(57)【要約】治療剤の制御送達に有用な組成物、ならびにそれらの調製および使用方法が提供される。組成物は、任意選択で酸化されたポーラスシリコンコア、ケイ酸金属塩を含む、ポーラスシリコンコアの表面上の層、および治療剤を含む。組成物は、粒子が、処置される被験体における目的の細胞または組織にターゲティングし、これに侵入することを可能にする１つまたは複数のターゲティング薬剤および／または細胞透過性薬剤を任意選択でさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポーラスシリコンコアを含む粒子；
ケイ酸金属塩を含む、前記ポーラスシリコンコアの表面上の層；および
治療剤
を含む、治療剤を送達するための組成物。
【請求項２】
前記粒子の表面上の前記層が、ポーラスシリコン前駆体粒子を前記治療剤および金属塩を含む水溶液で処理することにより形成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記水溶液が少なくとも０．１モル濃度の濃度の金属塩を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記粒子の表面上の前記層がケイ酸二価金属塩を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記粒子の表面上の前記層がケイ酸カルシウムを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポーラスシリコンコアが約１ｎｍ〜約１ｃｍの直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポーラスシリコンコアの表面上の前記層が、前記コアの前記直径の１〜９０パーセントの間の厚さを有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記粒子がフォトルミネセント粒子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記粒子が５００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で発光する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ポーラスシリコンコアが、エッチングされた結晶シリコン物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポーラスシリコンコアが、電気化学的にエッチングされた結晶シリコン物質を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポーラスシリコンコアが、化学的ステインエッチングされた結晶シリコン物質を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポーラスシリコンコアが、エッチングされたマイクロポーラスシリコン物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記エッチングされたマイクロポーラスシリコン物質が、平均ポア直径最大約１ｎｍの複数のポアを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポーラスシリコンコアが、エッチングされたメソポーラスシリコン物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記エッチングされたメソポーラスシリコン物質が、平均ポア直径約１ｎｍ〜約５０ｎｍの複数のポアを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポーラスシリコンコアが、エッチングされたマクロポーラスシリコン物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記エッチングされたマクロポーラスシリコン物質が、平均ポア直径約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの複数のポアを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記治療剤が、低分子薬剤、ビタミン、造影剤、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アプタマー、またはその混合物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記治療剤が負に荷電した治療剤である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記治療剤がオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記粒子がターゲティング薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ターゲティング薬剤がニューロンターゲティング薬剤である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記粒子が細胞透過性薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記細胞透過性薬剤が脂質化ペプチドである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記粒子がターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポーラスシリコンコアが酸化ポーラスシリコン物質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記酸化ポーラスシリコン物質が１５０℃を超える温度で酸化されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記酸化ポーラスシリコン物質が空気中で酸化されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記酸化ポーラスシリコン物質が、化学酸化剤を用いる反応により溶液中で酸化されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
前記化学酸化剤が、水、ボレート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジメチルスルホキシド、またはナイトレートである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３６】
治療剤の送達のための粒子を調製する方法であって、
ポーラスシリコン前駆体粒子を用意するステップ；
前記ポーラスシリコン前駆体粒子を、前記治療剤および金属塩を含む水溶液で処理するステップ
を含む方法。
【請求項３７】
前記水溶液が少なくとも０．１モル濃度の濃度の金属塩を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記金属塩が二価金属塩である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記金属塩がカルシウム塩である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が約１ｎｍ〜約１ｃｍの直径を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記処理から形成される前記粒子が、前記ポーラスシリコン前駆体粒子の表面上に、前記前駆体粒子の前記直径の１〜９０パーセントの間の厚さを有する金属塩の層を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記処理から形成される前記粒子がフォトルミネセント粒子である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記処理から形成される前記粒子が５００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で発光する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が、エッチングされた結晶シリコン物質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が、電気化学的にエッチングされた結晶シリコン物質を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が、化学的ステインエッチングされた結晶シリコン物質を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が、エッチングされたマイクロポーラスシリコン物質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
前記エッチングされたマイクロポーラスシリコン物質が、平均ポア直径最大約１ｎｍの複数のポアを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が、エッチングされたメソポーラスシリコン物質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５０】
前記エッチングされたメソポーラスシリコン物質が、平均ポア直径約１ｎｍ〜約５０ｎｍの複数のポアを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が、エッチングされたマクロポーラスシリコン物質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
前記エッチングされたマクロポーラスシリコン物質が、平均ポア直径約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの複数のポアを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記治療剤が、低分子薬剤、ビタミン、造影剤、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アプタマー、またはその混合物である、請求項３６に記載の方法。
【請求項５４】
前記治療剤が負に荷電した治療剤である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記治療剤がオリゴヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポーラスシリコン粒子をターゲティング薬剤に結合させるステップであって、前記結合させるステップが前記処理するステップの前または後にあるステップ
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６０】
前記結合させるステップが前記処理するステップの後にある、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ターゲティング薬剤がニューロンターゲティング薬剤である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポーラスシリコン粒子を細胞透過性薬剤に結合させるステップであって、前記結合させるステップが前記処理するステップの前または後にあるステップ
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６３】
前記結合させるステップが前記処理するステップの後にある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞透過性薬剤が脂質化ペプチドである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子をターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤に結合させるステップであって、前記結合させるステップが前記処理するステップの前または後にあるステップ
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポーラスシリコン前駆体粒子が酸化ポーラスシリコン物質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項６７】
前記酸化ポーラスシリコン物質が１５０℃を超える温度で酸化されている、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記酸化ポーラスシリコン物質が空気中で酸化されている、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記酸化ポーラスシリコン物質が、化学酸化剤を用いる反応により溶液中で酸化されている、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記化学酸化剤が、水、ボレート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジメチルスルホキシド、またはナイトレートである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
請求項１から３４のいずれか一項に記載の組成物の、処置を必要とする被験体への投与を含む処置方法。
【請求項７２】
前記投与が非経口投与による、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記投与がニューロン組織にターゲティングする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記被験体または前記被験体から単離された組織をモニタリングするステップをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記モニタリングするステップが光学的にモニタリングするステップである、請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年４月１４日に出願された米国仮出願第62/322,782号の利益を主張し、この出願の開示はその全体にわたって本明細書において参照により組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、the  National  Institutes  of  Healthにより授与された契約番号R24EY022025-01および認可番号NRSA  1F32CA177094-01、the  National  Science  Foundationにより授与された認可番号DMR1210417、およびthe  Defense  Advanced  Research  Projects  Agencyにより授与された協同協定番号HR0011-13-2-0017の下の政府の支援によりなされた。政府は本発明における一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
持続性でかつ信頼に足る治療剤の放出をもたらす薬物送達系を開発することに対して、相当の関心が寄せられている。このような系は、処置を必要とする被験体の任意の組織に治療剤を送達するように設計され得る。標的組織に応じて、薬物送達媒体は、経口、経粘膜、局所、注射、または吸入経路により投与され得る。組織内における薬物送達媒体からの薬剤の放出は、治療有効濃度の薬剤が標的組織内で実現されるよう十分に迅速であるべきであり、同時に、放出は、薬剤が組織において毒性レベルに到達するか、または分解代謝により無駄になるほど大きくすべきでない。
【０００４】
不安定な治療剤の場合、持続性でかつ信頼に足る送達は、安定性の問題からいっそう困難である。さらに、特定の組織への治療剤のターゲティング送達は、罹患した組織での処置の有効性を増大させ、罹患していない組織での副作用を最小限にするために望ましい場合がある。所与の標的組織の独自の特性および環境も、薬物送達系の設計における難題および好機の両方をもたらし得る。
【０００５】
例示的な薬物送達媒体には、リポソーム、有機マイクロスフェア、薬物−ポリマーコンジュゲート、無機担体などが含まれる。無機担体の中でも、その独自の物理化学的特性、具体的にはそれらの調節可能なサイズ、形状、表面反応性、および溶解性から、最近、無機ナノ粒子が薬物送達系において使用するための魅力的な候補となっている。薬物送達媒体として有用に使用される、無機ナノ粒子を含むナノ粒子の例には、リン酸カルシウムナノ粒子、炭素ナノチューブ、金ナノ粒子、酸化グラフェンナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、メソポーラスシリカナノ粒子などが含まれる。
【０００６】
例えば、Xueら（２００９年）Acta  Biomater.５巻：１６８６頁は、タンパク質薬剤の制御された吸着および放出のためのメソポーラスケイ酸カルシウムの使用について報告している。この研究では、溶液相からケイ酸カルシウム沈殿物が形成された。沈殿物は酸で処理されて、粒子の表面にメソポーラス構造が生成され、それにより粒子の表面積が増大し、それらの生物活性が改善され、表面とのタンパク質相互作用が強化された。
【０００７】
Salinasら（２００１年）J.  Sol-Gel  Sci.  Techn.２１巻：１３頁は、ゾル−ゲル法により、ケイ酸カルシウムゲルガラスを含むゲルガラスを生成した。これらの物質の特性が、動的アッセイモデルを使用する、疑似体液の存在下で調べられた。
【０００８】
Wuら（２０１０年）Adv.  Mater.２２巻：７４９頁は、界面活性剤不含の音響化学的方法を使用して、溶液相からナノ構造メソポーラスケイ酸カルシウム水和物球を合成した。薬物担体としての物質の能力を含む、これらの物質の物理化学的特性が評価された。
【０００９】
Liら（２００７年）J.  Biomed.  Mater.  Res.  B.８３Ｂ巻：４３１頁は、鋳型経路を使用する、溶液からのメソポーラスアモルファスケイ酸カルシウムの調製について報告する。物質は、従来のアモルファスケイ酸カルシウムと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで高い骨形成活性を示すことが判明した。
【００１０】
Wuら（２０１２年）J.  Mater.  Chem.２２巻：１６８０１頁は、歯の根尖を充填するのに生物活性メソポーラスケイ酸カルシウムナノ粒子を使用することについて記載している。この研究で使用されたナノ粒子は、カチオン性洗剤鋳型を使用して、溶液からの沈殿により合成された。
【００１１】
Kokuboら（２００３年）Biomaterials  ２４巻：２１６１頁は、骨代用物として使用するための、改善された機械的特性を有する無機生物活性物質の開発について概説している。このような物質には、その表面に、疑似体液の存在下でアパタイトの堆積中にアモルファスケイ酸カルシウム中間体を形成し得るガラスセラミックが含まれる。
上記の報告にもかかわらず、治療剤の送達、具体的には病変組織への治療剤のターゲティング送達のための改善された組成物、方法、および系を開発する必要性が引き続いて存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Xueら（２００９年）Acta  Biomater.５巻：１６８６頁
【非特許文献２】Salinasら（２００１年）J.  Sol-Gel  Sci.  Techn.２１巻：１３頁
【非特許文献３】Wuら（２０１０年）Adv.  Mater.２２巻：７４９頁
【非特許文献４】Liら（２００７年）J.  Biomed.  Mater.  Res.  B.８３Ｂ巻：４３１頁
【非特許文献５】Wuら（２０１２年）J.  Mater.  Chem.２２巻：１６８０１頁
【非特許文献６】Kokuboら（２００３年）Biomaterials  ２４巻：２１６１頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の要旨
本開示は、一態様では、ポーラスシリコンコアを含む粒子、ケイ酸金属塩を含む、コアの表面上の層、および治療剤を含む、治療剤を送達するための組成物を提供することにより、これらおよびその他の必要性に取り組んでいる。
【００１４】
一部の実施形態では、粒子の表面上の層は、ポーラスシリコン前駆体粒子を治療剤および金属塩を含む水溶液で処理することにより形成され、より具体的には、水溶液は少なくとも０．１モル濃度の濃度の金属塩を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、粒子の表面上の層は、ケイ酸カルシウムなどのケイ酸二価金属塩を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアは約１ｎｍ〜約１ｃｍの直径を有し、より具体的には、ポーラスシリコンコアの表面上の層は、コアの直径の１〜９０パーセントの間の厚さを有していてよい。
【００１７】
実施形態では、粒子は、５００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で発光し得るフォトルミネセント粒子である。
【００１８】
一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアは、電気化学的にエッチングされた結晶シリコン物質または化学ステインエッチングされた結晶シリコン物質などの、エッチングされた結晶シリコン物質を含む。一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアは、平均ポア直径最大約１ｎｍの複数のポアを含むエッチングされたマイクロポーラスシリコン物質などの、エッチングされたマイクロポーラスシリコン物質を含む。他の実施形態では、ポーラスシリコンコアは、平均ポア直径約１ｎｍ〜約５０ｎｍの複数のポアを含むエッチングされたメソポーラスシリコン物質などの、エッチングされたメソポーラスシリコン物質を含む。さらに他の実施形態では、ポーラスシリコンコアは、平均ポア直径約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの複数のポアを含むエッチングされたマクロポーラスシリコン物質などの、エッチングされたマクロポーラスシリコン物質を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、治療剤は、負に荷電した治療剤、例えばオリゴヌクレオチドなどの、低分子薬剤、ビタミン、造影剤、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アプタマー、またはその混合物である。一部の実施形態では、ポーラスシリコン粒子は、ターゲティング薬剤、細胞透過性薬剤、またはターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤の両方を含む。一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアは酸化ポーラスシリコン物質を含む。
【００２０】
別の態様では、本開示は、本組成物のいずれかおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
さらに別の態様では、本開示は、治療剤の送達のための粒子を調製する方法であって、
ポーラスシリコン前駆体粒子を用意するステップ；
ポーラスシリコン前駆体粒子を、治療剤および金属塩を含む水溶液で処理するステップ
を含む、方法を提供する。
【００２２】
さらに他の態様によれば、本開示の組成物の、処置を必要とする被験体への投与を含む処置方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１。ｓｉＲＮＡロードした、ケイ酸カルシウムコーティングポーラスシリコンナノ粒子（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ）の調製のための例示的プロセスの概略図。
【００２４】
【図２】図２Ａ〜２Ｅ。ｐＳｉＮＰ（図２Ａ）、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ（図２Ｂ）、およびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ（図２Ｃ）製剤の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。スケールバーは２００ｎｍである。図２Ｄは、ｐＳｉＮＰおよびＣａ−ｐＳｉＮＰ製剤の極低温窒素吸脱着等温線（ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｓｏｔｈｅｒｍ）を示す。図２Ｅは、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ製剤を調製するために使用される、ｐＳｉＮＰと３Ｍまたは４ＭのＣａＣｌ２水溶液との反応の間に得られた、フォトルミネセンス発光スペクトル（λｅｘ：３６５ｎｍ）を示す。典型的な量子閉じ込めは、ポーラスシリコンコアが薄くなるにつれて、発光スペクトルが青色にシフトする。電子的に不動態化する表面層の成長および非放射性再結合中心の抑制は、反応が進行するにつれて観察されるフォトルミネセンス強度の強力な増大において明らかである。
【００２５】
【図３】図３。ＰＰＩＢ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＰＩＢ）、ｓｉＰＰＩＢがロードされたアミノ化されたポーラスＳｉナノ粒子（ｐＳｉＮＰ）（ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ）、二重ペプチドナノ複合体中、ケイ酸カルシウムシェルで調製され、かつ外側シェル上に細胞ターゲティングペプチドおよび細胞透過性ペプチドの両方を含有するｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ構築物（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ）、外側シェル上に細胞透過性ペプチドのみを含有するｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ケイ酸カルシウムシェル構築物（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ｍＴＰ）、外側シェル上に細胞ターゲティングペプチドのみを含有するｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ケイ酸カルシウムシェル構築物（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧ）、およびルシフェラーゼに対する陰性対照ｓｉＲＮＡ配列を含有し、かつ外側シェル上に細胞ターゲティングペプチドおよび細胞透過性ペプチドの両方を含有するｐＳｉナノ粒子−ケイ酸カルシウムシェル構築物（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＬｕｃ−ＤＰＮＣ）で処理した後のＮｅｕｒｏ−２ａ細胞における相対ＰＰＩＢ遺伝子発現のサイレンシング。「７日」という名称は、実験前にナノ粒子構築物をエタノール中で、４℃で７日間保存したことを示している。細胞透過性ペプチドは、ミリストイル化輸送体（transportan）であり、細胞ターゲティングペプチドは、本文に記載されているように狂犬病ウイルス糖ペプチド（ＲＶＧ）由来のドメインである。統計解析は、スチューデントｔ検定（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０３）で行った。
【００２６】
【図４】図４Ａおよび４Ｂ。（１）対照としての食塩水、（２）Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ、および（３）Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣの静脈注射後の採取した臓器のｅｘ  ｖｉｖｏ蛍光画像。全てのｓｉＲＮＡ構築物は、共有結合したｄｙ６７７フルオロフォアを含有していた。図４Ａ：赤外線イメージングシステムＰｅａｒｌ  Ｔｒｉｌｏｇｙ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）を使用して得られた損傷した脳の蛍光画像。画像中の緑色チャネルは、ｄｙ６７７からの７００ｎｍの発光に対応し、脳組織の明視野像を、７００ｎｍの発光と統合する。図４Ｂ：Ｃｙ５．５チャネル（λｅｘ／ｅｍ：６７５／６９４ｎｍ）におけるＩＶＩＳ（キセノゲン）イメージングシステムで撮影された全主要臓器の蛍光画像。
【００２７】
【図５】図５Ａおよび５Ｂ。ｐＳｉＮＰ（図５Ａ）およびＣａ−ｐＳｉＮＰ（図５Ｂ）についての走査型電子顕微鏡画像および元素（ＥＤＸ）データ。
【００２８】
【図６】図６Ａ。示した通りの、ｐＳｉＮＰ（下の破線）およびＣａ−ｐＳｉＮＰ（上の実線）の粉末Ｘ線回折スペクトル。Ｓｉナノ粒子の回折パターンにおけるピークは、その回折ピークを担う結晶性Ｓｉ格子面のセットを示すミラー指数ｈ  ｋ  ｌで表示される。図６Ｂ。ｐＳｉＮＰ（下の破線）およびＣａ−ｐＳｉＮＰ（上の実線）のラマンスペクトル。図６Ｃ。ｐＳｉＮＰ（下の破線）およびＣａ−ｐＳｉＮＰ（上の実線）の拡散反射ＦＴＩＲスペクトル。分かりやすくするため、スペクトルはｙ軸に沿ってオフセットしている。
【００２９】
【図７】図７Ａ。ｐＨ９の緩衝液（三角、破線）、およびＣａＣｌ２中の３Ｍまたは４ＭであるｐＨ９の溶液（丸、実線）において時間の関数として測定したｐＳｉＮＰのＵＶ−Ｖｉｓ吸光度強度（λ＝４０５ｎｍ）。吸光度の低下は、ナノ粒子中の単体Ｓｉコアの分解に起因する；シリコンは４０５ｎｍの光を強く吸収するが、ＳｉＯ２またはケイ酸イオンはこの波長で透明である。図７Ｂ。ＰＢＳ緩衝液中、３７℃で時間の関数として放出されたｓｉＲＮＡの質量による累積百分率。ｐＳｉＮＰ−ＮＨ２−ｓｉＲＮＡ製剤は、２−アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）を使用してｐＳｉＮＰのポア壁にアミンを最初にグラフトし、次いで２時間の溶液曝露によりｓｉＲＮＡをロードすることによって調製した。
【００３０】
【図８】図８。ローダミン６Ｇ標準に比してＣａ−ｐＳｉＮＰ製剤の量子収量を計算するために使用された、光学吸収（３６５ｎｍ）の関数としての積分フォトルミネセンス強度。積分フォトルミネセンスは、５００〜９８０ｎｍの間で積分されたフォトルミネセンス強度−波長曲線を表す。ＱＥ−Ｐｒｏ（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ）分光計を使用し、励起λｅｘ＝３６５ｎｍ、および４６０ｎｍロングパスエミッションフィルターを使用してフォトルミネセンス強度を測定した。
【００３１】
【図９】図９。カルセインＡＭ生／死アッセイによって定量したＣａ−ｐＳｉＮＰ構築物の細胞傷害性。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞を、９６ウェルプレート中で三重にＣａ−ｐＳｉＮＰと共にインキュベートした。４８時間後、各ウェルをアッセイ溶液で処理し、そして生存率を、標準に対して測定した蛍光強度によって定量した。
【００３２】
【図１０】図１０。ＰＥＧ修飾および二重ペプチドのＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡへのコンジュゲーションの手順を示す模式図。カップリング剤２−アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）を、ナノ粒子の表面（ケイ酸カルシウムおよびシリカ）にグラフトし、ペンダント一級アミン基を生成した（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＮＨ２）。次いで、マレイミド−ポリ（エチレン−グリコール）−スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＳＣＭ）種を使用して、機能的ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＮＨ２ナノ粒子上の一級アミンに結合させた。スクシンイミジルカルボキシメチルエステルは、一級アミンとアミド結合を形成する。ＰＥＧ鎖の遠位端は第２の官能基であるマレイミドを含有していた。マレイミドは、システインのチオールと共有結合を形成し、ニューロンターゲティングペプチド（狂犬病ウイルス糖タンパク質）および細胞透過性ペプチド（ミリストイル化輸送体）の結合を可能にする。
【００３３】
【図１１】図１１Ａ。エタノール中に分散されたナノ粒子（本文中に記載されるようなｐＳｉＮＰ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＮＨ２、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ、およびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＮＨ２）のゼータ電位。図１１Ｂ。動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたｐＳｉＮＰおよびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣのサイズ分布。
【００３４】
【図１２】図１２。ナノ粒子製剤（下から上に）Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＰＥＧ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｍＴＰ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＲＶＧ、およびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ＤＰＮＣならびにペプチド（ｍＴＰおよびＦＡＭ−ＲＶＧ）のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトル。本文に記載されている製剤の略語。分かりやすくするため、スペクトルはｙ軸に沿ってオフセットする。
【００３５】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ。３７℃で２時間、（Ａ）Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣおよび（Ｂ）Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧで処理したＮｅｕｒｏ２ａ細胞の共焦点顕微鏡画像。シリコンナノ粒子の固有のルミネセンス（オリジナルは赤色）からのシグナルが、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧで処理した細胞の表面（図１３Ｂ）、およびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣで処理した細胞中で細胞内的に（図１３Ａ）観察され、ＤＡＰＩ核染色（オリジナルは青色）が、両方の画像の細胞核で観察され、ＲＶＧドメイン上のＦＡＭタグからのシグナル（オリジナルは緑色）が、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧ（図１３Ｂ）で処理した細胞の表面上ではさらに優勢であり、シリコンとＦＡＭ−ＲＶＧシグナルの重なり（赤と緑の組合せに起因してオリジナルは黄色）は、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ（図１３Ａ）で処理した細胞中で細胞内的にさらに優勢である。スケールバーは２０μｍである。
【００３６】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｄ。対照として粒子なし（図１４Ａ）、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧ（図１４Ｂ）、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ（図１４Ｃ）、およびＣｙ３タグ化ｓｉＲＮＡロードしたＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ（図１４Ｄ）で処理したＮｅｕｒｏ２ａ細胞のＦＡＣＳ分析。プロットの下に示されるパーセンテージは、ＦＡＭ−ＲＶＧ、Ｃｙ３タグ化ｓｉＲＮＡ、またはＦＡＭ−ＲＶＧとＣｙ３タグ化ｓｉＲＮＡの重複をトランスフェクトした細胞の定量された割合を表す。統計分析は、スチューデントｔ検定で行った（＊ｐ＜０．０４）。
【００３７】
【図１５】図１５。ｉｎ  ｖｉｖｏの傷害された脳へのｓｉＲＮＡのターゲティング送達のための例示的な実験手順。損傷から６時間後、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧまたはＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣを注射した。各製剤中のｓｉＲＮＡを、ｄｙ６７７蛍光タグで標識した。１時間の循環後、マウスを屠殺し、灌流し、その臓器を採取して、画像化した。
【００３８】
【図１６】図１６。４Ｍの塩化カルシウム、４Ｍの塩化マグネシウム、またはｐＨ９の緩衝液のいずれかで２４時間超音波処理された、新たにエッチングされたポーラスシリコン微粒子（ｐＳｉＭＰ）のＸ線回折スペクトル。
【００３９】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｃ。（Ａ）ｐＨ９の緩衝液、４ＭのＣａＣｌ２および４ＭのＭｇＣｌ２溶液を使用したローダミンＢ（ＲｈＢ）およびルテニウムビピリジン（Ｒｕ（ｂｐｙ））のローディング効率。ｐＨ９の緩衝液、ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２溶液中にロードした後のｐＳｉＭＰからの（Ｂ）ローダミンＢおよび（Ｃ）Ｒｕ（ｂｐｙ）の放出プロファイル。
【００４０】
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂ。（Ａ）クロラムフェニコールまたは（Ｂ）バンコマイシンをロードしたＣａ−ｐＳｉＮＰのローディング容量、薬物放出プロファイル、およびフォトルミネセンス低下プロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
ポーラスシリコン粒子を含む組成物
本開示は、一態様では、治療剤の送達に有用な組成物を提供する。このような組成物は、治療剤の制御放出が望ましい疾患またはその他の状態の処置に特に有用である。例えば、多くの疾患または状態が、長期にわたる活性な治療剤の安定した放出により有利に処置される。このような処置によって、注射、経口製剤、またはその他の典型的な送達系によりもたらされ得るよりも一定の、系における治療剤濃度がもたらされ、それにより、薬剤により引き起こされる可能性のある毒性作用が最小限となるのと同時に、治療活性が最大限となる。制御された送達系により、望ましい狭い治療濃度域内で薬剤の定常状態濃度を維持することで、所与の治療レジメンに必要な注射の頻度も有利に減少し、高価な治療剤の廃棄も有利に減少する。組成物は、単離された細胞または組織の処置にも有用であり、例えば処置の時間経過にわたって、治療剤の細胞内もしくは組織内送達の増加、または薬剤の安定性の改善をもたらし得る。
【００４２】
ポーラスシリコン（ｐＳｉ）は、典型的には結晶シリコンウエハーまたはその他のシリコン含有物質をエッチングすることによって形成される、ナノ構造シリコン含有物質を指す。例えば、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、Anglinら（２００８年）Adv.  Drug  Deliv.  Rev.  ６０巻：１２６６頁を参照のこと。したがって、本明細書で使用される場合、シリコン含有物質は好ましくは単体シリコン（elemental  silicon）（結晶および多結晶シリコンを含む）を含むが、ポリシロキサン、シラン、シリコーン、シロキサン、またはそれらの組合せも含んでいてよい。ポーラスシリコンは、エッチングプロセスから直接的に生じるナノ構造物質、およびその物質の任意の誘導体（エッチングされたポーラスシリコンのさらなる化学修飾から生じる酸化シリコンまたは共有結合により修飾されたシリコンなど）の両方を包含すると考えられるべきである。
【００４３】
ここで言及されたように、ポーラスシリコンは典型的には、シリコン含有物質の電気化学的または化学的ステインエッチングのいずれかにより調製される。例えば電気化学的エッチングの場合、電流密度、シリコンウエハー中のドーパントの種類および濃度、ウエハーの結晶方位、ならびに電解質濃度を制御することによるエッチングプロセスの制御により、ポアのサイズおよび形態を望ましいように調節することができる。このような調節で、例えば、マイクロポーラス、メソポーラス、またはマクロポーラスシリコンが生じ得る。
【００４４】
ポーラスシリコンは元々、そのフォトルミネセント特性が発見された後、光電子機器における使用のため開発された。Canham（１９９０年）Appl.  Phys.  Lett.  ５７巻：１０４６頁。しかし近年、ｐＳｉは薬物の制御放出用の担体として関心を集めている。Salonenら（２００８年）J.  Pharm.  Sci.  ９７巻：６３２頁；Chhablaniら（２０１３年）Invest.  Ophthalmol.  Vis.  Sci.  ５４巻：１２６８頁；Kovalainenら（２０１２年）Pharm.  Res.  ２９巻：８３７頁。例えばメソポーラスシリカなどの従来のシリコンベースの組成物は、生じた生成物の微細構造の制御があまりできない溶液−相反応、例えばゾル−ゲルまたは沈殿経路により得られる。対照的に、ｐＳｉ微細構造の有意な制御は、その合成に使用される電気化学的エッチングパラメータを調整することにより可能である。Martinezら（２０１３年）Biomaterials  ３４巻：８４６９頁；Houら（２０１４年）J.  Control.  Release  １７８巻：４６頁。空気中で高温で酸化されたポーラスシリコン粒子を含むポーラスシリコン粒子が、眼に治療剤を送達するのに使用されている。例えば、全ての目的においてその全体にわたって参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０５０２２１Ａ２号および第ＷＯ２００９／００９５６３Ａ２号を参照のこと。このような粒子が、粒子をウサギに硝子体内注射すると低い毒性で長期にわたって薬剤を送達することが示された。
【００４５】
ｐＳｉについての別の有用な特性は、容易に修飾される表面の化学である。例えば、熱酸化および熱ヒドロシリル化（hydrosylilation）などの方法を使用して、薬物ペイロードの特性に従って薬物のローディングおよび放出を最適化することができる。Salonenら（２００８年）J.  Pharm.  Sci.  ９７巻：６３２頁；Anglinら（２００８年）Adv.  Drug  Deliv.  Rev.  ６０巻：１２６６頁。特定の化学により、ｐＳｉマトリックスの分解が遅くなり得る、または溶解しにくい活性医薬品成分（ＡＰＩ）の放出が増強され得ることが観察されている。Salonenら（２００５年）J.  Control.  Release  １０８巻：３６２頁；Wangら（２０１０年）Mol.  Pharm.  ７巻：２２７頁。ｐＳｉ粒子の表面への官能化は、各種方法で、例えば、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１３０９９８Ａ１号に記載されるように、ポア内部の壁およびポア開口部を別に修飾することにより制御可能である。
【００４６】
ポーラスシリコンは、単体Ｓｉの酸化、および生じたケイ酸および最終的にオルトシリケートの溶解の組合せでにより、中性ｐＨの水溶液、例えば正常な体液中でゆっくりと溶解することが公知である。例えばｐＳｉナノ粒子の表面の修飾によって、このプロセスの速度および程度を制御することにより、粒子の毒性を有意に最小限にすることができる。例えば、硝子体内注射されたｐＳｉナノ粒子が非毒性であり、ウサギの硝子体において数カ月間安全に存在した後、眼から完全に分解および除去されたことが示されている。Chengら（２００８年）Br.  J.  Ophthalmol.  ９２巻：７０５頁；Nietoら（２０１３年）Exp.  Eye  Res.  １１６巻：１６１頁。米国特許公開第２０１０／０１９６４３５号も参照のこと。
【００４７】
したがって、以下でより詳細に記載されるように、本開示の粒子およびフィルムは、本明細書ではポーラスシリコン「骨格」とも呼ばれ得るポーラスシリコンコアを含む。一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアは、エッチングされた結晶シリコン物質、より具体的には電気化学的にエッチングされた結晶シリコン物質または化学的ステインエッチングされた結晶シリコン物質を含む。実施形態では、ポーラスシリコンコアは、エッチングされたマイクロポーラスシリコン物質、例えば平均ポア直径最大約１ｎｍの複数のポアを含む物質を含む。実施形態では、ポーラスシリコンコアは、エッチングされたメソポーラスシリコン物質、例えば平均ポア直径約１ｎｍ〜約５０ｎｍの複数のポアを含む物質を含む。実施形態では、ポーラスシリコンコアは、エッチングされたマクロポーラスシリコン物質、例えば平均ポア直径約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの、またはそれよりさらに大きい複数のポアを含む物質を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、本粒子およびフィルムのポーラスシリコンコアは、物質の総体積に対して約５％〜約９５％の開気孔率を有する。より具体的な実施形態では、ポーラスシリコンは、物質の総体積に対して約２０％〜約８０％、または約４０％〜約７０％の開気孔率を有する。一部の実施形態では、本組成物のポーラスシリコンの平均ポア直径は、約０．１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、約０．１ｎｍ〜約１ｎｍ、約０．１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、または約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍである。一部の実施形態では、平均ポア直径は、少なくとも約０．１ｎｍ、少なくとも約０．５ｎｍ、少なくとも約１ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、またはそれよりさらに大きい。一部の実施形態では、平均ポア直径は、最大約１０００ｎｍ、最大約１００ｎｍ、最大約５０ｎｍ、最大約１ｎｍ、またはそれよりさらに小さい。
【００４９】
本組成物のポーラスシリコンコアは、フィルムまたは粒子の形態であってよい。具体的には、本粒子およびフィルムの厚さは、好ましくは約５ｎｍ〜約１０００ミクロン、約１０ｎｍ〜約１００ミクロン、または約１００ｎｍ〜約３０ミクロンの範囲である。したがって、粒子およびフィルムは、少なくとも約５ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、またはそれよりさらに厚い厚さを有していてよい。同様に、粒子およびフィルムは、最大約１ｍｍ、最大約１００ミクロン、最大約３０ミクロン、またはそれよりさらに薄い厚さを有していてよい。ポーラスシリコンコアが粒子の形態である実施形態では、ポーラスシリコンコアの平均直径は、好ましくは約１ｎｍ〜約１ｃｍ、約３ｎｍ〜約１０００ミクロン、約１０ｎｍ〜約３００ミクロン、約１０ｎｍ〜約１００ミクロン、または約１ミクロン〜約５０ミクロンの範囲である。一部の実施形態では、平均粒子直径は、少なくとも約１ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１ミクロン、またはそれよりさらに大きい。一部の実施形態では、平均粒子直径は、最大約１ｃｍ、最大約１０００ミクロン、最大約３００ミクロン、最大約１００ミクロン、最大約５０ミクロン、またはそれよりさらに小さい。
【００５０】
ある特定の実施形態では、本組成物のポーラスシリコンコアは少なくとも部分的に酸化されている。本開示のポーラスシリコン組成物において単体シリコンを二酸化シリコンに酸化すると、組成物の安定性が増大し、組成物の毒性が減少し、かつ／または溶解特性の改善がもたらされ得る。本組成物のポーラスシリコンを酸化する例示的な方法は、調製方法で以下に詳細に与えられる。それらの方法のいずれかの酸化されたポーラスシリコン物質が、完全に酸化されたものであれ部分的に酸化されたものであれ、本組成物において有用であることが判明した。一部の場合において、下記の調製方法で使用される金属塩の塩化物イオンを、硝酸イオン、亜硝酸イオン、グルコン酸イオン、またはその他の適切なアニオンで置換することによってポーラスシリコンコアを酸化することが望ましい場合がある。硝酸金属塩または亜硝酸金属塩は、硝酸イオンおよび亜硝酸イオンの酸化性質により、金属塩化物よりも迅速にポーラスシリコンを酸化することができる。Fryら（２０１４年）Chem.  Mater.  ２６巻：２７５８頁。
【００５１】
「ポーラスシリコン酸化物」という用語が、シリコンおよび酸素を含み、一般化学量論式ＳｉＯｘの、ｘが最小では０．０１および最大では２であり得る物質を指し、「ポーラスシリコン」が、単体シリコン（結晶またはアモルファス状態のいずれか）から構成され、表面が水素、酸素、または炭素含有化学種を含む物質を指すことが理解されるべきである。さらに、「ポーラスシリコン」または「ポーラスシリコン酸化物」という用語は、マイクロポア、メソポア、もしくはマクロポア、または任意の２種もしくは３種全てのポア型の組合せを含む物質を指す。ポア内部の壁の表面を含むポーラス物質の表面が、水素、酸素、または炭素含有化学種を含み得ることも理解されるべきである。
【００５２】
ポーラスシリコンを含む例示的な組成物およびそれらの組成物を調製する方法は、例えば、それぞれがその全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２００５／００４２７６４号；第２００５／０００９３７４号；第２００７／０１４８６９５号；第２００７／００５１８１５号；第２００９／０２０８５５６号；および第２０１０／０１９６４３５号に詳細に記載されている。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示のポーラスシリコンコアは共有結合により修飾されている。具体的な実施形態では、共有結合による修飾はポーラスシリコンコアの表面上に存在する。アルキル化および特に熱ヒドロシリル化などの表面修飾により修飾されたポーラスシリコンの例が、Chengら（２００８年）Br.  J.  Ophthalmol.  ９２巻：７０５頁およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１４／１３０９９８Ａ１号に記載されている。このような物質は、治療剤の送達系として使用されると良好な生体適合性（biocompatability）を示すことが判明した。
【００５４】
上記の通り、ポーラスシリコンは中性ｐＨの水溶液にゆっくりと溶解することが公知である。ポーラスシリコンの分解機構には、シリコン骨格が酸化されて酸化シリコンが形成され（式１）、生じた酸化物相が溶解して水溶性のオルトケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）４）またはその同族体となること（式２）が伴う。Sailor、Porous  silicon  in  practice:  preparation,  characterization  and  applications.  （John  Wiley  &  Sons、２０１２年）を参照のこと。
【化１】
2019511582.tif 000002
【００５５】
有利なことに、ポーラスシリコンまたはポーラスシリコン酸化物の溶解により生じたケイ酸を高濃度の金属塩と反応させると、本明細書では「ケイ酸イオン」と呼ばれるアニオン、オルトケイ酸イオン（ＳｉＯ４４−）、メタケイ酸イオン（ＳｉＯ３２−）、またはその同族体を含む不溶性金属塩の形成がもたらされることが発見された。理論に縛られることを意図するものではないが、不溶性ケイ酸塩は、ポーラスシリコンまたはポーラスシリコン酸化物骨格のさらなる溶解を妨害する保護シェルとして作用すると考えられる。さらに、不溶性塩の形成は、ポア内に先にローディングされた物質が捕捉された状態となり得るように、物質のポア開口部を遮断する働きをする。ｓｉＲＮＡ治療剤を用いた例示については図１を参照のこと。ポーラスシリコンを比較的低濃度の水性カルシウムおよびホスフェートを含む溶液に曝露すると、ヒドロキシアパタイトの表面層の形成につながることが以前に実証されている（Liら（１９９８年）J.  Am.  Chem.  Soc.  １２０巻：１１７０６頁）が、高濃度の金属塩の存在下での不溶性シリケートの形成は実証されておらず、相当量のペイロード分子を捕捉するにあたってのこれらの反応の驚くべき有効性も有しない。セメント化学から、酸化カルシウムがシリカと反応してケイ酸カルシウムを形成すること（Minetら（２００６年）J.  Mater.  Chem.  １６巻：１３７９頁）、ならびに、シリケート水溶液およびカルシウムイオン溶液などの均質な前駆体を混合すると、沈殿物およびナノ粒子が生成され得ること（Wuら（２０１２年）J.  Mater.  Chem.  ２２巻：１６８０１頁；Wuら（２０１０年）Adv.  Mater.  ２２巻：７４９頁；Liら（２００７年）J.  Biomed.  Mater.  Res.  B.  ８３Ｂ巻：４３１頁；Saravanapavanら（２００３年）J.  Noncrystalline  Solids  ３１８巻：１頁；Kokuboら（２００３年）Biomaterials  ２４巻：２１６１頁；およびSalinasら（２００１年）J.  Sol-Gel  Sci.  Techn.  ２１巻：１３頁）が公知であるが、ナノ構造ポーラスシリコンと反応させた金属塩水溶液がコア／シェルナノ構造を生じ得ることは以前には実証されていない。さらに、本組成物のコア／シェル構造は、上記の均質な経路により調製される物質の特性とは異なる独自の特性を示し、本明細書に記載される調製方法により、有利なことに、治療剤をローディングし、その後ゆっくりと放出させることが可能となる。さらに、コア−シェル構造の、ポーラスシリコンのルミネセントシリコンドメインからのフォトルミネセンスの強度および持続性を増強させる能力が実証されており（Jooら（２０１４年）Adv.  Funct.  Mater.  ２４巻：５６８８頁）、本明細書では、これらの新たなシェルが、ポーラスシリコンの固有のフォトルミネセンス特性に同様の改善をもたらすことが実証されている。
【００５６】
したがって、本開示のポーラスシリコン粒子およびフィルムは、好ましくは、ケイ酸金属塩を含む、ポーラスシリコンコアの表面上の層を含む。上記の通り、この層は一部の例では「シェル」とも呼ばれ得る。一部の実施形態では、ケイ酸金属塩は、ケイ酸二価、三価、または四価金属塩である。より具体的には、ケイ酸金属塩はケイ酸二価金属塩である。例えば、ケイ酸二価金属塩は、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸マンガン、ケイ酸銅、ケイ酸亜鉛、ケイ酸ニッケル、ケイ酸白金、またはケイ酸バリウムであってよい。具体的な実施形態では、ケイ酸二価金属塩はケイ酸カルシウムまたはケイ酸マグネシウムである。さらにより具体的には、ケイ酸二価金属塩はケイ酸カルシウムである。他の具体的な実施形態では、ケイ酸金属塩はケイ酸三価または四価金属塩である。本開示のポーラスシリコン粒子およびフィルムにおいて有用性を有する例示的なケイ酸三価または四価金属塩には、ケイ酸ジルコニウム、ケイ酸チタン、およびケイ酸ビスマスが含まれる。一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアの表面上の層は、上に列挙された例示的なケイ酸金属塩のいずれかを任意の組合せで含む、ケイ酸金属塩の組合せを含む。
【００５７】
ポーラスシリコンまたはポーラスシリコン酸化物ナノ構造は、治療剤、診断剤、または別の有益な物質（「ペイロード」とも呼ばれる）を受容するように容易に構成される（Salonenら（２００８年）J.  Pharm.  Sci.  ９７巻：６３２頁；Anglinら（２００８年）Adv.  Drug  Deliv.  Rev.  ６０巻：１２６６頁）が、投与前または投与後のいずれかに、これらのペイロードが時期尚早に放出されると、所期の目的にとって望ましくない場合がある。さらに、水性条件でのポーラスシリコンまたはポーラスシリコン酸化物の分解が、持続性の薬物送達（Salonenら（２００８年）J.  Pharm.  Sci.  ９７巻：６３２頁；Anglinら（２００８年）Adv.  Drug  Deliv.  Rev.  ６０巻：１２６６頁）、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの画像化（Jooら（２０１４年）Adv.  Funct.  Mater.  ２４巻：５６８８頁；Guら（２０１３年）Nat.  Commun.  ４巻：２３２６頁；Parkら（２００９年）Nat.  Mater.  ８巻：３３１頁）、およびバイオセンサー（Janeら（２００９年）Trends  Biotechnol.  ２７巻：２３０頁）を伴う施用において重大な問題を引き起こし得ることから、（ポーラス骨格の）シリコンまたは酸化シリコンの内部コアがより安定な酸化シリコン（Jooら（２０１４年）Adv.  Funct.  Mater.  ２４巻：５６８８頁）、酸化チタン（Bettyら（２０１１年）Prog.  Photovoltaics  １９巻：２６６頁；Liら（２０１４年）Biosens.  Bioelectron.  ５５巻：３７２頁）、炭素（Tsangら（２０１２年）ACS  Nano  ６巻：１０５４６頁）、またはその他の動力学的に安定な物質（Buriak（２００２年）Chem.  Rev.  １０２巻：１２７１頁）のシェルで取り囲まれた、各種「コア−シェル」型構造の合成に至った。適切な条件下では、シェルの形成により、ポア中に先にローディングされた物質が捕捉されて、製剤のゆっくりした放出がもたらされ得る（Fryら（２０１４年）Chem.  Mater.  ２６巻：２７５８頁）。ポーラスシリコン含有コア物質内に物理的に捕捉されたカーゴ分子とともにコア−シェル構造を含む、融合性リポソームコーティングされたポーラスシリコンナノ粒子が、ともにその全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年７月９日出願の米国仮出願第６２／１９０，７０５号、およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１７／００８０５９Ａ１号に記載されている。
【００５８】
本組成物中にカルシウムイオンなどの金属イオンが存在することは、これらのイオンが製剤中に存在し得る残ったフッ化物イオンを隔離することができるため、組織にとってさらに有益となり得る。本組成物に使用されるポーラスシリコンおよびポーラスシリコン酸化物物質は、典型的には、フッ化物含有電解質中で電気化学的なエッチングにより調製され、このプロセスによりポーラスマトリックス中に微量のフッ化物が残ることがある（Koynovら（２０１１年）Adv.  Eng.  Mater.  １３巻：Ｂ２２５頁）。フッ化物は組織にとって非常に有毒であり得る（特に、眼などの敏感な組織）。しかし、水溶液中の、非常に溶解性が小さい生成物であるフッ化カルシウムおよびその他の金属フッ化物により、コア−シェル合成における高濃度の金属イオンの使用で、製剤中に残ったフッ化物と反応させ、それによりフッ化物およびそのｉｎ  ｖｉｖｏでの有害な効果を中和するというさらなる利益がもたらされ得る。
【００５９】
一部の実施形態では、ポーラスシリコンコアの表面上の層は、コアの平均直径または厚さの１〜９０パーセントの間、５〜６０パーセントの間、または１０〜４０パーセントの間の厚さを有する。
【００６０】
好ましい実施形態では、ポーラスシリコンコアの表面上の層のケイ酸金属塩は、ポーラスシリコンコアに化学的に結合している。
【００６１】
本開示の組成物は、好ましくはポーラスシリコン粒子またはフィルムのエッチングされたポア内に含まれる治療剤をさらに含む。治療剤という用語が、処置を必要とする被験体、組織、または細胞に対し治療効果を有し得る任意の薬剤を包含すると広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。治療剤には、核酸、炭水化物、およびタンパク質、ならびに脂質、ならびに一次および二次代謝物を含む任意のその他の天然に存在する分子などの生物ポリマーが含まれる。治療剤には、治療活性をもたらす、上記分子の任意の誘導体または別様に修飾された型も含まれていてよい。実際、治療剤は部分的にまたは完全に非天然の構造を有していてよい。治療剤は天然の供給源から精製されてもよく、半合成方法を使用して調製されてもよく、または合成的手法により全て調製されてもよい。治療剤は薬学的に許容される塩の形態で提供されてもよく、および治療効果を有しない薬学的に許容される賦形剤またはその他の薬剤とともに製剤化されてもよい。一部の状況では、本開示の単一の組成物中、またはさらには単一のポーラスシリコン粒子もしくはフィルム中に１種を超える治療剤を組み合わせることが有利であり得る。
【００６２】
本組成物に有用に含まれる治療剤には、限定されないが、ＡＣＥ阻害剤、アクチン阻害剤、鎮痛剤、麻酔剤、降圧剤（anti-hypertensive）、抗ポリメラーゼ、分泌抑制剤、抗生物質、抗がん物質、抗コリン薬、抗凝固剤、抗けいれん薬、抗うつ薬、制吐薬、抗真菌薬、抗緑内障薬溶質、抗ヒスタミン薬、降圧剤（antihypertensive  agent）、抗炎症剤（ＮＳＡＩＤなど）、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、抗酸化剤、抗寄生虫薬、抗パーキンソン病薬剤、抗増殖薬（抗血管新生剤を含む）、抗原虫薬溶質、抗精神病物質、解熱薬、消毒薬（antiseptic）、鎮痙薬、抗ウイルス剤、カルシウムチャネル遮断薬、細胞応答調節剤、キレート剤、化学療法剤、ドーパミンアゴニスト、細胞外マトリックス成分、線溶剤、フリーラジカルスカベンジャー、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、睡眠薬、免疫抑制剤、免疫毒素、表面糖タンパク質受容体の阻害剤、微小管阻害剤、縮瞳薬、筋収縮剤、筋弛緩剤、神経毒、神経伝達物質、オピオイド、プロスタグランジン、リモデリング阻害剤（remodeling  inhibitor）、スタチン、ステロイド、血栓溶解剤、精神安定剤、血管拡張剤、および／または血管攣縮阻害剤が含まれる。
【００６３】
一部の実施形態では、治療剤は、核酸または核酸アナログ、例えばこれらに限定されないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子一過性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、修飾ｍＲＮＡ（ｍｍＲＮＡ）、またはそのアナログもしくは組合せである。一部の実施形態では、治療剤は核酸アナログ、例えばこれらに限定されないが、アンチセンス核酸、オリゴ核酸すなわちオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補的ＰＮＡ（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＰＮＡ）（ｐｃＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはその誘導体もしくはアナログである。好ましい実施形態では、治療剤はｓｉＲＮＡである。
【００６４】
核酸薬剤などの負に荷電した治療剤が本ｐＳｉナノ粒子またはナノフィルムの表面上のケイ酸金属塩層とともに製剤化されることを考慮すると、本組成物におけるこれらの薬剤の送達が有利であり得ることを当業者は理解するはずである。理論に縛られることを意図するものではないが、組成物の金属成分が核酸治療剤成分のアニオン電荷を中和し、それにより本物質のローディング能力が改善され得る。
【００６５】
一部の実施形態では、治療剤はタンパク質またはペプチド、例えば抗体もしくはタンパク質生物製剤、ペプチドミメティック、アプタマー、またはその変異体である。
【００６６】
一部の実施形態では、治療剤は例えば、リポペプチド（例えば、ダプトマイシン）、グリシルサイクリン（例えば、チゲサイクリン）、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド）、リピアルマイシン（例えば、フィダキソマイシン）、ペニシリン、セファロスポリン、ポリミキシン、リファマイシン、キノロン、スルホンアミド、マクロライド、リンコサミド、テトラサイクリン、グリコペプチド（例えば、バンコマイシン）などの抗生物質である。
【００６７】
一部の実施形態では、治療剤は低分子疎水性治療剤である。多くの治療剤、具体的には疎水性治療剤は、非晶質形態、すなわちアモルファス形態で、より効率的に生物システムに送達される。実際、疎水性治療剤をアモルファス形態に製剤化することは、溶解特性を増大させ、それによりバイオアベイラビリティを増大させるための有望な戦略と考えられている。しかし、活性な薬剤のアモルファス形態は内部エネルギーが大きいことから、純粋なアモルファス薬剤は大抵、典型的には小さい溶解性を有する、より低いエネルギーの結晶状態まで急速に再結晶する。したがって、アモルファス状態が安定化するように疎水性治療剤を製剤化することが望ましい。
【００６８】
理論に縛られることを意図するものではないが、本ポーラスシリコン粒子およびフィルム、具体的にはポア表面が修飾されたポーラスシリコン物質のポア表面は、薬剤およびポア表面の間の強い分子相互作用により、治療剤のアモルファス形態を安定化させることができると考えられる。これらの相互作用により、薬物の再結晶が防止され、それにより薬剤が効率的に放出され、バイオアベイラビリティが増大し得る。
【００６９】
したがって、本粒子およびフィルムに有用に組み込まれる低分子治療剤の例には疎水性治療剤が含まれる。具体的な実施形態では、疎水性薬剤は、ラパマイシン、パクリタキセル、ダウノルビシン、ドキソルビシン、またはこれらの薬剤のいずれかのアナログである。好ましい実施形態では、薬剤はラパマイシン（シロリムスとしても公知）またはラパマイシンアナログである。ラパマイシンアナログの非限定的な例には、例えば、エベロリムス、ゾタロリムス、バイオリムスＡ９、テムシロリムス、ミオリムス（ｍｙｏｌｉｍｕｓ）、ノボリムス（ｎｏｖｏｌｉｍｕｓ）、タクロリムス、またはピメクロリムスが含まれる。
【００７０】
ラパマイシンの、共有結合により修飾された型が、限定されることなく本組成物に有用に含まれていてよい。例えば、米国特許第４，３１６，８８５号および第５，１１８，６７８号は、ラパマイシンのカルバメートについて報告している。米国特許第４，６５０，８０３号は、ラパマイシンの水溶性プロドラッグについて報告している。米国特許第５，１００，８８３号は、ラパマイシンのフッ素化エステルについて報告している。米国特許第５，１１８，６７７号は、ラパマイシンのアミドエステルについて報告している。米国特許第５，１３０，３０７号は、ラパマイシンのアミノエステルについて報告している。米国特許第５，３４６，８９３号は、ラパマイシンのスルホネートおよびスルファメートについて報告している。米国特許第５，１９４，４４７号は、ラパマイシンのスルホニルカルバメートについて報告している。米国特許第５，４４６，０４８号は、ラパマイシンオキシムについて報告している。米国特許第６，６８０，３３０号は、ラパマイシンジアルデヒドについて報告している。米国特許第６，６７７，３５７号は、ラパマイシン２９−エノールについて報告している。米国特許第６，４４０，９９０号は、Ｏ−アルキル化ラパマイシン誘導体について報告している。米国特許第５，９５５，４５７号は、水溶性ラパマイシンエステルについて報告している。米国特許第５，９２２，７３０号は、アルキル化ラパマイシン誘導体について報告している。米国特許第５，６３７，５９０号は、ラパマイシンアミジノカルバメートについて報告している。米国特許第５，５０４，０９１号は、ラパマイシンのビオチンエステルについて報告している。米国特許第５，５６７，７０９号は、ラパマイシンのカルバメートについて報告している。米国特許第５，３６２，７１８号は、ラパマイシンヒドロキシエステルについて報告している。これらのラパマイシン誘導体、およびその他は、本組成物に含まれ得る。
【００７１】
本開示の組成物に組み込まれる治療剤の量は、望ましい放出プロファイル、生物的効果に必要な治療剤濃度、および治療剤が処置のために放出されるべき時間の長さによって決まる。シリンジ針またはその他の適切な送達機器を介して注射するための許容される溶液の量または分散粘度を除き、本組成物に組み込まれる治療剤の量には上限がない。本組成物に組み込まれる治療剤の下限は、治療剤の活性および処置に必要な時間の長さによって決まる。具体的には、本発明の一実施形態では、組成物は、治療剤の１カ月の放出をもたらすように製剤化される。このような実施形態では、治療剤は好ましくは、組成物の約０．１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、好ましくは約２ｗｔ％〜約２５ｗｔ％で存在する。あるいは、本開示の別の実施形態では、組成物は、治療剤の３カ月の送達をもたらすように製剤化される。このような実施形態では、治療剤は好ましくは、組成物の約０．１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、好ましくは約２ｗｔ％〜約２５ｗｔ％で存在する。あるいは、本開示の別の実施形態では、組成物は、治療剤の６カ月の送達をもたらすように製剤化される。このような実施形態では、治療剤は好ましくは、組成物の約０．１ｗｔ％〜約５０ｗｔ％、好ましくは約２ｗｔ％〜約２５ｗｔ％で存在する。組成物は、組成物が完全に溶解するまで、そこに含まれる治療剤を制御された速度で放出する。
【００７２】
一部の実施形態において、治療剤は、ポーラスシリコンコアを含む粒子またはフィルムと共有結合していない。一部の実施形態では、治療剤はポーラスシリコンコアのポア内に含まれる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、本開示の治療剤を送達するための組成物は、ターゲティング薬剤および／または細胞透過性薬剤をさらに含む。これらの実施形態では、本組成物の粒子は、好ましくは、治療剤を投与部位から治療効果が望まれる部位まで輸送するようなサイズである。
【００７４】
したがって、本開示での使用に適したターゲティング薬剤には、本組成物の粒子を、処置される被験体内の特定の組織にターゲティングすることができる薬剤が含まれる。具体的には、ターゲティング薬剤は、例えば、ペプチド、または受容体もしくはターゲティングされる細胞に見られるその他の表面タンパク質もしくは脂質などの細胞表面成分に結合するその他の部分を含んでいてよい。適切なターゲティング薬剤の例は、短鎖ペプチド、タンパク質断片、および完全なタンパク質である。理想的には、ターゲティング薬剤は、ターゲティングされる細胞による粒子の取り込みを妨げるべきでない。一部の実施形態では、ターゲティング薬剤は、１００以下のアミノ酸、例えば５０以下のアミノ酸、３０以下のアミノ酸、またはさらに１０、５、もしくは３以下のアミノ酸を含んでいてよい。
【００７５】
ターゲティング薬剤は、粒子を特定の細胞または組織型にターゲティングするように選択されてよく、例えば粒子は、筋肉、脳、肝臓、膵臓、もしくは肺組織、またはマクロファージもしくは単球にターゲティングすることができる。あるいは、ターゲティング薬剤は、例えば、腫瘍細胞、病変冠動脈細胞、アルツハイマー病に罹患した脳細胞、細菌細胞、またはウイルス粒子などの、病変組織内の特定の細胞に粒子をターゲティングするように選択されてよい。本開示の好ましい実施形態では、ターゲティング薬剤は、例えば脳組織などのニューロン組織に対し選択的である。
【００７６】
ターゲティング薬剤の具体的な例には、骨格筋にターゲティングするファージディスプレイにより発見された筋肉特異的ペプチド（Flintら（２００５年）Laryngoscope  １１５巻：１９３０頁）、アセチルコリン受容体に結合する狂犬病ウイルス糖タンパク質の２９残基断片（Lentz（１９９０年）J.  Mol.  Recognit.  ３巻：８２頁）、その受容体を標的ニューロンにターゲティングする神経増殖因子の断片、ならびに、セクレチン受容体に結合し、例えば嚢胞性線維症の胆管および膵臓上皮にターゲティングするのに使用可能なセクレチンペプチド（Zengら（２００４年）J.  Gene  Med.  ６巻：１２４７頁およびMcKayら（２００２年）Mol.  Ther.  ５巻：４４７頁）が含まれる。代替として、免疫グロブリン、およびｓｃＦｖ抗体断片を含むその変異体も、ターゲティングされる細胞または組織の表面上のＶＥＧＦＲまたはその他の表面タンパク質などの特定の抗原に結合するターゲティング薬剤として使用可能である。さらに別の代替として、受容体リガンドが、ターゲティングされる受容体を発現する細胞または組織の表面に粒子をターゲティングするターゲティング薬剤として使用可能である。特定の実施形態では、本組成物のターゲティング薬剤は、例えば狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）由来のペプチド配列などのニューロンターゲティング薬剤である。
【００７７】
本開示の細胞透過性薬剤は、内部移行薬剤または細胞膜移行薬剤としても公知である。具体的な実施形態では、細胞透過性薬剤は細胞透過性ペプチドまたはタンパク質である。これらの薬剤には、特定の細胞またはウイルスタンパク質が膜を越えることを可能にする、比較的短鎖（例えば、５〜３０残基、７〜２０残基（reside）、またはさらに９〜１５残基）のペプチドの周知のクラスが含まれるが、その他のクラスも公知である。例えば、Milletti（２０１２年）Drug  Discov.  Today  １７巻：８５０頁を参照のこと。細胞透過性ペプチドの元のクラスにおける例示的なペプチドは、典型的には、ペプチドの細胞膜通過を促進すると考えられているアルギニンおよび／またはリジン残基が比較的高レベルで存在することにより、カチオン電荷を有する。一部の場合において、ペプチドは５、６、７、８、またはさらにそれを超えるアルギニンおよび／またはリジン残基を有する。例示的な細胞透過性ペプチドには、ペネトラチンまたはアンテナペディアＰＴＤおよび変異体、ＴＡＴ、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＰＴＤ−４、ＰＴＤ−５、ＦＨＢ  Ｃｏａｔ−（３５〜４９）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７〜２５）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４〜１６）、Ｄ−Ｔａｔ、Ｒ９−Ｔａｔ、トランスポータン（Transportan）、ＭＡＰ、ＳＢＰ、ＦＢＰ、ＭＰＧおよび変異体、Ｐｅｐ−１、Ｐｅｐ−２、ならびにポリアルギニン、ポリリジン、およびその変異体を含む各種周期的配列が含まれる。本組成物に有用な細胞透過性ペプチドのさらなる例については、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｄｄ.ｏｓｄｄ.ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅ／ｉｎｄｅｘ.ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ−ｐｅｐｔｉｄｅｓ.ｏｒｇを参照のこと。
【００７８】
いくつかのタンパク質、レクチン、およびその他の大分子、例えば、リシン、アブリン、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、ジフテリア毒素、コレラ毒素、炭疽毒素、易熱性毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＴＡ）、またはその断片などの植物および細菌タンパク質毒素も細胞透過特性を示し、本開示のための細胞透過性薬剤と考えることができる。その他の例示的な細胞透過性薬剤は、その全てがその全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、Temsamaniら（２００４年）Drug  Discov.  Today  ９巻：１０１２頁；De  Coupadeら（２００５年）Biochem  J.  ３９０巻：４０７頁；Saeaelikら（２００４年）Bioconjug.  Chem.  １５巻：１２４６頁；Zhaoら（２００４年）Med.  Res.  Rev.  ２４巻：１頁；およびDeshayesら（２００５年）Cell.  Mol.  Life  Sci.  ６２巻：１８３９頁に記載されている。
【００７９】
一部の実施形態では、細胞透過性薬剤、例えば細胞透過性ペプチドは、薬剤の結合親和性を改善するため、薬剤の細胞膜を通過して輸送される能力を改善するため、または安定性を改善するため、例えばアセチル化、リン酸化、脂質化、ペグ化、および／またはグリコシル化により誘導体化されていてよい。具体的な実施形態では、細胞透過性薬剤は、例えばミリストイル化、パルミトイル化、または、好ましくはラウリン酸およびステアリン酸などの炭素１０〜２０の鎖長を有するその他の脂肪酸の結合、ならびにゲラニル化、ゲラニルゲラニル化、およびその他の型のイソプレニル化により脂質化されている。より具体的な実施形態では、細胞透過性薬剤はミリストイル化されている。
【００８０】
具体的な実施形態では、細胞透過性薬剤はトランスポータンであり、より具体的には脂質化トランスポータンである。さらにより具体的な実施形態では、細胞透過性薬剤はミリストイル化トランスポータンである。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、ターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤の両方を含み、他の実施形態では、ターゲティング薬剤または細胞透過性薬剤のいずれかを含む。例えば、組成物が動物被験体、例えばヒト被験体の処置に使用される場合、具体的には処置が全身処置である場合、組成物がターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤の両方を含むことが有利となり得る。投与が動物被験体の特定の組織に直接的になされる場合、組成物がターゲティング薬剤を含む必要がないことがある。組成物がその他の目的に使用される場合、例えば組成物が細胞外の標的を対象とする場合、組成物が細胞透過性薬剤を含む必要がないことがある。一部の場合において、例えば組成物が単離された細胞または組織に直接的に投与される場合、当業者が理解するように、組成物はターゲティング薬剤も細胞透過性薬剤も含まなくてよい。
【００８２】
本開示によるポーラスシリコン粒子を含む例示的な組成物が、その全体にわたって参照により本明細書に組み込まれる、Kangら（２０１６年）Adv.  Mater.  ２８巻：７９６２頁に記載されている。
ケイ酸金属塩層を含むポーラスシリコン粒子を調製する方法
【００８３】
別の態様では、本開示は、上記のポーラスシリコン粒子およびフィルムを調製する方法を提供する。具体的には、本開示は、このような物質のポアおよび／または表面層において１種または複数の治療剤をローディングおよび保護する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ポーラスシリコン前駆体粒子またはフィルムを用意するステップ、ならびにポーラスシリコン前駆体粒子またはフィルムを治療剤および金属塩を含む水溶液で処理するステップを含む。好ましい実施形態では、方法は、ポーラスシリコン前駆体粒子の処理に適用される。
【００８４】
「前駆体粒子」または「前駆体フィルム」という用語は、本明細書では、調製方法に使用される粒子およびフィルムを、それらの方法による生成物と区別するためだけに使用される。
【００８５】
具体的な実施形態では、本調製方法に使用されるポーラスシリコン前駆体物質は、上記粒子およびフィルムの化学的および構造上の特性を有する。例えば、ポーラスシリコン前駆体物質は、約５ｎｍ〜約１０００ミクロン、約１０ｎｍ〜約１００ミクロン、または約１００ｎｍ〜約３０ミクロンの範囲の厚さを有していてよい。ポーラスシリコン前駆体物質が粒子の形態である実施形態では、粒子は、約１ｎｍ〜約１ｃｍ、約３ｎｍ〜約１０００ミクロン、約１０ｎｍ〜約３００ミクロン、約１０ｎｍ〜約１００ミクロン、または約１ミクロン〜約５０ミクロンの範囲の平均サイズを有していてよい。
【００８６】
本ポーラスシリコン組成物は、公知の方法によりポーラスシリコン前駆体フィルムおよび前駆体粒子から調製することができる。一般的に、例えば、Sailor、Porous  silicon  in  practice:  preparation,  characterization  and  applications  （John  Wiley  &  Sons、２０１２年）およびQinら（２０１４年）Part.  Part.  Syst.  Char.  ３１巻：２５２頁を参照のこと。具体的には、シリコンウエハーが、例えば、３：１  ４８％−ＨＦ：ＥｔＯＨ溶液を用いて、定められた粒子サイズ、気孔率、およびポアサイズを得るのに適切な電流密度で電気化学的にエッチングされてよい。エッチングされたポーラスシリコンの層は、例えば薄い水性ＨＦ中で低電流密度パルスを印加することによって、ウエハーから取り出すことができる。ｐＳｉナノ粒子（ｐＳｉＮＰ）の調製では、長期の低電流エッチング（例えば、４０ｍＡ／ｃｍ２、１．８秒）間の短期の周期的な高電流パルス（例えば、３７０ｍＡ／ｃｍ２、０．４秒）により、エッチング面に沿って穿孔が導入され、それにより、高気孔率および低気孔率が交互となった層が生成され得る（Qinら（２０１４年）Part.  Part.  Syst.  Char.  ３１巻：２５２頁）。ポーラスシリコンの層はウエハーから取り出されてフィルムを形成することができ、独立したフィルムが例えば一晩の超音波処理により破砕されて、単分散ｐＳｉナノ粒子が生成され得る。ｐＳｉ微粒子（ｐＳｉＭＰ）の調製では、例えば２０〜１００ｍＡ／ｃｍ２の範囲のエッチング電流が、例えば１サイクルあたり４秒および２．７秒の期間で印加されて、ストップバンド約４５０および５６０ｎｍで複合正弦構造を形成することができる。独立したフィルムは５〜７分間の超音波処理により破砕されて、望ましいサイズ（例えば、２０×６０×６０μｍ）のｐＳｉ微粒子が生成され得る。
【００８７】
その他の電流−時間波形を使用して、電気化学的にエッチングされたポーラスシリコン物質を生成させることができることは、当業者には明らかであるはずである。例えば、所定の期間の単一の定電流、または正弦電流−時間波形をこのような手法に使用することができる。あるいは、ポーラスシリコンコアを産生するのに、化学的ステインエッチングを上記の電気化学的エッチングの代わりとすることができる。Sailor、Porous  silicon  in  practice:  preparation,  characterization  and  applications  （John  Wiley  &  Sons、２０１２年）を参照のこと。さらに別の代替では、ナノ構造の酸化シリコンを化学的に還元することによってポーラスシリコンコアが産生され得る。Batchelorら（２０１２年）Silicon  ４巻：２５９頁を参照のこと。ステインエッチングでは、典型的にはシリコン前駆体としてシリコンウエハーの代わりにシリコン粉末、および電気化学的反応を推進するための電力供給の代わりに化学酸化剤を使用する。
【００８８】
一部の実施形態では、ポーラスシリコン前駆体物質は酸化または部分的に酸化されていてよい。具体的な実施形態では、ポーラスシリコン前駆体物質は、例えば少なくとも１５０℃、少なくとも２００℃、少なくとも３００℃、少なくとも４００℃、少なくとも５００℃、少なくとも６００℃、少なくとも７００℃、少なくとも８００℃、またはさらにそれより高い温度で熱酸化されてよい。一部の実施形態では、ポーラスシリコン前駆体物質は、約３００℃〜約１０００℃の温度、約４００℃〜約８００℃の温度、または約５００℃〜約７００℃の温度で酸化されてよい。好ましい実施形態では、熱酸化は空気中で実施される。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本方法のポーラスシリコン前駆体物質は、例えば酸化剤を含む溶液中でポーラスシリコン物質を懸濁させることにより、溶液中で酸化されてもよい。例えば、ポーラスシリコン物質を酸化するのに使用される溶液は、水、ボレート、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ジメチルスルホキシド、硝酸塩、または任意のその他の適切な酸化剤、または薬剤の組合せを含んでいてよい。
【００９０】
これまでに記載されたように、本組成物を調製するのに使用される溶液は、典型的には金属塩を含む。具体的な実施形態では、溶液は少なくとも０．１モル濃度、０．３モル濃度、０．５モル濃度、１モル濃度、２モル濃度、３モル濃度、またはさらにそれより高いモル濃度の濃度の金属塩を含む。一部の具体的な実施形態では、金属塩は二価、三価、または四価金属塩である。より具体的には、金属塩は二価金属塩である。例えば、二価金属塩は、カルシウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩、銅塩、亜鉛塩、ニッケル塩、白金塩、またはバリウム塩であってよい。具体的な実施形態では、二価金属塩はカルシウム塩またはマグネシウム塩である。さらにより具体的には、二価金属塩はカルシウム塩である。他の具体的な実施形態では、金属塩は三価または四価金属塩である。本開示の調製方法において有用性を有する例示的な三価または四価金属塩には、ジルコニウム塩、チタン塩、およびビスマス塩が含まれる。一部の実施形態では、調製方法では、上に列挙された例示的な金属塩のいずれかを任意の組合せで含む、金属塩の組合せを利用する。一部の実施形態では、ポーラスシリコン前駆体粒子またはフィルムを治療剤および金属塩を含む水溶液で処理するステップが、単一のステップで実施される。
【００９１】
一部の実施形態では、ポーラスシリコン粒子またはフィルムを処理するのに使用される治療剤は、上に詳細に記載された治療剤のいずれかである。例えば薬剤は、低分子薬物、ビタミン、造影剤、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、アプタマー、またはその混合物であってよい。より具体的には、治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドであってよい。治療剤がオリゴヌクレオチドである実施形態では、治療剤は好ましくはリボヌクレオチド、またはさらにはｓｉＲＮＡであってよい。
【００９２】
調製方法は、ポーラスシリコン前駆体粒子またはフィルムをターゲティング薬剤と結合させるステップをさらに含んでいてよい。より具体的には、ターゲティング薬剤は、ニューロンターゲティング薬剤または上記の特定のターゲティング薬剤のいずれかであってよい。あるいはまたはさらに、調製方法は、ポーラスシリコン前駆体粒子を細胞透過性薬剤、より具体的には脂質化ペプチドまたは上記の特定の細胞透過性薬剤のいずれかと結合させるステップを含んでいてよい。具体的な実施形態では、調製方法は、ポーラスシリコン前駆体粒子をターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤と結合させるステップをさらに含んでいてよい。例示的なターゲティング薬剤および細胞透過性薬剤は上に詳細に記載されている。
医薬組成物
【００９３】
別の態様では、本開示は、本開示の粒子−またはフィルム−含有組成物、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、スプリンクルカプセル剤（ｓｐｒｉｎｋｌｅ  ｃａｐｓｕｌｅ）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、坐剤、注射剤などの単位剤形であってよい。組成物は経皮送達系、例えば皮膚貼付剤に存在していてもよい。
【００９４】
「薬学的に許容される」という語は、本明細書では、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、またはその他の問題もしくは合併症なしに、ヒト被験体を含む動物被験体の組織と接触させて使用するのに適した、妥当なベネフィット／リスク比に見合う、これらの化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すために使用される。
【００９５】
「薬学的に許容される担体」という語は、本明細書で使用される場合、本粒子含有組成物をある器官または体の部分から別の器官または体の部分まで運搬または輸送することに関与する、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入物質などの、薬学的に許容される物質、組成物、または媒体を意味する。各担体は、当業者が理解するように、製剤のその他の成分に適合し、患者に有害でないという意味で「許容」されなければならない。薬学的に許容される担体として機能し得る物質の一部の例には：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどの、その誘導体；（４）トラガカント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含の水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；および（２１）医薬製剤に使用されるその他の非毒性の適合物質が含まれる。Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２０版（Alfonso  R.  Gennaro編）、２０００年を参照のこと。本組成物の治療剤が核酸、具体的にはリボ核酸である場合、薬学的に許容される担体は好ましくは、例えばリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを実質的に含むべきでない。
【００９６】
本開示の粒子含有組成物を含む医薬組成物は、例えば、経口（例えば、水溶液または非水溶液または懸濁液としての水薬、錠剤、ボーラス剤、散剤、顆粒剤、舌に施用するペースト剤）；舌下；経肛門、経直腸、または経膣（例えば、ペッサリー、クリーム剤、またはフォーム剤として）；非経口（筋肉内、静脈内、皮下、または髄腔内を含む、例えば滅菌溶液または懸濁液として）；経鼻；腹腔内；皮下；経皮（例えば皮膚に施用される貼付剤として）；または局所（例えば、皮膚に施用されるクリーム剤、軟膏剤またはスプレー剤として）を含むいくつかの投与経路のいずれかにより、被験体に投与されてよい。組成物は吸入用に製剤化されてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の粒子含有組成物は、滅菌水中に溶解または懸濁されているだけでもよい。適切な投与経路およびそれに適した組成物の詳細は、例えば、米国特許第６，１１０，９７３号；第５，７６３，４９３号；第５，７３１，０００号；第５，５４１，２３１号；第５，４２７，７９８号；第５，３５８，９７０号；および第４，１７２，８９６号、ならびにそこに引用される特許で見つけることができる。
【００９７】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語は、本明細書で使用される場合、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内（intrathecal）、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を含む。
処置方法
【００９８】
治療剤の送達が制御下で有用にもたらされる方法において、本組成物が特に有用であることが判明した。例えば、かつ医薬組成物について上に記載されたように、方法は、当業者が理解するように、吸入、または任意のその他の適切な投与様式による、経口的、舌下的、経肛門的、経直腸的、経膣的、非経口的、経鼻的、腹腔内、皮下、経皮的、局所的な治療剤の送達において有用であり得る。好ましい実施形態では、処置方法は、治療剤をニューロン組織、具体的には脳にターゲティングする。
【００９９】
上記の通り、本開示の組成物はルミネセントであってよく、この特性により、これらの組成物を投与された被験体のモニタリングが促進され得る。したがって、一部の実施形態では、処置方法は、被験体または被験体から単離された組織をモニタリングするステップをさらに含む。本開示の組成物のいくつかにおけるフォトルミネセント特性を考慮すれば、特定の実施形態では、モニタリングするステップは光学的にモニタリングするステップである。
【０１００】
本発明またはその任意の実施形態の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物、方法、および施用に対しその他の適切な変更および改変を行うことができることが、当業者には容易に明らかであるはずである。これまで本発明について詳細に記載してきたが、例示のためだけに本明細書に含まれ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照することで、より明確に理解されるはずである。
【実施例】
【０１０１】
損傷した脳へのターゲティングされたｓｉＲＮＡ送達のための自己封入ポーラスシリコン−ケイ酸カルシウムコア−シェルナノ粒子
ポーラスシリコンナノ粒子（ｐＳｉＮＰ）中の高濃度のｓｉＲＮＡを同時にロードおよび保護するための一ステップ手順を提示する。ｓｉＲＮＡおよび塩化カルシウムを含有する水溶液によるｐＳｉＮＰの処理は、ケイ酸カルシウムの表面層が浸透したｓｉＲＮＡロードしたｐＳｉＮＰコア（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ）からなるコア−シェルナノ構造を生成する。このシェル中のシリケートの供給源は、ｐＳｉマトリックスの局所的な溶解に由来する。理論に縛られるつもりはないが、高濃度のカルシウム（ＩＩ）イオンを含有する溶液において、Ｃａ２ＳｉＯ４の形成は、主にナノ粒子表面で起こり、自己限定的であることが理解される。したがって、不溶性ケイ酸カルシウムシェルは、ｐＳｉＮＰコアの分解を遅らせ、ｓｉＲＮＡペイロードの送達を延長し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでより効果的な遺伝子ノックダウンをもたらすことが理解される。おそらくシリケートシェルの電子的不動態化の性質に起因して、ケイ酸カルシウムシェルの形成は、ポーラスシリコンコアからのフォトルミネセンスの外部量子収率を０．１から２１％まで増大する。ニューロンターゲティングペプチドとしての狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）および細胞透過部分としてのミリストイル化トランスポータン（ｍＴＰ）から誘導された配列をＣａ−ｐＳｉＮＰに組み込む２つの機能性ペプチドの結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子サイレンシングの改善およびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達の改善を示す構築物を産生する。
【０１０２】
低分子、タンパク質、および核酸ベースの治療剤の有効性における重大な制限は、バイオアベイラビリティである。低い溶解度を有する分子は、治療上有効な濃度で血流または他の体液に入らない場合があり（Mullerら（２００１年）Adv.  Drug  Deliver.  Rev.４７巻：３頁；Kataokaら（２０１２年）Pharm.  Res.  -Dordr.２９巻：１４８５頁；Kipp（２００４年）Int.  J.  Pharm.２８４巻：１０９頁）、より可溶性の治療剤は、意図された組織に達する前に、種々の生物学的プロセスによって循環系から迅速なクリアランスを受ける場合がある（Chonnら（１９９２年）J.  Biol.  Chem.２６７巻：１８７５９頁；Pirolloら（２００８年）Trends  Biotechnol.２６巻：５５２頁；Gabizonら（１９８８年）P.  Natl  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：６９４９頁）。ポーラスまたは中空のナノ構造への治療剤のローディングは、薬物送達の濃度−時間の関係を制御し、これによって治療効力を改善する手段として浮上している。Louら（２００８年）Adv.  Mater.２０巻：３９８７頁；Anglinら（２００８年）Adv.  Drug  Deliver.  Rev.６０巻：１２６６頁。薬物用のナノ構造担体における多くの研究は、「ソフト」粒子、例えば、リポソームおよびポリマーコンジュゲート（Guら（２０１１年）Chem.  Soc.  Rev.４０巻：３６３８頁；Nishiyamaら（２００６年）Pharmacol.  Therapeut.１１２巻：６３０頁）、またはより堅いポーラス無機物質、例えばメソポーラスシリコンもしくはシリコン酸化物（Parkら（２００９年）Nat.  Mater.８巻：３３１頁；Wuら（２００８年）ACS  Nano  ２巻：２４０１頁；Godinら（２０１０年）J.  Biomed.  Mater.  Res.  A  ９４ａ巻：１２３６頁）に基づいている。メソポーラスシリコンおよびシリコン酸化物は、薬物送達用途のために十分に研究されている無機および生分解性物質である。Anglinら（２００８年）Adv.  Drug.  Deliver.  Rev.６０巻：１２６６頁；Mengら（２０１０年）J.  Am.  Chem.  Soc.１３２巻：１２６９０頁；Mengら（２０１０年）ACS  Nano  ４巻：４５３９頁；Patelら（２００８年）J.  Am.  Chem.  Soc.１３０巻：２３８２頁；Luら（２００７年）Small  ３巻：１３４１頁；Shabirら（２０１１年）Silicon-Neth.３巻：１７３頁；Wangら（２０１０年）Mol.Pharmaceut.７巻：２２３２頁；Kashanianら（２０１０年）Acta  Biomater.６巻：３５６６頁；Canhamら、米国特許公開第２０１５／０３５２２１１号；Jiangら（２００９年）Phys.  Status  Solidi.  A  ２０６巻：１３６１頁；Fanら（２００９年）Phys.  StatusSolidi.  A  ２０６巻：１３２２頁；Salonenら（２００８年）J.  Pharm.  Sci.  US  ９７巻：６３２頁；Sailorら（２０１２年）Adv.  Mater.２４巻：３７７９頁；Ruoslahtiら（２０１０年）J.Cell.Biol.１８８巻：７５９頁。
【０１０３】
ポーラスシリコン（ｐＳｉ）の分解の機構は、シリコンコアを酸化してシリコン酸化物を形成し、続いて得られた酸化物相を水溶性オルトケイ酸（Ｓｉ（ＯＨ）４）またはその同族体に加水分解することを含むと理解される。Sailorら（２０１２年）Adv.  Mater.２４巻：３７７９頁。ｐＳｉナノ粒子の急速な分解を防ぐために、ｐＳｉの内部コアがより安定なシリコン酸化物（Jooら（２０１４年）Adv.  Funct.  Mater.２４巻；５６８８頁；Rayら（２００９年）J.  Appl.  Phys.１０５巻：０７４３０１頁）、酸化チタン（Bettyら（２０１１年）Prog.  Photovoltaics  １９巻：２６６頁；Liら（２０１４年）Biosens.  Bioelectron.５５巻：３７２頁；Jeongら（２０１４年）ACS  Nano  ８巻：２９７７頁）、炭素（Tsangら（２０１２年）ACS  Nano  ６巻：１０５４６頁；Zhouら（２０００年）Chem.  Phys.  Lett.３３２巻：２１５頁；Gaoら（２００９年）Phys.  Chem.  Chem.  Phys.１１巻：１１１０１頁）または他の動力学的に安定な物質（Buriak（２００２年）Chem.  Rev.１０２巻：１２７１頁）の層またはシェルによって取り囲まれている様々な「コア−シェル」タイプの構造が合成されている。コア−シェル構造は、ナノ構造内に治療剤をより効果的にトラップするために、薬物のローディングと合わせてシェルの合成を行うことができるので、薬物送達製剤をゆっくり放出するための魅力的なプラットフォームである。Fryら（２０１４年）Chem.  Mater.２６巻：２７５８頁。さらに、ｐＳｉのルミネセントシリコンドメインからのフォトルミネセンスの強度および持続性を向上させるコア−シェル構造の能力が実証されており（Jooら（２０１４年）Adv.  Funct.  Mater.２４巻：５６８８頁）、これによって、ナノ物質に薬物送達の特徴を画像化することおよび自己報告することが加えられる。
【０１０４】
この実施例で開示されるのは、薬物ローディングと同時にケイ酸カルシウムのシェルを沈殿させることによって、ｐＳｉナノ粒子（ｐＳｉＮＰ）中の高濃度のｓｉＲＮＡを同時にロードおよび保護するための一ステップ手順である。本発明を限定するものではないが、シェル中のシリケートの供給源は、ｐＳｉマトリックスの局所的な溶解に由来すると理解され、高濃度のカルシウム（ＩＩ）イオンを含有する溶液においては、Ｃａ２ＳｉＯ４の形成が主にナノ粒子の表面で起こり、自己限定的であることが判明した。カルシウムイオン溶液がｓｉＲＮＡも含有する場合、オリゴヌクレオチドは、シェル形成中にポーラスナノ構造内にトラップされるようになる。再度、本発明を限定する意図はないが、不溶性ケイ酸カルシウムシェルは、ポーラスシリコンコアの分解およびｓｉＲＮＡの放出を遅らせると理解される。ポーラスＳｉコアは、量子閉じ込め効果に起因する固有のフォトルミネセンスを示し、シェル形成プロセスは、おそらくシリケートシェルの電子的不動態化の性質に起因して、外部量子収率の０．１から２１％への増大をもたらすことが判明した。このシステムによる遺伝子送達の可能性を実証するために、ケイ酸カルシウムコーティングｐＳｉＮＰ（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ）を、シラノール化学によって改変して、２つの機能性ペプチド、１つはニューロンターゲティングのため、もう１つは細胞透過のためのペプチドをコンジュゲートした。得られた構築物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有意に改善された遺伝子サイレンシング効力を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的組織に送達され得る。
【０１０５】
図１に例示するように、ポーラスＳｉ粒子の（水性媒体中での）穏やかな酸化によって、Ｓｉコア上に薄い酸化物層が生成される。形成されると、酸化物層は、水和されて可溶化され、溶液中にＳｉ（ＯＨ）４を放出する。水溶液中に存在する高濃度のＣａ２＋およびｓｉＲＮＡはポア内に拡散し、Ｃａ２＋イオンは局所的に高濃度のＳｉ（ＯＨ）４と反応して、ナノ構造内のｓｉＲＮＡペイロードをトラップする沈殿物を形成する。
【０１０６】
（動的光散乱による）平均サイズ１８０±２０ｎｍのｐＳｉＮＰを、先に記載したように調製した。Qinら（２０１４年）Part.  Part.  Syst.  Char.３１巻：２５２頁。オリゴヌクレオチドおよび高濃度（３Ｍまたは４Ｍ）のＣａＣｌ２を含有する水溶液中で撹拌することにより、ｓｉＲＮＡペイロードを、一ステップでポーラスナノ構造にロードし、封入した。得られたｓｉＲＮＡロードしたケイ酸カルシウムキャップのｐＳｉＮＰ（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ）中のシリコン、カルシウムおよび酸素の存在を、エネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析によって確認した（図５Ａおよび５Ｂ）。残留塩化物は検出されなかった。ｐＳｉＮＰ中の酸素の量は、Ｃａ２＋溶液との反応のときに測定可能に増大し、ｐＳｉＮＰが反応中に酸化されることを実証した。
【０１０７】
カルシウムイオン処理前の空のｐＳｉＮＰ、Ｃａ２＋での処理後のｐＳｉＮＰ（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ）、ならびにｓｉＲＮＡのローディングおよびＣａ２＋での処理後のｐＳｉＮＰ（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（図２Ａ〜２Ｃ）によって、Ｃａ２＋との反応が特有のコーティングを生成することが示された。元素分析に基づいて、ケイ酸カルシウムの低溶解度を考慮して（Medinagonzalesら（１９８８年）Fert.Res.１６巻：３頁）、理論に拘泥するものではないが、キャッピング物質は、オルトケイ酸二カルシウム（Ｃａ２ＳｉＯ４）またはオルトケイ酸カルシウム、メタシリケートおよびシリコン酸化物の混合相であることが提唱される。粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）により、結晶性ケイ酸カルシウム相またはシリコン酸化物相は観察されなかったが、ＸＲＤスペクトル（図６Ａ）、ラマンスペクトル（５２０ｃｍ−１での特徴的Ｓｉ−Ｓｉ格子モード、図６Ｂ）およびＦＴＩＲスペクトル（図６Ｃ）で残留結晶性Ｓｉが観察された。窒素吸脱着等温線分析は、ｐＳｉＮＰのＣａ−ｐＳｉＮＰへの変換のときに、全ポア容積が８０％（１．３６±０．０３ｃｍ３／ｇから０．２９±０．０４ｃｍ３／ｇ）減少したことを示した（図２Ｄ）。以前の研究では、酸素がシリコンコアに取り込まれるときにｐＳｉの酸化がポア壁の膨潤に起因するポア容積の減少をもたらし得、このプロセスはポア内のペイロードの効果的なトラップをもたらし得ることが示された。Sailorら（２０１２年）Adv.  Mater.２４巻：３７７９頁；Fryら（２０１４年）Chem.  Mater.２６巻：２７５８頁。
【０１０８】
溶液中の単体シリコンの量を測定するために使用される光学的吸収測定によって、カルシウムイオンが存在しない場合、ｐＳｉＮＰの約４０％がｐＨ９の緩衝液中で８０分以内に分解されたことが示された。しかし、３Ｍまたは４ＭのＣａＣｌ２溶液（ｐＨ９でも）では、同じ期間に約１０％の分解しか観察されなかった（図７Ａ）。ケイ酸カルシウムシェルはまた、ｓｉＲＮＡカーゴの放出も妨げた；Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ製剤は、ｓｉＲＮＡが静電気手段によりｐＳｉＮＰで保持された（表面アミン基で修飾されたｐＳｉＮＰ、ｐＳｉＮＰ−ＮＨ２、図７Ｂ）製剤と比較して、生理的条件（ｐＨ７．４の緩衝液、３７℃）下で約５倍遅い放出を示した。したがって、トラップ反応は、ｓｉＲＮＡペイロードを効果的にカプセル化し、ｐＳｉコアを水性媒体中でのその後の酸化および加水分解から保護した。
【０１０９】
ｐＳｉＮＰとＣａＣｌ２溶液との間の反応の経過の間に種々の時間で得られたフォトルミネセンススペクトルは、強度の漸進的増加を示した（図２Ｅ）。さらに、フォトルミネセンスブルーのピーク波長は、反応が進行するにつれてシフトした。これらの現象（フォトルミネセンス強度の増加およびフォトルミネセンススペクトルのブルーシフト）の両方は、シリコンナノ微結晶上の不動態化表面層の成長を示す。Jooら（２０１４年）Adv.  Funct.  Mater.２４巻：５６８８頁；Petrovakochら（１９９２年）Appl.  Phys.  Lett.６１巻：９４３頁；Sa‘ar（２００９年）J.Nanophotonics  ３巻：０３２５０１頁。観察されたブルーシフトは、量子閉じ込めシリコンナノ粒子の典型であり、その発光波長は、サイズに強く依存し、量子閉じ込めシリコンドメインが小さくなるにつれてブルーシフトを示す。Jooら（２０１５年）ACS  Nano  ９巻：６２３３頁。ｐＳｉＮＰ−ケイ酸カルシウムコア−シェル構造（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ）のフォトルミネセンス発光量子収率（外部）は２１％であった（λｅｘ＝３６５ｎｍ、図８）。
【０１１０】
培養Ｎｅｕｒｏ−２ａ（マウス神経芽細胞腫）細胞上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性スクリーニングでは、５０μｇ／ｍＬまでのナノ粒子濃度でＣａ−ｐＳｉＮＰ製剤の有意な細胞傷害性が示されなかったので（図９）、システムにはターゲティングおよび治療的ペイロードを遺伝子サイレンシング研究のためにロードした（ローディング手順は、図１０に概略的に記載されている）。内在性遺伝子（ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ、ＰＰＩＢ）をサイレンシングすることができる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を選択して、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究のために治療的なペイロードを保持、保護および送達するケイ酸カルシウム化学物質の能力を試験した。ｐＳｉＮＰに３ＭのＣａＣｌ２の存在下でＰＰＩＢに対するｓｉＲＮＡをロードしたところ（ｓｉＰＰＩＢ）、得られたナノ粒子（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ）中で約２０ｗｔ％のｓｉＲＮＡ含量が得られた。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ構築物の形態は、ＴＥＭによる薬物を含まないＣａ−ｐＳｉＮＰ調製物と類似していると思われた（図２Ｃ）が、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡの表面電荷（ゼータ電位、図１１Ａ）は正でなく、負であった。薬物を含まないＣａ−ｐＳｉＮＰ調製物の正のゼータ電位は、粒子表面の過剰のＣａ２＋イオンに起因し、負に荷電したｓｉＲＮＡペイロードは、これらの電荷を、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ構築物中に全体的な負のゼータ電位を生じる程度まで中性にする。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡ治療剤のターゲティング送達および細胞内輸送を達成するために、次いで、組織ターゲティングペプチドおよび細胞透過性ペプチドを、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ構築物のケイ酸カルシウムシェルにグラフトした。ＰＥＧリンカーを使用して、これらのペプチドの両方を結合させて全身循環を改善した（図１０）。最初に、化学カップリング剤２−アミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）を、ナノ粒子表面にグラフトし、ペンダント一級アミン基を生成させた（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＮＨ２）。Sailorら（２０１２年）Adv.  Mater.２４巻：３７７９頁。ナノ粒子の最も外側の表面上の一級アミン基に起因して、Ｃａ−ｐＳｉ−ＮＨ２またはＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＮＨ２製剤のいずれかのＡＰＤＭＥＳ反応後に、ゼータ電位がさらに正になった（図１１Ａ）。次いで、マレイミド−ポリ（エチレン−グリコール）−スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＳＣＭ）種を使用して、機能的ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）種を、これらの一級アミンを介してＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＮＨ２にグラフトした。Jooら（２０１５年）ACS  Nano  ９巻：６２３３頁。スクシンイミジルカルボキシメチルエステルは、一級アミンとアミド結合を形成し、したがって、アミノ化ナノ粒子にＰＥＧを結合させる便利な手段を提供する。ＰＥＧ鎖の遠位端は、第２の官能基であるマレイミドを含有していた。マレイミドは、チオールと共有結合を形成し、ターゲティングおよび細胞透過性ペプチドの結合を可能にする。ここで「ｍＴＰ」と呼ばれる２つのペプチド種、ｍｙｒ−ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＧＧＣＣ）（配列番号１）および「ＦＡＭ−ＲＶＧ」と呼ばれる狂犬病ウイルス由来ペプチド５ＦＡＭ−（ＣＣＧＧ）ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号２）を調製し、マレイミド基と関連ペプチドのシステインチオールとの反応を介してＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ製剤にコンジュゲートさせた。ここで、「５ＦＡＭ」は、生体分子（λｅｘ／λｅｍ＝４９５／５１８ｎｍ）を標識するために一般的に使用されるアミン反応性フルオロフォアである蛍光標識５−カルボキシフルオレセインである。
【０１１２】
輸送体（ＴＰ）などの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ｓｉＲＮＡ送達のための有望な補助剤であることが判明している。ＣＰＰをナノ粒子に組み込むと、内部移行後のエンドサイトーシス逃避を増大させ、ｓｉＲＮＡノックダウン効率を増大し得る。しかし、ＣＰＰは、細胞型特異性を欠いている。この欠点を克服するために、ＣＰＰは、細胞特異的ターゲティングペプチドと組み合わされてタンデムペプチドとして知られているものを生成し、これらの構築物は極めて効率的なｓｉＲＮＡ送達剤であることが示されている。Renら（２０１２年）ACS  Nano  ６巻：８６２０頁。本実施例では、細胞透過性輸送体ペプチドを、ペプチドと細胞膜の脂質二重層（ｍＴＰ）との間の疎水性相互作用を高めるために、疎水性１３炭素脂肪族鎖を含有するミリストイル基に結合させた。Renら（２０１２年）Sci.  Transl.  Med.４巻：１４７ｒａ１１２。細胞ターゲティング機能は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで効果的なニューロン細胞ターゲティング効率を示した狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）由来のペプチド配列を用いて達成された。Alvarez-Ervitiら（２０１１年）Nat.  Biotechnol.２９巻：３４１頁；Lentz（１９９０年）J.  Mol.  Recognit.３巻：８２頁；Kumarら（２００７年）Nature  ４４８巻：３９頁。ＲＶＧおよびｍＴＰペプチドの両方をＣａ−ｐＳｉＮＰに結合させると、ここでは「Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＤＰＮＣ」と呼ばれる二重ペプチドナノ複合体が生じた。ｍＴＰまたはＲＶＧペプチドのみを含有する対照ナノ粒子も調製し、本明細書ではそれぞれＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｍＴＰまたはＣａ−ｐＳｉＮＰ−ＲＶＧと命名した。
【０１１３】
およそ０．０８６ｍｇのＲＶＧを、１ｍｇのＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧとコンジュゲートさせ、ＦＡＭ標識の相対蛍光によって決定した。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣ構築物の場合、およそ０．０３７ｍｇのＲＶＧおよび同等の量のｍＴＰをコンジュゲートした。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＤＰＮＣのフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルは、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｍＴＰおよびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ＲＶＧの全ての特徴的なピークを示した（図１２）。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ構築物の平均直径は、４０ｎｍのｐＳｉＮＰ出発物質に対して増大を表す２２０ｎｍ（ＤＬＳ  Ｚ平均、強度に基づく）であった。ＤＬＳデータでは有意な凝集物は観察されなかった（図１１Ｂ）。
【０１１４】
Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ構築物は、未処理対照と比較して、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞におけるＰＰＩＢ遺伝子活性の５２．８％のノックダウンをもたらした（図３）。遺伝子サイレンシングがナノ複合体の毒性によって引き起こされる可能性を排除するために、ルシフェラーゼ遺伝子（ｓｉＬｕｃ）に対する陰性対照ｓｉＲＮＡをロードした類似の製剤を試験したところ、未処理対照と比較して統計学的有意差は見られなかった。さらなる対照として、細胞透過性ペプチドまたは細胞ターゲティングペプチドのみを含有するナノ粒子の遺伝子サイレンシング効率を試験した（それぞれ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ｍＴＰおよびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧ）。これらの構築物の両方とも、ＰＰＩＢ遺伝子発現のいくらかの観察可能なノックダウン（未処理対照と比較して２７．１〜２８．９％）を示したが、サイレンシング効果は、個々にいずれかのペプチド系と比較して二重ペプチドナノ粒子Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣで大きかった（ｐ＜０．０３）。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ｍＴＰの場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察される遺伝子ノックダウンは、ｍＴＰの細胞透過効果が細胞型特異性を欠いているので、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性に翻訳されるとは予想されない。他方では、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧによるサイレンシングは、ＲＶＧ配列のＮｅｕｒｏ−２ａ細胞への特異的結合に起因するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのより有効な細胞局在化に起因する。遊離ｓｉＰＰＩＢ（ナノ粒子に含有されない）および裸のｐＳｉＮＰ（Ｃａキャッピング化学なし、ターゲティングペプチドなし、細胞透過性ペプチドなし）にロードされたｓｉＰＰＩＢを使用したさらなる対照は、統計的に有意なノックダウンを示さなかった。さらに、ナノ構築物を単離し、エタノール中で、４℃で７日間保存して、それらのＰＰＩＢ遺伝子ノックダウン効率を依然として保持することができた（図３）。
【０１１５】
そのさらに高いノックダウン効率と一致して、共焦点顕微鏡画像は、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ製剤が、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧ製剤よりもＮｅｕｒｏ−２ａ細胞に対してより大きな親和性を有することを示した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ製剤は、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧと比較して、その表面上に数のおよそ半数の蛍光ＦＡＭマーカー分子を有していた。１粒子あたりより低いＦＡＭ蛍光シグナルでさえ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣで処理したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞は、ＲＶＧのみの製剤に対する、この二重ペプチド構築物の細胞親和性が大きいため、より大きなＦＡＭシグナルを示した。Ｃａ−ｐＳｉＮＰは、ナノ粒子の量子閉じ込めＳｉドメインからの固有フォトルミネセンスに起因して、蛍光顕微鏡画像において可視である。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣで処理された細胞の場合、Ｓｉシグナルは、ＲＶＧターゲティングペプチド上のＦＡＭ標識からのシグナルと共局在化され、細胞内部移行を示す、組み合わせたシグナルが細胞質ゾルに見られる。これらの２つのナノ粒子構築物の細胞親和性は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によってさらに正確に定量され（図１４Ａ〜１４Ｄ）、このデータによって、二重ペプチドナノ粒子が、ＲＶＧペプチドのみを含有するナノ粒子よりもＮｅｕｒｏ−２ａ細胞をターゲティングするのに効率的であったことが示される（それぞれ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣおよびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＲＶＧについて５１．４±５．６％対３６．４±５．６％（Ｐ＜０．０４））。ＲＶＧペプチド上の、およびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ中のｓｉＰＰＩＢ上の個別の蛍光標識によって、細胞のうち６５．９±８．７％がＲＶＧおよびｓｉＰＰＩＢの両方を含有することが証明された（図１４Ｄ）。この結果、ＲＶＧおよびｍＴＰの両方をナノ粒子にコンジュゲートさせることにより、より大きい細胞親和性が生じ、その結果、より強い遺伝子ノックダウン効果が生じるという仮説が支持される。
【０１１６】
同じナノ粒子（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＰＰＩＢ−ＤＰＮＣ）上に細胞透過性および細胞ターゲティングペプチドの両方を有することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最も強い遺伝子ノックダウンがもたらされるので、この組合せをｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達について試験した。このｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、マウスにおける浸透性脳損傷を含んだ。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣを注射したマウスにおいて、脳損傷部位に相当量のｓｉＲＮＡが蓄積した（図４）。マウス（ｎ＝３）は、食塩水を注射した対照マウスの蛍光バックグラウンドと比較して、ｓｉＲＮＡペイロードに関連する蛍光強度が２倍大きいことを示した。ターゲティングされていないナノ粒子Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧと比較して、二重ペプチドＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣによるターゲティングの観察された有効性が統計的により大きかった（ｐ＜０．０２）。ターゲティングされていないＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ構築物を注射されたマウスは、おそらく損傷部位への受動的漏出に起因して、注射されていない対照マウスと比較して、脳においていくつかのｓｉＲＮＡ蛍光シグナルを示した。
【０１１７】
要約すると、この研究は、オリゴヌクレオチドを生分解性および本質的にフォトルミネセンス性のナノ粒子にロードし得る自己封入化学手順を実証している。かなりの量のｓｉＲＮＡをロードし得（＞２０質量％）、治療関連タイムスケールのためにペイロードを保持する。ケイ酸カルシウムシェルは、細胞ターゲティング（狂犬病ウイルス糖タンパク質由来のＲＶＧペプチド）および細胞透過性（ミリストイル化（myristolated）輸送体）ペプチド、ならびに２つのペプチドの組合せで容易に改変され、ケイ酸カルシウム化学物質がｓｉＲＮＡペイロードを保持して保護する能力を伴っており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで改善された細胞ターゲティングおよび遺伝子ノックダウンをもたらす。多価コア−シェルナノ粒子は循環して、生存マウスの脳損傷にｓｉＲＮＡペイロードを送達し、二重ターゲティングナノ粒子は、非ターゲティングナノ粒子と比較してｉｎ  ｖｉｖｏ脳損傷モデルにおけるｓｉＲＮＡの送達の改善を示す。
実験セクション
【０１１８】
ポーラスシリコンナノ粒子の調製：ｐＳｉＮＰは、公開された「穿孔エッチング」手順に従って調製した。Qinら（２０１４年）Part.  Part.  Syst.  Char.３１巻：２５２頁。高度にホウ素でドープされたｐ＋＋型シリコンウエハー（約１ｍΩ−ｃｍの抵抗率、１００ｍｍの直径、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ，Ｉｎｃ．）を、３：１（ｖ：ｖ）の４８％水性ＨＦ：エタノールから構成される電解質中に、陽極エッチングした。エッチング波形は、４６ｍＡ  ｃｍ−２の低い電流密度が１．８１８秒間印加され、続いて３６５ｍＡ  ｃｍ−２のより高い電流密度パルスが０．３６３秒間印加された、方形波からなっていた。この波形を１４０サイクル繰り返して、ポーラス層を通っておよそ２００ｎｍごとに繰り返される、薄い、高い気孔率の「穿孔」を有する層状ポーラスシリコン（ｐＳｉ）フィルムを生成した。１：２０（ｖ：ｖ）の４８％水性ＨＦ：エタノールを含有する溶液中に３．４ｍＡ  ｃｍ−２の電流密度を２５０秒間印加することによって、シリコン基板からフィルムを除去した。独立したｐＳｉフィルムを、脱イオン水中に浸漬し、約１２時間超音波処理することによって、平均（Ｚ平均、強度に基づく）直径１８０ｎｍのナノ粒子（図１１Ｂ）に破砕した。
【０１１９】
ケイ酸カルシウムコーティングされたｓｉＲＮＡロードポーラスシリコンナノ粒子（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ）の調製：塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の４Ｍのストック溶液を、２．２５ｇの固体ＣａＣｌ２（ＭＷ：１１０．９８、無水物、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を５ｍＬのＲＮＡｓｅフリー水に加えることによって調製した。その溶液を遠心分離して沈殿物を除去し、使用前に４℃で保存した。オリゴヌクレオチドのローディングのために、ＰＰＩＢ（１）、ＰＰＩＢ（２）、およびルシフェラーゼのノックダウンのための３種類の二本鎖ｓｉＲＮＡ構築物を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｉｎｃ．によって３’−ｄＴｄＴオーバーハングを用いて合成した。Ambardekarら（２０１１年）Biomaterials  ３２巻：１４０４頁；Waiteら（２００９年）BMC  Biotechnol.９巻：３８頁。ｓｉＲＮＡに対するＰＰＩＢ遺伝子について（ｓｉＰＰＩＢ）、それぞれｓｉＰＰＩＢ（１）およびｓｉＰＰＩＢ（２）を得て、ｓｉＰＰＩＢ（１）：ｓｉＰＰＩＢ（２）の１：１混合物を使用して、ｓｉＰＰＩＢ（１）については、ｓｉＲＮＡ配列センス５’−ＣＡＡ  ＧＵＵ  ＣＣＡ  ＵＣＧ  ＵＧＵ  ＣＡＵ  Ｃ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号３）およびアンチセンス５’−ＧＡＵ  ＧＡＣ  ＡＣＧ  ＡＵＧ  ＧＡＡ  ＣＵＵ  Ｇ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号４）、ならびにｓｉＰＰＩＢ（２）について、センス５’−ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＧＣＡ  ＵＣＵ  ＡＵＧ  ＧＵＧ  Ａ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号５）およびアンチセンス５’−ＵＣＡ  ＣＣＡ  ＵＡＧ  ＡＵＧ  ＣＵＣ  ＵＵＵ  Ｃ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号６）上の広範囲のＰＰＩＢ遺伝子をカバーした。ｓｉＲＮＡに対するルシフェラーゼ遺伝子（ｓｉＬｕｃ）を、ｓｉＲＮＡ配列センス５’−ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号７）およびアンチセンス５’−ＵＣＧ  ＡＡＧ  ＵＡＣ  ＵＣＡ  ＧＣＧ  ＵＡＡ  Ｇ  ｄＴｄＴ−３’（配列番号８）上で得た。ｐＳｉＮＰ（１ｍｇ）をオリゴヌクレオチド溶液（１５０μＬ、ｓｉＲＮＡ中１５０μＭ）中に分散させ、ＣａＣｌ２ストック溶液（８５０μＬ）に加えた。この混合物を６０分間かき混ぜ、ＲＮＡｓｅフリー水、７０％エタノールおよび１００％エタノール中への連続的な分散／それからの遠心分離によって精製した。ｓｉＲＮＡローディング効率を分析するために、各遠心分離ステップからの上清を回収し、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＮＤ−２０００）を使用して遊離ｓｉＲＮＡについてアッセイした。対照として、ｓｉＲＮＡを含まないＣａ−ｐＳｉＮＰを、ｓｉＲＮＡの添加は除外したが、上記と同じ方法で調製した。
【０１２０】
Ｃａ−ｐＳｉＮＰへのペプチドのコンジュゲーション：調製したままのＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ、Ｃａ−ｐＳｉＮＰまたはｐＳｉＮＰ試料（１ｍｇ）を、無水エタノール（１ｍＬ）に懸濁し、アリコート（２０μＬ）のアミノプロピルジメチルエトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）を加え、その混合物を２時間かき混ぜた。次いで、無水エタノールからの遠心分離によって、アミノ化ナノ粒子（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＮＨ２、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＮＨ２、またはｐＳｉＮＰ−ＮＨ２）を３回精製して、結合していないＡＰＤＭＥＳを排除した。ヘテロ官能性リンカーであるマレイミド−ＰＥＧ−スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＳＣＭ、ＭＷ：５，０００、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、エタノール中５ｍｇ／ｍＬ）またはメトキシ−ＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート（ｍＰＥＧ−ＳＭＢ、Ｍｗ：５，０００、ＮＥＫＴＡＲ、エタノール中５ｍｇ／ｍＬ）の溶液（２００μＬ）を、アミノ化ナノ粒子（１００μＬ中１ｍｇ）に加え、２時間かき混ぜた。結合していないＰＥＧリンカー分子は、エタノールからの３回の遠心分離によってＰＥＧ化ナノ粒子（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧまたはＣａ−ｐＳｉＮＰ−ＰＥＧ）から排除した。ペプチドコンジュゲートした製剤については、以下のペプチド構築物２つのうちの１つを使用した：ペプチド配列ｍｙｒ−ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（ＧＧＣＣ）（配列番号１）上のＮ末端グリシン残基にアミド結合によって共有結合したミリストイル基（ｍｙｒ）からなるｍＴＰ、またはペプチド配列５−ＦＡＭ（ＣＣＧＧ）ＹＴＩＷＭＰＥＮＰＲＰＧＴＰＣＤＩＦＴＮＳＲＧＫＲＡＳＮＧ（配列番号２）上のＮ末端システイン残基にアミド結合によって結合した５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）からなるＦＡＭ−ＲＶＧのいずれか。これらの構築物の両方とも、ＣＰＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（ＲＮＡｓｅフリー水中１ｍｇ／ｍＬ）から得た。Ｃａ−ｐＳｉＮＰ二重ペプチドナノ複合体（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＤＰＮＣまたはＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣ）合成のために、５０μＬの各ペプチド溶液（ｍＴＰおよびＦＡＭ−ＲＶＧ）を、エタノール中の１００μＬのＣａ−ｐＳｉＮＰ−ＰＥＧに加えて、４℃で４時間インキュベートし、遠心分離で３回精製し、エタノールに浸漬し、使用前に４℃で保存した。単一のペプチドコンジュゲートしたＣａ−ｐＳｉＮＰ（Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ｍＴＰまたはＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ）対照試料の合成のために、１００μＬのペプチド溶液（ｍＴＰまたはＦＡＭ−ＲＶＧ）を、それぞれ、エタノール中の１００μＬのＣａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＧに加えた。その後の後処理は、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＰＮＣ構築物について上記したものと同じであった。
【０１２１】
特徴付け：透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を、ＪＥＯＬ−１２００  ＥＸ  ＩＩ装置で得た。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像およびエネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）データは、ＦＥＩ  ＸＬ３０電界放出装置を使用して得た。流体力学的サイズおよびゼータ電位を、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ９０、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。オーシャンオプティクスＱＥ−Ｐｒｏ分光計を使用して、４６０ｎｍのロングパスエミッションフィルターを用いて定常状態のフォトルミネセンススペクトル（λｅｘ：３６５ｎｍ）を得た。量子収率測定は、ローダミン６Ｇと比較してエタノール標準（Ｑ．Ｙ．９５％）で行った。量子収率測定に使用した全ての溶液は、λ＝３６５ｎｍで０．１未満の光吸収値を有していた。波長範囲５００〜９８０ｎｍのフォトルミネセンス強度を積分し、吸光度に対してプロットした（図８）。窒素吸脱着等温線は、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  ＡＳＡＰ２０２０装置を用いて７７Ｋの温度で乾燥粒子に対して得られた。フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ６７００  ＦＴＩＲ装置を使用して記録した。５３２ｎｍレーザ励起源を有するＲｅｎｉｓｈａｗ  ｉｎＶｉａ  Ｒａｍａｎ顕微鏡を使用して、ラマンスペクトルを得た。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験：マウスＮｅｕｒｏ−２ａ神経芽腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３１）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）中で培養した。合成されたナノ粒子の細胞傷害性を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｋｉｔ（分子プローブ生／死率／細胞毒性キット）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して評価した。Yeeら（２００６年）Adv.  Ther.２３巻：５１１頁。このキットは、２つのプローブ、生細胞染色（λｅｘ／λｅｍ＝４９４／５１７ｎｍ）用のカルセインＡＭおよび死細胞染色（λｅｘ／λｅｍ＝５２８／６１７ｎｍ）用のエチジウムホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）を使用する。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞（３０００個の細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート中で三重にナノ粒子で処理した。４８時間後、各ウェルを洗浄し、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水中の４μＭのＥｔｈＤ−１および２μＭのカルセインＡＭからなるアッセイ溶液で処理した。アッセイ溶液中で、室温で４５分間インキュベートした後、励起、発光、およびカットオフ波長４８５／５３８／５１５ｎｍおよび５４４／６１２／５９０ｎｍをそれぞれ使用して、ウェルプレートを、蛍光プレートリーダー（Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＰＳ分光蛍光光度計、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で読み取った。処理群１つあたり合計１５個のウェルを評価し、未処理対照蛍光強度のパーセンテージとしてプロットした。
【０１２３】
ナノ粒子で処理したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を、４０倍油浸対物レンズを使用して、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０  ＮＬＯ）で視覚化した。細胞を、カバースリップ（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐ、２２ｍｍ）上に播種し、ナノ粒子と共に２時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで核を染色してマウントした（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ）。ナノ粒子で処理したＮｅｕｒｏ−２ａ細胞を定量し、ＦＡＣＳ分析（ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ）によって細胞親和性およびｓｉＲＮＡ送達効率を実証した。
【０１２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのノックダウン効率を検討するために、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ  ｑＰＣＲシステム）分析を実施して、ＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ発現を調べた。Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞を、２４ウェルプレート（１ウェルあたり４×１０４個の細胞）に播種し、１００ｎＭのｓｉＲＮＡに対応する濃度でｓｉＲＮＡロードしたナノ粒子と共にインキュベートした。４８時間後、細胞を採取し、製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）に従って全ＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡを、製造業者のプロトコール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）に従ってｃＤＮＡに転写した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して合成ｃＤＮＡをｑＰＣＲ分析に供した。標的ｍＲＮＡ増幅としてのＰＰＩＢおよび参照ｍＲＮＡ増幅としてのＨＰＲＴのためのプライマー配列を以下に記載する。ＰＰＩＢフォワード：ＧＧＡＡＡＧＡＣＴＧＴＴＣＣＡＡＡＡＡＣＡＧＴＧ（配列番号９）、ＰＰＩＢリバース：ＧＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＧ（配列番号１０）；ＨＰＲＴフォワード：ＧＴＣＡＡＣＧＧＧＧＧＡＣＡＴＡＡＡＡＧ（配列番号１１）、ＨＰＲＴリバース：ＣＡＡＣＡＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＴＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号１２）。全ての手順は三重で行った。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験：全ての動物実験は、ＭＩＴ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣ）ならびにＳａｎｆｏｒｄ  Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｐｒｅｂｙｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅによって承認されたプロトコールのもとで実施された。この研究で使用された実験動物の全ての住居およびケアは、ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（研究における実験動物のケアおよび使用のためのＮＩＨガイド）（文書１８０Ｆ２２参照）ならびにＵＳＤＡによって発行された全ての要件および規制（補正として（文書１８−Ｆ２３参照）Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ（Ｐ．Ｌ．８９−５４４）を実行する規制を含む）に従った。ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、マウスにおける浸透性脳損傷を含んだ。最初に、マウスの右半球上の頭蓋骨の直径５ｍｍ部分を除去した。３×３グリッドの２１ゲージの針を使用して創傷を誘導し、各々３ｍｍの深さの合計９つの創傷を得た。損傷誘発後、頭蓋骨を置換した（図１５）。尾静脈を介して損傷の６時間後、マウスにナノ粒子構築物を注射した。ターゲティング損傷部位へのｓｉＲＮＡカーゴの送達効率を定量するために、Ｄｙ６７７標識（λｅｍ＝７００ｎｍ）ｓｉＲＮＡを、Ｃａ−ｐＳｉＮＰ−ＰＥＧおよびＣａ−ｐＳｉＮＰ−ＤＰＮＣにロードし、これらの製剤の各々を別個のマウスに注射した。１時間の循環後、マウスを灌流し、臓器を採取した。
【０１２６】
採取された臓器の蛍光画像は、従来のＩＶＩＳ２００、キセノゲン、およびＰｅａｒｌ  Ｔｒｉｌｏｇｙ、Ｌｉ−Ｃｏｒイメージングシステムを使用して得た。
【０１２７】
統計解析：本明細書中に提示される全てのデータは、平均±平均の標準誤差として表される。有意性検定は、両側スチューデントｔ検定を使用して行った。他に示さない限り、ｐ＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。
代替的なポーラスシリコン金属ケイ酸塩コア−シェル粒子
【０１２８】
代替的なコア−シェル粒子構造をまた、さらなる検討および特徴付けのために調製している。図１６は、４Ｍの塩化カルシウム、４Ｍの塩化マグネシウムおよびｐＨ９の緩衝液の溶液中で、電気化学的にエッチングされたポーラスシリコン粒子の超音波処理によって生成されたポーラスシリコン微粒子（ｐＳｉＭＰ）のＸ線回折スペクトルを示す。ｐＨ９の緩衝液で処理したｐＳｉＭＰのＸ線回折スペクトルは、有意なピークを示さず、これはｐＳｉＭＰがほとんど酸化されていることを示している。塩化マグネシウムから形成された粒子は、ほとんど分解も酸化も示さず、その代わりに結晶シリコンの強いスペクトルを示す。この観察によって、金属の静電吸着またはアモルファスシリケート形成のいずれかに起因して、起こり得るより強力かつ安定したマグネシウム−シリコン相互作用が示される。塩化カルシウムから形成された粒子は、結晶シリコンからいくらかのピークを示すだけでなく、結晶性ケイ酸カルシウム結合から生じ得るより多くのピークも示す。しかし、マグネシウムから形成された粒子と比較すると、おそらくシリコンマトリックスの周りのより薄いまたはより均一でないシェル形成の結果として、ピークははるかに弱い。
【０１２９】
ｐＳｉＭＰ（ｐＨ９の緩衝液）、Ｍｇ−ｐＳｉＭＰ、およびＣａ−ｐＳｉＭＰのポア構造は、窒素吸脱着等温線分析（表１）によって特徴付けられる。熱酸化されたｐＳｉＭＰについて結晶シリコンのさらなる酸化は起こり得ないが、ポア内のカルシウムおよびマグネシウム層の形成が、ポア容積の有意な低下によって観察された。
【表１】
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【０１３０】
上述のように、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびカルセインを含むアニオン性分子は、好都合な静電相互作用に起因してケイ酸カルシウム形成中に２０ｗｔ％を超えるローディング効率でポーラスシリコン粒子上にロードされ得る。ポーラスシリコン粒子上のＲｕ（ｂｐｙ）、クロラムフェニコール、バンコマイシンおよびローダミンＢなどのカチオン性または双性イオン性分子のローディングおよび放出も評価されている。特に、双性イオン性（ローダミンＢ）またはカチオン性（Ｒｕ（ｂｐｙ））分子のローディング効率は、アニオン性分子よりも低いが、トラップ機構に起因してより長い持続放出を示す（図１７Ａ〜１７Ｃ）。抗生物質クロラムフェニコールおよびバンコマイシンをロードされたＣａ−ｐＳｉＮＰのローディング効率、放出動態およびフォトルミネセンスプロファイルを、図１８Ａ〜１８Ｂに示す。組み込まれた薬物分子は、生理学的状態で徐々に放出され、フォトルミネセンス減少プロファイルと相関したが、放出動態はフォトルミネセンス減少プロファイルよりも幾分遅かった。
【０１３１】
本明細書において言及される全ての特許、特許公報および他の公開された参考文献は、各々が個々にかつ具体的に参照により本明細書に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
特定の例が提供されているが、上記の説明は例示的なものであり、限定的なものではない。前述の実施形態のいずれか１つまたは複数の特徴は、本発明における任意の他の実施形態の１つまたは複数の特徴と任意の方法で組み合わされてもよい。さらに、本発明の多くの変形が、本明細書を検討すれば当業者には明らかになる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に参照することによって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
2019511582.tif 000016
【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月8日(2019.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511582000001.app
【国際調査報告】
2019511582.tif 000023
2019511582.tif 000024
2019511582.tif 000025