結される。ゆえに、一態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチドに連結された、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。
【００９６】
本明細書において用いられ得る、宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチドには、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を制御し得る任意の転写プロモーターが含まれる。一般的に、微生物細胞から獲得されたプロモーターは、本明細書に従って微生物宿主が選択される場合に用いられ、一方で真核生物プロモーターは、真核生物宿主が選択された場合に選択される、等。宿主細胞における発現を制御し得るさらなるポリヌクレオチド成分には、転写ターミネーター、エンハンサー等が含まれ、そのすべては、本開示のキメラポリヌクレオチドに含まれ得る。
【００９７】
本開示に従って、本開示のキメラポリヌクレオチドは、好ましくは、宿主細胞におけるＳＬＡＭポリペプチドの良好な発現を確保する発現ベクター内に含まれる。したがって、本開示は、一実施形態において、機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む組換え発現ベクターを含み、当該発現ベクターは、宿主細胞における発現に適している。「宿主細胞における発現に適している」という用語は、組換え発現ベクターが、宿主細胞における発現を達成するために必要とされる遺伝子エレメントに連結された、本開示のキメラ核酸配列を含むことを意味する。これに関して発現ベクター内に含まれ得る遺伝子エレメントには、転写終結領域、マーカー遺伝子をコードする１種または複数種の核酸配列、１つまたは複数の複製の起点等が含まれる。遺伝子エレメントは、典型的に、当業者に公知であろうように、コード配列に対して転写の５’から３’方向に、例えばプロモーターに連結することによって機能的に連結される。好ましい実施形態において、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内へのベクターまたはその一部分の組み込みに必要とされる遺伝子エレメントをさらに含む。本開示に従って、発現ベクターは、マーカー遺伝子をさらに含有し得る。本開示に従って用いられ得るマーカー遺伝子には、すべての選択可能な及びスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含めた、形質転換細胞と非形質転換細胞との区別を可能にするすべての遺伝子が含まれる。マーカー遺伝子は、例えばカナマイシンまたはアンピシリンに対する、抗生物質耐性マーカーなどの耐性マーカーであり得る。目視検査を通じて形質転換体を同定するために採用され得るスクリーニング可能なマーカーには、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（米国特許第５，２６８，４６３号及び第５，５９９，６７０号）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｎｉｅｄｚ  ＲＰ，Ｓｕｓｓｍａｎ  ＭＲ，Ｓａｔｔｅｒｌｅｅ  ＪＳ．１９９５．Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ａｎ  ｉｎ−Ｖｉｖｏ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １４：４０３−４０６）、または他のタンパク質タグ、例えば図１１及び図１３に示されるポリ−ヒスチジンタグまたはＦｌａｇタグが含まれる。
【００９８】
本開示の一態様に従って、ＳＬＡＭをコードする天然に存在するポリヌクレオチドを改変し得る。ゆえに、例えばＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をコドン最適化することによって、天然に存在するポリヌクレオチドを改変して、宿主細胞におけるＳＬＡＭポリペプチドの発現を増強し得る。したがって、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１３に明示されるポリヌクレオチドを含めた、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドをさらに提供する。ＳＬＡＭをコードするポリヌクレオチドを、シグナル配列を含むようにさらに改変して、発現を促し得る。シグナル配列をコードする例示的なポリヌクレオチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７９に明示され、対応するポリペプチドシグナル配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８０に明示される。ゆえに、本開示は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８２に明示されるポリヌクレオチド及びポリペプチドを含めた、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された微生物シグナル配列をコードするキメラポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをさらに含む。
【００９９】
特に好都合に用いられ得る１つの宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用ベクターの調製は、制限消化、ライゲーション、ライゲーション非依存的クローニング、ゲル電気泳動、ＤＮＡシーケンシング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び他の方法論など、一般に公知の技法を用いて成し遂げられ得る。本発明者らが開発したカスタムベクターを含めた、組換え発現ベクターを調製するために必要とされる必要なステップを実施するために、多種多様のクローニングベクターが使用可能である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において機能的な複製システムを有するベクターの中には、ｐＵＣまたはｐＥＴシリーズのベクターなどのベクターがある。典型的に、これらのクローニングベクターは、形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含有する。ポリヌクレオチドは、例えば制限及びライゲーション酵素を用いて、これらのベクター内に導入され得、ベクターは、コンピテント細胞を調製すること、エレクトロポレーション、または当業者にとって他の周知の方法論を用いることによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に導入され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ培地などの適当な培地中で増殖し得、及び収穫され得る。細胞を収穫し及び溶解すると、組換え発現ベクターは細胞から容易に回収され得る。さらに、組換えベクターの調製及び組換え生物の増殖に関する一般的なガイダンスは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．に見出され得る。
【０１００】
組換えＳＬＡＭポリペプチドの産生は、細菌株の増殖を通して生じ得る、または、相当なバイオマスを達成する増殖の期間の後、例えばｌａｃＺプロモーターなどの誘導性プロモーターを用いた、発現の誘導によって達成され得る。
【０１０１】
本明細書に従って、一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドは、その後、他の宿主細胞成分から回収され、単離され、及び分離される。ゆえに、本開示は、さらなる実施形態において、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させること、ならびに
（ｃ）宿主細胞からＳＬＡＭポリペプチドを回収すること
を含む、宿主細胞においてＳＬＡＭポリペプチドを発現させる方法を提供する。
【０１０２】
ＳＬＡＭタンパク質の回収は、例えば金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過等を含めた、多様な異なるタンパク質精製技法によってもたらされ得る。タンパク質精製に関するさらなる一般的なガイダンスは、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｊａｎｓｏｎ  Ｊ−Ｃ．２０１３．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．５４．Ｗｉｌｅｙに見出され得る。本明細書において用いられる「回収される」という用語は、ポリペプチドが、程度の差はあるが純粋な形態で獲得されることを意味する。「実質的に純粋な」によって、免疫原性タンパク質が他の宿主細胞成分から分離されることが意味される。本明細書に従って、免疫原性タンパク質は、少なくとも９５％純粋、及びより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。
【０１０３】
別の態様において、本開示は、新規なＳＬＡＭポリペプチドに関する。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８４を含むもしくはそれからなるＳＬＡＭポリペプチド、またはそれと実質的に同一なポリペプチドを提供する。
【０１０４】
別の態様において、本開示は、ＳＬＡＭポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチドに関する。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８３を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチドを提供する。
【０１０５】
宿主細胞に関して、ＳＬＡＭポリペプチドは、その中に天然に存在するＳＬＡＭポリペプチドであり得、ゆえに一部の実施形態において、宿主細胞におけるＳＬＡＭポリペプチドの産生は、細胞内でのＳＬＡＭポリペプチドタンパク質濃度の変化をもたらし得、例えば、細胞内でのＳＬＡＭポリペプチドの濃度は、キメラポリペプチド配列の導入の結果として増加し得る。他の実施形態において、産生されたＳＬＡＭポリペプチドは、宿主細胞に天然には存在しない。
【０１０６】
標的タンパク質は、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への輸送を必要とし得る、任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドであり得る。本明細書において用いられる「細胞外表面」という用語は、細胞のサイトゾル部分をその外因的環境から分離する、細胞の細胞表面構造を指すことを意図される。細胞表面構造は、タンパク質を有する１つもしくは複数のリン脂質膜及び／またはその中に埋め込まれたリポ多糖を含み得る。グラム陰性細菌において、細胞外表面構造は、水性ペリプラズム区画によって互いに分離された内側のリン脂質二重層膜及び外側のリン脂質二重層膜を含む。宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への輸送があると、標的タンパク質は、細胞の細胞外表面構造と協調し及び相互作用する。そのような相互作用は、細胞の外因的環境への標的タンパク質の少なくとも一部分の曝露につながり得る。
【０１０７】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、宿主生物において免疫応答を誘発し得る免疫原性タンパク質である。
【０１０８】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、病原性微生物の外表面に天然に呈示される免疫原性ポリペプチドまたはその免疫原性部分である。
【０１０９】
少なくとも一部の実施形態において、免疫原性タンパク質は、表面リポタンパク質（ＳＬＰ）またはその一部分である。
【０１１０】
少なくとも一部の実施形態において、表面リポタンパク質（ＳＬＰ）は、本明細書に記載されている、配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２のうちの１つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１００、及び配列番号が偶数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６８、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８より選択されるポリペプチド配列またはその一部分を含むかまたはそれからなる。
【０１１１】
少なくとも一部の実施形態において、表面リポタンパク質（ＳＬＰ）は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９５から始まりＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８１で終わりかつそれを含む偶数の配列番号のうちの１つより選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列またはその一部分を含むかまたはそれからなる。
【０１１２】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に近接した細菌ゲノム上に位置する表面リポタンパク質である。
【０１１３】
少なくとも一部の実施形態において、免疫原性タンパク質は、一部の実施形態におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４８を含むＴｂｐＢポリペプチドを含めた、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）、一部の実施形態におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３２を含むＨｐｕＡポリペプチドを含めた、ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）、一部の実施形態におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１６を含むｆＨｂｐポリペプチドを含めた、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、及び一部の実施形態におけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３８を含むＬｂｐＢポリペプチドを含めた、ラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）からなる群より選択される表面リポタンパク質またはその免疫原性部分である。
【０１１４】
少なくとも一部の実施形態において、トランスフェリン結合タンパク質Ｂ（ＴｂｐＢ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４９を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１５】
少なくとも一部の実施形態において、ラクトフェリン結合タンパク質Ｂ（ＬｂｐＢ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６９を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１６】
少なくとも一部の実施形態において、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１５を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１７】
少なくとも一部の実施形態において、ヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質Ａ（ＨｐｕＡ）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２３を含むかまたはそれからなるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１１８】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、２種以上の表面リポタンパク質またはその一部分を含む融合タンパク質である。一部の実施形態において、標的タンパク質は、本明細書に記載されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９６〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７８より選択されるリポタンパク質のうちの少なくとも２種から獲得される２種もしくはそれを上回る種類のポリペプチドまたはその一部分を含む融合タンパク質である。さらなる実施形態において、標的タンパク質は、トランスフェリン結合タンパク質（ＴｂｐＢ）、ラクトフェリン結合タンパク質（ＬｂｐＢ）、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、及びヘモグロビン−ハプトグロビン結合タンパク質（ＨｐｕＡ）のうちの少なくとも２種から獲得される一部分を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態において、標的タンパク質は、Ｎ末端においてまたはＣ末端において、第二の表面リポタンパク質の免疫原性部分に融合した第一の表面リポタンパク質を含む融合ポリペプチドである。具体的な実施形態において、標的タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０２に明示される融合ポリペプチドである。本開示に従った、標的タンパク質としての融合ポリペプチドの使用の実施態様は、実施例９においてさらに例示される。
【０１１９】
概して、ＴｂｐＢペプチドの一部分が用いられる本明細書の実施形態において、そのような一部分は、少なくとも（ｉ）アンカーペプチドを含む、ＴｂｐＢシグナルペプチドリポボックス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７０）、及び／または（ｉｉ）ＴｂｐＢポリペプチドのＣ末端ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９８）を含む。
【０１２０】
相当数の標的タンパク質が本開示において提供されているものの、本開示の精神から逸脱することなく、新たな標的タンパク質が発見され得及び本開示に従って用いられ得る。ゆえに、本開示は、標的タンパク質に関して限定されることを意図されず、及び任意の標的タンパク質を用いて、本開示の新規な方法を行い得る。一実施形態において、新たな標的タンパク質を発見するために、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするゲノム領域にすぐ近接したゲノム領域を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在に対してプローブし得、及び任意の同定されたポリペプチドを標的タンパク質として評価し得る。したがって、さらに別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、細胞のサイトゾルから細胞外表面へＳＬＡＭポリペプチドによって輸送され得る標的タンパク質を同定するための方法を提供し、当該方法は、
（ａ）（ｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、及び
（ｉｉ）ポリペプチドをコードするのに十分に長く及び第一のヌクレオチド配列に天然に付着している第二のヌクレオチド配列
を含む、ゲノムヌクレオチド配列を提供すること、
（ｂ）第二のヌクレオチド配列を評価して、第二のヌクレオチド配列内のポリペプチドコード配列を同定すること、ならびに
（ｃ）ポリペプチドコード配列を用いて、ＳＬＡＭポリペプチドを含む宿主細胞において当該ポリペプチドを発現させて、タンパク質が宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面へ輸送されるかどうかを判定し、それによって当該タンパク質が標的タンパク質であるかどうかを同定すること
を含む。
【０１２１】
前述に従って、ＳＬＡＭポリペプチドをコードする任意のゲノムヌクレオチド配列が提供され得る。
【０１２２】
一部の実施形態において、例えばナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、マンヘミア属（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、及びビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）に属する細菌種のゲノムを含めた、任意の微生物ゲノム由来のゲノムヌクレオチド配列が提供される。ただし、第一及び第二のヌクレオチド配列は天然に付着しているという条件で、ならびにさらに、第二のヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むのに十分に長いという条件で、ゲノムヌクレオチド配列は長さが変動し得、ゲノム全体またはその一部分もしくはフラグメントに相当し得る。
【０１２３】
一部の実施形態において、第一のヌクレオチド配列は、配列番号が奇数のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９５のうちのいずれか１つより選択される配列を含む。
【０１２４】
概して、第一のヌクレオチド配列にいずれかの側または両側で（すなわち、ＳＬＡＭコード配列に対して５’または３’）付着し得る第二のヌクレオチド配列は、第一のヌクレオチド配列から少なくとも１００ヌクレオチド伸びる。第二のヌクレオチド配列もより長くあり得、例えばそれは、長さが少なくとも２５０ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、または少なくとも５，０００ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ゲノムヌクレオチド配列は、コンピューター画面、タブレットもしくは携帯用デバイスの画面、または紙面でのヌクレオチド配列のプリントアウトなど、ヌクレオチド配列情報を視覚的に呈示し得る媒体上に存在する、ヌクレオチド配列の視覚的表示である。ゲノムヌクレオチド配列を獲得するために、ポリヌクレオチドは、微生物生物からその単離があり次第提供され得、ポリヌクレオチドの配列は、当技術分野に周知のヌクレオチドシーケンシングのための技法を用いて決定され得、次いで、獲得されたヌクレオチド配列は、評価のために視覚的に表示され得る。ヌクレオチド配列は、例えば、ＥｘＰＡＳｙ（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，Ｅ．；Ｇａｔｔｉｋｅｒ，Ａ；Ｈｏｏｇｌａｎｄ，Ｃ；Ｉｖａｎｙｉ，Ｉ；Ａｐｐｅｌ，ＲＤ；Ｂａｉｒｏｃｈ，Ａ（２００３）．“ＥｘＰＡＳｙ：Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３１（１３）：３７８４−８）など、核酸配列翻訳が可能なコンピューターソフトウェアを含めた、当技術分野に周知の技法及び方法を用いて、オープンリーディングフレーム及びコード領域ポリペプチドコード配列の存在について評価され得及び分析され得る。第二の核酸内のポリペプチドコード配列の同定があり次第、ポリペプチドコード配列を含む遺伝子構築物を調製し及び宿主細胞における発現に用いて、当該ポリペプチドが、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面へ輸送されるかどうかを判定し得る。遺伝子構築物は、ポリペプチドコードヌクレオチド配列をその天然供給源の微生物生物から単離し、及び宿主細胞における発現に適した発現ベクター内にそれを導入することによって調製され得る。一部の実施形態において、ポリペプチドコードヌクレオチド配列は、ゲノムヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。今度は、発現ベクターが宿主細胞内に導入され得る。宿主細胞は、一部の実施形態ではその中に天然に存在し得る、または他の実施形態では宿主細胞内において組換えで発現され得るＳＬＡＭポリペプチドを含む細胞である。ポリペプチドコードヌクレオチド配列がゲノム配列を含むかまたはそれからなる実施形態において、ポリペプチドコードヌクレオチド配列及びＳＬＡＭポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞内に同時に導入され得る。一部の実施形態において、宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である。宿主細胞の増殖、及び宿主細胞における標的タンパク質の発現があり次第、ポリペプチドが宿主細胞の細胞外表面へ輸送されて細胞外表面と結��する場合には、当該ポリペプチドは標的タンパク質である。本開示の前述の実施形態は、下記で実施例８及び１０においてさらに例示される。
【０１２５】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、宿主細胞に天然に存在する。したがって、本開示は、
（ａ）細胞に天然に存在する標的タンパク質を含む宿主細胞を選択すること、
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ及びサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への、宿主細胞に天然に存在する標的タンパク質の輸送をもたらす方法をさらに含む。
【０１２６】
少なくとも少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）からなる細菌の群より選択される病原性細菌種の細胞に天然に存在する。
【０１２７】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、非共有結合によりＳＬＡＭポリペプチドと相互作用及び配位結合する。ＳＬＡＭポリペプチドと標的タンパク質の間の非共有結合的相互作用は、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質複合体の形成につながり得る。当該相互作用は、例えばサイトゾルから細胞外表面への標的ポリペプチドの輸送を可能にするのには十分に長い期間の、一時的な相互作用、またはＳＬＡＭポリペプチドと標的タンパク質の間の非共有結合的相互作用が、細胞の細胞外膜への標的ポリペプチドの輸送があっても依然としてそのままである、より長期にわたる相互作用であり得る。
【０１２８】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、宿主細胞に天然には存在しない。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第一のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む第二のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞に第一及び第二のキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を産生させること
を含む、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法をさらに提供する。
【０１２９】
少なくとも一部の実施形態において、標的タンパク質は、ＳＬＡＭポリペプチドに共有結合により連結している。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチドを産生させ及びサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらすこと
を含む、宿主細胞のサイトゾルから細胞外表面への標的タンパク質の輸送をもたらす方法を提供する。
【０１３０】
少なくとも一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチドのＣ末端への標的タンパク質のＮ末端の、好ましくはペプチド結合による、共有結合的連結をもたらす様式で構築される。
【０１３１】
少なくとも一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、標的タンパク質のＣ末端へのＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端の、好ましくはペプチド結合による、共有結合的連結をもたらす様式で構築される。
【０１３２】
少なくとも一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチドの一部分の除去、及び標的ポリペプチドによるその置き換えをもたらす様式で構築される。一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基の除去、及び標的タンパク質によるそのような残基（複数可）の置き換えをもたらす様式で構築される。一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチドのＣ末端の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基の除去、及び標的タンパク質による当該残基（複数可）の置換をもたらす様式で構築される。一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチドのポリペプチド配列内への標的タンパク質の挿入をもたらす様式で構築される。一部の実施形態において、キメラポリヌクレオチドは、ＳＬＡＭポリペプチド内への標的タンパク質の挿入、及び標的タンパク質によるＳＬＡＭポリペプチドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸残基（複数可）の置換をもたらす様式で構築される。
【０１３３】
少なくとも一部の実施形態において、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、実質的に切り取られ得る。とりわけ、ＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端部分を除去して、１２〜１４本の外膜貫通鎖からなるＣ末端ドメインβ−バレルドメインのみからなる、切り取られたＳＬＡＭポリペプチドを獲得し得る。本明細書に従って用いられて標的タンパク質の輸送をもたらし得る、切り取られたＳＬＡＭポリペプチドの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１２に明示される。
【０１３４】
本明細書の別の態様に従って、本開示は、特定の実施形態において、ワクチン製剤を調製する方法を提供する。したがって、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、
（ａ）免疫原を産生し得る宿主細胞を選択すること
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞にキメラ核酸配列を導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び免疫原を産生させること、ならびに
（ｄ）宿主細胞を弱毒化して、弱毒化した宿主細胞を調製すること、ならびに
（ｅ）弱毒化した宿主細胞を含むワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法をさらに提供する。
【０１３５】
一部の実施形態において、宿主細胞は微生物細胞である。
【０１３６】
一部の実施形態において、宿主細胞は病原性微生物細胞である。
【０１３７】
一部の実施形態において、宿主細胞は、感染性疾患を媒介する病原性微生物細胞である。
【０１３８】
少なくとも１つの実施形態において、宿主細胞は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、及びコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）からなる細胞群より選択される細胞である。免疫原は、宿主細胞に天然に存在し得る、またはそれは宿主細胞内において組換えで発現され得る。弱毒化を達成するために、細胞は、ＳＬＡＭタンパク質及び免疫原の産生があり次第、それらがもはや感染が可能でないような様式で処理される。典型的に、これは、細菌細胞の加熱殺傷によって、または外膜小胞を創出することによって達成される。弱毒化技法は、当業者に一般的に公知であり、例えばＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅ  Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ．Ｌｉ  Ｙ，Ｓｕｎ  ＹＨ，Ｉｓｏｎ  Ｃ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＭＭ，Ｔａｎｇ  ＣＭ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００４  Ｊａｎ；７２（１）：３４５−５１．Ｌｉ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｑ，Ｗｉｎｔｅｒｂｏｔｈａｍ  Ｍ，Ｍｏｗｅ  Ｅ，Ｇｏｒｒｉｎｇｅ  Ａ，Ｔａｎｇ  ＣＭ．Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｖｅ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｅｌｉｃｉｔ  ｓｅｒｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００６；７４（１１）：６３４８−５５．Ｄａｌｓｅｇ  Ｒ，Ｗｅｄｅｇｅ  Ｅ，Ｈｏｌｓｔ  Ｊ，Ｈａｕｇｅｎ  Ｉ  Ｌ，Ｈφｉｂｙ  Ｅ  Ａ，Ｈａｎｅｂｅｒｇ  Ｂ．Ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉ  ａｒｅ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｗｈｅｎ  ｇｉｖｅｎ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  ｔｏ  ｍｉｃｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ．１９９９；１７：２３３６−２３４５に見出され得る。
【０１３９】
少なくとも一部の実施形態において、本開示は、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む第一のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、及び
（ｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む第二のキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｃ）宿主細胞に第一及び第二のキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を産生させること、ならびに
（ｄ）（ｃ）の細胞を含むワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
【０１４０】
少なくとも一部の実施形態において、本開示は、
（ａ）機能的に連結された成分として、
（ｉ）宿主細胞における発現を制御し得るポリヌクレオチド、
（ｉｉ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び
（ｉｉｉ）標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むキメラポリヌクレオチドを提供すること、ならびに
（ｂ）宿主細胞にキメラポリヌクレオチドを導入し及び宿主細胞を増殖させて、ＳＬＡＭポリペプチド及び標的タンパク質を産生させること、ならびに
（ｃ）（ｂ）の細胞を含むワクチン製剤を調製すること
を含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
【０１４１】
少なくとも一部の実施形態において、本開示は、
（ａ）ＳＬＡＭポリペプチドをコードする核酸配列を含む病原性細菌株を提供すること、
（ｂ）病原性株におけるＳＬＡＭ産生を欠如させて、ＳＬＡＭを欠如した病原性細菌株を獲得すること、及び
（ｃ）ＳＬＡＭを欠如した病原性株を用いて、ワクチンを製剤化すること
を含む、病原性細菌感染症に対するワクチンを調製する方法をさらに提供する。
【０１４２】
好ましい実施形態において、病原性細菌株は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）の株である。
【０１４３】
少なくとも一部の実施形態において、病原性細菌株は、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する細菌株である。前述に従って、任意の細菌ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株が用いられ得る。ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株を欠如させるために、任意の方法論が用いられ得る。好ましくは、例えばトランスポゾン突然変異誘発による、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするゲノムポリヌクレオチド配列の弱毒化またはノックアウトをもたらす方法が用いられる。ゆえに、好ましい実施形態において、ＳＬＡＭを欠如したナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株は、実質的な量のＳＬＡＭポリペプチドが産生されないような様式で、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするゲノムポリヌクレオチドが変異しているナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株であり、そのような変異には、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの除去が含まれ得る。
【０１４４】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、欠如したゲノムＳＬＡＭポリヌクレオチド配列を含む病原性細菌株を提供する。「欠如したゲノムＳＬＡＭポリヌクレオチド配列を含む株」という用語を用いて、細菌株が実質的な量のＳＬＡＭポリペプチドを産生し得ないことが意味される。一部の実施形態において、病原性細菌株はナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株である。これには、オープンリーディングフレームが分断されているポリヌクレオチドを含む株が含まれ、ＳＬＡＭタンパク質の発現を調節する株は機能的でなく、及び当該用語は、ゲノムＳＬＡＭコードポリヌクレオチド配列がそこから除去されている株を含むことをさらに意図される。ゆえに、本開示は、ＳＬＡＭポリペプチドをコードするゲノムポリヌクレオチドを欠く変異体病原性細菌株をさらに含む。好ましい実施形態において、変異した病原性細菌株はナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株である。前述に従って、変異体株は、天然株と比較した場合に、ＳＬＡＭポリペプチドをコードする少なくとも１種のゲノムポリヌクレオチドを欠くことが意図される。好ましい実施形態において、変異体ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株または淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）株である。
【０１４５】
本開示の特定の態様に従って、ワクチン調製物が調製される。ワクチンを用いて、限定することなく、任意のウシ、ブタ、ウマ、ネズミ、イヌ、ネコ、サカナ、ヒツジ、ヤギ、サル、及びトリ動物を含めた、任意のヒト及び非ヒト動物を含む宿主生物に投与し得る。したがって、別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、本開示の方法のいずれかに従って調製されたワクチン調製物を提供する。
【０１４６】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの実施形態において、宿主生物を免疫化するための、本開示の方法のいずれかに従って作製されたワクチン調製物の使用を提供する。
【０１４７】
一部の実施形態において、ワクチン調製物を用いて、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）に属する細菌性生物によって媒介される感染性疾患に対して宿主生物を免疫化し得る。
【０１４８】
一部の実施形態において、ワクチン調製物を用いて、以下の種に属する細菌性生物によって媒介される感染性疾患に対して宿主生物を免疫化し得る：髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｃｅｒａ）、クレブシエラ・デニトリフィカンス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｏｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムニ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、またはコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）。
【０１４９】
本開示の少なくとも一部の実施形態において、ワクチンは、ヒトに投与された場合、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）細菌、とりわけ髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）及び淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）による感染症を予防する。本明細書に従って、ワクチン製剤は、本開示の方法を用いて調製された細胞を用いて調製され得る。一部の実施形態において、ワクチン製剤は、弱毒化細胞を用いて調製され得る。他の実施形態において、特定の画分、例えばタンパク質画分または膜がそこから獲得され得及びワクチンを調製するために用いられ得る供給源として、当該細胞が用いられ得る。本開示のワクチン調製物は、好ましくは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など、ビヒクル、賦形剤、及び補助物質をさらに含む。これらのビヒクル、賦形剤、及び補助物質は、一般的に、レシピエント対象において免疫応答を誘導しない及び過度の毒性なしで投与され得る、薬学的物質である。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、及びエタノールなどの液体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩もその中に含まれ得る。必要とされないものの、調製物は、特に本開示のポリペプチドを安定させるための安定剤として働く薬学的に許容される賦形剤を含有することも好ましい。ペプチドに対する安定剤としても作用する適切なキャリアの例には、限定することなく、薬学的グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が含まれる。他の適切なキャリアには、再度限定することなく、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムまたはカルシウム、クエン酸、グリシン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びそれらの組み合わせが含まれる。対象における免疫応答を増大させるために、本明細書において提供される組成物は、好ましくは、薬理学的作用物質、サイトカインなどのアジュバントをさらに含む。適切なアジュバントには、本開示の免疫原性ポリペプチドに対する対象の免疫応答を増強する任意の物質が含まれる。アジュバントの非限定的な例には、サイトカイン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−６が含まれ、Ｗｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒら（Ｗｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒ  ＪＨ，Ｔｏｒｒｅｓ  ＭＰ，Ｋｉｐｐｅｒ  ＭＪ，Ｍａｌｌａｐｒａｇａｄａ  ＳＫ，Ｗａｎｎｅｍｕｅｈｌｅｒ  ＭＪ，Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ  Ｂ．２００９．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ−Ｕｓ  ９８：１２７８−１３１６）に総説されるように、無機塩、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及びリン酸カルシウム；油エマルション、例えば鉱油、ＭＦ５９、ＱＳ−２１、Ｍｏｎｔａｍｉｄｅ  ＩＳＡ５１及びＩＳＡ−７２０；Ｉｓｏｃｏｍ、例えばＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ；微生物誘導体、例えばＭＰＬＡ、マクロファージ活性化タンパク質−２、ビロソーム、ＬＴ／Ｃ��、ＣｐＧ；天然ポリマー、例えば多糖類；ならびに合成ポリマー、例えばポリ無水物及びポリエステルがさらに含まれる。アジュバントは、弱毒化細胞の投与と同時に、その前に、またはその後に、例えばタンパク質または他の高分子として投与され得る。
【０１５０】
本開示は、病原性細菌種による感染症を有する患者の治療における使用のための化合物候補を同定するためのスクリーニング方法をなおさらに提供し、当該方法は、
（ａ）試験化合物を提供すること、
（ｂ）機能アッセイにおいて、病原性細菌種におけるＳＬＡＭポリペプチドの天然機能に対する試験化合物の効果を、対照と比較すること、及び
（ｃ）ＳＬＡＭポリペプチドの天然機能に対して効果を呈する試験化合物を同定すること
を含む。
【０１５１】
好ましい実施形態において、病原性細菌種はナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）に属する。
【０１５２】
前述に従って、化学的化合物を、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）感染症を有する患者を治療するその実用性について評価し得る。典型的に、これは、試験したい１種または複数種の化合物及び機能アッセイの性能を提供することによって達成される。アッセイは、好ましくはインビトロアッセイであり、複数種の化合物を同時に評価し得るように設定され得る。機能アッセイは、ＳＬＡＭポリペプチドの天然機能に対する効果を検出し得る任意のアッセイであり得る。例えば、アッセイは、化学的化合物の存在下での細胞表面への標的タンパク質の輸送についての評価、とりわけ陰性対照（例えば、無害化合物）または陽性対照（すなわち、ＳＬＡＭタンパク質の機能に対して効果を有することが公知の化合物）の存在下での輸送の比較を伴い得る。ゆえに、例えば、ＳＬＡＭポリペプチドの天然機能に対して効果を呈する化学的化合物が選択されると、ＴｂｐＢ輸送がモニターされ得、選択された化合物のさらなる評価は、ヒトへの化学的化合物の投与を含めた、インビトロまたはインビボ試験における化合物の試験を含み得る。
【０１５３】
本開示の方法を実施するための具体的な実施形態の例、ならびに本開示の組成物に相当する実施形態が、以下に提供される。実施例は、例示目的のみのために提供されるものであり、決して本開示の範囲を限定することを意図されるものではない。
【実施例】
【０１５４】
実施例１−ＳＬＡＭポリペプチド（ＳＬＡＭ１）をコードするポリヌクレオチドの単離
ＥＺ：：ＴＮ＜ＫＡＮ２＞トランスポゾンキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、Ｎ．ｍｅｎ−Ｂ１６Ｂ６ゲノムＤＮＡのインビトロ転位を実施した。およそ４００ｎｇの超音波処理したＤＮＡ（１〜６ｋｂ）を、１００μｌ反応中にて１０μｌのトランスポザーゼと混合し、３７℃で２時間インキュベートした。ＥＺＴＮ５−Ｓｔｏｐ溶液を添加し、７０℃で１０分間インキュベートした。エタノール沈殿による濃縮の後、ＤＮＡをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４リガーゼで修復した（Ｖ．ｐｅｌｉｃｉｃ，Ｓ．Ｍｏｒｅｌｌｅ，Ｄ．Ｌａｍｐｅ，Ｘ．Ｎａｓｓｉｆ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８２：５３９１（Ｏｃｔ  １，２０００））。
【０１５５】
トランスポゾンをスポット形質転換によってＢ１６Ｂ６に導入した（Ｔ．Ｈ．Ｄｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌ．Ｄｉｓ．９：２６９（Ｊａｎ  １，２０１３））。簡潔には、反応混合物を、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）プレートにスポットし、そこにＮ．ｍｅｎ−Ｂ１６Ｂ６コロニーを用いて、当該スポットを含むプレート全体にストリークした。プレートを５％ＣＯ２を有して３７℃で８時間、またはコロニーが出現するまでインキュベートした。スポット上で増殖したｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｉを、カナマイシン（８０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＨＩプレートに播種し、一晩インキュベートした。トランスポゾン変異体をマイクロタイタープレートに収集し、２０％グリセロールを有するＢＨＩ中にて−８０℃で凍結する前に、液体ＢＨＩ中で６時間増殖させた。
【０１５６】
トランスポゾン変異体を、表面ＴｂｐＢの存在についてドットブロットによってスクリーニングした。ホールセルをＰＢＳ中２％ホルムアルデヒドで固定し、ニトロセルロース上にスポットし、５％スキムミルクでブロッキングし、及びウサギ抗ＴｂｐＢ抗体とともにインキュベートした。表面ＴｂｐＢを示さない変異体を、ＲＡＴＥ  ＰＣＲ（Ｔ．Ｆ．Ｄｕｃｅｙ，Ｄｙｅｒ  Ｄ．，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｆｏｒｕｍ  ９，（２００２））またはスプリンケレットＰＣＲ（Ｃ．Ｊ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｌ．Ｌｕｏ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，ｅ１０１６８（Ｊａｎ  １，２０１０））によってシーケンシングした。ＲＡＴＥ  ＰＣＲに関しては、第一のラウンドではストリンジェントなアニーリング温度、第二では低いアニーリング温度、及び第三ではストリンジェントなアニーリング温度からなる３ステップＰＣＲ反応に対して、ゲノムＤＮＡを単一プライマー（ｉｎｖ１またはｉｎｖ２）と混合した。結果として生じた産物を、Ｋａｎ  ＦまたはＫａｎ  Ｒプライマーを用いてシーケンシングした。スプリンケレットＰＣＲに関しては、ゲノムＤＮＡを制限酵素（ＢｓｔＹ１、ＢｇｌＩＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩ）によって別個に消化し、スプリンケレットオリゴヌクレオチドにライゲートし得る付着末端を産生する。結果として生じた産物を２回のネステッドＰＣＲに用いて、ＴＮ５挿入とスプリンケレットの間のゲノム配列を増幅する。産物を、別のネステッドプライマーとのシーケンシングに用いる。前述の手法を用いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８５に明示されるＳＬＡＭ１をコードするポリヌクレオチドを獲得した。
【０１５７】
以下のプラスミド構築物に対して、制限フリークローニングを採用した（Ｆ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｔ，Ｊ．Ｌｏｗｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊａｎ  １，２００６））。簡潔には、ＮＭＢ０３１３  ＯＲＦをカナマイシンカセットで置き換えるために、ＮＭＢ０３１３ならびにＮＭＢ０３１３の５００ｂｐ上流及び下流を含有する約２５００ｂｐのフラグメントを、Ｆ１（ｐＵＣ１９ＯｍｐＵ４７６ＲＦ）及びＲ１（ｐＵＣ１９−ＯｍｐＵＲｅｖ）を用いてｐＵＣ１９内にクローニングした。プライマーＦ２（Ｆ−ＲＦ−ＯｍｐＵｄＫａｎ）及びＲ２（Ｒ−ＲＦ−ＯｍｐＵｄＫａｎ）を用いて、ＥＺ：：ＴＮトランスポゾンキットからのＫＡＮ２を増幅し、結果として生じたメガプライマーを用いて、第二のＲＦ反応でＮＭＢ０３１３  ＯＲＦを置き換えた。結果として生じたプラスミドを、ＷＴ  Ｂ１６Ｂ６におけるスポット形質転換に用いた。ノックアウトを、カナマイシン（８０μｇ／ｍＬ）を含有するＢＨＩプレート上で選択し、ＮＭＢ０３１３に隣接するプライマーを用いてＰＣＲによって検証した。
【０１５８】
プライマーＦ３（Ｆ−ＲＦ−ｐＧＯｍｐＵ）及びＲ３（Ｒ−ＲＦ−ｐＧＯｍｐＵ）を用いて、ＮＭＢ０３１３遺伝子をｐＧＣＣ４（Ｉ．Ｊ．Ｍｅｈｒ，Ｃ．Ｄ．Ｌｏｎｇ，Ｃ．Ｄ．Ｓｅｒｋｉｎ，Ｈ．Ｓ．Ｓｉｅｆｅｒｔ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５４，５２３（Ｆｅｂ  １，２０００））（Ｈ．Ｓｉｅｆｅｒｔからの贈与）のＰａｃＩ／ＦｓｅＩ部位にクローニングすることによって、補完ベクターｐＳＬＡＭを構築した。ＨＩＳタグを含有するリン酸化プライマーＦ４（Ｆ−ＯｍｐＵ−ＨＩＳ  ｐｈｏｓ）及びＲ４（Ｒ−ＯｍｐＵ−ＨＩＳ  ｐｈｏｓ）を用いてベクター全体を増幅し、産物をライゲートすることによって、単一ペプチドの後にＨＩＳタグを挿入した。スポット形質転換及びエリスロマイシン（３０μｇ／ｍＬ）プレート上での選択によって、ノックアウト及びトランスポゾン変異体をｐＳＬＡＭで補完した。ＮＭＢ０３１３の挿入をＰＣＲによって検証した。１ｍＭ  ＩＰＴＧ  ＢＨＩプレート上でコロニーを成長させることによって発現を誘導し、抗ＨＩＳウェスタンによって検証した。
【０１５９】
実施例２−第一のＳＬＡＭポリペプチド（ＳＬＡＭ１）の精製
ＳＬＡＭポリペプチドを図１に概説されるように精製した。ＮＭＢ０３１３及びそのホモログを、ｐＥＴ２６内にクローニングし、切断不能な７×Ｈｉｓタグが後に続くＮ末端ｐｅｌＢシグナルペプチドを有して発現させた。プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＢＬ２１−Ｃ４３細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを有するＬｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中で３７℃にて０．８のＯＤ６００まで増殖させ、その時点で、１ｍＭの最終濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によりタンパク質発現を誘導した。細胞を３７℃で付加的な１８時間増殖させ、４０００×ｇでの遠心分離によって収穫した。細胞を洗浄し、５ｇの細胞あたり１００ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５及び０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁した。細胞溶解を、リゾチーム及びＤＮａｓｅの存在下における４回の３０秒間パルスによる氷上での超音波処理によって行った。溶解されなかった細胞を、２０分間の１０，０００×ｇでの遠心分離によって除去した。次いで、溶解物を９５，８３４×ｇで１時間遠心分離して、膜画分を単離した。ペレットを洗浄し、溶解された５ｇの細胞あたり５０ｍＬの抽出バッファー（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ  ７．５及び３％Ｅｌｕｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））中に再懸濁した。抽出を４℃で一晩行った。９５，８３４×ｇで４０分間の遠心分離の後、可溶化されたタンパク質を０．４５μｍフィルターに通し、バッファーＡ（５０ｍＭリン酸カリウム、０．６％Ｃ８Ｅ４（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））で平衡化された１ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂カラム（ＧＥ）にロードした。バッファーＡとバッファーＢ（５０ｍＭリン酸カリウム、０．６％Ｃ８Ｅ４、４００ｍＭイミダゾール）とを混合することによって、イミダゾール勾配を作製した。カラムを２０ｍＭ、６０ｍＭ、及び８０ｍＭイミダゾールで洗浄し、所望のタンパク質を２６０ｍＭイミダゾール中に溶出した。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証し、さらなる精製を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６％Ｃ８Ｅ４中で平衡化された２４ｍＬ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００（ＧＥ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって達成した。５Ｈ３  ＮＭＢ０３１３を含有する単一ピークをＳｅｐｈａｄｅｘ−２００から収集し、５０ｋＤａ濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結果は図２に示されている。
【０１６０】
実施例３−ＳＬＡＭ２を含めた、ＳＬＡＭポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドの同定
ＳＬＡＭ１タンパク質配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８５）を鋳型として用いて、Ｂｌａｓｔｐ検索を実行した。次いで、結果をフィルターにかけて、同じ生物の複数種の株からＳＬＡＭヒットを除去し、上位のヒットを保った。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ７（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ／）を用いて、多重配列アライメント及び系統樹（近隣結合）構築を行った。固有のブートストラップモジュールを用いて、樹を１００回再サンプリングした。ｆＨＢＰ、ＴｂｐＢ、及びＬｂｐＢホモログを、ＳＬＡＭヒットを含有するゲノムのそれぞれにおいて検索し、系統樹に加えた。系統樹は図３に示されている。図３を参照すると、ＳＬＡＭホモログ（細菌ゲノムのＢＬＡＳＴ検索によって同定された）は、３つの群にクラスター形成する。群１（ライトグレー、上）におけるＳＬＡＭホモログは、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）及びカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）に属し、一方で群２（ミディアムグレー、中間）は、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のパスツレラ科（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ）のファミリーとは異なるメンバーを含有する。群３（ダークグレー、下）は、ナイセリア・シャエガニ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｈａｙｅｇａｎｉｉ）のみを含有する。樹は明瞭性のために省略されており；単一種からの多重ヒットは含まれず、ブートストラップ値は除去された。それらのゲノムにおいてＴｂｐＢ、ＬｂｐＢ、またはｆＨｂｐホモログを所有する種は、それぞれ丸、四角形、及び三角形によって示される。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の第二のＳＬＡＭポリペプチド、ＳＬＡＭ２のポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７として本明細書に記載されている。
【０１６１】
実施例４−第二のＳＬＡＭポリペプチド（ＳＬＡＭ２）の精製
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）の第二のＳＬＡＭポリペプチド（ＳＬＡＭ２；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８７）を、実施例２においてさらに記載される方法論を用いて精製した。図４は、得られた結果を示している。
【０１６２】
実施例５−無傷の及び切り取られたＳＬＡＭ１ポリペプチドを用いた、表面リポタンパク質トランスロケーション
髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＳＬＡＭノックアウト株Δｍｎｂ０３１３を用いて、表面リポタンパク質（ＳＬＰ）のトランスロケーションを評価した。全長ＳＬＡＭポリペプチド、ならびにＳＬＡＭポリペプチドのＮ末端及びＣ末端部分を用いた。Ｎ末端及びＣ末端部分は図５Ａに示されている。フローサイトメトリー（図５Ｂ）及びプロテイナーゼＫ消化（図５Ｃ）実験は、ＳＬＡＭノックアウト株において観察されたＳＬＰトランスロケーション欠陥は、Ｃ末端β−バレルドメイン（アミノ酸２０４〜４８８）のみで救済され得ることを明らかにしている。ＳＬＡＭのＮ末端ドメイン（Ｎｔｄ）（アミノ酸３２〜２０３）は、いかなるＳＬＰトランスロケーション活性をも提供しない。平均蛍光強度を各サンプルに対して測定し、野生型細胞から獲得されたシグナルを、ノックアウト及び単一ドメイン補完細胞由来のシグナルとの比較のために１００％に設定した。エラーバーは、３回の実験からの平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。＊は、結果がｐ＜０．０５で有意に異なることを示す。
【０１６３】
実施例６−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、ＳＬＡＭならびに表面リポタンパク質のＴｂｐＢ、ＬｂｐＢ、及びｆＨｂｐの共発現
ＴｂｐＢ及びＮＭＢ０３１３遺伝子を、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株Ｂ１６Ｂ６のゲノムから増幅した。ＬｂｐＢ遺伝子を、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型Ｂ株ＭＣ５８から増幅した。制限フリークローニング（（Ｆ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｎｔ，Ｊ．Ｌｏｗｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｊａｎ  １，２００６））を用いて、全長ＴｂｐＢを、ｐＥＴＤｕｅｔのマルチクローニングサイト２に挿入した。ＮＭＢ０３１３を、天然シグナルペプチドがｐｅｌＢのものによって置き換えられたｐＥＴ２６内に挿入した。これらのベクターに対して、変異及び切り取りを、それぞれ部位指向性突然変異誘発及び制限フリークローニングを用いて実施した。ベクターのペアを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３に形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を補充されたＬＢ寒天プレートで一晩増殖させた。
【０１６４】
ｔｂｐＢ遺伝子を、カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）株Ｏ３５Ｅ及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）株８６−０２８ＮＰのゲノムから増幅し、上記のように制限フリークローニングによってｐＥＴ５２ｂプラスミド内にクローニングした。対応するＳＬＡＭ（カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）  ＳＬＡＭ１、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）  ＳＬＡＭ１）を、また制限フリークローニングを用いてｐＥＴ２６ｂ内に挿入した。６Ｈｉｓタグを、上記のようにｐｅｌＢと成熟ＳＬＡＭ配列の間に挿入した。ベクターを、上記のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３に形質転換した。
【０１６５】
細胞を４０００ｇでの遠心分離によって収穫し、１ｍＬ  ＰＢＳで２回洗浄して、いかなる残存する増殖培地をも除去した。次いで、細胞を、０．０５〜０．１ｍｇ／ｍＬのビオチン化ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ  Ｔ３９１５−５ＭＧ）、α−ＴｂｐＢ（カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）に対するウサギ血清由来１：２００希釈；髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するウサギ血清由来１：１００００希釈）、またはα−ＬｂｐＢ（獲得されたウサギ血清由来１：１００００希釈、Ｊ．Ｌｅｍｉｅｕｘからの贈与）、またはａ−ｆＨｂｐ（マウス由来１：５０００希釈、Ｄ．Ｇｒａｎｏｆｆからの贈与）のいずれかとともに４℃で１．５時間インキュベートし、その後に１ｍＬのＰＢＳによる２回の洗浄が続いた。次いで、細胞を、２５ｕｇ／ｍＬのＲ−フィコエリスリン共役ストレプトアビジン（０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）またはＲ−フィコエリスリン共役抗ウサギＩｇＧ（ストック０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ）とともに４℃で１．５時間インキュベートした。次いで、細胞を１ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、２００ｕＬの固定液（ＰＢＳ＋２％ホルムアルデヒド）中に再懸濁し、及び２０分間放置した。最後に、細胞を２×１ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、５ｍＬポリスチレン製ＦＡＣＳチューブに移した。各サンプルのＰＥ蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いてＰＥ蛍光について測定した。結果をＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いて分析し、各サンプルに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）として提示した。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ実験に関しては、野生型蛍光シグナルを１００％に正規化することによって、すべてのサンプルを野生型株と比較した。エラーバーは、３回の実験にわたる平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。結果をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを用いて統計的に分析した。ＳＬＰのＴｂｐＢ（図６Ａ）、ＬｂｐＢ（図６Ｂ）、及びｆＨｂｐ（図６Ｃ）に関して図６に示された結果は、ＳＬＡＭが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において３種すべてのＳＬＰポリペプチドのトランスロケーションをもたらすことを実証している。図１０に示された結果は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるカタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）由来の（図１０Ｃ）及びインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）における（図１０Ｄ）ＴｂｐＢのトランスロケーションが、必要とされるＳＬＡＭタンパク質の共発現を必要とすることを実証している（Ｓｌａｍ  ｉｓ  ａｎ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄａｔｅｄ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ．Ｈｏｏｄａ  Ｙ，Ｌａｉ  ＣＣ，Ｊｕｄｄ  Ａ，Ｂｕｃｋｗａｌｔｅｒ  ＣＭ，Ｓｈｉｎ  ＨＥ，Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎ  ＳＤ，Ｍｏｒａｅｓ  ＴＦ．Ｎａｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１６  Ｆｅｂ  ２９；１：１６００９）。
【０１６６】
実施例７−欠如したＳＬＡＭ遺伝子を含むナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）株の菌力の低下
Ｇｏｒｒｉｎｇｅ  Ａ．Ｒ．，Ｒｅｄｄｉｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｖｏｅｔ  Ｐ．ａｎｄ  Ｐｏｏｌｍａｎ  Ｊ．Ｔ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６６，２４１（Ｊａｎ  １，２００１））及びＪｏｈｓｗｉｃｈ，Ｋ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８０，２３４６（Ｊｕｌ  １，２０１２））によって記載されるように、敗血症モデリングを実施した。６匹の８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の群に、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｂ１６Ｂ６、Ｂ１６Ｂ６  Δｔｂｐｂ、またはＢ１６Ｂ６  Δｎｍｂ０３１３を腹腔内注射により接種した（Ｎ＝２の独立した実験）。接種原を調製するために、感染用の細菌株を、ＧＣ寒天上で一晩増殖させ、再懸濁し、次いで１０ｍｌのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地中で振とうしながら３７℃で４時間増殖させた。最終的な各５００μｌ接種原が、１×１０６コロニー形成単位及び１０ｍｇヒト・ホロトランスフェリンを含有するように、培養物を調整した。マウスを、感染の４８時間前から始まり感染の４８時間後まで、少なくとも１２時間ごとに、重量、臨床症状、及び菌血症の変化についてモニターした。マウスを、以下の臨床症状の重症度に基づいて０〜２の尺度で採点した：身づくろい、姿勢、目及び鼻の外観、呼吸、脱水症、下痢、いわれのない挙動、ならびに誘発された挙動。評価項目基準に達した動物を、人道的に安楽死させた。動物実験は、トロント大学の動物倫理審査委員会に従って行われた。
【０１６７】
図７は、得られた結果を示している。図７Ａは、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定されまたはＳＤＳで溶解され、ニトロセルロース上にスポットされ、及びα−ＴｂｐＢ抗体でプローブされた、Ｎ．ｍｅｎ細胞からなる固相結合アッセイを示している。ΔＳＬＡＭ／ｔｎ５は、トランスポゾン挿入により獲得されたＳＬＡＭ欠損細胞の元の株を指す。ΔＳＬＡＭは、ＳＬＡＭ  ＯＲＦをカナマイシン耐性カセットで置き換えることによって獲得された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）におけるＳＬＡＭのノックアウトを記載する。図７Ｂは、Ｎｍ細胞がＳＬＡＭ欠損（ΔＳＬＡＭ）である場合のみの、ＴｂｐＢ、ＬｂｐＢ、及びｆＨｂｐの分解を示したプロテイナーゼＫ消化アッセイを示している。単独で及びＳＬＡＭとともに個々のＳＬＰを発現するＮｍ細胞をプロテイナーゼＫとともにインキュベートし、ウェスタンブロットを用いて、プロテアーゼ消化の有無（−／＋）での３種すべてのＳＬＰレベルのレベルを検出した。フローサイトメトリーを用いて、ΔＳＬＡＭ細胞が、細胞表面にＴｂｐＢ（図７Ｃ）またはｆＨｂｐ（図７Ｄ）を呈示し得ないことを確認した。ＴｂｐＢ及びｆＨｂｐに対する抗体を用いて、表面曝露されたＳＬＰに結合させ、その後にフィコエリスリンに連結されたα−ウサギ抗体とのインキュベーションが続いて、蛍光を提供した。各サンプルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒのＦＬ２検出器を用いて測定した。野生型細胞から獲得されたシグナルを、ノックアウト細胞からのシグナルとの比較のために１００％に設定した。エラーバーは、３回の実験からの平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。様々な株を用いた、マウス感染の結果が図７Ｅに示されている。マウスに、１×１０６ＣＦＵの野生型髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｂ１６Ｂ６、ＴｂｐＢのノックアウト（ΔｔｂｐＢ）と合わせたＢ１６Ｂ６、またはｎｍｂ０３１３  Δｓｌａｍのノックアウトと合わせたＢ１６Ｂ６を腹腔内注射により感染させ、感染前４８時間から始まり感染後４８時間まで、１２時間ごとに生存及び疾患症状についてモニターし、ならびに感染後３時間の時点でさらにモニターした。生存の統計的な差を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク検定（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５）によって査定した（＊ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．有意でない）。これらの結果は、ｎｍｂ０３１３  Δｓｌａｍ株のノックアウトに感染したマウスにおける感染後死亡率の著しい低下を示している。
【０１６８】
実施例８−パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）における新規なＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質の同定
ＳＬＡＭホモログを同定する所与の細菌種に対するゲノムを選択する際、完全にシーケンシングされたゲノムを含有する参照ゲノムを優先した。ＳＬＡＭホモログを、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）と近縁の種からより遠縁の種まで、反復Ｂｌａｓｔ検索を用いて同定した。これらの種において同定されたＳＬＡＭホモログのそれぞれに対して、対応するゲノム記録（ＮＣＢＩゲノム）を用いて、それらの対応する機能注釈に沿って上流及び下流にある遺伝子を同定した（ＮＣＢＩタンパク質データベース、Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ）。小数例において、ＳＬＡＭ遺伝子の上流または下流に遺伝子は予測されず、というのもそれらはコンティグの開始または終点に近すぎるためであり、ゆえにこれらの配列は無視された。
【０１６９】
近隣遺伝子を、１）Ｎ末端リポボックスモチーフ（ＬｉｐｏＰ、ＳｉｇｎａｌＰを用いて予測される）、及び２）溶質結合タンパク質、Ｔｂｐ様（ＩｎｔｅｒＰｒｏシグネチャー：ＩＰＲまたはＩＰＲ０１１２５０）、またはｐａｇＰ−βバレル（ＩｎｔｅｒＰｒｏシグネチャー：ＩＰＲ０１１２５０）の折り畳みについて分析した。それらが当該エレメントを含有する場合、本発明者らは、当該近接遺伝子を潜在的なＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質として同定した。
【０１７０】
ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＳＬＡＭを検索として用いて、推定ＳＬＡＭ（ＰＭ１５１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８７）をパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）において同定した。推定ＳＬＡＭ（ＰＭ１５１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８７）は、未知の機能を有する新たに予測されたリポタンパク質遺伝子（ＰＭ１５１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８３）に近接していた（図１１Ａ）。推定ＳＬＡＭは、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  ＳＬＡＭ１と３２％の同一性を呈示したが、一方でＳＬＰは、公知のＳＬＡＭ依存的ナイセリア（ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）ＳＬＰとの配列類似性を示さなかった。
【０１７１】
推定ＳＬＡＭ（ＰＭ１５１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８７）及びその近接リポタンパク質（ＰＭ１５１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８３）を、前に記載されるように、それぞれｐＥＴ２６ｂ及びｐＥＴ５２ｂ内にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３に形質転換し、ならびにカナマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）及びアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）を補充されたＬＢ寒天上で一晩増殖させた。
【０１７２】
細胞を自動誘導培地中にて３７Ｃで１８時間増殖させ、次いで収穫し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ中で２回洗浄し、及びα−Ｆｌａｇ（１：２００、Ｓｉｇｍａ）で４Ｃにて１時間標識した。次いで、細胞を、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで、Ｒ−ＰＥ共役α−マウスＩｇＧ（２５ｕｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４Ｃにて１時間標識した。染色後、細胞を２％ホルムアルデヒド中で２０分間固定し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳでさらに洗浄した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでフローサイトメトリーを実施し、ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いて結果を分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、少なくとも３回の反復を用いて算出し、それを用いて推定ＳＬＡＭ（ＰＭ１５１５）を含有するまたは欠くいずれかの株におけるリポタンパク質の表面曝露を比較した。それらは図１１Ｃ及び図１１Ｄに示されている。ＰＭ１５１４は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面で検出され得、ｉ）ＳＬＡＭを用いてＳＬＰを同定し得ること、及びｉｉ）これらのＳＬＰを細胞の表面へトランスロケーションさせるためにＳＬＡＭが必要とされることが例示され、ゆえに、「ＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質」と呼ばれるタンパク質のクラスが同定された。精製されたＰｍＳＬＰ（ＰＭ１５１４）に対して抗体を作り上げ、当該タンパク質は、ＰＫシェービングアッセイによりパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）の表面にあることが示された。
【０１７３】
実施例９−ＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質のトランスロケーションモチーフの同定、及びＳＬＡＭ特異性における役割
用いられた最小ドメイン及びドメイン入れ替え構築物は、ｐＥＴＤＵＥＴ  ＨｐｕＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９９）、ＴｂｐＢ  Ｎローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９５）、ＴｂｐＢ  Ｃローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９７）、及びＴｂｐＢ  Ｎローブ−ＨｐｕＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０１）であった。成熟ＨｐｕＡを増幅し、ＴｂｐＢのシグナルペプチドとインフレームで挿入し、及びｐＥＴＤＵＥＴ  ＴｂｐＢにおけるＴｂｐＢ遺伝子の残りを同時に置き換えて、制限フリークローニングを用いてｐＥＴＤＵＥＴ  ＨｐｕＡを創出した。アンカーペプチド（アミノ酸１〜４０）、ＴｂｐＢのＮローブ（アミノ酸４１〜３３１）、及びＴｂｐＢのＣローブ（アミノ酸３３２〜５７９）を、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｂ１６Ｂ６  ＴｂｐＢ構築物（ＰＤＢ  ＩＤ  ４ＱＱ１）に基づいて解析した。Ｎローブ構築物をインバースクローニングを用いてクローニングして、ｐＥＴＤＵＥＴ  ＴｂｐＢを鋳型として用いてＴｂｐＢのＮ及びＣローブの間に終止コドンを挿入した。ＴｂｐＢのＣローブ構築物を制限フリークローニングを用いてクローニングして、ｐＥＴＤＵＥＴ  ＴｂｐＢ  Ｎローブに挿入し及びＴｂｐＢ  Ｎローブを同時に置き換えた。Ｃローブを、アンカーペプチドとインフレームで挿入した。制限フリークローニングによりＨｐｕＡ（アミノ酸２〜最後）をｐＥＴＤＵＥＴ  ＴｂｐＢ  ＮローブのＮローブとインフレームで挿入することによって、融合構築物ｐＥＴＤＵＥＴ  ＴｂｐＢ  Ｎローブ−ＨｐｕＡをクローニングした。ｐＥＴＤＵＥＴ  ＴｂｐＢを鋳型として用いたＦａｓｔＣｌｏｎｉｎｇにより、ポリ−Ａｌａ変異を創出した。ＳＬＡＭ１またはＳＬＡＭ２のいずれかを含有するベクターを用いた。
【０１７４】
プラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｃ４３（ＤＥ３）細胞に形質転換し、自動誘導培地中にて３７Ｃで１８時間増殖させた。細胞を収穫し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳ中で２回洗浄し、及びα−ＴｂｐＢ抗体（１：２００、ウサギ血清）またはビオチン化ヒトトランスフェリン（０．０５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）のいずれかで４Ｃにて１時間標識した。次いで、細胞を、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳで２回洗浄し、次いで、Ｒ−ＦＩＴＣ共役α−ウサギＩｇＧ（２５ｕｇ／ｍl、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４Ｃにて１時間標識した。染色後、細胞を２％ホルムアルデヒド中で２０分間固定し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有するＰＢＳでさらに洗浄した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒでフローサイトメトリーを実施し、ＦＬＯＷＪＯソフトウェアを用いて結果を分析した。平均蛍光強度を、少なくとも３回の反復を用いて算出し、それを用いて、種々の株間で所定のＳＬＰの表面曝露を比較した。ＴｂｐＢのＣローブは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面へのＳＬＡＭ１依存的なトランスロケーションに必要とされるように思われ（図１２Ｂ）、一方でＮローブは、重大な役割を果たさないように思われる。加えて、ＴｂｐＢ  Ｎローブに融合したＨｐｕＡの使用は、ＳＬＡＭ１からＳＬＡＭ２へＳＬＡＭ依存性を推移させる（図１２Ｃ〜Ｅ）。
【０１７５】
上記の方法論を用いて、８本のβバレル鎖のうちの４本が、表面リポタンパク質の表面呈示において重要にプローブされた。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）  ＴｂｐＢのβバレル鎖のうちの２本の変異、Ｂ３０鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０７）及びＢ３１鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０９）は、ＴｂｐＢの表面発現に必要とされることが示された（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）。
【０１７６】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、カタル球菌（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、及びアクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＴｂｐＢからのＣローブの、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）及びナイセリア・ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）由来のＬｂｐＢのＣローブの、ならびに髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、及びクレブシエラ・デニトリフィカンス（Ｋ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のＨｐｕＡからの、８本鎖バレルドメインの最後の２本の鎖に対して、多重配列アライメントを実施した。図１３Ｅに示されるように、Ｂ３０鎖は、保存された［Ｌ／Ｍ］ＧＧｘ［Ｆ／Ｉ／Ｖ］配列を有することが示され、Ｂ３１鎖は、保存されたφｘ［Ａ／Ｔ／Ｖ］ＦＧ［Ａ／Ｇ］配列を有するように思われる。
【０１７７】
実施例１０−アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）における新規なＳＬＡＭ依存的表面リポタンパク質の同定
アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は日和見病原体であり、集中治療患者及び免疫欠陥があるまたは基礎疾患を有する者において疾患を引き起こす（Ｃａｍｐ，Ｃ．＆Ｔａｔｕｍ，Ｏ．Ｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４１，６４９−６５７（２０１０））。アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は、肺炎、敗血症、及び尿路感染症など、多様な臨床兆候を引き起こす。それは、戦闘地帯の病院で軟部組織感染症を引き起こすことで悪名を得ている。多剤耐性アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は、治療する医師に重大な課題を課し、ヒト健康に脅威を課す、というのもアシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は、診療所で用いられる抗生物質の多くに対して耐性があるためである（Ｃａｍｐ，Ｃ．＆Ｔａｔｕｍ，Ｏ．Ｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４１，６４９−６５７（２０１０））。
【０１７８】
元のクエリー配列としてＮｍＳＬＡＭを用いた反復ｂｌａｓｔ検索を用いて、アシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）における遺伝子クラスターにおいて、ＳＬＡＭ様タンパク質（ＡｂＳＬＡＭ）を同定した（図１４Ａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７７及び１１７８）。この遺伝子クラスターは、鉄獲得に関与する遺伝子を検索する間にＡｎｔｕｎｅｓらによって初めに発見されたものの、ＳＬＡＭ遺伝子は、仮想タンパク質として間違った注釈を付された（Ａｎｔｕｎｅｓ，Ｌ．Ｃ．Ｓ．，Ｉｍｐｅｒｉ，Ｆ．，Ｔｏｗｎｅｒ，Ｋ．Ｊ．＆Ｖｉｓｃａ，Ｐ．Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６２，２７９−２８４（２０１１））。ＳＬＡＭ遺伝子に近接して、未知の機能のリポタンパク質をコードする遺伝子（ＡｂＳＬＰ）がある。この予測は、当該タンパク質のＮ末端におけるリポボックスモチーフ（ＬＶＡＣ）の存在によって支持される。
【０１７９】
本発明者らは、ＡｂＳＬＰが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において外因的に発現し得、ＡｂＳＬＡＭと共発現させた場合にのみ細胞表面に局在することを、フローサイトメトリーを用いて実証した（図１４Ｂ）。さらには、ＡｂＳＬＰの構造を、Ｘ線結晶学によって解明した（図１４Ｃ）。ＡｂＳＬＰは、８本の逆平行β鎖からなるＮ末端のβ−ハンドル、及びＣ末端の８本鎖β−バレルから構成される。当該構造は、ＡｂＳＬＰが、公知のＳＬＡＭ依存的ＳＬＰ（ＴｂｐＢ、ＬｂｐＢ、ＨｐｕＡ）の構造と高い構造類似性を有するヘム結合タンパク質であることを示している（図１Ｂ〜Ｃ及び図２）。ＡｂＳＬＰをそのＳＬＡＭとともに発現させることは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＡｂＳＬＰの表面呈示につながる（図１４Ｂ）。ＡｂＳＬＰに対する抗体が作り上げられ、プロテイナーゼＫシェービングによって、ＡｂＳＬＰがアシネトバクター・バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）（ＬＡＣ４）の表面に位置することを例示している（図１４Ｄ）。
【０１８０】
近接ＳＬＡＭ遺伝子の存在による新規なＳＬＰであるＡｂＳＬＰの発見は、ＳＬＡＭ遺伝子に近接して位置する潜在的ワクチン抗原ＳＬＰを同定するＳＬＡＭの実用性を例示している。
【０１８１】
本開示は、好ましい例であると現時点で見なされるものを参照して記載されているが、本開示は、開示される例に限定されるわけではないことが理解されるべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲の内に含まれる様々な改変及び同等の編成を網羅することを意図される。
【０１８２】
すべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照によりその全体として組み入れられることを具体的に及び個々に示されているかと同程度に、参照によりそれらの全体として本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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