(57)【要約】  定量的RT-PCRを使ってDLBCLサブタイプを分類するための方法および組成物が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
びまん性大細胞型リンパ腫（DLBCL）を有する個体を同定する方法であって、
(a) 個体からサンプルを取り（DLBCLサンプル）；
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；そして
(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子の発現をqRT-PCRにより検出する
ことを含み、ここで
(i) GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比が前記個体のサンプル中のGCB閾値よりも高いことが、R-CHOP（リツキシマブまたはエトポシド；シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；およびプレドニソロン）の投与に対する前記個体の感受性を示し；または
(ii) ABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比が前記個体のサンプル中のABC閾値よりも高いことが、代替投与に対する前記個体の感受性を示す
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記(b)および／または(c)が
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカーZNF318、PTK2およびSSBP2の発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカーCCND2、FOXP1およびJADE3の発現をqRT-PCRにより検出する
ことにより実施されることを特徴とする、前記ステップ(a)〜(d)を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記GCB閾値が、GCB陽性対照におけるGCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比に基づいて設定される、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記ABC閾値が、ABC陽性対照におけるABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比に基づいて設定される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが肺生検または気管支肺胞洗浄細胞からのものである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが血液、血漿または血清である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記(b)および(c)の検出が多容器中での多重方式で実施される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
各GCBマーカーおよびABCマーカーが個別に検出される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記(b)の検出が各サンプルについて単一容器中で実施される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記(c)の検出が各サンプルについて単一容器中で実施される、請求項１〜８および１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記(d)の検出が、(b)および(c)の検出と同じ１または複数の容器中で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記代替投与がBTK阻害剤、SYK阻害剤、NFκB阻害剤または免疫活性調節剤を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記代替投与がR-CHOPを更に含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ(b)および(c)において各遺伝子について検出された発現レベルを、(d)において対照遺伝子の検出された発現レベルに基づいて調整することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
びまん性大細胞型リンパ腫（DLBCL）を有する個体について起始細胞（COO）サブタイプを決定する方法であって、
(a) 個体からサンプルを取り（DLBCLサンプル）；
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；
(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子の発現をqRT-PCRにより検出し；そして
(e) 個体のCOOサブタイプが
(i) GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比がGCB閾値よりも高い場合はGCB、または
(ii) ABCマーカー発現対GCB発現の比がABC閾値よりも高い場合はABC
であることを決定する
ことを含む方法。
【請求項１７】
前記ステップ(b)および／または(c)が
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカーZNF318、PTK2およびSSBP2の発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカーCCND2、FOXP1およびJADE3の発現をqRT-PCRにより検出する
ことにより実施されることを特徴とする、前記ステップ(a)〜(d)を含む請求項６記載の方法。
【請求項１８】
前記GCB閾値が、GCB陽性対照におけるGCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比に基づいて設定される、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記ABC閾値が、ABC陽性対照におけるABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比に基づいて設定される、請求項１６〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが肺生検または気管支肺胞洗浄細胞からのものである、請求項１６〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）である、請求項１６〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが血液、血漿または血清である、請求項１６〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記(b)および(c)の検出が多容器中で多重方式で実施される、請求項１６〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
各GCBマーカーおよびABCマーカーが個別に検出される、請求項１６〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記(b)の検出が各サンプルについて単一容器中で実施される、請求項１６〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記(c)の検出が各サンプルについて単一容器中で実施される、請求項１６〜２３および２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記(d)の検出が(b)および(c)の検出と同一容器中で実施される、請求項１６〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ(b)および(c)において各遺伝子について検出された発現レベルを、(d)において対照遺伝子の検出された発現レベルに基づいて調整することを含む、請求項１６〜２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
(a) 胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMP遺伝子産物の各々または胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PTK2およびSSBP2遺伝子産物の各々を特異的に増幅し検出する、プライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む混合物；および
(b) 活性化Ｂ細胞（ABC）マーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46C遺伝子産物の各々または活性化Ｂ細胞(ABC)マーカーCCND2、FOXP1およびJADE3遺伝子産物の各々を特異的に増幅し検出する、プライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む混合物
を含んでなるキット。
【請求項３０】
前記(a)または(b)の混合物が、対照遺伝子産物を特異的に増幅し検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを更に含み、ここで前記対照遺伝子産物を特異的に検出する蛍光標識されたプローブが、混合物(a)または混合物(b)中の蛍光標識されたプローブとは異なるように標識されていることを特徴とする、請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
前記混合物(a)中の蛍光標識されたプローブが全て同一の蛍光標識により標識されている、請求項２９または３０記載のキット。
【請求項３２】
前記混合物(b)中の蛍光標識されたプローブが全て同一の蛍光標識により標識されている、請求項２９〜３１のいずれか一項記載のキット。
【請求項３３】
逆転写酵素および／または耐熱性DNAポリメラーゼを更に含む、請求項２９〜３２のいずれか一項記載のキット。
【請求項３４】
逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を更に含む、請求項２９〜３３のいずれか一項記載のキット。
【請求項３５】
少なくとも１つの対照サンプルを更に含む、請求項２９〜３４のいずれか一項記載のキット。
【請求項３６】
GCBマーカーZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMP遺伝子産物の各々；ABCマーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46C遺伝子産物の各々；および対照遺伝子産物、を特異的に増幅し個別に検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む複数の混合物を含んでなるキットであって、前記対照遺伝子産物を特異的に増幅し個別に検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブが、前記複数の混合物の各々の中に存在することを特徴とするキット。
【請求項３７】
前記キットが３〜15混合物を含む、請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
前記キットが５混合物を含む、請求項３６または３７記載のキット。
【請求項３９】
前記キットが、下表記載のようなGCBマーカーとABCマーカーに特異的なプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを有する５混合物を含む、請求項３６〜３８のいずれか一項記載のキット。
【表１】
2019518422.tif 000020
【請求項４０】
逆転写酵素および／または耐熱性DNAポリメラーゼを更に含む、請求項３６〜３９のいずれか一項記載のキット。
【請求項４１】
逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を更に含む、請求項３６〜４０のいずれか一項記載のキット。
【請求項４２】
少なくとも１つの対照サンプルを更に含む、請求項３６〜４１のいずれか一項記載のキット。
【請求項４３】
GCB陽性対照とABC陽性対照を含む、請求項３６〜４２のいずれか一項記載のキット。
【請求項４４】
陰性対照を含む、請求項３６〜４３のいずれか一項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）は全非ホジキンリンパ腫の30〜35％を占めている。DLBCLは生物学的に侵攻性であるが、症例の＞50％は治癒することができる。しかしながら、1/3以下の患者に耐性が生じ、治療不応性である。標準的治療法は化学療法CHOPまたは化学療法＋リツキシマブRituximab（R-CHOP）である。DLBCLは３種の異なる起始細胞(COO）サブタイプに分類される：胚中心Ｂ細胞（GCB）、活性化Ｂ細胞（ABC）および縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（PMBCL）。リンパ腫／白血病分子プロファイリングプロジェクトによるレトロスペクティブ分析の結果、R-CHOPで治療するとGCBサブタイプを有するDLBCL患者がABCサブタイプの患者よりも良好な予後を生じると実証され、ABCサブタイプの予後を改善するための薬剤候補が現在開発中である。
【背景技術】
【０００２】
GCBサブタイプとABCサブタイプを識別する現行法には、免疫組織化学法（IHC）や遺伝子発現プロファイリングがある。IHCや遺伝子発現プロファイリング技術は時間を要し、サブタイプ分類には追加の欠点がある。例えば、遺伝子発現技術は凍結サンプルを使用し、臨床研究室において一般的に収集されるホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織（FFPET）検体を使用しない。Nanostring Technologies社（米国ワシントン州Seattle）は、FFPETサンプルを使ってDLBCLサブタイプを分類する遺伝子発現プロファイリングシグネチャーを開発したが、Nanostringプラットフォームは市場には広く採用されておらず、高価でもある。IHC法もFFPETサンプルを使用するが、実験室間で大きなアッセイ変動を示す。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）サブタイプを決定し、DLBCL患者を治療するための方法および組成物を提供する。びまん性大細胞型リンパ腫（DLBCL）サブタイプを決定しそしてDLBCL患者を治療するための方法および組成物が提供される。ある態様では、DLBCLを有する個体を同定する方法であって、(a) 個体からサンプルを取り（DLBCLサンプル）；(b) DLBCLサンプル中のGCBマーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6および／またはLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；(c) DLBCLサンプルと対照サンプル中のABCマーカー ARID3A、CCND2、 FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4および／またはFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；そして(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子（例えば内部標準）の発現をqRT-PCRにより検出することを含み、ここでGCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比が前記個体のサンプル中のGCB閾値よりも高いことが、R-CHOP（リツキシマブまたはエトポシド；シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；およびプレドニソロン）の投与に対する前記個体の感受性を示すことを特徴とする方法を提供する。ある態様は、ABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比が前記個体のサンプル中のABC閾値よりも高い場合、別の代替投与に対する個体の感受性を示す。ある態様では、該方法は、(d)において検出された対照遺伝子の発現に基づいてステップ(b)と(c)において各遺伝子の検出された発現レベルを調整することを更に含む。ある態様では、投与が患者に直接供される。
【０００４】
ある態様では、DLBCLを有する個体に治療を施す方法であって、(a) 個体からサンプルを採取し（DLBCLサンプル）；(b) DLBCLサンプル中のGCBマーカーZNF318, PDK3, HMGN1, PTK2, SSBP2, BCL6および／またはLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；(c) DLBCLサンプルと対照サンプル中のABCマーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4および／またはFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子（例えば内部標準）の発現をqRT-PCRにより検出し；そして(e) 個体に治療を施すことを含む方法を提供する。ある態様では、該治療は、GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比がGCB閾値よりも高い場合にR-CHOP（リツキシマブまたはエトポシド；シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；およびプレドニソロン）の投与を含む。ある態様では、該治療は、ABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比がABC閾値よりも高い場合に代替療法を含む。ある態様では、該方法は(d)において検出された対照遺伝子の発現に基づいてステップ(b)および(c)における検出された各遺伝子の発現レベルを調整することを更に含む。ある態様では、該治療は患者に直接施される。
【０００５】
ある態様では、１，２，３，４，５または６つのGCBマーカーがステップ(b)において任意の組み合わせで検出される。ある態様では、７つのGCBマーカー全てがステップ(b)において検出される。ある態様では、１，２，３，４，５，６または７つのABCマーカーがステップ(c)において任意の組み合わせで検出される。ある態様では、８つのABCマーカー全てがステップ(c)において検出される。ある態様では、ステップ(b)がZNF318、SSBP2およびPTK2の発現を検出することを含む。ある態様では、ステップ(c)がCCND2、FOXP1およびJADE3の発現を検出することを含む。
【０００６】
ある態様では、該方法が、GCB陽性対照に対してステップ(b)〜(d)を実施し、その結果をGCB閾値を設定するのに使用することを含む。ある態様では、GCB陽性対照が50〜100％の既知GCBサンプル、例えば55〜85％、55〜65％、60〜70％の既知GCBサンプルを含む。ある態様では、その残りのGCB陽性対照が既知ABCサンプルから構成される。ある態様では、該方法が、ABC陽性対照に対してステップ(b)〜(d)を実施し、その結果をABC閾値を設定するのに使用することを含む。ある態様では、ABC陽性対照が51〜100％の既知ABCサンプル、例えば55〜85％、55〜65％、60〜70％の既知ABCサンプルを含む。ある態様では、残りのABC陽性対照が既知GCBサンプルから構成される。ある態様では、該方法が陰性対照サンプル、例えば核酸不含有のサンプル、非癌性サンプル、またはABCおよびGCBマーカー核酸を実質的に含まないサンプルについて、ステップ(b)〜(d)を実施することをさらに含む。
【０００７】
ある態様では、サンプルが肺生検（例えば腫瘍組織）または気管支肺胞洗浄細胞からのものである。ある態様では、サンプルが、例えば、肺の中の腫瘍または転移した腫瘍サンプルからの、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）である。ある態様では、サンプルは血液、血漿、血清、尿、粘液、粘膜組織または唾液である。
【０００８】
ある態様では、(b)または(c)の検出が多容器において多重（マルチプレックス）に実施される。例えば、(b)の検出が１〜６容器中で実施され、GCBマーカーの各々が各GCBマーカープローブ上に異なる標識を使って、または２以上のGCBマーカープローブ上に同じ標識を使って検出される。同様に、(c)の検出が１〜７容器中で実施され、ABCマーカーの各々が各ABCマーカープローブ上に異なる標識を使って、または２以上のGCBマーカープローブ上に同じ標識を使って検出される。ある態様では、各GCBマーカーとABCマーカーが個別に検出される。ある態様では、(b)の検出が各サンプルについて１個の容器の中で実施される。別の態様では、(c)の検出が各サンプルについて１個の容器の中で実施される。ある態様では、(d)の検出が(b)および(c)の検出と同一の容器の中で実施される。
【０００９】
ある態様では、代替投与または療法がBTK阻害剤、SYK阻害剤、NFκB阻害剤、または免疫活性調節剤を含む。ある態様では、代替投与または療法が単独でのまたはBTK阻害剤、SYK阻害剤、NFκB阻害剤もしくは免疫活性調節剤と併用したR-CHOPを含む。
【００１０】
更に、DLBCLを有する個体について起始細胞（COO）サブタイプを決定する方法であって、(a) 個体からサンプルを取り（DLBCLサンプル）；(b) DLBCLサンプル中のGCBマーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6および／またはLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；(c) DLBCLサンプル中のABCマーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4および／またはFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子の発現をqRT-PCRにより検出し；そして(e) 個体のCOOサブタイプが(i)GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比がGCB閾値よりも高い場合は胚中心Ｂ細胞（GCB）であり、または(ii) ABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比がABC閾値よりも高い場合に活性化Ｂ細胞（ABC）であることを決定することを含む方法が提供される。ある場合には、該方法がステップ(d)において検出された対照遺伝子の発現に基づいて、ステップ(b)および(c)にて各遺伝子について検出された発現レベルを調整することを更に含む。
【００１１】
ある態様では、１，２，３，４，５または６つのGCBマーカーがステップ(b)において任意の組み合わせで検出される。ある態様では、７つのGCBマーカー全てがステップ(b)において検出される。ある態様では、１，２，３，４，５，６または７つのABCマーカーがステップ(c)において任意の組み合わせで検出される。ある態様では、８つのABCマーカー全てがステップ(c)において検出される。ある態様では、ステップ(b)がZNF318、SSBP2およびPTK2の発現を検出することを含む。ある態様では、ステップ(c)がCCND2、FOXP1およびJADE3の発現を検出することを含む。
【００１２】
ある態様では、該方法がGCB陽性対照に対してステップ(b)〜(d)を実施し、その結果をGCB閾値を設定するのに使用することを含む。ある態様では、GCB陽性対照が51〜100％の既知GCBサンプル、例えば55〜85％、55〜65％、60〜70％の既知GCBサンプルを含む。ある態様では、その残りのGCB陽性対照が既知ABCサンプルから構成される。ある態様では、該方法がABC陽性対照に対してステップ(b)〜(d)を実施し、その結果をABC閾値を設定するのに使用することを含む。ある態様では、ABC陽性対照が51〜100％の既知ABCサンプル、例えば55〜85％、55〜65％、60〜70％の既知ABCサンプルを含む。ある態様では、その残りのABC陽性対照が既知GCBサンプルから構成される。ある態様では、該方法が陰性対照サンプルについて、ステップ(b)〜(d)を実施することをさらに含む。
【００１３】
ある態様では、サンプルが肺生検（例えば腫瘍組織）または気管支肺胞洗浄細胞からのものである。ある態様では、サンプルが、例えば、肺の中の腫瘍または転移した腫瘍サンプルからの、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）である。ある態様では、サンプルは血液、血漿、血清、尿、粘液、粘膜組織または唾液である。
【００１４】
ある態様では、(b)および(c)の検出が多容器において多重（マルチプレックス）に実施される。例えば、(b)の検出が１〜６容器中で実施され、GCBマーカーの各々が各GCBマーカープローブごとに異なる標識を使って、または２以上のGCBマーカープローブ上に同じ標識を使って検出される。同様に、(c)の検出が１〜７容器中で実施され、ABCマーカーの各々が各ABCマーカープローブごとに異なる標識を使って検出され、または２以上のABCマーカープローブ上に同じ標識を使って検出される。ある態様では、各GCBマーカーおよびABCマーカーが個別に検出される。ある態様では、(b)の検出が各サンプルについて１個の容器の中で実施される。別の態様では、(c)の検出が各サンプルについて１個の容器の中で実施される。ある態様では、(d)の検出が(b)および(c)の検出と同一の容器（１または複数）の中で実施される。
【００１５】
ある態様では、該方法がCOOサブタイプに依存して個体に治療を施すことをさらに含む。
【００１６】
さらに本発明は、DLBCLを有する個体のCOOサブタイプを決定するためのキットを提供する。ある態様では、該キットが(a) GCBマーカーZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMP遺伝子産物の少なくとも１つ（例えば２，３，４，５，６または７つ全部）を特異的に増幅し検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む混合物；および(b) ABCマーカーARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46C遺伝子産物の少なくとも１つ（例えば２，３，４，５，６，７または８つ全部）を特異的に増幅し検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む混合物を含んでなる。ある態様では、該キットは全７つのGCBマーカーと全８つのABCマーカーを特異的に増幅し検出するプライマーセットとプローブとを含む。ある態様では、混合物(a)が ZNF318、SSBP2およびPTK2を特異的に増幅し検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む。ある態様では、混合物(b)がCCND2、FOXP1およびJADE3を特異的に増幅して検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む。ある態様では、混合物(a)および(b)の各々が、対照遺伝子産物を特異的に増幅し検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを更に含み、ここで前記対照遺伝子産物を特異的に検出する蛍光標識されたプローブが、混合物(a)および混合物(b)の中の蛍光標識されたプローブとは異なるように標識されている。ある態様では、混合物(a)の中の蛍光標識されたプローブが全て同じ蛍光標識で標識されている。ある態様では、混合物(b)の中の蛍光標識されたプローブが全て同じ蛍光標識で標識されている。
【００１７】
ある態様では、該キットは、(i) GCBマーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMP遺伝子産物の各々；(ii) ABCマーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46C遺伝子産物の各々；および(iii) 対照遺伝子産物を特異的に増幅し個別に検出するプライマーセットと蛍光標識プローブとを含み、ここで前記対照遺伝子産物を特異的に増幅し個別に検出するプライマーセットと蛍光標識プローブが、複数の混合物の各々の中に存在する。ある態様では、該キットが、ZNF318、PDK2およびSSBP2の各々；(ii) CCND2、FOXP1およびJADE3の各々；および(iii) 対照遺伝子産物、を特異的に増幅し個別に検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含み、ここで前記対照遺伝子産物を特異的に増幅し個別に検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブが、複数の混合物の各々の中に提供される。
【００１８】
ある態様では、該キットは、逆転写酵素および／または耐熱性DNAポリメラーゼを更に含む。ある態様では、該キットは逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性を有する酵素を更に含む。ある態様では、該キットは、本明細書中に記載の少なくとも１つの対照サンプル、例えばABC陽性対照および／またはGCB陽性対照を更に含む。ある態様では、該キットは陰性対照（例えば非癌性サンプル）を更に含む。
【００１９】
ある態様では、ZNF318を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号193〜208から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてZNF318を個別に検出するプローブの配列が配列番号302〜304から選択される。ある態様では、ZNF318を個別に検出するプローブの配列が配列番号304である。ある態様では、PDK3を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号177〜192から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてPDK3を個別に検出するプローブの配列が配列番号299〜301から選択される。ある態様では、PDK3を個別に検出するプローブの配列が配列番号300である。ある態様では、HMGN1を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号209〜220から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてHMGN1を個別に検出するプローブの配列が配列番号305〜307から選択される。ある態様では、HMGN1を個別に検出するプローブの配列が配列番号305である。ある態様では、PTK2を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号１〜24から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてPTK2を個別に検出するプローブの配列が配列番号253〜258から選択される。ある態様では、PTK2を個別に検出するプローブの配列が配列番号253である。ある態様では、SSBP2を特異的に増幅するプライマーセットが配列番号161〜176から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、SSBP2を個別に検出するプローブの配列が配列番号297および298から選択される。ある態様では、SSBP2を特異的に検出するプローブの配列が配列番号297である。ある態様では、BCL6を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号49〜64から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてBCL6を個別に検出するプローブが配列番号266〜268から選択される。ある態様では、BCL6を個別に検出するプローブの配列が配列番号266である。ある態様では、LRMPを特異的に増幅するプライマーセットが配列番号25〜48から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてLRMPを個別に検出するプローブの配列が配列番号259〜265から選択される。ある態様では、LRMPを個別に検出するプローブの配列が配列番号262である。ある態様では、ARIDA3Aを特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号81〜96から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてARIDA3Aを個別に検出するプローブの配列が配列番号276〜280から選択される。ある態様では、ARIDA3Aを個別に検出するプローブの配列が配列番号279である。ある態様では、CCND2を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号97〜112から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてCCND2を個別に検出するプローブの配列が配列番号281〜283から選択される。ある態様では、CCND2を個別に検出するプローブの配列が配列番号281である。ある態様では、FOXP1を特異的に増幅するプライマーセットが配列番号221〜236から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてFOXP1を個別に検出するプローブの配列が配列番号308および309から選択される。ある態様では、FOXP1を個別に検出するプローブの配列が配列番号309である。ある態様では、KIAA0226Lを特異的に増幅するプライマーセットが配列番号237〜252から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてKIAA0226Lを個別に検出するプローブの配列が��列番号310〜314から選択される。ある態様では、KIAA0226Lを個別に検出するプローブの配列が配列番号313である。ある態様では、JADE3を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号145〜160から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてJADE3を個別に検出するプローブの配列が配列番号290〜296から選択される。ある態様では、JADE3を個別に検出するプローブの配列が配列番号292である。ある態様では、PIM2を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号65〜80から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてPIM2を個別に検出するプローブの配列が配列番号269〜275から選択される。ある態様では、PIM2を個別に検出するプローブの配列が配列番号269〜275から選択される。ある態様では、PIM2を個別に検出するプローブの配列が配列番号275である。ある態様では、TCF4を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号129〜144から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてTCF4を個別に検出するプローブの配列が配列番号287〜289から選択される。ある態様では、TCF4を個別に検出するプローブの配列が配列番号287である。ある態様では、FAM46Cを特異的に増幅するプライマーセットが配列番号113〜128から選択された配列を有する正・逆プライマーであり、そしてFAM46Cを個別に検出するプローブの配列が配列番号284〜286から選択される。ある態様では、FAM46Cを個別に検出するプローブの配列が配列番号284である。
【００２０】
発明の詳細な説明
I．序論
びらん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）の起始細胞(COO）サブタイプを決定するための、新規多重リアルタイム定量的逆転写（qRT）-PCR分類子（classifier）が提供される。当該分類子は、qRT-PCR多重反応を利用して16の遺伝子標的（決定群15、対照群１）を定量し、DLBCLのCOOサブタイプを決定する。ある態様では、該アッセイは５チューブqRT-PCRである。DLBCLからのホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）におけるqRT-PCR分類子の実行可能性および精度が下記に示される。
【００２１】
本明細書に記載のアッセイは、実績のある広く適用される技術を基礎とし、正確で、再現性のある、迅速な結果を提供する。
【００２２】
II．定義
用語「多重」とは、複数の（２以上の）標的が検出されるアッセイのことを指す。
用語「容器（receptacle）」、「器（vessel）」、「チューブ」、「ウェル」、「チャンバー」、「マイクロチャンバー」等は、試薬またはアッセイ液を収容できる容器のことを指す。容器がキットの形であり試薬を収容しているか、または増幅反応に使用する予定である場合、汚染や蒸発を防ぐために密閉または密封することができる。容器がアッセイに使用される場合、少なくとも該アッセイの設定の間、開放状態にまたは利用可能にすることができる。
【００２３】
マーカー遺伝子またはマーカー遺伝子産物に言及する時の用語「個別に検出される」または「個別検出」という用語は、各マーカーが１の多重反応において検出されることを示す。すなわち、各マーカーが異なる標識と結合されている（異なるように標識されたプローブにより検出される）。
【００２４】
ほかの方法で標識されない限り、「COO分類子」「サブタイプ分類子」「COOサブタイプシグネチャー」「サブタイプ決定シグネチャー」等の用語は、DLBCL患者の起始細胞サブタイプを分類するのに用いることができる15遺伝子シグネチャーを指すのに用いられる。用語「６遺伝子COO分類子」、「６遺伝子サブタイプ分類子」、「６遺伝子COOサブタイプシグネチャー」、「６遺伝子サブタイプ決定シグネチャー」等の用語は、CCND2、FOXP1、JADE3、ZNF318、SSBP2およびPTK2を包含する分類子を指す。
【００２５】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを指し、天然型（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）、非天然型、および修飾核酸を意味する。この用語は、ポリマーの長さ（例えばモノマーの数）により限定されない。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一般に５′−３′ホスホジエステル結合を含むが、場合によってはヌクレオチド類似体が別の結合を有することがある。モノマーは典型的にはヌクレオチドを指す。用語「非天然ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」とは、修飾された窒素含有塩基、糖またはリン酸基を含むヌクレオチドを指すか、あるいは構造中に非天然の成分を含んでいるヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例としては、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化、アミノ化、脱アミノ化、アルキル化、ベンジル化および蛍光標識されたヌクレオチドが挙げられる。
【００２６】
用語「プライマー」とは、適当な条件下で核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として働く短鎖核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。ポリヌクレオチド合成および増幅反応は、典型的には適当な緩衝液、dNTPsおよび／またはrNTPs、並びに１以上の任意の補因子を含み、適当な温度にて実施される。プライマーは典型的には、標的配列に少なくとも実質的に相補的である（例えば０，１，２または３つのミスマッチを有する）少なくとも１つの標的ハイブリダイズ領域を含む。この領域は、典型的には約８〜約40のヌクレオチド、例えば12〜25ヌクレオチドの長さである。「プライマーセット」とは、標的配列に関して互いに反対方向に向けられ、増幅条件下で増幅生成物を産生する正プライマーと逆プライマーのことを指す。プライマーセットは、例えば対立遺伝子特異的増幅を実施するために、追加の正・逆プライマーを更に含むことができる。
【００２７】
本明細書中で用いるとき、「プローブ」は、特異的に意図された標的生体分子、例えばプローブにハイブリダイズする着目の核酸配列、に選択的に結合することができる任意の分子を意味する。該プローブは少なくとも１つの非ヌクレオチド成分で検出可能に標識される。ある態様では、該プローブはフルオロフォアおよび消光剤（クエンチャー）で標識される。
【００２８】
単語「相補的」または「相補性」は、第二のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成できるポリヌクレオチド中の核酸の能力のことを指す。例えば、配列A-G-T（RNAの場合はA-G-U）は配列T-C-A（RNAの場合はU-C-A）に相補的である。相補性は、塩基対合に従うと一部の核酸のみがマッチする部分的相補性であるか、または塩基対合に従うと全部の核酸がマッチする完全相補性であることができる。プローブまたはプライマーは、それが標的配列に対して少なくとも部分的に相補的であるならば、標的配列に「特異的である」と考えられる。条件に依存して、標的配列に対する相補性の程度は、長い配列の場合よりも、プライマーのような短い核酸のほうが典型的に高い（例えば80％、90％、95％またはそれ以上）。
【００２９】
用語「特異的に増幅する」とは、プライマーセットが統計的に有意なレベルで非標的配列よりも標的配列を増幅することを意味する。用語「特異的に検出する」とは、プローブが統計的に有意なレベルで非標的配列よりも標的配列を検出することを示す。当業者に理解されるように、特異的増幅および検出は、陰性対照（ネガティブコントロール）、例えば試験サンプルと同じ核酸を含むが標的配列を含まないサンプル、または核酸を欠いているサンプルを使って測定することができる。例えば、標的配列を特異的に増幅し検出するプライマーおよびプローブは、バックグラウンド（非標的配列）から容易に識別可能であるCt、例えばバックグラウンドよりも少なくとも２，３，４，５，5〜10、10〜20または10〜30サイクル少ないCtを生じる。
【００３０】
２以上の核酸または２以上のポリペプチドに関連する「一致」または「相同性」という用語は、BLASTまたはBLAST2.0配列比較演算法を使ってデフォルトパラメーターを用いて測定した場合、または手動整列と目視検査により測定した場合、特定の領域に関して同一であるかまたは特定の割合だけ同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸を有する（例えば、比較窓または指定領域に関して最大の一致になるよう比較し整列した時に、約60％一致、例えば少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い一致を有する）、２以上の配列または部分配列を指す。例えばncbi.nml.nih.gov/BLASTのNCBIウエブサイトを参照のこと。そのような配列は「実質的に同一」と言われる。相同性％は最適に整列された配列に関して決定され、その定義を欠失および／または付加を有する配列、並びに置換を有する配列にも適用する。当技術分野で一般に用いられる演算法は、ギャップ等をカウントする。典型的には、長さが少なくとも約８〜25アミノ酸またはヌクレオチドである配列を含む領域に渡り、または長さが50〜100アミノ酸またはヌクレオチドである領域に渡り、またはリファレンス配列の全長に渡り、相同性が存在する。
【００３１】
用語「キット」とは、本明細書に記載のRNAまたはDNAを特異的に増幅、捕捉、標識／変換または検出する、少なくとも１つの試薬、例えば核酸プローブまたはプローブプール等を含む任意の製品（例えばパッケージまたは容器）を指す。
【００３２】
用語「増幅条件」とは、プライマーのハイブリダイゼーションおよび鋳型依存性伸長を可能にする核酸増幅反応（例えばPCR増幅）の条件を指す。用語「アンプリコン」または「増幅生成物」とは、標的核酸配列の全部またはその断片を含み、かつ任意の適当な増幅法による試験管内増幅の生成物として形成される核酸分子を指す。当業者は、正および逆プライマー（プライマー対）が増幅生成物の境界線を限定することを知っているだろう。プライマーに対して用いられる用語「増幅生成物を産生する」とは、適当な条件下（例えばヌクレオチドポリメラーゼとNTPsの存在下）で、プライマーが特定の増幅生成物を産生することを示す。諸種のPCR条件がPCR Strategies (Innis他、1995, Academic Press, San Diego, CA)中の第14章：PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis他、Academic Press, NY, 1990)に記載されている。
【００３３】
用語「増幅生成物」は、増幅反応の生成物を指す。増幅生成物には、ポリヌクレオチド合成の各ラウンドを開始させるのに用いられるプライマーが含まれる。「アンプリコン」は、増幅に指向されるターゲット配列であり、この用語は増幅生成物を指すためにも用いることがある。アンプリコンの５′および３′端の境界は、正および逆プライマーにより限定される。
【００３４】
用語「サンプル」または「生物学的サンプル」とは、核酸を含むまたは含むと推定される任意の組成物を指す。この用語には、細胞、組織または血液、例えばDNA、RNA、タンパク質、無細胞部分または細胞溶解物の精製もしくは分離された成分が含まれる。本明細書に開示されるアッセイの状況では、サンプルは典型的には、例えば腫瘍または転移病巣からのFFPETである。サンプルは凍結または新鮮組織からのであることもでき、または液体サンプル、例えば血液もしくは血液成分（血漿または血清）、尿、精液、唾液、痰、粘液、精液、涙、リンパ液、脳脊髄液、洗口液／咽頭洗浄液、気管支肺胞洗浄液、標本から洗浄したもの（ぬぐい液）等からのであることもできる。サンプルは、個体から得られた細胞（細胞系を含む）の試験管内培養物の構成物または成分を含んでもよい。サンプルは、個体から直接得られたサンプルから部分的に処理されたもの、例えば細胞溶解物または赤血球を枯渇した血液であることもできる。
【００３５】
用語「個体からサンプルを得る」とは、個体からの生物学的サンプルを試験のために用意することを意味する。これは、個体からの直接の取得であることができ、または個体からサンプルを直接取得した第三者からの取得であることができる。
【００３６】
「対照（コントロール）」サンプルまたは数値とは、試験サンプルまたは試験条件に対する比較のための、リファレンス（参照）として（通常は既知のリファレンス）として働く値のことを指す。例えば、試験サンプルは試験条件から、例えば癌の疑いのある個体から、採取し、そして既知の条件、例えば癌のない個体（陰性対照）から、または癌を有することが分かっている個体（陽性対照）からのサンプルと比較することができる。本開示の範囲内では、試験サンプルは典型的にはDLBCL患者からのものである。対照は多数の試験または結果から蓄積された平均値または一領域を表すこともできる。対照は反応条件のために用意することもできる。例えば、核酸の存在、質および／または量についての対照（例えば内部標準）は、サンプル中に存在することが分かっている配列（例えばハウスキーピング遺伝子、例えばβアクチン、βグロビン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、リボソームタンパク質L37およびL38、PPIアーゼ、EIF3、真核性翻訳伸長因子２（eEF2）、DHFRまたはコハク酸デヒドロゲナーゼ）を検出するであろうプライマーまたはプローブを含むことができる。既知の追加のポリヌクレオチド、例えば指定された長さを有するものも追加することができる。陰性対照の例は、核酸を含まないもの、または試料中に存在しないであろう配列、例えば異なる種からの配列、に特異的なプライマーまたはプローブを含むものである。当業者は、対照の選択が、例えば対照が細胞型や生物体に適しているように、特定のアッセイに依存することを理解するであろう。当業者は、任意の数のパラメーターの評価のために対照を設計することができることを理解するだろう。例えば、対照は、薬理学的データ（例えば半減期）に基づいた治療上の有利性または治療上の評価基準（例えば有利性および／または副作用の比較）を比較するために構築することができる。対照は試験管内用途のために設計することができる。当業者は、対照が一定の状況において有用ありかつ対照数値に対する比較に基づいてデータを解析することができることを理解するだろう。例えば、一定のパラメーターの数値が対照の中で大きく変動する場合、試験サンプル内の変動は有意であると見なされないだろう。
【００３７】
用語「標識」、「タグ」、「検出可能成分」等の用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の物理的手段により検出可能である組成物を指す。例えば、有用な標識としては、蛍光色素（フルオロフォア）、発光剤、放射性同位体（例えば32P、3H）、高電子密度試薬、親和性に基づく成分、例えばポリＡ（ポリＴと相互作用する）またはポリＴタグ（ポリＡと相互作用する）、Hisタグ（Niと相互作用する）、またはストレプトアビジンタグ（ビオチンで分離できる）が挙げられる。
【００３８】
用語「個体を同定する」とは、個体（例えば患者）から誘導されたサンプルに基づいて、各々の個体が投与または治療に対して実際に感受性であるかどうかを決定することを意味する。
【００３９】
用語「個体に治療を施す」とは、治療薬が個体に投与されること（例えば入院患者治療）、あるいは個体または第三者が実際に治療薬を投与できるように治療薬を個体に利用可能にすることを意味する。
【００４０】
異なって定義されない限り、本明細書中で用いる技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier（第四版、2007）；Sambrook他、MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)。用語「１つの（aまたはan）は、１以上を意味するものである。ステップまたは要素の記述に先行して用いる用語「含む」、「含んでなる」とは、さらなるステップまたは要素の追加が任意であって排他的でないことを意味するものである。
【００４１】
III．核酸サンプル
核酸増幅のためのサンプルは、核酸を含むと思われる任意の源より取得することができる。サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）、組織生検（バイオプシー）、気管支肺胞洗浄液または培養細胞（例えば患者から取得したものまたは対照を表すもの）から取得することができる。本開示の範囲内では、サンプルは典型的に肺組織からまたは胚細胞を含む細胞集団、例えば肺癌細胞から採取される。ある場合には、サンプルは例えば尿、皮膚、痰、唾液、血液または血液画分から、非侵略的方法で取得される。
【００４２】
細胞を含むサンプルの場合、細胞を分離し（例えばサイズ分別ろ過または遠心を使って）、それにより無細胞核酸（cfNA）、例えばエクソソマー、微小胞、ウイルス粒子または自由に循環しているものの中の核酸を残すことができる。あるいは、磁気ガラス粒子（MGP）の存在下かまたはMGPへの細胞溶解物の添加前のいずれかにて、細胞を溶解し、細胞性核酸を得ることができる。
【００４３】
生物学的サンプルから核酸を単離する方法は、例えばSambrook他に記載のように既知であり、いくつかのキットが市販されている（例えばRoche社から入手可能な、高純度RNA単離キット（High Pure RNA Isolation Kit）、高純度ウイルス核酸キット（High Pure Viral Nucleic Acid Kit）、MagNA Pure LC全核酸単離キット（MagNA Pure LC Total Nucleic Aid Isolation Kit）、細胞・組織用DNA単離キット（DNA Isolation Kit for Cells and Tissues）、ほ乳類血液用DNA単離キット(DNA Isolation Kit for Mammalian Blood)、高純度FFPET  DNA単離キット（High Pure FFPET DNA Isolation Kit））。本開示方法の範囲内では、RNAが収集されるが、ある態様では以前に調製したcDNAに分類子を用いることができる。
【００４４】
IV．びらん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）および治療法
びらん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（DLBCL）は、非ホジキンリンパ腫の最も一般的なサブタイプである。患者のおよそ40％が、難治性であるか初期反応後に再発する疾病を有し、再発性DLBCLを有する患者の大部分が該疾病のために死亡する。DLBCLには２つの主要な生物学的に異なる分子サブタイプがある：胚中心Ｂ細胞（GCB）および活性化Ｂ細胞（ABC）。ABC DLBCLは、標準化学療法で処置すると実質的に悪い予後（アウトカム）に関連付けられる。
【００４５】
GCB患者は典型的には標準化学療法から恩恵を受ける。これはCHOP（シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；およびプレドニソロン）またはR-CHOP（これは更にリツキシマブおよび／またはエトポシドを含む）療法を含むことができる。この混合物は、一定期間の間、または腫瘍サイズの縮小および／または症状の軽減が検出されるまで、周期的に投与することができる。例えば、CHOPまたはR-CHOPは２または３週間ごとに投与することができる。処置または投与は、典型的には副作用を検出できるような低用量で始まり、副作用が出現するまでまたは患者の許容範囲の中で、用量が増加される。
【００４６】
多数の追加の薬剤（代替療法）がABC患者のために開発中である。それらは同時にまたは別個の用量でCHOPまたはR-CHOPと併用して投与することができる。このような代替療法には、BTK阻害剤（例えばイブルチニブ）、SYK阻害剤（例えばフォスタマチニブ）、NFκB阻害剤（例えばボルテゾミブ）または免疫活性調節剤（例えばタリドミドの構造および機能類似体、例えばレナリドミド）が挙げられる。
【００４７】
DLBCL GCBおよびABCサブタイプのためのその他の適当な療法は、Dunleavy他（2014年４月15日）Oncology and Nowakowki & Czuczman (2015) Am. Soc. Clin. Oncol. Educ. Book e449に記載されている。
【００４８】
Ｖ．増幅と検出
核酸サンプルは、例えば核酸増幅を使って、例えば任意のプライマー依存性方法を使って、検出および定量に用いることができる。ある態様では、予備的な逆転写工程が実施される（RT-PCRとも呼称される；リアルタイムPCRと混同してはならない）。例えば、Hierro他（2006）72:7148を参照のこと。本明細書中で用いる用語「qRT-PCR」とは、逆転写に続く定量的PCRを指す。両反応は中断なく単一のチューブの中で実施することができ、例えば試薬を添加することができる。例えば、ポリＴプライマーを用いて、ポリＡテールを有するサンプル中の全てのmRNAを逆転写することができ、ランダムオリゴヌクレオチドを使うことができ、あるいはcDNAに逆転写される特定の標的転写物に特異的であるプライマーを設計することができる。cDNAは定量的増幅に最初の鋳型鎖を形成することができる（リアルタイムまたは定量的PCR、すなわちRT-PCRまたはqPCR）。qPCRは、PCR工程の各サイクル中に生成する生成物の信頼できる検出と測定を可能にする。そのような技術は当業界で周知であり、キットや試薬は例えばロシュ・モレキュラーシステムズ（Roche Molecular Systems）、ライフテクノロジーズ社（Life Technologies）、バイオラッド社（Bio-Rad）等から市販されている。例えば、Pfaffl (2010) Methods: The ongoing evolution of qPCR、第50巻を参照のこと。
【００４９】
別々の逆転写酵素と耐熱性DNAポリメラーゼを使用でき、例えば２段階反応（逆転写に続いてDNAポリメラーゼの添加と増幅を行うもの）または複合反応（両酵素を一度に添加するもの）において使用できる。ある態様では、逆転写酵素活性とDNA鋳型依存性活性の両方を有する耐熱性ポリメラーゼを使って、標的核酸を増幅する。酵素の例としては、Tth DNAポリメラーゼ、C.thermポリメラーゼ系、並びにUS 20140170730およびUS 20140051126に開示されたものが挙げられる。
【００５０】
本明細書に記載の通り使用されるプローブは、フルオロフォアまたは消光剤（例えばTaqMan、LightCycler、Molecular Beacon、ScorpionまたはDual Labeled プローブ）で標識することができる。適当なフルオロフォアとしては、FAM、JOE、TET、Cal Fluor Gold 540、HEX、VIC、Cal Fluor Orange 560、TAMRA、Cyanine 3、Quasar 570、Cal Fluor Red 590、Rox、Texas Red、Cyanine 5、Quasar 670およびCyanine 5.5が挙げられる。適当な消光剤としてはTAMRA（FAM, JOEおよびTET用）、DABCYLおよびBHQ1-3が挙げられる。
【００５１】
検出装置は当業者に既知であり、特定の標識に合わせて適宜選択することができる。定量的PCRに適する検出装置としては、cobas（登録商標）およびLight Cycler（登録商標）システム（Roche社）、RRISM 7000および7300リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems社）等が挙げられる。６チャンネル式検出系は、CFX96リアルタイムPCR検出システム（Bio-Rad）およびRotorgene Q（Qiagen社）において入手可能であり、より高度の多重化（多元化）を可能にする。
【００５２】
結果は閾値サイクル（Ctと略記され、場合によってはCqまたはCpと略記される）の形で表わすことができる。Ct値が低い結果は、例えばより高い標的核酸濃度またはより効率的な増幅という理由で、予め決められた閾値レベルへの達成がより迅速であることを反映する。閾値サイクルは一般に所定の標的についての増幅が直線領域にあるように選択される。ある態様では、Ctは、例えばベースラインに関して、増幅シグナルが事前定義された閾値の線を超えた時点のサイクルとして設定され、または増幅曲線の二次導関数の最大値を求めることにより、設定される。Ctの決定は当業界で既知であり、例えば米国特許第7363168号明細書に記載されている。
【００５３】
VI．キット
DLBCL患者のCOOサブタイプを分類するための多重qRT-PCRアッセイ用キットが提供される。ある態様では、該キットは、GCBおよびABCマーカー遺伝子産物（RNA）の増幅、検出および定量用のプライマーとプローブとの混合物を含む。GCBマーカーはZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMPを含み、それらの遺伝子の転写物が非癌性患者またはABC患者からのサンプル中よりもGCB患者からのサンプル中のほうが高いレベルで存在する。ABCマーカーはARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46Cを含み、それらの遺伝子の転写物が非癌性患者またはGCB患者からのサンプル中よりもABC患者からのサンプル中のほうが高いレベルで存在する。
【００５４】
DLBCL患者の６遺伝子COOサブタイプを分類するための多重qRT-PCRアッセイ用のキットも本明細書中に含まれる。ある態様では、該キットはGCBおよびABCマーカー遺伝子産物（RNA）の増幅、検出および定量用のプライマーとプローブの混合物を含む。GCBマーカーはZNF318、PTK2およびSSBP2を含み、それらの遺伝子の転写物は非癌性またはGCB患者からのサンプル中よりもGCB患者からのサンプル中のほうが高いレベルで存在する。ABCマーカーはCCND2、FOXP1およびJAD3を含み、それらの遺伝子の転写物は非癌性またはGCB患者からのサンプル中よりもABC患者からのサンプル中のほうが高レベルで存在する。
【００５５】
マーカー特異的プライマーセットおよびプローブは、任意の組み合わせで混合することができ、対合させることができる。例えば、各マーカーを個別に検出することができる。６チャンネルを有する検出システムでは、最大５つのマーカーを内部標準と一緒に単一容器中で検出することができる。この場合、15マーカー全てを含ませるのにわずか３つのプライマーセットとプローブとの混合物が必要である。４チャンネルを有する検出システムでは、最大３つのマーカーを内部標準と一緒に単一容器中で検出することができる。この場合、５つのプライマーセットとプローブとの混合物が必要である。あるいは、サンプル中の15マーカー全ての発現を試験するのにより多数のプライマーセットとプローブとの混合物が要求されるように、アッセイをより低い多重度、または非多重方式で実施することができる。５チューブ多重アッセイの一例が実施例に示される。ある態様では、キットが５混合物（例えばマスター混合物）を含み、その各々が最大３つのGCBおよびABCプローブマーカーに特異的なプライマーセットとプローブ、および内部標準遺伝子に特異的なプライマーセットとプローブを含む。
【００５６】
６遺伝子COOシグネチャーの場合、該キットは２混合物を含み、例えば(i) ZNF318、PTK2およびSSBP2（および内部標準）を含むGCBマーカーを特異的に増幅し検出するプライマーとプローブとを含む混合物、および(ii) CCND2、FOXP1およびJADE3（および内部標準）を含むABCマーカーを特異的に増幅し検出するプライマーとプローブとを含む混合物、を含んでなる。ある態様では、混合物(i)および(ii)中の各遺伝子のためのプローブが、各遺伝子の発現が個別に検出できるように異なる標識を有する。ある態様では、混合物(i)および(ii)中の決定遺伝子（内部標準でない）の各々に対するプローブが同じ標識を有する。ある態様では、該キットが６種の異なる混合物を含み、６遺伝子COOシグネチャー中に各遺伝子について１つずつ存在する。
【００５７】
ある態様では、マーカーが個別に検出されない。例えば、GCBマーカーに特異的なプローブの全てを同じ標識で標識することができ、そしてABCマーカーに特異的なプローブの全てを同じ標識（GCBプローブ上のものとは異なる標識）で標識することができる。この場合、３チャンネルのみでの検出（GCBマーカープローブについて１つ、ABCマーカープローブについて１つ、および対照プローブについて１つ）のために15マーカー全てを単一容器中で大規模に多重化することができる。
【００５８】
ある態様では、混合物は逆転写と増幅に適したバッファー、dNTPsおよび他の要素（例えば補因子またはアプタマー）を更に含む。典型的には、アリコートをサンプル（例えばRNA）、酵素および／または水と一緒に最終反応容量にまで添加できるように、混合物が濃縮された形である。ある態様では、該キットが逆転写酵素（または逆転写活性を有する酵素）および／またはDNAポリメラーゼ（例えば耐熱性DNAポリメラーゼ、例えばTaq、ZO5およびその誘導体）を更に含む。
【００５９】
ある態様では、キットはサンプル、例えばFFPETサンプルからのRNA精製のための成分を更に含む。例えば、該キットはHigh PureまたはMagNA Pure FFPE RNA単離キット（Roche）、RNeasy FFPEキット（Qiagen）、PureLink FFPE RNA単離キット（Thermo Fisher）等からの成分を含むことができる。
【００６０】
ある態様では、該キットは少なくとも１つの対照サンプル、例えば非癌性サンプル（またはプールしたサンプル）からの核酸、または既知のABCもしくはGCBサンプル（またはプールしたサンプル）からの核酸を更に含む。ある態様では、該キットはABC陽性対照および／またはGCB陽性対照を含む。ある態様では、該キットは陰性対照、例えば核酸を欠くもの、ABCおよび／またはGCBマーカー核酸を欠くものを含む。ある態様では、該キットが核酸調製用の消耗品、例えばプレートまたはチューブ、サンプル収集用のチューブ等を更に含む。ある態様では、該キットが使用説明書、ウエブサイトへの参照、またはソフトウエアを更に含む。
【００６１】
VII．実施例
COOサブタイプ決定シグネチャーの設計
分類子遺伝子（表１）を選択するのに市販のDLBCL FFPET検体のセット（トレーニングコホート１；ｎ＝32）のセットを使った。Roche社製のFFPET RNAキットを使ってサンプルを調製した。
【００６２】
qRT-PCR分類子の中の遺伝子標的は、DLBCL検体の一群（ｎ＝32；トレーニングコホート）にてスクリーニングされた遺伝子のコレクション（ｎ＝76）から誘導された。本発明ではAffymetrixマイクロアレイプラットフォームを確認用「ゴールドスタンダード（究極の判断基準）」として使用した。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
一旦遺伝子が選択されたら、５つの別個のウェル中で実施できるようにqRT-PCRアッセイを設計した。200 ngのRNA試験サンプルと対照サンプル（各々40 ng／ウェル）を使用した。
【００６５】
反応条件は各反応について次の通りであった：
25μL RNA＋25μL反応混合物
反応混合物：5μLの酢酸マンガン＋10μLのRNAマスター混合物原液＋10μLのプライマー／プローブ混合物（最終濃度100〜300 nM）。
反応は４つのフィルターをセットしたcobas（登録商標）LC480中で実施し、表２に示すようにプローブを検出した。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
表２は、代表的なアッセイ設計を示し、最少数のウェルにおけるマーカー遺伝子の各々の個別検出と定量を可能にする。
【００６８】
より多数のまたは少数の反応容器を使用できる。例えば、同一標識（蛍光団１）で標識されたGCBマーカー全て、同一標識（フルオロフォア２）で標識されたABCマーカー全て、および異なる標識（フルオロフォア３）で標識された内部標準（IC）を有する、１チューブアッセイを使用できる。スペクトルの他方の側において、別個のウェル中で各分類子遺伝子を検出し、試験サンプルのCOOサブタイプを決定することができる。この試験は、GCBマーカーの発現レベルとABCマーカーの発現レベルを１サンプル内で比較することにより実施される。GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比が閾値（例えばGCB閾値）よりも高い場合、その結果は当該サンプルがABC DLBCLを有する個体からのものであることを示す。ABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比が閾値（例えばABC閾値）より高い場合、その結果は当該サンプルがABC DLBCLを有する個体からのものであることを示す。サンプル中の核酸の量または質に基づいて発現レベルを標準化するために内部標準が用いられる。
【００６９】
閾値レベルは、個体からのサンプル中のGCBおよびABC発現レベルがその個体のDLBCL COOサブタイプを正確に分類する確率に基づいている。例えば、GCB閾値レベルはGCBサブタイプを有することが分かっている個体（または個体群）からのサンプルを使って設定することができる。次いで既知のGCBサンプルを使ってGCB陽性対照を調製できる。ある態様では、GCB陽性対照は、GCB陽性対照中の核酸の＞50％が既知のGCBサンプルからのものであって最低のGCB対ABC発現レベル比を提供するように、ABC個体からのものであることが分かっているサンプルと混合した、既知のGCBサンプルから調製される。サンプルがその比（GCB閾値）より上のGCB対ABC発現の比を有する場合、その結果はGCB COOサブタイプの正確な判定（call）と考えられる。GCB陽性対照は51〜100％の既知GCBサンプル、例えば約55、58、60、62、65、68、70、75％またはそれ以上を使って調製することができ、比率が高ければ高いほどGCB閾値に関してより緊縮（ストリンジェント）な信頼水準をもたらす。サンプルがGCB閾値よりも低いGCB対ABC発現比を有する場合、その結果は決定されないか、ABC COOサブタイプであるかのいずれかである。ABC閾値も同様に設定される。例えば、ABC陽性対照は、51〜100％の既知ABCサンプル、例えば約55、58、60、62、65、68、70、75％またはそれ以上を使って調製することができる。ここでその比率が高いほど、ABC閾値に関してより緊縮（ストリンジェント）な信頼水準をもたらす。サンプルがABC閾値よりも上のABC対GCB発現比を有する場合、その結果はABC COOサブタイプの正確な判定（call）と考えられ、対してABC閾値より下の比率であるなら、結果は決定されないか、GCB COOサブタイプである。ある態様では、GCBおよびABC陽性対照が、既知量のGCBマーカー核酸とABCマーカー核酸とを混合することにより調製される。GCBおよびABC陽性対照は、例えば試薬が添加されたこと、および機器が正しく機能していることを確証するための、アッセイ性能の対照として働く。
【００７０】
表３と表４は、それぞれ、本発明分類子に使用することができるプライマーとプローブの配列を示す。
【００７１】
【表３−１】
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【００７２】
【表３−２】
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【００７３】
【表３−３】
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【００７４】
【表３−４】
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【００７５】
【表３−５】
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【００７６】
【表３−６】
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【００７７】
【表３−７】
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【００７８】
【表３−８】
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【００７９】
【表３−９】
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【００８０】
【表３−１０】
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【００８１】
【表４−１】
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【００８２】
【表４−２】
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【００８３】
【表４−３】
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【００８４】
15遺伝子シグネチャーのバリデーション
qRT-PCR分類子を、市販のDLBCL FFPET検体（バリデーションコホート２；ｎ＝29、およびバリデーションコホート３；ｎ＝46）においてバリデートした。qRT-PCRとAffymetrixマイクロアレイベースの分類子との間の一致率は97.1％であった（表５および表６）。
【００８５】
【表５】
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【００８６】
【表６】
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【００８７】
DLBCLサブタイプ分類シグネチャーにおける比較的少数の遺伝子を考えると、２つの独立したDLBCL群でのDLBCLシグネチャーの高信頼水準は驚くべきことである。これらの結果は、当該DLBCL分類子が急旋回（quck-turn around）で、簡易で安価でかつ正確なCOO決定に利用できることを示す。
【００８８】
６遺伝子シグネチャーのバリデーション
６遺伝子を有するqRT-PCR分類子を、市販のDLBCL FFPET検体（バリデーションコホート；ｎ＝50）においてバリデートした。６遺伝子シグネチャーに含まれる遺伝子は、ABC遺伝子CCND2、FOXP1およびJADE3と、GCB遺伝子ZNF318、SSBP2およびPTK2を含んだ。qRT-PCRおよびAffymetrixマイクロアレイをベースにした分類子の間の一致率は95％であった（表７）。
【００８９】
【表７】
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【００９０】
小規模６遺伝子DLBCLサブタイプ分類シグネチャーの高一致率は驚くべきことである。これらの結果は、６遺伝子DLBCL分類子が急旋回（quck-turn around）で簡易で安価でかつ正確なCOO決定に利用できることを示す。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年10月10日(2018.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
びまん性大細胞型リンパ腫（DLBCL）を有する個体を同定する方法であって、
(a) 個体からサンプルを取り（DLBCLサンプル）；
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；そして
(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子の発現をqRT-PCRにより検出する
ことを含み、ここで
(i) GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比が前記個体のサンプル中のGCB閾値よりも高いことが、R-CHOP（リツキシマブまたはエトポシド；シクロホスファミド；ドキソルビシン；ビンクリスチン；およびプレドニソロン）の投与に対する前記個体の感受性を示し；または
(ii) ABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比が前記個体のサンプル中のABC閾値よりも高いことが、代替投与に対する前記個体の感受性を示す
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記(b)および／または(c)が
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカーZNF318、PTK2およびSSBP2の発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカーCCND2、FOXP1およびJADE3の発現をqRT-PCRにより検出する
ことにより実施されることを特徴とする、前記ステップ(a)〜(d)を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記代替投与がBTK阻害剤、SYK阻害剤、NFκB阻害剤または免疫活性調節剤を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記代替投与がR-CHOPを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ(b)および(c)において各遺伝子について検出された発現レベルを、(d)において対照遺伝子の検出された発現レベルに基づいて調整することを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
びまん性大細胞型リンパ腫（DLBCL）を有する個体について起始細胞（COO）サブタイプを決定する方法であって、
(a) 個体からサンプルを取り（DLBCLサンプル）；
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PDK3、HMGN1、PTK2、SSBP2、BCL6およびLRMPの発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカー ARID3A、CCND2、FOXP1、KIAA0226L、JADE3、PIM2、TCF4およびFAM46Cの発現をqRT-PCRにより検出し；
(d) DLBCLサンプル中の対照遺伝子の発現をqRT-PCRにより検出し；そして
(e) 個体のCOOサブタイプが
(i) GCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比がGCB閾値よりも高い場合はGCB、または
(ii) ABCマーカー発現対GCB発現の比がABC閾値よりも高い場合はABC
であることを決定する
ことを含む方法。
【請求項７】
前記ステップ(b)および／または(c)が
(b) DLBCLサンプル中の胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカーZNF318、PTK2およびSSBP2の発現をqRT-PCRにより検出し；
(c) DLBCLサンプル中の活性化Ｂ細胞（ABC）マーカーCCND2、FOXP1およびJADE3の発現をqRT-PCRにより検出する
ことにより実施されることを特徴とする、前記ステップ(a)〜(d)を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記GCB閾値が、GCB陽性対照におけるGCBマーカー発現対ABCマーカー発現の比に基づいて設定される、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記ABC閾値が、ABC陽性対照におけるABCマーカー発現対GCBマーカー発現の比に基づいて設定される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルが肺生検または気管支肺胞洗浄細胞からのものである、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋組織（FFPET）である、請求項１〜１０いずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプルが血液、血漿または血清である、請求項１〜１１いずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記(b)および(c)の検出が多容器中で多重方式で実施される、請求項１〜１２いずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
各GCBマーカーおよびABCマーカーが個別に検出される、請求項１〜１３いずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記(b)の検出が各サンプルについて単一容器中で実施される、請求項１〜１４いずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記(c)の検出が各サンプルについて単一容器中で実施される、請求項１〜１５いずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記(d)の検出が(b)および(c)の検出と同一容器中で実施される、請求項１〜１６いずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ(b)および(c)において各遺伝子について検出された発現レベルを、(d)において対照遺伝子の検出された発現レベルに基づいて調整することを含む、請求項５〜１６いずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
(a) 胚中心Ｂ細胞（GCB）マーカー ZNF318、PTK2およびSSBP2遺伝子産物の各々を特異的に増幅し検出する、プライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む混合物；および
(b) 活性化Ｂ細胞（ABC）マーカー CCND2、FOXP1およびJADE3遺伝子産物の各々を特異的に増幅し検出する、プライマーセットと蛍光標識されたプローブとを含む混合物
を含んでなるキット。
【請求項２０】
前記(a)または(b)の混合物が、対照遺伝子産物を特異的に増幅し検出するプライマーセットと蛍光標識されたプローブとを更に含み、ここで前記対照遺伝子産物を特異的に検出する蛍光標識されたプローブが、混合物(a)または混合物(b)中の蛍光標識されたプローブとは異なるように標識されていることを特徴とする、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
前記混合物(a)中の蛍光標識されたプローブが全て同一の蛍光標識により標識されているか、または、前記混合物(b)中の蛍光標識されたプローブが全て同一の蛍光標識により標識されている、請求項１９または２０記載のキット。
【請求項２２】
逆転写酵素および／または耐熱性DNAポリメラーゼを更に含む、請求項１９〜２１のいずれか一項記載のキット。
【請求項２３】
逆転写酵素活性とDNAポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を更に含む、請求項１９〜２２のいずれか一項記載のキット。
【請求項２４】
少なくとも１つの対照サンプルを更に含む、請求項１９〜２３のいずれか一項記載のキット。
【国際調査報告】
2019518422.tif 000021
2019518422.tif 000022
2019518422.tif 000023