(57)【要約】  新規ホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の、肺がんの増殖および転移の治療のための医薬品としての用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺がんの増殖に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用。
【請求項２】
肺がんの転移に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用。
【請求項３】
肺がんの増殖および転移に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用。
【請求項４】
薬物が、経口で、注射によって、および噴霧の形態で投与されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＤＥ４阻害剤の使用、特にＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用に関する。それは腫瘍生物学の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
がんはヒトの死の主な原因であり、肺がんは、罹患率および死亡率の最も急速な増加を伴う悪性腫瘍であり、ヒトの健康および生命に対する最大の脅威である。世界的に、肺がんは男性において２番目に多いがんである。２０１２年には、世界で約１６０万人が肺がんにより死亡し、そのような症例の数は、３分の１以上を占めた。肺がんは、中国において、男性における最も高い発病率を有し、それらの８０％〜８５％が非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。肺がんに対する従来の治療法は、局所治療（手術、放射線療法などを含む）および全身治療（従来の化学療法、分子標的薬物療法などを含む）を含む。近代的な医学研究における大きな進歩、ならびに放射線療法、化学療法、および手術治療におけるいくらかの進歩が、肺がんに対して達成されているが、肺がんの全体的な予後は依然として不十分であり、その５年生存率は１５％未満である。したがって、肺がんを治療する新規の方法を探索することは、科学者によって解決されることが急務である課題となっている。
【０００３】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、細胞内セカンドメッセンジャーｃＡＭＰまたはｃＧＭＰを加水分解する機能を有し、セカンドメッセンジャー媒介シグナル伝達経路に影響を及ぼして細胞機能を調節する。ＰＤＥは１１のサブタイプを含み、そのうちのＰＤＥ４は、ｃＡＭＰを特異的に加水分解する。ＰＤＥ４は、マスト細胞、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞などを含む様々な炎症性細胞において主に発現する。ＰＤＥ４は、単球およびマクロファージの活性化、好中球の浸潤、血管平滑筋の増殖、血管拡張および心筋収縮などを促進することなど、関連する生理学的および病理学的プロセスに関与し、中枢神経機能、心臓血管機能、炎症／免疫系、細胞接着などに影響を及ぼす。研究は、ＰＤＥ４阻害剤（ＰＤＥ４ｉ）が抗炎症、抗アレルギーおよび抗血小板活性化の効果を有することを示している。その具体的なメカニズムは次のものを含む：１）様々な炎症性メディエーター／サイトカインの放出を阻害すること、およびＩＬ−４およびＩＬ−５遺伝子の発現を阻害すること；２）白血球の活性化（例えば、呼吸性バースト）を阻害すること、および白血球遊走を阻害すること；３）細胞接着因子（ＣＡＭ）の発現または上方制御を阻害すること；４）ＩＬ−６のような阻害活性を有するサイトカインの産生を誘導すること；５）アポトーシスを誘導すること；６）内在性ホルモンおよびカテコールアミンの放出を刺激すること。
【０００４】
現時点において、開発されてきたかまたは開発中のＰＤＥ４阻害剤は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、炎症性腸疾患、関節炎などを主な対象とする。しかしながら、多くの研究は、ＰＤＥ４阻害剤が悪性腫瘍に対する著しい阻害効果を有することを示している。Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｇｏｌｄｈｏｆｆは、ヒト神経膠芽腫Ｕ８７細胞をヌードマウスに異種移植し、ＰＤＥ４阻害剤を用いて、担腫瘍マウスの生存期間を延長させた。２００６年に、Ｍｏｔｏｓｈｉ  Ｎａｒｉｔａは、ＰＤＥ４ｉがヒトメラノーマ細胞の増殖を阻害できることを見出だした。Ｐｅｔｒｏｓ  Ｘ．  Ｅ．  Ｍｏｕｒａｔｉｄｉｓは、膵がん細胞に対するＰＤＥ４阻害剤ＣＣ−８０７５およびＣＣ−８０６２の添加後に、細胞増殖が減少し、細胞のアポトーシスが増加したことを見出だした。
【０００５】
既存のＰＤＥ４阻害剤は、ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラストなどを主に含む。ロリプラムおよびシロミラストは、めまい、頭痛および悪心、嘔吐および他の消化管の有害反応を起こす可能性があり、これらの薬物の適用は臨床診療において限られている。消化管における有害反応のあり得る原因の１つは、ＰＤＥ４阻害剤の不十分な特異性であり、それは全体的なＰＤＥファミリーを中程度かつ選択的に阻害する。例えば、シロミラストは、ＰＤＥ４を９２ｎＭのＫｉで阻害し、これはＰＤＥ１、２、３、および５に対するＫｉの５００〜１０００倍に過ぎない。したがって、高用量のシロミラストは、他のＰＤＥファミリーのメンバーと相互作用でき、副作用を引き起こし得る。実際、多くのＰＤＥ４阻害剤は、高用量において嘔吐という共通の副作用を有する。ロフルミラストは、肺炎症を軽減する効果、酸化ストレスに抵抗する効果、肺線維症を効果的に緩和する効果、粘膜クリアランスを向上させる効果、および気道を再構築する効果と共に、ＣＯＰＤの治療薬として米国ＦＤＡによって承認されているが、それは、下痢、体重減少、悪心、心房細動および悪化した精神病（不眠症、不安、うつ病など）などのような有害反応を引き起こしている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、肺がんの増殖および転移に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用を提供することである。
【０００７】
この目的を達成するために、本発明は、以下の技術的解決法を採用する。
【０００８】
肺がんの増殖に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用は本発明の保護の範囲内である。
【０００９】
本発明は、モデルとしてマウス肺がんＬＬＣを尾静脈注射によって注射したＣ５７ＢＬ６野生型マウスをおよびＡ５４９皮下腫瘍モデルを用いるＺＬ−ｎ−９１の病態生理学的効果を研究する。実験は、この阻害剤が、肺がん細胞の増殖を有意に阻害し、肺がんの増殖に対する薬物を調製する研究の基礎を築くことを確認した。
【００１０】
肺がんの転移に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用もまた本発明の保護の範囲内である。
【００１１】
本発明は、マウス肺がん細胞ＬＬＣおよびヒト肺がん細胞Ａ５４９を用いるＺＬ−ｎ−９１の生物学的効果を研究する。実験は、この阻害剤が、肺がん細胞の転移を有意に阻害し、肺がんの転移に対する薬物を調製する研究の基礎を築くことを確認した。
【００１２】
肺がんの増殖および転移に対する薬物の調製におけるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の使用もまた本発明の保護の範囲内である。
【００１３】
上述の使用に関し、好ましくは、薬物は経口で、注射によって、および噴霧の形態で投与される。
【００１４】
本発明のＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１は、次の式：
【００１５】
【化１】
2019504894.tif 000002
を有する。
【００１６】
本発明のＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１は、直接的に購入できるか、または自身で合成でき、例えば、Ｒｕｉｈｏｎｇ  Ｍａ、Ｂｉｎ−ｙａｎ  Ｙａｎｇ、Ｃｈａｎｇ−ｙｏｕ  Ｗｕ、「Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＤＥ４  （ＰＤＥ４）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｚｌ−ｎ−９１  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＩＬ−１７  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ．」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００８、８（１０）：１４０８−１４１７を参照にして合成および調製することができる。
【００１７】
本発明の化合物の効果を実証するために、肺がんの増殖および転移の治療におけるＰＤＥ阻害剤ＺＬ−ｎ−９１の役割は、インビボ生存曲線試験およびマウスのインビトロ試験ならびに試験結果と組み合わせて以下の実施形態においてさらに記載される。
【００１８】
本発明は次の有益な効果を達成できる。本発明のＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１は、肺がん細胞の増殖および転移を有意に阻害し、開発と適用の有望な見通しと共にこのＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１が抗肺がんの増殖および転移に対する研究の重要な対象となり、肺がんの増殖および転移に対する薬物の調製の基礎を提供することが予測されることを示す。ＰＤＥ４Ｄに対するＺＬ−ｎ−９１の強度は、他のＰＤＥファミリーのメンバーのものよりも５０００倍以上である。他のＰＤＥ４阻害剤と比較して、この化合物は、ＰＤＥ４Ｄに対する高い選択性を有する。それは高度に標的化され、少ない副作用をもたらし、嘔吐などの有害反応を効果的に軽減でき、また回避することさえもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後２４時間におけるマウス肺がん細胞ＬＬＣの増殖を示す図である。
【図２】左と右の図において、種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後２４時間および４８時間におけるヒト肺がん細胞Ａ５４９の増殖を示す図である。
【図３】種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後２４時間におけるマウス肺がん細胞ＬＬＣの移動を示す図である。
【図４】種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後３週間における、５×１０５のマウス肺がん細胞（ＬＬＣ）を接種したマウス由来の肺組織のＨＥ染色による病理学的切片を示す図である。図４Ａは正常群を示し、図４Ｂは溶媒群を示し、図４Ｃは高用量群を示し、図４Ｄは低用量群を示す。
【図５】種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後における、５×１０５のマウス肺がん細胞（ＬＬＣ）を接種したマウスの生存曲線を示す図である。
【図６】種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後における、ヒト肺がん細胞Ａ５４９の皮下異種移植片を有するマウスの腫瘍容積および腫瘍サイズの変化を示す図である。
【図７】種々の用量のＺＬ−ｎ−９１の投与後における、ヒト肺がん細胞Ａ５４９の皮下異種移植片を有するマウスの腫瘍重量の変化を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明は、以下の実施形態に基づいてよりよく理解できるであろう。しかしながら、実施形態に記載される内容は本発明の例示のためのみであり、特許請求の範囲に詳述される本発明を限定すべきでなくかつ限定しないことは当業者にとって容易に理解されよう。
【実施例】
【００２１】
実施例１：ＣＣＫ８法によって検出される、肺がん細胞の増殖に対するＺＬ−ｎ−９１の効果
１）対数増殖期の細胞（それぞれＡ５４９およびＬＬＣ）を取得して単一細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液を１００μｌ／ウェル（１×１０４細胞を含む）で９６ウェルプレートに播種し、それらを５つの群（ブランクコントロール群、ＤＭＳＯ群、１０μＭ群、５０μＭ群、１００μＭ群、２００μＭ群）に分割する。各々の群は６つの反復実験を含む。細胞を２４時間（３７℃、５％ＣＯ２において）、予めインキュベートする。
２）新鮮な培地を使用し、種々の濃度のＺＬ−ｎ−９１を各々の群に添加し、それぞれ２４時間および４８時間（３７℃、５％ＣＯ２において）細胞を培養することを継続する。
３）１００μｌの１０％ＣＣＫ−８溶液を各々のウェルに添加して気泡を防止する。
４）１〜２時間細胞をインキュベートすることを継続し、培養プレートをそれぞれ３０分、６０分、および９０分で取り出し、次いで、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００２２】
結果を図１および図２に示す。ＺＬ−ｎ−９１濃度が増加するにつれて、マウス肺がんＬＬＣおよびヒト肺がん細胞Ａ５４９の増殖が有意に減少した。
【００２３】
実施例２：マウス肺がん細胞（ＬＬＣ）の移動に対するＺＬ−ｎ−９１の効果
１）対数増殖期の細胞を取得して無血清ＤＭＥＭ培地による懸濁液を調製する。１００μｌの細胞懸濁液／ウェル（５×１０４細胞を含む）を上部のトランスウェルチャンバへと添加し、それらを３つの群（ブランクコントロール群、５０μＭ群、１００μＭ群）に分割する。各々の群は３つの反復実験を含む。細胞を種々の濃度の薬物で処理する。
２）１０％ＦＢＳを含む完全なＤＭＥＭ培地を１２ウェルプレートの下部チャンバに添加する。
３）２４時間後、上部チャンバを取り出し、固定のために３０分間氷冷メタノールに置き、次いで、それを室温で自然に乾燥させる。
４）６００μｌの０．１％クリスタルバイオレット溶液を１２ウェルプレートに添加して、チャンバの下部表面の細胞を１５分間染色する。
５）ＰＢＳを添加し、５分後にＰＢＳをピペッティングし、清潔な綿棒で上部チャンバの細胞をやさしく拭きとる。ＰＢＳで３回洗浄する。室温で自然に乾燥させる。
６）３００μｌの１０％酢酸溶液を１２ウェルプレートに添加し、チャンバの下部表面を１０分間浸漬して、細胞内のクリスタルバイオレットを溶解する。
７）１００μｌの溶液を９６ウェルプレートに添加し、マイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００２４】
結果（図３）は、薬物の濃度が１００μＭであったとき、ＺＬ−ｎ−９１がマウス肺がん細胞（ＬＬＣ）の移動を有意に阻害することを示した。
【００２５】
実施例３：肺がんを有するマウスに対するＺＬ−ｎ−９１の効果
１）５％ＣＯ２、３７℃、飽和湿度のインキュベーター内で肺がん細胞（ＬＬＣ）を培養する。対数増殖期で良好に増殖する細胞を回収し、それらを１×ＰＢＳで希釈し、濃度を１．６７×１０６／ｍｌに調整する。
２）０．３ｍｌの調製した細胞懸濁液を、１ｍｌ滅菌シリンジを用いて尾静脈を介して野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスに接種する。
３）マウスは、接種後３日目において薬物治療を受ける。
４）溶媒調製：生理食塩水中、４０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび６％ポリグリコールステアレート１５。
５）１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇのＺＬ−ｎ−９１を取得し、上述の溶媒に溶解し、ボルテックスによりよく混合し、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、および２０ｍｇ／ｋｇの３つの用量を調製する。
６）１００μｌの溶媒、および上述の３つの濃度の薬物のそれぞれを毎日胃内投与する。マウスの生存を観察および記録し、マウスの生存曲線を描く。
７）薬物の投与後３週間で数匹のマウスを犠牲にし、次いで、パラフィン包埋組織切片を用いた病理学的分析を実施する。
【００２６】
結果を図４に示す。悪性腫瘍細胞による肺葉の広範な浸潤は、コントロール群のマウスにおいて起きる。投与用量の増加と共に、マウスの腫瘍細胞凝集は緩和し、高用量マウスの腫瘍領域は、コントロール群のものと比べて優位に小さい。図５は、種々の用量のＺＬ−ｎ−９１を、肺がんを有するマウスへと与えた後に、薬物の用量の増加と共にマウスの生存期間が有意に延長することを示し、ＺＬ−ｎ−９１が肺がんを有するマウスの生存期間を有意に延長することを示す。
【００２７】
実施例４：皮下にＡ５４９細胞を移植したヌードマウスの処理
１）対数増殖期のＡ５４９細胞を取得し、無血清Ｆ−１２Ｋ培地による単一細胞懸濁液を調製し、１．５ｍｌのＥＰチューブ当たり１２０μｌのアリコート（２×１０６細胞を含む）を分注する。
２）０．１ｍｌの調製した細胞懸濁液を、１ｍｌ滅菌シリンジを用いてヌードマウスの皮下に接種する。
３）接種後３日目に薬物でマウスを処理する。
４）ヌードマウスを２つの群（溶媒コントロール群および投与群（１０ｍｇ／ｋｇ））に分割する。マウスは毎日投薬を受ける。週に２回、ヌードマウスの皮下の腫瘍容積を測定する。
５）マウスの腫瘍容積が１５００ｍｍ３に到達するとき、マウス腫瘍を摘出し、腫瘍のサイズを比較し、腫瘍の重量を記録する。
【００２８】
結果を図６および図７に示す。投薬の後、腫瘍容積および重量は、コントロール群の約１／３であり、ＺＬ−ｎ−９１がＡ５４９皮下異種移植片の増殖に対する有意な阻害効果を有することを示した。
【００２９】
上述の実験は、本発明において使用されるＰＤＥ４阻害剤ＺＬ−ｎ−９１ががん細胞の増殖を阻害するのみでなく、がん細胞の転移をも阻害し、良好な抗腫瘍効果を提供することを示す。
【図１】
2019504894.tif 000003
【図２】
2019504894.tif 000004
【図３】
2019504894.tif 000005
【図４】
2019504894.tif 000006
【図５】
2019504894.tif 000007
【図６】
2019504894.tif 000008
【図７】
2019504894.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月4日(2018.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＥ４阻害剤であるZL-n-91を含む、肺がんを治療することに用いるための医薬組成物。
【請求項２】
肺がんの増殖を阻害することに用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
肺がんの転移を阻害することに用いるための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
経口投与される、注射により投与される、または噴霧形態で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＰＤＥ４阻害剤であるZL-n-91が、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびポリグリコールステアレート１５を含む溶媒に溶解されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが、溶媒中で４０％の濃度を有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ポリグリコールステアレート１５が、溶媒中で６％の濃度を有する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＰＤＥ４阻害剤であるZL-n-91が、5 mg/kg、10 mg/kg、または20 mg/kgの濃度で対象に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
溶媒が、生理食塩水をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2019504894.tif 000010
2019504894.tif 000011