【手続補正書】
【提出日】令和3年11月18日(2021.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
【表４】
2021508496.tif 000001
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
クルイベロマイセス・ラクティス(K.ラクティス)株の酵母ゲノム内へ、異種抗原をコードする核酸の標的クローニングをするための該ラクティス株であって、KlLAC4遺伝子座の代わりに又は追加して、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び／若しくはKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを有することを特徴とする、前記K.ラクティス株。
（態様２）
前記発現カセットは、K.ラクティスLAC4-12プロモーター(PLAC4-12)又は該プロモーターの変種であってLAC12及びLAC4の間の遺伝子間領域も含むもの、前記抗原をコードする領域、及びAgTEF1ターミネーターを有することを特徴とする、態様１記載のK.ラクティス株。
（態様３）
異種抗原をコードする核酸の複数のコピーが、得られるK.ラクティス株のKlLAC4遺伝子座、若しくはKlURA3-20遺伝子座、若しくはKlMET5-1遺伝子座に、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して挿入されていることを特徴とする、態様１又は２記載のK.ラクティス株。
（態様４）
前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に、タンデム発現カセットの形で存在することを特徴とする、態様１〜３いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様５）
異なる異種抗原をコードする核酸の１以上のコピーが、KlLAC4遺伝子座、及び／若しくは、KlURA3-20遺伝子座、及び／若しくは、KlMET5-1遺伝子座に、シングル発現カセット、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して挿入されていることを特徴とする、態様１〜３いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様６）
異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))及びインフルエンザA M1(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))をコードする遺伝子が、前記K.ラクティス株のKlLAC4及びKlURA3-20遺伝子座に挿入されて、発現することを特徴とする、態様１〜３及び５いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様７）
前記K.ラクティス株は、前記ゲノム本来のKIGAL4遺伝子に加えて、追加で該KIGAL4遺伝子の第二の異所性コピーを含むことを特徴とする、態様１〜6いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様８）
前記KIGAL4遺伝子の異所性コピーは、KIGAL4プロモーター及びKIGAL4ターミネーターに隣接し、前記K.ラクティス株内の遺伝子座KLLA0E13795g(Klavt3::KlGAL4-1、配列番号:1)で組み込まれることを特徴とする、態様7記載のK.ラクティス株。
（態様９）
前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子は、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在することを特徴とする、態様１〜8いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様１０）
前記K.ラクティス株は、非誘導条件下では異種タンパク質をわずかに又は全く発現しない、LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有する、態様１〜9いずれか１項記載のK.ラクティス株であって、-1065及び-1540の間のプロモーターPLAC4-12の基本制御領域(BCR)(LR2欠損；PLAC4-12-LR2’；配列番号:2)は削除されていることを特徴とする、前記K.ラクティス株。
（態様１１）
前記異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在することを特徴とする、態様１０記載のK.ラクティス株。
（態様１２）
異種タンパク質発現の調節を可能にする、前記LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有する前記K.ラクティス株であって、該プロモーターのアクチベーターKlGal4(「上流活性化配列」1、2及び4、5)のための結合部位数が変動し、1、2、3又は4個のKlGal4結合部位が存在することを特徴とする、態様１〜１１いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様１３）
前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4で挿入されることを特徴とする、態様１〜１２いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様１４）
前記対立遺伝子Kllac4、Klura3-20及びKlmet5-1の遺伝子機能が回復され、前記K.ラクティス株は原栄養性であることを特徴とする、態様１〜１３いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様１５）
前記異種抗原BVDV E2外部ドメイン(1型、CP7)、BVDV E2外部ドメイン(2型、ニューヨーク93)及びBVDV Npro-NS3(1型、CP7)の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4、KlURA3-20、及びKlMet5-1に挿入されることを特徴とする、態様１〜１４いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様１６）
下記株から選択される、K.ラクティス株:
VAK952(受託番号:DSM32705)、
VAK1111(受託番号:DSM32696)、
VAK1118(受託番号:DSM32701)、
VAK1131(受託番号:DSM32700)、
VAK1171(受託番号:DSM32699)、
VAK1243(受託番号:DSM32702)、
VAK1283(受託番号:DSM32697)、
VAK1395(受託番号:DSM32706)、及び
VAK1400(受託番号:DSM32698)。
（態様１７）
KIpURA3(配列番号:3)又はKIpMET5(配列番号:4)から選択される、組み込み型発現ベクター。
（態様１８）
KIpMET5-PL4-12-Et、KIpMET5-PL4-12-LR2-Et、KIpMET5-PL4-Et、KIpMET5-PL4-LR2-Etから、並びにKIpURA3-PL4-12-Et、KIpURA3-PL4-12-LR2-Et、KIpURA3-PL4-Et及びKIpURA3-PL4-LR2-Et(配列番号:5、6、7又は8と組み合わされた配列番号No.3、4) から選択される、組み込み型発現ベクター。
（態様１９）
態様１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株を作製する方法であって、下記ステップ:
(i)目的とする抗原の遺伝子配列をKIpURA3ベクター及び／又はKIpMET5ベクター内に挿入するステップ、
(ii)K.ラクティス培養体を、改変され、かつ予め酵素的に消化されたベクター構築物で形質転換するステップ、
(iii)ウラシル及び／又はメチオニンを含まない固形培地を利用して、形質転換したK.ラクティス細胞を選択するステップ、並びに
(iv)任意で原栄養性を回復するステップ、
を含む、前記方法。
（態様２０）
前記複数の抗原の遺伝子配列が、異所的に同時に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、態様１９記載の方法。
（態様２１）
１の病原体の異なる複数の変種の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、態様２０記載の方法。
（態様２２）
異なる複数の病原体の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、態様２０記載の方法。
（態様２３）
態様１〜１６いずれか１項記載のK.ラクティス株を含む、医薬組成物。
（態様２４）
ワクチン接種に使用するための、態様１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様２５）
予防ワクチン接種に使用するための、態様１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株。
（態様２６）
態様１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株を、対象へ、該対象内で１以上の異種抗原に対する防御的免疫応答を引き起こすために充分な量で投与することを含む、ワクチン接種方法。
（態様２７）
前記K.ラクティス株は、皮下、筋肉内、又は、口／粘膜を通して投与されることを特徴とする、態様２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は態様２６記載の方法。
（態様２８）
前記K.ラクティス株は、病原体に対する防御的免疫応答を、１回適用／免疫化（「単回接種」）又は２回適用／免疫化（「プライムブースト」）で引き起こすことを特徴とする、態様２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は態様２６若しくは２７記載の方法。
（態様２９）
前記K.ラクティス株は、１の病原体の異なる複数の変種に対する交差防御的免疫応答を、１回使用／免疫化(「単回接種」)又は２回適用／免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、態様２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は態様２６若しくは２７記載の方法。
（態様３０）
前記K.ラクティス株は、異なる複数の病原体に対する防御的免疫応答を、１回使用／免疫化(「単回接種」)又は２回適用／免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、態様２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は態様２６若しくは２７記載の方法。