(57)【要約】本明細書では、いくつかの態様において、改変された細胞からの異種核酸の除去を可能にする方法、組成物、システム、およびキットを提供する。2019521717.tif 000006
2019521717.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)関心対象の第一の生成物をコードするヌクレオチド配列と、
(b)関心対象の第二の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列と
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
関心対象の第一の生成物の発現または活性が活性化可能であり、かつ、関心対象の第一の生成物がカセットの切除または分解を調節する、
改変された遺伝子構築物。
【請求項２】
関心対象の第一の生成物がリコンビナーゼである、請求項1記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項３】
リコンビナーゼがリガンド依存性キメラリコンビナーゼである、請求項2記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４】
リガンド依存性キメラリコンビナーゼが、変異したヒトエストロゲン受容体（ER）リガンド結合ドメインに連結されている、請求項3記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５】
リコンビナーゼが、第一の断片および第二の断片を含む分割リコンビナーゼであり、第一の断片および第二の断片は、組み合わされたときにリコンビナーゼを形成する、請求項3記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項６】
第一の断片および第二の断片の二量体化が誘導性である、請求項5記載の改変された細胞。
【請求項７】
第一の断片がFKBPドメインに連結され、かつ、第二の断片がFRBドメインに連結されている、請求項5記載の改変された細胞。
【請求項８】
リコンビナーゼが、チロシンリコンビナーゼおよびチロシンインテグラーゼから選択される、請求項2記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項９】
リコンビナーゼが、Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、およびHP1リコンビナーゼから選択されるチロシンリコンビナーゼである、請求項8記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１０】
リコンビナーゼが、セリンリコンビナーゼおよびセリンインテグラーゼから選択される、請求項2のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１１】
リコンビナーゼが、γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、およびR4リコンビナーゼから選択される、請求項10記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１２】
カセットが、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、請求項2〜11のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１３】
関心対象の第一の生成物がヌクレアーゼである、請求項1記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１４】
ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、RNAガイドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼから選択される、請求項13記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１５】
ヌクレアーゼが、イントロンエンドヌクレアーゼおよびインテインエンドヌクレアーゼから選択されるメガヌクレアーゼである、請求項14記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１６】
ヌクレアーゼが、Cas9ヌクレアーゼおよびCpf1ヌクレアーゼから選択されるRNAガイドヌクレアーゼである、請求項14記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１７】
カセットが、ヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項16記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１８】
カセットが同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項13〜17のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１９】
(a)のヌクレオチド配列が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、請求項1〜18のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２０】
(b)のヌクレオチド配列が、構成的プロモーターに機能的に連結されている、請求項1〜19のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２１】
(a)および(b)のヌクレオチド配列が、単一の構成的プロモーターに機能的に連結されている、請求項1〜18のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２２】
関心対象の第二の生成物が、治療用分子または予防用分子である、請求項1〜21のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２３】
関心対象の生成物が、タンパク質、ペプチド、または核酸である、請求項1〜22のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２４】
関心対象の生成物が、RNA、DNA、またはRNAとDNAの組み合わせから選択される核酸である、請求項23記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２５】
関心対象の生成物が、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択されるRNAである、請求項24記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２６】
逆選択マーカーがプロドラッグである、請求項1〜25のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２７】
逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、請求項1〜25のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項２８】
任意でプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項1〜27のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項1〜27のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項28記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３０】
幹細胞または免疫細胞である、請求項29記載の細胞。
【請求項３１】
間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項30記載の細胞。
【請求項３２】
ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される免疫細胞である、請求項30記載の細胞。
【請求項３３】
CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択されるT細胞である、請求項32記載の細胞。
【請求項３４】
T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、請求項32または33記載の細胞。
【請求項３５】
請求項1〜27のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物、請求項28記載のベクター、または請求項29〜34のいずれか一項記載の細胞を含む、組成物。
【請求項３６】
請求項1〜27のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項28記載のベクターと、少なくとも1つの誘導作用物質および／または逆選択物質とを含む、キット。
【請求項３７】
請求項1〜27のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項28記載のベクターを細胞の集団に導入する工程を含む、方法。
【請求項３８】
請求項29〜34のいずれか一項記載の細胞を対象に送達する方法。
【請求項３９】
(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、
(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
該カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、
改変された遺伝子構築物。
【請求項４０】
(a)が(b)から上流にある、請求項39記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４１】
ターミネーター配列が(a)と(b)との間に位置する、請求項39または40記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４２】
(a)が、異なるリコンビナーゼに各々連結された少なくとも2つの誘導性プロモーターを含み、かつ、カセットが、該異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、請求項39〜41のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４３】
(a)のヌクレオチド配列が、少なくとも2つの異なるリコンビナーゼをコードし、かつ、カセットが、該異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、請求項39〜41のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４４】
(b)のヌクレオチド配列が少なくとも2つの逆選択マーカーをコードする、請求項39〜43のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４５】
リコンビナーゼが、チロシンリコンビナーゼおよびチロシンインテグラーゼから選択される、請求項39〜44のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４６】
リコンビナーゼが、Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、およびHP1リコンビナーゼから選択される、請求項45記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４７】
リコンビナーゼが、セリンリコンビナーゼまたはセリンインテグラーゼから選択される、請求項39〜46のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４８】
リコンビナーゼが、γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、およびR4リコンビナーゼから選択される、請求項47記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項４９】
関心対象の生成物が、治療用分子または予防用分子である、請求項39〜48のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５０】
関心対象の生成物が、タンパク質、ペプチド、または核酸である、請求項39〜49のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５１】
関心対象の生成物が、RNA、DNA、またはRNAとDNAとの組み合わせから選択される核酸である、請求項50記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５２】
関心対象の生成物が、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択されるRNAである、請求項51記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５３】
逆選択マーカーがプロドラッグである、請求項39〜52のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５４】
逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、請求項39〜52のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項５５】
任意でプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項39〜54のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項５６】
請求項39〜54のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項55記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５７】
幹細胞または免疫細胞である、請求項56記載の細胞。
【請求項５８】
間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項57記載の細胞。
【請求項５９】
ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される免疫細胞である、請求項57記載の細胞。
【請求項６０】
CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択されるT細胞である、請求項59記載の細胞。
【請求項６１】
T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、請求項59または60記載の細胞。
【請求項６２】
請求項39〜54のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物、請求項55記載のベクター、または請求項56〜61のいずれか一項記載の細胞を含む、組成物。
【請求項６３】
請求項39〜54のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項55記載のベクターと、(a)の誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質とを含む、キット。
【請求項６４】
関心対象の生成物が、細胞の分化、増殖、または表現型の維持（持続）を助ける、請求項39〜55のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項56記載のベクターを細胞の集団に導入する工程を含む方法。
【請求項６５】
前記集団の細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
前記集団の細胞を誘導作用物質の存在下で培養する工程、(a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および改変された遺伝子構築物からカセットを切除する工程をさらに含む、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
前記集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程および逆選択マーカーを発現する細胞を殺傷する工程をさらに含む、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
前記集団の細胞の10％未満が、前記集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程後にカセットを含む、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
前記集団の細胞を対象に送達する工程をさらに含む、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
関心対象の生成物が治療用分子および／または予防用分子である、請求項36〜55のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項56記載のベクターを細胞の集団に導入する工程を含む、方法。
【請求項７１】
前記集団の細胞を対象に送達する工程をさらに含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
対象を誘導作用物質に曝露させる工程、(a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および改変された遺伝子構築物からカセットを切除する工程をさらに含む、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
対象を逆選択物質に曝露させる工程および逆選択マーカーを発現する細胞を殺傷する工程をさらに含む、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
前記集団の細胞の10％未満が、対象を逆選択物質に曝露させる工程後にカセットを含む、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
請求項56〜61のいずれか一項記載の細胞を対象に送達する工程を含む、方法。
【請求項７６】
(a)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、
(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
該カセットが、該カセットを任意で挟んでいる同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、
改変された遺伝子構築物。
【請求項７７】
(a)が(b)から上流にある、請求項76記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項７８】
ターミネーター配列が(a)と(b)との間に位置する、請求項76または77記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項７９】
(a)が、異なるヌクレアーゼに各々連結された少なくとも2つの誘導性プロモーターを含み、かつ、カセットが、該異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８０】
(a)のヌクレオチド配列が、少なくとも2つの異なるヌクレアーゼをコードし、かつ、カセットが、該異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む、請求項76〜79のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８１】
(b)のヌクレオチド配列が、少なくとも2つの逆選択マーカーをコードする、請求項76〜80のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８２】
ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、RNAガイドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼから選択される、請求項76〜81のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８３】
ヌクレアーゼが、イントロンエンドヌクレアーゼおよびインテインエンドヌクレアーゼから選択されるメガヌクレアーゼである、請求項82記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８４】
ヌクレアーゼが、Cas9ヌクレアーゼおよびCpf1ヌクレアーゼから選択されるRNAガイドヌクレアーゼである、請求項82記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８５】
カセットが、ヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項84記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８６】
関心対象の生成物が、治療用分子または予防用分子である、請求項76〜85のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８７】
関心対象の生成物が、タンパク質、ペプチド、または核酸である、請求項76〜86のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８８】
関心対象の生成物が、RNA、DNA、またはRNAとDNAとの組み合わせから選択される核酸である、請求項87記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項８９】
関心対象の生成物が、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択されるRNAである、請求項88記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項９０】
逆選択マーカーがプロドラッグである、請求項76〜89のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項９１】
逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、請求項76〜89のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項９２】
任意でプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項76〜91のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物を含む、ベクター。
【請求項９３】
請求項76〜91のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項92記載のベクターを含む、細胞。
【請求項９４】
幹細胞または免疫細胞である、請求項93記載の細胞。
【請求項９５】
間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項94記載の細胞。
【請求項９６】
ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される免疫細胞である、請求項94記載の細胞。
【請求項９７】
CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択されるT細胞である、請求項96記載の細胞。
【請求項９８】
T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、請求項96または97記載の細胞。
【請求項９９】
請求項76〜91のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物、請求項92記載のベクター、または請求項93〜98のいずれか一項記載の細胞を含む、組成物。
【請求項１００】
請求項76〜91のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項92記載のベクターと、(a)の誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質とを含む、キット。
【請求項１０１】
関心対象の生成物が、細胞の分化、増殖、または表現型の維持（持続）を助ける、請求項76〜91のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項92記載のベクターを細胞の集団に導入する工程を含む、方法。
【請求項１０２】
前記集団の細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程をさらに含む、請求項101記載の方法。
【請求項１０３】
前記集団の細胞を誘導作用物質の存在下で培養する工程、(a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および改変された遺伝子構築物からカセットを切除する工程をさらに含む、請求項102記載の方法。
【請求項１０４】
前記集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程および逆選択マーカーを発現する細胞を殺傷する工程をさらに含む、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
前記集団の細胞の10％未満が、前記集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程後にカセットを含む、請求項104記載の方法。
【請求項１０６】
前記集団の細胞を対象に送達する工程をさらに含む、請求項104記載の方法。
【請求項１０７】
関心対象の生成物が治療用分子および／または予防用分子である、請求項39〜55のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物または請求項56記載のベクターを細胞の集団に導入する工程を含む、方法。
【請求項１０８】
前記集団の細胞を対象に送達する工程をさらに含む、請求項107記載の方法。
【請求項１０９】
対象を誘導作用物質に曝露させる工程、(a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および改変された遺伝子構築物からカセットを切除する工程をさらに含む、請求項108記載の方法。
【請求項１１０】
対象を逆選択物質に曝露させる工程および逆選択マーカーを発現する細胞を殺傷する工程をさらに含む、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
前記集団の細胞の10％未満が、対象を逆選択物質に曝露させる工程後にカセットを含む、請求項110記載の方法。
【請求項１１２】
請求項93〜98のいずれか一項記載の細胞を対象に送達する工程を含む、方法。
【請求項１１３】
(a)少なくとも1つのリガンド依存性キメラリコンビナーゼをコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に機能的に連結されている少なくとも1つのプロモーターと、
(b)関心対象の生成物および逆選択分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている少なくとも1つのプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
該カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、
改変された遺伝子構築物。
【請求項１１４】
リガンド依存性キメラリコンビナーゼが、変異したヒトエストロゲン受容体（ER）リガンド結合ドメインに連結されている、請求項113記載の改変された遺伝子構築物。
【請求項１１５】
請求項113および114のいずれか一項記載の改変された遺伝子構築物を含む、細胞。
【請求項１１６】
請求項115記載の細胞を対象に送達する工程を含む、方法。
【請求項１１７】
(a)リコンビナーゼの第一の断片をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと、
(b)リコンビナーゼの第二の断片をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターであって、第一の断片および第二の断片が、組み合わされたときに完全長の機能的リコンビナーゼを形成する、プロモーターと、
(c)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
該カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、
改変された遺伝子構築物。
【請求項１１８】
第一の断片がFKBPドメインに連結され、かつ、第二の断片がFRBドメインに連結されている、請求項117記載の改変された細胞。
【請求項１１９】
請求項117または118記載の改変された遺伝子構築物を含む、細胞。
【請求項１２０】
請求項119記載の細胞を対象に送達する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づき2016年7月26日に出願された米国仮出願第62/366,755号の恩典を主張するものであり、これは参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【発明の概要】
【０００２】
概要
本明細書では、いくつかの態様において、改変された細胞（例えば、細胞療法において使用される）からの異種核酸（例えば、DNA）の高度に効果的な除去のための、方法、組成物、システム、およびキットが提供される。この技術は、次世代のヒト細胞療法の確立、改変、製造、および展開に広範に変革をもたらす。
【０００３】
改変された（合成／人工の）遺伝子の（遺伝子）回路は、一般に、例えば、エクスビボ分化および細胞治療薬の製造に有用である。細胞機能の動的制御を可能にする改変された遺伝子回路（異種遺伝子回路）を有する細胞を、多くの異なる病態を治療／予防するための治療法として患者に使用してもよい。しかしながら、所望の細胞タイプが作製されて、これが患者に展開されたのちに、改変された回路が、治療的適用に必要ではないことがあり得、さらには悪影響さえ及ぼす可能性もある。これらの遺伝子回路（例えば、異種DNAカセット）が患者に展開された後にこれらを効果的に除去できることが、患者の安全にとって有益である。例えば、遺伝子回路を通して幹細胞から膵臓ベータ島細胞への分化を増強することができるが3、ベータ膵島細胞が患者に導入された後、その遺伝子回路を除去することで、制御および安全性の懸念が軽減されるであろう。本明細書において提供される通りの多層プラットフォーム（いくつかの態様において、数種の遺伝子の切除技術および／または分解技術を組み合わせる）は、異種核酸（例えば、DNA）の効率的な除去（「消去」）のために改変される。したがって、本開示の改変された遺伝子構築物は「遺伝子イレーサー」と称しうる。
【０００４】
本開示の局面は、(a)関心対象の第一の生成物（例えば、リコンビナーゼまたはヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列と、(b)関心対象の第二の生成物（例えば、治療用分子）および逆選択マーカー（例えば、プロドラッグ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、関心対象の第一の生成物の発現または活性が活性化可能であり、かつ、関心対象の第一の生成物がカセットの切除または分解を調節する、発現カセット（カセット）を含む改変された遺伝子構築物（遺伝子イレーサー）を提供する。いくつかの態様において、成分(a)は、成分(b)から上流にある。
【０００５】
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物（遺伝子イレーサー）は、(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と、(b)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と、(b)関心対象の生成物（例えば、治療用分子）および逆選択マーカー（例えば、プロドラッグ）をコードするヌクレオチド配列とを含み、リコンビナーゼおよびヌクレアーゼが活性化可能であり、かつ、カセットの切除および／または分解を調節する、発現カセット（カセット）を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物（遺伝子イレーサー）は、(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含む、カセットであって、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、カセットを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物（遺伝子イレーサー）は、(a)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含む、カセットであって、ヌクレアーゼ認識部位によって挟まれている、カセットを含む。
【０００８】
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物（遺伝子イレーサー）は、(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(c)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含む、カセットであって、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれており、かつ、同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、カセットを含む。
【０００９】
本開示のいくつかの局面は、本明細書に記載の通りの改変された遺伝子構築物のいずれか1つの細胞に導入する工程を含む方法であって、関心対象の生成物が細胞の分化、増殖、または表現型の維持を助ける、方法を提供する。
【００１０】
本開示の他の局面は、本明細書に記載の通りの改変された遺伝子構築物のいずれか1つの細胞に導入する工程を含む方法であって、関心対象の生成物が治療用分子および／または予防用分子である、方法を提供する。
【００１１】
本開示はまた、本明細書に記載の通りの改変された遺伝子構築物のいずれかを含む、ベクター、細胞、組成物、およびキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】どのように複数の重複および直交リコンビナーゼタンパク質が利用されて、標的細胞から異種DNA構築物を切除するかの一例を示す。これらのリコンビナーゼは、誘導性転写、分割されたタンパク質活性の再構成、またはタンパク質のヌクレアーゼへの移動を通して制御される。
【図２Ａ】どのようにヌクレアーゼが使用されて、破壊するDNAをターゲティングし、ヌクレアーゼ標的部位（NTS）間に位置する大きなDNA断片を切除するかの一例を示す。これらのヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、CRISPR-Casヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALEヌクレアーゼを含むことができる。ヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断は、ターゲティングされたタンパク質コード配列を不活化するか、または大きな削除を触媒する、組換えを生じ得、これはドナーDNAの存在を通してさらに増強され得る。
【図２Ｂ】どのようにヌクレアーゼが使用されて、組換えの誘発のためにDNAをターゲティングし、ヌクレアーゼ標的部位（NTS）間に位置する大きなDNA断片を切除するかの一例を示す。これらのヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、CRISPR-Casヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、およびTALEヌクレアーゼを含むことができる。ヌクレアーゼによって誘導される二本鎖切断は、ターゲティングされたタンパク質コード配列を不活化するか、または大きな削除を触媒する、組換えを生じ得、これはドナーDNAの存在を通してさらに増強され得る。
【図３】異種DNA構築物内にコードされた逆選択マーカー（CSM）の一例であって、それによって、リコンビナーゼに基づくアプローチまたはヌクレアーゼに基づくアプローチによる効率的なDNA切除を受けない細胞が、毒性薬物へ変換されるプロドラッグの添加によって殺傷される一例を示す。加えて、毒素を発現する低分子誘導因子または分割毒素を二量体化する低分子誘導因子を添加することによって、細胞死を誘発する誘導性殺傷スイッチがコードされる。これらのCSMは、遺伝子イレーサーと組み合わせて利用されて、異種DNA削除の効率を増強する。
【図４】安定した組み込みのためのリコンビナーゼに基づく切除構築物の一例を示す。このモジュラー構築物は、ベクターを異なる制限酵素の組み合わせで単に消化することによる遺伝子部分の容易な交換を可能にする。
【図５】リコンビナーゼ切除効率をアッセイするためのシステムの一例を示す。レポーターベクターは、逆選択マーカー（例えば、HSVチミジンキナーゼ）を挟んだ組換え配列をコードする。DNAアセンブリを多工程アプローチ（例えば、制限酵素クローニング、Gibsonアセンブリ、およびGolden Gateアセンブリを含む）で実施してもよい。リコンビナーゼベクターは、リコンビナーゼ（例えば、Bxb1）をコードする。
【図６】種々のチロシンリコンビナーゼのリコンビナーゼ活性を試験する一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイからのデータを示す。293FT細胞を、等しい比率のレポータープラスミド、リコンビナーゼプラスミド、およびトランスフェクションマーカープラスミド（例えば、BFPをコードするプラスミド）で一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光についてアッセイし、BFP発現についてゲーティングした。上のグラフはGFP+細胞の％を表し、下のグラフはGFP+細胞のGFP平均蛍光強度の中央値を表す。バーの各群は、左から右へ、レポーター、リコンビナーゼ、およびレポーター＋リコンビナーゼについてのデータを示す。
【図７】種々のチロシンリコンビナーゼのリコンビナーゼ活性を試験する一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイからのデータを示す。293FT細胞を、等しい比率のレポータープラスミド、リコンビナーゼプラスミド、およびトランスフェクションマーカープラスミド（例えば、BFPをコードするプラスミド）で一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光についてアッセイし、BFP発現についてゲーティングした。ヒストグラムは、リコンビナーゼありおよびなしの両方のトランスフェクト細胞集団を表す。
【図８】リコンビナーゼ切除効率をアッセイするために使用されるシステムの一例を示す。BpiI(x2)-HSVtk-SV40pA-EGFP-Esp3I(x2)カセットを、pcDNA3.1(+)哺乳動物発現ベクター（Life Tech）に挿入した。組換え配列を、Golden Gate消化／ライゲーションを介してBpiIおよびEsp3I部位に挿入した。
【図９】種々のセリンインテグラーゼのリコンビナーゼ活性を試験する一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイからのデータを示す。293FT細胞を、等しい比率のレポータープラスミド、リコンビナーゼプラスミド、およびトランスフェクションマーカープラスミド（例えば、BFPをコードするプラスミド）で一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光についてアッセイし、BFP発現についてゲーティングした。上のグラフはGFP+細胞の％を表し、下のグラフはGFP+細胞のGFP平均蛍光強度の中央値を表す。バーの各群は、左から右へ、レポーター、リコンビナーゼ、およびレポーター＋リコンビナーゼについてのデータを示す。
【図１０】種々のセリンインテグラーゼの発現を試験する一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイからのデータを示す。293FT細胞を、等しい比率のレポータープラスミド、リコンビナーゼプラスミド、およびトランスフェクションマーカープラスミド（例えば、BFPをコードするプラスミド）で一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光についてアッセイし、BFP発現についてゲーティングした。ヒストグラムは、リコンビナーゼありおよびなしの両方のトランスフェクト細胞集団を表す。
【図１１】部位特異的組み込みのためのリコンビナーゼに基づく切除構築物の一例を示す。リコンビナーゼに基づく切除構築物をコードするエントリーベクターを、YFPおよびハイグロマイシンを発現する事前改変された293FTランディングパッド細胞株に組み込む。組み込みが成功すると、ピューロマイシンが発現する。
【図１２】GFPレポーターの293FTランディングパッド細胞株への組み込みの成功を示す。組み込みによって、細胞は、GFPを発現すると同時にYFPの発現を喪失する。ピューロマイシンによる選択圧は、組み込まれていない細胞を除去する。
【図１３】ゲノムに組み込まれた構築物を切除するための方法の一例を示す。リコンビナーゼに基づく切除構築物をコードするエントリーベクターを、事前改変された293FTランディングパッド細胞株に組み込む。組み込まれた細胞株を、リコンビナーゼ発現プラスミドおよびレポータープラスミド（例えば、BFPを発現する）で一過性にトランスフェクトし、GFP発現を経時的にアッセイする。逆選択マーカー（CSM）を使用して、組み込まれた構築物を保持する細胞を殺滅する。
【図１４】図13に記載の実験法を使用して得られた実験データを示す。3つの異なるリコンビナーゼに基づく切除構築物を発現する細胞株を、同族リコンビナーゼで一過性にトランスフェクトして、GFP発現を経時的にアッセイした。GFP+細胞の％を、BFP発現についてのゲーティングなしまたはゲーティングありのいずれか一方の細胞集団に対してプロットした。バーの各群は、左から右へ、2日目、4日目、および7日目についてのデータを示す。
【図１５】図13に記載の実験法を使用して得られた実験データを示す。図14のB3リコンビナーゼの一過性トランスフェクション後に、プロドラッグを適用して、pENTR_B3RT切除構築物を保持した細胞を殺滅した。逆選択マーカー（CSM）は、プロドラッグを毒性薬物へと変換する。この場合、CSMはHSVtkであり、かつ、プロドラッグはガンシクロビル（GCV）であった。細胞を、0.5、1、2、および5μMのGCVで7日間処理して、GFP発現を経時的にアッセイした。ヒストグラムは、GFP-細胞の％およびGFP+細胞の％を表す。
【図１６】図13に記載の実験法を使用して得られた実験データを示す。図14のFlpリコンビナーゼの一過性トランスフェクション後に、プロドラッグを適用して、pENTR_FRT切除構築物を保持した細胞を殺滅した。逆選択マーカー（CSM）は、プロドラッグを毒性薬物へと変換する。この場合、CSMはHSVtkであり、かつ、プロドラッグはガンシクロビル（GCV）であった。細胞を、0.5、1、2、および5μMのGCVで7日間処理して、GFP発現を経時的にアッセイした。ヒストグラムは、GFP-細胞の％およびGFP+細胞の％を表す。
【図１７】ゲノムに組み込まれた回路をガイドRNA（gRNA）が切断および除去するシステムの一例を示す。この図において、gRNAは、YFPレポーターが細胞に安定に組み込まれている場合、5’-UTRおよび3’-UTRをターゲティングする。
【図１８】CRISPR/Cas9を使用してゲノムに組み込まれた回路の除去を試験する一過性トランスフェクションアッセイからのデータを示す。単一のgRNAおよびCas9をコードするベクターを、レポータープラスミド（例えば、BFPを発現する）と一緒に、YFPを発現する細胞株に共トランスフェクトした。いくつかの場合では、異なるgRNAをコードする2つのベクターをレポータープラスミドと一緒にトランスフェクトした。細胞集団をBFP発現についてゲーティングして、YFP+細胞の％を経時的にプロットした。gRNAの異なる組み合わせを使用してYFPを除去してもよい。ヒストグラムは、YFP-細胞の％およびYFP+細胞の％を表す。バーの各群は、左から右へ、2日目、5日目、および7日目についてのデータを示す。
【図１９】図13に記載の実験法を使用して得られた実験データを示す。pENTR_B3RT_FRTリコンビナーゼに基づく切除構築物を発現する細胞株を、B3またはFlpで表示の時系列に従って逐次的にトランスフェクトした。GFP発現を経時的にアッセイし、ヒストグラムは、15日目のGFP+細胞の％を表す。pENTR_B3RT_FRTリコンビナーゼに基づく切除構築物は、構築物B3RT_FRT_iCasp9_SV40pA_FRT_B3RT_EGFP_BGHpAをコードし、その中で、B3RTおよびFRTはそれぞれB3およびFlpに対する組換え配列であり、iCasp9は逆選択マーカー（CSM）である。
【図２０】図13に記載の実験法を使用して得られた実験データを示す。pENTR_B3RT_FRTリコンビナーゼに基づく切除構築物を発現する細胞株を、表示の時系列に従ってB3またはFlpで逐次的にトランスフェクトした。GFP発現を経時的にアッセイして、15日目のGFP+細胞の％をプロットした。バーは、左から右へ、リコンビナーゼなし；B3；B3、Flp；Flp；およびFlp、B3についてのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本明細書に、改変された細胞から異種核酸を高い効率で除去することに部分的によって、次世代の細胞療法を可能にする強力な技術を記載する。本明細書における改変された遺伝子構築物を「遺伝子イレーサー」と称する場合がある。本明細書に記載の遺伝子消去技術は、少なくとも2つの主要な用途に有用である。第一に、これらは、患者へ導入される前に除去することができる、エクスビボの細胞の分化、増殖、または表現型の維持を助ける遺伝子回路を作製するのに有用である。第二に、これらは、改変された細胞から異種DNAを除去することによって、細胞療法がインビボ送達された後に誘発できる安全スイッチとして使用され、そのため、細胞療法がそれらの機能を喪失する。
【００１４】
したがって、いくつかの局面において、これらの遺伝子イレーサーは、エクスビボでの分化、増殖、または特定の表現型の持続を増強する遺伝子回路の実行と、それに続く、体内への導入前の遺伝子回路の除去を可能にする。細胞表現型を調節するための既存の戦略は、低分子、成長因子、RNA構築物、またはDNA回路の使用を含む。低分子は、分化を増強するのに有用であり得るが、そのような化学物質を発見することは、内在性の細胞調節の複雑さを考慮すれば面倒で困難である可能性がある。細胞をエクスビボでプログラミングすることに成長因子が使用されて成功しているが、その因子は、多くの潜在的な組み合わせを考慮すれば、発見、スケール変更、および応用するには高価である可能性がある。転写因子および細胞機能の他の細胞内調節因子をコードするRNA構築物が、細胞プログラミングに利用されているが、これは、プログラム可能なRNA調節因子の欠如が原因で、効率改善に必要である細胞プログラムへの複雑な動力学のコード化に使用されていない（とはいえ、これは、近年の進歩に伴って変化し始めている(25)）。上に考察したような、iPS細胞に由来する前駆細胞からベータ膵島様細胞への分化(3)などの複雑な転写プログラムをプログラミングするために、DNA回路が使用されている。これらの回路を使用して、転写因子およびマイクロRNAなどの細胞内調節因子を発現すること、ならびに、成長因子およびサイトカインなどの傍分泌因子を分泌させることができ、ひいては、スケールを増加させ、かつ、エクスビボの細胞プログラミングのコストを削減する潜在性を有する。患者への導入の前のそのような回路の除去は、安全性および規制負担に対する懸念を軽減するであろう。
【００１５】
本開示の遺伝子イレーサーは、いくつかの態様において、異種活性なしで細胞をベースライン状態に回復させることができ、かつ、外来DNAの痕跡をほとんど残さずゲノムをベースライン状態に回復させることができる（リコンビナーゼは、限りなく小さな作用を有する小さなDNA痕を残す可能性がある）、顕著なレベルの遺伝子の消去（削除／分解）を達成する複数の機序を組み込む。遺伝子イレーサーの複数の重複した層を使用することは、大幅に改善された遺伝子の削除効率を可能にし、かつ、この技術の臨床適用を可能にする（臨床等級の活性を達成する）のに重要である。
【００１６】
本明細書に記載の種々のアプローチについて、異種DNAを除去する効率または異種DNAを含有する細胞を殺傷する効率が測定される。前者では、蛍光またはqPCRベースのアッセイが使用される。後者では、生死アッセイを使用して細胞生存がモニタリングされる。これは、細胞株で試作化され、治療上関連する細胞タイプ（例えば、間葉幹細胞、T細胞、NK細胞）に拡張される。そのような技術は、効率的な細胞分化をプログラミングし、次いで、療法の前にこれらの回路を除去するのに有用である。そのような技術はまた、遺伝子改変細胞療法のインビボ適用のための、殺傷スイッチまたはOFFスイッチとしても有用である。
【００１７】
遺伝子イレーサーの重要な技術的課題は、遺伝子消去プロセスから逃れてしまう細胞の数を最小限に抑えることである。検査中のCAR T細胞の用量は、2×105〜2×107個のCD19 CAR T細胞/kgの範囲であるが、一方で、臨床で使用されている間葉幹細胞（MSC）は、1〜3×106個のMSC/kgの範囲である(27)。したがって、臨床で使用されている細胞療法の最大用量は、多くても細胞109個未満のようである。1用量当たり1未満の細胞が異種遺伝子材料を含有することを確実にするために、いくつかの態様において、109を超える効率を達成することができる遺伝子イレーサーが好ましいことを意味する。この厳しい効率を達成するため、複数の遺伝子消去機序を、本明細書において提供される通り、合わせて層状化することができる。遺伝子イレーサー成分の組み合わせは、増強された効率を導く。例えば、97％を超える切除効率が4つの異なるリコンビナーゼを用いて達成され、97％を超える殺傷効率が2つの逆選択マーカーを用いて達成される場合、遺伝子消去技術の適用後に約7.310個の細胞中わずか1個の細胞だけが残るであろう。いくつかの態様において、遺伝子回路をゲノムにコード化する代わりに、一定条件下で複製するプラスミドを使用することで、新たな動力学的調節因子を有する異種DNAまたはRNA回路を除去する効率が改善される(25)。
【００１８】
したがって、本明細書において、(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含み、カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、カセットを含む、改変された遺伝子構築物が提供される。リコンビナーゼは、カセットを自己切除するように機能し、逆選択マーカーは、切除事象後にカセットが残留している任意の細胞を殺滅するように機能する。いくつかの態様において、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターは、関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターから上流（から5’）にある。例えば、図1および3を参照のこと。
【００１９】
また、本明細書において、(a)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含み、カセットが同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、カセットを含む、改変された遺伝子構築物が提供される。ヌクレアーゼは、カセットおよび逆選択マーカーを切断／分解するように機能し、逆選択マーカーは、分解事象後にカセットが残留している任意の細胞を殺滅するように機能する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターは、関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターから上流（から5’）にある。例えば、図2および3を参照のこと。
【００２０】
上に考察した通り、本開示の技術は、多層化プラットフォームを含む。したがって、関心対象の生成物をコードする単一の遺伝子構築物が、複数（例えば、少なくとも2、3、4、または5つ）の異なるリコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、および／または逆選択マーカーをコードしてもよい。同様に、同じ遺伝子構築物は、異なるリコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼならびに関心対象の生成物をコードする核酸の高度に効率的な切除および／または分解を可能にする、複数対のリコンビナーゼ認識部位および／または複数のヌクレアーゼ認識部位を含んでもよい。
【００２１】
いくつかの態様において、単一の構築物は、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、および逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4または5つ）のリコンビナーゼ、少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4または5つ）のヌクレアーゼ、および少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4または5つ）の逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも1つのリコンビナーゼおよび少なくとも1つのヌクレアーゼをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも1つのリコンビナーゼおよび少なくとも1つの逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも1つのヌクレアーゼおよび少なくとも1つの逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも2つのリコンビナーゼおよび少なくとも1つのヌクレアーゼをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも2つのリコンビナーゼおよび少なくとも1つの逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも2つのヌクレアーゼおよび少なくとも1つのリコンビナーゼをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも2つのヌクレアーゼおよび少なくとも1つの逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも2つのリコンビナーゼ、少なくとも2つのヌクレアーゼおよび少なくとも1つの逆選択マーカーをコードする。いくつかの態様において、単一の構築物は、少なくとも2つのリコンビナーゼ、少なくとも2つのヌクレアーゼおよび少なくとも2つの逆選択マーカーをコードする。
【００２２】
したがって、いくつかの態様において、単一の構築物のカセットは、複数対の同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれていてよく、かつ／または、複数のヌクレアーゼ認識部位を含有してもよい。
【００２３】
さらに、一部の態様において、異なるリコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に各々連結された少なくとも2つの誘導性プロモーターを含み、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれておりかつ／または異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む、カセットを含む、改変された遺伝子構築物。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、異なるリコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼを各々コードする少なくとも2つのヌクレオチド配列に連結され、かつ、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれており、および／または、これら異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの態様において、構築物は、異なるリコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に各々連結された少なくとも3つの誘導性プロモーターを含み、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれており、かつ／または、これら異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの態様において、誘導性プロモーターは、異なるリコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼを各々コードする少なくとも3つのヌクレオチド配列に連結され、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれており、かつ／または、これら異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む。
【００２４】
上に考察した通り、遺伝子イレーサー成分の異なる組み合わせは、異種核酸の除去の増強された効率を導く。一連の切除、分解、および／または逆選択反応（発現カセットの各成分を発現するのに必要な全ての誘導物質および／または逆選択物質に細胞を曝露させることを含む）後に、いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物を当初受け入れた細胞の20％未満（例えば、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、または0％）が発現カセットを保持する。すなわち、細胞の80％超（例えば、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％）が、一連の切除、分解、および／または逆選択反応後に、発現カセットをもはや含有しない。いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物を当初受け入れた細胞の1〜20％、1〜15％、1〜10％、1〜5％、5〜20％、5〜15％、5〜10％、10〜20％、または15〜20％が、一連の切除、分解、および／または逆選択反応後に、発現カセットを保持する。いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物を当初受け入れた細胞の80〜100％、80〜95％、80〜90％、80〜85％、85〜100％、85〜95％、85〜90％、90〜100％、または95〜100％が、一連の切除、分解、および／または逆選択反応後に、発現カセットをもはや含有しない。
【００２５】
したがって、いくつかの態様において、本開示の方法は、本明細書において提供される通りの改変された遺伝子構築物を細胞の集団に導入する工程、細胞を培養して関心対象の生成物を生産する工程、細胞を少なくとも1つの（1つまたは複数の）誘導作用物質の存在下で培養して、リコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼを発現させ、改変された遺伝子構築物からカセットを切除および／または分解する工程、集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養して、逆選択マーカーを依然として保持および発現する細胞を殺傷する工程を含んでよい。誘導作用物質は、同族誘導性プロモーターを活性化する（その活性は、誘導因子の存在下で活性化される）任意の作用物質である。逆選択物質は、逆選択マーカー（細胞に対して毒性である、例えば、逆選択物質の存在下で毒性物質に変換される）を発現／含有する細胞を殺傷する任意の作用物質である。
【００２６】
リコンビナーゼに基づく切除
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物は、(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含み、カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、発現カセット（カセット)を含む。いくつかの態様において、成分(a)は、成分(b)から上流にある。いくつかの態様において、ターミネーター配列が、成分(a)と成分(b)との間に位置する。例えば、図1を参照のこと。
【００２７】
いくつかの態様において、成分(a)は、異なるリコンビナーゼに各々連結された少なくとも2つ（または少なくとも3つ）の誘導性プロモーターを含み、カセットは、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている。いくつかの態様において、成分(a)のヌクレオチド配列は、少なくとも2つ（または少なくとも3つ）の異なるリコンビナーゼをコードし、カセットは、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている。いくつかの態様において、成分(b)のヌクレオチド配列は、少なくとも2つ（または少なくとも3つ）の逆選択マーカーをコードする。
【００２８】
いくつかの態様において、リコンビナーゼは、チロシンリコンビナーゼおよびチロシンインテグラーゼから選択される。例えば、リコンビナーゼは、Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、およびHP1リコンビナーゼから選択されてよい。いくつかの態様において、リコンビナーゼは、セリンリコンビナーゼまたはセリンインテグラーゼから選択される。例えば、リコンビナーゼは、γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、およびR4リコンビナーゼから選択されてよい。
【００２９】
リコンビナーゼは、短いDNA配列（典型的には、約30塩基対(bp)〜40bpの間）を認識する部位特異的酵素であり、これらのリコンビナーゼ認識配列間の組換えを媒介し、リコンビナーゼ認識配列間のDNA断片の切除、組み込み、反転、または交換をもたらす。
【００３０】
リコンビナーゼを、別個の生化学的特性に基づいて、2つの別個のファミリー、セリンリコンビナーゼ（例えば、リゾルバーゼおよびインベルターゼ）およびチロシンリコンビナーゼ（例えば、インテグラーゼ）、に分類することができる。セリンリコンビナーゼおよびチロシンリコンビナーゼは、双方向リコンビナーゼおよび一方向リコンビナーゼにさらに分けられる。双方向セリンリコンビナーゼの例は、非限定的に、β-six、CinH、ParA、およびγδを含み、一方向セリンリコンビナーゼの例は、非限定的に、Bxb1、φC31、TP901、TG1、φBT1、R4、φRV1、φFC1、MR11、A118、U153、およびgp29を含む。双方向チロシンリコンビナーゼの例は、非限定的に、Cre、FLP、およびRを含み、一方向チロシンリコンビナーゼは、非限定的に、Lambda、HK101、HK022、およびpSAM2を含む。セリンリコンビナーゼおよびチロシンリコンビナーゼの名称は、当該リコンビナーゼがDNAに対して使用し、鎖交換の間にDNAに共有結合されるようになる、保存された求核性アミノ酸残基に由来する。リコンビナーゼは、遺伝子ノックアウトの作製およびソーティング問題の解決を含めた多数の標準的な生物学的用途に使用されている。
【００３１】
組換えの結果は、組換えられる2つの短い反復DNA配列（典型的には、30bp長未満）の位置および配向に部分的に依存する。リコンビナーゼは、各リコンビナーゼに特異的でありかつ本明細書においてリコンビナーゼ認識配列またはリコンビナーゼ認識部位と称される、これらの反復配列に結合する。したがって、本明細書において使用されるように、リコンビナーゼは、反復DNA配列間の反転または切除を媒介することができるときに、リコンビナーゼ認識部位に特異的である。本明細書において使用されるように、リコンビナーゼはまた、介在する遺伝子エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、または出力核酸配列）を挟むその同族リコンビナーゼ認識部位を認識すると言うこともできる。核酸または核酸の断片は、該エレメントが2つの反復DNA配列間に位置しかつ直接隣接しているとき、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれていると言う。いくつかの態様において、リコンビナーゼ認識部位は、互いに重なり合わない。しかしながら、他の態様において、リコンビナーゼ認識部位は、互いに重なり合い、これは、組み合わせの複雑さの大幅な増加を可能にする。
【００３２】
反転組換えは、2つの短い反転した反復DNA配列間で起こる。DNA屈曲タンパク質によって支援されるDNAループの形成が、2つの反復配列を合わせ、この時点で、DNA切断およびライゲーションが発生する。この反応は、ATP非依存性であり、超らせんDNAを必要とする。そのような反転組換え事象の最終結果は、反復部位間のDNA区間が反転して（すなわち、そのDNA区間が配向を反転させて）、コード鎖であったものが非コード鎖になる（逆もまた同様）ことである。そのような反応において、DNAは、DNAの正味の増加も損失もなく保存される。
【００３３】
これに対して、組み込み（切除）組換えは、同一方向に配向された2つの短い反復DNA配列間で発生する。この場合、介在DNAは、切除／除去される。
【００３４】
リコンビナーゼはまた、不可逆的であるか可逆的であるかで分類することもできる。不可逆的リコンビナーゼは、2つの相補的組換え部位間の組換えを触媒できるが、追加の因子の支援なしにはこの組換えによって形成されるハイブリッド部位間の組換えを触媒できないリコンビナーゼである。したがって、不可逆的認識部位は、不可逆的リコンビナーゼのための2つのDNA認識配列の1番目として機能することができかつその部位での組換え後にハイブリッド認識部位へと修飾される、リコンビナーゼ認識部位を指す。相補的な不可逆的認識部位は、不可逆的リコンビナーゼのための2つのDNA認識配列の2番目として機能することができかつその部位での相同組換え後にハイブリッド認識部位へと修飾される、リコンビナーゼ認識部位を指す。例えば、attBおよびattPは、Bxb1リコンビナーゼおよびphiC31リコンビナーゼのための不可逆的組換え部位であり、attBは、attPの相補的な不可逆的組換え部位である（逆もまた同様）。AttB/attP部位は、互いに相互作用するだけで他の変異体とは作用しない直交B/P対を作製するように変異され得る。これによって、単一のリコンビナーゼが、複数の直交B/P対の切除または組み込みまたは反転を制御することが可能となる。
【００３５】
phiC31（φC31）インテグラーゼは、例えば、真核細胞には見いだされない追加の因子の非存在下で、attB×attP反応のみを触媒する。リコンビナーゼは、attBとattPとの間の組換えによって形成されるattLおよびattRハイブリッド組換え部位間の組換えを媒介することができない。phiC31インテグラーゼなどのリコンビナーゼは、単独では逆反応を触媒できないので、phiC31 attB×attP組換えは安定である。
【００３６】
不可逆的リコンビナーゼや、不可逆的リコンビナーゼをコードする核酸は、当技術分野において記載されており、日常的な方法を使用して得ることができる。不可逆的リコンビナーゼの例は、非限定的に、phiC31（φC31）リコンビナーゼ（SEQ ID NO:11）、大腸菌ファージP4リコンビナーゼ、大腸菌ファージラムダインテグラーゼ、リステリアA118ファージリコンビナーゼ、およびアクチノファージR4 Sreリコンビナーゼ、HK101、HK022、pSAM2、Bxb1、TP901、TG1、φBT1、φRV1、φFC1、MR11、U153、およびgp29を含む。
【００３７】
これに対して、可逆的リコンビナーゼは、2つの相補的なリコンビナーゼ認識部位間の組換えを触媒することができ、かつ追加の因子の支援なしでも最初の組換え事象によって形成される部位間の組換えを触媒して、これを反転させることができる、リコンビナーゼである。組換えによって生成された生成物部位はそれ自体、後続の組換えのための基質である。可逆的リコンビナーゼシステムの例は、非限定的に、Cre-loxおよびFlp-frt系、R、β-six、CinH、ParA、およびγδを含む。
【００３８】
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物は、チロシンリコンビナーゼまたはチロシンインテグラーゼから選択されるリコンビナーゼをコードする。いくつかの態様において、リコンビナーゼは、Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、およびHP1リコンビナーゼから選択される。いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物は、セリンリコンビナーゼまたはセリンインテグラーゼから選択されるリコンビナーゼをコードする。いくつかの態様において、リコンビナーゼは、γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、およびR4リコンビナーゼから選択される。
【００３９】
本明細書において提供されるリコンビナーゼは、本開示の態様において使用することができるリコンビナーゼの唯一の例であることを意味しない。本開示の遺伝子イレーサーの複雑性は、新しい直交リコンビナーゼのデータベースをマイニングすること、または、定義されたDNA特異性を有する合成リコンビナーゼを設計することによって、拡張することができる。有用であるリコンビナーゼの他の例は、当業者に公知であり、発見または生成されるあらゆる新しいリコンビナーゼを本開示の異なる態様において使用することができると期待される。
【００４０】
さらに、リコンビナーゼ発現および／または活性化の制御を、例えば、ABAシステム（Liang, F.S., et al. Sci. Signal., 2011, 4, rs2 LP-rs2）、GIBシステム（Miyamota, T. et al. Nat Chem Biol, 2012, 8, 465-470）、FKBP-FRBに基づく二量体化システム（Komatsu, T. et al. Nat Meth, 2010, 7, 206-208）、タモキシフェンシステム（Matsuda, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104, 1027-1032）、DD（FKBP）システム（Banaszynski, L.A. et al. Cell, 2006, 126, 995-1004）、DD（DHFR）システム（Iwamoto, M. et al. Chem. Biol., 2010, 17, 981-988）、SMAshシステム（Chung, H.K. et al. Nature Chemical Biology, 11: 713-720, 2015）を使用する、または青色光誘導二量体化（Guntas, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 2015, 112, 112-117、その各々は、参照によって本明細書に組み入れられる）を介した、多くの異なる方法で達成できる。
【００４１】
いくつかの態様において、(a)少なくとも1つのリガンド依存性キメラリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と、(b)関心対象の生成物および逆選択分子をコードするヌクレオチド配列とを含み、カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、カセットを含む、改変された遺伝子構築物。
【００４２】
いくつかの態様において、(a)リコンビナーゼの第一の断片をコードするヌクレオチド配列と、(b)リコンビナーゼの第二の断片をコードするヌクレオチド配列（第一の断片および第二の断片は、組み合わせられた（二量体化した）ときに、完全長の機能的リコンビナーゼを形成する）（例えば、Miyamoto, T. et al. Nature Chemical Biology 8:465-470, 2012を参照のこと、参照によって本明細書に組み入れられる）と、(c)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列とを含み、カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、カセットを含む、改変された遺伝子構築物。
【００４３】
ヌクレアーゼに基づく切除／分解
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物は、(a)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、(b)関心対象の生成物および逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターとを含み、同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、発現カセット（カセット）を含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ認識部位は、カセットを挟んでいる。いくつかの態様において、成分(a)は、成分(b)から上流にある。いくつかの態様において、ターミネーター配列が、成分(a)と成分(b)との間に位置する。例えば、図2を参照のこと。
【００４４】
いくつかの態様において、成分(a)は、異なるヌクレアーゼに各々連結された少なくとも2つの誘導性プロモーターを含み、カセットは、これら異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの態様において、成分(a)のヌクレオチド配列は、少なくとも2つの異なるヌクレアーゼをコードし、カセットはこれら異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位を含む。いくつかの態様において、成分(b)のヌクレオチド配列は、少なくとも2つの逆選択マーカーをコードする。
【００４５】
いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼおよびRNAガイドヌクレアーゼから選択される。例えば、ヌクレアーゼは、イントロンエンドヌクレアーゼおよびインテインエンドヌクレアーゼから選択されるメガヌクレアーゼであってもよい。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼおよびCpf1ヌクレアーゼから選択されるRNAガイドヌクレアーゼである。したがって、カセットは、ヌクレアーゼ認識部位に相補的なガイドRNA（gRNA）をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。
【００４６】
ヌクレアーゼは、核酸の単量体間のホスホジエステル結合を切断する酵素である。制限エンドヌクレアーゼなどの多くのヌクレアーゼは、DNAをその分子に沿った特定の部位で切断する。ヌクレアーゼが切断するこれらの部位は、ヌクレアーゼ認識部位と称される。メガヌクレアーゼ、RNAガイドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼなどの制限ヌクレアーゼを含め、本開示に従って使用してもよい多くの異なる種類のヌクレアーゼがある。
【００４７】
メガヌクレアーゼ（例えば、I-SceI、I-CreI、I-DmoI、E-Drel、およびDmoCre）は、長い認識部位（例えば、12〜40塩基対の二本鎖DNA配列）を有するエンドデオキシリボヌクレアーゼである。したがって、この部位は、一般に、任意の所与のゲノムにおいて一度だけ生じる。当技術分野において公知の数百のメガヌクレアーゼがある。メガヌクレアーゼは主に、ホーミングエンドヌクレアーゼとしてまとめて知られる2つの主な酵素ファミリー、イントロンエンドヌクレアーゼおよびインテインエンドヌクレアーゼ、によって代表される。いくつかの態様において、メガヌクレアーゼは、LAGLIDADGファミリーエンドヌクレアーゼである。このファミリーの名称は、このファミリーのタンパク質の全てにおいて見いだされる（一般に保存されている）アミノ酸配列（またはモチーフ）に対応する。
【００４８】
RNAガイドヌクレアーゼは、標的部位に相補的な配列を含むガイドRNA（gRNA）鎖と会合することによって、それらの標的部位へ選択的に導かれるエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、RNAガイドヌクレアーゼは、クラスター化した規則的に配置された短い回文配列リピート（CRISPR）-CRISPR関連（Cas）システムのメンバーである。いくつかの態様において、RNAガイドヌクレアーゼは、II型CRISPR-Casシステムのメンバーである。CRISPR-Casシステムは、ウイルスおよび他の外来核酸に対する防御を媒介するために種々の細菌および古細菌によって使用される。スペーサーと呼ばれる外来DNAの短いセグメントは、CRISPRリピート間のゲノムに組み込まれ、過去の曝露の「メモリ」として役立つ。CRISPRスペーサーは、次いで、外因性の遺伝子エレメントを真核生物におけるRNAiと同様の手法で認識および発現停止するように使用される。II型CRISPR-Casシステムを、インビトロのターゲティングされた二本鎖DNA破壊を特定の配列に指向するよう改変することができる。RNAガイドヌクレアーゼ（RGN）は、典型的には、標的DNA配列との塩基対合に関与する5’端で20の可変ヌクレオチドを含有する、短い約100ヌクレオチドの単一ガイドRNA（gRNA）と、標的DNAを切断するCas9ヌクレアーゼとの、2つの成分を含む（Jinek, M., et al. Science 337, 816-821 (2012)）。
【００４９】
CRISPR-Casの特異性は、成熟ガイドRNA（gRNA）へと転写およびプロセシングされる、CRISPR遺伝子座中にコードされる直接リピートによって挟まれたスペーサー配列の同一性によって決まる（Jinek、M. et al. (2012)）。トランス活性化低分子RNA（tracrRNA）の助けによって、gRNAは、Cas9エンドヌクレアーゼに、標的DNA配列（プロトスペーサー）中に二本鎖破壊を導入させる（Jinek, M. et al. (2012); Bikard, D., et al. (2012)）。したがって、CRISPR遺伝子座中のスペーサーの簡単な修飾を通して、RNAガイドヌクレアーゼは、NGGモチーフをプロトスペーサーのすぐ3’側にする設計制限だけで、ほとんど全てのDNA配列の切断を指令することができる（Jinek, M. et al. (2012)）。
【００５０】
本明細書において使用し得るRNAガイドヌクレアーゼの非限定例は、Cas9およびCpf1を含む。
【００５１】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を含んでいる他のプログラム可能なヌクレアーゼ（およびシステム）を、本明細書において使用してもよい。
【００５２】
逆選択マーカー
いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物は、逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。逆選択マーカーは、それを内部に持つ細胞の死を促進する分子である（例えば、Reyrat, J. et al., Infect Immun. 66(9): 4011-4017, 1998を参照のこと）。逆選択マーカーを含む改変された遺伝子構築物を組み込んだ細胞は、例えば、逆選択化合物の存在下で排除される。したがって、逆選択マーカーを、本明細書において提供される通り、逆選択マーカーの喪失に導く切除／分解（消失）事象を受けている細胞の陽性選択に使用することができる。いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物のカセットは、（少なくとも1つの）逆選択マーカーを含み、したがって、逆選択マーカーは、同族リコンビナーゼ認識部位間に位置してよく、かつ／または、ヌクレアーゼ認識部位を含んでよい。いくつかの態様において、逆選択マーカーは、関心対象の生成物をコードする核酸から下流にある。いくつかの態様において、関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターもまた、逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている。
【００５３】
いくつかの態様において、逆選択マーカーは、プロドラッグである。プロドラッグは、投与後に薬理学的に活性な薬物へと代謝される医薬または化合物である。いくつかの態様において、逆選択マーカーは、シトシンデアミナーゼである。シトシンデアミナーゼは、5-フルオロシトシン（5-FC）を5-フルオロウラシル（5-FU）へと変換し、これが細胞毒性をもたらすことができる。いくつかの態様において、逆選択マーカーは、チミジンキナーゼ（例えば、HSVチミジンキナーゼ）である。HSVチミジンキナーゼ（HSV-tk）は、ガンシクロビルを毒性産物へと変換し、これを使用して細胞殺傷を誘発することができる。他の逆選択マーカー（例えば、殺傷スイッチ）は、公知であり、本明細書において提供される通り使用してよい。
【００５４】
例えば、以下に記載されているものを含め、他の逆選択マーカーが本開示に包含される：Deans, T.L. et al. Cell 130, 363-372, 2007; Ramos, C. A et al. Stem Cells, 28(6): 1107-1115, 2010; およびChung, H.K. et al. Nature Chemical Biology, 11: 713-720（その各々は、参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００５５】
改変された核酸
改変された核酸（例えば、改変された遺伝子構築物）は、自然界に存在しない核酸である。しかしながら、改変された核酸が総じて天然に存在しない一方で、それは、自然界に存在するヌクレオチド配列を含んでよいことが理解されるべきである。いくつかの態様において、改変された核酸は、異なる生物由来の（例えば、異なる種由来の）ヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの態様において、改変された核酸は、ネズミ科のヌクレオチド配列、細菌のヌクレオチド配列、ヒトのヌクレオチド配列、および／またはウイルスのヌクレオチド配列を含む。用語「改変された核酸」は、組換え核酸および合成核酸を含む。「組換え核酸」は、核酸分子を合わせることによって構築された分子を指し、いくつかの態様においては、生細胞において複製できる分子を指す。「合成核酸」は、増幅された分子、または、化学的にもしくは他の手段によって合成された分子を指す。合成核酸は、化学的に修飾されているかまたはその他の方法で修飾されているが、天然に存在する核酸分子と塩基対合できるものを含む。組換え核酸および合成核酸はまた、前述のいずれかの複製から生じる分子も含む。本開示の改変された核酸は、単一分子（例えば、同じプラスミドまたは他のベクターに含まれる）によって、または複数の異なる分子（例えば、複数の異なる、独立して複製する分子）によってコードされてよい。
【００５６】
本開示の改変された核酸は、標準的な分子生物学の方法を使用して生産されてよい（例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2012, Cold Spring Harbor Pressを参照のこと）。いくつかの態様において、改変された核酸構築物は、GIBSON ASSEMBLY（登録商標）クローニングを使用して生産される（例えば、Gibson, D.G. et al. Nature Methods, 343-345, 2009; およびGibson, D.G. et al. Nature Methods, 901-903, 2010を参照のこと、その各々は、参照によって本明細書に組み入れられる）。GIBSON ASSEMBLY（登録商標）は、典型的には、単管反応において3つの酵素活性、5’エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼのY伸長活性、およびDNAリガーゼ活性を使用する。5’エキソヌクレアーゼ活性は、5’端配列をつなぎ合わせ、アニーリングのための相補的配列を露出させる。次いで、ポリメラーゼ活性が、アニールされた領域のギャップを埋める。次いで、DNAリガーゼが、ニックをふさぎ、DNA断片を互いに共有結合する。隣接した断片の重複配列は、Golden Gate Assemblyで使用されるものよりはるかに長く、それ故、正確なアセンブリの割合がより高くなる。いくつかの態様において、改変された核酸構築物は、IN-FUSION（登録商標）クローニング（Clontech）を使用して生産される。
【００５７】
プロモーターは、核酸配列の残部の転写の開始および速度がそれで制御される、核酸配列の制御領域を指す。プロモーターはまた、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る下位領域を含有してもよい。プロモーターは、構成的、誘導性、活性化可能、抑制性、組織特異的、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動するか、または転写を駆動する。本明細書において、プロモーターが、その配列の転写開始および／または発現を制御（「駆動」）するためにそれが調節する核酸配列に対して、正確な機能的位置および配向にある場合、プロモーターは機能的に連結されているとみなされる。
【００５８】
構成的プロモーターは、転写を継続的に活性化する、アップレギュレートされたプロモーターである。構成的プロモーターの非限定例は、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、伸長因子1-アルファ（EF1a）プロモーター、伸長因子（EFS）プロモーター、MNDプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する修飾されたMoMuLV LTRのU3領域を含有する合成プロモーター）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター、脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）プロモーター、シミアンウイルス40（SV40）プロモーター、およびユビキチンC（UbC）プロモーターを含む。
【００５９】
誘導性プロモーターは、シグナルが存在するとき、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されたときに、転写活性を調節する（例えば、開始または活性化する）ことを特徴とする、プロモーターである。シグナルは、内在性であってもよく、通常は外因性であるが、誘導性プロモーター由来の転写活性を調節する際に活性となるような様式で誘導性プロモーターに接触する、条件（例えば、光）、化合物（例えば、化学系または非化学系の化合物）またはタンパク質（例えば、サイトカイン）であってもよい。転写の活性化は、プロモーターに直接作用して転写を駆動するか、または、プロモーターが転写を駆動することを防止するリプレッサーを不活性化することによってプロモーターに間接的に作用することを含んでもよい。反対に、転写の脱活性化は、プロモーターに直接作用して転写を防止するか、または、その後プロモーターに作用するリプレッサーを活性化することによってプロモーターに間接的に作用することを含んでもよい。プロモーターは、シグナルの存在下でプロモーターからの転写が活性化、脱活性化、増加、または減少される場合に、そのシグナルに応答性であるとみなされる。
【００６０】
いくつかの態様において、ターミネーター配列は、リコンビナーゼおよび／またはヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を、関心対象の生成物をコードする下流ヌクレオチド配列から分離する。ターミネーター配列は、転写を停止させる核酸配列である。ターミネーターは、一方向性であっても二方向性であってもよい。それは、RNAポリメラーゼによるRNA転写物の特異的終結に関与するDNA配列からなる。ターミネーター配列は、上流プロモーターによる下流核酸配列の転写活性化を防止する。最も一般的に使用されているタイプのターミネーターは、順方向ターミネーターである。通常転写される核酸配列の下流に置かれたとき、順方向転写ターミネーターは、転写を中断させるであろう。いくつかの態様において、通常順方向鎖と逆方向鎖の両方で転写を終結させる双方向転写ターミネーターが提供される。
【００６１】
真核生物系において、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるための新しい転写物の部位特異的切断を可能にする、特定のDNA配列を含んでもよい。これは、特殊な内在性ポリメラーゼに、転写物の3’端に約200A残基（ポリA）の区間を付加するためのシグナルを送る。このポリAテールで修飾されたRNA分子は、より安定的であり、より効率的に翻訳される。したがって、真核生物を含むいくつかの態様において、ターミネーターは、RNAの切断のためのシグナルを含んでもよい。いくつかの態様において、ターミネーターシグナルは、メッセージのポリアデニル化を促進する。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、出力核酸レベルを増強することおよび／または核酸間のリードスルーを最小限に抑えることに役立つ場合がある。
【００６２】
また、本明細書において、本開示の改変された遺伝子構築物を含むベクターが提供される。いくつかの態様において、ベクターは、エピソームベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、および／またはキメラウイルスベクター）である。
【００６３】
関心対象の生成物
本開示の改変された遺伝子構築物によってコードされる生成物は、例えば、治療用分子および／または予防用分子であってよい。いくつかの態様において、関心対象の生成物は、タンパク質またはペプチド（例えば、治療用タンパク質またはペプチド）である。いくつかの態様において、関心対象の生成物は、核酸（例えば、治療用核酸）である。核酸の例は、RNA、DNA、またはRNAとDNAとの組み合わせを含む。いくつかの態様において、関心対象の生成物は、DNA（例えば、一本鎖DNAまたは二本鎖DNA）である。いくつかの態様において、関心対象の生成物は、RNAである。例えば、関心対象の生成物は、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAなどのRNA干渉（RNAi）分子から選択されてよい。
【００６４】
抗体、酵素、ホルモン、炎症性物質、抗炎症性物質、免疫調節物質、および抗癌物質など、治療用および／または予防用分子の例。
【００６５】
細胞
本開示は、いくつかの態様において、本明細書に記載の改変された遺伝子構築物および／または本明細書に記載の改変された遺伝子構築物を含有するベクターを含む細胞を提供する。
【００６６】
いくつかの態様において、細胞は、幹細胞である。例えば、幹細胞は、間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、または多能性幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞）であってもよい。「幹細胞」は、培養中に無期限に分裂して特殊化された細胞を生じる能力を有する細胞を指す。「多能性幹細胞」は、生物の全ての組織に分化できるが単独では完全な生物発生を持続できない幹細胞の一種を指す。「ヒト誘導多能性幹細胞」は、胚性幹細胞を決定付ける特性を維持するために重要な遺伝子および因子を強制的に発現させることによって胚性幹細胞様状態に再プログラミングされている体細胞（例えば、成熟細胞または成体細胞）を指す（例えば、Takahashi and Yamanaka, Cell 126 (4): 663-76, 2006を参照のこと、参照によって本明細書に組み入れられる）。ヒト誘導多能性幹細胞は、幹細胞マーカーを発現し、3つの胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）全てを特徴とする細胞を生成することができる。
【００６７】
いくつかの態様において、細胞は、免疫細胞である。本明細書において提供される通り使用し得る免疫細胞の非限定例は、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞を含む。T細胞の例は、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞（例えば、CD4+、FOXP3+、CD25+細胞）を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、T細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞（例えば、CD3-ゼータ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（scFv）の融合体）である。
【００６８】
本開示に従って使用し得る細胞株の追加の非限定例は、293-T、293-T、3T3、4T1、721、9L、A-549、A172、A20、A253、A2780、A2780ADR、A2780cis、A431、ALC、B16、B35、BCP-1、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C2C12、C3H-10T1/2、C6、C6/36、Cal-27、CGR8、CHO、CML T1、CMT、COR-L23、COR-L23/5010、COR-L23/CPR、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、E14Tg2a、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、Hepa1c1c7、High Five細胞、HL-60、HMEC、HT-29、HUVEC、J558L細胞、Jurkat、JY細胞、K562細胞、KCL22、KG1、Ku812、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1、2、3....48、MC-38、MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MDCK II、MG63、MONO-MAC 6、MOR/0.2R、MRC5、MTD-1A、MyEnd、NALM-1、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NW-145、OPCN/OPCT Peer、PNT-1A/PNT 2、PTK2、Raji、RBL細胞、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、S2、Saos-2細胞、Sf21、Sf9、SiHa、SKBR3、SKOV-3、T-47D、T2、T84、THP1、U373、U87、U937、VCaP、WM39、WT-49、X63、YAC-1、およびYAR細胞を含む。
【００６９】
組成物およびキット
また、本明細書において、本開示の改変された遺伝子構築物の少なくとも1つ、本開示の改変された遺伝子構築物の少なくとも1つを含むベクター、または本開示の改変された遺伝子構築物の少なくとも1つを含む細胞を含む、組成物が提供される。
【００７０】
さらに、本明細書において、本開示の改変された遺伝子構築物の少なくとも1つまたは本開示の改変された遺伝子構築物の少なくとも1つを含む少なくとも1つのベクターを含む、キットが提供される。キットは、いくつかの態様において、発現カセットの誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質をさらに含む。いくつかの態様において、キットは、逆選択物質をさらに含む。
【００７１】
方法
本開示の局面は、少なくとも1つの改変された遺伝子構築物（例えば、(a)少なくとも1つのリコンビナーゼおよび／または少なくとも1つのヌクレアーゼと、(b)関心対象の生成物および少なくとも1つの逆選択マーカーとをコードする）を細胞の集団に導入する工程を含み、関心対象の生成物が細胞の分化、増殖、または表現型の維持（持続）を助ける（例えば、転写因子、成長因子など）、方法を提供する。いくつかの態様において、該方法は、集団の細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程をさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、集団の細胞を誘導作用物質の存在下で培養する工程、リコンビナーゼに機能的に連結されている誘導性プロモーターを活性化する工程、および改変された遺伝子構築物からカセットを切除する工程（および／または、細胞において異種核酸を切除する工程）をさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程および逆選択マーカーを発現する細胞を殺傷する工程をさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、集団の細胞を対象（例えば、ヒト対象）に送達する工程をさらに含む。
【００７２】
いくつかの態様において、集団の細胞の20％未満が、集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程後にカセットを含む。いくつかの態様において、集団の細胞の15％未満が、集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程後にカセットを含む。いくつかの態様において、集団の細胞の10％未満が、集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程後にカセットを含む。いくつかの態様において、集団の細胞の5％未満が、集団の細胞を逆選択物質の存在下で培養する工程後にカセットを含む。
【００７３】
細胞（例えば、幹細胞または免疫細胞）の集団は、105〜1011個の細胞を含んでもよい。例えば、細胞の集団は、105、106、107、108、109、1010、または1011個の細胞を含んでもよい。細胞の集団は、いくつかの態様においては、均一の細胞集団（全て同じ細胞タイプ）であるが、他の態様においては、細胞の集団は、不均一の細胞集団（異なる細胞タイプの混合物）である。
【００７４】
本開示の他の局面は、少なくとも1つの改変された遺伝子構築物（例えば、(a)少なくとも1つのリコンビナーゼおよび／または少なくとも1つのヌクレアーゼと、(b)関心対象の生成物および少なくとも1つの逆選択マーカーとをコードする）を細胞の集団に導入する工程であって、関心対象の生成物が治療用分子および／または予防用分子である、工程を提供する。いくつかの態様において、該方法は、集団の細胞を対象に送達する工程をさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、誘導性プロモーターを活性化してリコンビナーゼを発現させるために対象を誘導作用物質に曝露させる工程、および改変された遺伝子構築物からカセットを切除する工程（および／または、細胞において異種核酸を切除する工程）をさらに含む。いくつかの態様において、該方法は、対象を逆選択物質に曝露させる工程および逆選択マーカーを発現する細胞を殺傷する工程をさらに含む。
【００７５】
いくつかの態様において、集団の細胞の20％未満が、対象を逆選択物質に曝露させる工程後にカセットを含む。いくつかの態様において、集団の細胞の15％未満が、対象を逆選択物質に曝露させる工程後にカセットを含む。いくつかの態様において、集団の細胞の10％未満が、対象を逆選択物質に曝露させる工程後にカセットを含む。いくつかの態様において、集団の細胞の5％未満（例えば、4％、3％、2％または1％）が、対象を逆選択物質に曝露させる工程後にカセットを含む。
【００７６】
本開示の種々の局面によれば、方法は、本開示の改変された構築物のいずれかを細胞に送達する工程を含んでよい。同様に、本明細書において提供される通りの細胞のいずれかを、ヒト対象などの対象に送達してもよい。
【００７７】
改変された遺伝子構築物を、ウイルス送達システム（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ヘルパー依存型アデノウイルスシステム、ハイブリッドアデノウイルスシステム、単純ヘルペス、ポックスウイルス、レンチウイルス、エプスタイン-バールウイルス）または非ウイルス送達システム（例えば、物理的：裸のDNA、DNA衝撃、電気穿孔法、流体力学、超音波、もしくはマグネトフェクション；または化学的：カチオン性脂質、異なるカチオン性ポリマー、もしくは脂質ポリマー）を使用して、細胞に送達してもよい（Nayerossadat N et al. Adv Biomed Res. 2012; 1: 27、参照によって本明細書に組み入れられる）。いくつかの態様において、非ウイルス系送達システムは、ヒドロゲル系送達システムである（例えば、Brandl F, et al. Journal of Controlled Release, 2010, 142(2): 221-228を参照のこと、参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００７８】
改変された遺伝子構築物および／または細胞を、当技術分野において公知の任意のインビボ送達法によって、対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象）に送達してもよい。例えば、改変された遺伝子構築物および／または細胞を静脈内に送達してもよい。いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物および／または細胞は、送達ビヒクル（例えば、非リポソームナノ粒子またはリポソーム）中で送達される。いくつかの態様において、改変された遺伝子構築物および／または細胞は、癌または他の疾患を有する対象に全身に送達され、対象の癌細胞または病的細胞において特異的に活性化される（転写が活性化される）。
【００７９】
追加の態様
1. 
(a)リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、
(b)関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
カセットが同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、
改変された遺伝子構築物。
【００８０】
2. (a)が(b)から上流にある、パラグラフ1の改変された遺伝子構築物。
【００８１】
3. ターミネーター配列が(a)と(b)との間に位置する、パラグラフ2の改変された遺伝子構築物。
【００８２】
4. リコンビナーゼが、チロシンリコンビナーゼまたはチロシンインテグラーゼから選択される、パラグラフ1〜3のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００８３】
5. リコンビナーゼが、Cre、Dre、Flp、KD、B2、B3、λ、HK022、およびHP1リコンビナーゼから選択される、パラグラフ4の改変された遺伝子構築物。
【００８４】
6. リコンビナーゼが、セリンリコンビナーゼまたはセリンインテグラーゼから選択される、パラグラフ1〜3のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００８５】
7. リコンビナーゼが、γδ、ParA、Tn3、Gin、ΦC31、Bxb1、およびR4リコンビナーゼから選択される、パラグラフ6の改変された遺伝子構築物。
【００８６】
8. 関心対象の生成物が、治療用分子または予防用分子である、パラグラフ1〜7のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００８７】
9. 関心対象の生成物が、タンパク質またはペプチドである、パラグラフ1〜8のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００８８】
10. 関心対象の生成物が核酸である、パラグラフ1〜9のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００８９】
11. 核酸が、RNA、DNA、またはRNAとDNAとの組み合わせを含む、パラグラフ10の改変された遺伝子構築物。
【００９０】
12. RNAが、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択される、パラグラフ10の改変された遺伝子構築物。
【００９１】
13. (c)逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ1〜12のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００９２】
14. 逆選択マーカーが、同族リコンビナーゼ認識部位間に位置する、パラグラフ13の改変された遺伝子構築物。
【００９３】
15. (c)のヌクレオチド配列が、(b)のヌクレオチド配列から下流にある、パラグラフ13または14の改変された遺伝子構築物。
【００９４】
16. 逆選択マーカーが、プロドラッグである、パラグラフ9または10の改変された遺伝子構築物。
【００９５】
17. 逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、パラグラフ13〜16のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００９６】
18. 異なるリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に各々連結された少なくとも2つの誘導性プロモーターを含み、かつ、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、パラグラフ1〜17のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００９７】
19. 誘導性プロモーターが、異なるリコンビナーゼを各々コードする少なくとも2つのヌクレオチド配列に連結され、かつ、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、パラグラフ1〜17のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００９８】
20. 異なるリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に各々連結された少なくとも3つの誘導性プロモーターを含み、かつ、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、パラグラフ1〜17のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【００９９】
21. 誘導性プロモーターが、異なるリコンビナーゼを各々コードする少なくとも3つのヌクレオチド配列に連結され、かつ、カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、パラグラフ1〜17のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１００】
22. 
(a)異なるリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に各々機能的に連結されている少なくとも2つの誘導性プロモーターと、
(b)関心対象の生成物および逆選択分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
カセットが、これら異なるリコンビナーゼと同族であるリコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、
改変された遺伝子構築物。
【０１０１】
23. パラグラフ1〜22のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、ベクター。
【０１０２】
24. プラスミドまたはウイルスベクターである、パラグラフ23のベクター。
【０１０３】
25. パラグラフ1〜22のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、細胞。
【０１０４】
26. パラグラフ23または24のベクターを含む、細胞。
【０１０５】
27. 幹細胞である、パラグラフ25または26の細胞。
【０１０６】
28. 幹細胞が、間葉幹細胞、造血幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される、パラグラフ27の細胞。
【０１０７】
29. 免疫細胞である、パラグラフ25または26の細胞。
【０１０８】
30. 免疫細胞が、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される、パラグラフ29の細胞。
【０１０９】
31. T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択される、パラグラフ30の細胞。
【０１１０】
32. T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、パラグラフ30または31の細胞。
【０１１１】
33. パラグラフ1〜22のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、組成物。
【０１１２】
34. パラグラフ23または24のベクターを含む、組成物。
【０１１３】
35. パラグラフ25〜32のいずれか1つの細胞を含む、組成物。
【０１１４】
36. パラグラフ1〜22のいずれか1つの改変された遺伝子構築物、および(a)の誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質を含む、キット。
【０１１５】
37. パラグラフ23または24のベクター、および(a)の誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質を含む、キット。
【０１１６】
38.関心対象の生成物が細胞の分化、増殖、または表現型の維持（持続）を助ける、パラグラフ1〜24のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を細胞に導入する工程を含む方法。
【０１１７】
39. (b)のプロモーターが構成的プロモーターである、パラグラフ38の方法。
【０１１８】
40. 細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程をさらに含む、パラグラフ38または39の方法。
【０１１９】
41. (a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および細胞において異種核酸を切除する工程をさらに含む、パラグラフ38〜40のいずれか1つの方法。
【０１２０】
42. 細胞を対象に送達する工程をさらに含む、パラグラフ41の方法。
【０１２１】
43. パラグラフ1〜24のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を細胞に導入する工程を含む方法であって、関心対象の生成物が治療用分子または予防用分子である、方法。
【０１２２】
44. (b)のプロモーターが構成的プロモーターである、パラグラフ43の方法。
【０１２３】
45. 細胞を対象にさらに送達する、パラグラフ43または44の方法。
【０１２４】
46. (a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および細胞において異種核酸を切除する工程をさらに含む、パラグラフ45の方法。
【０１２５】
47. パラグラフ25〜32のいずれか1つの細胞を対象に送達する工程を含む、方法。
【０１２６】
48. 
(a)ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されている誘導性プロモーターと、
(b)関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
カセットを任意で挟んでいる同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、改変された遺伝子構築物。
【０１２７】
49. (a)が(b)から上流にある、パラグラフ48の改変された遺伝子構築物。
【０１２８】
50. ターミネーター配列が(a)と(b)との間に位置する、パラグラフ49の改変された遺伝子構築物。
【０１２９】
51. ヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼおよびRNAガイドヌクレアーゼから選択される、パラグラフ48〜50のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１３０】
52. メガヌクレアーゼが、イントロンエンドヌクレアーゼおよびインテインエンドヌクレアーゼから選択される、パラグラフ51の改変された遺伝子構築物。
【０１３１】
53. RNAガイドヌクレアーゼが、Cas9ヌクレアーゼおよびCpf1ヌクレアーゼから選択される、パラグラフ51の改変された遺伝子構築物。
【０１３２】
54. (c)ヌクレアーゼ認識部位に相補的でありかつヌクレアーゼ認識部位間に位置するガイドRNA（gRNA）をコードする、ヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフD6の改変された遺伝子構築物。
【０１３３】
55. 関心対象の生成物が治療用分子または予防用分子である、パラグラフ48〜54のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１３４】
56. 関心対象の生成物がタンパク質またはペプチドである、パラグラフ48〜55のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１３５】
57. 関心対象の生成物が核酸である、パラグラフ48〜56のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１３６】
58. 核酸が、RNA、DNA、またはRNAとDNAとの組み合わせを含む、パラグラフ57の改変された遺伝子構築物。
【０１３７】
59. RNAが、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択される、パラグラフ57の改変された遺伝子構築物。
【０１３８】
60. (c)逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ48〜59のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１３９】
61. 逆選択マーカーが、同族ヌクレアーゼ認識部位間に位置する、パラグラフ60の改変された遺伝子構築物。
【０１４０】
62. (c)のヌクレオチド配列が、(b)のヌクレオチド配列から下流にある、パラグラフ60または61の改変された遺伝子構築物。
【０１４１】
63. 逆選択マーカーが、プロドラッグである、パラグラフ56または57の改変された遺伝子構築物。
【０１４２】
64. 逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、パラグラフ60〜63のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１４３】
65. 異なるヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に各々連結された少なくとも2つの誘導性プロモーターを含み、かつ、カセットを任意で挟んでいる同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、パラグラフ48〜64のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１４４】
66. 誘導性プロモーターが、異なるヌクレアーゼを各々コードする少なくとも2つのヌクレオチド配列に連結され、かつ、カセットを任意で挟んでいる同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、パラグラフ48〜64のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１４５】
67. 異なるヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に各々連結された少なくとも3つの誘導性プロモーターを含み、かつ、カセットを任意で挟んでいる同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、パラグラフ48〜64のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１４６】
68. 誘導性プロモーターが、異なるヌクレアーゼを各々コードする少なくとも3つのヌクレオチド配列に連結され、かつ、カセットを任意で挟んでいる同族ヌクレアーゼ認識部位を含む、パラグラフ48〜64のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０１４７】
69. 
(a)異なるヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に各々機能的に連結されている少なくとも2つの誘導性プロモーターと、
(b)関心対象の生成物および逆選択分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターと
を含むカセットを含む、改変された遺伝子構築物であって、
カセットが、これら異なるヌクレアーゼと同族であるヌクレアーゼ認識部位によって挟まれている、
改変された遺伝子構築物。
【０１４８】
70. パラグラフ48〜69のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、ベクター。
【０１４９】
71. プラスミドまたはウイルスベクターである、パラグラフ70のベクター。
【０１５０】
72. パラグラフ48〜69のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、細胞。
【０１５１】
73. パラグラフ70または71のベクターを含む、細胞。
【０１５２】
74. 幹細胞である、パラグラフ72または73の細胞。
【０１５３】
75. 幹細胞が、間葉幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される、パラグラフ74の細胞。
【０１５４】
76. 免疫細胞である、パラグラフ72または73の細胞。
【０１５５】
77. 免疫細胞が、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される、パラグラフ76の細胞。
【０１５６】
78. T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択される、パラグラフ77の細胞。
【０１５７】
79. T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、パラグラフ77または78の細胞。
【０１５８】
80. パラグラフD1〜D22のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、組成物。
【０１５９】
81. パラグラフ70または71のベクターを含む、組成物。
【０１６０】
82. パラグラフ72〜79のいずれか1つの細胞を含む、組成物。
【０１６１】
83. パラグラフ48〜69のいずれか1つの改変された遺伝子構築物、および(a)の誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質を含む、キット。
【０１６２】
84. パラグラフ70または71のベクター、および(a)の誘導性プロモーターの活性を調節する少なくとも1つの誘導作用物質を含む、キット。
【０１６３】
85.関心対象の生成物が細胞の分化、増殖、または表現型の維持（持続）を助ける、パラグラフ48〜71のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を細胞に導入する工程を含む方法。
【０１６４】
86. (b)のプロモーターが構成的プロモーターである、パラグラフ85の方法。
【０１６５】
87. 細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程をさらに含む、パラグラフ85または86の方法。
【０１６６】
88. (a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および細胞において異種核酸を切除する工程をさらに含む、パラグラフ85〜87のいずれか1つの方法。
【０１６７】
89. 細胞を対象に送達する工程をさらに含む、パラグラフ88の方法。
【０１６８】
90. 関心対象の生成物が治療用分子または予防用分子である、パラグラフ48〜71のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を細胞に導入する工程を含む、方法。
【０１６９】
91. (b)のプロモーターが構成的プロモーターである、パラグラフ90の方法。
【０１７０】
92. 細胞を対象にさらに送達する、パラグラフ90または91の方法。
【０１７１】
93. (a)のプロモーターを活性化する工程、リコンビナーゼを発現する工程、および細胞において異種核酸を切除する工程をさらに含む、パラグラフ92の方法。
【０１７２】
94. パラグラフ72〜79のいずれか1つの細胞を対象に送達する工程を含む、方法。
【０１７３】
95.  (a)リガンド依存性キメラリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸と、
(b)関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸であって、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、核酸と
を含む、改変された細胞。
【０１７４】
96. リコンビナーゼが、リガンド依存性キメラリコンビナーゼである、パラグラフ95の改変された細胞。
【０１７５】
97. リガンド依存性キメラリコンビナーゼが、変異したヒトエストロゲン受容体（ER）リガンド結合ドメインに連結されている、パラグラフ96の改変された細胞。
【０１７６】
98. 関心対象の生成物が、治療用分子または予防用分子である、パラグラフ95〜97のいずれか1つの改変された細胞。
【０１７７】
99. 関心対象の生成物が、タンパク質またはペプチドである、パラグラフ95〜98のいずれか1つの改変された細胞。
【０１７８】
100. 関心対象の生成物が、核酸である、パラグラフ95〜98のいずれか1つの改変された細胞。
【０１７９】
101. 核酸が、RNA、DNA、またはRNAとDNAとの組み合わせを含む、パラグラフ100の改変された細胞。
【０１８０】
102. RNAが、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択される、パラグラフ101の改変された細胞。
【０１８１】
103. (b)の核酸が、逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ95〜102のいずれか1つの改変された細胞。
【０１８２】
104. 逆選択マーカーが、同族ヌクレアーゼ認識部位間に位置する、パラグラフ103の改変された細胞。
【０１８３】
105. 逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列が(b)のヌクレオチド配列から下流にある、パラグラフ103または104の改変された細胞。
【０１８４】
106. 逆選択マーカーが、プロドラッグである、パラグラフ103〜105のいずれか1つの改変された細胞。
【０１８５】
107. 逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、パラグラフ103〜105のいずれか1つの改変された細胞。
【０１８６】
108. 幹細胞である、パラグラフ95〜107のいずれか1つの改変された細胞。
【０１８７】
109. 幹細胞が、間葉幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される、パラグラフ108の改変された細胞。
【０１８８】
110. 免疫細胞である、パラグラフ95〜107のいずれか1つの改変された細胞。
【０１８９】
111. 免疫細胞が、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される、パラグラフ110の改変された細胞。
【０１９０】
112. T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択される、パラグラフ111の改変された細胞。
【０１９１】
113. T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、パラグラフ111または112の改変された細胞。
【０１９２】
114. パラグラフ95〜113のいずれか1つの改変された細胞を含む、組成物。
【０１９３】
115. 
(a)リガンド依存性キメラリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸と、
(b)関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸であって、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、核酸と
を含む、キット。
【０１９４】
116. パラグラフ95〜113のいずれか1つの改変された細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程を含む、方法。
【０１９５】
117. リガンド依存性キメラリコンビナーゼが、変異したヒトエストロゲン受容体（ER）リガンド結合ドメインに連結されている、パラグラフ116の方法。
【０１９６】
118. 改変された細胞を誘導作用物質と接触させる工程および細胞において異種核酸を切除する工程をさらに含む、パラグラフ116または117の方法。
【０１９７】
119. 誘導作用物質が、4-ヒドロキシタモキシフェン（OHT）および／またはICI 182,780（ICI）である、パラグラフ118の方法。
【０１９８】
120. 改変された細胞を対象に送達する工程をさらに含む、パラグラフ119の方法。
【０１９９】
121. 
(a)リコンビナーゼの第一の断片をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸と、
(b)リコンビナーゼの第二の断片をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸であって、第一の断片および第二の断片は組み合わされたときに、完全長の機能的リコンビナーゼを形成する、核酸と、
(c)関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸であって、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、核酸と
を含む、改変された細胞。
【０２００】
122. 第一の断片がFKBPドメインに連結され、かつ、第二の断片がFRBドメインに連結されている、パラグラフ121の改変された細胞。
【０２０１】
123. 関心対象の生成物が、治療用分子または予防用分子である、パラグラフ121または122の改変された細胞。
【０２０２】
124. 関心対象の生成物が、タンパク質またはペプチドである、パラグラフ121〜123のいずれか1つの改変された細胞。
【０２０３】
125. 関心対象の生成物が、核酸である、パラグラフ121〜123のいずれか1つの改変された細胞。
【０２０４】
126. 核酸が、RNA、DNAまたはRNAとDNAの組み合わせを含む、パラグラフ125の改変された細胞。
【０２０５】
127. RNAが、短鎖ヘアピンRNA、短鎖干渉RNA、およびマイクロRNAから選択される、パラグラフ126の改変された細胞。
【０２０６】
128. (c)の核酸が、逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、パラグラフ121〜127のいずれか1つの改変された細胞。
【０２０７】
129. 逆選択マーカーが、同族ヌクレアーゼ認識部位間に位置する、パラグラフ128の改変された細胞。
【０２０８】
130. 逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列が(c)のヌクレオチド配列から下流にある、パラグラフ128または128の改変された細胞。
【０２０９】
131. 逆選択マーカーが、プロドラッグである、パラグラフ128〜130のいずれか1つの改変された細胞。
【０２１０】
132. 逆選択マーカーが、シトシンデアミナーゼおよびチミジンキナーゼから選択される、パラグラフ128〜130のいずれか1つの改変された細胞。
【０２１１】
133. 幹細胞である、パラグラフ121〜132のいずれか1つの改変された細胞。
【０２１２】
134. 幹細胞が、間葉幹細胞、胚性幹細胞、および多能性幹細胞から選択される、パラグラフ133の改変された細胞。
【０２１３】
135. 免疫細胞である、パラグラフ121〜132のいずれか1つの改変された細胞。
【０２１４】
136. 免疫細胞が、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、T細胞、およびB細胞から選択される、パラグラフ135の改変された細胞。
【０２１５】
137. T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、ガンマ-デルタT細胞、および制御性T細胞から選択される、パラグラフ136の改変された細胞。
【０２１６】
138. T細胞が、キメラ抗原受容体（CAR）T細胞または改変されたT細胞受容体（TCR）細胞である、パラグラフ136または137の改変された細胞。
【０２１７】
139. パラグラフ121〜138のいずれか1つの改変された細胞を含む、組成物。
【０２１８】
140. 
(a)リコンビナーゼの第一の断片をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸と、
(b)リコンビナーゼの第二の断片をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸であって、第一の断片および第二の断片は、組み合わされたときに、完全長の機能的リコンビナーゼを形成する、核酸と、
(c)関心対象の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを含む核酸であって、同族リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、核酸と
を含む、キット。
【０２１９】
141. パラグラフ121〜138のいずれか1つの改変された細胞を培養する工程および関心対象の生成物を生産する工程を含む、方法。
【０２２０】
142. 第一の断片がFKBPドメインに連結され、かつ、第二の断片がFRBドメインに連結されている、パラグラフ141の方法。
【０２２１】
143. 改変された細胞を誘導作用物質と接触させる工程および細胞において異種核酸を切除する工程をさらに含む、パラグラフ141または142の方法。
【０２２２】
144. 誘導作用物質が、4-ヒドロキシタモキシフェン（OHT）および／またはICI 182,780（ICI）である、パラグラフ143の方法。
【０２２３】
145. 改変された細胞を対象に送達する工程をさらに含む、パラグラフ144の方法。
【０２２４】
146. (a)関心対象の第一の生成物をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターを、(b)関心対象の第二の生成物および任意で逆選択マーカーをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されているプロモーターから上流に含み、該関心対象の第一の生成物の発現または活性が活性化可能（誘導性）であり、かつ、該関心対象の第一の生成物がカセットの切除または分解を調節する、カセットを含む、改変された遺伝子構築物。
【０２２５】
147. (a)のプロモーターが誘導性プロモーターである、パラグラフ146の改変された遺伝子構築物。
【０２２６】
148. カセットが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれている、パラグラフ146または147の改変された遺伝子構築物。
【０２２７】
149. 関心対象の第一の生成物が、同族リコンビナーゼである、パラグラフ148の改変された遺伝子構築物。
【０２２８】
150. カセットが、ヌクレアーゼ認識部位によって挟まれている、パラグラフ146または147の改変された遺伝子構築物。
【０２２９】
151. 関心対象の第一の生成物が、同族ヌクレアーゼである、パラグラフ150の改変された遺伝子構築物。
【０２３０】
152. 関心対象の第二の生成物が、治療用分子または予防用分子である、パラグラフ146〜151のいずれか1つの改変された遺伝子構築物。
【０２３１】
153. パラグラフ146〜152のいずれか1つの改変された遺伝子構築物を含む、細胞。
【０２３２】
154. パラグラフ146〜152のいずれか1つの改変された遺伝子構築物またはパラグラフK8の細胞を含む、組成物またはキット。
【０２３３】
155. パラグラフ153の細胞を対象に送達する、方法。
【０２３４】
156. 
(a)リコンビナーゼ遺伝子の誘導性転写、リコンビナーゼの核への誘導性転移、および／または分割リコンビナーゼの誘導性二量体化によって調節される、1以上のリコンビナーゼ；
(b)1以上のメガヌクレアーゼまたはCRISPR-Casヌクレアーゼ；および／または
(c)1以上の逆選択マーカー
を含む、改変された遺伝子回路。
【実施例】
【０２３５】
実施例1
この実施例では、リコンビナーゼタンパク質を使用して、異種遺伝子カセットを切除する（図1）。リコンビナーゼ活性の制御は、リコンビナーゼ遺伝子の誘導性転写、リコンビナーゼの核への誘導性転移、および／または分割リコンビナーゼの誘導性二量体化を通して達成される。例えば、リコンビナーゼ発現は、ドキシサイクリン、フロレチン(9)、バニリン酸(13)、マクロライド(12)、または他の誘導因子の使用を通して制御される。別の例として、リコンビナーゼが誘導作用物質の非存在下で組換えを触媒しないように、リコンビナーゼを核内受容体に融合させることができる。4OHTなどの誘導作用物質の添加によって、リコンビナーゼは、核の中に移行して、組換えを触媒する(14、15)。このアプローチは、Cre、Flp、およびPhiC31について検証されており、追加のインテグラーゼに拡張可能である(15〜17)。なお別の例として、リコンビナーゼタンパク質を、2つの断片（それら自体に対しては不活性であるが、該断片の一方に各々融合された2つのタンパク質ドメイン（例えば、FKBPおよびFRB）との相互作用のために、低分子（例えば、ラパマイシン類似体）の添加によって二量体化することができる）に分割することができる(18)。このアプローチは、Creについて実証されており、他のリコンビナーゼに拡張可能である。リコンビナーゼのライブラリー(19)をこの手法で使用することができる。
【０２３６】
実施例2
この実施例では、メガヌクレアーゼまたはCRISPR-Casヌクレアーゼなどのヌクレアーゼタンパク質を使用し、ターゲティングされた二本鎖破壊を通して、異種遺伝子カセットを切除するかまたは分解する（図2）。これらのヌクレアーゼは、本発明者等の異種DNA構築物を囲む特定の部位で切断するようプログラミングされ、それは、遺伝子の削除効率を顕著に増強することが示されている(20)。削除されるべき領域の隣接端に相同であるドナーDNAの付加を使用して、削除効率を増強することができる。これらのエフェクターは、いくつかの態様において、誘導性プロモーターの制御下に置かれる。
【０２３７】
実施例3
この実施例では、シトシンデアミナーゼまたはチミジンキナーゼなどの逆選択マーカーを使用して、切除または分解反応後に依然として異種DNAを含有する細胞を殺傷する（図3を参照のこと）。例えば、酵母または細菌のシトシンデアミナーゼは、5-フルオロシトシン（5-FC）を5-フルオロウラシル（5-FU）へと変換し、これは細胞毒性をもたらすことができる(21、22)。HSVチミジンキナーゼ（HSV-tk）は、ガンシクロビルを毒性産物へと変換し、これを使用して細胞殺傷を誘発することができるが、毒性は細胞バックグラウンドに応じて変動し得る(23)。IPTGの制御下で、ジフテリア毒素のアルファ鎖を発現して細胞死を誘発する誘導性殺傷スイッチを使用してもよい(24)。いくつかの態様において、低分子を介した二量体化を通して毒素の誘導性活性化を使用して、細胞殺傷を増強することができる。
【０２３８】
実施例4
この実施例では、一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイを実施して、種々のチロシンリコンビナーゼのリコンビナーゼ活性を試験した。293FT細胞を、等しい比率のレポータープラスミド、リコンビナーゼプラスミド、およびトランスフェクションマーカープラスミド（例えば、BFPをコードするプラスミド）で一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光についてアッセイし、BFP発現についてゲーティングした。図6および7は、一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイからのデータを示す。上のグラフはGFP+細胞の％を表し、下のグラフはGFP+細胞のGFP平均蛍光強度の中央値を表す。
【０２３９】
実施例5
この実施例では、システムを使用して、リコンビナーゼ切除効率についてアッセイした。BpiI(x2)-HSVtk-SV40pA-EGFP-Esp3I(x2)カセットを、pcDNA3.1(+)哺乳動物発現ベクター（Life Tech）に挿入した。組換え配列を、Golden Gate消化／ライゲーションを介してBpiIおよびEsp3I部位に挿入した。図8を参照のこと。
【０２４０】
実施例6
この実施例では、一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイを実施して、種々のセリンインテグラーゼのリコンビナーゼ活性を試験した。293FT細胞を、等しい比率のレポータープラスミド、リコンビナーゼプラスミド、およびトランスフェクションマーカープラスミド（例えば、BFPをコードするプラスミド）で一過性にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの24時間後のGFP蛍光についてアッセイし、BFP発現についてゲーティングした。図9および10は、一過性293FT細胞トランスフェクションアッセイからのデータを示す。上のグラフはGFP+細胞の％を表し、下のグラフはGFP+細胞のGFP平均蛍光強度の中央値を表す。
【０２４１】
実施例7
この実施例では、リコンビナーゼに基づく切除構築物をコードするエントリーベクターを、YFPおよびハイグロマイシンを発現する事前改変された293FTランディングパッド細胞株に組み込む。図11を参照のこと。図12は、GFPレポーターの293FTランディングパッド細胞株への組み込みの成功を示す。組み込みによって、細胞は、GFPを発現すると同時にYFPの発現を喪失する。ピューロマイシンによる選択圧は、組み込まれていない細胞を除去する。
【０２４２】
実施例8
この実施例は、ゲノムに組み込まれた構築物を切除するための方法を概説する。リコンビナーゼに基づく切除構築物をコードするエントリーベクターを、事前改変された293FTランディングパッド細胞株に組み込む。組み込まれた細胞株を、リコンビナーゼ発現プラスミドおよびレポータープラスミド（例えば、BFPを発現する）で一過性にトランスフェクトし、GFP発現を経時的にアッセイする。逆選択マーカー（CSM）を使用して、組み込まれた構築物を保持する細胞を殺滅する。図13を参照のこと。
【０２４３】
3つの異なるリコンビナーゼに基づく切除構築物を発現する細胞株を、同族リコンビナーゼで一過性にトランスフェクトして、GFP発現を経時的にアッセイした。図14を参照のこと。
【０２４４】
B3リコンビナーゼの一過性トランスフェクション後に、プロドラッグを適用して、pENTR_B3RT切除構築物を保持した細胞を殺滅した。逆選択マーカー（CSM）は、プロドラッグを毒性薬物へと変換する。この場合、CSMはHSVtkであり、プロドラッグはガンシクロビル（GCV）であった。細胞を、0.5、1、2、および5μMのGCVで7日間処理して、GFP発現を経時的にアッセイした。ヒストグラムは、GFP-細胞の％およびGFP+細胞の％を表す。図15を参照のこと。Flpリコンビナーゼの一過性トランスフェクション後に、GCVを上記の通り適用して、pENTR_FRT切除構築物を保持した細胞を殺滅した。図16を参照のこと。
【０２４５】
pENTR_B3RT_FRTリコンビナーゼに基づく切除構築物を発現する細胞株を、表示の時系列に従ってB3またはFlpで逐次的にトランスフェクトした。GFP発現を経時的にアッセイし、ヒストグラムは、15日目のGFP+細胞の％を表す。pENTR_B3RT_FRTリコンビナーゼに基づく切除構築物は、構築物B3RT_FRT_iCasp9_SV40pA_FRT_B3RT_EGFP_BGHpAをコードし、その中で、B3RTおよびFRTはそれぞれB3およびFlpの組換え配列であり、iCasp9は逆選択マーカー（CSM）である。図19を参照のこと。
【０２４６】
pENTR_B3RT_FRTリコンビナーゼに基づく切除構築物を発現する細胞株を、表示の時系列に従ってB3またはFlpで逐次的にトランスフェクトした。GFP発現を経時的にアッセイして、15日目のGFP+細胞の％をプロットした。図20を参照のこと。
【０２４７】
実施例9
図17は、ゲノムに組み込まれた回路をガイドRNA（gRNA）が切断および除去するシステムの一例を示す。図17では、gRNAは、YFPレポーターが細胞に安定に組み込まれている場合、5’-UTRおよび3’-UTRをターゲティングする。
【０２４８】
一過性トランスフェクションアッセイを実施して、CRISPR/Cas9を使用してゲノムに組み込まれた回路の除去を試験した。単一gRNAおよびCas9をコードするベクターを、レポータープラスミド（例えば、BFPを発現する）と一緒に、YFPを発現する細胞株で共トランスフェクトした。いくつかの場合において、異なるgRNAをコードする2つのベクターをレポータープラスミドと一緒にトランスフェクトした。細胞集団をBFP発現についてゲーティングして、YFP+細胞の％を経時的にプロットした。gRNAの異なる組み合わせを使用してYFPを除去してもよい。図18を参照のこと。
【０２４９】
参考文献
2019521717.tif 000003
2019521717.tif 000004
2019521717.tif 000005
【０２５０】
本明細書に開示される全ての参考文献、特許および特許出願は、各々が引用される主題に関して参照することによって組み入れられ、これらは、いくつかの場合では、文書の全体を包含し得る。
【０２５１】
不定冠詞（a, an）は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、それとは反対の明確な指示のない限り、「少なくとも1つ」を意味するものと理解すべきである。
【０２５２】
また、それとは反対の明確な指示のない限り、2以上の工程または行為を含む本明細書において請求されるあらゆる方法において、その方法の工程または行為の順序は、その方法の工程または行為が列挙された順序に必ずしも限定されないことを理解すべきである。
【０２５３】
先の明細書だけでなく特許請求の範囲においても、「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（including）」、「〜を担持する（carrying）」、「〜を有する（having）」、「〜を含有する（containing）」、「〜を含む（involving）」、「〜を保持する（holding）」、「〜から構成される（composed of）」などの全ての移行句は、制限のない、すなわち、「〜を含むがこれらに限られない」ことを意味するものと理解すべきである。「〜からなる（consisting of）」および「〜から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句のみを、米国特許庁マニュアルの特許審査手続きのセクション2111.03に述べられている通り、それぞれ、制限または半制限のある移行句とすべきである。
【図１】
2019521717.tif 000007
【図２Ａ】
2019521717.tif 000008
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
2019521717.tif 000011
【図５】
2019521717.tif 000012
【図６】
2019521717.tif 000013
【図７】
2019521717.tif 000014
【図８】
2019521717.tif 000015
【図９】
2019521717.tif 000016
【図１０】
2019521717.tif 000017
【図１１】
2019521717.tif 000018
【図１２】
2019521717.tif 000019
【図１３】
2019521717.tif 000020
【図１４】
2019521717.tif 000021
【図１５】
2019521717.tif 000022
【図１６】
2019521717.tif 000023
【図１７】
2019521717.tif 000024
【図１８】
2019521717.tif 000025
【図１９】
2019521717.tif 000026
【図２０】
2019521717.tif 000027
【国際調査報告】
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2019521717.tif 000029
2019521717.tif 000030
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2019521717.tif 000033
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