(57)【要約】  本発明は、脳卒中後の低酸素組織への酸素の送達のためのH-NOXタンパク質を提供する。H-NOXタンパク質は、脳卒中と関連する低酸素ペナンブラ中に浸出し、低酸素組織への酸素の持続的送達のために優先的に蓄積して、脳卒中関連低酸素状態の有害効果を改善する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXを含む。【選択図】図７Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
【請求項２】
脳卒中後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、N-NOXが、ポリエチレングリコールに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
【請求項３】
前記脳卒中が虚血性脳卒中又は出血性脳卒中である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
個体の一過性虚血発作を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
【請求項５】
一過性虚血発作後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
【請求項６】
個体の低酸素脳損傷を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
【請求項７】
低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、前記方法。
【請求項８】
前記H-NOXが前記脳卒中と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記H-NOXが前記一過性虚血発作と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、請求項4又は5記載の方法。
【請求項１０】
前記H-NOXが前記低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、請求項6又は7記載の方法。
【請求項１１】
前記H-NOXの投与が前記低酸素ペナンブラにおける炎症を軽減する、請求項8〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記個体が、前記脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果として、脳の持続的低灌流を示す、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、該閉塞の部位又は該ペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、及び/又はマクロファージの活性化を低下させる、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXとともに投与される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが組成物中にある、請求項15又は16記載の方法。
【請求項１８】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に又は順次送達される、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に送達される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが順次送達される、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の前に投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の後に投与される、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが、前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約24時間後、又は約24時間よりも長い時間の後に投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、又は3日後のうちの1つ又は複数で投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約1日後、及び約2日後に投与される、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
前記個体が哺乳動物である、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が同じH-NOXタンパク質に由来する、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が異なるH-NOXタンパク質に由来する、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が1以上の遠位ポケット突然変異を含む、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記遠位ポケット突然変異がT.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
前記H-NOXが位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである、請求項32又は33記載の方法。
【請求項３５】
前記位置144におけるアミノ酸置換がL144F置換である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が重合体型H-NOXタンパク質である、請求項1〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記重合体型H-NOXタンパク質が単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記H-NOXドメインが前記重合ドメインに共有結合している、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
前記重合体型H-NOXタンパク質が三量体型H-NOXタンパク質である、請求項36〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記三量体型H-NOXタンパク質が1以上の三量体化ドメインを含む、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
前記三量体型H-NOXタンパク質が3つの単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインがバクテリオファージT4三量体化ドメインである、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
前記三量体化ドメインがフォルドンドメインである、請求項40又は41記載の方法。
【請求項４３】
前記フォルドンドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
前記H-NOXタンパク質が免疫グロブリンのFcドメインに融合している、請求項1〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつ該H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1nM〜約1000nMである、請求項1〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1μM〜約10μMである、請求項1〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約10μM〜約50μMである、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性が20℃で約700s-1未満である、請求項1〜48のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.65s-1以下である、請求項1〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である、請求項1〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である、請求項1〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
前記H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が37℃で約1h-1未満である、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
前記H-NOXが別の療法と組み合わせて投与される、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記他の療法が組織プラスミノーゲン活性化因子及び/もしくは再疎通又は神経保護物質による治療である、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
前記H-NOX投与が、前記他の治療の前、その間、又はその後に行われる、請求項56又は57記載の方法。
【請求項５９】
H-NOXの治療有効量を含む組成物であって、該H-NOXがポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、前記組成物。
【請求項６０】
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、請求項59記載の組成物。
【請求項６１】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が同じH-NOXタンパク質に由来する、請求項59又は60記載の組成物。
【請求項６２】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が異なるH-NOXタンパク質に由来する、請求項59〜61のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６３】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである、請求項59〜62のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６４】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む、請求項59〜63のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６５】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が1以上の遠位ポケット突然変異を含む、請求項59〜64のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６６】
前記遠位ポケット突然変異がT.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、請求項65記載の組成物。
【請求項６７】
前記H-NOXが位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである、請求項65又は66記載の組成物。
【請求項６８】
前記位置144におけるアミノ酸置換がL144F置換である、請求項67記載の組成物。
【請求項６９】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が重合体型H-NOXタンパク質である、請求項59〜68のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７０】
前記重合体型H-NOXタンパク質が単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
前記H-NOXドメインが前記重合ドメインに共有結合している、請求項70記載の組成物。
【請求項７２】
前記重合体型H-NOXタンパク質が三量体型H-NOXタンパク質である、請求項69〜71のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７３】
前記三量体型H-NOXタンパク質が1以上の三量体化ドメインを含む、請求項72記載の組成物。
【請求項７４】
前記三量体型H-NOXタンパク質が3つの単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインがバクテリオファージT4三量体化ドメインである、請求項73記載の組成物。
【請求項７５】
前記三量体化ドメインがフォルドンドメインである、請求項73又は74記載の組成物。
【請求項７６】
前記フォルドンドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項75記載の組成物。
【請求項７７】
前記H-NOXタンパク質が免疫グロブリンのFcドメインに融合している、請求項59〜76のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７８】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつ該H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、請求項59〜77のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７９】
前記重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1nM〜約1000nMである、請求項59〜78のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８０】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1μM〜約10μMである、請求項59〜79のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８１】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約10μM〜約50μMである、請求項59〜80のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８２】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性が20℃で約700s-1未満である、請求項59〜81のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８３】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、請求項59〜82のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８４】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、請求項83記載の組成物。
【請求項８５】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.65s-1以下である、請求項59〜84のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８６】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である、請求項59〜85のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８７】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である、請求項59〜86のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８８】
前記H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が37℃で約1h-1未満である、請求項59〜87のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８９】
請求項1〜58のいずれか一項記載の方法による個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物。
【請求項９０】
個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物であって、請求項59〜88のいずれか一項記載の組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項９１】
個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物であって、請求項59〜88のいずれか一項記載の組成物を含む、前記医薬組成物の使用。
【請求項９２】
個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のための医薬の製造における、請求項59〜88のいずれか一項記載の組成物を含む、H-NOXを含む組成物の使用。
【請求項９３】
ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOXの治療有効量及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXの治療有効量を含むキット。
【請求項９４】
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、請求項93記載のキット。
【請求項９５】
脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法で使用される、請求項93又は94記載のキット。
【請求項９６】
個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を治療する方法で使用される、請求項93〜95のいずれか一項記載のキット。
【請求項９７】
前記H-NOXが、前記脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する、請求項95又は96記載のキット。
【請求項９８】
前記個体が、前記脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果として、脳の持続的低灌流を示す、請求項95〜97のいずれか一項記載のキット。
【請求項９９】
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、該閉塞の部位又は該ペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、及び/又はマクロファージの活性化を低下させる、請求項95〜98のいずれか一項記載のキット。
【請求項１００】
閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達が、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する、請求項95〜99のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０１】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXとともに投与される、請求項93〜100のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０２】
前記H-NOXが、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比で送達される、請求項101記載のキット。
【請求項１０３】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが組成物中にある、請求項101又は102記載のキット。
【請求項１０４】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に又は順次送達される、請求項93〜103のいずれか一項記載のキット。
【請求項１０５】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが同時に送達される、請求項104記載のキット。
【請求項１０６】
前記PEGに共有結合しているH-NOX及び前記PEGに共有結合していないH-NOXが順次送達される、請求項104記載のキット。
【請求項１０７】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の前に投与される、請求項106記載のキット。
【請求項１０８】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与の後に投与される、請求項106記載のキット。
【請求項１０９】
前記PEGに共有結合しているH-NOXが、前記PEGに共有結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約24時間後、又は約24時間よりも長い時間の後に投与される、請求項108記載のキット。
【請求項１１０】
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、又は3日後のうちの1つ又は複数で投与される、請求項108記載のキット。
【請求項１１１】
前記PEGに結合しているH-NOXが、PEGに結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約1日後、及び約2日後に投与される、請求項108記載のキット。
【請求項１１２】
前記個体が哺乳動物である、請求項93〜111のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項112記載のキット。
【請求項１１４】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が同じH-NOXタンパク質に由来する、請求項93〜113のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１５】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が異なるH-NOXタンパク質に由来する、請求項93〜114のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１６】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14935-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである、請求項93〜115のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１７】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む、請求項93〜116のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１８】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が1以上の遠位ポケット突然変異を含む、請求項93〜117のいずれか一項記載のキット。
【請求項１１９】
前記遠位ポケット突然変異がT.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である、請求項118記載のキット。
【請求項１２０】
前記H-NOXが、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである、請求項118又は119記載のキット。
【請求項１２１】
前記位置144におけるアミノ酸置換がL144F置換である、請求項120記載のキット。
【請求項１２２】
前記PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は前記PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質が重合体型H-NOXタンパク質である、請求項93〜121のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２３】
前記重合体型H-NOXタンパク質が単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む、請求項122記載のキット。
【請求項１２４】
前記H-NOXドメインが前記重合ドメインに共有結合している、請求項123記載のキット。
【請求項１２５】
前記重合体型H-NOXタンパク質が三量体型H-NOXタンパク質である、請求項122〜124のいずれか一項記載のキット。
【請求項１２６】
前記三量体型H-NOXタンパク質が1以上の三量体化ドメインを含む、請求項125記載のキット。
【請求項１２７】
前記三量体型H-NOXタンパク質が3つの単量体を含み、ここで、該単量体がH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインがバクテリオファージT4三量体化ドメインである、請求項126記載のキット。
【請求項１２８】
前記三量体化ドメインがフォルドンドメインである、請求項126又は127記載のキット。
【請求項１２９】
前記フォルドンドメインが配列番号4のアミノ酸配列を含む、請求項128記載のキット。
【請求項１３０】
前記H-NOXタンパク質が免疫グロブリンのFcドメインに融合している、請求項93〜129のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３１】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつ該H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、請求項93〜130のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３２】
前記重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1nM〜約1000nMである、請求項93〜131のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３３】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約1μM〜約10μMである、請求項93〜132のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３４】
前記H-NOXタンパク質のO2解離定数が20℃で約10μM〜約50μMである、請求項93〜133のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３５】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性が20℃で約700s-1未満である、請求項93〜134のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３６】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い、請求項93〜135のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３７】
前記H-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い、請求項136記載のキット。
【請求項１３８】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.65s-1以下である、請求項93〜137のいずれか一項記載のキット。
【請求項１３９】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である、請求項93〜138のいずれか一項記載のキット。
【請求項１４０】
前記H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffが20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である、請求項93〜139のいずれか一項記載のキット。
【請求項１４１】
前記H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度が37℃で約1h-1未満である、請求項93〜140のいずれか一項記載のキット。
【請求項１４２】
使用のための指示をさらに含む、請求項93〜141のいずれか一項記載のキット。
【請求項１４３】
脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を治療するための組成物を調製する方法であって、PEGと共有結合しているH-NOXをPEGに共有結合していないH-NOXと混合することを含む、前記方法。
【請求項１４４】
PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比が、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、請求項143記載の方法。
【請求項１４５】
前記組成物が請求項59〜88のいずれか一項記載の組成物である、請求項143又は144記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、その開示があらゆる目的のために引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2016年2月16日に出願された米国仮特許出願第62/296,009号の恩典を主張する。
【０００２】
(ASCIIテキストファイルでの配列表の提出)
ASCIIテキストファイルでの以下の提出物の内容は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる:コンピュータ可読形態(CRF)の配列表(ファイル名: 627042001040SeqList.txt、記録日: 2017年2月16日、サイズ: 9KB)。
【０００３】
(連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する声明)
本研究は、1R43NS076272-01A1による支援を受けた。米国政府は、本出願に関して発行される任意の特許における権利を有する。
【０００４】
(技術分野)
本出願は、H-NOXタンパク質を用いて、臓器の損傷と関連する低酸素状態を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
(発明の背景)
H-NOXタンパク質(ヘム-一酸化窒素及び酸素(Heme-Nitric oxide and OXygen)結合ドメインに因み命名)は、高度に保存され、十分に特徴付けされたヘムタンパク質ファミリーのメンバーである(Iyer, LMらの文献(2003) BMC Genomics 4(1):5; Karow, DSらの文献(2004) Biochemistry 43(31):10203-10211; Boon, EMらの文献(2005) Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, EMらの文献(2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, EMらの文献(2005) J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902; Cary, SPらの文献(2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(37):13064-9; Karow DSらの文献(2005) Biochemistry 44(49):16266-74; Cary, SPらの文献(2006) Trends Biochem Sci 31(4):231-9; Boon, EMらの文献(2006) J Biol Chem 281(31):21892-902; Winger, JAらの文献(2007) J Biol Chem. 282(2):897-907)。H-NOXタンパク質は、これまでのヘモグロビンに基づく酸素担体とは異なって、一酸化窒素にニュートラル(nitric-oxide-neutral)であり、H-NOXは循環一酸化窒素を除去せず、したがって、高血圧を起こす副作用も腎臓への副作用も伴わない。内在性NOによるH-NOXタンパク質の不活性化の確率がより低く、かつH-NOXタンパク質による内在性NOの除去の確率がより低いことによる内因性の低NO反応性(及び高NO安定性)は、野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質を望ましい代用血液とする。重要なことに、一部のH-NOXタンパク質における遠位ポケットチロシンの存在(Pellicena, P.らの文献(2004) Proc Natl. Acad Sci USA 101(35): 12854-12859)は、望ましくない高NO反応性を示唆し、代用血液としての使用を禁忌とする。例えば、類推により、構造的に類似した遠位ポケットチロシンを有するヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)のヘモグロビンタンパク質は、NOと極めて迅速に反応し、この結核菌によって使用されて、感染宿主によって産生される防御的NOを効果的に除去及び回避する(Ouellet, H.らの文献(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99(9):5902-5907)。しかしながら、驚くべきことに、H-NOXタンパク質が、実際にはヘモグロビンのNO反応性よりもはるかに低いNO反応性を有することが分かり、代用血液としてのその使用が可能になった。
【０００６】
NOに結合するがO2に結合しないH-NOXタンパク質は、単一アミノ酸突然変異の導入により、NOとO2の両方に結合するH-NOXタンパク質に変換することができることが分かった(WO 2007/139791号及びWO 2007/139767号を参照)。したがって、O2及びNOに対するH-NOXタンパク質の親和性並びにO2リガンドとNOリガンドを識別するH-NOXタンパク質の能力は、1以上のアミノ酸突然変異を導入することにより改変することができ、H-NOXタンパク質を所望の親和性でO2又はNOに結合するように適合させることができる。さらなる突然変異を導入して、O2及び/又はNOに対する親和性をさらに改変することができる。したがって、H-NOXタンパク質ファミリーを、O2送達について改善された又は最適な動力学的特性及び熱力学的特性を示すように操作することができる。例えば、種々の臨床的及び産業的用途に対するH-NOXタンパク質の有用性を改善する、改変されたO2結合の解離定数及び/又は解離速度を有する突然変異体H-NOXタンパク質が作製されている。異なる「調整された」酸素親和性を有するH-NOX酸素結合タンパク質は、癌及び脳卒中などの広範囲の特定の低酸素/虚血状態に受け入れられる特性を有する一連のH-NOX酸素担体の構築を可能にしている。O2に結合して、それを送達するようにH-NOXタンパク質を調整する能力は、現在のO2担体の主要な弱点に対処し、それを克服する治療手段である。重合体型H-NOXタンパク質及び重合体型H-NOXタンパク質の使用方法は、WO 2014/107171号及びUS 20150273024A1号により提供される。
【０００７】
血管閉塞後、2つの主要な損傷域:速やかに死滅する梗塞コア、及び低酸素状態でかつ梗塞のリスクがある周囲ペナンブラが存在する。例えば、ペナンブラが梗塞するのを防ぐための血管再疎通(すなわち、血管内+/-IV tPA)による血流の再開は、救出可能な組織を呈する急性虚血性脳卒中患者の新たな標準治療になっている。しかしながら、全ての患者が再疎通によって恩恵を受けるわけではなく、ペナンブラは、再疎通が生じることができる前に、やはり梗塞を起こす。成功した又は部分的な再灌流にもかかわらず、救出されたペナンブラ内の二次性低酸素イベントは、不完全な臨床的回復の原因となり得る選択的ニューロン損失(SNL)を引き起こす可能性がある。H-NOXタンパク質を調整して、酸素を、特に、低酸素組織中で放出させ、低酸素状態を軽減して、再灌流したペナンブラ内での望ましくない結果を予防することができる。ある特定の治療的用途に必要とされるのは、臓器損傷(例えば、脳損傷)と関連する低酸素ペナンブラを透過して、O2を送達し、臓器損傷を有する個体の臓器(例えば、脳)の機能及び全体的な健康を改善し得るH-NOXである。
【０００８】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用されている全ての参考文献は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００９】
(発明の概要)
いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、脳卒中後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、N-NOXが、ポリエチレングリコールに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、脳卒中は、虚血性脳卒中又は出血性脳卒中である。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明は、個体の一過性虚血発作を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、一過性虚血発作後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明は、個体の低酸素脳損傷を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。
【００１２】
上記の態様のいくつかの実施態様において、H-NOXは、脳卒中と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、一過性虚血発作と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する。いくつかの実施態様において、H-NOXの投与は、低酸素ペナンブラにおける炎症を軽減する。いくつかの実施態様において、個体は、脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果として、脳の持続的低灌流を示す。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、該閉塞の部位又は該ペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、及び/又はマクロファージの活性化を低下させる。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する。
【００１３】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXは、PEGに共有結合していないH-NOXとともに投与される。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比は、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは、組成物中にある。
【００１４】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本方法のPEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは同時に又は順次送達される。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは同時に送達される。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは順次送達される。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXは、PEGに共有結合していないH-NOXの投与の前に投与される。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXは、PEGに共有結合していないH-NOXの投与の後に投与される。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXは、PEGに共有結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約24時間後、又は約24時間よりも長い時間の後に投与される。いくつかの実施態様において、PEGに結合しているH-NOXは、PEGに結合していないH-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、又は3日後のうちの1つ又は複数で投与される。いくつかの実施態様において、PEGに結合しているH-NOXは、PEGに結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約1日後、及び約2日後に投与される。
【００１５】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本方法の個体は哺乳動物である。いくつかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００１６】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本方法のPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及びPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、同じH-NOXタンパク質に由来する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、異なるH-NOXタンパク質に由来する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシス(T. tengcongensis) H-NOX、L.ニューモフィラ2群(L. pneumophilia 2) H-NOX、ヒト(H. sapiens) β1、ラット(R. norvegicus) β1、タイリクオオカミ(C. lupus) H-NOX、キイロショウジョウバエ(D. melangaster) β1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫(C. elegans) GCY-35、N.パンクチフォルム(N. punctiforme) H-NOX、C.クレセンツス(C. crescentus) H-NOX、S.オネイデンシス(S. oneidensis) H-NOX、又はC.アセトブチリクム(C. acetobutylicum) H-NOXである。
【００１７】
いくつかの実施態様において、本方法のPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又はPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、1以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、該遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様において、該H-NOXは、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである。いくつかの実施態様において、位置144におけるアミノ酸置換はL144F置換である。
【００１８】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本方法のPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又はPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は1以上の三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は3つの単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインはバクテリオファージT4三量体化ドメインである。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインはフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、フォルドンドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXは、三量体型のT.テングコンジェンシスL144F H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXは、三量体型のT.テングコンジェンシスL144F H-NOXタンパク質であり、ここで、該三量体のうちの1つ、2つ、又は3つ全ての単量体は、配列番号8に示される配列を含む。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質は免疫グロブリンのFcドメインに融合している。
【００１９】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつH-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、方法を提供する。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1nM〜約1000nMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1μM〜約10μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約10μM〜約50μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性は20℃で約700s-1未満である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.65s-1以下である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は37℃で約1h-1未満である。
【００２０】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXが別の療法と組み合わせて投与される方法を提供する。いくつかの実施態様において、他の療法は、組織プラスミノーゲン活性化因子及び/又は再疎通又は神経保護物質による治療である。いくつかの実施態様において、H-NOX投与は、他の治療の前、その間、又はその後に行われる。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、H-NOXの治療有効量を含む組成物であって、該H-NOXがポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、組成物を提供する。いくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比は、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である。
【００２２】
いくつかの実施態様において、本組成物のPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及びPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、同じH-NOXタンパク質に由来する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、異なるH-NOXタンパク質に由来する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである。
【００２３】
いくつかの実施態様において、本組成物のPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又はPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、1以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、該遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様において、該H-NOXは、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである。いくつかの実施態様において、位置144におけるアミノ酸置換はL144F置換である。
【００２４】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又はPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、該H-NOXドメインは重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は1以上の三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は3つの単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインはバクテリオファージT4三量体化ドメインである。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインはフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、フォルドンドメインは配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXは、三量体型のT.テングコンジェンシスL144F H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXは、三量体型のT.テングコンジェンシスL144F H-NOXタンパク質であり、ここで、該三量体のうちの1つ、2つ、又は3つ全ての単量体は配列番号8に示される配列を含む。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質は免疫グロブリンのFcドメインに融合している。
【００２５】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつH-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、組成物を提供する。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1nM〜約1000nMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1μM〜約10μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約10μM〜約50μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性は20℃で約700s-1未満である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.65s-1以下である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は37℃で約1h-1未満である。
【００２６】
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載される方法による個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物であって、本明細書に記載される組成物を含む、医薬組成物を提供する。
【００２７】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のためのH-NOXを含む医薬組成物であって、本明細書に記載される組成物のいずれかを含む、医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載される組成物のいずれかを含む、H-NOXを含む組成物の使用を提供する。
【００２８】
いくつかの実施態様において、本発明は、ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOXの治療有効量及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXの治療有効量を含むキットを提供する。いくつかの実施態様において、該キットのPEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比は、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である。いくつかの実施態様において、該キットは、脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法で使用される。いくつかの実施態様において、該キットは、個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を治療する方法で使用される。いくつかの実施態様において、該H-NOXは、脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラにO2を送達する。いくつかの実施態様において、個体は、脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果として、脳の持続的低灌流を示す。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、該閉塞の部位又は該ペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、及び/又はマクロファージの活性化を低下させる。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は脳卒中、一過性虚血発作、もしくは低酸素脳損傷と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXは、該PEGに共有結合していないH-NOXとともに投与される。
【００２９】
いくつかの実施態様において、該キットのH-NOXは、約9:1、約8:2、約7:3、約6:4;約5:5;約4:6;約3:7;約2:8;又は約1:9である、PEGに共有結合しているH-NOXとPEGに共有結合していないH-NOXの比で送達される。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び該PEGに共有結合していないH-NOXは、組成物中にある。
【００３０】
いくつかの実施態様において、該キットのPEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは同時に又は順次送達される。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは同時に送達される。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXは順次送達される。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXは、該PEGに共有結合していないH-NOXの投与の前に投与される。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXは、該PEGに共有結合していないH-NOXの投与の後に投与される。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXは、該PEGに共有結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約24時間後、又は約24時間よりも長い時間の後に投与される。いくつかの実施態様において、該PEGに結合しているH-NOXは、該PEGに結合していないH-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、又は3日後のうちの1つ又は複数で投与される。いくつかの実施態様において、該PEGに結合しているH-NOXは、該PEGに結合していないH-NOXの投与から約1時間後、約1日後、及び約2日後に投与される。
【００３１】
いくつかの実施態様において、該キットは、個体で使用するためのものであり、ここで、該個体は哺乳動物である。いくつかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００３２】
いくつかの実施態様において、該キットのPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及びPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、同じH-NOXタンパク質に由来する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、異なるH-NOXタンパク質に由来する。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである。
【００３３】
いくつかの実施態様において、該キットのPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又はPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、1以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、該遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様において、該H-NOXは、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである。いくつかの実施態様において、位置144におけるアミノ酸置換はL144F置換である。
【００３４】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、該キットのPEGに共有結合しているH-NOXタンパク質及び/又はPEGに共有結合していないH-NOXタンパク質は、重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、該H-NOXドメインは重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は1以上の三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は3つの単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインはバクテリオファージT4三量体化ドメインである。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインはフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、フォルドンドメインは配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXは、三量体型のT.テングコンジェンシスL144F H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、該PEGに共有結合しているH-NOX及び/又は該PEGに共有結合していないH-NOXは、三量体型のT.テングコンジェンシスL144F H-NOXタンパク質であり、ここで、該三量体のうちの1つ、2つ、又は3つ全ての単量体は配列番号8に示される配列を含む。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質は免疫グロブリンのFcドメインに融合している。
【００３５】
上記の態様及び実施態様のいくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXタンパク質のO2解離定数がヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつH-NOXタンパク質のNO反応性がヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い、キットを提供する。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1nM〜約1000nMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1μM〜約10μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約10μM〜約50μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性は20℃で約700s-1未満である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.65s-1以下である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は37℃で約1h-1未満である。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明は、個体の組織低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、低酸素ストレス下の個体の低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の組織低酸素状態の結果を軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、低酸素ストレスの結果は、細胞機能の喪失及び/又は細胞死である。いくつかの実施態様において、細胞機能の喪失及び/又は細胞死は、臓器(例えば、脳)及び/又は身体の機能不全をもたらす。
【００３７】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は点滴によって個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約10mg/kg〜約400mg/kgの用量で投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約10ml〜約1Lの容量で送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、急速静注として、約30分未満の期間にわたって送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、点滴によって、約30分〜約7日の期間にわたって送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、低酸素組織に直接投与されるか、又は全身に(例えば、静脈内に)投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、急速静注によって個体に投与され、その後、点滴によって、約30分〜約7日の期間にわたって個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、点滴によって、約1時間、3時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、又は7日よりも長い時間にわたって個体に投与される。
【００３８】
いくつかの実施態様において、低酸素組織は低灌流を示す。いくつかの実施態様において、低酸素組織は血管閉塞又は出血と関連する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、臓器損傷(例えば、脳損傷)又は四肢損傷と関連する低酸素ペナンブラにおける低酸素状態を軽減する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器(例えば、脳)又は四肢における低酸素状態の結果を軽減する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器又は四肢における低酸素状態と関連する細胞死及び機能不全を軽減する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、低酸素組織の炎症を軽減する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器又は四肢と関連する低酸素ペナンブラの炎症を軽減する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器及び/又は損傷した臓器もしくは四肢と関連する低酸素ペナンブラにおける炎症細胞の活性化を低下させる。いくつかの実施態様において、該炎症細胞は、マクロファージ、T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、好中球、単球、好酸球、好塩基球、及び/又はミクログリアである。
【００３９】
いくつかの実施態様において、臓器は、筋骨格系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、循環系、生殖系、神経系の臓器であるか、又は皮膚もしくは内分泌腺である。いくつかの実施態様において、臓器は、脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、又は肺である。いくつかの実施態様において、低酸素組織は、脳卒中、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、新興脳卒中、又は一過性虚血発作の結果である。
【００４０】
いくつかの実施態様において、個体は哺乳動物である。いくつかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施態様において、哺乳動物は、ペット、実験用研究動物、又は家畜である。いくつかの実施態様において、ペット、研究動物、又は家畜は、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタ、又はウシである。
【００４１】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXは、1以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、該遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様において、該H-NOXは、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである。いくつかの実施態様において、位置144におけるアミノ酸置換はL144F置換である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は1以上の三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は3つの単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインはバクテリオファージT4三量体化ドメインである。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインはフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、ここで、フォルドンドメインは配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は免疫グロブリンのFcドメインに融合している。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質はポリエチレングリコールに共有結合している。
【００４２】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のO2解離定数はヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつH-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1nM〜約1000nMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1μM〜約10μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約10μM〜約50μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性は20℃で約700s-1未満である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.65s-1以下である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は37℃で約1h-1未満である。
【００４３】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、医薬組成物中にある。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかによる個体の臓器(例えば、脳)の低酸素損傷の治療のためのH-NOXタンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００４４】
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかによる個体の臓器(例えば、脳)の低酸素損傷の治療のためのH-NOXタンパク質を含む医薬組成物の使用を提供する。
【００４５】
いくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXタンパク質を含む医薬組成物を含むキットであって、該H-NOXタンパク質が本明細書に記載される方法のいずれかで使用するためのものである、キットを提供する。
【００４６】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳の組織低酸素状態に対する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を別の療法と併せて投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、他の療法の前、その間、又はその後に送達される。いくつかの実施態様において、低酸素組織は、個体の脳卒中と関連する。いくつかの実施態様において、他の療法は、閉塞血管の化学的又は機械的再疎通である。いくつかの実施態様において、他の療法は、組織プラスミノーゲン活性化因子の投与である。
【００４７】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の急速静注を投与し、その後、該個体にH-NOXの点滴を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約1時間、3時間、6時間、12時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、又は7日よりも長い期間にわたって、点滴によって送達される。いくつかの実施態様において、点滴は、H-NOXの急速静注が個体に投与された直後、又はH-NOXの急速静注が個体に投与されてから約1、2、3、4、5、もしくは6時間後に開始される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、別の療法と併せて送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、他の療法の前、その間、又はその後に、急速静注及び/又は点滴によって送達される。いくつかの実施態様において、他の療法は、組織プラスミノーゲン活性化因子の投与又は機械的装置を用いた閉塞血管の再疎通である。いくつかの実施態様において、他の療法は、組織プラスミノーゲン活性化因子の投与である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、全身に(例えば、静脈内に、筋肉内に、皮下に)、閉塞の部位に(例えば、頭蓋内に)、脳に、又はCSFに送達される。
【００４８】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中後のペナンブラにO2を送達する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXの治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。
【００４９】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の低酸素脳損傷を治療する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、低酸素脳損傷を有する個体に酸素を送達する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【００５０】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の一過性虚血発作を治療する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、一過性虚血発作後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【００５１】
いくつかの実施態様において、本発明は、脳卒中後の個体の血管閉塞又は出血と関連する低酸素ペナンブラにおける炎症を軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【００５２】
いくつかの実施態様において、個体は、脳卒中、低酸素脳損傷、一過性虚血発作、脳血管攣縮、又は脳動脈瘤修復の結果として、脳の持続的低灌流を示す。
【００５３】
いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は閉塞の部位と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、閉塞の部位又は閉塞の部位と関連するペナンブラにおけるアストロサイト、ミクログリア、マクロファージの活性化、及びニューロンの損傷/死を低下させる。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は閉塞の部位と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、梗塞体積を低下させる。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は閉塞の部位と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、脳卒中、低酸素脳損傷、一過性虚血発作、脳血管攣縮、又は脳動脈瘤修復と関連する感覚運動障害を軽減する。
【００５４】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳の低酸素組織のリスクを軽減する方法であって、脳で低酸素組織を発生させるリスクのある個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、脳で低酸素組織を有するリスクのある個体に酸素を送達する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、脳で低酸素組織を有するリスクのある個体は、脳卒中のリスクがある。いくつかの実施態様において、脳卒中のリスクがある個体は、一過性虚血発作又は脳血管攣縮又は脳動脈瘤修復を経験したことがある。
【００５５】
いくつかの実施態様において、個体は哺乳動物である。いくつかの実施態様において、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施態様において、哺乳動物は、ペット、実験用研究動物、又は家畜である。いくつかの実施態様において、ペット、研究動物、又は家畜は、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタ、又はウシである。
【００５６】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスH-NOX、L.ニューモフィラ2群H-NOX、ヒトβ1、ラットβ1、タイリクオオカミH-NOX、キイロショウジョウバエβ1、キイロショウジョウバエCG14885-PA、線虫GCY-35、N.パンクチフォルムH-NOX、C.クレセンツスH-NOX、S.オネイデンシスH-NOX、又はC.アセトブチリクムH-NOXである。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、配列番号2に示されるT.テングコンジェンシスのH-NOXドメインに対応するH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXは、1以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、該遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する部位におけるアミノ酸置換である。いくつかの実施態様において、H-NOXは、位置144におけるアミノ酸置換を含むT.テングコンジェンシスH-NOXである。いくつかの実施態様において、位置144におけるアミノ酸置換はL144F置換である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは重合ドメインに共有結合している。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は1以上の三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は3つの単量体を含み、ここで、該単量体はH-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含み、ここで、該三量体化ドメインはバクテリオファージT4三量体化ドメインである。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインはフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、ここで、フォルドンドメインは配列番号4のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は免疫グロブリンのFcドメインに融合している。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質はポリエチレングリコールに共有結合している。
【００５７】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のO2解離定数はヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内であり、かつH-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも10倍低い。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1nM〜約1000nMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約1μM〜約10μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のO2解離定数は20℃で約10μM〜約50μMである。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性は20℃で約700s-1未満である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも100倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のNO反応性はヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも1,000倍低い。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.65s-1以下である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは20℃で約1.35s-1〜約2.9s-1である。いくつかの実施態様において、該H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は37℃で約1h-1未満である。
【００５８】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、医薬組成物中にある。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体をさらに含む。いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載される脳の低酸素状態を治療する方法のいずれかによる個体の脳の低酸素状態の治療のためのH-NOXタンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかによる個体の脳の低酸素状態の治療のためのH-NOXタンパク質を含む医薬組成物の使用を提供する。
【００６０】
いくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXタンパク質を含む医薬組成物を含むキットであって、該H-NOXタンパク質が、本明細書に記載される脳の低酸素状態を治療する方法のいずれかで使用するためのものである、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
(図面の簡単な説明)
【図１】図1Aは、MCAの近くにET1を頭蓋内注射した後のrCBFの変化の代表例を示している。レーザードップラーフローメトリーを、麻酔した動物に対して、非侵襲的VP5プローブ及びメジャーを用いて、〜7時間実施した。
【００６２】
図1Bは、若い(3カ月齢)又は高齢(7〜10カ月齢)ラットにおけるET1注射後のビヒクル又はH-NOX(三量体型H-NOX L144F)の投与前のrCBF測定を示している。ET1注射は、ベースライン値と比べて、平均〜60％のrCBF減少をもたらした。平均＋SEM、n＝15〜25匹/群、対応のないt-検定により、***p＜0.001。
【００６３】
【図２】図2Aは、ピモニダゾール染色を用いた、ラットET1誘導性tMCAOモデルにおける低酸素組織評価の検出を示している。条件当たりn＝3〜4匹のラット。
【００６４】
図2B及び2Gは、tMCAO後の低酸素状態及び梗塞形成の評価を示している。動物をtMCAOから1時間〜7日後に屠殺し、脳を、抗ピモニダゾール抗体(低酸素体積)又はクレシルバイオレット染色(梗塞体積)を用いる組織学的検査(図2B)又はELISA(図2C)用に処理した。クレシルバイオレット陰性かつピモニダゾール陽性の部分を1mm毎の9つの座標高度にわたる切片で定量した。平均＋SEM、組織学的検査については、n＝5匹/群; ELISAについては、1群当たりn＝10匹。
【００６５】
図2C〜2Fは、ET1 tMCAOモデルにおけるニューロンの死滅及びグリオーシスの評価を示している。動物をtMCAOから1〜7日後に屠殺した。脳切片を、NeuN(ニューロン)、FluoroJade(FJ; 神経変性)、ED1(活性化ミクログリア/マクロファージ)、及びGFAP(アストロサイト)を用いて染色した。NeuN+細胞(図2C)、FJ+細胞(図2D)、及びED1+細胞(図2E)の数をカウントし、GFAPシグナルで被覆された面積のパーセント(図2F)を梗塞周囲部分に位置する皮質の2つの非重複領域中の座標高度当たり8つの切片で測定した。平均＋SEM。n＝6〜10匹/群。
【００６６】
【図３】図3は、5-パラメータフィッティングモデルを用いてELISAにより定量したときの、ラットにおける静脈内注射後のH-NOX(三量体型H-NOX L144F)及びH-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)の血漿レベルを示している。
【００６７】
【図４】図4A及び4Bは、ラットにおけるET1誘導性tMCAO後の破壊された血管系を通した脳実質へのH-NOX(三量体型H-NOX L144F)及びH-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)の浸出を示している。単一用量のH-NOX又はH-NOXP(400mg/kg)をtMCAO開始から1時間後に投与し、動物を閉塞から2時間(図4A)〜24時間(図4B)で安楽死させた。切片を抗H-NOX抗体及び抗CD31(内皮細胞)抗体で染色した。H-NOXは、開始から2時間後に、血管系の外に漏出した。H-NOXPは、tMCAO後、少なくとも1日間、ペナンブラに蓄積し、漏れがあるBBBを越えて浸出し、最大1日間存続した(梗塞周囲のパネル)。対照的に、H-NOXPは、正常脳組織では無傷の血管系に残存していた(正常脳のパネル)。
【００６８】
【図５】図5は、H-NOX(三量体型H-NOX L144F)(左のパネル)又はH-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)(右のパネル)の投与後の低酸素組織中の酸素の検出を示している。H460皮下異種移植片腫瘍を担持するマウスを、腫瘍体積が〜400から600mm3に達したとき(腫瘍細胞皮下移植から〜10から18日後)に使用した。ポリマーマトリックス中に保持された塩化ルテニウム色素からなる先端直径230μmの4チャンネル光ファイバー酸素感知装置(OxyLite(商標)、Oxford Optronix, UK)を用いて、p02をH460腫瘍で測定した。プローブ移植後、H-NOX又はPEG化H-NOX L144FをIV又は腫瘍内注射し、蛍光クエンチングを時間の関数として記録した。
【００６９】
【図６】図6は、ビヒクル(Veh)又はH-NOX(三量体型H-NOX L144F)＋H-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)の1:1混合物を投与してから6時間後のラットET1 tMCAO及び永久MCAOモデル(上のパネル)並びにヒツジ心筋低酸素状態モデル(下のパネル)におけるピモニダゾールELISAにより定量された低酸素レベルの結果を示している。ヒツジについてのピモニダゾールの免疫組織化学染色の代表的写真が下のパネルに示されている。
【００７０】
【図７】図7A及び7Bは、ET1誘導性tMCAO後の低酸素組織喪失の防止を示している。H-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)(240mg/kg)又はビヒクル(Veh)を閉塞から1時間後に投与し、24時間毎に3日間繰り返した。tMCAOから1〜7日後の梗塞体積をクレシルバイオレット染色を用いる組織学的検査により定量した(図7A)。各々の切片について、各々の半球の総面積及び梗塞面積をImageJを用いて測定し、梗塞体積を浮腫について補正した。平均±SEM。n＝8〜10匹、7日目の対応のないt-検定により、p＝0.05。tMCAOから1〜7日後の梗塞及び低酸素組織体積をクレシルバイオレット及びピモニダゾール染色により定量した(図7B)。平均±SEM。Veh＝12匹/群; H-NOXP＝6匹/群。7日目: Veh対H-NOXP、対応のないt-検定により、p＝0.05。
【００７１】
【図８】図8A〜8Cは、ET1誘導性tMCAOから6時間後の低酸素状態及び細胞死に対するH-NOXの効果を示している。H-NOX(三量体型H-NOX L144F)＋H-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)の1:1混合物(120mg/kgもしくは240mg/kg)又はビヒクル(Veh)をtMCAOから30分後に投与した。ラットを、ピモニダゾールについて、ELISAによりアッセイするか(図8A)、又はカスパーゼ9活性について、ルミノメトリーアッセイ(Promega)によりアッセイした(図8B)。Veh: n＝20匹; 120mg/kg: n＝10匹; 240mg/kg: n＝8匹。平均＋SEM。一元配置ANOVA及びスチューデントのt検定により、***p＜0.001、**p＜0.01、*p＜0.05。H-NOXPのみ(240mg/kg)をtMCAOから1時間後に投与し、脳を閉塞から6時間後に摘出し、ピモニダゾールレベルについて、ELISAによりアッセイした(図8C)。平均±SEM。n＝6〜7匹/群。
【００７２】
【図９】図9は、ET1誘導性tMCAOから7日後のH-NOXにより媒介される炎症の減少を示している。ビヒクル(Veh)又はH-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)(240mg/kg)を閉塞から1時間後に投与し、投与を24時間毎に3日間繰り返した。ラットをtMCAOから7日後に屠殺した。切片を抗GFAP(アストロサイト)並びに抗ED1(活性化ミクログリア及びマクロファージ)について染色した。ED1+細胞をカウントし、GFAPの面積パーセントを切片にわたって測定した。平均±SEM。n＝6〜7匹/群。スチューデントのt検定により、*p＜0.05。
【００７３】
【図１０】図10は、tMCAOから1時間後にH-NOX(三量体型H-NOX L144F)(400mg/kg)又はビヒクル対照(Veh)のいずれかが投与され、投与が24時間毎に3日間繰り返された高齢ラットにおけるMCAOから29日後の梗塞周囲部分のNeuN及びGFAPの免疫組織化学染色を示している。ニューロン密度(NeuN+細胞により示される)を、GFAPシグナルが存在する梗塞周囲部分に位置する皮質の2つの非重複領域中の高度(1mm毎)当たり8つの座標にわたる切片で定量した。平均＋SEM。n＝6〜7匹/群。スチューデントのt検定により、*p＜0.05。
【００７４】
【図１１】図11は、tMCAOから1時間後にH-NOX(三量体型H-NOX L144F)(400mg/kg)又はビヒクル(Veh)が投与され、投与が24時間毎に3日間繰り返された高齢ラットにおける感覚機能及び運動機能を調べる粘着除去アッセイの結果を示している。検出待ち時間を、tMCAO後、1日目、6日目、13日目、及び29日目に記録した。二元配置反復測定ANOVAにより、*p＜0.05。Bsl＝ベースライン。ボンフェローニ事後検定解析により、6日目及び13日目のH-NOX群とビヒクル群が有意に異なることが示された。運動機能性能を、tMCAOから13日後、75秒以内にテープを除去するのに成功したラットのパーセンテージにより評価した。含まれたラットは全て、障害のない足のテープを除去するのに成功した(図示せず)。Veh(n＝12)、H-NOX(n＝9)。平均＋SEM。両側仮説を伴うフィッシャーの正確確率検定により、*p＜0.05。擬似動物は、有意な感覚運動障害を示さなかった(図示せず)。
【００７５】
【図１２】図12は、tMCAOから2時間後にH-NOX(三量体型H-NOX L144F)(240mg/kg)又はビヒクル(Veh)が投与され、投与が24時間毎に3日間繰り返された高齢ラットにおける運動機能を調べる粘着除去アッセイの結果を示している。除去待ち時間(秒)を、tMCAO後、1日目、3日目、10日目、24日目、及び28日目に記録した。二元配置反復測定ANOVAにより、*p＜0.05。運動機能性能を、tMCAOから20日後、60秒以内にテープを除去するのに成功したラットのパーセンテージにより評価した。含まれたラットは全て、障害のない足のテープを除去するのに成功した(図示せず)。ビヒクル(n＝15)、H-NOX(n＝21)。平均±SEM。二元配置ANOVA反復測定(除去待ち時間)により、*p＜0.05、かつ両側仮説を伴うフィッシャーの正確確率検定(除去成功)により、*p＜0.05。擬似手術を受けた動物は、有意な感覚運動障害を示さなかった(図示せず)。
【００７６】
【図１３】図13A及び13Bは、自発的再灌流時のtMCAOから6時間後のフリーラジカルに対するH-NOXの効果を示している。H-NOX(三量体型H-NOX L144F)＋H-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)(400mg/kg)の1:1混合物をtMCAOから1時間後に投与し、脳を、tMCAOから6時間後に、タンパク質カルボニル含量(図13A)については、ELISA(OxiSelect(商標))により、脂質過酸化(図13B)については、TBARsアッセイ(Cayman)によりアッセイした。これらは、酸化的ストレスの指標として広く受け入れられている2つのマーカーである。平均＋SEM、n＝6〜8匹のラット/群、ns:スチューデントのt検定により有意でない。C:対側、I:同側。
【００７７】
【図１４】図14は、ビヒクル対照(Veh)又はH-NOX(三量体型H-NOX L144F)＋H-NOXP(PEG化三量体型H-NOX L144F)の過剰な1:1混合物(tPAの量の100倍)が添加されるインビトロtPA活性アッセイを示している。
【００７８】
【図１５】図15は、H-NOXが脳卒中と関連する脳の低酸素状態を治療する可能性を示す模式図を示している。
【００７９】
【図１６】図16A及び16Bは、永久MCAO(pMCAO)モデルにおける梗塞体積及び低酸素状態を示している。梗塞体積をTTC染色でアッセイし(図16A)、低酸素状態をピモニダゾール染色で測定した(図16B)。各々のTTC染色切片(2mm毎の6つの切片)について、各々の半球の総面積及び梗塞面積をImageJを用いて測定した。浮腫について補正した梗塞体積を計算した。平均+/-SEM(n＝4)。屠殺する2時間前に、ピモニダゾール(60mg/kg)をi.v.注射し、脳を抗ピモニダゾール(pimonoidazole)抗体で染色するか、又は組織をELISAにより解析した。
【００８０】
【図１７】図17A及び17Bは、pMCAOモデルにおけるH-NOX(三量体型H-NOX L144F)の投与の結果を示している。H-NOX(240mg/kg)を閉塞から1時間後に投与した。動物をpMCAOから2時間後に安楽死させ、脳切片を抗H-NOX及び抗CD31抗体で染色するか(図17A)、又はpMCAOから6時間後に安楽死させ、脳を摘出し、ピモニダゾールについては、ELISAにより、カスパーゼ9活性については、ルミノメトリーによりアッセイした。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
(発明の詳細な説明)
いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合しているH-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の一過性虚血発作を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の低酸素脳損傷を治療する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。低酸素脳損傷には、脳の低酸素脳損傷、血管閉塞、及び出血が含まれるが、これらに限定されない。理論に束縛されるものではないが、PEGに結合していないH-NOXが、虚血性傷害後に低酸素部位へのO2の迅速な送達をもたらすのに対し、PEGに結合しているH-NOXは、低酸素組織中に蓄積し、より長期間のO2の送達をもたらして、低酸素組織の梗塞を軽減する。驚くことに、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの混合物は、脳で活性酸素種(ROS)を増大させない。脳卒中後の脳にO2を送達する過去の試みは、再灌流状況でROSを増大させることを示している(Thom, SRの文献、1985, J Appl Physiol. 106(3):988-995)。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明は、脳卒中後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、N-NOXが、ポリエチレングリコールに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、一過性虚血発作後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を投与することを含み、ここで、該H-NOXが、PEGに共有結合しているH-NOX及びPEGに共有結合していないH-NOXを含む、方法を提供する。
【００８３】
本発明は、少なくとも一部は、H-NOXタンパク質が血液脳関門から浸出し、低酸素組織に優先的に蓄積するという驚くべき発見に基づいており、それにより、臓器損傷(例えば、脳損傷)と関連する低酸素組織を酸素化する方法を提供するものである。ほとんどの薬剤は血液脳関門を横断しないので、これは驚くべきことであった。いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器(例えば、脳)の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、低酸素ストレス下の個体の臓器の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器(例えば、脳)の損傷と関連する低酸素状態の結果を軽減する方法であって、該個体(例えば、感覚運動障害、運動障害、認知障害、発話障害など)にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を別の療法と併せて投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の急速静注を投与し、その後、該個体にH-NOXの点滴を投与することを含む、方法を提供する。したがって、本発明は、臓器(例えば、脳)の損傷と関連する低酸素状態の後に酸素を送達するためのタンパク質、組成物、キット、及び方法を提供する。
【００８４】
(定義)
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味である。当業者はまた、本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料を用いて、本発明を実施又は試験することもできることを理解しているであろう。
【００８５】
本明細書における使用のために、別途明白に指示されない限り、「a」、「an」などの用語の使用は、1つ又は複数を指す。
【００８６】
本出願において、「又は」の使用は、当業者によって明示的に記述又は理解されない限り、「及び/又は」を意味する。複数の従属クレームの文脈において、「又は」の使用は、複数の先行する独立又は従属クレームを遡って指す。
【００８７】
本明細書における「約」値又はパラメータに対する言及は、その値又はパラメータ自体に関する実施態様を含む(記載する)。例えば、「約X」に言及する記載は、「X」の記載を含む。
【００８８】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
【００８９】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すために互換的に使用されており、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基の重合体は、天然又は非天然アミノ酸残基を含有することができ、かつアミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び重合体を含むが、これらに限定されない。全長タンパク質とその断片の両方が、この定義によって包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する欠失、付加、及び置換(一般に、保存的な性質のもの)などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるもののように、計画的なものであってもよく、又はタンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはPCR増幅によるエラーによるものなどの、偶発的なものであってもよい。本明細書で使用される場合、タンパク質は、共有結合的又は非共有結合的に会合した2以上のサブユニットを含むことができ;例えば、タンパク質は、2以上の会合した単量体を含むことができる。
【００９０】
「核酸分子」、「核酸」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用されることができ、かつヌクレオチドの重合体を指す。そのようなヌクレオチドの重合体は、天然及び/又は非天然ヌクレオチドを含有することができ、かつDNA、RNA、及びPNAを含むが、これらに限定されない。「核酸配列」は、核酸分子又はポリヌクレオチドを含むヌクレオチドの線状配列を指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「H-NOXタンパク質」は、H-NOXドメイン(ヘム-一酸化窒素及び酸素(Heme-Nitric oxide and OXygen)結合ドメインに因み命名)を有するタンパク質を意味する。H-NOXタンパク質は、H-NOXドメインに加えて、1以上の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。いくつかの例において、H-NOXタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。H-NOXタンパク質は、重合ドメインを含んでも含まなくてもよい。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「重合体型H-NOXタンパク質」は、2以上のH-NOXドメインを含むH-NOXタンパク質である。H-NOXドメインは、共有結合的又は非共有結合的に会合していてもよい。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「H-NOXドメイン」は、ヘムによって一酸化窒素及び/又は酸素に結合するタンパク質の全体又は一部である。H-NOXドメインは、ヘムを含むことができるか、又はヘムに結合することができるアポプロタンパク質として見出すことができる。いくつかの例において、H-NOXドメインは、6つのアルファ-ヘリックスと、それに続く、2つのベータ鎖と、それに続く、1つのアルファ-ヘリックスと、それに続く、2つのベータ鎖を含む。いくつかの例において、H-NOXドメインは、配列番号2に示されるサーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOXのH-NOXドメインに対応する。例えば、H-NOXドメインは、配列番号2に示されるサーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOXのH-NOXドメインと少なくとも約10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％同一であり得る。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、配列番号2に示されるサーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOXのH-NOXドメインと10％〜20％、20％〜30％、30％〜40％、40％〜50％、50％〜60％、60％〜70％、70％〜80％、80％〜90％、90％〜95％、95％〜99％、又は100％同一であり得る。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「重合ドメイン」は、単量体部分の会合を促進して、重合体構造を形成させるドメイン(例えば、ポリペプチドドメイン)である。例えば、重合ドメインは、単量体型H-NOXドメインの会合を促進して、重合体型H-NOXタンパク質を生成させることができる。例示的な重合ドメインは、三量体型ポリペプチドの形成を促進する、T4バクテリオファージのフォルドンドメインである。重合ドメインの他の例としては、Arc、POZ、コイルドコイルドメイン(GCN4、ロイシンジッパー、Velcroを含む)、ウテログロビン、コラーゲン、3本鎖コイルドコイル(マトリリン-1)、トロンボスポリン、TRPV1-C、P53、Mnt、アバジン(avadin)、ストレプトアビジン、Bcr-Abl、COMP、ベロ毒素サブユニットB、CamKII、RCK、及びNエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、STM3548、KaiC、TyrR、Hcp1、CcmK4、GP41、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、a-ヘモリジン、C4b結合タンパク質、Mi-CK、アリールスルファターゼA、及びウイルスカプシドタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸リンカー配列」又は「アミノ酸スペーサー配列」は、タンパク質の2つのドメインを連結するのに使用し得る短いポリペプチド配列である。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカー配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列としては、Gly-Ser-Gly配列及びArg-Gly-Ser配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「His6タグ」は、ポリペプチドに結合した6つのHis残基を含むペプチドを指す。His6タグを用いて;例えば、His6タグに特異的なクロマトグラフィーを用いて、タンパク質精製を容易にすることができる。精製後、His6タグは、エキソペプチダーゼを用いて切断することができる。
【００９７】
本明細書で使用される場合の「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、当業者が、2以上の数値間の差を、該値によって評価される生物学的特徴との関連において生物学的及び/又は統計学的有意性がほとんど又は全くないとみなすような、該2以上の値間の十分に高い類似度を表す。いくつかの実施態様において、2以上の実質的に同様の値は、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、又は約50％のうちのいずれか1つ以下だけ異なる。
【００９８】
本明細書で使用される場合の「実質的に低下した」又は「実質的に異なる」という語句は、当業者が、2つの数値間の差を、該値によって評価される生物学的特徴との関連において統計学的有意性があるとみなすような、該2つの数値間の十分に高い相違度を表す。いくつかの実施態様において、2つの実質的に異なる数値は、約10％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約70％、約80％、又は約90％のうちの約いずれか1つを超えて異なる。いくつかの実施態様において、2つの実質的に異なる数値は、約10％〜20％、約20％〜30％、約30％〜40％、約40％〜50％、約50％〜60％、約60％〜70％、約70％〜80％、約80％〜90％、約90％〜95％、約95％〜99％、又は約100％のうちのいずれか1つだけ異なる。
【００９９】
「ネイティブ配列」ポリペプチドは、自然に見出されるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。したがって、ネイティブ配列ポリペプチドは、任意の生物由来の天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。そのようなネイティブ配列ポリペプチドは自然から単離することができるか、又は組換えもしくは合成手段により産生することができる。「ネイティブ配列」ポリペプチドという用語は、具体的には、天然に存在する切断形態又は分泌形態のポリペプチド(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に存在する変異体形態(例えば、選択的スプライス形態)及び天然に存在するアレル変異体のポリペプチドを包含する。
【０１００】
ポリペプチド「変異体」は、配列を整列させ、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、ギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさないとした後に、ネイティブ配列ポリペプチドとの少なくとも約80％アミノ酸配列同一性を有する生物活性ポリペプチドを意味する。そのような変異体は、例えば、1以上のアミノ酸残基がポリペプチドのN-又はC-末端で付加され又は欠失しているポリペプチドを含む。いくつかの実施態様において、変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドとの少なくとも約80％、約90％、又は約95％のアミノ酸配列同一性のうちいずれか1つを有する。いくつかの実施態様において、変異体は、ネイティブ配列ポリペプチドとの約80％〜約90％、約90％〜約95％、又は約95％〜約99％のアミノ酸配列同一性のうちいずれか1つを有する。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「突然変異体タンパク質」は、自然に存在するタンパク質と比較して、1以上の突然変異を有するタンパク質を意味する。一実施態様において、突然変異体タンパク質は、自然に存在する全てのタンパク質の配列と異なる配列を有する。様々な実施態様において、突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するタンパク質の対応する領域の配列と少なくとも約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約95、約97、約98、約99、又は約99.5％同一のうちいずれかである。いくつかの実施態様において、突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するタンパク質の対応する領域の配列と少なくとも約10％〜約20％、約20％〜約30％、約30％〜約40％、約40％〜約50％、約50％〜約60％、約60％〜約70％、約70％〜約80％、約80％〜約90％、約90％〜約95％、約95％〜約99％、又は約100％同一のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、突然変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の少なくとも約25、約50、約75、約100、約150、約200、約300、又は約400個の連続するアミノ酸のうちのいずれかを含有するタンパク質断片である。いくつかの実施態様において、突然変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の約25〜約50、約50〜約75、約75〜約100、約100〜約150、約150〜約200、約200〜約300、又は約300〜約400個の連続するアミノ酸のうちのいずれかを含有するタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを、その中で指定されたデフォルトパラメータとともに用いて測定することができる(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置換、欠失、及び他の修飾に相同度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「突然変異」は、自然に存在する参照核酸配列又はアミノ酸配列の改変を意味する。例示的な核酸突然変異には、挿入、欠失、フレームシフト突然変異、サイレント突然変異、ナンセンス突然変異、又はミスセンス突然変異が含まれる。いくつかの実施態様において、核酸突然変異は、サイレント突然変異ではない。例示的なタンパク質突然変異には、1以上のアミノ酸の挿入(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸の挿入)、1以上のアミノ酸の欠失(例えば、N-末端、C-末端、及び/又は内側残基の欠失、例えば、少なくとも約5、約10、約15、約25、約50、約75、約100、約150、約200、約300個、もしくはそれより多くのアミノ酸のうちのいずれかの欠失、又は約5〜約10、約10〜約15、約15〜約25、約25〜約50、約50〜約75、約75〜約100、約100〜約150、約150〜約200、約200〜約300、もしくは約300〜約400個のアミノ酸のうちのいずれかの欠失)、1以上のアミノ酸の置換(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸の置換)、或いは上記の2以上の組合せが含まれる。特定のアミノ酸突然変異に言及する際に使用される命名法により、まず野生型アミノ酸、続いて残基番号、最後に置換アミノ酸が特定される。例えば、Y140Lは、チロシンが残基番号140でロイシンに置換されていることを意味する。同様に、変異体H-NOXタンパク質は、H-NOXタンパク質のアミノ酸変化によって言及されてもよい。例えば、T.テングコンジェンシスY140L H-NOXタンパク質は、位置番号140のチロシン残基がロイシン残基に置換されているT.テングコンジェンシスY140L H-NOXタンパク質を指し、T.テングコンジェンシスW9F/Y140L H-NOXタンパク質は、位置9のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置換されており、かつ位置番号140のチロシン残基がロイシン残基に置換されているT.テングコンジェンシスH-NOXタンパク質を指す。
【０１０３】
「進化的に保存された突然変異」は、あるタンパク質におけるアミノ酸の、同じタンパク質ファミリーの別のタンパク質の対応する位置におけるアミノ酸による置換である。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「に由来する」は、1以上の突然変異が導入されるタンパク質の供給源を指す。例えば、「哺乳動物タンパク質に由来する」タンパク質は、野生型(すなわち、自然に存在する配列)哺乳動物タンパク質の配列への1以上の突然変異の導入から結果として得られる目的のタンパク質を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、ペプチド、ポリペプチド、又は抗体配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列を整列させ、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために、ギャップを導入し、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさないとした後に、特定のペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアライメントは、当業者の技能範囲内の様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、又はMEGALIGNTM(DNASTAR)ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたる最大アライメントの達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、アライメントの測定に適切なパラメータを決定することができる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「koff」は、解離速度、例えば、タンパク質からのO2又はNOの放出速度を指す。数値的により低いkoffは、より遅い解離速度を示す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「kon」は、会合速度、例えば、タンパク質へのO2又はNOの結合速度を指す。数値的により低いkonは、より遅い会合速度を示す。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「解離定数」は、「動力学的解離定数」又は「計算上の解離定数」を指す。「動力学的解離定数」又は「KD」は、動力学的解離速度(koff)と動力学的結合速度(kon)の比であり、例えば、当業者に公知の及び/又は本明細書に記載される方法を含む標準的な方法(例えば、標準的な分光法、ストップトフロー法、又は閃光光分解法)を用いて絶対値として決定されるKD値である。「計算上の解離定数」又は「計算上のKD」は、測定されたkoffに基づく動力学的解離定数の近似値を指す。konの値は、本明細書に記載される動力学的KDとkoffの間の相関によって導き出される。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「酸素親和性」は、タンパク質のヘム部分への酸素結合の強度を指す定性的用語である。この親和性は、酸素に対するkoffとkonの両方に影響される。数値的により低い酸素KD値は、より高い親和性を意味する。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「NO親和性」は、タンパク質へのNO結合(例えば、タンパク質と会合したヘム基への又はヘム基に結合した酸素への結合)の強度を指す定性的用語である。この親和性は、NOに対するkoffとkonの両方に影響される。数値的により低いNO KD値は、より高い親和性を意味する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「NO安定性」は、酸素の存在下でのNOによる酸化に対するタンパク質の安定性又は抵抗性を指す。例えば、酸素の存在下でNOに結合したときに酸化されないタンパク質の能力は、タンパク質のNO安定性を示す。いくつかの実施態様において、約1時間、約2時間、約4時間、約6時間、約8時間、約10時間、約15時間、又は約20時間のうちのいずれかの間、20℃でインキュベートした後に、H-NOXタンパク質の約50％未満、約40％未満、約30％未満、約10％未満、又は約5％未満のうちのいずれかが酸化される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「NO反応性」は、ヘム結合タンパク質のヘム中の鉄が酸素の存在下でNOによって酸化される速度を指す。s-1という単位で表すNO反応性のより低い数値は、より低いNO反応性を示す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「自動酸化速度」は、ヘム結合タンパク質のヘム中の鉄が自動酸化される速度を指す。s-1という単位で表すより低い数値の自動酸化速度は、より低い自動酸化速度を示す。
【０１１４】
「ベクター」という用語は、宿主細胞で増殖させることができるクローニングされたポリヌクレオチド(単数又は複数)を含有するように改変することができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、以下のエレメントのうち1つ又は複数を含むことができる:複製起点、目的のポリペプチドの発現を調節する1以上の調節配列(例えば、プロモーター及び/もしくはエンハンサーなど)、並びに/又は1以上の選択可能マーカー遺伝子(例えば、抗生物質抵抗性遺伝子及び比色分析アッセイで使用することができる遺伝子、例えばβ-ガラクトシダーゼなど)。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞で目的のポリペプチドを発現させるのに使用されるベクターを指す。
【０１１５】
「宿主細胞」は、ベクターもしくは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントとなり得る又はそうなっている細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例示的な真核細胞には、哺乳動物細胞、例えば、霊長類又は非霊長類の動物細胞;真菌細胞、例えば、酵母;植物細胞;及び昆虫細胞が含まれる。例示的な原核細胞には、細菌細胞;例えば、大腸菌(E.coli)細胞が含まれる。
【０１１６】
本明細書で使用される場合の「単離された」という用語は、通常自然に見出される又は産生される成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが産生された細胞の成分の少なくとも一部から分離されている場合、「単離された」と呼ばれる。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌され、産生した細胞から該ポリペプチドを含有する上清を物理的に分離する場合、それは、ポリペプチドを「単離すること」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが、通常自然に見出されるより大きいポリヌクレオチド(例えば、DNAポリヌクレオチドの場合、ゲノムDNAもしくはミトコンドリアDNAなど)の一部ではない場合、又はそれが産生された細胞の成分の少なくとも一部から分離されている場合、例えば、RNAポリヌクレオチドの場合、「単離された」と呼ばれる。したがって、宿主細胞内部のベクターに含まれるDNAポリヌクレオチドは、「単離された」と呼ばれることができる。
【０１１７】
「個体」又は「被験体」という用語は、動物;例えば、哺乳動物を指すために本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施態様において、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物の実験動物、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技動物、及び哺乳動物のペットを含むが、これらに限定されない、哺乳動物を治療する方法が提供される。いくつかの例において、「個体」又は「被験体」は、疾患又は障害の治療を必要とする個体又は被験体を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される「疾患」又は「障害」は、治療が必要とされる状態を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「低酸素ペナンブラ」という用語は、血流、したがって、酸素輸送が局所的に低下し、もとの傷害部位付近の細胞の低酸素状態をもたらす、損傷の周囲の部分を指す。この酸素不足は、低酸素細胞死(梗塞)をもたらし、もとの損傷による損害を増幅させることがある。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「低灌流」という用語は、臓器又は四肢(例えば、脳)への不十分な血液供給を指す。低灌流が持続する場合、それにより、低酸素状態が生じることがあり、組織から必要な栄養素、酸素、及び廃棄物処理が奪われることがある。いくつかの例において、低灌流は、脳組織の死及び長期の神経学的機能不全を生じさせることがある。
【０１２１】
「癌」という用語は、制御されない細胞増殖、抑制されない細胞成長、及びアポトーシスによる細胞死の減少と関連する悪性増殖性障害を指す。
【０１２２】
「腫瘍」という用語は、異常に高いレベルの増殖及び成長を示す細胞の群を指すために本明細書で使用される。腫瘍は、良性、前悪性、又は悪性であり得;悪性腫瘍細胞は癌性である。腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞又は白血病性腫瘍細胞であり得る。「腫瘍成長」という用語は、対応する腫瘍サイズの増加をもたらす腫瘍を含む細胞(単数又は複数)による増殖又は成長を指すために本明細書で使用される。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本明細書で使用される場合の「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための治療薬の任意の投与又は適用を網羅する。本発明のために、有益な又は所望の臨床結果としては、以下のうちのいずれか1つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない: 1以上の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の拡大の予防又は遅延(例えば、臓器損傷と関連する低酸素ペナンブラにおける梗塞の軽減)、疾患の再発の予防又は遅延、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善、疾患又は疾患進行の阻害、疾患又はその進行の阻害又は減速、その発症の停止、及び寛解(部分的であれ完全であれ)。「治療」には、増殖性疾患の病理学的結果(例えば、組織の持続的低灌流の病理学的結果)の軽減も包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか1つ又は複数を企図する。
【０１２４】
「阻害」又は「阻害する」という用語は、任意の表現型特徴の減少もしくは休止又はその特徴の発生率、程度、もしくは可能性の減少もしくは休止を指す。「低下させる」又は「阻害する」ことは、参照と比較して、活性、機能、及び/又は量を減少、低下、又は停止させることである。ある実施態様において、「低下させる」又は「阻害する」とは、20％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施態様において、「低下させる」又は「阻害する」とは、50％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施態様において、「低下させる」又は「阻害する」とは、75％、85％、90％、95％、又は99％の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「疾患の発症の遅延」は、疾患又は障害(例えば、組織低酸素関連の疾患及び障害)の発症を延期し、妨害し、減速させ、遅延させ、安定化し、抑制し、及び/又は順延することを意味する。この遅延は、病歴及び/又は治療されている個体によって様々な期間であることができる。当業者には明白であるように、十分な又は顕著な遅延は、個体が疾患を発症しないという点において、事実上、予防を包含することができる。例えば、転移の発症などの、末期癌を遅延させることができる。
【０１２６】
本明細書で使用される「参照」は、比較目的で使用される任意の試料、標準、又はレベルを指す。参照は、健常及び/又は非罹患試料から得ることができる。いくつかの例において、参照は、未治療試料から得ることができる。いくつかの例において、参照は、被験体個体の非罹患又は非治療試料から得られる。いくつかの例において、参照は、被験体でも患者でもない1名以上の健常個体から得られる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合の「予防すること」とは、疾患の素因を有する可能性があるが、該疾患であるとまだ診断されていない被験体における該疾患の発生又は再発に関する予防を提供することを含む。
【０１２８】
薬剤の「有効量」は、必要とされる投薬量及び期間で、所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１２９】
本発明の物質/分子、アゴニスト、又はアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する物質/分子、アゴニスト、又はアンタゴニストの能力などの因子によって異なり得る。治療有効量は、物質/分子、アゴニスト、又はアンタゴニストの治療的に有益な効果が、該物質/分子、アゴニスト、又はアンタゴニストのいかなる毒性又は有害効果をも上回る量でもある。治療有効量は、1回以上の投与で送達することができる。
【０１３０】
「予防有効量」は、必要とされる投薬量及び期間で、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。必ずしもそうではないが、通常、予防的用量は、疾患の前又は疾患の初期に被験体において使用されるので、予防有効量は、治療有効量に満たない。
【０１３１】
「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物活性を有効にすることを可能にするような形態のものであって、かつ製剤が投与されることになる被験体にとって許容できないほどの毒性がある追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌され、かつエンドトキシンを本質的に含まないものであり得る。
【０１３２】
「医薬として許容し得る担体」は、被験体への投与のための「医薬組成物」を一緒に含む治療剤とともに使用するための当技術分野で常用の無毒な固体、半固体、又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、製剤化助剤、又は担体を指す。医薬として許容し得る担体は、利用されている投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、かつ製剤の他の成分と適合する。医薬として許容し得る担体は、利用されている製剤に適切である。
【０１３３】
「滅菌」製剤は、無菌であるか、又は生きた微生物及びその胞子を本質的に含まない。
【０１３４】
1以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時(simultaneous)(同時(concurrent))及び任意の順序での連続的又は順次投与を含む。
【０１３５】
「同時に(concurrently)」又は「同時に(simultaneously)」という用語は、投与の少なくとも一部が時間的に重複するか、又は一方の治療剤の投与が他方の治療剤の投与と比べて短い期間内に収まる、2以上の治療剤の投与を指すために本明細書で使用される。例えば、2以上の治療剤は、約1日以下、例えば、約60分以下、約30分以下、約15分以下、約10分以下、約5分以下、又は約1分以下のうちのいずれかの時間間隔で投与される。
【０１３６】
「順次」という用語は、1以上の薬剤の投与が1以上の他の薬剤の投与を中断した後に継続される2以上の治療剤の投与を指すために本明細書で使用される。例えば、2以上の治療剤の投与は、約15分超、例えば、約20分、約30分、約40分、約50分、もしくは約60分、約1日、約2日、約3日、約1週間、約2週間、又は約1カ月のうちのいずれかの時間間隔で投与される。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「と併せて」とは、ある治療モダリティを、別の治療モダリティに加えて投与することを指す。したがって、「と併せて」とは、ある治療モダリティを、他の治療モダリティの投与の前、その間、又はその後に、個体に投与することを指す。
【０１３８】
「添付文書」という用語は、そのような治療製品の使用に関する適応症、使用法、投薬量、投与、組合せ療法、禁忌、及び/又は警告に関する情報を含む、治療製品の商業的パッケージに慣習的に含まれる指示書を指すために使用される。
【０１３９】
「製造品」は、少なくとも1つの試薬、例えば、疾患もしくは障害(例えば、癌)の治療のための医薬、又は本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造物(例えば、パッケージもしくは容器)又はキットである。ある実施態様において、該製造物又はキットは、本明細書に記載される方法を実施するための単位として販促され、流通させられ、又は販売される。
【０１４０】
(H-NOXタンパク質)
(H-NOXタンパク質ファミリーの概説)
別途示されない限り、任意の野生型又は突然変異体H-NOXタンパク質を本明細書に記載される組成物、キット、及び方法で使用することができる。本明細書で使用される場合、「H-NOXタンパク質」は、H-NOXドメイン(ヘム-一酸化窒素及び酸素(Heme-Nitric oxide and OXygen)結合ドメインに因み命名)を有するタンパク質を意味する。H-NOXタンパク質は、H-NOXドメインに加えて1以上の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。H-NOXタンパク質は、高度に保存され、十分に特徴付けされたヘムタンパク質ファミリーのメンバーである(Iyer, L. M.らの文献(2003年2月3日). BMC Genomics 4(1):5; Karow, D. S.らの文献(2004年8月10日). Biochemistry 43(31): 10203-10211; Boon, E. M.らの文献(2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M.らの文献(2005年10月). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M.らの文献(2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902)。H-NOXタンパク質は、Pfam 07700タンパク質又はHNOBタンパク質とも呼ばれる(Pfam−タンパク質ドメインファミリーアライメント及び隠れマルコフモデルのデータベース、著作権(C)1996-2006、The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation社、59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA)。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、6つのアルファ-ヘリックスと、それに続く、2つのベータ鎖と、それに続く、1つのアルファ-ヘリックスと、それに続く、2つのベータ鎖を含む二次構造を有し、又は該二次構造を有すると予測される。H-NOXタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質又はヘムが結合したホロタンパク質であることができる。H-NOXタンパク質は、ヘム基に共有結合又は非共有結合することができる。一部のH-NOXタンパク質は、NOに結合するが、O2には結合せず、その他は、NOとO2の両方に結合する。単離された通性好気性菌由来のH-NOXドメインは、NOに結合するが、O2には結合しない。偏性好気性原核生物、線虫、及びキイロショウジョウバエ由来のH-NOXタンパク質は、NO及びO2に結合する。哺乳動物は、2つのH-NOXタンパク質:β1及びβ2を有する。マウス、ラット、ウシ、及びヒトH-NOX配列のアライメントは、これらの種が＞99％の同一性を共有することを示す。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のH-NOXドメイン又はH-NOXタンパク質全体は、天然に存在するサーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOXタンパク質(例えば、配列番号2)又は天然に存在するsGCタンパク質(例えば、天然に存在するsGC β1タンパク質)の対応する領域のH-NOXドメイン又はH-NOXタンパク質全体と少なくとも約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約95、約97、約98、約99、又は約99.5％同一のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のH-NOXドメイン又はH-NOXタンパク質全体は、天然に存在するサーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOXタンパク質(例えば、配列番号2)又は天然に存在するsGCタンパク質(例えば、天然に存在するsGC β1タンパク質)の対応する領域のH-NOXドメイン又はH-NOXタンパク質全体と少なくとも約10〜約20％、約20〜約30％、約30〜約40％、約40〜約50％、約50〜約60％、約60〜約70％、約70〜約80％、約80〜約90％、約90〜約95％、約95〜約99、又は約99〜約99.9％同一のうちのいずれかである。本明細書でさらに論じられているように、H-NOXタンパク質は、対応する天然に存在するH-NOXタンパク質と比べて、1以��の突然変異を任意に含有することができる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、H-NOXドメインの他に、1以上のドメインを含む。特定の実施態様において、H-NOXタンパク質は、別のタンパク質由来の1以上のドメイン又は配列全体を含む。例えば、H-NOXタンパク質は、H-NOXドメインと、別のタンパク質、例えば、アルブミン(例えば、ヒト血清アルブミン)の一部又は全体とを含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインのみが存在する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、タグ;例えば、His6タグを含む。
【０１４１】
(重合体型H-NOXタンパク質)
いくつかの態様において、本発明は、2以上のH-NOXドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質を提供する。2以上のH-NOXドメインは、共有結合的に連結されていても、非共有結合的に連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、又は十量体の形態のものである。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、同種H-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、異種H-NOXドメインを含み;例えば、H-NOXドメインは、特定の種のH-NOXドメインのアミノ酸変異体を含むことができるか、又は異なる種由来のH-NOXドメインを含むことができる。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインのうち少なくとも1つは、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144F突然変異に対応する突然変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、1以上の重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、少なくとも1つの三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は、3つのT.テングコンジェンシスH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXドメインは、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメインを含む。
【０１４２】
本発明のいくつかの態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、2以上の会合した単量体を含む。単量体は、共有結合的に連結されていても、非共有結合的に連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質の単量体サブユニットが産生され、ここで、該単量体サブユニットは、インビトロ又はインビボで会合して、重合体型H-NOXタンパク質を形成する。いくつかの実施態様において、単量体は、H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合ドメインは、H-NOXドメインに共有結合的に連結され;例えば、H-NOXドメインのC-末端は、重合ドメインのN-末端又はC-末端に共有結合的に連結される。他の実施態様において、H-NOXドメインのN-末端は、重合ドメインのN-末端又はC-末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施態様において、アミノ酸スペーサーは、H-NOXドメインと重合ドメインの間に共有結合的に連結される。「アミノ酸スペーサー」及び「アミノ酸リンカー」は、本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質の単量体サブユニットのうちの少なくとも1つは、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144F突然変異に対応する突然変異を含む。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、三量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質の単量体は、H-NOXドメイン及びT4バクテリオファージのフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質の単量体は、T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体H-NOXタンパク質は3つの単量体を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、アミノ酸リンカー;例えば、Gly-Ser-Glyリンカーを用いて、フォルドンドメインに連結される。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのH-NOXドメインはタグを含む。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのH-NOXドメインはHis6タグを含む。いくつかの実施態様において、His6タグは、アミノ酸リンカー;例えば、Arg-Gly-Serリンカーを用いて、フォルドンドメインに連結される。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインの全てがHis6タグを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は、配列番号6又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
T.テングコンジェンシス由来の例示的なH-NOXドメインは、約26.7kDalである。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、約50kDal、75kDal、100kDal、125kDalのうちのいずれかよりも大きく、約150kDalまでの原子質量を有する。
【０１４４】
本発明は、個体へのH-NOXタンパク質の投与後に、単一のH-NOXドメインを含む対応する単量体型H-NOXタンパク質と比較してより多くの蓄積を個体の1以上の組織で示す重合体型H-NOXタンパク質を提供する。対応するH-NOXタンパク質は、重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインのうちの少なくとも1つを含むH-NOXタンパク質の単量体形態を指す。優先的に重合体型H-NOXを蓄積する組織には、血管系が損傷した組織が含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、個体へのH-NOXタンパク質の投与後、少なくとも約1、2、3、4、6、12、もしくは24時間、又は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10日間、哺乳動物内に存続する。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、個体へのH-NOXタンパク質の投与後、約1〜2、2〜3、3〜4、4〜6、6〜12、もしくは12〜24時間、又は1〜2日、2〜4日、4〜8日、8〜10日、もしくは10日よりも長い間、哺乳動物内に存続する。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXの約10％未満が、個体へのH-NOXタンパク質の投与後、約1時間、2時間、又は3時間のうちのいずれか未満以内に、腎臓によって哺乳動物から排除される。
【０１４５】
(H-NOXタンパク質及びH-NOXドメインの供給源)
任意の属又は種由来のH-NOXタンパク質及びH-NOXドメインを本明細書に記載される組成物、キット、及び方法で使用することができる。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインは、哺乳動物(例えば、霊長類(例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど)、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、もしくはネコ)、昆虫、酵母、又は細菌由来のタンパク質又はドメインであるか、或いはそのようなタンパク質に由来する。例示的な哺乳動物H-NOXタンパク質としては、野生型ヒト及びラット可溶性グアニル酸シクラーゼ(例えば、β1サブユニット)が挙げられる。H-NOXタンパク質の例としては、野生型哺乳動物H-NOXタンパク質、例えば、ヒト、マウス(M. musculus)、イヌ(C. familiaris)、ウシ(B. Taurus)、タイリクオオカミ、及びラット;並びに野生型非哺乳動物H-NOXタンパク質、例えば、アフリカツメガエル(X. laevis)、メダカ(O. latipes)、O.クリバツス(O. curivatus)、及びトラフグ(F. rubripes)が挙げられる。非哺乳動物野生型NO結合H-NOXタンパク質の例としては、キイロショウジョウバエ、ガンビエハマダラカ(A.gambiae)、及びタバコスズメガ(M.sexta)の野生型H-NOXタンパク質が挙げられ;非哺乳動物野生型O2結合H-NOXタンパク質の例としては、線虫の野生型H-NOXタンパク質gcy-31、gcy-32、gcy-33、gcy-34、gcy-35、gcy-36、及びgcy-37;キイロショウジョウバエの野生型H-NOXタンパク質CG14885、CG14886、及びCG4154;並びにタバコスズメガの野生型H-NOXタンパク質β-3が挙げられ;原核生物野生型H-NOXタンパク質の例としては、T.テングコンジェンシス、コレラ菌(V.cholera)、V.フィシェリイ(V.fischerii)、N.パンクチフォルム、D.デスルフリカンス(D.desulfuricans)、L.ニューモフィラ1群(L.pneumophila 1)、L.ニューモフィラ2群、及びC.アセトブチリクムが挙げられる。
【０１４６】
例示的なH-NOXタンパク質のNCBIアクセッション番号としては、以下のものが挙げられる:ヒトβ1[gi:2746083]、ラットβ1[gi:27127318]、キイロショウジョウバエβ1[gi:861203]、キイロショウジョウバエCG14885-PA[gi:23171476]、線虫GCY-35[gi:52782806]、ノストク・パンクチフォルム[gi:23129606]、カウロバクター・クレセンツス[gi:16127222]、シェワネラ・オネイデンシス[gi:24373702]、レジオネラ・ニューモフィラ(ORF 2)[CUCGC_272624]、クリストリジウム・アセトブチリクム[gi:15896488]、及びサーモアナエロバクター・テングコンジェンシス[gi:20807169]。タイリクオオカミH-NOXは、GenBankアクセッション番号DQ008576により提供される。例示的なH-NOXタンパク質及びドメインの核酸及びアミノ酸配列は、図37に提供されている。
【０１４７】
例示的なH-NOXタンパク質としては、その遺伝子名と、それに続く、その種の略記及びGenbank識別子によって掲載されている、以下のH-NOXタンパク質(例えば、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2006年5月21日; 2006年5月22日; 2007年5月21日;又は2007年5月22日現在利用可能な以下のタンパク質配列)も挙げられる: Npun5905_Npu_23129606、alr2278_Ana_17229770、SO2144_Sone_24373702、Mdeg1343_Mde_23027521、VCA0720_Vch_15601476、CC2992_Ccr_16127222、Rsph2043_Rhsp_22958463(gi:46192757)、Mmc10739_Mcsp_22999020、Tar4_Tte_20807169、Ddes2822_Dde_23475919、CAC3243_Cac_15896488、gcy-31_Ce_17568389、CG14885_Dm_24647455、GUCY1B3_Hs_4504215、HpGCS-beta1_Hpul_14245738、Gycbeta100B_Dm_24651577、CG4154_Dm_24646993(gi:NP_650424.2、gi:62484298)、gcy-32_Ce_13539160、gcy-36_Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35_Ce_17507861(gi:71990146)、gcy-37_Ce_17540904(gi:71985505)、GCY1a3_Hs_20535603、GCY1a2-Hs_899477、又はGYCa-99B_Dm_729270(gi:68067738)(Lakshminarayanらの文献(2003). BMG Genomics 4:5-13)。これらの名前で使用される種の略記としては、Ana−アナベナ属の種(Anabaena Sp); Ccr−カウロバクター・クレセンツス; Cac−クリストリジウム・アセトブチリクム; Dde−デスルホビブリオ・デスルフリカンス; Mcsp−マグネトコックス属の種(Magnetococcus sp.); Mde−ミクロブルビファー・デグラダンス(Microbulbifer degradans); Npu−ノストク・パンクチフォルム; Rhsp−ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides); Sone−シェワネラ・オネイデンシス; Tte−サーモアナエロバクター・テングコンジェンシス; Vch−コレラ菌; Ce−線虫; Dm−キイロショウジョウバエ; Hpul−バフンウニ(Hemicentrotus pulcherrimus); Hs−ヒトが挙げられる。
【０１４８】
他の例示的なH-NOXタンパク質としては、その生物名及びPfamデータベースアクセッション番号によって掲載されている、以下のH-NOXタンパク質(例えば、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2006年5月21日; 2006年5月22日; 2007年5月17日; 2007年5月21日;又は2007年5月22日現在利用可能な以下のタンパク質配列)が挙げられる:ブリグサ線虫(Caenorhabditis briggsae) Q622M5_CAEBR、ブリグサ線虫Q61P44_CAEBR、ブリグサ線虫Q61R54_CAEBR、ブリグサ線虫Q61V90_CAEBR、ブリグサ線虫Q61A94_CAEBR、ブリグサ線虫Q60TP4_CAEBR、ブリグサ線虫Q60M10_CAEBR、線虫GCY37_CAEEL、線虫GCY31_CAEEL、線虫GCY36_CAEEL、線虫GCY32_CAEEL、線虫GCY35_CAEEL、線虫GCY34_CAEEL、線虫GCY33_CAEEL、ハイナンメダカ(Oryzias curvinotus) Q7T040_ORYCU、ハイナンメダカQ75WF0_ORYCU、メダカP79998_ORYLA、メダカQ7ZSZ5_ORYLA、ミドリフグ(Tetraodon nigroviridis) Q4SW38_TETNG、ミドリフグQ4RZ94_TETNG、ミドリフグQ4S6K5_TETNG、トラフグQ90VY5_FUGRU、アフリカツメガエルQ6INK9_XENLA、ヒトQ5T8J7_HUMAN、ヒトGCYA2_HUMAN、ヒトGCYB2_HUMAN、ヒトGCYB 1_HUMAN、ゴリラQ9N193_9PRIM、ボルネオオランウータン(Pongo pygmaeus) Q5RAN8_PONPY、チンパンジー(Pan troglodytes) Q9N192_PANTR、アカゲザル(Macaca mulatta) Q9N194_MACMU、シロテテナガザル(Hylobates lar) Q9N191_HYLLA、マウスQ8BXH3_MOUSE、マウスGCYB l_MOUSE、マウスQ3UTI4_MOUSE、マウスQ3UH83_MOUSE、マウスQ6XE41_MOUSE、マウスQ80YP4_MOUSE、ラットQ80WX7_RAT、ラットQ80WX8_RAT、ラットQ920Q1_RAT、ラットQ54A43_RAT、ラットQ80WY0_RAT、ラットQ80WY4_RAT、ラットQ8CH85_RAT、ラットQ80WY5_RAT、ラットGCYB 1_RAT、ラットQ8CH90_RAT、ラットQ91XJ7_RAT、ラットQ80WX9_RAT、ラットGCYB2_RAT、ラットGCYA2_RAT、イヌQ4ZHR9_CANFA、ウシGCYB 1_B0VIN、イノシシ(Sus scrofa) Q4ZHR7_PIG、フタホシコオロギ(Gryllus bimaculatus) Q59HN5_GRYBI、タバコスズメガO77106_MANSE、タバコスズメガO76340_MANSE、セイヨウミツバチ(Apis mellifera) Q5UAF0_APIME、セイヨウミツバチQ5FAN0_APIME、セイヨウミツバチQ6L5L6_APIME、ガンビエハマダラカ亜種PEST Q7PYK9_ANOGA、ガンビエハマダラカ亜種PEST Q7Q9W6_ANOGA、ガンビエハマダラカ亜種PEST Q7QF31_AN0GA、ガンビエハマダラカ亜種PEST Q7PS01_ANOGA、ガンビエハマダラカ亜種PEST Q7PFY2_ANOGA、ガンビエハマダラカQ7KQ93_ANOGA、キイロショウジョウバエQ24086_DROME、キイロショウジョウバエGCYH_DROME、キイロショウジョウバエGCY8E_DR0ME、キイロショウジョウバエGCYDA_DROME、キイロショウジョウバエGCYDB_DROME、キイロショウジョウバエQ9VA09_DROME、ウスグロショウジョウバエ(Drosophila pseudoobscura) Q29CE1_DR0PS、ウスグロショウジョウバエQ296C7_DROPS、ウスグロショウジョウバエQ296C8_DROPS、ウスグロショウジョウバエQ29BU7_DROPS、ジャンボアメフラシ(Aplysia californica) Q7YWK7_APLCA、バフンウニQ95NK5_HEMPU、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii) 、Q5YLC2_CHLRE、アナベナ属の種Q8YUQ7_ANASP、フラボバクテリア・バクテリウム(Flavobacteria bacterium) BBFL7 Q26GR8_9BACT、サイクロフレクサス・トルキス(Psychroflexus torquis) ATCC 700755 Q1VQE5_9FLA0、マリンガンマプロテオバクテリウム(marine gamma proteobacterium) HTCC2207 Q1YPJ5_9GAMM、マリンガンマプロテオバクテリウムHTCC2207 Q 1 YTK4_9 G AMM、カウロバクター・クレセンツスQ9A451_CAUCR、アシディフィリウム・クリプツム(Acidiphilium cryptum) JF-5 Q2DG60_ACICY、ロドバクター・スフェロイデスQ3J0U9_RHOS4、シリシバクター・ポメロイ(Silicibacter pomeroyi) Q5LPV1_SILP0、パラコックス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans) PD1222、Q3PC67_PARDE、シリシバクター属の種TM1040 Q3QNY2_9RHOB、ヤ��スキア属の種(Jannaschia sp) Q28ML8_JANSC、マグネトコックス属の種MC-1 Q3XT27_9PROT、レジオネラ・ニューモフィラQ5WXP0_LEGPL、レジオネラ・ニューモフィラQ5WTZ5_LEGPL、レジオネラ・ニューモフィラQ5X268_LEGPA、レジオネラ・ニューモフィラQ5X2R2_LEGPA、レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラQ5ZWM9_LEGPH、レジオネラ・ニューモフィラ亜種ニューモフィラQ5ZSQ8_LEGPH、コルウェリア・サイクレリスラエ(Colwellia psychrerythraea) Q47Y43_COLP3、シュードアルテロモナス・アトランティカ(Pseudoalteromonas atlantica) T6c Q3CSZ5_ALTAT、シェワネラ・オネイデンシスQ8EF49_SHEON、サッカロファグス・デグラダンス(Saccharophagus degradans) Q21E20_SACD2、サッカロファグス・デグラダンスQ21ER7_SACD2、ビブリオ・アングスツム(Vibrio angustum) S14 Q1ZWE5_9VIBR、ビブリオ・バルニフィクス(Vibrio vulnificus) Q8DAE2_VIBVU、ビブリオ・アルギノリチクス(Vibrio alginolyticus) 12G01 Q1VCP6_VIBAL、ビブリオ属の種DAT722 Q2FA22_9VIBR、腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus) Q87NJ1_VIBPA、ビブリオ・フィッシェリQ5E1F5_VIBF1、ビブリオ・バルニフィクスQ7MJS8_VIBVY、フォトバクテリウム属の種(Photobacterium sp) SKA34 Q2C6Z5_9GAMM、ハヘラ・チェジュエンシス(Hahella chejuensis) Q2SFY7_HAHCH、オケアノスピリルム属の種(Oceanospirillum sp) MED92 Q2B KV0_9GAMM、オケアノバクター属の種(Oceanobacter sp) RED65 Q1N035_9GAMM、デスルホビブリオ・デスルフリカンスQ310U7_DESDG、ハロサーモトリックス・オレニイ(Halothermothrix orenii) H 168 Q2ArW5_9FIRM、サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスQ8RBX6_THETN、カルディセルロシルプター・サッカロリティクス(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) DSM 8903 Q2ZH17_CALSA、クリストリジウム・アセトブチリクムQ97E73_CLOAB、アルカリフィルス・メタルリレジゲンス(Alkaliphilus metalliredigenes) QYMF Q3C763_9CLOT、破傷風菌(Clostridium tetani) Q899J9_CLOTE、及びクロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerincki) NCIMB 8052 Q2WVN0_CLOBE。これらの配列は、本明細書に記載されるPfamデータベースを用いた、これらのタンパク質がH-NOXタンパク質ファミリーに属するという同定に基づき、H-NOXタンパク質をコードすると予測される。
【０１４９】
本明細書に記載される医薬組成物及び方法における使用に好適であり得るさらなるH-NOXタンパク質、重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメイン、及び核酸は、標準的な方法を用いて同定することができる。例えば、標準的な配列アライメント及び/又は構造予測プログラムを用いて、さらなるH-NOXタンパク質及び核酸を、その一次構造及び/又は予測されるタンパク質二次構造と既知のH-NOXタンパク質及び核酸の一次構造及び/又は予測されるタンパク質二次構造との類似性に基づいて同定することができる。例えば、Pfamデータベースは、定義されたアライメントアルゴリズム及び隠れマルコフモデル(例えば、Pfam 21.0)を用いて、タンパク質をH-NOXタンパク質ファミリーなどのファミリーに分類する(Pfam−タンパク質ドメインファミリーアライメント及び隠れマルコフモデルのデータベース、著作権(C)1996-2006、The Pfam Consortium; GNU LGPL Free Software Foundation社、59 Temple Place - Suite 330, Boston, MA 02111-1307, USA)。swissprot-tremblデータベース(「expasy.org」のワールドワイドウェブ、Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Switzerland)などの標準的なデータベースを用いて、H-NOXタンパク質ファミリーのメンバーを同定することもできる。PredictProtein(630 West, 168 Street, BB217, New York、N.Y. 10032, USA)などの標準的な構造予測プログラムのデフォルト設定を用いて、H-NOXタンパク質の二次及び/又は三次構造を予測することができる。或いは、標準的な方法を用いて、H-NOXタンパク質の実際の二次及び/又は三次構造を決定することができる。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、T.テングコンジェンシスH-NOXにおける以下の遠位ポケット残基のいずれかと同じアミノ酸を対応する位置に有する: Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、Leu144、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せ。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、そのアミノ酸配列の配列アライメントに基づき、それぞれ、T.テングコンジェンシスH-NOXのPro115又はArg135の位置に対応する位置にプロリン又はアルギニンを有する。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、ラットβ1 H-NOXのHis105に対応するヒスチジンを有する。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、6つのアルファ-ヘリックスと、それに続く、2つのベータ鎖と、それに続く、1つのアルファ-ヘリックスと、それに続く、2つのベータ鎖を含む二次構造を有し、又は該二次構造を有すると予測される。この二次構造がH-NOXタンパク質について報告されている。
【０１５１】
望ましい場合、新たに同定されたH-NOXタンパク質又はH-NOXドメインを試験して、それがヘムに結合するかどうかを、標準的な方法を用いて決定することができる。O2担体として機能するH-NOXドメインの能力は、H-NOXドメインがO2に結合するかどうかを、標準的な方法、例えば、本明細書に記載される方法を用いて決定することにより試験することができる。望ましい場合、本明細書に記載される突然変異のうち1つ又は複数をH-NOXドメインに導入して、O2担体としてのその特徴を最適化することができる。例えば、1以上の突然変異を導入して、そのO2解離定数、酸素に対するkoff、ヘム自動酸化の速度、NO反応性、NO安定性、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せを改変することができる。標準的な技法、例えば、本明細書に記載される技法を用いて、これらのパラメータを測定することができる。
【０１５２】
(突然変異体H-NOXタンパク質)
本明細書でさらに論じられているように、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインは、対応する野生型タンパク質のH-NOXドメインと比較して、1以上の突然変異、例えば、O2解離定数、酸素に対するkoff、ヘム自動酸化の速度、NO反応性、NO安定性、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せを改変する突然変異を含有することができる。いくつかの実施態様において、本発明は、1以上の突然変異、例えば、O2解離定数、酸素に対するkoff、ヘム自動酸化の速度、NO反応性、NO安定性、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せを、対応する野生型タンパク質のものと比較して改変する突然変異を含有し得る1以上のH-NOXドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質を提供する。一連の改変H-NOXドメインは、本明細書に提供される教示を考慮して、本明細書に記載されており、かつさらに当業者に公知である技法を用いて、ランダム突然変異誘発と、それに続く、必要な又は所望の解離定数、解離速度、NO反応性、安定性、生理的適合性、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せについての実験的スクリーニングによって作製することができる。或いは、突然変異誘発は、特定の領域又は残基、例えば、実験的に決定されるかもしくは予測されるH-NOXタンパク質の三次元構造から明白な遠位ポケット残基(特に、野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質の配列に関して、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Boon, E. M.らの文献(2005). Nature Chemical Biology 1:53-59を参照)又は配列アライメントから同定される進化的に保存された残基(特に、野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質の配列に関して、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Boon E.M.らの文献(2005). Nature Chemical Biology 1:53-59を参照)を選択的に標的とすることができる。
【０１５３】
本発明のいくつかの実施態様において、突然変異体H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質の突然変異体H-NOXドメインは、自然に存在する全てのH-NOXタンパク質又はドメインの配列と異なる配列を有する。様々な実施態様において、突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するH-NOXタンパク質の対応する領域の配列と少なくとも約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約95、約97、約98、約99、又は約99.5％同一のうちのいずれかである。様々な実施態様において、突然変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するH-NOXタンパク質の対応する領域の配列と約10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、90〜95％、95〜99％、又は99.5％同一である。いくつかの実施態様において、突然変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の少なくとも約25、約50、約75、約100、約150、約200、約300、又は約400個の連続するアミノ酸のうちのいずれかを含有するタンパク質断片である。いくつかの実施態様において、突然変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の25〜50、50〜75、75〜100、100〜150、150〜200、200〜300、又は300〜400個の連続するアミノ酸を含有するタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを、その中で指定されたデフォルトパラメータとともに用いて測定することができる(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置換、欠失、及び他の修飾に相同度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施態様において、突然変異体H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質の突然変異体H-NOXドメインは、1以上のアミノ酸の挿入(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸の挿入)を含む。本発明のいくつかの実施態様において、突然変異体H-NOXタンパク質又は突然変異体H-NOXドメインは、1以上のアミノ酸の欠失(例えば、N-末端、C-末端、及び/又は内部残基の欠失、例えば、少なくとも約5、約10、約15、約25、約50、約75、約100、約150、約200、約300個、もしくはそれより多くのアミノ酸のうちのいずれかの欠失、又は5〜10、10〜15、15〜25、25〜50、50〜75、75〜100、100〜150、150〜200、200〜300、又は300〜400個のアミノ酸の欠失)を含む。本発明のいくつかの実施態様において、突然変異体H-NOXタンパク質又は突然変異体H-NOXドメインは、1以上のアミノ酸の置換(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個のアミノ酸の置換)、又は上記のうちの2つ以上の組合せを含む。いくつかの実施態様において、突然変異体タンパク質は、自然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも1つのアミノ酸変化を有する。いくつかの実施態様において、突然変異体核酸配列は、自然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも1つのアミノ酸変化を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施態様において、核酸は、自然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする自然に存在する核酸の縮重バージョンではない。
【０１５５】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインにおける突然変異は、進化的に保存された突然変異である(クラスI突然変異とも表される)。クラスI突然変異の例は、表1Aに掲載されている。表1Aにおいて、突然変異は、ヒトβ1 H-NOXの配列に従って付番/注釈付けされているが、全てのH-NOX配列について類似している。したがって、任意の他のH-NOXタンパク質中の対応する位置を表示された残基へと突然変異させることができる。例えば、ヒトβ1 H-NOXのPhe4をチロシンへと突然変異させることができるが、それは、他のH-NOXタンパク質が、この位置にチロシンを有するからである。対応するフェニルアラニン残基を任意の他のH-NOXタンパク質においてチロシンへと突然変異させることができる。特定の実施態様において、1以上の突然変異は、進化的に保存された残基に限定される。いくつかの実施態様において、1以上の突然変異は、少なくとも1つの進化的に保存された突然変異及び少なくとも1つの進化的に保存されていない突然変異を含むことができる。望ましい場合、これらの突然変異体H-NOXタンパク質は、本明細書に提供される教示を考慮して、NO/O2解離定数、NO反応性、安定性、及び生理的適合性についての実験的スクリーニングを受ける。
表1A.進化的に保存された残基を標的とする例示的なクラスI H-NOX突然変異
【表１】
2019511567.tif 000003
【０１５６】
いくつかの実施態様において、突然変異は、遠位ポケット突然変異、例えば、アルファ-ヘリックスA、D、E、又はG中の残基の突然変異である(Pellicena, P.らの文献(2004年8月31日). Proc Natl. Acad Sci USA 101(35): 12854-12859)。例示的な遠位ポケット突然変異(クラスII突然変異とも表される)は、表1Bに掲載されている。表1Bにおいて、突然変異は、ヒトβ1 H-NOXの配列に従って付番/注釈付けされているが、全てのH-NOX配列について類似している。いくつかの置換は、各々の列挙された残基において生存可能な突然変異をもたらすので、各々の表示された位置の残基を任意の他の天然又は非天然に存在するアミノ酸(「X」と表される)に変化させることができる。そのような突然変異は、種々の所望の親和性、安定性、及び反応性特徴を有するH-NOXタンパク質を生じさせことができる。
表1B.遠位ポケット残基を標的とする例示的なクラスII H-NOX突然変異
【表２】
2019511567.tif 000004
【０１５７】
特定の実施態様において、突然変異は、ヘム遠位ポケット突然変異である。本明細書に記載されているように、H-NOXファミリーのNO結合メンバーにおいてO2結合を妨げる極めて重要な分子決定要因は、ヘムの遠位ポケットにおけるH結合供与体の欠如である。したがって、いくつかの実施態様において、突然変異は、遠位ポケット内でのH-NOXドメインとリガンドの間のH結合を改変する。いくつかの実施態様において、突然変異は、遠位ポケットのH結合供与体を破壊し、かつ/又は対応する野生型H-NOXドメインと比べて低下したO2リガンド結合を付与する。例示的な遠位ポケット残基としては、T.テングコンジェンシスH-NOXのThr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、Tyr140、及びLeu144、並びに任意の他のH-NOXタンパク質中の対応する残基が挙げられる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインは、1以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上の遠位ポケット突然変異を含む。いくつかの実施態様において、遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144F突然変異に対応する。いくつかの実施態様において、遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144F突然変異である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインは、2つの遠位ポケット突然変異を含む。
【０１５８】
遠位ポケットに存在しない残基もヘム基の三次元構造に影響を及ぼす可能性があり;この構造がさらに、ヘム基中の鉄へのO2及びNOの結合に影響を及ぼす。したがって、いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質又は重合体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインは、遠位ポケットの外側に1以上の突然変異を有する。突然変異させることができるが、遠位ポケットに存在しない残基の例としては、T.テングコンジェンシスH-NOXのPro115及びArg135が挙げられる。いくつかの実施態様において、突然変異は、His105をヘム鉄に結合する残基として含む近位ポケットに存在する。
【０１５９】
いくつかの実施態様において、2以上の突然変異が存在する場合;少なくとも1つの突然変異は遠位ポケットに存在し、少なくとも1つの突然変異は遠位ポケットの外側にある(例えば、近位ポケットの突然変異)。いくつかの実施態様において、全ての突然変異が遠位ポケットに存在する。
【０１６０】
ヒト以外の供給源に由来するH-NOXタンパク質又はH-NOXドメインの免疫原性を低下させるために、H-NOXタンパク質又はH-NOXドメインのアミノ酸をヒトH-NOXの対応するアミノ酸へと突然変異させることができる。例えば、非ヒトH-NOXタンパク質又はH-NOXドメインの三次構造の表面にある1以上のアミノ酸をヒトH-NOXタンパク質又はH-NOXドメインの対応するアミノ酸へと突然変異させることができる。いくつかのバリエーションにおいて、1以上の表面アミノ酸の突然変異を、2以上の遠位ポケット残基の突然変異、遠位ポケットの外側の1以上の残基の突然変異(例えば、近位ポケットの突然変異)、又は上記のうちの2つ以上の組合せと組み合わせることができる。
【０１６１】
本発明はまた、本明細書に記載される突然変異、例えば、二重、三重、又はより高次の多重突然変異の任意の組合せに関する。例えば、本明細書に記載される突然変異のいずれかの組合せを同じH-NOXタンパク質で為すことができる。他の哺乳動物又は非哺乳動物H-NOXタンパク質中の等価な位置における突然変異も本発明によって包含されることに留意されたい。例示的な突然変異体H-NOXタンパク質又は突然変異体H-NOXドメインは、対応する野生型H-NOXドメインと比べて改変されたO2又はNOリガンド結合を付与し、生理学的に適合する哺乳動物O2血液ガス担体として作用する1以上の突然変異を含む。
【０１６２】
突然変異の残基番号は、記載されている特定のH-NOXタンパク質の配列中の位置を示す。例えば、T.テングコンジェンシスI5Aは、T.テングコンジェンシスH-NOXの5番目の位置におけるアラニンによるイソロイシンの置換を指す。同じイソロイシンからアラニンへの突然変異を任意の他のH-NOXタンパク質又はH-NOXドメインの対応する残基で為すことができる(この残基は、他のH-NOXタンパク質の配列における5番目の残基であってもよいし、そうでなくてもよい)。哺乳動物β1 H-NOXドメインのアミノ酸配列は、高々2つのアミノ酸が異なるので、野生型ラットβ1 H-NOXタンパク質に導入されたときに望ましい突然変異体H-NOXタンパク質又はH-NOXドメインを生じさせる突然変異は、ヒトなどの他の哺乳動物由来の野生型β1 H-NOXタンパク質又はH-NOXドメインに導入されたときに望ましい突然変異体H-NOXタンパク質又はH-NOXドメインを生じさせるとも予想される。
【０１６３】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含む三量体である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、3つのT.テングコンジェンシス野生型H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含む三量体である。
【０１６４】
(H-NOXタンパク質に対する修飾)
重合体型H-NOXタンパク質を含む、野生型又は突然変異体H-NOXタンパク質のいずれかを、標準的な方法を用いて修飾及び/又は製剤化して、治療的又は産業的用途を強化することができる。例えば、及び特に、異種の改変H-NOXタンパク質に適用される場合、そのような薬剤を、架橋、PEG化、炭水化物装飾などを含む、免疫監視機構から隔離するための種々の方法(特に、タンパク質の修飾に関して、例えば、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Rohlfs, R. J.らの文献(1998年5月15日). J. Biol. Chem. 273(20): 12128-12134; Migita, R.らの文献(1997年6月). J. Appl. Physiol. 82(6): 1995-2002; Vandegriff, K. D.らの文献(2004年8月15日). Biochem J. 382(Pt 1): 183-189)及び当業者に公知の他の技法が当技術分野で公知である。重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質とヒト血清アルブミンなどのヒトタンパク質との融合は、血清半減期、粘度、及びコロイド膠質浸透圧を増大させることができる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質を、その合成中又は合成後に修飾して、その免疫原性を減少させ、かつ/又はその血漿保持時間を増加させる。H-NOXタンパク質を封入することもできる(例えば、リポソーム又はナノ粒子内への封入)。
【０１６５】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、ポリエチレングリコール(PEG)に共有結合している。ポリエチレングリコールに共有結合しているH-NOXタンパク質は、PEG化されていると呼ばれる(本明細書において、「H-NOXP」と呼ばれる)ことができる。ポリエチレングリコールに共有結合していないH-NOXタンパク質は、PEG化されていないと呼ばれることができる。いくつかの実施態様において、H-NOXPタンパク質は、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含む三量体である。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXPタンパク質の少なくとも1つの単量体はPEG化されている。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXPタンパク質の各々の単量体はPEG化されている。いくつかの実施態様において、単量体H-NOXは、3つのPEG分子を含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXは、9つのPEG分子(各々の単量体に3つ)を含む。いくつかの実施態様において、PEGは5000という分子量を有する。
【０１６６】
いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの両方を個体に投与して、脳卒中、一過性虚血発作、及び低酸素脳損傷を治療する。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは同時に投与される。いくつかの実施態様において、個体に投与されるPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のいずれかである。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、組成物中にある。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、約99:1、約95:5、約90:10、約85:15、約80:20、約75:25、約70:30、約65:35、約60:40;約 55:45、約50:50、約45:55、約40:60、約35:65、約30:70、約25:75、約20:80、約15:85;約10:90;約5:95;約1:99のいずれかの比、又はその間の任意の比で組成物中にある。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質には、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含むPEG化三量体型H-NOXタンパク質が含まれる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質には、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含む非PEG化三量体型H-NOXタンパク質が含まれる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質には、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含むPEG化三量体型H-NOXタンパク質、並びに3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及び3つのフォルドンドメインを含む非PEG化三量体型H-NOXタンパク質が含まれる。
【０１６７】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は;例えば、H-NOXタンパク質の精製を助ける1以上のタグを含む。タグの例としては、His6、FLAG、GST、及びMBPが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、1以上のHis6タグを含む。1以上のHis6タグは、重合体型H-NOXタンパク質の使用前に;例えば、エキソペプチダーゼによる処理によって除去することができる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、3つのT.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン、3つのフォルドンドメイン、及び3つのHis6タグを含む三量体である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、3つのT.テングコンジェンシス野生型H-NOXドメイン、3つのフォルドンドメイン、及び3つのHis6タグを含む三量体である。
【０１６８】
(重合ドメイン)
いくつかの態様において、本発明は、2以上のH-NOXドメイン及び1以上の重合ドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質を提供する。重合ドメインを用いて、2以上のH-NOXドメインを連結し、重合体型H-NOXタンパク質を形成させる。1以上の重合ドメインを用いて、H-NOXタンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体などを産生することができる。重合ドメインは当技術分野で公知であり、例えば: T4バクテリオファージフィブリチンのフォルドン、Arc、POZ、コイルドコイルドメイン(GCN4、ロイシンジッパー、Velcroを含む)、ウテログロビン、コラーゲン、3本鎖コイルドコイル(マトリリン-1)、トロンボスポリン、TRPV1-C、P53、Mnt、アバジン(avadin)、ストレプトアビジン、Bcr-Abl、COMP、ベロ毒素サブユニットB、CamKII、RCK、及びNエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、STM3548、KaiC、TyrR、Hcp1、CcmK4、GP41、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、a-ヘモリジン、C4b-結合タンパク質、Mi-CK、アリールスルファターゼA、並びにウイルスカプシドタンパク質などがある。重合ドメインは、H-NOXドメインに共有結合又は非共有結合的に連結され得る。いくつかの実施態様において、複数の単量体サブユニット由来の重合ドメインが会合して、重合体型H-NOXドメインを形成するように、重合ドメインはH-NOXドメインに連結されて、単量体サブユニットを形成する。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインのC-末端は、重合ドメインのN末端に連結される。他の実施態様において、H-NOXドメインのN-末端は、重合ドメインのN末端に連結される。さらに他の実施態様において、H-NOXドメインのC-末端は、重合ドメインのC-末端に連結される。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインのN-末端は、重合ドメインのC-末端に連結される。
【０１６９】
リンカー;例えば、アミノ酸リンカーを用いて、重合ドメインをH-NOXドメインに接続することができる。いくつかの実施態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上のアミノ酸のうちのいずれか1つを含むリンカーを重合ドメインとH-NOXドメインの間に配置することができる。例示的なリンカーとしては、Gly-Ser-Glyリンカー及びArg-Gly-Serリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
(バクテリオファージT4フィブリチン三量体化ドメイン)
例示的な重合ドメインは、バクテリオファージT4のフォルドンドメインである。バクテリオファージT4由来のwac遺伝子は、C-末端三量体化ドメイン(残基457〜483)を有する486アミノ酸のタンパク質であるフィブリチンタンパク質をコードする(Efimov, V. P.らの文献(1994) J Mol Biol 242:470-486)。このドメインは、インビトロとインビボの両方でフィブリチンを三量体化させることができる(Boudko, S. P.らの文献(2002) Eur J Biochem 269:833-841; Letarov, A. V.らの文献(1999) Biochemistry(Mosc) 64:817-823; Tao, Y.らの文献(1997) Structure 5:789-798)。多くの場合、「フォルドンドメイン」と呼ばれる、単離された27残基の三量体化ドメインは、いくつかの異なるタンパク質(HIV外被糖タンパク質(Yang, X.らの文献(2002) J Virol 76:4634-4642)、アデノウイルスアドヘシン(Papanikolopoulou, K.らの文献(2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Papanikolopoulou, K.らの文献(2004) J Mol Biol 342:219-227)、コラーゲン(Zhang, C,らの文献(2009) Biotechnol Prog 25: 1660-1668)、ファージP22 gp26(Bhardwaj, A.らの文献(2008) Protein Sci 17: 1475-1485)、及び狂犬病ウイルス糖タンパク質(Sissoeff, L.らの文献(2005) J Gen Virol 86:2543-2552)を含む)において、キメラ三量体を構築するのに使用されている。フォルドンドメインの例示的な配列は図1に示されており、配列番号4によって提供されている。
【０１７１】
単離されたフォルドンドメインは、単一のβ-ヘアピン構造へと折り畳まれ、3つのヘアピンを含むβ-プロペラ構造へと三量体化する(Guthe, S.らの文献(2004) J Mol Biol 337:905-915)。フォルドンドメイン単独の構造はNMRによって決定されており(Guthe, S.らの文献(2004) J Mol Biol 337:905-915)、フォルドンドメインにより三量体化したいくつかのタンパク質の構造はX線結晶学によって解明されている(Papanikolopoulou, K.らの文献(2004) J Biol Chem 279:8991-8998; Stetefeld, J.らの文献(2003) Structure 11:339-346; Yokoi, N.らの文献(2010) Small 6: 1873-1879)。このドメインは、迅速に折り畳まれて、三量体化し、ミスフォールディングした中間体又は経路を外れた(off-pathway)オリゴマー化産物の機会を低下させる(Guthe, S.らの文献(2004) J Mol Biol 337:905-915)。フォルドンドメインは非常に安定であり、＞10％SDS、6.0M塩酸グアニジン、又は80℃で三次構造及びオリゴマー化を維持することができ(Bhardwaj, A.らの文献(2008) Protein Sci 17: 1475-1485; Bhardwaj, A.らの文献(2007) J Mol Biol 371:374-387)、フォルドンドメインに融合された配列の安定性を向上させることができる(Du, C.らの文献(2008) Appl Microbiol Biotechnol 79:195-202)。
【０１７２】
いくつかの実施態様において、H-NOXドメインのC-末端は、フォルドンドメインのN-末端に連結される。他の実施態様において、H-NOXドメインのN-末端は、フォルドンドメインのN-末端に連結される。さらに他の実施態様において、H-NOXドメインのC-末端は、フォルドンドメインのC-末端に連結される。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインのN-末端は、フォルドンドメインのC-末端に連結される。
【０１７３】
いくつかの実施態様において、リンカーを用いて、フォルドンドメインをH-NOXドメインに接続する。いくつかの実施態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上のアミノ酸のうちいずれか1つを含むリンカーを重合ドメインとH-NOXドメインの間に配置することができる。例示的なリンカーとしては、Gly-Ser-Gly及びArg-Gly-Serリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、本発明は、N-末端からC-末端へと: T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー、及びフォルドンドメインを含む三量体型H-NOXタンパク質を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、N-末端からC-末端へと: T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー、フォルドンドメイン、Arg-Gly-Serアミノ酸リンカー、及びHis6タグを含む三量体型H-NOXタンパク質を提供する。いくつかの実施態様において、T.テングコンジェンシスH-NOXドメインは、L144F変異を含む。いくつかの実施態様において、T.テングコンジェンシスH-NOXドメインは、野生型H-NOXドメインである。
【０１７４】
(単量体型H-NOXドメインサブユニット)
一態様において、本発明は、会合して、重合体型H-NOXタンパク質を形成することができる組換え単量体型H-NOXタンパク質(すなわち、重合体型H-NOXタンパク質の単量体型H-NOXサブユニット)を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載されるH-NOXドメイン及び重合ドメインを含む組換えH-NOXタンパク質を提供する。H-NOXドメイン及び重合ドメインは、共有結合的に連結されていても、非共有結合的に連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインのC-末端は、重合ドメインのN-末端に連結される。他の実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインのN-末端は、重合ドメインのN-末端に連結される。さらに他の実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインのC-末端は、重合ドメインのC-末端に連結される。いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質のH-NOXドメインのN-末端は、重合ドメインのC-末端に連結される。いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
【０１７５】
いくつかの実施態様において、単量体型H-NOXタンパク質は、野生型H-NOXドメインを含む。本発明のいくつかの実施態様において、単量体型H-NOXタンパク質は、H-NOXドメインに1以上の突然変異を含む。いくつかの実施態様において、1以上の突然変異は、O2解離定数、酸素に対するkoff、ヘム自動酸化の速度、NO反応性、NO安定性、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せを、対応する野生型H-NOXドメインのものと比較して改変する。いくつかの実施態様において、突然変異は、遠位ポケット突然変異である。いくつかの実施態様において、突然変異は、遠位ポケットに存在しない突然変異を含む。いくつかの実施態様において、遠位ポケット突然変異は、T.テングコンジェンシスのL144突然変異(例えば、L144F突然変異)に対応する。
【０１７６】
いくつかの態様において、本発明は、会合して、三量体型H-NOXタンパク質を形成する組換え単量体型H-NOXタンパク質を提供する。いくつかの実施態様において、組換えH-NOXタンパク質は、H-NOXドメイン及び三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは、本明細書で論じられているフォルドンドメインである。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、T.テングコンジェンシスH-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、T.テングコンジェンシスH-NOXドメインのC-末端は、フォルドンドメインのN-末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施態様において、T.テングコンジェンシスH-NOXドメインのC-末端は、フォルドンドメインのC-末端に共有結合的に連結される。いくつかの実施態様において、T.テングコンジェンシスドメインは、L144F H-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、T.テングコンジェンシスドメインは、野生型H-NOXドメインである。
【０１７７】
いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、アミノ酸リンカー配列を用いて、重合ドメインに共有結合的に連結される。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカー配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列としては、Gly-Ser-Gly配列及びArg-Gly-Ser配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、3つのH-NOXドメイン及び3つの三量体化配列を含む三量体型H-NOXタンパク質であり、ここで、該H-NOXドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して、該三量体化ドメインに共有結合的に連結されている。いくつかの実施態様において、単量体型H-NOXタンパク質は、N-末端からC-末端へと、以下のもの: T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、単量体型H-NOXタンパク質は、N-末端からC-末端へと、以下のもの:野生型T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメインを含む。
【０１７８】
いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質は、タグ;例えば、His6、FLAG、GST、又はMBPタグを含む。いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質はHis6タグを含む。いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質はタグを含まない。いくつかの実施態様において、タグ(例えば、His6タグ)は、アミノ酸スペーサー配列を用いて、重合ドメインに共有結合的に連結される。いくつかの実施態様において、アミノ酸リンカー配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列としては、Gly-Ser-Gly配列及びArg-Gly-Ser配列が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、3つのH-NOXドメイン、3つの三量体化配列、及び3つのHis6タグを含む三量体型H-NOXタンパク質であり、ここで、該H-NOXドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して、該三量体化ドメインに共有結合的に連結されており、三量体化ドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して、His6タグに共有結合的に連結されている。いくつかの実施態様において、単量体型H-NOXタンパク質は、N-末端からC-末端へと、以下もの: L144F T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Arg-Gly-Serリンカー配列、及びHis6タグを含む。いくつかの実施態様において、単量体型H-NOXタンパク質は、N-末端からC-末端へと、以下のもの:野生型T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Arg-Gly-Serリンカー配列、及びHis6タグを含む。
【０１７９】
いくつかの実施態様において、組換え単量体型H-NOXタンパク質は、配列番号6又は配列番号8のアミノ酸配列を含む。
【０１８０】
(野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質の特徴)
本明細書に記載されているように、様々なNO及びO2解離定数、O2 koff、NO反応性、並びに安定性をもたらす、重合体型H-NOXタンパク質を含む、多数の多様なH-NOX突然変異体タンパク質が作製されている。作用する血液ガス担体を提供するために、H-NOXタンパク質を用いて、ヘモグロビンなどの内在性O2担体を機能的に交換又は補充することができる。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質などのH-NOXタンパク質を用いて、O2を低酸素組織(例えば、低酸素ペナンブラ)に送達する。したがって、いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、ヘモグロビンなどの内在性O2担体と比較して、同様の又は改善されたO2会合速度、O2解離速度、O2結合に対する解離定数、NO安定性、NO反応性、自動酸化速度、血漿保持時間、又は上記のうちの2つ以上の任意の組合せを有する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質であり、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質であり、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【０１８１】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質のO2に対するkoffは、20℃で約0.01〜約200s-1、例えば、約0.1〜約200s-1、約0.1〜100s-1、約1.0〜約16.0s-1、約1.35〜約23.4s-1、約1.34〜約18s-1、約1.35〜約14.5s-1、約0.21〜約23.4s-1、約1.35〜約2.9s-1、約2〜約3s-1、約5〜約15s-1、又は約0.1〜約1s-1である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、20℃で約0.65s-1以下(例えば、20℃で約0.21s-1〜約0.65s-1)の酸素に対するkoffを有する。
【０１８２】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質のO2に対するkonは、20℃で約0.14〜約60μM-1s-1、例えば、約6〜約60μM-1s-1、約6〜12μM-1s-1、約15〜約60μM-1s-1、約5〜約18μM-1s-1、又は約6〜約15μM-1s-1である。
【０１８３】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質によるO2結合に対する動力学的又は計算上のKDは、約1nM〜1mM、約1μM〜約10μM、又は約10μM〜約50μMである。いくつかの実施態様において、O2結合に対する計算上のKDは、20℃で約2nM〜約2μM、約2μM〜約1mM、約100nM〜約1μM、約9μM〜約50μM、約100μM〜約1mM、約50nM〜約10μM、約2nM〜約50μM、約100nM〜約1.9μM、約150nM〜約1μM又は約100nM〜約255nM、約20nM〜約2μM、20nM〜約75nM、約1μM〜約2μM、約2μM〜約10μM、約2μM〜約9μM、又は約100nM〜500nMのうちのいずれか1つである。いくつかの実施態様において、O2結合に対する動力学的又は計算上のKDは、20℃で約100nM未満、約80nM未満、約50nM未満、約30nM未満、約25nM未満、約20nM未満、又は約10nM未満のうちのいずれかである。
【０１８４】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質によるO2結合に対する動力学的又は計算上のKDは、同じ条件下での(例えば、20℃での)ヘモグロビンのO2結合に対する動力学的又は計算上のKDの約0.01〜約100倍以内、例えば、同じ条件下での(例えば、20℃での)ヘモグロビンのO2結合に対する動力学的又は計算上のKDの約0.1〜約10倍又は約0.5〜約2倍である。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質によるNO結合に対する動力学的又は計算上のKDは、同じ条件下での(例えば、20℃での)ヘモグロビンのNO結合に対する動力学的又は計算上のKDの約0.01〜約100倍以内、例えば、同じ条件下での(例えば、20℃での)ヘモグロビンのNO結合に対する動力学的又は計算上のKDの約0.1〜約10倍又は約0.5〜約2倍である。
【０１８５】
いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質の約50％未満、約40％未満、約30％未満、約10％未満、又は約5％未満のうちのいずれかが、20℃での約1時間、約2時間、約4時間、約6時間、約8時間、約10時間、約15時間、又は約20時間のうちのいずれかのインキュベーション後に酸化される。
【０１８６】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質のNO反応性は、20℃で約700s-1未満、例えば、20℃で約600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1、又は0.6s-1未満である。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質のNO反応性は、20℃で約0.1〜約600s-1、例えば、20℃で約0.5〜約400s-1、約0.5〜約100s-1、約0.5〜約50s-1、約0.5〜約10s-1、約1〜約5s-1、又は約0.5〜約2.1s-1である。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質の反応性は、同じ条件下での、例えば、20℃でのヘモグロビンの反応性よりも少なくとも約10、100、1,000、又は10,000倍低い。
【０１８７】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は、37℃で約1.0h-1未満、例えば、37Cで約0.9h-1未満、約0.8h-1未満、約0.7h-1未満、約0.6h-1未満、約0.5h-1未満、約0.4h-1未満、約0.3h-1未満、約0.2h-1未満、約0.1h-1未満、又は約0.05h-1未満のうちのいずれかである。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は、37℃で約0.006〜約5.0h-1、例えば、37℃で約0.006〜約1.0h-1、0.006〜約0.9h-1、又は約0.06〜約0.5h-1である。
【０１８８】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含む突然変異体H-NOXタンパク質は、(a)ヘモグロビンのO2もしくはNO解離定数、会合速度(O2もしくはNOに対するkon)、又は解離速度(O2もしくはNOに対するkoff)の2桁以内のO2もしくはNO解離定数、会合速度(O2もしくはNOに対するkon)、又は解離速度(O2もしくはNOに対するkoff)を有しているか、(b)それぞれsGC β1のNO親和性よりも弱い(例えば、少なくとも約10倍、100倍、又は1000倍弱い)NO親和性を有しているか、(c)ヘモグロビンよりも少なくとも1000倍低い結合したO2とのNO反応性を有しているか、(d)ヘモグロビンのインビボ血漿保持時間よりも少なくとも2、10、100、又は1000倍高いインビボ血漿保持時間を有しているか、或いは(e)上記のうちの2つ以上の任意の組合せを有する。
【０１８９】
例示的で好適なO2担体は、ヘモグロビンの解離定数の2桁以内、すなわち、ヘモグロビンの解離定数の約0.01〜100倍、例えば、約0.1〜10倍又は約0.5〜2倍の解離定数をもたらす。種々の確立された技法、例えば、本明細書に記載される技法(特に、解離定数の測定に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Boon, E. M.らの文献(2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M.らの文献(2005年10月). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M.らの文献(2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D.らの文献(2004年8月15日). Biochem J. 382(Pt 1): 183-189)及び当業者に公知の技法を用いて、解離定数を定量することができる。例示的なO2担体は、結合したO2を有するH-NOXタンパク質の低い又は最小化されたNO反応性、例えば、ヘモグロビンのNO反応性よりも低いNO反応性をもたらす。いくつかの実施態様において、NO反応性は、ヘモグロビンのNO反応性よりもはるかにより低く、例えば、少なくとも約10、100、1,000、又は10,000倍低い。種々の確立された技法(特に、NO反応性の測定に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Boon, E. M.らの文献(2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M.らの文献(2005年10月). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M.らの文献(2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902), Vandegriff, K. D.らの文献(2004年8月15日). Biochem J. 382(Pt 1): 183-189)及び当業者に公知の技法を用いて、NO反応性を定量することができる。野生型T.テングコンジェンシスH-NOXは、そのような低いNO反応性を有するので、他の野生型H-NOXタンパク質及び突然変異体H-NOXタンパク質も同様の低いNO反応性を有し得る。例えば、T.テングコンジェンシスH-NOX Y140Hは、野生型T.テングコンジェンシスH-NOXのNO反応性と同様のNO反応性を有する。
【０１９０】
さらに、好適なO2担体は、高い又は最大化された安定性、特に、インビボ安定性をもたらす。種々の安定性測定基準、例えば、酸化的安定性(例えば、自動酸化又はNOによる酸化に対する安定性)、温度安定性、及びインビボ安定性を用いることができる。種々の確立された技法、例えば、本明細書に記載される技法(Boon, E. M.らの文献(2005). Nature Chem. Biol. 1:53-59; Boon, E. M.らの文献(2005年10月). Curr. Opin. Chem. Biol. 9(5):441-446; Boon, E. M.らの文献(2005). J. Inorg. Biochem. 99(4):892-902)及び当業者に公知の技法を用いて、安定性を定量することができる。血漿、血液、又は組織におけるインビボ安定性について、安定性の例示的な測定基準には、保持時間、クリアランスの速度、及び半減期が含まれる。好熱性生物由来のH-NOXタンパク質は、高温で安定であると予想される。様々な実施態様において、血漿保持時間は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも少なくとも約2、10、100、又は1000倍長い(例えば、Bobofchak, K. M.らの文献(2003年8月). Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285(2):H549-H561)。当業者に理解されるように、ヘモグロビンに基づく代用血液は、血漿から無細胞ヘモグロビンを除去するヘモグロビンの受容体が存在するため、血漿からの無細胞ヘモグロビンの急速なクリアランスによって制限される。血漿中にはH-NOXタンパク質の受容体が存在しないので、野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも長い血漿保持時間を有すると予想される。望ましい場合、標準的な方法(例えば、本明細書に記載される方法及び当業者に公知の方法)を用いて、H-NOXタンパク質をPEG化もしくは架橋するか又はH-NOXタンパク質を別のタンパク質と融合させることにより、血漿保持時間を増加させることができる。
【０１９１】
様々な実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質は、20℃で約1nM〜約1mMのO2解離定数及び同じ条件下、例えば、20℃でヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも約10倍低いNO反応性を有する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、20℃で約1nM〜約1mMのO2解離定数及び20℃で約700s-1未満のNO反応性(例えば、20℃で約600s-1、500s-1、100s-1、20s-1、又は1.8s-1未満)を有する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、ヘモグロビンのO2解離定数の2桁以内のO2解離定数及び同じ条件下、例えば、20℃でヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも約10倍低いNO反応性を有する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、20℃で約0.01〜約200s-1の酸素に対するkoff及び同じ条件下、例えば、20℃でヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも約10倍低いNO反応性を有する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、20℃で約0.65s-1未満(例えば、20℃で約0.21s-1〜約0.64s-1)の酸素に対するkoff及び同じ条件下、例えば、20℃でヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも約10倍低いNO反応性を有する。本発明のいくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のO2解離定数は、約1nM〜約1μM(1000nM)、約1μM〜約10μM、又は約10μM〜約50μMである。特定の実施態様において、H-NOXタンパク質のO2解離定数は、20℃で約2nM〜約50μM、約50nM〜約10μM、約100nM〜約1.9μM、約150nM〜約1μM、又は約100nM〜約255nMである。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質のO2解離定数は、20℃で約80nM未満、例えば、20℃で約20nM〜約75nMである。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のNO反応性は、同じ条件下、例えば、20℃でヘモグロビンのNO反応性よりも少なくとも約100倍低いか又は約1,000倍低い。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のNO反応性は、20℃で約700s-1未満、例えば、20℃で約600s-1、500s-1、400s-1、300s-1、200s-1、100s-1、75s-1、50s-1、25s-1、20s-1、10s-1、50s-1、3s-1、2s-1、1.8s-1、1.5s-1、1.2s-1、1.0s-1、0.8s-1、0.7s-1、又は0.6s-1未満である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは、20℃で0.01〜200s-1、例えば、約0.1〜約200s-1、約0.1〜100s-1、約1.35〜約23.4s-1、約1.34〜約18s-1、約1.35〜約14.5s-1、約0.21〜約23.4s-1、約2〜約3s-1、約5〜約15s-1、又は約0.1〜約1s-1である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のO2解離定数は、20℃で約100nM〜約1.9μMであり、H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは、20℃で約1.35s-1〜約14.5s-1である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は、37℃で約1h-1未満、例えば、約0.9h-1未満、約0.8h-1未満、約0.7h-1未満、約0.6h-1未満、約0.5h-1未満、約0.4h-1未満、約0.3h-1未満、約0.2h-1未満、又は約0.1h-1未満のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは、20℃で約1.35s-1〜約14.5s-1であり、H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は、37℃で約1h-1未満である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の酸素に対するkoffは、20℃で約1.35s-1〜約14.5s-1であり、H-NOXタンパク質のNO反応性は、20℃で約700s-1未満(例えば、20℃で約600s-1、500s-1、100s-1、20s-1、又は1.8s-1未満)である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質のヘム自動酸化の速度は、37℃で約1h-1未満であり、H-NOXタンパク質のNO反応性は、20℃で約700s-1未満(例えば、20℃で約600s-1、500s-1、100s-1��20s-1、又は1.8s-1未満)である。
【０１９２】
いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質溶液を含むH-NOXタンパク質溶液の粘度は、1〜4センチポアズ(cP)である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質溶液のコロイド膠質浸透圧は、20〜50mmHgである。
【０１９３】
(02及び/又はNO結合の測定)
当業者は、当技術分野で公知の方法及び下記の非限定的で例示的な方法によって、重合体型H-NOXタンパク質、例えば、三量体型H-NOXタンパク質を含む任意のH-NOXタンパク質の酸素及び一酸化窒素結合特徴を容易に決定することができる。
【０１９４】
(動力学的KD: koffとkonの比)
動力学的KD値は、重合体型H-NOSタンパク質を含む野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質について、特に、O2会合速度、O2解離速度、O2結合に対する解離定数、自動酸化速度、及びNO解離速度の測定に関して、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Boon, E.M.らの文献(2005). Nature Chemical Biology 1:53-59に本質的に記載されている通りに決定される。
【０１９５】
(kon(O2会合速度))
ヘムへのO2会合は、閃光光分解を用いて20℃で測定される。非常に速い対再結合動力学の結果として、FeII-O2錯体を閃光除去する(flash off)ことは不可能である;したがって、FeII-CO錯体を560nmのレーザー光(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)による閃光光分解に供して、5-配位FeII中間体を生じさせ、これに対する分子O2の結合を様々な波長で追跡する。タンパク質試料を、10mM亜ジチオン酸塩による嫌気的還元と、それに続く、PD-10カラム(Millipore社、Billerica, MA)上での脱塩によって作製する。次に、試料を、20μMヘムになるまで、100μL〜1mLのサイズ及び1-cmの路長を有する雰囲気調節石英キュベット内で50mM TEA、50mM NaCl、pH7.5バッファーに希釈する。COガスをこのキュベットのヘッドスペース越しに10分間流入させて、FeII-CO錯体を形成させ、この形成をUV-可視分光法により確認する(ソーレー最大423nm)。次に、この試料を用いて、閃光光分解後、まだ1気圧のCOガス下のうちにCO-再結合動態を測定するか、又はそれを開放し、空気中で30分間撹拌して、バッファーを完全に酸素化した後、閃光光分解して、O2再結合事象を観察する。ヘムへのO2会合は、複数の波長と時間との対比でモニタリングされる。これらのトレースを、Igor Proソフトウェア(Wavemetrics社、Oswego, OR;最新2005年版)を用いて、単一の指数関数と適合させる。この速度は、観察波長と無関係であるが、O2濃度に依存的である。UV-可視分光法を全体を通して用いて、全ての錯体及び中間体を確認する(Cary 3K, Varian社. Palo Alto, CA)。一過性吸収データは、特に、機器使用に関して、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Dmochowski, I. J.らの文献(2000年8月31日). J Inorg Biochem. 81(3):221-228に記載されている機器を用いて収集される。この機器は20nsの応答時間を有し、データは200メガ試料s-1でデジタル化される。
【０１９６】
(koff(O2解離速度))
koffを測定するために、タンパク質(5μMヘム)のFeII-O2錯体を嫌気的な50mM TEA、50mM NaCl、pH7.5バッファーに希釈し、様々な濃度の亜ジチオン酸塩及び/又は飽和COガスを含有する等容量の同じバッファー(嫌気的)と速やかに混合する。データを、20℃に設定されたNeslab RTE-100恒温槽を備えたHI-TECH Scientific SF-61ストップトフロー分光光度計で取得する(TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom)。ヘムからのO2の解離を、FeII-FeII-O2差スペクトルの最大値である437nm、又はFeII-FeII-CO差スペクトルの最大値である425nmにおける吸光度の増加としてモニタリングする。最終トレースを、機器の一部であるソフトウェアを用いて、単一の指数関数に適合させる。各々の実験を最低6回行い、得られた速度を平均化する。測定された解離速度は、亜ジチオン酸塩濃度と無関係であり、かつ10mM亜ジチオン酸塩が存在する場合も存在しない場合も、還元種のトラップとしての飽和COと無関係である。
【０１９７】
(動力学的KD)
動力学的KDは、上記のkoff及びkonの測定値を用いて、koffとkonの比を計算することにより決定される。
【０１９８】
(計算上のKD)
計算上のKDを測定するために、上記のように得られるkoff及び動力学的KDの値をグラフにする。koffと動力学的KDの線形関係は、等式(y＝mx＋b)によって定義される。次に、koff値を線に沿って内挿して、Excel: MAC 2004(Microsoft, Redmond, WA)を用いて、計算上のKDを導き出した。測定されたkonが存在しない場合、この内挿は、koffをKDと関連付ける方法を提供する。
【０１９９】
(自動酸化の速度)
自動酸化の速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元し、次に、5μMヘムになるまで、好気的な50mM TEA、50mM NaCl、pH7.5バッファーに希釈する。次に、これらの試料を、37℃に設定されたNeslab RTE-100恒温槽を備えたCary 3E分光光度計中でインキュベートし、定期的に走査する(Cary 3E, Varian社、Palo Alto, CA)。自動酸化の速度は、時間に対してプロットし、かつExcel: MAC 2004(Microsoft, Redmond, WA)を用いて単一の指数関数と適合させたFeIII-FeII差スペクトルの最大値と最小値の差から決定される。
【０２００】
(NOとの反応速度)
NO反応性を、バッファーA中に2μMで調製された精製タンパク質(H-NOX、重合体型H-NOX、ヒトヘモグロビン(Hs Hb)など)及びバッファーA中に200μMで調製されたNOを用いて測定する(バッファーA: 50mM Hepes、pH 7.5、50mM NaCl)。データを、20℃に設定されたNeslab RTE-100恒温槽を備えたHI-TECH Scientific SF-61ストップトフロー分光光度計で取得する(TGK Scientific LTD., Bradford On Avon, United Kingdom)。タンパク質を、積分時間を0.00125秒にして、1:1比でNOと速やかに混合する。最大変化の波長を、分光計の一部であるソフトウェアを用いて単一の指数関数に適合させ、NOによる酸化の律速段階を本質的に測定する。反応の最終産物は、HNOXタンパク質については第二鉄-NOであり、Hs Hbについては第二鉄-水和(aquo)である。
【０２０１】
(p50測定)
望ましい場合、突然変異体又は野生型H-NOXタンパク質のp50値を、特に、p50値の測定に関して、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Guarnone, R.らの文献(1995年9月/10月). Haematologica 80(5):426-430に記載されている通りに測定することができる。p50値は、HemOx分析計を用いて決定される。測定チャンバーは、0％酸素から開始し、100％酸素に向けてゆっくりと徐々に上昇させる。チャンバー内の酸素プローブは、酸素飽和％を測定する。第二のプローブ(UV-Vis光)は、ヘムタンパク質(例えば、ヘムと錯体形成したH-NOXなどのタンパク質)のUV-Visスペクトルのアルファ及びベータピークに合わされる2つの吸収波長を測定する。これらの吸収ピークは、ヘムタンパク質が酸素に結合するにつれて直線的に増加する。次に、非結合から100％結合までのパーセント変化を％酸素値に対しプロットして、曲線を作成する。p50は、ヘムタンパク質の50％が酸素に結合する曲線上の点である。
【０２０２】
具体的に、Hemox分析計(TCS Scientific Corporation, New Hope, PA)は、50μLの血液又はヘムタンパク質を増加する酸素分圧に曝露し、それを窒素ガスで脱酸素化することにより、オキシヘムタンパク質解離曲線(ODC)を決定する。Clark酸素電極は、酸素圧の変化を検出し、それをx-y記録計のx軸に記録する。得られたオキシヘムタンパク質画分の増加を560nm及び576nmでの二重波長分光光度測定によって同時にモニタリングし、y軸に表示する。血液試料を前内側静脈から採取し、ヘパリンで抗凝固処理し、アッセイするまで濡れた氷の上で4℃で維持する。50μLの全血を5μLのHemox溶液に希釈する。このHemox溶液は、溶液のpHを7.4±0.01の値に維持する製造業者提供のバッファーである。試料-バッファーをHemox分析計の一部であるキュベットに引き入れ、混合物の温度を平衡化し、37℃にし;次に、試料を空気で100％まで酸素化する。pO2値の調整後、試料を窒素で脱酸素化し;脱酸素化プロセスの間、曲線をグラフ用紙に記録する。Hemox分析計の一部であるソフトウェアを用いて、P50値をO2飽和が50％である点としてx軸に外挿する。完全な記録に必要とされる時間は、約30分である。
【０２０３】
(H-NOX核酸)
本発明はまた、本明細書に記載される突然変異体H-NOXタンパク質、重合体型H-NOX、又は組換え単量体H-NOXタンパク質サブユニットのうちのいずれかをコードする核酸を特色とする。
【０２０４】
特定の実施態様において、核酸は、H-NOXタンパク質又はH-NOXドメインをコードする核酸のうちのいずれかのセグメント又は該核酸のうちのいずれかの核酸配列全体を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、H-NOX核酸由来の少なくとも約50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、又はそれより多くの連続するヌクレオチドを含み、それが由来したH-NOX核酸と比較して、1以上の突然変異(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の突然変異)を含有する。様々な実施態様において、突然変異体H-NOX核酸は、それが由来したH-NOX核酸と比較して、約20、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、又は2個未満の突然変異を含有する。本発明はまた、突然変異体H-NOXタンパク質をコードする任意の核酸の縮重変異体を特色とする。
【０２０５】
いくつかの実施態様において、核酸は、2以上のH-NOXドメインをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、2以上のH-NOXドメインを含む核酸は、重合体型H-NOXタンパク質が該核酸から発現されるように連結される。さらなる実施態様において、核酸は、1以上の重合ドメインをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、2以上のH-NOXドメイン及び1以上の重合ドメインを含む核酸は、重合体型H-NOXタンパク質が該核酸から発現されるように連結される。
【０２０６】
いくつかの実施態様において、核酸は、重合ドメインをコードする任意の核酸のセグメント又は該核酸の核酸配列全体を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、H-NOXドメイン及び重合ドメインをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインをコードする核酸及び重合ドメインをコードする核酸は、産生されたポリペプチドが、H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む融合タンパク質となるように連結される。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、核酸は、1以上のHis6タグをコードする核酸を含む。いくつかの実施態様において、核酸は、H-NOXドメイン、重合ドメイン、及び/又はHis6タグをコードする核酸の間に位置するリンカー配列をコードする核酸をさらに含む。
【０２０８】
いくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXドメイン及びフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、T.サーモアナエロバクターH-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、野生型T.サーモアナエロバクターH-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、T.サーモアナエロバクターL144F H-NOXドメインである。
【０２０９】
いくつかの実施態様において、本発明は、5'から3'へと、以下のもの: L144F T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、5'から3'へと、以下のもの:野生型T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、及びフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。
【０２１０】
いくつかの実施態様において、本発明は、5'から3'へと、以下のもの: L144F T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Arg-Gly-Serリンカー配列、及びHis6タグをコードする核酸を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、5'から3'へと、以下のもの:野生型T.テングコンジェンシスH-NOXドメイン、Gly-Ser-Glyアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Arg-Gly-Serリンカー配列、及びHis6タグをコードする核酸を提供する。
【０２１１】
いくつかの実施態様において、核酸は、配列番号1、配列番号5、又は配列番号7に示される核酸配列を含む。
【０２１２】
本発明はまた、本明細書に記載される突然変異体H-NOXタンパク質をコードする少なくとも1つの核酸を含有する細胞又は細胞の集団を含む。例示的な細胞としては、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞、及び哺乳動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、標準的な方法、例えば、本明細書に記載される方法を用いる突然変異体H-NOXタンパク質の産生に有用である。
【０２１３】
いくつかの実施態様において、本発明は、H-NOXドメイン及びフォルドンドメインをコードする核酸を含む細胞を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、T.サーモアナエロバクターH-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、野生型T.サーモアナエロバクターH-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインは、T.サーモアナエロバクターL144F H-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、本発明は、配列番号1、配列番号5、又は配列番号7に示される核酸配列を含む核酸を含む細胞を提供する。
【０２１４】
(H-NOXタンパク質の製剤)
本明細書に記載される重合体型H-NOXタンパク質を含む任意の野生型又は突然変異体H-NOXタンパク質を医薬組成物又は非医薬組成物の製剤に使用することができる。いくつかの実施態様において、製剤は、単量体型H-NOXタンパク質がインビトロ又はインビボで会合して、重合体型H-NOXタンパク質を生じるような、H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む単量体型H-NOXタンパク質を含む。以下でさらに論じられるように、これらの製剤は、種々の治療的及び産業的用途において有用である。
【０２１５】
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、重合体型H-NOXタンパク質を含む本明細書に記載される1以上の野生型又は突然変異体H-NOXタンパク質及び医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含む。医薬として許容し得る担体又は賦形剤の例としては、標準的な医薬担体又は賦形剤、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば、油/水エマルジョン、及び様々なタイプの湿潤剤のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。エアロゾル又は非経口的投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝食塩水又は生理(0.9％)食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される(例えば、特に製剤に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、レミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990;及びRemingtonの文献、調剤の科学及び実践(The Science and Practice of Pharmacy)、第20版. Mack Publishing, 2000を参照)。いくつかの実施態様において、製剤は滅菌されている。いくつかの実施態様において、製剤はエンドトキシンを本質的に含まない。
【０２１６】
当業者に公知の任意の好適な担体を本発明の医薬組成物で利用することができるが、担体の種類は、投与の様式によって異なる。組成物は、例えば、静脈内、動脈内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内、頭蓋内、CSFへの投与、又は経皮投与を含む任意の適切な投与様式のために製剤化することができる。いくつかの実施態様において、送達は、血管閉塞の部位に直接又低酸素組織に直接であり得る。非経口投与、例えば、皮下注射について、担体としては、例えば、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、又はバッファーを挙げることができる。経口投与について、上記の担体又は固体担体、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、又は炭酸マグネシウムのうちいずれかを利用することができる。生分解性マイクロスフェア(例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート)を担体として使用することもできる。
【０２１７】
いくつかの実施態様において、医薬組成物又は非医薬組成物は、バッファー(例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストランなど)、酸化防止剤、キレート剤(例えば、EDTA、グルタチオンなど)、防腐剤、酸素の結合及び/もしくは輸送に有用な別の化合物、不活性成分(例えば、安定剤、充填剤など)、又は上記のうちの2つ以上の組合せを含む。いくつかの実施態様において、該組成物は、凍結乾燥物として製剤化される。H-NOXタンパク質は、周知の技術を用いて、リポソーム又はナノ粒子内に封入することもできる。H-NOXタンパク質に使用することができる他の例示的な製剤は、例えば、特にタンパク質の製剤に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,974,795号及び第6,432,918号に記載されている。
【０２１８】
本明細書に記載される組成物は、持続放出製剤(例えば、投与後に化合物の低速放出を生じるカプセル又はスポンジなどの製剤)の一部として投与することができる。そのような製剤は、通常、周知の技術を用いて調製し、例えば、経口、直腸、もしくは皮下移植によって、又は所望の標的部位での移植によって投与することができる。持続放出製剤は、担体マトリックス中に分散した及び/又は速度制御膜に囲まれたリザーバー内に収容されたH-NOXタンパク質を含有することができる。そのような製剤内で使用するための担体は生体適合性であり、かつ生分解性でもあり得る。いくつかの実施態様において、製剤は、相対的に一定のレベルのH-NOXタンパク質放出をもたらす。持続放出製剤内に含まれるH-NOXタンパク質の量は、移植部位、放出の速度及び予想される持続時間、並びに治療又は予防されることになる状態の性質によって決まる。
【０２１９】
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、野生型又は突然変異体H-NOXタンパク質の有効量を含有する。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、2以上の野生型又は突然変異体H-NOXドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質の有効量を含有する。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載される野生型又は突然変異体H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む組換え単量体型H-NOXタンパク質の有効量を含有する。いくつかの実施態様において、製剤は、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、製剤は、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【０２２０】
代用血液としてのヘモグロビンの例示的な用量は、患者の体重1キログラム当たり約10mg〜約5グラム、又はそれを上回る細胞外ヘモグロビンである。したがって、いくつかの実施態様において、ヒトへの投与のためのH-NOXタンパク質の有効量は、数グラム〜約350グラム超である。H-NOXタンパク質の他の例示的な用量は、適切な点滴速度、例えば、約0.5ml/分での約4.4G/DL、約5G/DL、約10G/DL、又は約13G/DL(ここで、G/DLは、循環中に点滴する前のH-NOXタンパク質溶液の濃度である)のうちのいずれかを含む(例えば、Winslow, R.の文献、代用血液(Blood Substitutes)の第12章を参照)。複数の投与の組合せ効果によって必要な有効量に達することができるので、各々の剤形の個々の用量に含まれる活性成分の単位含有量がそれ自体で有効量を構成する必要がないことが理解されるであろう。医薬組成物に含めるべきH-NOXタンパク質の量の選択は、利用される剤形、治療されている状態、及び当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的によって決まる。
【０２２１】
例示的な組成物は、対応する野生型H-NOXタンパク質と比べて改変されたO2又はNOリガンド結合をまとめて付与する1以上の突然変異を含み、かつ生理的に適合する哺乳動物血液ガス担体として作用する、単離又は精製し得る、遺伝子改変された組換えH-NOXタンパク質を含む。例えば、本明細書に記載される突然変異体H-NOXタンパク質。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、重合体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、本明細書に記載される野生型又は突然変異体H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む組換え単量体型H-NOXタンパク質である。いくつかの実施態様において、該組成物は、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、該組成物は、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【０２２２】
医薬組成物を投与されたヒト被験体における免疫応答を低下させ又は予防するために、ヒトH-NOXタンパク質もしくはドメイン(野生型ヒトタンパク質もしくは1以上の突然変異が導入されたヒトタンパク質のいずれか)又は他の非抗原性H-NOXタンパク質もしくはドメイン(例えば、哺乳動物H-NOXタンパク質)を使用することができる。ヒト以外の供給源に由来するH-NOXタンパク質の免疫原性を低下又は消失させるために、H-NOXタンパク質又はH-NOXドメイン中のアミノ酸を、ヒトH-NOX中の対応するアミノ酸へと突然変異させることができる。例えば、非ヒトH-NOXタンパク質の三次構造の表面の1以上のアミノ酸を、ヒトH-NOXタンパク質中の対応するアミノ酸へと突然変異させることができる。
【０２２３】
いくつかの実施態様において、H-NOXの製剤は、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの両方を含む。いくつかの実施態様において、製剤中のPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、H-NOXの製剤は、PEG化三量体型T.テングコンジェンシスL144F H-NOXと非PEG化三量体型T.テングコンジェンシスL144F H-NOXの両方を含む。いくつかの実施態様において、PEG化三量体型T.テングコンジェンシスL144F H-NOXと非PEG化三量体型T.テングコンジェンシスL144F H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のうちのいずれかである。
【０２２４】
(H-NOXタンパク質の治療的用途)
本明細書に記載される重合体型H-NOXタンパク質を含む野生型もしくは突然変異体H-NOXタンパク質のいずれか又は医薬組成物を治療的用途で使用することができる。重合体型H-NOXタンパク質を含む特定のH-NOXタンパク質を、そのような用途のために、治療されている特定の適応症について、望ましいO2会合速度、O2解離速度、O2結合に対する解離定数、NO安定性、NO反応性、自動酸化速度、血漿保持時間、又は上記のうち2つ以上の任意の組合せに基づき選択することができる。
【０２２５】
細胞外H-NOXタンパク質の血管系における分布は赤血球のサイズによって制限されないので、本発明の重合体型H-NOXタンパク質を用いて、赤血球が透過できない部分にO2を送達することができる。これらの部分としては、赤血球流入に対する障害物の下流に位置する任意の組織の部分、例えば、1以上の血栓、動脈閉塞、末梢血管閉塞、血管形成術バルーン、外科的機器、酸素欠乏を患う又は低酸素状態である組織などの下流にある部分を挙げることができる。さらに、全てのタイプの組織虚血を、H-NOXタンパク質を用いて治療することができる。そのような組織虚血としては、例えば、周術期虚血、脳卒中(例えば、虚血性脳卒中及び出血性脳卒中)、新興脳卒中、一過性虚血発作、気絶心筋及び冬眠心筋、急性又は不安定狭心症、新興狭心症、並びに心筋梗塞(例えば、STセグメント上昇心筋梗塞)が挙げられる。他の実施態様において、H-NOXを用いて、限定されないが、低酸素脳損傷、血管閉塞、及び脳出血を含む、低酸素脳損傷を治療する。他の実施態様において、H-NOXは、脳血管攣縮を治療するために、又は動脈瘤修復のために使用される。H-NOXタンパク質を用いて治療することができる他の例示的な心血管適応症としては、心臓麻痺及び鎌状赤血球貧血症が挙げられる。例示的な標的適応症としては、機能的ヘモグロビン欠損の状態、例えば、失血、低酸素症などを含む、代用血液又はO2担体が適応となる場合が挙げられる。
【０２２６】
いくつかの態様において、本発明は、個体の脳の低酸素状態を軽減する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体にH-NOXを投与することにより、個体の脳卒中を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体にH-NOXを投与することにより、脳卒中後の個体に酸素を送達する方法を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、ポリエチレングリコールに共有結合している(PEG化)H-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していない(非PEG化)H-NOXを含む。いくつかの実施態様において、個体に投与されるPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、組成物中にある。いくつかの実施態様において、H-NOXは、PEG化T.テングコンジェンシスL144F三量体型H-NOX及び非PEG化T.テングコンジェンシスL144F三量体型H-NOXを含み、ここで、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のうちのいずれかである。
【０２２７】
いくつかの態様において、本発明は、個体にH-NOXを投与することにより、個体の一過性虚血発作を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体にH-NOXを投与することにより、一過性虚血発作後の個体に酸素を送達する方法を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、ポリエチレングリコールに共有結合している(PEG化)H-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していない(非PEG化)H-NOXを含む。いくつかの実施態様において、個体に投与されるPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、組成物中にある。
【０２２８】
いくつかの態様において、本発明は、個体にH-NOXを投与することにより、個体の低酸素脳損傷を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体にH-NOXを投与することにより、低酸素脳損傷後の個体に酸素を送達する方法を提供する。いくつかの実施態様において、H-NOXは、ポリエチレングリコールに共有結合している(PEG化)H-NOX及びポリエチレングリコールに共有結合していない(非PEG化)H-NOXを含む。いくつかの実施態様において、個体に投与されるPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のうちのいずれかである。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、組成物中にある。
【０２２９】
いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を治療するために、同時に又は順次送達される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXは、非PEG化H-NOXの前に投与される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXは、非PEG化H-NOXの後に送達される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXは、非PEG化H-NOXの投与から約5分後、10分後、15分後、30分後、45分後、約1時間後、約2時間後、約4時間後、約6時間後、約8時間後、約10時間後、約12時間後、約16時間後、約24時間後、約2日後、約3日後、約4日後、約5日後、約6日後、約7日後、約2週間後、約3週間後、約4週間後、又は約1カ月よりも長い時間の後のいずれかに送達される。
【０２３０】
いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び/又は非PEG化H-NOXは、個体に複数回投与される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び/又は非PEG化H-NOXは、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、又は11回以上のいずれかで投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、脳卒中、一過性虚血発作、又は虚血脳損傷後の脳の低酸素部分が本質的に除去されてしまうまで複数回投与される。いくつかの実施態様において、非PEG化H-NOXが、脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷を患う個体に投与され、その後、PEG化H-NOXが複数回投与される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXは、非PEG化H-NOXの投与から1時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後、8日後、9日後、又は10日後の1つ又は複数で投与される。
【０２３１】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の治療有効量は、別の療法と併せて個体に投与される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び/又は非PEG化H-NOXの治療有効量は、別の療法と併せて個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、閉塞血管の機械的又は化学的再疎通と組み合わせて投与される。機械的再疎通の例としては、血管形成術、例えば、バルーン血管形成術が挙げられるが、これに限定されない。化学的再疎通の例としては、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、抗凝固剤、例えば、ヘパリン又はワルファリン(クマディン)と組み合わせて投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、神経保護物質と組み合わせて投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、他の療法による治療の前、それと同時、又はその後に投与される。
【０２３２】
いくつかの態様において、本発明は、個体の脳の低酸素状態に対する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の急速静注を投与し、その後、該個体にH-NOXを点滴することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の急速静注を投与し、その後、該個体にH-NOXを点滴することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の急速静注を皮下注射によって投与し、その後、該個体にH-NOXを点滴することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の急速静注を皮下注射によって投与し、その後、該個体にH-NOXを点滴することを含み、ここで、該H-NOXがPEG化H-NOX及び/又は非PEG化H-NOXを含む、方法を提供する。例えば、H-NOXの急速静注が現場で投与され、その後、病院でH-NOXが点滴されてもよい。いくつかの実施態様において、非PEG化H-NOXが急速静注として送達され、その後、PEG化H-NOXが点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、又は約7日のいずれかよりも長い時間にわたって、点滴によって、個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、急速静注として個体に投与され、その後、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、又は約7日のいずれかよりも長い時間にわたって点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、急速静注によるH-NOXタンパク質の投与の直後、又は急速静注によるH-NOXタンパク質の投与から約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、もしくは約7日のいずれかよりも長い時間の後、点滴によって投与される。
【０２３３】
いくつかの実施態様において、H-NOXは、急速静注によって個体に全身送達され、その後、全身に点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、脳の閉塞の部位への急速静注によって個体に送達され、その後、全身に点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、脳の閉塞の部位への急速静注によって個体に送達され、その後、脳の閉塞の部位に又は脳の閉塞と関連する低酸素ペナンブラに点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、急速静注によって個体に全身送達され、その後、脳の閉塞の部位に又は脳の閉塞の部位と関連する低酸素ペナンブラに点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、急速静注によって及び/又は点滴によって、脳に直接送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、急速静注によって及び/又は点滴によって、脳脊髄液(CSF)に送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、筋肉内又は皮下に送達される。
【０２３４】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の脳卒中後のペナンブラにO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXの治療有効量を急速静注として及び/又は点滴によって投与することを含む、方法を提供する。脳卒中と関連する低酸素ペナンブラへのO2の送達は、ペナンブラの梗塞のレベルを低下させる。
【０２３５】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の低酸素脳損傷を治療する方法であって、該個体に、H-NOXタンパク質の治療有効量を、急速静注として及び/又は点滴によって投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の低酸素脳損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体に、H-NOXタンパク質の治療有効量を、急速静注として及び/又は点滴によって投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の低酸素脳損傷と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体に、H-NOXタンパク質の治療有効量を、急速静注として及び/又は点滴によって投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、低酸素脳損傷は;例えば、血栓症又は塞栓症の結果としての局所的脳虚血である。他の態様において、低酸素脳損傷は;例えば、心停止の結果としての全脳虚血である。いくつかの実施態様において、低酸素脳損傷は、先天性障害;例えば、鎌状赤血球貧血又は不適切な動脈形成の結果である。いくつかの実施態様において、低酸素脳損傷は、プラーク形成又は血管の圧迫の結果である。
【０２３６】
いくつかの実施態様において、本発明は、個体の一過性虚血発作を治療する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の一過性虚血発作と関連する低酸素状態に対する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、個体の一過性虚血発作と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。多くの場合、一過性虚血発作に続いて、脳卒中が起こる。H-NOXによる一過性虚血発作の治療は、個体の脳卒中の可能性を低下させることができる。
【０２３７】
いくつかの実施態様において、H-NOXで治療されることになる個体は、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作の結果として、脳の持続的低灌流を示す。脳の低灌流は、低酸素ペナンブラをもたらす可能性があり、これは、その後、該ペナンブラと関連する組織の梗塞をもたらす可能性がある。低灌流部位へのO2の送達は、低灌流に起因する有害な結果を軽減することができる。
【０２３８】
いくつかの実施態様において、本発明は、(例えば、脳卒中、一過性虚血発作、低酸素脳損傷などの後の)個体の脳の血管閉塞と関連する低酸素ペナンブラにおける炎症を軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は閉塞の部位と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、該閉塞の部位又は該閉塞の部位と関連するペナンブラにおける、限定されないが、アストロサイト、マクロファージ、T細胞、好中球、単球、好酸球、好塩基球、及び/又はミクログリアを含む、浸潤性炎症細胞の活性化を低下させる。
【０２３９】
いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は閉塞の部位と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、脳卒中、低酸素脳損傷、又は一過性虚血発作と関連する感覚運動障害を軽減する。いくつかの実施態様において、閉塞の部位又は脳卒中、低酸素脳損傷、もしくは一過性虚血発作と関連する低酸素ペナンブラへのH-NOXの送達は、限定されないが、失語症、構音障害(神経学的損傷に起因する運動性発話障害)、失行(随意運動の変化)、記憶、歩行の変化、又は協調運動の変化を含む、脳の低酸素状態の結果を軽減する。
【０２４０】
いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中のリスクを軽減する方法であって、H-NOXタンパク質の治療有効量を、急速静注として及び/又は点滴によって、脳卒中を有するリスクのある個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の脳卒中の有害な結果を軽減する方法であって、H-NOXタンパク質の治療有効量を、急速静注として及び/又は点滴によって、脳卒中を有するリスクのある個体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、脳卒中を有するリスクのある個体に酸素を送達する方法であって、該個体に、急速静注として及び/又は点滴によって、H-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、脳卒中を有するリスクのある個体は、一過性虚血発作を経験したことがある。いくつかの実施態様において、脳卒中を有するリスクのある個体は、以下の状態、顔面の下垂;腕の衰弱;発話困難;特に半身の、顔面、腕、又は脚の突然のしびれ又は衰弱;突然の意識混濁;突然の音声理解の困難;突然の片目又は両目の視覚困難;突然の困難;突然の歩行困難、目眩、平衡又は協調運動の喪失;及び原因不明の突然の激しい頭痛のうちの1つ又は複数を示す。脳卒中の有害な結果としては、感覚運動障害、認知障害、失語症、構音障害、失行、記憶、歩行の変化、又は協調運動の変化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４１】
上記の治療方法のいくつかの実施態様において、本発明の方法のH-NOXタンパク質は、重合体型H-NOXタンパク質(例えば、三量体型H-NOXタンパク質)である。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144に対応する位置に突然変異を含む1以上のH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスH-NOXのL144F突然変異に対応する突然変異を含む1以上のH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXドメインはヒトH-NOXドメインである。いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメインを含む。
【０２４２】
いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器又は四肢の損傷と関連する低酸素組織を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。低酸素状態は、臓器の損傷と直接的に関連し得るか、又は該損傷と間接的に関連し得る。いくつかの実施態様において、低酸素状態は、該損傷の一次治療の結果であり得る。いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器の損傷と関連する低酸素組織を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器の損傷と関連する低酸素ペナンブラを治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器の損傷と関連する低酸素ペナンブラの度合いを軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。低酸素ペナンブラの度合いの軽減は、空間的軽減及び/又は時間的軽減であり得る。いくつかの実施態様において、該組織における低酸素のレベルの軽減は、臓器及び/又は体の機能不全をもたらし得る細胞機能の喪失及び/又は細胞死を軽減する。いくつかの実施態様において、臓器又は組織は、筋骨格系、呼吸器系、消化器系、泌尿器系、循環系、生殖系、神経系の部分であるか、又は皮膚もしくは内分泌腺である。いくつかの実施態様において、臓器は、脳、心臓、肝臓、腎臓、肺、脾臓、腸、又は膵臓である。いくつかの実施態様において、組織は筋肉である。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【０２４３】
いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、臓器の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達して、個体の臓器の損傷と関連する低酸素ペナンブラの度合いを軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。低酸素ペナンブラの度合いの軽減は、空間的軽減及び/又は時間的軽減であり得る。いくつかの実施態様において、臓器は、脳、心臓、肝臓、腎臓、肺である。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【０２４４】
いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素ペナンブラを治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素ペナンブラの度合いを軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。低酸素ペナンブラの度合いの軽減は、空間的軽減及び/又は時間的軽減であり得る。いくつかの実施態様において、四肢は、腕、手、手指、脚、膝、足、又は足指である。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【０２４５】
いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、四肢の損傷と関連する低酸素組織にO2を送達して、個体の四肢の損傷と関連する低酸素ペナンブラの度合いを軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。低酸素ペナンブラの度合いの軽減は、空間的軽減及び/又は時間的軽減であり得る。いくつかの実施態様において、四肢は、腕、手、手指、脚、膝、足、又は足指である。いくつかの態様において、本発明は、個体の四肢の損傷と関連する低酸素状態を治療する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。
【０２４６】
いくつかの実施態様において、臓器の損傷は、血管閉塞の結果である。例えば、該損傷は、冠血管の閉塞、脳の血管(例えば、大脳の血管もしくは小脳の血管など)、臓器に栄養を供給する血管、例えば、肝臓に栄養を供給する血管(例えば、門脈管)、腎臓に栄養を供給する血管(例えば、腎血管)、又は肺に栄養を供給する血管(例えば、肺血管)の閉塞によるものであり得る。いくつかの実施態様において、臓器損傷は、虚血の結果である。いくつかの実施態様において、臓器損傷は、臓器の外傷の結果である。いくつかの実施態様において、臓器の損傷は、損傷した臓器の組織又は損傷した臓器と関連する組織の低灌流をもたらす。いくつかの実施態様において、臓器の損傷は、損傷した臓器の組織又は損傷した臓器と関連する組織の持続的低灌流をもたらす。いくつかの実施態様において、臓器の損傷は、空間的にか又は機能的にかのいずれかで、損傷した臓器の組織又は損傷した臓器と関連する組織の低灌流をもたらす。いくつかの実施態様において、臓器の損傷は、損傷した臓器又はその近くで低酸素ペナンブラの発生をもたらす。
【０２４７】
いくつかの実施態様において、四肢の損傷は、血管閉塞の結果である。例えば、該損傷は、末梢血管閉塞であり得る。いくつかの実施態様において、血管閉塞は、虚血の結果である。いくつかの実施態様において、四肢損傷は、四肢の外傷の結果である。いくつかの実施態様において、四肢の損傷は、四肢の組織又は四肢と関連する組織の低灌流をもたらす。いくつかの実施態様において、四肢の損傷は、四肢の組織又は四肢と関連する組織の持続的低灌流をもたらす。いくつかの実施態様において、四肢の損傷は、空間的にか又は機能的にかのいずれかで、四肢の組織又は四肢と関連する組織の低灌流をもたらす。いくつかの実施態様において、四肢の損傷は、損傷した四肢又はその近くで低酸素ペナンブラの発生をもたらす。
【０２４８】
いくつかの態様において、本発明は、個体の臓器の損傷と関連する低酸素状態の結果を軽減する方法であって、該個体にH-NOXタンパク質の治療有効量を投与すること含む、方法を提供する。臓器の損傷と関連する低酸素状態の結果の例としては、感覚運動障害、運動障害、認知障害、発話障害、感情面での問題(不安症、無気力症、精神病、鬱病)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４９】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器の炎症を軽減し、かつ/又は損傷した臓器と関連する低酸素ペナンブラの炎症を軽減する。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器及び/又は損傷した臓器と関連する低酸素ペナンブラにおけるマクロファージの活性化を低下させる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質の投与は、損傷した臓器及び/又は損傷した臓器と関連する低酸素ペナンブラの細胞のアポトーシスを軽減する。
【０２５０】
いくつかの実施態様において、低酸素ペナンブラは、臓器損傷と関連する低灌流の結果である。低灌流は、脳又は手のような臓器又は四肢への不十分な血液供給を指す。低灌流が持続する場合、それにより、酸素の喪失が生じることがあり、組織から必要な栄養素及び廃棄物処理が奪われることがある。多くの場合、低灌流は、組織の死をもたらす。低灌流の症状は、場所によって異なる。心臓のような臓器の低灌流は、機能的な問題をもたらすことがあり、一方、脳の低灌流は、認知障害、不明瞭な発語、及び/又は意識混濁をもたらすことがある。
【０２５１】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、臓器又は四肢の損傷又は外傷と関連する低酸素状態を発症するリスクのある個体に投与される。H-NOXタンパク質は、低酸素状態の発症がリスクとなる医学的介入を受けている個体に投与することができる。例えば、H-NOXタンパク質を手術の前、その間、又はその後に投与して、手術関連低酸素症の可能性を低下させることができる。
【０２５２】
様々な実施態様において、本発明は、それを必要としている個体に、重合体型H-NOXタンパク質を含む野生型又は突然変異体H-NOXタンパク質を、個体にO2を送達するのに十分な量で投与することにより、個体(例えば、哺乳動物、例えば、霊長類(例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザルなど)、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコ)にO2を送達する方法を特色とする。いくつかの実施態様において、本発明は、個体、例えば、哺乳動物に血液ガスを運搬又は送達する方法であって、H-NOX組成物のうちの1つ又は複数を個体(例えば、哺乳動物)の血液に送達する(例えば、輸血するなど)工程を含む、方法を提供する。血液又は組織(例えば、哺乳動物の血液又は組織)にO2担体を送達するための方法は、当技術分野で公知である。様々な実施態様において、H-NOXタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質であるか、又はヘムが結合したホロタンパク質である。H-NOXタンパク質は、個体へのH-NOXタンパク質の投与前に、ヘムが結合していても、結合していなくてもよい。いくつかの実施態様において、O2は、個体に送達される前にH-NOXタンパク質に結合している。他の実施態様において、O2は、個体へのH-NOXタンパク質の投与前に、該タンパク質に結合しておらず、該H-NOXタンパク質は、個体内のある位置から個体内の別の位置にO2を輸送する。
【０２５３】
O2に対する相対的に低いKD(例えば、約80nM未満又は約50nM未満)を有する重合体型H-NOXタンパク質を含む野生型及び突然変異体H-NOXタンパク質は、低い酸素圧を有する組織(例えば、腫瘍、一部の創傷、又は酸素圧が非常に低い、例えば、p50が1mmHgを下回る他の部分)を治療するのに特に有用であると予想される。O2に対するそのようなH-NOXタンパク質の高い親和性は、O2がH-NOXタンパク質に結合し続ける時間の長さを増加させ、それにより、H-NOXタンパク質が治療されることになる組織に達する前に放出されるO2の量を低下させることができる。
【０２５４】
O2が結合したH-NOXタンパク質を体内の特定の部位(例えば、臓器損傷の部位)に直接送達するためのいくつかの実施態様において、O2が該タンパク質に既に結合しており(konの重要性を低くする)、酸素が体内の特定の部位又はその付近で(koffによって影響される速度で)放出される必要があるので、O2に対するkoffはKD値よりも重要である。いくつかの実施態様において、koffは、H-NOXタンパク質が循環中で赤血球の存在下にあるときにも重要である可能性があり、その場合、H-NOXタンパク質は、赤血球からのO2の拡散を容易にし、おそらく、血管系のさらなる地点にO2を輸送する希釈赤血球の能力を延ばす。
【０２５５】
個体の血流中を循環するH-NOXタンパク質を送達するためのいくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、肺でO2に結合し、体内の1以上の他の部位でO2を放出する。これらの用途の一部に関して、O2結合が平衡状態であるか又はそれに近いので、KD値はkoffよりも重要である。いくつかの実施態様において、極度の血液希釈に関して、H-NOXタンパク質は、循環中を移動するときに絶えずO2に結合し、それを放出するので、H-NOXタンパク質が主要なO2担体であるとき、KDはkoffよりも重要である。ヘモグロビンが14mmHgのp50を有し、赤血球(キャパシタのように作用する)が〜30mmHgのp50を有し、かつHBOCが5mmHg〜90mmHgの範囲を有するように開発されているので、H-NOXタンパク質の最適KD範囲は、一部の用途について、〜2mmHgから〜100mmHgであり得る。
【０２５６】
重合体型H-NOXタンパク質をイメージングに使用することもできる。特に、光イメージング(例えば、光干渉断層撮影法;例えば、特に光干渉断層撮影法に関して、引用により完全に組み込まれる、Villard, J. W.の文献(2002). Circulation 105: 1843-1849を参照)は、赤血球によって不明瞭になる 。H-NOXタンパク質は赤血球よりもはるかに小さいので、H-NOX溶液による灌流は、循環及び血管壁のよりクリアな画像を可能にする。
【０２５７】
本発明の重合体型H-NOXタンパク質を含むH-NOXタンパク質及び医薬組成物は、任意の従来的手段によって、例えば、経口、局所、眼内、髄腔内、肺内、気管内、もしくはエアロゾル投与によるか;経皮もしくは粘膜吸着によるか;又は注射(例えば、皮下、静脈内、動脈内、小胞内、もしくは筋肉内注射)によって、個体に投与することができる。H-NOXタンパク質は、代用血液として使用するための大容量非経口溶液に含めることもできる。例示的な実施態様において、H-NOXタンパク質は、個体の血液(例えば、静脈、動脈、もしくは毛細血管などの血管への投与)、創傷、腫瘍、低酸素組織、又は低酸素臓器に投与される。
【０２５８】
いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は急速静注として送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は点滴によって送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXはPEG化されている。いくつかの実施態様において、H-NOXはPEG化されていない。いくつかの実施態様において、H-NOXは、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXを含む。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、又は約7日のいずれかよりも長い時間にわたって、点滴によって、個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、損傷した臓器への点滴によるか又は全身への点滴によって、個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、急速静注によって個体に投与され、その後、点滴によって個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、急速静注として個体に投与され、その後、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、又は約7日のいずれかよりも長い時間にわたって、点滴される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、急速静注によるH-NOXタンパク質の投与から約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、又は約7日のいずれかよりも長い時間の後、点滴によって投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、全身への急速静注によって、その後、全身への点滴によって、個体に送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、損傷した臓器への急速静注によって、その後、全身への点滴によって、個体に送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、損傷した臓器への急速静注によって、その後、損傷した臓器への又は損傷した臓器と関連する低酸素ペナンブラへの点滴によって、個体に送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、全身への急速静注によって、その後、損傷した臓器への又は損傷した臓器と関連する低酸素ペナンブラへの点滴によって、個体に送達される。
【０２５９】
いくつかの実施態様において、H-NOXは、約10mg/kg〜約300mg/kgの用量で投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約10mg/kg〜約50mg/kg、約50mg/kg〜約100mg/kg、約100mg/kg〜約150mg/kg、約150mg/kg〜約200mg/kg、約200mg/kg〜約250mg/kg、又は約250mg/kg〜約300mg/kgのいずれかの範囲の用量で投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約10ml〜約1Lの容量で送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約10ml〜約25ml、約25ml〜約50ml、約50ml〜約100ml、約100ml〜約200ml、約200ml〜約300ml、約300ml〜約400ml、約400ml〜約500ml、約500ml〜約600ml、約600ml〜約700ml、約700ml〜約800ml、約800ml〜約900ml、又は約900ml〜約1Lの容量で送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、急速静注として、1分未満、2分未満、3分未満、4分未満、5分未満、10分未満、15分未満、20分未満、25分未満、又は約30分未満のいずれかの期間にわたって、送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約30分〜約7日の期間にわたって、点滴によって送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、約30分、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約7時間、約8時間、約9時間、約10時間、約11時間、約12時間、約16時間、約18時間、約1日、約2日、約3日、約4日、約5日、約6日、又は約7日のいずれかよりも長い時間にわたって、点滴によって送達される。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、約30分〜約1時間、約1時間〜約2時間、約2時間〜約3時間、約3時間〜約4時間、約4時間〜約5時間、約5時間〜約6時間、約6時間〜約7時間、約7時間〜約8時間、約8時間〜約9時間、約9時間〜約10時間、約10時間〜約11時間、約11時間〜約12時間、約12時間〜約16時間、約16時間〜約18時間、約18時間〜約1日、約1日〜約2日、約2日〜約3日、約3日〜約4日、約4日〜約5日、約5日〜約6日、又は約6日〜約7日のいずれかよりも長く、点滴によって投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXはPEG化されている。いくつかの実施態様において、H-NOXはPEG化されていない。いくつかの実施態様において、H-NOXは、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXを含む。
【０２６０】
いくつかの実施態様において、ヒトへの投与のためのH-NOXタンパク質の有効量は、数グラム〜約350グラム超である。H-NOXタンパク質の他の例示的な用量は、適切な点滴速度、例えば、約0.5ml/分での約4.4G/DL、約5G/DL、約10G/DL、又は約13G/DL(ここで、G/DLは、循環中に点滴する前のH-NOXタンパク質溶液の濃度である)のうちのいずれかを含む(例えば、Winslow, R.の文献、代用血液(Blood Substitutes)の第12章を参照)。複数の投与の組合せ効果によって必要な有効量に達することができるので、各々の剤形の個々の用量に含まれる活性成分の単位含有量がそれ自体で有効量を構成する必要がないことが理解されるであろう。医薬組成物に含めるべきH-NOXタンパク質の量の選択は、利用される剤形、治療されている状態、及び当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的によって決まる。いくつかの実施態様において、H-NOXはPEG化されている。いくつかの実施態様において、H-NOXはPEG化されていない。いくつかの実施態様において、H-NOXは、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXを含む。
【０２６１】
いくつかの実施態様において、組成物の持続的連続放出製剤が使用される。H-NOXタンパク質の投与は、例えば、投与の目的に応じて、数秒間から数時間の期間行うことができる。例えば、血液送達ビヒクルとして、投与の例示的な時間経過は、可能な限り迅速である。他の例示的な時間経過としては、約10分、約20分、約30分、約40分、約60分、約90分、又は約120分のうちのいずれかが挙げられる。血液代替物としてのH-NOX溶液の例示的な点滴速度は、約30mL/時間〜約13,260mL/時間、例えば、約100mL/時間〜約3,000mL/時間である。H-NOXタンパク質の例示的な総用量は、13,260mL/時間で20分間にわたって投与される約900mg/kgである。ブタのためのH-NOXタンパク質の例示的な総用量は、約18.9グラムである。
【０２６２】
例示的な投与頻度としては、1週間に少なくとも1、2、3、4、5、6、又は7回(すなわち、毎日)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、1日に少なくとも2、3、4、又は6回投与される。H-NOXタンパク質は、例えば、数日間又は数週間の期間にわたって投与することができる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質は、より長い期間、例えば、数カ月間又は数年間投与される。組成物の投与頻度は、投与担当の医師の判断に基づき、治療の間に調整することができる。
【０２６３】
本発明のいくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質(例えば、重合体型H-NOXタンパク質)は、別の療法と組み合わせて又は別の療法と併せて使用される。例えば、脳卒中又は脳卒中と関連する低酸素状態の治療のために。いくつかの実施態様において、H-NOXは、他の療法の投与よりも少なくとも約1時間前、2時間前、3時間前、4時間前、5時間前、6時間前、12時間前、又は24時間前のいずれかに、個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、他の療法の投与と同時に、個体に投与される。いくつかの実施態様において、H-NOXは、他の療法の投与から少なくとも約1時間後、2時間後、3時間後、4時間後、5時間後、6時間後、12時間後、又は24時間後のいずれかに、個体に投与される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXは、別の療法と組み合わせて投与される。いくつかの実施態様において、非PEG化H-NOXは、別の療法と組み合わせて投与される。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、別の療法と組み合わせて個体に投与される。
【０２６４】
上で述べたように、H-NOXタンパク質の投薬量の選択は、利用される剤形、投与の頻度及び回数、治療されている状態、並びに当業者の決定に従って達成されるべき特定の目的によって決まる。いくつかの実施態様において、ヒトへの投与のためのH-NOXタンパク質の有効量は、数グラム〜350グラム超である。
【０２６５】
いくつかの実施態様において、2以上の異なるH-NOXタンパク質は、同時に(simultaneously)、順次、又は同時に(concurrently)投与される。いくつかの実施態様において、O2の送達に有用な別の化合物又は療法は、1以上のH-NOXタンパク質の投与と同時に(simultaneously)、順次、又は同時に(concurrently)投与される。
【０２６６】
H-NOXタンパク質を使用することができる他の例示的な治療的用途は、例えば、特にO2担体の治療的用途に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第6,974,795号及び第6,432,918号に記載されている。
【０２６７】
(H-NOXタンパク質を有するキット)
重合体型H-NOXタンパク質を含む本明細書に記載されるH-NOXタンパク質のうちのいずれか及び好適なパッケージを含む製造品及びキットも提供される。いくつかの実施態様において、本発明は、(i)H-NOXタンパク質(例えば、本明細書に記載される野生型もしくは突然変異体H-NOXタンパク質又は本明細書に記載されるその製剤)及び(ii)キットを用いて、個体にO2を送達するための指示を有するキットを含む。
【０２６８】
いくつかの実施態様において、個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の治療において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施態様において、個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷の結果を軽減する(例えば、脳卒中と関連する感覚運動障害を軽減する)際に使用するためのキットが提供される。いくつかの実施態様において、個体の脳卒中、一過性虚血発作、又は低酸素脳損傷後の低酸素組織(例えば、低酸素ペナンブラ)へのO2の送達において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施態様において、個体の臓器の損傷と関連する低酸素状態の治療において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施態様において、個体の臓器の損傷後の低酸素組織(例えば、低酸素ペナンブラ)へのO2の送達において使用するためのキットが提供される。いくつかの実施態様において、個体の臓器の損傷と関連する低酸素状態の結果を軽減する際に使用するためのキットが提供される。
【０２６９】
いくつかの実施態様において、キットは、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの両方を含む。いくつかの実施態様において、キット中のPEG化H-NOX及び非PEG化H-NOXは、組成物中にある。いくつかの実施態様において、組成物中のPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90: 10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のいずれかである。
【０２７０】
いくつかの実施態様において、キットは、重合体型H-NOXタンパク質(例えば、PEG化重合体型H-NOXタンパク質及び/又は非PEG化H-NOXタンパク質)を含む。いくつかの実施態様において、キットは、2以上の野生型又は突然変異体H-NOXドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質の有効量を含む。いくつかの実施態様において、キットは、本明細書に記載される野生型又は突然変異体H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む組換え単量体型H-NOXタンパク質の有効量を含む。いくつかの実施態様において、キットは、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOX突然変異に対応する突然変異及び三量体化ドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は、ヒトH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、三量体型H-NOXタンパク質は、イヌH-NOXドメインを含む。いくつかの実施態様において、キットは、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。いくつかの実施態様において、キットは、3つの単量体を含む三量体型H-NOXタンパク質を含み、各々の単量体は、T.テングコンジェンシスL144F H-NOXドメイン及びフォルドンドメインを含む。
【０２７１】
本明細書に記載される組成物のための好適なパッケージは当技術分野で公知であり、これには、例えば、バイアル(例えば、密閉バイアル)、容器、アンプル、ボトル、瓶、可撓性のパッケージ(例えば、密閉されたMylar又はプラスチックバッグ)などが含まれる。これらの製造品は、さらに滅菌及び/又は密閉することができる。本明細書に記載される組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、好適なパッケージに単一又は複数の単位投薬量で保存することができ、さらに滅菌及び密閉することもできる。本発明のキットに供給される指示は、通常、ラベル又は添付文書(例えば、キットに含まれる紙シート)上の書面による指示であるが、機械可読指示(例えば、磁気又は光学式保存ディスク上に担持された指示)も許容される。H-NOXタンパク質の使用に関する指示は、通常、意図される治療的又は産業的使用のための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。キットは、治療に好適な個体の選択に関する記載をさらに含むことができる。いくつかの実施態様において、キットは、脳卒中、一過性虚血発作、及び/又は低酸素脳損傷の治療のための指示を含む。
【０２７２】
容器は、単位用量、バルクパッケージ(例えば、多用量パッケージ)、又はサブ単位用量であることができる。例えば、延長された期間、例えば、約1週間、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約3カ月、約4カ月、約5カ月、約6カ月、約7カ月、約8カ月、約9カ月、又はそれよりも長い間のうちのいずれかの間、個体に有効な治療を提供するのに十分な投薬量の本明細書に開示されるH-NOXタンパク質を含有するキットを提供することもできる。キットは、H-NOXタンパク質の複数の単位用量及び使用のための指示を含み、かつ薬局、例えば、病院内薬局及び調剤薬局における保存及び使用に十分な分量で包装することもできる。いくつかの実施態様において、キットは、再構成、再懸濁、又は再水和させて、H-NOXタンパク質の安定な水性懸濁液を全体として形成することができる乾燥(例えば、凍結乾燥)組成物を含む。
【０２７３】
いくつかの実施態様において、本発明は、PEG化H-NOX及び/又は非PEG化H-NOXを含有する製造品を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの混合物を含有する製造品を提供する。いくつかの実施態様において、該製造品は、容器、バイアル、瓶、アンプル、カプセル、シリンジ、又はバッグである。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、約95:5、約90:10、約80:20、約75:25、約70:30、約60:40、約50:50、約40:60、約30:70、約25:75、約20:80、約10:90、約5:95、又は約1:99のいずれかである。いくつかの実施態様において、PEG化H-NOXは、障壁によって、非PEG化H-NOXから隔離されている。いくつかの実施態様において、障壁を使用前に除去して、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXが混合するのを可能にすることができる。いくつかの実施態様において、本発明は、PEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの混合物を含むシリンジを提供する。
【０２７４】
(H-NOXタンパク質の例示的産生方法)
本発明はまた、PEG化H-NOXタンパク質及び非PEG化H-NOXタンパク質を含む組成物の産生方法であって、PEG化H-NOXを非PEG化H-NOXと混合することを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、該組成物中のPEG化H-NOXと非PEG化H-NOXの比は、約99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40; 55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85; 10:90; 5:95; 1:99、又はその間の任意の比のいずれかである。
【０２７５】
本発明はまた、本明細書に記載されるH-NOXタンパク質(例えば、重合体型H-NOXタンパク質)のいずれかの産生方法を提供する。いくつかの実施態様において、本方法は、重合体型H-NOXタンパク質をコードする核酸を有する細胞を、重合体型H-NOXタンパク質の産生に好適な条件下で培養する工程を含む。様々な実施態様において、重合体型H-NOXはまた、精製される(例えば、細胞又は培養培地からのH-NOXタンパク質の精製)。いくつかの実施態様において、本方法は、H-NOXドメイン及び重合ドメインを含む単量体H-NOXタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養する工程を含む。該単量体は、その後、インビボ又はインビトロで会合して、重合体型H-NOXタンパク質を形成する。異種H-NOXドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質は、所望のH-NOXドメインを有する単量体型H-NOXタンパク質をコードする2以上の核酸を共導入することにより生成させることができ、ここで、2以上の単量体型H-NOXタンパク質は、同じ重合ドメインを含む。
【０２７６】
いくつかの実施態様において、異種H-NOXドメインを含む重合体型H-NOXタンパク質は、所望のH-NOXドメイン及び共通の重合ドメインを含む同種単量体型H-NOXサブユニットを含む重合体型H-NOXタンパク質を別々に調製することにより調製される。異なる同種H-NOXタンパク質を異種H-NOXサブユニットの所望の比で混合し、同種重合体型H-NOXタンパク質を(例えば、熱、変性剤、高塩などによって)解離させ、その後、会合させて、異種重合体型H-NOXタンパク質を形成させる。異種重合体型H-NOXタンパク質の混合物は、所望の比の所望のサブユニットの存在について選択することにより、さらに精製することができる。例えば、各々の異なるH-NOX単量体は、異種重合体型H-NOXタンパク質の精製並びに異種サブユニットの同定及び定量に役立つ独特のタグを有することができる。
【０２７７】
上で述べたように、いくつかの野生型H-NOXタンパク質及び核酸の配列は公知であり、これらを用いて、本発明の突然変異体H-NOXドメイン及び核酸を作製することができる。組換えH-NOXタンパク質の突然変異、発現、及び精製のための技法は、例えば、特に組換えH-NOXタンパク質の突然変異、発現、及び精製に関して、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Boon, E.M.らの文献(2005). Nature Chemical Biology 1 :53-59及びKarow, D. S.らの文献(2004年8月10日). Biochemistry 43(31): 10203-10211に記載されている。これらの技法又は他の標準的な技法を用いて、任意の突然変異体H-NOXタンパク質を作製することができる。
【０２７８】
特に、本明細書に記載される突然変異体H-NOXタンパク質は、当技術分野で公知のいくつかの方法によって作製することができる。突然変異は、アミノ酸の化学修飾によってアミノ酸レベルで、又は所与のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の改変によってコドンレベルで起こり得る。タンパク質中の任意の所与の位置におけるアミノ酸の置換は、該アミノ酸をコードするコドンを改変することにより達成することができる。これは、例えば:(i)Taylor, J.W.らの文献(1985年12月20日). Nucleic Acids Res. 13(24):8749-8764; Taylor, J.W.らの文献(1985年12月20日). Nucleic Acids Res. 13(24):8765-8785; Nakamaye, K. L.らの文献(1986年12月22日). Nucleic Acids Res. 14(24):9679-9698;及びDenteらの文献(1985). DNAクローニング(DNA Cloning)所収、Glover編、IRL Press、791〜802ページの方法に基づくAmershamの技法(Amersham突然変異誘発キット、Amersham社、Cleveland, Ohio)、(ii)Promegaのキット(Promega社、Madison, Wis.)、又は(iii)特にタンパク質の突然変異誘発に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Kunkel, T. A.の文献(1985年1月). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(2):488-492; Kunkel, T. A.の文献(1987). Methods Enzymol. 154:367-382; Kunkelの文献、米国特許第4,873,192号の方法に基づく、Bioradのキット(Biorad社、Richmond, Calif.)を用いる部位特異的突然変異誘発により達成することができる。突然変異誘発は、他の市販の又は非商業的手段、例えば、突然変異体オリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発を利用する手段によって達成することもできる。
【０２７９】
部位特異的突然変異誘発は、PCRに基づく突然変異誘発、例えば、特にタンパク質の突然変異誘発に関して、各々、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Zhengbinらの文献(1992). 205〜207ページ、PCR法及び応用(PCR Methods and Applications)所収、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Jones, D. H.らの文献(1990年2月). Biotechniques 8(2): 178-183; Jones, D. H.らの文献(1991年1月). Biotechniques 10(1):62-66に記載されている突然変異誘発を用いて達成することもできる。部位特異的突然変異誘発は、当業者に公知の技法によるカセット突然変異誘発を用いて達成することもできる。
【０２８０】
突然変異体H-NOX核酸及び/又は重合ドメインは、標準的な技法を用いて、発現ベクターなどのベクターに組み入れることができる。例えば、制限酵素を用いて、突然変異体H-NOX核酸及びベクターを切断することができる。次に、切断された突然変異体H-NOX核酸及び切断されたベクターの適合する末端を連結することができる。得られたベクターを、コードされたH-NOXタンパク質の発現のための標準的な技法(例えば、エレクトロポレーション)を用いて、細胞(例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、又は細菌細胞)に挿入することができる。
【０２８１】
特に、異種タンパク質は、いくつかの生物学的発現系、例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、及び細菌細胞で発現させられている。したがって、任意の好適な生物学的タンパク質発現系を利用して、多量の組換えH-NOXタンパク質を産生することができる。いくつかの実施態様において、H-NOXタンパク質(例えば、突然変異体又は野生型H-NOXタンパク質)は、単離されたタンパク質である。
【０２８２】
望ましい場合、H-NOXタンパク質は、標準的な技法を用いて精製することができる。いくつかの実施態様において、該タンパク質は、該タンパク質が産生されるときに存在する他の成分を少なくとも約60重量％含まない。様々な実施態様において、該タンパク質は、少なくとも約75重量％、90重量％、又は99重量％純粋である。精製されたタンパク質は、例えば、天然の供給源、組換え発現系、又は化学合成の反応混合物からの精製(例えば、抽出)によって得ることができる。例示的な精製方法としては、免疫沈降、免疫親和性クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫親和性精製、及びプレート結合抗体によるパニング、並びに当業者に公知の他の技法が挙げられる。純度は、任意の適切な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はHPLC分析によってアッセイすることができる。いくつかの実施態様において、精製されたタンパク質は、本発明の医薬組成物に組み込まれるか、又は本発明の方法において使用される。本発明の医薬組成物は、精製されたタンパク質に加えて、添加物、担体、又は他の成分を有し得る。
【０２８３】
いくつかの実施態様において、重合体型H-NOXタンパク質は、1以上のHis6タグを含む。少なくとも1つのHis6タグを含むH-NOXタンパク質は、クロマトグラフィーを用いて;例えば、Ni2+親和性クロマトグラフィーを用いて精製することができる。精製後、His6タグは;例えば、エキソペプチダーゼを使用することにより除去することができる。いくつかの実施態様において、本発明は、精製された重合体型H-NOXタンパク質を提供し、ここで、該重合体型H-NOXタンパク質は、His6タグの使用により精製されたものである。いくつかの実施態様において、精製されたH-NOXタンパク質をエキソペプチダーゼで処理して、His6タグを除去する。
【実施例】
【０２８４】
(実施例)
本実施例は、本発明を純粋に例示するものであることが意図されており、したがって、決して、本発明を限定するものとみなされるべきではないが、これもまた、上で論じられている本発明の態様及び実施態様を説明及び詳述する。本実施例は、下記の実験が、実施される全て又は唯一の実験であることを表すようには意図されていない。別途示されない限り、温度は、セ氏温度で表されており、圧力は大気圧又はその前後である。
【０２８５】
(実施例1.低酸素状態の動物モデル)
(ヒツジの心筋低酸素状態)
新生仔ヒツジをケタミン塩酸塩(〜1mg/kg)で麻酔し、4.5-mm OD気管内チューブを挿管し、Healthdyne小児用時間設定従圧式ベンチレーター(Healthdyne, Marietta, GA)で機械的に酸素を供給した。筋弛緩させるために、塩化スクシニルコリン(2mg/kg)を間欠的に投与した。全身の動脈PCO2を35〜45トールの間で維持するように、21％酸素での酸素供給を調整した。中央胸骨切開により、ポリビニルカテーテルを設置して、全身、肺、右心房、及び左心房の圧力を測定した。アドミタンスカテーテルを圧容量ループ解析のために右心室及び左心室に配置し、フロープローブを左肺動脈に配置して、血流を測定した。その後、胸骨をタオルクランプで閉鎖した。安定なベンチレーションによる回復から45分後、血液動態変数、全身動脈血ガス、及びpHを測定した(ベースラインの正常酸素状態)。その後、窒素をガス混合物に添加することにより、正常二酸化炭素状態低酸素(10％O2)を導入して、25〜35トールのPO2を含む全身動脈血ガスを生じさせた。定常状態肺高血圧から15〜30分後、全ての変数を測定した(低酸素状態)。
【０２８６】
(永久中大脳動脈閉塞(MCAO)モデル)
先端がシリコーン製の腔内塞栓糸による閉塞法を若干修正して用いて、永久局所的脳虚血を、MCAの閉塞により、8週齢の雄スプラーグドーリーラット(290〜310g)(Charles River)で生じさせた。麻酔を自発換気による3％イソフルランの吸入によって導入し、手術中2〜2.5％で維持した。頸部腹側領域をクロレックスヒドリン(Chlorexhidrine)及びアルコールで消毒し、外科的正中切開を行って、左総頸動脈、内頸動脈、及び外頸動脈を露出させた。外頸動脈(ECA)を結紮し、総頸動脈(CCA)及び内頸動脈(ICA)をマイクロ血管クリップで一時的に閉鎖した。小さい切開をECAの中に作り、シリコンコーティングしたモノフィラメント縫合糸(Doccol Corporation)をECAからICAに挿入した。このフィラメントをさらに25mm前進させて、MCAの起点を塞いだ。閉塞糸をICA中に残すことにより、永久閉塞を達成した。マイクロ血管クリップを慎重に除去し、その後、創傷を閉鎖し、消毒した。擬似手術については、手術期間中、全ての動脈を露出させたが、フィラメントは挿入しなかった。
【０２８７】
(エンドセリン-1(ET1)中大脳動脈閉塞(MCAO)脳卒中モデル)
一過性MCAO(tMCAO)を、Charles Riverから購入した成体雄スプラーグドーリー(SD)ラット(3〜4カ月齢: 280〜320g; 6〜10カ月齢: 500〜800g)で誘導した。ラットに鎮痛剤(ブプレノルフィン; 0.05mg kg-1 s.c)を投与し、O2と4％イソフルランの混合物で麻酔をかけ、その後、頭部定位フレームに入れた。このフレームに取り付けたノーズコーンを通して送達されるO2と2％イソフルランの混合物を用いて、手術期間中、麻酔を維持した。頭蓋骨を露出させ、右半球の背側にある頭蓋にドリルで小さい穴を開けた。26ゲージの針で、240μMの血管作用性ペプチドET1を、右MCAの近傍に、1μl/分の割合で、以下の定位座標:ブレグマの1.6mm前方、5.2mm側方、かつ8.7mm腹側に注入した。針を注射後3分留置し、その後、回収した。体温を、直腸プローブを用いて、閉塞前及び閉塞後にモニタリングし、体温調節温熱パッドを用いて、37.0＋0.2℃で維持した。MCAO手術中、カプノグラフ及びパルスオキシメーターを用いて、バイタルサインを絶えずモニタリングした。局所脳血流(rCBF)を、虚血前、MCAO時、及び再灌流時に、頭蓋骨背面の右側に取り付けたレーザードップラーフロープローブ(VP5プローブ、Moor Instruments)で測定した(図1A及び1B)。手術後、体重減少を最小限に抑えるために、ラットに柔らかくした食餌を与えた。レーザードップラーフローメトリー(LDF)からのフラックスシグナルは、局所脳血流の迅速かつ連続的な記録及び一過性の血流変化の検出を可能にした。少なくとも60％のCBF低下を示さない動物、及び虚血誘導後に死ぬ動物は実験群から除外した。
【０２８８】
ET1誘導性tMCAOモデルにおける低酸素リスクのあるペナンブラを低酸素マーカーのピモニダゾール(pimo、屠殺の1〜2時間前に60mg/kgで投与される)で組織学的に可視化した(図2A)。このマーカーは、急性低酸素状態下の生きた組織を標識するが、死んだ組織から排除される。tMCAO後、1日目〜7日目に屠殺した動物を、低酸素体積については、pimo染色により、梗塞体積については、クレシルバイオレット染色により(図2B; 1群当たりn＝5匹)、ニューロンの細胞死については、NeuN/FluoroJade(FJ)染色により(図2C及び2D; 1群当たりn＝5匹)、ミクログリア/マクロファージ浸潤については、ED1染色により(図2E; 1群当たりn＝5匹)、並びにアストログリオーシスの動態については、GFAP染色により(図2F; 1群当たりn＝5匹)、組織学的に処理した。冠状脳切片(15μm厚)を、ブレグマ+4から-4まで1mm毎に、9つの座標レベルにわたって取得し、免疫組織化学用に処理した。切片を、100％メタノールにより、-20℃で20分間固定し、その後、ブロッキングし、5％BSA、5％ヤギ血清、及び0.1％Tween 20により、室温で1〜2時間、透過処理した。その後、切片を抗ピモニダゾール抗体(Hypoxyprobe、1:100)、抗NeuN抗体(Abcam)、抗GFAP抗体(Life Technologies)、又は抗ED1抗体(AbD Serotec)とともに4℃で一晩インキュベートし、その後、抗ウサギ又は抗ラット二次抗体(1:1000、Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA)とともに室温で2時間インキュベートした。ニューロンの損傷を可視化するために、その後、脳切片を、記載されている通りに(Nguemeniらの文献、2015 J Neurosci Methods. 2015 Mar 15;242:72-6)、Fuoro-Jade C(FJC、Histo-Chem社、AR, USA)で染色した。切片をSlowFade DAPI(Invitrogen)中で標本化し、CCDデジタルカメラが装備されたHD AxioImager Zeiss顕微鏡を用いて、UCSF Laboratory for Cell Analysis Coreでイメージングした。ニューロンをNeuN又はFluoro-Jade(FJ;神経変性)で標識し、炎症細胞をED1(活性化ミクログリア/マクロファージ)又はGFAP(アストロサイト)で検出した。NeuN+細胞、FJ+細胞、及びED1+細胞の数をカウントし、GFAPシグナルによって被覆された面積のパーセントを梗塞周囲部分に位置する皮質の2つの非重複領域中の座標レベル当たり8つの切片で測定した。
【０２８９】
tMCAOから1時間〜1日後に屠殺した動物(1群当たりn＝10匹)をピモニダゾールについてのELISAにより処理して、低酸素組織から梗塞組織への進展を追跡調査した。屠殺の2時間前に、ラットに、外因性低酸素マーカーのピモニダゾール(60mg/kg、Hypoxyprobe, Burlington Massachusetts)を静脈内注射した。その後、脳のタンパク質を抽出し、以前に記載されている通りに(Kleitherらの文献、2006 Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys)、競合的ピモニダゾールELISA用に処理した。簡潔に説明すると、試料を採取し、抗プロテアーゼが補充された抽出バッファー(Abcamキット# ab117996)中でホモジナイズした。タンパク質濃度を、Bradfordアッセイを用いて、各々の試料中で定量した。試料を、Omnioxにより開発された競合的ELISAアッセイを用いて、ピモニダゾール(Hypoxyprobe-1)量についてアッセイした。ピモニダゾールシグナルの減少は、ペナンブラから梗塞組織への進展を示している(図2G)。IC50値の定量を、ピモニダゾールELISAについての標準曲線の5パラメータフィットを用いて実施した。値を各々の試料中のタンパク質濃度に対して標準化し、その後、ビヒクル対照に対して標準化した。
【０２９０】
(実施例2. H-NOXの薬物動態及び分布)
三量体型H-NOX L144F及びPEG化三量体型H-NOX L144Fを大腸菌で発現させ、3工程クロマトグラフィー及びバッファー交換プロトコルにより精製すると、＞99％純粋で、エンドトキシンレベルが＜0.01EU/mgの産物が得られた。ラットに、100mg/kgの三量体型H-NOX L144F又は50mg/kgのPEG化三量体型H-NOX L144F静脈内注射し、血漿試料を、表示されている通りに、注射から5分〜96時間後に収集した(図3)。三量体型H-NOX L144Fの血漿レベルを、H-NOXタンパク質に特異的なELISAアッセイを用いて定量し、分布の定常状態体積(Vss)を決定した(表2)。循環半減期を、5パラメータ非線形フィットモデルを用いてデータ点を適合させることにより計算すると、三量体型H-NOX L144Fについては、1時間の循環半減期、及びPEG化三量体型H-NOX L144Fについては、顕著により長い20時間の半減期が得られた。ラットについて、PEG化三量体型H-NOX L144Fの正常組織への制限された分布が定常状態での少量の分布(〜41ml/kg)によって示された。これは、ラットの血漿量(31.2mL/kg; Davis, B.及びMorris, Tの文献、1993, Pharmaceutical Res 10, 1093)の分布をわずかしか上回らない。有害作用は処置を受けたラットで確認されず、三量体型H-NOX L144Fは、血液化学又は血液学パラメータの顕著な変化を誘導せず、それが十分に忍容されることを示した(データは示さない)。
表2. H-NOXの薬物動態
【表３】
2019511567.tif 000005
【０２９１】
ET1誘導性tMCAOから1時間後、三量体型H-NOX L144F又はPEG化三量体型H-NOX L144F(400mg/kg)をラットにi.v.投与した。動物を閉塞から2時間〜24時間後に屠殺した。脳を切片化し、抗H-NOX抗体及び抗CD31抗体で染色した。CD31は、血管系を可視化するために使用される内皮細胞のマーカーである。両方のタンパク質は漏れやすい血管系から拡散し、脳の間質組織の奥深くまで透過した(図4A及び4B)。三量体型H-NOX L144Fは、投与から1時間後に、虚血性病変の血管系の外側で検出され、脳実質内での三量体型H-NOX L144Fの早期分布が示された(図4A)。その長い循環半減期のために、PEG化三量体型H-NOX L144Fは、梗塞領域及び梗塞周囲領域の脳実質で少なくとも24時間保持されたが、非虚血性対側部位では血管腔に残存した(図4B)。梗塞した脳の保持時間に基づいて、PEG化三量体型H-NOX L144Fをさらなる試験のために選択した。
【０２９２】
(実施例3.低酸素組織への酸素の機能的H-NOX媒介性送達)
(低酸素組織中の酸素のリアルタイム検出(OxyLiteプローブ))
7〜8週齢のNu/Nu雌マウスに、3×106個のH460ヒト肺癌細胞を皮下移植し、腫瘍が〜600mm3の平均サイズに達する(腫瘍細胞の移植後9〜18日)までモニタリングした。500〜700mm3異種移植片H460腫瘍を担持するマウスに、20％酸素中で混合したイソフルランで麻酔をかけ、マイクロマニピュレーターを用いて、OxyLite(商標)酸素感知ナノファイバー装置(Oxford Optronix, UK)をH460皮下異種移植片腫瘍に移植した。OxyLite(商標)は、先端直径230μmのポリマーマトリックス中に保持された塩化ルテニウム色素からなる。〜20から30分間平衡化した後、光学蛍光センサー及び4チャネルユニットを用いて、pO2を測定した。低始動pO2により、隣接する血管から低酸素組織への侵入が確認された(〜0.2から1mmHg)。プローブ移植後、pO2測定が安定化するために、プローブを〜30分間放置した。マウスに、10mgの三量体型H-NOX L144F又はPEG化三量体型H-NOX L144Fを50〜100ulの製剤化バッファー(50mMコハク酸塩、50mM NaCl、3.4mM EDTA、及び10mM還元グルタチオン、pH 7)に入れて静脈内又は腫瘍内注射し、蛍光クエンチングをリアルタイムで記録した(図5)。三量体型H-NOX L144Fは、注射から約15分後に、最大の酸素送達をもたらし、組織は、注射後約50分まで、正常酸素レベルに戻ったが、PEG化三量体型H-NOX L144Fは、より漸進的かつ持続的な酸素の放出をもたらし、低酸素組織の正常酸素レベルへの復帰は、注射後約200分から注射後少なくとも約450分まで延長した。
【０２９３】
(実施例4. H-NOXは虚血性病変を改善する)
低酸素リスクのあるペナンブラを低酸素マーカーのピモニダゾール(pimo)で組織学的に可視化した。このマーカーは、急性低酸素状態下の生きた組織を標識するが、死んだ組織から排除される。屠殺の1〜2時間前に、ピモニダゾールを60mg/kg(ラット)又は100mg/kg(ヒツジ)で投与した。H-NOX/ビヒクル投与から6時間後、動物を屠殺した。臓器を凍結させ、競合的ピモニダゾールELISA用に処理した(図6)。ピモニダゾール染色によって測定される低酸素のレベルは、三量体型H-NOX L144F投与後に、ビヒクルと比べて、ET1 MCAO齧歯類脳卒中モデルと心筋低酸素ヒツジモデルの両方で有意により低かった。或いは、試料を切片化及び抗ピモニダゾール抗体(Hydroxyprobe)による染色用にヒツジで収集した。代表的な写真を下のパネルに示す。
【０２９４】
梗塞サイズに対する三量体型H-NOX L144Fの効果を調べるために、PEG化三量体型H-NOX L144F(240mg/kg)又はビヒクルをtMCAOから1時間後に全身投与し、投与を24時間毎に3日間繰り返した。動物を1日目〜7日目の間に屠殺し、梗塞体積を、クレシルバイオレット染色を用いる組織学的検査によって定量した(図7A)。別の実験では、動物を1日目又は7日目に屠殺し、梗塞体積及び低酸素組織体積を、先に記載されている通りに、それぞれ、クレシルバイオレット及びピモニダゾール染色を用いる組織学的検査によって定量した(図7B)。tMCAOから1日後にビヒクル処置ラットで見られた酸素が不足した低酸素組織(図7B、白の棒)は7日までにゆっくりと死滅し、〜25％の梗塞拡大をもたらした。対照的に、PEG化三量体型H-NOX L144Fは、酸素が不足した低酸素組織の〜90％が梗塞組織に進行するのを防ぎ、PEG化三量体型H-NOX L144Fが低酸素組織の大部分を救出したことを示している(図7B)。
【０２９５】
血管閉塞後、酸素が不足したペナンブラに局在する多くのニューロン細胞は、開始後、数時間〜数日間、アポトーシスを経る。したがって、本発明者らは、三量体型H-NOX L144F及び三量体型H-NOX L144F＋PEG化三量体型H-NOX L144Fの1:1混合物が極度に低いO2濃度の組織部分に到達すると、それが酸素を送達することにより、低酸素状態及び細胞死を軽減するかどうかを調べた。低酸素レベルは、重度低酸素状態下の生きた組織を標識するピモニダゾールのELISAアッセイで測定し(図8A)、カスパーゼ9活性は、生体発光アッセイを用いて測定した(図8B)。カスパーゼ-9の活性は、製造元の指示に従って、Caspase-Glo(登録商標) 9アッセイ系(Promega)で測定した。簡潔に説明すると、脳のタンパク質をネイティブ溶解バッファー(Abcam)で抽出し、25μLのタンパク質抽出物を、カスパーゼ9阻害剤Ac-LEHD-CHO(Enzo Lifesciences)の存在下又は非存在下で、25μLのCaspase-Glo(登録商標) 9試薬とともにインキュベートした。各々の試料の発光を、Victor 3ルミノメーター(Perkin Elmer)を用いて、90秒毎に37℃で1時間測定した。発光シグナルの曲線下面積を各々の試料について計算し、プロットした。tMCAOから30分後に投与される単一用量(120mg/kg又は240mg/kg)の三量体型H-NOX L144F＋PEG化三量体型H-NOX L144Fの1:1混合物は、低酸素及びカスパーゼ9活性のレベルを、ビヒクルと比較して、開始から6時間後、用量依存的に〜50％有意に減少させた。PEG化三量体型H-NOX L144Fのみ(240mg/kg)又はビヒクルをtMCAOから1時間後に投与したとき、開始から6時間後に、低酸素のレベルに違いは見られなかった。
【０２９６】
ET1媒介性血管閉塞による重度の酸素枯渇は、神経血管損傷の一因となるミクログリア、マクロファージ、及びアストロサイト活性化をもたらす炎症プロセスを誘発する。三量体型H-NOX L144Fによる重度低酸素状態の軽減がグリオーシスを軽減するかどうかを調べるために、ET1誘導性tMCAOを有するラットに、閉塞から1時間後に、PEG化三量体型H-NOX L144F(240mg/kg)を投与し、投与を24時間毎に3日間繰り返した。ラットをtMCAOから7日目に屠殺し、脳を切片化し、GFAP(アストロサイト)並びにED1(活性化ミクログリア及びマクロファージ)の免疫組織化学検査によって処理した。PEG化三量体型H-NOX L144F処置動物は、tMCAOから7日後、活性化ミクログリア及びマクロファージの存在の〜50から80％の有意な減少を示した(図9)。
【０２９７】
非ヒト霊長類及びヒトも脳卒中後に低酸素ペナンブラを生じるので、本齧歯類データは、霊長類における脳卒中の良好なモデルを提供し、本結果は、ヒトを含む霊長類に適用可能である。
【０２９８】
(実施例5. H-NOXは高齢ラットの虚血性機能障害を軽減する)
年齢は、高齢ラットにおける長期の組織学的及び機能的転帰を評価することの重要性を強調する、脳卒中の主要なリスク因子である。tMCAOから1時間後に投与された場合、高齢のPEG化三量体型H-NOX L144F処置ラットは、tMCAOから29日後に梗塞周囲ニューロンの数の有意な増加を示した(図10)。このラットの脳を上記のように調製し、NeuN及びGFAPで染色した。NeuN+細胞の数をカウントし、GFAPシグナルによって被覆された面積のパーセントを、梗塞周囲部分に位置する皮質の2つの非重複領域中のレベル(1mm毎)当たり8つの座標にわたる切片で測定した。PEG化三量体型H-NOX L144Fで処置したラットは、ビヒクル処置対照よりも有意に多いニューロンを梗塞周囲部分に有していた。
【０２９９】
選択的ニューロン損失の低下と一致して、PEG化三量体型H-NOX L144Fは、tMCAOから1時間後に投与された場合、tMCAOから13日後に、対照と比較して、粘着テープ除去課題で、感覚機能を〜80％、運動機能を〜180％改善した(図11)。tMCAOから2時間後に投与された場合、PEG化三量体型H-NOX L144Fで処置した高齢ラットは、tMCAOから20日後に、対照と比較して、〜80％の運動機能の有意な改善を示した(図12)。課題は、粘着テープのストリップ(8×8mm)を各々の前脚に貼ること及びラットの性能を測定することからなっていた。4つの測定を記録した: 1及び2(検出):ラットがその前脚を振るか及び/又はそのままその前脚をその口に持ってくるときに、各々の前脚が存在するストリップと反応するのにかかる時間、並びに3及び4(除去):動物が同側(障害がない側)又は対側(病変側)の足からテープのストリップを口で除去するのにかかる時間。120秒後にラットが成功しなかった場合、課題を終了した。接触までの時間と除去までの時間により、感覚障害が運動障害から切り離される。片側性の脳損傷を有するラットは、粘着剤と接触することと同側足からまず粘着剤を除去することの両方にバイアスを示す。個体間の違いを減らすために、動物を手術前に5日間訓練した(1日当たり4回の試行)。全てのラットが訓練の最後に最適性能に達し、右足と左足で同様の性能並びに粘着テープと接触するまでの時間及び粘着テープを除去するまでの時間における非常に短い待ち時間を示し、右側と左側で非対称性がなかった。粘着剤除去試験を、脳卒中後の1カ月間、ビヒクル又はPEG化及び非PEG化三量体型H-NOX L144Fで処置した高齢ラット(8〜9カ月齢)に対して週に〜2から3回実施した。この結果は、三量体型H-NOX L144F処置の結果としての感覚機能及び運動機能の改善を示している。
【０３００】
非ヒト霊長類及びヒトも脳卒中後に低酸素ペナンブラを生じるので、本齧歯類データは、霊長類における脳卒中の良好なモデルを提供し、本結果は、ヒトを含む霊長類に適用可能である。
【０３０１】
(実施例6. tPA処置と組み合わせたH-NOXの安全性)
(フリーラジカルアッセイ)
再灌流はフリーラジカルの過剰産生を生じる可能性があるので、酸素担体に関する1つの安全上の懸念は、タンパク質、脂質、及びDNAに対する二次性の酸化的損傷をもたらすフリーラジカル産生を増加させるその可能性である。三量体型H-NOX L144F＋PEG化三量体型H-NOX L144Fの1:1混合物(400mg/kg)をtMCAOから1時間後に投与し、tMCAOから6時間後、脳を、タンパク質カルボニル含有量(図13A)については、ELISA(OxiSelect(商標))により、脂質過酸化(図13B)については、TBARsアッセイ(Cayman)でアッセイした。これらは、酸化的ストレスの指標として広く受け入れられている2つのマーカーである。虚血/再灌流障害は、tMCAOラットの同側部位におけるタンパク質カルボニル化の増加を誘導した。しかしながら、三量体型H-NOX L144F投与は、脂質過酸化のマーカーであるマロンジアルデヒドの蓄積も、タンパク質酸化のマーカーであるタンパク質カルボニルの蓄積も増大させなかった。
【０３０２】
(インビボtPAアッセイ)
中大脳動脈閉塞(MCAO)モデルの標準的処置を7〜8週齢スプラーグドーリーラットで実施した。ラットに、フェイスマスクにより、酸素及び亜酸化窒素(30:70)と混合した4％イソフルランで麻酔をかけた。正中線頸部切開を行って、左総頸動脈を露出させた。外部頸動脈及び翼口蓋動脈を4-0シルクで結紮した。外部頸動脈と内部頸動脈の分岐点に近い外部頸動脈の壁で切開を行った。その後、熱で末端鈍化した4-0ナイロン縫合糸(Ethicon)を挿入し、分岐点から内部頸動脈の中に約17.5mm前進させ、それにより、中大脳動脈の小孔を60分間遮断した。所定の閉塞期間の後、ナイロン縫合糸を頸動脈から除去して、MCAへの血流の再灌流を可能にした。再灌流後、tPAを10mg/mlで注射し、tPAから30分後、PEG化三量体型H-NOX L144Fを100mg/mlで注射した。24時間後、ラットに、ヘパリン化食塩水を灌流させ、脳を切断して2mmの切片にし、実質出血(PH)、出血性梗塞(HI)、及び点状(punctate)又は点状(petechial)出血(HPT)について、視覚的に調べた。処理し、デジタル撮影したら、全ての切片を4℃で4％PFAで固定した。試験を実施し、無作為化し、STAIR及びRIGOR基準に従って盲検化した。全ての実験について、手術/脳卒中処置前に、無作為化の隠蔽を独立当事者を用いて保証して、ラットを処置群に無作為に割り当てた。無作為化の配列は、全ての事後解析が終了するまで明かされなかった。表3に示されているように、対照動物とH-NOX処置動物の間で、死亡率、罹病率、又は出血発生率についての差はなかった。
表3
【表４】
2019511567.tif 000006
【０３０３】
(インビトロtPAアッセイ)
発色性基質を利用した組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA、Genentech Activase)活性についてのアッセイを96ウェルプレートで実施した。簡潔に説明すると、1μlのtPA溶液(5ng/ウェル)及び177μlの試薬1(30mM Tris-HCl、30mMイミダゾール、及び130mM NaCl)を39℃でプレインキュベートした。10μlの発色性基質溶液(4mM;最終濃度0.212mM)を添加して、反応を開始させた。39℃で保持された加熱式SpectraMax M2分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale California)を用いて、反応を測定した。405nmのODを用いた吸光度の変化を測定した(ΔA/分又はΔA/5分)。上記の手順を用いて確立されたアッセイを用いて、本発明者らは、2μ1のPEG化三量体型H-NOX L144F(最終濃度:アッセイウェル中のtPAの量の0.01〜1000倍)を使用し、これを、上記のように、1μlのtPA及び175μlの試薬1とともにプレインキュベートした。ΔA/分を1分間の間隔で5分間にわたって測定した。阻害剤の効力を制御するために、本発明者らは、2μlのPAI-1(最終濃度: 0.247μM)を使用し、これを、上記のように、1μlのtPA及び175μlの試薬1とともにプレインキュベートした。ΔA/分を1分間の間隔で5分間にわたって測定した(図示せず)。図14に示されているように、tPAの量の100倍の濃度のPEG化三量体型H-NOX L144Fを用いたとき、tPA活性に有意な差はなかった。
【０３０４】
(実施例7.ラット永久MCAO(pMCAO)モデルにおけるH-NOX)
ET1モデルで観察される梗塞よりも大きい、一貫した梗塞を皮質及び皮質下構造に生じる近位pMCAOモデルで、三量体型H-NOX L144Fを評価した(図16A)。2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色を用いて、梗塞体積を測定した。各々のTTC染色切片(2mm毎の6つの切片)について、各々の半球の総面積及び梗塞面積をImageJを用いて測定した。浮腫について補正された梗塞体積を計算した(図16A)。しかしながら、pMCAOモデルにおいて、閉塞から6時間後のペナンブラ体積は、ピモニダゾール標識によって測定したとき、ET1モデルと比較してより小さく、かつ/又は早く消失する(図16B)。ピモニダゾール(60mg/kg)を屠殺の2時間前にi.v.注射し、切片を抗ピモニダゾール抗体で染色するか、又は組織を上記のようにELISAによって解析した。
【０３０５】
三量体型H-NOX L144Fの局在を評価するために、単一用量の三量体型H-NOX L144F(240mg/kg)をpMCAOから1時間後に投与し、動物をpMCAOから2時間後に安楽死させ、脳を切片化し、抗H-NOX抗体及び抗CD31抗体で染色した。pMCAOから1時間後に投与したとき、三量体型H-NOX L144Fは、pMCAOから早くも2時間後に、梗塞周囲脳実質に局在した(図17A)。正常脳組織(対側)では、三量体型H-NOX L144Fは血管に制限されていた。その後、虚血病変に対する三量体型H-NOX L144Fの効果を試験した。閉塞から1時間後、動物に単一用量の三量体型H-NOX L144F(240mg/kg)を投与し、pMCAOから6時間後に脳を摘出し、先に記載されている通りに、低酸素については、ピモニダゾールのELISAにより、カスパーゼ9活性については、ルミノメトリーによりアッセイした。図17Bに示されているように、三量体型H-NOX L144F投与は、pMCAOから6時間後、低酸素状態及びカスパーゼ9活性を軽減し、三量体型H-NOX L144Fが脳卒中を治療するための有望な薬剤であることを示している。
(配列)
核酸配列は5'から3'へと示されている。
アミノ酸配列はN-末端からC-末端へと示されている。
(サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOX-野生型)
(核酸)
【化１】
2019511567.tif 000007
(アミノ酸)
【化２】
2019511567.tif 000008
(フォルドンドメイン)
(核酸)
【化３】
2019511567.tif 000009
(アミノ酸)
【化４】
2019511567.tif 000010
(サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOX-L144F)
(核酸)
【化５】
2019511567.tif 000011
(アミノ酸)
【化６】
2019511567.tif 000012
(サーモアナエロバクター・テングコンジェンシスH-NOX-L144F-フォルドン)
【化７】
2019511567.tif 000013
(アミノ酸)
【化８】
2019511567.tif 000014
【図１】
2019511567.tif 000015
【図２Ａ−Ｄ】
2019511567.tif 000016
【図２Ｅ−Ｇ】
2019511567.tif 000017
【図３】
2019511567.tif 000018
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月12日(2018.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511567000001.app
【国際調査報告】
2019511567.tif 000041
2019511567.tif 000042
2019511567.tif 000043