(57)【要約】  乳がんに関連する染色体領域および相互作用を分析するためのプロセス。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集団内のサブグループを表す染色体状態を検出するプロセスであって、ゲノムの規定された乳がん疾患関連領域内における前記染色体状態に関連する染色体相互作用の有無を判定する工程を含み、前記染色体相互作用が、どの染色体相互作用が前記集団の乳がんサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法であって、前記染色体の状態が異なるサブグループ由来の第１の核酸セットと、指標となる第２の核酸セットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含み、前記第１および第２の核酸セット中の核酸が、染色体相互作用において一体となる両方の染色体領域からの配列を含む連結産物を表し、前記第１の核酸セットと第２の核酸セットとの間のハイブリダイゼーションのパターンが、どの染色体相互作用が乳がんサブグループに特異的であるかの判定を可能にする方法によって、任意に同定されているプロセス。
【請求項２】
（ｉ）表９（マーカーセット１）のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むか、または
（ｉｉ）表９（マーカーセット１）のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも４、５、６、７種を含む、
染色体相互作用の特異的な組み合わせが型付けされるか請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
（ｉ）マーカーセット２のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むか、または
（ｉｉ）マーカーセット２のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも４、５、６、７種を含む、
染色体相互作用の特異的な組み合わせが型付けされる、および／または
（ａ）マーカーセット３のプローブによって表される染色体相互作用のすべてを含むか、または
（ｂ）マーカーセット３のプローブによって表される染色体相互作用の少なくとも４、５、６、７種を含む、
染色体相互作用の特異的な組み合わせが型付けされる、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および／または
−前記染色体相互作用の部位におけるＤＮＡループの有無を検出する工程によって、および／または
−染色体コンホーメーョンにおいて接合される染色体の遠位領域の有無を検出する工程によって、および／または
−前記型付けの間に生成され、その配列が、前記染色体相互作用において一体となる染色体の領域にそれぞれ対応する２つの領域を含む連結核酸の存在を検出する工程によって、
型付けされ、
前記連結核酸の検出が好ましくはＰＣＲによって、任意に表１０または本明細書中の任意の表に列挙された少なくとも１個のプライマーを用いて実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
−乳がんを診断するために実施される、および／または
−前記第２の核酸セットが、前記第１の核酸セットよりも大きな個体群に由来する、および／または
−前記第１の核酸セットが、少なくとも８個体に由来する、および／または
−前記第１の核酸セットが、第１のサブグループからの少なくとも４個体、および好ましくは前記第１のサブグループと重複しない第２のサブグループからの少なくとも４個体に由来する、および／または
−医療のための個体を選択するために実行される、および／または
−性別または別の身体的特徴に基づいて選択された個体に対して実行される、
請求項１から４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
好ましくは本明細書の表または図のいずれか１つに規定されるマーカーを用いて、悪性乳がんを検出するために実行される、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記疾患関連領域が、
（ｉ）表９に列挙された遺伝子のいずれか１つに対応する、および／または
（ｉｉ）表９に示される任意のプローブによって表される染色体相互作用のいずれか１つに対応する、および／または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）を含むか、またはそれらに隣接する４０００塩基領域に対応する、および／または
（ａ）マーカーセット２もしくは３に関連する遺伝子のいずれか１つに対応する、および／または
（ｂ）染色体相互作用マーカーセット２もしくは３のいずれか１つに対応する、および／または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含むか、またはそれらに隣接する４０００塩基領域に対応する、
請求項１から６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
−前記第２の核酸セットが選択されていない群を表す、および／または
−前記第２の核酸セットが、規定された位置でアレイに結合されている、および／または
−前記第２の核酸セットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表す、および／または
−前記第２の核酸セットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含む、および／または
−前記第１の核酸セットおよび前記第２の核酸セットが、１０〜１００ヌクレオチド長の塩基を有する少なくとも１００個の核酸を含む、
請求項１から７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記第１の核酸セットが：
（ｉ）染色体相互作用において一体となる染色体領域を架橋する工程、
（ｉｉ）任意に酵素による制限消化切断によって前記架橋領域に切断を施す工程、および
（ｉｉｉ）前記架橋、切断されたＤＮＡ末端を連結して、（特に連結ＤＮＡを含む）前記第１の核酸セットを形成する工程、
を含む方法において得ることができる、請求項１から８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
少なくとも５〜２０の異なる染色体相互作用が型付けされ、好ましくは５〜２０の異なる領域または遺伝子が型付けされる、請求項１から９のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１１】
前記疾患関連領域が、
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、および／または
（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する、および／または
（ｉｉｉ）非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する、および／または
（ｉｖ）少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する、および／または
（ｖ）調節要素を発現する、および／または
（ｖｉｉ）はＣＴＣＦ結合部位を含む、
請求項１から１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
染色体相互作用の変化を引き起こすことができ、それにより治療効果を引き起こすことができる薬剤を選択することによって、乳がんを治療するための治療剤を同定または設計する方法であって、
前記染色体相互作用が、表９のマーカーセット２もしくはマーカーセット３で規定されるものである、および／または
前記染色体相互作用が、表９に記載されるか、またはマーカーセット２もしくは３に関連する任意の領域または遺伝子に存在し、
任意に：
−前記染色体相互作用が、どの染色体相互作用が請求項１で規定された染色体状態に関連するかを判定する方法によって同定され、および／または
−染色体相互作用の前記変化が、（ｉ）前記本明細書の表に記載された特異的プローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いて、または（ｉｉ）前記本明細書の表のいずれか１つにおいて規定されるプライマー対、または前記表のいずれか１つにおいて同定される任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対によってモニターされる方法。
【請求項１３】
（ａ）候補薬剤を投与する工程、
（ｂ）染色体状態に変化があるかどうかを検出し、それによって前記候補薬剤が治療剤であるかどうかを判定する工程、
を含み、
前記検出が、前記ゲノムの規定された領域内における染色体相互作用の有無を判定する工程を含み、好ましくは、
（ｉ）前記染色体状態が、表９に記載される、またはマーカーセット２もしくは３に関連する任意の遺伝子座、領域または遺伝子におけるものであり得、および／または
（ｉｉ）前記染色体相互作用が、本明細書に記載のもののいずれかであり得るか、または（ａ）表１０に開示される、もしくは（ｂ）前記表のいずれかに開示され、マーカーセット２もしくは３に関連するプローブまたはプライマー対のいずれかに対応し、
前記スクリーニングが、任意にインビトロ、好ましくは細胞中で実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
乳がんのための治療剤を同定または設計するための
（ｉ）染色体相互作用の検出であって、
−染色体相互作用が表９またはマーカーセット２もしくは３に規定される、および／または
−染色体相互作用が、どの染色体相互作用が請求項１で定義される染色体状態に関連するかを判定する方法によって同定される、および／または
−染色体相互作用が、表９に記載される、またはマーカーセット２もしくは３に関連する任意の領域または遺伝子に存在する、
染色体相互作用の検出、または
（ｉｉ）表９に記載される、またはマーカーセット２もしくは３に関連する特異的プローブ配列のいずれかと少なくとも７０％の同一性を有するプローブ、または
（ｉｉｉ）前記本明細書の表のいずれか１つに規定されるプライマー対、または表１０に同定されるか、もしくはマーカーセット２もしくは３に関連する任意のプライマー対と少なくとも７０％の同一性を有するプライマー対、
の使用。
【請求項１５】
候補薬剤を投与する工程、および染色体相互作用の前記検出、前記プローブまたは前記プライマー対を使用して、染色体状態の変化が存在するかどうかを検出し、それにより候補薬剤が治療剤であるかどうかを判定する工程を含み、任意にインビトロ、好ましくは細胞内で実施される、治療剤を同定するための請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定された個体において、乳がんを予防または治療する方法に使用するための乳がん治療剤。
【請求項１７】
個体において乳がんの予防または治療に用いる治療剤を選択する方法であって、請求項１から１１のいずれか一項に記載のプロセスで検出される染色体状態に基づいて前記治療剤を選択する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記型付けまたは検出が、前記連結産物を増幅することができるプライマー、およびＰＣＲ反応の間に前記連結部位に結合するプローブを使用する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による前記連結産物の特異的検出を含み、前記プローブが、前記染色体相互作用において一体となる染色体領域のそれぞれからの配列に相補的な配列を含み、任意に前記プローブが、
前記連結産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
前記オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合したフルオロフォア、および／または
前記オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合したクエンチャー、
を含み、ならびに
任意に
前記フルオロフォアが、ＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択され、および／または
前記プローブが、１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含む、請求項１から１７のいずれかに記載のプロセス、方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体相互作用の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、細胞増殖および分裂における調節の喪失によって引き起こされる。これは、細胞が突然変異を修正できずに、細胞のＤＮＡに突然変異が生じた場合に起こり、突然変異は遺伝性（生殖細胞系）または発達性（後天性）のいずれかであり得る。がんには良性と悪性の２つのタイプがあり、良性がんは、細胞分裂の調節の喪失が起きた場合に発症するが、腫瘍は身体の他の部分に広がらない。悪性（または転移性）がんはより深刻であり、がん細胞が血流またはリンパ系を介して体の他の部分に移動した場合に発症する。乳がんは、乳房から始まるがんの名称であり、世界で２番目に多いがんである。２０１２年に推定１，４１０万人の新たながん症例が発症した。現在、マンモグラムを用いた癌スクリーニングが、乳房の何らかの異常を検査するためのゴールドスタンダードであり、腫瘤が検出されると生検が行われる。浸潤性乳がんの組織学的グレーディングは、浸潤性乳がん患者を予後の異なる３つの群：良好、中程度、および不良に分類するために用いられる。
【発明の概要】
【０００３】
遺伝子座における特定の染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）は、病理学または治療に関連する調節的なエピジェネティック制御の設定により、存在または非存在となる。ＣＣＳは軽度の解離速度を有し、特定の表現型または病理を表す場合、それらは、新しい表現型への生理学的なシグナル伝達により、または外部介入の結果としてのみ変化する。さらに、これらの事象の測定値はバイナリであるため、この読出しは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾およびほとんどの非コードＲＮＡのさまざまなレベルの連続読出しとは著しく対照的である。現在までの大部分の分子バイオマーカーに用いられている連続読出しは、特定のバイオマーカーの変化の大きさが患者によって大きく変動するという点で、データ分析に困難な課題を提供し、患者のコホートを層別化するために使用される場合、分類統計に関して問題を引き起こす。これらの分類統計は、大きさの欠けているバイオマーカーの使用によくて適しており、表現型の違いの「はい  または  いいえ」バイナリスコアを提供し、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーが、潜在的な診断、予後および予測バイオマーカーのための優れた供給源であることを示す。
【０００４】
本発明者らは、集団内のサブグループの同定を可能にするアプローチを使用して、染色体相互作用が乳がんに関連するゲノムの領域を同定した。したがって、本発明は、集団内のサブグループを表す染色体状態を検出するプロセスであって、ゲノムの規定された乳がん疾患関連領域内における染色体相互作用の有無を判定する工程を含む方法を提供する。この染色体相互作用は、どの染色体相互作用が集団の乳がんサブグループに対応する染色体状態に関連するかを判定する方法であって、染色体の状態が異なるサブグループ由来の第１の核酸セットと、指標となる第２の核酸セットとを接触させる工程、および相補的配列をハイブリダイズさせる工程を含み、第１および第２の核酸セット中の核酸が、染色体相互作用において一体となる両方の染色体領域からの配列を含む連結産物を表し、第１の核酸セットと第２の核酸セットとの間のハイブリダイゼーションのパターンが、どの染色体相互作用が乳がんサブグループに特異的であるかの判定を可能にする方法によって、任意に、同定されている、または同定可能（または推論可能）である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＢＣａ１およびＢＣａ２アレイの有意なプローブの比較の図である。プローブはｐ値＜０．０５に調整した。
【図２】このベン図は、マーカー削減セット（１１８、セット１）とモデル検証セット（５０、セット２）に分割された患者セットを示す図である。他の患者セットは、部位２シップメント１２２から除外された対照を指す。
【図３】ＧＬＭＮＥＴモデルの交差検証プロットを使用して、ラムダ（ロジスティックモデルのペナルティ化された値）と係数（最小誤差）を選択する図である。Ｙ軸は平均二乗誤差である。Ｘ軸はｌｏｇ（λ）である。
【図４】シップメント１２２についての外れ値の品質管理の図である。最終的なＢｒＣａモデルからの８つのマーカーを用いた、部位２由来対照サンプルの因子分析（主成分分析）プロット。三角（部位２＿ｂ２）で示される患者はシップメント１２２（３０人の患者）由来であり、これらは全分析から除外され、丸（部位＿２）で示された患者は、使用されたシップメント１１３（２５人の患者）由来の部位２の対照である。このプロットは、同じ位置に由来するこれらの対照内に、比較の観点から生物学的にＢｒＣａと類似することを意味する患者を分離する、大きな変動成分が存在することを示す。この変動は、最終モデルにおけるＢｒＣａと対照との間の差異について競合するため、懸念事項となり、したがって、部位２バッチ２シップメント１２２サンプルは除外された。Ｙ軸はＤｉｍ２  １６．７９％である。Ｘ軸はＤｉｍ１  １８．１１％である。
【図５】最終的なＢｒＣａモデルからの８つのマーカーを用いた、分析に使用したすべての対照サンプル（６９の対照）についての因子分析（主成分分析）プロットを示す図である。患者にはわずかな地理的変動があるが、これは部位２対照（シップメント１２２）の外れ値の群との変動よりも小さい。丸は部位１である。三角形は部位２である。黒四角は部位３である。十字は部位４である。交差四角は部位５である。Ｙ軸はＤｉｍ２  １１．５７％である。Ｙ軸はＤｉｍ１  １５．４７％である。
【図６】最終的なＢｒＣａモデルからの８つのマーカーを用いた、分析に使用したすべての対照サンプル（６９の対照）、および部位２の３０の除外された外れ値群（シップメント１２２−十字円として示す）についての、因子分析（主成分分析）プロットを示す図である。データの広がりは、主に部位２シップメント１２２の問題によるものである。黒菱形は部位１である。黒丸は部位２である。黒四角は部位３である。黒三角は部位４である。十字は部位５である。白三角は部位６である。十字円は部位２＿ｂ２である。Ｙ軸はＤｉｍ２  １１．１４％である。Ｘ軸はＤｉｍ１  １２．３６％である。
【図７】マーカーＡＴＭ＿１１＿１０８１１８１３７＿１０８１２６３７２＿１０８１５５２７９＿１０８１５６６８７＿ＲＦの結果を示す図である。第１の図は、ＡＴＭプライマー５４および５６、４７２ｂｐの分析２による増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９１．７％であり、Ｒ２は０．９９６であり、傾きは−３．５３９であり、ｙ−切片は３９．７０６であることがわかる。
【図８】ＡＴＭ＿１１＿１０８１１８１３７＿１０８１２６３７２＿１０８１５５２７９＿１０８１５６６８７＿ＲＦの増幅線を示す図である。第１の図は、ＡＴＭプライマー５４および５６、４７２ｂｐの分析２行Ｃによる増幅を示す。第２の図は、ＡＴＭプライマー５４および５６、４７２ｂｐの分析２行Ｄによる増幅を示す。
【図９】マーカーＣＤＣ６＿１７＿３８４２１０８９＿３８４２３０７９＿３８４５１１９６＿３８４５７０５０＿ＦＦの結果を示す図である。第１の図は、ＰＣＲ２  ＣＤＣ６  ＦＦによる増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９０．７％であり、Ｒ２は０．９９０であり、傾きは−３．５６８であり、ｙ−切片は４０．６５２であることがわかる。
【図１０】マーカーＦＯＸＣ１＿６＿１５７７２５３＿１５８１９８９＿１６０４２０６＿１６０５９７３＿ＦＲの結果を示す図である。第１の図は、ＡＴＭ  ２０８ｂｐ  ＦＯＸＣ１による増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は１０１．６％、Ｒ２は０．９９２、勾配は−３．２８４、ｙ−切片は３７．７４６であることがわかる。
【図１１】マーカーＦＯＸＣ１＿６＿１５７７２５３＿１５８１９８９＿１６０４２０６＿１６０５９７３＿ＦＲの増幅線を示す図である。第１の図は、ＡＴＭ  ２０８ｂｐ、行Ｃによる増幅を示す。第２図は、ＡＴＭ  ２０８ｂｐ、行Ｄによる増幅を示す。
【図１２】マーカーＭＡＰ３Ｋ１＿５＿５６１０２２５９＿５６１１０５００＿５６１４０２２７＿５６１４４０７６＿ＦＦの結果を示す図である。第１の図は、増幅ＰＣＲ９  ＭＡＰ３Ｋ１細胞Ｃ１〜Ｃ６（ＲＦＵ対サイクル）を示す。第２の図はウェルＣ１〜Ｃ６の融解ピークを示す。ｙ軸は−ｄ（ＲＦＵ）／ｄｔを示す。ｘ軸は摂氏温度を示す。
【図１３】マーカーＭＡＰ３Ｋ１＿５＿５６１０２２５９＿５６１１０５００＿５６１４０２２７＿５６１４４０７６＿ＦＦの結果を示す。第１の図は、ＭＡＰ３Ｋ１  ４９５ｂｐによる増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９１．９％であり、Ｒ２は０．９９９であり、傾きは−３．５３３であり、ｙ−切片は４０．９４０であることがわかる。
【図１４】マーカーＭＥ３＿１１＿８６３０００６３＿８６３０４４０１＿８６４２０５３７＿８６４２６２００＿ＦＲの結果を示す図である。第１の図は増幅ＭＥ３  ＰＣＲ１２、Ａ７〜Ａ１２（ＲＦＵ対サイクル）を示す。第２の図は溶融ピークを示す。ｙ軸は−ｄ（ＲＦＵ）／ｄｔを示す。ｘ軸は摂氏温度を示す。
【図１５】マーカーＭＥ３＿１１＿８６３０００６３＿８６３０４４０１＿８６４２０５３７＿８６４２６２００＿ＦＲの結果を示す図である。第１の図は、ＭＥ３  ２９１ｂｐによる増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９６．８％、Ｒ２は０．９９８、勾配は−３．４００、ｙ−切片は３９．５９６であることがわかる。
【図１６】マーカーＭＥＬＫ＿９＿３６５７７６３０＿３６５７９２４３＿３６６３７０５０＿３６６４３００５＿ＲＦの結果を示す図である。第１の図は、ＭＥＬＫ  ２０７ｂｐによる増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９１．３％、Ｒ２は０．９９５、勾配は−３．５５０、ｙ−切片は４２．０００であることがわかる。
【図１７】マーカーＭＳＨ３＿５＿８００２１９１３＿８００２５０３０＿８０１５３９４８＿８０１５９０１２＿ＲＦの結果を示す図である。第１の図はＭＳＨ３  ２０７ｂｐによる増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９７．１％、Ｒ２は０．９９０、勾配は−３．３９４、ｙ−切片は４１．８７６であることがわかる。
【図１８】マーカーＮＦ１＿１７＿２９４７７１０３＿２９４８３７６４＿２９６５１７９９＿２９６５７３６８＿ＦＦの結果を示す図である。第１の図はＮＦ１  ４０１ｂｐによる増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９９．０％であり、Ｒ２は０．９８７であり、傾きは−３．３４７であり、ｙ−切片は４０．１９２であることがわかる。
【図１９】マーカーＳＲＤ５Ａ１＿５＿６６３４９７３＿６６３９０２５＿６６６７７７５＿６６６９７１１＿ＲＦの結果を示す図である。標準曲線のみが患者データなしで示される。第１の図はＳＲＤＡ５１による増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９５．５％であり、Ｒ２は０．９９７であり、傾きは−３．４３４であり、ｙ−切片は３９．７６１であることがわかる。
【図２０】マーカーＴＳＰＹＬ５＿８＿９８２７６４３１＿９８２８２７３６＿９８３１６４２１＿９８３１８７２０＿ＦＦの結果を示す図である。標準曲線のみが患者データなしで示される。第１の図はＴＳＰＹＬ５による増幅を示す。第２の図は標準曲線を示す。ＦＡＭが使用されている。効率は９４．２％、Ｒ２は０．９９８、勾配は−３．４６９、ｙ−切片は４１．３４４であることがわかる。
【図２１】例２のマーカーセット２に対応するデータを示す図である。ループ検出データは、マーカーががん疾患サンプルと関連しているか、または対照サンプルと関連しているかどうかを示す。
【図２２】例３のマーカーセット３に対応するデータを示す図である。ループ検出データは、マーカーが悪性疾患サンプルと関連しているか、または対照サンプルと関連しているかどうかを示す。統計量は、ネステッドＰＣＲ作業について示されている。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
増幅曲線を示すすべての図において、Ｙ軸はＲＦＵであり、Ｘ軸はサイクルであり、行Ｃのウェルについては、患者サンプルの増幅ラインはＸで記され、行Ｄでは患者増幅曲線が三角（△）で示される。
【０００７】
標準曲線を示すすべての図において、Ｙ軸はＣｑであり、Ｘ軸はログ開始量であり、丸は標準で十字は不明である。
【０００８】
本発明のプロセス
本発明のプロセスは、乳がんに関連する染色体相互作用を検出するための型付けシステムを含む。この型付けは、染色体相互作用において一体となる染色体の架橋領域に基づく、本明細書に記載のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）システムを使用して実施することができ、染色体ＤＮＡに切断を施し、次いで架橋体に存在する核酸を連結して、染色体相互作用を形成した両方の領域からの配列を有する連結核酸を得る。この連結核酸の検出は、特定の染色体相互作用の有無の判定を可能にする。
【０００９】
染色体相互作用は、第１および第２の核酸集団が使用される上記の方法を用いて同定することができる。これらの核酸は、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術を用いて生成することもできる。
【００１０】
本発明に関係するエピジェネティック相互作用
本明細書中で使用される場合、「エピジェネティック」相互作用および「染色体」相互作用という用語は、典型的には染色体の遠位領域間の相互作用を指し、前記相互作用は染色体の領域の状態に依存して動的であり、改変、形成または破壊される。
【００１１】
本発明の特定のプロセスでは、染色体相互作用は、その相互作用の一部である染色体の両方の領域からの配列を含む連結核酸を最初に作製することによって検出される。そのようなプロセスにおいて、これらの領域は、任意の適切な手段によって架橋することができる。好ましい実施形態では、相互作用はホルムアルデヒドを用いて架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによっても架橋することができる。パラ−ホルムアルデヒドは、４オングストローム離れたＤＮＡ鎖を架橋することができる。
【００１２】
染色体相互作用は、染色体領域の状態、例えば、それが生理学的状態の変化に応答して転写または抑制されているかどうかを反映し得る。本明細書で規定されるサブグループに特異的な染色体相互作用は安定であることが判明しており、したがって２つのサブグループ間の差異を測定する信頼できる手段を提供する。
【００１３】
さらに、特徴（疾患状態など）に特異的な染色体相互作用は、例えば、メチル化またはヒストンタンパク質の結合への変化のような他のエピジェネティックマーカーと比較して、通常生物学的過程の初期に生じる。したがって、本発明のプロセスは、生物学的過程の早期ステージを検出することができる。これにより、結果としてより効果的な早期介入（例えば治療）が可能になる。さらに、同じサブグループ内の個体間の関連する染色体相互作用にはほとんど変動がない。染色体相互作用を検出することは、遺伝子あたり５０種までの異なる相互作用候補によって非常に有益であり、したがって、本発明のプロセスは５００，０００種の異なる相互作用を調べることができる。
【００１４】
好ましいマーカーセット
特定のマーカーが本明細書において開示され、そのいずれも本発明において使用することができる。さらにマーカーのセット、例えば、本明細書に開示される組み合わせまたは数を使用することができる。マーカーセット１、２および３が好ましい。これらは、ｑＰＣＲ法を含む任意の適切な方法、例えば、本明細書に開示されるＰＣＲまたはプローブに基づく方法によって型付けすることができる。マーカーは、本明細書において、位置またはプローブおよび／またはプライマー配列によって定義される。
【００１５】
エピジェネティック相互作用の位置と原因
エピジェネティック染色体相互作用は、関連する遺伝子または記載されていない遺伝子をコードすることが示されている染色体の領域に重複していてもよく、これを含み得るが、同様に遺伝子間領域に存在することもある。さらに、本発明者らが、すべての領域におけるエピジェネティック相互作用が、染色体座の状態を判定する上で等しく重要であることを発見したことに留意すべきである。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域に存在するものではなく、遺伝子間領域に存在してもよい。
【００１６】
本発明で検出される染色体相互作用は、基礎となるＤＮＡ配列の変化、環境因子、ＤＮＡメチル化、非コードアンチセンスＲＮＡ転写産物、非突然変異誘発性発癌物質、ヒストン修飾、クロマチンリモデリングおよび特異的局所ＤＮＡ相互作用によって引き起こされ得る。染色体相互作用をもたらす変化は、それ自体が遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響しない、基礎となる核酸配列の変化によって引き起こされ得る。そのような変化は、例えば、遺伝子の内部および／または外部のＳＮＰ、遺伝子融合および／または遺伝子間ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非コードＲＮＡの欠失であり得る。例えば、約２０％のＳＮＰが非コード領域にあることが知られており、したがって、記載されたプロセスは非コードの場所においても有益である。一実施形態では、一体となって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対または２００塩基対未満離れている。
【００１７】
検出される染色体相互作用は、好ましくは、表９に記載の遺伝子のいずれかの内に存在する。検出される染色体相互作用は、マーカーセット１、２または３について記載の遺伝子のいずれかの内に存在する。しかし、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子またはコード配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００または最大５０００塩基上流または下流にあってもよい。
【００１８】
サブグループ、診断およびパーソナル化治療
本発明の目的は、乳がんサブグループに関連する染色体相互作用の検出を可能にすることである。したがって、このプロセスは、乳がんの診断に使用されても、または使用されなくてもよい。本発明のプロセスは、悪性乳がんの診断に使用することができ、好ましくはマーカーセット３からのマーカーがこのような実施形態に使用される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「サブグループ」は、好ましくは集団のサブグループ（集団内のサブグループ）、より好ましくは特定の動物、例えば特定の真核生物または哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト、非ヒト霊長類またはげっ歯類、例えばマウスもしくはラット）の集団内のサブグループを指す。最も好ましくは、「サブグループ」は、ヒト集団のサブグループを指す。
【００２０】
本発明は、集団内の特定のサブグループの検出および治療を含む。本発明者らは、所与の集団において、染色体相互作用がサブセット（例えば、２つまたは少なくとも２つのサブセット）の間で異なることを発見した。これらの違いを同定することで、医師は彼らの患者を、本プロセスに記載の集団の１つのサブセットの一部として分類することができる。したがって、本発明は、エピジェネティック染色体相互作用に基づいて、患者に対する医療をパーソナル化するプロセスを医師に提供する。
【００２１】
連結核酸の生成
本発明の特定の実施形態は、連結された核酸、特に連結されたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用において一体となる両方の領域からの配列を含み、したがって相互作用に関する情報を提供する。本明細書に記載のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、そのような連結核酸の生成を使用して、染色体相互作用を検出する。
【００２２】
したがって、本発明のプロセスは、以下の工程（これらの工程を含む方法を含む）：
（ｉ）染色体座に存在するエピジェネティック染色体相互作用を、好ましくはインビトロで架橋する工程；
（ｉｉ）任意に架橋ＤＮＡを前記染色体座から単離する工程；
（ｉｉｉ）前記架橋ＤＮＡに、例えば少なくとも１回切断する酵素（特に、前記染色体座内で少なくとも１回切断する酵素）による制限消化によって切断を施す工程；
（ｉｖ）前記架橋切断ＤＮＡ末端を、（特にＤＮＡループを形成するために）連結する工程；ならびに
（ｖ）任意に、前記連結ＤＮＡおよび／または前記ＤＮＡループの存在を、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のような技術を用いて同定して、特異的な染色体相互作用の存在を同定する工程、
によって、連結核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成する工程を含むことができる。
【００２３】
これらの工程を実施して、本明細書に記載の任意の実施形態のために、例えば、個体が乳がんサブグループの一部であるかどうかを判定するために染色体相互作用を検出することができる。また、この工程を実施して、本明細書に記載の第１および／または第２の核酸セットを生成することができる。
【００２４】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を使用して、連結核酸を検出または同定することができる。例えば、産生されるＰＣＲ産物のサイズは、存在する特異的な染色体相互作用を示すことができ、遺伝子座の状態を同定するために使用することができる。好ましい実施形態では、表１０に示す少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種のプライマーまたはプライマー対がＰＣＲ反応に使用される。他の好ましい実施形態では、マーカーセット２もしくは３に関連するか、またはこれらについて示される少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種のプライマーまたはプライマー対が、ＰＣＲ反応に使用される。当業者は、目的の染色体座内でＤＮＡを切断するために使用され得る多数の制限酵素を認識していると思われる。使用される特定の酵素が、研究される遺伝子座およびその中に位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明に記載のＤＮＡを切断するために使用できる制限酵素の非限定的な例は、ＴａｑＩである。
【００２５】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術などの実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術はまた、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャーの検出におけるマイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関連する。本明細書に記載の様式で連結核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの実施形態は、いくつかの利点を有する。例えば、本発明の第１の核酸セットからの核酸配列は、第２の核酸セットとハイブリダイズするか、またはハイブリダイズできないかのいずれかであるため、それらは確率的雑音のレベルが低い。これは、エピジェネティックレベルで複雑な機序を測定する比較的簡単な方法を可能にするバイナリ結果を提供する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術はまた、処理時間が短く、コストが低い。一実施形態では、処理時間は３時間〜６時間である。
【００２６】
サンプルおよびサンプル処理
本発明のプロセスは、通常、サンプルに対して実施される。サンプルは通常、個体由来のＤＮＡを含む。それには通常細胞が含まれる。一実施形態では、サンプルは最小の侵襲的手段によって得られ、例えば血液サンプルであり得る。ＤＮＡを抽出し、標準的な制限酵素で切断することができる。これにより、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームでどの染色体コンフォメーションが保持され、検出されるかを事前に判定できる。水平伝播を含む組織と血液との間の染色体相互作用の同調により、血液サンプルを使用して、疾患に関連する組織などの組織における染色体相互作用を検出することができる。癌などの特定の状態では、突然変異による遺伝的雑音は、関連する組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼすことがあり、したがって、血液を用いることが有利である。
【００２７】
本発明の核酸の特性
本発明は、本発明のプロセスにおいて使用または生成されるものとして本明細書に記載される連結核酸などの特定の核酸に関する。これらは、本明細書に記載の第１および第２の核酸と同じであっても、またはそれらの特性のいずれかを有してもよい。本発明の核酸は、典型的には、染色体相互作用において一体となる染色体の２つの領域のうちの一方に由来する配列をそれぞれが含む２つの部分を含む。典型的には、各部分は、長さが少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０ヌクレオチド長、例えば１０〜４０ヌクレオチド長である。好ましい核酸は、いずれかの表に記載のいずれかの遺伝子に由来する配列を含む。典型的には、好ましい核酸は、表９に記載の特異的プローブ配列、またはそのような配列の断片および／またはホモログを含む。典型的には、好ましい核酸は、マーカーセット２もしくは３に関連する、および／またはこれらについて記載される特異的プローブ配列、またはそのような配列の断片および／またはホモログを含む。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の実施形態において必要に応じて相補的配列を使用し得ることは理解されよう。
【００２８】
表１０に示されるプライマーはまた、本明細書に記載の本発明において使用することができる。一実施形態では、表１０に示す配列、または表１０に示す任意の配列の断片および／またはホモログのいずれかを含むプライマーが使用される。マーカーセット２もしくは３に関連する、および／またはこれらについて示されるプライマーもまた、本明細書に記載の本発明において使用することができる。一実施形態では、マーカーセット２もしくは３にについて示される配列、またはマーカーセット２もしくは３について示される任意の配列の断片および／またはホモログのいずれかを含むプライマーが使用される。
【００２９】
第２の核酸セット−「指標」配列
第２の核酸配列セットは、指標配列のセットであるという機能を有し、本質的に、サブグループ特異的配列を同定するのに適した核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用を表すことができ、何らかの方法で選択することができ、または選択されなくてもよい。それらは一般的にすべての染色体相互作用候補のサブセットである。
【００３０】
第２の核酸セットは、任意の適切なプロセスによって得ることができる。それらはコンピュータにより導くことができ、または個体における染色体相互作用に基づくこともできる。それらは、典型的には、第１の核酸セットよりも大きな集団群を表す。特定の一実施形態では、第２の核酸セットは、遺伝子の特異的セットにおけるすべてのエピジェネティック染色体相互作用候補を表す。別の特定の実施形態では、第２の核酸セットは、本明細書に記載の集団に存在するすべてのエピジェネティック染色体相互作用候補の大部分を表す。特定の一実施形態では、第２の核酸セットは、少なくとも２０、５０、１００または５００種の遺伝子、例えば２０〜１００または５０〜５００種の遺伝子におけるエピジェネティック染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％を表す。
【００３１】
第２の核酸セットは、典型的には、集団における疾患状態／表現型を改変、調節、または任意の方法で媒介する少なくとも１００種のエピジェネティック染色体相互作用候補を表す。第２の核酸セットは、種における疾患状態に影響を及ぼす染色体相互作用、例えば、任意の疾患状態、疾患の素因または疾患表現型に関連するサイトカイン、キナーゼまたは調節因子をコードする遺伝子における染色体相互作用を表すことができる。第２の核酸セットは、典型的には、乳がんサブグループに関連する、および関連しないエピジェネティック相互作用を表す配列を含む。
【００３２】
特定の一実施形態では、第２の核酸セットは、集団において天然に生じる配列から少なくとも部分的に誘導され、典型的にはインシリコプロセスによって得られる。前記核酸は、天然に生じる核酸中に存在する核酸の対応する部分と比較して、単一または複数の突然変異をさらに含み得る。突然変異には、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の欠失、置換および／または付加が含まれる。特定の一実施形態では、第２の核酸セットは、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルソログを表す配列を含み得る。別の特定の実施形態では、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００３３】
第２の核酸セットの特性
特定の一実施形態では、第２の核酸セットには少なくとも１００種の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００または５０００種の異なる核酸配列、最大１００，０００、１，０００，０００または１０，０００，０００種の異なる核酸配列が存在する。典型的な数は、１００〜１，０００，０００種、例えば１，０００〜１００，０００種の異なる核酸配列がある。すべてまたは少なくとも９０％または少なくとも５０％またはこれらが異なる染色体相互作用に対応すると思われる。
【００３４】
特定の一実施形態では、第２の核酸セットは、少なくとも２０種の異なる遺伝子座または遺伝子、好ましくは少なくとも４０種の異なる遺伝子座または遺伝子、さらに好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００種の遺伝子座または遺伝子、例えば１００〜１０，０００種の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を表す。第２の核酸セットの長さは、ワトソンクリック塩基対形成に従って第１の核酸セットと特異的にハイブリダイズして、サブグループに特異的な染色体相互作用の同定を可能にするために適している。典型的には、第２の核酸セットは、染色体相互作用において一体となる２つの染色体領域に対応する配列中の２つの部分を含む。第２の核酸セットは、典型的には、少なくとも１０、好ましくは２０、および好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）長の核酸配列を含む。別の実施形態では、核酸配列は、多くとも５００塩基対、好ましくは多くとも１００塩基対、さらに好ましくは多くとも５０塩基対の長さであり得る。好ましい実施形態では、第２の核酸セットは、１７〜２５塩基対の核酸配列を含む。一実施形態では、第２の核酸配列セットの少なくとも１００、８０％または５０％が上記の長さを有する。好ましくは、異なる核酸はいかなる重複配列も有さず、例えば核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％または５０％が、少なくとも５個の連続したヌクレオチドにわたって同じ配列を有さない。
【００３５】
第２の核酸セットが「指標」として作用することを考慮すると、同じ第２の核酸セットを、特徴の異なるサブグループを表すさまざまな第１の核酸セットと共に使用することができ、すなわち、第２の核酸セットは、異なる特徴に関連する染色体相互作用を同定するために使用することができる核酸の「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」コレクションであり得る。
【００３６】
第１の核酸セット
第１の核酸セットは、通常、乳がんを有する個体由来である。第１の核酸は、本明細書に記載の第２の核酸セットの特徴および特性のいずれかを有することができる。第１の核酸セットは、通常、本明細書に記載の治療および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けた個体由来のサンプルである。典型的には、第１の核酸セットは、個体から採取されたサンプル中に存在する染色体相互作用のすべて、または少なくとも８０％もしくは５０％を表す。
【００３７】
典型的には、核酸の第１のセットは、第２の核酸セットによって表される染色体相互作用と比較して、第２の核酸セットによって表される遺伝子座または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さい集団を表す、すなわち第２の核酸セットは遺伝子座または遺伝子の規定セットにおける相互作用のバックグラウンドまたは指標セットを表す。
【００３８】
核酸ライブラリー
本明細書に記載の核酸集団のタイプのいずれかは、そのタイプ、例えば「第１」または「第２」の核酸の少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００または少なくとも１００００の異なる核酸を含むライブラリーの形態で存在し得る。そのようなライブラリーは、アレイに結合された形態であり得る。
【００３９】
ハイブリダイゼーション
本発明は、第１の核酸セットおよび第２の核酸セットからの全体的または部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズ可能となる手段を必要とする。一実施形態では、第１の核酸セットのすべてを第２の核酸セットのすべてと、単一のアッセイ、すなわち単一のハイブリダイゼーション工程において接触させる。しかしながら、任意の適切なアッセイを使用することができる。
【００４０】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書に記載の核酸は、好ましくは、成功したハイブリダイゼーションの検出を補助するフルオロフォア（蛍光分子）または放射性標識のような独立した標識を用いて標識することができる。特定の標識は、ＵＶ光の下で検出することができる。例えば本明細書に記載のアレイ上のハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループ間のエピジェネティック染色体相互作用の差異を表し、したがって、エピジェネティック染色体相互作用を比較し、どのエピジェネティック染色体相互作用が本発明の集団のサブグループに特異的であるかを判定するプロセスを提供する。
【００４１】
「ハイブリダイゼーションのパターン」という用語は、第１の核酸セットと第２の核酸セットとの間のハイブリダイゼーションの有無、すなわち、第１セットからのどの特異的核酸が第２セットからのどの特異的核酸とハイブリダイズするかを広範囲に含み、任意の特定のアッセイもしくは技術、または「パターン」が検出され得る表面もしくはアレイを有する必要性に限定されない。
【００４２】
特定の特徴を持つサブグループの選択
本発明は、個体において乳がんに関連する特徴の有無を判定するために、典型的には５〜２０または５〜５００種のそのような相互作用、好ましくは２０〜３００または５０〜１００種の相互作用の有無を検出する工程を含むプロセスを提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書に記載の遺伝子のいずれかにおけるものである。一実施形態では、型付けされる染色体相互作用は、表９の核酸によって表されるものである。表９の「検出されたループ」と題された列は、各プローブによってどのサブグループ（乳がんまたは対照）が検出されたかを示す。図からわかるように、本発明のプロセスは、試験の一部として、乳がんサブグループおよび／または対照サブグループ（非乳がん）のいずれかを検出することができる。
【００４３】
被験個体
被験個体が由来する種の例は、本明細書に記載されている。さらに、本発明の方法における被験個体は、何らかのプロセスで選択されていてよい。例えば、個体は女性であってよい。
【００４４】
好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子および染色体相互作用
本発明のすべての態様のための、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子および染色体相互作用が表９に記載されている。典型的には、本発明のプロセスでは、染色体相互作用は、表９に列挙された関連遺伝子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種から検出される。好ましくは、表９のプローブ配列によって表される関連する特異的染色体相互作用の少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種の有無が検出される。疾患関連領域は、本明細書に記載の遺伝子のいずれかの上流または下流、例えば、コード配列から５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００４５】
本発明のすべての態様のための、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子および染色体相互作用は他の表にも記載されている。典型的には、本発明のプロセスでは、染色体相互作用は、例えばマーカーセット２または３にについて表に列挙された関連遺伝子の少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種から検出される。好ましくは、表中のプローブ配列によって表される関連する特異的染色体相互作用の少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８種の有無が検出される。疾患関連領域は、本明細書に記載の遺伝子のいずれかの上流または下流、例えば、コード配列から５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００４６】
一実施形態では、遺伝子座（染色体相互作用が検出される遺伝子および／または場所を含む）は、ＣＴＣＦ結合部位を含み得る。これは、転写リプレッサーＣＴＣＦに結合することができる任意の配列である。その配列は、その遺伝子座に１、２または３コピー存在し得る配列ＣＣＣＴＣからなるか、またはそれを含み得る。ＣＴＣＦ結合部位配列は、配列ＣＣＧＣＧＮＧＧＮＧＧＣＡＧ（ＩＵＰＡＣ表記法）を含み得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基以内または表９に示されるいずれかの染色体領域内にあり得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基以内、または例えばマーカーセット２もしくは３についての任意の表に示されるいずれかの染色体領域内にあり得る。
【００４７】
一実施形態では、検出される染色体相互作用は、表９に示される遺伝子領域のいずれかに存在する。連結された核酸が本プロセスで検出される場合、表９のプローブ配列のいずれかに示される配列が検出され得る。別の実施形態では、検出される染色体相互作用は、例えばマーカーセット２または３について他の表に示される遺伝子領域のいずれかに存在する。連結核酸が本プロセスで検出される場合、例えばマーカーセット２または３についての表中のプローブ配列のいずれかに示される配列が検出され得る。
【００４８】
したがって典型的には、プローブの両方の領域由来（すなわち、染色体相互作用の両方の部位由来）の配列を検出可能である。好ましい実施形態では、任意の表に示されるプローブと同一または相補的な配列を含むか、またはそれからなるプローブが本プロセスにおいて使用される。いくつかの実施形態では、表に示されるプローブ配列のいずれかと相同である配列を含むプローブが使用される。
【００４９】
本明細書に提供される表
表９は、乳がんに関連する染色体相互作用を表すプローブ（Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データおよび遺伝子データを示す。他のプローブおよび遺伝子データは、例えばマーカーセット２または３についての他の表に示されている。プローブ配列は、染色体相互作用において一体となる遺伝子領域の両部位から生成された連結産物を検出するために使用できる配列を示し、すなわち、このプローブは、連結産物中の配列に相補的な配列を含む。第１の２セットの開始−終結位置はプローブ位置を示し、第２の２セットの開始−終結位置は関連する４ｋｂ領域を示す。プローブデータの表には、以下の情報が提供される。
−ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ：超幾何濃縮のパラメータに基づいて、遺伝子座における有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの数を見出す確率についてのｐ値
−総プローブ数：遺伝子座において試験されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの総数
−有意なプローブ数：遺伝子座において統計的に有意であることが判明したＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの数
−ＦＤＲ  ＨｙｐｅｒＧ：多重検定（偽発見率）により補正された超幾何Ｐ値
−有意パーセント：遺伝子座において試験されたマーカーの数に対する有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのパーセンテージ
−ｌｏｇＦＣ：エピジェネティック比（ＦＣ）の底を２とする対数
−平均発現：すべてのアレイとチャネルにわたるプローブの平均ｌｏｇ２発現
−Ｔ：調整ｔ統計量
−ｐ値：生ｐ値
−調整ｐ値：調整されたｐ値またはｑ値
−Ｂ−Ｂ統計量（ロッズ（ｌｏｄｓ）またはＢ）は、その遺伝子が差次的に発現される対数オッズ（ｌｏｇ−ｏｄｄｓ）である。
−ＦＣ−非対数倍数変化
−ＦＣ＿１−ゼロを中心とした非対数倍数変化
−ＬＳ−ＦＣ＿１値に関連するバイナリ値。ＦＣ＿１の値が−１．１より小さい場合は−１に設定され、ＦＣ＿１の値が１．１より大きい場合は１に設定される。それらの値の間ではこの値は０である。
【００５０】
表９は、関連する染色体相互作用が起こることが判明した遺伝子を示す。他の表は同様のデータを示す。遺伝子座表のｐ値は、ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ（超幾何濃縮のパラメータに基づいて遺伝子座における有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの数を見出す確率についてのｐ値）と同じである。
【００５１】
プローブは、Ｔａｑ１部位から３０ｂｐ離して設計される。ＰＣＲの場合、ＰＣＲプライマーも、連結産物を検出するように設計されているが、Ｔａｑ１部位からのそれらの位置は変動する。
【００５２】
プローブの位置：
開始１−断片１のＴａｑＩ部位の３０塩基上流
終結１−断片１のＴａｑＩ制限部位
開始２−断片２のＴａｑＩ制限部位
終結２−断片２のＴａｑＩ部位の３０塩基下流
４ｋｂ配列の位置：
開始１−断片１のＴａｑＩ部位の４０００塩基上流
終結１−断片１のＴａｑＩ制限部位
開始２−断片２のＴａｑＩ制限部位
終結２−断片２のＴａｑＩ部位の４０００塩基下流
表１０および他の表は、上位ＰＣＲマーカーそれぞれについて示す：ＧＬＭＮＥＴ−ｌａｓｓｏ全体またはｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ正則化をフィッティングするための手順。ラムダを０．５に設定（ｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ）
【００５３】
サンプル調製および染色体相互作用検出のための好ましい実施形態
サンプルを調製し、染色体コンフォメーションを検出する方法を、本明細書に記載する。これらの方法の最適化された（非従来的な）バージョンを、例えばこの節に記載のように使用することができる。
【００５４】
典型的には、サンプルは少なくとも２×１０５個の細胞を含む。サンプルは最大５ｘ１０５個の細胞を含むことができる。一実施形態では、サンプルは、２×１０５〜５．５×１０５個の細胞を含む。
【００５５】
染色体座に存在するエピジェネティック染色体相互作用の架橋が本明細書に記載される。これは、細胞溶解が起こる前に行うことができる。細胞溶解は、３〜７分間、例えば４〜６分または約５分間行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞溶解は、少なくとも５分間および１０分間未満行われる。
【００５６】
制限酵素によるＤＮＡ消化が、本明細書に記載される。典型的には、ＤＮＡ制限は約５５℃〜約７０℃、例えば約６５℃において約１０〜３０分間、例えば約２０分間行われる。
【００５７】
好ましくは、４０００塩基対までの平均断片サイズを有する連結ＤＮＡの断片を生じるフリークエントカッター制限酵素が使用される。任意に、制限酵素は、約２００〜３００塩基対、例えば約２５６塩基対の平均断片サイズを有する連結ＤＮＡ断片をもたらす。一実施形態では、典型的な断片サイズは、２００〜４０００塩基対、例えば４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対である。
【００５８】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ法の一実施形態では、ＤＮＡ沈殿工程は、ＤＮＡ制限消化工程とＤＮＡ連結工程との間では行われない。
【００５９】
ＤＮＡの連結が本明細書に記載される。典型的には、ＤＮＡの連結は５〜３０分間、例えば約１０分間行われる。
【００６０】
サンプル中のタンパク質は酵素的に、例えばプロテイナーゼ、任意にプロテイナーゼＫを用いて消化することができる。タンパク質は約３０分〜１時間、例えば約４５分間酵素消化することができる。一実施形態では、タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化後に架橋逆転またはＤＮＡフェノール抽出工程は存在しない。
【００６１】
一実施形態では、ＰＣＲ検出は、好ましくは連結核酸の有／無についてのバイナリ読出しにより、連結核酸の単一コピーを検出することができる。
【００６２】
本発明のプロセスおよび使用
本発明のプロセスは、さまざまなやり方で記載することができる。本発明の方法は、連結核酸を作製する方法であって、（ｉ）染色体相互作用において一体となる染色体領域をインビトロで架橋する工程、（ｉｉ）前記架橋ＤＮＡに切断または制限消化切断を施す工程、および（ｉｉｉ）前記架橋、切断されたＤＮＡ末端を連結して、連結核酸を形成する工程を含み、連結核酸の検出が遺伝子座における染色体の状態の判定に使用することができ、好ましくは、
−前記遺伝子座が、表９に記載の遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および／または前記染色体相互作用が、本明細書中に記載の、または表９に開示のプローブのいずれかに対応する染色体相互作用のいずれかであり得、および／または
−前記連結産物が、（ｉ）表９に開示のプローブ配列のいずれかと同一であるか、または相同である配列；または（ｉｉ）（ｉｉ）に相補的な配列を有するか、または含む方法として記載することができる。
【００６３】
本発明のプロセスは、集団内の異なるサブグループを表す染色体状態を検出するプロセスであって、ゲノムの規定されたエピジェネティックに活性な（疾患関連）領域内における染色体相互作用の有無を判定する工程を含み、好ましくは
−前記サブグループが、乳がんの有無によって規定され、および／または
−前記染色体状態が、表９に記載の任意の遺伝子座、領域または遺伝子におけるものであり得、および／または
−前記染色体相互作用が、表９に記載のもの、またはその表に開示のプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る方法として記載することができる。
【００６４】
本発明は、表９に記載の任意の遺伝子座、遺伝子または領域における染色体相互作用を検出する工程を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に記載の核酸およびプローブの使用、例えば、少なくとも１、２、４、６または８種の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための少なくとも１、２、４、６または８種のそのような核酸またはプローブの使用を含む。本発明は、表１０に列挙されたプライマーもしくはプライマー対のいずれかを用いるか、または本明細書に記載のこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むか、またはこれらのプライマー配列の断片および／またはホモログを含む配列）を用いる染色体相互作用の検出を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、
−遺伝子座は、例えば、マーカーセット２または３についての任意の表に記載の遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および／または染色体相互作用は、本明細書に記載の染色体相互作用、または例えばマーカーセット２または３についての任意の表に開示のプローブのいずれかに対応するものであり得、および／または
−連結産物は、（ｉ）例えばマーカーセット２または３についての任意の表に開示のプローブ配列のいずれかと同一もしくは相同である配列、；または（ｉｉ）（ｉｉ）に相補的な配列、を有するか、または含み得る。
【００６６】
本発明のプロセスは、集団内の異なるサブグループを表す染色体状態を検出するプロセスであって、ゲノムの規定されたエピジェネティックに活性な（疾患関連）領域内における染色体相互作用の有無を判定する工程を含み、好ましくは
−前記サブグループが、乳がんの有無によって規定され、および／または
−前記染色体状態が、例えばマーカーセット２または３についての任意の表に記載の任意の遺伝子座、領域または遺伝子におけるものであり得、および／または
−前記染色体相互作用が、例えばマーカーセット２または３についての任意の表に記載のもの、またはその表に開示のプローブのいずれかに対応するもののいずれかであり得る方法として記載することができる。
【００６７】
本発明は、例えばマーカーセット２または３についての任意の表に記載の任意の遺伝子座、遺伝子または領域における染色体相互作用を検出する工程を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に記載の核酸およびプローブの使用、例えば、少なくとも１、２、４、６または８種の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための少なくとも１、２、４、６または８種のそのような核酸またはプローブの使用を含む。本発明は、例えばマーカーセット２もしくは３についての任意の表に列挙されたプライマーもしくはプライマー対のいずれかを用いるか、または本明細書に記載のこれらのプライマーの変異体（プライマー配列を含むか、またはこれらのプライマー配列の断片および／またはホモログを含む配列）を用いる、染色体相互作用の検出を含む。
【００６８】
新しい治療を同定するための本発明の方法の使用
染色体相互作用に関する知識は、状態の新しい治療法を同定するために使用することができる。本発明は、乳がんのための新しい治療剤を同定または設計するために、本明細書で定義される染色体相互作用の方法および使用を提供する。
【００６９】
ホモログ
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログを、本明細書において言及する。そのようなホモログは、典型的には、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を、例えば、少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体領域に由来する核酸部分にわたって有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（時に「ハードホモロジー（ｈａｒｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」と称される）に基づいて計算することができる。
【００７０】
したがって、特定の実施形態では、ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログは、配列同一性のパーセンテージを参照して本明細書で言及される。典型的にはそのようなホモログは、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を、例えば、少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれ以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体領域に由来する核酸部分にわたって有する。
【００７１】
例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えばそのデフォルト設定で使用される）相同性および／または％配列同一性を計算するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、ｐ３８７−３９５）。例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  ＭｏＩ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性および／または配列同一性％を計算することができ、および／または、配列を整列させることができる（（通常はそれらのデフォルト設定で）等価または対応する配列の同定）。
【００７２】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの文字列とアライメントしたときに、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはこれを満たすクエリ配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって、高いスコア配列対（ＨＳＰ）を最初に特定する工程を含む。Ｔは近傍文字列スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの最初の近傍文字列ヒットは、それらを含むＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種として機能する。文字列ヒットは、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向の文字列ヒットの伸長は、累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ下落した時、１つまたは複数のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ以下になる時、またはいずれかの配列の末端に到達した時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ５  ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９参照）アライメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００７３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行い、例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのポリヌクレオチド配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、第１の配列と第２の配列との比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列はもう一方の配列と類似していると考えられる。
【００７４】
相同配列は、典型的には１、２、３、４またはそれ以上の塩基、例えば１０、１５または２０塩基未満（ヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る）で異なる。これらの変化は、相同性および／または配列同一性％の計算に関して上記の領域のいずれかにわたって測定することができる。
【００７５】
アレイ
第２の核酸セットはアレイに結合されていてもよく、一実施形態では、アレイに結合された少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００または２５０，０００個の異なる第２の核酸があり、これらは好ましくは少なくとも３００、９００、２０００または５０００の遺伝子座において表される。一実施形態では、第２の核酸の異なる集団のうちの１または複数、またはすべてが、アレイの２以上の異なる領域に結合され、アレイ上で実質的に繰り返され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づいていてよい。アレイへの第１の核酸の結合の検出は、二色システムによって行うことができる。
【００７６】
治療剤
治療剤が本明細書に記載される。本発明は、特定の個体、例えば本発明のプロセスによって同定された個体において、乳がんの予防または治療に使用するための薬剤を提供する。これは、治療有効量の薬剤を必要とする個体に投与する工程を含み得る。本発明は、特定の個体において乳がんを予防または治療するための薬剤の製造における前記薬剤の使用を提供する。
【００７７】
好ましい治療剤は、がん細胞の増殖を妨害するために使用される細胞傷害性薬物である。乳がんを治療するために一般的に使用される多数の異なる化学療法薬がある。これらには、シクロホスファミド、エピルビシン、フルオロウラシル（５ＦＵ）、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトザントロン、ドキソルビシン、ドセタキセル（タキソテール）およびゲムシタビン（ジェムザール）が含まれる。通常、患者には約３種類の化学療法薬が併用される。この治療剤は、がん細胞の増殖を引き起こすホルモンのレベルを低下させることができる。ホルモン療法に使用されるさまざまな薬物には、アナストロゾール（アリミデックス）、エキセメスタン（アロマシン）、レトロゾール（フェマーラ）およびタモキシフェンが含まれる。治療剤は、癌性細胞間の相互作用を妨害し、それによって細胞分裂および増殖を停止させる薬物などの生物学的療法であることができる。生物学的療法に一般的に使用される薬物には、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ラパチニブ（タイバーブ）、ペルツズマブ（パージェタ）およびエベロリムス（アフィニトール）が含まれる。
【００７８】
薬剤は、薬剤の性質に応じて製剤化される。薬剤は、該薬剤と医薬として許容される担体または希釈剤とを含有する医薬組成物の形態で提供される。適切な担体および希釈剤には、等張性生理食塩水、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。典型的な経口投薬組成物には、錠剤、カプセル、溶液および懸濁液が含まれる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮または経口投与用に製剤化することができる。
【００７９】
薬剤の用量は、さまざまなパラメータ、特に使用される物質、治療されるべき個体の年齢、体重および状態、投与経路、および必要とされる投薬計画に応じて決定することができる。医師は、任意の特定の薬剤の必要な投与経路および投薬量を決定することができる。しかしながら、適切な用量は、例えば１日当たり１〜３回服用されるように、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよい。
【００８０】
本明細書に記載の物質の形態
本明細書に記載の核酸または治療剤などの物質のいずれかは、精製または単離された形態であり得る。それらは、自然界に見出されるものとは異なる形態であってもよく、例えば、他の物質との天然には生じない組み合わせで存在してもよい。核酸（本明細書で規定される配列の部分を含む）は、天然に見出される配列とは異なる、例えば、相同性に関する節に記載されるように配列中に少なくとも１、２、３、４つまたはそれ以上のヌクレオチド変化を有する配列を有してもよい。核酸は、５’または３’末端に異種配列を有することができる。核酸は、天然に見出されるものと化学的に異なるものであってもよく、例えば、何らかの方法で修飾されてもよいが、ワトソン−クリック塩基対形成が依然として可能であることが好ましい。適切な場合、核酸は、二本鎖または一本鎖形態で提供される。本発明は、本明細書において言及される特異的核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖形態で提供し、したがって、開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
【００８１】
本発明はまた、乳がんに関連する染色体相互作用の検出または乳がんの診断を含む、本発明の任意のプロセスを実施するためのキットを提供する。このようなキットは、本発明のプロセスによって生成された連結核酸を検出することができる薬剤のような、関連する染色体相互作用を検出することができる特異的結合剤を含むことができる。キット中に存在する好ましい薬剤には、例えばＰＣＲ反応において連結核酸を増幅することができる、本明細書に記載のように連結核酸またはプライマー対にハイブリダイズすることができるプローブが含まれる。
【００８２】
本発明はまた、関連する染色体相互作用を検出することができるデバイスを提供する。このデバイスは、好ましくは、本明細書に記載の任意のこのような薬剤、プローブまたはプライマー対のような、染色体相互作用を検出することができる任意の特異的結合剤、プローブまたはプライマー対を含む。
【００８３】
検出方法
一実施形態では、染色体相互作用に関連する連結配列の定量的検出は、ＰＣＲ反応中に活性化すると検出可能なプローブを用いて行われ、前記連結配列は、エピジェネティック染色体相互作用において一体となる２つの染色体領域からの配列を含み、前記方法は、ＰＣＲ反応の間に前記連結配列を前記プローブと接触させ、前記プローブの活性化の程度を検出する工程を含み、前記プローブは前記連結部位に結合する。この方法は、典型的には、二重標識蛍光加水分解プローブを使用して、ＭＩＱＥに準拠した様式で特定の相互作用の検出を可能にする。
【００８４】
プローブは、一般に、不活性な状態と活性な状態とを有する検出可能な標識で標識され、活性化された場合にのみ検出される。活性化の程度は、ＰＣＲ反応において存在する鋳型（連結産物）の程度に関連する。検出は、ＰＣＲの全体または一部の間、例えば、ＰＣＲサイクルの少なくとも５０％または８０％の間に行うことができる。
【００８５】
プローブは、オリゴヌクレオチドの一端に共有結合したフルオロフォアと、ヌクレオチドの他端に結合したクエンチャーとを含むことができ、フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光される。一実施形態では、フルオロフォアはオリゴヌクレオチドの５’末端に結合し、クエンチャーはオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合している。本発明の方法に使用できるフルオロフォアには、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ヤキマイエロー、ＨＥＸ、シアニン３、ＡＴＴＯ  ５５０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド、シアニン３．５、ＬＣ６１０、ＬＣ６４０、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、シアニン５、シアニン５．５およびＡＴＴＯ６８０が含まれる。適切なフルオロフォアと共に使用することができるクエンチャーには、ＴＡＭ、ＢＨＱ１、ＤＡＢ、Ｅｃｌｉｐ、ＢＨＱ２およびＢＢＱ６５０が含まれ、任意に前記フルオロフォアはＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択される。フルオロフォアとクエンチャーの好ましい組み合わせには、ＦＡＭとＢＨＱ１、およびテキサスレッドとＢＨＱ２が含まれる。
【００８６】
ｑＰＣＲアッセイにおけるプローブの使用
本発明の加水分解プローブは、典型的には濃度が一致する陰性対照により温度勾配最適化される。好ましくは、単一工程ＰＣＲ反応が最適化される。より好ましくは、標準曲線が計算される。連結配列の接合部をまたいで結合する特異的プローブを用いる利点は、連結配列に対する特異性が、ネステッドＰＣＲアプローチを使用することなく達成され得ることである。本明細書に記載の方法は、低コピー数標的の正確かつ的確な定量化を可能にする。標的連結配列は、温度勾配最適化の前に精製、例えばゲル精製することができる。標的連結配列を配列決定することができる。好ましくは、ＰＣＲ反応は、約１０ｎｇ、または５〜１５ｎｇ、または１０〜２０ｎｇ、または１０〜５０ｎｇ、または１０〜２００ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いて行われる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、一方のプライマーが連結ＤＮＡ配列中に表される染色体領域の１つの配列に結合し、他方のプライマーが連結ＤＮＡ配列中に表される他の染色体領域に、例えば、前記配列に相補的であることによって結合するように設計される。
【００８７】
連結ＤＮＡ標的の選択
本発明は、本明細書で定義されるＰＣＲ法で使用するためのプライマーおよびプローブを選択する工程であって、連結配列に結合して増幅するそれらの能力に基づいてプライマーを選択すること、および結合する標的配列の特性、特に、標的配列の湾曲に基づきプローブ配列を選択することを含む工程を含む。
【００８８】
プローブは、典型的には、制限部位にまたがる並置された制限断片である連結配列に結合するように設計／選択される。本発明の一実施形態では、特定の染色体相互作用に関連する連結配列候補の予測湾曲が、例えば本明細書で参照される特定のアルゴリズムを用いて計算される。湾曲は、ヘリカルターン当たりの角度、例えば１０．５°／ヘリカルターンとして表すことができる。連結配列は、連結配列が少なくとも５°／ヘリカルターン、典型的には少なくとも１０°、１５°または２０°／ヘリカルターン、例えば５°〜２０°／ヘリカルターンの湾曲傾向ピークスコアを有する場合に標的とするように選択される。好ましくは、ヘリカルターン当たりの湾曲傾向スコアは、連結部位の上流および／または下流の２０〜４００塩基など、少なくとも２０、５０、１００、２００または４００塩基について計算される。したがって、一実施形態では、連結産物中の標的配列は、これらのレベルの湾曲のいずれかを有する。標的配列は、最低の熱力学的構造自由エネルギーに基づいて選択することもできる。
【００８９】
特定の実施形態
特定の実施形態では、ＩＧＦＢＰ３における染色体相互作用は、型付け／検出されない。
【００９０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子のいずれかにおける染色体相互作用は、型付け／検出されない：一実施形態では、以下の遺伝子のいずれかは型付け／検出されない：
ＢＣＡＳ１、ＺＮＦ２１７、ＴＳＨＺ２、ＳＵＭＯ１Ｐ１、ＭＩＲ４７５６、ＢＣＡＳ３、ＴＢＸ２、Ｃ１７ｏｒｆ８２、ＴＢＸ４、ＢＣＡ５４、ＬＩＮＣ００６５１、ＵＢＥ２Ｖ１、ＴＭＥＭ１８９、ＣＥＢＰＢ、ＬＯＣ２８４７５１、ＰＴＰＮＩ、ＭＩＲ６４５、ＦＡＭ６５Ｃ  ＰＡＲＤ６８、ＡＤＮＰ、ＬＩＮＣ００４９４、ＰＲＥＸ１、ＡＲＦＧＥＦ２、ＣＳＥ１Ｌ、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＳＥＣ２２Ｂ、ＮＯＴＣＨ２ＮＬ  ＮＢＰ１０、ＨＦＥ２，ＴＸＮＩＰ、ＰＯＬＲ３ＧＬ、ＡＮＫＲＤ３４Ａ、ＬＩＸ１Ｌ、ＲＢＭ８Ａ、ＧＮＲＨＲ２、ＰＥＸ１１Ｂ、ＩＴＧＡ１０、ＡＮＫＲＤ３５、ＰＩＡＳ３、ＮＵＤＴＩ７、ＰＯＬＲ３Ｃ、ＲＮＦ１１５、ＣＤ１６０、ＰＤＺＫ１、ＧＰＲ８９Ａ、ＺＮＦ３３４。ＯＣＳＴＡＭＰ、ＳＬＣ１３Ａ３、ＴＰ５３ＲＫ、ＳＬＣ２Ａ１０、ＥＹＡ２、ＭＩＲ３６１６、ＺＭＹＮＤ８、Ｌ０Ｃ１００１３１４９６、ＤＬＧ１、ＭＩＲ４７９７、ＤＬＧ１−ＡＳ１、ＢＤＨ１、ＬＯＣ２２０７２；９、ＫＩＡＡ０２２６、ＭＩＲ９２２、ＦＹＴＴＤｌ、ＬＲＣＨ３、ＩＱＣＧ、ＲＰＬ３５Ａ、ＬＭＬＮ、ＡＮＫＲＤ１８ＤＰ、ＤＤＸ５９、ＣＡＭＳＡＰ２、ＧＰＲ２５、Ｃ１ｏｒｆ１０６、ＫＩＦ２１Ｂ、ＣＡＣＮＡ１５、ＡＳＣＬＳ、ＴＭＥＭ９、ＩＧＦＮ１、ＰＫＰ１、ＴＮＮ２、ＬＡＤ１、ＴＮＮＩ１、ＰＨＬＤＡ３、ＮＣＯＡ１、ＰＴＲＨＤ１、ＣＥＮＰＯ、ＡＤＣＹ３、ＤＮＡＪＣ２７、ＤＮＡＪＣ２７−ＡＳ１、ＥＦＲ３Ｂ。ＰＯＭＣ、ＤＮＭＴ３Ａ、ＭＩＲ１３０１、ＤＴＮＢ、ＳＰＯＮ２、ＬＯＣ１００１３０８７２、ＣＴＢＰ１、ＣＴＢＰ１−ＡＳ１、ＭＡＥＡ、ＵＶＳＳＡ、ＣＲＩＰＡＫ、ＦＡＭ５３Ａ、ＳＬＢＰ、ＴＭＥＭ１２９、ＴＡＣＣ３、ＦＧＦＲ３、ＬＥＴＭ１、ＷＨＳＣ１、ＳＣＡＲＮＡ２２、ＷＨＳＣ２、ＭＩＲ９４３、Ｃ４ｏｒｆ４８、ＮＡＴ８Ｌ、ＰＯＬＮ、ＨＡＵＳ３、ＭＸＤ４、ＭＩＲ４８００、ＺＦＹＶＥ２８、ＬＯＣ４０２１６０、ＲＮＦ４、ＬＯＣ１ＯＯ５０６１９０、Ｃ９ｏｒｆ５０、ＮＴＭＴ１、ＡＳＢ６、ＰＲＲＸ２、ＰＴＧＥＳ、ＴＯＲ１Ｂ、ＴＯＲ１Ａ、Ｃ９ｏｒｆ７８、ＵＳＰ２０、ＦＮＢＰ１、ＧＰＲ１０７、ＮＣ５１、ＡＳＳ１。
【００９１】
一実施形態では、染色体内相互作用のみが型付け／検出され、（異なる染色体間の）染色体外相互作用は型付け／検出されない。
【００９２】
刊行物
本明細書に記載のすべての刊行物の内容は、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明に関連する特徴をさらに規定するために使用することができる。
【００９３】
特定の実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常状態と異常状態との間の調節変化のエピジェネティックな調節シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られているヒト染色体の調節的高次構造に関連する遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定およびモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子調節解除のカスケードにおける明確な主要工程である。それらは、ＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングのような後期エピジェネティックバイオマーカー、および遺伝子発現バイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、独特の利点のセットを有する高次バイオマーカーである。
【００９４】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの４種の密度で独自の染色体コンフォメーションを持ち、各キメラ断片がアレイ上で４回反復され、有効密度はそれぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１００万になる。
【００９５】
カスタム設計のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーディスカバリー技術を使用して調べた約３００の遺伝子座を含む全ゲノムをスクリーニングすることができる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨ  マイクロアレイプラットフォーム上に構築されており、この技術は、４種の密度、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１００万のプローブを提供する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブは４連で表示されるため、アレイ当たりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、２５０Ｋに減少し、再現性の統計的評価が可能になる。遺伝子座当たりの調べるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー候補の平均数は５０であり、調査できる遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【００９６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリー生成後にＣｙ５で標識されたサンプルの１つのセットと、Ｃｙ３で標識された比較／分析されるサンプル（対照）のもう１つのセットとの２色システムである。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎスキャナーを使用してスキャンされ、得られた特徴はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを使用して抽出される。その後、データはＲでＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを使用して処理される。このアレイは、ＲでのＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：Ｌｉｍｍａ＊の標準２色パッケージを使用して処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ＊のアレイ内正規化機能を使用して行い、これは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対して行われる。データはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルタリングされ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは削除され、技術的複製プローブはＬｉｍｍａ＊を使用して解析するために平均化される。プローブは、比較される２つのシナリオの間の差異に基づいてモデル化され、偽発見率を使用して補正される。さらなるスクリーニングのために、変動係数（ＣＶ）≦３０％で、≦−１．１または≧１．１であり、ｐ≦０．１ＦＤＲのｐ値を有するプローブが使用される。プローブセットを減らすために、ＲでＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを使用して、多因子分析がさらに実行される。
＊注：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差次的発現を評価するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑから生じる遺伝子発現データの解析用のＲパッケージである。
【００９７】
プローブのプールは、最終的なピッキングのための調整ｐ値、ＦＣおよび＜３０％のＣＶ（任意のカットオフ点）のパラメータに基づいて最初に選択される。さらなる解析および最終リストは、最初の２つのパラメータ（調整ｐ値；ＦＣ）のみに基づいて導かれる。
【００９８】
本明細書に記載の遺伝子
ＴＳＰＹＬ５−ＴＳＰＹ様５
ＳＲＤ５Ａ１−ステロイド５α−レダクターゼ１
ＭＡＰ３Ｋ１−マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ１
ＶＡＶ３−ｖａｖグアニンヌクレオチド交換因子３
ＡＴＭ−ＡＴＭセリン／スレオニンキナーゼ
ＳＬＣ１６Ａ１０−溶質輸送体ファミリー１６メンバー１０
ＭＥ３−リンゴ酸酵素３
【００９９】
本発明は、以下の非限定的な例によって例示される。
【０１００】
例１
統計的パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに転換するための高い値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＲのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージを使用して処理する。
【０１０１】
工程１
プローブは、修正線形回帰モデルの産物である補正ｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択される。ｐ値≦０．１より下のプローブが選択され、その後、それらのエピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに縮小され、プローブＥＲは、さらなる解析のために≦−１．１または≧１．１で選択されなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは≦０．３より下でなければならない。
【０１０２】
工程２
統計リストの上位４０種のマーカーは、ＰＣＲ翻訳のためのマーカーとして選択するために、それらのＥＲに基づいて選択される。最も高い負のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカーおよび最も高い正のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカーによりリストを形成する。
【０１０３】
工程３
工程１から得られたマーカーである統計的に有意なプローブは、超幾何濃縮（ＨＥ）を用いた濃縮解析のベースを形成する。この解析は、有意なプローブリストからのマーカーの縮小を可能にし、工程２のマーカーと併せて、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに転換されるプローブのリストを形成する。
【０１０４】
統計プローブはＨＥによって処理され、どの遺伝子位置が統計的に有意なプローブの濃縮を有するかを判定し、どの遺伝子位置がエピジェネティックな差の中心であるかが示される。
【０１０５】
補正ｐ値に基づく最も有意な濃縮遺伝子座を、プローブリストの生成のために選択する。ｐ値が０．３または０．２より下の遺伝子位置を選択する。これらの遺伝子位置にマッピングされた統計的プローブは、工程２からのマーカーと共に、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ転換のための高い値のマーカーを形成する。
【０１０６】
アレイの設計と処理
アレイ設計
１．遺伝子座を、ＳＩＩソフトウェア（現在ｖ３．２）を使用して次のように処理する：
ａ．これらの特異的遺伝子座においてゲノムの配列（５０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流の遺伝子配列）を抜き出す。
ｂ．この領域内の配列がＣＣｓに関与する確率を規定する
ｃ．特異的ＲＥを使用して配列を切断する。
ｄ．どのような制限断片が特定の方向に相互作用する可能性が高いかを判定する
ｅ．異なるＣＣｓが相互に作用する可能性をランク付けする。
２．アレイのサイズ、したがって利用可能なプローブ位置の数（ｘ）を決定する
３．ｘ／４の相互作用を抜き出す。
４．各相互作用に対して、パート１の制限部位まで３０ｂｐの配列を、パート２の制限部位まで３０ｂｐの配列を規定する。これらの領域が繰り返しではないことを確認し、繰り返しであれば除外してリスト上の次の相互作用を選ぶ。両方の３０ｂｐを接合して、プロ−ブを規定する。
５．ｘ／４プローブと規定された対照プローブのリストを作成し、４回複製してアレイ上に作り出されるリストを作成する
６．カスタムＣＧＨアレイのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎウェブサイトにプローブリストをアップロードする。
７．プローブ群を使用して、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
【０１０７】
アレイ処理
１．鋳型作製のためにＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＳＯＰ）を使用してサンプルを処理する。
２．アレイ処理ラボでエタノール沈殿によりクリーンアップを行う。
３．Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ標識キットによるサンプルの処理−血液、細胞または組織のゲノムＤＮＡ解析酵素標識のためのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙに基づくＣＧＨ
４．Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔの特徴抽出ソフトウェアを使用したスキャン。
【０１０８】
乳がんの概要
年齢別の発生率は、浸潤性乳がんの年齢効果がアジア系人口と西洋系人口間で同様であることを示している。実際、最近の世代のアジアの乳がん率は、米国での歴史的に高い率を上回っており、アジア系人口の間の効率的な予防と治療戦略の緊急な必要性が強調されている。しかし、大規模な２５年の調査の結果、マンモグラフィーは乳がん関連死亡率を低下させなかったことが示された。腫瘍が巨視的になる前の乳がんの早期発見は、がんがより治療可能なステージで医学的介入の開始を可能にすることを意味する。
【０１０９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術の概要
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、異常および応答性の遺伝子発現に関連する主要な疾患のスクリーニング、早期発見、コンパニオン診断、モニタリングおよび予後分析の非常に有効な手段を提供する。このアプローチの主な利点は、非侵襲性で迅速であり、不安定なタンパク質／ＲＮＡ分子ではなく、染色体シグネチャーの一部として非常に安定したＤＮＡベースの標的に依存することである。
【０１１０】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーシグネチャーは、複雑な疾患の表現型の層別化において高い堅牢性、感度および特異度を示す。この技術は、エピジェネティックバイオマーカーの非常に有益なクラスとして、エピジェネティックスの科学、染色体コンフォメーションシグネチャーのモニタリングおよび評価における最新のブレークスルーを利用している。学術環境に配備された現在の研究方法論は、ＣＣＳを検出するための細胞材料の生化学的処理に３〜７日間を必要とする。これらの手順は感度と再現性に限界があり、さらに、設計段階でＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージによって提供された標的化された洞察の恩恵を受けていない。
【０１１１】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージ
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、調節の主要なエピジェネティックフレームワークの一部として、ヒト染色体の高次構造の変化を検出する。染色体の遠隔部位を並置すると、特異的なタイプのバイオマーカー−調節性染色体コンフォメーションシグネチャーが形成される。このプロセスにおける最大の課題の１つは、高次構造の一部を形成する染色体の遺伝子／遺伝子座における潜在的部位を同定することである。これは、所与の配列内の潜在的部位を同定する独自のパターン認識ソフトウェアの使用によって行われる。機械学習アルゴリズムを含むＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージソフトウェアは、ＣＣＳの高次構造を形成する可能性が高いＤＮＡのパターンを特定する。
【０１１２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによるインシリコマーカーの同定
ゲノムにわたるＣＣＳ部位は、すべての関連する層別化リードバイオマーカーの同定のために、試験コホートからの臨床サンプルについて、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって直接評価される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームは、ハイスループット能力と多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングする能力とのために、マーカーの同定に使用される。使用したアレイは、ＡｇｉｌｅｎｔのカスタムＣＧＨアレイであり、インシリコソフトウェアを介して調べるべきマーカーを同定することができる。
【０１１３】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ
次いで、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって同定されたマーカー候補は、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）のＰＣＲまたはＤＮＡシーケンサー（すなわち、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｍｉｎｉｏｎなど）のいずれかによって検証される。統計的に有意であり、最良の再現性を示す上位のＰＣＲマーカーは、最終的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）シグネチャーセットにさらに縮小されるように選択され、サンプルの独立したコホートについて検証される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲは、確立された標準化操作手順プロトコルに従って、熟練した技術者によって実施することができる。すべてのプロトコルおよび試薬の製造は、作業の質およびプロトコルの移行能力を保証するために、ＩＳＯ  １３４８５および９００１の認定に基づいて実施される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲおよびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイバイオマーカープラットフォームは、全血および細胞株の両方の分析に適合している。この試験は、少量の血液を使用して非常に少ないコピー数における異常を検出するのに十分な感度を有する。
【０１１４】
概要
本発明者らは、乳がん診断におけるコンパニオン診断法として使用されるバイオマーカーを同定するための基礎として、エピジェネティック染色体相互作用を使用した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームは、乳がんに関与する表現型変化を引き起こすようなエピジェネティックな調節シグネチャーの変化を検出するために発明者らによって開発された。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームは、エピジェネティックな転写機構に環境的きっかけを統合する際の初期調節プロセスを規定するＣＣＳを同定する。したがって、ＣＣＳは、遺伝子調節のカスケードにおける初期工程である。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームによって単離されたＣＣＳは、いくつかの十分に文書化された利点：厳しい生化学的および生理学的安定性；それらのバイナリ特性および読出し；ならびに遺伝子調節の真核生物カスケードにおけるそれらの初期位置；を有する。
【０１１５】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームを本発明に適用し、その結果をＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォーム上に転換して、以下の目的：
１．乳がん患者と健常個体を識別するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの同定；
２．現行の臨床実務に関連して、感度、特異度または陽性予測値（ＰＰＶ）の基準を提供する試験に発展させることができるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの同定；
を果たした。
【０１１６】
この乳がんバイオマーカー発見プロジェクトでは、５６，９６４個までの潜在的染色体コンフォメーションを４連で調査することが可能な、８×６０ｋのアレイが利用された。８つのプールされた健常対照患者サンプルに対して個別に試験されたさまざまなバックグラウンドから８つのステージＩＩ／ＩＩＩ乳がん患者サンプルを用いて２つのアレイを作製した。各アレイは、５６，９６４個のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブを含んでいた。各サンプルに対するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）鋳型を調製した。第１のアレイは、アジア系乳がんサンプルで実施した。第２のアレイは、ヨーロッパ系およびアジア系のサンプルを使用した。アジア系とヨーロッパ系の乳がんは、ＥＲ＋とＥＲ−のステータスが異なる可能性がある。複数の集団において同様のがんについて重複するプローブが見出された。次いで、各プローブをデータの統計的品質について試験し、その後下記のように分析した。
【０１１７】
血液サンプルの品質管理結果
この研究で使用したサンプルはマレーシア由来であった。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイに適した血液サンプルの生化学的品質は、ヘモグロビンによって例示されるように、サンプルの酸化およびタンパク質変性の程度によって直接影響を受ける。これらの２つのパラメータは、サンプル処理の前に血液の品質を評価する標準的な手段である。簡単に言えば、酸素化ヘモグロビン（オキシヘモグロビン）が酸化されると、メトヘモグロビンが形成され、グロビンドメインが変性するとメトヘモグロビンはヘミクロムに変換される。スペクトル変化を使用して、Ｗｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ（１９９０）、Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０；１８６：２６５−７２によって記述された、各ヘモグロビン画分の吸光係数に基づく品質管理方法によって各画分の存在量を計算した。この文書に従って、各サンプルの品質管理の一部として、血液をＰＢＳで希釈し、分光光度計（Ｅｐｏｃｈ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ＢｉｏＴｅｋ））で５６０、５７７および６３０ｎｍにおいて分析した。３つのヘモグロビン画分のそれぞれのマイクロモル濃度を標準的な計算に従ってモニターした：μＭオキシヘモグロビン＝１１９＊Ａ５７７−３９＊Ａ６３０−８９＊Ａ５６０、μＭメトヘモグロビン＝２８＊Ａ５７７＋３０７＊Ａ６３０−５５＊Ａ５６０、μＭヘミクロム＝−１３３＊Ａ５７７−１１４＊Ａ６３０＋２３３＊Ａ５６０。オキシヘモグロビン：メトヘモグロビン比が０．７５以上であることを示すサンプルが、品質管理を通過し、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）処理に適していると考えられた。１１種のサンプルは、ヘモグロビンＱＣを通過できず（サンプルＢｒＣａＭａ１３２、ＢｒＣａＭａ１３６、ＢｒＣａＭａ１３７、ＢｒＣａＭａ１４７、ＢｒＣａＭａ１６４、ＢｒＣａＭａ１６５、ＢｒＣａＭａ１６６、ＢｒＣａＭａ１６７、ＢｒＣａＭａ１６８、ＢｒＣａＭａ１６９、およびＢｒＣａＭａ１７０）、酸化および変性のそれらの生化学的状態に基づいて除外した。
【０１１８】
【表１−１】
2019521701.tif 000002
【表１−２】
2019521701.tif 000003
【表１−３】
2019521701.tif 000004
【表１−４】
2019521701.tif 000005
【表１−５】
2019521701.tif 000006
【表１−６】
2019521701.tif 000007
【０１１９】
処理されたすべてのサンプルのエピジェネティックプロファイリングは、外れ値についての第２の品質管理を含んでいた。シップメント１２２（部位２バッチ２対照）は、他のすべての部位およびシップメントと基本的に異なる分布および品質を示した。外れ値制御の標準的な実施によれば、部位２バッチ２（シップメント１２２）からの３０のサンプルは、試験の開発から除外された。
【０１２０】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイの結果
・両方のデータセットは、多くの有意なプローブを生成した；
・アレイ１、ＢＣａ１  ４１８５個の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した；
・アレイ２、ＢＣａ２  ４８５６個の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した；
・２つの研究の間で一致した２１１６個の有意なプローブが、両方の分析の間で重複していた（図１参照）。
【０１２１】
すべてのデータを元からとり、すべての過剰に供給されたプローブを除外した。それらを、チャネル間のデータを均等にするために正規化した。各データセットの４つの複製物のすべてを一緒に組み合わせ、変動係数を決定した。２１１６個のプローブを、正規化された相関値を用いて絞り込み、アレイ上で最も変化した遺伝子をランク付けした。濃縮度解析を使用して、偶然よりも高い最も差次的に発現する遺伝子を見出した。全体的に、ＢＣａ１およびＢＣａ２の組み合わせアレイからの１３８個のマーカーが、上方制御または下方制御された異なる発現を示した。アレイ１由来の４１個のマーカーおよびアレイ２由来の３９個のマーカーを含む上位８０個のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカー（付録Ｉ参照）を、乳がんと健常対照との間を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲアッセイによる検証のために利用した。
【０１２２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームおよびマーカー検証
プライマーは、マイクロアレイ上で同定されたマーカーからＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）ソフトウェア（および必要に応じてＰｒｉｍｅｒ３ウェブバージョン４．０．０ソフトウェア）を用いて設計した。各プライマーセットについてプライマー試験を行った。適切なプライマーが潜在的な相互作用を研究できるように、各セットをサンプルのプールされたサブセットで試験した。プライマー試験が成功した場合、プライマーセットをスクリーニングに取り入れた。
【０１２３】
１６８種のサンプルを使用した。これらのサンプルを２セットに分け、１１８種の患者サンプル（６８種のＢｒＣａおよび５０種の対照）をマーカー縮小およびモデル開発に使用し、残りの５０種のサンプル（３１種のＢｒＣａおよび１９種の対照）を、最初の１１８種の患者セットから開発された最終モデルを検証するための独立したコホートとして使用した。部位２、シップメント１２２（バッチ２として定義される）からの３０種の対照サンプルは、品質管理手順において外れ値であることが判明したので最終的な患者セットに使用しなかった。
【０１２４】
プライマーのスクリーニング
この試験を使用して、非特異的プライマーを除外し、プライマーが３Ｃコンフォメーションループの検出を可能にしているかどうかを判定した。すべての抽出血液サンプルを１：２〜１：６４に希釈した。初期結果は、バイナリ形式、すなわち、「１」−はい、バンドが正しいサイズで存在する、または「０」−いいえ、バンドが正しいサイズで存在しない、で生成した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲによるすべての読出しは、陽性対照および陰性対照の両方の検出を＞９５％の精度で行った。
【０１２５】
スクリーニング１
５１種のプライマーセットがプライマー試験段階に首尾よく合格し、８種のＢｒＣａおよび８種の対照の血液サンプルについて試験した。最初のスクリーニングでは、サンプルはアレイ上で使用されたものと一致した。
【０１２６】
【表２】
2019521701.tif 000008
【０１２７】
スクリーニング２
識別を示すプライマーセットを、さらに１２種のＢｒＣａおよび１２種の対照の血液サンプルでスクリーニングした。アッセイ感度の範囲を同定するために、１：２〜１：６４希釈系列を使用した。スクリーニング１および２の結果を併合して、使用した２０種のサンプルすべての完全な表示を得た。さらに２４種のＢｒＣａおよび２４種の対照および最後に残りのサンプルを試験した。
【０１２８】
スクリーニング３
最終的な２０種のＢｒＣａおよび２０種の対照サンプルを、各プライマーセットに対するアッセイの検出感度範囲に及ぶ最も有益な３つの希釈液を用いてスクリーニングした。最終的な２０のサンプルのスクリーニングに合計１３種のマーカーを使用した。スクリーニング３の結果を９０種のＢｒＣａおよび９０の種の対照のサンプルと併合して、ＢｒＣａおよび対照の両方に使用された１００種のサンプルの完全な表示を得た。次いで、ＢｒＣａ患者と対照サンプルとの識別の有効性について試験した。カイ２乗検定（フィッシャーの正確検定）を作成し、最終的なマーカーを得た。
【０１２９】
【表３】
2019521701.tif 000009
【０１３０】
希釈係数３と組み合わせた１３種のプライマーによる３９種のマーカーのマーカー縮小
最終的に選択された１３の位置および３９種のマーカーを作業分類モデルに縮小するために、Ｒ統計的言語を用いるＧＬＭＮＥＴパッケージを使用した。ＧＬＭＮＥＴは、リッジまたはｌａｓｓｏ回帰（マーカーの共直線性を省略）を可能にするペナルティ付（ｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔペナルティ）回帰モデルを実行する。ｌａｓｓｏ回帰を用いた多変量ロジスティック回帰分析を患者セット１について行った。［図３を参照］
【０１３１】
【表４】
2019521701.tif 000010
【０１３２】
ロジスティック回帰分析
Ｗａｉｋａｔｏ  ｔｏ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＥＫＡ）ソフトウェアバージョン３．６．１２を使用してロジスティック回帰分析を行った。この分析を用いて、患者セット１（１１８種の患者、６８種のＢｒＣａおよび５０種の対照）について、感度および特異度の分類関数が確立され、ＧＬＭＮＥＴ分析によって８つのマーカーを同定した。
【０１３３】
【表５】
2019521701.tif 000011
【０１３４】
モデル検証
次いで、８つのマーカーのロジスティックモデルを患者セット２（３１種のＢｒＣａおよび１９種の対照）で試験したが、これらの患者はマーカーを縮小させるために使用しない、独立したデータセットである。
【０１３５】
【表６】
2019521701.tif 000012
【０１３６】
主成分分析（ＰＣＡ）は、複雑なデータセットを簡素化するための探索的多変量統計解析技術である。ｎ個の変数に対してｍ個の観測値を与えると、ＰＣＡの目的は、ｎより小さい新しいｒ個の変数を見つけることによってデータ行列の次元数を減らすことである。主成分と呼ばれるこれらの新しい変数ｒは、相互に相関関係なく直交しながら、元の変数ｎの分散の大部分を可能な限り多く占める。各主成分は、元の変数の線形結合であるため、多くの場合、構成要素の表す意味に帰することができる。主成分分析は、外れ値遺伝子の探索におけるマイクロアレイデータの分析ならびに他のタイプの発現データの分析を含む広範な生物医学的問題に使用されてきた。
【０１３７】
【表７−１】
2019521701.tif 000013
【表７−２】
2019521701.tif 000014
【表７−３】
2019521701.tif 000015
【表７−４】
2019521701.tif 000016
【表７−５】
2019521701.tif 000017
【０１３８】
結論
品質管理手順により、他の部位およびシップメントからの他のすべてのサンプルとプロファイルおよび品質が根本的に異なるサンプルとして、シップメント１２２（部位２  対照）を同定し、除外した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）方法論による結果の染色体コンフォメーション分析およびロジスティック回帰は、８５．７％の感度、８０％の特異度、８５．７％のＰＰＶおよび８０％のＮＰＶの交差検定結果を有する乳がん患者および健常対照の１１８種のサンプルを層別化した８つのバイオマーカーのシグネチャーを開発した。５０種のサンプルの独立コホート検証は、８３．３％の感度、１００％の特異度、１００％のＰＰＶおよび８０％のＮＰＶのバイオマーカーを示した。
【０１３９】
【表８−１】
2019521701.tif 000018
【表８−２】
2019521701.tif 000019
【表８−３】
2019521701.tif 000020
【０１４０】
【表９−１】
2019521701.tif 000021
【０１４１】
【表９−２】
2019521701.tif 000022
【０１４２】
【表９−３】
2019521701.tif 000023
【０１４３】
上の表９の３つのセクションは、マーカーセット１の最終的な８つのマーカーについての情報を提供している。
【０１４４】
【表１０】
2019521701.tif 000024
【０１４５】
例２
オックスフォードバイオダイナミックス（ＯＢＤ）は異常な遺伝子発現およびエピジェネティクスの分野における特許取得済みのプラットフォーム技術を提供するヘルスケアサービス会社である。特許取得済みのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、エピジェネティックな調節シグネチャーの変化を検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームは、エピジェネティックおよび転写機構に環境的きっかけを組み込む際の初期調節プロセスを定義する染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）を同定する。したがって、ＣＣＳは、遺伝子調節のカスケードにおける初期工程である。
【０１４６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見プラットフォームによって単離されたＣＣＳは、いくつかの利点：
→厳しい生化学的および生理学的安定性；
→それらのバイナリ特性および読出し；
→遺伝子調節の真核生物カスケードにおけるそれらの初期位置；
を有する。
【０１４７】
遺伝子座における特定のコンフォメーションシグネチャーは、病理学または治療に関連する調節的なエピジェネティック制御の設定により、存在または非存在となる。ＣＣＳは軽度の解離速度を有し、特定の表現型または病理を表す場合、それらは、新しい表現型への生理学的なシグナル伝達により、または外部介入の結果としてのみ変化する。さらに、これらの事象の測定値はバイナリであるため、この読出しは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾およびほとんどの非コードＲＮＡのさまざまなレベルの連続読出しとは著しく対照的である。現在までの用いられている大部分の分子バイオマーカーについての連続読出しは、特定のバイオマーカーの変化の大きさが患者によって大きく変動するという点で、データ分析に困難な課題を提供し、患者を層別化するために使用される分類統計に問題を引き起こす。これらの分類統計および推論アプローチは、大きさの欠けているバイオマーカーの使用によくて適しており、表現型の違いの「はい  または  いいえ」バイナリスコアを提供し、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＣＳバイオマーカーが、潜在的な診断、予後および予測バイオマーカーのための優れた供給源であることを示す。
【０１４８】
ＯＢＤは、一次および二次罹患組織との高い一致および有力な検証結果により、その開発されたすべての適用において、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーが非常に広まっていることを一貫して観察してきた。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーシグネチャーは、複雑な疾患の表現型の層別化において高い堅牢性、および高い感度および特異度を示す。ＯＢＤ技術は、エピジェネティクスの科学における最新の進歩を利用しており、エピジェネティックバイオマーカーの非常に有益なクラスとして、染色体コンフォメーションシグネチャーの発見、モニタリング、および評価のためのユニークで唯一の工業品質のＩＳＯ認証プラットフォームを提供する。
【０１４９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、異常および応答性の遺伝子発現に関連する主要な疾患のスクリーニング、早期発見、コンパニオン診断、モニタリングおよび予後分析の非常に有効な手段を提供する。ＯＢＤアプローチの主な利点は、非侵襲性で迅速であり、不安定なタンパク質／ＲＮＡ分子ではなく、染色体シグネチャーの一部として非常に安定したＤＮＡベースの標的に依存することである。
【０１５０】
技術概要
ＣＣＳは、エピジェネティックな制御の安定した調節フレームワークを形成し、細胞の全ゲノムにわたる遺伝情報にアクセスする。ＣＣＳの変化は、結果が明らかな異常として現れる前に、調節様式および遺伝子発現の早期変化を反映する。ＣＣＳの簡単な考え方は、ＤＮＡの異なる遠隔調節部分が、近接して互いの機能に影響を与えるトポロジカルな配置であることである。これらの接続はランダムに行われるわけではなく、それらは高度に調節され、有意なバイオマーカー層別化力を有する高レベルの調節機構として十分に認識されている。適用されたエピジェネティクスの急速に発展している分野では、ＣＣＳは代替のバイオマーカープラットフォームに対して大きな利点を提供する。新しいバイオマーカーの実体として、ＣＣＳの発見、モニタリングおよび検証は、品質、安定性、感度、再現性、コストおよび操作回転率の性能に関して業界が許容する技術を必要とする。
【０１５１】
ゲノムにわたってＣＣＳの高次構造を形成する可能性が高いＤＮＡは、すべての関連する層別リードバイオマーカーの同定のための試験コホートからの臨床サンプルについてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって直接評価される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングの後、統計的に有意な層別化バイオマーカーのプールは通常３００リードを超える。次いでいくつかのリードがＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＣＲに転換される。層別化バイオマーカーの最小シグネチャー（＜１５）は標準的な検証を受け、一度確認され、検証されたシグネチャーはバイナリＣＣＳを含み、これは特定の病理を有する患者においてエピジェネティックな調節の条件バイオマーカーとして存在するか、または非存在である。ＯＢＤ技術は、エピジェネティクスの科学における最新の進歩を利用しており、染色体コンフォメーションシグネチャーの発見、モニタリング、および評価のためのユニークで唯一の工業品質のＩＳＯ認証プラットフォームを提供する。
【０１５２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アッセイ
臨床サンプルの独自の生化学処理によりエピジェネティックＣＣＳバイオマーカーの配列ベースの分析物への迅速かつ効果的な（４時間未満）変換が得られ、次いでこれがＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＧＨアレイプラットフォームの改訂バージョン）、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲまたはＤＮＡシーケンサー、すなわちＲｏｃｈｅ  ４５４、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｍｉｎｉｏｎなどにより読み出される。
【０１５３】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ分析
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームは、ハイスループットで多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングできる能力のため、マーカーの同定に使用される。このプロジェクトで使用されているアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔのカスタム−ＣＧＨアレイであり、これによりＯＢＤはインシリコソフトウェアで同定されたマーカーを調べることができる。
【０１５４】
このプロジェクトは、１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイを使用してグループ１（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）からのサンプルを有するアレイを用いて実施するが、分析の範囲を広げるために、サンプルは異なる民族性と併せて使用し、アレイから供給されるデータの幅を広げた。その代わりに、２つの８ｘ６０ｋアレイを使用し、これにより、最大５６，９６４の潜在的染色体コンフォメーションを４連に調べることができるので、このプロジェクトでは６０ｋのアレイを使用した。これを使用して、最大１４，０００のプローブで染色体コンフォメーションシグネチャーを４連に見ることができる。８種のプールされた健常対照患者サンプルに対して個別に試験されたさまざまなバックグラウンドから８種のステージＩＩ／ＩＩＩ乳がん患者サンプルを用いて２つのアレイを作製した。各サンプルに対するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）鋳型を調製した。第１のアレイは、ＯＢＤによって調達されたアジア系乳がんサンプルについて実施した。第２のアレイはポーランド系コホートと独立したアジア系サンプルコホートとを使用した。アジア系およびヨーロッパ系の乳がんは、ＥＲ＋およびＥＲ−の状態の間、ならびに他のサブタイプの罹患率およびエピジェネティックプロファイルが異なる可能性がある。複数の集団において同様のがんについて重複するプローブが見出された。
【０１５５】
分析の主な結果は、
・両方のデータセットは、多くの有意なプローブを生成した；
・アレイ１、ＢｒＣａ１  ４１８５個の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した；
・アレイ２、ＢｒＣａ２  ４８５６個の有意なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを、乳がん対健常対照の分析において同定した；
・２つの研究の間で一致した２１１６種の有意なプローブが、両方の分析の間で重複していた；
であった。
【０１５６】
図１は、ＢｒＣａ１（表１１）およびＢｒＣａ２（表１２、ポーランド系コホートを含む）アレイからの有意なプローブの比較を示す。プローブはｐ値＜０．０５に調整した。
【０１５７】
すべてのデータを元からとり、すべての過剰に供給されたプローブを除外した。チャネル間のデータを均等にするために正規化を行った。各データセットの４つすべての複製物を一緒に組み合わせ、変動係数を決定した。２１１６個のプローブを、正規化された相関値を用いて絞り込み、アレイ上で最も変化した遺伝子をランク付けした。濃縮度解析を使用して、偶然よりも高い最も差次的に発現する遺伝子を見出した。したがって、全体的に、ＢｒＣａ１およびＢｒＣａ２の組み合わせアレイからの１３８個のマーカーが、差次的な上方制御または下方制御された発現を示した。アレイで使用したサンプルは可能な限り年齢が近くなるようにあわせ、アレイは年齢範囲３３〜６８歳、アレイ２は３２〜６５歳であった。
【０１５８】
【表１１】
2019521701.tif 000025
【０１５９】
【表１２】
2019521701.tif 000026
【０１６０】
スクリーニング１、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの検証
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲアッセイは、標準化された操作手順プロトコルに従って、熟練した技術者によって実施することができる分子生物学的試験である。すべてのプロトコルおよび試薬製造は、作業の質およびプロトコルの伝達能力を保証するために、ＩＳＯ  １３４８５および９００１の仕様書に従って実施される。
【０１６１】
プライマーは、マイクロアレイにより同定されたマーカーからＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）ソフトウェア（および必要に応じてＰｒｉｍｅｒ３ウェブバージョン４．０．０ソフトウェア）を用いて設計した。サンプルの品質管理は、抽出された単一サンプルについてＭＭＰ１プライマーを用いて実施した。すべてのサンプルは、ＭＭＰ１について陽性の結果を示し、これらのサンプルはＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲに続けることが可能であった。すべての抽出血液サンプルを１：２〜１：６４に希釈し、ネステッドＰＣＲを実施した。初期結果は、バイナリ形式、すなわち、「１」−はい、バンドが正しいサイズで存在する、または「０」−いいえ、バンドが正しいサイズで存在しない、で生成した。
【０１６２】
統計解析後、アレイ１由来の４１個のマーカーおよびアレイ２由来の３９個のマーカーを含む上位８０個のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを、乳がんサンプルの間を層別化するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲアッセイによる検証のために利用した。
【０１６３】
８種のＢｒＣａおよび８種の対照サンプルのスクリーニングの第１ラウンドの後、マーカーを５１種に縮小し、第２ラウンドはさらに３６種のＢｒＣａおよび３６つの対照サンプルを使用し、マーカーをＢｒＣａと対照患者との間を層別化できる１３個の良好なマーカー（表１３）に縮小した。
【０１６４】
【表１３】
2019521701.tif 000027
【０１６５】
スクリーニング２、ＧｌｉｗｉｃｅサンプルについてのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ検証
スクリーニングは、５０のＧｌｉｗｉｃｅサンプルおよび２２の対照サンプルについて１３の良好なマーカーを用い、１：２〜１：６４の希釈系列を用いて行った。バイナリデータの結果については、付録の表１８を参照されたい。スクリーニング実施後、最終マーカーを得るために、カイ２乗検定（フィッシャーの正確検定）の使用によって対照サンプルからＢｒＣａを識別する有効性についてバイナリ結果を試験した。
【０１６６】
次いで、ＧＬＭＮＥＴおよびベイズロジスティックモデリング統計を用いて１３個のマーカーの結果を評価した。次いで、良好なスコアを有する１０個のマーカー（表４）を強調した。
【０１６７】
【表１４】
2019521701.tif 000028
【０１６８】
追加の統計解析によりマーカーをさらに縮小した。２４種のサンプルを使用する、６６％のトレーニングセットおよび３４％のテストセットを有する分類ランダムツリーを使用した。
【０１６９】
正確に分類されたインスタンスは１９（７９．１６６７％）であり、誤って分類されたインスタンスは５（２０．８３３３％）であり、これはカッパ統計量０．５および平均絶対誤差０．２３２２をもたらした。平均絶対誤差は０．４６５６であり、相対絶対誤差は５５．２９３４％であり、二乗平方根誤差は１０８．４２８６％であった
【０１７０】
【表１５】
2019521701.tif 000029
【０１７１】
最終的な８個のマーカーを、ＧＬＭＮＥＴを使用して生成した
【０１７２】
【表１６】
2019521701.tif 000030
【０１７３】
サンプルの独立した分類
最終段階では、ロジスティックモデリングおよび５分割交差検証を使用して、２５のサンプルの独立したコホートについてマーカーの層別化を試験した。
【０１７４】
【表１７】
2019521701.tif 000031
【０１７５】
これは、独立したコホート検証において、分類子が、８３．６％の感度および９１．０％の特異度およびＲＯＣ値０．９０３が可能な選択マーカーに基づくことを示す。これは、バイナリ分類子の性能が高い基準であることを意味し、ＲＯＣは最高１であり、最低０．５である。
【０１７６】
結論
この研究の目的は、乳がんを有する、または乳がんの素因がある女性の全血におけるエピジェネティックな変化を判定し、次にバイオマーカーを診断的層別化に使用することであった。
【０１７７】
対照患者からの乳がん患者の診断と関連して、５６９６４個の染色体相互作用候補を調べるために、６０ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイが開発された。
【０１７８】
アジア系のＢｒＣａと対照の患者サンプルを有する第１のアレイ、アジア系とポーランド系のＢｒＣａサンプル、および対照サンプルを有する第２のアレイの２つのアレイを作製し、これは２つのアレイ間に任意の類似のマーカーがあるかどうかを確認可能にするものであった。これは最終的に、異なる民族群間でマーカーのより奥深い発見を可能にする。アレイ分析の後、４１８５個および４８５６個のプローブが見出され、２１１６個の有意なプローブが重複していた。プローブの補正、正規化を行い、対照患者から乳がんの診断を決定するために使用できる１３８個のマーカー候補を見出した。さらなる統計的縮小を行い、ＰＣＲスクリーニングを行う上位８０個のマーカーを生成した。数回のスクリーニングの後、１３個のマーカーが、それらのスクリーニング力に堅牢性を示し、それぞれ０．３以上のｐ値を有した。これらの１３個のマーカーを使用して、その後Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｇｌｉｗｉｃｅ  Ｂｒａｎｃｈ（ＩＯＧ）からの５０種のＢｒＣａサンプル、および２２種の対照患者サンプルをスクリーニングした。段階希釈の後、ネステッドＰＣＲスクリーニングを行い、次いでバイナリ読出しを分析し、どのマーカーがＢｒＣａと対照とを識別できるかを判定して、最終的に８個のマーカーを絞り込んだ。表１６を参照されたい。
【０１７９】
【表１８】
2019521701.tif 000032
【０１８０】
分析の最終段階は、８個のマーカーが対照患者からの乳がん患者の診断に使用できるかどうかを判定することであった。マーカーがサンプルを正しく予測できるかどうかを判断するために、２５種のサンプルの独立したサブセットを使用してロジスティックモデリングを実行した。２５種のサンプルのうち、これらのマーカーは８３．６％の感度および９１．０％の特異度を示し、ＲＯＣ値は０．９０３であった。
【０１８１】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングによって見出されたマーカーはまた、がん診断における興味深い特徴を示す。血管拡張性失調症変異キナーゼ（ＡＴＭ）はＤＮＡ損傷応答に重要な役割を果たし、機能の喪失は癌の発症につながる可能性があり、それらはまた、持続的な腫瘍増殖においてシグナル伝達経路に関連している。ＡＴＭは、陽性乳がん細胞株におけるＨＥＲ２（ヒト表皮成長因子受容体２）の腫瘍形成能を促進する。ＡＴＭは、ＨＳＰ９０（熱ショックタンパク質）およびＨＥＲ２を有する三量体化合物に関与し、いくつかの腫瘍において同定されている。乳がんの重大なリスクは、ＣＨＥＫ２、ＰＡＬＢ２およびＴＰ５３に関連しており、ＡＴＭの突然変異で中程度のリスクがある。
【０１８２】
遺伝子ＳＬＣ１６Ａ１０、溶質輸送体ファミリー１６（芳香族アミノ酸トランスポーター）、メンバー１０は、腎臓、肝臓および腸で強く発現することが知られている、芳香族アミノ酸を選択的に輸送するＮａ＋非依存性トランスポーターシステムであるシステムＴに関与する。その関連経路には、グルコースおよび他の糖、胆汁酸塩および有機酸、金属イオンおよびアミン化合物の輸送、タンパク質の消化および吸収がある。この遺伝子に関連するＧＯアノテーションには、トランスポーター活性が含まれる。ユニポーターＴＡＴ１（Ｓｌｃ１６ａ１０）は、特定の膜を横切るＡＡＡの濃度を平衡させるために必要である。
【０１８３】
Ｖａｖ３は、前立腺癌の腫瘍形成において重要な役割を果たす癌遺伝子であり、乳がんにおいても発現および上方制御される。Ｖａｖタンパク質は、ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅのグアニンヌクレオチド交換因子である。それらは、細胞シグナル伝達および腫瘍形成に関与している。Ｖａｖ３は細胞の成長および増殖を促進する。乳がんおよび前立腺癌は、それらの成長がそれぞれのホルモン受容体によって媒介されるホルモン非依存性腫瘍である。Ｖａｖ３は、乳がんの発生においてエピジェネティックに調節される。
【０１８４】
ＭＳＨ３、ＭｕｔＳホモログ３は、結腸直腸癌、乳がん、前立腺癌、膀胱癌、甲状腺癌、卵巣癌および食道癌などのいくつかの異なるタイプのがんと関連している。ミスマッチ修復経路は、細胞周期調節、アポトーシスおよびＤＮＡ損傷に関与する。ヒトには７つのミスマッチ修復遺伝子があり、ＭＳＨ３遺伝子に関しては１８０のＳＮＰが報告されている。ＭＳＨ３タンパク質発現の喪失は結腸直腸癌に関連し、多型ｒｓ２６２７９Ｇは乳がんのリスクと関連している。
【０１８５】
ＦＯＸＣ１、フォークヘッドボックスＣ１は、胚発生中の中胚葉、脳および眼の発達に関与する転写因子であり、基底細胞様乳がんの重要な診断マーカーとなり得る。ＦＯＸＣ１のレベル上昇は、肺癌や肝細胞癌などのがんにおいて生存率が低いことを予測している。ＦＯＸＣ１タンパク質は、基底細胞において排他的に発現される。ＦＯＸＣ１は、Ｇｌｉ２転写因子の直接相互作用を介してヘッジホッグシグナル伝達のスムーズヘッド（ＳＭＯ）非依存性活性化因子として同定されている。
【０１８６】
これらの結果は、特定の遺伝子座の３Ｄクロマチン構造のレベルにおいてエピジェネティックな調節解除としてモニタリングされた、非常に強固で特異的なマーカーセットを示し、高度な信頼性を有する対照サンプルから乳がん患者サンプルを層別化するのを助けることができる。
【０１８７】
【表１９−１】
2019521701.tif 000033
【表１９−２】
2019521701.tif 000034
【表１９−３】
2019521701.tif 000035
【０１８８】
【表２０】
2019521701.tif 000036
【０１８９】
例３
この例に記載された研究は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびｑＰＣＲによって型付けされた１３個のネステッドマーカーに関する（下記の表１９を参照）。これらのマーカーは、非悪性個体から乳がん患者を識別するために開発した。
【０１９０】
【表２１】
2019521701.tif 000037
【０１９１】
ｑＰＣＲ開発の概要は次のとおりである：
−ネステッドＰＣＲプライマー
−単一工程ＳＹＢＲ  ＰＣＲ（温度勾配最適化）
−ゲル精製
−蛍光光度計の測定、配列決定、相同性およびゲノムマッピングチェック
−加水分解プローブの最適化
−患者サンプルを用いた標準曲線試験。
【０１９２】
この研究は、少量の血液サンプルを用いて非悪性物質から乳がん患者を識別するために使用できるエピジェネティックな変化を同定することであった。
【０１９３】
元の試験評価作業からの血液サンプルを含むアジア系コホートからの血液サンプルを、ＭＩＱＥ（定量的リアルタイムＰＣＲ実験の公表に必要な最小限の情報）ガイドラインに従ってｑＰＣＲプローブアッセイを検証するために使用した。
【０１９４】
各マーカーｑＰＣＲプローブおよび個々の検出アッセイを、品質検出のための以下のＭＩＱＥ準拠基準を満たすために、サンプルの代表的なプール（４×４）上で温度勾配にわたって開発および試験した：
１．特異度：予測されたＰＣＲアンプリコンを配列決定で検証した。
２．線形標準曲線（Ｒ２＞０．９８）。
３．効率（Ｅ）、Ｅ＞９０％。
４．すべてのアッセイにゲノム非特異的交差反応対照を使用。
【０１９５】
要件は、ネステッドマーカーの少なくとも７０％が、アッセイの性能が上記の４つの基準を満たす加水分解プローブを用いた検出のために開発されることであった。
【０１９６】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ｑＰＣＲアッセイ開発データ
ＣＣＳバイオマーカーをネステッドＰＣＲによって確認した。すべての開発ＰＣＲはＱＩＡｇｉｌｉｔｙを使用して作製した。ウェル当たり１０ｎｇの３Ｃサンプル鋳型を、単一工程温度勾配ＰＣＲおよびＳＹＢＲに基づく検出を用いて、濃度が一致した陰性対照を用いてスクリーニングした。１０種の相互作用を同定し、配列決定した。配列データをＥＮＳＥＭＢＬに提出し、予測された３Ｃ相互作用のそれぞれのゲノム位置をＥＮＳＥＭＢＬ  ＢｌａｔおよびＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いて確認した。加水分解プローブを、確認された各相互作用の接合領域に対して設計し、温度勾配によって最適化した。すべてのサンプルは、安定な独立した３Ｃ相互作用（ＭＭＰ１）について陽性であった。すべてのアッセイは、患者サンプルｎ＝８（４＝乳がん、４＝非悪性）、標準曲線および濃度一致陰性対照で試験した。
【０１９７】
元の配列決定電気泳動図を含む開発プロセスのプライマーデータを、各ｑＰＣＲアッセイについて明白で簡単に確認できるフォーマットで提示する。アッセイはアルファベット順に行う。プローブの温度勾配最適化の間、１０６コピーの標準を陽性対照として用いた。患者サンプルを１〜１０６コピーの間の曲線を用いて試験した。報告書に記載されている各アッセイについて、患者スクリーニング中の標準曲線の分析における任意の変化を記録する。
【０１９８】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ｑＰＣＲアッセイの概要
ＡＴＭ＿１１＿１０８１１８１３７＿１０８１２６３７２＿１０８１５５２７９＿１０８１５６６８７＿ＲＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは４７２ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定の後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ（図１）。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９６。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９１．７％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．このアッセイにより、患者（ｎ＝８）のサブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）の間に大きなコピー数の差が示される（表２０）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０１９９】
サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定の後のＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。
このＰＣＲ産物を配列決定し、染色体１１ｑ２２．３にマッピングした。２つの３Ｃ断片をＴａｑ  Ｉ（ＴＣＧＡ）において連結する。配列トレースの上は、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴマッピングデータ（配列相同性は赤色）である。
【０２００】
【表２２】
2019521701.tif 000038
【０２０１】
ＣＤＣ６＿１７＿３８４２１０８９＿３８４２３０７９＿３８４５１１９６＿３８４５７０５０＿ＦＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：バンドは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは４２８ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０１〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。効率９０．７％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．このアッセイにより、患者（ｎ＝８）のサブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）の間に大きなコピー数の差が示される（表２）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２０２】
【表２３】
2019521701.tif 000039
【０２０３】
ＦＯＸＣ１＿６＿１５７７２５３＿１５８１９８９＿１６０４２０６＿１６０５９７３＿ＦＲ。
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：バンドは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは２０８ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０１〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９２。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。このアッセイの効率は１０１．６％であった（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．このアッセイにより、患者（ｎ＝８）のサブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）の間に大きなコピー数の差が示される（表２１）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２０４】
サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定の後のＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。
ＦＯＸＣ１  ウェルＢ７  ２０８ｂｐの単一工程増幅（内部プライマー）のラボチップ画像。このＰＣＲ産物を配列決定し、染色体６ｐにマッピングした。
【０２０５】
【表２４】
2019521701.tif 000040
【０２０６】
ＭＡＰ３Ｋ１＿５＿５６１０２２５９＿５６１１０５００＿５６１４０２２７＿５６１４４０７６＿ＦＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは４９５ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９９。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９１．９％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．患者（ｎ＝８）のサブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）の間のコピー数の差（表２２）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２０７】
サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定の後のＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。
このＰＣＲ産物を配列決定し、染色体５ｑ１１．２にマッピングした。
【０２０８】
【表２５】
2019521701.tif 000041
【０２０９】
ＭＥ３＿１１＿８６３０００６３＿８６３０４４０１＿８６４２０５３７＿８６４２６２００＿ＦＲ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは２９１ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９８。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９６．８％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．患者（ｎ＝８）サブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）間のアッセイの差異（表５）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２１０】
【表２６】
2019521701.tif 000042
【０２１１】
ＭＥＬＫ＿９＿３６５７７６３０＿３６５７９２４３＿３６６３７０５０＿３６６４３００５＿ＲＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは２６５ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９５。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９１．３％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．患者（ｎ＝８）サブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）間のアッセイの差異（表２４）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２１２】
サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定の後のＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。
このＰＣＲ産物を配列決定し、染色体９ｐ１３．２にマッピングした。
【０２１３】
【表２７】
2019521701.tif 000043
【０２１４】
ＭＳＨ３＿５＿８００２１９１３＿８００２５０３０＿８０１５３９４８＿８０１５９０１２＿ＲＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは２０７ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９７．１％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．患者（ｎ＝８）サブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）間のアッセイの差異（表２５）。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２１５】
サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定の後のＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。
このＰＣＲ産物を配列決定し、染色体５ｑ１４．１にマッピングした。
【０２１６】
【表２８】
2019521701.tif 000044
【０２１７】
ＮＦ１＿１７＿２９４７７１０３＿２９４８３７６４＿２９６５１７９９＿２９６５７３６８＿ＦＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：期待されるサイズのアンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは４０１ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９８７。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９９％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
ｖｉ．このアッセイにより、患者（ｎ＝８）サブセット（Ｃ０１〜Ｃ１２＝乳がん、Ｄ０１〜Ｄ１２＝非悪性）間の差異（表２６）が示される。ＳＱ＝開始量、２０ｎｇの鋳型のコピー。ＮａＮ＝０コピー。
【０２１８】
【表２９】
2019521701.tif 000045
【０２１９】
ＳＲＤ５Ａ１＿５＿６６３４９７３＿６６３９０２５＿６６６７７７５＿６６６９７１１＿ＲＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは２１９ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９７。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９５．５％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
【０２２０】
ＴＳＰＹＬ５＿８＿９８２７６４３１＿９８２８２７３６＿９８３１６４２１＿９８３１８７２０＿ＦＦ
ｉ．３Ｃの鋳型を単一工程で増幅した。
ｉｉ．ラボチップ画像。コメント：アンプリコンは、パラホルムアルデヒド固定サンプル（テンプレート１０ｎｇ）でだけ見ることができる。単一工程ＰＣＲ産物の予想サイズは５０７ｂｐである。
ｉｉｉ．サンプルＰＣＲ産物の直接配列決定後の、ＥＮＳＥＭＢＬ  ＢＬＡＴ。コメント：良質の配列決定（フォワードおよびリバースプライマー）は、予測される３Ｃ相互作用との１００％の相同性を有する。
ｉｖ．定量的ＰＣＲアッセイ標準曲線の性能。標準曲線は１０２〜１０６コピーから線形である。Ｒ２＝０．９９８。
ｖ．１つのアンプリコンが倍増し、２つを生み出すことが効率１００％である。アッセイの効率＝９４．２％（ＭＩＱＥガイドラインは＞９０％）。
【０２２１】
結論：
１．３ＣマーカーＡＴＭ、ＦＯＸＣ１およびＴＳＰＹＬ１により、両方のプライマーセットについての単一工程産物が生成された。
２．ＡＴＭコピー数は乳がんにおいて増加する（ｎ＝４、表１）。Ｃ行（悪性末期疾患乳がん）のサンプルは、ｐ−値０．００９０３７７７２でＤ行（非悪性早期）とは異なる。
３．ＣＤＣ６＿ＦＦのコピー数は乳がんにおいて減少する（ｎ＝４、表２）。
４．ＦＯＸＣ１＿ＦＲのコピー数は乳がんにおいて減少する。行Ｃは、行Ｄと異なり、ｐ値が０．００４１１２６６８である。
【０２２２】
【表３０】
2019521701.tif 000046
【０２２３】
＞ＡＴＭ＿１１＿１０８１１８１３７＿１０８１２６３７２＿１０８１５５２７９＿１０８１５６６８７＿ＲＦ
下線＝フォワード、二重下線＝リバース、点線下線＝Ｔａｑ  Ｉ。
ＡＡＧＧＧＡＴＡＡＧＴＡＡＣＣＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＣＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＴＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＣＴＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＡＴＴＣＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＧＧＣＡＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴＡＣＴＣＡＧＣＣＴＣＴＡＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＴＣＡＡＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＡＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＴＴＡＡＴＣＴＴＡＣＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＡＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＣＧＴＴＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＴＧＴＡＴＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＴＡＧＣＡＴＡＡＡＡＴＴＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＡＧＴＴＧＴＡＣＡＴＴＴＣＡＧＴＧＧＴＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＴＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴＡＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＣＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡ
【０２２４】
【表３１】
2019521701.tif 000047
【０２２５】
＞ＣＤＣ６＿１７＿３８４２１０８９＿３８４２３０７９＿３８４５１１９６＿３８４５７０５０＿ＦＦ
ＡＧＧＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＣＧＣＴＧＴＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＣＴＴＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＴＡＣＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＡＴＡＡＴＧＣＴＡＴＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＧＧＧＴＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＴＧＴＡＡＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＡＡＣＣＣＡＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴ
【０２２６】
【表３２】
2019521701.tif 000048
【０２２７】
＞ＦＯＸＣ１＿６＿１５７７２５３＿１５８１９８９＿１６０４２０６＿１６０５９７３＿ＦＲ
ＣＧＣＣＧＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＧＡＴＡＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＧＡＣＣＧＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＣＧＣＡＣＡＧＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＣＧＴＴＡＧＴＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＣＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＧＴＴＧＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣＣＡＡＴＡＡＴＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＣＧＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＡＴＴＧＧＣＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＣＡＣＡＡＴＧＴＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＴＣＡＡＴＴＡＡＡＡＧＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＧＴＣＴＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＧＴＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＡＴＧＡＧＡＧＴＴＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧ
【０２２８】
【表３３】
2019521701.tif 000049
【０２２９】
＞ＭＡＰ３Ｋ１＿５＿５６１０２２５９＿５６１１０５００＿５６１４０２２７＿５６１４４０７６＿ＦＦ
ＡＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＧＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＴＣＡＧＴＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＧＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＡＣＧＴＡＧＡＧＴＣＣＡＧＧＧＡＣＴＡＧＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＣＣＧＧＣＣＧＧＴＧＧＣＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＴＣＧＧＡＴＴＣＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＧＴＧＡＣＡＴＴＡＣＣＧＡＧＣＡＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＣＧＣＧＣＴＡＴＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＧＴＡＣＧＧＧＡＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＣＡＡＡＴＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡＴＡＡＴＡＡＧＡＧＧＧＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＧＣＴＡＣＴＡＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡＧＴＣＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＴＡＡＡＧＴＡＣＡＴＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＴＡＴＴＡＡＣＴＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＣＴＣＴＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＧＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＣ
【０２３０】
【表３４】
2019521701.tif 000050
【０２３１】
＞ＭＥ３＿１１＿８６３０００６３＿８６３０４４０１＿８６４２０５３７＿８６４２６２００＿ＦＲ
ＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＡＴＣＴＡＴＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＣＴＧＣＡＴＧＧＧＧＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＧＴＡＴＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＴＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＧＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＣＡＴＡＧＴＡＡＡＡＧＴＴＡＧＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＡＧＧＣＡＣＣＧＴＡＣＡＡＣＡＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＴＡＡＣＣＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＴＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＡＴＡＣＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＡＧＡＣＴＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＧＴＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡＧＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＧＴＴＡＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＡＡＣＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＣＧＣＴＴＡＡＡＧＴＧＴＴＴＡ
【０２３２】
【表３５】
2019521701.tif 000051
【０２３３】
ＭＥＬＫ＿９＿３６５７７６３０＿３６５７９２４３＿３６６３７０５０＿３６６４３００５＿ＲＦ
ＡＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＴＡＣＡＧＧＴＧＴＧＡＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＣＡＴＴＧＴＡＣＡＡＣＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＡＴＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＡＡＧＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＴＴＣＡＣＣＴＣＧＡＣＴＡＧＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＣＧＣＴＴＧＴＴＡＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＣＧＣＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＴＣＣＣＧＡＣＣＴＣＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＣＧＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＣＴＴＧＣＴＡＴＡＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＴＣＴＴＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧ
【０２３４】
【表３６】
2019521701.tif 000052
【０２３５】
ＭＳＨ３＿５＿８００２１９１３＿８００２５０３０＿８０１５３９４８＿８０１５９０１２＿ＲＦ
ＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＡＣＣＡＡＣＧＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＡＣＧＡＣＴＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＡＡＴＡＧＡＴＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＡＴＣＴＣＡＡＡＧＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＴＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＣＡＡＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＧＴＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＴＡＡＡＡＣＴＧＡＴＡＴＣＡＣＧＴＣＣＣＡＣＣＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＡＴＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＡＴＴＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＧＴＡＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＴＡＡＴＴＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣＡＡＴＣＡＧＧＣＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＴＡＴＧＴＴＡＧＧＧＴＣＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＡＴＡＧＡＣＡＴＴＴＴＣＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＴＡＡＡＣＴＴＧＧＣＴＴＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＡＣＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＡＣＡＴＧＣＴＡＧＡＧＡＧＴＧＴＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＧＴＣＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＡＧＴＧＴＣＴＴＧＴＴＡＧＣＡＴＧＴＣＴＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＴＣＴＧＡＧＣＧＴＧＴＡＴＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＧＧＴ
【０２３６】
【表３７】
2019521701.tif 000053
【０２３７】
＞ＮＦ１＿１７＿２９４７７１０３＿２９４８３７６４＿２９６５１７９９＿２９６５７３６８＿ＦＦ
ＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＡＧＡＡＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＣＴＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＡＧＡＧＣＴＴＴＴＧＴＧＧＣＣＴＡＣＡＣＧＡＡＴＴＧＡＣＣＡＣＡＧＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＡＧＣＡＴＣＴＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＴＡＣＴＴＡＣＧＧＴＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＡＡＧＴＡＧＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＣＴＣＡＴＡＧＴＣＣＴＡＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＴＡＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧＴＡＧＴＡＧＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＧＴＴＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＴＴＡＡＡＡＧＣＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＡＡＡＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧＧＴＡＣＡＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＴＴＡＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＧＴＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＧＴＴＣＣＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＴＡＣＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＣＴＧＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＧＴＴＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＧＴＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＣＡＧＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＣＣＣＣＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＡＧＧＧＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＡＡＣＣＡＴＡＡＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＴＡＴＡＧＧＣＴＴＴＣＣＴＡＡＡＡＴＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＧＧＡＣＴＴＡＴＧＧＴＣＣＴＡＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＡＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＴＣＡＧ
【０２３８】
【表３８】
2019521701.tif 000054
【０２３９】
＞ＳＲＤ５Ａ１＿５＿６６３４９７３＿６６３９０２５＿６６６７７７５＿６６６９７１１＿ＲＦ
ＡＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＧＡＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＡＧＣＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＡＴＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＣＣＡＴＡＣＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴＡＴＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＴＧＴＣＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＡＡＣＡＡＧＧＴＡＧＣＴＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＴＡＡＴＴＧＴＴＡＣＡＴＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＣＴＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＴＴＡＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＣＣＴＴＡＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＧＴＧＴＴＧＴＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＧＴＡＡＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＴＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＡＣＡＴ
【０２４０】
【表３９】
2019521701.tif 000055
【０２４１】
＞ＴＳＰＹＬ５＿８＿９８２７６４３１＿９８２８２７３６＿９８３１６４２１＿９８３１８７２０＿ＦＦ
ＴＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＴＣＣＧＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＡＡＴＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＣＡＴＡＧＴＧＣＣＡＧＡＣＡＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＡＡＧＴＴＴＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＣＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＴＣＴＴＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＴＡＴＡＡＧＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＡＡＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＴＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＧＡＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＧＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＴＴＡＡＴＣＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＣＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＴＧＧＣＣＴＡＴＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＴＡＡＧＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＣＴＴＴＧＡＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＴＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＡＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＴＴＴＧＴＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＧＣＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＡＣＴＡＣ
【０２４２】
＞ＣＤＣ６＿１７＿３８４２１０８９＿３８４２３０７９＿３８４６７６７７＿３８４７４９６０＿ＦＲ
ＡＧＧＴＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＡＧＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＧＴＴＣＧＣＴＧＴＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＧＴＴＧＧＡＣＧＡＡＧＡＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＧＡＣＣＴＡＴＴＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＣＴＴＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＴＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＡＣＣＣＣＡＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＣＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＡＧＣＣＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＡＧＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＧＧＧＴＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＧＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＴＣＧＣＴＴＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＧＧＡＡＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＴＧＧＧＧ
【０２４３】
＞ＳＬＣ１６Ａ１０＿６＿１１１４４１９８９＿１１１４４７３０５＿１１１４９２９５１＿１１１４９８４２１＿ＦＲ
ＴＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＴＡＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＣＣＴＴＣＴＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＡＡＧＴＡＡＣＡＣＣＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＡＣＡＧＧＴＡＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＴＡＣＴＧＣＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＡＡＡＴＴＣＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＣＡＴＡＧＡＡＡＴＴＡＧＴＡＡＣＴＴＧＡＧＴＣＡＧＴＡＧＣＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＧＴＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＡＧＡＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＡＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＣＴＴＡＡＴＡＴＧＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣＡＴＡＧＧＧＣＴＴＡＡＣＴＴＣＣＴＴＴＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＴＡＧＡＧＴＡＧＴＡＴＡＣＴＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＡＧＡＣＡＧＡＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＧＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧＣＴＴＡＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＣＴＴＴＣＴＣＴＡＡＴＣＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＡＣ
【０２４４】
＞ＶＡＶ３＿１＿１０８１４８３０３＿１０８１５８０７３＿１０８２２０２００＿１０８２２７５３３＿ＲＦ
ＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣＡＡＡＴＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＴＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＧＡＴＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＧＣＴＧＣＡＣＴＡＧＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＡＣＡＡＧＡＧＴＣＡＴＴＧＴＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＴＴＧＧＴＡＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＣＴＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＣＴＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＧＴＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＣＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＣＡＣＴＴＣＣＧＧＴＣＣＣＡＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＡＴＡＡＧＧＧＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＴＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＡＡＴＣＴＡＣＣＴＧＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＴＴＧＡＴＡＣＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＣＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＣＴＣＴ
【０２４５】
二重標識加水分解プローブを用いて、５’−ＦＡＭ／ＢＨＱ１−３’で標識された配列決定済みの相互作用を検出した。プローブは温度勾配最適化され、３Ｃ断片の接合部をまたぐように設計され、３Ｃ産物を完全に特異的に検出させる。ｑＰＣＲ標準曲線（１０６コピー〜１コピー）を、報告書の図で使用した配列決定済みの産物から作成した。
【０２４６】
３Ｃライブラリー作製のための内部対照としてのＭＭＰ１コピー試験。
【０２４７】
使用したプライマーセットおよびプローブを以下の参照配列に示す。Ｔａｑ  Ｉ部位を強調表示してある。プローブは、両方の断片の接合部にまたがり、６６．４℃のアニーリング温度において特異的である。
【０２４８】
ＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＧＧＧＴＧＡＡＣＴＡＡＡＡＧＧＣＣＴＴＴＡＡＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＣＴＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＡＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＴＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＧＧＧＡＣＡＡＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡ
ＭＭＰ  １−４  ２Ｆ  ５’−ＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＡＧＧＴＧ−３’
ＭＰＰ  １Ｆ  ５’−ＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＡＧＣＡＴ−３’
ＭＭＰ１Ｆ１ｂ２プローブ  ５’−ＦＡＭ−ＡＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＣＴＧＣＡＴＣＡ−ＢＨＱ１−３’
【０２４９】
加水分解ｑＰＣＲについてのフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ配列は、前の表に記載されている。
【０２５０】
内部対照マーカーＭＭＰ１を用いた３Ｃライブラリーコピー数試験。
【０２５１】
ＭＭＰ−１との３Ｃ相互作用を、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリーの内部対照として用いた。二重標識５’ＦＡＭ−ＢＨＱ１−３’により標識された加水分解プローブを用いて、配列決定済みの相互作用を検出した。サンプルを２０ｎｇでスクリーニングし、コピー数を記録した。上記のように２６４ｂｐ産物を定量し、すべてのサンプルを３Ｃ標的でスクリーニングする前にＬａｂＣｈｉｐ上で実行した。標的は各実験のＭＭＰ１比として表した。
【０２５２】
標準曲線によるｑＰＣＲスクリーニングおよび３Ｃ断片コピー数の推定。
【０２５３】
ｑＰＣＲテンプレートを２０ｎｇの３ＣライブラリーＤＮＡに適合させ、正常血液由来の３Ｃライブラリーを含む濃度一致の陰性対照に使用した。さらなる陰性対照には、ホルムアルデヒド固定を伴わない患者の材料、消化および連結されたライブラリー材料、および正常ゲノムＤＮＡが含まれた。３Ｃ相互作用ＭＭＰ−１を、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリー合成のための内部対照として使用した。
【０２５４】
本発明者らは、ＨＥＸ、テキサスレッド、およびＦＡＭを、一致するクエンチャーと共に使用した。
【０２５５】
【表４０】
2019521701.tif 000056
【配列表フリーテキスト】
【０２５６】
配列表１  ＜２２３＞核酸配列について「ｎはａ、ｃ、ｇ、またはｔである」
【図１】
2019521701.tif 000057
【図２】
2019521701.tif 000058
【図３】
2019521701.tif 000059
【図４】
2019521701.tif 000060
【図５】
2019521701.tif 000061
【図６】
2019521701.tif 000062
【図７】
2019521701.tif 000063
【図８】
2019521701.tif 000064
【図９】
2019521701.tif 000065
【図１０】
2019521701.tif 000066
【図１１】
2019521701.tif 000067
【図１２】
2019521701.tif 000068
【図１３】
2019521701.tif 000069
【図１４】
2019521701.tif 000070
【図１５】
2019521701.tif 000071
【図１６】
2019521701.tif 000072
【図１７】
2019521701.tif 000073
【図１８】
2019521701.tif 000074
【図１９】
2019521701.tif 000075
【図２０】
2019521701.tif 000076
【図２１−１】
2019521701.tif 000077
【図２１−２】
2019521701.tif 000078
【図２１−３】
2019521701.tif 000079
【図２２−１】
2019521701.tif 000080
【図２２−２】
2019521701.tif 000081
【配列表】
2019521701000001.app
【国際調査報告】
2019521701.tif 000082
2019521701.tif 000083
2019521701.tif 000084
2019521701.tif 000085