(57)【要約】本開示は、ニューロンにおいて逆行移動に対する優先性を呈するAAVバリアント、およびそのようなバリアントを使用する方法を提供する。2019518793.tif 000016
2019518793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
xxDxTKx（SEQ ID NO:1）およびxDxTKxx（SEQ ID NO:2）からなる群より選択される配列を含む、ウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項２】
SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1に記載のウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項３】
SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項４】
SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸によってコードされる、請求項1に記載のウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項５】
SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号からなる群より選択される配列を有する核酸によってコードされる、請求項1に記載のウイルスキャプシドタンパク質。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか一項に記載のウイルスキャプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子。
【請求項７】
逆行移動に対する優先性を呈する、請求項6に記載のウイルス粒子。
【請求項８】
逆行輸送能力を保有する、請求項6に記載のウイルス粒子。
【請求項９】
ペイロードをコードする核酸をさらに含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項１０】
ペイロードをコードする核酸が、該ペイロードをコードするコード配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む、請求項9に記載のウイルス粒子。
【請求項１１】
プロモーターが、シナプシン-1、CMV、GFAP、CAG、CaMKII、MBP、EF1α、TRE、およびmDlxからなる群より選択される、請求項10に記載のウイルス粒子。
【請求項１２】
ペイロードをコードするコード配列が、タンパク質コード遺伝子および阻害性RNA核酸からなる群より選択される、請求項10または11に記載のウイルス粒子。
【請求項１３】
阻害性RNA核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはRNAiである、請求項12に記載のウイルス粒子。
【請求項１４】
ペイロードがエフェクタータンパク質である、請求項9に記載のウイルス粒子。
【請求項１５】
エフェクタータンパク質が、リコンビナーゼ（例えば、CreまたはFlp）、遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas9、TALEN、Znフィンガーヌクレアーゼ）、光遺伝学的試薬（アクチベーター（例えば、チャネルロドプシンもしくはそのバリアント）またはインヒビター（例えば、ハロロドプシンもしくはArch））、化学遺伝学的試薬（例えば、DREADDまたはPSAM/PSEMシステムのアクチベーター／インヒビターバージョン）、細胞系経路のアクチベーターおよび／またはインヒビター、ならびにエピジェネティクスの制御のための酵素からなる群より選択される、請求項14に記載のウイルス粒子。
【請求項１６】
ペイロードが光学的レポーター構築物である、請求項9に記載のウイルス粒子。
【請求項１７】
光学的レポーター構築物が、GCaMP6（s、m、またはf）、蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度GFP（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、tdTomato）、カラーフリッピング構築物（例えば、1つの細胞集団において1つのレポーターを発現し、別の集団において異なるレポーターを発現するペイロード）、グルコースセンサー、jRCaMP、jRGECO、およびCaMPARI、電位指示薬、二次メッセンジャー、受容体シグナル物質、転写レポーター、エピジェネティックレポーター、ならびに神経調節物質レポーターからなる群より選択される、請求項16に記載のウイルス粒子。
【請求項１８】
ペイロードがウイルスタンパク質である、請求項9に記載のウイルス粒子。
【請求項１９】
ウイルスタンパク質が狂犬病Gタンパク質である、請求項18に記載のウイルス粒子。
【請求項２０】
ウイルスタンパク質が、AAV以外のウイルスの機能を補完するタンパク質であるか、または細胞輸送および経細胞輸送に関連するタンパク質である、請求項18に記載のウイルス粒子。
【請求項２１】
ペイロードをコードするコード配列が治療用遺伝子である、請求項9に記載のウイルス粒子。
【請求項２２】
治療用遺伝子が、神経変性障害の処置のためである、請求項21に記載のウイルス粒子。
【請求項２３】
治療用遺伝子が、アルツハイマー病、または毒性タンパク質凝集物を有する他の疾患の処置のための、HSP104である、請求項22に記載のウイルス粒子。
【請求項２４】
治療用遺伝子が、フリードライヒ運動失調症の処置のためのフラタキシンである、請求項22に記載のウイルス粒子。
【請求項２５】
治療用遺伝子が、パーキンソン病の処置のためのリソソームグルコセレブロシダーゼ（GBA）である、請求項22に記載のウイルス粒子。
【請求項２６】
治療用遺伝子が、ハンチントン病の処置のためのポリQ結合タンパク質である、請求項22に記載のウイルス粒子。
【請求項２７】
治療用遺伝子が、脊髄性筋委縮症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、自閉症、認知症、末梢神経障害、統合失調症、または網膜変性症の処置のための生存運動ニューロン1である、請求項22に記載のウイルス粒子。
【請求項２８】
ペイロードが治療用部分である、請求項9に記載のウイルス粒子。
【請求項２９】
前記治療用部分が抗体またはその断片である、請求項28に記載のウイルス粒子。
【請求項３０】
前記治療用部分が免疫調節タンパク質である、請求項28に記載のウイルス粒子。
【請求項３１】
前記治療用部分がRNA干渉分子である、請求項28に記載のウイルス粒子。
【請求項３２】
イヌアデノウイルス-2（CAV-2）よりも最大で2桁大きい、皮質橋（cortico-pontine）投射ニューロンに対する逆行アクセスを呈する、請求項6〜28のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項３３】
皮質橋投射ニューロンまたは背内側線条体（DMS）への求心性神経に対する逆行アクセスが、合成トレーサーのFluoro-Gold蛍光ビーズに匹敵する、請求項6〜28のいずれか一項に記載のウイルス粒子。
【請求項３４】
1個または複数個のニューロンを、パッケージングされたペイロードを含むバリアントアデノ随伴ウイルス（AAV）と接触させる工程であって、該バリアントAAVが、xxDxTKx（SEQ ID NO:1）およびxDxTKxx（SEQ ID NO:2）からなる群より選択される配列を含むキャプシドタンパク質を含む、工程
を含む、ペイロードを1個または複数個のニューロンに送達する方法。
【請求項３５】
バリアントAAVが、ニューロンにおいて逆行移動を呈する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記ニューロンが投射ニューロンである、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
前記ニューロンが対象中にある、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ニューロンが、対象中の中枢神経系（CNS）中にある、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象がヒトである、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が非ヒトである、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記非ヒト対象が、霊長類、げっ歯類、爬虫類、および鳥類である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記接触させる工程が、細胞培養物中で行われる、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触させる工程が、頭蓋内注射、脊髄内注射、または筋肉内注射を介してインビボで行われる、請求項34〜41のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援の研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって授与されたEY022975の下、政府援助で行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下、2016年6月15日に提出された米国特許出願第62/350,361号、および2016年10月5日に提出された米国特許出願第62/404,585号に対する優先権の恩典を主張する。
【０００３】
技術分野
本開示は、概して、バリアントアデノ随伴ウイルスと、作製および使用方法とに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
知覚、認知、および運動の制御などの脳機能は、特定の計算を行い、これらの計算の結果を分配する長距離の接続によって互いに連結されている局所回路モジュールから構成されている、大規模ニューロンネットワークの協調作用に依存している。そのような長距離の接続は、多くの場合にいくつかの入り混じったクラスを含み、各々がネットワーク内の様々な下流標的に投射する、専門の投射ニューロンによって形成されている。投射ニューロンはまた、いくつかの神経変性疾患の、空間的に局在化した発症の部位からの広がりにも関係している。したがって、導入遺伝子送達のために（例えば、活動モニタリング／操作、または標的化遺伝子ノックアウトもしくは病理学的変異の修復用のゲノム編集のために）、投射ニューロンの特異的なクラスを選択的に標的とする能力は、大規模ネットワークがいかに脳機能に寄与しているかについて洞察を得るため、および長い目で見れば、神経変性疾患における治療的介入のための両方に重要であると考えられる。
【０００５】
ウイルスベクターは、特異的なニューロン集団中に導入遺伝子を導入するためのツールの重要なクラスを構成し、軸索終末での侵入、およびそれらのペイロードの細胞核への逆行輸送を通して投射ニューロンを標的とするための遺伝学的アクセスについて、断然最良の選択肢である。数ある中でも、狂犬病、ポリオウイルス、および単純ヘルペスウイルス（HSV）を含む、数多くの天然に進化した神経向性ウイルスが、その生活環の一部として、逆行伝播を呈する。これらのうち、狂犬病ウイルスは、特に神経侵襲性であり、経細胞移入により神経系を通して素早く広まる。しかし、生物学的調査および遺伝子治療の両方についてのその潜在性は、その毒性の低減に向けて前進がされているが、過剰な病原性によって妨害されている。天然に神経向性の株に加えて、多くの他のウイルスが、神経系に直接投与された場合に、ニューロンに感染することができ、「仮性狂犬病」（SuHV1、実際にはヘルペスウイルス）、アデノウイルス、およびレンチウイルスが、動物研究において最も一般的に使用されている。イヌアデノウイルス-2（CAV-2）は、このウイルスにおいて最良の感染性および逆行輸送を提示し、次第に、投射ニューロンにアクセスするために選ばれる試薬になってきている。しかし、CAV-2は、少なめのレベルのみの導入遺伝子発現を媒介し、毒性についての潜在性を提示し、かつ、現在、臨床グレードの生成またはさらに大きな動物での研究のための、規模拡大可能で確実な生産に容易に適合性ではない。したがって、様々な導入遺伝子の柔軟なパッケージングができ、軸索によって確実に内部移行されて逆行性に輸送され、かつ、長期の高レベルのペイロード発現を支持する、非毒性の容易に製造されるウイルスベクターの開発が、緊急に必要なままである。
【発明の概要】
【０００６】
概要
センサーおよびエフェクターの送達のための投射ニューロンに対する効率的な逆行アクセスは、回路の精査のための重要なかつ可能にする能力を構成する。そのようなアプローチはまた、機能的に接続され、高度に分配されたネットワークを通した病理学的広がりを特徴とする神経変性障害の処置を含む、遺伝子治療に有用であろう。ウイルスベクターは、特に、神経系のための強力な遺伝子送達ビヒクルであるが、すべての利用可能なツールは、非効率的な逆行輸送または限定された臨床的潜在性を欠点として有する。この必要に対処するために、神経科学研究およびクリニックにおいて有望さを示しているベクターであるアデノ随伴ウイルス（AAV）のキャプシド中に効力のある逆行機能性を操作して入れるように、インビボ定方向進化を適用した。rAAV2-retroと呼ばれる、本明細書に記載されるバリアントは、古典的な合成逆行標識試薬に匹敵する効率での、投射ニューロンに対する確実な逆行アクセスを許容し、かつ、機能的な回路の調査、および標的化ニューロン集団におけるCRISPR/Cas9を用いたインビボゲノム編集に十分である、高い発現レベルを可能にする。
【０００７】
1つの局面において、xxDxTKx（SEQ ID NO:1）およびxDxTKxx（SEQ ID NO: 2）からなる群より選択される配列を含むウイルスキャプシドタンパク質が、提供される。1つの態様において、ウイルスキャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、または78に対して少なくとも95％の配列同一性を有する。1つの態様において、ウイルスキャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、または78に示される配列を有する。1つの態様において、ウイルスキャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、または77の配列番号に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸によってコードされる。1つの態様において、ウイルスキャプシドタンパク質は、SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号に示される配列を有する核酸によってコードされる。
【０００８】
さらに別の局面において、本明細書に記載されるようなウイルスキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子が、提供される。いくつかの態様において、ウイルス粒子は、逆行移動に対する優先性を呈する。いくつかの態様において、ウイルス粒子は、逆行輸送能力を保有する。
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるようなウイルス粒子は、ペイロードをコードする核酸をさらに含む。いくつかの態様において、ペイロードをコードする核酸は、ペイロードをコードするコード配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む。代表的なプロモーター配列は、非限定的に、シナプシン-1、CMV、GFAP、CAG、CaMKII、MBP、EF1α、TRE、およびmDlxを含む。いくつかの態様において、ペイロードをコードするコード配列は、タンパク質コード遺伝子および阻害性RNA核酸からなる群より選択される。いくつかの態様において、阻害性RNA核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはRNAiである。
【００１０】
いくつかの態様において、ペイロードは、エフェクタータンパク質である。代表的なエフェクタータンパク質は、非限定的に、リコンビナーゼ（例えば、CreまたはFlp）、遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas9、TALEN、Znフィンガーヌクレアーゼ）、光遺伝学的試薬（アクチベーター（例えば、チャネルロドプシンもしくはそのバリアント）またはインヒビター（例えば、ハロロドプシンもしくはArch））、化学遺伝学的試薬（例えば、DREADDまたはPSAM/PSEMシステムのアクチベーター／インヒビターバージョン）、細胞系経路のアクチベーターおよび／またはインヒビター、ならびにエピジェネティクスの制御のための酵素を含む。
【００１１】
いくつかの態様において、ペイロードは、光学的レポーター構築物である。代表的な光学的レポーター構築物は、非限定的に、GCaMP6（s、m、またはf）、蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度GFP（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、tdTomato）、カラーフリッピング構築物（例えば、1つの細胞集団において1つのレポーターを発現し、別の集団において異なるレポーターを発現するペイロード）、グルコースセンサー、jRCaMP、jRGECO、およびCaMPARI、電位指示薬、二次メッセンジャー、受容体シグナル物質、転写レポーター、エピジェネティックレポーター、ならびに神経調節物質レポーターを含む。
【００１２】
いくつかの態様において、ペイロードは、ウイルスタンパク質である。代表的なウイルスタンパク質は、狂犬病Gタンパク質である。いくつかの態様において、ウイルスタンパク質は、AAV以外のウイルスの機能を補完するタンパク質、または細胞輸送および経細胞輸送に関連するタンパク質である。
【００１３】
いくつかの態様において、ペイロードをコードするコード配列は、治療用遺伝子である。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、神経変性障害の処置のためである。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、アルツハイマー病、または毒性タンパク質凝集物を有する他の疾患の処置のためのHSP104である。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、フリードライヒ運動失調症の処置のためのフラタキシンである。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、パーキンソン病の処置のためのリソソームグルコセレブロシダーゼ（GBA）である。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、ハンチントン病の処置のためのポリQ結合タンパク質である。いくつかの態様において、治療用遺伝子は、脊髄性筋委縮症、筋委縮性側索硬化症（ALS）、自閉症、認知症、末梢神経障害、統合失調症、または網膜変性症の処置のための生存運動ニューロン1である。
【００１４】
いくつかの態様において、ペイロードは、治療用部分である。代表的な治療用部分は、抗体またはその断片である。代表的な治療用部分は、免疫調節タンパク質である。代表的な治療用部分は、RNA干渉分子である。
【００１５】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるウイルス粒子は、イヌアデノウイルス-2（CAV-2）よりも最大で2桁大きい、皮質橋（cortico-pontine）投射ニューロンに対する逆行アクセスを呈する。いくつかの態様において、皮質橋投射ニューロンまたは背内側線条体（DMS）への求心性神経に対する逆行アクセスは、合成トレーサーのFluoro-Gold蛍光ビーズに匹敵する。
【００１６】
別の局面において、ペイロードを1個または複数個のニューロンに送達する方法が、提供される。そのような方法は、典型的に、1個または複数個のニューロンを、その中にパッケージングされたペイロードを含むバリアントアデノ随伴ウイルス（AAV）と接触させる工程であって、該バリアントAAVが、xxDxTKx（SEQ ID NO:1）およびxDxTKxx（SEQ ID NO:2）からなる群より選択される配列を含むキャプシドタンパク質を含む、前記工程を含む。いくつかの態様において、バリアントAAVは、ニューロンにおいて逆行移動を呈する。
【００１７】
いくつかの態様において、ニューロンは、投射ニューロンである。いくつかの態様において、ニューロンは、対象中（例えば、対象中の中枢神経系（CNS）中）にある。いくつかの態様において、対象は、ヒトである。いくつかの態様において、対象は、非ヒト（例えば、霊長類、げっ歯類、爬虫類、または鳥類）である。いくつかの態様において、接触させる工程は、細胞培養物中で行われる。いくつかの態様において、接触させる工程は、頭蓋内注射、脊髄内注射、または筋肉内注射を介したインビボである。
【００１８】
別の方法で定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、関係する方法および組成物が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、問題の方法および組成物の実行または試験において用いることができるが、適している方法および材料を、以下に記載する。加えて、材料、方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。本明細書において述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】rAAV2-retroの定方向進化を示す。図1のパネルAは、定方向進化手順の模式図である。エラープローンPCR、ペプチド挿入、ループ領域のランダム化、およびDNAシャッフリングによって事前に生成させたバリアントAAV cap遺伝子を含有するプラスミドライブラリーを、パッケージングして、黒質または深部小脳核中に注射した。3週間後、線条体組織または後脳組織をそれぞれ取り出し、ウイルスゲノムを単離し、選抜されたcap遺伝子を、次の選抜ラウンドのために増幅してパッケージングした。図1のパネルBは、対応する軸索の場において、様々な蛍光タンパク質を運ぶrAAV2-retroを注射することによって逆行的に標識された、線条体（CP：尾状核-被殻）、視床、および上丘（SC）に投射する皮質ニューロンの入り混じった亜集団を示す。
【図２】逆行輸送効率を定量する、実験からの結果を示す。図2のパネルAは、rAAV2-retroの基底橋（basal pontine）注射を介して標識された皮質橋路を示す［パネルAの上のパネルは、実験の模式図を示す；ターゲティングの整合性および注射品質を、AAV1-CAG-EGFPを同時注射することによってモニタリングした。パネルAの下のパネルは、注射の3週間後の発現のレベルを示す。スケールバー：1 mm］。図2のパネルBは、定量アッセイの設計を示す［パネルBの上のパネルは、実験の模式図を示す；矢印は、皮質橋路の皮質ニューロンにおける、期待される核GFP標識を示す。パネルBの中央のパネルは、AAV2を注射した脳の代表的な画像を示す。パネルBの下のパネルは、rAAV2retroを注射した脳の代表的な画像を示す。スケールバー：1 mm］。図2のパネルCは、半自動化定量手順の模式図を示す。蛍光の核（緑色）を、皮層Vの長さをたどった手動で描いた線（黒色）に沿って、自動的に検出し、計数した。図2のパネルDは、様々なAAVセロタイプについて、およびイヌアデノウイルス-2（CAV-2）についての逆行輸送効率を示す。エラーバーは、SEMを表す。図8も参照されたい。
【図３】rAAV2-retroによってできる逆行輸送の一般性を実証する、実験からの結果を示す。図3のパネルAは、皮質（画像番号1）、扁桃体（画像番号3）、および視床（画像番号4）を含む背側線条体に対する主要な入力構造における広範囲の標識を示す、代表的な画像である。図3のパネルBは、逆行標識の自動化全脳定量の模式図を示す。rAAV2-retro hSyn1-Creを注射したRosa26-LSL-H2B-GFPの脳を画像化して、DAPI染色核、およびH2B-GFP発現核由来の緑色蛍光を可視化した。緑色チャンネルを用いて、標識されたニューロンを検出する；青色チャンネルを、Allen Brain Instituteの標準的なマウス脳由来のニッスル画像に対して整列させる。この脳地図（brain atlas）によって提供される注釈を用いて、アラインメントにより、検出されたニューロンを様々な領域に割り当てることが可能になる。スケールバー：1.25 mm。図3のパネルCは、背内側線条体の小さな領域から外への逆行標識の全脳定量を示す。様々な脳領域についての略語を、Allen Brain Atlasにしたがって示す。矢印は、SNcを強調する。エラーバーは、SEMを表す。
【図４】rAAV2-retroシステムを、Creドライバー系統と組み合わせた実験からのデータである。図4のパネルAは、実験の模式図を示す。Cre依存的カラーフリッピング蛍光レポーターを運ぶrAAV2-retroを、皮層V特異的Cre系統の線条体中に注射した。図4のパネルBは、1つの経路においてレポーターのCre依存的反転を通して差次的に標識されているが、もう1つにおいては標識されていない、2つの皮層線条体経路を示す。
【図５】rAAV2-retroが機能的な回路の調査に十分な導入遺伝子発現を支持することを示す、実験からのデータである。図5のパネルAは、実験の模式図である。カルシウム指示薬GCaMP6fの発現を、rAAV2-retroの基底橋（basal pons）中への局在性注射を用いて、皮質橋ニューロンに限定させる。図5のパネルBは、皮質橋路を通したGCaMP6f発現を示す、脳の横断面である。図5のパネルCは、層V錘体路細胞体および尖端樹状突起を示す、二光子カルシウム画像の最大投射を示す。図5のパネルDは、単一のハンドリーチ反復（single hand reach repetition）中の89 ROIの活性を示す（破線は、トーン「ゴー」シグナルを意味する）。図5のパネルEおよびパネルFは、40回の連続的な試験中の、単一皮質橋ニューロンの2つの例である（図5のパネルBおよびパネルDと同じ動物）。
【図６】rAAV2-retroシステムが、CRISPR/Cas9を用いたインビボゲノム編集を可能にすることを示すデータである。図6のパネルAは、実験の模式図である［パネルAの上のパネルは、rAAV2-retroシステムを用いて、tdTomatoの発現を除去するように操作で作られた黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Cas9（SaCas9）-シングルガイドRNAの組み合わせを送達したことを示す。パネルAの下のパネルは、SaCas9-抗tdTomatoペイロードを運ぶrAAV2-retroを、層Vニューロンにおいて単一のゲノム遺伝子座由来のtdTomatoを発現するマウスの基底橋中に注射したことを示す。］。図6のパネルBは、tdTomatoに対してターゲティングされたか、または非ターゲティングガイドを運ぶCRISPR/Cas9システムを受けた動物の脳切片由来の代表的な画像を示す。SaCas9は、逆行的に標識されたニューロンの特定（緑色チャンネル）を可能にする、エピトープタグが付加されている。上向きの矢印は、tdTomatoの除去の成功後の期待される標識を示し；下向きの矢印は、tdTomato発現が影響を受けない場合の期待される標識を示す。図6のパネルCは、除去の効率を示す。エラーバーは、SEMを表す。
【図７】rAAV2-retroが、ラットにおいて投射ニューロンに対する効率的なアクセスを媒介することを示すデータである（図7に示したデータは、図1に示したデータに関連している）。図7のパネルAは、注射の模式図である。EGFPまたはtdTomatoを発現するrAAV2-retroの別個のロットを、それぞれ、線条体または上丘に注射した。図7のパネルB〜Eは、これらの局在性注射を通してアクセスし、ウイルス送達の3週間後に画像化した、種々の脳領域における投射ニューロンを示す。
【図８】基底橋における種々のAAVセロタイプを注射した動物由来の脳の代表的な画像であり、天然に存在しないAAVセロタイプが、皮質橋回路においてrAAV2-retroの性能に見合うことを示す（図8に示したデータは、図2に示したデータに関連している）。
【図９】rAAV2-retroについての、その親セロタイプAAV2と比較して低減したヘパリン親和性を示すデータである（図9に示したデータは、図1に示したデータに関連している）。図9のパネルAは、ヘパリン結合アッセイの模式図である。図9のパネルBは、150 mM NaClにおけるローディング後の、NaClの濃度の増大と共に溶出されるウイルスの画分を示す。ロード画分は、150 mM NaClにおける試料ローディング後のカラムフロースルーにおいて回収されたウイルスを表す。エラーバーは、SDを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）は、それらが高レベルの導入遺伝子発現を媒介し、非毒性であり、かつ最小の免疫応答を惹起するため、インビボ遺伝子治療のための有効なプラットフォームとして浮上してきている。これらの特性は、リポタンパク質リパーゼ欠損症のrAAV媒介性回復に対して任意の遺伝子治療処置の最初の完全な規制当局による承認を授ける決定の核心であった（例えば、Gaudet et al., 2010, Atherosclerosis Supplem., 11:55-60を参照されたい）。rAAVは、ある範囲の神経障害についての臨床試験において大いに有望であり、神経科学研究において最も広く普及したベクターのうちのいくつかを構成している。AAVが逆行輸送を受けることができるという最初の発見（Kaspar et al., 2002, Mol. Ther., 5:50-56）以来、rAAVは、選択回路において投射ニューロンに対するある程度の逆行アクセスができているが、逆行輸送についてのその天然の傾向は低く、回路計算または疾患進行における投射ニューロンの役割に対処する努力を妨害している。
【００２１】
本開示は、曝露部位でニューロン細胞体に感染するその通例の能力に加えて、軸索によって確実に内部移行され、合成色素などの古典的逆行標識試薬に匹敵する効率での投射ニューロンに対する逆行アクセスを媒介する、新たなrAAVバリアント（rAAV2-retro）を記載する。本明細書に記載されるrAAV2-retro遺伝子送達システムは、神経回路機能の有効な機能的調査、および標的化ニューロン集団におけるゲノム編集に十分である、長期の高レベルの導入遺伝子発現を達成するために、それ自体で、またはCreリコンビナーゼドライバー系統と共に使用することができる。
【００２２】
逆行輸送は、分子および／またはオルガネラを、軸索終末から離れて細胞体に向かって往復させる。逆行軸索輸送は、細胞質ダイニンによって媒介され、例えば、化学的メッセージおよびエンドリソソームに向かうエンドサイトーシス産物を、軸索から細胞へ戻して送るために使用される。高速逆行輸送は、およそ2μm/秒の平均速度で、インビボで作動し、1日あたり10〜20センチメートルをカバーすることができる。高速逆行輸送は、使用されたシナプス小胞および他の材料を細胞体に戻し、軸索終末での状態を細胞体に知らせる。したがって、本明細書において用いられる場合、「逆行」輸送とは、軸索におけるその細胞体に向かう移動を指す。
【００２３】
アデノ随伴ウイルス（AAV）核酸およびポリペプチド配列
本明細書に記載されるように、AAVキャプシドタンパク質中に存在する場合に、逆行輸送の効力における甚大な強化を結果としてもたらす、コンセンサス配列が特定された。それらのコンセンサス配列は、xxDxTKx（SEQ ID NO:1）またはxDxTKxx（SEQ ID NO:2）である。逆行輸送能力の付与についての、本明細書に記載されるコンセンサス配列の有効性を実証するために、本明細書に記載されるようなコンセンサス配列を各々が含有する、17種類の異なるキャプシド配列を生成して、ニューロンにおいて逆行移動に対する優先性を呈することを示した。それらの40種類のキャプシド配列の核酸配列を、SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77に示し、本明細書に記載されるコンセンサス配列のうちの1つを各々が含有する、コードされるキャプシドポリペプチドを、それぞれ、SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78に示す。
【００２４】
SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78の配列番号に示される配列を有するキャプシドポリペプチドに加えて、SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78の配列番号に示される配列を有するキャプシドポリペプチドに対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性）を有するポリペプチドが提供される。同様に、SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号に示される配列を有する核酸分子に加えて、SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号に示される配列を有する核酸分子に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％の配列同一性）を有する核酸分子が提供される。
【００２５】
パーセント配列同一性の計算においては、2つの配列を整列させ、2つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する。完全な一致の数を、整列させた領域の長さ（すなわち、整列させたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、100をかけて、パーセント配列同一性の値に達する。整列させた領域の長さは、最短配列の完全長サイズまでの、1つまたは両方の配列の一部分であることができると、認識されるであろう。また、単一の配列を、1つよりも多い他の配列と整列させることができ、したがって、各々の整列させた領域にわたって異なるパーセント配列同一性の値を有することができるとも、認識されるであろう。
【００２６】
パーセント配列同一性を決定するための2つ以上の配列のアラインメントは、World Wide Web上のncbi.nlm.nih.govで利用可能である、BLAST（basic local alignment search tool）プログラム中に組み込まれているような、Altschul et al.（1997, Nucleic Acids Res., 25:3389 3402）によって記載されているアルゴリズムを用いて行うことができる。 BLAST検索は、Altschul et al.のアルゴリズムを用いて、配列（核酸またはアミノ酸）と、整列させた任意の他の配列またはその一部分との間のパーセント配列同一性を決定するために行うことができる。BLASTNは、核酸配列を整列させ、その間の同一性を比較するために使用されるプログラムであり、他方、BLASTPは、アミノ酸配列を整列させ、その間の同一性を比較するために使用されるプログラムである。配列と別の配列との間のパーセント同一性を計算するためにBLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータが、概して使用される。
【００２７】
ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクターもまた、提供される。発現ベクターを含むベクターは、市販されており、または、組換え技術によって生じさせることができる。核酸分子を含有するベクターは、そのような核酸分子に機能的に連結された、発現のための1個または複数個のエレメントを有することができ、さらに、選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードするもの、および／またはポリペプチドの精製において使用できるもの（例えば、6×Hisタグ）などの配列を含むことができる。発現のためのエレメントは、核酸コード配列の発現を指示および調節する核酸配列を含む。発現エレメントの1つの例は、プロモーター配列である。発現エレメントはまた、核酸分子の発現を調整する、イントロン、エンハンサー配列、応答エレメント、または誘導性エレメントのうちの1つまたは複数も含むことができる。発現エレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、またはウイルスの起源のものであることができ、ベクターは、様々な起源由来の発現エレメントの組み合わせを含有することができる。本明細書において用いられる場合、機能的に連結されたとは、発現のためのエレメントが、コード配列の発現を指示または調節するように、コード配列に対してベクター中に位置していることを意味する。
【００２８】
核酸分子、例えば、ベクター（例えば、発現ベクター、ウイルスベクター）中の核酸分子を、宿主細胞中に導入することができる。「宿主細胞」という用語は、核酸分子がその中に導入されている特定の細胞を指すだけではなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。多くの適している宿主細胞が、当業者に公知であり；宿主細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌（E. coli））または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞）であることができる。代表的な宿主細胞は、非限定的に、A549、WEHI、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、WI38、HeLa、293細胞、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2、ならびに、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含む哺乳動物に由来する初代線維芽細胞、肝細胞、および筋芽細胞を含むことができる。核酸分子を宿主細胞中に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、非限定的に、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介性核酸移入（例えば、形質導入）を含む。
【００２９】
ポリペプチドに関して、「精製された」とは、天然でそれに付随する細胞構成要素から分離または精製されているポリペプチド（すなわち、ペプチドまたはポリペプチド）を指す。典型的には、ポリペプチドは、それが天然で会合しているポリペプチドおよび天然に存在する分子から遊離して、乾燥重量で少なくとも70％（例えば、少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、または99％）である場合に、「精製された」と考えられる。化学的に合成されるポリペプチドは、本来、天然でそれに付随する構成要素から分離されているため、合成ポリペプチドは、「精製された」と考えられるが、さらに、ポリペプチドを合成するために使用された構成要素（例えば、アミノ酸残基）から取り出すことができる。核酸分子に関して、「単離された」とは、ゲノムにおいてそれと通常会合している他の核酸分子から分離されている核酸分子を指す。加えて、単離された核酸分子は、組換え核酸分子または合成核酸分子などの、操作で作られた核酸分子を含むことができる。
【００３０】
ポリペプチドは、DEAEイオン交換、ゲル濾過、および／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの公知の方法によって、天然供給源（例えば、生物学的試料）から取得（例えば、精製）することができる。精製されたポリペプチドはまた、例えば、発現ベクターにおいて核酸分子を発現させることによって、または化学合成によって取得することもできる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC解析を用いて測定することができる。同様に、核酸分子は、非限定的に、組換え核酸技術（例えば、制限酵素消化およびライゲーション）、またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR；例えば、PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995を参照されたい）などの日常的な方法を用いて、取得（例えば、単離）することができる。加えて、単離された核酸分子は、化学的に合成することができる。
【００３１】
ニューロンにおいて逆行移動に対して優先性を呈するウイルス粒子を作製する方法
ひとたびキャプシドポリペプチドが生じるか、または、キャプシドポリペプチドを生じるようにひとたび核酸分子が生成し、発現すると、ポリペプチドを、例えば、パッケージング宿主細胞を用いてウイルス粒子中にアセンブルすることができる。ウイルス粒子の構成要素（例えば、rep配列、cap配列、逆方向末端反復（ITR）配列）は、1種類または複数種類のベクターを用いてパッケージング宿主細胞中に、一過性にまたは安定に導入することができる。ウイルス粒子のキャプシドポリペプチドは、本明細書に記載されるようなコンセンサス配列を含有することができるが、残りの構成要素は、1種類または複数種類の公知のAAVセロタイプ（例えば、AAV2、AAV8など）由来であることができる。
【００３２】
そのようなウイルス粒子は、日常的な方法を用いて精製することができる。本明細書において用いられる場合、「精製された」ウイルス粒子とは、ウイルス構成要素（例えば、rep配列、cap配列）、パッケージング宿主細胞、および、部分的にまたは不完全にアセンブルされたウイルス粒子などであるがそれらに限定されない、その中でそれらが作製された混合物における構成要素から取り出されているウイルス粒子を指す。
【００３３】
ひとたびアセンブルされると、ウイルス粒子を、例えば、複製する能力；遺伝子移入特性；受容体結合能力；および／または集団（例えば、ヒト集団）における血清有病率についてスクリーニングすることができる。ウイルス粒子が複製することができるかどうかの判定は、当技術分野において日常的であり、典型的には、宿主細胞にある量のウイルス粒子を感染させること、およびウイルス粒子の数が経時的に増大するかを判定することを含む。ウイルス粒子が遺伝子移入を行うことができるかどうかの判定もまた、当技術分野において日常的であり、典型的には、宿主細胞に、導入遺伝子（例えば、レポーター遺伝子などの検出可能な導入遺伝子）を含有するウイルス粒子を感染させることを含む。ウイルスの感染および排除の後、宿主細胞を、導入遺伝子の有無について評定することができる。ウイルス粒子がその受容体に結合するかどうかの判定は、当技術分野において日常的であり、そのような方法を、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【００３４】
ウイルス粒子の血清有病率の決定は、当技術分野において日常的に行われ、典型的には、個体の特定の集団由来の試料（例えば、血液試料）において1種類または複数種類の抗体の普及率を決定するために免疫アッセイを使用することを含む。血清有病率は、血清陽性である（すなわち、特定の病原体または免疫原に曝露されたことがある）、集団における対象の割合を指すように、当技術分野において理解されており、検討した集団における個体の総数によって割った、特定の病原体または免疫原に対する抗体を産生する、集団における対象の数として計算される。免疫アッセイは、当技術分野において周知であり、非限定的に、免疫ブロット、ウェスタンブロット、酵素免疫アッセイ（EIA）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、または放射免疫アッセイ（RIA）を含む。同様に、血清試料における中和抗体の程度を判定するためのいくつかの方法が、利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、実験試料が、抗体を有さない対照試料と比較した場合に50％以上感染を中和する抗体濃度を含有する力価を測定する。Fisher et al. (1997, Nature Med., 3:306-12)およびManning et al. (1998, Human Gene Ther., 9:477-85)もまた、参照されたい。
【００３５】
ニューロンにおいて逆行移動に対して優先性を呈するウイルスを使用する方法
本明細書に記載されるようなウイルスまたはその一部分は、数多くの研究および／または治療応用において使用することができる。例えば、本明細書に記載されるようなウイルスまたはその一部分は、遺伝子治療のために（例えば、遺伝子移入用のベクターもしくはベクター系において）、またはワクチン接種のために（例えば、抗原提示のために）、ヒトまたは動物の医療において使用することができる。より具体的には、本明細書に記載されるようなウイルスまたはその一部分を、遺伝子付加、遺伝子増強、ポリペプチド治療薬の遺伝学的送達、遺伝学的ワクチン接種、遺伝子サイレンシング、ゲノム編集、遺伝子治療、RNAi送達、cDNA送達、mRNA送達、miRNA送達、miRNAスポンジング、遺伝学的免疫化、光遺伝学的遺伝子治療、遺伝子組換え、DNAワクチン接種、またはDNA免疫化のために使用することができる。
【００３６】
宿主細胞に、ウイルスまたはその一部分を、インビトロ（例えば、培養での成長）またはインビボ（例えば、対象、例えば、ヒトまたは非ヒトにおいて）で、形質導入または感染させることができる。インビトロでウイルスまたはその一部分を形質導入または感染させることができる宿主細胞は、本明細書に記載されており；インビボでウイルスまたはその一部分を形質導入または感染させることができる宿主細胞は、非限定的に、投射ニューロン（例えば、皮質橋投射ニューロン、交感神経投射ニューロン、中枢神経系投射ニューロン）、背内側線条体（DMS）への求心性神経、脊髄皮質／真菌（spinal cortical/fungal）ニューロン、前小脳（pre-cerebellar）ニューロン、基底核への入力、前視床（pre-thalamic）ニューロン、運動ニューロン、感覚ニューロン、または中枢神経系の他のニューロンもしくは細胞を含む。
【００３７】
本明細書に記載されるようなウイルスまたはその一部分は、ペイロードを含むように修飾することができる。ペイロードは、典型的には、少なくとも1種類の核酸（例えば、ペイロードをコードするコード配列に機能的に連結されたプロモーター配列）を含む。ある特定の例において、ペイロードは、阻害性核酸であることができる。阻害性核酸は、当技術分野において公知であり、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉RNA（siRNA）、およびRNA干渉（RNAi）分子を含む。ある特定の例において、ペイロードは、1種類または複数種類のタンパク質コード遺伝子であることができる。非限定的に、タンパク質コード遺伝子は、光学的レポーター構築物、治療用遺伝子、またはエフェクタータンパク質を含む。
【００３８】
多くのタイプの光学的レポーター構築物が、当技術分野において公知であり、以下のリストは、代表的であって、網羅的ではないように意味される。例えば、光学的レポーター構築物は、非限定的に、GCaMP6（GCaMP6s、GCaMP6m、またはGCaMP6f；国際公開公報第2014/059154号を参照されたい）、蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度GFP（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、tdTomato）、カラーフリッピング構築物（例えば、1つの細胞集団において1つのレポーターを発現し、別の集団において異なるレポーターを発現するペイロード）、グルコースセンサー（例えば、米国特許出願公開第2015/0111222号）、iRCaMP（米国特許第9,644,007号）、iRGECO（例えば、米国特許第9,644,007号）、CaMPARI（例えば、米国特許第9,518,996号）、電位指示薬、二次メッセンジャー、受容体シグナル物質、転写レポーター、エピジェネティックレポーター、および神経調節物質レポーターを含む。
【００３９】
治療用遺伝子もまた、当技術分野において公知であり、処置される特定の疾患または障害に依存することになる。例えば、治療用遺伝子は、神経変性障害の処置のためであることができる。代表的な治療用遺伝子（またはコードされるポリペプチド）およびそれらの関連する神経変性障害は、非限定的に、アルツハイマー病の処置のためのHSP104、フリードライヒ運動失調症の処置のためのAtaxis（例えば、フラタキシン）、パーキンソン病の処置のためのリソソームグルコセレブロシダーゼ（GBA）、ハンチントン病の処置のためのポリQ結合タンパク質、脊髄性筋委縮症、および筋委縮性側索硬化症（ALS）、自閉症、認知症、末梢神経障害、統合失調症、および網膜変性症の処置のための生存運動ニューロン1を含む。いくつかの例において、ペイロードは、（遺伝子とは異なって）治療用部分であってもよい。治療用部分は、例えば、抗体もしくはその断片、免疫調節タンパク質、またはRNA干渉（RNAi）分子を含む。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、「エフェクター」タンパク質とは、細胞またはその内容物（例えば、核酸、タンパク質、オルガネラ、または上記のいずれかを含むプロセス）に対して効果を付与する、任意のタイプのタンパク質を指す。例えば、エフェクタータンパク質は、非限定的に、リコンビナーゼ（例えば、CreまたはFlp）、遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas9、TALEN、Znフィンガーヌクレアーゼ）、光遺伝学的試薬（アクチベーター（例えば、チャネルロドプシンもしくはそのバリアント）またはインヒビター（例えば、ハロロドプシンもしくはArch））、化学遺伝学的試薬（例えば、DREADDもしくはPSAM/PSEMシステムのアクチベーター／インヒビターバージョン）、細胞系経路のアクチベーターおよび／またはインヒビター、ならびにエピジェネティクスの制御のための酵素を含む。
【００４１】
ウイルス（例えば、AAV以外のウイルス）の機能を補完または阻害するウイルスタンパク質を送達することが望ましい場合があると、認識されるであろう。例えば、ウイルスタンパク質は、侵入受容体（例えば、細胞輸送および／または経細胞輸送に関連するタンパク質である、狂犬病Gタンパク質）である。
【００４２】
任意の数のプロモーターを、ペイロードをコードする配列を駆動するために使用することができる。構成性プロモーターが、組織特異的プロモーター（例えば、ニューロン特異的プロモーター）と同様に、当技術分野において公知である。単純に例として、プロモーターは、シナプシン-1、CMV、GFAP、CAG、CaMKII、MBP、EF1α、mDlx、またはTREプロモーターであることができる。
【００４３】
通常、生理学的に適合性の担体中に懸濁されたウイルスまたはその一部分を、対象（例えば、ヒトまたは非ヒト対象（例えば、霊長類、げっ歯類、爬虫類、もしくは鳥類））に投与することができる。適している担体は、様々な緩衝溶液と共に製剤化され得る食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、および水を含む。ウイルスまたはその一部分は、細胞に形質導入または感染するのに十分な量で、ならびに、十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供して、過度の有害作用を伴わずに治療的恩恵を提供するように投与される。投与の慣例的なかつ薬学的に許容される経路は、頭蓋内注射、脊髄内注射、または筋肉内注射を含むが、それらに限定されない。追加的な投与の経路は、例えば、経口、鼻腔内、気管内、吸入、静脈内、眼内、皮下、皮内、経粘膜、または他の投与の経路を含む。投与の経路は、望ましい場合、組み合わせることができる。
【００４４】
対象に投与されるウイルスまたはその一部分の用量は、処置される状態、ならびに対象の年齢、重量、および健康などの要因に主として依存することになる。例えば、ヒト対象に投与されるべきウイルスまたはその一部分の治療的に有効な投薬量は、概して、約1×101〜1×1012ゲノムコピー（GC）のウイルス（例えば、約1×103〜1×109 GC）の濃度を含有する、約0.1 ml〜約10 mlの溶液の範囲にある。導入遺伝子の形質導入および／または発現は、DNA、RNA、またはタンパク質のアッセイによって、投与後の様々な時点でモニタリングすることができる。いくつかの例において、導入遺伝子の発現のレベルをモニタリングして、投薬の頻度および／または量を決定することができる。
【００４５】
有意に、本明細書に記載されるAAV-retro粒子は、例えば、イヌアデノウイルス-2（CAV-2）よりも最大で2桁大きい、皮質橋投射ニューロンに対する逆行アクセスを呈し、ある特定のニューロン（例えば、皮質橋投射ニューロン、または背内側線条体（DMS）への求心性神経）に対する逆行アクセスは、Fluoro-Gold（登録商標）蛍光ビーズなどの合成トレーサーで観察されたものに匹敵している。
【００４６】
本発明にしたがって、当技術分野の技能内の慣例的な分子生物学、微生物学、生化学、および組換えDNA法が使用されてもよい。そのような技法は、文献において完全に説明されている。本発明を、添付の特許請求の範囲に記載される問題の方法および組成物の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【００４７】
実施例1‐実験手順
すべての手順は、Janelia Research CampusおよびUniversity of California Berkeley Institutional Animal Care and Use Committeesによって承認されたプロトコールにしたがって行った。
【００４８】
実施例2‐ライブラリー生成およびウイルス産生
4種類の以前に生成されたウイルスベクターを、定方向進化手順の開始時に使用した：1）AAV2 cap遺伝子（ウイルスタンパク質のVP1-3およびアセンブリー活性化タンパク質（AAP）をコードする）をエラープローンPCRに供することによって生成されたランダム変異誘発ライブラリー（Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol., 24:198-204）；2）N587とR588との間に7マーペプチド挿入物を含有するAAV2 cap遺伝子バリアントのライブラリー（Muller et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:1040-6）；3）ランダム化ループ領域を含有するAAV2 cap遺伝子バリアントのライブラリー（Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95）；ならびに4）野生型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、およびAAV9 cap遺伝子配列から生成されたDNAシャッフリングライブラリー（Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9）。変異体DNAの各プールは、元々、AAVビリオン中にパッケージングされた時に、任意の新たな特性または機能について選抜することができるウイルスプラスミドライブラリーを創出するために、複製能を有するAAVパッケージングプラスミド中にサブクローニングされていた。複製能を有するAAVシステムは、変異体cap遺伝子をウイルスペイロード中に組み込み、したがって、各バリアントの遺伝子型は、その表現型に連結されている。所望の特性のキャプシド配列を、次いで、被包性AAVゲノムのDNA配列解析によって回収することができる。
【００４９】
4種類の複製能を有するAAVライブラリーを、HEK293-T細胞のリン酸カルシウム一過性トランスフェクションによってパッケージングし、その後、ウイルス収集、イオジキサノール勾配遠心分離、およびAmicon濾過を行った（Maheshri et al., 2006, Nat. Biotechnol., 24:198-204）。
【００５０】
実施例3‐インビボのウイルスまたはトレーサーの注射
局在性インビボウイルス送達のために、マウスまたはラットに、イソフルラン（O2中、体積で約2％；SurgiVet, Smiths Medical）で麻酔をかけ、必要な注射部位の上の頭蓋骨に小さな穴をドリルで開けた（表1を参照されたい）。いくつかの注射部位について、数回の注射を、異なる深さで行った（表1を参照されたい）。ウイルス注射については、約50〜100 nl（マウス）または250〜500 nl（ラット）のウイルス含有溶液を、各々の深さで組織中にゆっくり注射した。トレーサー注射については、50 nlの0.9％ NaCl中5％ Fluoro-gold（Fluorochrome, Denver, CO）、または0.9％ NaCl中に1：1希釈した100 nlのretro-beads（LumaFluor, Durham, NC）を、各注射標的に対して同じセットの部位で注射した。注射は、ミネラルオイルで埋め戻した、引いたガラスピペット（25〜30μm（外径）になるように割って傾斜をつけた；Drummond Scientific, Wiretrol II Capillary Microdispenser）で行った。適合したプランジャーをピペット中に挿入し、油圧マニピュレータ（Narashige, MO-10）を用いて内容物を置き換えるように進めた。
【００５１】
プランジャーの後退を用いて、ピペットにウイルスをロードした。注射ピペットを、Sutter MP-285マニピュレータで配置した。
【００５２】
（表１）本研究において使用した座標
2019518793.tif 000003
＊すべてのA/P座標は、ブレグマに関して与えられている。
【００５３】
実施例4‐ライブラリー選抜および進化
4種類の変異体ウイルスライブラリーを、プールして、成体（6〜8週齢）野生型C57/Bl6Jマウス（いずれかの性別；Charles River）のSNr中または小脳中のいずれかに注射した。注射の3週間後、線条体組織または後脳組織を、それに応じて取り出し、DNAを抽出して、遠隔逆行標的組織に成功裡に到達したビリオンを、PCR増幅し、rcAAVパッケージングプラスミド中に再クローニングして、次のラウンドの選抜のために新たな複製能を有するAAVライブラリーを創出した。3回の選抜工程の後、レスキューされたcap遺伝子を、それぞれ、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして5'-ACG CGG AAG CTT CGA TCA ACT ACG CAG-3'（SEQ ID NO:79）および5'-AGA CCA AAG TTC AAC TGA AAC GAA TTA AAC GG-3'（SEQ ID NO:80）を用いたエラープローンPCRによってランダムに変異導入した。
【００５４】
2回の追加的なインビボ選抜ラウンドを、次いで行った。個々の単離物を、ラウンド4および5の後に配列決定し、ライブラリー濃縮の程度を評定した（表2）。
【００５５】
（表２）ラウンド4および5において単離されたバリアントについてのペプチド挿入配列の収束
2019518793.tif 000004
2019518793.tif 000005
【００５６】
17種類のバリアントを、ラウンド5の終わりに二次スクリーニングのために選び、対応するcap遺伝子配列を、rAAVヘルパープラスミド中に再クローニングした。次いで、CMV-EGFPペイロードを運ぶ、親の野生型AAV2および選んだ17種類の変異体バリアントの各々の個々の高力価プレップを、Vector BioLabs, Inc （Philadelphia, PA）によって行った。CMVプロモーターは、典型的にはニューロンにおいて弱く、したがって、この二次スクリーニングは、逆行輸送の効率の厳密な試験を提供した。個々のAAVバリアントを、小脳中または淡蒼球中のいずれかに注射した。3週間後、内因性の増幅されていないEGFP蛍光が、逆行輸送が効率的であった場合に標識されると期待される領域において可視化された。変異体5R-Hind6（SEQ ID NO:44をコードするSEQ ID NO:43）は、両方の回路において最強の逆行輸送を提示し、したがって、さらなる解析のために選び、rAAV2-retroと名付けた。
【００５７】
実施例5‐ヘパリン結合アッセイ
AAV2-retroおよび野生型AAV2のヘパリン親和性を、以前に記載されているように解析した（Jang et al., 2011, Mol. Ther., 19:667-75）。簡潔に言うと、およそ1011個の精製されたゲノム粒子を、150 mM NaClおよびpH 7.5の50 mM Trisで事前に平衡化した1 mL HiTrapヘパリンカラム（GE Healthcare Sciences, Piscataway, NJ）上にロードした。次いで、950 mMの最終濃度まで50 mMのステップでNaClの濃度を増大させることによって溶出を行い、その後、1M NaClでの洗浄を行った。各溶出液の小さな画分を用いて、HEK293T細胞に感染させ、GFP陽性細胞のパーセンテージを、Guava EasyCyte 6HTフローサイトメーター（EMD/Millipore）を用いて感染の48時間後に定量した。
【００５８】
実施例6‐研究において使用したペイロード
すべてのその後の実験については、CMVプロモーターを、成体ニューロンにおいてより確実であることが公知のプロモーターで置き換えた。CreリコンビナーゼおよびGCaMP6fカルシウムセンサーを、ヒトシナプシン-1（hSyn1）プロモーターによって駆動させた。蛍光体のすべては、CAGプロモーターによって駆動させ、カラーフリッピング構築物は、EF1-αプロモーターによって駆動させた。
【００５９】
実施例7‐逆行効率の定量のためのウイルス産生
hSyn-Creペイロードを、Janelia Viral Shared Resourceで、AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、DJ、およびAAV2-retroのキャプシドを用いてパッケージングした。7種類のウイルス調製物すべてを、並行して加工処理し、インビボ注射の前に力価を合わせた。すべてのロットを、測定される最低の力価（1.3E12 GC/ml）に希釈し、各ウイルスを、3匹の成体Rosa26Lox-STOP-LoxH2B-GFPマウス（He et al., 2012, Neuron, 73:35-48）の右の橋核中に注射した。
【００６０】
実施例8‐組織学
動物を、ウイルス注射の3週間後に屠殺し、その時点で脳を収集して、右半球を、50μmの厚さで矢状切片にした。切片を、DAPIを含有するVECTASHIELD Antifade Mounting Medium（Vector Laboratories）中でマウントして、20×対物レンズならびにFITCフィルターおよびDAPIフィルターを使用し、P-E Pannoramicスライドスキャナー（3D Histech）を用いて画像化した。
【００６１】
実施例9‐逆行輸送定量
Pannoramicスライドスキャナーで取得された画像を継ぎ合わせ、次いで、Matlab（Mathworks）言語で書かれた特注ソフトウェアを用いて解析して、GFPで標識された核を皮質にわたって検出した。関心領域（ROI）を皮質の周りに手動で描いて、自動化細胞計数のための画像中の区域を区別した。核の検出を強化するために、画像を次いで、2つのガウス分布（26.00μm分散および3.25μm分散）の差を含む「メキシカンハット」カーネルでコンボリューションした。画像ノイズを、中央値フィルターを用いて低減させ、次いで、基本的ピーク検出を行った。
【００６２】
実施例10‐逆行輸送の一般性の解析
Rosa26-LSL-H2B-GFPマウスに、25 nlのrAAV2-retro hSyn1-Creを、背側線条体に注射した。注射の3週間後に、冠状切片化した脳を、Pannoramicスキャナーを用いて画像化して、DAPI染色核、およびH2B-GFP発現核由来の緑色蛍光を可視化した。緑色チャンネルを、2つのガウス分布の差でコンボリューションし、次いで、ピークを、Matlabで書かれた特注関数を用いて、これらの閾値画像上の局所最大値として検出した。各切片の青色チャンネルを、Matlab Image Processing Toolboxの助けで書かれた特注解析ルーチンを用いて、Allen Brain Instituteの標準化マウス脳地図由来のニッスル画像に対して整列させた。次いで、ABIのマウス脳地図由来の注釈がついた領域を用いて、整列させた切片において検出されたニューロンを特定の脳領域に割り当てた。
【００６３】
個々の脳の解剖学的差異と共に参照地図の有限の精度が、顕著な求心性神経入力に対するこの半自動化プロセスの確実性を限定することが、注目された。
【００６４】
実施例11‐GCaMP6fの逆行送達後のインビボのニューロン集団活性の画像化
7匹の成体マウスに、イソフルラン（2％）で麻酔をかけ、37℃加熱パッド上で定位フレーム（Kopf Instruments; Tujunga, CA）に置いた。頭蓋骨の上の頭皮および骨膜を取り去り、UV硬化OptiBond接着剤（Kerr; Orange, CA）の層を適用し、特注で作製したヘッドポスト（headpost）（Osborne and Dudman, 2014, PLoS One, 9(2):e89007）を、歯科用セメントで取り付けた。hSynGCaMP6fペイロードを運ぶAAV2-retroを、Nanoliter 2010インジェクター（WPI）を用いて、BPN中に注射した（ブレグマに対して3.9 mm後方かつ0.4 mm外側、5.8、5.6、および5.4 mmの深さ、各々の深さで100 nl）。頭蓋窓（cranial window）（レーザーカットガラスの、1枚の170μmの厚さの窓ガラス、直径2 mm）を、一次運動皮質の上に置いた（ブレグマに対して0.7 mm前方かつ1.6 mm外側を中心とする）。
【００６５】
手術後に、ケトプロフェン（5 mg/kg）およびブプレノルフィン（0.1 mg/kg；Henry Schein Animal Health; Melville, NY）の注射を、皮下投与した。マウスを、手術後1週間回復させ、次いで、ウイルス発現を評価するために二光子顕微鏡下で短時間、画像化した。すべての動物は、注射の1週間後、M1の層Vに、視覚的に特定されたGCaMP6f発現細胞を有していた。次いで、動物を、以前に記載されているように、特注で作った装置における頭部固定に慣らし、食物ペレットを取り出すように訓練した（Guo et al., 2014, Nat. Med., 20:130-8）。
【００６６】
GCaMP6fを、Ti:Sapphireレーザー（Chameleon, Coherent）で、920 nm（典型的には背面開口部で20〜40 mW）で励起し、Nikon 16x, 0.8-N.A.対物レンズを通して画像化した。放出光は、565 DCXR二色性フィルター（Chroma Technology）およびET525/70m-2pフィルター（Chroma Technology）を通過し、GaAsP光電子倍増管（10770PB-40, Hamamatsu）によって検出された。画像（512×512ピクセル）を、ScanImageソフトウェアを用いた共鳴スキャナーで、約30 Hzで獲得した。
【００６７】
実施例12‐CRISPR/Cas9ゲノム編集
pAAV-CMV-SaCas9-empty（Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8）中のCMVプロモーターを、hSyn1で置き換えて、pAAV-hSyn1-SaCas9-emptyを生成した。sgRNAプロトスペーサー配列をコードするオリゴヌクレオチドを、特別注文し、リン酸化し、ハイブリダイズさせ、pAAV-hSyn1-SaCas9-emtpyのBsaI制限部位中にライゲーションして、pAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1〜-10を生成した。使用したオリゴヌクレオチド配列は、以下であった。
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【００６８】
ゲノム編集を指示する各オリゴの能力を、最初に、インビトロで評定した。Neuro2A細胞に、800 ngのpAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1〜-10、100 ngのpAAV-FLEX-CAGtdTomato、および100 ngのpAAV-CAG-EGFPを、ポリエチレンイミンを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション後72時間で、細胞を収集して、約70,000個のEGFP陽性Neuro2A細胞を、BD Influx Sorter（BD Biosciences）を用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）によって単離した。次いで、ゲノムDNAを抽出し、tdTomato遺伝子修飾の頻度を、以前に記載されているように、Surveyorヌクレアーゼアッセイ（Integrated DNA Technologies）によって評定した（Cong et al., 2013, Science, 339:819-23）。tdTomato配列内の2つの切断事象を指示するように見られた2種類のうちの1種類であるsgRNA 7を、retro-AAV2中にパッケージングして、インビボゲノム編集に使用した。
【００６９】
次いで、約100 nl（5×1013ベクターゲノム(vg)/ml）のAAV2-retro-hSyn1-SaCas9-tdTomatoまたはAAV2retro-hSyn1-SaCas9-emptyを、上記のようにRbp4-Cre×tdTomatoマウスのBPN中に注射した。注射の6週間後に、脳を収集して、40μmの厚さの冠状切片を切り出し、HAタグ付加Cas9に対して（Cell Signaling由来の抗HA抗体C29F4、1:1600希釈；二次抗体：ロバ抗マウスAlexa Fluor 488（1:250；Jackson ImmunoResearch））、およびNeuNニューロンマーカーに対して（Millipore由来の抗NeuN抗体A60、1:250希釈；二次抗体：ロバ抗ウサギAlexa Fluor 647（1:500；ThermoFisher, A-31573））染色した。抗体染色の後、切片を、DAPIを含有するVECTASHIELD Antifade Mounting Medium（Vector Laboratories）でスライド上にマウントし、Zeiss Axio Observer A1倒立顕微鏡（Zeiss）を用いて可視化した。免疫染色の定量は、ImageJ解析ソフトウェア（NIH）を用いて行った。
【００７０】
実施例13‐rAAV2-retroの定方向進化
逆行輸送が強化された新規rAAVを操作で作るために、マウス脳においてウイルス注射の部位まで長距離の投射を送るニューロンの細胞体に効率的に輸送されたrAAVキャプシドバリアントについて濃縮される、インビボ定方向進化アプローチを設計した（図1A）。所望の特性を有するバリアントを回収する可能性を最大にするために、以前に記載されているrAAV capバリアントのライブラリー（Koerber et al., 2008, Mol. Ther., 16:1703-9；Koerber et al., 2009, Mol. Ther., 17:2088-95；Koerber et al., 2006, Nat. Protocols, 1:701-6；Muller et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:1040-6）の多様な混合物を、出発材料として使用した。ウイルス粒子を、各バリアントキャプシドを、対応するcap遺伝子を含有するAAVゲノムに連結するようにパッケージングし、最終的なキャプシドバリアントのプールは、点変異体、AAV2がその共受容体であるヘパラン硫酸を結合するために利用する領域中にランダムな7マーペプチドの挿入を有するバリアント、および、7種類の親セロタイプ由来のキャプシド遺伝子配列のランダムキメラを含んでいた（図1A）。広い逆行向性を有するバリアントを特定するために、2種類の独立した投射ニューロンの集団：黒質網様部（SNr）に投射する線条体GABA作動性ニューロン、および小脳皮質に投射するグルタミン酸作動性後脳ニューロンを標的とした。全プールのrAAVバリアントのSNrまたは小脳中への注射（1匹の動物あたり1回の注射）の3週間後、線条体組織または後脳組織をそれぞれ取り出し、cap配列をPCRによって回収し、ウイルスを再パッケージングした（図1B）。2回のさらなる選抜工程の後、エラープローンPCRを行って、ライブラリーをさらに多様化し、その後、2回の最終的なインビボ選抜工程を行った。
【００７１】
30種類のcapバリアントを、第4ラウンドの進化後に配列決定すると、大多数は、挿入ライブラリーに由来しており、野生型AAV2 VP1キャプシド遺伝子のN587とR588との間に外因性7マーペプチドを含有していた。興味深いことに、回収された挿入物のすべては、
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または
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（配列中、太字で斜体の残基は、挿入物由来である）の形態であり；配列中の他の場所の変異もまた、濃縮されていた（表2）。さらに22クローンを、第5ラウンドの進化後に配列決定すると、この追加的な進化のラウンドで、すべての配列は、
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挿入物を有するAAV2変異体であり（表2）、さらなる収束の著しい程度が実証された。そのような収束により、ヘパリン結合ループ中への特異的なペプチド挿入が、他の部位からの潜在的な二次的寄与を伴って、逆行機能性を大きく担っていたことが示唆された。
【００７２】
キャプシド配列においてペプチド挿入および点変異の様々な組み合わせを保有する17種類の単離されたバリアントに対する二次スクリーニングを、次に検討した。高レベルの厳密性を適用するために、選んだバリアントを、典型的にはニューロンにおいて弱いCMVプロモーターによって駆動される、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）導入遺伝子と共にパッケージングした。各キャプシドバリアントについて、鍵となる求心性神経領域において細胞体に十分なペイロードを送達して、注射の3週間後に非抗体増幅EGFPシグナルの検出を可能にする、その能力を評定した。この二次スクリーニングにおいて2種類の独立した回路（皮質から淡蒼球、および下オリーブ／基底橋核から小脳）中で最強の逆行輸送を提示したクローン
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を、さらなる解析のために選び、rAAV2-retroと名付けた。げっ歯類インビボ研究においてより一般的に使用される2種類の追加的なプロモーターを評価した場合に（CAG‐図1B、またはヒトシナプシン-1、データは示されていない）、著しい逆行標識効率が、マウスおよびラットにおいてある範囲の様々な回路中で、このrAAVバリアントで観察された（図1Bおよび図7）。7マー挿入物の他の回収された配列のうちの1つへのスワッピング、またはスクリーニングにおいて特定された追加的な点変異の付加は、逆行輸送におけるさらなる増大をもたらさなかった。
【００７３】
実施例14‐投射ニューロンに対する効率的な逆行アクセス
下行性運動路内で、皮質橋路は、著しく収束性であり、基底橋核（BPN）に対する求心性神経の95％よりも多くに寄与することが公知である。この経路は、したがって、投射ニューロンの軸索終末によるウイルスの取り込みおよび逆行輸送の効率を定量するための、特に有利なシステムに相当する。実際に、BPN中へのrAAV2-retroの注射により、層Vニューロンの高密度の標識が結果としてもたらされ（図2A）、これは過去のトレース研究と整合性があった（Legg et al., 1989, J. Comp. Neurol., 286(4):427-41）。
【００７４】
次に、rAAV2-retro対いくつかの一般的に使用されるAAVセロタイプについての皮質橋回路における逆行輸送の効力を、同一の感染条件およびプロセシング条件の下で比較した（図2B〜D）。定量精度を保証するため、および導入遺伝子発現レベルにおける細胞間の変動性という可能性がある困惑を消去するために、AAVを用いて、Rosa26-Lox-STOP-Lox-H2B-GFPトランスジェニックマウス（He et al., 2012, Neuron, 73:35-48）においてCreリコンビナーゼを送達した。低濃度のCre酵素でさえも、そのようなCre依存性カセットの発現をオンにするのに十分であること、および、ヒストン融合レポーターの厳密な核局在化により、神経網シグナルを困惑させることなく感染した細胞の明白な特定ができることが示されている。
【００７５】
半自動化解析手順を用いて、BPNにおける局所ウイルス注射の3週間後に収集したマウス脳由来の画像化矢状切片において、感染した皮質投射ニューロンの線密度を計算した（図2C）。rAAV2が感染した動物について、最小の皮質GFP発現が観察された（線密度0.98±0.20ニューロン/mm、平均±標準誤差、n＝5；図2B、中央のパネル）。対照的に、および初期の観察（図2A）と一致して、GFP陽性層V投射ニューロンの高密度の層を、rAAV2-retro注射動物における皮質の体軸を通して観察することができた（線密度130.11±11.08ニューロン/mm、n＝4；図2B、下のパネル）。他の一般的に用いられるAAVセロタイプのいずれも、またイヌアデノウイルス-2も、操作で作られたrAAV2-retroバリアントの逆行効率に見合わなかった（線密度AAV1：0.05±0.04、AAV2：0.98±0.2、AAV5：2.38±1.24、AAV8：1.43±1.43、AAV9：1.98±0.86、DJ：24.82±14.32、CAV-2：5.56±4.13、各々n＝3〜5；図2D、図8）。さらに、rAAV2-retroによって標識された皮質投射ニューロンの密度は、確実な合成逆行トレーサーであるFluoro-Gold（Schmued and Fallon, 1986, Brain Res., 377:147-54）で達成されるものに匹敵していた（線密度81.03±11.08ニューロン/mm、n＝3）。したがって、rAAV2-retroは、皮質橋投射ニューロンに対する逆行アクセスにおいて、既存のセロタイプを最大で2桁上回る強化を呈し、合成逆行トレーサーの効率と肩を並べる。
【００７６】
実施例15‐逆行機能性の一般性
rAAV2-retroの逆行機能性が他の回路まで及ぶかどうかを、具体的には、それが、様々な皮質領領域および皮質下領領域から長距離の入力を受け取る基底核の一部である、背内側線条体（DMS）への種々の求心性神経を標識した程度を特徴決定することによって、次に検討した。DMS中、すなわち皮質、視床、および扁桃体中への最強の求心性神経入力に対するrAAV2-retro媒介性逆行アクセスの効力は、逆行トレースのために古典的に用いられる蛍光ビーズのものに匹敵していたことが見出された（図3A）。DMSへの有意な長距離入力を提供することが公知のすべての脳領域において、逆行的に標識されたニューロンの数についての不偏推定値を提供するために、注釈がついたAllen Brain Atlasに対して切片を整列させることによって、マウス脳の画像化切片における任意の検出された蛍光標識を特異的な脳領域に割り当てるアルゴリズムを開発した（図3B〜C）。定量解析（図3C）により、強い逆行標識が、線条体まで顕著な投射を送ることが以前に報告されている領域の非常に大部分において見出されたことが明らかになった（Pan et al., 2010, Front Neuroanat., 4:147）。1つの注目に値する例外において、少なめの標識のみが、それがDMSへの強いドーパミン作動性入力の供給源であるにもかかわらず、黒質緻密部において観察された（図3C、SNcについての細胞数での矢印）。投射ニューロンクラスの小さなサブセットが、試験した他の回路のいくつかにおいて、rAAV2-retroによる逆行アクセスに対して同様に不応性であることが見出された（表3；試験したすべての他のAAVセロタイプもまた、これらの投射路を標識できなかったことに注目されたい）。これらの例外にもかかわらず、rAAV2-retroは、中枢神経系内で広く適用可能である。
【００７７】
（表３）種々の回路におけるrAAV2-retroの効率。皮質視床投射および皮質丘（cortico-collicular）投射における逆行輸送の欠如ではなく低い効率が、投射ニューロン細胞体へのCre依存性ペイロードの局所送達後の投射ニューロンの効率的な標識によって示唆される。
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【００７８】
実施例16‐遺伝学的に定義されるニューロン集団に対する逆行アクセス
rAAV2-retroの逆行機能性を、Creトランスジェニック系統の特異性と組み合わせて、特異的なクラスの投射ニューロンの調査を可能にできるかどうかもまた、判定した。具体的には、rAAV2-retroおよびCreトランスジェニック系統を組み合わせて、2つの脳領域間に平行に走る2つの機能的に別個の長距離接続を分離することができるかどうかを判定するために、実験を行った。大脳皮質から線条体への投射は、主として、層V中のニューロンから生じるが、層IIおよびIII中のいくつかのニューロンもまた、線条体入力を提供する。異なる皮質層からの線条体への入力は、別々の経路を構成し、層V中のニューロンは、線条体のパッチ区画に投射し、層IIおよびIII中のニューロンは、マトリックスに投射する。パッチ区画およびマトリクス微小区画の互いにかみ合った性質により、rAAV2-retroシステム単独で、機能的調査のためにこれらの経路を選択的に標的とすることは難しくなる。そのため、rAAV2-retroを、すべての層VニューロンにおいてCreリコンビナーゼを発現する（Gerfen et al., 2013, Neuron, 80:1368-83）が、層IIおよびIII中のニューロンにおいては発現しないトランスジェニック系統と組み合わせることによって、2種類の入力が分離できるかどうかを探索した（図4A）。
【００７９】
同じ実験において両方の経路を強調するために、Creの非存在下でtdTomatoを発現するが、Cre陽性細胞においてはEGFPの発現を駆動するように反転する、Cre依存性カラーフリッピングペイロードを選んだ（Saunders et al., 2012, Front Neural Circuits, 6:47）。このペイロードを運ぶrAAV2-retroを、層V特異的Creドライバー系統Rbp4_KL100 Cre（Gerfen et al., 2013, Neuron, 80:1368-83）の背内側線条体中に注射した場合、線条体に投射する層VニューロンのみがEGFPを発現した。さらに、層IIおよびIIIの皮質線条体経路は、tdTomatoの発現によって明らかに区別可能であった（図4B）。皮質線条体投射の組織分布的な性質にしたがって、背内側線条体中へのウイルスの高度に局在性の注射は、対応して小さな皮質の切片の標識をもたらした。しかし、層V、ならびに層IIおよびIIIの皮質線条体集団は、常に同時標識され（図4B、下のパネル）、同じ皮質領域由来の2つの経路が、線条体内の隣接するマトリクス区画およびパッチ微小区画を通して横切ることが示唆された。
【００８０】
この実験は、両方の経路を強調したが、「Cre-オン」または「Cre-オフ」のペイロードを選ぶことにより、もう一方の排除で一方への選択的アクセスが可能になるであろう。そのため、この実施例は、高効率の逆行ウイルスを利用可能なCre（またはFlp）ドライバー系統と組み合わせることによって達成できる、回路の取り調べの追加された特異性を強調する。
【００８１】
実施例17‐回路の調査および遺伝子操作のためのrAAV2-retroの使用
回路の調査についてのrAAV2-retroの有用性は、遺伝子によりコードされる指示薬およびエフェクターの高レベルの発現を媒介するその能力に依存することになる。定義されたクラスの投射ニューロンにおいて神経活動をモニタリングする能力が、GCaMP6fのrAAV2-retro媒介性発現を通して最初に評価された（Chen et al., 2013, Nature, 499:295-300）（図5A〜C）。インビボ二光子Ca2+画像化を用いて、樹状突起および体性のCa2+過度応答が、BPNへのウイルス送達の7日後という早期に、一次運動皮質において検出された（図5D）。Ca2+シグナルの時間的プロファイルは、合図されたリーチ課題（reaching task）の構造を反映し、多くの皮質橋ニューロンにおけるシグナルは、「ゴー」合図に密接に連結されていた（図5E〜F）（Li et al., 2015, Nature, 519:51-6）。特定されたニューロンからの繰り返された記録は、発現時間経過における早期にセッション内の試験にわたって（図5E、F）、および感染後2か月を超える間の多くの行動セッションにわたっての両方で可能であった。したがって、rAAV2-retroは、画像化に十分なレベルで投射ニューロンにおいてセンサーを発現する能力を与え、回路計算への特異的な投射の寄与を解読するための多くの新たな機会を創出する。
【００８２】
最後に、rAAV2-retroの有用性を、投射ニューロンへの、CRISPR/Cas9遺伝子編集システムなどのエフェクターの送達について評定した（図6）。具体的には、黄色ブドウ球菌Cas9（SaCas9（Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8））、およびtdTomatoの発現を除去するように設計されたシングルガイドRNAを、rAAV2-retro中にパッケージングした。rAAV2-retro-SaCas9-抗tdTomatoの、皮層V興奮性ニューロンにおいてtdTomatoを発現する動物のBPNへの送達は、SaCas9発現層Vニューロンの88.6±0.7％において、tdTomato発現の抑制を結果としてもたらした（図6B、下のパネル、および図6C、n＝3）。対照的に、非ターゲティングSaCas9の送達は、いかなる識別可能な変化ももたらさず、細胞の4.4±3.2％が、tdTomato発現において潜在的な低減を提示しただけであった（図6B、上のパネル、および図6C、n＝3）。さらに、tdTomato発現は、橋注射を介してアクセスしづらかった層Vニューロンにおいて影響を受けないままであった。rAAV2-retroシステムは、このように、関心対象の特異的な領域に投射するニューロンにおいて選択的に、効率的な遺伝子修飾を可能にする。
【００８３】
集合的に、これらの観察により、神経回路の機能的調査のため、および長い目で見れば、可能性のある治療のために、投射ニューロンに遺伝学的にアクセスする有効な試薬としてのrAAV2-retroが確立される。
【００８４】
実施例18‐考察
組換えアデノ随伴ウイルスは、哺乳動物神経回路の機能的精査を大いに促進することができ、神経系の障害における治療的介入について有望である。定方向進化が、多くの回路において投射ニューロンに対する効率的な逆行アクセスについて追加的な能力を有するAAVキャプシドを授けるために、使用されてきている。新たに操作で作られたrAAV2-retroは、多くの回路において合成逆行トレーサーの効力に見合う、一般的に用いられるAAVセロタイプと比較して最大で2桁の、逆行輸送における強化を与える。逆行アクセスを介してrAAV2-retroで達成される導入遺伝子発現のレベルは、神経回路機能を取り調べるため、およびニューロンゲノムの標的化操作のために十分である。したがって、rAAV2-retroベースのツールは、様々な脳領域を接続する投射ニューロンの選択的モニタリングおよび操作を可能にすることによって、大規模ネットワークがいかに脳機能を可能にするかへの洞察を提供する態勢ができており、かつ、進行性の大規模ネットワーク機能不全を特徴とする疾患における治療的介入について有望である。
【００８５】
rAAV2-retroによってできる、その親セロタイプAAV2と比較して著しく増大した逆行アクセスの効力は、ヘパラン硫酸に対する天然の結合部位の挿入媒介性破壊を通して、および／または挿入されるペプチドを組み込む新たな結合表面の創出を通して可能とされているかもしれない。このバリアントは、低減したヘパリン親和性を有し（図9）、それが、AAV1およびAAV6で観察されているように、シナプス間隙の細胞外マトリクスにおけるウイルス滞留を減少させ、局所ベクター伝播を強化する可能性がある。しかし、他の挿入された7マー配列は、同様にヘパリン結合を破壊するが、逆行輸送に影響を及ぼさないため、結果として生じたウイルス伝播の増加だけでは、逆行輸送の効力を説明することはできない。さらに、AAV5およびAAV9は、ヘパリンに結合しないが、まだそれらの逆行輸送効率は、AAV2のものに類似している。代替的な説明を支持して、元の選抜において選抜されたペプチド挿入物
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は、保存されたモチーフの記載において単純に異なる、同じ全体的な組成を共有している。操作で作られたペプチド挿入物は、AAV経路における既存の細胞補因子（例えば、最近特定された共通AAV受容体）に対する結合の強化を支持し得るか、または、細胞機構、すなわち、細胞表面受容体および／または小胞輸送もしくは核侵入経路の構成要素との新規の相互作用を創出し得る。
【００８６】
rAAV2-retroが既存のセロタイプを上回って与える、逆行輸送における複数桁分の改善にもかかわらず、小さなセットの投射ニューロンのクラスが、この新たに進化したrAAVバリアントによる効率的な逆行感染に対して不応性であるように見られる（表3）。しかし、他のAAVセロタイプが同様にこれらの投射路を標識できないことが、注目されるべきである。これらのニューロンにおけるこの新規AAVバリアントと結び付く重大な細胞因子の発現レベルが、まさに極めて低いかどうか、すなわち、例として、rAAV2-retroが、依然として十分なCreリコンビナーゼを細胞体に送達し、局所的に送達されたCre依存性ペイロードについて高レベルの発現を指示することができたという観察による、皮質視床投射および皮質丘投射について支持された結論（表3、強調された侵入）、または、因子がすっかり欠損しているかどうかが、各々の例においてまだ決定されていない。このバリアントまたは他のバリアントに対する追加的な将来のキャプシド修飾は、これらのニューロンクラスの逆行形質導入の強化を可能にすることができるであろう。
【００８７】
個々のクラスの投射ニューロンに対するアクセスを得ることが、局所回路動力学および大規模ネットワーク機能がいかに協調しているかを解明する上で重大な可能にする工程であろうため、rAAV2-retroベクター系は、神経回路機能を精査するための遺伝学的ツールキットに対する重要な追加を提供する。局所回路計算は、次第に、特定の局所回路モジュール内の全ニューロン集団の動力学に依存すると考えられている。これらの動力学が、様々なクラスの投射ニューロン上にいかにマッピングするか、およびしたがって、何の情報が、様々な下流標的まで伝えられるかは、大部分の回路について未解決のままである。rAAV2-retroベースのベクターは、単独でまたは特異的なCreトランスジェニック系統との組み合わせで、投射ニューロンの特異的な集団に対する遺伝学的アクセスを可能にする。次に、狂犬病G糖タンパク質を運ぶrAAV2-retroを用いて、特定のクラスの投射ニューロンに影響を与えるシナプス前部マイクロ回路に対するアクセスのために、新たに開発された非毒性条件付き狂犬病ベクターをトランス補完することができる。結果として生じる、個々の投射ニューロンクラスおよびそれらの局所マイクロ回路の活動を選択的にモニタリングし、操作する能力は、投射ニューロンが、そのそれぞれの大規模ネットワークのために局所回路動力学をいかに翻訳するかへの洞察を提供するはずである。
【００８８】
rAAV2-retroはまた、いくつかの可能な応用を伴い、治療的介入について有望である。例えば、アルツハイマー病またはリソソーム蓄積症などの、病変が大量の神経組織に影響する状況において、複数回の注射は、安全性リスクの原因となり、必要とされるレベルの形質導入を達成するには不十分であり得る。しかし、戦略的な位置における少数の注射は、大量（例えば、BPNにおける収束の点からの皮質橋路）、またはアクセスが難しい組織（例えば、筋肉からの脊髄運動ニューロン）にわたってベクター分散を可能にすることができる。さらに、大規模機能的ネットワークは、多くの神経変性障害の、それらの空間的に局在化した発症からの広がりに関係している。顕著な出現しつつある考えは、脆弱なニューロン集団における正常でないタンパク質アセンブリーの沈着が、大規模機能的ネットワーク内の異常なニューロン活動の病理学的カスケード、およびその崩壊を誘発し、究極的に神経学的機能の不全をもたらすことを断定する。興味深いことに、多くの神経変性疾患を有する患者が、多くの場合に劇的改善の期間を提示するため、影響を受けた神経ネットワークは、疾患における早期に、異常な動力学を一過的に克服することができるように見られる。したがって、病変の皮質起源からの凝集物の広がりを減速させることを目標にした早期の介入は、認知機能を安定させ、またはさらに回復するのに十分であり得る。この観点から、病理学的タンパク質凝集物が最初に現れる中間皮質領域における皮質下に投射するニューロンは、アルツハイマー障害およびパーキンソン障害の両方において、魅力的な介入標的を構成する。例として、さらなる凝集をシスで停止することができる変異を導入するように、または凝集物を隠すことができるシャペロンを送達するように設計されたrAAV2retroベースのツールでそれらの投射ニューロンにアクセスすることは、最も衰弱性の認知症状の進行を減速させる潜在性を有する。非ヒト霊長類におけるrAAV2-retro試薬の効率および長期安全性の評定は、これらのおよび他の遺伝子治療アプローチについて最終的な考慮への道を開くことになる。
【００８９】
問題の方法および組成物を、数多くの様々な局面と共に本明細書において説明してきたが、種々の局面の前述の説明は、問題の方法および組成物を例証するように意図され、その範囲を限定するようには意図されない。他の局面、利点、および修飾が、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【００９０】
開示される方法および組成のために使用することができる、それと共に使用することができる、その調製において使用することができる、またはその産物である、方法および組成物が開示される。これらのおよび他の材料が、本明細書において開示され、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法の各々の種々の個々、ならびに集合的な組み合わせおよび順列に対する具体的な言及は、明示的には開示されないかもしれないが、各々は、本明細書において具体的に企図され、説明される。例えば、問題の特定の組成物または特定の方法が開示されて考察され、かつ、数多くの組成物または方法が考察される場合、組成物および方法の各々のおよびあらゆる組み合わせおよび順列は、反対のように具体的に示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に企図され、開示される。
【図１Ａ】
2019518793.tif 000017
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2019518793.tif 000023
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2019518793.tif 000040
【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
別の方法で定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、関係する方法および組成物が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、問題の方法および組成物の実行または試験において用いることができるが、適している方法および材料を、以下に記載する。加えて、材料、方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。本明細書において述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により組み入れられる。
[本発明1001]
xxDxTKx（SEQ ID NO:1）およびxDxTKxx（SEQ ID NO:2）からなる群より選択される配列を含む、ウイルスキャプシドタンパク質。
[本発明1002]
SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、本発明1001のウイルスキャプシドタンパク質。
[本発明1003]
SEQ ID NO: 4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、および78からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、本発明1001のウイルスキャプシドタンパク質。
[本発明1004]
SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸によってコードされる、本発明1001のウイルスキャプシドタンパク質。
[本発明1005]
SEQ ID NO: 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、および77の配列番号からなる群より選択される配列を有する核酸によってコードされる、本発明1001のウイルスキャプシドタンパク質。
[本発明1006]
本発明1001〜1005のいずれかのウイルスキャプシドタンパク質を含む、ウイルス粒子。
[本発明1007]
逆行移動に対する優先性を呈する、本発明1006のウイルス粒子。
[本発明1008]
逆行輸送能力を保有する、本発明1006のウイルス粒子。
[本発明1009]
ペイロードをコードする核酸をさらに含む、本発明1006〜1008のいずれかのウイルス粒子。
[本発明1010]
ペイロードをコードする核酸が、該ペイロードをコードするコード配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む、本発明1009のウイルス粒子。
[本発明1011]
プロモーターが、シナプシン-1、CMV、GFAP、CAG、CaMKII、MBP、EF1α、TRE、およびmDlxからなる群より選択される、本発明1010のウイルス粒子。
[本発明1012]
ペイロードをコードするコード配列が、タンパク質コード遺伝子および阻害性RNA核酸からなる群より選択される、本発明1010または1011のウイルス粒子。
[本発明1013]
阻害性RNA核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはRNAiである、本発明1012のウイルス粒子。
[本発明1014]
ペイロードがエフェクタータンパク質である、本発明1009のウイルス粒子。
[本発明1015]
エフェクタータンパク質が、リコンビナーゼ（例えば、CreまたはFlp）、遺伝子編集システム（例えば、CRISPR/Cas9、TALEN、Znフィンガーヌクレアーゼ）、光遺伝学的試薬（アクチベーター（例えば、チャネルロドプシンもしくはそのバリアント）またはインヒビター（例えば、ハロロドプシンもしくはArch））、化学遺伝学的試薬（例えば、DREADDまたはPSAM/PSEMシステムのアクチベーター／インヒビターバージョン）、細胞系経路のアクチベーターおよび／またはインヒビター、ならびにエピジェネティクスの制御のための酵素からなる群より選択される、本発明1014のウイルス粒子。
[本発明1016]
ペイロードが光学的レポーター構築物である、本発明1009のウイルス粒子。
[本発明1017]
光学的レポーター構築物が、GCaMP6（s、m、またはf）、蛍光体（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度GFP（EGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、tdTomato）、カラーフリッピング構築物（例えば、1つの細胞集団において1つのレポーターを発現し、別の集団において異なるレポーターを発現するペイロード）、グルコースセンサー、jRCaMP、jRGECO、およびCaMPARI、電位指示薬、二次メッセンジャー、受容体シグナル物質、転写レポーター、エピジェネティックレポーター、ならびに神経調節物質レポーターからなる群より選択される、本発明1016のウイルス粒子。
[本発明1018]
ペイロードがウイルスタンパク質である、本発明1009のウイルス粒子。
[本発明1019]
ウイルスタンパク質が狂犬病Gタンパク質である、本発明1018のウイルス粒子。
[本発明1020]
ウイルスタンパク質が、AAV以外のウイルスの機能を補完するタンパク質であるか、または細胞輸送および経細胞輸送に関連するタンパク質である、本発明1018のウイルス粒子。
[本発明1021]
ペイロードをコードするコード配列が治療用遺伝子である、本発明1009のウイルス粒子。
[本発明1022]
治療用遺伝子が、神経変性障害の処置のためである、本発明1021のウイルス粒子。
[本発明1023]
治療用遺伝子が、アルツハイマー病、または毒性タンパク質凝集物を有する他の疾患の処置のための、HSP104である、本発明1022のウイルス粒子。
[本発明1024]
治療用遺伝子が、フリードライヒ運動失調症の処置のためのフラタキシンである、本発明1022のウイルス粒子。
[本発明1025]
治療用遺伝子が、パーキンソン病の処置のためのリソソームグルコセレブロシダーゼ（GBA）である、本発明1022のウイルス粒子。
[本発明1026]
治療用遺伝子が、ハンチントン病の処置のためのポリQ結合タンパク質である、本発明1022のウイルス粒子。
[本発明1027]
治療用遺伝子が、脊髄性筋委縮症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、自閉症、認知症、末梢神経障害、統合失調症、または網膜変性症の処置のための生存運動ニューロン1である、本発明1022のウイルス粒子。
[本発明1028]
ペイロードが治療用部分である、本発明1009のウイルス粒子。
[本発明1029]
前記治療用部分が抗体またはその断片である、本発明1028のウイルス粒子。
[本発明1030]
前記治療用部分が免疫調節タンパク質である、本発明1028のウイルス粒子。
[本発明1031]
前記治療用部分がRNA干渉分子である、本発明1028のウイルス粒子。
[本発明1032]
イヌアデノウイルス-2（CAV-2）よりも最大で2桁大きい、皮質橋（cortico-pontine）投射ニューロンに対する逆行アクセスを呈する、本発明1006〜1028のいずれかのウイルス粒子。
[本発明1033]
皮質橋投射ニューロンまたは背内側線条体（DMS）への求心性神経に対する逆行アクセスが、合成トレーサーのFluoro-Gold蛍光ビーズに匹敵する、本発明1006〜1028のいずれかのウイルス粒子。
[本発明1034]
1個または複数個のニューロンを、パッケージングされたペイロードを含むバリアントアデノ随伴ウイルス（AAV）と接触させる工程であって、該バリアントAAVが、xxDxTKx（SEQ ID NO:1）およびxDxTKxx（SEQ ID NO:2）からなる群より選択される配列を含むキャプシドタンパク質を含む、工程
を含む、ペイロードを1個または複数個のニューロンに送達する方法。
[本発明1035]
バリアントAAVが、ニューロンにおいて逆行移動を呈する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記ニューロンが投射ニューロンである、本発明1034の方法。
[本発明1037]
前記ニューロンが対象中にある、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記ニューロンが、対象中の中枢神経系（CNS）中にある、本発明1034〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記対象がヒトである、本発明1034〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記対象が非ヒトである、本発明1034〜1038のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記非ヒト対象が、霊長類、げっ歯類、爬虫類、および鳥類である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記接触させる工程が、細胞培養物中で行われる、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記接触させる工程が、頭蓋内注射、脊髄内注射、または筋肉内注射を介してインビボで行われる、本発明1034〜1041のいずれかの方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
実施例12‐CRISPR/Cas9ゲノム編集
pAAV-CMV-SaCas9-empty（Slaymaker et al., 2016, Science, 351:84-8）中のCMVプロモーターを、hSyn1で置き換えて、pAAV-hSyn1-SaCas9-emptyを生成した。sgRNAプロトスペーサー配列をコードするオリゴヌクレオチドを、特別注文し、リン酸化し、ハイブリダイズさせ、pAAV-hSyn1-SaCas9-emtpyのBsaI制限部位中にライゲーションして、pAAV-hSyn1-SaCas9-tdTomato-1〜-10を生成した。使用したオリゴヌクレオチド配列は、以下であった。
2019518793.tif 000043
2019518793.tif 000044
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
30種類のcapバリアントを、第4ラウンドの進化後に配列決定すると、大多数は、挿入ライブラリーに由来しており、野生型AAV2 VP1キャプシド遺伝子のN587とR588との間に外因性7マーペプチドを含有していた。興味深いことに、回収された挿入物のすべては、
2019518793.tif 000045
または
2019518793.tif 000046
（配列中、太字で斜体の残基は、挿入物由来である）の形態であり；配列中の他の場所の変異もまた、濃縮されていた（表2）。さらに22クローンを、第5ラウンドの進化後に配列決定すると、この追加的な進化のラウンドで、すべての配列は、
2019518793.tif 000047
挿入物を有するAAV2変異体であり（表2）、さらなる収束の著しい程度が実証された。そのような収束により、ヘパリン結合ループ中への特異的なペプチド挿入が、他の部位からの潜在的な二次的寄与を伴って、逆行機能性を大きく担っていたことが示唆された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
rAAV2-retroによってできる、その親セロタイプAAV2と比較して著しく増大した逆行アクセスの効力は、ヘパラン硫酸に対する天然の結合部位の挿入媒介性破壊を通して、および／または挿入されるペプチドを組み込む新たな結合表面の創出を通して可能とされているかもしれない。このバリアントは、低減したヘパリン親和性を有し（図9）、それが、AAV1およびAAV6で観察されているように、シナプス間隙の細胞外マトリクスにおけるウイルス滞留を減少させ、局所ベクター伝播を強化する可能性がある。しかし、他の挿入された7マー配列は、同様にヘパリン結合を破壊するが、逆行輸送に影響を及ぼさないため、結果として生じたウイルス伝播の増加だけでは、逆行輸送の効力を説明することはできない。さらに、AAV5およびAAV9は、ヘパリンに結合しないが、まだそれらの逆行輸送効率は、AAV2のものに類似している。代替的な説明を支持して、元の選抜において選抜されたペプチド挿入物
2019518793.tif 000048
は、保存されたモチーフの記載において単純に異なる、同じ全体的な組成を共有している。操作で作られたペプチド挿入物は、AAV経路における既存の細胞補因子（例えば、最近特定された共通AAV受容体）に対する結合の強化を支持し得るか、または、細胞機構、すなわち、細胞表面受容体および／または小胞輸送もしくは核侵入経路の構成要素との新規の相互作用を創出し得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019518793000001.app
【国際調査報告】
2019518793.tif 000049
2019518793.tif 000050
2019518793.tif 000051
2019518793.tif 000052