(57)【要約】【解決手段】インスリンと、抗炎症又は抗血管新生活性を有するテトラ又はペンタペプチドとの組み合わせを含む、糖尿病の治療のための医薬製剤が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病に関連する眼病変の治療のためにインスリンと組み合わせて治療に使用するための、一般式（Ｉ）のペプチド：
Ｌ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、
（式中、  
Ｌ１は、Ｈ、又はアシル、又は任意にＮ−アシル化及び／若しくはＮ−アルキル化及び／若しくはＣα−アルキル化された、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、Ａｚｔ、Ｐｉｐ、ｐＧｌｕ、Ａｉｂ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃ、Ａｃ６ｃから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ１及びＸ３は、同じでも異なっていてもよく、任意にＮ−アルキル化及び／若しくはＣα−アルキル化された、Ａｒｇ、Ｏｒｎ及び任意にグアニジル化Ｌｙｓから選択される塩基性アミノ酸、並びにメタ又はパラ位でアミノ基又はグアニジノ基で置換されたフェニルアラニンであり；
Ｘ２は、任意にＮ−アルキル化された、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−メチルロイシン、α−メチルバリン、α−メチルグルタミン酸、Ａｉｂ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃ、Ａｃ６ｃから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｃ末端でアミド化又は非アミド化され、任意にＣα−アルキル化された、Ｐｈｅ、ｈ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、ｈ−１−Ｎａｌ、ｈ−２−Ｎａｌ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇから選択される、疎水性アミノ酸である）
及びその塩。
【請求項２】
請求項１に記載の使用のための、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ΝΗ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ΝΗ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５���−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−  （Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２から選択されるペプチド又はその塩。
【請求項３】
Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２又はＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２から選択される、請求項１に記載の使用のためのペプチド又はその塩。
【請求項４】
請求項１〜３のうちいずれか一項の定義によるペプチドと、インスリンとの組み合わせを、別々、同時、又は逐次的に投与するのに好適な形態で含む、医薬製剤。
【請求項５】
糖尿病合併症、特に糖尿病性網膜症の治療に使用するための、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
１〜２００ｍｇの単位用量のペプチドを、標準的な用量のインスリンと組み合わせて含む、請求項４又は５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
皮下、筋肉内、静脈内、経口、経鼻、舌下、局所、エアゾール若しくは経皮経路による、又は吸入による投与に好適な、請求項４又は５に記載の医薬製剤。
【請求項８】
皮下投与に好適な、請求項７に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病及び関連する眼病変の治療のための、抗炎症及び抗血管新生活性を有するテトラ又はペンタペプチドとインスリンとの組み合わせに関する。具体的には、本発明による組み合わせは、糖尿病性網膜症、白内障、緑内障及び黄斑変性症（degenerative maculopathy）のような視器官の変性プロセス等の糖尿病の症状に対して予防及び拮抗する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（ＤＭ）は、インスリン活性の低下から生じる代謝の変調である。具体的には、ＤＭは、上記ホルモンの利用能低下、その正常作用への妨害、又はこれら２つの要因の組み合わせによるものである可能性がある。１型ＤＭと２型ＤＭと呼ばれる２種類のＤＭが知られている。
【０００３】
１型ＤＭは、ＤＭ患者の約１０％が発症しており、上記ホルモンを産生するランゲルハンス島のβ細胞の破壊により膵臓がインスリンを産生できず、その結果インスリンを生涯毎日注射しなければならない。ただし、β細胞の破壊速度は変動が大きく、そのため一部の個体（通常は子供及び思春期）では疾患の発症が短期間で起こることがあり、成人では、よりゆっくりと起こる。
【０００４】
２型ＤＭは、１型よりも広く、糖尿病人口の約９０％で発症しており、複数の遺伝及び環境因子の組み合わせによって生じる多因子病因を有する。原因因子は、次の２つの主要メカニズムによって疾患の発症を招く：インスリン分泌の変調及びインスリン抵抗性の開始、すなわち、このホルモンの作用に対する標的組織の感度低下。
【０００５】
ＤＭは、ますます一般的になりつつある；米国だけで、毎年約２００，０００の糖尿病の新たな症例が報告されている。この疾患の罹患人口の世界的な割合は、ＷＨＯによると現在５％と推定され、女性の罹患率は２５％である。２０３０年までに世界で３億６０００万人を超える人々がＤＭに罹患すると推定される。疾患は年齢とともに増大し、３０歳未満の０．５％から、６５歳超の１０％以上までの範囲に及ぶ。
【０００６】
１型ＤＭでは総インスリンの欠乏があり、２型ＤＭでは食事療法及び経口糖尿病薬に抵抗性があり、薬理学的治療は、補充療法としてインスリンの投与を伴う。
【０００７】
現在、ブタインスリンのアミノ酸置換から得られた、又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の組換え株から産生されたヒトインスリンが主に使用されている。インスリン製剤にはさまざまな種類があり、その作用の持続時間に基づいて分類される：短時間で作用する速効型又は可溶性ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト及びインスリングルリジン；中間型のＮＰＨヒトインスリン及び遅効型ヒトインスリン；作用時間が長い超遅効型インスリン；及びインスリングラルギン及びインスリンデテミル等の持効型インスリン類似体。
【０００８】
インスリンは、皮下組織、好ましくは腹部の皮下組織への注射によって投与される。最も一般的な治療レジメンは、食事前に３回のインスリン注射による投与を伴う。上記の注射を、夕食前又は就寝前に摂取する中間型インスリンと組み合わせると、一晩の必要量をカバーするのに有用である。
【０００９】
他のプロトコルは、グラルギン又はデテミル等のインスリン類似体の毎日の注射で基礎必要量をカバーし、食事のときに即効型インスリンを注射する。これらのプロトコルは、食後血糖値をより効果的に制御するが、血糖値を一日中維持する効果は劣る。
【００１０】
米国ＦＤＡは最近、１型又は２型糖尿病の患者の血糖制御を改善するため、小型吸入器を用いた呼吸器投与のための乾燥形態を承認した。この薬剤は食前に摂取しなければならず、素早く吸収される。
【００１１】
ＤＭで常に現れる１つの特徴は、高血糖症で、これは時間とともに血管の重大な合併症である、大血管障害（特に重篤な、アテローム性動脈硬化症の初期形態であり、糖尿病に特異的ではない）、及び微小血管障害（小動脈の循環の病変で、特に網膜、腎臓及び神経で起こり、糖尿病に特異的である）と関連する傾向がある。特に障害となる長期的なＤＭ合併症は糖尿病性網膜症（ＤＲ）で、これはほとんどの場合２５〜６０歳の糖尿病患者に発症する；通常は、糖尿病の第１段階では発現せず、患者が少なくとも１０年間ＤＭに罹患したときに、急激に現れる。ＤＲは血管、特に視器官の微小循環の血管の壁の損傷によって引き起こされ；その結果、網膜の一部に対する血液（したがって酸素）の供給が不十分となり、結果的に網膜が虚血性になり、死滅する傾向がある。これが起こる前に、虚血性領域の組織は、新しい血管の成長因子を放出し、制御されない形で増殖することによって、網膜組織を更に損傷し、その機能を損なう。最も重篤な増殖形態において、ＤＲは、強力な血管増殖（房形成）の存在を特徴とする。この血管はきわめて脆く、しばしば破断する傾向があり、重篤な網膜損傷を引き起こし、これが視力低下を招き、最も重篤な場合には失明につながる。それよりも障害の小さい、非増殖形態では、ＤＲは新規血管形成を示さず、微小動脈のみである；ただし、これは小さい網膜血管だけでなく、より大きな血管にも作用し、時としてタンパク質、脂質、及び炭水化物堆積物と共に滲出し、これらが組み合わさって視力を悪化する。非増殖形態は、しばしば増殖形態へと変性する傾向がある。
【００１２】
一連の研究（非特許文献１；非特許文献２）は、経口低血糖治療からインスリンを用いた非経口治療への切り替えは、血糖制御が改善されるにもかかわらず、逆説的にＤＲを悪化し、これはおそらく、投与されたインスリンが、異常な血管過多を誘発する因子であるＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）の産生を刺激するからであることを実証している。
【００１３】
これらの知見を考慮して、インスリンの低血糖効果と、ＤＲの根底にある網膜血管新生の変性プロセスに対するＶＥＧＦの作用に拮抗する活性成分とを組み合わせた医薬製剤の開発に大いに興味が持たれる。
【００１４】
網膜及び黄斑における血管新生障害と関連する眼病変における抗−ＶＥＧＦ薬剤（アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ランパリズマブ及びａｂｉｃｉｐａｒ  ｐｅｇｏｌ）の有効性は投与形態と密接に関連し、その投与形態は、ほぼ毎月の投与で、必ず硝子体内注射でなければならない。
【００１５】
小ペプチドもＶＥＧＦ阻害剤として知られており（非特許文献３；特許文献１）、網膜血管過多の動物モデルにおいて有効であることが証明されている（非特許文献４、非特許文献５）。上記の治療は、身体の自由をかなり奪い、高額であり、活性成分の有効濃度を長期間維持することができず、多くの場合、最も重篤な症例である末期ＤＲには効かない。ＤＲの予防及び治療のための、より簡便で有効な投与形態は現在知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１７３７２号2
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Investigative Ophthalmology and Visual Science, 1999, Vol.40, No.13, p.3281-3286
【非特許文献２】Investigative Ophthalmology and Visual Science, 2007, Vol.48, No.12, p.5671-5676
【非特許文献３】Molecular Cancer Therapeutics, 2014, Vol.13, No.5, p.1092-1104
【非特許文献４】Investigative Ophthalmology and Visual Science, 2003, Vol.44, No.6, p.2361-2808
【非特許文献５】Investigative Ophthalmology and Visual Science, 2015, Vol.56, No.4, p.2392-2406
【非特許文献６】Journal of Neurochemistry, 2011, Vol.119, No.6, p.1317-1329
【非特許文献７】Experimental Eye Research, 2013, Vol.111, p.27-35
【非特許文献８】Investigative Ophthalmology and Visual Science, 2012, Vol.53, No.4, p.2181-2192
【非特許文献９】Investigative Ophthalmology and Visual Science, 2006, Vol.47, No.5, p.2125-2134
【非特許文献１０】European Journal of Scientific Research ISSN 1450-216X, 2009, Vol.32, No.3, p.398-402
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、しばしば失明につながるこれらの眼病変に、より外傷が少なく、より有効な方法で対抗する新規治療戦略を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
医薬製剤を以下に記載するインスリン処置と組み合わせることで、糖尿病と関連する眼病変の予防及び治療が可能になり、非外傷性投与経路を使用することで、限られたコストで、継続的治療及び活性成分が長期間にわたって有効な一定レベルにあることを可能する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、糖尿病に関連する眼病変の治療のためにインスリンと組み合わせた治療的使用のための、一般式（Ｉ）のペプチド：
Ｌ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４
（式中、
Ｌ１は、Ｈ、又はアシル、又は任意にＮ−アシル化及び／若しくはＮ−アルキル化及び／若しくはＣα−アルキル化された、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、Ａｚｔ、Ｐｉｐ、ｐＧｌｕ、Ａｉｂ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃ及びＡｃ６ｃから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ１及びＸ３は、同じでも異なっていてもよく、任意にＮ−アルキル化及び／若しくはＣα−アルキル化された、Ａｒｇ、Ｏｒｎ及び任意にグアニジル化Ｌｙｓから選択される塩基性アミノ酸、並びにメタ又はパラ位でアミノ基又はグアニジノ基で置換されたフェニルアラニンであり；
Ｘ２は、任意にＮ−アルキル化された、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、α−メチルロイシン、α−メチルバリン、α−メチルグルタミン酸、Ａｉｂ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃ及びＡｃ６ｃから選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｃ末端でアミド化又は非アミド化され、任意にＣα−アルキル化された、Ｐｈｅ、ｈ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、ｈ−１−Ｎａｌ、ｈ−２−Ｎａｌ、Ｃｈａ、Ｃｈｇ、Ｐｈｇから選択される、疎水性アミノ酸である）
及びその塩に関する。
【００２１】
式Ｉのペプチドは、特許文献１から既知である。
【００２２】
以下のものは、本発明によるペプチドの式に含まれ得る非天然アミノ酸のいくつかに使用される通常の略称である。
【００２３】
Ａｚｔ＝アゼチジン酸、Ｐｉｐ＝ピペコリン酸、Ａｉｂ＝α−アミノ−イソ酪酸、Ａｃ４ｃ＝１−アミノシクロブタン−１−カルボン酸、Ａｃ５ｃ＝１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸、Ａｃ６ｃ＝１−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、ｈ−Ｐｈｅ＝ホモフェニルアラニン、１−Ｎａｌ＝β−１−ナフチル−アラニン、２−Ｎａｌ＝β−２−ナフチル−アラニン、ｈ−１−Ｎａｌ＝ホモ−β−１−ナフチル−アラニン、ｈ−２−Ｎａｌ＝ホモ−β−２−ナフチル−アラニン、Ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン、Ｃｈｇ＝シクロヘキシルグリシン、Ｐｈｇ＝フェニルグリシン、ｐＧｌｕ＝ピログルタミン酸。
【００２４】
本発明による好ましいペプチドは：
Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ΝΗ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ν（Μｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ΝΗ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−ＯＨ；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２；Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ（Ｍｅ）Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２である。
【００２５】
ペプチドＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２及びＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２が特に好ましい。
【００２６】
本発明によるペプチドの全身注入投与、特に皮下投与を、インスリン処置と組み合わせると、いかなる毒性作用も示すことなく、糖尿病に関連する眼病変の発症に拮抗し、既に発現しているときにはその退行を導く。
【００２７】
これは、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ランパリズマブ、及びａｂｉｃｉｐａｒ  ｐｅｇｏｌの場合のように、全身投与した薬剤全般、特にペプチドが、薬理学的に有効な濃度で血液硝子体関門を通過する際に困難に直面することは周知であることから、意外である。上記薬剤は、眼病変に無効であるだけでなく、重篤な副作用も生じる。
【００２８】
本発明の別の態様において、本発明は、上記定義によるペプチドと、インスリンとの組み合わせを、別々、同時、又は逐次的に投与するのに好適な形態で含む、医薬製剤を提供する。
【００２９】
これらの製剤は、ペプチド及びインスリンを同じ剤形内に含有してもよく、又は式Ｉのペプチドの溶液を含む注射用アンプルと、皮下投与用インスリンが予め充填されたシリンジなど、別々の投与単位からなるの道具一式の形態であってもよい。
【００３０】
インスリンと組み合わせた推奨される治療的使用に関して、本発明によるペプチドは、そのままで、又は塩の形態で、液体若しくは固体医薬組成物に処方することができ、それをインスリン処置に従来使用されている全ての経路、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、経口、経鼻、舌下、局所、経皮、又は吸入により投与することができる。皮下投与が好ましく、この経路は通常インスリンに使用されている。ヒトにおけるペプチドの単位用量は、広い範囲、典型的には１投与当たり１００μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ〜２００ｍｇで変動すし得る。上記用量は、疾患の段階に応じ、患者の体重、性別及び年齢を考慮することによって、専門家は容易に決定できるであろう。
【００３１】
インスリンの好適な形態としては、速効型又は可溶性ヒトインスリン、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、ＮＰＨヒトインスリン、遅効型ヒトインスリン、作用時間が長い超遅効型ヒトインスリン；及びインスリングラルギン及びインスリンデテミル等の持効型インスリン類似体が挙げられる。
【００３２】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例証する。
【００３３】
実施例１、Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２コハク酸塩又はＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２コハク酸塩とインスリンとを含有する皮下投与用製剤
【００３４】
８０ｍｇ／ｍＬのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２コハク酸塩溶液１Ｌ、ｐＨ７．１〜７．３、２９０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ（溶液２）の調製：
【００３５】
８０ｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２コハク酸塩と２．０ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを、８００ｍＬのパイロジェンフリー水に溶解し、１ＮのＮａＯＨでｐＨを７．１〜７．３に調整し、この溶液をパイロジェンフリー水で１Ｌとし、０．２２μｍで濾過滅菌した。
【００３６】
９１ｍｇ／ｍＬのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２コハク酸塩溶液１Ｌ、ｐＨ７．１〜７．３、２９０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ（溶液４）の調製：
【００３７】
９１ｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２コハク酸塩と２．０ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを、８００ｍＬのパイロジェンフリー水に溶解し、１ＮのＮａＯＨでｐＨを７．１〜７．３に調整し、この溶液をパイロジェンフリー水で１Ｌとし、０．２２μｍで濾過滅菌した。
【００３８】
表１に、２０Ｕ／ｍＬのインスリン（溶液１）１ｍＬと上記ペプチド溶液（溶液２及び４）１ｍＬとを混合することによって調製したインスリン／ペプチド製剤を示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
表１−インスリン／ペプチド製剤は、２０Ｕ／ｍＬのインスリン１ｍＬを、８０ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２溶液１ｍL又は９１ｍｇ／ｍＬのペプチドＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２溶液１ｍＬと混合することによって、調製した。
【００４１】
実施例２、ＤＰ  ＢＢラットの治療における有効性
【００４２】
糖尿病に関連する網膜血管病変の治療における実施例１に記載の製剤３の有効性を、ＤＰ  ＢＢラット（ｄｉａｂｅｔｅｓ−ｐｒｏｎｅ  ＢｉｏＢｒｅｅｄｉｎｇラット、Ｍ＆Ｂ  Ｂｏｍｈｏｌｔｖｅｊ（デンマーク））を実験モデルとして使用して、処置動物の網膜機能を網膜電図検査（ＥＲＧ）により分析し、網膜の血管形成の状態を定量的免疫組織化学技術により分析することによって評価した。
【００４３】
ＤＰ  ＢＢラットは、１２〜１３週齢で自然に糖尿病を発症し、それは網膜の異常な血管形成による視力変性プロセスの開始を含め、様々な点で、ヒトで観察される糖尿病に非常に似ていることから、１型糖尿病の有用な実験モデルである。
【００４４】
雌雄両方の３週齢のＤＰ  ＢＢラット６０匹（雄３０匹と雌３０匹）を使用した。実験は、眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明（ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従い、ＥＥＣ指令８６／６０９に準拠して実施した。動物は、２３±１℃、湿度５０±５％、１２時間の明／暗サイクルの制御環境に収容し、餌及び水の摂取は無制限とした。動物を、生後第３週から３０週まで観察し、体重、血糖、尿中インスリン及び血中インスリンを含む種々のパラメータをモニタリングした。特に、糖尿病の発症は、血糖をＯｎｅ−Ｔｏｕｃｈ  ｐｒｏｆｉｌｅ（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）で週２回、第１３週からは毎日；尿中ブドウ糖をＣｌｉｎｉｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ（英国））で週２回；インスリンレベルを週２回、ＩＡ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｌａｎ（イタリア））で測定することによって評価した。ラットは、その血糖値が１２ｍＭを超えるが１５ｍＭ未満であるときに高血糖症とみなし、その血糖値が２回の連続する測定で１５ｍＭを超える場合に糖尿病とみなした。若年（３週齢）の動物は、血糖値が４〜５ｍＭの範囲であった；１０週齢で血糖値は６〜８ｍＭの範囲であった；１５週齢で、動物は明らかに糖尿病であり、血糖値は１５ｍＭを超え、体重は２００〜２７０ｇの範囲であった。このことから、第１５週からラットに皮下投与、１日２回、血糖値に応じて１〜２Ｕ（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｆｒａｎｃｅ  ＳＡ（フランス、パリ））の用量でインスリン処置を実施した。
【００４５】
治療に使用した溶液は、実施例１に記載のとおりである。
【００４６】
研究計画には、１０匹のラット（雄５匹、雌５匹）のグループを６つ使用した：グループＡ：第４週で安楽死させた動物。血糖値は４−５ｍＭで、末期糖尿病ではなく、いかなる処置も受けなかった；グループＢ：第１５週で安楽死させた動物。血糖値は１５ｍＭ近くに達し、いかなる処置も受けず、糖尿病とみなされた；グループＣ：２Ｕのインスリンを、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物；グループＤ：２Ｕのインスリン＋４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物；グループＥ：４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を、第３週から第１５週まで１日２回皮下投与した動物；グループＦ：４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を、第３週から第１５週まで１日２回皮下投与し、２Ｕのインスリン＋４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物。各グループの動物の網膜機能をＥＲＧにより評価した後で、安楽死させ、網膜を取り出して定量的組織化学的解析を行った。
【００４７】
網膜機能の評価
【００４８】
ＤＭの発症予防又はその退行取得における実施例１の製剤１の有効性を、種々の条件下で処置した動物の網膜機能を分析することによって評価した。網膜機能は、暗順応全視野ＥＲＧを用いて評価した。電気生理学的信号を、非特許文献６に報告されているように、記録した。ラットを終夜暗順応し、アベルチンの腹腔内注射によって麻酔した。瞳孔を、０．５％ｗ／ｗのアトロピンで散大した。応答部（錐体と杆体を合わせて）を、ガンツフェルド刺激装置（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｍａｎｇｏｎｉ（イタリア、ピサ））で発生した３．４〜１  ｌｏｇ  ｃｄ−ｓ．ｍ２の範囲の異なる強度の光の閃光によって刺激した。非光受容体の汚染を最小限に抑えるため、波の振幅を、刺激から８分の固定時間で測定した。波の振幅ｂは、波の最低点から波の最高点ｂまで測定した。５つの潜在的振動（ＰＯ）のうち、１  ｌｏｇ  ｃｄ−ｓ．ｍ２の光によって発生したＰＯ２、ＰＯ３及びＰＯ４のみを考慮に入れた。各ＰＯについて、最低−最高間の振幅を測定し、振幅を合計した（ＳＯＰ）。
【００４９】
表２に示すように、Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を毎日皮下投与することで、糖尿病の発症段階（グループＥ）、及び糖尿病が末期で動物のインスリン処置が必要なとき（グループＦ）に、網膜血管損傷の形成が防止された。ただし、インスリン処置だけでは大きな網膜血管損傷が生じ、視力を大きく低下した（グループＣ）のに対し、Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２＋インスリンでの処置は、網膜損傷の退行を生じ、視力を良好に回復した（グループＤ）。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
表２、網膜機能の評価。網膜機能は、暗順応全視野ＥＲＧを用いて、ＥＲＧにより評価した。ラットを終夜暗順応し、アベルチンの腹腔内注射によって麻酔し、瞳孔を、０．５％ｗ／ｗのアトロピンで散大した。応答部（錐体と杆体を合わせて）を、閃光（１  ｌｏｇ  ｃｄ−ｓ．ｍ２、ガンツフェルド刺激装置（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ  Ｍａｎｇｏｎｉ（イタリア、ピサ）により発生）によって刺激した。非光受容体の汚染を最小限に抑えるため、波の振幅を、刺激の８分後の固定時間で測定した。波の振幅ｂは、波の最低点から波の最高点ｂまで測定した。５つの潜在的振動（ＰＯ）のうち、１  ｌｏｇ  ｃｄ−ｓ．ｍ２の光によって発生したＰＯ２、ＰＯ３及びＰＯ４のみを考慮に入れた。各ＰＯについて、最低−最高間の振幅を測定し、振幅を合計した（ＳＯＰ）。各グループを、１０匹のＤＰ  ＢＢラット（雄５匹、雌５匹）で形成した。第１５週から、動物は、網膜血管状態の病変によって引き起こされる視力変性プロセスを伴う末期糖尿病を自然発症した。グループＡ：第４週で安楽死させた動物。血糖値は４~５ｍＭで、末期糖尿病ではなく、いかなる処置も受けなかった；グループＢ：第１５週で安楽死させた動物。血糖値は１５ｍＭ近くに達し、いかなる処置も受けず、糖尿病とみなされた；グループＣ：２Ｕのインスリン（５０μＬ  溶液１）を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物；グループＤ：２Ｕのインスリン＋４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液３）を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物；グループＥ：４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（５０μＬ  溶液２）を、第３週から第１５週まで１日２回皮下投与した動物；グループＦ：４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（５０μＬ  溶液２）を、第３週から第１５週まで１日２回皮下投与し、２Ｕのインスリン＋４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液３）を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物。
【００５２】
網膜血管形成状態の免疫組織化学試験及び定量的解析−処置した動物の網膜の血管形成状態を、内皮細胞の重要なマーカーである抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、全網膜について研究した。網膜の免疫組織化学試験並びに新生血管房形成、血管野及び無血管野の定量的解析を、文献（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献６；非特許文献９）の報告とおりに実施した。動物の安楽死及び眼球摘出後、網膜を除去し、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸緩衝液に４８℃で１．５時間浸漬することによって固定し、２５％ショ糖／０．１Ｍリン酸緩衝液ＰＢに移して、４８℃で保管した。
【００５３】
その後、全ての試料を採取したら、処置した網膜を解凍し、ＣＤ３１抗体（０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液中に１：５０）と共に４８℃で７２時間インキュベートした。全体を合わせて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８  二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ；０．１Ｍ  リン酸緩衝液中に１：２００）と共に４８℃で４８時間インキュベートした。最後に、処置した網膜を０．１Ｍ  リン酸緩衝液で洗浄し、０．１  Ｍ  グリセリン−リン酸緩衝液混合物を使用して、ゼラチンコートしたスライドガラスに載せてカバーガラスで覆った。
【００５４】
落射蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．（オランダ、アムステルダム））に、デジタルカメラコンバータ（ＳＤ−Ｆｉｌｃ  ｃａｍｅｒａ；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、網膜血管形成画像を取得した。電子画像を、画像処理ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ；Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理し、結果の定量的解析を可能にした。各実験条件について、１０匹のラットの２０の網膜から定量的データを得た。表３は、解析した試料の平均データを示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
表３−網膜の免疫組織化学試験並びに新生血管房形成の定量的解析。処置した動物の網膜の血管形成状態を、内皮細胞の重要なマーカーである抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、全網膜について研究した。動物の安楽死及び眼球摘出後、網膜を除去し、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸緩衝液に４８℃で１．５時間浸漬することによって固定し、２５％ショ糖／０．１Ｍリン酸緩衝液ＰＢに移して、４８℃で保管した。その後、全ての試料を採取したら、処置した網膜を解凍し、ＣＤ３１抗体（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する０．１Ｍリン酸緩衝液中に１：５０）と共に４８℃で７２時間インキュベートした。全体を合わせて、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ；０．１Ｍリン酸緩衝液中に１：２００）と共に４８℃で４８時間インキュベートした。最後に、処置した網膜を０．１Ｍ  リン酸緩衝液で洗浄し、０．１  Ｍ  グリセリン−リン酸緩衝液混合物を使用して、ゼラチンコートしたスライドガラスに載せてカバーガラスで覆った。落射蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．（オランダ、アムステルダム）に、デジタルカメラコンバータ（ＳＤ−Ｆｉｌｃ  ｃａｍｅｒａ；Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、網膜血管形成画像を取得した。電子画像を、画像処理ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ；Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理し、結果の定量的解析を可能にした。各実験条件について、１０匹のラットの２０の網膜から定量的データを得た。研究計画は、１０匹のＤＰ  ＢＢラット（雄５匹、雌５匹）のグループ６つを使用した。第１５週から、動物は、新生血管房形成を有する網膜血管状態の病変によって引き起こされる変性プロセスを伴う末期糖尿病を自然発症した。新血管形成面積は、まだ糖尿病ではない動物に存在する新血管形成の面積（グループＡ、網膜面積の約０．１％）と、そのグループの新血管形成の面積との比として表される。グループＡ：第４週で安楽死させた動物。血糖値は４〜５ｍＭで、末期糖尿病ではなく、いかなる処置も受けなかった；グループＢ：第１５週で安楽死させた動物。血糖値は１５ｍＭ近くに達し、いかなる処置も受けず、糖尿病とみなされた；グループＣ：２Ｕのインスリンを、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物（５０μＬ  溶液１）。グループＤ：２Ｕのインスリン＋４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液３）を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物；グループＥ：４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（５０μＬ  溶液２）を、第３週から第１５週まで１日２回皮下投与した動物；グループＦ：４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（５０μＬ  溶液２）を、第３週から第１５週まで１日２回皮下投与し、２Ｕのインスリン＋４ｍｇのＡｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液３）を、第１５週から第３０週まで１日２回皮下投与した動物。
【００５７】
表３に示すように、Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を毎日皮下投与することで、糖尿病の発症段階（グループＥ）、及び糖尿病が末期で動物のインスリン処置が必要なとき（グループＦ）に、網膜血管損傷の形成が防止された。ただし、表２のデータ（グループＣ）で確認されるように、インスリン処置だけでは、網膜血管損傷を示すＮＴＡの大幅な増大を引き起こし、視力を大きく低下したのに対し、Ａｃ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２＋インスリンでの治療は、網膜損傷の退行を生じ、視力を良好に回復した（グループＤ、表２）。
【００５８】
実施例３−ストレプトゾトシン処置によって糖尿病にしたラットの治療における、実施例１に記載の製剤５の有効性
【００５９】
糖尿病に関連する網膜血管病変の治療における、実施例１に記載の製剤５の有効性を、１５０ｍｇ／Ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；非特許文献１０）の単回腹腔内注射によって糖尿病にした１型糖尿病の８週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（雌雄両方、１７０〜２５０ｇ）（ＳＤ−ＳＴＺラットと呼ばれる）を実験モデルとして利用して、評価した。糖尿病状態の重篤度は、体重、臨床的徴候、及び血糖値を毎日モニタリングすることによって評価した。
【００６０】
糖尿病動物に現れた網膜血管病変を、実施例２に報告したように、網膜機能については網膜電図検査（ＥＲＧ）によって、また網膜の血管形成状態の判定は定量的免疫組織化学技術によって、評価した。
【００６１】
投与量のＳＴＺは、使用時に、化合物を０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解することによって調製した。ＳＴＺ投与では、動物を背臥位に置き、注射部位をヨード−ポビドン溶液で消毒及び緩衝し；ｉ．ｐ．注射を、ラットの尾側腹腔に、２５Ｇ滅菌針を用いて実施した。ＳＴＺ投与によって引き起こされた糖尿病の重篤度は毎日モニタリングし、血糖値はＯｎｅ−Ｔｏｕｃｈ  ｐｒｏｆｉｌｅ（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａ）で毎日；尿中ブドウ糖はＣｌｉｎｉｓｔｉｘ（Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ（英国、ベージングストーク））で週２回；インスリンレベルはＩＡ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ（イタリア、ミラノ））で週２回評価した。動物の血糖値を、血糖値に応じて１〜２Ｕの範囲の用量のインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ，Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｆｒａｎｃｅ  ＳＡ（フランス、パリ））で１日２回皮下処置したときに、ＳＴＺ処置の２４時間後に血糖が６−８ｍＭよりも高く、ＳＴＺ処置の２〜３日後に１５ｍＭを超えた場合に、その動物を糖尿病とみなした。
【００６２】
雌雄両方の８週齢のＳＤラット５０匹（雄３０匹と雌３０匹）を使用した。動物は、２３±１℃、湿度５０±５％、１２時間の明／暗サイクルの制御環境に収容し、餌及び水の摂取は無制限とした。
【００６３】
治療に使用した溶液は、実施例１に記載のとおりであった。
【００６４】
研究計画には、１０匹のラット（雄５匹、雌５匹）を用いた。グループＡ：ＳＴＺのｉ．ｐ．投与の直前に安楽死させたＳＤラット、糖尿病の徴候はなく、血糖値は４〜５ｍＭであり、何の処置も受けなかった；グループＢ：ＳＤ−ＳＴＺ５ｗラット、ＳＴＺ投与の２４時間後に、すでに血糖値＞１２ｍＭを示し、何の処置も受けず、ＳＴＺ処置の５週間後に安楽死させた；グループＣ：ＳＤ−ＳＴＺ５ｗラット、ＳＴＺ処置の２４時間後及びその後５週間、４．５５ｍｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μL  溶液５）を１日２回皮下投与し、ＳＴＺ処置の５週間後に安楽死させた；グループＤ：ＳＤ−ＳＴＺ１０ｗ動物、ＳＴＺ処置の２４時間後及びその後１０週間、２Ｕのインスリン（５０μL  溶液１）を１日２回皮下投与した；グループＥ：ＳＤ−ＳＴＺ１０ｗ動物、ＳＴＺ処置の２４時間後及びその後１０週間、２Ｕのインスリン＋４．５５ｍｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μL  溶液５）を１日２回皮下投与した。各グループの動物の網膜機能をＥＲＧにより評価した後で、安楽死させ、網膜を取り出して定量的組織化学的解析を行った。
【００６５】
網膜機能の評価−ＤＭの発症予防又はその退行取得における実施例１の製剤５の有効性を、実施例２に記載のように、種々の条件下で処置した動物の網膜機能を分析することによって評価した。
【００６６】
表４に示すように、Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を毎日投与することで、糖尿病の発症及び進展の段階において網膜血管損傷の形成が最初から防止された（グループＣ及びＥ）。しかし、インスリン処置だけでは大きな網膜血管損傷が生じ、視力を大きく低下した（グループＢ及びＤ）。
【００６７】
【表４】
2019504007.tif 000005
【００６８】
表４−網膜機能の評価。網膜機能は、実施例２に詳細に報告するように、ＥＲＧによって評価した。
【００６９】
研究計画は、１０匹のラット（雄５匹、雌５匹）のグループ５つを使用した。各グループは、１０匹のラット（雄５匹、雌５匹）で形成され、動物は１５０ｍｇ／Ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ；非特許文献１０）の単回腹腔内注射によって糖尿病にした、雌雄両方の８週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（１７０〜２５０ｇ）（ＳＤ−ＳＴＺラットと呼ばれる）で、ＳＴＺ処置のわずか２４時間後に末期糖尿病を示した。
【００７０】
グループＡ：ＳＴＺのｉ．ｐ．投与の直前に安楽死させたＳＤラット、糖尿病の徴候はなく、血糖値は４〜５ｍＭであり、何の処置も受けなかった；グループＢ：ＳＤ−ＳＴＺ５ｗラット、ＳＴＺ投与の５週間後に末期糖尿病を呈し、血糖値はきわめて高く、何の処置も受けず、ＳＴＺ処置の５週間後に安楽死させた；グループＣ：ＳＤ−ＳＴＺ５ｗラット、ＳＴＺ処置の２４時間後及び第５週まで、２Ｕのインスリン＋４．５５ｍｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液５）を１日２回皮下投与し、ＳＴＺ処置の５週間後に安楽死させた；グループＤ：ＳＤ−ＳＴＺ１０ｗ動物、ＳＴＺ処置の２４時間後及び第１０週まで、２Ｕのインスリン（５０μL  溶液１）を１日２回皮下投与した；グループＥ：ＳＤ−ＳＴＺ１０ｗ動物、ＳＴＺ処置の２４時間後及び第１０週まで、２Ｕのインスリン＋４．５５ｍｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液５）を１日２回皮下投与した。
【００７１】
網膜血管形成状態の免疫組織化学試験及び定量的解析−ＤＭの発症予防又はその退行取得における実施例１に記載の製剤５の有効性を、実施例２に記載のように、組織化学的手法によって定量的に評価した。
【００７２】
各実験条件について、１０匹のラットの２０の網膜から定量的データを得た。表５は、解析した試料の平均データを示す。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
表５−網膜の免疫組織化学試験並びに新生血管房形成の定量的解析。処置動物の網膜の血管形成の状態を、実施例２の報告のように研究した。各実験条件について、１０匹のラットの２０の網膜から定量的データを得た。研究計画は、ＳＴＺ処置によって糖尿病にした１０匹のラット（雄５匹、雌５匹）のグループ５つを使用した。処置後わずか２４時間で、動物は、末期糖尿病を発症し、最終的に、新生血管房形成を有する網膜血管状態の病変によって引き起こされる視力変性プロセスを伴った。新血管形成面積は、まだ糖尿病ではない動物に存在する新血管形成の面積（グループＡ、網膜面積の約０．１％）と、そのグループの新血管形成の面積との比として表される。グループＡ：ＳＴＺのｉ．ｐ．投与の直前に安楽死させたＳＤラット、糖尿病の徴候はなく、血糖値は４〜５ｍＭであり、何の処置も受けなかった；グループＢ：ＳＤ−ＳＴＺ５ｗラット、ＳＴＺ投与の５週間後に末期糖尿病を呈し、血糖値はきわめて高く、何の処置も受けず、ＳＴＺ処置の５週間後に安楽死させた；グループＣ：ＳＤ−ＳＴＺ５ｗラット、ＳＴＺ処置の２４時間後及び第５週まで、２Ｕのインスリン＋４．５５ｍｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μＬ  溶液５）を１日２回皮下投与し、ＳＴＺ処置の５週間後に安楽死させた；グループＤ：ＳＤ−ＳＴＺ１０ｗ動物、ＳＴＺ処置の２４時間後及び第１０週まで２Ｕのインスリン（５０μＬ  溶液１）を１日２回皮下投与した；グループＥ：ＳＤ−ＳＴＺ１０ｗ動物、ＳＴＺ処置の２４時間後及び第１０週まで、２Ｕのインスリン＋４．５５ｍｇのＡｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（１００μΕ  溶液５）を１日２回皮下投与した。
【００７５】
表５に示すように、Ａｃ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２を毎日投与することで、糖尿病の発症段階において網膜血管損傷の形成が防止された（グループＣ及びＥ）。ただし、処置なし（グループＢ）又はインスリン処置のみ（グループＤ）では、ＮＴＡが大きく増大し、網膜血管損傷を示唆しており、表３のデータ（グループＤ）で確認されるように、視力を著しく低下している。
【配列表】
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【国際調査報告】
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