(57)【要約】生体試料を保持するための保持部と、生体試料に誘電泳動力を作用させて保持部に移動させるための一対の電極と、前記一対の電極に交流電圧を印加するための電源を備えた生体試料固定装置を提供する。これにより、生体試料に含まれる複数の成分を簡便に１つずつ分離し、それぞれの遺伝子を１つずつ迅速同時に解析可能な高密度かつ小型化される。
2011149032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を保持する保持部分を有する保持部と、
交流電圧を印加可能な電源と、
前記電源から印加された交流電圧により、所定の誘電泳動空間内の生体試料に誘電泳動力を作用させて、前記保持部分に生体試料を移動させるための一対の電極を備え、
前記一対の電極のそれぞれは、前記所定の誘電泳動空間に対して前記保持部側に位置する共通の電極設置位置側から、該所定の誘電泳動空間内の生体試料に対して誘電泳動力を作用可能となるように配置される、
生体試料固定装置。
【請求項２】
前記保持部は、少なくとも２つの前記保持部分を有し、
前記一対の電極のそれぞれが配置される電極設置位置は、前記保持部が有する前記少なくとも２つの保持部分のそれぞれの内部空間を画定する共通の平面上に位置する、
請求項１に記載の生体試料固定装置。
【請求項３】
前記一対の電極のうち一方の電極は、前記少なくとも２つの保持部分のうち一部の保持部分において、生体試料と接触可能に配置され、
前記一対の電極のうち他方の電極は、前記少なくとも２つの保持部分のうち残りの保持部分において、生体試料と接触可能に配置される、
請求項２に記載の生体試料固定装置。
【請求項４】
前記保持部分は、前記所定の誘電泳動空間から生体試料が入り込む開口部を有し、
前記一方の電極は、前記一部の保持部分において前記開口部と対向する該保持部分の底部に配置され、
前記他方の電極は、前記残りの保持部分において前記開口部と対向する該保持部分の底部に配置される、
請求項３に記載の生体試料固定装置。
【請求項５】
前記一対の電極は、複数の小電極部を有し該小電極部を接続してなる第一の電極と、該第一の電極とは独立した、複数の小電極部を有し該小電極部を接続してなる第二の電極と、を有し、
前記第一の電極における複数の小電極部の少なくとも一部と、前記第二の電極における複数の小電極部の少なくとも一部が、前記共通の平面上において所定の電極間距離をもって交互に配置される、
請求項２から請求項４の何れか一項に記載の生体試料固定装置。
【請求項６】
前記一対の電極は、連続した線状の第一の電極と、該第一の電極とは独立した、連続した線状の第二の電極と、を有し、
前記第一の電極と前記第二の電極は、両電極間の長さ方向に沿って所定の電極間距離をもって前記共通の平面上に配置される、
請求項２から請求項４の何れか一項に記載の生体試料固定装置。
【請求項７】
前記第一の電極と前記第二の電極は、前記共通の平面上において連続した曲線の形状に、又は連続した折れ線の形状に配置される、
請求項６に記載の生体試料固定装置。
【請求項８】
前記保持部に固定された生体試料を採取可能となるように、該保持部の一方の端部が開放されている、
請求項１から請求項７の何れか一項に記載の生体試料固定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料固定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な疾患には遺伝的要素と環境的要素が関与しているが、先天性代謝異常症、癌、糖尿病、高血圧、アルツハイマー、自己免疫疾患、肥満、アルコール依存などの疾患では、遺伝的要素、即ち遺伝子の関与が大きな割合を占めている。近年、分子生物学の急速な進展によって、様々な疾患において遺伝的要素の関与が具体的に解明されるようになり、遺伝子をターゲットにした解析による疾病の早期発見や治療に注目が集まるようになってきている。
また例えば、癌細胞は同じ組織の癌においても様々な性質のものが存在し、癌細胞の性質によって進展悪性化の度合い、転移の可能性、治療用薬剤の効果、予後が異なるなど、ある種の疾患では当該疾病に特異的な性質を有する細胞が存在することも知られている。従って、例えば癌細胞等の疾病に関連する細胞の性質を解析し、その結果に基づいて癌を分類することにより、治療法や治療に用いる薬剤を選択するための重要な情報等を得ることができると考えられる。
また例えば、細胞中の特定の遺伝子上の変異を読み取ることによって、細胞が癌化しているか否かを極めて早い段階から解析することも考えられる。事実、細胞の癌化や癌細胞の異常増殖に関与する、いわゆる癌遺伝子の解析及び同定が進められている。また変異又は発現低下により癌化につながる癌抑制遺伝子についても同定が進められており、これまでに網膜芽細胞腫のＲｂ遺伝子、大腸癌のｐ５３遺伝子及びＡＰＣ遺伝子、Ｗｉｌｍｓ腫瘍のＷＴ１遺伝子などが癌抑制遺伝子であると報告されている。
このように、癌に関連する遺伝子は数多く知られているが、多くの場合、その解析には、遺伝子中の標的領域を増幅しうるＰＣＲ法（特許文献１から３）や遺伝子の変異を染色体ＤＮＡの標識により視覚化して見つけ出す蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法などが利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号
【特許文献４】特許第３７２３８８２号公報
【特許文献５】特開２００７−２９５９１２号公報
【特許文献６】特許第３０９７９３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
疾患に関連する細胞の性質を解析したり、細胞中の特定の遺伝子上の変異を読み取るためには、被験者の患部組織や体液などを採取し、これに含まれる細胞を解析することが考えられる。例えば癌細胞であれば、癌組織を採取し、該組織に含まれる細胞の性質を解析することが考えられる。また例えば、原発の腫瘍塊より離脱した癌細胞は血管やリンパ管内、あるいは腹腔内へと広がりながら全身に転移を起こすことから、体液に含まれる細胞を解析することも考えられる。【０００５】
かかる解析の際に最も重要となるのは、組織や体液等に含まれる細胞等の生体試料を個々に分離し、その性質やその中の特定の遺伝子を解析することに他ならない。生体試料（例えば細胞）を個々に解析する方法として、従来例がなく、わずかに血液中のリンパ球を１個ずつ１つのマイクロウエルに入れ、これらのリンパ球を抗原で刺激して抗原に反応する存在確率の低い抗原特異的リンパ球(０．１％以下)を検出してクローニングした抗原特異的抗体遺伝子から大量にヒト型モノクローナル抗体を生産した、との報告があるのみである（前述の特許文献４）。
前記したＰＣＲ法（特許文献１から３）やＦＩＳＨ法（特許文献４）といった、従来から多用されている遺伝子の解析手法では、同じ組織中存在する様々な性質を有する癌細胞等について、個々を解析するというよりも、個々の違いを平均化して解析することになる。従って従来の方法によって得られた解析結果からは、個々の生体試料（例えば個々の細胞）に関する情報を得ることができないという課題がある。
特許文献４ではアレイ状に形成した複数のマイクロウエルに細胞を１個ずつ固定し、分析を行っている。しかし、実際の操作は固定するリンパ球の直径の１から２倍の内径と深さのマイクロウエルに対して細胞懸濁液を加え、ウエル内に細胞が沈むのを待ってからウエル外の細胞を洗い流すことを繰り返し行うものである。このように前記特許文献４に記載された方法では、重力により細胞が沈むのを待つ時間が５分程度と長く、また細胞が沈むのを待って洗浄することを繰り返すため、時間がかかり、洗浄の過程でウエルに入らなかった細胞が失われ、分析に供された細胞の全てから情報を得ることができないという課題もある。【０００６】
また、特許文献５には、アレイ状に形成した複数の貫通孔に対して上下に設けられた電極間に交流電圧を印加して誘電泳動力を作用させることで、細胞を貫通孔に１個ずつ固定し、細胞融合を行う技術が開示されている。当該技術では、融合される２つの細胞の大きさと貫通孔の大きさを所定の関係に設定することで、効率的に細胞を融合できる。しかしながら、個々の融合した細胞がどのような遺伝子配列を有するか解析することができないという課題があった。なお、この誘電泳動力は、特許文献５に示す細胞の固定だけではなく、たとえば特許文献６に示すクロマトグラフィにおける試料中のタンパク分析にも利用される。【０００７】
以上より、本発明の目的は、生体試料を簡便に個々に分離し、１個ずつ固定したうえで、その性質やその中の特定の遺伝子を迅速に解析することができる解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、生体試料を保持するための保持部と、生体試料に誘電泳動力を作用させて保持部に移動させるための一対の電極と、前記一対の電極に交流電圧を印加するための電源を備えた生体試料固定装置である。また本発明は、生体試料を保持するための保持部と、生体試料に誘電泳動力を作用させて保持部に移動させるための一対の電極と、前記一対の電極に交流電圧を印加するための電源と、前記保持部に固定された生体試料を破砕するための破砕手段を備えた遺伝子抽出装置である。また本発明は、生体試料を保持するための保持部と、生体試料に誘電泳動力を作用させて保持部に移動させるための一対の電極と、前記一対の電極に交流電圧を印加するための電源と、前記保持部に固定された生体試料を破砕するための破砕手段と、破砕された生体試料から抽出された遺伝子を検出する検出手段を備えた遺伝子解析装置である。そして本発明は、生体試料に誘電泳動力を作用させ、移動させて保持部に固定し、固定された生体試料を破砕し、破砕された生体試料から抽出された遺伝子を検出する遺伝子解析方法である。以下、本発明を詳細に説明する。【０００９】
本発明の生体試料固定装置（以下「固定装置」と記載することがある）は、生体試料を保持するための保持部を有する。保持部は、例えば細胞等の１個の生体試料を固定できる寸法、形状の部分（以下「保持部分」と記載することがある）を有していれば特に制限はない。例えば１又は複数の部材を積層した平板状の部材であって、保持部分として貫通孔を設けたものを例示することができる。また本発明の固定装置は、一対の電極を備え、当該電極によって生体試料に誘電泳動力を作用させて生体試料を保持部の保持部分に移動させるためのものである。このため、保持部と電極は、一対の電極間に電圧が印加された場合に当該電極間に発生する電気力線が保持部分を通過するように配置される。例えば保持部分を前述のような貫通孔とする場合、図１に示したようにその一端を一方の電極で閉塞して底部とし、他方の電極を保持部分（貫通孔）を閉塞する電極と向き合うように配置することが例示できる。他にも図３に示したように、２以上の保持部分（貫通孔）を設け、その一部の一端を一方の電極で閉塞して底部とし、残りの一端を他方の電極で閉塞して底部とするように配置することが例示できる。なお、電気力線が保持部分を通過するようにするため、例えば図１で示したように保持部を絶縁性の部材を含む複数の部材で構成したり、保持部を構成する１又は複数の部材の全部を絶縁体で構成することにより、電極以外には通電しないようにする。【００１０】
前記一対の電極に交流電圧を印加して生体試料を保持部の保持部分に移動させる誘電泳動力を作用させるために、本発明の固定装置は電源を備える。電源は一対の電極に交流電圧を印加可能なものであれば特に制限はない。【００１１】
前記保持部の保持部分に固定されるべき生体試料は、生体試料を含む導電性の生体試料懸濁液として供給される。この目的のために、生体試料懸濁液を保持するための収容部を設けるが、収容部としては保持部分に連通する液溜を例示できる。より具体的には、図１に示したように、生体試料懸濁液を収容する部分を提供するスペーサー（枠体）を保持部の上部に設け、収容部に収容された生体試料懸濁液が保持部の保持部分に流入し得るようにすることが例示できる。なお図１に示したように、保持部分（貫通孔）の一端を一方の電極で閉塞して底部とし、他方の電極を保持部分（貫通孔）を閉塞する電極と向き合うように配置する場合、保持部と当該他方の電極間に収容部を配置して生体試料懸濁液を満たすことで保持部分（貫通孔）を通してこれら一対の電極間に電気力線が通るようになり、また図３に示したように、２以上の保持部分（貫通孔）を設け、保持部分（貫通孔）の一部の一端を一方の電極で閉塞して底部とし、残りの保持部分（貫通孔）の一端を他方の電極で閉塞して底部とするように配置する場合には、保持部分の上部に収容部を配置して、ある保持部分の底面とした一方の電極とそれ以外の保持部分の底面とした他方の電極間に保持部分を通してこれら一対の電極間に電気力線が通るようになる。【００１２】
また、本発明に係る生体試料固定装置を別の側面から捉えることも可能である。具体的には、本発明に係る生体試料固定装置は、生体試料を保持する保持部分を有する保持部と、交流電圧を印加可能な電源と、前記電源から印加された交流電圧により、所定の誘電泳動空間内の生体試料に誘電泳動力を作用させて、前記保持部分に生体試料を移動させるための一対の電極を備える。そして、前記一対の電極のそれぞれは、前記所定の誘電泳動空間に対して前記保持部側に位置する共通の電極設置位置側から、該所定の誘電泳動空間内の生体試料に対して誘電泳動力を作用可能となるように配置される。【００１３】
このように構成される生体試料固定装置において、上記所定の誘電泳動空間とは、一対の電極間で生じる電気力線によって生体試料に対して誘電泳動力を作用させることが可能な空間をいう。したがって、所定の誘電泳動空間は、最終的に生体試料が固定のために移動する保持部分の内部空間も含み得るものであり、当該内部空間に対して生体試料が移動可能なようにつながれた他の空間（例えば、上述した「収容部」に相当する空間）も含んでよい。また、保持部が有する保持部分について、誘電泳動力の作用により保持部分で生体試料が固定可能であれば、保持部分の数は１つであっても、複数であっても構わない。したがって、このような本発明に係る生体試料固定装置では、一対の電極間に作用する誘電泳動力によって所定の誘電泳動空間から保持部が有する保持部分に生体試料が移動させられ、そこで保持されることになる。このとき、一対の電極のそれぞれは、所定の誘電泳動空間に対して保持部側に位置する、共通する電極設置位置から生体試料に対して誘電泳動力を作用させることが可能となるように、換言すれば、一対の電極のそれぞれが、所定の誘電泳動空間を挟んだ状態とならないように配置される。このことは、本発明に係る生体試料固定装置では、電極の間に物理的な空間である所定の誘電泳動空間を存在させないことになるから、電極間の距離を可及的に短くすることができる。そのため、一対の電極において、電極間に印加する電圧が比較的低くても、生体試料に作用する誘電泳動力を大きく保持することが可能となり、換言すれば、効率的な誘電泳動により生体試料の固定が可能となる。【００１４】
また、上記の生体試料固定装置において、前記保持部が前記保持部分を少なくとも２つ有する場合、前記一対の電極のそれぞれが配置される電極設置位置は、前記保持部が有する前記少なくとも２つの保持部分のそれぞれの内部空間を画定する共通の平面上に位置するように構成されてもよい。このように構成することで、それぞれの保持部分に対して一対の電極がそれぞれ配置されるとともに、該保持部分に対する電極の相対位置を概ね均一にすることが可能となる。その結果、複数の保持部分における生体試料の保持を均一に行い、効率的な生体試料の保持が実現され得る。【００１５】
ここで、上記生体試料固定装置において、前記一対の電極のうち一方の電極は、前記少なくとも２つの保持部分のうち一部の保持部分において、生体試料と接触可能に配置され、前記一対の電極のうち他方の電極は、前記少なくとも２つの保持部分のうち残りの保持部分において、生体試料と接触可能に配置されてもよい。即ち、一対の電極を、それぞれの対応する保持部分において生体試料と接触可能となるように、上記共通の平面上で配置されることで、電圧印加時により確実に生体試料を保持部分にて保持することが可能となる。【００１６】
また、上記生体試料固定装置において、前記保持部分が、前記所定の誘電泳動空間から生体試料が入り込む開口部を有する場合、前記一方の電極は、前記一部の保持部分において前記開口部と対向する該保持部分の底部に配置され、前記他方の電極は、前記残りの保持部分において前記開口部と対向する該保持部分の底部に配置されるように構成されてもよい。このように構成することで、生体試料を保持部分に保持させる際に、生体試料に作用する重力も利用することが可能となり、より効率的な生体試料の固定が実現できる。【００１７】
ここで、上述までの生体試料固定装置において、前記一対の電極は、複数の小電極部を有し該小電極部を接続してなる第一の電極と、該第一の電極とは独立した、複数の小電極部を有し該小電極部を接続してなる第二の電極と、を有し、前記第一の電極における複数の小電極部の少なくとも一部と、前記第二の電極における複数の小電極部の少なくとも一部が、前記共通の平面上において所定の電極間距離をもって交互に配置される構成を採用してもよい。また、別法として、当該生体試料固定装置において、前記一対の電極は、連続した線状の第一の電極と、該第一の電極とは独立した、連続した線状の第二の電極と、を有し、前記第一の電極と前記第二の電極は、両電極間の長さ方向に沿って所定の電極間距離をもって前記共通の平面上に配置される構成を採用してもよい。これらの構成はあくまでも例示であり、本発明を何れかの構成に限定する意図はない。【００１８】
前者の構成においては、第一の電極と第二の電極を構成するそれぞれの小電極部が、互いに所定の電極間距離をもって交互に配置されるが、ここで言う所定の電極間距離とは、固定目標とする生体試料の誘電泳動を生じさせるのに十分な距離を言う。したがって、このような配置構成を有することにより、第一の電極と第二の電極との間で生じる誘電泳動力を、第一の電極側の小電極部と第二の電極側の小電極部とで交互に生じさせることが可能となる。したがって、第一の電極と第二の電極の間での、それぞれの小電極部の繰り返しが密集して配置されるほど、より多くの生体試料に誘電泳動力を作用させて効率的に保持部分に保持させることが可能となる。また、そのように密集することで、電極間に印加される電圧をより小さくさせつつ、効果的な誘電泳動力の発生を実現することができる。なお、このような構成の一例としては、図３に示した櫛状の電極構成が挙げられる。【００１９】
一方で、後者の構成においては、一対の電極がそれぞれ線状に形成され、その電極の延在方向に沿って、電極間の距離が所定の電極間距離に保たれるが、ここで言う所定の電極間距離とは、固定目標とする生体試料の誘電泳動を生じさせるのに十分な距離を言う。したがって、このような配置構成を有することにより、第一の電極を形成する「線」と第二の電極を形成する「線」との間に、生体試料の保持部分での保持に要する誘電泳動力を発生させることが可能となる。特に、第一の電極の全長と第二の電極の全長にわたって、電極間の距離を所定の電極間距離に保持すれば、電極間のいずれの位置ででも、適切に保持部分に対して電極を位置決めすることで生体試料の固定が可能となり、生体試料固定装置の設計の自由度が高まる。なお、このような構成の一例としては、前記第一の電極と前記第二の電極は、前記共通の平面上において連続した曲線の形状に、又は連続した折れ線の形状に配置される構成が挙げられる。【００２０】
ここで、上述までの生体試料固定装置において、前記保持部に固定された生体試料を採取可能となるように、該保持部の一方の端部が開放されている構成も採用できる。すなわち、上記のように一対の電極が所定の誘電泳動空間に対して片寄って配置されるため、結果的に固定された生体試料を電極間に挟んだ状態に置くことを回避することが可能となる。この結果、固定後の生体試料へのアクセスが容易となり、生体試料の採取だけではなく、生体試料への溶媒の供給や固定された生体試料の観察等も容易に、且つ好適に実現することが可能となる。【００２１】
以上のような本発明の固定装置によれば、一対の電極間に交流電圧が印加されると電極間に電気力線が通り、収容部や保持部分の内部空間等の所定の誘電泳動空間内の生体試料懸濁液に含まれる生体試料に誘電泳動力が生じるため、電気力線に沿って保持部の保持部分に移動する。これにより１個の保持部分に生体試料が移動するが、保持部分の寸法、形状が生体試料１個を固定するための寸法、形状であるため２個の生体試料が同一の保持部分に固定されることはなく、交流電圧を印加する間、保持部分に移動した生体試料は当該保持部分に固定される。なお、交流電圧の電極への印加を停止した後も生体試料を当該保持部分に固定するために、固定しようとする生体試料に対して親和性を有する物質を保持部分に固定しておくことが好ましい。【００２２】
本発明の遺伝子抽出装置（以下「抽出装置」と記載することがある）は、上述までの生体試料固定装置に加えて、前記保持部に固定された生体試料を破砕するための破砕手段を備える。保持部、一対の電極又は電源については固定装置と同様である。抽出装置が備える破砕手段は、生体試料を破砕して生体試料に含まれる核酸を生体試料外部に溶出することができれば特に制限はない。例えば、一対の電極と該電極に直流電圧又は１ヘルツ程度の低い周波数の交流電圧を印可するための電源からなり、保持部の保持部分に固定された生体試料に電圧を印加する手段を例示することができる。生体試料が細胞壁を有さない細胞であれば、細胞膜に１ボルト程度の電圧を印可することにより、当該細胞を破砕することが可能である。なお当該手段における一対の電極としては、生体試料に誘電泳動力を作用させて保持部に移動させるための電極を兼用することができる。また例えば、前記保持部の保持部分に固定された生体試料を加熱する加熱手段を例示することができる。数分程度、９０℃の温度条件下におくことにより、生体試料を破砕することが可能である。また例えば、保持部の保持部分に固定された生体試料を振動する超音波発生手段を例示することができる。１００から２００ワットの出力で、２０から４０キロヘルツの振動を連続的に又は間欠的に与えることにより、生体試料を破砕することが可能である。例示した電圧を印可する手段、加熱手段そして超音波発生手段は択一的にしか利用できないものではく、例えば、加熱手段と超音波発生手段の両方を利用する、ということも可能である。【００２３】
前述した通り、保持部は、細胞等の１個の生体試料を固定できる寸法、形状の保持部分を有している。この結果、１つの保持部分には１個の生体試料が固定され、固定された生体試料を当該保持部分内で破砕することによって１個の生体試料に含まれる核酸を取得することも可能になる。【００２４】
本発明の遺伝子解析装置（以下「解析装置」と記載することがある）は、上述までの遺伝子抽出装置に加えて、破砕された生体試料から抽出された遺伝子を検出する検出手段を備える。保持部、一対の電極、電源又は破砕手段については固定装置や抽出装置と同様である。【００２５】
解析装置が備える検出手段は、生体試料を破砕して生体試料外部に溶出させた核酸を検出することにより保持部の保持部分に固定された細胞の性質等を解析するためのものであり、例えば発光物質や蛍光物質等で標識された核酸プローブを使用する場合の発光又は蛍光強度の検出を行うための公知の光学検出手段、吸光度又は濁度の検出を行うための公知の光学検出手段、ＲＩ検出手段、目視によりかかる光学的な変化を視認するための光学顕微鏡や目視により濁度変化等を検出するために保持部分を拡大観察するための拡大手段等を例示することができる。検出手段として光学検出手段を利用する場合、例えば励起光等を照射し、保持部分からの蛍光等を受光して検出する場合を例に述べれば、励起光等の照射と蛍光等の受光を保持部の保持部分に対して同じ方向から行う（例えば保持部分の上方向から励起光等を照射し、上方向にて受光する）態様又は励起光等の照射と蛍光等の受光を異なる側で行う態様（例えば保持部分の上方向から励起光等を照射し、下方向にて受光する）態様のいずれであっても良いが、電極を設ける基板や後述する収容部を構成する部材として、励起光や蛍光等が通過可能であるものを選択等する。【００２６】
検出手段は、生体試料からその外部に溶出した核酸をそのまま検出するものに限られず、例えば溶出した核酸を増幅した後に検出する手段であっても良い。核酸の増幅は、それ自体公知の手法であるＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法又はＴＲＣ法等を利用することができる。ＰＣＲ法のようにその実施に温度サイクリングが要求される増幅を行う場合、検出手段には温調手段を追加するが、例えばＴＲＣ法のように一定温度で実施することが可能な増幅法である場合、該温度に温調する温調手段を設けるか、解析装置自体を該温度に温調された空間に設置する等すれば良い。なお、ＰＣＲ法を実施するための温調手段は、その温度サイクリングにおいて約９０℃程度にまで保持部分を昇温することになるため、前述した破砕手段として加熱手段を利用する場合には、両者を兼用とすることができる。【００２７】
特定の遺伝子に特異的に見いだされる配列を標的として、ＰＣＲ法等により当該配列が増幅された場合に蛍光や濁度の変化を生じるようにするためにも核酸プローブや呈色試薬等を利用することが例示できるが、例えば核酸増幅を行うことにより又は核酸増幅した後にかかるプローブや試薬を利用することにより、上記したような検出手段を用いることなく目視により標的となる遺伝子の存在等を知ることができる場合には、前記した抽出装置によって遺伝子の解析を行うことができる。【００２８】
本発明の解析装置の保持部に複数の保持部分が設けられ、２個以上の生体試料から抽出した遺伝子をそれぞれ別個に光学検出手段を用いて解析することができる解析装置である場合には、ある保持部分からの光学的シグナルが他の保持部分からの光学的シグナルによって影響を受けないようにするため、例えば図１に示したような遮光部材を備えることが好ましい。また保持部に複数の保持部分が設けられている場合には、保持部分の数に等しい数の光学検出手段を設けても良いが、装置構成を簡略化してメンテナンスや操作性を向上するためにも、保持部分の数よりも少ない光学検出手段を設け、これを適当なアクチュエータで駆動して各保持部分をスキャンニングする構成とすることが好ましい。保持部に複数の保持部分が設ける場合には、更に、後に複数の保持部分のうちの特定の保持部分から増幅等された核酸を取得すること等を容易にするため、ある光学的シグナルを発した保持部分が保持部に設けられた複数の保持部分のどれであるかを特定するための位置情報等を記憶する構成とすることが好ましい。【００２９】
本発明はまた、生体試料に誘電泳動力を作用させ、移動させて保持部に固定し、固定された生体試料を破砕し、破砕された生体試料から抽出された遺伝子を検出する遺伝子解析方法（以下「解析方法」と記載することがある）を提供する。なお、破砕された生体試料から溶出した核酸をＰＣＲ法で増幅した後に検出する場合、まず、生体試料を保持部の保持部分に固定した後、例えば後述する収容部にＰＣＲ反応を生じさせるためのプライマー、酵素、酵素基質等を含む反応液を供し、収容部に連通する保持部分に存在する溶液（生体細胞を懸濁するために使用した液）を反応液に置換する。ＰＣＲ反応では保持部分（貫通孔）に固定した生体試料から溶出した遺伝子を９０℃程度にまで昇温するが、その時保持部分の内部で熱対流が起こり、保持部分（貫通孔）内の生体試料由来の遺伝子が保持部分（貫通孔）外へ拡散し、隣接する保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液を汚染する可能性があるため、溶液置換が完了した段階で保持部分にシリコンオイル等を滴下するとともに、ＰＣＲ反応液の中に温度応答性高分子を添加してかかる熱対流を抑制することが好ましい。なお、生体試料をＰＣＲ反応のための反応液に懸濁して誘電泳動により保持部分に移動しようとすると、ＰＣＲ反応のための反応液中に含まれる各種電解質のために電圧を印可すると過電流となり、発熱による熱対流が発生して生体試料を保持部分に移動して固定することが困難になるため、かかる溶液置換を行うことが好ましい。封止を行った後、前述した破砕を行って核酸の検出を行う。【００３０】
また、本発明を別の側面から捉えることも可能である。本発明に係る生体試料固定装置（以下「固定装置」ともよぶ）は、生体試料を構成する成分の存在を示す物質により発せられる光を検出するために該生体試料をそれぞれ保持する複数の保持部分を有する生体試料固定装置であって、平板状の基板と、前記基板上に配置され、前記複数の保持部分が形成された保持部と、を備え、前記保持部は、少なくとも絶縁体膜と、該絶縁体膜と前記基板との間に設けられた遮光膜とを有し、前記保持部分は、前記保持部の上表面に開口し、前記絶縁体膜および前記遮光膜を経て前記基板まで延在する（到達する）、という構成を備える。【００３１】
この構成によれば、保持部に遮光膜を設けたことにより、例えば絶縁体膜自体の自家蛍光に起因するバックグラウンドノイズや隣接する保持部分からの漏れ光に起因するクロストークノイズなどの光ノイズを低減することができ、各保持部分内の観察対象物質により発せられる光のみを高感度かつ高精度に検出することが可能となる。そして、高感度かつ高精度の検出が可能であることから、検出時間の短縮を図る効果も期待できる。【００３２】
ここで、本発明の構造体が、前記保持部の上に前記生体試料を含む懸濁液を収容する収容部を更に備えており、前記保持部分が前記収容部と連通するように設けられていることが好ましい。これにより、各保持部分内への生体試料の導入を容易に行うことができる。なお、保持部分内へ生体試料を導入する方法としては、自然沈降（重力）を利用してもよいし、誘電泳動力を利用することもできるが、数秒程度の極めて短い時間で多数の保持部分に対し生体試料を導入できることから、誘電泳動力を利用する方法がより好適である。【００３３】
誘電泳動力を生体試料に作用させるには、収容部及び保持部分を懸濁液で満たした状態で、保持部分に電気力線が集中するような交流電界をかければよい。かかる交流電界を印加するための構成として、例えば、前記基板の前記保持部側の表面に、互いに異なる保持部分に対応する位置にそれぞれ配置される一対の電極が設けられ、前記保持部分は、前記保持部の上表面から前記基板上の電極まで延在する、という構成を採用することができる。また、前記基板の前記保持部側の表面に、前記保持部分に対応する位置に配置される第１の電極が設けられるとともに、前記保持部分は、前記保持部の上表面から前記基板上の第１の電極まで延在し、前記保持部および前記収容部を挟んで前記第１の電極とは反対の側に第２の電極が設けられる、という構成を採用することもできる。いずれの構成の場合も、２つの電極の間に所定の波形を有する交流電圧を印加することで、懸濁液中の生体試料を保持部分内へと導入することが可能である。【００３４】
ここで、前記遮光膜は、前記絶縁体膜と前記基板との間の境界面のうち前記複数の保持部分以外の部分に設けられているとよく、好ましくは、遮光膜を、前記絶縁体膜と前記基板との間の境界面のうち前記複数の保持部分以外の部分全体に設けるとよい。ただし、基板上に一対の電極が設けられている構成において、金属系膜からなる遮光膜を用いる場合には、電極間の短絡を防止するために、遮光膜を、保持部分以外の部分であって且つ前記電極の上にのみ設けることが好ましい。【００３５】
以下、図面を参照しつつ、本発明を更に詳細に説明する。図１に例示した本発明の固定装置では、装置の本体６は、下部電極基板２（一対の電極の一方）、スペーサー３で囲まれて構成された収容部５０、保持部分となる貫通孔５を設けた平板状の絶縁体４及び絶縁体と下部電極基板２の間に設置した遮光部材７からなる保持部と、上部電極基板１（一対の電極の他方）とから構成されている。ここで、上部電極基板１はスペーサーの上面に密着され、スペーサー内に生体試料懸濁液が満たされると、貫通孔（保持部分）５を通して下部電極基板２に電気力線が通るようにされるとともに、上蓋としてスペーサーの上面を覆い、生体試料懸濁液の飛散や蒸発を防止する役割も果たしている。したがって、図１に示す固定装置では、収容部５０および保持部分（貫通孔）５の内部空間が、本願の所定の誘電泳動空間に相当する。【００３６】
保持部を構成する絶縁体４と遮光部材７に設けられた保持部分（貫通孔）は同一の寸法、形状（円形）であり、それぞれの貫通孔が一致するように重ねられている。また保持部の保持部分（貫通孔）は、その一端が下部電極基板２によって閉塞され、生体試料が当該電極と接触可能になっている。なお図１の構成は、例えば収容部５０を密閉可能な箱状の形態とし、かつ、生体試料を含有する懸濁液の比重を生体試料の比重以上として生体試料がその懸濁液中で上方向に浮上するようにする（生体試料の比重が小さい場合であっても、懸濁液の比重をそれ以上とすることは容易である）場合、逆とする、即ち下部電極基板２を上部、上部電極基板１を下部とすることができる。しかし、生体試料の操作に重力をも利用することができること、固定後の生体試料の分別回収や抽出により生体試料から溶出した遺伝子の分別回収を考えると、当該操作を上部からの吸引等、極めて単純な操作で実施可能とするために、図１に例示したように、保持部は収容部５０の下部に位置するようにし、更に収容部５０であるスペーサーの上部を塞ぐ部分（図１における上部電極基板１）を取り外し可能としておくことが特に好ましい。【００３７】
本発明における生体試料とは、動植物等の生体に由来する細胞や微生物等、核酸を含有するものであって、誘電泳動により移動可能な誘電体であれば制限はない。具体的に例えば、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫又は培養細胞等を例示できる。上記例示した装置に供する生体試料懸濁液は、上記のような生体試料が誘電泳動で移動できるように懸濁された状態の液であれば良く、例えばマンニトールやグルコース、スクロース等の糖類の水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウムや塩化マグネシウムなどの電解質、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質を添加した水溶液に、解析する生体試料を懸濁した液が例示できる。懸濁する生体試料は、生体から取得した試料を原料として、種々の前処理を行って調製することができる。例えばヒト血液中の癌細胞を生体試料とする場合には、ヒトから採取した血系から、公知の手法により血小板や赤血球等を除去する前処理をしたものを生体試料として使用することが例示できる。【００３８】
図１に例示した装置では上部電極基板１を上蓋として収容部５０を塞ぐ構成としているが、収容部５０をこのような上蓋のない液溜として構成するのであれば、例えば図３に示した構成のものを例示できる。図３の装置では、下部電極基板２上に一対の電極３１及び３２を配置して図１における構成中の上部電極基板１を省略している。図４は図３の装置のＢ−Ｂ’断面を示す図であり、一対の電極３１及び３２を櫛状にして一枚の電極基板上に配置したものである。【００３９】
図３および図４に示す固定装置の構成について詳細に述べると、一対の電極３１、３２はいわゆる櫛型の形状を有している。図３に示すように、電極３１、３２は、それぞれ、スペーサー３に対して保持部分（貫通孔）５側に位置する共通の一つの平面上に配置された複数の小電極部（図中、帯状に延在する部分）を有し、これらの小電極部分がその基端部で接続されて、交流電源１１の端子に接続されている。各電極の小電極部は交互に、且つ共通する一の平面上に配置されている。そして、この一対の電極３１、３２のそれぞれの小電極部の上には、絶縁体４および遮光部材７に貫通して形成される保持部分（貫通孔）５が重ねられる（図４を参照）。したがって、図４においては、左右に隣接して並ぶ保持部分（貫通孔）５に対応する電極は３１もしくは３２となり、異なることとなる。このとき、電極３１側の小電極部と電極３２側の小電極部との間の距離は、所定の電極間距離に保たれている。この所定の電極間距離は、下記に示すように、固定装置により固定目標とされる生体試料の誘電泳動を生じさせるのに十分な距離を言い、生体試料等の特性を考慮して適宜決定され得る。このように構成された固定装置では、収容部５０および保持部分（貫通孔）５の内部空間が、本願の所定の誘電泳動空間に相当する。そして、保持部分（貫通孔）５の底部に電極３１、３２のそれぞれの小電極部が配置され、且つ、それらの小電極部は、共通する一の平面上に配置されている。そのため、電極間に交流電圧が印加されると、電極３１の小電極部に対応する保持部分（貫通孔）５と、電極３２の小電極部に対応する保持部分（貫通孔）５との間で電気力線が走り、その間に介在する生体試料に対して誘電泳動力を作用させることが可能となる。【００４０】
このような電極構成を有する固定装置では、電気力線が経由する生体試料懸濁液中の距離を、図１および図２に示す固定装置と比べて短くすることが可能となる。これは、図１等に示す固定装置では、スペーサー３等の厚さに相当する距離だけ離れた一対の電極１、２間で電気力線が経由することになるが、図３等に示す固定装置では、基本的にはスペーサー３の厚さを排除して電気力線を電極間に経由させることになり、また絶縁体４や遮光部材７の厚さはスペーサー３の厚さに比べて極めて小さいことによる。このように電極間に走らせる電気力線の距離を短くすることで、電極に印加する交流電圧を低くした状態でも、懸濁液中の生体試料に対して効果的な誘電泳動力を作用させることが可能となる。その結果、交流電源１１の小型化や、固定装置の電極構成における絶縁性の維持を好適に図ることができる。【００４１】
さらに図３等に示すように、一対の電極３１、３２を生体試料を含む懸濁液を収容する空間に対して一方側に配置させることで、その反対側（図３等においては固定装置上方側）における固定装置構成の設計をより自由にできる。これにより固定装置において、図３等に示すように、上蓋を必要としない構成を採用でき、その結果電極に交流電圧を印加して生体試料に誘電泳動力を作用させ、保持部の保持部分（貫通孔）に固定しつつ、固定された生体試料のうちの任意のものをマイクロピペット等で採取することを容易にできたり、固定後の生体試料に対して必要な所定の溶媒等を供給することが容易となる。また、固定後の生体試料を観察する場合、蓋等の構造物が存在しないことにより、生体試料から発せられる観察すべき信号（発光等）を蓋等による減衰が無い状態で的確に取得することが可能となる。一方で、図３等に示す固定装置においても、収容部５０に入れた生体試料を含む懸濁液の水分の蒸発を防止したり、図３のような態様の固定装置においては、生体試料を含む懸濁液を安定して固定装置に供給するという効果を得るために、上蓋を設けることは有用である。【００４２】
また、図３、図４に示す態様では、絶縁部４等には複数の保持部分（貫通孔）が形成されているが、原理的には図４Ａに示すように、絶縁部４等に１つの保持部分（貫通孔）５が形成された態様も、本発明に係る生体試料固定装置の範疇に属する。すなわち、当該態様では一つの保持部分（貫通孔）５が形成されるとともに、それに隣接して拡径凹部５’が形成されている。この拡径凹部５’は、保持部分（貫通孔）５と比べて大きな開口径（例えば、数１０倍程度）を有している。そして、一対の電極のうち一方の電極３１が保持部分（貫通孔）５の底部に配置され、
他方の電極３２は拡径凹部５’の底部に配置される。さらに、保持部分（貫通孔）５と拡径凹部５’は、その上方開口部側で収容部５０と接続している。このような構成の場合、保持部分（貫通孔）５の内部空間、拡径凹部５’の内部空間、収容部５０に懸濁液が存在することになるから、これらの空間が本発明に係る所定の誘電泳動空間に相当する。この所定の誘電泳動空間内に生体試料を含む懸濁液を配した状態で一対の電極３１、３２間に電圧印加すると電極間に電気力線が生じる。ただし、拡径凹部５’側では比較的その開口径が大きいため、そこに集約される電気力線の密度が低くなる一方で、保持部分（貫通孔）５側では上述のようにその開口部に電気力線が集中する。そのため、懸濁液中の生体試料を誘電泳動力によって引き寄せる効果は拡径凹部５’側では無視し得る。したがって、図４Ａに示す態様は、実質的に生体試料を保持する保持部分（貫通孔）５は一つのみ形成されている態様に相当する。そして、電極３２は、保持部分（貫通孔）５の内部空間を形成する平面上に、電極３１に対して所定の電極間距離をもって該電極３１とともに配置されていることから、図４に示した態様と同じように、１つの保持部分（貫通孔）５に対して、生体試料を固定することが可能であり、電極間に印加する交流電圧を可及的に小さくすることが可能となる。生体試料の保持効果の詳細については、再度後述する。【００４３】
なお、一つの保持部分（貫通孔）が設けられる別の態様としては、絶縁部４等の表面における表面張力を利用して、生体試料懸濁液を保持部分（貫通孔）５の外部に配して電極間に生体試料懸濁液が存在する状態で、誘電泳動のための電圧印加を行ってもよい。【００４４】
さらに生体試料を固定する際に電極間に印加する交流電圧を小さくする他の形態として、図４Ｂに示す形態が例示できる。図４Ｂに示す形態は、図４に示す形態と同様に、複数の保持部分（貫通孔）５が設けられ、それぞれの保持部分（貫通孔）５の上方の開口部は収容部５０に接続している。ここで、図４Ｂに示す形態と図４に示す形態については、一対の電極３１、３２が、保持部分（貫通孔）５に対して共通の設置位置側に配置されている、すなわち一対の電極が懸濁液が存在する収容部５０等を挟まない状態で配置されている点で一致しているが、図４Ｂに示す形態では基板２上の電極の高さが一定ではない点、換言すれば基板２上に電極が段差状に配置される点で相違する。その結果、それぞれの電極上に位置する保持部分（貫通孔）５の深さが場所によって異なっている。【００４５】
このように構成される固定装置であっても、上記の通り、一対の電極が収容部５０等を挟まない状態で配置されているため、誘電泳動力を発生させるための印加電圧を可及的に小さくすることができる。そして、電極上に設けられた保持部分（貫通孔）５の深さを場所によって変え、必要に応じて保持部分（貫通孔）５の開口部の径も適宜変化させることで、異なった生体試料をそれぞれに適した保持部分（貫通孔）５で同時に固定することが可能となる。例えば、懸濁液が異なる生体試料を含む場合や、細胞とその凝集体を同時にそれぞれ固定する場合等に、図４Ｂに示す態様は有用と考えられる。【００４６】
また上述までのような蓋の無い構成の他の形態としては、図４Ｃに示す一対の電極３１、３２と保持部分（貫通孔）５との相対位置関係を有する固定装置が挙げられる。図４Ｃは、一対の電極３１、３２と、絶縁部４等に形成された保持部分（貫通孔）５とを重ね合わせて記載した概略図である。本形態では、それぞれ連続した線状（電極の幅を考慮した場合には帯状とも言うことが可能である）の形状を有する一対の電極３１、３２が共通の平面上に配置されており、且つ両電極の線間の距離は、所定の電極間距離に保たれている。この所定の電極間距離は、下記に示すように、固定装置により固定目標とされる生体試料の誘電泳動を生じさせるのに十分な距離を言い、生体試料等の特性を考慮して適宜決定され得る。そして、このように配置された一対の電極３１、３２の上に保持部分（貫通孔）５を重ねて配置することで、図３等で述べたように、電極３１、３２間で生じる電気力線が経由する生体試料懸濁液中の距離を可及的に短くする形態での生体試料の固定が、各電極上に設けられた保持部分（貫通孔）５で実現し得る。また、同様に、図４Ｃに示す構成は、一対の電極を生体試料を含む懸濁液を収容する空間に対して一方側に配置させる形態であることから、固定装置上方を開放した構成とすることができ、固定された生体試料等への容易なアクセスが可能な状態となる。【００４７】
なお、図４Ｃには、連続した折れ線形状の一対の電極の構造を示したが、これに代えて、連続した曲線形状の一対の電極構造を採用してもよい。例えば、それぞれの電極を、渦巻き状に形成することも可能である。この場合においても、一対の電極間の距離は、上記所定の電極間距離とされる。【００４８】
上述までの図１−図４Ｃに示した固定装置において、収容部５０の一部を絶縁体の材料で構成するのは、電極に交流電圧を付加した際に、任意の保持部分（貫通孔）に対して電気力線を集中させ、生体試料を当該保持部分に移動させて固定するためである。なお保持部分（貫通孔）は、その縦と横の間隔が等間隔に配置されていることが好ましいが、それ以外にも、例えば直線上に、縦方向又は横方向にのみ等間隔で配置されていても良い。このように保持部分（貫通孔）を配置することで、電極間に印加した交流電圧によって生じる電界がすべての保持部分（貫通孔）にほぼ均等に生じることになり、本発明の装置において均一な操作を実現するという効果を発揮するからである。【００４９】
保持部は、その全部を絶縁体の材料で構成するか、又は、少なくともその一部を絶縁体で構成する。絶縁体は、生体試料をそこに設けた保持部分（貫通孔）に引き寄せて固定することから、生体試料と親和性のあるものであることが好ましい。具体的に生体試料が親水性である場合には親水性の絶縁体が、生体試料が疎水性である場合には疎水性の絶縁体が好ましい。親和性の目安としては、一般的には、絶縁体の表面に前記生体試料に近い親和性を有する液体を滴下したときに形成される液滴と絶縁体の表面との接触角で示される（接触角が小さいほど液体と絶縁体の表面との親和性が高く、接触角が大きいほど液体と絶縁体の表面との親和性が低い）。親水性の比較的高い絶縁体としてはガラスや酸化チタン等が、疎水性の比較的高い絶縁体としてはポリスチレン、ポリイミド、テフロン（登録商標）等の樹脂が例示できるが、扱う生体試料の親水性、疎水性に応じてこれらの材料を選択して用いることが好ましい。なお、本質的に生体試料との親和性が低い絶縁体を用いざるを得ない場合であっても、絶縁体の表面を改質することによって生体試料との親和性を高めることができる。樹脂等の疎水性の絶縁体を親水化する方法としては、既知の方法である、プラズマ処理、化学修飾、タンパク質の物理吸着などによる修飾、或いはこれらの方法を任意に組み合わせた方法などを用いればよい。またガラス等の親水性の絶縁体を疎水化する方法としては、シランカップリング剤を親水性の絶縁体表面に結合させる化学修飾による方法などを用いればよい。【００５０】
保持部に保持部分となる貫通孔を設けるためには、絶縁体の種類に応じた種々の方法を利用することができる。例えば樹脂に保持部分（貫通孔）を設けるためにはレーザーを照射する方法や、保持部分（貫通孔）を設けるためのピンを有する金型を用いて樹脂を成形する方法などの既知の方法を用いることができる。また光硬化性樹脂などを用いる場合は、保持部分（貫通孔）に相当するパターンを描画した露光用フォトマスクを用いて一般的なフォトリソグラフィー（露光）とエッチング（現像）により保持部分（貫通孔）を設けることができる。【００５１】
保持部は、その全部を絶縁体の材料で構成することもできる。例えば図１で示したように、保持部の一部である４を絶縁体の材料で構成し、遮光部材７を非絶縁体で４とは分けて構成することも可能である。例えば加工の容易な材料でスペーサー３（又はそれに代わり、枠）を形成し、懸濁液が漏れないように保持部分（貫通孔）を設けた樹脂製の絶縁体４と遮光材７を当該枠やスペーサーに結合することで、保持部の保持部分と収容部５０を連通することが例示できる。なお、保持部分（貫通孔）を設けた絶縁体４が遮光性の部材か、又は遮光処理した部材であれば、遮光部材７を省略することができる。遮光部材は、検出しようとする光（電磁波）を遮光することができれば、特に制限はない。例えば可視光領域である波長３８０ｎｍから７８０ｎｍの光に対しての遮光部材として、金属薄膜が例示できるが、基材である電極基板との密着性を考慮するとＣｒ金属薄膜（膜厚１００ｎｍ）が好ましい金属薄膜として例示できる。このように絶縁体と下部電極基板の間に遮光部材を設置し、保持部分（貫通孔）周辺の光ノイズを低減することにより、例えば保持部分（貫通孔）内において生体試料から発する微弱な光などの情報をより高感度に検出することが可能となる。【００５２】
図１の装置について、更に説明する。収容部５０を構成するスペーサー３は、生体試料の懸濁液を保持するスペースを確保するためのものであり、例えばガラス、セラミック、樹脂等の絶縁体を材料として構成しても良いし、上部電極基板１と下部電極基板２を電気的に導通しない構成であれば金属等の導電体を材料として構成しても良い。図１の例では、スペーサーに導入流路及び該流路に連通する導入口８と、懸濁液を排出する排出流路及び該流路に連通する排出口９を設け、装置に供する生体試料懸濁液の供給と排出を迅速に実施可能としている。スペーサー３の寸法、形状およびスペーサーの内側の空間と厚みは、収容部５０に収容する懸濁液の量との関係で決定すれば良く、特に制限はないが、通常は生体試料懸濁液を数μＬから数ｍＬ程度入れる容量があればよく、例えば、スペーサーのサイズが縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ程度の場合、スペーサーの内側の空間は、縦２０ｍｍ×横２０ｍｍ程度であればよく、スペーサーの厚みは０．５から２．０ｍｍ程度であればよい。電極基板上に配置される電極の材質は、導電部材であって化学的に安定な部材であればとくに制限はなく、白金、金、銅などの金属やステンレスなどの合金、及び、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウムスズ）等の透明導電性材料等を使用することができる。特に本発明の装置に生体試料懸濁液を供して解析を行った際に、保持部の保持部分（貫通孔）内において生体試料から得られる光などの可視的情報をモニターする目的で電極基板を透明なガラス等とする場合、ＩＴＯ電極は、その透明性や成膜性等の面で特に好ましい電極である。【００５３】
図２は、図１に示した装置のＡ−Ａ’断面図を示した概略図である。収容部５０を構成するスペーサー３、下部電極基板２、保持部を構成する絶縁体４及び遮光材７、及び上部電極基板１は貼り合わせてあるが、貼り合わせる手段としては、急速硬化タイプの接着剤をスペーサーの型枠に流し込み、スペーサーの形成と貼り合せを同時に行う方法、各部材を接着剤で貼り合わせる方法、加圧した状態で加熱して融着させる方法、スペーサーとしてＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）やシリコンシートのような表面粘着性のある樹脂を用いてこれらを作製し、圧着して貼り合わせる方法等が例示できる。装置の一対の電極には、導電線１０を介して交流電源１１が接続される。交流電源１１は、保持部分（貫通孔）に生体試料を移動させ、固定する電界を発生させるのに十分な交流電圧を電極間に印加できれば特に制限はない。具体的に例えば、ピーク電圧が１Ｖから２０Ｖ程度で、周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚ程度の正弦波、矩形波、三角波、台形波等の波形の交流電圧を印加できる電源が例示できるが、中でも、生体試料を移動させ、１つの保持部分（貫通孔）に１個の生体試料のみを固定し得るようにできる波形の交流電圧を電極間に印加することが特に好ましい。かかる波形の交流電圧としては、矩形波を使用することが好ましい。矩形波は、波形が正弦波、三角波、台形波である場合に比べて、瞬時に設定したピーク電圧に到達するため、生体試料を保持部分（貫通孔）に向けて速やかに移動させることが可能となり、２個以上の生体試料が重なるように保持部分（貫通孔）に入る確率を低くできる（１つの保持部分（貫通孔）に１個の生体試料のみを固定し得る確率が高くなる）からである。生体試料は電気的にコンデンサーと見なすことができるが、矩形波のピーク電圧が変化しない間は、保持部分（貫通孔）に固定された生体試料には電流が流れ難くなって電気力線が生じ難くなり、この結果生体試料を固定した保持部分（貫通孔）には誘電泳動力が発生し難くなる。従って、一度保持部分（貫通孔）に生体試料が固定されると、別の生体試料が同一の保持部分（貫通孔）に固定される確率は低くなり、代わりに電気力線が生じ誘電泳動力が発生している保持部分(生体試料を固定していない、空の保持部分（貫通孔））に、順次、生体試料が固定されるためである。なお、本発明の装置では、直流成分を有しない交流電圧を発生する電源を採用することが好ましい。直流成分を有する交流電圧を印加すると、直流成分により発生した静電気力により生体試料が特定の方向に偏った力を受けて移動し、誘電泳動力によって保持部分（貫通孔）に固定し難くなるからである。また直流成分を有する交流電圧を印加すると、生体試料を含有する懸濁液に含まれるイオンが電極表面で電気反応を生じて発熱し、それによって生体試料が熱運動を起こすため誘電泳動力によって動きを制御できなくなり、保持部分（貫通孔）に移動させて固定することが困難になる。【００５４】
本発明の装置では、印加する交流電圧の波形を好ましくは矩形とすることにより、１つの保持部分（貫通孔）に１個の生体試料のみを固定し得るようにするものであるが、かかる目的を達成するために、更に、保持部分（貫通孔）の配置、寸法、形状を、１つの保持部分（貫通孔）に１個の生体試料のみを固定し得るのに適した配置、寸法、形状とすることが好ましい。例えば配置に関しては、保持部に保持部分（貫通孔）をアレイ状に配置することが好ましいが、隣接する保持部分（貫通孔）同士の間隔が狭すぎると１つの保持部分（貫通孔）に複数の生体試料が固定されてしまう確率が高くなる、また両隣の保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液が混合する等、生体試料の解析に良い影響を与えない。逆に、隣接する保持部分（貫通孔）同士の間隔が広い場合は保持部分（貫通孔）と保持部分（貫通孔）の間に生体試料が残されてしまい、生体試料を固定できない保持部分（貫通孔）が発生する確率が高くなるからである。【００５５】
上記課題を回避するためには、隣接する保持部分（貫通孔）同士の間隔を、固定しようとする生体試料の粒径の３倍以上２０倍以下の範囲とすることが例示できる。また、生体試料に誘電泳動力が作用し保持部分（貫通孔）で固定を行うためには、保持部分（貫通孔）同士が接していなければよいとの観点に立てば、当該間隔は、１μｍ以上５０００μｍ以下が好ましく、更には５μｍ以上２５００μｍ以下が好ましく、更には１０μｍ以上５００μｍ以下が好ましい。次に、保持部分（貫通孔）の寸法、直径及び深さについては、それぞれ生体試料の直径の２倍以上５倍以下の範囲にすることが好ましい。またこれらの寸法については、生体試料に誘電泳動力が作用し保持部分（貫通孔）に生体試料が入り込み保持できればよいとの観点に立つこともできる。例えば、固定対象の生体試料がウィルス、微生物、細胞、組織片であれば、当該寸法は、１μｍ以上１０００μｍ以下と設定できる。特に、固定対象の生体試料が細胞やその凝集体である場合には、当該寸法は５μｍ以上５００μｍ以下であるのが好ましい。また、固定対象の生体試料が癌細胞やその凝集体（２〜３個程度）の場合には、当該寸法が１０μｍ以上１００μｍ以下であるのが好ましい。このようにすることで、保持部分（貫通孔）の底面の電極面と生体試料に静電気力が発生し、生体試料は保持部分（貫通孔）に確実に固定されるとともに解析を行うための反応空間を確保することができる。【００５６】
本発明の解析方法は、保持部の保持部分（貫通孔）に前記生体試料を固定した後、前記生体試料の特定の遺伝子を検出することを特徴とする。以下、本発明の解析方法について、図５から図８を用いて説明する。【００５７】
まず、図５に示すように、収容部５０を構成するスペーサーの導入口８から生体試料懸濁液を供し、前述した波形を有する交流電圧を印加すると、電極の真上に位置する保持部分（垂直方向に貫通した貫通孔５）に電気力線１２が集中し、生体試料１３に誘電泳動力が作用することで生体試料が電気力線に沿って移動する結果、１つの保持部分（貫通孔５）につき生体試料１つが固定される。以下では図５を用いて誘電泳動力の原理を説明する。交流電圧すなわち交流電界中に置かれた溶液の中の生体試料１３（細胞等）の誘電体粒子には分極が生じ、正負の電荷が誘導される。ここで図５に示すように、下部電極基板２上に配置した絶縁体に設けた保持部分（貫通孔）に、一様でない不均一な電界すなわち電気力線１２が与えられると、生体試料１３は電界の集中する方向（電気力線が密な方向）、すなわち保持部分（貫通孔）の方向へと引き寄せられる。これが誘電泳動力１４である。一般に誘電泳動力は、粒子の体積、粒子と溶液の誘電率の差、不均一な電界の大きさの２乗に比例する。例えば、直径５から１０μｍ程度の粒子に対し、電界として周波数１００ｋＨｚから３ＭＨｚ、１×１０５から５×１０５Ｖ／ｍの交流電界を与えると、誘電泳動力が作用して粒子が電界の集中する方向に引き寄せられる。この場合、生体試料は主に誘電泳動力、重力、電極からの静電気力によって保持部分（貫通孔）に誘導される。なお、装置に供する生体試料の数に特に制限はないが、生体試料を有効に使用することを考慮すると、保持部に設けた保持部分（貫通孔）の数と略同等であることが好ましい。【００５８】
次に、図６に示すように交流電圧を印加したまま生体試料と結合する物質１５で修飾した保持部分（貫通孔）の内側に生体試料を結合する。生体試料と結合する物質は、生体試料と特異的に結合すれば特に制限はない。例えば、生体試料表面の特有の物質を認識する分子（リガンド−レセプター、糖鎖−レクチン、抗原−抗体）、細胞の脂質二重膜に結合する脂質オレイル基を有するＢｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ａｎｃｈｏｒ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＡＭ）が例示できるが、比較的短時間に生体試料と結合させることを考慮すると、生体試料表面と静電気的に結合するポリ−Ｌ−リジンが好ましい物質として例示できる。【００５９】
生体試料と結合する物質による保持部分（貫通孔）の修飾方法は、保持部分に生体試料が結合できれば特に制限はない。例えば、Ａｕ−チオール結合を利用し、保持部分（貫通孔）底面のＡｕ電極にチオール基を持つ生体試料と結合する物質を反応させることで保持部分（貫通孔）内を特異的に修飾することができる。また生体試料を保持部分（貫通孔）に固定後、生体試料と結合する物質を含む溶液を収容部５０へ供することで保持部分（貫通孔）と生体試料を結合することが可能である。なお、生体試料と結合する物質を含む溶液を供することによって固定する場合は、結合反応後に生体試料を懸濁する溶液、例えばマンニトールやグルコース、スクロース等の糖類の水溶液及びその水溶液に塩化カルシウムや塩化マグネシウムなどの電解質やＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質を含有した水溶液にて保持部分を洗浄し、固定されなかった成分を除去することが好ましい。このように生体試料と結合する物質によって保持部分（貫通孔）に固定された生体試料は、交流電圧を印加し続けなくとも保持部分（貫通孔）から脱離することがなくなる。【００６０】
続いて図７に示すように解析のための試薬溶液を収容部５０へ注入する。解析に用いる試薬は特定の遺伝子を検出することができれば特に制限はない。例えば、市販のリアルタイムＰＣＲ法に用いるプライマー、プローブ、耐熱性ポリメラーゼやＦＩＳＨ法に用いる蛍光プローブなどが例示できる。一般的に特定の遺伝子の検出の際は、２本鎖のＤＮＡを高温で加熱することで熱変性し１本鎖にした後に、その１本鎖のＤＮＡに対してプライマー、プローブ、耐熱性ポリメラーゼを反応させたり、特定の遺伝子に相補的な蛍光プローブをハイブリダイゼーションさせて検出することが多い。したがって、保持部分（貫通孔）に固定した生体試料の遺伝子を解析する際に加熱処理を行う場合は、熱対流によって保持部分（貫通孔）内の生体試料由来の遺伝物質が保持部分（貫通孔）外へ拡散し、隣接する保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液を汚染する可能性が考えられる。そのような場合は解析のための試薬溶液中に温度応答性高分子１６を添加するとよい。温度応答性高分子１６は、高温でゲル化するものであれば特に制限はない。例えば、ポリビニルメチルエーテル（ＰＶＭＥ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＭＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）を例示できるが、隣接する保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液を汚染せず、生体試料の解析を阻害しない事を考慮すると、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が３２℃付近のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）が特に好ましい。【００６１】
さらに図８に示すように生体試料を結合した保持部分（貫通孔）を非水溶性液体１７で覆うことで、隣接する保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液の汚染及び生体試料懸濁液の蒸発を防止することが可能である。非水溶性液体は、水溶性液体でなければ特に制限はない。例えば、各種オイル類、フッ素溶媒などが例示できるが、保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液を蒸散させず、隣接する保持部分（貫通孔）内の生体試料懸濁液と混合せず、生体試料の解析を阻害しない事を考慮すると、ミネラルオイルが好ましい非水溶性液体として例示できる。なお、非水溶性液体１７で保持部分（貫通孔）を覆う際は、上蓋となる上部電極基板１を設置したまま非水溶性液体を収容部５０へ導入することで保持部分（貫通孔）を覆ってもよいし、生体試料と結合する物質によって生体試料は保持部分（貫通孔）に固定されているため、上蓋を外してから非水溶性液体にて保持部分（貫通孔）を覆ってもよい。解析後、試料を採取し更に詳細解析することを考慮すると後者の方法がより好ましい。【００６２】
特定の遺伝子を検出する方法は、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、マルチプレックスＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法などが好ましい方法として例示できる。特に生体試料を保持部分（貫通孔）に固定したまま特定の遺伝子を増幅させて蛍光検出する、もしくは特異的遺伝子に蛍光プローブを結合して検出し、生体試料を固定した保持部分（貫通孔）からの蛍光を直接検出することのできるリアルタイムＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法などが検出方法として好ましい。また本発明の装置は、多項目同時測定にも対応するため、解析において使用するプライマーやプローブは、適宜、塩基配列を変更した複数のプライマー、プローブを用意して、例えば癌細胞中の癌幹細胞の特定や同一種の細菌、ウイルスの間における変異株の同定、識別も行うことができる。【００６３】
上記図５−図８に基づいた本発明の解析方法は、図１及び図２に示す固定装置での解析方法であるが、図３、図４、図４Ｂに示す固定装置での生体試料の解析方法も、図１５Ａに示すように本質的に同様に行われる。すなわち、櫛状又は線状（帯状）に形成される一対の電極３１、３２に対して交流電圧が印加されると、その真上に位置する互いに隣接する貫通孔（保持部分）５間で電気力線１２が集中し、その結果、生体試料が誘電泳動力を受けて、１つの保持部分（貫通孔）５につき生体試料が１つ固定されることになる。また、図４Ａに示す固定装置での生体試料の解析方法については、図１５Ｂに示すような電気力線１２が発生する。すなわち、１つの保持部分（貫通孔）５の底部に設けられた電極３１と、拡径凹部５’の底部に設けられた電極３２との間に電気力線が発生するが、拡径凹部５’の方が電極面積が広いことから、そこに集まる電気力線の密度は、保持部分（貫通孔）５に集まる電気力線の密度よりも低くなる。その結果、生体試料の固定は、保持部分（貫通孔）５側で生じ、拡径凹部５’側では生じないこととなり、結果として、１つの保持部分（貫通孔）５に１つの生体試料が固定されることになる。そして、上記に示した溶媒等が、図１５Ａや図１５Ｂに示したように固定された生体試料に対して適宜供給されることで、生体試料の解析が行われる。この場合固定装置上方には蓋が設けられていないことから、蓋を取り外す手間を要することなく溶媒等の供給が可能となり、また解析時には、蓋によって解析作業が阻害されないという利点が見出せる。【００６４】
図９は、本発明の装置の応用例を示すものである。例えば癌などの異常細胞１８の存在が疑われる懸濁液を装置に供し、細胞を保持部分（貫通孔）に固定する。一方で当該検出の目的となる異常細胞１８内の特定の遺伝子を検出する遺伝子検出試薬を導入し、異常細胞内の特定の遺伝子を増幅する、もしくは特定の遺伝子に蛍光プローブをハイブリダイゼーションすることで検出する。さらに、蛍光顕微鏡１９にて検出された癌などの異常細胞を生体試料採取手段２０（マイクロピペット）を用いて採取し、より詳細に解析することも可能である。【００６５】
上記では生体試料採取手段としてマイクロピペットを説明したが、生体試料採取手段は生体試料を採取することができれば特に制限はなく、マイクロピペット以外にも、電気浸透流を利用して精密に生体試料を採取可能な生体試料採取手段を用いることができる。また、図３、図４、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃに示す固定装置においては、当初より固定装置上方には蓋が設けられていないことから、マイクロピペット等を利用した生体試料の取り出しを容易に行い得る。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の装置は、以下の効果を奏するものである。
（１）本発明の装置は、保持部に設けた保持部分（貫通孔）１つに対して１つの生体試料を速やかに固定することができる。特に、保持部分としてアレイ状に配置した複数の貫通孔を設けた絶縁体で保持部を構成した態様では、複数の生体試料を１つずつ速やかにアレイ状に配置した保持部分（貫通孔）に固定することができる。また、一対の電極を共通の平面上に配置する態様では、交流電圧の印加に要する電源の小型化を図ることができる。
（２）本発明の装置は、保持部分（貫通孔）に生体試料を固定したまま、複数の生体試料を１つずつ同時に解析することができる。特に、一対の電極を共通の平面上に配置する態様では、装置上方に蓋となる構造物を設置しない態様も採用し得ることから、生体試料の解析をより好適に行い得る。
（３）本発明の装置は、保持部分（貫通孔）に固定した生体試料由来の遺伝子産物を採取する事ができる。特に、一対の電極を共通の平面上に配置する態様では、装置上方に蓋となる構造物を設置しない態様も採用し得ることから、生体試料の取得をより容易に行い得る。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】本発明の装置を説明するための図である。
【図２】図１に示した装置の本体６のＡＡ’断面図である。
【図３】本発明の上蓋のない装置を説明するための図である。
【図４】図３に示した装置の本体６のＢＢ’断面図である。
【図４Ａ】図４に示した装置に関する別の形態の概略構成を示す断面図である。
【図４Ｂ】図４に示した装置に関する別の形態の概略構成を示す断面図である。
【図４Ｃ】本発明の上蓋のない装置の別の形態における、一対の電極と保持部分（貫通孔）との相対位置関係を示す図である。
【図５】本発明の装置による解析方法を説明するための図である。
【図６】本発明の装置による解析方法を説明するための図である。
【図７】本発明の装置による解析方法を説明するための図である。
【図８】本発明の装置による解析方法を説明するための図である。
【図９】本発明の装置を異常細胞の検出装置として応用した例を示す図である。
【図１０】一般的なフォトリソグラフィーとエッチングを用いて、保持部分（貫通孔）を設けた絶縁体と遮光部材からなる保持部及び電極が一体となった基板を作製する工程の概略図である。
【図１１】本発明及び実施例１に用いた装置を説明するための図である。
【図１２】図１１に示した装置の本体６のＣＣ’断面図である。
【図１３】本発明の装置と、保持部分（貫通孔）に固定した特定の細胞もしくは遺伝子を採取する生体試料採取手段として、マイクロピペットを設置した装置の図である。
【図１４Ａ】図３に示した装置に対応する、保持部分（貫通孔）を設けた絶縁体と遮光部材からなる保持部及び電極が一体となった基板を作製する工程の第一の図である。
【図１４Ｂ】図３に示した装置に対応する、保持部分（貫通孔）を設けた絶縁体と遮光部材からなる保持部及び電極が一体となった基板を作製する工程の第二の図である。
【図１４Ｃ】図４Ｂに示した装置に対応する、保持部分（貫通孔）を設けた絶縁体と遮光部材からなる保持部及び電極が一体となった基板を作製する工程の第一の図である。
【図１４Ｄ】図４Ｂに示した装置に対応する、保持部分（貫通孔）を設けた絶縁体と遮光部材からなる保持部及び電極が一体となった基板を作製する工程の第二の図である。
【図１５Ａ】本発明の装置による解析方法を説明するための図である。
【図１５Ｂ】本発明の装置による解析方法を説明するための図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６９】
実施例１においては、図１１に示すように上部電極基板１と下部電極基板２の間に、スペーサー３を配置し、複数の円状の保持部分（貫通孔５）をアレイ状に配置した絶縁体４及び遮光部材７からなる保持部をスペーサーと下部電極で挟んだ構造を有する装置を使用した。【００７０】
電極基板には、縦７８ｍｍ×横５６ｍｍ×厚さ１ｍｍのガラス基板を用いた。スペーサー３は、下部電極基板に縦２０ｍｍ×横２０ｍｍ×厚さ１.５ｍｍの空間を形成するように、アラルダイト（登録商標）樹脂によって作製した。また、スペーサーには、生体試料が含有した懸濁液を導入、排出するための導入口８と排出口９を設けた。【００７１】
複数の保持部分（貫通孔５）を設けた絶縁体４は、図１０に示すフォトリソグラフィーとエッチングによる方法により下部電極基板上に下部電極と一体的に形成した。ＩＴＯ２１を成膜したガラス２２のＩＴＯ成膜面にスパッタにより膜厚１００ｎｍのＣｒ２３を成膜した。次に、成膜したＣｒの上にスピンコーターを用いて４５μｍの膜厚になるようレジスト２４を塗布し、１分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（９５℃、１５分）を行った。レジストにはエポキシ系のネガタイプレジストを用いた。次に、縦３０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、保持部分（貫通孔）と保持部分（貫通孔）の縦と横の間隔が２００μｍで、縦１５０個×横１５０個のアレイ状に配置した直径φ３４μｍの微細孔パターンを描いた露光用フォトマスク２５を用いて、ＵＶ露光機にてレジストを露光２６し、現像液２７で現像した。露光時間と現像時間は、保持部分（貫通孔）の深さがレジストの膜厚と等しい４５μｍになるように調整し、現像後、３０％硝酸二アンモニアセリウム液２８により露出したＣｒ膜を剥離し、保持部分（貫通孔）の底面にＩＴＯが露出するようにした。その後、ホットプレートを用いてポストベーク（１５０℃、１５分）を行い、レジストを固め、貫通孔を設けた絶縁体と一体となった下部電極基板を製作した。【００７２】
このようにして作製した電極基板２９上にスペーサー３を図１１のように作製した。図１２は、図１１に示した解析容器のＣ−Ｃ’断面図である。スペーサーは、急速硬化タイプのアラルダイト（登録商標）接着剤をスペーサーの型枠に流し込み、スペーサーの形成と貼り合せを同時に行う方法で各部品を接着し、生体試料を含有した懸濁液を漏れなく収容部に入れることができた。スペーサーをくりぬいた面積が縦２０ｍｍ×横２０ｍｍであることから、この空間に存在する貫通孔の数は約１万個である。また、電極間に電圧を印加する電源１１（信号発生器）を導電線１０で接続した。【００７３】
生体試料には、マウスミエローマ細胞（粒径約１０μｍ）を用い、３００ｍＭの濃度のマンニトール水溶液に懸濁させ、１．２５×１０４個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調整した。【００７４】
続いて上記細胞懸濁液４００μＬを２回に分けてスペーサー３の導入口よりシリンジを用いて注入し（導入細胞数：約１万個）、交流電圧として信号発生器により電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２から３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に配置した保持部分（貫通孔）の１つ１つに、それぞれ１つの細胞を固定することができた。なお、「固定することができた」とは、保持部分（貫通孔）に細胞が入った場合を意味し、以下の比較例でも同じ定義とした。このときの、１つの保持部分（貫通孔）に概ね１つの細胞が入る生体試料固定率は約９０％であった。なお生体試料固定率とは、顕微鏡の視野に縦１５個×横１５個の２２５個の保持部分（貫通孔）が見えるようにし、生体試料を導入して固定したときの、１個の生体試料が入った保持部分（貫通孔）の数を２２５で割った値で定義し、以下の実施例と比較例でも同じである。【００７５】
１つの保持部（貫通孔）に概ね１つの細胞を固定した保持部へ２．５×１０-４％濃度のポリ−Ｌ−リジンを４００μＬ注入し、３分静置後、３００ｍＭ濃度のマンニトール水溶液を注入して収容部内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、保持部分（貫通孔）内へ細胞を静電気的に結合することができた。【００７６】
続いてマウスミエローマ細胞内のβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の増幅を行った。表１に示す組成の溶液を調製して収容部へ注入した後、ミネラルオイルによりすべての保持部分（貫通孔）を密封して、サーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行った。熱サイクルの条件は、９５℃、３分のプレヒートの後、９５℃で３０秒、６０℃で４０秒を４０サイクル行うこととした。【００７７】
【表１】
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【００７８】
β−ａｃｔｉｎ遺伝子の増幅は、蛍光により解析する方法であるＴａｑＭａｎ法により確認した。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端を蛍光物質で修飾し、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして利用する。このプローブは、蛍光物質とともに、クエンチャー物質が近傍にあるので、蛍光の発生は抑制されている。ＰＣＲの伸長反応のステップのときに、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５’から３’エキソヌクレアーゼ活性により、測定したい遺伝子鎖にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発生する。蛍光強度は、蛍光顕微鏡（Ｕ−ＲＦＬ−Ｔ/ＩＸ７１、オリンパス(株)製）を通じてＣＣＤカメラにより観察した。その結果、ＰＣＲを行う前の細胞が固定された保持部分（貫通孔）の蛍光顕微鏡像と比較して、ＰＣＲを行った後は蛍光顕微鏡像において蛍光強度は増加しており、β−ａｃｔｉｎ遺伝子が検出できた。一方、細胞の固定されていない保持部分（貫通孔）については、β−ａｃｔｉｎ遺伝子の増幅に伴う蛍光強度の増加は検出できなかった。【００７９】
図１３に示すように、生体試料採取手段２０を設置した。生体試料採取手段には、電気浸透流を利用して精密に生体試料を採取可能なピペットを用いることで、顕微鏡１９で観察しながら、保持部分（貫通孔）に固定した特定の細胞３３および保持部分（貫通孔）内のβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を採取する事ができた。β−ａｃｔｉｎ遺伝子の確認を行った。３．０％アガロースゲルを用いて電気泳動分析したところ、蛍光が検出できた保持部分（貫通孔）からはβ−ａｃｔｉｎを示す１１５ｂｐの単一フラグメントが確認できた。一方で蛍光が検出されなかった保持部分（貫通孔）からはフラグメントが全く確認できなかった。生体試料採取手段により得られたβ−ａｃｔｉｎ遺伝子を再増幅したＰＣＲ産物を使用して、ｐＭＤ２０−ベクター（Ｔａｋａｒａ）中へクローニングした。該ＰＣＲ産物をｐＭＤ２０−ベクターに連結した後、・BR>Y連結反応混合物を使用して、コンピテントセル（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ, ＪＭ１０９, Ｔａｋａｒａ）を形質転換した。挿入断片を有するｐＭＤ２０−ベクターを含有するクローンを、２０マイクロｇ/ｍＬ・Ｘ−ＧＡＬ、１０ｍＭ ＩＰＴＧおよび５０マイクロｇ/ｍＬアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ(ＬＢ)プレート上で白色のコロニーの存在により選択した。各ＰＣＲサンプルについて７個のコロニーを拾い、ＬＢ培地中で一晩増殖させた。続いてキアジェン・ＱＩＡプレップミニプレップキット（商品名、Ｑｕｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ）を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。得られた配列をＢＬＡＳＴソフトウェアで解析し、マウスのβ−ａｃｔｉｎ遺伝子と完全に一致することを確認した。【００８０】
（比較例）
比較のため、実施例１と同じ装置を用い、下記操作を行った。はじめに上記細胞懸濁液４００μＬを２回に分けて（細胞数：約１万個）スペーサーの導入口よりシリンジを用いて注入し、交流電圧として信号発生器により電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２から３秒程度の極めて短い時間でアレイ状に配置した保持部分（貫通孔）の１つ１つに、それぞれ１つの細胞を固定することができた。【００８１】
１つの保持部分（貫通孔）に概ね１つの細胞を固定した収容部へ２．５×１０-４％濃度のポリ−Ｌ−リジンを４００μＬ注入し、３分静置後、３００ｍＭ濃度のマンニトール水溶液を注入して収容部内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、保持部分（貫通孔）内へ細胞を静電気的に結合することができた。【００８２】
マウスミエローマ細胞内のβ−ａｃｔｉｎ遺伝子の増幅を行った。表２に示す組成の溶液を調製して収容部へ注入した後、ミネラルオイルによりすべての保持部分（貫通孔）を密封して、サーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行った。熱サイクルの条件は、９５℃、３分のプレヒートの後、９５℃で３０秒、６０℃で４０秒を４０サイクル行うこととした。【００８３】
【表２】
2011149032.tif 000004
【００８４】
β−ａｃｔｉｎ遺伝子の増幅は、蛍光により解析する方法であるＴａｑＭａｎ法により確認した。蛍光強度は、顕微鏡を通じてＣＣＤカメラにより観察した。その結果、ＰＣＲを行う前の細胞が固定された保持部分（貫通孔）の蛍光顕微鏡像と比較して、ＰＣＲを行った後は蛍光顕微鏡像において蛍光強度の増加は確認できず、保持部分（貫通孔）内の遺伝子および蛍光色素が貫通孔外へ拡散したことが推測された。
【実施例２】
【００８５】
次に、実施例２においては、図３及び図４に示す、生体試料を含む懸濁液を挟んで一方の側に、一対の電極３１、３２を備える構造、すなわち櫛状の電極対を有する構造を有する装置について言及する。本実施例においては、一対の電極を配置する基板には、縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍのガラス基板を用いた。スペーサー３は、縦４０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１．５ｍｍのシリコンシートの中央を縦２０ｍｍ×横２０ｍｍにくりぬいて作製した。また、生体試料を含む懸濁液を導入、排出するための導入口８と排出口９をスペーサー３に設けた。複数の保持部分（貫通孔）５を有する保持部と一対の電極３１、３２は、図１４Ａ、図１４Ｂに示すフォトリソグラフィーとエッチングによる方法によりガラス基板上に一体的に形成した。【００８６】
図１４Ａ、図１４Ｂに示すように、ガラス基板６０の片面に、スパッタにより膜厚１００ｎｍのＩＴＯ３７を成膜した。次に、成膜したＩＴＯの上にスパッタにより膜厚１００ｎｍのＣｒ３８を成膜した。次に、成膜したＣｒの上にスピンコーターを用いて１μｍの膜厚になるようレジスト４６を塗布し、１分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（１０５℃、１５分）を行った。レジストにはポジ型のものを用いた。【００８７】
次に、縦３０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、幅１０μｍの帯状電極ａと幅１０μｍの帯状電極ｂを５０μｍ間隔で形成した櫛状電極パターンを描いた露光用フォトマスク３９を用いて、ＵＶ露光機にてレジストを露光４２し、現像液４７で現像した。露光時間と現像時間は、現像により剥離する膜厚がレジストの膜厚と等しい１μｍになるように調整し、現像後、３０％硝酸二アンモニウムセリウム液４９により露出したＣｒ膜を剥離し、貫通孔の底面にＩＴＯ３７が露出するようにした。次に、ＩＴＯエッチング液（ＩＴＯ−Ｅｔｃｈａｎｔ，和光純薬工業）４８により、露出したＩＴＯ膜を剥離した。次に、図１４Ｂのように、レジストをリムーバー５５により剥離し、ＩＴＯ膜の上にＣｒ膜が配置された櫛状の一対の電極６１を形成した。【００８８】
このようにして作製した基板上に、スピンコーターを用いて５μｍの膜厚になるようレジスト４０を塗布し、１分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（９５℃、３分）を行った。レジストにはエポキシ系のネガタイプレジストを用いた。続いて、縦３０ｍｍ×横３０ｍｍのエリアに、直径φ８．５μｍの微細孔を５０μｍの間隔で縦６００個×横６００個のアレイ状に並べたパターンを描いた露光用フォトマスク４１を用いて、櫛状電極上に微細孔を位置合わせした状態で、ＵＶ露光機４２にてレジスト４０を露光し、現像液４３で現像した。露光時間と現像時間は、孔の深さがレジスト４０の膜厚と等しい５μｍになるように調整した。現像後、３０％硝酸二アンモニウムセリウム液４９により、露出したＣｒ膜を剥離し、保持孔の底面にＩＴＯ３７が露出するようにした。その後、ホットプレートを用いてポストベーク（１８０℃、３０分）を行い、レジストを固め、複数の保持孔が形成された保持部（絶縁体膜と遮光膜の積層体）と一体となった櫛状電極基板６２を作製した。【００８９】
このようにして作製した櫛状電極基板上の保持部の上に、図３、図４に示すようにスペーサー３を積層し圧着した。シリコンシートの表面は粘着性があるため、圧着することでスペーサー３と絶縁部４とを貼り合わせることができた。スペーサー３の収容部の面積が縦２０ｍｍ×横２０ｍｍであることから、この収容部内に存在する保持部分（貫通孔）５の数は約１６万個である。櫛状電極を構成する一対の電極のそれぞれに導電線１０を介して電源（信号発生器）を接続した。【００９０】
生体試料には、マウス脾臓細胞（粒径約６μｍ）を用い、３００ｍＭの濃度のマンニトール水溶液に懸濁させ、２．７×１０５個／ｍＬの密度になるように細胞懸濁液を調製した。【００９１】
続いて上記細胞懸濁液６００μＬをスペーサー３の導入口８よりシリンジを用いて注入し（導入細胞数：約１６万個）、信号発生器により電圧２０Ｖｐｐ、周波数３ＭＨｚの矩形波交流電圧を電極間に印加したところ、２から３秒程度の極めて短い時間で、アレイ状に形成した複数の保持孔のそれぞれに１つずつ細胞を固定することができた。次に、収容部へ２．５×１０−４％濃度のポリ−Ｌ−リジンを６００μＬ注入し、３分静置後、電圧の印加を停止した。次に、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を注入して収容部内のポリ−Ｌ−リジンを洗浄することで、保持孔内へ細胞を静電気的に結合することができた。【００９２】
続いてマウス脾臓細胞集団中のＢ細胞を検出した。Ｂ細胞を検出するための標的となる特定物質はＢ細胞表面に存在するＣＤ１９分子とした。ＣＤ１９分子は、Ｂ細胞表面レセプターであり、幹細胞の段階から最終的には形質細胞に分化するＢ系統細胞の分化全体を通して細胞において見出され、そのＢ系統細胞としては、プレＢ細胞、Ｂ細胞（ナイーブＢ細胞、抗原刺激性Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、プラズマ細胞、およびＢリンパ球を含む）および濾胞性樹状細胞が挙げられる。【００９３】
次に標識物質であるＰＥ標識−ＣＤ１９抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ, Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ, Ｇｅｒｍａｎｙ）を６００μＬ収容部へ送液し、抗原抗体反応によるＢ細胞の標識を行った後（４℃、１０分）、リン酸緩衝液にて洗浄、Ｂ細胞検出を実施した。標識されたＢ細胞は、蛍光顕微鏡（Ｕ−ＲＦＬ−Ｔ/ＩＸ７１、オリンパス、日本）を通じてＣＣＤカメラにより観察した。その結果、標識を行う前の細胞の蛍光顕微鏡像と比較して、標識を行った後はＢ細胞表面の蛍光強度のみが増加しており、Ｂ細胞を検出することができた。また、上述したマイクロピペットを用いて、Ｂ細胞を採取することができた。
【実施例３】
【００９４】
次に、実施例３においては、図４Ｂに示す、生体試料を含む懸濁液を挟んで一方の側に、一対の電極３１、３２を備える構造、すなわち櫛状の電極対を有する構造であって、基板上に電極が段差状に配置される装置について言及する。なお、本実施例においては、一対の電極を配置する基板には、実施例２と同様に縦７０ｍｍ×横４０ｍｍ×厚さ１ｍｍのガラス基板６０を用いた。ただし、ガラス基板６０の表面を、エッチングレートを変える等の手法により加工することで、当該表面上に段差（もしくは溝）を形成する。この段差が、電極が配置される段差形状となる。また、スペーサー３、当該スペーサ３に設けられる導入口８、排出口９については、実施例２と同様である。そして、実施例３では、複数の保持部分（貫通孔）５を有する保持部と一対の電極３１、３２が、図１４Ｃ、図１４Ｄに示すフォトリソグラフィーとエッチングによる方法により段差表面を有するガラス基板６０上に一体的に形成される。【００９５】
図１４Ｃ、図１４Ｄに示すように、段差表面を有するガラス基板６０の片面に、スパッタにより膜厚１００ｎｍのＩＴＯ３７を成膜した。次に、成膜したＩＴＯの上にスパッタにより膜厚１００ｎｍのＣｒ３８を成膜した。次に、成膜したＣｒの上にスピンコーターを用いて、レジストの高さがガラス基板６０の段差形状にかかわらず一定となるようにレジスト４６を塗布し、１分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（１０５℃、１５分）を行った。レジストにはポジ型のものを用いた。【００９６】
次に、各段差のＩＴＯ層上に一定幅のレジスト４６ａが残るように、図示しない露光用フォトマスクを用いてＵＶ露光機にてレジスト４６を露光し現像液で現像した。現像後、３０％硝酸二アンモニウムセリウム液により露出したＣｒ膜を剥離し、更に、ＩＴＯエッチング液（ＩＴＯ−Ｅｔｃｈａｎｔ，和光純薬工業）により、露出したＩＴＯ膜を剥離した。次に、図１４Ｄのように、レジストをリムーバーにより剥離し、段差状のガラス基板６０に形成されたＩＴＯ膜の上にＣｒ膜が配置された櫛状の一対の電極６１を形成した。【００９７】
このようにして作製した基板上に、スピンコーターを用いてレジストの高さが一定となるようにレジスト４６ｂを塗布し、１分自然乾燥後、ホットプレートを用いてプリベーク（９５℃、３分）を行った。レジストにはエポキシ系のネガタイプレジストを用いた。続いて、アレイ状に並べたパターンを描いた露光用フォトマスクを用いて、櫛状電極上に微細孔を位置合わせした状態で、ＵＶ露光機にてレジスト４６ｂを露光し、現像液で現像した。現像後、３０％硝酸二アンモニウムセリウム液により、露出したＣｒ膜を剥離し、保持孔の底面にＩＴＯ３７が露出するようにした。その後、ホットプレートを用いてポストベーク（１８０℃、３０分）を行い、レジストを固め絶縁体４６ｃを形成し、複数の保持部分が形成された保持部（絶縁体膜と遮光膜の積層体）と一体となった櫛状電極基板６２を作製した。【００９８】
このようにして作製した櫛状電極基板上の保持部の上に、スペーサー３を積層し圧着した。櫛状電極を構成する一対の電極のそれぞれに導電線１０を介して電源（信号発生器）を接続した。このように構成される固定装置を用いても、実施例２と同様に生体試料の固定、分析が可能である。
【符号の説明】
【００９９】
１：上部電極基板
２：下部電極基板
３：スペーサー
４、４６ｃ：絶縁体
５：保持部分（貫通孔）
５’：拡径凹部
６：本体
７：遮光部材
８：導入口
９：排出口
１０：導電線
１１：交流電源
１２：電気力線
１３：生体試料
１４：誘電泳動力
１５：生体試料と結合する物質
１６：温度応答性高分子
１７：非水溶性液体
１８：異常細胞
１９：顕微鏡
２０：生体試料採取手段
２１、３７：ＩＴＯ
２２、６０：ガラス
２３、３８：Ｃｒ
２４、４０、４６、４６ａ、４６ｂ：レジスト
２５、３９、４１：露光用フォトマスク
２６、４２：露光
２７、４３、４７：現像液
２８、４９：３０％硝酸アンモニアセリウム液
２９：電極基板
３１：電極の一方
３２：電極の他方
３３：細胞
４８：ＩＴＯエッチング液
５０：収容部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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