(57)【要約】本発明は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸の単離、及び非癌生体試料と比較した癌生体試料中の核酸におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化の検出に各々が基づく、少なくとも１種のプロモーター若しくは癌関連プロモーターの有無を決定する方法、又は癌予後のための方法に関する。非癌生体試料に比べて癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度が変化したプロモーターを含む癌検出のためのバイオマーカーもここに開示される。別の一発明においては、ＥＺＨ２の投与阻害剤を各々が含む、少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性を調節する方法、又は免疫応答を調節する方法も開示される。【選択図】図１Ｂ
2019511209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定する方法であって、
前記癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及び
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記癌及び非癌生体試料が、単細胞、多細胞、細胞の断片、体液又は組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌生体試料と非癌生体試料が同じ対象から得られる、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記癌生体試料と非癌生体試料が各々異なる対象から得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させるステップが、前記ヒストン修飾に特異的な前記抗体を用いたクロマチンの免疫沈降を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌生体試料からの少なくとも１種のプロモーターを少なくとも１個の参照核酸配列に対してマッピングして、前記少なくとも１種のプロモーターに関連する遺伝子転写物を同定するステップを更に含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１個の参照核酸配列が、
ｉ）注釈付きゲノム配列、
ｉｉ）新規トランスクリプトーム集合体、及び／又は
ｉｉｉ）非癌核酸配列ライブラリ若しくはデータベース
に由来する核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化が、前記非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の１．５倍を超えて増加又は減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の１．５倍を超えて増加するＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化が、前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの存在と相関する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性が、全プロモーター集団に比べたＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加と相関する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加が、前記少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の上方制御と相関する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加が、前記少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の下方制御と相関する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種のプロモーターが、公知の遺伝子転写物開始点から５００ｂｐ以内に位置する標準プロモーターである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子転写物開始点が、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、ＰＲＣ２標的遺伝子又は転写因子の１種以上に関連する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子転写物開始点が癌遺伝子に関連する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子転写物開始点が、ＭＹＣ、ＭＥＴ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ３、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＶＴ１、ＨＮＦ４α、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記癌が胃癌又は結腸癌である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のプロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが前記癌生体試料と前記非癌生体試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在しない、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐを超えて離れて位置する注釈のないプロモーターである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌生体試料及び非癌生体試料中の前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、前記測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及び
前記レポータープローブの前記デジタルプロファイリングに基づいて、前記非癌生体試料と比較した前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、非癌生体試料と比較した前記癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無を確認するステップ
を更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定するステップがＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プラットホームを用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象における癌の予後を判定する方法であって、
前記対象から得られる癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及び
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を参照核酸配列中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップ
を含み、
前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無が、前記対象における前記癌の予後を示している、
方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１種の癌関連プロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが前記癌生体試料と前記参照核酸配列の両方に存在し、前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌試料中の前記少なくとも１種の選択的プロモーターの有無が、前記対象における癌生存の予後不良を示している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記癌生体試料及び前記参照核酸配列における前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、前記測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及び
前記レポータープローブの前記デジタルプロファイリングに基づいて、前記非癌生体試料と比較した前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、前記参照核酸配列と比較した前記癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無を確認するステップ
を更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記測定するステップがＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プラットホームを用いて行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象における癌を検出するためのバイオマーカーであって、前記バイオマーカーが、非癌生体試料と比較して癌生体試料におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度が変化した少なくとも１種のプロモーターを含む、バイオマーカー。
【請求項２８】
前記少なくとも１種のプロモーターが、全プロモーター集団に比べてＥＺＨ２結合部位の増加を含む、請求項２７に記載のバイオマーカー。
【請求項２９】
前記少なくとも１種のプロモーターが低メチル化されている、請求項２７に記載のバイオマーカー。
【請求項３０】
前記少なくとも１種のプロモーターが高メチル化されている、請求項２７に記載のバイオマーカー。
【請求項３１】
前記少なくとも１種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐ未満離れて位置する標準プロモーターである、請求項２７に記載のバイオマーカー。
【請求項３２】
前記遺伝子転写物開始点が、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、ＰＲＣ２標的遺伝子又は転写因子の１種以上に関連する、請求項３１に記載のバイオマーカー。
【請求項３３】
前記遺伝子転写物開始点が癌遺伝子に関連する、請求項３１に記載のバイオマーカー。
【請求項３４】
前記遺伝子転写物開始点が、ＭＹＣ、ＭＥＴ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ３、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＶＴ１、ＨＮＦ４α、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連する、請求項３１に記載のバイオマーカー。
【請求項３５】
前記少なくとも１種のプロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが癌試料と非癌試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在しない、請求項２７に記載のバイオマーカー。
【請求項３６】
前記少なくとも１種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐを超えて離れて位置する注釈のないプロモーターである、請求項２７に記載のバイオマーカー。
【請求項３７】
細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性を調節する方法であって、ＥＺＨ２の阻害剤を前記細胞に投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
癌に対する対象の免疫応答を調節する方法であって、前記対象にＥＺＨ２の阻害剤を投与するステップを含み、前記ＥＺＨ２が前記対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、方法。
【請求項３９】
前記ＥＺＨ２の阻害剤が免疫原性Ｎ末端ペプチドの発現を調節する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１種の癌関連プロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが癌試料と非癌試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが癌試料にのみ存在しない、請求項３８又は３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記選択的プロモーターが転写物変異体に関連し、前記転写物変異体がＮ末端タンパク質変異体をコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｎ末端タンパク質変異体が、Ｎ末端切断型タンパク質又はＮ末端長鎖タンパク質である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＥＺＨ２の阻害剤がｓｉＲＮＡ又は小分子である、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＥＺＨ２の阻害剤がＧＳＫ１２６である、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定する方法であって、
前記癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を読み深度２０Ｍで検出するステップ、及び
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項４６】
細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の調節に使用するためのＥＺＨ２の阻害剤。
【請求項４７】
細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の調節のための医薬品の製造におけるＥＺＨ２の阻害剤の使用。
【請求項４８】
癌に対する対象の免疫応答の調節に使用するためのＥＺＨ２の阻害剤であって、前記ＥＺＨ２が前記対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、阻害剤。
【請求項４９】
癌に対する対象の免疫応答の調節のための医薬品の製造におけるＥＺＨ２の阻害剤の使用であって、前記ＥＺＨ２が前記対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その内容を参照によりその全体を本明細書に援用する、２０１６年２月１６日に出願されたシンガポール出願第１０２０１６０１１４２Ｖ号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
胃癌（ＧＣ：Ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）は、世界の癌死亡率の原因の第３位であり、多数の東アジアの国々における罹患率が高い。ＧＣ患者は、後期疾患を呈することが多く、幾つかの最近の否定的な第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験によって例示されるように、臨床的対応が困難である。分子レベルでは、研究によって、ＧＣにおける特徴的遺伝子変異、コピー数変化、遺伝子融合及び転写パターンが特定された。しかし、これらのうちほとんどは、ＨＥＲ２陽性ＧＣ及びトラスツズマブ（ｔｒａｚｔｕｚｕｍａｂ）を除いて、標的療法に臨床的に転換されていない。したがって、ＧＣの更なるより包括的な探究が強く求められており、これらは、疾患検出のための新しいバイオマーカー、患者の予後又は治療反応性の予測、及び新しい治療様式に光を当てる可能性がある。
【０００４】
プロモーターエレメントは、遺伝子転写開始を上流調節性刺激に関連づけて、多様なシグナル伝達経路からの入力を統合する機能を果たすシス調節エレメントである。プロモーターは、生物学的、機能的及び調節的な多様性の重要な貯蔵所であり、現在の推定によれば、ヒトゲノム中の遺伝子の３０〜５０％が、発生系譜及び細胞の状態の関数として選択的に活性化され得る複数のプロモーターに関連する。選択的プロモーターの差次的な使用によって、転写物中の異なる５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）及び第１エキソンが生成し、それらは５’翻訳領域の得失によって、ｍＲＮＡ発現レベル、翻訳効率、及び異なるタンパク質アイソフォームの生成に影響を及ぼし得る。現在まで、癌におけるプロモーター変化は、主として遺伝子ごとに研究され、ＧＣ及び他の固形悪性腫瘍におけるプロモーターレベルの多様性の全体的な程度についてはほとんど知られていない。
【０００５】
したがって、癌におけるプロモーターエレメントをプロファイリングする方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様においては、非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定する方法であって、癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を癌生体試料から単離するステップであって、単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定するステップを含む方法を提供する。
【０００７】
別の一態様においては、対象における癌の予後を判定する方法であって、対象から得られる癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を癌生体試料から単離するステップであって、単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を参照核酸配列中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップを含み、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無が、対象における癌の予後を示している、方法を提供する。
【０００８】
別の一態様においては、対象における癌を検出するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、非癌生体試料と比較して癌生体試料におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度が変化した少なくとも１種のプロモーターを含む、バイオマーカーを提供する。
【０００９】
別の一態様においては、細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性を調節する方法であって、ＥＺＨ２の阻害剤を細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１０】
別の一態様においては、癌に対する対象の免疫応答を調節する方法であって、対象にＥＺＨ２の阻害剤を投与するステップを含み、ＥＺＨ２が対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、方法を提供する。
【００１１】
別の一態様においては、非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定する方法であって、癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を癌生体試料から単離するステップであって、単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を読み深度２０Ｍで検出するステップ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップを含む、方法を提供する。
【００１２】
一態様においては、対象における癌を検出するのに使用するための、非癌生体試料と比較して癌生体試料におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度が変化した少なくとも１種のプロモーターを含むバイオマーカーを提供する。
【００１３】
一態様においては、対象における癌を検出するための医薬品の製造における、非癌生体試料と比較して癌生体試料におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度が変化した少なくとも１種のプロモーターを含むバイオマーカーの使用を提供する。
【００１４】
一態様においては、細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の調節に使用するためのＥＺＨ２の阻害剤を提供する。
【００１５】
一態様においては、細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の調節のための医薬品の製造におけるＥＺＨ２の阻害剤の使用を提供する。
【００１６】
一態様においては、癌に対する対象の免疫応答の調節に使用するためのＥＺＨ２の阻害剤であって、ＥＺＨ２が対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、阻害剤を提供する。
【００１７】
一態様においては、癌に対する対象の免疫応答の調節のための医薬品の製造におけるＥＺＨ２の阻害剤の使用であって、ＥＺＨ２が対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、使用を提供する。
【００１８】
定義
以下は、本発明の記述を理解するのに役立ち得る幾つかの定義である。これらは、一般的な定義として意図され、本発明の範囲をこれらの用語のみに限定するものでは決してなく、以下の記述の更なる理解のためのものである。
【００１９】
本明細書では「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を指すものとする。
【００２０】
本明細書では「癌性」という用語は、癌に特有である異常によって影響されること、又は該異常を示すことに関する。
【００２１】
本明細書では「生体試料」という用語は、患者から得られた、除去又は単離された、患者からの組織又は細胞の試料を指す。本明細書では「から得られた、又は、に由来する」という用語は、包括的に使用されるものとする。すなわち、生体試料から直接単離された任意のヌクレオチド配列、又は試料に由来する任意のヌクレオチド配列を包含するものとする。
【００２２】
本明細書では「抗体（単数又は複数）」という用語は、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指し、抗原結合断片、モノクローナル、組換え、ポリクローナル、キメラ、完全ヒト、ヒト化、二重特異性及びヘテロ共役抗体；単一可変ドメイン、単鎖Ｆｖ、ドメイン抗体、免疫学的に有効な断片及び二重特異性抗体を含む。
【００２３】
抗原結合タンパク質に関連して本明細書を通して使用される「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質が、非標的エピトープに結合したときよりも高い親和性で抗原の標的エピトープに結合することを意味する。ある実施形態においては、特異的結合とは、非標的エピトープに対する親和性の少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００又は１０００倍の親和性で標的に結合することを指す。例えば、結合親和性は、常法によって、例えば、競合ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、ＫＩＮＥＸＡ（商標）若しくはＰＲＯＴＥＯＮ（商標）を用いたＫｄの測定によって、測定することができる。
【００２４】
本明細書では「単離」という用語は、成分が自然に発生する生物の細胞中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、タンパク質並びに細胞小器官から実質的に分離又は精製された生物学的成分（核酸分子、タンパク質、細胞小器官など）に関する。「単離」された核酸及びタンパク質は、標準精製法によって精製された核酸及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞中で組換え発現によって調製された核酸及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。
【００２５】
本明細書では「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定しない限り、天然ヌクレオチドと同様に核酸とハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含する。「ヌクレオチド」としては、ピリミジン、プリン、それらの合成類似体などの糖と結合する塩基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）におけるように、アミノ酸と結合する塩基を含むモノマーが挙げられるが、それらに限定されない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド中の１個のモノマーである。ヌクレオチド配列とは、ポリヌクレオチドの塩基の配列を指す。
【００２６】
本明細書では「予後」という用語又はその文法上の変異形は、臨床症状又は疾患の確度の高い経過及び結果の予測を指す。患者の予後は、通常、疾患の順調な又は好ましくない経過又は結果を示している疾患の要因又は症候を評価することによってなされる。「予後」という用語は、状態の経過又は結果を１００％の確度で予測する能力を指すのではない。そうではなく、「予後」という用語は、ある経過又は結果が起こる確率が高いことを指し、すなわち、経過又は結果が、症状を示さない個体に比べて、所与の症状を示す患者において起こる可能性が高いことを指す。
【００２７】
本明細書では「調節」という用語は、免疫応答を所望のレベルに調節することを指すものとする。
【００２８】
本明細書では「注釈付きプロモーター」という用語は、公知のＧｅｎｃｏｄｅ転写開始点（ＴＳＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔａｒｔ  ｓｉｔｅ）の近くに（＜５００ｂｐ）位置するプロモーターを指す。
【００２９】
「注釈のないプロモーター」という用語は、公知のＧｅｎｃｏｄｅＴＳＳがないゲノム領域に位置するプロモーターを指す。
【００３０】
本明細書では、プロモーターに関連した「標準」という用語は、不変Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ピークを示すプロモーター領域を指す。
【００３１】
本明細書では「検出可能な標識」又は「レポーター」という用語は、核酸に取り付けることができる検出可能なマーカー又はレポーター分子を指す。典型的な標識としては、蛍光団、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、金属ゾル及びコロイド、並びに酵素が挙げられる。標識方法、及び様々な目的に有用である標識の選択のガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８７）に考察されている。
【００３２】
本明細書では「低メチル化」という用語は、ＤＮＡの正常なメチル化レベルの低下を指す。
【００３３】
本明細書では「高メチル化」という用語は、ＤＮＡの正常なメチル化レベルの増加を指す。
【００３４】
本明細書では、製剤の成分の濃度に関連した「約」という用語は、典型的には表示値の＋／−５％、より典型的には表示値の＋／−４％、より典型的には表示値の＋／−３％、より典型的には表示値の＋／−２％、更により典型的には表示値の＋／−１％、更により典型的には表示値の＋／−０．５％を意味する。
【００３５】
本開示を通して、ある実施形態を範囲形式で開示することができる。範囲形式の記述は、単に便宜及び簡略のためにすぎず、開示範囲を頑なに制限するものと解釈すべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の記述は、可能な部分範囲すべて、及びその範囲内の個々の数値を明確に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、及びその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５及び６を明確に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅にかかわらない。
【００３６】
ある実施形態を本明細書で広範に一般的に記述することもできる。一般的な開示範囲内のより狭い種及び亜属の分類の各々も、本開示の一部を成す。これは、削除された材料が本明細書で明確に列挙されたか否かにかかわらず、任意の主題を類概念から排除する条件又は否定的制限で、実施形態の一般的な記述を含む。
【００３７】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、又はそれに反することを明記しないかぎり、単数の整数、ステップ又は要素として本明細書に列挙された本発明の整数、ステップ又は要素は、列挙された整数、ステップ又は要素の単数形と複数形の両方を明白に包含する。
【００３８】
「実質的に」という語は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略することができる。
【００３９】
本明細書に説明のために記述された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数又は複数）又は制約（単数又は複数）の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇなど）」という用語は、包括的に、制限なしに、理解すべきである。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定的な用語ではなく、こうした用語及び表現の使用において、示し、記述した特徴の、又はその一部の、均等物を除外することは意図されず、種々の改変が、請求項に係る本発明の範囲内で可能であると認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示したが、本明細書で開示されるその中で例示される本発明の改変及び変形が当業者によってなされ得るものであり、こうした改変及び変形が本発明の範囲内にあるとみなされることを理解すべきである。
【００４０】
本発明は、本明細書に広範かつ一般的に記述されている。一般的な開示範囲内のより狭い種及び亜属の分類の各々も、本発明の一部を成す。これは、削除された材料が本明細書で明確に列挙されたか否かにかかわらず、任意の主題を類概念から排除する条件又は否定的制限で、本発明の一般的な記述を含む。
【００４１】
別の実施形態は、以下の請求項及び非限定的例の範囲内である。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記述される場合、当業者は、本発明が、それによって、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の亜群によっても記述されることを認識されたい。
【００４２】
本発明は、詳細な説明を参照し、非限定的例及び添付図面と併せて検討すると、更に理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】原発性胃腺癌における体細胞プロモーター変化を示す図である。不変ＧＣプロモーターの例。ＲＨＯＡ  ＴＳＳ（陰影の付いた四角）のＵＣＳＣゲノムトラックは、ＧＣ及び対応正常試料における類似のＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルを強調する。類似のシグナルは、ＧＣ株において見られる。下の２つのトラックは、同じＧＣ及び対応正常試料（ＲＮＡｓｅｑ）における類似レベルのＲＮＡ発現を示す。
【図１Ｂ】原発性胃腺癌における体細胞プロモーター変化を示す図である。増大体細胞プロモーターの例。ＣＥＡＣＡＭ６  ＴＳＳ（陰影の付いた四角）のＵＣＳＣゲノムトラックは、対応正常試料に比べて、ＧＣ試料及びＧＣ株におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルの増大を強調する。対照的に、隣接遺伝子ＣＥＡＣＡＭ５のＴＳＳには変化が見られない。ＲＮＡ発現の一致した腫瘍特異的増大が、同じＧＣ及び対応正常試料のＲＮＡ−ｓｅｑプロファイルを示す下の２つのトラックにおいて見られる。
【図１Ｃ】原発性胃腺癌における体細胞プロモーター変化を示す図である。損失体細胞プロモーターの例。ＡＴＰ４Ａ  ＴＳＳ（陰影の付いた四角）のＵＣＳＣゲノムトラックは、対応正常試料に比べて、ＧＣ試料及びＧＣ株におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルの損失を強調する。ＲＮＡ発現の一致した腫瘍特異的損失は、同じＧＣ及び胃正常試料のＲＮＡ−ｓｅｑプロファイルを示す下の２つのトラックにおいて見られる。
【図１Ｄ】原発性胃腺癌における体細胞プロモーター変化を示す図である。原発性ＧＣ及び対応正常試料における体細胞プロモーター（行）のＨ３Ｋ４ｍｅ３読み取り密度（目盛の付いた行）のヒートマップ。
【図１Ｅ】原発性胃腺癌における体細胞プロモーター変化を示す図である。一次胃試料（ｐｒｉｍａｒｙ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｓａｍｐｌｅ）におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３プロモーターシグナルとＨ３Ｋ２７ａｃ活性シグナルの相関（ｒ＝０．９１、Ｐ＜０．００１）。各データポイントは、単一のＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域に対応する。分析は、１６のＮ／Ｔ対からのデータを用いて行われた（表４）。
【図１Ｆ】原発性胃腺癌における体細胞プロモーター変化を示す図である。標準増大及び損失体細胞プロモーターに関連する上位５つの遺伝子セット。ＧＣにおいて上方及び下方制御される遺伝子に関連する遺伝子セットが再発見される。Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びＳＵＺ１２、ＰＲＣ２成分に関連した遺伝子セットが濃縮されることにも留意されたい。
【図２】ＧＣ及び別の腫瘍タイプにおける体細胞プロモーター変化と遺伝子発現の関連性を示す図である。  Ａ）ＧＣ体細胞プロモーターの例。例は、単なる説明のためのものである。  Ｂ）体細胞プロモーターと全プロモーターの間の発見試料におけるＲＮＡ−ｓｅｑ発現（上）及びＤＮＡメチル化（下）の変化。上−体細胞プロモーター（増大及び損失）を示すゲノム領域における９対の原発性ＧＣと胃正常試料の間のＲＮＡ−ｓｅｑ発現の変化を示すボックスプロット（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）。下−全プロモーターと比較した、２０対のＧＣと胃正常試料の間の体細胞プロモーターを示す領域におけるＤＮＡメチル化（β値）の変化を示すボックスプロット。（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）  Ｃ）独立した検証コホート。全プロモーターと比較した、３５４個（３２１個のＧＣ、３３個の正常）のＴＣＧＡ胃腺癌（ＳＴＡＤ）試料にわたる体細胞プロモーターを示すゲノム領域におけるＲＮＡ−ｓｅｑ発現の変化を示すボックスプロット（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）  Ｄ）別の癌タイプにおける体細胞プロモーター。３２６個のＴＣＧＡ結腸腺癌（ＣＯＡＤ）試料（２８６個のＣＯＡＤ、４０個の正常；＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）、１７０個のＴＣＧＡ腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）試料（９８個のｃｃＲＣＣ及び７２個の正常；＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）、及び１１５個のＴＣＧＡ肺腺癌（ＬＵＡＤ）試料（５８個のＬＵＡＤ、５７個の正常；＊＊＊Ｐ＜０．００１  体細胞増大対全プロモーター及び体細胞増大対体細胞損失、ウィルコクソン検定）にわたる、全プロモーターと比較した、ＧＣ体細胞プロモーターを示すゲノム領域におけるＲＮＡ−ｓｅｑ発現の変化を示すボックスプロット。
【図３Ａ】ＧＣにおける選択的プロモーターを示す図である。ＨＮＦ４α遺伝子のＵＣＳＣブラウザトラック。ＧＣと対応胃正常試料は、標準ＨＮＦ４αプロモーターにおいて等しいＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルを有する。しかし、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３増大によって見られる選択的プロモーターは、対応正常に比べてＧＣにおける下流ＴＳＳに認めることができる。ＲＮＡレベルでは、所内とＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ試料のどちらも、正常試料に比べて選択的プロモーター（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）ＴＳＳにおける遺伝子発現が増大する。
【図３Ｂ】ＧＣにおける選択的プロモーターを示す図である。ＥＰＣＡＭ遺伝子のＵＣＳＣブラウザトラック。下流ＴＳＳにおける選択的プロモーター使用の別の例。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の増大が標準プロモーターの下流のＴＳＳで認められ、一方、標準プロモーターは、ＧＣと胃正常において等しいＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナルを示す。ＲＮＡ−ｓｅｑ発現の増大も、ＧＣにおいて所内とＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ試料の両方で選択的プロモーターによって駆動される転写物において見ることができる。
【図３Ｃ】ＧＣにおける選択的プロモーターを示す図である。新規Ｎ末端切断型ＲＡＳＡ３転写物に対応する注釈のないＴＳＳ（暗灰色の四角）におけるプロモーター活性の増大を強調するＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＲＮＡ−ｓｅｑシグナルを示す、ＲＡＳＡ３遺伝子のＵＣＳＣブラウザトラック。この変異体転写物の発現は、ＧＣ株における５’ＲＡＣＥによって確認された（下）。
【図３Ｄ】ＧＣにおける選択的プロモーターを示す図である。翻訳されたＲＡＳＡ３標準及び選択的アイソフォームの機能ドメイン。選択的転写物は、ＲＡＳＧＡＰドメインを欠くＲＡＳＡ３タンパク質をコードすると予測される。
【図３Ｅ】ＧＣにおける選択的プロモーターを示す図である。ＳＮＵ１９６７（上）及びＧＥＳ１（下）細胞の遊走能力に対するＲＡＳＡ３標準（ＣａｎＴ）及び選択的（ＳｏｍＴ）アイソフォームの過剰発現の効果。遊走アッセイにおけるＲＡＳＡ３−Ｃｔｌ（空ベクター）、ＲＡＳＡ３−ＣａｎＴ及びＲＡＳＡ３−ＳｏｍＴの代表的画像（ｎ＝３）。バープロットは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンの面積に対する遊走細胞の面積％を示す。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）
【図４Ａ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。選択的転写物の使用（転写物の四角）及びＮ末端切断型タンパク質アイソフォーム（タンパク質の四角）をもたらす選択的プロモーターの使用を概説する模式図。
【図４Ｂ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣ、ＩＣ≦５０ｎｍ）との高親和性結合が予測されるペプチドの平均％を示すバープロット。反復性体細胞プロモーター（選択的プロモーター）に関連するＮ末端ペプチドは、標準ＧＣペプチド（Ｐ＜０．０１、フィッシャー検定）、ヒトプロテオーム由来のランダムペプチド（Ｐ＜０．００１）、及びＮ末端変化を示す同じ遺伝子に由来するＣ末端ペプチド（Ｐ＜０．０１）に比べて、かなり濃縮された予測ＭＨＣ  Ｉ結合を示す。標準ペプチドとは、ＧＣにおいて非選択的プロモーターを介して過剰発現するタンパク質コード遺伝子に由来するペプチドを指す。
【図４Ｃ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。体細胞増大又は損失によって分類される異なるＨＬＡ対立遺伝子に結合すると予測される高親和性ペプチドの割合（％）。大部分の対立遺伝子は、高い結合親和性を有すると予測されるＮ末端欠失ペプチドを多数有する。
【図４Ｄ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇプロファイリングを用いた体細胞プロモーター発現の定量化。上−異なるＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプローブが、選択的及び標準プロモーターによって駆動される転写物の発現を測定するように設計された。２種のプローブ、すなわち、不変Ｈ３Ｋ４ｍｅ３によって標識される５’転写物における標準プローブ、及び体細胞プロモーターの５’転写物における選択的プローブが各遺伝子に対して設計された。下−９５個のＧＣ及び対応正常試料からの選択的プロモーター発現のヒートマップ。ＧＣ試料をそれらの体細胞プロモーター使用レベルによって左から右に並べた。
【図４Ｅ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。体細胞プロモーターとＴ細胞免疫の関連性は相関する（シンガポール（ＳＧ）コホート）。左上−体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＧＣ試料におけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．１４４３）並びにＴ細胞溶解性マーカーＧＺＭＡ（Ｐ＝０．０００１）及びＰＲＦ１（Ｐ＝０．００８０６）の発現（ＳＧ）。選択的プロモーター使用率の高い試料は、免疫マーカーの発現が少ない。Ｐ値はすべてウィルコクソン片側検定のものである。右−体細胞プロモーター使用率の高い（上２５％）検証試料と体細胞プロモーター使用率の低い（下２５％）検証試料の間で全生存曲線を比較したカプラン−マイヤー分析（ＨＲ＝２．５６、Ｐ＝０．０２）。
【図４Ｆ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。体細胞プロモーターとＴ細胞の関連性はＴＣＧＡ及びＡＣＲＧコホートにおいて相関する。（左）体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＴＣＧＡ  ＳＴＡＤにおけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．０２）、ＧＺＭＡ（Ｐ＝０．０１）及びＰＲＦ１（Ｐ＝０．０３）の発現。体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＡＣＲＧ  ＧＣ試料におけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．０３５）、ＧＺＭＡ（Ｐ＝０．００１）及びＰＲＦ１（Ｐ＝０．０２５）のＲＮＡ−ｓｅｑ（転写物／百万、右）発現によってＴ細胞マーカーを評価した。Ｐ値はすべてウィルコクソン片側検定のものである。
【図４Ｇ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。９名のドナーに対する１５個のペプチドプールの全サイトカイン応答（アクチンに対する倍率変化）のＥｐｉＭＡＸヒートマップ。
【図４Ｈ】体細胞プロモーター変化が免疫編集サインを示すことを示す図である。複雑なサイトカイン応答を示す２名の個体ドナー（ドナー２及びドナー３）の１５種のペプチドに対する個々のサイトカイン応答（ＦＣ≧２）。
【図５Ａ】体細胞プロモーターがＥＺＨ２占有率に関連することを示す図である。体細胞プロモーターを示すゲノム領域におけるＲｅＭａｐによって定義されたＴＦＢＳの結合濃縮。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３によって定義された全プロモーター領域における結合頻度に従ってＴＦを分類した。ＥＺＨ２及びＳＵＺ１２結合部位は、体細胞プロモーター（増大及び損失）を示す領域と有意に重複する（Ｐ＜０．０１、経験分布検定）。
【図５Ｂ】体細胞プロモーターがＥＺＨ２占有率に関連することを示す図である。不変プロモーターに関連するＲＮＡ転写物と比較した、ＩＭ９５細胞におけるＧＳＫ１２６処理で変化する体細胞プロモーターに関連するＲＮＡ転写物の割合。上の体細胞プロモーターの図は、単なる説明のためのものである。不変プロモーターは、体細胞プロモーター以外のすべての遺伝子プロモーターとして定義された。すべての遺伝子の割合としての、処理によって変化する遺伝子の割合も示す。体細胞プロモーターは、不変プロモーター（ＯＲ１．４６、Ｐ＜０．００１）又はすべてのＧＳＫ１２６調節遺伝子（ＯＲ９．２１、Ｐ＜０．００１、フィッシャー検定）よりもＧＳＫ１２６処理後に発現が変化する可能性が高い。
【図５Ｃ】体細胞プロモーターがＥＺＨ２占有率に関連することを示す図である。プロモーター活性が失われた遺伝子ＳＬＣ９Ａ９  ＴＳＳのＵＣＳＣブラウザトラック。ＩＭ９５細胞において６日目（Ｄ６）と９日目（Ｄ９）の両方の処理でＧＳＫ１２６を用いたＥＺＨ２の阻害後に発現の増大が見られる。
【図５Ｄ】体細胞プロモーターがＥＺＨ２占有率に関連することを示す図である。プロモーター活性が失われたＰＳＣＡ  ＴＳＳのＵＣＳＣブラウザトラック。ＩＭ９５細胞において６日目（Ｄ６）と９日目（Ｄ９）の両方の処理でＧＳＫ１２６を用いたＥＺＨ２の阻害後に発現の増大が見られる。
【図６Ａ】体細胞プロモーターが新規癌関連転写物を明らかにすることを示す図である。最も近い注釈付きＴＳＳに対する異なるプロモーターカテゴリの距離の分布。（左）第１のバープロットは、胃正常組織中に存在するプロモーターの距離分布を示し、第２は、ＧＣ試料中に存在するプロモーターの距離分布を示し、第３は、体細胞変化（すなわち、腫瘍と正常で異なる）を示すプロモーターの距離分布を示す。（右）バープロットは、損失又は増大体細胞プロモーターに関連する距離分布を示す。かなりの割合の増大体細胞プロモーターが、前もって注釈の付けられたＴＳＳから遠い位置を占める。
【図６Ｂ】体細胞プロモーターが新規癌関連転写物を明らかにすることを示す図である。７つの異なる組織にわたるＧｅｎｏＳｋｙｌｉｎｅによって予測される注釈のないプロモーターの中央機能スコア。注釈のないプロモーターは、ＧＩ、胎児及びＥＳＣ組織で高い機能スコアを示した。
【図６Ｃ】体細胞プロモーターが新規癌関連転写物を明らかにすることを示す図である。全プロモーター又は体細胞プロモーターを比較し、ＣＡＧＥデータによっても裏付けられる、ＣＡＧＥによって検証されたプロモーターの平均ＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りを示すボックスプロット。（＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン片側検定）。体細胞プロモーターは、より低レベルのＲＮＡ−ｓｅｑ発現を有することが認められる。
【図６Ｄ】体細胞プロモーターが新規癌関連転写物を明らかにすることを示す図である。低発現転写物の検出におけるＮａｎｏＣｈＩＰ−ｓｅｑ及びＲＮＡ−ｓｅｑ感度に対するダイナミックレンジの提案される効果を示す図。ダイナミックレンジがより制限されるため、エピゲノムプロファイリングは、ＲＮＡｓｅｑによって多量に発現される遺伝子の無作為抽出のために、ＲＮＡ配列決定により見逃された活性プロモーターを検出することができる。
【図６Ｅ】体細胞プロモーターが新規癌関連転写物を明らかにすることを示す図である。サンプリング減少及びサンプリング増加分析。ｙ軸は、様々なＲＮＡ配列決定深さにおいて全プロモーター又は体細胞プロモーターと重複する検出転写物の数を示す。当初の一次試料ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、約１０６Ｍの読み取りで配列が決定され、２０Ｍ、４０Ｍ及び６０Ｍの読み取りまでサンプリングが減少した。深いＲＮＡ−ｓｅｑデータは、約１３９Ｍの読み深度で更に作成された。
【図６Ｆ】体細胞プロモーターが新規癌関連転写物を明らかにすることを示す図である。深いが規則的でないＲＮＡ−ｓｅｑ深さで検出される癌関連転写物。ＡＢＣＡ１３のＵＣＳＣゲノムブラウザトラックは、ＮａｎｏＣｈＩＰ−ｓｅｑによって読み深度２０Ｍで検出されるが、ＲＮＡ配列決定によって約１３９Ｍの読み深度でのみ検出される新規転写物の一例を示す（ディープシーケンシングＧＣ）。この転写物は、通常の深さのＲＮＡ−ｓｅｑによって検出されない（ＧＣ）。
【図７Ａ】原発性ＧＣのクロマチンプロファイルを示す図である。３つの標識（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ１）に対する原発性ＧＣ、対応正常胃粘膜及びＧＣ細胞系のクロマチンプロファイル。プロモーター位置において強いＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃシグナル並びに低いＨ３Ｋ４ｍｅ１を強調するＧＣドライバー遺伝子ＭＹＣのＵＣＳＣゲノムブラウザトラックを示す。
【図７Ｂ】原発性ＧＣのクロマチンプロファイルを示す図である。転写開始点（ＴＳＳ）におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ１シグナル分布。線図は、ＴＳＳ領域におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域のクロマチンシグナルの分布を示す（＋／−３ｋｂ）。ヒートマップは、上位１０，０００個のＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域のｎｇｓ．プロット（６）を用いてプロットされた。
【図７Ｃ】原発性ＧＣのクロマチンプロファイルを示す図である。同定されたＨ３Ｋ４ｍｅ３領域におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３：Ｈ３Ｋ４ｍｅ１比の密度分布。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１比＞１の全領域が更なる分析に選択された（７３％）
【図７Ｄ】原発性ＧＣのクロマチンプロファイルを示す図である。代表的遺伝子転写領域の特徴に対するＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の分布（上）。矢印はＴＳＳを表す。
【図７Ｅ】原発性ＧＣのクロマチンプロファイルを示す図である。Ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ  Ｒｏａｄｍａｐデータベース（行）からの異なる胃腸組織において定義された１５のクロマチン状態（列）に対するＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の濃縮。各列は、０〜１のスケールである。
【図７Ｆ】原発性ＧＣのクロマチンプロファイルを示す図である。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域とＦＡＮＴＯＭ５  ＣＡＧＥデータの重複
【図８Ａ】ＧＣプロモーターの上皮の特徴を示す図である。原発性ＧＣ、胃正常試料（赤タイプ、赤い矢印で強調）、及び全Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域にわたるＥｐｉｇｅｎｏｍｅ  Ｒｏａｄｍａｐデータベースからの種々の組織タイプのＨ３Ｋ４ｍｅ３シグナル間のスピアマン相関ヒートマップ
【図８Ｂ】ＧＣプロモーターの上皮の特徴を示す図である。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域とＧＣ細胞系（８７％）、胃腸線維芽細胞（６１％）及び結腸癌株（７４％）において同定されたＨ３Ｋ４ｍｅ３領域の重複
【図９Ａ】ＧＣ体細胞プロモーター特徴を示す図である。２つの独立したアルゴリズムＤＥＳｅｑ２及びｅｄｇｅＲから同定された異なる（体細胞）Ｈ３Ｋ４ｍｅ３領域。ＤＥＳｅｑ２から同定された領域の９６％は、ｅｄｇｅＲを用いて同定されたものと重複した。両方のセットが後続の分析のためにプールされた。
【図９Ｂ】ＧＣ体細胞プロモーター特徴を示す図である。体細胞プロモーターに基づく１６個のＧＣ及び胃正常試料の主成分分析
【図９Ｃ】ＧＣ体細胞プロモーター特徴を示す図である。１９５９種の体細胞プロモーターにわたる１６個のＧＣ及び胃正常試料にわたるＨ３Ｋ２７ａｃ読み取り密度のヒートマップ。
【図９Ｄ】ＧＣ体細胞プロモーター特徴を示す図である。増大体細胞（左、ｒ＝０．７８、ｐ＜０．００１）及び損失体細胞（右、ｒ＝０．８２、ｐ＜０．００１）プロモーターの一次胃試料におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３プロモーターシグナルとＨ３Ｋ２７ａｃ活性シグナルの相関。各データポイントは、単一のＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域に対応する。分析は、１６のＮ／Ｔ対からのデータを用いて行われた（表４）。
【図９Ｅ】ＧＣ体細胞プロモーター特徴を示す図である。倍率変化の差（ｘ軸）及び偽陽性率（ＦＤＲ：ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）調節有意性（−ｌｏｇ１０スケール、ｙ軸）のダイナミックレンジを強調する体細胞プロモーターのボルケーノプロット（上）。体細胞プロモーターの大部分は、ＦＣ１と２．８２の間にあり、Ｃｈｉｐ−ｓｅｑのダイナミックレンジを反映する可能性がある。表（下）は、様々な厳密性レベルで同定された体細胞プロモーターの数を示す。様々なＦＤＲ閾値にもかかわらず、示差ピークの大部分は、依然として維持されている（例えば、ｑ＜０．０１で５９％）。
【図９Ｆ】ＧＣ体細胞プロモーター特徴を示す図である。増大（赤）及び損失体細胞プロモーター（青）に関連する上位５つの遺伝子セット（図１Ｆ）の様々な倍率変化及びＦＤＲ（ｑ値）における体細胞プロモーターのエンリッチメント解析。Ｘ軸は、体細胞プロモーターのサブセットにおいて濃縮されることが判明した遺伝子セットの−ｌｏｇ１０  ｐ値を示す。より厳密な倍率変化（ＦＣ２）及びｑ値閾値（０．０５、０．０１及び０．００１）でも、類似のＧＣ特異的及びＰＲＣ２関連サインが依然として認められる。
【図１０】ＧＣ及び別の腫瘍タイプにおける体細胞プロモーターと遺伝子発現の関連性を示す図である。  Ａ）ＧＣ体細胞プロモーターの例。例は、単なる説明のためのものである。  Ｂ）体細胞プロモーターと不変プロモーターの間の発見試料におけるＲＮＡ−ｓｅｑ発現（上）及びＤＮＡメチル化（下）の変化。上−体細胞プロモーター（増大及び損失）を示すゲノム領域における９対の原発性ＧＣと胃正常試料の間のＲＮＡ−ｓｅｑ発現の変化を示すボックスプロット（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）。下−不変プロモーターと比較した、２０対のＧＣと胃正常試料の間の体細胞プロモーターを示す領域におけるＤＮＡメチル化（β値）の変化を示すボックスプロット（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）。  Ｃ）独立した検証コホート。不変プロモーターと比較した、３５４個（３２１個のＧＣ、３３個の正常）のＴＣＧＡ胃腺癌（ＳＴＡＤ）試料にわたる体細胞プロモーターを示すゲノム領域におけるＲＮＡ−ｓｅｑ発現の変化を示すボックスプロット（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）  Ｄ）別の癌タイプにおける体細胞プロモーター。３２８個のＴＣＧＡ結腸腺癌（ＣＯＡＤ）試料（２８６個のＣＯＡＤ、４０個の正常；＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）、１７０個のＴＣＧＡ腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）試料（９８個のｃｃＲＣＣ及び７２個の正常；＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）、及び１１５個のＴＣＧＡ肺腺癌（ＬＵＡＤ）試料（５８個のＬＵＡＤ、５７個の正常；＊＊＊Ｐ＜０．００１  体細胞増大対不変及び体細胞増大対体細胞損失、＊Ｐ＜０．０５  体細胞損失対不変、ウィルコクソン検定）にわたる、不変プロモーターと比較した、ＧＣ体細胞プロモーターを示すゲノム領域におけるＲＮＡ−ｓｅｑ発現の変化を示すボックスプロット。
【図１１】ＣｐＧ島を含むプロモーターにおけるＤＮＡメチル化の変化を示す図である。  Ａ）ＣｐＧ島を有する全プロモーターと比較した、２０対のＧＣと胃正常試料の間のＣｐＧ島を有する体細胞プロモーターにおけるＤＮＡメチル化（β値）の変化を示すボックスプロット（＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）
【図１２Ａ】選択的及び標準アイソフォームの発現分布を示す図である。４つの独立した定量化技術Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ、ＭＩＳＯ、Ｋａｌｌｉｓｔｏ及びＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを用いた全選択的転写物（全体−上）、ＨＮＦ４α（中央）及びＥＰＣＡＭ（下）の標準及び選択的転写物アイソフォームのＴ／Ｎ比の分布を示すバープロット。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットホームが本文（Ｍａｉｎ  Ｔｅｘｔ）の図４に導入されている。＋＋Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析は、クエリープローブに限定される。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン片側検定）。
【図１２Ｂ】選択的及び標準アイソフォームの発現分布を示す図である。選択的プロモーターに位置するＮ末端読み取りと比較した、標準プロモーターに位置するＮ末端読み取りのＴ／Ｎ比を示すバープロット。選択的プロモーターによって駆動される転写物は、有意に高いＴ／Ｎ比を示す（ｐ＝０．０４、ウィルコクソン片側検定）。
【図１３Ａ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。体細胞及び標準ＴＳＳにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＲＮＡ−ｓｅｑシグナルを示すＲＡＳＡ３遺伝子のＵＣＳＣブラウザトラック。標準ＴＳＳは、等しいシグナルを有するが、体細胞ＴＳＳは、新規Ｎ末端切断型ＲＡＳＡ３転写物に対応する注釈のないＴＳＳにおけるプロモーター活性の増大を示す。
【図１３Ｂ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。体細胞及び標準ＴＳＳにおけるＮＣＣ２４  ＧＣ細胞系のＲＮＡ−ｓｅｑシグナルを示すＲＡＳＡ３遺伝子のＵＣＳＣブラウザトラック。ＮＣＣ２４は、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴのみを発現する（Ｃも参照されたい）。
【図１３Ｃ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。左−ＮＣＣ２４及びＮＣＣ５９  ＧＣ細胞における５’ＲＡＣＥによるＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ及びＣａｎＴ転写物の同定。第３の系（ＭＫＮ１）は、ゲル図に示すようにＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴに対して陰性であった。ｎｏ−ＲＮＡテンプレートを負の対照とした。右−ＮＣＣ２４細胞におけるＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴタンパク質の発現を強調するウエスタンブロット。
【図１３Ｄ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。ＲＡＳ  ＧＴＰアッセイ。（左）ウエスタンブロットは、空ベクター（ＥＶ：ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ又はＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴを導入したＧＥＳ１細胞におけるＲＡＳのレベルを示す（ｎ＝３）。収集及びＲＡＳ−ＧＴＰプルダウンアッセイ前に、ＧＥＳ１細胞を終夜血清不足にし、続いて血清刺激を３０分間行った。全ＲＡＳを対応する細胞全体のタンパク質溶解物中で測定した。βアクチンを添加対照として使用した。プルダウンアッセイの陽性（ＧＴＰ）及び陰性（ＧＤＰ）対照も示す。（右）バープロットは、ＦＢＳ曝露条件下で空ベクター（ＥＶ）、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ又はＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴを導入したＧＥＳ１細胞において行われた３つの独立したプルダウンアッセイの活性ＲＡＳ強度を定量化したものである。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す（＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定）。
【図１３Ｅ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。０日目に規準化されたＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ及びＳｏｍＴ導入後のＳＮＵ１９６７、ＧＥＳ１及びＡＧＳ細胞の細胞増殖アッセイ。（３つの独立した実験を表す、３つ組で行われた平均±ＳＤとしてデータを示す）。
【図１３Ｆ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。ＧＥＳ１及びＳＮＵ１９６７細胞の浸潤能力に対するＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ及びＳｏｍＴアイソフォームの過剰発現の効果。浸潤アッセイにおけるＥＶ、ＲＡＳＡ３−ＷＴ及びＲＡＳＡ３−Ｖａｒの代表的画像（ｎ＝３）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンの面積に対する侵入細胞の面積％を示すバープロット。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）。
【図１３Ｇ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。高遊走性ＫＲＡＳ変異ＡＧＳ細胞の遊走能力に対するＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ及びＳｏｍＴタンパク質アイソフォームの過剰発現の効果。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンの面積に対する遊走細胞の面積％を示すバープロット。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）。ＲＡＳＡ３  ＷＴは、ＲＡＳＡ３  Ｖａｒよりも強力な遊走抑制を誘導し、ＲＡＳＡ３  ＷＴが遊走阻害剤であることを示唆している。
【図１３Ｈ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。ＮＣＣ２４細胞におけるＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン。細胞をｓｃ−ｓｉＲＮＡ（対照）及び２種のＲＡＳＡ３  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１−ｈｓ．Ｒｉ．ＲＡＳＡ３．１３  ＴｒｉＦＥＣＴａ（登録商標）キットＤｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ−３−Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｓ３５５）で処理した。（左）ｓｉＲＮＡ−１及びｓｉＲＮＡ−３処理後のＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴのｍＲＮＡ発現の倍率変化差を示すバープロット。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す。（右）ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴタンパク質の減少を確認するウエスタンブロット法の結果。細胞を導入の４８時間後に収集し、溶解した。（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）。
【図１３Ｉ】ＲＡＳＡ３アイソフォームの特性分析を示す図である。２種の独立したｓｉＲＮＡからのＮＣＣ２４細胞の遊走（左）及び浸潤（右）能力に対するＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴアイソフォームのｓｉＲＮＡノックダウンの効果。遊走及び浸潤アッセイにおけるｓｃ−ｓｉＲＮＡ（対照）、ｓｉＲＮＡ−１及びｓｉＲＮＡ−３の代表的画像（ｎ＝３）。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンの面積に対する遊走／侵入細胞の面積％を示すバープロット。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）。
【図１４Ａ】ＭＥＴアイソフォームの特性分析を示す図である。選択的下流遺伝子座におけるプロモーター活性の増大を強調するＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＲＮＡ−ｓｅｑシグナルを示す、ＭＥＴ遺伝子のＵＣＳＣブラウザトラック（暗灰色の四角）。
【図１４Ｂ】ＭＥＴアイソフォームの特性分析を示す図である。ＭＥＴ標準（ＷＴ）及び選択的（Ｖａｒ）アイソフォームの機能ドメイン。選択的アイソフォームは、Ｎ末端切断型ＳＥＭＡドメインを有するＭＥＴタンパク質をコードすると予測される。
【図１４Ｃ】ＭＥＴアイソフォームの特性分析を示す図である。５’ＲＡＣＥによって検出される、ＧＣ株におけるＭＥＴ（Ｖａｒ）転写物の発現。
【図１４Ｄ】ＭＥＴアイソフォームの特性分析を示す図である。０、１５及び３０分間のＨＧＦ処理（１００ｎｇ／ｍｌ）において空ベクター（ＥＶ）、ＭＥＴ標準完全長（ＭＥＴ−ＷＴ）及び切断型変異体（ＭＥＴ−Ｖａｒ）を導入したＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロット（ｎ＝３）。ＧＡＢ１、ＳＴＡＴ３及びＥＲＫ１／２は、ＭＥＴシグナル伝達の公知の下流エフェクターである。各バンドの下の数は、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂによる定量化強度である。未処理条件とＨＧＦ処理条件の両方において、ＭＥＴ−Ｖａｒ導入細胞は、ＭＥＴシグナル伝達の重要な媒介物質であるｐ−Ｇａｂ１（Ｙ６２７）をより高いレベルで示した（２．４８〜３．９５倍、ｐ＝０．００３（未処理）、ｐ＜０．０５（Ｔ１５及びＴ３０）。未処理試料においては、ＭＥＴ−Ｖａｒを導入した細胞は、ＭＥＴ−ＷＴより高いｐＥＲＫ１／２レベル（２．７４倍）及びより高いｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）レベル（１．８０倍）も示した（ｐＥＲＫ及びｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）それぞれでｐ＝０．０２３及びｐ＝０．０２６）。
【図１４Ｅ】ＭＥＴアイソフォームの特性分析を示す図である。ＨＧＦ処理の効果を反映した、ＥＶ、ＭＥＴ−ＷＴ及びＭＥＴ−ＶａｒにおけるＴ０、Ｔ１５及びＴ３０でのｐＥＲＫ１／２の増加を示す棒グラフ。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）
【図１４Ｆ】ＭＥＴアイソフォームの特性分析を示す図である。ＥＶ及びＭＥＴ−ＷＴと比較した、ＭＥＴ−Ｖａｒを導入した細胞におけるｐ−ＧＡＢ１（Ｙ６２７）、ｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）及びｐＥＲＫ１／２の増加を示す棒グラフ。３つの時点すべてのグラフを示す。データを平均±ＳＤ；ｎ＝３として示す。（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントの片側ｔ検定）
【図１５】Ｎ末端ペプチドの免疫原性を示す図である。  Ａ）ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ（ＩＣ≦５０ｎｍ）との高親和性結合が予測されるＮ末端ペプチドの平均％を示すバープロット。比較として、本文中の図は、全３つのＨＬＡクラス（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ）に基づく平均％である。反復性体細胞選択的プロモーターに関連するＮ末端ペプチドは、標準ＧＣペプチド（Ｐ＜０．０１）、ヒトプロテオーム由来のランダムペプチド及びＮ末端変化を示す同じ遺伝子に由来するＣ末端ペプチド（Ｐ＜０．００１、フィッシャー検定）に比べて、かなり濃縮された予測ＭＨＣ  Ｉ結合を示す。  Ｂ）ＲＮＡ−ｓｅｑ分析単独によって推測されるＮ末端ペプチドを用いたＭＨＣ結合予測。ＧＣ対正常で異なるＮ末端エキソンを示す注釈付き転写物を、２つの異なるＲＮＡ−ｓｅｑアルゴリズム（ＤＥＸＳｅｑ（７）及びＶｏｏｍ−ｄｉｆｆｓｐｌｉｃｅ（８））を用いて同定した（ＦＣ≧２、ＦＤＲ０．０５）。この分析は、潜在的選択的Ｎ末端転写物を有する９６個の遺伝子を同定し、そのうち４６個（４８％）は、異なるＮ末端ペプチド（紫の棒）をもたらすと予測される。
【図１６Ａ】免疫原性アッセイ及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプロファイリングを示す図である。同じ試料のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ及びＲＮＡ−ｓｅｑデータからの選択的及び標準プローブの発現の倍率変化（Ｔ対Ｎ）の散布図。相関の向上が選択的プローブを用いて認められる。
【図１６Ｂ】免疫原性アッセイ及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプロファイリングを示す図である。左−ＡＳＣＡＴによって推定される腫瘍純度の調節後の体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＳＧシリーズ（上）、ＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ（中央）及びＡＣＲＧコホート（下）におけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の発現。Ｐ値（ウィルコクソン片側検定）は、ＣＤ８Ａ−ｐ＝０．０９（ＳＧ）、０．００４（ＴＣＧＡ）、０．３（ＡＣＲＧ）；ＧＺＭＡ−０．０００１（ＳＧ）、０．００２（ＴＣＧＡ）、０．１６６（ＡＣＲＧ）、ＰＲＦ１−０．０１３（ＳＧ）、０．００６（ＴＣＧＡ）、０．３（ＡＣＲＧ）である。右−ＥＳＴＩＭＡＴＥによって推定される腫瘍含有量の調節後の体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＳＧシリーズ（上）、ＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ（中央）及びＡＣＲＧコホート（下）におけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の発現。ｐ値（ウィルコクソン片側検定）は、ＣＤ８Ａ−ｐ＝０．２８（ＳＧ）、０．１７（ＴＣＧＡ）、０．３７（ＡＣＲＧ）、ＧＺＭＡ−０．０００５（ＳＧ）、０．０３（ＴＣＧＡ）、０．０９（ＡＣＲＧ）、ＰＲＦ１−０．０２（ＳＧ）、０．２２（ＴＣＧＡ）、０．１７（ＡＣＲＧ）である。選択的プロモーター使用率の高い試料は赤、使用率の低いものは青である。
【図１６Ｃ】免疫原性アッセイ及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプロファイリングを示す図である。体細胞プロモーター使用率の高い検証試料と体細胞プロモーター使用率の低い検証試料（中央値で分割）の間で全生存曲線を比較したカプラン−マイヤー分析（ＨＲ＝１．８１、Ｐ＝０．０４）。
【図１６Ｄ】免疫原性アッセイ及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプロファイリングを示す図である。左−変異負荷の調節後の体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＴＣＧＡ  ＳＴＡＤにおけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の発現。Ｐ値（ウィルコクソン片側検定）は、Ｐ＝０．０２（ＣＤ８Ａ）、０．０１（ＧＺＭＡ）及び０．０３（ＰＲＦ１）である。右−変異負荷の調節後の体細胞プロモーター使用率の高い又は低いＡＣＲＧコホートにおけるＴ細胞マーカーＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１の発現。Ｐ値（ウィルコクソン片側検定）は、Ｐ＝０．１６７（ＣＤ８Ａ）、０．００９（ＧＺＭＡ）及び０．０３（ＰＲＦ１）である。
【図１６Ｅ】免疫原性アッセイ及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプロファイリングを示す図である。すべての増大選択的プロモーターについての２６４のＡＣＲＧ  ＧＣからの選択的プロモーター発現のヒートマップ。ＧＣ試料をそれらの体細胞プロモーター使用レベルによって左から右に並べた。
【図１７Ａ−１】ペプチド免疫原性の機能評価を示す図である。様々なペプチドプールに対して試験した他の正常ドナーＰＢＭＣの１５種のペプチドに対する個々のサイトカイン応答。
【図１７Ａ−２】ペプチド免疫原性の機能評価を示す図である。様々なペプチドプールに対して試験した他の正常ドナーＰＢＭＣの１５種のペプチドに対する個々のサイトカイン応答。
【図１７Ａ−３】ペプチド免疫原性の機能評価を示す図である。様々なペプチドプールに対して試験した他の正常ドナーＰＢＭＣの１５種のペプチドに対する個々のサイトカイン応答。
【図１７Ｂ】ペプチド免疫原性の機能評価を示す図である。実験免疫原性アッセイ。インビトロアッセイの実験計画−ｉ）ＨＬＡ−Ａ０２：０６ドナーのＣＤ１４＋単球から培養された未熟樹状細胞（ＤＣ：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）を成熟ＤＣに分化させた（「方法」参照）。成熟ＤＣを標準（ＣａｎＴ）及び体細胞（ＳｏｍＴ）ＲＡＳＡ３アイソフォームを発現する同質遺伝子ＧＣ細胞溶解物（ＡＧＳ細胞）に曝露した。ｉｉ）抗原提示及びＴ細胞活性化：Ｃａｎ又はＳｏｍ  ＲＡＳＡ３アイソフォームを提示するＤＣを、ＨＬＡ適合Ｔ細胞と共培養して、ＣａｎＴ又はＳｏｍＴ  ＲＡＳＡ３に対して刺激されたＴ細胞を得た。刺激を受けたＴ細胞を次いでＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ又はＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ発現ＧＣ細胞と２日間個別に共培養し、Ｔ細胞活性化のマーカーを評価した。
【図１７Ｃ】ペプチド免疫原性の機能評価を示す図である。抗原曝露後、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ又はＳｏｍＴアイソフォームで刺激されたＴ細胞の共培養によるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌の濃度。ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ刺激を受けたＴ細胞は、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ発現細胞と共培養されたときに、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴで刺激され、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ発現細胞と共培養されたＴ細胞に比べて、有意に多いＩＦＮ−γを放出した（Ｐ＝０．０２、ｎ＝３の実験を表す）。ＩＦＮ−γレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１８Ａ】ＥＺＨ２阻害を示す図である。全プロモーターと比較した体細胞プロモーターにおけるＨＦＥ−１４５細胞中のＥＺＨ２結合部位の濃縮の増加を示すバープロット（Ｐ＜０．０１）。
【図１８Ｂ】ＥＺＨ２阻害を示す図である。ＧＳＫ１２６投与後のＩＭ９５  ＧＣ細胞の増殖曲線。細胞増殖を２４〜２１６時間モニターし、ＤＭＳＯ対照処理細胞と比較した（平均±ｓ．ｅ．ｍ．は、３つの実験のデータを表し、各実験を二つ組で行った）
【図１８Ｃ】ＥＺＨ２阻害を示す図である。プロモーター遺伝子座におけるＧＳＫ１２６処理対ＤＭＳＯ対照ＩＭ９５  ＲＮＡ−ｓｅｑデータの示差分析から同定された遺伝子のセットの上位５つの濃縮精選遺伝子セット（Ｃ２）。
【図１８Ｄ】ＥＺＨ２阻害を示す図である。プロモーター活性の失われた選択的プロモーターＥＳＲＲＧのＵＣＳＣブラウザトラック（ＧＣ（赤）及び正常胃組織（青）Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）。ＩＭ９５細胞において６日目（Ｄ６）と９日目（Ｄ９）の両方の処理でＧＳＫ１２６を用いたＥＺＨ２の阻害後に発現の増大が見られる。
【図１９】注釈のない体細胞プロモーターを示す図である。  Ａ）全プロモーターと比較した注釈のないプロモーター領域におけるＬ１（ＦＣ＝８．０２、Ｐ＜０．００１）及びＥＲＶ１（ＦＣ＝２．７８、Ｐ＜０．００１）繰り返しエレメントの濃縮倍率を示すバープロット  Ｂ）Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナル（ｒｐｍ）を注釈のない体細胞プロモーターと注釈付き体細胞プロモーターで比較したボックスプロット。注釈のない体細胞プロモーターの方がＨ３Ｋ２７ａｃシグナルが低い。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
第１の態様においては、本発明は、非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定する方法に言及する。該方法は、癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を癌生体試料から単離するステップであって、単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定するステップを含む。
【００４５】
一実施形態においては、癌及び非癌生体試料は、単細胞、多細胞、細胞の断片、体液又は組織を含むことができる。一実施形態においては、癌生体試料と非癌生体試料を同じ対象から得ることができる。
【００４６】
一実施形態においては、癌生体試料と非癌生体試料は、各々異なる対象から得られる。
【００４７】
本明細書に記載の方法に係る接触させるステップは、ヒストン修飾に特異的な抗体を用いたクロマチンの免疫沈降を含むことができる。ヒストン修飾の例としては、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい一実施形態においては、ヒストン修飾は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及び／又はＨ３Ｋ４ｍｅ１である。更に別の一実施形態においては、ヒストン修飾は、Ｈ３Ｋ２７ａｃである。
【００４８】
該方法は、更に、癌生体試料からの少なくとも１種のプロモーターを少なくとも１個の参照核酸配列に対してマッピングして、少なくとも１種のプロモーターに関連する遺伝子転写物を同定するステップを含むことができる。
【００４９】
一部の実施形態においては、少なくとも１個の参照核酸配列は、ｉ）注釈付きゲノム配列、ｉｉ）新規トランスクリプトーム集合体、及び／又はｉｉｉ）非癌核酸配列ライブラリ若しくはデータベースに由来する核酸配列を含むことができる。
【００５０】
一実施形態においては、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化は、非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の０．５倍を超える、１倍を超える、１．５倍を超える、２倍を超える、２．５倍を超える、又は３倍を超える増加又は減少とすることができる。好ましい一実施形態においては、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化は、非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の１．５倍を超えて増加又は減少することができる。別の一実施形態においては、非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の０．５倍を超える、１倍を超える、１．５倍を超える、２倍を超える、２．５倍を超える、又は３倍を超える増加のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化は、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの存在と相関し得る。
【００５１】
好ましい一実施形態においては、非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の１．５倍を超えて増加するＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化は、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの存在と相関し得る。
【００５２】
一実施形態においては、少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性は、全プロモーター集団に比べたＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加と相関し得る。
【００５３】
一実施形態においては、ＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加は、少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の上方制御と相関する。別の一実施形態においては、ＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加は、少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の下方制御と相関する。
【００５４】
一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、公知の遺伝子転写物開始点から１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ又は１０００ｂｐ以内に位置する標準プロモーターとすることができる。好ましい一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、公知の遺伝子転写物開始点から５００ｂｐ以内に位置する標準プロモーターとすることができる。遺伝子転写物開始点は、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、ＰＲＣ２標的遺伝子又は転写因子の１種以上に関連し得る。一実施形態においては、遺伝子転写物開始点は、癌遺伝子に関連し得る。遺伝子転写物開始点は、ＭＹＣ、ＭＥＴ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ３、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＶＴ１、ＨＮＦ４α、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連し得る。
【００５５】
一実施形態においては、癌は、消化器癌、胃癌又は結腸癌である。
【００５６】
別の一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、標準プロモーターに関連し得る選択的プロモーターとすることができ、標準プロモーターは、癌生体試料と非癌生体試料の両方に存在してもよく、ｉ）選択的プロモーターは癌生体試料にのみ存在してもよく、又はｉｉ）選択的プロモーターは癌生体試料にのみ存在しなくてもよい。
【００５７】
一部の実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、遺伝子転写物開始点から１００ｂｐを超える、２００ｂｐを超える、３００ｂｐを超える、４００ｂｐを超える、５００ｂｐを超える、６００ｂｐを超える、７００ｂｐを超える、８００ｂｐを超える、９００ｂｐを超える又は１０００ｂｐを超える位置にある注釈のないプロモーターである。好ましい一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐを超えて離れて位置する注釈のないプロモーターである。
【００５８】
一実施形態においては、本明細書に記載の方法は、更に、癌生体試料及び非癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及びレポータープローブのデジタルプロファイリングに基づいて、非癌生体試料と比較した少なくとも１種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無を確認するステップを含む。
【００５９】
測定するステップは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プラットホームを用いて行うことができる。
【００６０】
別の一態様においては、本発明は、対象における癌の予後を判定する方法を提供する。該方法は、対象から得られる癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を癌生体試料から単離するステップであって、単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を参照核酸配列中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップを含み、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無が、対象における癌の予後を示している。
【００６１】
一実施形態においては、少なくとも１種の癌関連プロモーターは、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターとすることができ、標準プロモーターは、癌生体試料と参照核酸配列の両方に存在してもよく、ｉ）選択的プロモーターは癌生体試料にのみ存在してもよく、又はｉｉ）選択的プロモーターは癌生体試料にのみ存在しなくてもよい。
【００６２】
癌試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無が、対象における癌生存の予後不良を示している可能性がある。
【００６３】
一実施形態においては、本明細書に記載の方法は、更に、癌生体試料及び参照核酸配列における少なくとも１種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及びレポータープローブのデジタルプロファイリングに基づいて、非癌生体試料と比較した少なくとも１種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、参照核酸配列と比較した癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無を確認するステップを含む。
【００６４】
測定するステップは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プラットホームを用いて行うことができる。
【００６５】
別の一態様においては、本発明は、対象における癌を検出するためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、非癌生体試料と比較して癌生体試料におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度が変化した少なくとも１種のプロモーターを含む、バイオマーカーを提供する。
【００６６】
一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、全プロモーター集団に比べてＥＺＨ２結合部位の増加を含む。一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターを低メチル化することができる。別の一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターを高メチル化することができる。
【００６７】
少なくとも１種のプロモーターは、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐ未満離れて位置する標準プロモーターとすることができる。一実施形態においては、遺伝子転写物開始点は、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、ＰＲＣ２標的遺伝子又は転写因子の１種以上に関連し得る。一実施形態においては、遺伝子転写物開始点は、癌遺伝子に関連し得る。
【００６８】
一実施形態においては、遺伝子転写物開始点は、ＭＹＣ、ＭＥＴ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ３、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＶＴ１、ＨＮＦ４α、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ又はそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連し得る。
【００６９】
一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、標準プロモーターに関連し得る選択的プロモーターとすることができ、標準プロモーターは、癌試料と非癌試料の両方に存在してもよく、ｉ）選択的プロモーターは癌試料にのみ存在してもよく、又はｉｉ）選択的プロモーターは癌試料にのみ存在しなくてもよい。
【００７０】
一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、遺伝子転写物開始点から１００ｂｐを超えて、２００ｂｐを超えて、３００ｂｐを超えて、４００ｂｐを超えて、５００ｂｐを超えて、６００ｂｐを超えて、７００ｂｐを超えて、８００ｂｐを超えて、９００ｂｐを超えて又は１０００ｂｐを超えて離れて位置し得る注釈のないプロモーターとすることができる。好ましい一実施形態においては、少なくとも１種のプロモーターは、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐを超えて離れて位置し得る注釈のないプロモーターとすることができる。
【００７１】
別の一態様においては、細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性を調節する方法であって、ＥＺＨ２の阻害剤を細胞に投与するステップを含む、方法を提供する。別の一態様においては、癌に対する対象の免疫応答を調節する方法であって、対象にＥＺＨ２の阻害剤を投与するステップを含み、ＥＺＨ２が対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、方法を提供する。
【００７２】
一実施形態においては、ＥＺＨ２の阻害剤は、免疫原性Ｎ末端ペプチドの発現を調節することができる。
【００７３】
一実施形態においては、少なくとも１種の癌関連プロモーターは、標準プロモーターに関連し得る選択的プロモーターとすることができ、標準プロモーターは、癌試料と非癌試料の両方に存在してもよく、ｉ）選択的プロモーターは癌試料にのみ存在してもよく、又はｉｉ）選択的プロモーターは癌試料にのみ存在しなくてもよい。
【００７４】
一実施形態においては、選択的プロモーターは転写物変異体に関連し、転写物変異体はＮ末端タンパク質変異体をコードする。
【００７５】
一実施形態においては、Ｎ末端タンパク質変異体は、Ｎ末端切断型タンパク質又はＮ末端長鎖タンパク質とすることができる。一実施形態においては、ＥＺＨ２の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ又は小分子とすることができる。
【００７６】
一実施形態においては、ＥＺＨ２の阻害剤は、ＧＳＫ１２６とすることができる。
【００７７】
別の一態様においては、細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の調節のための医薬品の製造におけるＥＺＨ２の阻害剤の使用を提供する。
【００７８】
別の一態様においては、癌に対する対象の免疫応答の調節のための医薬品の製造におけるＥＺＨ２の阻害剤の使用であって、ＥＺＨ２が対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、使用を提供する。
【００７９】
別の一態様においては、細胞中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の調節に使用するためのＥＺＨ２の阻害剤を提供する。更に別の一態様においては、癌に対する対象の免疫応答の調節に使用するためのＥＺＨ２の阻害剤であって、ＥＺＨ２が対象における少なくとも１種の癌関連プロモーターに関連する、阻害剤を提供する。
【００８０】
別の一態様においては、非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定する方法を提供する。該方法は、癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な抗体と接触させるステップ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を癌生体試料から単離するステップであって、単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な領域を含む、ステップ、単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を読み深度２０Ｍで検出するステップ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップを含む。
【００８１】
実験の項
方法及び材料
一次組織試料及び細胞系
一次患者試料は、ＳｉｎｇＨｅａｌｔｈ組織貯蔵所から得られ、機関研究倫理審査委員会から認可を受け、患者のインフォームドコンセントに署名がなされた。この研究に使用される「正常」（非悪性）試料とは、胃から、腫瘍から遠い部位から収集され、外科的評価で腫瘍も腸上皮化生／異形成も目に見える証拠がない試料を指す。腫瘍試料は、凍結切片によって＞６０％腫瘍細胞を含むことが確認された。ＦＵ９７、ＩＭ９５、ＭＫＮ７、ＯＣＵＭ１及びＲＥＲＦ−ＧＣ−１Ｂ細胞系を、Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｂａｎｋから得た。ＡＧＳ、ＫＡＴＯＩＩＩ及びＳＮＵ１６、Ｈｓ１．Ｉｎｔ及びＨｓ７３８．Ｓｔ／Ｉｎｔ胃腸線維芽細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ＮＣＣ−５９、ＮＣＣ−２４及びＳＮＵ−１９６７及びＳＮＵ−１７５０をＫｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋから得た。ＹＣＣ３、ＹＣＣ７、ＹＣＣ２１、ＹＣＣ２２は、Ｙｏｎｓｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、韓国から供与された。ＨＦＥ１４５細胞は、Ｄｒ．Ｈａｓｓａｎ  Ａｓｈｋｔｏｒａｂ、ハワード大学から供与された。ＧＥＳ−１細胞は、Ｄｒ．Ａｌｆｒｅｄ  Ｃｈｅｎｇ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇから供与された。細胞系同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ）は、ＡＮＳＩ／ＡＴＣＣ  ＡＳＮ−０００２−２０１１ガイドラインを用いたＳＴＲ  ＤＮＡプロファイリングによって確認された。本発明者らの研究では、ＩＣＬＡＣ（ｈｔｔｐ：／／ｉｃｌａｃ．ｏｒｇ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｃｒｏｓｓ−ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｓ／）によって一般に誤認された細胞系として示されたＭＫＮ７細胞は、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  ＢａｎｋにおけるＭＫＮ７参照プロファイルと完全に一致した（１００％）。すべての細胞系は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ（商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）及びＭｙｃｏＳｅｎｓｏｒ  ｑＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価して、マイコプラズマ汚染が陰性であった。健康なドナーからのＰＢＭＣをプロトコルＣＩＲＢ  Ｒｅｆ  Ｎｏ．２０１０／７２０／Ｅに従って収集した。
【００８２】
Ｎａｎｏ−ＣｈＩＰｓｅｑ
Ｎａｎｏ−ＣｈＩＰ−Ｓｅｑを後述するように行った。
【００８３】
一次組織及び細胞系固定
新鮮凍結癌及び正常組織をかみそりの刃を用いて液体窒素中で切り裂いて、約５ｍｇサイズの小片を各ＣｈＩＰ用に得た。組織片を１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ緩衝剤中で１０分間室温で固定した。グリシンを最終濃度１２５ｍＭまで添加して固定を停止した。組織片をＴＢＳＥ緩衝剤で３回洗浄した。細胞系の場合、１００万個の新しい収集細胞を１％ホルムアルデヒド／培地緩衝剤中で１０分間（ｍｉｎ）室温で固定した。グリシンを最終濃度１２５ｍＭまで添加して固定を停止した。固定細胞をＴＢＳＥ緩衝剤で３回洗浄し、遠心分離した（５，０００ｒ．ｐ．ｍ．、５ｍｉｎ）。
【００８４】
ＣｈＩＰ
ペレット化細胞及び微粉砕組織を１００μｌの１％ＳＤＳ溶解緩衝剤に溶解し、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いて超音波処理して３００〜５００ｂｐにした。ＣｈＩＰを以下の抗体を用いて行った：Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（０７−４７３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（ａｂ８８９５、Ａｂｃａｍ）；Ｈ３Ｋ２７ａｃ（ａｂ４７２９、Ａｂｃａｍ）。
【００８５】
ＷＧＡ
ＣｈＩＰ及び入力ＤＮＡの回収後、全ゲノム増幅をＷＧＡ４キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＢｐｍＩ−ＷＧＡプライマーを用いて行った。増幅されたＤＮＡをＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ＢｐｍＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて消化して、ＷＧＡアダプターを除去した。
【００８６】
ライブラリ調製及び配列決定
増幅ＤＮＡ３０ｎｇを各配列決定ライブラリ調製（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に使用した。８つのライブラリを多重化し（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｈｉｓｅｑ２５００配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の２レーン上で平均深さ２０００〜３０００万読み取り／ライブラリまで配列を決定した。
【００８７】
配列決定読み取りを切り詰め（前後から１０ｂｐ）、ヒトゲノム参照ｈｇ１９に対してＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）（バージョン０．６．２）「ａｌｎ」アルゴリズムを用いてマッピングした。読み取り統計をｓａｍｔｏｏｌｓのｍａｐｓｔａｔを用いて作成した。本発明者らは、読み取りをそれらのマッピング品質（ＭＡＰＱ≧１０）に基づいて選別し、一義的にマッピングされた読み取りを用いて、ＣＣＡＴ  ｖ３．０によりピーク抽出を行った。本発明者らは、ＭＡＰＱ値≧１０を選択した。というのは、ｉ）ＭＡＰＱ≧１０は、信頼できる読み取りマッピングのための確実な値として以前に報告され、ｉｉ）ＭＡＰＱ≧１０は、ＢＷＡ−アルゴリズムの開発者によって信頼できるマッピングのための適切な閾値として推奨され、ｉｉｉ）種々の読み取り整列アルゴリズムを比較した独立した研究によれば、マッピング精度は、１０〜１２ＭＡＰＱ閾値で頭打ちになるからである。
【００８８】
ＥＺＨ２  ＣｈＩＰ−ｓｅｑ
細胞を１％ホルムアルデヒドを用いて１０分間室温で架橋し、グリシンを最終濃度０．２Ｍまで添加して停止した。クロマチンを抽出し、超音波処理して、約５００ｂｐの断片にした。ＥＺＨ２抗体（カタログ＃５２４６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）に使用した。クロマチン免疫沈降ＤＮＡ３０ｎｇを各配列決定ライブラリ調製（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に使用した。ライブラリをＨｉｓｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。免疫沈降前の細胞からの入力ＤＮＡを使用して、ＣｈＩＰ−ｓｅｑピーク抽出を規準化した。配列決定前に、ｑＰＣＲを使用して、正及び負の対照ＣｈＩＰ領域が線形範囲で増幅されたことを検証した。配列決定読み取りをヒトゲノム参照ｈｇ１９に対してＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ（ＢＷＡ）（バージョン０．７）「ａｌｎ」アルゴリズムを用いてマッピングした。読み取り統計をｓａｍｔｏｏｌｓのｍａｐｓｔａｔを用いて作成した。本発明者らは、読み取りをそれらのマッピング品質（ＭＡＰＱ≧１０）に基づいて選別し、一義的にマッピングされた読み取りを用いて、ＭＡＣＳ２によりピーク抽出を行った。
【００８９】
Ｎａｎｏ−ＣｈＩＰｓｅｑデータの品質管理評価
ＣｈＩＰ濃縮評価
本発明者らは、ＣｈＩＰライブラリ品質（Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１）を２つの異なる方法で評価した。まず、本発明者らは、ＣｈＩＰ品質、特にＨ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３を、タンパク質コード遺伝子の注釈付きプロモーターにおけるそれらの濃縮レベルを調べることによって推定した。具体的には、本発明者らは、高発現タンパク質コード遺伝子の転写開始点（ＴＳＳ、＋／−５００ｂｐ）周囲の入力及び入力補正ＣｈＩＰシグナルの中央読み取り密度を計算した。各試料について、本発明者らは、次いで、ＣｈＩＰと入力の読み取り密度比をデータ品質の代わりとして比較して、ＣｈＩＰ／入力比が２倍を超える試料のみを保持した。この基準を用いると、すべてのＨ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７ａｃ試料（ＧＣ株及び一次試料）は、２倍を超える濃縮を示し、濃縮が成功したことを示した。次に、本発明者らは、ＣｈＩＰライブラリの濃縮が成功したか不十分かを示す、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ品質管理及びプロトコル最適化のためのソフトウェアＣＨＡＮＣＥ（ＣｈＩｐ−ｓｅｑ  ＡＮａｌｙｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）を使用した。ＣＨＡＮＣＥ評価によって、本発明者らの研究における大多数（８１％）の試料の濃縮に成功したことを確認した。両方の方法で評価した各ライブラリの品質状態を表１に報告する。
【００９０】
【表１】
2019511209.tif 000003
【００９１】
【表２】
2019511209.tif 000004
【００９２】
【表３】
2019511209.tif 000005
【００９３】
【表４】
2019511209.tif 000006
【００９４】
【表５】
2019511209.tif 000007
【００９５】
【表６】
2019511209.tif 000008
【００９６】
【表７】
2019511209.tif 000009
【００９７】
【表８】
2019511209.tif 000010
【００９８】
【表９】
2019511209.tif 000011
【００９９】
【表１０】
2019511209.tif 000012
【０１００】
【表１１】
2019511209.tif 000013
【０１０１】
【表１２】
2019511209.tif 000014
【０１０２】
プロモーター分析
正常及びＧＣ試料にわたって統合されたすべてのＨ３Ｋ４ｍｅ３領域のＨ３Ｋ４ｍｅ３：Ｈ３Ｋ４ｍｅ１比を計算することによって、プロモーター（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ）領域を同定した。本発明者らは、腫瘍試料と正常試料の間の上位１００種の異なるプロモーターの平均シグナルに基づいて８０％検出力及び１０％第一種の過誤（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｗｅｒａｎｄｓａｍｐｌｅｓｉｚｅ．ｃｏｍ／）を達成するのに必要な試料サイズを推定した。この結果、推奨試料サイズは１１（平均）となり、本発明者らの研究において満たされた（１６Ｎ／Ｔ）。正常試料とＧＣ試料の両方においてＨ３Ｋ４ｍｅ３：Ｈ３Ｋ４ｍｅ１比＜１の領域を更なる分析から除外した。この研究で行われたすべての分析では、プロモーター領域は、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／ｍｅ１  ｌｏｗシグナルを示すゲノム位置として定義され、すべての後続の分析では、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３シグナルが比較されたのは、この予め定義されたＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／ｍｅ１  ｌｏｗサブセット内のみであった。Ｈ３Ｋ２７ａｃデータを相関分析に使用した。結腸癌株のＨ３Ｋ４ｍｅ３データ（ｆａｓｔｑｓ）を公開データベースからダウンロードした−ＥＮＣＯＤＥからのＨｃｔ１１６及びＣａｃｏ２、並びにＧＳＥ３６２０４からのＶ５０３及びＶ４００。ＧＣ試料と正常試料のプロモーターシグナルを比較するために、本発明者らは、ｃｈｉｐｓｅｑシグナルの読み取り数マトリックスを用いたＤＥＳｅｑ２及びｅｄｇｅＲ  ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して、複製情報に合わせて調節した。倍率変化が１．５を超える（ＦＤＲ０．１）領域を有意差として選択した。ＦＣ１．５及びｑ＜０．１の基準は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイルをＤＥＳｅｑ２及びｅｄｇｅＲを用いてやはり同様の閾値を用いて比較した以前の文献に基づいた。ＤＥＳｅｑ２によって同定されたかなり改変されたプロモーターは、ｅｄｇｅＲによって見いだされた改変プロモーターとほぼ完全に重複した。ＤＥＳｅｑ２読み取り数の正規化ｌｏｇ変換を使用して、ＰＣＡ及びヒートマップをプロットした。
【０１０３】
トランスクリプトーム分析
ＲＮＡ−ｓｅｑデータをＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｐｈｅｎｏｍｅ  Ａｒｃｈｉｖｅから受託番号ＥＧＡＳ００００１００１１２８で得た。データをまずＴｏｐＨａｔ  ｖ２．０．１２を用いてＧＥＮＣＯＤＥ  ｖ１９転写物注釈に整列させて処理した。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ２．２．０を使用して、ＦＰＫＭ存在量基準を作成した。新規転写物の同定のために、参照転写物注釈を使用せずにＣｕｆｆｌｉｎｋｓを使用した。次いで、転写物をすべてのＧＣ及び正常試料にわたって統合し、ＧＥＮＣＯＤＥ注釈と比較して、新規転写物をＣｕｆｆｍｅｒｇｅ２．２．０を用いて同定した。深度の深い鎖特異的ＲＮＡ配列決定も１０個の追加の一次試料に対して行った。全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて抽出し、ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡ）Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｇｏｌｄオプション（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）及び１ｕｇ全ＲＮＡを用いて製造者の指示に従って構築した。配列決定をペアエンド１０１ｂｐ読み取りオプションを用いて行った。ＴＣＧＡデータセットをＴＣＧＡ  Ｄａｔａ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ）からｆａｓｔｑファイルの形でダウンロードし、次いでＴｏｐＨａｔ  ｖ２．０．１２を用いてＧＥＮＣＯＤＥ  ｖ１９転写物注釈に整列させた。プロモーター関連ＲＮＡ発現を分析するために、ＴＣＧＡ試料（腫瘍及び正常）からのＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りを、全プロモーター、増大体細胞プロモーター及び損失体細胞プロモーターを含めて、発見試料におけるエピゲノムプロファイリングによって最初に定義されたプロモーター領域のゲノム位置に対してマッピングした（本文の図１参照）。これらのエピゲノムによって定義されたプロモーター領域に位置するＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りを、次いで、定量化し、プロモーター長さ（キロベース）及び全ライブラリサイズによって規準化し、発現の倍率変化を腫瘍試料グループと正常ＴＣＧＡ試料グループの間で計算した。プロモーター遺伝子座の長さを、ピーク抽出プログラムＣＣＡＴ  ｖ３．０．（１９０）によって同定されたＨ３Ｋ４ｍｅ３領域の開始と停止ゲノム座標の間の塩基対（ｂｐ）の数として定義した。選択的プロモーターによって駆動される転写物のアイソフォームレベル定量化を、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（ＦＰＫＭ）、Ｋａｌｌｉｓｔｏ（ＴＰＭ）及びＭＩＳＯ（アイソフォーム中心分析）を用いて行った。各アイソフォームの割当数をＤＥＳｅｑ２によって規準化した。
【０１０４】
ＤＮＡメチル化分析
胃腫瘍及び対応正常胃組織のゲノムＤＮＡを抽出し（ＱＩＡＧＥＮ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐｓ（ＨＭ４５０）を用いたＤＮＡメチル化プロファイリングのために処理した。メチル化β値を計算し、バックグラウンドをｍｅｔｈｙｌｕｍｉ  Ｒ  ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを用いて補正した。規準化をＢＭＩＱ法（Ｒ中のｗａｔｅＲｍｅｌｏｎパッケージ）を用いて行った。ＣｐＧ島の位置をＵＣＳＣゲノムブラウザからダウンロードした。プロモーター遺伝子座とＣｐＧ島の少なくとも１ｂｐの重複を、ＢＥＤＴｏｏｌｓ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔを用いて確認した。各グループ（全プロモーター、増大体細胞プロモーター及び損失体細胞プロモーター）について、本発明者らは、予測プロモーター領域に重複するプローブを特定し、平均ベータ値差を計算した。２標本ウィルコクソン検定を行った。
【０１０５】
生存率分析
全生存期間を成果の測定基準としたカプラン−マイヤー生存率分析を使用した。ログ−ランク検定を使用して、カプラン−マイヤー分析の有意性を評価した。
【０１０６】
遺伝子セット濃縮分析
遺伝子セット濃縮分析をＭｓｉｇＤＢを用いてＣ２セットの精選遺伝子に対する体細胞プロモーターに関連する遺伝子の重複を計算することによって行った。
【０１０７】
質量分析法及びデータ解析
９０個の結腸直腸癌（ＣＲＣ）試料及び６０個の正常結腸上皮試料のペプチドレベル質量分析データを、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＮＣＩ／ＮＩＨ）によって作成されたＣＰＴＡＣポータルからダウンロードした。（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｐｔａｃ−ｄａｔａ−ｐｏｒｔａｌ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｃｐｔａｃ）。スペクトルカウントをＩＤＰｉｃｋｅｒのｉｄＱｕｅｒｙツールを用いて抽出した。線形モデル（ｌｉｍｍａ  Ｒ）を変位値規準化及びｌｏｇ２変換スペクトルカウントにフィッティングすることによって、差次的に発現するペプチドを同定した。ＧＣ細胞系質量分析法では、ＡＧＳ、ＧＥＳ−１、ＳＮＵ１７５０及びＭＫＮ１細胞を、プロテアーゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝剤で抽出した。各生物学的四つ組（すなわち、１つの細胞系当たり４つの複製物）のタンパク質抽出物１５０μｇを１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分離した。ゲル内消化の場合、試料を２つの画分に分離し、１０ｍＭ  ＤＴＴ中で１時間５６℃で還元し、続いて５５ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を用いて４５分間暗所でアルキル化した。トリプシン消化をトリプシン２μｇを含む５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で３７℃で終夜行った。ペプチドをＳｔａｇｅＴｉｐｓで脱塩し、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計に連結されたＥＡＳＹ−ｎＬＣ  １２００システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のナノフロー液体クロマトグラフィによって分析した。ＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＱＡＱ  １．９μｍ樹脂（Ｄｒ  Ｍａｉｓｃｈ）を所内充填したＣ１８逆相カラム（長さ２５ｃｍ、内径７５μｍ）でペプチドを分離した。カラムをＥａｓｙ  Ｆｌｅｘ  Ｎａｎｏ  Ｓｏｕｒｃｅに搭載し、カラムオーブン（Ｓｏｎａｔｉｏｎ）によって４０℃で温度制御した。流量２２５ｎｌ／ｍｉｎの０．５％ギ酸中の２〜４０％アセトニトリルの２２５ｍｉｎ勾配を使用した。噴霧電圧を２．４ｋＶに設定した。Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦを１回のＭＳフルスキャンにつきＴＯＰ２０  ＭＳ／ＭＳスペクトル取得法で操作した。ＭＳスキャンを分解能６０，０００で行い、ＭＳ／ＭＳスキャンを分解能１５，０００で行った。データ解析では、生のファイルをＭａｘＱｕａｎｔバージョン１．５．２．８を用いてＵＮＩＰＲＯＴ注釈付きヒトタンパク質データベースに対して処理した。カルバミドメチル化を固定修飾として設定し、メチオニン酸化及びタンパク質Ｎ−アセチル化を可変修飾とみなした。検索結果を偽陽性率０．０１で選別するＭａｘＱｕａｎｔで処理した。実行オプションとＬＦＱ定量化の適合を作動させた。ＬＦＱ強度を潜在的混入物、逆タンパク質（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）について選別し、ｌｏｇ２変換した。次いで、それらを、オープンソースソフトウェアＰｅｒｓｅｕｓ（０．５幅、１．８ダウンシフト）を用いて帰属させ、線形モデル（ｌｉｍｍａ  Ｒ）を用いてフィッティングした。
【０１０８】
５’ＲＡＣＥ及び遺伝子クローニング
ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）を５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、バージョン２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８３７４−０５８）を用いて行った。手短に述べると、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ逆転写酵素、及び各遺伝子の遺伝子特異的プライマー１を用いた各逆転写反応に全ＲＮＡ２μｇを使用した。ｃＤＮＡ合成後、リボヌクレアーゼ混合物（リボヌクレアーゼＨ及びリボヌクレアーゼＴ１）を使用して、ＲＮＡを分解した。次いで、第１の鎖ｃＤＮＡをＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．カラムで精製し、ｄＣＴＰ及びＴｄＴを末端につないだ。ｄＣ末端ｃＤＮＡを短縮アンカープライマー及び入れ子状態の遺伝子特異的プライマー２を用いてＧｏ  Ｔａｑ（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ５００１）によって増幅した。続いて、一次ＰＣＲ産物を短縮汎用増幅プライマー（ＡＵＡＰ：ａｂｒｉｄｇｅｄ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ）及び遺伝子特異的プライマー３を用いて再増幅した。ゲル電気泳動を行った。ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ２０２０）を用いたクローニングのために、目的のＰＣＲバンドを切り出し、精製した。最小の１２個の独立したコロニーを単離し、精製プラスミドＤＮＡをＡＢＩ  ３７３０  ＤＮＡ分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で双方向に配列決定した（表２）。ＫＡＴＯＩＩＩ細胞由来の野生型及び変異ＭＥＴをコードする完全長ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によってＭＥＴ転写物の構築物を生成した。野生型及び変異ＲＡＳＡ３完全長転写物をＮＣＣ５９細胞からＰＣＲ増幅した。ｃＤＮＡ断片を、（Ｗａｎｊｉｎ  Ｈｏｎｇ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、シンガポールから供与されたＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ−Ｎｅｏベクターから改変された）ｐＣＩ−Ｐｕｒｏ−ＨＡベクター中にクローン化した。プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞系に一過性導入した。
【０１０９】
【表１３】
2019511209.tif 000015
【０１１０】
ウエスタンブロット法
３×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を播き、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて遺伝子導入した。細胞を、ヒトＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、１００ｎｇ／ｍｌ）を０、１５及び３０分間添加する前に１６時間血清不足にし、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含む冷たいＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶解緩衝剤（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を用いて氷上ですぐに収集した。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。細胞溶解物を９５℃で１０分間ＳＤＳ試料緩衝剤中で加熱し、各細胞溶解物２０μｇ／ウェルを添加した。タンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を４時間室温で以下の抗体と一緒にインキュベートすることによってウエスタンブロット法を行った：Ｍｅｔ＆βアクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐ−ＭＥＴ（Ｙ１２３４／１２３５＆Ｙ１３４９）、ｐＳＴＡＴ３（Ｓ７２７＆Ｙ７０５）、ＳＴＡＴ３、ＥＲＫ、ｐ−ＥＲＫ、Ｇａｂ１、ｐＧａｂ１（Ｙ６２７）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。膜を二次抗体中で１：３，０００で１時間室温でインキュベートし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて現像した。ウエスタンブロットバンドをＩｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（ＢＩＯＲＡＤ）を用いて定量化した。実験を３つ組で繰り返した。
【０１１１】
細胞増殖アッセイ
３×１０３個のＧＥＳ１、ＳＮＵ１９６７及びＡＧＳ細胞を、９６ウェルプレートの１０％ウシ胎仔血清を含む培地中で培養し、終夜放置して付着させた。翌日（０日目）、細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて野生型及び変異ＲＡＳＡ３構築物を一過性導入した。構築物の量は、ＡＧＳの場合４０ｎｇ／ウェル、ＧＥＳ１及びＳＮＵ１９６７細胞の場合１００ｎｇ／ウェルであった。導入から２４〜１２０時間後、細胞増殖をＷＳＴ−８アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８、Ｄｏｊｉｎｄｏ）によって測定した。ＷＳＴ−８溶液１０ｕＬ／ウェルを添加し、加湿恒温器中で２時間インキュベーション後に吸光度読み取りを４５０ｎｍで測定した。
【０１１２】
ＲＡＳＡ３  ｓｉＲＮＡ導入
２種のＲＡＳＡ３  ｓｉＲＮＡを使用して、ＮＣＣ２４細胞中のＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ転写物の発現を抑制した（ｈｓ．Ｒｉ．ＲＡＳＡ３．１３．１  ＴｒｉＦＥＣＴａ（登録商標）Ｋｉｔ  ＤｓｉＲＮＡ  Ｄｕｐｌｅｘ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｅ−Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｓ３５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。ＮＣＣ２４細胞に上記２種のｓｉＲＮＡ又は非標的対照（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇプール、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を最終濃度１００ｎＭで４８時間導入し、続いてｑＰＣＲ及びウェスタン検証及び遊走／浸潤アッセイを行った。
【０１１３】
遊走及び浸潤アッセイ
細胞遊走能力を求めるために、ＲＡＳＡ３野生型及び変異体導入ＡＧＳ及びＧＥＳ１、ＳＮＵ１９６７及びＡＧＳ、並びにｓｉＲＮＡ処理ＮＣＣ２４細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ６．５ｍｍ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌと８．０μｍ  Ｐｏｒｅ  Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ（３４２２、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて試験した。２．５×１０４個のＡＧＳ細胞及び２×１０４個のＧＥＳ１細胞、３×１０４個のＳＮＵ１９６７細胞及び５×１０４個のＮＣＣ２４細胞を０．１ｍｌ無血清ＲＰＭＩ培地に懸濁させ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートの上に添加した。１０％ＦＢＳを含む０．６ｍｌ  ＲＰＭＩを底部ウェルに化学誘引物質として添加した。５％ＣＯ２恒温器中で３７℃で２４時間インキュベーション後、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、１００％メタノールで透過処理した。非遊走細胞を、膜の上面から綿棒でこすり取った。遊走細胞を０．５％クリスタルバイオレットで染色した。遊走細胞数をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて計算される遊走細胞の総面積対Ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンの面積として表した。細胞浸潤アッセイでは、上記Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを使用前に０．１ｍｌ（３００μｇ／ｍＬ）Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス（３５４２３４、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）で２〜４時間３７℃で被覆した。すべての後続ステップを遊走アッセイ手順と同一にした。
【０１１４】
ＲＡＳＡ３  ｍＲＮＡレベルの測定
全ＲＮＡを３つの独立した実験からＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニキットを用いて製造者の指示に従って抽出した。ＲＮＡをＩｍｐｒｏｍ−ＩＩＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて逆転写した。実時間ＰＣＲをＱｕａｎｔｉｆａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＨＴ７９００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ上で３つ組で行った。倍率変化をＤｅｌｔａ  Ｃｔ法によって計算し、βアクチンに対して規準化した。プライマー配列は以下の通りである。βアクチン：Ｆ−５’ＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４３）、Ｒ−５’ＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４４）；ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ：Ｆ−５’ＴＴＧＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＴＡ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４５）、Ｒ−５’ＴＣＡＡＧＣＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４６）。
【０１１５】
ＲＡＳ−ＧＴＰアッセイ
ＧＥＳ１細胞にＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ又は空ベクターを４８時間導入した。細胞をＦＢＳ含有培地中のタンパク質のために収集し、又は収集前に終夜の血清不足、続いて３０分間の血清刺激に供した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）を含む氷冷溶解緩衝剤（Ａｃｔｉｖｅ  ＲＡＳ  Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてタンパク質を抽出した。活性ＲＡＳ画分をＡｃｔｉｖｅ  ＲＡＳ  Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造者の指示に従って得た。全ＲＡＳを対応する細胞全体のタンパク質溶解物中で測定した。βアクチンを添加対照として使用した。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。ＳＤＳ試料緩衝剤を溶解物に添加し、１００℃で５分間煮沸した。試料を４〜１５％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸゲル（Ｂｉｏｒａｄ）の各ウェルに添加し、半乾燥ブロッティングシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてＰＶＤＦ膜に移した。抗ＲＡＳ（１／２００希釈、Ａｃｔｉｖｅ  ＲＡＳ  Ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ中で供給）、又は５％乳−ＰＢＳＴ中のＢ−アクチン（１／５０００希釈、Ｓｉｇｍａ  Ａ５３１６）を用いて４℃で終夜膜を調べた。二次抗マウス抗体（ＬＮＡ９３１、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を１／２０００希釈で１時間室温で使用した。膜をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて現像し、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて画像化した。
【０１１６】
改変ペプチド及び抗原予測
改変ペプチドは、選択的プロモーターの使用における体細胞変化から生じる変異Ｎ末端タンパク質配列として定義された。以下のフィルターを適用して改変ペプチドのプールを選択した−ｉ）選択的ＲＮＡ−ｓｅｑ発現対標準ＲＮＡ−ｓｅｑ発現の少なくとも１．５の倍率変化、ｉｉ）遺伝子座１つ当たり１つのみの標準及び１つの選択的アイソフォーム、ｉｉｉ）注釈付き転写物が、Ｇｅｎｃｏｄｅによってコードされたタンパク質として確認される。標準プロモーターは、不変Ｈ３Ｋ４ｍｅ３ピークを示す領域として定義された。ヒトプロテオームからのランダムペプチドをＧｅｎｃｏｄｅコーディング転写物のアミノ酸配列から生成した。Ｎ末端ペプチド増大は、選択的転写物が標準転写物に比べて異なる翻訳タンパク質配列をもたらすと予測される異なる５’領域に関連する場合として認識された。各Ｎ末端改変タンパク質の場合、本発明者らは、９量体ペプチドの結合をＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ２．８を用いてＩＣ≦５０ｎｍの厳格な閾値を用いて評価して、強いＭＨＣ結合剤を特定した。Ｎ末端増大ペプチドを同じ遺伝子のタンパク質構築データに対してマッピングして、タンパク質発現を評価した。抗原予測をＯｐｔｉＴｙｐｅを用いて予測された１３種のＧＣ試料のＨＬＡタイプに対して行った。ＯｐｔｉＴｙｐｅによって提供される参照配列に整列させる読み取りを前もって選別するためのアライナとしてＢＷＡ  ｍｅｍを使用した以外は、ＯｐｔｉＴｙｐｅを初期設定パラメータで実行した。被覆の不十分な３つの試料及びミスマッチの不対読み取りを分析から除外した。東南アジアの集団における流行が増加している１１種のＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子変異体（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１／ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２／ＨＬＡ−Ａ＊３３：０３／ＨＬＡ−Ａ＊２４：０７、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１／ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１／ＨＬＡ−Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０４／ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０２／ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０１）をＡｌｌｅｌｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  Ｎｅｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔ）から得た。
【０１１７】
細胞溶解性マーカーと選択的プロモーター使用の関連性
局所免疫細胞溶解活性をグランザイムＡ（ＧＺＭＡ）及びパーフォリン（ＰＲＦ１）の発現によって評価した。腫瘍含有量を２つのアルゴリズム、すなわちＡＳＣＡＴ（７９）（異常細胞画分）及びＥＳＴＩＭＡＴＥ（腫瘍純度）を用いて推定した。ＳＧシリーズの発現データをダウンロードし（ＧＳＥ１５４６０）、「ａｆｆｙ」Ｒパッケージ中の堅牢なマルチアレイ平均アルゴリズムを用いて規準化し、ｌｏｇ２変換した。ＳＧシリーズ用のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０データをＧＳＥ３１１６８及びＧＳＥ８５４６６からダウンロードした。ＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ試料の変異頻度を、ＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ刊行物データ（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｓｔａｄ＿２０１４／）から、「ミスセンス」変異体分類で選別されたレベル２精選ＭＡＦファイル（ＱＣｖ５＿ｂｌａｃｋｌｉｓｔ＿Ｐａｓｓ．ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ．ｃａｐｔｕｒｅ．ｔｃｇａ．ｕｕｉｄ．ｃｕｒａｔｅｄ．ｓｏｍａｔｉｃ．ｍａｆ）を用いてダウンロードした。ＴＣＧＡ  ＳＴＡＤ試料（ＴＰＭ）の発現データをｋａｌｌｉｓｔｏアルゴリズムを用いて計算した。ＴＣＧＡ胃癌（ＳＴＡＤ）の生のＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０．ＣＥＬファイルをＧＤＣデータポータル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ−ｐｏｒｔａｌ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からダウンロードした。このデータセットへのアクセスは、ｄｂＧａＰ証明書及びｅＲＡ  ｃｏｍｍｏｎｓによって発行されたＩＤを用いて得られた。ＴＣＧＡ  ＳＴＡＤの事前計算ＥＳＴＩＭＡＴＥスコアをｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｅｓｔｉｍａｔｅ／からダウンロードし、式ｃｏｓ（０．６０４９８７２０１８＋０．０００１４６７８８４×ＥＳＴＩＭＡＴＥスコア）を用いて腫瘍純度に変換した。ＡＣＲＧシリーズの前処理された発現データをＧＳＥ６２２５４からダウンロードし、事前計算ＡＳＣＡＴスコアを共同研究者（ＪＬ）から得た。細胞溶解性マーカーの発現をスプライン回帰モデルを用いてミスセンス変異及び腫瘍純度頻度（ｐｕｒｉｔｙ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）に合わせて調節した。
【０１１８】
サイトカインアッセイ用ペプチド及び細胞
１５種の代表的選択的プロモーターに対する１セットのペプチドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）から購入した。各選択的プロモーターに対するペプチドプールのペプチド配列及び組成を表３に記載する。ヒトアクチンの対照ペプチドプールをＪＰＴから購入した（ＰＭ−ＡＣＴＳ、ＰｅｐＭｉｘ（商標）Ｈｕｍａｎ  （Ａｃｔｉｎ）  ＪＰＴ）。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を８つのＰＢＭＣ試料がＨＬＡタイプである９名の健康なボランティアから得た（表３）。
【０１１９】
【表１４】
2019511209.tif 000016
【０１２０】
ＥｐｉＭＡＸアッセイ
ＰＢＭＣを１μＭ  ＣＦＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識し、密度２００，０００細胞／ウェルで完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、５０μＭ  β２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）及び１０％熱失活ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むｃＲＰＭＩ）中で５日間培養した。各選択的プロモーターの個々のペプチドプールを培養開始時に各ペプチドについて濃度１μｇ／ｍｌで添加した。５日目の最後に、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）定着性近ＩＲ死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、ＣＤ４−ＢＵＶ７３７（ＢＤ）、ＣＤ８−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（ＢＤ）、ＣＤ３−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９−ＰＥ／ＴｅｘａｓＲｅｄ（Ｂｅｃｋｍａｎ）及びＣＤ５６−ＡＰＣ（ＢＤ）で標識した。ＣＦＳＥ希釈によるＴ細胞増殖の分析をＬＳＲＩＩ（ＢＤ）を用いたフローサイトメトリーによって行った。さらに、磁気ビーズベースのサイトカイン多重分析（ヒトサイトカインパネル１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｅｒｃｋ）を細胞培養上清に対して行い、分泌サイトカインレベルを測定した。
【０１２１】
ＩＦＮ−γアッセイ
ＲＡＳＡ３  ＷＴ及び変異体タンパク質配列の免疫原性を試験するために、ＣＤ１４＋単球をＨＬＡ−Ａ＊０２：０６ドナーから磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）を用いたポジティブ選択によって単離した。樹状細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）及びＩＬ−４（４００ＩＵ／ｍｌ）によって生成させ、ＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）及びＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ）によって２４時間更に成熟させた。次いで、同じドナーからのＴ細胞と１：５の比で共培養する前に、ＷＴ  ＲＡＳＡ３又は変異ＲＡＳＡ３を発現するＡＧＳ細胞溶解物でＤＣを２４時間刺激した。ＤＣと５日間共培養した後、Ｔ細胞をＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、ドイツ）を用いたポジティブ選択によって単離し、ＷＴ又は変異ＲＡＳＡ３を発現するＡＧＳ細胞と２０：１の比で２日間共培養した。上清を収集し、ＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）によって測定した。
【０１２２】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ分析
Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ＣｏｄｅＳｅｔをＳＧシリーズ試料上の９５種の遺伝子（ＧＣにおける８３種の上方制御及び１１種の下方制御）及び５種のハウスキーピング遺伝子（広範な発現範囲にわたるＡＧＰＡＴ１、ＣＬＴＣ、Ｂ２Ｍ、ＰＯＬ２ＲＬ及びＴＢＰ）に対して設計した。各遺伝子に対して、本発明者らは、ａ）選択的プロモーター位置の５’末端、ｂ）（ＧＣ試料と正常試料の両方における等しい濃縮のプロモーター領域、又は最長タンパク質コード転写物によって定義された）標準プロモーターの５’末端、及びｃ）共通下流プローブを標的にした３種のプローブを設計した。販売業者によって提供されたｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェア（ｎＳｏｌｖｅｒ）をデータ解析に使用した。生のカウントを各ＣｏｄｅＳｅｔに含まれる内部正対照プローブの幾何平均を用いて規準化した。
【０１２３】
ＡＣＲＧコホート上の８８種の遺伝子に対して別のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイを設計した。各遺伝子に対して、本発明者らは、ａ）選択的プロモーター位置の５’末端、ｂ）（ＧＣ試料と正常試料の両方における等しい濃縮のプロモーター領域、又は最長タンパク質コード転写物によって定義された）標準プロモーターの５’末端を標的にした３種のプローブを設計した。
【０１２４】
繰り返し濃縮分析
体細胞プロモーター変化を示す領域において過剰提示される繰り返しエレメントファミリーを、ＵＣＳＣ  Ｔａｂｌｅ  ＢｒｏｗｓｅｒからのＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ注釈を用いて同定した（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）。「不明」、「単純＿繰り返し」及び「サテライト」注釈を繰り返しセットから選別した。繰り返しエレメントは、それらがプロモーターと最低５０％重複した場合にのみ含まれた。繰り返しエレメントファミリーの濃縮をＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ  ＦＤＲ補正を用いた二項検定によって評価し、全プロモーター領域をバックグラウンドとして使用した。
【０１２５】
機能予測分析
ゲノム全体及び組織特異的機能スコアをそれぞれＧｅｎｏＣａｎｙｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｃａｎｙｏｎ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ＧｅｎｏＣａｎｙｏｎ＿Ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｈｔｍｌ、バージョン１．０．３）及びＧｅｎｏＳｋｙｌｉｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｃａｎｙｏｎ．ｍｅｄ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ＧｅｎｏＳｋｙｌｉｎｅ）からダウンロードした。重複をｂｅｄｔｏｏｌｓ  ＩｎｔｅｒｓｅｃｔＢｅｄを用いて計算し、各注釈のない体細胞プロモーターにわたる機能スコアを計算した。
【０１２６】
転写因子濃縮
２３７種のＴＦの転写因子結合部位をＲｅＭａｐデータベース、ＥＮＣＯＤＥの公開データベース、及び別の公開Ｃｈｉｐ−ｓｅｑ  ＴＦＢＳデータセットから得た。重複を体細胞プロモーターセットに対して計算し、カウントした。相対濃縮スコアを（＃状態及び重複特徴の塩基（ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｅａｔｕｒｅ））／（＃ゲノム中の塩基）と［（＃塩基重複特徴）／（＃ゲノム中の塩基）×（＃状態の塩基（ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｓｔａｔｅ））／（＃ゲノム中の塩基）］の比として計算した。
【０１２７】
ＥＺＨ２阻害
ＩＭ９５を選択的ＥＺＨ２阻害剤ＧＳＫ１２６（Ｓｅｌｌｅｃｋ、ＵＳＡ）で濃度５ｕＭで処理した。細胞増殖をＧＳＫ１２６処理後の９６ウェルプレート中でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって３つの独立した実験でモニターした。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析では、全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙミニキットを用いて製造者の指示に従って抽出した。細胞をＧＳＫ１２６（Ｓｅｌｌｅｃｋ、ＵＳＡ；ＤＭＳＯ溶解）で濃度５ｕＭで処理した。対照細胞を同じ濃度のＤＭＳＯ（０．１％）で処理した。プロモーター遺伝子座のＲＮＡｓｅｑ示差分析を、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを用いて推定されたＨ３Ｋ４ｍｅ３領域に位置する読み取り数に対してｅｄｇｅＲを用いて行った。ＲＮＡｓｅｑ遺伝子レベル示差分析をｃｕｆｆｄｉｆｆ２．２．１を用いて行った。
【０１２８】
追加情報
受託コード：この研究のためのゲノムデータをＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧＥＯデータベースに受託番号ＧＳＥ５１７７６及びＧＳＥ７５８９８（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ｔｏｋｅｎ＝ｋｆｏｘｑｅａｍｚｆｅｔｐａｌ＆ａｃｃ＝ＧＳＥ７５８９８）で寄託した。
【０１２９】
結果
ＧＣにおけるエピゲノムプロモーター変化の特定
ＮａｎｏＣｈＩＰ−ｓｅｑを用いて、本発明者らは、１７のＧＣ、対応正常胃粘膜（３４個の試料）及び１３のＧＣ細胞系にわたる３種のヒストン修飾標識（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ１）の特性を明らかにし、１１０のエピゲノムプロファイルを作成した（表１及び４に臨床及び配列決定測定基準を示す）（図１ａ）。Ｎａｎｏ−ＣｈＩＰｓｅｑデータの品質管理を２つの独立した方法で行った：公知のプロモーターにおけるＣｈＩＰ濃縮、並びにＣｈＩＰ−ｓｅｑ品質管理及び検証ツールＣＨＡＮＣＥ（ＣＨｉｐ−ｓｅｑＡＮａｌｙｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）の使用。高発現タンパク質コード遺伝子に関連する１，０００種のプロモーターにおけるＮａｎｏ−ＣｈＩＰｓｅｑ読み取り密度の比較によって、すべてのＨ３Ｋ２７ａｃ及びＨ３Ｋ４ｍｅ３ライブラリにおける濃縮の成功を確認した。ＣＨＡＮＣＥ分析によっても、試料の大多数（８１％）の濃縮の成功が明らかになった（表１）。本発明者らは、以前にも、Ｎａｎｏ−ＣｈＩＰシグナルが直交ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ結果と良好な一致を示すことを明らかにした。
【０１３０】
【表１５】
2019511209.tif 000017
【０１３１】
正確なプロモーターの同定を可能にするために、本発明者らは、複数のヒストン修飾からのデータを統合し、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１４２が同時に欠乏するＨ３Ｋ４ｍｅ３領域を選択した（「Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域」；図７、方法）。ＧＥＮＣＯＤＥ参照転写物、ＥＮＣＯＤＥクロマチン状態モデル及びＣＡＧＥ（ＣＡＰ分析遺伝子発現）データベースを含めた外部ソースからのデータとの比較によって、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の大部分を真のプロモーターエレメントとして検証した（「真のプロモーターとしてのＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の検証」という題目のセクション及び図７を参照されたい）。一次胃組織は、上皮細胞、免疫細胞及びストロマを含めた幾つかの異なる組織タイプを含むので、本発明者らは、更に、本発明者らのプロモータープロファイルが、胃及び胃以外の組織のＥｐｉｇｅｎｏｍｅ  Ｒｏａｄｍａｐデータとの比較によって、真の胃上皮を反映することを確認した。胃腫瘍及び対応正常プロモータープロファイルは、Ｒｏａｄｍａｐ胃粘膜と最高の相関を示し、他の胃腸組織（小腸、結腸粘膜、Ｓ状結腸）、胃関連筋肉、皮膚及び血液（ＣＤ１４）とは異なる（図８）。一次組織プロモータープロファイルは、胃腸線維芽細胞系（５８〜６９％）及び結腸癌株（５９〜７４％）と比較して、起源が純粋に上皮である、ＧＣ細胞系（８７％）のプロモータープロファイルともかなり重複した（図８）。
【０１３２】
全体として、本発明者らは、Ｎａｎｏ−ＣｈＩＰｓｅｑコホート中の約２３，０００種のプロモーターエレメントをマッピングした。これらのプロモーターエレメントの視覚的探索は、３つの主要プロモーターカテゴリ、すなわち、不変プロモーター、腫瘍において増大するプロモーター（増大体細胞又は腫瘍特異的プロモーター）、及び正常胃組織中に存在するが、ＧＣにおいて損失又は減少するプロモーター（損失体細胞又は正常特異的プロモーター）を確認した（図１ａ〜ｃ）。不変プロモーターの代表例としては、ＲｈｏＡ（図１ａ）が挙げられるが、細胞内接着遺伝子ＣＥＡＣＡＭ６は、腫瘍試料及び細胞系中のＣＥＡＣＡＭ６転写開始点（ＴＳＳ）における体細胞プロモーター増大を示した（図１ｂ）。逆に、ＡＴＰ４Ａ、ＧＣ４３発現が減少した壁細胞関連Ｈ＋／Ｋ＋  ＡＴＰａｓｅは、体細胞プロモーター損失を示した（図１ｃ）。ＣＥＡＣＡＭ６とＡＴＰ４Ａの両方のプロモーター変化は、それぞれ同じ試料における増加及び減少したＣＥＡＣＡＭ６及びＡＴＰ４Ａ遺伝子発現と相関した（図１ｂ及び１ｃ）。
【０１３３】
以前の研究で、ＧＣの異なる分子サブタイプが確立された。しかし、試料サイズが限られるため、本発明者らは、本滞在（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｙ）において、サブタイプに無関係に対照組織に比べて複数のＧＣ組織中に存在するプロモーター変化（「体細胞プロモーター」）を特定することを選択した。反復性の変化に注目することは、「個人的な」エピゲノム変化又は個々の試料特異的技術的誤差による潜在的アーチファクトを減少させる利点もある。ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータの分析に一般に使用される２つの相補的読み取りカウントベースのアルゴリズムを用いて、本発明者らは、その７５％がＧＣで増大する（ＦＣ１．５、ｑ＜０．１）約２０００種の高度に反復性の体細胞プロモーターを同定した。体細胞プロモーターに基づく２次元ヒートマップクラスター形成及び主成分分析（ＰＣＡ：ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ）プロットによって、プロモーター変化に基づく正常試料からのＧＣの分離を確認した（図１ｄ及び図９）。体細胞プロモーターＨ３Ｋ４ｍｅ３レベルは、活発な調節活性のマーカーと一般にみなされるＨ３Ｋ２７ａｃシグナルとも高度に相関した（ｒ＝０．９１、Ｐ＜０．００１、図１ｅ）。この相関は、すべての体細胞プロモーターで認められ（ｒ＝０．８４、Ｐ＜０．００１、図１Ｅ）、増大体細胞及び損失体細胞プロモーターが別々に分析されたときにも認められた（増大体細胞の場合、ｒ＝０．７８、Ｐ＜０．００１；損失体細胞の場合、ｒ＝０．８２、Ｐ＜０．００１、図９）。経路分析によれば、増大体細胞プロモーターと損失体細胞プロモーターの両方は、ＧＣにおいてそれぞれ上方及び下方制御されると以前に報告された発現遺伝子セットと有意に関連した（図１ｆ）。これらには、上方制御癌遺伝子（ＭＥＴ、ＡＢＬ２）、細胞接着遺伝子（ＣＥＡＣＡＭ６）及びクローディンファミリーメンバー（ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ３）が含まれた。体細胞プロモーターの１５〜１８％は、ＧＣに以前関連した、ＨＯＴＡＩＲ及びＰＶＴ１を含めた、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に位置した（表５）。厳密性の閾値が漸増する追加の分析（ＦＣ１．５〜２及びＦＤＲ０．１〜０．００１）も同様の結果を示し、この分析の堅牢性を裏付けた（図９）。これらの結果は、正常胃上皮とＧＣをエピゲノムプロモータープロファイルに基づいて区別できることを示している。
【０１３４】
【表１６】
2019511209.tif 000018
【０１３５】
【表１７】
2019511209.tif 000019
【０１３６】
【表１８】
2019511209.tif 000020
【０１３７】
【表１９】
2019511209.tif 000021
【０１３８】
【表２０】
2019511209.tif 000022
【０１３９】
真のプロモーターとしてのＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の検証
４つの証拠が、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の大部分を真のプロモーターとして裏付けている。第１に、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域は、公知のＧＥＮＣＯＤＥ転写開始点（ＴＳＳ）の１ｋｂ上流のゲノム位置に高度に濃縮された（図７）。第２に、ＴＳＳ領域においては、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３シグナルは、プロモーターに関連することが以前に報告された古典的な歪曲二峰性強度パターンを示した（図７）。第３に、Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｏａｄｍａｐ（ＥｐｉＲｄ）１５状態モデルによって定義された領域と重複するときには、本発明者らは、他の組織に比べて胃腸組織において、近位プロモーター状態（ＴＳＳ／転写部位に隣接する領域）においてＨ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域の有意な濃縮を認めた（図７）。第４に、ＣＡＧＥ（ＣＡＰ分析遺伝子発現：ＣＡＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、遺伝子プロモーターを５’ｍＲＮＡデータを用いてマッピングするのに使用される専用のトランスクリプトーム配列決定法である。ＦＡＮＴＯＭ５コンソーシアムのＣＡＧＥデータとの統合によって、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３  ｈｉ／Ｈ３Ｋ４ｍｅ１  ｌｏ領域と堅牢なＣＡＧＥタグクラスターが８１％重複することが明らかになった。（図７）。
【０１４０】
ＧＣにおける体細胞プロモーターは、多様な癌タイプにおいて調節解除を示す
エピゲノムプロモーター変化と遺伝子発現の関係を探索するために、本発明者らは、同じ発見コホートからのＲＮＡ−ｓｅｑデータを分析し（約１０６００万読み取り／試料）、エピゲノム誘導プロモーター領域に、又は直接下流に位置するＲＮＡ−ｓｅｑ転写物読み取りを定量化した。体細胞プロモーター領域を調べて（図２Ａは、増大体細胞プロモーターの説明のための一例である）、本発明者らは、全プロモーター（Ｐ＜０．００１、図２Ｂ）又は不変プロモーター（Ｐ＜０．００１、図１０）に比べて、ＧＣの増大体細胞プロモーターにおける発現が有意に増加することを認め、損失体細胞プロモーターにおける発現が有意に減少することを認めた。別のタイプのエピジェネティック修飾のうち、以前の研究は、活性調節領域とＤＮＡメチル化の相互関係も報告した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ  ４５０Ｋ  ＤＮＡメチル化アレイを用いて、本発明者らは、体細胞プロモーター領域に重なる７，５０５個のＣｐＧ部位を同定した（増大体細胞プロモーターの場合５，２１３個の部位、損失体細胞プロモーターの場合２，２９２個の部位）。ＧＣにおいて増大するプロモーターは、全プロモーターと比較して有意に低メチル化され（Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）、ＧＣにおいて失われるプロモーターは高メチル化された（Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）（図２ｂ、下）。ＤＮＡメチル化は一般に高ＣｐＧ領域で起こるので、（５６）本発明者らは、次いで、ＣｐＧ島を有するプロモーターのみに注目した分析を繰り返した（「方法及び材料」）。最初の結果と同様に、ＧＣにおいて増大するＣｐＧ島を有するプロモーターは、ＣｐＧ島を有する全プロモーターに比べて有意に低メチル化され（Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）、ＧＣにおいて失われるＣｐＧ島を有するプロモーターは高メチル化された（Ｐ＜０．００１、ウィルコクソン検定）（図１１）。
【０１４１】
より大きな独立したＧＣコホートにおける体細胞プロモーター変化を検証し、さらに、別の癌タイプにおけるそれらの挙動を調べるために、本発明者らは、ＴＣＧＡコンソーシアムからの３５４個のＧＣ試料のＲＮＡ−ｓｅｑデータを検索し始めた（ｎ＝３２１ＧＣ、ｎ＝３３対応正常）。この分析を行うために、ＴＣＧＡ試料からのＲＮＡ−ｓｅｑ読み取りを、発見試料によって定義されたエピゲノム誘導体細胞プロモーター領域に対してマッピングし、規準化して、ＧＣ対正常における発現の倍率変化差を計算した（「方法及び材料」参照）。発見シリーズ同様、本発明者らは、全プロモーター（Ｐ＜０．００１、図２Ｃ）又は不変プロモーター（Ｐ＜０．００１、図１０）に比べて、ＴＣＧＡ  ＧＣも増大体細胞プロモーターにおける発現が有意に増加し、損失体細胞プロモーターの発現が減少することを認めた。本発明者らは、さらに、結腸、腎明細胞癌（ｃｃＲＣＣ）及び肺腺癌（ＬＵＡＤ）を含めて、別の腫瘍タイプからのＲＮＡ−ｓｅｑデータを検索することによって、ＧＣ体細胞プロモーターの組織特異性を試験した（図２ｄ）。ＧＣ体細胞プロモーターのほぼ２／３（ｎ＝１２３１、６３％、ＦＣ＝１．５）もＴＣＧＡ結腸癌試料において差次的に調節され、同様に、ＧＣ体細胞プロモーターのかなりの割合が、ＴＣＧＡ  ｃｃＲＣＣ（ｎ＝９３９、４８％、ＦＣ＝１．５）及びＬＵＡＤ試料（ｎ＝１０５９、５４％、ＦＣ＝１．５）における差次的ＲＮＡ−ｓｅｑ発現にも関連した（図２Ｄ）。この結果は、多数のＧＣ体細胞プロモーターが、別の固形上皮悪性腫瘍における調節解除プロモーター活性にも関連する可能性があることを示唆している。
【０１４２】
選択的プロモーターの役割
体細胞プロモーターを参照Ｇｅｎｃｏｄｅデータベース（Ｖ１９）と比較することによって、本発明者らは、共通不変プロモーターが正常組織と腫瘍の両方に存在する（標準プロモーター）が、第２の腫瘍特異的プロモーターが後者に関与する（選択的プロモーター）状況として定義される、ＧＣにおける選択的プロモーター（１８％）の広範な使用を発見した。体細胞プロモーターの残りの８２％は、単一の主要なアイソフォーム又は注釈のない転写物に対応した（後述）。選択的プロモーターの５７％は、標準プロモーターの下流に生じた。複数のＲＮＡ−ｓｅｑ分析法を用いて、本発明者らは、選択的プロモーターによって駆動される転写物アイソフォームがＧＣにおいて同じ遺伝子中の標準プロモーターよりもかなり高度に過剰発現することを確認した（「方法及び材料」、図１２）。例えば、ＧＣにおいて過剰発現する転写因子ＨＮＦ４αは、２種のプロモーター（Ｐ１及びＰ２）によって駆動される。ＨＮＦ４α標準プロモーター（「Ｐ２」）においては、本発明者らは、ＧＣと正常組織において等しいプロモーターシグナルを観察した。しかし、本発明者らは、さらに、ＧＣにおいて転写開始点４５ｋｂ下流における追加のプロモーターの増大も認めた（「Ｐ１」）。同様のＨＮＦ４α  Ｐ１プロモーター増大は、ＧＣ細胞系においても認められ（図３ａ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析によってＧＣにおけるＨＮＦ４α  Ｐ１アイソフォーム発現が裏付けられた。選択的プロモーターの使用は、循環腫瘍細胞の同定に頻繁に使用されるＥｐＣＡＭ遺伝子においても認められ、ＥｐＣＡＭ転写物ＥＮＳＴ０００００２６３７３５．４の発現を引き起こした（図３ｂ）。特に、ＨＮＦ４α選択的アイソフォームとＥｐＣＡＭ選択的アイソフォームの両方は、それらの標準アイソフォームよりもかなり大きな癌過剰発現を示した（図１２）。ＮＫＸ６−３（ＦＣ１．８３、ｑ＜０．０５）及びＧＲＩＮ２Ｄ（ＦＣ１．９、ｑ＜０．００１）を含めて、腫瘍特異的選択的プロモーターに関連する別の遺伝子、初めて報告された多数。ＧＣ腫瘍特異的プロモーターの完全なリストを示す（表６）。
【０１４３】
【表２１】
2019511209.tif 000023
【０１４４】
【表２２】
2019511209.tif 000024
【０１４５】
【表２３】
2019511209.tif 000025
【０１４６】
【表２４】
2019511209.tif 000026
【０１４７】
【表２５】
2019511209.tif 000027
【０１４８】
【表２６】
2019511209.tif 000028
【０１４９】
【表２７】
2019511209.tif 000029
【０１５０】
【表２８】
2019511209.tif 000030
【０１５１】
【表２９】
2019511209.tif 000031
【０１５２】
タンパク質多様性に対する選択的プロモーターの影響を探究するために、本発明者らは、Ｎ末端タンパク質組成を変化させると予測され、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３データとＲＮＡ−ｓｅｑデータの両方によっても裏付けられた、７１４の腫瘍特異的プロモーター変化を特定した。これらの変化の大部分（＞９５％）は、標準タンパク質のそれとインフレームであった。これらのうち、４７％（ｎ＝３３８）は、腫瘍中の新しいＮ末端ペプチドの増大を引き起こすと予測された（「方法」参照）。消化器癌におけるこれらのＮ末端ペプチドのタンパク質レベル発現を確認するために、本発明者らは、９０個のＴＣＧＡ結腸直腸癌（ＣＲＣ）及び６０個の正常結腸試料の公的に利用可能なペプチドスペクトルデータを検索した。原発性ＧＣの大規模プロテオミクスデータは現在利用できず、多数のＧＣ体細胞プロモーターがＣＲＣにも認められるので、ＣＲＣデータをこの分析に使用した（図２ｄ）。腫瘍において増大すると予測されるＮ末端ペプチドのうち、本発明者らは、ＣＲＣデータ中の３３％（１１２／３３８）のタンパク質発現を確認し（表７）、そのうち５１．８％は、ＣＲＣ試料において正常結腸試料よりも過剰発現した（ＦＤＲ１０％）。別の実験では、本発明者らは、さらに、これらのＮ末端ペプチドが３種のＧＣ細胞系及び１種の正常胃上皮系（ＧＥＳ１）からのプロテオミクスデータにおいても腫瘍過剰発現を示すかどうか調べた（「方法及び材料」）。ＣＲＣデータと同様に、Ｎ末端ペプチドの４８％は、ＧＣ株において正常ＧＥＳ１胃細胞よりも過剰発現した。まとめると、これらの分析は、選択的プロモーターが消化器癌におけるプロテオミクスの多様性の大きな一因になり得ることを示唆している。
【０１５３】
【表３０】
2019511209.tif 000032
【０１５４】
【表３１】
2019511209.tif 000033
【０１５５】
【表３２】
2019511209.tif 000034
【０１５６】
【表３３】
2019511209.tif 000035
【０１５７】
【表３４】
2019511209.tif 000036
【０１５８】
【表３５】
2019511209.tif 000037
【０１５９】
【表３６】
2019511209.tif 000038
【０１６０】
【表３７】
2019511209.tif 000039
【０１６１】
【表３８】
2019511209.tif 000040
【０１６２】
【表３９】
2019511209.tif 000041
【０１６３】
【表４０】
2019511209.tif 000042
【０１６４】
【表４１】
2019511209.tif 000043
【０１６５】
【表４２】
2019511209.tif 000044
【０１６６】
【表４３】
2019511209.tif 000045
【０１６７】
【表４４】
2019511209.tif 000046
【０１６８】
【表４５】
2019511209.tif 000047
【０１６９】
【表４６】
2019511209.tif 000048
【０１７０】
【表４７】
2019511209.tif 000049
【０１７１】
【表４８】
2019511209.tif 000050
【０１７２】
【表４９】
2019511209.tif 000051
【０１７３】
【表５０】
2019511209.tif 000052
【０１７４】
【表５１】
2019511209.tif 000053
【０１７５】
【表５２】
2019511209.tif 000054
【０１７６】
【表５３】
2019511209.tif 000055
【０１７７】
【表５４】
2019511209.tif 000056
【０１７８】
【表５５】
2019511209.tif 000057
【０１７９】
【表５６】
2019511209.tif 000058
【０１８０】
【表５７】
2019511209.tif 000059
【０１８１】
【表５８】
2019511209.tif 000060
【０１８２】
【表５９】
2019511209.tif 000061
【０１８３】
【表６０】
2019511209.tif 000062
【０１８４】
【表６１】
2019511209.tif 000063
【０１８５】
【表６２】
2019511209.tif 000064
【０１８６】
【表６３】
2019511209.tif 000065
【０１８７】
【表６４】
2019511209.tif 000066
【０１８８】
【表６５】
2019511209.tif 000067
【０１８９】
【表６６】
2019511209.tif 000068
【０１９０】
【表６７】
2019511209.tif 000069
【０１９１】
【表６８】
2019511209.tif 000070
【０１９２】
【表６９】
2019511209.tif 000071
【０１９３】
【表７０】
2019511209.tif 000072
【０１９４】
【表７１】
2019511209.tif 000073
【０１９５】
【表７２】
2019511209.tif 000074
【０１９６】
【表７３】
2019511209.tif 000075
【０１９７】
【表７４】
2019511209.tif 000076
【０１９８】
【表７５】
2019511209.tif 000077
【０１９９】
【表７６】
2019511209.tif 000078
【０２００】
【表７７】
2019511209.tif 000079
【０２０１】
癌発生に対する体細胞プロモーターの可能性のある機能を調べるために、本発明者らは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのＧαｉ誘導阻害に必要なＲＡＳ  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ＲＡＳＡ３に注目した。ＧＣ（５０％）とＧＣ株の両方においては、本発明者らは、標準ＲＡＳＡ３  ＴＳＳから１２７ｋｂ下流のイントロンの領域においてプロモーター活性の増大を認めた（図３ｃ、上、図１０）。ＲＮＡ−ｓｅｑ及び５’ＲＡＣＥ分析によって、このより短いＲＡＳＡ３アイソフォームの発現を確認し（図３ｃ、下）、このより短いＲＡＳＡ３アイソフォームの発現がＴＣＧＡ  ＲＮＡ−ｓｅｑデータにおいても認められた（図３ｃ）。標準完全長ＲＡＳＡ３タンパク質（ＣａｎＴ）に比べて、より短い３１ｋＤａ  ＲＡＳＡ３体細胞アイソフォーム（ＳｏｍＴ）は、Ｎ末端ＲａｓＧＡＰドメインを欠くと予測される（図３ｄ）。これらの予測と一致して、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴをＧＥＳ１正常胃上皮細胞中に切除（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）すると、空ベクター又はＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ導入細胞よりも低レベルの活性なＧＴＰ結合ＲＡＳを誘導し、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴがより高いＲＡＳＧＡＰ活性を有することを示した（図１３）。
【０２０２】
ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴの機能を扱うために、本発明者らは、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ及びＳｏｍＴアイソフォームをＳＮＵ１９６７  ＧＣ細胞に導入した。非導入細胞に比べて、ＳＮＵ１９６７細胞へのＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴの導入は、遊走（Ｐ＜０．０１）及び浸潤（Ｐ＜０．０１）を有意に刺激し、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴは、浸潤（Ｐ＜０．００１）を有意に抑制した（図３Ｅ、図１３）。同様に、ＧＥＳ１細胞へのＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴの導入は、遊走（ｐ＜０．０１、図３ｅ）及び浸潤（Ｐ＜０．０１、図１３）を有意に刺激し、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴは有意に刺激しなかった。本質的に遊走性が高いＫＲＡＳ変異ＡＧＳ  ＧＣ細胞について試験すると、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴの発現は、遊走を強力に抑制し、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴは、減衰が有意に少なかった（Ｐ＜０．０１、図１３）。これらの結果は、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴの腫瘍特異的使用がＧＣ細胞遊走及び浸潤を増加させる可能性があることを示唆している。特に、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ及びＳｏｍＴの導入は、ＳＮＵ１９６７、ＧＥＳ１又はＡＧＳ細胞増殖速度を変えなかった（図１３）。これらの観察が非生理学的インビトロ発現レベルによるものではないことを確認するために、本発明者らは、次いで、通常は高内在性レベルのＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ及び最小のＲＡＳＡ３  ＣａｎＴを発現するＮＣＣ２４  ＧＣ細胞を調べた（図１３）。２種の独立したｓｉＲＮＡ構築物を用いた内在性ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴのサイレンシングは、ＮＣＣ２４遊走及び浸潤を有意に阻害し（Ｐ＜０．０１〜０．００１）（図１３）、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴが癌の遊走及び浸潤を促進する役割を果たすことと一致した。
【０２０３】
以前の研究においては、本発明者らは、別の癌タイプにおいて独立に確認された内部選択的プロモーターによって駆動されるＭＥＴ受容体チロシンキナーゼの転写物アイソフォームを報告した。しかし、このＭＥＴ変異体の機能的意味は、不明なままである。ＲＮＡ−ｓｅｑ及び５’ＲＡＣＥ分析によって、切断型ＳＥＭＡドメインを有すると予測される、このより短いアイソフォームの転写物発現を確認した（図１４）。野生型（ＷＴ）と変異体（Ｖａｒ）ＭＥＴの機能差を評価するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞へのＭＥＴ（ＷＴ）及びＭＥＴ（Ｖａｒ）の一過性導入を行った。未処理条件とＨＧＦ処理条件の両方において、ＭＥＴ−Ｖａｒ導入細胞は、ＭＥＴシグナル伝達の重要な媒介物質であるｐ−Ｇａｂ１（Ｙ６２７）を有意により高いレベルで示した（例えば、ＭＥＴ−Ｖａｒ対ＭＥＴ−ＷＴを比較して２．４８〜３．９５倍、Ｐ＝０．００３（未処理）、Ｐ＜０．０５（Ｔ１５及びＴ３０）。（６６）さらに、ＨＧＦ未処理試料においては、ＭＥＴ−Ｖａｒを導入した細胞は、ＭＥＴ−ＷＴより高いｐ−ＥＲＫ１／２レベル（２．７４倍）及びより高いｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）（６７−７０）レベル（１．８０倍）も示した（ｐ−ＥＲＫ及びｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）それぞれでＰ＝０．０２３及びＰ＝０．０２６）。これらの結果は、ＭＥＴ  Ｖａｒアイソフォームの発現が、ＧＣ腫瘍形成に重要な様式でＭＥＴ下流シグナル伝達動力学を促進し得ることを示唆している。
【０２０４】
体細胞プロモーターは、腫瘍免疫と相関する
癌免疫編集は、発達中の腫瘍が、それらの免疫原性及び抗原性プロファイルを変えて、宿主免疫監視を逃れるプロセスである。癌免疫編集の機序は、ＰＤ−Ｌ１などの免疫チェックポイント阻害剤の上方制御を含めて、多様である。腫瘍免疫に対する体細胞プロモーターの潜在的寄与を探索するために、本発明者らは、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞への抗原提示に必要である（ＩＣ５０≦５０ｎＭ、図４ａ）、ＧＣ特異的ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子と高い親和性で結合することが予測される体細胞プロモーター関連Ｎ末端ペプチドを特定した（表８及び９）。ＮｅｔＭＨＣｐａｎ−２．８アルゴリズムを用いた反復性体細胞プロモーター関連ペプチドの分析は、標準ＧＣペプチド（平均３６％対２４％；Ｐ＜０．０１）、無作為に選択されたペプチド（Ｐ＜０．００１）、及びＣ末端ペプチド（Ｐ＜０．０１）を含めて、複数の対照ペプチド集団に比べて、高親和性ＭＨＣ  Ｉ結合の有意な濃縮を示した（図４Ｂは、組み合わせたＨＬＡ−Ａ、Ｂ及びＣを示し、図１５ＡはＨＬＡ−Ａのみのデータを示す）。高親和性体細胞プロモーター関連ペプチドの大部分は、Ｎ末端ペプチドのない体細胞転写物が腫瘍において正常組織よりも過剰発現する状況に対応した（７８％損失；７６／９７高親和性ペプチド、図４Ｃ）。特に、Ｎ末端のない体細胞ＴＳＳによって駆動される転写物も、標準ＴＳＳによって駆動される転写物よりも腫瘍において有意に高度に過剰発現するので（Ｐ＜０．０５、ウィルコクソン片側検定）（図１２）、こうしたシナリオは、腫瘍中のこれらのＮ末端免疫原性ペプチドの相対的欠乏を招くと予測される。興味深いことに、（エピゲノムデータの非存在下で）ＲＮＡ−ｓｅｑデータを単独で用いた類似のＮ末端分析によって、エピゲノム誘導Ｎ末端ペプチドが、ＲＮＡ−ｓｅｑのみで同定されたペプチドに比べて有意に高い予測免疫原性スコアを示すことが明らかになり（ＭＨＣ提示に対して３６．１０％対２７％、Ｐ＝０．０２、フィッシャー検定）、エピゲノム誘導プロモーター同定が、ＲＮＡ−ｓｅｑのみで誘導される分析に相補的価値を与え得ることを示唆している（図１５）。
【０２０５】
【表７８】
2019511209.tif 000080
【０２０６】
【表７９】
2019511209.tif 000081
【０２０７】
【表８０】
2019511209.tif 000082
【０２０８】
【表８１】
2019511209.tif 000083
【０２０９】
【表８２】
2019511209.tif 000084
【０２１０】
【表８３】
2019511209.tif 000085
【０２１１】
【表８４】
2019511209.tif 000086
【０２１２】
【表８５】
2019511209.tif 000087
【０２１３】
【表８６】
2019511209.tif 000088
【０２１４】
【表８７】
2019511209.tif 000089
【０２１５】
【表８８】
2019511209.tif 000090
【０２１６】
【表８９】
2019511209.tif 000091
【０２１７】
【表９０】
2019511209.tif 000092
【０２１８】
【表９１】
2019511209.tif 000093
【０２１９】
【表９２】
2019511209.tif 000094
【０２２０】
【表９３】
2019511209.tif 000095
【０２２１】
【表９４】
2019511209.tif 000096
【０２２２】
【表９５】
2019511209.tif 000097
【０２２３】
【表９６】
2019511209.tif 000098
【０２２４】
【表９７】
2019511209.tif 000099
【０２２５】
【表９８】
2019511209.tif 000100
【０２２６】
【表９９】
2019511209.tif 000101
【０２２７】
【表１００】
2019511209.tif 000102
【０２２８】
【表１０１】
2019511209.tif 000103
【０２２９】
【表１０２】
2019511209.tif 000104
【０２３０】
【表１０３】
2019511209.tif 000105
【０２３１】
【表１０４】
2019511209.tif 000106
【０２３２】
【表１０５】
2019511209.tif 000107
【０２３３】
【表１０６】
2019511209.tif 000108
【０２３４】
【表１０７】
2019511209.tif 000109
【０２３５】
【表１０８】
2019511209.tif 000110
【０２３６】
【表１０９】
2019511209.tif 000111
【０２３７】
【表１１０】
2019511209.tif 000112
【０２３８】
【表１１１】
2019511209.tif 000113
【０２３９】
【表１１２】
2019511209.tif 000114
【０２４０】
【表１１３】
2019511209.tif 000115
【０２４１】
【表１１４】
2019511209.tif 000116
【０２４２】
【表１１５】
2019511209.tif 000117
【０２４３】
【表１１６】
2019511209.tif 000118
【０２４４】
【表１１７】
2019511209.tif 000119
【０２４５】
【表１１８】
2019511209.tif 000120
【０２４６】
【表１１９】
2019511209.tif 000121
【０２４７】
【表１２０】
2019511209.tif 000122
【０２４８】
【表１２１】
2019511209.tif 000123
【０２４９】
【表１２２】
2019511209.tif 000124
【０２５０】
【表１２３】
2019511209.tif 000125
【０２５１】
【表１２４】
2019511209.tif 000126
【０２５２】
【表１２５】
2019511209.tif 000127
【０２５３】
【表１２６】
2019511209.tif 000128
【０２５４】
【表１２７】
2019511209.tif 000129
【０２５５】
【表１２８】
2019511209.tif 000130
【０２５６】
【表１２９】
2019511209.tif 000131
【０２５７】
【表１３０】
2019511209.tif 000132
【０２５８】
【表１３１】
2019511209.tif 000133
【０２５９】
【表１３２】
2019511209.tif 000134
【０２６０】
【表１３３】
2019511209.tif 000135
【０２６１】
【表１３４】
2019511209.tif 000136
【０２６２】
【表１３５】
2019511209.tif 000137
【０２６３】
【表１３６】
2019511209.tif 000138
【０２６４】
【表１３７】
2019511209.tif 000139
【０２６５】
【表１３８】
2019511209.tif 000140
【０２６６】
【表１３９】
2019511209.tif 000141
【０２６７】
【表１４０】
2019511209.tif 000142
【０２６８】
【表１４１】
2019511209.tif 000143
【０２６９】
【表１４２】
2019511209.tif 000144
【０２７０】
【表１４３】
2019511209.tif 000145
【０２７１】
【表１４４】
2019511209.tif 000146
【０２７２】
【表１４５】
2019511209.tif 000147
【０２７３】
【表１４６】
2019511209.tif 000148
【０２７４】
【表１４７】
2019511209.tif 000149
【０２７５】
【表１４８】
2019511209.tif 000150
【０２７６】
【表１４９】
2019511209.tif 000151
【０２７７】
【表１５０】
2019511209.tif 000152
【０２７８】
【表１５１】
2019511209.tif 000153
【０２７９】
【表１５２】
2019511209.tif 000154
【０２８０】
【表１５３】
2019511209.tif 000155
【０２８１】
【表１５４】
2019511209.tif 000156
【０２８２】
【表１５５】
2019511209.tif 000157
【０２８３】
【表１５６】
2019511209.tif 000158
【０２８４】
【表１５７】
2019511209.tif 000159
【０２８５】
【表１５８】
2019511209.tif 000160
【０２８６】
【表１５９】
2019511209.tif 000161
【０２８７】
体細胞プロモーターが腫瘍抗原負荷及び免疫反応性をインビボで低下させる一因になり得るかどうかを探求するために、本発明者らは、種々の原発性ＧＣコホートにおけるプロモーター変化と腫瘍内Ｔ細胞活性の相関を調べ始めた。まず、９５のＧＣ−正常ペアのコホート（ＳＧコホート）におけるプロモーター変化を検出するために、本発明者らは、上位９５の反復性ＧＣ体細胞プロモーターを標的にしたカスタマイズされたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇパネルを作成し、標準プロモーター又は選択的プロモーターに関連する転写物を測定した。ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇデータとＲＮＡ−ｓｅｑの間には有意な相関が存在し（図１６、ｒ＝０．６５、Ｐ＜０．００１）、選択的プロモーターによって駆動される転写物の約３５％は、ＧＣの半分以上で上方制御された（図４Ｄ）。第２に、これらの同じＧＣ試料におけるＴ細胞活性のマーカーを調べるために、本発明者らは、ＣＤ８Ａ（ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球の尺度）、並びにどちらもＴ細胞エフェクター及びＴ細胞溶解活性の有効なマーカーであるグランザイム（ＧＺＭＡ）とパーフォリン（ＰＲＦ１）を測定する、以前に公表されたマイクロアレイデータを分析した。本発明者らは、これらの３種の遺伝子（ＣＤ８Ａ、ＧＺＭＡ及びＰＲＦ１）が体細胞プロモーターにそれ自体関連しないことを確認した。上位四分位値と下位四分位値を比較して、体細胞プロモーター使用率の高いＧＣは、有意により低いＧＺＭＡ及びＰＲＦ１レベルを示し（Ｐ＜０．００１及びＰ＝０．０１、ウィルコクソン検定）、より低いＴ細胞溶解活性（図４Ｅ、左上）及びより低いＣＤ８Ａレベルの傾向も示した（Ｐ＝０．１４、ウィルコクソン片側検定）。２つの異なるアルゴリズム（ＡＳＣＡＴ及びＥＳＴＩＭＡＴＥ）を使用して、本発明者らは、さらに、低下したＧＺＭＡ及びＰＲＦ１レベルがＧＣ間の腫瘍純度差と無関係であることを確認した（図１６）。同様の結果は、中央値プロモーター使用スコアに基づいてＧＣ試料を分割して得られた（ＧＺＭＡ、Ｐ＜０．００１及びＰＲＦ１、Ｐ＝０．０３）。体細胞プロモーター使用率の高い（上２５％）ＧＣ患者は、体細胞プロモーター使用率の低い（下２５％）ＧＣ患者よりも生存率も低かった（図４ｅ右上、ＨＲ２．５５、Ｐ＝０．０２）。また、患者をそれらの中央値体細胞プロモーター使用スコアによって分割しても、同様の生存率差を示した（図１１、ＨＲ＝１．８１、Ｐ＝０．０４）。
【０２８８】
これらの知見を検証するために、本発明者らは、次いで、２つの別の顕著なＧＣコホート、すなわちＴＣＧＡからのもの、及びＡｓｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐ（ＡＣＲＧ）からの別のものを分析した。ＴＣＧＡコホートにおいては、ＲＮＡ−ｓｅｑデータが入手可能なことから、本発明者らは、体細胞プロモーター使用率を次世代配列決定（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）データから直接推測することができた（図２ｃ）。シンガポールコホートと同様に、体細胞プロモーター使用率の高い（上２５％）ＴＣＧＡ  ＧＣは、体細胞プロモーター使用率の低い（下２５％）ＧＣに比べて腫瘍純度と無関係にＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．００２、ウィルコクソン片側検定）、ＧＺＭＡ（Ｐ＝０．００１、ウィルコクソン片側検定）及びＰＲＦ１レベル（Ｐ＝０．００５、ウィルコクソン片側検定、図４ｅ左下）が低下した（図１６）。特に、体細胞変異負荷が腫瘍内Ｔ細胞溶解応答とも相関し得ることを以前の研究が示唆しているように、本発明者らは、さらに、回帰に基づく手法によって各試料におけるミスセンス変異の総数に合わせて調節した後に分析を繰り返した。体細胞変異負荷を補正した後でも、本発明者らは、体細胞プロモーター使用率の高い（下２５％に対して上２５％）試料におけるＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．０２、ウィルコクソン片側検定）、ＧＺＭＡ（Ｐ＝０．０１、ウィルコクソン片側検定）及びＰＲＦ１発現（Ｐ＝０．０３、ウィルコクソン片側検定）の減少を依然認めた（図１１）。
【０２８９】
本発明者らは、ＡＣＲＧからのＧＣ試料の第３の独立したコホートを活用した。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを用いて８９種の標準及び選択的プロモーターを種々の免疫マーカーと一緒に標的にして、本発明者らは、ＡＣＲＧコホートからの２６４個の原発性ＧＣ試料の特性を明らかにした。選択的プロモーター転写物の４０％は、半数を超える試料において腫瘍特異的発現を示した（図１１）。再度、体細胞プロモーター使用率の高い（上２５％）試料は、ＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．０３５、ウィルコクソン片側検定）、ＣＤ４Ａ（Ｐ＝０．００５、ウィルコクソン片側検定）、ＧＺＭＡ（Ｐ＝０．００１、ウィルコクソン片側検定）及びＰＲＦ１（Ｐ＝０．０２５、ウィルコクソン片側検定）を含めて、Ｔ細胞溶解活性マーカーの発現が有意に低下した（図４ｅ、右下）（図１６）。同様の結果は、中央値プロモーター使用スコアに基づいてＧＣ試料を分割して得られた（表１１）。また、（情報が入手可能である場合）変異負荷に合わせて調節後、体細胞プロモーター使用率の高い試料は、ＣＤ８Ａ（Ｐ＝０．１６７、ウィルコクソン片側検定）、ＧＺＭＡ（Ｐ＝０．００９、ウィルコクソン片側検定）及びＰＲＦ１（Ｐ＝０．０３、ウィルコクソン片側検定）発現が依然として低下した（図１１）。まとめると、複数のＧＣコホートで観察され、多様な技術（マイクロアレイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）によって評価されたこれらの結果はすべて、体細胞プロモーター使用率と腫瘍免疫レベル低下の有意な関連性を裏付けるものである。重要なことには、体細胞プロモーター使用に関連するＴ細胞溶解活性レベルの低下は、腫瘍純度及び変異負荷と無関係である可能性がある。
【０２９０】
【表１６０】
2019511209.tif 000162
【０２９１】
体細胞プロモーター関連ペプチドは、インビトロで免疫原性である
免疫応答を誘発するＧＣ中で欠乏したＮ末端ペプチドの能力を機能的に試験するために、本発明者らは、Ｔ細胞増殖とサイトカイン産生の両方の複数エピトープ試験を可能にするハイスループットＥＰＩＭＡＸ（ＥＰＩｔｏｐｅ  ＭＡＸｉｍｕｍ）プラットホームを用いて、インビトロアッセイを行った。まず、本発明者らは、健康なＰＢＭＣ（末梢血単核球）ドナーのプールで高いＨＬＡ結合親和性を示すと予測されるＮ末端ペプチドを特定した。次に、１５種の選択的プロモーター関連ペプチドを試験のために選択し、本発明者らは、各ペプチドに対してペプチドプールを作成し（表９及び１０、「方法」）、次いでそれらを使用して、９名の健康なドナー由来のＰＢＭＣを刺激した。Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生レベルを測定し、対照ペプチドに対して評価した（表１２）。全１３５回の曝露で（９名のドナーの各１５種のペプチド）、本発明者らは、ドナーに依存する様式で複雑なＴｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７分極を誘導する、７９個のペプチドプール（５８％；アクチンペプチドに対してＦＣ≧２）（図４ｇ）の強力なサイトカイン応答を認めた（図１７）。
【０２９２】
【表１６１】
2019511209.tif 000163
【０２９３】
【表１６２】
2019511209.tif 000164
【０２９４】
【表１６３】
2019511209.tif 000165
【０２９５】
【表１６４】
2019511209.tif 000166
【０２９６】
【表１６５】
2019511209.tif 000167
【０２９７】
【表１６６】
2019511209.tif 000168
【０２９８】
【表１６７】
2019511209.tif 000169
【０２９９】
【表１６８】
2019511209.tif 000170
【０３００】
更なる細胞設定において特異的Ｎ末端ペプチドの免疫原性能力を試験するために、本発明者らは、次いで、それぞれ改変又は野生型ペプチドを発現するＨＬＡ適合同質遺伝子ＧＣ細胞と共培養したときに改変又は野生型ペプチドを認識するように前もって刺激を受けたＴ細胞の応答を評価した（図１２）。ＭＨＣ−Ｉ親和性スクリーニングによって、ＷＴ  ＲＡＳＡ３  Ｎ末端におけるＶＭＣＤＩＦＦＳＬ九量体が、ＨＬＡ−Ａ０２：０１（ＩＣ５０＝６．９３ｎｍ）対立遺伝子とＨＬＡ−Ａ０２：０６（ＩＣ５０＝９．７４ｎｍ）対立遺伝子の両方に高いＭＨＣ−Ｉ親和性結合を示すと予測された。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＧＳ細胞と交差反応性であるＨＬＡ−Ａ＊０２：０６  Ｔ細胞を用いて、本発明者らは、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ又はＳｏｍＴアイソフォームを発現するＡＧＳ溶解物に曝露後、刺激を受けたＴ細胞からのインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の放出を試験した。ＥＬＩＳＡアッセイの示すところによれば、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴを認識するように刺激を受けたＴ細胞は、ＲＡＳＡ３  ＣａｎＴ発現ＡＧＳ細胞と共培養すると、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ発現ＡＧＳ細胞と共培養したときよりもかなり多量のＩＦＮγを放出した。それに対して、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴで刺激されたＴ細胞は、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴ発現ＡＧＳ細胞と共培養しても測定可能なＩＦＮγを放出せず、ＲＡＳＡ３  ＳｏｍＴの免疫原性が低いことを示した（図１２）。まとめると、これらのインビトロ結果の示すところによれば、体細胞プロモーター変化によってＧＣにおいて欠乏すると予測されるペプチドは、免疫原性応答を生じる可能性があり、免疫応答の規模は、ペプチド配列と宿主免疫バックグラウンドの両方に依存する。
【０３０１】
体細胞プロモーターは、ＥＺＨ２占有率に関連する
体細胞プロモーター変化を推進する潜在的発癌機序を特定するために、本発明者らは、体細胞プロモーターのゲノム位置を８３個の異なる組織由来の２３７種の転写因子の転写因子結合部位（ＴＦＢＳ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）と交差させた。体細胞プロモーターを示す領域は、ＥＺＨ２（Ｐ＜０．０１）及びＳＵＺ１２（Ｐ＜０．０１）結合に関連する領域がかなり濃縮され（図６ａ、表１３）、より小さいコホートでの以前の知見を確認した。ＥＺＨ２とＳＵＺ１２の両方は、ＧＣを含めて多数の癌タイプで上方制御されるＰＲＣ２エピジェネティック制御因子複合体の成分である。これらの知見を検証するために、本発明者らは、次いで、ＨＦＥ−１４５正常胃上皮細胞に対してＥＺＨ２  Ｃｈｉｐ配列決定を行った（「方法及び材料」）。以前の知見と一致して、本発明者らは、全プロモーターと比較して体細胞プロモーターにおけるＥＺＨ２結合部位のかなりの濃縮を認め（濃縮スコアは、全プロモーターの１３に対して２７、Ｐ＜０．０１）、このＥＺＨ２濃縮は、増大体細胞プロモーター（濃縮スコア２８、Ｐ＜０．０１）と損失体細胞プロモーター（濃縮スコア２４、Ｐ＜０．０１）を別々に分析したときに有意なままであった（図１８）。
【０３０２】
【表１６９】
2019511209.tif 000171
【０３０３】
【表１７０】
2019511209.tif 000172
【０３０４】
【表１７１】
2019511209.tif 000173
【０３０５】
【表１７２】
2019511209.tif 000174
【０３０６】
【表１７３】
2019511209.tif 000175
【０３０７】
【表１７４】
2019511209.tif 000176
【０３０８】
【表１７５】
2019511209.tif 000177
【０３０９】
【表１７６】
2019511209.tif 000178
【０３１０】
【表１７７】
2019511209.tif 000179
【０３１１】
【表１７８】
2019511209.tif 000180
【０３１２】
【表１７９】
2019511209.tif 000181
【０３１３】
【表１８０】
2019511209.tif 000182
【０３１４】
【表１８１】
2019511209.tif 000183
【０３１５】
【表１８２】
2019511209.tif 000184
【０３１６】
【表１８３】
2019511209.tif 000185
【０３１７】
【表１８４】
2019511209.tif 000186
【０３１８】
【表１８５】
2019511209.tif 000187
【０３１９】
【表１８６】
2019511209.tif 000188
【０３２０】
【表１８７】
2019511209.tif 000189
【０３２１】
【表１８８】
2019511209.tif 000190
【０３２２】
【表１８９】
2019511209.tif 000191
【０３２３】
【表１９０】
2019511209.tif 000192
【０３２４】
ＥＺＨ２／ＰＲＣ２活性の阻害がＧＣにおける体細胞プロモーター使用率を調節できるかどうか実験的に試験するために、本発明者らは、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性の極めて選択的な小分子阻害剤ＧＳＫ１２６を用いてＩＭ９５  ＧＣ細胞を処理した。この系は、ＥＺＨ２欠乏に敏感であることが以前に示されたので選択された（図１４）。２つの処理時点（６及び９日目）におけるＧＳＫ１２６処理ＩＭ９５細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析によって、ＥＺＨ２阻害によって上方制御された遺伝子が、以前に特定されたＰＲＣ２標的遺伝子セットにおいて濃縮されることを確認した（図１８）。ＧＳＫ１２６処理は、全体で２１３４種のプロモーターの調節解除を引き起こした。原発性ＧＣにおける体細胞変化を示す１９５９種のプロモーターのうち（図１Ｄ）、ＧＳＫ１２６処理は、ＩＭ９５細胞中の２５１種の体細胞プロモーターの調節解除を引き起こした（１２．８％）。この割合は、ＧＳＫ１２６曝露後に調節解除を示す不変プロモーターの割合よりも有意に大きく（８．８％、ＯＲ１．４６  Ｐ＜０．００１、フィッシャー検定、図５Ｂ）、ＥＺＨ２阻害に対する体細胞プロモーターの感受性の増大を示唆している。ＥＺＨ２阻害後に調節解除された体細胞プロモーターの割合は、ＧＳＫ１２６によって調節される（Ｇｅｎｃｏｄｅによって定義された）遺伝子の全割合も超えた（１．５％、ＯＲ９．２１、Ｐ＜０．００１、図５Ｂ）。ＧＳＫ１２６調節解除と原発性ＧＣにおいて失われる体細胞プロモーターへのマッピングの両方を示すプロモーターのうち、８９．６％は、ＧＳＫ１２６投与後に再活性化され（７８／８７、ＦＣ≧２、ｑｖａｌ＜０．１、「方法及び材料」）、ＥＺＨ２がこれらのプロモーターを抑制するように機能することと一致した。例えば、図５Ｃ及び５Ｄは、ＧＳＫ１２６処理後に発現増加を示す、２種の損失体細胞プロモーター（ＳＬＣ９Ａ９及びＰＳＣＡ）を強調している（図５）。これらの結果は、したがって、ＧＣにおけるエピゲノムプロモーター変化の調節におけるＥＺＨ２にとっての一般的な役割を示唆している。
【０３２５】
体細胞プロモーターは、新規癌関連転写物を明らかにする
最後に、公知の遺伝子への両方の近接に関して改変体細胞プロモーターを分析すると、本発明者らは、体細胞プロモーターを注釈付きカテゴリと注釈のないカテゴリに分類することができた。注釈付きプロモーターは、公知のＧｅｎｃｏｄｅ転写開始点（ＴＳＳ）の近く（＜５００ｂｐ）に位置するプロモーターとして定義され、注釈のないプロモーターとは、公知のＧｅｎｃｏｄｅＴＳＳを欠くゲノム領域に位置するものを指す。非悪性組織中に存在するプロモーターの大部分、及び腫瘍と正常組織の間で不変のプロモーターも、前もって注釈の付けられたＴＳＳの近くにマッピングされる（７２％〜９２％）。それに対して、プロモーターの４１％しか注釈付きプロモーター位置に位置せず、残りの５９％は、ＧｅｎｃｏｄｅＴＳＳから遠い、多くの場合において２〜１０ｋｂ離れた、「注釈のない」位置に位置した（図６ａ）。
【０３２６】
これらの注釈のないプロモーターの機能的関連性を試験するために、本発明者らは、複数のレベルの保存及びエピゲノム情報を統合するゲノム機能的可能性のヌクレオチドレベル定量化ＧｅｎｏＣａｎｙｏｎを使用した。本発明者らは、注釈のないプロモーター領域の８１％が０．９を超える最大ゲノムワイド機能スコアを示し（範囲０〜１）、高い機能的可能性を示すことを認めた。組織タイプ特異性を確認するために、本発明者らは、次いで、Ｒｏａｄｍａｐ  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓデータを統合するＧｅｎｏＣａｎｙｏｎ枠組みの拡大部分であるＧｅｎｏＳｋｙｌｉｎｅを用いて、組織特異的注釈を適用した。本発明者らは、ＧＩ組織がＥＳＣ及び胎児組織に次いで３番目に高い中央値スコアを有することを認め、本発明者らの腫瘍が胃系列であり、脱分化もしていることと一致した（図５ｂ）。別の分析においては、最近の研究は、ヒトゲノム中の内在性繰り返しエレメントが、調節エレメント変化に有意に寄与する可能性があり、繰り返しエレメントの低メチル化が癌関連転写を誘導し得ることも示唆している。本発明者らは、注釈のないプロモーターが、繰り返しエレメントＥＲＶ１（Ｐ＜０．０００１注釈なし対全部）及びＬ１（Ｐ＜０．０００１注釈なし対全部、図１３）でも有意に濃縮されたことを見いだした。
【０３２７】
注釈付きプロモーターに比べて、注釈のないプロモーターは、より弱いＨ３Ｋ２７ａｃシグナルを示し、前者がより低い活性及び低下した遺伝子発現レベルを有し得ることを示唆している（図１３）。これを裏付けて、体細胞プロモーターは、（真のプロモーターを示す）ＣＡＧＥタグで支持されたものでも、ＣＡＧＥタグで支持された全プロモーターよりも有意に低いＲＮＡ−ｓｅｑ発現レベルを示した（図５ｃ）。本発明者らは、したがって、注釈のないプロモーターが低い転写物レベルに関連し、それによって、細胞トランスクリプトームの極めて広いダイナミックレンジ（異なる遺伝子に対して１０〜１０，０００転写物／細胞）を考慮すると、従来の深さのトランスクリプトーム配列決定によってそれらを検出することがより困難になると仮定した（図５ｄ）。この可能性を試験するために、本発明者らは、サンプリング減少分析とサンプリング増加分析の両方を採用した。ＲＮＡ−ｓｅｑ深さレベルの低下が、検出される体細胞プロモーター転写物の同時減少を引き起こしたことは驚くにあたらない。例えば、約４０Ｍ読み取りへのサンプリング減少によって、約２５０個の転写物（ＦＰＫＭ＞０、図５ｅ）が体細胞プロモーターで検出不可能になった。より確かなことに、相反的な実験においては、本発明者らは、対応する５つのＧＣ／正常ペアの深いＲＮＡ−ｓｅｑデータを実験的に作成し（平均読み深度が標準の１００Ｍに比べて１４０Ｍ）、４３５種の新しい体細胞プロモーター関連転写物の追加の検出を確認した（ＦＰＫＭ＞０）（図５ｅ）。本発明者らは、深いＲＮＡ配列決定データの使用によって、通常の深さのＲＮＡ−ｓｅｑで以前に検出できなかった注釈のないプロモーターの２２％で追加の転写物を本発明者らが発見できたと推定している（図５ｆ）。これらの結果の示すところによれば、真の癌関連転写物に関連するにもかかわらず、エピゲノムプロファイリングによって定義された多数の体細胞プロモーターが、従来の深さのＲＮＡ−ｓｅｑによって見逃された可能性がある。
【０３２８】
考察
体細胞的に改変されたシス調節エレメントの特定、及びこれらのエレメントが癌関連遺伝子発現を誘導する仕方の理解は、重要な科学的目標である。ここで、本発明者らは、ＧＣにおいて活性が変化する約２０００種のプロモーターを定義し、ＧＣにおける体細胞プロモーターが広範であることを示した。プロモーターは、基本転写因子を動員して転写を開始する近位シス調節エレメントとして標準的に定義される。しかし、コアプロモーターにおけるＲＮＡポリメラーゼによるＴＳＳの選択及び活性化は、多数の要因に依存する。コアプロモーターは、機能の異なる遺伝子間で分布が異なり、コアプロモーター領域のクロマチン分布及びエピジェネティック特性は、組織特異的にも異なり得る。同じ遺伝子内の複数の転写開始点の存在は、遺伝子発現を調節するスイッチとして作用し得る異なる５’ＵＴＲを有する異なる転写物アイソフォームを生成する可能性があり、選択的５’ＵＴＲの使用は、ＢＲＣＡ１、ＴＧＦ−β、ＥＲＧなどの癌関連遺伝子の翻訳とタンパク質安定性の両方にも影響し得る。こうした知見は、特異的プロモーターエレメント活性が複雑であり、細胞の状況に依存し、下流の転写、翻訳及び機能的プロセスに影響することを示している。
【０３２９】
体細胞プロモーターのかなりの割合（約１８％）が選択的プロモーターに対応した。癌においては、選択的プロモーターの利用は重大な関連性があり、ますます多くの遺伝子（例えば、ＬＥＦ１、ＴＰ５３、ＴＧＦＢ３）が、現在、悪性増殖への影響が異なる別個の選択的プロモーター関連アイソフォームを示すことが判明しつつある。現在の研究においては、本発明者らは、重要な臨床及び翻訳の意味を有するＧＣ生物学に公知と新規の両方の遺伝子中の選択的プロモーターを特定した。例えば、本発明者らは、胃腫瘍において特異的に活性化されるＥｐＣＡＭ遺伝子座における選択的プロモーターを発見した。ＧＣにおいては、ＥｐＣＡＭは、循環腫瘍細胞のマーカーとして提案された膜貫通糖タンパク質をコードし、ＥｐＣＡＭ発現レベルは、ＧＣ患者の予後と相関した。しかし、ＧＣにおいて高いＥｐＣＡＭ発現を駆動する具体的細胞機序についてはほとんど知られていない。ＥｐＣＡＭがＧＣにおいてその標準プロモーターによってではなく、癌特異的選択的プロモーターによって調節されるという本発明者らの知見は、実験的に好都合な表面マーカーとしての作用に加えて、ＥｐＣＡＭが、より直接的な発癌促進の役割を細胞増殖の刺激において実際に果たすことを示唆している最近の報告に信頼性を与え得るものである。
【０３３０】
本発明者らの研究において初めて特定された選択的プロモーター関連遺伝子の別の新規例は、ＲＡＳＡ３であった。癌におけるＲＡＳＡ３にとっての機能的役割は明確に確立されたが、別の生物学的分野からの研究によれば、ＲＡＳＡ３はＲＡＰ１を阻害する可能性があり、ＲＡＰ１は、種々の癌において浸潤及び転移に関係している。ＲＡＳＡ３の欠乏は、インテグリン及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼによってシグナル伝達を強化する可能性があり、ＲＡＳＡ３が腫瘍抑制因子として作用する可能性は、独立した異種間の癌研究によっても最近示唆された。潜在的腫瘍抑制因子としてのＲＡＳＡ３にとっての妥当な役割は、本発明者ら自身の結果と一致し、野生型ＲＡＳＡ３の発現は、ＧＣ細胞系における細胞遊走及び浸潤を強力に阻害し、Ｎ末端変異ＲＡＳＡ３は、正常胃上皮細胞における遊走及び浸潤を強化した。選択的プロモーターによって駆動される遺伝子の第３の例は、癌治療の標的として広範に検討されたＭＥＴであった。本発明者ら及び他の人は、癌におけるＮ末端切断型ＭＥＴ変異体の発現を以前に報告したが、この切断型ＭＥＴ変異体の機能的意味は不明なままであった。本研究においては、ＭＥＴ野生型及び変異体シグナル伝達の実験的評価によって、切断型ＭＥＴ変異体が完全長ＭＥＴアイソフォームとは異なる下流シグナル伝達効果を有し得ることを明らかにした。使用した実験条件下で、本発明者らは、ＭＥＴ−ＶａｒがＭＥＴ−Ｖａｒよりも発癌促進性であることと一致して、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ３及びＧＡＢ１のリン酸化パターンに有意差を認め、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ３及びＧＡＢ１のどれもＭＥＴ誘導シグナル伝達を促進することが示された。ＭＥＴシグナル伝達経路は、複数のフィードバックループを有し、特に複雑であることが知られており、Ｎ末端短鎖ＭＥＴアイソフォームの発現が下流の生存シグナル伝達を調節し得る仕方を理解することは、特に不成功であった抗体を用いた肺癌におけるＭＥＴを標的にした最近の臨床試験に鑑みて、将来の研究の重要な対象であろう。
【０３３１】
本発明者らの研究は、体細胞プロモーターと腫瘍免疫の予想外の関係も明らかにした。具体的には、本発明者らは、ＧＣにおいて過剰発現する選択的プロモーターアイソフォームは、高親和性ＭＨＣクラスＩ結合のコンピュータ予測及び他の免疫学的アッセイに基づいて、潜在的に免疫原性であると予測されるＮ末端ペプチドが有意に欠乏することを発見した。本発明者らは、知見が癌免疫に関連し、自己反応性Ｔ細胞の存在、過剰発現腫瘍抗原の潜在的免疫原性、及び腫瘍免疫編集のプロセスを確立した文献からの以前の知見を更に増強すると考える。まず、自己反応性Ｔ細胞の大部分は、初期発生中にクローン的に除去されたが、多数のグループが、周辺の自己反応性Ｔ細胞の頻繁な持続性も示した。例えば、トランスジェニックマウスの分析は、自己反応性Ｔ細胞の２５〜４０％が、除去リガンドの存在下でもクローン除去を逃れる可能性があることを示したが、ヒトにおいては、Ｙｕらが、クローン除去がＴ細胞レパートリーを取り除くが、自己反応性Ｔ細胞クローンを完全には除去しないことを示した。重要なことには、こうした自己反応性Ｔ細胞は、一般に結合活性が低く、通常の生理条件下では自己抗原を認識できないが、それらは、それでも、感染、抗腫瘍応答の増大などの適切な刺激の条件下で、活性化され、エフェクター及びメモリー細胞を産生する能力を保持する。
【０３３２】
第２に、癌においては、幾つかの研究によれば、自己反応性Ｔ細胞は、過剰発現した腫瘍抗原に対して、これらの抗原が正常組織においてもより低レベルで発現する場合でも、免疫学的活性を示すことができる。周知の一例は、両方の正常メラニン細胞によって発現され、悪性黒色腫細胞において過剰発現するメラニン細胞分化抗原Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１である。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１のＴ細胞認識は、黒色腫患者の５０％で検出され、健康な個体でも末梢血において不釣合いに高頻度のＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞を示すことが判明した。Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１に加えて、健康な個体と癌患者の両方で免疫学的認識を誘導する腫瘍関連自己抗原の別の例としては、黒色腫におけるチロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２）及び糖タンパク質（ｇｐ）１００、並びに肥満細胞腫細胞におけるＰ１Ａが挙げられる。こうした例は、ある場合においては、正常に発現されるタンパク質が、癌において過剰発現されると依然として免疫原性になり得ることを明瞭に示している。第３に、免疫制御を逃れる発達中の腫瘍の獲得能力である腫瘍免疫編集は、癌の一般に認められた特徴である。腫瘍免疫回避は、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１）の上方制御、抗原提示遺伝子又は腫瘍特異的抗原の転写の改変などの異なる機序によって起こり得る。例えば、メラノーマ抗原（例えば、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１及びＰ１Ａ）の発現の減少は、後期の病期への黒色腫の進行に関連する。したがって、遺伝子全体の明白な下方制御に加えて、スプライス形態及びプロモーター変異体に影響を及ぼす転写変化が腫瘍免疫編集の一因にもなり得ることは極めて妥当なことである。例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ：Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）におけるごく最近の研究は、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ（キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞）治療に反応したＮ末端切断型ＣＤ１９転写物変異体の産生を記述し、プロモーター転写物変異体が免疫圧力の結果として実際に生じ得ることを明瞭に示している。まとめると、本発明者らは、これらの以前に確立された知見すべてが、腫瘍の免疫原性の低下における選択的プロモーターにとっての妥当な役割を示していると考える。この点で、体細胞プロモーター変化を示す領域が、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２：Ｐｏｌｙｃｏｍｂ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ２）エピジェネティック制御因子複合体の結合標的とかなり重複し、ＥＺＨ２阻害に特に敏感であるという本発明者らの観察は、体細胞プロモーター関連エピトープを再覚醒させる薬理的手法が、抗腫瘍Ｔ細胞免疫反応性及び抗腫瘍活性を高める魅力的な戦略であることを示唆している。
【０３３３】
要するに、本発明者らの研究は、ＧＣにおける体細胞プロモーターにとっての重要な役割を示している。本発明者らは、最近の研究が注釈付きのままである数百の転写物遺伝子座の存在を示していることと一致して、体細胞プロモーターのかなりの部分（５２％）が注釈のないＴＳＳに集中したことにも注目する。興味深いことに、ヒトトランスクリプトームの大部分は、プロモーター活性を示すことができる、及び／又は非コードＲＮＡを発現することができる、繰り返しエレメントから生ずることが示された。本発明者らのＧＣ研究で活性化された注釈のないプロモーターは、初期ヒト胚細胞におけるステージ特異的転写に関連することが示されたＥＲＶ−１及びＬ１繰り返しエレメントが濃縮されることが見いだされ、これらのプロモーターにとってのまだ不明な機能的役割を示唆している。これらの注釈のないプロモーターの分析は、ＧＣの発生及び進行の機序への新しいこれまでに予期しない洞察のための土壌となる可能性がある。
【図１Ａ】
2019511209.tif 000193
【図１Ｂ】
2019511209.tif 000194
【図１Ｃ】
2019511209.tif 000195
【図１Ｄ】
2019511209.tif 000196
【図１Ｅ】
2019511209.tif 000197
【図１Ｆ】
2019511209.tif 000198
【図２】
2019511209.tif 000199
【図３Ａ】
2019511209.tif 000200
【図３Ｂ】
2019511209.tif 000201
【図３Ｃ】
2019511209.tif 000202
【図３Ｄ】
2019511209.tif 000203
【図３Ｅ】
2019511209.tif 000204
【図４Ａ】
2019511209.tif 000205
【図４Ｂ】
2019511209.tif 000206
【図４Ｃ】
2019511209.tif 000207
【図４Ｄ】
2019511209.tif 000208
【図４Ｅ】
2019511209.tif 000209
【図４Ｆ】
2019511209.tif 000210
【図４Ｇ】
2019511209.tif 000211
【図４Ｈ】
2019511209.tif 000212
【図５Ａ】
2019511209.tif 000213
【図５Ｂ】
2019511209.tif 000214
【図５Ｃ】
2019511209.tif 000215
【図５Ｄ】
2019511209.tif 000216
【図６Ａ】
2019511209.tif 000217
【図６Ｂ】
2019511209.tif 000218
【図６Ｃ】
2019511209.tif 000219
【図６Ｄ】
2019511209.tif 000220
【図６Ｅ】
2019511209.tif 000221
【図６Ｆ】
2019511209.tif 000222
【図７Ａ】
2019511209.tif 000223
【図７Ｂ】
2019511209.tif 000224
【図７Ｃ】
2019511209.tif 000225
【図７Ｄ】
2019511209.tif 000226
【図７Ｅ】
2019511209.tif 000227
【図７Ｆ】
2019511209.tif 000228
【図８Ａ】
2019511209.tif 000229
【図８Ｂ】
2019511209.tif 000230
【図９Ａ】
2019511209.tif 000231
【図９Ｂ】
2019511209.tif 000232
【図９Ｃ】
2019511209.tif 000233
【図９Ｄ】
2019511209.tif 000234
【図９Ｅ】
2019511209.tif 000235
【図９Ｆ】
2019511209.tif 000236
【図１０】
2019511209.tif 000237
【図１１】
2019511209.tif 000238
【図１２Ａ】
2019511209.tif 000239
【図１２Ｂ】
2019511209.tif 000240
【図１３Ａ】
2019511209.tif 000241
【図１３Ｂ】
2019511209.tif 000242
【図１３Ｃ】
2019511209.tif 000243
【図１３Ｄ】
2019511209.tif 000244
【図１３Ｅ】
2019511209.tif 000245
【図１３Ｆ】
2019511209.tif 000246
【図１３Ｇ】
2019511209.tif 000247
【図１３Ｈ】
2019511209.tif 000248
【図１３Ｉ】
2019511209.tif 000249
【図１４Ａ】
2019511209.tif 000250
【図１４Ｂ】
2019511209.tif 000251
【図１４Ｃ】
2019511209.tif 000252
【図１４Ｄ】
2019511209.tif 000253
【図１４Ｅ】
2019511209.tif 000254
【図１４Ｆ】
2019511209.tif 000255
【図１５】
2019511209.tif 000256
【図１６Ａ】
2019511209.tif 000257
【図１６Ｂ】
2019511209.tif 000258
【図１６Ｃ】
2019511209.tif 000259
【図１６Ｄ】
2019511209.tif 000260
【図１６Ｅ】
2019511209.tif 000261
【図１７Ａ−１】
2019511209.tif 000262
【図１７Ａ−２】
2019511209.tif 000263
【図１７Ａ−３】
2019511209.tif 000264
【図１７Ｂ】
2019511209.tif 000265
【図１７Ｃ】
2019511209.tif 000266
【図１８Ａ】
2019511209.tif 000267
【図１８Ｂ】
2019511209.tif 000268
【図１８Ｃ】
2019511209.tif 000269
【図１８Ｄ】
2019511209.tif 000270
【図１９】
2019511209.tif 000271
【配列表】
2019511209000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月15日(2018.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定する方法であって、
前記癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及び
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも１種のプロモーターの有無を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記癌及び非癌生体試料が、単細胞、多細胞、細胞の断片、体液又は組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌生体試料と非癌生体試料が同じ対象から得られる、請求項１から２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記癌生体試料と非癌生体試料が各々異なる対象から得られる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記接触させるステップが、前記ヒストン修飾に特異的な前記抗体を用いたクロマチンの免疫沈降を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌生体試料からの少なくとも１種のプロモーターを少なくとも１個の参照核酸配列に対してマッピングして、前記少なくとも１種のプロモーターに関連する遺伝子転写物を同定するステップを更に含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１個の参照核酸配列が、
ｉ）注釈付きゲノム配列、
ｉｉ）新規トランスクリプトーム集合体、及び／又は
ｉｉｉ）非癌核酸配列ライブラリ若しくはデータベース
に由来する核酸配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化が、前記非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の１．５倍を超えて増加又は減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の１．５倍を超えて増加するＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度の変化が、前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの存在と相関する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性が、全プロモーター集団に比べたＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加と相関する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加が、前記少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の上方制御と相関する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＵＺ１２又はＥＺＨ２結合部位の増加が、前記少なくとも１種の癌関連プロモーターの活性の下方制御と相関する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子転写物開始点が、細胞型特定遺伝子、細胞接着遺伝子、細胞性免疫遺伝子、胃癌関連若しくは調節解除遺伝子、ＰＲＣ２標的遺伝子又は転写因子の１種以上に関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子転写物開始点が癌遺伝子に関連する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子転写物開始点が、ＭＹＣ、ＭＥＴ、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＬＤＮ７、ＣＬＤＮ３、ＨＯＴＡＩＲ、ＰＶＴ１、ＨＮＦ４α、ＲＡＳＡ３、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＥｐＣＡＭ及びそれらの組合せからなる群から選択される遺伝子に関連する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が胃癌又は結腸癌である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種のプロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが前記癌生体試料と前記非癌生体試料の両方に存在し、前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在しない、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のプロモーターが、遺伝子転写物開始点から５００ｂｐを超えて離れて位置する注釈のないプロモーターである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌生体試料及び非癌生体試料中の前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、前記測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及び
前記レポータープローブの前記デジタルプロファイリングに基づいて、前記非癌生体試料と比較した前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、非癌生体試料と比較した前記癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無を確認するステップ
を更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定するステップがＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プラットホームを用いて行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象における癌の予後を判定する方法であって、
前記対象から得られる癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を検出するステップ、及び
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を参照核酸配列中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップ
を含み、
前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無が、前記対象における前記癌の予後を示している、
方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の癌関連プロモーターが、標準プロモーターに関連する選択的プロモーターであり、前記標準プロモーターが前記癌生体試料と前記参照核酸配列の両方に存在し、前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在する、又は前記選択的プロモーターが前記癌生体試料にのみ存在しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌試料中の前記少なくとも１種の選択的プロモーターの有無が、前記対象における癌生存の予後不良を示している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌生体試料及び前記参照核酸配列における前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現レベルを測定するステップであって、前記測定するステップがレポータープローブのデジタルプロファイリングを含む、ステップ、及び
前記レポータープローブの前記デジタルプロファイリングに基づいて、前記非癌生体試料と比較した前記少なくとも１種の選択的プロモーターの発現差異レベルを決定して、前記参照核酸配列と比較した前記癌生体試料中の少なくとも１種の選択的プロモーターの有無を確認するステップ
を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記測定するステップがＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プラットホームを用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
非癌生体試料と比較した癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定する方法であって、
前記癌生体試料をヒストン修飾Ｈ３Ｋ４ｍｅ３及びＨ３Ｋ４ｍｅ１に特異的な少なくとも１種の抗体と接触させるステップ、
Ｈ３Ｋ４ｍｅ３とＨ３Ｋ４ｍｅ１のシグナル比が１を超える核酸を前記癌生体試料から単離するステップであって、前記単離した核酸が前記ヒストン修飾に特異的な少なくとも１個の領域を含む、ステップ、
前記単離した核酸中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を読み深度２０Ｍで検出するステップ、及び
前記Ｈ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度を非癌生体試料中のＨ３Ｋ４ｍｅ３の信号強度と比較した変化に基づいて、前記癌生体試料中の少なくとも１種の癌関連プロモーターの有無を決定するステップ
を含む、方法。
【国際調査報告】
2019511209.tif 000272
2019511209.tif 000273
2019511209.tif 000274
2019511209.tif 000275
2019511209.tif 000276
2019511209.tif 000277
2019511209.tif 000278