(57)【要約】  本発明は、ガルス・ガルス・ドメスティクス胚の特徴を卵内で非破壊的に特定するための方法であって、（ａ）胚を含む卵に関連する物質の試料を得ること、および（ｂ）胚の特徴を示す試料中の少なくとも第１のバイオマーカーの存在および濃度のスコア値を測定すること、および（ｃ）（ｂ）で得られたスコア値および濃度に閾値を適用し、バイオマーカーの存在および濃度に関連する胚の特徴を特定することを含み、少なくとも第１のバイオマーカーが、１４０から１９０ｇ／モルまでの範囲中の分子量を有するアミノ化合物を含み、ステップ（ｃ）が、（ｉ）類似性尺度を使用して、各相関シグナルのスペクトラムを、相関する参照バイオマーカーの予想スペクトラムとマッチングして、少なくとも１つの正相関シグナルを規定することにより、各関連バイオマーカーシグナルを、参照バイオマーカーと相関させること、（ｉｉ）各正相関シグナルの強度を測定し、その絶対および／または相対シグナル強度をスコア化すること、および（ｉｉｉ）類似性関数から得られたスコア値に閾値を適用して、相関する胚特徴を決定することをさらに含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガルス・ガルス・ドメスティクス胚の特徴を卵内で非破壊的に特定するための方法であって、
（ａ）前記胚を含む卵に関連する物質の試料を得ること、および
（ｂ）前記胚の特徴を示す前記試料中の少なくとも第１のバイオマーカーの存在および濃度のスコア値を測定すること、および
（ｂ）で得られた前記スコア値および前記濃度に閾値を適用し、前記バイオマーカーの存在および濃度に関連する前記胚の前記特徴を特定することを含み、
少なくとも第１のバイオマーカーが、１４０から１９０ｇ／モルまでの範囲中の分子量を有するアミノ化合物を含み、ステップ（ｃ）が、
（ｉ）類似性尺度を使用して、各相関シグナルのスペクトラムを、相関する参照バイオマーカーの予想スペクトラムとマッチングして、少なくとも１つの正相関シグナルを規定することにより、各関連バイオマーカーシグナルを、前記参照バイオマーカーと相関させること、
（ｉｉ）各正相関シグナルの強度を測定し、その絶対および／または相対シグナル強度をスコア化すること、および
（ｉｉｉ）類似性関数から得られた前記スコア値に閾値を適用して、相関する胚特徴を決定することをさらに含む方法。
【請求項２】
前記バイオマーカーの存在および濃度が、胚が雄成体へと発生する可能性が高いこと、または雌成体へと発生する可能性が高いことに相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマーカーが、これらに限定されないが、４−（メチルスルファニル）イソバリン（２−アミノ−２−メチル−４−（メチルスルファニル）ブタン酸としても知られている）、Ｎ−またはイソプロピルシステイン、３−（メチル−スルファニル）バリン、４−（メチルスルファニル）バリン、３−メチル−３−スルファニル−イソバリン、４−（メチルスルファニル）イソバリン、２−アミノ−３−メチル−４−メチルスルファニル−酪酸、５−（メチルスルファニル）ノルバリン、２−アミノ−３−メチル−３−スルファニルペンタン酸、メチル３−スルファニル−バリナート、メチルスルホニウムメチオニン、Ｎ−メチル−Ｄ−メチオニン、または５−アミノ−６−スルファニルヘキサン酸などを含む、アミノ酸２−アミノ−４−エチルスルファニルブタン酸またはその構造異性体から選択され；メチル２−アミノ−４−メチルスルファニル）ブタノアート（メチルメチオニナートとしても知られている）またはその構造異性体、例えば、エチルメチル−システイナート、イソプロピル−システイナート、Ｎ−プロピルシステイナート、または２−［（２−ヒドロキシエチル）スルファニル］−Ｎ−メチルプロパンアミドなどの関連化合物、エチルホモシステイナート、２−イソプロピル−１，２−チアゾリジン１，１−ジオキシド、１−アミノ−２，２−ジエトキシエタン−１−チオン、３−［（２−ヒドロキシエチル）スルファニル］−Ｎ−メチルプロパンアミド、プロピル２−アミノ−３−スルファニルプロパノアート、２−（メチルアミノ）−４−（メチルスルファニル）ブタン酸、２−［（２−アミノエチル）スルファニル］−２−メチルプロパン酸、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］−２−メチルプロパン酸、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸、４−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸、２−アミノ−３−（プロピルスルファニル）プロパン酸、２−アミノ−３−（プロパン−２−イルスルファニル）プロパン酸、および３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸などのアミノ酸エステルから選択され、ラセミ体またはエナンチオマーまたは立体異性体が好適な比および量に濃縮されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカーが、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
尿膜腔液中の３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸の濃度が、７、８、または９日目に５０ｎｇ／ｍｌ以上の量であることが、雌胚と相関し、前記バイオマーカーが５０ｎｇ／ｍｌ未満で存在することが、雄胚と相関する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも第１および第２のバイオマーカーが検出および分析され、前記少なくとも第１および第２のバイオマーカーの絶対量および相対量を使用して、１つまたは複数の特徴が決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
選択される特徴が、胚が十分に成長して孵化を達成する成育能または成育不能の可能性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
選択される特徴が、胚が孵卵条件下で孵化へと進行するのに必要である可能性が高い発生段階および時間の経過予想である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
磁気共鳴画像法、スペクトル共鳴法、１つまたは複数の好適な検出器と接続された分析クロマトグラフ法、蛍光分光法、および／または前記１つもしくは複数のバイオマーカーの存在および濃度を測定するためのバイオマーカー選択的試薬を含むアッセイ法の１つまたは複数を適用することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
質量分光分析が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳ、ＬＤＴＤ（レーザーダイオード熱脱離）イオン源、および／またはイオン移動度センサー（ＩＭＳ）を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験試料が、分析前に処理される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料処理が、固相抽出（ＳＰＥ）、ガスクロマトグラフィー、単相または多相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による試料分離を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
参照バイオマーカーの１つまたは複数の内部標準物質が、質量分析法による分析の前に、前記試料に添加される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記絶対シグナル強度が、前記バイオマーカーシグナル強度を測定し、それを１つまたは複数の既知内部標準物質のシグナル強度と比較することによりスコア化される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
多数の卵が、１つまたは複数の胚特徴について検査される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
完全に自動化されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
卵中の胚が成育可能であり雄であるかまたは成育可能で雌であるかまたは成育不能であるかを決定すること、ならびに多数の成育可能な雄卵と多数の成育可能な雌卵と１つまたは複数の成育不能な卵とを分離することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記胚が孵化する可能性が高いと考えられる時間により成育可能な卵を選別することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
特定の特徴を有するオビパリアン種の幼体を選択的に孵卵するためのプロセスであって、
ａ．前記種から多数の卵を準備すること、および
ｂ．前記卵を請求項１〜１８に記載の方法に供して、前記胚の特徴を決定すること、および
ｃ．所望の特徴を有する卵を選択して、選択された多数の卵を形成すること、および
ｄ．前記幼体の１つまたは複数が孵化するまで、前記選択された卵を孵卵することを含むプロセス。
【請求項２０】
オビパリアン種胚性別検出および分析システムであって、
（ａ）個々の卵から試料を採取するための試料採取システム、
（ｂ）各試料と関連する１つまたは複数のスペクトルを収集するための分析システム、
（ｃ）前記分析システムにより分析された１つまたは複数の試料に由来する１つまたは複数のバイオマーカーに関連するシグナルをプログラムに基づいて特定する性別、発生段階、および／または成育能識別機能であり、前記シグナルおよびスコア値を、前記試料データに関して収集された対照スペクトラムの保存されているライブラリーとおよび／または内部基準物質と比較して、前記胚特徴を特定する分析をさらに実施する識別機能、ならびに
（ｄ）前記１つまたは複数の胚特徴情報を、試料および／または分析した卵と結び付ける出力手段を有するシステム。
【請求項２１】
前記識別機能が、前記分析システムと接続されている電子デバイスのソフトウェアに実装されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
動物および／もしくはヒト食料生産のための、化粧用、医療用、および／もしくは栄養用化合物の生産および／もしくは単離のための、発酵によるメタン生産のための、ならびに／または高品質肥料生産のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセスから取得可能な多数の卵の使用。
【請求項２３】
オビパリアン種の胚の特徴を卵内で特定するための方法であって、
（ｄ）前記胚を含む卵に関連する物質の試料を質量分光分析に供し、滞留時間指標および対応する質量ならびに検出された各シグナルの質量を記録すること、
（ｅ）各シグナルに対応する質量を、前記種に特異的なバイオマーカー質量の参照データベースと相関させて、１つまたは複数のシグナルと１つまたは複数の参照バイオマーカーとの相関性を形成すること、
（ｆ）類似性尺度を使用して、各対応するシグナルの質量スペクトルを、対応する参照バイオマーカーの質量スペクトルとマッチングすることにより、各対応するシグナルと前記参照バイオマーカーとの相関性を確認して、少なくとも１つの正相関シグナルを規定すること、
（ｇ）各正相関シグナルの強度を測定し、その絶対および／または相対シグナル強度をスコア化すること、および
（ｈ）判別関数から得られた前記スコア値に閾値を適用して、前記相関するバイオマーカーの存在および濃度に関連する前記胚の特徴を決定することを含む方法。
【請求項２４】
前記類似性尺度が、滞留指標および前記正相関シグナルと関連する断片化パターンを相関させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、静的ナノエレクトロスプレー原理、フローインジェクション分析、または試料を濃縮したフローインジェクションを用いた直接注入により分析される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記質量分光分析が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試験試料が、質量分光分析前に処理される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料処理が、固相抽出（ＳＰＥ）、ＳＰＭＥ、ガスクロマトグラフィー、単相または多相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による試料分離を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
質量分光分析法が、タンデムおよび／またはサーベイモードで操作される、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
参照バイオマーカーの原子タグで標識された１つまたは複数の内部標準物質が、質量分析法による分析の前に、前記試料に添加される、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記絶対シグナル強度が、前記バイオマーカーシグナル強度を測定し、それを１つまたは複数の既知内部標準物質のシグナル強度と比較することによりスコア化される、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記特徴が、前記卵の前記胚の性別、年齢、発生段階、および／または成育能を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
多数の卵が、１つまたは複数の胚の特徴について検査される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
完全に自動化されている、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
オビパリアン種の胚の特徴に関連する１つまたは複数のバイオマーカーを卵内で特定するための方法であって、
（ｉ）性別が既知の種の多数の卵に由来する多数の試料を質量分析計で分析して、バイオマーカーパターンを確立するために多数の質量スペクトルを得ること、および
（ｉｉ）前記質量スペクトルにパターン認識を実施して、バイオマーカーパターンを得ること、および
（ｉｉｉ）前記バイオマーカーパターンに基づき、胚の少なくとも１つの特徴と関連するバイオマーカーおよびバイオマーカーレベルを決定することを含む方法。
【請求項３６】
（ｖ）卵流体または卵から発散される揮発性化合物の試料を得ること、および
（ｖｉ）少なくとも１つのバイオマーカーの存在について前記試料を分析すること、および
（ｖｉｉ）前記試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を決定すること
を含む請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料に由来する複数のバイオマーカーから少なくとも１つのバイオマーカーを特定すること、および前記少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を、既知の特徴を有する個体中の同じバイオマーカーの値と比較することを含み、前記少なくとも１つのバイオマーカーのより高いかまたはより低い濃度が、前記胚が雄であるかもしくは雌であるか、成育可能であるかもしくは成育不能であるか、および／または前記胚の発生段階を示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーのより高いかまたはより低い濃度が、選択結果を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのバイオマーカーの濃度が、対象が雄または雌である可能性が高いことを示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項４０】
請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法により、オビパリアン種の性別、年齢、および／または成育能を決定するために好適なバイオマーカーを卵内で決定するための方法であって、
ａ．既知の性別、年齢、および／または成育能を有する卵の代表的な群から、卵流体または卵揮発物の試料を得ること、
ｂ．前記試料を質量分光分析に供し、滞留時間指標および対応する質量ならびに検出された各シグナルの質量を記録すること、
ｃ．性別、年齢、および／または成育能に関連する濃度関係性を示す前記試料に由来する少なくとも１つまたは複数のバイオマーカーに関連するシグナルパターンを分離、分析、および特定すること、
ｄ．前記濃度、および任意選択で少なくとも１つのバイオマーカーの少なくとももう１つの他の特徴を所与の条件で決定すること、および
ｅ．前記濃度および任意選択のさらなる特徴と関連する所与の結果に特徴的な参照値を生成すること、および
ｆ．前記評価に基づき選択された結果の経過予想を決定することを含む方法。
【請求項４１】
（ｉ）類似性尺度を使用して、各相関シグナルの質量スペクトラムを、相関する参照バイオマーカーの質量スペクトラムとマッチングして、少なくとも１つの正相関シグナルを規定することにより、各関連バイオマーカーシグナルを、前記参照バイオマーカーと相関させること、
（ｉｉ）各正相関シグナルの強度を測定し、その絶対および／または相対シグナル強度をスコア化すること、および
（ｉｉｉ）前記判別関数から得られた前記スコア値に閾値を適用して、前記相関するバイオマーカーの存在および濃度に関連する前記胚の特徴を決定すること
をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記測定されたバイオマーカーパターンと関連するパターン認識情報をさらに決定および選別する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオマーカーパターン認識情報から１つまたは複数のバイオマーカーを特定することを含む、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記選択された結果の経過予想の決定が、胚が雄成体または雌成体へと成長する可能性が高いことを決定することを含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記選択された結果が、胚が十分に成長して孵化を達成する成育能または成育不能の可能性の経過予想である、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記選択された結果が、胚が孵卵条件下で孵化へと進行するのに必要である可能性が高い発生段階および時間の経過予想である、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記類似性尺度が、滞留指標および前記正相関シグナルと関連する断片化パターンを相関させることを含む、請求項４０〜４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料が、静的ナノエレクトロスプレー原理、フローインジェクション分析、または試料を濃縮したフローインジェクションを用いた直接注入により分析される、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記質量分光分析が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を含む、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試験試料が、質量分光分析前に処理される、請求項４０〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料処理が、固相抽出（ＳＰＥ）、ガスクロマトグラフィー、単相または多相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による試料分離を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
質量分析法が、タンデムおよび／またはサーベイモードで操作される、請求項４０〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記オビパリアン種が、ガルス・ガルス・ドメスティクスであり、性別決定に関連するバイオマーカーが、１４０から１９０ｇ／モルまでの範囲中の分子量を有するアミノ化合物を含む、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
特定の特徴を有するオビパリアン種の幼体を選択的に孵卵するためのプロセスであって、
ａ．前記種から多数の卵を準備すること、および
ｂ．前記卵を請求項１〜１８に記載の方法に供して、前記胚の特徴を決定すること、および
ｃ．所望の特徴を有する卵を選択して、選択された多数の卵を形成すること、および
ｄ．前記幼体の１つまたは複数が孵化するまで、前記卵を孵卵することを含むプロセス。
【請求項５５】
前記特徴識別機能が、分光システムと接続されている電子デバイスのソフトウェアに実装されている、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
オビパリアン胚の性別、成育能、および／または発生段階を卵内で特定するための方法であって、
ａ．排卵親の餌中の添加剤として使用することが許容される少なくとも１つのトレーサー前駆体化合物を含むトレーサー前駆体物質を含む餌製品を準備すること、および
ｂ．卵を好適な期間にわたって孵卵し、前記トレーサー前駆体化合物の代謝を可能にして、好適な量の少なくとも１つのトレーサー化合物を形成すること、および
ｃ．前記卵または前記卵に由来する試料を分析に供して、前記１つまたは複数のトレーサー化合物の存在および量を決定すること、および
ｄ．ステップ（ｃ）で得られたデータから、前記オビパリアン胚の性別、成育能、および／または発生段階を決定することを含む方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つのトレーサー前駆体化合物が、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および／または欧州委員会により許容可能な食品添加物として列挙されている化合物から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つのトレーサー前駆体化合物が、ＢＨＴおよび／またはＢＨＡから選択され、前記トレーサーが、ブチル化ヒドロキシトルエンを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記トレーサー前駆体物質が、前記製品中のトレーサー化合物または各トレーサー化合物が所定の濃度になるように計算された量で前記餌製品に添加される、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記トレーサー前駆体物質が、前記卵または卵試料中のトレーサー化合物または各トレーサー化合物が、５ｐｐｂ〜５ｐｐｍの範囲の、より好ましくは約１０〜１０００ｐｐｂの範囲の、より好ましくは５０〜５００ｐｐｂの濃度になるように計算された量で前記製品に添加される、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記トレーサー物質が、１つよりも多くのトレーサー化合物を含み、前記トレーサー化合物の相対量が、オビパリアン胚の、性別、成育能、および／または発生段階の特定可能な特徴を提供するように選択され、前記卵または卵試料の分析が、前記トレーサー化合物の特徴的な相対量を特定するために実施される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記分析が、固相マイクロ抽出、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、またはパルス炎光光度検出器もしくは質量分析計と接続されたガスクロマトグラフィーの組合せ、および／またはイオン移動度センサー、またはＳＭＰＥにより実施される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記試料に存在する前記トレーサー化合物の少なくとも１つが、分析の前に前記製品から分離され、誘導体化、または濃縮される、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記卵流体を侵襲的または非侵襲的に分析するステップを含む、請求項２３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記胚が、トリ胚、爬虫類胚、甲殻類胚、魚類胚、または軟体類胚である、請求項２３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記胚が、ガルス・ガルス・ドメスティクス種のトリ胚であるか、または前記胚が、クルマエビ科、ザリガニ上科、およびミナミザリガニ科、テナガエビ科、ザリガニ上科、ミナミザリガニ科、アカザエビ科、およびウミザリガニ科を含む群から選択される甲殻類種の胚であるか、または前記胚が、コイ、ティラピア、ナマズ、シーブリーム、シーバス、マグロ、サバ、カツオ、またはブリから選択される魚類種の胚である請求項２３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
試料に関する性別の可能性の評価が、管理下多変量分析、好ましくは、部分最小二乗判別分析、ＰＬＳ−ＤＡ、または直交性部分最小二乗判別分析法を前記データに適用することを含む、請求項２３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
外れ値が、集団から除外される、請求項２３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
卵が、多数の雄卵または雌卵に分離される、請求項２３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記胚の成育能を決定すること、および卵を１つまたは複数の、好ましくは多数の成育可能な卵および成育不能な卵に分離することをさらに含む、請求項２３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
外れ値が前記集団から除外され、卵中の胚が成育可能で雄であるか、または成育可能で雌であるかを決定すること、および多数の成育可能な雄卵と多数の成育可能な雌卵と外れ値とを分離して、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群を形成することをさらに含む、請求項２３〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記成育可能な雌卵または雄卵の選択群を、孵卵および孵化プロセスに供して、雌動物が圧倒的に多い集団または雄動物が圧倒的に多い集団を形成することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
動物および／もしくはヒトの食料生産のための、化粧用、医療用、および／もしくは栄養用化合物の生産および／もしくは単離のための、発酵によるメタン生産のための、ワクチン生産のための、ならびに／または高品質肥料生産のための、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法による取得可能な多数の卵の使用。
【請求項７４】
好適な量のトレーサー前駆体化合物を含む、排卵親動物に使用される餌製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オビパリアン（ｏｖｉｐａｒｉａｎ）種、特にトリ種、より詳細にはガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ  Ｇａｌｌｕｓ）種の性別を卵内で非破壊決定するためのプロセスに関する。本プロセスは、雄卵および雌卵を選択すること、およびそれら選択した卵を使用して生動物の群を生産することに関する。
【０００２】
卵生（ｏｖｉｐａｒｏｕｓ）動物は卵を産み、母親内での他の胚発生は、ほとんどまたはまったくない。オビパリアン動物およびそれらの卵の養殖飼育は、世界的なタンパク質供給のかつてなく増え続ける部分、ならびにワクチンの生産などの種々の他の大規模工業プロセスをまかなっている。現在、オビパリアン動物の養殖飼育の最も重要なプロセスは、家禽などのトリ種の飼育、ならびに水産養殖、つまり魚類、甲殻類、および軟体類などの水生生物の養殖を含む。特に家禽、より詳しくは、つまりガルス・ガルス・ドメスティクス（Ｇａｌｌｕｓ  Ｇａｌｌｕｓ  Ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）種のセキショクヤケイは、世界で最も飼育されているオビパリアン種である。
【背景技術】
【０００３】
受精鶏卵は、ほぼ等しい配分の雄および雌動物をもたらす傾向がある。しかしながら、種々の理由により、孵卵場での管理では、種々の特性、特に性別に基づいて動物を分離することが望ましい場合がある。商業的家畜ニワトリおよび卵生産では、例えば、雄ヒナの孵卵および飼育は、非常に望ましくないものであり、毎年、何十億羽もの雄ヒナの間引きに結び付いている。
【０００４】
現在、いずれの場合でも、孵化したヒナの混合集団は、若年動物を、若年時に好適な形質がない場合は時にはさらに成体集団を視覚的に評価することによる雌雄鑑別にかけられる。いずれにしても、それは、非常に時間のかかるプロセスであり、高度に熟練した作業者を必要とし、典型的には、動物にとって非常にストレスがかかるものである。
【０００５】
またさらに、商業的卵生産では、雄ヒナの孵卵および飼育は、非常に望ましくないものであり、毎年、何十億羽もの雄ヒナの間引きに結び付いている。さらに、ある割合の卵は、未受精であるか、または孵卵期間の開始時に成育可能な胚を含まず、孵卵場での孵卵能力が大幅に低減される。
【０００６】
また、成体動物が雄雌鑑別される場合、集団全体を最低限の年齢まで飼育する必要があり、そのように飼育された動物の半分のみが、分離後に繁殖に使用される。例えば雄集団が存在すると、例えば共食いおよび飼育密度の低減による生産性低減がもたらされる場合があるというさらなる問題が生じる場合がある。
【０００７】
さらに、ある割合の卵は、未受精であるか、または孵卵期間の開始時に成育可能な胚を含まず、特に家禽卵の場合は孵卵場で使用される孵卵器の収容能力が大幅に低減される。
【０００８】
その結果、主に雄胚のみまたは雌胚のみの選択を可能にする初期性別選択が利用可能である場合に必要とされるものよりも少なくとも２倍の孵卵能力が必要とされる。
【０００９】
したがって、孵卵期前にトリ胚の性別決定を可能にし、また孵卵場収容能力の著しい増加を可能にする初期段階法が利用可能であれば、必要とされるエネルギーおよび他の資源の量が低減されるため環境にとって非常に有益であるだけでなく、同様に間引きされる不必要な動物をなくすために非常に有益であり、また新たに孵化した動物のストレスを低減するために非常に有益であろう。また、その方法が、未受精および／またはそうでなければ成育不能な胚から、成育可能な胚を選択することを可能にし、孵化プロセスの効率をさらに増加させることが可能であれば、さらに有益であろう。
【００１０】
文献には、卵のある代謝物質を検出することにより、例えば、ＮＭＲ分光法により、例えば、Ｙ．Ｆｅｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．（２００７年）、３２巻、２５７〜２６８頁；ＨＰＬＣ解析により、Ｇｕ  Ｄ．−Ｃら、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７巻、２３〜２５頁を参照）、および定量蛍光顕微鏡法を可能にするバイオマーカーと標的分子との特異的結合を使用することにより、例えば、マーカーとしてのエストロゲンステロイド化合物の存在を決定する場合は国際公開第２００６／１２４４５６号を参照することにより、トリ胚の性別を決定することに関する種々の方法が開示されている。なお、一般的には、ステロイドは、かなり大きな分子であり、容易に揮発（ｖｏｌａｔｉｚｅ）しない。
【００１１】
本明細書の上記で言及されているほとんどの方法の欠点は、大量の代謝物質が必要であり、試料を採取すると胚の生存および十分な発生が可能でなくなってしまう場合があるため、ニワトリ性別の非破壊決定を可能することができないことである。また、こうした方法は、商業的ニワトリ飼育に適切な処理量の提供は言うまでもなく、コストまたは複雑さのため、養鶏場では典型的には使用されない装置の使用を必要とする。
【００１２】
国際公開第２０１４／０２１７１５号には、卵中のトリ胚の性別、発生段階、および／または成育能を非破壊決定するためのプロセスであって、（ａ）卵中の糖および／またはアミノ酸、それらの前駆体および代謝物質から選択される少なくとも第１の発生マーカー化合物を、卵の孵卵の開始時から孵化までの期間に検出すること、（ｂ）少なくとも第１の検出された発生マーカー化合物の量を検出すること、および（ｃ）その量を、雄および雌の胚の発生段階、ならびに／または生胚および死亡胚もしくは非発生胚で確立された基線と比較して、胚が成育可能であるか否かを、雄もしくは雌であるかを、および／または胚の発生段階を決定することを含む方法が開示されている。この開示されている方法は、胚の性別、年齢、および発生段階の決定には非常に有用であるが、定量的測度方法の幾つかは感度が低いため、比較的より大量の試料が必要とされる。また、例えば、核共鳴法またはラマン分光法を含むスペクトル共鳴法を使用する自動化法の幾つかは、リアルタイム連続孵化プロセスで実施することが難しい。他の方法は、迅速ではあるが、比較的高価な装置の存在、および／または特定のバイオマーカー分子のための蛍光マーカーなどの特殊な化学薬品の使用を必要とする。
【００１３】
したがって、オビパリアン動物胚の性別ならびに発生段階および／または成育能を非破壊決定するための、より迅速でより高感度な方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２４４５６号
【特許文献２】国際公開第２０１４／０２１７１５号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｙ．Ｆｅｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．（２００７年）、３２巻、２５７〜２６８頁
【非特許文献２】Ｇｕ  Ｄ．−Ｃら、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７巻、２３〜２５頁
【発明の概要】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、ガルス・ガルス・ドメスティクス胚の特徴を卵内で非破壊的に特定するための方法であって、
（ａ）胚を含む卵に関連する物質の試料を得ること、および
（ｂ）胚の特徴を示す試料中の少なくとも第１のバイオマーカーの存在および濃度に関するスコア値を測定すること、および
（ｃ）（ｂ）で得られたスコア値および量に閾値を適用し、バイオマーカーの存在および濃度に関連する胚の特徴を特定することを含み、
少なくとも第１のバイオマーカーが、１４０から１９０ｇ／モルまでの範囲の分子量を有するアミノ化合物を含み、バイオマーカーの存在および濃度が、胚が雄成体または雌成体へと発育する可能性に相関する方法を提供することである。
【００１７】
さらなる目的は、孵卵場または水産養殖場などの遠隔地で、卵のリアルタイムオンライン分析を実施することが可能なシステムを提供することである。これらおよび他の目的は、本発明の装置およびプロセスにより取り組まれる。
【００１８】
さらなる態様では、主題のプロセスは、多数の成育可能な雌卵に関し、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群を形成する。またさらなる態様では、主題のプロセスは、本発明による方法によって得ることができる若年動物集団にも関する。またさらなる態様では、主題のプロセスは、動物および／もしくはヒト食料生産のための、化粧用、医療用、および／もしくは栄養用化合物の生産および／もしくは単離のための、発酵によるメタン生産のための、ワクチン生産のための、ならびに／または高品質肥料生産のための、本プロセスから得ることができる多数の卵の使用にも関する。
【００１９】
またさらなる態様では、主題のプロセスは、主題の方法を実施するための好ましくは完全に自動化された装置を含む、オビパリアン動物胚性別検出および分析システムにも関する。
【００２０】
また、本発明は、性別識別機能が、分光システムと接続されている電子デバイスのソフトウェアに実装されており、識別機能が、好ましくはコンピューターに内在するソフトウェア手段を含むシステムに関する。
【００２１】
ここでは、本発明の好ましい実施形態が示されている添付の図面を参照して、本発明をより完全に以下の通り説明する。しかしながら、本発明は、多数の異なる形態で使用することができ、本明細書に示されている実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろそうした実施形態は、本開示が十分および完全となり、本発明の範囲を当業者に十分に伝達することになるように提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａは、単一特徴に関するロジスティク回帰分類モデルであり、単一特徴は、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸の濃度であり、性別予想の正確性は、９０％よりも高いことを示す図である。図１Ｂは、２つの特徴に関するロジスティク回帰であり、ロジスティク回帰モデルを２つのバイオマーカーに適用すると、１０日目から正確性を＞９５％に増加させることができることを示す図である。
【図２】連続試験自動化ハイスループット試験における、本発明によるバイオマーカーのＬＤＰＤスペクトルを示す図である。本方法は、個々の試料１つ当たり１０秒未満で、バイオマーカーの存在を測定するだけでなく、絶対濃度も測定することが可能である。
【図３】雄（暗灰色）および雌（明灰色）試料から８５０秒で抽出された、２２０から１４５までの範囲の種々の質量ピークを有する化合物のクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明を限定することは意図されていない。
【００２４】
「トリ」および「鳥」という用語は、本明細書で使用される場合、任意のトリ種の雄または雌を含むが、主に、卵または肉のために商業的に飼育される家禽を包含することが意図されている。したがって、「鳥」および「トリ」という用語は、特に、セキショクヤケイ、ハイイロヤケイ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ハト、ダチョウ、エミュー、およびキジを包含することが意図されている。
【００２５】
「孵卵」という用語は、鳥が卵を孵化させるプロセス、および雌鳥の管を出た後の卵内部での胚発生を指す。孵卵期間は、本明細書では、特定の卵を、孵化するまで、つまり鳥が出現するまで、鳥の発生が停止しない限り、任意の取り扱いまたは例えば孵卵器から孵卵場ユニットへの移動を含む、抱卵を模倣する条件に置いておく連続した期間を指す。
【００２６】
「卵内」という用語は、本明細書で使用される場合、孵化前の卵内部に含まれている胚を指す。本発明は、これらに限定されないが、（家畜化）ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、およびキジ卵を含む、任意のタイプの鳥で実施することができる。
【００２７】
本明細書では、「注入」および「注入する」という用語は、卵もしくは胚内に物質を送達もしくは放出するための方法、卵もしくは胚から物質（つまり試料）を取り出すための方法、および／または卵もしくは胚内に検出器デバイスを挿入するための方法を含む、卵もしくは胚内にデバイス（典型的には細長いデバイス）を挿入するための方法を包含する。
【００２８】
本明細書では、「質量分光分析法」という用語は、質量に基づいてイオンを選別する分析技法を指す。質量分光分析法は、典型的には、多数の状況下で化学分析に使用されており、石油の複雑な混合物から遺伝子工学の産物まで、任意の試料に適用することができる。簡単に言えば、質量スペクトルは、試料の正確な化学的組成の全体像をもたらすことになる。
【００２９】
本出願は、第１の態様では、１４０から１９０ｇ／モルまでの、好ましくは１５０から１７０ｇ／モルまでの範囲の分子量を有する１つまたは複数のアミノ化合物の決定に関する。
【００３０】
本出願人らは、驚くべきことに、特定の代謝物質、エチオニンの構造異性体が、胚が雄または雌幼体のいずれに発生することになるかを示すことを見出した。好ましくは、バイオマーカー化合物は、式Ｒ３ＳＣＲ１ＨＣＲ２ＨＣＯＯＨ（Ｉ）またはその構造異性体であり、式中、好ましくは、Ｒ１は、ＣＨ３、Ｈ、ＮＨ２を表し、Ｒ２は、ＣＨ３、Ｈ、ＮＨ２を表し、Ｒ３は、−（ＣＨ２）２−ＮＨ２を表わす。より好ましくは、バイオマーカー化合物は、式Ｃ６Ｈ１３ＮＯ２Ｓである。より好ましくは、バイオマーカー化合物は、有利にはこれらに限定されないが、４−（メチルスルファニル）イソバリン、４−（メチルスルファニル）イソバリン（２−アミノ−２−メチル−４−（メチルスルファニル）ブタン酸としても知られている）、Ｎ−またはイソプロピルシステイン、３−（メチル−スルファニル）バリン、４−（メチルスルファニル）バリン、３−メチル−３−スルファニル−イソバリン、４−（メチルスルファニル）イソバリン、２−アミノ−３−メチル−４−メチルスルファニル−酪酸、５−（メチルスルファニル）ノルバリン、２−アミノ−３−メチル−３−スルファニルペンタン酸、メチル３−スルファニル−バリナート、メチルスルホニウムメチオニン、Ｎ−メチル−Ｄ−メチオニン、または５−アミノ−６−スルファニルヘキサン酸などを含む、２−アミノ−４−エチルスルファニルブタン酸（エチオニンとも呼ばれる）またはその構造異性体などのアミノ酸から選択され；メチル２−アミノ−４−メチルスルファニル）ブタノアート（メチルメチオニナートとしても知られている）またはその構造異性体、例えば、エチルメチル−システイナート、イソプロピル−システイナート、Ｎ−プロピルシステイナート、または２−［（２−ヒドロキシ−エチル）スルファニル］−Ｎ−メチルプロパンアミドなどの関連化合物、エチルホモシステイナート、２−イソプロピル−１，２−チアゾリジン１，１−ジオキシド、１−アミノ−２，２−ジエトキシエタン−１−チオン、
３−［（２−ヒドロキシエチル）スルファニル］−Ｎ−メチルプロパンアミド、プロピル２−アミノ−３−スルファニルプロパノアート、２−（メチルアミノ）−４−（メチルスルファニル）ブタン酸、２−［（２−アミノエチル）スルファニル］−２−メチルプロパン酸、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］−２−メチルプロパン酸、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸、４−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸、２−アミノ−３−（プロピルスルファニル）プロパン酸、２−アミノ−３−（プロパン−２−イルスルファニル）プロパン酸、および３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸などのアミノ酸エステルから選択することができる。化合物または異性体は、ラセミであってもよく、またはエナンチオマーもしくは立体異性体を好適な比および量で含んでいてもよい。
【００３１】
好ましくは、本化合物は、分子式Ｃ６Ｈ１３ＮＯ２Ｓおよび１６３．０６９０のモノアイソトピック質量ＭＷを有する。現在、本化合物は、以下の一般式Ｉによる構造を有する（３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸）と特定されていると考えられる。
【００３２】
【化１】
2019518213.tif 000002
【００３３】
本出願人らは、非タンパク新生アミノ酸であるとみなすことができる化合物（Ｉ）またはその構造異性体の、孵卵期間中の尿膜腔液中の濃度を使用して、卵中の胚の性別を非常に高い確実性で有利に決定することができることを見出した。さらなる利益として、このバイオマーカーは、抽出および／または揮発が比較的容易であり、したがって、例えばステロイド化合物と比較して比較的容易に分析することができる。
【００３４】
ステップ（ａ）は、胚を含む卵に関連する物質の試料を得ることを含む。
【００３５】
本発明の実施形態による方法および装置は、その孵卵期間とも呼ばれる胚発生期間中の任意の時点で卵の１つまたは複数の特徴を特定するために使用することができる。本発明の実施形態は、胚発生期間中の特定の日に限定されない。
【００３６】
本発明によるプロセスは、好ましくは、（ａ１）卵流体を含む試料を準備すること、および（ａ２）試料からスペクトラムを得ることを含む。任意選択のステップ（ａ３）では、好ましくは、限外ろ過または遠心分離などの好適な方法により、試料から濁りが除去される。上記に記載されているように、侵襲的な方法では、試料を直接的に採取し、試料採取した流体を分析に供することが可能であるが、好ましくは、本分析は、そのような分析方法が効率的であるため、ならびに卵殻およびその中の膜が無孔のままであるという事実のため、非侵襲的に実施される。任意の好適な方法を使用して、そのような非侵襲的分析を実施することができる。
【００３７】
非侵襲的方法が使用される場合、本明細書中の「流体」という用語は、卵殻を穿孔せずに卵から取り出すことができる揮発性化合物を指す場合がある。これは、任意選択で卵をわずかに減圧力下の検出チャンバーに設置することにより、および放出された揮発性化合物を好適な識別および定量方法に供することにより、有利に実施することができる。その場合、イオン移動度分光計（Ｉｏｎ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ，ＩＭＳ）を使用することを含む、上記で引用した質量分析（ＭＳ）法を適用してもよい。
【００３８】
分析が侵襲的に実施される場合、これは、典型的には、卵物質の試料を抽出すること含む。試料は、胚に対して最も有害ではない可能性が高いため、好ましくは胚流体から、トリ種の場合は好ましくは尿膜腔液から採取される。尿膜腔液は、典型的には、トリ胚の窒素含有代謝物質の排泄媒体である。
【００３９】
卵の貫通および卵物質の侵略的試料採取に好適な方法および装置は、例えば、米国特許出願公開第２００７０１３７５７７号、国際公開第００／２２９２１号、または国際公開第９９／３４６６７号に開示されている。その後、このように得られた試料は、好ましくは、発生マーカーの検出、ならびに存在する発生マーカーの相対量および／または絶対量の分析を可能にするための好適なプロトコールに供される。
【００４０】
尿膜腔液は、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，ＶおよびＨａｍｉｌｔｏｎ，ＨＬ（１９５１年）、「Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ、８８巻（１号）：４９〜９２頁に記載されているように、孵卵の３日目頃に生じ始める。この文献には、尿膜は、短い厚壁ポケットとして孵卵の６５時間後に識別可能であったが、まだ小胞にはなっていなかったことが示されている。７２時間後、尿膜は、平均して中脳の大きさの、大きさが様々な小胞だった。これは、尿膜および尿膜腔液が、３日目時点で存在することを示す。したがって、尿膜腔液を検査する場合、本方法は、３日目時点で適用することができる。
【００４１】
尿膜は、孵卵の約１３日目に最大容積に到達し、その後容積は、水分喪失および流体再吸収により孵卵が進行すると共に減少するが、かなり容積が孵卵の１８日目に依然として存在する。
【００４２】
尿膜腔液は、内殻膜および外殻膜ならびに漿尿膜により卵殻から分離されている。尿膜腔液は、有胚卵の周囲全体を取り囲んでいるが、典型的には、卵最上部の気室を覆う膜の真下に蓄積する。
【００４３】
卵の最上部に尿膜腔液が蓄積するのは、重力、ならびに高密度の胚および卵黄嚢による押出しによるものである。卵が直立している間に、卵の最上部から尿膜腔液の正確な試料採取を試みることは、空気空間が卵毎に様々であるため困難な場合がある。重力を使用して、局所部位の尿膜腔液をプールすることができる。卵をその縦軸で回転させると、尿膜腔液は、卵の最上部側の殻の真下にプールされることになるだろう。尿膜腔液は、卵をその縦軸に沿って配置することにより試料の抽出に有用となる。
【００４４】
尿膜腔液などの物質の卵からの抽出は、卵殻を貫通し、試料採取カニューレトラフを膜から挿入することを含む、種々の方法で実施することができる。その後、試料採取しようとする流体の試料を回収し、膜および／または殻を好適な封止材で能動的に密封するか、または自然に密封されることを可能にする。
【００４５】
上記で述べられているように、任意の好適な方法を使用して、非侵襲的分析を実施することができる。本発明の異なる好ましい実施形態では、本非侵襲的方法は、好適な分析装置と接続されている固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）を含んでいてもよい。ＳＭＰＥは、液相または気相であってもよい異なる種類の媒体から異なる種類の分析物（揮発物および非揮発物を両方とも含む）を抽出する、液体（ポリマー）または固形物（吸着剤）であってもよい抽出相でコーティングされているファイバーを使用することを含む固相抽出試料採取技法を指す。ファイバーにより抽出される分析物の量は、平衡に到達している限り、または短時間前平衡の場合には対流または撹拌の支援により、試料中のその濃度と均衡している。この技法は、好ましくは、揮発物を直接測定することができるようにＩＭＳと組み合わせてもよい。
【００４６】
幾つかの刊行物、例えば、米国特許出願公開第２０１１／１４４４７３号および米国特許第７９５０３４９号には、非侵襲的方法の使用が一般的に開示されているが、これら刊行物には、全体的な発光スペクトルが漠然と記載されているに過ぎず、実際には胚の性別を選択することは可能ではない。本プロセスは、特に、卵中の特定成分の存在が決定される点で、こうした開示されている方法とは異なり、この決定は、１つまたは複数の発生マーカー化合物の絶対量および相対量を選択的に求めることを可能にする二次微分スペクトルを使用することにより有利に実施することができる。
【００４７】
雄胚および雌胚を含む卵は、化学的組成が分子レベルで異なる。肉眼的レベルでは、胚は、大きさ、形状、および細胞形態も異なる。
【００４８】
本プロセスは、有利には、胚の性別を決定することを可能にする。好ましくは、決定は、好ましくは卵の孵卵開始後の６から１２日までの期間にステップａ）を実施するなど、孵卵の開始後の１から１５日まで、より好ましくは２から１４まで、さらにより好ましくは３から１３まで、およびさらにより好ましくは４から１２日までの期間に実施される。
【００４９】
これにより、成育可能でないかおよび／または所望の性別でないかのいずれかである卵の孵卵に伴うコストを回避することが可能になる。さらに、卵の実際の発生段階を決定することができる。家畜化ニワトリの孵卵時間よりも短いかまたは長い孵卵時間を有する種の場合、それに応じて好適に他の期間を適用することができる。
【００５０】
試料は、任意の目的の生物学的物質であってもよいが、生物学的組織および好ましくは血液または血漿などの生物学的流体であることが有利である。
【００５１】
ステップ（ｂ）は、胚の特徴を示す試料中の少なくとも第１のバイオマーカーの存在および濃度のスコア値を測定することを含む。
【００５２】
本発明の方法は、観察された質量シグナルと、既知のバイオマーカーの参照質量およびスペクトルとの相関性に依存する。参照データは、好ましくはコンピューターサーバーに保存されており、それにより、手順全体をコンピューター制御下で実施することが可能になる。シグナルは、例えば、本明細書に記載の計算機能を使用して比較することにより、参照標準物質と相関される。
【００５３】
好ましくは、シグナルは、類似性の閾値レベルが達成されるか否かにより「陽性」または「陰性」であると特徴付けられる。本プロセスでは、陰性であり、類似性の閾値レベルを達成しないシグナルは破棄されるが、陽性であり、バイオマーカーと一致するシグナルは、生物学的試料にそのバイオマーカーが存在するという診断をもたらす。
【００５４】
標準物質を用いた実施の場合、バイオマーカーシグナルのスコアは、試料中に存在するバイオマーカーのシグナルと、試料に添加された内部標準物質との比により算出することができる。複数のバイオマーカーを、同様に分析して、最終スコアファクターを得ることができる。
【００５５】
好ましくは、質量分光分析法による分析の前に、原子タグで標識された参照バイオマーカーの１つまたは複数の内部標準物質が、試料に添加される。これにより、バイオマーカーシグナル強度を測定し、それを１つまたは複数の既知内部標準物質のシグナル強度と比較することにより、絶対シグナル強度を決定およびスコア化することが可能になる。そのような標準物質を例えば同位体で標識すると、アッセイ読出しが、絶対的定量化の点で高度に正確ならびに有利になり得る。スクリーニングの較正手順に組み込むと、試料中の絶対的バイオマーカーレベルの測定が可能になるだろう。
【００５６】
本発明の方法は、好ましくは、内部標準物質を使用して、シグナル強度を定量化するための参照を提供する標準物質を使用する様式、およびそのような標準物質を用いない様式の、２つの様式で実施することができる。したがって、１つの実施形態では、質量分析法による分析の前に、１つまたは複数の内部標準物質が、試料に添加される。好ましくは、内部標準物質は、標識されている。有利には、その後、バイオマーカーシグナル強度を測定し、それを１つまたは複数の既知内部標準物質のシグナル強度と比較することにより、各バイオマーカーシグナルの絶対シグナル強度をスコア化することができる。代替的な実施では、試料は、内部標準物質を添加せずに処理される。そのような実施形態では、試料中の個々のバイオマーカーシグナル強度と、試料群の参照シグナル強度との比を測定することにより、相対シグナル強度がスコア化される。
【００５７】
好ましくは、選択される特徴は、孵化するために十分な成長を達成する胚の成育能または成育不能の可能性であってもよい。さらに好ましい選択される特徴は、胚が孵卵条件下で孵化へと進行するのに必要である可能性が高い発生段階および時間の経過予想である。好ましくは、本方法は、磁気共鳴画像法、スペクトル共鳴法、１つまたは複数の好適な検出器と接続された分析クロマトグラフ法、蛍光分光法、および／またはバイオマーカー選択的試薬を含むアッセイ法の１つまたは複数を適用することを含む。
【００５８】
１つまたは複数のバイオマーカーの識別および定量化は、任意の好適な方法により実施することができる。有利には、これは、核共鳴法を含む磁気共鳴画像法、ＵＶ／ＶＩＳ、赤外線、またはラマン分光法を含むスペクトル共鳴法、好適な検出器と接続されたＧＣまたはＨＰＬＣなどの分析方法、蛍光分光法、ディップスティック法の使用などの湿式および乾式法を含む酵素結合免疫吸着測定法、ならびに適切に準備された選択的アプタマーまたは同様の選択的試薬の使用により実施することができる。
【００５９】
典型的には、好ましくは、卵中に存在する発生マーカーの存在ならびに絶対量および／または相対量を決定するために二次スペクトルが使用される、赤外線またはラマン分光法を含む定量的スペクトル共鳴法も利用することができる。幾つかの刊行物、例えば、米国特許出願公開第２０１１／１４４４７３号および米国特許第７９５０３４９号には、非侵襲的方法の使用が開示されているが、これら刊行物には、全体的な発光スペクトルが漠然と記載されているに過ぎず、実際には胚の発生段階、成育能、および／または性別を選択することは可能ではない。本プロセスは、特に、卵中の特定成分の存在が決定される点で、このような開示されている方法とは異なり、この決定は、１つまたは複数の発生マーカー化合物の絶対量および相対量を選択的に求めることを可能にする二次微分スペクトルを使用することにより有利に実施することができる。特に、有利には、示差二次微分フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ）およびＦＴラマン分光法またはそれらの組合せを使用して、必要な正確性および再現性を達成することができ、好適には、核磁気共鳴法を使用して、発生マーカーの性質を決定し、システムを較正するための基線を確立することができる。本プロセスは、有利には、胚の成育能、および／または性別、および／または好ましくは卵の孵卵開始から孵化するまでの発生段階を決定することを可能にする。好ましい実施形態では、試料は、試料に存在するバイオマーカーを特定し、絶対量および相対量を定量化するスペクトルを検出および獲得するのに好適な任意の質量分析法により分析することができる。好ましくは、試料は、１試料当たり２０秒未満、より好ましくは１５秒未満でのリアルタイム分析を可能にする方法により分析することができる。
【００６０】
例としては、静的ナノエレクトロスプレー原理、フローインジェクション分析、または試料を濃縮したフローインジェクションを用いた直接注入が挙げられる。好ましくは、質量分光分析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法を含む。質量分析計は、好ましくは、タンデムおよび／またはサーベイモードで操作される。
【００６１】
有利には、試料は、質量分析の前に処理されていてもよい。試料処理は、固相抽出（ＳＰＥ）、ガスクロマトグラフィー、単相または多相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による試料分離を含む。
【００６２】
あるいは、バイオマーカー化合物を外部的に測定することができる場合、卵全体を非侵襲的に直接測定することによる直接非侵襲的分析を、例えば上記に示されているＩＭＳ技術を使用して実施することができる。
【００６３】
バイオマーカーを質量分光分析特徴付けするための好ましい方法としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）およびエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が挙げられる。いずれも、有利には、飛行時間型（ＴＯＦ）または他のタイプの質量分析センサーと組み合わせて、バイオマーカーの質量および／または断片化パターンを決定することができる。好ましくは、質量分析法は、クロマトグラフィー技法および本明細書中の他の分離技法とタンデムで使用することができる。ＭＡＬＤＩは、試料をレーザーでパルスすることにより作用する。この処理により、試料が、気化およびイオン化される。その後、荷電イオンの分子量（質量）が、ＴＯＦ分析機で決定される。このデバイスでは、電場により、荷電分子が検出器に向けて加速され、イオン化された断片が検出器に到達するまでにかかる時間の長さ、つまり飛行時間の差により、バイオマーカーの分子量が明らかになる。この場合、より小さな分子がより速く検出器に到達する。この方法では、試料の質量プロファイル、つまり混合物中の化合物の分子量および量のプロファイルが生成される。その後、こうしたプロファイルを使用して、バイオマーカーデータベースから既知のバイオマーカーを特定することができる。
【００６４】
ＥＳＩ−ＭＳが液体クロマトグラフィーと接続されている場合（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、ＬＣカラムから溶出する化合物が、質量分光分析計のイオン源内に導入される。細針に電圧が印加される。その後、針により液滴が質量分光分析機内に噴霧され、そこで液滴が気化され、バイオマーカーイオンが、断片化された様々な電荷状態に応じて放出され、それにより組成物を決定することができる。あるいは、ＳＰＥ（固相抽出法）またはガスクロマトグラフィーは、質量分光分析計と接続されていてもよい。
【００６５】
特に、ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｒａｐｉｄｆｉｒｅ  ＭＳ装置（Ｒａｐｉｄｆｉｒｅは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）、Ｐｈｙｔｒｏｎｉｃｓ  ＬＤＴＤ（レーザーダイオード熱脱離）イオン源（ＬＤＴＤは、Ｐｈｙｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）の使用など、本方法の自動化ハイスループット工業応用に有用であることが見出された。
【００６６】
電場におけるイオンの気相移動度に基づく、較正されたイオン移動度分光計（ＩＭＳ）を使用した装置がさらに有用であることが見出された。その場合、いわゆるイオン化チャンバー内部の部分放電ＵＶランプまたは６３Ｎｉ源により生成された物質のイオンは、それらがドリフト管を通る過程で分子量および／または幾何学的構造に応じて互いに分離される。その後、装置は、イオンがこの管をドリフトする特徴的な時間を測定し、超高感度で、１試料当たり数秒間で、物質の迅速な検出、特定、ならびに定量化を可能にする。
【００６７】
好ましくは、質量分光分析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳ、ＬＤＴＤ（レーザーダイオード熱脱離）イオン源、および／またはイオン移動度センサー（ＩＭＳ）を含む。
【００６８】
質量分光分析計システムは、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ、またはレーザーダイオードイオン化脱離（ＬＤＩＤ）ＭＳである。特に、ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｒａｐｉｄｆｉｒｅ  ＭＳ装置（Ｒａｐｉｄｆｉｒｅは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）、Ｐｈｙｔｒｏｎｉｃｓ  ＬＤＴＤ（レーザーダイオード熱脱離）イオン源（ＬＤＴＤは、Ｐｈｙｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）の使用など、本方法の自動化ハイスループット工業応用に有用であることが見出された。
【００６９】
電場におけるイオンの気相移動度に基づく、較正されたイオン移動度分光計（ＩＭＳ）を使用した装置がさらに有用であることが見出された。その場合、いわゆるイオン化チャンバー内部の部分放電ＵＶランプまたは６３Ｎｉ源により生成された物質のイオンは、それらがドリフト管を通る過程で分子量および／または幾何学的構造に応じて互いに分離される。その後、装置は、イオンがこの管をドリフトする特徴的な時間を測定し、超高感度で、１試料当たり数秒間で、物質の迅速な検出、特定、および定量化を可能にする。
【００７０】
好ましくは、試験試料は、分析の前に処理されていてもよい。好ましくは、試料処理は、固相抽出（ＳＰＥ）、ガスクロマトグラフィー、単相または多相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による試料分離を含む。好ましくは、分析の前に、参照バイオマーカーの１つまたは複数の内部標準物質が、試料に添加される。好ましくは、バイオマーカーシグナル強度を測定し、それを１つまたは複数の既知内部標準物質のシグナル強度と比較することにより、絶対シグナル強度がスコア化される。好ましくは、本方法は、完全自動化される。
【００７１】
好ましくは、多数の卵が、１つまたは複数の胚特徴について検査される。
【００７２】
好ましくは、本方法は、卵中の胚が成育可能であり雄であるかまたは成育可能で雌であるかを決定すること、および多数の成育可能な雄卵と多数の成育可能な雌卵と１つまたは複数の成育不能な卵とを分離することをさらに含む。
【００７３】
好ましくは、本方法は、試料に由来する複数のバイオマーカーから少なくとも１つのバイオマーカーを特定すること、および上記少なくとも１つのバイオマーカーの濃度を、既知の特徴を有する個々のニワトリ胚中の同じバイオマーカーの値と比較することをさらに含み、１つまたは複数のバイオマーカーの閾値に対してより高いかまたはより低い濃度が、胚が雄であるかもしくは雌であるか、成育可能であるかもしくは成育不能であるか、および／または胚の発生段階を示す。
【００７４】
ステップ（ｃ）は、（ｂ）で得られたスコア値および量に閾値を適用し、バイオマーカーの存在および濃度に関連する胚の特徴を特定することを含む。好ましくは、ステップ（ｃ）は、（ｉ）類似性尺度を使用して、各相関シグナルのスペクトラムを、相関する参照バイオマーカーの予想スペクトラムとマッチングし、少なくとも１つの正相関シグナルを規定することにより、各関連バイオマーカーシグナルまたは識別特徴を、参照バイオマーカーと相関させること、（ｉｉ）各正相関シグナルの強度を測定し、その絶対および／または相対シグナル強度をスコア化すること、および（ｉｉｉ）類似性関数から得られたスコア値に閾値を適用して、相関するバイオマーカーの存在および濃度に関連する胚の特徴を決定することをさらに含む。
【００７５】
本出願人らは、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸が、７、８、または９日目に５０ｎｇ／ｍｌ以上の量で尿膜腔液に存在することが、雌胚と相関し、５０ｎｇ／ｍｌ未満で存在するこのバイオマーカーの存在が、雄胚と相関することを見出した。好ましくは、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸は、雄卵には、７、８日目に、または、０．１から４５ｎｇ／ｍｌまでの量で、より好ましくは１から４０ｎｇ／ｍｌまでの量で存在する。好ましくは、３−［（２−アミノエチル）スルファニル］ブタン酸は、雌卵には、７、８、または９日目に、５０．１から１５０ｎｇ／ｍｌまでの量で、より好ましくは５５から１４０ｎｇ／ｍｌまでの量で存在する。
【００７６】
この単一バイオマーカーは、所望の特徴に関してほとんど完全な確実性を既にもたらすことができるが、有利には、少なくとも第１および第２のバイオマーカー、またはさらにより多くのバイオマーカーを同時に検出および分析することができる。その後、少なくとも第１および第２のマーカーの絶対量および／または相対量を使用して、さらに増加した確実性で１つまたは複数の特徴を決定することができる。
【００７７】
また、本発明は、好ましくは、特定の特徴を有するオビパリアン種の幼体を選択的に孵卵するためのプロセスであって、その種に由来する多数の卵を準備すること、および卵を、本明細書で開示した方法に供して、胚の特徴を決定すること、および所望の特徴を有する卵を選択して、選択された多数の卵を形成すること、および１つまたは複数の幼体が孵化するまで、選択された卵を孵卵することを含むプロセスに関する。
【００７８】
また、本発明は、好ましくは、オビパリアン種胚性別検出および分析システムであって、
（ｉ）個々の卵から試料を採取するための試料採取システム、
（ｉｉ）スペクトルを収集するための分析システム、
（ｉｉｉ）分析システムにより分析された１つまたは複数の試料に由来する１つまたは複数のバイオマーカーに関連するシグナルをプログラムに基づいて特定する性別および／または成育能識別機能であり、シグナルを、試料データに関して収集された対照スペクトルの保存されているライブラリーとおよび／または内部基準物質と比較して胚特徴を特定することを含む分析をさらに実施する成育能識別機能、ならびに
（ｉｖ）１つまたは複数の胚特徴情報を、試料および／または分析した卵と結び付ける出力手段を含むシステムに関する。
【００７９】
好ましくは、識別機能は、分析システムと接続されている電子デバイスのソフトウェアに実装されている。
【００８０】
また、本発明は、動物および／もしくはヒト食料生産のための、化粧用、医療用、および／もしくは栄養用化合物の生産および／もしくは単離のための、発酵によるメタン生産のための、ならびに／または高品質肥料生産のための、本発明による方法から得ることができる多数の卵の使用に関する。
【００８１】
本明細書では、「尿膜腔液」という用語は、トリ卵に由来するような他の卵物質が存在するまたは存在しない尿膜腔液を包含する。例えば、尿膜腔液という用語は、血液および尿膜腔液の混合物を含む場合がある。本発明の実施形態は、尿膜腔液から、または卵の上部表面付近の領域から物質を抽出することに限定されない。本明細書に記載のように尿膜腔液から物質を取り出すことは、本発明の考え得る実施形態の１つの例として提供されているに過ぎない。これらに限定されないが、羊膜、卵黄、殻、卵白、組織、膜、および／または血液を含む種々の物質を卵から抽出し、アッセイし、分光光度分析に供して、下記に記載されているように胚の性別を特定することができる。
【００８２】
所望の場合、物質は、事実上任意の配向性を有する卵から抽出することができる。本明細書中の「所定の場所」という用語は、卵内部の一定の位置または深さを示す。例えば、デバイスを、卵の一定の深さおよび／または一定の位置へと卵に注入することができる。代替的な実施形態では、注入は、卵から得られる情報、例えば卵内部の胚または胚下腔の位置に関する情報に基づいて実施することができる。
【００８３】
本プロセスでは、発生マーカーは、好ましくは、侵襲的または非侵襲的に分析することができる。
【００８４】
好ましくは、決定は、例えば、好ましくは卵の孵卵開始後の６から１２日までの期間にステップａ）を実施するなど、孵卵開始後の１から１５日まで、より好ましくは２から１４まで、さらにより好ましくは３から１３まで、およびさらにより好ましくは４から１２日までの期間に実施される。さらに、卵の実際の発生段階を決定することができる。
【００８５】
好ましくは、本発明による胚特徴の決定は、非破壊方法として実施される。つまり、所望の場合、そのようにして試験した胚を成長させることができるか、または胚が成育可能である場合は、卵内ワクチン生産などのさらなるステップに供することができるか、または例えば肉生産のために雄卵のみを成長させて排他的に雄のニワトリ集団にすることができるが、またはそのようにして飼育したヒナを他の目的のために使用することができる。
【００８６】
「スペクトルを比較する」という用語は、有利には、測定したスペクトルの単変量または好ましくは多変量分析、およびトリ胚とある集団との関連性の決定を含んでいてもよい。このステップは、スペクトルデータの多変量統計分析により、あるシグナルピークがスペクトラムに存在することを決定することを含んでいてもよい。多変量統計分析プログラムは、好ましくは、主成分分析プログラムおよび／または部分最小二乗回帰分析プログラムを含む。したがって、主題の発明は、トリ胚の性別および／または成育能を卵内で決定するためのプロセス、装置、およびシステムであって、多変量統計分析プログラムならびにそれらを決定するためのマイクロプロセッサ実施プロセスを含む、プロセス、装置、およびシステムにも関する。好ましくは、ステップ（ｂ）は、任意の２つの試料間の濃度差による強度効果を正規化するステップをさらに含む。
【００８７】
したがって、比較は、好ましくは、測定されたスペクトルの多変量分析を使用して試料の性別の可能性を評価すること、およびトリ胚とある集団との関連性を決定することを含む。これは、有利には、部分最小二乗判別分析法（ＰＬＳ−ＤＡ）を使用して実施される。このプロセスは、好ましくは、トレーサー化合物データの数学的処理を含み、ＰＣＡ（主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ））などの多変量分析、好ましくはその後の教師付分析、より好ましくはＰＬＳ−ＤＡ（部分最小二乗判別分析）、またはさらにより好ましくは直交性ＰＬＳＤＡ、または類似の好適な統計手法を含む。主題のプロセスのパターンマッチングステップは、ある類似性尺度を特定することになる。その類似性尺度を使用して、バイオマーカーの正しい構造が確認される。この確認は、スペクトルマッチングによりなされる。スペクトルマッチングは、試料スペクトルおよびデータベース中の参照スペクトルを比較することにより実施される。この段階での陽性特定には、正確な決定を確認するために、好適な相関性が必要とされる。好適な閾値および類似性尺度は、当業者であれば明白であろう。このプロセスでは、大量のデータを扱いやすいサイズに低減すること、および観察されたデータ間の隠れた関係性を示す潜在的変数を決定するために、統計的に駆動されるモデルを適用することが試みられる。
【００８８】
その後、特徴識別機能は、試料データにフィルターをかけ、それにより試料間にわたって目的クラスターが特定されることになる。このクラスターは、試料間にわたる類似性を表わし、性別プロファイルを特定するために使用される。好ましくは、分析は、主成分分析（ＰＣＡ）およびＰＬＳ−ＤＡを含む。ＰＣＡでは、数学的なアルゴリズムを使用して、データセット内の差異および類似性が決定される。ＰＣＡでは、多数の関連する可能性のある変数が、プリンシプル（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）成分と呼ばれる少数の無関連変数に変換される。第１のプリンシプル成分は、データの多様性をできるだけ反映する。各追加成分は、データの残りの多様性をできるだけ反映することを試みる。収集したデータは行列に方形配置することができ、ＰＣＡは、平方和および外積により正方対称行列の「固有値」および「固有ベクトル」を解く。最大固有値に関連する固有ベクトルは、第１のプリンシプル成分と同じ方向を有する。２番目に大きな固有値に関連する固有ベクトルは、第２のプリンシプル成分の方向を決定する。固有値の合計は、正方行列のトレースと等しく、固有ベクトルの最大数は、この行列の行（または列）の数と等しい。決定後、算出した固有値のスクリーンプロットを図示することが可能である。当業者であれば、多数の異なるアルゴリズムを使用して、固有値および固有ベクトルを計算することができることを認識するだろう。データは、以下の２つのプロットを使用して表示される。ｉ）グループクラスタリングを示すスコアプロット、およびｉｉ）グループクラスタリングをもたらすスペクトルデータが、原点から最大距離にあるものとして特定されるローディングプロット。
【００８９】
本方法は、有利には、卵中の胚が成育可能で雄であるか、または成育可能で雌であるかを決定すること、および試験した卵を多数の成育可能な雌卵と多数の成育可能な雄卵と多数の成育不能な卵とに分離して、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群または成育不能な卵が圧倒的に多い選択群を形成することができる。所望の場合、成育可能な雌卵または雄卵の選択群を、孵卵および孵化プロセスに供して、雌動物が圧倒的に多い集団または雄動物が圧倒的に多い集団を形成することができる。
【００９０】
卵は、例えば、好ましくはウイルスまたはウイルス様物質を、生胚を含み、雄または雌であることが特定された各卵に注入することによるワクチン生産などの、種々の応用に使用することができる。その後、このように注入された卵を好適に孵卵した後、ワクチンまたはワクチン素材を、孵卵した卵から単離することができる。本発明のさらなる好ましい実施形態は、卵流体試料中の物質の存在を検出するための方法であって、一般的に０．１〜３５μｌの範囲の試料があれば十分であり得る方法である。
【００９１】
類似性尺度は、好ましくは、滞留指標および正相関シグナルと関連する断片化パターンを相関させることを含む。
【００９２】
さらに、統計的に有意な類似性は、関連バイオマーカー同一性または複数バイオマーカー同一性として検出および登録することができる。統計的に有意な類似性の決定は、データベース、ならびに本方法論の要求を満たすように開発されたアルゴリズムを使用することを含む。
【００９３】
これは、特に、新しい種のバイオマーカーの有用性を決定する場合、管理下（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）多変量分析、好ましくは部分最小二乗判別分析、ＰＬＳ−ＤＡ、または直交性部分最小二乗判別分析をデータに適用することを含む。
【００９４】
好ましくは、決定しようとする特徴は、卵中の胚の性別、年齢、発生段階、および／または成育能を含む。工業応用の場合、多数の卵が、１つまたは複数の胚特徴について検査される。
【００９５】
本方法は、好ましくは完全自動化され、それにより卵に関連する試料中のバイオマーカーの自動化された正確なアッセイが提供される。したがって、アッセイは、バイオマーカーを特定するために質量分析法に依存する。有利には、本方法では、試料中のある特定されたバイオマーカーに関連する電荷、質量、および断片化パターンの固有特性の各々に基づくデータセットの質量および同一性がフィルターにかけられ、スクリーニングされる。
【００９６】
有利には、トレーサー化合物データの分析を、性別が既知の試料のライブラリーと相関させることにより、性別の決定の選択性をさらに向上させることができる。本プロセスは、有利には、卵中の胚が成育可能で雄であるか、または成育可能で雌であるかを決定することをさらに含み、また、多数の成育可能な雌卵と多数の成育可能な雄卵とを分離して、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群を形成することができる。このようにして形成された成育可能な雌卵または雄卵の選択群を、孵卵および孵化プロセスに供して、雌ヒナが圧倒的に多い集団または雄ヒナが圧倒的に多い集団を形成することができる。
【００９７】
本発明による方法は、何百または何千個もの卵、および各卵から採取した試料中の何百または何千個ものバイオマーカーを同時に分析することを可能にする。本方法は、特徴と関連することが示されているバイオマーカーのデータベースであって、バイオマーカーの各々の質量およびスペクトルデータを含むデータベースに依存し、所与の試料中のバイオマーカーを好適なソフトウェアにより正確に特定することを可能にする。
【００９８】
加えて、ある種に関するデータベースは、試料に存在するバイオマーカーをスクリーニングし、化合物が質量検出器に到達する時間と相関する滞留時間指標に基づいて不要なシグナルを除去することにより確立することができる。したがって、多数の配列を数分で分析し、所与のバイオマーカーを、高い信頼性で特定することができる。したがって、本方法は、自動化可能でハイスループットであり、比較的未熟練の技術者により運用可能であり、したがって、遠隔地、例えば孵卵場、養鶏場、または養魚場での使用に好適である。
【００９９】
試料は、前分離手順を行わずに質量分析に供してもよい。そのような実施形態では、試料は、好ましくは、例えば静的ナノエレクトロスプレー原理、フローインジェクション分析、または試料を濃縮したフローインジェクションを用いた直接注入により分析される。
【０１００】
質量分析前に試料を処理して、好ましくは質量分析計に負荷する前に試料成分を分離することが有利である。例えば、試料処理は、単相または多相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または固相抽出（ＳＰＥ）による試料分離を含む。
【０１０１】
質量分光分析計システムは、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ、またはレーザーダイオードイオン化脱離（ＬＤＩＤ）ＭＳである。
【０１０２】
本発明による方法は、有利には、自動化され、コンピューター制御下で実施される。試料中のバイオマーカーの特定は、バイオマーカーの参照データと比較することにより行われ、好ましくは、複数のバイオマーカーの参照質量およびスペクトルデータはコンピューターに保存されている。規定のバイオマーカーの参照質量スペクトルは、好ましくは、下記に示されるようなクラスタリング計算により得られる実際の測定データから得られる平均スペクトルである。バイオマーカーは、客観的に測定され、性別、年齢、および成育能、または栄養ステータスなどの条件の指標として評価される特徴について関連するものを、単独で、他のマーカーと組み合わせて使用することができる。有用なバイオマーカーは、バイオマーカーの存在またはレベルと発生段階の存在を含む条件のある局面と間に相関性が存在する特定の状態または疾患と関連する任意の特定可能で測定可能な指標であってもよい。相関性は、定性的であってもよく、定量的であってもよく、または定性的および定量的の両方であってもよい。典型的には、バイオマーカーは、化合物、化合物断片、または化合物の群である。そのような化合物は、タンパク質およびペプチド、核酸、アミノ酸、糖、ならびに他の化合物を含む、生物中に見出されるか、または生物により産生される任意の化合物であってもよい。バイオマーカーは、「客観的に測定され、性別、年齢、および成育能、または栄養ステータスなどの条件の指標として評価される特徴」と記載することができる。有用なバイオマーカーは、バイオマーカーの存在またはレベルと、発生段階の存在を含む条件のある局面と間に相関性が存在する特定の状態または疾患と関連する任意の特定可能で測定可能な指標であってもよい。相関性は、定性的であってもよく、定量的であってもよく、または定性的および定量的の両方であってもよい。また、バイオマーカーは、排卵親に導入され、その後その発生中に胚により代謝され、トレーサー代謝物質をバイオマーカーとして排泄するトレーサー前駆体分子の代謝物質である化合物を含んでいてもよい。
【０１０３】
対照試料から収集した対照スペクトルのデータベースセットは、好ましくは、まず、所与のニワトリ品種の特定の性別の試料を選択することにより集積される。完全なライブラリーまたはデータベースは、両性別の試料を含むことが企図された。
【０１０４】
具体的には、分類は、紫外および可視範囲の両方の部分にわたって出現するスペクトル差異に基づく。現在、こうした差異の由来は分かっていないが、分子レベルでの内因性吸収差によるものである可能性がある。
【０１０５】
加えて、計算手段は、コンピューターに内在するソフトウェア手段を含む。
【０１０６】
当業者であれば、これらに限定されないが、尿膜腔液、卵黄、卵白、および卵殻などの他の卵部分およびそれらの成分を特徴付けるためのシステムおよび方法を含む、さらなる実施形態が企図され得ることを理解することができる。
【０１０７】
また、本発明は、本プロセスにより得ることができる卵選択群、および孵化後のヒナまたはヒナ集団に関する。
【０１０８】
また、本発明は、オビパリアン種、より一般的な用語では、これに限定されないが家禽、またはさらにより詳しくはガルス・ガルス・ドメスティクスの胚の性別、成育能、および／または発生段階を卵内決定するための方法、システム、および餌製品に関する。
【０１０９】
したがって、本発明は、オビパリアン種の胚の性別、成育能、および／または発生段階を卵内で決定するためのプロセスにも関する。本プロセスは、雄卵および雌卵を選択すること、およびそれら選択した卵を使用して生動物の群を生産することにさらに関する。卵生動物は卵を産み、母親内での他の胚発生は、ほとんどまたはまったくない。これは、ほとんどの魚類、両生類、爬虫類、すべての鳥類、ならびにほとんどの昆虫類、軟体類、およびクモ類の生殖方法である。オビパリアン動物およびそれらの卵の養殖飼育は、世界的なタンパク質供給のかつてなく増え続ける部分、ならびにワクチンの生産などの種々の他の大規模工業プロセスをまかなっている。現在、オビパリアン動物の養殖飼育の最も重要なプロセスは、家禽などのトリ種の飼育、ならびに水産養殖、つまり魚類、甲殻類、および軟体類などの水生生物の養殖を含む。
【０１１０】
また、本発明は、オビパリアン胚の性別、成育能、および／または発生段階を卵内で特定するための方法であって、ａ．排卵親の餌中の添加剤として使用することが許容される少なくとも１つのトレーサー前駆体化合物を含むトレーサー前駆体物質を含む餌製品を準備すること、およびｂ．卵を好適な期間にわたって孵卵し、トレーサー前駆体化合物の代謝を可能にして、好適な量の少なくとも１つのトレーサー化合物を形成すること、およびｃ．卵または卵に由来する試料を分析に供して、１つまたは複数のトレーサー化合物の存在および量を決定すること、およびｄ．ステップ（ｃ）で得られたデータから、オビパリアン胚の性別、成育能、および／または発生段階を決定することを含む方法に関する。
【０１１１】
ほとんどのオビパリアン種の受精卵は、ほぼ等しい配分の雄および雌動物をもたらす傾向がある。しかしながら、種々の理由により、孵卵場での管理では、種々の特性、特に性別に基づいて動物を分離することが望ましい場合がある。商業的家畜ニワトリおよび卵生産では、例えば、雄ヒナの孵卵および飼育は、非常に望ましくないものであり、毎年、何十億羽もの雄ヒナの間引きに結び付いている。エビおよび中型エビの生産では、卵の成熟を誘導するプロセスが必要であるため、排他的に雌の集団を作り上げることが望ましい。
【０１１２】
現在、いずれの場合でも、孵化した動物の混合集団は、若年動物を、若年時に好適な特徴がない場合は時にはさらに成体集団を視覚的に評価することによる雌雄鑑別にかけられる。いずれにしても、それは、非常に時間のかかるプロセスであり、高度に熟練した作業者を必要とし、典型的には、動物にとって非常にストレスがかかるものである。また、成体動物が雄雌鑑別される場合、集団全体を最低限の年齢まで飼育する必要があり、そのように飼育された動物の半分のみが、分離後に繁殖に使用される。例えば雄集団が存在すると、例えば共食いおよび飼育密度の低減による生産性低減がもたらされる場合があるというさらなる問題が生じる場合がある。これは、例えば淡水中型エビＭ．ロセンベルギイ（Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ）で報告されている。
【０１１３】
また、養魚業では、魚の性別または雄雌の決定は、圧倒的に雄が多い単一性の集団または圧倒的に雌が多い単一性の集団の飼育を可能にし、それにより、好ましくは全雄集団として養殖されるナイルティラピアで現在実施されているように、集団の成長および健康をより特異的に目指すことが可能になるだろう。この場合も、ほとんどの魚類では、後期若年または成体段階でしか、性別を目視検査により決定することができず、そのため「超雄」ハイブリッドを用いた複雑な繁殖パターンおよび特定の集団が確立されなければならない。「超雄」ハイブリッドは、遺伝障害の存在を増強し易い場合があり、また、遺伝的に非常に小さな集団蔓延に関連するある疾患に罹り易い場合がある。
【０１１４】
さらに、ある割合の卵は、未受精であるか、または孵卵期間の開始時に成育可能な胚を含まず、特に家禽卵用に孵卵場で使用される孵卵器の収容能力が大幅に低減される。
【０１１５】
その結果、主に雄胚または雌胚のみの選択を可能にする初期性別選択が利用可能である場合に必要とされるものよりも少なくとも２倍の孵卵能力が必要とされる。
【０１１６】
したがって、孵卵期前にトリ胚の性別決定を可能にし、また孵卵場収容能力の著しい増加を可能にする初期段階方法が利用可能であれば、必要なエネルギーおよび他の資源の量が低減されるため環境にとって非常に有益であるだけでなく、同様に間引きされる不必要な動物をなくすために非常に有益であり、ならびに新たに孵化した動物のストレスを低減するために非常に有益であろう。その方法が、未受精および／またはそうでなければ成育不能な胚から成育可能な胚を選択することを可能にし、孵化プロセスの効率をさらに増加させることも可能であれば、さらに有益であろう。
【０１１７】
魚またはエビの場合、種々の主にＰＣＲまたは抗体に基づく方法が公開されている。しかしながら、それらは、かなり高価で複雑である。
【０１１８】
したがって、オビパリアン動物胚の性別、発生段階、および／または成育能を卵内で非破壊決定するための、より迅速で適用がより容易な方法が依然として必要とされている。
【０１１９】
したがって、本発明のさらなる目的は、オビパリアン種の胚の特徴を卵内で特定するための方法であって、（ａ）胚を含む卵に関連する物質の試料を質量分析に供し、滞留時間指標および対応する質量ならびに検出された各シグナルの質量を記録すること、（ｂ）各シグナルに対応する質量を、その種に特異的なバイオマーカー質量の参照データベースと相関させて、１つまたは複数のシグナルと１つまたは複数の参照バイオマーカーとの相関性を形成すること、（ｃ）類似性尺度を使用して、各対応するシグナルの質量スペクトラムを、対応する参照バイオマーカーの質量スペクトラムとマッチングすることにより、各対応するシグナルと参照バイオマーカーとの相関性を確認して、少なくとも１つの正相関シグナルを規定すること、および（ｄ）各正相関シグナルの強度を測定し、その絶対または相対シグナル強度をスコア化すること、および（ｅ）判別関数から得られたスコア値に閾値を適用して、相関するバイオマーカーの存在および濃度に関連する胚の特徴を決定することを含む方法を提供することである。
【０１２０】
さらなる目的は、孵卵場で使用するためのそのような機器装備を提供することである。またさらなる目的は、孵卵場または水産養殖場などの遠隔地で、卵のリアルタイムオンライン分析を実施することが可能なシステムを提供することである。これらおよび他の目的は、本発明の装置およびプロセスにより取り組まれる。したがって、本発明は、オビパリアン種の胚の特徴に関連する１つまたは複数のバイオマーカーを卵内で特定するための方法であって、性別が既知の種の多数の卵に由来する多数の試料を質量分析計で分析して、バイオマーカーパターンを確立するために多数の質量スペクトルを得ること、および質量スペクトルにパターン認識を実施して、バイオマーカーパターンを得ること、およびバイオマーカーパターンに基づき、胚の少なくとも１つの特徴と関連するバイオマーカーおよびバイオマーカーレベル決定することを含む方法に関する。
【０１２１】
さらなる態様では、主題のプロセスは、多数の成育可能な雌卵にも関し、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群を形成する。またさらなる態様では、主題のプロセスは、本発明による方法により得ることができる若年動物集団にも関する。またさらなる態様では、主題のプロセスは、動物および／もしくはヒト食料生産のための、化粧用、医療用、および／もしくは栄養用化合物の生産および／もしくは単離のための、発酵によるメタン生産のための、ワクチン生産のための、ならびに／または高品質肥料生産のための、本プロセスから得ることができる多数の卵の使用にも関する。
【０１２２】
またさらなる態様では、主題のプロセスは、主題の方法を実施するための好ましくは完全に自動化された装置を含む、オビパリアン動物胚性別検出および分析システムにも関する。
【０１２３】
またさらなる態様では、本発明は、オビパリアン胚の性別、成育能、および／または発生段階を卵内で特定するための方法であって、（ａ）排卵親の餌中の添加剤として使用することが許容される少なくとも１つのトレーサー前駆体化合物を含むトレーサー前駆体物質を含む餌製品を準備すること、および（ｂ）卵を好適な期間にわたって孵卵し、トレーサー前駆体化合物の代謝を可能にして、好適な量の少なくとも１つのトレーサー化合物を形成すること、および（ｃ）卵または卵に由来する試料を分析に供して、一以上のトレーサー化合物の存在および量を決定すること、および（ｄ）ステップ（ｃ）で得られたデータから、オビパリアン胚の性別、成育能、および／または発生段階を決定することを含む方法に関する。
【０１２４】
さらなる態様では、本発明は、胚の性別、成育能、および／または発生段階を決定するための餌製品、ならびに動物餌中のトレーサー前駆体化合物の使用にも関する。
【０１２５】
また、本発明は、性別識別機能が、分光システムと接続されている電子デバイスのソフトウェアに実装されており、好ましくは識別機能が、コンピューターに内在するソフトウェア手段を含むシステムに関する。
【０１２６】
図１には、Ａ）単一特徴に関するロジスティク回帰分類モデルが示されている。測定した特徴すべてについて単一予測因子モデルを評価したところ、特徴１５９９を使用した場合に最良の正確性が観察された。この場合、９日目から＞９０％の正確性がもたらされた。Ｂ）２つの特徴に関するロジスティク回帰分析。測定した特徴のすべての考え得る対について、ロジスティク回帰モデルを評価した。測定のロバスト性を検証した後、特徴１５９９および５０７の組合せにより、最良の性能が達成された。これは、１０日目から＞９５％の正確性をもたらした。
【０１２７】
したがって、本方法は、性別などの特性の相対的決定に関する。これは、さらなる特徴を追加することにより、および例えば外れ値または曖昧な特徴を有する卵を除外することにより著しく増加し、それにより正確性を著しく増加させることができる。
【０１２８】
図３には、雄（暗灰色）および雌（明灰色）試料から８５０秒で抽出された、２２０から１４５までの範囲の種々の質量ピークを有する化合物のクロマトグラムが示されている。
【０１２９】
別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明を説明するために本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載するためのものであり、本発明を限定することは意図されていない。多数のオビパリアン種が商業的に飼育されている。
【０１３０】
「水産養殖」は、管理された条件下で淡水および海水集団を養殖することを含み、野生の魚および他の海洋動物の水揚げである商業的漁業と対比させることができる。
【０１３１】
本明細書での「魚類」種は、指を有する四肢を欠如し、えらを有する水生脊椎動物をすべて含む。海洋魚または塩水魚（ｓｗｅａｔ  ｗａｔｅｒ  ｆｉｓｈ）に関わらず、現在生息しているメクラウナギ、ヤツメウナギ、ならびに軟骨および硬骨魚類種がこの定義に含まれる。商業的に養殖される重要な魚種または科としては、以下のものが挙げられる：コイ、真ミノー（ｔｒｕｅ  ｍｉｎｎｏｗ）、およびそれらの近縁種、例えばバーブ（ｂａｒｂ）、バーベル（ｂａｒｂｅｌ）、およびナマズ、およびパンガシウス科（Ｐａｎｇａｓｉｉｄａｅ）、ソウギョ、コイ（ｃｏｍｍｏｎ  ｃａｒｐ）、コクレン（Ｂｉｇｈｅａｄ  ｃａｒｐ）、ハクレン（Ｓｉｌｖｅｒ  ｃａｒｐ）、カトラ（Ｃａｔｌａ）、およびフナ（Ｃｒｕｃｉａｎ  Ｃａｒｐ）などのコイ科（Ｃｙｐｒｉｎｉｄａｅ）のメンバー；サケ、マス、イワナ、淡水ホワイトフィッシュ、およびカワヒメマスを含むサケ科（Ｓａｌｍｏｎｉｄａｅ）、例えば、タイセイヨウサケ、ブラウンマス（Ｓｅａ  ｔｒｏｕｔ）、およびニジマス；バラマンディ（ｂａｒｒａｍｕｎｄｉ）、またはアジアシーバス、ニホンシーバス、ヨーロッパシーバスなどのハタ科（Ｓｅｒｒａｎｉｄａｅ）；アカメ科（Ｌａｔｉｄａｅ）；シーブリーム（ｓｅａ  ｂｒｅａｍ）およびボーギ（ｐｏｒｇｙ）などのタイ科（Ｓｐａｒｉｄａｅ）；ナイルティラピアまたはモザンビークティラピアなどのカワスズメ科（Ｃｉｃｈｌｉｄａｅ）；ならびにタイセイヨウチョウザメまたはベルーガチョウザメなどのチョウザメ科（Ａｃｉｐｅｎｓｅｒｉｄａｅ）。
【０１３２】
本明細書では、「甲殻類」は、個別の雄雌を有し、性的に生殖する節足動物種の群を指し、カニ、ロブスター、ザリガニ、エビのようなよく知られている動物を含む。
【０１３３】
本明細書では「カニ」は、短尾下目の十脚類甲殻類である。
【０１３４】
本明細書では、「エビ」および／または「中型エビ」は、塩水または汽水水産養殖されるクルマエビ科（Ｐｅｎａｅｉｄａｅ）、好ましくはクルマエビ（Ｐｅｎａｅｕｓ）属の中型エビ、ウシエビ（ｇｉａｎｔ  ｔｉｇｅｒ  ｐｒａｗｎ）、Ｐ．モノドン（Ｐ．ｍｏｎｏｄｏｎ）、タイヘイヨウホワイトシュリンプ（Ｐａｃｉｆｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｓｈｒｉｍｐ）、バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ）、西洋ブルーシュリンプ（Ｐ．ｓｔｙｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）、チュウゴクホワイトシュリンプ（Ｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、クルマエビ（Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、インドホワイトシュリンプ（Ｐ．ｉｎｄｉｃｕｓ）、バナナエビ（Ｐ．ｍｅｒｇｕｉｅｎｓｉｓ）、およびコエビ族（Ｃａｒｉｄｅａ）または根鰓亜目（Ｄｅｎｄｒｏｂｒａｎｃｈｉａｔａ）科の他のメンバー；ならびに例えば、オニテナガエビ（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ  ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ）、Ｍ．ニッポニーズ（Ｍ．ｎｉｐｐｏｎｅｎｓｅ）およびＭ．マルコルムソニイ（Ｍ．ｍａｌｃｏｌｍｓｏｎｉｉ）などの淡水水産養殖される甲殻類；アメリカザリガニ（Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓ  ｃｌａｒｋｉｉ）などのザリガニ上科（Ａｓｔａｃｏｉｄｅａ）およびミナミザリガニ科（Ｐａｒａｓｔａｃｏｉｄｅａ）の属に由来するザリガニ；ならびにイセエビ科（Ｐａｌｉｎｕｒｉｄａｅ）に由来するイセエビだけでなく、アカザエビ科（Ｎｅｐｈｒｏｐｉｄａｅ）およびウミザリガニ科（Ｈｏｍａｒｉｄａｅ）に由来する養殖可能なロブスター種などの任意の種類の養殖可能な甲殻類を指す。
【０１３５】
本明細書では、「軟体類」は、個別の雄雌を有し、受精が外部的である、イカ、コウイカ、およびタコなどの頭足類軟体類；多板綱（ｐｏｌｙｐｌａｃｏｐｈｏｒａ）、堀足類（ｓｃａｐｈｏｐｏｄ）、およびツノガイ（ｔｕｓｋ  ｓｈｅｌｌ）などの二枚貝を含む、軟体動物目として知られている無脊髄動物の大きな門を指す。
【０１３６】
「トリ」および「鳥」という用語は、本明細書で使用される場合、任意のトリ種の雄または雌を含むが、主に、卵または肉のために商業的に飼育される家禽を包含することが意図されている。したがって、「鳥」および「トリ」という用語は、特に、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ハト、ダチョウ、エミュー、およびキジを包含することが意図されている。
【０１３７】
本明細書では、「孵卵」という用語は、鳥などのオビパリアン動物が卵を孵化させるプロセス、および成体の管を出た後の卵内での胚発生を指す。本明細書では、「孵卵期間」は、特定の卵を、孵化するまで、つまり、幼体が出現するまで、動物の発生が停止しない限り、任意の取り扱いまたは例えば孵卵器から孵卵場ユニットへの移動を含む、抱卵を模倣する条件にかけておく連続した期間を指す。
【０１３８】
「卵内」という用語は、本明細書で使用される場合、孵化前の卵内に含まれている胚を指す。本発明は、これらに限定されないが、（家畜化）ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、およびキジ卵、コイ、サケ科、またはティラピア卵などの魚、エビまたは中型エビ卵、および軟体類卵を含む、任意のタイプの鳥類、魚類、軟体類、爬虫類、または甲殻類卵で実施することができる。
【０１３９】
本明細書では、「注入」および「注入する」という用語は、卵もしくは胚内に物質を送達または放出するための方法、卵もしくは胚から物質（つまり試料）を取り出すための方法、および／または卵もしくは胚内に検出器デバイスを挿入するための方法を含む、卵もしくは胚内にデバイス（典型的には細長いデバイス）を挿入するための方法を包含する。
【０１４０】
本明細書では、「質量分光分析法」という用語は、質量に基づいてイオンを選別する分析技法を指す。質量分光分析法は、典型的には、多数の状況下で化学分析に使用され、石油の複雑な混合物から遺伝子工学の産物まで、任意の試料に適用することができる。簡単に言えば、質量スペクトルは、試料の正確な化学的組成の全体像をもたらすことになる。
【０１４１】
質量スペクトラムは、質量対電荷比の関数としてのイオンシグナルのプロットである。こうしたスペクトルは、試料の元素または同位体識別特徴、粒子および分子の質量を決定するために、ならびに分子の化学構造を解明するために使用される。質量分光分析法では、化学化合物をイオン化して、荷電分子または分子断片を生成し、それらの質量対電荷比が測定される。
【０１４２】
典型的なＭＳ手順では、固体、液体、または気体であってもよい試料を、例えば電子で衝撃を加えることによりイオン化する。これにより、一部の分子が破壊されて荷電断片になる。その後、典型的には、こうしたイオンを加速させ、それらを電場または磁場に曝すことにより、こうしたイオンをそれらの質量対電荷比に応じて分離する。同じ質量対電荷比のイオンは、同じ量の偏向を起こすことになる。
【０１４３】
イオンは、電子増倍管などの、荷電粒子を検出することが可能な好適な機構により検出される。結果は、質量対電荷比の関数としての、検出イオンの相対存在量のスペクトルとして表示される。既知の質量を、特定された質量と相関させることにより、または特徴的な断片化パターンにより、試料中の原子または分子を特定することができる。本状況では、質量分析法を適用して、好適なバイオマーカーを特定および検出する。質量分析法（ＭＳ）は、分子の固有特性である質量を非常に高い感度で測定するため、価値のある分析技法である。したがって、ＭＳは、広範なバイオマーカー分子および広範な試料採取した物質を測定するために使用することができる。ＭＳシグナル生成およびスペクトル分解能および感度には、正しい試料調製が重要であることが知られている。したがって、試料調製は、分析の全体的な実現可能性および感度の重要な領域である。
【０１４４】
バイオマーカーを質量分析特徴付けするための好ましい方法としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）およびエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が挙げられる。いずれも、有利には、飛行時間型（ＴＯＦ）または他のタイプの質量分析センサーと組み合わせて、バイオマーカーの質量および／または断片化パターンを決定することができる。好ましくは、質量分析法は、クロマトグラフィー技法および本明細書中の他の分離技法とタンデムで使用することができる。
【０１４５】
ＭＡＬＤＩは、試料をレーザーでパルスすることにより作用する。この処理により、試料が気化およびイオン化される。その後、荷電イオンの分子量（質量）が、ＴＯＦ分析機で決定される。このデバイスでは、電場により、荷電分子が検出器に向けて加速され、イオン化された断片が検出器に到達するまでにかかる時間の長さ、つまり飛行時間の差により、バイオマーカーの分子量が明らかになる。この場合、より小さな分子がより速く検出器に到達する。
【０１４６】
この方法では、試料の質量プロファイル、つまり混合物中の化合物の分子量および量のプロファイルが生成される。その後、こうしたプロファイルを使用して、バイオマーカーデータベースから既知のバイオマーカーを特定することができる。
【０１４７】
ＥＳＩ−ＭＳが液体クロマトグラフィーと接続されている場合（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、ＬＣカラムから溶出する化合物が、質量分析計のイオン源内に導入される。細針に電圧が印加される。その後、針により液滴が質量分析機内に噴霧され、そこで液滴が気化され、バイオマーカーイオンが、断片化された様々な電荷状態に応じて放出され、それにより組成物を決定することができる。あるいは、ＳＰＥ（固相抽出法）またはガスクロマトグラフィーを、質量分析計と接続してもよい。特に、ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｒａｐｉｄｆｉｒｅ  ＭＳ装置（Ｒａｐｉｄｆｉｒｅは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）、またはレーザーダイオードもしくは熱イオン脱離ＬＤＩＤ装置の使用など、本方法の自動化ハイスループット工業応用に有用であることが見出された。
【０１４８】
タンデム型質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）は、標的ガスと衝突させることにより前駆イオンを活性化することを含み、荷電および中性断片を生成することができる。断片イオンの性質ならびにそれらの強度は、前駆イオンの構造を示すことが多く、したがって、未知分析物を特定するための有用な情報をもたらし、ならびに異なるクラスの分析物の有用なスクリーニング技法を提供することができる。複数の衝突による活性化は、活性化時間を延長し、かつより大きなエネルギーが前駆イオンに付与されることを可能にする。また、より高い衝突ガス圧力は、より高い衝突緩和速度を意味する。
【０１４９】
好ましくは、本発明による胚特徴の決定は、非破壊方法として実施される。つまり、所望の場合、そのようにして試験した胚を成長させることができるか、または胚が成育可能である場合は、卵内ワクチン生産などのさらなるステップに供することができる。
【０１５０】
本明細書では、「尿膜腔液」という用語は、トリ卵に由来するような他の卵物質が存在するまたは存在しない尿膜腔液を包含する。例えば、尿膜腔液という用語は、血液および尿膜腔液の混合物を含んでいてもよい。本発明の実施形態は、尿膜腔液から、または卵の上部表面付近の領域から物質を抽出することに限定されない。本明細書に記載のように尿膜腔液から物質を取り出すことは、本発明の考え得る実施形態の１つの例として提供されているに過ぎない。これらに限定されないが、羊膜、卵黄、殻、卵白、組織、膜、および／または血液を含む種々の物質を卵から抽出し、アッセイし、分光光度分析に供して、下記に記載されているように胚の性別を特定することができる。
【０１５１】
所望の場合、物質は、事実上任意の配向性を有する卵から抽出することができる。本明細書では、「所定の場所」という用語は、卵内の一定の位置または深さを示す。例えば、デバイスは、卵の一定の深さおよび／または一定の位置へと卵に注入することができる。代替的な実施形態では、注入は、卵から得られる情報、例えば卵内部の胚または胚下腔の位置に関する情報に基づいて実施することができる。
【０１５２】
あるいは、特に、軟体類、魚、またはエビ卵の場合、そのような卵は、トリ卵と比較して高度に半透明であり、ならびに比較的小型であるため、卵全体の直接非侵襲的測定により直接非侵襲的分析することが可能な場合がある。
【０１５３】
「スペクトルを比較する」という用語は、有利には、測定したスペクトルの単変量または好ましくは多変量分析、およびトリ胚とある集団との関連性の決定を含んでいてもよい。このステップは、スペクトルデータの多変量統計分析により、あるシグナルピークがスペクトラムに存在することを決定することを含んでいてもよい。多変量統計分析プログラムは、好ましくは、主成分分析プログラムおよび／または部分最小二乗回帰分析プログラムを含む。したがって、主題の発明は、トリ胚の性別および／または成育能を卵内で決定するためのプロセス、装置、およびシステムであって、多変量統計分析プログラムならびにそれらを決定するためのマイクロプロセッサ実施プロセスを含む、プロセス、装置、およびシステムにも関する。
【０１５４】
したがって、比較は、好ましくは、測定されたスペクトルの多変量分析を使用して試料の性別の可能性を評価すること、およびトリ胚とある集団との関連性を決定することを含む。これは、部分最小二乗判別分析法（ＰＬＳ−ＤＡ）を使用して実施されることが有利である。
【０１５５】
このプロセスは、好ましくは、トレーサー化合物データの数学的処理を含み、ＰＣＡ（プリンシプル成分分析）などの多変量分析、好ましくはその後の管理下分析、より好ましくはＰＬＳ−ＤＡ（部分最小二乗判別分析）、またはさらにより好ましくは直交性ＰＬＳＤＡ、または類似の好適な統計手法を含む。
【０１５６】
主題のプロセスのパターンマッチングステップは、ある類似性尺度を特定することになる。その類似性尺度を使用して、バイオマーカーの正しい構造を確認する。この確認は、スペクトルマッチングによりなされる。スペクトルマッチングは、試料スペクトルおよびデータベース中の参照スペクトルを比較することにより実施される。この段階での陽性特定には、正確な決定を確認するために、好適な相関性が必要とされる。好適な閾値および類似性尺度は、当業者であれば明白であろう。
【０１５７】
このプロセスでは、大量のデータを扱いやすいサイズに低減し、観察されたデータ間の隠れた関係性を示す潜在的変数を決定するために、統計的に駆動されるモデルを適用することが試みられる。
【０１５８】
その後、性別識別機能は、試料データにフィルターをかけ、それにより試料間にわたって目的クラスターが特定されることになる。このクラスターは、試料間にわたる類似性を表わし、性別プロファイルを特定するために使用される。好ましくは、分析は、主成分分析（ＰＣＡ）およびＰＬＳ−ＤＡを含む。
【０１５９】
ＰＣＡでは、数学的なアルゴリズムを使用して、データセット内の差異および類似性が決定される。ＰＣＡでは、多数の関連する可能性のある変数が、プリンシプル成分と呼ばれる少数の無関連変数に変換される。第１のプリンシプル成分は、データの多様性をできるだけ反映する。各追加成分は、データ中の残りの多様性をできるだけ反映することを試みる。収集したデータは行列に方形配置することができ、ＰＣＡは、平方和および外積により正方対称行列の「固有値」および「固有ベクトル」を解く。
【０１６０】
最大固有値に関連する固有ベクトルは、第１のプリンシプル成分と同じ方向を有する。２番目に大きな固有値に関連する固有ベクトルは、第２のプリンシプル成分の方向を決定する。固有値の合計は、正方行列のトレースと等しく、固有ベクトルの最大数は、この行列の行（または列）の数と等しい。決定後、算出した固有値のスクリーンプロットを図示ことが可能である。当業者であれば、多数の異なるアルゴリズムを使用して、固有値および固有ベクトルを計算することができることを認識するだろう。データは、以下の２つのプロットを使用して表示される。ｉ）グループクラスタリングを示すスコアプロット、およびｉｉ）グループクラスタリングをもたらすスペクトルデータが、原点から最大距離にあるものとして特定されるローディングプロット。
【０１６１】
本発明によるプロセスは、好ましくは、（ａ１）卵流体を含む試料を準備すること、および（ａ２）試料からスペクトルを得ることを含む。好ましくは、ステップ（ｂ）は、任意の２つの試料間の濃度差による強度効果を正規化するステップをさらに含む。任意選択のステップ（ａ３）では、好ましくは、限外ろ過または遠心分離などの好適な方法により、試料から濁りが除去される。
【０１６２】
好ましくは、胚は、トリ胚、爬虫類胚、甲殻類、魚類、または軟体類である。最も好ましくは、家禽飼育は重要性が高いため、およびその卵が比較的大型であり、つまり試料採取が可能であるため、トリ胚が試験に供される。
【０１６３】
本方法は、有利には、卵中の胚が成育可能で雄であるか、または成育可能で雌であるかを決定すること、および試験した卵を多数の成育可能な雌卵と多数の成育可能な雄卵と多数の成育不能な卵とに分離して、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群または成育不能な卵が圧倒的に多い選択群を形成することができる。所望の場合、成育可能な雌卵または雄卵の選択群を、孵卵および孵化プロセスに供して、雌動物が圧倒的に多い集団または雄動物が圧倒的に多い集団を形成することができる。
【０１６４】
構成および作業方法の両方に関して本発明を特徴付ける特徴、ならびにそのさらなる目的および利点は、添付の図面と共に使用される以下の説明からより良好に理解されるだろう。図面は、図示および説明のためのものであり、本発明の範囲を規定することは意図されていないことが明示的に理解されるべきである。本発明により達成されるこれらおよび他の目的ならびに提供される利点は、これより下記の説明を添付の図面と共に読むと、より完全に明白になるだろう。
【０１６５】
本発明の実施形態による方法および装置は、その孵卵期間とも呼ばれる胚発生期間中の任意の期間に卵の１つまたは複数の特徴を特定するために使用することができる。本発明の実施形態は、胚発生期間中の特定の日に限定されない。
【０１６６】
本発明の方法は、内部標準物質を使用して、シグナル強度を定量化するための参照を提供する様式、およびそのような標準物質を用いない様式の、２つの様式で実施することができる。したがって、１つの実施形態では、質量分析法による分析の前に、１つまたは複数の内部標準物質が試料に添加される。好ましくは、内部標準物質は、標識されている。有利には、その後、バイオマーカーシグナル強度を測定し、それを１つまたは複数の既知内部標準物質のシグナル強度と比較することにより、各バイオマーカーシグナルの絶対シグナル強度をスコア化することができる。代替的な実施では、試料は、内部標準物質を添加せずに処理される。そのような実施形態では、試料中の個々のバイオマーカーシグナル強度と、試料群の参照シグナル強度との比を測定することにより、相対シグナル強度がスコア化される。
【０１６７】
類似性尺度は、好ましくは、滞留指標および正相関シグナルと関連する断片化パターンを相関させることを含む。
【０１６８】
さらに、統計的に有意な類似性は、関連バイオマーカー同一性または複数バイオマーカー同一性として検出および登録することができる。統計的に有意な類似性の決定は、データベース、ならびに本方法論の要求を満たすように開発されたアルゴリズムを使用することを含む。
【０１６９】
これは、特に、新しい種のバイオマーカーの有用性を決定する場合、管理下多変量分析、好ましくは部分的最小二乗判別分析、ＰＬＳ−ＤＡ、または直交性部分最小二乗判別分析をデータに適用することを含む。
【０１７０】
好ましくは、決定しようとする特徴は、卵中の胚の性別、年齢、発生段階、および／または成育能を含む。工業応用の場合、多数の卵が、１つまたは複数の胚の特徴について検査される。
【０１７１】
本発明による方法では、ある種に関するデータベースは、試料に存在するバイオマーカーをスクリーニングし、化合物が質量検出器に到達する時間と相関する滞留時間指標に基づいて不要なシグナルを除去することにより確立することができる。したがって、多数の配列を数分で分析し、所与のバイオマーカーを、高い信頼性で特定することができる。したがって、本方法は、自動化可能でハイスループットであり、比較的未熟練の技術者により運用可能であり、したがって、遠隔地、例えば孵卵場、養鶏場、または養魚場での使用に好適である。
【０１７２】
試料は、前分離手順を行わずに質量分析に供してもよい。そのような実施形態では、試料は、好ましくは、例えば静的ナノエレクトロスプレー原理、フローインジェクション分析、または試料を濃縮したフローインジェクションを用いた直接注入により分析される。
【０１７３】
質量分光分析計システムは、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ、または表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ、またはレーザーダイオードイオン化脱離（ＬＤＩＤ）ＭＳである。
【０１７４】
特に、ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｒａｐｉｄｆｉｒｅ  ＭＳ装置（Ｒａｐｉｄｆｉｒｅは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）、Ｐｈｙｔｒｏｎｉｃｓ  ＬＤＴＤ（レーザーダイオード熱脱離）イオン源（ＬＤＴＤは、Ｐｈｙｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．社の登録商標である）の使用などの、本方法の自動化ハイスループット工業応用に有用であることが見出された。
【０１７５】
上記に示されているように、本発明は、胚の性別、成育能、および／または発生段階を決定するための餌製品、ならびに動物餌中のトレーサー前駆体化合物の使用にも関する。本出願人らは、驚くべきことに、排卵親の餌に好適な前駆体化合物を添加することにより、胚発生中の卵内での前駆体化合物の代謝物質の発現が異なることを見出した。
【０１７６】
その結果、卵は、胚の性別などの胚の特徴に応じて、ある代謝物質の測定可能な変化を示す。好ましくは、少なくとも１つのトレーサー前駆体化合物は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および／または欧州委員会により許容可能な食品添加物として列挙されている化合物から選択される。特に好適なトレーサー前駆体化合物は、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）および／または関連化合物ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択してもよい。これらは、脂肪を保存するために食品に好適に添加されるフェノール化合物である。ＢＨＡは、本明細書では、異性体３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールおよび２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソールの混合物を指し、ＢＨＴは、メチル−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−パラ−クレゾールとしても知られている３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシトルエンを指す。ＢＨＡおよびＢＨＴは、公知の酸化防止剤であり、酸素が、酸化され易い油脂ではなく、ＢＨＡまたはＢＨＴと優先的に反応し、それにより油脂の劣化が防止されると考えられている。酸化可能なことに加えて、ＢＨＡおよびＢＨＴは脂溶性である。トレーサー前駆体物質は、好ましくは、製品中のトレーサー化合物または各トレーサー化合物が所定の濃度になるように計算された量で餌製品に添加される。好ましくは、トレーサー前駆体物質は、卵または卵試料中のトレーサー化合物または各トレーサー化合物が、５ｐｐｂ〜５ｐｐｍの範囲の、より好ましくは約１０〜１０００ｐｐｂの範囲の、さらにより好ましくは５０〜５００ｐｐｂの濃度になるように計算された量で製品に添加される。
【０１７７】
トレーサー物質は、有利には、１つよりも多くのトレーサー化合物を含んでいてもよく、トレーサー化合物の相対量は、オビパリアン胚の、性別、成育能、および／または発生段階の特定可能な特徴を提供するように選択され、卵または卵の試料の分析は、トレーサー化合物の特徴的な相対量を特定するために実施される。分析は、好ましくは、例えばイオン移動度センサーなどの質量分析計を使用して実施される。まず、試料を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、または好ましくは好適なセンサーと接続されているガスクロマトグラフィーの組合せに供してもよい。ＭＳセンサーの代替品は、炎光光度検出器であってもよい。
【０１７８】
好ましくは、卵流体を侵襲的にまたは非侵襲的に分析するステップ後、卵から採取された試料に存在するトレーサー化合物の少なくとも１つを、分析の前に分離、誘導体化、または濃縮してもよい。好ましくは、特徴が調査される胚は、トリ胚、爬虫類胚、甲殻類胚、魚類胚、または軟体類胚である。より好ましくは、胚は、好ましくはガルス・ガルス・ドメスティクス種のトリ胚であるか、または胚は、クルマエビ科（Ｐｅｎｅｉｄａｅ）、ザリガニ上科、およびミナミザリガニ科、テナガエビ科（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉａｅ）、ザリガニ上科、ミナミザリガニ科、アカザエビ科、およびウミザリガニ科を含む群から選択される甲殻類種の胚であるか、または胚は、好ましくは、コイ、ティラピア、ナマズ、シーブリーム、シーバス、マグロ、サバ、カツオ、またはブリ（ｙｅｌｌｏｗｔａｉｌ）から選択される魚類種の胚である。
【０１７９】
また、本発明は、好適な量のトレーサー前駆体化合物を含む、排卵親動物に使用される餌製品に関連する。
【０１８０】
試料に関する性別の可能性の評価は、好ましくは、管理下多変量分析、好ましくは、部分最小二乗判別分析、ＰＬＳ−ＤＡ、または直交性部分最小二乗判別分析法をデータに適用することを含む。
【０１８１】
有利には、外れ値を集団から除外し、それにより決定の確実性をさらにより増加させると共に、他の目的に使用される卵の流動に寄与することができる。
【０１８２】
本方法は、有利には、卵を多数の雄卵または雌卵に分離することをさらに含み、また、有利には、胚の成育能を決定し、卵を１つまたは複数の、好ましくは多数の成育可能な卵および成育不能な卵に分離することをさらに含んでいてもよい。
【０１８３】
本方法は、外れ値が集団から除外され、有利には、卵中の胚が成育可能で雄であるか、または成育可能で雌であるかを決定すること、および多数の成育可能な雌卵と多数の成育可能な雄卵と外れ値とを分離して、雄卵が圧倒的に多い選択群または雌卵が圧倒的に多い選択群を形成することをさらに含む。
【０１８４】
本方法は、有利には、成育可能な雌卵または雄卵の選択群を、孵卵および孵化プロセスに供して、雌動物が圧倒的に多い集団または雄動物が圧倒的に多い集団を形成することをさらに含む。
【０１８５】
胚の成育能は、有利には、測定されたバイオマーカーを使用して決定することができる。不受精卵、ならびにある期間後（つまり代謝終了後の数分間に死滅した胚の場合、測定結果は、完全に測定窓の外側にあることが明らかであり、成育可能な卵から除外される外れ値に結び付く。同様に、少なくともトリ胚の場合、例えば尿膜試料を使用すると、こうした非常に迅速な代謝終了後の活性が撹乱され、卵黄の分離を維持する膜が溶解することにより最終的に黄色になるだろう。加えて、心拍動または血流を測定して、胚の代謝活性を決定することができる。
【０１８６】
また、本発明は、動物および／もしくはヒト食料生産のための、化粧用、医療用、および／もしくは栄養用化合物の生産および／もしくは単離のための、発酵によるメタン生産のための、ワクチン生産のための、ならびに／または高品質肥料生産のための、本明細書で開示された方法から得ることができる多数の卵の使用に関する。
【０１８７】
以下の非限定的な例は、本発明を例示するために提供されている。
【実施例】
【０１８８】
［実施例１］
試料発送および保管
バイオマーカー発見のために、複数の分析的代謝物質プロファイリングプラットフォームを使用した。それらは、生体アミン、陰極性脂質、非標的グローバルプロファイリング、およびＧＣ−ＭＳだった。
【０１８９】
発見局面では、１００個の試料を分析した。栄養および品種の背景が異なる卵に由来する３５０個の試料の別のセットを、確認局面で分析し、性別および年齢のバイオマーカーが、少なくとも２つのプラットフォームで見出されたことが判明した。
【０１９０】
尿膜腔液（ブラウンニワトリ（ｂｒｏｗｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ）に由来する）の第１の１５０個の試料を、孵卵７〜１１日目に収集し、−８０℃で保管した。
【０１９１】
ＰＣＲ法を使用して、これら試料の遺伝的性別決定データを準備した。日毎性別毎に試料を選択し、現セットの過剰試料をＮＭＲ分析に使用した。その後、これら試料の代謝プロファイルを、アミン、極性陰性脂質、ＣＧ−ＭＳ（糖化合物用）、およびグローバルプロファイリングプラットフォームを使用して分析した。
【０１９２】
さらに３００個の尿膜腔液試料を、ブラウンニワトリの孵卵７〜１１日目に孵卵場で収集した。
【０１９３】
遺伝的性別分析がもたらされたが、統計モデル構築まで使用しなかった。これら試料を使用して、以前のグローバルプロファイリング分析で見出された特徴を確認した。加えて、白卵（Ｈｅｙ系ＣＶ２４）から５９個の試料を収集し、それらもこの確認研究に使用した。
【０１９４】
アリコート
アリコートする前に、試料を４℃で一晩解凍した。試料をボルテックスし、以下の通り手作業でアリコートした。アミンプロファイリング用に５μＬ、極性陰性脂質プロファイリング用に５０μＬ、およびＧＣ−ＭＳ（糖化合物分析）用に１００μＬ。各試料から等量を取り、その後よく混合することにより、品質管理（ＱＣ）プールを生成した。
【０１９５】
バッチ設計
発見局面では、試料を無作為化し、アミン測定用に２つのバッチへと分配した。陰性脂質およびグローバルなプロファイリングの場合、試料を１つのバッチで分析した。７試料毎に重複試料を選択した。較正系、ＱＣ、およびブランクも含まれていた。１０試料毎にＱＣを分析した。それらを使用して、データ品質を評価し、機器応答を補正した。ブランクを使用して、研究試料からバックグラウンドレベルを差し引いた。
【０１９６】
生データを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量分析ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ社、バージョンＢ．０５．０１）を使用して前処理した。
【０１９７】
アミンプロファイリング
言及されている装置、補給品、およびソフトウェアはすべて、別様の指示がない限り、Ｗａｔｅｒｓ社（Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ、オランダ）からのものである。Ｗａｔｅｒｓ社からのものを適用したＡｃｃＱタグ誘導体化戦略が使用されるアミンプラットフォームは、アミノ酸および生体アミンをカバーする。手短に言えば、尿膜腔液試料（各５μＬ）を、内部標準溶液でスパイクし（表１）、その後ＭｅＯＨ（Ａｃｔｕ−Ａｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）除タンパク質を行った。上清（１０．０００ｒｐｍ、１０℃、１０分間）を、真空条件下で乾燥した。残留物を、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルカルバマート（ＡＱＣ）試薬を有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に再構成した。誘導体化反応を、１０μＬの２０％ギ酸（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ社）で中和した。上清（１０．０００ｒｐｍ、１０℃、１０分間）をバイアルに移し、ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムへの注入（１μＬ）まで、冷却（１０℃）オートサンプラートレーに入れておいた。
【０１９８】
データ分析
獲得したデータを評価し、帰属させたＭＲＭピークを、ＴａｒｇｅｔＬｙｎｘソフトウェアを使用して統合した。適切な内部標準物質を使用してＭＲＭピークを正規化し、アミノ酸の分析には、それらの１３Ｃ１５Ｎ標識類似体を使用し、他のアミンには、最も近くに溶出した内部標準物質を使用した。ブランク試料を使用して、バックグラウンドを補正した。自己開発したアルゴリズムを、プールしたＱＣ試料を使用して適用し、質量分析計の感度の変化をバッチにわたって補正した。
【０１９９】
探索的データ分析を実施して、性別特的特徴を発見することができたか否かを調査した。この単変量および多変量の場合、標準的データ分析法を、本発明者らがバイオマーカーを発見するために通常使用するＢＭＦＬに適用した。
【０２００】
その後、試料を、自動化ハイスループット接続ＳＰＥ／ＭＳ／ＭＳ  Ｒａｐｉｄｆｉｒｅ装置、ならびにＬＤＰＤ  Ｐｈｙｔｒｏｎｉｘ装置での試験に供した。結果は、成育可能な卵の性別が、９５％を超える正確性で、１試料当たり１０秒未満で決定されることを示す。図１には、得られた性別決定の確実性が示されており、確実性は、２つのバイオマーカーを共に考慮した場合、９または１０日目に９５％超に達した。
【０２０１】
孵化
上記に示されている試料採取に供され、雄または雌とみなされた一連の２５個の卵は、試験を、市販の孵卵装置および典型的な孵卵条件を使用した孵化へと進めた。幼体はすべて効果的に卵から出現し、試料採取の成育能を示した。孵化したヒナは、完全に雄の集団または完全に雌の集団のいずれかだった。
［実施例２］
揮発物および固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）を使用した非侵襲的決定
揮発性試料収集は、アルミニウムホイルおよび金属蓋で密封されたガラスジャーに単一の卵を移すことにより実施した。その後、ジャーを加温板に置いて、ジャー内部の温度を３７℃に維持した。ジャー内の卵を１５分間静置して、ジャーの上部空間を平衡状態に到達させた。回収ファイバー材料を、製造業者の説明書に従って使用前に前処理した。その後、ファイバーを挿入し、５０分間にわたって抽出を実行した。抽出後、ファイバーを、ガスクロマトグラフインジェクターに５分間にわたって導入し、スプリットレスモードで２５０℃にて分析物を離脱させた。揮発物収集後直ちに、卵を孵卵器に戻した。空のジャーに対してＳＰＭＥを行うことによりブランクを製作し、分析前にファイバー前処理を実施して、ピークの非存在およびＳＰＭＥ手順の良好な品質を保証した。
【０２０２】
その後、卵から放出された揮発物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製質量選択的検出器（ＭＳＤ５９７５Ｃ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製（ウィルミントン、デラウェア州、ＵＳＡ）７８９０Ａでのガスクロマトグラフィーにより測定した。クロマトグラフ分離は、流速が１ｍＬ／分のヘリウムをキャリヤガスとして使用して、２５ｍの膜厚を有するＨＰ−５ＭＳ  ＵＩ（５％Ｐｈｅｎｙｌ  Ｍｅｔｈｙｌ  Ｓｉｌｏｘ）３０ｍ×０．２５ｍ  ＩＤカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社）で実施した。シングル四重極質量分析計を電子イオン化（ＥＩ、７０ｅＶ）で使用した。質量分析計は、ＳＣＡＮモードで操作した。揮発性化合物の抽出は、ホルダー付きの６０μｍ  ＰＤＭＳ／ＤＶＢ  Ｓｔａｂｌｅｆｌｅｘ２４ゲージ固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）ファイバーを使用した。生データを、ＭＳＤ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ  Ｆ．０１．００．１９０３を使用してＣＤＦ形式に変換した。ピーク選択を実施するために、ＸＣＭＳスクリプトを設計し、Ｒソフトウェア（Ｒバージョン３．２．０）に適用した。そのために使用した方法は、’’ｍａｔｃｈｅｄＦｉｌｔｅｒであり、ｆｗｈｍ＝４（ピーク幅）、ステップ＝０．５（質量窓）、およびｓｎｔｈｒｅｓｈ＝５（Ｓ／Ｎ）だった。Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ３．０を統計分析に使用した。最後に、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｂ．００５．００を使用して、得られた結果に従って最も重要な特徴を手作業で確認した。ＮＩＳＴ質量スペクトルライブラリー  バージョン２．０を使用して、特定を行った。
【０２０３】
このプロセスでは、滞留時間が異なり質量が異なる１４８６個の特徴が、各試料のＴＩＣから得られた。これら特徴は、抽出された後、ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ３．０を使用して単変量法を試験に適用し、９９％の信頼性で性別識別特徴を特定することにより処理した。
【０２０４】
本出願人らは、雄卵と雌卵とで統計的に有意な差を示す特に関連するバイオマーカーは、前駆体であるＢＨＴの誘導体であるブチル化ヒドロキシトルエンであることを見出した。
【０２０５】
雌卵は、雄卵と比較して、著しくより高い濃度のブチル化ヒドロキシトルエンを示した。このように、トレーサー前駆体の使用は、完全に非侵襲的な様式により高い確実性で、雄および雌ニワトリ胚を卵内で識別することを可能にしたバイオマーカーに結び付いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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