(57)【要約】本発明は、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）膜貫通細胞表面受容体を発現するがんに対して細胞毒性化合物を送達し得る抗体−薬物コンジュゲートに関する。いくつかの実施形態では、抗体分子のＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも８５％同一である配列を含み、ＶＬは配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または  配列番号８と少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体分子は、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖を含む。 【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体−薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩であり：
【化３１】
2019511462.tif 000054
であって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５及び配列番号６のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体にコンジュゲートされたＣＤＡ−３ＡまたはＣＤＡ−３Ｂを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩であって：
【化３２−１】
2019511462.tif 000055
【化３２−２】
2019511462.tif 000056
式中、Ｍは、−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオンであり；かつ式中
【化３３】
2019511462.tif 000057
は抗体である。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
前記重鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
前記薬物：抗体比（ＤＡＲ）が約１〜約８の範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
前記ＤＡＲが約１〜約４の範囲である、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記ＤＡＲが約２〜約３の範囲である、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与するステップを包含する、対象における胃腸起源のがんの対象を処置する方法。
【請求項９】
前記胃腸起源の癌が、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃食道癌、胃癌及び食道癌から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記結腸直腸癌が、結腸直腸腺癌、結腸直腸平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、結腸直腸黒色腫、及び結腸直腸神経内分泌腫瘍から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記胃癌が、胃腺癌、胃リンパ腫、胃肉腫及びそれらの転移から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、扁平上皮癌及び前記食道の腺癌から選択される食道癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与するステップを包含する、膵臓癌の対象を処置する方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを包含する、ＧＣＣ発現腫瘍の増殖を低減または阻害する方法。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを包含する、ＧＣＣ発現癌に罹患している対象における転移性病変の数または大きさを減少させる方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを包含する、ＧＣＣ発現癌に罹患している対象における腫瘍負荷を低減させる方法。
【請求項１７】
ＧＣＣ発現癌に罹患している対象の生存時間を延長するか、及び／または生活の質を維持もしくは改善する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを含む包含する方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２中で製剤化される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、５０ｍＭヒスチジン、６．７％スクロース、０．１％ポリソルベート−８０、５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ５．５中で製剤化される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５及び配列番号６のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と、
【化３４−１】
2019511462.tif 000058
【化３４−２】
2019511462.tif 000059
またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される細胞傷害性薬剤とを反応させるステップを包含する、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法。  
【請求項２２】
前記反応が、７５ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．０、及びジメチルアセトアミドの混合物中で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応が、１３０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．７及びジメチルアセトアミドの混合物中で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ジメチルアセトアミドの量が１〜２５容積％である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ジメチルアセトアミドの量が５〜２０容積％である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応が１６〜３０℃で行われる、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応が２２〜２５℃で行われる、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
精製の前に、反応を１５０ｍＭ塩酸ヒスチジン及び７５０ｍＭ  ＥＰＰＳでクエンチする、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
精製の前に前記反応を７５０ｍＭ  ＥＰＰＳでクエンチする、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体−薬物コンジュゲートを精製することをさらに包含する、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、クロマトグラフィーカラムを使用して精製される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、濾過に続いて接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて精製される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月５日出願の米国仮特許出願第６２／２９２，０８７号の優先権の利益を主張し、これは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣ）膜貫通細胞表面受容体を発現するがんに対して細胞毒性化合物を送達し得る抗体−薬物コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＧＣＣは、腸液の維持、電解質ホメオスターシス、及び細胞増殖において機能する。Ａｒｓｈａｄ及びＶｉｓｗｅｓｗａｒｉａｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８６：２８３５−２８４０（２０１２）。正常な成体の哺乳動物では、機能的なＧＣＣは、小腸、大腸及び直腸に存在する粘膜細胞によって発現される。これらの細胞は増殖、遊走、分化、及びアポトーシスの恒常的サイクルを受け、増殖とアポトーシスとの間の不均衡は、胃腸管内の腫瘍の形成につながる可能性がある。Ａｒｓｈａｄ及びＶｉｓｗｅｓｗａｒｉａｈ（２０１２）。
【０００４】
ＧＣＣは、抗原発現腫瘍への選択的標的化を可能にする、解剖学的に区画化された発現を有する表面タンパク質である。ＧＣＣ発現は、全ての原発性及び転移性の結腸直腸腫瘍における発現を伴う、腸上皮細胞の新生物形質転換の際に維持される。Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２５）：１４８２７−１４８３２（１９９６）。ＧＣＣ標的化剤は、腸壁に浸透し、ＧＣＣが通常見出される部位に到達することはできないが、細胞表面上でＧＣＣを発現し続ける癌細胞に到達する。
【０００５】
ＧＣＣリガンドであるＥ．ｃｏｌｉ熱安定性エンテロトキシンは、結腸直腸癌細胞への抗癌治療タンパク質剤の送達のための潜在的な標的化ビヒクルとして記載されている。Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１（１１）：１６１８−１６２７（２００５）。さらに、抗ＧＣＣ抗体−薬物コンジュゲートは、以前に、膵臓癌におけるＧＣＣに対して活性を有することが実証されている。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９−２３，  ２０１３，  Ｂｏｓｔｏｎで提示されたＶｅｉｂｙ，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＰＲ１２／Ｂ１９。しかし、すべての抗体−薬物コンジュゲートが、診療所で採用するのに必要な生物学的プロファイルを満たすわけではない。
【０００６】
抗体プロファイルまたは薬物ペイロードプロファイルに単に基づいて、抗体−薬物コンジュゲートが臨床適用に対して十分に安全で効果的であることは、前もって予測することはできない。例えば、特定の薬物ペイロードは、１つの標的に向けられた抗体にコンジュゲートされたときに完全に良好に機能し得るが、異なる標的に対する抗体にコンジュゲートされた場合、または同じ標的に対する異なる抗体にコンジュゲートされた場合でさえ、ほぼ同様には機能し得ない。なぜ異なる抗体−薬物コンジュゲートがインビボで異なる抗腫瘍活性を示すのかは、新しい抗体−薬物コンジュゲートの設計において正確な予測を可能にするためには十分には十分に理解されていない。多くの要因の予測不能な相互作用が、ある役割を果たすと推測されている。これらの因子としては、例えば、抗体−薬物コンジュゲートの標的抗原への結合親和性、コンジュゲートが固形腫瘍に浸透する能力、及び毒性を引き起こさない腫瘍への適切な曝露のための循環中の半減期が挙げられる。
【０００７】
複雑性及び予測不可能性は、抗体親和性だけで十分に立証される。高い親和性を有する抗体または抗体−薬物コンジュゲートは、より良好な細胞取り込みを伴い、これは、細胞内で放出されるさらに高レベルの細胞傷害性ペイロードをもたらす。親和性が高いほど、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強することも公知である。これらの全ての属性は、抗体−薬物コンジュゲートの細胞死滅特性に有利である。しかし、抗体または抗体−薬物コンジュゲートの高親和性は、「抗原バリア効果」を介した効率的な腫瘍浸透を妨げる可能性があることも公知であり、インビボで強い抗腫瘍活性を達成するためには、抗体−薬物コンジュゲートの親和性はまさに正しいものでなければならないことが示唆される  （多すぎもせず、少なすぎもせず）。現在のところ、抗体−薬物コンジュゲートの親和性にとって何がもっとも有効であるか、または有効なレベルであるかを予測する方法は知られていない。
【０００８】
さらに、インビボでは、抗腫瘍活性は、リンカー及びペイロード単独の機構では予測できない。例えば、Ｏ．Ａｂ  ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１４（＆）：１６０５−１６１３（２０１５）によって、前臨床癌モデルで試験した場合、異なるリンカーを介して同じ抗チューブリン毒素にコンジュゲートした同じ抗体が劇的に異なる抗腫瘍活性を示したことが、実証された。この例は、２つのリンカーの化学構造が非常に類似しているので特に驚くべきことである。さらに、上位コンジュゲート中に存在するリンカーは、親水性部分を含んでいた。親水性代謝産物は一般に膜透過性が低く、リソソーム（コンジュゲート分解部位）からの流出が遅く、放出されるペイロードの抗チューブリン活性が遅くなると考えられている。この知見は、ペイロード送達の「理想的な」動態を論じているが、今日まで、そのような動態を構成するものについての洞察はない。この複雑さに加わるのは、たとえ特定の細胞型について定義されていても、ペイロード送達の理想的な動態がすべての細胞型にあてはまるかどうかという未解決の問題である。したがって、単にリンカーまたはペイロードの化学組成物から最も効果的なインビボ抗腫瘍活性を予測することは不可能である。
【０００９】
インビボでの抗体−薬物コンジュゲート活性の予測不可能性をさらに支持することは、異なる抗体にコンジュゲートした同じリンカーペイロード（ＳＰＤＢ−ＤＭ４）を共有する２つの抗体−薬物コンジュゲート（両方とも液体腫瘍を標的とする）である。第一の抗ＣＤ３３−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、インビボでは無効であることが判明した。Ｓ．Ｌａｐｕｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ３０：１１２１−１１３１（２０１２）。対照的に、抗ＣＤ１９−ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートは、臨床試験ではリンパ腫に対して有効であることが示された。Ｖ．Ｒｉｂｒａｇ，ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０（１）：２１３−２２０（２０１４）。
結果的に、現在のところ、ＧＣＣ抗原を発現する癌細胞に選択的に細胞傷害性薬剤を送達し得る抗体−薬物コンジュゲートはもとより、抗ＧＣＣ抗体を含有する，癌治療のために承認された医薬品がないことは驚くべきことではない。このように、ＧＣＣを発現するがんを処置する抗体−薬物コンジュゲートの必要性は満たされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｒｓｈａｄ及びＶｉｓｗｅｓｗａｒｉａｈ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８６：２８３５−２８４０（２０１２）
【非特許文献２】Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２５）：１４８２７−１４８３２（１９９６）
【非特許文献３】Ｂｕｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１（１１）：１６１８−１６２７（２００５）
【非特許文献４】Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９−２３，  ２０１３，  Ｂｏｓｔｏｎ
【非特許文献５】Ｏ．Ａｂ  ｅｔ．ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１４（＆）：１６０５−１６１３（２０１５）
【非特許文献６】Ｓ．Ｌａｐｕｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ３０：１１２１−１１３１（２０１２）
【非特許文献７】Ｖ．Ｒｉｂｒａｇ，ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０（１）：２１３−２２０（２０１４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、部分的には、以下から選択される細胞傷害性薬剤（ＣＤＡ）にコンジュゲートされた、配列番号１（ＶＨＣＤＲ１）、配列番号２（ＶＨＣＤＲ２）及び配列番号３（ＶＨＣＤＲ３）の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４（ＶＬＣＤＲ１）、配列番号５（ＶＬＣＤＲ２）、及び配列番号６（ＶＬＣＤＲ３）のＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体分子を含んでいる抗体−薬物−薬物コンジュゲートを提供する。
【化１−１】
2019511462.tif 000002
【化１−２】
2019511462.tif 000003
この抗体分子は、例えば、以下のような任意の適切なリンカーを介してＣＤＡに連結されてもよい：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホーＳＰＤＢ）。
【００１２】
いくつかの実施形態では、抗体分子のＶＨは、配列番号７のアミノ酸配列、または配列番号７と少なくとも８５％同一である配列を含み、ＶＬは配列番号８のアミノ酸配列を含むか、または  配列番号８と少なくとも９５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体分子は、配列番号９のアミノ酸配列、または配列番号９と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列、または配列番号１０と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖を含む。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、ＧＣＣ抗原を発現する腫瘍細胞に抗癌療法を標的化する方法、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによって腫瘍の増殖を阻害する方法、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによって腫瘍のサイズを縮小する方法、及び本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによってＧＣＣの発現を特徴とするがんを処置する方法を包含する。いくつかの実施形態では、処置する腫瘍／がんとは、胃腸系のがん（例えば、結腸直腸癌、食道癌、または胃癌）である。いくつかの実施形態では、処置する腫瘍／がんとは、膵臓癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】図１Ａ〜図１Ｄは、ＧＣＣ発現細胞への細胞結合データを示す。図１Ａは、非コンジュゲート化５Ｆ９抗体の親和性値を反映する。図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄは、抗体−薬物コンジュゲート５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３の親和性値をそれぞれ反映する。
【図１−２】図１Ａ〜図１Ｄは、ＧＣＣ発現細胞への細胞結合データを示す。図１Ａは、非コンジュゲート化５Ｆ９抗体の親和性値を反映する。図１Ｂ、図１Ｃ、及び図１Ｄは、抗体−薬物コンジュゲート５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３の親和性値をそれぞれ反映する。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞における５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの相対的効力を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞における５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの相対的効力を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞における５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの相対的効力を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２腫瘍保有マウスにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２腫瘍保有マウスにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２腫瘍保有マウスにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの一次ヒト腫瘍異種移植モデルの単回投与後における、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。図４Ｄ〜図４Ｆは、分画用量後の結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの一次ヒト腫瘍異種移植モデルの単回投与後における、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。図４Ｄ〜図４Ｆは、分画用量後の結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜図４Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの一次ヒト腫瘍異種移植モデルの単回投与後における、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。図４Ｄ〜図４Ｆは、分画用量後の結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜図４Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの一次ヒト腫瘍異種移植モデルの単回投与後における、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。図４Ｄ〜図４Ｆは、分画用量後の結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜図４Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの一次ヒト腫瘍異種移植モデルの単回投与後における、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。図４Ｄ〜図４Ｆは、分画用量後の結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜図４Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの一次ヒト腫瘍異種移植モデルの単回投与後における、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。図４Ｄ〜図４Ｆは、分画用量後の結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ａ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ｂ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ｂ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜図５Ｃは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ｂ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｂは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ｃ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、結腸直腸癌、ＰＨＴＸ（ｃ）腫瘍保有マウスの初代ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける、それぞれ５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３のインビボでの有効性を示す。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｃは、実施例８に記載の５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２または５Ｆ９−ＣＤＡ−３の投与後のＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍保有マウスの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す。
【図７−２】図７Ａ〜図７Ｃは、実施例８に記載の５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２または５Ｆ９−ＣＤＡ−３の投与後のＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍保有マウスの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、実施例８に記載の５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２または５Ｆ９−ＣＤＡ−３の投与後のＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍保有マウスの薬力学（ＰＤ）プロファイルを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、スルホン化反応の液体クロマトグラムを示す。図９Ｂは、ＣＤＡ−３Ｂに対応するピークの質量分析プロファイルを示す。
【図９Ｂ】図９Ａは、スルホン化反応の液体クロマトグラムを示す。図９Ｂは、ＣＤＡ−３Ｂに対応するピークの質量分析プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
別段定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。一般的に、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学及びハイブリダイゼーションと関連して利用される命名法、ならびにそれらの技術は、当該技術分野において公知であるものである。
抗体分子
本明細書で使用される「抗体分子」という用語は、配列番号１〜６を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。抗体分子としては、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）を参照のこと）、及び単一ドメイン抗体分子（例えば、Ｗ０９４０４６７８を参照のこと）が挙げられる。「抗体分子」はまた、二本鎖及び多鎖の免疫グロブリンタンパク質及び糖タンパク質を指す場合もある。本明細書中で使用される場合、抗体の「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」という用語は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント、一本鎖抗体、機能的重鎖抗体（ナノボディ）ならびにＧＣＣに対する特異性を有する抗体の任意の部分を指す。抗原結合フラグメントは、組換え技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生され得る。抗原結合フラグメントという用語は、軽鎖及び重鎖を有する抗体の単鎖、例えば重鎖と一緒に使用される場合、他の鎖、例えば軽鎖の完全な可変領域と対になった時、丸ごとの重鎖及び軽鎖可変領域でみられる結合の少なくとも２５％、５０％、７５％、８５％または９０％の結合を可能にするのにその鎖のフラグメントが十分であることを意味する。
【００１６】
「抗体分子」という用語はまた、合成及び遺伝子操作されたバリアントも包含する。いくつかの実施形態では、バリアントは、それぞれ配列番号７及び配列番号８と少なくとも９５％同一である配列番号１〜６のＣＤＲ配列ならびにＶＨ及びＶＬ配列を含む。いくつかの実施形態において、バリアントは、配列番号１〜６のＣＤＲ配列、ならびにそれぞれ配列番号９及び配列番号１０と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は、１つ以上のＣＤＲ配列において１、２、３、４または５の保存的アミノ酸置換が行われた、配列番号１〜６のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は、１つ以上のＣＤＲ配列において１、２、３、４または５の非保存的アミノ酸置換が行われた、配列番号１〜６のＣＤＲ配列を含む。これらのアミノ酸置換は、抗体に有益な特性、例えば、良好な腫瘍浸透、腫瘍に対する高い蓄積、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の変化、より良い有効性、より良い毒性プロファイル、またはより広い治療ウインドウなどを提供する、抗体の親和性、結合活性、オンレート  （Ｋｏｎ）、またはオフレート（Ｋｏｆｆ）  の増大または低下のいずれを伴ってもよい。例えば、Ｒｕｄｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１（６）：２２５０−２２５９（２０１１）に記載の固形腫瘍における抗体の取り込み及び浸透に対する親和性の効果を参照のこと。いくつかの実施形態では、抗体分子は、配列番号９及び配列番号１０を含み、ここで、一方または両方の配列を定常ドメインで改変して、安定性を改善するか、免疫原性を低下させるか、または抗体に他の有益な特性、例えば、変更されたエフェクター機能などを提供した。例えば、Ｋｕｂｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１００（９）：１５６６−１５７２（２００９），米国特許出願公開第２００６／０２７５２８２号，及び米国特許第９，０８５，６２５号に記載された定常ドメイン配列に対する修飾を参照のこと。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートに用いられる抗体分子は、ヒト定常領域を含む。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎ．Ｉ．Ｈ．  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒト定常領域遺伝子はまた、公知のクローンから容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体固定、または抗体依存性細胞傷害性における活性など、所望のエフェクター機能によって導かれる。アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。特定の実施形態では、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２である。ヒト軽鎖定常領域のいずれか、カッパまたはラムダを使用してもよい。次いで、キメラのヒト化抗体を従来の方法により発現させる。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＧＣＣ抗体分子は、ＧＣＣを発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）にＡＤＣＣを誘導し得る。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを有する抗体は、Ｆｃ受容体に結合するその能力に起因して、抗体依存性細胞傷害能力においてエフェクター機能を誘発するために有用である。ＩｇＧ２アイソタイプ及びＩｇＧ４アイソタイプを有する抗体は、Ｆｃレセプターに結合するそれらの能力が低いので、ＡＤＣＣ応答を最小にするために有用である。関連する実施形態では、Ｆｃ領域の置換または抗体のグリコシル化組成の変化（例えば、改変された真核生物細胞株における増殖による）によって、Ｆｃ受容体は、抗ＧＣＣ抗体が結合する細胞の細胞毒性を認識、結合及び／または媒介する能力を高めることができる。例えば、米国特許第７，３１７，０９１号；同第５，６２４，８２１号；及び刊行物、例としては、ＷＯ００／４２０７２、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４（２００１）、Ｌａｚａｒｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：４００５−４０１０（２００６）、Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．６：１１６１−１１７３（２００６）を参照のこと。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメント（例えば、ヒト起源の抗体、ヒト抗体）は、機能（例えば、エフェクター機能）を変更または調整するアミノ酸の置換または置き換えを含んでもよい。例えば、ヒト起源の定常領域（例えば、γ１定常領域、γ２定常領域）は、補体活性化及び／またはＦｃ受容体結合を減少させるように設計してもよい。（例えば、その教示全体が、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号；及び同第５，８３４，５９７号を参照のこと）。好ましくは、このようなアミノ酸の置換または置き換えを含むヒト起源の定常領域のアミノ酸配列は、ヒト起源の未変更の定常領域のアミノ酸配列と全長にわたって少なくとも約９５％同一、より好ましくはヒト起源の未変更の定常領域のアミノ酸配列と全長にわたって少なくとも約９９％同一である。
【００１９】
さらに別の実施形態では、エフェクター機能は、抗体のグリコシル化パターンを調整することによって変更されてもよい。改変とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、及び／または抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。例えば、抗体のＦｃ領域に結合したフコースを欠いている成熟炭水化物構造を有するＡＤＣＣ活性が増強された抗体は、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号に記載されている。また、米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号も参照のこと。
【００２０】
さらにまたは代わりに、フコシル残基の量が減少した低フコシル化抗体または増加したバイセクト（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体のような、改変型のグリコシル化を有する抗体を作製してもよい。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成してもよい。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それによって、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生するように操作された宿主細胞として使用してもよい。例えば、欧州特許第１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株であって、そのような細胞系において発現された抗体は低フコシル化を示す細胞株を記載している。ＷＯ０３／０３５８３５は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合炭水化物に結合させる能力が低下し、その宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をもたらす、バリアントＣＨＯ細胞株Ｌｅｃ１３細胞を記載する。Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０（２００２）も参照のこと。ＷＯ９９／５４３４２は、遺伝子操作された細胞株において発現される抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらす、バイセクトＧｌｃＮａｃ構造の増大を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を発現するように遺伝子操作した細胞株を記載している。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０（１９９９）も参照のこと。
【００２１】
特定の実施形態では、抗体分子は、少なくとも１対の結合配列が配列番号１〜６のＣＤＲ配列を含む、二重特異性抗体であっても、バイパラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）抗体であってもまたは二機能性抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体または二機能性抗体の両方の結合部位は、配列番号１〜６のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性または二機能性抗体は、配列番号７及び／または配列番号８と少なくとも９５％同一である配列を含む、配列番号７及び８のアミノ酸配列またはそのバリアントを含む。
【００２２】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートにおける使用のための好ましい抗体分子は、抗体分子５Ｆ９及びそのバリアント、ならびにそのような抗体分子を作製する組み換え方法の開示について参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／０５０２４２に記載されている完全ヒト抗体分子である。ヒトｍＡｂ５Ｆ９（ＩｇＧ２、カッパ）は、アクセッション番号ＰＴＡ−８１３２としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に２００７年１月１０日に寄託されたハイブリドーマ４６．５Ｆ９．８．２によって産生され得る。しかしながら、抗体を作製する他の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体分子は、米国特許第６，１６２，９６３号；同第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；及び同第６，０７５，１８１号に記載されているＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術によって生成されたトランスジェニックマウスにおいて産生されてもよい。他の抗体産生トランスジェニックマウスは、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号；及び同第５，６２５，８２５号に記載されているようなミニ遺伝子座アプローチを用いて作製してもよい。さらなる抗体産生マウスとしては、ＨＵＭＡＢ−ＭＯＵＳＥ（商標）、ＫＩＲＩＮ  ＴＣ  ＭＯＵＳＥ（商標）及びＫＭ−ＭＯＵＳＥ（商標）が挙げられる。
【００２３】
あるいは、抗体分子は、培養された細胞中で発現されてもよい。さらに具体的には、特定の抗体をコードする配列を、抗体を産生する細胞からクローニングし、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に用いてもよい。いくつかの実施形態では、免疫化マウスからの脾臓及び／またはリンパ節リンパ球をマウスから単離し、以前にＢａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７８４３−７８４８（１９９６）に記載されたようにプラークアッセイでプレートする。要するに、細胞をＧＣＣ抗原で被覆したヒツジ赤血球で寒天にプレートし、ＧＣＣ抗原に対するｍＡｂを分泌する細胞は、補体を固定し、ｍＡｂ産生細胞を直に囲む赤血球を溶解する。クリアされたプラーク内の細胞を、免疫グロブリン配列の配列決定及び発現ベクターへのサブクローニングのために持ち上げる。ＧＣＣ特異的ｍＡｂを含有する一時的にトランスフェクトされた細胞からの上清を、その後、ＥＬＩＳＡによって、及びフローサイトメトリーによる細胞への結合についてスクリーニングする。特定のエピトープに結合するＣＤＲを含む産生されたヒト抗体の可変配列またはその一部を、修飾された抗体の産生に利用してもよい。例えば、産生された抗体の可変領域は、米国特許出願公開第２００６０１４７４４５号に記載のように、構築物の移入、構築物の発現の増大、及び／または全長抗体またはそのフラグメントの発現が可能なベクターへの構築物の組み込みを容易にするための発現カセット中にスプライシングしてもよい。ヒト抗体はまた、米国特許第５，５６７，６０１号及び同第５，２２９，２７５号に記載されているように、インビトロで活性化されたＢ細胞を使用して生成されてもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、発現カセットは、ＩｇＧアイソタイプの重鎖定常領域を含む。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎ．Ｉ．Ｈ．  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）に見出され得る。ヒト定常領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体固定、または抗体依存性細胞傷害性における活性など、所望のエフェクター機能によって導かれる。アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。特定の実施形態では、本発明の抗体分子は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２である。特定の実施形態において、アイソタイプは、ＩｇＧ１である。ヒト軽鎖定常領域のいずれか、カッパまたはラムダを使用してもよい。
【００２５】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートに用いられる抗体分子は、ＧＣＣの細胞外ドメインを標的とし、特異的に結合する。本明細書で使用される場合、「特異的結合」、「特異的に結合する」または「結合特異性」とは、抗ＧＣＣ抗体分子に関して、その抗体分子がＧＣＣ、例えばヒトＧＣＣタンパク質に対して、それが非ＧＣＣタンパク質、例えば、ＢＳＡに対して結合するよりも高い親和性で結合することを意味する。典型的には、抗ＧＣＣ分子は、非ＧＣＣタンパク質、例えば、ＢＳＡについてあるＫｄ  を有し、これは、ＧＣＣ、例えば、ヒトＧＣＣタンパク質についてそのＫｄの２倍より大きいか、１０倍より大きいか、１００倍より大きいか、１，０００倍より大きいか、１０４倍より大きいか、１０５倍より大きいか、または１０６倍より大きい。ＧＣＣ及び非ＧＣＣタンパク質、例えば、ＢＳＡについてのＫｄの決定は、同じ条件下で実施されるべきである。
【００２６】
２つの配列間の「相同性」の計算は、以下のようにして行うことができる。配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、最適なアライメントのために第一及び第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入してもよく、非相同配列は、比較目的のために無視してもよい）。比較目的で整列された参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、４０％、もしくは５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合には、分子は、その位置にて同一である（本明細書で使用されるとき、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性パーセントとは、ギャップの数、及び２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００２７】
配列の比較及び２つの配列間の相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、当該分野で公知の任意の方法を用いて決定してもよい。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズムは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重み、及び１、２、３、４、５もしくは６の長さ重みを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれている。２つのヌクレオチド配列間のパーセント相同性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｅｒｙｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み及び１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、決定してもよい。相同性の決定のためのパラメーターの例示的なセットは、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティを有するＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【００２８】
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、ポリペプチド機能に実質的な影響を及ぼさない、さらなる保存的または非必須アミノ酸置換を有し得ることが理解される。また、本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、ポリペプチド機能に実質的な影響を及ぼさない、追加の非保存的アミノ酸置換を有してもよいことも理解される。特定の置換が許容されるか否か、すなわち、結合活性のような所望の生物学的特性に悪影響を及ぼさないか否かは、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）またはＰａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−１３９（１９９５）に記載のように決定してもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非分極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。「非保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が任意の他のアミノ酸で置換されている置換である。
【００２９】
「非必須」アミノ酸残基とは、結合性因子、例えば抗体の野生型配列を、生物学的活性を廃することなく、または実質的に変化させることなく変更し得る残基である。
【００３０】
本発明の抗体−薬物コンジュゲート中の抗体分子は、ＧＣＣを発現する癌細胞にＣＤＡを引き付ける。本発明の例示的な抗体分子のアミノ酸及び核酸の配列を表１に示す。
【表１−１】
2019511462.tif 000004
【表１−２】
2019511462.tif 000005
【表１−３】
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【００３１】
細胞傷害性薬剤（ＣＤＡ）
本発明の抗体−薬物コンジュゲートに使用されるインドリノベンゾジアゼピン誘導体は、インビボで高い力価及び／または高い治療指数（最大許容用量対最小有効用量の比）を有すると記載されている。ベンゾジアゼピン誘導体ＣＤＡ−１は、ＣＤＡ−１に関連する開示に関して参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７６５，７４０号に記載されている。ＣＤＡ−１は、以下のスルホン化型（ＣＤＡ−１Ａ）及び非スルホン化型（ＣＤＡ−１Ｂ）で存在し：
【化２】
2019511462.tif 000007
式中、Ｍは、−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオン、例えば、Ｎａ＋またはＫ＋などである。ＣＤＡ−１ＡまたはＣＤＡ−１Ｂのいずれかが、任意の薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００３２】
ＣＤＡ−２は、ＣＤＡ−２に関連する開示に関して参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４８０６４に記載されている。ＣＤＡ−１と同様に、ＣＤＡ−２は、以下のスルホン化型（ＣＤＡ−２Ａ）及び非スルホン化型（ＣＤＡ−２Ｂ）で存在し：
【化３】
2019511462.tif 000008
式中、Ｍは、−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオン、例えば、Ｎａ＋またはＫ＋などである。ＣＤＡ−２ＡまたはＣＤＡ−２Ｂのいずれかが、任意の薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００３３】
ＣＤＡ−３は、ＣＤＡ−３に関連する開示に関して参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４８０５９に記載されている。ＣＤＡ−３は、以下のスルホン化型（ＣＤＡ−３Ａ）及び非スルホン化型（ＣＤＡ−３Ｂ）で存在し：
【化４】
2019511462.tif 000009
式中、Ｍは、−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオン、例えば、Ｎａ＋またはＫ＋などである。ＣＤＡ−３ＡまたはＣＤＡ−３Ｂのいずれが、任意の薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００３４】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書において用いる場合、本発明の化合物の薬学的に許容される有機塩または無機塩を指す。例示的な塩として、限定するものではないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシル酸塩」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、パモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、及びアンモニウム塩が挙げられる。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン、または他の対イオン等の別の分子の封入を伴ってもよい。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機部分であっても、または無機部分であってもよい。さらに、薬学的に許容可能な塩は、その構造中に２個以上の荷電原子を有していてもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容可能な塩の一部である例では、複数の対イオンを有してもよい。よって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／または１つ以上の対イオンを有してもよい。
【００３５】
本発明の化合物が塩基である場合、所望の薬学的に許容される塩は、当該技術分野で利用可能な任意の好適な方法、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、メタンスルホン酸、リン酸等の無機酸を用いるか、または、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸、例えばグルクロン酸もしくはガラクツロン酸、アルファヒドロキシ酸、例えば、クエン酸もしくは酒石酸、アミノ酸、例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸、芳香族酸、例えば、安息香酸もしくは桂皮酸、スルホン酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸もしくはエタンスルホン酸、等のような有機酸を用いる遊離塩基の処理によって、調製されてもよい。
【００３６】
本発明の化合物が酸である場合、所望の薬学的に許容される塩は、任意の好適な方法、例えば、アミン（第一級、第二級、または第三級）、アルカリ金属水酸化物、もしくはアルカリ土類金属水酸化物等のような無機塩基または有機塩基での遊離酸の処理によって、調製されてもよい。好適な塩の具体例としては、限定するものではないが、グリシン及びアルギニン等のアミノ酸、アンモニア、第一級、第二級、及び第三級のアミン、ならびにピペリジン、モルホリン、及びピペラジン等の環状アミンから誘導される有機塩、ならびにナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム、及びリチウムから誘導される無機塩が挙げられる。
【００３７】
抗体−薬物コンジュゲート
抗体−薬物コンジュゲートとは、抗原を発現する細胞（例えば、抗原発現腫瘍細胞）に選択的に送達される殺細胞剤または細胞毒性剤として、抗原標的部分としての抗体または薬物またはペイロードの両方を組み合わせた複合分子である。これらのタイプの分子の特性（例えば、有効性または安全性）は、選択された抗原標的に親和性を有する抗体を細胞毒性剤と単にコンジュゲートさせることによっては、予測することができない場合が多い。成功した抗体−薬物コンジュゲートの基準には、標的抗原結合及び内在化特性、細胞毒性活性、インビボ有効性、ＰＫ／ＰＤプロファイル、ならびにそのような抗体−薬物コンジュゲートの使用に関連する安全性及び毒性の問題が含まれる。以下の実施例に示すように、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、それぞれ所望の特性を示した。
【００３８】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートに用いられる抗体分子を、任意の適切な方法によって、または本明細書の実施例５に開示されるように、細胞傷害性薬剤（ＣＤＡ−１、ＣＤＡ−２またはＣＤＡ−３）にコンジュゲートし、以下の抗体−薬物コンジュゲートを生成してもよく：
【化５−１】
2019511462.tif 000010
【化５−２】
2019511462.tif 000011
【化５−３】
2019511462.tif 000012
またはその薬学的に許容される塩であって、式中、Ｍは−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオン、例えば、Ｎａ＋またはＫ＋などであり、式中、
【化６】
2019511462.tif 000013
は、配列番号９の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１０の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。抗体に結合されたＮＨ基は、このような抗体のリジン残基のアミノ基側鎖を指す。
【００３９】
「抗体−薬物コンジュゲート」、「抗体コンジュゲート」、「免疫コンジュゲート」、「コンジュゲート」及び「ＡＤＣ」という用語は、互換的に使用され、非抗体部分にコンジュゲートした抗体、例えば、細胞傷害性薬剤を指す。「リンカー」、「リンカー部分」または「連結基」という用語は、本明細書において用いる場合、抗体及び細胞傷害性化合物のような２つの基を一緒に連結する部分を指す。いくつかの実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、細胞傷害性薬剤（ＣＤＡ−１、ＣＤＡ−２またはＣＤＡ−３）及び抗体を含み、ここでこの細胞傷害性薬剤は、抗体に共有結合されている。特定の実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、細胞傷害性薬剤（ＣＤＡ−１またはＣＤＡ−２）及びリンカー（例えば、スルホ−ＳＰＤＢ）を介して抗体に細胞傷害性薬剤が共有結合される抗体を含む。他の実施形態では、細胞傷害性薬剤（ＣＤＡ−３）は、抗体と共有結合を直接形成し得る、反応性基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を有する。
【００４０】
様々な適切なリンカー（例えば、抗体分子を細胞傷害性薬剤に連結するためのヘテロ二官能性試薬）は、当技術分野で公知である。リンカーは、リンカーの切断が細胞内環境で薬物を放出するように、例えば生理条件下で、例えば細胞内条件下で、切断可能であってもよい。他の実施形態では、リンカーは切断可能ではなく、例えば抗体分解によって薬物が放出される。
【００４１】
リンカーは、抗体部分上の化学的に反応性の基、例えば、遊離のアミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオール、またはカルボキシル基へ（例えば、Ｎ−またはＣ−末端へ、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基へ、１つ以上のグルタミン酸またはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基へ、１つ以上のシステイン残基のスルフヒドリル基へ、または１つ以上のセリン残基もしくはトレオニン残基のヒドロキシル基へ）結合されてもよい。リンカーが結合する部位は、抗体部分のアミノ酸配列中の天然残基であってもよいし、あるいは例えば、ＤＮＡ組換え技術によって（例えば、システインまたはプロテアーゼ切断部位をアミノ酸配列に導入することによって）またはタンパク質生化学（例えば、還元、ｐＨ調節、またはタンパク質分解）によって抗体部分に導入されてもよい。
【００４２】
典型的には、リンカーは、接続されている２つの基が連結される条件下で実質的に不活性である。「二官能性架橋剤」、「二官能性リンカー」または「架橋剤」という用語は、リンカーの各末端に２つの反応性基を有する変性剤であって、その結果、１つの反応性基を最初に細胞傷害性化合物と反応させ、リンカー部分を有する化合物及び第二の反応性基を提供し、次いでこれが抗体と反応し得る変性剤を指す。あるいは、二官能性架橋剤の一方の末端を最初に抗体と反応させて、リンカー部分及び第二の反応性基を有する抗体を得てもよく、次にこれを細胞傷害性化合物と反応させてもよい。連結部分は、特定の部位での細胞傷害性部分の放出を可能にする化学結合を含んでもよい。適切な化学結合は、当技術分野で周知であり、これには、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定結合、光不安定結合、プロテアーゼ／ペプチダーゼ不安定結合、及びエステラーゼ不安定結合が挙げられる。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；同第５，４７５，０９２号；同第６，４４１，１６３号；同第６，７１６，８２１号；同第６，９１３，７４８号；同第７，２７６，４９７号；同第７，２７６，４９９号；同第７，３６８，５６５号；同第７，３８８，０２６号及び同第７，４１４，０７３号を参照のこと。いくつかの実施形態において、結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル、及び／またはプロテアーゼ／ペプチダーゼ不安定結合である。本発明で使用することができる他のリンカーとしては、非切断性リンカー、例えば、米国特許出願公開第２００５０１６９９３３号明細書に記載されているリンカー、荷電リンカー、または親水性リンカー、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２７４７１３号、米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４号、及びＷＯ２００９／１３４９７６（各々が参照によって本明細書に明示的に組み込まれている）に記載されるリンカーが挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断剤によって切断可能である。リンカーは、例えば、限定するものではないが、リソソームまたはエンドソームのプロテアーゼを含む、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのアミノ酸長を含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，  Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ｔｏｓｙｌ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｂ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｃｉｔ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｖａｌ−Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ−Ｄ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｍｅｔ、及びＭｅｔ−Ａｌａから選択される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ−Ａｌａ、及びＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａから選択される。切断剤としては、カテプシンＢ及びＤ、ならびにプラスミンが含まれ得、これらの全ては、標的細胞の内部で活性薬物の放出をもたらすジペプチド薬物誘導体を加水分解することが公知である（例えば、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ及びＷａｌｋｅｒ、１９９９、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照のこと）。細胞傷害性薬剤の細胞内タンパク質分解放出を用いることの１つの利点は、この薬剤がコンジュゲートされると典型的には減弱され、コンジュゲートの血清安定性が典型的には高いということである。
【００４４】
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性であり、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用してもよい（例えば、米国特許第５，１２２，３６８号；同第５，８２４，８０５号；同第５，６２２，９２９号；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ及びＷａｌｋｅｒ、１９９９、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３−１４６６１を参照のこと）。このようなリンカーは、血液中などの中性ｐＨ条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。特定の実施形態において、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されるチオエーテルなど）である（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
【００４５】
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。抗体と細胞傷害性化合物とのジスルフィド結合を介した連結を可能にする二官能性架橋剤としては、限定するものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−４−（４−ニトロピリジル−２−ジチオ）ブタン酸、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ペンタン酸（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブタン酸（ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタン酸（スルホ−ＳＰＤＢ）が挙げられる。Ｓｕｌｆｏ−ＳＰＤＢは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，２３６，３１９号に記載されている。あるいは、２−イミノチオラン、ホモシステインチオラクトン、またはＳ−アセチルコハク酸無水物などのチオール基を導入する架橋剤を使用してもよい。他の実施形態では、リンカーは、先に記載したペプチドリンカー、ｐＨ感受性リンカーまたはジスルフィドリンカーの１つ以上の組み合わせを含んでもよい。
【００４６】
「ヘテロ二官能性架橋剤」は、２つの異なる反応基を有する二官能性架橋剤である。アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）及びカルボニル反応性ヒドラジン基の両方を含む異種二官能性架橋剤も、細胞傷害性化合物を抗体と連結するために使用してもよい。このような市販のヘテロ二官能性架橋剤の例としては、スクシンイミジル６−ヒドラジノニコチンアミドアセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル４−ヒドラジドテレフタレート塩酸塩（ＳＨＴＨ）及びスクシンイミジルヒドラジニウムニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）が挙げられる。酸不安定結合を有するコンジュゲートはまた、本発明のヒドラジン含有ベンゾジアゼピン誘導体を用いて調製してもよい。使用され得る二官能性架橋剤の例としては、スクシンイミジル−ｐ−ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）及びスクシンイミジル−ｐ−ホルミルフェノキシアセテート（ＳＦＰＡ）が挙げられる。
【００４７】
本発明は、単一抗体に連結された１つ以上の細胞傷害性薬剤を含む抗体−薬物コンジュゲートを提供する。薬物対抗体比（ＤＡＲ）は、抗体分子あたり結合した細胞傷害性薬剤の数を表す。様々な実施形態において、ＤＡＲは、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２の範囲である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４または２〜３の範囲である。他の実施形態では、ＤＡＲは約２、約２．５、約３、約４、約５、または約６である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは、約２〜約４の範囲である。ＤＡＲは、質量分析、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、ＥＬＩＳＡアッセイ及び／またはＨＰＬＣなどの従来の手段によって特徴付けてもよい。
【００４８】
本発明は、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法を包含する。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、抗体が、まずリンカーに共有結合され、次いで予め形成された抗体−リンカー中間体が細胞傷害性剤と反応するように、抗体を架橋剤（リンカー）及び細胞傷害性剤と順次接触させることによって調製される。抗体−リンカー中間体は、細胞傷害性剤と接触させる前に精製ステップに供されてもよいし、されなくてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、リンカーと細胞傷害性剤を反応させることによって、予め形成された細胞傷害性剤−リンカー化合物と抗体を接触させることによって調製してもよい。予め形成されたリンカー−細胞傷害性剤は、抗体と接触する前に精製工程に供されてもよいし、されなくてもよい。他の実施形態では、抗体は、１つの反応混合物中にリンカー及び細胞傷害性剤を含み、抗体とリンカーとの間、及びリンカーと細胞傷害性剤との間の共有結合の同時形成が可能になる。抗体−薬物コンジュゲートを調製するこの方法は、反応混合物にリンカーを添加する（逆もまた同様である）前に抗体が細胞傷害性薬剤に接触する反応を包含し得る。特定の実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、抗体を、例えばＣＤＡ−３のようなリンカー中に構造を有する細胞傷害性剤と接触させることによって調製してもよい。
【００４９】
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法は、ｐＨが３〜９である緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液はｐＨ４〜９である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは７〜９である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは８〜９である。いくつかの実施形態では、緩衝液のｐＨは８．０である。他の実施形態では、緩衝液のｐＨは８．７である。
【００５０】
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法は、種々のイオン強度を有する緩衝溶液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液のイオン強度は１０ｍＭ〜３００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液のイオン強度は１５ｍＭ〜２００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液のイオン強度は６０ｍＭ〜１５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液のイオン強度は７５ｍＭである。他の実施形態では、緩衝液のイオン強度は１３０ｍＭである。
【００５１】
特定の実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法は、様々な濃度の緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度は１０ｍＭ〜３００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液のイオン濃度は１５ｍＭ〜２００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度は６０ｍＭ〜１５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液の濃度は７５ｍＭである。他の実施形態では、緩衝液の濃度は１３０ｍＭである。
【００５２】
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法は、当該分野で公知の任意の緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを利用する。緩衝液の例は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈのウェブサイト（http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html）に列挙されている。緩衝液の例としてはまた、限定するものではないが、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及び酢酸緩衝液が挙げられる。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）である。他の実施形態では、緩衝液はＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）である。
【００５３】
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法としては、有機溶媒、例えば、限定するものではないが、ＤＭＡ（ジメチルアセトアミド）、及びＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が挙げられる。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、緩衝液及び有機溶媒の総容積あたり１〜４０％の量でコンジュゲーション反応中に存在する。いくつかの実施形態では、有機溶媒はＤＭＡであり、５〜２０％の量で存在する。いくつかの実施形態では、有機溶媒はＤＭＡであり、１０％の量で存在する。他の実施形態では、有機溶媒はＤＭＡであり、１３．５％の量で存在する。他の実施形態では、有機溶媒はＤＭＡであり、１５％の量で存在する。
【００５４】
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法は、２℃〜３７℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、温度は１０℃〜３０℃である。いくつかの実施形態では、温度は１５℃〜２５℃である。いくつかの実施形態では、温度は２５℃である。他の実施形態では、温度は２２℃である。
【００５５】
抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法によって、コンジュゲーション反応が２分間〜２日間進行することが可能になる。いくつかの実施形態では、反応は０．５時間〜２４時間進行する。いくつかの実施形態では、反応は１時間〜８時間進行する。いくつかの実施形態では、反応は６時間進行する。いくつかの実施形態では、反応は４時間進行する。他の実施形態では、反応は１時間進行する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法は、コンジュゲートの形成後に高いイオン強度を有するクエンチング溶液を添加するステップをさらに包含する。一実施形態では、クエンチング溶液は、７５０ｍＭのＥＰＰＳ及び１５０ｍＭの塩酸ヒスチジンを含む。別の実施形態において、クエンチング溶液は、７５０ｍＭのＥＰＰＳを含む。いくつかの実施形態では、クエンチング溶液のｐＨは５〜６である。いくつかの実施形態では、クエンチング溶液のｐＨは５．５である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、クエンチング溶液は、ＥＰＰＳ及び塩酸ヒスチジンを含み、クエンチング溶液をコンジュゲーション反応混合物に添加した後、得られる混合物は、２００ｍＭ〜４００ｍＭのＥＰＰＳ及び４０〜６０ｍＭの塩酸ヒスチジンを含む。一実施形態では、得られる混合物は、２５０ｍＭ〜３５０ｍＭのＥＰＰＳ及び４０〜６０ｍＭの塩酸ヒスチジンを含む。別の実施形態において、得られる混合物は、３００ｍＭ〜３５０ｍＭのＥＰＰＳ及び４５ｍＭ〜５５ｍＭの塩酸ヒスチジンを含む。
【００５８】
上述の方法に従って調製された抗体−薬物コンジュゲートを、精製ステップに供してもよい。精製ステップは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の任意の生化学的方法、またはそれらの任意の組み合わせ方法を包含する。これらとしては、限定するものではないが、接線流濾過（ＴＦＦ）、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、任意の電荷または等電点ベースクロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、例えば、ＣＨＴ（セラミックヒドロキシアパタイト）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、濾過、選択的沈殿、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００５９】
薬学的組成物
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体とともに製剤化された、本明細書に記載の本発明の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物、例えば薬学的に許容される組成物を特徴とする。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、生理学的に適合する任意の及びすべての溶媒、分散媒、等張剤及び吸収遅延剤などを包含する。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適していてもよい。医薬組成物は、１種以上のさらなる賦形剤、例えば塩、緩衝剤、浸透張力調節剤、凍結保護剤、非イオン性界面活性剤、界面活性剤及び防腐剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、製剤緩衝液は、ｐＨ２．５〜９．０の範囲の、限定するものではないが、ヒスチジン、コハク酸塩、トリスまたは酢酸塩を含む、５ｍＭ〜３００ｍＭの範囲の薬学的に許容される緩衝液を含む。他の実施形態では、製剤緩衝液は、賦形剤、例えば、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、シクロデキストリン、例えばガンマ−シクロデキストリン、例えば、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）など、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、亜硫酸水素ナトリウム、または任意の他の賦形剤（生成の間または貯蔵の際のいずれかに、タンパク質または免疫コンジュゲートを安定化させ、高分子量種の形成またはＡＤＣからの薬物の脱コンジュゲーションを最小限に抑えることが当該技術分野において公知である）を含む。
【００６１】
この組成物は、様々な形態であってもよい。これらとしては、例えば、液体、半固体及び固体剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、リポソーム及び坐剤が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式及び治療的適用に依存する。いくつかの典型的な組成物は、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）用の注射可能または注入可能な溶液の形態である。いくつかの実施形態では、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。他の実施形態では、抗体は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【００６２】
「非経口投与」及び「非経口的に投与する」という句は、本明細書において用いる場合、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、これには、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射ならびに注入を包含する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、製造及び保存の条件下で無菌であり、安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、マイクロスフェア、または高抗体濃度に適した他の規則構造として製剤化してもよい。滅菌注射溶液は、活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）を、適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組合せとともに必要な量で組み込み、続いて滅菌、例えば濾過することによって、調製してもよい。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒及び上で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製の提供された方法は、活性成分の粉末に加えて、任意の追加の所望される成分が、事前に無菌濾過されたその溶液から得られる、真空乾燥及び凍結乾燥である。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことによって、もたらすことができる。
【００６４】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、当技術分野で公知の様々な方法によって投与することができるが、多くの治療用途では、投与経路／投与方式は静脈内注射または注入である。当業者によって理解されるように、投与の経路及び／または方式は、所望の結果に依存して変化するであろう。特定の実施形態では、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のような、化合物を急速放出から保護する担体で調製してもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用してもよい。そのような製剤の調製のための多くの方法は、当業者には特許取得済みか、または一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、ｅｄ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照のこと。
【００６５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートは、例えば、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与されてもよい。化合物（及び必要に応じて他の成分）を、硬質または軟質ゼラチンカプセルに封入し、錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハーなどに圧縮してもよい。非経口投与以外の方法で本発明の抗体または抗体フラグメントを投与するには、その不活性化を防止する物質で化合物をコーティングするか、または化合物を同時投与する必要がある場合がある。
【００６６】
治療用組成物は、当該技術分野で公知の医療機器により投与してもよい。例えば、医薬調製物は、１つ以上の投与量を含む装置、例えば、気密容器または液密容器内に配置してもよい。送達デバイスの例としては、限定するものではないが、バイアル、カニューレ、針、ドリップバッグ、及びラインが挙げられる。本発明はまた、本発明の抗体−薬物コンジュゲートをこのようなデバイスに入れる方法も提供する。
【００６７】
投薬レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、複数の分割用量が経時的に投与されてもよく、またはその用量は、治療状況の緊急事態によって指示される場合、比例的に低減されても、もしくは増加されてもよい。投与の容易性及び投薬量の均一性のために、単位投与剤形の非経口組成物を製剤化することが特に有益である。本明細書で使用される「単位投薬剤形」という用語は、治療される対象の単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の処置のために、そのような活性化合物を配合する当該技術に内在する限界によって影響され、それらに直接的に依存する。
【００６８】
本発明の抗体または抗原結合性フラグメントの治療上または予防上有効な量の例示的で非限定的な範囲は、２０μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇまたは３０μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量値は、緩和すべき状態の種類及び重症度によって変化し得ることに留意されたい。任意の特定の対象にとって、個々の必要性及び組成物の投与を施すかまたは監督する者の専門的判断に従って、特定の投与レジメンを経時的に調整すべきであること、ならびに本明細書に記載の投与量範囲は、例示的なものに過ぎず、特許請求される組成物の範囲または実施を限定することを意図しないことがさらに理解されるべきである。
【００６９】
本発明の薬学的組成物は、「治療上有効」量の本発明の抗体−薬物コンジュゲートを含んでもよい。「治療上有効な」量とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。本発明の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重などの因子、ならびに、抗体または抗体部分が個体において所望の応答を誘発する能力に応じて変化し得る。治療有効量とはまた、抗体−薬物コンジュゲートの任意の毒性または有害な影響よりも治療的に有益な効果が上回る量でもある。「治療的に有効な投薬量」は、好ましくは、処置対象における測定可能なパラメーター（例えば、腫瘍増殖速度）を、未処置の対象に比べて、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、及びいくつかの実施形態においては少なくとも約８０％阻害する。測定可能なパラメーター、例えば、がんを阻害する化合物の能力は、例えば、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。あるいは、組成物のこの特性は、例えば、実施例７に記載されているようなインビトロアッセイで評価してもよい。
【００７０】
本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含むキットもまた、本発明の範囲内である。このキットは、以下を含む１つ以上の他の要素を備えてもよい：使用説明書；他の試薬、例えば、ラベル、追加の治療剤；投与のための本発明の抗体−薬物コンジュゲートを調製するためのデバイスまたは他の材料；薬学的に許容される担体；及び対象に投与するためのデバイスまたは他の材料。使用説明書には、例えば、がん（例えば、胃腸由来の癌、例えば、結腸癌、胃癌、食道癌など）を有する患者における推奨投与量及び／または投与様式を包含する治療適用のためのガイドを備えてもよい。
【００７１】
このキットは、１つ以上の別個の医薬調製物中に、適宜製剤化された、本発明の少なくとも１つの追加の試薬、例えば追加の治療剤及び／または１つ以上の追加の抗体−薬物コンジュゲートをさらに含んでもよい。
【００７２】
治療用途
本明細書で使用する「処置」または「処置する」とは、がんもしくは腫瘍、またはその少なくとも１つの識別可能な症状の改善を指す。特定の実施形態において、「処置」または「処置する」とは、必ずしも患者が識別可能ではない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。さらに別の実施形態において、「処置」または「処置する」とは、物理的に、例えば、識別可能な症状の安定化、生理学的、例えば物理的パラメータの安定化、またはその両方のいずれかで癌の進行を阻害することを指す。「処置」または「処置する」とは、本明細書において用いる場合、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの対象、例えば患者への投与、または対象に戻される対象由来の単離された組織または細胞への適用による投与を指す。抗体−薬物コンジュゲートは、単独で、または追加の治療剤と組み合わせて投与してもよい。処置とは、障害、障害の症状または障害、例えば、がんに対する素因を治療、治癒、軽減、救済、変更、修正、回復、緩和、改善または影響させ得る。理論に縛られることを望まないが、処置とは、インビトロまたはインビボでの細胞の阻害、アブレーションもしくは死滅を引き起こすか、またはそうでなければ異常細胞などの細胞が本明細書に記載の障害（例えば、がん）などの障害を媒介する能力を低減すると考えられる。
【００７３】
本明細書において用いる場合、「対象」という用語は、哺乳動物、霊長類、ヒト及び非ヒト動物を含むものとする。例えば、対象は、例えば胃腸起源のがん（例えば、結腸癌）を有する患者（例えば、ヒト患者または獣医学的患者）であってもよいし、がん、例えば胃腸起源のがん（例えば、結腸癌）の症状を有する患者（細胞の少なくともいくつかがＧＣＣを発現する）であってもよいし、またはがん、例えば胃腸起源のがん（例えば結腸癌）の素因を有する患者（細胞の少なくともいくつかがＧＣＣを発現する）であってもよい。本発明の「非ヒト動物」という用語には、全ての非ヒト脊椎動物、例えば非ヒト哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが、特に明記しない限り包含される。一実施形態では、対象は、マウス、ラット、ウサギまたはヤギのうち１つ以上またはすべてを除外する。
【００７４】
本明細書において用いる場合、抗体−薬物コンジュゲートの、障害を治療するために「有効な」もしくは「十分な」量、または「治療上有効な量」もしくは「治療上十分な量」とは、細胞、例えば、癌細胞（例えば、ＧＣＣ発現腫瘍細胞）の処置において、腫瘍サイズを減少させるか、または対象における腫瘍もしくはがんの増殖を阻害することにおいて、対象の生存を延長することにおいて、あるいは、このような処置の非存在下で予想されるものを上回って１つ以上の対象の症状を緩和、救済または改善することにおいて、本明細書に記載の障害に罹患している対象への単回投与または複数回投与の際に有効である抗体−薬物コンジュゲートの量を指す。本明細書中で使用される場合、腫瘍または癌の「増殖を阻害する」とは、その成長及び／または転移の遅延、中断、阻止または停止を指し、必ずしも腫瘍増殖の完全な排除を示すものではない。
【００７５】
一態様では、本発明は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによってＧＣＣ発現細胞の増殖を死滅、阻害もしくは調節するか、またはその細胞の代謝の妨害を行う方法を特徴とする。一実施形態では、本発明は、ＧＣＣ媒介性細胞シグナル伝達を阻害する方法または細胞を死滅させる方法を提供する。この方法は、癌性細胞または転移性病変のような、ＧＣＣを発現する任意の細胞または組織で使用してもよい。ＧＣＣ発現癌の非限定的な例としては、大腸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌及び直腸癌が挙げられる。ＧＣＣ発現細胞の非限定的な例としては、Ｔ８４ヒト結腸腺癌細胞、新鮮または凍結の結腸腫瘍細胞、及びＧＣＣまたはその一部をコードする組換え核酸を含む細胞が挙げられる。
【００７６】
本発明の方法は、有効量、すなわち細胞を死滅させるのに十分な量で、本明細書に記載の本発明の抗体−薬物コンジュゲートと細胞とを接触させるステップを包含する。この方法は、培養中の細胞で、例えば、インビトロ、インビボ、エキソビボ、またはインサイチュで使用してもよい。例えば、ＧＣＣを発現する細胞（例えば、腫瘍または転移性病変の生検によって収集された細胞；確立された癌細胞株由来の細胞；または組換え細胞）を、インビトロで培養培地中で培養してもよく、接触ステップは、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを培養培地に添加することによって達成してもよい。この方法は、特にＧＣＣを発現する腫瘍細胞（例えば、結腸腫瘍細胞）を含む、ＧＣＣを発現する細胞を死滅させる。
【００７７】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートの抗体部分は、抗原を発現する細胞中のＧＣＣの細胞外ドメインまたはその一部に結合する。結果として、本発明の方法を実施して癌細胞を死滅させるか、抑制するか、または検出する場合、抗体−薬物コンジュゲートの抗体部分は、固定された細胞またはそうでなければ細胞外環境に曝露される細胞内抗原性ドメインだけでなく、このような全ての細胞に結合する。結果的に、これらのＧＣＣ発現細胞が固定されているか固定されていないか、生存可能であるか、または壊死しているかにかかわらず、ＧＣＣを発現する細胞が存在する領域に結合が集中する。
【００７８】
この方法はまた、インビボプロトコールの一部として、対象に存在する細胞に対して行ってもよい。一実施形態では、対象はヒト対象である。あるいは、対象は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートが交差反応するＧＣＣ抗原を発現する哺乳動物であってもよい。本発明の抗体−薬物コンジュゲートはまた、獣医学目的またはヒト疾患の動物モデルとして抗体が交差反応するＧＣＣ様抗原（例えば、霊長類、ブタまたはマウス）を発現する非ヒト哺乳動物に投与してもよい。動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するために有用であり得る（例えば、投与の用量及び時間経過の試験）。インビボの実施形態では、接触ステップは対象において達成され、細胞上に発現されたＧＣＣの細胞外ドメインへの抗体分子の結合、及び細胞の処置の両方を可能にするのに有効な条件下で、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを対象に投与することを包含する。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートをそのような治療を必要とする患者に投与することによってがんを治療する方法を提供する。この方法は、ＧＣＣ抗原を発現する少なくともいくつかの細胞を含む任意の癌性障害の処置に使用してもよい。本明細書中で使用される場合、「癌」という用語は、組織病理学的タイプまたは侵襲性のステージに関係なく、あらゆるタイプの癌性増殖または発癌プロセス、転移組織または悪性に形質転換された細胞、組織または器官を含むことを意味する。「癌」及び「腫瘍」という用語は、互換的に使用してもよい（例えば、治療方法の文脈で使用される場合、「癌の処置」及び「腫瘍の処置」は同じ意味を有する）。
【００８０】
いくつかの実施形態では、処置は、対象の腫瘍の増殖を減少または阻害するか、転移病巣の数もしくはサイズを減少させるか、腫瘍負荷を軽減するか、原発腫瘍負荷を軽減するか、侵襲性を低下させるか、生存時間を延長するか、及び／または生活の質を維持もしくは改善するために十分である。
【００８１】
癌性障害の例としては、限定するものではないが、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、及び転移性病変が挙げられる。固形腫瘍の例としては、様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺癌及び癌腫、例えば、結腸、膀胱、子宮頸部、食道、頭頸部、肝臓、肺、直腸、胃及び膵臓に影響を及ぼす腫瘍が挙げられる。癌腫としては、例えば、膀胱尿路上皮癌、子宮頸部扁平上皮癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、肝臓肝細胞癌及び肺細胞癌腫が挙げられる。腺癌としては、例えば、肺の非小細胞癌、子宮頚部腺癌、結腸腺癌、膵臓腺癌、直腸腺癌及び胃腺癌のような悪性腫瘍が挙げられる。前述の癌の転移性病変はまた、本発明の方法及び組成物を用いて治療または予防してもよい。いくつかの実施形態において、処置される癌は、胃腸系の癌（例えば、結腸直腸癌、結腸癌、直腸癌、食道癌、胃食道癌または胃癌）である。いくつかの実施形態では、処置される癌は膵臓癌である。
【００８２】
一実施形態では、癌は結腸直腸癌、例えば、結腸直腸腺癌、結腸直腸平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、結腸直腸黒色腫、または結腸直腸神経内分泌腫瘍である。特定の実施形態では、癌は転移性結腸癌である。別の実施形態において、癌は、胃癌（例えば、胃腺癌、リンパ腫または肉腫）またはその転移である。別の実施形態において、癌は、食道癌（例えば、扁平上皮細胞癌または食道の腺癌）である。
【００８３】
この方法は、任意のステージまたは下位分類で関連障害を処置するのに有用であり得る。例えば、方法を使用して、早期もしくは後期の結腸癌、または任意のステージ０、Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ及びＩＶの結腸癌を処置してもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、処置サイクルで投与される。「処置サイクル」は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートが上記のように投与される処置期間と、その後に本発明の抗体−薬物コンジュゲートが投与されない休止期間とからなる。治療サイクルは、所望の効果を達成するために必要に応じて繰り返してもよい。
【００８５】
本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートは、他の療法と組み合わせて使用してもよい。例えば、併用療法は、１つ以上の追加の治療剤、例えば、１つ以上の抗癌剤、例えば、追加の細胞傷害性または細胞増殖抑制剤、ホルモン処置、ワクチン、及び／または他の免疫療法と同時製剤化されるか、及び／または同時投与される本発明の組成物を含んでもよい。他の実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、外科手術、放射線療法、凍結手術及び／または温熱療法を含む他の治療的治療様式と組み合わせて投与される。そのような併用療法は有利なことに、さらに低投薬量の治療剤の投与を利用し、それにより様々な単独療法に伴う可能性のある毒性または合併症を回避する場合がある。
【００８６】
「組み合わせて」投与されるとは、本明細書において用いる場合、２つ（またはより多く）の異なる処置が、障害に罹患している対象の経過中に対象に送達されること、例えば、２つ以上の処置が、対象が障害を有すると診断された後で、及び障害が治癒または取り除かれる前に、送達されることを意味する。いくつかの実施形態では、１つの処置の送達が、第二の送達が開始するときに依然として存在しており、その結果、重複している。これは時には、「同時」または「同時発生」の送達と呼ばれる。他の実施形態では、１つの処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、処置は、組み合わせた投与のおかげでさらに有効である。例えば、第二の処置がより効果的であり、例えば、等価な効果が、第二の処置が少なくても見られるか、または第二の処置は、その第二の処置が、第一の処置なしで施される場合にみられるものより、さらに大きい程度まで症状を低下するか、または同様の状況が第一の処置でみられる。いくつかの実施形態では、送達とは、症状の減少または障害に関連する他のパラメータが、他方の非存在下で送達される一方の処置で観察されるよりも大きくなるようなものである。２つの処置の効果は、部分的に相加的であるか、全体的に相加的であるか、または相加より大きい場合がある。送達は、送達される第一の処置の効果が、第二の処置が送達されるときに依然として検出可能であるように送達されてもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体−薬物コンジュゲートは、化学療法剤と組み合わせて使用される。ＤＮＡ損傷化学療法剤の非限定的な例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン及びそれらの類似体または代謝産物、ならびにドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、及びダウノルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ及びシクロホスファミド）；ＤＮＡインターカレーター（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン）；ＤＮＡインターカレーター及びフリーラジカル発生剤、例えばブレオマイシン；及びヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、及びヒドロキシ尿素）が挙げられる。
【００８８】
併用療法としては、細胞複製を破壊する化学療法剤、例えば：パクリタキセル、ドセタキセル及び関連類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチン、及び関連アナログ；サリドマイド、レナリドマイド、及び関連する類似体（例えば、ＣＣ−５０１３及びＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブ及びゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ）；ＮＦ−κＢ阻害剤、例としては、ＩκＢキナーゼの阻害剤；がんにおいて過剰発現されるタンパク質に結合し、それによって細胞複製をダウンレギュレートする抗体（例えば、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、及びベバシズマブ）；がんにおいてアップレギュレートされるか、過剰発現されるか、または活性化されることが知られているタンパク質または酵素の他の阻害剤（その阻害は細胞複製をダウンレギュレートする）が挙げられる。
【００８９】
本発明の抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせられる治療剤（複数可）または処置様式の選択は、処置される障害に依存する。追加の薬剤（複数可）または処置様式は、例えば、処置される適応症に対する標準的に承認された療法を含んでもよい。例えば、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを、結腸癌の処置に使用する場合、それは、例えば外科手術；放射線療法；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、ロイコボリン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツマム、またはそれらの組み合わせ（例えば、オキサリプラチン／カペシチビン（ＸＥＬＯＸ）、５−フルオロウラシル／ロイコボリン・オキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）、５−フルオロウラシル／ロイコボリン／イリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）、ＦＯＬＦＯＸに加えてベバシズマブ）またはＦＯＬＦＩＲＩに加えてベバシズマブ）と組み合わせて使用してもよい。
【００９０】
別の態様では、本発明は、医薬の製造における本発明の抗体−薬物コンジュゲートの使用を特徴とする。ある実施形態では、この医薬は、がん、例えば胃腸癌、例えば、結腸直腸癌、食道癌または胃癌を処置するためのものである。いくつかの実施形態では、癌は膵臓癌である。一実施形態では、医薬は、結腸直腸癌、例えば、結腸直腸腺癌、結腸直腸平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、結腸直腸黒色腫、または結腸直腸神経内分泌腫瘍を処置するために使用される。特定の実施形態において、この医薬は、転移性結腸癌を処置するために使用される。別の実施形態において、この医薬は、胃癌（例えば、胃腺癌、リンパ腫または肉腫）またはその転移を処置するために使用される。別の実施形態において、この医薬は、食道癌（例えば、扁平上皮細胞癌または食道の腺癌）を処置するために使用される。
【実施例】
【００９１】
以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態を示す。当業者であれば、本開示の精神または範囲を変更することなく実行され得る多くの改変及び変形を認識するであろう。そのような改変及び変形は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、なんら本開示を制限するものではない。
【００９２】
実施例１：抗体産生細胞株の作製
＞６００ｍｇ／Ｌの生産性で５Ｆ９を発現する安定なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株クローンを作製するために、ＷＴヒトＩｇＧ１  Ｆｃ及びネオマイシン耐性遺伝子を含有するｐＬＫＴＯＫ５８発現ベクター中へ、軽鎖可変領域（配列番号８）及び重鎖可変領域（配列番号７）をサブクローニングすることによって、５Ｆ９の発現ベクターを作製した。５Ｆ９可変領域−ＩｇＧ１融合産物の発現は、ＥＦ−１αプロモーターの制御下にある。
【００９３】
抗ＧＣＣヒトモノクローナル抗体５Ｆ９可変領域のクローニング及び配列決定
ヒトハイブリドーマ４６．５Ｆ９サブクローン８．２から全ＲＮＡを単離した（Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  ＲＮｅａｓｙキット）。このハイブリドーマは、軽鎖の「標準的な」公開されたカッパ定常領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＷ３８３６２５またはＢＭ９１８５３９）及び重鎖の「標準」公開されたＩｇＧ２定常領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＸ６４０６２３またはＡＪ２９４７３１）を保有する。５’レースレディー（ｒａｃｅ−ｒｅａｄｙ）、ポリ−ＧテイルｃＤＮＡを伝統的な方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：６２９−６３０（２００５））により合成した。軽鎖可変領域を、カッパ定常領域に特異的なリバースプライマーと組み合わせてポリＣアンカーオリゴを用いて５’レース（ｒａｃｅ）によってｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。重鎖可変領域を、公知の重鎖リーダー配列に特異的なフォワードプライマーとの複数の組み合わせにおいてＩｇＧ２定常領域に特異的なリバースプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）クローニングし、Ｍ１３Ｆ及びＭ１３Ｒプライマーを用いて配列決定した。
【００９４】
抗ＧＣＣヒトモノクローナル抗体５Ｆ９を保有する哺乳動物発現ベクターの構築
５Ｆ９軽及び重可変領域を保有する哺乳動物発現ベクターを構築して、産生ＣＨＯ細胞株を作製した。天然構築物については、５Ｆ９軽鎖及び重鎖の可変領域をｐＬＫＴＯＫ５８Ｄにサブクローニングした（米国特許出願公開第２００４００３３５６１号）。このベクターは、ネオマイシン耐性及びＤＨＦＲ／メトトレキセート（増幅用）を含む、２つの哺乳類選択マーカーを保有する。このベクターによって、そのベクターのリーダー−カッパ定数及びリーダー−ＩｇＧ１（野生型Ｆｃ）定常領域の上流にそれぞれ位置するタンデムＥＦ−１αプロモーターからの軽鎖及び重鎖の同時発現が可能になる。サブクローニングのために、軽鎖及び重鎖の可変領域を、ベクターのそれぞれのリーダー−カッパ及びリーダー−ＩｇＧ１領域の接合部への方向性クローニングのための固有の制限部位を含む遺伝子特異的プライマーを用いて、配列確認されたＴＯＰＯクローンからＰＣＲ増幅した。プライマーの配列は以下のとおりである（５Ｆ９可変領域特異的配列は太字である）：
天然の５Ｆ９軽鎖リーダー可変プライマー：
フォワードＮｏｔＩ
【化７】
2019511462.tif 000014
（配列番号１３）
リバースＢｓｉＷＩ
【化８】
2019511462.tif 000015
（配列番号１４）
天然の５Ｆ９重鎖リーダー可変プライマー：
フォワードＥｃｏＲＩ
【化９】
2019511462.tif 000016
（配列番号１５）
リバースＢｌｐＩ
【化１０】
2019511462.tif 000017
（配列番号１６）
【００９５】
軽鎖及び重鎖の両方の二本鎖ＤＮＡ配列決定によってクローンを確認した。
以下の２つのトランスフェクション法を使用して、構築物をＣＨＯ細胞に導入した：伝統的ＭＰＩプロセス及びＣｒｕｃｅｌｌプロセス。ＣＨＯ細胞トランスフェクションは、伝統的なＭＰＩプロセスを用いて天然の５Ｆ９構築物で開始された。エレクトロポレーションまたはＬｉｐｏｐｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ＣＤトランスフェクションのいずれかを用いて、直鎖状及び非直鎖状ＤＮＡを使用した。約３０の安定なプールが、Ｇ４１８、非ヌクレオシド培地、及び５ｎＭのメトトレキサートでの選択によって生成された。抗体産生レベルのＦＭＡＴ分析に基づいて、３つの安定なプールをクローニングのために選択した。最も高い生産量を有するプールは、１２．２μｇ／ｍＬの抗体を分泌した。これらの３つのプールを凍結した。
【００９６】
Ｃｒｕｃｅｌｌ  ＳＴＡＲエレメントを評価して、ＳＴＡＲエレメントを含む５Ｆ９発現ベクターを作製してもよい。
以下に列挙する５Ｆ９の重鎖及び軽鎖の核酸配列を、ｐＴＯＫ５８Ｄベクターに挿入した。
ｐＴＯＫ５８Ｄベクター中の５Ｆ９重鎖核酸配列：
【化１１】
2019511462.tif 000018
ｐＴＯＫ５８Ｄベクター中の５Ｆ９軽鎖核酸配列
【化１２】
2019511462.tif 000019
【００９７】
実施例２:細胞傷害性薬剤ＣＤＡ−１の調製
【化１３】
2019511462.tif 000020
無水１，２−ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のアニリン１ａ（１．５５ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）及び２−（メチルジチオ）−イソブチルアルデヒド（０．７ｍＬ、５．１８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（１．１ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）及び塩化亜鉛粉末（３５３ｍｇ、２．５９ｍｍｏｌ）を、続いて無水硫酸マグネシウム（８００ｍｇ）を加えた。この混合物を室温で６時間撹拌し、次いで２−（メチルジチオ）−イソブチルアルデヒド（０．７ｍＬ、５．１８ｍｍｏｌ）及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．１ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）の第二部分を加えた。撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物をセライトで濾過し、ジクロロメタンで洗浄した。濾液を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ、４０ｇカラム、ジクロロメタン／ＭｅＯＨ）で精製して、化合物１ｂ（４８７ｍｇ、ｙ＝２２％）を無色油状物として得た。未反応の出発物質であるアニリン１ａ（１．０２ｇ）も６５％の収率で回収された。１Ｈ  ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．７６（ｓ，２Ｈ）、６．６３（ｓ，１Ｈ）、４．５５（ｓ，４Ｈ）、３．６５−３．５１（ｍ，１４Ｈ）、３．３５（ｓ，３Ｈ）、２．４４（ｓ，３Ｈ）、１．３３（ｓ，６Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４９．０，１４２．３５，１１４．０，１１１．１，７１．９８，７０．７，７０．６，７０．５，６７．６，６５．５，５９．７５，５９．１，５３．９，５１．９，２６．６，２５．７，２０．７５；ＭＳ（ｍ／ｚ）実測値４５６．２（Ｍ＋Ｎａ）＋。
【化１４】
2019511462.tif 000021
【００９８】
トリメチルアミン（２３４μＬ、１．６８ｍｍｏｌ）に無水ジクロロメタン（３．５ｍＬ）中の化合物１ｂ（２４３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液を加えた。この混合物を−１０℃に冷却し、塩化メタンスルホニル（１１３μＬ、１．４６ｍｍｏｌ）をシリンジを介して１５分かけてゆっくりと加えた。この溶液を−１０〜−７℃で６０分間撹拌し続け、氷／水の添加によりクエンチした。次いで、これを酢酸エチルで希釈し、冷水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、高真空にして、メシラートを淡黄色油状物（３４０ｍｇ）として得た。このメシラートを酢酸エチル／ジクロロメタンを含む１０ｍＬの丸底フラスコに移し、濃縮し、高真空とした。ＩＢＤ単量体（４１２ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を添加し、続いて無水ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）及び無水炭酸カリウム（２３２ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた黄色がかった混合物を室温で一晩撹拌し、次いでジクロロメタンで希釈し、ブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をジクロロメタンに溶解し、シリカゲルカラムにロードし、ジクロロメタン／メタノール（１５：１、次に１０：１）で溶離した。化合物１ｃを含む画分を合わせて濃縮して７０５ｍｇの粗生成物を得、これを分取逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、アセトニトリル／水で溶出）でさらに精製して、化合物１ｃを黄色がかったフワフワした固体として得た（１８１ｍｇ、ｙ＝３３％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．２８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．８６（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．５９（ｓ，２Ｈ）、７．３１−７．２６（ｍ，４Ｈ）、７．１２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、６．８７−６．８０（ｍ，５Ｈ）、５．１８（ｄｄ，Ｊ１＝２０．８Ｈｚ，Ｊ２＝１２．４Ｈｚ，４Ｈ）、４．５０−４．４７（ｍ，２Ｈ）、３．９９（ｓ，６Ｈ）、３．７５−３．４８（ｍ，１８Ｈ）、３．３７（ｓ，３Ｈ）、２．４４（ｓ，３Ｈ）、１．３２（ｓ，６Ｈ）；ＭＳ（ｍ／ｚ）ｆｏｕｎｄ１０２５．９（Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｎａ）＋、１０４３．９（Ｍ＋２Ｈ２Ｏ＋Ｎａ）＋，９８３．８（Ｍ−Ｈ）−、１０５５．８（Ｍ＋４Ｈ２Ｏ−Ｈ）−。
【化１５】
2019511462.tif 000022
【００９９】
水素化ホウ素ナトリウム（０．９ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）を、０℃で無水ジクロロメタン（０．３ｍＬ）及び無水エタノール（０．６ｍＬ）中の化合物１ｃ（１１２ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に加えた。氷浴を５分後に除去した。この混合物を室温で３時間撹拌し、０℃に冷却した。この混合物を飽和塩化アンモニウムでクエンチし、ジクロロメタンで希釈し、分離した。有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥し、セライトで濾過し、濃縮した。この残渣を、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、アセトニトリル／水）により精製した。対応する画分を、ジクロロメタンで抽出し、濃縮して生成物１ｄ、１ｅ及び未反応出発物質１ｃを得た。化合物１ｄ：３７．１ｍｇ（ｙ＝３３％），ＭＳ（ｍ／ｚ）：実測値１０１０．４（Ｍ＋Ｎａ）＋、１０２８．４（Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｎａ）＋，１０４０．３（Ｍ＋３Ｈ２Ｏ−Ｈ）−；化合物１ｅ：６．４ｍｇ（ｙ＝５．７％），ＭＳ（ｍ／ｚ）：実測値１０１２．４（Ｍ＋Ｎａ）＋；化合物１ｃ：４４．１ｍｇ（ｙ＝３９％）。
【化１６】
2019511462.tif 000023
【０１００】
新たに調製したＴＣＥＰ溶液（飽和炭酸水素ナトリウムでｐＨ６〜６．５に中和した１７ｍｇのＴＣＥＰ  ＨＣｌ塩を次にｐＨ６．５のリン酸緩衝液０．５ｍＬで希釈）を、アセトニトリル（３ｍＬ）及びメタノール（３ｍＬ）中の化合物１ｄ（２３．６ｍｇ、０．０２４  ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に室温で加えた。この混合物を室温で３時間撹拌し、次いでジクロロメタン及び脱イオン水で希釈し、分離した。この有機層をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。この濾液を濃縮し、高真空にして、２２ｍｇの化合物１ｆ（ＣＤＡ−１Ｂ）を淡黄色泡状物として得た。
【０１０１】
ＣＤＡ−１Ｂのスルホン化型であるＣＤＡ−１Ａは、ＣＤＡ−１ＢをＮａＨＳＯ３で処理することによって調製してもよい。以下の実施例３において、ＣＤＡ−２ＢをＣＤＡ−２Ａに変換するための例示的な反応条件を参照のこと。
【０１０２】
実施例３：細胞傷害性薬剤ＣＤＡ−２の調製
【化１７】
2019511462.tif 000024
【０１０３】
化合物（１２Ｓ、１２ａＳ）−９−（（３−（４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ、１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］  ［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンジル）オキシ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２、１２ａ、１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−１２−スルホン酸（ＣＤＡ−２Ａ）を以下のように調製した：
【０１０４】
４−メチル−４−（メチルジスルファニル）ペンタン酸（１．２８１ｇ、６．５９ｍｍｏｌ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．５３ｇ、１３．１９ｍｍｏｌ）、及び４−ジメチルアミノピリジン（０．０８１ｇ、０．６５９ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（１６．４８ｍＬ）及び無水テトラヒドロフラン（１６．４８ｍＬ）中の（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（１．０１ｇ、６．５９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。得られた混合物を室温で１８時間撹拌した。反応を、飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチし、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を水及びブラインで洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を濾過し、減圧下で濃縮し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、化合物２ａを白色固体として得た（０．７０ｇ、収率３２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６：δ９．９０（ｓ，１Ｈ）７．４３（ｓ，２Ｈ）、６．９３（ｓ，１Ｈ）、５．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、４．４４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ）、２．４３（ｓ，３Ｈ）、２．４１−２．３８（ｍ，２Ｈ）、１．９２−１．８８（ｍ，２Ｈ）、１．２９（ｓ，６Ｈ）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：実測値３３０．０（Ｍ＝１）１。
【化１８】
2019511462.tif 000025
無水ジクロロメタン（６．６５ｍＬ）中の化合物２ａ（２１９ｍｇ、０．６６５ｍｍｏｌ）の冷却した（−１０℃）溶液にトリメチルアミン（４６３μｌ、３．３２ｍｍｏｌ）を加え、続いて無水メタンスルホン酸（２９８ｍｇ、１．６６２ｍｍｏｌ）を滴下した。その混合物を−１０℃で２時間撹拌し、次いで混合物を氷水でクエンチし、冷酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で抽出した。この有機抽出物を氷水ですすぎ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して粗ジメシレートを得た。
【０１０５】
粗ジメシラート（２２７ｍｇ、０．４６７ｍｍｏｌ）及びＩＧＮ単量体Ａ（３０３ｍｇ、１．０２８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３．１１ｍＬ）に溶解した。炭酸カリウム（１６１ｍｇ、１．１６９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１８時間撹拌した。脱イオン水を加え、得られた沈殿物を濾過し、水ですすいだ。固体をジクロロメタンに再溶解し、水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。粗残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン）で精製して、化合物２ｂを得た（２２７ｍｇ、３６％収率）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：実測値８８２．５（Ｍ＋１）＋。
【化１９】
2019511462.tif 000026
【０１０６】
無水１，２−ジクロロエタン（３．３４６ｍＬ）中の化合物２ｂ（２２７ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３７．３ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム溶液でクエンチした。この混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。粗残渣をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８、水／アセトニトリル）により精製した。所望の生成物を含む画分をジクロロメタンで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して化合物２ｃを得た（３５ｍｇ、１９％収率）。MS(m/z)、実測値884.3(M+1)+。
【化２０】
2019511462.tif 000027
【０１０７】
リン酸ナトリウム緩衝液（１３２μＬ、０．７５Ｍ、ｐＨ６．５）中の飽和重炭酸ナトリウム溶液（０．２ｍＬ）で中和した、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１７．５１ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（９２１μＬ）及びメタノール（６５８μＬ）中の化合物２ｃ（１８ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。この混合物を室温で３．５時間撹拌し、次いでジクロロメタン及び脱イオン水で希釈した。その有機層を分離し、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して粗チオール（ＣＤＡ−２Ｂ）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）、実測値８３８．３（Ｍ＋１）＋。
【０１０８】
粗チオール（ＣＤＡ−２Ｂ）（１５．５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を２−プロパノール（１．２３ｍＬ）に溶解した。次いで、脱イオン水（６１７μＬ）及び亜硫酸水素ナトリウム（５．７７ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を室温で５時間撹拌した。反応物をアセトン／ドライアイス浴で凍結し、凍結乾燥させ、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８、脱イオン水／アセトニトリル）で精製した。所望の生成物を含有する画分を凍結し、凍結乾燥して化合物（１２Ｓ、１２ａＳ）−９−（（３−（４−メルカプト−４−メチルペンタンアミド）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ，１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）ベンジル）オキシ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ、１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−１２−スルホン酸（化合物２ｄまたはＣＤＡ−２Ａ）（６．６ｍｇ、収率３９％）を得た。ＭＳ（ｍ／ｚ）、実測値９１８．２（Ｍ−１）−。
【０１０９】
実施例４:細胞傷害性薬剤ＣＤＡ−３の調製
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ、１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ（１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノアート（ＣＤＡ−３Ｂ）の合成は以下のとおり行った：
【化２１】
2019511462.tif 000028
【０１１０】
（Ｓ）−２−（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（５ｇ、２２．４０ｍｍｏｌ）及び（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル２−アミノプロパノアート塩酸塩（４．４８ｇ、２４．６４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（４４．８ｍＬ）及びＥＤＣ・ＨＣｌ（４．７２ｇ、２４．６４ｍｍｏｌ）中に溶解し、ＨＯＢｔ（３．４３ｇ、２２．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（９．７５ｍＬ、５６．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物をアルゴン下、室温で一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、次いで飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。粗油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）で精製して化合物３ａを得た（６．７ｇ、収率８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３８−７．３１（ｍ，５Ｈ）、６．５３−６．４２（ｍ，１Ｈ）、５．４２−５．３３（ｍ，１Ｈ）、５．１４（ｓ，２Ｈ）、４．４８−４．４１（ｍ，１Ｈ）、４．３２−４．２０（ｍ，１Ｈ）、１．４９（ｓ，９Ｈ）、１．４２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．３８（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【化２２】
2019511462.tif 000029
【０１１１】
化合物３ａ（６．７ｇ、１９．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（６０．７ｍＬ）及び水（３．０３ｍＬ）に溶解した。溶液をアルゴンで５分間パージした。パラジウム炭素（湿性、１０％）（１．０１７ｇ、０．９５６ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。反応物を水素雰囲気下で一晩攪拌した。溶液をセライトを通して濾過し、メタノールですすぎ、濃縮した。次いでそれをメタノール及びアセトニトリルと共沸させ、得られた油状物を、高真空下に直接置いて化合物３ｂを得た（４．０２ｇ、収率９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．７８−７．６３（ｍ，１Ｈ）、４．４９−４．４２（ｍ，１Ｈ）、３．５５−３．５０（ｍ，１Ｈ）、１．７３（ｓ，２Ｈ）、１．４８（ｓ，９Ｈ）、１．３９（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．３６（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
【化２３】
2019511462.tif 000030
【０１１２】
化合物３ｂ（４．０２ｇ、１８．５９ｍｍｏｌ）及びモノメチルアジペート（アジピン酸モノメチル）（３．０３ｍＬ、２０．４５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（６２．０ｍＬ）に溶解した。ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．９２ｇ、２０．４５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２．８５ｇ、１８．５９ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６．４９ｍＬ、３７．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。反応物をジクロロメタン／メタノール（１５０ｍＬ、５：１）で希釈し、飽和塩化アンモニウム、飽和重炭酸ナトリウム及びブラインで洗浄した。これを硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そしてストリッピングした。この化合物をアセトニトリル（５Ｘ）と共沸させ、次いで３５℃で高真空下でポンピングして、化合物３ｃ（６．６６ｇ、収率１００％）を得た。この粗製物を精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．７５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、６．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、４．５２−４．４４（ｍ，１Ｈ）、４．４３−４．３６（ｍ，１Ｈ）、３．６５（ｓ，３Ｈ）、２．３５−２．２９（ｍ，２Ｈ）、２．２５−２．１８（ｍ，２Ｈ）、１．７１−１．６０（ｍ，４Ｈ）、１．４５（ｓ，９Ｈ）、１．３６（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）。
【化２４】
2019511462.tif 000031
【０１１３】
化合物３ｃ（５．９１ｇ、１６．５ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（２８．６ｍＬ、３７２ｍｍｏｌ）及び脱イオン水（１．５ｍＬ）中で室温で３時間攪拌した。反応混合物をアセトニトリルで濃縮し、高真空下に置いて、粘着性固体として粗化合物３ｄを得た（５．８８ｇ、収率１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、６．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、４．６９−４．６０（ｍ，１Ｈ）、４．５９−４．５１（ｍ，１Ｈ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）、２．４０−２．３３（ｍ，２Ｈ）、２．３１−２．２４（ｍ，２Ｈ）、１．７２−１．６３（ｍ，４Ｈ）、１．５１−１．４５（ｍ，３Ｈ）、１．４２−１．３７（ｍ，３Ｈ）。
【化２５】
2019511462.tif 000032
【０１１４】
化合物３ｄ（５．６ｇ、１８．５２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１１８ｍＬ）及び無水メタノール（５８．８ｍＬ）に溶解した。次いで、（５−アミノ−１，３−フェニレン）ジメタノール（２．７０ｇ、１７．６４ｍｍｏｌ）及びＥＥＤＱ（８．７２ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。溶媒を除去し、酢酸エチルを加えた。得られたスラリーを濾過し、酢酸エチルで洗浄し、真空／Ｎ２下で乾燥させて化合物３ｅを得た（２．７９ｇ、収率３６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．８２（ｓ，１Ｈ）、８．０５，（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．０１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．４６（ｓ，２Ｈ）、６．９５（３，１Ｈ）、５．２１−５．１２（ｍ，２Ｈ）、４．４７−４．４２（ｍ，４Ｈ）、４．４０−４．３３（ｍ，１Ｈ）、４．３３−４．２４（ｍ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、２．３３−２．２６（ｍ，２Ｈ）、２．１６−２．０９（ｍ，２Ｈ）、１．５４−１．４６（ｍ，４Ｈ）、１．３０（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．２２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）。
【化２６】
2019511462.tif 000033
【０１１５】
化合物３ｅ（０．５２ｇ、１．１８９ｍｍｏｌ）及び四臭化炭素（１．１８３ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１１．８９ｍＬ）に溶解した。次いで、トリフェニルホスフィン（０．９３５ｇ、３．５７ｍｍｏｌ）を加え、反応物をアルゴン下で４時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０：１）で希釈し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製して、化合物３ｆ（２６２ｍｇ、収率３９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．０１（ｓ，１Ｈ）、８．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、８．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、７．６７（ｓ，２Ｈ）、７．２１（ｓ，１Ｈ）、４．７０−４．６４（ｍ，４Ｈ）、４．４０−４．３２（ｍ，１Ｈ）、４．３１−４．２３（ｍ，１Ｈ）、３．５８（ｓ，３Ｈ）、２．３４−２．２６（ｍ，２Ｈ）、２．１８−２．１０（ｍ，２Ｈ）、１．５５−１．４５（ｍ，４Ｈ）、１．３１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．２１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。
【化２７】
2019511462.tif 000034
【０１１６】
ジブロミド化合物３ｆ及びＩＧＮ単量体ＢをＤＭＦに溶解した。炭酸カリウムを加え、室温で一晩撹拌した。水を反応混合物に加えて生成物を沈殿させた。スラリーを室温で撹拌し、次いで濾過し、真空／Ｎ２下で乾燥させた。この粗物質をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）で精製して、化合物３ｇ（３３６ｍｇ、収率７４％）を得た。ＬＣＭＳ＝５．９１分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９０．６（Ｍ＋１）＋。
【化２８】
2019511462.tif 000035
【０１１７】
ジイミン化合物３ｇを１，２−ジクロロエタンに溶解した。ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（ＳＴＡＢ）を反応混合物に加え、室温で１時間撹拌した。反応物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチした。層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。粗物質をＲＰＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、アセトニトリル／水）で精製して、化合物３ｈ（８５．５ｍｇ、収率２５％）を得た。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：９９２．６（Ｍ＋１）＋。
【化２９】
2019511462.tif 000036
【０１１８】
化合物３ｈを１，２−ジクロロエタンに溶解した。トリメチルスタンナノールを反応混合物に加え、８０℃で一晩加熱した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、水で希釈した。この水層を、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ約４に酸性化した。この混合物をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗物質をシリカプラグを通して、化合物３ｉを得た（４８．８ｍｇ、８０％収率）を得た。ＬＣＭＳ＝５．８９分（１５分法）。ＭＳ（ｍ／ｚ）：９７８．６（Ｍ＋１）＋。
【化３０】
2019511462.tif 000037
【０１１９】
ＥＤＣ・ＨＣｌを、室温で、ＣＨ２Ｃｌ２中の酸化合物３ｉ及びＮ−ヒドロキシスクシンアミドの撹拌溶液に添加した。この反応混合物を２時間撹拌した。この反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水及びブラインで洗浄した。この有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、ＲＰＨＰＬＣ（Ｃ−１８カラム、アセトニトリル／水）により精製し、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル６−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（３−（（（（Ｓ）−８−メトキシ−６−オキソ−１１，１２，１２ａ、１３−テトラヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）−５−（（（（Ｒ）−８−メトキシ−６−オキソ−１２ａ，１３−ジヒドロ−６Ｈ−ベンゾ［５，６］［１，４］ジアゼピノ［１，２−ａ］インドール−９−イル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）アミノ）−６−オキソヘキサノエート、化合物３ｊまたはＣＤＡ−３Ｂ（８．２  ｍｇ、収率３０％）を得た。ＬＣＭＳ＝６．６４分（１５分法）。MS(m/z):1075.4(M+1)+。
【０１２０】
ＣＤＡ−３Ｂのスルホン化型であるＣＤＡ−３Ａは、ＣＤＡ−３ＢをＮａＨＳＯ３で処理することによって調製してもよい。上記の実施例３においてＣＤＡ−２ＢをＣＤＡ−２Ａに変換するための例示的な反応条件を参照のこと。
【０１２１】
実施例５：抗体−薬物コンジュゲートの調製
Ａ．ｈｕ５Ｆ９−ＣＤＡ−１の調製
ｉ．コンジュゲーション
コンジュゲーションの前に、ヒト５Ｆ９抗体を、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５緩衝液中に交換した。次いで、２段階反応プロトコールを用いてコンジュゲートを作製した。ステップ１において、スルホ−ＳＰＤＢリンカー（例えば、米国特許第８，２３６，３１９号、段落［０４２］を参照のこと）を、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５及びジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）という９７／３水性：有機比で、４ｍｇ／ｍＬという最終抗体濃度まで、５Ｆ９抗体（表２に記載した代表モル過剰）で滴定した。この反応混合物を２５℃の水浴中で２時間インキュベートし、次に下記のように精製した。
【０１２２】
ステップ２では、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５及びＤＭＡの８５／１５の水性：有機比で、抗体−リンカー混合物に１．５モル当量のＣＤＡ−１をスルホＳＰＤＢを上回って添加した。この反応混合物を、２５℃の水浴中で４時間インキュベートした後、製剤緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２）中に精製した。
【表２】
2019511462.tif 000038
【０１２３】
ｉｉ．精製
５Ｆ９−スルホ−ＳＰＤＢ反応混合物を、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．９）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＮＡＰカラムを用いて精製した。精製した反応混合物をリンカー対抗体比（ＬＡＲ）分析の前に０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを用いて濾過した。
【０１２４】
５Ｆ９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＣＤＡ−１（５Ｆ９−ＣＤＡ−１）コンジュゲーション反応混合物を、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲル濾過カラムで濾過した。０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターを用いて精製コンジュゲートをろ過し、４℃で一晩保存した。翌日、分析前に０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを用いてスルホン化コンジュゲートを再濾過した。
【０１２５】
Ｂ．ｈｕ５Ｆ９−ＣＤＡ−２の調製
ｉ．コンジュゲーション
コンジュゲーションの前にヒト５Ｆ９抗体を、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５緩衝液に交換した。次いで、２段階反応プロトコールを用いてコンジュゲートを作製した。ステップ１では、スルホ−ＳＰＤＢリンカーを、９７／３水性：有機比の１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５及びＤＭＡ中で、最終抗体濃度４ｍｇ／ｍＬまで、５Ｆ９抗体（表３に記載された代表モル過剰）で滴定した。この反応混合物を２５℃の水浴中で２時間インキュベートし、次に下記のように精製した。
【０１２６】
ステップ２では、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５及びＤＭＡの８５／１５水性：有機比で、スルホ−ＳＰＤＢ上回る１．５モル当量のＣＤＡ−２を、抗体−リンカー混合物に添加した。この反応混合物を、２５℃の水浴中で４時間インキュベートした後、製剤緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２）中に精製した。
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
ｉｉ．精製
５Ｆ９−スルホ−ＳＰＤＢ反応混合物を、１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．９）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＮＡＰカラムを用いて精製した。精製された反応混合物を、ＬＡＲ分析の前に０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターを用いて濾過した。
【０１２９】
５Ｆ９−スルホ−ＳＰＤＢ−ＣＤＡ−２（５Ｆ９−ＣＤＡ−２）コンジュゲーション反応混合物を、２０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲル濾過カラムで濾過した。０．２２μｍＰＶＤＦシリンジフィルターを用いて精製コンジュゲートをろ過し、４℃で一晩保存した。翌日、分析前に０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを用いてスルホン化コンジュゲートを再濾過した。
【０１３０】
Ｃ．ｈｕ５Ｆ９−ＣＤＡ−３の調製
ｉ．コンジュゲーション及び精製：プラットフォームプロトコール
ヒト５Ｆ９抗体を、コンジュゲーションの前に１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．５）に緩衝液交換した。次に、スルホン化型のＣＤＡ−３、ＣＤＡ−３Ａを用いて５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートを調製した。ＣＤＡ−３Ａは、ＣＤＡ−３Ｂを、５倍モル過剰の亜硫酸水素ナトリウム及び５０ｍＭコハク酸塩（ｐＨ５．０）とともに、９０／１０有機：水溶液中、周囲温度で３時間インキュベートした後、４℃での一晩インキュベートによって最初にスルホン化した。次に、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５中の２．０ｍｇ／ｍＬの５Ｆ９抗体を使用し、抗体に基づいて特定のモル過剰量でＣＤＡ−３Ａを添加してコンジュゲーション反応を行った（代表的なコンジュゲーションについては表４を参照のこと）。コンジュゲーション反応は、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ８．５及びＤＭＡの最終的な９０／１０水性：有機組成物を有し、２５℃の水浴中で４時間インキュベートした後、製剤緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２）中に精製した。
【０１３１】
１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム（ｐＨ６．２）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＮＡＰカラムを用いて、５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲーション反応混合物を精製した。０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを使用して精製コンジュゲートをろ過し、新鮮な製剤緩衝液に対して４℃で一晩透析した後、新鮮な製剤緩衝液を用いて周囲温度で４時間透析した。このコンジュゲートを、分析前に０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを使用して再濾過した。
【表４】
2019511462.tif 000040
【０１３２】
ｉｉ．コンジュゲーション及び精製：最適化プロトコールＩ
所望の５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートの収率を最適化するために、等張強度、導電率、ｐＨ、反応濃度、及びＣＤＡ−３のモル当量を含む様々なパラメータを調べた。７５ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０緩衝液を利用する最適化プロトコールが、これらの研究から明らかになった。標準的なプラットフォームプロトコールと同様に、５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートを、スルホン化ＣＤＡ−３Ａ（前のセクションで説明したように調製した）を用いて作製した。最適化されたコンジュゲーション反応は、７５ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０中の２．０ｍｇ／ｍＬの５Ｆ９抗体を用い、抗体に基づいて特定のモル過剰量でＣＤＡ−３Ａを添加して行った（代表的なコンジュゲーションについては表５を参照のこと）。コンジュゲーション反応は、７５ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０及びＤＭＡの最終９０／１０水性：有機組成物を有し、２５℃の水浴中で４時間インキュベートした後、製剤緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２）中に精製した。
【０１３３】
１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム（ｐＨ６．２）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＮＡＰカラムを用いて、５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲーション反応混合物を精製した。０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを使用して精製コンジュゲートをろ過し、新鮮な製剤緩衝液に対して４℃で一晩透析した後、新鮮な製剤緩衝液を用いて周囲温度で４時間透析した。コンジュゲートを、分析前に０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを使用して再濾過した。
【表５】
2019511462.tif 000041
【０１３４】
ｉｉｉ  コンジュゲーション及び精製：最適化プロトコールＩＩ
最適化スルホン化
ＣＤＡ−３Ｂを以下のようにスルホン化してＣＤＡ−３Ａを生成させた。３．７５ｍＬの５０ｍＭコハク酸ナトリウム（ｐＨ３．３）にＤＭＡを６．１１ｍＬの量で添加した。水浴中で混合し、１０℃まで平衡化した後、ＤＭＡ（３０．０μｍｏｌのＣＤＡ−３）中の２１．５ｍＭのＣＤＡ−３Ｂストック溶液１．３９ｍＬを添加して混合した。この添加後、３．７５ｍＬの２０ｍＭの亜硫酸水素ナトリウム水溶液（２．５当量、７５μｍｏｌ）を反応に導入した。混合後、反応を１０℃で１５．５時間進行させ、精製することなく次のステップで直ちに使用した。反応混合物の液体クロマトグラフィー（逆相）分析では、２．４％の未反応ＣＤＡ−３Ｂを残してＣＤＡ−３Ａへの変換率９２．４％が図９Ａで示された。ＣＤＡ−３Ａのピーク同一性は、図９Ｂに示されるようにＬＣ／ＭＳによって確認された。
【０１３５】
コンジュゲーション後クエンチ
コンジュゲーション後のイオン強度の増大が高分子量（ＨＭＷ）種の形成を減少させる状態を決定するために、以下の最適化を行った。５Ｆ９抗体（２ｍｇ／ｍＬ）を３．８モル当量のＣＤＡ−３Ａに対して２２℃で８０〜９０分間コンジュゲートさせた。コンジュゲーション反応の最終組成物は、容量１５％のＤＭＡを含む１３０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．７を含んでいた。コンジュゲーション反応が完了した直後に、アリコートを、表６に詳述するクエンチ溶液の示された容積で希釈した。ＨＭＷ種のパーセントの変化を、２２℃に保持して指示時間の間モニタリングした。この発見に基づいて、７５０ｍＭＥＰＰＳを用いた１．４〜１．６倍希釈、及び７５０ｍＭ  ＥＰＰＳ／１５０ｍＭ塩酸ヒスチジンを用いた１．４〜１．６倍希釈を選択した。以下のコンジュゲーション実施例では、７５０ｍＭのＥＰＰＳ／１５０ｍＭ塩酸ヒスチジンを用いた１．５倍希釈を使用した。表６は、粗製５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートの安定性に対するクエンチ溶液の効果を示す。粗５ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートを、特定の長さの時間をかけて異なるクエンチ溶液と共にインキュベートし、そして分子量種のパーセントの変化をサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。
【表６−１】
2019511462.tif 000042
【表６−２】
2019511462.tif 000043
【表６−３】
2019511462.tif 000044
＊表に示された時間における実験のＨＭＷ％からｔ＝０分で適切な対照のＨＭＷ％を差し引くことによって計算した。
【０１３６】
最適化したコンジュゲーション及び精製
１３０ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．７）３２５ｍＬを含むオーバーヘッド撹拌機を備えた１Ｌのジャケット付きガラス反応器に、６８．６ｍＬのＤＭＡを加えた。２２℃までの溶液の混合及び平衡化の後、１３０ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．７中の１０．０ｍｇ／ｍＬの５Ｆ９抗体溶液１００ｍＬをこの反応器に導入し、１５分間混合させた。続いて、１２．８ｍＬの２ｍＭ  ＣＤＡ−３Ａ溶液（２５．５μｍｏｌ、３．７当量の５Ｆ９抗体；先に記載した最適化スルホン化プロトコールを用いて調製した）を反応溶液に導入した。２２℃で６０分間撹拌した後、１５０ｍＭの塩酸ヒスチジン及び７５０ｍＭのＥＰＰＳを含む２５０ｍＬの水溶液をこの反応容器に移した。完全に混合した後、この物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ４７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ０．５／０．２μＭフィルターで濾過した。次いで、粗反応混合物を、ＴａｎｇｅｎＸ  ０．０２ｍ２ＨｙＳｔｒｅａｍ  ３０ｋＤ  Ｓｉｕｓ  ＬＳＮ  ＴＦＦカセットを用いた限外濾過によって、２．５ｍｇ／ｍＬの計算されたバルクタンパク質濃度に濃縮した。濃縮ステップの後、溶液を４．８Ｌの５０ｍＭヒスチジン、６．７ｗ／ｖ（重量／容量）％スクロース、０．１ｖ／ｖ（体積／容量）％ポリソルベート−８０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ  ５．５緩衝液に対してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの後、残留の溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ４７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＳＨＣ  ０．５／０．２μＭフィルターで濾過した。２〜８℃で２日間保存した後、必要量の追加の５０ｍＭヒスチジン、６．７ｗ／ｖ％スクロース、０．１ｖ／ｖ％ポリソルベート−８０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ５．５緩衝液を添加することにより、溶液を１．０ｍｇ／ｍｌコンジュゲートに希釈した。次いで、この溶液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｏｐｔｉｓｃａｌｅ  ４７  Ｄｕｒａｐｏｒｅ０．２２μＭフィルターで濾過し、８１８ｍＬの１．０ｍｇ／ｍＬコンジュゲートを得た。最終コンジュゲートの測定されたＤＡＲは、９７．４％の単量体でＵＶ／ｖｉｓで２．６、及びＳＥＣにより２．５％のＨＭＷである。生成物の最終収率は８２％であった。
【０１３７】
Ｄ．５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ−ＣＤＡ−３の調製
７５ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ  ８．０緩衝液を利用する、前のセクションに記載のプロトコールを用いて、５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ−ＣＤＡ−３コンジュゲートを調製した。５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ抗体は、類似の位置でＩｇＧ２中の高度に保存されたアミノ酸であるＰＶＡによって、ＦｃγＲＩＩＩｂの結合に重要であるＩｇＧ１の重鎖（配列番号９）においてＥＬＬＧを置換するアミノ酸置換を含む（Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５（５２０）：１−１７（２０１４））。
【０１３８】
コンジュゲーション反応は、抗体に基づいて特定のモル過剰量でスルホン化ＣＤＡ−３Ａを添加して７５ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０中２．０ｍｇ／ｍＬの５Ｆ９  ＰＶＡｄＧ抗体を用いて行った（代表的なコンジュゲーションについては表６を参照のこと）。コンジュゲーション反応は、７５ｍＭ  ＥＰＰＳ、ｐＨ８．０及びＤＭＡの最終９０／１０水性：有機組成物を有し、２５℃の水浴中で４時間インキュベートした後、製剤緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２）中に精製した。
【０１３９】
１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、及び５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム（ｐＨ６．２）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＨｉＰｒｅｐカラムを用いて、５Ｆ９−ＰＶＡｄＧ−ＣＤＡ−３コンジュゲーション反応混合物を精製した。精製されたコンジュゲートを、分析前に０．２２μｍのＰＶＤＦシリンジフィルターを使用して濾過した。
【表７】
2019511462.tif 000045
【０１４０】
実施例６：抗体−薬物コンジュゲートの分析
Ａ．リンカー対抗体比（ＬＡＲ）の決定
２８０ｎｍの吸光度値及び５Ｆ９抗体の吸光係数（ε＝２２４，０００Ｍ−１；表８））を使用して、紫外／可視範囲分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）によって、精製５Ｆ９−スルホ−ＳＰＤＢ中の抗体の濃度を決定した。スルホ−ＳＰＤＢリンカーの濃度は、ｐＨ７．５の緩衝液中でのジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理の際の放出されたチオピリジンあたりの結合分子の１：１比、続いて３４３ｎｍでのＵＶ／Ｖｉｓアッセイ（ε＝８，０８０Ｍ-1）と仮定して測定した。抗体に対するリンカーのモル濃度の比をＬＡＲ値として報告する。
【０１４１】
Ｂ．薬物対抗体比（ＤＡＲ）の決定
精製コンジュゲート試料中の５Ｆ９抗体及びＣＤＡの濃度を、２８０ｎｍ及び３３０ｎｍでの吸光度値を用いてＵＶ／Ｖｉｓによって決定した。抗体及びＣＤＡの両方とも２８０ｎｍで吸収するので、各部分に起因する総シグナルの部分を考慮するために必要な二項方程式が必要であった。ＣＤＡのみが３３０ｎｍで吸収するので、その波長での濃度はエフェクター分子のみに起因する可能性がある。コンジュゲートされた部分の吸光係数の値を表７に示す。
抗体及びＣＤＡ成分は、以下の代数式を使用して定量したが、これらの式は、各波長で各構成要素の寄与を説明する：
【数１】
2019511462.tif 000046
【０１４２】
ＡｘはＸｎｍ波長における吸光度値であり、ＣＡｂは抗体のモル濃度（すなわち、５Ｆ９）であり、ＣＣＤＡはＣＤＡのモル濃度である。ＣＤＡ：Ａｂ（ＤＡＲ）の比は、上記のモル濃度の比として計算した。５Ｆ９及びＣＤＡのｍｇ／ｍＬ（ｇ／Ｌ）濃度は、表８に記載の分子量を用いて計算した。
【表８】
2019511462.tif 000047
コンジュゲーション及び精製で使用するために代替プロトコールを使用して再計算：最適化プロトコールＩＩ
【０１４３】
Ｃ．単量体コンジュゲートの割合の決定
精製５Ｆ９−ＣＤＡ試料中の単量体コンジュゲートの割合を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用するＨＰＬＣ分析によって決定した。およそ１０〜１００μｇの５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを、ＳＥＣカラム（ＴＳＫ  ＧＥＬＧ３０００ＳＷｘｌ  ５μｍ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．０８５４１；推奨ガードカラムＴＳＫ  ＧＥＬ、４ｃｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．０８５４３、ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）を装備したＨＰＬＣ装置に注入し、４００ｍＭの過塩素酸ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５％のイソプロパノールの定組成移動相を用いて１分あたり０．５ｍＬで流す。吸光度シグナルを２８０ｎｍ及び３３０ｎｍの波長で３０分間集めた。
【０１４４】
５Ｆ９抗体単量体は、典型的には、約１７分で溶出したが、５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲート単量体は、約１７分〜約１９分でピークを有する二重線として溶出することが多い。高分子量種（ＨＭＷ、例えば二量体、凝集体）及び低分子量種（ＬＭＷ、例えばフラグメント）は、典型的にはそれぞれ、約１２分及び約２４分で溶出した。
【０１４５】
１７分のピーク（または１７／１９の二重線）の２８０ｎｍのピーク面積から単量体抗体（またはコンジュゲート）％を計算し、組み合わせた全タンパク質ピークの面積と比較した。単量体ピークのＤＡＲはまた、上記セクションに示すＣＣＤＡ及びＣＡｂ式のＡ２８０及びＡ３３０空間に２８０ｎｍ及び３３０ｎｍのシグナルのピーク領域を置き換え、次いでＣＣＤＡ/ＣＡｂを割ることによって決定した。
【０１４６】
Ｄ．非コンジュゲートＣＤＡの割合の決定
精製５Ｆ９−ＣＤＡ試料中に存在する非結合ＣＤＡ（「遊離薬物」）の量を、タンデムＳＥＣ及びＣ−１８逆相カラム（「二重カラム」）を用いたＵＰＬＣ分析によって決定した。２つのＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣカラム（１．７μｍ、４．６×３０ｍｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．１８６００５７９３、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を連続して接続して丸ごとの５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを遊離薬物から分離し、次いで、これをＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｔｅｃｓ  ＵＰＬＣ  Ｃ−１８カラム（２．１×５０ｍｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．１８６００７０９３）に導き、遊離ＣＤＡ種を分離して定量した。アセトニトリル（ＡＣＮ）で２０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮに希釈し、カラムシリーズ（２５μＬ）に注入し、表９に示す勾配に従って泳動することにより、５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを調製した：
【表９】
2019511462.tif 000048
【０１４７】
２．２分でインラインＳＥＣからＣ−１８へカラムを迂回させ、１４．０分でインラインＳＥＣに戻した。シグナルを２６５ｎｍで収集した。ＣＤＡ−１またはＣＤＡ−３由来の標準曲線を使用して、試料中に存在する遊離薬物の量を、２．２−１４．０分のウインドウに見られるピークから、以下の式を用いて計算した：
【数２】
2019511462.tif 000049
【０１４８】
実施例７：抗体−薬物コンジュゲートの特徴付け
細胞株
機能的アッセイに使用した細胞株は、ＧＣＣトランスフェクト及びベクターの対照ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞という細胞対であった。ＨＥＫ２９３細胞を、ＣＭＶプロモーターの制御下で、または空のベクター（ｐＮ８ｍｙｃＳＶ４０）で制御してｍｙｃ標識した全長ＧＣＣでトランスフェクトし、ブラストサイジンで選択した。ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２クローンは、最も高いＧＣＣ発現を示した。ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞におけるＧＣＣ発現を、放射性標識リガンド（ＳＴ−毒素）による全細胞結合アッセイを用いてさらに分析し、ＧＣＣ受容体レベルの定量によって、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞が、他のＧＣＣ発現細胞株（例えば、ＧＣＣトランスフェクトヒト結腸直腸腺癌ＨＴ−２９細胞及びＴ８４ヒト結腸腺癌細胞）よりも多くのＧＣＣを発現することが示唆された。
【０１４９】
Ａ．細胞結合／アフィニティーアッセイ
各抗体−薬物コンジュゲートがＧＣＣ発現細胞に結合する能力を測定するために、フローサイトメトリーを用いた間接免疫蛍光アッセイによって５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを評価した。ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２及びベクター対照細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した標準的な細胞培養培地中で増殖させた。細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ；カタログ番号１５０４０−０６６）を用いてプレート表面から非酵素的に取り外し、ＦＢＳを含む滅菌チューブ中で１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、３％ＦＢＳ／リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含まない）中で洗浄した。この遠心分離−洗浄ステップをもう一度繰り返した後、細胞を３％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で５×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させ、Ｖ底９６ウェルプレートの実験ウェルに１００μＬアリコートで添加した（約５００，０００細胞）。このプレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０１５０】
遠心分離後、上清を各ウェルから取り出し、５０μＬの一次抗体−薬物コンジュゲート溶液と置き換えた。５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３の溶液は、それぞれ１μｇ／ｍＬの最終濃度で調製した。９６ウェルディッシュを覆い、４℃（氷上）で１時間インキュベートした後、溶液をウェルから除去し、細胞を１００μＬの３％ＦＢＳ／ＰＢＳ（Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含まない）で２回洗浄した。
【０１５１】
マウスのａｄｓ−ＰＥ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ；カタログ番号２０４３−０９）の二次抗体であるヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧを、製造者の示唆するように１：２００に希釈した。２回目の洗浄が完了した後、５０μＬの二次抗体溶液を各実験ウェルに加え、カバーした９６ウェルプレートを４℃（氷上）で１時間置いておいた。次いで、プレートを遠心分離し、上清を１００μＬの３％ＦＢＳ／ＰＢＳ（Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含まない）で置換した。この遠心分離−洗浄ステップを合計２サイクル繰り返した。細胞を２００μＬのＰＢＳ（Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含まない）で最終的に再構成し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）にロードした。データは、ＦＡＣＳ  ＩＩ  Ｃａｎｔｏシステムソフトウェア及び適切なフィルター設定を用いて分析した。
【０１５２】
ＣＤＡの抗体分子へのコンジュゲーションによって、その標的抗原に対するこのような抗体の親和性を変化させるか、またはその抗原に対するそのような抗体の細胞結合を破壊し得る。図１によって、ＣＤＡコンジュゲーションが５Ｆ９抗体のＧＣＣへの結合に影響も与えず、減少もさせないことが実証される。親和性値は、非コンジュゲート５Ｆ９（図１Ａ）と、本発明の５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲート（図１Ｂ〜１Ｄ）との間で匹敵している。表９によって、５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲート中の５Ｆ９へのＣＤＡコンジュゲーションが、抗体分子のＧＣＣへの結合に影響せず、低下もしないことが実証される。
【表１０】
2019511462.tif 000050
【０１５３】
Ｂ．細胞傷害性／力価アッセイ
各５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートがＧＣＣ発現細胞を死滅させる能力を測定するために、細胞傷害性アッセイを行った。このアッセイでは、ＧＣＣ発現ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞及びベクター対照細胞を９６ウェルディープウェルプレート中にウェルあたり２×１０３の密度で三連で播種した。５Ｆ９−ＣＤＡの連続希釈液を、この播種したウェルに直ちに添加し、プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、製造業者の推奨に従って細胞生存率を評価した。生存率を未処理対照細胞に対して標準化し、誤差を平均の標準誤差（ＳＥＭ）として算出した。
【０１５４】
ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞における５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの相対効力を、図２に示す。５Ｆ９−ＣＤＡ−２（図２Ｂ）及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３（図２Ｃ）は、５Ｆ９−ＣＤＡ−１（図２Ａ）よりも強力な抗体−薬物コンジュゲートである。表１１を参照のこと。これらのアッセイによってまた、本発明の抗体−薬物コンジュゲートが、ＧＣＣ発現細胞を特異的に標的とし、死滅させ、ＧＣＣ抗原を発現しない細胞において細胞傷害性を有意に低下させることが実証される。
【表１１】
2019511462.tif 000051
【０１５５】
Ｃ．内在化アッセイ
抗ＧＣＣ抗体分子の内在化を、免疫蛍光顕微鏡を用いて、ＧＣＣ発現ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞及びベクター対照細胞の両方において試験した。細胞をカバースリップ上で増殖させ、氷上に１０分間置いた後、氷上で２０分間、冷培養培地中で５Ｆ９抗体（１０μｇ／ｍＬ）とインキュベーションした。次いで、抗体含有培地を新鮮な培養培地と交換し、細胞を３７℃で２〜３時間インキュベートするか、または４℃で（氷上で）維持した。ＰＢＳ中で１回すすぎ、室温で４％パラホルムアルデヒドで短時間固定した後、細胞を５％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００中で１５分間透過処理した。５Ｆ９抗体の局在化を、レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いた蛍光標識抗ＩｇＧ抗体を用いて測定した。５Ｆ９抗体は、氷上ではＧＣＣ発現細胞の細胞表面に局在したが、３７℃でインキュベートした細胞は細胞膜内で点状染色を示し、内在化が示された。ベクターの対照細胞では内在化は検出されなかった。
【０１５６】
実施例８：インビボの評価
Ａ．腫瘍モデルにおけるＡＤＣの有効性
マウス異種移植モデルにおいて、５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートのインビボ有効性を評価した。
【０１５７】
すべての有効性研究のために、雌性ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（６〜７週齢）に５×１０６個のＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２細胞を脇腹に皮下接種するか、または６〜７週齢のヌードマウスに、患者（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）由来のヒト原発腫瘍（ＰＨＴＸ）の２ｍｍ×３ｍｍの腫瘍断片を、１０％ＦＢＳなしのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、脇腹に連続的に移植して、接種した。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達したとき、動物を処置群に無作為化した。処置群（１群あたりｎ＝５）には、適切なビヒクルを投与した対照群、ｃｈＫＴＩ−ＣＤＡを投与した対照群、または本発明の５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを投与した実験群が含まれていた。
【０１５８】
キメラＫＴＩ（ｃｈＫＴＩ）抗体は、米国特許第４，９５９，３１０号；Ｂｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．５３：９７−１０１（１９８８）；Ｂｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３６：１３３６−１３４１（１９８８）；Ｂｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．３９：３２７−３３５（１９９１）；及びＢｒａｎｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉ．３２：１５０２−１５０５（１９９２）に記載のＡＴＣＣハイブリドーマＨＢ−９５１５に由来するマウス／ヒトキメラ抗体である。ｃｈＫＴＩ抗体は、Ｋｕｎｉｔｚダイズトリプシン阻害剤（ＫＴＩ）に結合する。ｃｈＫＴＩ抗体は、ＧＣＣを標的とせず、Ａｂ−ＣＤＡコンジュゲート対照として使用された。
【０１５９】
マウスには、種々の用量の５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを含有する溶液の単回静脈内注射または３週間にわたる週１回の対照処置（すなわち、０，７及び１４日目の分画レジメン投与）、または単一の急性の同じ用量（すなわち、０日目のみ投与）のいずれかを施した。ノギスを用いて腫瘍増殖を１１週間にわたり週１回モニターした。平均腫瘍体積は、式（Ｖ＝［Ｗ２×Ｌ］／２）を用いて計算した。実験薬剤の抗腫瘍有効性は、ビヒクルコントロールアームの平均腫瘍体積を各実験薬剤と比較することによって決定した。
【０１６０】
ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍を有するマウスにおいて、５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートは、耐久性のある抗腫瘍活性を達成した（図３）。具体的には、再増殖は、５Ｆ９−ＣＤＡ−１及び５Ｆ９−ＣＤＡ−２処置後の５〜６週間までは起こらなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。抗腫瘍活性は、５Ｆ９−ＣＤＡ−３研究で最も顕著であり、腫瘍再増殖は、処置後８−９週間まで典型的には観察されなかった（図３Ｃ）。５Ｆ９−ＣＤＡ−１で処置した群には６０μｇ／ｋｇで投与したが、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３で処置した群にはそれぞれ１０μｇ／ｋｇで投与し、５Ｆ９−ＣＤＡ−３で観察された抗腫瘍活性はさらに顕著となった。
【０１６１】
一次ヒト腫瘍異種移植（ＰＨＴＸ）結腸直腸モデルにおいて、５Ｆ９−ＣＤＡ−１（６０−１８０μｇ／ｋｇ）での処置は、ＭＬＮ０２６４（５Ｆ９−ｖｃＭＭＡＥ、米国特許第８，７８５，６００号を参照のこと）に対して不応性であるモデルであるＰＨＴＸ（ａ）（図４Ａ及び４Ｄ）、及びＰＨＴＸ（ｂ）（図５Ａ）において最大５週間まで腫瘍再増殖の開始を遅延させた。増殖阻害は、５Ｆ９−ＣＤＡ−２（図４Ｂ、４Ｅ、５Ｂ及び６Ａ）または５Ｆ９−ＣＤＡ−３（図４Ｃ、４Ｆ、５Ｃ及び６Ｂ）を用いて低用量（２０〜６０μｇ／ｋｇ）で処置したＰＨＴＸ（ａ）、ＰＨＴＸ（ｂ）及びＰＨＴＸ（ｃ）腫瘍においてさらに長期間でさえ観察された。ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍保有マウスの観察と同様に、５Ｆ９−ＣＤＡ−３の静脈内投与は、処置後少なくとも８〜１４週の範囲で、腫瘍再増殖の最長の遅延をもたらした。
【０１６２】
腫瘍／対照（Ｔ／Ｃ）値を、それぞれの原発腫瘍モデルにおいて実施されたインビボの有効性試験に関して表１２に示す。Ｔ／Ｃとは、対照アーム（Ｃ）に対する所与の処置アーム（Ｔ）の腫瘍サイズを報告する測定基準である。強い抗腫瘍活性は、一般にＴ／Ｃ≦０．４０として定義される。各研究について、コントロールアームが測定された最後の日にＴ／Ｃを計算した。５Ｆ９−ＣＤＡ−１は、高用量（９０及び１２０μｇ／ｋｇ）でＴ／Ｃ値≦０．４０を達成したが、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３は両方とも、各モデルにおいて低用量（２０〜４５μｇ／ｋｇ）でＴ／Ｃ値≦０．４０を達成した。
【表１２】
2019511462.tif 000052
【０１６３】
Ｂ．薬物動態学的研究／薬力学的研究
研究は、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ腫瘍保有マウスにおける５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）を決定するために行った。ＰＫ研究は、上記の有効性試験と同じ皮下接種プロトコールに従った。平均腫瘍体積が約５００ｍｍ３に達したとき、動物を処置群に無作為化化した。
【０１６４】
マウスに、５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートまたはビヒクルの単回静脈内用量を３０μｇ／ｋｇで投与した。注射後の各規定時点（１、２４、４８、９６、１６８、３３６及び５０４時間）で３匹の動物を屠殺し、腫瘍及び全血試料を採取した。血液試料を血清分離管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号３６５９５６）に移した。下に記載のとおり、腫瘍組織をホルマリン固定し、薬力学的バイオマーカー変化の分析のためにパラフィン包埋した。
【０１６５】
Ｃ．血漿中の総抗体及び総ＡＤＣのＰＫ評価
５Ｆ９−ＣＤＡ処置後のマウス血液試料中の総抗体及び総抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の量の評価を、サンドイッチイムノアッセイを用いて行った。９６ウェルプレートを、マウスＦｃ領域に融合したＧＣＣの細胞外ドメインを含むタンパク質でコーティングした。ＧＣＣ抗原のこの部分は、試料中に存在する５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートを捕獲し得る。ルテニル化ロバ抗ヒトＦｃ−γ抗体を用いて総抗体アッセイのために、捕獲された５Ｆ９−ＣＤＡを検出し、一方ではルテニル化抗ＣＤＡ抗体を用いて総ＡＤＣを測定した。トリプロピルアミン含有読取り緩衝液の存在下で、ルテニウムタグは電圧によって誘発される化学発光シグナルを生成する。化学発光は、ＭＥＳＯ  ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ１２０機器（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で測定した。
【０１６６】
総抗体及び総ＡＤＣレベルは、５Ｆ９−ＣＤＡ−１での処置後、特に１６８及び３３６時間の時点で、互いに検知できるほど異なっていた（図７Ａ）。この差によって、循環中のＡＤＣのある程度の不安定性が示唆される。対照的に、総抗体及び総ＡＤＣレベルは、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３の両方のすべての時点で同等であり（図７Ｂ及び７Ｃ）、これらのコンジュゲートがインビボで安定であることが示されている。
【０１６７】
下記の表１３では、非コンパートメント分析を用いて計算されたＰＫパラメーターを報告する。注目すべきことに、５Ｆ９−ＣＤＡ−３は、５Ｆ９−ＣＤＡ−１または５Ｆ９−ＣＤＡ−２のいずれよりも遅いクリアランス（ＣＬ）を示した。この差は、曲線下面積（ＡＵＣ）値に反映されるように、経時的に５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートの曝露をより大きくした。
【表１３】
2019511462.tif 000053
【０１６８】
Ｄ．５Ｆ９  ＡＤＣの単回投与後のＰＤバイオマーカー活性
薬力学的（ＰＤ）バイオマーカーを、ＨＥＫ２９３−ＧＣＣ＃２腫瘍のパラフィン包埋切片の免疫組織化学染色により、検出した。切片をガラススライド上に載せ、１００℃で２０分間エピトープ回収のためにＥＤＴＡベースの溶液（ｐＨ９．０）と共にインキュベートし、無血清タンパク質ブロック（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ；カタログ番号Ｘ０９０９）中でブロックして、非特異的抗体結合を妨げる。次いで、一次抗体溶液を、ホスホ−ＣＨＫ１（１：２００；ＡｂＣａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；カタログ番号ＭＩＬ２．０９１４１１．ｆｚｈ）及びホスホ−γ−Ｈ２ＡＸ（１：１５００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；カタログ番号９１７８）を認識する抗体を用いて調製し、加湿チャンバー内の切片と共に１時間インキュベートした。チェックポイントキナーゼ１（ＣＨＫ１）は、その活性化が細胞周期停止及び特定型の遺伝毒性ストレスを示すセリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼであり、一方、γ−Ｈ２ＡＸは、ＤＮＡ修復タンパク質の補充及び局在化の間にリン酸化されるヒストンファミリーのメンバーである。ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）ポリマー検出試薬を染色の検出及び視覚化に用い、カスタム画像解析アルゴリズムを用いて、バックグラウンド染色に対する染色の量を決定した。結果は、組織切片における抗原陽性細胞／全生存細胞のパーセンテージとして報告される。
【０１６９】
図８によって、各５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの単回投与が、ホスホＣＨＫ１（図８Ａ）及びホスホ−γ−Ｈ２ＡＸ（図８Ｂ）の両方の顕著な増大をもたらしたこと、ならびに、この増大は、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３による処置後に最も顕著であったことが示される。したがって、ＤＮＡ損傷応答バイオマーカーを用いて、インビボでの５Ｆ９−ＣＤＡコンジュゲートの活性を検出してもよい。
【０１７０】
要約すると、５Ｆ９−ＣＤＡ−１、５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３は全て、ＧＣＣ陽性モデルにおける細胞／腫瘍増殖への影響についてインビトロ及びインビボで試験されている。まとめると、これらのＡＤＣの各々を用いて生成されたデータによって、５Ｆ９−ＣＤＡ−３が広範囲のモデルにおいてより大きなＧＣＣ依存活性を有することが示唆される。５Ｆ９−ＣＤＡ−２及び５Ｆ９−ＣＤＡ−３の活性のマージンはインビトロで匹敵するものであるが、ＡＤＣはインビボで試験したときに分かれ始める。単回投与または反復投与後の各ＡＤＣの忍容性は、前臨床マウスのがんモデルにおいて同等であるが、抗腫瘍活性は、対応するアイソタイプ対照ＡＤＣと比較してさらに顕著である。さらに、５Ｆ９−ＣＤＡ−３の抗腫瘍活性は、５Ｆ９−ＣＤＡ−２について観察されたものより一貫してさらに耐久性がある。これは分画投与及び／または単回投与後の図３〜６に示されている。図８に示すＰＫデータは、非区画分析を用いて計算された。注目すべきことに、５Ｆ９−ＣＤＡ−３は、５Ｆ９−ＣＤＡ−１または５Ｆ９−ＣＤＡ−２のいずれよりも遅いクリアランス（ＣＬ）を示した。この差は、曲線下面積（ＡＵＣ）値に反映されるように、経時的に５Ｆ９−ＣＤＡ−３コンジュゲートの曝露をより大きくした。この観察と一致して、５Ｆ９−ＣＤＡ−３の単回投与後のＰＤバイオマーカーｐＣＨＫ−１及びｐｇ−Ｈ２ＡＸの最も堅調な活性化も観察された。
【図１−１】
2019511462.tif 000060
【図１−２】
2019511462.tif 000061
【図２Ａ】
2019511462.tif 000062
【図２Ｂ】
2019511462.tif 000063
【図２Ｃ】
2019511462.tif 000064
【図３Ａ】
2019511462.tif 000065
【図３Ｂ】
2019511462.tif 000066
【図３Ｃ】
2019511462.tif 000067
【図４Ａ】
2019511462.tif 000068
【図４Ｂ】
2019511462.tif 000069
【図４Ｃ】
2019511462.tif 000070
【図４Ｄ】
2019511462.tif 000071
【図４Ｅ】
2019511462.tif 000072
【図４Ｆ】
2019511462.tif 000073
【図５Ａ】
2019511462.tif 000074
【図５Ｂ】
2019511462.tif 000075
【図５Ｃ】
2019511462.tif 000076
【図６Ａ】
2019511462.tif 000077
【図６Ｂ】
2019511462.tif 000078
【図７−１】
2019511462.tif 000079
【図７−２】
2019511462.tif 000080
【図８】
2019511462.tif 000081
【図９Ａ】
2019511462.tif 000082
【図９Ｂ】
2019511462.tif 000083
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月7日(2018.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体−薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩であり：
【化３１】
2019511462.tif 000084
であって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５及び配列番号６のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体にコンジュゲートされたＣＤＡ−３ＡまたはＣＤＡ−３Ｂを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩であって：
【化３２−１】
2019511462.tif 000085
【化３２−２】
2019511462.tif 000086
式中、Ｍは、−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオンであり；かつ式中
【化３３】
2019511462.tif 000087
は抗体である。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４】
前記重鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項５】
薬物：抗体比（ＤＡＲ）が約１〜約８の範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項６】
前記ＤＡＲが約１〜約４の範囲である、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項７】
前記ＤＡＲが約２〜約３の範囲である、請求項５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、対象における胃腸起源のがんの対象を処置するための組成物。
【請求項９】
前記胃腸起源の癌が、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃食道癌、胃癌及び食道癌から選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記結腸直腸癌が、結腸直腸腺癌、結腸直腸平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、結腸直腸黒色腫、及び結腸直腸神経内分泌腫瘍から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記胃癌が、胃腺癌、胃リンパ腫、胃肉腫及びそれらの転移から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記癌が、扁平上皮癌及び前記食道の腺癌から選択される食道癌である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、膵臓癌の対象を処置するための組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、ＧＣＣ発現腫瘍の増殖を低減または阻害するための組成物。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、ＧＣＣ発現癌に罹患している対象における転移性病変の数または大きさを減少させるための組成物。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む、ＧＣＣ発現癌に罹患している対象における腫瘍負荷を低減させるための組成物。
【請求項１７】
ＧＣＣ発現癌に罹患している対象の生存時間を延長するか、及び／または生活の質を維持もしくは改善するための組成物であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２中で製剤化される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、５０ｍＭヒスチジン、６．７％スクロース、０．１％ポリソルベート−８０、５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ５．５中で製剤化される、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５及び配列番号６のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と、
【化３４−１】
2019511462.tif 000088
【化３４−２】
2019511462.tif 000089
またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される細胞傷害性薬剤とを反応させるステップを包含する、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法。  
【請求項２２】
前記反応が、７５ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．０、及びジメチルアセトアミドの混合物中で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応が、１３０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．７及びジメチルアセトアミドの混合物中で行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ジメチルアセトアミドの量が１〜２５容積％である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
ジメチルアセトアミドの量が５〜２０容積％である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記反応が１６〜３０℃で行われる、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応が２２〜２５℃で行われる、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
精製の前に、反応を１５０ｍＭ塩酸ヒスチジン及び７５０ｍＭ  ＥＰＰＳでクエンチする、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
精製の前に前記反応を７５０ｍＭ  ＥＰＰＳでクエンチする、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体−薬物コンジュゲートを精製することをさらに包含する、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、クロマトグラフィーカラムを使用して精製される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体−薬物コンジュゲートが、濾過に続いて接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて精製される、請求項３０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本発明のさらなる局面は、ＧＣＣ抗原を発現する腫瘍細胞に抗癌療法を標的化する方法、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによって腫瘍の増殖を阻害する方法、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによって腫瘍のサイズを縮小する方法、及び本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与することによってＧＣＣの発現を特徴とするがんを処置する方法を包含する。いくつかの実施形態では、処置する腫瘍／がんとは、胃腸系のがん（例えば、結腸直腸癌、食道癌、または胃癌）である。いくつかの実施形態では、処置する腫瘍／がんとは、膵臓癌である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
抗体−薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩であり：
【化３１】
2019511462.tif 000090
であって、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５及び配列番号６のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体にコンジュゲートされたＣＤＡ−３ＡまたはＣＤＡ−３Ｂを含む、抗体−薬物コンジュゲート。
（項目２）
項目１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩であって：
【化３２−１】
2019511462.tif 000091
【化３２−２】
2019511462.tif 000092
式中、Ｍは、−Ｈまたは薬学的に許容される陽イオンであり；かつ式中
【化３３】
2019511462.tif 000093
は抗体である。
（項目３）
前記重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、項目１または項目２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
（項目４）
前記重鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が配列番号１０のアミノ酸配列を含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
（項目５）
前記薬物：抗体比（ＤＡＲ）が約１〜約８の範囲である、項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
（項目６）
前記ＤＡＲが約１〜約４の範囲である、項目５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
（項目７）
前記ＤＡＲが約２〜約３の範囲である、項目５に記載の抗体−薬物コンジュゲート。
（項目８）
項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与するステップを包含する、対象における胃腸起源のがんの対象を処置する方法。
（項目９）
前記胃腸起源の癌が、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃食道癌、胃癌及び食道癌から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記結腸直腸癌が、結腸直腸腺癌、結腸直腸平滑筋肉腫、結腸直腸リンパ腫、結腸直腸黒色腫、及び結腸直腸神経内分泌腫瘍から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記胃癌が、胃腺癌、胃リンパ腫、胃肉腫及びそれらの転移から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記癌が、扁平上皮癌及び前記食道の腺癌から選択される食道癌である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与するステップを包含する、膵臓癌の対象を処置する方法。
（項目１４）
項目１〜７のいずれか１項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを包含する、ＧＣＣ発現腫瘍の増殖を低減または阻害する方法。
（項目１５）
項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを包含する、ＧＣＣ発現癌に罹患している対象における転移性病変の数または大きさを減少させる方法。
（項目１６）
項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを包含する、ＧＣＣ発現癌に罹患している対象における腫瘍負荷を低減させる方法。
（項目１７）
ＧＣＣ発現癌に罹患している対象の生存時間を延長するか、及び／または生活の質を維持もしくは改善する方法であって、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの治療上有効な量を投与することを含む包含する方法。
（項目１８）
項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目１９）
前記抗体−薬物コンジュゲートが、１０ｍＭヒスチジン、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８．５％スクロース、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ６．２中で製剤化される、項目１８に記載の医薬組成物。
（項目２０）
前記抗体−薬物コンジュゲートが、５０ｍＭヒスチジン、６．７％スクロース、０．１％ポリソルベート−８０、５０μＭ亜硫酸水素ナトリウム、ｐＨ５．５中で製剤化される、項目１８に記載の医薬組成物。
（項目２１）
配列番号１、配列番号２及び配列番号３のＣＤＲアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、ならびに配列番号４、配列番号５及び配列番号６のＣＤＲアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と、
【化３４−１】
2019511462.tif 000094
【化３４−２】
2019511462.tif 000095
またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される細胞傷害性薬剤とを反応させるステップを包含する、抗体−薬物コンジュゲートを調製する方法。  
（項目２２）
前記反応が、７５ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．０、及びジメチルアセトアミドの混合物中で行われる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記反応が、１３０ｍＭ  ＥＰＰＳ緩衝液、ｐＨ８．７及びジメチルアセトアミドの混合物中で行われる、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ジメチルアセトアミドの量が１〜２５容積％である、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２５）
ジメチルアセトアミドの量が５〜２０容積％である、項目２２または２３に記載の方法。
（項目２６）
前記反応が１６〜３０℃で行われる、項目２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記反応が２２〜２５℃で行われる、項目２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
精製の前に、反応を１５０ｍＭ塩酸ヒスチジン及び７５０ｍＭ  ＥＰＰＳでクエンチする、項目２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
精製の前に前記反応を７５０ｍＭ  ＥＰＰＳでクエンチする、項目２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記抗体−薬物コンジュゲートを精製することをさらに包含する、項目２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記抗体−薬物コンジュゲートが、クロマトグラフィーカラムを使用して精製される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記抗体−薬物コンジュゲートが、濾過に続いて接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて精製される、項目３０に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511462000001.app
【国際調査報告】
2019511462.tif 000096
2019511462.tif 000097
2019511462.tif 000098