(57)【要約】壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法が開示される。一局面において、上記方法は、弾性ステント上に取り付けた生体心臓弁を提供すること；上記生体心臓弁を組織固定液で処理すること；上記ステントおよび上記生体弁を、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；上記生体弁を、罹患した生得の弁の部位における上記脈管の中に移植すること；上記被覆組成物を上記生体弁から溶出すること；ならびに（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）上記生体心臓弁組織を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化させることによって、上記生体心臓弁への幹細胞（上記幹細胞は、上記生体心臓弁の外部または近辺を循環する）の付着を防止することによって、上記生体心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害することを包含する。
2019520184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法であって、該方法は、
１またはこれより多くの弁尖を有する組織を含む生体心臓弁を提供することであって、該生体心臓弁は、罹患した生得の弁の置換のために弾性ステント上に取り付けられていること；
該生体心臓弁を組織固定液で処理すること；
該ステント、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方を、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；
該生体弁を罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植すること；
該被覆組成物を該弾性ステント、１種もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出すること；
（ｉ）循環する幹細胞における、（ｉｉ）該生体心臓弁組織を覆う内皮細胞ライニングにおける、または（ｉｉｉ）両方における、一酸化窒素生成を活性化することによって、該生体心臓弁、弾性ステントまたは両方の外部または近辺を循環する幹細胞の、該生体心臓弁への付着を防止することによって、該生体心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、
を包含する方法。
【請求項２】
前記幹細胞は、ｃＫｉｔ陽性幹細胞  ＳＣＡ１細胞、ＣＯＰ細胞、間葉系幹細胞および前述のものの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体心臓弁組織を、アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、Ｌ−アルギニン、シトルリン、ＮＡＤＰＨ、アセチルコリン、ヒスタミン、アルギニンバソプレッシン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ブラジキニン、アデノシン二リン酸・三リン酸、５−ヒドロキシトリプタミン、トロンビン、インスリン、グルココルチコイド、サリチレート、Ｌ−ＮＭＭＡ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、５−一硝酸イソソルビド、亜硝酸アミル、ニコランジル、テトラヒドロビオプテリン、ゼチーアおよび前述のものの組み合わせから選択されるｅＮＯＳアクチベーターで処理することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被覆組成物は、前記幹細胞から発生する骨芽細胞における骨形成を阻害するための、（ｉ）抗増殖剤；（ｉｉ）細胞外生成のインヒビター；（ｉｉｉ）骨芽細胞生成のインヒビター；および（ｉｖ）前述のものの組み合わせのうちの１またはこれより多くを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗増殖剤は、パクリタキセル、シロリムス、ビオリムス、エベロリムスおよび前述のものの組み合わせから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外生成のインヒビターは、抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターまたは両方から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターは、ロナファルニブ、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ  Ｒ１１５７７７、ＦＴＩ  ＳＣＨ６６３３６、ＳＴＩ５７１、ＦＬＴ−３インヒビター、プロテアソームインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、ＢＭＳ−２１４６６２、タンパク質パルミトイル化、ファルネシル−ペプチドパルミトイル化のタイプＩ非脂質インヒビターまたはミリストイル−ペプチドパルミトイル化のタイプ２インヒビター、パルミトイル化アシルトランスフェラーゼインヒビター、２−ブロモパルミトイル（２ＢＰ）を含む脂質ベースのパルミトイル化インヒビター、ツニカマイシン、セルレニンおよび前述のものの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記骨芽細胞生成のインヒビターは、アレンドロネート、リセドロネート、ゾレドロン酸、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、チルドロネート、デノスマブ抗体、カルシトニン−カルシメア、ミアカルシン、フォルテオテリパラチド、ラロキシフェン（エビスタ）および前述のものの組み合わせを含むビスホスホネート薬物のような抗骨粗鬆症剤から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ｅＮＯＳアクチベーターの経口投与量を投与することをさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記経口投与量は、１日あたり１０ｍｇ〜８０ｍｇのアトルバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのシンバスタチン；１日あたり５ｍｇ〜４０ｍｇのロスバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのプラバスタチン；１日あたり１ｍｇ〜４ｍｇのピタバスタチン；１日あたり１０ｍｇのゼチーアおよび前述のものの組み合わせを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、前記抗パルミトイル化インヒビターまたは両方の経口投与量を投与することをさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与量は、有効量のゼチーア１０ｍｇと組み合わせて１１５ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の範囲で、１１５ｍｇ／ｍ２用量の投与量でのロナファルニブを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
筋肉内注射または皮下注射によって有効量のＰＣＳＫ９インヒビターを投与することをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの最初の用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記最初の用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記有効量は、２〜４週間ごとにアリロクマブ７５〜１５０ｍｇ、２週間ごとにもしくは１ヶ月に１回のエボロクマブ１４０ｍｇ、および前述のものの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
壁を有する脈管における移植後の機械式心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法であって、該方法は、
Ｇｏｒｔｅｘ材料によって覆われたソーイングリングを有する機械式心臓弁を提供すること；
該機械式心臓弁、該Ｇｏｒｔｅｘ材料、または両方を、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；
該機械式心臓弁を罹患した生得の弁の部位の部位において該脈管に移植すること；
該被覆組成物を、該機械式心臓弁、該Ｇｏｒｔｅｘ材料または両方から溶出すること；
（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）該機械式心臓弁および／もしくはＧｏｒｔｅｘ材料を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化することによって、該機械式心臓弁の外部または近辺を循環する幹細胞の、該機械式心臓弁またはＧｏｒｔｅｘ材料への付着を防止することによって、該機械式心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、
を包含する方法。
【請求項１８】
壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法であって、該方法は、
ソーイングリングを有しステントのない手術用心臓弁を提供することであって、該手術用心臓弁は、１もしくはこれより多くの弁尖を有する組織を含み、該手術用心臓弁は、罹患した生得の弁の置換用である、こと；
該手術用心臓弁を組織固定液で処理すること；
該手術用心臓弁、１もしくはこれより多くの弁尖および／またはソーイングリングを、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；
該手術用心臓弁を、罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植すること；
該被覆組成物を該ソーイングリング、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出すること；
（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）該手術用心臓弁を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化することによって、該手術用心臓弁の外部または近辺を循環する幹細胞の、該手術用心臓弁への付着を防止することによって、該手術用心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１６年６月２７日に出願した係属中の米国出願第１５／１９３，２０８号の一部継続出願であり、米国出願第１５／１９３，２０８号は、２０１４年４月２８日に出願した米国出願第１４／２６３，４３８号の分割出願であり、米国出願第１４／２６３，４３８号は、２０１２年１０月２２日に出願し、放棄した米国出願第１３／６５６，９２５号の一部継続出願である。そして本願は、２０１５年４月１５日に出願した係属中の米国出願第１４／６８７，４７９号の一部継続出願であり、米国出願第１４／６８７，４７９号は、２０１４年４月２８日に出願した係属中の米国出願第１４／２６３，４３８号の一部継続出願であり、米国出願第１４／２６３，４３８号は、２０１２年１０月２２日に出願し、放棄した米国出願第１３／６５６，９２５号の一部継続出願である。そして本願は、２０１６年４月２２日に出願した係属中の米国出願第１５／０３１，５３２号の一部継続出願であり、米国出願第１５／０３１，５３２号は、２０１４年１０月２２日に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６１７４５号に対する優先権を主張する３７１（ｃ）国内段階出願である。これらの全体は、本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、心臓弁および心臓弁補綴物の狭窄、閉塞、または石灰化を阻害するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
心臓は、律動的に収縮することによって生物の身体全体に血液を循環させる中空の筋性の器官である。哺乳動物において、心臓は、右心房および右心室が、左心房および左心室から完全に隔てられているように配置されている４つの部屋を有する。通常は、血液は、体静脈から右心房へと流れ、次いで、右心室へ、右心室から血液が肺へと肺動脈を介して駆出される。肺から戻ると、血液は左心房に入り、次いで左心室へと流れ、左心室から血液は体動脈へと駆出される。
【０００４】
４つの主要な心臓弁（三尖弁、肺動脈弁、僧帽弁、および大動脈弁）が、律動的収縮の間の血液の逆流を防止する。三尖弁は、右心房と右心室とを隔てており、肺動脈弁は、右心房（ｒｉｇｈｔ  ａｔｒｉｕｍ）と肺動脈とを隔てており、僧帽弁は、左心房と左心室とを隔てており、そして大動脈弁は、左心室と大動脈とを隔てている。一般に、心臓弁の異常を有する患者は、心臓弁膜症を有すると特徴づけられる。
【０００５】
心臓弁が機能不全に陥り得る１つの過程は、狭窄に起因して適切に開かなくなることであり、手術または経皮的動脈手段によるこの弁の置き換えが必要となる。置換弁は、代表的には、他の動物（例えば、ブタまたはウシ）の弁から作製される生体弁（bioprosthetic  valve）である。残念ながら、時間を経ると、その置換弁自体は、狭窄、閉塞および石灰化のような問題を起こしやすい。
【０００６】
長年にわたって、心臓の石灰化は、受動的変性現象であると考えられていた。米国特許出願番号２００２／０１５９９８３におけるＲａｊａｍａｎｎａｎの研究は、不成功に終わったが、まず、罹患心臓弁の狭窄および石灰化という課題に対処しようと試みた。Ｒａｊａｍａｎｎａｎは、内皮型一酸化窒素シンターゼ（一酸化窒素シンターゼ活性を有するポリペプチド）をコードまたは活性化する外因性核酸を含む、生きている、固定されていない心臓弁細胞を有する心臓弁組織の狭窄、閉塞または石灰化を阻害するための方法を開示する。当時は、グルタルアルデヒドを使用して加工処理される前に、一酸化窒素が生きている組織の石灰化を停止させると考えられた。Ｒａｊａｍａｎｎａｎは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）を使用し、そのポリペプチド（内皮型一酸化窒素シンターゼ）が発現されるように、心臓弁の生きている細胞へ注射（ヒトまたはブタ−インビボまたはインビトロで）することによって外因性核酸（ｅＮＯＳ）を導入した。その細胞は、石灰化を停止させる過剰量の一酸化窒素シンターゼを作製すると考えられた。Ｒａｊａｍａｎｎａｎはまた、ヒドロキシメチルグルタリルｃｏＡレダクターゼ活性のインヒビター（例えば、プラバスタチン、アトルバスタチン、シンバスタチンまたはロバスタチン）を経口で哺乳動物に投与すること、および／またはその細胞を、前述を含むウシ血清に浸すことを開示する。前述の処置の後、ヒトまたはブタの心臓弁はグルタルアルデヒドで固定された。上記で特に言及されるように、この技術は、不成功に終わった。
【０００７】
必要なものは、心臓弁および生体心臓弁の狭窄、閉塞、および／または石灰化の形成を阻害する新しい方法およびシステムである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の簡単な要旨
本発明に従う心臓弁および方法は、従来の生体心臓弁、手術用心臓弁および機械式心臓弁に伴う欠点に対処する。
【０００９】
１つの態様では、壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法は、１またはこれより多くの弁尖を有する組織を含む生体心臓弁を提供することであって、該生体心臓弁は、罹患した生得の弁の置換のために弾性ステント上に取り付けられていること；該生体心臓弁を組織固定液で処理すること；該ステント、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方を、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；該生体弁を罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植すること；該被覆組成物を該弾性ステント、１種もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出すること；（ｉ）循環する幹細胞における、（ｉｉ）該生体心臓弁組織を覆う内皮細胞ライニングにおける、または（ｉｉｉ）両方における、一酸化窒素生成を活性化することによって、該生体心臓弁、弾性ステントまたは両方の外部または近辺を循環する幹細胞の、該生体心臓弁への付着を防止することによって、該生体心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、を包含する。
【００１０】
本発明の別の態様では、方法の幹細胞は、ｃＫｉｔ陽性幹細胞  ＳＣＡ１細胞、ＣＯＰ細胞、間葉系幹細胞および前述のものの組み合わせから選択される。
【００１１】
本発明の別の態様では、前記方法は、前記生体心臓弁組織を、アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、Ｌ−アルギニン、シトルリン、ＮＡＤＰＨ、アセチルコリン、ヒスタミン、アルギニンバソプレッシン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ブラジキニン、アデノシン二リン酸・三リン酸、５−ヒドロキシトリプタミン、トロンビン、インスリン、グルココルチコイド、サリチレート、Ｌ−ＮＭＭＡ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、５−一硝酸イソソルビド、亜硝酸アミル、ニコランジル、テトラヒドロビオプテリン、ゼチーアおよび前述のものの組み合わせから選択されるｅＮＯＳアクチベーターで処理することをさらに包含する。
【００１２】
本発明の別の態様では、前記被覆組成物は、前記幹細胞から発生する骨芽細胞における骨形成を阻害するための、（ｉ）抗増殖剤；（ｉｉ）細胞外生成のインヒビター；（ｉｉｉ）骨芽細胞生成のインヒビター；および（ｉｖ）前述のものの組み合わせのうちの１またはこれより多くを含む。
【００１３】
本発明の別の態様では、前記抗増殖剤は、パクリタキセル、シロリムス、ビオリムス、エベロリムスおよび前述のものの組み合わせから選択される。
【００１４】
本発明の別の態様では、前記細胞外生成のインヒビターは、抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターまたは両方である。
【００１５】
本発明の別の態様では、前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（anti-farnysltransferase  inhibitor）および／または抗パルミトイル化インヒビターとしては、ロナファルニブ、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ  Ｒ１１５７７７、ＦＴＩ  ＳＣＨ６６３３６、ＳＴＩ５７１、ＦＬＴ−３インヒビター、プロテアソームインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、ＢＭＳ−２１４６６２、タンパク質パルミトイル化、ファルネシル−ペプチドパルミトイル化のタイプＩ非脂質インヒビターまたはミリストイル−ペプチドパルミトイル化のタイプ２インヒビター、パルミトイル化アシルトランスフェラーゼインヒビター、２−ブロモパルミトイル（２ＢＰ）を含む脂質ベースのパルミトイル化インヒビター、ツニカマイシン、セルレニンおよび前述のものの組み合わせが挙げられる。
【００１６】
本発明の別の態様では、前記骨芽細胞生成のインヒビターとしては、アレンドロネート、リセドロネート、ゾレドロン酸、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、チルドロネート、デノスマブ抗体、カルシトニン−カルシメア、ミアカルシン、フォルテオテリパラチド、ラロキシフェン（Raloxfine）（エビスタ）および前述のものの組み合わせを含むビスホスホネート薬物のような抗骨粗鬆症剤が挙げられる。
【００１７】
本発明の別の態様では、ｅＮＯＳアクチベーターの経口投与量を投与することをさらに包含する。前記経口投与量としては、１日あたり１０ｍｇ〜８０ｍｇのアトルバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのシンバスタチン；１日あたり５ｍｇ〜４０ｍｇのロスバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのプラバスタチン；１日あたり１ｍｇ〜４ｍｇのピタバスタチン；１日あたり１０ｍｇのゼチーアおよび前述のものの組み合わせが挙げられる。
【００１８】
本発明の別の態様では、前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、前記抗パルミトイル化インヒビターまたは両方の経口投与量は、患者に投与される。前記投与量としては、有効量のゼチーア１０ｍｇと組み合わせて１１５ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の範囲で、１１５ｍｇ／ｍ２用量の投与量でのロナファルニブを含み得る。
【００１９】
本発明の別の態様では、有効量のＰＣＳＫ９インヒビターは、筋肉内注射または皮下注射によって患者に投与される。前記ＰＣＳＫ９インヒビターの最初の用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇ；０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。
【００２０】
本発明の別の態様では、前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記有効量は、２〜４週間ごとにアリロクマブ７５〜１５０ｍｇ、２週間ごとにもしくは１ヶ月に１回のエボロクマブ１４０ｍｇ、および前述のものの組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
本発明をよりよく理解し、本発明がどのように実行され得るかを示すために、ここで例示によって、添付の図面に言及がなされる。
【００２２】
【図１】図１は、ウシまたはブタから心臓弁を得、これをグルタルアルデヒドで固定して、その組織を不活性にし、その組織をステント付きの弁または手術用置換弁の中に配置するという商業的プロセスの図示である。
【００２３】
【図２Ａ】図２Ａは、組織で覆われたソーイングリングを有する手術用生体心臓弁の斜視図である。
【００２４】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ソーイングリング上を覆うＧｏｒｔｅｘを有する機械式心臓弁の上面図である。
【００２５】
【図２Ｃ】図２Ｃは、経皮的なステント付き生体心臓弁の斜視図である。
【００２６】
【図３】図３は、心臓石灰化の細胞起源および心臓弁上での骨形成の３つの段階を図示する。
【００２７】
【図４】図４は、３種のウサギ処置群（左縦列、コントロール食餌；中央縦列、コレステロール食餌；および右縦列、コレステロール食餌＋アトルバスタチン）からの移植弁の光学顕微鏡検査スライドを示す（いずれも、フレームは倍率２０倍、右下隅は倍率１００倍）。パネルＡ．マッソントリクローム染色。パネルＣ．増殖中の細胞の核抗原染色。パネルＤ．オステオポンチン染色。
【００２８】
【図５】図５は、３種のウサギ処置群からの移植弁の半定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す；生体弁の総ＲＮＡを使用する、ｃＫｉｔ（７３１ｂｐ）、サイクリン（１５１ｂｐ）、オステオポンチン（ＯＰ）（１０２ｂｐ）、Ｓｏｘ９（１７０ｂｐ）、Ｃｂｆａ−１（２８９ｂｐ）、およびＧＡＰＤＨ（４５１ｂｐ）に関するＲＴ−ＰＣＲ。
【００２９】
【図６】図６は、生体弁石灰化の機構を図示する。
【００３０】
【図７】図７は、ウサギ研究から取り出した心膜弁からのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴＰＣＲ）の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、弁の固定およびその後の弁移植の必要な患者における弁移植の後に、ソーイングリング１２ありまたはなしのステント付きの生体心臓弁１１または手術用置換弁１０における弁尖および弁組織の狭窄、閉塞、および／または石灰化を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、機械式心臓弁のソーイングリング１８の周りのＧｏｒｔｅｘライニング１６を有する機械式心臓弁１４の狭窄、閉塞、および／または石灰化を阻害するための方法を提供する。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「狭窄（ｓｔｅｎｏｓｉｓ）」とは、心臓からの血流を遮断または閉塞し得、心臓における流れおよび圧力の逆流を引き起こし得る、心臓弁の狭窄をいう。弁狭窄は、とりわけ、疾患（例えば、リウマチ熱）に起因する瘢痕化；進行性石灰化；進行性の摩耗および断裂が挙げられるが、これらに限定されない種々の原因から生じ得る。これは、ステント化処置にとってではなく、弁にとって重要である（この流れは特許の残りの部分に十分ですか）。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「弁（ｖａｌｖｅ）」とは、律動的収縮の間の血液の逆流を防止する４つの主要な心臓弁のうちのいずれかを指し得る。その４つの主要な心臓弁は、三尖弁、肺動脈弁、僧帽弁、および大動脈弁である。三尖弁は、右心房と右心室とを隔てており、肺動脈弁は、右心房（ｒｉｇｈｔ  ａｔｒｉｕｍ）と肺動脈とを隔てており、僧帽弁は、左心房と左心室とを隔てており、そして大動脈弁は、左心室と大動脈とを隔てている。従って、一局面において、生体弁および罹患（diseased）弁は、大動脈弁、肺動脈弁、三尖弁、または僧帽弁であり得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「生体弁（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｖａｌｖｅ）」とは、ステント付き組織心臓弁であり、欠損しているか、機能不全であるか、または失われている（ｍｉｓｓｉｎｇ）心臓弁を置き換えるかまたは補うために使用されるデバイスを指し得る。生体弁補綴物（bioprosthetic  valve  prostheses）の例としては、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓａｐｉｅｎ  １  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓａｐｉｅｎ  ２  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓａｐｉｅｎ  ３  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、およびＥｄｗａｒｄｓ  Ｓａｐｉｅｎ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒの弁の全ての他のバリエーション（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓａｐｉｅｎ  ＸＴ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅが挙げられるがこれらに限定されない）、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｏｔｕｓ  Ｅｄｇｅ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｈｅａｒｔ  ＶａｌｖｅおよびＬｏｔｕｓ  Ｖａｌｖｅの全てのバリエーション、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｒｅ  Ｖａｌｖｅ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  ＶａｌｖｅおよびＭｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｒｅ  Ｖａｌｖｅ  Ｅｖｏｌｕｔ  Ｒ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｖａｌｖｅ、Ｍｅｌｏｄｙ  Ｔｒａｎｓｃａｔｈｅｔｅｒ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｖａｌｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｙおよびこれらの全てのバリエーションが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
一般に、生体弁（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）は、１またはこれより多くの弁尖（cusp）を有する組織弁を含み、その弁は、フレームまたはステント（その両方とも、代表的には、弾性である）に取り付けられている。本明細書で使用される場合、用語「弾性の（ｅｌａｓｔｉｃａｌ）」とは、デバイスが可撓性であり得るか、折りたたみ可能であるか、拡張可能であるか、またはこれらの組み合わせであり得ることを意味する。弁の弁尖は、一般に、哺乳動物（例えば、ブタ（ｐｉｇｓ（ｐｏｒｃｉｎｅ））、ウシ（ｃｏｗｓ（ｂｏｖｉｎｅ））、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない）の組織から作製される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「手術用心臓弁（ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｈｅａｒｔ  ｖａｌｖｅ）」とは、組織およびソーイングリングのみを含み、ブタまたはウシから採取されたものである。手術用心臓弁は、代表的には、ステントレスである（ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ）。手術用心臓弁の非限定的例としては、以下が挙げられる：ＡＴＳ  ３Ｆ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｍａｇｎａ  Ｅａｓｅ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｍａｇｎａ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｍａｇｎａ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｔｈｅｏｎ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＥＲＩＭＯＵＮＴ  Ｔｈｅｏｎ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄｕｒａｆｌｅｘ  Ｌｏｗ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｄｕｒａｆｌｅｘ生体僧帽弁（ブタ）、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｓ．Ａ．Ｖ．  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｐｒｉｍａ  Ｐｌｕｓ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標）  Ａｏｒｔｉｃ  Ｒｏｏｔ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｈａｎｃｏｃｋ（登録商標）  ＩＩ  Ｓｔｅｎｔｅｄ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｈａｎｃｏｃｋ  ＩＩ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｍｏｓａｉｃ（登録商標）  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｃ、Ｍｏｓａｉｃ  Ｕｌｔｒａ（登録商標）  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ、Ｓｔ．  Ｊｕｄｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｉｏｃｏｒ（登録商標）、Ｂｉｏｃｏｒ．ＴＭ．Ｓｕｐｒａ、Ｂｉｏｃｏｒ（登録商標）  Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａ、Ｂｉｏｃｏｒ．ＴＭ．Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ、Ｅｐｉｃ．ＴＭ、Ｅｐｉｃ  Ｓｕｐｒａ．ＴＭ、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｖａｌｖｅ  （ＳＰＶ（登録商標））、Ｔｏｒｏｎｔｏ  ＳＰＶ  ＩＩ（登録商標）、Ｔｒｉｆｅｃｔａ、Ｓｏｒｉｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｉｔｒｏｆｌｏｗ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｖａｌｖｅ（登録商標）、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ  ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅ（登録商標）  Ｃｒｙｏｌｉｆｅ  ｐｕｌｍｏｎｉｃ  Ｖａｌｖｅ（登録商標）、Ｃｒｙｏｌｉｆｅ−Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  ａｏｒｔｉｃ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｖａｌｖｅ（登録商標）Ｃｏｎｔｅｇｒａ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｖａｌｖｅ  Ｃｏｎｄｕｉｔ、Ｅｐｉｃ  Ｓｔｅｎｔｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｎｘ  ＡＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｏｒｔｉｃ  ａｎｄ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｖａｌｖｅｓ；Ｔｒｉｆｅｃｔａ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａｏｒｔｉｃ  ａｎｄ  Ｍｉｔｒａｌ  Ｖａｌｖｅｓ。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「機械式心臓弁（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｈｅａｒｔ  ｖａｌｖｅ）」とは、熱分解性炭素のような生体適合性材料から代表的に製造されるものである。機械式心臓弁の非限定的例としては、以下が挙げられる：ＳＪＭ  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ，  Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ；およびＳｔａｒｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｖａｌｖｅ，  Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ；Ｓｍｅｌｏｆｆ  Ｃｕｔｌｅｒ  Ｖａｌｖｅ，  Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ；Ｃａｇｅｄ  Ｂａｌｌ  Ｖａｌｖｅ，  Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ；傾斜式ディスク弁、Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ；二葉弁、Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ；Ｂｊｏｒｋ−Ｓｈｉｌｅｙ  Ｖａｌｖｅ，  Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｈａｌｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ，  Ｍｉｔｒａｌ  ａｎｄ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｓ、Ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ  Ｒｉｎｇｓ（Ｐｈｙｓｉｏ  ＩおよびＰｈｙｓｉｏ  ＩＩを含む）、Ｄｕｒａｎ  ＡｎＣｏｒｅ  Ｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｎｄ、ＣＧ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂａｎｄ、Ｐｒｏｆｉｌｅ  ３Ｄ  Ｒｉｎｇ、Ｏｐｅｎ  Ｐｉｖｏｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ、Ｍｅｄｔｒｏｉｎｃ  Ｏｐｅｎ  Ｐｉｖｏｔ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｖａｌｖｅｄ  Ｇｒａｆｔ、Ｓｉｍｕｌｕｓ  Ａｄｊｕｓｔｉｂｌｅ  Ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｍｕｌｕｓ  Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｍｕｌｕｓ  Ｓｅｍｉ−Ｒｉｇｉｄ  Ａｎｎｕｌｏｐｌａｓｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｍｐｌａｔｚｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｐａｔｅｎｔ  Ｆｏｒａｍｅｎ  Ｏｖａｌｅ、Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｓｅｐｔａｌ  Ｃｌｏｓｕｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅ、Ａｔｒｉａｌ  Ｓｅｐｔａｌ  Ｄｅｆｅｃｔ  Ｄｅｖｉｃｅ、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｕｃｔｕｓ  Ａｒｔｅｒｉｏｓｕｓ  Ｄｅｖｉｃｅが挙げられるが、これらに限定されない）、およびＣｒｙｏＬｉｆｅ  Ｏｎ−Ｘ  Ｖａｌｖｅｓ（Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｆｏｒｍ−Ａ  Ｓｅｗｉｎｇ  Ｒｉｎｇ、Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ａｎａｔｏｍｉｃ  Ｓｅｗｉｎｇ  Ｒｉｎｇ、Ａｏｒｔｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｗｉｎｇ  Ｒｉｎｇ、Ｍｉｔｒａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｅｗｉｎｇ  Ｒｉｎｇ、Ｍｉｔｒａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｎｆｏｒｍ−Ｘ  ｓｅｗｉｎｇ  Ｒｉｎｇ、Ａｓｃｅｎｄｉｎｇ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓが挙げられるが、これらに限定されない）。
【００３８】
ここで図１を参照すると、罹患した生得（native）弁の経皮的弁置換に対する手術用弁置換において、生体心臓弁に使用される材料のうちの２つのタイプ（ウシ心膜弁および／またはブタ大動脈弁の弁尖）が示される。生体材料の構造的要素ならびにソーイングリングおよび／または手術用ステントにおける配置の前の組織の改変は、図１に示されるように、アルデヒド溶液を使用して組織の架橋を引き起こして、組織を生きていないかまたは不活性にすることによる、固定といわれる慣用的な組織調製前処理である。組織の「固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）」は、種々の濃度のグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドを使用して行われる。この前処理は、架橋剤としてグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドを使用して組織耐久性を改善するために行われる。
【００３９】
弁尖（ウシ心膜弁および／またはブタ大動脈弁のいずれか）をグルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒド固定で処理し、ソーイングリングおよび／またはステントに取り付けた後に、それは、２つの方法のうちの１つにおいて罹患弁を置き換えるためにヒトの身体に配置される。その手術アプローチは、罹患弁を置き換えるために胸腔を開くことを包含する。経皮アプローチは、生体弁をカテーテル上に配置し、生体弁が罹患弁の部位に達するまで動脈を通してそれを進めることを包含し、この部位で罹患弁が当業者に公知の技術を使用して生体弁で置き換えられる。経心尖アプローチもまた使用され得、その場合、生体弁は、当業者に公知の技術を使用して心尖を通して罹患弁の部位へと導入される。
【００４０】
ここで図２Ａ〜２Ｃを参照すると、３種の異なるタイプの心臓弁が図示される。図２Ａは、組織によって覆われた３枚の弁尖２０、２１、２２およびソーイングリング１２を有する手術用生体心臓弁１０を示す。図２Ｂは、２枚の機械式弁尖２３、２４を有する機械式心臓弁１４を示す。機械式心臓弁は、開胸手順を使用して手術によって配置される。機械式心臓弁１４は、弁尖に関しては組織を使用しないとはいえ、機械式心臓弁の弁構造自体１４、２３、２４ならびにソーイングリング１８を覆うＧｏｒｔｅｘライニング１６もまた、石灰化のリスクにあり得る。図２Ｃは、ステント２６に取り付けられた生体心臓弁１１を示す。ステント付き生体弁は、代表的には、動脈を通して経皮的に配置され、そして経心尖的にも配置され得る。
【００４１】
石灰化を阻害する本発明に従う方法を理解するために、石灰化の機構を理解することは重要であり、これは、図３および図６で図示される。弁が心臓に、心臓の大動脈弁、肺動脈弁、三尖弁および／または僧帽弁の位置のいずれかに配置されると、心臓は、移植後数週間の間に弁尖、ステントおよびソーイングリングを含めた弁表面領域全体を覆う、そして機械弁の場合にはＧｏｒｔｅｘを覆う、内皮ライニングを生成する。時間を経て、高コレステロール、高血圧（高血圧症）、糖尿病、喫煙、および高レベルのＣ反応性タンパク質のようなストレス要素に曝されることにより、内皮ライニングは、内皮型一酸化窒素シンターゼ遺伝子のｅＮＯＳ機能を減少させ、内皮ライニングによる一酸化窒素の生成を減少させることになる。一酸化窒素生成が少なくなると、（ｉ）内皮細胞からのＷｎｔの放出が生じ、（ｉｉ）内皮細胞が一酸化窒素の生成の減少に起因して「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）」になる。翻って、Ｗｎｔの放出は、循環している幹細胞におけるＷｎｔカスケードを活性化する。内皮細胞は、「粘着性の」幹細胞であるので、ｃＫＩＴ陽性細胞、ＳＣＡ１、循環している骨原性前駆細胞、循環している間葉系幹細胞、および前述のものの組み合わせは、弁上で増殖した異常な内皮ライニングに付着する。前述の細胞におけるＷｎｔの放出およびＷｎｔカスケードの活性化は、骨形成の３つの段階、すなわち、細胞増殖、軟骨特異的タンパク質の細胞外マトリクス生成および骨芽細胞形成を誘発し、ここで上記幹細胞は、骨芽細胞になり、骨芽細胞は、骨マトリクス（カルシウムおよびホスフェート）を軟骨足場へと沈着させ、その軟骨足場においてカルシウムおよびホスフェートが骨マトリクスに結合する。この骨マトリクスまたは石灰化は、生体弁を「殻（ｓｈｅｌｌ）」のように覆い、これが、石灰化であり、骨形成を表す。
【００４２】
本発明者らは、生体弁石灰化が幹細胞媒介性アテローム硬化性プロセスであるという仮説を検証した。幹細胞マーカーに関する補綴弁石灰化のモデルを検証した。通常の生体弁を、ウサギ（（ｎ＝１０）コントロール、（ｎ＝１０）  ０．５％  コレステロール食餌および（ｎ＝１０）  ０．５％  コレステロール＋アトルバスタチン）の皮下に３ヶ月間移植し、アテローム硬化性骨形成に関して分析した。そのコレステロール食餌を給餌したウサギから外植した生体弁組織は、重篤なアテローム硬化とともに、ｃｋｉｔ、マクロファージ、およびオステオポンチン発現に関して陽性の幹細胞の島を示した。コントロール弁は、これらのマーカーの軽度の増大を示した。アトルバスタチン処置弁は、幹マーカーの証拠もアテローム硬化の証拠も有しなかった（ｐ＜０．０５）。生体弁石灰化は、間葉系ｃｋｉｔ媒介性アテローム硬化性石灰化プロセスであり、これは、アトルバスタチンによって弱められる。これらの実験データは、弁石灰化の進行を遅らせるための、生体弁を有する患者の将来的な治療を指示する。
【００４３】
石灰性大動脈弁狭窄症は、米国および欧州において手術による弁置換の最も一般的な適応症である。現在、機械式心臓弁と生体心臓弁とは、弁置換の２つの選択肢である。弁の選択は、手術時の患者の特性に依存する。生体心臓弁は、血栓症のリスクが低下していので、抗凝固の必要性を低減する。従って、これらは、長期耐久性は限定的であるにも拘わらず、７５歳を超える患者または長期の抗凝固に対する禁忌を有する患者において一般に好まれる弁である。近年の研究から、この疾患プロセスの基礎を確立するヒト大動脈弁同種異系移植片において骨タンパク質の発現が示された。移植した生体心臓弁のうちの２０〜３０％は、１０年で、ある程度の血行力学的機能不全を有すると予測される。何年もの間、弁変性の機構は、受動的なプロセスに起因すると考えられてきた。しかし、近年の研究から、血管のアテローム硬化に類似の生体弁石灰化のリスク因子が示された。さらに、近年の病理研究から、脂質沈着、炎症性細胞浸潤、および骨マトリクスタンパク質発現を含む炎症反応が、これらの石灰化する生体補綴物において発生することが明らかに示された。これらの知見は、天然の石灰性大動脈弁疾患において見出される類似の組織病理学的病変に対応する。
【００４４】
生体心臓弁が石灰化する機構を研究するために、この研究は、生体弁石灰化が幹細胞媒介性アテローム硬化性プロセスに二次的に起こるという仮説を検証した。アテローム硬化リスク因子が、生体弁劣化の発生と独立して関連する場合、アテローム硬化の実験モデルは、生体補綴物の心臓弁膜症の発生を検証するための方法を提供し得る。
【００４５】
この研究は、高コレステロール血症のウサギモデルにおいて手術により移植した牛心内膜弁を評価して、その移植した弁の表面に沿って類似のアテローム硬化性病変が発生するか否かを決定した。間葉系ｃＫｉｔ陽性幹細胞が炎症の存在下で弁にホーミングするという仮説を検証する。最後に、その研究は、アトルバスタチンがその実験モデルにおいてこのアテローム硬化プロセスを弱めるか否かを決定しようとした。
【００４６】
コントロール動物からの移植弁尖は、図４のパネルＡ１のマッソントリクローム染色によって示されるように、その弁尖の表面に沿って若干量（mild  amount）の細胞浸潤を有するようであった。高倍率では、弁尖と弁尖表面に沿って発生する細胞浸潤との間の境界が示される。コントロール生体弁において少量（small  amount）のｃＫｉｔ陽性染色細胞が存在し（図４、パネルＢ１）、同様に図４、パネルＣ１およびＤ１に示されるように、オステオポンチンを発現する若干量の増殖中の細胞が存在した。対照的に、コレステロール給餌ウサギからの弁組織（図４、パネルＡ２、Ｂ２、Ｃ２、Ｄ２）では、マッソントリクロームで示されるとおりの顕著な細胞炎症性浸潤物が、青く染色される細胞とともに存在し、この細胞浸潤物は、左下隅の高解像度視野において示されるとおり、ｃＫｉｔ、ＰＣＮＡおよびＯＰＮを発現する。最後に、半定量的視覚分析によって測定されるように、外植時および光学顕微鏡法により、アテローム硬化負荷は、コレステロール処置で４倍増大した。アトルバスタチン処置ウサギにおいて移植した弁尖は、アテローム硬化性細胞浸潤物、増殖、ｃＫｉｔおよびオステオポンチン発現の量において顕著な減少を示した（図４、パネルＡ３、Ｂ３、Ｃ３、Ｄ３）。免疫組織化学およびマッソントリクロームは、コレステロール給餌動物およびコントロール動物における弁尖と比較しての、アトルバスタチン処置動物の弁尖における劇的な改善を示す。形態計測分析から、アテローム硬化を有意に（ｐ＜０．０５）弱めたアトルバスタチン処置弁と比較して、アテローム硬化量（burden）において４倍の増大が示された。コントロールは、炎症応答を誘導するウサギにおいて弁を移植するという効果に二次的な炎症において２倍の増大を有した。
【００４７】
図５は、コントロール処置ウサギ、コレステロール処置ウサギおよびコレステロール＋アトルバスタチン処置ウサギのＲＮＡ遺伝子発現を示す。コントロールと比較して、コレステロール給餌動物の弁尖においてＳｏｘ９骨芽細胞転写因子、サイクリン、およびｃＫｉｔの増大が存在し、サイクリンおよびｃＫｉｔは、コントロールに対してコレステロールにおいて顕著に増大し（ｐ＜０．０５）、アトルバスタチンは、コレステロール群と比較して、ｃＫｉｔ、サイクリンおよびＳｏｘ９を減少させた（ｐ＜０．０５）。３種全ての異なる処置群において、Ｃｂｆａ１の発現はなく、オステオポンチン遺伝子発現において差異はなかった。図７は、ウサギ研究からのＲＴＰＣＲデータである。
【００４８】
血清コレステロールレベルは、コントロール動物と比較して、コレステロール給餌において有意に高かった（１８４６．０±５２５．３ｍｇ／ｄＬ  対  １８．０±７ｍｇ／ｄＬ，  ｐ＜０．０５）。アトルバスタチン処置ウサギは、コレステロール食餌単独を受けたウサギより低いコレステロールレベルを現した（８２４．０±１５２．１ｍｇ／ｄｌ，  ｐ＜０．０５）。コントロールウサギと比較して、コレステロール給餌におけるｈｓＣＲＰ血清レベルの増大が存在した（１３．６±１９．７ｍｇ／ｄｌ  対  ０．２４±０．１ｍｇ／ｄＬ，  ｐ＜０．０５）。これは、図７によれば、アトルバスタチンによって低減した（７．８±８．７ｍｇ／ｄＬ，  ｐ＜０．０５）。
【００４９】
近年の疫学研究から、生体弁石灰化のリスク因子、すなわち、男性という性別、喫煙、および上昇した血清コレステロールが、血管のアテローム硬化と関連するリスク因子に類似であることが明らかにされた。このデータは、実験的高コレステロール血症が、大動脈弁疾患の初期段階において見出される変化に類似である生体心膜弁組織の表面に沿ったアテローム硬化性の変化の生化学的および形態学的証拠を生じることを示す。
【００５０】
具体的には、高コレステロール食餌を給餌した動物の弁表面に沿ったアテローム硬化性の病変、およびアトルバスタチンでのこのプロセスの減弱が存在する。このモデルでは、高コレステロール血症の生体弁は、増殖性であるアテローム硬化性の病変だけでなく、免疫組織化学および骨芽細胞骨マーカーＳｏｘ９によれば、骨マトリクスタンパク質の増大したレベルを発現する病変をも発生させた。このｈｓＣＲＰレベルはまた、実験的高コレステロール血症のこのモデルにおいて増大される。このことは、移植した弁尖への間葉系幹細胞のホーミングのための炎症環境を示す。ウサギ皮下モデルにおいて、関連するアテローム硬化を有する高コレステロール血症ウサギから取り出した生体補綴物組織におけるＳｏｘ９発現の増大の確認。
【００５１】
これらのアテローム硬化性の生体弁におけるｃＫｉｔおよび他の間葉系の発現の知見は、石灰化が機構において示されるように発生し得る機構を提供する。図６を参照すると、生体弁石灰化の機構が図示される。上昇したコレステロール、高血圧、喫煙、糖尿病、および／または異常な酸化的ストレスのプロセスの存在下では、循環している幹細胞は、正常な生体心臓弁にホーミングし、細胞炎症の存在下で弁尖に付着する。その炎症は、循環しているｃＫｉｔ陽性細胞、ならびに骨原性前駆細胞、間葉系細胞、ｓｃａ1陽性細胞のうちの任意のおよび全てのタイプを心室表面および大動脈表面に付着させ、弁尖および／またはステントおよび／またはソーイングリングの両側に石灰化を引き起こす。リスク因子の存在下では、主に高脂血症は、移植された心臓弁の周りをライニングする新たに形成された内皮ライニング細胞において異常な酸化的ストレスおよび異常な内皮型一酸化窒素シンターゼ機能を引き起こす。循環しているｃＫｉｔ陽性細胞、循環している骨原性前駆細胞、間葉系細胞、ｓｃａ1陽性細胞は、その移植された弁に沿って新たに形成された内皮ライニングに「粘着する」。これらの種々のタイプの幹細胞は、骨原性経路に沿って分化して弁尖上に骨を形成する能力を有し、生体弁尖の劣化を引き起こす。この分化プロセスまたは１つの細胞タイプから別の細胞タイプへの細胞形質転換プロセスは、Ｗｎｔが、その移植された弁を周む新たに形成された内皮ライニング細胞から一旦分泌された後に起こる。幹細胞は、上昇した脂質の存在下で新たに形成された内皮ライニングに粘着することから、その内皮ライニングに粘着している幹細胞がすぐ近傍にあることで、その分泌されたＷｎｔが、「付着した幹細胞」の細胞膜上に位置するＬｒｐ５レセプターに結合することを可能にする。そのＬｒｐ５／Ｗｎｔが一旦結合した後、幹細胞は、骨形成細胞へと分化または形質転換する。細胞が弁へ付着することを止めさせる化合物の一例は、炎症を低減して、弁尖に付着する幹細胞の数を減少させる、および石灰化の進行を遅らせるために動物モデルにおいて試験されたように、アトルバスタチンを使用することである。高コレステロール血症の存在下では、ｃＫｉｔ陽性細胞は、生体弁に付着し、骨原性遺伝子プログラム、インビボでの皮下移植の低血圧モデルにおける最初のＳｏｘ９アップレギュレーション、および次いで、手術からのエキソビボでのヒト外植弁の高血圧モデルにおけるＣｂｆａｌアップレギュレーションを介して分化し始める。その細胞の残りは、天然の線維芽細胞であり、大動脈弁疾患の他の研究において示唆されるように、骨芽細胞表現型へと分化する。このモデルにおいて、高コレステロール血症の環境は炎症を誘導するので、間葉系幹細胞は、移植した生体弁へと移動およびホーミングする。これらの細胞は、以前の研究において示されるように骨原性経路に沿って分化する可能性を有する。
【００５２】
前述の知見は、インビボ実験モデルにおいて、高コレステロール血症が、生体弁石灰化において決定的な機構であり得る生体心膜弁尖におけるｃＫｉｔ陽性細胞、アテローム硬化、および骨原性遺伝子発現を発現することを示す。
【００５３】
弁石灰化の前述の機構に対処するために、本発明者らは、（ｉ）骨形成の３つの段階、すなわち、生体弁または機械式弁の外部および近傍の領域における、循環しているｃｋｉｔおよびＳｃａ1陽性幹細胞、骨原性細胞、および間葉系幹細胞の増殖、軟骨特異的タンパク質の細胞外マトリクス生成の防止、ならびに軟骨足場への骨マトリクスの骨芽細胞生成または沈着；ならびに（ｉｉ）心臓弁および／または機械式心臓弁上のＧｏｒｔｅｘライニングへの前述の細胞の付着を阻害することによって、弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害する方法を発明した。前述の防止は、内皮細胞自体における一酸化窒素を活性化することによって達成される。
【００５４】
内皮細胞における一酸化窒素を活性化するために、心臓弁尖は、グルタルアルデヒドでの固定後、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆され、これは、心臓弁尖、ステントに、および／または機械式心臓弁の場合にはＧｏｒｔｅｘに、付着する。その被覆組成物は、弁尖、ステント、および／もしくは生体弁が固定されるソーイングリング、または機械式弁の場合には、ソーイングリングを覆うＧｏｒｔｅｘライニングの両側に沈着され得、それによって、移植の必要な患者において移植後の弁補綴物の狭窄、閉塞、または石灰化を阻害し得る。
【００５５】
その被覆組成物は、溶媒中にポリマーおよび治療剤を溶解または懸濁することによって調製され得る。その被覆組成物を調製するために使用され得る適切な溶媒としては、溶液にそのポリマーおよび治療剤を溶解または懸濁し得るものが挙げられる。適切な溶媒の例としては、テトラヒドロフラン、メチルエチルケトン（ＭＥＫ）、クロロホルム、トルエン、アセトン、イソオクタン、１，１，１，トリクロロエタン、ジクロロメタン、イソプロパノール、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、溶媒は、多くの場合には必要とされない。
【００５６】
その被覆組成物は、弁補綴物または生体補綴物およびソーイングリングの弾性ステント部分の表面に、当業者に公知の任意の方法によって適用され得る。弁補綴物の弾性ステント部分の表面にその被覆組成物を適用するための適切な方法としては、スプレーコーティング、ペインティング、ローリング、静電沈着、インクジェットコーティング、およびバッチ処理（例えば、エアサスペンション、パンコーティングもしくは超音波ミストスプレー）、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
その被覆組成物を適用した後、それは硬化され得る。本明細書で使用される場合、「硬化（ｃｕｒｉｎｇ）」とは、熱、真空、および／または化学的薬剤の適用によって最終のまたは有用な状態へと任意のポリマー材料を変換するプロセスであって、その適用が、物理化学的変化を誘導するプロセスを指し得る。硬化のために適用可能な時間および温度は、当業者によって公知のように、関わる特定のポリマーおよび使用される特定の治療剤によって決定される。また、弾性ステントが被覆された後、当該分野で公知のとおりの滅菌法によって滅菌され得る（例えば、Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  ＦＤＡ  Ｓｔａｆｆ――Ｎｏｎ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
http://www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedoc-uments/ucm071863.htmおよび米国特許第７，９９８，４０４号（発明の名称「Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｅｎｔｓ」）を参照のこと）。
【００５８】
その被覆組成物は、治療剤の１〜４つのカテゴリーまでを含み得る。第１のカテゴリーは、ｅＮＯＳアクチベーターであり得る；第２のカテゴリーは、細胞増殖を阻害する抗増殖剤であり得る；第３のカテゴリーは、細胞外マトリクス生成を阻害する；そして第４のカテゴリーは、骨芽細胞生成を阻害する。
【００５９】
「粘着性の」弁構造上への幹細胞の付着を阻害するために、その目的は、その弁構造上の新たに増殖した内皮ライニングおよび循環している幹細胞における内皮型一酸化窒素をアップレギュレートして、その弁構造への幹細胞の付着を防止することである。一酸化窒素の生成をアップレギュレートする薬剤（ｅＮＯＳアクチベーター）は、アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、Ｌ−アルギニン、シトルリン、ＮＡＤＰＨ、アセチルコリン、ヒスタミン、アルギニンバソプレッシン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ブラジキニン、アデノシン二リン酸・三リン酸、５−ヒドロキシトリプタミン，  トロンビン、インスリン、グルココルチコイド、サリチレート、Ｌ−ＮＭＭＡ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、５−一硝酸イソソルビド、亜硝酸アミル、ニコランジル、テトラヒドロビオプテリンおよび前述のものの組み合わせから選択され得る。
【００６０】
さらに、一酸化窒素をアップレギュレートする薬剤および脂質降下薬は、患者の体重に依存して種々の投与量において経口で与えられ得る。このような薬剤としては、アトルバスタチン（患者のＬＤＬレベルに依存して、１０〜８０ｍｇ／日）、ロスバスタチン（５〜４０ｍｇ／日）、プラバスタチン（１０〜４０ｍｇ／日）、メバスタチン（５〜４０ｍｇ／日）、フルバスタチン（５〜４０ｍｇ／日）、シンバスタチン（５〜４０ｍｇ／日）、ロバスタチン（５〜４０ｍｇ／日）、ゼチーア（１０ｍｇ／日）および前述のものの組み合わせが挙げられる。
【００６１】
ＰＣＳＫ９インヒビターは、患者の体重と相関する投与量で患者に筋肉注射することによって与えられ得る。ＰＣＳＫ９インヒビターの最初の用量は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇまたは約１．５ｍｇ／ｋｇであり得、最初の用量およびその次の回の用量およびさらにその後の用量は、約１週間互いに時間的に分離され得る。ＰＣＳＫ９インヒビターおよびそれらの投与量は、２〜４週間ごとの７５〜１５０ｍｇの量のアリロクマブおよび２週間ごとのエボロクマブ  １４０ｍｇを含み、１ヶ月に２回（bimonthly）または１ヶ月に１回の皮下注射、および前述のものの組み合わせによって与えられ得る。ＰＣＳＫ９は、血漿リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の調節因子であり、冠動脈疾患におけるリスク低減において有効な薬剤である。プロタンパク質コンベルターゼであるズブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）タンパク質は、患者の内皮に沿っておよび肝臓の中に位置する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターの活性を調節する。モノクローナル抗体でのＰＣＳＫ９の阻害は、ＬＤＬレセプターの増大したサイクリングおよびＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の増大したクリアランスを生じる。肝臓において高度に発現されるＰＣＳＫ９は、プロドメインの自己触媒切断後に分泌され、これは、触媒ドメインと非共有結合的に会合したままである。ＰＣＳＫ９の触媒ドメインは、低密度リポタンパク質レセプター（ＬＤＬＲ）の上皮増殖因子様リピートＡ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合する。ＰＣＳＫ９の両方の機能が、ＬＤＬＲ−ＰＣＳＫ９複合体をリソソーム分解に標的化するためにおよびＬＤＬ−Ｃ低下のために必要とされる。このことは、機能喪失および機能獲得に関連する両方のドメインにおける変異と一致する。
【００６２】
アトルバスタチンは、１０ｍｇ〜８０ｍｇの範囲において、シンバスタチンは、１０ｍｇ〜４０ｍｇの範囲において、ロスバスタチンは、５ｍｇ〜４０ｍｇの範囲において、プラバスタチンは、１０ｍｇ〜８０ｍｇの範囲において、ピタバスタチンは、１ｍｇ〜４ｍｇの範囲において、経口で与えられ得る。
【００６３】
被覆組成物の中に、骨原性骨形成の３つの段階を阻害する治療剤を含めることは、等しく重要である。パクリタキセル、シロリムス、ビオリムス、エベロリムス、タクロリムスおよび前述のものの組み合わせから選択される薬剤は、細胞増殖を阻害するために被覆組成物の中に含まれ得る。
【００６４】
被覆組成物はまた、抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（ａｎｔｉ−ｆａｒｎｙｓｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＦＴＩ）および抗パルミトイル化インヒビターのような細胞外マトリクス生成のインヒビターを含み得る。このような薬剤としては、ロナファルニブ、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ  Ｒ１１５７７７、ＦＴＩ  ＳＣＨ６６３３６、ＳＴＩ５７１、ＦＬＴ−３インヒビター、プロテアソームインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、ＢＭＳ−２１４６６２、タンパク質パルミトイル化、ファルネシル−ペプチドパルミトイル化のタイプＩ非脂質インヒビターまたはミリストイル−ペプチドパルミトイル化のタイプ２インヒビター、パルミトイル化アシルトランスフェラーゼインヒビター、２−ブロモパルミトイル（２ＢＰ）を含む脂質ベースのパルミトイル化インヒビター、ツニカマイシン、セルレニン（ｃｅｒｕｌｎｉｎ）および前述のものの組み合わせが挙げられ得る。
【００６５】
ＦＴＩインヒビター  抗パルミトイル化インヒビターはまた、経口で与えられ得る。ロナファルニブは、１０ｍｇの有効量のゼチーアと組み合わせて、１１５ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の範囲で、１１５ｍｇ／ｍ２用量の投与量で与えられ得る。
【００６６】
被覆組成物はまた、ビスホスホネート薬物（アレンドロネート（患者の臨床状態に依存して、経口で５〜７０ｍｇ）、リセドロネート（患者の臨床状態に依存して、経口で１日に５〜１５０ｍｇ）、ゾレドロン酸（１年に１回１５分間にわたって５ｍｇ  ＩＶ注入）、エチドロネート（弁置換後に１ヶ月間にわたって２０ｍｇ／ｋｇ／日）、イバンドロネート（１ヶ月間に１回経口で１５０ｍｇ）、パミドロネート（６０〜９０  ＩＶ  注入１回用量）、チルドロネート（３ヶ月間にわたって１日に１回経口で４００ｍｇ）、デノスマブ抗体（６ヶ月ごとに６０ｍｇ皮下注射）、カルシトニン−カルシメア（Calcitonin-Calcimare）（経口で毎日６０ｍｇ）、ミアカルシン（Ｍｉａｃａｌｃｉｎ）（毎日経口で６０ｍｇ）、フォルテオテリパラチド（毎日経口で６０ｍｇ）、ラロキシフェン（エビスタ）（毎日経口で６０ｍｇ）および前述のものの組み合わせが挙げられる）のような抗骨粗鬆症剤を含み得る。これらの薬剤は、移植された弁における骨形成を阻害することによって、最終の骨形成段階を阻害する。
【００６７】
骨形成の第３相を処置する前述の薬剤はまた、患者の体重に対応する投与量において経口でまたは筋肉内注射によって、患者に与えられ得る。
【実施例】
【００６８】
実施例Ｉ
生体心臓弁を、ｅＮＯＳアクチベーター、アトルバスタチン、抗増殖剤、パクリタキセル；細胞外生成のインヒビター、抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター；および骨芽細胞生成のインヒビターであるビスホスホネート薬物を含む被覆組成物で被覆する。その生体心臓弁を、７５歳の女性患者に移植する。その患者はまた、毎日経口でアトルバスタチン  ８０ｍｇおよび皮下注射によって７５ｍｇの量の１ヶ月に１回のＰＣＳＫ９インヒビターを含む脂質降下治療を受けて、彼女のＬＤＬコレステロールレベルを３５０ｍｇ／ｍｌから８０ｍｇ／ｍｌへと降下させる。彼女の心エコー図を検討すると、その移植した生体弁の弁尖およびステントは、平均勾配１０ｍｍＨｇおよび大動脈弁面積２．０ｃｍ２で、２５年間の期間にわたって正常な血行力学を有する。その生体弁尖およびステントは、コンピューター断層撮影法および心エコー法によって診断される場合、石灰化のいかなる証拠をも示さない。
【００６９】
本発明は、種々の局面および実施形態を参照しながら記載されてきたが、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、変更が形式上および詳細において行われ得ることを認識する。
【図１】
2019520184.tif 000003
【図２Ａ】
2019520184.tif 000004
【図２Ｂ】
2019520184.tif 000005
【図２Ｃ】
2019520184.tif 000006
【図３】
2019520184.tif 000007
【図４】
2019520184.tif 000008
【図５】
2019520184.tif 000009
【図６】
2019520184.tif 000010
【図７】
2019520184.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月26日(2018.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための阻害組成物であって、該組成物は、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物を含み、
該心臓弁は、１またはこれより多くの弁尖を有する組織を含む生体心臓弁であり、該生体心臓弁は、罹患した生得の弁の置換のために弾性ステント上に取り付けられており；
該生体心臓弁は、組織固定液で処理され；
該ステント、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方は、該阻害組成物で被覆され；
該生体弁は、罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植されるものであり；
該阻害組成物は、該弾性ステント、１種もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出され；
該阻害組成物は、（ｉ）循環する幹細胞における、（ｉｉ）該生体心臓弁組織を覆う内皮細胞ライニングにおける、または（ｉｉｉ）両方における、一酸化窒素生成を活性化することによって、該生体心臓弁、弾性ステントまたは両方の外部または近辺を循環する幹細胞の、該生体心臓弁への付着を防止することによって、該生体心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害する、阻害組成物。
【請求項２】
前記幹細胞は、ｃＫｉｔ陽性幹細胞  ＳＣＡ１細胞、ＣＯＰ細胞、間葉系幹細胞および前述のものの組み合わせから選択される、請求項１に記載の阻害組成物。
【請求項３】
前記生体心臓弁組織は、アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、Ｌ−アルギニン、シトルリン、ＮＡＤＰＨ、アセチルコリン、ヒスタミン、アルギニンバソプレッシン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ブラジキニン、アデノシン二リン酸・三リン酸、５−ヒドロキシトリプタミン、トロンビン、インスリン、グルココルチコイド、サリチレート、Ｌ−ＮＭＭＡ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、５−一硝酸イソソルビド、亜硝酸アミル、ニコランジル、テトラヒドロビオプテリン、ゼチーアおよび前述のものの組み合わせから選択されるｅＮＯＳアクチベーターでさらに処理される、請求項１に記載の阻害組成物。
【請求項４】
前記被覆組成物は、前記幹細胞から発生する骨芽細胞における骨形成を阻害するための、（ｉ）抗増殖剤；（ｉｉ）細胞外生成のインヒビター；（ｉｉｉ）骨芽細胞生成のインヒビター；および（ｉｖ）前述のものの組み合わせのうちの１またはこれより多くを含む、請求項１に記載の阻害組成物。
【請求項５】
前記抗増殖剤は、パクリタキセル、シロリムス、ビオリムス、エベロリムスおよび前述のものの組み合わせから選択される、請求項４に記載の阻害組成物。
【請求項６】
前記細胞外生成のインヒビターは、抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターまたは両方から選択される、請求項４に記載の阻害組成物。
【請求項７】
前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターは、ロナファルニブ、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ  Ｒ１１５７７７、ＦＴＩ  ＳＣＨ６６３３６、ＳＴＩ５７１、ＦＬＴ−３インヒビター、プロテアソームインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、ＢＭＳ−２１４６６２、タンパク質パルミトイル化、ファルネシル−ペプチドパルミトイル化のタイプＩ非脂質インヒビターまたはミリストイル−ペプチドパルミトイル化のタイプ２インヒビター、パルミトイル化アシルトランスフェラーゼインヒビター、２−ブロモパルミトイル（２ＢＰ）を含む脂質ベースのパルミトイル化インヒビター、ツニカマイシン、セルレニンおよび前述のものの組み合わせから選択される、請求項６に記載の阻害組成物。
【請求項８】
前記骨芽細胞生成のインヒビターは、アレンドロネート、リセドロネート、ゾレドロン酸、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、チルドロネート、デノスマブ抗体、カルシトニン−カルシメア、ミアカルシン、フォルテオテリパラチド、ラロキシフェン（エビスタ）および前述のものの組み合わせを含むビスホスホネート薬物のような抗骨粗鬆症剤から選択される、請求項４に記載の阻害組成物。
【請求項９】
前記ｅＮＯＳアクチベーターは、経口投与量でさらに投与される、請求項３に記載の阻害組成物。
【請求項１０】
前記経口投与量は、１日あたり１０ｍｇ〜８０ｍｇのアトルバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのシンバスタチン；１日あたり５ｍｇ〜４０ｍｇのロスバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのプラバスタチン；１日あたり１ｍｇ〜４ｍｇのピタバスタチン；１日あたり１０ｍｇのゼチーアおよび前述のものの組み合わせを含む、請求項９に記載の阻害組成物。
【請求項１１】
前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、前記抗パルミトイル化インヒビターまたは両方は、経口投与量でさらに投与される、請求項７に記載の阻害組成物。
【請求項１２】
前記投与量は、有効量のゼチーア１０ｍｇと組み合わせて１１５ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の範囲で、１１５ｍｇ／ｍ２用量の投与量でのロナファルニブを含む、請求項１１に記載の阻害組成物。
【請求項１３】
有効量のＰＣＳＫ９インヒビターは、筋肉内注射または皮下注射によってさらに投与される、請求項１に記載の阻害組成物。
【請求項１４】
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの最初の用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇである、請求項１３に記載の阻害組成物。
【請求項１５】
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記最初の用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである、請求項１４に記載の阻害組成物。
【請求項１６】
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記有効量は、２〜４週間ごとにアリロクマブ７５〜１５０ｍｇ、２週間ごとにもしくは１ヶ月に１回のエボロクマブ１４０ｍｇ、および前述のものの組み合わせである、請求項１３に記載の阻害組成物。
【請求項１７】
壁を有する脈管における移植後の機械式心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための阻害組成物であって、該阻害組成物は、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物を含み、
該機械式心臓弁は、Ｇｏｒｔｅｘ材料によって覆われたソーイングリングを有し；
該機械式心臓弁、該Ｇｏｒｔｅｘ材料、または両方は、該阻害組成物で被覆され；
該機械式心臓弁は、罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植されるものであり；
該阻害組成物は、該機械式心臓弁、該Ｇｏｒｔｅｘ材料または両方から溶出し；
該阻害組成物は、（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）該機械式心臓弁および／もしくはＧｏｒｔｅｘ材料を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化することによって、該機械式心臓弁の外部または近辺を循環する幹細胞の、該機械式心臓弁またはＧｏｒｔｅｘ材料への付着を防止することによって、該機械式心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害する、阻害組成物。
【請求項１８】
壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための阻害組成物であって、該阻害組成物は、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物を含み、
該心臓弁は、ソーイングリングを有しステントのない手術用心臓弁であり、該手術用心臓弁は、１もしくはこれより多くの弁尖を有する組織を含み、該手術用心臓弁は、罹患した生得の弁の置換用であり；
該手術用心臓弁は、組織固定液で処理され；
該手術用心臓弁、１もしくはこれより多くの弁尖および／またはソーイングリングは、該阻害組成物で被覆され；
該手術用心臓弁は、罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植されるものであり；
該阻害組成物は、該ソーイングリング、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出され；
該阻害組成物は、（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）該手術用心臓弁を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化することによって、該手術用心臓弁の外部または近辺を循環する幹細胞の、該手術用心臓弁への付着を防止することによって、該手術用心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害する、阻害組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１７年５月２２日に出願した国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３３７９２号の国内段階特許出願である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の別の態様では、前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記有効量は、２〜４週間ごとにアリロクマブ７５〜１５０ｍｇ、２週間ごとにもしくは１ヶ月に１回のエボロクマブ１４０ｍｇ、および前述のものの組み合わせである。
特定の実施形態において、例えば、以下が提供される：
（項目１）
壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法であって、該方法は、
１またはこれより多くの弁尖を有する組織を含む生体心臓弁を提供することであって、該生体心臓弁は、罹患した生得の弁の置換のために弾性ステント上に取り付けられていること；
該生体心臓弁を組織固定液で処理すること；
該ステント、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方を、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；
該生体弁を罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植すること；
該被覆組成物を該弾性ステント、１種もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出すること；
（ｉ）循環する幹細胞における、（ｉｉ）該生体心臓弁組織を覆う内皮細胞ライニングにおける、または（ｉｉｉ）両方における、一酸化窒素生成を活性化することによって、該生体心臓弁、弾性ステントまたは両方の外部または近辺を循環する幹細胞の、該生体心臓弁への付着を防止することによって、該生体心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、
を包含する方法。
（項目２）
前記幹細胞は、ｃＫｉｔ陽性幹細胞  ＳＣＡ１細胞、ＣＯＰ細胞、間葉系幹細胞および前述のものの組み合わせから選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記生体心臓弁組織を、アトルバスタチン、ロスバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、Ｌ−アルギニン、シトルリン、ＮＡＤＰＨ、アセチルコリン、ヒスタミン、アルギニンバソプレッシン、ノルエピネフリン、エピネフリン、ブラジキニン、アデノシン二リン酸・三リン酸、５−ヒドロキシトリプタミン、トロンビン、インスリン、グルココルチコイド、サリチレート、Ｌ−ＮＭＭＡ、Ｌ−ＮＡＭＥ、ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、５−一硝酸イソソルビド、亜硝酸アミル、ニコランジル、テトラヒドロビオプテリン、ゼチーアおよび前述のものの組み合わせから選択されるｅＮＯＳアクチベーターで処理することをさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記被覆組成物は、前記幹細胞から発生する骨芽細胞における骨形成を阻害するための、（ｉ）抗増殖剤；（ｉｉ）細胞外生成のインヒビター；（ｉｉｉ）骨芽細胞生成のインヒビター；および（ｉｖ）前述のものの組み合わせのうちの１またはこれより多くを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗増殖剤は、パクリタキセル、シロリムス、ビオリムス、エベロリムスおよび前述のものの組み合わせから選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記細胞外生成のインヒビターは、抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターまたは両方から選択される、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、抗パルミトイル化インヒビターは、ロナファルニブ、Ｚａｒｎｅｓｔｒａ  Ｒ１１５７７７、ＦＴＩ  ＳＣＨ６６３３６、ＳＴＩ５７１、ＦＬＴ−３インヒビター、プロテアソームインヒビター、ＭＡＰＫインヒビター、ＢＭＳ−２１４６６２、タンパク質パルミトイル化、ファルネシル−ペプチドパルミトイル化のタイプＩ非脂質インヒビターまたはミリストイル−ペプチドパルミトイル化のタイプ２インヒビター、パルミトイル化アシルトランスフェラーゼインヒビター、２−ブロモパルミトイル（２ＢＰ）を含む脂質ベースのパルミトイル化インヒビター、ツニカマイシン、セルレニンおよび前述のものの組み合わせから選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記骨芽細胞生成のインヒビターは、アレンドロネート、リセドロネート、ゾレドロン酸、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、チルドロネート、デノスマブ抗体、カルシトニン−カルシメア、ミアカルシン、フォルテオテリパラチド、ラロキシフェン（エビスタ）および前述のものの組み合わせを含むビスホスホネート薬物のような抗骨粗鬆症剤から選択される、項目４に記載の方法。
（項目９）
前記ｅＮＯＳアクチベーターの経口投与量を投与することをさらに包含する、項目３に記載の方法。
（項目１０）
前記経口投与量は、１日あたり１０ｍｇ〜８０ｍｇのアトルバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのシンバスタチン；１日あたり５ｍｇ〜４０ｍｇのロスバスタチン；１日あたり１０ｍｇ〜４０ｍｇのプラバスタチン；１日あたり１ｍｇ〜４ｍｇのピタバスタチン；１日あたり１０ｍｇのゼチーアおよび前述のものの組み合わせを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、前記抗パルミトイル化インヒビターまたは両方の経口投与量を投与することをさらに包含する、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記投与量は、有効量のゼチーア１０ｍｇと組み合わせて１１５ｍｇ／ｍ２〜１５０ｍｇ／ｍ２の範囲で、１１５ｍｇ／ｍ２用量の投与量でのロナファルニブを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
筋肉内注射または皮下注射によって有効量のＰＣＳＫ９インヒビターを投与することをさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの最初の用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記最初の用量は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＰＣＳＫ９インヒビターの前記有効量は、２〜４週間ごとにアリロクマブ７５〜１５０ｍｇ、２週間ごとにもしくは１ヶ月に１回のエボロクマブ１４０ｍｇ、および前述のものの組み合わせである、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
壁を有する脈管における移植後の機械式心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法であって、該方法は、
Ｇｏｒｔｅｘ材料によって覆われたソーイングリングを有する機械式心臓弁を提供すること；
該機械式心臓弁、該Ｇｏｒｔｅｘ材料、または両方を、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；
該機械式心臓弁を罹患した生得の弁の部位の部位において該脈管に移植すること；
該被覆組成物を、該機械式心臓弁、該Ｇｏｒｔｅｘ材料または両方から溶出すること；
（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）該機械式心臓弁および／もしくはＧｏｒｔｅｘ材料を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化することによって、該機械式心臓弁の外部または近辺を循環する幹細胞の、該機械式心臓弁またはＧｏｒｔｅｘ材料への付着を防止することによって、該機械式心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、
を包含する方法。
（項目１８）
壁を有する脈管における移植後の心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害するための方法であって、該方法は、
ソーイングリングを有しステントのない手術用心臓弁を提供することであって、該手術用心臓弁は、１もしくはこれより多くの弁尖を有する組織を含み、該手術用心臓弁は、罹患した生得の弁の置換用である、こと；
該手術用心臓弁を組織固定液で処理すること；
該手術用心臓弁、１もしくはこれより多くの弁尖および／またはソーイングリングを、１種またはこれより多くの治療剤を含む被覆組成物で被覆すること；
該手術用心臓弁を、罹患した生得の弁の部位において該脈管に移植すること；
該被覆組成物を該ソーイングリング、１もしくはこれより多くの弁尖、または両方から溶出すること；
（ｉ）循環する幹細胞において、（ｉｉ）該手術用心臓弁を覆う内皮細胞ライニングにおいて、または（ｉｉｉ）両方において、一酸化窒素生成を活性化することによって、該手術用心臓弁の外部または近辺を循環する幹細胞の、該手術用心臓弁への付着を防止することによって、該手術用心臓弁の狭窄、閉塞および／または石灰化を阻害すること、
を包含する方法。
【国際調査報告】
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