(57)【要約】  本明細書には、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含むマイクロニードルデバイスが記載され、ここで組換えアルファウイルスレプリコンは、複数のマイクロニードル上にコーティングされるか又はそれらに埋め込まれる。本明細書にはまた、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含むマイクロニードルデバイスを調製する方法が記載される。本明細書にはまた、個体において免疫反応を誘導する方法が開示され、該方法は、個体を、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含むマイクロニードルデバイスと接触させる工程を含む。【選択図】図２２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスであって、
（ａ）複数のマイクロニードルを含む基板；および
（ｂ）複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡを含む組成物を含む、マイクロニードルデバイス。
【請求項２】
ＲＮＡ分子が組換えアルファウイルスレプリコンである、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３】
ＲＮＡ分子が脱水される、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４】
複数のマイクロニードルが、溶解性、生体溶解性、または生分解性である、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項５】
外因性ポリペプチドが、外来抗原または自己抗原である、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項６】
自己抗原が、癌に関連した抗原である、請求項５に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項７】
外来抗原が、感染病原体に関連した抗原である、請求項５に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項８】
組換えアルファウイルスレプリコンが、外来抗原または自己抗原に対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項９】
外因性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスＨＡまたはＮＡのポリペプチドである、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドまたはＢ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドである、請求項９に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１１】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨ１８から選択される群１のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する、請求項１０に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１２】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、またはＨ１５から選択される群２のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する、請求項１０に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１３】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｂ型インフルエンザウイルスのウイルス株に由来する、請求項１０に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１４】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株に由来する、請求項１１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１５】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株に由来する、請求項１２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１６】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統またはビクトリア系統のウイルス株に由来する、請求項１３に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１７】
組換えアルファウイルスレプリコンが、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドが、
（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または
（ｅ）それらの組み合わせを含む、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１８】
組換えアルファウイルスレプリコンが、少なくとも２つの外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドが、
（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または
（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチドを含む、請求項１７に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項１９】
外因性ポリペプチドの各々が、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項１８に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２０】
外因性ポリペプチドが、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項１８に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２１】
外因性ポリペプチドが、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、請求項１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２２】
組換えアルファウイルスレプリコンが、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドが、
（ａ）ポリオウイルスからの抗原；
（ｂ）破傷風菌からの抗原；
（ｃ）狂犬病ウイルスからの抗原；または
（ｄ）それらの組み合わせを含む、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２３】
組換えアルファウイルスレプリコンが、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドが、
（ａ）ポリオウイルスからの抗原；
（ｂ）破傷風菌からの抗原；および
（ｃ）狂犬病ウイルスからの抗原を含む、請求項２２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２４】
外因性ポリペプチドの各々が、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項２３に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２５】
外因性ポリペプチドが、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項２３に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２６】
組換えアルファウイルスレプリコンが、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドが、
（ａ）マールブルグウイルスからの抗原；
（ｂ）スーダンエボラウイルスからの抗原；
（ｃ）ザイールエボラウイルスからの抗原；または
（ｄ）それらの組み合わせを含む、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２７】
組換えアルファウイルスレプリコンが、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドが、
（ａ）マールブルグウイルスからの抗原；
（ｂ）スーダンエボラウイルスからの抗原；および
（ｃ）ザイールエボラウイルスからの抗原を含む、請求項２６に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２８】
外因性ポリペプチドの各々が、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項２７に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項２９】
外因性ポリペプチドが、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項２７に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３０】
マイクロニードルデバイスが、室温での少なくとも１か月の間の保存後に外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効である、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３１】
複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた第２の生物活性剤をさらに含む、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３２】
第２の生物活性剤がポリペプチドである、請求項３１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３３】
第２の生物活性剤が、個体における免疫反応を増強する、請求項３１に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３４】
第２の生物活性剤がアジュバントである、請求項３３に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３５】
組換えアルファウイルスレプリコンが、デンドリマー−レプリコンナノ粒子として製剤される、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３６】
デンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項３５に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３７】
ＰＡＭＡＭデンドリマーがアミノ表面反応基を含む、請求項３６に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３８】
ＰＡＭＡＭデンドリマーが、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項３７に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項３９】
ＰＡＭＡＭデンドリマーが、修飾されたアミノ表面反応基を含む、請求項３７に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４０】
修飾されたアミノ表面反応基が、フッ素化剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはアミノ酸で修飾されている、請求項３９に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４１】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは細胞透過性ペプチドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項４０に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４２】
フッ素化剤がヘプタフルオロ酪酸無水物である、請求項４０に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４３】
アミノ酸が、アルギニンまたはヒスチジンである、請求項４０に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４４】
デンドリマー−レプリコンナノ粒子が、マイクロ流体混合デバイスによって製剤される、請求項３５に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４５】
組換えアルファウイルスレプリコンが、マイクロ流体分配デバイスを使用して複数のマイクロニードル上にコーティングされる、請求項２に記載のマイクロニードルデバイス。
【請求項４６】
ＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスであって、該マイクロニードルデバイスが、
（ａ）複数のマイクロニードルを含む基板；および
（ｂ）複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物を含む、マイクロニードルデバイス。
【請求項４７】
ポリペプチドをそれを必要としている個体に送達する方法であって、該方法が、請求項１−４６のいずれか１項のマイクロニードルデバイスを個体に適用する工程を含む、方法。
【請求項４８】
マイクロニードルデバイスを調製する方法であって、該方法は、
（ａ）複数のマイクロニードルを含む基板を得る工程；および
（ｂ）外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を含む組成物を複数のマイクロニードル上にコーティングするか又はそれらに埋め込む工程を含む、方法。
【請求項４９】
ＲＮＡ分子が組換えアルファウイルスレプリコンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
組換えアルファウイルスレプリコンを脱水する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
組換えアルファウイルスレプリコンが、複数のマイクロニードル上にコーティングされるか又はそれらに埋め込まれる前に脱水される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
組換えアルファウイルスレプリコンが、複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた後に脱水される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
複数の個々のマイクロニードルが、溶解性、生体溶解性、または生分解性である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
組換えアルファウイルスレプリコンが、デンドリマー−レプリコンナノ粒子として製剤される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
デンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＡＭＡＭデンドリマーがアミノ表面反応基を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＰＡＭＡＭデンドリマーが、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
デンドリマー−レプリコンナノ粒子が、マイクロ流体混合デバイスによって生成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
組換えアルファウイルスレプリコンが、マイクロ流体分配デバイスを使用して複数のマイクロニードル上にコーティングされる、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
必要としている個体において免疫反応を誘導する方法であって、該方法が、
（ａ）個体の皮膚表面をマイクロニードルデバイスと接触させる工程であって、該マイクロニードルデバイスが、
（ｉ）複数のマイクロニードルであって、複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む、複数のマイクロニードルを含む、工程、および
（ｂ）組換えアルファウイルスレプリコンを個体に送達する工程を含み、それによって、個体において免疫反応を誘導する、方法。
【請求項６１】
組換えアルファウイルスレプリコンが脱水される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
複数の個々のマイクロニードルが、溶解性、生体溶解性、または生分解性である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
外因性ポリペプチドが、外来抗原または自己抗原である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
自己抗原が、癌に関連した抗原である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
外来抗原が、感染病原体に関連した抗原である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
組換えアルファウイルスレプリコンが、単独で外来抗原または自己抗原に対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
外因性ポリペプチドが、インフルエンザウイルスＨＡまたはＮＡのポリペプチドである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドまたはＢ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨ１８から選択される群１のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、またはＨ１５から選択される群２のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｂ型インフルエンザウイ複数のマイクロニードルルスのウイルス株に由来する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株に由来する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株に由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドが、Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統またはビクトリア系統のウイルス株に由来する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
組換えアルファウイルスレプリコンが、
（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または
（ｅ）それらの組み合わせ、
から選択される外因性ポリペプチドをコードする、請求項６０に記載の方法。
【請求項７６】
組換えアルファウイルスレプリコンが、
（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または
（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド、
から選択される少なくとも２つの外因性ポリペプチドをコードする、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
外因性ポリペプチドの各々が、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
外因性ポリペプチドが、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
外因性ポリペプチドが、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項８０】
組換えアルファウイルスレプリコンが、デンドリマー−レプリコンナノ粒子として製剤される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８１】
デンドリマーがＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ＰＡＭＡＭデンドリマーがアミノ表面反応基を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
デンドリマーが、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
デンドリマー−レプリコンナノ粒子が、マイクロ流体混合デバイスによって製剤される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
組換えアルファウイルスレプリコンが、マイクロ流体分配デバイスを使用して複数のマイクロニードル上にコーティングされる、請求項６０に記載の方法。
【請求項８６】
組換えアルファウイルスレプリコンが、個体において外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する、請求項６０に記載の方法。
【請求項８７】
マイクロニードル中に又はそれらの上に包装された第２の生物活性剤をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項８８】
第２の生物活性剤がポリペプチドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
第２の生物活性剤が免疫反応を増強する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
第２の生物活性剤がアジュバントである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
個体をマイクロニードルデバイスと接触させる前に皮膚表面を前処理する工程をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９２】
個体を複数のマイクロニードルを含む第２のマイクロニードルデバイスと接触させる工程をさらに含み、ここで各マイクロニードルが、マイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９３】
第２の投与経路によって外因性ポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンを含む第２の組成物を個体に投与する工程をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項９４】
第２の投与経路が経口である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
第２の組成物の経口投与が、個体をマイクロニードルデバイスと接触させる前に行われる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
第２の組成物の経口投与が、個体をマイクロニードルデバイスと接触させた後に行われる、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
個体において免疫反応をモニタリングする方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１−４６のいずれか１項のマイクロニードルデバイスを個体に適用する工程；および
（ｂ）個体における外因性ポリペプチドに対する免疫反応のレベルを判定するために個体からのサンプルを分析する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１６年１１月１１日に出願された、米国仮特許出願第６２／２７７，３１２の利益を主張するものであり、これはその全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
標的細胞または組織への組成物の送達は、様々な輸送障壁に直面している。タンパク質などの遺伝子産物をコードする核酸、およびノンコーディングＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡｓ）は、直接望ましい脊椎動物被験体に送達され得るか、あるいはエクスビボで被験体から得られたか又は被験体に由来する細胞に送達され、細胞は被験体へと再移植され得る。脊椎動物被験体へのそのような核酸の送達は、コードされたポリペプチドに対する免疫反応を誘導する、または内因性遺伝子の発現を調節する、遺伝子療法などの多くの目的に望まれている。このアプローチの使用は、遊離ＤＮＡが細胞によって容易に取り上げられず、遊離ＲＮＡがインビボで急速に分解されるため、妨げられてきた。さらに、送達も問題かもしれない。例えば、皮下針を使用する皮下または筋肉内の注射は、被験体において痛み、外傷、および不安を引き起こしかねない。
【０００３】
１つ以上のポリペプチドの送達には、それがタンパク質としての直接、またはコード化ポリヌクレオチドによる間接の送達であっても、ワクチン接種を含む多くの有用な用途がある。ワクチン接種は、感染症と戦い及びそれを根絶をもする有効な手段であると証明されている。例えば、インフルエンザワクチンが、インフルエンザを予防する主要な方法としてＣＤＣによって現在推奨されている。しかしながら、インフルエンザウイルスは突然変異および抗原変異となる割合が高く、予測された循環する病原株に基づいて、毎年新しいワクチンが典型的に生成されている。これには多くの困難が伴う。例えば、ワクチンの有効性は単に予測に基づいたものに過ぎない。優性の株の予測が正しくなければ、ワクチンの有効性はほとんどの人にとって制限される。さらに、集団をワクチン接種するのに十分なインフルエンザワクチンを生成するには数か月かかり得る。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書には、幾つかの実施形態において、ＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスが開示され、該マイクロニードルデバイスは、（ａ）複数のマイクロニードルを含む基板；および（ｂ）複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡを含む組成物、を含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、組換えアルファウイルスレプリコンである。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ分子は脱水される。幾つかの実施形態では、複数のマイクロニードルは、溶解性であるか、生体溶解性であるか、または生分解性である。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、外来抗原または自己抗原である。幾つかの実施形態では、自己抗原は、癌に関連した抗原である。幾つかの実施形態では、外来抗原は、感染病原体に関連した抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、外来抗原または自己抗原に対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスＨＡまたはＮＡのポリペプチドである。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドまたはＢ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドである。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨ１８から選択される群１のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、またはＨ１５から選択される群２のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｂ型インフルエンザウイルスのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統またはビクトリア系統のウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドは、（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または（ｅ）それらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、少なくとも２つの外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドは、（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドの各々は、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドは、（ａ）ポリオウイルスからの抗原；（ｂ）破傷風菌からの抗原；（ｃ）狂犬病ウイルスからの抗原；または（ｄ）それらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは，外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドは、（ａ）  ポリオウイルスからの抗原；（ｂ）  破傷風菌からの抗原；および（ｃ）狂犬病ウイルスからの抗原。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドの各々は，単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは，異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは，外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドは、（ａ）マールブルグウイルスからの抗原；（ｂ）スーダンエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ Ｓｕｄａｎ ｖｉｒｕｓ）からの抗原；（ｃ）ザイールエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ Ｚａｉｒｅ ｖｉｒｕｓ）からの抗原；または（ｄ）それらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは，外因性ポリペプチドをコードし、該外因性ポリペプチドは、（ａ）マールブルグウイルスからの抗原；（ｂ）スーダンエボラウイルスからの抗原；および（ｃ）ザイールエボラウイルスからの抗原を含む。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドの各々は，単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは，異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、マイクロニードルデバイスは、室温での少なくとも１か月の間の保存後に外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効である。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤が、複数のマイクロニードル上にコーティングされるか又はそれらに埋め込まれる。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤はポリペプチドである。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤は、個体における免疫反応を増強する。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤はアジュバントである。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、デンドリマー−レプリコンナノ粒子（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−ｒｅｐｌｉｃｏｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）として製剤される。幾つかの実施形態では、デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーはアミノ表面反応基を含む。幾つかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは修飾されたアミノ表面反応基を含む。幾つかの実施形態では、修飾されたアミノ表面反応基は、フッ素化剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、またはアミノ酸で修飾されている。幾つかの実施形態では、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは細胞透過性ペプチドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。幾つかの実施形態では、フッ素化剤はヘプタフルオロ酪酸無水物である。幾つかの実施形態では、アミノ酸は、アルギニンまたはヒスチジンである。幾つかの実施形態では、デンドリマー−レプリコンナノ粒子は、マイクロ流体混合デバイスによって製剤される。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体分配デバイスを使用して複数のマイクロニードル上にコーティングされる。
【０００５】
本明細書には、幾つかの実施形態において、ＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスが開示され、該マイクロニードルデバイスは、（ａ）複数のマイクロニードルを含む基板；および（ｂ）複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物、を含む。
【０００６】
本明細書には、幾つかの実施形態において、必要としている個体にポリペプチドを送達する方法が開示され、該方法は、本明細書に記載されるマイクロニードルデバイスのいずれか１つを個体に適用する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）工程を含む。本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、マイクロニードルデバイスを調製する方法が開示され、該方法は、（ａ）複数のマイクロニードルを含む基板を得る工程；および（ｂ）外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を含む組成物を複数のマイクロニードル上にコーティングするか又はそれらに埋め込む工程、を含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ分子は組換えアルファウイルスレプリコンである。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは脱水される。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、複数のマイクロニードル上にコーティングされるか又はそれらに埋め込まれる前に脱水される。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた後に脱水される。幾つかの実施形態では、複数の個々のマイクロニードルは、溶解性であるか、生体溶解性であるか、または生分解性である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、デンドリマー−レプリコンナノ粒子として製剤される。幾つかの実施形態において、デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーはアミノ表面反応基を含む。幾つかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、デンドリマー−レプリコンナノ粒子は、マイクロ流体混合デバイスによって生成される。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体分配デバイスを使用して複数のマイクロニードル上にコーティングされる。
【０００７】
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、必要としている個体において免疫反応を誘導する方法が開示され、該方法は、（ａ）個体の皮膚表面をマイクロニードルデバイスと接触させる工程であって、該マイクロニードルデバイスが、（ｉ）複数のマイクロニードルであって、複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む、複数のマイクロニードルを含む、工程、および（ｂ）組換えアルファウイルスレプリコンを個体に送達する工程を含み、それによって、個体において免疫反応を誘導する。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは脱水される。幾つかの実施形態では、複数の個々マイクロニードルは、溶解性であるか、生体溶解性であるか、または生分解性である。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、外来抗原または自己抗原である。幾つかの実施形態では、自己抗原は、癌に関連した抗原である。幾つかの実施形態では、外来抗原は、感染病原体に関連した抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、単独で外来抗原または自己抗原に対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスＨＡまたはＮＡのポリペプチドである。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドまたはＢ型インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドである。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨ１８から選択される群１のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、またはＨ１５から選択される群２のＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｂ型インフルエンザウイルスのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡポリペプチドは、Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統またはビクトリア系統のウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；または（ｅ）それらの組み合わせ、から選択される外因性ポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、（ａ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ１のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｂ）Ａ型インフルエンザウイルスＨ３のサブタイプのウイルス株からのＨＡポリペプチド；（ｃ）Ｂ型インフルエンザウイルスの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド；
または（ｄ）Ｂ型インフルエンザウイルスのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド、から選択される少なくとも２つの外因性ポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドの各々は、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、デンドリマー−レプリコンナノ粒子として製剤される。幾つかの実施形態において、デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーはアミノ表面反応基を含む。幾つかの実施形態では、デンドリマーは、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、デンドリマー−レプリコンナノ粒子は、マイクロ流体混合デバイスによって製剤される。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体分配デバイスを使用して複数のマイクロニードル上にコーティングされる。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、個体において外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤は、マイクロニードル中に又はそれらの上に包装される。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤はポリペプチドである。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤は免疫反応を増強する。幾つかの実施形態では、第２の生物活性剤はアジュバントである。幾つかの実施形態では、皮膚表面は、個体をマイクロニードルデバイスと接触させる前に前処理される。幾つかの実施形態では、個体は、複数のマイクロニードルを含む第２のマイクロニードルデバイスと接触させられ。ここで各マイクロニードルは、マイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、個体は、第２の投与経路によって外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む第２の組成物を投与される。幾つかの実施形態では、第２の投与経路は経口である。幾つかの実施形態では、第２の組成物の経口投与は、個体をマイクロニードルデバイスと接触させる前に行われる。幾つかの実施形態では、第２の組成物の経口投与は、個体をマイクロニードルデバイスと接触させた後に行われる。
【０００８】
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、個体において免疫反応をモニタリングする方法が開示され、該方法は、（ａ）請求項１−４６のいずれか１項のマイクロニードルデバイスを個体に適用する工程；および（ｂ）個体における外因性ポリペプチドに対する免疫反応のレベルを判定するために個体からのサンプルを分析する工程、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明の新規な特徴は、特に添付の請求項に明記されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される実施形態を明記する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られる。
【００１０】
【図１】図１は、被験体への経皮投与のために組換えアルファウイルスレプリコンを生成する典型的な方法を例示する。直鎖ＤＮＡ鋳型は、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンをコードする配列を含む。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列をＲＮＡ転写物へと転写する。４つの非構造性遺伝子（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）および５つの構造遺伝子（カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）を含有している野生型のアルファウイルスレプリコンのカセットも例示される。典型的に、構造遺伝子の１つ以上、しかし好ましくはすべては、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンから除外される。組換えアルファウイルスレプリコンの生成後、それは、マイクロニードルまたはマイクロニードルアレイ中に又はそれらの上に包装される。マイクロニードルは、レプリコンの皮内投与のために被験体の皮膚に適用される。
【図２】図２は、生物活性剤の送達に有用なマイクロニードルの実例を示す。幾つかの実施形態では、ニードルの高さは約１５００ミクロンであり、底辺の直径は約６７０ミクロンである。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、約１ｃｍ２の領域を有するパッチ上のアレイなどのアレイに提供される。
【図３】図３は、ＤＮＡプラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰを含有しているＥＧＦＰ−レプリコンを例示する。
【図４】図４は、ＤＮＡプラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＨＡを含有しているインフルエンザＨＡ−レプリコンを例示する。
【図５】図５は、Ｂ型肝炎表面抗原レプリコンＤＮＡプラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＨＢｓＡｇ２を例示する。
【図６】図６は、ポリペプチドのないレプリコン（「空のレプリコン（ｅｍｐｔｙ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）」）；ＤＮＡプラスミドｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶを例示する。
【図７】図７は、線状の自己複製ＲＮＡレプリコンを例示する。
【図８】図８は、レプリコンＲＮＡの成功したインビトロでの転写を示す典型的なアガロースゲルである。
【図９】図９は、ＥＧＦＰ−レプリコンでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から得られた２４時間および４８時間の細胞溶解物の典型的なＥＧＦＰウエスタンブロットである。未変性の（Ｎａｔｉｖｅ）レプリコンＥＧＦＰは、２６．９ｋＤａのタンパク質であり、一方で商業上得られた陽性対照ＥＧＦＰタンパク質は、３２．７ｋＤａのタンパク質である。
【図１０】図１０は、ＨＡ−レプリコンでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から得られた細胞溶解物の典型的なインフルエンザＨＡタンパク質のウエスタンブロットである。分子量ラダーはレーン１と７に示され、一方でＨＡタンパク質陽性対照（７２ｋＤａ）はレーン２に示される。ＨＡ−レプリコンでトランスフェクトされたサンプルは、レーン４、５、および６に存在する。抗ＨＡ抗体は、ＨＥＫ−２９３細胞溶解物とのいくらかの交差反応性を実証しているが、レーン３において溶解緩衝液のみの陰性対照中に７２ｋＤａのバンドは存在しない。
【図１１】図１１は、ＥＧＦＰ−レプリコンでのトランスフェクションの２４−４８時間後に得られたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞溶解物からのＥＧＦＰ蛍光の典型的な分析である。
【図１２】図１２は、ＥＧＦＰ−レプリコンＲＮＡ対ＥＧＦＰ ｍＲＮＡのＥＧＦＰ蛍光の量の典型的な比較である。
【図１３】図１３は、レプリコンＲＮＡ、Ｇ９デンドリマー、およびデンドリマーレプリコン複合体のサイズの典型的なＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒの特徴づけである。
【図１４】図１４は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓのマイクロ流体混合のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｒｅｐ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ， Ｒｅｐ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ ＃２）または手による混合（残りのサンプル）のいずれかにおけるナノ粒子の集合後に脂質またはデンドリマーで作られたレプリコン粒子のサイズの典型的なＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒの特徴づけである。
【図１５】図１５は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓのマイクロ流体混合のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｒｅｐ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ， Ｒｅｐ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ ＃２）または手による混合（残りのサンプル）のいずれかでナノ粒子の集合後に脂質またはデンドリマーで作られたレプリコン粒子の多分散指数（ＰＤＩ）の例示的Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒの特徴づけである。
【図１６】図１６は、キュビットフルオロメーター（Ｑｕｂｉｔ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）で測定されたＢｉｏＤｏｔ印刷されたマイクロニードルアレイからのＥＧＦＰ ｍＲＮＡの回収を例示する。
【図１７】図１７は、典型的な個々のマイクロニードルのＣＡＤ図面である。
【図１８】図１８は、５ｎＬ １％のコンゴーレッド／ウェル（Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ／ｗｅｌｌ）が装填された典型的な１ｃｍ２のマイクロニードルアレイの写真である（矢じりを参照）。
【図１９】図１９は、Ｚ平面での装填されたマイクロニードルを例示する。
【図２０】図２０は、マウスの背部皮膚に適用されたマイクロニードルアレイのパッチを例示する。
【図２１】図２１は、ＥＧＦＰタンパク質を含有しているマイクロニードルアレイのパッチで処置されたマウスの背部皮膚におけるＥＧＦＰ蛍光を例示する。
【図２２】図２２は、ＥＧＦＰ−レプリコンＲＮＡでコーティングされたがマイクロニードルアレイのパッチで処置されたマウスの２８日目の血清から得られたＥＧＦＰ抗体の産生と力価を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書には、幾つかの実施形態において、必要としている被験体への送達のために製剤される自己複製ＲＮＡまたはレプリコンＲＮＡを含む組成物、それらを調製する方法、およびワクチン接種または遺伝子療法などのために、組成物をそれらを必要としている被験体に投与する方法が開示される。
【００１２】
幾つかの実施形態では、組成物は、マイクロニードルまたはマイクロニードルのアレイ上コーティングされたか又はそれらに埋め込まれた、生物活性剤（例えば、外因性ポリペプチドをコードする、ポリペプチド、あるいは組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子）を含む。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、マイクロニードル上にコーティングされるか又はそれに埋め込まれるか、あるいは脱水型である。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロニードルに埋め込まれる。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロニードル上にコーティングされる。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、浸漬によってマイクロニードル上にコーティングされ、その後、コーティングされたアルファウイルスレプリコンが脱水される。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体分配デバイスによってマイクロニードル上にコーティングされ、その後、コーティングされたアルファウイルスレプリコンが脱水される。幾つかの実施形態では、マイクロ流体分配デバイスは、ＢｉｏＤｏｔプリンター、または類似したデバイスである。
幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコン−デンドリマーナノ粒子へと製剤される。幾つかの実施形態において、デンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、デンドリマーは、アミノ表面反応基を有するＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、アミノ表面反応基を有するＰＡＭＡＭデンドリマーは、Ｇ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、デンドリマーは、修飾された（例えば、フッ素化された）アミノ表面反応基を含むＰＡＭＡＭデンドリマーである。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコン−デンドリマーナノ粒子は、手による混合によって製剤される。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコン−デンドリマーナノ粒子は、マイクロ流体混合デバイスによって製剤される。幾つかの実施形態では、マイクロ流体混合デバイスは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ、または類似したデバイスである。
【００１３】
＜特定の用語＞
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。それらは、あらゆる長さのヌクレオチドの高分子形態、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、あるいはそれらのアナログを指す。下記はポリヌクレオチドの限定しない実施例である：遺伝子または遺伝子断片のコード領域またはノンコーディング領域、連鎖解析から定義された遺伝子座、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集合の前または後に与えられる。幾つかの実施形態では、ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって妨げられる。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などによって、重合後にさらに修飾される。
【００１４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、あらゆるタンパク質、ペプチド、タンパク質断片、またはそれらの成分である。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、自然界で自然発生するタンパク質または通常自然界で見られないタンパク質である。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、大部分が標準の２０のタンパク質構築アミノ酸から成るか、あるいは非標準のアミノ酸を組み込むように修飾される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、リン酸化、アセチル化、アシル化、ホルミル化、アルキル化、メチル化を含む、任意の数の生化学的官能基の添加、脂質添加（例えば、パルミトイル化、ミリストイル化、プレニル化など）および炭水化物添加（Ｎ結合およびＯ結合したグリコシル化など）によって、典型的に宿主細胞により修飾される。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、ジスルフィド架橋またはタンパク質切断の形成などの宿主細胞中の構造変化を受ける。
【００１５】
一般に、「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列のそれぞれ正確なヌクレオチド間またはアミノ酸間の一致を指す。典型的に、配列同一性を判定するための技術は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を判定すること及び／又はそれによってコードされたアミノ酸配列を判定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。あらゆる適切な技術が、本明細書の開示によって熟考される。幾つかの実施形態では、２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）が、それらの「パーセント同一性」を判定することによって比較される。幾つかの実施形態では、配列同一性の望ましい程度の範囲は、およそ８０％−１００％およびそれらの間の整数値である。幾つかの実施形態では、開示される配列と請求される配列との間のパーセント同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。
【００１６】
用語「被験体」、「個体」、および「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、哺乳動物は、限定されないが、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌｓ）、およびペットを含む。幾つかの実施形態では、インビボで得られたか又はインビトロで培養された組織、細胞、およびそれらの生物学的存在の子孫が包含される。本明細書で使用されるようなこれらの用語はどれも、医療従事者の監督を含意しない。
【００１７】
本明細書で使用されるように、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために利用されているデバイスまたは方法に関する誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００１８】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、請求される主題が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。前述の一般的な説明および次の詳細な説明が、単に典型的且つ例示的なものであり、請求される主題を限定するものでないことを理解されたい。本出願では、単数形の使用は、特に他に明記されない限り、複数形を包含している。本明細書および添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が特に他に明確に指示していない限り、複数の指示対象を包含することが留意されなければならない。本出願では、「または」の使用は、特に他に明記されない限り、「及び／又は」を意味する。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）などの他の形態と同様に、列挙される項目をそれだけで限定するように意図されていない。本明細書で使用されるセクションの表題は、構成上の目的のみにあり、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。
【００１９】
＜マイクロニードルおよびマイクロニードルアレイ＞
本明細書には、幾つかの実施形態において、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスが開示され、該マイクロニードルデバイスは、複数のマイクロニードルを含む基板；および複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子を含む組成物を含む。本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、マイクロニードルデバイスを調製する方法が開示され、該方法は、複数のマイクロニードルを含む基板を得る工程；および外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを複数のマイクロニードル上にコーティングするか又はそれらに埋め込む工程を含む。本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、必要としている個体において免疫反応を誘導する方法が開示され、該方法は、（ａ）個体の皮膚表面をマイクロニードルデバイスと接触させる工程であって、該マイクロニードルデバイスが、（ｉ）複数のマイクロニードルであって、複数のマイクロニードル上にコーティングされたか又はそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む、複数のマイクロニードルを含む、工程、および（ｂ）組換えアルファウイルスレプリコンを個体に送達する工程を含み、それによって、個体において免疫反応を誘導する。
【００２０】
マイクロニードルは、典型的にマイクロメートルからミリメートルのサイズの構造であり、好ましくは、皮膚を貫通し、被験体の表皮または真皮に組成物を送達するように設計される。マイクロニードルは、従来の皮下または筋肉内の注射を超える幾つかの利点を提供する。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、レプリコンを直接皮膚における免疫細胞に送達するために使用され、これは免疫化の目的で利点がある。従来の皮下または筋肉内の注射と比較した、マイクロニードルの適用に必要とされるレプリコンの量は少なく、生産コストおよび時間を削減することができる。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは自己適用される（ｓｅｌｆ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）。幾つかの実施形態では、レプリコンは、マイクロニードル上で乾燥され、これは、室温で組成物の安定性を大幅に増大させる。マイクロニードルの適用は無痛であり、これによって、より耐容性のある投与の形態となる。
【００２１】
幾つかの実施形態では、マイクロニードルは固体構造である。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは中空構造である。幾つかの実施形態では、送達のための生物活性剤（例えば、ポリペプチドあるいは組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子）は、中空構造によって放出される（例えば、液体組成物は皮膚に注射または注入される）。幾つかの実施形態では、生物活性剤（例えば、ポリペプチドあるいは組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子）は、マイクロニードル上に包装される（例えば、形成後にマイクロニードルの表面上にコーティングされる）。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、乾燥型としてマイクロニードル上に包装される。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、マイクロニードル上に包装された後に脱水される。幾つかの実施形態では、組成物は、マイクロニードル中に包装される（例えば、マイクロニードルの内部への堆積、またはマイクロニードルを形成するために使用される混合物への含有などによって、マイクロニードル自体の部分を形成する）。幾つかの実施形態では、レプリコンは、皮膚コンパートメント中に溶解される。幾つかの実施形態では、レプリコンは、皮膚に注射される。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、複数のマイクロニードルを含むアレイにおいて形成される。幾つかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、マイクロニードルの５ｘ５アレイである。幾つかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、固体支持体または基板に物理的に又は動作可能に連結される。幾つかの実施形態では、固体支持体はパッチである。幾つかの実施形態では、マイクロニードルアレイは、組成物の皮内投与のために直接皮膚に適用される。
【００２２】
マイクロニードルアレイのパッチは、適切な形状またはサイズであり得る。幾つかの実施形態では、マイクロニードルアレイのパッチは、顔面特徴、例えば眉を模倣するために形作られる。幾つかの実施形態では、マイクロニードルアレイのパッチは、選択される量の生物活性剤を送達することが可能な最も小さなサイズである。
【００２３】
マイクロニードルのサイズおよび形状は、望まれるように変更される。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、先端を有する円錐部分に物理的に又は動作可能に連結された円筒部分を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、全体的なピラミッド形状または全体的な円錐形状を有している。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、底部および先端を含む。幾つかの実施形態では、先端の半径は、約１マイクロメートル以下である。幾つかの実施形態では、マイクロニードルの長さは、角質層を貫通し、表皮または真皮へと通すのに十分な長さである。特定の実施形態では、マイクロニードルの長さは、（それらの先端から底部まで）約０．１マイクロメートルから約５ミリメートルの間、例えば、約５ミリメートル以下、４ミリメートル以下、約１ミリメートルから約４ミリメートルの間、約５００マイクロメートルから約１ミリメートルの間、約１０マイクロメートルから約５００マイクロメートルの間、約３０マイクロメートルから約２００マイクロメートルの間、または約２５０マイクロメートルから約１，５００マイクロメートルの間の長さである。幾つかの実施形態では、マイクロニードルの長さは、（それらの先端から底部まで）約４００マイクロメートルから約６００マイクロメートルの間の長さである。
【００２４】
幾つかの実施形態では、個々のマイクロニードルのサイズは、特定の組織型における破損を回避するために、ニードルの望ましい標的深さ又は強度の要件に応じて最適化される。幾つかの実施形態では、経皮的なマイクロニードルの断面寸法は、約１０ｎｍから１ｍｍの間、約１マイクロメートルから約２００マイクロメートルの間、または約１０マイクロメートルから約１００マイクロメートルの間である。幾つかの実施形態では、中空ニードルの外径は、約１０マイクロメートルから約１００マイクロメートルの間であり、中空ニードルの内径は、約３マイクロメートルから約８０マイクロメートルの間である。
【００２５】
マイクロニードルは、様々な異なるパターンで配置され得る。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、長方形または正方形のグリッドまたは同心円などの均一の方法で間隔を置かれる。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、長方形のグリッドの外周上などの、基板の外周上で間隔を置かれる。幾つかの実施形態では、間隔は、マイクロニードルの高さ及び幅、マイクロニードルの表面に適用されるフィルムの特性の他に、マイクロニードルに通して移動されるように意図される物質の量およびタイプを含む、多数の因子に左右される。幾つかの実施形態では、マイクロニードルの配置は、約５０マイクロメートル以上、約１００マイクロメートルから約８００マイクロメートル、または約２００マイクロメートルから約６００マイクロメートルのマイクロニードル間の「先端間（ｔｉｐ−ｔｏ−ｔｉｐ）」の間隔である。
【００２６】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、適切な材料でできている。実例となる材料は、金属、セラミックス、半導体、有機物、ポリマー、および合成物を含む。幾つかの実施形態では、製造用材料は、限定されないが、医薬品グレードのステンレス鋼、金、チタン、ニッケル、鉄、金、スズ、クロム、銅、これらまたは他の金属の合金、ケイ素、二酸化ケイ素、およびポリマーを含む。幾つかの実施形態では、ポリマーは、生分解性ポリマーまたは非生物分解性ポリマーである。代表的な生分解性ポリマーは、限定されないが、乳酸およびグリコール酸のポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリドなどのヒドロキシ酸のポリマー、およびＰＥＧ、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）とポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）を有するコポリマーを含む。代表的な非生物分解性ポリマーは、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレン酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリエステルを含む。
【００２７】
幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、溶解性、生体溶解性、または生分解性であるか、またはそれらの組み合わせである。「生分解性」は、細菌または別の生物によって分解される物質または物体を指すために使用される。適切な溶解性、生体溶解性、及び／又は生分解性のマイクロニードルは、本明細書に開示される組成物および方法との使用のために熟考される。幾つかの実施形態では、溶解性、生体溶解性、または生分解性のマイクロニードルは、水溶性物質で構成されている。幾つかの実施形態では、これらの物質は、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、マルトース、デキストロース、ガラクトース、アルギン酸塩、アガロース、セルロース（カルボキシメチルセルロースまたはヒドロキシプロピルセルロースなど）、デンプン、ヒアルロン酸、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、選択される物質は、皮膚への浸透を可能にするのに十分に弾性である。幾つかの実施形態では、溶解性のマイクロニードルは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、５０、６０、１２０、１８０秒、またはそれを超える秒などの数秒以内に皮膚中に溶解する。幾つかの実施形態では、溶解性のマイクロニードルは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、６０、または１２０分、またはそれを超える分などの数分以内に皮膚中に溶解する。幾つかの実施形態では、溶解性のマイクロニードルは、溶解性部分（マイクロニードルの先端など）および非溶解性部分（マイクロニードルの底部など）を含み、その結果、マイクロニードル構造の一部が皮膚中に溶解する。幾つかの実施形態では、溶解性のマイクロニードルは、マイクロニードル全体を包含し、その結果、マイクロニードル構造全体が皮膚中に溶解する。幾つかの実施形態では、溶解性のコーティングが、非溶解性の支持構造上に形成され、その結果、コーティングのみが皮膚中に溶解する。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、溶解性、生分解性、生体溶解性、またはそれらの組み合わせであるポリマーでコーティングされる。
【００２８】
幾つかの実施形態では、レプリコン組成物は、溶解性、生分解性、または生体溶解性のマイクロニードル上に直接コーティングされる。幾つかの実施形態では、レプリコン組成物は、（例えば、溶解性のポリマーマトリックスの部分を形成することによって）溶解性、生分解性、または生体溶解性のマイクロニードル自体内に含有される。幾つかの実施形態では、レプリコン組成物は、マイクロニードル構造の成形および重合前にポリマーマトリックスと混合される。
【００２９】
マイクロニードルを製造する様々な方法が利用可能であり、あらゆるマイクロニードルまたはマイクロニードルアレイを製造する適切な方法が、本明細書に開示される組成物および方法との使用のために熟考される。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、限定されないが、成形（例えば、自己成形、マイクロ成形、マイクロエンボス加工、マイクロインジェクションなど）、鋳造（例えば、ダイカスト）、またはエッチング（例えば、ソフトマイクロリソグラフィー技術（ｓｏｆｔ ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ））を含む、適切な方法を使用して製造される。製造の方法は、利用される物質に左右される。
【００３０】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、用語「生物学的に活性」および「生物活性」は、生物学的効果を有している組成物または化合物自体、あるいは生物学的効果を有している第２の分子の活性と結合する、反応する、それを修正する、引き起こす、促進する、増強する、ブロックする、または低減する組成物または化合物を指す。幾つかの実施形態では、第２の分子は内因性分子である。幾つかの実施形態では、第２の分子は外因性分子である。幾つかの実施形態では、「生物学的効果」は、限定されないが、免疫反応応答を刺激するか又は引き起こす；（例えば、動物における）細胞、組織、または生物中の生物学的プロセスに影響を与える；病原体または寄生生物中の生物学的プロセスに影響を与える；あるいは検出可能なシグナルを生成するまたは生成する原因となる、効果を含む。幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組成物、複合体、または化合物は、使用される、調査的、治療的、予防的、及び／又は診断的な方法および組成物に使用される。幾つかの実施形態では、生物学的に活性な組成物、複合体、または化合物は、細胞、組織、臓器、または生物（例えば、動物）に対する望ましい効果を引き起こすか又は刺激するように作用する。望ましい効果の限定しない例は、限定されないが、細胞、組織、臓器、または生物において遺伝子発現を調節する、阻害する、または増強すること；患っている動物の疾患または疾病を予防する、処置する、または治療すること；感染した動物における病原体の成長を制限する又はそれを死滅させること；動物の表現型または遺伝子型を増強すること；動物における予防的な免疫反応応答を刺激すること；および動物の疾患または障害を診断すること、を含む。
【００３１】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、本明細書に記載される組換えアルファウイルスレプリコンである。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかなどの、ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態では、生物活性剤は抗原を含む。幾つかの実施形態では、生物活性剤は抗原のエピトープを含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含み、ポリペプチドをさらに含む。例えば、生物活性剤として有用なポリペプチドは、インフルエンザウイルス抗原、例えば、血球凝集素（ＨＡ）である。幾つかの実施形態では、レプリコン組成物は、ＨＡタンパク質をコードするレプリコンＲＮＡおよび１つ以上の異なるＨＡタンパク質のエピトープを含む生物活性分子を含む。幾つかの実施形態では、レプリコン組成物は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードするレプリコンＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、免疫反応を増強するポリペプチド（例えば、抗原またはアジュバント）である。
【００３２】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、２つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、３つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、４つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、５つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、６つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、７つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、８つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、９つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、１０の異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、同じタイプである（例えば、それぞれが異なるポリペプチドをコードする、複数のアルファウイルスレプリコン）。幾つかの実施形態では、単一のアルファウイルスレプリコンは、複数の生物活性剤（例えば、複数の外因性ポリペプチド）をコードする。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドはそれぞれ、別々のアルファウイルスレプリコンによってコードされる。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、異なるタイプである（例えば、アルファウイルスレプリコンおよびポリペプチドを含む）。
【００３３】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、２つの生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、２つの異なる組換えアルファウイルスレプリコン、２つの異なるポリペプチド、または１つの組換えアルファウイルスレプリコンと１つのポリペプチドなどの、２つの異なる生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、２つの異なる組換えアルファウイルスレプリコンを含み、それら各々は異なるポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、２つの異なるポリペプチドをコードする単一の組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコンおよびインフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン（二価ワクチン）を含む。幾つかの実施形態では、単一のアルファウイルスレプリコンは、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチドおよびインフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチドおよびインフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチドは、別々のアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、ポリペプチドおよび同じポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコン（例えば、インフルエンザＨ１ポリペプチドおよびインフルエンザＨ１ポリペプチドをコードするレプリコン）などの、２つの生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、ポリペプチドおよび異なるポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコン（例えば、インフルエンザＨ１ポリペプチドおよびインフルエンザＨ３ポリペプチドをコードするレプリコン）などの、２つの異なる生物活性剤を含む。
【００３４】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、３つの生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、３つの異なる組換えアルファウイルスレプリコンを含み、それら各々は異なるポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、３つの異なるポリペプチドをコードする単一の組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン、インフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン、およびＢ型インフルエンザＨＡウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン（三価ワクチン）を含む。幾つかの実施形態では、単一のアルファウイルスレプリコンは、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチド、インフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチド、およびＢ型インフルエンザＨＡウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチド、インフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチド、およびＢ型インフルエンザＨＡウイルス株からのＨＡポリペプチドは、３つの別々のアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、３つの異なる生物活性剤を含み、ここで生物活性剤の少なくとも１つはポリペプチドである。
【００３５】
幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、４つの生物活性剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、４つの異なる組換えアルファウイルスレプリコンを含み、それら各々は異なるポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、４つの異なるポリペプチドをコードする単一の組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン、インフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン、Ｂ型インフルエンザの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン、およびＢ型インフルエンザのビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするレプリコン（４価ワクチン）を含む。幾つかの実施形態では、単一のアルファウイルスレプリコンは、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチド、インフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチド、Ｂ型インフルエンザの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド、およびＢ型インフルエンザビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードする。幾つかの実施形態では、インフルエンザＨ１ウイルス株からのＨＡポリペプチド、インフルエンザＨ３ウイルス株からのＨＡポリペプチド、Ｂ型インフルエンザの山形系統のウイルス株からのＨＡポリペプチド、およびＢ型インフルエンザビクトリア系統のウイルス株からのＨＡポリペプチドは、４つの別々のアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は４つの異なる生物活性剤を含み、ここで生物活性剤の少なくとも１つはポリペプチドである。幾つかの実施形態では、単一のアルファウイルスレプリコンは、本明細書に開示される外因性ポリペプチドのいずれかなどの、５つの外因性ポリペプチドをコードする。
【００３６】
幾つかの実施形態では、生物活性剤はアジュバントである。典型的なアジュバントは、限定されないが、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム）；スクアレン；サポニン（ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭＳ）、膜タンパク質抗原に複合したサポニン（免疫刺激複合体）；鉱油を有するプルロニックポリマー、鉱油中の死滅させられたマイコバクテリア、油相中に死滅させられた／乾燥されたマイコバクテリアを含有している鉱油中水型エマルジョン、マイコバクテリアのないより弱い製剤；フロインド完全アジュバント；フロインド不完全アジュバント；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）とリポ多糖（ＬＰＳ）、ＭＰＬに加えて、リピドＡなどの、細菌産物；リポソーム、樹木のキラヤ・サポナリア（ｔｒｅｅ Ｑｕｉｌｌｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）から抽出された膜活性グルコシド（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｃｔｉｖｅ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤；タンパク質を細胞表面に結合する傾向がある代謝されていない合成分子；感染性粒子；水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）；ＣｐＧ（オリゴヌクレオチド）−ＴＬＲアゴニスト；およびイミキモドおよび免疫ペプチドのような他のＴＬＲアゴニスト、を含む。
【００３７】
幾つかの実施形態では、生物活性剤はマイクロニードル上に包装される。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、マイクロニードルに包装されるか又は埋め込まれる。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態では、生物活性剤は、組換えアルファウイルスレプリコンである。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、マイクロニードルに又はその上に包装する前に脱水される。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、マイクロニードルに又はその上に包装した後に脱水される。幾つかの実施形態では、マイクロニードルは、レプリコンの単位用量で個々に包装される。幾つかの実施形態では、単位用量は、被験体において外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効である。幾つかの実施形態では、単位用量は、室温での少なくとも約１週間（例えば、約１、２、３、４、６、８、１２週間、またはそれ以上の週）の保存後に、被験体において外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効である。幾つかの実施形態では、単位用量は、室温での少なくとも約１か月間（例えば、約１、２、３、４、６、８、１０、１２か月間、またはそれ以上の月）の保存後に、被験体において外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、被験体において外因性ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、単独で外来抗原または自己抗原に対する免疫反応を誘導するのに有効な量で存在する。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンの量は、処置される個体の健康および体調、年齢、処置される個体の分類群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類、ヒトなど）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望ましい保護の程度、ワクチンの製剤、および他の関連要因によって様々である。幾つかの実施形態では、特定の組成物のポリペプチドおよびＲＮＡの含量は、１用量当たりのＲＮＡの量によって表わされる。幾つかの実施形態では、ＲＮＡの用量は、≦１００μｇ（例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇまたは１００μｇなどの、１０−１００μｇ）である。幾つかの実施形態では、はるかに低いレベル（例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量）で、発現が見られる。
【００３８】
＜自己複製ＲＮＡ分子＞
幾つかの実施形態では、マイクロニードルへの又はそれら上への送達のために包装された生物活性剤は、レプリコンである。「レプリコン」は、自己複製核酸分子などにおける、全体的に又は部分的に自己複製を受けることができるＤＮＡまたはＲＮＡの分子を指す。好ましい実施形態では、レプリコンはＲＮＡ分子である。レプリコンＲＮＡは、コードされたタンパク質の産生を実質的に増幅することができ、これは、標的細胞における翻訳およびタンパク質産生の保持につながる。幾つかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ウイルスに基づくか又は由来する。様々な適切なウイルス（例えば、ＲＮＡウイルス）が利用可能であり、それらは、限定されないが、ピコルナウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、ペスチウイルス、ルビウイルス、カリシウイルス（ｃａｌｃｉｖｉｒｕｓ）、およびヘパシウイルスを含む。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンはアルファウイルスに由来する。幾つかの実施形態では、レプリコンはプラス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）であり、それによって、逆転写などの中間の複製工程を必要とせずに宿主細胞によって直接翻訳される。幾つかの実施形態では、レプリコンは、マイナス鎖のウイルスに由来する。幾つかの実施形態では、マイナス鎖のウイルスに由来するレプリコンは、センダイウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスからのものである。幾つかの実施形態では、プラス鎖のレプリコンは、宿主細胞に送達されるときに直接翻訳され、それにより、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが生成され、これは、その後、送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方を産生する。幾つかの実施形態では、これらのＲＮＡ転写物は直接翻訳され、それによって、宿主細胞はコードされたポリペプチドを産生するか、あるいはＲＮＡ転写物はさらに転写されて、より多くのコードされたポリペプチドを産生するために宿主細胞によって翻訳される、より多くの転写物が産生される。
【００３９】
好ましい実施形態では、レプリコンはアルファウイルスに由来する。アルファウイルス属は、トガウイルス科に属しており、２８の既知のウイルス種を含有している。プラスセンス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）のアルファウイルスゲノムは、典型的に、２つのオープンリーディングフレームを含有しており、４つの非構造性タンパク質（ｎｓＰ１−４）および５つの構造タンパク質（カプシド、Ｅ３、Ｅ２、Ｅ１、および６Ｋ）をコードする。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く。構造タンパク質をコードする遺伝子の除外は、ウイルス複製を防ぐ。幾つかの実施形態では、構造タンパク質をコードする遺伝子は、外因性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡと取り替えられ、それによって、宿主細胞は大量の外因性ポリペプチドを産生するが、感染性ウイルス粒子を産生しない。
【００４０】
本開示に従うレプリコンの要素の提供に適した様々なアルファウイルスが利用可能である。幾つかの実施形態では、レプリコン配列は、野生型アルファウイルス配列を含む。幾つかの実施形態では、レプリコン配列は、突然変異したアルファウイルス配列を含む。幾つかの実施形態では、アルファウイルスに由来するレプリコンは、基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）野生型アルファウイルスレプリコン、またはその一部（例えば、非構造性遺伝子またはそれらの部分）に対して少なくとも約８０％、８５％  ９０％  ９５％またはそれ以上同一である配列要素（例えば、外因性ポリペプチドをコードする配列の複製を促進する要素）を含む。幾つかの実施形態では、アルファウイルスに由来する配列要素は、長さが５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、またはそれ以上のヌクレオチドである。実例となるアルファウイルスは、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）などの寄託機関から利用可能であり、アウラ（Ａｕｒａ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）、カバソウ（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２７）、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−１２７７）、ミデルバーグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）、トリニティ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）、ウナ（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳炎（ＡＴＣＣ ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）を含む。幾つかの実施形態では、複数の異なるアルファウイルスからの配列を含む、キメラアルファウイルスレプリコンが使用される。幾つかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはそれらの組み合わせに由来する。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルスに由��する。
【００４１】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、外因性の転写物またはポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に送達するためのベクターとして使用される。幾つかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、宿主細胞に送達されたときに、ポリペプチドまたは活性転写物の産生を結果としてＲＮＡ配列を含有している。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ配列は、選択されるポリペプチドに対する遺伝子コードを含有しており、ＲＮＡレプリコンは、そのポリペプチドまたは活性ＲＮＡを「コードする」と言われている。用語「外因性」は、ウイルスのレプリコンによって通常コードされない分子（例えば、ポリペプチド、核酸など）を指すために使用される。幾つかの実施形態では、含む組換えポリヌクレオチドを産生するために、外因性の配列は組換え技術または人工合成によって外因性配列がアルファウイルスレプリコンへと挿入される。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、組換えレプリコンのアルファウイルス配列部分が由来するアルファウイルス以外の生物に由来する。幾つかの実施形態では、レプリコンは、外因性ポリペプチドをコードするように改変され、それにより、宿主細胞への改変されたＲＮＡレプリコンの送達は、結果として宿主細胞による大量の外因性ポリペプチドの産生をもたらす。
【００４２】
組換えレプリコンを産生する様々な方法が利用可能である。幾つかの実施形態では、インビトロでの転写（ＩＶＴ）技術によって実験室で組換えレプリコンが生成される。幾つかの実施形態では、ＩＶＴは、ｃＤＮＡ、線状化した細菌プラスミドなどの直鎖ＤＮＡ鋳型、またはＰＣＲ産物を使用する。幾つかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡ合成を開始するためにＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素に特異的なプロモーター配列を有している。あらゆる適切な技術が熟考されるが、ＤＮＡ鋳型は、典型的に細菌プラスミドにおいて生成され、伝播されるか、または合成的に（例えば、ＰＣＲまたは当該技術分野に既知の他の合成ＤＮＡ方法）作成される。幾つかの実施形態では、直鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ）を使用するインビトロでの酵素反応のための鋳型として作用し、結果として、鋳型ＤＮＡ分子のＲＮＡ転写物（「コピー」）がもたらされる。そのようなプロセスに有用なバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの例としては、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。幾つかの実施形態では、鋳型ＤＮＡは、４つの非構造性遺伝子（例えば、ｎｓＰ１−４）および外因性ポリペプチドをコードする配列を含むアルファウイルスレプリコンを含み、それによって、ｍＲＮＡ転写物は、アルファウイルスの非構造性遺伝子（例えば、ｎｓＰ１−４）および外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含むようになる。アルファウイルスレプリコンを生成する方法が利用可能であり、アルファウイルスレプリコンを産生する適切な方法が、本明細書に開示される組成物および方法との使用のために熟考される。
【００４３】
本開示に従う開示された組換えアルファウイルスレプリコンの長さは、様々である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、長さが約４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、またはそれ以上のヌクレオチドである。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、長さが５０００−２５０００のヌクレオチド（例えば、８０００−１５０００のヌクレオチド、または９０００−１２０００のヌクレオチド）である。幾つかの実施形態では、レプリコンは５’キャップを含む。幾つかの実施形態では、５’キャップは７−メチルグアノシンである。幾つかの実施形態では、５’キャップは、ＲＮＡのインビボでの翻訳を増強する。
【００４４】
幾つかの実施形態では、レプリコンの５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有する。幾つかの実施形態では、キャッピングされたＲＮＡにおいて、５’三リン酸基は、５’間の架橋によって７−メチルグアノシンに連結される。幾つかの実施形態では、５’三リン酸塩は、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強し、それ故、アジュバント効果を促進する。幾つかの実施形態では、レプリコンは３’ポリ−Ａテールを含む。幾つかの実施形態では、レプリコンは、その３’末端近くにポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含む。幾つかの実施形態では、被験体への送達のためのレプリコンは、一本鎖である。幾つかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＲＮＡヘリカーゼ、及び／又はＰＫＲへの結合によってアジュバント効果を発揮し始める。幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、二本鎖形態（ｄｓＲＮＡ）で送達され、ＴＬＲ３に結合する。幾つかの実施形態では、ＴＬＲ３は、一本鎖ＲＮＡの複製の間に又は一本鎖ＲＮＡの二次構造内に形成されるｄｓＲＮＡによって引き起こされる。幾つかの実施形態では、レプリコンは、（あらゆる５’キャップ構造に加えて）修飾された核酸塩基を有する１つ以上のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、自己複製ＲＮＡは、プソイドウリジン及び／又は５−メチルシトシン残基などの、１つ以上の修飾されたピリミジン核酸塩基を含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾された核酸塩基を含まない。幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドを含まない（例えば、ＲＮＡ中のヌクレオチドはすべて、幾つかの実施形態において、７’−メチルグアノシンを含む、あらゆる５’キャップ構造を除く、標準のＡ、Ｃ、ＧおよびＵのリボヌクレオチドである）。幾つかの実施形態では、レプリコンは、７’−メチルグアノシンを含む５’キャップを含むＲＮＡであり、最初の１、２、３、またはそれ以上の５’リボヌクレオチドは、リボースの２’ＯＨ位置で修飾される。様々な２’ＯＨリボース修飾が利用可能であり、本明細書に開示される組成物および方法との使用のために熟考される。２’ＯＨ修飾の例としては、限定されないが、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−ＭＯＥ、２’−アミノ、および２’−Ｆが挙げられる。幾つかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合のみを含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、または他の結合（ｌｉｎｋａｇｅｓ）（２’−４’−ロックド／架橋糖（２'−４'−ｌｏｃｋｅｄ／ｂｒｉｄｇｅｄ ｓｕｇａｒｓ）（例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、またはＵＮＡ）など）を含む。
【００４５】
幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドをコードするＲＮＡレプリコンは、それらを必要としている被験体への送達のために調製される。幾つかの実施形態では、本開示に従う組換えアルファウイルスレプリコンは、ワクチン接種に使用される。幾つかの実施形態では、本開示に従う組換えアルファウイルスレプリコンは、ワクチン接種または遺伝子療法に使用される。幾つかの実施形態では、ワクチン接種に使用されるレプリコンは、１つ以上の抗原ポリペプチド（「抗原」または「免疫原」とも呼ばれる）をコードし、液性免疫反応、細胞性免疫反応、またはその両方によって媒介された被験体の適応免疫系を活性化することなどによって、被験体における免疫原性反応を生成することができる。幾つかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の抗原が、１つ以上のレプリコン（例えば、複数の抗原をコードする１つのレプリコン、または異なる抗原をコードする複数のレプリコン）においてコードされる。幾つかの実施形態では、抗原は、外来抗原または自己抗原である。一般に、用語「自己抗原」は、被験体にとってネイティブな免疫原性の抗原または抗原決定基を指す。幾つかの実施形態では、自己抗原は、癌に関連した抗原である。「外来抗原」は、感染病原体、化学物質、花粉などに由来する抗原などの、自己抗原でない抗原を指す。幾つかの実施形態では、外来抗原は感染病原体に由来する。典型的な感染病原体は、限定されないが、細菌、ウイルス、原生生物、菌類、プリオン、蠕虫類および他の寄生生物、およびそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、本開示における感染病原体に由来する外来抗原は、病原性である感染病原体に由来する。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるレプリコンまたはポリペプチドベースのワクチンは、未処置の集団と比較して、処置された集団において、感染の発生率を低下させる（少なくとも約１０％、２０％  ３０％  ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上など）、感染を確立するのに必要な感染性粒子の平均数を増加させる（少なくとも約２５％、５０％、１００％、２５０％、５００％、またはそれ以上など）、または関連する疾患の平均持続時間を短縮する（少なくとも約１０％、２０％  ３０％  ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上など）ことなどによって、保護効果を提供する。幾つかの実施形態では、保護効果は、適切な動物モデルにおいて、または処置された及び未処置の集団の疫学調査によって測定される。幾つかの実施形態では、抗原は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、またはそれ以上のアミノ酸を含むか又はそれらから成る。幾つかの実施形態では、特定のソースに由来する抗原は、典型的に、抗原の長さにわたって由来する配列に最適に並べられたときに、ヌクレオチドまたはアミノ酸のレベルで約８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有している。
【００４６】
幾つかの実施形態では、本開示の組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされた抗原は、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タンパク質である。幾つかの実施形態では、本開示の組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされた抗原は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質である。幾つかの実施形態では、ＨＡは、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型のインフルエンザウイルスのウイルス株に由来する。幾つかの実施形態では、抗原は、Ａ型インフルエンザウイルスのウイルス株に由来し、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、またはＨＡ１８を含む１つ以上のＨＡサブタイプを含む。幾つかの実施形態では、各々が異なるＨＡをコードする複数のレプリコンが使用され、それによって、１つを超えるＨＡに対する免疫原性反応が誘発される。幾つかの実施形態では、複数の異なるＨＡポリペプチドをコードする単一のレプリコンが使用され、それによって、１つを超えるＨＡに対する免疫原性反応が誘発される。幾つかの実施形態では、レプリコン組成物は、単価（ワクチンが、１つのＨＡサブタイプ抗原、例えばＨ１などの、１つのインフルエンザ株から保護する）、二価（ワクチンが、２つのＨＡサブタイプ抗原、例えば、Ｈ１、Ｈ３などの、２つのインフルエンザ株から保護する）三価（ワクチンが、３つのＨＡサブタイプ抗原、例えば、Ｈ１、Ｈ３、および循環するＢ型インフルエンザ株などの、３つのインフルエンザ株から保護する）、四価（ワクチンが、４つのＨＡサブタイプ抗原、例えばＨ１、Ｈ３、Ｂ型インフルエンザの山形、およびＢ型インフルエンザのビクトリアなどの、４つのインフルエンザ株から保護する）、またはより高い結合価である。幾つかの実施形態では、ＨＡ抗原は、特定の季節に病原を引き起こす優性のインフルエンザ株（または最も優性であると予測された株）に基づいて決定される。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は二価であり、Ａ型インフルエンザＨ１ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチドおよびＡ型インフルエンザＨ３ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、二価のＨＡポリペプチドは、同じアルファウイルスレプリコンにおいてコードされる。幾つかの実施形態では、二価のＨＡポリペプチドは、別のアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は三価であり、Ａ型インフルエンザＨ１ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド；
Ａ型インフルエンザＨ３ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド；および循環するＢ型インフルエンザウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド、をコードするアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、三価のＨＡポリペプチドは、同じアルファウイルスレプリコンにおいてコードされる。幾つかの実施形態では、三価のＨＡポリペプチドは、別のアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、マイクロニードル組成物は４価であり、Ａ型インフルエンザＨ１ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド；Ａ型インフルエンザＨ３ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド；Ｂ型インフルエンザの山形系統ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド；およびＢ型インフルエンザのビクトリア系統ウイルスのウイルス株からのＨＡポリペプチド、をコードするアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、４価のＨＡポリペプチドは、同じアルファウイルスレプリコンにおいてコードされる。幾つかの実施形態では、４価のＨＡポリペプチドは、別のアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、免疫原性組成物のために選ばれたＨＡサブタイプは、与えられた季節の間に最も優性のインフルエンザ株（または最も優性であると予測されたインフルエンザ株）によって決定される（ｄｉｃｔａｔｅｄ）。幾つかの実施形態では、ＨＡ抗原をコードするレプリコンは、被験体に送達されたときに被験体においてインフルエンザウイルス抗原に対する免疫反応（特に抗体反応）を生成する。
【００４７】
幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルスに由来する抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）である。
【００４８】
幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、ポリオウイルスからの抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、破傷風菌からの抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、狂犬病ウイルスからの抗原である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスは、（ａ）ポリオウイルスからの抗原；（ｂ）破傷風菌からの抗原；および（ｃ）狂犬病ウイルスからの抗原、からの外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドの各々は、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。適切なポリオウイルス、破傷風菌、または狂犬病ウイルスの抗原が、本明細書の開示によって熟考される。
【００４９】
幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、マールブルグウイルスからの抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、スーダンエボラウイルスからの抗原である。幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、ザイールエボラウイルスからの抗原である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるマイクロニードルデバイスは、（ａ）マールブルグウイルスからの抗原；（ｂ）スーダンエボラウイルスからの抗原；および（ｃ）ザイールエボラウイルスからの抗原、からの外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドの各々は、単一の組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。幾つかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、異なる組換えアルファウイルスレプリコン上でコードされる。適切なマールブルグウイルス、スーダンエボラウイルス、またはザイールエボラウイルスの抗原が、本明細書の開示によって熟考される。
【００５０】
幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原である。幾つかの実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０、Ｇｐ１６０、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＮｅｆのタンパク質またはそれらの部分である。他のＨＩＶ抗原の例としては、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、およびＶｐｕのタンパク質が挙げられる。ＨＩＶ抗原をコードするレプリコンは、好ましくは、被験体に送達されたときに被験体においてＨＩＶウイルスエピトープに対する免疫反応（抗体反応など）を生成する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、細菌に由来する抗原である。幾つかの実施形態では、細菌に由来する抗原は、以下のいずれか１つ又はそれ以上に由来する抗原を含む：アドヘシン、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、およびＨ因子結合タンパク質などの膜タンパク質を含む、髄膜炎菌；ＲｒｇＢ線毛サブユニット、ベータ−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的ストレスタンパク質（Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｔｒｅｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／トレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌表面アドヘシンＰｓａＡなどの、肺炎球菌；連鎖球菌群Ａ抗原などの、化膿連鎖球菌；カタル球菌；百日咳毒素または百日咳トキソイド（ＰＴ）、繊維状血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン、および凝集原２および３などの、百日咳菌；溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、フェリクロム結合タンパク質（ｆｅｒｒｉ ｃｈｒｏｍｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｓｔａ００６）及び／又は、ｓｔａＯｌｌリポタンパク質などの、黄色ブドウ球菌；破傷風トキソイドなどの、破傷風菌；ジフテリアトキソイドなどの、ジフテリア菌（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；インフルエンザ菌；緑膿菌；ストレプトコッカス・アガラクチア；ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧなどの、クラミジア・トラコマチス；肺炎クラミジア；ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、及び／又はウレアーゼなどの、ピロリ菌；毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、散在付着性大腸菌（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ）（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性大腸菌（ＥｘＰＥＣ）及び／又は腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原などの、大腸菌。ＥｘＰＥＣ株は、尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連の大腸菌（ＭＮＥＣ）を含む。幾つかの大腸菌型に有用な免疫原は、ＡｃｆＤ；炭疽菌である。幾つかの実施形態では、抗原は、ペスト菌；表皮ブドウ球菌；ウェルシュ菌またはボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ）；レジオネラ・ニューモフィラ；Ｑ熱コクシエラ；ウシ流産菌、ブルセラ・カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・ネオトマエ（Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ）、ブルセラ・オビス（Ｂ．ｏｖｉｓ）、 ブルセラ・スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、ブルセラ・ピニペディアエ（Ｂ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）などの、ブルセラ菌；フランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、野兎病菌などの、フランキセラ属；淋菌；梅毒トレポネーマ；軟性下疳菌；フェカリス菌；エンテロコッカス・フェシウム；スタフィロコッカス・サプロフィチカス；腸炎エルシニア；結核菌；リケッチア；リステリア菌；コレラ菌；チフス菌；ライム病ボレリア；ジン��バリス菌；およびクレブシエラ、に由来する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、ウイルスに由来する抗原である。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は：オルソミクソウイルス；血球凝集素、ノイラミニダーゼまたはマトリックスＭ２タンパク質などのインフルエンザＡ型、Ｂ型、またはＣ型ウイルス；ニューモウイルス（例えばＲＳウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えばムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えばパラインフルエンザウイルス）、メタニューモウイルス、およびモルビリウイルス属（例えば麻疹）、に由来するものなどのパラミクソウイルス科のウイルス；大痘瘡と小痘瘡を含むがこれらに限定されない、真正痘瘡などのオルソポックスウイルス由来のものを含むポックスウイルス科；エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）、カルジオウイルスおよびアフトウイルスに由来するものなどのピコルナウイルス；カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルス、リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス、または、クリミア・コンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルスに由来するものを含むブンヤウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）；エボラウイルス（ザイール、コートジボアール、レストン、またはスーダンのエボラウイルスを含む）またはマールブルグウイルスなどのフィロウイルス；ルビウイルス、アルファウイルス、または、風疹ウイルスを含むアルテリウイルス、を含むトガウイルス；ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング熱（１、２、３または４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスなどのフラビウイルス；ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラ（ＣＳＦＶ）、またはボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ））などのヘパドナウイルス；Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスまたはＧ型肝炎ウイルスなどの他の肝炎ウイルス；リッサウイルス（例えば狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）を含むラブドウイルス；ノーウォークウイルス（ノロウイルス）と、ハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルスとを含むカリシウイルス科；ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、に由来する免疫原を含むコロナウイルス；の１つ以上に由来する。いくつかの実施形態では、コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチド（ｓｐｉｋｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）；オンコウイルス、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、またはスプーマウイルスなどのレトロウイルス；オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルティウイルスを含むレオウイルス；パルボウイルスＢ１９を含むパルボウイルス；一例として、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）（例えばＨＳＶ１および２型）、水痘帯���疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）、などのヒトヘルペスウイルスを含むヘルペスウイルス；パピローマウイルスとポリオーマウイルスに由来するものを含むパポバウイルス、である。いくつかの実施形態では、（ヒト）パピローマウイルスは、１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３または、６５型のもの、例えば、６、１１、１６および／または１８型の１つ以上に由来するものである；アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）を含むアデノウイルス、である。エンテロウイルスの例は、ポリオウイルス、例えば１型、２型および／または３型ポリオウイルス；ＥＶ７１エンテロウイルス；コクサッキーＡまたはＢウイルス、を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）、アメリカナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サーモンピコルナ様ウイルス（また大西洋サケのピコルナ様ウイルスとしても知られる）、ヤマメウイルス（ＬＳＶ）、大西洋サケロタウイルス（ＡＳＲ）、トラウトストロベリー病ウイルス（ＴＳＤ）（ｔｒｏｕｔ  ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）（ｃｏｈｏ  ｓａｌｍｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ）、または、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、などの、魚または他の動物を感染させるウイルスに由来する抗原である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、真菌に由来する抗原である。例示的な真菌抗原は、アブシディア属、アクレモニウム属、アルテルナリア属、アスペルギルス属、  バシジオボラス属、バイポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属、ブラストミセス属、カンジダ属、クラミジア属、コクシジオイデス属、コニディオボルス属、クリプトコッカス属、カーブラリア（Ｃｕｒｖａｌａｒｉａ）属、エピデルモフィトン属、エクソフィアラ属、ゲオトリクム属、ヒストプラスマ属、マズレラ属、マラセジア属、ミクロスポルム属、モニリエラ属、モルチエレラ属、ケカビ属、ペシロマイセス属、ペニシリウム属、フィアレモニウム属、フィアロフォラ属、プロトテカ属、シュードアレシェリア属、シュードミクロドチウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍ）属、フハイカビ属、リノスポリジウム属、リゾープス属、スコレバシジウム（Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、スポロトリクス属、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）属、トリコフィトン属、毛芽胞菌属およびキシロヒファ属のいずれかからの抗原を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、真菌抗原は、エピデルモフィトン・フロッコースム、ミクロスポルム・オーズアニー、ミクロスポルム・カニス、ミクロスポルム・ジストルツム、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ギプスム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム、渦状白癬菌、トリコフィトン・エクイヌム、トリコフィトン・ガリネ、トリコフィトン・ギプスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニーニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス、トリコフィトン・ワインケアナム、トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・シェーンライン、トリコフィトン・トンズランス、トリコフィトン・ベルコーズム、Ｔ．ベルコーズムアルバム変種、ジスコイデス変種、オクラセイム変種（ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、紫色白癬菌、および／またはトリコフィトン・ファヴィフォルメ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）のいずれかに由来し；または、アスペルギルス・フミガーツスから、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニードランス、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・シドウィ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラヴァトゥス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｇｌａｕｃｕｓ）、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｉｔａｔｕｓ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・エノラーゼ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・パラシローシス、カンジダ・ステラトイデア、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクーセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・プソイドトロピカリス、カンジダ・ギリエルモン���ィ、クラドスポリウム・カリオニイ、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマティティディス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ゲオトリクム・クラヴァツム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム、クレブシエラ・ニューモニエ、微胞子虫、エンセファリトゾーン菌種、セプタタ・インテスティナリス（Ｓｅｐｔａｔａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、および、エンセファリトゾーンエンテロシトゾーン・ビエヌーシに由来し；それほど一般的でないものは、ブラキオラ属菌種（Ｂｒａｃｈｉｏｌａ  ｓｐｐ．）、ミクロスポリジウム属菌種、ノゼマ属菌種、プレイストフォラ属菌種、トラキプレイストフォラ属菌種（Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａｓｐｐ．）、ヴィタフォルマ属菌種、ブラジルバラコクシジオイデス、ニューモシスティスカリニ、フィチウム・インシジオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポルム・オヴァレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｏｖａｌｅ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ブーラーディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ポンベ、スケドスポリウム・アピオスペルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリクス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイジェリー（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ、ペニシリウム・マルネッフェイ、マラセジア属菌種、フォンセセア属菌種、ワンジエラ（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ）属菌種、スポロトリクス属菌種、バシディオボールス属菌種、コニディオボルス属菌種、リゾプス菌種、ケカビ属菌種、アブシディア属菌種、モルティエラ属菌種、クンニングアメラ属菌種、サクセネア属菌種、アルテルナリア属菌種、クルブラリア属菌種、ヘルミントスポリウム属菌種、フザリウム属菌種、アスペルギルス属菌種、ペニシリウム属菌種、モノリニア（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ）属菌種、リゾクトニア属菌種、ペシロミセス属菌種、ピトミセス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ）属菌種、および、クラドスポリウム属菌種、である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、寄生生物に由来する抗原である。典型的な寄生生物は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、Ｐ．マラリアエ（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）またはＰ．オヴァレ（Ｐ．ｏｖａｌｅ）などのプラスモディウム属のものを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原は、ウオジラミ（Ｃａｌｉｇｉｄａｅ）科の寄生生物、特にレペオフティルス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）属およびカリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）属のもの、例えばサケジラミ（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉ）およびカリグス・ロゲルクレッセイイ（Ｃａｌｉｇｕｓ  ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）に対する免疫反応を誘導する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、アレルゲンに由来する抗原である。典型的なアレルゲンには、花粉アレルゲン（木、ハーブ、雑草および草の花粉アレルゲン）；昆虫またはクモ類のアレルゲン（吸入性、唾液および毒液アレルゲン、ダニアレルゲン、ゴキブリおよびユスリカのアレルゲン、ハチの毒液アレルゲン）動物の毛およびフケのアレルゲン（例えばイヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどからのもの）および、食物アレルゲン（例えばグリアジン）、が含まれるが、これらに限定されない。木、草およびハーブからの典型的な花粉アレルゲンは、カバ（マカンバ属）、ハンノキ（ハンノキ属）、ハシバミ（ハシバミ属）、クマシデ（クマシデ属）およびオリーブ（オリーブ属）、スギ（スギ属とビャクシン属）、スズカケノキ（ズズカケノキ属）を含むが、これらに限定されない、ブナ目、モクセイ目、球果植物目およびスズカケノキ科の分類学的目、ドクムギ属、アワガエリ属、イチゴツナギ属、ギョウギシバ属、カモガヤ属、シラゲガヤ属、クサヨシ属、ライムギ属およびモロコシ属の草を含むイネ目の目、ブタクサ属、ヨモギ属およびヒカゲミズ属のハーブを含むキク目とイラクサ目の目、から生じる。他の典型的な吸入アレルゲンは、ヒョウヒダニ属およびチリダニ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）、貯蔵庫ダニ（ｓｔｏｒａｇｅ  ｍｉｔｅ）、例えばレピドグリフィス（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、ニクダニ属（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ）およびチロファグス属（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ）のイエダニ（ｈｏｕｓｅ  ｄｕｓｔ  ｍｉｔｅ）由来のもの、ゴキブリ、ユスリカおよびノミ、例えばチャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｅｌｌａ）、ワモンゴキブリ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）、ユスリカ属（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）およびイヌノミ属（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ）に由来するものならびに哺乳類、例えばネコ、イヌおよびウマに由来するもの、毒液アレルゲン、例えば針で刺すまたはかみつく昆虫、例えばミツバチ（ミツバチ科（Ａｐｉｄａｅ））、スズメバチ（スズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄｅａ））およびアリ（アリ科（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ））を含むハチ目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の分類学上の目に由来するものなど、である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡまたは組換えアルファウイルスレプリコンによってコードされたポリペプチドは、腫瘍抗原に由来する抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は下記のものまたはその一部のいずれか１つ以上から選択される：（ａ）ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１、ならびに、ＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、およびＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２などの癌精巣抗原；（ｂ）変異抗原、例えばｐ５３、ｐ２１／Ｒａｓ、ＣＤＫ４、ＭＵＭｌ、カスパーゼ−８、ＣＩＡ  ０２０５、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、ベータカテニン、ＴＣＲ、ＢＣＲ−ａｂｌ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ  ０２０５、ＣＤＣ−２７、および、ＬＤＬＲ−  ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現抗原、例えば、メソテリン、リビン（ｌｉｖｉｎ）、サバイビン、ＩＣＡＭ−１、ガレクチン４、ガレクチン９、プロテアーゼ３、ＷＴ  １、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、マンマグロビン、アルファー−フェトプロテイン、ＫＳＡ、ガストリン、テロメラーゼ触媒性タンパク質、ＭＵＣ−１、Ｇ−２５０、ｐ５３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および癌胎児抗原；（ｄ）共有抗原、例えば、ＭＡＲＴ−ｌ／Ｍｅｌａｎ  Ａ、Ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰｌ、および、チロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２、などのメラノーマ−メラノサイト分化抗原；（ｅ）ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２などの抗原に関連する前立腺；（ｆ）免疫グロブリンイデオタイプ；（ｇ）またはこれらの任意の組み合わせ、を含む。特定の実施形態では、腫瘍免疫原は、限定されないが、ｐｉ５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン−バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６とＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈｌ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐｌ６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１  Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ  ２７．２９ＹＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８￥ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、またはその任意の組み合わせ、を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、レプリコンは被験体に外因性のポリペプチドを送達するために使用される。いくつかの実施形態では、レプリコンは例えば制限なく、被験体の変異または欠損したポリペプチドを置換するための機能的な治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、レプリコンは、被験体の内因性のポリペプチドの機能を阻害または妨害するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、レプリコンによってコードされたポリペプチドは、被験体へ治療上の利益を提供する外因性のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、治療上の利益とは、疾病、疾患または障害の処置、発症の減少、症状の軽減、または治癒を意味する。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは抗原である。いくつかの実施形態では、レプリコンは、化粧のために送達されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本開示の組成物および方法に従って（例えばマイクロニードルデバイスによって）送達される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドには、自然に見られる任意のポリペプチド、改変されたポリペプチド（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）、キメラポリペプチド（例えば、２つ以上のポリペプチド源に由来する断片または部分を含む）などを含む。本明細書に開示されるポリペプチドおよびポリペプチドにコードされたレプリコンは任意の適切な長さでありうる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは約２０未満のアミノ酸（例えば２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０未満またはより少数のアミノ酸）を包含している；約２０超から約５０未満のアミノ酸；または、約５０超のアミノ酸を包含しているタンパク質を包含している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約１００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、７５００、１００００、２００００またはより多くのアミノ酸を包含している。
【００５９】
いくつかの実施形態では、レプリコンは、被験体に治療上および／または美容上の利益を提供するのに使用するためのポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、治療上および／または美容上の利益を提供するのに使用するためのポリペプチドには、酵素、酵素阻害剤、ホルモン、天然免疫グロブリン、修飾免疫グロブリン、キメラ免疫グロブリン、またはそれらの断片などの免疫グロブリン、リンホカイン、サイトカインおよびケモカインが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、哺乳類（例えば、限定されないが、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシなど）、バクテリア、ウイルス、真菌または寄生生物に由来する。いくつかの実施形態では、コードされるポリペプチドはヒト由来である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、自然発生的なもの、自然状態から修飾されたもの、少なくとも２つの異なるタンパク質に由来するタンパク質の断片を含むキメラタンパク質、増強された機能または活性を有する改変されたタンパク質、機能または活性が低下したかまたは、細胞の特定の区画、例えば、細胞質、膜、または核、またはそれらの任意の組み合わせ、に標的化された改変されたタンパク質、である。いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドは、糖尿病、例えば、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の処置に有用なヒトインスリンである。
【００６０】
ポリペプチドとして直接、または、ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたは他のポリヌクレオチドを送達することによって間接的に送達されるポリペプチドの例は：ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、ＥＧＦ−Ｒ、ｃ−ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−１、ＯＸ４０、ＴＡＣ１−５、ＩｇＥ、ＢＡＦＦ／ＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ５Ｌ、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ＦｃイプシロンＲ２、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２８、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６／ＳＲ−Ｂ３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５２、ＣＤ５５／ＤＡＦ、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ５９、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ９０／Ｔｈｙｌ、Ｃｌｑ  Ｒ１／ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、ＤＥＰ−１／ＣＤ１４８、ＣＤ１５１、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２００−Ｒ１、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＴＮＦα、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、補体受容体  １、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、α２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１１／イオタキシン、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４／イオタキシン−２、ＣＣＬ２６／イオタキシン−３、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０、ＩＬ１ａ、ＩＬ１−Ｒ１、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ２、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ６−Ｒ、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆ１０、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１、ネトリン２、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＡＤＡＭＳ１、ＡＤＡＭＳ５、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ３３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／Ｐｕｎｃｔｉｎ、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−１、ＡＰＲＩＬ、アンジオジェニン、アンフィレギュリン、アンジオポエチン  ｌ、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＡＣＥ−１、ＢＡＣＥ−２、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ１、Ｂ��Ｐ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、ＢＭＰＲ−１Ａ／ＡＬＫ−３、ＢＭＰＲ−１Ｂ／ＡＬＫ−６、ＢＭＰＲ−２、ＣＲＰ、Ｅ−カドヘリン／カドヘリン１、Ｎ−カドヘリン／カドヘリン２、Ｐ−カドヘリン／カドヘリン３、カドヘリン−４／Ｒカドヘリン、ＶＥ−カドヘリン／カドヘリン５、カドヘリン６、カドヘリン８、カドヘリン１１、カドヘリン１２、カドヘリン１３、カドヘリン１７、カテプシン１、カテプシン３、カテプシン６、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＨ、カテプシンＬ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＣＴＬＡ−４、インテグリンα４βｌ、インテグリンα４β７、リンフォトキシン、ジゴキシン、ＲｈｏＤ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、リンフォトキシン、ａ／ｂ受容体、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１  Ａ、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０  リガンド／ＴＮＦＳＦ５、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲ−１／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣ１／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＷＥＡＫ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、Ｐｒｏ−ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１−Ａ、ＴＮＦベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦＲ−２／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ２、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、４ＥＢＰ１、１４−３−３のズイータ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、８Ｄ６Ａ、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼＮ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ、アミノペプチダーゼＰ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼＰ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ−１、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、アクチン、アンフィレギュリン、ベータアクチン、アクチビンＡ、ＡＭＰＫα１、アクチビン  ＡＢ、ＡＭＰＫα２、アクチビンＢ、ＡＭＰＫベータ１、アクチビンＣ、ＡＭＰＫベータ２、アクチビンＲ１２Ａ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、アクチビン  Ｒ１Ｂ／ＡＬＫ−４、血管原性アクチビンＲ２Ａ、アクチビンＲ２Ｂ、ＡＤＡＭ１０、アンジオポエチン様１、アンジオポエチン様２、アンジオポエチン様３、アンジオポエチン��４、アンジオポエチン様７／ＣＤＴ６、血液造成阻害剤、アネキシンＡ１／アネキシン１、アネキシンＡ７、アネキシン  Ａ１０、アネキシンＶ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、アグリカン、ＡＰＡＦ−１、アグリン、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＪ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−１、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔ１、アポリポタンパク質Ａ１、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ、血清アルブミン、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−１、アルテミン（Ａｒｔｅｍｉｎ）、ＡＬＫ−７、アリルスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎアシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ−２、α−２ｕグロブリン、ＡＳＣ、α１−酸性糖タンパク質、ＡＳＧＲｌ、αフェトプロテイン、ＡＳＫ１、ＡＬＳ、ＡＴＭ、エナメル芽細胞ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、オーロラＡ、ＡＭＩＧＯ、オーロラＢ、ＡＭＩＧＯ２、アキシン−１、ＡＭＩＧＯ３、Ａｘ１、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼＡ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、６−ビオチン−１７−ＮＡＤ、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＢＬＩＭＰ１、Ｂｉｋ、ＢＭＩ−１、Ｂａｄ、Ｂａｇ−１、ＢＡＫ、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＡＲＤ１、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−１０、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−２関連タンパク質Ａ１、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ  −ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＯＫ、ＢＰＤＥ、ブラキュリ、Ｂ−Ｒａｆ、ベータＩＧ−Ｈ３、ベータセルリン、ＢＲＣＡ１、ベータデフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、バイグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｃ１ｑＴＮＦ１、Ｃ１ｑＴＮＦ４、Ｃ１ｑＴＮＦ５、補体成分Ｃ１ｒ、補体成分Ｃ１ｓ、補体成分Ｃ２、補体成分Ｃ３ａ、補体成分Ｃ３ｄ、補体成分Ｃ５ａ、ＣＤＣ２、ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣＰ１、ＣＤＯ、ＣＤＸ４、ＣＥＡＣＡＭ−６、サーベラス  １、ＣＦＴＲ、ｋカルビンディンＤ、カルシニューリンＡ、Ｃｈｅｍ  Ｒ２３、カルシニューリンＢ、ケマリン（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）、ＣａＭキナーゼ２、キチナーゼ３様１、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋ１、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１Ｉ３、ＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２、炭酸脱水酵素Ｉ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｈＡＴ、炭酸脱水酵素ＩＩ、コンドロレクチン（Ｃｈｏｎｄｒｏｌｅｃｔｉｎ）、炭酸脱水酵素ＩＩＩ、コーディン、炭酸脱水酵素ＩＶ、コーディン様１、炭酸脱水酵素ＶＡ、コーディン様２、炭酸脱水酵素ＶＢ、ＣＩＮＣ−１、炭酸脱水酵素ＶＩ、ＣＩＮＣ−２、炭酸脱水酵素ＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、炭酸脱水酵素ＶＩＩＩ、クラスピン、炭酸脱水酵素ＩＸ、クラウディン−６、炭酸脱水酵素Ｘ、ＣＬＣＮ５、炭酸脱水酵素ＸＩＩ、ＣＬＥＣ−１、炭酸脱水酵素ＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、炭酸脱水酵素ＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ−１３／ＣＬＥＣ−４Ｆ、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−１、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラスタリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラスタリン様１、カルボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸ１、ＣＭＶ  ＵＬ１４６、カルジオトロフィン−１、ＣＭＶ  ＵＬ１４７、カモシン（Ｃａｍｏｓｉｎｅ）ジペプチターゼ１、ＣＮＰ、カロント（Ｃａｒｏｎｔｅ）、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦＲα、凝固因子ＩＩ／トロンビン、カスパーゼ−１、凝固因子ＩＩＩ／組織因子、カスパーゼ−２、凝固因子ＶＩＩ、カスパーゼ−３、凝固因子Ｘ、カスパーゼ−４、凝固因子ＸＩ、Ｃａｓρａｓｅ６、凝固因子ＸＩＶ／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヒーシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通のガンマ鎖（Ｃｏｍｍｏｎ  ｇａｍｍａ  Ｃｈａｉｎ）／ＩＬ−２  Ｒガンマ、カスパーゼペプチド阻害剤、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分Ｃ１ｒＬＰ、ベータカテニン、補体成分Ｃ１ｑＡ、補体成分Ｃ１ｑＣ、補体Ｄ因子、補体Ｉ因子、補体ＭＡＳＰ３、コネクシン４３、コンタクチン−１、コンタクチン−２／ＴＡＧ１、コンタクチン−４、コンタクチン−５、コリン（Ｃｏｒｉｎ）、コーヌリン（Ｃｏｒｎｕｌｉｎ）、ＣＯＲＳ２６／Ｃ１ｑＴＮＦ３、ＣＯＵＰ−ＴＦ  Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、ＣＢＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ  ＩＩ／ＮＲ２Ｆ２、ＣＣＩ、ＣＯＸ−１、ＣＣＫＡＲ、ＣＯＸ−２、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＣＲ１、Ｃ反応性タンパク質、ＣＣＲ２、クレアチンキナーゼ、Ｍｕｓｃｌｅ／ＣＫＭＭ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＲＥＢ、ＣＣＲ５、ＣＲＥＧ、ＣＣＲ６、ＣＲＥＬＤ１、ＣＣＲ７、ＣＲＥＬＤ２、ＣＣＲ８、ＣＲＨＢＰ、ＣＣＲ９、ＣＲＨＲ−１、ＣＣＲ１０、ＣＲＩＭ１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＩＳＰ−２、ＣＲＩＳＰ−３、Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ−２、ＣＲＴＡＭ、ＣＲＴＨ−２、ＣＲＹ１、Ｃｒｙｐｔｉｃ、ＣＳＢ／ＥＲＣＣ６、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＣＴＬＡ−４、キュビリン、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ２７  リガンドＶＴＮＦＳＦ７、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦδ、ＣＸＣＲ６、シクロフィリンＡ、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、シスタチンＤ、シスタチンＥ／Ｍ、シスタチンＦ、シスタチンＨ、シスタチンＨ２、シスタチンＳ、シスタチンＳＡ、シスタチンＳＮ、
シトクロムｃ、アポシトクロムｃ、ホロシトクロム（Ｈｏｌｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）ｃ、サイトケラチン８、サイトケラチン１４、サイトケラチン１９、シトニン（Ｃｙｔｏｎｉｎ）、Ｄ６、ＤＩＳＰ１、ＤＡＮ、Ｄｋｋ−１、ＤＡＮＣＥ、Ｄｋｋ−２、ＤＡＲＰＰ−３２、Ｄｋｋ−３、ＤＡＸ１／ＮＲ０Ｂ１、Ｄｋｋ−４、ＤＣＣ、ＤＬＥＣ、ＣＬＥＣ４Ａ、ＤＬＬ１、ＤＣＡＲ、ＤＬＪＬ４、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、ＤＮＡポリメラーゼベータ、ＤｃＴＲＡＩＬ−Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＤＮＡＭ−１、ＤｃＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＤＲ１、ＤＮＥＲ、ＤＤＲ２、ＤＯＰＡデカルボキシラーゼ／ＤＤＣ、ＤＥＣ−２０５、ＤＰＣＲ−１、  デカペンタプレジック、ＤＰＰ６、デコリン、ＤＰＰＡ４、デクチン−１／ＣＬＥＣｙＡ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、デクチン−２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＰＰＩＩ／ＱＰＰ／ＤＰＰ７、デザートヘッジホッグ、デスミン、デスモグレイン−１、ＤＳＣＡＭ、デスモグレイン−２、ＤＳＣＡＭ−Ｌ１、デスモグレイン−３、ＤＳＰＧ３、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−１、Ｄｔｋ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−３、ダイナミン、ＥＡＲ２／ＮＲ２Ｆ６、ＥｐｈＡ５、ＥＣＥ−１、ＥｐｈＡ６、ＥＣＥ−２、ＥｐｈＡ７、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＥｐｈＡ８、ＥＣＭ−Ｉ、ＥｐｈＢｌ、エコチン、ＥｐｈＢ２、ＥＤＡ、ＥｐｈＢ３、ＥＤＡ−Ａ２、ＥｐｈＢ４、ＥＤＡＲ、ＥｐｈＢ６、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５、エフリンＡ１、ＥＤＧ−８、エフリン−Ａ２、ｅＥＦ−２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、ＥＧＲ１、エフリン−Ｂ、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、エフリン−Ｂ１、ｅＩＦ２α、エフリン−Ｂ２、ｅＩＦ４Ｅ、エフリンＢ３、ＥＩｋ−１、エピジェン、ＥＭＡＰ−ＩＩ、エピモルフィン（Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｎ）／シンタキシン  ２エピレギュリン、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ、ＥＰＲ−１／Ｘａ受容体、エンドカン（Ｅｎｄｏｃａｎ）、ＥｒｂＢ２、エンドグリン（Ｅｎｄｏｇｌｉｎ）／ＣＤ１０５、ＥｒｂＢ３、エンドグリカン、ＥｒｂＢ４、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＥＲＣＣ１、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＥＲＣＣ３、エンドヌクレアーゼＶ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＥＲＫ１、エンドレペリン（Ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）／パールカン、ＥＲＫ２、エンドスタチン、ＥＲＫ３、エンドセリン−１、ＥＲＫ５／ＢＭＫ１、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２、ＥＲＲα／ＮＲ３Ｂ１、ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＥＲＲベータ／ＮＲ３Ｂ２、エンテロペプチダーゼ／エンテロキナーゼ、ＥＲＲガンマ／ＮＲ３Ｂ３、エリトロポイエチン、エリトロポイエチンＲ、ＣＣＬ２６／イオタキシン−３、ＥＳＡＭ、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１、ＥＲα／ＮＲ３Ａｌ、ＥＰＣＲ、ＥＲベータ／ＮＲ３Ａ２、Ｅｐｈ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＥｐｈＡ１、エクソストシン様（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ）２／ＥＸＴＬ２、ＥｐｈＡ２、エクソストシン様（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ−ｌｉｋｅ）３／ＥＸＴＬ３、ＥｐｈＡ３、ＦＡＢＰ１、ＦＧＦ−ＢＰ、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦ  Ｒ１、ＦＧＦ  Ｒ２、ＦＧＦ  Ｒ３、ＦＧＦ  Ｒ４、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＢＰ７、ＦＡＢＰ９、ＦＧＦ  Ｒ５、補体Ｂ因子、ＦＨＲ５、ＦＡＭ３Ａ、フィブロネクチン、ＦＡＭ３Ｂ、フィコリン−２、ＦＡＭ３Ｃ、フィコリン−３、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＩＴＣ、繊維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰ、ＦＫＢＰ３８、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、フラップ（Ｆｌａｐ）、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＦＬＩＰ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＧ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＴ１、ＦＡＴＰ５、ＦＬＲＴ２、ＦｃガンマＲＩ／ＣＤ６４、ＦＬＲＴ３、ＦｃガンマＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、Ｆｌｔ−３、ＦｃガンマＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＦｃガンマＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、フォリスタチン、ＦｃガンマＲＩＩＩ／ＣＤ１６、フォリスタチン様１、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＦｏｓＢ／ＧＯＳ３、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＦｏｘＤ３、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＦｏｘＪ１、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＦｏｘＰ３、Ｆｃ受容体様３／ＣＤ１６−２、Ｆｐｇ、ＦＥＮ−１、ＦＰＲ１、フェツインＡ、ＦＰＲＬ１、フェツインＢ、ＦＰＲＬ２、ＦＧＦ酸性（ａｃｉｄｉｃ）、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、ＦＧＦ塩基性（ｂａｓｉｃ）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１、ＦＧＦ−３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２、ＦＧＦ−４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３、ＦＧＦ−５、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４、ＦＧＦ−６、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５、ＦＧＦ−８、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６、ＦＧＦ−９、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７、ＦＧＦ−１０、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８、ＦＧＦ−１１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、ＦＧＦ−１２、Ｆｒｋ、ＦＧＦ−１３、ｓＦＲＰ−１、ＦＧＦ−１６、ｓＦＲＰ−２、ＦＧＦ−１７、ｓＦＲＰ−３、ＦＧＦ−１９、ｓＦＲＰ−４、ＦＧＦ−２０、フューリン、ＦＧＦ−２１、ＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４、ＦＧＦ−２２、Ｆｙπ、ＦＧＦ−２３、Ｇ９ａ／ＥＨＭＴ２、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ  Ｒα−３、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα１、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ  Ｒα−４、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα２、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα４、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ  １８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα５、ＧＬＩ−１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα６、ＧＬＩ−２、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒベータ１、ＧＬＰ／ＥＨＭＴ１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒベータ２、ＧＬＰ−Ｉ  Ｒ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒベータ３、グルカゴン、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒガンマ２、グルコサミン（Ｎ−アセチル）  −  ６−スルファターゼ／ＧＮＳ、ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２、ＧｌｕＲ１、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、ＧｌｕＲ２／３、ＧＡＤ２／ＧＡＤ６５、ＧｌｕＲ２ＧＡＤＤ４５α、ＧｌｕＲ３、ＧＡＤＤ４５ベータ、Ｇｌｕｔ１、ＧＡＤＤ４５ガンマ、Ｇｌｕｔ２、ガレクチン−１、Ｇｌｕｔ３、ガレクチン−２、Ｇｌｕｔ４、ガレクチン−３、Ｇｌｕｔ５、ガレクチン−３  ＢＰ、グルタレドキシン  １、ガレクチン−４、グリシンＲ、ガレクチン−７、グリコホリンＡ、ガレクチン−８、グリピカン  ２、ガレクチン−９、グリピカン  ３、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、グリピカン  ５、ＧＡＰ−４３、グリピカン  ６、ＧＡＰＤＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇａｓ１、ＧＭ−ＣＳＦ  Ｒα、Ｇａｓ６、ＧＭＦベータ、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ｇｐ１３０、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、グリコーゲンフォスフォリラーゼＢＢ／ＧＰＢＢ、ＧＡＴＡ−１、ＧＰＲ１５、ＧＡＴＡ−２、ＧＰＲ３９、ＧＡＴＡ−３、ＧＰＶＩ、ＧＡＴＡ−４、ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１、ＧＡＴＡ−５、Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ、ＧＡＴＡ−６、グラニュライシン、ＧＢＬ、グランザイム  Ａ、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、グランザイム  Ｂ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、グランザイム  Ｄ、Ｇ−ＣＳＦ、グランザイム  Ｇ、Ｇ−ＣＳＦ  Ｒ、グランザイム  Ｈ、ＧＤＦ−１、ＧＲＡＳＰ、ＧＤＦ−３、ＧＲＢ２、ＧＤＦ−５、グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、ＧＤＦ−６、ＧＲＯ、ＧＤＦ−７、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＧＤＦ−８、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯベータ、ＧＤＦ−９、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯガンマ、ＧＤＦ−１１、成長ホルモン、ＧＤＦ−１５、成長ホルモンＲ、ＧＤＮＦ、ＧＲＰ７５／ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＦＡＰ、ＧＳＫ−３α／ベータ、ＧＦＩ−１、ＧＳＫ−３α、ＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ  Ｒα−１、ＧＳＫ−３ベータ、ＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ  Ｒα−２、ＥＺＦＩＴ、Ｈ２ＡＸ、Ｈ６０、ＨＭ７４Ａ、ＨＡＩ−１、ＨＭＧＡ２、ＨＡＩ−２、ＨＭＧＢ１、ＨＡＩ−２Ａ、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１ベータ、ＨＡＩ−２Ｂ、ＨＮＦ−３ベータ／ＦｏｘＡ２、ＨＡＮＤ１、ＨＮＦ−４α／ＮＲ２  Ａ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＮＦ−４ガンマ／ＮＲ２Ａ２、気道トリプシン様プロテアーゼ／ＨＡＴ、ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＯ−２／ＨＭＯＸ２、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＨＰＲＧ、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、Ｈｒｋ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＨＲＰ−１、αＨＣＧ、ＨＳ６ＳＴ２、Ｈｃｋ、ＨＳＤ−１、ＨＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／Ｂ、ＨＳＤ−２、ＨＤＧＦ、ＨＳＰ１０／ＥＰＦ、ヘモグロビン、ＨＳＰ２７、ヘパソシン（Ｈｅｐａｓｓｏｃｉｎ）、ＨＳＰ６０、ＨＥＳ−１、ＨＳＰ７０、ＨＥＳ−４、ＨＳＰ９０、ＨＧＦ、ＨＴＲＡ、ＨＧＦ賦活物質、ＨＴＲＡ  １／ＰＲＳＳ１１、ＨＧＦ  Ｒ、ＨＴＲＡ２／Ｏｍｉ、ＨＩＦ−１α、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＩＦ−２α、ヒアルロナン、ＨＩＮ−１／セクレトグロビン（Ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）  ３Ａ１、Ｈｉｐ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＩＬ−１０、ｃＩＡＰ、ＩＬ−１０  Ｒα、ｃＩＡＰ−１／ＨＩＡＰ−２、ＩＬ−１０  Ｒベータ、ｃＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１、ＩＬ−１１、ＩＢＳＰ／サイアロプロテインＩＩ、ＩＬ−１１  Ｒα、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＩＬ−１２、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＣＡＭ−３／ＣＤ５０、ＩＬ−１２  Ｒベータ１、ＩＣＡＭ−５、ＩＬ−１２  Ｒベータ２、ＩＣＡＴ、ＩＬ−１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１３  Ｒα１、イズロネート２−スルファターゼ／ＩＤＳ、ＩＬ−１３  Ｒα２、ＩＦＮ５、ＩＬ−１５、ＥＦＮ−α、ＩＬ−１５  Ｒα、ＤＦＮ−α１、ＩＬ−１６、ＩＦＮα２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α４ｂ、ＩＬ−１７  Ｒ、ＩＦＮαＡ１、ＩＬ−１７  ＲＣ、ＩＦＮαＢ２、ＩＬ−１７  ＲＤ、ＩＦＮαＣ、ＩＬ−１７Ｂ、ＥＦＮ−αＤ、ＩＬ−１７Ｂ  Ｒ、ＩＦＮ−αＦ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＦＮ−αＧ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＦＮ−αＨ２、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＦＮ−α１、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＦＮ−αＪ１、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＦＮ−αＫ、ＩＦＮ−αＷＡ、ＩＬ−１８  ＢＰｃ、ＩＦＮ−α／ベータＲ１、ＩＬ−１８  ＢＰｄ、ＩＦＮ−α／ベータＲ２、ＩＦＮ−ベータ、ＥＦＮ−ｇａｒｍｎａ、��Ｌ−１９、ＩＦＮ−ガンマＲ１、ＥＬ−２０、ＩＦＮ−ガンマＲ２、ＩＬ−２０  Ｒα、ＩＦＮオメガ、ＩＬ−２０  Ｒベータ、ＩｇＥ、ＩＬ−２１、ＩＧＦＢＰ−Ｉ、ＩＬ−２１  Ｒ５、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＬ−２２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＬ−２２  Ｒ、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＬ−２２ＢＰ、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＬ−２３、ＩＧＦＢＰ−６、ＩＬ−２３  Ｒ５、ＩＧＦＢＰ−Ｌ１、ＩＬ−２４、ＩＬ−２６／ＡＫ１５５、ＩＧＦＢＰ−ｒＰ１０、ＩＬ−２７、ＩＧＦ−１、ＩＬ−２８Ａ、ＩＧＦ−１  Ｒ、ＩＬ−２８Ｂ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−２９／ＩＦＮラムダ、ＩＧＦ−ＩＩ  Ｒ  １、ＩＬ−３１、ＩｇＧ５、ＩＬ−３１  ＲＡ５、ＩｇＭ５、ＩＬ−３２α、ＩＧＳＦ２、ＩＬ−３３、ＩＧＳＦ４Ａ／ＳｙｎＣＡＭ、ＩＬＴ２／ＣＤ８５Ｊ、ＩＧＳＦ４Ｂ、ＪＬＴ３／ＣＤ８Ｓｋ、ＩＧＳＦ８、ＩＬＴ４／ＣＤ８５ｄ、ＩｇＹ５、ＩＬＴ５／ＣＤ８５ａ、ＢｃＢ−ベータ、ＩＬＴ６／ＣＤ８５ｅ、ＩＫＫα、インディアンヘッジホッグ、ＩＫＫイプシロン、ＩＮＳＲＲ、ＤＣＫガンマ、インシュリン、ＩＬ−Ｉα／ＩＬ−１Ｆ１、インシュリンＲ／ＣＤ２２０、プロインシュリン、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、インスリジン／ＩＤＥ、ＩＬ−１Ｆ５／ＦＩＬ１デルタ、インテグリンα２／ＣＤ４９ｂ、ＩＬ−１Ｆ６／ＦＩＬ１イプシロン、インテグリンα３／ＣＤ４９ｃ、ＩＬ−１Ｆ７／ＦＩＬ１ゼータ、インテグリンα３ベータｌ／ＶＬＡ−３、ＩＬ−１Ｆ８／ＦＩＬ１イータ、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、ＩＬ−１Ｆ９、インテグリンα５／ＣＤ４９ｅ、ＩＬ−１Ｆ１０／ＩＬ−１ＨＹ２、インテグリンα５ベータ１、ＩＬ−１  ＲＩ５、インテグリンα／ＣＤ４９ｆ  ６、ＩＬ−１  ＲＩＩ、インテグリンα７、ＩＬ−１  Ｒ３／ＩＬ−１  Ｒ  ＡｃＰ、インテグリンα９、ＩＬ−１  Ｒ４／ＳＴ２、インテグリンαＥ／ＣＤ１０３、ＩＬ−１  Ｒ６／ＩＬ−１  Ｒ  ｒｐ２、インテグリンαＬ／ＣＤ１  Ｉａ、ＩＬ−Ｉ  Ｒ８、インテグリンαＬベータ２、ＩＬ−Ｉ  Ｒ９、インテグリンαＭ、インテグリンαＭベータ２、ＩＬ−２  Ｒα、インテグリンαＶ／ＣＤ５１、ＩＬ−２  Ｒベータ、インテグリンαＶベータ５、ＩＬ−３、インテグリンαＶベータ３、ＩＬ−３  Ｒα、インテグリンαＶベータ６、ＩＬ−３  Ｒベータ、インテグリンαＸ／ＣＤ１  Ｉｃ、ＩＬ−４、インテグリ
ンベータ１／ＣＤ２９、ＩＬ−４  Ｒ、インテグリンベータ２／ＣＤ１８、ＩＬ−５、インテグリンベータ３／ＣＤ６１、ＩＬ−５  Ｒα、インテグリンベータ５、ＩＬ−６、インテグリンベータ６、ＩＬ−６  Ｒ、インテグリンベータ７、ＩＬ−７、ＣＸＣＬｌ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＩＬ−７  Ｒα／ＣＤ１２７、ＩＲＡＫ１、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８  ＲＡ、ＩＲＡＫ４、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８  ＲＢ、ＩＲＳ−１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、Ｉｓｌｅｔ−１、ＩＬ−９、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＩＬ−９  Ｒ、Ｊａｇｇｅｄ−１、ＪＡＭ−４／ＩＧＳＦ５、Ｊａｇｇｅｄ−２、ＪＮＫ、ＪＡＭ−Ａ、ＪＮＫ１／ＪＮＫ２、ＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭ、ＪＮＫ１、ＪＡＭ−Ｃ、ＪＮＫ２、キニノーゲン、カリクレイン３／ＰＳＡ、キニノスタチン（Ｋｉｎｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、カリクレイン４、ＫＩＲ／ＣＤ１５８、カリクレイン５、ＫＩＲ２ＤＬ１、カリクレイン６／ニューロシン、ＫＩＲ２ＤＬ３、カリクレイン７、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、カリクレイン８／ニューロプシン、ＫＩＲ２ＤＳ４、カリクレイン９、ＫＩＲ３ＤＬ１、血漿カリクレイン／ＫＬＫＢ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、カリクレイン１０、キレル（Ｋｉｒｒｅｌ）２、カリクレイン１１、ＫＬＦ４、カリクレイン１２、ＫＬＦ５、カリクレイン１３、ＫＬＦ６、カリクレイン１４、クロトー（Ｋｌｏｔｈｏ）、カリクレイン１５、クロトーベータ、キープ（Ｋｅａｐ）１、クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）−１、ＫｅＩｌ、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＡＩＲ１、リピン２、ＬＡＩＲ２、リポカリン−１、ラミニンα４、リポカリン−２／ＮＧＡＬ、ラミニンガンマ１、５−リポキシゲナーゼ、ラミニン１、ＬＸＲα／ＮＲ１Ｈ３、ラミニンＳ、ＬＸＲベータ／ＮＲ１Ｈ２、ラミニン−１、リビン（Ｌｉｖｉｎ）、ラミニン−５、ＬＬＸ５、ＬＡＭＰ５、ＣＤ３００Ａ、ランゲリン（Ｌａｎｇｅｒｉｎ）、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ラテキシン（Ｌａｔｅｘｉｎ）、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、ライリン（Ｌａｙｉｌｉｎ）、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ５、ＬＭＯ２、ＬＤＬ  Ｒ５、ＬＯＸ−１／ＳＲ−Ｅ１、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ５、ＬＲＩＧ１、レフティ、ＬＲＩＧ３、レフティ−１、ＬＲＰ−１、レフティ−Ａ、ＬＲＰ−６、レグメイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＬＳＥＣｔｒｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ１５／ランキン（Ｌｕｎｇｋｉｎｅ）、ロイコトリエンＢ４、ロイコトリエンＢ４  Ｒ１、リンフォトキシン、ＬＩＦ、リンフォトキシンベータ／ＴＮＦＳＦ３、ＬＩＦ  Ｒα、リンフォトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リン（Ｌｙｎ）、リミチン（Ｌｉｍｉｔｉｎ）、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リシルオキシダーゼホモログ２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−１、ＬＩＮＧＯ−１、α２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ミンディン、Ｒ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＭａｆＢ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１αアイソフォームＬＤ７８ベータ、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−��α、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／Ｓｉｇｌｅｃ−４ａ、ＣＣＩＡ／ＭＩＰ−１ベータ、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１デルタ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１ガンマ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン（Ｍａｒａｐｓｉｎ）／パンクレアシン（Ｐａｎｃｒｅａｓｉｎ）、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ベータ、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−１、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン−２、ＭＩＰ−ＵＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳ  ＲＩＩ、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、ＭｃＩ−１、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４α、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦ  Ｒ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶタイプπ、ＭＭＰ−１０、ＭＤ−１、ＭＭＰ−１１、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−１、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ  −  ２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン（Ｍｅｌｕｓｉｎ）、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンα、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンベータ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、Ｍｅｒ、Ｍｒｅ１１、メソテリン、ＭＲＰ１、メテオリン、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ、ＭＳＫ１、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰ  Ｒ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−１、ＭＧＬ２、ムサシ−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹ  ＤＮＡグリコシラーゼ、ＭｔＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロペルオキシダーゼ、ベータ２ミクログロブリン、ミオカルディン、ミッドカイン、ミオシリン、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰ、ＮＧＦＩ−Ｂガンマ／ＮＲ４Ａ３、Ｎａｎｏｇ、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨ１、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓ１、ナイドジェン−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ナイドジェン−２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、一酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリライシン／ＣＤ１０、ＮＫｐ４４、ネプリライシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１  ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇ１ａ、ＮＭＤＡ  Ｒ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、Ｎｏｄａｌ、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン、ニューリチン（Ｎｅｕｒｉｔｉｎ）、Ｎｏｇｏ受容体、ニューロＤ１、Ｎｏｇｏ−Ａ、ニューロファスチン（Ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ）、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、Ｎｏｐｅ、ニューロゲニン−２、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ニューロリシン（Ｎｅｕｒｏｌｙｓｉｎ）、ｉＮＯＳ、ニューロフィジンＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、Ｎｏｔｃｈ−１、ニューロピリン−２、Ｎｏｔｃｈ−２、ニューロポイエチン、Ｎｏｔｃｈ−３、Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ、Ｎｏｔｃｈ−４、ニュールツリン、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭ１、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢ１、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−Ｌ、ＮＴ−４、ＮＦＭ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨ１、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン（Ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ）、ベータＮＧＦ、Ｎｕｒｒ−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂα／ＮＲ４Ａ１、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン（Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭＲベータ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン（Ｏｓｔｅｏａｃｔｉｖｉｎ）／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン（Ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン（Ｏｓｔｅｏｃｒｉｎ）、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、Ｏｔｘ２、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン（Ｏｐｔｉｃｉｎ）、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫｌ、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢα／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢベータ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、レックス−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１α、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−  １ベータ、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ−１デルタ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１イプシロン、リボソームタンパク質Ｓ６、Ｒａｅ−１ガンマ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、ＲａｌＡ／ＲａｌＢ、ＲＯＢＯ３、ＲａＩＡ、ＲＯＢＯ４、ＲａＩＢ、ＲＯＲ／ＮＲ１Ｆ１−３、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＲＯＲα／ＮＲＩＦ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲガンマ／ＮＲ１Ｆ３、Ｒａｐ１  Ａ／Ｂ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＲＡＲα／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲベータ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲガンマ／Ｎ１ｌＢ３、ＲＰＡ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫ１、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、Ｒｅｇ  Ｉ、ＲＳＫ３、ＲｅｇＩＬ  ＲＳＫ４、ＲｅｇＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、ＲｅｇＨＩａ、Ｒ−スポンジン２、ＲｅｇＩＶ、Ｒ−スポンジン３、レラキシン−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、レラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、レラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭα、ＲＸＲα／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭベータ、ＲＸＲベータ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲガンマ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰＩ、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／ディアブロ、Ｓ１００Ｂ、Ｓｍａｄ１、Ｓ１００Ｐ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、デルタ−サルコグリカン、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−１、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ６、ＳＣＦ  Ｒ／ｃ−Ｋｉｔ、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、α−平滑筋アクチン、ＳＣＬ、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、Ｓｎａｉｌ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウムカルシウム交換輸送体１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、Ｓｏｇｇｙ−１、αセクレターゼ、ソニックヘッジホッグ、γセクレターゼ、ＳｏｒＣＳ１、βセクレターゼ、ＳｏｒＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソルチリン、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマフォリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマフォリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマフォリン３Ｅ、ＳＯＸ７、セマフォリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマフォリン６Ａ、ＳＯＸ１０、セマフォリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマフォリン６Ｃ、ＳＯＸ２１セマフォリン６Ｄ、ＳＰＡＲＣ、セマフォリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ様１、セパラーゼ、ＳＰ−Ｄ、スピネシン（Ｓｐｉｎｅｓｉｎ）、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣ阻害剤、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンギオテンシノゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−１、セルピンＣ１／抗トロンビンＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリン補因子ＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２、スタビリン−ｌ、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン（Ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）１、セルピンＧ１／Ｃ１阻害因子、スタニオカルシン２、セルピン１２、ＳＴＡＴ１、漿液アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲ０Ｂ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−１、ＳＴＡＴ６、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、ステラ／Ｄｐｐａ３、Ｓｉｇｌｅｃ−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−１、Ｓｉｇｌｅｃ−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、Ｓｉｇｌｅｃ−５、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、Ｓｉｇｌｅｃ−６、スルファターゼ変更因子１／
ＳＵＭＦｌ、Ｓｉｇｌｅｃ−７、スルファターゼ変更因子／ＳＵＭＦ２、Ｓｉｇｌｅｃ−９、ＳＵＭＯ１、Ｓｉｇｌｅｃ−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、Ｓｉｇｌｅｃ−１１、ＳＵＭＯ３、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ−Ｚｎ  ＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ−２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰベータ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サバイビン、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシン１、スリーピングビューティートランスポサーゼ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）、シンデカン−１／ＣＤ１３８、Ｓｌｉｔ３、シンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＥＦＦ／トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）−１、ＴＡＯ２、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−αＡ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、Ｔａｕ、ＴＮＦＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ  ＲＩＬ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＣＡＭ−１、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−１、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＪＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲα／ＮＲ１Ａ１、テネイシンＣ、ＴＲベータ／ＮＲ１Ａ２、テネイシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスティカン（Ｔｅｓｔｉｃａｎ）１／ＳＰＯＣＫ１、ＴＲＡＤＤ、テスティカン２／ＳＰＯＣＫ２、ＴＲＡＦ−１、テスティカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−α、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦ−ベータ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＡＰ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、潜在性ＴＧＦベータ１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦ−ベータ１．２、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦベータ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＴＧＦ−ベータ３、トランスフェリンＲ、ＴＧＦベータ５、アポトランスフェリン、潜在性ＴＧＦベータｂｐｌ、ホロ−トランスフェリン、潜在性ＴＧＦベータｂｐ２、トラッピン−２／エラフィン、潜在性ＴＧＦベータｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦベータＲＩ／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦベータＲＩＩ、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦベータＲＩＩｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦ−ベータＲＩＩＩ、ＴＲＦ−１、サーモリシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ分解エクトエンザイム（ＴＲＨ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  Ｅｃｔｏｅｎｚｙｒｎｅ）／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭ５、チオレドキシン−８０、トリペプチジルペプチダーゼ１、チオレドキシン様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰ１、ＴｒｋＢ、トロンボモジュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポイエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポイエチンＲ、トロポニンＩペプチド３、トロンボスポンジン−１、トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン−４、トリプシン１、サイモポイエチン、トリプシン／ＰＲＳＳ２  ２、胸腺ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、タイ−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、タイ−２、トリプターゼα／ＴＰＳ１、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼベータ−１／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼベータ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼイプシロン／ＢＳＳＰ−４、ＴＩＭ−４、トリプターゼガンマ−１／ＴＰＳＧ１、ＴＩＭ−５、トリプトファン水酸化酵素、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−１、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰ  Ｒ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、ベータ−ＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ  １２、ＴＬＲ５、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＵＧＲＰ１、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−１、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦ  Ｒ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦ  Ｒ１／Ｆｌｔ−１、バソヒビン、ＶＥＧＦ  Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン（Ｖａｓｏｒｉｎ）、ＶＥＧＦ  Ｒ３／Ｆｌｔ−４、バソスタチン（Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ）、バーシカン、Ｖａｖ−１、ＶＧ５Ｑ、ＶＣＡＭ−１、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１Ｉ１、ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ−Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレインα、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７ｂ、ＷＩＦ−１、Ｗｎｔ−８ａ、ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−５ｂ、ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲ１、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡＰ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ１、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４、を含むが、これに限定されない。
【００６１】
いくつかの実施形態では、選択されたポリペプチドは以下のものを含む、任意の数のイオンチャネルを含む。５−ヒドロキシトリプタミン３受容体Ｂサブユニット；５−ヒドロキシトリプタミン３受容体前駆体；５−ヒドロキシトリプタミン受容体３サブユニットＣ；ＡＡＤ  １４タンパク質；アセチルコリン受容体タンパク質、アルファサブユニット前駆体；アセチルコリン受容体タンパク質、ベータサブユニット前駆体；アセチルコリン受容体タンパク質、デルタサブユニット前駆体；アセチルコリン受容体タンパク質、イプシロンサブユニット前駆体；アセチルコリン受容体タンパク質、ガンマサブユニット前駆体；酸感受性イオンチャネル３スプライスバリアントｂ；酸感受性イオンチャネル３スプライスバリアントｃ；酸感受性イオンチャネル４；ＡＤＰリボースピロホスファターゼ、ミトコンドリア前駆体；アルファ１Ａ−電位依存性カルシウムチャネル；アミロライド感受性カチオンチャネル１、ニューロン性（ｎｅｕｒｏｎａｌ）；アミロライド感受性カチオンチャネル２、ニューロン性（ｎｅｕｒｏｎａｌ）；アミロライド感受性カチオンチャネル４、アイソフォーム２；アミロライド感受性ナトリウムチャネル；アミロライド感受性ナトリウムチャネルアルファサブユニット；アミロライド感受性ナトリウムチャネルベータサブユニット；アミロライド感受性ナトリウムチャネルデルタサブユニット；アミロライド感受性ナトリウムチャネルガンマサブユニット；アネキシン  Ａ７；アピカル様タンパク質；ＡＴＰ感受性内向き整流性カリウムチャネル１；ＡＴＰ感受性内向き整流性カリウムチャネル１０；ＡＴＰ感受性内向き整流性カリウムチャネル１１；ＡＴＰ感受性内向き整流性カリウムチャネル１４；ＡＴＰ感受性内向き整流性カリウムチャネル１５；ＡＴＰ感受性内向き整流性カリウムチャネル８；カルシウムチャネルアルファ１２．２サブユニット；カルシウムチャネルアルファＩＥサブユニット、デルタ１９  デルタ４０  デルタ４６スプライスバリアント；カルシウム活性化カリウムチャネルアルファサブユニット１；カルシウム活性化カリウムチャネルベータサブユニット１；カルシウム活性化カリウムチャネルベータサブユニット２；カルシウム活性化カリウムチャネルベータサブユニット３；カルシウム依存性クロライドチャネル−１；カチオンチャネルＴＲＰＭ４Ｂ；ＣＤＮＡ  ＦＬＪ９０４５３  ｆｉｓ、６含有カリウムチャネルテトラマー化ドメインに非常に類似しているクローンＮＴ２ＲＰ３００１５４２；ＣＤＮＡ  ＦＬＪ９０６６３  ｆｉｓ、クロライド細胞内チャネルタンパク質５に非常に類似しているクローンＰＬＡＣＥ１  ００５０３１；ｃＧＭＰ−依存性（ＣＧＭＰ−ｇａｔｅｄ）カチオンチャネルベータサブユニット；クロライドチャネルタンパク質；クロライドチャネルタンパク質２；クロライドチャネルタンパク質３；クロライドチャネルタンパク質４；クロライドチャネルタンパク質５；クロライドチャネルタンパク質６；クロライドチャネルタンパク質ＣＩＣ−Ｋａ；クロライドチャネルタンパク質ＣＩＣｋｂ；クロライドチャネルタンパク質、骨格筋；クロライド細胞内チャネル６；クロライド細胞内チャネルタンパク質３；クロライド細胞内チャネルタンパク質４；クロライド細胞内チャネルタンパク質５；ＣＨＲＮＡ３タンパク質；Ｃｌｃｎ３ｅタンパク質；ＣＬＣＮＫＢタンパク質；ＣＮＧＡ４タンパク質；Ｃｕｌｌｉｎ−５；環状ＧＭＰ感受性カリウムチャネル（Ｃｙｃｌｉｃ−ＧＭＰ  ｇａｔｅｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ）；環状ヌクレオチド感受性カチオンチャネル４；環状ヌクレオチド感受性カチオンチャネルアルファ３；環状ヌクレオチド感受性カチオンチャネルベータ３；環状ヌクレオチド感受性嗅覚チャネル（Ｃｙｃｌｉｃ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｇａｔｅｄ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｃｈａｎｎｅｌ）；嚢胞性繊維症膜コンダクタンス制御因子；シトクロムＢ−２４５重鎖；ジヒドロピリジン感受性Ｌ−タイプ、カルシウムチャネルアルファ−２／デルタサブユニット前駆体；ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子３前駆体；ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子５前駆体；ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子６前駆体；ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子７；ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子８前駆体；Ｇタンパク質活性化内向き整流性カリウムチャネル１；Ｇタンパク質活性化内向き整流性カリウムチャネル２；Ｇタンパク質活性化内向き整流性カリウムチャネル３；Ｇタンパク質活性化内向き整流性カリウムチャネル４；γ−アミノ酪酸受容体α−１サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体α−２サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体α−３サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体α−４サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体α−５サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体α−６サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ベータ−１サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ベータ−２サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ベータ−３サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体デルタサブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体イプシロンサブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ガンマ−１サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ガンマ−３サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体パイサブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ｒｈｏ−１サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体ｒｈｏ−２サブユニット前駆体；γ−アミノ酪酸受容体シータサブユニット前駆体；ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体；グルタミン酸受容体１前駆体；グルタミン酸受容体２前駆体；グルタミン酸受容体３前駆体；グルタミン酸受容体４前駆体；グルタミン酸受容体７；グルタミン酸受容体Ｂ；グルタミン酸受容体デルタ−１サブユニット前駆体；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸１前駆体；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸２前駆体；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸３前駆体；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸４前駆体；グルタミン酸受容体、イオンチャネル型カイニン酸５前駆体；グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ａ前駆体；グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ｂ前駆体；グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットイプシロン１前駆体；グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットイプシロン２前駆体；グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットイプシロン４前駆体；グルタミン酸［���ＭＤＡ］受容体サブユニットゼータ１前駆体；グリシン受容体α−１鎖前駆体；グリシン受容体α−２鎖前駆体；グリシン受容体α−３鎖前駆体；グリシン受容体β鎖前駆体；Ｈ／ＡＣＡリボ核タンパク複合体サブユニット１；高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体ベータサブユニット；仮想タンパク質（Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＤＫＦＺｐ３１３１０３３４；仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ７６１Ｍ１７２４；仮想タンパク質ＦＬＪ１２２４２；仮想タンパク質ＦＬＪ１４３８９；仮想タンパク質ＦＬＪ１４７９８；仮想タンパク質ＦＬＪ１４９９５；仮想タンパク質ＦＬＪｌ  ６１８０；仮想タンパク質ＦＬＪｌ  ６８０２；仮想タンパク質ＦＬＪ３２０６９；仮想タンパク質ＦＬＪ３７４０１；仮想タンパク質ＦＬＪ３８７５０；仮想タンパク質ＦＬＪ４０１６２；仮想タンパク質ＦＬＪ４１４１５；仮想タンパク質ＦＬＪ９０５７６；仮想タンパク質ＦＬＪ９０５９０；仮想タンパク質ＦＬＪ９０６２２；仮想タンパク質ＫＣＴＤ１５；仮想タンパク質ＭＧＣ１５６１９；イノシトール、１，４，５−三リン酸受容体（１，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タイプ１；イノシトール、１，４，５−三リン酸受容体タイプ２；イノシトール、１，４，５−三リン酸受容体タイプ３；中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質４；内向き整流性カリウムチャネル１３；内向き整流性カリウムチャネル１６；内向き整流性カリウムチャネル４；内向き整流Ｋ（＋）チャネル陰性制御因子Ｋｉｒ２．２ｖ；カイニン酸受容体サブユニットＫＡ２ａ；ＫＣＮＨ５タンパク質；ＫＣＴＤ  １７タンパク質；ＫＣＴＤ２タンパク質；ケラチノサイト関連膜貫通型タンパク質１；ｋｖチャネル相互作用タンパク質４；メラスタチン１；膜タンパク質ＭＬＣ１；ＭＧＣ  １５６１９タンパク質；ムコリピン（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ）−１；ムコリピン−２；ムコリピン−３；多剤耐性関連タンパク質４；Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ｃサブユニット前駆体；ＮＡＤＰＨオキシダーゼホモログ１；Ｎａｖｌ．５；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−１０サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−２サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−３サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−４サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−５サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−６サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−７サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、α−９サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、ベータ−２サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、ベータ−３サブユニット前駆体；ニューロンのアセチルコリン受容体タンパク質、ベータ−４サブユニット前駆体；ニューロンの電位依存性カルシウムチャネルα２Ｄサブユニット；Ｐ２Ｘ  プリン受容体  １；Ｐ２Ｘ  プリン受容体  ２；Ｐ２Ｘ  プリン受容体  ３；Ｐ２Ｘ  プリン受容体  ４；Ｐ２Ｘ  プリン��容体  ５；Ｐ２Ｘ  プリン受容体  ６；Ｐ２Ｘ  プリン受容体  ７；膵臓カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｂ；膵臓カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｃ；膵臓カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｄ；ホスホレマン前駆体；プラスモリピン（Ｐｌａｓｍｏｌｉｐｉｎ）；腎多嚢胞病２関連タンパク質；腎多嚢胞病２様１タンパク質；腎多嚢胞病２様２タンパク質；卵のゼリーに関連する（ｅｇｇ  ｊｅｌｌｙ−ｒｅｌａｔｅｄ）タンパク質前駆体についての腎多嚢胞病および受容体；ポリシスチン−２；カリウムチャネル制御因子；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１０；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１２；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１３；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１５；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１６；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１７；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー２；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー４；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー５；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー６；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー７；カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー９；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有３（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３）；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質１２；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質１４；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質２；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質４；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質５；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有１０；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有タンパク質１３；カリウムチャネルテトラマー化ドメイン含有１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー４；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー５；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＡメンバー６；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＢメンバー１；カリウム電位
依存性チャネルサブファミリーＢメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＣメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＣメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＣメンバー４；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＤメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＤメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＤメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＥメンバー４；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＦメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＧメンバー４；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー４；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー５；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー６；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー７；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＨメンバー８；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー４；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＫＱＴメンバー５；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＳメンバー１；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＳメンバー２；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＳメンバー３；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーＶメンバー２；カリウム電位依存性チャネル、サブファミリーＨ、メンバー７、アイソフォーム２；カリウム／ナトリウム過分極活性化型環状ヌクレオチド感受性チャネル１；カリウム／ナトリウム過分極活性化型環状ヌクレオチド感受性チャネル２；カリウム／ナトリウム過分極活性化型環状ヌクレオチド感受性チャネル３；カリウム／ナトリウム過分極活性化型環状ヌクレオチド感受性チャネル４；高可能性ミトコンドリア移入受容体サブユニットＴＯＭ４０ホモログ（Ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｍｐｏｒｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ＴＯＭ４０  ｈｏｍｏｌｏｇ）；プリン受容体Ｐ２Ｘ５、アイソフォームＡ；推定上の４反復（４  ｒｅｐｅａｔ）電位依存性イオンチャネル；推定上のクロライドチャネルタンパク質７；推定上のＧｌｕＲ６カイニン酸受容体；推定上のイオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２バリアントｉ；推定上のイオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２バリアント２；推定上のイオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２バリアント３；カリウムチャネルタンパク質バリアント１の推定上���制御因子；推定上のチロシン−プロテインホスファターゼＴＰＴＥ；リアノジンレセプタ１；リアノジンレセプタ２；リアノジンレセプタ３；ＳＨ３ＫＢＰ１結合タンパク質１；短一過性受容器電位チャネル１；短一過性受容器電位チャネル４；短一過性受容器電位チャネル５；短一過性受容器電位チャネル６；短一過性受容器電位チャネル７；小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質１；小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質２、アイソフォームｂ；小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質３、アイソフォームｂ；小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ２；小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ３；ナトリウムチャネル；ナトリウムチャネルベータ−１サブユニット前駆体；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＩＩαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＩＩＩαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＩＶαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＩＸαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＶαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＶＩＩαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＶＩＩＩαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＸαサブユニット；ナトリウムチャネルタンパク質タイプＸＩαサブユニット；ナトリウムおよびクロライド活性化ＡＴＰ感受性カリウムチャネル；ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼγ鎖；精子関連カチオンチャネル１；精子関連カチオンチャネル２、アイソフォーム４；シンタキシン−１Ｂｌ；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー２；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー３；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー６；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー７；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー２；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー３；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー４；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー５；一過性受容器電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー６；一過性受容器電位チャネル４イプシロンスプライスバリアント；一過性受容器電位チャネル４ゼータスプライスバリアント；一過性受容器電位チャネル７ガンマスプライスバリアント；腫瘍壊死因子、α誘導タンパク質１、内皮；２ポアカルシウムチャネルタンパク質２；ＶＤＡＣ４タンパク質；電位依存性カリウムチャネルＫｖ３．２ｂ；電位依存性ナトリウムチャネルベータ１Ｂサブユニット；電位依存性アニオンチャネル；電位依存性アニオンチャネル２；電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質１；電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質２、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質３、電位依存性カルシウムチャネルガンマ１サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−２サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−３サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−４サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−５サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−６サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−７サブユニット；電位依存性カルシウムチャネルガンマ−８サブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルアルファ−１Ｃサブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルアルファ−ＩＤサブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルアルファ−ｌＳサブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルベータ１サブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルベータ２サブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルベータ３サブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルベータ４サブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルα−ＩＢサブユニット；電位依存性Ｐ／Ｑ−タイプカルシウムチャネルアルファ−１Ａサブユニット；電位依存性Ｒ−タイプカルシウムチャネルアルファ−１Ｅサブユニット；電位依存性Ｔ−タイプカルシウムチャネルアルファ−１Ｇサブユニット；電位依存性Ｔ−タイプカルシウムチャネルアルファ−ｌＨサブユニット；電位依存性Ｔ−タイプカルシウムチャネルアルファ−ｌｌサブユニット；電位依存性Ｌ−タイプカルシウムチャネルアルファ１サブユニット；電位依存性カリウムチャネルベータ１サブユニット；電位依存性カリウムチャネルベータ２サブユニット；電位依存性カリウムチャネルベータ３サブユニット；電位依存性カリウムチャネルＫＣＮＡ７。
【００６２】
いくつかの実施形態では、例示的なＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、以下のものを含むが、これに限定されない。クラスＡロドプシン様受容体、例えば、ミューズ、アセチルコリン脊椎動物タイプ１（ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｔｙｐｅ  １）；ミューズ、アセチルコリン脊椎動物タイプ２；ミューズ、アセチルコリン脊椎動物タイプ３；ミューズ、アセチルコリン脊椎動物タイプ４；アドレナリン受容体、例えば、アルファアドレナリン受容体タイプ１；アルファアドレナリン受容体タイプ２；ベータアドレナリン受容体タイプ１；ベータアドレナリン受容体タイプ２；ベータアドレナリン受容体タイプ３；ドーパミン脊椎動物タイプ１；ドーパミン脊椎動物タイプ２；ドーパミン脊椎動物タイプ３；ドーパミン脊椎動物タイプ４；ヒスタミンタイプ１；ヒスタミンタイプ２；ヒスタミンタイプ３；ヒスタミンタイプ４；セロトニンタイプ１；セロトニンタイプ２；セロトニンタイプ３；セロトニンタイプ４；セロトニンタイプ５；セロトニンタイプ６；セロトニンタイプ７；セロトニンタイプ８；他のセロトニンタイプ；微量アミン、アンギオテンシンタイプ１；アンギオテンシンタイプ２；ボンベシン；ブラジキニン；Ｃ５ａアナフィラトキシン；Ｎ−ホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ）、ＡＰＪ様、インターロイキン８タイプＡ；インターロイキン８タイプＢ；他のタイプのインターロイキン８、タイプ１からタイプ１１および他のタイプのＣ−Ｃケモカイン；Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（タイプ２からタイプ６および他のタイプ）；Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン；コレシストキニンＣＣＫ；ＣＣＫタイプＡ；ＣＣＫタイプＢ；および他のもの；エンドセリン；メラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）；ダッフィ抗原（Ｄｕｆｆｙ  ａｎｔｉｇｅｎ）；プロラクチン放出性ペプチド（ＧＰＲ１０）；神経ペプチドＹ（タイプ１から７）；神経ペプチドＹ、他の神経ペプチドＹ、ニューロテンシン；オピオイド（タイプＤ、Ｋ、Ｍ、Ｘ）；ソマトスタチン（タイプ１から５）；タキキニン（Ｐ物質（ＮＫ１）、Ｋ物質（ＮＫ２））；ニューロメジンＫ（ＮＫ３）；タキキニン様１；タキキニン様２；バソプレシン／バソトシン（タイプ１から２）；バソトシン、オキシトシン／メソトシン；コノプレッシン；ガラニン様；プロテアーゼ活性化様（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｉｋｅ  ）（ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４）；オレキシンおよび神経ペプチド；ＦＦＪＱＲＦＰ；ケモカイン受容体様；ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）；ホルモンタンパク質（濾胞刺激ホルモン、ルトロピン−コリオゴナドトロピンホルモン（Ｌｕｔｒｏｐｉｎ−ｃｈｏｒｉｏｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）、チロトロピン、性腺刺激ホルモンタイプＩ、性腺刺激ホルモンタイプＩＩ）；（ロド）オプシン；ロドプシン脊椎動物（タイプ１−５）；ロドプシン脊椎動物タイプ５；ロドプシン節足動物；ロドプシン節足動物タイプ１；ロドプシン節足動物タイプ２；ロドプシン節足動物タイプ３；ロドプシン軟体動物；ロドプシン；嗅覚（Ｏｌｆａｃｔｏ���ｙ）（嗅覚ＩＩファミリー１から１３）；プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰｌ、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４、プロスタグランジンＦ２アルファ）；プロスタサイクリン；トロンボキサン；アデノシンタイプ１から３；プリン受容体；プリン受容体  Ｐ２ＲＹ  １−４、６、１１；ＧＰＲ  ９１；プリン受容体  Ｐ２ＲＹ５、８、９、１０；ＧＰＲ  ３５；ＧＰＲ  ９２；ＧＰＲ  １７４；プリン受容体  Ｐ２ＲＹ  １２−１４；ＧＰＲ８７（ＵＤＰ−グルコース）；カンナビノイド；血小板活性因子；性腺刺激ホルモン放出ホルモン；性腺刺激ホルモン放出ホルモンタイプＩ；性腺刺激ホルモン放出ホルモンタイプＩＩ；脂肪動態ホルモン様（Ａｄｉｐｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｌｉｋｅ）；コラゾニン（Ｃｏｒａｚｏｎｉｎ）；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび分泌促進物質；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン；成長ホルモン分泌促進因子；成長ホルモン分泌促進因子様；脱皮行動誘導ホルモン（Ｅｃｄｙｓｉｓ−ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）（ＥＴＨＲ）；メラトニン；リゾスフィンゴリピドおよびＬＰＡ（ＥＤＧ）；スフィンゴシン１−ホスフェート（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔ）；Ｅｄｇ−１；Ｅｄｇ−２；Ｅｄｇ−３；Ｅｄｇ−４；Ｅｄｇ−５；Ｅｄｇ−６；Ｅｄｇ−７；Ｅｄｇ−８；ロイコトリエンＢ４レセプタＢＬＴ１；ロイコトリエンＢ４レセプタＢＬＴ２；クラスＡオーファン／他；推定上の神経伝達物質；ＳＲＥＢ；Ｍａｓ癌原遺伝子およびＭａｓ関連（ＭＲＧ）；ＧＰＲ４５様；システイニルロイコトリエン；Ｇタンパク質共役型胆汁酸受容体；遊離脂肪酸受容体（ＧＰ４０、ＧＰ４１、ＧＰ４３）；クラスＢセクレチン様；カルシトニン；副腎皮質刺激ホルモン放出因子；胃抑制ペプチド；グルカゴン；成長ホルモン放出ホルモン；副甲状腺ホルモン；ＰＡＣＡＰ；セクレチン；血管作用性腫ポリプチド；ラトロフィリン；ラトロフィリンタイプ１；ラトロフィリンタイプ２；ラトロフィリンタイプ３；ＥＴＬレセプタ；脳特異的血管形成阻害剤（ＢＡＩ）；メトセラ様タンパク質（ＭＴＨ）；カドヘリンＥＧＦＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）；非常に大きなＧタンパク質共役型受容体；クラスＣ代謝調節型グルタメート／フェロモン；代謝調節型グルタメート群ＩからＩＩＩ；カルシウム感知性様（Ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｌｉｋｅ）；細胞外カルシウム感知性；他のフェロモン、カルシウム感知性様（Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ，  ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｌｉｋｅ  ｏｔｈｅｒ）；推定上のフェロモン受容体；ＧＡＢＡ−Ｂ；ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１；ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２；ＧＡＢＡ−Ｂ様；オーファンＧＰＲＣ５；オーファンＧＰＣＲ６；セブンレスの妻（Ｂｒｉｄｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）のタンパク質（ＢＯＳＳ）；味覚受容体（ＴｌＲ）、クラスＤ真菌フェロモン（Ｃｌａｓｓ  Ｄ  Ｆｕｎｇａｌ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ）；真菌フェロモンＡ因子様（Ｆｕｎｇａｌ  ｐｈｅｒｏｍｏｎｅ  Ａ−Ｆａｃｔｏｒ  ｌｉｋｅ）（ＳＴＥ２、ＳＴＥ３）；真菌フェロモンＢ様（ＢＡＲ、ＢＢＲ、ＲＣＢ��ＰＲＡ）；クラスＥｃＡＭＰ受容体；眼白子症タンパク質；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄファミリー；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ群Ａ（Ｆｚ１、２、４、５、７−９）；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ群Ｂ（Ｆｚ３および６）；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ群Ｃ；鋤鼻受容体（Ｖｏｍｅｒｏｎａｓａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；線虫化学受容体（Ｎｅｍａｔｏｄｅ  ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；昆虫嗅覚受容体（Ｉｎｓｅｃｔ  ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）；および、クラスＺ  古細菌／バクテリア／真菌のオプシン。
【００６３】
いくつかの実施形態では、レプリコンは、被験体に美容上の利益を提供するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、レプリコンは、細菌のクロストリジウム・ボツリヌムに由来するポリペプチドボツリヌス毒素、またはそのホモログまたはオーソログをコードする。高用量のボツリヌス毒素は、しばしば致命的な状態のボツリヌス中毒を引き起こすことがあるが、皮膚に送達される少量のボツリヌス毒素の局所送達は美容上の利益を提供することができる。現在、２つのタイプのボツリヌス毒素（ＢＴＸ）が治療上使用されている；タイプＡ（ＢＴＸ−Ａ）（商品名：  Ｂｏｔｏｘ、ＤｙｓｐｏｒｔおよびＸｅｏｍｉｎ）および、タイプＢ（ＢＴＸ−Ｂ）（商品名：  ＭｙｏＢｌｏｃ）である。ＢＴＸは、斜視（寄り目）、眼瞼痙攣（目の制御されない攣縮またはまばたき）、上位運動ニューロン症候群、重症の多大な腋窩の多汗症（過度の発汗）、頚部ジストニア、慢性片頭痛、アカラシア、慢性の限局性神経障害、歯ぎしり、特発性および神経原性の排尿筋過活動、失禁、肛門裂傷、膣痙、中枢神経系の傷害または疾病に関連した運動障害、を扱うために治療上使用される、局所性ジストニア、胃癌、顎関節疼痛障害（ｔｅｍｐｏｒｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｊｏｉｎｔ  ｐａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、糖尿病性神経障害、創傷治癒、過度の唾液分泌、声帯機能不全、アレルギー性鼻炎、を処置するために治療上使用され、および、美容上の目的（例えばしわを処置すること）に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記述された組成物は、ＢＴＸの局所的な、例えば皮膚への、送達に直接使用される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、レプリコンは１つ以上のＢＴＸをコードし、美容的に（例えば、しわの出現を低減するために）使用される。他の実施形態では、組成物中のＢＴＸは、規定量のタンパク質が（例えば、単位用量で）提供されるように、組換えアルファウイルスレプリコンにおいてコードされる代わりに、ＢＴＸポリペプチドの形態である。
【００６５】
美容目的に使用することができる他のポリペプチドは限定されないが、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ｈＰＴＨ（１→３４）、ＥＧＦ、インシュリン、セクレチン、オキシトシン、アンギオテンシン、β−エンドルフィン、グルカゴン、バソプレシン、ソマトスタチン、ガストリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、エンケファリン、ニューロテンシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、ソマトトロピン、ソマトトロピン放出ホルモン、ブラジキニン、Ｐ物質、ダイノルフィン、甲状腺刺激ホルモン、プロラクチン、インターフェロン、インターロイキン、Ｇ−Ｃ  ＳＦ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、デスモプレシン、ソマトメジンおよびエンドセリン、を含む。
【００６６】
＜デンドリマーおよびデンドリマーナノ粒子＞
「デンドリマー」という用語は、その樹状の分岐構造に由来し、多数の分岐点、三次元の球形状、単分散度およびナノメートルサイズの範囲を特徴とする合成高分子として定義される。デンドリマーの球形状は、その化学組成を所望の用途（例えば、薬物固定化）に合わせることができる多数の末端官能基（「表面基（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｓ）」または「表面反応基（ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ）」）を可能にする。デンドリマーは、段階的に分岐するモノマー単位の結合によって合成されるので、分子サイズ、形状、密度、極性、可撓性および可溶性の正確な制御が実現可能である。異なる分岐単位および官能表面基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｓ）の選択は、デンドリマーに基づくナノ構造の最終的な物理的特性および化学的特性を決定する。様々なタイプのデンドリマーが利用可能であり、任意の適切なデンドリマーが、本明細書に開示された組成物および方法での使用に熟考される。ＮＳＡＩＤｓは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリグルタミン酸デンドリマー、ポリ‐Ｌ‐リジンデンドリマー、ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマー、ポリメラミンデンドリマー、トリアジンデンドリマー、カルボシランデンドリマー、ＤＥＴＭデンドリマー、リンデンドリマー、ポリエステルデンドリマー、ポリエーテルデンドリマー、ＰＡＭＡＭＯＳデンドリマー、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリル酸塩（ＰＤＭＡＥＭＡ）デンドリマー、ジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＡＥデキストラン）デンドリマー、テクト（ｔｅｃｔｏ）デンドリマー、マルチリンガル（ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｉａｌ）デンドリマー、両親媒性デンドリマー、キラルデンドリマー、および、ミセルデンドリマー、を含むが、これに限定されない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、デンドリマーまたはデンドリマーの表面反応基は修飾される。任意の適切なデンドリマー修飾が、本明細書の開示によって熟考される。例示的なデンドリマー修飾は、脂質修飾デンドリマー（例えば、脂質修飾ＰＡＭＡＭまたはＰＰＩデンドリマー）、フッ素化デンドリマー（例えば、フッ素化ＰＡＭＡＭデンドリマー）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル修飾デンドリマー（例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは細胞透過性ペプチドのヒドロキシスクシンイミドエステル）、アミノ酸修飾デンドリマー（例えば、アルギニンおよびリジン修飾ＰＡＭＡＭデンドリマー）、タンパク質およびペプチド修飾デンドリマー、糖修飾デンドリマー（例えば、シクロデキストリン修飾ＰＡＭＡＭデンドリマー）、ポリマー修飾デンドリマー（例えばＰＥＧ化ヒアルロン酸修飾デンドリマー、または、キトサン修飾デンドリマー）、ナノ粒子修飾デンドリマー（例えば、カーボンナノチューブ、グラフェン、量子ドット、金ナノ粒子、磁気ナノ粒子、アップコンバージョンナノ粒子またはシリコンナノ材料）、およびカチオン部分修飾デンドリマー（例えば、オリゴアミン、三級アミン、四級アンモニウム、イミダゾリウム（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ）、グアニジウム、または、ホスホニウム修飾デンドリマー）、を含むが、これに限定されない。好ましい実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンはＰＡＭＡＭデンドリマーナノ粒子で製剤される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーは修飾ＰＡＭＡＭデンドリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭＡＭデンドリマーのアミノ表面反応基は、フッ素化（例えば、ヘプタフルオロ酪酸無水物による）によって修飾される。デンドリマーの表面反応基が修飾される場合、いくつかの実施形態では、表面反応基の一部のみが修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、フッ素化ＰＡＭＡＭデンドリマーは、未修飾アミノ表面反応基およびフッ素化アミノ表面反応基の両方を含む。
【００６８】
ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーは、分子均一性、狭い分子量分布、規定されたサイズおよび形状の特性、および多機能末端表面を示す超分岐ポリマーである。これらのナノスケールポリマーは、エチレンジアミンコア、反復分岐アミドアミン内部構造、および、一次（ｐｒｉｍａｒｙ）アミン表面反応基からなる。デンドリマーは、反復性製造プロセスにおいて中心コアから「成長（ｇｒｏｗｎ）」し、その後の各ステップはデンドリマーの新しい「世代」を表す。世代が増加することで、より大きな分子直径、これは反応性表面部位の２倍でありかつ先の世代の分子量の約２倍である、巨大分子を生成する。
【００６９】
ＰＡＭＡＭデンドリマーは、多種多様な遺伝物質を多くの細胞に送達するための非常に有効な薬剤である。合成非ウイルスベクターとして、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、免疫反応、細胞傷害性を最小化し、かつ、効率的な送達のためにヌクレアーゼに対するポリ核酸を効果的に安定化するように特異的に設計することができる。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、多様な範囲の利用可能な表面修飾を含み、これは：一次アミノ、カルボキシレート、ヒドロキシ、混合アミン／ヒドロキシル、Ｃ１２疎水性、およびコハク酸の表面反応基を含むが、これらに限定されない。
【００７０】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、ＰＡＭＡＭデンドリマーナノ粒子で製剤され、ＰＡＭＡＭデンドリマーは一次アミン表面反応基を含む。いくつかの実施形態では、デンドリマーは、アミノ表面反応基を含む、世代０（Ｇ０）、世代１（Ｇ１）、世代２（Ｇ２）、世代３（Ｇ３）、世代４（Ｇ４）、世代５（Ｇ５）、世代６（Ｇ６）、世代７（Ｇ７）、世代８（Ｇ８）、世代９（Ｇ９）、または、世代１０（Ｇ１０）のＰＡＭＡＭデンドリマーである。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリコンはＰＡＭＡＭデンドリマーナノ粒子で製剤され、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、アミノ表面反応基を含むＧ５またはＧ９のＰＡＭＡＭデンドリマーである。
【００７１】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体混合デバイスを使用して製剤される。マイクロ流体混合デバイスは、ナノリットルスケールでナノ粒子成分のミリ秒の混合を可能にするカスタマイズされ改変された（ｃｕｓｔｏｍ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）マイクロ流体混合カートリッジを介して、制御された上向きの（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ）ナノ粒子の自己組織化を促進する。小さなスケールでの迅速な混合は、ナノ粒子形成の従来の方法（手での混合など）と比較して、粒子形成に対する再現性のある制御を可能にする。いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体デバイスを使用して、ＰＡＭＡＭデンドリマーナノ粒子として製剤される。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスはＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）である。
【００７２】
＜リポソームのカプセル化＞
いくつかの実施形態では、１つ以上の生物活性剤（例えばポリペプチドまたは組換えアルファウイルスレプリコン）は、リポソームにカプセル化される。いくつかの実施形態では、種々の両親媒性脂質は、リポソームとして生物活性剤含有水性コアをカプセル化するために水性環境内で二重層を形成する。いくつかの実施形態では、これらの脂質にはアニオン、カチオン、または、双性イオン性の親水性の頭部を有する。いくつかの実施形態では、いくつかのリン脂質はアニオンであり、他のものは双性イオンである。適切なクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロールを含むが、これに限定されない。典型的なカチオンの脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これに限定されない。双性イオン脂質には、アシル双性イオン脂質およびエーテル双性イオン脂質が含まれるが、これらに限定されない。有用な双性イオン脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣおよびドデシルホスホコリンである。いくつかの実施形態では、脂質は飽和している。いくつかの実施形態では、脂質は飽和していない。
【００７３】
いくつかの実施形態では、リポソームは単一の脂質または脂質の混合物から形成される。いくつかの実施形態において、混合物は：（ｉ）  アニオン脂質の混合物；（ｉｉ）  カチオン脂質の混合物；（ｉｉｉ）  双性イオン脂質の混合物；（ｉｖ）  アニオン脂質およびカチオン脂質の混合物；（ｖ）  アニオン脂質および双性イオン脂質の混合物；（ｖｉ）  双性イオン脂質およびカチオン脂質の混合物；または、（ｖｉｉ）アニオン脂質、カチオン脂質、および双性イオン脂質の混合物、を含む。いくつかの実施形態では、混合物は飽和脂質および不飽和脂質の両方を含む。いくつかの実施形態では、混合物はＤＳＰＣ（双性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含む。いくつかの実施形態では、脂質の混合物が使用される場合、混合物中の成分脂質の全てが両親媒性である必要はなく、例えば、１つ以上の両親媒性脂質がコレステロールと混合される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、脂質の親水性部分はポリエチレングリコールの結合（例えば共有結合）によって修飾される（ＰＥＧ化とも呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化は安定性を高め、リポソームの非特異的吸着を防止する。いくつかの実施形態では、脂質は任意の適切な技術を使用して、ＰＥＧに結合される。
【００７５】
リポソームは、通常３つの群に分けられる：多重層の小胞（ＭＬＶ）；小さい単層の小胞（ＳＵＶ）；および、大きい単層の小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、各小胞内に複数の二重層を有し、いくつかの別個の水性区画を形成する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアをカプセル化する単一の二重層を有する。ＳＵＶは典型的には５０ｎｍより小さい直径を有し、および、ＬＵＶは、５０ｎｍより大きい直径を有する。いくつかの実施形態では、リポソームは、５０−２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。いくつかの実施形態では、様々な直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物について：（ｉ）数にして少なくとも８０％は２０−２２０ｎｍの範囲の直径を有し、（ｉｉ）  集団の平均直径（Ｚａｖ、強度別）は４０−２００ｎｍの範囲内であり、および／または（ｉｉｉ）直径は、０．２より小さい多分散指数を有する。適切なリポソームを調製するための様々な技術が利用可能であり、任意の適切なリポソーム調製技術が熟考される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、生物活性剤（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）をカプセル化することで生物活性剤の安定性が増加する。いくつかの実施形態では、抗原をコードする組換えアルファウイルス粒子を含むマイクロニードル組成物の単位用量が、抗原に対する検出可能な免疫反応を誘導するのに効果的なままである時間が、カプセル化されていないレプリコンと比較して、レプリコンをリポソームにカプセル化することによって増加する。いくつかの実施形態では、増加は、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、５００％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、生物活性剤の安定性は、リポソームにカプセル化することによって２倍以上になる。いくつかの実施形態では、生物活性剤をリポソームにカプセル化することは、生物活性剤を細胞に送達する効率を高めるのに有効である。いくつかの実施形態では、リポソームにカプセル化することで、所望の結果（例えば、防御免疫反応）を達成するのに必要な生物活性剤の量を、生物活性剤がカプセル化されずに送達される場合に必要とされる量と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多く減少させる。
【００７７】
＜脱水組成物＞
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスであって、該デバイスは：複数のマイクロニードルを含む基板と；複数のマイクロニードルの上にコーティングされたか、またはそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子を含む組成物と、を含む。また、本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、マイクロニードルデバイスを調製する方法であって、該方法は：複数のマイクロニードルを含む基板を得る工程と；外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを複数のマイクロニードルの上または中にコーティングまたは埋め込む工程と、を含む。また、本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、それを必要とする個体において免疫反応を誘導する方法であって、該方法は：（ａ）（ｉ）複数のマイクロニードルの上にコーティングされ、またはそれらに埋め込まれた外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む複数のマイクロニードル、を含むマイクロニードルデバイスと個体の皮膚表面を接触させる工程と、（ｂ）組換えアルファウイルスレプリコンを個体に送達する工程、とを含み、それによって個体に免疫反応を誘導させる工程の方法である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるＲＮＡ組成物は脱水型で提供される。いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロニードルに適用または埋め込む前後などに、脱水される型である。いくつかの実施形態では、リポソームにカプセル化されたレプリコンは、脱水型である。いくつかの実施形態では、脱水は、組成物の安定性の増加、組成物の貯蔵期限の延長、および組成物の減量を含む、いくつかの利点を提供する。
【００７９】
一般に、「脱水」という用語は、組成物からある量の水を除去することを指す。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上の出発量の水を除去するように脱水される。いくつかの実施形態では、出発量の水の少なくとも５０％が除去される。いくつかの実施形態では、除去されることが望ましい水の量は、目標量以下の水の量に達するように、水の出発量に左右される。いくつかの実施形態では、組成物は約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、またはより少ない水を含むように脱水される。いくつかの実施形態では、脱水型は１％未満の水を含有する。いくつかの実施形態では、組成物、またはその構成要素は、実質的に全ての、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、またはより多くの水分を除去するように脱水される。いくつかの実施形態では、脱水されたレプリコン組成物は実質的に含水量がない。いくつかの実施形態では、組成物の水分の９８％は除去される。いくつかの実施形態では、脱水される組成物の出発形態は、液体、半液体、半固体、固体、またはゲルである。一般に、脱水した組成物は「乾燥した」組成物と称される。幾つかの実施形態において、乾燥した組成物は粉末形態である。いくつかの実施形態では、乾燥した組成物はゲル様である。いくつかの実施形態では、脱水された組成物は、乾燥した組成物に還元された液体レプリコン組成物を含む。いくつかの実施形態では、脱水されたレプリコン組成物は、室温（例えば、２１℃−２８℃間の温度）での安定性が増大する。いくつかの実施形態では、脱水されたレプリコン組成物は、室温での貯蔵期限が延長した。いくつかの実施形態では、室温の安定性の増加は、脱水前の組成物または液体形態で提供される同等の組成物と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、５００％またはそれ以上である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、脱水は、任意の数の方法によって達成される。１つの実施形態では、レプリコン組成物の脱水は、「凍結乾燥」とも呼ばれるフリーズドライによって達成される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、組成物中の水を固体状態に凍結させ、続いて昇華させる工程を含む。いくつかの実施形態では、昇華は真空中で行われる。いくつかの実施形態では、昇華プロセスを加速するために熱が組成物に加えられる。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、組成物の実質的に全ての水分を除去する。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、低温乾燥法が望ましい場合に使用される。いくつかの実施形態では、フリーズドライの機械は、多数の異なる製造業者から容易に入手可能である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、脱水方法は凍結乾燥に制限されておらず、脱水の他の方法が熟考される。いくつかの実施形態では、レプリコン組成物は風乾される。いくつかの実施形態では、レプリコンは揮発性アルコール（例えばイソプロパノールまたはエタノール）で洗浄される。いくつかの実施形態では、この工程は、組成物中の水分を揮発性アルコールで置換し、核酸分子を沈殿させる。いくつかの実施形態では、沈殿した核酸分子をペレットにするための遠心分離の工程の後、揮発性アルコールは、例えば、揮発性アルコールをピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）または注ぎ出すことなどによって除去され、ペレットにされた核酸分子は風乾される。いくつかの実施形態では、脱水は、乾燥剤の使用を含む。乾燥剤の例には、アルミナ、アルミニウムアマルガム、酸化バリウム、過塩素酸バリウム、無水ホウ酸、塩化カルシウム（無水）、酸化カルシウム、硫酸カルシウム（無水）、硫酸銅（ＩＩ）（無水）、マグネシウムアマルガム、過塩素酸マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（無水）、五酸化リン、カリウム、炭酸カリウム（無水）、水酸化カリウム、シリカゲル、ナトリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムカリウム合金、硫酸ナトリウム（無水）、硫酸、などが含まれる。脱水の他の利用可能な方法には、加熱乾燥、液体窒素によるフリーズドライ、および噴霧乾燥が含まれる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、脱水された生物活性剤は、被験体への投与のためにマイクロニードル構造上に直接コーティングされる。いくつかの実施形態では、液体レプリコン組成物は、構造をコーティングするためにマイクロニードル上に直接噴霧乾燥される。別の例において、マイクロニードルは液体のレプリコン組成物に浸漬され、次に、組成物は構造上で風乾される。いくつかの実施形態では、液体レプリコンまたはポリペプチドの組成物は、マイクロ流体デバイス（例えば本明細書に記載のＢｉｏＤｏｔプリンタ）を使用して、マイクロニードル上にコーティングされる。いくつかの実施形態では、脱水されたレプリコン組成物は、金属マイクロニードル構造上に直接コーティングされる。他の実施形態では、脱水されたレプリコン組成物は、ポリマーマイクロニードル構造上に直接コーティングされる。さらなる他の実施形態では、脱水されたレプリコン組成物は、ポリマーコーティングマイクロニードル構造上に直接コーティングされる。いくつかの実施形態において、マイクロニードル自身を含む組成物は脱水される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、組換えアルファウイルスレプリコンは、マイクロ流体分配デバイスを使用して、マイクロニードル上にパッケージングされる。マイクロ流体分配デバイスは、１つのマイクロニードル、複数のマイクロニードル、またはマイクロニードルアレイ上に正確な印刷容積を再現可能に分配する、高速吸引および分配能力を備えた非接触液体処理システムである。マイクロ流体分配デバイスは、典型的には、予め決められた体積の試薬（例えばレプリコンＲＮＡ）を正確に吸い上げ、次いで、印刷テーブル上に配置された基板（例えばマイクロニードルアレイ）へとナノリットル容積を放出する（印刷する）、セラミックニードルを保持する可動ステージを利用する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体分配デバイスはＢｉｏＤｏｔＡＤ１５２０卓上ワークステーション（ｔａｂｌｅｔｏｐ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、脱水された生物活性剤（例えばポリペプチドまたはレプリコン）がマイクロニードル自体に組み込まれる（例えば、マイクロニードルに埋め込まれる）。いくつかの実施形態では、脱水されたレプリコンは、成形および重合の前にポリマーと混合される。いくつかの実施形態では、レプリコン−ポリマー組成物は、その後、成形され、重合されて固体マイクロニードル構造を形成し、ここにおいて、レプリコンはマイクロニードル構造内に含まれている。いくつかの実施形態では、ポリマー物質は、溶解性、生分解性、生体溶解性、またはそれらの組み合わせであり、その結果、マイクロニードルを被験体の皮膚に適用すると、ポリマーは溶解性、生分解性および／または可溶化され、レプリコンが放出される。
【００８５】
＜医薬組成物＞
いくつかの実施形態では、本開示のマイクロニードルデバイスは、医薬組成物として製剤された活性成分（例えば、組換えアルファウイルスレプリコンおよび／またはポリペプチド）を含んでいる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、組換えアルファウイルスレプリコンおよび薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示のマイクロニードルデバイスは、水または緩衝液（例えばリン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸塩緩衝液）中の組換えアルファウイルスレプリコン、または、他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤、を含む。任意の適切な薬学的に許容可能な担体または賦形剤は、本明細書の開示によって熟考される。いくつかの実施形態では、緩衝液塩類は、存在する場合、５−２０  ｍＭ範囲内で含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５．０から９．５の間、例えば６．０から８．０の間のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、等張性を得るためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含む。いくつかの実施形態では、例えば１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度のＮａＣｌは、典型的には約９ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は金属イオンキレート化剤を含む。いくつかの実施形態では、キレート化剤は、ホスホジエステル加水分解を加速するイオンを除去することによってＲＮＡ安定性を延ばす。キレート化剤の例は、限定されないが、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などを含み、これはいくつかの実施形態では、１０−５００μＭの間、例えば０．１ｍＭの間で、存在する。いくつかの実施形態では、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩はキレート化剤として作用するが、一方、有利なことに緩衝作用も提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、２４０−３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または２９０−３１０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの１つ以上の保存料を含んでいる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は水銀を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は保存料を含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は滅菌または殺菌される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は非発熱性であり、例えば、用量当たり１ＥＵ未満（エンドトキシン単位、標準測定値）、場合によっては１用量あたり０．１ＥＵ未満を含有する。いくつかの実施形態において、医薬組成物はＲＮＡｓｅ阻害剤を含む。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＲｏｃｈｅによって市販されているものなどの、任意の適切なＲＮＡｓｅ阻害剤が本明細書での使用が意図される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は単位用量形態で調製される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物はさらに、小分子免疫増強剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＴＬＲ２アゴニスト（例えばＰａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、Ｅ６０２０などのアミノアルキル−グルコサミニド−リン酸塩）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えばイミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えばレシキモド）、および／またはＴＬＲ９アゴニスト（例えばＩＣ３１）を含む。いくつかの実施形態では、そのようなアゴニストは、＜２０００ Ｄａの分子量を有するように選択される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、レプリコン分子の完全性を維持するために、レプリコン組成物を低温で保存する。いくつかの実施形態では、適切な保存温度は−８０℃から＋４℃である。いくつかの実施形態では、レプリコン組成物は液状であり、−８０℃から＋４℃で保存される。他の実例では、レプリコン組成物は脱水型であり、室温で保存される。
【００８８】
＜使用の方法＞
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子を投与するためのマイクロニードルデバイスであって、該デバイスは：複数のマイクロニードルを含む基板；および、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンまたはＲＮＡ分子を含む組成物であって、複数のマイクロニードルをコーティングする、またはそれに埋め込まれた組成物、を含む。さらに本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、マイクロニードルデバイスを調製する方法であって、該方法は：複数のマイクロニードルを含む基板を得る工程；および、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンをマイクロニードル上にコーティングする、またはそれに埋め込む工程、を含む。本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、必要としている個体における免疫反応を誘導する方法であって、該方法は：（ａ）マイクロニードルデバイスを個体の皮膚表面と接触させる工程であって、該マイクロニードルデバイスは、（ｉ）複数のマイクロニードル上にコーティングされた、またはそれに埋め込まれた、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む複数のマイクロニードルを含む、工程、および（ｂ）組換えアルファウイルスレプリコンを個体に送達し、それによって個体における免疫反応を誘導する工程、を含む。
【００８９】
化合物を送達するための従来の注入法（抗原を用いたワクチン接種など）は、皮膚の免疫系を回避し、および化合物は皮下組織または筋肉に直接注入される。皮膚は、上皮のランゲルハンス細胞および真皮樹状細胞を含む多くの免疫細胞を含んでいる。理論に縛られることなく、これらの細胞は、細胞性免疫反応を誘導すると共に、抗体を放出するリンパ球、Ｂ細胞による抗体の生成を強化すると考えられる。いくつかの実施形態では、ワクチンの皮内投与は、免疫原の効果を引き起こすために用いられる。
【００９０】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、マイクロニードルデバイスを調製する方法であって、該方法は：複数のマイクロニードルを含む基板を得る工程；および、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンをマイクロニードル上にコーティングする、またはそれに埋め込む工程、を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、マイクロニードルの中または上に組換えアルファウイルスを包装する（例えば、上にコーティングする、または中に埋め込むことによる）工程と、組換えアルファウイルスを包装前に脱水する工程を含む。いくつかの実施形態では、該方法は、マイクロニードルの中または上に組換えアルファウイルスを包装する（例えば、上にコーティングする、または中に埋め込むことによる）工程と、組換えアルファウイルスを包装後に脱水する工程を含む。組換えアルファウイルスレプリコンを調整し、さらに包装、脱水、および／またはカプセル化するための物質と方法は、本明細書に開示される物質と方法のいかなるものも含むことができ、開示の他の態様に関連して包含する。
【００９１】
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、必要としている個体における免疫反応を誘導する方法であって、該方法は：（ａ）マイクロニードルデバイスを個体の皮膚表面と接触させる工程であって、該マイクロニードルデバイスは、（ｉ）複数のマイクロニードル上にコーティングされた、またはそれに埋め込まれた、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを含む複数のマイクロニードルを含む、工程；および（ｂ）組換えアルファウイルスレプリコンを個体に送達し、それによって個体における免疫反応を誘導する工程を含む。「皮膚表面」は一般的に、表皮の外層または実質的な外層（外部環境にさらされた表皮細胞の層）を指す。いくつかの実施形態では、レプリコンは、被験体への皮内投与のためのマイクロニードルの中または上に包装される。いくつかの実施形態では、他の投与経路は、マイクロニードル組成物が適用される標的組織に応じて可能である。いくつかの実施形態では、他の投与経路は、限定されないが、筋組織、腹腔内組織、皮内組織、皮下組織および頬の組織（例えば頬または舌）への適用を含む。いくつかの実施形態では、脱水したレプリコンの投与は、多数の異なる方法で行われる。一例では、脱水したレプリコンは、マイクロニードルの表面にコーティングされ、被験体の皮膚に直接マイクロニードルを適用する際に、または皮膚表面の浸透に際して分解される。いくつかの実施形態では、脱水したレプリコンは、数秒または数分で分解する。いくつかの実施形態では、脱水したレプリコンは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４５、５０、６０、１２０、１８０秒内、またはそれ以上で分解する；または、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、６０、１２０分分内、またはそれ以上の分内で分解する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、レプリコン組成物は、必要としている被験体にポリペプチドを送達するために使用される。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原をコードするレプリコンは、癌を処置するために使用される。これらの方法に従った使用のための癌抗原の例が記載される。開示されたマイクロニードル組成物を使用して処置される癌の例は、限定されないが、以下を含む：棘細胞腫、腺房細胞癌、聴神経腫、末端性黒子性黒色腫、先端汗腺、急性好酸球性白血病、急性リンパ性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、分化型急性骨髄芽球白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、エナメル上皮腫、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺様歯原性腫瘍、副腎皮質細胞腫、成人Ｔ細胞白血病、アグレッシブＮＫ細胞白血病、ＡＩＤＳ関連の癌、ＡＩＤＳ関連のリンパ腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮線維腫、肛門癌、未分化大細胞リンパ腫、組織非形成性甲状腺癌 、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管筋脂肪腫、血管肉腫、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍（AT/RT）、基底細胞癌、 Basal-like癌腫、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、ベリニ管癌、胆道癌、膀胱癌、真性腫瘍、骨癌、骨腫瘍、脳幹部神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、ブレンナー腫瘍、気管支腫瘍、細気管支肺胞上皮癌、褐色腫、バーキットリンパ腫、原因部位不明の癌、カルチノイド腫瘍、癌腫、上皮内癌、陰茎の癌腫、原因部位不明の癌腫、癌肉腫、カストルマン病、中枢神経系胚芽腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頚癌、胆管癌、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、脈絡叢乳頭腫、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、慢性好中球性白血病、明細胞腫瘍、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｄｅｇｏｓ病、隆起性皮膚線維肉腫、類皮嚢胞、線維形成性小細胞腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、胎児性癌、卵黄嚢腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、子宮内膜性腫瘍、腸疾患に関連するＴ細胞性リンパ腫、脳室上衣芽腫、上衣腫、類上皮肉腫、赤白血病、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイングファミリー腫瘍、ユーイングファミリー肉腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、乳腺外ページェット病、ファロピウス管癌、封入奇形胎児、繊維腫、線維肉腫、濾胞性リンパ腫、甲状腺濾胞癌、胆嚢癌、胆嚢癌、神経細胞神経膠腫、神経節神経腫、胃癌、胃リンパ腫、胃腸癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍、胚細胞腫、妊娠性絨毛癌、妊娠性絨毛腫瘍、骨巨細胞腫、多形神経膠芽腫、神経膠腫、神経膠腫症、グロムス腫瘍、グルカゴノーマ、性腺芽細胞腫、顆粒膜細胞腫、ヘアリー細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、頭頸部癌、心臓腫瘍、血管芽腫、血管外皮腫、血管肉腫、血液悪性腫瘍、肝細胞癌、 肝脾T細胞リンパ腫、遺伝性乳癌・卵巣癌症候群、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部の神経膠腫、炎症性乳癌、眼球内黒色腫、島細胞癌、島細胞腫、若年性骨髄単球性白血病、サルコーマ、カポジ肉腫、腎臓癌、Ｋｌａｔｓｋｉｎ腫瘍、クルッケンベルク腫瘍、喉頭癌、喉頭癌、悪性��子型黒色腫、白血病、白血病、口唇癌および口腔癌、脂肪肉腫、肺癌、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ上皮腫、リンパ性白血病、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、悪性線維性組織球腫、骨悪性線維性組織球腫、悪性神経膠腫、悪性中皮腫、悪性末梢神経鞘腫、悪性ラブドイド腫瘍、悪性トリトン腫瘍、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、マスト細胞白血病、縦隔胚細胞腫、縦隔腫瘍、甲状腺髄様癌、髄芽腫、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、メラノーマ、髄膜腫、メルケル細胞癌、中皮腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、尿路上皮細胞癌、ミュラー管混合腫瘍、単球性白血病、口腔癌、粘液性腫瘍、多発性内分泌腺腫症、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、菌状息肉腫、骨髄異形成疾患、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性肉腫、脊髄増殖性疾患、粘液腫、鼻腔癌、鼻咽腔癌、上咽頭癌、新生物、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経芽腫、神経線維腫、神経腫、結節型黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫性皮膚癌、非小細胞肺癌、眼腫瘍、乏突起星細胞腫、乏突起膠腫、膨大細胞腫、視神経鞘髄膜腫、口腔癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫、卵巣低悪性度腫瘍、乳房ページェット病、パンコースト腫瘍、膵癌、膵臓癌、甲状腺乳頭癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、血管周囲類上皮細胞腫瘍、咽頭癌、クロム親和細胞腫、中間型松果体実質腫瘍、松果体芽腫、下垂体細胞腫、下垂体腺腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、多胚腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、中枢神経原発悪性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、原発性肝細胞癌、原発性肝癌、原発性腹膜癌、原始神経上皮腫瘍、前立腺癌、腹膜偽性粘液腫、直腸癌、腎細胞癌、染色体１５上のＮＵＴ遺伝子を含む呼吸器系の癌腫、網膜芽細胞腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、リヒター転化、仙尾部奇形腫、唾液腺癌、サルコーマ、シュワノマトーシス、脂腺癌、続発性新生物、精上皮腫、漿液性腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫、性器索間質腫瘍、セザリー症候群、印環細胞癌、皮膚癌、小型円形細胞からなる腫瘍（Ｓｍａｌｌ ｂｌｕｅ ｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ）、小細胞癌、小細胞肺癌、小細胞性リンパ腫、小腸癌、軟部組織肉腫、ソマトスタチン産生腫瘍、ばい煙性いぼ、脊髄腫瘍、脊柱腫瘍、脾辺縁帯リンパ腫、有棘細胞癌、胃癌、表在拡大型黒色腫、テント上原始神経上皮腫瘍、表層上皮性・間質性腫瘍、滑膜肉腫、Ｔ細胞急性リンパ性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、Ｔ細胞性白血病、Ｔ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、奇形腫、末期リンパ腺癌、精巣癌、莢膜腫、喉頭癌、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂と尿管の移行上皮癌、移行上皮癌、尿膜管癌、尿道癌、泌尿生殖器腫瘍、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、膣癌、ヴァーナー−モリソン症候群、いぼ状癌、視神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ワルチン腫瘍、ウィルムス腫瘍。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法と組成物の治療の有効性は、癌の処置に関して、良性か悪性かに関わらず、腫瘍細胞の増殖の抑制、腫瘍の血管新生の抑制、腫瘍細胞の根絶、および／または少なくとも１つの腫瘍のサイズの減少を、該方法と組成物が促進した度合によって測定され、これらによって被験体の増殖性の障害を処置する。いくつかの実施形態では、いくつかのパラメータが治療の有効性の確定において考慮され、本明細書において論じられる。いくつかの実施形態では、臨床医が、特定の状態に関するパラメータの適切な組み合わせを確立する。処置中の癌の経過（例えば、腫瘍サイズの減少または癌細胞の根絶）は、腫瘍サイズと癌の経過を追跡するために、クリニックで現在使用されている方法などの、適切な方法を用いて確認される。いくつかの実施形態では、癌の処置を評価するために使用される１つの有効性パラメータは、腫瘍サイズの減少である。腫瘍サイズは、寸法測定、またはＷａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって開発され、腫瘍体積の正確評価を可能にするＦｒｅｅＦｌｉｇｈｔソフトウェアなどの、利用可能なコンピューターソフトウェアを使用した腫瘍体積の評価などの、適切な技術を用いて計算できる。いくつかの実施形態では、腫瘍サイズは、例えばＣＴ、超音波、ＳＰＥＣＴ、スパイラルＣＴ、ＭＲＩ、写真などを使用して、腫瘍を可視化することで判定される。いくつかの実施形態では、治療期間の満了後に腫瘍が外科的に切除される場合、腫瘍組織の存在および腫瘍サイズは、切除される組織のグロス分析、および／または切除された組織の病理学的分析によって判定される。いくつかの実施形態では、腫瘍の成長は、処置の結果、安定する（例えば、１つ以上の腫瘍は、そのサイズが１％、５％、１０％、１５％、または２０％よりも増大しない、および／または転移しない）。いくつかの実施形態では、腫瘍は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間、またはそれ以上；または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、またはそれ以上の期間、安定する。いくつかの実施形態では、腫瘍のサイズは、少なくとも約５％（例えば少なくとも約１０％、１５％、２０％または２５％）減少する。いくつかの実施形態では、腫瘍サイズは、少なくとも約３０％（例えば少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％）減少する。いくつかの実施形態では、腫瘍サイズは、少なくとも約７０％（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％）減少する。最も好ましくは、腫瘍は完全に除去されるか、または検出レベルより低いレベルに減少する。いくつかの実施形態では、被験体は、処置後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間、またはより期間、腫瘍のない状態が続く（例えば緩解）。いくつかの実施形態では、被験体は、処置後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、またはより期間、腫瘍のない状態が続く。いくつかの実施形態では、被験体は、処置後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年、またはより長い期間、腫瘍のない状態が���く。
【００９４】
本開示はさらに、いくつかの実施形態において、個体における免疫反応をモニタリングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、被験体にアルファウイルスレプリコン組成物を投与する工程；および、外因性のポリペプチドに対する個体の免疫反応のレベルを判定するために、被験体からのサンプルを分析する工程、を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、レプリコンは、利用可能で適切なインビトロまたはインビボ試験法を使用して、その治療特性を確認するためにスクリーニングまたは分析される。いくつかの実施形態では、レプリコンから構成されるワクチンは、対象となる特定のリンパ球型、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、Ｔ細胞クローンの、増殖を誘導する効果、またはそれらのエフェクター機能について試験される。いくつかの実施形態では、免疫を与えられたマウスからの脾臓細胞は単離され、および、免疫原をコードするレプリコンを含む自己由来の標的細胞を溶解するための細胞毒性Ｔリンパ球の能力。いくつかの実施形態では、Ｔヘルパー細胞分化は、ＥＬＩＳＡによりＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマ）および／またはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの増殖または生成を測定することで分析され、または細胞質のサイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞において直接分析される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗原をコードするレプリコンは、例えば、対象の抗原に特異的な抗体のＢ細胞生成の誘導によって証明された、体液性免疫反応を誘導する能力に関して試験される。いくつかの実施形態では、これらのアッセイは、免疫を与えられた個体からの末梢性Ｂリンパ球を使用して実施されるが、適切なアッセイ法が熟考される。いくつかの実施形態では、レプリコンを特徴づけるために使用されるアッセイは、コードされた抗原の標的細胞による発現を検知することを含む。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳは、細胞表面または細胞内での抗原発現を検知するために使用される。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳの選択は、異なるレベルの発現を分類する。いくつかの実施形態では、より低い発現が望ましい。いくつかの実施形態では、特定の抗原を発現する細胞の特定に適した他の方法には、プレート上でのモノクローナル抗体を使用したパニング、またはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用した捕捉が含まれる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、被験体は、皮膚を介したマイクロニードル組成物の送達を促進する薬剤で前処置されている。いくつかの実施形態では、前処置は皮膚バリアの物理的な破壊である。いくつかの実施形態では、前処置は、マイクロクリスタルピーリング、剥脱、熱アブレーション、化学的アブレーション、レーザー療法、電流、電気穿孔法、ソノフォレーシスなどを含む。いくつかの実施形態では、前処置は化学薬剤の適用である。いくつかの実施形態では、前処置は物理的な破壊と化学薬剤の組み合わせである。いくつかの実施形態では、前処置は、生物活性剤の送達前に行なわれる一般的な美容整形術である。いくつかの実施形態では、前処置は美顔用である。いくつかの実施形態では、前処置は、処置される表面の洗浄および／または殺菌である。いくつかの実施形態では、生物活性剤による美容処置を受ける被験体は、皮膚科医の診察所で処置を受ける。いくつかの実施形態では、処置は、マイクロニードル組成物を適用する表面の前処置後に、生物活性剤（例えば組換えアルファウイルスレプリコン）を含むマイクロニードル組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、前処置は、拭き取り繊維、綿棒または他の物質により処置される表面を拭う工程を含む。いくつかの実施形態では、拭き取り繊維、綿棒または他の物質は包装された状態で供給される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、処置は、しわと眉間しわ線の処置のために、ＢＴＸポリペプチドを含むマイクロニードル組成物を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、処置は、他の美容整形術、例えば美顔術と組み合わせられる。いくつかの実施形態では、美顔術はレプリコンの送達を促進する。いくつかの実施形態では、被験体は一次処置として美顔術を受ける。いくつかの実施形態では、ＢＴＸポリペプチドを含むマイクロニードルは、美顔術を受けた、好ましくは所望の処置の部位である顔面領域に適用される。いくつかの実施形態では、ＢＴＸは皮内投与によって被験体に送達される。
【００９９】
＜経口組成物＞
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、経口組成物の生成方法および被験体への経口組成物の投与法である。いくつかの実施形態では、経口組成物は、被験体にＲＮＡレプリコンまたはポリペプチドを送達するために使用される。いくつかの実施形態では、経口組成物はポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは本明細書に記載される核酸分子（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせ）である。
【０１００】
場合によっては、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはコード配列を含むＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写によって生成され、その方法は本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ポリペプチドをコードするコード配列またはコード領域を含む。ポリペプチドは本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはワクチンとしての用途に適した抗原である。本明細書は、ワクチンとしての用途に適した抗原の例を提供する。場合によっては、抗原は外来性の抗原である。いくつかの実施形態では、外来性の抗原は、本明細書に開示される外来性の抗原である。いくつかの実施形態では、外来性の抗原は、インフルエンザウイルス（例えば血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ））に関係する抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は自己抗原（すなわち癌に関係する抗原）である。いくつかの実施形態では、レプリコンによってコードされた抗原は、被験体に送達される。いくつかの実施形態では、抗原は、被験体の免疫反応を引き出す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは７−メチルグアノシンキャップ（すなわち５’キャップ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはポリアデニル化末端を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはその両方を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、経口組成物はＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは本明細書に記載されるＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、ペスチウイルス、ルビウイルス、カリシウイルス、ヘパシウイルス、またはアルファウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ポリペプチドをコードするコード配列またはコード領域を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは本明細書に記載されるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはワクチンとしての用途に適した抗原である。本明細書は、ワクチンとしての用途に適した抗原の例を提供する。場合によっては、抗原は外来性の抗原である。いくつかの実施形態では、外来性の抗原は、本明細書に開示される外来性の抗原である。いくつかの実施形態では、外来性の抗原は、インフルエンザウイルス（例えば血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ））に関係する抗原である。いくつかの実施形態では、抗原は自己抗原（すなわち癌に関係する抗原）である。いくつかの実施形態では、レプリコンによってコードされた抗原は、被験体に送達される。いくつかの実施形態では、抗原は、被験体の免疫反応を引き出す。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、経口組成物は、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上のレプリコン分子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のレプリコン分子は、１以上の、２以上の、３以上の、４以上の、５以上の、６以上の、７以上の、８以上の、９以上の、１０以上の、またはより多くのポリペプチドをコードする。場合によっては、１つのポリペプチドは１つのレプリコン分子によってコードされる。その他の場合において、２つ以上のポリペプチドは１つのレプリコン分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、経口組成物は、４つの異なるインフルエンザウイルスのサブタイプまたは菌株に由来する血球凝集素（ＨＡ）をコードする、複数のレプリコン分子を含む４価のインフルエンザワクチンである。しかしながら、本開示は送達するワクチン剤に制限されていない。いくつかの実施形態では、実質的に、本明細書に記載されるいかなるポリペプチドもコードするレプリコンは、経口組成物（例えば遺伝子治療用の）で使用される。
【０１０３】
場合によっては、経口組成物はウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、抗原をコードするＲＮＡまたはＤＮＡ塩基配列を送達するために使用される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは様々なウイルスに由来し、その非限定的な例には、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）、ラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス）、ポックスウイルス（例えば鶏痘ウイルス、鳥類ポックスウイルスまたはワクシニア）、アルファウイルス（例えばＶＥＥ、シンドビス、またはＳＦＶ）などが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが複製欠陥であるように、ウイルスベクターは弱毒化ウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、特定の組織または細胞型がウイルスの成長を助け、および他の組織または細胞型はウイルスの成長を助けないような指向性を示す。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはウイルスの指向性を拡大するために修飾される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはウイルスの指向性を制限するために修飾される。いくつかの実施形態では、指向性は特定の種である（例えば、鳥類の細胞だけに感染可能なウイルス）。いくつかの実施形態では、ウイルスの指向性はワクチンに一致し、また、ワクチン接種されている種および所望の標的組織または細胞型について考慮される。
【０１０４】
＜経口組成物の製剤＞
いくつかの実施形態では、経口組成物は、胃腸系の環境と適合するように設計される。いくつかの実施形態では、経口組成物は、不十分な溶解度、低透過性、不安定性および急速な代謝を含む、経口の生物学的利用能（バイオアベイラビリティ）に影響する多数の要因により制限される。いくつかの実施形態では、開示される経口組成物を製造する際に、とりわけこれらの要因を考慮する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、開示される経口組成物は、本明細書に開示されるようにポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは「裸の」状態である（すなわち、他の生物活性剤、添加剤などを実質的に含まない）。いくつかの実施形態では、経口組成物は裸のＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、裸のポリヌクレオチドは固形剤である。いくつかの実施形態では、裸のポリヌクレオチドは、乾燥粉を作るために（例えばＰＥＧにより）沈殿され、脱水される。いくつかの実施形態では、裸のポリヌクレオチドは液体製剤にある。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはデンドリマー、例えばＧ５およびＧ９デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ）で複合体を形成する。本明細書に記載されるような適切なデンドリマーを熟考する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはリポソームでカプセル化される。いくつかの実施形態では、リポソームでポリヌクレオチドをカプセル化する方法は本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、被験体への経口での送達に適したリポソームでカプセル化されたＲＮＡレプリコンを含む。理論に縛られることなく、組成物のリポソームは、腸の円柱上皮に結合および浸透し、細胞質にＲＮＡレプリコン「ペイロード」を放出することができる。いくつかの実施形態では、次にレプリコンは、免疫反応を引き起こすために抗原ポリペプチドに翻訳される。
【０１０７】
場合によっては、組成物は小さな核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＬＰは、被験体に治療的に核酸を送達するために使用される微細粒子（直径が〜１２０ｎｍ）である。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＬＰは、カチオンと融合性脂質の混合物を含む。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＬＰは拡散性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされる。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＬＰは、本開示のポリヌクレオチドをカプセル化し、かつ被験体にポリヌクレオチドを送達するために使用される。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＬＰはリポソームである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は固形剤を含む。いくつかの実施形態では、固形剤の非限定的な例には、錠剤、カプセルまたは丸剤が含まれる。いくつかの実施形態では、固形剤は、それを必要としている被験体への組成物の経口投与に適している。いくつかの実施形態では、経口投与用の遅効性製剤は、胃腸管内で体液と接したポリヌクレオチドの制御放出を達成するために、および実質的に一定した有効なレベルのポリヌクレオチドを血漿内に提供するために、調製される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはこの目的のために、生物分解性重合体、水溶性高分子、またはそれらの混合物のポリマーマトリクスに、および随意に適切な界面活性剤に、包埋される。いくつかの実施形態では、包埋は、ポリマーのマトリックスに微小粒子を取り込むことである。いくつかの実施形態では、制御放出製剤は、既知の分散技術またはエマルジョンコーティング技術によって分散した微小粒子または乳化された微小滴のカプセル化を通じて得られる。いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドはカプセルとして調剤される。いくつかの実施形態では、組成物のポリヌクレオチドはカプセルによってカプセル化された固形剤または液剤である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、組成物の配合は腸溶性である。場合によっては、乾燥したポリヌクレオチド組成物は、腸溶性カプセルとして調剤される。いくつかの実施形態では、乾燥したポリヌクレオチド組成物は、腸溶錠として調剤される。理論によって縛られずに、腸溶剤は、胃の酸性胃液から組成物を保護することができ、胃粘膜の炎症を防ぐことができ、組成物の作用開始を遅らせることができ、および小腸への組成物の放出を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、腸溶性の配合は、コーティング錠、糖衣錠、軟ゼラチンカプセル、硬質ゼラチンカプセル、グラニュレートまたはペレットである。使用に適した腸溶剤の非限定的な例は以下を含む：腸被膜形成剤 、例えばポリメタクリレート（例えばメタクリル酸−エタクリレートポリ（ＭＡ１−ＥＡ１）、メタクリル酸−メチルメタクリレートポリ（ＭＡ１−ＩＭＭＡ１）およびポリ（ＭＡ１−ＭＭＡ２））、セルロース系ポリマー（例えば、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリット酸セルロース、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、ポリビニル誘導体（例えばポリビニルアセテートフタレート）、スチレンとマレイン酸のハーフエステル共重合体、ビニルエーテルとマレイン酸のハーフエステル共重合体、酢酸ビニルとクロトン酸の共重合体；可塑剤、例えばクエン酸、酒石酸およびセバシン酸のアルキルエステル（例えば、セバシン酸ジエチル、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、クエン酸アセチルトリエチル、クエン酸アセチルトリブチル、酒石酸ジブチル）、フタル酸のエステル（例えば、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、フタル酸ジオクチル、エチルフタリル−およびブチルフタリルエチルグリコラート）、グリセリンエステル（例えば、ヒマシ油、胡麻油、アセチル化された脂肪酸グリセライド、グリセリンジアセタート、グリセリントリアセタート）、高級アルコール（例えばグリセロール、１，２−プロピレングリコール）、ポリエーテル（例えばポリエチレングリコールおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、界面活性剤（例えばＰＥＧ−４００ステアリン酸塩、ＰＥＧソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノオレアート）；抗癒着剤（例えば滑石、ステアリン酸マグネシウム、微粉にされたアモルファスケイ酸、カオリン）；着色剤および顔料（例えば酸化チタン、酸化鉄顔料）；および他の添加剤。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物はさらに任意の数の賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、あらゆる溶媒、コーティング剤、香味料、着色料、滑剤、崩壊剤、保存剤、甘味料、結合剤、希釈剤および溶剤を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、本開示の治療用組成物に適合する。いくつかの実施形態では、賦形剤は、小腸での組成物の吸収を促進するために、ビタミンＢ１２、葉酸、またはそれらの組み合わせを含む。場合によっては、賦形剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。場合によっては、賦形剤は、ビタミンＢ１２（ＰＥＧ／Ｂ１２）で誘導体化されたＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧおよびＰＥＧ／Ｂ１２は、開示のポリヌクレオチドを沈殿するために使用される。いくつかの実施形態では、医薬組成物における賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。
【０１１１】
＜用法・用量＞
いくつかの実施形態では、開示される配合の適切な用量を、必要とする被験体に経口で投与する。いくつかの実施形態では、組成物は食物と共に投与される。場合によっては、被験体は、配合物が不足しておりそれを必要としている。いくつかの実施形態では、配合物が不足しておりそれを必要としている被験体は、ワクチンが不足しておりそれを必要としている被験体である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、開示されるポリヌクレオチドの治療上有効な量は、被験体の体重ｋｇ当たりのポリヌクレオチドｍｇとして表現される。いくつかの例では、治療上有効な量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１６０ｍｇ／ｋｇ、約１８０ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２２０ｍｇ／ｋｇ、約２４０ｍｇ／ｋｇ、約２６０ｍｇ／ｋｇ、約２８０ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約３２０ｍｇ／ｋｇ、約３４０ｍｇ／ｋｇ、約３６０ｍｇ／ｋｇ、約３８０ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約４２０ｍｇ／ｋｇ、約４４０ｍｇ／ｋｇ、約４６０ｍｇ／ｋｇ、約４８０ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約５２０ｍｇ／ｋｇ、約５４０ｍｇ／ｋｇ、約５６０ｍｇ／ｋｇ、約５８０ｍｇ／ｋｇ、約６００ｍｇ／ｋｇ、約６２０ｍｇ／ｋｇ、約６４０ｍｇ／ｋｇ、約６６０ｍｇ／ｋｇ、約６８０ｍｇ／ｋｇ、約７００ｍｇ／ｋｇ、約７２０ｍｇ／ｋｇ、約７４０ｍｇ／ｋｇ、約７６０ｍｇ／ｋｇ、約７８０ｍｇ／ｋｇ、約８００ｍｇ／ｋｇ、約８２０ｍｇ／ｋｇ、約８４０ｍｇ／ｋｇ、約８６０ｍｇ／ｋｇ、約８８０ｍｇ／ｋｇ、約９００ｍｇ／ｋｇ、約９２０ｍｇ／ｋｇ、約９４０ｍｇ／ｋｇ、約９６０ｍｇ／ｋｇ、約９８０ｍｇ／ｋｇ、約１０００ｍｇ／ｋｇ、または１０００ｍｇ／ｋｇ以上である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、組成物は経口で１回、または２回以上投与される。場合によっては、組成物は、単一用量として経口で投与される。その他の場合では、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、またはより多くの用量として経口で投与される。いくつかの実施形態では、用量は経口で、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、または１日１０回以上投与される。場合によっては、用量は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１０日以上の間に１回投与される。いくつかの実施形態では、用量は連続的に（すなわち連日）投与される、または用量の投与されない日が間に入る。場合によっては、用量は、１週間に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、毎月１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、４ヶ月ごとに１回、５ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回、７ヶ月ごとに１回、８ヶ月ごとに１回、９ヶ月ごとに１回、１０ヶ月ごとに１回、１１ヶ月ごとに１回、１年に１回、または数年に１回、投与される。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、組成物は「プライムブースト」レジメンとして投与される。いくつかの実施形態では、本明細書において定義される「プライムブースト」レジメンは、免疫系が標的抗原により「刺激され（ｐｒｉｍｅｄ）」、免疫が標的抗原の再投与により選択的に高められる、ワクチン接種レジメンである。いくつかの実施形態では、プライムブーストは異種である（すなわち、第１のベクターは標的抗原を投与するために使用され（「プライム」）、第２の別個のベクターは標的抗原を投与するために使用される（「ブースト」））。いくつかの実施形態では、プライムブーストは同種である（すなわち、第１および第２のベクターは同じである）。いくつかの実施形態では、「ブースト」は、いくつもの別個のベクターの複数回投与を要する。いくつかの実施形態では、プライムブーストレジメンは、第１のベクターによる「プライム」、続いて第２のベクターによる「ブースト」、続いて第３のベクターによる別の「ブースト」を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、異種のプライムブーストは２つ以上の別個のベクターを含む。いくつかの実施形態では、プライムブーストは、免疫系を刺激するために、標的抗原をコードするアルファウイルスレプリコンを含み、続いて、免疫を上げるために、同じ標的抗原をコードするＶＳＶウイルスベクターを含む。本明細書に記載されるものを含む別個のベクターの組み合わせが、異種のプライムブースト戦術において使用するために熟考される。いくつかの実施形態では、標的抗原は同じである。場合によっては、標的抗原は異なる。場合によっては、両方のベクターは同じ投与経路で投与される。いくつかの実施形態では、第１のワクチンおよび第２のワクチンは、共に経口で送達される。いくつかの実施形態では、第１のワクチンおよび第２のワクチンは異なる投与経路で投与される。いくつかの実施形態では、第１のワクチンは、免疫系を刺激するために経口で投与され、続いて、選択的に免疫を上げるために、第２のワクチンがマイクロニードル注入される。いくつかの実施形態では、第１のワクチンはマイクロニードル注入によって投与され、続いて第２のワクチンが経口投与される。開示の方法を行なうのに適した投与経路の非限定的な例は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、経口投与、鼻腔内投与および点滴を含む。場合によっては、第１および第２のベクターは同じであるが、異なる投与経路で送達される。その他の場合では、第１および第２のベクターは異なるが、同じ投与経路で送達される。さらに他の場合では、第１および第２のベクターは異なり、異なる投与経路で送達される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、プライムブーストレジメンは、第１のワクチンの送達と第２のワクチンの送達との間に一定期間を挟む。いくつかの実施形態では、第１のワクチンの送達および第２のワクチンの送達が同じ日に（例えば同じ病院受診で）行われる。いくつかの実施形態では、第２のワクチンは、最初のワクチンの送達と同日に、またはその１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週後、２週後、３週後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、７ヶ月後、８ヶ月後、９ヶ月後、１０ヶ月後、１１ヶ月後、１年後、２年後、３年後、４年後、５年後、１０年後、または１０年以上後に送達される。
【０１１７】
＜インフルエンザワクチンの製造方法＞
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、インフルエンザウイルスワクチンを製造するための方法である。インフルエンザウイルスワクチン製造における現在の標準では、インフルエンザワクチンの製造には数ヶ月を要する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、インフルエンザワクチンを製造するのに必要な時間を減らす。場合によっては、改良された方法は、新しいインフルエンザワクチンを製造するのにわずか２週間または３週間しか必要としない。いくつかの実施形態では、インフルエンザワクチンの製造における１つの律速的な工程は、株特異的な血球凝集素（ＨＡ）免疫反応性を示す抗体標準を作るのに必要な時間である。
【０１１８】
いくつかの態様では、本開示は、株特異性ＨＡまたはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質標準を生成するための改良方法を提供する。場合によっては、ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質標準は、インビトロ結合転写・翻訳システムで生成される。インビトロ転写・翻訳システムは当技術分野において知られており、市販のキットとして（例えばＰｒｏｍｅｇａから）購入することができる。いくつかの実施形態では、株特異性ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質標準は、タンパク質のＣ末端の端部におけるアフィニティータグを用いて生成される。いくつかの実施形態では、アフィニティータグは当技術分野において知られており、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびポリヒスチジンタグ（ＨＩＳ）を制限なく含む。いくつかの実施形態では、アフィニティータグはＨＡおよび／またはＮＡタンパク質標準を精製するために使用される。いくつかの実施形態では、ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、Ｃ末端に追加されたＨＩＳタグを含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＳタグを付けられたＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、ＨＩＳタグを付けたタンパク質を例えばニッケルアフィニティーカラムまたはニッケル磁気アガロースビーズに結合させることによって精製される。いくつかの実施形態では、組換えアフィニティータグ付きＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、一般に当技術分野において知られているタンパク質工学法によって生成される。場合によっては、組換えアフィニティータグ付きＨＡおよび／またはＮＡタンパク質は、インビトロで、例えば細菌細胞で生成される。いくつかの実施形態では、ＨＡおよび／またはＮＡタンパク質標準は、本開示のインフルエンザワクチンに応じて、細胞培養で合成されたＨＡおよび／またはＮＡ抗原の量を定量化するために使用される。場合によっては、アフィニティータグ付きＨＡおよび／またはＮＡタンパク質標準は、迅速にＨＡおよび／またはＮＡ抗体標準を生成するために、抗原として使用される。動物（例えばウサギ）において多クローン性抗体を生成する方法は、当技術分野において周知である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質と抗体の標準はさらに、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で利用される。ＥＬＩＳＡアッセイを生成するおよび実行する方法は一般に当技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイは、本開示のインフルエンザワクチンに応じて、細胞培養で合成されたＨＡおよび／またはＮＡ抗原の量を定量化するために使用される。いくつかの実施形態では、抗原および／または抗体の定量化する他の方法は当技術分野において知られており、一元放射状免疫拡散法アッセイ（ＳＲＩＤ）、表面プラズモン共鳴検出およびＴｉｔｅｒ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ（Ｆｌｕ−ＴｏＣ）を制限なく含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質と抗体の標準は、場合によっては、血球凝集反応阻害測定を開発するために使用される。いくつかの実施形態では、赤血球を凝集させるインフルエンザウイルスの特定菌株の能力を試験する。いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスを、複数の赤血球を含むマイクロウェルプレートに加える。理論によって縛られずに、インフルエンザウイルスの表面上にある血球凝集素（ＨＡ）は、赤血球の表面上のＮ−アセチルノイラミン酸に結合することができ、ウイルスを細胞に付着させて格子状構造を形成させる。場合によっては、本明細書に開示される抗原またはワクチンによって生成されたＨＡ抗体は、赤血球へのインフルエンザウイルスの結合を防ぐ（および凝集を防ぐ）ために使用される。いくつかの実施形態では、細胞へのウイルスの結合を抑制するために必要とされるＨＡ抗体の最小濃度により、ウイルスの力価を決定する。いくつかの実施形態では、ＨＡ抗体は、本開示の方法によって生成された任意のＨＡ抗体である。場合によっては、ＨＡ抗体は、本開示の組成物（すなわちＨＡ抗原）の接種を受けた被験体からの血清に由来する。
【０１２１】
いくつかの態様では、本開示は遺伝子プロファイリングの方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子プロファイリングは被験体の免疫反応のバイオマーカーを特定するために使用される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物を用いたワクチン接種を受ける被験体は、免疫反応を示すバイオマーカーについてスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、遺伝子プロファイリングは、ワクチン接種前とワクチン接種後に末梢血細胞で行なわれる。いくつかの実施形態では、遺伝子プロファイリングは、ワクチン接種前、ワクチン接種の１日後、ワクチン接種の３日後、およびワクチン接種の７日後に、末梢血細胞で行なわれる。場合によっては、遺伝子プロファイリングは、本開示の組成物の接種を受けた被験体で行なわれる。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。場合によっては、遺伝子プロファイリングは、例えば臨床試験の一部として、新しいインフルエンザワクチンの有効性を評価するために行なわれる。
【０１２２】
＜キット＞
本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、外因性ポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンなどの、生物活性剤を製造および／または投与するためのキットである。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される組成物のいずれか１つ以上を、任意の適切な組み合わせで含む。いくつかの実施形態では、キットは、マイクロニードル中または上に生物活性剤を包装するための物質、ＲＮＡナノ粒子を生成するための物質（例えばデンドリマー）、生物活性剤を脱水するための物質（マイクロニードルへの適用前または後）、および／またはリポソームでアルファウイルスレプリコンをカプセル化するための物質を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の実施形態に従って、被験体に組成物を投与するための説明書と共に組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、被験体に組成物を投与するための道具を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、すぐさま使用できるように準備された形態、または他の物質（キットにある、またはユーザーによって供給される）と混合して再構成する必要のある形態などの、任意の適切な形態で提供される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスレプリコンの生成に適した物質は、制限なく以下の組み合わせを含む：外因性ポリペプチドをコードする遺伝子を含む合成鋳型ＤＮＡ分子、任意の適切なアルファウイルス株に由来するアルファウイルスレプリコン、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）、緩衝剤、プライマー、ＮＴＰ、制限酵素、ＲＮＡリガーゼ、リボヌクレアーゼ阻害剤など。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、マイクロニードルの中または上にアルファウイルスレプリコンを包装するのに適した物質は、制限なく以下を含む：マイクロニードル、またはマイクロニードルを製造するための物質（例えばポリマー、金型など）、レプリコン組成物を脱水する物質など。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書において熟考されたキットは、外因性ポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンを含み経口で被験体に投与される組成物と、その使用説明書を含むキットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、第１の投与経路によって外因性ポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンを含む第１の組成物、第２の投与経路によって外因性ポリペプチドをコードするアルファウイルスレプリコンを含む第２の組成物、およびその使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の経路は同じである。いくつかの実施形態では、第１および第２の経路は異なる。いくつかの実施形態では、第１の投与経路は経口投与であり、また第２の投与経路は皮内投与である。いくつかの実施形態では、キットは、皮内投与が考慮される場合、マイクロニードル内に包装された組成物を含む。
【実施例】
【０１２６】
以下の例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなるやり方でも本発明を制限することを意図していない。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、好ましい実施形態を現時点において代表するものであり、典型的なものであるが、本発明の範囲を制限する意図はない。それらにおける変更、および特許請求の範囲により定義されるような本発明の趣旨に含まれる他の用途を、当業者は見出すだろう。
【０１２７】
＜実施例１−組換えアルファウイルスＤＮＡ構築物＞
ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を、ＧｅｎｅＢａｎｋからの配列と共に使用して設計された。外因性のポリペプチドをコードする組換えアルファウイルスレプリコンを、図７に例示されるように設計した。手短に言えば、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、インフルエンザ血球凝集素タンパク質（ＨＡ、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＦ００９５５４．１を参照）、またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＫＰ６５９２４７．１；１５５−８３５を参照）のいずれかをコードするＤＮＡ塩基配列を、４つのアルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４）を含むアルファウイルスレプリコンカセットの下流（すなわち３’の方向に）融合させた。空のレプリコンカセット（つまり、アルファウイルス非構造タンパク質のみを含み、対象の遺伝子を含まない）をさらに設計した。５’および３’非翻訳領域（それぞれ５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ）をさらに、ホスト細胞における発現を促進するために、レプリコン構築物に含有させた。組換えアルファウイルスレプリコンを、図３（ｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰ）、図４（ｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＨＡ）、図５（ｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＨＢｓＡｇ）、および図６（ｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７−ＶＥＥＶ）に示されるように、ｐＵＣ５７−Ｋａｎ−Ｔ７ベクターに挿入した。
【０１２８】
ＤＮＡを、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）またはＤＮＡ ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）を用いて合成し、およびクローン化した。ＤＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐを、Ｚｙｐｐｙ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ Ｃａｔ＃ Ｄ４０３６（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて準備した。ＤＮＡ Ｍａｘｉｐｒｅｐを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標） Ｈｉ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ ＃８００２７０８）を用いて行った。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ３７３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを、Ｇｅｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｂｅｔｔｅｒ Ｂｕｆｆｅｒと共に使用し、ＵＣ Ｄａｖｉｓ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｉｌｉｔｙでＤＮＡ塩基配列決定を行なった。適切な対象遺伝子を、上述のように組換えアルファウイルスレプリコンとして設計し合成することができる。
【０１２９】
＜実施例２−組換えアルファウイルスレプリコンＲＮＡのインビトロ合成＞
実施例１に記載されたプラスミドＤＮＡを、ＮｄｅＩまたはＭｌｕＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、３’挿入に向かって直鎖状にした。ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｋｉｔをメーカーの説明書（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ＃ ＡＭ１３３３）に従って使用し、ＲＮＡを直鎖状の鋳型ＤＮＡからインビトロで合成した。大規模転写反応の精製のためのＭＥＧＡｃｌｅａｒ（登録商標）Ｋｉｔをメーカーの説明書（Ａｍｂｉｏｎ Ｃａｔ＃１９０８）に従って使用し、ＲＮＡを精製した。Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｃａｔ＃Ｍ２０８０Ｓ）を使用して、５’キャップをＲＮＡに付加した。ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（登録商標）Ｋｉｔをメーカーの説明書に従って使用して、ＲＮＡを再度精製した。いくつかの例では、ＴｒｉＬｉｎｋ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、レプリコンＲＮＡ構築物を適切な鋳型ＤＮＡから合成した。様々な方法を用いてプラスミドＤＮＡからＲＮＡのインビトロ転写を行うことが可能であり、任意の適切な方法を本明細書に記載される組換えアルファウイルスレプリコンを生成するために用いることができる。
【０１３０】
１μｇのレプリコンＲＮＡを、０．２μｇ／μＬに希釈し、さらに同量のサンプルローディングダイで希釈し、ＲＮＡバンドが完全に分解されるまで１．０％のアガロースゲル上で移動させた。Ｔ７−ＶＥＥＶレプリコン（ｎｓＰ１−４のみ）からのＲＮＡ、Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰレプリコン、およびＴ７−ＶＥＥＶ−ＨＡレプリコン（Ａ型インフルエンザの株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９ Ｈ１Ｎ１）を、図８に示す。
【０１３１】
＜実施例３−トランスフェクトされたレプリコンＲＮＡはインビトロでのタンパク質発現を誘導する＞
【０１３２】
＜組織培養法＞
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞はピーター・バリー博士（ＵＣ Ｄａｖｉｓ）によって提供された。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ ＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃａｔ＃ ＳＨ３００２２．０１）を、１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃２１４０−０８７）と５０Ｕ／ｍｌのペニシリンと５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと共に用いて、３７℃および５％のＣＯ２下で細胞を育てた。Ｓｔｅｍｆｅｃｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔをメーカーの説明書（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に従って使用し、実施例２に記載されたＨＡまたはＥＧＦＰ ＲＮＡレプリコンを用いて細胞をトランスフェクトした。
【０１３３】
＜ウエスタンブロット＞
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１μｇまたは２μｇのＨＡレプリコンまたはＥＧＦＰレプリコンを備えた６ウェルプレート中でトランスフェクトし、３７℃および５％のＣＯ２下で２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション期間後、暖かいＨＢＳＳを用いて細胞を注意深く洗浄し、２５０μｌ １ｘ溶解緩衝液中で採取した。溶解物を２０分間、氷の上でインキュベートし、超音波で１分間処理し、次に１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上澄みを清潔なチューブに移動させ、およびＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をメーカーの説明書に従って使用してタンパク質濃度を判定した。
【０１３４】
ゲル電気泳動のためのサンプルを、２つの濃度、２０μｇ／１５μｌおよび４０μｇ／１５μｌで調製した。サンプル調製のために、上澄みの一定分量をｄｄＨ２Ｏで希釈し、４ｘ Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファーと混ぜ合わせ、続いて変性のために６０℃で２０分間温めた。次に、サンプル（１レーン当たり１５μｌ）とラダー（５μｌ）を、４−２０％のＴＧＸグラジエントゲル（Ｂｉｏｒａｄ）に載せ、２００Ｖで３０分間動かした。電気泳動の後、分離されたタンパク質を、タンク式（ウェット式）電気泳動転写によってニトロセルロースメンブレンにブロッティングした。ゲルと濾紙とメンブレンを、まずは転写緩衝液で平衡にし、次にパッドで緩衝された「転写サンドイッチ」（濾紙−ゲル−メンブレン−濾紙）に配置し、支持グリッドで一緒にプレスした。支えられたゲルサンドイッチを、ステンレス鋼／白金線電極間のタンクに垂直に入れ、転写緩衝液で満たした。転写を１００Ｖで１時間行なった。転写の後、ニトロセルロースメンブレンを、転写を確認するためにポンソーＳで染色した。
【０１３５】
ｄｄＨ２Ｏで脱染した後に、メンブレンを１ｘＴＢＳの５％の脱脂乳粉末中で１時間ブロッキングし、続いてマウス抗ＨＡ抗体（１：１０００）またはマウス抗ＥＧＦＰ抗体と共に、振動する振とう機において１ｘＴＢＳの０．５％の脱脂乳粉末中で、室温で１時間インキュベートした。次に、メンブレンを、１ｘＴＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で５分間３回洗浄し、次に、ＨＲＰ複合抗マウス抗体（１：５０００）と共に、１ｘＴＢＳ、０．５％の脱脂乳粉末内、室温で１時間、振動する振とう機上でインキュベートし、続いて３回洗浄した。最後に、メンブレンを室温で３０分間、１−Ｓｔｅｐ ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてインキュベートした。
【０１３６】
図９に示されるように、１μｇまたは２μｇのいずれかのＥＧＦＰレプリコンでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、２４時間（レーン３および４、図９）と４８時間（レーン６および７、図９）の両方の時点で、容易に検知可能な量のＥＧＦＰタンパク質を発現した。未変性のＥＧＦＰ（上記のトランスフェクトされたＥＧＦＰレプリコンによって生成）は、２３８のアミノ酸、２６．９ｋＤａのタンパク質であり、一方でＢｉｏｖｉｓｉｏｎ社の市販のＥＧＦＰ（陽性対照、レーン１、図９）は、２９３のアミノ酸、３２．７ｋＤａのタンパク質である。２４時間および４８時間の溶解緩衝液のみのサンプル（陰性対照、レーン２および５、図９）は、検知可能なＥＧＦＰバンドを含まなかった。
【０１３７】
１μｇまたは２μｇ（データは図示せず）のいずれかのＡ型インフルエンザＨＡレプリコンを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、２４時間と４８時間の両方の時点において、容易に検知可能な量のＨＡタンパク質を発現した。図１０に示されるように、完全長の７２ｋＤａのＨＡタンパク質バンド（陽性対照、レーン２、図１０）は、はっきりと目視可能である。抗ＨＡ抗体はある程度の交差反応性を示しているが、緩衝液のみの陰性対照に見られた対応する７２ｋＤａバンドは見られない（レーン３、図１０）。２つの異なる溶解緩衝液を、ＨＡレプリコンでトランスフェクトしたサンプルで試験し（レーン３−６、図１０）、および、図１０の矢印によって示されるように、分析された全てのサンプルには７２ｋＤａのＨＡバンドが存在していた。
【０１３８】
＜ＥＧＦＰ蛍光分析＞
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、６つのウェルプレートで播種し、２４時間後に〜７０％の培養密度に至ることができた。次に培地を交換し、実施例２に記載されたように０、０．５、１、２、または４μｇのＥＧＦＰ  ＲＮＡレプリコンのいずれかを用いて、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ（商標）を使用し細胞をトランスフェクトした。残りのウェルを陽性対照として、１μｇのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いてトランスフェクトした。２４時間または４８時間のインキュベーション後、培地は取り除かれ、０．５ｍＬの細胞溶解緩衝液を、細胞を溶解するために加えた。細胞溶解産物を、キュビットフルオロメーターをメーカーの説明書に従って使用し、蛍光について分析した。
【０１３９】
図１１および１２で見られるように、Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰレプリコンのトランスフェクションはＥＧＦＰの激しい発現に結びつく。同等量のＴ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰ  ＲＮＡおよびＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの蛍光を比較した場合、Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰレプリコンはＥＧＦＰ  ｍＲＮＡと比較しておよそ３．５倍のＥＧＦＰを産生する（図１２）。トランスフェクション後の４８時間では、Ｔ７−ＶＥＥＶ−ＥＧＦＰレプリコンでトランスフェクトされた細胞は、ＥＧＦＰ産生の増加を示し、ｍＲＮＡが依然として合成されていることを示唆した（図１１）。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、２４時間および４８時間において、同様のレベルのＥＧＦＰ蛍光を示す（図１１）。
【０１４０】
＜実施例４−ＢｉｏＤｏｔ印刷されたマイクロニードルからのＥＧＦＰ ｍＲＮＡのコーティングと溶出＞
ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡは、２つの方法を使用して、５ｘ５マイクロニードルアレイ上に転写された：（１）浸漬；および（２）マイクロ流体分配ＢｉｏＤｏｔプリンターを使用。
【０１４１】
＜浸漬法＞
アレイを、まず１０分間超音波処理し、続いて４５０℃で１時間焼いた。滅菌に続いて、３つのアレイを３０分間パラフィルム上で、ＤＥＰＣ処理したｄｄＨ２Ｏ中の、０．１ｍｇ／ｍＬのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの１００μＬの小球に浮かせた（浸した）。コーティングに続いて、アレイを周囲温度で乾燥させることが許された。さらに３つのアレイをＢｉｏＤｏｔプリンターを使用してコーティングした。
【０１４２】
＜ＢｉｏＤｏｔ印刷＞
最初に、マイクロニードルアレイを、Ｓｔｅｒｉｓ Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを推力設定９にして、室温で１１分間超音波処理することにより洗浄した。超音波処理に続いて、アレイを１７１℃で１時間殺菌するか、またはシリコン処理をするかのいずれかを行う。シリコン処理については、清潔なマイクロニードルアレイを、０．１％のダウコーニングＭＤＸ４／２．５％ストダードソルベント／９７．５％イソプロピルアルコールの溶液で２０秒間インキュベートし、溶液から取り出し、室温で１時間乾燥させ、６０℃で一晩硬化させる。シリコン処理に続いて、アレイを前述されたように熱殺菌し、こうして印刷の準備が整う。
【０１４３】
ＢｉｏＤｏｔ（ＡＤ１５２０）システムは、正確な印刷体積によって高レベルの再現性を伴うｍＲＮＡマイクロニードルの製作を可能にする。その機器は、予め決められた量の試薬（ｍＲＮＡ）を正確に吸い上げ、次に印刷テーブル上に配置されたマイクロニードルアレイ上にナノリットル量を排出（印刷）する、セラミックニードル（開口部７５−１９０μｍ）を保持する可動ステージを利用する。
【０１４４】
ＢｉｏＤｏｔはｍＲＮＡ印刷に先立って、ニードル内の気泡を確実に除去するために、多数の吸引工程と０．０１％のＰＢＳを用いた溶出工程を含む洗浄工程を経験する。その後、５μｌのｍＲＮＡをセラミックニードル内に吸引し、各マイクロニードル上に５ｎＬの液滴を繰り返し排出することによってマイクロニードルアレイに印刷し、印刷の合間には６０−１２０秒の乾燥時間を伴う。印刷と乾燥に続いて、マイクロニードルを９０度の角度で上方へ曲げて、使用できる状態にする。トリス緩衝液中の１．０ｍｇ／ｍＬのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの計４０ｎＬが、５ｘ５アレイの各ニードル上に、一度に５ｎＬコーティングされた（アレイ全体では、合計１μｇのｍＲＮＡ）。アレイは、周囲温度で乾燥させることが可能であった。
【０１４５】
＜コーティングされたマイクロニードルからのＲＮＡ溶出＞
コーティングと乾燥の後、アレイを、５、１５および３０分間軽く震動させながら、パラフィルム上で１００μＬのＤＥＰＣ処理されたｄｄＨ２Ｏの小球に浮かせた。サンプルを各間隔でアレイから採取し、さらなる処理のために氷で冷やしておいた。すべてのサンプルを採取した後、キュビットフルオロメーターを使用して、各サンプルの一定分量をＲＮＡの存在について試験した。残りのサンプルは、量的ＲＴ‐ＰＣＲ解析のために利用した。表１および図１６に見られるように、ＢｉｏＤｏｔで印刷されたサンプルからのＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの回収は、測定された３つの溶出時間全体にわたって一貫しており、また強固であった。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
＜実施例５−ＲＮＡナノ粒子のマイクロ流体配合＞
ナノ粒子をさらに、ＳＨＭ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ ｃｈｉｐ）を用いたＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒのマイクロ流体混合デバイス（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して製剤した。手短に言えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）Ｃ１２デンドリマー（Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ ｃａｔ＃５３，６８５−７または５３，６８７−３）と、１、２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を、エタノール内で結合させた。デオキシリボヌクレアーゼ／リボヌクレアーゼを含まない無エンドトキシン水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および無菌の１００ｍＭ（ｐＨ３．０）ＱＢクエン酸塩緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）または１００ｍＭのＮａ酢酸塩（ｐＨ４．０）で、ＲＮＡを１０ｍＭの最終クエン酸塩または酢酸塩濃度へと希釈した。エタノールと水性流をＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅに装填し、ナノ粒子を生成するために、１：３の体積測定比率と５．０ｍｌ／分の合算流速で混ぜ合わせた。ナノ粒子をさらに、エタノール段階でポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調製した。ナノ粒子を、２０，０００の分画分子量用のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｃａｓｓｅｔｔｅを使用して、ＰＢＳに対して透析した。透析されたナノ粒子を、Ａｍｉｃｏｎのスピンフィルターで濃縮し、０．２μｍポリ（エーテルスルホン）フィルタ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して除菌した。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてナノ粒子の特徴を明らかにした；図１４および１５における、脂質ナノ粒子と脂質ナノ粒子＃２を参照。
【０１４８】
＜実施例６−ＲＮＡレプリコンデンドリマーナノ粒子の配合＞
Ｇ５およびＧ９のＮＨ２ ＰＡＭＡＭデンドリマーは、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈからのものであった。ＥＧＦＰレプリコンデンドリプレックス（ｄｅｎｄｒｉｐｌｅｘ）は、２０のＮ／Ｐ比率で構成された（Ｎはデンドリマーから、ＰはレプリコンＲＮＡから）。サイズ（図１３および１４）および多分散指数（ＰＤＩ）（図１５）を、裸のＲＮＡ、デンドリマー（それぞれＧ５およびＧ９）、および対応するデンドリマーナノ粒子（Ｇ５＋レプリコンＲＮＡおよびＧ９＋レプリコンＲＮＡ）に関して判定した。図１３および１４に示されるように、Ｇ５およびＧ９デンドリマーの両方がＲＮＡ分子のサイズを劇的に縮小した。
【０１４９】
＜実施例７−ＥＧＦＰタンパク質でコーティングされたマイクロニードルデバイスで処置されたマウスにおけるＥＧＦＰ蛍光のインビボ検知＞
実施例８に記載されたようにマイクロニードルアレイを準備した。ＥＧＦＰタンパク質を、実施例４で記載されたようにＢｉｏＤｏｔマイクロ流体分配デバイスを使用して、マイクロニードルアレイ上にコーティングした。実施例８に記載されたように、Ｂａｌｂ／ｃマウスの背側の皮膚毛を取り除き、およびＥＧＦＰタンパク質コーティングされたマイクロニードルパッチを、むき出しの皮膚に適用した。２０分のインキュベーション期間後、ＥＧＦＰタンパク質の存在を蛍光によって視覚化した。マウスに適用されたアレイパッチによるＥＧＦＰの局在は、図２１に例示される。
【０１５０】
＜実施例８−レプリコンＲＮＡコーティングされたマイクロニードルデバイスで処置されたマウスにおける抗ＥＧＦＰ抗体のインビボ生成＞
マイクロニードルアレイをステンレス鋼フォイル（ＳＳ３０４、７５ｕｍの厚さ）で作成した。マイクロニードルアレイは、１ｃｍ２の５×５グリッドパターン内に２５のマイクロニードルを含んだ。ニードルとアレイはそれぞれ図１７および１８に例示される。マイクロニードルはＫｅｍａｃ（Ａｚｕｓａ，ＣＡ）によるフォトリソグラフィによって製造された。ウェルとヒンジはハーフエッチング３７μｍの深さであった。
【０１５１】
Ｇ５とＧ９のＮＨ２  ＰＡＭＡＭデンドリマーはＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）からのものであった。実施例１と２に記載されたようにＥＧＦＰレプリコンデンドリプレックスは、２０のＮ／Ｐ比率で構成された（Ｎはデンドリマーから、ＰはｍＲＮＡから）。反応は、下記の表のように室温（ＲＴ）で３０分間、１００μＬで行われた。要するに、デンドリマーを、ヌクレアーゼを含まない水とＨｅｐｅｓ緩衝液で希釈し（最終濃度１０ｍＭ；ｐＨ７．４）、レプリコンＲＮＡを加えた。３０分後、サンプルをＢｉｏＤｏｔ ＡＤ １５２０プリンターのローディングトレイに置き、５×５ウェルのマイクロニードルアレイを５ｎＬ／ウェル（０．６μｇのｍＲＮＡ／アレイ）で８回印刷した。印刷溶液は、アレイ間をピペットで静かに移すことによって混合された。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
各アレイが印刷された直後に、プローブと治具を使用し手動で、ニードルを９０度曲げた。したがって、ニードルはここにおいてＳＳフォイルシートに対して直角のＺ平面にある（図１９）。Ｚ平面のニードルを有しレプリコンＲＮＡを含んだ、完成したマイクロニードルアレイは、直径２．５ｃｍの粘着性包帯（Ｃｕｒａｄ）にパッドなしで配置され、フォイルの袋に密閉され、ＵＣ Ｄａｖｉｓ Ｍｏｕｓｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＭＢＰ）においてマウスに適用されるまで、ドライアイス上で保存された。
【０１５４】
６−８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスは、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。１週間、動物施設に慣らした後に、試験の最低でも２４時間前に、マウスにイソフルランで軽く麻酔をかけ、パッチを貼布する背側の皮膚の一定領域（腰仙と上部後足の領域）の毛を取り除いた。毛の除去は、電子式クリッパーを用いて太い毛を取り除き、続いて脱毛クリーム（Ｎａｉｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈａｉｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ Ｃｒｅａｍ）を適用することにより行われた。脱毛クリームは、綿棒を使用して皮膚に適用され、ガーゼで拭きとられるまでに１０−１５秒間放置された。重篤な化学的熱傷を引き起こす可能性もあるため、Ｎａｉｒを１５秒以上放置することはなかった。さらなる適用が必要である場合、Ｎａｉｒは毛のある領域のみに適用され、５−１０秒後に除去された。Ｎａｉｒの適用後、炎症を防ぐために、皮膚に残留物が残らないことを確実にするために、すべての皮膚領域を食塩水で洗浄した。毛の除去と回収に続いて、無毛の領域にアレイパッチを塗布し、２０分間優しく押し付けた（図２０）。そして、パッチを当てられている期間、当該動物を二重のケージに個別に収容し、動物がパッチを外してしまうのを防ぐために注意深く見守った。その後、パッチが除去されると、全ての動物は群飼に戻された。
【０１５５】
パッチの塗布後７日、１４日および２１日において、血液を外側の伏在静脈から採取し、および血清を単離し、８０℃で保存した。十分な治癒を可能にし、かつ血管の完全性を維持するために、血液を各週、交互の後ろ足から採取した。パッチの塗布後の２８日に、マウスを安楽死させ、血液を経心的に採取し、そして血清を単離して−８０℃で保存した。
【０１５６】
＜ＥＧＦＰ抗体のスクリーニング＞
２８日に抜き取った血液のマウス血清を、ＥＧＦＰ抗体に関して試験した。ＥＬＩＳＡプレートをＥＧＦＰタンパク質（２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、炭酸緩衝液中で１晩４℃においた。プレートをＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５，５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、室温で１時間、ＴＢＳ内で５％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いてブロッキングした。洗浄後、１％のＢＳＡ／ＴＢＳＴ中のマウス血清（１：１００−１：１２５００）および陽性対照（１：５００−１：１２，５００；抗−ＧＦＰ抗体、細胞信号）を加え、室温で２時間インキュベートし、続いて洗浄した。次に、１％のＢＳＡ／ＴＢＳＴ中の１：５０００の抗ウサギ２次抗体（対照用）または抗マウス２次抗体（血清用）を、室温で１時間加えた。プレートを再度洗浄し、次に室温で２０分間、１％のＢＳＡ／ＴＢＳＴにおいて抗ＳＡ（１：２００）を用いてインキュベートした。洗浄後、基板を加え、室温で３０分間インキュベートした。その反応は５０ｕｌ ２Ｎ硫酸の添加によって止まった。
【０１５７】
些細な呈色反応を、ほとんどのサンプル中の１：１００希釈のマウス抗血清（未処置動物の血清を含む）において見ることができ、血清含量からのバックグラウンドバインディングと考えることができる。マウス＃３６（ＥＧＦＰ−Ｒｅｐ／Ｇ５デンドリマー；Ｎ：Ｐ ２０：１）は、バックグラウンドの２倍を超える呈色反応を示し、およびマウス＃３９（ＥＧＦＰ−Ｒｅｐ／Ｇ９デンドリマー；Ｎ：Ｐ ２０：１）は、バックグラウンドよりも４倍の呈色反応を示した。したがって図２２に示されるように、マウス３６のＥＬＩＳＡによるＥＧＦＰ抗体の力価は１：２００であり、マウス３９のそれは１：４００であった。図２２に示されるように、デンドリマーの欠如したＥＧＦＰレプリコンＲＮＡ（ＥＧＦＰ−Ｒｅｐ（３．２ｕｇ）＊Ｔｒｉｌｉｎｋ）は結果として力価を示さなかった。陽性対照は市販の抗ＥＧＦＰ抗体であった（図２２）。
【０１５８】
＜実施例９−レプリコンＲＮＡコーティングされたマイクロニードルデバイスで処置されたマウスにおける、抗インフルエンザＨＡ抗体のインビボ生成＞
実施例８で記載されたようにマイクロニードルアレイが製造される。実施例１と２で記載されたようにインフルエンザＨＡレプリコンＲＮＡが調製される。Ｇ５とＧ９のＮＨ２ ＡＭＡＭデンドリマーはＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）からのものである。実施例８で記載されたように、ＨＡレプリコンデンドリプレックスは、２０のＮ／Ｐ比率（Ｎはデンドリマーから、ＰはＲＮＡから）で構成される。その後、実施例８で記載されたように、ＢｉｏＤｏｔ ＡＤ １５２０プリンターを使用して、ＨＡレプリコンＲＮＡを５×５ウェルのマイクロニードルアレイ上に印刷する。レプリコンＲＮＡを含む完成したマイクロニードルアレイを、２．５ｃｍ直径の粘着性包帯にパッチなしで配置し、フォイルバッグに密閉し、マウスへの適用までドライアイス上で保存した。
【０１５９】
実施例８に記載されたように、６−８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスから背側の皮膚毛を取り除き、マイクロニードルパッチを２０分間無毛の領域に適用する。陽性対照として、市販されているインフルエンザワクチン（Ｆｌｕｌａｖａｌ（登録商標）ＱＩＶ １Ｘ ５ＭＬ ＭＤＶ ２０１６−２０１７ Ｓｅａｓｏｎ−ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を使用してマウスにワクチン接種を行う。パッチの塗布後７日、１４日および２１日において、血液を外側の伏在静脈から採取し、および血清を単離して８０℃で保存した。パッチの塗布後の２８日に、マウスを安楽死させ、血液を経心的に採取し、そして血清を単離して−８０℃で保存する。マイクロニードルおよび対照ＨＡマウスの血清中の抗ＨＡ抗体の存在は、実施例８に記載されたようにＥＬＩＳＡによって測定される。
【０１６０】
＜実施例１０−インフルエンザウイルス用の４価アルファウイルスレプリコンワクチンの生成および投与＞
インフルエンザウイルスに対する免疫をヒト被験体に与えるために設計されたワクチンについて記載する。手短に言えば、複数のアルファウイルスレプリコンを生成し、各々が異なる血球凝集素（ＨＡ）を発現する；以下に由来するＨＡ：Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２株、およびＢ型インフルエンザウイルスの２つの別個の系統。使用される株は、その季節に支配的であろうと予想されるインフルエンザウイルス株によって決定される。ＨＡレプリコンＲＮＡ配列を、実施例１および２で記載したように生成する。随意に、レプリコンは、実施例５および６で記載されたようにマイクロ流体混合デバイスを使用して、Ｇ５またはＧ９のＮＨ２  ＰＡＭＡＭデンドリマーナノ粒子と共に調剤される。Ｇ５またはＧ９のＮＨ２  ＰＡＭＡＭデンドリマーを利用する場合、それらはフッ素付加によって随意に修飾される。
【０１６１】
その後、レプリコンはマイクロ流体混合デバイス（例えばＢｉｏＤｏｔ）を使用して、マイクロニードルアレイ上で包装される。随意に、レプリコンまたはレプリコンデンドリマーナノ粒子はマイクロニードルアレイ内に包装される（例えば、埋め込まれる）。レプリコンがマイクロニードルアレイ内に包装される場合、真皮の間質液との接触に際して溶解可能なようにポリマーが選択される。重合に先立って、レプリコンとポリマーを混ぜ合わせる。ポリマー混合物は鋳型に注がれ、重合される。
【０１６２】
その後、マイクロニードルは包装され、医療施設に室温で出荷される。ワクチンは個体に適用される。マイクロニードルが肌の皮膚表面を貫通するように、マイクロニードルは個体の腕の皮膚表面に適用される。マイクロニードルは５分間適用される。レプリコンを溶解可能なマイクロニードルアレイに包装する場合、レプリコンを含むポリマー混合物は５分以内に溶解され、それによってレプリコンが真皮の免疫細胞に送達される。
【０１６３】
＜実施例１１−インフルエンザワクチンの生成および投与＞
インフルエンザウイルスに対する免疫をヒト被験体に与えるために設計された経口ワクチンについて記載する。手短に言えば、複数のアルファウイルスレプリコンを生成し、各々が異なる血球凝集素（ＨＡ）を発現する；以下に由来するＨＡ：Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１株、Ａ型インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２株、およびＢ型インフルエンザウイルスの２つの別個の系統。使用される株は、その季節に支配的であろうと予想されるインフルエンザウイルス株によって決定される。ＨＡレプリコンＲＮＡ配列を、実施例１および２で記載したように生成する。その後、各ＨＡレプリコンをリポソームでカプセル化し、凍結乾燥する。代替的に、ＨＡレプリコンをＳＮＡＬＰでカプセル化してもよい。凍結乾燥しカプセル化したレプリコンを、経口投与用の腸溶性カプセルに包装する。レプリコンが小腸に送達されるように、ワクチンを被験者に投与する。
【０１６４】
＜実施例１２−インフルエンザワクチン接種用の異種プライムブーストレジメン＞
インフルエンザウイルスワクチンをヒト被験体にワクチン接種するための投与レジメンを記載する。手短に言えば、Ａ型インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１に由来する血球凝集素（ＨＡ）をコードするアルファウイルスレプリコンを含むカプセルを、被験体の免疫系を刺激するために、ヒト被験体に経口で投与する。２週間後、ＨＡをコードするアルファウイルスレプリコンを、マイクロニードルを用いて被験体の皮内に再投与し、それによって被験体の免疫反応を選択的に高める。
【０１６５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、記載されたが、そのような実施形態が単なる例として提供されていることは、当業者にとって明白だろう。多くの変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの同等物がそれによって包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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