(57)【要約】  マクロファージ機能を調節することにより抗炎症作用を発揮する新規な抗炎症薬を提供する。具体的にはアクチビン類を用いたM2マクロファージの誘導により抗炎症作用を発揮する新規な抗炎症薬を提供する。
2011149036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビン類を有効成分として含有する抗炎症薬。
【請求項２】
アクチビン類が、アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBから選ばれる1種以上である、請求項1に記載の抗炎症薬。
【請求項３】
アクチビン類が、アクチビン類の遺伝子が組み込まれたベクターである、請求項1又は2に記載の抗炎症薬。
【請求項４】
M2マクロファージ誘導物質を有効成分として含有する抗炎症薬。
【請求項５】
アクチビン類を被験者に投与する工程を含む炎症の治療又は改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ機能を調節することにより抗炎症作用を発揮する新規な抗炎症薬に関する。具体的にはM2マクロファージの誘導により抗炎症作用を発揮する新規な抗炎症薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満症では全身に慢性かつ低レベルの炎症状態が惹起される。これはインスリン抵抗性や2型糖尿病などの様々な代謝疾患の基礎的な病態となっている。肥満症における炎症促進性作用に関与する細胞のうち、脂肪組織に浸潤するマクロファージの働きが近年注目されている。【０００３】
最近の研究によると、非肥満の内臓脂肪組織では、非活性型のM2マクロファージが、抗炎症性サイトカインであるIL-10やNO生合成を抑制するアルギナーゼを産生することによって炎症性変化を抑制しているが、肥満に伴い活性型のM1マクロファージが増加すると、TNF-αやIL-6といった炎症性サイトカインを分泌して脂肪組織の炎症性変化を促進すると考えられている。【０００４】
非肥満の内臓脂肪組織ではM1マクロファージはほとんど認められないが、肥満に伴いその浸潤数が増加することが知られている。脂肪組織のM1マクロファージは、TNF-α、IL-6、MCP-1などの炎症性サイトカインやiNOSなどの酸化ストレス関連遺伝子を強く発現する。これより、M1マクロファージは内臓脂肪組織の慢性炎症や酸化ストレスを促進し、肥満に伴うインスリン抵抗性の発症に重要な役割を果たしていると考えられている。【０００５】
非肥満の脂肪組織では、M2マクロファージがびまん性に存在する。M2マクロファージの数は肥満に伴い増加することはない。M2マクロファージがインスリン感受性に与える影響についての報告は少ないが、M2マクロファージは、インスリン感受性の維持・改善に関与するのではないかと考えられている。M2マクロファージでは、IL-10、アルギナーゼ-1、Mrc1、YM1、CD209など、M1マクロファージとは異なる遺伝子が強く発現しており、抗炎症性サイトカインのひとつであるIL-10は培養脂肪細胞においてインスリンシグナルを増強することが報告されている(非特許文献1)。また、M2マクロファージに強く発現するアルギナーゼはiNOSと競合的に働く。肥満脂肪組織の酸化ストレスはインスリン抵抗性を促進することから、アルギナーゼを高発現するM2マクロファージはインスリン抵抗性の改善に関与する可能性があると考えられている。【０００６】
近年、肥満の脂肪組織におけるMCP-1(monocyte chemoattractant protein-1:本明細書中MCP1と表記することもある)の産生亢進により、脂肪組織へのマクロファージ浸潤が誘導されることが明らかになってきた。MCP-1あるいはMCP-1の主要な受容体であるCCR2(C-C Chemokine receptor 2)を全身で欠損するマウスでは、高脂肪食負荷による肥満において、脂肪組織に浸潤するマクロファージが減少し、TNF-α産生の低下や全身のインスリン抵抗性の改善が認められた(非特許文献2、非特許文献3)。逆に、脂肪組織特異的にMCP-1を過剰発現させたマウスでは、脂肪組織におけるマクロファージ浸潤とTNF-α産生の増加が認められ、全身のインスリン抵抗性が悪化した(非特許文献3、非特許文献4)。【０００７】
遺伝性肥満db/dbマウスとMCP-1ノックアウトマウスの交配によって得られるマウス(db/WT:MCP-1-/WT)では、db/dbマウスと同程度のマクロファージ浸潤とインスリン抵抗性を示すことが報告されており、MCP-1以外のシグナルの関与も示唆されている(非特許文献5)。オステオポンチンやCXCL14のノックアウトマウス、あるいはα4インテグリン変異マウスで、高脂肪食誘導性肥満における脂肪組織へのマクロファージ浸潤の抑制、インスリン抵抗性の改善が報告されている(非特許文献6、非特許文献7、非特許文献8)。【０００８】
脂肪組織では多くの炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインが産生されており、体脂肪量の増加における両者のバランスの破綻が、肥満を基盤とするメタボリックシンドロームの発症・進展に関与すると考えられている。上述したようにM1マクロファージとM2マクロファージは、それぞれ炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカイン産生の主要な産生細胞であり、両マクロファージの数や機能を調整することで、脂肪細胞の炎症性変化を抑制し、さらに全身の糖脂質代謝の恒常性を維持・制御できる可能性が考えられる。【０００９】
発明者らは、遺伝性肥満db/dbマウスや高脂肪食負荷マウス、あるいは肥満傾向のヒト個体の脂肪細胞において、フォリスタチン様タンパク質3(FSTL3)の発現が増加することを見出した(未公開の特願2010-122148)。FSTL3は、アクチビンと結合することでアクチビンが受容体に結合することを阻害することが知られているタンパク質である。
アクチビンはTGF-β スーパーファミリーに属するサイトカインであり、TGF-β等と同様に二量体構造を有するが、当該二量体を構成するサブユニット(βサブユニットと呼ばれる)は5種類が知られており、哺乳類では、βA、βBの他にβC、βEの遺伝子が存在することが明らかにされている(非特許文献9、非特許文献10)。これまでに哺乳動物生体内でタンパク質として発現が確認されているアクチビン類は、アクチビンA(βA-βA)、アクチビンAB(βA-βB)、アクチビンB(βB-βB)の三種類である。アクチビンをコードする遺伝子には、インヒビンβA遺伝子とβB遺伝子の二種類があり、インヒビンβA遺伝子の産物同士が二量体を形成するとアクチビンA、インヒビンβB遺伝子の産物同士が二量体を形成するとアクチビンB、インヒビンβA遺伝子及びインヒビンβB遺伝子、それぞれの産物が二量体を形成するとアクチビンABと呼ばれる。アクチビン類(アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB)は、アクチビン
II型受容体(ActRIIAあるいはActRIIB)に結合し、その複合体がアクチビンI型受容体(ALK4)を活性化することによりシグナルが伝達されるものと考えられている(非特許文献11)。【００１０】
アクチビンは、βA、βB共に膵臓で発現し(非特許文献12、非特許文献13、非特許文献14)、膵臓β細胞の機能分化に重要(非特許文献15)であると考えられたことから、膵臓再生因子の観点で新規膵臓機能改善作用を有する治療薬として注目され、アクチビンを有効成分として含有する糖尿病治療薬が提案されている(特許文献1)。しかしながら、これまで、アクチビン類のマクロファージに対する作用や炎症との関係についての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2003-113111
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】J. Clin. Invest., 117: 175-184, 2007
【非特許文献２】J. Clin. Invest., 116: 1494-1505, 2006
【非特許文献３】J. Clin. Invest., 116: 115-124, 2006
【非特許文献４】J. Bio. Chem., 281: 26602-26614, 2006
【非特許文献５】Diabetologia, 50: 471-480, 2007
【非特許文献６】J. Clin. Invest., 117: 2877-2888, 2007
【非特許文献７】J. Bio. Chem., 282: 30794-30803, 2007
【非特許文献８】Diabetes, 57: 1842-1851, 2008
【非特許文献９】Biochem. Biophys. Res. Commun., 228: 669-674, 1996
【非特許文献１０】Biochim. Biophys. Acta., 1307: 145-148, 1996
【非特許文献１１】Endocrinol., 141: 2281-2284, 2000
【非特許文献１２】Endocrinology, 133: 624-630, 1993
【非特許文献１３】FEBS Letters, 319: 217-220, 1993
【非特許文献１４】J. Gastrointest. Surg., 4: 269-275, 2000
【非特許文献１５】J. Clin. Invest., 102: 294-301, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、マクロファージ機能を調節することにより抗炎症作用を発揮する新規な抗炎症薬を提供することを目的とする。また本発明は、脂肪細胞の炎症性変化を効果的に抑制する物質及び当該物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、アクチビン類(アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンB)がM2マクロファージ誘導をすること、及び脂肪細胞における炎症性変化を効果的に抑制することを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下を提供する。【００１５】
(1)アクチビン類を有効成分として含有する抗炎症薬。
(2)アクチビン類が、アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBから選ばれる1種以上である、(1)に記載の抗炎症薬。
(3)アクチビン類が、アクチビン類の遺伝子が組み込まれたベクターである、(1)又は(2)に記載の抗炎症薬。
(4)M2マクロファージ誘導物質を有効成分として含有する抗炎症薬。
(5)アクチビン類を被験者に投与する工程を含む炎症の治療又は改善方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】RAW264.7細胞をアクチビンA又はアクチビンBの存在下で培養し、M2及びM1マクロファージマーカーの発現を調べた試験結果の図である。
【図２】RAW264.7細胞をアクチビンAの存在下で培養し、M2マクロファージマーカーの発現を調べた試験結果の図である。
【図３】db/dbマウス又は高脂肪食負荷B6マウスにおいて、組換えアデノウイルスを投与してアクチビンA又はアクチビンBを発現させ、内臓脂肪中のアルギナーゼmRNA発現を調べた試験結果の図である。
【図４】RAW264.7細胞をアクチビンA、アクチビンB又はSB431542の存在下、パルミチン酸を添加して培養し、M2及びM1マクロファージマーカーの発現を調べた試験結果の図である。
【図５】RAW264.7細胞をアクチビンA、アクチビンB又はFstl3の存在下、パルミチン酸を添加して培養し、M2及びM1マクロファージマーカーの発現を調べた試験結果の図である。
【図６】RAW264.7細胞をアクチビンA、Fstl3、抗Fstl3抗体又はマウスIgGの存在下、パルミチン酸を添加して培養し、M2マクロファージマーカー(アルギナーゼI)の発現を調べた試験結果の図である。
【図７】高脂肪食負荷B6マウスに対し、組換えアデノウイルスを投与してアクチビンA又はアクチビンBを発現させ、グルコース負荷試験(GTT)を調べた試験結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の抗炎症薬に含有される有効成分は、アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBから選ばれる1種類以上のアクチビン類である。アクチビン類は、アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBをそれぞれ単独で有効成分として含有させても、2種類以上を有効成分として含有させてもよい。アクチビン類は、M2マクロファージ誘導活性を有することを限度として、天然物由来のタンパク質、遺伝子工学的手法により製造されたタンパク質、当該タンパク質に由来するポリペプチド(断片)のいずれであってもよい。アクチビンA及びアクチビンBは、前記限度において、二量体のみならず、二量体を構成するサブユニットであってもよい。また、アクチビン類の遺伝子を含むベクターであってもよい。またさらに、当該タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸、及び、当該遺伝子における核酸は、1〜数個、例えば、1〜5個程度の付加、置換又は欠失があってもよい。遺伝子工学的手法により製造されたタンパク質は、M2マクロファージ誘導活性の増強やタンパク質としての保存安定性、溶解性を向上させる目的等により、従来公知の手法を使用して、他のタンパク質との融合体としたり、化学的な修飾を施したりして使用することができる。
【００１８】
欠失、置換、挿入及び/又は付加されるアミノ酸の数は1以上であり上限は特に限定されないが、部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、1個から数十個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個である。
【００１９】
また、本発明の抗炎症薬に含有されるタンパク質又はポリペプチドが、アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBとしての活性を有するタンパク質であるか、あるいはアクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBとしての活性を有するタンパク質を構成するポリペプチドであるためには、アクチビンA、アクチビンAB又はアクチビンBとしてNCBI等で公開されているアミノ酸配列と、少なくとも60% 以上、通常は80%以上、さらには85%以上の同一性を有していることが好ましく、より好ましくは90%以上、特に95% 以上の同一性を有していることが好ましい。上記記載を基礎に、アクチビン類の遺伝子を含むベクターを構成するアクチビン類の遺伝子の配列を改変等できることは当業者には容易に理解されるであろう。
【００２０】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST〔Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)〕やFASTA〔Methods Enzymol., 183, 63 (1990)〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore= 100、wordlength= 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore= 50、wordlength= 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である( http://www.ncbi.nlm.nih.gov.) 。
【００２１】
本明細書において「M2マクロファージ誘導」とは、M1及びM2マクロファージ間の量的あるいは機能的バランスをM2優位に傾かせることを総称していい、例えば、マクロファージ前駆細胞のM2マクロファージへの分化・誘導、M2マクロファージの機能活性化、IL-10やアルギナーゼ1等の抗炎症性のサイトカインや酵素類の産生亢進を意味する。
また、「M2マクロファージ誘導物質」とは、前記した作用効果のいずれかを有する物質をいう。例えば、アクチビン類それ自体、あるいはFSTL3等のアクチビン類の作用を阻害する物質を中和・抑制することができる物質、すなわち、抗FSTL3抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のFSTL3遺伝子の発現阻害物質、天然FSTL3とアクチビンとの結合を阻害するFSTL3突然変異体等があげられる。
【００２２】
アクチビン類は、抗炎症薬として適用する動物個体が許容できることを限度として、その由来には制限がなく、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどあらゆる哺乳動物由来のアクチビン類が使用できる。
【００２３】
アクチビン類又はM2マクロファージ誘導物質を有効成分として含む本発明の抗炎症薬を治療薬として使用する場合には、薬学的組成物中に含ませて使用することができる。このような場合、従来公知の任意の担体物質を用いることができる。担体物質は、経腸、経皮、もしくは非経口投与に適した有機又は無機の担体物質であってよい。適切な担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性油脂、ポリアルキレングリコール、ワセリン等が含まれる。さらに、薬学的調製物は他の薬学的に活性のある薬剤を含んでもよい。香味剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等のさらなる添加剤も、薬学的調合の慣例に従い添加してよい。
【００２４】
また、本明細書の記載を参照すれば本発明の抗炎症薬と類似する脂肪細胞の炎症性変化を効果的に抑制する物質をスクリーニングすることができる。
【００２５】
上記の、アクチビン類又はM2マクロファージ誘導物質を有効成分として含む本発明の抗炎症薬及び前記本発明の抗炎症薬と類似する脂肪細胞の炎症性変化を効果的に抑制する物質の使用対象は、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ラットなどがあげられる。ヒトにおいては、肥満症、糖尿病、耐糖能障害を持つ個体もしくはその予備群に使用することが特に好ましい。
【実施例】
【００２６】
実施例1
(1)アクチビン類によるM2マクロファージ誘導
RAW264.7細胞に、アクチビン A(10 ng/mL 又は 30 ng/mL)、アクチビン B(10 ng/mL 又は 30 ng/mL)をそれぞれ単独で添加した。アクチビン AはHuman Recombinant (R&D Systems, 338AC005)、アクチビン Bは Recombinant (R&D Systems, 659AB005)を使用した。8時間後にRNeasy Mini Kit (250) (Qiagen, Cat. number 74106)を用いて細胞を回収し、RNAを抽出した。
(2)マクロファージマーカーの発現解析
前記(1)工程で抽出したRNAを用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (ABI)のプロトコールに則って逆転写反応を行い、TaqMan PCRを行った。M2マクロファージマーカーとしてアルギナーゼ-1、M1マクロファージマーカーとしてIL-6、MCP-1を選び、それぞれTaqManプローブを作成した。各mRNAの発現量は、いずれも同一サンプル中のシクロフィリンA (cyclophilin A) mRNAの発現量を1とした場合の倍数で表したものである(以下、特に断らない限り、TaqMan PCRを用いた実施例において同じ)。
(3)結果
アクチビンA又はアクチビンBをそれぞれ添加した場合、アルギナーゼ-1の発現が顕著に増加した。その一方、IL-6、MCP-1の発現量に変化はなかった。アルギナーゼ-1の発現量はアクチビンの添加濃度に依存していた。これよりアクチビンA及びアクチビンBはM2マクロファージ誘導をすることが確認された(図1a及び1b参照)。【００２７】
実施例2
(1)アクチビン類によるM2マクロファージ誘導
RAW264.7細胞に、アクチビン A(10 ng/mL 又は 30 ng/mL) 、SB431542(0.1-1μM、santa cruz biotechnology, inc.,sc-204265)を図2に示した組み合わせで添加した。アクチビン AはHuman Recombinant (R&D Systems,338AC005)、を使用した。24時間後にRNeasy Mini Kit (250) (Qiagen, Cat. number 74106)を用いて細胞を回収し、RNAを抽出した。
(2)マクロファージマーカーの発現解析
前記(1)工程で抽出したRNAを用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (ABI)のプロトコールに則って逆転写反応を行い、TaqMan PCRを行った。M2マクロファージマーカーとしてアルギナーゼ-1、Mrc2(マンノースレセプター2)、IL-10を選び、それぞれTaqManプローブを作成した。
(3)結果
アクチビンAを添加した場合、アルギナーゼ-1、Mrc2、IL-10の発現が顕著に増加した。この増加はアクチビン類の受容体であるアクチビン様キナーゼ(ALK)4/5/7の阻害剤SB431542の添加によりコントロールと同程度まで低下した。これよりアクチビンAはM2マクロファージを誘導することが、実施例1とは別のM2マクロファージマーカーであるMrc2、IL-10の発現量増加によってさらに確認された(図2参照)。【００２８】
実施例3
(1)組換えアデノウイルスの作製
全長マウスインヒビンβA cDNAあるいは全長マウスインヒビンβB cDNAは、pcDNA3.1/V5-HisA(インビトロジェン)を用い、推奨された方法に従って増幅された。当該増幅産物をHindIII及びEcoRV処理し、組換えアデノウイルス作成に用いた。インヒビンβAあるいはインヒビンβBそれぞれの組換えアデノウイルスは、Takara Adenovirus Expression Vector Kit(Takara)を用いて、推奨された方法に従って作製した。ネガティブコントロールとして、キットに添付されているβ-ガラクトシダーゼ遺伝子含有ウイルスを用いた。HEK293細胞へのアデノウイルスのトランスフェクションはCellPhect(登録商標) Transfection Kit(GE Healthcare)を用いてリン酸カルシウム法で行った。
(2)db/dbマウス
7週齢の雄性db/dbマウスを1週間馴化した後、5.0X1011 pfu/mLの前記組換えアデノウイルスをPBS 150μLに溶解し、週に1度、2週間、尾静脈より投与した。2回目の投与後7日目に内臓脂肪を採取しHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (ABI)のプロトコールに則って逆転写反応を行い、TaqMan PCRでアルギナーゼ-1の発現解析を行った。
(3)12週間高脂肪食B6マウス(高脂肪食負荷マウス)
5週齢の雄性B6マウスを普通食下で1週間馴化した後、12週間高脂肪食を負荷した。5.0X1011pfu/mLの前記組換えアデノウイルスをPBS 150μLに溶解し、18週目に入ったマウスに週に1度、2週間、尾静脈より投与した。2回目の投与後7日目に内臓脂肪を採取しHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (ABI)のプロトコールに則って逆転写を行い、TaqMan PCRでアルギナーゼ-1の発現解析を行った。
(4)結果
db/dbマウスにおいて、アクチビンBの発現(インヒビンβB組換えアデノウイルス投与)によりアルギナーゼ-1の発現がコントロールに対して顕著に増加した。一方アクチビンAの発現(インヒビンβA組換えアデノウイルス投与)によるアルギナーゼ-1の発現はコントロールとの差を認めなかった。12週間高脂肪食B6マウス(高脂肪食負荷マウス)でも同様にアクチビンBの発現によりアルギナーゼ-1の発現量が増加する一方、アクチビンAを発現させた場合にもアルギナーゼ-1の発現量はわずかではあるが増加していた(図3参照)。
前記した実施例2において、アクチビン類の受容体の阻害剤であるSB431542を共存させると、アクチビンAの過剰発現によって顕著に増加したアルギナーゼ-1の発現量がコントロールと同程度まで減少している。この結果を踏まえると、本実施例において遺伝性肥満のdb/dbマウスや高脂肪食負荷マウスの内臓脂肪のアクチビン発現量に顕著な増加が見られなかったが、これは各モデルマウスの脂肪細胞においてアクチビンの受容体への結合を阻害するFSTL3の発現も増加していることが理由の一つと考えることができる。以上より、当業者に周知の方法でアクチビン類の発現量を調節することにより、所望のM2マクロファージ誘導を得ることができると考えられる。【００２９】
実施例4
(1)アクチビン類によるマクロファージ誘導
RAW264.7細胞に、アクチビン A(10 ng/mL)、アクチビン B( 10 ng/mL)、SB431542(0.1-1μM)を図4に示した組み合わせで添加した。アクチビン AはHuman Recombinant (R&D Systems, 338AC005)、アクチビン Bは Recombinant (R&D Systems, 659AB005) を使用した。30分後に終濃度200 μMとなるようにパルミチン酸(炎症惹起物質)を添加し、8時間後にRNeasy Mini Kit (250) (Qiagen, Cat. number 74106)を用いて細胞を回収し、RNAを抽出した。
(2)マクロファージマーカー発現解析
前記(1)工程で抽出したRNAを用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (ABI)のプロトコールに則って逆転写反応を行い、TaqMan PCRを行った。M2マクロファージマーカーとしてアルギナーゼ-1、M1マクロファージマーカーとしてIL-6、MCP-1を選び、それぞれTaqManプローブを作成した。
(2)マクロファージマーカーの発現解析
実施例1のマクロファージマーカーの発現解析と同様にして解析した。
(3)結果
(i) SB431542のみを添加した場合(バックグラウンド・コントロール)
本実施例において、SB431542及びパルミチン酸の両方の添加がない場合を単にコントロールという。アクチビン類の受容体であるアクチビン様キナーゼ(ALK)4/5/7の阻害剤であるSB431542(0.1-1μM)のみを添加し、パルミチン酸添加をしなかった場合、コントロールと比較してアルギナーゼ-1、IL-6、MCP-1発現量は変化しないか、わずかの変化であった。
(ii)パルミチン酸をアクチビン類の非存在下に添加した場合
a) アルギナーゼ-1の発現量はコントロールと比較して、変化しないか、わずかの変化であった。
b) IL-6の発現量はコントロールと比較して、パルミチン酸添加で顕著に増加した。さらにSB431542の添加濃度に依存して増加を続けた。
c) MCP-1の発現量はコントロールと比較して、パルミチン酸添加で顕著に増加した。この増加はSB431542の添加によって変化しなかった。
(iii) パルミチン酸をアクチビンAの存在下に添加した場合
a) アルギナーゼ-1の発現量はコントロールと比較して、パルミチン酸添加で顕著に増加した。その一方、SB431542の添加濃度に依存して発現量は低下した。
b) IL-6の発現量はコントロールと比較してパルミチン酸添加で顕著に増加した。さらにSB431542の添加濃度に依存して増加を続けた。アクチビンAの添加によりIL-6の発現は微減した。
c) MCP-1の発現量はコントロールと比較してパルミチン酸添加で顕著に増加した。この増加はSB431542の添加によって変化しなかった。アクチビンAの添加によるMCP-1の発現量に変化はなかった。
(iv) パルミチン酸をアクチビンBの存在下に添加した場合
a) アルギナーゼ-1の発現量はコントロールと比較して、パルミチン酸添加で顕著に増加した。その一方、SB431542の添加濃度に依存して発現量は低下した。
b) IL-6の発現量はコントロールと比較してパルミチン酸添加で顕著に増加した。さらにSB431542の添加濃度に依存して増加を続けた。アクチビンBの添加によりIL-6の発現は微減した。
c) MCP-1の発現量はコントロールと比較してパルミチン酸添加で顕著に増加した。この増加はSB431542の添加によって変化しなかった。アクチビンBの添加によるMCP-1の発現量に変化はなかった。
(v) まとめ
炎症惹起物質であるパルミチン酸の添加により、M1マクロファージマーカー(IL-6及びMCP-1)は発現量が増加したが、M2マクロファージマーカー(アルギナーゼ-1)の発現量は変わらなかった。この結果は、従来報告されているM1及びM2マクロファージの炎症における挙動と一致するものであった。一方、アクチビンA又はアクチビンBを共存させるとパルミチン酸添加の場合でもアルギナーゼ-1の発現量が亢進した。これは、マクロファージが刺激を受けた際、アクチビン類がM2マクロファージ誘導(活性化)作用を有することを示すものと考えられた。またIL-6の発現量はアクチビン類が共存しない場合と比較して、共存する場合のほうが相対的に低かった。これは、アクチビン類がM1マクロファージにおけるIL-6産生を抑制する効果を有することを示すものと考えられた。以上より、アクチビン類は、マクロファージ機能を調節することにより抗炎症作用を発揮する抗炎症薬として使用できることがわかった(図4参照)。【００３０】
実施例5
(1)アクチビン類によるマクロファージ誘導
RAW264.7細胞に、アクチビン A(10 ng/mL)、アクチビン B( 10 ng/mL)、Fstl3(3-30ng/mL)を図5に示した組み合わせで添加した。アクチビン AはHuman Recombinant (R&D Systems, 338AC005)、アクチビン Bは Recombinant(R&D Systems, 659AB005) 、Fstl3はFollistatin-like3 Recombinant(R&D Systems 1255F3025)を使用した。30分後に終濃度200 μMとなるようにパルミチン酸(炎症惹起物質)を添加し、8時間後にRNeasy Mini Kit (250) (Qiagen, Cat. number 74106)を用いて細胞を回収し、RNAを抽出した。
(2)マクロファージマーカー発現解析
実施例4と同様の方法で行った。発現量は、パルミチン酸、アクチビン類及びFstl3のいずれも非添加のコントロールにおける、シクロフィリンA (cyclophilin A)の測定値に対する各マーカーの測定値を1とした比で表した。
(3)結果
パルミチン酸によって炎症が惹起された培養細胞系においても、アクチビン類の添加によってアルギナーゼ1の発現が誘導された(パルミチン酸存在下、アクチビン類添加、Fstl3非添加)。アクチビンAと同時にFstl3を培養液に添加すると、Fstl3の添加量30ng/mLにおいてアルギナーゼ1の発現が減少した。これは、Fstl3がアクチビンAと結合することでアクチビンAのM2マクロファージ誘導作用が阻害されたためと考えられる。このことからも実施例3のdb/dbマウスでは、アクチビンAの作用を阻害するのに十分な量のFstl3が発現しているため、アルギナーゼ1の発現が上昇しなかったと推察できる。
また、M1マクロファージのマーカーであるIL-6の発現は、パルミチン酸添加によって増加し、アクチビンの添加によって減少した。アクチビン類の添加によって抗炎症性サイトカイン類を産生するM2マクロファージが誘導され、炎症性サイトカインの発現が減少し、アクチビン類の抗炎症作用が示唆された。
一方、MCP1は、アクチビン類の存在の有無に関らずパルミチン酸刺激によって発現が増加したがその変化はわずかであり、発現量はFSTL3の存否によって変化しなかった。パルミチン酸によって誘導された炎症におけるMCP1の発現は、アクチビン類によるシグナル伝達とは異なる経路によって制御されていると推察される(図5a及び5b参照)。【００３１】
実施例6
(1)M2マクロファージ誘導物質によるM2マクロファージ誘導
RAW264.7細胞に、Fstl3(30 ng/mL)、抗Fstl3抗体もしくはマウスIgG(0.3-10 ug/mL)、アクチビンA(10 ng/mL)を図6に示した組み合わせで添加した。アクチビン AはHuman Recombinant (R&D Systems, 338AC005)、アクチビン Bは Recombinant (R&D Systems, 659AB005) 、Fstl3はFollistatin-like3 Recombinant(R&D Systems 1255F3025)を使用した。30分後に終濃度200 μMとなるようにパルミチン酸(炎症惹起物質)を添加し、8時間後にRNeasy Mini Kit (250) (Qiagen, Cat. number 74106)を用いて細胞を回収し、RNAを抽出した。
(2)マクロファージマーカーの発現解析
前記(1)工程で抽出したRNAを用い、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor (ABI)のプロトコールに則って逆転写反応を行い、TaqMan PCRを行った。M2マクロファージマーカーとしてアルギナーゼ1を選び、TaqManプローブを作成した。
(3)結果
パルミチン酸による炎症誘発下でも、アクチビンAの添加によってアルギナーゼ1の発現量は増加したが、FSTL3が同時に存在するとアルギナーゼ1の発現量はアクチビンA及びFSTL3非添加のコントロールと同程度まで減少した。
マウスIgGを添加してもアルギナーゼ1の発現量に変化はなかったが、10ng/mL 抗FSTL3抗体を添加すると、FSTL3非添加時と同程度までアルギナーゼ1の発現量が回復した。パルミチン酸による刺激のない条件下では、より低濃度の抗FSTL3抗体でアルギナーゼ1の発現量が回復したことから(データ示さず)、炎症の程度によって適宜M2マクロファージ誘導物質の量を調整することで、最適な抗炎症効果が得られる(図6参照)。【００３２】
実施例7
(1)組換えアデノウイルス作製
実施例3における組換えアデノウイルス作製と同様にして作製した。
(2) 12週間高脂肪食B6マウス(高脂肪食負荷マウス)
5週齢の雄性B6マウスを普通食下で1週間馴化した後、12週間高脂肪食を負荷した。5.0X1011pfu/mLの前記組換えアデノウイルスをPBS 150μLに溶解し、18週目に入ったマウスに週に1度、2週間、尾静脈より投与した。2回目の投与後7日目にグルコース負荷試験(GTT)を行った。
(3) グルコース負荷試験(GTT)
GTTは以下のように行った。試験前日より16時間絶食させたマウスの腹腔にグルコース1.0mg/g-BW(生理的食塩水で希釈)を投与した。採取した全血から血清を分離し、グルコーステストワコー(和光純薬工業社製)にてグルコース濃度を測定した。
(4)結果
高脂肪食によって糖尿病症状(インスリン抵抗性)を呈したマウスにアクチビンAあるいはアクチビンBを発現させるとアクチビンA、アクチビンBともに糖代謝を改善させた。アクチビン類によるマクロファージ機能調節は、実際に病態改善に結びつくことがわかった(図7参照)。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年8月2日(2012.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンAB又はアクチビンBを有効成分として含有する抗炎症薬。
【請求項２】
前記アクチビンAB又はアクチビンBが、アクチビンAB又はアクチビンBの遺伝子が組み込まれたベクターである、請求項1に記載の抗炎症薬。
【手続補正書】
【提出日】平成24年12月14日(2012.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクチビンBを有効成分として含有する抗炎症薬。
【請求項２】
アクチビンBの遺伝子が組み込まれたベクターを有効成分として含有する抗炎症薬。
【国際調査報告】
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