(57)【要約】  本発明は、ネオサキシトキシン、およびその類似体と変種、ならびに組換え宿主細胞でのネオサキシトキシンの生産における中間体、を作製するためのプロセスに関する。ネオサキシトキシンおよびその類似体と変種は、医薬組成物の生産において使用され得る。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞においてネオサキシトキシンを生産するためのプロセスであって、
（Ａ）ＰＰＴａｓｅをコードしＳｘｔポリペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸをコードする核酸分子を含む宿主細胞をネオサキシトキシンの生産に適している条件下において基質：
（ｉ）Ｓ−アデノシルメチオニン、
（ｉｉ）アルギニン、
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ、および
（ｉｖ）カルバモイルリン酸
の存在下で培養培地において培養するステップであって、前記宿主細胞は、ＳｘｔポリペプチドＣ、Ｆ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４をコードする核酸分子を含まない、ステップと、
任意選択で（Ｂ）ネオサキシトキシンを前記宿主細胞から、または前記培養培地から、単離および／または精製するステップと、
を含む、プロセス。
【請求項２】
ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）反応媒体中で基質：
（ｉ）Ｓ−アデノシルメチオニン、
（ｉｉ）アルギニン、
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ、および
（ｉｖ）カルバモイルリン酸
をＳｘｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸのポリペプチドと接触させるステップと、
任意選択で（Ｂ）ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を前記反応媒体から単離および／または精製するステップと、
を含む、プロセス。
【請求項３】
前記反応媒体が、ＰＰＴａｓｅをさらに含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
宿主細胞においてネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）ＳｘｔポリペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸをコードする核酸分子を含む宿主細胞をネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種の生産に適している条件下において基質：
（ｉ）Ｓ−アデノシルメチオニン、
（ｉｉ）アルギニン、
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ、および
（ｉｖ）カルバモイルリン酸
の存在下で培養培地において培養するステップと、
任意選択で（Ｂ）ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を前記宿主細胞から、または前記培養培地から、単離および／または精製するステップと、
を含む、プロセス。
【請求項５】
前記宿主細胞が、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記基質が、ＳｘｔポリペプチドＣ、ＪおよびＫのうちの１つ以上または全てと接触させられない、および／または
前記宿主細胞が、ＳｘｔポリペプチドＣ、ＪおよびＫのうちの１つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
請求項２〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記基質が、ＳｘｔポリペプチドＱ、ＲおよびＯＲＦ２４のうちの１つ以上または全てと接触させられない、および／または
前記宿主細胞が、ＳｘｔポリペプチドＱ、ＲおよびＯＲＦ２４のうちの１つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
請求項２〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記基質が、（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）Ｃ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４；
（ｂ）Ｌ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４；または
（ｃ）Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４；
のうちの１つ以上のＳｘｔポリペプチドのいずれとも接触させられない、および／または
前記宿主細胞が、（ａ）〜（ｃ）のうちの１つ以上の前記Ｓｘｔポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子を含まない、
請求項２〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記基質が、ＳｘｔポリペプチドＦ、ＭおよびＰのうちの１つ以上または全てと接触させられない、および／または
前記宿主細胞が、ＳｘｔポリペプチドＦ、ＭおよびＰのうちの１つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
請求項２〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記基質が、ＳｘｔＣ、Ｅ、Ｊ、Ｋ、ＬおよびＲからなる群より選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド（好ましくはＣおよび／またはＥ）とさらに接触させられる、および／または
前記宿主細胞が、ＳｘｔポリペプチドＣ、Ｅ、Ｊ、Ｋ、ＬおよびＲのうちの１つ以上（好ましくはＣおよび／またはＥ）をコードする核酸分子をさらに含む、
先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記基質が、ＳｘｔＦ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡからなる群より選択されるＳｘｔポリペプチドのうちの１つ以上または全てと接触させられない、および／または
前記宿主細胞が、ＳｘｔポリペプチドＦ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡのうちの１つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、
先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記基質が、ＳｘｔＮおよび／またはＳｘｔＤＩＯＸとさらに接触させられる、および／または
前記宿主細胞が、ＳｘｔＮおよび／またはＳｘｔＤＩＯＸをコードする核酸分子をさらに含む、
先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、原核宿主細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１または４〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、従属栄養生物である、請求項１または４〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、組換え宿主細胞である、請求項１または４〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種、あるいはその医薬的に許容される塩が、医薬組成物に製剤化される、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
製剤化するステップが、単離または精製されたネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を１種以上の医薬的に許容される担体、補助剤および／または賦形剤と混合することを含む、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセスによって生産された、ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種。
【請求項１９】
ＳｘｔポリペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸをコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、
（ｉ）ＳｘｔポリペプチドＣ、ＪまたはＫのうちの１つ以上または全て；
（ｉｉ）ＳｘｔポリペプチドＱ、ＲおよびＯＲＦ２４のうちの１つ以上または全て；
（ｉｉｉ）ＳｘｔポリペプチドＣ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４のうちの１つ以上または全て；
（ｉｖ）ＳｘｔポリペプチドＬ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４のうちの１つ以上または全て；
（ｖ）ＳｘｔポリペプチドＪ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、ＲおよびＯＲＦ２４のうちの１つ以上または全て；あるいは
（ｖｉ）ＳｘｔポリペプチドＦ、ＭおよびＰのうちの１つ以上または全て；
をコードする核酸分子を含まない、宿主細胞。
【請求項２０】
ＳｘｔＣ、Ｅ、Ｊ、Ｋ、Ｌおよび／またはＲからなる群より選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド（好ましくはＣおよび／またはＥ）をコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ＳｘｔＮおよび／またはＳｘｔＤＩＯＸをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９または請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
Ｆ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡからなる群より選択されるＳｘｔポリペプチドのうちの１つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない、請求項１９〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
原核宿主細胞であり、好ましくは細菌細胞であり、最も好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネオサキシトキシンおよびその類似体、ならびに組換え宿主細胞でのネオサキシトキシンの生産における中間体、を作製するためのプロセスに関する。ネオサキシトキシンは、医薬組成物の生産において使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）は、細胞の形質膜を介してナトリウムイオン（Ｎａ＋）を伝導するイオンチャネルを形成する膜内在性タンパク質である。それらは、活動電位の開始において重要な役割を果たす。
【０００３】
そのようなチャネルの遮断が、痛みのインパルスの伝達を阻止するのに有用である可能性があるということが長く知られていた。ＶＧＳＣは、今では、十分に検証された、疼痛の処置のための標的である。特に、いくつかのＶＧＳＣアンタゴニストが、現在、鎮痛薬および麻酔薬の生産において研究されている。
【０００４】
サキシトキシンおよびネオサキシトキシンは両方とも、ＶＧＳＣの特異的遮断薬として作用する。従って、これらの化合物は、疼痛の処置において有用である可能性がある。麻痺性貝毒（ＰＳＴ）としても知られているサキシトキシン（ＳＸＴ）は、多くのラン藻類（例えば、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ属、Ｌｙｎｇｂｙａ属、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ属、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ属、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ属）および渦鞭毛藻類（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ属およびＰｙｒｏｄｉｎｉｕｍ属）によって生産される神経毒である。サキシトキシンは、これまでに知られている最も致命的な非タンパク質性神経毒の１つであり、可逆的にＶＧＳＣに結合して麻痺を引き起こす。サキシトキシンは、この毒素を生物蓄積する汚染されたろ過摂食性水生動物（例えば、甲殻類、軟体動物、貝）の摂取に起因するヒトの食中毒の多くの症例の原因である。
【０００５】
しかし、（ＳＸＴのＮ１−ヒドロキシル化類似体である）ネオサキシトキシンを含め、ＳＸＴの類似体がいくつか存在し、それらは、高い特異的毒性を有するものの、低用量で投与された場合には全身毒性はない。従って、それらは、ヒトの治療薬として有用である可能性がある。
【０００６】
２０１５年６月に、ドイツの製薬会社Ｇｒｕｎｅｎｔｈａｌは、局所麻酔と術後の疼痛管理のための新規の麻酔薬としてのネオサキシトキシンの使用を開発するために、チリの会社Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｓ．Ａ．および米国に本拠を置くＢｏｓｔｏｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌと共同研究を開始した。
【０００７】
また、筋弛緩剤として臨床的に試験されているゴニオトキシンなど、他のサキシトキシン類似体の市場も存在する。
【０００８】
Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｓ．Ａ．は、天然にネオサキシトキシンおよびサキシトキシンを生産する細胞（例えば、ラン藻細胞）からのネオサキシトキシンおよびサキシトキシンの生産と回収に関する特許出願（例えば、ＵＳ２０１５／００９９８７９）を行っている。
【０００９】
サキシトキシンの生産のための生合成経路は、Ｓｈｉｍｉｚｕらによって初めて提唱された（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８４），  １０６，  ６４３３−６４３４）。しかし、２００８年になって初めてサキシトキシン（ｓｘｔ）遺伝子クラスターが同定された。これは、ラン藻Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３においてのことであった（Ｋｅｌｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８，  ７４，  ４０４４−４０５３）。ｓｘｔ遺伝子クラスターは、３４個の遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。これにより、Ｋｅｌｌｍａｎｎらは、Ｓｘｔタンパク質の理論的機能に基づいて、サキシトキシンの生産のための修正された（１０段階の）生合成経路（本願の図１を参照のこと）を提唱した。
【００１０】
それ以来、異なる属において４つの他のｓｘｔ遺伝子クラスターが同定されている：Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｉｒｃｉｎａｌｉｓ  １３１ＣおよびＡｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｓｐ．  ＮＨ−５（Ｍｉｈａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０，  ８（２００９））；Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉ（Ｍｉｈａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ６，  ｅ１４６５７（２０１１））；ならびにＲａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ  ｂｒｏｏｋｉｉ  Ｄ９（Ｓｔｕｃｋｅｎ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５，  ｅ９２３５（２０１０））。しかし、これらの遺伝子クラスターには、いくつかの遺伝子が存在しないことおよび他の遺伝子が重複していることを含め、いくつかの違いが存在するということは注目に値する。さらに、ｓｘｔクラスターのアーキテクチャは、いくつかのゲノムにおいて再編成されており、サキシトキシン類似体の生合成をもたらす。これが、サキシトキシンおよびネオサキシトキシンの生産のための生合成経路の解明を特に困難にしており、従って、組換えによる経路でのサキシトキシンおよびネオサキシトキシンの生産を妨げている。
【００１１】
Ｋｅｌｌｍａｎｎ（２００８）によって提唱された経路では、第１段階がｓｘｔＡの遺伝子産物を伴うということが示唆された。ｓｘｔＡ遺伝子は、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に関連するマルチドメインタンパク質をコードする。ＳｘｔＡはアルギニンと１つのメチル化アセテート単位の縮合を触媒して４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタン（ＡＯＧＨ）中間体を生成することがＫｅｌｌｍａｎｎによって提唱された。このプロセスは段階的に起こることが提唱され、ＳｘｔＡの４つのドメインによって触媒された。アセチルトランスフェラーゼドメインは選択的にホロ−アシルキャリアータンパク質のパンテテイニルアーム上にアセチル−ＣｏＡを繋ぎ止めると言われた。第１のＳｘＡドメインによって触媒されるアセチル部分のＳＡＭ依存的メチル化はプロピオネートの形成をもたらすと言われた。ＡＯＧＨの生合成における最後のステップは、クラスＩＩアミノトランスフェラーゼドメインによって触媒されるアルギニンへのプロピオネートの縮合であると言われた。ＡＯＧＨは、ｓｘｔ遺伝子クラスターの他のメンバーによってコードされる下流の酵素によるサキシトキシンの生合成のための基質として使用された。しかし、化学的標準物質が無かったため、ＡＯＧＨの構造は確認されなかった。
【００１２】
最近になってＴｓｕｃｈｉｙａとその共同研究者がＡＯＧＨの合成経路を解明したが（Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １２，  ３０１６−３０２０（２０１４）；Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．  ２１，  ７８３５−７８４０（２０１５））、この研究は、ＡＯＧＨの生産におけるＳｘｔＡまたは他のＳｘｔタンパク質の関与については調べなかった。このステップは、サキシトキシンおよびネオサキシトキシンの生産において重要なステップである。
【００１３】
従って、まとめると、サキシトキシンおよびネオサキシトキシンを作製するために現在使用可能である唯一の商業的に利用可能な高収率の経路は、天然にそれを生産する細胞（ラン藻など）からそれを単離することである。
【発明の概要】
【００１４】
現在のネオサキシトキシンの生産のための方法では、所望の医薬組成物を製造するのに必要な量のネオサキシトキシンを生産することができない。従って、ネオサキシトキシンを生産するための改善された方法が必要とされている。
【００１５】
本願では、ネオサキシトキシンの生産のための生合成経路が、組換えによる経路でのネオサキシトキシンの生産を可能にするのに十分なほど詳細に解明された。特に、Ｋｅｌｌｍａｎｎ（２００８）によって同定された３４個のｓｘｔ遺伝子またはＯＲＦの中から、ネオサキシトキシンの生産に必要であるものが特定された。
【００１６】
本願では、Ｋｅｌｌｍａｎｎ（２００８）によって提唱された生合成経路が正しくないということ、ならびにＫｅｌｌｍａｎｎの経路は、ネオサキシトキシンの組換え生産に必要ではないいくつかの遺伝子を対象とするということが見出された。Ｋｅｌｌｍａｎｎ（２００８）の経路はまた、ネオサキシトキシンの生産に必要であるいくつかのｓｘｔ遺伝子を対象としていない。
【００１７】
従って、本発明は、ネオサキシトキシンとその類似体の生産のための組換えによる経路、ならびにネオサキシトキシンとその類似体の生産における様々な中間体の生産のための組換えによる経路を初めて提供する。
【００１８】
本発明はまた、サキシトキシンおよび他のその類似体（ゴニオトキシンなど）の生産を容易にする。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一実施形態において、本発明は、ネオサキシトキシンまたはその類似体を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）反応媒体中で基質：
（ｉ）Ｓ−アデノシルメチオニン、
（ｉｉ）アルギニン、
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ、および
（ｉｖ）カルバモイルリン酸
をＳｘｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸのポリペプチドと接触させるステップと、
任意選択で（Ｂ）反応媒体からネオサキシトキシンまたはその類似体を単離および／または精製するステップと、
を含むプロセスを提供する。
【００２０】
好ましくは、プロセスは、前記Ｓｘｔのポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞内で行われる。
【００２１】
本発明はまた、宿主細胞においてネオサキシトキシンまたはその類似体を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）ＳｘｔポリペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、基質：
（ｉ）Ｓ−アデノシルメチオニン、
（ｉｉ）アルギニン、
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ、および
（ｉｖ）カルバモイルリン酸
の存在下で培養培地において、好ましくはネオサキシトキシンまたはその類似体の生産に適している条件下で、培養するステップ
を含むプロセスも提供する。好ましくは、宿主細胞は、ＰＰＴａｓｅをコードする核酸分子をさらに含む。
【００２２】
好ましくは、プロセスは、宿主細胞から、または培養培地から、ネオサキシトキシンまたはその類似体を単離および／または精製するステップをさらに含む。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ネオサキシトキシン」なる用語は、以下の構造：
【化１】
2019504650.tif 000003
を有する化合物またはその立体異性体を指す。
【００２４】
宿主細胞は、指定されるＳｘｔポリペプチドの全てをコードする核酸分子を発現することが可能である任意の細胞であってよい。宿主細胞は、好ましくは組換え宿主細胞である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「組換え」なる用語は、宿主細胞が野生型宿主細胞ではない（例えば、それらが、指定されるＳｘｔポリペプチドのうちの１つ以上をコードする１種以上の核酸分子の導入によって改変されている）という事実を指す。
【００２６】
宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。例えば、宿主細胞は、細菌細胞であってよい。細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってよい。グラム陽性細菌は、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびテネリクテス門（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ）からなる群より選択されてよい。グラム陰性細菌は、アクイフィカエ門（Ａｑｕｉｆｉｃａｅ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）／フィブロバクター−クロロビウム門（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ−Ｃｈｌｏｒｏｂｉ）（ＦＣＢ群）、デイノコッカス−サーマス門（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ−Ｔｈｅｒｍｕｓ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ゲムマチモナデテス門（Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ）、ニトロスピラ門（Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ）、プランクトミセテス−ベルコミクロビウム門／クラミジア門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ／Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ）（ＰＶＣ群）、プロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、スピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）およびシネルギステス門（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ）からなる群より選択されてよい。
【００２７】
好ましくは、宿主細胞は、プロテオバクテリア門のものであり、より好ましくはガンマプロテオバクテリア綱（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）のものであり、より好ましくは腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）のものであり、さらにより好ましくはエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のものである。最も好ましくは、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ種である。一部の実施形態において、宿主細胞は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のものである。
【００２８】
真核細胞（例えば、酵母細胞および哺乳動物細胞）が使用されてもよい。ネオサキシトキシンは多くの真核細胞に対して有毒であるため、真核生物の宿主細胞は、好ましくは、ネオサキシトキシンの毒性に対して非感受性であるものである。そのような細胞は、天然に非感受性であってよいか（例えば、酵母細胞）、またはそれらは、非感受性となるように操作されていてよい（例えば、ネオサキシトキシンアンタゴニストを共発現する哺乳動物細胞）。
【００２９】
あるいは、宿主細胞は、ネオサキシトキシンを分泌しない（すなわち、生産されるネオサキシトキシンが細胞内に保持される（従って、それが毒性作用を発揮するのを防ぐ））ものであってよい。宿主細胞はまた、植物細胞であってもよい。
【００３０】
一部の実施形態において、宿主細胞は従属栄養生物である。宿主細胞は、光従属栄養生物または化学合成従属栄養生物であってよい。従属栄養生物は、炭素を固定できない生物であり、生育のために有機炭素を使用する。従属栄養生物は、それらがどのようにしてエネルギーを得るかに基づいて、さらに分けることができる。従属栄養生物が、エネルギーのために光を使用するのであれば、それは光従属栄養生物である。従属栄養生物が化学エネルギーを使用する場合、それは化学合成従属栄養生物である。一部の実施形態において、宿主細胞は、独立栄養生物ではない。独立栄養生物は、光独立栄養生物または化学合成独立栄養生物であってよい。
【００３１】
ネオサキシトキシンは、海洋性渦鞭毛藻類および淡水性ラン藻類のいくつかの種によって天然に生産される。本発明は、そのような野生型宿主細胞の種によるネオサキシトキシンの天然生産には関連しない。従って、本発明の一部の実施形態において、宿主細胞は、渦鞭毛藻類でもラン藻類でもない。
【００３２】
特に、宿主細胞は、好ましくは、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ、Ａｎｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ（ＡＰｈ）  ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｏｉ（ｕｓａｃｅｂ）  Ｐｒｏｓｋｉｎａ−Ｌａｖｒｅｎｃｏ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｇｒａｃｉｌｅ（Ｌｅｍｍ）  Ｌｅｍｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｉｒｃｉｎａｌｉｓ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉおよびＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓからなる群からは選択されない。
【００３３】
特に、宿主細胞は、好ましくは、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ属、Ｌｙｎｇｂｙａ属、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ属、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ属、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ属および渦鞭毛藻類（Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ属およびＰｙｒｏｄｉｎｉｕｍ属）からなる群からは選択されない。
【００３４】
しかし、宿主細胞は、組換え渦鞭毛藻または組換えラン藻、例えば、（例えば、１種以上の遺伝子の付加によって、好ましくは１種以上のｓｘｔ遺伝子の付加によって）野生型の渦鞭毛藻またはラン藻と比較して改変されている渦鞭毛藻またはラン藻、であってもよい。宿主細胞は、指定されるＳｘｔタンパク質をコードする核酸分子を含む、および／またはそれを発現する。
【００３５】
好ましくは、Ｓｘｔポリペプチドおよびｓｘｔ遺伝子は、ラン藻または渦鞭毛藻から取得される。より好ましくは、Ｓｘｔポリペプチドおよびｓｘｔ遺伝子は、Ａｎａｂａｅｎａ属、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ属、Ｌｙｎｇｂｙａ属、Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ属、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ属、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ属、Ａｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ属、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ属またはＰｙｒｏｄｉｎｉｕｍ属から取得される。さらにより好ましくは、Ｓｘｔポリペプチドおよびｓｘｔ遺伝子は、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ、Ａｎｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ（ＡＰｈ）  ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｏｉ（ｕｓａｃｅｂ）  Ｐｒｏｓｋｉｎａ−Ｌａｖｒｅｎｃｏ、Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ  ｇｒａｃｉｌｅ（Ｌｅｍｍ）  Ｌｅｍｍ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｉｒｃｉｎａｌｉｓ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉまたはＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ  ｔａｍａｒｅｎｓから取得される。最も好ましくは、Ｓｘｔポリペプチドおよびｓｘｔ遺伝子は、Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３株から取得される。一部の実施形態では、Ｓｘｔポリペプチドおよびｓｘｔ遺伝子は、Ｄｏｌｉｃｈｏｓｐｏｒｕｍ  ｃｉｒｃｉｎａｌｅ  １３４ＣまたはＡ．ｍｉｎｕｔｕｍから取得されてもよい。
【００３６】
指定されるＳｘｔタンパク質をコードする核酸分子は、異種性分子（すなわち、野生型宿主細胞に天然には存在しないもの）であってよい。
【００３７】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＡなる用語は、好ましくは、配列番号１０で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、４つの触媒ドメイン（ｓｘｔＡ１：メチルトランスフェラーゼ；ｓｘｔＡ２：ＧＮＡＴアセチルトランスフェラーゼ；ｓｘｔＡ３：アシルキャリアータンパク質；およびｓｘｔＡ４：クラスＩＩアミノトランスフェラーゼ）を有するポリケチドシンターゼ関連タンパク質の機能を有するポリペプチドを指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、ｓｘｔＡなる用語は、好ましくは、配列番号１１または１２で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、４つの触媒ドメイン（ｓｘｔＡ１：メチルトランスフェラーゼ；ｓｘｔＡ２：ＧＮＡＴアセチルトランスフェラーゼ；ｓｘｔＡ３：アシルキャリアータンパク質；およびｓｘｔＡ４：クラスＩＩアミノトランスフェラーゼ）を有するポリケチドシンターゼ関連タンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＢなる用語は、好ましくは、配列番号７で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、シチジンデアミナーゼの機能を有するポリペプチドを指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、ｓｘｔＢなる用語は、好ましくは、配列番号８または９で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、シチジンデアミナーゼをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＢポリペプチドはまた、環化が可能であってもよい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＣなる用語は、好ましくは、配列番号４で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、調節サブユニットをコードするポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ＳｘｔＣなる用語は、好ましくは、配列番号５または６で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、調節サブユニットをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＣポリペプチドはまた、脱カルバモイル化が可能であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＤなる用語は、好ましくは、配列番号１で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、デサチュラーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＤなる用語は、好ましくは、配列番号２または３で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、デサチュラーゼをコードする核酸分子を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＥなる用語は、好ましくは、配列番号１３で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、シャペロン様タンパク質の機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＥなる用語は、好ましくは、配列番号１４または１５で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、シャペロン様タンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＦなる用語は、好ましくは、配列番号１６で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ナトリウム駆動型多種薬剤・毒性化合物放出タンパク質（sodium-driven multidrug and toxic compound extrusion protein）の機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＦなる用語は、好ましくは、配列番号１７または１８で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ナトリウム駆動型多種薬剤・毒性化合物放出タンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＧなる用語は、好ましくは、配列番号１９で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、アミジノトランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＧなる用語は、好ましくは、配列番号２０または２１で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、アミジノトランスフェラーゼをコードする核酸分子を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＨなる用語は、好ましくは、配列番号２２で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ジオキシゲナーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＨなる用語は、好ましくは、配列番号２３または２４で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ジオキシゲナーゼをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＨポリペプチドはまた、Ｃ１２ヒドロキシル化が可能であってもよい。
【００４７】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＩなる用語は、好ましくは、配列番号２５で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＩなる用語は、好ましくは、配列番号２６または２７で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＪなる用語は、好ましくは、配列番号２８で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＪなる用語は、好ましくは、配列番号２９または３０で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＫなる用語は、好ましくは、配列番号３１で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＫなる用語は、好ましくは、配列番号３２または３３で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子を指す。ｓｘｔＪおよびｓｘｔＫは、Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼと関連していることが多い。それらは、調節サブユニットであってよく、および／または他のタンパク質への、もしくは膜への、ＳｘｔＩの結合を媒介してよい。
【００５０】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＬなる用語は、好ましくは、配列番号３４で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ＧＤＳＬ−リパーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＬなる用語は、好ましくは、配列番号３５または３６で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ＧＤＳＬ−リパーゼをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＬポリペプチドはまた、脱カルバモイル化が可能であってもよい。
【００５１】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＭなる用語は、好ましくは、配列番号３７で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ナトリウム駆動型多種薬剤・毒性化合物放出タンパク質の機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＭなる用語は、好ましくは、配列番号３８または３９で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ナトリウム駆動型多種薬剤・毒性化合物放出タンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＮなる用語は、好ましくは、配列番号４０で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、スルホトランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＮなる用語は、好ましくは、配列番号４１で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、スルホトランスフェラーゼをコードする核酸分子を指す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＯなる用語は、好ましくは、配列番号７２で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、アデニリル硫酸キナーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＯなる用語は、好ましくは、配列番号７３で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、アデニリル硫酸キナーゼをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＯポリペプチドはまた、ＰＡＰＳ生合成が可能であってもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＰなる用語は、好ましくは、配列番号６９で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、推定上のサキシトキシン結合タンパク質の機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＰなる用語は、好ましくは、配列番号７０または７１で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、推定上のサキシトキシン結合タンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００５５】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＱなる用語は、好ましくは、配列番号６６で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＱなる用語は、好ましくは、配列番号６７または６８で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子を指す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＲなる用語は、好ましくは、配列番号６３で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、アシル−ＣｏＡ  Ｎ−アシルトランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＲなる用語は、好ましくは、配列番号６４または６５で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、アシル−ＣｏＡ  Ｎ−アシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を指す。
【００５７】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＳなる用語は、好ましくは、配列番号５７で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ネオサキシトキシン前駆体のエポキシ化と環形成が可能であるポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＳなる用語は、好ましくは、配列番号５８または５９で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ネオサキシトキシン前駆体のエポキシ化と環形成が可能である核酸分子を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＴなる用語は、好ましくは、配列番号５４で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ネオサキシトキシン前駆体のＣ−１１ヒドロキシル化が可能であるポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＴなる用語は、好ましくは、配列番号５５または５６で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ネオサキシトキシン前駆体のＣ−１１ヒドロキシル化が可能である核酸分子を指す。
【００５９】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＵなる用語は、好ましくは、配列番号５１で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＵなる用語は、好ましくは、配列番号５２または５３で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＵポリペプチドはまた、Ｃ１還元が可能であってもよい。
【００６０】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＶなる用語は、好ましくは、配列番号４８で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ＦＡＤ依存型コハク酸デヒドロゲナーゼ／フマル酸レダクターゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＶなる用語は、好ましくは、配列番号４９または５０で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ＦＡＤ依存型コハク酸デヒドロゲナーゼ／フマル酸レダクターゼをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＶポリペプチドはまた、ジオキシゲナーゼレダクターゼをコードしてもよい。
【００６１】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＷなる用語は、好ましくは、配列番号４５で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、フェレドキシンの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＷなる用語は、好ましくは、配列番号４６または４７で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、フェレドキシンをコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＷポリペプチドはまた、電子運搬体をコードしてもよい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＸなる用語は、好ましくは、配列番号４２で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ネオサキシトキシンのＮ−１ヒドロキシル化が可能であるポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＸなる用語は、好ましくは、配列番号４３または４４で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ネオサキシトキシンのＮ−１ヒドロキシル化が可能である核酸分子を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＹなる用語は、好ましくは、配列番号７４で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、リン酸依存型転写調節因子の機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＹなる用語は、好ましくは、配列番号７５で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、リン酸依存型転写調節因子をコードする核酸分子を指す。ＳｘｔＹポリペプチドはまた、シグナル伝達が可能であってもよい。
【００６４】
本明細書で使用される場合、ＳｘｔＺなる用語は、好ましくは、配列番号７６で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ヒスチジンキナーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ｓｘｔＺなる用語は、好ましくは、配列番号７７で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ヒスチジンキナーゼをコードする核酸分子を指す。
【００６５】
ｓｘｔ遺伝子のうちのいくつかの機能と能力が図２〜４でさらに説明されており、いくつかは中間体Ｘを中間体Ｙに変換することが可能であるということが分かる（ここでＸとＹは、定義された中間体の構造である）。
【００６６】
本明細書で使用される場合、ＯＲＦ５なる用語は、好ましくは、配列番号６０で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、シアノファージＳ−ＰＭ２タンパク質ＣＡＦ３４１４１様タンパク質の機能を有するポリペプチドを指す。ＯＲＦ５は、当技術分野ではＯＲＦ２４としても知られている。本明細書で使用される場合、ｏｒｆ５なる用語は、好ましくは、配列番号６１または６２で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、シアノファージＳ−ＰＭ２タンパク質ＣＡＦ３４１４１様タンパク質をコードする核酸分子を指す。
【００６７】
好ましくは、宿主細胞はさらに、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）をコードする核酸分子を含む、および／または発現する。本明細書で使用される場合、ＰＰＴａｓｅなる用語は、好ましくは、配列番号７８または９０で提示されるアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する配列、を有するポリペプチドであって、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、ＰＰＴａｓｅ遺伝子なる用語は、好ましくは、配列番号７９、８０または８９で提示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列、を有する核酸分子であって、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を指す。好ましくは、ＰＰＴａｓｅは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのｓｆｐ遺伝子（配列番号８９）によってコードされる。最も好ましくは、ＰＰＴａｓｅは、Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３株に由来する。一部の実施形態では、ＰＰＴａｓｅの溶解性を高めるためにＰＰＴａｓｅの最初の２０アミノ酸のうちの１〜２０個（例えば２０個）が除去されてもよい。さらに、そのアミノ酸配列中の最初のＶがＭに変更されてもよい。
【００６８】
好ましくは、核酸分子のヌクレオチド配列は、宿主細胞に対してコドン最適化される。
【００６９】
Ｓｘｔポリペプチド、ＯＲＦおよびＰＰＴａｓｅは、好ましくは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有すると本明細書で定義される。好ましくは、Ｓｘｔ、ＯＲＦおよびＰＰＴａｓｅのポリペプチドは、指定される参照ポリペプチドに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ｓｘｔの核酸分子、ｏｒｆおよびＰＰＴａｓｅの核酸分子は、好ましくは、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を有すると本明細書で定義される。好ましくは、ｓｘｔ、ｏｒｆおよびＰＰＴａｓｅの核酸分子は、指定される参照核酸分子に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。
【００７０】
核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。アミノ酸配列同一性およびヌクレオチド配列同一性のパーセンテージは、ＢＬＡＳＴのアライメント法を用いて取得してよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），  「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータが使用される。タンパク質データベースにおいて類似配列を見出すために、標準的なタンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｐ）を用いてよい。他のＢＬＡＳＴプログラムと同様に、ｂｌａｓｔｐは、類似した局所領域を見出すように設計されている。配列の類似性が配列全体に及ぶ場合、ｂｌａｓｔｐはまた、全体的なアライメントも報告し、これは、タンパク質の同定を目的とする場合には好ましい結果である。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータが使用される。場合によっては、「ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ」がオフにされてもよい。また、ＢＬＡＳＴＸプログラム、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施してもよい。比較を目的としてギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：  ３３８９で説明されているように（ＢＬＡＳＴ２．０の）Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用できる。あるいは、（ＢＬＡＳＴ２．０の）ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施できる（上記のＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する際、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメータが使用されてよい。ヌクレオチド配列の比較に関しては、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ−ｍｅｇａｂｌａｓｔおよびｂｌａｓｔｎを用いて、この目標を達成してよい。好ましくは、標準またはデフォルトのアライメントパラメータが使用される。ＭＥＧＡＢＬＡＳＴは、非常に類似した配列間の長いアライメントを効率的に見出すように特別に設計されている。本発明の核酸と類似しているが同一ではないヌクレオチド配列を見出すためにＤｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ＭＥＧＡＢＬＡＳＴを用いてよい。ＢＬＡＳＴヌクレオチドアルゴリズムは、クエリを、ワードと呼ばれる短いサブ配列に分解することによって類似配列を見出す。このプログラムは、最初にクエリワードとの正確な一致（ワードヒット）を特定する。次いで、ＢＬＡＳＴプログラムは、これらのワードヒットを複数のステップで拡張して最終ギャップアライメントを生成する。一部の実施形態では、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で実施できる。ＢＬＡＳＴ検索の感度を左右する重要なパラメータの１つは、ワードサイズである。ｂｌａｓｔｎがＭＥＧＡＢＬ��ＳＴよりも高感度である最も重要な理由は、それが、より短いデフォルトのワードサイズ（１１）を使用するということである。このために、ｂｌａｓｔｎは、他の生物に由来する関連ヌクレオチド配列とのアライメントを見出すことにおいてＭＥＧＡＢＬＡＳＴよりも優れている。ワードサイズは、ｂｌａｓｔｎにおいて調整可能であり、デフォルト値から最小の７に減らして検索の感度を上げることができる。新たに導入されたｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔのページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｎｅｗｓｌｔｒ／ＦａｌｌＷｉｎｔｅｒ０２／ｂｌａｓｔｌａｂ．ｈｔｍｌ）を用いて、より高感度の検索を達成できる。このページは、Ｍａら（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００２  Ｍａｒ；  １８（３）：４４０−５）によって報告されたものと類似するアルゴリズムを使用する。アライメントの拡張のためのシードとして正確なワードの一致を必要とするのではなく、ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔは、テンプレートのより長いウィンドウ内の非連続ワード（non-contiguous word）を使用する。コーディングモードでは、コドンの一番目と二番目の位置における一致を見出すことに集中する一方で三番目の位置における不一致を無視することによって、三番目の塩基のゆらぎが考慮される。同じワードサイズを使用したｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ＭＥＧＡＢＬＡＳＴでの検索は、同じワードサイズを使用した標準的なｂｌａｓｔｎよりも高感度かつ効率的である。ｄｉｓｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｍｅｇａｂｌａｓｔに固有のパラメータは、ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ：１１または１２；ｔｅｍｐｌａｔｅ：１６、１８、または２１；ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｔｙｐｅ：ｃｏｄｉｎｇ（０）、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ（１）、またはｂｏｔｈ（２）である。
【００７１】
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３のｓｘｔ遺伝子のＳｘｔポリペプチドの配列は、受入番号ＤＱ７８７２００でＧｅｎＢａｎｋから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＤＱ７８７２００）。Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３のＳｘｔポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書において、添付の「配列」のセクションに提示されている。しかし、本発明は、これらのポリペプチドの配列に限定されない。本発明は、列挙されるＣｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３のポリペプチドと同じ機能を有する、他の種に由来するポリペプチドを包含する。
【００７２】
本発明のプロセスでは、基質を、ＳｘｔポリペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸと接触させるか、または宿主細胞が、そのようなポリペプチドをコードする１種以上の核酸分子を含む。本発明の一部の実施形態では、基質は、ＳｘｔポリペプチドＡ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸのうちの１つ以上と接触させられないか、または宿主細胞が、そのようなポリペプチドをコードする１種以上の核酸分子を含まない。本発明のプロセスの一部の実施形態では、他のＳｘｔポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子が使用されても使用されなくてもよい。
【００７３】
本発明のプロセスが特定のＳｘｔポリペプチドを用いる場合、基質は、そのＳｘｔポリペプチドと接触させられることになる、および／または宿主細胞は、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含むことになる。本発明のプロセスが特定のＳｘｔポリペプチドを用いない場合、基質は、そのＳｘｔポリペプチドと接触させられないことになる、および／または宿主細胞は、そのようなポリペプチドをコードする核酸分子を含まないことになる。
【００７４】
一部の実施形態では、本発明のプロセスは、ＳｘｔＣ、Ｅ、Ｊ、Ｋ、ＬおよびＲからなる群より独立的に選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を追加的に用いても用いなくてもよい。好ましくは、本発明のプロセスは、ＳｘｔＣ、Ｅ、Ｊ、Ｋ、ＬおよびＲからなる群より選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド（好ましくはＣおよび／またはＥ）、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を追加的に用いる。
【００７５】
一部の実施形態では、本発明のプロセスは、ＳｘｔＥ、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を追加的に用いる。他の実施形態では、本発明のプロセスは、ＳｘｔＥ、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を追加的に用いない。
【００７６】
一部の実施形態では、本発明のプロセスは、ＳｘｔＱポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を利用しても利用しなくてもよい。
【００７７】
一部の実施形態では、本発明のプロセスは、ＳｘｔＲポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を利用しても利用しなくてもよい。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明のプロセスは、ＯＲＦ２４ポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を利用しても利用しなくてもよい。
【００７９】
他の実施形態では、本発明のプロセスは、ＳｘｔＦ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡからなる群より独立的に選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を用いても用いなくてもよい。好ましくは、本発明のプロセスは、ＳｘｔＦ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡからなる群より選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を用いない。
【００８０】
本発明の一部の実施形態では、本発明のプロセスは、
Ｓｘｔ  ＡＣＴ        Ｃ−１３アシルトランスフェラーゼ（ＬＷＴＸ）
Ｓｘｔ  ＤＩＯＸ      ジオキシゲナーゼ（Ｃ−１１）
Ｓｘｔ  Ｎ１          Ｎ−スルホトランスフェラーゼ
Ｓｘｔ  Ｎ２          Ｎ−スルホトランスフェラーゼ
Ｓｘｔ  ＳＵＬ        Ｏ−スルホトランスフェラーゼ（Ｃ−１１）
Ｓｘｔ  Ｈ１          不活性ジオキシゲナーゼ
Ｓｘｔ  Ｍ１          ＭＡＴＥエクスポーター
Ｓｘｔ  Ｍ２          ＭＡＴＥエクスポーター
Ｓｘｔ  Ｍ３          ＭＡＴＥエクスポーター
Ｓｘｔ  ＰＥＲ        薬剤エクスポーター
Ｓｘｔ  ＰＥＲ２      不活性薬剤エクスポーター
からなる群より独立的に選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子）を用いても用いなくてもよい。
【００８１】
Ｓｘｔ  ＡＣＴは、サキシトキシンの、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉに固有の「奇妙な」類似体（ＬＷＴＸ−１〜ＬＷＴＸ−６）を作製するのに必要である可能性がある。これらは、カルバモイル側鎖の代わりにメチル−アセチルエステル側鎖を有する。
【００８２】
Ｓｘｔ  ＤＩＯＸとＳｘｔ  ＳＵＬは、Ｃ−１１硫酸化トキシン類似体（ゴニオトキシン１〜４およびＣ−１〜Ｃ−４トキシンなど）を作製するのに必要である可能性がある。
【００８３】
Ｓｘｔ  Ｎ１とＳｘｔ  Ｎ２は、様々なＮ−スルホカルバモイル類似体（Ｃ−トキシン）を作製するのに必要である可能性がある。Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３由来のＳｘｔＮは、触媒部位における変異のせいで不活性であるかもしれない。
【００８４】
他の実施形態では、本発明のプロセスは、ＯＲＦ２４、ＰおよびＱからなる群より独立的に選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を用いても用いなくてもよい。好ましくは、本発明のプロセスは、ＯＲＦ２４、ＰおよびＱからなる群より選択される１種以上のＳｘｔポリペプチド、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸分子、を用いない。
【００８５】
本発明の宿主細胞は、標準的な分子生物学的手法（例えば、Ｇｒｅｅｎ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，  第４版，  ２０１２）を用いて、および本明細書で開示される実施例を参照して、作製されてよい。
【００８６】
指定されるポリペプチドの各々のコード配列は、宿主細胞中での指定されるポリペプチドの生産を促進する好適な調節エレメントと機能可能に結合されるであろう。例えば、各コード配列は、好適なプロモーターおよびターミネーターのエレメントと機能可能に結合されるであろう。好ましくは、これらの調節エレメントは、宿主細胞における使用のために最適化される。例えば、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである場合には、Ｅ．ｃｏｌｉの調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合配列）が好んで使用される。
【００８７】
核酸分子のうちの１つ以上が、宿主細胞のゲノム中に組み込まれてもよい。核酸分子のうちの１つ以上が、プラスミドまたはベクターの形態で宿主細胞中に存在してもよい。好ましくは、指定される核酸の全てが、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。指定される核酸のうちの１つ以上が、宿主細胞のゲノム中の糖オペロン内に挿入されてもよい。
【００８８】
核酸分子は、オペロン、または遺伝子クラスターのフラグメント、の形態で存在してよい（すなわち、所望のポリペプチドのうちの２つ以上をコードする）。これらは、独立的に、宿主細胞に形質転換されてよい。例えば、第１の核酸分子は、ｓｘｔＡ、ｓｘｔＢおよびｓｘｔＣをコードするオープンリーディングフレームを含んでよい；第２の核酸分子は、ｓｘｔＤ、ｓｘｔＥ、ｓｘｔＧ、ｓｘｔＨ、ｓｘｔＩ、ｓｘｔＪ、ｓｘｔＫおよびｓｘｔＬをコードするオープンリーディングフレームを含んでよい；第３の核酸分子は、ｓｘｔＱ、ｓｘｔＲ、ｏｒｆ２４、ｓｘｔＳ、ｓｘｔＴ、ｓｘｔＵ、ｓｘｔＶ、ｓｘｔＷおよびｓｘｔＸをコードするオープンリーディングフレームを含んでよい；ならびに／または第４の核酸分子は、ｓｘｔＦ、ｓｘｔＰおよびｓｘｔＭをコードするオープンリーディングフレームを含んでよい。一部の実施形態では、第３の核酸分子は、ｓｘｔＱ、ｓｘｔＲ、ｓｘｔＳ、ｓｘｔＴ、ｓｘｔＵ、ｓｘｔＶ、ｓｘｔＷおよびｓｘｔＸ；またはｓｘｔＳ、ｓｘｔＴ、ｓｘｔＵ、ｓｘｔＶ、ｓｘｔＷおよびｓｘｔＸをコードするオープンリーディングフレームを含んでよい。
【００８９】
核酸分子はまた、適切な選択マーカー（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）を含んでもよい。核酸分子はまた、ポリペプチドのうちの１つ以上の発現が誘導性であるように、さらなる制御エレメントを含んでもよい。一部の好ましい実施形態では、ＳｘｔＡの発現は誘導性である。
【００９０】
本発明の一部の実施形態では、核酸分子のうちの１つ以上が、または機能的に等価であるポリペプチドをコードする核酸分子が、既に宿主細胞中に（宿主細胞のゲノム中に、または内因性プラスミド中に）内因的に存在してもよい。
【００９１】
本発明はまた、本明細書で定義されるような全ての宿主細胞にも及ぶ。特に、本発明は、Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸからなる群より独立的に選択される１種以上のＳｘｔポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、ＳｘｔＣ、Ｅ、Ｊ、Ｋ、Ｌおよび／またはＲからなる群より独立的に選択される１種以上のＳｘｔポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含んでも含まなくてもよい。宿主細胞は、ＳｘｔＱをコードする核酸分子をさらに含んでも含まなくてもよい。
【００９２】
宿主細胞は、ＳｘｔＦ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡからなる群より独立的に選択されるＳｘｔポリペプチドのうちの１つ以上または全てをコードする１つ以上の核酸分子をさらに含んでも含まなくてもよい。好ましくは、宿主細胞は、ＳｘｔＦ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｙ、Ｚ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ２９、ＯＲＦ３４、ＯＭＰＲまたはＨＩＳＡからなる群より選択されるＳｘｔポリペプチドのうちの１つ以上または全てをコードする核酸分子を含まない。
【００９３】
反応媒体および培養培地は、ネオサキシトキシンまたはその類似体の生産に適したものである。条件はまた、当業者が容易に決定できるような、適切なｐＨと温度も包含するであろう。宿主細胞は、ネオサキシトキシンまたはその類似体の生産に適している条件の下で培養培地において培養される。好適な培養培地は当技術分野で周知である。これらは、使用されている宿主細胞に応じて選択されるであろう。好ましくは、培養培地は、水性の培地であろう。
【００９４】
ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種の生産のための出発基質は、
（ｉ）Ｓ−アデノシルメチオニン、
（ｉｉ）アルギニン、
（ｉｉｉ）アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡまたはプロピオニル−ＣｏＡ、および
（ｉｖ）カルバモイルリン酸
である。
【００９５】
従って、上記の基質の適切な濃度がプロセスの開始時に反応媒体および培養培地において利用可能である必要がある。上記の基質の適切な濃度は、当業者によって容易に決定され得る。アルギニンは、周囲の培養培地から基質として宿主細胞に容易に取り込まれ得る。他の基質（すなわち、Ｓ−アデノシルメチオニン、アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、プロピオニル−ＣｏＡおよびカルバモイルリン酸）は不安定である。好ましくは、これらの基質は、宿主細胞内において十分な量で生産される（それらは全ての生細胞に存在する）。必要であれば、宿主細胞は、当技術分野において通例の方法で、これらの基質の生産を増加させるように容易に改変され得る。
【００９６】
本発明の一部の実施形態では、プロセスは、１４〜２４℃という温度で、好ましくは１６〜２２℃で、さらに好ましくは約１７、１８、１９、２０または２１℃で、最も好ましくは約１９℃で、行われる。
【００９７】
好ましくは、ネオサキシトキシンは、反応媒体または培養培地から単離および／または精製される。そのような単離／精製は、任意の好適な手段によるものであってよい。
【００９８】
プロセスが宿主細胞内で行われる本発明の実施形態では、ネオサキシトキシンは、宿主細胞内で生産されることになる。従って、宿主細胞は、（例えば、濾過または遠心分離によって）培養培地から分離されてよく、その後、宿主細胞が溶解されて、ネオサキシトキシンが回収されてよい。
【００９９】
ネオサキシトキシンは、疎水性化合物を除去するためのＣ−１８逆相樹脂上での固相抽出によって反応媒体または培養培地から単離されてよい。ネオサキシトキシンは、フロースルー中に存在するであろう。また、活性炭上の陽イオン交換樹脂を用いた固相抽出が使用されてもよい。さらなる精製技術については、ＵＳ２０１５／００９９８７９を参照してよい。
【０１００】
本発明はまた、以下で定義されるような、ネオサキシトキシンの生産における様々な中間体を生産するためのプロセスも提供する。これらのプロセスは、無細胞の媒体において、または適切なＳｘｔポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞において、行われてよい。
【０１０１】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化２】
2019504650.tif 000004
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化３】
2019504650.tif 000005
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体３）をＳｘｔＳと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１０２】
本発明はまた、式Ｉ：
【化４】
2019504650.tif 000006
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化５】
2019504650.tif 000007
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体３）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＳをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＳが生産されるような条件であってＳｘｔＳが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１０３】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化６】
2019504650.tif 000008
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化７】
2019504650.tif 000009
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体３）をＳｘｔＳと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１０４】
本発明はまた、式Ｉ：
【化８】
2019504650.tif 000010
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化９】
2019504650.tif 000011
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体３）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＳをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＳが生産されるような条件であってＳｘｔＳが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１０５】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化１０】
2019504650.tif 000012
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化１１】
2019504650.tif 000013
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４）をＳｘｔＤと、および任意選択でＮＡＤＨと、および任意選択でＮＡＤＰＨと、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１０６】
本発明はまた、式Ｉ：
【化１２】
2019504650.tif 000014
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化１３】
2019504650.tif 000015
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＤをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＤが生産されるような条件であってＳｘｔＤが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１０７】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化１４】
2019504650.tif 000016
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化１５】
2019504650.tif 000017
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４’）をＳｘｔＤと、および任意選択でＮＡＤＨと、および任意選択でＮＡＤＰＨと、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１０８】
本発明はまた、式Ｉ：
【化１６】
2019504650.tif 000018
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化１７】
2019504650.tif 000019
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体４’）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＤをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＤが生産されるような条件であってＳｘｔＤが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１０９】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化１８】
2019504650.tif 000020
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化１９】
2019504650.tif 000021
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５）をＳｘｔＳと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１１０】
本発明はまた、式Ｉ：
【化２０】
2019504650.tif 000022
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化２１】
2019504650.tif 000023
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＳをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＳが生産されるような条件であってＳｘｔＳが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１１１】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化２２】
2019504650.tif 000024
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化２３】
2019504650.tif 000025
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５’）をＳｘｔＳと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１１２】
本発明はまた、式Ｉ：
【化２４】
2019504650.tif 000026
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化２５】
2019504650.tif 000027
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体５’）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＳをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＳが生産されるような条件であってＳｘｔＳが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１１３】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化２６】
2019504650.tif 000028
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体７）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化２７】
2019504650.tif 000029
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６）をＳｘｔＳと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１１４】
本発明はまた、式Ｉ：
【化２８】
2019504650.tif 000030
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体７）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化２９】
2019504650.tif 000031
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＳをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＳが生産されるような条件であってＳｘｔＳが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１１５】
他の実施形態では、本発明は、式Ｉ：
【化３０】
2019504650.tif 000032
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体７’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化３１】
2019504650.tif 000033
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６’）をＳｘｔＳと、および任意選択でα−ケトグルタレートと、および任意選択で分子状酸素と、接触させるステップ、および
（Ｂ）反応媒体から式Ｉの化合物を単離または精製するステップ、
を含むプロセスを提供する。
【０１１６】
本発明はまた、式Ｉ：
【化３２】
2019504650.tif 000034
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体７’）を生産するためのプロセスであって、
（Ａ）式ＩＩ：
【化３３】
2019504650.tif 000035
（式中、ＲはＯＨである）の化合物（中間体６’）の存在下で培養培地において、ＳｘｔＳをコードする核酸分子を含む宿主細胞を、ＳｘｔＳが生産されるような条件であってＳｘｔＳが式ＩＩの化合物を式Ｉの化合物に変換するような条件の下で培養するステップ、
を含むプロセスも提供する。
【０１１７】
本発明はまた、ＲがＨである上記のプロセスも包含する。
【０１１８】
「ネオサキシトキシン類似体」なる用語は、本明細書で使用される場合、以下で言及される化合物（好ましくはサキシトキシン）など、ネオサキシトキシンの類似体と変種を包含する。
【０１１９】
本明細書で開示されるようなサキシトキシンおよびネオサキシトキシンの生合成経路の解明はまた、（サキシトキシンの構造を基準にして）以下に示される変種など、様々なサキシトキシン、ネオサキシトキシンおよびゴニオトキシンの変種の生産も可能にする。
【０１２０】
【化３４】
2019504650.tif 000036
【０１２１】
本明細書で開示されるようなサキシトキシンおよびネオサキシトキシンの生合成経路の解明はまた、（サキシトキシンの構造を基準にして以下に示される）以下のネオサキシトキシンの類似体と変種の生産も可能にする。
【０１２２】
【化３５】
2019504650.tif 000037
【０１２３】
サキシトキシンの分子構造。
【０１２４】
麻痺性貝毒の天然誘導体（Ｏｓｈｉｍａ  １９９５）。使用される略語は、ＳＴＸ：サキシトキシン；ＧＴＸ：ゴニオトキシン；Ｃ：Ｃ−トキシン；ｄｃ：デカルバモイル；ｄｏ：デオキシ、である。
【０１２５】
【表１】
2019504650.tif 000038
【０１２６】
珍しいサキシトキシン誘導体の置換基。
（使用される略語は、ＬＴＸ：Ｌｙｎｇｂｙａ  ｗｏｌｌｅｉトキシン；ＧＣ：Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｃａｔｅｎａｔｕｍトキシン、である）
【表２】
2019504650.tif 000039
【０１２７】
【化３６】
2019504650.tif 000040
【０１２８】
ゴールデンフロッグＡｔｅｌｏｐｕｓ  ｚｅｔｅｋｉ由来のゼテキトキシンＡＢの分子構造（Ｙｏｔｓｕ−Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）。
【０１２９】
従って、さらなる態様では、本発明は、ネオサキシトキシン、またはネオサキシトキシンの生産における中間体、の生産のための本明細書で開示されるようなプロセスを含む、上記の表で定義されるようなサキシトキシンの変種、またはその生産における中間体、の生産のためのプロセスを提供し、ここで、このプロセスは、サキシトキシンの変種、またはその生産における中間体、を生産するように改変されている。
【０１３０】
例えば、サキシトキシンの生産では、ＳｘｔＸポリペプチドまたはｓｘｔＸ遺伝子の使用は不要であってよく、これは、ＳｘｔＸポリペプチドが、ネオサキシトキシンの生産におけるＮ１−ヒドロキシル化ステップを担う（そしてサキシトキシンはＮ１−ヒドロキシル化されない）ためである。
【０１３１】
ＧＴＸ−１〜ＧＴＸ−４などのＣ−１１硫酸化トキシンを生産するためのＣ−１１におけるスルホン化の前に、炭素Ｃ−１１がヒドロキシル化される必要がある。これは、ＳｘｔＤＩＯＸによって行われると推定される。
【０１３２】
スルホトランスフェラーゼＳｘｔＮは、Ｎ−スルホン化を触媒してＮ−スルホカルバモイルトキシン（ＧＴＸ５／６およびＣ１〜４トキシンなど）を生成すると推定される。これらの反応が経路のどこで起こるのかは不明である。しかし、それらは、ＳＴＸの形成よりも前に（すなわち、経路の最終産物ではなく中間体に対して）起こる可能性が高い。
【０１３３】
さらなる態様では、ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種を生産するための本発明のプロセスであって、ネオサキシトキシンまたはその類似体もしくは変種をＳｘｔＮポリペプチドまたはＳｘｔＤＩＯＸポリペプチドと接触させるステップをさらに含むプロセスが提供される。例えば、宿主細胞は、ｓｘｔＮおよび／またはｓｘｔＤＩＯＸをコードする遺伝子をさらに含むものであってよい。
【０１３４】
そのような方法で、サキシトキシンは、ＳｘｔＮによって（カルバモイル側鎖の硫酸化によって）ＧＴＸ−５に変換されてよい。同様に、サキシトキシンは、ＳｘｔＤＩＯＸによって１１−ヒドロキシサキシトキシンに変換されてよい。このステップは、サキシトキシンをＧＴＸ−２／３に（またはネオサキシトキシンをＧＴＸ−４／１に）変換するためのＣ−１１の硫酸化に先行するであろう。
【０１３５】
所与の株において生産されるトキシンのアレイは、異なる動態（反応速度）を有する各酵素と様々な修飾を有する中間代謝物に対する様々な緩い基質特異性との組み合わせの結果である可能性が高い。
【０１３６】
中間体８は、Ｏ−カルバモイルトランスフェラーゼＳｘｔＩによって中間体９に変換される。中間体８ならびに中間体９は両方とも、中間体８をｄｃＳＴＸに変換し中間体９をＳＴＸに変換するジオキシゲナーゼＳｘｔＨとＳｘｔＴの基質である可能性がある。ｎｅｏＳＴＸおよびｄｃｎｅｏＳＴＸの生産についても類似の経路である可能性が高い。
【０１３７】
【化３７】
2019504650.tif 000041
【０１３８】
中間体９およびデカルバモイルサキシトキシンへの中間体８の変換、ならびにサキシトキシンへの中間体９の変換。
【０１３９】
【化３８】
2019504650.tif 000042
【０１４０】
ヒドロキシル化中間体９およびデカルバモイルネオサキシトキシンへのヒドロキシル化中間体８の変換、ならびにネオサキシトキシンへのヒドロキシル化中間体９の変換。
【０１４１】
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のプロセスによって生産されるネオサキシトキシンまたはその類似体を提供する。本発明のプロセスによって生産されるネオサキシトキシンまたはその類似体は、塩に、特に無機性または有機性の酸または塩基との医薬的に許容されるその塩に、さらに変換されてよい。
【０１４２】
この目的のために使用され得る酸には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルホン酸、メタンスルホン酸、リン酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸およびアスコルビン酸が包含される。この目的に適している可能性がある塩基には、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化セシウム）、アンモニアならびに有機アミン（ジエチルアミン、トリエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、シクロヘキシルアミンおよびジシクロヘキシルアミンなど）が包含される。塩の形成のための手順は、当技術分野の従来通りのものである。
【０１４３】
本発明のプロセスによって生産されるネオサキシトキシンまたはその類似体あるいはその塩は、さらに、医薬組成物における使用のために製剤化されてよい。従って、さらなる態様では、単離または精製されたネオサキシトキシンまたはその塩を医薬組成物に製剤化するステップをさらに含む、ネオサキシトキシンまたはその類似体あるいはその塩を生産するための本発明のプロセスが提供される。好ましくは、このステップは、単離または精製されたネオサキシトキシンまたはその類似体あるいはその塩を１種以上の医薬的に許容される担体、補助剤および／または賦形剤と組み合わせることを含む。
【０１４４】
特に、ネオサキシトキシンまたはその類似体あるいはその塩は、当技術分野で周知の技術に従って、１種以上の従来の担体、希釈剤および／または賦形剤と共に製剤化されてよい。医薬的に許容される担体、補助剤および／または賦形剤は、保存剤であってよい。
【０１４５】
組成物は、経口投与に、または（例えば、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、または筋肉内注射による）非経口投与に、適合させてよい。従って、好適な医薬形態には、必要に応じて１種以上の従来の不活性担体および／または希釈剤（コーンスターチ、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、クエン酸、酒石酸、水、水／エタノール、水／グリセロール、水／ソルビトール、水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ステアリルアルコール、カルボキシメチルセルロースまたは脂肪性物質（ハードファットなど）あるいは上記のいずれかの好適な混合物など）と共に、活性成分を含有する、単純な錠剤もしくはコーティングされた錠剤、カプセル剤、懸濁液および溶液が包含される。
【０１４６】
あるいは、ネオサキシトキシンまたはその塩は、局所投与のために、例えば従来の希釈剤、担体または賦形剤と共にネオサキシトキシンまたはその塩を含む、例えばゲル、クリーム、エマルジョン、ペースト等の形態に、製剤化されてよい。
【０１４７】
他の実施形態では、ネオサキシトキシンまたはその塩は、経皮投与のために製剤化されてよい。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】Ｋｅｌｌｍａｎｎ（２００８）によって提唱されたサキシトキシンの生産のための以前の生化学的経路。
【図２】２つの修正された、ネオサキシトキシンの生産のための生化学的経路。図２では、経路は、６−５−５−員環中間体の使用を伴う。図３では、経路は、６−５−５−環系に変換される５−５−５−員環中間体の使用を伴う。
【図３】２つの修正された、ネオサキシトキシンの生産のための生化学的経路。図２では、経路は、６−５−５−員環中間体の使用を伴う。図３では、経路は、６−５−５−環系に変換される５−５−５−員環中間体の使用を伴う。
【図４Ａ】ネオサキシトキシンの生産においてＮ−１ヒドロキシル基が経路のどこで導入されるかを示す、提唱される生化学的経路。Ｒ基は、ヒドロキシル化が起こり得る箇所を示す。
【図４Ｂ】ネオサキシトキシンの生産においてＮ−１ヒドロキシル基が経路のどこで導入されるかを示す、提唱される生化学的経路。Ｒ基は、ヒドロキシル化が起こり得る箇所を示す。
【図５】ＩＭＡＣ後のＳｘｔＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。レーン１：ＳｘｔＡ（１４７ｋＤａ）、シャペロンであるＤｎａＫとＧｒｏＥＳ（それぞれ、７０ｋＤａおよび６０ｋＤａ）、Ｓｆｐ（２７ｋＤａ）を含むタンパク質溶液。レーン２：Ｌａｄｄｅｒ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ（ＢｉｏＲａｄ）。
【図６】ＳｘｔＡ−ＡＣＰドメインのホスホパンテテイニル化のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ分析。精製したＳｘｔＡ（ａ）およびＳｆｐと共発現させたＳｘｔＡ（ｂ）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦで分析し、質量はそれぞれ１４，６９４Ｄａおよび１５，０３４Ｄａであった。３４０Ｄａの差は、ホスホパンテテイニルアームの結合に相当する。
【図７】Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体のメタノール抽出物の液体クロマトグラフィー−質量分析。ａ）誘導した抽出物（破線）および誘導していない抽出物（実線）の両方の全イオン電流クロマトグラム。ｂ）誘導した抽出物（破線）および誘導していない抽出物（実線）の両方のｍ／ｚ＝１８７．０６についての抽出されたイオンクロマトグラム。ｃ）誘導した抽出物（四角）と誘導していない抽出物（丸）との間でｍ／ｚ  １８７．０６の分子イオンの発現を比較するＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓＱＩ統計分析。ｄ）誘導した抽出物の質量スペクトル。
【図８】Ｅ．ｃｏｌｉのマンニトールオペロンへのＰＰＴａｓｅ遺伝子コンストラクトの挿入についてのスキーム。
【図９Ａ】（ａ）ラクトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ１。カナマイシンカセットは、フリッパーゼ組換えによって除去されている。（ｂ）マルトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ２。カナマイシンカセットは、フリッパーゼ組換えによって除去されている。（ｃ）キシロースオペロンに組み込まれたｓｘｔ３（全ての遺伝子）。カナマイシンカセットは、フリッパーゼ組換えによって除去されている。（ｄ）メロビオースオペロン（melobiose operon）に組み込まれたｓｘｔ４。カナマイシンカセットは除去されていない。
【図９Ｂ】（ａ）ラクトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ１。カナマイシンカセットは、フリッパーゼ組換えによって除去されている。（ｂ）マルトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ２。カナマイシンカセットは、フリッパーゼ組換えによって除去されている。（ｃ）キシロースオペロンに組み込まれたｓｘｔ３（全ての遺伝子）。カナマイシンカセットは、フリッパーゼ組換えによって除去されている。（ｄ）メロビオースオペロンに組み込まれたｓｘｔ４。カナマイシンカセットは除去されていない。
【図１０】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１の細胞抽出物における中間体８の検出。
【図１１】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１の細胞抽出物における中間体８のＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図１２】ネオサキシトキシン標準溶液（１００ｎＭ）の精密質量ＬＣ−ＭＳ分析。ｍ／ｚ  ３１６．１３６３９（４００ｍｍｕのウィンドウ）の選択イオンモニタリングクロマトグラムが上段のプロットに示されており、ピーク全体にわたるＭＳスペクトル、および理論上のスペクトルが、それぞれ中段および下段のプロットに示されている。保持時間（ＲＴ）、手動で積分されたピーク面積（ＭＡ）、シグナル・ノイズ比（ＳＮ）は、上段のプロットに提示されている。測定された質量、化学組成および質量誤差（ｐｐｍ）は、中段および下段のプロットに提示されている。
【図１３】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３からの抽出物の精密質量ＬＣ−ＭＳ分析。ｍ／ｚ  ３１６．１３６３９（４００ｍｍｕのウィンドウ）の選択イオンモニタリングクロマトグラムが上段のプロットに示されており、ピーク全体にわたるＭＳスペクトル、および理論上のスペクトルが、それぞれ中段および下段のプロットに示されている。保持時間（ＲＴ）、手動で積分されたピーク面積（ＭＡ）、シグナル・ノイズ比（ＳＮ）は、上段のプロットに提示されている。測定された質量、化学組成および質量誤差（ｐｐｍ）は、中段および下段のプロットに提示されている。
【図１４】様々な細胞溶解の方法によるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＶＢ−ｓｘｔＡＢＣからの中間体１の回収。ＬＣ−ＭＳ分析をＳＩＭモード（４００ｍｍｕの質量ウィンドウでのｍ／ｚ  １８７．１５５３４）で行った。装置の反応がピーク面積（１秒あたりのカウント数）として提示されている。
【図１５】Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ４（ｓｆｐ  ｓｘｔ１２３  Ｖ４）に対するパーセントでのｎｅｏＳＴＸの生産レベル。ｓｆｐ  ｓｘｔ１２３  Ｖ４の抽出物におけるｎｅｏＳＴＸの推定濃度は２．８ｎＭであった。
【図１６】振とうフラスコ培養で５０ｍＬのＴＢ培地において増殖させたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ（陰性対照株）とＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３からのナトリウムチャネル遮断毒素ｎｅｏＳＴＸの濃度。各棒は、生物学的再現を表す。エラーバーは、同じ抽出物で４回反復したＭＮＢＡアッセイの標準偏差を表す。サンプルは全て、分析の前に弱陽イオン交換固相抽出によって１．２ｇの細胞ペレットから抽出された。濃度は、１リットルあたりのｎｅｏＳＴＸのｎｍｏｌで提示されている。抽出物中のｎｅｏＳＴＸの平均濃度は３８．７４ｎＭ（±７．８標準偏差）であった。
【図１７】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ｐＶＢ−ｓｘｔＡによる中間体１の生産。ｓｆｐ  ｐＶＢ：インサートを含まないｐＶＢベクター。ｓｆｐ  ｎａｔ８：天然のｓｘｔＡのコドン使用頻度およびＲＢＳと開始コドンとの間の８ｂｐのスペーサーを有するｐＶＢベクター。ｓｆｐ  ｎａｔ１０：天然のｓｘｔＡのコドン使用頻度およびＲＢＳと開始コドンとの間の１０ｂｐのスペーサーを有するｐＶＢベクター。ｓｆｐ  ｓｙｎ８：Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン使用頻度を最適化した合成ｓｘｔＡ遺伝子およびＲＢＳと開始コドンとの間の８ｂｐのスペーサーを有するｐＶＢベクター。ｓｆｐ  ｓｙｎ１０：Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためにコドン使用頻度を最適化した合成ｓｘｔＡ遺伝子およびＲＢＳと開始コドンとの間の１０ｂｐのスペーサーを有するｐＶＢベクター。
【図１８】Ｅ．ｃｏｌｉ株における中間体８とｎｅｏＳＴＸの生産。Ｔ３ＰＰＴ：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３Ｖ１。ＮｓＰＰＴ：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３Ｖ１  ｐＥＴ２８ｂ−ＮｓＰＰＴ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする）。Ｔ３Ａｌａ１８Ｔ３ＰＰＴａｓｅ：Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３Ｖ１  ｐＥＴ３０ｂ−Ａｌａ１８Ｔ３ＰＰＴａｓｅ（発現中の溶解性を改善するために最初の１８個のＮ−末端アミノ酸が除去されたＴ３ＰＰＴａｓｅをコードする）。示されているところでは、培養液を０．２ｍＭのＩＰＴＧおよび１ｍＭのトルイル酸で誘導した。
【図１９】基質としてサキシトキシンを用いたＳｘｔＮのスルホトランスフェラーゼアッセイの（上から下に）ＬＣクロマトグラム、ＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーション。
【図２０】基質としてＳＴＸを用いたジオキシゲナーゼアッセイ（ＳｘｔＤＩＯＸ）の（上から下に）ＬＣクロマトグラム、ＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳフラグメンテーション。対照（左側）には存在しない、アッセイにおいてヒドロキシ−ＳＴＸの生産を示すピーク（右側）が、矢印で示されている。
【実施例】
【０１４９】
以下の実施例によって本発明がさらに説明されるが、これらの実施例では、特に明記しない限り、部および百分率は重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示を目的として提示されているに過ぎないということが理解されるべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途および条件に適合させるために本発明の様々な変更および改変を行うことができる。従って、本明細書で示され説明されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変も、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１５０】
本明細書に記載される各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５１】
実施例１：ＳｘｔＡの生産
ｐＥＴ２８ｂにおけるｓｘｔＡとｓｆｐのサブクローニング
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３由来のｓｘｔＡおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓｆｐのＰＣＲ増幅を、Ｖｅｌｏｃｉｔｙポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を使用してゲノムＤＮＡから行った。製造業者のプロトコルに従ったが、アニーリング温度は５５℃であり、伸長時間はｓｘｔＡとｓｆｐについてそれぞれ４分と１分であった（ｓｘｔＡプライマー：フォワード５’−ＧＧＧＣＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＴＴＡＡ−３’（配列番号８１）およびリバース５’−ＡＡＡＧＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＡＴ−３’（配列番号８２）；ｓｆｐプライマー：フォワード５’−ＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＧＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＧＧＡＡ−３’（配列番号８３）およびリバース５’−ＧＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＧＣＧＣＴＴＣＧ−３’（配列番号８４））。ＰＣＲの増幅産物を精製し（ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ５Ｘ  ｋｉｔ，  ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ（ｓｘｔＡ）またはＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ（ｓｆｐ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。消化産物を精製し、同じ酵素で切断してアガロースゲル電気泳動により精製（ＤＮＡ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｋｉｔ，  ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）したｐＥＴ−２８ｂに連結した。エレクトロコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＧＢ２００５細胞での形質転換の後、ユニバーサルプライマーＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターを用いた精製済みプラスミド（ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰＣＲによって陽性クローンをスクリーニングした。確認のためにインサートを配列決定した（ＵＮＳＷのＲａｍａｃｉｏｔｔｉ  Ｃｅｎｔｅｒ、オーストラリア）。
【０１５２】
ｓｘｔＡとの共発現のために、ｓｆｐ遺伝子を、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターに対するプライマー（５’−ＧＧＴＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ−３’（配列番号８５）、５’−ＴＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣ−３’（配列番号８６））と共にＶｅｌｏｃｉｔｙポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用いてｐＥＴ２８ｂ：：ｓｆｐから増幅した。製造業者のプロトコルに従ったが、アニーリング温度は５５℃であり、伸長時間は１分であった。増幅産物を精製し（ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ  ５Ｘ  ｋｉｔ，  ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、ＢｇｌＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。消化産物を精製し、同じ酵素で切断して先に説明したように精製したｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡに連結した。エレクトロコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＧＢ２００５細胞での形質転換の後、精製済みプラスミド（ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＰＣＲによって陽性クローンをスクリーニングした。確認のためにインサートを配列決定した（ＵＮＳＷのＲａｍａｃｉｏｔｔｉ  Ｃｅｎｔｅｒ、オーストラリア）。
【０１５３】
ｓｆｐを伴うｓｘｔＡの発現およびホロ−ＳｘｔＡの精製
ｓｘｔＡの発現のために、ｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡ，ｓｆｐおよびｐＲＡＲＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を一晩培養したもの０．５ｍＬを、５０μｇ・ｍＬ−１のカナマイシンおよび３０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコールを追加した５０ｍＬの溶原ブロス（ＬＢ）培地で継代培養し、６００ｎｍで０．８〜１．０の光学密度になるまで攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３０℃でインキュベートした。次いで、培養液を、２００μＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、撹拌しながら１８℃で一晩インキュベートし、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ遠心機、Ｒ１０Ａ５ローター）によってペレット化した。細胞ペレットは、さらなる精製まで凍結した。
【０１５４】
ペレット化した細胞を１０ｍＬの溶解バッファ（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール（imadazole））に再懸濁し、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｍ４５０、３ｍｍプローブ、３０％の振幅、１５秒の電源オンおよび５９秒の電源オフというサイクルで４℃にて３分）によって溶解させた。得られた懸濁液を遠心分離（２００００ｒｐｍ、４℃で６０分間、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ遠心機、Ｒ２０Ａ２ローター）し、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール（バッファＡ）で平衡化したＮｉ−アフィニティーカラム（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒに装着した１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐカラム，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。注入後、カラムを洗浄し（３５ｍＬのバッファＡ、１ｍＬ・ｍｉｎ−１）、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール（バッファＢ）と、２０分で０％から２０％のバッファＢへの段階勾配、続いて２０％で１０分、次いで２０分で２０％から１００％への直線勾配、および１０分間の１００％での最終洗浄と、を用いてタンパク質を溶出させた。回収した画分（１ｍＬ、２８０ｎｍで検出）を、変性条件下での１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析し、純粋なタンパク質を含有する画分をプールした。タンパク質溶液を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４を用いて遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルターユニット１００ｋ）により脱塩および濃縮した後、グリセロールを１０％（ｗ／ｖ）という最終濃度になるように添加した。タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質濃度を決定し、−８０℃で保存した。
【０１５５】
単独発現およびｓｆｐとの発現のためのｓｘｔＡのアシルキャリアータンパク質ドメインのクローニング
ｓｘｔＡのアシルキャリアータンパク質（ｓｘｔＡ−ＡＣＰ）をコードする遺伝子を、Ｖｅｌｏｃｉｔｙポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）（プライマー：フォワード５’−ＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＡ−３’（配列番号８７）およびリバース５’−ＴＡＴＣＴＣＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＣＴＧ−３’（配列番号８８））を用いて増幅した。製造業者のプロトコルに従ったが、アニーリング温度は５４℃であり、伸長時間は１．５分であった。ｓｆｐについて説明したのと同じ方法を用いて、ＰＣＲの増幅産物を精製し、消化し、ｐＥＴ−２８ｂに連結した。エレクトロコンピテントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＧＢ２００５細胞での形質転換の後、ユニバーサルプライマーＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーターで陽性クローンをスクリーニングし、先に説明したように配列決定した。ｓｆｐとの共発現のために、先に説明したように遺伝子をｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡ−ＡＣＰプラスミドにクローニングした。
【０１５６】
アポ−およびホロ−ｓｘｔＡ−ＡＣＰの発現と精製
ｓｘｔＡ−ＡＣＰの発現のために、ｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡ−ＡＣＰおよびｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡ−ＡＣＰ，ｓｆｐのプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を一晩培養したもの１０ｍＬを、５０μｇ・ｍＬ−１のカナマイシンおよび３０μｇ・ｍＬ−１のクロラムフェニコールを追加した１Ｌの溶原ブロス（ＬＢ）で増殖させ、上述されるような１００μＭのＩＰＴＧでの誘導まで攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。細胞を、遠心分離（４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ遠心機、Ｒ１０Ａ５）によって回収し、１５ｍＬの溶解バッファに再懸濁し、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｍ４５０、３ｍｍプローブ、３０％の振幅、１秒の電源オンの後に４秒の電源オフというサイクルで４℃にて３分）によって破壊した。得られた懸濁液を遠心分離（２００００ｇ、４℃で６０分間、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ遠心機、Ｒ２０Ａ２ローター）し、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール（バッファＡ）で先に平衡化したＮｉ−アフィニティーカラム（ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒに装着した１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。注入後、カラムを洗浄し（３５ｍＬのバッファＡ、１ｍＬ・ｍｉｎ−１）、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール（バッファＢ）と、２０分で０％から２０％のＢへの直線勾配、次いで２０％で１０分、次いで２０分で２０％から１００％への直線勾配、および２０分間の１００％での最終洗浄と、を用いてタンパク質を溶出させた。回収した画分（１ｍＬ、２８０ｎｍで検出）を、変性条件下での１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析し、純粋なタンパク質を含有する画分をまとめてプールした。タンパク質溶液を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４を用いた遠心濾過（centrifucation filtration）（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット３ｋ）を用いて脱塩および濃縮し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。タンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質濃度を決定した。
【０１５７】
ＩＭＡＣでの精製とＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、ＳｘｔＡが首尾よく検出された（図５）。１４３ｋＤａの予想サイズのタンパク質が、０．５ｍｇ・Ｌ−１培養液という収量で精製され、トリプシン分解によって、その正体がＳｘｔＡであることを確認した。
【０１５８】
アポ−およびホロ−ｓｘｔＡ−ＡＣＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析
タンパク質の質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析によって検出した。マトリックスの調製のために、１０ｍｇの３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシル桂皮酸を、０．１％のＴＦＡを含む８０％のアセトニトリル１ｍＬに添加し、１ｍＬのマトリックスをＭＡＬＤＩターゲットプレートの表面上で１μｌのタンパク質サンプルと混合した後、ＹＡＧレーザーを備えたＢｒｕｋｅｒ  ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって分析した。データの取得は陽イオンモードで実施し、装置を各分析の直前に較正した。１００の平均スペクトルを取得する線形ディレイド・エクストラクションモード（linear delayed extraction mode）で分析を実施した。結果を図６に示す。
【０１５９】
４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタンの抽出
ｐＲＡＲＥおよびｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡ，ｓｆｐを含むＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を、０．１％の酢酸（acid acetic）で酸性化したメタノールに再懸濁した。超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｍ４５０、３ｍｍプローブ、３０％の振幅、５秒の電源オンおよび１５秒の電源オフというサイクルで４℃にて２分）によって細胞を破壊した。得られた懸濁液を遠心分離（２０，０００ｒｐｍ、４℃で３０分間、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＣＲ２２ＧＩＩＩ遠心機、Ｒ２０Ａ２ローター）した。上清を回転蒸発で乾燥させ、さらなる分析まで−２０℃で保存した。
【０１６０】
４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタンの質量分析
ＳｘｔＡの生合成産物を決定するために、ｐＥＴ２８ｂ：：ｓｘｔＡ，ｓｆｐおよびｐＲＡＲＥを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞の細胞内代謝物を化学的に抽出し、ＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０１６１】
９５：５のアセトニトリル：水（典型的には１ｍＬ）にサンプルを再懸濁し、質量分析用のＨＰＬＣバイアルに移した。加熱したエレクトロスプレーインターフェースを介してＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にインターフェースされたＤｉｏｎｅｘ  Ｕ３０００  ＵＨＰＬＣを使用して、１０μＬのサンプルに対してＬＣ−ＭＳ分析を実施した。イオン化は、（製造業者のＴｕｎｅソフトウェアによって提案されるように）デフォルトのソース条件でポジティブモードにて実施した。サンプルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣカラム（２．１×１００ｍｍ、１．９μｍ）に注入した。クロマトグラフィーの条件は、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．におけるものと同様であり、改変しなかった。
【０１６２】
質量分析計をデータ依存解析モードで動作させ、６つのＭＳ／ＭＳスペクトルを、全てのフルスキャン質量スペクトルの後に収集した。文献からのトキシンと代謝物の包括リストを用いて、それらの検出を優先させた。
【０１６３】
誘導した細胞と誘導していない対照との間での質量スペクトルの比較は、ＡＯＧＨ（Ｃ８Ｈ１８Ｎ４Ｏ）のプロトン化された質量に該当するｍ／ｚ  １８７．０６［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンの存在を１．１分に示した。この分子イオンの二次イオンフラグメンテーションは、ＡＯＧＨに酷似するフラグメンテーションパターンをもたらした。この実験を８回繰り返し、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩによって質量データを解析して、誘導した抽出物と誘導していない抽出物との間の発現の差を定量化した。推定上のＡＯＧＨ化合物が、誘導していない対照と比較して、誘導した細胞で過剰発現していることが観察され（図）、最大倍率変化は無限大に等しく（陰性対照では全く存在しない）、ＡＮＯＶＡのｐ値は１．１×１０−１６であった。
【０１６４】
１８７．０６Ｄａの質量の化合物を精製し、ＮＭＲで分析してＡＯＧＨの構造を確認した。
【０１６５】
実施例２：ｓｘｔ１フラグメント
Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３に由来する以下の３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、「ｓｘｔ１」と名付けたヌクレオチドフラグメント中に配置した：ｓｘｔＡ、ｓｘｔＢおよびｓｘｔＣ。各ＯＲＦは、ＧｅｎｅＡｒｔソフトウェアを用いてＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによってＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化された。
【０１６６】
このフラグメントの両端にＥｃｏＲＩ制限部位を付加した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムへの、ＲＥＤ  ＥＴにより媒介される組換えによる組み込みのために、ｌａｃＺ（Ｈ１）遺伝子およびｌａｃＡ（Ｈ２）遺伝子に対する５０ｂｐの相同領域を、それぞれ５’端および３’端に付加した。Ｈ１の下流には、リードスルーを防止するためにターミネーターを付加し、その後ろに転写因子遺伝子ｘｙｌＳおよびそのＰｓ２プロモーターが続いた（ＸｙｌＳは、その誘導物質であるトルイル酸に結合した後にＰｍプロモーターからの転写に必要である転写因子である）。この後ろにターミネーターが続き、次いで、下流のｓｘｔ遺伝子の転写のためのＰｍプロモーターが続いた。各ＯＲＦの上流にリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を付加した。最後に、フリッパーゼ−リコンビナーゼ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）による切除のための２つのＦＲＴ部位によって挟まれたカナマイシン耐性マーカー、および相同性アームＨ２を付加した（末端ＥｃｏＲＩ部位を含む）。
【０１６７】
実施例３：ｓｘｔ２フラグメント
以下のｓｘｔ遺伝子を「ｓｘｔ２」フラグメントに含めた：ｓｘｔＤ、ｓｘｔＥ、ｓｘｔＧ、ｓｘｔＨ、ｓｘｔＩ、ｓｘｔＪ、ｓｘｔＫ、ｓｘｔＬ。各ＯＲＦは、ＧｅｎｅＡｒｔソフトウェアを用いてＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによってＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化された。
【０１６８】
ｓｘｔ２フラグメントは、末端ＥｃｏＲＩ部位と、Ｅ．ｃｏｌｉのｍａｌＥ（Ｈ１）遺伝子およびｍａｌＧ（Ｈ２）遺伝子との組換えのための相同性アームと、ｓｘｔ遺伝子の上流のＰｍプロモーターと、を有するように設計された。このフラグメントはまた、フラグメントｓｘｔ１と同様にＦＲＴ部位を有するｋａｎＲ耐性カセットも含んだ。
【０１６９】
実施例４：ｓｘｔ３フラグメント
ｓｘｔ３フラグメントの３つのバリアントを設計した。以下のｓｘｔ遺伝子を「ｓｘｔ３」フラグメント・バリアント１に含めた：ｓｘｔＱ、ｓｘｔＲ、ｏｒｆ２４、ｓｘｔＳ、ｓｘｔＴ、ｓｘｔＵ、ｓｘｔＶ、ｓｘｔＷ、ｓｘｔＸ。以下のｓｘｔ遺伝子を「ｓｘｔ３」フラグメント・バリアント２に含めた：ｓｘｔＱ、ｓｘｔＲ、ｓｘｔＳ、ｓｘｔＴ、ｓｘｔＵ、ｓｘｔＶ、ｓｘｔＷ、ｓｘｔＸ。以下のｓｘｔ遺伝子を「ｓｘｔ３」フラグメント・バリアント３に含めた：ｓｘｔＳ、ｓｘｔＴ、ｓｘｔＵ、ｓｘｔＶ、ｓｘｔＷ、ｓｘｔＸ。各ＯＲＦは、ＧｅｎｅＡｒｔソフトウェアを用いてＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによってＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化された。
【０１７０】
ｓｘｔ３フラグメントの各バリアントは、末端ＥｃｏＲＩ部位と、Ｅ．ｃｏｌｉのｘｙｌＦ（Ｈ１）遺伝子およびｘｙｌＢ（Ｈ２）遺伝子との組換えのための相同性アームと、ｓｘｔ遺伝子の上流のＰｍプロモーターと、を有するように設計された。このフラグメントの各バリアントはまた、フラグメントｓｘｔ１と同様にＦＲＴ部位を有するｋａｎＲ耐性カセットも含んだ。
【０１７１】
実施例５：ｓｘｔ４フラグメント
以下のｓｘｔ遺伝子を「ｓｘｔ４」フラグメントに含めた：ｓｘｔＦ、ｓｘｔＰ、ｓｘｔＭ。各ＯＲＦは、ＧｅｎｅＡｒｔソフトウェアを用いてＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによってＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化された。
【０１７２】
ｓｘｔ４フラグメントは、末端ＥｃｏＲＩ部位と、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｅｌＲ（Ｈ１）遺伝子およびｍｅｌＢ（Ｈ２）遺伝子との組換えのための相同性アームと、ｓｘｔ遺伝子の上流のＰｍプロモーターと、を有するように設計された。このフラグメントはまた、フラグメントｓｘｔ１と同様にＦＲＴ部位を有するｋａｎＲ耐性カセットも含んだ。
【０１７３】
実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅの作製
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）を用いてポリケチドシンターゼＳｘｔＡのアポ−形態をそのホロ−形態に変換することが望ましい。
【０１７４】
Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｓｉｓ  ｂｒｏｏｋｉ  Ｄ９とＣｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｏｂｏｒｓｋｉｉ  ＣＳ−５０５の全ゲノムが配列決定されており、その配列はＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。これらの株の各々は、１つのＰＰＴａｓｅ遺伝子しか含まない。Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３由来のＰＰＴａｓｅ遺伝子をＰＣＲ増幅して配列決定するために、Ｄ９とＣＳ−５０５のＰＰＴａｓｅ遺伝子に基づいて特異的ＰＣＲプライマーを設計した。
【０１７５】
Ｃ．ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３のＰＰＴａｓｅ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のマルトースオペロンに組み込むために、合成遺伝子コンストラクトを設計した。ＰＰＴａｓｅ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、このコンストラクトに、Ｔ７プロモーターとアンピシリン耐性の選択のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子とを取り付けた。開始コドンもＡＴＧに変更した。
【０１７６】
その後、製造業者の指示に従ってＱｕｉｃｋ＆Ｅａｓｙ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ，  カタログ番号：Ｋ００６）を使用して、および図８に示すように、遺伝子コンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のマルトースオペロンに組み込んだ。正しく組み込まれていること、および意図しない変異が存在しないことを配列決定によって確認した。
【０１７７】
実施例７：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅ  ｐＳｘｔ１による４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタンの生産
Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによってｐＭＡ−ＲＱ（ａｍｐＲ）プラスミドバックボーンの中にｓｘｔ１フラグメントが作製された。このプラスミドは、本明細書ではｐＳｘｔ１と呼称される。そのゲノム中にＣｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｓ  ｒａｃｉｂｏｒｓｋｉｉ  Ｔ３由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅにｐＳｘｔ１プラスミドを形質転換した。ＰＰＴａｓｅ遺伝子は、Ｔ７プロモーターの制御下にあり（ＩＰＴＧ誘導性）、ｐＳｘｔ１上のｓｘｔＡ遺伝子、ｓｘｔＢ遺伝子およびｓｘｔＣ遺伝子は、Ｐｍプロモーターの制御下にある（ｍ−トルイル酸誘導性）。
【０１７８】
この実験の目的は、一定の誘導物質濃度（ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）およびｍ−トルイル酸（１ｍＭ））において３つの異なる温度（５℃、１９℃、および３０℃）でのＥ．ｃｏｌｉにおけるｓｘｔＡ遺伝子の発現と活性を測定することであった。実験株はＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅ  ｐＳｘｔ１であり、陰性対照はＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（親株）であった。ＳｘｔＢとＳｘｔＣの基質は、ｐＳｘｔ１上にはコードされていない他の酵素（ＳｘｔＧなど）の酵素生成物であるため、ＳｘｔＡだけの酵素生成物が期待された。
【０１７９】
ＢＬ２１（ＤＥ３）（親株）およびＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅ  ｐＳｘｔ１の種培養液を、それぞれＬＢおよびＬＢ  ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとカナマイシンにおいて３７℃で一晩増殖させた。翌日、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む２００ｍｌのＬＢ培地３組にＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅ  ｐＳｘｔ１の種培養液をそれぞれ２ｍｌ植菌し、培養液が約０．６のＯＤ６００に達するまで３０℃でインキュベートした。
【０１８０】
陰性対照については、抗生物質を含まない２００ｍｌのＬＢ培地３組にＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の種培養液をそれぞれ２ｍｌ植菌し、約０．６のＯＤ６００まで３０℃でインキュベートした。次いで、全ての培養液を対応する温度に移し、３０分間順化させた。その後、ＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）およびｍ−トルイル酸（最終濃度１ｍＭ）を各培養液に添加し、次いで、これらを、５℃で４８時間、１９℃および３０℃で１８時間、インキュベートした。
【０１８１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびにＲＴ−ＰＣＲのためのサンプルを誘導前および実験終了時に採取した。１８時間の誘導の後、７．５００ｒｐｍで１２分間の遠心分離によって培養液を回収した。細胞ペレットは、ＬＣ−ＭＳ分析のための抽出まで凍結させた。
【０１８２】
抽出
細胞ペレットを１ｍｌの水に再懸濁し、氷上で超音波処理した（出力コントロール４、デューティサイクル５０％、２〜３分のサイクルで合計７分）。超音波処理の後、４ｍｌのアセトニトリルを添加し、サンプルをボルテックスし、遠心分離して細胞片および他の微粒子を除去した。
【０１８３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｈａｕｋｅｌａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＨｏｒｍｏｎｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙにて、５０×２．１ｍｍ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨアミドカラムを取り付けたｉｃｌａｓｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣに連結したＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  ＴＱ−Ｓで行った。移動相Ａは、１０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）からなり、移動相Ｂは、１０ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を含む９５％のアセトニトリルからなるものであった。流速は０．４ｍｌ／分であり、カラム温度は４０℃に保持された。８５％のＢから７０％のＢへと３分間にわたる勾配を適用した。注入量は常に１μｌであった。
【０１８４】
アナライトは、エレクトロスプレーイオン化によってポジティブモードでイオン化した。以下のｍｒｍトランジションを測定した。アルギニン１７５．０５−＞６０．００，  １７５−＞７０．０２、４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタン：１８７．１−＞１７０．１，  １８７．１−＞１２８．１，  １８７．１−＞１１０．１，  １８７．１−＞７２．０８，  １８７．１−＞６０．０５（Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）およびＴｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）に準ずる）。
【０１８５】
大きなアルギニンのピークが全ての培養処理において、ならびに純粋なアルギニン溶液に対して、検出されたが（データは示さない）、４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタンのシグナルは、アルギニン溶液および全ての対照には存在しなかった。さらに、４−アミノ−３−オキソ−グアニジノヘプタンのシグナルは、１９℃で誘導された培養液以外の全てのＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅ  ｐＳｘｔ１の培養液には存在しなかった。
【０１８６】
この実験は、合成ＤＮＡコンストラクトを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）において触媒活性のある形態でＳｘｔＡを発現させることができるということを実証した。この実験では、発現は、１９℃という増殖温度でのみ、および０．５ｍＭのＩＰＴＧと１ｍＭのトルイル酸での誘導の後に、生じた。
【０１８７】
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＥ３（ＢＬ２１）  ＰＰＴａｓｅの糖分解オペロンへのフラグメントｓｘｔ１〜ｓｘｔ３の組み込み
以下のようにｓｘｔ１コンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ  ＤＥ３（ＢＬ２１）  ＰＰＴａｓｅのｌａｃオペロンに組み込んだ。
【０１８８】
５０μｌの反応容量で２μｌのテンプレートＤＮＡ、０．４μＭのプライマー、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して合成ＤＮＡコンストラクトｓｘｔ１をＰＣＲ増幅した。
【０１８９】
ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９８℃で１分間、３０サイクル：９８℃で５秒間、７２℃で２分間、７２℃で５分間、次いで４℃に保持。
【０１９０】
次いで、ＰＣＲ産物（８０１９ｂｐ）を、ゲル電気泳動およびゲル抽出によって精製した後、ＲＥＤ  ＥＴにより媒介される組換えに用いた。組換えの前に、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ＰＰＴａｓｅをプラスミドｐＲＥＤ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）で形質転換し、ｐＲＥＤがコードするリコンビナーゼの転写を製造者の指示に従って誘導した。その後、形質転換された株を上述のＰＣＲ産物と共にエレクトロポレーションし（２．５ｋＶ、２００オーム、２５μＦ、５μｌ中に１５０ｎｇのＰＣＲ産物）、その後にｌａｃオペロンへの組換えが続いた。
【０１９１】
エレクトロポレーションされた細胞を、１５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。得られたクローンを採取し、１５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（ラクトースを含む）上にプレーティングし、３７℃で少なくとも２４時間増殖させた。得られた白色のコロニーを純粋培養へと単離し、ｌａｃオペロンにフラグメントｓｘｔ１が正しく、および変異なしに、組み込まれていることをＰＣＲと配列決定によって試験した。
【０１９２】
確認の後、製造業者のプロトコル（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ）に従ってプラスミドｐ７０７を用いてフリッパーゼ組換えによりカナマイシン耐性カセットを除去するためにクローンを選択した。得られたクローンをカナマイシン耐性についてスクリーニングし、カナマイシン耐性カセットが首尾よく除去されていることをＰＣＲによって確認した。さらに、ＰＣＲを用いて、ｓｘｔ１フラグメントの残部が完全なままであることを確認した。
【０１９３】
次いで、得られた株を、同じ手法を用いて、マルトースオペロンへのフラグメントｓｘｔ２の組み込みに使用した。得られた株（フラグメントｓｘｔ１とｓｘｔ２が組み込まれており、カナマイシン耐性カセットが除去された後のもの）を同じ手法で使用して、キシロースオペロンへのｓｘｔ３フラグメントの３つのバリアントの各々を組み込んだ。
【０１９４】
【表３】
2019504650.tif 000043
【０１９５】
次いで、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ遺伝子ｓｆｐ（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＢＡ，  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：１７９０−２）を用いて、上記の株の各々においてＴ３  ＰＰＴａｓｅを置き換え、さらなる株を作製した。
【０１９６】
次いで、得られた株を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐのメロビオースオペロンへのフラグメントｓｘｔ４の組み込みに使用した。カナマイシンカセットは除去されなかった。ｓｘｔ１〜４のフラグメントの略図を図９に提示する。
【０１９７】
実施例９：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３のバリアント株の作製
親株として株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３を用いて、相同組換え法により個々の遺伝子または遺伝子のセットが除去された以下の株を作製した。
【０１９８】
【表４】
2019504650.tif 000044
2019504650.tif 000045
【０１９９】
実施例１０：ネオサキシトキシンと中間体を検出するためのＬＣ−ＭＳの使用
ＬＣ−ＭＳを使用してネオサキシトキシンとネオサキシトキシンの生産における中間体とを検出した。ＬＣ−ＭＳ分析は、ＥＳＩ  ＩＩイオン源を装着し、オンラインでＤｉｏｎｅｘ  ３０００  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ＲＳＬＣ超高圧液体クロマトグラフィー装置に連結した、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｑ  Ｅｘａｔｉｖｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ質量分析計で実施した。
【０２００】
【表５】
2019504650.tif 000046
【０２０１】
実施例１１：Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物における中間体１と中間体８の検出
１００ｍｌのフラスコ中で２０ｍｌのＬＢブロスにおいてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰｔａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１を１９℃にて振盪（２００ｒｐｍ）しながら増殖させた。培養液が０．９というＯＤ６００に達したら、０．２ｍＭのＩＰＴＧ、１ｍＭのトルイル酸で培養液を誘導し、ＯＤ６００＝５になるまで１８時間増殖させた。
【０２０２】
遠心分離によって細胞を回収し、メタノール中の０．１Ｍの酢酸８００μｌで抽出した。溶解物を遠心分離し、その上清を、ＬＣ−ＭＳ分析の前にアセトニトリルで１：５に希釈した。
【０２０３】
抽出物において中間体１および８が検出された。中間体８からのスペクトルを図１０および図１１に示す。
【０２０４】
実施例１２：ネオサキシトキシンの生産
５０ｍｌのＨｉ  ＹＥ培地においてＥ．ｃｏｌｉ  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３の種培養液を調製し、３０℃で一晩インキュベートした（２２５ｒｐｍ）。ヒータースリーブ（heater sleave）、水冷、ｐＨと溶存酸素のプローブを備えたＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＢｉｏＦｌｏ  １１０発酵槽（２Ｌ容積）を製造業者の指示に従って発酵実験のためにセットアップした。発酵槽に２ＬのＨｉ−ＹＥ培地のベースを充填し、オートクレーブした。酵母エキス、塩化マグネシウム、グルコースおよびグリセロールのストック溶液をオートクレーブ処理後に発酵槽に無菌的に添加した。さらに、５％のａｎｔｉｆｏａｍ２０４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の無菌溶液２ｍｌを発酵槽に添加した。５．７１というＯＤ６００を有する一晩培養した種培養液２０ｍｌを培地に植菌した。開始培養液のＯＤ６００は、０．１５と測定された。培養液を１９℃でインキュベートしたが、初期の撹拌は５０ｒｐｍであり、２６時間のインキュベーションの後に６００ｒｐｍまで増加させた。培養液を２ｌ／時間の流速にて加圧空気でパージした。ｐＨと溶存酸素のレベルを連続的にモニタリングし、サンプルを採取した後に増殖をオフラインで測定した。ｐＨ（ｐＨ７．１）ならびに溶存酸素レベル（１００％）は、実験全体の間、安定していた。２２時間のインキュベーションの後に（ＯＤ６００＝１０．６）、０．５ｍＭのｍ−トルイル酸および０．２ｍＭのＩＰＴＧで培養液を誘導し、さらに２２時間インキュベートした。無菌グルコース溶液（４００ｇ／ｌ）を実験の２４〜２６．３時間の間に２．９ｍｌ／分の流速で培養液に供給し（合計１１．４ｇ）、増殖およびｎｅｏＳＴＸの生産を刺激するために実験の２６．３時間の時点で１．８ｍｌの無菌１Ｍ硫酸マグネシウム溶液を添加した。４５時間後に実験を終了し、その時点で遠心分離（５０００×５、４℃で３０分）によって培養液を回収した。細胞ペレットを５０ｍｌの氷冷ＭＱ水で２回洗浄し（５．０００×ｇ、１０分、４℃）、秤量し、分析まで−２０℃で保存した。得られた全バイオマスは２３．７７ｇであった。
【０２０５】
発酵実験からの細胞を０．１％のギ酸中で煮沸することによって溶解させ、この抽出物を、ＬＣ−ＭＳ分析の前に、０．１％のギ酸を含むアセトニトリルで１：５に希釈した（図１２および図１３を参照のこと）。ペレット中のｎｅｏＳＴＸの含有量も、マウス神経芽腫アッセイＭＳによって分析した。
【０２０６】
実施例１３：中間体を抽出するための細胞溶解の最適化
天然の遺伝子ｓｘｔＡ、ｓｘｔＢ、ｓｘｔＣをｐＶＢベクター（Ｖｅｃｔｒｏｎｓ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）にクローニングし、得られたベクターｐＶＢ−ｓｘｔＡＢＣをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＡＰ１に形質転換した。ＢＡＰ１  ｐＶＢ−ｓｘｔＡＢＣを１０ｍｌのＴＢ培地において２００ｒｐｍで振盪しながら１９℃にて２４時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、氷冷ＭＱ水で２回洗浄し、ペレットを秤量し、分析まで−２０℃で保存した。
【０２０７】
ペレットを様々な溶解溶液に再懸濁した（１：３の湿重量：体積）：
１．    ２５ｍＭの水酸化ナトリウムを含む５０％メタノール
２．    ０．５％の水酸化アンモニウムを含む５０％メタノール
３．    ０．１％のギ酸を含む５０％メタノール
４．    ０．１ｍＭの塩酸
５．    ０．１％のギ酸
６．    ０．５％の水酸化アンモニウム
【０２０８】
処理１、２および３は、マイクロプローブを備えたＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（出力２、デューティサイクル５０％）を用いて２分間超音波処理した。処理３〜５は、沸騰水中で５分間煮沸した。抽出物を１８０００×ｇ（４℃）で１０分間遠心分離した。２５０μｌの上清を、０．４％のギ酸を含むアセトニトリル７５０μｌと混合し、遠心分離した（１８０００×ｇで１０分、４℃）。上清を中間体１のＬＣ−ＭＳ分析のためにオートサンプラーバイアルに移した（図１４を参照のこと）。
【０２０９】
０．１％のギ酸中での５分の煮沸は、ＨＩＬＩＣ  ＬＣ−ＭＳに支障を与えず、且つ抽出中に最小量の沈殿しか生じさせなかったため、最も好適な方法とみなされた。
【０２１０】
実施例１４：最適な株および生産レベル
１０ｍｌのＬＢブロスでＥ．ｃｏｌｉ株の種培養液を調製し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて一晩増殖させた。ｎｅｏＳＴＸの生産レベルについて、以下の株を比較した：
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ｓｘｔ１  ｓｘｔ２
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ１
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ２
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ４
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ５
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ６
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ７
【０２１１】
０．４％のグリセロールを含み、８９ｍＭのリン酸緩衝液でｐＨ６．８に緩衝化された、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）３０ｍｌに、０．０５という適切なＯＤ６００となるように、一晩培養した種培養液３００μｌを植菌した。培養液を、０．４というＯＤ６００に達するまで、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃にてインキュベートした。次いで、培養液を１９℃（振盪２２５ｒｐｍを伴う）に移し、０．５というＯＤ６００まで増殖させた。ｓｆｐ遺伝子とｓｘｔ遺伝子の誘導のために、０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度０．０５ｍＭ）およびトルイル酸（最終濃度０．５ｍＭ）を培養液に添加し、これを振盪（２２５ｒｐｍ）しながら１９℃でさらに４８時間インキュベートした。各株を３連の継代培養で増殖させた。各培養液の２５ｍｌを、４℃にて１０分間の３０００×ｇでの遠心分離によって回収した。１ｍｌの上清のアリコートを−２０℃で保存し、残りの上清は捨てた。細胞ペレットを、それぞれ２５ｍｌおよび５ｍｌの氷冷ＭＱ水で２回洗浄した（３０００×ｇ、１０分間、４℃）。細胞ペレットを秤量し、−２０℃で保存した。
【０２１２】
細胞ペレットからのトキシン抽出
細菌細胞ペレットを０．１％のギ酸に１：４（ｗｗｔ：ｖｏｌ）の比率で再懸濁し、５分間煮沸した。抽出物を氷上で短時間冷却し、１６．０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。ＬＣ−ＭＳ分析のために、上清を、２５ｎＭのサキシトキシン−１５Ｎ４内部標準を含む、９０％アセトニトリル：１０％メタノール：０．１％ギ酸により１：５の比率で希釈した。サンプルを遠心分離し（１６．０００×ｇ、１０分間、４℃）、その上清をＬＣ−ＭＳ分析のためにオートサンプラーバイアルに移した。
【０２１３】
増殖培地からのトキシン抽出
増殖培地（２００μｌ）を、１０％のギ酸２μｌで酸性化し、５分間煮沸し、氷上で冷却し、４℃にて１０分間、１６０００×ｇで遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、４０μｌの内部標準を添加した（１０％メタノールと９０％アセトニトリルと０．１％ギ酸において２５ｎＭのサキシトキシン−１５Ｎ４）。チューブを１６０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清をＬＣ−ＭＳ分析のためにＨＰＬＣオートサンプラーバイアルに移した。結果を図１５に示す。
【０２１４】
実施例１５：ナトリウムチャネル遮断毒素の検出のためのマウス神経芽腫アッセイ（ＭＮＢＡ）
ＭＮＢＡのためのＥ．ｃｏｌｉ培養
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐおよびＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐ  ＮＳＸ３ｖ３の種培養液を１０ｍｌのＬＢブロスで調製し、２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩増殖させた。０．４％のグリセロールを含み、８９ｍＭのリン酸緩衝液でｐＨ６．８に緩衝化された、Ｔｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）５０ｍｌに、０．０５という適切なＯＤ６００となるように、一晩培養した種培養液５００μｌを植菌した。培養液を、０．４というＯＤ６００に達するまで、２２５ｒｐｍで振盪しながら３０℃にてインキュベートした。次いで、培養液を１９℃（振盪２２５ｒｐｍを伴う）に移し、０．５というＯＤ６００まで増殖させた。ｓｆｐ遺伝子とｓｘｔ遺伝子の誘導のために、０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度０．０５ｍＭ）およびトルイル酸（最終濃度０．５ｍＭ）を培養液に添加し、これを振盪（２２５ｒｐｍ）しながら１９℃でさらに４８時間インキュベートした。各株を３連の継代培養で増殖させた。４℃にて１０分間の２５００×ｇでの遠心分離によって培養液を回収した。細胞ペレットを、それぞれ２５の氷冷ＭＱ水で２回洗浄した（２５００×ｇ、１０分間、４℃）。細胞ペレットを秤量し、−２０℃で保存した。
【０２１５】
ＭＮＢＡのための細胞抽出
ＭＮＢＡのために、以下のプロトコルに従ってＡｃｃｅｌｌ  Ｐｌｕｓ  ＣＭカートリッジ（３６０ｍｇ，  １．１ｍｌ，  ＷＡＴ０１０９１０，  Ｗａｔｅｒｓ）を使用して細菌細胞を弱陽イオン交換固相抽出（ＷＣＸ−ＳＰＥ）により抽出した。
【０２１６】
１．２ｇの細胞ペレットを０．１５％のギ酸３．６ｍｌに再懸濁し、５分間煮沸することによって溶解させた。細胞抽出物を、１６．０００×ｇで１０分間の遠心分離によって清澄化した。
【０２１７】
カラムを３．６ｍｌのメタノールで、次いで０．１５％のギ酸３．６ｍｌで整えた。３ｍｌのサンプルをロードし、カラムを１．８ｍｌのＭＱ水で、次いで１．８ｍｌのアセトニトリルで洗浄した。次いで、カラムを乾燥させ、サンプルを、５％のギ酸を含むメタノール２×３．６ｍｌで溶出した。真空遠心分離によって溶出液を乾燥させ、０．０１％のギ酸２００μｌでサンプルを再構成した。
【０２１８】
ナトリウムチャネル遮断毒素についてのマウス神経芽腫アッセイ
マウスｎｅｕｒｏ−２ａ細胞株（ＣＣＬ１３１）を使用したマウス神経芽腫アッセイを用いた（Ｈｕｍｐａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６：１５１２−９に記載される通り）。
【０２１９】
ＭＮＢＡアッセイのための較正曲線は、ｎｅｏＳＴＸの認定された参照物質（ＣＲＭ−ＮＥＯ−ｃ、ロット：２００９−０２−１８、３ｍＭのＨＣｌ中で６５．６μＭ）を用いて、生体マトリックス有りで、および生体マトリックス無しで、作成した。結果を図１６に示す。
【０２２０】
実施例１６：ＥＬＩＳＡによるネオサキシトキシンの免疫化学的検出
サキシトキシンＥＬＩＳＡキット（Ａｂｒａｘｉｓ  ＰＮ  ５２２５５Ｂ，  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  ９６Ｔ）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉで生産されたｎｅｏＳＴＸを検出した。このキットは、ｎｅｏＳＴＸに対して１．３％の交差反応性を有するポリクローナルサキシトキシン抗体を利用する。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ３の培養液を調製し、細胞溶解物を得た。ＳａｍｐｌｉＱシリカカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＰＮ  ５９８２−２２１１，  １ｍｌ，  １００ｍｇ）上での固相抽出によってサンプルを抽出した（Ｊａｎｓｓｏｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ａｓｔｏｔ  Ｃ（２０１５）ｍ  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  １４１７：４１−８）。抽出し蒸発させたサンプルを、ＳＴＸ  ＥＬＩＳＡキットによって提供されるサンプルバッファ１００μｌに溶解させた。サンプルバッファ中のＥ．ｃｏｌｉ  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ３抽出物の１：１０００希釈物も調製した。アッセイは、キットによって提供される、ブランクとしてのＳｔｄ０、Ｓｔｄ１（０．０６６８ｎＭのＳＴＸ）およびＳＴｄ５（１．３３６５ｎＭのＳＴＸ）を使用した２点の標準曲線によって較正された。参照サンプルを使用してｎｅｏＳＴＸについてのＳＴＸ  ＥＬＩＳＡキットの精度を推定したが、ＳＰＥの間のｎｅｏＳＴＸの回収率は、抽出された参照サンプル対参照サンプルの比に基づいて推定した。アッセイの結果を以下の表に示す。推定された精度は１１９％であったが、ＳＰＥの間の回収率は９２％であった。このアッセイは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ３の細胞抽出物において１．１６ｎＭのＳＴＸに相当する量を検出した。ｎｅｏＳＴＸに変換すると、これは、８９．１ｎＭとなり、Ｅ．ｃｏｌｉの培養液１リットル当たり約２２３ｐｍｏｌのｎｅｏＳＴＸという収量である。
【０２２１】
【表６】
2019504650.tif 000047
【０２２２】
実施例１７：合成と天然の遺伝子およびＲＢＳスペーサーの効果
以下のエレメントを用いて、いくつかのｐＶＢコンストラクトを作製した：
（ｉ）Ｐｍプロモーター；
（ｉｉ）ｓｘｔＡ合成（Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化）またはｓｘｔ天然遺伝子；および
（ｉｉｉ）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンの間の８または１０ｂｐのスペーサー。
【０２２３】
ＲＢＳとＳｘｔＡの開始コドンとの間に８ｂｐのスペーサーを有するＰｍプロモーターの配列を以下に示す。ＲＢＳと開始コドンが大文字で示され、スペーサーには下線が引かれている：
【化３９】
2019504650.tif 000048
【０２２４】
ＲＢＳとＳｘｔＡの開始コドンとの間に１０ｂｐのスペーサーを有するＰｍプロモーターの配列を以下に示す。ＲＢＳと開始コドンが大文字で示され、スペーサーには下線が引かれている：
【化４０】
2019504650.tif 000049
【０２２５】
４種のｐＶＢ−ｓｘｔＡプラスミドを独立的にＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐに形質転換した。
【０２２６】
ｐＶＢ−ｓｘｔＡのバリアントを含む４種のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｓｆｐの各々の培養液を調製し、細胞を回収した。細胞ペレットを抽出し、中間体１の存在をＬＣ−ＭＳによって分析した。結果を図１７に示す。ＲＢＳと開始コドンの間に１０ｂｐのスペーサーを含む合成のｓｘｔＡコンストラクトでは、８ｂｐのスペーサーを含む合成のｓｘｔＡコンストラクトと比較して、中間体１が有意に多く生産されたということが分かる。
【０２２７】
実施例１８：様々なＰＰＴａｓｅの存在下での中間体８の生産
この実験では、以下のＰＰＴａｓｅを比較した：
１．  Ｔ３ＰＰＴ：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１
２．  Ｔ３ＰＰＴ：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１  ｐＥＴ２８Ｂ−ＮｓＰＰＴ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ由来のホスホパンテテイニルトランスフェラーゼを含むｐＥＴベクター）
３．  Ａｌａ１８Ｔ３ＰＰＴ：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  Ｔ３ＰＰＴａｓｅ  ＮＳＸ３ｖ１  ｐＥＴ３０ｂ−Ａｌａ１８Ｔ３ＰＰＴａｓｅ（発現されるタンパク質の溶解性を増加させるために最初の１８アミノ酸が除去されたＴ３ＰＰＴａｓｅ）。
【０２２８】
これらの株を、２００ｒｐｍで振盪しながら１９℃でＬＢブロス２０ｍｌにおいて１８時間培養した。ｐＥＴベクターを有する株は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下で増殖させた。培養物は、誘導物質なしで増殖させたか、あるいは約０．８というＯＤ６００で０．２ｍＭのＩＰＴＧおよび１ｍＭのトルイル酸により誘導した。誘導物質の非存在下においてｓｘｔ遺伝子およびＰＰＴａｓｅ遺伝子の明確なバックグラウンド発現が存在した。
【０２２９】
中間体８とｎｅｏＳＴＸを測定し、ＰＰＴａｓｅの有効性の指標として用いた。結果を図１８に示す。Ａｌａ１８Ｔ３ＰＰＴは、最も高いレベルをもたらしたが、誘導後はレベルが低下した。この現象は、ＰＰＴａｓｅのレベルが高くなり過ぎて酵素を占有した際のＳｘｔＡの阻害に起因する可能性がある。
【０２３０】
実施例１９：サキシトキシンの類似体と変種の生産
サキシトキシンは、ＳｘｔＮによって（すなわち、カルバモイル側鎖のスルホン化によって）ＧＴＸ−５に変換され得る。同様に、サキシトキシンは、ＳｘｔＤＩＯＸによって１１−ヒドロキシＳＴＸに変換され得る。これは、ＳＴＸをＧＴＸ−２／３に（またはネオサキシトキシンをＧＴＸ−４／１に）変換するＣ−１１スルホン化に先行するステップである。
【０２３１】
Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ  ｃｆ．ｃｒｉｓｐｕｍ  ＵＣＦＳ１５由来のｓｘｔＮを適切な発現ベクターにクローニングし、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下におき、そのＮ末端とＣ末端にヘキサヒスチジンタグを付加した。
【０２３２】
Ｓ．ｃｆ．ｃｒｉｓｐｕｍ  ＵＣＦＳ１５由来のｓｘｔＯを適切な発現ベクターにクローニングし、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下におき、そのＮ末端とＣ末端にヘキサヒスチジンタグを付加した。
【０２３３】
これらの発現ベクターをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、Ｎｏ−ＮＴＡレジン（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してＳｘｔタンパク質を精製した。タンパク質の純度は、ＳＤＳゲル上で評価した。
【０２３４】
サキシトキシンまたはＧＴＸ２を用いてＳｘｔＮのスルホトランスフェラーゼ活性を試験した。結果をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて判定した。基質としてサキシトキシンを用いると、対照には存在しない２．１３分におけるピークが同定された。これは、ｍ／ｚ  ３８０．１０の主要ピークを含み、この主要ピークは３００．１４と２８２．１３のｍ／ｚに断片化し（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、ＧＴＸ５であると提示された（図１９に示す）。基質としてＧＴＸ２を用いた場合、サンプルと対照との間でトキシンの存在の差は観察されなかった。
【０２３５】
サキシトキシンを用いてＳｘｔＤＩＯＸのジオキシゲナーゼ活性を試験した。結果をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて判定した。基質は、アッセイおよび対照の両方で同定された。さらに、対照には存在しない１．６６分におけるｍ／ｚ  ３１６．１４＞２９６．１３のピークがアッセイで同定され、ヒドロキシル化サキシトキシンの存在が示唆された（図２０）。
【０２３６】
配列
添付の配列表は、説明の一部として本明細書に完全に組み込まれる。
【０２３７】
【表７】
2019504650.tif 000050
2019504650.tif 000051
2019504650.tif 000052
2019504650.tif 000053
2019504650.tif 000054
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2019504650.tif 000068
2019504650.tif 000069
2019504650.tif 000070
【０２３８】
配列表フリーテキスト
配列番号９１
Ｅ．ｃｏｌｉのラクトースオペロンへの組み込み後のｓｘｔ１フラグメントの配列。
配列番号９２
Ｅ．ｃｏｌｉのキシロースオペロンに組み込まれたｓｘｔ３フラグメント・バージョン１の配列。
配列番号９３
Ｅ．ｃｏｌｉのキシロースオペロンに組み込まれたｓｘｔ３フラグメント・バージョン２の配列。
配列番号９４
Ｅ．ｃｏｌｉのキシロースオペロンに組み込まれたｓｘｔ３フラグメント・バージョン３の配列。
配列番号９５
Ｅ．ｃｏｌｉのラクトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ１フラグメントの配列。
配列番号９６
Ｅ．ｃｏｌｉのメロビオースオペロンに組み込まれたｓｘｔ４フラグメントの配列。
配列番号９７
Ｅ．ｃｏｌｉのマルトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ２フラグメントの配列。
配列番号９８
ｓｘｔＬの除去後にマルトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ２フラグメントの配列。
配列番号９９
マルトースオペロンに組み込まれたｓｘｔ２フラグメントの配列。
【図１】
2019504650.tif 000071
【図２】
2019504650.tif 000072
【図３】
2019504650.tif 000073
【図４Ａ】
2019504650.tif 000074
【図４Ｂ】
2019504650.tif 000075
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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