(57)【要約】本開示は、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置するための組成物およびその使用を提供する。本開示の処置は、抗ＣＤ２０  ＣＡＲなどの融合タンパク質を発現する宿主細胞の、任意選択でＣＤ２０特異的結合分子、化学療法薬、免疫抑制成分の阻害剤、またはこれらの組み合わせと組み合わせた使用を含む。任意選択で、方法は、ＣＤ２０に特異的な融合タンパク質を発現する宿主細胞と組み合わせた治療有効量のＣＤ２０特異的結合分子をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ２０抗体由来のｓｃＦｖまたはＣＤ２０抗原に特異的なＴＣＲ由来のｓｃＴＣＲを含む。
2019515652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０に特異的に結合することができる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；
（ｂ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；
（ｃ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；
（ｄ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；
（ｅ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなるか；または
（ｆ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなる、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質。
【請求項３】
（ａ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質と少なくとも９０％同一であるか；
（ｂ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質で構成されるか；
（ｃ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質からなるか；
（ｄ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか；
（ｅ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されるか；または
（ｆ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列からなる、
請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含み、請求項２または３に記載の融合タンパク質を発現することができる宿主細胞。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドがコドン最適化されている、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
Ｔ細胞または被験体の自己Ｔ細胞である、請求項４または５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはその両方である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞のバルク集団または亜集団であり、任意選択でセントラルメモリー細胞もしくはセントラルメモリー細胞およびナイーブ細胞の亜集団である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項４から８までのいずれか一項に記載の宿主細胞およびＣＤ２０特異的結合分子を含む組成物。
【請求項１０】
前記ＣＤ２０特異的結合分子が抗体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗体が、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体におけるＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項４から８までのいずれか一項に記載の宿主細胞を投与するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、Ｔ細胞または前記被験体の自己Ｔ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはその両方である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞のバルク集団または亜集団であり、任意選択でセントラルメモリー細胞もしくはセントラルメモリー細胞およびナイーブ細胞の亜集団である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｂ細胞の数を減少させるか、または異常なＢ細胞活性に関連する疾患または障害を処置する、請求項１２から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤ２０発現に関連する障害または疾患が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫を含む）、ヘアリーセル白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ組織型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および原発性滲出性リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫または白血病；特発性炎症性ミオパチー、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、重症筋無力症、グレーブス病、１型糖尿病、抗糸球体基底膜抗体病、急速進行性糸球体腎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質抗体症候群、視神経脊髄炎、多発性硬化症、自己免疫疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、またはワルデンシュトレーム高ガンマグロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）などの、自己抗体の産生を特徴とする疾患；Ｂ細胞経路に関連する不適切なＴ細胞刺激を特徴とする疾患；多発性骨髄腫；あるいは黒色腫である、請求項１２から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体がＣＤ２０特異的結合分子を用いて前処置されており、任意選択で、前記ＣＤ２０特異的結合分子が、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１２から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記被験体に、治療有効量のＣＤ２０特異的結合分子を前記宿主細胞と並行して、同時に、またはその後に投与する、請求項１２から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ２０特異的結合分子が抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法であって、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体に、治療有効量のＣＤ２０特異的結合分子、および融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む治療有効量の宿主細胞を投与するステップを含み、前記融合タンパク質が、疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分とを含み、前記細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、前記細胞内成分がエフェクタードメインを含む、方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ２０特異的結合分子が抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質がキメラ抗原受容体である、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ２０に特異的な結合ドメインがｓｃＦｖまたはｓｃＴＣＲである、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質が、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせに由来するｓｃＦｖを含む、請求項２２から２６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｓｃＦｖが、以下：
（ａ）配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む１．５．３  ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；
（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１．５．３  ｓｃＦｖであるか；
（ｃ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む１Ｆ５  ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；
（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１Ｆ５  ｓｃＦｖであるか；
（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＬｅｕ１６  ｓｃＦｖであり、前記ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；あるいは
（ｆ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬｅｕ１６  ｓｃＦｖである、
請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｓｃＦｖが、以下：
（ａ）配列番号６７の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６７の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６９の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号６９の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６８の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；あるいは
（ｆ）配列番号６８の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド
によりコードされる、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が、配列番号２６〜４３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるキメラ抗原受容体である、請求項２２から２９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記疎水性部分が膜貫通ドメインである、請求項２２から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記膜貫通ドメインがＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ２７膜貫通ドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記エフェクタードメインもしくはその機能的部分が、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはその任意の組み合わせである、請求項２２から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞内成分が、以下：
（ａ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその一部；
（ｂ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部；
（ｃ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその一部；
（ｄ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部；
（ｅ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその一部；あるいは
（ｆ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部
を含む、請求項２２から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＣＤ２０特異的結合分子および前記融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む前記宿主細胞を同時に、逐次的に、または並行して投与する、請求項２２から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞がＴ細胞または前記被験体の自己Ｔ細胞である、請求項２２から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはその両方である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｔ細胞が、Ｔ細胞のバルク集団または亜集団であり、任意選択でセントラルメモリー細胞またはセントラルメモリー細胞およびナイーブ細胞の亜集団である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｂ細胞の数を減少させるか、または異常なＢ細胞活性に関連する疾患または障害を処置する、請求項２２から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＤ２０発現に関連する障害または疾患が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫を含む）、ヘアリーセル白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ組織型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および原発性滲出性リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫または白血病；特発性炎症性ミオパチー、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、重症筋無力症、グレーブス病、１型糖尿病、抗糸球体基底膜抗体病、急速進行性糸球体腎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質抗体症候群、視神経脊髄炎、多発性硬化症、自己免疫疾患、皮膚筋炎、多発性筋炎、またはワルデンシュトレーム高ガンマグロブリン血症（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ  ｍａｃｒｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａ）などの、自己抗体の産生を特徴とする疾患；Ｂ細胞経路に関連する不適切なＴ細胞刺激を特徴とする疾患；多発性骨髄腫；あるいは黒色腫である、請求項２２から３９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、自殺形質導入マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１２から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記形質導入マーカーに特異的に結合し、それにより前記融合タンパク質を発現する前記宿主細胞に対する細胞傷害効果を引き起こすことができる細胞傷害性抗体、抗体−薬物コンジュゲート、または他の細胞傷害性薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記自殺形質導入マーカーが、切断されたＥＧＦＲポリペプチドを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記切断されたＥＧＦＲポリペプチドが配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞傷害性薬剤が抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記自殺形質導入マーカーが、切断されたＣＤ１９ポリペプチドを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記切断されたＣＤ１９ポリペプチドが配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞傷害性薬剤が、ブリナツモマブ、コルツキシマブ・ラブタンシン、ＭＯＲ２０８、ＭＥＤＩ−５５１、デニンツズマブ・マホドチン、Ｍｅｒｃｋ  ｐａｔｅｎｔ抗ＣＤ１９、タプリツモマブパプトクス、ＸｍＡｂ  ５８７１、ＭＤＸ−１３４２、ＳＡＲ３４１９、ＳＧＮ−１９Ａ、またはＡＦＭ１１からなる群より選択される、請求項４７または４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益についての記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＣＡ１５４８７４の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４４１ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは２１０ＫＢであり、２０１７年３月１６日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子改変されたＴ細胞の養子移入は、様々な悪性疾患に対する強力な療法として出現した。最も広く使用されている戦略は、腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する患者由来のＴ細胞を注入することである。この手法には、Ｔ細胞を任意の細胞表面抗原に標的化できること、腫瘍エスケープ機構として主要組織適合性遺伝子複合体が喪失するのを回避できること、および、ヒト白血球抗原ハプロタイプにかかわらずいずれの患者を処置するためにも単一のベクター構築物を使用できることを含めた多数の理論的利点がある。例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対するＣＡＲ臨床試験では、現在まで、悪性リンパ系細胞ならびに正常なＢ細胞上に発現するＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２抗原が標的とされている（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１３；５（１７７）：１７７ｒａ３８；Ｈａｓｏら、Ｂｌｏｏｄ  ２０１３；１２１（７）：１１６５−７４；Ｊａｍｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；１８０（１０）：７０２８−３８；Ｋａｌｏｓら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１１；３（９５）：９５ｒａ７３；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１５；３３（６）：５４０−９；Ｌｅｅら、Ｌａｎｃｅｔ  ２０１５；３８５（９９６７）：５１７−２８；Ｐｏｒｔｅｒら、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１５；７（３０３）：３０３ｒａ１３９；Ｓａｖｏｌｄｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１１；１２１（５）：１８２２−６；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２（６）：２２６１−７１；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ  ２０１２；１１９（１７）：３９４０−５０；Ｃｏｉｆｆｉｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００２；３４６（４）：２３５−４２）。リンパ系悪性疾患に対する治療を研究している大多数の研究者がＣＤ１９を標的化することを選択している。なぜなら、この分子がＢ細胞分化においてＣＤ２０またはＣＤ２２よりも早い段階から発現するからである。したがって、ＣＤ１９標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、分化のプロＢ細胞またはプレＢ細胞の段階で生じる急性リンパ芽球性白血病を含めた若干広い範囲のＢ細胞悪性疾患を処置するために使用することができる。
【０００４】
しかし、ＣＤ２０も、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体であるリツキシマブを使用した試験において実証されているとおり、広範囲にわたり上首尾の免疫療法の標的として臨床的に記録されているので、魅力的な抗原のままである（Ｃｏｉｆｆｉｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２００２年；３４６巻（４号）：２３５〜４２頁；Ｌｅｎｚら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００５年；２３巻（９号）：１９８４〜９２頁；Ｍａｒｃｕｓ  Ｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８年；２６巻（２８号）：４５７９〜８６頁；Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ、２０１１年；１２巻（１１号）：１０１３〜２２頁）。抗体が結合すると容易に内部移行するＣＤ１９とは対照的に、（Ｐｕｌｃｚｙｎｓｋｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９３年；８１巻（６号）：１５４９〜５７頁）、ＣＤ２０は、抗体が結合した後はるかにゆっくりとエンドサイトーシスを受ける（Ｐｒｅｓｓら、Ｂｌｏｏｄ、１９９４年；８３巻（５号）：１３９０〜７頁；Ｐｕｌｃｚｙｎｓｋｉら、Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ、１９９４年；１８巻（７号）：５４１〜５２頁）。この安定性は、免疫学的シナプスの質およびその後のＣＡＲ誘発およびＴ細胞活性化に理論的に影響を及ぼし得る。腫瘍細胞上のＣＤ１９発現の喪失は、ＣＤ１９標的化Ｔ細胞で処置された患者におけるエスケープ機構として記載されている（Ｇｒｕｐｐら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、２０１３年；３６８巻（１６号）：１５０９〜１８頁）。抗ＣＤ２０抗体療法後のＣＤ２０喪失についても記載されているが、ＣＤ２０特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞により、逐次的な療法を可能にする代替標的がもたらされる、またはこれをＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞と協調させて使用して複数の抗原を同時に標的とし、抗原喪失による免疫エスケープのリスクを低下させることができる。
【０００５】
ＣＤ２０のＣＡＲの標的抗原としての１つの潜在的な限定は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法試験の候補になる可能性がある、再発したまたは不応性のリンパ腫を有する患者が、多くの場合、リツキシマブを含有するレジメンによる処置を最近受けていることである。抗体は血清中で数カ月にわたって持続し得るので、理論的に、残留するリツキシマブによりＣＡＲとＣＤ２０の結合が遮断され、Ｔ細胞活性化が防止されるまたは弱まり、それにより、潜在的に療法の効果がなくなる可能性がある。以前のＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞試験では（Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻：２２６１〜７１頁、２００８年；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：３９４０〜５０頁、２０１２年）、適格性基準により、最近リツキシマブを用いた処置を受けた患者は排除された。しかし、この手法は、自然増加に有意に影響を及ぼし、最終的に、新規の処置選択肢を最も必要としている患者に対するこの療法の利用可能性を限定することになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ（２００８年）１１２巻：２２６１〜７１頁
【非特許文献２】Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ（２０１２年）１１９巻：３９４０〜５０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在、免疫療法の分野では、がん（例えば、白血病、リンパ腫）を含めた様々な疾患を対象とする追加的または代替的な免疫療法のための組成物および方法が依然として必要とされている。本明細書で開示される実施形態は、この必要性に対処し、他の関連する利点をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、異なる抗ＣＤ２０抗体（Ｌｅｕ１６、１Ｆ５、および１．５．３）由来のｓｃＦｖを含有するＣＤ２０特異的ＣＡＲ構築物の概略図を示す。（Ａ）ＣＤ２０特異的ＣＡＲ構築物およびそれらのそれぞれの成熟ＣＡＲタンパク質を示す。（Ｂ）追加的な成熟ＣＤ２０特異的ＣＡＲタンパク質を示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、異なる抗ＣＤ２０抗体（Ｌｅｕ１６、１Ｆ５、および１．５．３）由来のｓｃＦｖを含有するＣＤ２０特異的ＣＡＲ構築物の概略図を示す。（Ａ）ＣＤ２０特異的ＣＡＲ構築物およびそれらのそれぞれの成熟ＣＡＲタンパク質を示す。（Ｂ）追加的な成熟ＣＤ２０特異的ＣＡＲタンパク質を示す。
【０００９】
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２Ｆは、リツキシマブおよびオファツムマブが、ＣＡＲ  ｓｃＦｖを生成するために使用した抗体の抗原への結合を遮断することを示す。Ｒａｍｏｓ細胞（ＣＤ２０＋）を、示されている濃度のリツキシマブ（Ａ〜Ｃ）またはオファツムマブ（Ｄ〜Ｆ）と共に３０分インキュベートし、その後、ＰＥで標識した抗ＣＤ２０抗体（クローンＬｅｕ１６）またはアイソタイプ対照と共に４℃（ＡおよびＤ）または３７℃（ＢおよびＥ）のいずれかで３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによって分析して、ＰＥ蛍光強度によって測定される利用可能なＣＤ２０結合性部位を決定した。図２Ｃおよび図２Ｆに示されているグラフは、それぞれリツキシマブまたはオファツムマブの濃度に応じた、４℃または３７℃のいずれかにおける幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を要約する。データは、３回の独立した実験を表す。
【図２Ｃ】同上。
【図２ＤＥ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【００１０】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるリツキシマブのＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対する影響を示す。示されているＢ細胞ＮＨＬ細胞株に照射を行い、様々なリツキシマブ濃度（Ｔ細胞の添加後に示されている最終濃度がもたらされるようにインキュベーション中は２×濃度で）と共に室温で３０分インキュベートした。Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ−ｔＥＧＦＲ  ＣＤ２０特異的ＣＡＲを発現するＣＦＳＥ染色Ｔ細胞を標的細胞に１：１の体積および比で添加した。（Ａ）４日後にＴ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈物に対するフローサイトメトリーによって分析した。刺激されていないＴ細胞に対するパーセント分裂ＣＤ３＋Ｔ細胞が左側の軸に示されている（塗りつぶされた棒）。前方散乱の幾何平均によって決定されるＣＤ３＋Ｔ細胞の細胞サイズ（培地のみ中の細胞のサイズを差し引く）が右側の軸に示されている（白抜きの棒）。（Ｂ）これらのＴ細胞のサイトカイン分泌を、再刺激の２４時間後の上清を使用したＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。インターロイキン（ＩＬ）−２濃度が左側のｙ軸に示されており、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αが右側のｙ軸に示されている。示されているデータは、３回の独立した実験を表す。
【図３Ｂ】同上。
【００１１】
【図４】図４は、リツキシマブのＣＡＲ  Ｔ細胞媒介性細胞傷害に対する影響を示す。示されている５１Ｃｒで標識した標的細胞をリツキシマブ（Ｔ細胞の添加後に示されている最終濃度がもたらされるようにインキュベーション中は２×濃度で）と共に３０分プレインキュベートし、次いで、標準の５時間５１クロム放出アッセイにおいてＬｅｕ１６−２８−ｚ  ＣＡＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を示されたＥ：Ｔ比で添加した。模擬形質導入Ｔ細胞、およびリツキシマブおよび標的細胞のみを伴う試料（「０：１」）を陰性対照として使用した。２連のウエルの平均値が示されており、エラーバーは標準偏差を表す。データは、４回の独立した実験からの結果を表す。
【００１２】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、リツキシマブ遮断に対する感受性が標的細胞上のＣＤ２０抗原密度に依存することを示す。ＣＤ８０およびＣＤ２０で形質導入したＫ５６２細胞（「Ｋ８０−２０」）を、限界希釈によってクローニングし、高レベル、中レベル、または低レベルのＣＤ２０発現について選択し（図１０）、（図５Ａ）図３に記載されているＣＦＳＥで標識したＬｅｕ１６−２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を使用した、増殖および細胞サイズ（培地のみ中の細胞のサイズを差し引いた、ゲーティングされたＣＤ３＋細胞の幾何平均前方散乱）についてのアッセイ；（図５Ｂ）Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定される、上の（図５Ａ）から２４時間の時点でのＬｅｕ１６−２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞のサイトカイン分泌についてのアッセイ；ならびに（図５Ｃ）図４に記載されている５１Ｃｒ放出アッセイによる、Ｌｅｕ１６−２８−ｚ  ＣＡＲ形質導入ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した細胞傷害についてのアッセイにおいて標的細胞として使用した。データは、３回の独立した実験を表す。サイトカイン分泌についての絶対値が図１１に示されている。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【００１３】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、抗ＣＤ２０  ＣＡＲを発現しているＴ細胞の増殖およびそれによるサイトカインの分泌を示す。健康なドナーＴ細胞を分類し、抗ＣＤ３／２８ビーズを使用して刺激し、その後、１Ｆ５−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。（Ａ）刺激後９日目に、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、照射されたＫ５６２−ＣＤ８０−ＣＤ２０（「Ｋ８０−２０」）またはＫ５６２−ＣＤ８０（「Ｋ８０」）標的細胞のいずれかを用いて再刺激し、４日後にＣＦＳＥ希釈物をフローサイトメトリーによって測定してＴ細胞増殖を測定した。刺激されていないＴ細胞に対するパーセント分裂ＣＤ３＋Ｔ細胞が示されている。模擬形質導入Ｔ細胞を陰性対照として使用した。（Ｂ）Ｔ細胞によるサイトカインの分泌を、再刺激の２４時間後に上記の培養物から上清試料を回収し、示されているサイトカイン濃度をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって分析することによって決定した。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、抗ＣＤ２０  ＣＡＲを発現しているＴ細胞の増殖およびそれによるサイトカインの分泌を示す。健康なドナーＴ細胞を分類し、抗ＣＤ３／２８ビーズを使用して刺激し、その後、１Ｆ５−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。（Ａ）刺激後９日目に、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、照射されたＫ５６２−ＣＤ８０−ＣＤ２０（「Ｋ８０−２０」）またはＫ５６２−ＣＤ８０（「Ｋ８０」）標的細胞のいずれかを用いて再刺激し、４日後にＣＦＳＥ希釈物をフローサイトメトリーによって測定してＴ細胞増殖を測定した。刺激されていないＴ細胞に対するパーセント分裂ＣＤ３＋Ｔ細胞が示されている。模擬形質導入Ｔ細胞を陰性対照として使用した。（Ｂ）Ｔ細胞によるサイトカインの分泌を、再刺激の２４時間後に上記の培養物から上清試料を回収し、示されているサイトカイン濃度をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって分析することによって決定した。
【００１４】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるリツキシマブのＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対する影響を示す。Ｎｏｄ−ＳＣＩＤ−γ−／−（ＮＳＧ）マウスに５×１０５個のリツキシマブ不応性Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃリンパ腫細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射し、その後、以下の処置のうちの１つを行った：無処置、５日後にリツキシマブのみ（２５μｇまたは２００μｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）、腫瘍の６日後に１０７個の１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のみ、または腫瘍の５日後にリツキシマブ（２５μｇまたは２００μｇ）をｉ．ｐ．、その後、腫瘍の６日後に１０７個のＣＡＲ  Ｔ細胞。週２回マウスを生物発光について画像化した。（Ａ）マウス実験の図。（Ｂ）全身生物発光によって測定される、経時的な群当たりの平均腫瘍負荷。９５％信頼区間での幾何平均発光値が示されており、腫瘍体積グラフにおける誤解を招くようなゆらぎを防止するために、各マウスの最後の生物発光レベルは、屠殺後に、その群のマウスがいなくなるまで進めた。個々の生物発光のトレースは図１３に示されている。（Ｃ）各処置群の全生存を示すカプラン・マイヤープロット。（Ｄ）Ｔ細胞注入日（６日目）およびＴ細胞注入の１週間後（１３日目）の血清リツキシマブレベル。横棒は中央値を示す。（Ｅ）前４カ月以内にリツキシマブを含有するサルベージ化学療法を受けたリンパ腫患者からの血清リツキシマブレベル。灰色の横線は中央値を示し、黒色の横線は四分位数間範囲（２５〜７５％）を示す。
【図７ＢＣ】同上。
【図７ＤＥ】同上。
【００１５】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるオファツムマブのＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対する影響を示す。照射Ｒｅｃ−１細胞もしくはＲａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞または照射していない５１Ｃｒ標識Ｒｅｃ−１細胞を２×示されている濃度のオファツムマブと共に３０分プレインキュベートし、その後、図３および４の説明文に記載されている方法体系を使用して、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲを発現しているＴ細胞の機能を決定するための実験を行った。（Ａ）刺激されていないＴ細胞に対するパーセント分裂ＣＤ３＋Ｔ細胞が左側の軸に示されている（塗りつぶされた棒）。前方散乱の幾何平均によって決定されるＣＤ３＋Ｔ細胞の細胞サイズ（培地のみ中の細胞のサイズを差し引く）が右側の軸に示されている（白抜きの棒）。（Ｂ）これらのＴ細胞のサイトカイン分泌を、再刺激の２４時間後の上清を使用したＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。ＩＬ−２濃度が左側のｙ軸に示されており、ＩＦＮ−γが右側のｙ軸に示されている。（Ｃ）Ｒｅｃ−１標的細胞を用いた標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセイを使用して１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害を決定した。２連のウエルの平均値が示されており、エラーバーは標準偏差を表す。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【００１６】
【図９】図９は、フローサイトメトリーによって決定されたＫ８０−２０ｌｏｗ、Ｋ８０−２０ｍｅｄ、Ｋ８０−２０ｈｉｇｈのＣＤ２０発現を示す。白抜きのヒストグラムは、ＦＩＴＣとコンジュゲートした１Ｆ５抗体（抗ＣＤ２０）で染色された細胞を表し、塗りつぶされたヒストグラムは、アイソタイプ対照抗体Ａｂで染色された細胞を表す。
【００１７】
【図１０】図１０は、図５の実験からのＴ細胞上清からの絶対的なサイトカイン濃度を示す。
【００１８】
【図１１ＡＢＣＤ】図１１Ａ〜１１Ｅは、完全ヒト抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖを用いた、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌、および細胞傷害を示す。健康なドナーＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞を、抗ＣＤ３／２８ビーズを使用して刺激し、その後、１．５．３−ＮＱ−２８−ｚまたは１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ、リツキシマブ不応性Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ（ＲＲ−Ｒａｊｉ）、またはＲｅｃ−１標的細胞で再刺激した。（Ａ）４日後に細胞をＣＦＳＥ希釈物に対するフローサイトメトリーによって分析することにより１．５．３−ＮＱ−２８−ｚＴ細胞の増殖を評価した。刺激されていないＴ細胞に対するパーセント分裂ＣＤ３＋Ｔ細胞が示されている。（Ｂ）１．５．３−ＮＱ−２８−ｚＴ細胞によるサイトカインの分泌を、再刺激の２４時間後に上記の培養物から上清試料を回収し、示されているサイトカイン濃度をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって分析することによって決定した。ＩＬ−２およびＴＮＦ−α濃度が左側のｙ軸に示されており、ＩＦＮ−γ濃度が右側のｙ軸にプロットされている。（Ｃ）上のパートＢと同様に決定された、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌。（Ｄ）１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害を、示されている標的細胞株を用いた標準の５時間クロム５１放出アッセイを使用して決定した。（Ｅ）上のパート（Ａ）と同様であり、Ｇｒａｎｔａ、Ｒｅｃ−１、ＦＬ−１８、またはＫ８０−２０細胞で刺激した１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌。
【図１１Ｅ】同上。
【００１９】
【図１２】図１２は、リツキシマブ不応性Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃが親Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞と同じＣＤ２０発現を有することを示す。Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞（実線のヒストグラム）またはリツキシマブ不応性Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞（破線のヒストグラム）を抗ＣＤ２０−ＰＥ抗体または抗ＣＤ２０−ＡＰＣ抗体で染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞株についてアイソタイプ対照抗体（塗りつぶされたヒストグラム）と比べたＣＤ２０発現が示されている。
【００２０】
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置した図７からの異種移植腫瘍マウスモデルの生物発光のトレースおよび画像を示す。（Ａ）経時的な個々のマウスの生物発光腫瘍負荷のトレース。各線は個々のマウスを表す。灰色の線は、ベースライン自己蛍光を規定する、腫瘍を有さないマウスを表す。（Ｂ）代表的なマウス生物発光画像。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置した図７からの異種移植腫瘍マウスモデルの生物発光のトレースおよび画像を示す。（Ａ）経時的な個々のマウスの生物発光腫瘍負荷のトレース。各線は個々のマウスを表す。灰色の線は、ベースライン自己蛍光を規定する、腫瘍を有さないマウスを表す。（Ｂ）代表的なマウス生物発光画像。
【００２１】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｃは、マウスにおける循環Ｔ細胞の存在を示す。腫瘍注射後２８日目に取得した後眼窩血液試料から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ヒトＣＤ３、マウスＣＤ４５、およびヒトＣＤ１９（形質導入Ｔ細胞のマーカーとして）についてフローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）循環ヒトＴ細胞（生存可能なリンパ球についてゲーティングした）の代表的なドットプロットが左側のパネルに示されており、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞についてゲーティングしたＣＡＲ＋細胞（ＣＤ１９発現に基づく）が右側のパネルに示されている。（Ｂ）２８日目におけるＴ細胞の持続性の概要。（Ｃ）持続しているＴ細胞におけるＣＡＲ発現の概要。図１４Ｂおよび図１４Ｃのどちらについても、ＣＡＲのみ群とＣＡＲ＋リツキシマブ群の差異は、対応のない両側ｔ検定に基づいて統計的に有意ではなかった。
【図１４ＢＣ】同上。
【００２２】
【図１５ＡＢ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける様々なＣＡＲ構築物によるサイトカインの分泌を示す。セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖（ｅｘｐａｎｄ）させた。１４日目に、細胞を、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞（図１５Ａおよび図１５Ｃ）、Ｇｒａｎｔａ−５１９細胞（図１５Ｂ）、およびＪｅｋｏ細胞のいずれかで再刺激した（図１５Ｄ）。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、陽性対照として提供される。２４時間後に上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってインターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−２、および腫瘍壊死因子−αレベルについて分析した。
【図１５ＣＤ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける様々なＣＡＲ構築物によるサイトカインの分泌を示す。セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖（ｅｘｐａｎｄ）させた。１４日目に、細胞を、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞（図１５Ａおよび図１５Ｃ）、Ｇｒａｎｔａ−５１９細胞（図１５Ｂ）、およびＪｅｋｏ細胞のいずれかで再刺激した（図１５Ｄ）。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、陽性対照として提供される。２４時間後に上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってインターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−２、および腫瘍壊死因子−αレベルについて分析した。
【００２３】
【図１６Ａ】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌を示す。（Ａ）１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚレンチウイルスベクターで形質導入し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃＣＤ２０＋リンパ腫細胞で再刺激した。２４時間後に細胞の上清中の示されているサイトカインの分泌をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。（Ｂ）凍結保存したＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を解凍し、Ｋ５６２細胞またはＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞で再刺激し、２４時間の時点で細胞内染色によってＩＦＮ−γについてフローサイトメトリーによって分析した。
【図１６Ｂ】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌を示す。（Ａ）１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚレンチウイルスベクターで形質導入し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃＣＤ２０＋リンパ腫細胞で再刺激した。２４時間後に細胞の上清中の示されているサイトカインの分泌をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。（Ｂ）凍結保存したＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を解凍し、Ｋ５６２細胞またはＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞で再刺激し、２４時間の時点で細胞内染色によってＩＦＮ−γについてフローサイトメトリーによって分析した。
【００２４】
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、様々なＣＡＲ構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害を示す。セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖させた。１４日目に、細胞を、（図１７Ａおよび１７Ｂ）Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞、および（図１７Ｂ）Ｊｅｋｏ細胞を標的として使用した標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおけるエフェクターとして使用した。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、陽性対照として提供される。各ＣＡＲ  Ｔ細胞集団の特異的な標的細胞溶解が示されている。
【図１７Ｂ−１】同上。
【図１７Ｂ−２】同上。
【００２５】
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚレンチウイルスベクターで形質導入し（または模擬形質導入し）、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させ、次いで、凍結保存した。次いで、細胞を解凍し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（ＣＦＳＥ）で染色し、照射ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃリンパ腫細胞、Ｋ５６２細胞、またはＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞で再刺激した。４日後に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）ＣＡＲ＋細胞（ＣＤ３＋／ｔＣＤ１９＋についてゲーティングした）のＣＦＳＥ希釈物が示されている。破線のヒストグラムは、培養培地のみにおけるＴ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示し、実線のヒストグラムは、標的細胞と共インキュベートしたＴ細胞である。（Ｂ）各群について、分裂した細胞の百分率が示されている。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚレンチウイルスベクターで形質導入し（または模擬形質導入し）、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させ、次いで、凍結保存した。次いで、細胞を解凍し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎａｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（ＣＦＳＥ）で染色し、照射ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃリンパ腫細胞、Ｋ５６２細胞、またはＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞で再刺激した。４日後に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。（Ａ）ＣＡＲ＋細胞（ＣＤ３＋／ｔＣＤ１９＋についてゲーティングした）のＣＦＳＥ希釈物が示されている。破線のヒストグラムは、培養培地のみにおけるＴ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示し、実線のヒストグラムは、標的細胞と共インキュベートしたＴ細胞である。（Ｂ）各群について、分裂した細胞の百分率が示されている。
【００２６】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、様々なＣＡＲ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させた。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、本発明者らのセンターで臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、ベンチマーク対照として提供される。ＮＳＧマウスにＲａｊｉ−ｆｆＬｕｃ腫瘍細胞をｉ．ｖ．注射し、続いて、２日後に、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ、１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ  ＣＡＲ、ＪＣＡＲ−０１４（抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ζ）、または空ベクターで形質導入した、拡大増殖させたセントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。（Ａ）生物発光画像化によって評価される経時的な腫瘍負荷；および（Ｂ）全生存のカプラン・マイヤープロット。
【００２７】
【図２０】図２０は、マントル細胞リンパ腫に対するＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を示す。ＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢｚ  ＣＡＲで形質導入し、７日前にＧｒａｎｔａ−ｆｆＬｕｃマントル細胞リンパ腫細胞を尾静脈に接種したＮＳＧマウスを処置するために使用した。全生存のカプラン・マイヤープロット。
【００２８】
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を示す。Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ播種性腫瘍を担持するＮＳＧマウスにおけるＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞または空ベクターｔＣＤ１９発現Ｔ細胞のいずれかの注入後の逐次的な時点で後眼窩血液試料を得た。各時点でｔＣＤ１９形質導入マーカーを発現するＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってヒトＣＤ３＋／マウスＣＤ４５陰性／ヒトＣＤ１９＋細胞として定量した。（図２１Ａ）注入後の３つの時点でのｔＣＤ１９＋Ｔ細胞が血液中の総有核細胞の百分率として示されている（ＣＡＲ  Ｔ細胞群において最初ｎ＝９）。空ベクターマウスからの切断されたＣＤ１９＋細胞が参照として示されている（図２１Ｂ）。別々の実験において、各群（空ベクター対ＣＡＲ  Ｔ細胞）２匹のマウスからのｔＣＤ１９＋細胞が毎週の測定値で縦方向に示されている。
【００２９】
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、様々な長さのスペーサーを有する様々な構築物についての比較データを示す。セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させた。１Ｆ５−２８−ＢＢ−ｚ、ＩｇＧ１ｍｕｔは、全長スペーサーを有する。リンカーなしは、ほぼ全長であるが６アミノ酸リンカー（接合部アミノ酸）を欠き、ＣＨ３は切断されたスペーサーを有し、接合部アミノ酸およびＣＨ２ドメインを欠く。（Ａ）２０日目に、細胞をＧｒａｎｔａまたはＲｅｃ−１リンパ腫細胞で再刺激し、２４時間後に上清を回収し、ＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ−２濃度（右側）およびＩＦＮ−γ濃度（左側）について分析した。（Ｂ）セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズで刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させた。「ＩｇＧ１ｍｕｔ  ＮＱ」は全長ＣＨ２ＣＨ３スペーサーを有し、ＣＨ３のみは上記のとおり中間の長さであり、Ｌｅｕ１６ショートはＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをどちらも欠く。２０日目に、細胞を、Ｒａｊｉ細胞を標的として使用した標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。
【００３０】
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｆは、様々な改変を伴うスペーサーを有する様々な構築物についての比較データを示す。ＩｇＧ２接合部アミノ酸（「ＩｇＧ１ｍｕｔ」と表示される）およびＮ２９７Ｑ変異（「ＮＱ」と表示される）を有するＣＡＲの概略図が示されている（図２３Ａ）。野生型ＩｇＧ１スペーサー、ＩｇＧ１変異体スペーサー（ＩｇＧ１接合部アミノ酸がＩｇＧ２接合部アミノ酸で置き換えられている）を有する、または接合部アミノ酸を有さない（ＩｇＧ１接合部アミノ酸が欠失している）ＣＡＲを発現しているＴ細胞をビオチン化可溶性ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）で染色し、その後、ストレプトアビジン−ＰＥで染色し、次いで、フローサイトメトリーによって分析し、それにより、Ｆｃ受容体が野生型スペーサーには結合するが改変スペーサーには結合しないことが実証された（図２３Ｂ）。示されているＣＡＲ構築物を発現しているＴ細胞を、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を発現しているＫ５６２細胞またはＦｃ受容体を欠く親Ｋ５６２と共インキュベートした。共インキュベーションの２４時間後に、Ｔ細胞を、活性化の指標としてＣＤ２５発現およびＣＤ６９発現についてフローサイトメトリーによって評価した。ドットプロットはＣＤ３＋ＣＤ１９＋細胞（ＣＡＲ＋Ｔ細胞）を表す。野生型スペーサーのＦｃ受容体への結合によりＴ細胞活性化が導かれたが、改変スペーサーではＴ細胞活性化は導かれなかった（図２３Ｃ）。セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大増殖させ、ＮＳＧマウスに、Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞のｉ．ｖ．投与の２日後に注射した。（ＤおよびＥ）２つの異なる実験についての生物発光による腫瘍負荷データ。（Ｆ）上のパート（Ｅ）の実験からのカプラン・マイヤー生存曲線。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２３Ｄ】同上。
【図２３Ｅ】同上。
【図２３Ｆ】同上。
【００３１】
【図２４】図２４は、本開示の免疫療法の方法および組成物を伴う臨床試験についての処置スキームの図である。
【００３２】
【図２５Ａ】図２５Ａおよび２５Ｂは、臨床試験における抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製剤化の方法および投与のモデルの図である。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび２５Ｂは、臨床試験における抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の製剤化の方法および投与のモデルの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、ＣＤ２０発現細胞の数を減少させるか、またはＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する（例えば、Ｂ細胞の数を減少させるか、または異常なＢ細胞活性に関連する疾患または障害を処置する）ための組成物および方法であって、被験体を、治療有効量の、融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む宿主細胞を用いて処置するステップを含み、当該融合タンパク質が、細胞外成分および疎水性部分によって細胞外成分と連結した細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、当該細胞内成分がエフェクタードメインを含む、組成物および方法を提供する。任意選択で、方法は、ＣＤ２０に特異的な融合タンパク質を発現する宿主細胞と組み合わせた治療有効量のＣＤ２０特異的結合分子をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。さらに別の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ２０抗体由来のｓｃＦｖまたはＣＤ２０抗原に特異的なＴＣＲ由来のｓｃＴＣＲを含む。
【００３４】
背景として、一般に、残留する抗ＣＤ２０抗体レベルがＣＤ２０標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する主要な制約になり得ると考えられている。例えば、他の標的を用いた以前の試験により、癌胎児性抗原、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原、またはＣＤ３０を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン分泌および細胞傷害が、最大１０μｇ／ｍｌのレベルの可溶性同族抗原の存在下ではほとんど損なわれないことが実証された（Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０００年；７巻（１２号）：１０６７〜７５頁；Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、１９９９年；６巻（２号）：３００〜４頁；Ｎｏｌａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９年；５巻（１２号）：３９２８〜４１頁；Ｗｅｓｔｗｏｏｄら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２００９年；３２巻（３号）：２９２〜３０１頁）；これよりも高いレベルが潜在的に阻害性であることが観察された（Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０００年；７巻（１２号）：１０６７〜７５頁）。本開示において、驚いたことに、様々な抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が、臨床的に意義のある濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでは、抗ＣＤ２０  ＣＡＲを発現しているＴ細胞の活性にほとんど影響を及ぼさないことが見出された（Ｇａｌｌら、Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．、３３巻：４５２頁、２００５年も参照されたい）。さらに、本開示のマウス実験により、併用療法を受けた群がＣＡＲ  Ｔ細胞を単独で用いて処置されたマウスと同様に良好なまたはより良好な転帰を有することが実証される。
【００３５】
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を示すことは、それを理解するのに有用であり得る。付加的な定義は、本開示を通して説明する。
【００３６】
本説明では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、特に示さない限り、列挙範囲内の任意の整数および、適切な場合、その分数（整数の十分の一および百分の一など）の値を含むと理解すべきである。また、ポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さなどの、任意の物理的特徴に関連して本明細書で列挙する任意の数の範囲は、特に示さない限り、列挙範囲内の任意の整数を含むと理解すべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特に示さない限り、表示された範囲、値または構造の±２０％を意味する。「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「１つまたは複数」の列挙された構成要素を意味することが理解されるものとする。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方またはその任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される場合、「包含する」、「有する」および「含む」という用語は、同義で使用され、それらの用語およびその変形形態は、非限定的と解釈するものとする。
【００３７】
「任意選択の」または「任意選択で」とは、その後に記載されている要素、成分、事象、または状況が存在してもしなくてもよいこと、ならびに、記載が、要素、成分、事象、または状況が存在する例およびそれらが存在しない例を含むことを意味する。
【００３８】
さらに、本明細書に記載の構造およびサブユニットの様々な組み合わせに由来する個々の構築物、または構築物の群は、あたかも各構築物または構築物の群が個別に記載されたものと同じ程度に本出願によって開示されることが理解されるべきである。したがって、特定の構造または特定のサブユニットの選択は本開示の範囲内である。
【００３９】
「から本質的になる」という用語は、指定された材料もしくはステップに、または特許請求の範囲に記載されている発明の基本的特性に実質的に影響を及ぼさない材料もしくはステップに特許請求の範囲を限定する。例えば、タンパク質ドメイン、領域、モジュールまたは断片（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュールまたはタグ）もしくはタンパク質（１つまたは複数のドメイン、領域、またはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュール、断片またはタンパク質のアミノ酸配列が、一緒に、ドメイン、領域、モジュール、カセットまたはタンパク質の長さの多くて２０％（例えば、多くて１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）、カセット（複数可）またはタンパク質の活性（例えば、結合ドメインの標的結合親和性）に実質的に影響を及ぼさない（すなわち、活性を４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％以下など、５０％超低下させない）挿入、欠失、置換またはそれらの組み合わせ（例えば、アミノもしくはカルボキシ末端またはドメイン間におけるアミノ酸の付加）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合したα−炭素を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。
【００４１】
「保存的置換」は、特定のタンパク質の結合特性に有意に影響を及ぼさないまたは変化させないアミノ酸置換を指す。一般に、保存的置換は、置換されるアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。保存的置換は、以下の群のうちの１つにおいて見出される置換を含む：群１：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；群２：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＺ）；群３：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；群４：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；群５：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）；および群６：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）。それに加えて、またはその代わりに、アミノ酸を、同様の機能、化学構造、または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、または硫黄含有）によって保存的置換群に群分けすることができる。例えば、脂肪族の群分けは、置換の目的上、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅを含み得る。他の保存的置換群は、硫黄含有：Ｍｅｔおよびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ；小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ；極性、負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎ；極性、正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＣｙｓ；ならびに大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐを含む。追加的な情報は、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙに見出すことができる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００４３】
「パーセント配列同一性」は、２つまたはそれよりも多くの配列を比較することによって決定されるそれらの配列間の関係を指す。配列同一性を決定するための好ましい方法は、比較される配列間に最良のマッチがもたらされるように設計される。例えば、最適に比較するために配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができる）。さらに、比較する目的上、非相同配列を無視することができる。本明細書において参照されるパーセント配列同一性は、別段の指定のない限り、参照配列の長さにわたって算出される。配列同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに見出すことができる。配列アラインメントおよびパーセント同一性の算出は、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＢＬＡＳＴＸ）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用される数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年に見出すことができる。本開示に関しては、配列分析ソフトウェアを分析に使用する場合、分析の結果は、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されよう。「デフォルト値」とは、ソフトウェアに最初の初期化時に元々ロードされている任意の値またはパラメーターのセットを意味する。
【００４４】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」とは、天然のサブユニット（例えば、プリンまたはピリミジン塩基）で構成されてもよく、または非天然サブユニット（例えば、モルホリン環）で構成されてもよい、共有結合により連結したヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。プリン塩基は、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、およびキサンチンを含み、ピリミジン塩基は、ウラシル、チミン、およびシトシンを含む。核酸分子は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、これは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含み、これらはいずれも一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖である場合、核酸分子は、コード鎖であっても非コード（アンチセンス鎖）であってもよい。アミノ酸配列をコードする核酸分子は、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列のいくつかのバージョンは、イントロン（複数可）が同時転写機構または転写後機構によって除去される限りでは、イントロン（複数可）も含み得る。言い換えれば、遺伝暗号の冗長性または縮重の結果として、またはスプライシングによって、異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードし得る。
【００４５】
本開示の核酸分子の改変体も意図されている。改変体核酸分子は、本明細書に記載の定義されたまたは参照ポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一の核酸分子であるか、または、ポリヌクレオチドと、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、約６５〜６８℃、もしくは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、約４２℃のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子である。核酸分子改変体は、標的分子（例えば、ＣＤ２０）への特異的結合などの本明細書に記載の機能性を有する融合タンパク質またはその結合ドメインをコードする能力を保持する。
【００４６】
「機能的改変体」とは、本開示の親または参照化合物と構造的に類似したまたは実質的に構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる（例えば、１つの塩基、原子または官能基が異なる、付加されている、または除去されている）ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指し、したがって、ポリペプチドまたはコードされるポリペプチドがコードされる親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を、少なくとも５０％の効率、好ましくは親ポリペプチドの活性の少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のレベルで実施することができる。言い換えれば、本開示のポリペプチドまたはコードされるポリペプチドの機能的改変体は、機能的改変体が、結合親和性を測定するためのアッセイ（例えば、会合定数（Ｋａ）または解離定数（ＫＤ）を測定するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）または四量体染色）などの選択されたアッセイにおいて親または参照ポリペプチドと比較して５０％以下の性能の低下を示す場合、「同様の結合性」、「同様の親和性」または「同様の活性」を有する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「機能的部分」または「機能的断片」は、親または参照化合物のドメイン、部分または断片のみを含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指し、ポリペプチドまたはコードされるポリペプチドは、親または参照化合物のドメイン、部分または断片に関連する少なくとも５０％の活性、好ましくは親ポリペプチドの活性の少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％のレベルを保持する、または生物学的利益（例えば、エフェクター機能）をもたらす。本開示のポリペプチドまたはコードされるポリペプチドの「機能的部分」または「機能的断片」は、機能的部分または断片が、結合親和性を測定するためまたはエフェクター機能（例えば、サイトカインの放出）を測定するためのアッセイなどの選択されたアッセイにおいて親または参照ポリペプチドと比較して５０％以下の性能の低下（親和性に関しては親または参照と比較して、好ましくは２０％以下もしくは１０％以下、または１ｌｏｇ以下の差異）を示す場合、「同様の結合性」または「同様の活性」を有する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「異種性」または「非内因性」または「外因性」は、宿主細胞もしくは被験体にとって天然ではない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、もしくは活性、または、変更された宿主細胞もしくは被験体にとって天然である、任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、もしくは活性を指す。異種性、非内因性、または外因性は、構造、活性、またはその両方が、天然の遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子と変更された遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子の間で異なるように変異したまたは他のやり方で変更された遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、異種、非内因性または外因性の遺伝子、タンパク質または核酸分子（例えば、受容体、リガンドなど）は、宿主細胞または被験体に対して内因性ではなくてよいが、その代わりに、そのような遺伝子、タンパク質または核酸分子をコードする核酸が、宿主細胞に、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔などによって付加されていてよく、ここで、付加された核酸分子は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれていてもよく、染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製性ベクターとして）存在していてもよい。「相同」または「ホモログ」という用語は、宿主細胞、種、または株において見いだされるまたはそれに由来する遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子または活性を指す。例えば、異種性または外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子は、天然のポリヌクレオチドまたは遺伝子と相同であり、相同なポリペプチドまたは活性をコードするものであり得るが、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、変更された構造、配列、発現レベル、またはそれらの任意の組み合わせを有してよい。非内因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子、ならびにコードされるポリペプチドまたは活性は、同じ種、異なる種、またはこれらの組み合わせに由来するものであり得る。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「内因性」または「天然」という用語は、宿主細胞または被験体に通常存在するポリヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、化合物、分子、または活性を指す。
【００５０】
「発現」は、発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結した核酸分子の転写または翻訳を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「操作された」、「組換え」または「非天然」という用語は、少なくとも１つの遺伝学的変更を含む、または外因性核酸分子の導入により改変された生物体、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指し、そのような変更または改変は、遺伝子工学（すなわち、ヒトによる介入）により導入される。遺伝学的変更は、例えば、タンパク質、融合タンパク質または酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸分子の付加、欠失、置換または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊を含む。追加的な改変は、例えば、改変によりポリヌクレオチド、遺伝子またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域を含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、単鎖で少なくとも２つの別個のドメインを有し、それらのドメインが天然ではタンパク質において一緒には見いだされない、タンパク質を指す。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＣＲ、組換え操作などを使用して構築することができる、または、そのような融合タンパク質は、合成することができる。融合タンパク質は、タグ、リンカーモジュールまたは形質導入マーカーなどの他の成分をさらに含有し得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）により発現または産生される融合タンパク質は細胞表面に位置し、そこで、融合タンパク質は細胞膜につなぎ止められ（例えば、膜貫通ドメインを介して）、細胞外部分（例えば、結合ドメインを含有する）および細胞内部分（例えば、シグナル伝達ドメイン、エフェクタードメイン、共刺激ドメインまたはそれらの組み合わせを含有する）を含む。
【００５３】
抗体技術の当業者により理解される用語には、本明細書において明確に異なって定義されていなければ、それぞれ、当技術分野において得られる意味が与えられる。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むインタクトな抗体、ならびに標的分子に結合する能力を有するまたは保持するインタクトな抗体の抗原結合部分を指す。抗体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体は、天然に存在するもの、組換えによって産生されたもの、遺伝子操作されたもの、または改変されたものであってよく、例えば、細胞内抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ナノボディ、単一ドメイン抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジ−ｓｃＦＶ、タンデムトリ−ｓｃＦｖ）などの、改変された形態の免疫グロブリンを含む。抗体由来の「抗原結合部分」、「抗原結合性断片」または「抗原結合ドメイン」は、インタクトな抗体の一部を含み、抗体の抗原性決定可変領域または相補性決定領域を含有する「抗体断片」を指す。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ（すなわち、一般に約１０〜約２５アミノ酸の短い連結ペプチドで連結した、Ｉｇ分子の可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）領域の融合タンパク質）、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）、ならびに抗体断片を含む多重特異性抗体を含む。モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、非ヒト、キメラ、ヒト化またはヒトのものであってもよく、好ましくは、ヒト化またはヒトのものである。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に総説されている。抗体は、ＩｇＧおよびそのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤを含む任意のクラスまたはサブクラスのものであり得る。
【００５４】
用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、抗体軽鎖および重鎖それぞれからの可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の、別個の明確に定義された部分領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎ）で構成されている。
【００５５】
用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」（ＨＶＲ）が、抗原特異性または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことは、当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）があり、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）がある。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指す。一般に、各完全長重鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４）があり、各完全長軽鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３およびＦＲ−Ｌ４）がある。
【００５７】
用語「ＣＬ」は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖からの定常領域を指す。用語「ＣＨ」は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指し、この領域は、抗体アイソタイプに依存して、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）へとさらに分割可能である。
【００５８】
「抗原結合性断片」（Ｆａｂ）領域は、抗原に結合し、鎖間ジスルフィド結合を介して軽鎖と連結した重鎖の可変領域およびＣＨ１を含む抗体の部分である。「結晶化可能断片」（Ｆｃ）領域は、Ｆａｂ領域ではなく、ＣＨ１以外のＣＨ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２およびＣＨ３、またはＩｇＥ抗体のＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含む抗体の部分である。背景として、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および補体結合、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）への結合、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べて長いｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期、プロテインＡ結合、および、おそらく、さらには胎盤移行（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）などの、免疫グロブリンのエフェクター機能に関与する（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７巻：５２５頁、１９８９年を参照されたい）。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域部分」は、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、またはそれらの任意の組み合わせなどの１つまたは複数の定常ドメインを含む、抗体由来のＦｃ断片の重鎖定常領域セグメントを指す。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインもしくはそれらの任意の組み合わせ、またはＩｇＭもしくはＩｇＥ抗体のＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインおよびそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４構造は、同じ抗体のアイソタイプに由来する小領域ドメインを有し、ヒト、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭなど（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４に由来するＣＨ２ＣＨ３）である。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質において見出されるＦｃ領域部分は、免疫グロブリンのエフェクター機能の１つもしくは複数を媒介することができる、１つもしくは複数の増強されたエフェクター機能を媒介することができる、またはこれらの活性の１つもしくは複数もしくは全てを、例えば、当技術分野で公知の１つまたは複数の変異によって欠く。
【００６０】
さらに、抗体は、一般にはＦａｂ領域とＦｃ領域の間に位置するヒンジ配列を有する（しかし、ヒンジの下位区域はＦｃ領域のアミノ末端部分を含み得る）。背景として、免疫グロブリンヒンジは、Ｆａｂ領域が空間内を自由に移動するのを可能にする柔軟なスペーサーとして作用する。定常領域とは対照的に、ヒンジは構造的に多様であり、免疫グロブリンのクラス間で、およびさらにはサブクラスの中でも、配列および長さの両方が変動する。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は制限されずに柔軟であり、それにより、Ｆａｂ領域がそれらの対称軸の周りを回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の最初のものを中心とした球体内を移動することが可能になる。比較すると、ヒトＩｇＧ２ヒンジは、比較的短く、４つの重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された剛性のポリ−プロリン二重らせんを含有し、これにより柔軟性が制限される。ヒトＩｇＧ３ヒンジは、他のサブクラスとは、６２アミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含有し、柔軟でないポリ−プロリン二重らせんを形成し、Ｆａｂ領域がＦｃ領域から比較的遠いことに起因してより大きな柔軟性をもたらす独特の伸長したヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍長い）によって異なる。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１よりも短いがＩｇＧ２とは同じ長さであり、また、その柔軟性はＩｇＧ１の柔軟性とＩｇＧ２の柔軟性との間の中間である。
【００６１】
「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する免疫系細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの発現の増大、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の低下）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原経験済みおよび長寿命）およびエフェクター細胞（抗原経験済み、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現の増大、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の低下）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ４５ＲＡの発現の低下、ならびにＣＤ１２７の発現の増大）のサブセットにさらに分けることができる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現の低下を有し、グランザイムおよびパーフォリンについて陽性である抗原経験済みＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。Ｔヘルパー細胞（ＴＨ）は、抗原シグナル伝達を補助するサイトカインを放出し、また、成熟すると、表面タンパク質ＣＤ４を発現する（ＣＤ４＋である）。本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、霊長類、イヌ、またはウマ、好ましくはヒトを含めた任意の哺乳動物に由来するものである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、自己、同種異系、または同系である。
【００６２】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３と会合すると、一般に、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面上に見いだされる分子を指す。大多数のＴ細胞では、ＴＣＲは、高度に可変性のα鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）のジスルフィド連結ヘテロダイマーを有する。Ｔ細胞の小さなサブセットでは、ＴＣＲは、可変性のγ鎖およびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）ヘテロダイマーで構成される。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｎ末端免疫グロブリン可変ドメイン１つ、免疫グロブリン定常ドメイン１つ、膜貫通領域、およびＣ末端における短い細胞質尾部を有する（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４：３３頁、１９９７年を参照されたい）。本開示において使用されるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマ、または他の哺乳動物を含めた、様々な動物種に由来し得る。ＴＣＲは、細胞に結合した形態（すなわち、膜貫通領域もしくはドメインを有する）または可溶性形態であり得る。本明細書で考察されている通り、本開示による結合ドメインは、免疫グロブリンに由来するｓｃＦｖと類似しており、例えばペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーを使用しておよび任意選択でジスルフィド結合によって一緒に連結したＴＣＲα鎖由来の可変ドメインとＴＣＲβ鎖由来の可変ドメインを含む単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含み得る。
【００６３】
「主要組織適合性遺伝子複合体分子」（ＭＨＣ分子）は、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜を貫通するα鎖（３つのαドメインを有する）および非共有結合により会合したβ２ミクログロブリンからなるヘテロダイマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、どちらも膜を貫通する２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβで構成される。各鎖は２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞質ゾルにおいて生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこで、ペプチド：ＭＨＣ複合体がＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系において生じたペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマまたは他の哺乳動物を含めた、様々な動物種に由来し得る。
【００６４】
「Ｔ細胞系列の細胞」は、Ｔ細胞またはその前駆体または前駆細胞の、それらの細胞を他のリンパ系細胞および赤血球または骨髄系列の細胞と区別する少なくとも１つの表現型特性を示す細胞を指す。そのような表現型特性は、Ｔ細胞に特異的な１つもしくは複数のタンパク質の発現（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）、またはＴ細胞に特異的な生理的特徴、形態学的特徴、機能的特徴、もしくは免疫学的特徴を含み得る。例えば、Ｔ細胞系列の細胞は、Ｔ細胞系列に拘束された前駆体または前駆細胞；ＣＤ２５＋未成熟および不活性化Ｔ細胞；ＣＤ４またはＣＤ８分化系列拘束を受けた細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋２重陽性である胸腺前駆細胞；単一陽性ＣＤ４＋またはＣＤ８＋；ＴＣＲαβまたはＴＣＲγδ；または成熟および機能的なまたは活性化Ｔ細胞であり得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、混合物中の細胞型の量に関して「濃縮された」または「枯渇した」とは、１つまたは複数の濃縮または枯渇プロセスまたはステップの結果生じた、細胞の混合物中の「濃縮された」型の数の増加、「枯渇した」細胞の数の減少、またはその両方を指す。したがって、濃縮プロセスに供される元の細胞の集団の供給源に応じて、混合物または組成物は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれよりも多い（数または計数で）「濃縮された」細胞を含有し得る。枯渇プロセスに供された細胞からは、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％パーセントまたはそれよりも少ない（数または計数で）「枯渇した」細胞を含有する混合物または組成物が生じ得る。ある特定の実施形態では、混合物中のある特定の細胞型の量は濃縮され、異なる細胞型の量は枯渇する、例えば、ＣＤ４＋細胞が濃縮される一方でＣＤ８＋細胞が枯渇する、またはＣＤ６２Ｌ＋細胞が濃縮される一方でＣＤ６２Ｌ−細胞が枯渇する、またはこれらの組み合わせなどである。
【００６６】
「処置する」または「処置」または「改善する」は、被験体（例えば、ヒト、または、霊長類、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、マウスもしくはラットなどの非ヒト哺乳動物）の疾患、障害、または状態の医学的管理を指す。一般に、融合タンパク質を発現する宿主細胞であって、当該融合タンパク質が疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が本開示のエフェクタードメインを含む、宿主細胞、および任意選択でアジュバントを含む適切な用量または処置レジメンを、治療的利益または予防的利益を引き出すために十分な量で投与する。治療的または予防的／防止的利益は、臨床転帰の改善；疾患に関連する症状の軽減または緩和；症状の出現の減少；生活の質の改善；より長い無病状態；疾患の程度の低下、疾患状態の安定化；疾患の進行の遅延；寛解；生存；生存の持続；またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書にさらに記載されているとおり、処置レジメンは、１つまたは複数のＣＤ２０特異的結合分子、例えば抗ＣＤ２０抗体などを、１つまたは複数の第２のまたは補助的治療薬の投与の前、それと同時に、それと同時発生的に、またはその後に投与する併用療法を含み得る。本明細書に記載の治療方法における使用に適した例示的な抗ＣＤ２０抗体は、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、およびオクレリズマブを含む。
【００６７】
ＣＤ２０特異的結合分子、融合タンパク質、または本開示の融合タンパク質（例えば、ＣＤ２０  ＣＡＲ）を発現する宿主細胞の「治療有効量」または「有効量」は、臨床転帰の改善；疾患に関連する症状の軽減もしくは緩和；症状の出現の減少；生活の質の改善；より長い無病状態；疾患の程度の低下、疾患状態の安定化；疾患の進行の遅延；寛解；生存；または生存の持続を含めた治療効果を統計的に有意な様式でもたらすために十分なＣＤ２０特異的結合分子、融合タンパク質、または宿主細胞の量を指す。単独で投与される個々の活性成分または単一の活性成分を発現する細胞について言及する場合、治療有効量は、その成分またはその成分を発現する細胞の単独での効果を指す。組み合わせについて言及する場合、治療有効量は、逐次的に投与されるか同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす、活性成分または組み合わされる補助的活性成分と活性成分を発現する細胞とを合わせた量を指す。組み合わせはまた、１つ超の活性成分、例えば２つの異なるＣＤ２０  ＣＡＲ、または１つのＣＤ２０  ＣＡＲとＣＤ２０  ＴＣＲ、またはＣＤ２０  ＣＡＲと別の関連する治療薬などを発現する細胞であり得る。
【００６８】
「薬学的に許容される賦形剤または担体」または「生理学的に許容される賦形剤または担体」という用語は、本明細書においてより詳細に記載されている、ヒトまたは他の非ヒト哺乳動物被験体への投与に適しており、また、一般に安全であるまたは重篤な有害事象を引き起こさないと理解されている、生物学的に適合性のビヒクル、例えば、生理食塩水を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「統計的に有意」とは、スチューデントｔ検定を使用して算出したｐ値が０．０５０またはそれ未満であることを指し、測定された特定の事象または結果が偶然に生じる可能性は低いことを示す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「養子免疫療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）」または「養子免疫療法（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、天然に存在するまたは遺伝子操作された、疾患抗原に特異的な免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の投与を指す。養子細胞免疫療法は、自己（免疫細胞がレシピエントに由来する）、同種異系（免疫細胞が同じ種のドナーに由来する）または同系（免疫細胞がレシピエントと遺伝的に同一のドナーに由来する）であり得る。
【００７１】
融合タンパク質
ある特定の態様では、本開示は、疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分とを含む融合タンパク質を提供する。
【００７２】
「細胞外成分」は、ＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含む。「結合ドメイン」（「結合領域」または「結合部分」とも称される）は、本明細書で使用される場合、標的分子（例えば、ＣＤ２０）と特異的かつ非共有結合により会合する、１つに合わさる、または組み合わさる能力を保有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質などの分子を指す。結合ドメインは、目的の生体分子または他の標的の、任意の天然に存在する、合成、半合成、または組換えにより生成した結合パートナーを含む。一部の実施形態では、結合ドメインは、抗体またはＴＣＲ、または機能的結合ドメインまたはその抗原結合性断片などの抗原結合ドメインである。
【００７３】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、可変領域リンカー（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。「可変領域リンカー」は、具体的には、重鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＨ）と軽鎖免疫グロブリン可変領域（ＶＬ）を連結する、またはＴＣＲ  Ｖα／β鎖とＣα／β鎖を連結する（例えば、Ｖα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ）または各Ｖα−Ｃα対、Ｖβ−Ｃβ対、またはＶα−Ｖβ対とヒンジまたは疎水性ドメインを連結する、５アミノ酸から約３５アミノ酸の配列を指し、得られる単鎖ポリペプチドが抗体またはＴＣＲと同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持するように２つのサブ結合ドメインの相互作用に十分なスペーサー機能および柔軟性をもたらす。
【００７４】
ある特定の実施形態では、可変領域リンカーは、約１０アミノ酸から約３０アミノ酸まで、または約１５アミノ酸から約２５アミノ酸までを含む。特定の実施形態では、可変領域リンカーペプチドは、１〜１０のＧｌｙｘＳｅｒｙの反復を含み、式中、ｘおよびｙは、独立に、０〜１０の整数であるが、ただし、ｘおよびｙの両方が０になることはなく（例えば、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）、Ｇｌｙ３Ｓｅｒ、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６の整数である）、また、連結した可変領域は機能的な免疫グロブリン様結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＴＣＲ）を形成する。
【００７５】
例示的な結合ドメインは、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、もしくはＦａｂ）、ＴＣＲの抗原結合領域、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）など、または生体分子に結合する特異的な能力に関して選択された合成ポリペプチドを含む。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」は、試料中の任意の他の分子もしくは成分と有意に会合することも１つに合わさることもなしに、１０５Ｍ−１に等しいもしくはより大きい親和性もしくはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的分子に結合ドメイン、もしくはその融合タンパク質が会合することもしくは１つに合わさることを指す。結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）または「低親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）と分類することができる。「高親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）は、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）を指す。「低親和性」結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）は、最大で１０７Ｍ−１まで、最大で１０６Ｍ−１まで、最大で１０５Ｍ−１までのＫａを有する結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）を指す。
【００７７】
あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することができる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、「増強された親和性」を有し得、これは、標的抗原に対して野生型（または親）結合ドメインよりも強力な結合を有する、選択または操作された結合ドメインを指す。例えば、増強された親和性は、標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）が野生型結合ドメインよりも大きいことに起因し得る、標的抗原に対するＫｄ（解離定数）が野生型結合ドメインよりも低いことに起因し得る、または標的抗原に対する解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（Ｋｏｆｆ）が野生型結合ドメインよりも低いことに起因し得る。ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析などの、特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するためならびに結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための様々なアッセイが公知である（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、５１巻：６６０頁、１９４９年；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等物も参照されたい）。
【００７８】
タンパク質の三次構造を分析するための結合ドメインの一次および二次アミノ酸構造の分析またはコンピューターモデリングは、構造を有意に変更させることなく、および結果として結合ドメインの結合特異性および親和性を潜在的に有意に低下させることなく置換する、付加する、または欠失させることができる特定のアミノ酸残基を同定するために役立ち得る。
【００７９】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ＶＨ領域を含む。例えば、本開示の結合ドメインにおける領域は、公知のモノクローナル抗体のＶＨに由来するものまたはそれに基づくものであり得、公知のモノクローナル抗体のＶＨと比較して１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の挿入、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）の欠失、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組み合わせを含有し得る。挿入、欠失または置換は、各ＣＤＲが、公知のモノクローナル抗体のＶＨ領域のＣＤＲから変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つまたは４つの変化を含み、また、改変されたＶＨ領域を含有する結合ドメインがその標的に野生型の結合ドメインと同様の親和性で特異的に結合するのであれば、領域のアミノ末端、カルボキシ末端または両末端を含めた、ＶＨ領域内のどこにあってもよい。
【００８０】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ＶＬ領域を含む。例えば、本開示の結合ドメイン内のＶＬ領域は、公知のモノクローナル抗体のＶＬに由来するまたはそれに基づくものであり、公知のモノクローナル抗体のＶＬと比較して１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）の挿入、１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）の欠失、１つもしくは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、または上記の変化の組み合わせを含有し得る。挿入、欠失、または置換は、各ＣＤＲが公知のモノクローナル抗体のＶＬ領域のＣＤＲから変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つまたは４つの変化を含み、また、改変されたＶＬ領域を含有する結合ドメインがその標的に野生型結合ドメインに類似した親和性で特異的に結合するのであれば、アミノ末端、カルボキシ末端、またはこれらの領域の両末端を含めた、ＶＬ領域のどこにあってもよい。
【００８１】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列；例えば、１．５．３（配列番号１）、１Ｆ５（配列番号３）、Ｌｅｕ１６（配列番号２）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＬと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８２】
さらなる実施形態では、結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列；例えば、１．５．３（配列番号４）、１Ｆ５（配列番号６）、Ｌｅｕ１６（配列番号５）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＨと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８３】
なおさらなる実施形態では、結合ドメインは、（ａ）ＶＬのアミノ酸配列；例えば、１．５．３（配列番号１）、１Ｆ５（配列番号３）、Ｌｅｕ１６（配列番号２）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＬと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるアミノ酸配列；および（ｂ）ＶＨのアミノ酸配列；例えば、１．５．３（配列番号４）、１Ｆ５（配列番号６）、Ｌｅｕ１６（配列番号５）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＨと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。上記の実施形態のいずれかでは、ＶＬ、ＶＨまたは両方の各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体もしくはその断片もしくは誘導体と比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし改変されたＶＬ、ＶＨまたは両方領域を含有する結合ドメインは、ＣＤ２０に野生型結合ドメインに類似した親和性で特異的に結合する．
【００８４】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、１．５．３（配列番号６４）、１Ｆ５（配列番号６６）、Ｌｅｕ１６（配列番号６５）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブの抗体由来のｓｃＦｖのアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体もしくはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する．
【００８５】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）；例えば、１．５．３（配列番号７０）、１Ｆ５（配列番号７２）、Ｌｅｕ１６（配列番号７１）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＬをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるポリヌクレオチドにコードされる。
【００８６】
さらなる実施形態では、結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）；例えば、１．５．３（配列番号７３）、１Ｆ５（配列番号７５）、Ｌｅｕ１６（配列番号７４）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＨをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。
【００８７】
なおさらなる実施形態では、結合ドメインは、（ａ）ＶＬ；例えば、１．５．３（配列番号７０）、１Ｆ５（配列番号７２）、Ｌｅｕ１６（配列番号７１）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＬをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるポリヌクレオチド；および（ｂ）ＶＨ；例えば、１．５．３（配列番号７３）、１Ｆ５（配列番号７５）、Ｌｅｕ１６（配列番号７４）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブ由来のＶＨをコードするポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。上記の実施形態のいずれかでは、ＶＬ、ＶＨまたは両方の各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体もしくはその断片もしくは誘導体をコードするのポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１〜６のヌクレオチド変化を含み、ただし改変されたＶＬ、ＶＨまたは両方の領域を含有する結合ドメインは、ＣＤ２０に野生型結合ドメインに類似した親和性で特異的に結合する。
【００８８】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖ、例えば、１．５．３（配列番号６７）、１Ｆ５（配列番号６９）、Ｌｅｕ１６（配列番号６８）、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、ウブリツキシマブまたはオクレリズマブの抗体由来の可変ドメインを含むコードされたｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。上述の実施形態のそれぞれでは、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体由来の親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１〜６のヌクレオチド変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する。
【００８９】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、結合ドメインは、ウブリツキシマブ（例えば、ＵＳ２０１５／０２９０３１７を参照されたい）、リツキシマブ（例えば、ＵＳ２０１４／０００４０３７を参照されたい）、オクレリズマブ（例えば、ＵＳ８，６７９，７６７を参照されたい）、オファツムマブ（例えば、ＵＳ２００９／０１６９５５０を参照されたい）、またはベルツズマブ（例えば、ＵＳ２００９／０１６９５５０を参照されたい）に由来するＶＨ、ＶＬまたはその両方からなる、それを含む、それに基づく、またはそれに由来するものであってよく、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書に記載の方法のいずれかでは、ＣＤ２０結合分子は、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、またはオクレリズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００９０】
本開示の融合タンパク質は、エフェクタードメインを含む細胞内成分を含む。本明細書で使用される場合、「エフェクタードメイン」は、適切なシグナルを受け取った際に細胞における生物学的応答または生理学的応答を直接または間接的に促進することができる、融合タンパク質または受容体の細胞内部分またはドメインである。ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、結合の際、または、タンパク質またはその一部またはタンパク質複合体が標的分子に直接結合し、エフェクタードメインからのシグナルを誘発した際にシグナルを受け取る、タンパク質またはタンパク質複合体に由来するまたはその一部である。エフェクタードメインは、１つまたは複数のシグナル伝達ドメインまたはモチーフ、例えば、共刺激分子に見出される免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）などを含有する場合、細胞応答を直接促進することができる。ＩＴＡＭを含む共刺激分子またはその一部は、一般に、リガンドとの会合後にＴ細胞活性化シグナル伝達を開始できることが公知である。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、細胞応答を直接促進する１つまたは複数の他のタンパク質と会合することによって細胞応答を間接的に促進する。
【００９１】
ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４））に由来する１つまたは複数のＩＴＡＭを有するポリペプチド、またはこれらの組み合わせを含む。さらに別の実施形態では、エフェクタードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含み、細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体またはそのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、共刺激因子、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００９２】
例示的なエフェクタードメインとして、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、Ｗｎｔ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２由来のもの、またはその任意の組み合わせが挙げられる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、任意選択で天然のＣＤ２８タンパク質（配列番号１５；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０２巻：４３２０頁、２００３年を参照されたい）の１８６〜１８７位にＬＬ→ＧＧ変異を含み得る、共刺激分子ＣＤ２８に由来する部分またはドメインを含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ３ζまたはその機能的部分（配列番号１７）、および、１つまたは複数の、共刺激分子に由来する部分またはドメイン、例えば、ＣＤ２８（配列番号１５）、４−１ＢＢ（配列番号１６）、ＣＤ２７、またはＯＸ４０などを含む。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質のエフェクタードメインは、ＣＤ３ζ（配列番号１７）およびＣＤ２８（配列番号１５）；ＣＤ３ζ（配列番号１７）および４−１ＢＢ（配列番号１６）；またはＣＤ３ζ（配列番号１７）、ＣＤ２８（配列番号１５）、および４−１ＢＢ（配列番号１６）に由来するエフェクタードメインまたはその機能的部分を含む。
【００９４】
ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、配列番号８６と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるＣＤ３ζもしくはその機能的部分を含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、配列番号８４と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドにコードされる共刺激分子ＣＤ２８由来の部分もしくはドメインを含む。なおさらなる実施形態では、エフェクタードメインは、配列番号８５と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドにコードされる共刺激分子４−１ＢＢ由来の部分もしくはドメインを含む。
【００９５】
本開示の細胞外ドメインおよび細胞内ドメインは、疎水性部分によって連結されている。「疎水性部分」は、本明細書で使用される場合、細胞膜において熱力学的に安定な三次元構造を有する任意のアミノ酸配列を意味し、一般に、約１５アミノ酸から約３０アミノ酸までの長さにわたる。疎水性部分の構造は、アルファヘリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータへリックス、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、疎水性部分は、細胞膜に挿入され得るまたはまたがり得る膜貫通タンパク質の部分である、公知の膜貫通タンパク質由来の「膜貫通ドメイン」で構成される。一部の実施形態では、疎水性部分は、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８（例えば、配列番号１４）、ＣＤ２７膜貫通ドメイン、および４−１ＢＢ膜貫通ドメインなどの膜貫通ドメインである。ある特定の実施形態では、疎水性部分は、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号１４）である。さらなる実施形態では、疎水性部分はＣＤ２８膜貫通ドメインであり、これは、配列番号８３にコードされると少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドにコードされる。
【００９６】
本開示の融合タンパク質は、リンカーモジュールをさらに含み得る。「リンカーモジュール」は、約２アミノ酸から約５００アミノ酸までを有するアミノ酸配列であってよく、リンカーによって連結された２つの領域、ドメイン、モチーフ、断片、またはモジュール間のコンフォメーション運動のための柔軟性および余地をもたらすものである。ある特定の実施形態では、リンカーモジュールは、結合ドメインと疎水性領域との間に位置してよい。そのような実施形態では、リンカーモジュールにより、結合ドメインを細胞表面から離して位置づけて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にすることができる（Ｐａｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、６巻：４１２〜４１９頁、１９９９年）。リンカーモジュールの長さは、選択された標的分子、選択された結合エピトープ、または抗原結合ドメインのサイズおよび親和性に基づいて、腫瘍認識が最大になるように変動させることができる（例えば、Ｇｕｅｓｔら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２８巻：２０３〜１１頁、２００５年；ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照されたい）。例示的なリンカーモジュールは、１〜約１０のＧｌｙｘＳｅｒｙの反復（式中、ｘおよびｙは、独立に、０から１０までの整数であるが、ただし、ｘおよびｙの両方が０になることはない（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２、Ｇｌｙ２Ｓｅｒ、またはこれらの組み合わせ、例えば（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｇｌｙ２Ｓｅｒなど））を有するグリシン−セリン（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカーを有するものを含む。ある特定の実施形態では、リンカーモジュールは、１つまたは複数の免疫グロブリン重鎖定常領域、例えば、ＣＨ３単独、またはＣＨ２ＣＨ３構造、ＣＨ３ＣＨ４構造、免疫グロブリンヒンジ、またはそれらの任意の組み合わせ（例えば、ヒンジと一緒になったＣＨ２ＣＨ３構造）などを含む。さらなる実施形態では、リンカーモジュールは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはこれらの組み合わせから選択されるＦｃドメインの全部または一部を含む（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０３１６８７号を参照されたい）。
【００９７】
例示的なリンカーモジュールは、長さが変動することができ、例えば、約５アミノ酸〜約５００アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３５０アミノ酸、約１５アミノ酸〜約１００アミノ酸、約２０アミノ酸〜約７５アミノ酸、または約２５アミノ酸〜約３５アミノ酸であり得る。さらなる実施形態では、リンカーモジュールは、ヒンジ領域、タグまたは両方をさらに含み得る。リンカーモジュールのそのような成分のそれぞれは、相互排他的ではない。
【００９８】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質のリンカーモジュールは、Ｎ２９７Ｑ変異を伴うＩｇＧ１  ＣＨ２領域（配列番号１０）；ＩｇＧ４  ＣＨ２領域（配列番号１１）；ＩｇＧ１  ＣＨ３領域（配列番号１２）；またはＩｇＧ４  ＣＨ３領域（配列番号１３）を含み得る。ある特定の実施形態では、リンカーモジュールは、グリシン−セリンリンカー（配列番号８９にコードされ得る配列番号２０、または配列番号９０にコードされ得る配列番号２１）を含み得る。
【００９９】
さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質のリンカーモジュールは、配列番号７９と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるＮ２９７Ｑ変異を伴うＩｇＧ１  ＣＨ２領域を含み得る。別の実施形態では、本開示の融合タンパク質のリンカーモジュールは、配列番号８０と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるＩｇＧ４  ＣＨ２領域を含み得る。なお別の実施形態では、本開示の融合タンパク質のリンカーモジュールは、配列番号８１と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるＩｇＧ１  ＣＨ３領域を含み得る。さらに別の実施形態では、本開示の融合タンパク質のリンカーモジュールは、配列番号８２と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるＩｇＧ４  ＣＨ３領域を含み得る。
【０１００】
ある特定の実施形態では、リンカーモジュールは、ヒンジ領域をさらに含む。本明細書で使用される場合、「ヒンジ領域」または「ヒンジ」は、（ａ）免疫グロブリンヒンジ配列（例えば、上部およびコア領域で構成されている）もしくはその機能的断片もしくは改変体、（ｂ）ＩＩ型Ｃ−レクチンドメイン間（スターク（ｓｔａｌｋ））領域もしくはその機能的断片もしくは改変体、または（ｃ）表面抗原分類（ＣＤ）分子スターク領域もしくはその機能的改変体を指す。本明細書で使用される場合、「野生型免疫グロブリンヒンジ領域」は、抗体の重鎖に見出されるＣＨ１およびＣＨ２ドメイン間に介在し、それらを連結する天然に存在する上部および中間ヒンジアミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態では、ヒンジ領域は、ヒトのものであり、また特定の実施形態では、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含む。さらなる実施形態では、ヒンジ領域は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０３１６８７号に記載されている変更されたＩｇＧ４ヒンジ領域である。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質のヒンジ領域は、ＩｇＧ１ヒンジ（配列番号７）であり得る。関連する実施形態では、本開示の融合タンパク質のヒンジ領域は、配列番号７６に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＩｇＧ１ヒンジであり得る。
【０１０１】
本開示の融合タンパク質は、接合部アミノ酸をさらに含み得る。「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」は、タンパク質の２つの隣接するドメイン、モチーフ、領域、モジュール、または断片の間、例えば、結合ドメインと隣接するリンカーモジュールとの間、疎水性ドメインと隣接するエフェクタードメインとの間、または、２つのドメイン、モチーフ、領域、モジュール、または断片を連結するリンカーモジュールの一方の末端もしくは両方の末端上（例えば、リンカーモジュールと隣接する結合ドメインとの間もしくはリンカーモジュールと隣接するヒンジとの間）の１つまたは複数（例えば、約２〜２０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築デザインに起因し得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中の制限酵素部位の使用に起因するアミノ酸残基）。例えば、融合タンパク質の疎水性部分は、アミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方に１つまたは複数の接合部アミノ酸を有し得る。接合部アミノ酸の例は、ＩｇＧ２由来の接合部アミノ酸（例えば、配列番号９、配列番号７８によりコードされ得る）を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域がＩｇＧ４に由来する場合、ヒンジ領域は、接合部アミノ酸（例えば、配列番号８、配列番号７７によりコードされ得る）を含み得る。ある特定の実施形態では、疎水性部分は、配列番号１４のアミノ酸を有するＣＤ２８膜貫通ドメインであり、ここで、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、例えば、メチオニンのアミノ末端接合部アミノ酸を含む（例えば、配列番号３０、３１、３９、および４０の融合タンパク質を参照されたい）。したがって、ある特定の実施形態では、リンカーモジュールは、ＩｇＧ４ヒンジ、ＩｇＧ４接合部アミノ酸、およびＩｇＧ４  ＣＨ２−ＣＨ３を含む。ある特定の他の実施形態では、リンカーモジュールは、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ２接合部アミノ酸、およびＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、タグをさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「タグ」は、異種性または非内因性の同族結合分子（例えば、受容体、リガンド、抗体、または他の結合パートナー）が特異的に結合することができる、目的のタンパク質に添付された、融合した、またはその一部である独特のペプチド配列を指し、特に、タグを付けたタンパク質がタンパク質もしくは他の材料の不均質な集団の一部である場合、またはタグを付けたタンパク質を発現する細胞が、細胞の不均質な集団（例えば、末梢血のような生体試料）の一部である場合に、タグを付けたタンパク質またはタグを付けたタンパク質を発現する細胞を検出する、同定する、単離するまたは精製する、追跡する、濃縮する、または標的化するために結合特性を使用することができる（例えば、ＷＯ２０１５／０９５８９５を参照されたい）。提供される融合タンパク質では、タグ（複数可）の同族結合分子（複数可）と特異的に結合する能力は、結合ドメイン（複数可）の標的分子（複数可）に特異的に結合する能力とは別個のものであるまたはそれに加えたものである。タグは、一般には抗原結合分子ではない、例えば、抗体またはＴＣＲまたはその抗原結合部分ではない。タグの例は、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグを含む。特定の実施形態では、Ｓｔｒｅｐタグは、配列番号６２または配列番号６３のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
本開示の融合タンパク質は、シグナルペプチドを含み得る。「シグナルペプチド」は、融合タンパク質を細胞表面発現のために標的化するために使用される短い（例えば、５〜３０アミノ酸）配列である。例示的なシグナルペプチドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル伝達ペプチド（配列番号１８、配列番号８７によりコードされ得る）およびマウスカッパシグナルペプチド（配列番号１９、配列番号８８によりコードされ得る）を含む。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体である。「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、天然には存在しないまたは宿主細胞において天然には存在しないやり方で一緒に連結した２つまたはそれよりも多くの天然に存在するアミノ酸配列を含有するように操作された本開示の融合タンパク質を指し、融合タンパク質は、細胞の表面に存在すると、受容体として機能し得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、完全ヒトＣＡＲまたはヒト化ＣＡＲである。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ２０抗体由来のｓｃＦｖまたはＣＤ２０抗原に特異的なＴＣＲ由来のｓｃＴＣＲを有する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、ウブリツキシマブ、またはその任意の組み合わせ由来のｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、またはその任意の組み合わせを含むリンカーモジュールを含む。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ２９７Ｑ変異を伴うＩｇＧ１  ＣＨ２領域、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域、ＩｇＧ１  ＣＨ３領域、ＩｇＧ４  ＣＨ３領域、またはその任意の組み合わせを含むリンカーモジュールを含む。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲの疎水性部分は、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはそれらの任意の組み合わせに由来する部分またはドメインを含む細胞内ドメインを含む。上記の実施形態のいずれかでは、ＣＡＲは、２つの隣接するドメイン、モチーフ、領域、モジュール、または断片の間の接合部アミノ酸を含む。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号２６）；１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号２７）；１．５．３−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号２８）；１．５．３−ＮＱ−ｚ（配列番号２９）；Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３０）；Ｌｅｕ１６−２８−ｚ（配列番号３１）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３２）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号３３）；または１Ｆ５−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号３４）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であり得る。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２６〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４４〜５２のいずれか１つの核酸分子配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一であり得る。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号４４〜５２のいずれか１つの配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドにコードされる。
【０１０８】
ＣＡＲを含む融合タンパク質を作製する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６，４１０，３１９号；米国特許第７，４４６，１９１号；米国特許公開第２０１０／０６５８１８号；米国特許第８，８２２，６４７号；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０３１６８７；米国特許第７，５１４，５３７号；およびＢｒｅｎｔｊｅｎｓら、２００７、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １３：５４２６に記載される。
【０１０９】
宿主細胞、核酸およびベクター
ある特定の態様では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質の任意の１つまたは複数をコードする核酸分子を提供する。所望の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、所望の配列もしくはその一部を発現する細胞由来のライブラリーのスクリーニング、配列を、それを含むことが分かっているベクターから引き出すことによって、または配列もしくはその一部を、それを含有する細胞もしくは組織から直接単離することによってなど、標準の技法を使用する当技術分野で公知の組換え方法を使用して得るまたは産生させることができる。あるいは、目的の配列を合成により作製することができる。そのような核酸分子は、目的の宿主細胞（例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）への導入のために、適切なベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドベクター）に挿入することができる。
【０１１０】
「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。一部の実施形態では、ベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するための転写もしくは翻訳ターミネーター、開始配列、またはプロモーターを含有する。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、またはファージ、またはトランスポゾン系（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、例えば、Ｇｅｕｒｔｓら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、８巻：１０８頁、２００３年；Ｍａｔｅｓら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、４１巻：７５３頁、２００９年を参照されたい）であり得る。「発現ベクター」は、適切な環境に存在すると、ベクターに担持されている１つまたは複数の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである。
【０１１１】
コアウイルスをコードするベクターは、本明細書では、「ウイルスベクター」と呼ばれる。ヒト遺伝子療法への適用のために同定されたものを含め、本開示の組成物と共に使用するのに適した多数の入手可能なウイルスベクターが存在する（ＰｆｅｉｆｅｒおよびＶｅｒｍａ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．、２巻：１７７頁、２００１年を参照されたい）。適切なウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスに基づくベクター、例えば、レトロウイルス由来ベクターを含む。
【０１１２】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスであり、当該ＲＮＡゲノムは、逆転写酵素を使用してＤＮＡに逆転写され、次いで、逆転写されたＤＮＡは宿主細胞のゲノムに組み入れられる。「ガンマレトロウイルス」は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の属を指す。ガンマレトロウイルスの例は、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスを含む。「レンチウイルス」は、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができる、レトロウイルスの別の属を指す。レンチウイルスのいくつかの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；１型ＨＩＶ、および２型ＨＩＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ガンマレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターであり得る。別の実施形態では、ウイルスベクターは、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターであり得る。ＨＩＶ−１由来ベクターはこのカテゴリーに属する。他の例は、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディ−ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来するレンチウイルスベクターを含む。ＣＡＲ導入遺伝子を含有するウイルス粒子を用いて哺乳動物宿主細胞に形質導入するための、レトロウイルスウイルスベクターおよびレンチウイルスウイルスベクターならびにパッケージング細胞の使用方法は当技術分野で公知であり、以前に、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻：３２７９３０頁、２０１１年；Ｚｈａｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７４巻：４４１５頁、２００５年；Ｅｎｇｅｌｓら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１４巻：１１５５頁、２００３年；Ｆｒｅｃｈａら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１８巻：１７４８頁、２０１０年；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、５０６巻：９７頁、２００９年に記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系はまた、市販もされている。例えばアデノウイルスに基づくベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターを含めた、ＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶを含めた、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するベクターを含めた他のウイルスベクターも、ポリヌクレオチド送達のために使用することができる（Ｋｒｉｓｋｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５巻：１５１７頁、１９９８年）。
【０１１４】
遺伝子療法への使用のために最近開発された他のベクターも本開示の組成物および方法と共に使用することができる。そのようなベクターは、バキュロウイルスおよびα−ウイルスに由来するもの（Ｊｏｌｌｙ，  Ｄ  Ｊ．、１９９９年、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．、２０９〜４０頁、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ  Ｔ．編、Ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ）、またはプラスミドベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙまたは他のトランスポゾンベクターなど）を含む。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターを使用して、ＣＤ２０などの標的に特異的な融合タンパク質をコードする非内因性ポリヌクレオチドを導入する。そのような実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、形質導入についてのマーカーをコードする核酸配列も含み得る。ウイルスベクター用の形質導入マーカーは当技術分野で公知であり、薬物耐性を付与することができる選択マーカー、または、フローサイトメトリーなどの方法によって検出することができる蛍光マーカーまたは細胞表面タンパク質などの検出可能なマーカーを含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、形質導入マーカーを含む。本明細書で使用される場合、「形質導入マーカー」は、トランスフェクション効率をモニターするためまたは目的の融合タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として任意の構築物に含めることができる。例示的な形質導入マーカーは、緑色蛍光タンパク質、ヒトＣＤ２の細胞外ドメイン、切断されたヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ；配列番号２５、配列番号９４によりコードされ得る；Ｗａｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：１２５５頁、２０１１年を参照されたい）、または切断されたＣＤ１９（配列番号２４、配列番号９３によりコードされ得る）である。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ｉＣａｓｐ９（例えば、ＧａｒｇｅｔｔおよびＢｒｏｗｎ、Ｆｒｏｎｔ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５巻：２３５頁、２１０４を参照されたい）、またはＨＳＶ−ＴＫ（例えば、Ｆｉｌｌａｔら、Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３巻：１３頁、２００３年を参照されたい）などの自殺遺伝子を含む。
【０１１７】
ウイルスベクターゲノムが、別々の転写物として宿主細胞において発現される複数ポリヌクレオチドを含む場合、ウイルスベクターは、２つ（またはそれ超）の転写物の間に、バイシストロン性または多シストロン性の発現を可能にする追加的な配列も含み得る。ウイルスベクターに使用するそのような配列の例は、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、フューリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、ベクター構築物は、自己切断性ペプチド（例えば、Ｅ２Ａ（配列番号２２、配列番号９１によりコードされ得る）、Ｔ２Ａ（配列番号２３、配列番号９２によりコードされ得る）、Ｐ２Ａ（配列番号９５、配列番号９７によりコードされ得る）、またはＦ２Ａ（配列番号９６、配列番号９８によりコードされ得る））をコードするポリヌクレオチドを含み得、したがって、成熟融合タンパク質は形質導入マーカーまたは自殺遺伝子を含有しない。ある特定の実施形態では、核酸ベクターは、任意選択で形質導入マーカー（例えば、ｔＣＤ１９またはｔＥＧＦＲなど）を含有する本開示の融合ペプチドをコードし得る。さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子は、Ｔ細胞などの特定の型の細胞における発現が増強または最大化されるようにコドン最適化することができ（Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１９巻：１３５〜１４５頁、２００６年）、また、任意選択で形質導入マーカー（例えば、ｔＣＤ１９またはｔＥＧＦＲなど）を含有し得る。
【０１１８】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、形質導入マーカーをコードするポリヌクレオチドも含有してよく、これを、形質導入マーカーを発現する宿主細胞を消失または死滅の標的とするために使用することができる。機能的な抗原標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性により、抗原を内因的に発現する健康な細胞の持続した枯渇が引き起こされ得ることが示されている（例えば、Ｐａｓｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１２６巻（１１号）：４２６２〜４２７２頁（２０１６年）を参照されたい）。したがって、所望の抗腫瘍効果を達成した後に、移入されたＴ細胞の調節（例えば、消失、殺滅、または別の細胞傷害効果の生成）を可能にする制御機構が望ましい。本明細書で使用される場合、「細胞傷害効果」という用語は、細胞の消失、殺滅、または他のやり方で細胞の成長、分裂もしくは生存する能力を損なうまたは低下させることを包含する。細胞傷害効果の非限定的な例は、壊死、溶解、アポトーシス、腫脹、膜完全性の喪失、転写のレベルまたは速度の低下、翻訳のレベルまたは速度の低下、ＡＴＰ産生のレベルまたは速度の低下、反応性酸素種のレベルまたは率の上昇、ミトコンドリア機能の低下、核凝縮、細胞のＤＮＡの切断の増大、分裂または増殖の速度の低下、および特異的な細胞機能の低下または喪失（例えば、Ｂリンパ球の免疫グロブリンを産生する能力）を含む。１つの例示的な手法は、抗体（例えば、セツキシマブ）または抗体−薬物コンジュゲートにより認識できるマーカー（例えば、ｔＥＧＦＲ）であって、マーカーに結合した際に、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）応答もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）応答を容易にして、または、細胞傷害性分子を送達して、移入Ｔ細胞を消失させる、殺滅させる、もしくは他のやり方で移入Ｔ細胞に対する細胞傷害効果を引き起こすマーカーを使用することである。したがって、ある特定の実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、また、形質導入マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。細胞傷害性抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたは他の細胞傷害性薬剤が特異的に結合することができる形質導入マーカーは、本明細書では「自殺形質導入マーカー」と称される。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法は、本開示に従って治療有効量の形質転換された宿主細胞を被験体に投与することを含み、当該形質転換された宿主細胞は、融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドおよび自殺形質導入マーカーをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、当該方法は、任意選択で、自殺形質導入マーカーと特異的に会合する、結合する、またはそれと複合体を形成する細胞傷害性抗体、抗体−薬物コンジュゲートまたは他の細胞傷害性薬剤を投与することを含む。一部の実施形態では、自殺形質導入マーカーは、例えばセツキシマブなどの抗ＥＧＦＲ抗体に特異的に結合する、切断されたＥＧＦＲ（例えば、配列番号２５）を含むまたはそれからなる。さらなる実施形態では、自殺形質導入マーカーは、例えばブリナツモマブ、コルツキシマブ・ラブタンシン（ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、ＭＯＲ２０８、ＭＥＤＩ−５５１、デニンツズマブ・マホドチン（ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、Ｍｅｒｃｋ  ｐａｔｅｎｔ抗ＣＤ１９、タプリツモマブパプトクス（ｔａｐｌｕｔｕｍｏｍａｂｐａｐｔｏｘ）、ＸｍＡｂ  ５８７１、ＭＤＸ−１３４２、ＳＡＲ３４１９、ＳＧＮ−１９Ａ、またはＡＦＭ１１などの細胞傷害性抗ＣＤ１９抗体または抗体−薬物コンジュゲートが特異的に結合する、切断されたＣＤ１９（例えば、配列番号２４）を含むまたはそれからなる（例えば、ＮａｄｄａｆｉおよびＤａｖａｍｉ、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｅｄ．、４巻（３号）：１４３〜１５１頁（２０１５年）を参照されたい）。
【０１１９】
任意の本明細書に記載の実施形態では、本開示のコードされる融合タンパク質は、ＣＡＲ、例えば、ＣＤ２０特異的ＣＡＲであり得る。ある特定の実施形態では、本開示のベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされるＣＡＲもしくはその結合ドメインは、完全ヒトであるかまたはヒト化されている。さらなる実施形態では、本開示のベクターにコードされるＣＡＲは、抗ＣＤ２０抗体由来のｓｃＦｖまたはＣＤ２０抗原由来のｓｃＴＣＲに特異的なＴＣＲを有する。なおさらなる実施形態では、本開示のベクターにコードされるＣＡＲは、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、ウブリツキシマブ、またはその任意の組み合わせ由来のｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、本開示のベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされるＣＡＲは、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、またはその任意の組み合わせを含むリンカーモジュールを含む。さらなる実施形態では、本開示のベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされるＣＡＲは、Ｎ２９７Ｑ変異を伴うＩｇＧ１  ＣＨ２領域、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域、ＩｇＧ１  ＣＨ３領域、ＩｇＧ４  ＣＨ３領域、またはその任意の組み合わせを含むリンカーモジュールを含む。特定の実施形態では、本開示のベクターにコードされるＣＡＲのリンカーモジュールまたは可変領域リンカーは、グリシン−セリンリンカーを含む。なおさらなる実施形態では、本開示のベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされるＣＡＲの疎水性部分は、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示のベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされるＣＡＲは、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、またはその任意の組み合わせ由来の部分もしくはドメインを含む細胞内ドメインを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示のベクターに含有されるポリヌクレオチドによりコードされるＣＡＲは、隣接するドメイン、モチーフ、領域、モジュール、または断片の間の接合部アミノ酸を含む。
【０１２０】
任意の本明細書に記載の実施形態では、ベクターは、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号２６）；１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号２７）；１．５．３−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号２８）；１．５．３−ＮＱ−ｚ（配列番号２９）；Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３０）；Ｌｅｕ１６−２８−ｚ（配列番号３１）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３２）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号３３）；または１Ｆ５−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号３４）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み得る。さらなる実施形態では、ベクターは、配列番号２６〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【０１２１】
なおさらなる実施形態では、ＣＤ２０特異的ＣＡＲは、ベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされ、ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５２のいずれか１つの核酸分子配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の同一性を有する。関連の実施形態では、ＣＤ２０特異的ＣＡＲはベクターに含まれるポリヌクレオチドにコードされ、ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５２のいずれか１つの配列を含むまたはそれからなる。
【０１２２】
任意選択で、本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む本開示の任意のベクターは、形質導入マーカーとＣＡＲが別々の分子−ＣＡＲおよび形質導入マーカーに分離されるように自己切断性ペプチドも含み得る形質導入マーカー（例えば、ｔＣＤ１９）もコードすることができる。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＣＤ２０特異的ＣＡＲとｔＣＤ１９形質導入マーカーの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができ、このポリヌクレオチドは、配列番号５３〜６１のいずれか１つの核酸分子配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一である。さらなる実施形態では、ベクターは、ＣＤ２０特異的ＣＡＲとｔＣＤ１９形質導入マーカーの間に配置された自己切断性ペプチドをコードし、配列番号５３〜６１のいずれか１つの核酸分子配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを含み得る。
【０１２３】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、単離されたポリヌクレオチドは、ＣＤ２０に特異的に結合することができる融合タンパク質をコードし、ポリヌクレオチドは、以下：（ａ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；（ｂ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；（ｃ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；（ｄ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；（ｅ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなるか；または（ｆ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなる。
【０１２４】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、融合タンパク質は、本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、アミノ酸配列からなるかまたは含み、融合タンパク質は、（ａ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号２６〜２９および３５〜３８および３２〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質と少なくとも９０％同一であるか；（ｂ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質で構成されるか；（ｃ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質からなるか；（ｄ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか；（ｅ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されるか；または（ｆ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の異種ポリヌクレオチドを含み、異種ポリヌクレオチドにコードされる融合タンパク質を発現することができる宿主細胞が提供される。
【０１２６】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、宿主細胞は、ＣＤ２０に特異的に結合することができる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドは、以下：（ａ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；（ｂ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；（ｃ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；（ｄ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；（ｅ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなるか；または（ｆ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、アミノ酸配列からなるかまたは含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、（ａ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号２６〜２９および３５〜３８および３２〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質と少なくとも９０％同一であるか；（ｂ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質で構成されるか；（ｃ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質からなるか；（ｄ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか；（ｅ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されるか；または（ｆ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の異種ポリヌクレオチドを含み、異種ポリヌクレオチドにコードされる融合タンパク質を発現することができる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、結合ドメインは、以下：（ａ）配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む１．５．３  ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１．５．３  ｓｃＦｖであるか；（ｃ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む１Ｆ５  ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１Ｆ５  ｓｃＦｖであるか；（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＬｅｕ１６  ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；あるいは（ｆ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬｅｕ１６  ｓｃＦｖである。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが、以下：（ａ）配列番号６７の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号６７の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号６９の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号６９の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号６８の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；あるいは（ｆ）配列番号６８の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、融合タンパク質はキメラ抗原受容体であり、配列番号２６〜３４４３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、疎水性部分を含む融合タンパク質を含みをコードする異種ポリヌクレオチド、疎水性部分は膜貫通ドメインである。ある特定の実施形態では、疎水性部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８またはＣＤ２７膜貫通ドメインである。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、エフェクタードメインもしくはその機能的部分を含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、エフェクタードメインもしくはその機能的部分は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはその任意の組み合わせである。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、細胞内成分を含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、細胞内成分は、以下：（ａ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｂ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｃ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｄ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｅ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその一部；あるいは（ｆ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部を含む。
【０１３５】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の融合タンパク質を含有するベクターを宿主細胞に形質導入する。「形質導入」は、核酸分子（例えば、本開示の融合タンパク質をコードするベクター）を宿主細胞に導入することを指す。形質導入後、宿主細胞は、ベクターを染色体外に担持し得るまたは染色体内に組み込み得る。宿主細胞のゲノムまたは自己複製性ベクターへの組込みの結果、一般に、形質転換されたベクターの遺伝的に安定な遺伝がもたらされる。任意の適切な形質導入方法を利用することができる。ベクターは、物理的手段、化学的手段、または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。形質転換された核酸分子を含有する宿主細胞は、「操作された」、「組換え」または「非天然」と称される。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、被験体から得たＴ細胞などの細胞を、本明細書に記載の細胞表面に位置する融合タンパク質をコードする核酸分子を導入することによって、操作された細胞、非天然細胞、または組換え細胞（例えば、操作されたＴ細胞、非天然Ｔ細胞、または組換えＴ細胞）に変換することができ、ここで、細胞は融合タンパク質を発現する。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するようにトランスフェクトされる宿主細胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、セントラルまたはエフェクターメモリーＴ細胞、γδ  Ｔ細胞、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞などの機能的Ｔ細胞である。さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＴＣＭ細胞、ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組み合わせに導入する。さらに別の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＴＣＭ細胞、ＣＤ４＋ＴＥＭ細胞、またはそれらの任意の組み合わせに導入する。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＴＣＭ細胞が濃縮されたＴ細胞の集団に導入する。さらに他の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸分子を、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＴＣＭ細胞が濃縮されたＴ細胞の集団に導入する。上述の実施形態のいずれかにおいて、Ｔ細胞は、操作されたＣＤ２０特異的ＴＣＲ、操作されたＣＤ２０特異的高親和性ＴＣＲ、ＣＤ２０特異的ＣＡＲ、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子をさらに含有する。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質構築物を用いたＴ細胞の拡大増殖および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源を被験体（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、または脾臓組織）から得、それから、当技術分野で公知の方法を使用してＴ細胞を単離する。特定のＴ細胞サブセットを公知の技法に従って回収し、抗体への親和性結合、フローサイトメトリー、または免疫磁気選択などの公知の技法によって濃縮または枯渇させることができる。濃縮または枯渇ステップおよび融合タンパク質の導入後、所望の改変Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ拡大増殖を公知の技法（米国特許第６，０４０，１７７号に記載されているものを含む）または当業者には明らかであろうその変形に従って行うことができる。
【０１３９】
例えば、所望のＴ細胞集団または亜集団を、最初のＴ細胞集団を培養培地にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加し、次いで、非分裂性ＰＢＭＣなどのフィーダー細胞を培養培地に添加することによって拡大増殖し（例えば、得られる細胞の集団が、拡大増殖される最初の集団中の各Ｔ細胞当たり少なくとも約５、１０、２０、または４０またはそれよりも多くのＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）、培養物をインキュベートすることができる（例えば、Ｔ細胞の数を拡大するために十分な時間にわたって）。非分裂性フィーダー細胞は、ガンマ照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。一部の実施形態では、ＰＢＭＣにガンマ線約３０００〜３６００ｒａｄの範囲で照射する。Ｔ細胞およびフィーダー細胞を培養培地に添加する順序は所望であれば逆にすることができる。培養物を、一般には、Ｔ細胞の成長に適した、温度などの条件下でインキュベートすることができる。ヒトＴリンパ球の成長のためには、例えば、温度を、一般に、少なくとも約２５℃、好ましくは少なくとも約３０℃、より好ましくは約３７℃にする。
【０１４０】
任意選択で、拡大増殖方法は、非分裂性エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダー細胞として添加することをさらに含み得る。ＬＣＬにガンマ線を約６０００〜１０，０００ｒａｄの範囲で照射することができる。ＬＣＬフィーダー細胞は、ＬＣＬフィーダー細胞の最初のＴリンパ球に対する比が少なくとも約１０：１のなどの任意の適切な量で提供することができる。
【０１４１】
Ｔリンパ球の単離後、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球の両方を、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団に分類し、その後、融合タンパク質を用いて遺伝子改変し、拡大増殖させることができる。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質を発現するように改変されるＴ細胞は、バルクＴ細胞（例えば、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞またはバルクＣＤ８＋Ｔ細胞）であるか、または、セントラルメモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞）もしくはセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）とナイーブＴ細胞（ＴＮ）の組み合わせ（例えば、ＣＤ４＋ＴＣＭ＋ＴＮ細胞）などのＴ細胞の亜集団である。
【０１４２】
任意の本明細書に記載の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号２６）；１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号２７）；１．５．３−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号２８）；１．５．３−ＮＱ−ｚ（配列番号２９）；Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３０）；Ｌｅｕ１６−２８−ｚ（配列番号３１）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３２）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号３３）；または１Ｆ５−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号３４）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一であるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。さらなる実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、配列番号２６〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＡＲをコードするポリヌクレオチを含むベクターを含む。任意のこれらの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞、またはＣＤ４＋セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびＣＤ４＋ナイーブ（ＴＮ）Ｔ細胞の組み合わせである。ＣＡＲ改変ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＡＲ改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、被験体への投与の前に３：１〜１：１〜１：３の比に混合することができ、または同じまたは類似の比で別々に被験体に投与することができる。
【０１４３】
なおさらなる実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ２０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５２のいずれか１つの核酸分子配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の同一性を有する。関連の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ２０特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号４４〜５２のいずれか１つの配列を含むまたはそれからなる。任意のこれらの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞、またはＣＤ４＋セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびＣＤ４＋ナイーブ（ＴＮ）Ｔ細胞の組み合わせである。ＣＡＲ改変ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＡＲ改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、被験体への投与の前に３：１〜１：１〜１：３の比に混合することができ、または同じまたは類似の比で別々に被験体に投与することができる。
【０１４４】
任意選択で、本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する本開示の任意のベクターを含む宿主細胞は、形質導入マーカーとＣＡＲが別々の分子−ＣＡＲおよび形質導入マーカーに分離されるように自己切断性ペプチドも含み得る形質導入マーカー（例えば、ｔＣＤ１９）もコードし得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ２０特異的ＣＡＲとｔＣＤ１９形質導入マーカーの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含み、ポリヌクレオチドは、配列番号５３〜６１のいずれか１つの核酸分子の配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である。さらなる実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ２０特異的ＣＡＲとｔＣＤ１９形質導入マーカーの間に配置されており、配列番号５３〜６１のいずれか１つの核酸分子の配列を含むまたはそれからなる自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含む。
【０１４５】
Ｔ細胞またはＴ細胞集団が特定の細胞表面マーカーについて陽性であるかどうかは、表面マーカーに特異的な抗体およびアイソタイプを適合させた対照抗体を用いた染色を使用したフローサイトメトリーによって決定することができる。マーカーについて「陰性」である細胞集団は、特異的な抗体を用いてアイソタイプ対照を上回る細胞集団の有意な染色がないことを指し、「陽性」は、アイソタイプ対照で見られるレベルを上回る細胞集団の均一な染色を指す。一部の実施形態では、１つまたは複数のマーカーの発現の低下は、ＭＦＩにおける１ｌｏｇ１０の喪失、または参照Ｔ細胞集団と比較した場合の、少なくとも２０％の細胞、２５％の細胞、３０％の細胞、３５％の細胞、４０％の細胞、４５％の細胞、５０％の細胞、５５％の細胞、６０％の細胞、６５％の細胞、７０％の細胞、７５％の細胞、８０％の細胞、８５％の細胞、９０％の細胞、９５％の細胞、または１００％の細胞、あるいは２０％および１００％の間の任意の割合のマーカーを提示するＴ細胞の割合の減少を指す。一部の実施形態では、マーカーについて陽性であるＴ細胞集団とは、参照Ｔ細胞集団と比較した場合の、少なくとも５０％の細胞、５５％の細胞、６０％の細胞、６５％の細胞、７０％の細胞、７５％の細胞、８０％の細胞、８５％の細胞、９０％の細胞、９５％の細胞、または１００％の細胞、あるいは５０％および１００％の間の任意の割合であり得る、マーカーを提示する細胞の割合を指す。
【０１４６】
市販の臨床グレードの抗体ビーズコンジュゲートを使用してＴ細胞亜集団を精製するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスを使用した免疫磁気選択方法を使用することもできる（例えば、Ｔｅｒａｋｕｒａら、２０１２年、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻：７２〜８２頁；Ｗａｎｇら、２０１２年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５巻：６８９〜７０１頁を参照されたい）。例えば、ヒトＣＤ８＋ＴＣＭ細胞を単離するために、ＣＤ４＋、ＣＤ１４＋、およびＣＤ４５ＲＡ＋細胞を、抗体とコンジュゲートした常磁性ビーズを用いて枯渇させることによって末梢血単核細胞から除去し、次いで、残りの細胞からのＣＤ６２Ｌ＋画分を、抗ＣＤ６２Ｌ標識ビーズを用いて陽性選択してＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋ＴＣＭ亜集団を濃縮する。濃縮したＣＤ８＋ＴＣＭ亜集団は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズまたは抗原で活性化し、レトロウイルスもしくはレンチウイルスベクターを使用して腫瘍特異的ＣＡＲで改変し、そして細胞免疫療法における使用のために拡大増殖させることができる（例えば、Ｔｅｒａｋｕｒａら、上記；Ｗａｎｇら、上記を参照されたい）。
【０１４７】
あるいは、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩと融合した低親和性Ｆａｂ断片を使用してＴ細胞サブセットを選択することができる。Ｆａｂモノマーは、細胞表面上の標的抗原に安定に結合するために十分な結合親和性を有さない。しかし、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズ上でマルチマーを形成すると、これらの試薬は、標的細胞に安定に結合し、細胞表面マーカー特異性に基づく選択が可能になる。Ｆａｂマルチマー結合は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎに対して高い親和性を有し、Ｆａｂ断片上のＳｔｒｅｐ−タグとＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ「骨格」と間の結合を妨害するＤ−ビオチンを過剰に添加することによって急速に逆転させることができる。Ｆａｂモノマーは、細胞への安定な結合を維持することができない。この「Ｆａｂ−Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓ」技術は、複数の細胞表面マーカーに基づくＴ細胞の逐次的な陽性濃縮を可能にするものであり、任意の所望のＴ細胞サブセットを選択するために使用することができる（例えば、Ｓｔｅｍｂｅｒｇｅｒら、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、７巻：ｅ３５７９８頁、２０１２年を参照されたい）。
【０１４８】
バルクＣＤ８＋Ｔ細胞は、標準の方法を使用することによって得ることができる。一部の実施形態では、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞を、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、およびエフェクターＴ細胞に、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の型のそれぞれに関連付けられる特定の細胞表面マーカーを同定することによってさらに分類する。ある特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ６２Ｌ−サブセットの両方に存在する。例えば、ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８および抗ＣＤ６２Ｌ抗体を用いた染色後にＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８＋およびＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分に分類することができる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、またはＣＤ１２７を含むか、または、グランザイムＢについて陰性である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、またはＣＤ１２７の発現について陰性であるもしくは発現が低下している、または、グランザイムＢまたはパーフォリンの発現について陽性であるもしくは発現が増大している。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、またはＣＤ４５ＲＡを含めたナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とする。
【０１４９】
バルクＣＤ４＋リンパ球は、標準の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞を、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、およびエフェクター細胞に、特定の細胞表面マーカーを有する細胞集団を同定することによってさらに分類する。一部の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性かつＣＤ４５ＲＯ陽性である。一部の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２ＬもしくはＣＤ４５ＲＯ陰性であるまたはセントラルメモリーＣＤ４＋細胞と比較してＣＤ６２ＬもしくはＣＤ４５ＲＯの発現が低下している。
【０１５０】
抗原に特異的なＴＣＲを有するＣＤ４＋およびＣＤ８＋の集団は、ナイーブまたは抗原特異的Ｔリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。例えば、抗原特異的ＴＣＲを有するＴ細胞クローンを、例えば、サイトメガロウイルス抗原に対して、感染させた被験体由来のＴ細胞から単離し、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて同じ抗原を用いて刺激することによって生成することができる。ナイーブＴ細胞を、抗原提示細胞またはペプチド−ＭＨＣ複合体の状況で提示されたペプチド抗原に曝露することによって使用することもできる。腫瘍細胞、がん細胞、または病原因子由来の任意の数の抗原を利用することができる。そのような抗原の例は、ＨＩＶ抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、ＥＢＶ抗原、寄生生物抗原、および腫瘍抗原、例えば、オーファンチロシンキナーゼ受容体ＲＯＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５６、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＡ１２５、ｃ−ＭＥＴ、ＦｃＲＨ５、ＷＴ１、葉酸受容体α、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＰＳＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、メソテリン、ＣＥＡなどを含む。そのような抗原特異的ＴＣＲを有するＴ細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質を含有するようにさらに改変することができ、ここで、融合タンパク質は、同じ抗原に特異的である、同じ抗原上の異なるエピトープに特異的である、または異なる抗原に特異的である。これらの実施形態のいずれかでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は異なるＣＡＲを含有し、特に、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達成分が別個である。
【０１５１】
Ｔ細胞を、本開示の融合タンパク質を発現するように調製および改変する方法、融合タンパク質で改変されたＴ細胞活性を確認する方法、融合タンパク質で改変されたＴ細胞集団を拡大増殖する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈｏｌｌｙｍａｎら、２００９年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２巻：１６９〜１８０頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０７９０００号；米国特許第８，８０２，３７４号；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｂｌｏｏｄ、１１８巻：４８１７〜４８２８頁、２０１１年；米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２７１６３５号に記載されている。
【０１５２】
使用
本開示は、被験体における疾患、状態または障害を処置する方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかを被験体に投与するステップを含む方法を提供する。複数の実施形態では、本開示の方法は、被験体におけるＢ細胞の数を減少させるか、または異常なＢ細胞活性に関連する疾患または障害を処置する方法を含む。別の実施形態は、被験体における疾患、状態または障害を処置する方法であって、被験体の生体試料を疾患、状態、または障害に関連する抗原の存在について分析するステップ、および、抗原に特異的に結合する、本明細書に記載の融合タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患、状態、または障害に関連する抗原は腫瘍関連抗原である。
【０１５３】
本開示に記載の組成物および方法を用いて処置することができる疾患、状態、または障害は、がんおよび免疫疾患（例えば、自己免疫性）を含む。例えば、ある特定の実施形態では、ＣＤ２０発現細胞はＢ細胞を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害はＢ細胞または異常なＢ細胞活性に関するもの、例えば、Ｂ細胞関連がんである。養子免疫および遺伝子療法は、様々な型のがん（Ｍｏｒｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４巻：１２６頁、２００６年；Ｓｃｈｍｉｔｔら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２０巻：１２４０頁、２００９年；Ｊｕｎｅ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻：１４６６頁、２００７年）に対して有望な処置である。
【０１５４】
固形腫瘍または白血病を含む、様々ながんは、本明細書で開示する組成物および方法に感受性（ａｍｅｎａｂｌｅ）である。処置することができる例示的な種類のがんは、乳房、前立腺および結腸の腺癌；肺のすべての型の気管支原性癌；骨髄性白血病；黒色腫；肝がん；神経芽腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；ならびに癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアス、管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、エンバク細胞、乳頭、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞および移行細胞）を含む。処置することができるさらなる種類のがんは、組織球性障害；悪性組織球症；白血病；ホジキン病；免疫増殖性小細胞（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）：非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；栄養膜腫瘍を含む。さらに、以下の種類のがんも処置に感受性であると考えられる：腺腫；胆管腫；コレステリン腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺がん；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝がん；汗腺腫；膵島細胞腫瘍；ライジッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫（ｌｅｉｍｙｏｍａ）；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫（ｍｙｏｍｍａ）；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節神経腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫。処置することができる種類のがんは、被角血管腫；好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌腫；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症（ｎｅｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）；および子宮頸部異形成をも含む。
【０１５５】
本明細書に記載される本明細書に開示の組成物および方法に感受性である例示的なさまざまな過剰増殖性障害は、ＣＤ２０発現と関連する障害または疾患、例えば、Ｂ細胞がんを含む異常なＢ細胞活性化、例えば、Ｂ細胞リンパ腫（様々な種類のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫など）、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病のＢ細胞芽球化反応など）ならびに骨髄腫（多発性骨髄腫など）である。さらなるＢ細胞がんは、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ組織型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性の可能性のあるＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症および移植後リンパ増殖性障害を含む。ある特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、多発性骨髄腫、黒色腫、幹細胞の多発性骨髄腫および幹細胞の黒色腫を含めた、ＣＤ２０発現に関連する非Ｂ細胞障害または疾患を処置するために使用することができる。
【０１５６】
本明細書に開示の組成物および方法に感受性である炎症性疾患および自己免疫疾患は、関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、特発性炎症性ミオパチー、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性腸疾患、クローン病、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性応答を伴う状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状ループス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シドナム舞踏病、サイトカインおよびＴ−リンパ球によって媒介される急性過敏症および遅延型過敏症に関連する免疫応答、結核、サルコイドーシス、ウェゲナー肉芽腫症およびチャーグ・ストラウス病を含めた肉芽腫症、顆粒球減少症、血管炎（過敏性血管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）／過敏性血管炎（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｇｉｉｔｉｓ）、ＡＮＣＡおよびリウマチ性血管炎を含む）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含めた免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球ろう（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器傷害症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜抗体病、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、レイノー症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、スティーブンス・ジョンソン症候群、実質臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多発性内分泌腺症、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティフ・マン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｒｏｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含めた精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、自己免疫性多腺性症候群（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｌｙｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（または多腺性内分泌疾患症候群）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼ばれる１型糖尿病およびシーハン症候群を含めた自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性��炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛および巨細胞（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸症）、寒冷グロブリン血症、肝炎に関連する寒冷グロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群および閉塞性血栓性血管炎を含む。
【０１５７】
本発明によって処置することができる被験体は、一般に、ヒトおよび他の霊長類被験体、例えば、獣医学的医療の目的に関してはサルおよび類人猿などである。被験体は雄であっても雌であってもよく、また、乳児、若年、青年、成体、および老齢被験体を含めた、任意の適切な年齢の被験体であってよい。
【０１５８】
本開示の融合タンパク質は、当業者に理解される任意の適切な様式で投与するために製剤化することができる。本開示のＣＤ２０特異的融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）（または異なる標的に特異的な融合タンパク質）は、細胞に結合した形態で被験体に投与することができる（例えば、標的細胞集団（成熟Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）または他のＴ細胞系列の細胞）のｅｘ  ｖｉｖｏ改変）。特定の実施形態では、被験体に投与される本開示のＣＤ２０特異的融合タンパク質（または異なる標的に特異的な融合タンパク質）を発現するＴ細胞系列の細胞は、被験体に対して同系細胞、同種異系細胞、または自己細胞である。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む細胞は、（生体試料、組織、または培養培地から）細胞を回収し、洗浄し、濃縮し、投与に適した媒体および容器系中に製剤化することによって調製される。
【０１５９】
本開示は、本明細書で開示される融合タンパク質を発現する細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む組成物を提供する。適切な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなどおよびこれらの組み合わせを含む。複数の実施形態では、本明細書に開示される融合タンパク質を発現する細胞を含む組成物は、適切な注入媒体をさらに含む。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体製剤であり得、一般には、ノーマルセーライン、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）、水中５％デキストロース、乳酸リンゲル液を利用することができる。注入媒体にはヒト血清アルブミンまたは他のヒト血清成分を補充することができる。
【０１６０】
他の実施形態では、本開示のＣＤ２０特異的融合タンパク質（または異なる標的に特異的な融合タンパク質）は、可溶性の形態で被験体に投与することができる。例えば、可溶性ＴＣＲは、当技術分野で公知である（例えば、Ｍｏｌｌｏｙら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５巻：４３８頁、２００５年；米国特許第６，７５９，２４３号を参照されたい）。
【０１６１】
本開示の融合タンパク質、またはそれを含む細胞は、医療技術分野の当業者によって決定される、処置される疾患、状態または障害に適した様式で投与することができる。上記の実施形態のいずれかでは、本明細書に記載の融合タンパク質を含む細胞を、静脈内、腹腔内、腫瘍内、骨髄内、リンパ節内、または脳脊髄液内に投与する。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む細胞を腫瘍の部位に送達する。
【０１６２】
組成物の適切な用量、適切な持続時間、および投与の頻度は、患者の状態；疾患、状態、または障害のサイズ、型、および重症度；活性成分の特定の形態；および投与の方法などの因子によって決定される。
【０１６３】
上記の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、治療有効量の本開示の融合タンパク質を発現する宿主細胞または本開示の融合物を発現する宿主細胞を投与するステップを含む。組成物中の細胞の治療有効量は、少なくとも１つの細胞（例えば、１つの融合タンパク質で改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞亜集団；１つの融合タンパク質で改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団）であるか、または、より一般には、１０２個よりも多くの細胞、例えば、最大１０６個、最大１０７個、最大１０８個の細胞、最大１０９個の細胞、または１０１０個超の細胞である。ある特定の実施形態では、細胞を、１ｍ２当たり約１０６〜約１０１０個の細胞の範囲、好ましくは、１ｍ２当たり約１０５〜約１０９個の細胞の範囲で投与する。細胞の数は、組成物に関して意図されている最終的な使用ならびに組成物中に含まれる細胞の型に依存する。例えば、特定の抗原に特異的な融合タンパク質を含有するように改変された細胞は、そのような細胞を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多く含有する細胞集団を含む。本発明で提供される使用に関しては、細胞は、一般に、１リットルまたはそれ未満、５００ｍｌまたはそれ未満、２５０ｍｌまたはそれ未満、または１００ｍｌまたはそれ未満の体積のものである。複数の実施形態では、所望の細胞の密度は、一般には、１ｍｌ当たり細胞１０４個よりも大きく、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０７個よりも大きく、一般に、１ｍｌ当たり細胞１０８個またはそれよりも大きい。細胞は、単回注入として投与することもでき、ある範囲の時間にわたって複数回注入で投与することもできる。臨床的に意義のある免疫細胞の数を、累積的に１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１０１０個、または１０１１個の細胞と同等になるまたはそれを超える複数回注入に配分することができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本開示の方法は、完全ヒトまたはヒト化ＣＡＲである本開示のＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、抗ＣＤ２０抗体由来のｓｃＦｖまたはＣＤ２０抗原に特異的なＴＣＲ由来のｓｃＴＣＲを有するＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、１．５．３、１Ｆ５、Ｌｅｕ１６、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、ウブリツキシマブ、またはそれらの任意の組み合わせに由来するｓｃＦｖを含むＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。上記の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ４ヒンジ、またはそれらの任意の組み合わせを含むリンカーモジュールを含むＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、Ｎ２９７Ｑ変異を伴うＩｇＧ１  ＣＨ２領域、ＩｇＧ４  ＣＨ２領域、ＩｇＧ１  ＣＨ３領域、ＩｇＧ４  ＣＨ３領域、またはそれらの任意の組み合わせを含むリンカーモジュールを含むＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。本開示の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、グリシン−セリンリンカーモジュールまたはグリシン−セリン可変領域リンカーを含むＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、ＣＤ２８膜貫通ドメインで構成される疎水性部分を含むＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、ＣＤ３ζ由来のドメイン、４−１ＢＢ由来のドメイン、ＣＤ２８由来のドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む細胞内ドメインを含むＣＡＲを発現する宿主細胞を投与することを含む。上記の実施形態のいずれかでは、本開示の方法は、隣接するドメイン、モチーフ、領域、モジュール、または断片の間の接合部アミノ酸を含むＣＡＲを投与することを含む。
【０１６５】
任意の本明細書に記載の実施形態では、本開示の方法は、被験体に融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む宿主細胞を投与するステップを含み、当該融合タンパク質が疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が本開示のエフェクタードメインを含み、コードされる融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号２６）；１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号２７）；１．５．３−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号２８）；１．５．３−ＮＱ−ｚ（配列番号２９）；Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３０）；Ｌｅｕ１６−２８−ｚ（配列番号３１）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ（配列番号３２）；１Ｆ５−ＮＱ−２８−ｚ（配列番号３３）；または１Ｆ５−ＮＱ−ＢＢ−ｚ（配列番号３４）と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％同一である。さらなる実施形態では、本開示の方法は、被験体に融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む宿主細胞を投与するステップを含み、当該融合タンパク質が疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が本開示のエフェクタードメインを含み、コードされる融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、配列番号２６〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。任意のこれらの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞、またはＣＤ４＋セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびＣＤ４＋ナイーブ（ＴＮ）Ｔ細胞の組み合わせである。ＣＡＲ改変ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＡＲ改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、被験体への投与の前に３：１〜１：１〜１：３の比に混合することができ、または同じまたは類似の比で別々に被験体に投与することができる。
【０１６６】
なおさらなる実施形態では、本開示の方法は、被験体に融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む宿主細胞を投与するステップを含み、当該融合タンパク質が疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が本開示のエフェクタードメインを含み、当該融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、配列番号４４〜５２のいずれか１つの核酸分子配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％の同一性を有するポリヌクレオチドにコードされる。関連の実施形態では、方法は、被験体に融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む宿主細胞を投与するステップを含み、当該融合タンパク質が疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が本開示のエフェクタードメインを含み、当該融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）は、配列番号４４〜５２のいずれか１つの配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドにコードされる。任意のこれらの実施形態では、宿主細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞は、バルクＣＤ４＋Ｔ細胞、バルクＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞、またはＣＤ４＋セントラルメモリー（ＴＣＭ）およびＣＤ４＋ナイーブ（ＴＮ）Ｔ細胞の組み合わせである。ＣＡＲ改変ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＡＲ改変ＣＤ８＋Ｔ細胞は、被験体への投与の前に３：１〜１：１〜１：３の比に混合することができ、または同じまたは類似の比で別々に被験体に投与することができる。
【０１６７】
任意選択で、本明細書に記載の方法における使用のための、本開示の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む本開示の任意のベクターを含む宿主細胞は、形質導入マーカーとＣＡＲが別々の分子−ＣＡＲおよび形質導入マーカーに分離されるように自己切断性ペプチドも含み得る形質導入マーカー（例えば、ｔＣＤ１９）もコードすることができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ２０特異的ＣＡＲとｔＣＤ１９形質導入マーカーの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号５３〜６１のいずれか１つの核酸分子配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一である。さらなる実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＣＤ２０特異的ＣＡＲとｔＣＤ１９形質導入マーカーの間に配置された自己切断性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、配列番号５３〜６１のいずれか１つの核酸分子配列を含むまたはそれからなるベクターを含む。
【０１６８】
したがって、本明細書に記載の方法のいずれかでは、宿主細胞は、ＣＤ２０に特異的に結合することができる融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、以下：（ａ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；（ｂ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるか；（ｃ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；（ｄ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むか；（ｅ）配列番号５３〜５６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなるか；または（ｆ）配列番号４４〜４７のいずれか１つのポリヌクレオチド配列からなる。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、アミノ酸配列からなるかまたは含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、（ａ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号２６〜２９および３５〜３８および３２〜３４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質と少なくとも９０％同一であるか；（ｂ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質で構成されるか；（ｃ）ｔＣＤ１９形質導入マーカーが除去された配列番号３５〜３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む成熟融合タンパク質からなるか；（ｄ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるか；（ｅ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列で構成されるか；または（ｆ）配列番号２６〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、本明細書に記載の異種ポリヌクレオチドを含み、融合タンパク質を発現することができる。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、結合ドメインは、以下：（ａ）配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む１．５．３  ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；（ｂ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１．５．３  ｓｃＦｖであるか；（ｃ）配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む１Ｆ５  ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；（ｄ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる１Ｆ５  ｓｃＦｖであるか；（ｅ）配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むＬｅｕ１６  ｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖの各ＣＤＲは、ＣＤ２０に特異的に結合する親モノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体の対応するＣＤＲと比較して変化がないかまたは最大で１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合するか；あるいは（ｆ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＬｅｕ１６  ｓｃＦｖである。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが、以下：（ａ）配列番号６７の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号６７の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号６９の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号６９の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号６８の核酸分子の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドであって、ｓｃＦｖの各ＣＤＲをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＤ２０に特異的に結合するモノクローナル抗体に由来する親ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドと比較して変化がないかまたは最大で１つ〜６つのヌクレオチドの変化を含み、ただし１つまたは複数の改変されたＣＤＲを含有するｓｃＦｖは、ＣＤ２０に野生型ｓｃＦｖまたは対応する抗体に類似した親和性で特異的に結合する、ポリヌクレオチド；あるいは
（ｆ）配列番号６８の核酸分子の配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、融合タンパク質は、キメラ抗原受容体であり、配列番号２６〜４３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、疎水性部分を含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、疎水性部分は膜貫通ドメインである。ある特定の実施形態では、疎水性部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８またはＣＤ２７膜貫通ドメインである。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、エフェクタードメインもしくはその機能的部分を含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、エフェクタードメインもしくはその機能的部分は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはその任意の組み合わせである。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、方法で使用される宿主細胞は、細胞内成分を含む融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、細胞内成分は、以下：（ａ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｂ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｃ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｄ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部；（ｅ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、ＣＤ２７共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその一部；あるいは（ｆ）ＣＤ３ζエフェクタードメインもしくはその機能的部分、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激ドメインもしくはその機能的部分およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）共刺激ドメインもしくはその一部を含む。
【０１７７】
本開示の組成物は、１つまたは複数の他の治療剤の投与と同時に、その前に、またはその後に投与することもできる。そのような併用療法は、本開示の融合タンパク質および１つまたは複数の追加的な活性薬剤を含有する単一の投与製剤を投与すること、ならびに本開示の融合タンパク質および各活性薬剤を独自の別々の投与製剤で投与することを含む。例えば、本開示の融合タンパク質および別の活性薬剤は、被験体に、単一の注入投与組成物として一緒に投与することもでき、各薬剤を別々の注入投与製剤で投与することもできる。別々の投与製剤を使用する場合、本開示の融合タンパク質と１つまたは複数の追加的な活性薬剤を同じ時に、すなわち同時に、基本的に同じ時に、すなわち並行して、または別々にずらした時に、すなわち逐次的に、投与することができる；併用療法は、これらのレジメンの全てを包含するものと理解される。
【０１７８】
本開示は、ＣＤ２０特異的結合分子、本明細書に開示される融合タンパク質を発現する細胞またはその両方、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０特異的結合分子は、抗体である。そのような実施形態では、ＣＤ２０特異的抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法は、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体に、融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む有効量の宿主細胞を投与するステップを含み、当該融合タンパク質が疎水性部分によって連結された細胞外成分と細胞内成分を含み、当該細胞外成分がＣＤ２０に特異的に結合する結合ドメインを含み、細胞内成分が本開示のエフェクタードメインを含み、方法は、任意選択で治療有効量のＣＤ２０特異的結合分子、化学療法薬、または免疫抑制成分の阻害剤を投与するステップを含む。さらなる実施形態では、方法は、Ｂ細胞の数を減少させるか、または異常なＢ細胞活性に関連する疾患または障害を処置する。
【０１８０】
したがって、ある特定の実施形態では、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法であって、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体に、配列番号２６〜２９および３２〜３８、および４１〜４３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列から構成される融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む有効量の宿主細胞を投与するステップ、および任意選択でＣＤ２０特異的結合分子、化学療法薬、免疫抑制成分の阻害剤、またはこれらの組み合わせを投与するステップを含む、方法が提供される。さらなる実施形態では、方法は、Ｂ細胞の数を減少させるか、または異常なＢ細胞活性に関連する疾患または障害を処置する。
【０１８１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、化学療法剤もしくは免疫修飾物質（例えば、免疫抑制剤、または免疫抑制成分の阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤）と共に投与される。免疫チェックポイント阻害剤として、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｔｉｍ−３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＣＤ２４４の阻害剤、またはその任意の組み合わせが挙げられる。免疫チェックポイント分子の阻害剤は、抗体またはその抗原結合性断片、融合タンパク質、小分子、ＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。化学療法薬は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗有糸分裂剤、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０１８２】
任意の本明細書に記載の実施形態では、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法は、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体に、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む有効量の宿主細胞と、治療有効量の免疫抑制成分の阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤とを投与するステップを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｔｉｍ−３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＣＤ２４４の阻害剤、またはその任意の組み合わせである。
【０１８３】
したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法であって、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体に、配列番号２６−２９および３２−３８、および４１−４３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む有効量の宿主細胞と、治療有効量の免疫抑制成分の阻害剤、例えば、免疫チェックポイント阻害剤とを投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｔｉｍ−３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＣＤ２４４の阻害剤、またはその任意の組み合わせである。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ−１に特異的な抗体、例えば、ピジリズマブ、ニボルマブ、もしくはペムブロリズマブなど；（ｂ）ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体、例えば、ＭＤＸ−１１０５、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、もしくはＭＳＢ００１０７１８Ｃなど；または（ｃ）ＣＴＬＡ４に特異的な抗体、例えば、トレメリムマブもしくはイピリムマブなどから選択される。
【０１８４】
さらなる実施形態では、本開示は、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を処置する方法であって、ＣＤ２０発現に関連する疾患または障害を有するまたは有する疑いがある被験体に、配列番号２６〜２９、３２〜３８、および４１〜４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする異種核酸分子を含む有効量の宿主細胞と、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤とを投与するステップを含み、任意選択で、免疫チェックポイント阻害剤は、（ａ）ＰＤ−１に特異的な抗体、例えば、ピジリズマブ、ニボルマブ、もしくはペムブロリズマブなど；（ｂ）ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体、例えば、ＭＤＸ−１１０５、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、またはＭＳＢ００１０７１８Ｃなど；または（ｃ）ＣＴＬＡ４に特異的な抗体、例えば、トレメリムマブもしくはイピリムマブなどから選択される、方法を提供する。
【０１８５】
例示的な化学療法剤は、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ブスルファン、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード、例えば、ベンダムスチン、ウラムスチン（ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、テモゾロミド）、代謝拮抗薬（例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、メルカプトプリン、フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン（ｉｄａｒｕｉｃｉｎ）、ミトキサントロン、バルルビシン）、ブレオマイシン、マイトマイシン（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシン、ヒドロキシウレア、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド）、モノクローナル抗体（例えば、イピリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アベルマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、シクロホスファミド、プレドニゾン、ロイコボリン、オキサリプラチン、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒｏｄｉｎａｓｅ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、化学療法薬は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、コビメチニブ、スニチニブ、エルロチニブ、パクリタキセル、ドセタキセル、またはそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、患者を、まず、他の免疫細胞を阻害または破壊する化学療法剤を用いて処置し、その後、本明細書に記載の医薬組成物を用いて処置する。一部の場合では、化学療法を完全に回避することができる。
【０１８６】
本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、本開示の方法を、ＣＤ２０特異的結合分子を用いて前処置された被験体に適用し、ここで、任意選択で、ＣＤ２０特異的結合分子は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、もしくはそれらの任意の組み合わせ；または化学療法薬（例えば、ＣＨＯＰ［シクロホスファミド−ヒドロキシダウノルビシン−オンコビン−プレドニゾン］、ＣＨＯＰ−Ｒ［Ｒはリツキシマブである］、もしくは、ＣＨＯＥＰもしくはＣＨＯＥＰ−Ｒ［Ｅはエトポシドである］レジメン）；または免疫抑制成分の阻害剤（例えば、ＰＤ−１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＣＴＬＡ４に対する抗体など）である。
【０１８７】
本開示のある特定の化合物（例えば抗体、化学療法剤もしくは免疫修飾物質）、またはそれらの薬学的に許容される塩の、純粋な形態でまたは適切な医薬組成物としての投与は、同様の有用性がある薬剤についての任意の投与形式を使用して行うことができる。本開示の医薬組成物は、本開示の化合物を適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせることによって調製することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態の調製物に製剤化することができる。そのような医薬組成物を投与する例示的な経路は、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、膣、および鼻腔内を含む。
【０１８８】
「非経口的な」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射または注入技法を含む。本開示の医薬組成物（例えば、化学療法剤または免疫修飾物質）は、その中に含有される活性成分が、組成物が患者に投与された際に生物学的に利用可能なものであることが可能になるように製剤化される。被験体または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投与単位の形態をとり、例えば、錠剤が単一の投与単位であってよく、また、エアロゾル形態の本開示の化合物の容器に複数の投与単位を保持することができる。そのような剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者には明らかになろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年を参照されたい）。投与される組成物は、いずれにしても、本開示の教示に従った治療方法のための、治療有効量の本開示の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する。
【０１８９】
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を散剤、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム、ウェーハなどの形態に製剤化することができる。例示的な固体組成物は、１つまたは複数の不活性な希釈剤または食用担体を含有し得る。さらに、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトースもしくはデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味剤などの矯味矯臭剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；または着色剤を含めた１つまたは複数の添加剤が存在し得る。医薬組成物がゼラチンカプセルなどのカプセル剤の形態である場合、上記の型の材料に加えて、ポリエチレングリコールまたは油またはこれらの組み合わせなどの液体担体を含有し得る。
【０１９０】
医薬組成物は、エリキシル剤、シロップ剤、溶液、エマルション、または懸濁物などの液体の形態であり得る。ある特定の実施形態では、液体組成物は、２つの例として、経口投与用にまたは注射による送達用に製剤化することができる。経口投与が意図されている場合、例示的な組成物は、１つまたは複数の本開示の化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、染料／着色剤、香味増強剤（ｆｌａｖｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含有し得る。注射による投与が意図されている例示的な組成物は、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝液、安定剤、等張化剤、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含有し得る。
【０１９１】
本開示の液体医薬組成物は、溶液、懸濁物または他の同様の形態のいずれであるかにかかわらず、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒もしくは懸濁媒としての機能を果たし得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの、張度を調整するための薬剤を含めたアジュバントをさらに含み得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入することができる。生理食塩水が好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、無菌であることが好ましい。
【０１９２】
本開示の医薬組成物は、局所的投与が意図され得、その場合、担体は、適切な溶液、エマルション、軟膏剤、ゲル基剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。基剤は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、みつろう、鉱油、水およびアルコールなどの希釈剤、乳化剤、安定剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。局所的投与用の本開示の医薬組成物には増粘剤が存在し得る。経皮投与が意図されている場合、組成物は、経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含み得る。
【０１９３】
本開示の医薬組成物は、例えば、直腸内で融解し、活性化合物（複数可）を放出する坐薬の形態で、直腸投与が意図され得る。直腸投与用の組成物は、適切な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有し得る。例示的な基剤は、ラノリン、カカオバター、ポリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９４】
本開示の医薬組成物は、固体または液体の投与単位の物理的形態を改変する様々な材料を含み得る。例えば、組成物は、活性成分（複数可）の周囲に被覆殻を形成する材料を含み得る。被覆殻を形成するための例示的な材料は、糖、シェラック、または他の腸溶コーティング剤などの不活性なものであり得る。あるいは、活性成分（複数可）をゼラチンカプセルで包むことができる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本開示の化合物および組成物は、固体または液体の形態であり得る。例示的な固体または液体製剤は、半固体、半液体（ｓｅｍｉ  ｌｉｑｕｉｄ）、懸濁物、およびゲルの形態を含む。固体または液体の形態の本開示の医薬組成物は、本開示の化合物に結合し、それにより、化合物の送達を補助する薬剤をさらに含み得る。この能力で作用し得る適切な薬剤は、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、タンパク質、またはリポソームを含む。
【０１９６】
本開示の医薬組成物は、エアロゾルとして投与することができる投与単位からなり得る。エアロゾルという用語は、コロイド性の系から加圧パッケージからなる系までにわたる様々な系を示すために使用される。送達は、液化もしくは圧縮ガスによるものまたは活性成分を分配する適切なポンプ系によるものであり得る。活性成分（複数可）を送達するために、本開示の化合物のエアロゾルを一相、二相、または三相系で送達することができる。エアロゾルの送達は、必要な容器、活性化因子、弁、サブ容器などを含み、これらはまとめてキットを形成することができる。
【０１９７】
本開示の医薬組成物は、製薬技術分野において周知の方法体系によって調製することができる。例えば、注射による投与が意図されている医薬組成物は、本開示の化合物を滅菌蒸留水と組み合わせて溶液を形成することによって調製することができる。均一な溶液または懸濁物の形成を容易にするために界面活性剤を添加することができる。界面活性剤は、本開示の化合物と非共有結合的に相互作用して、水性送達系中への化合物の溶解または均一な懸濁を容易にする化合物である。
【０１９８】
本開示の化合物またはそれらの薬学的に許容される塩は治療有効量で投与され、治療有効量は、使用される特定の化合物の活性；化合物の代謝安定性および作用の長さ；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事；投与の様式および時間；排出速度；薬物の組み合わせ；特定の障害または状態の重症度；ならびに療法を受ける被験体を含めた様々な因子に応じて変動する。本開示の製剤および方法に従った療法の投与後、試験被験体は、プラセボで処置されたまたは他の適切な対照被験体と比較して、処置される疾患または障害に関連する１つまたは複数の症状の約１０％から約９９％に至るまでの低減を示す。
【０１９９】
本開示の化合物またはその薬学的に許容される誘導体を１つまたは複数の他の治療剤の投与と同時に、その前に、またはその後に投与することもできる。そのような併用療法は、本開示の化合物および１つまたは複数の追加的な活性薬剤を含有する単一の医薬投与製剤を投与すること、ならびに本開示の化合物および各活性薬剤を独自の別々の医薬投与製剤で投与することを含む。例えば、本開示の化合物および他の活性薬剤は、錠剤またはカプセル剤などの単一の経口投与組成物にまとめて患者に投与することもでき、各薬剤を別々の経口投与製剤で投与することもできる。別々の投与製剤を使用する場合、本開示の化合物および１つまたは複数の追加的な活性薬剤は、基本的に同じ時、すなわち並行して投与することもでき、別々にずらした時に、すなわち逐次的に投与することもできる；併用療法は、これらのレジメンの全てを包含するものと理解される。
【０２００】
本明細書に記載のプロセスにおいて、中間体化合物の官能基を適切な保護基によって保護する必要がある場合があることも当業者には理解されよう。そのような官能基は、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、およびカルボン酸を含む。ヒドロキシに対する適切な保護基は、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどを含む。アミノ、アミジノおよびグアニジノに対する適切な保護基は、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどを含む。メルカプトに対する適切な保護基は、Ｃ（Ｏ）Ｒ’’（式中、Ｒ’’はアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、ｐメトキシベンジル、トリチルなどを含む。カルボン酸に対する適切な保護基は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルエステルを含む。保護基は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている標準の技法に従って付加または除去することができる。保護基の使用は、Ｇｒｅｅｎ，  Ｔ．Ｗ．およびＰ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｚ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９年）、第３版、Ｗｉｌｅｙに詳細に記載されている。当業者には理解されるとおり、保護基は、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂または２−クロロトリチル−クロリド樹脂などのポリマー樹脂であってもよい。
【０２０１】
本開示の化合物のそのような保護された誘導体はそれ自体では薬理活性を有さない場合があるが、哺乳動物に投与され、その後、体内で代謝されて薬理活性のある本開示の化合物を形成することができることも当業者には理解されよう。したがって、そのような誘導体は、「プロドラッグ」と記載することができる。ある特定の実施形態では、本開示の化合物はプロドラッグの形態である。
【０２０２】
さらに、遊離塩基または酸の形態で存在する本開示の化合物は全て、当業者に公知の方法によって適切な無機または有機塩基または酸で処理することによってそれらの薬学的に許容される塩に変換することができる。本開示の化合物の塩は、標準の技法によってそれらの遊離塩基または酸の形態に変換することができる。
【０２０３】
本開示による融合タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞の場合では、投与は、細胞の個々のアリコートを使用して実施することができる。ある特定の実施形態では、形質転換された宿主細胞はＴ細胞を含み、当該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはその両方を含み得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする異種核酸を含む。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、被験体への投与のためにＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞との１：１の比がもたらされるように分類する。細胞は、各被験体に対して指定の細胞用量でおよそ２０〜３０分にわたって静脈内に投与することができる。指定の細胞用量は、ベクターにおいて融合タンパク質と協調的に発現する形質導入マーカーの発現レベルによって決定することができる。例えば、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞を、切断されたＣＤ１９形質導入マーカーとＣＡＲを協調的に発現する１つまたは複数のベクターを使用して形質転換する。本開示の種々の実施形態における使用のための例示的なＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与レベルを以下の表１に記載する。
【表１】
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【０２０４】
ある特定の実施形態では、細胞は、被験体から標準の非動員白血球アフェレーシスによって得た自己末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）産物から製造される。免疫磁気選択を実施してＣＤ８＋細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤ８＋細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に濃縮し、各サブセットを別々に、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８常磁性ビーズで刺激し、その後、融合タンパク質および任意選択で例えばｔＣＤ１９形質導入マーカーなどの形質導入マーカーをコードするベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を用いて形質導入する。形質導入Ｔ細胞を拡大増殖し、次いでＣＤ２０を発現している標的細胞株で再刺激して成長をブーストし、さらにｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させ、次いで、製剤化して、注入のための指定の細胞用量を達成することができる。例えば、ある特定の実施形態では、本開示による抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ）は、以下を含む方法に従って製造することができる：
【０２０５】
１．白血球アフェレーシス産物または全血からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の画分からＣＤ４＋Ｔ細胞を濃縮する。
【０２０６】
２．ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮と並行して、残りの白血球アフェレーシス産物またはＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する。
【０２０７】
３．濃縮されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、別々の培養で、グルタミン、βメルカプトエタノール、およびウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＣＴＬ培地＋１０％ＦＢＳ）、５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２中、臨床グレードの抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされた常磁性ビーズ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）で刺激する。
【０２０８】
４．抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激後の１日目、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲレンチウイルスベクターを形質導入する。
【０２０９】
５．形質導入ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＴＬ培地＋１０％ＦＢＳおよび５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２中で拡大増殖させる。
【０２１０】
６．ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後の４日目、磁気枯渇によって抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを２回除去する。
【０２１１】
７．抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後の７日目、照射された、臨床的に適格な形質転換ＣＤ２０＋Ｂ細胞株（ＴＭ−ＬＣＬ）で刺激する。このステップは、７日目のインプロセス細胞計数によりＴＭ−ＬＣＬ刺激なしでも十分な細胞拡大増殖が予測される場合には省略することができる。
【０２１２】
８．ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、ＣＴＬ培地＋１０％ＦＢＳおよび５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を伴うＧ−Ｒｅｘフラスコ中で拡大増殖させる。
【０２１３】
９．抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激後の１５日目（１３日目〜１７日目の範囲）に各サブセットの細胞を回収し、組み合わせたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞産物を凍結保存または注入用に製剤化する。
【０２１４】
１０．インプロセスおよび最終的なリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）試験のために製造手順中の適切な時点でＣＤ８＋Ｔ細およびＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれから試料を回収する。
【０２１５】
１１．患者に、ｔＣＤ１９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞とｔＣＤ１９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞との比１：１で、示されている用量で静脈内注入によって投与する。被験体は、リンパ球枯渇化学療法で前処置され、化学療法が完了してから少なくとも３６時間後にＴ細胞注入を受ける。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、被験体に対して生成された細胞は、製造のすぐ後に新鮮な細胞として供給することもでき、まず凍結保存し、液体窒素冷凍庫内で保管した後、解凍した細胞を洗浄して残留する凍結保護物質を除去し、その後、注入用に製剤化することもできる。細胞の総数は、解凍からの回収中の細胞の喪失を説明するため、および臨床プロトコールで指定されている細胞用量レベルを達成するために十分なものである。ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含むある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の総比率は、個々の被験体における個々のサブセットの形質導入の差異に起因して１：１とは異なる可能性がある。このような理由で、サブセットを別々に形質導入して形質導入Ｔ細胞の所望の製剤を達成することができる。ＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８  ＣＡＲ  Ｔ細胞により、動物モデルにおける相乗効果が実証されている（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０１５年）。
【０２１７】
形質転換された細胞を、速度制御冷凍庫内での凍結保存のために適切な凍結保存培地（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０（登録商標））に懸濁することができる。凍結保存された細胞を液体窒素冷凍庫の気相で保管することができる。次いで、新鮮なまたは解凍した細胞をＮｏｒｍｏｓｏｌ＋１％ＨＳＡに再懸濁させ、臨床プロトコールで指定されている総細胞用量レベルで移入用パックに移すことができる。製剤化された産物を２〜８℃で保管し、次いで、投与のために、適切な条件下で臨床の場に移動させることができる。
【０２１８】
白血球アフェレーシスの後、被験体は、形質転換された細胞が産生される間、疾患を制御するために細胞減少性化学療法を受けることができる。例えば、ある特定の実施形態では、被験体は、白血球アフェレーシス後に低強度の化学療法（例えば、レナリドマイド、イブルチニブ）を受けることができる。本開示による形質転換された細胞を投与する前に、移入Ｔ細胞の生存を容易にするため、および細胞の注入前の腫瘍負荷を低減するために、リンパ球枯渇をもたらすために化学療法または免疫調節療法が適切である場合がある。例えば、被験体は、リンパ球枯渇化学療法を細胞注入前の所定の時間（例えば、３６〜９６時間）にわたって受けることができる。ある特定の実施形態では、被験体は、最初にシクロホスファミド（ＣＹ）などの化学治療剤のｉ．ｖ．単回用量（例えば、１ｇ／ｍ２）の処置を受けることができる。しかし、被験体奏効率が不十分であると決定された場合、リンパ球枯渇レジメンを、その後に患者が第２のさらなる化学療法薬または免疫調節剤（例えば、ＣＹ＋フルダラビン）を受けるように変化させることができる。さらに、被験体は、細胞を投与する前に前投薬を受けることができるが、必ずしもそうである必要はない。
【０２１９】
本明細書に記載の細胞の１回または複数回の静脈内注入を、被験体に、リンパ球枯渇化学療法の完了後（例えば、３６〜９６時間後）に行うことができる。被験体に投与される細胞の用量は、表１に示されている用量レベルに従って決定することができ、その後、調整して、投与される細胞の量、組成、比、または速度を増大させる、低減させる、または他の点で変化させることができる。ある特定の実施形態では、被験体に単回注入を行う。さらなる実施形態では、第１の注入により完全奏効（ＣＲ）がもたらされなかった場合、またはＣＲ後に疾患が再発した場合には、第２の注入を行うことができる。さらに別の実施形態では、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、またはさらなる注入を行うことができる。ある特定の実施形態では、細胞注入は、非経口薬物についての内毒素限界（£５  ＥＵ／ｋｇ／時間）に関するガイドラインに従って必要に応じて調整された、選択された期間（例えば、およそ２０〜３０分）にわたって静脈内に行うことができる。被験体が軽度の注入に関連する有害事象（グレード２またはそれ未満）を経験した場合には注入速度を調整することもできる。
【実施例】
【０２２０】
（実施例１）
材料および方法
細胞株
Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、およびＲａｍｏｓ（バーキットリンパ腫）、Ｒｅｃ−１（マントル細胞リンパ腫）、ならびにＫ５６２（ＣＤ２０陰性赤白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ））腫瘍細胞株をＡＴＣＣから入手した。Ｇｒａｎｔａ−５１９（マントル細胞リンパ腫）をＤＳＭＺから入手し、ＦＬ−１８（形質転換された濾胞性リンパ腫）をＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｍａｌｏｎｅｙ（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手した。実験前にＣＤ２０発現をすべての細胞株に対してフローサイトメトリーによって立証した。細胞株を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％Ｌ−グルタミンを伴うＲＰＭＩ１６４０中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。Ｋ５６２細胞に、ＣＤ２０を発現させるためにレトロウイルスベクターを形質導入し、一部の細胞にはヒトＣＤ８０を発現させるために再度レンチウイルスベクターを形質導入した。限界希釈クローニング後に選択することによって低、中、および高ＣＤ２０発現Ｋ５６２−ＣＤ８０細胞株を得た。Ｒａｊｉ細胞にホタルルシフェラーゼ−Ｔｈｙ１．１−Ｎｅｏをコードするレトロウイルスを形質導入し、以前に記載されているとおりＧ４１８を用いて選択することによってＲａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞を作製した（Ｊａｍｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４巻（２７号）：５４５４〜６３頁）。以前に記載されているとおりリツキシマブ濃度を漸増させる繰り返しの断続的サイクルでリツキシマブ不応性Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞を生成した（Ｃｚｕｃｚｍａｎら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００８年；１４巻（５号）：１５６１〜７０頁）。
【０２２１】
フローサイトメトリー
Ｒａｍｏｓ細胞株を０μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌまでにわたる濃度のリツキシマブと共に室温で３０分インキュベートした。ＣＤ２０遮断後、抗ＣＤ２０−ＰＥ抗体（クローンＬ２７［Ｌｅｕ１６］、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、細胞を４℃または３７℃のいずれかで３０分インキュベートした。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％ウシ胎仔血清および２．５ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  ２フローサイトメーターで分析した。データを、ＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．１（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。別々の実験において、ＦＬ−１８細胞を様々な濃度のリツキシマブで遮断し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、次いで、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ抗体（クローン１Ｆ５、ハイブリドーマから所内で作製；Ｐｒｅｓｓら、Ｂｌｏｏｄ、１９８７年；６９巻（２号）：５８４〜９１頁）を添加し、遮断した細胞と共に４℃で１５分インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、上記のとおり分析した。リツキシマブの代わりにオファツムマブを使用した同様の実験も行った。
【０２２２】
ベクター構築物
ＣＤ２０特異的Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ−ｔＥＧＦＲ構築物（配列番号５７）を、Ｌｅｕ１６  ｓｃＦｖ（Ｗａｎｇら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００７年；１８巻（８号）：７１２〜２５頁；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００４年；９巻（４号）：５７７〜８６頁）をＰＣＲによって増幅し、ＩｇＧ４−Ｆｃ、ＣＤ２８、および４１ＢＢドメイン、およびＣＤ３ζドメインをコードするｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターのＮｈｅＩ部位およびＲｓｒＩＩ部位中にクローニングすることによって生成した（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２０１３年；１９巻（１２号）：３１５３〜６４頁）。Ｌｅｕ１６−２８−ｚ構築物（配列番号４９または５８）を、４１ＢＢドメインおよび切断されたＥＧＦＲを除去するためのＬｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ−ｔＥＧＦＲベクターのスプライスオーバーラップＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｅ  ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ）によって生成した。ＣＤ２０特異的１Ｆ５−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターは以前記載されているが（Ｂｕｄｄｅら、ＰＬｏＳ  ｏｎｅ、２０１３年；８巻（１２号）：ｅ８２７４２頁）、ＨＩＶ−１に基づくＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ＰＧＫ．ＧＦＰ．ｗｐｒｅ自己不活性化第３世代レンチウイルスベクター骨格（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０１０年；１７巻（１０号）：１２４４〜５２頁；Ｄｒ．Ｈａｎｓ−Ｐｅｔｅｒ  Ｋｉｅｍ、ＦＨＣＲＣより）に移入した。この構築物のＦｃスペーサー領域を、以前に記載されているとおり（Ｈｕｄｅｃｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４年；３巻（２号）：１２５〜３５頁；Ｈｏｍｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０１０年；１７巻（１０号）：１２０６〜１３頁）、ＩｇＧ１接合部アミノ酸をＩｇＧ２接合部アミノ酸（配列番号９）で置換し、Ｎ２９７Ｑ変異（配列番号１０）を付加することにより、Ｆｃγ受容体への結合が抑止されるように改変して、１Ｆ５−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ構築物（配列番号５０または５９）を作製した。１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ構築物（配列番号４４または５３）を生成するために、コドン最適化アルゴリズム（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して１．５．３完全ヒト抗ＣＤ２０抗体からＶＬ配列およびＶＨ配列を合成することによって新規のｓｃＦｖ配列を作製し（例えば、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ、２０１０年；２８巻（５号）：５６１〜７４頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３０４５８号を参照されたい）、１５アミノ酸グリシン−セリンリンカー（配列番号２０）によって分離し、ＧＭ−ＣＳＦシグナルペプチド（配列番号１８）を先行させた。スプライスオーバーラップＰＣＲにより生じた重複する断片を使用して１Ｆ５−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ構築物のｓｃＦｖドメインを置き換え、それをＡｇｅＩ／ＳａｃＩＩ制限部位にクローニングした。誘導性カスパーゼ９自殺遺伝子および下流の２Ａ配列（配列番号２２または２３）をスプライスオーバーラップＰＣＲによってこの構築物から除去した。１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ構築物（配列番号２７）を、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚからスプライスオー��ーラップＰＣＲによって４１ＢＢドメインを除去することによって生成した。全ての構築物をＳａｎｇｅｒ配列決定によって確認した。レンチウイルスは、記載の骨格ベクターならびにパッケージングベクターｐＣＧＨＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２、およびｐＣＭＶ−Ｇを一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用して作製し、パッケージングされたレンチウイルスを含有する上清を遠心分離によって１００倍に濃縮した。
【０２２３】
Ｔ細胞の単離および形質導入
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＦＨＣＲＣにおける治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された研究プロトコールの下で同意を得た健康なドナーからのアフェレーシスまたはＰｕｇｅｔ  Ｓｏｕｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒから購入した使用済みＰａｌｌ白血球フィルターからのいずれかで得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配培地を用いて遠心分離によって単離したＰＢＭＣにアンモニウム−塩化物−カリウム（ＡＣＫ）緩衝液を用いた赤血球溶解を行い、１０％ＤＭＳＯおよび９０％ＦＢＳ中で凍結保存した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験のために、Ｔ細胞を解凍されたＰＭＢＣからＰａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用したＭＡＣＳによる陰性選択を行った。細胞傷害実験のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞を健康なドナーアフェレーシスＰＢＭＣから抗ＣＤ８抗体をコーティングしたビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＭＡＣＳによって正に選択した後に凍結保存した。一部の実験については、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）を、凍結保存前に、健康なドナーアフェレーシスＰＢＭＣから、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ抗ＣＤ１４および抗ＣＤ４５ＲＡビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と共にインキュベートした後に、ＡｕｔｏＭＡＣＳデバイスを使用した陰性選択によって単離し、その後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ６２Ｌビーズを用いた陽性選択を行った。他の実験では、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞を抗ＣＤ４または抗ＣＤ８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して陽性免疫磁気選択によって濃縮した。選択されたＴ細胞を、αＣＤ３／αＣＤ２８ＡｂでコーティングしたヒトＴ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３：１のビーズ：Ｔ細胞比で用いて刺激した。翌日、活性化Ｔ細胞に、ＣＤ２０  ＣＡＲ構築物のうちの１つ（感染多重度２〜６）をコードするレンチウイルスベクターおよび４〜８μｇ／ｍｌのポリブレンをスピン形質導入（ｓｐｉｎ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅ）した（３２℃、２１００ｒｐｍで６０分）。形質導入Ｔ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１５（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を伴うまたは伴わない５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン２（ｒｈＩＬ−２）を含有する培地で培養し、刺激後４〜５日間インキュベートした後、αＣＤ３／αＣＤ２８ビーズを磁気により除去し、フローサイトメトリーによって分析してＣＡＲ発現を確認した。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を機能アッセイに使用した。
【０２２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏマウス実験のために、ＴＣＭまたはＣＤ４およびＣＤ８濃縮Ｔ細胞を解凍し、活性化し、翌日、濃縮した、各実験に示されている構築物をコードするレンチウイルスの上清を形質導入した。５日目にＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を５０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２中で拡大増殖し、７〜１０日目に照射ＣＤ２０＋ＬＣＬをレスポンダー：ステミュレーター比１：１で再刺激し、ＬＣＬを用いた再刺激の８〜１１日後にマウスに注射した。
【０２２５】
増殖およびサイトカイン分泌アッセイ
Ｔ細胞（総細胞２×１０５個）を５μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、次いで、８０００〜１００００ｃＧｙで照射を行った腫瘍標的株と１：１の比で共培養した。リツキシマブ遮断実験では、照射を受けた標的細胞を様々な濃度のリツキシマブと共に室温で３０分インキュベートした後にＴ細胞と共インキュベートした。プレーティングの２４時間後に上清を回収し、その後、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、およびＴＮＦ−αを定量するために以前に記載されている（Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２年；１１９巻（１７号）：３９４０〜５０頁）Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってサイトカイン分析を行うまで−２０℃で保管した。４〜５日後、細胞を抗ＣＤ３−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色し、増殖の尺度として、ＣＤ３でゲーティングしたリンパ球のＣＦＳＥ希釈物をフローサイトメトリーによって決定した。活性化の別の尺度として、細胞サイズを、前方散乱（ＦＳＣ−Ａ）パラメーターの幾何平均を使用したフローサイトメトリーによって決定し、休止状態のＴ細胞の細胞サイズを差し引いた。フローサイトメトリーのデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ７．６．１；Ｔｒｅｅｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して分析した。一部の実験では、リツキシマブの代わりにオファツムマブを使用した。
【０２２６】
ＩＦＮ−γの細胞内染色によってサイトカイン分泌の評価も決定した。ＣＤ２０  ＣＡＲ＋ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、照射を受けたＫ５６２またはＫ５６２−ＣＤ２０細胞と２４時間共培養した。細胞内染色のために、細胞を固定し、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて氷上で１５分にわたって透過処理した。次いで、細胞を、固定および透過処理後に抗ＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて氷上で１時間にわたって染色した。データをＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。データを分析するためにＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用した。
【０２２７】
細胞傷害アッセイ
以前に記載されているとおりＣＤ２０  ＣＡＲ  ＣＤ８＋Ｔ細胞を５１Ｃｒで標識した標的細胞株と４〜５時間共インキュベートすることによって標準の５１Ｃｒ放出アッセイを実施した（Ｗａｎｇら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、２００７年；１８巻：７１２〜７２５頁）を参照されたい。最大５１Ｃｒ放出を、５％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０で溶解された、標識された細胞の上清の５１Ｃｒ含有量を直接測定することによって決定した。上清を回収して９６ウエルＬｕｍａｐｌａｔｅに入れ、終夜風乾し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて計数をアッセイした。パーセント細胞傷害を方程式：［試料−Ｍｉｎａｖｇ］／［Ｍａｘａｖｇ−Ｍｉｎａｖｇ］＊１００によって算出した。
【０２２８】
リツキシマブ遮断実験に関しては、５１Ｃｒで標識した標的細胞株を様々なリツキシマブ濃度（０μｇ／ｍＬから２００μｇ／ｍＬまでにわたる）で３０分（１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および２００μｇ／ｍｌの最終濃度をもたらすために最初のインキュベーション時には２倍の最終濃度で）インキュベートした後、ＣＡＲ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。細胞を、２連で、Ｕ底９６ウエルプレートにおいて、熱により不活性化したＦＢＳを含有する培地中、５１Ｃｒで標識したリツキシマブで遮断した標的細胞と共に３７℃で５時間培養した。対照ウエルには、リツキシマブに誘導されるＣＤＣの可能性を排除するために、リツキシマブを含有する培地中、Ｔ細胞を伴わずにインキュベートした標的細胞を含有させた（図に「０：１」Ｅ：Ｔ比として示されている）。一部の実験では、リツキシマブの代わりにオファツムマブを使用した。
【０２２９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性に対するリツキシマブの影響のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
６〜１０週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ−／−［ＮＳＧ］）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）５〜１０匹の群に、リツキシマブ抵抗性Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃまたはＧｒａｎｔａ−５１９リンパ腫細胞５×１０５個を２〜７日間、尾静脈に接種した。２〜７日後（各実験に示されているとおり）、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｔＣＤ１９＋）または空ベクターＴ細胞１０７個を尾静脈に注射した。リツキシマブ遮断実験では、リツキシマブ２５μｇまたは２００μｇを腫瘍接種の５日後かつＣＡＲ  Ｔ細胞投与の１日前に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。腫瘍成長を決定するための生物発光画像化を、公知の方法を使用して実施した（Ｊａｍｅｓら、Ｂｌｏｏｄ、２００９年；１１４巻（２７号）：５４５４〜６３頁；Ｒｕｆｅｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．、２０１６年；４巻：５０９〜５１９頁を参照されたい）。画像の飽和を導くことなく最大感度を達成するためにビニングおよび露出を調整した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアを用い、カプラン・マイヤー方法を使用して生存曲線を生成した。
【０２３０】
養子移入Ｔ細胞の持続性を試験するために、様々な時点で後眼窩出血によって回収した全血をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）によって溶解させた。腫瘍接種後６日目および１３日目に後眼窩叢からの凝血した血液検体を遠心分離することによってマウス血清を得、以前に記載されているとおりＥＬＩＳＡアッセイを使用して血清リツキシマブレベルを測定してリツキシマブ濃度を決定した（Ｇｏｐａｌ  ＡＫら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年；１１２巻（３号）：８３０〜５頁；Ｍａｌｏｎｅｙ  ＤＧら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年；９０巻（６号）：２１８８〜９５頁を参照されたい）。単離された細胞のＦｃ受容体を静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）で遮断し、細胞をｍＣＤ４５に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（３０−Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｈＣＤ３に対するモノクローナル抗体（ＨＴＴ３ａ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびｈＣＤ１９に対するモノクローナル抗体（ＨＩＢ１９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  ２を用いてデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。マウス試験は、ＦＨＣＲＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【０２３１】
患者血清試料
ヒト血清試料は、Ｂ細胞リンパ腫患者から、Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉに従ってＩＲＢの認可およびインフォームドコンセントを得た後に提供された。リツキシマブを含有するサルベージ化学免疫療法後４カ月以内に血清試料を回収した。血清リツキシマブ濃度を以前公開されたとおり決定した（Ｍａｌｏｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７年；９０巻（６号）：２１８８〜９５頁）。
【０２３２】
（実施例２）
抗ＣＤ２０  ｓｃＦｖを含有するＣＡＲによるＣＤ２０への結合に対するリツキシマブの影響
それぞれＣＤ２０分子の大きな細胞外ループ上のエピトープに結合する２つの異なるマウスモノクローナル抗体、Ｌｅｕ１６抗体（Ｌ２７；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年；１１２巻（６号）：２２６１〜７１頁；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、２０１２年；１１９巻（１７号）：３９４０〜５０頁を参照されたい）または１Ｆ５抗体（Ｗａｎｇ  Ｊら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００７年；１８巻（８号）：７１２〜２５頁；Ｂｕｄｄｅら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１３年；８巻（１２号）：ｅ８２７４２頁を参照されたい）のいずれかに由来するｓｃＦｖを使用した、ＣＤ２０を対象とするＣＡＲは以前に試験されている（Ｐｏｌｙａｋら、Ｂｌｏｏｄ、２００２年；９９巻（９号）：３２５６〜６２頁を参照されたい）。これらのＣＤ２０エピトープはリツキシマブエピトープと重複し（Ｐｏｌｙａｋら、Ｂｌｏｏｄ、２００２年；９９巻（９号）：３２５６〜６２頁を参照されたい）、したがって、リツキシマブはこれらのＣＡＲの結合を遮断すると予測される。フローサイトメトリーを使用して、様々な濃度のリツキシマブの、Ｒａｍｏｓリンパ腫細胞上に発現するＣＤ２０へのＬｅｕ１６抗ＣＤ２０抗体の結合を遮断する能力を、これらの細胞を、Ｌｅｕ１６  Ａｂと共にインキュベートする前にリツキシマブと共にプレインキュベートすることによって評価した。ＣＤ２０の用量依存的遮断が観察され、４℃、５０μｇ／ｍｌのリツキシマブでほぼ完全な遮断が観察された。しかし、抗ＣＤ２０−ＰＥ（Ｌｅｕ１６）を生理的に関連する温度の３７℃でインキュベートした場合、２００μｇ／ｍｌのリツキシマブであっても低レベルのＣＤ２０結合が生じた（図２Ａ〜２Ｆ）。ＦＬ−１８細胞に対して１Ｆ５抗ＣＤ２０抗体を使用した実験において同様の所見が観察された（データは示していない）。したがって、リツキシマブは、本開示の抗ＣＤ２０  ＣＡＲと重複するエピトープに結合し、ＣＤ２０＋標的細胞に対するＣＡＲ  Ｔ細胞活性に干渉する潜在性を有する。
【０２３３】
（実施例３）
ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能に対するリツキシマブの影響
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能に対するリツキシマブによるＣＤ２０遮断の影響を、５種の異なるＣＤ２０  ＣＡＲレンチウイルス構築物を使用して、様々なＣＤ２０＋Ｂ細胞ＮＨＬ細胞株と共にインキュベートした後に増殖、サイトカイン分泌、および細胞傷害を測定することによって評価した。ＣＡＲ構築物（図１Ａおよび１Ｂ）は、第３世代Ｌｅｕ１６−２８−ＢＢ−ｚ−ｔＥＧＦＲおよび１Ｆ５−２８−ＢＢｚ構築物（Ｂｕｄｄｅら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１３年；８巻（１２号）：ｅ８２７４２頁を参照されたい）、第２世代Ｌｅｕ１６−２８−ｚ構築物、ならびに完全ヒト１．５．３抗ＣＤ２０  Ａｂ（リツキシマブと重複するエピトープにも結合する）に由来する２種のＣＤ２０  ＣＡＲ（１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚおよび１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ）であった（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ、２０１０年；２８巻（５号）：５６１〜７４頁を参照されたい）。典型的に、Ｔ細胞の４０〜８０％でＣＡＲ発現が達成された（データは示していない）。
【０２３４】
ＣＦＳＥで標識したＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖は、様々なＮＨＬ標的細胞株（Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｒｅｃ−１、およびＦＬ−１８）と共にリツキシマブの存在下で培養した場合、大きくは損なわれなかった。最大２００μｇ／ｍｌの濃度のリツキシマブの存在下で標的細胞により刺激したＣＡＲ  Ｔ細胞は、リツキシマブの非存在下での刺激後に観察された増殖の＞９６％を示した（図３Ａ）。Ｔ細胞活性化の別の尺度は細胞サイズである（Ｇｒｕｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００４年；２１巻（１号）：１９〜３０頁を参照されたい）。ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、細胞サイズの推定として前方散乱についてフローサイトメトリーによって分析し、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、リツキシマブと共にプレインキュベートしたＲａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、またはＲｅｃ−１腫瘍細胞による刺激後に、リツキシマブに曝露していない対照細胞のサイズの＞８５％のサイズ中央値を示したことが見出された（図３Ａ）。ＦＬ−１８細胞と共にインキュベートしたＴ細胞は、リツキシマブと共にインキュベートした後、わずかにより明白であるが、それでもなお中程度の細胞サイズの縮小を示した（２００μｇ／ｍｌで対照細胞サイズの７３％）。
【０２３５】
増殖とは対照的に、ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌は漸増リツキシマブレベルの存在下で減少することが見出された（図３Ｂ）。しかし、１００μｇ／ｍｌのリツキシマブであってさえ、サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αの産生はそれぞれベースラインレベルの３４〜５１％、７０〜９２％、および７９〜１０８％であった。標的としてＣＤ８０およびＣＤ２０を発現するように遺伝子改変されたＫ５６２細胞を使用し、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞活性の抗原特異性を実証するための対照としてＣＤ２０陰性Ｋ５６２−ＣＤ８０細胞を用いて、同様の所見が観察された（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０２３６】
様々なＣＤ２０＋ＮＨＬ標的細胞株に対するＣＡＲ＋Ｔ細胞の細胞溶解活性に対するリツキシマブの影響も調査した。ＣＡＲ＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクターとして用い、Ｒａｊｉ、ＦＬ−１８、Ｇｒａｎｔａ、またはＲｅｃ−１を標的として用いた標準の５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、試験した全ての標的細胞株に対して、細胞傷害は、最大５０μｇ／ｍｌのリツキシマブ濃度で最小限でしか損なわれず（図４）、また、１００μｇ／ｍｌのリツキシマブ濃度でベースライン細胞溶解活性の＞６５％が保持されたことが見出された。
【０２３７】
完全ヒト１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能性をリツキシマブの存在下で試験した。Ｌｅｕ１６  ＣＡＲおよび１Ｆ５  ＣＡＲと同様に、リツキシマブで前処理した標的細胞に対するサイトカイン分泌および細胞傷害の中程度の用量依存的低減が観察されたが、増殖では観察されなかった。
【０２３８】
（実施例４）
抗ＣＤ２０に対するＣＡＲ  Ｔ細胞感受性に対するＣＤ２０の発現レベルの影響
腫瘍細胞上のＣＤ２０発現のレベルがリツキシマブ遮断に対する感受性に影響を及ぼし得るかどうかを調査するために、限界希釈クローニング後に低、中、および高ＣＤ２０発現レベルを有するＫ５６２−ＣＤ８０細胞株（図１０）を試験のために選択した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞機能を様々な濃度のリツキシマブの存在下で再度評価した。ＮＨＬ細胞株と同様に、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖は、標的細胞上のＣＤ２０の発現レベルにかかわらず完全にインタクトであった（図５Ａ）。細胞サイズは、ＣＤ２０ｈｉｇｈ細胞を標的として使用した場合には縮小しなかったが、より低いレベルのＣＤ２０を発現する細胞に関しては細胞サイズの中程度の縮小が見出された。増殖および細胞サイズとは対照的に、サイトカイン分泌は、ＣＤ２０ｌｏｗ標的細胞で刺激すると有意に損なわれ、１００〜２００μｇ／ｍｌのリツキシマブでＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−αレベルはそれぞれベースライン値の５％、１７％、および２２％の低さであったが（図５Ｂ；図１１Ａ〜１１Ｅ）、ＣＤ２０ｈｉｇｈ標的で刺激したＴ細胞では、１００μｇ／ｍｌのリツキシマブ濃度でベースライン活性の＞７５％が保持された。
【０２３９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞細胞溶解活性のリツキシマブにより媒介される阻害に対するＣＤ２０抗原密度の影響が図５Ｃに示されている。高レベルのＣＤ２０を発現する標的細胞のＴ細胞による殺滅へのリツキシマブの影響は、低Ｅ：Ｔ比であっても、最小であった。しかし、ＣＤ２０ｌｏｗおよびＣＤ２０ｍｅｄｉｕｍＫ５６２−ＣＤ８０標的に対してはＴ細胞細胞傷害が用量依存的に低減し、これは、より低いエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で最も明白であった。ＣＤ２０ｌｏｗ標的に対する細胞溶解活性は、２００μｇ／ｍｌのリツキシマブにおける５０：１のＥ：Ｔ比でベースラインの４７％に保持されたが、２：１のＥ：Ｔ比ではベースラインのたった１６％であった。
【０２４０】
（実施例５）
残留するリツキシマブの存在下でのＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、中程度のレベルのリツキシマブが存在するにもかかわらず、ＣＤ２０＋腫瘍に対する有意な機能性を保持することが示された。これらの知見がどのようにｉｎ  ｖｉｖｏの状況に転換されるかを評価するために、マウスリンパ腫モデルにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞活性に対する残留するリツキシマブの影響を調査した。
【０２４１】
背景として、リツキシマブは、単一の薬剤として、免疫無防備状態のマウス異種移植モデルにおけるＲａｊｉ細胞に対する有意な抗腫瘍活性を有する（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｉｌｉｚａｌｉｔｕｒｒｉ  ＦＪら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００３年；９巻（１６号、第１部）：５８６６〜７３頁を参照されたい）。併用療法実験におけるリツキシマブ由来の潜在的な交絡治療効果を克服するために、以前に記載された方法を使用してリツキシマブ不応性Ｒａｊｉ細胞株（ＲＲ−Ｒａｊｉ）を生成し（Ｃｚｕｃｚｍａｎ  ＭＳら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２００８年；１４巻（５号）：１５６１〜７０頁を参照されたい）、この細胞株においてＣＤ２０発現が保持されることが見出された（図１２）。
【０２４２】
ＮＳＧマウスにＲＲ−Ｒａｊｉ細胞をｉ．ｖ．接種し、一部の群を、接種の５日後に腫瘍が確立したら高用量または低用量リツキシマブで処置し、次いで、翌日にＣＤ２０  ＣＡＲ＋Ｔ細胞をｉ．ｖ．投与した（図７Ａ）。リツキシマブを単独で受けたマウスでは、中程度の一過性の抗腫瘍効果が実証されたが、全てが２４日目までに腫瘍進行のため死亡し、一方、ＣＡＲ  Ｔ細胞単独で処置したマウスでは有意に腫瘍が退縮し、マウスの４０％において腫瘍が根絶され、生存期間中央値が倍加した（５２日間）。Ｔ細胞注入の前日にリツキシマブを受けたマウスでは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞活性はＣＡＲ  Ｔ細胞を単独で受けたマウスと比較して損なわれなかった；２５μｇ／ｍｌのリツキシマブ群では１匹を除いて全てのマウス、および２００μｇ／ｍｌのリツキシマブ群では全てのマウスで腫瘍の根絶が実証された（図７Ｂおよび７Ｃ；図１３Ａおよび１３Ｂ）。
【０２４３】
生理的に関連する血清中レベルのリツキシマブの存在下で生じるこれらの腫瘍の寛解を確認するために、リツキシマブで処置したマウスから、Ｔ細胞注入日および１週間後に血清を回収し、血清リツキシマブレベルを測定した。２００μｇ／ｍｌのリツキシマブを受けたマウスでは、最初の血清リツキシマブ濃度中央値が１３８．５μｇ／ｍｌ（５４．５〜１７３．６の範囲）であり、１週間後には３９．７μｇ／ｍｌ（１．６〜５１．９の範囲）であり、２５μｇ／ｍｌのリツキシマブを受けたマウスの濃度中央値はベースラインでは１１．７μｇ／ｍｌ（２．８〜１７．８にわたる）であり、Ｔ細胞注入の１週間後には０μｇ／ｍｌであった（図７Ｄ）。
【０２４４】
さらに、腫瘍注射の２８日後に循環ＣＡＲ  Ｔ細胞レベルをフローサイトメトリーによって定量した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を単独で受けたマウスとリツキシマブおよびＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスとの間でＣＡＲ  Ｔ細胞レベルに有意な差異はなく、これにより、リツキシマブの存在によりＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性は損なわれなかったことが示される（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
【０２４５】
（実施例６）
サルベージリツキシマブ含有レジメンで処置された患者の血清リツキシマブ濃度
上記の結果を臨床の状況に置くために、意図された患者集団における残留する血清リツキシマブレベルの臨床的に意義のある範囲を、調査プロトコールで自己幹細胞移植を受け、移植前の血清リツキシマブ測定値が入手可能であるＢ細胞ＮＨＬ患者のデータベースにおいて照会した（Ｇｏｐａｌら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年；１１２巻（３号）：８３０〜５頁を参照されたい）。血清採血の４カ月以内にリツキシマブを含有する化学療法レジメンを受けた患者合計１０３名（０．５〜３．８カ月の範囲、中央値１．８）を同定し、これらの患者におけるリツキシマブ濃度中央値は、３８．３μｇ／ｍｌであり、四分位数間範囲は１９．１〜７１．７μｇ／ｍｌであった（図７Ｅ）。リツキシマブ濃度は、患者の８６％において１００μｇ／ｍｌまたはそれ未満であった。
【０２４６】
（実施例７）
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対するオファツムマブの影響
抗ＣＤ２０抗体のＣＡＲ機能に対する効果に対するエピトープ位置の重要性を決定するために、ＣＤ２０のより小さな細胞外ループならびに大きなループの異なる領域を伴うリツキシマブとは別個のエピトープに結合する抗ＣＤ２０抗体であるオファツムマブを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを繰り返した（Ｄｕら、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年；４６巻（１１〜１２号）：２４１９〜２３頁；Ｔｅｅｌｉｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００６年；１７７巻（１号）：３６２〜７１頁を参照されたい）。まず、Ｌｅｕ１６抗ＣＤ２０抗体の結合を遮断するオファツムマブの能力をフローサイトメトリーによって評価し、それにより、異なるエピトープにもかかわらず、第２の抗体の結合がオファツムマブによって顕著に遮断されたことが示された。さらに、リツキシマブよりも低濃度であっても結合が遮断された（図２Ｄ〜Ｆ）。次いで、様々な濃度のオファツムマブと共にプレインキュベートしたＲｅｃ−１およびＲａｊｉ−ｆｆＬｕｃリンパ腫細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを実施した（図８Ａ〜８Ｃ）。結果は、増殖および細胞サイズは最小の影響を受けたが、サイトカイン産生はより強い影響を用量依存的に受けたという点で、リツキシマブを用いたアッセイと同様であった。リツキシマブと比較して、細胞傷害はオファツムマブの存在下でさらに顕著に損なわれた。これらの所見から、抗ＣＤ２０抗体の阻害効果が立体的阻害に起因し、ＣＡＲ結合エピトープの直接遮断に起因するものではないことが示された。したがって、オファツムマブのより強力な阻害効果は、リツキシマブと比較して解離速度がより遅いことに起因するものであった。これは、以前報告された（Ｔｅｅｌｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ、２００４年；１０４巻（６号）：１７９３〜８００頁を参照されたい）データと一致してオファツムマブのはるかに低い解離が確認された４℃または３７℃での競合的な細胞結合フローサイトメトリー試験により裏付けられた（図２Ｄ〜Ｆ）。
【０２４７】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける様々なＣＡＲ構築物によるサイトカインの分泌
セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖させた。１４日目に、細胞を、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞（図１５Ａおよび図１５Ｃ）、Ｇｒａｎｔａ−５１９細胞（図１５Ｂ）、およびＪｅｋｏ細胞（図１５Ｄ）のいずれかで再刺激した。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、陽性対照として提供される。２４時間後に上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってインターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−２、および腫瘍壊死因子−αレベルについて分析した。
【０２４８】
（実施例９）
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるサイトカインの分泌
１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚレンチウイルスベクターで形質導入し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて拡大増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、照射Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃＣＤ２０＋リンパ腫細胞で再刺激した。２４時間後に細胞の上清中の示されているサイトカインの分泌をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによって測定した。（図１６Ａ）。凍結保存したＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を解凍し、Ｋ５６２細胞またはＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞で再刺激し、２４時間の時点で細胞内染色によってＩＦＮ−γについてフローサイトメトリーによって分析した。（図１６Ｂ）。
【０２４９】
（実施例１０）
様々なＣＡＲ構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害
セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖させた。１４日目に、細胞を、（図１７Ａおよび１７Ｂ）Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ細胞、および（図１７Ｂ）Ｊｅｋｏ細胞を標的として使用した標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおけるエフェクターとして使用した。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、陽性対照として提供される。各ＣＡＲ  Ｔ細胞集団の特異的な標的細胞溶解が示されている。
【０２５０】
（実施例１１）
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖
ＣＤ８＋Ｔ細胞を１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚレンチウイルスベクターで形質導入し（または模擬形質導入し）、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させ、次いで、凍結保存した。次いで、細胞を解凍し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色し、照射ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃリンパ腫細胞、Ｋ５６２細胞、またはＣＤ２０を発現するＫ５６２細胞で再刺激した。４日後に細胞をフローサイトメトリーによって分析した。（図１８Ａ）ＣＡＲ＋細胞（ＣＤ３＋／ｔＣＤ１９＋についてゲーティングした）のＣＦＳＥ希釈物が示されている。破線のヒストグラムは、培養培地のみにおけるＴ細胞のＣＦＳＥ蛍光を示し、実線のヒストグラムは、標的細胞と共インキュベートしたＴ細胞である。（図１８Ｂ）各群について、分裂した細胞の百分率が示されている。
【０２５１】
（実施例１２）
様々なＣＡＲ構築物のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
セントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを用いて刺激し、２４時間後に、示されているＣＡＲ構築物をコードするレンチウイルスベクターで形質導入し、ｉｎ  ｖｉｖｏで拡大増殖させた。「１９−ＢＢ−ｚ」構築物は、本発明者らのセンターで臨床試験において使用される臨床グレードのＣＤ１９標的化ＣＡＲであり、ベンチマーク対照として提供される。ＮＳＧマウスにＲａｊｉ−ｆｆＬｕｃ腫瘍細胞をｉ．ｖ．注射し、続いて、２日後に、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚ  ＣＡＲ、１．５．３−ＮＱ−２８−ｚ  ＣＡＲ、ＪＣＡＲ−０１４（抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ζ）、または空ベクターで形質導入した、拡大増殖させたセントラルメモリー（ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞をｉ．ｖ．注射した。（図１９Ａ）生物発光画像化によって評価される経時的な腫瘍負荷；および（図１９Ｂ）全生存のカプラン・マイヤープロット。
【０２５２】
（実施例１３）
マントル細胞リンパ腫に対するＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
ＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢｚ  ＣＡＲで形質導入し、７日前にＧｒａｎｔａ−ｆｆＬｕｃマントル細胞リンパ腫細胞を尾静脈に接種したＮＳＧマウスを処置するために使用した。全生存のカプラン・マイヤープロットが図２０に示されている。
【０２５３】
（実施例１４）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性および関連する生理学的効果
Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ播種性腫瘍を担持するＮＳＧマウスにおけるＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞または空ベクターｔＣＤ１９発現Ｔ細胞のいずれかの注入後の逐次的な時点で後眼窩血液試料を得た。各時点でｔＣＤ１９形質導入マーカーを発現するＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞をフローサイトメトリーによってヒトＣＤ３＋／マウスＣＤ４５陰性／ヒトＣＤ１９＋細胞として定量した。（図２１Ａ）注入後の３つの時点でのｔＣＤ１９＋Ｔ細胞が血液中の総有核細胞の百分率として示されている（ＣＡＲ  Ｔ細胞群において最初ｎ＝９）。空ベクターマウスからの切断されたＣＤ１９＋細胞が参照として示されている。（図２１Ｂ）別々の実験において、各群（空ベクター  対  ＣＡＲ  Ｔ細胞）における２匹のマウス由来のｔＣＤ１９＋細胞が毎週の測定値とともに縦方向に示されている。
【０２５４】
さらに、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスを毒性の徴候について、体重、全般的な挙動および外観、身体活動、姿勢、毛づくろいの癖、皮膚色、下痢の存在、眼、口、もしくは皮膚の炎症の徴候、嗜眠、または重症の貧血の徴候（青白い耳介もしくは足もしくは粘膜）に基づいてモニターした。ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた１１回の実験にわたって、いずれのマウスにおいてもＴ細胞に関連する毒性の徴候は観察されなかったが、例外として、後の時点で一部のマウスに異種移植片対宿主病の所見が生じた。この所見は、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスならびに空ベクター細胞を受けたマウスのどちらにおいても生じ、したがって、ＣＡＲベクターに関連するものではなく、異種Ｔ細胞移入の公知の結果である。各実験において、各マウスの体重を１週間当たり少なくとも３回記録し、これは、生涯の最後の数日間に体重減少が生じた末期腫瘍進行を経験したマウス以外は概して安定であった（データは示していない）。
【０２５５】
最後に、２回の実験においてマウスのサブセットから血液試料を取得して動物の生理機能を決定した。第１の実験では、Ｇｒａｎｔａマントル細胞リンパ腫腫瘍を担持するマウスを形質導入されていないＴ細胞、ＣＤ２０＋ＴＭ−ＬＣＬ細胞で再刺激されていないＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞、またはＴＭ−ＬＣＬ細胞で再刺激されたＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを用いて処置した（新鮮に注入するか、または、まず凍結保存し、次いで解凍し注入した）。処置したマウスの後眼窩血液試料における血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニンを使用して腎機能を測定し、アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）を使用して肝機能を測定し、白血球数（ＷＢＣ）、ヘモグロビン、および血小板数によって骨髄機能を測定した（データは示していない）。無処置のマウスと比較して、ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスにおいてＢＵＮもしくはクレアチニンの増加も肝機能の有意な変化も見られなかった。ＴＭ−ＬＣＬ細胞で再刺激していないＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスでは、無処置のマウスと比較してＷＢＣが降下したが、これは、ＴＭ−ＬＣＬで再刺激したＴ細胞で処置したマウスでは観察されなかった。ＴＭ−ＬＣＬで再刺激したＣＡＲ  Ｔ細胞で処置したマウスではヘマトクリットのわずかな降下が観察されたがヘモグロビンでは観察されなかったが、これは、再刺激されていないＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスにおいては見られなかった。血小板数は、再刺激されていないＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスでは増加したが、再刺激されたＣＡＲ  Ｔ細胞を受けたマウスでは有意な変化は見られなかった。
【０２５６】
第２の実験では、Ｒａｊｉ−ｆｆＬｕｃ腫瘍を担持するマウスを低用量（マウス当たりＣＡＲ＋細胞１×１０６個）または高用量（マウス当たりＣＡＲ＋細胞５×１０６個）のいずれかを用いて処置し、腎機能および肝機能を評価した。Ｔ細胞を受けたマウスではＢＵＮがより高い傾向が見られたが、血清クレアチニンに変化はなかった（データは示していない）。肝臓トランスアミナーゼの上昇は観察されなかった。
【０２５７】
（実施例１５）
抗ＣＤ２０  ＣＡＲ療法の臨床研究
ＣＤ２０特異的ＣＡＲ、１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ｚを発現するように形質導入した自己ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物を用いた養子Ｔ細胞療法の安全性および最大耐量（ＭＴＤ）を評価するために、Ｉ／ＩＩ相試験をデザインした。本研究においてＴ細胞に形質導入するために使用した、この構築物を保有する自己不活性化（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターは、ヒトＣＤ２０の大きな細胞外ループ内のエピトープを認識し、また、改変ヒトＩｇＧ１ヒンジ／スペーサー領域、ヒトＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、およびヒト４−１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと連結した１．５．３完全ヒトモノクローナル抗体由来のｓｃＦｖをコードする第３世代ＨＩＶ−１由来レンチウイルスである（図１Ａ）。ベクターはまた、ＣＡＲ  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで追跡することを容易にする自己切断性Ｅ２ＡエレメントによってＣＡＲカセットから分離された非機能性の切断された細胞表面ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）をコードする。ＣＤ１９の切断により、細胞内ドメインが１９アミノ酸に短縮され、リン酸化部位としての機能を果たす全てのチロシン残基が除去されるが、抗ＣＤ１９抗体によって認識される細胞外エピトープは保持される。例えば、持続性Ｂ細胞形成不全の場合では、ＣＡＲ  Ｔ細胞を排除するためにｔＣＤ１９をＣＤ１９標的化抗体または抗体−薬物コンジュゲートの標的として使用することもできる。
【０２５８】
抗ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ療法を調査した以前の試みにより、いくらかの成功が示されたが、トランスフェクション効率が低いこと（＜０．１％）により、抗生物質の選択および持続的なｅｘ  ｖｉｖｏ成長が必要になり、その結果、低ＣＡＲ発現およびＴ細胞消耗が生じた（例えば、Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１９巻（１７号）：３９４０〜３９５０頁、２０１２年；Ｔｉｌｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１２巻（６号）：２２６１〜２２７１頁、２００８年；Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５巻（２号）：１６０〜７５頁、２０１４年；ｄａ  Ｓｉｌｖａら、Ｂｌｏｏｄ  ＡＳＨ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：  抄録＃１８５１、２０１６年を参照されたい）。
【０２５９】
少なくとも１つの以前の療法レジメンへの応答後に再発したまたは以前の療法に不応性である、マントル細胞、濾胞性、リンパ形質細胞性、辺縁帯、形質転換した低悪性度Ｂ細胞リンパ腫（形質転換したＣＬＬを含む）、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含めたＢ細胞非ホジキンリンパ腫の被験体３０名が臨床試験に登録される。重大な適格性基準は、１８歳またはそれよりも上であること（任意の性別、人種、または民族性）；ＣＤ２０発現の証拠を伴う測定可能な疾患；女性参加者は妊娠中でも授乳中でもない可能性があること；臨床プロトコールにおいて定義される適切な肝機能、腎機能、肺機能、心機能、および血液機能；活動性の中枢神経系への転移または過去／現在の臨床的に意義のある中枢神経系の病理がないこと；全身免疫抑制療法を必要とするＨＩＶも、活動性の制御されていない感染も、活動性の自己免疫疾患もないこと。
【０２６０】
新規ＤＬＢＣＬの患者は、以下の基準のうちの１つを満たさなければならない：
・アントラサイクリンとリツキシマブまたは他の抗ＣＤ２０抗体の両方を含有する最先端のレジメン後に生検により診断された不応性疾患（すなわち「一次不応性」）、ここで、レジメンが完了してから３カ月以内に再発したすべての疾患が不応性とみなされる。
・以下の少なくとも１つの後に再発したまたは不応性疾患：
〇少なくとも２系統の療法（アントラサイクリンおよび抗ＣＤ２０抗体を用いた少なくとも１つを含む）自己幹細胞移植
〇同種異系幹細胞移植
【０２６１】
一般的な処置スキームの図は図２４に提示されており、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の製剤およびモデルの図表示は図２５Ａおよび２５Ｂに提示されている。
【０２６２】
各患者に白血球アフェレーシスを実施して末梢血単核細胞を得る。静脈間アフェレーシスに不適格な患者には、経皮中心静脈カテーテルを設置してこの回収を可能にすることを選択することができる。ヘマトクリットが少なくとも３８％であり、総非悪性（正常な）リンパ球数が＞２０００／ｍｃｌである、アフェレーシスに不適格な患者は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の生成に必要なＰＢＭＣを得るための血液４００ｍｌの静脈切開術を受けることができる。この手法は、用量レベル０（１ｋｇ当たりｔＣＤ１９＋細胞１×１０５個）、１（１ｋｇ当たりｔＣＤ１９＋細胞３．３×１０５個）および２（１ｋｇ当たりｔＣＤ１９＋細胞１×１０６個）に登録された患者にのみ行われる。参加者は、白血球アフェレーシスの前に腫瘍生検を受ける。リンパ節への接近可能性に応じて腫瘍生検および白血球アフェレーシスの前、またはその後にＰＥＴ  ＣＴを実施することができる。
【０２６３】
各患者について、標準の非動員白血球アフェレーシスによって得た自己末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）産物からＣＡＲ  Ｔ細胞を製造する。ＰＢＭＣに免疫磁気選択を行ってＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に濃縮し、各サブセットを別々に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８常磁性ビーズで刺激し、その後、完全ヒト第３世代ＣＤ２０特異的ＣＡＲおよびｔＣＤ１９形質導入マーカーをコードする１．５．３−ＮＱ−２８−ＢＢ−ζレンチウイルスベクターを用いて形質導入する。形質導入Ｔ細胞を拡大増殖し、次いで、ＣＤ２０を発現している標的細胞株で再刺激して成長をブーストし、さらにｅｘ  ｖｉｖｏで拡大増殖させ、次いで、ＣＤ４／ＣＤ８比１：１に製剤化して、注入のために指定の細胞用量を達成する。細胞産物を新鮮に注入することもでき、凍結保存し、次いで解凍し、洗浄し、そして注入することもできる。
【０２６４】
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、１：１の比のｔＣＤ１９＋ＣＤ４＋細胞とｔＣＤ１９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞からなり、ｔＣＤ１９は、ＣＡＲと同時発現し、ＣＡＲ＋細胞を同定する形質導入マーカーである。各患者について生成されたＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物は、製造のすぐ後に新鮮な細胞として与えることもでき、まず凍結保存し、液体窒素冷凍庫内で保管し、次いで、解凍した細胞を洗浄して残留する凍結保護物質を除去し、次いで、注入用に製剤化することもできる。細胞の総数は、解凍からの回収中の細胞の喪失を説明するため、および臨床プロトコールで指定されている細胞用量レベルを達成するために十分なものにする。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の総比率は、個々のサブセットの形質導入は同様であるが個々の患者では同一ではないので、１：１とは異なる可能性がある。このような理由で、サブセットを別々に形質導入して形質導入Ｔ細胞の正確な製剤を可能にすることができる。この比についての理論的根拠は、動物モデルにおけるＣＤ４  ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＤ８  ＣＡＲ  Ｔ細胞の相乗作用を実証している公開された研究（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０１５年）、および、あらゆる患者が異なる組成物を受ける場合には難しい、毒性および有効性の評価を補助するために全ての患者に均一な細胞産物を提供するという本発明者らの目的に基づく。
【０２６５】
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、速度制御冷凍庫内で凍結保存するためにＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０（登録商標）または他の適切な凍結保存培地に懸濁させる。凍結保存された細胞を液体窒素冷凍庫の気相に保存する。新鮮なまたは解凍したＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＮｏｒｍｏｓｏｌ＋１％ＨＳＡに再懸濁させ、臨床プロトコールで指定されている総細胞用量レベルで移入用パックに移すことができる。製剤化された産物を２〜８℃で保管し、次いで、投与のためにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎまたはＳｅａｔｔｌｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃａｒｅ  Ａｌｌｉａｎｃｅのいずれかの臨床の場に冷蔵ゲルパックで移入させる。産物をＦＨＣＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙからリリースする。細胞産物は、研究参加者に製剤化から６時間以内に注入されなければならない。ＦＨＣＲＣ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙは、分配の記録および調査産物の返却（適用可能な場合）に責任を負う。
【０２６６】
患者は、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入の３６〜９６時間前にリンパ球枯渇化学療法を受ける。化学療法薬の最後の用量とＴ細胞注入との間には少なくとも３６時間の間隔を空けなければならない。化学療法の投与の目標は、移入Ｔ細胞の生存を容易にするためにリンパ球枯渇をもたらす、およびＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入前の腫瘍負荷を低下させるためのものである。プロトコールの統計学的考察において概説したとおり、患者は、最初に、シクロホスファミド（ＣＹ）ｉ．ｖ．１ｇ／ｍ２の単回用量で処置される。しかし、奏効率が不十分である場合、リンパ球枯渇レジメンを、その後に患者がＣＹ＋フルダラビンを受けるように変化させる。
【０２６７】
参加者は、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受ける前に、プロトコールにより禁じられているいかなる肺毒性、心血管毒性、肝毒性、腎毒性、または神経毒性が発生していないこと；制御されていない活動的かつ重篤な感染が発生していないこと；およびＴ細胞注入の３０日以内に他の調査薬剤を用いた処置を受けていないこと確実にするために評価される。
【０２６８】
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞産物を投与する前の前投薬は必要ない。標準の前投薬は研究者の自由裁量で使用することができる。
【０２６９】
各患者は、リンパ球枯渇化学療法が完了してから３６〜９６時間後にＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の単回の静脈内注入を受ける。各患者に投与されるＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、臨床プロトコールに記載されている統計学的設計に従って決定される。以下の表２に用量レベルが示されている。第１の注入でＣＲが生じなかった場合、またはＣＲ後に疾患が再発した場合には、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の第２の注入を行うことができる。この目的のために、患者は、以下の臨床プロトコールに指定されている基準を満たさなければならない。
【０２７０】
細胞投与：１：１の比のＣＤ４＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の個々のアリコートから合わせた単一細胞産物を、各被験体に対する指定の細胞用量でおよそ２０〜３０分にわたって静脈内に投与する。指定のＴ細胞用量は、ベクター内のＣＡＲと協調的に発現する切断されたＣＤ１９形質導入マーカーの発現によって決定されるＣＡＲ＋Ｔ細胞を指す。提唱されたプロトコールの下で投与のために計画された用量レベルは、以下のとおりである：
【表２】
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【０２７１】
全ての患者を各Ｔ細胞注入中モニターする。生命徴候（酸素飽和度を含む）を注入前および注入中、ならびに注入後１時間ごとに２時間にわたって記録すべきである。酸素飽和度は、Ｔ細胞注入中およびＴ細胞注入後２時間にわたって、連続的なパルスオキシメトリーを用いてモニターすべきである。被験体は、注入後最低でも２時間、または、外来患者としての試験被験体に有意なリスクをもたらすとみなされるあらゆる注入に関連する毒性が消散するまで細胞注入ユニットに留まる。
【０２７２】
注入速度：各細胞注入は、静脈内におよそ２０〜３０分にわたって投与されるべきであり、非経口薬物についての内毒素限界（£５  ＥＵ／ｋｇ／時間）に関するガイドラインに従って必要に応じて調整される。被験体が、軽度の注入に関連する有害事象（グレード２またはそれ未満）を経験した場合にも注入速度を調整することができる。
【０２７３】
この試験の主要目的は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の最大耐量（ＭＴＤ）を推定することである。これらの目的に関するＭＴＤは、真の用量制限毒性率２５％と定義され、ＤＬＴは、注入から２８日以内に生じ、少なくとも４日間続き、トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｕｚｉｍａｂ）、デキサメタゾン、または他の抗炎症薬に対して応答性でない、ＣＡＲ  Ｔ細胞注入に起因するグレード３またはそれよりも高い非血液毒性と定義される。連続再評価方法（ＣＲＭ）の改変を使用してＭＴＤを推定する。改変は、患者を（１つではなく）２つの群で処置し、群間で１回用量レベルの最大の増加を可能にすることを含む。患者は、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を患者２名の第１群について用量レベル１から始まる４つの漸増用量レベルのうちの１つで単回の静脈内注入を受ける。各用量レベル（上記を参照されたい）で重篤な毒性を経験する患者の数を考慮に入れて、ＣＲＭアルゴリズムによって用量漸増または漸減を決定する。
【０２７４】
用量漸増／漸減群の患者の処置は交互に行い、したがって、患者２名の各セット間で、注入後、次の用量レベルに漸増するまで最低２８日の間隔が必要になる。これらの用量レベルを最初にＣＹ単独と組み合わせて評価し、ＣＲ率を評価して、ＣＹ単独で十分な活性を有するかどうかまたはフルダラビンを追加するかどうか（ＣＹ／ｆｌｕ）を決定する。いずれかの基準がＣＹ／ｆｌｕへの切り換えに適合する場合、ＣＲＭを、暫定の推奨用量（ＣＹ単独で用いて）を下回る１回用量レベルから出発して、ＣＹ／ｆｌｕと組み合わせて再度開始する。暫定の推奨用量は、これまでに評価された最大用量、またはｍＣＲＭに基づいて１回目、２回目および３回目の暫定分析につき８番目、１６番目、または２０番目の患者の後に選択された次の用量のいずれか低い方と定義される。この評価を合計３０名の患者まで続ける。これらの基準のいずれも満たされない場合には、追加的な１０名の患者にＣＹを単独で用いてＣＲＭ手法を続ける（合計３０名の患者に達するまで）。第２の注入を受ける患者に関しては、ＤＬＴおよび有効性転帰を最初の注入の用量に基づいて評価する。
【０２７５】
ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受ける患者では、腫瘍抗原と遭遇した後のＴ細胞活性化、増殖、およびサイトカイン分泌に起因する重篤な毒性が発生する可能性がある。サイトカイン放出症候群、マクロファージの活性化、および神経毒性が生じ、集中治療サポートが必要になる可能性があり、また、これらの毒性がコルチコステロイドおよび／またはトシリズマブを用いた４連続日の処置後に可逆的でない場合を除き、腫瘍のＴ細胞による認識に起因するとみなされる場合にはＤＬＴとはみなされない。
【０２７６】
１００日目までの処置に関連する死亡の真の確率が２０％を超える（用量にかかわらず）ことが示唆される十分な証拠がこれまでに存在する場合、ＰＩ、試験モニター、統計学者、およびＤＳＭＢによる詳細な再調査の間、患者の登録は一時中断する。この目的のための十分な証拠は、下方８０％信頼限界が２０％を超える任意の観察された転帰と定義される。
【０２７７】
有効性の予備評価を提供するための評価も実施する。試験の副次目的は、有効性の調査を含む（寛解率、無増悪生存期間、およびＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける持続性に関して）。これらの分析では、最終的なリンパ球枯渇レジメン（ＣＹ単独またはＣＹ／フルダラビン）と組み合わせた、全ての用量で処置された患者を使用し、用量に応じて転帰をモデリングして実施する。ロジスティック回帰モデルを使用してバイナリー転帰（ＣＲおよびＣＲ／ＰＲ）を評価する。コックス比例ハザードモデルを使用して事象までの時間転帰（ＰＦＳ、ＯＳ）を評価する。これらのエンドポイントに関して形式的な統計学的仮説を検定するのではなく、推定値および関連する信頼区間を説明的にもたらす。
【０２７８】
追加的な副次目的は、養子移入されたＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性に関する持続時間および養子移入されたＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の移動を評価することである。ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性を評価するために、患者−レベル曲線下面積（ＡＵＣ）を推定し、ＡＵＣの概算統計値を評価する。移動（ＣＡＲ  Ｔ細胞が処置後に存在する場合）は、１０〜１６日目に腫瘍内にＣＡＲ  Ｔ細胞が存在すること、および該当する場合には２８日目にＢＭが存在することと定義される。ＡＵＣおよび移動と臨床転帰との関連性は、大部分は、図式的な提示を含めて本質的に説明されるものである。
【０２７９】
処置への抵抗性の生物学的原因の評価に関連する副次目的を評価するために、以下の分析を実施する。対応のあるｔ検定を使用して、ベースラインの腫瘍と処置後の腫瘍の間でバイオマーカープロファイルを必要であれば適切な転換を伴って比較する。ロジスティック回帰モデルを使用してベースラインのバイオマーカー値と応答の関連性を評価する。その時点で生検材料が取得された患者についてＣＲ／ＰＲ時に測定された相関の関連性を評価するための、コックス比例ハザード回帰モデルを使用してランドマーク時間（ｌａｎｄｍａｒｋ  ｔｉｍｅ）からの生存時間（ＰＦＳおよびＯＳ）を測定する、１カ月の時点でＣＲまたはＰＲが達成された患者の間でのランドマーク分析。モデルは、全ての患者／用量レベルについての値を含み、用量レベルに関する変数を含む。
【０２８０】
内因性抗腫瘍応答の発生およびエピトープ拡散（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）も、大半は探索的な様式で評価した。各時点のデータを要約し、十分なデータを用いて、混合効果モデルを使用して時間により変動する転帰をモデリングした。実証されたエピトープ拡散を有する患者と有さない患者の間で示差的な遺伝子発現分析を行って免疫応答に関連するバイオマーカーを同定する。
【０２８１】
試験においてＣＲを達成できなかった患者、または完全奏効（ＣＲ）が達成されたが後で再発した患者、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の第２の注入を受けることを望む患者は、十分な数のＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞を産生することができ、かつ以下に列挙されている基準を満たすという条件で、ＣＤ２０  ＣＡＲ  Ｔ細胞の第２の注入を受けるのに適格であり得る：
ａ．第１のＴ細胞注入後に疾患が持続している、またはＣＲ後に腫瘍が再発した証拠が存在すること
ｂ．用量を制限するまたは用量漸減が必要な、第１の注入に帰する毒性がなかったこと
ｃ．患者が第１のＴ細胞注入から３０日以上経っていること
ｄ．臨床的および／または実験室除外基準がないこと（ＣＲを達成し、後で再発した患者は、腫瘍細胞上の進行中のＣＤ２０発現を実証する再発後生検を有さなければならない）
【０２８２】
参加者は、スクリーニング時、リンパ球枯渇化学療法の前、Ｔ細胞注入中、および各Ｔ細胞注入後の合間に評価を受ける。臨床プロトコールに従った安全性および毒性評価のために以下のデータを得る：
・病歴ならびにＴ細胞注入の前およびＴ細胞注入後の合間の身体検査
・注入前および注入中のパルスオキシメトリー
・Ｔ細胞注入前およびＴ細胞注入後の合間の血液検査、肝臓検査、腎臓検査、および電解質血液検査
・Ｔ細胞注入前およびＴ細胞注入後の合間の、腫瘍崩壊症候群、凝固障害、およびサイトカイン放出症候群について評価する臨床検査
・ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ  バージョン４．０に従った毒性悪性度分類
・血清サイトカインレベル
・Ｂ細胞再構成
・血清免疫グロブリンレベル
・複製コンピテントレンチウイルス検査
・遺伝子改変されたＴ細胞の持続性
・有害事象報告
【０２８３】
上に記載の種々の実施形態をさらなる実施形態を提供するために組み合わせることができ。本明細書で言及された、および／または出願データシートに示された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物のすべては、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願および刊行物の概念を用いることが必要である場合、実施形態の態様を修正することができる。
【０２８４】
上記の詳細な説明に照らして実施形態についてこれらおよび他の変更を行うことができる。一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定すると解釈されるべきではないが、すべての可能な実施形態、加えてそのような特許請求の範囲により権利が与えられる同等物のすべての範囲を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示に限定されない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２ＡＢ】
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【図２Ｃ】
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【図２ＤＥ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2019515652.tif 000017
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７ＢＣ】
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【図７ＤＥ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
2019515652.tif 000026
【図１１ＡＢＣＤ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４ＢＣ】
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【図１５ＡＢ】
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【図１５ＣＤ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ−１】
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【図１７Ｂ−２】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
2019515652.tif 000044
【図２１】
2019515652.tif 000045
【図２２】
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【図２３Ａ】
2019515652.tif 000047
【図２３Ｂ】
2019515652.tif 000048
【図２３Ｃ】
2019515652.tif 000049
【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
2019515652.tif 000051
【図２３Ｆ】
2019515652.tif 000052
【図２４】
2019515652.tif 000053
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019515652.tif 000058
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