(57)【要約】本開示は、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のゲノム及びプロテオミクスシグネチャー、遺伝子発現、及び活性化に基づいて、疾患状態（例えばがん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断、治療失敗、再燃、再発など）の予測因子を生成するための方法論又は技術を対象とする。本開示はまた、臨床的に難治性の悪性腫瘍のための処置を標的化し、設計し、そして使用する方法を対象とする。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてがんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法であって、
内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のプロテオミクスシグネチャー経路を示す１又は複数の入力及びゲノムシグネチャー経路を示す１又は複数の入力に応答して標的マーカー情報を生成する工程；及び
標的マーカー情報を有する生体サンプルの検出される発現レベル及び配列情報の比較に応答して異常オブジェクト情報を生成する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的マーカー情報を生成する工程が、ＳＣＡＲ経路を示す１又は複数の入力に応答して標的マーカー情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的マーカー情報を生成する工程が、ＳＣＡＲ経路標的遺伝子を示す１又は複数の入力に応答して標的マーカー情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的マーカー情報を生成する工程が、ＥＬＦ３；ＰＣＤＨ１５；ＭＡＬＡＴ１；ＰＴＰＮ１１；ＲＢ１；ＣＨＳＴ６；ＮＦ１；ＶＥＺＦ１；ＴＰ５３；ＳＭＡＤ４；ＫＥＡＰ１；ＳＴＫ１１；ＰＲＸ；ＺＮＦ２８；ＩＤＨ１；ＦＥＺ２；ＤＰＰＡ２；ＬＰＨＮ３；ＫＩＡＡ１２４４；ＥＰＨＡ７；ＥＧＦＲ；ＴＬＲ４；ＤＡＢ２ＩＰ；ＮＯＴＣＨ１；ＧＬＵＤ２；ＤＭＤ；ＫＤＭ６Ａ；ＫＲＡＳ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＤＮＭＴ３Ａ；ＦＬＴ３；ＮＦＥ２Ｌ２；ＮＰＭ１；ＭＩＲ１４２；ＦＯＸＬ２；Ｈ３Ｆ３Ａ；Ｈ３Ｆ３Ｂ；ＫＭＴ２Ｄ；ＲＮＦ４３；ＴＥＲＴ；ＥＲＢＢ２；ＰＬＣＧ１のうち１又は複数に関連する標的マーカー情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的マーカー情報を生成する工程が、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又はタンパク質のうち１又は複数に関連する標的マーカー情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的マーカー情報を生成する工程が、ＰＬＣＸＤ１、ＨＫＲ１、ＺＮＦ２８３、ＡＤＡ、ＡＭＡＣＲ＋ｐ６３、ＡＮＫ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＢＭＩ−１、ＢＵＢ１、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＥＳ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＲＹＡＢ、ＥＳＭ１、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＳ、Ｇｂｘ２、ＨＣＦＣ１、ＩＥＲ３、ＩＴＰＲ１、ＪＵＮＢ、ＫＬＦ６、ＫＩ６７、ＫＮＴＣ２、ＭＧＣ５４６６、Ｐｈｃ１、ＲＮＦ２、Ｓｕｚ１２、ＴＣＦ２、ＴＲＡＰ１００、ＵＳＰ２２、Ｗｎｔ５Ａ及びＺＦＰ３６のうち１又は複数に関連する標的マーカー情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、前記生体サンプルに関連する配列の質が１又は複数の参照配列と比較して異なる場合に異常配列情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、１又は複数の参照配列と比較して、前記生体サンプルに関連する配列全体内の複数の塩基の異なる位置付けを示す１又は複数の入力に応答して異常配列情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、１又は複数の参照配列と比較して、前記生体サンプルに関連する配列の異なる断片を示す１又は複数の入力に応答して異常配列情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、発現レベルが標的閾値を超えた場合を示す１又は複数の入力に応答して異常発現レベル情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、検出された発現レベルが標的閾値を上回る場合に発現レベル異常スコアを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、前記生体サンプルに関連する複数の塩基の検出された位置付けが１又は複数の参照配列と比較して異なる場合に、配列異常スコアを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、次世代シーケンシング、多色定量的免疫蛍光共局在分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び定量ＲＴ−ＰＣＲ分析からの１又は複数の入力に応答して配列異常スコアを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、既知の診断又は既知の治療後の臨床成績を有する生体被験体から得られたサンプルに由来する参照情報を比較することによって閾値レベルを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
少なくとも２つのマーカーの標的閾値係数を上回る異常な発現及び発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断を生成する工程
をさらに含む、方法。
【請求項１６】
前記異常オブジェクト情報を生成する工程が、異常配列情報及びマーカー共発現レベル情報を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、
異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答してがん治療有効性状態を生成する工程
をさらに含む、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、
異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、生体被験体におけるがんの存在又は非存在を示す情報を生成する工程
をさらに含む、方法。
【請求項１９】
被験体においてがんを診断するための又はがん治療成績を予測するためのシステムであって、
内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のプロテオミクスシグネチャー経路を示す１又は複数の入力及びゲノムシグネチャー経路を示す１又は複数の入力に応答して、標的マーカー情報を生成するように構成される回路；及び
標的マーカー情報を有する生体サンプルの配列を示す少なくとも１つの入力と発現レベルを示す少なくとも１つの入力の比較に応答して、異常オブジェクト情報を生成するように構成される回路
を含む、システム。
【請求項２０】
請求項１９に記載のシステムであって、
異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、生体被験体におけるがんの存在又は非存在を示す情報を生成するように構成される回路
をさらに含む、システム。
【請求項２１】
請求項１９に記載のシステムであって、
少なくとも２つのマーカーの標的閾値係数を上回る異常な発現及び発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断を生成するように構成される回路
をさらに含む、システム。
【請求項２２】
請求項１９に記載のシステムであって、
異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、がん治療有効性状態を生成するように構成される回路
をさらに含む、システム。
【請求項２３】
がんを処置するためのシステムであって、
がんを有すると診断された被験体における幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）経路活性化に関連する情報を取得するように構成される回路；及び
がんを有すると診断された被験体における幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）経路活性化に関連する１又は複数の入力に応答して、単一の治療剤又は複数の治療剤の組み合わせを同定し、ユーザ固有の処置プロトコルを生成するように構成される回路
を含む、システム。
【請求項２４】
被験体においてがんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法であって、
内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について生体サンプルを同時にスクリーニングする工程；
前記生体サンプルに関連する配列を、前記配列の質が参照配列と比較して異なる場合に、異常であるとスコア付けする工程；及び
検出された発現レベルが標的閾値係数を上回る場合に、前記生体サンプルに関連する発現レベルを異常であるとスコア付けする工程
を含む、方法。
【請求項２５】
内在性ＳＣＡＲのゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について生体サンプルを同時にスクリーニングする工程が、生体被験体におけるがん診断又はがん治療失敗の予後を示す１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について、生体サンプルを同時にスクリーニングする工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、
生体被験体におけるがん診断又はがん治療失敗の予後に関連する異常な配列又は異常な発現レベルを示す１又は複数の入力に応答してユーザ固有のがん治療プロトコルを生成する工程
をさらに含む、方法。
【請求項２７】
内在性ＳＣＡＲのゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について生体サンプルを同時にスクリーニングする工程が、生体被験体におけるがん治療の進行を示す１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について、生体サンプルを同時にスクリーニングする工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
生体被験体におけるがん治療の進行に関連する異常な配列又は異常な発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、ユーザ固有のがん治療プロトコルを生成する工程
をさらに含む、方法。
【請求項２９】
検出閾値が、既知の診断又は既知の治療後の臨床成績を有する被験体から得られたサンプルの参照データベースにおける値と比較することによって決定されており、試験サンプルにおける、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの異常な発現レベルの存在及び２つ以上のそのようなマーカーの異常な発現の存在が、がん診断又はがん治療失敗の予後を示す、又は被験体におけるがん治療の進行を示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
試験された各患者の成績データをサンプルの参照データベースに追加すること、及び自動化された及び／又は再帰的な方法で、手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、診断、予後、又は将来のがん治療の明細の正確さを連続して向上させることによって、検出閾値が連続して改良される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプル表現型が、がん、非がん、再発、非再発、再燃、非再燃、浸潤性、非浸潤性、転移性、非転移性、限局性、腫瘍サイズ、腫瘍悪性度、Ｇｌｅａｓｏｎスコア、生存予後、リンパ節の状態、腫瘍の病期、分化の程度、年齢、ホルモンレセプターの状態、腫瘍抗原レベル（ＰＳＡレベル、ＰＳＭＡレベル、サバイビンレベル、がん胎児性タンパク質レベル、精巣抗原レベルを含むが、これらに限定されない）、組織学的タイプ、免疫細胞のレベル、表現型及び遺伝子型、及び活性化状態、及び無病生存率からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記閾値係数が、絶対値≧０．５を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
前記閾値係数が、絶対値≧０．６を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記閾値係数が、絶対値≧０．７を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記閾値係数が、絶対値≧０．８を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記閾値係数が、絶対値≧０．９を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記閾値係数が、絶対値≧０．９５を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記閾値係数が、絶対値≧０．９９を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
前記閾値係数が、絶対値≧０．９９５を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記閾値係数が、絶対値≧０．９９９を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項４１】
サンプル表現型を分類するための検出閾値を決定する方法であって、
マーカーのサブセットを同定し、請求項２４に記載の方法にしたがって細胞におけるマーカー発現をスコア付けする工程；及び
既知の表現型を有する被験体からのサンプルの参照データベースを使用して、複数の異なる検出閾値でサンプル分類の正確さを決定する工程
を含む、方法。
【請求項４２】
自動化された及び／又は再帰的な方法で、手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、サンプル分類の正確さを決定する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出閾値の最高性能の大きさを決定し、前記大きさを使用して、サンプル表現型を分類する際の前記確立された検出閾値の信頼性を評価する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
自動化された及び／又は再帰的な方法で、手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、前記検出閾値の最高性能の大きさを決定し、前記大きさを使用して、サンプル表現型を分類する際の前記確立された検出閾値の信頼性を評価する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出閾値の最高性能の大きさを使用して分類されていないサンプルをスコア付けし、サンプル表現型を前記サンプルに割り当てる工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、前記検出閾値の最高性能の大きさを使用して分類されていないサンプルをスコア付けし、サンプル表現型を前記サンプルに割り当てる工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列から本質的に成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の９０％から本質的に成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の８０％から本質的に成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の７０％から本質的に成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の６０％から本質的に成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の５０％から本質的に成る、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
がんを処置する方法であって、
がんを有すると診断された被験体におけるＳＣＡＲの経路活性化の分子シグナルを検出する工程；及び
ＳＣＡＲの経路活性化の前記分子シグナルの検出に基づいて、活性化されたＳＣＡＲの遺伝子座及び／又は下流のＳＣＡＲ制御遺伝子座を標的としたユーザ固有の治療的処置を生成する工程
を含む、方法。
【請求項５４】
活性化されたＳＣＡＲ経路の規定されたゲノム要素をサイレンシングするために、前記ユーザ固有の治療的処置が、ゲノム編集に基づき、このゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体媒介ゲノム編集を含むがこれに限定されない、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
活性化されたＳＣＡＲ経路の規定されたゲノム要素を活性化するために、前記ユーザ固有の治療的処置が、ゲノム編集に基づき、このゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体媒介ゲノム編集を含むがこれに限定されない、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ユーザ固有の治療的処置が、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の適用に基づく、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記ユーザ固有の治療的処置が、抗レトロウイルス薬、Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ（ＲＡＬ、Ｉｓｅｎｔｒｅｓｓ、旧ＭＫ−０５１８）の投与に基づく、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記ユーザ固有の治療的処置が、転写活性のあるＳＣＡＲの遺伝子座及び／又は活性化されたＳＣＡＲ経路の規定されたゲノム要素に対するアンチセンス療法の適用に基づく、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記ユーザ固有の治療的処置が、アンタゴニスト抗体又はその断片、アゴニスト抗体又はその断片、自家細胞、同種異系細胞、ペプチド、小分子、シグナル伝達タンパク質又はその断片、又は上記のうち２つ以上を含む組成物及び単一分子又は細胞療法において上記のうち２つ以上のすべて又は一部を含む組成物のうち少なくとも１つを含み、活性化されたＳＣＡＲ配列によってコードされるタンパク質及び／又はペプチドに対する、標的化された免疫療法の適用に基づく、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
単独の機能として又は免疫システムの抗がんモジュレーターの活性を増大させるために、請求項３９−４５に記載の方法が使用されて、処置された被験体の腫瘍において腫瘍浸潤リンパ球を増強する、がんを処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国仮出願第62/339007号（２０１６年５月１９日出願）の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
以下の関連出願の全てもまた、それらの全体が参照により組み込まれる：米国仮出願第60/875,061号（２００６年１２月１５日出願）；米国仮出願第60/823,577号（２００６年８月２５日出願）；米国仮出願第60/822,705号（２００６年８月１７日出願）；及び米国仮出願第60/787,818号（２００６年３月３１日出願）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
一態様において、本開示は、とりわけ、患者内のがんの存在を診断するための、がんを有する被験体が様々な異なるタイプの処置レジメンの影響を受けやすいかどうかを決定するための、患者内のがんの処置を監視するための、新規の方法及びキットを対象とし、個別化され標的化されたがん治療を含むがん治療を提供する新規の方法を提供する。試験、監視及び処置されるべきがんは、前立腺がん、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、リンパ腫、中皮腫、脳がん、肝臓がん、上記のうちいずれかの転移、及び血液がん（ＡＬＬ、ＡＭＬ、及びＣＣＬを含むがこれらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。処置レジメンの初期に治療抵抗性である可能性の高い患者の同定は、より成功した成績を達成するための治療の変更につながる可能性がある。
【０００４】
一態様において、本開示は、とりわけ、がんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法を対象とし、この方法は、同じ細胞において同時に、細胞の集団において、又はリキッドバイオプシー標本において、複数のマーカーの配列及び／又は発現レベルを検出する工程、及びそれらの配列及び／又は発現を、ある特定の閾値に関して定性的に異なる又は定量的に異なる（上又は下）ものであるとスコア付けする工程（ここで、マーカーはがんに関連する特定の経路に由来し、スコアはがん診断又はがん治療失敗の予後を示す）によるものである。この方法は、様々ながんについて、がんを診断する又はがん治療成績を予測するために使用することができる。一実施形態において、本方法は、遺伝的シグネチャー情報及びタンパク質シグネチャー情報を使用することによって、個体がＳＣＡＲのネットワーク活性化を経験しているかどうかを決定する工程を含む。
【０００５】
一態様において、本開示は、とりわけ、がん前駆病変の初期の検出を含む、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のゲノム及びプロテオミクスシグネチャーの同定及び監視に基づく、臨床的に難治性の悪性腫瘍の診断及び治療標的化の新規の方法を対象とする。マーカーは、具体的にはＳＣＡＲの経路及び「幹性」経路を含む、がんの制御に関与している任意の経路に由来することができる。マーカーは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又はペプチドであることができる。一態様において、本開示は、とりわけ、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに基づいて、臨床的に難治性の悪性腫瘍のための処置を設計及び使用する新規の方法を対象とする。核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを、一塩基ミスマッチ特異性で検出するための技術及び方法論の非限定的な例は、J.S. Gootenberg et al., "Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2," Science, doi:10.1126/science.aam9321, 2017（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において説明されるものを含む。
【０００６】
一態様において、本開示は、とりわけ、患者内のがんの存在を診断するための、がんを有する被験体が様々な異なるタイプの処置レジメンの影響を受けやすいかどうかを決定するための、患者内のがんの処置を監視するための、方法及びキットを対象としており、個別化され標的化されたがん治療を含むがん治療を提供する新規の方法を提供する。試験、監視及び処置されるべきがんは、前立腺がん、乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、リンパ腫、中皮腫、脳がん、肝臓がん、上記のうちいずれかの転移、及び血液がん（ＡＬＬ、ＡＭＬ、及びＣＣＬを含むがこれらに限定されない）を含むが、これらに限定されない。全体として、これらの方法の潜在的な実用的有用性が、ヒトがんの２９の異なるタイプについて証明された。
【０００７】
一実施形態において、方法は、複数のマーカーの配列、複数のマーカーの発現レベルを、同じ細胞において同時に、細胞の集団において、又はリキッドバイオプシー標本において、同時に又は順次に検出する工程、及びそれらの配列及び／又は発現を異常であるとスコア付けする工程（ここで、マーカーはがんに関連する特定の経路に由来し、スコアはがん診断又はがん治療失敗の可能性の予後を示す）を含む。この方法は、様々ながんについて、がんを診断する又はがん治療成績を予測するために使用することができる。同じ細胞、細胞の集団、又は被験体からのリキッドバイオプシー標本における、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの同時共発現は、がんの診断指標及び被験体が標準的ながん治療に対して抵抗性であることの予測因子である。マーカーは、具体的にはＳＣＡＲの経路、ＰｃＧ経路及び「幹性」経路を含む、がんの制御に関与している任意の経路に由来することができる。マーカーは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又はペプチドであることができる。
【０００８】
一態様において、本開示は、とりわけ、ＳＣＡＲの経路からの複数のマーカーの、閾値レベルを超える、同じ細胞における同時の発現（ここで、マーカーはがんに関連する経路内に見出される）が、がんを診断するための及びがんを有すると既に診断された患者が治療反応性又は治療抵抗性となるかどうかを予測するためのアッセイとして使用することができる、という新規の発見を対象とする。アッセイの要素は、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーが、同じ細胞内で、細胞の集団内で、又はリキッドバイオプシー標本において、同時に検出されることである。マーカー検出は、免疫蛍光によるバーコーディング及び次世代シーケンシングを含む様々な検出手段により行うことができる。検出されるマーカーは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、及びペプチドを含む様々な産物であることができる。ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡベースのマーカーについては、次世代シーケンシング及び／又はＰＣＲを検出手段として使用することができる。加えて、核酸配列、タンパク質配列、タンパク質産物又は遺伝子コピー数は、本分野において既知の検出手段により同定することができる。検出されるマーカーは、がんに関連する様々な経路に由来することができる。マーカーの適切な経路は、発がん及び転移に関連する任意の経路を含み、より具体的には、ＳＣＡＲの経路、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ群（ＰｃＧ）クロマチンサイレンシング経路及び「幹性」経路を含む。
【０００９】
一態様において、本開示は、とりわけ、生体被験体においてがんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法を対象とする。
【００１０】
一実施形態において、本方法は、生体サンプル（例えば、組織、細胞、体液の標本、生体液、バイオマーカー組成物など）を被験体から得る工程を含む。
【００１１】
一実施形態において、本方法は、マーカーをがんに関連する経路から選択する工程を含み、
【００１２】
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの同時の異常な配列及び／又は発現レベルについてスクリーニングする工程を含み、
【００１３】
一実施形態において、本方法は、それらの配列を、配列の質（配列全体又はその断片内の塩基の位置の規定される配列）が参照配列と比較して異なる場合に、異常であるとスコア付けする工程を含み、
【００１４】
一実施形態において、本方法は、検出された発現レベルがある特定の閾値を上回る場合に、それらの発現レベルを異常であるとスコア付けする工程を含む。
【００１５】
一実施形態において、本方法は、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のそのようなマーカーの異常な配列及び／又は異常な発現レベルの存在が、被験体におけるがん診断又はがん治療失敗の予後を示すことを含む。
【００１６】
一実施形態において、マーカーの異常な配列及び／又は共発現レベルは、被験体におけるがんの存在を示すことができる、又は被験体におけるがん治療失敗を予測することができる。マーカーは、任意の適切ながん経路から選択することができ、好ましい実施形態においてＳＣＡＲの又は「幹性」経路からのマーカーが含まれる。異常な配列検出のために、これらのマーカーは、ＥＬＦ３；ＰＣＤＨ１５；ＭＡＬＡＴ１；ＰＴＰＮ１１；ＲＢ１；ＣＨＳＴ６；ＮＦ１；ＶＥＺＦ１；ＴＰ５３；ＳＭＡＤ４；ＫＥＡＰ１；ＳＴＫ１１；ＰＲＸ；ＺＮＦ２８；ＩＤＨ１；ＦＥＺ２；ＤＰＰＡ２；ＬＰＨＮ３；ＫＩＡＡ１２４４；ＥＰＨＡ７；ＥＧＦＲ；ＴＬＲ４；ＤＡＢ２ＩＰ；ＮＯＴＣＨ１；ＧＬＵＤ２；ＤＭＤ；ＫＤＭ６Ａ；ＫＲＡＳ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＤＮＭＴ３Ａ；ＦＬＴ３；ＮＦＥ２Ｌ２；ＮＰＭ１；ＭＩＲ１４２；ＦＯＸＬ２；Ｈ３Ｆ３Ａ；Ｈ３Ｆ３Ｂ；ＫＭＴ２Ｄ；ＲＮＦ４３；ＴＥＲＴ；ＥＲＢＢ２；ＰＬＣＧ１からなる群より選択される遺伝子であることができる。異常な発現検出のために、これらのマーカーは、ＰＬＣＸＤ１、ＨＫＲ１、ＺＮＦ２８３、ＡＤＡ、ＡＭＡＣＲ＋ｐ６３、ＡＮＫ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＢＭＩ−１、ＢＵＢ１、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＥＳ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＲＹＡＢ、ＥＳＭ１、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＳ、Ｇｂｘ２、ＨＣＦＣ１、ＩＥＲ３、ＩＴＰＲ１、ＪＵＮＢ、ＫＬＦ６、ＫＩ６７、ＫＮＴＣ２、ＭＧＣ５４６６、Ｐｈｃ１、ＲＮＦ２、Ｓｕｚ１２、ＴＣＦ２、ＴＲＡＰ１００、ＵＳＰ２２、Ｗｎｔ５Ａ及びＺＦＰ３６からなる群より選択される遺伝子であることができる。好ましい実施形態において、マーカーは、ＳＣＡＲの経路の制御及び下流遺伝要素、転写因子、及びメチル化パターンからなる群より選択される。一つの好ましい実施形態において検出される異常な配列、及び別の好ましい実施形態において検出される異常な共発現レベルは、ＳＣＡＲの経路の制御及び下流遺伝要素、転写因子、及びメチル化パターンのものである。検出されるマーカーは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又はペプチドの形態である。
【００１７】
一実施形態において、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの異常な発現レベルは、本分野において既知の任意の検出手段によって検出することができ、検出手段には、次世代シーケンシング、多色定量的免疫蛍光共局在分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び定量ＲＴ−ＰＣＲ分析からなる群より選択される分析に細胞を供することが含まれるが、これに限定されない。
【００１８】
一態様において、本開示は、とりわけ、単細胞、細胞の集団、又はリキッドバイオプシーサンプルにおいて、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの異常な配列及び／又は共発現レベルを同時に検出するための方法を対象とする。一実施形態において、組織、細胞、又は体液の標本のサンプルを得る。一実施形態において、経路によって規定されるマーカーを選択する。一実施形態において、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの同時の異常な配列及び／又は発現レベルについてスクリーニングする。一実施形態において、それらの配列を、配列の質（配列全体又はその断片内の塩基の位置の配列）が参照配列と比較して異なる場合に、異常であるとスコア付けする。一実施形態において、検出された発現レベルがある特定の閾値を上回る場合に、それらの発現レベルを異常であるとスコア付けする。
【００１９】
一態様において、本開示は、とりわけ、単細胞、細胞の集団、又はリキッドバイオプシーサンプルにおいて、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの異常な配列及び／又は共発現レベルのうち少なくとも１つを検出するための方法を対象とする。一実施形態において、組織、細胞、又は体液の標本のサンプルを得る。一実施形態において、経路によって規定されるマーカーを選択する。一実施形態において、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの同時の異常な配列及び／又は発現レベルについてスクリーニングする。一実施形態において、それらの配列を、配列の質（配列全体又はその断片内の塩基の位置の配列）が参照配列と比較して異なる場合に、異常であるとスコア付けする。一実施形態において、検出された発現レベルがある特定の閾値を上回る場合に、それらの発現レベルを異常であるとスコア付けする。
【００２０】
一態様において、本開示は、とりわけ、単細胞、細胞の集団、又はリキッドバイオプシーサンプルにおいて、２つ以上のマーカーの異常な配列又は共発現レベルを同時に検出するのに有用なキットを対象とする。一態様において、本開示は、とりわけ、単細胞、細胞の集団、又はリキッドバイオプシーサンプルにおいて、２つ以上のマーカーの異常な配列又は共発現レベルのうち少なくとも１つを検出するのに有用なキットを対象とする。
【００２１】
一態様において、本開示は、とりわけ、任意の適切ながん経路から選択される分子マーカー（これは、好ましい実施形態において、ＳＣＡＲの又は「幹性」経路からのマーカーを含む）を保持する悪性腫瘍の標的治療の方法を対象とする。前記悪性腫瘍の治療標的化は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、又はペプチドの形態の検出されるマーカーによって導かれる。好ましい実施形態において、治療様式は、制御性ＳＣＡＲ遺伝子座及びＳＣＡＲの経路の下流の遺伝要素からなる群より選択される分子標的に対して設計される。
【００２２】
本開示は、複数のマーカーについて配列、発現レベル、遺伝子レベル、転写レベルなどを検出することによって、がんを診断する、がん治療成績を予測する、がんを有する被験体が様々な異なるタイプの処置レジメンの影響を受けやすいかどうかを決定する、がん処置の有効性を監視する、がん診断又はがん治療失敗の予後を決定する、などのための、１又は複数の方法論又は技術を詳述する。
【００２３】
一実施形態において、処置不可能ながん（例えば、活性化された内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）ネットワークを有するもの）を診断するための１又は複数の方法論又は技術は、４２の遺伝子（表Ｓ１に列挙される）の配列の突然変異の検出、特定のＳＣＡＲ配列の転写レベルの分析、タンパク質配列のレベルの分析、シグネチャーにおける発現レベルの分析、遺伝子発現レベルの決定、及びデータセットＳ１、データセットＳ２、及びデータセットＳ３の遺伝子コピー数の決定のうち１又は複数を含む。
【００２４】
例えば、一実施形態において、方法論又は技術は、表３．３に列挙される１又は複数の遺伝子座の発現レベルに関連する異常な配列又は異常な発現レベルを示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、ユーザ固有のがん治療プロトコル、又はユーザ固有のがん診断を生成する工程を含む。ゲノムシグネチャー経路、シグネチャー評価方法などの非限定的な例は、米国特許第8,349,555号及び7,890,267号公報（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【００２５】
一実施形態において、方法論又は技術は、補足表（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｔａｂｌｅ）Ｓ３に列挙される１又は複数のペプチドの発現レベルに関連する異常な発現レベルを示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、疾患状態（例えば、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断、治療失敗、再燃、再発など）の予測因子を生成する工程を含む。
【００２６】
一実施形態において、方法論又は技術は、補足表Ｓ４に列挙される遺伝子のＳＣＡＲの経路活性化シグネチャーを示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、疾患状態（例えば、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断、治療失敗、再燃、再発など）の予測因子を生成する工程を含む。
【００２７】
一実施形態において、方法論又は技術は、補足表Ｓ５に列挙される１又は複数の遺伝子座の発現レベルに関連する異常な発現レベルを示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、ＳＣＡＲ活性化状態を生成する工程を含む。
【００２８】
一実施形態において、方法論又は技術は、補足表Ｓ６に列挙される１又は複数の遺伝子座の発現レベルに関連する異常な発現レベルを示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、疾患状態（例えば、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断、治療失敗、再燃、再発など）の予測因子を生成する工程を含む。
【００２９】
一実施形態において、方法論又は技術は、データセットＳ１に列挙される１又は複数の遺伝子座の発現レベル又はコピー数に関連する異常な発現レベル又は遺伝子コピー数を示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、疾患状態（例えば、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断、治療失敗、再燃、再発など）の予測因子を生成する工程を含む。
【００３０】
一実施形態において、方法論又は技術は、データセットＳ２に列挙される１又は複数の配列の発現レベルに関連する異常な発現レベルを示す１又は複数の入力を受け取ることに応答して、疾患状態（例えば、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断、治療失敗、再燃、再発など）の予測因子を生成する工程を含む。
【００３１】
一態様において、本開示は、とりわけ、ＳＣＡＲ配列に由来するゲノム遺伝子座によってコードされる共通のペプチド配列の同定の方法を対象とする。一実施形態において、本方法は、複数の異なるゲノム座標に位置するＳＣＡＲ由来のゲノム遺伝子座の核酸配列を検索する工程；及び前記核酸配列内の全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定する工程を含む。一実施形態において、本方法は、前記核酸配列によってコードされ、前記核酸配列から潜在的に転写される、全てのペプチド配列を同定する工程；及び複数の異なるゲノム座標に位置する複数の異なるＳＣＡＲ由来のゲノム遺伝子座に共通のペプチド配列を同定する工程を、さらに含む。
【００３２】
一実施形態において、方法論又は技術は、遺伝的シグネチャー情報及びタンパク質シグネチャー情報を使用してＳＣＡＲのネットワーク活性化を決定する工程を含む。一実施形態において、ＳＣＡＲのネットワーク活性化情報は、がん成績予後を生成するために使用される。例えば、活性化されたＳＣＡＲのネットワークは、不良ながん治療成績又は予後不良を示す。
【００３３】
一実施形態において、方法論又は技術は、ＳＣＡＲネットワークマーカーの発現レベルを示す１又は複数の入力及び異常な配列を示す１又は複数の入力に基づいてがん関連成績を生成する工程を含む。
【００３４】
ＳＣＡＲのネットワークの非限定的な例は、ｉ）対応するＲＮＡ分子の発現の検出に基づいて規定される、転写活性のあるＳＣＡＲの遺伝子座；及びｉｉ）タンパク質コード遺伝子、非コードＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ、及びＳＣＡＲ活性によって影響を受ける他の制御及び構造分子をコードする遺伝子を含む、下流のＳＣＡＲ制御コード遺伝子の発現シグネチャーの、ゲノムワイドな概略を含む。
【００３５】
ＳＣＡＲ経路の非限定的な例は、単細胞及び細胞の集団を含む、特定の細胞及び／又は特定の生体サンプルにおいて転写活性のあるＳＣＡＲの遺伝子座のサブセットを含む。
【００３６】
ＳＣＡＲの経路：単細胞及び細胞の集団を含む、特定の細胞及び／又は特定の生体サンプルにおけるゲノムワイドなＳＣＡＲのネットワーク分析によって規定されるゲノム遺伝子座のサブセット。
【００３７】
シグネチャーの非限定的な例は、７４遺伝子シグネチャー（例えば表Ｓ４を参照）、５５遺伝子シグネチャー（例えば表Ｓ４を参照）、ヒト卵母細胞の単細胞分析によって規定されるＳＣＡＲの経路シグネチャーを含み、これらの遺伝子の発現変化はＨＥＲＶ−Ｈ由来レトロウイルス配列の活性化された転写に関連しているようである。遺伝子記号は第１列に列挙されている。これらはコード遺伝子であり、その発現は、ＨＥＲＶ−Ｈにコードされた制御転写物を標的化するｓｈＲＮＡ干渉プロトコルを使用して、特定の方法で変化する（上方制御及び下方制御される）（対数変換された発現変化倍率は第２列に列挙されている）。ヒト卵母細胞におけるこれらの遺伝子の発現変化（対数変換された発現変化倍率は第３列に列挙されている）は、ＨＥＲＶ−Ｈ経路活性化と一致する（ｒ＝−０．７４０４３）、すなわち、発現がｓｈＨＥＲＶＨ干渉に続いて上方制御される遺伝子は、卵母細胞において下方制御されるようであり、反対に、発現がｓｈＨＥＲＶＨ干渉に続いて下方制御される遺伝子は、卵母細胞において上方制御されるようである。これらのシグネチャーの有用性は、前立腺がんサンプル及び前立腺上皮内新生物サンプルを含む、正常ヒト前立腺及び病的ヒト前立腺のサンプルの分析によって証明された（図１Ｃ及び２Ｄ）。表Ｓ４に列挙される個々の遺伝子のそれぞれの発現変化倍率は、当業者に既知の技術及び方法を使用して決定されるだろう。対応する遺伝子についての値は、それが第３列に列挙される卵母細胞の値について示されているとおりに、表Ｓ４において規定される順序で列挙されることとなる。次に、第２列及び第３列に列挙される値について、相関係数を計算する。相関係数の負の値は、ＳＣＡＲの経路活性化を示すものとして解釈されるべきものである。相関係数の正の値は、ＳＣＡＲの経路活性化の証拠がないことを示すものである。
【００３８】
一実施形態において、遺伝的シグネチャー及びタンパク質シグネチャーは、独立して疾患状態の予測因子として使用される。一実施形態において、現在のシグネチャーに列挙されるいくつかの特定の遺伝子／タンパク質標的は、がんに関連する可能性が高い。一実施形態において、現在のシグネチャーに列挙されるいくつかの特定の遺伝子／タンパク質標的は、ＳＣＡＲの経路及びネットワーク活性化を検出するために利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１Ａ−１Ｋ（集合的に「図１」と呼ばれ、図１Ａ−１Ｄは時折「Ａ」と呼ばれ、図１Ｅ−１Ｈは時折「Ｂ」と呼ばれ、図１Ｉ−１Ｋは時折「Ｃ」と呼ばれる）。１細胞期対８細胞期の正倍数体及び異数体ヒト胚（図１Ａ−１Ｄ）、発生的に生存可能な接合子対非生存可能な接合子（Ａ、図１Ｄ）、及びインビボの成熟したヒト卵母細胞（図１Ｅ−１Ｈ）におけるＨＥＲＶＨ制御遺伝子の異なる発現パターン。
【００４０】
Ａ（図１Ａ−１Ｄ）：ヒト接合子対８細胞ヒト胚において異なって発現される合計３６の統計的に有意な遺伝子は、ｈＥＳＣにおいてＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９によって制御される。これらの遺伝子のうち１４個の発現は、正倍数体ヒト胚対異数体ヒト胚において顕著に異なり（図１Ａ及び１Ｃ）、一方でこれらの遺伝子のうち２２個の発現は、正倍数体ヒト胚対異数体ヒト胚において顕著に異ならない（図１Ｂ）。同様に、１７４のＨＥＲＶＨ制御遺伝子の発現シグネチャーは、発生的に生存可能なヒト接合子及び非生存可能なヒト接合子において異なる（ｑ＜０．０００５；Ａ、図１Ｄ）。発生的に非生存可能なヒト接合子において上方制御された遺伝子がハイライトされている。
【００４１】
Ｂ（図１Ｅ−１Ｈ）：マイクロアレイ分析は、成熟ヒト卵母細胞におけるＨＥＲＶＨ制御遺伝子の遺伝子発現シグネチャーを同定する。
【００４２】
【図２】図２Ａ−２Ｍ（集合的に「図２」と呼ばれ、図２Ａ−２Ｄは時折「Ａ」と呼ばれ、図２Ｅ−２Ｈは時折「Ｂ」と呼ばれ、図２Ｉ及び２Ｊは時折「Ｃ」と呼ばれ、図２Ｋ−２Ｍは時折「Ｄ」と呼ばれる）。ヒト着床前胚発生の様々な段階での（Ａ−Ｃ）、及び正常前立腺上皮、正常前立腺間質、良性前立腺肥大、前立腺の萎縮性病変、前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）の推定上の前立腺がん前駆病変、前立腺がん病変に隣接する形態学的に正常な前立腺上皮、限局性前立腺がん、及び転移性前立腺がんの臨床サンプルにおける（Ｄ）、個々のＳＣＡＲ遺伝子座（Ａ、Ｂ）、ＬｎｃＲＮＡ  ＨＰＡＴ３のＳＣＡＲ−制御配列（Ｃ）、及びＳＣＡＲ制御タンパク質コード遺伝子（Ｄ）の単細胞次世代シーケンシング（Ａ−Ｃ）及びマイクロアレイ遺伝子発現解析（Ｄ）。
【００４３】
Ａ−Ｃ、ヒト着床前胚の単細胞次世代ＲＮＡ配列解析は、ヒト卵母細胞及び接合子における選択されたＨＥＲＶＨ及びｐＨＥＲＶＫ遺伝子座の発現の活性化を明らかにする。ヒト着床前胚の各段階での個々のＨＥＲＶ遺伝子座の発現パターンが示されている。プロットされた発現値は、卵母細胞における発現レベルに対して正規化された平均発現値（Ａ）又は胚発生の対応する段階の全ての個々の細胞における実際の測定値（Ｂ、Ｃ）のいずれかによって規定した。
【００４４】
Ｄ、正常前立腺上皮、正常前立腺間質、良性前立腺肥大、前立腺の萎縮性病変、前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）の推定上の前立腺がん前駆病変、前立腺がん病変に隣接する形態学的に正常な前立腺上皮、限局性前立腺がん、及び転移性前立腺がんから切除された細胞で構成される、正常前立腺上皮から転移性前立腺腫瘍への悪性進行の仮想的順序の重要な段階を表す、臨床サンプルのマイクロアレイ遺伝子発現プロファイリング。
【００４５】
【図３】図３Ａ−３Ｄ（集合的に「図３」と呼ばれ、図３Ａ−３Ｄは以下の説明においてそれぞれＡ−Ｄとも呼ばれる）。ＳＣＡＲ標的化タンパク質コード遺伝子の遺伝子発現及び遺伝子コピー数の変化は、がん患者の長期生存率との顕著な関連を示す。宿主／ウイルスキメラ転写物の構造成分を含むタンパク質コード遺伝子の遺伝子コピー数及びｍＲＮＡ発現レベルを、１２のＴＣＧＡコホート（１２の異なるがんタイプのＰＡＮＣＡＮ１２研究）にわたる５，１５８の臨床サンプル及び全てのＴＣＧＡコホートにわたる１２，０９３の臨床サンプルを含むＴＣＧＡ汎がんデータベースにおけるカプラン・マイヤー生存率分析によって規定されるがん患者の長期生存確率との関連について評価した。遺伝子発現変化（Ａ−Ｃ）及び遺伝子コピー数変化（Ｄ）の、ＴＣＧＡ  ＰＡＮＣＡＮ１２研究のがん患者の長期生存率との顕著な関連を示すＳＣＡＲ標的化遺伝子の例を示す（Ａ；Ｃ；Ｄ）。がんの３つの個別のタイプ［前立腺がん（ｎ＝５６８）、乳がん（ｎ＝１，２４１）、及び直腸がん（ｎ＝１８７）］のＴＣＧＡコホートについてのこれらの関連の代表的な例を（Ｂ）に示す。遺伝子発現ヒートマップ及び対応するカプラン・マイヤー生存曲線を（Ａ）に示す。遺伝子発現（左の画像）及びコピー数（右の画像）のヒートマップ及び関連するカプラン・マイヤー生存曲線を（Ｄ）に示す。縦の破線は、１０年生存データ点を示す。対応するｐ値を補足データセットＳ１において報告する。
【００４６】
【図４】図４Ａ−４Ｄ（集合的に「図４」と呼ばれ、図４Ａ−４Ｄは以下の説明においてそれぞれＡ−Ｄとも呼ばれる）。ヒト特異的ウイルス／宿主キメラ転写物の翻訳されたアミノ酸配列のタンパク質アラインメントは、異なるＳＣＡＲ遺伝子座によってコードされる保存タンパク質ドメインの異なるパターンを同定する。材料及び方法において説明されているように、ヒト特異的キメラ転写物のヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳し、ＢＬＡＳＴタンパク質アラインメント分析に供した。ヒト特異的ＳＣＡＲ由来の宿主／ウイルスキメラ転写物によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列内で最も頻繁に表される保存タンパク質ドメインは、ＧＶＱＷアミノ酸配列であることに留意されたい（Ａ；Ｃ；Ｄ）。
【００４７】
【図５】図５Ａ−５Ｄ（集合的に「図５」と呼ばれ、図５Ａ−５Ｄは以下の説明においてそれぞれＡ−Ｄとも呼ばれる）。chrX:278899-284216及びchrY:278899-284216のＳＣＡＲのヒト特異的キメラウイルス／宿主転写物の同一の核酸配列に由来するＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインのヒト特異的拡大の進化的追跡。ＧＶＱＷ保存ドメインをコードするヌクレオチド配列を、数個の隣接するアミノ酸を含むように拡大した。これは、ＳＣＡＲの遺伝子座特異的ヌクレオチド配列を得るのに十分であった。ＧＶＱＷをコードする配列のゲノム起源を、所与のゲノム配列及び対応する遺伝子座特異的ＳＣＡＲ由来の配列の１００％ヌクレオチド配列同一性に基づいて、推測した。ＢＬＡＴアルゴリズムを利用して、特定のＳＣＡＲの遺伝子座によってコードされるキメラウイルス／宿主転写物の配列と１００％同一である、ヒト及び非ヒト霊長類のゲノム中のＧＶＱＷをコードするヌクレオチド配列の数を決定した。マウス及びラットゲノムにおいて、ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインをコードする配列は検出されなかったことに留意されたい。chrX:278899-284216及び／又はchrY:278899-284216のＳＣＡＲ転写物に由来するＧＶＱＷをコードする配列のみが、ヒトゲノムにおいて顕著に拡大しているようであり（図３Ｃの赤のバー）、この拡大は、他の大型類人猿と比較したときのヒトプロテオームにおける、保存されたＧＶＱＷドメインを保持するタンパク質の数の著しい富化に関連している（図３Ｄ）。
【００４８】
【図６】図６Ａ−６Ｂ（集合的に「図６」と呼ばれ、図６Ａ−６Ｂは以下の説明においてそれぞれＡ−Ｂとも呼ばれる）。ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを保持する２１のジンクフィンガータンパク質の遺伝子レベルのコピー数の変化は、２９の異なるタイプの悪性腫瘍を有すると診断されたがん患者の長期生存率との顕著な関連を示す。２９のがんタイプを表す全てのＴＣＧＡコホートにわたる１２，０９３の臨床サンプルを含むＴＣＧＡ汎がんデータベースのカプラン・マイヤー生存率分析によって規定されるがん患者の長期生存確率との関連について、ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを保持する現在同定された全てのジンクフィンガータンパク質の遺伝子コピー数を評価した。遺伝子コピー数変化（Ａ）及び関連するカプラン・マイヤー生存曲線（Ｂ）のヒートマップを示す。カプラン・マイヤー生存率分析の結果が、ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメイン及び３のＳＣＡＲ標的化ジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ４４３；ＺＮＦ５８７；ＺＮＦ８１４）を保持する２１のジンクフィンガータンパク質について示されている。報告されたｐ値は、Ｘｅｎａがんゲノムブラウザデータ可視化ツール（http://xena.ucsc.edu/）によって生成したカプラン・マイヤー生存曲線からのものである。
【００４９】
【図７】図７Ａ−７Ｄ（集合的に「図７」と呼ばれ、図７Ａ−７Ｄは以下の説明においてそれぞれＡ−Ｄとも呼ばれる）。低い生存率及び高いがんによる死亡の可能性によって規定される、悪性腫瘍の臨床的難治性の体細胞非サイレント突然変異のシグネチャー。
【００５０】
Ａ、がんによる死亡の表現型の体細胞非サイレント突然変異シグネチャーを保持する１８の遺伝子の同定。１８のトップスコアのヒト遺伝子を同定した。ここで、体細胞非サイレント突然変異（ＳＮＭ）の最大の数が、全てのＴＣＧＡコホートにわたる１２，０９３の腫瘍サンプルにおいて検出された（ただし、腫瘍におけるこれらの突然変異の存在が、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定される顕著に高いがんによる死亡の可能性に関連している、という要件が満たされている）。上のパネルは、ＴＰ５３遺伝子のＳＮＭのプロファイルに整列させた患者の腫瘍サンプルの中の１８の遺伝子のＳＮＭの分布を示す。１８の遺伝子のそれぞれのＳＮＭを有するがん患者の数は、事象のパーセントとして報告される。陰影の付いたエリアは、ＳＮＭのないがん患者の相対的な数をハイライトしている。これらの１８の遺伝子のそれぞれについてのカプラン・マイヤー生存曲線が、生存確率が顕著に低くがんによる死亡の可能性が高い患者を同定することに留意されたい。それ故に、腫瘍サンプルから単離されたこれらの１８の遺伝子のそれぞれにおけるＳＮＭの検出は、腫瘍にこれらの遺伝子のＳＮＭを有しない患者と比較して、がん患者の不良な長期予後に関連している（図５Ａ）。下線を付した遺伝子記号は、その発現が、ｈＥＳＣにおいてＳＣＡＲによって制御される遺伝子を同定している。赤色の遺伝子記号はＳＣＡＲ標的化遺伝子を表し、一方で黒色の遺伝子記号は既報の候補がんドライバー遺伝子を同定する。
【００５１】
Ｂ、ＴＰ５３遺伝子のみについての、腫瘍にＳＮＭを有する及び有しない７，５０９人のがん患者のカプラン・マイヤー生存率分析の比較（図７Ａ、下記の左上の図）；１８遺伝子のＳＮＭのシグネチャー（図７Ｂ、下記の右上の図）；ＴＰ５３のない２６遺伝子のＳＮＭのシグネチャー（図７Ｃ、下記の左下の図）；ＴＰ５３遺伝子を含む２７遺伝子のＳＮＭのシグネチャー（図７Ｄ、下記の右下の図）。
【００５２】
Ｃ、Ｄ、２８（Ｃ）及び１９（Ｄ）のがんタイプを有すると診断された患者における、悪性腫瘍の臨床的難治性の線形回帰分析。Ｃ、２８のがんタイプのＴＣＧＡ汎がんコホートからのがん患者の生存データを利用して、各がんタイプについての死亡事象のパーセントを計算した。得られた値を、がん患者の対応する群におけるＳＮＭのがんによる死亡シグネチャーを有する患者のパーセントと整列させて、線形回帰分析に供した。Ｄ、１９がんタイプについての米国における年齢調整されたがん発生率及び死亡率（１００，０００人あたり）を、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）の米国がん統計（ＵＳＣＳ）の報告書から得た。各がんタイプについての推定死亡率は、対応する発生率の値及びＳＮＭのがんによる死亡シグネチャーを有する患者のパーセントの値を掛け合わせることによって計算した。得られた値を対応するがんタイプについての実際の死亡率と整列させて、回帰分析に供した。
【００５３】
【図８】図８Ａ−８Ｂ（集合的に「図８」と呼ばれ、図８Ａ−８Ｂは以下の説明においてそれぞれＡ−Ｂとも呼ばれる）。ＳＣＡＲ幹性ネットワークの遺伝子のタンパク質発現変化は、低い長期生存率及び高いがんによる死亡の可能性と統計的に有意な関連を示す。
【００５４】
１２のＴＣＧＡコホートにわたる５，１５８の臨床サンプルを含むＴＣＧＡ汎がんデータベースにおける、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定されるがん患者の長期生存確率との関連について、３８のＳＣＡＲ幹性ネットワークの遺伝子のタンパク質発現変化を評価した。全体として、２３のＳＣＡＲ制御遺伝子（６０．５％）のタンパク質発現レベルの変化が、がん患者の長期生存確率と顕著な関連を示した（補足データセットＳ１）。タンパク質発現のヒートマップ及び関連するカプラン・マイヤー生存曲線を示す。対応するｐ値を補足データセットＳ１に報告する。
【００５５】
【図９】図９。転写活性のあるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ  ＳＣＡＲは、代替の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ修復経路を利用することによって、宿主ＤＮＡ（青線）の二本鎖切断（雷の形）の修復に寄与する。部分的な相同性領域を有するＳＣＡＲ  ＲＮＡ（黒破線）の宿主ＤＮＡへの逆転写は、宿主ＤＮＡの二本鎖切断の部位でギャップを埋めるＤＮＡ分子（黒実線）を生成する。二本鎖ＤＮＡ切断のＳＣＡＲ関連修復のこのメカニズムの特徴は、ヒトゲノム中のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ配列の挿入部位での祖先ＤＮＡセグメント（赤実線）の欠失の証拠である（詳細については表３及びテキストを参照されたい）。このプロセスは、ＳＣＡＲのヒト特異的組込み部位を生成し、宿主／ウイルスキメラ転写物（青／黒破線）の生成を容易にする可能性がある。ＤＳＢ、二本鎖切断；ＮＨＥＪ、非相同末端結合；ＲＴ、逆転写；ＳＣＡＲ、幹細胞関連レトロウイルス。
【００５６】
【図１０】図１０。血液、血清、及び血漿サンプル；循環腫瘍細胞；原発性及び転移性腫瘍サンプルにおける、ＳＣＡＲのネットワーク活性状態を監視するための、継続的な連続サンプリングに基づく、がん患者の臨床管理における意思決定プロセスのフローチャート。
【００５７】
この配列の任意の段階で活性化されたＳＣＡＲのネットワークの遺伝的及び／又は分子的証拠の同定は、治療抵抗性の臨床的に致死的な疾患の表現型の診断に有利に働き、以下の治療選択肢の即座の検討のために必要なものをもたらすであろう：「次の候補の」積極的な処置プロトコル；ＳＣＡＲの経路を特異的に標的化する新規の治療及び／又はＳＣＡＲのネットワークの活性状態を示す悪性腫瘍を有する患者に適切だと考えられる治療的介入。ＣＴＣ、循環腫瘍細胞；ＦＦＰＥ、ホルマリン固定パラフィン包埋。Glinsky, GV. 2008. "Stemness" genomics law governs clinical behavior of human cancer: Implications for decision making in disease management. Journal of Clinical Oncology, 26: 2846-53から採用した。
【００５８】
【図Ｓ１】補足図（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｆｉｇｕｒｅ）Ｓ１Ａ−Ｓ１Ｋ（集合的に「補足図Ｓ１」と呼ばれる）。（図４に関連する）。ｈＥＳＣの内在性ヒトＳＣＡＲによってコードされた宿主／ウイルスキメラ転写物の翻訳されたアミノ酸配列内の、保存タンパク質ドメイン発現の異なる及び共通の複数のパターンの追加の例。タンパク質ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）及び保存タンパク質ドメインの同定及び可視化のための関連のウェブベースツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=3HZ5BMES01R&mode=all）（これらは、他の場所で詳細に説明された［８０、８１］）を使用して、ヒト特異的キメラ転写物のヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳し、タンパク質アラインメント分析に供した。
【００５９】
ヒト特異的ウイルス／宿主キメラ転写物の翻訳されたアミノ酸配列のタンパク質アラインメントは、異なるＳＣＡＲ遺伝子座によってコードされる保存タンパク質ドメインの異なるパターンを同定する。材料及び方法において説明されているように、ヒト特異的キメラ転写物のヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳し、ＢＬＡＳＴタンパク質アラインメント分析に供した。ヒト特異的ＳＣＡＲ由来の宿主／ウイルスキメラ転写物によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列内で最も頻繁に表される保存タンパク質ドメインは、ＧＶＱＷアミノ酸配列であることに留意されたい。
【００６０】
【図Ｓ２】補足図Ｓ２Ａ−Ｓ２Ｅ（集合的に「補足図Ｓ２」と呼ばれ、補足図Ｓ２Ａ−Ｓ２Ｄは、以下の説明においてそれぞれＡ−Ｄとも呼ばれ、補足図Ｓ２Ｅは補足図Ｓ２Ａ−Ｓ２Ｅの編集物である）。（図６に関連する）。ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを保持するジンクフィンガータンパク質の遺伝子発現及び遺伝子コピー数の変化は、がん患者の長期生存率との顕著な関連を示す。ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを保持するジンクフィンガータンパク質の遺伝子コピー数（Ｄ）及びｍＲＮＡ発現レベル（Ａ−Ｃ）を、前立腺がん（ｎ＝５６８）；乳がん（ｎ＝１，２４１）；結腸がん（ｎ＝５５０）；直腸がん（ｎ＝１８７）；膵臓がん（ｎ＝１９６）を有すると診断されたがん患者；及び１２のＴＣＧＡコホート（１２の異なるがんタイプのＰＡＮＣＡＮ１２研究）にわたる５，１５８の臨床サンプルを含むＴＣＧＡ汎がんデータベースの、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定されるがん患者の長期生存確率との関連について、評価した。がんの５つの個別のタイプ［前立腺がん（Ａ）；乳がん（Ｂ；Ｃ、左下のパネル）；結腸がん（Ｃ；左上のパネル）；直腸がん（Ｃ；右上のパネル）；及び膵臓がん（Ｃ、右下のパネル）］のＴＣＧＡコホートにおける、遺伝子発現変化（Ａ−Ｃ）の顕著な関連を示す、ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを有するジンクフィンガータンパク質の代表的な例を示す。遺伝子コピー数変化のＴＣＧＡ  ＰＡＮＣＡＮ１２研究のがん患者の長期生存率との顕著な関連を示す、ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを有するジンクフィンガータンパク質の例を、図４Ｄに示す。遺伝子発現ヒートマップ及び対応するカプラン・マイヤー生存曲線を（Ａ−Ｃ）に示す。遺伝子発現（左の画像）及びエキソン発現（右の画像）のヒートマップ及び関連するカプラン・マイヤー生存曲線を（Ｃ）に示す。遺伝子発現（左の画像）及びコピー数（右の画像）のヒートマップ及び関連するカプラン・マイヤー生存曲線を（Ｄ）に示す。対応するｐ値を補足データセットＳ１に報告する。
【００６１】
【図Ｓ３】補足図Ｓ３Ａ−Ｓ３Ｂ（集合的に「補足図Ｓ３」と呼ばれ、補足図Ｓ３Ａ−Ｓ３Ｂは、以下の説明においてそれぞれＡ−Ｂとも呼ばれる）。（図７に関連する）。フォローアップ生存データの完全な臨床記録を有する患者のみを含む、ＳＮＭ遺伝子の分類性能の追加のカプラン・マイヤー生存率分析。
【００６２】
Ａ、腫瘍にＳＮＭを有する及び有しない７，２５８人のがん患者（左上及び左下の図）及び生存期間の昇順にソートした後同一のサイズ（ｎ＝２，４１９）のサブグループに階層化したがん患者（左上及び左下の図）のカプラン・マイヤー生存率分析の比較。この分析において、フォローアップ生存データの完全な臨床記録を有する患者のみを含めた。
【００６３】
Ｂ、がんによる死亡の表現型のＳＮＭシグネチャーを保持する遺伝子の突然変異のフィンガープリントの可視化。臨床腫瘍サンプルから単離されたこれらの遺伝子には、突然変異が「散らばっている」ように見え、その圧倒的多数がＳＮＭによって表されることに留意されたい。
【００６４】
【図Ｓ４】補足図Ｓ４Ａ−Ｓ４Ｅ（集合的に「補足図Ｓ４」と呼ばれ、補足図Ｓ４Ａ−Ｓ４Ｄは、以下の説明においてそれぞれＡ−Ｄとも呼ばれ、補足図Ｓ４Ｅは補足図Ｓ４Ａ−Ｓ４Ｅの編集物である）。ＨＥＳＣにおけるＳＣＡＲ関連幹性ネットワークのマスター転写制御因子の遺伝子レベルのコピー数の変化（枠で囲んだＫＬＦ４；ＬＢＰ９；ＮＡＮＯＧ；及びＰＯＵ５Ｆ１遺伝子のカプラン・マイヤープロット）及びＳＮＭのがんによる死亡シグネチャーの遺伝子は、低い長期生存率及び高いがんによる死亡の可能性と統計的に有意な関連を示す。示されたタンパク質コード遺伝子の遺伝子レベルのコピー数変化を、１２のＴＣＧＡコホートにわたる５，１５８の臨床サンプル（Ａ；Ｃ）及び２９のＴＣＧＡコホートにわたる１２，０９３の臨床サンプル（Ｂ；Ｄ）を含む２つのＴＣＧＡ汎がんデータベースにおいて、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定されるがん患者の長期生存確率との関連について、独立して評価した。著しく類似した結果が、ＢＭＩ１（Ｃ及びＤの左下の図）及びＥＺＨ２（Ｃ及びＤの右下の図）遺伝子のコピー数変化について観察され、その遺伝子のコピー数変化と、がんによる死亡の可能性が高いがん患者からの腫瘍における、Ｐｏｌｙｃｏｍｂクロマチンサイレンシング経路の活性化及び幹性遺伝子発現シグネチャーとの関連は、既に実証されたものである（３７−５１）ことに留意されたい。対応するｐ値を補足データセットＳ１に報告する。
【００６５】
【図Ｓ５】補足図Ｓ５。１１遺伝子のがんによる死亡シグネチャー及び３つのＳＣＡＲネットワーク遺伝子（ＰＬＣＸＤ１、ＨＫＲ１、ＺＮＦ２８３）の発現シグネチャーの発現プロファイルに基づいて、異なるサブグループに階層化された前立腺がん患者における、治療成績のカプラン・マイヤー生存率分析。
【００６６】
【図ＴＳ１】表Ｓ１Ａ（「表Ｓ１」とも呼ばれる）。複数の汎がんデータベースにおける治療失敗及びがんによる死亡の高い可能性との顕著な関連に基づいて同定された、体細胞非サイレント突然変異の分析のための４２の遺伝子のパネル。
【００６７】
【図ＴＳ２】表Ｓ２Ａ−Ｓ２Ｃ（集合的に「表Ｓ２」と呼ばれる）。
【００６８】
表Ｓ２Ａ：両側ｐ値：０．０００９０４７４；ｐ＝０．０００９；図７Ｃに関連する。
【００６９】
表Ｓ２Ｂ：両側ｐ値；図７Ｄに関連する。
【００７０】
表Ｓ２Ｃ：図７に関連する。
【００７１】
【図ＴＳ３】表Ｓ３Ａ−Ｓ３Ｂ（集合的に「表Ｓ３」と呼ばれる）。
【００７２】
表Ｓ３Ａ。ＣｈｒＹ＿ＣｈｒＸ
【００７３】
表Ｓ３Ｂ。ｃｈｒ３＿ｃｈｒ１１
【００７４】
【図ＴＳ４】表Ｓ４Ａ−Ｓ４Ｂ（集合的に「表Ｓ４」と呼ばれる）。
【００７５】
表Ｓ４Ａ。７４の遺伝子。
【００７６】
表Ｓ４Ｂ。５５の遺伝子。
【００７７】
【図ＴＳ５】表Ｓ５Ａ−Ｓ５Ｃ（集合的に「表Ｓ５」と呼ばれる）。
【００７８】
表Ｓ５Ａ。ヒト胚形成の接合子段階で最も顕著な活性化を示すＨＥＲＶＨ−遺伝子座。図２に関連する。
【００７９】
表Ｓ５Ｂ。ヒト胚形成の接合子段階で最も顕著な活性化を示す、ＨＥＲＶＫ−；ＨＥＲＶＨ−；及び他のＳＣＡＲ遺伝子座。図２に関連する。
【００８０】
表Ｓ５Ｃ（部分的に図において示される）。ヒト胚形成及びヒト被験体における病理学的状態の発症に関係するＳＣＡＲ配列。
【００８１】
【図ＴＳ６】表Ｓ６Ａ−Ｓ６Ｃ（集合的に「表Ｓ６」と呼ばれる）。
【００８２】
表Ｓ６Ａ。６４のＨＥＲＶ１ヒト特異的キメラ転写物（ボノボ及びチンパンジーアラインメント失敗）。
【００８３】
表Ｓ６Ｂ。
【００８４】
表Ｓ６Ｃ。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
詳細な説明
近年、新規の方法の、個人に合わせた、標的の調整されたがん治療を含む、幅広いがん処置プロトコルが開発されている。しばしば、非常に積極的ながん治療は、そのような治療によって生じる望ましくない副作用に起因して、末期がんのために保留される。しかしながら、そのような積極的な治療でさえ、そのような末期では一般に失敗する。最も積極的な治療にのみ応答するがんをより初期段階で同定できれば、そのようながんを有する患者の予後を大幅に向上できる可能性がある。
【００８６】
近年、そのような成績を予測する潜在的に有用なマーカーが同定されている。Glinsky, G.V. et al., J. Clin. Invest. 113: 913-923 (2004)は、遺伝子発現プロファイリングが前立腺がんの臨床成績を予測することを教示している。Van 't Veer et al., Nature 415: 530-536 (2002)は、遺伝子発現プロファイリングが乳がんの臨床成績を予測することを教示している。Glinsky et al., J. Clin. Invest. 115: 1503-1521 (2005)は、ＢＭＩ１癌遺伝子の発現の変化が、正常及び白血病幹細胞の自己再生状態、並びに複数のタイプのがんを有する患者における治療失敗を予測する１１遺伝子のがんによる死亡のシグネチャーの予後不良プロファイルに、機能的にリンクしていることを教示している。これらの研究は、マイクロアレイ遺伝子発現解析アプローチを利用した。
【００８７】
それ故に、がんの早期診断のための高度に正確な方法及び臨床現場に容易に適合可能ながん治療のための予後アッセイが、継続してますます必要とされている。そのような方法は、臨床検査室において容易に実施することができる状態の最新技術を利用するはずであり、標準的な治療レジメンに適用される様々ながんの抵抗性の可能性を正確に予測するはずである。
【００８８】
処置を発見、規定、及び設計し、処置を開発するために、そして転移性及び難治性のがんを処置するために、非常にたくさんの試みがなされている。それらは主に、迅速な細胞成長の基本的メカニズム又は異常ながん細胞代謝経路のいずれかを攻撃することによるが、ほとんど成功していない。最近、腫瘍及び微小転移に対するその攻撃において、免疫システムを有効化又は再有効化するいくつかの方法が、試験及び商業的使用においてかなり有望なデータを示しているが、転移性及び難治性の疾患を有する患者の大多数が、これらの免疫調節治療に対しても難治性であることが証明されている。それ故に、単独の治療剤として、又は他の様式、特に免疫調節と組み合わせて使用され、転移表現型を可能にする細胞メカニズムを根本的に攻撃するように設計された、新規のがん治療が必要とされている。そのような新規の治療は、がん細胞の転移及び生存に関与している重要遺伝子シグネチャーの理解から誘導されるはずである。
【００８９】
体細胞突然変異及び染色体不安定性は、がん細胞におけるゲノム異常の特徴である。異数体は、ヒト胚及び悪性固形腫瘍においてしばしば観察される、染色体不安定性の一般的な発現を表す。ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）由来遺伝子座の活性化は、着床前ヒト胚、ｈＥＳＣ、及び複数のタイプのヒト悪性腫瘍において実証されている。ＨＥＲＶ活性化が、ヒト胚発生の初期段階における染色体不安定性の頻繁な発生及びがんにおけるゲノム異常の出現に寄与する、共通の分子経路を浮き彫りにすることができるかどうかは不明のままである。
【００９０】
ヒト着床前胚の単細胞ＲＮＡ配列解析は、卵母細胞から接合子への移行中の特定のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の活性化を明らかにし、ヒト胚における異数性に関連するＨＥＲＶＨネットワークシグネチャーを同定する。相関パターンの分析は、推定上の前駆病変（前立腺上皮内新生物）から限局性及び転移性の前立腺がんへのがん進行経路の存在を支持する、前立腺腫瘍の臨床サンプルの遺伝子発現プロファイルを有するインビボの成熟したヒト卵母細胞のＨＥＲＶＨネットワーク活性化のトランスクリプトームシグネチャーとリンクしている。既知の長期治療成績を有するがん患者の腫瘍サンプルにおいて、ＨＥＲＶＨネットワークの活性化のシグネチャーを追跡することにより、治療失敗及びがんによる死亡の著しく異なる可能性を有するサブグループへの患者の階層化が可能になった。
【００９１】
２９のがんタイプにわたる１２，０９３の臨床腫瘍サンプルにおける、幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）によって制御されるネットワークのヒト特異的遺伝要素のゲノムワイドな分析は、ＳＣＡＲ制御宿主遺伝子の転写物の及びタンパク質の発現、体細胞非サイレント突然変異（ＳＮＭ）の存在、遺伝子レベルのコピー数変化によって規定される、臨床的に致死的な治療抵抗性疾患の汎がんゲノムシグネチャーを明らかにした。全てのがん死亡の７３％超が、腫瘍にＳＮＭのシグネチャーのある患者において発生した。米国国民集団におけるがん難治性の線形回帰分析は、臓器特異的がん死亡率が、腫瘍にＳＮＭのシグネチャーのある患者のパーセンテージと直接相関していることを証明した。
【００９２】
ＳＣＡＲにコードされたＲＮＡ分子は、保存タンパク質ドメイン（ＣＰＤ）として規定されるアミノ酸配列を含む、内在性タンパク質コード能力を保有する。ＳＣＡＲにコードされたＣＰＤのマッピングは、ゲノムワイドに散在する、ＣＰＤの数千の遺伝子座特異的フィンガープリントを明らかにした。特定のＣＰＤをコードするＳＣＡＲの配列の進化的拡大は、ＣＰＤが見出される独特のタンパク質配列のヒトプロテオームにおける著しい富化をもたらした。これらの結果は、高い発現レベルのＳＣＡＲ  ＲＮＡを有する罹患細胞が、免疫療法介入のための魅力的で高度に特異的な分子標的を提供する、著しく多くの量のＳＣＡＲ  ＲＮＡにコードされたペプチドを有する可能性が高いことを示している。
【００９３】
ヒト特異的ウイルス／宿主キメラ転写物の分子構造の系統的解析は、ヒトゲノムにおけるＳＣＡＲの組込みの特徴が、祖先ＤＮＡの複数種生物の欠失パターンであることを証明している。ヒト特異的挿入及び欠失を有するＳＣＡＲの遺伝子座の異種間の追跡は、宿主細胞の即座の生存及び適応を増強し得るＳＣＡＲの推定上の生物学的機能を浮き彫りにする、二本鎖ＤＮＡ切断の修復における潜在的役割を示唆している。進化的規模では、数千のヒト特異的制御配列を蒔くことに加えて、ＳＣＡＲの活性は、ＤＮＡ修復及びヒトゲノム全体にわたる特定のＣＰＤの配列の拡散に関与しているようである。
【００９４】
本明細書に示す実施例は、分化細胞におけるＳＣＡＲ制御幹性ネットワークの覚醒が、複数のタイプの臨床的に致死的な悪性腫瘍においてその後容易に検出可能であり、治療抵抗性表現型の出現に寄与している可能性が高い、多様な範囲にわたるゲノム異常の発生に関連していることを証明している。
【００９５】
キーワード：ヒト内在性幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）；ヒト特異的制御配列；ヒトＥＳＣ；ヒト胚；多能性状態制御因子；ＮＡＮＯＧ；ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）；ＣＴＣＦ；ＬＴＲ７  ＲＮＡ；長い末端反復、ＬＴＲ；ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ；ＬＴＲ５ＨＳ／ＨＥＲＶＫ；治療抵抗性がん；がん幹細胞
【００９６】
略語リスト
ＨＥＲＶ、ヒト内在性レトロウイルス
ｈＥＳＣ、ヒト胚性幹細胞
ＬＩＮＥ、長い散在反復配列（ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）
ｌｎｃＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ
ｌｉｎｃＲＮＡ、長い遺伝子間非コードＲＮＡ
ＬＴＲ、長い末端反復
ＮＡＮＯＧ、Ｎａｎｏｇ  ホメオボックス
ＰＯＵ５Ｆ１、ＰＯＵクラス５ホメオボックス１
ＳＣＡＲ、幹細胞関連レトロウイルス
ＴＣＧＡ、がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）
ＴＥ、転位因子
ＴＦ、転写因子
ＴＦＢＳ、転写因子結合部位
ｓｎｃＲＮＡ、小さい非コードＲＮＡ
【００９７】
幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）
【００９８】
内在性レトロウイルスの活性は、ヒト細胞において抑制されて、機能的ゲノム完全性に対する突然変異の潜在的に有害な効果を制限し、且つゲノム安定性の維持を保証する。これに関して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び初期段階のヒト胚は、著しく異なっているようである。ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、具体的には、ＨＥＲＶＨ及びＨＥＲＶＫサブファミリーの発現は、ｈＥＳＣにおいて著しく活性化される［１−３］。ヒトゲノムにおけるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ配列の挿入の割合の増強は、ヒト特異的転写結合部位［３］、及び長い非コードＲＮＡ［５］を含む、多能性コア転写因子の結合部位に関連しているようである［１；３；４］。ｈＥＳＣにおける転写因子結合部位の分析は、ＨＥＲＶＨの発現が多能性制御回路によって制御されることを示唆している。なぜなら、５０の最も高度に発現されたＨＥＲＶＨ遺伝子座の長い末端反復（ＬＴＲ）の８０％が、ＮＡＮＯＧ及びＰＯＵ５Ｆ１を含む多能性コア転写因子によって占められているからである［１］。さらに、転位因子（ＴＥ）由来配列、特にＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ、ＬＴＲ５＿Ｈｓ／ＨＥＲＶＫ、及びＬ１ＨＳは、ｈＥＳＣのゲノムに推定上の転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を有する候補ヒト特異的制御配列（ＨＳＲＳ）の９９．８％を保持している［３］。ＨＥＲＶのこれらの特定のファミリーの一般的な機能的特徴（これらは、ヒト胚及びｈＥＳＣにおいて、それらの活性発現によって媒介される）に基づいて［６−９］、それらは、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）として指定された。
【００９９】
最近の研究は、ヒト着床前胚及び胚性幹細胞におけるＳＣＡＲの活性化のメカニズム及び推定上の生物学的機能を浮き彫りにした。ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨサブファミリーは、ヒト胚の胚盤胞において迅速に脱メチル化及び上方制御され、ｈＥＳＣにおいて高度に発現された状態を維持する［１０］。下流の完全長ＨＥＲＶＨ−ｉｎｔ要素のためのプロモーターを典型的に保持する、ＬＴＲ７、ＬＴＲ７Ｂ、及びＬＴＲ７Ｙの配列が、最も高いレベルで発現されたことが見出され、ヒトＥＳＣ及び誘導多能性幹細胞、ｉＰＳＣにおいて、最も統計的に有意に上方制御されたレトロトランスポゾンであった［１１］。ＨＥＲＶＨサブファミリーのＬＴＲ、具体的には、ＬＴＲ７がｈＥＳＣにおいてエンハンサーとして機能し、ＨＥＲＶＨ配列がｈＥＳＣの多能性及び同一性の維持に必要とされる核非コードＲＮＡをコードしていることが証明されている［１２］。分化したヒト細胞の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への再プログラミング、多能性の維持及び分化能力の再確立には、ＨＥＲＶＨの一時的な空間時間的に制御された過活性化が必要である［１３］。ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ活性の制御及びサイレンシングに失敗すると、神経系列において分化に欠陥のある表現型が生じる［１３、１４］。Ｌ１レトロトランスポゾンの活性化はまた、これらのプロセスに寄与し得る。なぜならば、ヒト及び他の大型類人猿のｉＰＳＣにおいて、Ｌ１転写及び転移の両方の顕著な活性が最近報告されたためである［１５］。ヒト着床前胚及び胚性幹細胞の単細胞ＲＮＡシーケンシング［１６、１７］により、特定のレトロウイルス要素の著しい活性化によって規定される、初期のヒト胚性幹細胞の特定の異なる集団の同定が可能となった［１８］。
【０１００】
内在性ヒトＳＣＡＲの発見及びヒト胚形成におけるそれらの必須の役割の説得力のある証拠は、いくつかの即座の実用的意義を有する可能性がある。ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣの異種集団は、最も幅広く頑強な多系列発生能力を有するナイーブ状態幹細胞を含み、それ故に、再生医療における多数の人命を救う治療用途に、かなり有望である。ナイーブ様ｈＥＳＣの特徴としての高いＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ発現の定義と一致して、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ発現が著しく上昇したｈＥＳＣ及びヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の亜集団は、ナイーブ様多能性幹細胞の重要な特性を示す［１９］。さらに、ヒトナイーブ様多能性幹細胞は、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨの転写の上昇のマーカーに基づいて、遺伝的にタグ付けされ、首尾よく単離され、インビトロで維持され得る［１９］。胚性幹細胞特異的転写因子ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、ＫＬＦ４、及びＬＢＰ９は、ヒト多能性幹細胞においてＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ転写を駆動する［１９］。ＨＥＲＶＨ活性及びＨＥＲＶＨ由来転写物での標的化された干渉は、ヒト多能性幹細胞の自己再生機能を大幅に損なう［１９］。
【０１０１】
ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨサブファミリーと同様に、ＨＥＲＶＫレトロウイルスの最も進化的に新しいゲノム組込み部位を表す、低メチル化ＬＴＲでの、多能性マスター転写因子ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）によるＬＴＲ５＿Ｈｓ／ＨＥＲＶＫのトランス活性化は、正常ヒト胚形成中にＨＥＲＶＫ発現を誘導する［２０］。それは、胚性ゲノム活性化が、８細胞期で起こり、着床前胚盤胞におけるエピブラスト細胞の段階にわたって続き、胚盤胞生成物からのｈＥＳＣ誘導の間に停止することと一致する［２０］。ヒト胚形成中のＨＥＲＶＫ活性化の明白な実験的証拠が、Ｇｒｏｗらによって報告されている［２０］。彼らは、ヒト胚盤胞におけるＨＥＲＶＫウイルス様粒子及びＧａｇタンパク質の存在を証明した。これは、内在性ヒトレトロウイルスが、初期のヒト胚発生中に活性があり機能的であるという考えを支持するものである。この仮説と一致して、多能性細胞におけるＨＥＲＶＫウイルス−アクセアリータンパク質Ｒｅｃの過剰発現は、宿主タンパク質ＩＦＩＴＭ１レベルを増加させてウイルス感染を阻害するのに十分であった［２０］。これは、ヒトの初期段階の胚におけるこの抗ウイルス防御メカニズムが、ＨＥＲＶＫ活性化によって誘発され得ることを示唆している。レトロトランスポゾンの活性化が胚性幹細胞における種特異的遺伝子発現をどのように調整するかについての詳細な分析が、最近のレビューで示されており［２１］、これは、ヒト細胞における特定のレトロトランスポゾンの活性化と抑制の間で、進化の間に確立された精密な制御バランスを浮き彫りにしている。
【０１０２】
最近の実験は、ｈＥＳＣにおいてＳＣＡＲの重要な生物学的活性を媒介する重要なエフェクター分子を同定した。ＳＣＡＲ由来の長い非コードＲＮＡは、ｈＥＳＣの多能性、機能的同一性、及び完全性を維持するための必須の制御分子として記載されている［１２］。集合的に、これらの実験は、ｈＥＳＣ及びｉＰＳＣを含むヒト多能性幹細胞の多能性維持及び機能的同一性のための、特定の内在性レトロウイルスの、持続的ではあるがしっかりと空間時間的に制御された活性の必須の役割を決定的に確立した。ＳＣＡＲの覚醒が、がん細胞における幹性ゲノムネットワークの活性化及び複数のタイプの悪性腫瘍を有すると診断された患者における臨床的に致死的ながんによる死亡の表現型の出現に関連している可能性があるという仮説が立てられている［６−９］。
【０１０３】
要約すると、新たな合意見解は、ヒト着床前胚中の内在性幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）、具体的にはＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ及びＬＴＲ５＿Ｈｓ／ＨＥＲＶＫサブファミリーの、空間時間的に制御された活性化が、ナイーブ状態ＥＳＣの多能性維持、機能的同一性及び完全性、並びに初期段階のヒト胚の抗ウイルス抵抗性のために必要である、ということである。ＳＣＡＲの発現は、分化したヒト細胞においてエピジェネティックにサイレンシングされ、ＳＣＡＲ活性の制御及び効率的なサイレンシングに失敗すれば、分化に欠陥のある表現型を生じる。がん細胞におけるＳＣＡＲ遺伝子座のエピジェネティックなサイレンシングの逆転は、複数のタイプのヒト腫瘍におけるＳＣＡＲ発現の活性化に関連しているようである（９及びその参考文献において概説されている）。
【０１０４】
この寄稿では、ヒト着床前胚の単細胞ＲＮＡ配列解析は、卵母細胞から接合子への移行中の特定のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の活性化を明らかにし、ヒト胚における異数性に関連するＨＥＲＶＨネットワークシグネチャーを同定する。相関パターンの分析は、前立腺上皮内新生物から限局性及び転移性の前立腺がんへのがん進行経路の存在を支持する、前立腺腫瘍の臨床サンプルの遺伝子発現プロファイルを有するインビボの成熟したヒト卵母細胞のＨＥＲＶＨネットワーク活性化のトランスクリプトームシグネチャーとリンクしている。臨床的に致死的な疾患を有するがん患者からの悪性腫瘍における、多様な範囲にわたるゲノム異常の発現は、がん細胞におけるＳＣＡＲネットワークの活性化に関連している。２９のがんタイプを表す、全てのＴＣＧＡコホートにわたる、１２，０９３の臨床サンプルにおける、ＳＣＡＲネットワークのがんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）にガイドされた分析は、ＳＣＡＲ関連タンパク質コード遺伝子及び非コードＲＮＡ遺伝子座の体細胞非サイレント突然変異、遺伝子発現、遺伝子レベルのコピー数変化、タンパク質発現によって規定される、臨床的に致死的な治療抵抗性疾患の汎がんゲノムシグネチャーを明らかにした。
【実施例】
【０１０５】
実験例の説明
単細胞トランスクリプトーム分析は、異数性をよく生成し発生的に非生存可能なヒト接合子におけるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ制御遺伝子の発現の変化及び選択されたＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座からの活性転写を明らかにする。
【０１０６】
染色体不安定性は、初期段階のヒト胚発生において一般的であり、異数体は卵割期ヒト胚の５０−８０％で観察される［Vanneste E, Voet T, Le Caignec C, Ampe M, Konings P, Melotte C, Debrock S, Amyere M, Vikkula M, Schuit F, Fryns JP, Verbeke G, D'Hooghe T, Moreau Y, Vermeesch JR. Chromosome instability is common in human cleavage-stage embryos. Nat Med. 2009; 15 :577-83; Johnson DS, Gemelos G, Baner J, Ryan A, Cinnioglu C, Banjevic M, Ross R, Alper M, Barrett B, Frederick J, Potter D, Behr B, Rabinowitz M. Preclinical validation of a microarray method for full molecular karyotyping of blastomeres in a 24-h protocol. Hum Reprod. 2010; 25: 1066-75; Chavez SL, Loewke KE, Han J, Moussavi F, Colls P, Munne S, Behr B, Reijo Pera RA. Dynamic blastomere behaviour reflects human embryo ploidy by the four-cell stage. Nat Commun. 2012; 3:1251; Vera-Rodriguez M, Chavez SL, Rubio C, Reijo Pera RA, Simon C. Prediction model for aneuploidy in early human embryo development revealed by single-cell analysis. Nat Commun. 2015; 6: 7601; Yanez LZ, Han J, Behr BB, Pera RA, Camarillo DB. Human oocyte developmental potential is predicted by mechanical properties within hours after fertilization. Nat Commun. 2016; 7: 10809］。
【０１０７】
ヒト胚における異数体は、細胞周期停止、細胞生存能力の喪失、及び発生不全につながる、適切な発生を損なう。単細胞トランスクリプトーム分析は、接合子の遺伝子発現シグネチャーが、正倍数体及び異数体ヒト胚の発生を確実に予測し、発生的に生存可能な接合子と非生存可能な接合子とを区別することができたことを証明した［Vera-Rodriguez M, Chavez SL, Rubio C, Reijo Pera RA, Simon C. Prediction model for aneuploidy in early human embryo development revealed by single-cell analysis. Nat Commun. 2015; 6: 7601; Yanez LZ, Han J, Behr BB, Pera RA, Camarillo DB. Human oocyte developmental potential is predicted by mechanical properties within hours after fertilization. Nat Commun. 2016; 7: 10809］。
【０１０８】
特定のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の活性化がヒト胚における異数体の発生に関連しているという仮説の妥当性試験は、これらの実験的パラダイムに適合し、以下の仮定に従わなければならない：
・高いＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ発現は、ヒト接合子において容易に検出可能であるはずである；
・接合子段階でＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座が活性化された細胞は、ヒト胚形成の後続の段階の間、持続しないはずである；及び
・異数性をよく生成するヒト胚の遺伝子発現シグネチャーは、顕著な数のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ制御遺伝子を保持するはずである。
【０１０９】
ヒト胚発生関連遺伝子の分析は、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ制御遺伝子の数が、正倍数体胚と比較して、異数体胚において異なって発現される遺伝子の間で顕著に富化されていることを証明している（表１Ａ）。対照的に、ヒト胚発生関連遺伝子の６の異なる遺伝子発現カテゴリーを表す他の遺伝子セットにおいて、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ制御遺伝子の顕著な富化は実証されなかった（表１Ａ）。ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の活性化がヒト胚における異数体の発生に関連しているという仮説と一致して、ｓｈＨＥＲＶＨ処置ｈＥＳＣの遺伝子発現シグネチャーと異数体胚対正倍数体胚で異なって発現される遺伝子で構成される接合子対８細胞胚の遺伝子発現プロファイルとの間で、顕著な相関が観察された（図１）。対照的に、ｓｈＨＥＲＶＨ処置ｈＥＳＣの発現シグネチャーと異数体胚対正倍数体胚間で異なって発現されない遺伝子で構成される接合子対８細胞期胚の遺伝子発現プロファイルとの間では、顕著な相関は実証されなかった（図１）。ＨＥＲＶＨ制御遺伝子の発現が異なる発生能力を有するヒト接合子を区別するという考えと一致して、発生的に生存可能な接合子対非生存可能な接合子において異なって発現される全ての遺伝子の５０パーセントが、ｈＥＳＣにおいてＬＢＰ９／ＨＥＲＶＨによって制御される遺伝子で構成されたことが観察されている（図１）。
【０１１０】
次に、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ発現の活性化が、卵母細胞の受精後の胚形成の初期に起こり、それ故に、ヒト着床前胚の単細胞トランスクリプトーム分析中にヒト接合子において容易に観察され得る、という予測の妥当性を試験した。この考えと一致して、受精ヒト卵母細胞の接合子への移行中に、いくつかの規定されたＬＴ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の顕著な活性化が観察された（図２）。特に、接合子における高いＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ発現は、限定された数の特定のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座のみに制限され、８細胞期を超えて持続しなかった（図２）。予想通り、ほとんどのＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座は、初期胚形成期中にはサイレントのままであり、後期胚盤胞期中に、エピブラスト形成期中に、及びｈＥＳＣ生成の開始時に、膨大な量の活性化を受ける［１−１４；１６−２１］。仮説と一致して、接合子においてＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の活性化された細胞の圧倒的多数は、ヒト胚形成の後続の段階の間持続しなかった（図２）が、パターン４細胞は、胚形成のエピブラスト期及びｈＥＳＣ生成段階でＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ発現の著しい増加を示した。ヒト胚形成中に発現プロファイルのパターン４を示すＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の活性化は、基底状態多能性状態及びナイーブｈＥＳＣの生成に関連している可能性が高い。この仮説は、ｈＥＳＣの多能性制御及び維持ネットワークにおいて重要な役割を果たすＨＰＡＴ３  ｌｉｎｃＲＮＡのＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ配列の発現プロファイルの単細胞トランスクリプトーム分析によってさらに裏付けられる（図２）。
【０１１１】
ヒト卵母細胞におけるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨネットワーク活性化の遺伝子発現シグネチャーは、前立腺がん前駆病変、限局性及び転移性の前立腺がんを、正常前立腺上皮及び良性前立腺肥大と区別する。
【０１１２】
胚形成の間、胚性ゲノム活性化の前に転写は起こらない。これは、胚形成の初期段階が、卵母細胞から排他的に受け継がれる母方の遺伝情報によって排他的に制御されることを示している。胚性ゲノムの転写活性化の主要な波が、ヒト胚形成の４細胞期から８細胞期で観察された［Dobson AT, Raja R, Abeyta MJ, Taylor T, Shen S, Haqq C, Pera RA. The unique transcriptome through day 3 of human preimplantation development. Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 1461-1470］。これらの考察は、ヒト接合子において観察される高いＨＥＲＶＨ遺伝子座の発現が、卵母細胞におけるそれらの活性転写状態に関連している可能性があることを示唆している。この考えと一致して、卵巣からの除去後数分以内に得られたヒト分裂中期ＩＩ卵母細胞のトランスクリプトームの分析［Kocabas AM, Crosby J, Ross PJ, Otu HH, Beyhan Z, Can H, Tam WL, Rosa GJ, Halgren RG, Lim B, Fernandez E, Cibelli JB. The transcriptome of human oocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 14027-32］は、異なって発現されたＨＥＲＶＨ制御遺伝子の大きいセットを同定した（図１）。さらに、ヒト着床前胚の単細胞トランスクリプトーム分析は、ヒト卵母細胞における選択されたＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の発現の直接の実験的証拠を明らかにした［図２］。ヒト卵母細胞におけるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨネットワーク活性化の遺伝子発現シグネチャーの同定は、この遺伝子シグネチャーが悪性腫瘍の臨床サンプルにおけるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨトランスクリプトーム活性化の検出に有用であり得るか否かを決定する機会を提供する。注目すべきことに、この分析は、ヒト卵母細胞におけるＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨネットワーク活性化の遺伝子発現シグネチャーが、前立腺がん前駆病変、限局性及び転移性の前立腺がんを、正常前立腺上皮、間質、及び良性前立腺肥大の臨床サンプルから区別するようであるということを明らかにする（図３）。
【０１１３】
これらの観察は、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨトランスクリプトームの活性化が、前立腺がん前駆病変（サンプルの３１−４６％）、限局性前立腺腺がん（サンプルの２２−２８％）、及び転移性前立腺がん（サンプルの４５−６０％）を構成する、前立腺上皮内新生物の臨床サンプルの大きいサブセットにおいて起こることを強く示唆している。集合的に、これらの結果は、ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ制御ネットワークの活性化が、臨床的に重要な前立腺がんの発症の初期に起こり、推定上の前駆病変（前立腺上皮内新生物）から限局性及び転移性の前立腺がんへの前立腺がん進行中に持続を示す、と主張する。
【０１１４】
ヒト特異的キメラ宿主／ウイルス転写物の発現の差は、がん患者を、著しく異なる長期生存確率を有する複数のサブグループに分離する。
【０１１５】
ＳＣＡＲの覚醒が、がん細胞における幹性ゲノムネットワークの活性化及び複数のタイプの悪性腫瘍を有すると診断された患者における臨床的に致死的ながんによる死亡の表現型の出現に関連しているという仮説が立てられている［６−９］。ｈＥＳＣゲノムの規定された領域へのＳＣＡＲの挿入は、代替プロモーター、エキソン化、及び選択的スプライシングを生成することによって、宿主遺伝子及びキメラ宿主／ウイルス転写物の発現に、顕著に影響を及ぼすようである（１８−２０）。これらのデータは、ＳＣＡＲネットワークの活性化のゲノムシグネチャーが、ＳＣＡＲ由来の転写物、ＳＣＡＲ制御タンパク質コード遺伝子、キメラ宿主／ウイルス転写物、及び非コードＲＮＡを含む、遺伝要素の様々な異なるクラスから成る可能性があることを示唆している。興味深いことに、完全長ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座の約７５％が、ヒト及び非ヒト霊長類において高度に保存されているように見えるが（表１）、３００超の遺伝子座が候補ヒト特異的調節エレメントを表しており、したがって、保存された霊長類特異的且つヒトに特有の制御ＳＣＡＲ由来の配列の生物学的役割の調査の必要性をはっきりと示している。注目すべきは、完全長ヒト特異的ＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ配列が、不活性のＬＴＲ７／ＨＥＲＶＨ遺伝子座と比較して、転写活性のある遺伝子座の間で顕著に富化されていることである（表１）。それ故に、宿主／ウイルスキメラ転写物の構造成分を含むタンパク質コード遺伝子のｍＲＮＡ発現プロファイルは、ヒト腫瘍における遺伝子座特異的ＳＣＡＲ活性化の潜在的な臨床的関連性の評価に有用であり得る。
【０１１６】
ＳＣＡＲ活性化の潜在的な臨床的関連性を評価するために、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定されるがん患者の長期生存確率に関連する、宿主／ウイルスキメラ転写物の構造成分を含むタンパク質コード遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの変化のパターンを評価した（図１）。この分析の主眼は、ヒト特異的ＳＣＡＲ挿入を保持し、それ故に、候補ヒト特異的制御配列として規定された、宿主／ウイルスキメラ転写物であった（表１−３）。
【０１１７】
１２のＴＣＧＡコホート（１２の異なるがんタイプのＰＡＮＣＡＮ１２研究）にわたる５，１５８の臨床サンプル及び全てのＴＣＧＡコホートにわたる１２，０９３の臨床サンプルを含む、２つのＴＣＧＡ汎がんデータベースの問い合わせ（https://genomecancer.soe.ucsc.edu/proj/site/xena/datapages/）は、ＳＣＡＲ標的化タンパク質コード遺伝子の遺伝子発現及び遺伝子コピー数の変化が、がん患者の長期生存率と２つの異なる関連パターンを示すことを証明する（図１）。
【０１１８】
関連パターンの１つは、ＳＣＡＲ標的化遺伝子の高い遺伝子発現レベルが、低いがん患者の生存の可能性に関連しているようである、という観察によって規定される。このパターンは、ＰＬＣＸＤ１及びＣＣＬ２６遺伝子について観察された（図１）。対照的に、第２の関連パターンは、ＳＣＡＲ標的化遺伝子の低い遺伝子発現レベルが低いがん患者の生存確率に関連しているという証拠によって示される。このパターンは、ＺＮＦ４４３、ＬＲＢＡ、ＴＰＴ１、ＡＢＨＤ１２Ｂ、及びＬＩＮ７Ａ  ｍＲＮＡについて観察された（図１）。
【０１１９】
ＴＣＧＡ乳がんコホート（１，２４１臨床サンプル）；ＴＣＧＡ前立腺がんコホート（５６８臨床サンプル）；及びＴＣＧＡ直腸がんコホート（１８７臨床サンプル）を含む、がんタイプ特異的な患者の生存プロファイルの分析中に、ＴＣＧＡ汎がんデータセットと同様の関連パターンが観察された（図１Ｂ）。特に、前立腺及び直腸がんを有すると診断された患者の間で、診断及び治療後１０年を超えて約１００％の生存確率を有する個体で構成される患者の予後良好のサブグループを同定することが可能であるように思われる（図１及び補足図Ｓ２）。それ故に、宿主／ウイルスキメラ転写物の構造的要素を含むヒト特異的レトロウイルス挿入を有するＳＣＡＲ標的化タンパク質コード遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル及び遺伝子コピー数の変化は、悪性腫瘍において観察される様々な異なるＳＣＡＲの活性化パターンが、がん患者における臨床的に異なる成績に関連している、という仮説と一致しているようである。
【０１２０】
高いがんによる死亡の可能性に関連する体細胞非サイレント突然変異のフィンガープリント。がん患者の効率的なエビデンスベースの個別化された管理、及び新規の診断、予後、及び治療の用途の開発のために、治療失敗、疾患再発、転移性進行、及び最終的にはがんによる死亡の高い確率によって規定される、悪性腫瘍の臨床的難治性の体細胞非サイレント突然変異の遺伝的シグネチャーを同定することは、特に有用であろう。この目的のために、ＳＣＡＲのゲノムネットワーク及びがんドライバー遺伝子を、体細胞非サイレント突然変異を獲得した遺伝子（腫瘍サンプルにおけるその検出は、高いがんによる死亡の可能性に関連する）について系統的に探索した。このタイプの関連の、複数の統計的に有意な事例が観察された：すなわち、ＳＣＡＲ関連ゲノムネットワークの遺伝子は、悪性腫瘍において体細胞非サイレント突然変異（ＳＮＭ）を獲得し、これらの突然変異を有する腫瘍を有するがん患者は、顕著に低い長期生存確率及び高いがんによる死亡の可能性を示した（図５）。これらの観察は、臨床的に致死的ながんによる死亡の表現型の遺伝的ドライバーとして機能し得る遺伝子がＳＣＡＲ関連ゲノムネットワーク内に存在することを示唆した。反対に、がんドライバーとして既に規定されている遺伝子のいくつかが、候補ＳＣＡＲ制御遺伝子のカテゴリーを構成し得ると期待することは妥当であった。
【０１２１】
この仮説は、いくつの既報の候補がんドライバー遺伝子が、独立した実験においても、候補ＳＣＡＲ制御遺伝子（これはｓｈＲＮＡアプローチを使用して最近発見された［１９］）として同定されたかを決定することによって、試験した。高信頼性のがんドライバー遺伝子として報告された［２２］２９１遺伝子のうち合計１８３遺伝子（６３％）が、ｈＥＳＣの候補ＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９制御遺伝子として同定された。同様に、ヒト腫瘍において顕著に変異した遺伝子として既に同定されている［２３］１２７の遺伝子のうち７５遺伝子（５９％）が、候補ＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９制御遺伝子であると報告された。最後に、がん遺伝子センサス（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ）（http://cancer.sanger.ac.uk/census）の最新のリリースの５７２遺伝子のうち３２５遺伝子（５７％）が、ｈＥＳＣの候補ＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９制御遺伝子として同定された。集合的に、これらの観察は、腫瘍サンプルの複数のコホートにわたりポジティブセレクションのシグナルを示し、候補がんドライバー遺伝子として規定された遺伝子の大多数が、ｈＥＳＣにおいてＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９幹性経路によって制御されるようである、ということを示している。
【０１２２】
これらの考察に基づいて、低い生存確率及び高いがんによる死亡の可能性を有する患者を分離する、１８遺伝子のがんによる死亡のＳＮＭのシグネチャーを同定した（図５）。腫瘍サンプルから単離されたこれらの１８の遺伝子のそれぞれにおける体細胞非サイレント突然変異の検出は、腫瘍にこれらの遺伝子の体細胞非サイレント突然変異を有しない患者と比較して、がん患者の不良な長期予後に関連しているようである（図５）。意義深いことに、全てのがん死亡事象の約７０％が、１８遺伝子のがんによる死亡突然変異のシグネチャーによって規定される予後不良患者のサブグループにおいて起こった一方で、ＴＰ５３突然変異シグネチャー単独が死亡事象の５０％未満を占めたことが観察された（図５）。がんによる死亡のＳＮＭのシグネチャーを含む１８の遺伝子は、ヒト遺伝子であって、体細胞非サイレント突然変異の存在が、全てのＴＣＧＡコホートにわたる７，５０９の腫瘍サンプルの単一の汎がんデータセットにおいて検出され、１，９３４から８，２７２までの腫瘍サンプルに及ぶ９の汎がんデータセットのフォローアップ分析中に確認された、ヒト遺伝子を表す（ただし、腫瘍におけるこれらの突然変異の存在が、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定される顕著に高いがんによる死亡の可能性に関連している、という要件が満たされている（下記参照））。特に、追加の９の顕著なＳＮＭ遺伝子がカプラン・マイヤー生存率分析に含まれていた場合に、ＳＮＭシグネチャーの分類力は、ほんのわずかに増加するようである（図５）。
【０１２３】
ＳＮＭ遺伝子のがん生存可能性分類性能を、いくつかの追加の分析を使用して確認した（補足図Ｓ３）。これらの分析において、フォローアップ生存データの完全な臨床記録を有する患者のみを含めた。腫瘍にＳＮＭを有する及び有しない７，２５８人のがん患者のカプラン・マイヤー生存率分析の比較は、２つのＳＮＭ遺伝子を有する患者（生存期間中央値１，７２５日）又は１つのみのＳＮＭ遺伝子を有する患者（生存期間中央値１，９４４日）と比較して、腫瘍に少なくとも３つのＳＮＭ遺伝子を保持するがん患者が、最も短い生存期間中央値（１，４３８日）を示したことを証明する。腫瘍にＳＮＭ遺伝子を有しないがん患者は、最も長い生存期間中央値（４，０６８日）を有した。７，２５８人のがん患者を、生存期間の昇順にソートした後３つの同一のサイズ（ｎ＝２，４１９）のサブグループに階層化した場合、３６０日の生存期間中央値を有する患者の６３．４％が、腫瘍にＳＮＭ遺伝子を有した一方で、それぞれ８６９日及び４，２２２日の生存期間中央値を有するがん患者の５８．５％及び５１．８％が、腫瘍にＳＮＭ遺伝子を有した（補足図Ｓ３Ａ）。がんによる死亡の表現型のＳＮＭシグネチャーを保持する遺伝子の突然変異のフィンガープリントの可視化は、臨床腫瘍サンプルから単離されたこれらの遺伝子には、突然変異が「散らばっている」ように見え、その圧倒的多数がＳＮＭによって表されることを明らかにした（補足図Ｓ３Ｂ）。
【０１２４】
興味深いことに、１８のうち１１（６１％）のがんによる死亡のＳＮＭのシグネチャー遺伝子が、１５のヒト特異的ＮＡＮＯＧ結合部位の近くに位置している［３］。これは、これらの遺伝子が、ｈＥＳＣにおけるＮＡＮＯＧ制御ネットワークの遺伝要素を表している可能性があることを示唆している。１１のがんによる死亡のＳＮＭのシグネチャー遺伝子の近くの、１５のヒト特異的ＮＡＮＯＧ結合部位の配置は、偶然にのみ期待され得るよりも有意に高い（ｐ＝９．９５Ｅ−０５；超幾何分布検定）。これは、がんによる死亡のＳＮＭのシグネチャー遺伝子の近くの顕著な配置富化を示さない、他のヒト特異的転写因子結合部位（ＣＴＣＦ；ＰＯＵ５Ｆ１；ＲＮＡＰＩＩ）とは対照的である（データは示さず）。特に、これらの１８の遺伝子全ての遺伝子コピー数の変化は、不良ながん患者の長期生存率に関連しているようであり（補足図Ｓ４）、したがって、遺伝子特異的な遺伝的変化の検出のための独立した分析エンドポイントを使用して、この遺伝子パネルの潜在的な診断値及び予後値を確認している。
【０１２５】
次に、高いがんによる死亡の可能性に関連するＳＮＭの遺伝子検出の探索を、複数の汎がんデータセット（下記参照）を採用して、ヒトがんにおいて顕著に変異した１２７の遺伝子［２３］及びがんの体細胞突然変異のカタログ（ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）、ＣＯＳＭＩＣ（http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/census）に列挙された１７７の遺伝子を問い合わせて、実施した。全体として、４２の遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、悪性腫瘍の臨床サンプルにおいて体細胞非サイレント突然変異を獲得した。そして、これらの突然変異の存在は、不良な治療成績及びがんによる死亡の顕著に高い可能性に関連している（補足データセット３）。特に、がんによる死亡の表現型の突然変異のフィンガープリントを保持する、４２の遺伝子のうち３３の遺伝子（７８．６％）が、ＳＣＡＲ関連ゲノムネットワークのメンバーを構成する（補足表Ｓ１及び補足データセットＳ３）。
【０１２６】
高いがんによる死亡の可能性に関連するＳＮＭのシグネチャーの妥当性確認解析。ゲノムワイドな高スループット実験における体細胞非サイレント突然変異（ＳＮＭ）の検出は、重要な実験的且つ分析的課題を突きつける。ＳＮＭのコールは、同じＤＮＡサンプルの処理中でさえ、多数の要因の影響を受ける。ライブラリー調製及びシーケンシングプラットフォームなどの技術的要因に加えて、シーケンシングリード及びコーリングアルゴリズムのマッピング、参照ゲノムデータベースの選択、ゲノムアノテーション、及び標的選択領域などの、分析及び計算の方法論の差異は全て、ＳＮＭの同定に寄与する。最終的に、遺伝子及びサンプルのブラックリストなどのアドホックプレ／ポストデータ処理の差異は、交絡要因となる可能性がある。これらの潜在的な変動原因を説明するために、がん患者の生存率とＳＮＭコールとの間の関連の有意性を調べた。その際には、ＵＣＳＣ  Ｘｅｎａブラウザで利用可能な汎がんデータセットのために様々な異なる研究チームによって報告された体細胞非サイレント突然変異コールのデータベースを使用した。全体として、１，９３４から８，２７２までの腫瘍サンプルを含む１０の汎がんデータセットを、この分析において評価した（補足データセットＳ３）。ＳＮＭのがんによる死亡の表現型シグネチャーの１８の遺伝子全て（図５）を、少なくとも２つの汎がんデータセットにおいて統計的に有意な遺伝子としてスコア付けした（補足データセットＳ３）。１８のＳＮＭのシグネチャー遺伝子のうち１７（９４．４％）が、少なくとも３つのデータセットにおいて、統計的に有意な遺伝子として同定された。その中のＳＮＭの突然変異は、カプラン・マイヤー分析によって規定される高いがんによる死亡の可能性に関連していた（補足データセットＳ３）。同様に、４２の遺伝子のうち３９の遺伝子（９２．９％）におけるＳＮＭの検出は、少なくとも２つの汎がんデータセットにおいて、顕著に高いがんによる死亡の可能性に関連していた（補足データセットＳ３）。まとめると、これらの観察は、ここで同定された遺伝子が、決定的な突然変異標的部位特異的妥当性確認実験及びフォローアップ構造−機能及び機構的研究の正当性を証明するのに十分に頑強な、有望な候補遺伝マーカーを表していることを、主張しているようである。
【０１２７】
複数のタイプの悪性腫瘍を有すると診断された患者における悪性腫瘍の臨床的難治性の線形回帰分析は、がんによる死亡の可能性、がんタイプ、及び腫瘍におけるＳＮＭのがんによる死亡シグネチャーの存在の間の関連の、顕著な証拠を明らかにした（図５）。１つの分析において、２８のがんタイプのＴＣＧＡ汎がんコホートからのがん患者の生存データを利用して、各がんタイプについての死亡事象のパーセントを計算した。得られた値を、がん患者の対応する群におけるＳＮＭのがんによる死亡シグネチャーを有する患者のパーセントと整列させて、線形回帰分析に供した（図５Ｃ）。別の分析において、１９がんタイプについての米国における年齢調整されたがん発生率及び死亡率（１００，０００人あたり）を、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）米国がん統計（ＵＳＣＳ）報告から得た。各がんタイプについての推定死亡率は、対応する発生率の値及びＳＮＭのがんによる死亡シグネチャーを有する患者のパーセントの値を掛け合わせることによって計算した。推定死亡率の値を、対応するがんタイプについての実際の死亡率と整列させて、回帰分析に供した（図５Ｄ）。いずれの場合においても、ひときわ顕著な相関が観察された。これは、腫瘍におけるＳＮＭのシグネチャーの存在が、臨床的に致死的な疾患を発症する可能性が高いという分子シグナルを表し得るという仮説を、強く支持している。
【０１２８】
集合的に、本分析は、臨床腫瘍サンプルにおけるＳＣＡＲ関連ゲノムネットワークの規定された遺伝要素の活性化の分子的証拠が、悪性腫瘍の診断及び治療後の不良ながん患者の長期生存率によって規定される、臨床的に致死的ながんによる死亡の表現型の発現の高い可能性とリンクしているようであることを示す。不良ながん患者の生存率と、ＳＣＡＲ活性及びｈＥＳＣにおける幹性ネットワークの維持のマスター転写制御因子を構成する遺伝子、すなわちＫＬＦ４、ＬＢＰ９、ＰＯＵ５Ｆ１、及びＮＡＮＯＧ、のコピー数変化との間に観察された顕著な相関は、この仮説を強く支持する（補足図Ｓ４）。これらのデータは、がん細胞におけるＳＣＡＲ関連ゲノムネットワークの活性化が、選択的成長及び／又は生存上の利点を提供し、悪性進行中にポジティブセレクションの遺伝的シグナルを表し得ることを示唆している。
【０１２９】
この結論は、ＴＣＧＡ  ＰＡＮＣＡＮ１２コホートの臨床サンプルにおける、ＳＣＡＲ制御遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の分析によって、さらに支持される（図６）。カプラン・マイヤー生存曲線に関連する全ての利用可能なタンパク質発現データを、３８のＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９制御遺伝子について評価した。特に、２３のＳＣＡＲ制御遺伝子（６０．５％）のタンパク質発現レベルの変化が、がん患者の長期生存確率と顕著な関連を示した（補足データセット１）。これらの高度に顕著な関連の例を図６に示しており、これは、ＳＣＡＲ関連幹性ゲノムネットワークの機能的変化が、がん患者における臨床的に致死的な疾患進行において役割を果たす可能性がある、という仮説を確認するものである。
【０１３０】
本分析の結果に基づいて、ヒトがんの２９の異なるタイプを表す全てのＴＣＧＡコホートにわたる１２，０９３の臨床サンプルにおける、ＳＣＡＲのネットワークのＴＣＧＡにガイドされた調査が、体細胞非サイレント突然変異（ＳＮＭ）の存在、遺伝子レベルのコピー数変化、ＳＣＡＲ制御宿主遺伝子の転写物の及びタンパク質の発現によって規定される、臨床的に致死的な治療抵抗性疾患の汎がんゲノムシグネチャーを明らかにした、という結論に達した。この通信文で報告される遺伝子は、決定的な突然変異標的部位特異的妥当性確認実験及びフォローアップ構造−機能及び機構的研究の正当性を証明するのに十分に頑強な、臨床的に致死的な形のヒトがんの有望な候補遺伝マーカーを表す。
【０１３１】
複数の異なるＳＣＡＲの遺伝子座の規定された遺伝的シグネチャーのゲノムワイドなマッピングは、ヒト特異的キメラ転写物によってコードされる保存タンパク質ドメインの、ヒトゲノムにおける著しい拡大を明らかにした。
【０１３２】
ヒト特異的ＳＣＡＲ由来の宿主／ウイルスキメラ転写物によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列内の保存タンパク質ドメインの分析は、複数の異なるＳＣＡＲの遺伝子座が、保存タンパク質ドメインのコンビナトリアルパターンによって規定される異なるタンパク質コードシグネチャーを示すことを証明する（図２及び補足図Ｓ１）。個々のＳＣＡＲの配列の系統的ＢＬＡＳＴ分析は、ウイルス配列の突然変異が、機能性ウイルスタンパク質の完全なコード能力を低下させたこと、及びある特定の保存タンパク質ドメインの残存構造のみが保存された状態を維持することを証明する（図２及び補足図Ｓ１）。特に、ヒト特異的ＳＣＡＲ由来の宿主／ウイルスキメラ転写物によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列内で最も頻繁に表される保存タンパク質ドメインの１つは、ＧＶＱＷアミノ酸配列である（図２及び３）。ＧＶＱＷアミノ酸配列をコードする複数の異なるＳＣＡＲの遺伝子座のヌクレオチド配列が容易に区別可能であるため、複数の異なるＳＣＡＲ遺伝子座が蒔かれたヒトゲノム中のＧＶＱＷをコードする配列の数を特定することが可能であった。この分析が、ヒトゲノム全体にわたるＧＶＱＷドメインの拡散に対する、複数の異なるＳＣＡＲ遺伝子座の拡大の相対的影響の評価に有用であり得る、という仮説が立てられている。
【０１３３】
保存されたＧＶＱＷタンパク質ドメインをコードする複数の異なるＳＣＡＲの遺伝子座の特定の遺伝的シグネチャーのゲノムワイドなマッピングは、ヒトゲノム全体にわたり散乱した数千の遺伝子座特異的遺伝的フィンガープリントを同定した。これは、親のＳＣＡＲの配列と比較して、ギャップ又は挿入なしで１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列として規定された（図３）。注目すべきことに、この分析は、ヒトゲノム中のＧＶＱＷ保存タンパク質ドメイン配列をコードするＤＮＡ配列の大多数が、ChrY:278899 -284215及びchrX:278899 -284215上のＤＮＡ配列に由来するヒト特異的キメラ転写物に由来しているようであることを明らかにした（図３）。特定のＳＣＡＲ由来のヌクレオチド配列のこの拡大は、他の大型類人猿と比較したときの、ヒトプロテオーム内のＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインの著しい富化に寄与した可能性がある（図３）。
【０１３４】
さらなる分析は、ジンクフィンガータンパク質が、ＧＶＱＷドメインを保持するヒトゲノム中の最大のタンパク質ファミリーの１つを表すことを明らかにした。それ故に、ＧＶＱＷドメインを保持するジンクフィンガータンパク質の発現が、治療後に異なる長期生存率を有するがん患者の悪性腫瘍において変化しているかどうかを決定することが、関心の対象となった。注目すべきことに、この分析は、ＧＶＱＷドメインを保持するジンクフィンガータンパク質のｍＲＮＡ発現レベル及び遺伝子コピー数の変化が、著しく異なる処置成績のサブグループにがん患者を分離するようであることを証明する（補足図Ｓ２）。遺伝子発現及び遺伝子コピー数の変化の観察されたパターンは、前立腺、乳、結腸、直腸、及び膵臓がんを有すると診断された患者の間での、治療失敗及びがんによる死亡の高い可能性を有する個体の同定に有用であるようである（補足図Ｓ２）。ＧＶＱＷドメインの機能が何であるか、及びこのドメインの特定のタンパク質配列への挿入が、宿主タンパク質の構造−機能特性にどのようにして影響を及ぼすのかを、実験的に決定することが、関心の対象となるだろう。
【０１３５】
注目すべきことに、ＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインを有する２１の全てのジンクフィンガータンパク質及び３のＳＣＡＲネットワークジンクフィンガータンパク質遺伝子（ＺＮＦ４４３；ＺＮＦ５８７；ＺＮＦ８１４）の遺伝子レベルのコピー数変化は、ＴＣＧＡ汎がんコホートを含む１２，０９３の臨床サンプルの、予後不良及びカプラン・マイヤー生存率分析によって規定される高いがんによる死亡の可能性と、高度に顕著な関連を示す（図４）。これらのデータは、がん患者の臨床管理のための、及び治療失敗及び疾患進行のリスクが高い個体の同定のための、保存されたＧＶＱＷドメインを含むジンクフィンガータンパク質の潜在的な診断的及び予後的価値に関する結論を強化する。
【０１３６】
内在性ヒトＳＣＡＲによってコードされるヒト特異的制御配列の生成における、ＤＮＡ修復経路の推定上の役割。
【０１３７】
哺乳動物細胞は、損傷の近傍で利用可能な、ほぼ全てのＤＮＡ分子で、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）にパッチを当てることができる、高度に有効なＤＮＡ修復経路を効率的に利用するように進化してきた［２４、２５］。転位因子（ＴＥ）由来ＤＮＡ配列（ＤＮＡトランスポゾン並びにＬＴＲ及び非ＬＴＲ両方のレトロトランスポゾンを含む）の、ＤＮＡ損傷部位での挿入は、ＤＳＢを修復するために真核細胞によって利用されているようである［２６−３１］。ＴＥ由来ＤＮＡ捕捉の代替モデル、ＤＮＡ  ＤＳＢ修復部位でのエンドヌクレアーゼ非依存性Ｌ１挿入メカニズムが提案されている［２７、２８、３０］。この経路は、ＤＮＡ修復欠損げっ歯類細胞株において最初に観察された［２７］。後続の報告は、このメカニズムがヒトゲノムにおいても機能する可能性が高いことを示した［２８、３０−３２］。ＴＥ挿入の非古典的メカニズムが、Ａｌｕエレメント［３１］及びＨＥＲＶ−Ｋレトロウイルス［３２］によって媒介されるＤＳＢ修復に関連している可能性があることが示唆されている。ＳＣＡＲ活性が、ヒト細胞におけるＤＮＡ修復に寄与しているかどうかを特定することが、関心の対象となった。
【０１３８】
レトロトランスポゾンの様々なクラスについて観察される非古典的ＴＥ挿入メカニズムのコンセンサスシグネチャー特徴は、ＴＥ由来配列の挿入部位内での祖先ＤＮＡ配列の欠失である。ＴＥ媒介性ＤＳＢに関連するヒト特異的欠失はしばしば、祖先ＤＮＡ配列の数千の塩基対にまで拡張される［３１、３２］。ＳＣＡＲがＤＳＢ修復経路に寄与しているかどうかを特定するために、内在性ヒトＳＣＡＲによってコードされる候補ヒト特異的制御配列（ＨＳＲＳ）を同定し、制御ＤＮＡのヒト特異的獲得（挿入）及び喪失（欠失）の存在について分析した（表１、２）。予想通り、ヒト多能性幹細胞ＨＳＲＳにおいて転写活性のあるものの大多数（７５．０％−７９．５％）は、ヒト特異的挿入を含む（表２）。注目すべきことに、ヒトの２０１３年１２月のＵＣＳＣゲノムブラウザ（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）アセンブリ（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｃ．  ２０１３  （ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?db=hg38&position=chr1%3A90820922-90821071&hgsid=441235989_eelAivpkubSY2AxzLhSXKL5ut7TN）の２０の哺乳動物（１７の霊長類）のＬｉｆｔＯｖｅｒアルゴリズム及びＭｕｌｔｉｚアラインメントを使用するＤＮＡ配列保存分析は、ＳＣＡＲにコードされたＨＳＲＳの７４．４％−８８．６％が、チンパンジーゲノム及びボノボゲノムとの比較によって規定される祖先ＤＮＡ配列の欠失を含むことを明らかにした（表２）。特に、ＳＣＡＲにコードされたＨＳＲＳの４０．０％−５９．１％は、長さが１，０００ｂｐを超えるＤＮＡセグメントの大きい連続的ヒト特異的喪失を含む。最も極端な例のいくつかは、チンパンジーのゲノムと比較して２７，８４３ｂｐのヒト特異的欠失（ｈｇ３８座標：chr4:132,117,632-132,124,853）及びボノボのゲノムと比較して８１，１０８ｂｐのヒト特異的欠失（ｈｇ３８座標：chr4:3,927,445-3,933,080）を含む。同様に、７５，１７１ｂｐ（chr12:8,279,022-8,294,090）、３５，３２６ｂｐ（chr4:3,927,445-3,933,080）、及び７１，０３６ｂｐ（chr1:112,809,666-112,826,054）の大きいヒト特異的欠失が、それぞれゴリラゲノム、オランウータンゲノム及びテナガザルゲノムと比較して、ＳＣＡＲの挿入の異なる遺伝子座で検出された。
【０１３９】
本分析は、霊長類の進化の間に異なるヒト特異的ＤＮＡ喪失の複数の独立した事象を経験した、ヒト多能性幹細胞において転写活性のある、ＳＣＡＲにコードされたヒト特異的制御遺伝子座を１０１同定した（表２）。ヒト特異的欠失のカスケードパターンを示すこれらの１０１の遺伝子座のゲノム座標を、２０の哺乳動物（１７の霊長類）のＭｕｌｔｉｚアラインメントのＵＣＳＣゲノムブラウザトラックを使用して、ヒトＤＮＡ配列を、非ヒト霊長類のオルソロガスな配列と比較することによって同定した。この分析において、ヒトゲノム中の連続的ヒト特異的ＤＮＡ配列が、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザルから構成される群から選択される、非ヒト霊長類の少なくとも２つの異なる種のゲノムと比較して、ヒト特異的欠失の少なくとも２つの異なる事象を示す場合に、ＨＳＲＳを、ヒト特異的欠失のカスケードパターンを有するゲノム遺伝子座として規定した。それ故に、ヒト特異的欠失のカスケードパターンを示すゲノム遺伝子座は、霊長類の進化の間の長い期間にわたって、複数の異なる連続的ＤＮＡセグメントの反復喪失を経験するようであり、これは、これらのゲノム位置でのＳＣＡＲ配列の挿入によって媒介される、ＤＳＢの発生及びＤＮＡ分子の修復の反復サイクルのメカニズムと一致するだろう。
【０１４０】
ヒト特異的ＳＣＡＲの組込み部位のこれらの独特の構造的特徴は、ＳＣＡＲ関連ＤＳＢ修復の分子メカニズムが、代替非相同末端結合（Ａｌｔ  ＮＨＥＪ）として知られるバックアップＤＮＡ修復経路に類似している可能性があることを示唆している。なぜならば、Ａｌｔ  ＮＨＥＪ経路によって構築される修復接合部の顕著な特徴は、大きいＤＮＡ欠失、挿入、及びマイクロホモロジーのトラクトであるからである［３３、３４］。集合的に、これらのデータは、ＤＳＢ修復のＡｌｔ  ＮＨＥＪ経路が、特定のゲノム位置でのＳＣＡＲの挿入に寄与し、これがヒト多能性幹細胞において転写活性のあるＨＳＲＳの生成をもたらした可能性がある、という仮説を支持する（図７）。
【０１４１】
潜在的な、生物学的、病態生理学的、診断的、及び治療的意義の説明
【０１４２】
リキッドバイオプシー用途のための意義
【０１４３】
がん細胞のアポトーシス死及び／又は壊死の結果として、悪性腫瘍が、ＤＮＡの無細胞断片を血流中に放出するという観察は、がん細胞に由来する循環無細胞（ｃｆＤＮＡ）の分析に基づくリキッドバイオプシーの概念の、実験的及び臨床的がん研究への開示及び迅速な導入の道を開く。がん細胞に由来するｃｆＤＮＡの負荷は、腫瘍進行度分類及び予後と相関しているようである、という合意見解が出てきた［Diaz LA Jr, Bardelli A. Liquid Biopsies: Genotyping Circulating Tumor DNA. J Clin Oncol. 2014;32: 579-86; Haber, D. A. & Velculescu, V. E. Blood-Based Analyses of Cancer: Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Cancer Discov. 2014; 4: 650-661; Bettegowda, C. et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 2014; 6: 224ra24; Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW Jr, Alizadeh AA, Diehn M. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. Nat Med. 2014; 20: 548-54; Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, Biggs H, Rueda OM, Chin SF, Dunning MJ, Gale D, Forshew T, Mahler-Araujo B, Rajan S, Humphray S, Becq J, Halsall D, Wallis M, Bentley D, Caldas C, Rosenfeld N. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 2013; 368: 1199-209; Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, Ng C, Hrebien S, Cutts RJ, Cheang M, Osin P, Nerurkar A, Kozarewa I, Garrido JA, Dowsett M, Reis-Filho JS, Smith IE, Turner NC. Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in early breast cancer. Sci Transl Med. 2015;7: 302ra133］。次世代シーケンシング技術の最新の進歩は、腫瘍由来ＤＮＡの分析の感度、特異性、及び正確さを顕著に向上させた。原理的には、最先端の次世代シーケンシング技術の状態は、従来はがん細胞の直接分析によってのみ実証可能であった、体細胞ゲノム改変のための腫瘍由来ｃｆＤＮＡの遺伝子型判定を可能にしてきた。ｃｆＤＮＡベースのアッセイを使用して、個々の腫瘍における非常に不均一な一連の突然変異を容易に検出し確実に定量化する能力は、がん患者における個人に合わせた疾患管理の概念の臨床的実行を容易にする、様々な翻訳アプリケーションに使用することができる、腫瘍進化のダイナミクスのリアルタイムでの追跡において、非常に効率的であることが証明されている。
【０１４４】
複数の翻訳アプリケーションに大きな期待が持たれているが、現在の形のリキッドバイオプシー技術には、大きな制限がある。これらの制限は、初期段階の固形腫瘍の診断又はがんドライバー遺伝子の治療的に実施可能な突然変異の予測同定のための、リキッドバイオプシーの意図される使用が、注意深く検討されるときに、特に明らかである。その現在の形において、リキッドバイオプシーは主として、予め選択されたがんドライバー遺伝子のセットにおいて体細胞突然変異を確実に検出しようという主な意図で、血液サンプル（血漿又は血清）から抽出されたｃｆＤＮＡの徹底的高分解能シーケンシングに利用される。がん細胞由来ｃｆＤＮＡが血液中に出現するためには、腫瘍の血管新生が必要とされるだろうと予測することは、妥当だと思われる。しかしながら、がん患者における本質的に全ての固形腫瘍の発生の初期段階は、血管新生の必要がないことによって特徴付けられ、そして実際、長年にわたり、拡散によって十分な栄養物の供給を受ける、腫瘍発生及び進行の無血管段階を表すことは、十分に確立されている。この文脈において、血液中の腫瘍由来ｃｆＤＮＡの出現は、腫瘍の血管新生の証拠及び転移性疾患への悪性進行の高い可能性の分子シグナルとみなされるべきである。この論理の道筋と一致して、腫瘍由来ｃｆＤＮＡが、進行した固形腫瘍を有するがん患者の＞９０％の血液中に、確実に且つ再現性よく検出される一方で、初期段階のがんを有すると診断された患者の血液中での検出率は、約５０％（又はそれ以下）に低下する。重要なことに、次世代シーケンシング技術の分析性能のさらなる向上がこれらの現実を劇的には変えないだろうということは、ほぼ確実である。
【０１４５】
がん細胞由来ｃｆＤＮＡの主な起源が、アポトーシス死及び／又は壊死を受けている腫瘍細胞に由来するということが合意見解であるようである。血液サンプルから抽出された腫瘍由来ｃｆＤＮＡの起源が、生存可能で活発に分裂しているがん細胞又は腫瘍成長を維持するがん細胞の少数の亜集団、例えば元のがんの細胞、腫瘍開始細胞、又はがん幹細胞など、に由来することを一貫して証明する信頼できる証拠はない。それ故に、がん患者の血液から抽出された腫瘍由来ｃｆＤＮＡの突然変異シグネチャーが、腫瘍進化の過去の歴史を表しており、死んだがん細胞から抽出された遺伝情報に基づいて、リアルタイム突然変異状態を識別するための、又は腫瘍進化の将来を予測するための、信頼できる方法はない、と考えることは妥当である。
【０１４６】
単一核分解能での、腫瘍進化中のゲノムワイドな突然変異ダイナミクスの最新の分析は、体細胞点突然変異は、異数体とは対照的に、徐々に進化し広範なクローン多様性を生じたことを明らかにした［Wang Y, Waters J, Leung ML, Unruh A, Roh W, Shi X, Chen K, Scheet P, Vattathil S, Liang H, Multani A, Zhang H, Zhao R, Michor F, Meric-Bernstam F, Navin NE. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 2014; 512: 155-160］。標的化された単一分子シーケンシングは、決定的に、腫瘍において検出される多様な点突然変異の多くが、腫瘍細胞集団の＜１０％の頻度で起こることを証明した。それとはかなり対照的に、異数体再配列は、腫瘍進化の初期に現れ、クローン増殖中に非常に安定したままであった［Wang, Y., et al. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing. Nature. 2014; 512: 155-160］。この寄稿は、異数体の発生とＳＣＡＲネットワークの異常な活性とを結びつけ、活性化されたＳＣＡＲの経路の遺伝子発現シグネチャーを、がん前駆病変、限局性腫瘍、及び転移性がんの臨床サンプルにおいて検出することができることを証明する。集合的に、これらの観察は、ＳＣＡＲネットワークの活性化及び関連するゲノム異常ががん前駆細胞において起こりやすく、転移性疾患への腫瘍進化及び進行を通してずっと持続することを、強く主張する。それ故に、ここで同定されたＳＣＡＲ配列、ＳＣＡＲ／宿主遺伝子ハイブリッド配列、ＳＣＡＲ制御タンパク質コード遺伝子及び非コードＲＮＡ配列の検出は、リキッドバイオプシー技術を利用する、診断、予後、治療選択、及び疾患管理用途のための、目覚ましい機会を切り開くだろう。
【０１４７】
核酸及びタンパク質を含む無細胞巨大分子は、エキソソームと呼ばれるナノスケールサイズの粒子にしばしば存在する。エキソソーム中のＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子のパッケージングは、細胞外ヌクレアーゼによる分解からそれらを保護するようであり、ｍｉｃｒｏＲＮＡ及びｌｉｎｃＲＮＡなどの生物学的に活性な核酸分子は、安定した状態を維持するようである。それ故に、リキッドバイオプシー分析のためのサンプル調製プロトコルは、エキソソーム富化及び精製ステップを含むことにより恩恵を受ける可能性が高い。
【０１４８】
ＤＮＡ修復におけるＳＣＡＲの配列の推定上の役割及び転移性がん細胞の生存の増加
【０１４９】
本分析は、ＤＮＡ修復におけるＳＣＡＲの妥当な生物学的役割を示唆する。その役割とは、不死がん細胞にとって特に有益である、即座の生存及び適応の利点を宿主細胞に提供することによって、レトロトランスポゾン駆動突然変異の潜在的に有害な効果を無効にすることができる、というものである。ＤＮＡ修復経路の比較的高い活性にもかかわらず、ｈＥＳＣは、放射線誘導ＤＮＡ損傷及びアポトーシスに対する高い感受性を示す［３５、３６］。ｈＥＳＣのアポトーシスに対する高い感受性は、ＤＮＡ損傷に応える低いアポトーシス閾値に起因することが示唆されている［３６］。それとはかなり対照的に、治療抵抗性悪性腫瘍、高度に転移性のがん細胞、及び循環腫瘍細胞における幹性経路の活性化の既報の実験的及び臨床的証拠は、様々な生体関連微小環境の変化及び様々な異なる化学的摂動によって誘導されるアポトーシスに対する、著しく高い抵抗性の発現との、遺伝的及び表現型の関連を、一貫して証明した［３７−５１］。正常ヒト多能性幹細胞と、活性化された幹性遺伝子ネットワークを有する腫瘍細胞の高度に悪性の集団との間の、ゲノム構造の根本的な差異によって規定される、これらの重要な生物学的差異は、がん幹細胞の腫瘍開始能力、容赦ない成長、自己再生、及び生存に関与している可能性が高い。腫瘍細胞におけるＳＣＡＲの継続的な転写活性は、機能的ウイルスゲノムをコードすることが明らかに構造的にできないにもかかわらず、不変の潜在的に致命的な脅威である可能性がある。ヒトゲノムに組み込まれたＳＣＡＲの配列の何千もの変異体が存在する。これは、ＳＣＡＲの遺伝子の多くの突然変異が、ＳＣＡＲの配列の内在性コピーでの組換えによって修復できることを示唆している。この仮説と一致して、必須のウイルス遺伝子に致死的欠失を有する変異型レトロウイルスの導入は、内在性ＤＮＡ配列との相同組換えによって突然変異を修復した復帰変異ウイルスの拡散をもたらす可能性があることが証明されている［５２］。
【０１５０】
幹細胞関連レトロウイルスのゲノムネットワークは、臨床的に難治性の悪性腫瘍のシグネチャーを保持する
【０１５１】
ＳＣＡＲ及び関連する幹性ゲノムネットワークの本分析は、ヒト特異的制御ネットワーク及び経路の発生に寄与した可能性のあるヒト特異的挿入及び／又は欠失を保持する遺伝子座に焦点を当てた。この戦略の選択のための主な論理の道筋の１つは、広く実証されている、ヒトと非ヒト霊長類との間での、がん発生率の明らかな主要な差異に基づく。非ヒト霊長類において、前立腺がんは本質的に存在せず、肺がんは非常に稀である（５３−５８）。全体的に、乳がん、前立腺がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん、及び胃がんを含む、一般的ながんの発生率は、約２％〜４％の範囲にあると推定される（５３−５７）。幹性ゲノムネットワークの回路内で作動する、ヒト特異的制御遺伝子座及び経路のヒトに特有の表現型の効果は、がん発生率におけるこれらの劇的な種特異的差異に寄与している可能性がある。
【０１５２】
この考えに基づいて、最初の分析は、ヒト特異的ＳＣＡＲ挿入を保持する宿主／ウイルスキメラ転写物に焦点を当てた（表１−３；図１）。宿主／ウイルスキメラ転写物の構造的要素を含むヒト特異的レトロウイルス挿入を有するＳＣＡＲ標的化タンパク質コード遺伝子のｍＲＮＡ発現レベル及び遺伝子コピー数の観察された変化は、様々な異なるＳＣＡＲの活性化パターンが、著しく異なるがん患者の長期生存率に関連しているという仮説を支持する。
【０１５３】
次に、ヒト特異的ＳＣＡＲ由来の宿主／ウイルスキメラ転写物によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列内の保存タンパク質ドメインの分析を行った。この分析は、複数の異なるＳＣＡＲの遺伝子座が、保存タンパク質ドメインのコンビナトリアルパターンによって規定される異なるタンパク質コードシグネチャーを示すことを証明する（図２及び補足図Ｓ１）。ヒト特異的ＳＣＡＲ由来の宿主／ウイルスキメラ転写物によってコードされる翻訳されたアミノ酸配列内で最も頻繁に表される保存タンパク質ドメインの１つが、ＧＶＱＷアミノ酸配列であることが観察された（図２及び３）。ＧＶＱＷドメインをコードするヌクレオチド配列の規定されたＳＣＡＲ遺伝子座特異的シグネチャーを使用して、ヒトゲノム中のＧＶＱＷアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の大多数の起源が、ChrY:278899 -284215及びchrX:278899 -284215上のＤＮＡ配列によってコードされるヒト特異的キメラ転写物に由来することが、決定された（図３）。ＳＣＡＲ由来のヌクレオチド配列の拡散は、特定のＧＶＱＷをコードするＤＮＡ配列の著しい拡大、及び他の大型類人猿と比較したときの、ヒトプロテオーム内のＧＶＱＷ保存タンパク質ドメインの約１０倍の富化をもたらすようである（図３）。これらのデータは、継続的なＳＣＡＲ活性の生物学的に重要な結果の１つが、ヒトゲノム全体にわたり、特定の保存タンパク質ドメインをコードするヌクレオチド配列を蒔いたことであると、強く主張している。
【０１５４】
注目すべきことに、後続の分析は、ＧＶＱＷドメインを保持するジンクフィンガータンパク質のｍＲＮＡ発現レベル及び遺伝子コピー数の変化が、著しく異なる処置成績のサブグループにがん患者を分離することを証明する（図４及び補足図２）。遺伝子発現及びコピー数の変化の観察されたパターンは、前立腺、乳、結腸、直腸、及び膵臓がんを有すると診断された患者の間で、治療失敗及びがんによる死亡の高い可能性を有する個体を分離するようである（補足図２）。前立腺及び直腸がんを有すると診断された患者の間で、診断及び治療後１０年を超えて約１００％の生存確率を有する個体で構成される患者の予後良好のサブグループを同定することが可能であるように思われる（補足図２）。これは、個別化された、エビデンスベースの疾患管理意思決定プロセスにとって、非常に重要な臨床的意義を有する可能性がある。
【０１５５】
ＳＣＡＲ活性の遺伝的シグネチャーが、診断用途及び予後用途に潜在的に有用であるかどうかを決定するために、ＳＣＡＲのゲノムネットワークを、体細胞非サイレント突然変異を獲得した遺伝子（腫瘍サンプルにおけるその検出は、高いがんによる死亡の可能性に関連する）について系統的に探索した。全てのＴＣＧＡコホートにわたる臨床腫瘍サンプルにおける獲得された体細胞非サイレント突然変異及び悪性腫瘍におけるこれらの突然変異の存在が、顕著に高いがんによる死亡の可能性に関連しているようであるという、この寄稿において、合計４２のヒト遺伝子が同定された（図５；補足表Ｓ１；補足データセットＳ３）。がんによる死亡の表現型の突然変異のフィンガープリントを保持する遺伝子のかなりの大多数（４２のうち３３；７８．６％）が、ＳＣＡＲ関連ゲノムネットワークのメンバーを構成する（補足表Ｓ１及び補足データセットＳ３）。したがってこれは、臨床腫瘍サンプルにおけるＳＣＡＲ関連幹性ゲノムネットワークの規定される遺伝要素の活性化の分子的証拠が、カプラン・マイヤー生存率分析によって規定される臨床的に致死的ながんによる死亡の表現型の発現の高い可能性とリンクしているようである、ということを確認するものである。意義深いことに、全てのがん死亡事象の７０％超が、がんによる死亡のＳＮＭのシグネチャーによって規定される予後不良患者のサブグループにおいて起こったことが観察された（図５）。
【０１５６】
この寄稿において報告した重要な結論の１つは、臨床腫瘍サンプルにおけるＳＣＡＲ関連幹性ゲノムネットワークの規定される遺伝要素の活性変化の分子的証拠の検出が、悪性腫瘍の診断及び治療後の不良ながん患者の長期生存率によって規定される、疾患進行の臨床発現の高い可能性に関連しているようである、という観察に基づく。腫瘍におけるＳＣＡＲネットワーク内の特定の遺伝子の関与の観察は、体細胞非サイレント突然変異及び遺伝子コピー数の変化の検出に基づいており、これは、がん細胞におけるＳＣＡＲ関連ゲノムネットワークの活性変化が、選択的成長及び／又は生存上の利点を提供し、悪性進行中にポジティブセレクションの遺伝的シグナルを表し得ることを示唆している。意義深いことに、２８のがんタイプを有すると診断された患者の長期生存率に基づいて特定された、悪性疾患の臨床的難治性は、腫瘍に体細胞非サイレント突然変異のシグネチャーを保持するがん患者のパーセンテージと直接相関している。それ故に、ここで報告されたがんによる死亡の表現型の遺伝的相関は、難治性のヒト悪性腫瘍に対する新規の診断、予後、及び治療用途の開発にとって、非常に魅力的な標的を表す可能性がある。
【０１５７】
ＳＣＡＲのゲノムネットワークのヒト特異的構造−機能的特徴が、Ｈ．  ｓａｐｉｅｎｓの生理及び病理の両方において独特の役割を果たし得るという考えと一致して、ＨＥＲＶ−Ｈトランスクリプトームが、定方向選択の影響下でヒトにおいて最近進化してきたものであり、チンパンジーとヒトとの分離以来、宿主に対して検出可能な適応効果を発揮する可能性が高いことが報告されている（５９）。病理学的及び生理学的状態におけるＳＣＡＲの生物学的に重要な機能の調査は、感染性ウイルス粒子の検出及び単離に排他的に焦点を当てるべきではない。多くの他のＨＥＲＶファミリーと同様に、ＳＣＡＲの配列の大多数は、進化中に複数の突然変異及び欠失を蓄積した。そして、ＨＥＲＶ配列が自己複製性及び感染性であることは示されていない。
【０１５８】
ヒトゲノムにおいて、ＨＥＲＶ−Ｋファミリーは、レトロウイルスタンパク質の完全な又は部分的なコード能力を有する９１のプロウイルス及び９４４のソロＬＴＲを含む（６０）。集合的に、ＨＥＲＶ−Ｋプロウイルスは、感染力に必要な全てのレトロウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームを維持し、たった３つのＨＥＲＶ−Ｋプロウイルスの間での潜在的組換えは、感染性レトロウイルスの産生を容易にする可能性がある（６１）。しかしながら、ヒトにおけるがんの発生に対する、ＳＣＡＲ由来のレトロウイルス配列の重要な影響の新規の決定的な証拠は、感染性ウイルスの単離及びウイルス感染とがん発生との間の相関の確立を、必ずしも必要としない可能性がある。レトロウイルス配列の病理学的に重要な効果は、それらの生物学的活性の多くの異なるメカニズムに起因する可能性があり、以下の実験的証拠として証明することができる（６２）：
レトロウイルスの新規のがん特異的組込み部位の存在；
多くの異なる腫瘍における１個又は数個の宿主遺伝子の一貫した制御標的化；
レトロウイルス遺伝子（ｅｎｖ；ｒｅｃ；ｎｐ９）のタンパク質産物の発がん作用；
新規のスプライスドナー又はアクセプター部位、代替プロモーター、及び転写制御部位の寄与に起因する宿主遺伝子の発現に対する標的化された制御効果。
【０１５９】
加えて、同じ及び／又は異なる染色体上の複数のＳＣＡＲの配列の存在は、許容状態のクロマチンという文脈の中で、ゲノム遺伝子座間の組換え事象に起因する染色体再配列を容易にする可能性が高い。
【０１６０】
本分析は、分化細胞におけるサイレンシングされたＳＣＡＲの遺伝子座のエピジェネティックな活性化が、幹性制御ネットワークに関与することによって、細胞においてがん感受性状態を確立し得ることを示唆している。後続の突然変異誘発及びがんドライバー遺伝子の選択が、ＳＣＡＲ活性化幹性ネットワークを有する細胞において起こると主張することは妥当だと思われ、このことは、なぜ、高信頼性がんドライバー及びＣＯＳＭＩＣ遺伝子のほぼ３分の２が、ｈＥＳＣにおいてＳＣＡＲによって制御されるようであるのかを説明するだろう（上記参照）。この仮説の中心的な仮定は、がん幹細胞の前駆体としての機能を果たし得る、ＳＣＡＲ活性化幹性ネットワークを有する前がん状態の分化細胞の存在を予測し、その出現は、臨床的に難治性の悪性腫瘍の発生、腫瘍成長、がん進行、及び転移を、続いて促進するだろう。
【０１６１】
材料及び方法
【０１６２】
データソース及び分析プロトコル
【０１６３】
この分析のために、もっぱら公的に利用可能なデータセット及びリソースを使用した。また、方法論的アプローチ及び計算パイプラインが、霊長類特異的遺伝子及びヒト特異的制御遺伝子座の発見について妥当性確認された［３；６３−６８］。ｓｈＲＮＡ実験を使用してｈＥＳＣにおいて同定されたＨＥＲＶＨ／ＬＢＰ９制御遺伝子［１９］を含む、ＳＣＡＲ関連幹性ゲノムネットワークを含む個々の遺伝要素を、転写活性のあるＳＣＡＲ遺伝子座［１２；１６−２０］、宿主／ウイルスキメラ転写物［１８−２０］、及びＳＣＡＲがｈＥＳＣゲノムに蒔かれたヒト特異的転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）［３］を報告している、最近公表された寄稿から得た。
【０１６４】
がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）プロジェクトのウェブベースツールの最新のベータ版、ＵＣＳＣ  Ｘｅｎａ（http://xena.ucsc.edu/）、関連する臨床データ、及び数千の腫瘍サンプルにおいて同定された複数の機能的がんゲノミクスのエンドポイントを利用して、ＳＣＡＲ関連幹性ゲノムネットワークの個々の遺伝要素の遺伝子発現、体細胞非サイレント突然変異、及び遺伝子コピー数の臨床的に関連するパターンを、調査、分析、及び可視化した。これは、１万２千を超える注釈付きの臨床腫瘍サンプルの包括的な機能的がんゲノミクスデータセット（https://genomecancer.soe.ucsc.edu/proj/site/xena/datapages/）を問い合わせることによって行った。１２のＴＣＧＡコホート（１２の異なるがんタイプのＰＡＮＣＡＮ１２研究）にわたる５，１５８の臨床サンプル及び全てのＴＣＧＡコホートにわたる１２，０８８臨床サンプルを含む、２つのＴＣＧＡ汎がんデータベース（https://genomecancer.soe.ucsc.edu/proj/site/xena/datapages/）を問い合わせることによって、高いがんによる死亡の可能性に関連する遺伝子発現、体細胞非サイレント突然変異、及びコピー数変化の汎がんシグネチャーを同定した。
【０１６５】
配列保存分析は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）のＬｉｆｔＯｖｅｒアルゴリズムに基づいている。このＬｉｆｔＯｖｅｒアルゴリズムは、０．９５のＭｉｎＭａｔｃｈ及びデフォルト設定の他の検索パラメーターで予め計算された全ゲノムＢＬＡＳＴＺアラインメントの連鎖ファイルを使用して、ヒトブロックの座標を対応する非ヒトゲノムに変換するためのものである（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver）。ヒトクエリーについての、ＬｉｆｔＯｖｅｒアルゴリズムによるＢＬＡＳＴＺアラインメントの抽出は、ＬｉｆｔＯｖｅｒアウトプット「新たに欠失した（Ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ｎｅｗ）」を生成する。このアウトプットは、ヒト配列が、所与の非ヒトゲノム中のいずれの鎖とも交差しないことを示す。これは、対象ゲノム中にクエリー配列が存在しないことを示し、非ヒト参照ゲノム中のヒト配列の存在又は非存在を推測するために使用された。ＢＬＡＳＴアルゴリズム及び対応する参照ゲノムデータベースの最新のリリースを使用して、２０１３年４月から２０１５年１０月までの期間、ヒト特異的制御配列を、それらの同一性及びゲノム特徴の妥当性確認をするために、手動でキュレートした。
【０１６６】
宿主遺伝子に対するＳＣＡＲの推定上の機能的に重要な制御効果の考察は、部分的に、対応する候補調節エレメント及び標的遺伝子のゲノムワイドな近接配置分析の結果に基づいた。近接配置分析中の近接の定量限界は、いくつかの測定基準に基づいて規定された。測定基準の１つは、ｈＥＳＣにおいて分析された調節タンパク質の５０％の最も近い標的に対して実験的に規定された距離よりも、推定上の標的タンパク質コード遺伝子又はｌｎｃＲＮＡ遺伝子に近く、ヒト特異的制御配列を配置するゲノム座標を使用して規定された［６９］。関心の対象となる各遺伝子について、ｈＥＳＣにおいてタンパク質コードＴＦによって制御される最も近い標的遺伝子までの距離の平均値より小さい、ＨＳＧＲＬと推定上の標的遺伝子との間のゲノム距離で、特定のＨＳＧＲＬを同定し表にした。Ｇｕｔｔｍａｎらによって報告された［６９］ｈＥＳＣにおけるＴＦの最も近い標的遺伝子までの距離に基づいて、タンパク質コード標的遺伝子及びｌｎｃＲＮＡ標的遺伝子についての対応する平均値を計算した。加えて、同じトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）の境界内での共局在及び２５１の新皮質／前頭前皮質関連遺伝子の近くに位置するヒト特異的ＮＡＮＯＧ結合部位（ＨＳＮＢＳ）の配置富化パターンに基づいて、近接配置測定基準を規定した［７０］。ＨＳＮＢＳの配置富化分析は、１．５Ｍｂ未満のゲノム距離で最も顕著な富化を同定し、１．５Ｍｂのゲノム距離で富化ｐ値の鋭いピークを示した［７０］。
【０１６７】
この研究では、ｈＥＳＣゲノムにおいて同定された個々の調節エレメント及びクロマチン制御ドメインの包括的なデータベースを検討した。ｈＥＳＣ中の３，１２７のトポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）；６，８２３のｈＥＳＣ富化エンハンサー；ｈＥＳＣ中の６，３２２の従来のエンハンサー及び６８４のスーパーエンハンサー（ＳＥ）；ｍＥＳＣ中の２３１のＳＥ及び１９７のスーパーエンハンサードメイン（ＳＥＤ）のゲノム座標が、既に公表されている寄稿において報告された［２；７１−７４］。ｈＥＳＣ中のＮＡＮＯＧ−、ＰＯＵ５Ｆ１−、及びＣＴＣＦ−結合部位及びヒト特異的ＴＦＢＳの種特異的データセットが既に報告されており［３；４］、公的に利用可能である。規定されるゲノム領域の細胞タイプ特異的転写活性の可視化及び分析のために、ＲＮＡ−ＳｅｑデータセットをＵＣＳＣデータリポジトリサイトから取り出した（http://genome.ucsc.edu/；［７５］）。単一塩基分解能でのヒトメチロームのゲノムワイドなマップが既に報告されており［７６；７７］、公的に利用可能である（http://neomorph.salk.edu/human_methylome）。可視化及び分析のためのヒストン修飾及び転写因子クロマチン免疫沈降シーケンス（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）データセットを、ＵＣＳＣデータリポジトリサイト（http://genome.ucsc.edu/；［７８］）から得た。ペアエンドタグシーケンシングによるクロマチン組込み解析（ＣｈＩＡ−ＰＥＴ）法によって決定された、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰＩＩ）結合部位のゲノム座標を、ＭＣＦ７及びＫ５６２ヒト細胞株について構築した飽和ライブラリーから得た［７９］。選択されたヒト染色体の１−Ｍｂ及び１−ｋｂの連続するセグメントあたりのタンパク質特異的結合事象の数を定量化し、得られた結合部位密度分布を可視化のためにプロットすることによって、染色体の所与のセグメントに対するＴＦ結合の密度を推定した。ＷｅｂＬｏｇｏアルゴリズム（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）を使用して、複数の配列アラインメントの可視化を実施した。コンセンサスＴＦ結合部位モチーフロゴは既報である［４；８０；８１］。
【０１６８】
３人のネアンデルタール人、１２人の新人、及び４１，０００年前のデニソワ人ゲノムの個々のゲノムにおけるＨＳＧＲＬの保存の評価［８２；８３］を、個々のゲノム及びヒトゲノム参照データベース（http://genome.ucsc.edu/Neandertal/）から取り出した対応する配列の直接比較によって実施した。
【０１６９】
タンパク質ＢＬＡＳＴアルゴリズム（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome）及び保存タンパク質ドメインの同定及び可視化のための関連のウェブベースツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=3HZ5BMES01R&mode=all）（これらは、他の場所で詳細に説明された［８４、８５］）を使用して、ヒト特異的キメラ転写物のヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳し、タンパク質アラインメント分析に供した。
【０１７０】
米国における年齢調整されたがん発生率及び死亡率を、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）米国がん統計（ＵＳＣＳ）報告から得た：
【０１７１】
米国がん統計ワーキンググループ。米国がん統計：１９９９−２０１２年の発生率及び死亡率のウェブベースの報告。アトランタ：米国保健福祉省、疾患管理予防センター及び国立がん研究所；２０１５年。www.cdc.gov/uscsで利用可能。
【０１７２】
公的に利用可能なデータセットの統計的分析
【０１７３】
エラー率推定、バックグラウンド及び技術的ノイズの測定及びフィルタリング、特徴ピークコール、特徴選択、参照ヒトゲノムの対応する構築物へのゲノム座標の割り当て、及びデータ可視化を含む、公的に利用可能なゲノムデータセットの全ての統計的分析は、対応するデータ可視化トラック（http://genome.ucsc.edu/及びhttp://xena.ucsc.edu/）にリンクされている元の刊行物及び関連する参考文献において報告されているとおりに正確に実施した。統計的分析の任意の変更又は新規の要素は、結果の対応するセクションにおいて説明している。ピアソン相関係数の統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．００ソフトウェアを使用して決定した。群間の事象の数の差異の有意性は、両側のフィッシャー直接検定及びカイ二乗検定を使用して計算し、事象間の重複の有意性は、超幾何分布検定を使用して決定した［８６］。
【０１７４】
参考文献
1. Santoni, F.A., Guerra, J., and Luban, J. HERV-H RNA is abundant in human embryonic stem cells and a precise marker for pluripotency. Retrovirology 2012; 9: 111.
2. Xie W, Schultz MD, Lister R, Hou Z, Rajagopal N, Ray P, Whitaker JW, Tian S, Hawkins RD, Leung D, Yang H, Wang T, Lee AY, Swanson SA, Zhang J, Zhu Y, Kim A, Nery JR, Urich MA, Kuan S, Yen CA, Klugman S, Yu P, Suknuntha K, Propson NE, Chen H, Edsall LE, Wagner U, Li Y, Ye Z, Kulkarni A, Xuan Z, Chung WY, Chi NC, Antosiewicz-Bourget JE, Slukvin I, Stewart R, Zhang MQ, Wang W, Thomson JA, Ecker JR, Ren B. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell 2013. 153: 1134-1148.
3. Glinsky, GV. Transposable Elements and DNA Methylation Create in Embryonic Stem Cells Human-Specific Regulatory Sequences Associated with Distal Enhancers and Noncoding RNAs. Genome Biol Evol. 2015; 7: 1432-54.
4. Kunarso, G, Chia, NY, Jeyakani, J, Hwang, C, Lu, ., Chan, YS, Ng, HH, and Bourque, G. Transposable elements have rewired the core regulatory network of human embryonic stem cells. Nat Genet. 2010; 42: 631-634.
5. Kelley, D, and Rinn, J. Transposable elements reveal a stem cell-specific class of long noncoding RNAs. Genome Biol. 2012; 13: R107.
6. Glinsky GV. Endogenous human stem cell-associated retroviruses. BioRxiv 2015; doi: http://dx.doi.org/10.1101/024273  
7. Glinsky GV. SCARs: endogenous human stem cell-associated retroviruses and therapy-resistant malignant tumors. arXiv preprint 2015; arXiv:1508.02022 http://arxiv.org/abs/1508.02022  
8. Glinsky GV. Viruses, stemness, embryogenesis, and cancer: a miracle leap toward molecular definition of novel oncotargets for therapy-resistant malignant tumors?  Oncoscience 2015; 2: 751-754.
9. Glinsky GV. Activation of endogenous human Stem Cell-Associated Retroviruses and therapy-resistant phenotypes of malignant tumors. 2016. In revision. 
10. Smith ZD, Chan MM, Humm KC, Karnik R, Mekhoubad S, Regev A, Eggan K, Meissner A. DNA methylation dynamics of the human preimplantation embryo. Nature 2014; 511: 611-615.
11. Fort A, Hashimoto K, Yamada D, Salimullah M, Keya CA, Saxena A, Bonetti A, Voineagu I, Bertin N, Kratz A, Noro Y, Wong CH, de Hoon M, Andersson R, Sandelin A, Suzuki H, Wei CL, Koseki H; FANTOM Consortium, Hasegawa Y, Forrest AR, Carninci P. Deep transcriptome profiling of mammalian stem cells supports a regulatory role for retrotransposons in pluripotency maintenance. Nature Genet. 2-14; 46: 558-566.
12. Lu X, Sachs F, Ramsay L, Jacques PE, Goke J, Bourque G, Ng HH. The retrovirus HERVH is a long noncoding RNA required for human embryonic stem cell identity. Nat Struct Mol Biol. 2014; 21:423-425. 
13. Ohnuki M, Tanabe K1, Sutou K, Teramoto I, Sawamura Y, Narita M, Nakamura M, Tokunaga Y, Nakamura M, Watanabe A, Yamanaka S, Takahashi K. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proc Natl Acad Sci USA. 2014. 111:12426-31.
14. Koyanagi-Aoi M, Ohnuki M, Takahashi K, Okita K, Noma H, Sawamura Y, Teramoto I, Narita M, Sato Y, Ichisaka T, Amano N, Watanabe A, Morizane A, Yamada Y, Sato T, Takahashi J, Yamanaka S. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110: 20569-74.
15. Marchetto MC, Narvaiza I, Denli AM, Benner C, Lazzarini TA, Nathanson JL, Paquola AC, Desai KN, Herai RH, Weitzman MD, Yeo GW, Muotri AR, Gage FH. (2013). Differential LINE-1 regulation in pluripotent stem cells of humans and other great apes. Nature 503: 525-529.
16. Xue Z, Huang K, Cai C, Cai L, Jiang CY, Feng Y, Liu Z, Zeng Q, Cheng L, Sun YE, Liu JY, Horvath S, Fan G. Genetic programs in human and mouse early embryos revealed by single-cell RNA sequencing. Nature 2013; 500: 593-597. 
17. Yan L, Yang M, Guo H, Yang L, Wu J, Li R, Liu P, Lian Y, Zheng X, Yan J, Huang J, Li M, Wu X, Wen L, Lao K, Li R, Qiao J, Tang F. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 2013; 20: 1131-1139.
18. Goke J, Lu X, Chan YS, Ng HH, Ly LH, Sachs F, Szczerbinska I. Dynamic transcription of distinct classes of endogenous retroviral elements marks specific populations of early human embryonic cells. Cell Stem Cell 2015; 16: 135-141.
19. Wang J, Xie G, Singh M, Ghanbarian AT, Rasko T, Szvetnik A, Cai H, Besser D, Prigione A, Fuchs NV, Schumann GG, Chen W, Lorincz MC, Ivics Z, Hurst LD, Izsvak Z.  Primate-specific endogenous retrovirus-driven transcription defines naive-like stem cells. Nature 2014; 516: 405-9.
20. Grow EJ, Flynn RA, Chavez SL, Bayless NL, Wossidlo M, Wesche DJ, Martin L, Ware CB, Blish CA, Chang HY, Pera RA, Wysocka J. Intrinsic retroviral reactivation in human preimplantation embryos and pluripotent cells. Nature 2015; 522: 221-5.
21. Robbez-Masson L, Rowe HM. Retrotransposons shape species-specific embryonic stem cell gene expression. Retrovirology 2015; 12: 45. 
22. Tamborero D1, Gonzalez-Perez A, Perez-Llamas C, Deu-Pons J, Kandoth C, Reimand J, Lawrence MS, Getz G, Bader GD, Ding L, Lopez-Bigas N. Comprehensive identification of mutational cancer driver genes across 12 tumor types. Sci Rep. 2013; 3: 2650. 
23. Hoadley KA, Yau C, Wolf DM, Cherniack AD, Tamborero D, Ng S, Leiserson MD, Niu B, McLellan MD, Uzunangelov V, Zhang J, Kandoth C, Akbani R, Shen H, Omberg L, Chu A, Margolin AA, Van't Veer LJ, Lopez-Bigas N, Laird PW, Raphael BJ, Ding L, Robertson AG, Byers LA, Mills GB, Weinstein JN, Van Waes C, Chen Z, Collisson EA; Cancer Genome Atlas Research Network, Benz CC, Perou CM, Stuart JM. Multiplatform analysis of 12 cancer types reveals molecular classification within and across tissues of origin. Cell 2014; 158: 929-44.
24. Yu, X. and Gabriel, A. Patching broken chromosomes with extranuclear cellular DNA. Mol. Cell 1999; 4: 873-881. 
25. Lin, Y. and Waldman, A.S. Promiscuous patching of broken chromosomes in mammalian cells with extrachromosomal DNA. Nucleic Acids Res. 2001; 29: 3975-3981.
26. Teng, S.C., Kim, B. and Gabriel, A. Retrotransposon reverse transcriptase-mediated repair of chromosomal breaks. Nature 1996; 383: 641-644.
27. Morrish, T.A., Gilbert, N., Myers, J.S., Vincent, B.J., Stamato, T.D., Taccioli, G.E., Batzer, M.A. and Moran, J.V. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition. Nat. Genet. 2002; 31: 159-165.
28. Morrish TA, Garcia-Perez JL, Stamato TD, Taccioli GE, Sekiguchi J, Moran JV. Endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition at mammalian telomeres. Nature. 2007; 446: 208-12.
29. Ichiyanagi, K., Nakajima, R., Kajikawa, M. and Okada, N. (2007) Novel retrotransposon analysis reveals multiple mobility pathways dictated by hosts. Genome Res. 2007; 17: 33-41.
30. Sen, S.K., Huang, C.T., Han, K., Batzer, M.A. Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome. Nucleic Acids Res. 2007; 35: 3741-3751.
31. Srikanta D, Sen SK, Huang CT, Conlin EM, Rhodes RM, et al. An alternative pathway for Alu  63 retrotransposition suggests a role in DNA double strand break repair. Genomics 2009; 93: 205-212.
32. Shin W, Lee J, Son S-Y, Ahn K, Kim H-S, Han, K. Human-specific HERVK insertion causes genomic variations in the human genome. PLoS ONE 2013; 8: e60605. 
33. Nussenzweig A, Nussenzweig MC. A backup DNA repair pathway moves to the forefront. Cell. 2007; 131: 223-225. 
34. Iliakis G. Backup pathways of NHEJ in cells of higher eukaryotes: cell cycle dependence. Radiother Oncol. 2009; 92: 310-315.
35. Bogomazova AN, Lagarkova MA, Tskhovrebova LV, Shutova MV, Kiselev SL. Error-prone nonhomologous end joining repair operates in human pluripotent stem cells during late G2. Aging (Albany NY). 2011; 3: 584-96. 
36. Fan J, Robert C, Jang YY, Liu H, Sharkis S, Baylin SB, Rassool FV. Human induced pluripotent cells resemble embryonic stem cells demonstrating enhanced levels of DNA repair and efficacy of nonhomologous end-joining. Mutat Res. 2011; 713: 8-17. 
37. Glinsky GV, Glinskii AB, Berezovskaya O. Microarray analysis identifies a death-from-cancer signature predicting therapy failure in patients with multiple types of cancer. Journal of Clinical Investigation 2005; 115: 1503 - 21.
38.  Glinsky GV. Death-from-cancer signatures and stem cell contribution to metastatic cancer. Cell Cycle 2005; 4: 1171 - 5.
39. Glinsky, GV. Genomic models of metastatic cancer: Functional analysis of death-from-cancer signature genes reveals aneuploid, anoikis-resistant, metastasis-enabling phenotype with altered cell cycle control and activated Polycomb Group (PcG) protein chromatin silencing pathway. Cell Cycle, 2006; 5: 1208-1216.
40. Berezovska, OP, Glinskii, AB, Yang, Z, Li, X-M, Hoffman, RM, Glinsky, GV. Essential role of the Polycomb Group (PcG) protein chromatin silencing pathway in metastatic prostate cancer. Cell Cycle, 2006; 5: 1886-1901.
41. Glinskii AB, Smith BA, Jiang P, Li XM, Yang M, Hoffman RM, Glinsky GV. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 2003; 63: 4239-43. 
42. Berezovskaya O, Schimmer AD, Glinskii AB, Pinilla C, Hoffman RM, Reed JC, Glinsky GV. Increased expression of apoptosis inhibitor protein XIAP contributes to anoikis resistance of circulating human prostate cancer metastasis precursor cells. Cancer Res. 2005; 65: 2378-86.
43. Glinsky GV, Glinskii AB, Berezovskaya O, Smith BA, Jiang P, Li XM, Yang M, Hoffman RM. Dual-color-coded imaging of viable circulating prostate carcinoma cells reveals genetic exchange between tumor cells in vivo, contributing to highly metastatic phenotypes. Cell Cycle. 2006; 5: 191-7.
44. Holt, S., Glinsky, V.V., Ivanova, A.B., Glinsky, G.V.  Resistance to apoptosis in human cells conferred by telomerase function and telomere stability.  Molecular Carcinogenesis 1999; 25: 241-248.
45. Glinsky, G.V., Glinsky, V.V., Ivanova, A.B., Hueser, C.N. Apoptosis and metastasis: Increased apoptosis resistance of metastatic cancer cells is associated with the profound deficiency of apoptosis execution mechanisms.  Cancer Letters 1997; 115: 185-193. 
46. Glinsky, G.V.  Apoptosis in metastatic cancer cells.  Crit. Rev. Oncol/Hemat. 1997; 25: 175-186.
47. Glinsky, GV, Glinsky, VV.  Apoptosis and metastasis: A superior resistance of metastatic cancer cells to programmed cell death.  Cancer Letters 1996; 101: 43-51. 
48. Glinsky GV. Stem cell origin of death-from-cancer phenotypes of human prostate and breast cancers. Stem Cells Reviews 2007; 3: 79-93.
49. Glinsky GV. "Stemness" genomics law governs clinical behavior of human cancer: Implications for decision making in disease management. Journal of Clinical Oncology 2008; 26:2 846-53.
50. Glinsky GV, Berezovska O, Glinskii A. Genetic signatures of regulatory circuitry of embryonic stem cells (ESC) identify therapy-resistant phenotypes in cancer patients diagnosed with multiple types of epithelial malignancies. Cancer Research 2007; 67 (9 Supplement):1272. 
51. Glinskii A, Berezovskaya O, Sidorenko A, Glinsky G. Stemness pathways define therapy-resistant phenotypes of human cancers. Clinical Cancer Research 2008; 14 (15 Supplement):B38.
52. Schwartzberg P, Colicelli J, Goff SP. Recombination between a defective retrovirus and homologous sequences in host DNA: reversion by patch repair. J Virol. 1985; 53: 719-26.    
53. McClure HM. Tumors in nonhuman primates: observations during a six-year period in the Yerkes primate center colony. Am J Phys Anthropol. 1973; 38:425-429. 
54. Seibold HR, Wolf RH. Neoplasms and proliferative lesions in 1065 nonhuman primate necropsies. Lab Anim Sci. 1973; 23:533-539. 
55. Beniashvili DS. An overview of the world literature on spontaneous tumors in nonhuman primates. J Med Primatol. 1989; 18:423-437. 
56. Scott, G.B.D. 1992. Comparative primate pathology. Oxford University Press, New York, NY.
57. Waters DJ, Sakr WA, Hayden DW, Lang CM, McKinney L, Murphy GP, Radinsky R, Ramoner R, Richardson RC, Tindall DJ. Workgroup 4: spontaneous prostate carcinoma in dogs and nonhuman primates. Prostate. 1998; 36: 64-67. 
58. Simmons HA, Mattison JA. The incidence of spontaneous neoplasia in two populations of captive rhesus macaques (Macaca mulatta). Antioxid Redox Signal. 2011; 14: 221-7. 
59. Gemmell, P., Hein, J., Katzourakis, A. Orthologous endogenous retroviruses exhibit directional selection since the chimp-human split. Retrovirology 2015; 12: 52. 
60. Subramanian, R.P., Wildschutte, J.H., Russo, C., Coffin, J.M. Identification, characterization, and comparative genomic distribution of the HERV-K (HML-2) group of human endogenous retroviruses. Retrovirology 2011; 8: 90.
61.  Hohn, O., Hanke, K., Bannert, N. HERV-K(HML-2), the best preserved family of HERVs: Endogenization, expression, and implications in health and disease. Front Oncol 2013; 3: 246.
62. Bhardwaj, N., Coffin, J.M. Endogenous Retroviruses and Human Cancer: Is There Anything to the Rumors? Cell Host & Microbes 2014; 15: 255-250.
63. Kent, WJ. BLAT - the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 2002; 12: 656-664. 
64. Schwartz, S., Kent, W.J., Smit, A., Zhang, Z., Baertsch, R., Hardison, R.C., Haussler, D., and Miller, W. Human-mouse alignments with BLASTZ. Genome Res. 2003; 13: 103-107. 
65. Tay, S.K., Blythe, J., and Lipovich, L. Global discovery of primate-specific genes in the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106: 12019-12024.
66. Capra, J.A., Erwin, G.D., McKinsey, G., Rubenstein, J.L., Pollard, K.S. Many human accelerated regions are developmental enhancers. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368 (1632): 20130025. 
67. Marnetto D, Molineris I, Grassi E, Provero P. Genome-wide identification and characterization of fixed human-specific regulatory regions. Am J Hum Genet 2014; 95: 39-48.  
68. Gittelman RM, Hun E, Ay F, Madeoy J, Pennacchio L, Noble WS, Hawkins RD, Akey JM. 2015. Comprehensive identification and analysis of human accelerated regulatory DNA. Genome Res 2015; 25: 1245-55. 
69. Guttman, M., Donaghey, J., Carey, B.W., Garber, M., Grenier, J.K., Munson, G., Young, G., Lucas, A.B., Ach, R., Bruhn, L., Yang, X., Amit, I., Meissner, A., Regev, A., Rinn, J.L., Root, D.E., and Lander, E.S. lincRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation. Nature 2011; 477: 295-300. 
70. Glinsky, GV. Rapidly evolving in humans topologically associating domains. 2015. arXiv:1507.05368 .
71. Dixon, J.R., Selvaraj, S., Yue, F., Kim, A., Li, Y., Shen, Y., Hu, M., Liu, J.S., and Ren, B. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 2012; 485: 376-380. 
72. Dowen J.M., Fan Z.P., Hnisz D., Ren G., Abraham B.J., Zhang L.N., Weintraub A.S., Schuijers J., Lee T.I., Zhao K., Young RA. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell 2014; 159: 374-387. 
73. Hnisz, D., Abraham, B.J., Lee, T.I., Lau, A., Saint-Andre´, V., Sigova, A.A., Hoke, H.A., and Young, RA. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell 2013; 155: 934-947.
74. Whyte, W.A., Orlando, D.A., Hnisz, D., Abraham, B.J., Lin, C.Y., Kagey, M.H., Rahl, P.B., Lee, T.I., and Young, RA. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell 2013; 153: 307-319.
75. Meyer, L.R., Zweig, A.S., Hinrichs, A.S., Karolchik, D., Kuhn, R.M., Wong, M., Sloan, C.A., Rosenbloom, K.R., Roe, G., Rhead, B., Raney, B.J., Pohl, A., Malladi, V.S., Li, C.H., Lee, B.T., Learned, K., Kirkup, V., Hsu, F., Heitner, S., Harte, R.A., Haeussler, M., Guruvadoo, L., Goldman, M., Giardine, B.M., Fujita, P.A., Dreszer, T.R., Diekhans, M., Cline, M.S., Clawson, H., Barber, G.P., Haussler, D., and Kent, W.J. The UCSC Genome Browser database: extensions and updates 2013. Nucleic Acids Res. 2013; 41: D64-69.
76. Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R.H., Hawkins, R.D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J.R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q.M., Edsall, L., Antosiewicz-Bourget, J., Stewart, R., Ruotti, V., Millar, A.H., Thomson, J.A., Ren, B., and Ecker, JR. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature 2009; 462: 315-322.
77. Lister R, Mukamel EA, Nery JR, Urich M, Puddifoot CA, Johnson ND, Lucero J, Huang Y, Dwork AJ, Schultz MD, Yu M, Tonti-Filippini J, Heyn H, Hu S, Wu JC, Rao A, Esteller M, He C, Haghighi FG, Sejnowski TJ, Behrens MM, Ecker JR. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science 2013; 341: 1237905.
78. Rosenbloom, K.R., Sloan, C.A., Malladi, V.S., Dreszer, T.R., Learned, K., Kirkup, V.M., Wong, M.C., Maddren, M., Fang, R., Heitner, S.G., Lee, B.T., Barber, G.P., Harte, R.A., Diekhans, M., Long, J.C., Wilder, S.P., Zweig, A.S., Karolchik, D., Kuhn, R.M., Haussler, D., and Kent, WJ. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Res 2013; 41: D56-63.
79. Li, G., Ruan, X., Auerbach, R.K., Sandhu, K.S., Zheng, M., Wang, P., Poh, H.M., Goh, Y., Lim, J., Zhang, J., Sim, H.S., Peh, S.Q., Mulawadi, F.H., Ong, C.T., Orlov, Y.L., Hong, S., Zhang, Z., Landt, S., Raha, D., Euskirchen, G., Wei, C.L., Ge, W., Wang, H., Davis, C., Fisher-Aylor, K.I., Mortazavi, A., Gerstein, M., Gingeras, T., Wold, B., Sun, Y., Fullwood, M.J., Cheung, E., Liu, E., Sung, W.K., Snyder, M., and Ruan, Y. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell 2012; 148: 84-98.
80. Wang, J., Zhuang, J., Iyer, S., Lin, X., Whitfield, T.W., Greven, M.C., Pierce, B.G., Dong, X., Kundaje, A., Cheng, Y., Rando, O.J., Birney, E., Myers, R.M., Noble, W.S., Snyder, M., and Weng, Z. Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors.  Genome Res. 2012; 22: 1798-1812.
81. Ernst, J., and Kellis, M. 2013. Interplay between chromatin state, regulator binding, and regulatory motifs in six human cell types. Genome Res. 2013; 23: 1142-1154.
82. Reich, D., Green, R.E., Kircher, M., Krause, J., Patterson, N., Durand, E.Y., Viola, B., Briggs, A.W., Stenzel, U., Johnson, P.L., Maricic, T., Good, J.M., Marques-Bonet, T., Alkan, C., Fu, Q., Mallick, S., Li, H., Meyer, M., Eichler, E.E., Stoneking, M., Richards, M., Talamo, S., Shunkov, M.V., Derevianko, A.P., Hublin, J.J., Kelso, J., Slatkin, M., Paabo, S. Genetic history of an archaic hominin group from Denisova Cave in Siberia. Nature 2010; 468: 053-1060.
83. Meyer, M., Kircher, M., Gansauge, M.T., Li, H., Racimo, F., Mallick, S., Schraiber, J.G., Jay, F., Prufer, K., de Filippo, C., Sudmant, P.H., Alkan, C., Fu, Q., Do, R., Rohland, N., Tandon, A., Siebauer, M., Green, R.E., Bryc, K., Briggs, A.W., Stenzel, U., Dabney, J., Shendure, J., Kitzman, J., Hammer, M.F., Shunkov, M.V., Derevianko, A.P., Patterson, N., Andres, A.M., Eichler, E.E., Slatkin, M., Reich, D., Kelso, J., Paabo, S. A high-coverage genome sequence from an archaic Denisovan individual. Science 2012; 338: 222-226. 
84. Marchler-Bauer A, Lu S, Anderson JB, Chitsaz F, Derbyshire MK, DeWeese-Scott C, Fong JH, Geer LY, Geer RC, Gonzales NR, Gwadz M, Hurwitz DI, Jackson JD, Ke Z, Lanczycki CJ, Lu F, Marchler GH, Mullokandov M, Omelchenko MV, Robertson CL, Song JS, Thanki N, Yamashita RA, Zhang D, Zhang N, Zheng C, Bryant SH. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Res. 2011; 39: D225-9. 
85. Marchler-Bauer A, Derbyshire MK, Gonzales NR, Lu S2, Chitsaz F, Geer LY, Geer RC, He J, Gwadz M, Hurwitz DI, Lanczycki CJ, Lu F, Marchler GH, Song JS, Thanki N, Wang Z, Yamashita RA, Zhang D, Zheng C, Bryant SH. CDD: NCBI's conserved domain database. Nucleic Acids Res. 2015; 43: D222-6.
86. Tavazoie, S., Hughes, J.D., Campbell, M.J., Cho, R.J., and Church, GM. 1999. Systematic determination of genetic network architecture. Nat. Genet.1999; 22: 281-285.
【０１７５】
【表１Ａ】
2019520851.tif 000003
【０１７６】
【表１】
2019520851.tif 000004
【０１７７】
【表２】
2019520851.tif 000005
【０１７８】
【表３−１】
2019520851.tif 000006
【表３−２】
2019520851.tif 000007
【表３−３】
2019520851.tif 000008
【０１７９】
表４．図１のデータ
【表４】
2019520851.tif 000009
【０１８０】
表５．図４のデータ
【表５−１】
2019520851.tif 000010
【表５−２】
2019520851.tif 000011
【０１８１】
表６．図５のデータ
【表６】
2019520851.tif 000012
【０１８２】
表７．図６のデータ
【表７】
2019520851.tif 000013
【０１８３】
表８．図７のデータ
【表８】
2019520851.tif 000014
【０１８４】
表９．図８のデータ（タンパク質Ｐ値）
【表９】
2019520851.tif 000015
【０１８５】
表１０−１４（データセットＳ２）は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、及びアカゲザルのゲノムを含む、１７種の霊長類のゲノムの配列との、ヒトゲノム配列の比較中の直接及び相互配列アラインメント変換失敗に基づいて規定される、ヒト特異的ＳＣＡＲ遺伝子座の説明を含む。表１０−Ｘはまた、各ＳＣＡＲ遺伝子座について、１７種の霊長類のゲノムへの配列アラインメントによって規定される、祖先ＤＮＡのヒト特異的欠失のサイズを示す。
【０１８６】
表１０．２５１ｂ．ｃ．失敗
【表１０−１】
2019520851.tif 000016
【表１０−２】
2019520851.tif 000017
【表１０−３】
2019520851.tif 000018
【表１０−４】
2019520851.tif 000019
【表１０−５】
2019520851.tif 000020
【表１０−６】
2019520851.tif 000021
【表１０−７】
2019520851.tif 000022
【表１０−８】
2019520851.tif 000023
【表１０−９】
2019520851.tif 000024
【表１０−１０】
2019520851.tif 000025
【表１０−１１】
2019520851.tif 000026
【表１０−１２】
2019520851.tif 000027
【０１８７】
表１１．チンパンジー及びボノボのゲノムからヒトゲノムへの相互アラインメントの失敗に基づいて規定される、ヒト特異的ＳＣＡＲ
【表１１−１】
2019520851.tif 000028
【表１１−２】
2019520851.tif 000029
【表１１−３】
2019520851.tif 000030
【０１８８】
表１２．１２８ｈｅｒｖｈから。
【表１２−１】
2019520851.tif 000031
【表１２−２】
2019520851.tif 000032
【０１８９】
表１３．ＨＥＲＶＨ由来ｌｉｎｃＲＮＡ。
【表１３−１】
2019520851.tif 000033
【表１３−２】
2019520851.tif 000034
【０１９０】
表１４．４３のヒト特異的組込み部位
【表１４】
2019520851.tif 000035
【０１９１】
表１５．ＳＮＭの１０のデータセット。
【表１５−１】
2019520851.tif 000036
【表１５−２】
2019520851.tif 000037
【表１５−３】
2019520851.tif 000038
【表１５−４】
2019520851.tif 000039
【表１５−５】
2019520851.tif 000040
【表１５−６】
2019520851.tif 000041
【表１５−７】
2019520851.tif 000042
【表１５−８】
2019520851.tif 000043
【表１５−９】
2019520851.tif 000044
【表１５−１０】
2019520851.tif 000045
【０１９２】
表１６．ＳＮＭ  Ｐ値。
【表１６−１】
2019520851.tif 000046
【表１６−２】
2019520851.tif 000047
【０１９３】
表１７．ＳＮＭのパーセント。
【表１７】
2019520851.tif 000048
【０１９４】
注：表４−９は「データセットＳ１」であり、表１０−１４は「データセットＳ２」であり、表１５−１７は「データセットＳ３」である。
【０１９５】
パラグラフ１：被験体においてがんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法であって、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のプロテオミクスシグネチャー経路を示す１又は複数の入力及びゲノムシグネチャー経路を示す１又は複数の入力に応答して標的マーカー情報を生成する工程；及び標的マーカー情報を有する生体サンプルの検出される発現レベル及び配列情報の比較に応答して異常オブジェクト情報を生成する工程を含む、方法。
【０１９６】
一実施形態において、異常オブジェクト情報を生成する工程は、異常オブジェクト情報をクライアント装置、ユーザインターフェイスなどに表示する工程を含む。一実施形態において、異常オブジェクト情報を生成する工程は、異常オブジェクト情報をリモートネットワークで交換する工程を含む。異常オブジェクト情報の非限定的な例は、異常配列情報、異常発現レベル情報、発現レベルが標的閾値情報を上回っていること、複数の塩基の検出された位置付け、配列異常スコアなどを含む。
【０１９７】
さらなる異常オブジェクト情報の非限定的な例は、生体被験体から得られたサンプルに由来する参照情報を比較することによって得られた閾値レベルを示す情報；標的マーカー情報を有する生体サンプルの配列を示す少なくとも１つの入力と発現レベルを示す少なくとも１つの入力の比較を示す情報；などを含む。
【０１９８】
パラグラフ２：標的マーカー情報を生成する工程が、ＳＣＡＲ経路を示す１又は複数の入力に応答して標的マーカー情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０１９９】
パラグラフ３：標的マーカー情報を生成する工程が、ＳＣＡＲ経路標的遺伝子を示す１又は複数の入力に応答して標的マーカー情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２００】
パラグラフ４：標的マーカー情報を生成する工程が、ＥＬＦ３；ＰＣＤＨ１５；ＭＡＬＡＴ１；ＰＴＰＮ１１；ＲＢ１；ＣＨＳＴ６；ＮＦ１；ＶＥＺＦ１；ＴＰ５３；ＳＭＡＤ４；ＫＥＡＰ１；ＳＴＫ１１；ＰＲＸ；ＺＮＦ２８；ＩＤＨ１；ＦＥＺ２；ＤＰＰＡ２；ＬＰＨＮ３；ＫＩＡＡ１２４４；ＥＰＨＡ７；ＥＧＦＲ；ＴＬＲ４；ＤＡＢ２ＩＰ；ＮＯＴＣＨ１；ＧＬＵＤ２；ＤＭＤ；ＫＤＭ６Ａ；ＫＲＡＳ；ＣＤＫＮ２Ａ；ＤＮＭＴ３Ａ；ＦＬＴ３；ＮＦＥ２Ｌ２；ＮＰＭ１；ＭＩＲ１４２；ＦＯＸＬ２；Ｈ３Ｆ３Ａ；Ｈ３Ｆ３Ｂ；ＫＭＴ２Ｄ；ＲＮＦ４３；ＴＥＲＴ；ＥＲＢＢ２；ＰＬＣＧ１のうち１又は複数に関連する標的マーカー情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０１】
パラグラフ５：標的マーカー情報を生成する工程が、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又はタンパク質のうち１又は複数に関連する標的マーカー情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０２】
パラグラフ６：標的マーカー情報を生成する工程が、ＰＬＣＸＤ１、ＨＫＲ１、ＺＮＦ２８３、ＡＤＡ、ＡＭＡＣＲ＋ｐ６３、ＡＮＫ３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＩＲＣ５、ＢＭＩ−１、ＢＵＢ１、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＥＳ１、ＣＨＡＦ１Ａ、ＣＲＩＰ１、ＣＲＹＡＢ、ＥＳＭ１、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ２、ＦＯＳ、Ｇｂｘ２、ＨＣＦＣ１、ＩＥＲ３、ＩＴＰＲ１、ＪＵＮＢ、ＫＬＦ６、ＫＩ６７、ＫＮＴＣ２、ＭＧＣ５４６６、Ｐｈｃ１、ＲＮＦ２、Ｓｕｚ１２、ＴＣＦ２、ＴＲＡＰ１００、ＵＳＰ２２、Ｗｎｔ５Ａ及びＺＦＰ３６のうち１又は複数に関連する標的マーカー情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０３】
パラグラフ７：異常オブジェクト情報を生成する工程が、生体サンプルに関連する配列の質が１又は複数の参照配列と比較して異なる場合に異常配列情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０４】
パラグラフ８：異常オブジェクト情報を生成する工程が、１又は複数の参照配列と比較して、生体サンプルに関連する配列全体内の複数の塩基の異なる位置付けを示す１又は複数の入力に応答して異常配列情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０５】
パラグラフ９：異常オブジェクト情報を生成する工程が、１又は複数の参照配列と比較して、生体サンプルに関連する配列の異なる断片を示す１又は複数の入力に応答して異常配列情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０６】
パラグラフ１０：異常オブジェクト情報を生成する工程が、発現レベルが標的閾値を超えた場合を示す１又は複数の入力に応答して異常発現レベル情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０７】
パラグラフ１１：異常オブジェクト情報を生成する工程が、検出された発現レベルが標的閾値を上回る場合に発現レベル異常スコアを決定する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０８】
パラグラフ１２：異常オブジェクト情報を生成する工程が、生体サンプルに関連する複数の塩基の検出された位置付けが１又は複数の参照配列と比較して異なる場合に、配列異常スコアを決定する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２０９】
パラグラフ１３：異常オブジェクト情報を生成する工程が、次世代シーケンシング、多色定量的免疫蛍光共局在分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び定量ＲＴ−ＰＣＲ分析からの１又は複数の入力に応答して配列異常スコアを決定する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２１０】
パラグラフ１４：異常オブジェクト情報を生成する工程が、既知の診断又は既知の治療後の臨床成績を有する生体被験体から得られたサンプルに由来する参照情報を比較することによって閾値レベルを決定する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２１１】
パラグラフ１５：パラグラフ１４に記載の方法であって、少なくとも２つのマーカーの標的閾値係数を上回る異常な発現及び発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断を生成する工程をさらに含む、方法。
【０２１２】
パラグラフ１６：異常オブジェクト情報を生成する工程が、異常配列情報及びマーカー共発現レベル情報を生成する工程を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【０２１３】
パラグラフ１７：パラグラフ１に記載の方法であって、
異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答してがん治療有効性状態を生成する工程
をさらに含む、方法。
【０２１４】
パラグラフ１８：パラグラフ１に記載の方法であって、異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、生体被験体におけるがんの存在又は非存在を示す情報を生成する工程をさらに含む、方法。
【０２１５】
パラグラフ１９：被験体においてがんを診断するための又はがん治療成績を予測するためのシステムであって、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のプロテオミクスシグネチャー経路を示す１又は複数の入力及びゲノムシグネチャー経路を示す１又は複数の入力に応答して、標的マーカー情報を生成するように構成される回路；及び標的マーカー情報を有する生体サンプルの配列を示す少なくとも１つの入力と発現レベルを示す少なくとも１つの入力の比較に応答して、異常オブジェクト情報を生成するように構成される回路を含む、システム。
【０２１６】
パラグラフ２０：パラグラフ１９に記載のシステムであって、異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、生体被験体におけるがんの存在又は非存在を示す情報を生成するように構成される回路をさらに含む、システム。
【０２１７】
パラグラフ２１：パラグラフ１９に記載のシステムであって、少なくとも２つのマーカーの標的閾値係数を上回る異常な発現及び発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、がん治療有効性状態、がん治療進行、がん予後、がん診断を生成するように構成される回路をさらに含む、システム。
【０２１８】
パラグラフ２２：パラグラフ１９に記載のシステムであって、異常な配列及び閾値マーカー共発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、がん治療有効性状態を生成するように構成される回路をさらに含む、システム。
【０２１９】
パラグラフ２３：がんを処置するためのシステムであって、がんを有すると診断された被験体における幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）経路活性化に関連する情報を取得するように構成される回路；及びがんを有すると診断された被験体における幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）経路活性化に関連する１又は複数の入力に応答して、単一の治療剤又は複数の治療剤の組み合わせを同定し、ユーザ固有の処置プロトコルを生成するように構成される回路を含む、システム。
【０２２０】
パラグラフ２４：被験体においてがんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法であって、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について生体サンプルを同時にスクリーニングする工程；生体サンプルに関連する配列を、配列の質が参照配列と比較して異なる場合に、異常であるとスコア付けする工程；及び検出された発現レベルが標的閾値係数を上回る場合に、生体サンプルに関連する発現レベルを異常であるとスコア付けする工程を含む、方法。一実施形態において、被験体においてがんを診断する又はがん治療成績を予測するための方法であって、内在性ヒト幹細胞関連レトロウイルス（ＳＣＡＲ）のゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在の少なくとも１つについて生体サンプルをスクリーニングする工程；生体サンプルに関連する配列を、配列の質が参照配列と比較して異なる場合に、異常であるとスコア付けする工程；及び検出された発現レベルが標的閾値係数を上回る場合に、生体サンプルに関連する発現レベルを異常であるとスコア付けする工程を含む、方法。
【０２２１】
パラグラフ２５：内在性ＳＣＡＲのゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について生体サンプルを同時にスクリーニングする工程が、生体被験体におけるがん診断又はがん治療失敗の予後を示す１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について、生体サンプルを同時にスクリーニングする工程を含む、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２２２】
パラグラフ２６：パラグラフ２５に記載の方法であって、生体被験体におけるがん診断又はがん治療失敗の予後に関連する異常な配列又は異常な発現レベルを示す１又は複数の入力に応答してユーザ固有のがん治療プロトコルを生成する工程をさらに含む、方法。
【０２２３】
パラグラフ２７：内在性ＳＣＡＲのゲノム及びプロテオミクスシグネチャーに関与する経路に関連する１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について生体サンプルを同時にスクリーニングする工程が、生体被験体におけるがん治療の進行を示す１又は複数の標的マーカーの異常な配列及び異常な発現レベルの存在について、生体サンプルを同時にスクリーニングする工程を含む、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２２４】
パラグラフ２８：パラグラフ２７に記載の方法であって、生体被験体におけるがん治療の進行に関連する異常な配列又は異常な発現レベルを示す１又は複数の入力に応答して、ユーザ固有のがん治療プロトコルを生成する工程をさらに含む、方法。
【０２２５】
パラグラフ２９：検出閾値が、既知の診断又は既知の治療後の臨床成績を有する被験体から得られたサンプルの参照データベースにおける値と比較することによって決定されており、試験サンプルにおける、少なくとも１つであるが好ましくは２つ以上のマーカーの異常な発現レベルの存在及び２つ以上のそのようなマーカーの異常な発現の存在が、がん診断又はがん治療失敗の予後を示す、又は被験体におけるがん治療の進行を示す、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２２６】
パラグラフ３０：試験された各患者の成績データをサンプルの参照データベースに追加すること、及び自動化された及び／又は再帰的な方法で、手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、診断、予後、又は将来のがん治療の明細の正確さを連続して向上させることによって、検出閾値が連続して改良される、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２２７】
パラグラフ３１：前記サンプル表現型が、がん、非がん、再発、非再発、再燃、非再燃、浸潤性、非浸潤性、転移性、非転移性、限局性、腫瘍サイズ、腫瘍悪性度、Ｇｌｅａｓｏｎスコア、生存予後、リンパ節の状態、腫瘍の病期、分化の程度、年齢、ホルモンレセプターの状態、腫瘍抗原レベル（ＰＳＡレベル、ＰＳＭＡレベル、サバイビンレベル、がん胎児性タンパク質レベル、精巣抗原レベルを含むが、これらに限定されない）、組織学的タイプ、免疫細胞のレベル、表現型及び遺伝子型、及び活性化状態、及び無病生存率からなる群より選択される、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２２８】
パラグラフ３２：前記閾値係数が、絶対値≧０．５を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２２９】
パラグラフ３３：前記閾値係数が、絶対値≧０．６を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３０】
パラグラフ３４：前記閾値係数が、絶対値≧０．７を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３１】
パラグラフ３５：前記閾値係数が、絶対値≧０．８を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３２】
パラグラフ３６：前記閾値係数が、絶対値≧０．９を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３３】
パラグラフ３７：前記閾値係数が、絶対値≧０．９５を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３４】
パラグラフ３８：前記閾値係数が、絶対値≧０．９９を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３５】
パラグラフ３９：前記閾値係数が、絶対値≧０．９９５を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３６】
パラグラフ４０：前記閾値係数が、絶対値≧０．９９９を有する、パラグラフ２４に記載の方法。
【０２３７】
パラグラフ４１：サンプル表現型を分類するための検出閾値を決定する方法であって、マーカーのサブセットを同定し、パラグラフ２４に記載の方法にしたがって細胞におけるマーカー発現をスコア付けする工程；及び既知の表現型を有する被験体からのサンプルの参照データベースを使用して、複数の異なる検出閾値でサンプル分類の正確さを決定する工程を含む、方法。
【０２３８】
パラグラフ４２：自動化された及び／又は再帰的な方法で、手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、サンプル分類の正確さを決定する工程を含む、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２３９】
パラグラフ４３：前記検出閾値の最高性能の大きさを決定し、前記大きさを使用して、サンプル表現型を分類する際の前記確立された検出閾値の信頼性を評価する工程をさらに含む、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４０】
パラグラフ４４：自動化された及び／又は再帰的な方法で、手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、前記検出閾値の最高性能の大きさを決定し、前記大きさを使用して、サンプル表現型を分類する際の前記確立された検出閾値の信頼性を評価する工程をさらに含む、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４１】
パラグラフ４５：前記検出閾値の最高性能の大きさを使用して分類されていないサンプルをスコア付けし、サンプル表現型を前記サンプルに割り当てる工程をさらに含む、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４２】
パラグラフ４６：手動で又はコンピュータによる方法を使用して、ローカルに、リモートサーバに、又はクラウドに保存されたデータを使用して、前記検出閾値の最高性能の大きさを使用して分類されていないサンプルをスコア付けし、サンプル表現型を前記サンプルに割り当てる工程をさらに含む、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４３】
パラグラフ４７：マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列から本質的に成る、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４４】
パラグラフ４８：マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の９０％から本質的に成る、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４５】
パラグラフ４９：マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の８０％から本質的に成る、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４６】
パラグラフ５０：マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の７０％から本質的に成る、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４７】
パラグラフ５１：マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ１、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の６０％から本質的に成る、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４８】
パラグラフ５２：マーカーの前記サブセットが、表１Ａ、表１、表２、表３、表Ｓ１、表Ｓ３、表Ｓ４、表Ｓ５、表Ｓ６、データセットＳ２、データセットＳ３において同定される遺伝子、遺伝子座、及び配列の５０％から本質的に成る、パラグラフ４１に記載の方法。
【０２４９】
パラグラフ５３：がんを処置する方法であって、がんを有すると診断された被験体におけるＳＣＡＲの経路活性化の分子シグナルを検出する工程；ＳＣＡＲの経路活性化の前記分子シグナルの検出に基づいて、活性化されたＳＣＡＲの遺伝子座及び／又は下流のＳＣＡＲ制御遺伝子座を標的としたユーザ固有の治療的処置を生成する工程を含む、方法。
【０２５０】
パラグラフ５４：活性化されたＳＣＡＲ経路の規定されたゲノム要素をサイレンシングするために、ユーザ固有の治療的処置が、ゲノム編集に基づき、このゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体媒介ゲノム編集を含むがこれに限定されない、パラグラフ５３に記載の方法。
【０２５１】
パラグラフ５５：活性化されたＳＣＡＲ経路の規定されたゲノム要素を活性化するために、ユーザ固有の治療的処置が、ゲノム編集に基づき、このゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体媒介ゲノム編集を含むがこれに限定されない、パラグラフ５３に記載の方法。
【０２５２】
パラグラフ５６：ユーザ固有の治療的処置が、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の適用に基づく、パラグラフ５３に記載の方法。
【０２５３】
パラグラフ５７：ユーザ固有の治療的処置が、抗レトロウイルス薬、Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ（ＲＡＬ、Ｉｓｅｎｔｒｅｓｓ、旧ＭＫ−０５１８）の投与に基づく、パラグラフ５３に記載の方法。
【０２５４】
パラグラフ５８：ユーザ固有の治療的処置が、転写活性のあるＳＣＡＲの遺伝子座及び／又は活性化されたＳＣＡＲ経路の規定されたゲノム要素に対するアンチセンス療法の適用に基づく、パラグラフ５３に記載の方法。
【０２５５】
パラグラフ５９：ユーザ固有の治療的処置が、アンタゴニスト抗体又はその断片、アゴニスト抗体又はその断片、自家細胞、同種異系細胞、ペプチド、小分子、シグナル伝達タンパク質又はその断片、又は上記のうち２つ以上を含む組成物及び単一分子又は細胞療法において上記のうち２つ以上のすべて又は一部を含む組成物を含むがこれらに限定されず、活性化されたＳＣＡＲ配列によってコードされるタンパク質及び／又はペプチドに対する、標的化された免疫療法の適用に基づく、パラグラフ５３に記載の方法。
【０２５６】
パラグラフ６０：単独の機能として又は免疫システムの抗がんモジュレーターの活性を増大させるために、パラグラフ３９−４５に記載の方法が使用されて、処置された被験体の腫瘍において腫瘍浸潤リンパ球を増強する、がんを処置する方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2019520851.tif 000051
【図１Ｄ】
2019520851.tif 000052
【図１Ｅ】
2019520851.tif 000053
【図１Ｆ】
2019520851.tif 000054
【図１Ｇ】
2019520851.tif 000055
【図１Ｈ】
2019520851.tif 000056
【図１Ｉ】
2019520851.tif 000057
【図１Ｊ】
2019520851.tif 000058
【図１Ｋ】
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【図２Ａ】
2019520851.tif 000060
【図２Ｂ】
2019520851.tif 000061
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図３Ａ１】
2019520851.tif 000073
【図３Ａ２】
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【図３Ａ３】
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【図３Ａ４】
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【図３Ａ５】
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【図３Ａ６】
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【図３Ｂ１】
2019520851.tif 000079
【図３Ｂ２】
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【図３Ｂ３】
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【図３Ｂ４】
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【図３Ｃ１】
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【図３Ｃ２】
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【図３Ｃ３】
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【図３Ｃ４】
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【図３Ｄ１】
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【図３Ｄ２】
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【図３Ｄ３】
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【図３Ｄ４】
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【図４Ａ】
2019520851.tif 000091
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2019520851.tif 000096
【図５Ｃ】
2019520851.tif 000097
【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ１】
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【図６Ｂ２】
2019520851.tif 000101
【図６Ｂ３】
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【図６Ｂ４】
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【図６Ｂ５】
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【図６Ｂ６】
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【図６Ｂ７】
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【図６Ｂ８】
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【図６Ｂ９】
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【図６Ｂ１０】
2019520851.tif 000109
【図６Ｂ１１】
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【図６Ｂ１２】
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【図６Ｂ１３】
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【図６Ｂ１４】
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【図６Ｂ１５】
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【図６Ｂ１６】
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【図６Ｂ１７】
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【図６Ｂ１８】
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【図６Ｂ１９】
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【図６Ｂ２０】
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【図６Ｂ２１】
2019520851.tif 000120
【図６Ｂ２２】
2019520851.tif 000121
【図６Ｂ２３】
2019520851.tif 000122
【図６Ｂ２４】
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【図７Ａ１】
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【図７Ａ２】
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【図７Ａ３】
2019520851.tif 000126
【図７Ａ４】
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【図７Ａ５】
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【図７Ａ６】
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【図７Ａ７】
2019520851.tif 000130
【図７Ａ８】
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【図７Ａ９】
2019520851.tif 000132
【図７Ａ１０】
2019520851.tif 000133
【図７Ａ１１】
2019520851.tif 000134
【図７Ａ１２】
2019520851.tif 000135
【図７Ａ１３】
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【図７Ａ１４】
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【図７Ａ１５】
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【図７Ａ１６】
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【図７Ａ１７】
2019520851.tif 000140
【図７Ａ１８】
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【図７Ａ１９】
2019520851.tif 000142
【図７Ｂ１】
2019520851.tif 000143
【図７Ｂ２】
2019520851.tif 000144
【図７Ｂ３】
2019520851.tif 000145
【図７Ｂ４】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2019520851.tif 000148
【図８Ａ１】
2019520851.tif 000149
【図８Ａ２】
2019520851.tif 000150
【図８Ａ３】
2019520851.tif 000151
【図８Ａ４】
2019520851.tif 000152
【図８Ａ５】
2019520851.tif 000153
【図８Ａ６】
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【図８Ｂ１】
2019520851.tif 000155
【図８Ｂ２】
2019520851.tif 000156
【図８Ｂ３】
2019520851.tif 000157
【図８Ｂ４】
2019520851.tif 000158
【図８Ｂ５】
2019520851.tif 000159
【図８Ｂ６】
2019520851.tif 000160
【図９】
2019520851.tif 000161
【図１０】
2019520851.tif 000162
【図Ｓ１Ａ】
2019520851.tif 000163
【図Ｓ１Ｂ】
2019520851.tif 000164
【図Ｓ１Ｃ】
2019520851.tif 000165
【図Ｓ１Ｄ】
2019520851.tif 000166
【図Ｓ１Ｅ】
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【図Ｓ１Ｆ】
2019520851.tif 000168
【図Ｓ１Ｇ】
2019520851.tif 000169
【図Ｓ１Ｈ】
2019520851.tif 000170
【図Ｓ１Ｉ】
2019520851.tif 000171
【図Ｓ１Ｊ】
2019520851.tif 000172
【図Ｓ１Ｋ】
2019520851.tif 000173
【図Ｓ２Ａ１】
2019520851.tif 000174
【図Ｓ２Ａ２】
2019520851.tif 000175
【図Ｓ２Ａ３】
2019520851.tif 000176
【図Ｓ２Ａ４】
2019520851.tif 000177
【図Ｓ２Ａ５】
2019520851.tif 000178
【図Ｓ２Ａ６】
2019520851.tif 000179
【図Ｓ２Ｂ１】
2019520851.tif 000180
【図Ｓ２Ｂ２】
2019520851.tif 000181
【図Ｓ２Ｂ３】
2019520851.tif 000182
【図Ｓ２Ｂ４】
2019520851.tif 000183
【図Ｓ２Ｂ５】
2019520851.tif 000184
【図Ｓ２Ｂ６】
2019520851.tif 000185
【図Ｓ２Ｃ１】
2019520851.tif 000186
【図Ｓ２Ｃ２】
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【図Ｓ２Ｃ３】
2019520851.tif 000188
【図Ｓ２Ｃ４】
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【図Ｓ２Ｄ１】
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【図Ｓ２Ｄ２】
2019520851.tif 000191
【図Ｓ２Ｄ３】
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【図Ｓ２Ｄ４】
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【図Ｓ２Ｅ１】
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【図Ｓ２Ｅ２】
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【図Ｓ２Ｅ３】
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【図Ｓ２Ｅ４】
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【図Ｓ２Ｅ５】
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【図Ｓ２Ｅ６】
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【図Ｓ２Ｅ７】
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【図Ｓ２Ｅ８】
2019520851.tif 000201
【図Ｓ２Ｅ９】
2019520851.tif 000202
【図Ｓ２Ｅ１０】
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【図Ｓ３Ａ１】
2019520851.tif 000204
【図Ｓ３Ａ２】
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【図Ｓ３Ａ３】
2019520851.tif 000206
【図Ｓ３Ａ４】
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【図Ｓ３Ｂ１】
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【図Ｓ３Ｂ２】
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【図Ｓ４Ａ１】
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【図Ｓ４Ａ２】
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【図Ｓ４Ａ３】
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【図Ｓ４Ａ４】
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【図Ｓ４Ａ５】
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【図Ｓ４Ａ６】
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【図Ｓ４Ｂ１】
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【図Ｓ４Ｂ２】
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【図Ｓ４Ｂ３】
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【図Ｓ４Ｂ４】
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【図Ｓ４Ｂ５】
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【図Ｓ４Ｂ６】
2019520851.tif 000221
【図Ｓ４Ｃ１】
2019520851.tif 000222
【図Ｓ４Ｃ２】
2019520851.tif 000223
【図Ｓ４Ｃ３】
2019520851.tif 000224
【図Ｓ４Ｃ４】
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【図Ｓ４Ｄ１】
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【図Ｓ４Ｄ２】
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【図Ｓ４Ｄ３】
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【図Ｓ４Ｄ４】
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【図Ｓ４Ｅ１】
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【図Ｓ４Ｅ２】
2019520851.tif 000231
【図Ｓ４Ｅ３】
2019520851.tif 000232
【図Ｓ４Ｅ４】
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【図Ｓ５−１】
2019520851.tif 000234
【図Ｓ５−２】
2019520851.tif 000235
【図Ｓ５−３】
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【図ＴＳ１Ａ１】
2019520851.tif 000237
【図ＴＳ１Ａ２】
2019520851.tif 000238
【図ＴＳ１Ａ３】
2019520851.tif 000239
【図ＴＳ２Ａ１】
2019520851.tif 000240
【図ＴＳ２Ａ２】
2019520851.tif 000241
【図ＴＳ２Ｂ１】
2019520851.tif 000242
【図ＴＳ２Ｂ２】
2019520851.tif 000243
【図ＴＳ２Ｃ１】
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【図ＴＳ２Ｃ２】
2019520851.tif 000245
【図ＴＳ３Ａ】
2019520851.tif 000246
【図ＴＳ３Ｂ】
2019520851.tif 000247
【図ＴＳ４Ａ１】
2019520851.tif 000248
【図ＴＳ４Ａ２】
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【図ＴＳ４Ａ３】
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【図ＴＳ４Ｂ１】
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【図ＴＳ４Ｂ２】
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【図ＴＳ５Ａ１】
2019520851.tif 000253
【図ＴＳ５Ａ２】
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【図ＴＳ５Ａ３】
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【図ＴＳ５Ａ４】
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【図ＴＳ５Ｂ１】
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【図ＴＳ５Ｂ２】
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【図ＴＳ５Ｂ３】
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【図ＴＳ５Ｂ４】
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【図ＴＳ５Ｃ１】
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【図ＴＳ５Ｃ２】
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【図ＴＳ６Ａ１】
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【図ＴＳ６Ａ２】
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【図ＴＳ６Ａ３】
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【図ＴＳ６Ａ４】
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【図ＴＳ６Ａ５】
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【図ＴＳ６Ａ６】
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【図ＴＳ６Ａ７】
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【図ＴＳ６Ｂ１】
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【図ＴＳ６Ｂ２】
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【図ＴＳ６Ｂ３】
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【図ＴＳ６Ｂ４】
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【図ＴＳ６Ｂ５】
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【図ＴＳ６Ｃ１】
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【図ＴＳ６Ｃ２】
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【図ＴＳ６Ｃ３】
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【図ＴＳ６Ｃ４】
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【図ＴＳ６Ｃ５】
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【図ＴＳ６Ｃ６】
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【図ＴＳ６Ｃ７】
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【図ＴＳ６Ｃ８】
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【図ＴＳ６Ｃ９】
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【図ＴＳ６Ｃ１０】
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【図ＴＳ６Ｃ１１】
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【図ＴＳ６Ｃ１２】
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【図ＴＳ６Ｃ１３】
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【図ＴＳ６Ｃ１４】
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【図ＴＳ６Ｃ１５】
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【図ＴＳ６Ｃ１６】
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【図ＴＳ６Ｃ１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019520851.tif 000293
2019520851.tif 000294