(57)【要約】  本発明は、血液凝固剤として処置するための、および／または出血状態の処置もしくは予防で使用するための血小板糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）の阻害剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液凝固剤として使用するための、血小板糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）の阻害剤。
【請求項２】
出血状態の処置または予防で使用するための、血小板糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）の阻害剤。
【請求項３】
前記出血状態が血小板障害によって引き起こされる、請求項２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
前記血小板障害が血小板数の減少を特徴とする、請求項３に記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
前記出血状態が、炎症性出血、出血性卒中、敗血症が原因の過度の出血、血小板減少が原因の過度の出血、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）が原因の過度の出血、化学療法が原因の過度の出血、溶血性尿毒症症候群が原因の過度の出血、可溶性ＧＰＶの投与の際の過度の出血およびＨＩＶ感染症が原因の過度の出血からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
前記ＧＰＶがヒトＧＰＶである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項７】
ＧＰＶの細胞外ドメインに対する抗体または抗体の機能的断片もしくは誘導体であり、前記断片または誘導体がＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項８】
前記抗体、断片または誘導体が、ＧＰＶのコラーゲン結合部位と異なる、ＧＰＶの細胞外ドメインの領域に結合する、請求項７に記載の使用のための阻害剤。
【請求項９】
前記抗体、断片または誘導体がコラーゲン誘導性凝集を遅らせない、請求項７に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体またはその機能的断片もしくは機能的誘導体である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１１】
ＧＰ５  ｍＲＮＡの発現を低減させることができる核酸である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１２】
対象に投与する際に、前記対象の血小板の数に影響を及ぼさない、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
血液凝固剤として使用される、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
前記処置または予防が、医薬的に有効量の前記阻害剤を対象に、好ましくはヒトに投与することを含む、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１５】
前記処置または予防が、前記阻害剤以外の血液凝固剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１４に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１６】
前記阻害剤以外の前記血液凝固剤が、抗線溶剤、血小板濃縮物、凝固因子濃縮物および新鮮な凍結血漿からなる群から選択される、請求項１５に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の阻害剤および医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
出血状態の処置または予防で使用するための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
対象、好ましくはヒトにおいて、出血状態を処置する方法であって、有効量の請求項１〜１３のいずれか１項に記載の阻害剤または請求項１７に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
血管損傷部位における血小板活性化および引き続く血栓形成は正常な止血に極めて重要であるが、これはまた、心筋梗塞および卒中の原因になり得る（非特許文献１）。血小板の接着および活性化は、複数の血小板受容体−リガンド相互作用が関与する多段階プロセスである。血管壁損傷の際に、循環血小板は、露出した内皮下細胞外基質（例えばコラーゲン）上に固定化されたフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）との糖タンパク質（ＧＰ）Ｉｂ−Ｖ−ＩＸ複合体の一過的な相互作用によって、急速に減速する（非特許文献２）。この相互作用は、血小板を血管壁の近くにとどめておき、ＧＰＶＩとコラーゲンの間の接触を促進する（非特許文献３）。ＧＰＶＩ−コラーゲン相互作用は、血小板の活性化ならびに第２の血小板アゴニスト、例えば、トロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の放出につながる細胞内シグナリングカスケードを誘導する。これらの可溶性アゴニストは、局部的に生成されたトロンビンとともに、Ｇタンパク質（Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２／１３）結合受容体を介して、さらに血小板活性化に寄与する（非特許文献４）。これらシグナリング経路のすべてが協力して、複雑な細胞応答、例えば、インテグリンの活性化、顆粒内容物の放出および凝固カスケードの活性化のための凝固促進表面の供給を誘導する（非特許文献５；非特許文献６）。最終的な血栓は、フィブリンネットワークに埋め込まれ、流動している血液によって生成される剪断力に耐える。新しく形成された血栓の安定化は、血管損傷部位で出血を止めるのに必須である。
【０００２】
血小板接着におけるこれらの中心的役割は、以下の２つの受容体複合体を血小板研究の中心にする：ｉ）損傷した血管壁または活性化した血小板上に固定化されたｖＷＦと相互作用し、それによって、剪断が高まった条件下で血流から血小板を反応表面に動員するＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ複合体。ｉｉ）アゴニスト受容体によって媒介されるインサイドアウトの活性化を必要とし、剪断抵抗性血小板接着を安定させるのに寄与し、凝集体形成に必須である、フィブリノーゲンおよびｖＷＦに対する受容体である、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（インテグリンαＩＩｂβ３）。ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸ複合体は、４つの関連する膜貫通型ＧＰ：ＧＰＩｂα、ＧＰＩｂβ、ＧＰＶおよびＧＰＩＸからなり、これらは、２：４：２：１の化学量で結合している（非特許文献７）。この複合体内で、ＧＰＩｂαおよびＧＰＩｂβはジスルフィド結合しており、ＧＰＩＸと非共有結合的に結合している。ＧＰＶは、ＧＰＩｂ−ＩＸと非共有結合的に結合している（非特許文献８）。およそ３０，０００コピーのＧＰＩｂ−ＩＸ複合体がヒト血小板の表面に見いだされる（非特許文献９）。ＧＰＩｂ−Ｖ−ＩＸの機能の喪失により、重度の出血障害であるベルナール−スリエ症候群（ＢＳＳ）が引き起こされる。ＢＳＳは、ｖＷＦへの接着に欠陥があり、トロンビン応答性が低減している、異常で巨大な循環血小板を特徴とする（非特許文献１０）。ＧＰＩｂまたはＧＰＩＸの欠如または機能障害はＢＳＳに関連するが、ＧＰ５の機能喪失変異は報告されておらず、マウスのＧＰＶの欠如はＢＳＳ表現型をもたらさない（非特許文献１１；非特許文献１２）。ＧＰＶは、複合体の正確な発現に必要とされない唯一のサブユニットである（非特許文献１３）。ＧＰＶは高度にグリコシル化されており、トロンビンの存在下で、血小板の表面からのＧＰＶの量的な除去および可溶性ＧＰＶ（ｓＧＰＶ）の生成につながるトロンビン切断部位を含む（非特許文献１４；非特許文献１５）。注目すべきことに、このトロンビン切断部位は、マウス、ラットおよびヒトのタンパク質で保存されている（非特許文献１４）。しかし、トロンビン刺激の際に応答しないプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）４−欠損マウス（非特許文献１２；非特許文献１６）と対照的に、Ｇｐ５−／−マウスは、肉眼的に正常な血小板機能性を示す。
【０００３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｇｐ５−／−血小板は野生型血小板とほとんど識別できない（非特許文献１１；非特許文献１２）。閾値用量のトロンビンで活性化した後のみ応答性の増大が観察され（非特許文献１１）、これは、ＰＡＲと競合するトロンビンの代替の基質としてのＧＰＶの欠如の結果とみなされた。２つのＧｐ５−／−マウス系統のうちの１つについては、尾の出血時間の低減、血栓形成の加速および塞栓形成の増大が報告されたが（非特許文献１１；非特許文献１７）、第２のマウスラインの解析によって、尾の出血時間の未変化および血栓形成の障害が明らかになった（非特許文献１２；非特許文献１８）。後者の群は、不完全な血栓形成をコラーゲンシグナリングにおけるＧＰＶの役割のせいにされ、それによって、コラーゲンをＧＰＶに対するリガンドとして証明した（非特許文献１８）。Ｇｐ５−／−マウスに関する最新の報告は、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドと戻し交配したマウスを使用し、トロンビン応答性の増大およびコラーゲンに対するわずかに低減した接着を確認した。レーザー損傷を使用して、本発明者らは、血栓形成に対するＧＰＶ欠損の影響は損傷の重症度に依存することを示し、ＧＰＶは動脈の血栓形成について関連性はわずかしかないと結論した（非特許文献１９）。これまで、血栓形成および止血におけるＧＰＶの役割は、止血および血小板機能の維持について、関連性はわずかしかないように思われる。しかし、血栓形成、止血および血栓炎症性脳梗塞におけるＧＰＶの正確な機能は、依然としてほとんど理解されていないままである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｏｕｇｈｌｉｎ  ＳＲ．Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０７：２５８〜６４
【非特許文献２】Ｓｈａｐｉｒｏ  ＭＪら、ＪＢＣ．２０００；２７５：２５２１６〜２１
【非特許文献３】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２：４４９〜６１
【非特許文献４】Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  Ｓ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００６；９９：１２９３〜３０４
【非特許文献５】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｍａｔｓｕｉ  Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０４：６０９〜１３
【非特許文献６】Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＭＡら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０００；１９１：４５５〜６２
【非特許文献７】Ｌｕｏ  Ｓ．−Ｚら、Ｂｌｏｏｄ，２００７．１０９（２）：６０３〜９
【非特許文献８】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００９；７：２０６〜９
【非特許文献９】Ｖａｒｇａ−Ｓｚａｂｏ  Ｄら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００９；７：１０５７〜６６
【非特許文献１０】Ｃａｎｏｂｂｉｏ  Ｉら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．２００４；１６：１３２９〜４４
【非特許文献１１】Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  Ｖら、ＰＮＡＳ．１９９９；９６：１３３３６〜４１
【非特許文献１２】Ｋａｈｎ  ＭＬら、Ｂｌｏｏｄ．１９９９；９４：４１１２〜２１
【非特許文献１３】Ｄｏｎｇ  Ｊ−ｆら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３：３１４４９〜５４
【非特許文献１４】Ｒａｖａｎａｔ  Ｃら、Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３２５３〜６２
【非特許文献１５】Ａｚｏｒｓａ  ＤＯら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１９９９；８１：１３１〜８
【非特許文献１６】Ｋａｈｎ  ＭＬら、Ｎａｔｕｒｅ．１９９８；３９４：６９０〜４
【非特許文献１７】Ｎｉ  Ｈら、Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：３６８〜７３
【非特許文献１８】Ｍｏｏｇ  Ｓら、Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１０３８〜４６
【非特許文献１９】Ｎｏｎｎｅ  Ｃら、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００８；６：２１０〜２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、驚いたことに、ＧＰＶのコラーゲン結合部位と異なる、ＧＰＶの細胞外ドメインの領域に対する抗体で処置したマウスが、ｉｎ  ｖｉｖｏで血栓形成に対する時間の加速を示すことを発見した。さらに、ＧＰＶの抗体媒介性遮断は、ｉｎ  ｖｉｖｏの血栓形成および止血において、ＧＰＶＩの欠如を十分に補うことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は以下の実施形態［１］〜［２８］に関する：
［１］血液凝固剤として使用するための、糖タンパク質Ｖ（血小板糖タンパク質Ｖ；ＧＰＶ）の阻害剤。
［２］出血状態の処置または予防で使用するための、糖タンパク質Ｖ（血小板糖タンパク質Ｖ；ＧＰＶ）の阻害剤。
［３］前記出血状態が血小板障害によって引き起こされる、実施形態［２］に記載の使用のための阻害剤。
［４］前記血小板障害が血小板数の減少を特徴とする、実施形態［３］に記載の使用のための阻害剤。
［５］血小板障害が、血小板減少症、例えば、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、化学療法に起因する血小板減少症または免疫性血小板減少症である、実施形態［３］または［４］に記載の使用のための阻害剤。
［６］前記出血状態が、炎症性出血、出血性卒中、敗血症が原因の過度の出血、血小板減少が原因の過度の出血、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）が原因の過度の出血、化学療法が原因の過度の出血、溶血性尿毒症症候群が原因の過度の出血、可溶性ＧＰＶの投与の際の過度の出血およびＨＩＶ感染症が原因の過度の出血からなる群から選択される、実施形態［２］〜［４］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［７］前記ＧＰＶがヒトＧＰＶである、実施形態［１］〜［６］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［８］前記ヒトＧＰＶが配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、またはその配列からなる、実施形態［７］に記載の使用のための阻害剤。
［９］ポリペプチドである、実施形態［１］〜［８］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［１０］（ｉ）ＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる抗体、（ｉｉ）ＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる、抗体の断片もしくは誘導体、（ｉｉｉ）ＧＰＶの細胞外ドメイン内のエピトープに結合することができる抗体、または（ｉｖ）ＧＰＶの細胞外ドメイン内のエピトープに結合することができる、抗体の断片もしくは誘導体である、実施形態［９］に記載の使用のための阻害剤。
［１１］前記細胞外ドメインが配列番号３のアミノ酸１〜５０３を含む、またはそれからなる、実施形態［１０］に記載の使用のための阻害剤。
［１２］前記抗体、断片または誘導体が、ＧＰＶのコラーゲン結合部位と異なる、ＧＰＶの細胞外ドメインの領域に結合する、実施形態［１０］または［１１］に記載の使用のための阻害剤。
［１３］前記抗体、断片または誘導体がコラーゲン誘導性凝集を遅らせない、実施形態［１０］〜［１２］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［１４］前記エピトープがＧＰＶのコラーゲン結合部位の外側にある、および／またはＧＰＶのコラーゲン結合部位と重複しない、実施形態［１０］〜［１３］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［１５］前記抗体がモノクローナル抗体またはその機能的断片もしくは機能的誘導体である、実施形態［１０］〜［１４］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［１６］核酸である、実施形態［１］〜［１５］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［１７］前記核酸がＧＰＶの発現を低減させることができる、実施形態［１６］に記載の使用のための阻害剤。
［１８］前記核酸がアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡからなる群から選択される、実施形態［１７］に記載の使用のための阻害剤。
［１９］前記核酸がＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる、実施形態［１６］に記載の使用のための阻害剤。
［２０］前記核酸がアプタマーである、実施形態［１９］に記載の使用のための阻害剤。［２１］対象に投与する際に、前記対象の血小板の数に実質的に影響を及ぼさない、実施形態［１］〜［２０］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［２２］血液凝固剤として使用される、実施形態［２］〜［２１］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［２３］前記処置または予防が、医薬的に有効量の前記阻害剤を対象に、好ましくはヒトに投与することを含む、実施形態［２］〜［２２］のいずれか１つに記載の使用のための阻害剤。
［２４］前記処置または予防が、前記阻害剤以外の血液凝固剤を前記対象に投与することをさらに含む、実施形態［２３］に記載の使用のための阻害剤。
［２５］前記阻害剤以外の前記血液凝固剤が、抗線溶剤、血小板濃縮物、凝固因子濃縮物および新鮮な凍結血漿からなる群から選択される、実施形態［２４］に記載の使用のための阻害剤。
［２６］実施形態［１］〜［２５］のいずれか１つに記載の阻害剤および医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
［２７］出血状態の処置または予防で使用するための、実施形態［２６］に記載の医薬組成物。
［２８］対象、好ましくはヒトにおいて、出血状態を処置する方法であって、有効量の、実施形態［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の阻害剤または実施形態［２６］に記載の医薬組成物を該対象に投与することを含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】モノクローナル抗ＧＰＶ抗体８９Ｆ１２がＧＰＶの細胞外ドメインに結合することを示す図である。（Ａ）フローサイトメトリーによって評価した場合に、８９Ｆ１２−ＦＩＴＣはＷＴに結合するが、ＧＰＶ欠損血小板には結合しない。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ系において、８９Ｆ１２−ＨＲＰは組換えマウスｓＧＰＶを検出する。
【図２】モノクローナル抗ＧＰＶ抗体８９Ｆ１２が、血小板数およびＧＰＶのトロンビン媒介性切断に影響を及ぼすことなく、ＧＰＶの細胞外ドメインに結合することを示す図である。（Ａ、Ｂ）８９Ｆ１２  １００μｇを静脈内注射し、その後、血小板数およびＧＰＶの表面発現を解析した。（Ｃ）フローサイトメトリーによって評価した場合に、抗体８９Ｆ１２はＧＰＶのトロンビン媒介性切断に影響を及ぼさない。（Ｄ）８９Ｆ１２は、トロンビンに反応するαＩＩｂβ３インテグリン媒介性血小板活性化およびＰ−セレクチン曝露を変化させない。
【図３】８９Ｈ１１はＧＰＶのコラーゲン結合部位を遮断するが、８９Ｆ１２は遮断しないことを示す図である。コラーゲン結合インテグリンα２β１（Ｉｔｇａ２−／−）を欠くマウス由来の洗浄したマウス血小板を、ビヒクル（黒色の曲線）または抗ＧＰＶ抗体８９Ｈ１１（ライトグレー）もしくは８９Ｆ１２（ダークグレー）の存在下で、２μｇ／ｍｌの線維性コラーゲンで刺激した。各群あたり４マウスを用いる２つの独立した実験の代表的な凝集測定曲線を示す。
【図４】抗体８９Ｆ１２が野生型マウスにおいて止血を増し、ＧＰＶＩ／ＣＬＥＣ−２二重欠損動物において止血を回復させることを示す図である。指定されるマウスラインの尾の出血時間を示す。各記号は１匹の動物を示す。マウスが出血を止めることができない場合には、フィッシャーの正確確率検定を使用してＰ値を計算した。
【図５】抗体８９Ｆ１２がＧＰＶＩ／ＩＴＧＡ２二重欠損マウスにおいて止血を回復させることを示す図である。指定されるマウスラインの尾の出血時間を示す。各記号は１匹の動物を示す。マウスが出血を止めることができない場合には、フィッシャーの正確確率検定を使用してＰ値を計算した。
【図６】モノクローナル抗ＧＰＶ抗体８９Ｆ１２が、ｉｎ  ｖｉｖｏ血栓形成モデルにおいて、ＧＰＶＩの欠如を補うことを示す図である。２０％ＦｅＣｌ３で腸間膜細動脈に損傷を与え、生体顕微鏡によって、蛍光標識した血小板の接着および血栓形成をモニターした。各ドットは１つの血管を示し、横線は中央値を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】抗体８９Ｆ１２が、止血においてＲｈｏＡの欠如を補うことができることを示す図である。指定されるマウスラインの尾の出血時間を示す。各記号は１匹の動物を示し、横線は中央値を示す（中央値が１２００秒より大きかったと思われる場合は、示さない）。マウスが出血を止めることができない場合には、フィッシャーの正確確率検定を使用して、Ｐ値を計算した。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、血液凝固剤として使用するための血小板糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）の阻害剤、および／または出血状態の処置もしくは予防で使用するためのＧＰＶの阻害剤に関する。
【０００９】
糖タンパク質Ｖ
本明細書で使用する場合、用語「糖タンパク質Ｖ」または「ＧＰＶ」は、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する膜タンパク質を意味する。好ましくは、ＧＰＶは、配列番号３に示すアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。ＧＰＶは、機能的膜貫通ドメインを有する。
【００１０】
本発明によれば、評価される配列（「比較配列」）は、２つの配列のアライメント後に、特許請求されるもしくは記載される配列（「参照配列」）と特定の「パーセント同一性」を有する、またはそうした配列に特定の「パーセントが同一である」。「パーセント同一性」は、次の式：
パーセント同一性＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
に従って決定される。
【００１１】
この式では、Ｃは、２つの配列間のアライメントの長さにわたる、参照配列と比較配列の間の相違の数であり、（ｉ）比較配列中に対応する整列した塩基を有さない参照配列中の各塩基、および（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および（ｉｉｉ）比較配列中の整列した塩基と異なる参照配列中の整列した各塩基が、相違を構成する。Ｒは、比較配列とのアライメントの長さにわたる参照配列の塩基の数であり、参照配列中に生成された任意のギャップも塩基として数えられる。
【００１２】
パーセント同一性（上記のように計算される）が指定された最小値にほぼ等しい、または指定された最小値を超えるアライメントが比較配列と参照配列の間に存在する場合、その指定されたものよりも低いパーセント同一性を示すアライメントが配列の他の個所に存在し得る場合でさえも、比較配列は、その指定された最小パーセント同一性を有する。
【００１３】
好ましい実施形態では、比較のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より一層好ましくは少なくとも６０％、およびより一層好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である。
【００１４】
２つのアミノ酸配列間の配列の比較およびパーセント同一性（およびパーセント類似性）の決定は、任意の適切なプログラム、例えば、次のパラメーター：マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２；開始ギャップ１１および伸長ギャップ１のペナルティー；ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ５０；期待値１０．０ワードサイズ３；フィルター：無し、を有する、プログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｐ）」（Ｔａｔｕｓｏｖａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９９；１７４：２４７〜２５０）を使用して達成することができる。本発明によれば、配列比較は、少なくとも４０アミノ酸、好ましくは少なくとも８０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸および最も好ましくは少なくとも１２０アミノ酸をカバーする。
【００１５】
本明細書で言及するＧＰＶは、典型的には血小板糖タンパク質Ｖである。
【００１６】
典型的には、ＧＰＶは天然に存在するＧＰＶである。好ましくは、ＧＰＶは哺乳類起源のものである。最も好ましくは、ＧＰＶはヒトＧＰＶである。本実施形態によれば、ＧＰＶは、好ましくは、配列番号３に示すアミノ酸配列を含む、またはその配列からなる。
【００１７】
ＧＰＶの阻害剤
ＧＰＶの阻害剤（以降、「ＧＰＶ阻害剤」と呼ぶ）は、（ｉ）凝固促進活性を有し、（ｉｉ）ＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる、またはＧＰＶ  ｍＲＮＡの発現を弱めることができる化合物である。好ましくは、ＧＰＶ阻害剤は、（ｉ）凝固促進活性を有し、（ｉｉ）ＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる化合物である。本発明によれば、凝固促進活性は、実施例に記載されているように「出血時間アッセイ」で決定されるが、但し、出血時間アッセイで使用されるマウスは内在性のＧＰＶを欠き、ヒトＧＰＶを発現する遺伝子組換えマウスである。ＧＰＶの細胞外ドメインへの結合は、実施例に記載されているようにＥＬＩＳＡで決定することができる。一実施形態では、ＧＰＶの細胞外ドメインへの結合は、図１Ｂに示すように、組換え可溶性ＧＰＶを使用してＥＬＩＳＡで決定されるが、但し、組換え可溶性ヒトＧＰＶが使用される。最も好ましくは、ＧＰＶの細胞外ドメインへの結合は、図１Ｂで示すように、組換え可溶性ＧＰＶを使用してＥＬＩＳＡで決定されるが、但し、配列番号３のアミノ酸１〜５０３から実質的になる組換え可溶性ヒトＧＰＶが使用される。
【００１８】
ＧＰＶ阻害剤は、ＧＰＶ阻害剤を対象に投与する際に、対象のＧＰＶのトロンビン媒介性切断に影響を及ぼす、例えば、この切断を阻害することができる。別の実施形態では、ＧＰＶ阻害剤を対象に投与する際に、ＧＰＶ阻害剤は対象のＧＰＶのトロンビン媒介性切断に影響を及ぼさない。
【００１９】
ＧＰＶ阻害剤のタイプまたはクラスは、特に制限されない。しかし、好ましくは、この化合物はペプチドまたはポリペプチドであり、より好ましくは、この化合物は抗体またはその断片である。さらに別の実施形態では、ＧＰＶ阻害剤は核酸である。
【００２０】
抗体
好ましい実施形態では、ＧＰＶ阻害剤は抗体である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、特定の抗原に結合する、または特定の抗原と免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、これには、抗体のポリクローナル形態、モノクローナル形態、遺伝子操作形態ならびに他の改変形態、例えば、限定されないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ）、シングルドメイン抗体（ナノボディ）、ならびに例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒｌｇＧおよびｓｃＦｖ断片を含めた抗体の抗原結合断片が含まれる。さらに、別段指示がない限り、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、インタクトな分子ならびにタンパク質に結合することができる抗体断片（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片など）の両方を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、インタクトな抗体のＦｃ断片を欠き、動物の循環からより急速に消え、インタクトな抗体よりも少ない非特異的組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９８３；２４：３１６）。
【００２１】
典型的には、抗体はＧＰＶの、好ましくはヒトＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる。分子または抗体がＧＰＶの細胞外ドメインに結合できるかどうかは、実施例／図１Ａまたは１Ｂに記載されている結合アッセイによって決定することができる（以下を参照されたい）。
【００２２】
本明細書で言及する抗体、断片または誘導体は、好ましくは、ＧＰＶのコラーゲン結合部位と異なる、ＧＰＶの細胞外ドメイン内の領域に結合する。別の実施形態では、抗体、断片または誘導体は、コラーゲン誘導性凝集を遅らせない。これは、実施例に記載されているように、凝集アッセイで決定することができる（図３ならびに材料および方法を参照されたい）。
【００２３】
さらに好ましい阻害剤は、ヒトＧＰＶへの結合について抗体８９Ｆ１２と競合する抗体、その断片および誘導体である。さらに好ましい阻害剤は、抗体８９Ｆ１２のＧＰＶ上のエピトープと重複するＧＰＶ上のエピトープに結合する、抗体、その断片および誘導体である。さらに好ましい阻害剤は、ＧＰＶ上の、抗体８９Ｆ１２同じエピトープに結合する、抗体、その断片および誘導体である。
【００２４】
他の実施形態では、阻害剤は、ヒトＧＰＶへの結合について抗体８９Ｈ１１と競合しない、抗体、その断片または誘導体である。別の実施形態では、阻害剤は、抗体８９Ｈ１１のＧＰＶ上のエピトープと重複しないＧＰＶ上のエピトープに結合する、抗体、その断片または誘導体である。さらに別の実施形態では、阻害剤は、抗体８９Ｈ１１のＧＰＶ上のエピトープと異なるＧＰＶ上のエピトープに結合する、抗体、その断片または誘導体である。
【００２５】
他の実施形態では、阻害剤は、ヒトＧＰＶへの結合について抗体Ｖ．３（Ａｚｏｒｓａ  ＤＯら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．１９９９；８１：１３１〜８；Ｍｏｏｇ  Ｓら、Ｂｌｏｏｄ．２００１；９８：１０３８〜４６）と競合しない、抗体、その断片または誘導体である。別の実施形態では、阻害剤は、抗体Ｖ．３のＧＰＶ上のエピトープと重複しないＧＰＶ上のエピトープに結合する、抗体、その断片または誘導体である。さらに別の実施形態では、阻害剤は、抗体Ｖ．３のＧＰＶ上のエピトープと異なるＧＰＶ上のエピトープに結合する、抗体、その断片または誘導体である。
【００２６】
上記の段落の実施形態は、互いに組み合わせることができる。
【００２７】
抗体は、好ましくは、配列番号３のアミノ酸１〜５０３内のエピトープに結合する。例えば、本発明は、限定はされないが次の実施形態を含む：
【００２８】
【表１】
2019504031.tif 000002
【００２９】
【表２】
2019504031.tif 000003
【００３０】
ＧＰＶの細胞外ドメインおよび抗体によって形成される複合体の解離定数ＫＤは、好ましくは１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、最も好ましくは５μＭ未満である。典型的には、ＫＤは、約１ｐＭ〜約１０μＭまたは約１０ｐＭ〜約１μＭまたは約１００ｐＭ〜約１００ｎＭの範囲にわたる。好ましくは、抗体−ＧＰＶ複合体は、５ｐＭ〜１ｎＭ、最も好ましくは１０ｐＭ〜５００ｐＭの範囲内のＫＤを有する。
【００３１】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して生成される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物またはファージのクローンを含めた単一クローンに由来する抗体を指し、それが生成される方法を指すものではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術またはこれらの組合せの使用を含めた、当技術分野で既知の多種多様な技法を使用して調製することができる（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．）。
【００３２】
他の実施形態では、ヒトにおける抗ＧＰＶ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を含めて、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用することができる。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体、より好ましくはモノクローナルヒト抗体またはモノクローナルヒト化抗体である。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「キメラ」抗体は、非ヒト免疫グロブリン、例えば、ラットまたはマウス抗体に由来する可変配列、および典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を生成する方法は当技術分野で既知である。例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８５；２２９（４７１９）：１２０２〜７；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９８６；４：２１４〜２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９８５；１２５：１９１〜２０２；ＵＳ５，８０７，７１５；ＵＳ４，８１６，５６７；およびＵＳ４，８１６，３９７を参照されたい。
【００３４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらの断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または他の標的結合サブ配列）であり、これは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は、実質的にすべての少なくとも１つのおよび典型的には２つの可変ドメインを含み、すべてまたは実質的にすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのフレームワーク（ＦＲ）領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、選択されるヒト免疫グロブリン鋳型のものを含むこともできる。ヒト化は、ヒト可変ドメインの１つまたはそれ以上のアミノ酸または部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体を作製する技法である。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つまたはそれ以上のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子由来のＦＲを有する、所望の抗原に結合する、非ヒト種において生成される抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、好ましくは向上させるために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較によって、特定される。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８８．３３２：３２３〜７ならびにＱｕｅｅｎら、ＵＳ５，５３０，１０１；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；およびＵＳ６，１８０，３７０（これらのそれぞれは、参照によってその全体を組み入れる）を参照されたい。抗体は、例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＣＤＲグラフト化（ＥＰ２３９４００；ＷＯ９１／０９９６７；ＵＳ５，２２５，５３９；ＵＳ５，５３０，１０１およびＵＳ５，５８５，０８９）、ベニア化（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ．ＭｏＩ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；２８：４８９〜９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ．１９９４；７：８０５〜８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  １９９４；９１：９６９〜９７３、ならびに鎖シャッフリング（ＵＳ５，５６５，３３２））を含めた当技術分野で既知の様々な技法を使用して、ヒト化することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５３０，１０１；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ５，６９３，７６１；ＵＳ５，６９３，７６２；およびＵＳ６，１８０，３７０（これらのそれぞれは、参照によってその全体を組み入れる）に記載されているように調製される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＶ抗体はヒト抗体である。ヒト患者の治療的処置にとって完全「ヒト」抗ＧＰＶ抗体が望ましい可能性がある。本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えされ、内在性免疫グロブリンを発現しない動物から単離した抗体を含む。ヒト抗体はヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する上記のファージディスプレイ方法を含めた、当技術分野で既知の様々な方法によって作製することができる。参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＵＳ４，４４４，８８７およびＵＳ４，７１６，１１１；ならびにＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９８／１６６５４；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；およびＷＯ９１／１０７４１を参照されたい。ヒト抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる、遺伝子組換えマウスを使用して生成することもできる。例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＵＳ５，４１３，９２３；ＵＳ５，６２５，１２６；ＵＳ５，６３３，４２５；ＵＳ５，５６９，８２５；ＵＳ５，６６１，０１６；ＵＳ５，５４５，８０６；ＵＳ５，８１４，３１８；ＵＳ５，８８５，７９３；ＵＳ５，９１６，７７１；およびＵＳ５，９３９，５９８を参照されたい。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を使用して生成することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９８８；１２：８９９〜９０３）。
【００３７】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＶ抗体は霊長類化抗体である。用語「霊長類化抗体」は、サル可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化抗体を生成する方法は当技術分野で既知である。例えば、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、ＵＳ５，６５８，５７０；ＵＳ５，６８１，７２２；およびＵＳ５，６９３，７８０を参照されたい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＶ抗体は誘導体化抗体である。例えば、限定するものではないが、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断または細胞のリガンドもしくは他のタンパク質への結合（抗体コンジュゲートの議論については以下を参照されたい）によって、修飾された誘導体化抗体である。限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化またはツニカマイシンの代謝的合成などを含めた既知の技法によって、多数の化学修飾のうちのいずれかを行うことができる。さらに、誘導体は、１つまたはそれ以上の非古典的なアミノ酸を含むことができる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＶ抗体またはその断片は、その配列が、対応する野生型配列と比べて、少なくとも１つの定常領域媒介性生物学的エフェクター機能を低減させるように改変された、抗体または抗体断片でもよい。Ｆｃ受容体への結合の低減を示すように抗ＧＰＶ抗体を改変するために、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域で、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることができる（例えば、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９１；１７３：１４８３〜１４９１；ならびにＬｕｎｄら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１；１４７：２６５７〜２６６２を参照されたい）。抗体のＦｃＲ結合能力の低減は、ＦｃＲ相互作用に依拠する他のエフェクター機能、例えば、オプソニン作用、食作用および抗原依存的細胞傷害性を低減させることもできる。
【００４０】
さらに別の態様では、抗ＧＰＶ抗体またはその断片は、胎児性Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎへのその結合親和性を増大または低減させるように改変された、抗体または抗体断片でもよい。ＦｃＲｎへの結合親和性を変化させるために、ＦｃＲｎ相互作用に必要な特定の領域で、抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることができる（例えば、ＷＯ２００５／１２３７８０を参照されたい）。ＦｃＲｎへの結合親和性の増大は抗体の血清半減期を増大させるべきであり、ＦｃＲｎへの結合親和性の低減は、逆に、抗体の血清半減期を低減させるべきである。適切なアミノ酸置換の特定の組合せは、ＷＯ２００５／１２３７８０の表１で特定され、その表は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。参照によってその全体を本明細書に組み入れる、Ｈｉｎｔｏｎら、ＵＳ７，２１７，７９７、ＵＳ７，３６１，７４０、ＵＳ７，３６５，１６８およびＵＳ７，２１７，７９８も参照されたい。さらに他の態様では、抗ＧＰＶ抗体は、例えば、ＵＳ２００７／０２８０９３１に記載されているように、その超可変領域の１つまたはそれ以上の中に挿入された１つまたはそれ以上アミノ酸を有する。
【００４１】
抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＶ抗体は、例えば、共有結合がＧＰＶへの結合を妨げないように、抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された抗体コンジュゲートである。エフェクター部分を抗体にコンジュゲートする技法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒａｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、６２３〜５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１９８２；６２：１１９〜５８およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １９９９；８３：６７〜１２３を参照されたい）。
【００４２】
一例を挙げれば、抗体またはその断片は、別のタンパク質（またはその部分；好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０または５０アミノ酸部分）のアミノ酸配列に場合によりＮ末端またはＣ末端で、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して融合している。好ましくは、抗体またはその断片は、抗体の定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に連結している。例えば、ＷＯ８６／０１５３３およびＥＰ０３９２７４５に記載されているように、組換えＤＮＡ手順を使用して、そのような融合体を生成することができる。別の例では、エフェクター分子はｉｎ  ｖｉｖｏで半減期を増大させることができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質またはアルブミン結合化合物、例えば、ＷＯ２００５／１１７９８４に記載されているものが挙げられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＶ抗体はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分と結合していてもよい。例えば、抗体が抗体断片である場合、抗体断片にある任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を介して、ＰＥＧ部分を結合させることができる。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在し得るか、組換えＤＮＡ法を使用して断片中に作り出すことができる。例えば、ＵＳ５，２１９，９９６を参照されたい。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。好ましくは、ＰＥＧ部分は、抗体断片にある少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。結合点としてチオール基が使用される場合、適切に活性化されたエフェクター部分、例えばチオール選択的誘導体、例えば、マレイミドおよびシステイン誘導体を使用することができる。
【００４４】
別の例では、抗ＧＰＶ抗体コンジュゲートは、例えば、ＥＰ０９４８５４４に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化された、すなわち、共有結合したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する、修飾Ｆａｂ’断片である。Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２）；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ、１９９７）；ならびにＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｍ．ＡｓｌａｍおよびＡ．Ｄｅｎｔ編、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８）；ならびにＣｈａｐｍａｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２；５４：５３１〜５４５も参照されたい。
【００４５】
核酸
本発明の他の実施形態では、ＧＰＶ阻害剤は核酸である。特定の実施形態では、核酸は、ＧＰＶ  ｍＲＮＡの発現を弱めることができる。例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用することによるＲＮＡ干渉によって、ＧＰＶの発現を阻害するまたは低減させるまたは無効にすることができる。別の可能性は、アンチセンス核酸、例えば、アンチセンスＲＮＡの使用である。
【００４６】
本明細書で使用する場合、語句「ｍＲＮＡの発現を弱める」は、ある量の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与して、または発現させて、ｍＲＮＡの切断または翻訳の直接的阻害のいずれかを介して、タンパク質への標的ｍＲＮＡの翻訳を低減させることを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応するタンパク質の発現の低減は、一般に「ノックダウン」と呼ばれ、非標的対照ＲＮＡ（例えば、非標的対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現の後に存在するレベルと比べて報告される。５０％以上〜１００％以下の間の量の発現のノックダウンが本明細書の実施形態で意図される。しかし、本発明の目的のために、そのようなノックダウンレベルが達成される必要はない。ノックダウンは、一般に、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅を使用して、ｍＲＮＡレベルを測定することによって、またはウェスタンブロット法もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によりタンパク質レベルを測定することによって、評価される。タンパク質レベルの解析によって、ｍＲＮＡの切断と翻訳阻害の両方が評価される。ノックダウンを測定するためのさらなる技法としては、ＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼプロテクション、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイを用いる遺伝子発現のモニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイおよび蛍光活性化細胞解析が挙げられる。
【００４７】
ＧＰＶ  ｍＲＮＡの発現阻害は、例えば、ＧＰＶ干渉ＲＮＡのトランスフェクション後のヒト細胞において、ＧＰＶ  ｍＲＮＡレベルまたはＧＰＶタンパク質レベルを評価することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定することもできる。
【００４８】
本発明の一実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続的な相補性の領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖およびアンチセンス鎖を有し、それぞれ、アンチセンス鎖は、ＧＰＶ  ｍＲＮＡの標的配列に対して、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続的な相補性の領域を含み、センス鎖は、ＧＰＶ  ｍＲＮＡの標的配列と、少なくとも１９ヌクレオチドの少なくともほぼ完全な連続的な同一性の領域を含む。本発明のさらなる実施形態では、干渉ＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の対応する標的配列の３’末端の最後から２番目のそれぞれ１３、１４、１５、１６、１７または１８ヌクレオチドに対して、配列相補性パーセンテージを有するか、または配列同一性パーセンテージを有する、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７または１８個の連続的なヌクレオチドの領域を含む。
【００４９】
干渉ＲＮＡの各鎖の長さは１９〜４９ヌクレオチドを含み、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９ヌクレオチドの長さを含むことができる。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに組み込まれ、それによって、ＲＩＳＣが、切断または翻訳抑制のために、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的に相補的な標的ｍＲＮＡを特定することが可能になるという点において、ｓｉＲＮＡの活性なガイド因子である。本発明の実施形態では、ＧＰＶ  ｍＲＮＡ配列内の干渉ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は、利用可能な設計ツールを使用して選択される。次いで、ＧＰＶ標的配列に対応する干渉ＲＮＡを、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクションによって試験し、次いで、上記のようにノックダウンの評価を行う。ｓｉＲＮＡに対する標的配列を選択する技法は、「ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｄｅｂｒａ  Ｊ．Ｔａｘｍａｎ編、２０１２（ＩＳＢＮ−１３：９７８１６２７０３１１８９）中に提供される。
【００５０】
第２の特定の実施形態では、核酸はヒトＧＰＶの細胞外ドメインに結合することができる。この実施形態によれば、核酸は好ましくはアプタマーである。アプタマーは、「Ｄｅ  ｎｏｖｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ」、２０１３、Ｇｉｓｂｅｒｔ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ編、第２１章（ＩＳＢＮ−１３：９７８３５２７６７７０３０）；または「Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、２００６、Ｓｖｅｎ  Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ編（ＩＳＢＮ−１３：９７８３５２７６０７９１４）に記載されているように設計することができる。
【００５１】
出血状態
本明細書に記載の阻害剤は、好ましくは、出血状態の処置または予防で使用される。出血状態は過度の出血を特徴とする。過度の出血は、様々な原因を有し得る。
【００５２】
一実施形態では、出血状態は血小板障害によって引き起こされる。
【００５３】
血小板障害は、例えば血小板減少症の場合には、血小板数の減少を特徴とし得る。特定の血小板減少症としては、限定されないが、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、（例えば、ヘパリン、トリメトプリム／スルファメトキサゾールによる）免疫媒介性血小板破壊が原因の薬物誘発性血小板減少症、（例えば、化学療法剤による）用量依存的骨髄抑制が原因の薬物誘発性血小板減少症、全身感染症に付随する血小板減少症、化学療法に起因する血小板減少症、妊娠性血小板減少症および免疫性血小板減少症（ＩＴＰ、以前は、免疫性血小板減少性紫斑病と呼ばれた）が挙げられる。
【００５４】
血小板障害は、例えば、血小板受容体またはシグナリング分子の欠如が原因の不完全な血小板シグナリングの場合には、血小板の機能障害を特徴とし得る。
【００５５】
好ましい実施形態では、出血状態は、炎症性出血、出血性卒中、敗血症が原因の過度の出血、血小板減少が原因の過度の出血、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）が原因の過度の出血、化学療法が原因の過度の出血、溶血性尿毒症症候群が原因の過度の出血およびＨＩＶ感染症が原因の過度の出血からなる群から選択される。
【００５６】
特定の実施形態では、本発明は、可溶性ＧＰＶの投与に対する解毒薬としての、本明細書に記載の阻害剤の使用に関する。
【００５７】
医薬組成物および処置
疾患の処置は、任意の臨床病期もしくは臨床徴候において任意の形態の疾患を有すると既に診断された患者の処置；疾患の症状もしくは症候の発症もしくは進展（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）もしくは増悪もしくは悪化の遅延；ならびに／または疾患の予防および／もしくは疾患の重症度の低減を包含する。
【００５８】
ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体が投与される「対象」または「患者」は、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）または霊長類（例えば、サルもしくはヒト）でもよい。ある種の態様では、ヒトは小児患者である。他の態様では、ヒトは成人患者である。
【００５９】
ＧＰＶ阻害剤、および場合により１つまたはそれ以上のさらなる治療剤、例えば、以下に記載の第２の治療剤を含む組成物が本明細書に記載される。組成物は、典型的には、医薬的に許容可能な担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、任意の適切な形態で存在することができる（それを患者に投与する所望の方法に依存する）。
【００６０】
ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体は、例えば、経口的、経皮的、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、髄腔内、局所的または局部的などの様々な経路によって、患者に投与することができる。任意の所与のケースにおける投与に最も適した経路は、特定の抗体、対象ならびに疾患の性質および重症度ならびに対象の健康状態に依存する。典型的には、ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体は静脈内に投与される。
【００６１】
本発明の別の態様は、本発明の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物である。抗体またはその抗原結合性断片は、医薬組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化することができる。例えば、抗体またはその抗原結合性断片を、１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することができる。例えば、滅菌水または生理食塩水を使用することができる。ｐＨ緩衝溶液、粘性低減剤または安定化剤などの他の物質も含めることができる。
【００６２】
多種多様な医薬的に許容可能な賦形剤および担体が当技術分野で既知である。そのような医薬担体および賦形剤ならびに適切な医薬製剤は、様々な刊行物に十分に記載されている（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｆｒｏｋｊａｅｒら、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）、または「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ｋｉｂｂｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら編、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅら編、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃを参照されたい）。特に、本発明の抗体を含む医薬組成物は、凍結乾燥形態または安定な可溶性形態で製剤化することができる。当技術分野で既知の様々な手順によって、ポリペプチドを凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容可能な希釈剤、例えば、無菌注射用水または無菌生理的食塩水を加えることによって、使用前に再構成される。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知である、投薬量でおよび技法によって投与することができる。投与の量およびタイミングは、所望の目的を達成するように、処置する医師または獣医師によって決定される。投与経路は、安全かつ治療的に有効な量を処置される対象の血液に送達するいかなる経路を介してもよい。あり得る投与経路としては、全身的経路、局所的経路、経腸経路および非経口経路、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内、腹腔内、経口、経粘膜的、硬膜外または髄腔内が挙げられる。好ましい経路は、静脈内または皮下である。
【００６４】
有効投薬量および投与経路は、対象の年齢および体重などの要因によって、ならびに抗体またはその抗原結合性断片の性質および治療域によって、決定される。投薬量の決定は、既知の方法によって決定され、過度の実験を必要としない。
【００６５】
治療有効量は、処置を必要とする患者または対象において正の治療効果をもたらす、本発明の抗体またはその抗原結合性断片の用量である。治療有効量は、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇまたは約０．１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲である。処置は、単回（例えば、ボーラス）用量または複数回用量を与えることを含むことができる。あるいは、継続投与が可能である。複数回用量が必要とされる場合、これは、毎日、隔日、毎週、隔週、毎月もしくは隔月または必要に応じて、投与することができる。抗体またはその抗原結合性断片を緩徐にかつ継続的に放出する貯蔵場所（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を使用することもできる。治療有効量は、対象においてＧＰＶを少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、９９％またはさらに１００％阻害する用量でもよい。
【００６６】
抗体は、水性液剤として製剤化することができる。
【００６７】
医薬組成物は、好都合には、用量あたり所定量のＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体を含む単位用量形態で提供される。そのような単位は、０．５ｍｇ〜５ｇ、例えば、限定はされないが、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇまたは前述の値の任意の２つの間の任意の範囲、例えば、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇもしくは３０ｍｇ〜３００ｍｇを含むことができる。医薬的に許容可能な担体は、例えば、処置すべき状態または投与経路に応じて、多種多様な形態をとることができる。
【００６８】
ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体を用いる、有効投薬量、投与の総回数および処置の長さの決定は、十分に当業者の能力内であり、標準的な用量漸増研究を使用して、決定することができる。
【００６９】
本明細書に記載の方法において適切な、ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体の治療製剤は、所望の程度の純度を有する阻害剤、例えば抗体を、当技術分野で典型的に用いられる随意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤（これらすべてを本明細書では「担体」と呼ぶ）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および種々の他の添加剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水性液剤として貯蔵用に調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（Ｏｓｏｌら、１９８０）を参照されたい。そのような添加剤は、用いられる投薬量および濃度において受容者に対して無毒でなければならない。
【００７０】
緩衝剤は、生理的条件に近い範囲内にｐＨを維持するのに役立つ。これは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭに及ぶ濃度で存在し得る。適切な緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方ならびにそれらの塩、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸ニナトトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびトリメチルアミン塩、例えばＴｒｉｓを使用することができる。
【００７１】
微生物の増殖を妨げるために防腐剤を加えることができ、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）に及ぶ量でこれを加えることができる。適切な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウムならびにアルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび３−ペンタノールが挙げられる。液体組成物の等張性を確実にするために、「安定化剤」として知られることもある等張化剤を加えることができ、等張化剤としては、多価糖アルコール、好ましくは、三価または高級糖アルコール、例えば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが挙げられる。安定化剤は、機能が充填剤から添加剤におよび、治療剤を可溶化する、または変性もしくは容器の壁への接着を防止するのに役立つ、賦形剤の広範なカテゴリーを指す。典型的な安定化剤は、（上記に列挙した）多価糖アルコール；アミノ酸、例えば、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロールグリセリンなど（シクリトール、例えば、イノシトールを含める）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；含硫還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロールグリセリン、α−モノチオグリセロールグリセリンおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、単糖類、例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類、例えば、ラクトース、マルトース、ショ糖および三糖、例えば、ラフィノース；ならびに多糖、例えばデキストランでもよい。安定化剤は、活性タンパク質重量部あたり０．１〜１０，０００重量の範囲内に存在し得る。
【００７２】
治療剤の可溶化を助長する、および治療用タンパク質を撹拌誘導性凝集から保護するために、非イオン性表面活性剤または界面活性剤（「湿潤剤」としても知られる）を加えることができ、これはまた、タンパク質を変性させることなく、応力が加えられた剪断表面に製剤を曝露することを可能にする。適切な非イオン性表面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）が挙げられる。非イオン性表面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲内または約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内に存在し得る。
【００７３】
さらなる種々の賦形剤としては、充填剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）および共溶媒が挙げられる。
【００７４】
本明細書の製剤は、ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体に加えて、第２の治療剤を含むこともできる。適切な第２の治療剤の例を以下に提供する。
【００７５】
投薬スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度およびＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体に対する患者の感受性を含めたいくつかの臨床的要因に応じて、月１回から毎日まで変動し得る。特定の実施形態では、ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体は、毎日、週２回、週３回、５日ごと、１０日ごと、２週ごと、３週ごと、４週ごともしくは月１回、または前述の値の任意の２つの間の任意の範囲、例えば、４日ごとから毎月、１０日ごとから２週ごと、もしくは週２回から週３回などで投与される。投与されるＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体の投薬量は、特定の抗体、対象ならびに疾患の性質および重症度、対象の健康状態、治療レジメン（例えば、第２の治療剤が使用されるかどうか）、ならびに選択される投与経路に従って変動し；当業者が適切な投薬量を容易に決定することができる。
【００７６】
ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体の最適な量およびそれぞれの投薬の間隔は、処置される状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに処置を受ける特定の対象の年齢および状態によって決定されること、ならびに医師が使用される適切な投薬量を最終的に決定することが、当業者に認識されるであろう。この投薬量は、適切な頻度で繰り返すことができる。副作用が発生する場合、通常の臨床診療に基づいて、投薬の量および／または頻度を変えるまたは低減させることができる。
【００７７】
併用療法
好ましくは、ＧＰＶ阻害剤、例えば抗ＧＰＶ抗体で処置を受ける患者は、従来の血液凝固剤でも処置される。例えば、過度の出血を罹患する患者は、典型的には、抗線溶剤、血小板濃縮物、凝固因子濃縮物および／または新鮮な凍結血漿でも処置される。
【００７８】
本発明のさらに別の態様は、止血を促進するための、上記で定義した阻害剤（好ましくは抗体）の使用である。
【００７９】
本発明のさらに別の態様は、過度の出血を罹患する患者における出血時間の低減で使用するための、上記で定義した化合物（好ましくは抗体）である。
【００８０】
本発明は、有効量の、上記で定義した阻害剤（好ましくは抗体）を対象に投与することを含む、出血時間を低減させる方法にさらに関する。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、有効量の、上記で定義した阻害剤（好ましくは抗体）を、それを必要とする患者に投与することを含む、出血状態を処置する方法である。出血状態は、好ましくは上記の状態のうちの１つである。
【００８２】
本発明のさらなる態様は、有効量の、上記で定義した阻害剤（好ましくは抗体）を、それを必要とする患者に投与することを含む、出血状態を予防する方法である。出血状態は、好ましくは上記の状態のうちの１つである。
【００８３】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の概説：
【表３】
2019504031.tif 000004
【実施例】
【００８４】
結果
８９Ｆ１２は、モノクローナルラット抗マウスＧＰＶ抗体である。これは、不死化したＡＧ１４骨髄腫細胞およびマウス血小板で免疫化したラットの脾臓細胞の融合によって生成した。８９Ｆ１２は野生型に結合するが、ＧＰＶ欠損マウスの血小板には結合せず（図１Ａ）、８９Ｆ１２は受容体のトロンビン切断の際に形成される可溶性ＧＰＶに結合する（図１Ｂ）。さらに、８９Ｆ１２は、マウスＧＰＶの組換えで発現させた細胞外ドメインに結合する（図１Ｂ）。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、８９Ｆ１２−ＩｇＧまたは８９Ｆ１２−Ｆａｂ断片は、血小板数に影響がなく、ＧＰＶのトロンビン媒介性切断に影響しない（図２およびデータ非表示）。さらに、８９Ｆ１２は、フローサイトメトリー（図２Ｄ）、凝集測定法または流動接着アッセイ（ｆｌｏｗ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（非表示）によって評価した場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで血小板活性化に影響を及ぼさない。注目すべきことは、これは、コラーゲン誘導性凝集を遅らせないので、ＧＰＶのコラーゲン結合部位に干渉せず（図３）、ＧＰＶのコラーゲン結合部位を遮断する抗ＧＰＶ抗体である８９Ｈ１１と対照的である。
【００８６】
止血および血栓形成に対する抗ＧＰＶ抗体の効果をｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。ＷＴマウスにおける８９Ｆ１２  １００μｇの静脈内注射は、尾の出血時間アッセイにおいて、血液喪失の停止に対する時間を加速した。それぞれＪＡＱ１注射およびＩＮＵ１注射によるＧＰＶＩおよびＣＬＥＣ−２の同時枯渇は、１４匹のマウスのうちの５匹が２０分の観察期間内に出血を止めることができなかったので、明白な止血異常をもたらした。８９Ｆ１２によるＧＰＶの細胞外ドメインの遮断は、ＧＰＶＩ／ＣＬＥＣ−２二重枯渇マウスの止血異常を補うことができ、８９Ｆ１２処置ＷＴマウスに匹敵する、これらのマウスにおける尾の出血時間をもたらした。これは、８９Ｆ１２が、ＧＰＶＩ／ＣＬＥＣ−２二重枯渇マウスにおいて止血を回復させることができることを意味する。それによって、８９Ｆ１２は、ＧＰＶＩおよびＣＬＥＣ−２の非存在下で、止血性合併症を予防する（図４）。受容体の二量体化または抗体のＦｃ部分が血栓形成に対するその作用に必要とされるかどうかを試験するために、ＧＰＶＩ枯渇化α２−欠損（Ｉｔｇａ２−／−）マウスをビヒクルまたは８９Ｆ１２−Ｆａｂ断片で処置した。ビヒクル処置ＧＰＶＩ枯渇化Ｉｔｇａ２−／−マウスは２０分を超えて出血したが、８９Ｆ１２−Ｆａｂ断片は、これらのマウスの止血機能を回復させた（図５）。
【００８７】
ＧＰＶ遮断は止血を促進するので、８９Ｆ１２処置マウスにおいて血栓形成も研究した。８９Ｆ１２処置マウスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで血栓形成に対する時間の加速を示した。ＪＡＱ１を使用してコラーゲン受容体ＧＰＶＩを活性化する主要な血小板の枯渇はＷＴマウスで血栓形成時間を遅らせ、１３の血管うちの６個しか観察期間内に閉塞しなかった。ＧＰＶＩの非存在下でさえ、ＧＰＶの８９Ｆ１２媒介性遮断は、血栓形成の早期開始をもたらし（データ非表示）、最終的に、未処置ＷＴ対照と比較した場合でさえも、より速い血管閉塞に至った（Ｐ＜０．００１、図６）。ＧＰＶの８９Ｆ１２媒介性遮断は、ｉｎ  ｖｉｖｏの血栓形成および止血において、ＧＰＶＩの欠如を十分に補うことができた。
【００８８】
ＧＰＶ遮断が（ｈｅｍ）ＩＴＡＭ受容体ＧＰＶＩおよびＣＬＥＣ−２の欠如の埋め合わせをすることができたという事実は、ＧＰＶが血小板活性化の一般的な負の制御因子として働くことを示唆する。したがってＧＰＶ遮断が他の重要なシグナリング分子の欠如を補うことができるかどうかを調べた。
【００８９】
血管壁損傷時の血小板活性化は、円盤状から球状の血小板形状への転換に、顆粒の分泌および拡散に極めて重要である、細胞骨格再配列をもたらす。低分子量ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリー、例えばＲｈｏＡは、これらのプロセスの多くに関与すると考えられる。ＲｈｏＡは、ストレスファイバーの形成を介するアクチン細胞骨格の組織化、アクトミオシンの収縮性の調節および微小管動態の調節において中心的役割を果たす（Ｂｕｓｔｅｌｏ  ＸＲら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ．２００７；２９：３５６〜７０）。さらに、ＲｈｏＡは、Ｇｑ−およびＧ１３−結合アゴニスト受容体の下流の様々な細胞プロセスに関与する（Ｐｌｅｉｎｅｓ  Ｉら、Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９：１０５４〜６３）。
【００９０】
巨核球および血小板特異的ＲｈｏＡ欠損マウスは、血小板数の５０％の減少をともなう、明白な巨大血小板性血小板減少症を示した（Ｐｌｅｉｎｅｓ  Ｉら、Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９：１０５４〜６３）。ＲｈｏＡの欠如は、尾の出血時間を延ばした（ＷＴマウスの４３０±２６７秒と比較して７２０±３２１秒）。これに対して、ＲｈｏＡ欠損マウスの８９Ｆ１２処置は、ＲｈｏＡｆｌ／ｆｌ，ＰＦ４−ｃｒｅマウスの止血異常をレスキューすることができ、ＷＴマウスと比較して尾の出血時間を短縮した（８９Ｆ１２処置ＲｈｏＡ欠損マウスについて２８６±１１８秒、ＲｈｏＡ−欠損マウスと比較してＰ＜０．０１、図７）。これによって、抗体媒介性ＧＰＶ遮断が重要な下流シグナリング分子の欠如も補うことができることが示された。
【００９１】
血小板減少は、出血の重大な危険因子である。これらの条件下でＧＰＶ遮断の役割を評価するために、免疫エフェクター機構から独立して、マウスにおいて循環血小板を枯渇させる２つのモノクローナル抗ＧＰＩｂα抗体（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９６：２５２０〜７；Ｂｅｒｇｍｅｉｅｒ  Ｗら、Ｂｌｏｏｄ．２０００；９５：８８６〜９３）を注射することによって、血小板減少をマウスで誘導した。最初の血小板数を各マウスについて上記のように評価し、１００％とみなした。その後の数を抗体の注射から１時間後に評価し、最初の値に対して標準化した。血小板数が正常の１５％未満に減少した野生型マウスは、出血時間の延長を示すか、２０分の観察期間内に出血を止めることができなかった。これに対して、正常の５％までの血小板数の減少は、正常な血小板数を有する８９Ｆ１２処置マウスと比較して尾の出血時間を変化させなかったが、血小板枯渇化ＷＴマウスと比較した場合に、有意に短縮された尾の出血時間を示し、これによって、ＧＰＶの遮断が正常な止血を維持するために必要とされる血小板数を下げることが示された（非表示）。
【００９２】
材料および方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＲｊ（Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）を野生型対照マウスとして使用した。ＧＰＶ（Ｇｐ５−／−）、α２−インテグリンサブユニット（Ｉｔｇａ２−／−）を欠くマウスは、以前に記載されている（Ｋａｈｎ  Ｍら、Ｂｌｏｏｄ  １９９９．９４：４１１２〜２１、Ｈｏｌｔｋｏｔｔｅｒ  Ｏ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２．２７７（１３）：１０７８９〜９４）。巨核球／血小板においてＲｈｏＡを欠くマウス（ＲｈｏＡｆｌ／ｆｌ，Ｐｆ４−ｃｒｅ＋／−）は以前に記載されている（Ｐｌｅｉｎｅｓ  Ｉ．ら、Ｂｌｏｏｄ  ２０１２．１１９：１０５４〜６３）。ＧＰＶＩは、抗ＧＰＶＩ抗体１００μｇ、ＪＡＱ１（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００１；１９３：４５９〜６９．）を実験の６日前にｉ．ｐ．注射することによって枯渇させた。ＣＬＥＣ−２は、ＩＮＵ１２００μｇ（（Ｍａｙ  Ｆら、Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４：３４６４〜７２）；抗ＣＬＥＣ−２抗体）のｉ．ｐ．注射によって枯渇させた。ＧＰＶ遮断は、５０μｇの８９Ｆ１２−ＩｇＧまたはＦａｂ断片を実験の３０分から１２時間前に注射することによって達成した。動物研究は、Ｌｏｗｅｒ  Ｆｒａｎｃｏｎｉａ（Ｂｅｚｉｒｋｓｒｅｇｉｅｒｕｎｇ  Ｕｎｔｅｒｆｒａｎｋｅｎ）の行政区政府によって承認された。
【００９３】
モノクローナル抗体
抗ＧＰＶ抗体の生成
６〜８週齢の雌のウィスターラットをマウス血小板で繰り返し免疫化した。次いで、ラットの脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞（Ａｇ１４．６５３）と融合し、ＨＡＴ培地中でハイブリドーマを選択した。血小板表面抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマをフローサイトメトリーによって特定した（以下を参照されたい）。Ｇｐ５−／−血小板を対照として使用して、ＧＰＶに対する抗体特異性を試験した。陽性のハイブリドーマを２回サブクローニングしてから、大規模に生成した。
【００９４】
使用するさらなる抗体を以下の表に概説する。
【００９５】
【表４】
2019504031.tif 000005
【００９６】
緩衝液および培地
すべての緩衝液は、再蒸留水を用いて調製した。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．１４
【表５】
2019504031.tif 000006
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血小板解析
血小板の調製および洗浄
イソフルラン麻酔下で後眼窩叢からマウスを出血させた。３００μｌのヘパリンを入れたＴＢＳ（２０Ｕ／ｍｌ、ｐＨ７．３）を含む１．５ｍｌの反応チューブに７００μｌの血液を採取した。８００ｒｐｍ（５２ｇ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４１５Ｃ）で５分間、室温で血液を遠心分離した。上清およびバフィーコートを新しいチューブに移し、８００ｒｐｍで６分間、室温で遠心分離して、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。洗浄した血小板を調製するために、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）（０．１μｇ／ｍｌ）の存在下で、２８００ｒｐｍ（６３９ｇ）で５分間、室温でＰＲＰを遠心分離し、ＰＧＩ２（０．１μｇ／ｍｌ）およびアピラーゼ（０．０２Ｕ／ｍｌ）を含むＣａ２＋フリータイロード緩衝液１ｍｌにペレットを再懸濁した。１０分間３７℃でインキュベートした後、２８００ｒｐｍで５分間サンプルを遠心分離した。１ｍｌのＣａ２＋フリータイロード緩衝液に血小板をもう一度再懸濁してから、１：１０希釈の血小板溶液を利用し、Ｓｙｓｍｅｘカウンターで血小板数を測定して、血小板レベルを決定した（以下を参照されたい）。ペレットを、５００，０００血小板／μｌを得るのに必要とする容積のアピラーゼ（０．０２Ｕ／ｍｌ）含有タイロード緩衝液に再懸濁し、少なくとも３０分間３７℃でインキュベートしたままにしてから、解析した。血小板の数およびサイズの決定については、ヘパリン添加したマイクロキャピラリーを使用して、麻酔をかけたマウスの後眼窩叢から５０μｌの血液を取り出し、３００μｌのヘパリンを入れたＴＢＳ（２０Ｕ／ｍ、ｐＨ７．３）を含む１．５ｍｌの反応チューブに採取した。ヘパリン添加血をＰＢＳで希釈し、Ｓｙｓｍｅｘ  ＫＸ−２１Ｎ自動血液アナライザー（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）を使用して、血小板の数およびサイズを決定した。
【００９８】
フローサイトメトリー
糖タンパク質の発現レベルを決定するために、飽和量の、フルオロフォアをコンジュゲートした上記の抗体で血小板（１＊１０６）を１０分間室温で染色し、５００μｌのＰＢＳを加えた直後に解析した。５００μｌのＰＢＳを加えることにより反応を止め、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でサンプルを解析した。血小板活性化研究については、ＪＯＮ／Ａ−ＰＥおよび抗Ｐ−セレクチン−ＦＩＴＣの存在下で、洗浄した血液を指示アゴニストとともに１５分間インキュベートした。
【００９９】
ＥＬＩＳＡ
洗浄した血小板を上記のように調製し、０．１Ｕ／ｍｌのトロンビンで１５分間、３７℃で刺激した。その後、血小板懸濁液を２８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新しい反応チューブに移し、最大スピードで５分間再度遠心分離した。トロンビンで刺激した血小板の上清１００μｌを、前もって８９Ｈ１１（抗ＧＰＶ抗体）３０μｇでコーティングし、５％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした９６ウェルプレートに移した。１時間インキュベートしてから、９６ウェルプレートを洗浄し、第２の抗ＧＰＶ抗体であるＨＲＰ標識化８９Ｆ１２とともにインキュベートして、切断されたＧＰＶを検出した。ＴＭＢを使用してＨＲＰ基質を発色させ、Ｈ２ＳＯ４で反応を止め、４０５ｎｍにおいてＥＬＩＳＡリーダーで進行させた。
【０１００】
血小板凝集
５０μｌの洗浄した血小板（０．５×１０６血小板／μｌの濃度）またはヘパリン添加ＰＲＰを、タイロード緩衝液１１０μｌ（２ｍＭのＣａＣｌ２および１００μｇ／ｍｌのヒトフィブリノーゲンを有する）を含むキュベットに移した。凝集の測定のために、抗体を加えて１０μｇ／ｍｌの終濃度にし、１００倍濃縮されたアゴニストを加え、光透過を、Ａｐａｃｔ  ４−チャネルオプティカル凝集システム（ＡＰＡＣＴ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１０分間にわたって記録した。アゴニストを加える前の各測定のキャリブレーションのために、タイロード緩衝液を１００％凝集と設定し、洗浄した血小板懸濁液またはＰＲＰを０％凝集と設定した。
【０１０１】
血小板機能のｉｎ  ｖｉｖｏ解析
血小板の枯渇
各マウスについて、上記のように最初の血小板数を評価した。これらの値を１００％とみなし、その後の数をこれらの値に対して標準化した。マウス１ｇあたり０．２μｇ抗ＧＰＩｂ抗体をマウスに静脈内注射して、Ｆｃ非依存的血小板減少を誘導した。実験の１時間前にマウスを注射して、５〜１０％の残存血小板数を達成して、ＦｃγＲ非依存的血小板減少を誘導した。注射してから１時間後に、血小板数を再び評価した。
【０１０２】
腹部大動脈の機械的損傷
麻酔をかけたマウス（１０〜１６週齢）の腹腔を切開するために、縦断正中切開（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｍｉｄｌｉｎｅ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を行い、腹部大動脈を露出させた。ドップラー超音波フロープローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を大動脈の周囲に設置し、フロープローブの上流の鉗子の単回の力強い加圧（１５秒）による機械的損傷によって、血栓形成を誘導した。完全な閉塞が起こるまで、または３０分が経過するまで、血流をモニターした。
【０１０３】
出血時間アッセイ
三倍麻酔（ｔｒｉｐｌｅ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）の腹腔内注射によってマウスに麻酔をかけ、尾端の２ｍｍのセグメントをメスで除去した。創傷部位に直接的に接触することなく、２０秒間隔で血液を濾紙で軽く吸収することによって、尾の出血をモニターした。濾紙上に血液が観察されなくなったときに、出血が終わったと決定した。焼灼によって、２０分後に手作業で実験を止めた。
【０１０４】
統計解析
結果は、群当たり少なくとも３回の個々の実験からの平均±ＳＤとして示す。適用可能な場合、フィッシャーの正確確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）を統計解析に使用した。そうでなければ、ウェルチのｔ検定を統計解析について行った。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意であるとみなした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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