(57)【要約】本発明は、コラーゲン７を含む組成物及びＤＥＢを治療するためのそれを用いる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えコラーゲン７、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約５ｍＭのクエン酸ナトリウム、約７０ｍＭの塩化ナトリウム、約１００ｍＭのアルギニン、約５０ｍＭのスクロース、及び約０．０５％のポリソルベート２０を含んでなる、組成物。
【請求項２】
７．０〜７．２のｐＨを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組換えコラーゲン７がヒトコラーゲン７である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
組換えコラーゲン７、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約５ｍＭのクエン酸ナトリウム、約７０ｍＭの塩化ナトリウム、約１００ｍＭのアルギニン、約５０ｍＭのスクロース、約０．０５％のポリソルベート２０及び１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項５】
７．０〜７．２のｐＨを有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組換えコラーゲン７がヒトコラーゲンである、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
（ａ）前記組成物５００ｍＬが１リットルのポリカーボネートボトル内で貯蔵されるとき、−６５±５℃又は−２０±５℃で３か月間；
（ｂ）前記組成物５．５ｍＬが１０ｃｍ３（１０ｃｃ）のガラスバイアル内で貯蔵されるとき、−６５±５℃又は−２０±５℃で６か月間；
（ｃ）２５±３℃で２週間；及び
（ｄ）５±３℃で最大１か月間、
のうちの少なくとも１つの条件で安定である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
栄養障害型表皮水疱症の治療に用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
栄養障害型表皮水疱症を治療する方法であって、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物を有効量でそれを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物（例えば医薬組成物）、より詳細にはコラーゲン７組成物、及び栄養障害型表皮水疱症を治療するためにそれを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンＶＩＩ（Ｃ７）タンパク質は構造タンパク質であり、ここでＣ７は、表皮及び真皮の付着を可能にする係留線維の形成のための構造及び機能前駆物質の双方である。Ｃ７単量体は、１つのＮＣ−１及び１つのＮＣ−２結合領域を含有する約９００ｋＤａのホモ三量体として集合する。ホモ三量体は、αヘリカルコイルを介して一緒に保持される。これらのＣ７タンパク質前駆物質は、ホモ三量体から、分子量の１．８ｍＤａへの増加を伴う逆平行二量体に整列する。逆平行二量体の外側アセンブリは、係留線維の形成をもたらす。ｒＣ７タンパク質は、「粘着性」、特にＰＢＳ緩衝液中、高タンパク質濃度で沈殿する傾向を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
Ｃ７の欠乏は、これらの係留線維の異常な減少及び栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）として知られる状態をもたらす。ＥＢは、皮膚への軽度の機械的外傷後の水疱の発生によって特徴づけられる分子的に多様な疾患群を包含する（１）。重症度、真皮外徴候及び臨床経過はＥＢのタイプに依存するが、ほぼすべての患者が水疱形成又は皮膚破裂を経験する（２）。
【０００４】
栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）は、治癒による瘢痕の発生によって特徴づけられるＥＢの一形態である（３）。ＤＥＢを有する患者では、水疱形成は、皮膚の極度な脆弱性のために軽度の機械的外傷によっても引き起こされ得る。これは、水疱形成、治癒、及び再水疱形成（ｒｅｂｌｉｓｔｅｒｉｎｇ）の慢性サイクルをもたらし、それにより患者が上皮組織の痛々しい傷及び衰弱性瘢痕（ｄｅｂｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｓｃａｒｒｉｎｇ）を患う原因となる。ＤＥＢに対する治療法はなく、支持療法が管理の対象である。
【０００５】
ジストロフィー型ＥＢは、基底膜を下層の真皮に係留する係留線維の形成にとって必須のタンパク質である、コラーゲンＶＩＩ（Ｃ７）のα鎖をコードするＣｏｌ７ａ１遺伝子における突然変異によって引き起こされる（４）。その状態は、優性型（ＤＤＥＢ）又は劣性型（ＲＤＥＢ）のいずれかとして遺伝され、ＲＤＥＢは典型的にはより重篤な表現型を有する（５）。
【０００６】
ＤＥＢマウスモデル（Ｃｏｌ７ａ１−／−）は、Ｃｏｌ７ａ１遺伝子の標的化不活性化を有し、それは重篤なヒトＲＤＥＢの組織学的及び超微細構造的症状を模倣する重篤な水疱形成をもたらす（６）。これらのマウスは、係留線維が完全に欠如した真皮−上皮基底膜ゾーン（ＢＭＺ）に検出不能なコラーゲンＶＩＩを有し、それらの腹側表面上に広範な皮膚水疱、またそれらの足と首に出血性水疱を持って生まれ、典型的には誕生１週目の間に死亡が認められる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、コラーゲン７を含む組成物及びかかる組成物を調製する方法に関する。特定の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルギニン、糖、及び界面活性剤を含む。リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルギニン、糖、又は界面活性剤の１つ以上を組成物から除外することは可能である。
【０００８】
特定の実施形態では、糖は、スクロースである。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０又はポリソルベート８０である。
特定の実施形態では、リン酸ナトリウムは、１００ｍＭ〜１ｍＭ、５０ｍＭ〜５ｍＭ、２５ｍＭ〜５ｍＭ、１０ｍＭ〜５ｍＭ、１０ｍＭ〜１ｍＭの範囲又は約１０ｍＭの量で存在する。
【０００９】
特定の実施形態では、クエン酸ナトリウムは、１００ｍＭ〜１ｍＭ、５０ｍＭ〜１ｍＭ、２５ｍＭ〜１ｍＭ、１０ｍＭ〜１ｍＭ、５ｍＭ〜１ｍＭの範囲又は約５ｍＭの量で存在する。
【００１０】
特定の実施形態では、塩化ナトリウムは、２００ｍＭ〜１０ｍＭ、１００ｍＭ〜２０ｍＭ、８０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲、又は約７０ｍＭの量で存在する。
特定の実施形態では、アルギニンは、２００ｍＭ〜５ｍＭ、１５０ｍＭ〜５０ｍＭ、１００ｍＭ〜７５ｍＭの範囲、又は約１００ｍＭの量で存在する。
【００１１】
特定の実施形態では、糖は、１００ｍＭ〜１０ｍＭ、１００ｍＭ〜５０ｍＭ、７５ｍＭ〜３５ｍＭ、６０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲、又は約５０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、スクロースは、１００ｍＭ〜１ｍＭ、１００ｍＭ〜５０ｍＭ、７５ｍＭ〜３５ｍＭ、６０ｍＭ〜４０ｍＭの範囲、又は約５０ｍＭの量で存在する。
【００１２】
特定の実施形態では、界面活性剤は、１％〜０．０１％、０．５％〜０．０５％、０．０２５％〜０．０５％、０．１％〜０．０５％、０．０５％〜０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲又は約０．０５％（ｗ／ｖ）の量で存在する。特定の実施形態では、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０）は、１％〜０．０１％、０．５％〜０．０５％、０．０２５％〜０．０５％、０．１％〜０．０５％、０．０５％〜０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲又は約０．０５％（ｗ／ｖ）の量で存在する。
【００１３】
特定の実施形態では、組成物は、８．０〜６．０、７．５〜６．５、７．５〜７．０、７．４〜７．０、７．３〜７．０、７．２〜７．０、７．１〜７．０、７．２〜７．１の間、７．２±０．３、約７．１、又は約７．２のｐＨを有する。
【００１４】
特定の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、１００ｍＭ〜１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭ〜１ｍＭのクエン酸ナトリウム、２００ｍＭ〜１０ｍＭの塩化ナトリウム、２００ｍＭ〜１０ｍＭのアルギニン、１００ｍＭ〜１０ｍＭのスクロース、及び１．０％〜０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０及び任意選択的には７．２〜７．１のｐＨを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、２５ｍＭ〜５ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭ〜１ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ〜２０ｍＭの塩化ナトリウム、１５０ｍＭ〜５０ｍＭのアルギニン、７５ｍＭ〜３５ｍＭのスクロース、及び０．５％〜０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０及び任意選択的には７．２〜７．１のｐＨを含む。
【００１６】
一実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、約５ｍＭのクエン酸ナトリウム、約７０ｍＭの塩化ナトリウム、約１００ｍＭのアルギニン、約５０ｍＭのスクロース、及び約０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、かつ約７．１のｐＨを有する。
【００１７】
別の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７０ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのスクロース、及び０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、かつ７．１のｐＨを有する。
【００１８】
別の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７０ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのスクロース、及び０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、かつ７．２±０．３のｐＨを有する。
【００１９】
特定の実施形態では、組換えコラーゲン７は、ヒトコラーゲン７である。
コラーゲン７組成物は、増加した安定性を有する。特定の実施形態では、組成物は、１リットルのポリカーボネートボトル内（組成物５００ｍＬ）、−６５±５℃又は−２０±５℃で貯蔵後、３か月間安定である。特定の実施形態では、組成物は、１０ｃｍ３（１０ｃｃ）のガラスバイアル内（組成物５．５ｍＬ）、−６５±５℃又は−２０±５℃で貯蔵後、６か月間安定である。特定の実施形態では、組成物は、２５±３℃で２週間の貯蔵後、安定である。特定の実施形態では、組成物は、５±３℃で最大１か月間の貯蔵後、安定である。
【００２０】
組成物は、例えばＤＥＢを治療するために用いることができる１つ以上の追加的な医薬賦形剤を含む医薬組成物であってもよい。
別の態様は、ＤＥＢを治療する方法であって、本明細書に記載されるような組換えコラーゲン７組成物を有効量でそれを必要とする対象に投与するステップを含む、方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ｒＣ７組成物又は対照の投与後５〜７日間生存するＣｏｌ７ａ１−／−マウスからの舌及び前足における代表的な免疫蛍光画像を示す。
【図２】ｒＣ７組成物又は対照の投与後のＣｏｌ７ａ１−／−マウスからの舌における代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。
【図３】ｒＣ７組成物又は対照の投与後のＣｏｌ７ａ１−／−マウスの生存確率を示すカプラン・マイヤー曲線である。
【図４】ｒＣ７製剤の凍結／解凍ストレスへの曝露後のＳＥＣ−ＨＰＬＣ特性を示す。
【図５】３７℃で１時間のインキュベーション後、Ｄ−ＰＢＳ及び１０％血清で希釈された０．５ｍｇ／ｍＬのｒＣ７におけるＳＥＣ−ＨＰＬＣを示す。
【図６】様々な温度で貯蔵後の様々な量のアルギニンを含有するｒＣ７製剤の％ＨＭＷ種を示す。
【図７】様々な温度で貯蔵後の様々な量のアルギニンを含有するｒＣ７製剤のフィブロネクチン結合を示す。
【００２２】
ｒＣ７組成物の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明からより明白になるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
係留線維の主成分として、コラーゲン７は組織完全性を維持する機能がある。係留線維は、皮膚、口腔粘膜、及び頸部を含む、幾つかの組織の上皮層と間葉層との間の界面で付着複合体として役立つ構造要素である（チャン（Ｃｈｕｎｇ）ら著、ダーマトロジック・クリニックス（Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｃｌｉｎ）、２０１０年、第２８巻、第１号、ｐ．９３〜１０５）。皮膚では、係留線維は、上皮基底膜の下位部から下層の真皮乳頭層にかけて広がり、上皮基底膜と真皮乳頭層との間の連結を確保する（ヴァルキ（Ｖａｒｋｉ）ら著、ジャーナル・オブ・メディカル・ジェネティクス（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ）、２００７年、第４４巻、ｐ．１８１〜１９２）。この関連性は、表皮と真皮との間の接着を提供し、維持することを助け、皮膚の完全性（その適切な構造、機能、及び恒常性にとって重要である）に寄与する（ヴィローン（Ｖｉｌｌｏｎｅ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２００８年、第２８３巻、第３６号、ｐ．２４５０６〜２４５１３）。コラーゲン７をコードする核酸配列及びそれがコードするポリペプチドは、当該技術分野で公知である。一実施形態では、組換えコラーゲン７は、ヒトコラーゲン７である。
【００２４】
本明細書に記載の組換え方法により生成されるコラーゲン７は、当該技術分野で公知の標準的プロトコル（例えば、沈殿、遠心分離など）に従い、宿主細胞培養系から回収されてもよい。本明細書に記載の組換えコラーゲン７は、以下の参考文献に示される通り、宿主細胞培地に分泌され、硫酸アンモニウム沈殿とそれに続く遠心分離により回収されてもよい（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２００２年、第２７７巻、第１８号、ｐ．２１１８〜２１２４）。
【００２５】
本明細書に記載の組換え及び分子生物学的方法により生成され、回収されたコラーゲン７は、当該技術分野で公知の標準的プロトコル（例えば、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳゲル電気泳動など）に従って精製されてもよい。本明細書に記載の組換えコラーゲン７は、以下の参考文献に示される通り、イオン交換クロマトグラフィーにより、均一になるまで精製されてもよい（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）、２００２年、第２７７巻、第１８号、ｐ．２１１８〜２１２４）。
【００２６】
本開示は、緩衝液、非必須アミノ酸、抗凍結剤、界面活性剤、及びキレート剤を含有する組換えＣ７（ｒＣ７）製剤を提供する。特定の実施形態では、非必須アミノ酸は、アルギニン、好適にはＬ−アルギニンである。特定の実施形態では、抗凍結剤は糖である。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、キレート剤は、クエン酸塩である。好ましい実施形態では、ｒＣ７製剤は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのスクロース、７０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、及び約７．２のｐＨを含む。
【００２７】
これらの改善された製剤は、過去に用いられたＰＢＳ緩衝液と比べると、ｒＣ７の溶解度を高め、過去に用いられたＰＢＳ緩衝液と比べると、ｒＣ７タンパク質濃度を約８〜１０倍増加させ、また凍結及び解凍、ならびに貯蔵及びハンドリングの間の熱応力に対する頑強性／安定性を増強する。特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＣ７組成物は、−６５±５℃及び−２０±５℃の双方で３か月間安定である。特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＣ７組成物は、−６５±５℃及び−２０±５℃の双方で６か月間安定である。特定の実施形態では、ｒＣ７組成物は、２５±３℃で２週間及び５±３℃で最大１か月間、安定である。送達装置の互換性の観点から、特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＣ７組成物は、ディスポーザブルシリンジ内での貯蔵時に２５±３℃で最大８時間、又は生理食塩水での０．１ｍｇ／ｍＬへの希釈時に２５±３℃で最大６時間、安定である。本明細書で用いられるとき、「安定な」は、指示される貯蔵条件後、２８０ｎｍの吸光度による測定として、タンパク質の量における有意差がなく、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる測定として、高分子量種、二量体、ホモ三量体、及び低分子量種の量における有意差がなく、またフィブロネクチン結合アッセイにおける測定として、効力の有意な低下がないことを意味する。
【００２８】
組成物中で用いられてもよい糖は、限定はされないが、非還元二糖（例えば、スクロース、トレハロース）又は糖アルコール、例えばソルビトールを含む。特定の実施形態では、組成物中の糖は、スクロースである。
【００２９】
組成物はまた、１つ以上の緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム）、ヒスチジン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液を含んでもよい。
【００３０】
組成物はまた、１つ以上の界面活性剤及び／又は増量剤を含んでもよい。界面活性剤は、限定はされないが、ポロクサマー（例えば、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０）、ＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）、又はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）を含む。特定の実施形態では、組成物中の界面活性剤は、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０）である。増量剤は、限定はされないが、ＰＶＰ、ＰＥＧ、デキストラン、マンニトール及びグリシンを含む。
【００３１】
組成物はまた、１つ以上の追加的な薬学的に許容できる賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容できる賦形剤の例として、限定はされないが、塩、タンパク質（例えばアルブミン）、キレート剤（例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸）、ゲル化ポリマー、尿素（又はその誘導体）、及びそれらの組み合わせを含む。
【００３２】
一態様は、ＤＥＢを治療するための本明細書に記載の組成物の使用を対象とする。さらに提供されるのは、ＤＥＢを治療する方法であって、組換えコラーゲン７、緩衝液、非必須アミノ酸、抗凍結剤、界面活性剤、及びキレート剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法である。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸塩緩衝液（例えばリン酸ナトリウム）である。特定の実施形態では、非必須アミノ酸は、アルギニンである。特定の実施形態では、抗凍結剤は、糖、例えばスクロースである。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０又はポリソルベート８０である。特定の実施形態では、キレート剤は、クエン酸塩である。各成分の量は、本願全体を通じて記載に従って変動し得る。一実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン７、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７０ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのスクロース、及び０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含み、かつ７．１又は７．２のｐＨを有する。
【実施例】
【００３３】
実施例１
凍結／解凍特性及び熱安定性を比較するため、以前に用いたＰＢＳ製剤を含む５つの製剤を選択した。これらの製剤を表１に列挙する。
【００３４】
【表１】
2019504043.tif 000002
【００３５】
これらの製剤を試験することにより、Ｌ−アルギニン及びスクロース、好適には７５〜１００ｍＭのＬ−アルギニン及び１．７％（ｗ／ｖ）のスクロースが溶解度を改善することが発見された。界面活性剤（例えば０．０５％ポリソルベート２０）の封入により濾過性が改善されたことから、潜在的な非特異的吸着が低下することが予想される。ＮａＣｌ、好適には約７０ｍＭのＮａＣｌの製剤への封入により、外観が改善された。
【００３６】
以前に用いたｒＣ７製剤（ＰＢＳ）は、０．４ｍｇ／ｍＬのみの溶解度の上昇を、この濃度を超える著しい粘性負荷とともに達成した。場合によっては、ＰＢＳ製剤は０．８ｍｇ／ｍＬ押し上げることができたが、従来のタンパク質精製プロセス、例えばＵＦ／ＤＦとスケーラブル又は互換可能でない非常に特異的な実験室条件下に限られた。約７．２のｐＨで１ｍｇ／ｍＬのｒＣ７、１０ｍＭのリン酸塩、５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＬ−アルギニン、１．７％（ｗ／ｖ）のスクロース、７０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）のポリソルベート２０を含む製剤（「第Ｉ相製剤」）は、１００ｋＤａのＰＥＳ分子量カットオフを有する通常のスピンカラムを用いて、約１０倍高いタンパク質濃度（約４ｍｇ／ｍＬの上昇）を達成することができた。
【００３７】
ＰＢＳ製剤との比較時と同様、粘性における改善が見られた。ＰＢＳ製剤は、０．８ｍｇ／ｍＬを超えるタンパク質濃度を支持することができなかった。したがって、より高濃度のタンパク質製剤との直接的比較はできなかった。しかし、３ｍｇ／ｍＬのｒＣ７タンパク質製剤における粘性読み取り値はすべて、高粘性とみなされない約４センチポイズ（ｃｐ）であった。これらのデータは、一般に粘性の増加がｒＣ７タンパク質濃度の増加と相関することを示す。粘性をタンパク質濃度と比較する場合（ｃＰ／タンパク質濃度）、アルギニン含有製剤がＰＢＳ製剤の場合よりも低い値を有することが明らかになる。したがって、アルギニン製剤は、粘性の増加をより良好に制御する一方でより高いタンパク質含量を支持する。
【００３８】
チンダル光の強度下で、タンパク質の屈折及びタンパク質沈殿物は、より高いタンパク質濃度（３〜４ｍｇ／ｍＬの上昇）での第Ｉ相製剤において有意により少なかった。これにより、より清澄でかつ混濁度が低下した外観の第Ｉ相製剤が得られた。
【００３９】
第Ｉ相製剤をさらに、強固な小規模凍結／解凍モデルを用いて、凍結及び解凍ストレス条件に晒した。製造規模（スケーラビリティ）にて遭遇され得る凍結／解凍ストレスを反映するため、第Ｉ相製剤を３つの凍結／解凍サイクル（表２を参照）に曝露した。
【００４０】
【表２】
2019504043.tif 000003
【００４１】
３サイクルの完了後、タンパク質含量（Ａ２８０ｎｍでの吸光度による測定として；表３を参照）又は会合状態（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる測定として；図４を参照）のいずれにおいても全く変化がなかった。
【００４２】
【表３】
2019504043.tif 000004
【００４３】
アルギニン含有製剤に、−６５℃、−２０℃、５±３℃、及び２５℃の温度で２か月間の貯蔵を施した。任意の貯蔵条件で２か月後、外観上全く変化がなかった。同じ材料によると、５±３℃（最小）又は２５℃のいずれかで貯蔵した製剤を除いて、タンパク質濃度（Ａ２８０ｎｍ）又はＳＥＣ−ＨＰＬＣ特性（表４を参照）において有意な変化が示されなかった。２５℃で２か月貯蔵後、高分子量（ＨＭＷ）種の増加（約２％）が見られた。
【００４４】
【表４】
2019504043.tif 000005
【００４５】
１ｍｇ／ｍＬ用量での第Ｉ相製剤は、動物送達装置及び投与シリンジとの互換性についても評価した。１ｍｇ／ｍＬ製剤を適切なシリンジで注入セットに注射し、薬剤を各々の装置内で最大６０分間保持した。装置内で６０分後、可視粒子又はｐＨ変化は認められなかった。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ特性もまた有意な変化を示さなかった
ｒＣ７を血流中に静脈内注射するときに何が生じるかを知ることは困難である。しかし、１０％ウシ血清を含有し、３７℃で保持される緩衝液などのより生理学的関連条件にタンパク質が曝露するときの任意の変化について監視することにより、生成物の品質変化についての可能性を評価することは可能である。ｒＣ７タンパク質は、可溶性凝集及び沈殿の傾向がある。これらの事象は、一般的な分析技術を通じて監視することができる。タンパク質含量における変化について監視するため、Ａ２８０の吸光度を用いる。不可溶性微粒子の形成に起因する混濁度における変化について監視するため、Ａ３２０の吸光度を用いる。ＨＭＷ及び／又はＬＭＷ種が形成する場合の可溶性タンパク質における変化について監視するため、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いる。血清効果の影響を最大化するため、緩衝液を等量の血清で希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度、（第Ｉ相製剤中）ｒＣ７の存在下でインキュベートした。体温をシミュレートするため、全試料を３７℃で１時間保持した。これらの結果のまとめを表５に列挙する。その結果によると、生理学的培地への３７℃で１時間の曝露後、タンパク質含量（Ａ２８０）、又は混濁度（Ａ３２０）に変化がないことが示された。したがって、データは、血清へのｒＣ７送達の希釈時に即時性の溶解度制限が明白でないことを示唆している。
【００４６】
【表５】
2019504043.tif 000006
【００４７】
カルシウム及びマグネシウムが生成物品質における変化に対する効果を有したか否かを確認するため、最初のダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）を緩衝液中にＣａ２＋及びＭｇ２＋カチオンを封入せずに入手した。この溶液を試験し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を生理学的レベルで添加する場合のＤ−ＰＢＳと比較した。これらは、結果に対する効果を有しないことが判明した（表５）．
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ特性によると、様々な試験緩衝液マトリックスに３７℃で１時間曝露後、不可溶性凝集体の増加が認められないことが確認された。図５。様々な緩衝液への曝露により、おそらくはαヘリックスの可動性の増加に起因して、ピークの低分子量側領域における初期変化が惹起される。
【００４８】
様々な量のＬ−アルギニン（２５ｍＭ〜１００ｍＭ）を含有するｒＣ７製剤に対して、熱安定性試験を実施した。結果によると、Ｌ−アルギニンレベルの低下により、５±３℃及び２５±３℃の双方で最大１か月間の貯蔵後、（フィブロネクチン結合アッセイによる測定として）高分子量種におけるわずかな増加及び効力低下がもたらされることが示される。図６及び７。加えて、２５ｍＭ及び５０ｍＭのアルギニンでの試料中で、さらなる乳白光が見られた。これらの試験では、他の賦形剤レベルは同じく保持した。
実施例２
初期開発研究に基づき、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７０ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０、及び約７．１のｐＨを含む製剤を、ＤＥＢのマウスモデルにおけるＣｏｌ７ａ１−／−マウスへの投与に用いた。
【００４９】
組換えヒトコラーゲン７（ｒＣ７）をＣＨＯ細胞内で生成した。２つの異なる作製プロセスを用いて、ｒＣ７をＣＨＯ細胞から精製した。各作製プロセスから生成されたｒＣ７ロットは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７０ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０、及び約７．１のｐＨを含む組成物中で製剤化した。
【００５０】
出生後２〜３日目、ｒＣ７の単回静脈内投与後の分布及び組織学的改善を評価するため、３つの治療群を通じて全部で５９の新生児Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスにて試験を実施した。この試験では、さらに全生存を試験した。各組成物（被験物質１及び被験物質２）は、０．４ｍｇ／ｍＬ（４０μＬ中１６μｇ）の用量で２６の新生児Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスに静脈内投与した。組成物は、出生後２〜３日目、浅側頭静脈を介して単回静脈内ボーラスとして投与した。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、７０ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのアルギニン、５０ｍＭのスクロース、０．０５％のポリソルベート２０、及び約７．１のｐＨを含むが、ｒＣ７を有しない対照組成物もまた、新生児Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスに静脈内投与した。
【００５１】
被験物質１及び被験物質２の投与の結果、新生児Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスにおける舌及び前足皮膚での真皮−上皮ＢＭＺに対してｒＣ７の分布が得られた。図１。それに対し、溶媒対照を注射したすべてのマウスにおいて、Ｃ７は検出されなかった。図１。
【００５２】
舌組織切片の代表的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）画像によって示される通り、試験組成物の静脈内投与の結果、溶媒対照と比べて、Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスにおける真皮−上皮分離の修正が生じた。図２。舌は、毛がないことから真皮−上皮分離を試験するのに最適な組織であり、表皮を真皮に係留し、新しく誘導される水疱の形成を阻止するのに役立ち得る
舌における表皮と真皮との間の完全な閉鎖（すなわち分離なし）を伴うマウスの割合は、被験物質１、被験物質２、及び溶媒対照を投与したＣｏｌ７ａ１−／−マウスにおいて各々、５０％（２６中１２）、６３％（２６中１５）、及び１０％（１０中１）であった。真皮−上皮分離の完全な閉鎖を伴うＣｏｌ７ａ１−／−マウスの割合は、ｒＣ７治療マウスにおいて、溶媒対照よりも高かった（被験物質１対溶媒、フィッシャーｐ＝０．０６、被験物質２対溶媒、フィッシャーｐ＝０．０２）。真皮−上皮分離の閉鎖を伴うＣｏｌ７ａ１−／−マウスの割合は、ｒＣ７治療マウス間で異ならなかった（フィッシャーｐ＝０．５８）。
【００５３】
被験物質１又は２の新生児Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスへの単回静脈内投与の結果、下の表７及び図３に示すように、生存において、溶媒対照と比べて統計学的に有意な改善が得られた。中央値（四分位範囲）生存時間は、溶媒対照、被験物質１、及び被験物質２を投与したＣｏｌ７ａ１−／−マウスにおいて各々、２．５、９、及び１４日であった。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
表６では、ハザード比をＣｏｘ比例ハザードモデルにて評価した。比例ハザード仮説は、シェーンフィールド残差による評価として、満足された（ｐ＞０．３７）。
この試験では、ＤＥＢの新生児マウスモデルでの試験対象のｒＣ７組成物における有効性が実証された。詳細には、舌及び皮膚における真皮−上皮ＢＭＺに対して分布した両被験物質が、真皮−上皮分離を修正し、その結果、Ｃｏｌ７ａ１−／−マウスにおける単回静脈内注射後、生存において、溶媒対照と比べて統計学的に有意な改善をもたらした。
【００５６】
栄養障害型表皮水疱症（ＤＥＢ）プログラムの第Ｉ／ＩＩ相臨床試験を支持するため、以下の原体／製剤：原体（ＤＳ）-１Ｌのポリカーボネート（ＰＣ）ボトル内に１．０ｍｇ／ｍＬのｒＣ７で５００ｍＬ満たした凍結液体；製剤（ＤＰ）−１０ｃｍ３（１０ｃｃ）のガラスバイアル内に１．０ｍｇ／ｍＬのｒＣ７で５．５ｍＬ満たした凍結液体を用いることになる。製剤は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＬ−アルギニン、５０ｍＭのスクロース、７０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、約７．２のｐＨを含む。
【００５７】
ＤＳにおける今日までの長期貯蔵安定性の観点では、ＧＭＰ材料は、−６５±５℃及び−２０±５℃の双方で３か月間安定であり、２８０ｎｍでの吸光度による測定として、タンパク質濃度における有意な変化はなく、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる測定として、高分子量種、二量体、ホモ三量体、及び低分子量種の量における有意な変化はなく、かつフィブロネクチン結合アッセイにおける測定として、効力における有意な変化はない。ＤＰにおいては、今日まで、開発ロットは、−６５±５℃及び−２０±５℃の双方で６か月間安定である。ハンドリングにおいては、製剤は、２５±３℃で２週間、また５±３℃で最大１か月間安定である。光からの曝露を最小限にし、生成物のハンドリング中での過剰な振盪を阻止することに注意を払う必要がある。送達装置の互換性の観点では、製剤は、ディスポーザブルシリンジ内での貯蔵時、２５±３℃で最大８時間、又はｒＣ７を生理食塩水で０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈する時、２５±３℃で最大６時間安定である。さらに、タンパク質含量における変化は、３７℃で１時間の貯蔵後、１０％ウシ血清を含有するＰＢＳの存在下で認められなかった。これは、製剤投与時の生理学的互換性を示す。
【００５８】
１つ以上の例示的実施形態が本明細書中で記載されているが、形態及び詳細における様々な変化が、以下の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の概念の精神及び範囲から逸脱しない限り、本明細書中に設けられてもよいことは当業者によって理解されるであろう。
【００５９】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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