(57)【要約】  本発明は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体を含んでなるかもしくはそれからなるポリペプチド、ならびに医薬における、特に癌の予防および／または治療におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない前記ポリペチドの機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチド。
【請求項２】
前記機能的に等価な変異体が、配列番号１のポリペプチドに対して１種またはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入または付加から生じる任意のポリペプチドであるか、または配列番号１のポリペプチドの化学的修飾から生じ、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の腫瘍抑制活性を実質的に保存する任意のポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチドからなるものであるか、または配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体からなるものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号３のポリペプチドからなるものである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１の８９位の残基Ｘがセリンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４からなる、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１の８９位の残基Ｘがアラニンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ａ．請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体と、
ｂ．前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する化学的部分と
を含んでなるコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する前記化学部分が細胞透過性ペプチド配列であり、該細胞透過性ペプチド配列と前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体とが融合タンパク質を形成する、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記細胞透過性ペプチド配列が、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３８）およびＲＲＲＲＲＲＬＲ（配列番号３９）からなる群から選択されるものである、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
更なる核局在化シグナルをさらに含んでなる請求項８〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲートであって、特に該核局在化シグナルが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）およびＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号７）からなる群から選択されるものである、コンジュゲート。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項８〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、または請求項１３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１５】
薬学的有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、または請求項１４に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
医薬における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の宿主細胞、または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
癌の予防および／または治療における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のベクター、請求項１４に記載の宿主細胞、または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記癌が膠芽腫および非小細胞肺癌からなる群から選択されるものである、請求項１７に記載の使用のための前記ポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体、前記コンジュゲート、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記宿主細胞または前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の分野に関し、より具体的には、ポリペプチド、組成物、ならびに医薬における、特に癌の予防および／または治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
理想的な抗癌剤は、腫瘍の維持に継続的に必要であるが、いかなる正常組織の維持および機能にも不要な非冗長性の機能を標的とすべきである。それゆえ、最も一般的な論理は、これらの突然変異分子が癌の「ドライバー」と考えられ、おそらく正常組織にとってそれほど重要ではないということに基づき、癌において特異的に突然変異している遺伝子産物を標的とすることである。これらの理由から、特定の種類の癌における再発性病変の分類に多くの注意が向けられている。残念ながら、このアプローチにはいくつかの問題がある。第一に、ほとんどの固形ヒト癌はゲノム不安定性のエピソードを通過し、「ドライバー」突然変異と、それらに付随するエフェクター経路とを不明瞭にし得る突然変異ノイズを示す。第二に、癌は、複数の進化的ボトルネックを介した移動を伴うプロセスの最終結果である。各ボトルネックには特定の種類の突然変異が必要とされ得るが、その後、その機能は腫瘍の維持には不要であり、結果的に腫瘍の進化におけるその時点以降の優れた治療標的ではない。
【０００３】
Ｍｙｃは、成長制御および癌に関与する基本的なヘリックスーループーヘリックスロイシンジッパー（ｂ−ＨＬＨ−ＬＺ）タンパク質であり、これは構造的に関連するタンパク質Ｍａｘ、ＭａｄおよびＭｎｔとネットワークで機能する。Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体は遺伝子転写を活性化し、細胞増殖またはアポトーシスを誘発する。Ｍａｄ／ＭａｘおよびＭｎｔ／Ｍａｘ複合体はリプレッサーとして作用し、細胞増殖停止および分化を引き起こす。すべての二量体は、同じＤＮＡコンセンサス部位、ＣＡＣＧＴＧ  Ｅ―ボックスを認識する。
【０００４】
Ｍｙｃは正常細胞では厳密に制御されており、そのレベルは増殖細胞中ではより高くて非増殖細胞中ではより低い。異常に高いおよび／または制御解除されたＭｙｃ活性は、ほとんどの癌に因果関係があるとされており、攻撃的、低分化および血管由来の腫瘍に関連していることが多い。Ｍｙｃ発現の制御解除は、遺伝子増幅による過剰発現、転写制御の喪失、分解の抑制または安定化の増大によるものである。これは異常な増殖、生存率の増大、代謝の変化、血管新生および炎症をもたらし、これらはすべて癌の主要な特徴を表す。多数の研究が腫瘍形成の細胞内および細胞外の側面を支配する上でのＭｙｃの重要な役割を立証しており、その機能を標的とすることが、治療的に価値があることを示唆している。
【０００５】
ＢＥＴブロモドメインインヒビターによるＭｙｃの下方制御は複数の腫瘍型の後退をもたらすことが知られている。このアプローチは優れた可能性を示しているが、毒性および多数のオフターゲット効果などの、いくつかの制限がある。Ｍｙｃ／Ｍａｘ相互作用を乱す多くの小分子がｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏで低い特異性を示した。
【０００６】
しかしながら、Ｍｙｃ阻害剤はまだ臨床的に利用可能となっておらず、その設計は種々の警告を提示している。第一に、Ｍｙｃは核転写因子であり、その結果、これは膜または細胞質分子よりも到達することが困難である。第二に、Ｍｙｃは標的となり得る酵素的「活性部位」を持たない。第三に、Ｍｙｃファミリーは３つの異なるタンパク質、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃを含み、これらは特定の条件では機能的に冗長であるので、それらのすべてが同時阻害を必要とする。さらに、Ｍｙｃ阻害は正常組織の増殖を阻害することによって重篤な副作用を誘発することが懸念されている。これらすべての理由から、Ｍｙｃ阻害薬を作ることは困難である。
【０００７】
Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｙｃのｂ−ＨＬＨ−ＬＺドメインを含み、Ｍｙｃのロイシンジッパーに４つのアミノ酸置換を含むドミナントネガティブＭＹＣ突然変異体である（Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，２４６３−２４７２；Ｓｏｕｃｅｋ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：３５０７−３５１０）。アミノ酸置換Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４Ｑ、およびＲ７５Ｎは、改変された二量体化特異性をタンパク質に付与し、このタンパク質は、その天然のパートナーＭａｘに結合し、それ自体とホモ二量体を形成するほかに、野生型ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃともヘテロ二量体を形成する能力を保持する。
【０００８】
これらの特性のために、Ｏｍｏｍｙｃは、ＭｙｃがそのＤＮＡ認識結合部位であるＥボックスに結合する能力を無効にすることによって、インビトロおよびインビボの両方でＭｙｃ依存性遺伝子トランス活性化機能を妨げることができる。同時に、Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｙｃ発現レベルに依存してＭｙｃ誘発アポトーシスを強く増強し、それによってＭｙｃ転写抑制活性を強化する。したがって、Ｏｍｏｍｙｃは、Ｍｉｚ−１依存性のプロモーターへの結合および転写抑制を保持しながら、ＭｙｃのプロモーターＥボックスへの結合および標的遺伝子のトランス活性化を妨げる。Ｏｍｏｍｙｃの存在下では、Ｍｙｃインタラクトームは抑制に導かれ、その活性は前発癌性から腫瘍抑制性へと変わる。
【０００９】
欧州特許出願公開第２８０１３７０号明細書においては、Ｏｍｏｍｙｃペプチド自体が細胞膜を横切って効率的に形質導入して核に移動することができ、それがその腫瘍抑制効果を発揮することが実証された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、癌の治療のための新規で改良された治療アプローチを開発することが最新技術において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の簡単な概要
第一の態様において、本発明は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチドを指す。
【００１２】
第二の態様において、本発明は、
ａ．本発明によるポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体と、
ｂ．前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する化学的部分と
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【００１３】
第三の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドまたは本発明によるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
第四の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。
【００１５】
第五の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【００１６】
第六の態様において、本発明は、薬学的有効量の本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクターまたは本発明による宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１７】
第七の態様において、本発明は、医薬における使用のための、本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞または本発明による医薬組成物に関する。
【００１８】
第八の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療における使用のための、本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞または本発明による医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞生存率アッセイは、ＯｍｏＣＳ（Ｃ８９Ｓの変化を含む）が低濃度でＯｍｏｍｙｃよりも効率的にＵ８７悪性神経膠腫細胞（Ａパネル）およびＡ５４９肺腺癌細胞（Ｂパネル）の増殖を阻害することを示す図である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｐｏ）は効果が一切ない。Ｔ検定を用いて統計的有意性を計算した。＊＊＝Ｐ＜０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１。
【図２】細胞密度アッセイは、ＯｍｏＣＡ（Ｃ９８Ａ変化を含む）が低濃度でＯｍｏＣＳ（Ｃ９８Ｓの変化を含む）と同程度に効率的にＡ５４９肺腺癌細胞の増殖を阻害することを示す図である。リポフェクタミン（Ｌｉｐｏ）は効果が一切ない。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは、８９位のシステインがセリンで置き換えられている配列番号１のポリペプチド（ＯｍｏＣＳと命名される）が、Ｏｍｏｍｙｃよりも効率的にその腫瘍抑制効果を発揮することができることを見出した（実施例１）。この腫瘍抑制効果は、配列番号１の８９位のシステインが他のアミノ酸で置き換えられた場合に維持される。実施例２は、８９位のシステインがアラニンで置き換えられている配列番号１のポリペプチド（ＯｍｏＣＡと命名される）が、ＯｍｏＣＳと同じ腫瘍抑制効果を有することを示す。
【００２１】
本発明のポリペプチド
したがって、第一の態様において、本発明は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチド、または配列番号１の８９位のＸがシステインではない前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチドに関する。
【００２２】
配列番号１は、以下に相当する。
【化１】
2019525753.tif 000002
【００２３】
配列番号１のポリペプチドはＯｍｏｍｙｃタンパク質配列に対応するが、８９位の残基Ｘはシステインではない。本明細書で用いられる「Ｏｍｏｍｙｃ」という用語は、Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎ突然変異を有するＭｙｃタンパク質のｂＨＬＨＺｉｐドメインの突然変異型からなるポリペプチドを指す（ここで、突然変異位置のナンバリングは、２０１５年３月１５日公開のＮＣＢＩデータベースにおける受託番号ＮＰ＿００２４５８の下で定義されるポリペプチドのアミノ酸３６５〜４５４個に対応するＭｙｃ領域の配列に関連して与えられる）。ＮＣＢＩデータベースに受託番号ＮＰ＿００２４５８で提供されるｃ−Ｍｙｃの配列を以下に示し（配列番号５）、その中でＯｍｏｍｙｃが由来する領域には下線を引いて示している：
【化２】
2019525753.tif 000003
【００２４】
本明細書で用いられる「Ｍｙｃ」という用語は、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−ＭｙｃおよびＬ−Ｍｙｃを含む転写因子のファミリーを指す。Ｍｙｃタンパク質は、コンセンサス配列ＣＡＣＧＴＧ（エンハンサーボックス配列またはＥボックス）への結合およびヒストンアセチル−トランスフェラーゼまたはＨＡＴの動員を介して多くの遺伝子の発現を活性化する。しかしながら、Ｍｙｃは転写抑制因子としても作用する。Ｍｉｚ−１転写因子を結合してｐ３００共活性化因子を置き換えることで、ＭｙｃはＭｉｚ−１標的遺伝子の発現を阻害する。ＭｙｃはＤＮＡ複製の制御においても直接的な役割を果たす。
【００２５】
Ｍｙｃ  ｂ−ＨＬＨ−ＬＺまたはＭｙｃ塩基性領域ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパードメインは、Ｍａｘタンパク質とのＭｙｃ二量体化およびＭｙｃ標的遺伝子への結合を決定する領域を指す。この領域は、ヒトＭｙｃのアミノ酸３６５〜４５４個に対応し、ループでつながれた２つのアルファヘリックスによって特徴付けられる（Ｎａｉｒ，Ｓ．Ｋ．，＆  Ｂｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｋ．，２００３，Ｃｅｌｌ，１１２：１９３−２０５）。
【００２６】
好ましい実施形態において、配列番号１のポリペプチドを含んでなるポリペプチドは、以下に示す配列番号３を含むか、該配列番号３からなるか、または配列番号３から本質的になる：
【化３】
2019525753.tif 000004
【００２７】
これに関連して、「〜から本質的になる」は、特定の分子が、配列番号３の活性を変化させる任意の追加の配列を含まないことを意味する。
【００２８】
本発明は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１を含んでなるポリペプチド、該配列番号１からなるポリペプチド、または該配列番号から本質的になるポリペプチドに関する。腫瘍抑制効果をもたらす突然変異が保存されているという条件で、前記ポリペプチドは、当該技術分野において公知の任意のＭｙｃタンパク質のｂＨＬＨＺｉｐドメインに由来することができる。したがって、本発明において使用することができるポリペプチドは、家庭用動物および農用動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたは齧歯動物）、霊長類およびヒトを含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物種に由来することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒトＭｙｃタンパク質（２０１５年３月１５日公開の受託番号ＮＰ＿００２４５８）に由来する。
【００２９】
好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチド、または前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体からなるポリペプチドに関する。
【００３０】
本発明によれば、配列番号１の８９位の残基は、システイン以外の任意のアミノ酸であってもよい。
【００３１】
本明細書で用いられる「システイン」は、式ＨＯ２ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＳＨを有するアミノ酸に関する。それはコドンＵＧＵおよびＵＧＣによってコードされている。この用語は非天然システインも含む。
【００３２】
システインは、ホモ二量体型のＯｍｏｍｙｃにおいてジスルフィド結合を形成することができ、それゆえ、他の任意のアミノ酸に対するその突然変異は、ジスルフィド結合形成の不能をもたらすことになり、ＯｍｏＣＳによって得られるのと同じ効能特性をもたらすはずである。したがって、配列番号１の８９位の残基は、システイン以外の任意の天然アミノ酸、非天然アミノ酸または合成アミノ酸、特に本発明のポリペプチドの他の単量体と架橋してホモ二量体を形成することができなかった任意のアミノ酸であってもよい。
【００３３】
「アミノ酸」または「残基」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号のいずれかによって言及することができる。
【００３４】
アミノ酸という用語は、天然に存在するアミノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ）、珍しい天然アミノ酸および非天然（合成）アミノ酸を含む。アミノ酸は、好ましくはＬ配置であるが、Ｄ配置、またはＤおよびＬ配置のアミノ酸の混合物も考えられる。
【００３５】
「天然アミノ酸」という用語は、脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）、ヒドロキシル化アミノ酸（セリンおよびスレオニン）、硫化アミノ酸（メチオニン）、ジカルボン酸およびそれらのアミド（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグルタミン）、２つの塩基性基を有するアミノ酸（リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）ならびに環状アミノ酸（プロリン）を含む。１つの実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘは脂肪族アミノ酸である。別の実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘは硫化アミノ酸である。別の実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘはジカルボキシルアミノ酸またはそれらのアミドである。別の実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘは、２つの塩基性基を有するアミノ酸である。別の実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘは芳香族アミノ酸である。別の実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘは環状アミノ酸である。好ましい実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘはヒドロキシル化アミノ酸、好ましくはセリンである。好ましい実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘは、セリン、トレオニンおよびアラニンから選択される、好ましくはセリンおよびアラニンから選択されるアミノ酸である。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「非天然アミノ酸」という用語は、アミン基で置換され、構造的に天然アミノ酸に関連しているカルボン酸、またはその誘導体を指す。修飾アミノ酸または珍しいアミノ酸の例示的で非限定的な例には、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンが含まれる。
【００３７】
珍しいアミノ酸の例示的で非限定的な例は、ヒドロキシリジンおよびヒドロキシプロリン、チロキシン、Ｎ−メチルアルギニンおよびｎ−アセチルリジンである。
【００３８】
好ましい実施形態において、８９位の残基Ｘは、本発明のポリペプチドの他の単量体と架橋してホモ二量体対を形成することができなかった他の任意のアミノ酸である。
【００３９】
本発明のポリペプチドのより好ましい実施形態において、配列番号１の８９位の残基はアミノ酸セリンである。
【００４０】
本明細書で用いられる「セリン」は、ヒトにおいてコドンＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵおよびＡＧＣによってコードされた２−アミノ−３−ヒドロキシプロパン酸に関する。この用語は、非限定的な例として、リン酸化またはスルホン化セリンなどの修飾セリン、Ｎ−ベンゾイル−（２Ｒ，３Ｓ）−３−フェニルイソセリン、Ｄ−シクロセリン、Ｌ−イソセリン、フェニルセリンを含む。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２に示される配列を含んでなる：
【化４】
2019525753.tif 000005
【００４２】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号４からなるか、または配列番号４から本質的になる：
【化５】
2019525753.tif 000006
【００４３】
本発明のポリペプチドのより好ましい実施形態において、配列番号１の８９位の残基はアミノ酸アラニンである。
【００４４】
本明細書で用いられる「アラニン」は、ヒトにおいてコドンＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、およびＧＣＧによってコードされた２−アミノプロパン酸に関する。この用語は、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニンなどの修飾アラニンも含む。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６３に示される配列を含んでなる：
【化６】
2019525753.tif 000007
【００４６】
別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号６４からなるか、または配列番号６４から本質的になる：
【化７】
2019525753.tif 000008
【００４７】
「機能的に等価な変異体」という用語は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１を指す場合、配列番号１のポリペプチドに対して１種またはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入または付加から生じる任意のポリペプチド、または配列番号１のポリペプチドの化学的修飾から生じ、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の腫瘍抑制活性を実質的に保存する、好ましくはＯｍｏＣＳの腫瘍抑制活性を実質的に保存する任意のポリペプチドを指す。腫瘍抑制活性の保存には、変異体がＭｙｃおよび／またはその絶対パートナーｐ２１／ｐ２２Ｍａｘと二量体化し、Ｍｙｃ活性が核内に見出されたらそれを阻害することと、変異体が細胞膜を横切って転位することができることと、変異体が核膜を横切って移行することができることとが必要であると当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドの機能的に等価な変異体は、Ｏｍｏｍｙｃｙよりも少なくホモ二量体化するか、またはジスルフィド橋の形成によってホモ二量体に強いられない。特に、本発明のポリペプチドのホモ二量体形態におけるジスルフィド橋形成は、ポリペプチドＯｍｏＭｙｃにおける形成よりも少ない。
【００４８】
本明細書で用いられる「低ホモ二量体化」は、還元条件下であっても本発明のポリペプチドの絶対ホモ二量体を形成する能力が低いことに関する。好ましい実施形態において、その能力は、Ｏｍｏｍｙｃのホモ二量体を形成する能力よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％低い。本明細書で用いられる還元条件は、レドックス化学反応において別の化学種に電子を供与する化合物である還元剤の存在に関する。還元剤の例示的で非限定的な例は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、ｂ−メルカプトエタノールまたはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）である。ホモ二量体の量はインビトロで同じであることと、本発明のポリペプチドとＯｍｏｍｙｃとの間の相違は、ジスルフィドの不在がヘテロ二量体の潜在的により高い形成を可能にするヘテロ二量体化パートナーの存在下の細胞にのみ存在することとが可能である。
【００４９】
円偏光二色性によって監視される熱変性による例示的で非限定的な例を手段として、ペプチドのホモ二量体化を決定するためにいくつかのアッセイを使用することができ、そのため二量体化はフォールディングおよび熱安定性定量化によって検出することができる。
【００５０】
機能的に等価な適切な変異体には、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチドから本質的になるポリペプチドが含まれる。
【００５１】
これに関連して、「〜から本質的になる」は、特定の分子が、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の活性を変化させる任意の追加の配列を含まないことを意味する。
【００５２】
標的ペプチドの適切な機能的変異体は、約２５％超のアミノ酸配列同一性、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列番号１のペプチド（好ましくはＯｍｏＣＳ、配列番号４）に対してある程度の同一性を示すものである。２種のポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピューターアルゴリズムおよび方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、これまでに記載されているＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いることで決定される［ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３−４１０］。好ましい実施形態において、配列同一性は、配列番号１のポリペプチドの全長にわたって、もしくは変異型の全長にわたって、またはその両方にわたって決定される。
【００５３】
本発明のポリペプチドの機能的に等価な変異体には、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、ミリストイル化、タンパク質分解プロセシングなどの翻訳後修飾も含まれることができる。
【００５４】
あるいは標的ペプチドの適切な機能的変異体は、本発明のポリペプチド内の１つ以上の位置が上記のタンパク質中に存在するアミノ酸の保存的置換であるアミノ酸を含むものである。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸を、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えることから生じる。例えば、以下の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。そのような保存的アミノ酸置換の選択は、当業者の技術の範囲内であり、例えば、Ｄｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９９，２１７；７２１−７３９）およびＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１９８６，１１９：２０５−２１８）によって記載されている。
【００５５】
好ましい実施形態において、配列番号１の機能的に等価な変異体の全配列は、システインアミノ酸を含まない。配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体は、ヒトｃ−Ｍｙｃに由来するＯｍｏｍｙｃに見出される突然変異Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎに対応する位置に突然変異を含むことが理解されるであろう。機能的に等価な変異体において前記突然変異が生じなければならない位置は、異なるＭｙｃ配列の多重配列アラインメントにより決定することができ、ヒトｃ−Ｍｙｃ由来のＯｍｏｍｙｃの配列内の位置６１、６８、７４および７５に対応するそれらの位置のアラインメントにより同定することができる。
【００５６】
多重配列アラインメントは、一度に３つ以上の配列を組み込むためのペアワイズアラインメントを拡張したものである。多重アラインメント方法は、所与のクエリセットにおけるすべての配列を整列させる。好ましい多重配列アラインメントプログラム（およびそのアルゴリズム）は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ２ＷまたはＣｌｕｓｔａｌＷ  ＸＸＬである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３−４６８０参照）。本明細書に記載されるように、異なる生物由来のｃ−Ｍｙｃの配列と変異体の配列とを比較する（整列させる）と、当業者は容易に、Ｏｍｏｍｙｃに見出される位置Ｅ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎに対応する各配列内の位置を同定することができ、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の変異体内に、ヒトｃ−Ｍｙｃに由来するＯｍｏｍｙｃに見出されるＥ６１Ｔ、Ｅ６８Ｉ、Ｒ７４ＱおよびＲ７５Ｎ突然変異に対応する突然変異を導入することができる。
【００５７】
ポリペプチドが、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体と見なすことができるかどうかを決定するための適切なアッセイには、限定するものではないが、以下のものが含まれる：
−  ＭａｘおよびＭｙｃと二量体複合体を形成するポリペプチドの能力を測定するアッセイ、例えば、Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８，１７：２４６３−２４７２）に記載されるレポーター遺伝子の発現に基づくアッセイならびにＰＬＡ（タンパク質ライゲーションアッセイ）または共免疫沈降法。
−  ポリペプチドがＤＮＡ内のＭｙｃ／Ｍａｘ認識部位（ＣＡＣＧＴＧ部位）に結合する能力を測定するアッセイ、例えばＳｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載される電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。
−  Ｍｙｃ誘発トランス活性化を抑制する能力を測定するアッセイ、例えばＳｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されるＭｙｃ／Ｍａｘに特異的なＤＮＡ結合部位の制御下でのレポーター遺伝子の発現に基づくアッセイ。
−  Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載される、遺伝子産物またはポリペプチドがｍｙｃ癌遺伝子を発現する細胞の増殖を阻害する能力に基づくアッセイ。
−  ポリペプチドがｍｙｃ誘発アポトーシスを増強する能力を測定するアッセイ、例えばＳｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されるアッセイ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９８：１７，２４６３−２４７２）。さらに、細胞中のアポトーシスを評価するための当該技術分野において一般的に知られている任意のアッセイ、例えばヘキスト染色、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはアネキシンＶ染色、トリパンブルー、ＤＮＡラダーリング／フラグメンテーションおよびＴＵＮＥＬなどを用いることができる。
【００５８】
好ましい実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体には、１つ以上、好ましくは以下のすべての特徴を持つ配列が含まれる：Ｍｙｃと二量体化し、その活性を阻害し、細胞膜を横切って移動し、核に移動することができること、Ｏｍｏｍｙｃと比較してホモ二量体を形成することができないか、またはホモ二量体をあまり形成することができないこと、本発明のポリペプチドをコードする１２．５ｎＭ  ｍＲＮＡの量で、Ｏｍｏｍｙｃよりも低い、実施例１で行ったインビトロアッセイにおける細胞生存率。好ましい実施形態において、本発明の機能的に等価な変異体は、本発明のポリペプチドをコードする１２．５ｎＭ  ｍＲＮＡの量で、Ｏｍｏｍｙｃよりも低い、実施例１で行ったインビトロアッセイにおける細胞生存率を媒介する配列に対応する。
【００５９】
好ましい実施形態において、ポリペプチドが、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体と見なされるのは、それが、上記アッセイの１つ以上において、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の活性（好ましくはＯｍｏＣＳの活性）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である活性を示す場合である。
【００６０】
さらに、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体は、その変異体が細胞と接触した後に前記細胞に形質導入することもできる。
【００６１】
好ましい実施形態において、ポリペプチドが、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体と見なされるのは、それが、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１（好ましくはＯｍｏＣＳ、配列番号４として）と同じくらい効率的に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％で標的細胞を形質導入することができる場合である。
【００６２】
さらに、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体は、標的腫瘍細胞の核に移動することもできる。
【００６３】
好ましい実施形態において、ポリペプチドが、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体と見なされるのは、それが、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１（好ましくはＯｍｏＣＳ、配列番号４として）と同じくらい効率的に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％で標的腫瘍細胞の核に移動することができる場合である。
【００６４】
ポリペプチドが、細胞膜を横切って核に移動するその能力に関して、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体であるかどうかを決定するための適切なアッセイには、ポリペプチドに特異的な試薬および細胞の核を特異的に標識する色素（例えばＤＡＰＩまたはＨｏｅｃｈｓｔ色素）による細胞の二重標識が含まれる。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの検出は、共焦点顕微鏡または蛍光顕微鏡によって行われる。
【００６５】
配列番号１の本発明のポリペプチドは、配列ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＦ（配列番号５５）を有するｃ−ＭｙｃのＭ２ドメインも含み（Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８，８：４０４８−４０５４参照）、これは核局在化シグナルに対応する。
【００６６】
別の好ましい実施形態において、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体は、配列番号５５の配列を含んでなる。
【００６７】
本明細書で用いられる「核局在化シグナル」という用語は、長さが約４〜２０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列を指し、これはタンパク質を核に指向するのに役立つ。典型的には、核局在化配列は、塩基性アミノ酸が豊富であり、例示的な配列は当該技術分野において周知である（Ｇｏｒｌｉｃｈ  Ｄ．（１９９８）ＥＭＢＯ  ５．１７：２７２１−７）。
【００６８】
いくつかの実施形態において、ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号６）、ヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ、配列番号７）、ＣＢＰ８０  ＮＬＳ（ＲＲＲＨＳＤＥＮＤＧＧＱＰＨＫＲＲＫ、配列番号８）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖタンパク質ＮＬＳ（ＲＱＡＲＲＮＲＲＲＷＥ、配列番号９）、ＨＴＬＶ−１  Ｒｅｘ（ＭＰＫＴＲＲＲＰＲＲＳＱＲＫＲＰＰＴ、配列番号１０）、ｈｎＲＮＰ  Ａ  ＮＬＳ（ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＫＰＲＮＱＧＧＹ、配列番号１１）、ｒｐＬ２３ａ  ＮＬＳ（ＶＨＳＨＫＫＫＫＩＲＴＳＰＴＦＴＴＰＫＴＬＲＬＲＲＱＰＫＹＰＲＫＳＡＰＲＲＮＫＬＤＨＹ、配列番号１２）からなる群から選択される。本発明の１つの実施形態において、核局在化シグナルは、モチーフＫ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号１３）を含んでなる。
【００６９】
さらに、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない機能的に等価な配列番号１の変異体は、変異体が細胞と接触した後に形質導入細胞の核に到達することができる。配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１の機能的に等価な変異体は、配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインまたは別の機能的ＮＬＳではない配列番号１に見出されるＮＬＳを含むことが理解されるであろう。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１に見出される天然のＮＬＳを含まず、配列番号１に見出される前記ＮＬＳを置き換える別の機能的ＮＬＳまたは本発明のポリペプチドの他の任意の部分を含む。
【００７０】
本発明のコンジュゲート
別の態様において、本発明は、
ａ）本発明によるポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体と、
ｂ）前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する化学的部分と
を含んでなるコンジュゲートに関する。
【００７１】
本明細書で用いられる「コンジュゲート」という用語は、各化合物の機能がコンジュゲートにおいて保持されるように互いに共有結合している２種以上の化合物を指す。
【００７２】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートは、ポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０個またはそれ以上の化学的部分を含んでなる。
【００７３】
１つの実施形態において、ポリペプチドの細胞内取り込みを促進する化学的部分は、脂質または脂肪酸である。
【００７４】
脂肪酸は、一般的に、鎖の末端に酸性部分（例えばカルボン酸）を有する炭素鎖を含む分子である。脂肪酸の炭素鎖は、任意の長さであってもよいが、炭素鎖の長さは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の炭素原子分であって、そこから導き出される任意の範囲であることが好ましい。特定の実施形態において、炭素鎖の長さは、脂肪酸の鎖部分の４〜１８個の炭素原子である。特定の実施形態において、脂肪酸炭素鎖は、奇数の炭素原子を含んでいてもよいが、鎖中の偶数の炭素原子が特定の実施形態において好ましい場合もある。その炭素鎖中に単結合のみを含む脂肪酸は飽和と呼ばれ、他方で、その鎖中に少なくとも１つの二重結合を含む脂肪酸は不飽和と呼ばれる。脂肪酸は分岐していてもよいが、本発明の好ましい実施形態においては分岐していない。具体的な脂肪酸には、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、アラキドン酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
好ましい実施形態において、ポリペプチドの細胞取り込みを促進する化学的部分は、細胞透過性ペプチド配列であり、その場合、コンジュゲートは、本発明のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体と、細胞透過性ペプチド配列とを含んでなる融合タンパク質である。
【００７６】
「融合タンパク質」という用語は、異なるタンパク質に由来する２つ以上の機能的ドメインからなる遺伝子技術によって生成されたタンパク質に関する。融合タンパク質は、従来の手段によって、例えば、適切な細胞中の前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子発現によって得ることができる。細胞透過性ペプチドは、配列番号１のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体の一部を形成する細胞透過性ペプチドとは異なる細胞透過性ペプチドを指すことが理解されるであろう。
【００７７】
「細胞透過性ペプチド配列」という用語は、本明細書において、「ＣＰＰ」、「タンパク質形質導入ドメイン」または「ＰＴＤ」と互換的に用いられる。それは細胞内のタンパク質の輸送を指向する可変長のペプチド鎖を指す。細胞内への送達プロセスは一般的にエンドサイトーシスによって起こるが、ペプチドは直接膜移動によって細胞内に内在化することもできる。ＣＰＰは、典型的には、高い相対存在量の正荷電アミノ酸、例えばリジンもしくはアルギニンを含むアミノ組成物、または極性／荷電アミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸との交互パターンを含む配列を有するアミノ酸組成物のいずれかを有する。本発明において使用することがＣＰＰの例には、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質ＣＰＰ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号１４）中に見出される、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＶＰ２２  ＤＮＡ−結合タンパク質（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ；配列番号１５）中に見出されるＣＰＰ、Ｂａｃ−７（ＲＲＩＲＰＲＰＰＲＬＰＲＰＲＰＲＰＬＰＦＰＲＰＧ；配列番号１６）のＣＰＰ、アミノ酸４９〜５７個からなるＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１７）のＣＰＰ、アミノ酸４８〜６０個（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＴＰＱ；配列番号１８）、アミノ酸４７〜５７個（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１９）、Ｓ４１３−ＰＶペプチド（ＡＬＷＫＴＬＬＫＫＶＬＫＡＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号２０）のＣＰＰ、ペネトラチン（ＲＱＩＫＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；配列番号２１）のＣＰＰ、ＳｙｎＢ１（ＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ；配列番号２２）のＣＰＰ、ＳｙｎＢ３（ＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ；配列番号２３）のＣＰＰ、ＰＴＤ−４（ＰＩＲＲＲＫＫＬＲＲＬＫ；配列番号２４）のＣＰＰ、ＰＴＤ−５（ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ；配列番号２５）のＣＰＰ、ＦＨＶ  Ｃｏａｔ−（３５−４９）（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ；配列番号２６）のＣＰＰ、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ；配列番号２７）のＣＰＰ、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ；配列番号２８）のＣＰＰ、Ｄ−Ｔａｔ（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ；配列番号２９）のＣＰＰ、Ｒ９−Ｔａｔ（ＧＲＲＲＲＲＲＲＲＲＰＰＱ；配列番号３０）のＣＰＰ、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＬＡＬＡＬＫＬＡ；配列番号３１）のＣＰＰ、ＳＢＰ（ＭＧＬＧＬＨＬＬＶＬＡＡＡＬＱＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号３２）のＣＰＰ、ＦＢＰ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ；配列番号３３）のＣＰＰ、ＭＰＧ（ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号３４）のＣＰＰ、ＭＰＧ（ＥＮＬＳ）（ａｃ−ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号３５）のＣＰＰ、Ｐｅｐ−１（ａｃ−ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号３６）のＣＰＰ、Ｐｅｐ−２（ａｃ−ＫＥＴＷＦＥＴＷＦＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ−ｃｙａ；配列番号３７）のＣＰＰ、構造ＲＮを有するポリアルギニン配列（ここで、Ｎは４〜１７である）、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（配列番号３８）、ＲＲＲＲＲＲＬＲ配列（配列番号３９）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ配列（配列番号４０）；Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ配列番号４１）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号４２）；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号４３）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（配列番号４４）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ配列（配列番号４５）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ配列（配列番号４６）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ配列（配列番号４７）；ＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ配列（配列番号４８）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
好ましい実施形態において、前記細胞透過性ペプチドは、配列番号１に含まれる内因性のものではない。
【００７９】
好ましい実施形態において、ＣＰＰは、アミノ酸４９〜５７個からなるＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号４９）のＣＰＰである。別の好ましい実施形態において、ＣＰＰは、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列（配列番号５０）またはＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５１）である。
【００８０】
１つの実施形態において、細胞透過性ペプチド配列は、本発明のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体のＮ末端に融合している。別の実施形態において、細胞透過性ペプチドは、本発明のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体のＣ末端に融合している。
【００８１】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートまたは融合タンパク質は、配列番号１のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体に見出されるそれ自体の細胞透過性ペプチドに加えて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０種以上の追加の細胞透過性ペプチドを含む。
【００８２】
本発明の適切な融合タンパク質には、以下に定義されるポリペプチドＯｍｏＣＳ＊ＴＡＴおよびＯｍｏＣＳ＊ＬＺＡｒｇが含まれる。
【００８３】
【表１】
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【００８４】
別の好ましい実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質は、本発明のポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体を含み、さらにＮ末端またはＣ末端の核局在化シグナルを含む。
【００８５】
当業者は、融合タンパク質が、本発明のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、細胞透過性ペプチド配列および／またはＮＬＳを連結する１種またはそれ以上の柔軟なペプチドをさらに含むことが望ましいこともあることを理解するであろう。したがって、特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、細胞透過性ペプチド配列に直接連結している。別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、柔軟なペプチドを介して細胞透過性ペプチド配列に連結している。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＮＬＳに直接結合している。別の実施形態において、本発明のポリペプチドは、柔軟なペプチドを介してＮＬＳに連結している。
【００８６】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、細胞透過性ペプチド配列およびＮＬＳに直接連結している。
【００８７】
１つの実施形態において、ＮＬＳは、Ｍ１ペプチド（ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ、配列番号５４）またはＭ２ペプチド（ＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＦ、配列番号５５）などのＭｙｃ配列に内因的に出現するＮＬＳの１つである。
【００８８】
別の実施形態において、追加のＮＬＳは、配列番号１のポリペプチドまたはそのポリペプチドの機能的に等価な変異体に見られる内因性ＮＬＳとは異なるＮＬＳを指す。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明によるコンジュゲートまたは融合タンパク質は、本発明のポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体に見られる内因性ＮＬＳに加えて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０種のＮＬＳを含む。
【００９０】
別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、第一の柔軟なペプチドリンカーを介して細胞透過性ペプチド配列に連結しており、第二の可撓性ペプチドリンカーを介してＮＬＳに連結している。
【００９１】
本明細書で用いられる「柔軟なペプチド」、「スペーサーペプチド」または「リンカーペプチド」という用語は、２つのタンパク質または部分を共有結合するが、いずれかのポリペプチドの一部ではなく、タンパク質または部分のいずれかの機能に実質的な有害な影響を引き起こすことなく、一方を他方に対して移動させることを可能にする。したがって、柔軟なリンカーは、ポリペプチド配列の腫瘍抑制活性、細胞透過性ペプチドの細胞透過性活性、またはＮＬＳの核局在化能力に影響を及ぼさない。
【００９２】
柔軟なペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１４個のアミノ酸、少なくとも１６個のアミノ酸、少なくとも１８個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも４５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、柔軟なペプチドは、タンパク質の溶解度を増大させるためにおよび／またはその活性を改善するために、一方のタンパク質を他方に対して移動させることを可能にする。適切なリンカー領域には、ポリグリシン領域、グリシン、プロリンおよびアラニン残基の組み合わせのＧＰＲＲＲＲ配列（配列番号５６）が含まれる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、とりわけ、蛍光基、ビオチン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸類似体、非天然アミノ酸、リン酸基、グリコシル基、放射性同位元素標識、および医薬分子を含む追加の化学的部分を含み得る。他の実施形態において、異種ポリペプチドは、とりわけ、ケトン、アルデヒド、Ｃｙｓ残基およびＬｙｓ残基を含む１個以上の化学反応性基を含み得る。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質は、コンジュゲート、または前記融合タンパク質もしくは前記ポリペプチドの変異体のＣ末端もしくはＮ末端ドメインに結合したタグを含む。前記タグは、一般的に、前記融合タンパク質の単離または精製に使用することができるペプチドまたはアミノ酸配列である。したがって、前記タグは、１つ以上のリガンド、例えば、クロマトグラフィー支持体またはビーズなどの親和性マトリックスの１つ以上のリガンドに高い親和性で結合することができる。前記タグの例は、ヒスチジンタグ（ＨｉｓタグまたはＨＴ）、例えばヒスチジンの６つの残基（Ｈｉｓ６またはＨ６）を含むタグであり、これはニッケル（Ｎｉ２＋）またはコバルト（Ｃｏ２＋）のカラムに高い親和性で結合することができる。Ｈｉｓタグは、ほとんどのタンパク質を変性させ、ほとんどのタンパク質間相互作用を破壊する条件下でそのリガンドに結合することができるという望ましい特徴を持つ。したがって、それは、餌が関与したタンパク質間相互作用の破壊に続けてＨ６でタグ付けされた餌タンパク質を除去するために使用することができる。
【００９５】
融合タンパク質を単離または精製するのに有用なタグの追加の例示的で非限定的な例には、Ａｒｇタグ、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号５７）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号５８）、抗体によって認識され得るエピトープ、例えば（抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって認識される）ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号５９）、Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号６０）、ＳＢＰ−タグ、Ｓ−タグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡ、Ａｖｉ−タグなど（Ｔｅｒｐｅ  Ｋ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３、６０：５２３−５２５）、ＡＨＧＨＲＰ（配列番号６１）またはＰＩＨＤＨＤＨＰＨＬＶＩＨＳＧＭＴＣＸＸＣ（配列番号６２）、β−ガラクトシダーゼなどのアミノ酸配列が含まれる。
【００９６】
所望される場合、タグを前記融合タンパク質の単離または精製に使用することができる。
【００９７】
本発明のポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
別の態様において、本発明によるポリペプチドまたは本発明によるコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００９８】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために互換的に用いられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類似体を含み得る。ヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知または未知の任意の機能を果たすことができる。「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。本発明の核酸分子は、天然核酸分子に加えて、修飾核酸分子を含んでいてもよい。本明細書で用いられるｍＲＮＡは、細胞中で翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００９９】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
【０１００】
ｍＲＮＡは化学的に合成することができ、インビトロ転写によって得ることができ、または標的細胞中でｉｎ  ｖｉｖｏで合成することができる。本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを形成するヌクレオチド配列は、その発現のための同じ正しい読み枠内にある。
【０１０１】
別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。
【０１０２】
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、細胞内で前記配列を転写および翻訳した後に本発明のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドが生成されるように必要な配列を含む核酸配列を指す。前記配列は、対象宿主細胞中でその自律複製を提供する追加のセグメントに作動可能に連結している。好ましくは、ベクターは発現ベクターであり、これは、宿主細胞中の自律複製の領域に加えて、本発明の核酸に作動可能に連結しており、本発明による核酸の産物の発現を増強することができる領域を含むベクターとして定義される。本発明のベクターは、当該技術分野において広く知られている技術によって得ることができる。
【０１０３】
ベクターの例には、ウイルスベクター、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドを含む適切なベクターは、原核生物、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体における発現ベクター、ｐ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージおよび「シャトル」ベクター、例えばｐＳＡ３およびｐＡＴ２８、酵母における発現ベクター、例えば２ミクロンプラスミド型のベクター、組み込みプラスミド、ＹＥＰベクター、動原体プラスミドおよび類似のもの、昆虫細胞における発現ベクター、例えばｐＡＣシリーズおよびｐＶＬシリーズのベクター、植物における発現ベクター、例えばシリーズｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥおよび類似のもの、ならびにウイルスベクター（アデノウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスに関連するウイルス、特にレンチウイルス）に基づく上位真核生物細胞における発現ベクターのほかに、非ウイルスベクター、例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬ、ｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１である。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｐＥＧＦＰまたはｐＢａｂｅレトロウイルスベクターおよびｐＴＲＩＰＺまたはｐＳＬＩＫレンチウイルスベクターからなる群より選択されるベクターに含まれる。
【０１０４】
本発明のベクターは、前記ベクターによって形質転換、トランスフェクトまたは感染させることができる細胞を形質転換、トランスフェクトまたは感染させるために使用することができる。前記細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。
【０１０５】
ベクターは、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドの発現を調節する配列に作動的に結合した本発明のポリヌクレオチドを含んでなる。本発明において使用される調節配列は、核プロモーター、あるいは異種核酸配列の発現を増大させるエンハンサー配列および／または他の調節配列であってもよい。原則として、ポリヌクレオチドが発現されるべき細胞と適合性である限り、任意のプロモーターを本発明において使用することができる。したがって、本発明を実現するのに適したプロモーターには、構成的プロモーター、例えば、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ、トリ肉腫ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどの真核生物ウイルスゲノムの誘導体、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１α遺伝子プロモーター、ならびにタンパク質発現が分子または外因性シグナルの付加に依存する誘導プロモーター、例えばテトラサイクリン系、ＮＦκＢ／ＵＶ光系、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系および熱ショック遺伝子プロモーター、国際公開第２００６／１３５４３６号に記載されている調節可能なＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターおよび組織特異的プロモーターが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１０６】
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含んでなる宿主細胞に関する。
【０１０７】
本発明において適切な細胞は、哺乳動物、植物、昆虫、真菌および細菌細胞を含むが、これらに限定されない。細菌細胞には、バチルス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属由来の種などのグラム陽性細菌由来の細胞、ならびにエシェリヒア属およびシュードモナス属由来の細胞などのグラム陰性細菌由来の細胞が含まれるが、これらに限定されない。真菌細胞には、好ましくは、サッカロミセス、ピキアパストリスおよびハンセヌラポリモルファなどの酵母細胞が含まれる。昆虫細胞には、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が含まれるが、これらに限定されない。植物細胞には、とりわけ、穀物、薬用植物もしくは観賞用植物などの作物細胞、または球根由来のものが含まれる。本発明に適した哺乳動物細胞には、上皮細胞株（ブタなど）、骨肉腫細胞株（ヒトなど）、神経芽細胞腫細胞株（ヒトなど）、上皮癌腫（ヒトなど）、グリア細胞（マウスなど）、肝細胞株（サルなど）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、ヒトＮＴＥＲＡ−２  ＥＣＣ細胞、ｍＥＳＣ株由来のＤ３細胞、非ヒト胚性幹細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、２９３Ｔ、ＲＥＨおよびＭＣＦ−７細胞ならびにｈＭＳＣ細胞が含まれる。
【０１０８】
前述の用語および実施形態はすべて、本発明のこの態様にも等しく適用可能である。
【０１０９】
本発明の医薬組成物
別の態様において、本発明は、薬学的有効量の本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクターまたは本発明による宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【０１１０】
本発明で使用される場合、「医薬組成物」という表現は、細胞、細胞群、器官、組織または細胞分裂が制御されていない動物組織、例えば癌に所定用量の１種またはそれ以上の治療上有用な薬剤を投与するのに適した製剤に関する。
【０１１１】
本明細書で使用される「薬学的有効量」という表現は、治療効果をもたらすことができる量として理解され、それは当業者によって一般的に使用される手段によって決定することができる。本発明による医薬組成物中で組み合わせることができる本発明のポリペプチドもしくはその機能的に等価な変異体、本発明のコンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクターもしくは宿主細胞または抗腫瘍性化合物の量は、対象および特定の投与方法に依存して異なる。当業者は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９６），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩ，ｐｐ．１７０７−１７１１およびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ＩＩ，ｐｐ．４７５−４９３からのガイダンスを用いて投与量を決定することができることも理解するであろう。
【０１１２】
医薬組成物中の有効成分の適切な投与量は、治療される癌の種類、疾患の重症度および経過、組成物が予防目的または治療目的のどちらで投与されるか、薬歴、患者の病歴およびペプチドまたはポリペプチドに対する応答、ならびに担当医の裁量に依存する。本発明のポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体、本発明のコンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の量は、一度にまたは一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、適切な投与量レベルは、一般的に、１日に患者の体重１ｋｇあたり約０．０１〜５００ｍｇであり、これは単回または複数回投与で投与することができる。好ましくは、投与量レベルは、１日当たり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１日当たり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。適切な投与量レベルは、１日あたり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日あたり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１日あたり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投与量は、１日当たり０．０５〜０．５、０．５〜５または５〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。経口投与のためには、組成物は、好ましくは、治療される患者への投与量の対症療法的調整のために有効成分１．０〜１０００ミリグラム、特に有効成分１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０および１０００．０ミリグラムを含有する錠剤の形態で提供される。化合物は、１日当たり１〜４回、好ましくは１日当たり１回または２回の投与計画で投与することができる。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、１種またはそれ以上の追加の薬学的に許容される賦形剤も含有する。「薬学的に許容される賦形剤」は、有効成分を組み込むために使用されると言われる治療上不活性な物質と理解され、それは薬理学的／毒物学的観点から患者にとってや、組成、製剤、安定性、患者の受け入れおよび生物学的利用能に関する物理的／化学的観点からそれを製造する製薬化学者にとって許容可能である。賦形剤または担体は、医薬組成物中の有効成分の送達および有効性を改善するのに役立つ任意の物質も含む。薬学的に許容される担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、ならびにそれらの組み合わせ物が含まれる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容される担体は、融合タンパク質または医薬組成物の一部を形成する組成物の貯蔵寿命または有効性を向上させる、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含み得る。適切な担体の例は、文献でよく知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５参照）。担体の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、およびマルチトールなどの一連の糖類；コーンスターチ、小麦スターチ、ライススターチ、およびポテトスターチなどの一連のスターチ；セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびヒドロキシルプロピルメチルセルロースなどの一連のセルロース；ならびにゼラチンおよびポリビニルピロリドンなどの一連の充填剤であるが、これらに限定されない。場合によっては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加してもよい。
【０１１４】
薬学的に許容される賦形剤の数および性質は所望の剤形に依存する。薬学的に許容される賦形剤は当業者に知られている（Ｆａｕｌｉ  ｙ  Ｔｒｉｌｌｏ  Ｃ．（１９９３）「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ」，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，Ｍａｄｒｉｄ）。前記組成物は、最新技術において知られている従来の方法（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００３）Ｇｅｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＵＳ）によって調製することができる。
【０１１５】
核酸分子である作用物質を含む医薬組成物については、核酸分子は、核酸、ならびに例えば本明細書に提供される組換え発現構築物などの細菌、ウイルスおよび哺乳動物の発現系を含む、当業者に公知の様々な送達系のいずれかの中に存在していてもよい。そのような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は当業者に周知である。ＤＮＡは、例えば、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−４９，１９９３に記載され、Ｃｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２，１９９３で概説されているように「ｎａｋｅｄ」であってもよい。ｎａｋｅｄ  ＤＮＡの取り込みは、細胞内に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡをコーティングすることによって増大する。
【０１１６】
核酸分子は、当該技術分野において記載されるいくつかの方法のうちのいずれか１つに従って細胞内に送達することができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９（１９９２）；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５，Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９−４０（１９９９）；Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５−９２（１９９９）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４−９２（２０００）；米国特許第６，３９５，７１３号明細書；国際特許出願公開番号ＷＯ９４／０２５９５；Ｓｅｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：８５３−５９（２０００）；Ｓｅｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２３：１０３−１２（２００２）；米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号明細書および同２００３／０７７８２９号明細書参照）。当業者に知られているそのような送達方法には、リポソームへのカプセル化、イオントフォレシスによるもの、または生分解性ポリマー；ヒドロゲル；シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−７４（１９９９）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願公開番号ＷＯ０３／４７５１８および同ＷＯ０３／４６１８５）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡミクロスフェア（ペプチドおよびポリペプチドおよび他の物質の送達にも有用）（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号明細書；米国特許出願公開第２００２／１３０４３０号明細書参照）；生分解性ナノカプセル；ならびに生体接着性ミクロスフェアなどの他の賦形剤中への組み込みによるもの、またはタンパク質性ベクター（国際出願公開番号ＷＯ００／５３７２２）によるものが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、免疫細胞における免疫応答を変化させる（抑制または増強する）のに使用するための核酸分子および免疫学的疾患または障害を治療するための核酸分子は、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えばポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書も参照のこと）と配合または複合体化することもできる。
【０１１７】
好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物または医薬組み合わせ物は、一緒にまたは別々に抗腫瘍剤をさらに含む。
【０１１８】
本明細書で使用される「抗腫瘍剤」は、腫瘍を治療するかまたはその形成を妨げる前記の生物学的または化学的化合物として理解される。好ましい実施形態において、前記抗腫瘍剤は、細胞傷害剤、抗血管新生剤、抗転移剤および抗増殖剤からなる群から選択される。
【０１１９】
本発明で使用される「細胞傷害剤」という用語は、細胞死を促進することができ、増殖を減少させる能力、増殖を停止させる能力、または細胞、特に急速に増殖する細胞、とりわけ腫瘍細胞を破壊する能力を有する薬剤に関する。細胞死は、例えばアポトーシスなどの任意のメカニズムによって引き起こされ得るが、代謝阻害、細胞骨格の組織化の妨害またはＤＮＡの化学的修飾によるこの原因に限定されない。細胞傷害剤という用語は、有機小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドなどを含む任意の化学療法剤；毒素；酵素；サイトカイン；放射性同位元素または放射線療法剤を含む。
【０１２０】
「抗血管新生剤」は、新しい血管の形成、すなわち血管新生を阻害または減少させる化学的または生物学的物質として理解される。
【０１２１】
本発明の第一の態様によるポリペプチドまたは本発明の第二の態様による融合タンパク質と共に使用することができる抗血管新生剤には、パクリタキセル、２−メトキシエストラジオール、プリノマスタット、バチマスタット、ＢＡＹ  １２−９５６６、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＣ−１０８８、デキストロメトルファン酢酸、ジメチルキサンテノン酢酸、エンドスタチン、ＩＭ−８６２、マリマスタット、ペニシラミン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４、ＲＰＩ．４６１０、スクアラミンラクテート、ＳＵ５４１６、サリドマイド、コンブレタスタチン、タモキシフェン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、ＳＵ６６６８、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｍｅｄｉ−５２２（Ｖｉｔａｘｉｎ  ＩＩ）、ＣＡＩ、インターロイキン１２、ＩＭ８６２、アミロリド、アンジオスタチン、Ｋｌ−３アンジオスタチン、Ｋｌ−５アンジオスタチン、カプトプリル、ＤＬ−α−ジフルオロメチルオルニチン、ＤＬ−α−ジフルオロメチルオルニチンＨＣｌ、エンドスタチン、フマギリン、ハービマイシンＡ、４−ヒドロキシフェニルレチナミド、ジュグロン、ラミニン、ラミニンヘキサペプチド、ラミニンペンタペプチド、ラベンダスチンＡ、メドロキシプロゲステロン、ミノサイクリン、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、スラミン、トロンボスポンジン、血管新生促進因子に対する抗体（例えば、アバスチン、エルビタックス、ベクティビックス、ハーセプチン）；血管新生促進性長因子の低分子量チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、タルセバ、ネクサバール、ステント、イレッサ）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えばトリセル）；インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１２、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤（例えば、ＣＯＬ３、マリマスタット、バチマスタット）；ＺＤ６４７４、ＳＵ１１２４８、ビタキシン；ＰＤＧＦＲ阻害剤（例えばグリベック）；ＮＭ３および２−ＭＥ２；シレンギチドなどのシクロペプチドからなる群から選択される抗血管新生剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２２】
「抗転移剤」は、癌を引き起こす細胞の転移、すなわち、基本的にリンパ流または血流による距離の伝播、および転移の目的部位における新しい腫瘍の増殖を阻害または低減する化学的または生物学的物質として理解される。
【０１２３】
「抗増殖剤」は、腫瘍の形成または成長を防止または阻害することができる化学的または生物学的物質として理解される。抗増殖薬には、（ｉ）代謝拮抗物質、例えば葉酸代謝拮抗物質（アミノプテリン、デノプテリン、メトトレキセート、エダトレキセート、トリメトレキセート、ノラトレキセド、ロメトレキソール、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、ピリトレキシム、プテロプテリン、ロイコボリン、１０−プロパルギル−５，８−ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、プリン類似体（クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）およびピリミジン類似体（カペシタビン、シタラビンもしくはａｒａ−Ｃ、デシタビン、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、フロクスリジンおよびゲムシタビン）；（ｉｉ）天然物、例えば抗腫瘍抗生物質および有糸分裂阻害剤、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンなどのビンカアルカロイド；タキサン、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））；コルヒチン（ＮＳＣ  ７５７）、チオコルヒチン（ＮＳＣ  ３６１７９２）、コルヒチン誘導体（例えばＮＳＣ  ３３４１０）、およびアロコルヒチン（ＮＳＣ  ４０６０４２）；ハリコンドリンＢ（ＮＳＣ  ６０９３９５）；ドラスタチン１０（ＮＳＣ  ３７６１２８）；マイタンシン（ＮＳＣ  １５３８５８）；リゾキシン（ＮＳＣ  ３３２５９８）；エポチロンＡ、エポチロンＢ；ディスコデルモライド；エストラムスチン；ノコダゾール；（ｉｉｉ）ホルモンおよびその拮抗物質、例えばタモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、アルゾキシフェン、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、ナホキシジン、フルベストラント、アミノグルテチミド、テストラクトン、アタメスタン、エキセメスタン、フェドロゾール、フォルメスタン、レトロゾール、ゴセレリン、ロイプロレリンまたはロイプロリド、ブセレリン、ヒストレリン、メゲストロールおよびフルオキシメステロン；（ｉｖ）生物学的物質、例えばウイルスベクター、インターフェロンアルファおよびインターロイキン；（ｖ）白金系化合物、例えばカルボプラチン、シスプラチン［シス−ジアミンジクロロ白金（ＣＤＤＰ）］、オキサリプラチン、イプロプラチン、ネダプラチン、四硝酸トリプラチン、テトラプラチン、サトラプラチン（ＪＭ２１６）、ＪＭ１１８［シスアンミンジクロロ（ＩＩ）］、ＪＭ１４９［シスアンミンジクロロ（シクロヘキシルアミン）トランスジヒドロキソ白金（ＩＶ）］、ＪＭ３３５［トランスアンミンジクロロジヒドロキソ白金（ＩＶ）］、トランスプラチン、ＺＤ０４７３、シス，トランス，シス−Ｐｔ（ＮＨ３）（Ｃ６Ｈ１１ＮＨ２）（ＯＯＣＣ３Ｈ７）２Ｃｌ、マロン酸−１，２−ジアミノシクロヘキサノ白金（ＩＩ）、５−スルホサリチル酸−トランス−（１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）（ＳＳＰ）、ポリ−［（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金］−カルボキシアミロース（ＰＯＬＹ−ＰＬＡＴ）および４−ヒドロキシ−スルホニルフェニルアセテート（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ��（ＳＡＰ）など、ならびに（ｖｉ）ＤＮＡアルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネートおよびトリアゼンであって、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標））、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ピポブロマン、メルファラン（Ｌ−サルコリジン）、クロラムブシル、メクロレタミンまたはムスチン、ウラムスチンまたはウラシルマスタード、ノベンビシン、フェノステリン、トロスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、クロロゾトシン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、チオテパ、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、プロカルバジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２４】
抗腫瘍剤を含有する本発明による医薬組成物または組み合わせ物の場合、組成物は、単一製剤として（例えば、一定量の各成分を含む錠剤またはカプセル剤として）提示することができるが、他方で、後で共同投与、逐次投与、または別々の投与のために組み合わせるために別々の製剤として提示することもできる。本発明の組成物または組み合わせ物には、成分は別々に配合されているが同じ容器に包装されているキットオブパーツとしての製剤も含まれる。当業者は、本発明による第二の医薬組成物の場合の異なる成分の製剤が類似していてもよく、言い換えれば（錠剤または丸剤で）同様に配合されていてもよく、それにより同じ経路でそれらの投与が可能になることを理解するであろう。本発明の異なる成分が別々に配合される場合、２つの成分はブリスター中に存在し得る。各ブリスターは、日中に消費されなければならない薬物を含有する。薬物を１日に数回投与しなければならない場合、各投与に対応する薬物をブリスターの異なる部分に入れることができ、薬物が投与されるべき時刻をブリスターの各部分に記録することが好ましい。あるいは本発明の組成物の成分は、異なる成分が異なる形で投与されるように異なる形で配合することができる。したがって、第一の成分はその経口投与用に錠剤またはカプセル剤として配合され、第二の成分はその静脈内投与用に配合されるか、またはその逆であることが可能である。本発明による第二の医薬組成物中で使用される組成物の一部である成分間の比は、特定の各場合において使用される抗腫瘍剤のほかに所望の適応症に応じて、当業者によって調整されることができる。したがって、本発明は、２つの成分の量の間の比が、５０：１〜１：５０、特に２０：１〜１：２０、１：１０〜１０：１、または５：１〜１：５の範囲であり得る組成物を想定している。
【０１２５】
本発明の医薬組成物または組み合わせ物は、所望の剤形の製剤に必要な薬学的に許容される賦形剤が含まれるように、経口経路、局所経路、吸入または非経口経路などの任意の種類の適切な経路によって投与することができる。前記医薬組成物の好ましい投与経路は静脈内経路である。
【０１２６】
「経口経路」は、嚥下後に生物中に組み込まれる医薬組成物として理解される。特定の実施形態において、本発明の医薬組成物は、それが固体であろうと液体であろうと、経口経路によるその投与に適した剤形にすることができる。経口経路によるそれらの投与に適した剤形は、錠剤、カプセル剤、シロップ剤または溶液剤であることができ、結合剤、例えばシロップ剤、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトールまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば乳糖、糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトールもしくはグリシン；圧縮用の潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えばデンプン、ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウムもしくは微結晶セルロース；または薬学的に許容される湿潤剤、ラウリル硫酸ナトリウムなどの当該技術分野において公知の任意の従来の賦形剤を含み得る。固体経口組成物は、混合、充填または圧縮の従来のプロセスによって調製することができる。反復混合操作を使用して、大量の充填剤を使用する組成物中に活性剤を完全に分配することができる。前記操作は、当該技術分野において慣例的である。錠剤は、例えば湿式または乾式造粒によって調製することができ、場合により通常の薬務において知られているプロセスに従って、特に腸溶コーティングでそれらをコーティングすることができる。
【０１２７】
他方で、「局所経路」は、非全身経路による投与として理解され、本発明の医薬組成物の表皮上、口腔内への外用ならびに前記組成物の耳、眼および鼻への点滴注入を含み、この場合、組成物が血流に著しく入ることはない。「全身経路」は、経口経路、静脈内経路、腹腔内経路および筋肉内経路による投与として理解される。「吸入」は、鼻腔内経路による投与および経口吸入による投与として理解される。前記投与に適した剤形、例えばエアロゾル製剤または定量吸入器を、従来の技術によって調製することができる。１つの実施形態において、投与経路は鼻腔内経路である。
【０１２８】
本明細書で使用される「非経口」という用語は、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路または皮下経路による投与を含む。非経口投与の皮下、筋肉内および静脈内投与形態が一般的に好ましい。
【０１２９】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、適切な単位剤形の滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥製品などのそれらの非経口投与に適合させることができる。その注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（それらが水に可溶である場合）、または滅菌注射用溶液もしくは分散液の即時調製用の分散液および滅菌粉末が含まれる。静脈内経路によるその投与のために、いくつかの適切な担体には、リン酸で緩衝化された食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、注射が容易に可能になる点まで流動性でなければならない。組成物は製造および貯蔵条件において安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、薬学的に許容されるポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合に必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサールなどによって達成することができる。ほとんどの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール；または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって引き起こされ得る。
【０１３０】
注射用滅菌溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて前述の成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み入れ、続けて滅菌膜を介した濾過で滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体および前で列挙したものの中から必要とされる残りの成分を含有する滅菌賦形剤に組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製プロセスは真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分に加えて予め濾過されたその滅菌溶液からの任意の所望の追加成分を有する粉末を生じる。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、例えば組成物の用量を減少させながら、パルス注入によって適切に投与することができる。好ましくは、用量は、注射、より好ましくは静脈内または皮下注射によって投与されるが、投与が急性または慢性であるかに部分的に依存する。
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明の第一または第二の医薬組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化投与システムを含む制御放出製剤など、身体からの急速な排出から前記ポリペプチドを保護する担体と共に調製される。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。前記製剤を調製するためのプロセスは当業者にとって明らかであろう。これらの材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃでも商業的に入手することができる。
【０１３３】
徐放性組成物は、結晶を懸濁状態に維持することができる適切な製剤中に懸濁された抗体結晶の調製物も含む。これらの調製物は、それらが皮下または腹腔内経路によって注射された場合、徐放性効果を生み出す可能性がある。他の組成物は、リポソーム中に捕捉された抗体も含む。そのような抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８５）８２：３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８０）７７：４０３０−４０３４；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；欧州特許出願公開第８８，０４６号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書などの公知の方法によって調製される。
【０１３４】
本発明のポリペプチドならびに本発明のポリペプチドを含有するコンジュゲートおよび融合タンパク質は生体膜を横切って移動することができるという事実にもかかわらず、当業者は、ポリペプチドを含むコンジュゲートまたは融合タンパク質をナノ粒子に配合することも好都合であり得ることを理解する。
【０１３５】
本明細書で用いられる「ナノ粒子」という用語は、１〜１０００ｎｍの範囲の寸法を有する任意の材料を指す。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、２〜２００ｎｍの範囲、好ましくは２〜１５０ｎｍの範囲、さらにより好ましくは２〜１００ｎｍの範囲の寸法を有する。
【０１３６】
ナノ粒子は、標的器官に到達するまで、生物学的流体中のポリペプチドの完全性を維持するのに寄与し得る。さらに、抗腫瘍剤を含む組成物の場合、組成物のカプセル化は、抗腫瘍剤によって引き起こされる二次的効果を減少させ得る。最後に、ナノ粒子は、対象器官へのナノ粒子の標的化を可能にする部分を含むように修飾され得る。
【０１３７】
したがって、別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ナノ粒子の一部を形成する本発明によるコンジュゲート、融合タンパク質および組成物を含んでなる。
【０１３８】
本発明の文脈で使用することができる適切なナノ粒子には、脂質系ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、ナノシェル、半導体ナノ結晶、量子ドット、ポリマー系ナノ粒子、シリコン系ナノ粒子、シリカ系ナノ粒子、金属系ナノ粒子、フラーレンおよびナノチューブなどのナノスケール材料が含まれる。
【０１３９】
ナノ粒子がそれらのポリペプチドペイロードを送達する能力を損なうことなく、リガンドの添加によって標的化送達を達成することができる。これにより特定の細胞、組織および器官への送達が可能になると考えられる。リガンド系送達系の標的特異性は、異なる細胞型へのリガンド受容体の分布に基づいている。標的リガンドは、ナノ粒子と非共有結合しているかまたは共有結合しているかのいずれかであってよく、本明細書で考察される様々な方法によってナノ粒子にコンジュゲートされ得る。
【０１４０】
ナノ粒子を標的とするために使用することができるタンパク質またはペプチドの例には、トランスフェリン、ラクトフェリン、ＴＧＦ−β、神経成長因子、アルブミン、ＨＩＶ  Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド、およびインスリン、ならびに他のものが含まれる。
【０１４１】
ナノ粒子への本発明の生成物の配合は、生成物のセル内部への接近を容易にすることを意図していないか、または単に意図していないが、生成物を分解から保護することおよび／またはナノ粒子の対象器官への標的化を容易にすることを意図していることが理解されるであろう。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、任意の種類の哺乳動物、好ましくはヒトへの投与に適している。
【０１４３】
前述の用語および実施形態はすべて、本発明のこの態様にも等しく適用可能である。
【０１４４】
医療用途
別の態様において、本発明は、医薬における使用のための、本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞または本発明による医薬組成物に関する。
【０１４５】
別の態様において、本発明は、癌の予防および／または治療における使用のための、本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞または本発明による医薬組成物に関する。
【０１４６】
あるいは本発明は、癌の予防および／または治療方法であって、それを必要とする被験体に治療有効量の本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞または本発明による医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１４７】
あるいは本発明は、癌の予防および／または治療用の医薬を調製するための、本発明によるポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、本発明によるコンジュゲート、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞または本発明による医薬組成物の使用に関する。
【０１４８】
「予防」は、疾患の初期または早期段階における化合物の投与として、またはその発症を予防するためのものとして理解される。
【０１４９】
「治療」という用語は、臨床的徴候の出現前または出現後に疾患の進行を制御するための化合物の投与を示すのに用いられる。疾患の進行の制御は、症状の減少、疾患の期間の減少、病的状態の安定化（特に追加の障害の回避）、疾患の進行の遅延、病的状態および寛解（部分的および完全なものの両方）の改善を含むが、これらに限定されない有益なまたは所望の臨床結果として理解される。疾患の進行の制御には、治療が適用されなかった場合の予想生存期間と比較した生存期間の延長も含まれる。
【０１５０】
本明細書で使用される「被験体」には、癌を有するかまたは癌の兆候を示すか、または癌を有するもしくは癌の兆候を示すリスクがある任意の動物が含まれる。適切な被験体（患者）には、実験用動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、農用動物、および家庭用動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者が含まれる。
【０１５１】
「癌」という用語は、制御されない細胞分裂（または生存率もしくはアポトーシス耐性の増加）、前記細胞の他の隣接組織への侵入能力（浸潤）、または細胞が通常位置していない身体の領域へのリンパ管および血管を通しての拡大（転移）によって特徴付けられる疾患を指す。腫瘍が浸潤および転移によって広がることができるかどうかに応じて、それらは良性または悪性のいずれかに分類される。良性腫瘍は、浸潤または転移によって拡大することができない腫瘍、すなわち、それらは局所的にのみ増殖する。一方で、悪性腫瘍は、浸潤と転移によって広がることができる腫瘍である。本発明による方法は、局所および悪性腫瘍の治療に有用である。本明細書中で用いられる癌という用語には、以下の種類の癌が含まれるが、これらに限定されない：乳癌；胆道癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳腫瘍；子宮頸癌；絨毛癌；大腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；；急性リンパ性白血病および骨髄性白血病を含む血液腫瘍；Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫；有毛細胞白血病；慢性骨髄性白血病；多発性骨髄腫；エイズ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵癌；前立腺癌；直腸癌：平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および骨肉腫を含む肉腫；黒色腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、基底細胞癌、および扁平上皮癌を含む皮膚癌；セミノーマ、非セミノーマ（奇形腫、絨毛癌）、間質性腫瘍、および胚細胞性腫瘍などの胚性腫瘍を含む精巣癌：甲状腺腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌。他の癌は当業者に知られているであろう。好ましい実施形態において、治療される癌は、肺癌、好ましくは肺腺癌、さらに好ましくはＫＲａｓ駆動型肺腺癌である。
【０１５２】
好ましい実施形態において、癌は固形腫瘍である。
【０１５３】
本発明の化合物および癌の種類のすべての組み合わせ物が本発明に含まれる。
【０１５４】
好ましい実施形態において、癌は、膠芽腫および非小細胞肺癌からなる群から選択される。
【０１５５】
膠芽腫およびグレードＩＶ星状細胞腫としても知られる「膠芽腫」は、脳内で発生する最も一般的で最も攻撃的な癌である。
【０１５６】
本明細書で用いられる「ＮＳＣＬＣ」または「非小細胞肺癌」という用語は、それらの予後および管理が世界保健機関／国際肺癌学会（Ｔｒａｖｉｓ  ＷＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｔｕｍｏｕｒｓ．３ｒｄ  ｅｄ．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）に従ってほぼ同一であることから、一緒にグループ化された異質性疾患の群を指す。
１．ＮＳＣＬＣの３０％〜４０％を占める扁平上皮癌（ＳＣＣ）は、より大きい呼吸管において発生するが、成長がより遅く、すなわち、これらの腫瘍の大きさは診断によって異なる。
２．腺癌は、ＮＳＣＬＣの５０〜６０％を占めるＮＳＣＬＣの最も一般的な亜型であり、肺のガス交換表面近くから発生し、亜型である気管支肺胞癌を含み、これは治療に対して異なる応答を示すことがある。
３．大細胞癌は、肺の表面近くで増殖する急成長型である。それは主に除外診断であり、さらに調査を行うと、通常は扁平上皮癌または腺癌に再分類される。
４．腺扁平上皮癌は、扁平上皮細胞（特定の器官の内側を覆う細く平らな細胞）と腺様細胞の２種類の細胞を踏む癌の一種である。
５．多形性、肉腫様または肉腫様要素を有する癌腫。これは、組織学的異質性ならびに上皮および間葉分化における連続体を反映する一群のまれな腫瘍である。
６．カルチノイド腫瘍は、成長が遅い神経内分泌肺腫瘍であり、神経系によって提供される刺激に応答してホルモンを放出することができる細胞から発生する。
７．唾液腺型の癌腫は、肺の大きな気道の内側に位置する唾液腺細胞において発生する。
８．分類されていない癌腫には、前述の肺癌カテゴリーのいずれにも当てはまらない癌が含まれる。
【０１５７】
本発明は以下のものにも関する。
［１］．配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチド、または前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体を含んでなるポリペプチド。
［２］．配列番号１の８９位の残基Ｘがシステインではない配列番号１のポリペプチドからなるものであるか、または前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体からなるものである、［１］に記載のポリペプチド。
［３］．配列番号１の８９位の残基Ｘがセリンである、［１］または［２］記載のポリペプチド。
［４］．配列番号４からなる、［３］に記載のポリペプチド。
［５］．ａ．［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体と
ｂ．前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する化学的部分と
を含んでなるコンジュゲート。
［６］．ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体の細胞内取り込みを促進する化学部分が細胞透過性ペプチド配列であり、該細胞透過性ペプチド配列と前記ポリペプチドまたは該ポリペプチドの機能的に等価な変異体とが融合タンパク質を形成する、［５］に記載のコンジュゲート。
［７］．細胞透過性ペプチド配列が、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３８）およびＲＲＲＲＲＲＬＲ（配列番号３９）からなる群から選択されるものである、［６］に記載のコンジュゲート。
［８］．更なる核局在化シグナル、特に核局在化シグナルをさらに含んでなる、［５］〜［７］のいずれかに記載のコンジュゲートであって、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）およびＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号７）からなる群から選択されるものである、コンジュゲート。
［９］．［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドまたは［５］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチド。
［１０］．［９］に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
［１１］．［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチド、［５］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲート、［９］に記載のポリヌクレオチド、または［１０］に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
［１２］．［１］〜［４］のいずれかに記載の薬学的有効量のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、［５］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲート、［９］に記載のポリヌクレオチド、［１０］に記載のベクター、または［１１］に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
［１３］．医薬における使用のための、［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能的に等価な変異体、［５］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲート、［９］に記載のポリヌクレオチド、［１０］に記載のベクター、〔１１〕に記載の宿主細胞、または〔１２〕に記載の医薬組成物。
［１４］．癌の予防および／または治療における使用のための、［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体、［５］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲート、［９］に記載のポリヌクレオチド、［１０］に記載のベクター、［１１］に記載の宿主細胞、または［１２］に記載の医薬組成物。
［１５］．癌が膠芽腫および非小細胞肺癌からなる群から選択されるものである、［１４］に記載の使用のためのポリペプチドまたはその機能的に等価な変異体、コンジュゲート、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞または医薬組成物。
【０１５８】
前述の用語および実施形態はすべて、本発明のこの態様にも等しく適用可能である。
【０１５９】
以下の実施例によって本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものでは決してない。
【実施例】
【０１６０】
材料および方法
ＯｍｏｍｙｃおよびＯｍｏＣＳ  ｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクション
ＯｍｏｍｙｃおよびＯｍｏＣＳ突然変異体のｍＲＮＡは、それぞれＴｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から０．７８２ｍｇ／ｍＬおよび０．８７６ｍｇ／ｍＬの濃度で購入した（ＡＲＣＡキャップ、５−メチル−Ｃ完全置換し、ｐｓｅｕｄｏ−Ｕ修飾）。
【０１６１】
ＯｍｏｍｙｃまたはＯｍｏＣＳ  ＤＮＡ配列のいずれかを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよび３ｐ末端に位置するポリ（Ｔ）テールの下流のベクターに導入した。５−メチルシチジン−５’−三リン酸およびシュードリジン−５’−三リン酸修飾−ＲＮＡを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって製造した。［３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］ＲＮＡキャップ構造類似体を用いてＲＮＡをキャップした。鋳型ＤＮＡベクターを、ＤＮＡｓｅを用いて分解し、残留三リン酸をホスファターゼ処理により除去した。次いで、ＲＮＡ産物を精製し、完全性および量をそれぞれアガロースゲル電気泳動およびＮａｎｏｄｒｏｐにより評価した。ＲＮＡは−８０℃で保存した。
【０１６２】
リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。Ａ５４９およびＵ８７細胞系を、９６ウェルプレートに、ウェルあたりそれぞれ５００および１０００細胞で播種した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％Ｌ−グルタミン（完全培地）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。２４時間後、細胞をリポフェクタミン−ｍＲＮＡ複合体でトランスフェクトした。各２μＬのリポフェクタミンについて３μｇのｍＲＮＡを別々に無血清培地で希釈し、１０分間インキュベートした。次いで、ｍＲＮＡおよびリポフェクタミン希釈物を混合し、５分間インキュベートして複合体を形成させた。ウェルを無血清培地で２回洗浄した。全無血清培地１００μＬで、１ウェルあたり１μｇから出発して０．０６２５μｇのｍＲＮＡで細胞を段階希釈した。各濃度について、対照細胞をリポフェクタミンのみで処理し、そして各条件について３連で使用した。４時間のトランスフェクション後、無血清培地およびｍＲＮＡ−リポフェクタミン複合体をウェルから除去し、完全培地で置換した。細胞を３日間インキュベートした。次いで、Ｐｒｏｍｅｇａ社からのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅを用いて生存度を評価した。未処理ウェルに対する吸光度を各条件について計算した。統計的有意性はｔ検定によって計算した。
【０１６３】
ＯｍｏＣＳおよびＯｍｏＣＡ  ｍＲＮＡによる細胞のトランスフェクション
ＯｍｏＣＳおよびＯｍｏＣＡ突然変異体のｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した（ＡＲＣＡキャップ、５−メチル−Ｃ完全置換し、ｐｓｅｕｄｏ−Ｕ修飾）。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して、ＯｍｏＣＳおよびＯｍｏＣＡのｍＲＮＡ濃度を、それぞれ０．８４５ｍｇ／ｍＬおよび０．８３２ｍｇ／ｍＬと決定した。リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。Ａ５４９細胞を、９６ウェルプレートに、ウェルあたり５００細胞で播種した。細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％Ｌ−グルタミン（完全培地）を補充したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）で培養した。２４時間後、細胞をリポフェクタミン−ｍＲＮＡ複合体でトランスフェクトした。各１．５μＬのリポフェクタミンについて２μｇのｍＲＮＡを別々に無血清培地で希釈し、１０分間インキュベートした。次いで、ｍＲＮＡおよびリポフェクタミン希釈物を混合し、５分間インキュベートして複合体を形成させた。ウェルを無血清培地で２回洗浄した。全無血清培地（２００ｎＭ）５０μＬで、１ウェルあたり１μｇのｍＲＮＡで開始して連続１：２希釈で処理した。各濃度について、細胞を処理しないか（非処理）または対照ウェルとしてリポフェクタミンのみで処理した（Ｌｉｐｏのみ）。各条件について３連で行った。４時間のトランスフェクション後、無血清培地およびｍＲＮＡ−リポフェクタミン複合体をウェルから除去し、完全ＲＰＭＩ培地で置換した。細胞を３日間インキュベートした。その時点で、クリスタルバイオレット染色を用いて細胞密度を評価した。非処理ウェルに対する吸光度を各濃度について計算した。
【０１６４】
実施例１
驚くべきことに、ＯｍｏＣＳ突然変異体は低濃度で元のＯｍｏｍｙｃ配列と比較して細胞増殖のより高い阻害を示す（図１）。元のＯｍｏｍｙｃ配列と比較したこの改善された効能は、Ｏｍｏｍｙｃホモ二量体の酸化型界面システインがＭｙｃまたはＭａｘとのＯｍｏｍｙｃのヘテロ二量体化を妨げ、Ｏｍｏｍｙｃの活性を単なるＥボックス結合の競合に限定するという仮説によって少なくとも部分的に説明することができる。代わりに、ＯｍｏＣＳ突然変異体は、ヘテロ二量体集団の形成を促進することによって、Ｏｍｏｍｙｃの他の生物学的活性に有利に働くだろう。
【０１６５】
実施例２
驚くべきことに、ＯｍｏＣＡ突然変異体は同じ増殖アッセイにおいて、ＯｍｏＣＳとまさに同じように挙動する（図２）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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