(57)【要約】方法は、ライトシートイメージングを使用してサンプルをイメージングすることを含む。ライトシートイメージングは、光を発生することと、それぞれの照射軸に沿ってサンプル内の１つ以上の位置でその光から１つ以上のライトシートを形成することと、１つ以上のライトシートとサンプルとの間の光学的相互作用によりサンプルから検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することと、を含む。この方法は、ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することと、１つ以上の測定された特性を分析することと、１つ以上の測定された特性の分析に基づいてライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することと、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライトシートイメージングを使用してサンプルをイメージングすることであって、前記ライトシートイメージングが、光を発生することと、照射軸と平行なそれぞれの照射方向に沿って前記サンプル内の１つ以上の位置で前記光から１つ以上のライトシートを形成することと、前記１つ以上のライトシートと前記サンプルとの間の光学的相互作用により前記サンプルから検出方向に沿って放出された蛍光の画像を記録することであって前記検出方向が検出軸と平行であることと、を含むことと、
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することと、
前記１つ以上の測定された特性を分析することと、
前記１つ以上の測定された特性の前記分析に基づいて前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、前記ライトシートイメージング全体を通して並びに前記１つ以上の特性の前記測定中に生きたままである生体生物試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル内の１つ以上の位置で前記光から１つ以上のライトシートを形成することが、前記サンプル内の１つ以上の位置で前記光から２つのライトシートを形成することを含み、第１のライトシートが第１の照射方向に沿って延び、第２のライトシートが第２の照射方向に沿って延びる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の照射方向が前記第２の照射方向と逆平行である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ライトシートが、像平面に沿って前記サンプル内で空間的にかつ時間的にオーバーラップし、前記像平面内で前記サンプルと光学的に相互作用し、
蛍光の画像を記録することが、複数の検出焦点面のそれぞれで、前記２つのライトシートと前記サンプルとの間の前記光学的相互作用により前記サンプルから前記検出方向に沿って放出された前記蛍光の画像を記録することを含み、
前記ライトシート同士の間の前記時間的オーバーラップが、前記ライトシートイメージングの空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の測定された特性を分析することが、前記サンプルについて何らかの仮定を行わずに前記１つ以上の測定された特性を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルについて何らかの仮定を行わずに前記１つ以上の測定された特性を分析することが、前記サンプルの物理的性質、前記サンプルの光学的性質、並びに前記サンプル内の蛍光マーカの分布及び数について何らかの仮定を行わずに前記１つ以上の特性を分析することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、１つ以上の記録された画像の品質、前記サンプル内部の前記ライトシートの位置、及び前記サンプル内部の前記ライトシートの向きのうちの１つ以上を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記ライトシートと検出方向に沿った前記蛍光の画像が記録される検出焦点面との間の角度、前記ライトシートが前記サンプル内に形成される前記１つ以上の位置、及び前記ライトシートと前記検出焦点面との間の相対位置のうちの１つ以上を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記１つ以上のライトシート、前記サンプル、及び前記蛍光の画像が記録される焦点面のうちの１つ以上の特性を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、前記サンプルの前記ライトシートイメージングを実行するために前記蛍光の画像が記録されない時間において前記１つ以上の特性を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、
前記サンプルに対して１つ以上のライトシートを回転させることと
前記照射軸に対して垂直な方向に沿って１つ以上のライトシートを並進させること、
前記照射軸に対して平行な方向に沿って１つ以上のライトシートを並進させること、
前記照射軸に沿ってライトシートのウエストを並進させること、及び／又は、
前記蛍光の画像が記録される焦点面を前記検出軸に沿って並進させること、
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、
前記ライトシートによって照らされる前記サンプルの一部分の画像を形成することと、
前記形成された画像の品質を定量化することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
構造化ライトシートを作成することを更に含み、
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、前記構造化ライトシートによって前記サンプルのイメージングに関する１つ以上の特性を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造化ライトシートを作成することが、前記形成されたライトシートの特性をある周波数で変調することを含み、
前記変調周波数が、前記ライトシートイメージングの実行に関連する光学的伝達関数に基づいて決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記形成されたライトシートの前記特性を前記周波数で変調することが、前記像平面内の空間位置の関数として前記周波数で前記ライトシートの強度を変調することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、
前記ライトシートによって照らされる前記サンプルの一部分の画像を形成することであって、前記画像が前記サンプル内の蛍光マーカのセットから放射する光を含むことと、
複数の形成された画像内のそれぞれの形成された画像において前記特性を測定することであって、それぞれの形成された画像が、前記ライトシートによって照らされる前記サンプルの別個の一部分に対応することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライトシートによって照らされる前記サンプル部分の前記画像を形成することが、前記ライトシートイメージングを実行するために蛍光の画像が記録される前記サンプル部分の前記画像を形成することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記ライトシートと画像が記録される前記位置によって規定される焦点面との間の相対位置を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライトシートを形成することが、走査方向及び前記照射方向によって規定される平面内に前記ライトシートを形成するために前記照射軸に対して垂直な前記走査方向に沿って前記光を走査することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ライトシートイメージングに関する前記１つ以上の特性を測定することが、
前記サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することと、
前記ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータを計数値のセットに変更することと、
前記選択された基準領域において前記セット内の前記動作パラメータのそれぞれの値について、
前記基準領域から放出された蛍光の画像を記録することと、
それぞれの記録された画像の品質を決定することと、
を含み、
前記１つ以上の測定された特性を分析することが、
前記選択された基準領域において動作パラメータ値の範囲内のどの動作パラメータ値が最高品質を備えた前記記録された画像を生成するかを観察することと、
この基準領域について前記動作パラメータに関する前記観察に関連する数量を記憶することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
記録された画像の前記品質を決定することが、前記記録された画像の前記品質を表す実数を生成するために前記記録された画像に画像品質メトリックを適用することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
パラメータ値の前記範囲が、前記少なくとも１つの動作パラメータの計数値の前記セットに基づくものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記記憶された品質に基づいて前記ライトシートイメージングに関連する前記１つ以上の動作パラメータを調整する方法を決定することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライトシートイメージングに関連する前記１つ以上の動作パラメータを調整する方法を決定することが、前記１つ以上の動作パラメータをどのように調整できるかを制限する１つ以上の制約にも基づくものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータを計数値の前記セットに変更することが、前記ライトシートの平面及び／又は前記蛍光の画像が記録される焦点面のうちの１つ以上を変更することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することが、前記サンプルの複数の基準領域を選択することを含み、
前記ライトシートイメージングに関する前記少なくとも１つの動作パラメータを計数値の前記セットに変更することが、前記ライトシートイメージングに関する少なくとも第１の動作パラメータを調整することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ライトシートイメージングに関連する前記１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記第１の動作パラメータとは別個の少なくとも第２の動作パラメータを調整することを含み、
前記方法が、前記複数の基準領域内のそれぞれの基準領域について前記動作パラメータに関する前記観察に関連する前記記憶された数量に基づいて前記第２の動作パラメータを調整する方法を決定することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の動作パラメータを調整することが、前記ライトシートと前記焦点面との間の角度を調整することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択された基準領域において動作パラメータ値の前記範囲内のどの動作パラメータ値が前記最高品質を備えた前記記録された画像を生成するかを観察することが、蛍光が検出されたどの焦点面が前記最高品質を備えた前記記録された画像を生成するかを観察することを含み、
前記観察に関連する前記数量を記憶することが、前記焦点面がｚ方向に沿って位置決めされる値と、ｘｙ平面内に規定される前記対応する基準領域からなるセットによって規定される３次元空間内の位置を記憶することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライトシートと前記焦点面との間の角度を調整する方法を決定することが、３次元空間内の前記記憶された位置のそれぞれを通過する可能性が最も高い平面を決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することが、
検出焦点面からｚ方向にｚ基準位置のセットを選択することと、
前記セット内のそれぞれのｚ基準位置について、前記ｚ方向に対して垂直な前記ｘｙ平面内に規定される複数の基準領域を選択することであって、前記基準領域のそれぞれが他の基準領域とは別個のものであることと、
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
サンプルに向かって照射方向に沿ってライトシートを生成して誘導するように配置された光源及び照明用光デバイスのセットと、１つ以上の照明用光デバイスに結合されたアクチュエータのセットと、を含む少なくとも１つの照明サブシステムと、
検出方向に沿って前記サンプルから放出された蛍光の画像を収集して記録するように配置されたカメラ及び検出用光デバイスのセットと、前記カメラ及び前記検出用光デバイスのうちの１つ以上に結合されたアクチュエータのセットと、を含む少なくとも１つの検出サブシステムと、
前記少なくとも１つの照明サブシステム及び前記少なくとも１つの検出サブシステムに接続された制御システムであって、
前記少なくとも１つの照明サブシステム及び前記少なくとも１つの検出サブシステムによりライトシートイメージングに関する１つ以上の特性の測定値を受信することと、
前記１つ以上の測定された特性を分析することと、
前記分析に基づいて前記少なくとも１つの照明サブシステム及び前記少なくとも１つの検出サブシステムの１つ以上のアクチュエータに制御信号を送信することと、
を実行するように構成される、制御システムと、
を含む、顕微鏡システム。
【請求項３４】
前記サンプルが、生体生物試料を含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの照明サブシステムが、２つの照明サブシステムを含み、それぞれの照明サブシステムがそれぞれの照射方向に沿って前記ライトシートを誘導するように配置され、前記照射方向が互いに逆平行であり、照射軸と平行である、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３６】
前記ライトシートが、像平面に沿って前記サンプル内で空間的にかつ時間的にオーバーラップし、前記像平面内で前記サンプルと光学的に相互作用し、
前記ライトシート同士の間の前記時間的オーバーラップが、前記顕微鏡システムの空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内である、請求項３５に記載の顕微鏡システム。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの検出サブシステムが２つの検出サブシステムを含み、それぞれが検出方向を規定し、前記検出方向が互いに逆平行であり、検出軸と平行である、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの照明サブシステムの前記アクチュエータが、
前記照射方向に関して横方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成されたアクチュエータと、
前記サンプル内のその位置に関して縦方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成されたアクチュエータと、
前記照射方向の周りのある角度内で前記ライトシートを回転させるように構成されたアクチュエータと、
前記照射方向に対して垂直な方向の周りのある角度内で前記ライトシートを回転させるように構成されたアクチュエータと、
を含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３９】
前記照明サブシステムが、前記ライトシートを形成するために走査面に沿って光を走査するように構成された走査装置を含み、
前記走査面が、前記照明方向と前記ライトシートがその周りで回転される垂直方向とによって規定される、請求項３８に記載の顕微鏡システム。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの検出サブシステムが、
像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの画像を生成するように構成された対物レンズと、
前記像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像を検出するように構成された検出器と、を含み、
前記少なくとも１つの検出サブシステムの前記アクチュエータが、前記検出方向に沿って前記対物レンズを並進させ、それにより前記像平面を移動させるように構成されたアクチュエータを含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４１】
前記サンプルが、蛍光マーカのセットを含み、
前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像が、蛍光発光波長の光を放射する前記蛍光マーカのセットによって生成され、
前記蛍光発光波長が、前記ライトシートの波長とは別個のものである、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４２】
前記アクチュエータのうちの１つ以上が、圧電アクチュエータとガルバノメータスキャナのうちの１つ以上を含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４３】
前記制御システムが、前記記録された蛍光の画像を分析し、前記分析に基づいて前記試料の画像を作成するように構成される、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４４】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性の前記測定が、前記サンプルの前記画像を作成するために使用される蛍光の画像の記録間に発生する期間中に行われる、請求項４３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４５】
前記１つ以上の受信した特性が、記録された蛍光の画像であり、
前記制御システムが、前記記録された画像に基づいて画像品質メトリックを発生することにより前記記録された画像を分析するように構成される、請求項４４に記載の顕微鏡システム。
【請求項４６】
指定の波長を有する光を生成するように構成された光源と、
照射軸と平行な照射方向に沿ってサンプル内のある位置でライトシートに前記光を形成するように構成された照明光学部品と、
前記照射軸に関して横方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成された第１のコントローラと、
前記サンプル内の前記位置に関して縦方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成された第２のコントローラと、
前記照射軸の周りの横揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された第３のコントローラと、
前記照射軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された第４のコントローラと、
を含む、顕微鏡。
【請求項４７】
前記光源が、レーザであり、
前記レーザによって生成される前記光が、ビームの断面を通るガウス型輪郭を有する前記ビームを含み、
前記ビームが、前記ビームの前記ガウス型輪郭が最小幅を有する前記照射軸に沿った位置にウエストを有し、
前記サンプル内の前記位置に関して前記縦方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成された前記第２のコントローラが、前記照射軸に沿って前記ビームの前記ウエストを移動させるように更に構成される、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項４８】
前記照射軸の周りの前記横揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された前記第３のコントローラが、二軸ガルバノメータスキャナを含む、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項４９】
前記照射軸に対して垂直な前記方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された前記第４のコントローラが、縦チルトミラー及び横チルトミラーを有する二軸旋回ガルバノメータスキャナを含み、
前記縦チルトミラーが、前記照射軸に対して第１の方向θｘに前記光を角変位させるように構成され、
前記横チルトミラーが、前記照射軸に対して第２の方向θｚに前記光を角変位させるように構成され、
前記第２の方向が、前記第１の方向に対して垂直であり、
前記偏揺れ角が、θｘとθｚの集合である、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項５０】
前記照射軸に対して垂直な前記方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された前記第４のコントローラが、２つのリレーレンズを更に含み、
前記二軸旋回ガルバノメータスキャナが、前記レーザからの平行ビームが第１のリレーレンズによって垂直走査ミラー上に合焦され、第２のリレーレンズが、視準を復旧し、前記二軸ライトシートガルバノメータスキャナ上に前記ビームを誘導するように、前記２つのリレーレンズ間の焦点距離に位置決めされる、請求項４９に記載の顕微鏡。
【請求項５１】
検出軸と平行な検出方向に対して垂直な像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの画像を生成するように構成された対物レンズと、
前記像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像を検出するように構成された検出器と、
前記検出軸に沿って前記対物レンズを並進させるように構成された第５のコントローラと、
を更に含む、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項５２】
前記サンプルが、蛍光マーカのセットを含み、
前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像が、前記対物レンズ内に蛍光発光波長の光を放射する前記蛍光マーカのセットによって生成される、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項５３】
蛍光発光波長が前記指定の波長とは異なるものである、請求項５２に記載の顕微鏡。
【請求項５４】
前記画像の画像品質メトリックの最適化に応じて前記第１のコントローラ、前記第２のコントローラ、前記第３のコントローラ、前記第４のコントローラ、及び前記第５のコントローラのそれぞれを制御するように構成された適応制御メカニズムを更に含む、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項５５】
前記適応制御メカニズムが、前記画像品質メトリックの前記最適化の実行前にガウスカーネル機能によって前記画像についてたたみこみ操作を実行するように更に構成される、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５６】
前記画像品質メトリックが、前記画像のピクセルの強度のアフィン変換に対して不変である、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５７】
前記画像品質メトリックが、光学的帯域通過を通過できる空間周波数のみに依存する、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５８】
前記画像品質メトリックが、スペクトル画像品質メトリックを含む、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５９】
前記スペクトル画像品質メトリックが、正規化された離散コサイン変換（ＤＣＴ）シャノンエントロピメトリックを含む、請求項５８に記載の顕微鏡。
【請求項６０】
前記適応制御メカニズムが、前記画像品質メトリックの前記最適化を実行する際に、周波数原点にセンタリングされた辺２ｒｐの正方形の外部の空間周波数を抑制するように構成された低域フィルタを実行し、数量ｒｐ＝ｗ（Ｉ）／ｒ０が前記対物レンズの点広がり関数の半径であり、ｗが前記像平面内の正方形の画像Ｉの幅であり、ｒ０が前記顕微鏡の光学的伝達関数（ＯＴＦ）のサポート半径である、請求項５８に記載の顕微鏡。
【請求項６１】
前記第５のコントローラが、圧電性アクチュエータを含み、
前記圧電性アクチュエータが、前記検出軸に沿って前記対物レンズを移動させるように構成される、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項６２】
前記光源及び前記照明光学部品が、前記顕微鏡内の第２の照射方向に沿ってサンプル内の第２の位置で第２のライトシートに前記光を形成するように更に構成され、前記第２の照射方向が前記照射軸と平行であり、
前記顕微鏡が、
前記検出軸と平行な第２の検出方向に対して垂直な第２の像平面内で前記第２のライトシートによって照らされた前記サンプルの第２の画像を生成するように構成された第２の対物レンズと、
前記第２の像平面内で前記第２のライトシートによって照らされた前記サンプルの前記第２の画像を検出するように構成された第２の検出器と、
前記照射軸に関して第２の横方向オフセットの周りで前記第２のライトシートを並進させるように構成された第６のコントローラと、
前記サンプル内の前記第２の位置に関して第２の縦方向オフセットの周りで前記第２のライトシートを並進させるように構成された第７のコントローラと、
前記照射軸の周りの第２の横揺れ角内で前記第２のライトシートを回転させるように構成された第８のコントローラと、
前記照射軸に対して垂直な第２の方向の周りの第２の偏揺れ角内で前記第２のライトシートを回転させるように構成された第９のコントローラと、
前記検出軸に沿って前記第２の対物レンズを並進させるように構成された第１０のコントローラと、
を更に含む、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項６３】
顕微鏡内で、指定の波長を有する光を発生することと、
前記顕微鏡の照射軸と平行な照射方向に沿ってサンプル内のある位置で前記光からライトシートを形成することと、
前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの一部分の画像を形成することと、
前記形成された画像に基づいて画像メトリックを発生することと、
前記画像メトリックに基づいて、（ｉ）前記照射軸に対して横向きの方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉ）前記照射軸に沿った方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉｉ）前記照射軸の周りの横揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、及び、（ｉｖ）前記照射軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、により前記ライトシートを調整することと、
を含む、方法。
【請求項６４】
非一時的記憶媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトであって、前記コンピュータプログラムプロダクトが、電子デバイス上での前記コンピュータプログラムプロダクトの実行時に、前記電子デバイスにある方法を実行させるコードを含み、前記方法が、
顕微鏡の照射軸と平行な照射方向に沿ってライトシートによって照らされたサンプル内のある位置で前記顕微鏡内の前記サンプルの画像に基づいて画像メトリックを発生することと、
前記画像メトリックに基づいて、（ｉ）前記照射軸に対して横向きの方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉ）前記照射軸に沿った方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉｉ）前記照射軸の周りの横揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、及び、（ｉｖ）前記照射軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、により前記ライトシートを調整することと、
を含む、コンピュータプログラムプロダクト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月２４日に出願された米国特許出願第６２／３５４，３８４号及び２０１７年１月１７日に出願された米国特許出願第６２／４４７，１５４号に対する優先権を主張するものである。これらの出願はいずれも参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書は一般にライトシート顕微鏡法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ライトシート顕微鏡法は、生物系の発達及び機能をイメージングするための技法である。高解像度画像を首尾良く生成するために、これらの顕微鏡では、サンプルを照らすために使用される薄いライトシートと画像を形成するために使用される対物レンズの焦点面との間のオーバーラップを実現する。このオーバーラップが存在しない場合、必ず空間分解能及びイメージコントラストが悪化する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
いくつかの一般的な態様では、方法は、ライトシートイメージングを使用してサンプルをイメージングすることを含む。ライトシートイメージングは、光を発生することと、それぞれの照射軸に沿ってサンプル内の１つ以上の位置でその光から１つ以上のライトシートを形成することと、１つ以上のライトシートとサンプルとの間の光学的相互作用によりサンプルから検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することとを含む。この方法は、ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することと、１つ以上の測定された特性を分析することと、１つ以上の測定された特性の分析に基づいてライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することとを含む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
諸実施形態は以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、サンプルは、ライトシートイメージング全体を通して並びに１つ以上の特性の測定中に生きたままである生体生物試料を含むことができる。
【０００６】
１つ以上のライトシートは、サンプル内の１つ以上の位置で光から２つのライトシートを形成することにより、サンプル内の１つ以上の位置で光から形成することができる。第１のライトシートは第１の照射軸に沿って延び、第２のライトシートは第２の照射軸に沿って延びる。第１の照射軸は第２の照射軸と逆平行にすることができる。ライトシートは、像平面に沿ってサンプル内で空間的にかつ時間的にオーバーラップし、像平面内でサンプルと光学的に相互作用する。蛍光の画像は、複数の検出焦点面のそれぞれで、２つのライトシートとサンプルとの間の光学的相互作用によりサンプルから検出軸に沿って放出された蛍光の画像を記録することにより記録することができる。ライトシート同士の間の時間的オーバーラップは、ライトシートイメージングの空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内にすることができる。
【０００７】
１つ以上の測定された特性は、サンプルについて何らかの仮定を行わずに１つ以上の測定された特性を分析することにより分析することができる。１つ以上の特性は、サンプルの物理的性質、サンプルの光学的性質、並びにサンプル内の蛍光マーカの分布及び数について何らかの仮定を行わずに１つ以上の特性を分析することにより、サンプルについて何らかの仮定を行わずに分析することができる。
【０００８】
ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、１つ以上の記録された画像の品質、サンプル内部のライトシートの位置、及びサンプル内部のライトシートの向きのうちの１つ以上を測定することにより測定することができる。
【０００９】
ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、ライトシートと検出軸に沿った蛍光の画像が記録される検出焦点面との間の角度、ライトシートがサンプル内に形成される１つ以上の位置、及びライトシートと検出焦点面との間の相対位置のうちの１つ以上を調整することにより調整することができる。ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、１つ以上のライトシート、サンプル、及び蛍光の画像が記録される焦点面のうちの１つ以上の特性を調整することにより調整することができる。
【００１０】
ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、サンプルのライトシートイメージングを実行するために蛍光の画像が記録されない時間において１つ以上の特性を測定することにより測定することができる。
【００１１】
ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、サンプルに対して１つ以上のライトシートを回転させることにより調整することができる。ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、照射軸に対して垂直な方向に沿って１つ以上のライトシートを並進させることにより調整することができる。ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、照射軸に対して平行な方向に沿って１つ以上のライトシートを並進させることにより調整することができる。ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、照射軸に沿ってライトシートのウエスト（ｗａｉｓｔ）を並進させることにより調整することができる。ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、蛍光の画像が記録される焦点面を検出軸に沿って並進させることにより調整することができる。
【００１２】
ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、ライトシートによって照らされるサンプルの一部分の画像を形成することと、形成された画像の品質を定量化することにより測定することができる。
【００１３】
この方法は、構造化ライトシート（structured light sheet）を作成することを含むことができる。ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、構造化ライトシートによってサンプルのイメージングに関する１つ以上の特性を測定することにより測定することができる。構造化ライトシートは、形成されたライトシートの特性をある周波数で変調することにより作成することができる。変調周波数は、ライトシートイメージングの実行に関連する光学的伝達関数に基づいて決定することができる。形成されたライトシートの特性は、像平面内の空間位置の関数としてその周波数でライトシートの強度を変調することにより、その周波数で変調することができる。
【００１４】
ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、ライトシートによって照らされるサンプルの一部分の画像を形成することであって、その画像がサンプル内の蛍光マーカのセットから放射する光を含むことと、複数の形成された画像内のそれぞれの形成された画像において特性を測定することにより測定することができる。それぞれの形成された画像は、ライトシートによって照らされるサンプルの別個の一部分に対応することができる。ライトシートによって照らされるサンプル部分の画像は、ライトシートイメージングを実行するために蛍光の画像が記録されるサンプル部分の画像を形成することにより形成することができる。
【００１５】
ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、ライトシートと画像が記録される位置によって規定される焦点面との間の相対位置を調整することにより調整することができる。ライトシートは、走査方向及び照射軸によって規定される平面内にライトシートを形成するために照射軸に対して垂直な走査方向に沿って光を走査することにより形成することができる。
【００１６】
ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することと、ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータを計数値のセットに変更することと、選択された基準領域においてそのセット内の動作パラメータのそれぞれの値について、基準領域から放出された蛍光の画像を記録することと、それぞれの記録された画像の品質を決定することにより測定することができる。１つ以上の測定された特性は、選択された基準領域において動作パラメータ値の範囲内のどの動作パラメータ値が最高品質を備えた記録された画像を生成するかを観察することと、この基準領域について動作パラメータに関する観察に関連する数量を記憶することにより分析することができる。記録された画像の品質は、記録された画像の品質を表す実数を生成するために記録された画像に画像品質メトリック（image quality metric）を適用することにより決定することができる。
【００１７】
パラメータ値の範囲は、少なくとも１つの動作パラメータの計数値のセットに基づくことができる。この方法は、記憶された品質に基づいてライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整する方法を決定することを含むことができ、この決定は、１つ以上の動作パラメータをどのように調整できるかを制限する１つ以上の制約に基づくことができる。
【００１８】
ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータは、ライトシートの平面及び／又は蛍光の画像が記録される焦点面のうちの１つ以上を変更することにより変更することができる。
【００１９】
サンプルの少なくとも１つの基準領域は、サンプルの複数の基準領域を選択することにより選択することができる。ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータは、ライトシートイメージングに関する少なくとも第１の動作パラメータを調整することにより変更することができる。ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータは、第１の動作パラメータとは別個の少なくとも第２の動作パラメータを調整することにより調整することができる。この方法は、複数の基準領域内のそれぞれの基準領域について動作パラメータに関する観察に関連する記憶された数量に基づいて第２の動作パラメータを調整する方法を決定することを含むことができる。
【００２０】
第２の動作パラメータは、ライトシートと焦点面との間の角度を調整することにより調整することができる。選択された基準領域において動作パラメータ値の範囲内のどの動作パラメータ値が最高品質を備えた記録された画像を生成するかという観察は、蛍光が検出されたどの焦点面が最高品質を備えた記録された画像を生成するかという観察にすることができる。記憶されるこの観察に関連する数量は、焦点面がｚ方向に沿って位置決めされる値と、ｘｙ平面内に規定される対応する基準領域からなるセットによって規定される３次元空間内の位置にすることができる。ライトシートと焦点面との間の角度を調整する方法の決定は、３次元空間内の記憶された位置のそれぞれを通過する可能性が最も高い平面の決定にすることができる。
【００２１】
サンプルの少なくとも１つの基準領域は、検出焦点面からｚ方向にｚ基準位置のセットを選択することと、そのセット内のそれぞれのｚ基準位置について、ｚ方向に対して垂直なｘｙ平面内に規定される複数の基準領域を選択することであって、基準領域のそれぞれが他の基準領域とは別個のものであることにより、選択することができる。
【００２２】
その他の一般的な態様では、顕微鏡システムは、少なくとも１つの照明サブシステムと、少なくとも１つの検出サブシステムと、少なくとも１つの照明サブシステム及び少なくとも１つの検出サブシステムに接続された制御システムとを含む。照明サブシステムは、サンプルに向かって照射軸に沿ってライトシートを生成して誘導するように配置された光源及び照明用光デバイスのセットと、１つ以上の照明用光デバイスに結合されたアクチュエータのセットとを含む。検出サブシステムは、検出軸に沿ってサンプルから放出された蛍光の画像を収集して記録するように配置されたカメラ及び検出用光デバイスのセットと、カメラ及び検出用光デバイスのうちの１つ以上に結合されたアクチュエータのセットとを含む。制御システムは、少なくとも１つの照明サブシステム及び少なくとも１つの検出サブシステムによりライトシートイメージングに関する１つ以上の特性の測定値を受信し、１つ以上の測定された特性を分析し、分析に基づいて少なくとも１つの照明サブシステム及び少なくとも１つの検出サブシステムの１つ以上のアクチュエータに制御信号を送信するように構成される。
【００２３】
諸実施形態は以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、サンプルは生体生物試料を含むことができる。
【００２４】
少なくとも１つの照明サブシステムは２つの照明サブシステムを含むことができ、それぞれの照明サブシステムはそれぞれの照射軸に沿ってライトシートを誘導するように配置され、照射軸は互いに逆平行である。ライトシートは、像平面に沿ってサンプル内で空間的にかつ時間的にオーバーラップし、像平面内でサンプルと光学的に相互作用することができ、ライトシート同士の間の時間的オーバーラップは、顕微鏡システムの空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内である。
【００２５】
少なくとも１つの検出サブシステムは２つの検出サブシステムを含むことができ、それぞれが検出軸を規定し、その検出軸は互いに逆平行である。
【００２６】
少なくとも１つの照明サブシステムのアクチュエータは、照射軸に関して横方向オフセット（transverse offset）の周りでライトシートを並進させるように構成されたアクチュエータと、サンプル内のその位置に関して縦方向オフセット（longitudinal offset）の周りでライトシートを並進させるように構成されたアクチュエータと、照射軸の周りのある角度内でライトシートを回転させるように構成されたアクチュエータと、照射軸に対して垂直な方向の周りのある角度内でライトシートを回転させるように構成されたアクチュエータと、を含むことができる。照明サブシステムは、ライトシートを形成するために走査面に沿って光を走査するように構成された走査装置を含むことができ、走査面は照明軸とライトシートがその周りで回転される垂直方向とによって規定される。
【００２７】
少なくとも１つの検出サブシステムは、像平面内でライトシートによって照らされたサンプルの画像を生成するように構成された対物レンズと、像平面内でライトシートによって照らされたサンプルの画像を検出するように構成された検出器とを含むことができる。少なくとも１つの検出サブシステムのアクチュエータは、検出軸に沿って対物レンズを並進させ、それにより像平面を移動させるように構成されたアクチュエータを含むことができる。
【００２８】
サンプルは蛍光マーカのセットを含むことができ、ライトシートによって照らされたサンプルの画像は蛍光発光波長（fluoresced wavelength）の光を放射する蛍光マーカのセットによって生成され、蛍光発光波長はライトシートの波長とは別個のものである。
【００２９】
アクチュエータのうちの１つ以上は、圧電アクチュエータとガルバノメータスキャナのうちの１つ以上を含むことができる。
【００３０】
制御システムは、記録された蛍光の画像を分析し、その分析に基づいて試料の画像を作成するように構成することができる。ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性の測定は、サンプルの画像を作成するために使用される蛍光の画像の記録間に発生する期間中に行うことができる。１つ以上の受信した特性は記録された蛍光の画像にすることができ、制御システムは、記録された画像に基づいて画像品質メトリックを発生することにより記録された画像を分析するように構成することができる。
【００３１】
その他の一般的な態様では、顕微鏡は、指定の波長を有する光を生成するように構成された光源と、顕微鏡内の光軸に沿ってサンプル内のある位置でライトシートに光を形成するように構成された照明光学部品と、光軸に関して横方向オフセットの周りでライトシートを並進させるように構成された第１のコントローラと、サンプル内の位置に関して縦方向オフセットの周りでライトシートを並進させるように構成された第２のコントローラと、光軸の周りの横揺れ角内でライトシートを回転させるように構成された第３のコントローラと、光軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内でライトシートを回転させるように構成された第４のコントローラと、を含む。
【００３２】
諸実施形態は以下の特徴のうちの１つ以上を含むことができる。光源はレーザにすることができる。レーザによって生成される光は、ビームの断面を通るガウス型輪郭を有するビームを含むことができ、そのビームはビームのガウス型輪郭が最小幅を有する光軸に沿った位置にウエストを有する。サンプル内の位置に関して縦方向オフセットの周りでライトシートを並進させるように構成された第２のコントローラは、光軸に沿ってビームのウエストを移動させるように構成することができる。
【００３３】
光軸の周りの横揺れ角内でライトシートを回転させるように構成された第３のコントローラは、二軸ガルバノメータスキャナを含むことができる。
【００３４】
光軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内でライトシートを回転させるように構成された第４のコントローラは、縦チルトミラー（vertical tilting mirror）及び横チルトミラー（lateral tilting mirror）を有する二軸旋回ガルバノメータスキャナを含むことができる。縦チルトミラーは、光軸に対して第１の方向θｘに光を角変位させるように構成される。横チルトミラーは、光軸に対して第２の方向θｚに光を角変位させるように構成される。第２の方向は第１の方向に対して垂直であり、偏揺れ角はθｘとθｚの集合である。光軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内でライトシートを回転させるように構成された第４のコントローラは、２つのリレーレンズを含むことができる。二軸旋回ガルバノメータスキャナは、レーザからの平行ビームが第１のリレーレンズによって垂直走査ミラー上に合焦され、第２のリレーレンズが視準を復旧し、二軸ライトシートガルバノメータスキャナ上にビームを誘導するように、２つのリレーレンズ間の焦点距離に位置決めすることができる。
【００３５】
この顕微鏡は、像平面内でライトシートによって照らされたサンプルの画像を生成するように構成された対物レンズと、像平面内でライトシートによって照らされたサンプルの画像を検出するように構成された検出器と、光軸に沿って検出器を並進させるように構成された第５のコントローラも含むことができる。サンプルは蛍光マーカのセットを含むことができる。ライトシートによって照らされたサンプルの画像は、対物レンズ内に蛍光発光波長の光を放射する蛍光マーカのセットによって生成することができる。蛍光発光波長は指定の波長とは異なるものにすることができる。
【００３６】
この顕微鏡は、画像の画像品質メトリックの最適化に応じて第１のコントローラ、第２のコントローラ、第３のコントローラ、第４のコントローラ、及び第５のコントローラのそれぞれを制御するように構成された適応制御メカニズムを含むことができる。適応制御メカニズムは、画像品質メトリックの最適化の実行前にガウスカーネル機能によって画像についてたたみこみ操作を実行するように構成することができる。画像品質メトリックは、画像のピクセルの強度のアフィン変換に対して不変にすることができる。画像品質メトリックは、光学的帯域通過を通過できる空間周波数のみに依存することができる。画像品質メトリックはスペクトル画像品質メトリックを含むことができる。スペクトル画像品質メトリックは、正規化された離散コサイン変換（ＤＣＴ）シャノンエントロピメトリックを含むことができる。適応制御メカニズムは、画像品質メトリックの最適化を実行する際に、周波数原点にセンタリングされた辺２ｒｐの正方形の外部の空間周波数を抑制するように構成された低域フィルタを実行することができ、数量ｒｐ＝ｗ（Ｉ）／ｒ０は対物レンズの点広がり関数の半径であり、ｗは像平面内の正方形の画像Ｉの幅であり、ｒ０は顕微鏡の光学的伝達関数（ＯＴＦ）のサポート半径である。
【００３７】
第５のコントローラは圧電性アクチュエータを含むことができ、圧電性アクチュエータは対物レンズを移動させるように構成される。
【００３８】
光源及び照明光学部品は、顕微鏡内の光軸に沿ってサンプル内の第２の位置で第２のライトシートに光を形成するように更に構成することができる。この顕微鏡は、第２の像平面内で第２のライトシートによって照らされたサンプルの第２の画像を生成するように構成された第２の対物レンズと、第２の像平面内で第２のライトシートによって照らされたサンプルの第２の画像を検出するように構成された第２の検出器と、光軸に関して第２の横方向オフセットの周りで第２のライトシートを並進させるように構成された第６のコントローラと、サンプル内の第２の位置に関して第２の縦方向オフセットの周りで第２のライトシートを並進させるように構成された第７のコントローラと、光軸の周りの第２の横揺れ角内で第２のライトシートを回転させるように構成された第８のコントローラと、光軸に対して垂直な第２の方向の周りの第２の偏揺れ角内で第２のライトシートを回転させるように構成された第９のコントローラと、光軸に沿って第２の検出器を並進させるように構成された第１０のコントローラとを含むことができる。
【００３９】
その他の一般的な態様では、方法は、顕微鏡内で、指定の波長を有する光を発生することと、顕微鏡内の光軸に沿ってサンプル内のある位置で光からライトシートを形成することと、ライトシートによって照らされたサンプルの一部分の画像を形成することと、形成された画像に基づいて画像メトリックを発生することと、画像メトリックに基づいて、（ｉ）光軸に対して横向きの方向にライトシートを並進させること、（ｉｉ）光軸に沿った方向にライトシートを並進させること、（ｉｉｉ）光軸の周りの横揺れ角内でライトシートを回転させること、及び（ｉｖ）光軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内でライトシートを回転させることにより、ライトシートを調整することと、を含む。
【００４０】
更なる一般的な態様では、コンピュータプログラムプロダクトは非一時的記憶媒体を含み、このコンピュータプログラムプロダクトは、電子デバイス上でのコンピュータプログラムプロダクトの実行時に、電子デバイスにある方法を実行させるコードを含む。この方法は、光軸に沿ってライトシートによって照らされたサンプル内のある位置で顕微鏡内のサンプルの画像に基づいて画像メトリックを発生することと、画像メトリックに基づいて、（ｉ）光軸に対して横向きの方向にライトシートを並進させること、（ｉｉ）光軸に沿った方向にライトシートを並進させること、（ｉｉｉ）光軸の周りの横揺れ角内でライトシートを回転させること、及び（ｉｖ）光軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内でライトシートを回転させることにより、ライトシートを調整することと、を含む。
【００４１】
自動時空的適応システムは、空間分解能及び信号強度を２倍から５倍に改善し、非適応イメージングによって解明されない多くの領域において細胞及び亜細胞組織を回復し、遺伝学的にコード化された蛍光マーカの時空的動力学に適応し、生物における大規模な形態形成変化中にイメージング性能をロバストに最適化する。
【００４２】
自動時空的適応システムは、高い光の効率を維持し、高い空間分解能（高い軸方向分解能及び高い横方向分解能を含む）を維持するので、生体試料の高分解能イメージングに適している。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】光学顕微鏡内に統合された自動時空的適応システムを含む顕微鏡システムのブロック図である。
【図２】図１の顕微鏡システムを使用してイメージングされた試料を示す概略図である。
【図３】図１の顕微鏡システムの４つの主要ビューを示す概略図である。
【図４Ａ】図１の顕微鏡システムによって基準面のセットでイメージングされる試料の斜視図である。
【図４Ｂ】ホルダに取り付けられたサポートマトリックス（support matrix）内の図４Ａの試料の斜視図である。
【図５Ａ】計算フレームワークを含む適応システムの斜視図及びブロック図である。
【図５Ｂ】光学顕微鏡によって生成されたライトシートによってイメージングされる試料の斜視図である。
【図５Ｃ】試料がライトシートによってイメージングされる時にＸＺ平面に沿って取られ、光学顕微鏡の動作パラメータＩ（ｌｓ）の変化を示す、図５Ｂの試料の側部断面図である。
【図５Ｄ】試料がライトシートによってイメージングされる時にＺＹ平面に沿って取られ、光学顕微鏡の動作パラメータＤ（ｆｐ）の変化を示す、図５Ｂの試料の上部断面図である。
【図５Ｅ】試料がライトシートによってイメージングされる時にＸＺ平面に沿って取られ、光学顕微鏡の動作パラメータα（ｌｓ）の変化を示す、図５Ｂの試料の側部断面図である。
【図５Ｆ】試料がライトシートによってイメージングされる時にＺＹ平面に沿って取られ、光学顕微鏡の動作パラメータβ（ｌｓ）の変化を示す、図５Ｂの試料の上部断面図である。
【図５Ｇ】試料がライトシートによってイメージングされる時にＺＹ平面に沿って取られ、光学顕微鏡の動作パラメータＹ（ｌｓ）の変化を示す、図５Ｂの試料の上部断面図である。
【図６】図１の適応システムによって実行されるプロセスワークフローの一実施形態を示す概略図である。
【図７Ａ】ＺＹ平面に沿って取られ、図１の適応システムによるイメージングのために使用される基準面ＰＬのセットを示す、試料の上部断面図である。
【図７Ｂ】ＺＹ平面に沿って取られ、図１の適応システムによるイメージングのために使用されるシフト済み基準面ＰＬのセットを示す、試料の上部断面図である。
【図８】図１の適応システムを含む光学顕微鏡の一実施形態のブロック図である。
【図９】図１の適応システムを含む光学顕微鏡の一実施形態の斜視図である。
【図１０Ａ】図１の光学顕微鏡の照明サブシステムのうちの１つの一実施形態のブロック図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａの照明サブシステムの旋回光学配置（pivot optical arrangement）内のライトビームの経路を示すブロック図である。
【図１０Ｃ】ライトビームが旋回光学配置により重心軸を外れて旋回された、図１０Ａの照明サブシステムの実施形態のブロック図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｃの照明サブシステムの旋回光学配置内のライトビームの経路を示すブロック図である。
【図１１】図１０Ａの照明サブシステムの光学スキャナ配置を通るライトビームの経路を示すブロック図である。
【図１２Ａ】図１０Ａの旋回光学配置と光学スキャナ配置との間のリレーレンズにおいてライトビームによって取られる可能性がある３つの経路の位置を示す概略図である。
【図１２Ｂ】図１０Ａの光学スキャナ配置に続くｆθレンズにおいて図１２Ａのリレーレンズでライトビームによって取られる可能性のある３つの経路のそれぞれの位置を示す概略図である。
【図１３】図１の光学顕微鏡の制御システムの一実施形態のブロック図である。
【図１４】適応イメージングのために制御システムの制御下で図１の光学顕微鏡によって実行される手順のフローチャートである。
【図１５Ａ】ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定するために図１の光学顕微鏡によって実行される手順のフローチャートである。
【図１５Ｂ】図１５Ａの手順によって測定された特性を分析するために図１の光学顕微鏡によって実行される手順のフローチャートである。
【図１６Ａ】光学顕微鏡の動作パラメータのうちの２つ以上の間の関係を定義するために図１の計算フレームワークによって使用される制約グラフの表現を示している。
【図１６Ｂ】図１の光学顕微鏡の状態変数とデフォーカスとの直線関係並びに制約関係を記述する行列を示している。
【図１６Ｃ】図１の光学顕微鏡の検出対物レンズの位置の固定質量中心を定義するシステムアンカリング制約である制約の一例の図を示しており、このような制約は図１の光学顕微鏡の質量中心のドライブを防止するために必要である。
【図１６Ｄ】図１の光学顕微鏡内で生成された蛍光信号が実験中に弱すぎる場合にパラメータの値を調整する制約の一例の図を示している。
【図１７Ａ】ショウジョウバエ胚発生の実験中の時間の関数としての画像品質メトリックからの出力のグラフであり、検出対物レンズの位置の摂動及び図１の光学顕微鏡のライトシートのオフセットは手動で導入される。
【図１７Ｂ】図１７Ａの摂動が実行された時に基準面に関する時間の関数として図１の光学顕微鏡のいくつかの動作パラメータを示すグラフである。
【図１７Ｃ】図１７Ａの実験中の特定の時間において図１の光学顕微鏡の検出サブシステムから出力される最大値投影を示している。
【図１７Ｄ】図１７Ａの実験中の特定の時間において図１の光学顕微鏡の検出サブシステムから出力される最大値投影を示している。
【図１７Ｅ】図１７Ａの実験中の特定の時間において図１の光学顕微鏡の検出サブシステムから出力される最大値投影を示している。
【図１８Ａ】図１の光学顕微鏡によってイメージングされた試料を通る断面図を示しており、試料内部のライトシートの角度βは試料とマトリックスとの間の境界面における屈折の結果としてそれぞれの像平面で変化する。
【図１８Ｂ】図１８Ａの試料を通る断面図を示しており、ライトシート及び検出焦点面が試料外部では同一平面上にあるが、試料内部では互いに対して傾斜している場合でも、ライトシートによって照らされる試料のすべての領域がどのように同時に合焦状態にあるわけではないかを示す。
【図１８Ｃ】ライトシートと検出焦点面との間の角度の不一致の測定及び補正が図１の光学顕微鏡内の空間分解能をどのように改善するかを示す試料の画像を示している。
【図１８Ｄ】実験的に測定され、理論的に予測された補正角が試料のボリューム全体わたって調整される、図１８Ａの試料の図を示している。
【図１８Ｅ】図１８Ａから図１８Ｄの試料におけるライトシートの３次元の向きを自動的に決定するための手順の図を示している。
【図１９】図１の光学顕微鏡によってイメージングされた試料におけるイメージング深さの関数として課されたライトシート角αと測定されたライトシート角βとの関係のグラフを示している。
【図２０Ａ】幼生ゼブラフィッシュの脳をイメージングした時の光学顕微鏡の最適化のタイムラインのグラフを示しており、その際に３回の反復最適化が実行される。
【図２０Ｂ】図２０Ａのそれぞれの反復中に特定の基準面におけるライトシートに関する画像品質メトリックの焦点依存性を示すグラフを示している。
【図２０Ｃ】図２０Ａ及び図２０Ｂの最適化が実行された時に図１の光学顕微鏡から出力される模範的な画像を示している。
【図２１Ａ】図１の適応システムが時空的適応イメージングを実行する低速度撮影実験におけるＲＦＰを表すキイロショウジョウバエ幼胚の背腹最大値画像投影を示している。
【図２１Ｂ】図２１Ａの幼胚において時間及び空間位置の関数としてそれぞれの検出焦点面に対するライトシートの位置のリアルタイム補正を示すグラフを示している。
【図２１Ｃ】図２１Ａ及び図２１Ｂの幼胚のイメージングにおける空間分解能及び画像品質が時空的適応イメージングを使用して改善されることを実証する画像を示している。
【図２１Ｄ】適応補正後（上段）及び未補正（中段）の顕微鏡状態に関する画像の代表的領域における画像品質及び空間分解能の並列比較を示している。
【図２２Ａ】ショウジョウバエ幼胚の時空的適応イメージング中の時間の関数としての画像品質のグラフを示している。
【図２２Ｂ】図２２Ａのショウジョウバエ幼胚について時間の関数としていくつかの基準面における顕微鏡の４つの動作パラメータの時間的補正を示している。
【図２３】産卵から２１時間後のショウジョウバエ幼胚における適応補正後（１列目）及び未補正（２列目）の顕微鏡状態で記録された画像の比較分析を示している。
【図２４Ａ】図１の光学顕微鏡によって実行された低速度撮影実験における細胞核内のＧＦＰを表すゼブラフィッシュ種幼胚の一連の横方向最大値投影を示している。
【図２４Ｂ】光学顕微鏡の計算フレームワークが、蛍光信号が欠落している参照位置にどのように自動的にフラグを立て、図２４Ａの試料における時間及び空間位置の関数として蛍光信号の出現を監視するかを示している。
【図２４Ｃ】図２４Ａの幼胚における時間及び空間位置の関数としてそれぞれの検出焦点面に対する２つのライトシートの位置のリアルタイム補正を可視化するグラフを示している。
【図２４Ｄ】図１の適応システムの計算フレームワークによって計算された光学顕微鏡に対する補正あり（上段）及び補正なし（下段）で取得したデータ（２列目）のフーリエ解析とともに６時間後に図２４Ｃにマークされた空間位置に関する画像データを示している。
【図２４Ｅ】被包の終了時の光学顕微鏡の適応補正後及び未補正の動作パラメータに関する２つの代表的画像領域内の画像品質及び空間分解能の並列比較を示している。
【図２５】被包の終了時のゼブラフィッシュ幼胚における適応補正後（１列目）及び未補正（２列目）の顕微鏡状態で記録された画像の比較分析を示している。
【図２６Ａ】図１の適応システムを使用する２０時間の低速度撮影実験を表すＲＦＰを表すキイロショウジョウバエ幼胚の背腹最大値画像投影を示している。
【図２６Ｂ】図１の適応システムを使用する汎神経マーカ（pan-neural marker）の表現の発現の自動検出を示すグラフである。
【図２６Ｃ】図１の光学顕微鏡の動作パラメータに対する補正あり（上段）及び補正なし（下段）で取得した画像データ（２列目）のフーリエ解析とともに１８．５時間後に図２６Ｂにマークされた空間位置に関する模範的な画像データを示している。
【図２６Ｄ】Nikon製16×/0.8対物レンズを使用する検出サブシステムの一実施形態の概略図である。
【図２６Ｅ】適応システムがイメージング中の照明対物レンズのリアルタイム調整により照明ライトシートのビームウエストの位置を最適化する際の図２６Ａの幼胚の断面図（左）並びにそれぞれのカラーチャンネルに関する照明焦点の軌跡の分析を示している。
【図２７Ａ】ライトシートウエストの最適軸位置が試料内の像平面の位置につれてどのように変化するかを示す概略図を示している。
【図２７Ｂ】画像品質が最高になる位置を決定することにより最適軸位置がどのように推定されるかを示している。
【図２７Ｃ】試料における画像品質対深さの模範的なグラフを示している。
【図２７Ｄ】試料における画像品質対深さの模範的なグラフを示している。
【図２７Ｅ】試料における画像品質対深さの模範的なグラフを示している。
【図２７Ｆ】ライトシートウエストの軸位置を最適化することによりイメージコントラスト及び空間分解能が実質的に改善される光学顕微鏡から出力される画像を示している。
【図２７Ｇ】ライトシートウエストの軸位置を最適化することにより試料の多くの領域内の細胞分解能が復旧される画像を示している。
【図２８Ａ】図１の顕微鏡システムによってイメージングすべき試料の一例であり、背側から見たゼブラフィッシュ幼生脳の背側半分の略図を示している。
【図２８Ｂ】図１の顕微鏡システムによるイメージングから１１時間後に図２８Ａにおいて２８Ｂとマークされた領域の適応補正後及び未補正の画像データにおける画像品質及び空間分解能の並列比較を示している。
【図２８Ｃ】図２８Ｂにおいて２８Ｃとマークされた領域の上部拡大図を示している。
【図２８Ｄ】補正後及び未補正の顕微鏡状態並びに図１の顕微鏡システムによって実行されたイメージングの２つのバージョンについて、図２８Ａにおいて２８Ｄとマークされた領域の接写写真を示している。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
図１を参照すると、顕微鏡システム１００は、サンプル又は試料１１の全体としてのイメージングのために設計され、光学顕微鏡１１０内で動作する自動時空的適応システム１６０を含む。光学顕微鏡１１０は、ライトシートイメージングを使用して試料１１をイメージングするマルチビューライトシート顕微鏡である。自動時空的適応システム１６０により、光学顕微鏡１１０は、ライトシートイメージングの進行中に変化する試料内で遭遇する動的光学条件に連続的かつ自動的に適応することにより試料１１のライトシートイメージングの空間分解能を実質的に改善できるスマートライトシート顕微鏡に変わる。試料１１のライトシートイメージングのプロセスは本明細書では試料１１の主要ライトシートイメージング又は低速度撮影ライトシートイメージング実験と呼ぶことができ、適応システム１６０によって実行される適応態様は本明細書では時空的適応イメージングと呼ぶことができる。
【００４５】
試料１１は、発達中の幼胚などの複雑な生体生物試料１１である可能性がある。例えば、複雑な生物試料１１は受精卵として始まる可能性があり、この場合、顕微鏡システム１００は受精卵全体の機能動物への変態を捕捉する（capture）ことができ、数時間又は数日というスケールの期間をかけて形を成す時に受精卵から形成される幼胚内のそれぞれの細胞を追跡する能力を含む。顕微鏡システム１００は、数時間から数日の経過につれて捕捉された多くの画像の寄せ集めを提供することができ、何がイメージングされているか次第で、観察者は単一集団の細胞として出現し始めた幼胚内の生物学的構造が数万個の高密度に詰め込まれた細胞を備えた細長い体に変身するのを見ることができる。顕微鏡システム１００は同時マルチビューイメージングを提供するライトシート顕微鏡法技術を使用し、これはより遅い順次マルチビューイメージングによって引き起こされる可能性のある時空的アーチファクトを除去又は低減するものである。更に、照らされている試料１１の一部を検出器が記録する間に試料１１の薄片（例えば、Ｚ軸に沿って取られた幅が１マイクロメートル（μｍ）程度のもの）が走査されたレーザライトシートによって一度に照らされるだけであるので、試料１１に対する損傷が低減される。同時マルチビューイメージングを実行するために試料１１の機械的回転は不要である。
【００４６】
顕微鏡システム１００は光学顕微鏡１１０（マルチビューライトシート顕微鏡である）と制御システム１８０とを含む。光学顕微鏡１１０と制御システム１８０は、互いに情報を交換するように構成される。一般に、光学顕微鏡１１０は、照射軸に沿って存在する別個のそれぞれの照射方向から試料１１を照らす複数のライトシート（例えばライトシート１２、１４）と、検出軸と平行な複数の検出方向又はビューに沿って結果として生じる蛍光を収集する複数の検出サブシステム（例えば検出サブシステム１１６、１１８）から構成される。以下に示す例では、それぞれの照明サブシステム１１２、１１４において２つのライトシート１２、１４が生成され、これらは照射軸と平行でライトシート方向又は照射方向と呼ばれる両方向から試料１１を照らす。それぞれの検出サブシステム１１６、１１８はそれぞれの検出対物レンズの向きによって規定される２つの検出ビュー（又は検出方向）に沿って結果として生じる蛍光３６、３８を収集し、検出方向は検出軸と平行である。この特定の例では、ライトシート方向はそのライトシート１２、１４が試料１１に入る時に移動する方向によって規定され、検出方向は試料１１に対する検出サブシステム１１６又は１１８のそれぞれの検出対物レンズの向きによって規定される。従って、この例では、ライトシート方向は照射軸であるＹ軸と平行であり、検出方向は検出軸であって、Ｙ軸に対して垂直なＺ軸と平行である。Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸は光学顕微鏡１１０の絶対座標系を規定する。
【００４７】
図２により詳細に示されているように、試料１１の薄片（例えば、Ｚ軸に沿って取られた幅が１マイクロメートル（μｍ）程度のもの）はレーザライトシート１２又は１４によって一度に照らされる。例えば、ライトシート１２は＋Ｙ軸に沿って誘導され、ライトシート１４は−Ｙ軸に沿って誘導される。それぞれのライトシート１２、１４は、それぞれのライトシート１２、１４の平面領域が試料１１と一致するか又はそれを横断するように、Ｘ軸に沿った広がりと、Ｚ軸に沿ったより小さい広がりも有する。Ｚ軸に沿った広がりはＸ軸又はＹ軸のいずれかに沿ったライトシート１２、１４の広がりよりかなり小さく、このＺ軸の広がりはライトシート１２、１４のウエストで最も薄くなる。
【００４８】
ライトシート１２、１４は、Ｙ−Ｘ平面に沿って広がるイメージボリュームＩＶに沿って試料１１内で互いに空間的にオーバーラップし、時間的にオーバーラップし、イメージボリュームＩＶ内で試料１１と光学的に相互作用する。時間的オーバーラップは、光学顕微鏡１１０の空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフト又は時間差の範囲内である。特に、これは、ライトシート１２、１４が、同時に又は時間差中に生物試料１１内で追跡された細胞の任意の変位が顕微鏡１１０の分解能限界より著しく（例えば、以下に示す１桁分）小さくなるほど小さい時間差だけ時間的にずらして、試料１１のイメージボリュームＩＶ内で空間的にオーバーラップすることを意味し、この場合、分解能限界は光学顕微鏡１１０の空間分解能限界に対応する時間である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ライトシート１２、１４は、Ｘ軸を横切ってライトビームを走査するか又は偏向させることによって形成される。他の例として、ライトシート１２、１４は代わりに、Ｚ軸に沿ってその曲率で向けられた円柱レンズを通ってレーザビームを誘導し、それによりＺ軸に沿ってライトシート１２、１４を合焦させるが、Ｘ軸に沿って不変のままにすることにより形成される。
【００５０】
ライトシート１２、１４は、ライトシート１２、１４のウエストが図２に示されているように試料１１内に存在するように、それぞれの照明サブシステム１１２、１１４内のコンポーネントによって調整される。ライトシート１２、１４のウエストは、Ｚ軸の方向にライトシート１２、１４の最も薄い部分である。ライトシート１２、１４の平面領域はＸ軸及びＹ軸によって規定することができ、ライトシート１２、１４の平面領域は試料１１を切るように進む。試料１１及び（それぞれの検出サブシステム１１６、１１８内で）互いに直交するように向けられた検出対物レンズの焦点領域を照らすライトシート１２、１４（具体的には、ライトシート１２、１４の平面領域）は、検出サブシステム１１６、１１８が試料１１から放出された蛍光３６、３８を効率的に収集するために、試料１１内で互いにオーバーラップしなければならない。
【００５１】
この例では、顕微鏡システム１００は、４つの補完的（かつ異なる）光学ビューの取得により完璧に近い適用範囲を提供する。例えば、図３を参照すると、第１のビュー（ビュー１）はライトシート１２と試料１１との相互作用により放出された蛍光３６＿２を検出する検出システム１１６から得られ、第２のビュー（ビュー２）はライトシート１４と試料１１との相互作用により放出された蛍光３６＿４を検出する検出システム１１６から得られ、第３のビュー（ビュー３）はライトシート１２と試料１１との相互作用により放出された蛍光３８＿２を検出する検出システム１１８から得られ、第４のビュー（ビュー４）はライトシート１４と試料１１との相互作用により放出された蛍光３８＿４を検出する検出システム１１８から得られる。
【００５２】
顕微鏡システム１００はライトシート蛍光顕微鏡法を使用し、これは生物試料１１のライブイメージングを可能にし、優れた空間及び時間分解能を提供し、生理学的条件下で試料１１内の生物学的プロセスの長期観察を容易にする。生物試料１１は生きており、従って、空間的に異種であるだけでなく、時間的に動的でもある複雑な光学的性質を有する。この複雑さは典型的に、ライトシート１２、１４によって規定される平面領域と、検出システム１１６、１１８の焦点領域によって規定されるイメージング面との間に著しい時空的に可変な不一致をもたらす。培養組織内又は多細胞生物の表面における個々の細胞など、小さく透明な試料１１において回折限界に近い高い空間分解能を達成することは実現可能であるが、幼胚全体などのより大きく光学的により挑戦的な試料の高解像度画像を達成することは困難である可能性がある。このような難題は、ライトシート１２、１４の平面領域が検出システム１１６、１１８内の検出対物レンズの焦点領域とオーバーラップするというライトシート顕微鏡法における原理要件に直接的にリンクされる。第一次近似として、ライトシート１２、１４の平面領域はライトシート面（例えば、Ｘ−Ｙ平面と平行）と見なすことができ、検出対物レンズの焦点領域は焦点面（図２に示されている焦点面２６、２８など）と見なすことができ、ライトシート面は検出対物レンズの焦点面と同一平面上になければならない。いかなる時及び場所でもこの空間関係に違反する場合、空間分解能及び画像品質は劣化する。
【００５３】
従って、ライトシート１２、１４を使用する顕微鏡法における最適画像品質は、照明ライトシート１２、１４の平面とそれぞれの検出サブシステム１１６、１１８内の検出対物レンズの焦点面２６、２８とのオーバーラップを必要とする。しかしながら、上述のように、生体試料１１の時空的に変化する光学的性質により、ライトシート面と検出面２６、２８との間の不一致が発生する可能性がある。実際には、ライトシート１２、１４の平面と生体試料１１内の検出焦点面２６、２８との間の時空的に変化する不一致に対して、多くの要因が貢献するが、このような貢献の４つの例について次に説明する。
【００５４】
第一に、多細胞生物である生体試料１１は典型的に複雑な３次元（３Ｄ）形状を有する。試料１１、周囲のサポートマトリックス（例えば、アガロース）、及び試料１１を保持する顕微鏡チャンバ内の媒体（例えば、水）の平均屈折率は通常、実質的に異なるので、光の屈折は試料１１の表面で発生する可能性があり、ライトシート１２、１４の平面と検出面２６、２８との相対位置及び３Ｄ配向の不一致をもたらす可能性がある。これらの不一致は、ボリュメトリックイメージングの過程にわたりライトシート１２、１４が試料１１の異なる領域に移動するにつれて変化する。
【００５５】
第二に、図４を参照すると、試料１１自体は、細胞密度、細胞サイズ、及び生化学的組成の局所的な差の結果として、空間的に変化する光学的性質を有する。例えば、ショウジョウバエ又はゼブラフィッシュの幼胚内の脂質豊富な卵黄は、幼胚の組織領域とは別個の細胞密度、細胞サイズ、及び生化学的組成を有する。この空間的異種性は、発達中に連続的に変化し、試料１１内部でライトシート１２、１４によって横断される光路の方向及び長さに更に影響を及ぼす。例えば、図４では、試料４１は、ホルダ４１０によって支持されるサポートマトリックス４０５（例えば、アガロースゲルにすることができる）内に取り付けられる。この例では、この時点で試料４１は４つの別個の領域Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、及びＣ４を有し、それぞれが別個の屈折率ｎＣ１、ｎＣ２、ｎＣ３、及びｎＣ４を有する。その上、サポートマトリックス４０５は異なる屈折率ｎＢを有し、サポートマトリックス４０５を取り囲む環境は別個の回折率ｎＡを有する。ライトシート１２又は１４は、それが試料４１に向かって更に試料４１を通って移動する時に遭遇する領域次第で様々に変質されることになり、これはライトシート１２、１４によって横断される光路の方向及び長さの変化を引き起こす。
【００５６】
第三に、波長に依存する効果及び色収差はライトシート１２、１４の平面及び検出面２６、２８において追加の不一致をもたらし、これらの不一致はイメージング深さの関数として変動し、蛍光マーカのスペクトル照明及び検出ウィンドウに依存する。ライブイメージング中の顕微鏡コンポーネントにおける熱、機械、及び電子的ドリフトは空間分解能の劣化に更に貢献する可能性がある。
【００５７】
第四に、蛍光マーカの分布は、イメージング実験中に、特に特定の（潜在的に非定常の）細胞集団をターゲットとする遺伝的にコード化されたマーカの使用又は特定の遺伝子産物の追跡を伴う実験において、頻繁に時空的変化を経験する。被包中の初期ゼブラフィッシュ（学名：D.rerio）幼胚などの発達中の生物をイメージングする場合、光学条件がサンプル内で時間及び空間位置の関数として連続的に変化することを考慮する必要もある。ショウジョウバエにおける発達中の神経系を追跡する汎神経蛍光マーカなど、遺伝的にコード化された蛍光マーカのライブイメージングは、マーカ表現における時空的動力学によって更に複雑になる。従って、イメージング実験において最適分解能を回復することは、動的蛍光信号を追跡しながら、動的光学条件に対する顕微鏡の時空的適応が必要になる。
【００５８】
従って、ライトシート１２、１４の平面と検出面２６、２８の空間関係は、実験の開始時に定量的に説明できない実験中の動的変化を受けやすい。
【００５９】
もう一度、図１を参照し、更に図５Ａ及び図５Ｂも参照すると、制御システム１８０によって生成された結果として生じる画像において高い空間分解能を達成し維持するために、空間分解能を低減するように作用しているこれらの要因にもかかわらず、顕微鏡システム１００は、時空的適応イメージングを保証する自動時空的適応システム１６０（本明細書では適応システムと呼ばれる）を含む。適応システム１６０は、試料４１のライトシートイメージングに関連する諸態様を連続的に分析し最適化する（又は改善する）ことができる。例えば、適応システム１６０は、試料４１のボリューム全体にわたってライトシート１２、１４の平面及び検出面２６、２８の空間及び時間関係を改善することができる。適応システム１６０によって実行される適応はリアルタイムで実行され、これは、光学顕微鏡１１０を使用する主要イメージング取得の実行とともにその適応が実行されることを意味する。適応システム１６０は、試料４１の光学的性質及びその環境に適応することにより、試料４１（生物など）全体にわたって空間分解能を系統的に査定し最適化するものであり、このため、適応システム１６０は、光学顕微鏡１１０内に統合されると、自動マルチビューライトシート顕微鏡１１０を提供する。
【００６０】
適応システム１６０は、光学顕微鏡１１０のライトシート１２、１４によるイメージングに関する１つ以上の特性の測定１５２と、測定１５２から１つ以上の特性を受信し、この受信した測定１５２に基づいて１つ以上の分析を実行し、その分析に基づいて１つ以上の制御信号を出力する自動計算フレームワーク１８５と、フレームワーク１８５からの受信した制御信号に基づいて光学顕微鏡１１０の１つ以上の動作パラメータを制御又は調整するために光学顕微鏡１１０に接続された作動装置１５０とを含む。制御又は調整される動作パラメータは、光学顕微鏡１１０の動作に関する自由度（ＤＯＦ）と見なすことができる。
【００６１】
測定１５２は画像の品質に関することができる。具体的には、試料１１内の基準領域（基準面にすることができる）のセットにおいて画像品質をサンプリングすることができる。例えば、図４Ａに示されているように、基準面ＰＬ０〜ＰＬ４を使用して試料４１の画像品質をサンプリングする。画像品質は画像品質メトリックに基づいて推定することができる。画像品質メトリックは、その引数として画像を取り、実数を返す関数として定義される。光学顕微鏡１１０のダウンタイム（以下に図６に関連して述べるアイドル時間）中に、光学顕微鏡１１０は、試料１１全体にわたってセット内の基準面のそれぞれで既知の動作パラメータを摂動させ（又は増分的に変化させ）、次にこれらの摂動がこれらの基準面でサンプリングされた画像の品質にどのように影響を及ぼすかを分析することにより探査される。サンプリングされる画像のいくつかは、サンプリングされた画像におけるより多くのぶれ（又はデフォーカス）を発生する摂動動作パラメータのセットを有する可能性があり、従って、これらの基準面におけるこのような画像の品質は低減される。サンプリングされるその他の画像は、サンプリングされた画像におけるぶれ（又はデフォーカス）を低減する摂動動作パラメータのセットを有する可能性があり、従って、このような画像の品質は改善される。適応システム１６０はこの探査中にシステムに供給されるパラメータのセットを把握しているので、どの動作パラメータがより高い品質の画像を生成するかを決定することは可能である。その上、これらの画像品質値は主要ライトシートイメージング中に得られた現行画像と比較することができ、適応システム１６０は、作動装置１５０に信号を送ることによりイメージングを改善するように光学顕微鏡１１０の１つ以上の動作パラメータを調整すべきかどうかを決定することができる。測定１５２の分析の結果として調整される１つ以上の動作パラメータは、測定１５２を判断するために探査しながら、光学顕微鏡１１０を摂動させるように変更される１つ以上の動作パラメータとは別個のものである場合もあれば、同じものである場合もある。
【００６２】
作動装置１５０のコンポーネントについて述べる前に、図５Ａから図５Ｅに関連して動作パラメータについて次に述べる。図５Ｂから図５Ｅでは、ライトシート１２、１４は一般にｌｓとして表され（ｌｓは１２又は１４にすることができる）、検出焦点面２６、２８は一般にｆｐとして表される（ｆｐは２６又は２８にすることができる）。更に、図５Ａから図５Ｅでは、試料４１はサポートマトリックス４０５内に取り付けられる。図５Ａから図５Ｅの図は一定の縮尺で描かれているわけではなく、詳細を示すために誇張されている可能性がある。
【００６３】
作動装置１５０は、ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整するために光学顕微鏡１１０内に統合される。作動装置１５０は、計算フレームワーク１８５からの命令に基づいて光学顕微鏡１１０内の１つ以上のコンポーネントを作動させる。作動装置１５０は、Ｘ、Ｙ、及びＺの３つの軸のうちの１つ以上においてライトシート面及び／又は検出面を回転及び／又は並進させるために光学顕微鏡１１０のエレメントに結合されたアクチュエータを含む。
【００６４】
例えば、図５Ｂ及び図５Ｃに関連して述べると、照射軸（Ｙ軸）に対して垂直な方向に沿った（例えば、Ｚ軸に沿った）ライトシートｌｓの並進に関連するパラメータＩ（ｌｓ）は、それぞれ、Ｉ（１２）及びＩ（１４）と呼ぶことができる。図５Ｂ及び図５Ｄに関連して述べると、Ｚ軸に沿って取られた検出焦点面ｆｐの位置に関連するパラメータＤ（ｆｐ）は、それぞれ、Ｄ（２６）及びＤ（２８）と呼ぶことができる。
【００６５】
図５Ｂ及び図５Ｅに関連して述べると、ライトシートｌｓの伝搬方向の周りのライトシートの回転に関連するパラメータα（ｌｓ）は、それぞれ、α（１２）及びα（１４）と呼ぶことができる。ライトシートｌｓの伝搬方向がＹ軸上に存在する場合、このパラメータは、Ｙ軸の周りを回転させた角度α（ｌｓ）と見なすことができる。
【００６６】
図５Ｂ及び図５Ｆを参照すると、ライトシートｌｓのウエストの位置を表すポイントによって規定される軸の周りのライトシートｌｓの回転に関連するパラメータβ（ｌｓ）は、それぞれ、β（１２）及びβ（１４）と呼ぶことができる。ウエスト位置のポイントはＸ軸と平行な方向に沿って存在し、従って、パラメータβ（ｌｓ）はＸ軸と平行な方向の周りでライトシートｌｓを回転させることに関連する。
【００６７】
他の例として、作動装置１５０は、Ｙ軸と平行な照射軸に沿ってライトシートｌｓを並進させるための光学顕微鏡１１０のエレメントに結合されたアクチュエータを含む。図５Ａ及び図５Ｇに示されているように、Ｙ軸に沿って取られたライトシートｌｓのウエストＷ（ｌｓ）の位置に関連するパラメータＹ（ｌｓ）は、それぞれ、Ｙ（１２）及びＹ（１４）と呼ぶことができる。
【００６８】
他の例として、作動装置１５０は、蛍光３６、３８がイメージングされるボリュームを変更し、それによりサンプル１１のジオメトリの変化を補償するための光学顕微鏡１１０のエレメント（例えば、検出サブシステム１１６、１１８又は試料１１のホルダなど）に結合されたアクチュエータを含む。蛍光３６、３８がイメージングされるボリュームは、Ｚ軸に沿ってより大きい範囲の値全体にわたって試料１１を移動することによりＺ軸において変更することができる。高速の機能的イメージング実験では、試料１１が静止状態のままになり、３次元（３Ｄ）イメージングのための対物レンズ及びライトシート１２、１４が調整され、検出サブシステム１１６、１１８に結合されたアクチュエータを調整することができる。非常に大きい試料１１のより低速の発達イメージングの場合、代わりに試料１１を移動することができ、適応システム１６０は、完全なサンプルボリュームを捕捉するために試料１１が移動する範囲を更新することが必要になるであろう。この場合、ライトシート１２、１４及び焦点面２６、２８は、ライトシート１２、１４と焦点面２６、２８との不一致を補正するためにのみ、依然として調整される。これらの場合、計算フレームワーク１８５は、その幾何学的中心（又は蛍光質量中心）が静止状態のままになるように、Ｘ軸、Ｙ軸、及びＺ軸のそれぞれにおいて試料１１を追跡するためのアルゴリズムを含む。
【００６９】
他の例として、作動装置１５０は、蛍光３６、３８の波面を補正するための検出サブシステム１１６、１１８のエレメントに結合されたアクチュエータを含む。例えば、アクチュエータは変形可能ミラーにすることができるか、又はアクチュエータは検出サブシステム１１６、１１８内のチューブレンズに結合することができる。
【００７０】
適応システム１６０は、光学顕微鏡１１０からの測定１５２を急速に分析し、この分析に基づいて試料１１のボリューム全体にわたって空間分解能をリアルタイムで連続的に最適化又は改善する完全自動計算フレームワーク１８５を制御システム１８０内に含む。測定１５２は、光学顕微鏡１１０のライトシート１２、１４によるイメージングに関する１つ以上の特性の測定である。いくつかの実施形態では、測定１５２は検出サブシステム１１６、１１８のうちの１つ以上から得られる。例えば、測定１５２は、試料１１に関連するジオメトリ（例えば、サイズ、形状、及び／又は位置）の測定にすることができる。他の例として、測定１５２は、顕微鏡システム１００によって形成される試料１１の画像に関する測定にすることができる。例えば、測定１５２は顕微鏡システム１００によって形成される試料１１の画像の品質にすることができる。測定１５２は蛍光３６、３８の波面から取ることができる。
【００７１】
図６も参照すると、適応システム１６０を使用する時空的適応イメージングのための模範的なプロセスワークフロー６００が示されている。一般に、試料１１に関する低速度撮影実験における主要画像取得６０５は、繰り返し離散方式で顕微鏡システム１００によって実行される。例えば、連続する画像取得６０５の開始は期間Ｔ６０５だけ分離することができる。その上、１回の主要画像取得６０５の終了と次の主要画像取得６０５の開始又は始まりとの間にはアイドル時間６１０が存在する。このアイドル時間６１０中に適応システム１６０の１つ以上のサブアクション６１５が実行される。例えば、適応システム１６０に関する測定１５２は、このアイドル時間６１０中に、主要画像取得６０５が完了した後に実行される。測定１５２は可能な限り短い期間の間に取られ、従って、測定１５２の実行により引き起こされる可能性のある、試料１１のイメージングにおける光退色、光毒性、及び時間分解能に対する影響を最小化するために、低速度撮影実験中に時間的に分散される。アイドル時間６１０中に実行される１つ以上のサブアクション６１５は、アイドル時間６１０中に受信した測定１５２に基づいて計算フレームワーク１８５によって実行される計算も含むことができる。また、アイドル時間６１０中に実行される１つ以上のサブアクション６１５は、計算フレームワーク１８５が作動装置１５０に信号を送信することを含み、次に作動装置１５０が次の主要画像取得６０５中にライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することも可能である。しかしながら、作動装置１５０に信号を送信する前に複数のアイドル時間６１０からの複数の測定１５２に基づいて分析を実行する前に、計算フレームワーク１８５が複数のアイドル時間６１０にわたって数セットの測定１５２を取得することは有益である可能性がある。この場合、複数のアイドル時間６１０後に光学顕微鏡１１０に対する更新６２０（計算フレームワーク１８５が作動装置１５０に信号を送信すること及び作動装置１５０が計算フレームワーク１８５からの命令に基づいて光学顕微鏡１１０内の１つ以上のコンポーネントを作動させることを含む）を実行することができる。
【００７２】
図７Ａも参照すると、測定１５２が光学顕微鏡１１０のライトシート１２、１４によるイメージングに関する１つ以上の特性の測定である場合、計算フレームワーク１８５は、適応システム１６０で使用するための試料７０１の画像がいつどこで取られるかを制御することができる。例えば、測定１５２は、ＸＹ平面と平行で、Ｚ軸に沿った８つの別個の位置Ｚ０、Ｚ１、・・・Ｚ７で試料７１全体に分散される８つの別個で分離された基準面ＰＬ０、ＰＬ１、・・・ＰＬ７で取られた（蛍光３６又は３８の）取得した画像にすることができる。大きく部分的に不透明な試料をイメージングする場合、基準面のいくつか（例えば、面ＰＬ０、ＰＬ１、ＰＬ２、及びＰＬ３）はこのような基準面により近接した検出サブシステム１１６により関連するものになり、その他の基準面（例えば、面ＰＬ４、ＰＬ５、ＰＬ６、及びＰＬ７）はこのような基準面により近接した検出サブシステム１１８により関連するものになる。更に、典型的にそれぞれの位置ＺＳ−１及びＺＳにおいて試料７１の中心付近に位置する基準面のサブセット（例えば、同期面と呼ばれる面ＰＬＳ−１及びＰＬＳ）は検出サブシステム１１６、１１８の両方に関連する可能性がある。これらの同期面に関連する関連自由度は、試料７１のボリュームの残りの部分で使用されるものとは異なる制約を受け、これらの同期面で実行される測定１５２は試料７１のボリューム全体を通して空間連続性を保証するために使用される。
【００７３】
図７Ｂに関連して述べると、試料７１のイメージング中に基準面の位置を調整することは可能である。上述のように、測定１５２は、試料７１に関連するジオメトリ（例えば、サイズ、形状、及び／又は位置）の測定にすることができる。この場合、計算フレームワーク１８５は、基準面で検出された画像を分析し、試料７１のエッジ、外周、サイズ、及び／又は中心を決定することができる。その上、計算フレームワーク１８５がこの決定を行うと、試料７１が時間の経過につれて変化した時に試料７１のジオメトリの変化に対処するために試料７１内の基準面の位置を調整することが必要になる可能性もある。例えば、図７Ｂに示されているように、試料７１のジオメトリは（そのサイズ又はボリュームの増加、その質量中心の変化、又はその形状の変化により）変化しており、基準面ＰＬ０、ＰＬ１、・・・ＰＬ７の位置は、試料７１のジオメトリの変化に対処するために新しい位置Ｚ０’、Ｚ１’、・・・Ｚ７’に調整されている。
【００７４】
より一般的に記載すると、測定１５２は、設定数Ｋの基準面で取られた画像のものにすることができ、Ｋは１より大きい任意の整数である。従って、８つより少ないか又は８つより多い基準面を使用することができる。この基準面のセットは、位置のセット［Ｚ０，Ｚ１，・・・ＺＫ−１］で取られたセット［ＰＬ０，ＰＬ１，・・・ＰＬＫ−１］と呼ぶことができる。他の例として、図４Ａに示されているように、５つの基準面ＰＬ０、ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３、及びＰＬ４で画像が記録される。
【００７５】
計算フレームワーク１８５は、長期の高速イメージング実験の過程にわたり最適画像品質を維持するために、試料１１における動的変化に連続的に適応する。すべての判断は、データ駆動型であり、実験のバックグラウンドで動作する時間及び光に関して効率的な手順を使用して収集された画像派生情報のリアルタイム評価に基づくものである。制御システム１８０内の計算フレームワーク１８５は、作動装置１５０に信号を送信し、それによりライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータ（３次元におけるライトシート１２、１４の平面及び検出サブシステム１１６、１１８の平面の並進、回転、又は並進と回転の両方、あるいは試料１１がイメージングされるボリュームの変更など）を調整することにより、イメージングの空間分解能を連続的に最適化又は改善する。制御システム１８０内の計算フレームワーク１８５は光学顕微鏡１１０を制御するためのソフトウェア又はプログラムを含み、この制御ソフトウェアは、試料１１全体にわたって最大画像品質を回復し維持するために光学顕微鏡１１０の構成の変更が必要であるかどうか（及びどの変更が必要か）を急速に検出できる最適化手順と統合される。
【００７６】
もう一度、図５Ａを参照すると、適応システム１６０の計算フレームワーク１８５は、いくつかのソフトウェアモジュール５８６、５８７、５８８、及び５８９と、データがソフトウェアモジュール５８６、５８７、５８８、５８９、作動装置１５０、測定１５２の間を移動する際に通るデータインターフェース５９０とを含む。
【００７７】
ソフトウェアモジュール５８７は、測定１５２から受信された画像の品質を推定し、異なるシステム状態で画像品質を比較し、推定を実行するために画像品質メトリックを使用する、画像品質ソフトウェアモジュールである。ソフトウェアモジュール５８８は、基準面［ＰＬ０，ＰＬ１，・・・ＰＬＫ−１］における測定１５２の影響を低減又は最小化するために試料１１においてライトシートジオメトリを再構築するために（単一デフォーカスイメージシーケンスから）パラメータに関する最適設定を計算する、ライトシートジオメトリ推定ソフトウェアモジュールである。ライトシートジオメトリ推定ソフトウェアモジュール５８８は、全体的な適応スキームを改善するために使用される。ライトシートジオメトリ推定ソフトウェアモジュール５８８は、測定１５２によって提供される画像に基づいて、試料１１内部のライトシート１２、１４の位置又は試料１１内部のライトシート１２、１４の向きを決定することができる。
【００７８】
ソフトウェアモジュール５８９は、モジュール５８７及び５８８からの出力を受信し、受信した出力に基づいて分析を実行し、光学顕微鏡１１０の動作パラメータに関する補正状態を決定して試料１１のイメージングを改善する、最適化ソフトウェアモジュールである。最適化ソフトウェアモジュール５８９は制約グラフを使用することができ、これは顕微鏡１１０の光学機械式自由度並びにそれらの互いの空間、時間、及びスペクトル関係を表す数学的オブジェクトである。この制約は固定することができ、即ち、不変の幾何学的及び光学要件に関するものにすることができる。この制約は動的なものにすることができ、即ち、変化する受信測定１５２に関するものにすることができる。画像品質ソフトウェアモジュール５８７からの出力は、ライトシート及び検出焦点面パラメータＩ（１２）、Ｉ（１４）、Ｄ（２６）、及びＤ（２８）並びに照射軸（Ｙ（１２）及びＹ（１４））に沿ったライトシート１２、１４の並進を制御するために使用される。ライトシートジオメトリ推定ソフトウェアモジュール５８８からの出力は、ライトシート１２、１４の角度α（１２）、α（１４）、β（１２）、β（１４）を制御するために使用される。
【００７９】
ソフトウェアモジュール５８６は、ソフトウェアモジュール５８９からの分析の出力に基づいて光学顕微鏡１１０の動作パラメータをどのように調整しなければならないかを決定する、作動ソフトウェアモジュールである。この決定が行われると、ソフトウェアモジュール５８６はリアルタイム制御信号を作動装置１５０に提供して、光学顕微鏡１１０に対する調整を実施する。
【００８０】
適応システム１６０は、すべての次元においてライトシート１２、１４及び検出焦点面の平面のコンピュータ制御の並進及び回転のために完全にデジタルで調整可能な光学機械式自由度を提供する。また、適応システム１６０は、イメージング中にサイズが不変ではない試料１１も補償する。例えば、適応システム１６０は、試料１１がイメージング中に発達している時に測定１５２を使用して試料１１の空間的広がり及び形状を決定することができ、従って、適応システム１６０は、拡大している試料１１に対処するために試料１１をどのようにイメージングするかについて諸態様を変更することができる。適応システム１６０は、測定１５２を使用してリアルタイムで試料１１全体にわたって空間分解能及び画像品質をロバストに査定し、系統的に追跡する。イメージングに関する特性の測定１５２は、時空的測定であり、試料１１に関連する光子収支、試料１１の生理学、及び光学顕微鏡１１０がイメージングする速度に対する測定の影響を最小化又は低減するように設計される方式で行われる。
【００８１】
適応システム１６０は、スマートライトシート顕微鏡、即ち、自動時空的適応イメージングのための複合型ハードウェアソフトウェアフレームワークを可能にする。適応システム１６０は、光学顕微鏡１１０の異なる生物学的モデルシステム、生物学的プロセス、マーカ戦略、時空的信号力学、及び光学構成に関してロバストである。適応システム１６０は、このような適応システム１６０が欠落している光学顕微鏡１１０と比較した場合、大きい多細胞生物全体にわたって空間分解能及び信号強度を２〜５倍改善する。
【００８２】
次に、光学顕微鏡１１０及び作動装置１５０から始めて、適応システム１６０の説明を示す。
【００８３】
光学顕微鏡及び作動装置
ライトシート１２、１４は試料１１の両側でＹ軸に沿って試料１１を照らす。薄いボリュームと、照射軸（一般にＹ軸と平行である）に対して（Ｚ軸に沿って）直角の蛍光方向による高速走査は光学的に区分された画像を提供する。ライトシート１２、１４は試料１１内の蛍光体をより高いエネルギーレベルに励起し、その結果、蛍光光子のその後の放出が行われ、これらの蛍光光子はひとまとめにして蛍光３６、３８と呼ばれ、それぞれの検出サブシステム１１６、１１８において検出される。試料１１内で励起される蛍光体は、例えば、ＧＦＰなどの遺伝的にコード化された蛍光タンパク質又はＡｌｅｘａ−４８８などの染料など、試料１１の細胞に添付されるラベルにすることができる。蛍光体はいくつかの実施形態では、試料１１の細胞内の実際のタンパク質又は天然タンパク質にすることができ、このようなタンパク質はライトシート１２、１４によって露光した時に特定の波長の光を放出する。
【００８４】
ライトシート１２、１４及びそれらと試料１１との相互作用並びに照明サブシステム１１２、１１４及び検出サブシステム１１６、１１８に関する詳細な考察は、２０１６年８月２日に発行された「Multi-view Light Sheet Microscopy」という名称の米国特許第９，４０４，８６９号に記載され、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【００８５】
図８を参照すると、光学顕微鏡１１０の一実施形態がブロック図形式で示されている。光学顕微鏡１１０のそれぞれの照明サブシステム１１２、１１４はそれぞれの光源８２２、８２４を含み、それぞれの光源８２２、８２４はライトビームを出力する。それぞれの光源８２２、８２４から出力されるライトビームは、光学コンポーネントのそれぞれのセット８３２、８３４によって変更される。これらの光学コンポーネントは、ライトビームの方向、サイズ、角度、ジオメトリなどの特性を変更してそれぞれのライトシート１２、１４を生成する。例えば、照明サブシステム１１２、１１４内で生成されるライトシート１２、１４は、以下に詳述するように、それぞれの光源８２２、８２４の出力を走査することにより生成することができる。光学コンポーネントのセット８３２、８３４を通過した後、それぞれのライトシート１２、１４は、試料１１内の照射面にライトシート１２、１４を合焦させるそれぞれの照明対物レンズ８４２、８４４を通って誘導される。照明対物レンズ８４２、８４４は、いくつかの実施形態では、比較的長い作動距離の空気対物レンズにすることができる。
【００８６】
それぞれの検出サブシステム１１６、１１８は、試料１１から放出されたそれぞれの蛍光３６、３８を収集する、それぞれの検出対物レンズ８２６、８２８を含む。それぞれの検出対物レンズ８２６、８２８によって収集された蛍光３６、３８は次に、それぞれのカメラ８４６、８４８に入る前に１つ以上の光学コンポーネントのそれぞれのセット８３６、８３８を通って誘導される。従って、ライトシートイメージングの１つ以上の特性の測定１５２は、カメラ８４６、８４８から出力される画像の特性の測定にすることができ、この測定１５２は処理及び分析のために計算フレームワーク１８５に誘導される。光学コンポーネントのそれぞれのセット８３６、８３８は、検出すべき光の波長のあたりに中心を合わせた波長帯域の外側の波長の光を拒絶するフィルタなどのコンポーネントを含むことができる。光学コンポーネントのそれぞれのセット８３６、８３８は、それぞれのカメラ８４６、８４８のセンサ上に収集した蛍光を合焦させる１つ以上のレンズ（チューブレンズなど）を含むことができる。
【００８７】
次に、顕微鏡１１０のこれらのコンポーネントに関連して作動装置１５０内のアクチュエータについて説明する。作動装置１５０は、照射軸（一般にＹ軸と平行である）に沿ってライトシート１２、１４のウエストを調整するためにそれぞれの照明対物レンズ８４２、８４４に物理的に結合されたアクチュエータ５１（１２）、５１（１４）を含み、上述のように、ウエストの位置はそれぞれパラメータＹ（１２）及びＹ（１４）によって与えられる。アクチュエータ５１（１２）、５１（１４）は、照射軸（Ｙ軸）に沿ってそれぞれの照明対物レンズ８４２、８４４を並進させることによりそれぞれのライトシート１２、１４のウエストに対する調整を実施することができる。
【００８８】
作動装置１５０は、検出軸（Ｚ軸である）に沿ってライトシート１２、１４の照射面（ＸＹ平面と平行である）を並進させるためにそれぞれのセット８３２、８３４内のそれぞれの光学コンポーネントに物理的に結合されたアクチュエータ５２（１２）、５２（１４）を含む。Ｚ軸上のライトシート１２、１４の照射面の位置はパラメータＩ（１２）、Ｉ（１４）によって与えられる。
【００８９】
作動装置１５０は、照射軸（Ｙ軸である）の周りでそれぞれのライトシート１２、１４を回転させるためにそれぞれのセット８３２、８３４内のそれぞれの光学コンポーネントに物理的に結合されたアクチュエータ５３（１２）、５３（１４）を含む。ライトシート１２、１４がＹ軸の周りで回転する角度はそれぞれのパラメータα（１２）、α（１４）によって与えられ、これらは横揺れと呼ぶことができる。
【００９０】
作動装置１５０は、照射軸に対して垂直なＸ軸の周りでそれぞれのライトシート１２、１４を回転させるためにそれぞれのセット８３２、８３４内のそれぞれの光学コンポーネントに物理的に結合されたアクチュエータ５４（１２）、５４（１４）を含む。ライトシート１２、１４がＸ軸の周りで回転する角度はそれぞれのパラメータβ（１２）、β（１４）によって与えられ、これらは偏揺れ又は旋回と呼ぶことができる。
【００９１】
作動装置１５０は、検出軸（Ｚ軸である）に沿って焦点面２６、２８の位置を調整するためにそれぞれの検出対物レンズ８２６、８２８に物理的に結合されたアクチュエータ５５（２６）、５５（２８）を含み、上述のように、焦点面２６、２８の位置はそれぞれのパラメータＤ（２６）及びＤ（２８）によって与えられる。アクチュエータ５５（２６）、５５（２８）は、検出軸に沿ってそれぞれの検出対物レンズ８２６、８２８を並進させることにより蛍光３６、３８の焦点面２６、２８に対する調整に影響を及ぼすことができる。
【００９２】
作動装置１５０は、蛍光３６、３８がイメージングされるボリュームを変更し、それによりサンプル１１のジオメトリの変化を補償するために検出サブシステム１１６、１１８のエレメントに結合されたアクチュエータ５６（１６）、５６（１８）を含む。例えば、アクチュエータ５６（１６）、５６（１８）は、計算フレームワーク１８５によって分析される基準面［ＰＬ０，ＰＬ１，・・・ＰＬＫ］の別個のＺ位置を調整するためにカメラ８４６、８４８、セット８３６、８３８の光学コンポーネント、及びカメラ８４６、８４８のうちの１つ以上に結合することができる。
【００９３】
他の例として、作動装置１５０は、蛍光３６、３８の波面を補正するために検出サブシステム１１６、１１８のエレメントに結合されたアクチュエータ５７（１６）、５７（１８）を含む。例えば、これらのアクチュエータは、変形可能ミラーにするか、又は光学コンポーネントのセット８３６、８３８内のチューブレンズに結合することができる。
【００９４】
作動装置１５０は図８に示されていないその他のアクチュエータを含むこともできる。
【００９５】
図９を参照すると、光学顕微鏡９１０の一実施形態が斜視図で示されており、この実施形態では、それぞれの光源８２２、８２４の出力を走査することによってライトシート１２、１４が作成され、図８に示されている作動装置１５０のアクチュエータのうちのいくつかが使用される。この実施形態では、光学顕微鏡９１０は試料１１を収容するチャンバを含む。
【００９６】
例えば、光学顕微鏡９１０の作動装置１５０は、Ｙ軸に沿ってそれぞれの対物レンズ８４２、８４４を並進させることにより（パラメータＹ（１２）及びＹ（１４）に基づいて）Ｙ軸に沿ってライトシート１２、１４のウエストを調整するためにそれぞれの照明対物レンズ８４２、８４４に物理的に結合されたアクチュエータ５１（１２）、５１（１４）を含む。アクチュエータ５１（１２）、５１（１４）は圧電ポジショナにすることができる。それぞれの照明サブシステム１１２、１１４の光軸（Ｙ軸）に沿ったライトシートウエストの位置（Ｙ（１２）及びＹ（１４））の精密な制御のために、アクチュエータ５１（１２）、５１（１４）は、移動範囲が８００μｍであり、E-665圧電増幅器及びコントローラ（Physik Instrumente製）によって動作するP-628.1CD Hera圧電ポジショナであり、それぞれの対物レンズ８４２、８４４は圧電ポジショナに取り付けられる。
【００９７】
光学顕微鏡９１０の作動装置１５０は、Ｚ軸に沿ってそれぞれの検出対物レンズ８２６、８２８を並進させることにより（パラメータＤ（２６）及びＤ（２８）に基づいて）Ｚ軸に沿って焦点面２６、２８の位置を調整するためにそれぞれの検出対物レンズ８２６、８２８に物理的に結合されたアクチュエータ５５（２６）、５５（２８）を含む。アクチュエータ５５（２６）、５５（２８）は圧電ポジショナにすることができる。それぞれの検出サブシステム１１６、１１８の光軸に沿った検出焦点面の位置（Ｄ（２６）及びＤ（２８））の精密な制御のために、アクチュエータ５５（２６）及び５５（２８）は、移動範囲が２５０μｍであり、E-665圧電増幅器及びコントローラ（Physik Instrumente製）によって動作するP-622.1CD Hera圧電ポジショナにすることができ、それぞれの対物レンズ８２６、８２８は圧電ポジショナに取り付けられる。
【００９８】
光学顕微鏡９１０の作動装置１５０は、ライトシートイメージングの２つの動作パラメータに対する複合調整に影響を及ぼすためにそれぞれのセット８３２、８３４内のそれぞれの光学コンポーネント（ミラーなど）に物理的に結合されたアクチュエータ５２（１２）、５２（１４）及びアクチュエータ５３（１２）、５３（１４）を含む。具体的には、アクチュエータ５２（１２）、５２（１４）及びアクチュエータ５３（１２）、５３（１４）の複合セットは、それぞれのセット８３２、８３４内の光学コンポーネント上で一緒に働いて、（パラメータＩ（１２）、Ｉ（１４）に基づいて）Ｚ軸に沿ってライトシート１２、１４の照射面（ＸＹ平面と平行である）を並進させるとともに、（パラメータα（１２）、α（１４）に基づいて）Ｙ軸の周りでそれぞれのライトシート１２、１４を回転させる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、アクチュエータ５２（１２）、５２（１４）、５３（１２）、５３（１４）のうちの１つ以上は圧電ドライバである。その他の実施形態では、アクチュエータ５２（１２）、５２（１４）、５３（１２）、５３（１４）はCombridge Technology製のモデル6215HSM40Bなどのガルバノメータスキャナである。いくつかの実施形態では、アクチュエータ５２（１２）、５２（１４）、５３（１２）、５３（１４）及びそれらが制御するセットのミラーは、例えばPhysik Instrumente (PI)製のS-334ミニチュアピエゾチップ／チルトミラーを使用して互いに統合することができる。圧電制御のミラーは、ガルバノメータスキャナと同じ機能性を提供することができるが、隠されたシステム摂動の導入を単純化できる追加のアナログオフセット入力を提供する。追加のアナログオフセット入力に関する要件がない場合、ガルバノメータスキャナは、改善された温度安定性と、圧電制御が提供するものより高速のライン繰り返し率を提供することができる。
【０１００】
また、光学顕微鏡９１０の作動装置１５０は、（それぞれのパラメータβ（１２）、β（１４）に基づいて）Ｘ軸の周りでそれぞれのライトシート１２、１４を回転させるためにそれぞれのセット８３２、８３４内のそれぞれの光学コンポーネント（ミラーなど）に物理的に結合されたアクチュエータ５４（１２）、５４（１４）も含む。いくつかの実施形態では、アクチュエータ５４（１２）、５４（１４）のうちの１つ以上は圧電ドライバである。その他の実施形態では、アクチュエータ５４（１２）、５４（１４）はCombridge Technology製のモデル6215HSM40Bなどのガルバノメータスキャナである。
【０１０１】
それぞれの照明システムの光軸に対して垂直なライトシートオフセット（Ｉ（１２）及びＩ（１４））並びに試料１１における空間内の横揺れライトシート角度（α（１２）及びα（１４））の精密な制御のために、アクチュエータ５２（１２）、５２（１４）及び５３（１２）、５３（１４）は、二軸6215Hガルバノメータスキャナ（Cambridge Technology）として単一ユニット内に形成することができる。同様に、試料１１における空間内の偏揺れライトシート角度（β（１２）及びβ（１４））の精密な制御のために、アクチュエータ５４（１２）、５４（１４）は、二軸6215Hガルバノメータスキャナ（Cambridge Technology）として形成することができる。それぞれの照明サブシステム１１２、１１４では、光源８２２、８２４からのライトビームと相互作用する第１の二軸ガルバノメータスキャナ（アクチュエータ５４（１２）、５４（１４）は、試料１１の平面に対して共役し、試料１１の空間内でライトシート１２、１４の角度の向きを制御するのに対し、ライトビームと相互作用する第２の二軸ガルバノメータスキャナ（アクチュエータ５２（１２）／５３（１２）、５２（１４）／５３（１４）の対）は、検出対物レンズ８２６、８２８の焦点面２６、２８に対して共役し、横方向（Ｚ軸）ライトシートオフセットを制御する（更に走査したライトシート照明自体も容易にする）。
【０１０２】
幼胚全体の発達又は組織及び臓器の形成など、試料１１内の動的生物学的プロセスの長期イメージング中に画像品質及び空間分解能を最適化するために、適応システム１６０によって可能になった時空的適応イメージングの手法は、これら１０個の動作パラメータ（自由度と見なすことができるもの）Ｙ（１２）、Ｙ（１４）、Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、Ｉ（１４）、α（１２）、α（１４）、β（１２）、及びβ（１４）のデジタル制御を頼みにしており、これらはすべてのライトシート１２、１４と検出焦点面２６、２８との間の相対オフセット及び角度を特徴付けるものである。これらの自由度の制御を自動化することにより、適応システム１６０のフレームワーク１８５は、試料１１の光学的性質における時空的変化、試料１１における蛍光マーカの局所及び大域分布及び成熟、並びに光学顕微鏡１１０の様々なコンポーネントにおける機械及び熱ドリフトを補償することができる。
【０１０３】
図１０Ａ及び図１０Ｂを参照すると、図８及び図９の照明サブシステム１１４の一実施形態の概略図が示され、記載されている。照明サブシステム１１２は設計及び動作の点で照明サブシステム１１４と同様のものであり、単純にするために照明サブシステム１１４のコンポーネントのみについて述べる。
【０１０４】
光源８２４は、アクチュエータ５４（１４）によって制御され調整される旋回光学配置１００５に最初に誘導されるライトビーム１０００を生成する。旋回光学配置１００５は図９の照明サブシステム１１４内にもあるが、他のコンポーネントが配置１００５をブロックしているために見えない。旋回光学配置１００５は、それぞれのレンズ１０１０、１０１５まで１焦点距離離れた場所で２つのリレーレンズ１０１０、１０１５の間に挟まれている。旋回光学配置１００５は、照明サブシステム１１４から出力されるライトシート１４の偏揺れ角β（１４）を調整又は制御するために組み合わせて使用される第１のチルトミラー１００５Ａと第２のチルトミラー１００５Ｂとを含む。以下に述べるように、旋回光学配置１００５は、Ｘ軸の周りのみの回転によって制約を受ける試料１１においてライトシート１４に対する調整を引き起こすように構成することができる。このようにして、照明サブシステム１１４のその他のコンポーネントは、ライトシート１４の他の特性を制御するために使用することができる。
【０１０５】
照明サブシステム１１４は、リレーレンズ１０１５を通過するライトビーム１０００を受け取る光学スキャナ配置１０２０を含む。光源８２４によって生成された視準ライトビーム１０００はリレーレンズ１０１０によってチルトミラー１００５Ａ上に合焦され、リレーレンズ１０１５は視準を復旧し、ライトビーム１０００を光学スキャナ配置１０２０に誘導する。
【０１０６】
光学スキャナ配置１０２０はアクチュエータ５２（１４）及び５３（１４）によって制御され調整される。光学スキャナ配置１０２０はライトビーム１０００をＸ軸に沿って偏向させてライトシート１０２５を形成し、そのライトシート１０２５はｆθレンズ１０３０、チューブレンズ１０３５、及び照明対物レンズ８４４に向かって誘導され、照明対物レンズ８４４の出力はライトシート１４を形成する。光学スキャナ配置１０２０は、次に簡単に説明するいくつかの機能を実行するために組み合わせて使用される第１のチルトミラー１０２０Ａと第２のチルトミラー１０２０Ｂとを含む。チルトミラー１０２０Ａ、１０２０Ｂは、Ｘ軸全体にわたってライトビーム１０００を走査してライトシート１０２５を形成するように調整される。チルトミラー１０２０Ａ、１０２０Ｂは、照射軸（Ｙ軸と平行である）に対して垂直な方向に沿ってライトシート１４の平面をオフセット又は並進させるように調整され、例えば、ライトシート１４の平面はＺ軸に沿ってオフセットすることができる。上述のように、照射軸に対して垂直なライトシート１４の平面のオフセットの量はパラメータＩ（１４）によって与えられる。その上、チルトミラー１０２０Ａ、１０２０Ｂは、Ｙ軸の周りのライトシート１４の回転である、ライトシート１４の横揺れ角α（１４）を制御又は調整するように調整される。
【０１０７】
旋回光学配置１００５はライトシート１４の偏揺れ角β（１４）の制御を担当し、光学スキャナ配置１０２０は横揺れ角α（１４）及びライトシート並進Ｉ（１４）を制御する。光学顕微鏡１１０のフットプリント（又はサイズ）を低減するために、これらの配置１００５、１０２０のそれぞれは、二軸スキャナでセットアップされる（これは、それぞれのアクチュエータが２つの異なる軸の周りでライトビームを制限するか又は回転させることを意味する）。
【０１０８】
光学スキャナ配置１０２０の主要機能は、試料１１内でＸ軸に沿ってライトシート１４の高さを規定する角度範囲を生成するように入射ライトビーム１０００を偏向することである。更に、光学スキャナ配置１０２０はｆθレンズ１０３０の焦点面に位置するように位置決めされ、その結果、巨視的ライトシート１４を生成するので、光学スキャナ配置１０２０を出るライトビーム１０００の角度はｆθレンズ１０３０によってＸ軸又はその方向に沿った変位に変換される。チューブレンズ１０３５と照明対物レンズ８４４の対は、ｆθレンズ１０３０から出力された巨視的ライトシート１４を試料１１における微視的ライトシート１４に集束させる。照明対物レンズ８４４は比較的長い作動距離の空気対物レンズにすることができる。
【０１０９】
次に、ライトシート１４の偏揺れ角β（１４）の制御について説明する。偏揺れ角β（１４）は、走査されたライトビーム１４のウエストの位置を表すポイントによって規定されるＸ軸の周りの試料１１におけるライトシート１４の回転である。偏揺れ角β（１４）は、アクチュエータ５２（１４）又は５３（１４）を横方向に物理的に変位させるか又は光学スキャナ配置１０２０と相互作用するライトビーム１０００を横方向に変位させることにより、調整することができる。（光学スキャナ配置１０２０と相互作用するライトビーム１０００を横方向に変位させるための）第２の手法は、より単純な設計であり、自動かつデジタル制御の方式で実行できるので、より実用的なものである。
【０１１０】
チルトミラー１００５Ａ及び１００５Ｂの角度又は傾斜を調整することにより、ライトビーム１０００はリレーレンズ１０１５の平面においてＸＺ平面内のどこかで光軸から外れて位置決めすることができる。図１０Ａ及び図１０Ｂの構成では、第１のチルトミラー１００５Ａ及び第２のチルトミラー１００５Ｂは、噛み合っておらず、非旋回かつ軸上の位置にあり、これは、ライトシート１４が旋回されておらず、偏揺れ角β（１４）の値がゼロであることを意味する。図１０Ｃ及び図１０Ｄの構成では、第１のチルトミラー１００５Ａ及び第２のチルトミラー１００５Ｂは、噛み合っており、旋回位置にあり、これは、ライトシート１４が旋回されており、偏揺れ角β（１４）の値が非ゼロであることを意味する。
【０１１１】
上記のように、旋回光学配置１００５は、それぞれのレンズまで１焦点距離離れた場所で２つのリレーレンズ１０１０及び１０１５の間に位置決めされる。このため、（旋回光学配置１００５及びレンズ１０１０、１０１５からなる）複合システムはその光軸に対してライトビーム１０００の平行移動をもたらし、その平行移動は照明サブシステム１１４の下流光学コンポーネントによって旋回運動又は調整、即ち、試料１１の位置における偏揺れ角β（１４）に変換される。図１０Ｃ及び図１０Ｄは、旋回運動β（１４）を生成するためのライトビーム１０００の変位の導入を示している。旋回されたライトビーム１０２５（図１０Ｃ及び図１０Ｄに示されている）は、光学スキャナ配置１０２０後に軸上のライトビーム１０２５（図１０Ａ及び図１０Ｂに示されている）に対して横方向に（Ｚ軸に沿って）変位する。
【０１１２】
第１のチルトミラー１００５Ａが図１０Ａ及び図１０Ｂの非旋回位置から図１０Ｃ及び図１０Ｄの旋回された位置まで回転すると、ミラー１００５ＡはＸに沿って角度θＸだけライトビーム１０００を変位する。第２のチルトミラー１００５Ｂが図１０Ａの非旋回位置から図１０Ｃの旋回された位置まで回転すると、ミラー１００５ＢはＺに沿って角度θＺだけライトビーム１０００を変位する。図１０Ｃ及び図１０Ｄに示されているチルトミラー１００５Ａ及び１００５Ｂの両方を回転させることによる蓄積効果は、チルトミラー１００５Ａにおいて図１０Ａ及び図１０Ｂの軸上／非旋回ライトビーム１０００に対して角度γだけＸＺ平面内のライトビーム１０００を角変位することである。
【０１１３】
チルトミラー１００５Ａ、１００５Ｂの回転は、旋回光学配置１００５による調整の全体的な効果により、Ｘ軸以外の他の軸の周りでライトシート１４の偏向を引き起こさずに試料１１において偏揺れ角β（１４）だけライトシート１４を偏向させることであることを保証するようなやり方で抑制することができる。この全体的な効果を保証する制約は、光学スキャナ配置１０２０の設計に関するものであり、次に図１１、図１２Ａ、及び図１２Ｂに関連して述べる。図１１に示されているように、光学スキャナ配置１０２０内のチルトミラー１０２０Ａ、１０２０Ｂはそれぞれのシャフト１１２１Ａ、１１２１Ｂ上に取り付けられ、これらのシャフトはそれぞれのアクチュエータ５２（１４）及び５３（１４）のコンポーネントである。それぞれのシャフト１１２１Ａ、１１２１Ｂは主要軸１１２２Ａ、１１２２Ｂを規定し、シャフト１１２１Ａ、１１２１Ｂは、それぞれのミラー１０２０Ａ、１０２０Ｂがそれぞれの主要軸１１２２Ａ、１１２２Ｂの周りを回転できるモータ回転子に取り付けられている間、所定の場所に固定される。シャフト１１２１Ｂの主要軸１１２２Ｂは、シャフト１１２２Ａの主要軸１１２２Ａが存在するＹＺ平面に対してηの角度で固定される。この角度ηは、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されているように、リレーレンズ１０１５におけるＸ軸に対してライトビーム１０００のシフト後の位置の向きを規定する。アクチュエータ対５２（１４）及び５３（１４）が61021506R40 XYマウントを使用するCambridge Technology製のモデル6215Hなどの二軸スキャナである場合、ηの値は約１７°である（ただし、他の値も可能である）。
【０１１４】
具体的には、ライトビーム１０００が衝突するリレーレンズ１０１５における旋回位置ＰはＸＺ平面内の制約線ＣＬ上に存在しなければならない。制約線ＣＬはＸ軸に対して角度ηである。これは、旋回光学配置１００５によるライトビーム１０００の変位によりリレーレンズ１０１５における旋回位置ＰをＸＺ平面内の制約線ＣＬ上に残存させることを意味する。その上、光学スキャナ配置１０２０を通過した後、ライトビーム１０２５はＺ軸のみに沿って偏向したままになり、Ｘ軸に沿った偏向を呈しない。これはｆθレンズ１０３０における偏向面１２００の位置から明白である。このため、チューブレンズ１０３５及び照明対物レンズ８４４から出力されたライトシート１４はＸ軸のみの周りでＺ軸のみに沿って回転する。従って、旋回位置Ｐが制約線ＣＬまでに抑制されると、旋回光学配置１００５によって引き起こされる調整による全体的な影響は、ライトシート１４をＸ軸のみの周りで回転させること（偏揺れ角β）になる。比較のため、リレーレンズ１０１５におけるライトビーム１０００の非旋回位置は図１２ＡでＯとして示し、ｆθレンズ１０３０における非偏向位置の位置は図１２Ｂで１２０５として示す。
【０１１５】
図１２Ａに示されているように、リレーレンズ１０１５におけるシフト後の旋回位置Ｐ’が制約線ＣＬから偏向されるようにライトビーム１０００が旋回光学配置１００５によって調整される場合、光学スキャナ配置１０２０から出力されるライトビーム１０２５は図１２Ｂに示されているようにＺ軸とＸ軸の両方に沿って偏向される。これはｆθレンズ１０３０における偏向位置１２１０の位置から明白である。このため、チューブレンズ１０３５及び照明対物レンズ８４４から出力されたライトシート１４はＸ軸の周りだけでなくＺ軸の周りでも回転する。
【０１１６】
一般に、旋回位置Ｐの向きは、ライトビーム１０２５が光学スキャナ配置１０２０から出てｆθレンズ１０３０に衝突した時に９０°−ηだけ反転する。従って、アクチュエータ５４（１４）はθＸの角度だけライトビーム１０００を変位させて、光学スキャナ配置１０２０後に横方向の変位を引き起こす。更に、軸角ηについて補正するために、ライトビーム１０００はθＺだけ変位される。累積的に、ライトビームはチルトミラー１００５Ａで測定された光軸に対する角度γだけ変位され、そこでライトビーム１０００は合焦され、これによりライトシート１４は試料１１において平面１０４０内でＸ軸の周りで角度β（１４）だけ旋回することになる（図１０Ｃに示されている通り）。
【０１１７】
更に、ライトビーム１４の回転軸の位置（偏揺れ角β（１４）及び横揺れ角α（１４）の両方に関するもの）は、ライトシートオフセットＩ（１４）の値に応じてライトシート１０００を並進させることにより変更することができる。
【０１１８】
以下の数学的関係は、旋回光学配置１００５のチルトミラー１００５Ａ、１００５Ｂによって生成される光角θＸ及びθＺを確立するのに役に立つ。光学軸からのライトビームの偏差はγによって示され（図１０Ｄに示されている）、以下の式で示される。
【数１】
2019525216.tif 000003
ここで、ｆＲはレンズ１０１５の焦点距離であり、ＯＰは位置Ｐと位置Ｏの中心同士の距離である。その上、試料１１の平面１０４０内の旋回又は偏揺れ角β（１４）は以下の式で示される。
【数２】
2019525216.tif 000004
ここで、ＭはｆＴＬ／ｆｏｂｊで示されるチューブレンズ１０３５及び照明対物レンズ８４４の倍率であり、ｆ１０３０はレンズ１０３０の焦点距離である。光学軸γからのライトビーム１０２５の角偏差は、以下のように既知の数量によって書き直すことができる。
【数３】
2019525216.tif 000005
上記の式では、すべての角度が自由空間で規定されることに留意されたい。
【０１１９】
実験的に、旋回角β（１４）は試料１１が浸漬される媒体である浸漬媒体内にあり、旋回角はβｍ＝β／ｎｍによって示され、ｎｍは浸漬媒体の屈折率である。このため、所期の旋回β（１４）が規定されると、γによって示される光学軸からのライトビーム１０００の偏差は上記の関係を使用して求めることができ、旋回光学配置１００５内の２つのチルトミラー１００５Ａ、１００５Ｂによって発生される光角は、以下のように図１０Ｂ及び図１０Ｄに示されている幾何学的構成を使用して導出される以下の式を使用して確認することができる。
【数４】
2019525216.tif 000006
ここで、Δは旋回光学配置１００５内のチルトミラー１００５Ａと１００５Ｂとの間の分離である。
【０１２０】
次に、光学顕微鏡１１０のハードウェアコンポーネントの例について説明する。１つの照明サブシステム１１４のみに対する言及は両方の照明サブシステム１１２に適用される。
【０１２１】
光学顕微鏡１１０は、レーザシステムにすることができる光源８２２、８２４を含む２つの照明サブシステム１１２、１１４と、２つの検出サブシステム１１６、１１８と、試料１１を収容する試料チャンバと、Ｘ軸、Ｙ軸、又はＺ軸におけるチャンバ内の試料１１の位置を調整するための位置決めシステムと、顕微鏡１１０の制御及びデータ取得を提供する制御システム１８０のためのコンピュータワークステーション及びリアルタイム電子機器と、顕微鏡１１０の制御のためのLabVIEWベースのソフトウェアと、計算ワークフレーム１８５のためのJava及びLabVIEWベースのソフトウェアと、を含む。これらのコンポーネントの概要を示す。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、光学顕微鏡１１０又は９１０（試料１１に関する光学部品及び位置決めハードウェアのすべてを含む）は、光学ブレッドボード（メートル単位又はインペリアル単位の複数ねじ穴からなるアレイ又は長方形グリッドである）９５０及び光学テーブル９５５上に組み立てられる（図９）。光学ブレッドボード９５０は、Newport Corporation製のカスタムＲＧグレードのブレッドボード、例えば、製品コード04SI69108にすることができる。光学テーブル９５５は、IQ-200-YG-8というダンパアップグレードを備え、Newport Corporation製の自動レベリングを備えた４つのS-2000シリーズ28’’アイソレータによって支持されたST-UT2-48-8光学テーブルにすることができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、光源８２２、８２４は単一レーザ源から形成され、その出力はそれぞれの照明サブシステム１１２、１１４で使用するための２つのビームを形成するために分割される。単一レーザ源は、赤外線（ＩＲ）範囲内の波長、例えば、６５０ｎｍ〜１１００ｎｍの値の波長を有するライトビームを出力する、Coherent,Inc.製のChameleon Ultra IIなどのパルスチタン：サファイア（Ti:Sapphire）レーザにすることができる。単一レーザ源からの光は、例えば、Melles Griot、Casix、又はLinosによるビームスプリッティング光学部品によって分割することができる。例えば、このビームスプリッタは、Melles Griot製のモデルPBSH-450-2000-100広帯域偏光キューブビームスプリッタ又はCasix製のWPA 1312-2-700-1000アクロマチック２分の１波長板にすることができる。いくつかの実施形態では、光源８２２、８２４からの光は、Canoptics製のモデル350-80-LA-02 KD*Pシリーズの電気光学変調器及びモデル302RMドライバなどのポッケルスセルにより誘導することができる。
【０１２４】
その他の実施形態では、光源８２２、８２４は、スペクトルの可視部分及びＩＲ部分内のレーザビームを結合するためにデュアルポートファイバモジュール、ファイバコリメータ、及びダイクロイックミラー内に結合された３つの固体レーザを備えたレーザアレイなどの複数のレーザから成る。デュアルポートファイバモジュール内に結合された固体レーザの一例は、OmicronによるSOLE-3など、ドイツRodgau-DudenhofenのOmicron-Laserage Laserprodukte GmbH製のSOLE（登録商標）レーザライトエンジンである。
【０１２５】
その他の実施形態では、任意の所与の時点で、即ち同時に、異なる色を有する複数の光源及び／又は複数のライトシートを使用し、それぞれの検出サブシステム１１６、１１８にダイクロイックビームスプリッタ及び複数のカメラを装備し、異なるカラーチャンネルを同時に記録できるようにすることが可能である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、それぞれの照明サブシステム１１２、１１４は、VMM-D3スリーチャンネルドライバを備え、AlMgF2コーティングを有するUniblitzレーザシャッタモデルVS14S2ZM1-100などのレーザシャッタを含む。それぞれの照明サブシステム１１２、１１４は、ノッチフィルタ及び中性フィルタを装備したフィルタホイールを含むことができる。このフィルタホイールは、Ludl製のモデルMAC6000 DCサーボコントローラによって制御されるモデル96A351フィルタホイールにすることができ、中性フィルタはMelles Griot製のNDQ中性フィルタにすることができ、ノッチフィルタはChroma製のレーザクリーンアップノッチフィルタモデル488/10、561/10、又は594/10にすることができる。
【０１２７】
旋回光学配置１００５のチルトミラー１００５Ａ、１００５Ｂは銀メッキ６ｍｍミラーにすることができ、旋回光学配置１００５のアクチュエータ５４（１４）はその上に銀メッキミラーが固定される二軸ガルバノメータスキャナにすることができる。二軸ガルバノメータスキャナは、MicroMax 673XX二軸積分サーボドライバ増幅器を備えたCambridge Technology製のモデル6215HSM40Bガルバノメータスキャナにすることができる。銀メッキ６ｍｍミラーはセットとしてスキャナに取り付けることができる。アクチュエータ５４（１４）用の電源はAstrodyne製のMK320S-24電源にすることができる。
【０１２８】
同様に、光学スキャナ配置１０２０のチルトミラー１０２０Ａ、１０２０Ｂは銀メッキ６ｍｍミラーにすることができ、光学スキャナ配置１０２０のアクチュエータ５２（１４）／５３（１４）はその上に銀メッキミラーが固定される二軸ガルバノメータスキャナにすることができる。二軸ガルバノメータスキャナは、MicroMax 673XX二軸積分サーボドライバ増幅器を備えたCambridge Technology製のモデル6215HSM40Bガルバノメータスキャナにすることができる。銀メッキ６ｍｍミラーはセットとしてスキャナに取り付けることができる。アクチュエータ５４（１４）用の電源はAstrodyne製のMK320S-24電源にすることができる。
【０１２９】
リレーレンズ１０１０、１０１５はEdmund Optics製のモデル49-361-INKなどのリレーレンズ対にすることができる。ｆθレンズは、Special Optics製のモデル66-S80-30T-488-1100nmなど、約４８８ｎｍ〜約１１００ｎｍの波長を有するライトビーム１０２５をサポートするカスタムｆθレンズにすることができる。チューブレンズ１０３５及び照明対物レンズ８４４は、一光子又は二光子励起のために最適化できる、Olympus又はNikon製などの整合セットにすることができる。例えば、チューブレンズモジュールはOlympus製のモデルU-TLU-1-2カメラチューブにすることができ、照明対物レンズ８４４用のアクチュエータ５１（１４）は、Physik Instrumente製のE-665圧電増幅器及びサーボコントローラを使用する、モデルP-622.1CN PIHera圧電リニアステージなどの圧電ポジショナにすることができる。照明対物レンズ８４４は、Olympus製のモデルLMPLN5XIR 5×/0.10、モデルLMPLN10XIR 10×/0.30、又はモデルXLFLUOR 4×/340/0.28にすることができる。
【０１３０】
検出対物レンズ８２６、８２８は、以下の模範的な仕様を有する高開口数水浸検出対物レンズにすることができる。例えば、検出対物レンズは、１６×又は２０×の倍率を提供し、少なくとも０．８の開口数を有することができる。検出対物レンズは、Nikon製のモデルCFI60/75 LWD水浸シリーズ又はCarl Zeiss製のアポクロマート／プランアポクロマート水浸シリーズにすることができる。
【０１３１】
光学コンポーネント８３６、８３８のセットは、それぞれの検出対物レンズ８２６、８２８に整合したチューブレンズと、カメラ８４６、８４８への入力において適切なフィルタを備えたフィルタホイールを含むことができる。検出対物レンズ８２６、８２８に整合したチューブレンズは、Nikon製のＣＦＩ第２レンズユニット又はCarl Zeiss製のAxioImager 130mm ISDチューブレンズにすることができる。フィルタホイールは、Ludl製のMAC6000 DCサーボコントローラを備えたモデル96A354フィルタホイールにすることができる。フィルタホイール上のフィルタは、４８８ｎｍ、５６１ｎｍ、及び／又は５９４ｎｍのRazorEdge及びEdgeBasicロングパスフィルタあるいはSemrock製の５２５ｎｍ及び／又は５５０ｎｍのBrightLine帯域フィルタのうちの１つ以上にすることができる。
【０１３２】
検出対物レンズ８２６、８２８用のアクチュエータ５５（２６）、５５（２８）は、Physik Instrumente製のE-665圧電増幅器及びサーボコントローラを使用する、モデルP-622.1CN PIHera圧電リニアステージなどの圧電ポジショナにすることができる。カメラ８４６、８４８は、Hamamatsu製のJULABOウォータチラーを備えたOrca Flash 4.0 v2カメラにすることができる。
【０１３３】
図４Ｂに関連して述べたように、試料４１は、ホルダ４１０によって支持されるサポートマトリックス４０５内に取り付けられる。このホルダは、ライトシート１２、１４が試料４１に入れるようにするため、及び蛍光３６、３８がそれぞれの検出サブシステム１１６、１１８に入れるようにするための４つの開口部を有する試料チャンバ内に位置決めされる。試料チャンバは試料４１を受け入れるための開口部も含む。このチャンバは黒のデルリンから製造することができる。試料ホルダ４１０は、医療グレードのステンレス鋼から製造されたホルダカップにすることができる。その上、試料ホルダ４１０は、Ｘ軸、Ｙ軸、又はＺ軸のうちの任意の１つに沿って試料ホルダ４１０及び従って試料４１を移動させるためにマルチステージ位置決めシステムに取り付けることができる。例えば、試料ホルダ４１０は、３つの並進ステージに取り付けることができ、それぞれの並進ステージはＸ軸、Ｙ軸、又はＺ軸のうちの１つに沿って試料ホルダ４１０を並進させるように配置される。並進ステージはPhysik Instrumente製のモデルM-111K046ステージにすることができる。試料ホルダ４１０は、Physik Instrumente製のモデルM-116.2DG回転ステージなどの回転ステージに取り付けることができる。マルチステージ位置決めシステムは、モーション入出力インターフェース及び増幅器と、制御システム１８０と通信するモーションコントローラとを含むことができる。例えば、増幅器はPhysik Instrumente製のモデルC-809.40 4チャンネルサーボ増幅器にすることができ、モーションコントローラはNational Instruments製のモデルPXI-7354四軸ステッパ／サーボモーションコントローラにすることができる。
【０１３４】
次に、制御システム１８０及び計算フレームワーク１８５に関する詳細を示す。制御システム１８０は、１つ以上の出力装置（モニタ又はプリンタなど）、キーボード、マウス、タッチディスプレイ、又はマイクロホンなどの１つ以上のユーザ入力インターフェース、特定のタスクを実行するための専用ワークステーションを含む１つ以上の処理装置、メモリ（例えば、ランダムアクセスメモリ又は読み取り専用メモリ又は仮想記憶装置など）、並びにハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、又は光ディスクなどの１つ以上の記憶装置などのハードウェアを含む。処理装置は、スタンドアロンプロセッサにすることができるか、又は本来的にワークステーションなどのサブコンピュータにすることができる。
【０１３５】
図１３を参照すると、制御システム１８０は、いくつかの機能が１つのホストコンピュータ（高性能ワークステーションなど）１３８０Ａ上に割り振られるか又は配置され、その他の機能がリアルタイム制御システム１３８０Ｂ上に割り振られるか又は配置される、分散アーキテクチャを有する制御システム１３８０として設計することができる。例えば、ユーザインターフェース、短時間データ記憶領域、データ管理ソフトウェア、及び画像取得ファイルロギングは高性能ワークステーション上に配置することができる。その上、計器制御（光学顕微鏡１１０の制御）、波形生成、及び実験シーケンス制御ソフトウェアはリアルタイム制御システム上に配置することができる。高性能ワークステーション１３８０Ａ及びリアルタイム制御システム１３８０Ｂは、例えば、ＴＣＰ／ＩＰサーバクライアントアーキテクチャ１３８２により通信することができる。また、制御システム１３８０は、計算フレームワーク１８５によって使用するための適応プロセスに関するアルゴリズムを記憶するためのライブラリ１３９０も含む。このライブラリ１３９０は、焦点及び画像品質メトリックに関するアルゴリズム、状態モデリング及び最適化のためのプログラミングインターフェース、試料１１内部のライトシート１２、１４の３次元ジオメトリをマッピングするためのアルゴリズム、並びに適応プロセスを主要制御ソフトウェアと統合するためのインターフェースを含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、リアルタイム制御システム１３８０ＢはPXI-8110リアルタイムコントローラ（National Instruments製）である。このリアルタイムコントローラは、４つのPXI-6733高速アナログ入出力インターフェースボード（National Instruments製）、PXI-8432/2シリアルインターフェースボード（National Instruments製）、及びPXI-7354四軸ステッパ／サーボモーションコントローラ（National Instruments製）、並びにC-809.40 4チャンネルサーボ増幅器（Physik Instrumente製）及び４つのBNC-2110シールドコネクタブロック（National Instruments製）を装備することができる。リアルタイム計器制御、波形生成、実験シーケンスのためのソフトウェア層はリアルタイム制御システム１３８０ＢのPXI-8110リアルタイムコントローラ上に配備される。PXIシャーシは４つのPXI-6733 8チャンネルアナログ出力モジュールを保持し、これらのモジュールはガルバノメータスキャナ（即ち、アクチュエータ５２（１２、１４）、５３（１２、１４）、及び５４（１４））、光源８２２、８２４、カメラ８４６、８４８用のトリガ、圧電ポジショナ（アクチュエータ５１（１２、１４）及び５５（２６、２８）用）、ポッケルスセル、及びシャッタ状態を制御するために使用される。その他のPXIモジュールはフィルタホイール及びホルダ４１０の動きを制御するために使用される。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、高性能コンピュータワークステーション１３８０ＡはColfax International製の高性能コンピュータワークステーションである。このワークステーションは、２つのXeon E5-2687W CPU(Intel)、イメージングリングバッファに割り振られた１９２ＧＢのメモリ、２つのｓＣＭＯＳカメラからの同時ストリーミングのためにRS2WG160 SAS RAIDコントローラ(Intel)を使用して２つのRAID-0アレイに結合された１４個のＳＡＳハードディスク（2.5 XE 900GB、Western Digital）、及びストレージサーバへのデータオフロードのためのX520-SR1 10Gファイバコントローラ（Intel）を装備することができる。ワークステーション１３８０Ａは、画像データストリームの受信、処理、及びオンライン可視化のためのソフトウェアモジュールと、適応システム１６０を使用して主要イメージング実験及び適応制御を構成するためのグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）とを含む。
【０１３８】
適応システム１６０は、試料１１に対する低速度撮影イメージング実験における主要ライトシート画像取得の前の初期システム最適化、及び低速度撮影実験中の顕微鏡状態更新という２つの別個のモードで動作する（図６に示されているものなど）。適応システム１６０のユーザは、顕微鏡状態適応の複数の収束反復を実行することにより、試料１１内のそれぞれの基準面ＰＬ及びライトシート１２、１４のそれぞれの波長についてそれぞれのパラメータに使用するための値［例えば、Ｙ（１２，１４）、Ｄ（２６，２８）、Ｉ（１２，１４）、α（１２，１４）、及びβ（１２，１４）］を自動的に決定する初期システム最適化モードを実行する。次に、図６に関連して上述したように、低速度撮影イメージング実験中に、実験時点間のユーザ定義の間隔で顕微鏡状態更新（小さい補正であると想定されるもの）が行われる。これは、試料１１の形態及び光学的性質の動的変化、試料１１内部の蛍光マーカ分布、並びに試料１１の環境の光学的性質に対する光学顕微鏡１１０の連続的時空的適応を保証するものである。
【０１３９】
図６に関連して上述したように、低速度撮影実験中に画像が取得される速度に対する適応システム１６０の影響を最小化又は低減するために、計算フレームワーク１８５は、時点取得間のアイドル時間中に排他的に画像品質を監視し（全顕微鏡帯域幅の５％未満を使用する）、試料１１、４１のボリューム全体を通して分散されたユーザ定義の基準面ＰＬ（典型的に、２０〜８０μｍステップでボリュームを区分する４〜８つの平面）においてより良好なパラメータ設定を迅速に探索する。これらの基準面ＰＬで取られた測定の影響を最小化又は低減するために、単一のデフォーカスイメージシーケンスから同時に３つのパラメータクラスについて最適設定を計算できるアルゴリズムが開発される。このアルゴリズムは、試料１１内部の３Ｄライトシートジオメトリを再構築し、それによりライトシート角度α及びβ並びにライトシートデフォーカスオフセットＩを決定する。
【０１４０】
１０自由度（パラメータ）のすべてについて試料１１のボリューム全体にわたって実行された測定をひとまとめにして使用して最適化問題を公式化し、それにより光学顕微鏡１１０の新しい最適状態が計算される。この最適化手順は、制約グラフ、光学顕微鏡１１０の光学機械式自由度を表す数学的オブジェクト、並びにそれらの空間、時間、及びスペクトルの関係を使用する。制約グラフでは、それぞれのノードはパラメータを表し、エッジは本質的に固定又は動的のいずれかである制約を規定する。固定制約は不変の幾何学的及び光学的要件をコード化し、例えば、２つのカメラフィールド全体にわたって画像空間の連続性を強制し、複数のカラーチャンネルにおいて画像データを位置合わせする。
【０１４１】
動的制約は、画像品質測定、局所信号の有無、及びサンプル内の局所ライトシートジオメトリに関する。時間的に動的であるか又は空間的に希薄な蛍光マーカ分布の場合、置換制約は特定の時点及び試料１１内の特定の空間位置における蛍光信号の欠落に自動的に取りかかる。
【０１４２】
図１４を参照すると、手順１４００は適応イメージングのために制御システム１８０の制御下で光学顕微鏡１１０によって実行される。手順１４００は、制御システム１８０の制御下でライトシートイメージング（１４０５）を使用してサンプル（試料１１、４１など）をイメージングすることを含む。例えば、図６に関連して述べると、このライトシートイメージングは、試料１１に対する低速度撮影実験における主要画像取得６０５を指す。上述のように、ライトシートイメージング（１４０５）は、光を発生すること、それぞれの照射軸に沿ってサンプル内の１つ以上の位置で光から１つ以上のライトシート１２、１４を形成すること、及び１つ以上のライトシートとサンプルとの間の光学的相互作用によりサンプルから検出軸に沿って放出された蛍光３６、３８の画像を記録することを含む。
【０１４３】
次に、ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性が適応システム１６０の制御下で測定される（１４１０）。例えば、図６に関連して述べると、これらの測定（１４１０）は、最後のライトシートイメージング（１４０５）の終了と次のライトシートイメージングの開始との間のアイドル時間６１０中に行うことができる。
【０１４４】
適応システム１６０は、光学顕微鏡１１０を調整する必要があるかどうかを判断するための完全な分析を実行するために、十分な測定値が取得されているかどうかを判断する（１４２５）。十分な測定値が取得されている場合、適応システム１６０の制御下で１つ以上の測定された特性が分析される（１４３０）。例えば、図６に関連して述べると、分析（１４３０）はアイドル時間６１０と一致する場合もあれば、主要画像取得６０５のうちの１つ以上と並行して実行される場合もある。それ以外の場合は、手順１４００はライトシートイメージング（１４０５）を実行し続ける。
【０１４５】
適応システム１６０は、分析（１４３０）に基づいて、光学顕微鏡１１０に対する調整が保証されるかどうかを判断する（１４４５）。調整が保証される場合（１４４５）、１つ以上の測定された特性の分析（１４３０）に基づいて、ライトシートイメージング（１４０５）に関連する１つ以上の動作パラメータが調整される（１４５０）。この調整は、主要画像取得６０５間のアイドル時間６１０中に光学顕微鏡１１０に対する更新６２０中に実行することができる（１４５０）。
【０１４６】
１つ以上の測定された特性の分析（１４３０）は、サンプル１１についていずれの仮定も行わずに実行することができる。例えば、分析（１４３０）は、サンプル１１の物理的性質、サンプル１１の光学的性質、並びにサンプル１１内の蛍光マーカの分布及び数について仮定を行わずに実行することができる。
【０１４７】
測定されるライトシートイメージングに関する１つ以上の特性としては、１つ以上の記録された画像の品質、サンプル１１内部のライトシート１２、１４の位置、及び／又はサンプル１１内部のライトシート１２、１４の向きのうちの１つ以上を含むことができる。
【０１４８】
調整されるライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータ（１４５０）としては、１つ以上のライトシート１２、１４、サンプル１１、及び蛍光３６、３８の画像が記録される焦点面２６、２８のうちの１つ以上の特性であって、例えば、ライトシート１２、１４と検出軸に沿って蛍光３６、３８の画像が記録される検出焦点面２６、２８との間の角度、ライトシート１２、１４がサンプル１１内に形成される１つ以上の位置、及びライトシート１２、１４と検出焦点面２６、２８との相対位置などを含むことができる。
【０１４９】
１つ以上の動作パラメータに対する調整（１４５０）としては、サンプル１１に対する１つ以上のライトシート１２、１４の回転、照射軸Ｙに対して垂直な方向に沿った１つ以上のライトシート１２、１４の並進、照射軸Ｙに対して平行な方向に沿った１つ以上のライトシート１２、１４の並進、照射軸Ｙに沿ったライトシート１２、１４のウエストの並進、及び／又は蛍光３６、３８の画像が検出軸Ｚに沿って記録される焦点面２６、２８の並進のうちの１つ以上を含むことができる。
【０１５０】
図１５Ａ及び図１５Ｂも参照すると、ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は手順１５１０により測定される。手順１５１０は、適応システム１６０、特に計算フレームワーク１８５の制御下で光学顕微鏡１１０によって実行される。
【０１５１】
適応システム１６０により探査するためにサンプル１１の少なくとも１つの基準領域が選択される（１５１１）。例えば、計算フレームワーク１８５は、（例えば、検出サブシステム１１６、１１８及び／又は照明サブシステム１１２、１１４の特性を調整することにより）サンプル１１の選択された基準領域を探査するように光学顕微鏡１１０を構成するために作動装置１５０に信号を送信することができる。次に、ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータが計数値のセットのうちの１つの計数値に変更される（１５１２）。例えば、計算フレームワーク１８５は、動作パラメータの計数値に基づいて作動装置１５０に信号を送信することができる。従って、１５１２が完了した後、適応システム１６０は、特定の基準領域におけるイメージングの品質及び少なくとも１つの動作パラメータの計数値を探査する準備ができている。例えば、変更されるライトシートイメージングに関する動作パラメータ（１５１２）は、ライトシートの平面及び／又は蛍光３６、３８の画像が記録される焦点面２６、２８にすることができる。
【０１５２】
基準領域から放出される蛍光３６、３８の画像が検出サブシステム１１６、１１８によって記録される（１５１３）。この記録された画像は計算フレームワーク１８５に送信され、その計算フレームワークが記録された画像の品質を決定する（１５１４）。記録された画像の品質は、記録された画像に画像品質メトリックを適用して、記録された画像の品質を表す実数を生成することにより、決定することができる（１５１４）。計算フレームワーク１８５は、その動作パラメータを計数値のセット内の他の計数値に変更すべきかどうかを判断する（１５１５）。そうである場合、計算フレームワーク１８５は動作パラメータを計数値のセット内の他の計数値に変更し始める（１５１２）。そのセットの動作パラメータのすべての計数値が探査された（従って、これらの計数値のそれぞれにおいて記録された画像の画像品質が記録された（１５１４））場合、手順１５１０は、図１５Ｂに示されているように、記録された画像の品質を分析するための手順１５３０を実行する。分析を実行する手順１５３０の完了後、計算フレームワーク１８５は、サンプル１１の他の基準領域を探査する必要があるかどうかを判断し（１５１６）、そうである場合、サンプルの次の基準領域が探査される。
【０１５３】
図１５Ｂに関連して述べると、分析を実行する手順１５３０は、選択された基準領域において動作パラメータ値の範囲内のどの動作パラメータ値が最高品質を備えた記録された画像を生成するかを計算フレームワーク１８５（及び特にソフトウェアモジュール５８８及び／又はソフトウェアモジュール５８９）が観察すること（１５３１）を含む。動作パラメータ値の範囲は動作パラメータの計数値のセットに限定されない。特に、そのセット内の動作パラメータの計数値より高い分解能を備えた動作パラメータ値の位置を抽出するために計数値セットに基づくフィッティング戦略を使用することができる。次に、この基準領域に関する動作パラメータの観察に関連する数量が計算フレームワーク１８５によって記憶される（１５３２）。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、手順１５１０及び１５３０は、次に述べるようにソフトウェアモジュール５８７及び５８９によって実行される。これらの実施形態では、計算フレームワーク１８５は、手順１５３０中に得られた記憶された数量に基づいてライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整する方法を決定し、次に１つ以上の動作パラメータを調整し始める（１４５０）。従って、１４５０で調整されるこれらの動作パラメータは、探査中に変更される動作パラメータ（１５１２）に対応することができる。計算フレームワーク１８５は、１つ以上の動作パラメータをどのように調整できるかを制限する１つ以上の制約に基づいて、１つ以上の動作パラメータを調整する方法の決定を行うこともできる。
【０１５５】
その上、サンプルの複数の基準領域を１５１１で選択することができる。例えば、基準面ＰＬ０、ＰＬ１、・・・ＰＬＫのそれぞれを１５１１で選択することができる。ソフトウェアモジュール５８７及び５８９がどのように手順１５１０及び１５３０を実行するかに関する考察については、図１６Ａから図１６Ｄ及び図１７Ａから図１７Ｅに関連して以下に示す。
【０１５６】
その他の実施形態では、手順１５１０及び１５３０はソフトウェアモジュール５８８によって実行される。これらの実施形態では、サンプルの複数の基準領域が１５１１で選択される。それぞれの基準領域は、検出サブシステム１１６、１１８によって取得された画像の一部分又は小領域に対応することができる。例えば、検出焦点面からｚ方向のｚ基準位置のセットが選択され、そのセット内のそれぞれのｚ基準位置について、ｚ方向に対して垂直なｘｙ平面内で規定される複数の基準領域（その画像の小領域に対応するもの）が選択される。それぞれの基準領域は他の基準領域とは別個のものである。ｚ方向はＺ軸に対して垂直な方向であり、ｘｙ平面はＸ軸及びＹ軸によって規定されるＸＹ平面と平行な平面である。
【０１５７】
変更される動作パラメータは、ライトシートイメージングに関する第１の動作パラメータであると見なすことができる（ライトシート１２、１４の平面の位置又は焦点面２６、２８の位置など）。
【０１５８】
これらの実施形態では、調整されるライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータ（１４５０）は、第１の動作パラメータとは別個の第２の動作パラメータに対応する。例えば、調整できる第２の動作パラメータは、ライトシート１２、１４と検出サブシステム１１６、１１８の焦点面２６、２８との間の角度にすることができる。その上、手順１５１０は第２の動作パラメータを調整する方法に関する決定を含むことができ、この決定は複数の基準領域内のそれぞれの基準領域に関する動作パラメータの観察に関連する記憶された数量（１５３２）に基づくことができる。
【０１５９】
これらの実施形態では、最高品質を備えた記録された画像を生成するものとして観察される動作パラメータ値の範囲内の動作パラメータ値（１５３１）は、最高品質を備えた記録された画像を生成する焦点面にすることができる。その上、記憶される観察に関連する数量は、焦点面がｚ方向に沿って位置決めされる値と、それに対応してｘｙ平面内で規定される基準領域とのセットによって規定される３次元空間内の位置にすることができる。ライトシートと焦点面との間の角度を調整する方法を決定するために、計算フレームワーク１８５は、３次元空間内でそれぞれの記憶された位置を通過する可能性が最も高い平面を決定することができる。
【０１６０】
ソフトウェアモジュール５８８がどのように手順１５１０及び１５３０を実行するかに関する考察については、図１８Ａから図１８Ｅに関連して以下に示す。
【０１６１】
画像品質メトリック
完全自動時空的適応イメージングは、動作パラメータ値の範囲内のどの動作パラメータが最高品質を備えた記録された画像を生成するかを観察する（１５３１）ために、異なるシステム状態における画像品質を推定し、定量的に比較するための高速かつロバストな手順又は方法を決定的に必要とする。光学顕微鏡１１０の解像度の変化に非常に敏感な画像品質メトリックは、画像品質を推定できるやり方の１つである。
【０１６２】
光学顕微鏡１１０などの複雑な多軸顕微鏡のシステム状態の最適化及び時空的適応イメージングにおける基本的な難題は、画像品質の推定及び比較分析である（１５３１）。
【０１６３】
画像品質メトリックはライトシート顕微鏡法における自動画像解析のために評価される。ライトシート顕微鏡法によるイメージングは、広視野顕微鏡法及び写真などのその他のイメージングモダリティとは非常に異なるものである。薄いボリュームの光学セクショニングは、空間的に限られた照明によって達成される。その後、このボリュームセクションの画像は、同様に薄い被写界深度を備えた対物レンズを使用して取得される。照らされたボリュームの種々の部分は、検出焦点面に対するそれぞれの位置次第で、多かれ少なかれ焦点が合っているように見える。更なる相違点は、ガウスライトシートの双曲的軸変化図、サンプルによってもたらされる収差、及び光散乱の結果としてのコントラストの損失から発生する。その上、ノイズの相対的影響は、イメージング速度の増加及び露光時間の減少につれて増加する。従って、既存の画像品質メトリックの評価は、適応システム１６０を使用するライトシート顕微鏡法における適応イメージングのための最良実行メトリックを識別するために実行することができる。
【０１６４】
画像品質メトリックは、従来の及び変更された候補メトリックを含み、広域スペクトルのタイプの試料１１（生物学的モデルシステム）、マーカ戦略、及びイメージング検定をカバーする画像データセットについて評価される。いくつかの画像品質メトリックは、画像内の隣接ピクセル間の相関関係を頼みにしている（Ｖｏｌｌａｔｈ尺度など）。いくつかの画像品質メトリックは、ピクセル強度の平均、最大、分散、尖度、又はヒストグラムなどの単純な統計的数量を頼みにしている。いくつかの画像品質メトリックは、光学顕微鏡画像がカメラ８４６、８４８における読み出し雑音によって劣化し、帯域限定光学システム（光学コンポーネント８３６、８３８のセット内で光学帯域フィルタを使用するもの）によって取得されるという事実を頼みにしており、これらのメトリックは、光学顕微鏡１１０の光学帯域フィルタを通過できるすべての情報のみを定量化するように明示的に設計される。この概念に基づいて評価された画像品質メトリックの例としては、離散フーリエ変換（ＤＦＴ）、離散コサイン変換（ＤＣＴ）、及び離散ウェーブレット変換（ＤＷＴ）などのデータ変換を含む。
【０１６５】
合成データ及び実数データのベンチマークを使用すると、正規化離散コサイン変換（ＤＣＴＳ）のシャノンエントロピは、ライトシート蛍光顕微鏡法（光学顕微鏡１１０によって実行されるもの）のための最適又は有用なメトリックの１つとして識別される。ＤＣＴＳは、ピクセルあたり２７ｎｓの中央処理速度で動作しながら、最良の焦点局所化精度（３．０μｍのライトシート半値全幅厚及び１．７５μｍの検出焦点深度の場合に３２０ｎｍの平均誤差）、大域最適付近の高い信号対背景比、及び焦点曲線に沿った局所最大の低い密度を提供する。
【０１６６】
評価されたメトリックの詳細説明については、２０１７年１月１７日に出願された米国特許出願第６２／４４７，１５４号及び２０２６年６月２４日に出願された米国特許出願第６２／３５４，３８４号に含まれており、どちらも参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
手順１５１０及び１５３０を実行するソフトウェアモジュール５８７／５８９
原則として、画像メトリックが選択されると、それぞれの動作パラメータ［Ｉ（１２，１４）、Ｄ（２６，２８）、Ｙ（１２，１４）、α（１２，１４）、β（１２，１４）］は、顕微鏡１１０から出力される画像品質を最適化又は改善するように分離して調整し評価することができる。それにもかかわらず、複数の検出サブシステム１１６、１１８及び複数の照明サブシステム１１２、１１４を備えた複雑な光学顕微鏡１１０では、これらの動作パラメータはすべて相互依存している。以下の説明では、最適化の背後にある数学的理論について述べる。単純かつ明瞭にするためにのみ、この説明は、２つ以下の照明サブシステム１１２、１１４と２つ以下の検出サブシステム１１６、１１８を有する光学顕微鏡１１０に関するものであり、検出面及びライトシート１２、１４の平面の並進に対応するシステムパラメータのみを考慮する。次にこの理論を大域的最適化理論に拡張する。
【０１６８】
光学顕微鏡１１０は、直交構成の２つの同軸検出アーム（検出サブシステム１１６、１１８）と２つの同軸照明アーム（照明サブシステム１１２、１１４）からなる。合焦に関連する状態変数又はパラメータは、Ｄ（２６）及びＤ（２８）として示される２つの検出面の位置と、Ｉ（１２）及びＩ（１４）として示される検出軸Ｚに沿った２つのライトシート１２、１４の位置である。これらの４つの状態変数は以下のようにシステムの状態ベクトルＳを構成する。
【数５】
2019525216.tif 000007
【０１６９】
２つの検出アームは、それぞれ２つのカメラ８４６及び８４８上に、試料１１によって放出された蛍光３６、３８をイメージングする。それぞれのカメラ８４６及び８４８について、第１のライトシート１２又は第２のライトシート１４のいずれかを使用して試料１１を照らすことによって形成できる２つの異なる画像が存在する。従って、照明及び検出アーム（Ｉ（１２，１４）、Ｄ（２６，２８））のそれぞれの組み合わせごとに、光学顕微鏡１１０は、Ｉ（１２，１４）及びＤ（２６，２８）の値次第で、多かれ少なかれ合焦させた画像を生成することができる。これらの変数は、顕微鏡の電子機器及びソフトウェアフレームワーク（上述のもの）によって直接制御可能であり、合焦状態に対応すると想定できない任意の未定義ゼロ位置を有する。
【０１７０】
４アームのライトシート顕微鏡１１０の手動合焦は、例えば、パラメータ又は変数Ｄ（２６）を固定することと、次にＩ（１２）及びＩ（１４）を独立して調整することからなる。最後に、変数Ｄ（２８）は、前に決定された値Ｉ（１２）及びＩ（１４）に基づいて２つの先験的に異なる値に設定することができる。この２つの値を調和させるために、単純に平均を取ることができる（最終的に両方のライトシートによって同時にイメージングを実行する必要がある場合）。その他の順序も可能であり、例えば、まずＩ（１２）を固定し、次にＤ（２６）及びＤ（２８）を決定し、最後にＩ（１４）のための折衷案を見つける。この素朴な順次手法には、（ｉ）定義できる唯一の制約が変数の固定であること、（ｉｉ）システム全体の補正が最小限になるという保証が全くないこと、（ｉｉｉ）このスキームが本質的に漸進的であり、このため、システムの状態を変更する前に必要な測定をすべて行うことが可能ではないことといういくつかの短所がある。以下の説明では、これらの短所について我々の焦点最適化理論でどのように対処するかを示す。
【０１７１】
もう一度、図５Ａから図５Ｇを参照すると、示されている適応イメージングに関する１０個の模範的な状態変数は、Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、Ｉ（１４）、Ｙ（１２）、Ｙ（１４）、α（１２）、α（１４）、β（１２）、及びβ（１４）である。適応システム１６０の目標は、試料１１の高度に合焦させた画像を生成することである。光学顕微鏡１１０によって生成される画像の合焦は、それぞれの検出面２６、２８とそれぞれのライトシート面との間の距離に依存する。これらの距離は、以下に示されている焦点行列（focus matrix）Ｍを使用して計算することができる。
【数６】
2019525216.tif 000008
【０１７２】
Ｍ内の項目の符号は軸の向きに依存する。実際には、異なるユニットがＤ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、及びＩ（１４）に使用されることは可能である。そうである場合、単一ユニットが選択され、行列Ｍ内のいくつかの項目は＋１又は−１とは異なる値を有する。その上、変数Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２），及びＩ（１４）は、アクチュエータ（例えば、アクチュエータ５５（２６）、５５（２８）、５２（１２）、５２（１４）、５３（１２）、又は５３（１４））コマンドに直接変換されるので、先験的に未定義のゼロ位置を有する。その結果、行列Ｍによって計算された距離も未定義のオフセットを有することになるが、物理的なゼロ位置は必ずしも数値的なゼロに対応しない。この数学的形式は、以下に述べるように、これらの不十分な確定性を扱うことができる。実際に、以下に示す理論の主要目的は、従来のシステム較正がない場合に光学顕微鏡１１０の合焦状態について推論できることである。
【０１７３】
行列Ｍは以下のように状態ベクトルＳから焦点状態ベクトルＦを計算するものである。
【数７】
2019525216.tif 000009
行列Ｍはランク３のランク欠乏であるので、その結果、異なるシステム状態Ｓが同じ焦点状態に対応することになる。直観的に、これは、すべての平面を同じ量だけ同じ物理的方向に並進させる時の合焦不変性に留意することによって理解することができる。形式的に、システム状態Ｓは以下のようにＭのカーネルＫｅｒ（Ｍ）内の任意のベクトルＫによって変換することができる。
Ｆ＝Ｍ（Ｓ＋Ｋ）
本明細書に記載されているマルチビュー顕微鏡１１０の場合、カーネルは以下のように生成することができる。
【数８】
2019525216.tif 000010
実際には、状態変数は限られた範囲を有するので、ｋの範囲も限られる。
【０１７４】
システムを合焦させることは、すべての検出面及び照射面が一致するような最適焦点ベクトルＦを見つけることを意味する。ベクトルＦのそれぞれの成分Ｆｕ，ｖは検出器Ｄｕによって取得された画像Ｊｕ，ｖに関連し、それから焦点値ｆ（Ｊｕ，ｖ）を計算することができる。このため、それぞれの焦点状態Ｆについて、（画像を取得し、それぞれの画像の焦点値を計算することにより）以下のベクトルを計算することができる。
【数９】
2019525216.tif 000011
単純にするため、φはｆ（Ｆ）と書くことができる。最適の探索は、それぞれのφｕ，ｖの最大値に達するまでベクトルＦのそれぞれの成分Ｆｕ，ｖを独立して変化させることによって達成される。それぞれのＦｕ，ｖは、対応する検出面Ｄｕ又はＩｖの位置を変更することによって変化させることができる（焦点行列Ｍの最初の２列を参照）。しかしながら、実際には、取得した画像の比較可能性を改善するために、ライトシートを静止状態に維持することがより良いことである。従って、Ｆｕ，ｖは、Ｄｕを変化させることによって変化する。補正の局所性及び連続性を想定しているので、Ｉｖの代わりにＤｕを変化させることによって決定される補正は小さい変位に有効である。分析及び最適化が先験的に未合焦の焦点状態Ｆから始まり、この方法によって新しいより良好な焦点状態Ｆ’を見つけることを考慮すると、以下のようになる。
ΔＦ＝Ｆ−Ｆ’＝Ｍ（Ｓ−Ｓ’）＝ＭΔＳ
ここで、ΔＦは最高焦点品質を達成する現行焦点状態に対する補正ベクトルであり、ΔＳは同等のシステム状態の補正ベクトルである。焦点状態補正ΔＦに基づいてシステム補正ΔＳを決定するには、焦点行列Ｍの一般逆行列の決定が必要である。
【０１７５】
模範的な一般逆行列はムーア・ペンローズ一般逆行列である。行列Ｍのムーア・ペンローズ一般逆行列は以下のようになる。
【数１０】
2019525216.tif 000012
ムーア・ペンローズ一般逆行列は、所与のΔＦについて、システムΔＦ＝ＭΔＳの最小Ｌ２ノルム解ΔＳを返す。
ΔＳ＝Ｍ＋ΔＦ
次に、システムは、Ｓ’＝Ｓ＋ΔＳを適用することにより、より良好合焦状態Ｓ’に移動することができる。この数学的形式は、補正が数学的に明確に定義されることを保証する。
【０１７６】
最適化プロセスが時間の経過につれてドリフトしないことを保証するために、変数Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、又はＩ（１４）のうちの１つを固定するよう要求することにより、プロセスをアンカリングすることができる。これは、ΔＳの選択された成分がゼロになるようにΔＳに近似的に選択されたベクトルΔＫ∈Ｋｅｒ（Ｍ）を加えることにより達成することができる。ΔＫはＫｅｒ（Ｍ）に属すので、この新しい補正は依然としてシステムΔＦ＝ＭΔＳに対する解である。これは、素朴な手動手法を使用して達成できるものと同様のものである。代替的に、光学顕微鏡１１０の固定質量中心を維持することが可能である。本明細書で考慮されるすべての自由度（パラメータ）は同じ軸に沿っており、カーネルＫｅｒ（Ｍ）はランク１のものであるので、その結果、質量中心は以下の積によって得られた単一次元によってパラメータ化できることになる。
【数１１】
2019525216.tif 000013
交互の符号は、Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、及びＩ（１４）の異なる軸の向きから発生する。その場合、顕微鏡１１０の質量中心が不変のままになるようなΔＫ∈Ｋｅｒ（Ｍ）を加えることにより補正ΔＳを調整することができる。この能力は、手動合焦について述べた時に前述したポイント（ｉｉ）に対処するものである。
【０１７７】
１つの検出アーム及び／又は１つの照明アームのみが必要である場合、補正ΔＳは、まず焦点補正ベクトルΔＦの対応する成分をゼロに設定し、状態補正ΔＳを計算することによって見つけることができる。
【０１７８】
ΔＳはΔＦから決定することができ、ΔＦは対応するφ’ｕ，ｖを最大化するＦ’ｕ，ｖを探索することによって見つけられる。実際には、φ’ｕ，ｖを最大化する最適Ｆ’ｕ，ｖは、以下のように初期値Ｆｕ，ｖあたりのＦ’ｕ，ｖのｍ個の値をサンプリングすることによって見つけることができる。
【数１２】
2019525216.tif 000014
ここで、ｒは探索半径であり、ｋ∈［０，．．．，ｍ−１］である。実際には、（２ｋ−ｍ＋１）／（ｍ−１）がゼロになり、従ってシステムに対する補正なしの可能性を提供するように奇数個のサンプルｍを選ぶことが有用である。その場合、最適Ｆ’ｕ，ｖは以下のようになる。
【数１３】
2019525216.tif 000015
ここで、
【数１４】
2019525216.tif 000016
であり、
【数１５】
2019525216.tif 000017
はライトシートｖを使用して検出サブシステムｕで取得された画像である。この単純順序バッチ順次手法は、顕微鏡のハードウェア及び電子機器の好ましい動作モードのため、フィボナッチ探索、ゴールデンセクションサーチ、又はブレント法を実行するより高速である。カメラ８４６、８４８及び制御システム１８０の低レベル制御電子機器は、確定的な事前定義シーケンスの画像を取得するように指示された時に更に高速で実行し、機械的考慮事項は順次順序付けられたコマンドを要求する。少数のサンプル（ｍ≦１０）に関するロバストネスを改善するために、以下のように焦点値の正規化が実行される。
【数１６】
2019525216.tif 000018
ここで、
【数１７】
2019525216.tif 000019
であり、
【数１８】
2019525216.tif 000020
である。Ｆ’ｕ，ｖを見つけるために、標準的なガウシアンフィッティング又は我々のよりロバストなargmaxアルゴリズムが適用される。
【０１７９】
次に、ｋ個の
【数１９】
2019525216.tif 000021
のポイントが与えられたargmaxの計算について説明する。最も単純な手法は、レーベンバーグ・マーカートアルゴリズムによりα、μ、及びσの選択肢を最適化することによってガウス曲線
【数２０】
2019525216.tif 000022
をフィッティングすることである。上述のように、このガウシアンは、焦点曲線の形状のために良いモデルであると経験的に分かっている。多項式モデルは変動するというその固有の傾向に悩まされ、ローレンツ・コーシー又はフォークトなどのその他のガウス様分布は実際には十分に機能せず、付加的な複雑さ以上の何物にも貢献しない。Apache Commons MathライブラリにおけるMINPACKベースの実施形態（https://commons.apache.org/proper/commons-math）は、初期ステップ限界係数１００、コスト関連許容差１０−１０、パラメータ関連許容差１０−１０、及び直交性許容差１０−１０とともに使用することができる。その場合、最適値Ｆ’ｕ，ｖは以下の公式によって得られる。
【数２１】
2019525216.tif 000023
この手法は多くの場合に十分機能するが、信号対雑音比が低いことに苦しむイメージングシナリオではロバストネスが欠如する可能性がある。
【０１８０】
argmaxは、潜在的に、低速度撮影イメージング実験中に数千回計算しなければならない。汎神経マーカ表現の発現の場合など、画像の信号対雑音比が非常に低い場合、これは雑音の多い焦点測定
【数２２】
2019525216.tif 000024
をもたらし、次にこれは顕微鏡１１０の全体的な安定性を最終的に劣化させる雑音の多いＦ’ｕ，ｖ値をもたらす。この問題に対処するために、集合手法を使用するロバストなargmaxフィッターアルゴリズムを開発することができる。
【０１８１】
データポイント
【数２３】
2019525216.tif 000025
に曲線をフィッティングするため、及びargmaxを見つけるための直截的な手法は特定の条件に対して脆弱である。例えば、ガウス曲線フィッティングは対称形の単峰性曲線で十分機能するが、応答に偏りがあり、非対称形である（非ナル歪度（non-null skewness））場合には一般に適切ではない。この場合、３次又は４次の多項式の方が良い選択肢である可能性があるが、多項式は周知の通り、過剰フィッティングするという固有の傾向を有し、特に雑音がある場合に破滅的に変動する、悪い補間である。より良好な手法は例えばスプライン補間又はLoessフィルタリング手法であるが、この場合も失敗に終わるケースがあるであろう。解決策は多くの異なる手法を同時に活用することによりargmaxを推定することである。以下の説明ではｙ＝ｆ（ｘ）というargmaxについて探索する。また、以下の１１通りの推定も並行して計算する。
１．三点二次フィット（Three point quadratic fit）：このアルゴリズムは、３つの点（ｘに関する最小値、平均値、及び最大値）のみを取り、単一の放物線にフィットする。
２．レーベンバーグ・マーカート二次フィット（Levenberg-Marquardt quadratic fit）：このアルゴリズムは、すべての点を放物線にフィットさせ、放物線の極値位置を返す。
３．レーベンバーグ・マーカートガウシアンフィッティング（Levenberg-Marquardt Gaussian fit）：このアルゴリズムは、すべての点をガウスにフィットさせ、ガウスの平均を返す。
４．レーベンバーグ・マーカート四次フィット（Levenberg-Marquardt quartic fit）：このアルゴリズムは、すべての点を四次式にフィットさせ、そのargmaxを返す。
５．スプラインフィット（Spline fit）：アンクランプスプライン（unclamped spline）はデータにフィットされ、高分解能サンプリングによって経験的にargmaxを決定する。
６．ランダムスプラインフィット（Random spline fit）：データのランダムサブセットが選択され、スプラインがそれぞれにフィットされ、すべてのデータサブセットについて中間argmaxが計算される。目的はアウトライアに対するロバストネスを達成することである。
７．Loessフィット（Loess fit）：データは局所回帰アルゴリズム（Loess）を使用してフィットされ、argmaxは高分解能リサンプリングによって経験的に計算される。
８．トップ５二次フィット（Top 5 quadratic fit）：最高ｙ値の５つのデータ点（ｘ，ｙ）が選択され、放物線がフィットされ、極値位置が返される。
９．質量中心argmax（Center-of-mass argmax）：データ点の質量中心が計算され、分布として解釈される。
１０．モード（Mode）：データ点のモードが計算され、分布として解釈される（最高ｙ値に関するｘ値）。
１１．中央値（Median）：データ点の中央値が計算され、分布として解釈される。
【０１８２】
これらのアルゴリズムはすべて制御システム１８０内の異なるプロセッサスレッド上で同時に実行され、中間推定を計算することは、それらの結果を１つのロバスト推定に結合する。上記のargmax推定法のすべて又は多くが同じデータセットについて失敗に終わるか又は偏りのある結果をもたらすことは非常に可能性が低い。全体的に見て、すべての推定の中央値によって理想的なargmax値のよりロバストな推定が得られる。
【０１８３】
強い雑音が存在する場合でも正しいargmax値を推定する能力が重要である。しかしながら、「断念する」時期を把握することは更により重要である。従って、argmax計算が信頼できる場合又は信頼できない場合を判断するための評価を行うことができる。最悪の事態のシナリオでは、顕微鏡１１０は、重要な蛍光信号がない試料１１の領域について調整される。これは、雑音によって支配された暗い画像
【数２４】
2019525216.tif 000026
のシーケンスと、その結果、
【数２５】
2019525216.tif 000027
のランダムシーケンスをもたらす。ほとんどの場合、このような事態を検出し、これらの測定を信頼できないものとしてマークするために、
【数２６】
2019525216.tif 000028
について閾値を設定することで十分である。しかしながら、異なるタイプの実験についてこれらの閾値を調整することが必要になる場合も多い。その代わりに、低品質画像から高い確実性で派生する測定値を排除する保守的に低いＤＣＴＳ閾値を使用する方がより良い可能性がある。残念ながら、これは、何らかの信号が存在するが、信頼できるargmax推定を行うには十分ではないという多くの境界例を残すものである。もう一つの補完的手法は、データの標準偏差（ＲＭＳＤ）に関する閾値をガウシアンフィットに設定することである。しかしながら、ＲＭＳＤに関する閾値を決定する際に根本的な困難があり、これは経験的に実行できるが、ほとんど保証がないものである。全体的に見て、まず第一にこのような閾値が不要であれば、確かにより良いことであろう。この問題を解決するために、データに対するフィットのＲＭＳＤが計算される。次に、
【数２７】
2019525216.tif 000029
の置換によってランダム化された同じデータの１００のインスタンスに対してガウスをフィッティングすることによって得られたＲＭＳＤ値が計算される。このようにして、観察されたＲＭＳＤが偶然のみによるものである確率の推定を行うことができる。直観的に、データがすでにランダムである場合、ランダム置換後は統計的に区別のできないものになる。しかしながら、データがランダムではない場合、即ち、単峰性ガウス様形状を有する場合、置換後はその構造を失うことになり、フィットエラーは徹底的に異なるものになる。形式的に、伝統的な統計的仮説検定の観点から、帰無仮説はデータがランダムであることである。ランダム置換により、帰無仮説に基づくＲＭＳＤの確率分布は経験的に計算され、これにより対応するｐ値の計算が可能になる。ｐ値（ｐｖ）は、帰無仮説の真理を想定して、ある事象が少なくとも極端なものと見なされる確率（真の非ランダム化データに関する所与のＲＭＳＤ）である。実際の確率１−ｐｖについて閾値を適用することができ、これは通常、良好なフィットの場合は０．９９を十分上回り、非常に雑音の多い曲線の場合は容易に０．５未満に低下する可能性がある。実際には、明確に定義された解釈を有する０．９９などの閾値が選択され、雑音の多いデータから「幻覚として経験されて」いる確率が＞１％である測定は拒絶される。
【０１８４】
長期イメージングセッションを開始する前に、初期合焦ステップが必要である。最適値Ｆ’ｕ，ｖは現在値Ｆｕ，ｖから先験的に遠く離れているので、０．５μｍという予想誤差を達成するために、ｒ及びｍは大きい値（典型的にｒ＝６０μｍ及びｍ＝１２１）に設定される。これは、使用可能な光子収支に関して無駄が多すぎると思われ、例えば、露光量に対して極めて敏感な初期の幼胚の生理学に影響を及ぼす可能性がある。その代わりに、探索空間を増分的に狭くする反復手法を使用することができる。例えば、ｍを１１に設定することができ、典型的にｓ＝３を使用して、ｓ個のステップでｒ＝６０μｍからｒ＝３μｍの半径により、合焦手順全体を適用することができる。これは、合計３３個のサンプルのみの場合に０．２５μｍ以下というより高い予想精度（実際にはＤＣＴＳのベンチマーク性能を考慮して実現可能なものである）を達成する（測定値の７５％の低減）。
【０１８５】
試料１１又は試料１１が埋め込まれる媒体によってもたらされる収差がない場合、決定される合焦状態Ｓは試料１１内の異なる深さで有効なままになると想定することができる。しかしながら、ショウジョウバエ又はゼブラフィッシュ幼胚全体などのいくつかの試料１１では、異なるイメージング深さにおける最適画像品質のために異なる補正が必要になる。この変動性に対処するために、Ｚ軸に沿ったそれぞれの位置［Ｚ０，Ｚ１，・・・ＺＫ−１］におけるいくつかのイメージング基準面［ＰＬ０，ＰＬ１，・・・ＰＬＫ−１］で光学顕微鏡１１０の最良状態が決定され、対応する最適状態［Ｓ０，Ｓ１，・・・ＳＫ−１］が記憶される。計算フレームワーク１８５は、これらの記憶された最適状態間において直線補間し、記憶された光学状態の外側で直線補外して、任意のイメージング深さＺにおける状態ＳＺを得ることができる。
【０１８６】
完全に透明ではない試料の場合、それぞれの検出サブシステム１１６、１１８は、試料１１の約半分、即ち、図７Ａ及び図７Ｂに示されているように検出対物レンズ８２６、８２８が面している半分についてのみ、典型的に高品質の画像データを取得することができる。例えば、検出サブシステム１１６は、検出対物レンズ８２６に面している試料１１の半分について高品質の画像データを取得する。その上、それぞれの他の検出サブシステム１１６、１１８は一般に、検出経路長がより短いために、試料１１の残りの半分についてより良好な画像品質を提供する。これに留意すると、真ん中の合焦基準面ＰＬはＺＳ及びＺＳ−１に位置決めされる。例えば、図７Ａ及び図７ＢではＳ＝３である。その結果、検出サブシステム１１６に面する試料１１の半分に関する最適顕微鏡状態Ｓｋ≦Ｓ−１の決定は変数Ｄ（２６）、Ｉ（１２）、及びＩ（１４）を必要とし、検出サブシステム１１８に面する試料１１の半分における最適状態Ｓｋ≧Ｓの決定は変数Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、及びＩ（１４）を必要とすることになる（Ｚ＞０）。それぞれの平面Ｚｋについて独立して最適顕微鏡状態Ｓｋを決定することは、変数Ｄ（２６）とＤ（２８）との間に相対的なドリフトが存在する場合にイメージングされたボリュームの連続性を保証しないであろう。空間連続性は、検出サブシステム１１６に面する試料１１の半分の場合、Ｄ（２６）を固定位置に維持することによって保証され、検出サブシステム１１８に面する試料１１の半分の場合、Ｄ（２８）を固定位置に維持することによって保証される。特に、（ライトシート１２、１４の移動を担当するあまり正確ではないガルバノメータスキャナ又はチップチルトミラーとは対照的に）それぞれの検出対物レンズ８２６、８２８を移動させるために圧電ポジショナなどの非常に正確なアクチュエータ５５（２６）、５５（２８）を使用する場合、変数Ｄ（２６）及びＤ（２８）を固定する方が変数Ｉ（１２）又はＩ（１４）を固定するより良い選択になる可能性がある。試料１１の２つの半分同士の間の連続的で明確に定義されたリンクは、平面ＺＳ−１から平面ＺＳにおけるライトシート位置Ｉ（１２）及びＩ（１４）を持ち越し、Ｉ（１２）及びＩ（１４）の両方を固定することによってＤ（２８）について平面ＺＳにおいて光学顕微鏡システムを解くことによって確立される。これは、試料１１のボリューム全体のシームレスな空間連続性を保証するものである。
【０１８７】
最長で数日間を要する可能性のある発達中の幼胚などの試料１１の長期イメージング中に、イメージング品質は通常、試料自体の発達によってもたらされる熱、機械、及び電子的ドリフト並びに光学的変化に左右される。このような低速度撮影実験全体を通して最適合焦を改善するために、最良合焦状態ＳＺは連続する時点として調整しなければならない。システム状態変数Ｓｔ，Ｚは時間（ｔ）と深さＺの関数になる。例えば、８つの基準面ＰＬを伴う再合焦シーケンス全体を実行するには典型的に、８０回程度の画像取得を必要とする。画像あたり２４０ｍｓという平均計算コスト（取得及び処理を含む）の場合、顕微鏡１１０全体の再合焦には約１９秒を必要とすると思われ、これは使用可能な時間予算次第で受け入れられない可能性がある。例えば、細胞追跡のためにショウジョウバエの胚発育をイメージングする場合、細胞がある時点から次の時点までに細胞径の半分以上移動しないことを保証するために、３０秒という時間分解能が好ましい。このシナリオにおいてボリュメトリックイメージングのために試料１１を移動させるために電動式ステージを使用する場合、適応システム１６０（図６に示されているものなど）の測定に使用できる時点同士の間において５秒以上のアイドル時間（即ち、主要画像取得時に消費されない時間）が存在しない可能性がある。
【０１８８】
この問題に対する解決策は、複数の時点について再合焦するために必要な測定を分散することである。観察量子、即ち、実際にはより小さい測定に分割できない測定は、所与の波長及び深さＺに関する
【数２８】
2019525216.tif 000030
の測定である。取得デューティサイクルはしばしば９０％までになる。これは、適応システム１６０が画像品質測定を実行するために１０％未満の時間が使用可能であることを意味する。発達上の低速度撮影イメージングにおける典型的な取得設定の場合、これは、ｍ個の画像を取得し、画像品質メトリックを計算し、最適パラメータ設定を決定するために使用可能な２つの時点同士の間の３〜６秒という時間予算に変換される。深さＺにおいて顕微鏡システム状態を補正するためにすべての情報が使用可能になると、新しい値Ｓｔ＋１，Ｚが計算され、その結果、前の値Ｓｔ，Ｚが更新される。図６は、実験タイムラインを示し、画像品質測定が概念上、どのように時間的に分散できるかを示している。高速機能イメージングの場合、イメージング実験の時間分解能に影響を及ぼさずに画像品質測定を実行することは典型的に可能ではない（単に、顕微鏡１１０が可能な最大イメージング速度で取得を実行する場合が多くなり、その結果、画像品質測定のための時間が全く残らないからである）。しかしながら、これらのタイプの記録は通常、非常に短いので、初期合焦のみを必要とし、時間的再合焦から著しく利益を得るものではない。
【０１８９】
試料１１における蛍光マーカの表現は空間又は時間の点で必ずしも一定ではなく、例えば、蛍光性のタグが付いた転写因子又は発達中の幼胚内で移動する細胞の個々にラベルが付いた集団をイメージングする場合である。従って、最良顕微鏡システム状態Ｓｔ，Ｚを決定するために所与の時間ｔ及び基準面Ｚｋにおいて蛍光３６、３８からの蛍光信号（即ち、情報）が常に十分にあるわけではない。時空的適応顕微鏡１１０は、時間又は空間のいずれかの点で信号の欠如に対してロバストでなければならない。ＤＣＴＳ画像品質メトリックの高い感度にもかかわらず、蛍光３６、３８からの十分な量の蛍光信号がない場合の合焦は、雑音によるシステム変動のリスクをもたらす。この難題に対処するために、基準面ＰＬが信号を欠いているかどうかを判断するために２つの戦略が評価され、即ち、（ｉ）絶対焦点値閾値ｆｍｉｎが設定され、（ｉｉ）ガウシアンフィットの誤差の上限が設定される。この定義に基づいて、基準面Ｚｋが空である場合、新しい顕微鏡システム状態Ｓ’ｋは平均
【数２９】
2019525216.tif 000031
に設定され、ここで、
【数３０】
2019525216.tif 000032
は隣接平面からの前に決定された合焦状態である（ｋ−１＜０又はｋ＋１＞ｎ−１である場合、代わりに
【数３１】
2019525216.tif 000033
が使用される）。その結果、局所信号がより良好な局所最適を決定するのに十分な強さになるまで、蛍光３６、３８からの十分な蛍光信号を提供しない基準面ＰＬがその隣接平面の挙動に追従することになる。
【０１９０】
ライトシート顕微鏡法における一般的な試料１１調製戦略は低密度のアガロースゲルに試料１１を埋め込むことに基づく。このゲルは、優れたイメージング品質を提供するが、試料１１が長期イメージングセッションにおいてＸ軸、Ｙ軸、又はＺ軸のうちのいずれか１つ以上に沿って移動するというドリフトの傾向をもたらす可能性もある。極端な場合、これらのドリフトは、試料１１の各部がイメージングされたボリュームの外側に移動する場合に記録自体を危うくする可能性がある。加えて、幼胚に対する平面Ｚｋの位置は、このドリフトのために変化する可能性がり、これが原則として時空的合焦の品質に影響する可能性がある。この問題に対処するために、試料１１をイメージングされたボリューム内で静止状態に維持する３次元試料追跡技法が実現される。
【０１９１】
次に、大域的最適化理論について述べる。時空的適応イメージングのための大域的最適化理論の基礎は、単一の潜在的に大きい線形反転問題が、すべての基準面ＰＬ［ＰＬ０，ＰＬ１，・・・ＰＬＫ−１］及びすべてのカラーチャンネル（波長）に関するすべての自由度（すべてのパラメータ）に関するすべての観察、線形パラメータ関係、及び制約を表せるように、焦点行列Ｍの基礎において公式化された逆問題を拡張できるという認識である。この最適化はすべての自由度（パラメータ）について同時に実行され、従って、個々の観察からの雑音の伝搬を低減する。これは、マルチカラーイメージングにおいて色収差を正確に補償すること並びに精巧なパラメータアンカリング及びブリッジングスキームを導入することを可能にする。
【０１９２】
以下の説明では、普遍性の喪失なしにいくつかの仮定が行われる。第一に、２つの検出サブシステム１１６、１１８及び２つの照明サブシステム１１２、１１４を含むマルチビューライトシート顕微鏡１１０について、時空的適応イメージングが実行されることが想定される。顕微鏡１１０の状態ベクトルＳは、すべての基準面ＰＬ及びすべてのカラーチャンネル（波長）についてすべての自由度（パラメータ）の値を含む。
【数３２】
2019525216.tif 000034
自由度Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、Ｉ（１４）は前述のものと同じ変数である。新しい状態変数Ｙ（１２）、Ｙ（１４）はそれぞれの照射軸（Ｙ軸と平行なもの）に沿ったライトシート１２、１４の並進に対応する。パラメータＡ（１２）、Ａ（１４）、及びＢ（１２）、Ｂ（１４）はそれぞれ、それぞれのライトシート１２、１４の２つの角自由度（α及びβ）に対応する。すべてのカラーチャンネル及びすべての基準面ＰＬについて、状態ベクトルＳｔは１０自由度のそれぞれに関する項目を含む。例えば、２カラー３平面の構成の場合、状態ベクトルＳは長さが６０になるであろう。カラーチャンネルは、特定の励起波長及び検出フィルタについて取得された画像のセットに対応する。主要イメージング実験中に複数の波長が使用される場合、それぞれの波長に関する画像を順次取得することができ、この取得フェーズのそれぞれにおいて顕微鏡状態パラメータの専用セットを使用することができる。これは、例えば、１つの波長に関するレーザビームが他の波長に関するレーザビームと完全に一致するわけではない場合、又は試料１１が異なる波長において異なる光学的性質を有する場合に有用である可能性があり、従って、最適画像を得るために、それぞれの波長について異なる設定α、β、Ｙ、Ｉ、Ｄが必要になる可能性がある。
【０１９３】
角自由度Ａ（１２）及びＡ（１４）並びにＢ（１２）及びＢ（１４）を加える際の根本的な困難は、それらとＩ（１２）及びＩ（１４）との結合並びにそれらとＤ（２６）及びＤ（２８）との間接的な結合である。実際は、ライトシート１２、１４の回転軸は必ずしも試料１１の所与の光学セクションの幾何学的中心と一致していないので、角自由度Ａ及び／又はＢの変化は検出焦点面２６、２８に対するライトシート１２、１４のデフォーカスももたらす可能性がある。単純な較正スキームを使用して、試料１１内の特定のポイントまでライトシート１２、１４の回転ポイントをシフトするのに必要なパラメータを識別することができる。
Ｉ’＝Ｉ−ｄａｔａｎ（Ａ）−ｄｂｔａｎ（Ｂ）
ここで、
【数３３】
2019525216.tif 000035
はライトシートの回転ポイントを変位させるベクトルである。この変換は、ライトシート１２、１４の位置及び角度に関する画像品質メトリックの直交性を保証するものである。以下の説明では、それぞれのライトシート１２、１４について、制御変数Ｉ、Ａ、及びＢがこのような変換によって切り離されていることが想定される。変数Ｙ、Ａ、及びＢの最適化は大部分は主な変数Ｄ及びＩから独立している。その結果、これらの自由度のそれぞれが独立した１次元の最適化問題として最適化できることになる。単純にするため、以下の解説ではこの新しい追加の変数は無視される。
【０１９４】
図１６Ａから図１６Ｄを参照すると、時空的適応イメージングに関する大域的最適化理論の基礎をなす主要概念が示されている。単純かつ読みやすくするため、これらの図では時空的適応イメージングのためのフレームワークで使用される１０自由度［Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、Ｉ（１４）、Ｙ（１２）、Ｙ（１４）、α（１２）、α（１４）、β（１２）、及びβ（１４）］のうちの４つ（Ｄ（２６）、Ｄ（２８）、Ｉ（１２）、及びＩ（１４））のみについて考慮する。その上、単純にするため、図１６Ａから図１６Ｄ並びに図１６Ａから図１６Ｄに関する付随考察において、Ｄ１はＤ（２６）を表し、Ｄ２はＤ（２８）を表し、Ｉ１はＩ（１２）を表し、Ｉ２はＩ（１４）を表し、ｚｉはＺ軸における基準面ＰＬｉの位置に対応し、カラーは波長λ０及びλ１によって示される。
【０１９５】
図１６Ａは、２カラー（λ０及びλ１）３平面（ｚ０、ｚ１、及びｚ２）構成においてＤ１、Ｄ２、Ｉ１、及びＩ２に関する合焦制約の制約グラフ表現を示している。ライトシートオフセット位置（Ｉ１及びＩ２）を表す変数は、検出対物レンズ位置（Ｄ１及びＤ２）に対して観察されたデフォーカス測定を介してリンクされる。検出対物レンズ８２６、８２８に取り付けられた圧電ポジショナは顕微鏡１１０内の最も精密な空間測定デバイスであり、従って、空間的基準として機能するので、検出対物レンズ８２６、８２８は所与のカラーチャンネル（λ０及びλ１）においてすべての基準面（ｚ０、ｚ１、及びｚ２）について一定の位置に維持される。２つのカラーチャンネルは、検出対物レンズ８２６、８２８の位置の質量中心（その個々の絶対位置ではない）が異なるカラーチャンネルについて同じであるという要件によってリンクされる。
【０１９６】
図１６Ｂは、状態変数Ｓとデフォーカス及び制約違反観察Ｆとの直線関係を記述する単一行列Ｍに合焦制約を集約できることを示している。値Ｆｕ，ｖはデフォーカス測定であり、値Ｖｋは制約違反補正項である。
【０１９７】
図１６Ｃは、システムアンカリング制約（検出対物レンズ８２６、８２８の位置の固定質量中心）の図を示しており、これは顕微鏡１１０の質量中心のドリフトを防止するために必要なものである。明瞭かつ単純にするために、この制約は図１４Ａのパネルでは省略されている。
【０１９８】
図１６Ｄは、蛍光３６、３８からの信号が任意の基準面ＰＬにおいて実験中の任意の時間に（例えば、遺伝的にコード化された蛍光マーカを表さないか又はまだ表していない試料１１の領域において、あるいは細胞によってまだ占有されていないが大規模な細胞運動事象の過程で後で占有済みになる試料１１の領域において）弱いか又は存在しない場合に、画像品質メトリックが事前定義閾値未満で応答し、特別な置換制約を使用して欠落情報を概算することを示している。ここに示されている例では、ライトシートオフセット位置は、１つの隣接基準面における値に設定される。実際には、この値は、考慮される基準面が最初の基準面又は最後の基準面ではない限り、隣接基準面の平均値になるように設定される。
【０１９９】
ベイズの確率理論における係数グラフを暗示するように、最適化問題は、ノードが状態変数（状態ベクトルＳの個々の項目）であり、エッジがこれらの変数に関する制約である制約グラフとして表すことができる。図１６Ａは、単一のブリッジング平面（ｚ１）及び両方のカラーチャンネルに関する同じ質量中心を備えた２カラー３平面構成に関する制約グラフの一例を提供する。この例では、（ｉ）デフォーカス測定に依存し、従って、時間が変動する可能性のあるデフォーカス制約、（ｉｉ）検出対物レンズ８２６、８２８の位置のサンプル深さ不変性を強制する同等制約、及び（ｉｉｉ）２つの検出対物レンズ８２６、８２８間の中間点がすべてのカラーチャンネルについて同じであることを保証する質量中心同等制約という３つのタイプの制約が存在する。単純にするため、システムをアンカリングするかあるいは欠落又は低信頼デフォーカス情報を扱うために必要な制約は省略されている。以下の説明では、図１６Ａに示されている３つの制約並びにその他の有用な制約について詳細に述べる。述べられているこれらの制約は、デフォーカス制約、同等制約、質量中心同等制約、アンカリング制約、及び置換による欠落情報充填制約である。
【０２００】
最も重要な制約は、以下のように検出対物レンズ位置（Ｄ１、Ｄ２）をライトシート位置（Ｉ１、Ｉ２）にリンクするデフォーカス制約である。
ΔＦｕ，ｖ＝ΔＤｕ−ΔＩｖ
この差の符号は、ΔＤｕΔＦｕ，ｖ＞０になるように選択され、これは、Ｉｖを一定に保持しながらＤｕを変更することによりデフォーカスΔＦｕ，ｖの測定を可能にするものである。
【０２０１】
このその他の非常に基本的な制約は、例えば、検出対物レンズの位置（Ｄ１及びＤ２）がイメージング深さ（ｚ）によって不変であることが必要である時に発生する。
【数３４】
2019525216.tif 000036
これは、
【数３５】
2019525216.tif 000037
から
【数３６】
2019525216.tif 000038
への変化は
【数３７】
2019525216.tif 000039
への同じ変化を伴わなければならないことを意味する。
【数３８】
2019525216.tif 000040
が最初に等しいと想定すると、その結果、
【数３９】
2019525216.tif 000041
は補正が適用された後に等しいままになることになる。これらの制約の示差的側面は、
【数４０】
2019525216.tif 000042
の現在値を観察することにより得られる補正項で０を置き換えることによって除去することができる。
【数４１】
2019525216.tif 000043
これは、補正
【数４２】
2019525216.tif 000044
が、最初に該当しない場合でも
【数４３】
2019525216.tif 000045
になるようなものであることを保証する。
【０２０２】
検出対物レンズは、作動距離をある波長から他の波長にわずかに変動させる色収差に苦しんでいる。検出対物レンズ８２６、８２８の焦点面２６又は２８は、イメージングされる蛍光３６、３８の波長次第でシフトする。例えば、いくつかの実験で使用されるNikon製16×/0.8対物レンズの場合、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって生成された蛍光３６、３８をイメージングする場合と赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）によって生成された蛍光３６、３８をイメージングする場合では、焦点面２６又は２８は約０．８μｍだけシフトする。マルチビューライトシート顕微鏡１１０は、互いに面している２つの検出対物レンズ８２６、８２８を使用するので、異なる波長では２つの対物レンズ８２６、８２８間の相対距離が異なる必要がある。理想的には、２つの対物レンズ８２６、８２８の質量中心は、焦点面２６、２８と一致するので、静止状態でなければならない。この制約は以下のように表すことができる。
【数４４】
2019525216.tif 000046
同様に、この示差的制約は以下のようにインテグラルにすることができる。
【数４５】
2019525216.tif 000047
表記を単純にするため、変数ｔは
【数４６】
2019525216.tif 000048
において省略されている。
【０２０３】
図１６Ａの行列Ｍはフルランクを持たない。１つの制約なし自由度が残存しており、依然として適正な計器位置合わせを維持しながら、システム全体の実量中心を並進させることができる。システムをアンカリングし、複数の補正ラウンドにおけるドリフトを防止するために、一定のままになるように検出対物レンズ８２６、８２８の質量中心を抑制することができる。
０＝ΔＤ１＋ΔＤ２
この場合も、これは以下のようにインテグラル形式で表すことができる。
−（Ｄ１＋Ｄ２）＝ΔＤ１＋ΔＤ２
対応する制約は図１６Ｃに示されている。
【０２０４】
上述のように、蛍光３６、３８からの信号は、試料１１のそれぞれの蛍光マーカが存在しない特定のカラーチャンネル又は基準面ＰＬの場合、（時には又は永続的に）低いか又は存在しない可能性がある。この状況では、画像品質測定は必ずしも信頼できるわけではない。従って、システムロバストネスのために、隣接平面又は補完的カラーチャンネルをプロキシとして使用することは好ましい。このようにして、例えば、隣接ライトシート位置を補間することにより、欠落デフォーカス観察を置換することができる。これは、実際には、例えば以下のように単純な平均化によって行うことができる。
【数４７】
2019525216.tif 000049
これが
【数４８】
2019525216.tif 000050
を伴う唯一の制約である場合、
【数４９】
2019525216.tif 000051
の値はその隣接値の平均変動に従うことになるが、必ずしもその隣接値の平均値と等しくなるわけではない。代替的に、以下のようにインテグラル形式を使用することができる。
【数５０】
2019525216.tif 000052
この場合、
【数５１】
2019525216.tif 000053
の値は、最初に該当しない場合でも補正が適用された後の
【数５２】
2019525216.tif 000054
の平均になる。対応する制約は図１６Ｃに示されている。
【０２０５】
グラフ内のそれぞれの制約は、Ｓ内の項目とＦ内の対応する項目のサブセットを伴う１次方程式である。その結果、それぞれの制約が行列Ｍ内の行としてコード化できることになる。図１６Ｂは図１６Ａの制約グラフに対応する行列Ｍを示している。種々のタイプの制約は、Ｆ内の項目を順序付けることにより行列Ｍに一緒に暗示的にグループ化される。
【０２０６】
一般化した焦点行列は明示的にデフォーカス観察のベクトルΔＦを状態ベクトル補正ΔＳに関連付けるものである。
ΔＦ＝ＭΔＳ
基本的な漸進的手法とは対照的に、状態ベクトルＳはこの時点ですべてのカラー及び平面に関する状態情報を含み、ΔＦはデフォーカス測定及びインテグラル制約に関する補正項を含む。
【０２０７】
状態ベクトルＳの補正ΔＳは、焦点行列Ｍを疑似反転し、ΔＦが与えられたΔＳを計算することによって計算される。
ΔＳ＝Ｍ＋ΔＦ
上述のように、この解は最小自乗解（Ｌ２ノルム）に対応する。これは、最小エネルギのベクトルΔＳ（Ｌ２ノルム）が返されることを意味する。これは、ΔＳを得るための最も単純な手法である。より精巧な及び／又は強力なその他の手法も可能であり、次にこれらについて述べる。
【０２０８】
前述の手法は、行列Ｍがフルランクのものであるか又は過剰抑制されている場合に最良のものである。行列Ｍがフルランクのものではない場合、例えば、システムがアンカリングされていない場合、潜在的に多くの異なる解ΔＳが存在するので、問題は特異なものになる。この場合、希薄な補正ベクトルΔＳを支持する最小Ｌ１長の解ΔＳを探索することは有利である。直観的に、この手法は、最適焦点を達成するために最も小さい数の自由度を変更する。
【０２０９】
測定から実際の補正への雑音の伝搬を制限するためのすべての努力にもかかわらず、実際には、（例えば、検出面
【数５３】
2019525216.tif 000055
対ライトシートオフセット
【数５４】
2019525216.tif 000056
について）他のものより大きい特定の自由度の補正振幅を制限することは有用なままになる。不適切に位置合わせされたシステムをもたらす可能性があるので、最適化後に補正を制限することは選択肢にならない。この問題に対する我々の解は、これらの限界をより一般的な最適化問題に統合することからなる。以下の制約付き二次最適化問題は以下のように解くことができる。
【数５５】
2019525216.tif 000057
Ｌｉはそれぞれの自由度に関する補正を制限する制限ベクトルＬの成分である。値ΔＳｉは状態補正ベクトルΔＳの成分であり、（ＭΔＳ）ｉはベクトルＭΔＳに関する成分である。第１のセットの不等式はそれぞれの自由度に関する補正を制限するものである。第２のセットは、制約グラフからの制約がすでに満足され、（ΔＦ）ｉ＝０である時に、それが満足されたままになり、（ＭΔＳ）ｉ＝０になることを保証するものである。これらの不等式の役割を理解するためのもう１つの方法は、（大域問題に対する局所的解ではなく）局所的問題に関する局所的解を支持することにより、制約グラフ全体を通して補正の伝搬を回避する希薄誘発不等式としてである。
【０２１０】
補正サイクルは、（ｉ）すべてのデフォーカス測定ΔＦを取得することと、（ｉｉ）補正ベクトルΔＳを計算し、これらの補正を適用することからなる。
【０２１１】
極端なケースでは、いくつかのカラーチャンネル及び多くの基準面ＰＬに関する補正サイクルは、完了するのに数分を要する可能性がある。特に、デフォーカス測定と補正の適用との間には遅延が存在する（予想される遅延は補正サイクルの半分である）。これは、顕微鏡１１０の摂動が補正されるまでに平均して１．５補正サイクルが経過することを意味する。しかしながら、ライトシート１２、１４に関するデフォーカス補正は、その後の観察及び補正のための基準として最後に補正されたシステム状態を不変の状態で保持しながら、それらを観察した直後に適用することができる。それにより、適応システムは通常の大域補正サイクルに影響を及ぼさないが、同時に、可能な限り迅速にデフォーカスを局所的に補正することができる。これらの高速局所補正はＩ１及びＩ２を変更するが、一般に、値Ｄ１及びＤ２を変更することはできない。これは制約グラフ（例えば、図１６Ａを参照）から理解することができ、その場合、Ｉ１及びＩ２に関する変数は「リーフノード」であり、従って、第１の近似において局所的に最適化することができる。
【０２１２】
試料によって誘発される画像摂動の処理に加えて、適応イメージング用の自動顕微鏡１１０は、システムによって誘発される画像摂動から迅速に回復することもできなければならない。このために適応システム１６０の能力を系統的にテストするために、核ラベル化（Ｈｉｓ２Ａｖ−ＲＦＰ）キイロショウジョウバエ幼胚における胚条収縮及び背側閉鎖の４時間低速度撮影を記録しながら、外部摂動が誘発された。この実験中に、検出対物レンズ８２６、８２８の位置を規定する圧電性アクチュエータ及びライトシート１２、１４のオフセットを規定するチップ／チルトミラーのゼロオフセットは（ハードウェアレベルで）手動でシフトされた。重要なことに、摂動は（アナログコントローラ上のそれぞれのノブによりベースライン電圧を調整することにより）ソフトウェア及び電子機器層の下流で手動で誘発されるので、計算フレームワークはこれらの摂動の実行、タイミング、及び規模に気付かない。
【０２１３】
３０秒ごとに１回、ショウジョウバエ幼胚の完全な４ビューの３Ｄ画像データセット（イメージスタックあたり５１５×１１８６×１１１ボクセルを含む）が取得された。４分ごとに、４つの均一間隔の基準面に関する完全な補正サイクルを完了した。補正サイクルの位相に対して摂動が発生した時期次第で、３０秒程度の短い時間内に単一平面及びビューを補正することができた。時間の経過につれてシステム全体がサンプルに対してドリフトしないことを保証するために、第１の検出対物レンズの位置（Ｄ１）はロックされ、他の自由度のみに対する補正が可能になる。９通りのタイプの摂動がトリガされ、それぞれは顕微鏡１１０の４つの主要自由度のサブセット、即ち、２つの検出対物レンズの位置（Ｄ１及びＤ２）並びに２つのライトシートのオフセット（Ｉ１及びＩ２）を伴う。
【０２１４】
図１７Ａは、それぞれの摂動によって影響される対応する自由度及び摂動の振幅を含み、９回の摂動の概要を提供する。図１７Ａでは、ボリュメトリックＤＣＴＳ焦点値は、ショウジョウバエ胚発生の適応ライブイメージング実験中の時間の関数として示されており（試料１１はショウジョウバエである）、検出対物レンズ８２６、８２８の位置の９回の摂動及びライトシート１２、１４へのオフセットは手動で導入された。９回の摂動のそれぞれは焦点品質の一時的な下降をもたらし（青色バー）、これはその後、適応システム１６０によって提供される時空的適応イメージングのために自動フレームワーク１８５によって開始される適切な対策により復旧される。
【０２１５】
摂動＃１〜＃６は、個々の自由度（Ｄ１、Ｄ２、Ｉ１、Ｉ２）並びに自由度の対（Ｄ１及びＤ２、Ｉ１及びＩ２）の瞬時変化である。摂動＃７及び＃８は、最初にＩ２及び次にＤ１を伴う２回の低速傾斜（１μｍ／分の速度でシステムを位置合わせ不良にする）である。最後の摂動＃９は、摂動＃１の前の初期ベースライン構成にシステムを戻す、Ｉ２及びＤ１の強い（８μｍ）同時瞬時変化である。この最後の摂動は非常に強いので、生物試料１１のみによって実行される「通常実験」において発生する可能性は非常に低い。しかしながら、このテストは、真剣にシステムを吟味し、極端な条件下でそのロバストネスを評価するために含まれていた。
【０２１６】
顕微鏡１１０によって記録された画像データの品質を監視するために、それぞれの取得ボリュームについて、最良遂行焦点メトリック（ＤＣＴＳ）に基づいてボリュメトリック品質メトリックが計算される。図１７Ａは、胚発育がボリュメトリック焦点品質メトリックにおける正の縦方向傾向をもたらすことを示し、これは時間の経過につれて核密度の増加並びに対応する微細細部及びイメージングボリュームにおける高周波テクスチャの増加によるものである。より重要なことに、この可視化は、それぞれの摂動がボリュメトリック焦点品質メトリックにおける一時的な下降をどのようにもたらすかも示している。
【０２１７】
図１７Ｂは、顕微鏡１１０の４つの自由度（Ｄ１、Ｄ２、Ｉ１、Ｉ２）を基準面ｚ２に関する時間の関数として示している。図１７Ｂは、基準面ｚ３において４つの自由度にシステムによって自動的に適応された変化を示している。基準面ｚ３は、この平面における画像が制約なしの自由度Ｄ２にリンクされるのでこの実証のために選択されたものである（これにより、この位置で読み出されたデータがシステムロバストネスを評価するために特に有用なものになる）。
【０２１８】
図１７Ｃは、最大値投影（左）と、第４の摂動の直前及び直後の幼胚の小さい領域の拡大図の時系列（右）とを示している。このイメージシーケンスは、対物レンズＯ４によって照らされ、対物レンズＯ２によってイメージングされる試料１１の象限を強調している。最適焦点品質は、示されている象限については０．５分以内に復旧され、試料１１のボリューム全体については２分以内に復旧される。
【０２１９】
図１７Ｄは、最大値投影（左）と、第５の摂動の直前及び直後の幼胚の小さい領域の拡大図の時系列とを示している。このイメージシーケンスは、対物レンズＯ４によって照らされ、対物レンズＯ２によってイメージングされる試料１１の象限を強調している。最適焦点品質は、示されている象限については１分以内に復旧され、試料１１のボリューム全体については４分以内に復旧される。
【０２２０】
図１７Ｅは、最大値投影（左）と、第９の摂動の直前及び直後の幼胚の小さい領域の拡大図の時系列とを示している。第９の摂動は、このベンチマークに含まれる最も厳しいシステム摂動である。２つのイメージシーケンスは、対物レンズＯ４（右）及びＯ３（左）によって照らされ、対物レンズＯ１によってイメージングされる試料１１の象限内の領域を強調している。
【０２２１】
図１７Ｃから図１７Ｅは、対物レンズＯ４（右）及びＯ３（左）によって照らされ、対物レンズＯ１によってイメージングされる象限に関するイメージシーケンスを示している。同じ方向にそれぞれ８μｍのＤ１及びＩ２の同時シフトは、Ｏ３によって照らされ、Ｏ１によってイメージングされる象限について互いに打ち消し合うものである。Ｏ４によって照らされ、Ｏ１によってイメージングされる象限に関する画像データに見られるかなり劇的な焦点品質の損失からの回復は、局所的には１６時点、ボリューム全体では２２時点を要する。
【０２２２】
図１７Ｃ、図１７Ｄ、及び図１７Ｅは、平面ｚ３における画像品質が３つの摂動例＃４、＃５、及び＃９によってどのように影響されるかを示している。図１７Ａに示されているように、摂動＃４はボリュメトリック画像品質メトリックにおける非常に小さい下降をもたらし、それは、図１７Ｃに示されている摂動に続く画像品質のほとんど感知不能な劣化によって更に確認される。摂動＃５は両方の検出対物レンズ８２６、８２８を伴い、平面ｚ３では２時点（１分）以内に、ボリューム全体では１０時点（フルシステム補正サイクルの長さに近い期間）以内に完全に補償される（図１７Ａを参照）。対照的に、例外的に強い摂動＃９（振幅：８μｍ）は、試料ボリューム全体を通して完全に補正されるためにフル補正サイクル２回分を必要とする。
【０２２３】
図１７Ａ及び図１７Ｅに示されているように、適応システム１６０は、その適切な合焦状態の強い外部摂動に直面した場合など、極端な条件下でも首尾良く回復することができる。特に、この同じテスト実験中に、適応システム１６０は、生体幼胚の発達に従い、それに対して調整することにより、サンプルによって誘発される摂動も首尾良く処理した。
【０２２４】
上述のように、自由度（ＤＯＦ）に対する調整は順次線分探索によって行われた。しかしながら、２つの角度ライトシート自由度α及びβの場合、図５Ｅ及び図５Ｆに示されているように、ライトシート角度を変化させると、照らされる試料１１のセクションも変化させるので、この手法は不適切である。このシナリオでは、結果的に特異な問題になるような異なる基礎的蛍光体分布から発生する画像の品質を比較することが必要になるであろう。以下の説明では、ライトシートジオメトリパラメータを単一焦点スタック、即ち、Ｄ及びＩを最適化するために使用される同じスタックから直接抽出するために開発された画像解析アルゴリズムに関する詳細が提供される。従って、この手法は、３Ｄライトシートジオメトリを決定するためのライトシート角度の変化を回避し、その結果、上記で概説した問題を克服するものであり、システム状態を最適化するために取得する必要がある画像の数を最小化し、その結果、試料の光子収支に対する影響を最小化するという追加の利点を有する。
【０２２５】
手順１５１０及び１５３０を実行するソフトウェアモジュール５８８
ライトシート面、ライトシートウエスト、及び検出焦点面２６、２８の位置を適応させることに加えて、適応システム１６０は、ライトシートと検出焦点面との間の３次元角度（α（１２）、α（１４）、β（１２）、及びβ（１４））を制御する。これらの自由度は、試料１１とその環境との間の境界面において空間的に可変のライトシート屈折を補償するために使用される。ライトシート角度の空間適応がない場合、図１８Ａ及び図１８Ｂに示されているように、視野全体にわたって合焦することは不可能又は困難になるので、それに対応するライトシートと検出焦点面との共平面性の損失により空間分解能及び画像品質が劣化する。図１８Ａは、屈折率ｎｍが屈折率ｎｅと等しくないので、取り付けマトリックス（屈折率ｎｍを有するもの）と試料１１（屈折率ｎｅを有するもの）との間の境界面における屈折の結果として、生体試料１１内部のライトシート角度βが像平面同士の間でどのように変化すると予想されるかを示している。対照的に、その短軸が照射軸と位置合わせされた場合、ライトシート角度αは卵形試料１１の全体にわたって変動するとは予想されない。図１８Ｂは、画像の品質に対する屈折の効果を示している。ライトシート面と検出焦点面２６、２８が試料１１外部では同一平面上にあるが、試料１１内部では互いに対して傾斜している場合、ライトシート１２、１４によって照らされるすべての領域が同時に合焦状態にあるわけではない。例えば、ショウジョウバエ幼胚内の５０μｍの深さでは、ラベル化領域ａ、ｂ、ｃ、及びｄを比較することにより示されるように、最適焦点設定は像平面全体にわたって連続的に変化し、これにより、β＝０．６°に対応する２μｍの焦点拡散がもたされる。
【０２２６】
図１８Ｃは、ライトシート面と検出焦点面との間の角度の不一致α及びβの測定及び補正が自由度Ｄ、Ｉ、及びＹのみに制限される時空的適応イメージングによって達成されるレベルを超えて空間分解能をどのように改善するかを示している。ショウジョウバエ幼胚内の表面領域及び深部画像領域の代表的な例は、α及びβの適応最適化あり（上）及びなし（下）で取得された拡大図（紫色、緑色）として示されている。スペクトル線変化図（下）は、Ｄ、Ｉ、及びＹのみを補正することによって解明されない亜細胞の特徴を明らかにしている。
【０２２７】
図１８Ｄは、キイロショウジョウバエ幼胚のボリューム全体わたって実験的に測定され、理論的に予測された補正角β（βグラフにおける黒色及び灰色の線）を示している。予測は、幼胚内の表面領域と、試料１１が保持されるマトリックスの１．３３９及び１．３５という平均屈折率を想定する光線光学モデルによって得られた。実験とモデルとの良好な合致は、１．幼胚と周囲のマトリックス／媒体との間の境界面におけるライトシート屈折、並びに２．光学検出経路（Ｚ軸）に沿って試料によって誘発されるレンジングの結果としての試料１１内部の検出焦点面２６、２８の曲率という２つの主要光学効果が試料１１内部のライトシート及び検出焦点面２６、２８の角度の不一致の責任を負うべきであることを示唆している。
【０２２８】
計算フレームワーク１８５は、ライトシート角度α及びβの連続最適化のためのロバストなイメージベースのアルゴリズムを使用して、試料１１のボリューム全体にわたって３次元ライトシート経路を計算的にマッピングし補正する。このアルゴリズムは、ライトシート及び検出焦点面（Ｉ１、Ｉ２、Ｄ１、及びＤ２）のオフセットを補正するために使用される同じデフォーカスイメージシーケンスについて機能するものであり、これは追加の測定の必要性を解消し、時間の使用及び光子収支を最適化する。空間適応方式でライトシート屈折を補償することは、大きい視野全体にわたって系統的に解像度を改善するために不可欠であり、並進自由度に限定される適応イメージングによって置き換えることはできない。
【０２２９】
パラメータのフルセットについて複数のモデルシステムにおける解像度の改善を定量化することに加えて、角自由度がない場合のライトシートと検出焦点面との間の発散の原因と影響が調査される。α及びβ偏向角の値は深さの関数としてショウジョウバエ幼胚内で測定され、ライトシート伝搬の理論的モデルは幼胚の光学及び幾何学的特性を考慮して開発される。カメラ８４６、８４８からの出力の空間分解能を最適化するために、βは、それぞれのカメラフィールドにおいて間隔［０．５°  ２．０°］及び［−０．５°  −２．０°］に及ぶ非線形パラメータ軌跡を使用して連続的に調整する必要がある（図１８Ｄに示されている通り）。これらの補正の必要性は２つの主要光学効果から発生する。試料１１とその環境との間の屈折率の不一致は、（ｉ）試料１１の表面において位置に依存するライトシートの屈折をもたらし、（ｉｉ）試料１１内部で検出焦点面２６、２８の空間的に可変の曲率をもたらす。これらのメカニズムは、完全なデータ駆動方式で計算フレームワーク１８５によって決定され実行される最適補正と良好に合致する、ライトシート面と検出焦点面２６、２８との間の理論的に位置に依存する角度の不一致をもたらす（図１８Ｄに示されている通り）。
【０２３０】
ライトシート角度αはライトシート顕微鏡のシステムアライメント中に調整される（この自由度が顕微鏡の設計において考慮された場合）。この自由度の調整は適切に実行する必要があるが、角度αは典型的に、時間の経過につれて実質的にドリフトするか又は実験中に重大なイメージングアーチファクトの責任を主に負うべきであるとは予想されない。しかしながら、大きい試料及び／又は複雑な試料ジオメトリ（マウンティング媒体とは異なる屈折率分布を備えたもの）の場合、上述のように、ライトシート面と検出面２６、２８との角度の不一致をもたらす収差及び光屈折が発生する可能性がある。角度αとは対照的に、深さに依存する方式で角度βを調整するためのより強いケースが存在する。例えば、典型的な球形又は楕円形の試料１１（ゼブラフィッシュ又はショウジョウバエ幼胚など）の場合、イメージング面は試料１１の一方の端部からそのもう一方の端部までＺ軸に沿って移動するので、媒体とサンプルとの境界面に対するライトシート入射角は−９０度から＋９０度に変動する。
【０２３１】
従って、試料１１に入ると、ライトシート１２、１４は像平面の位置に依存する量だけ屈折する（図１８Ｄに示されている通り）。ライトシート面のこの示差的経路偏向により、試料１１内の異なる像平面は、最適画像品質を復旧するために異なる角度焦点調整を必要とする。このような考慮は、実際には、いかなる焦点並進調整もライトシート１２、１４の不可避な屈折を完全に補正できないので、角度調整に代わるものは何もないことを示している。
【０２３２】
図１８Ｅを参照すると、試料１１内のライトシート１２、１４の３次元の向きは、以下のように、適応システム１６０によって実行される手順１５１０及び１５３０を使用して自動的に決定される。手順１５１０及び１５３０は、ライトシートパラメータｚ、α、及びβを決定するために使用され、これらは２つのライトシート角度並びに最良焦点品質のオフセット位置ｚを含む（従って、ライトシート面の３次元ジオメトリを完全に規定する）。
【０２３３】
画像の標準焦点スタックＳＴが取得される。画像の標準焦点スタックＳＴは、再合焦のためにカメラ８４６、８４８によって取得される。このスタックはいくつかの画像ＳＴｋ（実際には９つ又は１１個の画像）からなり、ここでｋはスタック内の画像の数である。次に、クロップ済みスタックＳＴＣを形成するためにスタックＳＴのそれぞれの画像がクロップされ、次にクロップ済みスタックＳＴＣのそれぞれの画像が小領域ＳＴｉ，ｊに分割され、ｉ及びｊは画像の平面を規定する２つの軸（Ｘ軸及びＹ軸など）に沿った小領域の数に対応する。それぞれの小領域ＳＴｉ，ｊはサンプルの選択された基準領域（１５１１）に対応する。その上、変更される動作パラメータ（１５１２）は焦点面２６、２８又はＺ軸に沿ったライトシート１２、１４の平面Ｉの位置である。蛍光の画像は小領域ＳＴｉ，ｊのそれぞれで記録される（１５１３）。
【０２３４】
それぞれの小領域の品質は、それぞれの小領域に画像メトリックＭＥＴを適用して３次元ライトシート経路を特徴付けるポイント（ｘ，ｙ，ｄ）を決定することによって決定される（１５１４）。使用できる画像メトリックはＤＣＴＳ画像メトリックである。それぞれのサブスタックＳＴｉ，ｊについて、それぞれの画像のメトリックＭＥＴであるＭＥＴ（ＳＴｋ，ｉ，ｊ）が計算される。
【０２３５】
最高品質画像を生成する動作パラメータは、それぞれのサブスタックＳＴｉ，ｊについて最適焦点深さｚｉ，ｊを個々に決定することによって観察され（１５３１）、これらは記憶される（１５３２）。いくつかのサブスタックの場合、統計的に無意味なフィッティングのために（例えば、例外的に長い照射及び検出経路長によるスタックのリモート位置における信号の欠落又は不十分な画像品質の結果として）信頼できる焦点情報を決定することが可能ではない場合もある。この場合、対応するデータ点は廃棄される。
【０２３６】
アウトライアが検出される。ライトシート面と検出焦点面との間の角度α及びβの動作パラメータはロバストに再構築される。それぞれの幾何学的隔離及びサブスタックあたりのそれぞれの最大メトリック（例えばＤＣＴＳ）値の両方に関してアウトライアを除去するためにデータ点の追加のフィルタリングを実行することができる。次に、これらの点を通過する可能性が最も高い平面を見つけるために、収集されたデータ点（ｘｉ，ｊ，ｙｉ，ｊ，ｚｉ，ｊ）が使用される。この平面はライトシート面自体に対応し、原則として、単純な最小２乗回帰を適用することによって見つけることができる。しかしながら、アウトライアは慎重なフィルタリング後でも依然としてデータ点間に残存する可能性があるので、インライアとアウトライアを区別できるロバストな線形フィット推定法を使用することができる。
【０２３７】
最終結果は、以下の形の２次元平面フィットである。
ｚ＝ａｘ＋ｂｙ＋ｃ
２つの角度は以下のように抽出することができる。
α＝ａｔａｎ（ｂ）
β＝ａｔａｎ（ａ）
これらの角度は、例えば、更新６２０中に（図６）調整することができる（１４５０）。
【０２３８】
テスト／実験
適応システム１６０の性能を評価するために、既知の規模の明確に定義された光学摂動を使用するシステムベンチマークが実行された。このベンチマークは、次の項に記載されている生物学的実験において遭遇される先験的に未知の光学摂動に適応システム１６０をさらす前に我々の方法の妥当性検査及び特徴付けとして機能した。
【０２３９】
変動する規模のライトシート及び検出焦点面位置について明確に定義された瞬時ジャンプ及び連続ドリフト（２〜８μｍのジャンプ、１μｍ  ｍｉｎ−１のドリフト）を電子的に誘発しながら、生体ショウジョウバエ幼胚を使用する短期ボリュメトリックイメージング実験が実行される。これらの摂動は、ライトシート及び検出対物レンズの位置決めを担当する圧電コントローラを使用し、顕微鏡制御フレームワーク自体がこれらの外部事象のタイミング、タイプ、及びソースに気付かないことを保証して、生成された。従って、適応システム１６０は、実際の生物学的イメージング実験において遭遇される難題を模倣して、取得した画像のリアルタイム分析のみによってこれらの摂動を査定し、補償することができるであろう。誘発されたシステム摂動の規模及びタイプを適応システム１６０の判断及び応答タイミングと比較することにより、図１７Ａから図１７Ｅに示されているように、適応システム１６０の性能をテストすることができる。このベンチマークは、ライトシートと焦点面との間の３Ｄ空間関係に影響を及ぼす様々な摂動に応じて最適画像品質の急速かつ正確な回復を実証するものであり、すべての摂動について、適応システム１６０は、影響を受けた自由度（複数も可）を正しく識別し、平均して摂動後の１〜２時点以内に摂動によって誘発された画像品質の損失の９２％を回復した。
【０２４０】
角自由度に関する追加のベンチマークは、既知の規模のライトシート偏向（０．２５〜２°のジャンプ）を導入し、それを補償することによって実行される。この後者の実験は、適応システム１６０が図１９に示されているようにそれぞれαｉ及びβｉについて０．１５°及び０．２１°の精度で生体試料内部のライトシートと検出焦点面との間の角度の不一致を正しく識別し、補正することを示している。
【０２４１】
最後に、適応システム１６０は、どの程度迅速に未補正光学顕微鏡１１０を改めて（未知の状態から始めて）最適化し、大きい試料全体にわたって高い空間分解能を回復するかを査定するためにテストされる。図２０に示されているように、遺伝的にコード化されたカルシウム指標を表す、ゼブラフィッシュ幼生脳全体に関するシステム補正時間を測定した。図２０Ａに示されているように、８００×６００×２００μｍ３というボリュームの試料１１を５つの基準領域に分割し、試料１１の光学的性質に対する反復集束パラメータ適応を３回実行し、図２０Ｂに示されているように、最後の回で最適システム性能に達したことを確認した。図２０Ｃに示されているように、脳全体を通して細胞分解能が完全に欠落している状態から始めた後、システム最適化は４０秒を要し、脳全体を通して高分解能を系統的に回復した。このシステム全体最適化手順は、光学顕微鏡１１０が明確に定義された最適状態にあることを保証するために、低速度撮影実験の開始時に１回実行することができる。その後のシステム状態更新は、反復スキームを必要とせず、適応システム１６０によってタスクについて費やされる時間を最小限にするために測定のサブセットに区分することができる。
【０２４２】
適応システム１６０の例
適応システム１６０の能力及びロバストネスは、広範囲の（ｉ）種々のタイプの形態学的マーカ及びカルシウム指標を含むマーカ戦略、（ｉｉ）ショウジョウバエ及びゼブラフィッシュ幼胚並びにゼブラフィッシュ幼生脳を含むモデルシステム、及び（ｉｉｉ）発達、機能、マルチカラー、及びマルチビューイメージング実験を含むイメージング検定を使用して実証される。
【０２４３】
ショウジョウバエ発達の時空的適応イメージング
図２１Ａから図２１Ｄ、図２２Ａ、図２２Ｂ、及び図２３を参照すると、多細胞生物の高分解能ライブイメージングに関する難題は、特に試料形態の変化中における、局所光学的性質の動的変化の発生である。このシナリオにおける時空的適応イメージングの潜在能力は、挑戦的なテストケースを提示するショウジョウバエ胚発育を使用してテストされる。
【０２４４】
胚発生の初期段階では、形態学的変化が幼胚全体にわたって発生し、組織の高速再配列及びリモデリングとなって現れる。その上、初期ショウジョウバエ幼胚は大量の脂質豊富な卵黄を含み、これは時間の経過につれて消費される。これらのプロセスは、試料全体を通して局所光学的性質に影響を及ぼし、不明の状態で残された場合、空間分解能及び画像品質を劣化させるものである。
【０２４５】
２１時間の低速度撮影イメージング実験は、すべての細胞においてヒストン−赤色蛍光タンパク質（ヒストン−ＲＦＰ）を表すショウジョウバエ幼胚で実行される。適応システム１６０は、この実験を完全に制御でき、図２１Ａから図２１Ｄ、図２２Ａ、及び図２２Ｂに示されているように、光学顕微鏡１１０の状態を連続的にかつ自動的に最適化するように主要自由度（Ｉ１、Ｉ２、Ｄ１、及びＤ２）を調整することができた。ライトシート及び検出焦点面を並進させるために必要なこれらの４つの自由度は、効果的なシステム補正に必要な最小パラメータセットを形成する。次の結果の項では、１０自由度すべてを備えた高度な適応イメージングについて述べる。予想されるように、最適空間分解能に必要な補正（図２１Ｂ）は時間の関数として変動し、幼胚内部のイメージング深さに依存する。空間及び時間の全体にわたって、ライトシート位置は、すべての参照位置について平均して５．３μｍだけ（最大で９．４μｍまで）調整する必要があった（図２１Ｂ）。適応システム１６０によって実行されるリアルタイム補正は更に、幼胚において最も高速かつ最も顕著な内部形態学的変化が起こる、産卵の３〜８時間後（図２１Ａ及び図２１Ｂの０〜５時間に対応する）にシステム状態調整の最も差し迫った必要性が発生することを実証している。空間分解能はイメージング実験全体を通して実質的に改善され、発達中の神経系の深部組織領域内を含む、非適応顕微鏡法（図２１Ｃ）において低画像品質に苦しむと思われる多くの領域で細胞及び亜細胞の特徴が回復される。空間分解能の改善は、（図２１Ｄ及び図２３に示されているように）細胞核境界と交差する強度変化図を系統的に分析することにより、幼胚全体を通して定量化される。この分析は、適応イメージングによって空間分解能が平均２．４倍（局所的に３．８倍まで）、信号強度が平均１．６倍（局所的に２．０倍まで）改善されたことを示している。適応イメージングによって取得されたデータのフーリエ解析は、半径で３０〜４０％の増加を示し、最大周波数サポートをマークする（図２１Ｃ）。帯域限定で雑音の多い画像が、分解能限界の推定とは無関係の低周波構造のみを含む領域を含む全体として考慮されるので、この分析はスペクトル線変化図と比較して解像度の改善を過小評価している。
【０２４６】
更に、公正な比較のために、定量化は一般に適応システム１６０の性能を過小評価し、低速度撮影イメージング実験の開始時に適応システム１６０によって決定される完全に最適化された顕微鏡構成を使用して、未補正顕微鏡状態を表す画像が取得された。従って、この分析は、単にライブイメージング中の連続顕微鏡状態更新に帰因する改善を定量化するものである。
【０２４７】
ゼブラフィッシュにおける大規模な細胞運動の適応イメージング
図２４Ａから図２４Ｅ及び図２５を参照すると、上述のイメージング実験では、ショウジョウバエ幼胚は初期発生中に大規模な形態学的変化を経験するが、偏在的なラベル化幼胚全体を通して常に蛍光信号が入手可能である。その他のモデルシステム、発達プロセス、又はマーカ戦略による実験では、蛍光信号の分布は実質的に時間の関数として変化する可能性がある。従って、次に、形態学的変化の結果として信号分布における大規模な変化に対するオンデマンド顕微鏡適応を実行するために適応システム１６０がテストされる。このために、原腸胚形成全体を通して発達中のゼブラフィッシュ幼胚の時空的適応イメージングが実行される。長さ６〜１２時間の実験は被包のプロセス全体を捕捉し、これは幼胚全体にわたって大規模な定方向細胞運動によって特徴付けられる（図２４Ａ）。従って、顕微鏡は、局所信号の出現について試料ボリュームを連続的に監視し、オンデマンドで、前に蛍光信号が欠落していた新しい領域に急速に適応しなければならない（図２４Ｂ）。
【０２４８】
１２時間の低速度撮影実験のうちの最初の４．５時間の間、核局在化ＧＦＰを表す細胞は動物から植物半球に移動し、最初は空の基準面ｚ４〜ｚ６を漸次占有する（図２４Ａ）。適応システム１６０は、蛍光における関連の時空的変化を自動的に検出し、これらの新たに占有された領域に光学顕微鏡１１０を適応させる（図２４Ｂ及び図２４Ｃ）。基準面ＰＬの密度は、空間的に変動する光学的性質の妥当な補正を保証するために十分高く設定される。実用的な選択肢は、隣接平面に関するライトシートオフセット補正の差が焦点深度を超えない設定である（〜２μｍ、その結果、ゼブラフィッシュ幼胚の全体にわたって７つの基準面が得られる、図２４Ｃ）。これらの設定は典型的に、同じ生物学的モデルシステムによって実行されるすべての実験にわたってロバストである。適応システム１６０からの以前の測定がまったく入手可能ではない場合、第１の実験においてすでに最適の画像品質を保証しながら、光学効果を査定するために、高密度の基準面（例えば、２０μｍの間隔）を使用することができる。空の基準面は、それに関する蛍光信号が入手可能な、その最も近い空間隣接物と同じパラメータ変化にかけられる。
【０２４９】
大規模な細胞運動中に、光学顕微鏡１１０は、イメージングボリュームの変化に漸次適応し、局所信号に基づく測定が使用可能になると直ちに画像品質を局所的に最適化する。ショウジョウバエの発達に関して上記で示されているように、時空的適応イメージングは、発達中のゼブラフィッシュ幼胚に関する空間分解能及び画像品質の実質的な改善も提供し、非適応イメージングによって解明されない多くの領域において細胞及び亜細胞の特徴を回復する（図２４Ｄ）。解像度の定量分析は、適応イメージングによって空間分解能が平均３．１倍（局所的に５．９倍まで）、信号強度が平均２．１倍（局所的に４．８倍まで）改善されたことを示している（図２４Ｅ及び図２５）。適応イメージングによって取得されたデータのフーリエ解析は、半径で２０〜３０％の増加を更に示し、最大周波数サポートをマークする（図２４Ｅ）。
【０２５０】
動的遺伝子発現の適応マルチカラーイメージング
図２６Ａから図２６Ｅを参照すると、マルチカラーイメージングは生物における動的プロセスを照会するための強力なツールである。重要な適用例としては、例えば、タンパク質同士の相互作用の研究及び局所組織コンテキストに対する細胞型固有情報の登録を含む。それぞれのマーカの空間分布は頻繁に動的変化を経験し、特定の遺伝子産物を追跡する遺伝子ラベルは低速度撮影実験の開始時に表すことができない。マルチカラー設定における先験的に未知のマーカ分布に対するオンデマンド顕微鏡適応を実証するために、すべての細胞における核局在化ＲＦＰ及び胚神経系を形成する前駆細胞における細胞質ＧＦＰを表す発達中のショウジョウバエ幼胚全体おいて２０時間の間、細胞力学を追従した（図２６Ａ）。従って、発達中の幼胚における光学的変化への適応に加えて、適応システム１６０は、試料１１の種々の部分におけるＧＦＰ表現の発現を自律的に検出し、幼胚全体を通して連続的に変化するＧＦＰの分布に適応しなければならない。更に、２カラーチャンネルは空間的に正しく登録する必要があり、これは色収差の自動検出及び補償を必要とする。
【０２５１】
汎神経マーカの時空的表現を追跡することにより（図２６Ｂ）、適応システム１６０は、局所的画像品質を改善するための情報をどの測定が提供するかを評価し、低信号を有する領域に対応するデータ点を置換する。この選択的最適化手順は、幼胚全体を通して空間分解能をロバストに改善し、適応イメージングなしでは細胞分解能が欠落する出現中の神経系の多くの部分の個々の細胞を解明する（図２６Ｃ）。試料及び光学部品によって誘発された色収差は自動的に検出され、除去される（図２６Ｄ）。その上、照明対物レンズの位置（Ｙ１及びＹ２）を制御することにより、適応システム１６０は、ライトシートの最も薄い領域が試料全体にわたって３Ｄマーカ分布を系統的に追跡することを保証する（図２７Ａから図２７Ｇに示されている通り）。偏在（ＲＦＰ）及び汎神経（ＧＦＰ）マーカは空間的に異なる分布になるので、適応システム１６０は、それぞれのカラーチャンネルについて個別に最適照明焦点軌跡を決定することにより更に空間分解能を改善する（図２６Ｅ、図２７Ｆ、及び図２７Ｇ）。
【０２５２】
幼生ゼブラフィッシュにおける適応全脳機能イメージング
上述の発達イメージング適用を補完すると、適応システム１６０は時空的適応全脳機能イメージングに適用される。このような実験は、神経細胞活動に応じて強度レベルを変更し、発達イメージング実験よりかなり高い画像取得速度を要求するカルシウム指標によって頻繁に実行される。生後４日及び５日の幼生ゼブラフィッシュの脳の全体わたるライトシート屈折は、ショウジョウバエ幼胚のものより顕著ではない（例えば、図１８Ｄに示されているように、βｉは平均して３倍小さい）。しかしながら、ライトシートオフセットＩｉは、実質的に脳全体わたって変動し、検出焦点の深さに匹敵する空間スケールにおいて時間的に更に動的である。これは、全脳機能イメージングが適応システム１６０の制御下で実質的に顕微鏡適応の恩恵を受けるはずであることを示唆している。同時に複数のビューからの急速圧電ベースのボリュメトリックイメージングを可能にする光学顕微鏡１１０設計を利用すると、適応システム１６０によって仲介されたシステム最適化と同時に高速機能イメージングのためのイメージング検定が開発される。
【０２５３】
深さ２００μｍの脳のボリュームにおよぶライトシート及び７つの基準面の両方に関する適応システム１６０の測定及び計算は１０秒を要する。進んだ発達段階における光学条件の低速ドリフトにより、コアパラメータセット（Ｉｉ、Ｄｉ）に関する１０分の更新周波数は最適画像品質を維持するために十分なものである。従って、顕微鏡帯域幅の残りの９８％は、３Ｈｚという持続的ボリュームレートでの高分解能全脳イメージングのために排他的に確保することができる。図２８Ａから図２８Ｄを参照すると、補正済み画像データと未補正画像データとの比較は、適応機能イメージングによって、顕微鏡適応なしでは解明できない複数の脳領域における単細胞分解能が回復され、単一ニューロン活動追跡の忠実度において更に実質的な改善が提供されることを示している。例えば、１時間のイメージング後、画像品質は依然として中脳領域において比較可能なものであるが、前脳領域の未補正画像は実質的な劣化に苦しんでいる（図２８Ｄ）。２０時間の低速度撮影実験の中間点では、前脳及び中脳の両方の大きいセクションにおける画像品質は、適応顕微鏡状態補正なしでは実質的に劣化する。
【０２５４】
構造化ライトシートの実施形態
基準面［ＰＬ０，ＰＬ１，・・・ＰＬＫ−１］で取られた画像の測定１５２は、画像内のデータの固有周波数内容とは無関係に自動焦点のロバストネスを保証するために画像内に組み込まれる工学的高周波成分を含むことができる。
【０２５５】
構造化ライトシートを使用すると、均一なテクスチャレスマーカ分布を含む、広範囲のマーカ戦略全体にわたってロバストネスが改善される。具体的には、高周波レーザ強度変調によって作成された構造化ライトシートによってライトシートジオメトリと焦点がマッピングされる。このモードでは、画像データの（先験的に既知の）固有周波数内容とは無関係に自動焦点のロバストネスを保証するために、工学的高周波成分が画像に組み込まれる。これに反して、主要画像データ取得は従来の均一ライトシートによって実行される。ロバストネスの強化に加えて、焦点局所化のための構造化ライトシートの使用は試料１１のエネルギ荷重を更に低減するものである。
【０２５６】
これらの実施形態では、手順１４００は構造化ライトシートを作成することも含む。このようにして、測定される（１４１０）ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性は、構造化ライトシートによるサンプルのイメージングに関する１つ以上の特性を含む。構造化ライトシートは、形成されたライトシート１２、１４の特性をある周波数で変調することによって作成することができる。変調周波数は、ライトシートイメージングの実行に関連する光学的伝達関数に基づいて決定される。
【０２５７】
この変調は、像平面内の空間位置の関数としてその周波数でライトシートの強度を変調することによって実行することができる。
【０２５８】
結論
適応システム１６０は、時空的適応ライブイメージングのためのライトシート顕微鏡フレームワークを提供する。このフレームワークは、生体試料において遭遇される動的光学条件に対して連続的にかつ自動的に適応することにより実質的に空間分解能を改善できる「スマート」ライトシート顕微鏡を効果的にもたらすものである。このフレームワークは、多種多様なモデルシステム、蛍光マーカ戦略、及びイメージング検定のためのロバストな性能を提供する。本書で提示されているデータを補完して、適応システム１６０は、３通りのタイプのライトシート顕微鏡１１０上に配備される。従って、適応システム１６０を使用するという手法によって実現される高レベルの自動化により、非熟練者によるライトシート顕微鏡の使用が単純化され、挑戦的な生物試料について作業するか又は複雑なイメージングワークフローを実行する場合でも、イメージング経験が限られているユーザが一貫して最適なデータ品質を得ることができる。
【０２５９】
適応システム１６０の基礎をなす概念は、その他のタイプのライトシート顕微鏡に適用できる設計原理に従うものである。適応システム１６０は、特定のモードの蛍光励起に抑制されず、従って、２光子イメージング、ベッセルビーム、及び格子ライトシートに適用可能である。概念的に、適応システム１６０は、任意の数の照明及び検出アームを備えた顕微鏡設計に一般化され、必要であれば、追加の自由度を容易に操作することができる。
【０２６０】
また、時空的適応イメージングのための適応システム１６０は、大きい生体試料におけるライトシートベースの適応光学部品のための基礎も築くものである。適応システム１６０を使用して得られるライトシートと検出焦点面との間の空間的オーバーラップの最適化は、このための重要な前提条件である。従って、適応システム１６０は、顕微鏡の照明及び検出アーム内の波面センサ、空間光変調器、及び変形可能ミラーを操作するように更に拡張することができ、それにより、補完的な光学補正を可能にすることになるであろう。
【０２６１】
適応システム１６０によって達成される高分解能及びシステム自動化は更に、大きい生物試料の高分解能ライブイメージングのためのハイスループット検定に対して門戸を開放するものである。多細胞生物の高分解能インビボデータを必要とする本質的にすべての調査を利することに加えて、適応システム１６０は、自動ドラッグスクリーン、突然変異体スクリーン、並びに様々な生物学的モデルシステムにおける解剖学的及び発達上のアトラスの構築のためのライトシート顕微鏡の使用を可能にすることができる。
【０２６２】
自動時空的適応システム１６０は、手動適応システムと比較した時に適応のための時間を低減する。その上、自動時空的適応システム１６０は、多数のパラメータが制御されるので、顕微鏡システム１００内で機能するのに手動適応システムより適している。更に、試料１１の光学的性質はライブイメージング中に変化し、その変化が発生する速度は急速すぎて手動調整できないので、自動時空的適応システム１６０は手動システムよりライブイメージング時に実行するのに適している。関心のある生物学的プロセスの発現（例えば、初期発生事象をイメージングする場合）又は試料１１の劣化の発現（例えば、敏感な臓器外植片をイメージングする場合）の前に限られた時間しか使用可能ではないことを考慮すると、実験の開始時でも手動手法は現実的なオプションではない場合が多い。低速度撮影イメージング中に生体試料１１における時空的変化を連続的に手動監視し、それに対して光学顕微鏡１１０を適応させることは実際的に実行可能ではない。従って、大きいか又は複雑な生体試料１１において空間分解能を系統的に最適化するには、自動時空的適応イメージングが可能な顕微鏡システム１００が必要である。
【０２６３】
自動時空的適応システム１６０は、遺伝的にコード化された蛍光マーカの時空的動力学に自動的に適応し、生物における大規模な形態形成変化中にイメージング性能をロバストに最適化する。自動時空的適応システム１６０によって実現される高レベルの顕微鏡自動化は更に、非熟練ユーザがライトシート顕微鏡をフル活用して、最適品質の画像データを生成できるようにする。自動時空的適応システム１６０は本明細書では光学顕微鏡１１０の特定の設計に関連して示されているが、その他のライトシート顕微鏡設計に容易に適応できる一般的なシステムである。その上、自動時空的適応システム１６０は、非適応ライトシート顕微鏡では解明できない、多くの解剖学的領域内の細胞及び亜細胞の特徴を回復する。自動時空的適応システム１６０を使用して、発達中のゼブラフィッシュ（学名：Danio rerio）及びキイロショウジョウバエ幼胚全体の長期適応イメージングが実証され、幼生ゼブラフィッシュにおける適応全脳機能イメージングが実行される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2019525216.tif 000092
【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ−Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ−Ｅ】
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【図２５】
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【図２６Ａ−Ｅ】
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【図２７Ａ−Ｂ−Ｆ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｇ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月28日(2019.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライトシートイメージングを使用してサンプルをイメージングすることであって、前記ライトシートイメージングが、光を発生することと、照射軸と平行なそれぞれの照射方向に沿って前記サンプル内の１つ以上の位置で前記光から１つ以上のライトシートを形成することと、前記１つ以上のライトシートと前記サンプルとの間の光学的相互作用により前記サンプルから検出方向に沿って放出された蛍光の画像を記録することであって前記検出方向が検出軸と平行であることと、を含むことと、
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することと、
前記１つ以上の測定された特性を分析することと、
前記１つ以上の測定された特性の前記分析に基づいて前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、前記ライトシートイメージング全体を通して並びに前記１つ以上の特性の前記測定中に生きたままである生体生物試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル内の１つ以上の位置で前記光から１つ以上のライトシートを形成することが、前記サンプル内の１つ以上の位置で前記光から２つのライトシートを形成することを含み、第１のライトシートが第１の照射方向に沿って延び、第２のライトシートが第２の照射方向に沿って延びる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の照射方向が前記第２の照射方向と逆平行である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ライトシートが、像平面に沿って前記サンプル内で空間的にかつ時間的にオーバーラップし、前記像平面内で前記サンプルと光学的に相互作用し、
蛍光の画像を記録することが、複数の検出焦点面のそれぞれで、前記２つのライトシートと前記サンプルとの間の前記光学的相互作用により前記サンプルから前記検出方向に沿って放出された前記蛍光の画像を記録することを含み、
前記ライトシート同士の間の前記時間的オーバーラップが、前記ライトシートイメージングの空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の測定された特性を分析することが、前記サンプルについて何らかの仮定を行わずに前記１つ以上の測定された特性を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルについて何らかの仮定を行わずに前記１つ以上の測定された特性を分析することが、前記サンプルの物理的性質、前記サンプルの光学的性質、並びに前記サンプル内の蛍光マーカの分布及び数について何らかの仮定を行わずに前記１つ以上の特性を分析することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、１つ以上の記録された画像の品質、前記サンプル内部の前記ライトシートの位置、及び前記サンプル内部の前記ライトシートの向きのうちの１つ以上を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記ライトシートと検出方向に沿った前記蛍光の画像が記録される検出焦点面との間の角度、前記ライトシートが前記サンプル内に形成される前記１つ以上の位置、及び前記ライトシートと前記検出焦点面との間の相対位置のうちの１つ以上を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記１つ以上のライトシート、前記サンプル、及び前記蛍光の画像が記録される焦点面のうちの１つ以上の特性を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、前記サンプルの前記ライトシートイメージングを実行するために前記蛍光の画像が記録されない時間において前記１つ以上の特性を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、
前記サンプルに対して１つ以上のライトシートを回転させることと
前記照射軸に対して垂直な方向に沿って１つ以上のライトシートを並進させること、
前記照射軸に対して平行な方向に沿って１つ以上のライトシートを並進させること、
前記照射軸に沿ってライトシートのウエストを並進させること、及び／又は、
前記蛍光の画像が記録される焦点面を前記検出軸に沿って並進させること、
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、
前記ライトシートによって照らされる前記サンプルの一部分の画像を形成することと、
前記形成された画像の品質を定量化することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
構造化ライトシートを作成することを更に含み、
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、前記構造化ライトシートによって前記サンプルのイメージングに関する１つ以上の特性を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記構造化ライトシートを作成することが、前記形成されたライトシートの特性をある周波数で変調することを含み、
前記変調周波数が、前記ライトシートイメージングの実行に関連する光学的伝達関数に基づいて決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記形成されたライトシートの前記特性を前記周波数で変調することが、前記像平面内の空間位置の関数として前記周波数で前記ライトシートの強度を変調することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性を測定することが、
前記ライトシートによって照らされる前記サンプルの一部分の画像を形成することであって、前記画像が前記サンプル内の蛍光マーカのセットから放射する光を含むことと、
複数の形成された画像内のそれぞれの形成された画像において前記特性を測定することであって、それぞれの形成された画像が、前記ライトシートによって照らされる前記サンプルの別個の一部分に対応することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ライトシートによって照らされる前記サンプル部分の前記画像を形成することが、前記ライトシートイメージングを実行するために蛍光の画像が記録される前記サンプル部分の前記画像を形成することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ライトシートイメージングに関連する１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記ライトシートと画像が記録される前記位置によって規定される焦点面との間の相対位置を調整することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライトシートを形成することが、走査方向及び前記照射方向によって規定される平面内に前記ライトシートを形成するために前記照射軸に対して垂直な前記走査方向に沿って前記光を走査することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ライトシートイメージングに関する前記１つ以上の特性を測定することが、
前記サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することと、
前記ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータを計数値のセットに変更することと、
前記選択された基準領域において前記セット内の前記動作パラメータのそれぞれの値について、
前記基準領域から放出された蛍光の画像を記録することと、
それぞれの記録された画像の品質を決定することと、
を含み、
前記１つ以上の測定された特性を分析することが、
前記選択された基準領域において動作パラメータ値の範囲内のどの動作パラメータ値が最高品質を備えた前記記録された画像を生成するかを観察することと、
この基準領域について前記動作パラメータに関する前記観察に関連する数量を記憶することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
記録された画像の前記品質を決定することが、前記記録された画像の前記品質を表す実数を生成するために前記記録された画像に画像品質メトリックを適用することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
パラメータ値の前記範囲が、前記少なくとも１つの動作パラメータの計数値の前記セットに基づくものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記記憶された品質に基づいて前記ライトシートイメージングに関連する前記１つ以上の動作パラメータを調整する方法を決定することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライトシートイメージングに関連する前記１つ以上の動作パラメータを調整する方法を決定することが、前記１つ以上の動作パラメータをどのように調整できるかを制限する１つ以上の制約にも基づくものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ライトシートイメージングに関する少なくとも１つの動作パラメータを計数値の前記セットに変更することが、前記ライトシートの平面及び／又は前記蛍光の画像が記録される焦点面のうちの１つ以上を変更することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することが、前記サンプルの複数の基準領域を選択することを含み、
前記ライトシートイメージングに関する前記少なくとも１つの動作パラメータを計数値の前記セットに変更することが、前記ライトシートイメージングに関する少なくとも第１の動作パラメータを調整することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ライトシートイメージングに関連する前記１つ以上の動作パラメータを調整することが、前記第１の動作パラメータとは別個の少なくとも第２の動作パラメータを調整することを含み、
前記方法が、前記複数の基準領域内のそれぞれの基準領域について前記動作パラメータに関する前記観察に関連する前記記憶された数量に基づいて前記第２の動作パラメータを調整する方法を決定することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の動作パラメータを調整することが、前記ライトシートと前記焦点面との間の角度を調整することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択された基準領域において動作パラメータ値の前記範囲内のどの動作パラメータ値が前記最高品質を備えた前記記録された画像を生成するかを観察することが、蛍光が検出されたどの焦点面が前記最高品質を備えた前記記録された画像を生成するかを観察することを含み、
前記観察に関連する前記数量を記憶することが、前記焦点面がｚ方向に沿って位置決めされる値と、ｘｙ平面内に規定される前記対応する基準領域からなるセットによって規定される３次元空間内の位置を記憶することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライトシートと前記焦点面との間の角度を調整する方法を決定することが、３次元空間内の前記記憶された位置のそれぞれを通過する可能性が最も高い平面を決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルの少なくとも１つの基準領域を選択することが、
検出焦点面からｚ方向にｚ基準位置のセットを選択することと、
前記セット内のそれぞれのｚ基準位置について、前記ｚ方向に対して垂直な前記ｘｙ平面内に規定される複数の基準領域を選択することであって、前記基準領域のそれぞれが他の基準領域とは別個のものであることと、
を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
サンプルに向かって照射方向に沿ってライトシートを生成して誘導するように配置された光源及び照明用光デバイスのセットと、１つ以上の照明用光デバイスに結合されたアクチュエータのセットと、を含む少なくとも１つの照明サブシステムと、
検出方向に沿って前記サンプルから放出された蛍光の画像を収集して記録するように配置されたカメラ及び検出用光デバイスのセットと、前記カメラ及び前記検出用光デバイスのうちの１つ以上に結合されたアクチュエータのセットと、を含む少なくとも１つの検出サブシステムと、
前記少なくとも１つの照明サブシステム及び前記少なくとも１つの検出サブシステムに接続された制御システムであって、
前記少なくとも１つの照明サブシステム及び前記少なくとも１つの検出サブシステムによりライトシートイメージングに関する１つ以上の特性の測定値を受信することと、
前記１つ以上の測定された特性を分析することと、
前記分析に基づいて前記少なくとも１つの照明サブシステム及び前記少なくとも１つの検出サブシステムの１つ以上のアクチュエータに制御信号を送信することと、
を実行するように構成される、制御システムと、
を含む、顕微鏡システム。
【請求項３４】
前記サンプルが、生体生物試料を含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの照明サブシステムが、２つの照明サブシステムを含み、それぞれの照明サブシステムがそれぞれの照射方向に沿って前記ライトシートを誘導するように配置され、前記照射方向が互いに逆平行であり、照射軸と平行である、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３６】
前記ライトシートが、像平面に沿って前記サンプル内で空間的にかつ時間的にオーバーラップし、前記像平面内で前記サンプルと光学的に相互作用し、
前記ライトシート同士の間の前記時間的オーバーラップが、前記顕微鏡システムの空間分解能限界に対応する分解能時間より小さいタイムシフトの範囲内である、請求項３５に記載の顕微鏡システム。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの検出サブシステムが２つの検出サブシステムを含み、それぞれが検出方向を規定し、前記検出方向が互いに逆平行であり、検出軸と平行である、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの照明サブシステムの前記アクチュエータが、
前記照射方向に関して横方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成されたアクチュエータと、
前記サンプル内のその位置に関して縦方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成されたアクチュエータと、
前記照射方向の周りのある角度内で前記ライトシートを回転させるように構成されたアクチュエータと、
前記照射方向に対して垂直な方向の周りのある角度内で前記ライトシートを回転させるように構成されたアクチュエータと、
を含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項３９】
前記照明サブシステムが、前記ライトシートを形成するために走査面に沿って光を走査するように構成された走査装置を含み、
前記走査面が、前記照明方向と前記ライトシートがその周りで回転される垂直方向とによって規定される、請求項３８に記載の顕微鏡システム。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの検出サブシステムが、
像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの画像を生成するように構成された対物レンズと、
前記像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像を検出するように構成された検出器と、を含み、
前記少なくとも１つの検出サブシステムの前記アクチュエータが、前記検出方向に沿って前記対物レンズを並進させ、それにより前記像平面を移動させるように構成されたアクチュエータを含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４１】
前記サンプルが、蛍光マーカのセットを含み、
前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像が、蛍光発光波長の光を放射する前記蛍光マーカのセットによって生成され、
前記蛍光発光波長が、前記ライトシートの波長とは別個のものである、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４２】
前記アクチュエータのうちの１つ以上が、圧電アクチュエータとガルバノメータスキャナのうちの１つ以上を含む、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４３】
前記制御システムが、前記記録された蛍光の画像を分析し、前記分析に基づいて前記サンプルの画像を作成するように構成される、請求項３３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４４】
前記ライトシートイメージングに関する１つ以上の特性の前記測定が、前記サンプルの前記画像を作成するために使用される蛍光の画像の記録間に発生する期間中に行われる、請求項４３に記載の顕微鏡システム。
【請求項４５】
前記１つ以上の受信した特性が、記録された蛍光の画像であり、
前記制御システムが、前記記録された画像に基づいて画像品質メトリックを発生することにより前記記録された画像を分析するように構成される、請求項４４に記載の顕微鏡システム。
【請求項４６】
指定の波長を有する光を生成するように構成された光源と、
照射軸と平行な照射方向に沿ってサンプル内のある位置でライトシートに前記光を形成するように構成された照明光学部品と、
前記照射軸に関して横方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成された第１のコントローラと、
前記サンプル内の前記位置に関して縦方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成された第２のコントローラと、
前記照射軸の周りの横揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された第３のコントローラと、
前記照射軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された第４のコントローラと、
を含む、顕微鏡。
【請求項４７】
前記光源が、レーザであり、
前記レーザによって生成される前記光が、ビームの断面を通るガウス型輪郭を有する前記ビームを含み、
前記ビームが、前記ビームの前記ガウス型輪郭が最小幅を有する前記照射軸に沿った位置にウエストを有し、
前記サンプル内の前記位置に関して前記縦方向オフセットの周りで前記ライトシートを並進させるように構成された前記第２のコントローラが、前記照射軸に沿って前記ビームの前記ウエストを移動させるように更に構成される、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項４８】
前記照射軸の周りの前記横揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された前記第３のコントローラが、二軸ガルバノメータスキャナを含む、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項４９】
前記照射軸に対して垂直な前記方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された前記第４のコントローラが、縦チルトミラー及び横チルトミラーを有する二軸旋回ガルバノメータスキャナを含み、
前記縦チルトミラーが、前記照射軸に対して第１の方向θｘに前記光を角変位させるように構成され、
前記横チルトミラーが、前記照射軸に対して第２の方向θｚに前記光を角変位させるように構成され、
前記第２の方向が、前記第１の方向に対して垂直であり、
前記偏揺れ角が、θｘとθｚの集合である、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項５０】
前記照射軸に対して垂直な前記方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させるように構成された前記第４のコントローラが、２つのリレーレンズを更に含み、
前記二軸旋回ガルバノメータスキャナが、前記レーザからの平行ビームが第１のリレーレンズによって垂直走査ミラー上に合焦され、第２のリレーレンズが、視準を復旧し、前記二軸ライトシートガルバノメータスキャナ上に前記ビームを誘導するように、前記２つのリレーレンズ間の焦点距離に位置決めされる、請求項４９に記載の顕微鏡。
【請求項５１】
検出軸と平行な検出方向に対して垂直な像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの画像を生成するように構成された対物レンズと、
前記像平面内で前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像を検出するように構成された検出器と、
前記検出軸に沿って前記対物レンズを並進させるように構成された第５のコントローラと、
を更に含む、請求項４６に記載の顕微鏡。
【請求項５２】
前記サンプルが、蛍光マーカのセットを含み、
前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの前記画像が、前記対物レンズ内に蛍光発光波長の光を放射する前記蛍光マーカのセットによって生成される、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項５３】
蛍光発光波長が前記指定の波長とは異なるものである、請求項５２に記載の顕微鏡。
【請求項５４】
前記画像の画像品質メトリックの最適化に応じて前記第１のコントローラ、前記第２のコントローラ、前記第３のコントローラ、前記第４のコントローラ、及び前記第５のコントローラのそれぞれを制御するように構成された適応制御メカニズムを更に含む、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項５５】
前記適応制御メカニズムが、前記画像品質メトリックの前記最適化の実行前にガウスカーネル機能によって前記画像についてたたみこみ操作を実行するように更に構成される、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５６】
前記画像品質メトリックが、前記画像のピクセルの強度のアフィン変換に対して不変である、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５７】
前記画像品質メトリックが、光学的帯域通過を通過できる空間周波数のみに依存する、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５８】
前記画像品質メトリックが、スペクトル画像品質メトリックを含む、請求項５４に記載の顕微鏡。
【請求項５９】
前記スペクトル画像品質メトリックが、正規化された離散コサイン変換（ＤＣＴ）シャノンエントロピメトリックを含む、請求項５８に記載の顕微鏡。
【請求項６０】
前記適応制御メカニズムが、前記画像品質メトリックの前記最適化を実行する際に、周波数原点にセンタリングされた辺２ｒｐの正方形の外部の空間周波数を抑制するように構成された低域フィルタを実行し、数量ｒｐ＝ｗ（Ｉ）／ｒ０が前記対物レンズの点広がり関数の半径であり、ｗが前記像平面内の正方形の画像Ｉの幅であり、ｒ０が前記顕微鏡の光学的伝達関数（ＯＴＦ）のサポート半径である、請求項５８に記載の顕微鏡。
【請求項６１】
前記第５のコントローラが、圧電性アクチュエータを含み、
前記圧電性アクチュエータが、前記検出軸に沿って前記対物レンズを移動させるように構成される、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項６２】
前記光源及び前記照明光学部品が、前記顕微鏡内の第２の照射方向に沿ってサンプル内の第２の位置で第２のライトシートに前記光を形成するように更に構成され、前記第２の照射方向が前記照射軸と平行であり、
前記顕微鏡が、
前記検出軸と平行な第２の検出方向に対して垂直な第２の像平面内で前記第２のライトシートによって照らされた前記サンプルの第２の画像を生成するように構成された第２の対物レンズと、
前記第２の像平面内で前記第２のライトシートによって照らされた前記サンプルの前記第２の画像を検出するように構成された第２の検出器と、
前記照射軸に関して第２の横方向オフセットの周りで前記第２のライトシートを並進させるように構成された第６のコントローラと、
前記サンプル内の前記第２の位置に関して第２の縦方向オフセットの周りで前記第２のライトシートを並進させるように構成された第７のコントローラと、
前記照射軸の周りの第２の横揺れ角内で前記第２のライトシートを回転させるように構成された第８のコントローラと、
前記照射軸に対して垂直な第２の方向の周りの第２の偏揺れ角内で前記第２のライトシートを回転させるように構成された第９のコントローラと、
前記検出軸に沿って前記第２の対物レンズを並進させるように構成された第１０のコントローラと、
を更に含む、請求項５１に記載の顕微鏡。
【請求項６３】
顕微鏡内で、指定の波長を有する光を発生することと、
前記顕微鏡の照射軸と平行な照射方向に沿ってサンプル内のある位置で前記光からライトシートを形成することと、
前記ライトシートによって照らされた前記サンプルの一部分の画像を形成することと、
前記形成された画像に基づいて画像メトリックを発生することと、
前記画像メトリックに基づいて、（ｉ）前記照射軸に対して横向きの方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉ）前記照射軸に沿った方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉｉ）前記照射軸の周りの横揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、及び、（ｉｖ）前記照射軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、により前記ライトシートを調整することと、
を含む、方法。
【請求項６４】
非一時的記憶媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトであって、前記コンピュータプログラムプロダクトが、電子デバイス上での前記コンピュータプログラムプロダクトの実行時に、前記電子デバイスにある方法を実行させるコードを含み、前記方法が、
顕微鏡の照射軸と平行な照射方向に沿ってライトシートによって照らされたサンプル内のある位置で前記顕微鏡内の前記サンプルの画像に基づいて画像メトリックを発生することと、
前記画像メトリックに基づいて、（ｉ）前記照射軸に対して横向きの方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉ）前記照射軸に沿った方向に前記ライトシートを並進させること、（ｉｉｉ）前記照射軸の周りの横揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、及び、（ｉｖ）前記照射軸に対して垂直な方向の周りの偏揺れ角内で前記ライトシートを回転させること、により前記ライトシートを調整することと、
を含む、コンピュータプログラムプロダクト。
【国際調査報告】
2019525216.tif 000119
2019525216.tif 000120