(57)【要約】非組み込みウイルス送達系が開示される。系は、ウイルス担体を含み、ここで、ウイルス担体は、欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。
2019520814.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を含有するウイルス担体、
ｂ．異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点、
ｃ．前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および
ｄ．少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡ
を含む、非組み込みウイルス送達系。
【請求項２】
前記ウイルス担体がレンチウイルスである、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項３】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点がパピローマウイルスに由来する、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項４】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点がヒトパピローマウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来する、請求項３に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項５】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点がヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に由来する、請求項４に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項６】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点がＨＰＶ１６の長制御領域（ＬＣＲ）に由来する、請求項５に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項７】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が配列番号１を含む、請求項６に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項８】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が配列番号１の５’トランケーションを含む、請求項６に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項９】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、配列番号１の少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約４００ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチド、または少なくとも約６００ヌクレオチド、または少なくとも約７００ヌクレオチドの５’トランケーションを含む、請求項６に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１０】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、ＨＰＶ１６の前記ＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）、Ｆｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含む、請求項６に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１１】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、ＨＰＶ１６の前記ＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）、Ｆｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含む、請求項６に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１２】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質がＥ１またはその作動可能な断片を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１３】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質がＥ２またはその作動可能な断片を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１４】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質がＥＢＮＡ−１またはその作動可能な断片を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１５】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１６】
前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質がＥ１およびＥ２またはそれらの作動可能な断片である、請求項１５に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列が単一の別個のプラスミドまたは非組み込みウイルスベクターに存在する、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１８】
前記系が、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み、前記少なくとも２つのイニシエータータンパク質をコードする配列が、単一の別個のプラスミドまたは非組み込みウイルスベクターに存在する、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項１９】
前記系が、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み、ここで、第１のイニシエータータンパク質のための配列および第２のイニシエータータンパク質のための配列が、別個のプラスミドまたは非組み込みウイルスベクターに存在する、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの遺伝子産物が、抗体、抗体断片、または増殖因子を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項２１】
前記抗体が、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片を含む、請求項２０に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項２２】
前記増殖因子が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはそのバリアントを含む、請求項２０に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項２３】
前記ｍｉＲＮＡが、ＣＣＲ５  ｍｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項２４】
請求項１に記載の前記非組み込みウイルス送達系および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを細胞中で発現させる方法であって、
前記細胞を、有効量の非組み込みウイルス送達系に接触させること
を含み、ここで、前記系が、
ｉ．欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を含有するウイルス担体、
ｉｉ．異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点、
ｉｉｉ．前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および
ｉｖ．少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡ
を含む、方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを、それを必要とする対象中で発現させる方法であって、
前記対象に、有効量の非組み込みウイルス送達系を投与することを含み、ここで、前記系が、
ｉ．欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を含有するウイルス担体、
ｉｉ．異種ウイルスエピソーム複製起点、
ｉｉｉ．異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および
ｉｖ．少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡ
を含む、方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列が、単一の別個のプラスミドに存在し、前記少なくとも１つのイニシエータータンパク質が、Ｅ１またはＥ２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの第１の発現レベルを開始させるための第１の量の前記単一の別個のプラスミドを、それを必要とする前記対象に投与することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの第２の発現レベルを開始させるための第２の量の前記単一の別個のプラスミドを、それを必要とする前記対象に投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の量が前記第１の量より低いとき、前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの発現レベルが減少する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の量が前記第１の量より高いとき、前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの発現レベルは増加する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記系が、前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの低レベルの基底発現を生じるように最適化されており、ここで、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、配列番号１またはＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項３３】
前記系が、前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの低レベルの基底発現を生じるように最適化されており、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、配列番号１またはＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項３４】
前記系が、前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの中等度レベルの基底発現を生じるように最適化されており、ここで、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項３５】
前記系が、前記少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの中等度レベルの基底発現を生じるように最適化されており、前記異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点が、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含む、請求項１に記載の非組み込みウイルス送達系。
【請求項３６】
最適化された非組み込みウイルス送達系を選択する方法であって、
基底発現レベルを選択すること
を含み、ここで、レベルＸが選択されるとき、対応するＹが選択され、ここでＹは、前記非組み込みウイルス送達系に組み入れられるように選択される異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に対応し、
Ｘ＝カーゴの基底発現の第１の規定されたレベルの場合、Ｙは、ＬＣＲ（配列番号１）またはＦｒａｇ１（配列番号２）を含み、
Ｘ＝カーゴの基底発現の第２の規定されたレベルの場合、Ｙは、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含む、方法。
【請求項３７】
前記第１の規定されたレベルが、１細胞当たり０．０２０未満のカーゴのエピソームコピーを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の規定されたレベルが、１細胞当たり０．０２０またはそれよりも高いカーゴのエピソームコピーを含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、「ＮＯＮ−ＩＮＴＥＧＲＡＴＩＮＧ  ＶＩＲＡＬ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ」との表題の、２０１６年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３４７，５５２号、「ＮＯＮ−ＩＮＴＥＧＲＡＴＩＮＧ  ＶＩＲＡＬ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＴＨＥＲＥＴＯ」との表題の、２０１６年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４３１，７６０号、および「ＮＯＮ−ＩＮＴＥＧＲＡＴＩＮＧ  ＶＩＲＡＬ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＴＨＥＲＥＴＯ」との表題の、２０１６年１２月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／６６１８５に対する優先権を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は概して、ウイルスベクター、および遺伝子送達のための系、および他の治療、診断、または調査のための使用の分野に関する。さらに具体的には、本開示の実施形態は、非組み込みウイルスベクター、および遺伝子送達のための系、および他の治療、診断、または調査のための使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルスベクターは、その特異的なウイルスエンベロープ−宿主細胞受容体相互作用および遺伝子発現のためのウイルスメカニズムのために、遺伝子および他の治療用核酸構築物を標的細胞に形質導入するために使用されてきた。その結果、ウイルスベクターは、単離された組織試料、ｉｎ  ｓｉｔｕでの組織標的、および培養された細胞系を含むがこれらに限定されない、多くの異なる細胞型への遺伝子の移入のための媒体として使用されている。外来遺伝子を細胞内に導入し、発現させる能力は、遺伝子発現の研究、ならびに細胞系統及び経路の解明、ならびに、遺伝子療法および様々なタイプの免疫療法などの治療的介入の可能性の提供に有用である。
【０００４】
レンチウイルス、マウスレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むいくつかのウイルス系が、見込みのある治療用遺伝子移入ベクターとして提案されている。しかしながら、多くのハードルが、承認された治療薬としてこれらを旺盛に利用することを妨げてきた。研究開発のハードルとしては、限定されないが、発現の安定性および制御、ゲノムパッケージング能力、ならびに構築物依存性のベクター安定性が挙げられる。さらに、ウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの適用は、ウイルス構造タンパク質および／または形質導入された遺伝子産物に対する宿主の免疫応答によって制限されることがあり、これは有害な抗ベクター免疫学的作用に至る場合がある。
【０００５】
研究者は、これらのハードルの一部を克服する方法として、安定な発現系を見出すことを試みてきた。一つのアプローチは、そのような発現系で、組換えポリペプチド、または小型ＲＮＡを含む遺伝子調節分子を利用することである。これらの系は、形質導入されたレトロウイルスゲノムまたはその少なくとも一部分の、宿主細胞のゲノムへの、染色体組み込みを採用する。これらのアプローチの重要な制限は、遺伝子組み込みの部位が一般的にランダムであり、任意の特定の部位で組み込まれる遺伝子の数および比率がしばしば予測不可能であることである。したがって、染色体組み込みに依存するベクターは、治療間隔を超え得る組換え遺伝子の永続的な維持をもたらすが、プラスミドまたは他の非複製ＤＮＡは上手く制御されず、所望の治療間隔が完了する前に崩壊する場合がある。
【０００６】
別のアプローチは、一過性発現系の使用である。一過性発現系の下では、目的の遺伝子の発現は非組み込み型プラスミドに基づくものであり、したがって、典型的には細胞がその後に分割するにつれ発現が失われたり、またはプラスミドベクターが内因性ヌクレアーゼによって破壊されたりする。したがって、一過性遺伝子発現系は、典型的には時間がたつにつれて十分な発現に至らず、典型的に反復処置を要することとなり、これは所望しない特長になると一般に理解されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
安定なウイルス送達系および方法が提供される。様々な態様では、送達系は、一過性発現系を含む。一態様によれば、送達系は、非組み込みである。別の態様では、送達系は、非組み込みであり一過性である。
【０００８】
様々な態様および実施形態では、系は、様々に、１つまたは全てのウイルス担体を含み、ここで、ウイルス担体は、欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。ウイルス担体は、レンチウイルスであり得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、パピローマウイルスに由来し得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ヒトパピローマウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来し得る。
【０００９】
異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に由来し得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６の長制御領域（ｌｏｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ：ＬＣＲ）に由来し得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１を含み得る。任意選択で、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１の５’トランケーションを含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１の少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約４００ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチド、または少なくとも約６００ヌクレオチド、または少なくとも約７００ヌクレオチドの５’トランケーションを含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）（本明細書で断片１としても参照される）、またはＦｒａｇ２（配列番号３）（本明細書で断片２としても参照される）、またはＦｒａｇ３（配列番号４）（本明細書で断片３としても参照される）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）（本明細書で断片４としても参照される）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）、Ｆｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含み得る。
【００１０】
異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、Ｅ１またはその作動可能な断片を含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、Ｅ２またはその作動可能な断片を含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、ＥＢＮＡ−１またはその作動可能な断片を含み得る。任意選択で、系は、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質は、Ｅ１とＥ２のいずれか単独または組合せ、またはそれらの作動可能な断片を含み得る。少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列は、単一の別個のプラスミドまたは非組み込みウイルスベクターに存在し得る。任意選択で、系は、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み得、ここで、少なくとも２つのイニシエータータンパク質をコードする配列は、単一の別個のプラスミドまたは非組み込みウイルスベクターに存在し得る。任意選択で、系は、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み得、ここで、第１のイニシエータータンパク質のための配列および第２のイニシエータータンパク質のための配列は、別個のプラスミドまたは非組み込みウイルスベクターに存在し得る。
【００１１】
開示された非組み込みウイルス送達系に関して、少なくとも１つの遺伝子産物は、抗体、抗体断片、または増殖因子を含み得る。抗体は、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片を含み得る。増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはそのバリアントを含み得る。ｍｉＲＮＡは、ＣＣＲ５  ｍｉＲＮＡを含み得る。
【００１２】
別の態様では、医薬組成物が開示される。医薬組成物は、本明細書において開示される非組み込みウイルス送達系および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。
【００１３】
別の態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを細胞中で発現させる方法が提供される。方法は、細胞を、有効量の非組み込みウイルス送達系に接触させることを含み、ここで、系は、ウイルス担体を含み、ウイルス担体は、１つまたは全ての欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。
【００１４】
別の態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを、それを必要とする対象中で発現させる方法が提供される。方法は、それを必要とする対象に、有効量の非組み込みウイルス送達系を投与することを含み、ここで、系は、ウイルス担体を含み、ここで、ウイルス担体は、１つまたは全ての欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列は、単一の別個のプラスミドに存在する場合があり、少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、Ｅ１とＥ２のいずれか単独または組合せ、またはそれらの作動可能な断片を含み得る。方法は、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの第１の発現レベルを開始させるための第１の量の単一の別個のプラスミドを、それを必要とする対象に投与することをさらに含み得る。方法は、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの第２の発現レベルを開始させるための第２の量の単一の別個のプラスミドを、それを必要とする対象に投与することをさらに含み得る。第２の量が第１の量より低いときの状況では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの発現レベルは減少し得る。第２の量が第１の量より高いときの状況では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの発現レベルは増加し得る。
【００１５】
別の態様では、本明細書に開示される非組み込みウイルス送達系は、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの低レベルの基底発現を生じるように最適化されている。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１またはＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含み得る。
【００１６】
別の態様では、本明細書に開示される非組み込みウイルス送達系は、系が、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの低レベルの基底発現を生じるように最適化されており、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１またはＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）を含み得る。
【００１７】
別の態様では、本明細書に開示される非組み込みウイルス送達系は、系が、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの中等度レベルの基底発現を生じるように最適化されており、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含み得る。系は、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの中等度レベルの基底発現を生じるように最適化され得、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含み得る。
【００１８】
別の態様では、最適化された非組み込みウイルス送達系を選択する方法が開示される。方法は、基底発現レベルを選択することを含む。その後、レベルＸが選択されるとき、対応するＹが選択され、ここでＹは、非組み込みウイルス送達系に組み入れられるように選択される異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に対応し、Ｘ＝カーゴの基底発現の第１の規定されたレベルの場合、Ｙは、ＬＣＲ（配列番号１）またはＦｒａｇ１（配列番号２）を含み、Ｘ＝カーゴの基底発現の第２の規定されたレベルの場合、Ｙは、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含む。複数の実施形態では、第１の規定されたレベルは、細胞当たり０．０２０未満のカーゴのエピソームコピーを含む。複数の実施形態では、第２の規定されたレベルは、細胞当たり０．０２０またはそれよりも多くのカーゴのエピソームコピーを含む。
【００１９】
さらなる態様は、例えば、感染性疾患を処置する方法を含む。さらなる態様は、感染性疾患を予防する方法を含む。別の態様では、創傷治癒を増強する方法が開示される。別の態様では、骨損傷を処置する方法が、開示される。さらなる態様は、本明細書に詳述される系を使用して遺伝性疾患を処置する方法を含む。
【００２０】
先の一般的記載および以下の詳細な説明は、例示的で説明的なものであり、特許請求の範囲に記載の本発明をさらに説明することを意図したものである。他の目的、利点、および新規な特長は、以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明から当業者に容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）の実施形態を示す図である。図１（Ａ）は、線形型のベクターを示し、図１（Ｂ）は、環状型のベクターを示す。
【００２２】
【図２】図２は、Ｅ１イニシエータータンパク質を含有する例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）の実施形態（本明細書でベクター１としても参照される）を示す図である。
【００２３】
【図３】図３は、ベクター１を使用する３つの別個の実験からの２９３Ｔ細胞における形質導入の結果を示す図である。
【００２４】
【図４】図４は、Ｅ１およびＥ２イニシエータータンパク質の両方を含有する例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）の実施形態（本明細書でベクター１９としても参照される）を示す図である。
【００２５】
【図５】図５は、（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙおよび（Ｂ）ＶＥＧＦをそれぞれ発現する例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）の実施形態を示す図である。
【００２６】
【図６】図６は、Ｅ１およびＥ２がプラスミド（Ａ）によってまたはレンチウイルス（Ｂ）でそれぞれ提供されるときの種々に記載の構築物についてのｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の発現を示す図である。
【００２７】
【図７】図７は、本明細書に詳述される実施例と組み合わせて使用される例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）の実施形態を示す図である。
【００２８】
【図８】図８は、ＨＰＶ１６長制御領域（ＬＣＲ）の断片１を含有する種々に記載の構築物についてのＶＥＧＦの発現レベルを示す図である。
【００２９】
【図９】図９は、本明細書に詳述される実施例と組み合わせて使用される例示的なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）実施形態を示す図である。
【００３０】
【図１０】図１０は、非組み込みレンチウイルスベクターのエピソーム形態の例示的な図解を示す図である。
【００３１】
【図１１】図１１は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３およびＦｒａｇ４の間のゲノム関係を示す図である。
【００３２】
【図１２】図１２は、本明細書において記載されるインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターにおけるＨＰＶ１６ｏｒｉのエピソームコピー数の分析を示す図である。
【００３３】
【図１３】図１３は、（Ａ）ＨＰＶ  ＬＣＲおよび３’断片を含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターからのｍＣｈｅｒｒｙ発現、および（Ｂ）単一ベクターからのＨＰＶ１６  Ｅ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２を発現するかまたは発現しないインテグラーゼ欠損ベクターからのｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析を示す図である。
【００３４】
【図１４】図１４は、Ｅ１、Ｅ１−ＣおよびＥ２−１１の添加後のＨＰＶ  ＬＣＲを含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターからのｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析を示す図である。
【００３５】
【図１５】図１５は、（Ａ）免疫ブロットおよび（Ｂ）ＩｇＧ濃度により決定される、ＨＰＶ  ＬＣＲを含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを使用する抗ＨＥＲ２抗体の発現を示す図である。
【００３６】
【図１６】図１６は、ＨＰＶ  ｏｒｉ配列を含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを使用する抗ＥＧＦＲ抗体の発現を示す図である。
【００３７】
【図１７】図１７は、ＨＰＶ１６の全長ＬＣＲを含有するレンチウイルスベクターを使用するＣＣＲ５発現のノックダウンを示す図である。
【００３８】
【図１８】図１８は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ２を含有するレンチウイルスベクターを使用するＣＣＲ５発現のノックダウンを示す図である。
【００３９】
【図１９】図１９は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ｏｒｉＰ配列を使用するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した細胞のＧＦＰの発現を示す図である。
【００４０】
【図２０】図２０は、ＨＰＶ１６のＦｒａｇ１、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４および全長ＬＣＲについての基底およびＥ１−Ｅ２−誘導エピソームコピー数を実証する概要を示す図である。
【００４１】
【図２１】図２１は、本明細書に詳述される実施例でさらに記載される、相対的な構造機能活性の知見に基づくＬＣＲ断片選択のための一実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書において開示されるものは、安定なウイルス送達系および方法である。様々な態様では、送達系は、一過性発現系を含む。一態様によれば、送達系は、非組み込みである。別の態様では、送達系は、非組み込みであり一過性である。
【００４３】
さらなる態様では、非組み込み性の、エピソーム複製するウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）およびその使用方法が提供される。本開示のエピソームで複製するベクターは、ウイルス様Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウシパピローマウイルスまたはＢＰＶ）またはＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エプスタイン・バーウイルスまたはＥＢＶ）またはＨｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＨＢＶ）のウイルス成分を含有し得る。これらのウイルスに由来するエピソームで複製するベクターは、複製起点および少なくとも１つのウイルストランス作用因子、例えば、ＢＰＶポリメラーゼのためのＥ１およびＥＢＶもしくはＨＢＶポリメラーゼのためのＥＢＮＡ−１などのイニシエータータンパク質、またはアデノウイルスの末端結合タンパク質を含有し得る。エピソーム複製のプロセスは、典型的には、宿主細胞の複製機構およびウイルストランス作用因子の両方を組み入れる。
【００４４】
異種ウイルスの複製起点を使用することによって、新規なベクターは、複製起点を認識するために必要なウイルスタンパク質の発現の「オフ」スイッチで操作され得る。ＤＮＡ複製をオフに切り替えることは、治療用ＤＮＡのレベルを、時間をかけて劇的に低下させる。いかなる特定の理論にも制限されないが、非複製ＤＮＡは、例えばヌクレアーゼ活性によっておよび宿主細胞が自然のアポトーシス（細胞死）事象を受けるにつれて、時間をかけて単純に分解すると考えられる。最終的にそのような非複製ＤＮＡは検出不能となって患者から時間をかけて完全にまたはほぼ消失し得る。
【００４５】
開示される系および方法は、毒性および形質導入された遺伝子の過剰発現または発現の延長から生じるあらゆる毒性効果を低減または予防する能力を含む。一旦ＤＮＡ複製が停止した遺伝子を排除することで、その後の望ましくない遺伝子発現または宿主遺伝子発現のノックダウンが予防される。同様に、エピソーム複製の有益な点を異種ウイルス系に組み合わせることによって、目的の遺伝子を様々な細胞型に安全かつ効率的に形質導入し得るプラットフォームが提供される。
パピローマウイルス
【００４６】
パピローマウイルスは、哺乳動物細胞において主にエピソームとして複製する。ＤＮＡヘリカーゼとして機能するウイルスＥ１タンパク質の、ウイルスＤＮＡ複製起点（ｏｒｉ）に対する作用が、感染した上皮細胞の分化状態に応じて細胞当たり数百から数千のＤＮＡコピーの生産を駆動する。「シャトルプラスミド」として公知になっているものを使用するパピローマウイルスに基づく遺伝子送達系の開発を試みた。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＤＮＡの生産を可能にするための細菌のＤＮＡ複製起点および哺乳動物細胞におけるエピソーム複製を可能にするパピローマウイルスｏｒｉを用いて、多くの研究が遺伝子発現の安全性および耐久性を実証するために行われた。ほとんどのケースにおいて、ｏｒｉはウシパピローマウイルスに由来するものであった。
【００４７】
パピローマウイルスは、表皮細胞および上皮細胞に感染するように進化している。感染細胞が基底面から管腔表面に分化するにつれ、パピローマウイルスはＤＮＡ複製を増大させ、コピー数は、大量のウイルスが内腔表面で放出されるまで非常に増える。これによって、ヒトパピローマウイルスから明らかであるように、パピローマウイルスは非常に伝染性となる。コピー数の急増は、主に宿主因子に起因する。しかし、パピローマウイルスのこの特長は、一時的な遺伝子療法が表皮表面および上皮表面を標的にするために利用することができる。
【００４８】
パピローマウイルスの特定の特長は、エピソームベクターの発現および複製を行わせるため、ならびにベクターの発現を特異的細胞型に標的化するために、本開示の様々な態様および実施形態に従って使用される。
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）
【００４９】
ヒトヘルペスウイルス４としても公知であるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。これは最も一般的なヒトウイルスの１つであり、ほとんどの人は人生で何度かＥＢＶに感染する。
【００５０】
ＥＢＶは、およそ８５の遺伝子を含有し、ＥＢＶは、Ｂ細胞および上皮細胞に感染することが公知である、二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＥＢＶは、溶解性複製および潜伏複製の両方が可能であり、潜伏複製によって、環状化型のＥＢＶゲノムの宿主細胞核への転座が生じ、核において、ＥＢＶは宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼによって複製され得る。
【００５１】
ＥＢＶは、少なくとも３つの異なる経路を介して潜伏複製し得るが、各経路は、エピソーム複製起点を結合し宿主細胞の分割の間のエピソームの区分化を媒介するタンパク質である、エプスタイン・バーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）の発現を伴う。ＥＢＮＡ−１は、ＥＢＶ遺伝子の調節、複製、およびエピソームの維持における不可欠な役割を有する。
【００５２】
ＥＢＶの特定の特長は、本開示の様々な態様および実施形態に従って使用される。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
【００５３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルスファミリーのメンバーである。これは、進行性肝臓線維症、肝炎、および肝細胞癌に関連する一般的なヒトウイルスである。
【００５４】
ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介しウイルスポリメラーゼに依存して複製する、二本鎖ＤＮＡウイルスである。肝細胞におけるＨＢＶの安定な維持は、根絶が困難な、共有結合により閉環したウイルスＤＮＡ環状形態の存在に起因する。
【００５５】
したがって、ＨＢＶの特定の特長は、本開示の様々な態様および実施形態に従って使用される。
レトロウイルス
【００５６】
レトロウイルスは、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡコピーを生成することが可能な逆転写酵素をコードすること、および宿主細胞染色体へのプロウイルスの組み込みを特徴とするウイルスファミリーである。レンチウイルスは、大量のウイルス核酸を宿主細胞内に送達し得るレトロウイルスの属である。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染する／形質導入する固有の能力を有することを特徴とし、形質導入の後、レンチウイルスは自らの核酸を宿主細胞の染色体に組み込む。
【００５７】
感染性レンチウイルスは、病原性タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖをコードする３つの主要な遺伝子、ならびにｔａｔおよびｒｅｖを含む２つの調節遺伝子を有する。特異的な血清型およびウイルスに応じて、ウイルス核酸の調節、合成、および／またはプロセシング、ならびにレンチウイルス感染に対する生来の細胞防御を打ち消すことを含む他の複製機能に関与するタンパク質をコードするさらなるアクセサリー遺伝子が存在し得る。
【００５８】
レンチウイルスは、およそ６００ｎｔ長であり得る長い末端反復（ＬＴＲ）領域を含有する。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域にセグメント化され得る。ＬＴＲは、インテグラーゼの作用を介して宿主染色体へのレトロウイルスＤＮＡの組み込みを媒介し得る。あるいは、インテグラーゼを機能化せずに、ＬＴＲは、ウイルス核酸を環状化するために使用され得る。
【００５９】
レンチウイルス複製の初期段階に関与するウイルスタンパク質には、逆転写酵素およびインテグラーゼが含まれる。逆転写酵素は、ウイルスによってコードされる、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼである。この酵素は、ウイルスＲＮＡゲノムを相補的ＤＮＡコピーの合成のための鋳型として使用する。逆転写酵素はまた、組み込みの用意がされた二本鎖ＤＮＡの産生を完了するためのＤＮＡ第二鎖合成のために必要なＲＮＡ鋳型の破壊のためのＲＮａｓｅＨ活性を有する。インテグラーゼは、ウイルスゲノムを宿主ＤＮＡ内に挿入する前にＬＴＲをプロセシングする。ｔａｔは、転写の間にトランス活性化因子として作用して、ウイルスＤＮＡから作製されるＲＮＡコピーの開始および伸長を増強する。ｒｅｖ応答性エレメントは転写後に作用し、ｍＲＮＡのスプライシングおよび細胞質への輸送を調節する。
【００６０】
レンチウイルスを含むレトロウイルスの特定の特長は、本開示の様々な態様および実施形態に従って使用される。
ベクター・イン・ベクター系
【００６１】
様々なウイルス種の所望の特長を組み合わせることによって遺伝子の送達および発現を正確に調節し得る、新規なベクター・イン・ベクター（ＶＩＶ）系が提供される。レンチウイルス（ＬＶ）プラットフォームを含む多くのウイルスベクターが使用され得る。レンチウイルスの形質導入は、安定な形質導入のほとんどの他の形態と同様に、ＬＶペイロード（例えば、目的の遺伝子）の染色体組み込みを生じさせる。様々な態様に従って、染色体組み込みは、ウイルスインテグラーゼ遺伝子を不活化する選択的変異を介して無効にされる。パピローマウイルスｏｒｉプラスＥ１タンパク質、またはＥＢＶ  ｏｒｉプラスＥＢＮＡ−１、またはヘパドナウイルス末端プラスウイルスポリメラーゼが、通常はエピソームで維持され得ない異種ウイルスの遺伝子カーゴの一部として本明細書において使用される。この異種ウイルス複製機構をレンチウイルスベクターに組み入れることで、目的の治療遺伝子を収容し得るおよそ５ｋｂのさらなるカーゴ空間が残る。
【００６２】
他の態様では、他の制御エレメントを、開示されるＶＩＶ系内に組み入れることができる。非限定的な例として、Ｅ１またはＥ２またはＥＢＮＡ−１またはＨＢＶポリメラーゼの発現は、誘導性プロモーターによって駆動することができる。さらに、非限定的な例として、Ｅ１および／もしくはＥ２またはそれらのバリアントは、プラスミドまたは非組み込みウイルスベクターを使用して発現させることができる。多くのタイプの誘導性プロモーターが当技術分野において公知であり、本開示の目的では、誘導性プロモーターには、限定はしないが、抗生物質（すなわち、テトラサイクリン、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、ポリミキシンなど）もしくは他の薬物、銅および他の金属、アルコール、ステロイド、光、酸素、熱、冷気、または他の物理的もしくは化学的刺激に応答するプロモーターが含まれ得る。例えば、開示されるウイルス系を使用する方法は、カーゴ遺伝子の発現のための薬物のコンスタントな供給に依存するテトラサイクリン誘導性の遺伝子発現を採用することを含む。誘導性プロモーターを誘導するために使用される化合物は、エピソーム複製の期間および所望のカーゴ送達のタイミングに応じて１回または繰り返して添加され得る。ＤＮＡ複製およびエピソームの維持は、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥＢＮＡ−１の誘導に多様に依存し、次いで、この誘導は、遺伝子発現の誘導因子（すなわち、テトラサイクリン）に依存する。
【００６３】
図１に例示的ＶＩＶ系が示される。開示されるＶＩＶは、目的の少なくとも１つの遺伝子またはヌクレオチド配列（例えば、図１Ａに示されるカーゴ）を含む。ＶＩＶに組み入れられる遺伝子または配列は、ＶＩＶの目的に依存する。図１を一般に参照すると、レンチウイルスがインテグラーゼ欠陥系でパッケージングされるか、または形質導入が、インテグラーゼ活性をブロックするために使用される臨床的薬物（例えば、ドルテグラビルまたはラルテグラビル）の存在下で行われる。組み込みが失敗すると、直鎖状の二本鎖ベクターＤＮＡは一般的に、宿主の酵素機構を使用して環状化する（例えば、図１Ｂ）。必要に応じて、薬物誘導性プロモーターは、必要に応じてＥ１および／またはＥ２タンパク質を発現させるように活性化され得、これによって次いでＤＮＡ複製を駆動する。治療カーゴは組み込まれたカセットから発現される。様々な実施形態では、誘導性プロモーターを誘導する化合物（本明細書では「誘導因子」とも呼ばれる）は、中止されるかまたは停止される。誘導因子の停止は、Ｅ１および／またはＥ２の合成を下方調節する。さらなる実施形態では、Ｅ１および／またはＥ２の生産は効果的に停止する。いずれの事象においても、これによってエピソームＤＮＡのレベルが低下し、最終的にベクター構築物が排除される。
【００６４】
ＶＩＶ系のさらなる例示的な図解を図２に示す。Ｅ１イニシエータータンパク質が存在し、カーゴはＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーター下のＧＦＰである。図１および２は、Ｅ１を含有するＶＩＶ系を示す一方で、本明細書に示される図４は、単一のウイルスベクター上にＥ１およびＥ２の両方を含有するＶＩＶ系を示す。さらなる実施形態では、同一のｍＲＮＡからＥ１およびＥ２の両方を発現するために、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を付加して、タンパク質翻訳の再開を可能にする。Ｅ１およびＥ２などのイニシエータータンパク質は、別個のプラスミドまたは非組み込みレンチウイルスベクターで発現させることもできる。
【００６５】
ＶＩＶ系のさらなる例示的な図解を図４に示す。遺伝子カーゴは、ＣＭＶ／ＧＦＰカセットによって表される。カーゴ遺伝子配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し得る。例えば、合成オリゴヌクレオチドプライマー、例えば、カーゴ遺伝子の５’末端に同一であるおよび／またはカーゴ遺伝子の３’末端に相補的であるプライマーなどを使用することができる。５’プライマーは、エンドヌクレアーゼのための認識部位を有するその５’末端から伸長され得る。３’プライマーはまた、エンドヌクレアーゼ認識のための相補体を有するその３’末端で伸長され得る。得られた増幅されたカーゴ遺伝子配列は、レンチウイルスベクターなどの適切なベクターにアニーリングされ得る。遺伝子カーゴの非限定的な例には、ＣＭＶ／ＶＥＧＦ、ＣＭＶ／抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、抗ＨＥＲ２抗体、またはｍｉＲＮＡ抑制Ｃ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）が含まれる。
【００６６】
カーゴの適切な発現は、適切なアッセイによって判定され得る。例えば、ＤＮＡのコピー数は、定量ＰＣＲによって測定され得る。ベクター１またはベクター１９（本明細書において記載される）などの非限定的な例から翻訳されたタンパク質産物は、例えば分析用フローサイトメトリーによって測定され得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＶＥＧＦなどの分泌型タンパク質などの特定のカーゴの存在を検出するために使用され得る。ウェスタンブロット技術もまた、抗ＥＧＦＲなどの抗体などの特定のカーゴを検出するために使用され得る。さらに、カーゴタンパク質、例えばＣＣＲ５などのケモカイン受容体の細胞表面発現の減少をモニタリングすることもまた採用され得る。
【００６７】
カーゴに関して、および非限定的な例として、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）をコードする遺伝子は、目的のｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子抑制ＲＮＡと共に、遺伝子として、創傷治癒を促進するために使用されるＶＩＶに組み入れることができる。開示されるＶＩＶ系は、発現され得る遺伝子または配列の特定のタイプに限定されない。
【００６８】
開示されるＶＩＶは、例えば、感染性疾患またはがんに関連する抗原（複製している病原体上の抗原、および外因性毒素である抗原、および腫瘍細胞上の抗原を含む）に対する抗体、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、脳由来の増殖因子、神経成長因子、ヒト増殖因子、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ジストロフィンまたはジストロフィン関連複合体、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、リポタンパク質リパーゼ、α−および／またはβ−サラセミア、因子ＶＩＩＩ、骨形成タンパク質１〜４、シクロオキシゲナーゼ２、血管内皮増殖因子、ケモカイン受容体ＣＣＲ５、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５、大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病に関与する自己免疫抗原に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、アヘン剤またはアルコールに対する神経衰弱を調節するｍｉＲＮＡを含む常用癖に関与する低分子干渉ＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、プロアポトーシスまたは抗アポトーシス遺伝子およびプロ自食作用または抗自食作用遺伝子を含む細胞生存を調節する遺伝子、放射線照射耐性因子をコードする遺伝子、腫瘍細胞の転移または他の細胞輸送現象の追跡に使用される発光タンパク質をコードする遺伝子、あるいは、放射線照射、外科手術、もしくは化学療法の最大効果を得るために身体を調整して、または放射線照射、外科手術、もしくは化学療法から組織を保護して、器官の移植を改善するかまたは特に気道における過剰反応性を抑制するべく宿主組織またはグラフト組織を改変するために使用され得る様々な他の治療上有用な配列をコードする配列を含む、多くの治療的または予防的遺伝子または配列を組み入れ得る。
【００６９】
前述のいずれも限定することなく、カーゴは、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙなどの診断タンパク質、ならびにｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび抗体を含むことができる。さらに、カーゴは、本明細書において記載されるＶＥＧＦおよびＢＭＰなどの特定のカーゴを含むことができる。
【００７０】
さらなる態様では、「安全性スイッチ」として、ＶＩＶ系のエピソーム形態に遺伝子を維持することが望ましい。例えば、特定の遺伝子産物が毒性である場合、誘導因子分子の中止によって、ＤＮＡ複製が減少するまたは停止する。その後、エピソーム数は減少し、遺伝子およびベクターは最後には消失する。従来の調節型遺伝子発現と異なり、開示される発現構築物は内因性ヌクレアーゼによって分解され、それが効果的に消失するまで細胞分裂によって希釈され、それによって、あらゆる短期または長期のブレークスルー発現が予防される。
【００７１】
さらなる態様によれば、目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子抑制ＲＮＡをエピソーム形態に維持することによって、広範囲にわたり、従来のレンチウイルス形質導入によって達成されるよりもはるかに高いレベルで、コピー数を調節することも可能になる。
【００７２】
開示されるＶＩＶ系は、多くの有益な点を示す。例えば、エピソームＤＮＡは、染色体改変に対する感受性が低く、これによって、従来の形質導入ベクターの遺伝子サイレンシングが生じ得る。同様に、ＶＩＶエピソームＤＮＡベクターは、少なくとも、約１から約４ヶ月、および場合によってはそれ以上の短期間から中期間にわたって、活性な遺伝子送達をサポートする。他の実施形態では、エピソームＤＮＡベクターは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２週間またはそれより長い期間にわたって、活性な遺伝子送達をサポートする。他の実施形態では、エピソームＤＮＡベクターは、約１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、またはそれ以上の期間にわたって、活性な遺伝子送達をサポートする。これらの期間のあらゆる組合せ、例えば、１ヶ月および１週間、または３ヶ月および２週間もまた、本明細書に開示された方法において使用することができる。
【００７３】
開示されるＶＩＶ系の組み込みのためのレンチウイルス担体の使用に特異的に関連する有益な点があるが、開示される系は、単一のタイプのウイルスベクターに限定されない。限定はしないが、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ワクシニア、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ヘパドナウイルス、パルボウイルス、およびマウスウイルスを含む、あらゆるＤＮＡウイルスまたはＤＮＡ中間体を使用するウイルスを、本明細書のＶＩＶ系を組み入れるための担体として使用することができる。
【００７４】
前述のいずれも限定することなく、本開示の一態様では、非組み込みウイルス送達系が開示される。系は、ウイルス担体を含み、ここで、ウイルス担体は、１つまたは複数の欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。ウイルス担体は、レンチウイルスであり得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、パピローマウイルスに由来し得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ヒトパピローマウイルスまたはウシパピローマウイルスに由来し得る。
【００７５】
異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に由来し得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６の長制御領域（ＬＣＲ）に由来し得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１を含み得る。任意選択で、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１の５’トランケーションを含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、配列番号１の少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチド、または少なくとも約４００ヌクレオチド、または少なくとも約５００ヌクレオチド、または少なくとも約６００ヌクレオチド、または少なくとも約７００ヌクレオチドの５’トランケーションを含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）、Ｆｒａｇ２（配列番号３）、Ｆｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を含み得る。異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点は、ＨＰＶ１６のＬＣＲのＦｒａｇ１（配列番号２）、またはＦｒａｇ２（配列番号３）、またはＦｒａｇ３（配列番号４）、またはＦｒａｇ４（配列番号５）を含み得る。前述のいずれかまたは本明細書に詳述される実施例を限定することなく、ＬＣＲのゲノム構成を図１１に示す。本明細書に詳述される断片に加えて、さらなる断片を、ＬＣＲの５’および３’領域の欠失によって作製することができる。さらに、変異、置換、付加および／または欠失を全長ＬＣＲまたは関連する断片に行うことができる。さらに、および上記または本明細書に詳述される実施例を限定することなく、本明細書に詳述されるベクターの成分は、新たなおよび／または修飾されたベクターを開発するために互換的に使用され得ることが理解され、そのことは本開示の実施形態の範囲内である。
ベクター・イン・ベクター系の調整可能性
【００７６】
本開示の一態様では、ウイルスベクター系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が調節されている、配列、または少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡの１つまたは複数を修飾することによって調整可能であるかまたは最適化される。修飾は、少なくとも１つの遺伝子産物の最大用量を制御するため、標的細胞または組織における発現の持続性に影響を与えるため、ならびに一時的に必要とされる生物学的分子が間違った用量で送達されたときおよびそのような生物学的分子がもはや必要でなくなったまたは毒性となり得る後も発現が継続するときに毒性または副作用を防ぐために同じ生物学的分子を用いて疾患または損傷を処置するために行われる。
【００７７】
複数の実施形態では、開示される系の修飾は、遺伝子治療試験においてプラセボ対照に必要とされ得る検出不能またはほぼ検出不能であるカーゴ発現を達成するために、生物学的分子の発現レベルを調整することおよび発現の持続時間を制御することを可能にする。複数の実施形態では、この結果は、欠陥のある遺伝子を除去または訂正する試みにおいて低レベルで短い間隔で与えられたときにより安全である遺伝子編集タンパク質およびＲＮＡを送達するために必要となり得る、検出不能とは統計的に異なるが、誘導されたまたは高レベル発現の基準は満たさない、低レベル発現に至る。複数の実施形態では、例えば同じカーゴの検出可能であるが低い基底レベルと比較しておよそ５倍より高いピーク発現レベルを含むカーゴ発現の高または誘導レベルが生じる。複数の実施形態では、このことは、腫瘍部位でまたはその付近で生じるときにより有効で高レベルで存在する必要があるが正常組織へのオフサイト効果を回避するためにまたは自己免疫の開始を予防するために崩壊および血液から除去しなければならない腫瘍標的化生物学的薬剤を含む治療用抗体を発現させるときに最適であり得る。
【００７８】
複数の実施形態では、開示される系は、がんを処置するために調整可能である。開示される系は、腫瘍部位でまたはその付近でセツキシマブ、リツキシマブまたはトラスツズマブなどの腫瘍標的化抗体の発現を可能にするため、標的細胞における遺伝子用量を増加させるためにエピソームＤＮＡを複製することによって有効な腫瘍標的化のために十分なレベルで抗体を産生するため、ならびにその後、Ｅ１／Ｅ２タンパク質の産生が止むときにエピソームＤＮＡ複製を終了させ、これらおよび類似の生物学的薬剤の安全性および有効性を改善することがわかっている治療用抗体の予測される崩壊曲線に適合する抗体発現低下と共にエピソーム導入遺伝子分子の崩壊に至らせるために調整可能である。
【００７９】
複数の実施形態では、開示される系は、感染性疾患を処置または予防するために調整可能である。開示される系は、病原体の複製を破壊または中和することができる治療用抗体を発現するため、感染部位もしくはその付近での抗体の局所産生を指示するまたは血液およびリンパ循環へ抗体を放出するため、標的細胞における遺伝子用量を増加させるためにエピソームＤＮＡを複製することによって有効な病原体予防または根絶のために十分なレベルで抗体を産生するため、ならびにその後、Ｅ１／Ｅ２タンパク質の産生が止むときにエピソームＤＮＡ複製を終了させ、これらおよび類似の生物学的薬剤の安全性および有効性を改善することがわかっている治療用抗体の予測される崩壊曲線に適合する抗体発現低下と共にエピソーム導入遺伝子分子の崩壊に至らせるために調整可能である。
【００８０】
複数の実施形態では、開示される系は、外傷または再生性疾患を処置するために調整可能である。複数の実施形態では、開示される系は、治療効力を有する生物学的に活性な分子を発現するため、損傷または疾患の部位もしくはその付近での抗体の局所産生を指示するため、標的細胞における遺伝子用量を増加させるためにエピソームＤＮＡを複製することによって有効な治療のために十分なレベルで抗体を産生するため、ならびに、Ｅ１／Ｅ２タンパク質の産生が止むときにエピソームＤＮＡ複製を終了させ、ピークの導入遺伝子用量で高レベルの投与に達するが短期処置ウインドウの間に必要とされる生物学的治療薬の永続的または非常に長期の発現から生じる副作用または毒性は回避する生物学的治療薬の発現低下と共にエピソーム導入遺伝子分子の崩壊に至らせるために調整可能である。
【００８１】
複数の実施形態では、ＬＣＲ断片は、所望の処置経過または転帰に応じて選択および使用され得る。図２０〜２１、表１および実施例１６〜２０に提供される非限定的な例に示すように、所望の処置経過または転帰に応じて、ウイルス送達系は、調整可能であるかまたは最適化される。
【表１−１】
2019520814.tif 000003
【表１−２】
2019520814.tif 000004
【００８２】
本開示の複数の態様では、所望の処置経過または転帰に基づいて、ウイルス送達系が、第１象限、第２象限、第３象限、または第４象限の因子に従って調整可能であるかまたは最適化される。
【００８３】
複数の実施形態では、第１象限の因子は、ＬＣＲが全長、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４、またはそれらのバリアントから選択されるウイルス送達系を含む。第１象限の因子は、記載のベクター系を使用して、遺伝子カーゴの一過性の基底発現を提供する。ほとんどの場合に、ＤＮＡコピー数は、この系で達成され得る最も高いレベルのおよそ２０分の１と予想される。カーゴの発現を駆動するプロモーターを慎重に選択することにより、この系の柔軟性および組織特異性はさらに増加する。
【００８４】
複数の実施形態では、第２象限の因子は、ＬＣＲがＦｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４、またはそれらのバリアントから選択されるウイルス送達系を含む。第２象限の因子はまた、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。複数の実施形態では、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質は、プラスミドを介して提供される。複数の実施形態では、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質は、レンチウイルスベクターを介して提供される。第２象限の因子は、再びプロモーター選択に依存して、潜在的に非常に高い遺伝子発現レベルを有する高いエピソームＤＮＡコピー数を提供する。さらに、より短いＬＣＲ断片の使用は、カーゴとして組み入れることができるＤＮＡインサートのサイズを増加させる。
【００８５】
複数の実施形態では、第３象限の因子は、ＬＣＲがＬＣＲ、Ｆｒａｇ１、またはそれらのバリアントから選択されるウイルス送達系を含む。第３象限の因子はまた、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。複数の実施形態では、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質は、プラスミドを介して提供される。複数の実施形態では、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質は、レンチウイルスベクターを介して提供される。第３象限の因子は、高いが第２象限で得られ得るよりもわずかに低いエピソームコピー数を提供する。第３象限の利点は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質を導入するまたはしないことによって高度に制御可能な系を作製するエピソームＤＮＡの非常に低い基底レベルがあることである。
【００８６】
複数の実施形態では、第４象限の因子は、ＬＣＲが全長ＬＣＲ、Ｆｒａｇ１、またはそれらのバリアントから選択されるウイルス送達系を含む。第４象限の因子の選択は、用量漸増治験または所望の適応症のための最大耐用レベルまたは最適レベルを確立するための用量試験におけるプラセボ対照または初期用量のために必要とされ得る非常に低い発現をもたらす。
【００８７】
本開示の複数の態様では、カーゴ発現の非常に低い基底レベルが所望されるとき、第４象限の因子がウイルス送達系に導入される。複数の実施形態では、第４象限の因子は、Ｆｒａｇ１または全長ＬＣＲまたはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、カーゴ発現のわずかに高い基底レベルが所望されるとき、第１象限の因子がウイルス送達系に導入される。複数の実施形態では、第１象限の因子は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４またはそれらのバリアントを含む。
【００８８】
複数の実施形態では、カーゴ発現の高い誘導レベルが所望されるとき、第２象限の因子または第３象限の因子が、ウイルス送達系に導入される。複数の実施形態では、第２象限の因子は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、第２象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。複数の実施形態では、第３象限の因子は、ＬＣＲ、Ｆｒａｇ１、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、第３象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。複数の実施形態では、カーゴ発現の高い誘導レベルが所望され、より大きなカーゴのサイズが企図されるとき、第２象限の因子がウイルス送達系に導入される。複数の実施形態では、カーゴ発現の高い誘導レベルが所望され、より小さなカーゴサイズが企図されるとき、第３象限の因子がウイルス送達系に導入される。したがって、現行の系の調整可能性または最適化は、カーゴサイズに基づく調整可能性または最適化を可能にする。
【００８９】
複数の実施形態では、カーゴ発現の基底レベルと誘導レベルとの間で大きな倍率変化の増加が所望されるとき、第３象限の因子がウイルス送達系に導入される。複数の実施形態では、第３象限の因子は、ＬＣＲ、Ｆｒａｇ１、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、第３象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。
【００９０】
複数の実施形態では、カーゴ発現の基底レベルと誘導レベルとの間で小さな倍率変化の増加が所望されるとき、第２象限の因子がウイルス送達系に導入される。さらなる実施形態では、カーゴ発現の基底レベルと誘導レベルとの間で図１２および２０に示す第３象限プロファイルと比較して小さな倍率変化の増加が所望されるとき、第２象限の因子がウイルス送達系に導入される。複数の実施形態では、第２象限の因子は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、第２象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。
【００９１】
別の態様では、第１象限の処置経過のために対象を処置する方法が提供される。方法は、第１象限の因子を含むウイルス送達系を、対象に投与することを含む。複数の実施形態では、第１象限の因子は、ＬＣＲが全長、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４、またはそれらのバリアントから選択されるウイルス送達系を含む。
【００９２】
別の態様では、第２象限の処置経過のために対象を処置する方法が提供される。方法は、第２象限の因子を含むウイルス送達系を対象に投与することを含む。複数の実施形態では、第２象限の因子は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、Ｆｒａｇ４、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、第２象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。
【００９３】
別の態様では、第３象限の処置経過のために対象を処置する方法が提供される。方法は、第３象限の因子を含むウイルス送達系を対象に投与することを含む。複数の実施形態では、第３象限の因子は、ＬＣＲ、Ｆｒａｇ１、またはそれらのバリアントを含む。複数の実施形態では、第３象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質を含む。
【００９４】
別の態様では、第４象限の処置経過のために対象を処置する方法が提供される。方法は、第４象限の因子を含むウイルス送達系を対象に投与することを含む。複数の実施形態では、第４象限の因子は、ＬＣＲ、Ｆｒａｇ１、またはそれらのバリアントを含む。
【００９５】
別の態様では、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質が、ウイルス系に存在する。複数の実施形態では、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、Ｅ１またはその作動可能な断片を含む。複数の実施形態では、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、Ｅ２またはその作動可能な断片を含む。複数の実施形態では、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、ＥＢＮＡ−１またはその作動可能な断片を含む。複数の実施形態では、系は、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含む。複数の実施形態では、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質は、Ｅ１およびＥ２またはそれらの作動可能な断片である。複数の実施形態では、少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列は、単一の別個のプラスミドに存在する。複数の実施形態では、系は、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み、少なくとも２つのイニシエータータンパク質をコードする配列は単一の別個のプラスミドに存在し得る。複数の実施形態では、系は、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも２つのイニシエータータンパク質を含み、第１のイニシエータータンパク質に対する配列と第２のイニシエータータンパク質に対する配列とは別個のプラスミドに存在し得る。
【００９６】
本開示の複数の態様では、少なくとも１つの遺伝子産物が存在する。複数の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子産物は、抗体、抗体断片、増殖因子、または小型ＲＮＡを含む。複数の実施形態では、抗体は、抗ＨＥＲ２抗体またはその断片を含む。複数の実施形態では、増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはそのバリアントを含む。複数の実施形態では、小型ＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。複数の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＣＣＲ５  ｍｉＲＮＡを含む。
方法
【００９７】
本開示の態様は、それを必要とする患者にＶＩＶ系を投与する方法であって、ＶＩＶ系が少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、または少なくとも５つの目的の遺伝子をコードする、方法を含む。多用途性および治療可能性および開示されるＶＩＶ系を考慮すると、本開示の態様に記載のＶＩＶ系は、限定はしないが、感染性疾患または感染性病原体によって生産される毒素に関連する抗原に対する抗体、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、脳由来の増殖因子、神経成長因子、ヒト増殖因子、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、ジストロフィンまたはジストロフィン関連複合体、リポタンパク質リパーゼ、α−および／またはβ−サラセミア、因子ＶＩＩＩ、骨形成タンパク質１〜４、シクロオキシゲナーゼ２、血管内皮増殖因子、ケモカイン受容体ＣＣＲ５、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ５、大腸炎、炎症性腸疾患、またはクローン病に関与する自己免疫抗原に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、アヘン剤またはアルコールに対する神経衰弱を調節するｍｉＲＮＡを含む常用癖に関与する低分子干渉ＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、プロアポトーシスまたは抗アポトーシス遺伝子およびプロ自食作用または抗自食作用遺伝子を含む細胞生存を調節する遺伝子、放射線照射耐性因子をコードする遺伝子、腫瘍細胞の転移または他の細胞輸送現象の追跡に使用される発光タンパク質をコードする遺伝子、あるいは、放射線照射、外科手術、もしくは化学療法の最大効果を得るために身体を調整して、または放射線照射、外科手術、もしくは化学療法から組織を保護して、器官の移植を改善するかまたは特に気道における過剰反応性を抑制するべく宿主組織またはグラフト組織を改変するために使用され得る様々な他の治療上有用な配列を含む遺伝子または核酸配列をコードし得る。
【００９８】
さらに、前述のいずれも限定することなく、別の態様では，少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを細胞中で発現させる方法が提供される。方法は、細胞を、有効量の非組み込みウイルス送達系に接触させることを含み、ここで、系は、ウイルス担体を含み、ウイルス担体は、欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。
【００９９】
別の態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを、それを必要とする対象中で発現させる方法が提供される。方法は、それを必要とする対象に、有効量の非組み込みウイルス送達系を投与することを含み、ここで、系は、ウイルス担体を含み、ウイルス担体は、欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列であって、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的な少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列の発現が誘導性である、配列、および少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを含む。少なくとも１つのイニシエータータンパク質をコードする配列は、単一の別個のプラスミドに存在する場合があり、少なくとも１つのイニシエータータンパク質は、Ｅ１とＥ２のいずれか単独または組合せ、またはそれらの断片であり得る。方法は、任意選択で、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの第１の発現レベルを開始させるための第１の量の単一の別個のプラスミドを、それを必要とする対象に投与することを含む。方法は、任意選択で、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの第２の発現レベルを開始させるための第２の量の単一の別個のプラスミドを、それを必要とする対象に投与することを含む。第２の量が第１の量より低いときの状況では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの発現レベルは減少し得る。第２の量が第１の量より高いときの状況では、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡの発現レベルは増加し得る。
感染性疾患
【０１００】
感染性疾患を処置または予防するための方法が提供される。高リスク個体、例えば、健康状態または地理的位置により感染性疾患に接触するリスクが高い個体にモノクローナル抗体の予防的送達を行うことが現在実施されている。予防的送達は、例えば、風土病地域内を移動する個体（例えば、エボラ感染地域に入る衛生兵および救援隊員）を保護するための、致命的なウイルス性因子に対する防御抗体の送達を含む。ワクチンは、エボラもしくはラッサ熱ウイルス、またはデング熱、またはチクングニヤウイルス、またはマラリアの原因であるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．などの疾患についてはほとんど試験されておらず、組み込みベクターの使用を介する予防的抗体遺伝子の慢性的発現は、未知の健康上のリスクを有する。したがって、高いが一過性でなくてはならない効果的な抗体発現が医学的に非常に要求されている。
【０１０１】
開示されるＶＩＶ系ならびに高いコピー数の目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを限られた期間にわたり送達する方法は、この医学的要求を満たす。感染性疾患を処置するために送達され得る遺伝子産物の非限定的な例は、問題の感染性疾患に特異的な抗体である。
【０１０２】
一態様では、本開示は、感染性疾患に関連する状態、症候、または副作用を処置、予防、または最小になる方法に関する。特定の実施形態では、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エボラウイルス、ラッサ熱ウイルス、デング熱、ジカウイルス、マラリア、結核、狂犬病、ワクシニアウイルス、または他の感染性疾患であり得る。一部の実施形態では、ＶＩＶ系は、予防的にまたは感染性疾患に感染した後に投与され得る。
【０１０３】
別の態様では、ＶＩＶ系は、感染性疾患を予防するために使用することができる。特定の感染疾患と接触するリスクが増加している疑いのある対象は、問題の感染性疾患を特異的に標的とする抗体をコードする予防有効量のＶＩＶの投与を受けることができる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、感染性疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エボラウイルス、ラッサ熱ウイルス、デング熱、ジカウイルス、マラリア、結核、狂犬病、ワクシニアウイルス、または他の感染性疾患であり得る。ある特定の実施形態では、ＶＩＶベクターは、予防的にまたは感染性疾患に感染した後に投与され得る。
創傷治癒
【０１０５】
創傷治癒
別の実施形態では、本開示は、創傷治癒に関連する状態、症候、または副作用を処置、予防、または最小にする方法に関する。開示される組成物は、全身に、または事故、損傷、もしくは外科手術後の創傷に直接投与され得る。外科手術のケースでは、ＶＩＶ系は、治癒を促進するために予防的に投与され得る。事故、損傷、または外科手術による創傷のケースでは、ＶＩＶ系は、創傷形成のある程度後に投与され得る。例えば、ＶＩＶ系は、創傷形成の約１、約２、約３、約４、約５、約１０、約１２、約２４、約３６、約４８、約６０、約７２、約８４、約９６、約１０８、約１２０、または約１６８時間以内に投与され得る。
【０１０６】
本開示の方法および組成物の別の適用は、創傷治癒を加速させる血小板増殖因子を発現し得るＶＩＶ構築物の一時的送達である。血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、関連増殖因子、その断片、およびそれらに関連するヌクレオチド変異体の高用量は、非常に迅速であるが一時的であることが必要とされる。開示される系および方法は、このタイプの適用に理想的である。
【０１０７】
さらなる短期間の適用には、アルコール乱用の断続的処置のための脳由来の増殖因子の発現、脊髄再生のための神経成長因子、および皮膚状態のための局部適用が含まれる。
【０１０８】
骨の疾患または損傷
一実施形態では、本開示は、骨損傷を有する対象を識別するステップ、および治療有効量の本明細書に開示されるウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、骨の治癒を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。骨損傷は、事故、損傷、または外科手術によるものであり得、骨の癒合不全または急性骨折または所要の脊椎固定術であり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子抑制ＲＮＡは、骨形成タンパク質１〜４またはシクロオキシゲナーゼ−２または血管内皮増殖因子またはそれらの断片をコードする。さらに、ある特定の実施形態では、上述の変異体は、骨損傷または関連疾患を処置するために好ましく、またそれらは本開示の範囲内である。
【０１０９】
一実施形態では、本開示は、骨疾患を有する対象を識別するステップ、および治療有効量の本開示に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、骨の治癒を増強する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。骨疾患は、例えば、事故、損傷、または外科手術によるものであり得、骨の癒合不全または急性骨折または所要の脊椎固定術であり得る。さらに、骨疾患は、低い骨密度、骨への低い血流量、加齢、遺伝性の状態などであり得る。一部の実施形態では、目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、骨形成タンパク質１〜４またはシクロオキシゲナーゼ−２または血管内皮増殖因子をコードする。
遺伝性遺伝子疾患
【表２】
2019520814.tif 000005
【０１１０】
実施形態では、本開示は、遺伝性遺伝子疾患に関連する状態、症候、または副作用を処置、予防、または最小にする方法に関する。このような遺伝性遺伝子疾患のいくつかの例を、以下の命名を用いて、突然変異の原因型および関与する染色体と共に、本明細書の表２に開示する。
Ｐ−点突然変異、または全体が１つの遺伝子内にあるあらゆる挿入／欠失
Ｄ−１つまたは複数の遺伝子の欠失
Ｃ−全染色体の過剰、喪失、またはその両方（染色体異常を参照されたい）
Ｔ−トリヌクレオチド反復障害：遺伝子はその長さを伸長している
【０１１１】
現在の遺伝子療法には、遺伝子の欠失、置換、または再シーケンシングを介してゲノムＤＮＡを編集する試みが含まれる。当技術分野において公知の様々な遺伝子療法系には、レンチウイルス形質導入による遺伝物質の送達に依存する、Ｔａｌｅｎ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮなどが含まれる。しかし、本開示とは異なり、これらの系は、活性な染色体改変系が予想外の部位を改変し得るので、延長された期間の間細胞内で活性であり続け、がんを含む新たな遺伝子疾患に至る予想外の結果を有し得る。宿主ＤＮＡの改変に真に実用的な系には、本明細書において開示されている方法などの方法を介する、一過性で良く調節された発現が必要である。
【０１１２】
一実施形態では、本開示は、遺伝性遺伝子疾患を有する対象を識別するステップ、および治療有効量の本開示に従ったウイルス送達系を対象に投与するステップを含む、遺伝性遺伝子疾患を処置する方法に関する。ウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列のうちの１つまたはそれより多く、ならびに目的の少なくとも１つの遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。遺伝性遺伝子疾患は、例えば、表２に列挙する疾患であり得、一部の実施形態では、目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡは、表２に列挙する遺伝子の非突然変異型をコードする。上記を限定することなく、特定の遺伝性遺伝子疾患はＣＦであることができ、処置は、本明細書に詳述されるように、ＣＦＴＲの非変異形態を発現することによって追跡することができる。
【０１１３】
別の実施形態では、ガイドＲＮＡ標的配列が開示されるＶＩＶ系に組み入れられる。ガイドＲＮＡ配列は、変異したか、または他の方法で修正を要する宿主ゲノム内の特定部位に遺伝子編集機構を向けるために使用される配列である。ＶＩＶ系のカーゴ内にガイドＲＮＡを含めることによって、修正を要する染色体セクションの改変が可能になり、同一の改変がＶＩＶ内で生じて、宿主による分解および／または希釈が加速する。１つの実施形態では、開示されるウイルス送達系は、ウイルス担体、異種ウイルスエピソーム複製起点、異種ウイルスエピソーム複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列のうちの１つまたはそれより多く、目的の少なくとも１つの遺伝子、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／または他の遺伝子サイレンシングＲＮＡ、ならびに少なくとも１つのガイドＲＮＡを含み、ここで、ウイルス担体は欠陥のあるインテグラーゼ遺伝子を有し、異種ウイルスエピソームＤＮＡ複製起点に特異的なイニシエータータンパク質をコードする配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。
【０１１４】
細胞または組織のｅｘ  ｖｉｖｏでの改変
別の態様では、ＶＩＶ系は、疾患の治療に使用される細胞または組織を改変するために使用され得る。細胞には、限定はしないが、リンパ球、幹細胞、上皮細胞、神経細胞などの一次細胞が含まれ得る。例えば、ＶＩＶ系は、がん、感染性疾患、または自己免疫を含む特定疾患に再び向けられるリンパ球を改変するために、かつ遺伝子改変された細胞の長期的存在が健康上のリスクを有する場合に、使用され得る。例えば、ＶＩＶ系は、高レベルの転写産物因子を要する多能性幹細胞を規定された間隔にわたりプログラムするために、そして組み込まれたウイルスベクターの長期的存在が望ましくない場合に、使用され得る。好適な上皮細胞は、合成皮膚または他の適用に使用され得る上皮細胞を含む。これらは、処置後の正常組織の機能に有害となり本明細書に開示されるＶＩＶ系によって最良に送達される栄養因子または増殖因子の、最初の処置の間の発現を要し得る。
【０１１５】
用量および剤形
開示されるＶＩＶ系は、目的の遺伝子または配列の短期、中期、または長期の発現、および開示されるベクターのエピソームでの維持を可能にする。したがって、投薬レジメンは、処置される状態および投与方法に基づいて変化し得る。
【０１１６】
一実施形態では、ＶＩＶは、必要とする対象に様々な用量で投与され得る。具体的には、対象は、≧１０６感染用量（１標的細胞を形質導入するために平均して１用量が必要とされる）で投与され得る。さらに具体的には、対象は、≧１０７、≧１０８、≧１０９、または≧１０１０感染用量で投与され得る。ＶＩＶ投薬の上限は疾患適応症ごとに決定され、個々の製品または製品ロットについての毒性／安全性プロファイルに基づく。
【０１１７】
さらに、ＶＩＶは、１日に１回または２回投与され得る。あるいは、ＶＩＶは、必要とする対象に１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月おき、３ヶ月おき、６ヶ月おき、９ヶ月おき、１年に１回、１８ヶ月おき、２年おき、３６ヶ月おき、または３年おきまたはそれより長い期間おきに投与され得る。
【０１１８】
種々の態様および実施形態では、ＶＩＶは医薬組成物として投与される。実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、臨床適用のために、広範な、経鼻、肺、経口、局所的、または非経口剤形で製剤化され得る。剤形のそれぞれは、様々な崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤などの希釈剤、または他の薬学的に許容される賦形剤を含有し得る。ＶＩＶを含む医薬組成物はまた、注射のために処方され得る。
【０１１９】
ＶＩＶ組成物は、鼻腔内投与、バッカル投与、舌下投与、経口投与、直腸投与、眼投与、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、大槽内、腹腔内）投与、肺投与、膣内投与、局所的投与、局所的投与、瘢痕化後の局部所的投与、エアロゾルを介するまたはバッカルもしくは経鼻スプレー製剤を介する粘膜投与などの、あらゆる薬学的に許容される方法を使用して投与され得る。
【０１２０】
さらに、ＶＩＶ組成物は、固体剤形、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、液体分散剤、ゲル剤、エアロゾル剤、肺エアロゾル剤、鼻エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、半固体剤形、および懸濁剤などの、あらゆる薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。さらに、組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはそのあらゆる組合せであり得る。さらに、組成物は経皮送達系であり得る。
【０１２１】
別の実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形に製剤化され得、固体剤形は、粉末剤、顆粒剤、カプセ剤ル、錠剤剤、またはピル剤であり得る。別の実施形態では、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、ショ糖、乳糖、微晶質セルロース、またはゼラチンなどの１つまたは複数の賦形剤を含み得る。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含み得る。実施形態では、経口剤形は、即時放出または改変された放出形態であり得る。改変された放出剤形には、制御または延長放出、腸溶性放出などが含まれる。改変された放出剤形で使用される賦形剤は、当業者に一般に公知である。
【０１２２】
実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、舌下またはバッカル剤形として製剤化され得る。このような剤形は、舌下錠剤または舌の下に投与される溶液組成物、および頬と歯茎との間に置かれるバッカル錠剤を含む。
【０１２３】
別の実施形態では、ＶＩＶを含む医薬組成物は、経鼻剤形として製剤化され得る。本開示のこのような剤形は、鼻送達のための溶液剤、懸濁剤、およびゲル組成物を含む。
【０１２４】
実施形態では、医薬組成物は、経口投与のための液体剤形、例えば、懸濁剤、エマルジョン剤、またはシロップ剤に製剤化され得る。実施形態では、液体剤形は、水および液体パラフィンなどの一般に使用される単純な希釈剤に加えて、湿潤剤、甘味料、香料、または防腐剤などの様々な賦形剤を含み得る。実施形態では、ＶＩＶを含む組成物またはその薬学的に許容される塩は、小児患者への投与に適するように製剤化され得る。
【０１２５】
実施形態では、医薬組成物は、無菌水溶液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、非水性溶液剤、または坐剤などの、非経口投与のための剤形に製剤化され得る。実施形態では、非水性溶液剤または懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、またはオレイン酸エチルなどの注射可能なエステルが含まれ得る。坐剤の基材として、ウイテプゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ  ６１、カカオ油、ラウリン油、またはグリセリン化されたゼラチンを使用することができる。
【０１２６】
医薬組成物の投薬は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および態様、排出速度、ならびに疾患の重症度に応じて変化し得る。
【０１２７】
定義
本明細書で具体的に定義されない語は、当業者によって理解される意味と同じ意味を有すると理解される。
【０１２８】
本明細書において使用する場合、用語「約」は当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化する。その用語が使用される文脈を考慮しても当業者に自明でない用語が使用される場合には、「約」は、具体的な用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味する。
【０１２９】
活性物質「の投与」または活性物質「を投与する」という用語は、本開示の活性物質を、治療上有用な形態および治療有効量で個体の体内に導入し得る形態で、処置を必要とする対象に提供することを意味する。
【０１３０】
用語「基底レベル」は、少なくとも１つのイニシエータータンパク質が添加されていないときのカーゴの発現を指す。
【０１３１】
用語「ＢＭＰ」は、骨形成タンパク質を指す。
【０１３２】
用語「カーゴ」は、本明細書に開示されるウイルス送達系を使用して発現される遺伝子または遺伝子産物を指す。
【０１３３】
用語「ＣＦ」は嚢胞性線維症を指し、用語「ＣＦＴＲ」は嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子タンパク質を指す。
【０１３４】
用語「発現」、「発現される」、または「コードする」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシング、または他の形態の転写後修飾もしくは翻訳後修飾を含み得る。
【０１３５】
用語「断片１」は、「Ｆ１」および「Ｆｒａｇ１」と同義であり、本明細書で詳述されるＬＣＲの断片１トランケーションを指す。用語「断片２」は、「Ｆ２」および「Ｆｒａｇ２」と同義であり、本明細書で詳述されるＬＣＲの断片２トランケーションを指す。用語「断片３」は、「Ｆ３」および「Ｆｒａｇ３」と同義であり、本明細書で詳述されるＬＣＲの断片３トランケーションを指す。用語「断片４」は、「Ｆ４」および「Ｆｒａｇ４」と同義であり、本明細書で詳述されるＬＣＲの断片１構築物を指す。
【０１３６】
用語「個体」、「宿主」、「対象」および「患者」は、本明細書で互換的に使用される。
【０１３７】
用語「誘導レベル」は、少なくとも１つのイニシエータータンパク質の添加後のカーゴの発現を指す。
【０１３８】
用語「ＬＣＲ」は、例えば、ＨＰＶ１６の長制御領域を指す。
【０１３９】
用語「ＰＤＧＦ」は、血小板由来増殖因子を指す。
【０１４０】
用語「第１象限の処置経過」は、図２１の第１象限に含まれる処置経過への参照を含む。非限定的な例として、第１象限の処置経過は、遺伝子編集、安全性研究、および実施例１７で概説される目的を含む。用語「第２象限の処置経過」は、図２１の第２象限に含まれる処置経過への参照を含む。非限定的な例として、第２象限の処置経過は、細胞リプログラミング、チェックポイント抑制、および実施例１８で概説される目的を含む。用語「第３象限の処置経過」は、図２１の第３象限に含まれる処置経過への参照を含む。非限定的な例として、第３象限の処置経過は、受動免疫、免疫刺激、および実施例１９で概説される目的を含む。用語「第４象限の処置経過」は、図２１の第４象限に含まれる処置経過への参照を含む。非限定的な例として、第４象限の処置経過は、プラセボ対照、および実施例２０で概説される目的を含む。
【０１４１】
用語「第１象限の因子」は、図２０の第１象限に示すような基底エピソームコピー数プロファイルを促進する任意の生物学的因子を指す。非限定的な例として、第１象限の因子は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３およびＦｒａｇ４配列を含む。用語「第２象限の因子」は、図２０の第２象限に示すような誘導性エピソームコピー数プロファイルを促進する任意の生物学的因子を指す。非限定的な例として、第２象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質と組み合わせたＦｒａｇ２、Ｆｒａｇ３、およびＦｒａｇ４配列を含む。用語「第３象限の因子」は、図２０の第３象限に示すような誘導性エピソームコピー数プロファイルを促進する任意の生物学的因子を指す。非限定的な例として、第３象限の因子は、Ｅ１および／またはＥ２イニシエータータンパク質と組み合わせたＬＣＲおよびＦｒａｇ１配列を含む。用語「第４象限の因子」は、図２０の第４象限に示すような基底エピソームコピー数プロファイルを促進する任意の生物学的因子を指す。非限定的な例として、第４象限の因子は、ＬＣＲおよびＦｒａｇ１配列を含む。
【０１４２】
用語「ｓｈＲＮＡ」はショートヘアピンＲＮＡを指す；用語「ｓｉＲＮＡ」は小さい（または短い）干渉ＲＮＡを指す；および用語「ｍｉＲＮＡ」はマイクロＲＮＡを指す。
【０１４３】
用語「治療有効量」は、および所与の病気、損傷、疾患、または状態を患っている患者において見られる合併症の症候、進行、または発病を処置または予防するために適切な組成物内の、かつ適切な剤形の、十分な量の本開示の活性物質を差す。治療有効量は、患者の状態またはその重症度、および処置される対象の年齢、体重などに応じて変化する。治療有効量は、例えば、投与経路、対象の状態、および当業者によって理解されている他の因子を含む、多くの因子のいずれかに応じて変化し得る。
【０１４４】
用語「処置」または「処置すること」は、概して、処置されている対象の自然経過を改変するための試みへの介入を指し、予防のためまたは臨床病理学の経過の間に行われ得る。所望の効果には、限定はしないが、疾患の発生または再発を予防すること、症候を軽減すること、疾患のあらゆる直接的なまたは間接的な病理学的結果を抑制すること、弱めること、または阻害すること、病状を改善または緩和すること、および寛解または予後の改善を生じさせることが含まれる。
【０１４５】
用語「非常に低い」は、基底発現レベルの文脈で使用されるとき、非常に低い発現レベルおよび／またはエピソームコピー数（必要に応じて）を指し、検出できない発現および／またはエピソームコピー数を含み得る。非限定的な例として、非常に低い発現レベルは、細胞当たり０．０２０未満のエピソームコピーを含む。用語「非常に低い」は、基底発現レベルの文脈で使用されるとき、本明細書で「第１の規定されたレベル」として参照される場合もある。用語「わずかに高い」は、基底発現レベルの文脈で使用されるとき、低い発現および／またはエピソームコピー数のレベルであるが、「非常に低い」基準と比較してわずかに高い発現および／またはエピソームコピー数のレベルを指す。非限定的な例として、わずかに高い発現レベルは、細胞当たり０．０２０またはそれよりも高いエピソームコピーであって、細胞当たり０．２未満のエピソームコピーを含む。用語「わずかに高い」は、基底発現レベルの文脈で使用されるとき、本明細書で「第２の規定されたレベル」として参照される場合もある。
【０１４６】
本明細書において使用する場合、用語「ＶＩＶ」は、少なくとも１つの目的の遺伝子、遺伝子産物、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または他のＲＮＡを発現させるためのベクター・イン・ベクター系を指す。用語「ＶＩＶ」は、本明細書で使用されるとき、ウイルス送達系および一過性ベクターと同義的に使用される。
【０１４７】
以下の実施例は、本発明の態様を説明するために提供される。しかし、本発明はこれらの実施例において記載されている具体的な条件または詳細に限定されない。本明細書で参照される全ての発行された刊行物は、参照によって具体的に組み入れられる。
【実施例】
【０１４８】
実施例１
感染性疾患を処置するためのＶＩＶ
この実施例は、感染性疾患を処置するための例示的なＶＩＶ構築物を実証する。
【０１４９】
この実施例では、図１Ａは、エボラウイルス感染性疾患を処置するための例示的な線形ＶＩＶ構築物を表す。ここで、図１Ａに示す「カーゴ」部分の少なくとも１つは、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードする。図１Ｂに示すように、例示的なＶＩＶ構築物の長末端反復（ＬＴＲ）部分はウイルス核酸を環状化するために使用することができる。
【０１５０】
エボラウイルスを有する疑いがあるかまたはエボラウイルスを有すると診断された対象に、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、またはエボラを処置もしくは予防するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与し得る。エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従って、経口により、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。次いで対象を、限定はしないが、例えば、発熱、疲労、倦怠感、衰弱、目の赤み、関節および筋肉痛、頭痛、吐き気、嘔吐、出血、ならびに死亡を含むエボラウイルスに関連する徴候および症候の存在および／または重症度について毎日評価する。処置は、エボラウイルス感染の１つまたは複数の徴候または症候が改善または排除されるような時間まで維持する。
【０１５１】
エボラウイルスが感染した疑いがあるかまたはエボラウイルスを有すると診断され、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードする治療有効量のＶＩＶを投与されている対象が、重症度の低減またはエボラウイルス感染に関連する１つもしくは複数の症候の排除を示すことは、合理的に予測される。さらに、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶを１つまたは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが相乗的な効果を有することが豪的に予想される。
【０１５２】
これらの結果は、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶがエボラウイルスの処置において有用であることを示す。
実施例２
感染性疾患を予防するためのＶＩＶ
【０１５３】
この実施例は、感染性疾患を予防するための例示的なＶＩＶ構築物を実証する。この実施例では、図１Ａは、エボラウイルス感染性疾患の感染を予防するための例示的な線形ＶＩＶ構築物を表す。ここで、図１Ａに示す「カーゴ」部分の少なくとも１つは、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードする。図１Ｂに示すように、例示的なＶＩＶ構築物の長末端反復（ＬＴＲ）部分はウイルス核酸を環状化するために使用することができる。
【０１５４】
エボラウイルスに罹患するリスクが増大している疑いがある対象に、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードする予防有効量のＶＩＶを、単独で、またはエボラを処置もしくは予防するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて、エボラに罹患するリスクが増大している区域に入る前に投与し得る。エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。次いで、対象を、限定はしないが、例えば、発熱、疲労、倦怠感、衰弱、目の赤み、関節および筋肉痛、頭痛、吐き気、嘔吐、出血、ならびに死亡を含むエボラウイルスに関連する徴候および症候の存在および／または重症度について毎日評価する。処置は、エボラの１つまたは複数の徴候または症候が予防されるような時間まで維持する。
【０１５５】
エボラウイルスに曝露された疑いがあるかまたはエボラウイルスに曝露されたと診断され、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードする予防有効量のＶＩＶを投与される対象は、エボラに接触するリスクが低減することが合理的に予測される。さらに、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶと１つまたは複数のさらなる作用物質とを組み合わせた投与が相乗的な効果を有することが合理的に予測される。これらの結果は、エボラウイルスを特異的に標的とする抗体をコードするＶＩＶがエボラウイルスの予防において有用であることを示す。
実施例３
創傷治癒を増強するためのＶＩＶ
【０１５６】
この実施例は、創傷治癒を増強するための例示的なＶＩＶ構築物を実証する。この実施例では、図１Ａは、創傷治癒を増強するための例示的な線形ＶＩＶ構築物を表す。ここで、図１Ａに示す「カーゴ」部分の少なくとも１つは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（配列番号１７）をコードする。図１Ｂに示すように、例示的なＶＩＶ構築物の長末端反復（ＬＴＲ）部分は、ウイルス核酸を環状化するために使用することができる。
【０１５７】
創傷（例えば、事故、損傷、または外科手術による）を有する対象に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、または創傷を処置もしくは滅菌するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与し得る。ＶＩＶ  ＰＤＧＦおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。次いで、対象を、創傷の状態を判定するために毎日評価する。処置は、創傷が治癒し、瘢痕化が最小になるような時間まで維持する。
【０１５８】
創傷を有し、治療有効量のＶＩＶ  ＰＤＧＦを投与されている対象が、創傷治癒の増強を示すことは、合理的に予測される。さらに、ＰＤＧＦをコードするＶＩＶを１つまたは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが相乗的な効果を有することが合理的に予想される。これらの結果は、ＰＤＧＦをコードするＶＩＶが創傷治癒の増強に有用であることを示す。
実施例４
骨損傷を処置するためのＶＩＶ
【０１５９】
この実施例は、骨損傷を処置するための例示的なＶＩＶ構築物を実証する。この実施例では、図１Ａは、骨損傷を処置するための例示的な線形ＶＩＶ構築物を表す。ここで、図１Ａに示す「カーゴ」部分の少なくとも１つは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）（配列番号１８）をコードする。図１Ｂに示すように、例示的なＶＩＶ構築物の長末端反復（ＬＴＲ）部分はウイルス核酸を環状化するために使用することができる。
【０１６０】
骨損傷を有する疑いがあるかまたは骨損傷を有すると診断された対象に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、または骨損傷を処置するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与する。ＢＭＰをコードするＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。次いで、対象を、骨損傷に関連する徴候および症候の存在および／または重症度について毎週評価して、治癒の速度および強さを判定する。処置は、骨が治癒するような時間まで維持する。
【０１６１】
骨損傷を有する疑いがあるかまたは骨損傷を有すると診断され、ＢＭＰをコードする治療有効量のＶＩＶを投与されている対象が、損傷の重症度の低減および治癒の増強を示すことは、合理的に予測される。さらに、ＢＭＰをコードするＶＩＶを１つまたは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが相乗的な効果を有することが合理的に予想される。これらの結果は、ＢＭＰをコードするＶＩＶが骨の損傷または疾患の処置において有用であることを示す。
実施例５
遺伝性疾患を処置するためのＶＩＶ
【０１６２】
この実施例は、嚢胞性線維症（ＣＦ）を処置するための例示的なＶＩＶ構築物を実証する。この実施例では、図１Ａは、遺伝性疾患であるＣＦを処置するための例示的な線形ＶＩＶ構築物を表す。ここで、図１Ａに示す「カーゴ」部分の少なくとも１つは、嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする（ＮＭ＿０００４９２）。図１Ｂに示すように、例示的なＶＩＶ構築物の長末端反復（ＬＴＲ）部分はウイルス核酸を環状化するために使用することができる。
【０１６３】
（ＣＦ）を有する疑いがあるかまたは（ＣＦ）を有すると診断された対象に、嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする治療有効量のＶＩＶを、単独で、またはＣＦを処置するための１つもしくは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与し得る。ＣＦＴＲをコードするＶＩＶおよび／またはさらなる作用物質を、当技術分野において公知のまたは本明細書において記載される方法に従って、経口的に、鼻腔内に、髄腔内に、眼内に、皮内に、経粘膜的に、イオン泳動的に、局所的に、全身に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、または筋肉内に投与する。次いで、対象を、限定はしないが、例えば、成長不良、持続性の咳、濃い喀痰および粘液、喘鳴、息切れ、運動能力の低下、肺感染の反復、鼻孔の炎症、油っぽい便、腸閉塞、ならびに体重増加不良を含むＣＦに関連する徴候および症候の存在および／または重症度について毎週評価する。処置は、ＣＦの１つまたは複数の徴候または症候が改善または排除されるような時間まで維持する。
【０１６４】
ＣＦを有する疑いがあるかまたはＣＦを有すると診断され、ＣＦＴＲをコードする治療有効量のＶＩＶを投与されている対象が、重症度の低減またはＣＦに関連する１つもしくは複数の症候の排除を示すことは、合理的に予測される。さらに、ＣＦＴＲをコードするＶＩＶを１つまたは複数のさらなる作用物質と組み合わせて投与することが相乗的な効果を有することが合理的に予想される。これらの結果は、ＣＦＴＲをコードするＶＩＶがＣＦの処置において有用であることを示す。
実施例６
カーゴを発現するためのＥ１を含有するＶＩＶ
【０１６５】
緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）をカーゴとして含有する図２に従ったベクターを作製した。ヒトパピローマウイルス１６型（ＮＣＢＩ受託番号Ｕ８９３４８、配列番号１９）の完全な遺伝子座制御領域およびＥ１タンパク質を含有するＤＮＡを化学的に合成した。個々のセグメントおよび／またはコード配列を最初に合成した。これらを、緑色蛍光タンパク質遺伝子の５’末端に同一である合成オリゴヌクレオチドプライマー、そして緑色蛍光タンパク質の３’末端に相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。５’プライマー（配列番号２０）は、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼのための認識部位を有するその５’末端から伸長した。３’プライマー（配列番号２１）は、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ認識部位の相補体を有するその３’末端で伸長した。次いで、得られた増幅された緑色蛍光タンパク質遺伝子配列をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。
【０１６６】
レンチウイルスベクターは、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃから入手した。プラスミドをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で切断し、過剰に増幅した緑色蛍光タンパク質遺伝子配列と、インサート対ベクターが１：３の比率で混合した。
【０１６７】
次いで、酵素活性を摂氏７０度で２０分の熱不活化によって停止させた。上記の混合物を室温まで冷却し、アニーリングを可能にした。
【０１６８】
アニーリング反応は、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、３０分、室温で行った。２．５マイクロリットルの得られたライゲーション混合物を、２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。
【０１６９】
次いで、トランスフェクションを摂氏４２度での簡単な（１分）熱ショックによって行った。
【０１７０】
細菌細胞を、アンピシリンを含有する寒天プレート上にストリークして、細菌培養物を得た。これらの培養物をＬｕｒｉａ培養液内で増殖させた。
【０１７１】
増幅した緑色蛍光タンパク質遺伝子配列の、レンチウイルスベクターパッケージングプラスミド内への挿入を確認するために、ＤＮＡを上記の細菌培養物から抽出し、標準的な方法によって精製した。精製したＤＮＡを、構築物を作製するために使用した同一のエンドヌクレアーゼで消化した。断片の長さをアガロースゲル電気泳動によって分析し、増幅した緑色蛍光タンパク質遺伝子配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ  ＬＬＣから入手した特異的プライマーを使用してＤＮＡシーケシングによって検証した。
【０１７２】
レンチウイルスベクターストックを以下のように作製した。少なくとも２つのレンチウイルスパッケージングプラスミドプラスカーゴプラスミドを、ウイルス遺伝子およびゲノムＲＮＡを発現させるＨＥＫ細胞にコトランスフェクトし、インテグラーゼ欠損レンチウイルス粒子内にアセンブルし、そして培養培地内に放出させた。無細胞上清を、トランスフェクション後３〜１０日の間隔をあけて生成および回収した。レンチウイルス粒子を、遠心分離、一時的なフロー濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、サイズ排除濾過、またはイオン交換クロマトグラフィーを含み得る方法の組合せを含む標準的手順によって精製した。各ストックについての濃度および生物学的活性（ｍｌ当たりの形質導入単位数）を判定した。
【０１７３】
２９３Ｔ細胞を含む哺乳動物細胞を、レンチウイルス由来エピソームの形成、コピー数、および発現を試験するために使用した。２９３Ｔ細胞に、インテグラーゼ欠損レンチウイルス粒子を、ポリブレンの存在下で、１から１０の範囲の感染多重度で形質導入した。吸収されなかったウイルスを、適用の３時間後に細胞を洗浄することによって除去し、細胞を３日間培養した。細胞を蛍光顕微鏡で観察し、ＧＦＰを発現している細胞を計数した。形質導入されなかった２９３Ｔ細胞を陰性対照として使用した。データを、培養物中の生存細胞１００個当たりのＧＦＰ陽性細胞として報告した。最少３００個の細胞を顕微鏡視野当たりで計数し、５〜１０の視野を各複製実験で計数した。１つの陰性対照（最も左のデータカラム）および３つの複製実験（すなわち、実験１、実験２および実験３として指定されたデータカラム）を含む４つの独立した形質導入実験を行って、形質導入された細胞の頻度を判定した。データは図３に示され、３つの複製実験にわたるＧＦＰの発現を示す。
実施例７
カーゴを発現するためのＥ１およびＥ２を含有するＶＩＶ
【０１７４】
図４を参照するに、ベクター１９は、Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）イニシエータータンパク質の両方を含むように構築することができる。ここで、遺伝子カーゴは、誘導性プロモーターの制御下のＣＭＶ／ＧＦＰ発現カセットである。
【０１７５】
２９３Ｔ細胞に、ベクター１９を、細胞当たり１から２０の間の範囲の形質導入単位の感染多重度で形質導入し得る。３時間後、細胞を、吸着されなかったビリオンを除去するために培地で洗浄し、培養物に戻す。形質導入の１２〜２４時間後、細胞を、誘導性プロモーターを誘導し得る少なくとも１投薬量の化合物で処理する。誘導性プロモーターを誘導し得る化合物を添加すると、Ｅ１およびＥ２のｍＲＮＡがエピソームから転写され、遺伝子座制御領域断片２（ＬＣＲ／Ｆ２）（配列番号３）に組み合わされ、そしてアセンブリされて、ＤＮＡ複製が引き起こされる。レンチウイルス由来のエピソームは、プロモーター誘導の停止のおよそ２４〜３６時間後に崩壊し始める。ベクター１９内のカーゴからのタンパク質生成物を、分析用フローサイトメトリーによって測定する。
実施例８
カーゴを発現するためのＥ１およびＥ２の導入
【０１７６】
カーゴを発現するＥ１およびＥ２の効果を判定するために、２９３Ｔ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙと全長ＨＰＶ１６（配列番号１）長制御領域（ＬＣＲ）または本明細書で断片１（配列番号２）、断片２（配列番号３）、断片３（配列番号４）および断片４（配列番号５）に記載されるような３’断片とを発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（すなわち、図５Ａにおけるベクター）で形質導入した。
【０１７７】
なお、図５Ａを参照するに、全長ＬＣＲまたは３’断片を、図５Ａに示すＬＣＲ領域で利用した。さらに具体的に、設計された構築物の図示は、本明細書の図７にベクター９〜１３として実証されている。図７に示す追加のエレメントは、ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖエレメント（配列番号２３）；ｃＰＰＴ（セントラルポリプリン配列）エレメント（配列番号２４）；およびウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）を指す。
【０１７８】
２４時間後、細胞を、リポフェクタミン２０００を用いて、ＨＰＶ１６  Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を含有するプラスミドでトランスフェクトした。２日後、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を、ＦＡＣＳによって分析した。これらの実験結果を本明細書の図６Ａに示す。
【０１７９】
Ｅ１およびＥ２がプラスミドを介して導入された上記実験と対比するために、第２のセットの実験を以下に記載されるように実施した。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、本明細書の図５Ａに示す一般化されたベクターに基づく、ｍＣｈｅｒｒｙと全長ＨＰＶ１６長制御領域（ＬＣＲ）（配列番号１）またはより短い断片１（配列番号２）とを発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した。同時に、細胞を、ＨＰＶ１６  Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を発現するレンチウイルスで形質導入した。２日後、本明細書の図６Ｂに示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を、ＦＡＣＳによって分析した。本明細書の図６Ｂに示すように、Ｅ１およびＥ２をｍＣｈｅｒｒｙと全長ＬＣＲ（配列番号１）またはより短い断片１（本明細書で断片１としても参照され、また本明細書で配列番号２としても参照される）とを発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで導入したとき、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞のより大きなパーセンテージが達成された。
【０１８０】
この実施例で詳述されるデータは、Ｅ１およびＥ２がレンチウイルス媒介発現を介して発現されるとき、ＨＰＶ  ｏｒｉ（ＬＣＲ）全長および断片のより強い発現、したがってより大きな活性化があったことを実証する。
【０１８１】
第２に、この実施例からのデータは、ＬＣＲ領域のサイズに依存してＨＰＶ  ｏｒｉ活性化に差異があることを実証する。例えば、図６を参照するに、全長ＬＣＲ（配列番号１）および断片１（配列番号２）を使用するとき、断片２（配列番号３）、３（配列番号４）、および４（配列番号５）を用いた場合と比較して、ｍＣｈｅｒｒｙの発現により顕著な変化があった。
実施例９
ＶＥＧＦの発現
【０１８２】
本明細書で述べるように、ＶＥＧＦは、とりわけ、骨損傷を処置するための「カーゴ」領域として選択することができる。ＶＥＧＦ発現レベルをさらに分析するために、２９３Ｔ細胞を、ＶＥＧＦのためのヒトｃＤＮＡ（配列番号２６）とＨＰＶ１６長制御領域（ＬＣＲ）の断片１（配列番号２）とを含有するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した（ＶＥＧＦ含有ベクターの一般的説明について図５Ｂ参照）。同時に、細胞を、ＨＰＶ１６  Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を含有するレンチウイルスベクターで形質導入した。２日後、細胞培養培地を回収し、ＶＥＧＦ用ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて分析した。図８に示すように、ＶＥＧＦ発現ベクターを用いてＶＥＧＦレベルの増加があり（３５９４ｐｇ／ｍｌ）、Ｅ１およびＥ２を用いるとさらに増加した（１１８５６ｐｇ／ｍｌ）。
【０１８３】
上記実施例８からのｍＣｈｅｒｒｙの結果と類似した様式で、結果は、ＬＣＲ領域のサイズに応じてＨＰＶｏｒｉ活性化に差異があったことを実証する。図８に示すように、Ｅ１／Ｅ２を添加した後、ＶＥＧＦレベルにおよそ３倍の変化があった。したがって、全長ＬＣＲ（配列番号１）または断片１（配列番号２）は目的の遺伝子（すなわち、ＶＥＧＦ）を低レベルで発現するが、Ｅ１／Ｅ２を導入したとき、発現の強い誘導があった。対照的に、試験した他の断片はより高い初期レベルで発現し、Ｅ１／Ｅ２を導入した際の差異は減少した。
実施例１０
Ｅ１およびＥ２含有ベクターの開発
【０１８４】
標準的な分子生物学的技術（例えば、Sambrook；Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第４版）ならびに本明細書に記載の技術を使用して、ＨＰＶ  ＬＣＲならびにＥ１およびＥ２を含有する一連のレンチウイルスベクターを下記により詳細に記載するように開発した。これらのベクターはまた、本明細書の図９でも示す。
【０１８５】
図９を参照するに、ベクター２０を開発したが、これはｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを発現するための一般的なレンチウイルスベクターである。ベクター２０を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；プロモーター；ｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくは他のカーゴエレメント；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）、本明細書で詳述するＬＣＲ断片を含有することができるＬＣＲ部分；ならびに長末端反復部分（配列番号２８）。
【０１８６】
図９を参照するに、ベクター２１を開発したが、これはＥ１を発現するためのレンチウイルスベクターである。ベクター２１を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；ＣＭＶプロモーター（配列番号２９）；Ｅ１（配列番号６）ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）；ならびに長末端反復部分（配列番号２８）。
【０１８７】
図９を参照するに、ベクター２２を開発したが、これはＥ１−Ｃ（カルボキシ末端）（配列番号８）を発現するためのレンチウイルスベクターである。ベクター２２を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；ＣＭＶプロモーター（配列番号２９）；Ｅ１−Ｃ（配列番号８）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）；ならびに長末端反復部分（配列番号２８）。
【０１８８】
図９を参照するに、ベクター２３を開発したが、これはＥ２（ＨＰＶ１６）（配列番号７）を発現するためのレンチウイルスベクターである。ベクター２３を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；ＵｂｉＣプロモーター（配列番号３０）；Ｅ２（ＨＰＶ１６）（配列番号７）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）；ならびに長末端反復部分（配列番号２８）。
【０１８９】
図９を参照するに、ベクター２４を開発したが、これはＥ２−１１（ＨＰＶ１１）（配列番号９）を発現するためのレンチウイルスベクターである。ベクター２４を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；ＵｂｉＣプロモーター（配列番号３０）；Ｅ２−１１（ＨＰＶ１１）（配列番号９）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）；ならびに長末端反復エレメント（配列番号２８）。
【０１９０】
図９を参照するに、ベクター２５を開発したが、これはＥ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２（配列番号１０）を発現するためのレンチウイルスベクターである。ベクター２５を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；ＣＭＶプロモーター（配列番号２９）；Ｅ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２（配列番号１０）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）；ならびに長末端反復部分（配列番号２８）。
【０１９１】
図９を参照するに、ベクター２６を開発したが、これはＥ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２（配列番号１０）および完全長ＬＣＲ（配列番号１）またはその断片（例えば、配列番号２〜５）を発現するためのレンチウイルスベクターである。ベクター２６を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；ＣＭＶプロモーター（配列番号２９）；Ｅ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２（配列番号１０）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）、ＬＣＲ部分；ならびに長末端反復部分（配列番号２８）。
【０１９２】
なお図９を参照するに、ベクター２７は、例えば、ｃＤＮＡ、抗体、マイクロＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡを発現するための一般的なレンチウイルスベクターである。ベクター２７を参照するに、左から右へ、開発したベクターの重要な成分は、次の通りである：長末端反復部分（配列番号２７）；ｐｓｉパッケージングエレメント（配列番号２２）；ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）（配列番号２３）；プロモーター；ｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくは他のカーゴエレメント；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２５）、ＥＢＶｏｒｉ（配列番号３１）；ならびに長末端反復エレメント（配列番号２８）。
【０１９３】
本明細書に詳述される線形ベクターは、例えば、ベクター２０（図９に示す）の環状化を示す図１０に示すように細胞内で環状化する。本明細書に詳述される実験の目的のために、図１０は、３’および５’長末端反復（ＬＴＲ）に位置する矢印としてプライマーセットを詳述する。このプライマーセットは、エピソーム形態のレンチウイルスベクターを増幅するように設計されており、組み込まれた形態のベクターは増幅しない。レンチウイルスエピソームの検出のために適切なプライマーは、以下の配列を含有する：
３’ＬＴＲフォワード  ＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＡＡＣＧＡＡＧ（配列番号１１）；および
５’ＬＴＲリバース  ＧＣＣＧＡＧＴＣＣＴＧＣＧＴＣＧＡＧＡＧ（配列番号１２）。
【０１９４】
ここで詳述する実験では、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターコピー数を、ベクター２０とベクター２１、ベクター２２、ベクター２３またはベクター２４との組合せを利用する組合せによって調節した。代替的に、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターコピー数を、ベクター２０とベクター２５またはベクター２６との組合せを利用する組合せによって調節した。
実施例11 
ＬＣＲ断片および関連ベクターの開発
【０１９５】
本明細書で議論されるように、本明細書に詳述されるベクターのＬＣＲ部分は、断片１（配列番号２）、断片２（配列番号３）、断片３（配列番号４）および断片４（配列番号５）などの断片であることができ、それらの使用を通じて修飾した。
【０１９６】
ＬＣＲおよび本明細書に記載の断片のゲノム構成を図１１に示す。その図で全長ＬＣＲ（上部）は、一連のＡＰ１、ＹＹ１、Ｅ１およびＥ２結合部位を含んでいる。例えば図１１に示すように、断片１（配列番号２）、断片２（配列番号３）、断片３（配列番号４）および断片４（配列番号５）は、一連のＡＰ１、ＹＹ１およびＥ２結合部位が減少する５’トランケーションの増加に伴ってＬＣＲの増加を表す。ＬＣＲ断片を利用するレンチウイルスベクターが、本明細書に詳述される（例えば、図７および本明細書における関連実施例）。
実施例12 
ＬＣＲ断片およびＥ１／Ｅ２バリアントを含有するベクターの試験
【０１９７】
本明細書に詳述される様々なＬＣＲ断片を含有するベクターを試験するために、２９３Ｔ細胞を、全長ＨＰＶ１６長制御領域（ＬＣＲ）、または本明細書において記載される断片１（配列番号２）、断片２（配列番号３）、断片３（配列番号４）および断片４（配列番号５）のいずれかを含有するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した（例えば、図７および本明細書における関連実施例を参照）。
【０１９８】
２４時間後、細胞を、リポフェクタミン２０００を用いて、ＨＰＶ１６  Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を含有するプラスミドでトランスフェクトした。２日後、ＤＮＡを、ｑＰＣＲによる分析のために抽出した。レンチウイルスベクターのエピソーム形態に特異的な配列番号１１および配列番号１２によって表されるプライマーを使用してエピソームコピー数を決定した。なお、このプライマーセットは、１−および２−ＬＴＲエピソームのみを増幅した。この実施例についてのデータを図１２に示す。この図において、ＬＣＲおよびその断片に関連づけられた数は、Ｅ１およびＥ２添加後の条件のそれぞれについての倍率変化の増加を反映している。
【０１９９】
図１２に示すように、全長ＬＣＲおよびＦｒａｇ１についての基底エピソームコピー数は非常に低かった。例えば、これらの２つの条件（すなわち、全長ＬＣＲおよびＦｒａｇ１）について、基底エピソームコピー数は、細胞当たり０．０２０未満のエピソームコピーであった。基底エピソームコピー数は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３およびＦｒａｇ４構築物についてわずかに高かった。例えば、これらの３つの条件（すなわち、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３およびＦｒａｇ４）について、基底エピソームコピー数は細胞当たり０．０２０またはそれよりも高いエピソームコピーであった。基底エピソームコピー数のデータは、試験した条件のそれぞれについて、相対倍率変化に影響を与えた。図１２に示すように、Ｅ１／Ｅ２が系に導入されたとき、全長ＬＣＲ構築物は、エピソームコピー数で２６７倍率変化の増加に至った。Ｅ１／Ｅ２が系に導入されたとき、Ｆｒａｇ１構築物は、エピソームコピー数で３６２倍率変化の増加に至った。Ｅ１／Ｅ２が系に導入されたとき、Ｆｒａｇ２構築物は、エピソームコピー数で６倍率変化の増加に至った。Ｅ１／Ｅ２が系に導入されたとき、Ｆｒａｇ３構築物は、エピソームコピー数で６１倍率変化の増加に至った。Ｅ１／Ｅ２が系に導入されたとき、Ｆｒａｇ４構築物は、エピソームコピー数で７倍率変化の増加に至った。図１２で詳述されるデータはまた、本明細書の図２０において、別個の形式で再計算されている。
【０２００】
別のセットの関連実験では、ＨＰＶ  ＬＣＲおよびその３’断片を含むインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターからのｍＣｈｅｒｒｙ発現について分析を実施した。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙならびに全長ＨＰＶ１６長制御領域（ＬＣＲ）または断片１（配列番号２）、断片２（配列番号３）、断片３（配列番号４）および断片４（配列番号５）のいずれかを発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した。同時に、細胞を、ＨＰＶ１６  Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を発現するレンチウイルスで形質導入した。２日後、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を、ＦＡＣＳによって分析した。
【０２０１】
図１３Ａに示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞のパーセントを、試験した条件のそれぞれについて特定した。ＬＣＲおよびその断片に関連づけられた数は、Ｅ１およびＥ２添加後の条件のそれぞれについての倍率変化の増加を反映している。
【０２０２】
別の一組の関連実験で、２９３Ｔ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙと、配列番号１として先に同定された全長ＨＰＶ１６長制御領域とを発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した。同時に、細胞を、単一のベクター（図９のベクター２５参照）からのＨＰＶ１６  Ｅ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２（配列番号１０）を発現するレンチウイルスで形質導入した。２日後、ｍＣｈｅｒｒｙ発現をＦＡＣＳによって分析した。データを図１３Ｂに示す。その図で示すように、ＨＰＶ１６  Ｅ１−Ｔ２Ａ−Ｅ２（配列番号１０）での形質導入は、陽性ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の顕著な増加に至った。
【０２０３】
別の一組の関連実験では、Ｅ１、Ｅ１−ＣおよびＥ２−１１の添加後に、ＨＰＶ  ＬＣＲを含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを使用してｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析を実施した。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙとＨＰＶ１６ＬＣＲ（配列番号１）または断片１（配列番号２）とを発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで形質導入した。同時に、細胞を、ＨＰＶ１６  Ｅ１（すなわち、図９におけるベクター２１；および配列番号６）またはＥ１カルボキシ（Ｃ）末端断片（すなわち、図９におけるベクター２２；および配列番号８）ならびにＨＰＶ１６  Ｅ２（すなわち、図９におけるベクター２３；および配列番号７）またはＨＰＶ１１  Ｅ２（すなわち、図９におけるベクター２４；および配列番号９）で形質導入した。２日後、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を、ＦＡＣＳによって分析した。図１４に示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞のパーセントを、試験した条件のそれぞれについて特定した。試験した条件に関連づけられた数は、Ｅ１およびＥ２添加後の条件のそれぞれについての倍率変化の増加を反映している。
実施例13 
抗体発現
【０２０４】
本明細書で述べるように、開示される系の特長の１つは、抗体を発現させるための開示される系の有用性である。本明細書に詳述される一連の代表的実験では、抗ＨＥＲ２抗体を、レンチウイルスベクター系を使用して発現させた。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、ＨＥＲ２に対する抗体配列（配列番号１３）およびＨＰＶ  ＬＣＲ（配列番号１）配列を含有するＤ６４インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（すなわち、ベクター２０）で感染させた。
【０２０５】
同時に、細胞を、Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を含有するレンチウイルスベクターで感染させた。３日後、細胞培養培地を回収した。抗体をタンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズを使用して培地から精製した。免疫ブロットは、ヒツジ抗ヒト抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。抗体産生は、図１５Ａに示すように、Ｅ１およびＥ２の添加で増加した。さらに、図１５Ｂに示すように、抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ濃度を、ＥａｓｙＴｉｔｅｒ  ＩｇＧキットを使用して決定した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【０２０６】
さらに、本明細書の図１６に示すように、さらなる抗体は、本明細書に開示される系を使用して発現させることもできる。図１６において、抗ＥＧＦＲ抗体（配列番号１４）の発現を実証する免疫ブロットを示す。簡単に述べると、２９３Ｔ細胞を、ＥＧＦＲに対する抗体配列（下記配列番号１４参照）およびＨＰＶ断片２（配列番号３）を含有するＤ６４インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターで感染させた。
【０２０７】
２４時間後、細胞を、Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）を含有するレンチウイルスベクターで感染させた。３日後、細胞溶解物および細胞培養培地を回収した。抗体を、タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズを使用して培地から精製し、細胞溶解によって細胞から抽出した。免疫ブロットは、ヒツジ抗ヒト抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および細胞溶解物についてのタンパク質ローディング対照用抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）抗体を使用して実施した。抗体産生は、図１６に示すように、Ｅ１およびＥ２を添加した細胞溶解物ならびに培地の両方で増加した。
実施例14 
マイクロＲＮＡ発現およびノックダウン
【０２０８】
本明細書で述べるように、開示される系の特長の１つは、マイクロＲＮＡを発現させるための開示される系の有用性である。非限定的な例として、構築物を、配列番号１５に基づくＣＣＲ５についてマイクロＲＮＡを発現するように設計した。
【０２０９】
簡単に述べると、ＣＣＲ５を発現するＨｅＬａ細胞を、ＣＣＲ５（配列番号１５）に対するマイクロＲＮＡ配列および全長ＨＰＶ  ＬＣＲ（配列番号１）配列を含有するＤ６４インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（すなわち、ベクター２０）で感染させた。同時に、細胞を、Ｅ１およびＥ２を含有するレンチウイルスベクターで感染させた。３日後、細胞を回収し、抗ＣＣＲ５  ＡＰＣコンジュゲート抗体を用いてＦＡＣＳ分析により、ＣＣＲ５発現について分析した。図１７に示すように、ＣＣＲ５陽性細胞のパーセンテージは、ＬＶ−ＬＣＲ  ｍｉＲ−ＣＣＲ５を用いて９２．６％から７０．９％まで、ＬＶ−ＬＣＲ  ｍｉＲ−ＣＣＲ５＋Ｅ１およびＥ２を用いて４４％まで減少した。
【０２１０】
関連する実験では、ＣＣＲ５に対するマイクロＲＮＡ配列および断片２（配列番号３）ＬＣＲ配列を含有するＤ６４インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクターを利用した。図１８に示すように、ｍｉＲ−ＣＣＲ５の添加後にＣＣＲ５発現の同様の低下があり、Ｅ１およびＥ２を添加したときになおさらなる低下があった。
【０２１１】
図１８をより詳細に参照するに、上部パネルは、ｍＣｈｅｒｒｙの発現レベルに基づいた単一の点でそれぞれ表される細胞の分布を示す。下部パネルは、ＣＣＲ５発現における対応する変化を示しており、この変化は、ＤＮＡ複製およびＣＣＲ５に対するｍｉＲＮＡ産生のレベルに関係している。ＣＣＲ５は、細胞表面を染色するために使用される蛍光モノクローナル抗体によって検出される。いずれのＬＶベクターも無い場合（左パネル）、ｍＣｈｅｒｒｙの発現は無く（全ての細胞がセクター１にある）、ＣＣＲ５発現は約２００蛍光強度単位で均一に高い。ｍｉＲＣＣＲ５を含有するＬＶ−ＬＣＲ（断片２；配列番号３）を添加することにより、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙの基底発現を有する細胞（ここでセクター２において５５％の細胞が見出された）と、約３０強度単位に集中する蛍光強度単位を有する新たな集団を導くＣＣＲ５発現の一部減少（下部、中央パネルの破線）を見出す。ＬＶ−ＬＣＲ  ｍｉＲＣＣＲ５とＥ１およびＥ２複製タンパク質を発現する非組み込みレンチウイルスベクターとの両方を添加することにより、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙの最も高い発現を有する１８．８％の細胞（セクター３）と、蛍光強度単位が２０未満であるさらに低いＣＣＲ５発現を有する新たな集団（曲線３、灰色の破線）を見出す。これらのデータは、ＣＣＲ５タンパク質の細胞表面発現の減少において生物学的に活性であるｍｉＲＣＣＲ５の基底レベルを発現するＬＣＲ断片２（配列番号３）を含有するＶＩＶの能力を実証する。さらに、結果は、Ｅ１／Ｅ２  ＤＮＡ複製タンパク質の添加がベクターコピー数（ｍＣｈｅｒｒｙの発現に関連）に影響を与えること、および増加したｍｉＲＣＣＲ５発現が細胞表面ＣＣＲ５発現のさらなる減少を導くことを示す。
実施例15 
ＥＢＶに基づくイニシエータータンパク質
【０２１２】
本明細書で述べるように、Ｅ１（配列番号６）およびＥ２（配列番号７）などのイニシエータータンパク質は、本明細書に記載の系の効力を高めるために使用することができる。現行の系で使用される代替的イニシエータータンパク質はＥＢＮＡ−１（配列番号３２）である。したがって一連の実験において、２９３Ｔ細胞を、ＧＦＰおよびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ＯｒｉＰ配列（配列番号３１）を発現するＤ６４Ｖインテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（すなわち、ベクター２７）で形質導入した。
【０２１３】
２４時間後、リポフェクタミン２０００を用いて、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−１（配列番号３２）を含有するプラスミドで細胞をトランスフェクトした。２日後、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって分析した。図１９に代表的データで示すように、ＥＢＶ＋ＥＢＮＡは、ＧＦＰ発現の増強をもたらした。したがって、このデータは、イニシエータータンパク質／ｏｒｉ相互作用が、Ｅ１／Ｅ２相互作用に限定されず、エプスタイン・バーウイルス成分も含むことを実証する。
実施例16 
最適化されたウイルス送達系を設定するためのＬＣＲ断片の選択
【０２１４】
ＬＣＲ断片長を、細胞における所望の発現レベルに従って選択した。図２０は、本明細書における図１２で生成されたエピソームコピー数のデータを示す。さらに具体的には、図２０は、本発明の一態様に従った選択ルブリックを説明する。細胞当たりのエピソームコピー（Ｙ軸）をＬＣＲ断片長（Ｘ軸）に対してグラフ化した。図２０に示すように、細胞当たりのエピソームコピーによって決定される発現レベルの変動は、本明細書で試験した種々のＬＣＲ断片に起因した。図２０に示すように、右から左へ移りながら、全長ＬＣＲ（配列番号１）、断片１（配列番号２）、断片２（配列番号３）、断片３（配列番号４）および断片４（配列番号５）のデータを、Ｅ１／Ｅ２有り（黒色丸データ点）および無し（薄灰色丸データ点）で示す。図１２に示されるように、細胞当たりのエピソームコピーによって決定される基底発現は、ＬＣＲおよびＦｒａｇ１構築物で最も低かった。例えば、これらの２つの条件（すなわち、全長ＬＣＲおよびＦｒａｇ１）について、基底エピソームコピー数は、細胞当たり０．０２０未満のエピソームコピーであった。基底発現は、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３およびＦｒａｇ４条件でわずかに高かった。例えば、これらの３つの条件（すなわち、Ｆｒａｇ２、Ｆｒａｇ３およびＦｒａｇ４）について、基底エピソームコピー数は細胞当たり０．０２０またはそれよりも高いエピソームコピーであった。
【０２１５】
図１１および２０の両方を参照するに、ＬＣＲの５’末端からの欠失の増加により、重要な機能的エレメントが除去された。基底発現は、ＬＣＲまたはＬＣＲ断片がレンチウイルス由来エピソームベクター内に存在し、Ｅ１／Ｅ２タンパク質の添加が無いとき（例えば、薄灰色丸データ点）に定量ＰＣＲアッセイによって測定されるエピソームＤＮＡコピーの数によって定義した。誘導活性は、Ｅ１およびＥ２を含有する発現プラスミドをトランスフェクトし（例えば、黒色丸データ点）、次いでレンチウイルス由来エピソームベクターを導入した後に、細胞当たりのエピソームＤＮＡコピー数を定量ＰＣＲアッセイで測定することによって測定した。同様の結果が、Ｅ１／Ｅ２タンパク質発現構築物が非組み込みレンチウイルスベクターとして送達されたときに得られた。本明細書に詳述されるように、基底発現は、ＬＣＲの断片２、３および４について最も高いと決定された。このことは、基底発現が、図１１に示すようにＬＣＲと断片１の両方に存在するが断片２〜４には存在しないＹＹ１転写因子結合部位の存在によって抑制されたことを示している。断片２〜４の中では、断片２が最も高い基底発現を示し、この断片は、両方のＡＰ１転写因子結合部位を含む唯一の断片であった。このように、基底転写は、ＹＹ１部位が除去され、両方のＡＰ１部位が保存されたときに増加した。本明細書で詳述されるように、誘導活性は、断片１および３について最も高く、断片２および４についてはより低く、インタクトのＬＣＲについて最も低いと決定された。ＬＣＲ内にあって断片１には存在しない未特定のエレメントがあったが、それが誘導性ＤＮＡ複製を抑制するように作用した。ＹＹ１およびＡＰ１部位が存在したとき（断片１）、エピソームＤＮＡレベルは、ＹＹ１および全てのＡＰ１部位を除去した場合（断片３）と比較して低かった。ＡＰ１部位がＹＹ１無しに存在したとき（断片２）、またはＹＹ１、ＡＰ１および４つのうち２つのＥ２結合部位が除去されたとき（断片４）、誘導性エピソームＤＮＡ形成は中等度であり、ＬＣＲと同様であった。
【０２１６】
図２０に要約されるように、本明細書に詳述されるデータは、発現の基底レベルの識別可能な差異およびそのような発現を誘導する能力を実証する。このデータに基づいて、活性の少なくとも４つの象限を、図２０に示すように定義した。
【０２１７】
図２１を参照するに、４つの象限は、ＬＣＲおよびその関連断片に起因する活性の変動度合を表している。図２１に示すように、第１象限は、低活性だが第４象限より３〜４倍高い活性を反映し、小さいＬＣＲ断片を有する。第２象限は、高活性を反映し、再び小さいＬＣＲ断片を有する。第３象限は、高活性を反映しているが、今度は、比較的長いＬＣＲ断片を有する。最後に、第４象限は、非常に低い活性を反映し、比較的長いＬＣＲ断片を有する。
【０２１８】
図２１に詳述されるように、各象限は、特定の所望の処置経過または転帰に合理的に関連づけられている。代表的な例として、所望の処置経過または転帰が遺伝子編集を含むとき、第１象限から選ばれるＬＣＲが選択される。代表的な例として、所望の処置経過または転帰が細胞リプログラミングを含むとき、第２象限からのＬＣＲが選択される。代表的な例として、所望の処置経過または転帰が免疫刺激であるとき、第３象限からのＬＣＲが選択される。代表的な例として、所望の処置経過または転帰がプラセボ効果であるとき、第４象限からのＬＣＲが選択される。したがって、所望の処置経過または転帰に基づいて、様々なＬＣＲ断片が現行の系を使用して採用される。
実施例17 
第１象限下での個体の処置
【０２１９】
処置を、鎌状赤血球貧血のために設計する。このアプローチでは、ＣＤ３４＋骨髄由来造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）を取り出し、ｅｘ  ｖｉｖｏで、遺伝子修飾で処理し、自家細胞療法として移植する。この戦略は、胎児型グロビン発現の強力なリプレッサである（Akinsheyeら、Blood、１１８巻：１９頁、２０１１年）Ｂｃｌ１１Ａタンパク質の発現を減少させる阻害性ｍｉＲＮＡを発現させることによる。Ｂｃｌ１１Ａレベルが減少するとき、胎児型グロビンの発現が増加し、正常細胞機能の点から成体グロビンに置き換わる。
【０２２０】
ウイルスベクター用量を劇的に増加させずに阻害性ｍｉＲＮＡの十分なレベルを発現する能力が、今度は、形質導入ＣＤ３４＋  ＨＰＳＣの生存性を減少させ、処置の効率を低下させ、治療コストを上げることになり得るという、安全性試験の懸念が生じる。レンチウイルスベクターの量を増加させずに発現を増加させるという問題を克服するために、遺伝子用量を増加させることができる非組み込みベクターが最良の選択肢であると判断される。まず、Ｂｃｌ１１Ａ  ｍｉＲＮＡを発現する染色体外ＤＮＡの低用量が、Ｂｃｌ１１Ａ発現を阻害し、胎児型グロビン発現を上昇させるために十分であるかを試験することが必要である。
【０２２１】
レンチウイルスベクター（ＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａ）を、以下を含有する標準の一般的に許容される臨床等級ベクター骨格およびパッケージング系（変異によって不活性化されたインテグラーゼ機能を備える）を使用して構築する：適切なプロモーターの制御下にＢｃｌ１１Ａ  ｍＲＮＡ内で見出せる配列に適合するガイド配列を備えた合成ｍｉＲＮＡ構築物；２００ヌクレオチド長のＬＣＲ断片；およびＥ１および／またはＥ２複製タンパク質の付随する発現はなし。
【０２２２】
形質導入細胞の頻度を最大にし、ＨＰＳＣ細胞死を最少化する条件である５に等しい感染多重度で、ＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａを使用してＨＰＳＣに形質導入する。形質導入細胞を、適切な細胞減少のコンディショニング後に、元のドナーの骨髄に生着させる。治験参加者をモニタリングして、形質導入細胞の頻度、細胞当たりの染色体外ＤＮＡのコピーおよび胎児型グロビン発現レベルを決定する。この第１象限アプローチは、低い細胞当たりの染色体外ＤＮＡコピー数を生じ、ＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａの低い治療用量を構成することが合理的に予測される。
実施例18
第２象限下での個体の処置
【０２２３】
処置を、鎌状赤血球貧血に関連する細胞リプログラミングのために設計する。このアプローチでは、ＣＤ３４＋骨髄由来造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）を取り出し、ｅｘ  ｖｉｖｏで、遺伝子修飾で処理し、自家細胞療法として移植する。この戦略は、胎児型グロビン発現の強力なリプレッサであるＢｃｌ１１Ａタンパク質の発現を減少させる阻害性ｍｉＲＮＡを発現させることによる。Ｂｃｌ１１Ａレベルが減少するとき、胎児型グロビンの発現が増加し、正常細胞機能の点から成体グロビンに置き換わる。
【０２２４】
ウイルスベクター用量を劇的に増加させずに阻害性ｍｉＲＮＡの十分なレベルを発現する能力が、今度は、形質導入ＣＤ３４＋  ＨＰＳＣの生存性を減少させ、処置の効率を低下させ、治療コストを上げることになり得るという懸念が生じる。
【０２２５】
レンチウイルスベクターの量を増加させずに発現を増加させるという問題を克服するために、遺伝子用量を変動させることができる非組み込みベクターが最良の選択肢であると判断される。第１象限条件（Ｅ１および／またはＥ２複製タンパク質の付随する発現の無い短いＬＣＲ断片）（すなわち、実施例１７）を使用する初期試験に続いて、Ｂｃｌ１１Ａ  ｍｉＲＮＡを発現する染色体外ＤＮＡの高用量が、Ｂｃｌ１１Ａ発現を阻害し、胎児型グロビン発現を上昇させるために十分であるかを試験することが必要である。短いＬＣＲならびにＥ１および／またはＥ２複製タンパク質の付随する発現を使用する遺伝子用量の誘導的性質により、同一用量のＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａを、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質の一過性発現のための非組み込みレンチウイルスベクターと共に送達して、ＣＤ３４＋  ＨＰＳＣ生存性を減少させるレンチウイルスベクター用量の上昇無しに、５倍を超えて遺伝子用量を増加させることができる。
【０２２６】
レンチウイルスベクター（ＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａ）を、以下を含有する標準の一般的に許容される臨床等級ベクター骨格およびパッケージング系（変異によって不活性化されたインテグラーゼ機能を備える）を使用して構築する：適切なプロモーターの制御下にＢｃｌ１１Ａ  ｍＲＮＡ内で見出せる配列に適合するガイド配列を備えた合成ｍｉＲＮＡ構築物；２００ヌクレオチド長のＬＣＲ断片；ＤＮＡ複製を制御するために、Ｅ１および／またはＥ２複製タンパク質は、ＬＣＲを含まない非組み込みレンチウイルスベクターで発現させる。
【０２２７】
形質導入細胞の頻度を最大にし、ＨＰＳＣ細胞死を最少化する条件である５に等しい感染多重度で、ＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａを使用してＨＰＳＣに形質導入する。形質導入細胞を、適切な細胞減少のコンディショニング後に、元のドナーの骨髄に生着させる。治験参加者をモニタリングして、形質導入細胞の頻度、細胞当たりの染色体外ＤＮＡのコピーおよび胎児型グロビン発現レベルを決定する。第２象限アプローチは、高い細胞当たりの染色体外ＤＮＡコピー数を生じ、ＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａの高治療用量を構成することが合理的に予測される。
【０２２８】
実施例１７および１８に示す試験を比較して、処置の効率および効力を最大化するためにＣＤ３４＋  ＨＰＳＣをＬＶｍｉＲＢｃｌ１１Ａと共に形質導入するための最適な条件を決定する。
実施例19
第３象限下での個体の処置
【０２２９】
ＨＩＶ疾患について提唱される受動免疫処置は、ウイルスの付着と感受性Ｔ細胞の侵入を促進する細胞表面インテグリン受容体アルファ４ベータ７を欠失させるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集の使用を含む。処置戦略は、末梢血からＴ細胞を単離し、次いで、アルファ４ベータ７遺伝子配列に特異的なガイドＲＮＡを含む抗アルファ４ベータ７ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を保有するレンチウイルスで形質導入することを含む。単離したＴ細胞を治療レンチウイルスで形質導入してアルファ４ベータ７受容体を欠失させる。次いで、細胞を、注入を介して、体に戻す。循環に戻ると、これらのＨＩＶ耐性細胞は数が増加し、ＨＩＶ複製に抵抗する能力を含む正常な免疫機能の提供を開始し得る。高用量のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９レンチウイルスベクターが、アルファ４ベータ７遺伝子の均一な欠失を達成するために必要であると予測される。提唱される治験（すなわち、実施例２０）の一つのアームは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アルファ４ベータ７を発現するがＥ１および／またはＥ２複製タンパク質は含まない、かろうじて検出可能レベルを超えるコピー数を増加させるために必要な、ＬＣＲの長形態を有する非組み込みレンチウイルスベクターを利用する。
【０２３０】
治験のこの治療アームでは、同じＬＶＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アルファ４ベータ７が送達され、ＬＣＲは含有せずＤＮＡ複製できない構築物でのＥ１および／またはＥ２複製タンパク質を発現する非組み込みレンチウイルスの付随する送達がある。これによりＴ細胞に効率的に形質導入するために必要なＬＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アルファ４ベータ７の量を変化させることなく遺伝子用量が増加し、治験の高用量治療アームと考えられる。
【０２３１】
レンチウイルスベクターを構築し、一般的に使用されるウイルスベクター骨格内に以下のエレメントを含有させる：Ｅ１および／またはＥ２複製タンパク質が提供されるときに誘導性である７２０ヌクレオチド長のＬＣＲ；ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質のための遺伝子転写の適切なプロモーターおよびアルファ４ベータ７相補的ガイドＲＮＡを含有する発現カセット。ベクターは、通常のウイルスＤＮＡ組み込みを阻止するためのインテグラーゼ遺伝子の変異を伴ってパッケージングされる。第２の非組み込みレンチウイルスを使用して、ＬＣＲを含有せずＤＮＡを複製することができない構築物でのＥ１および／またはＥ２  ＤＮＡ複製タンパク質の一過性発現を提供する。
【０２３２】
遺伝子用量がＥ１および／またはＥ２タンパク質の添加により増加したため、Ｔ細胞は、高ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡ発現を有する非組み込みレンチウイルスベクターでｅｘ  ｖｉｖｏ修飾される。細胞を、試験の治療アームにおける治験対象に戻す。臨床転帰は、ＨＩＶ存在下でのアルファ４ベータ７遺伝子欠失を保有するＴ細胞の比率の増加、抗レトロウイルス医薬非存在下でのＴ細胞機能およびＨＩＶ複製自然制御の改善に基づいて評価される。この第３象限アプローチは、ＨＩＶ存在下でのアルファ４ベータ７遺伝子欠失を保有するＴ細胞の比率の増加、抗レトロウイルス医薬非存在下でのＴ細胞機能およびＨＩＶ複製自然制御の改善をもたらすことが合理的に予測される。
実施例20 
第４象限下での個体の処置
【０２３３】
ＨＩＶ疾患について提唱される処置は、ウイルスの付着と感受性Ｔ細胞の侵入を促進する細胞表面インテグリン受容体アルファ４ベータ７を欠失させるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集の使用を含む。処置戦略は、末梢血からＴ細胞を単離し、次いで、アルファ４ベータ７遺伝子配列に特異的なガイドＲＮＡを含む抗アルファ４ベータ７ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を保有するレンチウイルスで形質導入することを含む。単離したＴ細胞を治療レンチウイルスで形質導入してアルファ４ベータ７受容体を欠失させ、次いで、細胞を、注入を介して、体に戻す。循環に戻ると、これらのＨＩＶ耐性細胞は数が増加し、ＨＩＶ複製に抵抗する能力を含む正常な免疫機能の提供を開始し得る。
【０２３４】
処置の臨床試験を開始する前に、ベクターの安全性と特異性を確認することが重要である。重大な懸念は、アルファ４ベータ７特異的ガイドＲＮＡを含む治療遺伝子カセットが組み込まれ、遺伝毒性を引き起こすかどうかということである。この懸念は、ガイドＲＮＡがヒトゲノムと直接的な相同性を有し、長期ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９発現が可能な構築物を組み込む作用が、細胞の形質転換およびがんを含む予測できない結果を生じ得ることによる。
【０２３５】
アルファ４ベータ７遺伝子へのベクター組み込みが高確率の事象ではないことを実証するために、対照治験は、非組み込み一過性ベクターを使用して注入前にｅｘ  ｖｉｖｏでＴ細胞を修飾する１つのアームを含むように設計されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ試験でシミュレートされ得るよりもｉｎ  ｖｉｖｏで分析される事象の数が非常に大きいので、リスクを評価するために十分なものではない。
【０２３６】
一般的に使用されるウイルスベクター骨格内に以下のエレメントを含有するレンチウイルスベクターを構築する：Ｅ１およびＥ２タンパク質の付随する発現の無い７２０ヌクレオチド長のＬＣＲ；ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質のための遺伝子転写の適切なプロモーターおよびアルファ４ベータ７相補的ガイドＲＮＡを含有する発現カセット。ベクターは、通常のウイルスＤＮＡ組み込みを阻止するためのインテグラーゼ遺伝子の変異を伴ってパッケージングされる。
【０２３７】
遺伝子用量は、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質無しでは増加しないため、Ｔ細胞は、最小のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはガイドＲＮＡ発現を有する非組み込みレンチウイルスベクターでｅｘ  ｖｉｖｏ修飾される。細胞を試験の対照アームの治験対象に戻し、そして染色体ＤＮＡを抽出し、適切なＰＣＲに基づく試験を実施して染色体ＤＮＡと組み換えられたウイルスＤＮＡを同定することによって、ウイルスＤＮＡ組み込みのパターンを測定する。任意の組み込まれたＤＮＡの組換え部位は高スループットＤＮＡ配列決定により決定され、有害事象の可能性を示す潜在的な遺伝毒性事象として報告される。この第４象限アプローチは、組換え事象をモニタリングするための有効な対照となることが、合理的に予測される。
配列
以下の配列が、本明細書で参照される。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
2019520814.tif 000013
【表３−９】
2019520814.tif 000014
【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
2019520814.tif 000020
【表３−１６】
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【表３−１７】
2019520814.tif 000022
【表３−１８】
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【表３−１９】
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【表３−２０】
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【表３−２１】
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【表３−２２】
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【表３−２３】
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【表３−２４】
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【表３−２５】
2019520814.tif 000030
【表３−２６】
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【表３−２７】
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【表３−２８】
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【表３−２９】
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【表３−３０】
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【０２３８】
本発明のある特定の好ましい実施形態を本明細書において記載し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図してはいない。これに対する様々な修正が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく行われ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
2019520814000001.app
【国際調査報告】
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2019520814.tif 000058
2019520814.tif 000059