(57)【要約】本発明はピリチオン化合物と薬理的に許容され得るピリチオン塩を使用する成分と方法を開示する。本発明は局所療法による皮膚癌治療、子宮頚癌治療、その他の癌の治療、皮膚前癌病変からの皮膚癌発症の予防、パピローマウイルス感染症からの子宮頚癌発症の予防、パピローマウイルス感染症からその他の癌の発症の予防の方法を開示する。更に、本発明においてはピリチオン化合物の少なくとも一種類、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩のいずれか、アスコルビン酸誘導体のいずれか、ピリドキシン、ピリドキシン誘導体、薬理的に許容され得る緩衝剤を含む薬剤成分を開示する。薬剤成分のｐＨは４．５から６．４の間であるとする。
2019520310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の有効成分を含有する、悪性腫瘍の予防及び／又は治療組成物。
【請求項２】
ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の有効成分を含有する、前癌病変に対する予防組成物。
【請求項３】
前記有効成分は、ピリチオン及びピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上であり、
ＥＤＴＡ、及びＥＤＴＡ塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、及びアスコルビン酸化合物から選択されるいずれか１種以上をさらに含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
緩衝剤存在下でのｐＨが６．９以下である、請求項１から３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の有効成分を用いた悪性腫瘍の予防及び／又は治療方法。
【請求項６】
ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の有効成分を用いた前癌病変に対する予防方法。
【請求項７】
前記有効成分は、ピリチオン及びピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上であり、
前記有効成分を、ＥＤＴＡ、及びＥＤＴＡ塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びアスコルビン酸化合物から選択されるいずれか１種以上と共に用いる、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記有効成分をｐＨ６．９以下の状態で用いる、請求項５から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
悪性腫瘍の予防及び／又は治療のための薬剤の製造における、ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の使用。
【請求項１０】
前癌病変に対する予防のための薬剤の製造における、ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の使用。
【請求項１１】
前記ピリチオン及び前記ピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上と、ＥＤＴＡ、及びＥＤＴＡ塩、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びアスコルビン酸化合物から選択されるいずれか１種以上との併用である、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１２】
ｐＨが６．９以下である、請求項９から１１のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
急速に増殖する癌細胞はその代謝の結果酸を産生し、放出された酸は癌周囲の環境を酸性化する。このことにより、癌を取り巻く環境は正常組織を取り巻く環境よりも高い酸性度を呈する。本発明は酸性環境下で発生し増殖する癌を治療又は予防するための薬剤処方及び治療・予防方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は全世界で主要な死因の一つである。国際がん研究機構が２０１２年に行った統計によると、全世界における年間癌発症者総数は２０１２年では１４００万人以上であったが、これが２０３０年には２０００万人以上にまで増加すると予想される。同様に全世界における年間癌死亡者総数は２０１２年においては８００万人であったが、これが２０３０年には１３００万人以上にまで増加すると予想される。
【０００３】
化学療法、外科手術、及び放射線療法が、悪性腫瘍に対する最も一般的な治療戦略である。癌研究領域は顕著な進歩を遂げたものの、現在の治療法には数々の問題点があり、それらを改善する必要がある。一例として、伝統的化学療法の多くはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）に化学損傷を与えて、癌細胞の高い増殖活性と細胞分裂を阻害することを目標に治療が行われる。ＤＮＡは癌細胞及び正常細胞共に有する遺伝情報の青写真であるため、このような従来の化学療法はしばしば癌細胞以外の正常細胞にも損傷を与えて重篤な副作用を引き起こす。その他の化学療法剤には、細胞構成タンパク質のうち細胞増殖や細胞分裂に関わるものを標的にしているものもあるが、これらの化学療法剤も骨髄や細胞分裂のさかんな腸管細胞等癌細胞以外の正常細胞に対して非特異的な毒性を発揮する。より最近になって、癌細胞のみに存在し正常細胞には存在しないような癌特異分子を標的にする治療薬が注目を集めてきた。細胞成長因子受容体阻害剤エルロチニブとゲフィチニブが癌特異分子を標的にする治療剤の好例である。しかし、全ての癌細胞が十分なレベルの成長因子受容体を持っているわけではない。また、癌特異分子標的療法に治療開始当初治療効果を奏した症例でも、抑制された成長因子受容体の働きを相補する他の機序が作動することでいずれは癌細胞が治療抵抗性を獲得する傾向がある。外科療法は孤立した悪性腫瘍を除去する上では効果的かもしれないが、再発や外科手技によっておこる癌の他の身体部位への浸潤が大きな問題である。更に外科手術は、出血、瘢痕形成、感染症、正常臓器損傷を起こしうる。放射線療法も正常組織障害や二次発癌の危険があり、長期的な美容上の危険もある。化学療法は、特に経静脈的・経口的に行われた場合、先に述べた多くの重篤な副作用を起こし得る。新たな抗癌治療方法の開発が強く必要とされる。
【０００４】
悪性腫瘍は単なる癌細胞の寄せ集めではない。腫瘍細胞の周囲を取り囲む正常組織と正常細胞が独特の環境（時に「腫瘍微小環境」とも呼ばれる）を形成して癌細胞の増殖、浸潤、転移を促進するのである。酸は腫瘍微小環境の最も重要な要素の一つである。腫瘍微小環境は、腫瘍のない環境に比べて酸性度がより強い。腫瘍細胞から細胞外に放出された酸性代謝物が腫瘍微小環境の酸の根源であり、これが化学・射線療法治療効率の低下を来し、更には腫瘍の増殖及び浸潤を促進する。酸性環境は悪性腫瘍治療の魅力的な標的である。酸性環境で増殖する腫瘍細胞増殖を効率的に抑制する治療法は有望な新しい治療法になることが予想される。
【０００５】
それ自体は癌ではないが癌に進展する危険性が高い病態は「前癌病変」と呼ばれる。前癌病変に伴う持続的で制御不能な炎症反応の結果、前癌病変部位では癌が発症する以前に酸性度の高い環境が形成される。酸性環境は、遺伝情報の変化と癌の発症を促進する（非特許文献１：Coussens and Werb, 2002）。いったん悪性腫瘍細胞が発生すると、酸性環境下で悪性腫瘍細胞が正常細胞に比べてより選択的に増殖するので、酸性化が更に亢進することになる。酸性環境下で悪性腫瘍が正常細胞よりも選択的に増殖すること以外に、過剰な酸によって免疫細胞活性が弱められることによっても癌化の可能性が高められる（非特許文献２：Lardner, 2001）。
【０００６】
日光角化症とパピローマウイルス感染症は前癌病変の好例である。  日光角化症は過剰な紫外線暴露により引き起こされるざらざらした鱗片状病変であり、米国の皮膚科外来受診患者の10パーセントを占める最も頻繁に診断される皮膚病の一つである。日光角化症はしばしば皮膚癌の原因となり、ある研究結果によると６５パーセントの扁平上皮癌、３６パーセントの基底細胞癌は日光角化症が原因で発症するとも言われている（非特許文献３：Criscione et al., 2009)。凍結手術と抗癌化学療法剤経皮投与が日光角化症の主な治療法である。しかし、日光角化症は癌化する前は生命に影響を及ぼすような疾患ではない。癌化には１０年かそれ以上の年月が必要であり、しばしば複数の日光角化症が同一患者に出現し、どの日光角化症が侵襲性の癌に進展するのかを予想することは難しい。これらの事実が日光角化症の治療を難しくしている。
【０００７】
パピローマウイルス感染症は子宮頚部、女性生殖器外表部、肛門、陰茎及び口腔で起こる。世界保健機構（WHO）によると、パピローマウイルス感染症は性的接触によって伝染するウイルス感染症のうち最も頻度の高いものである（非特許文献４）。パピローマウイルス感染症は上記のこれらの部位に癌を引き起こすことが知られているが、特に子宮頸癌ではそのほぼ全例においてパピローマウイルス感染が関与している。子宮頚癌は女性の癌のうち４番目に多い癌であるが、全患者数の８５パーセント以上を占める発展途上国においては女性の間で２番目に多い癌である。パピローマウイルスワクチンと癌スクリーニングによる早期診断によって先進国における子宮頸癌の頻度は顕著に低下したが、発展途上国でこれらの方法を採用することは社会的経済的問題のため困難である。より簡便で安価な方法が待ち望まれる。 
【０００８】
最近行われた実験研究により、亜鉛ピリチオンが、免疫欠損マウスの皮下に移植されたヒトの口腔癌細胞（非特許文献５：Srivastava et al., 2015）及びヒトの白血病細胞（白血球細胞由来悪性腫瘍）（非特許文献６：Tailler et al., 2012）の増殖を、効率的に抑えることが示唆された。どちらの研究も、癌細胞増殖を抑制する濃度において、ピリチオンは宿主生体には副作用を起こさないことを明らかにした。同様に、低濃度の亜鉛ピリチオンは前立腺癌細胞を効果的に殺すのに対し、癌ではない細胞を殺すのにはこれより１０倍高い濃度の亜鉛ピリチオンが必要であることが明らかにされた（非特許文献７：Carraway and Dobner, 2012）。しかし、これら先行技術は、癌の治療又は予防のための方法、或いは薬剤成分に関する情報を提供していない。
【０００９】
ピリチオンは、生体膜に組み込まれて、亜鉛を透過する小さな穴を形成する。癌細胞の重金属に対する毒性を利用して、亜鉛やその他の金属を癌治療に使う方法が知られている。例えば、特許文献１（米国特許出願公開第２０１１／０１１７２１０号明細書）は、亜鉛有機塩、亜鉛無機塩を癌治療に利用する方法を紹介している。特許文献２（米国特許第７，５２８，１２５号明細書）は、一連のピリチオンを化学的に修飾した新しい化合物を開示し、これを用いて亜鉛、銅、マンガン、鉄、その他金属化合物を腫瘍に投与する方法を開示した。更に、特許文献３（米国特許出願公開第２００６／００４０９８０号明細書）は抗癌薬剤、抗血管造成薬剤として亜鉛ピリチオンと亜鉛塩を併用する方法を開示した。より最近の実験研究では、更にこの技術とアイディアを発展させ、ピリチオン塩を媒体として銅（非特許文献８：Liu et al., 2014）、カドミウム、白金（非特許文献９：Zhao et al., 2016b）、ニッケル（非特許文献１０：Zhao et al., 2016a）といった、より広範な重金属を白血病、骨髄腫瘍、骨髄腫、肺癌、肝臓癌に投与する方法を提唱している。これら先行技術から、ピリチオンによって生体膜に形成される穴を通過した重金属が、悪性腫瘍の殺細胞効果、抗増殖作用を示すことを我々は学んだのである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／０１１７２１０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，５２８，１２５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／００４０９８０号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Coussens, L.M., and Werb, Z. (2002). Inflammation and cancer. Nature 420, 860-867.
【非特許文献２】Lardner, A. (2001). The effects of extracellular pH on immune function. Journal of leukocyte biology 69, 522-530.
【非特許文献３】Criscione, V.D., Weinstock, M.A., Naylor, M.F., Luque, C., Eide, M.J., and Bingham, S.F. (2009). Actinic keratoses. Cancer 115, 2523-2530.
【非特許文献４】"Human papillomavirus (HPV) and cervical cancer", 世界保健機関ウェブサイト，2018年2月15日公開，http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs380/en/
【非特許文献５】Srivastava, G., Matta, A., Fu, G., Somasundaram, R.T., Datti, A., Walfish, P.G., and Ralhan, R. (2015). Anticancer activity of pyrithione zinc in oral cancer cells identified in small molecule screens and xenograft model: Implications for oral cancer therapy. Molecular oncology 9, 1720-1735.
【非特許文献６】Tailler, M., Senovilla, L., Lainey, E., Thepot, S., Metivier, D., Sebert, M., Baud, V., Billot, K., Fenaux, P., and Galluzzi, L. (2012). Antineoplastic activity of ouabain and pyrithione zinc in acute myeloid leukemia. Oncogene 31, 3536-3546.
【非特許文献７】Carraway, R.E., and Dobner, P.R. (2012). Zinc pyrithione induces ERK-and PKC-dependent necrosis distinct from TPEN-induced apoptosis in prostate cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research 1823, 544-557.
【非特許文献８】Liu, N., Liu, C., Li, X., Liao, S., Song, W., Yang, C., Zhao, C., Huang, H., Guan, L., and Zhang, P. (2014). A novel proteasome inhibitor suppresses tumor growth via targeting both 19S proteasome deubiquitinases and 20S proteolytic peptidases. Scientific reports 4, 5240.
【非特許文献９】Zhao, C., Chen, X., Zang, D., Lan, X., Liao, S., Yang, C., Zhang, P., Wu, J., Li, X., and Liu, N. (2016b). Platinum-containing compound platinum pyrithione is stronger and safer than cisplatin in cancer therapy. Biochemical Pharmacology in press.
【非特許文献１０】Zhao, C., Chen, X., Zang, D., Lan, X., Liao, S., Yang, C., Zhang, P., Wu, J., Li, X., and Liu, N. (2016a). A novel nickel complex works as a proteasomal deubiquitinase inhibitor for cancer therapy. Oncogene.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
酸性の腫瘍微小環境は、多くの抗癌化学療法剤に対する耐性の原因になることが知られている。また、前癌病変からの癌化を予防するために現在施行可能な方法は、効率、安全性、経費といった面で限界がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、酸性度を用いて抗癌作用を増強して悪性腫瘍の治療と予防を行うための、薬剤成分とその方法を開示する。いくつかの実施形態においては、開示した治療方法と薬剤成分は、前癌病変部に散発的に発生しつつある癌細胞を殺すことで、前癌病変から癌への進行を予防することに用いられる。
【００１４】
本発明のある側面として、亜鉛ピリチオン、ソディウムピリチオン、その他ピリチオン塩、又は塩を含まないピリチオンのいずれか一つ、或いはそれら複数、を皮膚、子宮頚部、膣、陰茎、肛門、その他の身体部位に発生した悪性腫瘍に対する治療を用途とする医薬品として製造し使用することを開示する。構成成分のｐＨは薬理的に許容され得るｐH調整剤を用いて酸性に保たれる。本法は悪性腫瘍の酸性環境下での増殖を効率的に抑制する。別の側面として、本法は化学療法、放射線療法、外科療法などの既存の抗癌治療法と併用してもよい。
【００１５】
今回の発明の別の側面として、ピリチオンに加えてキレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ＥＤＴＡカルシウム塩、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、ＥＤＴＡアンモニウム塩、ＥＤＴＡ二カリウム塩、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩、ＴＥＡ−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ四ナトリウム塩、ＥＤＴＡ四カリウム塩、ＥＤＴＡ三ナトリウム塩、ＨＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ三ナトリウム塩 及びその他のＥＤＴＡ塩を含有する、癌或いは悪性腫瘍の治療、及び予防を用途とする医薬品の製造に用いることを開示する。これにより、亜鉛その他の金属に依存したキレート化されていないピリチオンによる抗癌作用という先行技術に立脚し、これに更に改善を加えることで、ピリチオンによる抗癌作用を更に有効なものにする。
【００１６】
本発明の更に別の側面として、ピリチオンを用い、更に一般にビタミンＢ６と総称される所のピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、及びこれらの５リン酸エステルをピリチオンと共に加えたものを悪性腫瘍の治療及び予防を用途とする薬剤の製造に用いることを開示する。これにより、悪性腫瘍の酸性環境下での増殖阻害効果を改善、促進する。 
【００１７】
本発明の更に別の側面として、ピリチオンを用い、更にＬ−アスコルビン酸、ビタミンＣとして知られる所のアスコルビン酸、アスコルビン酸塩類のいずれか、アスコルビン酸由来の化合物のいずれか一種類、またはこれら二種類、或いはそれ以上の組み合わせたものをピリチオンと共に加えて、悪性腫瘍の治療及び予防を用途とする薬剤の製造に用いることを開示する。これにより、悪性腫瘍の酸性環境下での増殖阻害効果を改善、促進する。
【００１８】
本発明の更に別の側面として、ピリチオンをパピローマウイルス感染症の生殖器感染や皮膚日光角化症などに代表される前癌病変からの癌発症を予防するための医薬品製造に使用することを開示する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ピリチオンを主要原料とする抗癌剤成分が酸によって増強されることを利用して、効率的、簡便、安全、そして安価な癌細胞増殖抑制効果が可能になる。
【００２０】
ピリチオンが癌細胞増殖を抑制するのに必要な濃度は、本願において開示された増強剤と薬剤成分の酸性を組み合わせた場合、先行技術によって知られている既存抗癌剤が癌細胞増殖を抑制するために必要な濃度に比べて１００倍から１０００倍低いことが見出された。これは今回開示する方法及び薬剤成分の有効性を明確に現している。更に、今回開示する治療方法、薬剤成分、医薬品製造への応用は、酸性腫瘍微小環境において成長する癌細胞を選択的に殺すという、既存技術においては達成し得なかった技術上の必要性を満たすものである。
【００２１】
いくつかの実施形態において、酸性を有する処方が、体表近傍、或いは臓器表面近傍に生育する癌に対して局所投与される。局所投与法は全身投与法に比べて、ピリチオンを含有した処方を投与する上で、多くの点で より優れている。第一に、局所投与法は安全であることで、これは局所投与では処方薬剤が血液や健常臓器と接触する機会が少なく、健常組織に対する好ましくない影響が生じにくいためである。第二に、局所投与には高度の技術が必要とされず、有病者自身による投与も全身投与に比べて容易であることである。第三に、本発明において開示される局所投与のために至適化された酸性処方は、薬効成分を効果的に癌に到達させることができることである。更に、局所投与法は、酸性薬剤成分を全身の血液や健常臓器の酸性度に影響を与えることなく、癌組織に到達させられるという点でも有利である。注意を要するのは、血液及び全身を酸性にすると心不全が起きるということである。ある実施形態においては、ピリチオン（及び増強剤）の局所投与とある種の増強剤の全身投与（例えばビタミンＢ６の経口投与、ビタミンＣの静脈注射）を組み合わせるが、このことによって更に治療効果が向上する。
【００２２】
本件で開示されたピリチオン及びその他薬剤成分は、これまでに開示された大量生産技術によって産業用途に広範に使用されていることから、本件により開示される方法と薬剤成分を使って安価に医薬品を製造することが熟練技術により可能である。このことは、比較的経済発展が進んでいない国で医薬品を製造する際に特に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は亜鉛ピリチオン（図中場合によっては“Ｐｙｚ”と略記）とソディウムピリチオン（図中場合によっては“Ｐｙｎ”と略記）の化学構造を示したものである。
【図２】図２は亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）を二種類の異なるｐＨを有する細胞培養液（培地）中で処理したときに、ヒト脳腫瘍Ｕ８７細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、及び大腸癌ＨＴ２９細胞の生存に及ぼす効果を示したグラフである。細胞は、示された濃度の亜鉛ピリチオン存在又は非存在下３７℃で３日間培養した。細胞生存率は、メチルチオゾリルジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アセイによって計測された。
【図３】図３はソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）を二種類の異なるｐＨを有する細胞培養液中で処理したときに、ヒト脳腫瘍Ｕ８７細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、及び大腸癌ＨＴ２９細胞の生存に及ぼす効果を示したグラフである。細胞は示された濃度のソディウムピリチオン存在下又は非存在下、３７℃で３日間培養された。細胞生存率はＭＴＴアセイによって計測された。
【図４】図４にソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）と亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）を、二種類の異なるｐＨを有する細胞培養液（培地）中で、ＨｅＬａ細胞に処理したときに示す殺細胞効果をまとめた。細胞は、示された濃度のピリチオン存在下又は非存在下、３７℃で３日間培養された。非生存細胞はトリパンブルー染色法により計測された。
【図５】図５は亜鉛ピリチオンをスフェロイド三次元培養法で培養した脳腫瘍Ｕ８７細胞に、二種類の異なるｐＨを有する細胞培養液（培地）中で処理したときに認められる酸誘導性抗増殖効果を示した写真である。
【図６】図６は亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）又はソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）を二種類の異なるｐＨを有する細胞培養液（培地）中で子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に処理したときに、スーパーオキシドがミトコンドリア内に蓄積した様子を示した写真である。
【図７】図７にエルロチニブ 及び ゲフィチニブを二種類の異なるｐＨを有する細胞培養液（培地）中で、脳腫瘍Ｕ８７細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞及び大腸癌ＨＴ２９細胞に処理したときの生存率に及ぼす効果をまとめた。細胞生存率はＭＴＴアセイによって計測された。
【図８】図８は亜鉛ピリチオンのヒト脳腫瘍Ｕ８７細胞、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、及び大腸癌ＨＴ２９細胞に対する抗癌作用をエチレンヂアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が増強する効果をまとめたグラフである。細胞生存率はＭＴＴアセイによって計測された。
【図９】図９は亜鉛ピリチオンがヒト子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に対して示す抗癌作用をピリドキシンが増強する効果をまとめたグラフである。細胞生存率はＭＴＴアセイによって計測された。
【図１０】図１０はソディウムピリチオンと亜鉛ピリチオンが子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に対して示す抗癌作用をソディウムアスコルビン酸と３−ｏ−エチルアスコルビン酸が増強する効果をまとめたグラフと写真である。細胞生存率は二次元培養法（図１０Ａ）とスフェロイド三次元培養法（図１０Ｂ）で調べられた。
【図１１】図１１Ａは亜鉛ピリチオン、３−ｏ−エチルアスコルビン酸及びアスコルビルテトラアイソパルミチン酸を含有した、或いは含有しない、薬剤処方の局所投与が免疫欠損マウス皮下に移植されたヒト皮膚癌細胞の増殖に及ぼす効果を示したグラフである。              図１１Ｂは亜鉛ピリチオン、３−ｏ−エチルアスコルビン酸、及びアスコルビルテトラアイソパルミチン酸を含有する薬剤処方の経皮投与が、正常皮膚、肝臓、腎臓に対して副作用を表さないことを示した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
特に指定がない限り、「ピリチオン」と「ピリチオン化合物」は同義に使われ、ピリチオン及びピリチオンの塩のいずれかで、他の処方成分と干渉することなく人体に投与可能なものを指す。ピリチオンは最も一般的には、亜鉛塩、又はナトリウム塩として商業的販路から入手されるが（図１参照）、ニッケル、白金といった他の塩の形態も知られている。ピリチオンは２−メルカプトピリジン−Ｎ−オキシド、１−ハイドロキシ−２−ピリジンチオン、１−ハイドロキシピリジン−２−チオン、オメジン、（２−ピリジルチオ）−Ｎ−オキシド、２−ピリヂンチオール−１−オキシドといった他の名称でも知られている。誘導体とは、類似の構造，機能を有する化合物を意味する。ピリチオンのナトリウム塩（ソディウムピリチオン）は商品に広範に使用されている。ソディウムピリチオンは一般的に２−クロロピリジン−Ｎ−オキシドと硫化水素ナトリウム、水酸化ナトリウムと反応されることで合成され得る（例えば米国特許第３，１５９，６４０号明細書参照）。ピリチオンの亜鉛塩（亜鉛ピリチオン）は、ピリチオン酸（１−ハイドロキシ−２−ピリジンチオン）又はその水溶性塩と亜鉛塩（例えば硫酸亜鉛、塩化亜鉛）とによって形成される亜鉛ピリチオン沈殿として合成され得る（例えば米国特許第２,８０９，９７１号明細書参照）。
【００２５】
腫瘍とは、身体構成部分の腫脹、として定義づけられる病理学用語である。腫瘍には癌のように無制限に増殖する悪性腫瘍と称されるタイプと、一般的に無害で治癒可能な良性腫瘍と称されるタイプが存在する（ただし、ある種の癌は良性腫瘍から発生するものもある）。
【００２６】
悪性腫瘍は無制限に細胞分裂をし、近隣組織への直接浸潤、及び転移と呼ばれる血液やリンパ系を介した遠隔組織への浸潤が可能な腫瘍である。癌とは厳密には皮膚や臓器の上皮細胞由来の悪性腫瘍の一群と理解される。これに対し、血液、骨、血管、軟骨、筋肉、支持組織、といった上皮細胞以外の細胞由来の悪性腫瘍は、厳密には癌からは除外される。例えば病理学的定義では、皮膚のメラノーマは非上皮細胞由来の悪性腫瘍であるから癌ではないことになる。しかし現実的には、悪性腫瘍、癌、ネオプレイジアという名称は広義には互換的に使われ、そのため、メラノーマはしばしば皮膚癌の一部と称される。ここでは「癌」という用語は広義に「悪性腫瘍」と互換性あると理解される。
【００２７】
皮膚に認められる悪性腫瘍は、皮膚扁平上皮癌、皮膚メラノーマ（悪性黒色腫）、皮膚腺癌、その他皮膚領域に発生又は皮膚に転移した悪性腫瘍を含む。癌腫（カルシノーマ）とは上皮由来の悪性腫瘍を表す病理用語で、メラノーマ（悪性黒色腫）は非上皮細胞由来の悪性腫瘍である。別の分類法では、皮膚に発症する悪性腫瘍は、基底細胞癌、扁平上皮癌、メラノーマ（悪性黒色腫）を含むその他に分類される。
【００２８】
子宮と膣に認められる悪性腫瘍とは、扁平上皮癌、扁平腺癌、その他悪性腫瘍、及び転移性腫瘍を指す。
【００２９】
ここで使われる「治療」とは、好ましくない医学的状態からの改善、或いはそのような好ましくない状態が悪化することを防ぐことを目的に行われる有病者に対する医療行為を指す。「抗腫瘍効果」、「抗癌効果」、及び「抗ネオプレイジア効果」の各用語は互換的に使われ、腫瘍の増殖を遅延又は消退させ、腫瘍の大きさを縮小させ他の臓器への浸潤を防ぐことを意味する。ある側面においては、ある化合物が腫瘍の大きさを縮小させたときに、その化合物に効果が認められたと判断される。別の側面においては、ある化合物が癌に伴う症状を緩和することによって、その化合物に効果が認められたと判断される。更に別の側面においては、ある化合物が医学的検査によって腫瘍の負荷の減少を示唆する結果が得られることによって、その化合物に効果が認められたと判断される。医学的検査とは生化学的検査、腫瘍マーカー検査、画像診断、病理組織検査を含む。また更に別の意味においては、ある化合物の投与によって有病者の生存期間の延長を見ることによって、その化合物に有効性が認められたと判断される。
【００３０】
経皮投与という用語は、ここではより広範に定義づけられ、局所投与という用語と互換的に使われる。局所投与は薬剤の体表からの薬剤投与、及び一般に上皮、粘膜として知られている体内管の内縁部からの薬剤投与に関わる全ての方法を総称する。
【００３１】
賦形剤とは、有効薬剤成分と干渉することなくこれら有効成分の薬物キャリアとして働く有機・無機化合物である。薬理的に許容され得る薬物キャリアは、水、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、塩溶液、ラクトース、アミロース、アルコール、油類、脂肪酸、ゼラチン、ケイ酸、表面活性剤、粘性パラフィン、ハイドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、潤滑剤、及びこれらに準じるものを含む。
【００３２】
悪性腫瘍の治療方法及び治療薬剤成分
悪性腫瘍は、ｐＨ６．０から６．９の酸性細胞外環境を有し、時にはさらに低いｐＨを示すのに対して、非癌正常組織のｐＨは７．３から７．４である（Parks et al., 2013）。これまでに行われてきた実験研究では、プロトンポンプを阻害したり酸を作る酵素を阻害することによって、腫瘍環境の酸性度を緩和して腫瘍の増殖を抑制しようと試みてきた。しかし、腫瘍環境を酸性化するためのある一つのメカニズムを阻害しても、これらを相補するようなそれ以外のメカニズムがより活性化されるため、このような戦略では期待されたほどの治療効果は挙げられていない。本発明は、このような戦略とは異なり、腫瘍の酸性度を利用して癌細胞を効率的かつ選択的に殺す方法である。
【００３３】
本発明者は、ｐＨ６．９及び６．４といった腫瘍微小環境で典型的な酸性度を有する細胞培地によって、抗癌作用が亢進するような薬剤をスクリーニングした。その結果驚くべきことに、ピリチオンの抗癌作用が酸性の細胞培地 によって劇的に亢進することが見出された（図１，２，３，４，５，６参照）。酸性環境下でのピリチオンの抗癌作用は子宮頚癌、脳腫瘍、大腸癌、乳癌、といった遺伝的背景の異なる癌細胞において認められたが、処方成分の酸性による抗癌作用の増強効果は上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ特異的阻害剤であるゲフィチニブ 及びエルロチニブにおいては認められなかった（図７）。
【００３４】
本発明において、悪性腫瘍の治療または予防のためのピリチオンの局所投与法とその成分を開示する。薬剤処方は、ピリチオン、酸性環境下で増強作用を促す化学成分、及び薬効成分に干渉しない薬剤キャリア、により構成される。薬剤処方は、体表または体内臓器内腔表面に直接塗布される。局所投与は、体表面近傍或いは体内臓器内腔表面近傍に生育する悪性腫瘍細胞に治療薬剤を効率的に到達させる上で有効である。薬剤処方成分の酸性ｐＨが腫瘍自体の酸性度と相まって、ピリチオンが効率的な殺腫瘍細胞効果を発揮する。処方成分のあるものは、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、吸入、経口的にも投与されてもよい。
【００３５】
ある実施形態においては、薬剤処方成分のｐＨは最大６．９とするが、これはピリチオンの抗腫瘍効果はｐＨ６．９であるときの方がｐＨ７．４であるときに比べて顕著に薬効が高いからである（一例として図１０を参照）。より好ましくは、薬剤処方成分のｐＨは最大６．４とするが、これはピリチオンの抗腫瘍効果がｐＨ６．４であるときの方がｐＨ６．９であるときに比べて顕著に薬効が高いからである（一例として図１０を参照）。更に好ましくは、薬剤処方成分のｐＨは最大５．６とするが、これはｐＨ５．５に調整されたピリチオンを含む薬剤調剤の局所投与によりマウスに移植されたヒト皮膚癌細胞の増殖を抑制したことからである（図１１参照）。以前に開示された米国特許第６，４５５，０７６号明細書は、化粧品の有効成分の効率を促進する上での酸の重要性を認識している。この先行技術は更に、皮膚の刺激を防止する方法  を提示した。この先行技術によると、ｐＨ２．０相当の酸によって発生する皮膚刺激は防止可能である。この理由により、更なる実施形態として、本薬剤処方成分のｐＨは最低でも２．０以上とする。
【００３６】
化合物のスクリーニングにより、ＥＤＴＡが酸性条件での亜鉛ピリチオンの抗腫瘍効果を顕著に高めることが見出された（図８）。ＥＤＴＡは、亜鉛やその他の重金属をある許容量の範囲内で除去し中和する働きをし、医薬品、化粧品、食品の安定剤として汎用されている。これはつまり、ピリチオンは亜鉛やその他の重金属が存在しなくても強力な抗腫瘍効果を発揮するということを意味し、ピリチオンを透過するような重金属が、抗腫瘍効果の上で重要であることを明らかにした先行技術（背景と関連技術参照）からは予測できなかったものである。ソディウムピリチオンが、亜鉛ピリチオンと同様に強力な酸性誘導性の抗癌作用を示す、という本願における発見（図２と図３を参照）とも鑑みて、亜鉛ピリチオンとソディウムピリチオンのどちらも悪性腫瘍治療に有効であることを意味する。本願で開示する、亜鉛（又は他のいかなる重金属）に依存しないピリチオンによる抗腫瘍効果は、長期投与による重金属の過剰摂取の危険を軽減するかもしれない。腫瘍治療における、亜鉛ピリチオン（又はその他いずれかの金属を付加したピリチオン）の使用、及びソディウムピリチオン（又はその他のいずれの金属を含まないピリチオン）の使用をここに開示する。
【００３７】
化合物スクリーニングの結果、１０から１００μＭ濃度のピリドキシンと処方成分の酸性とを組み合わせることで、亜鉛ピリチオンによる抗癌作用を著しく増強することが見出された（図９）。更に、１ｍＭ濃度のピリドキシンの場合、処方成分の酸性と組み合わせることで、亜鉛ピリチオンによる抗癌作用を増強するのみならず、ピリチオンが存在しなくてもピリドキシン単独で酸依存性の抗癌作用を示すことが発見された。ピリドキシンはビタミンＢ６活性を有する化合物の一つで、その他のビタミンＢ６化合物としてはピリドキサール、ピリドキサミン、及びそれらの５位リン酸エステルを含む。ある実施形態においては、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、それらの５位リン酸エステル、ピリドキシンジカプリレート、ピリドキシンダイパルミテート、これら誘導物のいずれかを亜鉛ピリチオン（又はその他いずれかの金属付加型ピリチオン）又はソディウムピリチオン（又は金属を含まないピリチオンのいずれか）と共に供給されるものとする。
【００３８】
アスコルビン酸ナトリウムは、特に処方成分を酸性にすることと組み合わせることで、亜鉛ピリチオンによる抗癌作用を著しく増強することが見出された（図１０）。アスコルビン酸ナトリウムはアスコルビン酸塩の一つで、アスコルビン酸同様の活性を示す。
【００３９】
３−ｏ−エチルアスコルビン酸はエチル基を有し、このエチル基がアスコルビン酸の３−ハイドロキシ基とエーテル結合することによって化学的安定性は増強され、経皮的な吸収が容易に行われるようになる。３−ｏ−エチルアスコルビン酸は、特に処方成分の酸性との組み合わせることで、亜鉛ピリチオンによる抗癌作用を著しく増強することが見出された（図１０）。更に３−ｏ−エチルアスコルビン酸は、特に処方成分を酸性にすることと組み合わせることで、ソディウムピリチオンによる抗癌作用を著しく増強することが見出された。
【００４０】
アスコルビルテトラアイソパルミチン酸は脂溶性のアスコルビン酸誘導物質で、容易に経皮的に吸収されアスコルビン酸に変換される。このためアスコルビルテトラアイソパルミチン酸及び3-o-エチルアスコルビン酸はスキンケア商品に汎用される。低濃度の亜鉛ピリチオン（１μＭ）、３−ｏ−エチルアスコルビン酸（3ｍＭ）及びアスコルビルテトラアイソパルミチン酸（2 ｍＭ）を含有する薬剤処方の局所投与により、マウスの皮膚に移植したヒト皮膚癌細胞の増殖を抑制することが見出された（図１１）。
【００４１】
当該局所薬剤処方に暴露された皮膚部位、肝臓、腎臓の組織検査において組織損傷、組織異常の所見は認められなかった（図１１Ｂに示された顕微鏡写真）。更に、表にまとめられた結果が示すように、ピリチオンとアスコルビン酸誘導物質群を含有する薬剤成分の局所投与による血液異常は認められなかった。これらの知見を総括すると、今回開示する方法で重篤な副作用はおこらないことを示唆している。
【００４２】
ある実施形態において、３−ｏ−エチルアスコルビン酸、アスコルビルテトラアイソパルミチン酸（又はその他アスコルビン酸誘導物質のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他アスコルビン酸塩のいずれか）、アスコルビン酸、又は上記を組み合わせたもの  が亜鉛ピリチオン（又はその他いずれかの金属を付加したピリチオン）又はソディウムピリチオン（又はいずれの金属も含まないピリチオン）と共に局所投与されるものとする。
【００４３】
体表や体内臓器の表面近傍の癌細胞、及び前癌病変部位への薬剤成分の直接投与は、薬理的に許容され得る塩を使って、クリーム、軟膏、ローション、ジェル、固形スティック、噴霧剤、ドロップ（点眼剤、点鼻剤等）、或いは密閉装置の形態によって行われてもよい。これら薬剤処方は、水中油滴（Ｏ／Ｗ型）エマルジョン、油中水滴（Ｗ／Ｏ型）エマルジョン、粘性溶液、又は水溶液であってもよい。ピリチオンや抗癌剤、ステロイド、抗炎症剤等の薬剤活性物質を放出させるために、ピリチオンやその他の活性物質を含むリザーバーを覆う半透過性膜などの密閉装置を用いることも可能である。ピリチオンの局所投与用薬剤処方は、適当な賦形剤を用いた一般的な方法で調剤することが可能であり、賦形剤としては例えば、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、保湿剤、スキンコンディショナー、皮膚保護剤、サンスクリーン剤、等が含まれてもよい。密閉式局所投与装置には、オプションとしてメチルハイドロキシパラベン、プロピルハイドロキシパラベン、クロロクレゾール等防腐剤や細菌増殖抑制剤が含まれてもよい。
【００４４】
薬剤成分は、体表面近傍の或いは体内臓器表面近傍の癌、或いは前癌病変部位に対して、薬理的に許容され得る塩を使って、針又はそれに準じる装置、高圧狭窄ジェット投与法、外部電解差の適用、超音波、レーザービーム、電磁波、放射線等を用いて投与してもよい。
【００４５】
膣及び直腸への導入に対しては座薬を使用してもよい。座薬処方は、本願により開示された化合物と処方構成成分、及びココアバター、様々な分子量のポリプロピレングリコール、グリセリン、グリセリン化ゼラチン等の適切な賦形剤を配合することによって調整されてもよい。これら賦形剤は室温では固体であるが体温によって溶解し、化合物と処方構成成分が直腸、膣、子宮頚部に放出される。
【００４６】
ある実施形態において、体表又は体内構造の内縁部からの吸収を促進するために、先行技術に基づいて皮膚透過性亢進剤や溶解促進剤が処方に加えられてもよい（Williams and Barry, 2012）。皮膚透過性亢進剤は、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸などの不飽和脂肪酸、テルペン、テルペノイド、エッセンシャルオイル、アゾン、ピロリドンといったものを含む。溶解促進剤の例としては低濃度界面活性剤、サイクロデキストリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等がある。
【００４７】
０．０００００３１７％重量濃度（１００ｎＭ）の亜鉛ピリチオンは、酸と組み合わせることで、二次元培養による癌細胞増殖を抑制することが見出された（図２、３、６を参照）。先行技術によると、ピリチオンの経皮吸収効率は１％前後と言われている（（Wedig et al., 1974）を参照）。このことから、ある実施形態において、ピリチオンを最低０．０００３１７重量％含むものとする。三次元培養による癌細胞増殖を抑制するためには０．００００６３４％（２μＭ）のピリチオンが必要であることから（図５を参照）、より好ましくは最低０．００６３４重量％のピリチオンを含むものとする。１重量％の亜鉛ピリチオンを含むクリームが顕著な抗腫瘍効果を表した（図１１）。このことから、更に好ましくは最低１％のピリチオンを含むものとする。ピリチオン５．５％を含む乳化液が安定であることが見出されたことから、別の実施形態としてピリチオンを最高５．５重量％含むものとする。
【００４８】
ある実施形態においては、ＥＤＴＡを亜鉛ピリチオンの抗癌作用を増強するために必要な最低濃度である０．０００３重量％（１０μＭ）（図８を参照）を最低濃度として含有するものとする。薬剤処方はＥＤＴＡを最大１０から１５重量％含有するものとするが、この濃度のＥＤＴＡは短期の歯科治療に安全に使用できるからである（Lanigan and Yamarik, 2002）。更に好ましくは、薬剤処方は最大約２重量％のＥＤＴＡを含有するものとするが、この濃度がＥＤＴＡを化粧品成分として長期使用する際に適当である所の最大濃度であることによる。
【００４９】
ある実施形態において、局所薬剤処方は最低０．０００１７重量％（１０ｍＭ）のピリドキシンを含有するものとするが、この濃度が亜鉛ピリチオンの酸依存性抗腫瘍効果を促進するのに必要なピリドキシンの最低濃度であることによる（図９）。より好ましくは、当該薬剤処方は最低０．００１７重量％（１００μＭ）のピリドキシンを含有するものとするが、この濃度のピリドキシンが更に高い効力を発揮することによる。更に好ましくは、当該薬剤処方は最低０．０１７重量％（１ｍＭ）のピリドキシンを含有するものとするが、この濃度のピリドキシンは、亜鉛ピリチオン非存在下においても酸依存性抗腫瘍効果を発揮することによる。皮膚透過性、浸透性、化学的安定性等、その他の要因により、実際に期待される効果を発揮するためには更に高濃度のピリドキシンが必要とされると考えられる。例えば、先行技術が０．００１％ から１５％のピリドキシンを含む化粧品の成分を開示された（米国特許出願公開第２００６／００１８８６０号明細書参照）。しかしながら、他の処方構成成分存在下では、１０重量％或いはそれ以下の濃度のピリドキシンを含有する処方の方がより安定であることが分かった。このことにより、ある実施形態において、薬剤処方は１０重量％あるいはそれ以下の濃度のピリドキシンを含有するものとする。脂溶性ピリドキシン誘導体であるピリドキシンジカプリレートやピリドキシンジパルミテートは体表から容易に吸収され、一旦吸収されると安定した活性を示す。ある実施形態において、ピリドキシンジカプリレート、ピリドキシンジパルミテート、又はその他ピリドキシン誘導体が最低０．０００１７重量％以上、好ましくは最低０．００１７重量％以上、更に好ましくは最低０．０１７重量％以上含有するものとし、最大１０重量％またはそれ以下の濃度で含有されるものとする。
【００５０】
ある実施形態において、局所薬剤処方は最低０．０４重量％（２ｍＭ）の３−ｏ−エチルアスコルビン酸を含有するものとするが、これは２ｍＭの３−ｏ−エチルアスコルビン酸はピリチオンと酸の存在下で、癌細胞の二次元培養条件下での増殖を抑制するからである（図１０参照）。より好ましくは、局所薬剤処方は最低０．２重量％（１０ｍＭ）の３−ｏ−エチルアスコルビン酸を含有するものとするが、これは１０ｍＭの３−ｏ−エチルアスコルビン酸はピリチオンと酸の存在下で癌細胞の三次元培養条件下での増殖を抑制するからである（図１０参照）。更に好ましくは、局所薬剤処方は、最低３重量％の３−ｏ−エチルアスコルビン酸を含有するものとするが、これは３％の３−ｏ−エチルアスコルビン酸はマウスに移植されたヒト皮膚癌細胞の増殖を、ピリチオンと酸の存在下で効率的に抑制するからである（図１１参照）。３％の３−ｏ−エチルアスコルビン酸と亜鉛ピリチオンの他に、当該処方は２重量％のアスコルビルテトラアイソパルミテートを含有している（実施例１１参照）。このことから、更に好ましくは、最低3重量％濃度又はそれ以上の３−ｏ−エチルアスコルビン酸、２重量% 濃度又はそれ以上のアスコルビルテトラアイソパルミテート、アスコルビルパルミテート、その他のアスコルビン酸誘導体のいずれか一つあるいは二つ以上の組み合わせを含有するものとする。本発明者は、２０重量％以上の３−ｏ−エチルアスコルビン酸を含有する処方は過敏性の皮膚に対してときに皮膚刺激を起こすことに気づいた。このことから、ある実施形態において、２０％以下、より好ましくは１０％以下のピリドキシンを含有するものとする。
【００５１】
０．０４重量％（約２ｍＭ）のアスコルビン酸ナトリウムをピリチオンと酸と共に二次元培養下で癌細胞に処理すると、癌細胞の増殖を抑制することが見出された（図１０）。ある実施形態において、局所投与薬剤処方は０．０４％かそれ以上の濃度のアスコルビン酸ナトリウム（又はその他いずれかのアスコルビン酸塩）、アスコルビン酸、又はアスコルビルテトラアイソパルミテート（又はその他いずれかのアスコルビン酸誘導体）を含有するものとする。３０％アスコルビン酸ナトリウム又は１５％アスコルビルテトラアイソパルミテートを含有する処方は安定で皮膚過敏性も示さなかった。このことから、ある実施形態においては、薬剤処方は３０％かそれ以下の濃度、より好ましくは２０％かそれ以下、更に好ましくは１０％かそれ以下の濃度のアスコルビン酸ナトリウム（又はその他いずれかのアスコルビン酸塩）を含有するものとする。更に別の実施形態においては、薬剤処方は１５％かそれ以下、より好ましくは１０％かそれ以下、更に好ましくは、５％かそれ以下の濃度のアスコルビルテトラアイソパルミテート（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）を含有するものとする。
【００５２】
一日一回、ピリチオンを含有する処方をマウス皮膚へ局所投与することによって皮膚癌の増殖が抑制されることが見出された（図１１）。このことから、ある実施形態においては、ピリチオンと増強剤を含有する薬剤処方を一日一回局所投与するものとする。既知の技術によると、亜鉛ピリチオンを局所投与した２０時間後には、その３４％しか皮膚投与領域に残存しない（Parekh et al., 1970）。更にこの先行技術は、投与間隔２０時間以内でピリチオンの局所再投与が行われた場合、投与された皮膚領域のピリチオン残存濃度が増加することを明らかにした。これは一日一回以上の投与によりピリチオンの皮膚における有効濃度が増加することを意味する。別の実施形態において、ピリチオンと増強剤を含有する薬剤処方は一日二回局所投与されるものとする。更に別の実施形態において、ピリチオンと増強剤を含有する薬剤処方は一日三回局所投与されるものとする。ある実施形態において、薬剤は望ましい効果が得られるまで投与されるが、典型的には、ピリチオン薬剤処方は２か月から３６か月の期間投与される。別の実施形態においては、各治療サイクルの間で、１日から４週間の休薬期間を設けるものとする。更に別の実施形態において、化学療法、放射線療法、外科療法がこの休薬期間に行われる。熟練技術者によって適当であると思われる場合、その他の投薬・休薬サイクル方式と治療期間が考慮されてもよい。
【００５３】
ピリチオン局所投与の一例として、皮膚の悪性腫瘍の治療に応用される。
【００５４】
ピリチオン局所投与の別の例として、子宮頚癌、膣癌、その他子宮頚部・膣部の悪性腫瘍の治療に応用される。
【００５５】
ピリチオン局所投与は、体表から到達可能なその他の悪性腫瘍治療に応用できる。対象疾患は、頭頚部、口腔内、肛門、直腸、前立腺、乳腺、骨、筋肉、軟骨に生じた悪性腫瘍、これらの部位に転移した悪性腫瘍を含むが、それ以外の悪性腫瘍も対象になり得る。
【００５６】
局所療法は薬剤成分を腫瘍の外表面から浸透させる。全身療法は薬剤成分を腫瘍に血流を供給する血管を介して腫瘍に供給する。これら二つの投与方法を組み合わせることによって薬剤成分の腫瘍内有効濃度が最大化される。経口及び静脈投与法はビタミンの血清濃度を増加させるために広く使われる全身投与法である。
【００５７】
経口投与されたピリドキシン６００ｍｇは０．３時間以内に速やかに全身循環に入り、投与１．３時間後には血清濃度が２５μＭに達することが先行技術によって明らかにされた（（Zempleni, 1995）を参照）。２５μＭという濃度は、ピリドキシンがピリチオン及び酸と共に投与されたときに抗癌作用を呈するのに必要な最低濃度である１０μＭよりも高い（図９）。これに対して、１００ｍｇのピリドキシンを経静脈注入というもう一つの汎用される方法で投与しても、６時間かかって達成されるピリドキシンの最高血清濃度は０．３７μＭに過ぎない。これらから、ある実施形態においては一日最低投与量６００ｍｇのピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、又はこれら化合物の５位リン酸化エステルの経口投与が、ピリチオンとピリドキシン（又はその誘導体）の局所投与と併用して行われる。先行技術により、一日１，０００ｍｇを超えるピリドキシンの大量摂取と神経障害の危険性との関連が示された（（Bender, 1999）を参照）。従って、別の実施形態において、一日最高投与量１０００ｍｇ濃度を上限とするピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、又はこれら化合物の５位リン酸化エステルの経口投与をピリチオンとピリドキシン（又はその誘導体）の局所投与と併用して行われる。経口投与されたピリドキシンは、全身循環に入ると想定半減期1時間以内で速やかに分解されるので（（Zempleni, 1995）を参照）、一日投与量を複数回に分割投与することが望ましい。別の実施形態において、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、又はこれら化合物の５位リン酸化エステルを経口で一日二回、より好ましくは一日三回、更に好ましくは一日四回投与する。
【００５８】
先行技術により、静脈投与により達成され得るアスコルビン酸の最大血清濃度は１３，４００μＭであるのに対して、経口投与により達成され得るアスコルビン酸の最大血清濃度はわずか２２０μＭであることが示されている（（Padayatty et al., 2004）を参照）。これはアスコルビン酸を静脈投与することで、ピリチオンと酸の存在下で癌の増殖を抑制するのに必要な最低血清濃度（１から１０ｍＭ）を達成できるのに対し、経口投与ではこの血清濃度に達しないことを表している（図１０）。ある実施形態において、３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸の静脈投与をピリチオンと３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸のいずれか一つあるいはこれらの複数の組み合わせを含む局所投与と併用する。先行技術により、アスコルビン酸５ｇを静脈投与すると、アスコルビン酸血清濃度を２ｍＭかそれ以上に上げられるが、３ｇまたは１ｇの静脈投与では同様の効果が得られないことが示された。このことから、ある実施形態において、最低５ｇのアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）、又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）が静脈投与されるものとする。１００ｇまでのアスコルビン酸の静脈投与は、血清アスコルビン酸濃度を上昇させるための安全で効果的な方法であることが知られている。このことから、ある実施形態において、最高１００ｇのアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）、又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）が静脈投与されるものとする。
【００５９】
先行技術はまた、アスコルビン酸の一日投与量を複数回に分割して投与することが、体内の血清有効濃度を一定レベルに保つ上で有用であることを我々に教えた。例えば、１００ｇ、５０ｇ及び１０ｇのアスコルビン酸の静脈内注入により血清アスコルビン酸濃度を２ｍＭ或いはそれ以上に保持する時間はそれぞれ約５．５時間、３．５時間及び１．３時間である。これは、５０ｇアスコルビン酸を一日二回静脈内注入すること、或いは１０ｇアスコルビン酸を一日五回静脈内注入することの方が、１００ｇのアスコルビン酸を一日一回静脈内注入するよりも、血清アスコルビン酸濃度２ｍＭ以上に保つ上ではより効率的であることを意味する。このことから、ある実施形態においては、一回５０ｇのアスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）、３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）又はアスコルビン酸を一日二回静脈内に注入する。また別の実施形態においては、一回１０ｇのアスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩）又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体）を一日五回静脈内に注入する。別の実施形態においては、一回３３ｇのアスコルビン酸、３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体）、又はアスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩）を一日三回静脈内に注入する。ある実施形態においては、各治療サイクル間で1日から４週間の休薬期間を設けるものとする。熟練技術者によって適当であると判断される場合その他の投薬・休薬サイクル方式と治療期間が考慮されてもよい。
【００６０】
原則的にはピリチオン及びその他処方成分の標準濃度と投与プロトコールは、腫瘍増殖抑制と腫瘍退縮を目標として行われる。治療応用に当たって、ピリチオン及びその他処方成分の標準濃度と使用される投与プロトコールは、病状、悪性腫瘍の種類、年齢、治療を受ける有病者の体重、投与経路、その他、治療を行う臨床専門家の経験で決められる要因によって異なる。ピリチオン及びその他処方構成成分の標準濃度と投与プロトコールは、他の治療と併用される場合、併用される治療の種類、治療効果及び副作用の程度によっても異なる。悪性腫瘍の腫瘍退縮は腫瘍サイズによって判定され得る。治療終了後悪性腫瘍が再発しないことによっても腫瘍縮退と判断し得る。
【００６１】
前癌病変から悪性腫瘍への進展を予防するための方法と薬剤成分
【００６２】
皮膚及び子宮頚部の悪性腫瘍に独特な性質として、これらの臓器の悪性腫瘍が高頻度で非癌性炎症性病態から発症するということが挙げられる。このことは、皮膚及び子宮頚部における悪性腫瘍の発症は、しばしばこれら臓器の異常状態によって予測可能である、とも言える。前癌病変部位における持続的かつ制御不能な炎症によって引き起こされる酸性環境は、ここに新たに発生する悪性腫瘍の増殖をピリチオンを使って抑制するためには理想的である。本願では、更に新たな一面として、ピリチオンを含有する薬剤処方の局所投与を用いて、将来悪性腫瘍に進展する可能性が高い体表又は粘膜病変部からの癌の発症を予防する方法を開示する。開示する方法は、前癌病変部位の酸性ｐHとピリチオン処方自体の酸性ｐＨを利用して、少数の悪性腫瘍細胞が目に見える大きさの腫瘍塊を形成する以前に縮退させる。
【００６３】
ある応用分野としては、日光角化症やその他皮膚の前癌病変からの皮膚癌の発症を予防することである。
【００６４】
別の応用分野としては、パピローマウイルス慢性感染から子宮頚癌、膣癌、肛門癌、陰茎癌、口腔内癌の発症を予防することである。
【００６５】
局所投与は、薬理的に許容され得る塩類をクリーム、軟膏、ローション、ジェル、固形スティック、噴霧剤、密閉装置に含有させることで行ってもよい。これら薬剤処方は、水中油滴（Ｏ／Ｗ型）エマルジョン、油中水滴（Ｗ／Ｏ型）エマルジョン、粘性溶液、又は水溶液であってもよい。
【００６６】
ある実施形態において、局所薬剤処方のｐＨは６．９かそれ以下とし、より望ましくは６．４かそれ以下、更に望ましくは５．６かそれ以下とする。前癌病変部位においては酸性環境が極度に強いことから、薬剤処方のｐＨは４．５かそれ以下であることが更に望ましい。更に別の実施形態において薬剤処方のｐＨは最低でも２．０以上とする。本願の動物実験に使われた薬剤処方には、２０ｍＭのクエン酸緩衝液が含有されている（実施例１１参照）。ある実施形態において、ｐＨ安定性を増強するために、薬剤処方中最高１００ｍＭ濃度のクエン酸緩衝液を含有するが、化学的安定性を保つためにより望ましい最高濃度は７５ｍＭ、更に望ましい最高濃度は５０ｍＭとする。別の実施形態において、クエン酸緩衝液の最低濃度は５ｍＭ、より望ましくは７．５ｍＭ、更に望ましくは１０ｍＭとする。ある実施形態においては、リン酸緩衝液やその他の人体に安全な緩衝液を使う。
【００６７】
ある実施形態において、皮膚からの吸収効率を上げるため皮膚透過性亢進剤と溶解促進剤を既知技術に則って処方に加える（（(Williams and Barry, 2012）を参照）。皮膚透過性更新剤は、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸といった不飽和脂肪酸、テルペン、テルペノイド、エッセンシャルオイル、アゾン、ピロリドン等を含む。溶解促進剤の例としては、低濃度界面活性剤、サイクロデキストリン、ジメチルスルホキシド等がある。
【００６８】
膣及び直腸への投与は座薬の形態を用いてもよい。座薬処方は本発明の薬効成分及び薬剤処方をココアバター、様々な分子量のポリエチレングリコール、グリセリン、グリセリン化ゼラチンなどの賦形剤を配合することによって作成できる。これら賦形剤は室温では固体であるが、体温によって溶解し、薬効成分及び薬剤処方が直腸、膣、子宮頚部に放出される。
【００６９】
ある実施形態においては、局所投与薬剤処方は、亜鉛ピリチオン、ソディウムピリチオン、又はその他のピリチオン化合物を最低0.000317重量%、より望ましくは最低0.00634%、更に望ましくは最低1%含むものとする。別の実施形態として、薬剤処方は最大5.5重量% の亜鉛ピリチオン、ソディウムピリチオン、又はその他いずれかのピリチオン化合物を含有するものとする。
【００７０】
ある実施形態において、０．０００３重量％から１５％、より望ましくは０．０００３％から１０％、更に望ましくは０．０００３％から２％のＥＤＴＡを薬剤処方中に含有するものとする。
【００７１】
ある実施形態において、局所投与薬剤処方は最低０．０００１７重量％、より望ましくは最低０．００１７％、更に望ましくは最低０．０１７％のピリドキシンを含有するものとする。別の実施形態として、薬剤処方は最大１０重量％以下、より望ましくは最大５％以下、更に望ましくは最大２．５％以下のピリドキシンを含有するものとする。脂溶性ピリドキシン誘導体であるピリドキシンジカプリレートやピリドキシンダイパルミテートは、体表から容易に吸収され、一旦吸収されると安定した活性を示す。ピリドキサミン、ピリドキサール５リン酸、及びピリドキサミン５リン酸はピリドキシンと似た生物活性を示す。脂溶性ピリドキシン誘導体であるピリドキシンジカプリレートやピリドキシンダイパルミテートは、皮膚から容易に吸収され、一旦吸収されると安定した活性を示す。ある実施形態において、薬剤処方中にこれら化合物を含有されるものとする。
【００７２】
ある実施形態において、局所投与薬剤処方は最低０．０４重量％以上、より望ましくは最低０．２％以上、更に望ましくは最低３％以上の３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸を含有するものとする。更に望ましくは、局所投与薬剤処方は最低３％以上の３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸に加えて、２％かそれ以上の濃度のアスコルビルテトラアイソパルミテート、アスコルビルパルミテート、その他の脂溶性アスコルビン酸誘導体のいずれか一つあるいは二つ以上の組み合わせを含有するものとする。ある実施形態において、２０重量％以下、より望ましくは１０％以下のピリドキシンを含有するものとする。
【００７３】
ある実施形態において、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、及びそれらの５位リン酸エステル経口投与を、一日に０．１ｍｇから１ｇ、より望ましくは一日１０ ｍｇから３００ｍｇ、ピリチオン含有処方の局所投与と併用して行う。ある実施形態において、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、及びそれらの５位リン酸エステルは一日一回経口投与される。別の実施形態において、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール、ピリドキサミン、及びそれらの５位リン酸エステルは一日三回８時間ごとに経口投与される。
【００７４】
いくつかの実施形態において、３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸の静脈投与と、ピリチオン及び３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸のいずれか一種あるいは二種以上の組み合わせを含有する薬剤処方の局所投与と併用する。ある実施形態において、一日５ｇを最少投与量として、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）、又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）を静脈投与する。別の実施形態において、一日１００ｇを最大投与量として、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）、又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）を静脈投与する。ある実施形態において局所薬剤処方は、最低０．０４重量％、より望ましくは最低０．２％の、更に望ましくは最低３％の３−ｏ−エチルアスコルビン酸を含有するものとする。更により望ましくは局所薬剤処方は、最低３％濃度以上の３−ｏ−エチルアスコルビン酸と最低２％かそれ以上の濃度のアスコルビルテトラアイソパルミテート、アスコルビルパルミテート、その他の脂溶性アスコルビン酸誘導体のいずれか一つあるいは二つ以上の組み合わせを含有するものとする。別の実施形態として、局所薬剤処方は３−ｏ−エチルアスコルビン酸を最大３０％濃度以下、より望ましくは２０％以下、更に望ましくは１０％以下含有する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、３−ｏ−エチルアスコルビン酸（又はその他のアスコルビン酸誘導体のいずれか）、アスコルビン酸ナトリウム（又はその他のアスコルビン酸塩のいずれか）又はアスコルビン酸静脈投与を、ピリチオンを含有する薬剤処方の局所投与と併用する。ある実施形態において、一日投与量が一日一回の注射で投与される。別の実施形態において一日投与量が一日二回の注射で投与される。更に別の実施形態において一日投与量が一日三回の注射で投与される。ある実施形態において、薬剤は望ましい効果が得られるまで投与される。別の実施形態においては、各治療サイクル間で1日から4週間の休薬期間を設けるものとする。熟練当業者によって適当であると思われる場合その他の投薬・休薬サイクル方式と治療期間が考慮されてもよい。
【００７６】
ピリチオンを含有する局所投与薬剤処方は一日一回、より望ましくは一日二回、更に望ましくは一日三回、体表面、生殖器又はその他臓器から投与され得る。ある実施形態において、ピリチオン含有局所投与薬剤処方は毎日投与される。別の実施形態において、ピリチオン含有局所投与薬剤処方は週に三回投与される。ある実施形態において薬物投与期間は１週間から９６週間、より好ましくは２週間から３２週間、更に好ましくは２週間から１６週間までとする。ある実施形態において、各投与サイクルの間に一日から４週間の休薬期間を設ける。その他熟練当業者によって適当と思われる投薬・休薬サイクル方式と治療期間が考慮されてもよい。
【００７７】
治療期間中、投薬分量は医師によって厳密に監督される。投与期間と投与間隔は臨床試験と前臨床試験によっても判断される。熟練当業者は年齢、体重、臨床状態等多くの要素からこれらを判断し得る。臨床状態は徴候、症状、及びルーチンで行われる医学的検査結果によって判断される。その他臨床診断法としては病理試験、コルポスコピー（膣及び子宮頚部の特殊拡大鏡による検査）及び血清検査が含まれる。
【実施例】
【００７８】
実施例１
細胞株と細胞試薬、大腸癌ＨＴ２９細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、脳腫瘍Ｕ８７細胞、皮膚癌Ａ２０５８細胞はアメリカタイプ培養コレクション（American Type Culture Collection、 ATCC）から入手した。これらの細胞はトリプシン処理後、９０％ダルベッコ変法培地（Dalbecco's Modified Eagle's Media 、DMEM）と１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により構成される細胞培地に懸濁された。
【００７９】
子宮頚癌ＨｅＬａ細胞は１０％ＤＭＳＯ存在下で実験に使用するまで液体窒素に凍結保存された。実験の前に細胞は液体窒素から取り出され、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％含有ＤＭＥＭ培地を用いて５％二酸化炭素を含む大気中で培養した。細胞密度が８０％ほどになった所で、細胞はトリプシンで処理され１：４の比率で希釈継代された。試験化合物に暴露されない細胞は、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを加えてｐＨ７．３に調整したＤＭＥＭ培地に、ウシ胎仔血清を１０％加えて、５％二酸化炭素を含む大気中で培養された。ピリチオン及びその他の化合物が、ｐＨ及び濃度依存性に癌細胞増殖に及ぼす影響を調べるためには、ＤＭＥＭ培地に１，４−ピペラジエタンサルフォン酸緩衝剤（PIPES, pKa 6.1~7.5）を１０ｍＭ濃度になるように添加しｐＨ６．４に調整、ＤＭＥＭ培地に４−（２−ハイドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸（HEPES, pKa 6.8~8.2）を１０ｍＭ濃度になるように添加しｐＨ７．４に調整された。ＰＩＰＥＳ（P6757, Lot#026K5416）、ＨＥＰＥＳ（H4034, Lot#087K54432）、ソディウムピリチオン（２−メルカプトピリジン  Ｎ−オキシドソディウム，H3261, Lot#0655M4172V）、メチルチオゾリルジフェニル-テロラゾリウムブロマイド（MTT, M5655, Sigma）はシグマから購入した。亜鉛ピリチオン（PHR1401, Lot#LRAA8431）はフルカから購入した。エルロチニブ（#10483, Lot#0459700-31）とゲフィチニブ（sc-202166, Lot#A0616）はケイマン化学とサンタクロースバイオテクノロジーからそれぞれ購入した。一般的な化学試薬は可能な限り純度の最も高いものを使用し、その他の試薬は特に指定のない限りシグマから購入した。
【００８０】
実施例２
癌細胞に亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）をｐＨ７．４及びｐＨ ６．４条件下で処理したとき癌細胞生存率に及ぼす影響
悪性腫瘍は悪性腫瘍に特徴的なｐＨ６．０から６．９という強い細胞外酸性を作り出すのに対し、正常組織の細胞外のｐＨは７．３から７．４である（Parks et al., 2013）。亜鉛ピリチオンを子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、脳腫瘍Ｕ８７細胞、大腸癌ＨＴ２９細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の４種類の異なるヒト癌細胞に接触させると、これら細胞の生存率が著しく低下することが示された。ｐＨ６．４の酸性培地中で亜鉛ピリチオン処理したとき、ｐＨ７．４の培地で処理したときに比べてより顕著に細胞生存率低下を起こした。亜鉛ピリチオンの化学構造を図１に示した。
【００８１】
癌細胞を９６ウェル培養ディッシュの一ウェルあたり２,０００個ずつ播種し、ウシ胎仔血清を１０％含有するＤＭＥＭ培地中、二酸化炭素を５%含有する大気中で３７℃一晩培養した。ピリチオン及びその他の化合物のｐＨ依存性抗癌作用を調べるために、ｐＨ＝６．４  ＤＭＥＭ培地は、ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ濃度になるように添加しｐＨを６．４に合わせることで調整した。ｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地は、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭ濃度になるように添加しｐＨを７．４に合わせることで調整した。ＰＩＰＥＳ（pKa 6.1~7.5）とＨＥＰＥＳ（pKa 6.8~8.2）はそれぞれｐＨ値を６．４と７．４に合わせるために用いられた。ｐＨ  ６．４は腫瘍環境の酸性度をモデルする代表的なｐＨ値として、ｐＨ  ７．４は正常組織環境の酸性度をモデルする代表的なｐＨ値として、それぞれ実験に採用された。細胞はｐＨ＝６．４  ＤＭＥＭ培地またはｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地中で異なる濃度の亜鉛ピリチオン存在下７２時間３７℃で培養した。実験は重炭酸塩が媒介する細胞膜を介したプロトン移動によるｐＨ変動を最小限にするために、重炭酸塩を含まない培地と大気中の二酸化炭素を含まない条件で行われた。亜鉛ピリチオンに７２時間暴露した後、一つのウェルあたり５０μＬのウシ胎仔血清を１０％含有するＤＭＥＭに１ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを新たに加えた培地に変えて、培養を継続した。２時間培養した後、２０％ＳＤＳ、２％酢酸、２．５％塩酸、及び５０％ＤＭＦを以て構成成分とする細胞抽出液を一ウェルあたり培地容積と等量の５０μＬ加えることで細胞を融解した。９６ウェル培養ディッシュを振盪した後、３７℃で４時間反応させて、５７０ｎｍの吸光度を測定した。バックグラウンド減算後、薬剤非処理群の計測値を対照群とした相対的生存率を算出した。異なる条件群とそれぞれの対照群との統計的有意性はそれぞれスチューデントｔテストによって調べた。ｐ−値が０．０５以下であることを以て有意に異なると見なされた。
【００８２】
癌細胞に５０ｎＭ亜鉛ピリチオンを、ｐＨを７．４に合わせた培養液（培地）中で７２時間処理したとき、亜鉛ピリチオンで処理されていない細胞群との相対的な細胞生存率は約８０−９０％であった。対して、これらの癌細胞に５０ｎＭ亜鉛ピリチオンを、ｐＨを６．４に合わせた弱酸性の培養液（培地）中で７２時間処理したとき、亜鉛ピリチオンで処理されていない細胞群との相対的な細胞生存率は約５−２０％であった。例えば、ヒト子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に５０ｎＭ亜鉛ピリチオンをｐＨ７．４で処理したとき、亜鉛ピリチオン処理されなかった細胞群に対する相対的な生存率は８７±９％であったのに対し、ＨｅＬａ細胞に５０ｎＭ亜鉛ピリチオンをｐＨ６．４で処理したとき、亜鉛ピリチオン処理されなかった細胞群に対する相対的な生存率は５．３±１．６％（ｐ＜０．００１）であった。これらの新たな知見は、酸性環境が亜鉛ピリチオンによる抗癌作用の効力を増強することを示す。結果は図２にまとめられた。０．０５以下のＰ値を以て有意な差異とみなされる。
【００８３】
実施例３
癌細胞にソディウムピリチオンをｐＨ７．４及びｐＨ６．４条件下で処理したとき癌細胞生存率に及ぼす影響
亜鉛ピリチオンまたはその他の重金属付加型ピリチオンが抗癌作用を示すことが示唆されている。一方、金属が付加されていないピリチオンにも抗炎症、抗感染作用があることが示唆されていた。これらのことから、抗癌治療の新しい方法を開発するために必要となる次の重要な問題は、酸によって増強される抗癌作用はピリチオンによるものなのか、それとも亜鉛によるものなのか、ということである。この疑問に答えるために、ソディウムピリチオンの癌細胞増殖に及ぼす影響を調べた。
【００８４】
本願において、ソディウムピリチオンをヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ細胞）、脳腫瘍細胞（Ｕ８７細胞）、大腸癌細胞（ＨＴ２９細胞）、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）の4種類の異なる癌細胞に暴露すると、細胞生存率が顕著に低下することが示された。ソディウムピリチオンをｐＨ６．４の酸性培地中で処理したとき、ｐＨ７．４の非酸性培地中で処理したときに比べて、より顕著な細胞生存率の低下を見た。
【００８５】
癌細胞を９６ウェル培養ディッシュの一ウェルあたり２,０００個ずつ播種しウシ胎仔血清を１０％含有するＤＭＥＭ培地中で二酸化炭素を５％含む大気中３７℃一晩培養した。ソディウムピリチオンのｐＨ依存性抗癌作用を調べるために、ｐＨ ＝６．４  ＤＭＥＭ培地は、ＰＩＰＥＳを１０ｍＭ濃度になるように添加しｐＨを６．４に合わせることで調整した。ｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地は、ＨＥＰＥＳを１０ｍＭ濃度になるように添加しｐＨを7.4に合わせることで調整した。細胞はｐＨ＝６．４  ＤＭＥＭ培地またはｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地中で、低い濃度から高い濃度まで異なる濃度のソディウムピリチオン存在下７２時間３７℃で培養した。実験は重炭酸塩が媒介する細胞膜を介したプロトン移動によるｐＨ変動を最小限にするために、重炭酸塩を含まない培地を用いて、大気中に二酸化炭素を含まない条件で行われた。細胞をソディウムピリチオンに７２時間暴露した後、ＭＴＴアセイは実施例２に準じて行われた。異なる実験条件群と対照群との統計的有意性は、スチューデントｔ−テストによって調べた。０．０５以下のｐ−値を以て有意な差異と見なされる。
【００８６】
癌細胞に１００ｎＭソディウムピリチオンを、ｐＨを７．４に合わせた培地中で７２時間処理したとき、ソディウムピリチオンで処理されていない細胞群に比べて相対的な細胞生存率は約７５％であった。これらの癌細胞に１００ｎＭソディウムピリチオンをｐＨ６．４酸性培地中で７２時間処理したとき、ソディウムピリチオンで処理されていない細胞群と比べて相対的な細胞生存率は約５％から２０％であった。例えば、ヒト子宮頚癌ＨｅＬａ細胞に１００ｎＭの亜鉛ピリチオンをｐＨ７．４又はｐＨ６．４で処理したとき、ソディウムピリチオンで処理されていない細胞群と比べて相対的な生存率はそれぞれ９０±９％と４．９±１．７％（ｐ＜０．００１）であった。０．０５以下のＰ値を以て有意な差異とみなされる。
【００８７】
これらの新たな発見は酸性環境がソディウムピリチオンの抗癌作用の効力を増強したことを示す。結果は図３にまとめられた。
【００８８】
実施例４
ＭＴＴアセイは細胞の代謝活性を検出することによって細胞生存率を計測する。トリパンブルーは死細胞の統合性の失われた生体膜から細胞の内部に侵入することができる（しかし、生きている細胞の内部には侵入できない）。斯くしてトリパンブルーを使って死細胞のみを可視化できる。亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）又はソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）をｐＨ７．４又はｐＨ６．４でＨｅＬａ細胞に処理したときの殺細胞効果をトリパンブルー染色アセイで行った。Ｃｔｒは薬剤処理群と同濃度の溶媒のみを含み薬剤を含まない培地で処理された対照群細胞を示す。
【００８９】
癌細胞を１２ウェル培養ディッシュに一ウェルあたり２０，０００個ずつ播種し、ウシ胎仔血清を１０％含有するＤＭＥＭ培地中で二酸化炭素を５％含有する大気中、３７℃一晩培養した。亜鉛ピリチオン及びソディウムピリチオンのｐＨ依存性抗癌作用を調べるために、ｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地はＨＥＰＥＳを１０ｍＭ濃度になるよう添加しｐＨを７．４に合わせることで調整した。ｐＨ＝６．４  ＤＭＥＭ培地はＰＩＰＥＳを１０ｍＭ濃度になるよう添加しｐＨを６．４に合わせることで調整した。細胞はｐＨ＝６．４  ＤＭＥＭ培地またはｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地中で、低濃度から高濃度までの異なる濃度の亜鉛ピリチオン又はソディウムピリチオン存在下、７２時間３７℃で培養した。重炭酸塩が媒介する細胞膜を介したプロトン移動によるｐＨ変動を最小限にするために、実験は培地中の重炭酸塩と大気中の二酸化炭素を含まない条件で行われた。細胞は亜鉛ピリチオン又はソディウムピリチオンに７２時間暴露された後、懸濁回収され、トリパンブルーを０．４％含むＰＢＳ溶液が細胞懸濁液と等量添加された。記録写真上、細胞の総数とトリパンブルーで染色された細胞数を計測し、トリパンブルーで染色された細胞の比率を算出した。一つの条件に対して４枚の写真を撮り、トリパンブルーで染まった細胞の比率の平均とエラーバーで示された標準偏差をグラフに示した。結果は図４にまとめた通りである。
【００９０】
トリパンブルーで染まらないことにより判定された細胞生存率は、ＭＴＴアセイで判定された細胞生存率とほぼ一致する。このことは、ピリチオンがｐＨ  ６．４培地中で処理されたときの方がピリチオンがｐＨ  ７．４培養液中で処理されたときよりも殺細胞効果に対する感受性が高いことを支持する。
【００９１】
実施例５
亜鉛ピリチオンは、スフェロイド三次元培養した脳腫瘍細胞に抗増殖効果を及ぼす。
【００９２】
細胞外基質であるコラーゲンジェルを培地に加え半浮遊状態で腫瘍細胞を培養したときに腫瘍塊が形成される。このような細胞外基質内に発生する腫瘍は「スフェロイド」と称され、三次元での腫瘍微小環境を再現するモデルとして使われる。スフェロイド培養法は、抗癌剤の効果を、実際の癌の複雑性を再現する三次元培養において解析することを可能にする（Friedrich et al., 2009）。多くの化合物の生体活性は腫瘍微小環境によって影響されるので、ピリチオンがスフェロイドの増殖に影響を与えるか、という問題は重要である。この疑問に答えるために、コラーゲンの存在下で作られた脳腫瘍Ｕ８７細胞スフェロイドを酸性条件（ｐＨ６．４）又は中性条件（ｐＨ７．４）のもと作成し、３７℃で３日間亜鉛ピリチオン処理を行い、スフェロイドの成長を測定した。
【００９３】
１％の寒天溶液を６０℃で加熱溶解し、等量の培養液（ｐＨ６．４  ＤＭＥＭ培地に１０％ウシ胎仔血清を添加したもの、又はｐＨ７．４  ＤＭＥＭ培地にウシ胎仔血清１０％添加したもの）を加えた混合物が、９６ウェル培養プレートの一ウェルあたり５０μｌずつ移された。プレートは室温で３０分寒天が固形化するまで冷却され、１，０００個の細胞を５０μｌの培養液中に懸濁したものがそこに上層された。細胞は３７℃で３日間培養され、寒天層の上に形成されたスフェロイドは、異なる濃度の亜鉛ピリチオン存在下又は非存在下で３日間培養された。１μＭ又は２μＭの亜鉛ピリチオンをｐＨ６．４の培養液で３日間処理したスフェロイドの大きさは、ピリチオンを含まないｐＨ６．４の培養液で３日間で処理された対照群のスフェロイドの大きさに比べて顕著に小さかった。これとは好対照に、１μＭ又は２μＭの亜鉛ピリチオンをｐＨ７．４の培養液で３日間処理したスフェロイドの大きさは、ピリチオンを含まないｐＨ７．４の培養液で３日間処理した対照群のスフェロイドの大きさに比べて違いはほぼ認められなかった。結果は図５にまとめられた。
【００９４】
実施例６
酸により増強されるピリチオンの抗癌作用によって、ミトコンドリア内にスーパーオキシドの蓄積をおこす。
【００９５】
過酸化水素やスーパーオキシドなどのフリーラジカル産生物質は、細胞代謝の過程で作られる。これら活性酸素種（ＲＯＳ）は、未変換のまま放置されると細胞に即時性の危険を及ぼす。外的ストレス又は毒素によるミトコンドリア機能不全が活性酸素種の細胞内小器官内への蓄積を促進することがこれまでに示されている。ほとんどの正常組織では活性酸素種を中和してそれ以上の細胞障害の進展を阻止できるのに対し、癌細胞は細胞内活性酸素種の濃度増減に対してより敏感で、活性酸素種蓄積に対する耐性も低いことが示されている（（Liou and Storz, 2010）を参照）。ピリチオンは光化学的にハイドロキシラディカルと（ピリジン−２−イル）スルファニル基を分解することから（（DeMatteo et al., 2005）を参照）、我々はピリチオンがミトコンドリア内のスーパーオキシド産生と除去に関与するかもしれないという仮説を立てた。これを検証するべく、癌細胞をピリチオンで２時間処理した後、ミトコンドリアのスーパーオキシドの濃度に応じて可視化する蛍光プローブを用いて解析した。
【００９６】
ＨｅＬａヒト子宮頚癌細胞を８ウェルのガラス底チャンバースライドの一ウェルあたり４，０００個ずつ播種し、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１０％濃度で含有するＤＭＥＭ培地にて３７℃で一晩培養された。ピリチオンを酸性又は中性の細胞外環境で処理したとき、ミトコンドリア内スーパーオキシド蓄積に如何なる影響を及ぼすか調べるために、細胞は亜鉛ピリチオン又はソディウムピリチオンを含む、又は含まない、ｐＨ＝６．４又はｐＨ＝７．４のＤＭＥＭ培地にて３７℃２時間培養された 。細胞洗浄後、1.25 μM MitoSOXTM (M31008, Invitrogen) と 2.5 μM DRAQ5TM （#62254, Thermo Scientific）を含むｐＨ７．４培地で３７℃５分間処理された。MitoSOXTM はミトコンドリアのスーパーオキシド産生を定量的に測定するために、DRAQ5TM は核を蛍光染色して蛍光顕微鏡下で細胞を可視化するために、それぞれ使用された。５分後細胞はＮａＣｌ−生理食塩水緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム，５ｍＭ塩化カリウム，２ｍＭ塩化カルシウム，１ｍＭ塩化マグネシウム，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４）に浸潤された状態で共焦点顕微鏡にて観察された。
【００９７】
スーパーオキシドのミトコンドリア内蓄積は癌細胞を殺す機序の一つである。ミトコンドリア内のスーパーオキシドを高感度かつ特異的に検出可能なMitoSOXTM を用いることによって、癌細胞に２００ｎＭの亜鉛ピリチオン又は４００ｎＭのソディウムピリチオンをｐＨ６．４の酸性培地中で２時間処理したとき、劇的にスーパーオキシドがミトコンドリア内に蓄積することを確認できた（図６）。これに対し、癌細胞に２００ｎＭの亜鉛ピリチオン又は４００ｎＭのソディウムピリチオンをｐＨ７．４の通常培地中で２時間処理したときには、スーパーオキシドのミトコンドリア内蓄積は確認できなかった（図６）。癌細胞をピリチオンを含有しないｐＨ６．４の酸性培地に２時間暴露してもスーパーオキシドのミトコンドリア内蓄積は認められなかった。これらの結果から、ピリチオンを酸性環境下で癌細胞に接触させることがスーパーオキシドのミトコンドリア内蓄積を惹起されることが示唆される。
【００９８】
実施例７
ゲフィチニブとエルロチニブによる抗癌作用は酸性培地によって増強されない。
【００９９】
ゲフィチニブとエルロチニブは上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor；EGFR） チロシンキナーゼ阻害剤で、癌細胞の増殖を特異的に抑制することが可能で、これによって古典的抗癌化学療法剤とは異なる作用機序を提供する。ゲフィチニブ と エルロチニブ は肺癌や皮膚の悪性黒色腫（メラノーマ）等の悪性腫瘍治療に臨床で使われている。これら臨床で使われている分子標的治療剤の抗癌作用が、酸性によって増強されるか否かは知られていない。
【０１００】
子宮頚癌ＨｅＬａ細胞を９６ウェルディッシュの一ウェルあたり２,０００個ずつ播種し、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１０％濃度含有するＤＭＥＭ培地中、二酸化炭素を５％含有する大気中にて３７℃で一晩培養した。細胞に低濃度から高濃度まで濃度の異なるゲフィチニブ又はエルロチニブを、ｐＨ６．４  ＤＭＥＭ培地又はｐＨ７．４  ＤＭＥＭ培地中で処理した。重炭酸塩による細胞膜を介したプロトン移動によるｐＨ変動を最小限にするために、重炭酸塩を含まないｐＨ＝６．４又はｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地中で、大気中には二酸化炭素を含まない条件で実験が行われた。ゲフィチニブ又はエルロチニブを７２時間暴露した後、実施例２に準じてＭＴＴアセイが行われた。
【０１０１】
ピリチオンとは異なり、酸による抗癌作用の増強効果は、ゲフィチニブ 又はエルロチニブ では認められなかった。一例として、ＨｅＬａ細胞に２０μＭのゲフィチニブをｐＨ７．４又はｐＨ６．４に調整された培地中で７２時間処理したとき、ＭＴＴアセイによって検出された細胞生存率はそれぞれ、５４±１６％、６１±９％であった。別の例として、ＨｅＬａ細胞に２０μＭのエルロチニブをｐＨ７．４又はｐＨ６．４に調整された培地中で７２時間処理されたとき、ＭＴＴアセイによって検出された細胞生存率は、それぞれ３９±８％、４６±１４％であった。ゲフィチニブとエルロチニブ による抗癌効果は酸性度によって影響されないという発見は、ピリチオンの抗癌作用の酸による増強効果の特異性を表している。結果は図７にまとめられた。
【０１０２】
実施例８
これまでの多くの研究が、亜鉛ピリチオンの抗癌作用は亜鉛によって起きることを示しているので、本願における、ソディウムピリチオンも亜鉛ピリチオン同様癌細胞の生存率を低下させるという発見は驚きであった。そこで本発明者は、先行技術によって既に開示されている、亜鉛を介した毒性以外に、亜鉛なしのピリチオンが癌細胞に対して毒性を有する可能性を更に探求した。これを調べるために、金属キレート剤ＥＤＴＡが、亜鉛ピリチオンによる殺癌細胞効果へ及ぼす影響を調べた。
【０１０３】
子宮頚癌ＨｅＬａ細胞、大腸癌ＨＴ２９細胞、脳腫瘍Ｕ８７細胞を９６ウェルディッシュの一ウェルあたり２，０００個ずつ播種し、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１０％含有するＤＭＥＭ培地中、二酸化炭素を５％含有する大気中にて３７℃で一晩培養した。大腸癌ＨＴ２９細胞と脳腫瘍Ｕ８７細胞は、異なる濃度の亜鉛ピリチオンでウシ胎仔血清を含まないｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地中で３７℃、２０時間処理されたのに対し、子宮頚癌ＨｅＬａ細胞はこれとほぼ同等の効果が得られる72時間処理がなされた。実験によっては、亜鉛ピリチオンと共に、異なる濃度のＥＤＴＡが培地中に添加された。これらの実験が、ウシ胎仔血清のない条件で行われたのは、血清中に存在する金属や陽イオンがＥＤＴＡを不活化するという好ましくない事態を避けるためである。重炭酸もｐＨ＝７．４  ＤＭＥＭ培地から除外され、実験は大気中二酸化炭素非存在下において行われた。亜鉛ピリチオンとＥＤＴＡとの併用処理、亜鉛ピリチオン単独処理、或いはＥＤＴＡ単独処理、が施された後、ＭＴＴアセイは実施例２に準じて行われた。
【０１０４】
図６に示したように、癌細胞への亜鉛ピリチオン処理をＥＤＴＡが存在する条件で行ったときの方が、より強く癌細胞の生存率を抑制することが見出された。一例として、脳腫瘍Ｕ８７細胞に５０ｎＭ亜鉛ピリチオンをウシ胎仔血清を含まない培地中で処理したときの細胞生存率は薬剤処理をされていない対照群のＵ８７細胞の生存率の６０±７％であった。５０ｎＭの亜鉛ピリチオンと共に１０μＭのＥＤＴＡを加えて処理したときの細胞生存率は３０±４％まで低下し、２０μＭのＥＤＴＡを加えたときには更に１９±１１％まで低下した。これに対し、当該濃度のＥＤＴＡのみで処理された場合は１０％以下の軽微な影響しか見られなかった。この驚くべき結果は、ピリチオンが亜鉛ピリチオンによる抗癌作用の重要な要素であり、ＥＤＴＡによる亜鉛の除去によって抗癌作用が増強されることを示唆する。ＥＤＴＡ付加による増強作用は、ＥＤＴＡ付加によって亜鉛ピリチオンが抗癌作用に必要とされる濃度を更に下げることを意味し、実用応用へ向けた有用な状況を提供するものである。
【０１０５】
実施例９
亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）による抗癌作用は酸性条件下でピリドキシンによって増強される。
【０１０６】
子宮頚癌ＨｅＬａ細胞を９６ウェル培養ディッシュの一ウェルあたり２,０００個ずつ播種し、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１０％濃度含有するＤＭＥＭ培地中、二酸化炭素を５％含有する大気中にて３７℃で一晩培養した。細胞に低濃度から高濃度までの異なる濃度の亜鉛ピリチオンをｐＨ＝６．９またはｐＨ＝７．４のウシ胎仔血清を含まないＤＭＥＭ培地中で２４時間培養した。ある実験においては、異なる濃度のピリドキシンが亜鉛ピリチオンと共に処理された。重炭酸塩が媒介する細胞膜を介したプロトン移動によるｐＨ変動を最小限にするために、実験は重炭酸塩を含まないｐＨ＝６．９又はｐＨ＝７．４のＤＭＥＭ培地で、大気中の二酸化炭素を含まない条件で行われた。細胞に亜鉛ピリチオンをピリドキシンと共に、或いは亜鉛ピリチオン単独で処理した後、ｐＨ＝７．４培地中３７℃で更に４８時間培養した。ＭＴＴアセイは実施例２に準じて行われた。
【０１０７】
１０μＭと１００μＭのピリドキシン（図９においてＢ６と標識された）をｐＨ＝７．４の非酸性培地中で５０ｎＭ亜鉛ピリチオンと共に処理しても細胞生存率に影響を及ぼさなかったのに対し、ｐＨ＝６．９の酸性培地中で５０ｎＭ亜鉛ピリチオンを１０μＭのピリドキシンと共に処理すると生存率は７２±４％まで低下、１００μＭのピリドキシンと共に処理すると生存率は４０±１２％まで低下した（図９）。ｐＨ＝６．４の酸性培地中で１０μＭ或いは１００μＭのピリドキシンを５０ｎＭ亜鉛ピリチオンと共に加えて処理すると、生存率は更に低下し、それぞれ１．４±０．６％、２．５±０．９％であった（図９）。１０μＭ或いは１００μＭ濃度のピリドキシンのみを酸性培地、或いは非酸性培地に加えても細胞の生存率には影響はなかった（図９）。これらの結果は、１０μＭと１００μＭ濃度のピリドキシンが、亜鉛ピリチオンと酸との組み合わせによって生じる抗癌作用を増強することを示唆する。１ｍＭのピリドキシンもまた、亜鉛ピリチオンと酸との組み合わせによる抗癌作用を増強した。１ｍＭのピリドキシンを５０ｎＭ亜鉛ピリチオンと共に加えてｐＨ＝７．４の非酸性培地中で処理すると、細胞生存率は７１．５±１３％であった。１ｍＭのピリドキシンを５０ｎＭ亜鉛ピリチオンと共に加えてｐＨ＝６．９の酸性培地中で処理すると細胞生存率は５．１±３％であった。１ｍＭの ピリドキシンを５０ｎＭ亜鉛ピリチオンと共に加えてｐＨ＝６. ４の酸性培地中で処理すると、細胞生存率は１．２±０．８％であった。これらの結果は、ピリドキシンとピリチオンと酸性を組み合わせることによって効率的な抗癌作用を現すことを示している。興味深いことに、１ｍＭのピリドキシンを ピリチオン非存在下でｐＨ＝７．４、６．９及び６．４の培地に加えると、細胞生存率はそれぞれ７２．９±８％、２１．６±６％、及び２８．４±３％になった。この結果は１ｍＭの ピリドキシンにはピリチオンと酸との組み合わせによって生じる強力な抗癌作用の他に、１ｍＭのピリチオンそのものにも中程度の酸性に依存する抗癌作用があることを示唆している。
【０１０８】
実施例１０
亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）とソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）による抗癌作用は酸性条件下でアスコルビン酸ナトリウム、又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸によって増強される。
【０１０９】
子宮頚癌ＨｅＬａ細胞を９６ウェルディッシュの一ウェルあたり２,０００個ずつ播種し、血清（ＦＢＳ）を１０％含有するＤＭＥＭ培地中、二酸化炭素５％含有する大気中にて３７℃一晩培養した。細胞に低濃度から高濃度まで異なる濃度の亜鉛ピリチオンをｐＨ＝６．４の血清（ＦＢＳ）を含有しないＤＭＥＭ、ｐＨ＝６．９の血清（ＦＢＳ）を含有しないＤＭＥＭ、又はｐＨ＝７．４の血清（ＦＢＳ）を含有しないＤＭＥＭ培地中で２４時間処理した。実験によっては、異なる濃度のアスコルビン酸ナトリウム又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸が亜鉛ピリチオンと共に培地中に加えられた。重炭酸塩が媒介する細胞膜を介したプロトン移動によるｐＨ変動を最小限にするために、実験は重炭酸塩を含まない培地と大気中の二酸化炭素を含まない条件で行われた。細胞に亜鉛ピリチオンをアスコルビン酸ナトリウム又は３−ｏ−エチルアスコルビン酸と共に、或いは亜鉛ピリチオンのみを処理した後、細胞はｐＨ＝７．４培地中３７℃で更に４８時間培養された。ＭＴＴアセイは実施例２に準じて行われた。
【０１１０】
２ｍＭ  ３−ｏ−エチルアスコルビン酸（ＡｓｃＥ）をｐＨが６．９の培地に、５ｎＭ及び１０ｎＭの亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）と共に加えると、細胞生存率は薬剤で処理されていない対照群に比べてそれぞれ９１±１１％及び４３±１１％に減少することが見出された。２ｍＭ  ３−ｏ−エチルアスコルビン酸（ＡｓｃＥ）をｐＨ＝６．４の培地中に、５ｎＭ及び１０ｎＭの亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）と共に加えると、細胞生存率は薬剤で処理されていない対照群に比べてそれぞれ２２±１０％及び１１±１０％に減少することが見出された。これに対して、１０ｎＭ以下の濃度の亜鉛ピリチオンのみを加えても細胞生存率に影響は見られなかった（図１０Ａ）。また、２ｍＭ  ３−ｏ−エチルアスコルビン酸と１０ｎＭ以下の濃度の亜鉛ピリチオンとを共にｐＨ７．４の非酸性培地に加えても、細胞生存率は減少しなかった。これらの結果から３−ｏ−エチルアスコルビン酸は亜鉛ピリチオンによる抗癌作用を酸依存的に増強することが示唆される。
【０１１１】
同様に、２ｍＭの３−ｏ−エチルアスコルビン酸（ＡｓｃＥ）をｐＨ６．９の酸性培地中に１０ｎＭ及び２０ｎＭのソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）と共に加えると、細胞生存率は薬剤で処理されていない対照群に比べてそれぞれ９６±５及び４８±７％に減少する。２ｍＭの３−ｏ−エチルアスコルビン酸（ＡｓｃＥ）をｐＨ６．４の酸性培地中に１０ｎＭ及び２０ｎＭのソディウムピリチオン（Ｐｙｎ）と共に加えると、細胞生存率は薬剤で処理されていない対照群に比べてそれぞれ１７±５％及び７±３％と更に顕著な減少を見た。これに対して、２０ｎＭ或いはそれ以下の濃度のソディウムピリチオンのみを酸性培地に加えても、或いは非酸性培地中で２ｍＭ  ３−ｏ−エチルアスコルビン酸と２０ｎＭ或いはそれ以下の濃度のソディウムピリチオンを共に加えても、細胞生存率減少は見られなかった。
【０１１２】
アスコルビン酸ナトリウム（ＡｓｃＮａ）と酸の組み合わせによっても亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）による抗癌作用の亢進を見た。一例として、１ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムをｐＨ＝６．９の酸性培地中に１０ｎＭの亜鉛ピリチオンと共に加えると、細胞生存率は非処理対照群に比べて８５±５％と中程度の低下を見たのに対し、１ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムと共に１０ｎＭの亜鉛ピリチオンをｐＨ＝６．４の酸性培地中に添加すると細胞生存率は非処理対照群に比べて４６±５％と更に顕著に低下することが見出された（図１０Ａ）。１ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムと２０ｎＭの亜鉛ピリチオンを共にｐＨが６．９及び６．４の酸性培地に加えたときにも同様に、しかし更に顕著な効果が見られた。これに対して、１０ｎＭ或いはそれ以下の濃度の亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）のみを酸性培地に加えても薬剤非処理対照群と比べて細胞生存率の有意な変化は見られず、亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）と１ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（ＡｓｃＮａ）を共にｐＨ＝７．４の非酸性培地に加えても、薬剤非処理対照群と比べて細胞生存率の有意な変化は見られなかった（図１０Ａ)。これらの結果からアスコルビン酸ナトリウムは亜鉛ピリチオンによる抗癌作用を酸依存的に増強することを示唆する。
【０１１３】
三次元培養された脳腫瘍細胞に対するピリチオンの抗癌作用が３−ｏ−エチルアスコルビン酸によって増強されることが、スフェロイド培養法によって測定された。
【０１１４】
６０℃で加熱溶解した１％のアガロース溶液と、等量の培地（ｐＨ７．４  ＤＭＥＭ培地にウシ胎仔血清１０％添加したもの）を混合後、この混合物が９６ウェル培養プレートの一ウェルに対して５０μｌずつ分注された。プレートは室温で３０分アガロースが固形化するまで冷却し、アガロース層の上に１,０００個の細胞を含む５０μｌの培養液が上層され、１，５００ｇで５分間遠心分離にかけられた。３７℃で２４時間培養された後、スフェロイドは異なる濃度の亜鉛ピリチオン、３−ｏ−エチルアスコルビン酸、又は亜鉛ピリチオンと３−ｏ−エチルアスコルビン酸を含む条件、或いはいずれの薬剤も含まない条件、で更に７２時間培養された。その後、スフェロイドは別の９６ウェルに移された。プレートは１，５００ｇで５分間遠心分離にかけられ、ウェルの底にある細胞を攪拌することなく、薬剤溶液はＰＢＳに入れ替えられた。プレートは再度１，５００ｇで５分間遠心分離にかけられ、ウェルの底にある細胞を攪拌することなく、ＰＢＳが、０．１Ｍ  ｐＨ＝５．０ 酢酸ナトリウムと０．１重量%Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液に５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸 （＃３４０４５，サーモフィッシャーサイエンス株式会社）が実験直前に添加されたもの、に入れ替えられ、３７℃２時間培養された。２時間後、反応を停止するために１０モル濃度のＮａＯＨ溶液が滴下され、４５０ ｎｍの吸光度が測定された。
【０１１５】
５００ｎＭ亜鉛ピリチオン（Ｐｙｚ）のみで処理されたスフェロイドの生存率は、非処理スフェロイドに比べて８８±８％まで低下した（図１０Ｂ）。これに対し、亜鉛ピリチオン と共に、５ｍＭ又は１０ｍＭの３−ｏ−エチルアスコルビン酸（ＡｓｃＥ）が加えられると、細胞生存率は それぞれ７６±４％、６３±７％まで更に低下した。これらの結果は３−ｏ−エチルアスコルビン酸が三次元培養において細胞増殖を抑制する効果を促進することを示唆している。更に、１０ｍＭの３−ｏ−エチルアスコルビン酸が亜鉛ピリチオンと共に加えられたとき、三次元スフェロイド構造の脆弱化が起こり、スフェロイドの辺縁部から剥離した細胞群が散見された（図１０Ｂの右側パネルを参照）。
【０１１６】
実施例１１
亜鉛ピリチオン、３−ｏ−エチルアスコルビン酸及びアスコルビルテトラアイソパルミチン酸を含有した処方の局所投与で、マウスの皮下に移植されたヒト皮膚癌細胞の増殖が抑制された。
【０１１７】
３−ｏ−エチルアスコルビン酸及びアスコルビルテトラアイソパルミチン酸は皮膚から速やかに吸収されてアスコルビン酸に変換されるアスコルビン酸の誘導体である。亜鉛ピリチオン、3-o-エチルアスコルビン酸、アスコルビルテトラアイソパルミチン酸、或いはそれら複数の組み合わせを含有する薬剤処方の局所投与による抗癌効果が皮膚癌のマウス移植モデルで調べられた。
【０１１８】
生後６週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６無胸腺マウス皮下に２．５×１０６個のヒト皮膚癌Ａ２０５８細胞が移植された。移植２−３日後腫瘍の大きさが約３ｍｍ３になった所で、マウスは無作為的に５匹ずつ４つのグループに分けられ、クリーム形態の薬剤処方が一日一回、腫瘍直上の皮膚の部位に塗布された。第一のグループ（Ｐｙｚ）は１％の亜鉛ピリチオンのみを含有するもの、第二のグループ（Ａｓｃ）は３％  ３−ｏ−エチルアスコルビン酸と ２％アスコルビルテトラアイソパルミテートを含有するもの、第三のグループ（Ｐｙｚ＋Ａｓｃ）は１％亜鉛ピリチオン及び、３％  ３−ｏ−エチルアスコルビン酸と２％アスコルビルテトラアイソパルミテートを含有するもの、そして第四のグループ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）はキャリアのみを含有するもの、が局所投与された。処方構成成分は以下の通りである。
【０１１９】
グループ１に使われた処方成分
ａ）水層
グリセロール                    ：５％
ポリソルベート２０              ：１％
クエン酸１モル濃度溶液          ：０．７％
クエン酸ナトリウム１モル濃度溶液：１．３％
亜鉛ピリチオン                  ：１％
蒸留水                          ：全容量を１００％にするために必要な分量
ｂ）油層
べへニルアルコール              ：３％
セタノール                      ：３％
ステアリン酸グリセリル          ：１％
ステアリン酸                    ：１％
ソルビタンステアレート          ：１％
パルミチン酸セチル              ：１％
ジメチコン：1%
ｃ）冷却層
シクロメチコン                  ：５％
ｄ）ｐＨをＨＣｌ又はＮａＯＨにより５．５に調整
水層成分は適当な容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は別の容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は水層成分に加えられ、エマルジョン化するまで攪拌された。エマルジョンは５０−５５℃まで冷却後、完全に均一化するまで攪拌が続けられた。
【０１２０】
グループ２に使われた処方成分
ａ）水層
グリセロール                    ：５％
ポリソルベート２０              ：１％
クエン酸１モル濃度溶液          ：０．７％
クエン酸ナトリウム１モル濃度溶液：１．３％
蒸留水                          ：全容量を１００％にするために必要な分量
ｂ）油層
べへニルアルコール              ：３％
セタノール                      ：３％
ステアリン酸グリセリル          ：１％
ステアリン酸                    ：１％
ソルビタンステアレート          ：１％
パルミチン酸セチル              ：１％
ジメチコン：1%
ｃ）冷却層
シクロメチコン                  ：５％
３−ｏ−エチルアスコルビン酸    ：３％
アスコルビルテトラアイソパルミテート：２％
ｄ）ｐＨをＨＣｌ又はＮａＯＨにより５．５に調整
水層成分は適当な容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は別の容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は水層成分に加えられ、エマルジョン化するまで攪拌された。エマルジョンは５０−５５℃まで冷却後、完全に均一化するまで攪拌が続けられた。
【０１２１】
グループ３に使われた処方成分
ａ）水層
グリセロール                    ：５％
ポリソルベート２０              ：１％
亜鉛ピリチオン                  ：１％
クエン酸１モル濃度溶液          ：０．７％
クエン酸ナトリウム１モル濃度溶液：１．３％
蒸留水                          ：全容量を１００％にするために必要な分量
ｂ）油層
べへニルアルコール              ：３％
セタノール                      ：３％
ステアリン酸グリセリル          ：１％
ステアリン酸                    ：１％
ソルビタンステアレート          ：１％
パルミチン酸セチル              ：１％
ジメチコン：1%
ｃ）冷却層
シクロメチコン                  ：５％
３−ｏ−エチルアスコルビン酸    ：３％
アスコルビルテトラアイソパルミテート：２％
ｄ）ｐＨをＨＣｌ又はＮａＯＨにより５．５に調整
水層成分は適当な容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は別の容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は水層成分に加えられ、エマルジョン化するまで攪拌された。エマルジョンは５０−５５℃まで冷却後、完全に均一化するまで攪拌が続けられた。
【０１２２】
グループ４に使われた処方成分
ａ）水層
グリセロール                    ：５％
ポリソルベート２０              ：１％
クエン酸１モル濃度溶液          ：０．７％
クエン酸ナトリウム１モル濃度溶液：１．３％
蒸留水                          ：全容量を１００％にするために必要な分量
ｂ）油層
べへニルアルコール              ：３％
セタノール                      ：３％
ステアリン酸グリセリル          ：１％
ステアリン酸                    ：１％
ソルビタンステアレート          ：１％
パルミチン酸セチル              ：１％
ジメチコン：1%
ｃ）冷却層
シクロメチコン                  ：５％
ｄ）ｐＨをＨＣｌ又はＮａＯＨにより５．５に調整
水層成分は適当な容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は別の容器中にて完全に溶解するまで７５℃で熱しながら攪拌された。油層成分は水層成分に加えられ、エマルジョン化するまで攪拌された。エマルジョンは５０−５５℃まで冷却後、完全に均一化するまで攪拌が続けられた。
【０１２３】
腫瘍容積はａ：腫瘍長径、ｂ：腫瘍短径に基づいてａｂ２／２の計算式によって算出され、それぞれの治療群の相対的腫瘍容積が計算されグラフ上に示された（図１１Ａ）。グラフの横軸は経皮投与後の日数を、縦軸は相対的腫瘍容積をそれぞれ示す。実験のエンドポイントにおいてグループ３マウスの腫瘍サイズの平均値は（図１１Ａにおける”Ｐｙｚ＋Ａｓｃ”）他のグループのマウスの腫瘍サイズの平均値よりも小さかった。この結果からピリチオンとアスコルビン酸誘導体の双方を含む処方は腫瘍増殖を抑えるのに有効な方法であるが、ピリチオン単剤、或いはアスコルビン酸誘導体のみでは有効ではないことが示された。
【０１２４】
実験のエンドポイントにおいて、薬剤処方と接触したマウス皮膚領域、肝臓、腎臓の組織サンプルが通常用いられる方法によって作成された。切片はヘマトキシリン・エオジン染色が施された。組織サンプルの顕微鏡写真は図１１Ｂに示された。組織損傷、異常な細胞死、或いはその他副作用を示唆する所見は、グループ３（ＰｙＺ＋Ａｓｃ；ピリチオン、３−ｏ−エチルアスコルビン酸、アスコルビルテトラアイソパルミテートを含有するクリーム処方で処理されたマウス）、及びグループ４（Ｖｅｈｉｃｌｅ；ピリチオン、３−ｏ−エチルアスコルビン酸、アスコルビルテトラアイソパルミテートいずれも含有しないクリーム処方で処理されたマウス）においていずれも認められなかった。
【０１２５】
動物を処理する日に採血検査が行われ、その結果が表にまとめられた。平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）低下、平均赤血球容積（ＭＣＶ）低下、血小板（ＰＬＴ）増加が全ての処方グループで、恐らくは移植された癌細胞のために認められたが、それ以外のすべての検査項目においては異常が認められなかった。アスコルビン酸のみを処方されたグループ（”Ａｓｃ”）で若干の顆粒球％増加が見られたものの顆粒球数は正常値であるため顆粒球％増加は有意とはみなされない。顆粒球％増加以外にはある処方グループに特異的な血液異常は認められなかった。Ｒｅｆ：正常値；  ＧＲ：顆粒球数（１Ｌあたりの数）；  ＧＲ％：顆粒球（％）；  ＨＣＴ：ヘマトクリット（％）；  ＨＧＢ：ヘモグロビン（ｇ／Ｌ）；  ＬＹ：リンパ球数；  ＬＹ％：リンパ球（％）；  ＭＣＨ：平均赤血球容積 (ｐｇ)；  ＭＣＨＣ：平均赤血球容積濃度（ｇ/Ｌ）；  ＭＯ：単球数（１Ｌあたりの数）；  ＭＯ％：単球 （％）；  ＭＰＶ：平均血小板容積（ｆＬ）；  ＰＣＴ：プロカルシトニン（％）；  ＰＤＷ：血小板分布幅(ｆＬ)；  ＰＬＴ：血小板(ｇ/Ｌ)；  ＲＢＣ：赤血球数（１Ｌあたりの数）；  ＲＤＷ：赤血球分布幅（％）；  ＷＢＣ：白血球数（１Ｌあたりの数）
【０１２６】
【表１】
2019520310.tif 000003
【０１２７】
引用文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月10日(2019.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリチオン及びピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上の有効成分を含有し、
緩衝剤の存在下でｐＨが６．９以下である、悪性腫瘍の予防及び／又は治療用組成物。
【請求項２】
ピリチオン及びピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上の有効成分を含有し、
緩衝剤の存在下でｐＨが６．９以下である、前癌病変に対する予防組成物。
【請求項３】
前記有効成分は、ピリチオン及びピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上であり、
ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ塩、ビタミンＢ６類化合物、リン酸付加型ビタミンＢ６類、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、及びアスコルビン酸化合物から選択されるいずれか１種以上をさらに含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
ｐＨが６．９以下である、悪性腫瘍の予防及び／又は治療のための薬剤の製造における、ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の使用。
【請求項５】
ｐＨが６．９以下である、前癌病変に対する予防のための薬剤の製造における、ピリチオン、ピリチオン塩、ビタミンＢ６類、及びリン酸付加型ビタミンＢ６類から選択されるいずれか１種以上の使用。
【請求項６】
前記ピリチオン及び前記ピリチオン塩から選択されるいずれか１種以上と、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ塩、ビタミンＢ６類化合物、リン酸付加型ビタミンＢ６類、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩及びアスコルビン酸化合物から選択されるいずれか１種以上との併用である、請求項４又は５に記載の使用。
【国際調査報告】
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