(57)【要約】  本発明は、対象の角膜にα−Ｌ−イズロニダーゼを送達するためのウイルスベクター並びに対象におけるムコ多糖症Ｉ型による角膜混濁又は失明の治療又は予防のための該ウイルスベクターの使用方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする配列を含む組換え核酸であって、ヌクレオチド配列がヒト細胞内での発現のためにコドン最適化されている、組換え核酸。
【請求項２】
配列番号１と９０％以上同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノム。
【請求項５】
前記核酸が構成型プロモーターに作動可能に連結されている，請求項４に記載のＡＡＶベクターゲノム。
【請求項６】
請求項４又は請求項５に記載のＡＡＶベクターゲノムを含むインビトロ細胞。
【請求項７】
前記ベクターゲノムが細胞ゲノムに安定的に組み込まれている、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
請求項４又は請求項５に記載のＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子。
【請求項９】
ＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ粒子の生産方法であって、
インビトロで細胞に、ＡＡＶ  Ｃａｐ及びＡＡＶ  Ｒｅｐをコードする配列、請求項４又は請求項５に記載のＡＡＶベクターゲノム並びに増殖的ＡＡＶ感染を発生させるためのヘルパー機能を与えること、及び
ＡＡＶカプシドを含み、かつＡＡＶベクターゲノムをカプシド内に被包する組換えＡＡＶ粒子を組み立てさせること
を含む方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって生産されたＡＡＶ粒子。
【請求項１１】
当該ＡＡＶ粒子がＡＡＶ２、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９粒子である、請求項８又は請求項１０に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１２】
当該ＡＡＶ粒子がキメラＡＡＶ８／ＡＡＶ９粒子である、請求項８又は請求項１０に記載のＡＡＶ粒子。
【請求項１３】
請求項８又は請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子と薬学的に許容される媒体とを含む医薬製剤。
【請求項１４】
対象の角膜にＩＤＵＡを送達する方法であって、対象の角膜に、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の有効量を投与し、もって対象の角膜にＩＤＵＡを送達することを含む方法。
【請求項１５】
対象におけるムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ−Ｉ）関連角膜混濁を治療又はその発症を遅延させる方法であって、対象の角膜に、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の治療有効量を投与し、もって対象におけるＭＳＰ−Ｉ関連角膜混濁を治療又はその発症を遅延させることを含む方法。
【請求項１６】
インビトロ又はエクスビボで角膜にＩＤＵＡを送達する方法であって、角膜を、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の有効量と接触させ、もって角膜にＩＤＵＡを送達することを含む方法。
【請求項１７】
前記角膜を、それを必要とする対象に移植することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＡＡＶ粒子が、請求項８又は請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載のＡＡＶ粒子或いは請求項１３に記載の医薬製剤である、請求項１４乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＡＶ粒子が、実質内注射によって角膜に投与される、請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＡＶ粒子が角膜に局所的に投与される、請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象がヒト患者である、請求項１４乃至請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象がＭＰＳ−Ｉと診断されている、請求項１４乃至請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が角膜の混濁を未だに発症していない、請求項１４乃至請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が角膜の混濁を発症している、請求項１４乃至請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の角膜にα−Ｌ−イズロニダーゼを送達するためのウイルスベクター並びに対象におけるムコ多糖症Ｉ型による角膜混濁及び失明の治療又は予防のための該ウイルスベクターの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ−Ｉ）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を分解する偏在性細胞内分泌酵素であるα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする遺伝子のヌル変異又はナンセンス変異に起因する常染色体劣性リソソーム蓄積症である。機能性ＩＤＵＡが存在しないと、リソソームにＧＡＧが蓄積して脂質、糖及びタンパク質の正常な細胞内輸送を損なって、多系統終末器官障害を生じる。ＭＰＳの発症頻度は約１０００００人に１人であり、この疾患は肝脾腫、心不全、骨及び関節の変形、低身長、精神発達遅滞及び重篤な神経系障害によって特徴づけられ、１０歳までに死亡することが多い。追加の症状として、難聴、関節拘縮、及び失明に至る角膜の混濁が挙げられる（Ａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １２５（１３）：２１６４（２０１５））。
【０００３】
現行のＭＰＳ−Ｉ治療法には、静脈内注射によるＩＤＵＡ酵素補充療法（enzyme replacementtreatment：ＥＲＴ）（ＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ（登録商標））があり、これは病状の軽いＭＰＳ−Ｉ患者における肝脾腫の軽減、並びに心筋機能、肺症状及び運動性の改善に有用であることが判明している。さらに有望な治療法は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に依拠するものであり、これは過去２０〜３０年間にわたりＭＰＳ−Ｉ患者に用いられている。ＨＳＣＴは、認知機能の改善、肝脾腫の軽減、虚血性心疾患の予防及び患者の寿命の（場合によっては数十年もの）延長に成功したことが判明している。臨床成績は、骨髄破壊的化学療法及び臍帯血ドナー（提供者）を用いたときが最良であり、持続的ドナーキメリズムの程度にも相関している。依然として前臨床評価段階にある第３のＭＰＳ−Ｉ治療法はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＤＵＡ遺伝子付加戦略に依拠するものである。マウス、ネコ及びイヌＭＰＳ−Ｉモデルにおいて頸動脈、脳実質内、脳室内及びくも膜下腔内を含めた幾つかの経路での投与による中枢神経系標的ＡＡＶ−ＩＤＵＡ遺伝子治療が研究されている（Ｊａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ７４（１）：９９（２０１４）；  Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  Ｄｉｓ．  ４３（１）：１２３（２０１１）；  Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２２（１２）：２０１８（２０１４））。これらの遺伝子治療研究では、組織学的、生化学的及び特に認知機能の改善が独立に報告されており、ＩＤＵＡ関連毒性も観察されていない。しかし、ＥＲＴ、ＨＳＣＴ及びＡＡＶによるＣＮＳ標的又は全身遺伝子治療には共通の短所がある。すなわち、関節及び眼を含む特権区画でのＭＰＳ−Ｉ関連疾患を是正できないことである。
【０００４】
眼の異常に関して、ＭＰＳ−Ｉの小児の約９０％が角膜混濁のため視力を失うが、これは空胞化した実質細胞が原因とされている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ６２（４）：３７７（１９９６））。ＭＰＳ−Ｉヒト角膜の詳細な分析によって、コンドロイチン及びデルマタン硫酸ＧＡＧが蓄積し、コラーゲン繊維の均一分布、構造及びサイズを変化させることが実証されている（Ａｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ６８（５）：５２３（１９９９）；  Ｆａｈｎｅｈｊｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  ８４（６）：７８１（２００６））。角膜失明に対処するためＭＰＳ−Ｉ小児で角膜移植が用いられてきたが、近年では高い拒絶率のため、この治療法を標準的治療法とするのははばかられている。対照的に、ＨＳＣＴを用いた複数の別個の報告は、角膜の透明度を安定化、改善及び場合によっては回復することができることを実証している（Ｆａｈｎｅｈｊｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  ８４（６）：７８１（２００６）；  Ｈｏｂｂｓ，  Ｌａｎｃｅｔ  ２（８２４９）：７３５（１９８１）；  Ｈｏｏｇｅｒｂｒｕｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３４５（８９６２）：１３９８（１９９５）；  Ｖｅｌｌｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｄｉｓ．  Ｃｈｉｌｄ．  ７６（２）：９２（１９９７）；  Ｇｕｌｌｉｎｇｓｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，  １０５（６）：１０９９（１９９８）；  Ｓｏｕｉｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ３１（１２）：１１０５（２００３））。
【０００５】
本発明は、角膜でＩＤＵＡを発現させるためのウイルスベクター並びにＭＳＰ−Ｉ関連角膜混濁又は失明の治療又は予防するための方法を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＭＰＳ−Ｉの対象の角膜にＩＤＵＡを送達するためのＡＡＶベクターの使用が、角膜全体でのＩＤＵＡの発現に有効であるという知見に基づくものである。従って、本発明の一つの態様は、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸であって、該ヌクレオチド配列がヒト細胞内での発現のためにコドン最適化されている、組換え核酸に関する。
【０００７】
本発明の別の態様は、本発明の核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、該ＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子並びに該ＡＡＶ粒子を含む医薬組成物に関する。
【０００８】
本発明のさらに別の態様は、ＡＡＶカプシドを含む組換えＡＡＶ粒子の生産方法であって、インビトロで細胞に、ＡＡＶ  Ｃａｐ及びＡＡＶ  Ｒｅｐをコードする配列、本発明のＡＡＶベクターゲノム並びに増殖的ＡＡＶ感染を発生させるためのヘルパー機能を与えること、及びＡＡＶカプシドを含み、かつＡＡＶベクターゲノムをカプシド内に被包する組換えＡＡＶ粒子を組み立てさせることを含む方法に関する。
【０００９】
本発明の追加の態様は、対象の角膜にＩＤＵＡを送達する方法であって、対象の角膜に、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の有効量を投与し、もって対象の角膜にＩＤＵＡを送達することを含む方法に関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、対象におけるＭＰＳ−Ｉ関連角膜混濁を治療又はその発症を遅延させる方法であって、対象の角膜に、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の治療有効量を投与し、もって対象におけるＭＳＰ−Ｉ関連角膜混濁を治療又はその発症を遅延させることを含む方法に関する。
【００１１】
本発明の上記その他の態様について、以下の本発明の説明でさらに詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜図１ＤはＡＡＶ遺伝子治療によるＭＰＳ−Ｉ患者繊維芽細胞でのＩＤＵＡ活性の回復を示す。（Ａ）ＡＡＶ−ＩＤＵＡ最適化ベクター構築物の概略図。（Ｂ）ＡＡＶ２感染及び非感染繊維芽細胞、正常ヒト繊維芽細胞（ＮＨＦ）又はＭＰＳ−Ｉ繊維芽細胞から得られた細胞溶解物（左図）及び上清（右図）をＩＤＵＡタンパク質発現について分析した。細胞溶解物中の全タンパク質のローディング対照としてβ−アクチンの検出を行った。（Ｃ，Ｄ）ＡＡＶ２感染及び非感染繊維芽細胞、ＮＨＦ又はＭＰＳ−Ｉ繊維芽細胞から得られた細胞溶解物（Ｃ）及び上清（Ｄ）について、ＩＤＵＡタンパク質の機能活性を得た。細胞溶解物に関しては、４−ＭＵのナノモル数を１時間の反応及びｍｇ全タンパク質に対して標準化した。細胞上清に関しては、５−ＭＵのナノモル数を１０μｌの試料に対して標準化した。４−ＭＵ：４−メチルウンベリフェロン、ＣＭＶ：サイトメガロウイルスプロモーター、ＩＴＲ：末端逆位反復配列、ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質。
【図２】図２は、ＭＰＳ−Ｉ線維芽細胞へのＡＡＶ２−ＧＦＰ及びＡＡＶ２−ｏｐｔＩＤＵＡ投与後に細胞毒性がみられないことを示す。
【図３】図３は、角膜注射後の墨汁含有ビヒクルの分布を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、ヒト角膜におけるＡＡＶカプシドセロタイプ評価を示す。（Ａ）ＡＡＶセロタイプ８、９又は８／９キメラ８Ｇ９にカプシド被包された自己相補的ＣＭＶ−ＧＦＰカセットをヒト角膜実質に注射した。７日後にウェスタンブロットを用いてＧＦＰを検出した。ＰＢＳは、ＰＢＳ（ビヒクル対照）のみを注射したヒト角膜に相当する。ローディング対照としてβ−アクチンの検出を行った。（Ｂ）一本鎖ＡＡＶ８Ｇ９−ＣＭＶ−ＧＦＰをヒト角膜実質内に注射し、７日後に組織検査のために採取した。左：ヒト角膜切片での組換えＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰウイルス感染の分布を示す免疫蛍光画像。ＰＢＳを注射したヒト角膜を陰性対照とした。画像は１０×対物レンズで取得し、スティッチ処理によって合成した。スケールバーは２０００μｍである。右：２０×対物レンズで撮像した同一の染色ヒト角膜の異なる領域。スケールバーは１００μｍである。ＤＡＰＩを核対比染色に用いた。（Ｃ）ＧＦＰ及び表記の細胞マーカーで染色した（Ｂ）の角膜の代表的切片。スケールバーは１０μｍである。ＤＡＰＩを核対比染色に用いた。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡによるヒト角膜でのＩＤＵＡ活性の回復を示す。（Ａ）ＩＤＵＡ抗体及び細胞マーカーで染色した正常な非注射角膜の代表的切片。ＤＡＰＩを核対比染色に用いた。スケールバーは１０μｍである。（Ｂ）ＡＡＶ８Ｇ９−ＩＤＵＡ注射後のＩＤＵＡ産生量を検出するウエスタンブロット。ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰの投与をベクター感染対照とした。Ｂ−アクチンをローディング対照とした。（Ｃ）ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ注射後７日目のヒト角膜から得られたＩＤＵＡタンパク質の機能活性。ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰを陰性対照として用いた。４−ＭＵのナノモル数を１時間の反応及びｍｇ全タンパク質に対して標準化した。ＰＢＳは、ビヒクル対照のみを注射したヒト角膜に相当する。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ形質導入後のＩＤＵＡタンパク質の分布を示す。（Ａ）ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ又はＰＢＳ（ビヒクル）注射後７日目のヒト角膜切片でのＩＤＵＡタンパク質の分布を示す免疫蛍光画像。画像は１０×対物レンズで取得し、スティッチ処理によって合成した。スケールバーは２０００μｍである。ＤＡＰＩを核対比染色に用いた。（Ｂ）２０×対物レンズで撮像した同一の染色ヒト角膜の断面。一番上の図は染色の陰性対照であり、一次抗体を用いないこと以外は他の試料と全く同じように実施した。ＤＡＰＩを核対比染色に用いた。スケールバーは１００μｍである。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、ヒト角膜においてＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ注射後に細胞毒性がないことを示す。（Ａ）ＰＢＳ、ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ又はＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを注射したヒト角膜を７日後にＴＵＮＥＬ染色処理した。上図は１０倍で撮像した画像。下図は２０倍で撮像した画像。陽性対照として、ＰＢＳを注射したヒト角膜をヌクレアーゼ処理した。スケールバーは１００μｍである。（Ｂ）（Ａ）で実施した染色全体のピクセル面積の定量。ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ又はＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを注射した角膜で細胞毒性に統計学的差異は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。
【図８】図８Ａ〜図８Ｅは、ＭＰＳ１イヌにおけるＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡの実質内注射を示す。イヌＩ−７１２の左眼にＡＡＶ８Ｇ９−ＣＭＶ−ｏｐｔＩＤＵＡ（１ｅ９ｖｇ／μｌ）溶液を注射した。インスリン注射器の針先を角膜実質に挿入し（Ａ）、溶液を徐々に注入して（Ｂ）全量（６５μｌ）を投与した（Ｃ）。注射直後に、液体保持領域が、角膜表面の３０％の部分の、軸角膜の曇り又は浮腫として視認された（Ｄ）。（Ｅ）眼科用超音波生体顕微鏡によって、表記時点での中心角膜厚を測定することができた。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、ＭＰＳ１イヌにおいてＡＡＶ８Ｇ９−ＣＭＶ−ｏｐｔＩＤＵＡが角膜混濁を消失させることを示す。Ａ）ＭＰＳ１イヌの片眼にＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを、反対側の眼に対照としてＡＡＶ−ＧＦＰを、いずれも実質内注射によって投与した。眼底の反帰光線法での輝板の反射率の向上は、表記の期間の角膜の透明度を示す。Ｂ）角膜浮腫及び回復。イヌＩ−７０９は、急性角膜浮腫を、５週目に左眼で（発症した週の画像は示していない）を、次いで１０週目に右眼で発症した。角膜浮腫は、全身性ステロイド薬（ＳＳ）と共に又は無しで局所ステロイド薬（ＴＳ）を投与した間の２〜３週間以内に収縮し、注射後１９週までいずれの眼でも再発しなかった。重要なことに、一時的な免疫反応から回復した後も、ＩＤＵＡを注射した左眼では治療効果がはっきりと残っていた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付の図面を参照しながら本発明について説明し、本発明の好ましい実施形態を示す。ただし、本発明は、異なる形態で実施することもでき、本明細書に記載された実施形態に限定されるものではない。これらの実施形態は、本明細書の開示内容を十分かつ完璧なものとするとともに、当業者に本発明の技術的範囲を十分に伝えるためのものである。
【００１４】
別途定義しない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語はすべて、当業者が通常理解する通りの意味を有する。本明細書で本発明の説明に用いる用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明を限定するものではない。本明細書で引用する刊行物、特許出願、特許その他の文献の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００１５】
本明細書では、ヌクレオチド配列は、別途記載しない限り、５’から３’方向の一本鎖のみで左から右に向かって記載する。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎの推奨する方法或いは（アミノ酸については）一文字略号又は三文字略号のいずれかによって表記するが、いずれも３７ＣＦＲ§１．８２２及び慣例に合致するものである。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ，  ９９−１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（米国特許商標庁）参照。
【００１６】
別途記載する場合を除いて、組換えパルボウイルス及びＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐ及び／又はＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、並びに一過的及び安定的に形質移入されたパッケージング細胞の構築には、当業者に公知の標準法を使用し得る。かかる技術は、当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８９）；  ＡＵＳＵＢＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。
【００１７】
さらに、本発明では、本発明の実施形態によっては、本明細書に記載された特徴のいずれか又は特徴の組合せを除外又は省略してもよいと想定される。
【００１８】
さらに説明すると、例えば、明細書に特定のアミノ酸をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ及び／又はＶから選択することができると記載されている場合、この記載は、例えばＡ、Ｇ、Ｉ又はＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ又はＶ；Ａ又はＧ；Ｌのみ等の、これらのアミノ酸の任意の部分集合からアミノ酸を選択できることを意味し、そのようなサブコンビネーションが本明細書にすべて明示的に記載されているものとして扱われる。さらに、このような記載は、特定されたアミノ酸の１以上を権利範囲から除外できることを示す。例えば、ある特定の実施形態では、アミノ酸はＡ、Ｇ又はＩではない；Ａではない；Ｇ又はＶではない等、そのような可能な除外規定がすべて明細書に明示的に記載されているものとして扱われる。
【００１９】
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、以下の用語を用いる。
【００２０】
単数形で記載されたものであっても、文脈から別途明らかでない限り、複数の場合も含む。
【００２１】
さらに、本明細書において測定可能な数値（例えばポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の長さ、投与量、時間、温度等）に言及する際に用いられる「約」という用語は、記載された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、さらには０．１％の変動を包含することを意味する。
【００２２】
また、本明細書で用いる「及び／又は」という用語は、その用語と共に列挙されたものの１以上のあらゆる可能な組合せに加えて、選択肢（「又は」）として解釈した場合の組合せの欠如も示し、それらを包含する。
【００２３】
本明細書で用いる「から本質的になる」という移行句は、請求項に係る発明（例えば、ｒＡＡＶ複製）について記載された物質又は工程「並びに基本的かつ新規な特徴に実質的な影響を与えないもの」を含むと解釈すべきである。従って、本明細書で用いる「から本質的になる」という用語は、「含む」と同義に解釈すべきではない。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して用いられる「から本質的になる」という記載（及び文法的変形）は、記載された配列（例えば、配列番号）からなるポリヌクレオチド又はポリペプチドだけでなく、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの機能が実質的に変化しないように、記載された配列の５’及び／又は３’或いはＮ末端及び／又はＣ末端に合計１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個）の追加のヌクレオチド又はアミノ酸が付加したものも意味する。合計１０個以下の追加のヌクレオチド又はアミノ酸は、両端に付加された追加のヌクレオチド又アミノ酸を合計した数である。本発明のポリヌクレオチドに対して用いられる「実質的に変化」という用語は、コードされたポリペプチドを発現する能力の増減が、記載された配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、５０％以上であることをいう。本発明のポリペプチドに対して用いられる「実質的に変化」という用語は、記載された配列からなるポリペプチドの活性と比較して、酵素活性の増減が５０％以上であることをいう。
【００２５】
本明細書で用いる「パルボウイルス」という用語は、自律的複製パルボウイルス及びディペンドウイルスを含めて、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）を包含する。自律的パルボウイルスには、パルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス属（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス属（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）及びコントラウイルス属（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）に属するものが挙げられる。自律的パルボウイルスの具体例としては、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス及びＢ１９ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。他の自律的パルボウイルスも当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。
【００２６】
ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）はアデノ随伴ウイルスを含み、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ及びヒツジＡＡＶが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；並びに表１参照。
【００２７】
本明細書で用いる「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語には、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ或いは既知の又は後日発見される他のＡＡＶが包含されるが、これらに限定されない。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。多数の比較的新しいＡＡＶセロタイプ及びクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７８：６３８１；  Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｖｉｒｏｌ．  ３３−：３７５並びに表１参照）。
【００２８】
本発明のパルボウイルスベクター、粒子及びゲノムは、限定されるものではないが、ＡＡＶ由来のものであってもよい。ＡＡＶ及び自律的パルボウイルスの様々なセロタイプのゲノム配列、並びに天然ＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列が公知である。こうした配列は文献又はＧｅｎＢａｎｋのような公開データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２及びＡＹ５３０５７９を参照されたい。なお、これらの開示内容はパルボウイルス及びＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列の教示に関して援用によって本明細書の内容の一部をなす。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：  ９３９；  Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：６８２３；  Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：１３０９；  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９：１１８５４；  Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｖｉｒｏｌ．  ３３−：３７５−３８３；  Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）  Ｖｉｒｏｌ．  ３３０：３７５；  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）  Ｖｉｒｏｌ．  ２２１：２０８；  Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：３３８５；  Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：３０９；  Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：８９１１；  Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５８：９２１；  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４５：５５５；  Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：３９９４；国際公開第００／２８０６１号、同第９９／６１６０１号、同第９８／１１２４４号及び米国特許第６１５６３０３号も参照されたい。なお、これらの開示内容はパルボウイルス及びＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列の教示に関して援用によって本明細書の内容の一部をなす。また、表１も参照されたい。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２及びＡＡＶ３のＩＴＲ配列に関する初期の記載は、Ｘｉａｏ，  Ｘ．，（１９９６），  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，”博士論文，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ（米国ペンシルヴァニア州ピッツバーグ）（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）でなされている。
【００２９】
本明細書で用いる「トロピズム」という用語は、細胞へのウイルスの進入、任意には及び好ましくは、それに続くウイルスゲノムによって運搬される配列の細胞内での発現（例えば転写及び任意には翻訳）、例えば組換えウイルスでは異種配列の発現をいう。当業者には明らかであろうが、ウィルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば誘導性プロモーターその他で制御された核酸配列について、トランス作用性因子の非存在下では開始されないことがある。ＡＡＶの場合、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス、非組込みエピソームその他ウイルスが細胞内で取り得る任意の形態に由来し得る。
【００３０】
本明細書において、パルボウイルス又はＡＡＶによる細胞の「形質導入」とは、パルボウイルス／ＡＡＶによって媒介される細胞への遺伝物質の導入をいう。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（３ｄ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。
【００３１】
「５’部分」及び「３’部分」という用語は、２以上のエレメント間の空間的関係を規定する相対的な用語である。例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流にあるポリヌクレオチドのセグメントを示す。「３’部分」という用語は、そのセグメントが、ポリヌクレオチドの３’末端にあっても、ポリヌクレオチドの３’側の半分にあってもよいが、必ずしもポリヌクレオチドの３’末端にあることを示すものでもなければ、必ずしもポリヌクレオチドの３’側の半分にあることを示すものでもない。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流にあるポリヌクレオチドのセグメントを示す。「５’部分」という用語は、そのセグメントが、ポリヌクレオチドの５’末端にあっても、ポリヌクレオチドの５’側の半分にあってもよいが、必ずしもポリヌクレオチドの５’末端にあることを示すものでもなければ、必ずしもポリヌクレオチドの５’側の半分にあることを示すものでもない。
【００３２】
本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語は、別途記載しない限り、ペプチド及びタンパク質の両方を包含する。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然ヌクレオチド及び非天然ヌクレオチドの両方を包含する）であり、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列のいずれであってもよい。
【００３４】
本明細書で用いる「配列同一性」という用語は、当技術分野における通常の意味を有する。当技術分野で公知の通り、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが既知の配列と配列同一性又は類似性を有するか否かを決定するのに、多種多様なプログラムを使用することができる。配列同一性又は類似性は、当技術分野で公知の標準技術、例えば、限定されるものではないが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実装手段（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（米国ワイオミング州マディソン、サイエンス・ドライブ５７５）のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １２：３８７（１９８４）に記載されたベストフィット配列プログラムによって、好ましくはデフォルト設定を用いて、或いは検査によって決定し得る。
【００３５】
【表１】
2019511927.tif 000003
2019511927.tif 000004
【００３６】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、一群の関連配列から、累進的ペアワイズアライメントを用いて多重配列アラインメントを生成する。これは、アラインメント生成に用いたクラスター関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２５：３５１（１９８７）の累進的アライメント法の簡易法を使用するが、この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１（１９８９）に記載されたものと同様である。
【００３７】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３（１９９０）及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：４６０（１９９６）；  ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２では、幾つかの検索パラメーターが用いられるが、これらは好ましくはデフォルト値に設定される。パラメーターは動的な値であり、特定の配列の構成及び関心配列が検索される特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが、感度を高めるため値を調整してもよい。
【００３８】
別の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９（１９９７）に記載されたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ法である。
【００３９】
アミノ酸配列同一性（％）の値は、一致する同一残基の数を、整列領域における「長い方の」配列の残基の総数で除することによって求められる。「長い方の」配列は、整列領域において実残基が最も多い配列である（アライメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２によって導入されるギャップは無視される。）。
【００４０】
同様に、核酸配列同一性（％）は、候補配列において、本明細書に具体的に開示されたポリヌクレオチドのヌクレオチドと同一のヌクレオチド残基の百分率と定義される。
【００４１】
アライメントは、アライメントすべき配列へのギャップの導入を含んでいてもよい。さらに、本明細書に具体的に開示されたポリヌクレオチドよりもヌクレオチド数の多い又は少ない配列については、一実施形態では、配列同一性の百分率は、ヌクレオチドの総数に対する同一ヌクレオチドの数に基づいて決定される。例えば、本明細書に具体的に開示された配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では、その短い方の配列のヌクレオチド数を用いて決定される。同一性（％）の計算において、相対的重みは、挿入、欠失、置換等の配列変異の様々な表出には割り当てられない。
【００４２】
一実施形態では、同一性だけに正（＋１）のスコアが割り当てられ、ギャップを含めたあらゆる形態の配列変異には「０」の値が割り当てられて、配列類似性計算のための後述の重み付きスケール又はパラメーターの必要性が排除される。配列同一性（％）は、例えば、一致する同一残基の数を、整列領域における「短い方の」配列の残基の総数で除し、１００を乗じることによって計算することができる。「長い方の」配列は、整列領域において実残基が最も多い配列である。
【００４３】
本明細書で用いる「単離」ポリヌクレオチド（例えば「単離ＤＮＡ」又は「単離ＲＮＡ」）は、天然に存在する生物又はウイルスの残りの成分（例えばそのポリヌクレオチドに関して通常見出される細胞又はウイルスの構造成分又は他のポリペプチドもしくは核酸）の少なくとも一部から分離された或いはそれらを実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。
【００４４】
同様に、「単離」ポリペプチドは、天然に存在する生物又はウイルスの残りの成分（例えばそのポリペプチドに関して通常見出される細胞又はウイルスの構造成分又は他のポリペプチドもしくは核酸）の少なくとも一部から分離された或いはそれらを実質的に含まないポリペプチドを意味する。
【００４５】
「治療用ポリペプチド」は、細胞又は対象におけるタンパク質の欠如又は欠損に起因する症状を緩和又は軽減し得るポリペプチドである。或いは、「治療用ポリペプチド」は、対象に恩恵（例えば抗癌作用又は移植生存率の向上等）をもたらすものである。
【００４６】
本明細書において、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して用いられる「修飾」という用語は、１以上の欠失、付加、置換又はそれらの組合せのため、野生型配列とは異なる配列をいう。
【００４７】
本明細書において、ウイルスベクターの「単離」又は「精製」とは、ウイルスベクターを、出発材料中の残りの成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離することを意味する。
【００４８】
「治療」という用語は、対象の状態の重症度が低減、少なくとも部分的に改善又は安定化されること及び／又は１以上の臨床症状のある程度の緩和、軽減、減少又は安定化が達成されること及び／又は疾患又は障害の進行の遅延があることを意味する。
【００４９】
「予防」という用語は、本発明の方法なしで起こるであろうものに比べて、対象における疾患、障害及び／又は臨床症状の予防及び／又は発症の遅延並びに／或いは疾患、障害及び／又は臨床症状の発症の重症度の低減を意味する。予防は完全なもの（例えば疾患、障害及び／又は臨床症状が全く存在しない等）であることもある。予防は部分的なものであって、対象における疾患、障害及び／又は臨床症状の発生並びに／或いは発症の重症度が本発明なしで起こるであろうものに比べて低減することもある。
【００５０】
本明細書で用いる「治療有効」量は、対象にいくらかの改善又は恩恵をもたらすのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療有効」量は、対象の１以上の臨床症状にある程度の緩和、軽減、減少又は安定化をもたらす量である。当業者には明らかであろうが、いくらかの恩恵が対象にもたらされる限り、治療効果が完全又は根治的である必要はない。
【００５１】
本明細書で用いる「予防有効」量は、本発明の方法なしで起こるであろうものに比べて、対象における疾患、障害及び／又は臨床症状の予防及び／又は発症の遅延並びに／或いは疾患、障害及び／又は臨床症状の発症の重症度の低減をもたらすのに十分な量である。当業者には明らかであろうが、いくらかの恩恵が対象にもたらされる限り、予防のレベルは完全である必要はない。
【００５２】
「異種ヌクレオチド配列」及び「異種核酸」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、ウイルスに天然には存在しない配列をいう。幾つかの実施形態では、異種核酸は、目的の（例えば、細胞又は対象に送達するための）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム又は非翻訳ＲＮＡを含む。
【００５３】
本明細書で用いる「ウイルスベクター」、「ベクター」又は「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えばウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えばＡＡＶ）粒子をいう。或いは、文脈によっては、「ベクター」という用語は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独又はプラスミドをいうのに用いられることもある。
【００５４】
本発明のウイルスベクターは、国際公開第０１／９２５５１号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）に記載されているような二重鎖パルボウイルス粒子であってもよい。したがって、ある実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムをパッケージングすることができる。
【００５５】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」又は「ｒＡＡＶゲノム」は、１以上の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般にウイルスを生成するためにシスの１４５塩基のＩＴＲしか必要としない。他のすべてのウイルス配列は不必要であり、トランスで提供してもよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターに効率的にパッケージングできる導入遺伝子のサイズを最大にするため１以上のＩＴＲ配列しか保持していない。構造及び非構造タンパク質コード配列は、トランスで（例えば、プラスミドのようなベクターから、或いは配列をパッケージング細胞に安定的に組み込むことによって）で提供し得る。本発明の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、１以上のＩＴＲ配列（例えばＡＡＶ  ＩＴＲ配列）、任意には２つのＩＴＲ（例えば２つのＡＡＶ  ＩＴＲ）を含んでおり、これらは典型的にはベクターゲノムの５’及び３’末端に位置し、異種核酸に隣接しているが、それらと接している必要はない。これらのＩＴＲは互いに同一であっても異なっていてもよい。
【００５６】
「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、ヘアピン構造を形成するとともに、末端逆位反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組込み及び／又はプロウイルスレスキュー等の所望の機能を媒介する）あらゆるウイルス末端反復又は合成配列を包含する。ＩＴＲはＡＡＶ  ＩＴＲでも、非ＡＡＶ  ＩＴＲでもよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のもの或いはＳＶ４０複製の起点として作用するＳＶ４０ヘアピンのような非ＡＡＶ  ＩＴＲ配列を、ＩＴＲとして使用することができ、これらはさらに、トランケーション、置換、欠失、挿入及び／又は付加によってさらに修飾できる。さらに、ＩＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他の米国特許第５４７８７４５号に記載された「二重Ｄ配列」のように、部分的又は完全に合成されたものであってもよい。
【００５７】
パルボウイルスゲノムは、その５’及び３’末端の両方にパリンドローム配列を有する。配列がパリンドロームであることから、相補的塩基対の間での水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成をもたらす。このヘアピン構造は、「Ｙ」形又は「Ｔ」形をとると考えられている。例えばＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６９  ＆  ７０（４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。
【００５８】
「ＡＡＶ末端逆位反復」又は「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、限定されるものではないが、セロタイプ１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ或いは既知の又は後日発見される他のＡＡＶ（例えば表１参照）を始めとする任意のＡＡＶに由来し得る。ＡＡＶ  ＩＴＲは、末端反復が所望の機能（例えば、複製、ウイルスパッケージング、持続性及び／又はプロウイルスレスキュー等）を媒介する限り、ネイティブ末端反復配列を有している必要はない（例えば、ネイティブＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーション及び／又はミスセンス変異によって改変し得る）。
【００５９】
本発明のウイルスベクターは、「標的」ウイルスベクター（例えば、指向性トロピズムを有するもの）及び／又は国際公開第００／２８００４号及びＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６１９に記載されているような「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＩＴＲとウイルスカプシドとが異なるパルボウイルスに由来するもの）であってもよい。
【００６０】
さらに、ウイルスカプシド又はゲノムエレメントは、挿入、欠失及び／又は置換を含めた他の改変を含んでいてもよい。
【００６１】
本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸、その修飾形及び合成アミノ酸を包含する。
【００６２】
天然に存在する左旋性（Ｌ−）アミノ酸を表２に示す。
【００６３】
【表２】
2019511927.tif 000005
【００６４】
或いは、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基（非限定的な例を表３に示す）であってもよいし、或いは翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化又は硫酸化）によって修飾されたアミノ酸であってもよい。
【００６５】
【表３】
2019511927.tif 000006
【００６６】
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ３５：２２５−４９に記載されているような「非天然」アミノ酸であってもよい。これらの非天然アミノ酸は、関心分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するのに好適に使用することができる。
【００６７】
本明細書で用いる「鋳型」又は「基質」という用語は、パルボウイルスウイルスＤＮＡの生産のため複製し得るポリヌクレオチド配列をいう。ベクター生産の目的に関しては、鋳型は、限定されるものではないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）又はウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バールウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクター等）を始めとする、もっと大きなヌクレオチド配列又は構築物に埋め込まれる。或いは、鋳型は、パッケージング細胞の染色体に安定的に組み込まれていてもよい。
【００６８】
本明細書において、パルボウイルス又はＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製及び新たなウイルス粒子の産生を媒介するパルボウイルス又はＡＡＶ非構造タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルス及びＡＡＶ複製遺伝子及びタンパク質については、例えばＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６９  ＆  ７０（４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
【００６９】
「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルス又はＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質のすべてをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関して、Ｒｅｐコード配列は４種のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）のすべてをコードする必要はなく、実際、ＡＡＶ５はスプライシングされたＲｅｐ６８及びＲｅｐ４０タンパク質しか発現しないと考えられている。代表的な実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、少なくとも、ウイルスゲノムの複製及び新ビリオンへのパッケージングに必要な複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、１以上の大型Ｒｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）と１つの小型Ｒｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８タンパク質とＡＡＶ  Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０タンパク質をコードする。別の実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに別の実施形態では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質、又はＲｅｐ７８及びＲｅｐ４０タンパク質をコードする。
【００７０】
本明細書で用いる「大型Ｒｅｐタンパク質」という用語は、Ｒｅｐ６８及び／又はＲｅｐ７８をいう。請求項に係る発明の大型Ｒｅｐタンパク質は、野生型又は合成のいずれでもよい。野生型の大型Ｒｅｐタンパク質は、セロタイプ１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１３或いは既知の又は後日発見される他のＡＡＶ（例えば表１参照）を始めとする任意のＡＡＶ或いはパルボウイルスに由来し得る。合成大型Ｒｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーション及び／又はミスセンス変異によって改変し得る。
【００７１】
当業者には明らかであろうが、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドにコードされている必要はない。例えば、ＭＶＭについて、ＮＳ−１及びＮＳ−２タンパク質（これらはスプライスバリアントである）は互いに独立に発現し得る。同様に、ＡＡＶについて、ｐ１９プロモーターを不活性化してもよく、１以上の大型Ｒｅｐタンパク質を１つのポリヌクレオチドから発現させ、１以上の小型Ｒｅｐタンパク質を異なるポリヌクレオチドから発現させてもよい。ただし、典型的には、単一の構築物から複製タンパク質を発現させる方が便利であろう。系によっては、ウイルスプロモーター（例えばＡＡＶ  ｐ１９プロモーター）は細胞によって認識されないことがあり、別々の発現カセットから大型及び小型Ｒｅｐタンパク質を発現させる必要がある。別の事例では、大型Ｒｅｐタンパク質及び小型Ｒｅｐタンパク質を別々に、つまり別個の転写及び／又は翻訳調節エレメントの制御下で発現させることが望ましい場合がある。例えば、大型Ｒｅｐタンパク質と小型Ｒｅｐタンパク質との比を減少させるため、大型Ｒｅｐタンパク質の発現を制御するのが望ましいことがある。昆虫細胞の場合、細胞への毒性を避けるために大型Ｒｅｐタンパク質（例えばＲｅｐ７８／６８）の発現を下方制御するのが有利なことがある（例えば、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５参照）。
【００７２】
本明細書において、パルボウイルス又はＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能的パルボウイルス又はＡＡＶカプシドを形成する（つまり、ＤＮＡをパッケージングし、標的細胞を感染させることができる）構造タンパク質をコードする。典型的には、ｃａｐコード配列は、パルボウイルス又はＡＡＶカプシドサブユニットのすべてをコードするが、機能的カプシドが産生される限り、カプシドサブユニットの一部をコードするものでもよい。必須ではないが、典型的には、ｃａｐコード配列は単一の核酸分子上に存在する。
【００７３】
自律性パルボウイルス及びＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．  ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，  ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６９  ＆  ７０（４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に詳細に記載されている。
【００７４】
ＩＤＵＡを発現するパルボウイルスベクター
本発明は、ＩＤＵＡをコードするヌクレオチド配列を含んでいて、対象の角膜においてＩＤＵＡを発現させることができるパルボウイルスベクター（例えばＡＡＶベクター）を提供する。
【００７５】
本発明の一つの態様は、ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むか、該配列から本質的になるか、或いは該配列からなる組換え核酸であって、ヌクレオチド配列が、ヒト細胞内での発現のためにコドン最適化されている組換え核酸に関する。ある実施形態では、核酸は、天然には存在しない配列である。幾つかの実施形態では、核酸は、配列番号１と９０％以上同一のヌクレオチド配列、例えば配列番号１と９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上同一のヌクレオチド配列を含むか、該配列から本質的になるか、或いは該配列からなる。幾つかの実施形態では、核酸は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むか、該配列から本質的になるか、或いは該配列からなる。幾つかの実施形態では、核酸は、配列番号１の連続したヌクレオチドを１０個以上（例えば、少なくとも１０、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００個又はそれ以上）含む。
【００７６】
配列番号１
1 CACCGGTCGC CACCATGCGA CCACTGAGACCACGGGCCGC TCTGCTGGCT
51 CTGCTGGCTT CACTGCTGGC CGCTCCCCCT GTCGCTCCTGCTGAGGCTCC
101 CCACCTGGTG CATGTGGACG CAGCTCGCGC CCTGTGGCCACTGAGGAGAT
151 TCTGGAGGAG CACAGGCTTT TGCCCACCTC TGCCTCACAGCCAGGCTGAC
201 CAGTACGTGC TGTCCTGGGA TCAGCAGCTG AACCTGGCATATGTGGGAGC
251 CGTCCCCCAC AGGGGGATCA AACAGGTGAG AACTCATTGGCTGCTGGAGC
301 TGGTCACCAC ACGAGGATCT ACTGGAAGGG GGCTGAGTTACAACTTCACC
351 CACCTGGACG GCTATCTGGA TCTGCTGAGA GAGAATCAGCTGCTGCCTGG
401 ATTTGAACTG ATGGGCTCAG CCAGCGGACA TTTCACCGACTTTGAGGATA
451 AGCAGCAGGT GTTCGAATGG AAAGACCTGG TCAGCTCCCTGGCTCGGCGC
501 TACATTGGGC GGTATGGCCT GGCACACGTG AGTAAGTGGAACTTTGAGAC
551 TTGGAATGAA CCAGACCACC ATGACTTCGA TAACGTGTCAATGACCATGC
601 AGGGGTTTCT GAATTACTAT GATGCCTGCT CCGAGGGCCTGCGGGCAGCC
651 TCTCCAGCTC TGCGACTGGG AGGACCAGGC GATTCCTTCCACACACCACC
701 CAGAAGTCCC CTGTCATGGG GCCTGCTGCG GCACTGTCATGACGGAACCA
751 ACTTCTTTAC AGGAGAAGCA GGGGTGAGAC TGGATTACATCTCCCTGCAT
801 CGAAAGGGGG CCAGGTCTAG TATCTCTATT CTGGAGCAGGAAAAGGTGGT
851 CGCTCAGCAG ATCCGGCAGC TGTTCCCCAA ATTTGCCGACACACCTATCT
901 ACAATGACGA GGCTGATCCT CTGGTGGGAT GGTCTCTGCCTCAGCCATGG
951 CGAGCCGATG TGACTTATGC TGCAATGGTG GTCAAAGTCATTGCTCAGCA
1001 CCAGAACCTG CTGCTGGCAA ATACTACCAG TGCTTTCCCATACGCACTGC
1051 TGAGTAACGA CAATGCCTTC CTGTCATATC ACCCCCATCCTTTTGCCCAG
1101 AGAACACTGA CTGCTCGGTT TCAGGTGAAC AATACCCGACCTCCACATGT
1151 GCAGCTGCTG AGGAAGCCTG TCCTGACAGC CATGGGCCTGCTGGCTCTGC
1201 TGGACGAGGA ACAGCTGTGG GCAGAGGTGT CTCAGGCCGGGACTGTCCTG
1251 GATAGTAACC ACACCGTGGG CGTCCTGGCT TCTGCACATCGACCTCAGGG
1301 ACCAGCAGAC GCTTGGCGAG CAGCTGTGCT GATCTACGCATCAGACGATA
1351 CACGAGCACA CCCTAACCGA AGCGTGGCAG TCACTCTGCGACTGCGAGGA
1401 GTGCCACCTG GACCAGGACT GGTGTACGTC ACCCGCTATCTGGACAATGG
1451 CCTGTGCTCT CCCGATGGAG AGTGGCGAAG GCTGGGGAGGCCCGTGTTCC
1501 CTACAGCAGA GCAGTTTAGA CGGATGAGAG CAGCCGAAGATCCAGTGGCT
1551 GCAGCACCAC GACCACTGCC TGCAGGAGGC AGACTGACCCTGCGGCCAGC
1601 CCTGCGCCTG CCAAGCCTGC TGCTGGTGCA CGTCTGCGCAAGGCCTGAAA
1651 AGCCACCCGG ACAGGTGACA AGGCTGAGAG CTCTGCCACTGACTCAGGGA
1701 CAGCTGGTGC TGGTCTGGTC AGACGAGCAT GTGGGGAGCAAATGTCTGTG
1751 GACTTACGAA ATTCAGTTCA GCCAGGATGG GAAGGCCTATACCCCTGTGA
1801 GCCGGAAACC CAGCACCTTC AACCTGTTCG TCTTTTCCCCAGACACCGGG
1851 GCCGTGTCCG GCTCTTACCG GGTCCGCGCT CTGGACTATTGGGCAAGGCC
1901 AGGCCCCTTC AGCGATCCTG TGCCATACCT GGAAGTGCCTGTGCCTCGCG
1951 GCCCACCATC TCCTGGAAAC CCTTGAGGGG ATCCGTCGAC TAG
【００７７】
ある生物での発現を最大にするためのヌクレオチド配列のコドン最適化の方法は、当技術分野で周知であり、公衆に利用可能なソフトウェアを用いて実施することができる。ヒトＩＤＵＡの野生型配列は当技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースで見出すことができる。ヒトＩＤＵＡ受託番号の具体例には、Ａ２６４９４、ＡＫ２９１８１６及びＡＨ００２６００があり、その記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００７８】
本発明は、本発明のＩＤＵＡ核酸を含むウイルスベクターゲノムも提供する。特定の実施形態では、ＩＤＵＡ核酸は、野生型ヒトＩＤＵＡ配列又はコドン最適化配列である。ウイルスベクターゲノムは、パルボウイルスベクターゲノム、例えばＡＡＶベクターゲノムとし得る。ウイルスベクターは、ＩＤＵＡ核酸に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、プロモーターは構成型プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターとし得る。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的又は優先的プロモーターであってもよい。本発明はさらに、本発明のＡＡＶベクターゲノムを含むインビトロ細胞、例えば該ＡＡＶベクターゲノムが細胞のゲノムに安定的に組み込まれたインビトロ細胞を提供する。本発明はさらに、本発明のウイルスベクターゲノムを含む組換えパルボウイルス粒子（例えば、組換えＡＡＶ粒子）を提供する。ウイルスベクター及びウイルス粒子については、以下でさらに説明する。
【００７９】
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本発明のカプシドタンパク質の存在により、改変トロピズムを示す。一実施形態では、パルボウイルスベクターは、角膜に対して全身性トロピズムを示す。別の実施形態では、パルボウイルスベクターは、野生型カプシドタンパク質を含むウイルスベクターに比べて、肝臓に対するトロピズムが低下している。
【００８０】
ウイルスベクターの生産方法
本発明はさらに、ウイルスベクターの生産方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、組換えパルボウイルス粒子の生産方法であって、パルボウイルス複製を許容する細胞に、（ａ）（ｉ）ＩＤＵＡをコードする核酸と（ｉｉ）パルボウイルスＩＴＲとを含む組換えパルボウイルス鋳型、（ｂ）Ｒｅｐ及びＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドを、組換えパルボウイルス鋳型の複製及びパッケージングに十分な条件下で、与え、もって細胞内で組換えパルボウイルス粒子を産生させることを含む方法を提供する。組換えパルボウイルス鋳型の複製及びパッケージングに十分な条件は、例えば、パルボウイルス鋳型の複製及びパルボウイルスカプシド内への被包に十分なＡＡＶ配列（例えば、パルボウイルスｒｅｐ配列及びパルボウイルスｃａｐ配列）の存在並びにアデノウイルス及び／又はヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在である。特定の実施形態では、パルボウイルス鋳型は２つのパルボウイルスＩＴＲ配列を含んでいて、それらは異種核酸配列の５’側及び３’側に位置するが、異種核酸配列と直接接している必要はない。
【００８１】
幾つかの実施形態では、組換えパルボウイルス鋳型は、国際公開第０１／９２５５１号に記載されているように二重鎖ＡＡＶベクターとするためＲｅｐによって分離しないＩＴＲを含む。
【００８２】
パルボウイルス鋳型並びにパルボウイルスｒｅｐ及びｃａｐ配列は、パルボウイルスカプシド内にパルボウイルス鋳型がパッケージングされたウイルスベクターが細胞内で産生されるような条件下で提供される。本方法は、細胞からウイルスベクターを回収する工程をさらに含んでいてもよい。ウイルスベクターは、培地から及び／又は細胞の溶解によって回収できる。
【００８３】
細胞は、パルボウイルスのウイルス複製を許容する細胞とすることができる。当技術分野で公知の適切な細胞を用いることができる。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞（例えば、霊長類又はヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損型ヘルパーウイルスから欠失した機能を与えるトランス相補性パッケージング細胞株（例えば２９３細胞その他のＥ１ａトランス相補細胞）であってもよい。
【００８４】
パルボウイルス複製及びカプシド配列は、当技術分野で公知の方法によって提供し得る。現在のプロトコールでは、典型的には、単一プラスミド上でパルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。パルボウイルス複製及びパッケージング配列は一緒に提供する必要はないが、それが好都合なこともある。パルボウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列は、任意のウイルスベクター又は非ウイルスベクターによって提供し得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルス又はヘルペスウイルスベクターによって提供し得る（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥ１ａ又はＥ３領域に挿入される）。ＥＢＶベクターも、パルボウイルスｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の発現に使用し得る。この方法の一つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソームであり、連続的な細胞分裂の間終始高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶ系核エピソーム」と呼ばれる染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎ．  １５８：６７参照。）。
【００８５】
さらに別の選択肢として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を細胞に安定的に組み込んでもよい。
【００８６】
典型的には、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキュー及び／又はパッケージングを防ぐため、ＴＲに隣接していない。
【００８７】
パルボウイルス鋳型は、当技術分野で公知の方法を用いて細胞に与えることができる。例えば、鋳型は、非ウイルスベクター（例えばプラスミド）又はウイルスベクターによって与え得る。特定の実施形態では、パルボウイルス鋳型は、ヘルペスウイルス又はアデノウイルスベクターによって提供される（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａ又はＥ３領域に挿入される）。別の具体例として、Ｐａｌｏｍｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：５０２５には、ＡＡＶ  ＴＲに隣接するレポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターが記載されている。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述したように、ＥＢＶベクターを用いて鋳型を送達することもできる。
【００８８】
別の代表的な実施形態では、パルボウイルス鋳型は、増殖性ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに別の実施形態では、パルボウイルス鋳型を含むＡＡＶプロウイルスを細胞の染色体に安定的に組み込む。
【００８９】
ウイルス力価を高めるため、増殖性パルボウイルス感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）を細胞に与えることができる。パルボウイルス複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスベクターによってもたらされる。或いは、アデノウイルス又はヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスベクター又はウイルスベクター（例えばＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ３：１２９５並びに米国特許第６０４０１８３号及び同第６０９３５７０号に記載されているような効率的パルボウイルス産生を促進するヘルパー遺伝子のすべてを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミド）によって提供することもできる。
【００９０】
さらに、ヘルパーウイルス機能は、ヘルパー配列が染色体に埋め込まれた又は安定な染色体外エレメントとして維持されているパッケージング細胞によって提供してもよい。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にはパッケージングすることができず、例えばＩＴＲに隣接しない。
【００９１】
当業者には明らかであろうが、パルボウイルス複製及びカプシド配列とヘルパーウイルス配列（例えばアデノウイルス配列）とを単一のヘルパー構築物で提供できれば有利であることもある。このヘルパー構築物は、非ウイルス系又はウイルス系構築物とし得る。ある非限定的な例として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルス又はハイブリッドヘルペスウイルスとすることができる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供される。このベクターは、パルボウイルス鋳型をさらに含んでいてもよい。パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列及び／又はパルボウイルス鋳型は、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａ又はＥ３領域）に挿入することができる。
【００９３】
さらに別の実施形態では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供される。この実施形態では、パルボウイルス鋳型はプラスミド鋳型として提供することができる。
【００９４】
別の例示的な実施形態では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、パルボウイルス鋳型は細胞にプロウイルスとして組み込まれる。或いは、パルボウイルス鋳型は、細胞内に染色体外エレメント（例えば、ＥＢＶ系核エピソーム）として維持されるＥＢＶベクターによって与えられる。
【００９５】
さらに別の例示的な実施形態では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。パルボウイルス鋳型は、別個の増殖性ウイルスベクターとして提供できる。例えば、パルボウイルス鋳型は、パルボウイルス粒子又は第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供できる。
【００９６】
前述の方法では、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルス複製及びパッケージングに十分なアデノウイルス５’及び３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復及びＰＡＣ配列）を含む。パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列及び（存在する場合には）ＡＡＶ鋳型はアデノウイルス骨格に埋め込まれ、これらの配列がアデノウイルスカプシド内にパッケージングできるように５’及び３’シス配列に隣接する。上述の通り、アデノウイルスヘルパー配列及びパルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列は一般にＩＴＲに隣接しておらず、これらの配列はパルボウイルスビリオン内にパッケージングされない。
【００９７】
Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １８：７０４−１２には、アデノウイルスとＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子とを両方共含むキメラヘルパーが記載されている。
【００９８】
ヘルペスウイルスも、パルボウイルスパッケージング法におけるヘルパーウイルスとして使用し得る。１以上のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、好適には、スケーラブルなパルボウイルスベクター産生機構を促進し得る。ＡＡＶ−２  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクターは既に報告されている（Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６：９８６及び国際公開第００／１７３７７号）。
【００９９】
さらに別の選択肢として、本発明のウイルスベクターは、例えばＵｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １３：１９３５−４３に記載されているように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びパルボウイルス鋳型を送達するためのバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞で産生させることができる。
【０１００】
夾雑ヘルパーウイルスを含まないパルボウイルスベクターストックは、当技術分野で公知の方法によって得ることができる。例えば、パルボウイルス及びヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別し得る。パルボウイルスは、ヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離することもできる（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９７３）。夾雑ヘルパーウイルスが複製能をもたないように、欠失した複製欠損型ヘルパーウイルスを使用することができる。さらに別の方法として、パルボウイルスのパッケージングの媒介にはアデノウイルスの初期遺伝子発現しか必要とされないので、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーを使用することができる。後期遺伝子発現が欠損したアデノウィルス突然変異体は当技術分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９アデノウィルス突然変異体）。
【０１０１】
組換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ及びインビボでの細胞への核酸の送達に有用である。特に、本ウイルスベクターは、哺乳動物細胞を始めとする動物に核酸を送達又は導入するのに好適に使用できる。特に、本発明のウイルスベクターは、ＩＤＵＡをコードする核酸を対象の角膜に送達するのに有用である。
【０１０２】
角膜標的ＡＡＶ遺伝子治療は、主に、創傷治癒アッセイにおける局所適用と角膜実質への直接注入との２通りの投与経路による動物モデルで研究されている。局所適用に関して、ＡＡＶセロタイプ９（ＡＡＶ９）が実質形質導入に最も効率的であると報告されているが、これはほぼ完全に上皮／実質境界に局在化している（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ９１（３）：４４０  （２０１０））。ヒト角膜外植片への実質内注射後のＡＡＶ遺伝子送達に関して、ＡＡＶ８は、ＣＤ３４＋角膜実質細胞及びマクロファージを含めた複数の細胞型を含む実質形質導入についてＡＡＶ２又はＡＡＶ１よりも効率的であることが観察されている（Ｈｉｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７（４）：ｅ３５３１８  （２０１２））。重要なことに、これらの薬物投与経路のいずれも、ＡＡＶベクターに関連した有害な結果は観察されていない（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ９１（３）：４４０  （２０１０）；  Ｈｉｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７（４）：ｅ３５３１８  （２０１２）；  Ｍｏｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６（１０）：ｅ２６４３２  （２０１１））。
【０１０３】
当業者には明らかであろうが、ＩＤＵＡをコードする核酸は、適切な調節配列と作動可能に連結していてもよい。例えば、核酸は、転写／翻訳調節シグナル、複製開始点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター及び／又はエンハンサー等のような発現調節エレメントと作動可能に連結し得る。
【０１０４】
当業者には明らかであろうが、所望のレベル及び組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントを使用できる。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成型又は誘導型とし得る。プロモーター／エンハンサーはネイティブ又は外来であってよく、天然又は合成配列であってもよい。外来とは、転写開始領域が野生型宿主にはなく、野生型宿主に転写開始領域が導入されることを意図する。
【０１０５】
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞又は治療すべき対象にネイティブなものであってもよい。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、ＩＤＵＡ核酸配列にネイティブなものであってもよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、関心の標的細胞で機能するように選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成型でも誘導型でもよい。
【０１０６】
誘導型発現調節エレメントは、典型的には、核酸配列の発現の調節が望まれる用途において有利である。遺伝子送達のための誘導型プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的又は優先的プロモーター／エンハンサーエレメントとすることができ、眼特異的又は優先的（網膜特異的及び角膜特異的なものを包含する）プロモーター／エンハンサーエレメントが包含される。他の誘導型プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ホルモン誘導性及び金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導型プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、限定されるものではないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【０１０７】
核酸配列が標的細胞内で転写及び翻訳される実施形態では、一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のため特異的開始シグナルが含まれる。これらの外来性翻訳調節配列は、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含んでいてもよく、天然及び合成のものを含め、様々な起源のものとし得る。
【０１０８】
本発明のウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えばＡＡＶベクターとすることができる。ＡＡＶベクターはどのようなＡＡＶセロタイプであってもよい。幾つかの実施形態では、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９ベクターである。幾つかの実施形態では、ＡＡＶベクターはハイブリッドベクターであり、例えばあるセロタイプ由来のカプシドタンパク質と別のセロタイプ由来のゲノムとを有するもの或いは合成カプシドタンパク質を有するものである。特定の実施形態では、ベクターは、改変されたトロピズムを有するハイブリッドカプシドを含む。一例では、ハイブリッドカプシドは、あるセロタイプ（例えばＡＡＶ９）由来のグリカン結合部位（例えばガラクトース結合部位）を、別のセロタイプ（例えばＡＡＶ８）由来のカプシド配列内に含む（例えば、国際公開第２０１４／１４４２２９号参照、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）
【０１０９】
本発明に係るウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞を包含する広範な細胞にＩＤＵＡ核酸を送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えばインビトロでのポリペプチド生産のため又はエクスビボ遺伝子治療のため、インビトロで細胞に核酸を送達するのに使用し得る。ウイルスベクターは、また、核酸を必要とする対象に（例えばＩＤＵＡを発現させるために）核酸を送達する方法で有用である。このようにして、対象においてインビボでポリペプチドを産生させることができる。対象は、ポリペプチドの欠損を有していて、ポリペプチドを必要とするものであってもよい。さらに、本方法は、対象でのポリペプチドの産生がある有益な効果を与え得るので、実施することができる。
【０１１０】
ウイルスベクターはまた、培養細胞又は対象で（例えば、対象を、ポリペプチドを生産するための或いは対象における（例えばスクリーニング法に関連した）ポリペプチドの効果を観察するためのバイオリアクターとして用いて）ＩＤＵＡを産生させるのにも使用できる。
【０１１１】
本発明のウイルスベクターは、ＩＤＵＡを送達することが有益である病態（例えばＭＰＳ−Ｉ）の治療及び／又は予防のために、ＩＤＵＡをコードする核酸を送達するのに使用することができる。
【０１１２】
本発明に係るウイルスベクターは、細胞培養系、器官又は器官培養物（例えば、眼）、或いはトランスジェニック動物モデルにおいてＩＤＵＡ核酸を一過的に又は安定に発現させる診断及びスクリーニング方法に用途を見出すことができる。
【０１１３】
本発明のウイルスベクターは、治療以外の目的にも使用することができ、その例として、当業者には明らかであろうが、遺伝子ターゲティング、クリアランス、転写、翻訳等を評価するためのプロトコルでの使用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ウイルスベクターは、安全性（伝播、毒性、免疫原性等）の評価の目的にも使用することができる。このようなデータは、例えば、臨床的有効性の評価前の規制当局による承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。
【０１１４】
或いは、ウイルスベクターをエクスビボ細胞（例えば角膜外植片）に投与し、改変細胞又は外植片を対象に投与することができる。ＩＤＵＡ核酸を含むウイルスベクターを細胞に導入し、細胞を対象に投与すると、そこで核酸を発現させることができる。
【０１１５】
対象、医薬製剤及び投与モード
本発明に係るウイルスベクター及びカプシドは、獣医学用途及び医学用途の両方に用途が見出される。適切な対象には、鳥類及び哺乳動物が包含される。本明細書で用いる「鳥類」という用語には、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコ等が包含されるが、これらに限定されない。本明細書で用いる「哺乳動物」という用語には、ヒト、ヒト以外の霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等が包含されるが、これらに限定されない。ヒト患者には、新生児、乳児、少年及び成人が包含される。
【０１１６】
特定の実施形態では、本発明は、医薬組成物であって、薬学的に許容される媒体中の本発明のウイルスベクター、及び任意には他の医薬、薬剤、安定化剤、緩衝剤、媒体、アジュバント、希釈剤等を含む医薬組成物を提供する。注射用では、媒体は典型的には液体である。他の投与方法では、媒体は固体又は液体とし得る。吸入投与では、媒体は呼吸可能なものであり、任意には固体又は液体の微粒子形態とし得る。
【０１１７】
「薬学的に許容される」とは、有毒でもないしその他の不都合もない物質を意味し、換言すると、該物質は、望ましくない生物学的作用を起こさずに対象に投与し得る。
【０１１８】
本発明の一つの態様は、インビトロで核酸を細胞に導入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入方法によって適切な感染多重度で細胞に導入することができる。投与されるウイルスベクターの力価は、標的細胞の種類及び数並びに特定のウイルスベクターに応じて、変更することができ、当業者であれば過度の実験を要することなく決定することができる。代表的な実施形態では、約１０３感染単位以上、さらに好ましくは約１０５感染単位以上で細胞に導入される。
【０１１９】
ウイルスベクターが導入される細胞は、どのようなタイプのものでもよく、限定されるものではないが、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、及び角膜細胞（例えば、角膜実質細胞、上皮細胞及び内皮細胞等）が包含される。さらに、細胞は、上述の通り、どのような種を起源とするものであってもよい。
【０１２０】
ウイルスベクターは、対象に改変細胞を投与する目的のため、インビトロ細胞に導入することができる。特定の実施形態では、対象から細胞を取り出して、それにウイルスベクターを導入し、次いで細胞を対象に投与して戻す。エクスビボで操作するため対象から細胞を取り出し、次いで対象に戻す方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第５３９９３４６号参照）。或いは、組換えウイルスベクターは、ドナーからの細胞、培養細胞又は他の適切な供給源からの細胞に導入し、その細胞をそれを必要とする対象（すなわち「レシピエント」）に投与することもできる。
【０１２１】
エクスビボ遺伝子送達に適した細胞は上述の通りである。対象への細胞の投与量は、対象の年齢、状態及び種、細胞の種類、細胞で発現される核酸、投与モード等によって変化する。典型的には、薬学的に許容される媒体中で１用量当たり、少なくとも約１０２乃至約１０８個の細胞又は少なくとも約１０３乃至約１０６個の細胞が投与される。特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質導入した細胞は、医薬媒体と組合せて治療有効量又は予防有効量で対象に投与される。
【０１２２】
本発明の別の態様は、対象にウイルスベクターを投与する方法である。それを必要とするヒト患者又は動物への本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野で公知の手段によることができる。任意には、ウイルスベクターは、薬学的に許容される媒体中で治療有効量又は予防有効量で送達される。
【０１２３】
対象に投与されるウイルスベクターの量は、投与モード、治療及び／又は予防すべき疾患又は状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター及び送達すべき核酸等に依存し、常法によって決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位、任意には約１０８〜約１０１３形質導入単位の力価である。
【０１２４】
特定の実施形態では、所望のレベルの遺伝子発現を達成するため、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回又はそれ以上の投与）を様々な間隔（例えば毎日、毎週、毎月、毎年）の期間にわたって行ってもよい。
【０１２５】
角膜への例示的な投与モードには、実質内、局所、硝子体内及び網膜下が包含される。
【０１２６】
標的組織への送達は、ウイルスベクターを含むデポーを送達することによっても達成できる。代表的な実施形態では、ウイルスベクターを含むデポーを角膜その他の眼の組織に植え込むか、或いは組織を、ウイルスベクターを含むフィルムその他のマトリックスと接触させることができる。このような植込み型マトリックス又は基材は米国特許第７２０１８９８号に記載されている。
【０１２７】
特定の実施形態では、ＭＰＳ−Ｉに関連する角膜混濁及び／又は失明の治療、発症の遅延及び／又は予防のため、本発明のウイルスベクターを角膜に投与する。
【０１２８】
そこで、一つの態様として、本発明は、対象の角膜にＩＤＵＡを送達する方法であって、対象の角膜に、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の有効量を投与し、もって対象の角膜にＩＤＵＡを送達することを含む方法をさらに包含する。
【０１２９】
別の態様では、本発明は、対象におけるＭＰＳ−Ｉ関連角膜混濁の治療、発症の遅延及び／又は予防を行う方法であって、対象の角膜に、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の治療有効量を投与し、もって対象におけるＭＳＰ−Ｉ関連角膜混濁の治療、発症の遅延、及び／又は予防を行うことを含む方法をさらに包含する。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、インビトロ又はエクスビボで（例えば、対象における移植前に）角膜にＩＤＵＡを送達する方法であって、角膜を、ＩＤＵＡを発現するＡＡＶ粒子の有効量と接触させ、もって角膜にＩＤＵＡを送達することを含む方法をさらに包含する。幾つかの実施形態では、角膜をＡＡＶ粒子と共にインキュベートしてもよいし、或いはＡＡＶ粒子を角膜に注射してもよい。
【０１３１】
本発明の方法において、対象は、ＭＰＳ−Ｉと診断されたものであっても、ＭＰＳ−Ｉが疑われるものであってもよい。特定の実施形態では、対象は、例えば１８歳未満、例えば１８歳未満、１７歳未満、１６歳未満、１５歳未満、１４歳未満、１３歳未満、１２歳未満、１１歳未満、１０歳未満、９歳未満、８歳未満、７歳未満、６歳未満又は５歳未満の乳児又は子供である。幾つかの実施形態では、対象は、角膜の混濁を発症していない。
別の実施形態では、対象は、角膜の少なくとも部分的な混濁を有し、例えば、対象の視力は、ＭＰＳ−Ｉを有していない対象に比して、約１０％未満、例えば、約１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満又は９０％未満低下する。
【０１３２】
注射剤は、慣用の形態で、液体溶液又は懸濁液、注射前に液体中で溶液又は懸濁液とするのに適した固体形態、或いはエマルションのいずれかとして調製できる。或いは、本発明のウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドを局所的に、例えばデポー又は徐放性製剤中で投与することもできる。さらに、ウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドは、（例えば、米国特許公開第２００４／００１３６４５号に記載されているような）外科植込み型マトリックスに付着させて送達することもできる。
【０１３３】
以上本発明を説明してきたが、以下の実施例で本発明をさらに詳しく説明する。ただし、以下の実施例は例示のためのものにすぎず、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１３４】
実施例１
材料及び方法
ＡＡＶベクターの作製：細胞培養実験に関して、実施例で使用したベクターの生産には、文献に記載されたトリプルトランスフェクション法を使用した（Ｇｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  １（３）：１４１２（２００６））。この方法ではｐＸＲ２又はｐＸＲ８Ｇ９プラスミドを使用したが、これらはいずれもＡＡＶのｒｅｐ２を含んでおり、それぞれ表記のセロタイプのカプシド遺伝子を含む。ｐＴＲ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰのｅｇｆｐ遺伝子をＡｇｅＩ及びＳａｌＩ部位でコドン最適化ＩＤＵＡ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社から提供）で置換することによって、所期のＡＡＶゲノムを含むプラスミドを最初に構築した。ＡＡＶ産生及び塩化セシウム勾配分離（Ｇｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  １（３）：１４１２（２００６））後に、ピーク画分をＰＢＳで透析し、定量的ＰＣＲ（ＣＭＶ＿Ｆ  ＣＡＡ  ＧＴＡ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＣ（配列番号２）、ＣＭＶ＿Ｒ  ＡＡＧ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＴＧＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＧ（配列番号３））で力価を測定し、これをサザンドットブロット（Ｇｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  １（３）：１４１２（２００６））で確認した。ヒト外植片での実験のため、ＧＭＰグレードのベクター標品はＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅから提供された。
【０１３５】
細胞培養及びベクター形質導入：ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＭＰＳ−Ｉ患者線維芽細胞及び正常ヒト線維芽細胞（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．  ４：１８（２００５））は、１０％ウシ胎仔血清及びペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｉｇｍａ社）中、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に維持した。培養細胞の形質導入は、２４ウェルプレート中で一定の体積で実施した。これらの実験に関して、ベクターは、表記のウイルスゲノム／細胞量でウェルに添加し、実験期間中は除去しなかった。
【０１３６】
ヒト角膜実験：すべての実験プロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  ａｔ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）によって承認された。人間の角膜は視覚組織調達バンクの尽力によって提供された。これらの匿名化死後組織実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の人を対象とする研究の人研究倫理オフィス（ＩＲＢ−１４−１０１９）に従って実施した。両性別の角膜を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中、提供されたＯｐｔｉ−Ｍｅｍ中で維持した。注射は、３１ゲージのインスリン注射器で行った。注射を検証するための色素として墨汁を使用した。角膜を７日間培養し、本明細書に記載の通り分析した。
【０１３７】
機能的ＩＤＵＡアッセイ：定量的ＩＤＵＡ酵素活性は、文献に記載された通り測定した（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｂｕｌｌ．  ７４（６）：４２９（２００７））。簡潔に説明すると、１０μｌの上清又は細胞溶解溶液を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）中の５０μＭの４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドと暗所で６０分間３７℃でインキュベートした。８０μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨ／グリシン緩衝液ｐＨ１０．３を添加して反応を停止させた。９６ウェルプレートを４℃で１分間１３０００ｒｐｍで遠心分離し、その上清を、３６５ｎｍの励起後４５０ｎｍで蛍光測定するため蓋付きで底が透明な黒色９６ウェルプレートに移した。開裂した基質の量は、４−メチルウンベリフェロンで予め確立しておいた標準曲線から計算し、細胞溶解液中の酵素活性はｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ単位、上清の分析値はｎｍｏｌ／ｈ／１０μｌ単位で表す。各サンプルのタンパク質量はＢＣＡアッセイで求めた。
【０１３８】
ＴＵＮＥＬアッセイ：ＡＡＶ形質導入時の細胞毒性によるアポトーシス細胞は、ＤＡＢによるデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰ−ビオチンニックエンド標識によって決定した。ＴＵＮＥＬアッセイは、ＴＡＣＳ２  ＴｄＴ−Ｂｌｕｅ  Ｌａｂｅｌインサイチュアポトーシス検出キット（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社（米国メリーランド州ゲイザースバーグ））を用いて行った。簡単に説明すると、脱パラフィン及び再水和後、ヒト角膜切片をプロテイナーゼＫで２０分間消化した。スライドを１×ＰＢＳで洗浄し、組織をメタノール中３％Ｈ２Ｏ２溶液とインキュベートすることによって内在性ペルオキシダーゼ活性を消失させた。スライドを１×ＰＢＳで洗浄した後、組織切片を１×ＴｄＴ標識緩衝液と５分間インキュベートした。標識反応は、角膜組織を、ＴｄＴ酵素、ビオチン化ｄＵＴＰを有するｄＮＴＰ、及び１×ＴｄＴ標識緩衝液中の１×塩化マンガンと３７℃の加湿チャンバー内で１時間インキュベートすることからなる。反応は１×ＴｄＴ停止緩衝液とインキュベートすることによって完了させた。断片化されたＤＮＡは、切片をストレプトアビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼ及びＤＡＢ溶液で処理することによって視覚化した。
【０１３９】
免疫蛍光染色：ヒト角膜組織をパラフィンに包埋し、ミクロトームを用いて厚さ５μｍの切片とした。スライドを免疫蛍光抗体で染色するため、スライドをキシレン中で５分間計２回インキュベートして脱パラフィンした後、１００％、９５％及び７０％エタノール溶液中に各５分間、最後に水中に５分間順次浸漬することにより再水和した。切片を染色する前に、パラフィン包埋プロセスのためにマスクされていたエピトープを露出させるための抗原賦活化手順を行った。具体的には、スライドを、予熱しておいた抗原賦活化溶液（Ｄａｋｏ）中に９８℃で７分間浸漬した。次いで、スライドを１×ＰＢＳ中１０％ＮＧＳと室温で１時間インキュベートすることによって、組織内の非特異的結合部位をブロックした。スライドを１×ＰＢＳ中２％ＮＧＳで各５分間２回洗浄した。次いで、切片を１×ＰＢＳ中の２％ＮＧＳ溶液で適度に希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、非特異的に結合した一次抗体を除去するためスライドを各５分間３回洗浄した。洗浄液は１×ＰＢＳ中２％ＮＧＳを含んでいた。次いで、適切な蛍光標識二次抗体（５μｇ／ｍｌ）を、１×ＰＢＳ中２％ＮＧＳで希釈したスライドに添加し、スライドを４℃で１時間インキュベートした。最後に、スライドを２回１×ＰＢＳ中２％ＮＧＳで各５分間３回洗浄し、最後に４℃で１×ＰＢＳで洗浄した。切片内の核を対比染色するため、数滴のＨｏｅｃｈｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ−Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ３５６９  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、五水和物−１μｇ／ｍｌ）を７分間添加し、次いで水洗した。スライドを次いでＣｙｔｏｓｅａｌ  ６０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＮＹＳＥ：ＴＭＯ））と共にカバーグラスで覆った。
【０１４０】
本研究に用いた一次抗体は以下の通りであった：ＩＤＵＡ染色用には、ウサギポリクローナルＩＤＵＡ抗体（Ｂｉｏｒｂｙｔ社、カタログ番号ｏｒｂ１５７６１５、１／５０希釈）、ＧＦＰ染色用には、ニワトリ抗ＧＦＰ抗体（Ａｖｅｓ社、カタログ番号ＧＦＰ−１０２０、１／１００希釈）、ＣＤ３４染色用には、マウスモノクローナル抗体（クローン：Ｂ−６）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、ｓｃ−７４４９９、１／１００希釈）、α−平滑筋アクチン染色用には、マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ社、クローン＃１Ａ４、カタログ番号ＭＡＢ１４２０、１／１００希釈）、及びＦ４／８０マーカー染色用には、ラットモノクローナル抗体（クローン：ＢＭ８）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、ｓｃ−５２６６４、１／１００希釈）。二次抗体は以下の通りであった：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａ−１１０１２）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド））、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ａ−１１０３９）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド））、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ａ−１１００６）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド））及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａ−１１００１）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国カリフォルニア州カールスバッド））。各スライドからの画像は、４０×対物レンズ（オリンパス（株））を装着したＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７８０共焦点顕微鏡を用いて撮影した。完全なヒト角膜を構成する画像は、１０×対物レンズで撮影し、タイトル機能、次いでスティッチ処理した。画像は次いでＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて処理した。すべての実験において陰性対照染色として、各組織からの切片を二次抗体単独で染色した。
【０１４１】
ＭＰＳ−Ｉ細胞形質移入及びウエスタンブロット：ＭＰＳ−Ｉ患者繊維芽細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり２００００個播種した。２４時間後、各ウェルに１μｇのプラスミドＤＮＡと３μｌのＰＥＩと６０μｌのＤＭＥＭのミックスを添加して、各処理毎に９つのウェルを形質移入した。形質移入して２４時間後に、各ウェルから４０μｌの上清を回収し、３つのウェルを一緒にして各サンプルとした。４０μｌのＤＭＥＭを各ウェルに添加して、後の上清回収のため同一容積に維持した。形質移入して４８時間後に、３つのウェルを一緒にして全上清を回収し、三つ組を再度形成した。この時点で、ウェル当たり７０μｌのＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号７８５０１）を試薬プロトコルに従って添加することによって全細胞タンパク質を回収した。
ウェスタンブロット用に、タンパク質溶解物を４×Ｎｕｐａｇｅサンプル緩衝液中の５％β−メルカプトエタノール溶液に添加した。得られた溶液を１０分間煮沸し、氷上で１０分間冷却し、次いで１０％ビス−トリスプレキャストゲルに流した。ゲルを１×ＭＯＰＳランニング緩衝液中で泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンをｄｄＨ２Ｏ中の５％ミルクでブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液（１×ＰＢＳ中０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１：５００希釈したマウス宿主ＩＤＵＡ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ−４１１９）で２時間又はＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：５０００希釈したマウス宿主β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社）と反応させた。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１：１００００希釈したマウス西洋ワサビペルオキシダーゼ二次抗体を反応させた。Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｂｒｉｇｈｔ  Ｓｉｒｉｕｓ化学発光試薬を製品プロトコールに従って使用し、ブロットをオートラジオグラフィーフィルムを用いて露光した。
【０１４２】
コドン最適化ＩＤＵＡに対する野生型の２９３細胞形質移入の比較：２９３細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり１０００００個播種した。２４時間後、ウェル当たり１μｇのプラスミドＤＮＡと３μｌのＰＥＩと６０μｌのＤＭＥＭのミックスを用いて３つのウェルを形質移入した。７２時間後に、細胞培養上清を保存してから、各ウェルに７０μｌのＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社カタログ番号７８５０１）を添加することによって、全細胞タンパク質を回収した。
【０１４３】
ＭＰＳ−Ｉ患者の細胞毒性アッセイ：患者細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり２００００個播種した。２４時間後に、ＡＡＶ−２  ３１６を四つ組で添加した。７２時間後に上清を保存し、細胞を０．０５％トリプシンとそれらの対応する上清を用いて再懸濁した。すべてのサンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ生死細胞アナライザーを用いて分析した。
【０１４４】
実施例２
ＭＰＳ−Ｉ線維芽細胞におけるＡＡＶ  ＩＤＵＡ発現カセット
ＡＡＶ  ＩＤＵＡ発現カセットを開発するために、ヒトｉｄｕａ  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０００２０３）をヒト発現のためにコドン最適化し（ｏｐｔ−ＩＤＵＡ）、ＡＡＶ末端逆位反復配列セロタイプ２プラスミドコンテクストにおけるＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化配列との間に配置させた（図１Ａ）。ＡＡＶ２−ｏｐｔ−ＩＤＵＡベクターを文献に記載の通り調製し（Ｇｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｎｇ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９９：１１９（２００５））、ＭＰＳ−Ｉ患者由来線維芽細胞の特性解析に使用した。不死化正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）を対照細胞株として用いた（Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇ．  ４：１８（２００５））。用量漸増実験において、ＭＰＳ−Ｉ線維芽細胞のＡＡＶ２−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ形質導入によって、細胞溶解物及び培養上清の両方でＩＤＵＡ回復レベルが増加した（図１Ｂ）。実際、ＮＨＦにおけるＩＤＵＡの静止レベルは比較的低いので、５０００ウイルスゲノム／細胞の用量で、細胞溶解物及び培養上清のいずれにおいても既に超生理的レベルとなった（図１Ｂ）。ＩＤＵＡ機能は、形質導入したＭＰＳ−Ｉ患者の線維芽細胞において一貫して回復及び上昇し、検討した最も高い用量では細胞溶解物及び上清においてそれぞれ１０倍及び３０倍増大した（図１Ｃ及び図１Ｄ）。ＡＡＶベクター形質導入後のＩＤＵＡ過剰産生にもかかわらず、色素排除アッセイではいずれの用量でも患者線維芽細胞に毒性は観察されなかった（図２）。重要な点として、これらの結果は、ＭＰＳ−Ｉ患者におけるＡＡＶ２−ｏｐｔ−ＩＤＵＡの機能性及び安全性を実証している。
【０１４５】
実施例３
角膜におけるＡＡＶ  ＩＤＵＡ発現カセット
ＭＰＳ１患者の角膜の分析から、角膜実質異常が、失明をもたらす角膜混濁の原因とされている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ６２（４）：３７７（１９９６））。したがって、ＡＡＶ−ｏｐｔ−ＩＤＵＡの直接投与は、ＭＰＳ−Ｉ患者の角膜実質区画におけるＩＤＵＡ活性を回復し、ＭＰＳ−Ｉ表現型を予防又は逆転させると期待される。以前の報告では、角膜に存在する最も一般的な細胞型の１つであるヒト角膜実質細胞の形質導入に対するＡＡＶ８（Ｈｉｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７（４）：ｅ３５３１８（２０１２））及びＡＡＶ９（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ９１（３）：４４０（２０１０））の有用性が実証されている。そこで、死後数週間生存可能である正常ヒト角膜外植片において、自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰゲノムを有するこれらのカプシドを評価した。予備実験で、角膜実質への体積５０μｌの注射が、最小限の組織膨張及び成人角膜の約５０％分布を伴って容認されることが墨汁を含有するベクタービヒクルを用いて実証された（図３）。したがって、ＧＦＰレポーター遺伝子を含むＡＡＶセロタイプ８又は９を注射（５０μｌ中１ｅ１０ｖｇ）によってヒト角膜実質に投与し、７日後にウェスタンブロッティングによって分析した。角膜形質導入に関するセロタイプ８及び９の両者についての報告があるので、ＡＡＶ８カプシドにＡＡＶ９のガラクトース受容体を合体させたＡＡＶ８／９キメラカプシド（８Ｇ９）についても、同様の方法で検討した（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．  ９１（３）：４４０（２０１０）；  Ｈｉｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７（４）：ｅ３５３１８（２０１２））。ウェスタンブロッティングは、ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰがいずれかの親セロタイプよりも大きな形質導入をもたすことを示している（図４Ａ）。
【０１４６】
一本鎖ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ形質導入（最終体積５０μｌ）の生体内分布を決定するために、ヒト角膜断面でＧＦＰ免疫蛍光を行った。結果は、ベクター形質導入が角膜を横断して横方向に広がるだけでなく、若干の内皮細胞形質導入を含め、深い実質層への浸透を伴うことを示している（図４Ｂ）。角膜実質細胞のマーカーであるＣＤ３４、分化した角膜実質の指標となるα平滑筋アクチン（α−ＳＭ）及びマクロファージマーカーであるＦ４／８０との同時染色は、ＡＡＶ８Ｇ９カプシドに対して角膜細胞が無差別に交わることを示している（図４Ｃ）。
【０１４７】
ＡＡＶ８Ｇ９カプシドが角膜実質形質導入に最も効率的であることを確認した後、ＡＡＶ８Ｇ９で形質導入した細胞型がＩＤＵＡを自然に産生するか否かを決定した。これを行うために、細胞型マーカー及びＩＤＵＡタンパク質での二重染色を、正常な未処理ヒト角膜で実施した。結果は、ＡＡＶ８Ｇ９で形質導入した確認されるすべての角膜細胞がＩＤＵＡを自然に産生することを示している（図５Ａ）。
【０１４８】
次に、ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ前臨床ベクター標品をＵＮＣ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅで作成し、エクスビボ正常ヒト角膜で評価した。これらの実験では、一本鎖ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰの注射を評価し、ＰＢＳを陰性対照として用いた。注射７日後（５０μｌ中１ｅ１０ｖｇ）、全タンパク質を回収し、ＩＤＵＡの存在量をウェスタンブロッティングで調べた。全角膜溶解物では、ＩＤＵＡの静止レベルが比較的低く、ベクター由来のＩＤＵＡ（前駆体及び切断型の両方）が容易に検出された（図５Ｂ）。一貫して、ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを注射した角膜では、ヒト角膜における正常レベルと比較して、ＩＤＵＡ活性が１０倍上昇したことが観察された（図５Ｃ）。
【０１４９】
免疫蛍光染色及びヒト角膜断面での検出によって、ＩＤＵＡの静止レベル及び分布を求めた（図６）。ＭＰＳ−Ｉ患者の角膜は稀少であるので、同一条件下でのＩＤＵＡ一次抗体なしでの染色を陰性対照として用いた。結果は、比較的低レベルのＩＤＵＡが角膜実質内だけでなく、角膜上皮、及び量は少ないが内皮細胞層にも存在することを示している（図６）。ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを注射したヒト角膜の横断面でもＩＤＵＡ染色を行った。その結果をＩＤＵＡウエスタンブロット及び機能アッセイの結果と相関させると（図５Ａ〜図５Ｃ）、ヒト角膜における安静時のレベルと比較して、ＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを投与すると正常ヒト角膜でＩＤＵＡの約５〜１０倍の増加がみられる（図６）。さらに、ＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰで観察された結果と同様に、ベクター由来ＩＤＵＡも十分に分布していた（図４Ｂ及び図６）。
【０１５０】
細胞毒性実験を、正常ヒト角膜においてｓｓＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ又はＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ実質注射（１ｅ１０ｖｇ）後に実施した。細胞アポトーシスの指標となる断片化ＤＮＡを検出するＴＵＮＥＬ染色を注射後７日目に行った。ヌクレアーゼ処理した陽性対照サンプルは広範なＴＵＮＥＬ染色を示したが、ＩＤＵＡ存在量／機能が格段に上昇した角膜は、非注射又はＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ注射角膜と有意差がなかった（図７）。これらの結果は、ＭＰＳ−Ｉ患者線維芽細胞を用いて得られた結果と一致し、総合的に、ＭＰＳ−Ｉ患者角膜におけるＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ遺伝子治療の安全性を補強する。
【０１５１】
骨髄破壊的化学療法後に同種骨髄又は臍帯血ドナーを用いた造血幹細胞移植は、特に２歳未満の小児ＭＰＳ−Ｉで行った場合に、寿命を延長し、その全体的質を改善することが報告されている（Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｉｎｈｅｒｉｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓ．  １８（４）：４１３（１００５）；  Ｗｈｉｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  ４６（２）：２０９（１９９３）；  Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１２（７）：２９７９（２００８）；  Ｂｏｅｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ４３（８）：６５５（２００９）；  Ｓｕｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ９６（７）：９７７（１９８９））。移植ドナー細胞は全身性ＩＤＵＡ源となり、ドナー小グリア細胞の生着を通して脳における酵素補充をもたらす。移植した小児で、ＨＳＣＴ後１０乃至２０年生存し、完全なドナーキメリズムを示す者は、正常な血液ＩＤＵＡレベルを有し、正常乃至ほぼ正常な認知及び心臓機能をもつ。移植後のＭＰＳ−Ｉでみられる後及び進行性の症状は、一般に関節、骨及び眼に限定され、これらはすべてドナー由来のＩＤＵＡが少量しか存在せず届きにくい器官である。従って、本明細書において本発明者らが検討した前臨床角膜アプローチは、幹細胞移植及びＣＮＳ標的ＡＡＶ遺伝子治療の短所に対処するための補充ＭＰＳ−Ｉ療法として設計された。
【０１５２】
ＭＰＳ−Ｉ患者の角膜は稀にしか入手できないので、最初にＭＰＳ−Ｉ患者の線維芽細胞における疾患の是正について検討した。データは、低用量のベクターでＩＤＵＡ機能の回復を示す。これは、部分的には、正常線維芽細胞におけるＩＤＵＡレベルが比較的低く、おそらく正常な細胞生理学には十分であることによる（図１）。一貫して、正常ヒト角膜でみられるＩＤＵＡの存在量も余り多くなかった。実際、全角膜溶解物において、ＩＤＵＡの存在はウエスタンブロッティングでは容易には検出されなかったが、組織学的検査によって角膜上皮、内皮、及び実質内にある複数の細胞型の大半におけるＩＤＵＡの静止レベルが同定された（図５及び図６）。このＩＤＵＡ存在量及びＡＡＶ媒介回復の評価は、主に、ＭＰＳ−Ｉ小児の角膜のＷＴ  ＩＤＵＡ機能を回復させるには少量のＩＤＵＡしか必要としないという、本発明の角膜遺伝子治療アプローチの非常に重要な側面を明らかにしている。角膜外植片で選択したＡＡＶ量（１ｅ１０ｖｇ）は過剰であることが判明し、ＩＤＵＡ機能の１０倍もの超生理学的上昇をもたらした。ただし、このような高いＩＤＵＡレベルであっても、毒性は全く検出されなかった（図５、図６、図７）。分泌されるＩＤＵＡが隣接細胞も横断的に是正することができること、正常ヒト角膜の静止レベル、及びヒト角膜形質導入に対するＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡの効率を考慮すると、本明細書のデータは、低いベクター用量であっても、ＭＰＳ−Ｉ患者の角膜に正常レベルのＩＤＵＡをもたらすことを示唆している。さらに、ヒト角膜には抗体が存在しないので、ＩＤＵＡ導入遺伝子産物（ＩＤＵＡ）に対する中和抗体応答に関連して報告された合併症は起こらないと予想される（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２３（８）：１２９８（２０１５））。
【０１５３】
本明細書のデータを総合すると、ＭＰＳ−Ｉ角膜におけるＩＤＵＡ機能の回復は実現性が高いと思われる。さらに、ＡＡＶ８Ｇ９は、内皮層並びにＩＤＵＡを天然に産生する実質細胞におけるＩＤＵＡ産生を惹起する（図６）。本発明のＡＡＶ−ｏｐｔ−ＩＤＵＡ戦略は、これらの区画の両方を形質導入することができるので（図６）、ＨＳＣＴ又はＡＡＶ全身性遺伝子送達に対する補助療法として、ＭＰＳ−Ｉ関連角膜失明を治療又は予防する見込みは、実現性を保ち続けている。
【０１５４】
実施例４
インビボでの角膜におけるＡＡＶ  ＩＤＵＡ発現カセット
インビボでのＡＡＶ  ＩＤＵＡ発現の効果をＭＰＳ１イヌで試験した。イヌＩ−７１２の左眼に、図８Ａ〜図８Ｄに示すようにＡＡＶ８Ｇ９−ＣＭＶ−ｏｐｔＩＤＵＡ（１ｅ９ｖｇ／μｌ）溶液を注射した。インスリン注射器の針先を角膜実質に挿入し（Ａ）、溶液を徐々に注入して（Ｂ）全量（６５μｌ）を投与した（Ｃ）。注射直後に、液体保持領域が、角膜表面の３０％の部分の、軸角膜の曇り又は浮腫として視認された（Ｄ）。眼科用超音波生体顕微鏡によって、表記時点での中心角膜厚を測定することができた（図８Ｅ）。注射２分後にみられた膨張は２日以内に解消した。
【０１５５】
次の実験において、２匹のＭＰＳ１イヌの片眼にＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔ−ＩＤＵＡを、反対側の眼に対照としてＡＡＶ−ＧＦＰを、いずれも実質内注射によって投与した。眼底の反帰光線法での輝板の反射率の向上は、表記の期間の角膜の透明度を示す（図９Ａ）。両方のイヌで、反射率の大幅な改善が７日以内に観察されて１１３日間維持され、ＩＤＵＡ発現によって角膜混濁が解消したことが実証された。
【０１５６】
イヌＩ−７０９は、急性角膜浮腫を、５週目に左眼で（発症した週の画像は示していない）を、次いで１０週目に右眼で発症した（図９Ｂ）。角膜浮腫は、全身性ステロイド薬（ＳＳ）と共に又は無しで局所ステロイド薬（ＴＳ）を投与した間の２〜３週間以内に収縮し、注射後１９週までいずれの眼でも再発しなかった。重要なことに、一時的な免疫反応から回復した後も、ＩＤＵＡを注射した左眼では治療効果がはっきりと残っていた。
【０１５７】
以上は本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定され、特許請求の範囲の均等もその技術的範囲に属する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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