(57)【要約】一態様において、フローサイトメトリーを行うためのシステムであって、サンプルを照射するためのレーザ放射線を生成するためのレーザと、照射に応答してサンプルから放射される放射線の少なくとも一部を検出し、検出された放射線に対応する時間信号を生成する少なくとも１つの検出器と、時間信号を受信し、サンプルの画像を再構成するためにフォワードモデルなどのモデルに基づいて時間信号の統計分析を実行するための分析モジュールとを含むシステムが開示されている。
2019521316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーを行うためのシステムであって、
サンプルを照射するためのレーザ放射線を生成するためのレーザと、
照射に応答して前記サンプルから放射される放射線の少なくとも一部を検出し、時間信号を生成するように構成された少なくとも１つの検出器と、
前記時間信号を受信し、前記サンプルの画像を再構成するためにフォワードモデルに基づいて前記時間信号の統計分析を実行するために、前記検出器に接続された分析モジュールと
を備えるシステム。
【請求項２】
前記レーザ放射線は、無線周波数によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を含み、前記時間信号は、前記少なくとも２つの光周波数の差に対応する少なくとも１つのビート周波数を示す時間−周波数波形である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記時間信号は、時間蛍光信号である、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記サンプルから放射される前記放射線は蛍光放射線であり、前記時間信号は、前記サンプルの蛍光像を形成するように前記分析モジュールが動作する蛍光信号である、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記サンプルから放射される前記放射線は、散乱されたレーザ放射線であり、前記分析モジュールは、前記時間信号に対して動作して前記サンプルの暗視野像を生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記サンプルから放射される前記放射線は、前記サンプルを透過する照射レーザ放射線の一部であり、前記分析モジュールは、前記時間信号に対して動作して前記サンプルの明視野像を形成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記統計分析は、前記フォワードモデルの１つ以上のパラメータの最尤推定値を生成することに基づいている、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記統計分析は、最小２乗最適化、勾配降下最適化、粒子群最適化、遺伝的アルゴリズム最適化、パラメトリック推定及びベイズスペクトル推定のいずれかを使用する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記分析モジュールは、前記サンプルの初期画像を形成し、前記統計分析のためのシード画像として前記初期画像を使用して、改善された信号対雑音比または前記シード画像に対する改善された分解能を有する再構成画像を生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記分析モジュールは、前記初期画像を形成するためにフーリエ変換及びロックイン検出のいずれかを用いる、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記分析モジュールは、前記フォワードモデルを使用して、複数の時間セグメントとして検出された時間信号のモデルを生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記統計分析は、モデル化された時間セグメントとそれぞれの測定された時間セグメントとの間の差に対応する２乗残差和を最小化することによって、モデル化された時間セグメントに関連するパラメータの値を得るために最小２乗回帰分析を用いる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記時間セグメントの各々が、１つの正弦の項及び１つの余弦の項を含むようにモデル化される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記分析モジュールは、最小２乗分析を使用して、照射されるサンプルの画像のモデルに関連する１つ以上のパラメータの１つ以上の推定値を、検出された時間信号と前記フォワードモデルから推定された時間信号との間の差に対応する２乗残差和を最小化することによって取得する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記フォワードモデルは、非線形モデルを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記統計分析は、勾配降下最適化法を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記勾配降下最適化法は、前記フォワードモデルに基づく予測時間信号と測定された時間信号との間の距離を示す誤差勾配を計算し、先行の画像が前記誤差勾配をステップダウンすることによって、前記サンプルの更新される画像を反復計算する、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記勾配降下最適化法は、測定された時間信号に基づいて計算された初期推定画像を用いて反復計算を開始する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記分析モジュールは、フーリエ変換及びロックイン検出のいずれかを、測定された時間信号に適用することによって、初期画像を計算する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記統計分析は、前記サンプルの画像を再構成するために、測定された時間信号に関する先験的な情報を、ベイズスペクトル推定と組み合わせて使用する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前記先験的な情報は、前記時間信号が未知の周波数及び振幅の複数の正弦曲線からなることを示す、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ベイズスペクトル推定は、前記正弦曲線の未知の周波数及び振幅の推定値を提供する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記統計分析は、粒子群最適化法を使用する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記統計分析は、遺伝的アルゴリズムを使用する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記無線周波数は、約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲にある、請求項２に記載のシステム。
【請求項２６】
前記サンプルは、細胞、微小胞、細胞断片、リポソーム、ビーズ、及び小生物のいずれかを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項２７】
前記レーザ放射線は、約３００ＴＨｚ〜約１０００ＴＨｚの範囲の周波数を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項２８】
フローサイトメトリーを実施するための方法であって、
サンプルをレーザ放射線で照射すること、
照射に応答して前記サンプルから放射される放射線の少なくとも一部を検出し、検出された放射線に対応する時間信号を生成するために検出器を配備すること、及び
前記サンプルの画像を再構成するように、フォワードモデルに基づいて前記時間信号の統計分析を実行するためにコンピュータプロセッサを利用すること
を含む、方法。
【請求項２９】
前記画像は、蛍光像、暗視野像、及び明視野像のいずれかである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記レーザ放射線は、前記サンプルからの蛍光放射線を引き出すために、無線周波数によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を含み、前記時間信号は、無線周波数が分離した光周波数に関連する１つ以上のビート周波数を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記時間信号を処理して蛍光像を生成し、前記蛍光像を前記統計分析を行うためのシード画像として使用することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記統計分析は、検出された時間信号と前記フォワードモデルから推測されたそれぞれの時間信号との間の差に対応する２乗残差和を最小化することによって、再構成画像を得るために最小２乗法を使用する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記時間信号は、蛍光信号である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記時間信号は、散乱信号である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
検出された時間信号を、それぞれが１つの正弦の項及び１つの余弦の項を有する複数の時間セグメントとしてモデル化することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記統計分析は、モデル化された時間セグメントとそれぞれの測定された時間セグメントとの差に対応する２乗残差和を最小化することによって、前記時間信号のモデルのパラメータの値を得るために最小２乗回帰分析を用いる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記フォワードモデルは、非線形モデルを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記統計分析は、勾配降下最適化法を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記勾配降下最適化法は、前記フォワードモデルに基づく予測時間信号と測定された時間信号との間の距離を示す誤差勾配を計算し、先行の画像が前記誤差勾配をステップダウンすることによって、更新される画像を反復計算する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記勾配降下最適化法は、測定された時間信号に基づいて計算された初期推定画像を用いて反復計算を開始する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を測定された時間信号に適用することによって前記初期推定画像を計算するために前記コンピュータプロセッサを使用することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記統計分析は、前記サンプルの画像を再構成するために、測定された時間信号に関する先験的な情報を、ベイズスペクトル推定と組み合わせて使用する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記先験的な情報は、前記時間信号が未知の周波数及び振幅の複数の正弦曲線からなることを示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ベイズスペクトル推定は、前記正弦曲線の未知の周波数及び振幅の推定値を提供する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記統計分析は、粒子群最適化法を使用する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
前記統計分析は、遺伝的アルゴリズムを使用する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記無線周波数は、約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプルは、細胞、微小胞、細胞断片、リポソーム、ビーズ、及び小生物のいずれかを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
前記レーザ放射線は、約３００ＴＨｚ〜約１０００ＴＨｚの範囲の周波数を有する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してサンプルの蛍光分析のための装置及び方法に関し、より詳細には、蛍光に基づくフローサイトメトリーのための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光イメージングは、例えば生物学的検体の分子組成に関する情報を得る際に、様々な生物医学的用途を有する。生物医学的フローサイトメトリーでは、外因性及び／または内因性の細胞のフルオロフォアによって放出された蛍光放射線を収集し、分析して、細胞の化学的及び／または物理的特性に関する情報を得る。
【０００３】
しかし、従来の蛍光に基づくフローサイトメトリーでは、高速で流れる細胞、またはサブミリ秒の生化学的ダイナミクスのような他の高速の現象がぼやけてない画像を取得することは困難であり得る。
【０００４】
特に、キロヘルツ範囲の画像化フレームレートにてサンプルを短時間曝露して結合された多くのフルオロフォアの弱い発光により、ぼやけていない画像を取得することが困難になっている。さらに、多くの従来のシステムは、１つの画像化モードでしか動作せず、したがって、サンプルの分析に十分な柔軟性を付与することができていない。
【０００５】
したがって、蛍光分析をするための改良された方法及びシステムの必要性、特に蛍光に基づくフローサイトメトリーを実施するための改良された方法及びシステムの必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、フローサイトメトリーを行うためのシステムであって、サンプル（例えば、細胞）を照射するためのレーザ放射線を生成するためのレーザと、照射に応答してサンプルから放射される放射線の少なくとも一部を検出し、検出された放射線に対応する時間信号を生成するように構成された少なくとも１つの検出器と、時間信号を受信し、サンプルの画像を再構成するために、またフォワードモデルなどのモデルに基づいて時間信号の統計分析を実行するために検出器に接続された分析モジュールとを含むシステムが開示されている。いくつかの実施形態ではフォワードモデルは線形モデルであり、その一方で他の実施形態ではフォワードモデルは非線形モデルである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、サンプルから放射される放射線は、蛍光放射線であり得る。このとき、その時時間信号は、サンプルの蛍光像を形成するように分析モジュールが動作する蛍光信号である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、サンプルから放射される放射線は、サンプルにより散乱されたレーザ放射線の一部の場合があり、分析モジュールは、散乱されたレーザ放射線に対応する時間信号に対して動作でき、サンプルの暗視野像を生成することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、サンプルから放射される放射線は、サンプルにより透過される照射レーザ放射線の一部の場合があり、分析モジュールは、透過されるレーザ放射線に対応する時間信号に対して動作でき、サンプルの明視野像を生成することができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、統計分析は、モデルの１つ以上のパラメータの最尤推定値を生成することに基づいている。例として、統計分析は、検出された時間信号と、フォワードモデルから推測されたそれぞれの時間信号との間の差に対応する２乗残差和を最小にすることによって、サンプルの画像を再構成する最小２乗法を使用することができる。
【００１１】
本発明を実施する際に使用するために適した統計分析のいくつかの例には、最小自乗最適化、勾配降下最適化、粒子群最適化、遺伝的アルゴリズム最適化、及びベイズスペクトル推定が含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
いくつかの実施形態では、分析モジュールは、サンプルの初期画像を形成し、統計分析のための初期（シード）画像としてその画像を使用する。例として、分析モジュールは、初期画像を形成するためフーリエ変換及びロックイン検出のいずれかを用いることができる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、分析モジュールは、検出された時間信号のモデルを複数の時間セグメントとして使用する。例として、各時間セグメントは、正弦及び余弦の項を有するものとしてモデル化することができる。そのような実施形態では、統計分析は、モデル化された時間信号のパラメータの値、例えば、正弦及び余弦の項の振幅と位相を、モデルと、対応する測定された時間セグメントとの間の差に対応する２乗残差和を最小化することによって得るために、最小２乗回帰法を使用することができる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、統計分析は勾配降下最適化法を使用する。このような実施形態では、勾配降下最適化法は、フォワードモデルに基づく予測時間信号と測定された時間信号との間の距離を示す誤差勾配を計算し、サンプルの画像の先行の推定が誤差勾配をステップダウンして改善された画像を得る。このプロセスは、最良適合画像が得られるまで反復的に繰り返すことができる。勾配降下最適化法は、測定された時間信号に基づいて計算された画像の初期推定値を用いて反復プロセスを開始することができる。例として、分析モジュールは、フーリエ変換、例えばＦＦＴを、測定された時間信号に適用することによって初期画像の推定値を計算することができる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、分析モジュールは、サンプルの画像を再構成するために、測定された時間信号に関する先験的な情報をベイズスペクトル推定と組み合わせて使用する。例として、いくつかの実施形態では、このような先験的な情報は、時間信号が未知の周波数、振幅及び位相の複数の正弦曲線からなることを示すことができる。さらに、場合によっては、時間信号は、雑音成分、例えばポアソン分布を有する雑音成分を含むことが知られていることがある。そのような場合、ベイズスペクトル推定は、モデル化された雑音に関連するパラメータと同様に、正弦曲線の未知の周波数、振幅及び位相の推定値を提供することができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、レーザ放射線は、無線周波数によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を含む。例として、無線周波数シフトは、約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲であり得る。いくつかのそのような実施形態では、レーザ放射線は、各々が別の放射線に対して無線周波数シフトを有する複数の角度で隔てられたレーザビームの形態であってもよい。いくつかのこのような実施形態では、時間信号（例えば、蛍光信号）は、少なくとも２つの光周波数の差に対応する少なくとも１つのビート周波数を示す時間−周波数波形であってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態において、試験中のサンプルは、細胞（例えば、哺乳類の細胞）、微小胞、細胞断片、リポソーム、ビーズ、及び小生物のいずれかを含むことができる。
【００１８】
以下により詳細に説明するように、分析モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアで実施することができる。いくつかの実施形態では、そのような分析モジュールは、他の構成要素の中でも、１つ以上の通信バスを介して１つ以上のメモリモジュールと通信することができるプロセッサを含むことができる。プロセッサは、フローサイトメーターでの呼掛けの下でサンプルの画像を再構成するための本教示による統計分析のみならずフォワードモデルを実施するプログラムを実行することができる。
【００１９】
関連する態様では、フローサイトメトリーを実施する方法が開示されており、この方法は、サンプル（例えば、細胞）をレーザ放射線で照射すること、照射に応答してサンプルから放射される放射線の少なくとも一部を検出し、検出された放射線に対応する時間信号を生成するための検出器を配備すること、及びサンプルの画像を再構成するように、フォワードモデルなどのモデルに基づいて時間信号の統計分析を実行するためにコンピュータプロセッサを利用することを含む。例として、再構成された画像は、蛍光、暗視野、及び明視野の像のいずれかとすることができる。いくつかの実施形態では、レーザ放射線は、サンプルから蛍光放射線を引き出すために選択される、無線周波数によって互いにシフトされた少なくとも２つの光周波数を含み得る。そのような実施形態では、時間信号は、無線周波数シフトされた光周波数に関連する１つ以上のビート周波数を含むことができる。このような時間信号は、サンプルの改良された画像を再構成するために統計分析を実行することができるシード蛍光像を生成するために処理できる。
【００２０】
上記方法のいくつかの実施形態では、統計分析は、検出された時間信号と、フォワードモデルから推定されたそれぞれの時間信号との間の差に対応する２乗残差和を最小化することによってサンプルの画像を再構成するために最小２乗法を使用する。時間信号は、例えば、蛍光信号、散乱信号、または透過信号のいずれかであり得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、時間信号は、複数の時間セグメントとしてモデル化することができる。いくつかのこのような実施形態では、各時間セグメントは、１つの正弦及び１つの余弦の項を有するものとしてモデル化することができる。このような実施形態では、統計分析はモデル化された時間セグメントとそれぞれの測定された時間セグメントとの間の差に対応する２乗残差和を最小化することによって、モデル化された時間信号のパラメータの値を得るために最小２乗回帰分析を用いることができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、統計分析は、画像を再構成するために勾配降下最適化法を使用している。勾配降下最適化法は、フォワードモデルに基づいて計算された予測時間信号と測定された時間信号との間の距離を示す誤差勾配を計算し、先行の画像が誤差勾配をステップダウンすることによって、更新される画像を反復計算することができる。反復プロセスは、例えば、測定された時間信号へのフーリエ変換の適用を介して、測定された時間信号に基づいて計算されたサンプルの初期推定画像から開始することができる。
【００２３】
上記方法のいくつかの実施形態では、統計分析は、サンプルの画像を再構成するために、ベイズスペクトル推定と組み合わせて、測定された時間信号に関する先験的な情報を使用することができる。例として、いくつかの実施形態では、先験的な情報は、時間信号が、未知の周波数、振幅及び位相の複数の正弦曲線からなることを示すことができる。ベイズスペクトル推定は、周波数、振幅及び位相の推定値を提供することができる。さらに、場合によっては、先験的な情報は、時間信号がポアソンの周波数分布を有する雑音成分を含むことができることを示すことができる。ベイズ推定は、雑音成分のパラメータを判定することができる。
【００２４】
上記方法の他の実施形態では、統計分析は、粒子群または遺伝的最適化法のいずれかを使用することができる。
【００２５】
上記方法は、細胞（例えば、哺乳類の細胞）、微小胞、細胞断片、リポソーム、ビーズ、及び小生物を含有するサンプルなど、様々な異なるサンプルの画像を得るために、用いることができる。
【００２６】
本発明の様々な態様は、以下で簡単に説明する関連性がある図面と関連させて、以下の詳細な説明を参照することによって、さらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の実施形態によるシステムを概略的に示す。
【図２】Ａは、ビームの伝播方向に垂直な平面のガウスビームの概略的な例示的なプロファイルである。Ｂは、トップハットビーム整形器によりＡに示されたガウスビームを通過させ、ビーム整形器の出力ビームを集束させることによって得られる、概略的なトップハットビームプロファイルである。
【図３】例示的なトップハットビーム整形器の構成要素を概略的に示す。
【図４】複数のＲＦコームビームの断面のビームプロファイルを概略的に示す。
【図５】図４に示すＲＦコームビームと、トップハットビームプロファイルを有するＬＯビームとの重ね合わせを概略的に示す。
【図６】分析中のサンプルを照射する、図５に示された複合ビームを概略的に示す。
【図７】仮想フルオロフォアの例示的なエネルギー準位を概略的に示す。
【図８】図７の仮想フルオロフォアに対応する吸収曲線を概略的に示す。
【図９Ａ】本教示の実施形態による検出システムを概略的に示しており、蛍光放射線を透過させるための光ファイバを含んでいる。
【図９Ｂ】蛍光放射線が空き領域を伝播して複数の光検出器に到達する、本教示の実施形態による別の検出システムを概略的に示す。
【図９Ｃ】本教示のいくつかの実施形態で使用するための明視野及び暗視野像生成アームを概略的に示す。
【図９Ｄ】明視野像を生成するための検出アームと、サンプルから散乱された励起放射線の検出能力、ならびにサンプルによって放射された蛍光放射線を統合する検出アームとを含む、本教示のいくつかの実施形態で使用する検出システムを概略的に示す。
【図１０】本発明によるシステムの実施形態における光検出器によって生成された蛍光信号が、増幅器によって増幅でき、増幅された信号が分析モジュールによって分析されて分析下のサンプルの蛍光像を構築できることを概略的に示す。
【図１１Ａ】複数のＲＦコームビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームからなる複合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号の分析のための、本発明の方法による様々なステップを示す。
【図１１Ｂ】複数のＲＦコームビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームからなる複合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号の分析のための、本発明の方法による様々なステップを示す。
【図１２】本発明の実施形態による分析モジュールの例示的なハードウェア実装の選択された構成要素を概略的に示す。
【図１３Ａ】複数のＲＦコームビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームからなる複合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号の分析のための、本発明の別の方法における様々なステップを示す。
【図１３Ｂ】複数のＲＦコームビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームからなる複合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号の分析のための、本発明の別の方法における様々なステップを示す。
【図１４Ａ】複数のＲＦコームビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームからなる複合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号の分析のための、本発明のさらに別の方法における様々なステップを示す。
【図１４Ｂ】複数のＲＦコームビーム及びトップハットプロファイルのＬＯビームからなる複合ビームでサンプルを照射することによって得られる蛍光信号の分析のための、本発明のさらに別の方法における様々なステップを示す。
【図１５Ａ】単一励起周波数でのトップハットプロファイルのビームによるサンプルの照射を概略的に示す。
【図１５Ｂ】蛍光寿命測定及び蛍光寿命イメージングを可能にする、本教示の実施形態によるシステムの概略図である。
【図１６】Ａは、本教示の実施形態によるサイトメトリーシステムを用いて得られた８つの別個のレベルの蛍光色素で染色されたポリスチレンビーズの暗視野強度対明視野強度の散布図である。Ｂは、複数のポリスチレンビーズによって放出された赤色蛍光（ＰＥ）対緑色蛍光（ＦＩＴＣ）の散布図を示しており、データは、ゲートとしてＡに示されるプロットの矩形断面を用いることによって得られたものである。Ｃ及びＤは、Ｂに示すデータに対応するヒストグラムである。
【図１７Ａ】本教示によるサイトメトリーシステムを用いて得られた抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色された固定末梢血白血球を含有するサンプルの明視野、暗視野及び蛍光像を示し、サンプルはまた、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色した生存ＨｅＬａ細胞の画分を含んでいる。
【図１７Ｂ】集団Ａが白血球を表し、集団Ｂがサンプル中のＨｅＬａ細胞を表す散布図であり、サンプルには図１７Ａが画像をもたらしている。
【図１８Ａ】本教示の実施形態によるサイトメトリーシステムを用いて得られた抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した固定末梢血白血球を含有するサンプルの明視野、暗視野及び蛍光像を示し、それにおいてサンプルは抗ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した固定ＭＣＦ−７細胞の小画分が添加されている。
【図１８Ｂ】集団Ａが白血球を表し、集団Ｂがサンプル中のＭＣＦ−７細胞を表す散布図であり、サンプルには図１８Ａが画像をもたらしている。
【図１９Ａ】調査中のサンプルの画像を再構成するために統計分析を用いるフローサイトメトリーを行うための、本教示による方法の実施形態における様々なステップを示すフローチャートである。
【図１９Ｂ】フローサイトメトリーを行うための本教示による方法の実施形態における様々なステップを示すフローチャートであり、サイトメトリー信号が複数の時間セグメントとしてモデル化され、最小２乗回帰分析がモデルのパラメータの推定値を得るために使用されている。
【図１９Ｃ】照射に応答してサンプルから得られたサイトメトリー信号からサンプルの画像を得るための、本教示による方法の実施形態における様々なステップを示すフローチャートである。
【図１９Ｄ】フローサイトメトリーを実施するための本教示による方法の実施形態における様々なステップを示すフローチャートであり、サンプルの最良適合画像を得るために、勾配降下最適化法を使用して、サンプルの画像推定を反復的に改善する。
【図２０】本教示の実施形態によるサイトメトリーシステムの様々な構成要素のモデリングを概略的に示す。
【図２１Ａ】細長いミドリムシの細胞による光の消光及び散乱の測定値を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ａに示す信号のフーリエ成分を抽出することによる、ミドリムシの細胞の画像を示す。
【図２１Ｃ】本教示の実施形態によるシステムの励起モデル、電子的モデル及び位相応答を利用することによる、ミドリムシの細胞の改善された画像を示す。
【図２２Ａ】図２１Ｂ及び図２１Ｃに描かれたミドリムシの細胞の脂質内容物のＦＩＲＥ（無線周波数タグ放出）測定値を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａに示される信号のフーリエ係数の抽出を介して得られる画像を示す。
【図２２Ｃ】収集用電子機器の周波数応答、システムを駆動する基礎となるＦＩＲＥ信号、及びシステムの位相応答に関する情報を組み込むことによって得られる、図２２Ｂに示された画像の改良版を示す。
【図２２Ｄ】基礎の信号のモデルと、フォトニックショット雑音の影響とを利用することによって得られる、図２２Ｂに示された画像の改良版を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本教示は、一般に、フローサイトメトリー、例えばサンプルの蛍光分析を実施するための方法及びシステムに関する。いくつかの実施形態では、統計的手法は、呼掛け式放射線（例えば、レーザ放射線）によるサンプルの照射に応答してサンプルから得られた、例えば時間−周波数波形の形で時間データから蛍光、明視野及び暗視野の像のいずれかを再構成する際に使用され得る。時間データは、様々な異なるシステムを使用して得ることができる。以下に開示されるいくつかの実施形態では、時間データは、無線周波数シフトされた複数のビームレットを有する光学ビームでサンプルを照射することによって生成できる。そのような実施形態の例を以下に記載するが、本発明の教示はこれらの実施形態に限定されない。
【００２９】
多くの実施形態では、このような統計的手法を使用することは、再構成画像の空間分解能、強度分解能、及び／または信号対雑音比を、有利にも改善することができる。いくつかの実施形態では、例えば、信号のＦＦＴ分析を使用して、初期（シード）蛍光像、明視野像または暗視野像を再構成することができる。続いて、後述する統計的手法の少なくとも１つを画像に適用して、改良された画像を生成することができる。いくつかの実施形態では、統計的手法を用いて、モデルのパラメータを、例えば以下に説明する方法で、１つ以上の検出器によって検出される蛍光、明視野及び／または暗視野の信号に直接適合させることができる。
【００３０】
本教示を記載するために以下で使用される様々な用語は、別段に記載されていない限り、当技術分野における通常の意味を有する。例えば、「フルオロフォア」という用語は、本明細書では、当技術分野における慣習的な意味と一致して、励起放射線による照射に応答して放射線を放出できる蛍光性化合物を示す。
【００３１】
また、「サイトメトリー」及び「フローサイトメトリー」という用語は、当技術分野におけるそれらの通常の意味と一致して使用されている。特に、「サイトメトリー」という用語は、細胞を同定及び／または選別、さもなければ分析する技術を示すことがある。「フローサイトメトリー」という用語は、流体の流れに存在する細胞を、蛍光マーカーで標識し、放射線の励起を介して蛍光マーカーを検出することなどにより、同定及び／または選別、さもなければ分析することができるサイトメトリー技術を示すことができる。本明細書で使用される「約」及び「実質的に」という用語は、数値を含む特性に関して１０％または５％の最大の変動を示す。
【００３２】
「フォワードモデル」という用語は、所与のインプット（例えば、１つ以上のインプットパラメータ）に対するシステムまたはプロセスのアウトプットを数学的に予測するためのシステムまたはプロセスの数学的モデルを示す。例として、以下の実施形態のいくつかにおいて、フォワードモデルは、フローサイトメーターにおける呼掛け中のサンプルのピクセル化した画像の数学的モデルであり得、これは、サンプルから得られた時間信号を、フローサイトメーターにおけるその照射に応じて予測するために利用できる。次に、予測された時間信号と測定された時間信号との間の差を最小限にすることによって、モデルのパラメータを精緻化するために、統計分析を利用してもよい。その信号は、例えば、ＲＦ変調された照射放射線などの呼掛け式放射線による照射に応答してサンプルから放射される放射線を検出することで測定された信号が挙げられる。
【００３３】
図１は、本教示の実施形態によるサイトメトリーを行うためのシステム１０を概略的に示しており、このシステムは３つの動作モードで動作することができる。以下でより詳細に説明するように、１つの動作モードでは、試験中のサンプルを複数の励起周波数で同時に照射することができ、その各々は、例えばレーザビームの中心的な周波数をシフトすることで得られる。より具体的には、参照レーザビーム（本明細書では局部発振器ビームとも称される）を複数の無線周波数シフトされたレーザビームと混合することにより生成されるレーザビームによって、複数のサンプルの位置を同時に照射することができ、その結果、各サンプルの位置は、参照ビームと無線周波数シフトされたビームとのうちの１つによって照射されて、存在する場合には、その位置で対象のフルオロフォアを励起する。いくつかの実施形態では、参照ビーム自体が、レーザビームの無線周波数シフトを介して生成され得る。したがって、サンプルの各空間位置は、参照ビームの周波数と無線周波数シフトされたビームの１つの周波数との間の差に対応する異なるビート周波数で「タグ付け」することができる。言い換えれば、フルオロフォアによって発せられた蛍光放射線は、ビート周波数を空間的にコード化する。蛍光発光を検出することができ、その周波数成分を分析してサンプルの蛍光像を構築することができる。
【００３４】
別の動作モードでは、サンプルは、複数の励起周波数でレーザビームによって一時的な間隔で連続して照射することができる。いくつかのこのような実施形態では、励起周波数は、レーザビームを受け取る音響光学偏向器（ＡＯＤ）に時変駆動信号を印加することによって得ることができる。多くの実施形態では、レーザビームは、例えば、約３００ＴＨｚ〜約１０００ＴＨｚという範囲の数百テラヘルツ（ＴＨｚ）の範囲の周波数を有する。ＡＯＤに印加される駆動信号は、典型的には、無線周波数の範囲、例えば、約１０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの範囲内にある。ＡＯＤを通るレーザビームの通過は、それぞれ異なる回折次数に対応する複数の回折ビームを生成する。０次回折ビームはインプットされるレーザビームの周波数に対して周波数シフトを示さないが、高次回折ビームは駆動信号の周波数またはその複合の周波数に対応したインプットされるレーザビームの周波数に対して周波数シフトを示す。いくつかの実施形態では、駆動信号によってシフトされたインプットされたレーザビームの周波数に対応する周波数を有する一次回折ビームは、分析中のサンプルに存在する場合には、対象のフルオロフォアを励起するための励起ビームとして使用される。駆動信号が時間と共に変化すると、一次回折ビームの周波数シフト及び角度シフトもまた変動し、それにより異なる位置で異なる励起周波数でのサンプルの照射が可能になる。照射された各々の位置から蛍光の放出があれば収集し、分析してサンプルの蛍光像を構築することができる。
【００３５】
さらに別の動作モードでは、システム１０を動作させて、単一の励起周波数によってサンプルの複数の位置を同時に照射することができ、これは、例えば、無線周波数によりレーザビームの中心周波数をシフトすることなどにより発生させることができる。例えば、サンプルの水平な広がりは、単一の励起周波数でレーザビームによって照射することができる。検出された蛍光放射線を使用して、サンプル、例えば細胞／粒子の蛍光内容物を分析することができる。
【００３６】
このように、システム１０の利点の１つは、後述するものの中でも特に、様々な機器を使用する必要なく、または異なる動作モード間で切り替えるときにシステムにいかなる機械的な変更をも加える必要なく、多様なモードで蛍光放出データを得る際に相当な柔軟性を付与するということである。
【００３７】
特定の実施形態では、システムは、１つ以上の光源を含む。いくつかの例では、光源は、狭帯域光源、例えば非限定的に狭波長ＬＥＤ、１つ以上の光学バンドパスフィルタ、回折格子、モノクロメータまたは組合せて照射光の狭帯域を生成するそれらの任意の組み合わせと連結されるレーザまたは広帯域光源である。特定の例で、光源は、単一波長ダイオードレーザ（例えば、４８８ｎｍレーザ）などの単一波長レーザである。いくつかの実施形態では、対象のシステムは、単一の光源（例えば、レーザ）を含む。他の実施形態では、対象のシステムは、２つ以上の異なる光源、例えば３つ以上の異なる光源、４つ以上の異なる光源、及び５つ以上の異なる光源などを含む。例えば、システムは、第１の波長をアウトプットする第１の光源（例えば、レーザ）と、第２の波長をアウトプットする第２の光源とを含むことができる。他の実施形態では、システムは、第１の波長をアウトプットする第１の光源と、第２の波長をアウトプットする第２の光源と、第３の波長をアウトプットする第３の光源とを含む。
【００３８】
各光源は、３００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲、例えば３５０ｎｍ〜９５０ｎｍ、例えば４００ｎｍ〜９００ｎｍ及び４５０ｎｍ〜８５０ｎｍなどの波長を有することができる。特定の実施形態では、光源は、１つ以上のフルオロフォアの吸収最大値に対応する波長を有する（後述する）。例えば、光源は、２８０〜３１０ｎｍ、３０５〜３２５ｎｍ、３２０〜３５０ｎｍ、３７０〜４２５ｎｍ、４００〜４５０ｎｍ、４４０〜５００ｎｍ、４７５〜５５０ｎｍ、５２５〜６２５ｎｍ、６２５〜６７５ｎｍ、及び６５０〜７５０ｎｍの１つ以上の範囲の波長を有する光をアウトプットすることができる。特定の実施形態では、各光源は、３４８ｎｍ、３５５ｎｍ、４０５ｎｍ、４０７ｎｍ、４４５ｎｍ、４８８ｎｍ、６４０ｎｍ及び６５２ｎｍから選択される波長を有する光をアウトプットする。
【００３９】
システム１０は、レーザビーム１４を生成するレーザ放射源１２を含む。例として、レーザビームは、約１０００ＴＨｚ〜約３００ＴＨｚの範囲の周波数を有することができ、約３００ｎｍ〜約１０００ｎｍという範囲の真空の波長に対応している。レーザビームのビーム直径（例えば、ガウシアンレーザビームが使用される場合のビームウエスト）は、例えば、約０．１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲とすることができる。一般性を失うことなく、この実施形態では、レーザ１２は、約１ｍｍのビーム直径を有する４８８ｎｍの波長の放射線を放出する。
【００４０】
レーザビームの周波数は、システムが意図されている特定の用途（複数可）に基づいて選択することができる。具体的には、以下により詳細に説明するように、レーザ周波数は、例えば、放射線の吸収を介して、対象のフルオロフォアの電子移行を励起して、低い周波数でフルオロフォアに蛍光放射線を放出させるために適している可能性がある。種々のレーザ源を用いることができる。このようなレーザ源のいくつかの例として、非限定的に、米国カリフォルニア州サンタクララのＣｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．により販売されているＳａｐｐｈｉｒｅ  ４８８−ＳＦ、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＭＸ−４８８−１０００−ＳＴＭ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）、ＯＢＩＳ  ４０５−ＬＸ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州サクラメントのＶｏｒｔｒａｎ  Ｌａｓｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．により販売されているＳｔａｄｕｓ  ４０５−２５０、及び米国カリフォルニア州アーバインのＮｅｗｐｏｒｔ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＬＱＣ−６６０−１１０が挙げられる。本実施形態ではいずれかの一般性を失うことなく、レーザビームはその伝播方向に垂直な平面でガウス強度プロファイルを有すると仮定される。
【００４１】
ミラー１６は、レーザ放射ビーム１４を受け取り、反射を介して音響光学偏向器（ＡＯＤ）１８にレーザビームを向ける。この実施形態では、ＡＯＤ１８は、ビーム１４の伝搬方向に垂直な軸を中心としたＡＯＤの回転を可能にする、調整可能なポストホルダマウント（Ａ）に取り付けられる。コントローラ２１の制御下で動作するダイレクトデジタルシンセサイザ（ＤＤＳ）２０は、１つ以上の駆動信号をＡＯＤ１８に印加することができる。例として、いくつかの実施形態では、これらの駆動信号は、約５０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚの周波数の範囲に及ぶことが可能である。いくつかの実施形態では、駆動信号は、約０．１ＭＨｚ〜約４ＭＨｚの範囲の周波数によって互いに分離されてもよい。この実施形態では、電子動力増幅器２１’は、ＤＤＳ２０によって生成された無線周波数信号を増幅してＡＯＤ１８に印加する。
【００４２】
サンプルが複数の励起周波数で同時に照射される動作モードでは、ＲＦコーム発生器２０は、複数のＲＦ駆動信号を同時にＡＯＤ１８に印加する。例として、同時に印加されるＲＦ駆動信号数は約２０〜約２００の範囲にあることができる。レーザビームと駆動信号との相互作用は、レーザ１２により発生されたレーザビームの周波数に対して駆動信号の１つに対応する周波数シフトを各々有する、角度で隔たりがある複数のレーザビームを生成する。いずれか特定の理論に限定されることなく、ＡＯＤにおいて、圧電トランスデューサは、水晶などの結晶において高周波のフォノンを発生させることができ、このような高周波のフォノンによるレーザビームの光子の散乱は、周波数シフトされたレーザビームの生成をもたらし得る。これらの周波数シフトされたビーム２２の１つは、本明細書では「局部発振器」（ＬＯ）ビームと称され、残りの周波数シフトされたビーム２４は、本明細書では「ＲＦコームビーム」と称される。例えば、周波数シフトされたビームの角度の隔たりは、約１ミリラジアン〜約１００ミリラジアンの範囲であり得る。
【００４３】
ＬＯ及びＲＦコームビームはレンズ２６を通過するが、この実施形態では、レンズは約５０ｍｍの焦点距離を有する正レンズである。レンズ２６を通過した後、ＬＯレーザビームは、ＬＯビームを異なる方向（この実施形態ではＬＯビームの元の伝搬方向に実質的に直交する方向）に方向転換するミラー２８によって遮断される。ミラー２８は、ＲＦコームビームに対して配置し、これらのビームがミラー２８を外れて、レンズ３０（この実施形態では２００ｍｍの焦点距離を有する）に伝播するようにする。このようにして、ＬＯビーム及びＲＦコームビームは異なる伝播方向に向けられる。先に開示したようにピックオフミラー２８を使用することにより、単一のＡＯＤを利用して、ＬＯビームとＲＦコームビームとの両方を生成し、以下に説明する方法でそれらを組み合わせてサンプルを照射するための励起ビームを生成することができる。複数のＡＯＤ（例えば、ＬＯビームを生成するためのものと、ＲＦコームビームを生成するための他方との２つのＡＯＤ）を用いるのではなく、単一のＡＯＤを使用することにより、システムの設計が単純化され、さらに、以下により詳細に説明するように、複数の別個の動作モードのシステムを有効に使用できるようにする。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＬＯビームのビームプロファイルは、ＲＦビームコムと再結合する前に修正される。例えば、ＬＯビームのビームプロファイルは、空間的な次元、ビームの形状、強度、ビームの空間分布、またはそれらの任意の組み合わせにおいて調整（増加または減少）することができる。特定の実施形態では、ＬＯビームのビームプロファイルの空間的な次元が修正される。例えば、ビームプロファイルは、流れの縦軸に直交する長手方向軸のように、ビームプロファイルを１つ以上の次元で引き延ばすように調整することができる。これらの実施形態による一例では、ビームプロファイルの（例えば、１つ以上の次元における）空間的な次元は、１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上及び５倍以上など増加し得る。これらの実施形態による別の例では、ビームプロファイルの（例えば、１つ以上の次元における）空間的な次元は、１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上及び５倍以上など減少し得る。
【００４５】
他の実施形態では、ＬＯビームのビーム形状が修正される。例えば、ビーム形状は、ビームプロファイルを１つ以上の次元で引き延ばすように修正することができる。特定の例では、ＬＯビームのビーム形状は、ＬＯビームの伝播に垂直な平面で引き延ばされる。特定の実施形態では、ＬＯビームプロファイルの形状は、円形のビームプロファイルから、流れの長手方向軸に直交する軸において引き延ばされた楕円形のビームプロファイルに変更される。他の実施形態では、ＬＯビームプロファイルの形状は、円形のビームプロファイルから、流れの長手方向軸に直交する軸において長い次元の矩形のビームプロファイルに変更される。さらに他の実施形態では、ＬＯビームの強度が変更される。例えば、ＬＯビームの強度は、１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上、及び５倍以上など増加し得る。特定の実施形態では、ＬＯビームの強度は、ＲＦコームビームの強度に一致するように修正される。例えば、ＬＯビームは、ＲＦコームビームの強度と１０％以下、例えば９％以下、例えば８％以下、例えば３％以下、例えば２％以下、例えば１％以下、例えば０．０１％以下異なる強度を有してもよく、ＬＯビームの強度がＲＦコームビームと０．００１％以下異なる場合を含めてよい。特定の例では、ＬＯビーム及びＲＦコームビームの強度は同一である。
【００４６】
さらに他の実施形態では、ビームプロファイルの空間的な分布も修正することができる。例えば、ＬＯビームは、ＬＯビームの強度がもはや１つ以上の次元においてガウス型ではなくなるように修正してもよい。例えば、ＬＯビームは、流れの長手方向軸に平行であり、流れの長手方向軸に直交する第２の軸に沿って非ガウス分布である第１の軸に沿ってガウス分布を有するように修正されてもよい。
【００４７】
屈折及び回折ビーム整形プロトコルを含むがこれに限定されないＬＯビームのビームプロファイルを修正するために、任意のビーム整形プロトコルを使用することができる。いくつかの実施形態では、ＬＯビームはトップハットビーム整形器によって修正される。
【００４８】
この実施形態では、ＬＯビームは別の正レンズ３２（この実施形態では約２００ｍｍの焦点距離を有する）に伝搬する。レンズ２６とレンズ３２との組み合わせはＬＯビームを拡大及びコリメートし、トップハットビーム整形器３４の後ろ側の開口を概ね満たすようにする。より具体的には、ＬＯビーム２２は、レンズ３２を通過し、ミラー３３及び３５によって反射されて、トップハットビーム整形器３４に至る。
【００４９】
トップハットビーム整形器３４は、トップハット強度プロファイルの整形を可能にするために、ガウスＬＯビームの同位相波面を整形する。より詳細には、トップハットビーム整形器を出るＬＯレーザビーム２２’は、ビームスプリッタ４４によって反射され、レンズ４６（この実施形態では１００ｍｍの焦点距離を有する）によって中間像面４８上に集束される。中間像面４８でのレーザビームは、ビームの伝播方向に垂直な平面で水平方向に沿ったトップハット強度プロファイルを有する。この実施形態では、ＡＯＤ１８と同様に、ビームスプリッタ４４は調整可能なポストホルダマウント（Ｂ）に取り付けられている。この実施形態では、トップハットビーム整形器は、放射の偏光がビームのトップハット方向に沿って（この実施形態では水平方向に沿って）実質的に均一であるトップハットビームプロファイルを生成する。
【００５０】
例証として、図２Ａは、トップハットビーム整形器に入るときのＬＯレーザビームのガウス強度プロファイルを概略的に示す。図２Ｂに概略的に示すように、中間像面４８では、ＬＯレーザビームは水平方向（この例証では紙面に垂直な方向）に伸長し、水平線Ａなどのプロファイルを通って延びる各水平線に沿って実質的に一定であるが、ガウスプロファイルに従って垂直に変化するビームプロファイルを示す。
【００５１】
様々なトップハットビーム整形器を使用することができる。例えば、非球面または回折光学素子を有する屈折光学素子は、レンズによって集束された後に、レンズの焦点面にトップハットのプロファイルのパターンを生成する適切な空間的同位相波面を有するビームを生成するために使用することができる。このようなトップハットビーム整形器には複数のフォームファクタが存在し、この教示の様々な実施形態においてサンプルに適切なＬＯビームの形状を生成するために、このアプローチの様々な実施態様が利用可能である。例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｖｅｒｔｓ  ａ  ｌａｓｅｒ  ｂｅａｍ  ｔｏ  ａ  ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ  ｆｌａｔ−ｔｏｐ  ｂｅａｍ」と題する米国特許第６，２９５，１６８号と、「Ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ  ｆｌａｔ−ｔｏｐ  ｂｅａｍ  ｓｈａｐｅｒ」と題する米国特許第７，４００，４５７号とは、本教示のいくつかの実施形態によるシステムにおいてフラットトップビーム整形器として使用することができるビーム整形システムを開示している。例証として、図３は米国特許第７，４００，４５７号の図１を再現したものであり（参照符号は異なる）、それは直交する２つの非シリンドリカルレンズ３０２、３０４を含む正方形または矩形のビームを提供するためのビーム整形システム３００を概略的に示す。第１の非シリンドリカルレンズ３０２は、Ｘ軸に沿った入射ビームＡを整形するためのもので、第２の非シリンドリカルレンズ３０４は、Ｙ軸に沿った入射ビームＡを整形するためのものである。２つの交差した非シリンドリカルレンズは、Ｘ軸に沿ったフラットトッププロファイルを有する、得られる矩形のレーザビームＢを提供するように適合される。非シリンドリカルレンズ３０２のインプット面３０２ａは、表面の中心が小さく、レンズの両方のＸ先端に向かって緩やかに増加する可変の曲率半径を有する凸状の円筒面である。第２の非シリンドリカルレンズ３０４は、第１の非シリンドリカルレンズと類似しているが、Ｙ軸に沿ってビームを整形するために、レンズ３０２に対して直角に配置される。レンズ３０２及び３０４のインプット面３０２ａ／３０４ａ及びアウトプット面３０２ｂ／３０４ｂのプロファイルは、入射ビームＡのＸ及びＹプロファイルと、得られた矩形ビームＢの所望の強度プロファイルとの関数として独立して選択することができる（例えば、当該特許の第５欄及び第６欄を参照）。
【００５２】
使用可能な市販のトップハットビーム整形器の例としては、例えば、カナダのラチネのＯｓｅｌａ，Ｉｎｃ．が販売するＤＴＨ−１Ｄ−０．４６ｄｅｇ−４ｍｍが挙げられる。
【００５３】
以下により詳細に説明するように、水平方向に沿ってＬＯビームを伸張するためにビーム整形器を使用すると、複数の利点が得られる。例えば、確実にＬＯビームとＲＦコームビームとの組み合わせが実質的に類似した照射の強度で複数のサンプルの位置を照射するようにし、サンプルの位置全体にわたってＬＯビームとＲＦコームビームとの強度を一致させて、それにより、高次の変調深度を有する蛍光信号の強度振幅変調を生成することができる。このような強度の整合がない場合、画像化システムは視野が小さく、ＡＯＤを駆動する周波数（ピクセル）のすべては利用できない。蛍光信号の変調の深度は、サンプルの蛍光像を再構成するシステムの能力において重要な役割を果たすので、全ピクセルにおける励起ビート周波数の一様に高次である変調の深度は、システムの動作に対し特に有効である。さらに、ＲＦコームビームを生成するためにＡＯＤに印加される電気信号の振幅は、ＲＦコームビームを等化するためにダイレクトデジタルシンセサイザのアウトプットを（例えば、コントローラ２１を用いて）制御することによって調整することができ、その結果ＲＦコームビームとＬＯビームとが重なり合うすべての空間的な位置にわたってＲＦコームビームの強度がＬＯビームのビーム強度に等しくなる。この特徴は、蛍光放射線の強度振幅変調の高い変調深度を保証するという利点をもたらす。
【００５４】
再び図１を参照すると、ＲＦコームビーム２４は、レンズ２６及び３０の組み合わせを介して中間像面３８に画像化される。より具体的には、ＲＦコームビーム２４は、レンズ２６を通過し、ミラー２８を外れてレンズ３０に到達する。それはミラー４０及び４２を介して中間像面３８にＲＦコームビームを導く。
【００５５】
図４は、中間像面３８における例示的な数のＲＦコームビームの分布を概略的に示している（一般性を失うことなく、ＲＦコームビームの数は、例証の目的のために６つに選択される（ＲＦ１、．．．、ＲＦ６と分類）、ただし他の数字も使用することができる）。図４に示すように、中間像面３８において、ＲＦコームビーム２４は、水平方向に沿って互いに空間的に隔てられている。他の実施形態では、ＲＦコームビーム２４のうちの２つ以上が部分的に重なってもよい。したがって、レンズ２６及び３０の組み合わせは、角度において隔たりがあるＲＦコームビームを、水平方向に広がる、空間的に隔たりがあるビームのセットに変換する。
【００５６】
再び図１を参照すると、上述のように、ビームスプリッタ４４は、トップハットビーム整形器３４から出るレーザビーム２２’を受け取り、そのビームをレンズ４６に反射させ、それが次にビームを中間像面４８に集束させ、ＬＯビームがトップハットビームプロファイルを呈する。ビームスプリッタはまた、中間像面３８からＲＦコームビーム２４を受け取り、それをＲＦコームビームが通過できるようにする。レンズ４６は、ＲＦコームビーム２４を中間像面４８上に集束させて、トップハットビームプロファイルを有するＬＯビームと結合して、結合ビーム４９を生成する。
【００５７】
例証として、図５は、その伝搬軸に垂直な平面において結合させたビーム４９の１つの例示的なプロファイルを概略的に示す。結合させたビームの強度プロファイルは、トップハットＬＯビーム（四角形で概略的に示す）の強度プロファイルとＲＦコームビーム２４（それぞれ円の１つで概略的に示す）の強度プロファイルとの重ね合わせとして生成される。以下でより詳細に説明するように、ＬＯビームとＲＦコームビームとのこの重ね合わせは、水平の広がりに沿って、その水平の広がりに沿った１つの空間的な位置にそれぞれ対応する複数のビート周波数を提供する。サンプルの水平の広がりを照射すると、サンプルの位置から放射された蛍光放射線は、振幅の変調を介して、その位置を照射する放射線に関連するビート周波数をコード化する。
【００５８】
再び図１を参照すると、この実施形態では調整可能なポストホルダマウントＣに取り付けられた正レンズ５０（この実施形態では２００ｍｍレンズ）及び対物レンズ５２は、フローセル５４に流れるサンプル上に中間面４８で像を中継するべく望遠鏡を形成する。この実施形態では、ミラー５６がレンズ５０に複合ビーム４９を反射させ、ダイクロイックミラー５８が、レンズ５０から通過した後に結合された光ビームを対物レンズ５２に向かって反射する。
【００５９】
図６に概略的に示すように、複合ビーム４９は、フローセル５４を通って流れるサンプル６２の複数の空間的な位置６０を同時に照射する。したがって、各位置６０は、ＲＦコームビームの１つと、トップハット形状のＬＯレーザビームの一部との重なり合いにより照射される。これらの空間的な位置では、放射線は、存在する場合にはサンプルにおける対象のフルオロフォアを励起する。より具体的には、この実施形態では、ＬＯビーム及びＲＦコームビームは、複数のサンプルの位置６０において、例えば励起された電子状態への電子移行を引き起こすことによってフルオロフォアを同時に励起する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、サンプルは、複数の細胞が同伴される流動的な流体を含むことができる。場合によっては、細胞を１つ以上の蛍光マーカー（フルオロフォア）で標識することができる。蛍光マーカーの一部の例は、非限定的に蛍光性タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ）、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート）（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ））で標識された抗体、核酸染色（例えば、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ＳＹＴＯ１６、ヨウ化’プロピジウム（ＰＩ））、細胞膜染色（例えば、ＦＭＩ−４３）、及び細胞機能色素（例えば、Ｆｌｕｏ−４、Ｉｎｄｏ−１）を含む。他の場合には、細胞に存在する内在性フルオロフォアを用いて、細胞から蛍光放射線を引き出すことができる。以下でより詳細に述べるように、このような外因性または内在性フルオロフォアは、照射放射に応答して電子励起を受け、蛍光放射線を放出（典型的には励起周波数より低い周波数で）し、それが収集及び分析される。
【００６１】
例証として、いかなる特定の理論にも限定されるものではないが、図７は、基底電子状態Ａに対応する仮定上のエネルギー準位、ならびにフルオロフォアの２つの電子励起電子状態Ｂ及びＣを示す。フルオロフォアは、放射線エネルギーの吸収を介してその基底電子状態（Ａ）から励起電子状態（Ｂ）に励起することができる。次いで、フルオロフォアは、フルオロフォアの振動モードによって媒介される低放射移行を介して、より低次の励起状態Ｂに緩和し得る。フルオロフォアは、光学上の移行を介して低次の電子状態Ｃから基底状態にさらに緩和することが可能であり、それにより励起周波数より低い周波数で蛍光放射線を放出する。この仮説の例は、説明のみを目的として提示したものであり、蛍光放射線を放出できる唯一のメカニズムを示すものではないことを理解されたい。
【００６２】
多くの場合、フルオロフォアは、基底状態から励起電子状態に励起される周波数の範囲にわたって電磁放射線を吸収することができる。例証として、図８は、図７に関連して論じた仮定上のフルオロフォアの吸収曲線を示す。本教示による実施形態の一実施態様では、ＬＯ周波数は、対象のフルオロフォアの吸収のピークに対応する周波数と一致するように選択することができる。無線周波数シフトされたビームは、それぞれのビート周波数によって吸収のピークと隔たる周波数を有することができる。典型的には、これらの周波数の隔たりは、励起周波数のいずれかの劣悪化を回避するためにフルオロフォアの吸収帯域幅と比較して小さいものにする。例として、また例証のみとして、破線Ａ及びＢは、ＬＯビーム及びＲＦコームビームの１つの周波数を概略的に示す（説明を簡単にするために図は縮尺通りに描いていない）。ＬＯレーザビームと描かれたＲＦコームビームの１つとの両方によるサンプルの空間的な位置の同時照射は、ＬＯビームとＲＦコームビームとの周波数の差に対応するビート周波数での振幅の変調を示す蛍光放射線をもたらす。
【００６３】
やはり例証として、またいずれか特定の理論に限定されることなく、ＬＯビームとＲＦコームビームの１つとの同時照射によってフルオロフォアに印加される電界は、以下のように数学的に定義することができる。
【００６４】
【数１】
2019521316.tif 000003
【００６５】
式中、
Ｅｃｏｍは、複合ビームの電界を示し、
ＥＲＦは、ＲＦコームビームの１つに関連する電界の振幅を示し、
ＥＬＯは、ＬＯビームに関連する電界の振幅を示し、
ω０は、レーザ１２で発生するレーザビームの周波数を示し、
ωＲＦは、ＲＦコームビームに関連する周波数シフトを示し、
ωＬＯは、ＬＯビームに関連する周波数シフトを示す。
【００６６】
ＬＯ及びＲＦコームビームの電界の重ね合わせに応答して放出される蛍光放射線の強度は、（ωＲＦ−ωＬＯ）に対応するビート周波数で変調を示す。したがって、ＬＯビームとＲＦコームビームの１つとの重ね合わせによって照射されるサンプルの各々の空間的な位置から放射される蛍光放射線は、その空間的な位置を照らすＬＯビームに関連する無線周波数シフトとＲＦコームビームに関連する無線周波数シフトとの差に対応するビート周波数での変調を示す。
【００６７】
蛍光発光のプロセスは有限の時間（一般的な有機フルオロフォアでは典型的に１〜１０ナノ秒）を必要とするので、励起ビート周波数が高すぎると放出される蛍光は高い変調深度を示さない。したがって、多くの実施形態において、励起ビート周波数は、１／τf よりも大幅に小さくなるように選択され、この場合、τf はフルオロフォアの特徴的な蛍光寿命である。いくつかの例では、励起ビート周波数は、１％以上、例えば２％以上、例えば３％以上、例えば５％以上、例えば１０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば１．５倍以上、例えば２倍以上、例えば３倍以上及び５倍以上など、１／τf より小さくてもよい。例えば、励起ビート周波数は、０．０１ＭＨｚ以上、例えば０．０５ＭＨｚ以上、例えば０．１ＭＨｚ以上、例えば０．５ＭＨｚ以上、例えば１ＭＨｚ以上、例えば５ＭＨｚ以上、例えば１０ＭＨｚ以上、例えば２５ＭＨｚ以上、例えば５０ＭＨｚ以上、例えば１００ＭＨｚ以上、例えば２５０ＭＨｚ以上、例えば５００ＭＨｚ以上及び７５０ＭＨｚ以上など、１／τf より小さくてもよい。いくつかの実施形態では、光検出器は、照射されるサンプルからの光（例えば、蛍光などの発光）を検出するように構成される。いくつかの実施形態では、光検出器は、１つ以上の検出器、例えば２つ以上の検出器、例えば３つ以上の検出器、例えば４つ以上の検出器、例えば５つ以上の検出器、例えば６つ以上の検出器、例えば７つ以上の検出、及び８つ以上の検出器などを含み得る。任意の光検出プロトコルを使用することができ、例えば非限定的に、アクティブピクセルセンサ（ＡＰＳ）、象限フォトダイオード、イメージセンサ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、発光ダイオード、フォトンカウンタ、ボロメーター、焦電素子、フォトレジスタ、光起電力セル、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタ、量子ドット光伝導体またはフォトダイオード、及びそれらの組み合わせのような他の光検出器が、他の光検出器の中でも挙げられる。いくつかの実施形態では、対象の光検出器は、３５０ｎｍ〜１２００ｎｍ、例えば４５０ｎｍ〜１１５０ｎｍ、例えば５００ｎｍ〜１１００ｎｍ、例えば５５０ｎｍ〜１０５０ｎｍ、例えば５００ｎｍ〜１０００ｎｍ及び４００ｎｍ〜８００ｎｍなどの範囲の光を検出するように構成されている。特定の実施形態では、光検出器は、例えば３９５ｎｍ、４２１ｎｍ、４４５ｎｍ、４４８ｎｍ、４５２ｎｍ、４７８ｎｍ、４８０ｎｍ、４８５ｎｍ、４９１ｎｍ、４９６ｎｍ、５００ｎｍ、５１０ｎｍ、５１５ｎｍ、５１９ｎｍ、５２０ｎｍ、５６３ｎｍ、５７０ｎｍ、５７８ｎｍ、６０２ｎｍ、６１２ｎｍ、６５０ｎｍ、６６１ｎｍ、６６７ｎｍ、６６８ｎｍ、６７８ｎｍ、６９５ｎｍ、７０２ｎｍ、７１１ｎｍ、７１９ｎｍ、７３７ｎｍ、７８５ｎｍ、７８６ｎｍ、または８０５ｎｍの発光の最大放出で光を検出するように構成される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、サンプルによって放射された蛍光放射線は、様々な異なる方法で、例えば励起ビームの伝搬方向に垂直な光路に沿って収集することができる。他の実施形態では、蛍光放射線が外方向で検出される。
【００６９】
再び図１を参照すると、この実施形態では、照射されるサンプルに存在する１つ以上のフルオロフォアにより放射された蛍光放射線は、対物レンズ５２を通過し、ダイクロイックミラー５８を透過して光検出器６４に到達する。より具体的にはこの実施形態では、レンズ６５はダイクロイックミラー５８を透過した蛍光放射線をスリット開口６６上に集束させる。スリットを透過した蛍光放射線は蛍光放射フィルタ６８を通過して光検出器６４に達する。スリット開口６６（または後述する他の実施形態では光学フィルタ）は、光検出器の前面に配置されており、面外の蛍光放射線を阻止しながら、実質的にサンプルの特定の平面から放射される蛍光放射線の通過を可能にする。さらに、蛍光放射フィルタ６８、例えば通過帯域フィルタは、他の周波数での放射線の通過を実質的に阻止しながら、蛍光放射線の光検出器６４への通過を可能にする。
【００７０】
光検出器６４は、ビート周波数の全範囲から信号を検出して送信するために十分なＲＦ帯域幅を有する。適切な光検出器のいくつかの例には、とりわけ、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、ＰＩＮフォトダイオード、及びハイブリッド光検出器が含まれるが、これらに限定されない。例として、いくつかの実施形態では、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって市販されている光電子増倍管（例えば、Ｒ３８９６、Ｒ１０６９９、Ｈ１１４６２）を使用することができる。光検出器は、受信した蛍光放射線の検出に応答して、信号、例えばこの実施形態ではアナログ信号を生成する。
【００７１】
別の例として、図９Ａを参照すると、ＬＯビームと空間的に隔てられたＲＦコームビームとの同時照射に応答してサンプルから放射された蛍光放射線は、対物レンズ５２及びダイクロイックミラー５８を通過し、レンズ１００を介してマルチモード光ファイバ１０２上に結合されており、そのファイバは近位端１０２ａから遠位端１０２ｂまで延在する。より具体的には、光ファイバ１０２の近位端１０２ａが、蛍光放射線を受け取るように、レンズ１００の焦点面の近傍に配置される。光ファイバの遠位端１０２ｂに連結された蛍光取り出しレンズ１０４は、ファイバを出る放射線をコリメートする。
【００７２】
多くの場合、サンプルを照射する励起放射線は、励起周波数がサンプルの複数のフルオロフォアの吸収スペクトル内に入るように、十分広い放射線吸収スペクトルを有することができる複数のフルオロフォア（例えば、有機フルオロフォア）を励起する。その時、各フルオロフォアは多様な周波数で蛍光放射線を発する。一般性を失うことなく、例証の目的で、この実施形態では、検出システムは、４つの光電子増倍管１０６、１０８、１１０、及び１１２を含み、それぞれが図解している例の励起放射線によって励起される４つのフルオロフォアの１つによって放射される蛍光放射線に対応するコリメートされた放射線の一部を受け取る。より具体的には、ダイクロイックミラー１１４は、第１の周波数でフルオロフォアの１つによって放射された蛍光放射線を光電子増倍管１０６に反射し、他の周波数での蛍光放射線は通過させる。別のダイクロイックミラー１１６は、異なる第２の周波数が異なるフルオロフォアによって発せられた蛍光を光電子増倍管１０８に反射する一方で、第３の周波数のさらに別のフルオロフォアによって発せられた蛍光放射線を含む放射線の残りを、第３のダイクロイックミラー１１８に届かせ、それがその蛍光放射線を光電子増倍管１１０に反射させる。ダイクロイックミラー１１８は、第４の放射周波数で第４のフルオロフォアによって放射された蛍光放射線を含む放射線の残りを通過させて光電子増倍管１１２に到達させる。
【００７３】
４つの蛍光周波数のうちの１つを中心とする複数のバンドパスフィルタ１２０、１２２、１２４及び１２６が、光電子増倍管１０６、１０８、１１０及び１１２の前にそれぞれ配置されている。各光電子増倍管によって検出された信号は、後述するように分析されて、それぞれの蛍光周波数で蛍光像を生成する。いくつかの実施形態では、複数の光検出器を用いるのではなく、単一の光検出器、例えば単一の光電子増倍管を使用して蛍光放射線、例えば単一のフルオロフォアからの放射に対応する蛍光周波数を検出することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態では、サンプルがフローセルを流れるとき、サンプルの異なる水平の列が照射され、各々の水平の列に関連する蛍光放射線が光電子増倍管１０６、１０８、１１０及び１１２などの１つ以上の光検出器によって検出される。
【００７５】
図９Ｂは、図９Ａに関連して上述したものと同様の検出システムを概略的に示す。ただし、この検出システムでは、光ファイバを用いるのではなく、ダイクロイックミラー５８を通過した複数のフルオロフォアからの蛍光放出を含む蛍光放射線が、空き領域を伝播して光電子増倍管１０６、１０８及び１１２に到達する。より具体的には、レンズ１００は、レンズ１００と１０４との間に配置された開口１２６上に蛍光放射線を集束し、開口は、焦点外放射線を阻むことができる。レンズ１０４は、開口を通過する放射線をコリメートし、コリメートされた放射線は、図９Ａに関連して上述した方法で、光電子増倍管間で分配される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、システム１０は、励起放射線を使用してサンプルの暗視野及び明視野の像（サンプル不存在下でのフローセルの画像）を提示するように構成することができる。例として、図９Ｃは、サンプルの暗視野及び明視野の像をそれぞれ検出するための２つの検出アーム２００及び２０２を含むシステム１０の実施形態を概略的に示す。
【００７７】
より具体的には、検出アーム２００は、フローセルを流れるサンプルによって散乱される励起放射線の一部を受け取るように、励起放射線の伝搬に対して垂直に配置される。検出アーム２００は、サンプルによって散乱された励起放射線の少なくとも一部を、レンズ２０４によって光電子増倍管２０８に入射された立体角に集合的に向ける２つのレンズ２０４及び２０６を含む。より具体的には、レンズ２０４は、受け取った散乱放射線をコリメートし、レンズ２０６がコリメートされた散乱放射線を光電子増倍管２０８に集束させる。この実施形態では、適切なバンドパスフィルタ２１０が、光電子増倍管２０８の前に配置され、所望の周波数を有する放射線が光電子増倍管２０８へと通過することを可能にする一方、望ましくない周波数の放射線を阻止する。光電子増倍管２０８のアウトプットは、例えば暗視野像を生成するために以下に説明するような分析モジュールによって、当技術分野で知られている方法で処理することができる。
【００７８】
検出アーム２０２は、順に２つのレンズ２１２及び２１４を含み、レンズ２１２は、フローセルを出る励起放射線を順方向に（実質的に、フローセル５４に入る励起放射線の伝播方向に沿って）コリメートし、レンズ２１４はコリメートされた放射線を光検出器２１６に集束させる。光検出器の前に配置されたバンドパスフィルタなどの適切なフィルタ２１８は、励起周波数を光検出器２１６に伝達させる一方で、実質的に他の放射周波数を阻止する。光検出器２１６のアウトプットは、フローセルの明視野像を生成するために当技術分野で知られている方法で処理することができる。
【００７９】
このように、検出アーム２００は、細胞を流れる流体によって散乱された励起放射線を検出し、検出アーム２０２は、フローセルを透過する励起放射線を検出する。流体がフローセルを流れていないとき、光電子増倍管２０８によって検出される信号は低く、光検出器２１６によって検出される信号は高い、なぜならばフローセルを通過する励起放射線の散乱がほとんどなく、したがって、励起放射線は多くの割合、またいくつかの場合にはすべてがフローセルを透過するからである。対照的に、フローセルを通る流体サンプルの流れは、光電子増倍管２０８によって生成された信号を、サンプルによる励起放射線の一部の散乱により増加させることができ、光検出器２１６によって生成された信号は、フローセルを透過する励起放射線のレベルが低下するので減少する。
【００８０】
さらなる例として、また図９Ｄを参照すると、本教示によるシステムの一実施形態では、励起放射線の伝搬方向と実質的に直交する方向にフローセル５４に対して配置された検出アーム２２０ａは、サンプルの複数のフルオロフォアにより放出される蛍光放射線、ならびにサンプルによって散乱される励起放射線の双方を検出するための光検出器を含む。より具体的には、検出アーム２２０は、集束されていない放射線を阻止する開口２２６に蛍光放射線ならびに散乱された励起放射線を導くレンズ２２２及び２２４を含む。レンズ２２８は、開口を通過する放射線をコリメートする。ダイクロイックミラー２３０は、暗視野像を検出するために励起周波数の放射線の一部を光電子増倍管２３２に反射させる一方、蛍光放射線を通過させる。光電子増倍管２３２の前に配置された適切なフィルタ２３２ａ、例えばバンドパスフィルタは、励起周波数の放射線を光電子増倍管２３２に通過させる一方、不要な放射周波数を阻止する。別のダイクロイックミラー２３４は、第１の周波数のフルオロフォアによって放出された蛍光放射線を光電子増倍管２３６に反射する一方で、他の周波数で他のフルオロフォアによって放出される蛍光放射線の通過を可能にする。別のダイクロイックミラー２３８は、第２の周波数で別のフルオロフォアによって放出された蛍光放射線を光電子増倍管２４０に反射する一方で、光電子増倍管２４２によって検出される、第３の周波数でさらに別のフルオロフォアから放出される蛍光放射線の通過を可能にする。先行の実施形態と類似して、複数のフィルタ２３６ａ、２４０ａ、及び２４２ａが、光電子増倍管２３６、２４０、及び２４２の前にそれぞれ配置され、望ましくない放射周波数を実質的に阻止しながら所望の周波数の放射線を透過させる。
【００８１】
引き続き図９Ｄを参照すると、本教示によるシステムのこの実施態様は、例えば、図９Ｃに関連して説明した方法で明視野像を生成するための別の検出アーム２２０ｂをさらに含む。より具体的には、検出アーム２０２は、励起放射線の明視野像を生成するために光を光検出器２１６に集束する２つのレンズ２１２及び２１４を含む。フィルタ２１８、例えばバンドパスフィルタが光検出器２１６の前に配置され、不要な放射周波数を排除しながら励起放射線を検出器に通過させる。
【００８２】
再び図１及び図１０を参照すると、この実施形態では、トランスインピーダンス増幅器７０を光検出器６４のアウトプット（または図９Ａ〜図９Ｄに関連して説明した光検出器のそれぞれ）に結合して光検出器によって生成された信号を増幅することができる。データ分析ユニット７２（本明細書では、分析モジュールまたは分析装置とも称される）は、増幅された信号を受信し、その信号を分析してサンプルの蛍光像を生成する。データ分析ユニット７２は、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアで実施することができる。例として、検出された蛍光データを分析する方法は、プロセッサの制御下でアクセスされる分析モジュールのＲＯＭ（ｒｅａｄ−ｏｎｌｙ−ｍｅｍｏｒｙ）ユニットに記憶して、受信された蛍光信号を分析することができる。
【００８３】
以下により詳細に説明するように、分析方法は、時間変化する光検出器のアウトプットの周波数成分を判定し、それらの周波数成分に基づいてサンプルの蛍光像を構築する。光検出器のアウトプットの周波数内容を判定するため様々な方法を用いることができる。そのような適切な方法のいくつかの例には、フーリエ変換、ロックインでの検出、フィルタリング、Ｉ／Ｑ復調、ホモダイン検出、及びヘテロダイン検出が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
例として、図１１Ａ及び図１１Ｂは、サンプルの蛍光像を生成するために分析モジュール７２によって実行され得る例示的な分析ステップを示す。ステップ（１）では、アナログ増幅信号をデジタル化してデジタル化された蛍光データを生成する。ステップ（２）では、デジタル化されたデータの適切な部分（長さ）が分析のために選択される。例えば、サンプルの照射された列（本明細書ではフレームとも称される）に対応する蛍光データを分析のために選択することができる。あるいは、データフレームの一部を分析のために選択することができる。
【００８５】
ステップ（３）では、選択されたデータのフーリエ変換が行われる。例として、いくつかの実施形態では、データの周波数成分を判定するために、データの高速フーリエ変換（ＦＦＴ）が実行される。いくつかのそのような実施形態では、ＦＦＴのビンは、データ取得のために選択された周波数に対応させることができる。例えば、２５６ＭＨｚのサンプリングレートの場合、２５６個のサンプルが、例えばＤＣから１２８ＭＨｚまで、互いに１ＭＨｚだけ分離された周波数ビンを生成することができる。ＦＦＴ分析により、放出された蛍光放出が振幅変調を示すビート周波数に対応する周波数が得られる。
【００８６】
引き続き、図１１Ａ及び図１１Ｂを参照すると、この実施形態では、ステップ（４）において、ＦＦＴデータに存在する各周波数成分の振幅の尺度は、その周波数成分の実数成分と虚数成分との２乗の和の平方根を得ることにより計算する。各周波数成分は、サンプルの特定の位置から蛍光放射線を引き出すために使用されるビート周波数の１つに対応するので、周波数成分の振幅の尺度は、その周波数成分に関連する位置のピクセルの値を水平な列のサンプルに沿って提供できる。このようにして、サンプルの水平な列の画像のピクセルの値を判定することができる。サンプルがフローセルを垂直方向に流れるため、サンプルの各々の水平の列について得られた蛍光データに対して、上記のステップを繰り返すことができる。ピクセルの値を用いて蛍光像を構築することができる（ステップ５）。
【００８７】
上述したように、分析モジュール７２は、当技術分野で知られている技術を用いて、本教示に従って、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアで実施することができる。例として、図１２は、分析器７２の例示的な実施態様を概略的に示しており、それは増幅された蛍光信号を増幅器７０から受信し、その信号をデジタル化して、デジタル化された蛍光データを生成するためのアナログ／デジタル変換器７４を含む。分析モジュールは、計算及び論理演算の実行を含む分析モジュールの動作を制御する中央処理装置（ＣＰＵ）７６をさらに含む。分析モジュールはまた、ＲＯＭ（読出し専用メモリ）７８、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）８０及び永久メモリ８２を含む。通信バス８４は、ＣＰＵ７６と他の構成要素との間の通信を含む分析モジュールの様々な構成要素間の通信を容易にする。メモリモジュールは、蛍光データ及び分析結果を分析するための命令を記憶するために使用できる。例として、いくつかの実施形態では、データ分析用の命令、例えば、図１１Ａ及び図１１Ｂに関連して説明した上記のステップを実行するための命令がＲＯＭ７８に記憶できる。ＣＰＵは、ＲＯＭ７８に記憶された命令を使用して、ＲＡＭ８０に記憶されたデジタル化された蛍光データを操作して、サンプルの蛍光像（例えば、一次元または二次元の画像）を生成することができる。ＣＰＵは、永久記憶装置８２、例えばデータベースの蛍光像の記憶を行うことができる。図１２に概略的に示すように、分析モジュールは、受信したデータ（例えば、蛍光データ）からピクセルの強度及び他の量の計算を実行するためのグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）７６’を任意に含むことができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、光検出器によって生成されたアウトプット信号の周波数の復調は、ロックイン検出技術を使用して達成することができる。例として、図１３Ａ及び図１３Ｂを参照すると、このような１つの実施形態では、増幅された蛍光信号をデジタル化して（ステップ１）、デジタル化された蛍光信号の数個のコピーを生成して（ステップ２）おり、この場合デジタル化されたコピーの数（Ｎ）は、ＲＦコームビームに関連付けられている周波数の数に対応している。信号の各デジタル化されたコピーは、ＲＦコームビームの１つ及びＬＯビームの周波数の差に等しいビート周波数に対応する周波数を有する正弦曲線及び余弦曲線と乗算されて、複数の中間信号を生成する（ステップ２）。各中間信号がローパスフィルタを通過し（ステップ３）、それはＲＦコーム周波数間の周波数間隔の半分に等しい帯域幅を有する。
【００８９】
ＲＦコーム周波数の１つに対応する各ビート周波数（換言すれば、照射されるサンプルの空間的な位置に対応する各周波数）に対して、その周波数に対応する、２つのフィルタリングされた中間信号の２乗の和の平方根は、ＬＯビーム及び当該の周波数を有するＲＦコームビームによって照射されるサンプルの位置に対応する画像のピクセルの振幅の尺度として得られる（ステップ４）。いくつかの実施形態では、同じビート周波数に対応する（すなわち、同じサンプルの位置に対応する）複数の蛍光データ信号を上述の方法で処理することができ、ピクセルの値を平均して平均ピクセルの値を得ることができる。
【００９０】
サンプルがフローセルを垂直方向に流れるときに、サンプルの各々の水平の列について得られた蛍光データに対して、上記のステップを繰り返すことができる。ピクセルの値を用いて蛍光像を構築することができる（ステップ５）。
【００９１】
上記のロックインの検出方法は、ソフトウェア、ファームウェア及び／またはハードウェアで実施することができる。例として、一実施形態では、特に、６種を超える周波数が使用される場合、上記のロックイン検出方法は、フィールド・プログラマブル・ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、スイスのチューリッヒのＺｕｒｉｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが販売するＨＦ２Ｌ−ＭＦ多周波増幅器のような多周波数ロックイン増幅器を使用することができる。
【００９２】
さらなる例として、いくつかの実施形態では、検出された蛍光信号の周波数の復調は、バンドパスフィルタベースの画像復調技術を使用することによって達成することができる。図１４Ａ及び図１４Ｂを参照すると、このような周波数復調法の一実施形態では、光検出器６４及び増幅器７０によって提供される蛍光信号をデジタル化し（ステップ１）、デジタル化した信号の幾つかのコピーを生成し（ステップ２）、この場合デジタル化したコピーの数（Ｎ）は、ＲＦコームビームに関連する周波数の数に対応する。デジタル化された蛍光信号の各コピーは、その信号をＲＦコームビームの１つに関連するビート周波数（すなわち、サンプルの特定の位置に関連するビート周波数）を中心とするバンドパスフィルタに通すことによってフィルタリングされる（ステップ３）。より具体的には、バンドパスフィルタは、Ｎ個のビート周波数のうちの１つの中心に位置し、隣り合うビート周波数間の周波数間隔の半分に等しい帯域幅を有する。
【００９３】
各ビート周波数における包絡線検波器を用いて、各水平ラインについて、その周波数に対応する各ピクセルの振幅を推定する（ステップ４）。場合によっては、当該のピクセルに関連するサンプルの位置に対応する複数の蛍光信号を処理することによって得られたピクセルに対応する複数のピクセルの値を平均化して、平均ピクセルの値が得られる。サンプルがフローセルを垂直方向に流れるとき、サンプルの各々の水平の列について得られた蛍光データに対して上記のステップを繰り返すことができる。ピクセルの値は、サンプルの一次元または二次元の蛍光像を構築するために使用することができる（ステップ５）。
【００９４】
また、分析モジュールは、明視野像及び暗視野像のデータを受信及び処理するように構成できる。例えば、図９Ｃ及び図１０を参照すると、分析モジュール７２は、暗視野像及び明視野像を生成するために、光検出器２０８及び２１８から暗視野像及び明視野像のデータを受信するようにさらに構成することができる。例えば、図１２を参照すると、暗視野及び明視野像を生成するための命令は、例えば、当技術分野で公知の方法で、永久メモリ８２に記憶することができる。プロセッサ７６は、これらの命令を使用して、受信した暗視野像及び明視野像のデータを処理して画像を生成することができる。分析モジュールは、例えば蛍光像、明視野像及び暗視野像の一方または両方を重ね合わせることによって複合画像を生成するように構成することもできる。
【００９５】
上記のシステム１０のような、本教示によるシステムによって生成された蛍光像ならびに明視野像及び暗視野像は、異なる様々な方法で使用することができる。例えば、蛍光像は、従来のフローサイトメーターによって生成されたデータと同等な値を生成するために統合することができる。蛍光像はまた、当該の像を生じる蛍光プローブの位置を判定するために分析され得る（例えば、プローブが核にあるか、細胞質にあるか、細胞小器官に局在するか、細胞膜の外側にあるかを判定することができる）。さらに、いくつかの応用例では、すべてが同じ細胞から得られる異なる蛍光帯域を検出することにより得られる複数の蛍光像を用いて、細胞内で複数の蛍光プローブがどの程度共局在しているかを判定することができる。さらに、とりわけ、多色の蛍光像、明視野及び暗視野像を使用して、細胞の形態、細胞シグナル伝達、内在化、細胞−細胞相互作用、細胞死、細胞周期、及びスポット計数（例えば、ＦＩＳＨ）の分析が可能である。
【００９６】
上記のように、システム１０は、少なくとも３つの異なるモードで動作させることができる。上述した１つのモードでは、ＬＯビーム及び複数のＲＦコームビームがサンプルの一部（例えば、水平の広がりに沿って配置された位置）を同時に照射し、照射された場所から放射された蛍光放射線を検出し、サンプルの蛍光像を構築するために分析する。別の動作モードでは、複数のＲＦ駆動信号をＡＯＤに同時に印加するのではなく、駆動信号を含む周波数ランプをＡＯＤに印加して、レーザビームの周波数を開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）に経時的に変化させる。周波数ランプの各駆動周波数に対して、レーザビームの周波数はその駆動周波数だけシフトされ、サンプルは周波数シフトされたレーザビームによって照射され、サンプルから蛍光放射線を引き出す。言い換えれば、このモードでは、システムは、中心のレーザ周波数からシフトされる複数の周波数で一時的な間隔でサンプルを連続的に照射することによって、サンプルからの蛍光放射線を得るように動作させる。ＡＯＤによって生成される周波数シフトには角度の偏向が伴い、同一の光路を使用しながらビームがサンプルを横切って高速で走査される。
【００９７】
より具体的には、この動作モードでは、ＲＦ周波数シンセサイザ１０は、ＡＯＤ１８に印加される駆動信号を開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）にランプさせるために使用される。例として、駆動信号がランプされる周波数の範囲は、約５０ＭＨｚ〜約２５０ＭＨｚとすることができる。いくつかの実施形態では、駆動信号は、約１００ＭＨｚから約１５０ＭＨｚまでランプする。この実施形態では、例えば高速を成し遂げるために、駆動周波数が時間の経過とともに継続的に変更される。他の実施形態では、駆動周波数は、開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）まで離散的なステップで変更することができる。
【００９８】
周波数シフトされたビームがミラー２８を外れて、レンズ２６、レンズ３０、ミラー４０／４２、ビームスプリッタ４４、レンズ４６、ミラー５６、レンズ５０、ミラー５８及び対物レンズ５２によって画定される光路に沿って伝搬して、サンプルホルダを流れるサンプルの一部を照射するように、駆動周波数が選択される。ランプ速度は、サンプルがビームを横切って流れる際に放出される蛍光放射線に基づいて生成される蛍光像の垂直方向のいずれかのぼけを改善し、好ましくは防止するために十分に速いことが好ましい。これは、例えば、ランプ速度をサンプルの流速と一致させることによって達成できる。サンプルのレーザスポットの大きさは、適切な速度を推定するために使用することができる。例として、１マイクロメートルのレーザスポットの大きさの場合、画像がぼやけることを避けるために、０．１メートル／秒というサンプルの流速に対して１列にわたる走査時間を１０マイクロ秒以下にするべきである。
【００９９】
励起放射線による照射に応答してサンプルから放出された蛍光放射線は、上述の方法で収集され、検出される。具体的には、図１０を参照すると、蛍光放射線は光検出器６４によって検出される。検出された蛍光は増幅器７０によって増幅され、増幅された信号は分析モジュール７２によって分析されて、サンプルの蛍光像を再構成する。画像の再構成は、開始周波数（ｆ1 ）から終了周波数（ｆ2 ）までの走査期間内の特定の時間に、水平なピクセル位置を割り当てることによって行われる。上記の動作モードのようにピクセルの値を得るために周波数成分の振幅を分析することとは対照的に、この動作モードで使用される復調手法は、検出された蛍光信号の時間領域の値のみを用いて、画像のピクセルに値を割り当てる。サンプルの二次元蛍光像を得るために、サンプルが垂直方向に流れるときに、このプロセスを繰り返すことができる。
【０１００】
サンプルによって放出された蛍光放射線がもしあれば、光検出器６４によって収集される。図１０を参照すると、検出された蛍光放射線は、増幅器７０によって増幅される。分析モジュール７２は、増幅された信号を受信する。この動作モードでは、分析モジュールは蛍光信号を分析して、サンプル、例えば細胞／粒子の蛍光内容物を判定する。この動作モードでは、サンプルを励起するビームは１つしかないので、サンプルを励起するために応答してビート周波数は生成されない。したがって、蛍光信号の周波数領域に画像の情報は存在しない。むしろ、検出された蛍光信号は、時間の領域においてコード化された画像情報を有する。この動作モードでは、検出された蛍光信号の時間の値を水平なピクセルの座標として、また蛍光信号のデジタル化された電圧の値をピクセルの値（輝度）として使用して、デジタルで画像を再構成することができる。ＡＯＤに印加される駆動周波数のそれぞれの走査は、画像の１つの水平な列（行）を生成する。画像の再構成は、サンプルが照射領域（点）を流れる際に連続走査によって達成される。
【０１０１】
さらに別の動作モードでは、システム１０を動作させて、単一の励起周波数によってサンプルの複数の位置を同時に照射することができ、これは、例えば、無線周波数によるレーザビームの中心周波数をシフトすることによって生成できる。より具体的には、再び図１を参照すると、このような動作モードでは、単一の駆動無線周波数をＡＯＤ１８に印加して、ＡＯＤ１８に入射するレーザビームに対してシフトされる周波数を有するレーザビームを生成することができる。さらに、周波数シフトされるレーザビームは、ＡＯＤに入射するレーザビームに対する角度シフトを呈し、無線周波数のレーザビームがミラー２８によって遮蔽されて、レンズ３２、ミラー３３及び３５を介して、トップハットビーム整形器３４に向かって反射されるようにする。トップハットビーム整形器を出るビームはビームスプリッタ４４によって反射され、レンズ４６によって中間像面４８上に集束される。その面では、図１５Ａに概略的に示すように、レーザビーム１０００は、水平方向に沿って伸長するプロファイルを示す。
【０１０２】
水平方向に伸長するレーザビームは、ミラー５６によって正レンズ５０に向けて反射される。レーザビームは、レンズ５０を通過した後、ミラー５８によって対物レンズ５２に反射される。前述したように、正レンズ５０及び対物レンズ５２は、トップハットのプロファイルのレーザビームを中間像面４８からフローセル５４を流れるサンプル上に中継するための望遠鏡を形成している。
【０１０３】
水平に伸張されたレーザビームはサンプルの水平の広がりを照射して、サンプルに存在するならば、その水平の広がりに沿って対象のフルオロフォアを励起する。したがって、この動作モードでは、サンプルの複数の水平な位置が異なる励起周波数で照射される第１の動作モードとは異なり、サンプルの複数の水平な位置が同じ励起周波数で照射される。この動作モードにより、使用者が流れる細胞または粒子の画像を得ることは、可能にはならない。しかし、この動作モードでは、他の２つの動作モードよりも強力な光強度を典型的にサンプルに印加することができ、それは画像が必要でない場合には、より高い信号対雑音比のデータを得るために有用なことがある。この動作モードは、システムにいずれかの機械的な変更を加える必要なしに、音響光学偏向器を駆動する電気信号を単に変更することによって利用可能である。
【０１０４】
したがって、システム１０は、サンプルから蛍光放射線を引き出すために、３つの異なる動作モードで動作させることができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、蛍光寿命測定をサンプルの各々の空間的な位置で実行することができ、それは例えば、無線周波数シフトされた及び局部発振器のビームのそれぞれに関するビートの位相を、検出された蛍光信号における各無線周波数成分の位相と比較することによってなされる。例として、図１５Ｂは、このような蛍光寿命測定を可能にする、上述のシステム１０の修正版であるシステム１０’を示す（図１に示される特定の構成要素は、簡略化のためにこの図には示していない）。具体的には、ビームスプリッタ４４に入射するＲＦコームビームの一部は、ビームスプリッタによって収束レンズ４００上に反射される（この実施形態では例証として、レンズ４００は２００ｍｍの焦点距離を有するが、他の焦点距離も利用し得る）。レンズ４００は、ＲＦコームビームの当該の部分を、励起ビームを検出するフォトダイオード４０２に集束させる。フォトダイオード４０２のアウトプットは、分析モジュール７２によって受け取ることができる（図１０参照）。分析モジュールは、例えば上述の復調技術の１つを使用して励起ビームの周波数逆多重化をもたらし、励起ビームの各無線周波数成分の位相を判定することができる。これは、検出された蛍光信号の各無線周波数成分に対して、その無線周波数成分の位相を比較することができる参照位相を提供することができる。例えば、励起信号のＦＦＴの実数成分及び虚数成分、またはロックイン型復調のＩ成分及びＱ成分を用いることができる。あるいは、サンプル／フローセルの明視野像を検出する検出器のアウトプットを用いて、蛍光ビート周波数の位相を比較することができる基準位相を得ることができる。
【０１０６】
より具体的には、分析モジュール７２は、例えば上述したように、検出された蛍光信号の周波数逆多重化をもたらすことができる。当業者に理解されるように、蛍光信号の各ビート周波数について、空間的に分解された蛍光寿命測定及び蛍光寿命画像を得るために、無線周波数成分の位相を励起ビームのそれぞれの基準位相と比較することができる。
【０１０７】
特定の実施形態では、対象のシステムは、流れにおけるサンプルによって放射された光を検出するための上記光学的構成を使用するフローサイトメトリーシステムを含む。特定の実施形態では、対象のシステムは、米国特許第３，９６０，４４９号；第４，３４７，９３５号；第４，６６７，８３０号；第４，７０４，８９１号；第４，７７０，９９２号；第５，０３０，００２、第５，０４０，８９０号；第５，０４７，３２１号；第５，２４５，３１８号；第５，３１７，１６２号；第５，４６４，５８１号；第５，４８３，４６９号；第５，６０２，０３９号；第５，６２０，８４２号；第５，６２７，０４０号；第５，６４３，７９６号；第５，７００，６９２号；第６，３７２，５０６号；第６，８０９，８０４号；第６，８１３，０１７号；第６，８２１，７４０号；第７，１２９，５０５号；第７，２０１，８７５号；第７，５４４，３２６号；第８，１４０，３００号；第８，２３３，１４６号；第８，７５３，５７３号；第８，９７５，５９５号；第９，０９２，０３４号；第９，０９５，４９４号；及び第９，０９７，６４０号に記載されているフローサイトメーターの１つ以上の構成要素を含むフローサイトメトリーシステムであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
上述のように、いくつかの実施形態では主題のシステムは、フローサイトメーターの流れなどの、流れとして流れているサンプルの画像化粒子（例えば細胞）のために構成されている。フローストリームの粒子の流速は、０．００００１ｍ／ｓ以上、例えば０．００００５ｍ／ｓ以上、例えば０．０００１ｍ／ｓ以上、例えば０．０００５ｍ／ｓ以上、例えば０．００１ｍ／ｓ以上、例えば０．００５ｍ／ｓ以上、例えば０．０１ｍ／ｓ以上、例えば０．０５ｍ／ｓ以上、例えば０．１ｍ／ｓ以上、例えば０．５ｍ／ｓ以上、例えば１ｍ／ｓ以上、例えば２ｍ／ｓ以上、例えば３ｍ／ｓ以上、例えば４ｍ／ｓ以上、例えば５ｍ／ｓ以上、例えば６ｍ／ｓまたは０μＬ／ｍｉｎ以上、例えば７ｍ／ｓ以上、例えば８ｍ／ｓ以上、例えば９ｍ／ｓ以上、例えば１０ｍ／ｓ以上、例えば１５ｍ／ｓ以上、及び２５ｍ／ｓ以上などであってよい。例えば、流れ（例えば、フローノズルオリフィス）の大きさ次第で、流れは、０．００１μＬ／ｍｉｎ以上、例えば０．００５μＬ／ｍｉｎ以上、例えば０．０１μＬ／ｍｉｎ以上、例えば０．０５μＬ／ｍｉｎ以上、例えば０．１μＬ／ｍｉｎ以上、例えば０．５μＬ／ｍｉｎ以上、例えば１μＬ／ｍｉｎ以上、例えば５μＬ／ｍｉｎ以上、例えば１０μＬ／ｍｉｎ以上、例えば２５μＬ／ｍｉｎ以上、例えば５０μＬ／ｍｉｎ以上、例えば１００μＬ／ｍｉｎ以上、例えば２５０μＬ／ｍｉｎ以上、及び５００μＬ／ｍｉｎ以上などの対象のシステムにおける流速を有することができる。
【０１０９】
上述したように、サンプルに呼掛けることによって得られた、蛍光データなどの時間データ（信号）から、画像（例えば蛍光像）を再構成するために、複数の技術を使用することができる。いくつかの実施形態では、当該の信号を生成した可能性が最も高い基礎画像に到達するように、測定される信号を分析するために基礎画像に基づいて予測信号（例えば蛍光信号）を提供するフォワードモデルが使用される。いくつかの実施形態では、フォワードモデルを反転させて、画像を得るために測定信号で動作させるためのリバースモデルを生成することができる。例えば、フォワードモデルは、基礎画像をスペクトログラムの大きさとして扱うことができる。そのような場合には、画像に逆フーリエ変換を適用することによって、画像を生じさせる信号を得ることができる。次いでリバースモデルは、フーリエ変換を測定された信号に適用して画像に到達させることを伴う。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本教示によるサイトメトリーのシステムが、１つ以上のＲＦ周波数によって互いに隔てられる複数の光ビームによって照射されるサンプルの基礎となる「真の画像」を、測定される時間信号にいかに変換するかということを示唆するモデルを構成する。このモデルを反転し、システムの既知のパラメータまたは測定されたパラメータを組み込むことによって、測定された信号は、基礎となる真の画像に一層近似する推定値に変換することができる。さらなる例証として、図２０は、このようなモデルをいかに構築することができるかを概略的に示す。二次元強度マップ（Ｉ（ｘ，ｙ））として表されるサンプルの「真の画像」の生成、及び測定された信号（ｙ（ｔ））への変換は、検出アームに使用される照射システム、光学的収集システム、及び電子システムなどのサイトメトリーシステムの成分の複数の特性によって、影響を受ける。例として、照射システムは、他の要素の中でも、レーザビーム、レーザビームを受信する音響光学偏向器、及び偏向器にＲＦ信号を印加するためのＲＦ発生器を含むことができ、１つ以上のＲＦ周波数によって周波数において分離された複数の光学ビームを生成するようにする。これらのシステムに関連するパラメータ（楕円で示す）に関する知見により、サンプルの画像を推定する能力が向上する。例えば、いくつかの実施形態では、電子構成要素の応答は、画像信号を含まない電子構成要素の測定されたアウトプットの応答のフーリエスペクトルの部分から測定することができる。応答のロールオフのモデルが仮定され、モデルは測定された応答に適合させることができる。
【０１１１】
サンプルの照射スポットは、わずかに異なる周波数を有する２つのビームの光干渉によって生成することができる。ビームの経路長の差は、サンプルにおけるビート周波数の位相シフトを引き起こし得る。多くの実施形態では、システムの機械的振動による（例えば、冷却ファンによって引き起こされる）微小な経路長の変動でさえ、サンプルにおけるビームの位相に影響を及ぼし得る。ロックイン検出を展開するには、これらの位相の変化を考慮する必要がある。いくつかの実施形態では、全事象の前後の位相シフトは、典型的には高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を有し、そうでなければ位相を変えるべきでない、明視野信号の位相内容を用いて測定することができる。得られた位相シフトは、周波数領域で分割された信号のフーリエ成分の回転としてモデル化することができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、電子システムに関連するショット雑音は、その行に存在する信号の量に比例した白色ガウス雑音の行として画像に現れることが可能である。これは、独立したガウス雑音またはピクセル単位のポアソン雑音（各ピクセルの雑音はそのピクセルの強度に比例する）のいずれかを仮定する従来の画像化の大半の雑音モデルとは異なる。いくつかの実施形態では、この特性を有する雑音により像に誤りがある場合、基礎画像の最尤を見出すことによって、画像の質を改善することができる。１つの技術は、自然に生み出される画像が白色雑音とは異なり、ピクセルは相関がないという事実を適用する。このような技術は、真の画像が比較的平坦な強度の多くの領域を含むことを担うことができる。これは、最適化問題としての推定を表す。可能な限り測定信号に近いが、推定値内のその変動量を最小にする画像の推定値を見つける必要がある。いくつかの実施形態では、これは、以下のコスト関数によって達成することができる。
｜｜Ｇ−ｙ｜｜  ＋  λ（ｒ）×ＴＶ（Ｇ）
式中、｜｜Ｇ−ｙ｜｜は画像（Ｇ）の推定値と測定画像との間の距離に推定値Ｇの総分散（行に依存するペナルティ項λによって重み付けされる）を加えたものを表す。このコスト関数は、サンプルの最良適合画像を得るために最小化することができる。任意の最適化手法を使用して、この最小化（粒子群最適化、遺伝的アルゴリズム、または勾配降下を含む）を行うことができる。
【０１１３】
上述したように、いくつかの場合において、フォワードモデルはまた、信号に対する様々な雑音寄与モデル、例えばショット雑音モデル、及び光電子増倍管及び／または電子増幅器からの雑音寄与のモデル、例えば乗法雑音、熱雑音、高調波歪み、及び非線形歪みを組み込むこともできる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、統計的手法を使用して、モデルパラメータを測定データに適合させることができる。そのようないくつかの実施形態では、フォワードモデルを直接反転することはできない。場合によっては、そのような統計的手法は、測定データを生じさせる可能性が最も高いモデルパラメータを生成する最尤推定量として動作する。さらに、いくつかの実施形態では、上述のＦＦＴまたはロックインベースの処理などのリバースモデルを使用して再構成された画像を、このような統計的手法の初期（シード）画像として使用でき、信号対雑音比、及び／または画像の解像度をさらに高める。
【０１１５】
例として、図１９Ａのフローチャートを参照すると、本教示によるフローサイトメトリーを実行するための１つの例示的な方法では、サンプルにレーザ放射線を照射し、照射に応答してサンプルから放射される放射線の少なくとも一部を検出して、検出された放射線に対応する時間信号を生成する。フォワードモデルに基づく信号の統計分析は、サンプルの画像を再構成するように実行される。画像は、サンプルの蛍光像、暗視野像及び明視野像のいずれかとすることができる。
【０１１６】
さらなる例証として、このような統計的手法のいくつかの例を以下に示す。
【０１１７】
このような統計的手法の一例は、最小２乗最適化であり、それはシステム／プロセスを、正規分布の誤差を有する複数の線形成分の和としてモデル化することができる。例として、図１９Ｂを参照すると、信号を複数の短い時間セグメント（例えば、持続時間が約１〜１００マイクロ秒のセグメント）に分割することによって、サイトメトリー信号（例えば、蛍光、明視野及び／または暗視野）の信号をモデル化することができる（ステップ１）。いくつかの実施形態では、各セグメントは、ゼロ、一次及び二次の項と共に各画像のピクセルについて１つの正弦及び１つの余弦の項を有するものとしてモデル化することができ、Ｎ×Ｍのピクセル画像に適合する（２×Ｎ＋３）×Ｍのパラメータを得る。さらに、各セグメントは、雑音、例えば正規分布の雑音を含むようにモデル化することもできる。次いで、モデルによって予測された時間セグメントと、測定されたサイトメトリー信号と関連するそれぞれの時間セグメントとの間の差に対応する残差の２乗の和を最小化することによって、モデルのパラメータの測定された値を得るために、最小２乗法の回帰分析を使用することができる（ステップ２）。サイトメトリー画像の再構成に使用するための最小２乗最適化法は、高速であり、例えば、行列演算を使用して実施することができる。
【０１１８】
さらなる例として、図１９Ｃを参照すると、サンプルにレーザ放射線を照射することができ（ステップ１）、レーザ放射線（例えば本実施形態では蛍光放射線）による照射に応答してサンプルから放射される放射線を検出して、検出された放射線に対応する蛍光信号を生成し得る（ステップ２）。例えば、上記のシステムを用いて、無線周波数タグされた蛍光データを取得することができる。モデルから推定された蛍光シグナルと測定された蛍光シグナルとの間の差に対応する残差の２乗和を最小化することによって、最小２乗分析を使用して、サンプルのピクセル化された画像のモデルに関連するパラメータの最良の推定値（例えば、この実施形態ではサンプルの蛍光像）を得ることができる（ステップ３）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、勾配降下最適化法を、サイトメトリー画像、例えば、蛍光、明視野、及び／または暗視野の像の再構成のために使用することができる。この方法は、非線形モデルを使用することを可能にし、それによってフリーパラメータの数を減らし、通常は計算時間を犠牲にする。フリーパラメータが少なくなると、モデルの分散が減少し、それにより画像の信号対雑音比（ＳＮＲ）を改善できる。勾配降下は、画像（例えば、蛍光像）の初期推定から始めることができる反復性の最適化法である。より具体的には、図１９Ｄのフローチャートを参照すると、このような実施形態では、サンプルにレーザ放射線を照射することができ（ステップ１）、照明、例えば蛍光放射線に応答してサンプルから放射される放射線を検出して時間データを生成することができる（ステップ２）。時間データは、サンプルの画像の初期推定を生成するために処理することができる。例えば、いくつかの実施形態では、そのような推定は、サンプルから得られた時間データ、例えば蛍光データにＦＦＴまたは上記の最小２乗法を適用することによって得ることができる。サンプルの最終的な画像を得るために、画像の初期推定が反復的に改善される。各反復において、予測された信号と測定された信号との間の距離及び関連する誤差勾配を示す誤差関数が計算され、画像は誤差勾配がステップダウンする。反復プロセスは、誤差が最小になるまで繰り返され、それによって最良適合画像が生成される（ステップ３）。画像が誤差勾配をステップダウンするステップサイズは、例えば、計算時間と精度との間のトレードオフに基づいて選択することができる。
【０１２０】
場合によっては、最適化プロセスがパラメータ空間の極小にトラップされる可能性があるので、勾配降下最適化法は、最良のグローバルな画像に到達しないことがある。したがって、いくつかの実施形態では、粒子群最適化を、サイトメトリー画像の再構成に用いることができる。勾配降下最適化法と同様に、粒子群最適化は、画像の推定（例えば、検出された蛍光データに対してＦＦＴまたは最小２乗法を適用することによって得られる蛍光像の推定）から開始することができる。次いで、粒子群最適化は、それらの負の誤差勾配の方に偏るようにパラメータ空間を無作為にサンプリングする、それぞれが粒子と称される複数の（「群」）モデルを使用する。無作為サンプリングの程度を制御することにより、群はより遅い収束を犠牲にして極小を回避することができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、遺伝的アルゴリズムの最適化が画像の再構成に使用される。そのような方法では、ランダムに変化するパラメータを有するモデルの集団が用いられる。各モデルの「適応度」は、例えば、予測された画像データと測定された画像データとの間の誤差の程度に基づいて評価される。次いで、閾値よりも大きい「適応度」を有するモデルが選択され、それらのパラメータをランダムに結合して、新しい世代のモデルが生成される。これらの子孫は、最も適合したモデルが残るまで同じプロセスを経る。特に、画像のピクセルは、遺伝的アルゴリズムで使用されるパラメータである。システムのフォワードモデルは、このパラメータのセットを予想される時間信号に変換し、その後、予想された信号と測定された信号との間の差が、モデルの適合度を評価するために使用される。測定された信号とは非常に異なる時間信号を生成する画像は、あまり適合しないと考えられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、画像信号（例えば、蛍光、明視野または暗視野の信号）に関する先験的な情報を、ベイズスペクトル推定と一緒に使用して、高解像度画像を得ることができる。例として、いくつかの実施形態で、画像信号が、未知の周波数及び振幅の複数の正弦曲線からなることが分かる場合がある。そのようないくつかの実施形態では、ベイズスペクトル推定方法を使用して、従来のパワースペクトル手法を使用して得られるものよりも高い精度及び正確さでこれらの正弦曲線のパラメータを推定することができる。これは、ひいては従来可能であったよりも高い周波数分解能をもたらし、超高解像度の画像化を可能にし得る。言い換えれば、そのような実施形態では、時間領域信号は、限られた数のパラメータでの複数の独立した測定値として扱うことができ、パラメータの最尤推定値を得ることができる。
【０１２３】
画像を再構成するための上記の方法は、ハードウェア、ファームウェア及び／またはソフトウェアで実施することができる。例として、上記データ分析モジュール７２（例えば、図１０参照）は、統計分析技術を使用して上記の画像再構成法を実行するように構成することができる。例として、上記の方法を実行するための必要なステップを含むプログラムは、分析モジュールのメモリユニット、例えばＲＯＭに記憶することができる。次いで、モジュールのプロセッサは、プログラムにアクセスして、画像再構成法のステップを、試験中のサンプルから受け取った時間データ、例えば、蛍光データに適用することができる。
【０１２４】
以下の実施例は、本教示の様々な態様のさらなる解明のためにのみ提供され、本発明の教示を実施する最適な方法または得られる最適な結果を必ず示すことを意図してはいない。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
図９Ａに関連して上述したものと類似した検出システムと共に、図１に関連して上述したものと類似したシステムを用いて、８つの別個のレベルの蛍光色素で染色されたポリスチレン製ビーズから出る蛍光放射線を測定した。それらは、イリノイ州レイクフォレストのＳｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．により、商品名ＲＣＰ−３０−５Ａで市販されている。このシステムはまた、上述の方法で明視野及び暗視野の像を生成するために使用された。
【０１２６】
図１６Ａは、暗視野強度対明視野強度の散布図である。プロットの矩形部分をゲートとして使用して、図１６Ｂ、図１６Ｃ、及び図１６Ｄに示すデータを生成した。これは測定されたすべての事象の約３２％を含む（合計５０，０００事象が検出された）。図１６Ｂは、各粒子によって放出される赤色蛍光（ＰＩ）対緑色蛍光（ＦＩＴＣ）の散布図を示す。このプロットは、明るさのレベルが異なる８つの集団を明確に示している。図１６Ｃ及び図１６Ｄは同じデータのヒストグラムである。
【０１２７】
実施例２
ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色した固定末梢血白血球のＦＩＲＥ、明視野及び暗視野の像を、図９Ａに関連して上述したものと類似した検出システムと共に図１に関連して上述したものと類似したシステムを用いて得た。サンプルはまた、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色された生存ＨｅＬａ細胞の一部を含んでいた。細胞は、データ取得間に０．５ｍ／秒の速度でフローセルを通って流れていた。
【０１２８】
図１７Ａに示す画像は、上から下へ、明視野、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、及びヨウ化プロピジウム蛍光チャンネルのオーバーレイ、明視野、暗視野、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、及びＰＩチャンネル蛍光である。補正は適用されず、すべての画像は表示のために自動スケーリングされている。２、３、５、８、９、１２、１７，２０、及び２１という番号の細胞は、ＨｅＬａ細胞（Ｂ集団）であり、他の細胞は白血球（Ａ集団）である。
【０１２９】
図１７Ｂは、集団Ａが白血球を表し、集団ＢがＨｅＬａ細胞を表す散布図である。
【０１３０】
実施例３
ＣＤ４５−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウムで染色された固定末梢血白血球のＦＩＲＥ、明視野及び暗視野の像を、図９Ａに関連して上述したものと類似した検出システムと共に図１に関連して上述したものと類似したシステムを用いて得た。サンプルは、固定されたＭＣＦ−７細胞の小部分を添加し、抗ＥｐＣＡＭ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。細胞は、データ取得間に０．５ｍ／秒の速度でフローセルを通って流れていた。
【０１３１】
図１８Ａに示す画像は、上から下へ、明視野、ＦＩＴＣ及びＰＩチャネル蛍光のオーバーレイ、明視野、暗視野、ＦＩＴＣ及びＰＩ蛍光である。白血球集団において、緑色蛍光は、ＰＩ染色由来の蛍光過剰の人工物である。すべての画像は、表示のために明るさが自動調整され、したがって、白血球はＦＩＴＣ蛍光を示しているように見えるが、これはＰＩからの小さな蛍光過剰信号である。１、２、４、５、１０、１３、１５及び１６という番号の細胞がＭＣＦ−７細胞である。
【０１３２】
図１８Ｂは、集団Ａが白血球を表し、集団ＢがＭＣＦ−７細胞を表す散布図である。
【０１３３】
実施例４
図２１Ａは、細長いミドリムシ（藻類）細胞による光消滅及び光散乱の高い信号対雑音（ＳＮＲ）のＦＩＲＥ測定を示し、細胞の存在により信号が減少する。図２１Ｂは、図２１Ａに示す信号のフーリエ成分を抽出して得られた細胞の画像を示す。これは、細胞の許容可能な画像である。しかし、この画像は、上述したように、ＦＩＲＥ励起信号、電子応答、及びシステムの位相応答に関する情報を組み込んで、図２１Ｃに示す画像を生成することによって改善することができる。
【０１３４】
実施例５
図２２Ａは、蛍光による実施例４のミドリムシ細胞の脂質内容物の低信号対雑音ＦＩＲＥ測定を示す。蛍光ターゲットによって生成される明確なパルスが存在しているが、大量の雑音が信号を破壊している。図２２Ｂは、信号のフーリエ係数を抽出した結果を示す。細胞は雑音に対して認識されていない。収集用電子装置の周波数応答、システムを駆動する基礎のＦＩＲＥ信号、及びシステムの位相応答に関する情報を組み込むことにより、図２２Ｃに示す改善されたが雑音が多い画像が生成される。上述の方法で、基礎信号のより洗練されたモデル及びフォトニックショット雑音の影響が、図２２Ｄに示される画像を生成する。
【０１３５】
当業者であれば、本教示の範囲から逸脱することなく様々な変更を行うことができることを理解するであろう。特に、上述の実施形態の様々な特徴、構造、または特性は、適切な方法で組み合わせることができる。例えば、一実施形態に関連して論じた検出システムを別の実施形態で使用することができる。
【０１３６】
関連出願
本願は、２０１６年５月１２日に出願された「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」と題する仮特許出願第６２／３３５，３５９号に対する優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本願はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１７年３月１７日に出願された「Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ」と題された米国特許出願第１５／４６１，１２４号にも関連する。
【図１】
2019521316.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【国際調査報告】
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