(57)【要約】本開示の主題は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、非Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲシステム）の改善を含む組成物および方法を提供する。かかる組成物は、Ｈ１プロモーター領域への修飾、５’ＵＴＲ修飾の追加、Ｈ１プロモーターの異なるオルソロガスな配列、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩの両方の活性を有する新規のコンパクトな双方向プロモーター配列、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の追加、終結配列、条件的ｐｏｌ  ＩＩ／ｐｏｌ  ＩＩＩ双方向プロモーター発現の追加、突然変異を修正するためのドナー鋳型配列の追加、またはそれらの組合せを含み得る。本発明の他の態様は、転写後細胞周期調節融合物を介したＣａｓ９への修飾、ヌクレアーゼがＤＮＡ切断なしに結合できるように操作された部分的標的部位、自己調節部位、および半減期をモジュレートするためのＮ末端修飾に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子またはＲＮＡは、前記細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子またはＲＮＡを切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ヌクレアーゼシステム。
【請求項２】
ＣＲＩＳＰＲである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記アデノ随伴パッケージングウイルスが、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記アデノ随伴パッケージングウイルスがアデノウイルス血清型５である、請求項７に記載のシステム。
【請求項６】
１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記プロモーターが、Ｈ１プロモーター、７ｓｋ、ヒトＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２、ＳＲＰ−ＲＰＳ２９、７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４、ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１、ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２、ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７、ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３、ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９、ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９、ＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１、マウスＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２およびラットＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記プロモーターがＨ１プロモーターである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記Ｈ１プロモーターが、配列番号１２または３２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記Ｈ１プロモーターが、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記Ｈ１プロモーターが、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記プロモーターが、前記Ｈ１プロモーターに対してオルソロガスである、請求項９から１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記オルソロガスなＨ１プロモーターが、マウスまたはラットに由来する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、請求項９から１４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１６】
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、請求項９から１５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１７】
前記プロモーターが７ｓｋプロモーターである、請求項８に記載のシステム。
【請求項１８】
前記７ｓｋプロモーターが、ヒト、ラットまたはマウスに由来する、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記７ｓｋプロモーターが、７ｓｋ１、７ｓｋ２および７ｓｋ３からなる群から選択される、請求項１７から１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２０】
前記７ｓｋプロモーターが７ｓｋ１である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記７ｓｋ１が、ヒトに由来する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ヒト７ｓｋ１が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ヒト７ｓｋ１が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記７ｓｋ１が、マウスに由来する、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２５】
前記マウス７ｓｋ１が、配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記マウス７ｓｋ１が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２４から２５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記７ｓｋプロモーターが７ｓｋ２である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２８】
前記７ｓｋ２が、ヒトに由来する、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記ヒト７ｓｋ２が、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ヒト７ｓｋ２が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
前記７ｓｋ２が、マウスに由来する、請求項２７に記載のシステム。
【請求項３２】
前記マウス７ｓｋ２が、配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記マウス７ｓｋ２が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記７ｓｋプロモーターが７ｓｋ３である、請求項１９に記載のシステム。
【請求項３５】
前記７ｓｋ３が、ヒトに由来する、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記ヒト７ｓｋ３が、配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のシステム。
【請求項３７】
前記ヒト７ｓｋ３が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記７ｓｋ３が、マウスに由来する、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３９】
前記マウス７ｓｋ３が、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
前記マウス７ｓｋ３が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記プロモーターが、少なくとも１つの修飾を有する、請求項８から４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記プロモーターの前記少なくとも１つの修飾が、条件的調節を可能にするエレメントを含む、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記エレメントがｔｅｔ応答性プロモーターである、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記ｔｅｔ応答性プロモーターが、前記Ｈ１プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記ＴｅｔＲが、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記ＴｅｔＲが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
前記ＴｅｔＯが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４８】
前記ＴｅｔＯが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
前記Ｈ１−ＴｅｔＯが、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載のシステム。
【請求項５０】
前記Ｈ１−ＴｅｔＯが、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
前記プロモーターの前記少なくとも１つの修飾が、自己調節を可能にする部位を含む、請求項４１に記載のシステム。
【請求項５２】
前記自己調節部位が、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記自己調節部位が、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記自己調節部位が、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５５】
少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項５６】
前記少なくとも１つのターミネーター配列が、ＳＶ４０または合成ポリＡ（ＳＰＡ）配列からなる群から選択される、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
前記ターミネーター配列が、ＳＶ４０の１２０（配列番号１２３）または２４０（配列番号１２２）塩基対の配列である、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５８】
前記ターミネーター配列が、ＳＰＡの４９塩基対の配列である、請求項５６に記載のシステム。
【請求項５９】
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６０】
Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６１】
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１または２に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載のシステム。
【請求項６２】
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６３】
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６１に記載のシステム。
【請求項６４】
翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６５】
前記ＲＮＡ配列が、６．９４７または６．９６７からなる群から選択される、請求項６４に記載のシステム。
【請求項６６】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項６７】
前記Ｃａｓ９が、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項６６に記載のシステム。
【請求項６８】
前記Ｃａｓ９が、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６７に記載のシステム。
【請求項６９】
前記Ｃａｓ９が、少なくとも１つの修飾を含む、請求項６６から６８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項７０】
前記Ｃａｓ９中の前記少なくとも１つの修飾が、切断配列中の変更を含む、請求項６９に記載のシステム。
【請求項７１】
前記切断配列中の前記変更が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択される、請求項７０に記載のシステム。
【請求項７２】
前記Ｔ２Ａが、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７３】
前記Ｔ２Ａが、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載のシステム。
【請求項７４】
前記Ｐ２Ａが、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７５】
前記Ｐ２Ａが、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７６】
前記Ｅ２Ａが、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７７】
前記Ｅ２Ａが、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
前記Ｆ２Ａが、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載のシステム。
【請求項７９】
前記Ｆ２Ａが、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のシステム。
【請求項８０】
前記Ｃａｓ９中の前記少なくとも１つの修飾が、前記細胞における発現のために最適化されたコドンを含む、請求項６９に記載のシステム。
【請求項８１】
前記Ｃａｓ９が、細胞周期依存的タンパク質とインフレームで作動可能に融合したリンカー配列（Ｃａｓ９融合物）をさらに含む、請求項６６から８０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項８２】
前記細胞周期依存的タンパク質が、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８３】
前記細胞周期依存的タンパク質がジェミニンである、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８４】
前記細胞周期依存的タンパク質がヒトジェミニンである、請求項８３に記載のシステム。
【請求項８５】
前記ヒトジェミニンが、１〜１１０位のアミノ酸を含む（ｈＧｅｍ（１−１１０））、請求項８４に記載のシステム。
【請求項８６】
前記ｈＧｅｍ（１−１１０）が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８７】
前記ｈＧｅｍ（１−１１０）が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８８】
前記細胞周期依存的タンパク質がＣｄｔ１である、請求項８２に記載のシステム。
【請求項９０】
前記細胞周期依存的タンパク質がヒトＣｄｔ１である、請求項８８に記載のシステム。
【請求項９１】
前記ヒトＣｄｔ１が、３０〜１２０位のアミノ酸を含む（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））、請求項９０に記載のシステム。
【請求項９２】
前記ｈＣｄｔ１（３０−１２０）が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９１に記載のシステム。
【請求項９３】
前記ｈＣｄｔ１（３０−１２０）が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
前記Ｃａｓ９融合物が、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項８１から９３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９５】
前記Ｃａｓ９融合物が、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
前記Ｃａｓ９が、ユビキチンタンパク質とインフレームで作動可能に融合している（Ｕｂ−Ｃａｓ９）、請求項６６から９５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項９７】
前記Ｕｂ−Ｃａｓ９が、少なくとも１つのＮ末端修飾を有する、請求項９６に記載のシステム。
【請求項９８】
前記Ｎ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９が、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９７に記載のシステム。
【請求項９９】
前記Ｎ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９が、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
前記ユビキチンタンパク質が、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項９６に記載のシステム。
【請求項１０１】
前記ユビキチンタンパク質が、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１００に記載のシステム。
【請求項１０２】
ＳａＣａｓ９ニッカーゼをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０３】
ドナー鋳型配列をさらに含む、請求項１０２に記載のシステム。
【請求項１０４】
少なくとも１つのベクターが、配列番号６２または６７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０２から１０３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０５】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０４に記載のシステム。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０４に記載のシステム。
【請求項１０７】
前記ドナー鋳型配列が、少なくとも１つの遺伝子突然変異を修正する、請求項１０３から１０６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１０８】
前記少なくとも１つの遺伝子突然変異が、ｒｄ１０またはｒｄ１２である、請求項１０７に記載のシステム。
【請求項１０９】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６３または６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０８に記載のシステム。
【請求項１１０】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１１】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０９に記載のシステム。
【請求項１１２】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６５または６６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０８に記載のシステム。
【請求項１１３】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１１２に記載のシステム。
【請求項１１４】
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１１２に記載のシステム。
【請求項１１５】
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、請求項８から５４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１１６】
前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧ、ＧＮ１９ＮＧＧ、ＣＮ１９ＮＧＧまたはＴＮ１９ＮＧＧを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１７】
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１８】
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項１１７に記載のシステム。
【請求項１１９】
前記真核生物細胞が網膜光受容体細胞である、請求項５に記載のシステム。
【請求項１２０】
前記１つまたは複数の遺伝子産物がロドプシンである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２１】
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２２】
細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、請求項１に記載の天然に存在しないヌクレアーゼシステムを前記細胞中に導入するステップを含む、方法。
【請求項１２３】
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２７】
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記細胞が網膜光受容体細胞である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２９】
前記細胞が網膜神経節細胞である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１３０】
前記真核生物細胞ががん性細胞である、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
前記がん性細胞において細胞増殖が阻害または低減される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記がん性細胞においてアポトーシスが増強または増加される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
それを必要とする対象において網膜ジストロフィー、角膜ジストロフィー、マイクロサテライト増大疾患およびがんからなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、
（ａ）請求項１に記載の天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップ；および
（ｂ）有効量の前記システムを前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１３４】
前記疾患が角膜ジストロフィーである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記疾患が網膜ジストロフィーである、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
前記網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３７】
前記角膜ジストロフィーが、上皮基底膜ジストロフィー、上皮反復性びらんジストロフィー、上皮下粘液性角膜ジストロフィー、メースマン角膜ジストロフィー、リッシュ角膜上皮ジストロフィー、膠様滴状角膜ジストロフィー、ライス・ビュックラー角膜ジストロフィー、ティール・ベーンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー１型（古典的）、格子状角膜ジストロフィー２型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩ型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩ／ＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩＶ型、多形性（角膜）アミロイドーシス、顆粒状角膜ジストロフィー１型、顆粒状角膜ジストロフィー２型、斑状角膜ジストロフィー、シュナイダー角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、角膜斑点状ジストロフィー、後部無定形角膜ジストロフィー、フランソワ中心部雲状変性、プレデスメ角膜ジストロフィー、フックス角膜内皮ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィーおよびＸ連鎖角膜内皮ジストロフィーからなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３８】
前記マイクロサテライト増大疾患が、眼裂狭小、眼瞼下垂および眼角贅皮逆位合指症、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性中枢性低換気症候群、ハダド症候群、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、フックス角膜内皮ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ振戦失調症候群）、手足性器症候群、ＨＤ（ハンチントン病）、全前脳胞症、成長ホルモン分泌不全を伴う精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウエスト症候群、パーティントン症候群、眼咽頭型筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）および合多指症からなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３９】
前記対象に投与するステップが、移植、注射またはウイルスによって行われる、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４０】
前記対象に投与するステップが、網膜下注射によって行われる、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記対象に投与するステップが、外用的に、血管内に、皮内に、経真皮的に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、鼻腔内に、皮下に、局部的に、経皮的に、気管内に、腹腔内に、動脈内に、膀胱内に、腫瘍内に、腫瘍周囲に、吸入により、全身的に、灌流により、洗浄により、注射を介して直接、または投与および製剤を介して経口で行われる、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４２】
前記対象に投与するステップが、眼の表面に外用的に行われる、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記対象に投与するステップが、角膜、強膜上もしくはその外側で、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後空間に、または眼瞼中もしくはその周囲で行われる、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４４】
前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記抗がん剤が、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される、請求項１４４から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記抗がん療法、放射線療法、化学療法または手術である、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記がんが固形腫瘍である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１４９】
前記がんが、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１５０】
前記がんが脳がんである、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記全身投与が、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１５２】
前記対象が哺乳動物である、請求項１３３から１５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年７月５日に出願された米国仮出願番号第６２／３５８，３３５号の利益を主張しており、この仮出願の全体は、参考として本明細書によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）は、ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子と合わせて、細菌および古細菌において侵入する外来核酸に対する獲得された耐性を提供する適応免疫系を構成する（Barrangouら（２００７年）Science ３１５巻：１７０９〜１２頁）。ＣＲＩＳＰＲは、ファージまたはプラスミドＤＮＡに起源する場合が多いスペーサーと呼ばれる同様のサイズの独自の可変性のＤＮＡ配列が散在する、短い保存されたリピート配列のアレイからなる（Barrangouら（２００７年）Science ３１５巻：１７０９〜１２頁；Bolotinら（２００５年）Microbiology １５１巻：２５５１〜６１頁；Mojicaら（２００５年）J. Mol. Evol. ６０巻：１７４〜８２頁）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ領域中に挿入され、一致する配列を保有するファージおよびプラスミドへの引き続く曝露に対する免疫を提供する外来ＤＮＡ（スペーサー）の短い小片を獲得することによって機能する（Barrangouら（２００７年）Science ３１５巻：１７０９〜１２頁；Brounsら（２００８年）Science ３２１巻：９６０〜６４頁）。外来核酸のｃｒＲＮＡ媒介性サイレンシングを可能にするのが、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ干渉／免疫である（HorvathおよびBarrangou（２０１０年）Science ３２７巻：１６７〜７０頁；Deveauら（２０１０年）Annu. Rev. Microbiol. ６４巻：４７５〜９３頁；MarraffiniおよびSontheimer（２０１０年）Nat. Rev. Genet. １１巻：１８１〜９０頁；Bhayaら（２０１１年）Annu. Rev. Genet. ４５巻：２７３〜９７頁；Wiedenheftら（２０１２年）Nature ４８２巻：３３１〜３３８頁）。
【０００３】
合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とカップリングされた、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に依存するＣＲＩＳＰＲ構築物（Makarovaら（２０１１年）Nat. Rev. Microbiol. ９巻：４６７〜７７頁）の使用は最近、ゲノム操作を進化させ、ＤＮＡ配列の前例のない操作を可能にしている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物は、合成が単純かつ迅速であり、多重化され得る。しかし、それらの合成が比較的容易であるにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９自体の特性およびそのｇＲＮＡの合成の両方の関数である、標的化可能なゲノム空間へのアクセスに関する技術的制限を有する。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲシステムによる切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列へのｇＲＮＡの相補的塩基対合および標的部位に対して３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Jinekら（２０１２年）Science ３３７巻：８１６〜８２１頁）。理論上は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してゲノム中の任意の独自のＮ２０−ＰＡＭ配列を標的化することができる。使用される特定のＣａｓ９の起源の種に依存して変動するＰＡＭ配列のＤＮＡ結合特異性は、１つの制約を提供する。現在、制限が最小であり最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であり、これは、配列ＮＧＧを認識し、したがって、ゲノム中の、２つのグアノシンヌクレオチドが後に続く任意の独自の２１ヌクレオチド配列（Ｎ２０ＮＧＧ）が標的化され得る。タンパク質構成要素によって課される利用可能な標的化空間の増大は、変更されたＰＡＭ要件を有する新規Ｃａｓ９タンパク質の発見および使用に制限され（Congら（２０１３年）Science ３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. １１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）、または突然変異誘発もしくは定向進化を介した新規Ｃａｓ９バリアントの生成を待っている。
ＣＲＩＳＰＲシステムの第２の技術的制約は、５’グアノシンヌクレオチドにおけるｇＲＮＡ発現の開始から生じる。ＩＩＩ型クラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの使用は、ｇＲＮＡ発現のために特に受け入れられてきたが、それは、これらの短い非コード転写物が十分に規定された末端を有し、１＋ヌクレオチドを除く転写に必要な全てのエレメントが上流プロモーター領域中に含有されるからである。しかし、一般的に使用されるＵ６プロモーターは、転写を開始するためにグアノシンヌクレオチドを必要とするので、Ｕ６プロモーターの使用は、ゲノム標的化部位をＧＮ１９ＮＧＧへとさらに制約している（Maliら（２０１３年）Science ３３９巻：８２３〜８２６頁；Dingら（２０１３年）Cell Stem Cell １２巻：３９３〜３９４頁；Ranganathan, Vら、Nature communications ５巻、４５１６頁（２０１４年））。代替的手法、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写もまた、開始グアノシンヌクレオチド（単数または複数）を必要とする（Adhyaら（１９８１年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ７８巻：１４７〜１５１頁；Meltonら（１９８４年）Nucleic Acids Res. １２巻：７０３５〜７０５６頁；Pleissら（１９９８年）RNA ４巻：１３１３〜１３１７頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Barrangouら（２００７年）Science ３１５巻：１７０９〜１２頁
【非特許文献２】Barrangouら（２００７年）Science ３１５巻：１７０９〜１２頁；Bolotinら（２００５年）Microbiology １５１巻：２５５１〜６１頁
【非特許文献３】Mojicaら（２００５年）J. Mol. Evol. ６０巻：１７４〜８２頁
【非特許文献４】Barrangouら（２００７年）Science ３１５巻：１７０９〜１２頁
【非特許文献５】Brounsら（２００８年）Science ３２１巻：９６０〜６４頁
【非特許文献６】HorvathおよびBarrangou（２０１０年）Science ３２７巻：１６７〜７０頁
【非特許文献７】Deveauら（２０１０年）Annu. Rev. Microbiol. ６４巻：４７５〜９３頁
【非特許文献８】MarraffiniおよびSontheimer（２０１０年）Nat. Rev. Genet. １１巻：１８１〜９０頁
【非特許文献９】Bhayaら（２０１１年）Annu. Rev. Genet. ４５巻：２７３〜９７頁
【非特許文献１０】Wiedenheftら（２０１２年）Nature ４８２巻：３３１〜３３８頁
【非特許文献１１】Makarovaら（２０１１年）Nat. Rev. Microbiol. ９巻：４６７〜７７頁
【非特許文献１２】Jinekら（２０１２年）Science ３３７巻：８１６〜８２１頁
【非特許文献１３】Congら（２０１３年）Science ３３９巻：８１９〜８２３頁
【非特許文献１４】Houら（２０１３年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. １１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁
【非特許文献１５】Maliら（２０１３年）Science ３３９巻：８２３〜８２６頁
【非特許文献１６】Dingら（２０１３年）Cell Stem Cell １２巻：３９３〜３９４頁
【非特許文献１７】Ranganathan,Vら、Nature communications ５巻、４５１６頁（２０１４年）Adhyaら（１９８１年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ７８巻：１４７〜１５１頁
【非特許文献１８】Meltonら（１９８４年）Nucleic Acids Res. １２巻：７０３５〜７０５６頁
【非特許文献１９】Pleissら（１９９８年）RNA ４巻：１３１３〜１３１７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明の実施は、典型的には、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来の技術を使用する。ある特定のこれらの技術の非限定的な記載は、以下の刊行物中に見出される：Ausubel,  F.ら（編）、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Current  Protocols  in  Immunology、Current  Protocols  in  Protein  ScienceおよびCurrent  Protocols  in  Cell  Biology、全てJohn  Wiley  &  Sons、N.Y.、２００８年１２月時点の版；Sambrook、RussellおよびSambrook、Molecular  Cloning.  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、２００１年；Harlow,  E.およびLane,  D.、Antibodies-A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、１９８８年；Freshney,  R.  I.、「Culture  of  Animal  Cells,  A  Manual  of  Basic  Technique」、第５版、John  Wiley  &  Sons、Hoboken、N.J.、２００５年。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、GoodmanおよびGilmanのThe  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第１１版、McGraw  Hill、２００５年、Katzung,  B.（編）Basic  and  Clinical  Pharmacology、McGraw-Hill/Appleton  &  Lange  第１０版（２００６年）または第１１版（２００９年７月）中に見出される。遺伝子および遺伝障害に関する非限定的な情報は、McKusick,  V.  A.：Mendelian  Inheritance  in  Man.  A  Catalog  of  Human  Genes  and  Genetic  Disorders.  Baltimore：Johns  Hopkins  University  Press、１９９８年（第１２版）またはより最近のオンラインデータベース：ワールドワイドウェブ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/上で入手可能な、２０１０年５月１日時点のOnline  Mendelian  Inheritance  in  Man、OMIM（商標）.  McKusick-Nathans  Institute  of  Genetic  Medicine、Johns  Hopkins  University（Baltimore、Md.）およびNational  Center  for  Biotechnology  Information、National  Library  of  Medicine（Bethesda、Md.）、ならびにワールドワイドウェブ：http://omia.angis.org.au/contact.shtml上で入手可能な、動物種（ヒトおよびマウス以外）における遺伝子、遺伝性障害および形質のデータベースであるOnline  Mendelian  Inheritance  in  Animals（ＯＭＩＡ）中に見出される。本明細書で言及されている全ての特許、特許出願および他の刊行物（例えば、科学論文、書籍、ウェブサイトおよびデータベース）は、それらの全体が参照により組み込まれる。本明細書と組み込まれた参考文献のいずれかとの間に矛盾がある場合、本明細書（組み込まれた参考文献に基づき得るその任意の補正を含む）が支配するものとする。特に示さない限り、用語の標準的な当該分野で受容された意味が本明細書で使用される。種々の用語の標準的な略号が本明細書で使用される。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（すなわち、Ｈ１プロモーターを使用するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ）の改善を含む組成物および方法が、本明細書に提供されている。一部の実施形態では、これらの改善は、Ｈ１プロモーター領域への修飾を含む。一部の実施形態では、これらの組成物は、５’ＵＴＲ修飾を使用してＨ１双方向ｐｏｌ  ＩＩ発現を増強することを含む。一部の実施形態では、これらの組成物は、Ｈ１プロモーターの異なるオルソロガスな配列の使用を介して双方向発現をモジュレートすることを含む。一部の実施形態では、これらの組成物は、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩの両方の活性を有する新規のコンパクトな双方向プロモーター配列（例えば、７ｓｋ、５’ＵＴＲ、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、またはそれらの組合せ）を含む。一部の実施形態では、この方法は、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩおよびＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩの両方の活性を有する双方向プロモーターについての発現スクリーニングを含む。一部の実施形態では、これらの組成物は、リボ核タンパク質酵素活性またはＲＮＡ配向型ヌクレアーゼを調節できる条件的ｐｏｌ  ＩＩ／ｐｏｌ  ＩＩＩ双方向プロモーター発現（例えば、ＴｅｔＲおよびＴｅｔＯ部位）を含む。一部の実施形態では、これらの改善は、突然変異を修正する（例えば、相同性配向型修復（ＨＤＲ））ためのドナー鋳型配列の追加を含む。
【０００８】
本発明の他の実施形態では、これらの改善は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの構成要素への修飾を含む。一部の実施形態では、これらの修飾は、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）に対して行われる。一部の実施形態では、このヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、転写後細胞周期調節を介して修飾される（例えば、ジェミニン（Ｇｅｍ）またはＣｄｔ１を含む融合タンパク質）。一部の実施形態では、このヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ヌクレアーゼがＤＮＡ切断なしに結合できるように部分的標的部位を操作することによって修飾される。一部の実施形態では、このヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、Ｎ末端アミノ酸同一性を使用してその半減期をモジュレートすることによって修飾される。
【０００９】
本発明の一態様は、ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子またはＲＮＡは、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡを切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ヌクレアーゼシステムに関する。
【００１０】
一部の実施形態では、このシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、非Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ−１システムなど）である。
【００１１】
一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。
【００１２】
一部の実施形態では、このアデノ随伴パッケージングウイルスは、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される。
【００１３】
一部の実施形態では、このアデノ随伴パッケージングウイルスはアデノウイルス血清型５である。
【００１４】
一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。
【００１５】
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。
【００１６】
一部の実施形態では、このプロモーターは、Ｈ１プロモーター、７ｓｋ、ヒトＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２、ＳＲＰ−ＲＰＳ２９、７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４、ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１、ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２、ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７、ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３、ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９、ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９、ＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１、マウスＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２およびラットＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２からなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、このプロモーターはＨ１プロモーターである。
【００１８】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号１２または３２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、このプロモーターは、このＨ１プロモーターに対してオルソロガスである。
【００２２】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、真獣類哺乳動物に由来する。
【００２３】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ  ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ、ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ、ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ、ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ  ｈｏｆｆｍａｎｎｉ、ｄａｓｙｐｕｓ  ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ、ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ  ｏｒｄｉｉ、ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ、ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ  ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ、ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ、ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ、ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ、ｏｃｈｏｔｏｎａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ、ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ、ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、ｐｒｏｃａｖｉａ  ｃａｐｅｎｓｉｓ、ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｖａｍｐｙｒｕｓ、ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ｔａｒｓｉｕｓ  ｓｙｒｉｃｈｔａ、ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ、ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ、ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓに由来する。
【００２４】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、マウスまたはラットに由来する。
【００２５】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９からなる群に示されるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは双方向性である。このＨ１プロモーターは、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの両方である。
【００２７】
一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。
【００２８】
一部の実施形態では、このプロモーターは７ｓｋプロモーターである。
【００２９】
一部の実施形態では、この７ｓｋプロモーターは、ヒト、ラットまたはマウスに由来する。
【００３０】
一部の実施形態では、この７ｓｋプロモーターは、７ｓｋ１、７ｓｋ２および７ｓｋ３からなる群から選択される。
【００３１】
一部の実施形態では、この７ｓｋプロモーターは７ｓｋ１である。
【００３２】
一部の実施形態では、この７ｓｋ１は、ヒトに由来する。
【００３３】
一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ１は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ１は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、この７ｓｋ１は、マウスに由来する。
【００３６】
一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ１は、配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ１は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、この７ｓｋプロモーターは７ｓｋ２である。
【００３９】
一部の実施形態では、この７ｓｋ２は、ヒトに由来する。
【００４０】
一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ２は、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ２は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
一部の実施形態では、この７ｓｋ２は、マウスに由来する。
【００４３】
一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ２は、配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ２は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
一部の実施形態では、この７ｓｋプロモーターは７ｓｋ３である。
【００４６】
一部の実施形態では、この７ｓｋ３は、ヒトに由来する。
【００４７】
一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ３は、配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ３は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、この７ｓｋ３は、マウスに由来する。
【００５０】
一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ３は、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ３は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５２】
一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１つの修飾を有する。
【００５３】
一部の実施形態では、このプロモーターのこの少なくとも１つの修飾は、条件的調節を可能にするエレメントを含む。
【００５４】
一部の実施形態では、このエレメントはｔｅｔ応答性プロモーターである。
【００５５】
一部の実施形態では、このｔｅｔ応答性プロモーターは、このＨ１プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、このＴｅｔＲは、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、このＴｅｔＲは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、このＴｅｔＯは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、このＴｅｔＯは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、このＨ１−ＴｅｔＯは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、このＨ１−ＴｅｔＯは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、このプロモーターのこの少なくとも１つの修飾は、自己調節を可能にする部位を含む。
【００６３】
一部の実施形態では、この自己調節部位は、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、この自己調節部位は、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
一部の実施形態では、この自己調節部位は、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、この方法は、少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む。
【００６７】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのターミネーター配列は、ＳＶ４０または合成ポリＡ（ＳＰＡ）配列からなる群から選択される。
【００６８】
一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＶ４０の１２０（配列番号１２３）または２４０（配列番号１２２）塩基対の配列である。
【００６９】
一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＰＡの４９塩基対の配列である。
【００７０】
一部の実施形態では、この方法は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列をさらに含む。
【００７１】
一部の実施形態では、この方法は、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む。
【００７２】
一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列は、配列番号１または２に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、この方法は、翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む。
【００７６】
一部の実施形態では、このＲＮＡ配列は、６．９４７または６．９６７からなる群から選択される。
【００７７】
一部の実施形態では、このゲノム標的化ヌクレアーゼはＣａｓ９タンパク質である。
【００７８】
一部の実施形態では、このＣａｓ９は、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、このＣａｓ９は、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、このＣａｓ９は、少なくとも１つの修飾を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、このＣａｓ９中のこの少なくとも１つの修飾は、切断配列中の変更を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、この切断配列中のこの変更は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択される。
【００８３】
一部の実施形態では、このＴ２Ａは、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、このＴ２Ａは、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、このＥ２Ａは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８８】
一部の実施形態では、このＥ２Ａは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００８９】
一部の実施形態では、このＦ２Ａは、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、このＦ２Ａは、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、このＣａｓ９中のこの少なくとも１つの修飾は、この細胞における発現のために最適化されたコドンを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、このＣａｓ９は、細胞周期依存的タンパク質とインフレームで作動可能に融合したリンカー配列（Ｃａｓ９融合物）をさらに含む。
【００９３】
一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質は、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される。
【００９４】
一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はジェミニンである。
【００９５】
一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトジェミニンである。
【００９６】
一部の実施形態では、このヒトジェミニンは、１〜１１０位のアミノ酸を含む（ｈＧｅｍ（１−１１０））。
【００９７】
一部の実施形態では、このｈＧｅｍ（１−１１０）は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、このｈＧｅｍ（１−１１０）は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はＣｄｔ１である。
【０１００】
一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトＣｄｔ１である。
【０１０１】
一部の実施形態では、このヒトＣｄｔ１は、３０〜１２０位のアミノ酸を含む（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））。
【０１０２】
一部の実施形態では、このｈＣｄｔ１（３０−１２０）は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、このｈＣｄｔ１（３０−１２０）は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、このＣａｓ９融合物は、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、このＣａｓ９融合物は、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、このＣａｓ９は、ユビキチンタンパク質とインフレームで作動可能に融合している（Ｕｂ−Ｃａｓ９）。
【０１０７】
一部の実施形態では、このＵｂ−Ｃａｓ９は、少なくとも１つのＮ末端修飾を有する。
【０１０８】
一部の実施形態では、このＮ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９は、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、このＮ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９は、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、このユビキチンタンパク質は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、このユビキチンタンパク質は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、この方法は、ＳａＣａｓ９ニッカーゼをさらに含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、この方法は、ドナー鋳型配列をさらに含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、少なくとも１つのベクターは、配列番号６２または６７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１１６】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１１７】
一部の実施形態では、このドナー鋳型配列は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を修正する。
【０１１８】
一部の実施形態では、この少なくとも１つの遺伝子突然変異は、ｒｄ１０またはｒｄ１２である。
【０１１９】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６３または６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６５または６６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。
【０１２６】
一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧ、ＧＮ１９ＮＧＧ、ＣＮ１９ＮＧＧまたはＴＮ１９ＮＧＧを含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。
【０１２８】
一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
【０１２９】
一部の実施形態では、この真核生物細胞は網膜光受容体細胞である。
【０１３０】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。
【０１３１】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０１３２】
本発明の別の態様は、細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、上に示される天然に存在しないヌクレアーゼシステムを細胞中に導入するステップを含む方法に関する。
【０１３３】
一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。
【０１３４】
一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。
【０１３５】
一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０１３６】
一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。
【０１３７】
一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。
【０１３８】
一部の実施形態では、この細胞は網膜光受容体細胞である。
【０１３９】
一部の実施形態では、この細胞は網膜神経節細胞である。
【０１４０】
一部の実施形態では、この真核生物細胞はがん性細胞である。
【０１４１】
一部の実施形態では、このがん性細胞において細胞増殖は阻害または低減される。
【０１４２】
一部の実施形態では、このがん性細胞においてアポトーシスは増強または増加される。
【０１４３】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において網膜ジストロフィー、角膜ジストロフィー、マイクロサテライト増大疾患およびがんからなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、（ａ）上に示される天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップ；および（ｂ）有効量のこのシステムを対象に投与するステップを含む方法に関する。
【０１４４】
一部の実施形態では、この疾患は角膜ジストロフィーである。
【０１４５】
一部の実施形態では、この疾患は網膜ジストロフィーである。
【０１４６】
一部の実施形態では、この網膜ジストロフィーは、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される。
【０１４７】
一部の実施形態では、この角膜ジストロフィーは、上皮基底膜ジストロフィー、上皮反復性びらんジストロフィー（Epithelial Recurrent Erosion Dystrophy）、上皮下粘液性角膜ジストロフィー、メースマン角膜ジストロフィー、リッシュ角膜上皮ジストロフィー（Lisch Epithelial Corneal Dystrophy）、膠様滴状角膜ジストロフィー、ライス・ビュックラー角膜ジストロフィー、ティール・ベーンケ角膜ジストロフィー（Thiel-Behnke Corneal Dystrophy）、格子状角膜ジストロフィー１型（古典的）、格子状角膜ジストロフィー２型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩ型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩ／ＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩＶ型、多形性（角膜）アミロイドーシス、顆粒状角膜ジストロフィー１型、顆粒状角膜ジストロフィー２型、斑状角膜ジストロフィー、シュナイダー角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、角膜斑点状ジストロフィー（Fleck Corneal Dystrophy）、後部無定形角膜ジストロフィー、フランソワ中心部雲状変性（Central Cloudy Dystrophy of Francois）、プレデスメ角膜ジストロフィー（Pre-Descemet Corneal Dystrophy）、フックス角膜内皮ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィー（Congenital Hereditary Endothelial Dystrophy）およびＸ連鎖角膜内皮ジストロフィーからなる群から選択される。
【０１４８】
一部の実施形態では、このマイクロサテライト増大疾患は、眼裂狭小、眼瞼下垂および眼角贅皮逆位合指症（ptosis and epicanthus inversus syndactyly）、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性中枢性低換気症候群、ハダド症候群（Haddad syndrome）、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、フックス角膜内皮ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ振戦失調症候群）、手足性器症候群（Hand-foot-genital syndrome）、ＨＤ（ハンチントン病）、全前脳胞症、成長ホルモン分泌不全を伴う精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウエスト症候群、パーティントン症候群（Partington syndrome）、眼咽頭型筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）および合多指症からなる群から選択される。
【０１４９】
一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、移植、注射またはウイルスによって行われる。
【０１５０】
一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、網膜下注射によって行われる。
【０１５１】
一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、外用的に、血管内に、皮内に、経真皮的に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、鼻腔内に、皮下に、局部的に、経皮的に、気管内に、腹腔内に、動脈内に、膀胱内に、腫瘍内に、腫瘍周囲に、吸入により、全身的に、灌流により、洗浄により、注射を介して直接、または投与および製剤を介して経口で行われる。
【０１５２】
一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、眼の表面に外用的に行われる。
【０１５３】
一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、角膜、強膜上もしくはその外側で、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後空間に、または眼瞼中もしくはその周囲で行われる。
【０１５４】
一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される。
【０１５５】
一部の実施形態では、この抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される。
【０１５６】
一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される。
【０１５７】
一部の実施形態では、この抗がん療法は、放射線療法、化学療法または手術である。
【０１５８】
一部の実施形態では、このがんは固形腫瘍である。
【０１５９】
一部の実施形態では、このがんは、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される。
【０１６０】
一部の実施形態では、このがんは脳がんである。
【０１６１】
一部の実施形態では、この全身投与は、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される。
【０１６２】
一部の実施形態では、この対象は哺乳動物である。
【０１６３】
一部の実施形態では、この哺乳動物はヒトである。
【０１６４】
本開示の主題によって全体的にまたは部分的に扱われる本開示の主題のある特定の態様が本明細書で上記されているが、他の態様は、以下に本明細書に最良に記載されている添付の実施例および図面と関連して解釈すると、説明が進むにつれて明らかになる。
【０１６５】
このように本開示の主題を一般に述べたところで、必ずしも一定の縮尺で描かれたものではない添付の図面を参照する：
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１−１】図１は、６つのパネル、Ａ〜Ｆを含み、５’ＵＴＲ配列のＨ１  Ｐｏｌ  ＩＩ発現に対する影響を示す図である。図１Ａ〜１Ｃは、５’ＵＴＲおよび翻訳エンハンサーのＨ１  Ｐｏｌ  ＩＩ発現に対する影響を示す。図１Ｄおよび１Ｅは、５’ＵＴＲ  Ｋｏｚａｋ配列のＨ１  Ｐｏｌ  ＩＩ発現に対する影響を示す。図１Ｆは、ターミネーター配列を示す。機能的なターミネーターはほぼ同等であった。最も短い有効なターミネーターは、４９ｂｐのＳＰＡターミネーターである。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【０１６７】
【図２−１】図２は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含み、異なるオルソロガス配列を使用することによって双方向発現をモジュレートすることを示す図である。
【図２−２】同上。
【０１６８】
【図３】図３は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、異なるオルソロガス配列のＨ１アラインメントを示す図である。
【０１６９】
【図４−１】図４は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、双方向プロモーターからのＰｏｌ  ＩＩおよびＰｏｌ  ＩＩＩ突然変異体についてのスクリーンを示す図である。
【図４−２】同上。
【０１７０】
【図５】図５は、さらなる異なるオルソロガス配列のＨ１アラインメントを示す図である。
【０１７１】
【図６−１】図６は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、リボ核タンパク質酵素活性の調節にＴｅｔＯを使用したＨ１  Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現の条件的発現を示す図である。図６Ａは、Ｈ１プロモーターにおける操作されたＴｅｔＯ部位の概略図を示す。図６Ｂは、操作されたＨ１からのＰｏｌ  ＩＩ発現が、Ｔｅｔオペレーター配列の存在による著しい影響を受けないことを示す。
【図６−２】同上。
【０１７２】
【図７−１】図７は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、リボ核タンパク質酵素活性を調節したＨ１  Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現の条件的発現を示す図である。図７Ａは、Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現がＴｅｔＲの存在下およびドキシサイクリンの不在下で抑圧されることを示す。図７Ｂは、ＴｅｔＲの存在下およびドキシサイクリンの存在下でＰｏｌ  ＩＩＩ発現が抑制解除されることを示す。
【図７−２】同上。
【０１７３】
【図８−１】図８は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、リボ核タンパク質酵素活性を調節するＨ１  Ｐｏｌ  ＩＩＩ発現の条件的発現を示す図である。図８Ａは、ドキシサイクリンの存在下の活性な酵素複合体を示す。図８Ｂは、ドキシサイクリンの不在下の不活性な酵素複合体を示す。
【図８−２】同上。
【０１７４】
【図９】図９は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含み、ＤＮＡ切断に対する細胞応答の概略図を示す図である。図９Ａは、ＤＮＡ切断に対する細胞応答が細胞周期によってモジュレートされることを示す。図９Ｂは、細胞周期の相がＤＮＡ経路の選択に大きく影響することを示す。図９Ｃは、ＲＮＡ配向型ヌクレアーゼをｈＧＥＭ１ドメインまたはｈＣＤＴ１ドメインのいずれかと融合し、これらのタンパク質の細胞周期依存性調節をもたらすことができることを示す。
【０１７５】
【図１０−１】図１０は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含む図である。図１０Ａは、Ｓ期、Ｇ２期およびＭ期中に活性である、細胞周期調節型構築物（上）、ならびにＧ１期中に活性である、細胞周期調節型構築物（下）を示す。図１０Ｂは、ＥｃｏＲＩ部位をロドプシン遺伝子にノックインするために使用されるオリゴ配列、およびＣＲＩＳＰＲ標的およびカット部位の位置を示す。図１０Ｃは、ロドプシン遺伝子への上首尾のＨＤＲおよびＥｃｏＲＩ部位の遺伝子への組み入れ後の配列を示す。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１０−５】同上。
【０１７６】
【図１１−１】図１１は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含む図である。図１１Ａは、異なる細胞周期調節型構築物についての、異なる量のドナーオリゴ配列を用いたＴ７  ＥｎｄｏＩアッセイを使用したＮＨＥＪの数量化を示す図である。図１１Ｂは、異なる細胞周期調節型構築物についての、異なる量のドナーオリゴ配列を用いたＥｃｏＲＩアッセイを使用したＨＤＲの数量化を示す。図１１Ｃは、ＮＨＥＪおよびＨＤＲデータの数量化を示す。Ｇｅｍ構築物は、ＨＤＲを優先的に誘導し、一方、Ｃｄｔ構築物は、ＮＨＥＪを優先的に誘導する。両方の混合物（ｇｅｍ／ｃｄｔ）は、融合していない類似したＣａｓ９であり、ＮＨＥＪおよびＨＤＲの全体的な率は、予測通り、条件全てにわたってほぼ同等である。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【０１７７】
【図１２】図１２は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、部分的な標的部位を使用したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの自己調節を示す図である。図１２Ａは、標的部位において完全な相補性を有し、ＤＮＡ切断をもたらすＣａｓ９を示す（白色の矢印）。図１２Ｂは、相補性を伴わなくても結合する広範囲にわたる塩基対合を有するが、ＤＮＡ切断活性はないＣａｓ９を示す。
【０１７８】
【図１３】図１３は、３つのパネル、Ａ、Ｂ、およびＣを含み、部分的な標的部位を使用したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの自己調節を示す図である。図１３Ａは、２０塩基の標的配列へのポリメラーゼ結合を示す。図１３Ｂは、ＤＮＡに結合するがカットはしないｄＣａｓ９（Ｃａｓ９のヌクレアーゼデッドバージョン）を示す。これがプロモーター領域および活性な転写の領域に結合すると、おそらく立体的影響に起因して転写が阻害され得る。図１３Ｃは、相補性を伴わなくても結合する広範囲にわたる塩基対合を有するが、ＤＮＡ切断活性はないＣａｓ９を示す。
【０１７９】
【図１４】図１４は、部分的な標的部位を使用したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの自己調節を示す図である。所望の部位における完全な相補性によりＤＮＡ切断がもたらされる（白色の矢印）（左下の描写）。操作されたプロモーター部位における不完全な相補性によりＤＮＡ切断およびそれ自体の発現の抑制はもたらされない（右下の描写）。
【０１８０】
【図１５−１】図１５は、部分的な標的部位：ＧＦＰレポーターを使用したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの自己調節を示す図である。棒グラフは、操作されたＨ１からのＰｏｌ  ＩＩ発現は部分的な標的配列の存在による著しい影響を受けないことを示す。
【図１５−２】同上。
【０１８１】
【図１６】図１６は、部分的な標的部位：Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを使用したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの自己調節を示す。
【０１８２】
【図１７−１】図１７は、２つのパネル、ＡおよびＢを含む図である。図１７Ａは、メチオニン（Ｍｅｔ）、その後のグリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、またはシステイン（Ｃｙｓ）が、Ｎ末端メチオニンを切断するメチオニンアミノペプチダーゼによりプロセシングされることを示す。図１７Ｂは、Ｎ末端規則が細胞内でのタンパク質半減期の推定として役立つことを示す。
【図１７−２】同上。
【０１８３】
【図１８】図１８は、直鎖状ポリ−ユビキチンが細胞内で個々のＵｂペプチドを切断する脱ユビキチン化酵素によって認識されることを示す図である。このプロセスを利用して、Ｕｂと任意のタンパク質のＮ末端を融合することによって特定のＮ末端残基を生成することができる。
【０１８４】
【図１９−１】図１９は、２つのパネル、ＡおよびＢを含み、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼ、脱ユビキチン化、または代替方法のいずれかによるＮ末端アミノ酸の単純な変化により、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ半減期の調節を実現できることを示す図である。図１９Ａおよび１９Ｂは、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣａｓ９のレベルを、Ｎ末端アミノ酸の同一性によってヌクレアーゼについての有意な発現の範囲である８〜１０倍と同程度にモジュレートすることができることを示す。
【図１９−２】同上。
【０１８５】
【図２０】図２０は、細胞内のタンパク質レベルをモジュレートするために、一般に使用される２Ａペプチドもどのように活用することができるかを示す図である。
【０１８６】
【図２１−１】図２１は、３つのパネル、Ａ〜Ｃを含み、ＡＡＶパッケージング容量の図解を示す図である。野生型ＡＡＶは、約４．７ｋｂであり、組換えＡＡＶは、最大５．２ｋｂまで詰め込むことができる。図２１Ｂは、ＳｐＣａｓ９および単一のｇＲＮＡを発現させるためにＨ１双方向プロモーターを使用したＡＡＶウイルスのサイズの図解を示す。図２１Ｃは、より強力なマウスプロモーターを使用した構築物を示す。第１の実験のセットを、ヒトプロモーターを使用して行った。図２１Ｂの構築物を、ＳＶ４０ターミネーターをより小さなＳＰＡターミネーターで置き換えて使用した。
【図２１−２】同上。
【図２１−３】同上。
【０１８７】
【図２２−１】図２２は、９つのパネル、Ａ〜Ｉを含む図である。図２２Ａは、ＡＡＶ送達に関する問題を示す。従来の方法によってＣａｓ９およびｇＲＮＡを発現させるために必要なＤＮＡは５．２ｋｂを超える：Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（約０．５ｋｂ）、ＳｐＣａｓ９（約４．１ｋｂ）、Ｐｏｌ  ＩＩターミネーター（約０．２ｋｂ）、Ｕ６プロモーター（約０．３ｋｂ）、およびｇＲＮＡ（約０．１ｋｂ）。図２２Ｂは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９よりも約１ｋｂ小さく、それをＡＡＶにパッケージングすることが可能であることを示す。図２２Ｃは、フォワード方向に発現するＨ１ＲＮＡ（ｐｏｌ  ＩＩＩ転写物）、および反対方向に転写されるＰＡＲＰ−２遺伝子（ｐｏｌ  ＩＩ転写物）を示すＨ１ゲノム遺伝子座を示す。この約２００ｂｐの配列は、非常に小型の双方向プロモーターである。図２２Ｄは、最も一般に使用され、最も広範に試験されているＣａｓ９タンパク質であるＳｐＣａｓ９を送達するための「指示」の縮小を示す。重要なことに、ＳｐＣａｓ９タンパク質は、ＳａＣａｓ９タンパク質よりもはるかに多数のゲノム部位を標的にすることができる。これは、より多くの突然変異／疾患を標的にすることができることを意味する。図２２Ｅは、真核細胞におけるゲノム編集に関して有効であることが示されているいくつもの他のＣａｓ９タンパク質を送達するための「指示」の縮小を示す。ＳａＣａｓ９を、標準のプロモーターの使用によるものよりもはるかに小型のベクターで送達することもできる。図２２Ｆは、本発明が、はるかに多数のゲノム、したがって、はるかに多数の潜在的な突然変異および疾患を標的にする潜在性を可能にするものであることを示す。図２２Ｇは、ＳａＣａｓ９および単一のｇＲＮＡを発現させるためにＨ１双方向プロモーターを使用したＡＡＶウイルスのサイズの図解を示す。およそ１ｋｂの余地がＨＤＲ鋳型として利用可能である。図２２Ｈは、ＳａＣａｓ９および単一のｇＲＮＡおよび鋳型を発現させるためにＨ１双方向プロモーターを使用したＡＡＶウイルスのサイズの図解を示す。図２２Ｉは、以下を示す：１．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が最も安全であり、かつ遺伝子療法において最も一般に使用されるベクターであること。当該ウイルスは、非常に小さいという１つの欠点を有する。２．天然に、４７００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡゲノムからなる。ゲノムの末端は、ＩＴＲとして公知の逆方向反復配列である（オレンジ色）。３．これらの配列（それぞれ約１５０ｂｐ）は、ＤＮＡをＡＡＶにパッケージングするために必要な唯一のエレメントであり、したがって、ウイルス配列（ＲｅｐおよびＣａｐ）の中身を取り除くことができる。４．任意のカーゴ（青色）をＩＴＲ間に挿入することができ、また、ウイルスには全部で最大５２００ヌクレオチドまで詰め込むことができる、つまり、ウイルスを最大４９００ヌクレオチドまでのカーゴに適応させることができる。５．カーゴを細胞内に送達するための高効率ビヒクルとして組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が使用される。細胞の内部に入ったら、一本鎖ゲノムは二本鎖になり、細胞の寿命にわたって内部に留まる。
【図２２−２】同上。
【図２２−３】同上。
【図２２−４】同上。
【図２２−５】同上。
【図２２−６】同上。
【図２２−７】同上。
【図２２−８】同上。
【図２２−９】同上。
【図２２−１０】同上。
【図２２−１１】同上。
【図２２−１２】同上。
【図２２−１３】同上。
【０１８８】
【図２３】図２３は、Ｃａｓ９、単一のｇＲＮＡおよび鋳型を含有する単一のＡＡＶウイルスによる部位特異的組換えの機構を示す図である。
【０１８９】
【図２４−１】図２４は、２つのパネル、ＡおよびＢを含む図である。図２４Ａは、ＡＡＶベクター内の、ＨＤＲ送達のための潜在的な立体配置を示す。図２４Ｂは、ＡＡＶベクター内のＲＮＡ配向型ポリメラーゼのイントロン領域内の、ＨＤＲ送達のための潜在的な立体配置を示す。
【図２４−２】同上。
【０１９０】
【図２５−１】図２５は、２つのパネル、ＡおよびＢを含む図である。図２５Ａは、ＳａＣａｓ９および単一のｇＲＮＡおよび鋳型を使用したＣａｓ９ニッカーゼ手法の図解を示す。図２５Ｂは、劣性ＲＰＥ６５突然変異を修正するためのｒｄ１２標的化配列の描写を示す。
【図２５−２】同上。
【０１９１】
【図２６−１】図２６は、２つのパネル、ＡおよびＢを含む図である。図２６Ａは、ＳｐＣａｓ９および単一のｇＲＮＡを発現させるためにＨ１双方向プロモーターを使用したＡＡＶウイルスのサイズの図解を示す。およそ０．７ｋｂの余地がＨＤＲ鋳型として利用可能である。図２６Ｂは、ＲＮＡ配向型ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、および鋳型を単一のＡＡＶで送達するための一般的な手法を示す。
【図２６−２】同上。
【０１９２】
【図２７】図２７は、劣性ＰＤＥ６ｂ突然変異を修正するためのｒｄ１０標的化配列を示す図である。
【０１９３】
【図２８】図２８は、ＨＤＲ鋳型を挿入することによって容易にカスタマイズ可能なクローニングベクターを示す図である。
【０１９４】
【図２９−１】図２９は、２つのパネル、ＡおよびＢを含有する図である。図２９Ａは、ｐｏｌ  ＩＩ活性およびｐｏｌ  ＩＩＩ活性の両方を有する小型の双方向プロモーター配列の略画による概略図および表を示す。図２９Ｂは、図２９Ａに示されている小型の双方向プロモーター配列を含む構築物のＧＦＰ発現を示す棒グラフを示す。図２９Ｂは、右側のｙ軸から出発してｘ軸に沿って左に移動して、以下の棒の標識を示す、１）マイナス対照、２）ｈＨ１Ｋｏｚ（配列番号７１（または配列番号１２もしくは３２））、３）ｈＳｋ１（配列番号７３）、４）ｂｉＳＲＰ（配列番号７２）、５）ｂｉＣＧＢ１（配列番号７４）、６）ｂｉＡｌｏｘＥ３（配列番号７７）、７）ｂｉＤＰＰ９（配列番号７９）、８）ｂｉＴＨＥＭ（配列番号８３）、および９）ｂｉＯＲＦ（配列番号８０）。
【図２９−２】同上。
【０１９５】
【図３０−１】図３０は、２つのパネル、ＡおよびＢを含有する図である。図３０Ａは、ｐｏｌ  ＩＩ活性およびｐｏｌ  ＩＩＩ活性の両方を有するオルソロガスな双方向プロモーター配列の略画による概略図および表を示す。図３０Ｂは、図３０Ａに示されているオルソロガスな双方向プロモーター配列を含む構築物のＧＦＰ発現を示す棒グラフを示す。図３０Ｂは、右側のｙ軸から出発してｘ軸に沿って左に移動して、以下の棒の標識を示す、１）マイナス対照、２）ｈＨ１＋（ヒトＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２に対応する）、３）ｍＨ１＋（マウスＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２に対応する）、および４）ｒＨ１＋（ラットＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２に対応する）。
【図３０−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【０１９６】
詳細な説明
ここで、本開示の主題は、本開示の主題の一部であるが全てではない実施形態が示される添付の図面を参照して、以下により完全に記載される。あらゆる場所で、同様の番号は同様の要素を指す。本開示の主題は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満足するように提供される。実際、本明細書に示される本開示の主題の多くの修飾および他の実施形態は、前述の説明および添付の図面に示される教示の利益を有する、本開示の主題が関連する分野の当業者に想起される。したがって、本開示の主題が、開示されている具体的な実施形態に限定されないこと、ならびに修飾および他の実施形態が添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる意図であることを理解すべきである。
【０１９７】
ゲノム編集技術、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（PorteusおよびBaltimore（２００３年）Science  ３００巻：７６３頁；Millerら（２００７年）Nat.  Biotechnol.  ２５巻：７７８〜７８５頁；Sanderら（２０１１年）Nature  Methods  ８巻：６７〜６９頁；Woodら（２０１１年）Science  ３３３巻：３０７頁）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（Woodら（２０１１年）Science  ３３３巻：３０７頁；Bochら（２００９年）Science  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁；MoscouおよびBogdanove（２００９年）Science  ３２６巻：１５０１頁；Christianら（２０１０年）Genetics  １８６巻：７５７〜７６１頁；Millerら（２０１１年）Nat.  Biotechnol.  ２９巻：１４３〜１４８頁；Zhangら（２０１１年）Nat.  Biotechnol.  ２９巻：１４９〜１５３頁；Reyonら（２０１２年）Nat.  Biotechnol.  ３０巻：４６０〜４６５頁）は、標的化されたゲノム修飾を生成する能力を与え、疾患突然変異を正確に修正する能力を提供する。有効ではあるが、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ対は共に、所与のＤＮＡ標的部位のために大きい独自の認識タンパク質を合成することを必要とするので、これらの技術は、実務上の制限によって妨げられる。いくつかのグループが、これらの重要な制限を回避する操作されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用を介した高効率ゲノム編集を最近報告している（Congら（２０１３年）Science  ３３９巻：８１９〜８２３頁；Jinekら（２０１３年）eLife  ２巻：ｅ００４７１頁；Maliら（２０１３年）Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁；Choら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.  ３１巻：２３０〜２３２頁；Hwangら（２０１３年）Nat.  Biotechnol.  ３１巻：２２７〜２２９頁）。比較的時間がかかり作製が困難であるＺＦＮおよびＴＡＬＥＮとは異なり、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とカップリングされたＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性に依存するＣＲＩＳＰＲ構築物は、合成が単純かつ迅速であり、多重化され得る。しかし、それらの合成が比較的容易であるにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲは、Ｃａｓ９自体の特性およびそのｇＲＮＡの合成の両方の関数である、標的化可能なゲノム空間へのアクセスに関する技術的制限を有する。
【０１９８】
ＣＲＩＳＰＲシステムによる切断は、２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列へのｇＲＮＡの相補的塩基対合および標的部位に対して３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする（Jinekら（２０１２年）Science  ３３７巻：８１６〜８２１頁）。理論上は、ＣＲＩＳＰＲ技術を使用してゲノム中の任意の独自のＮ２０−ＰＡＭ配列を標的化することができる。使用される特定のＣａｓ９の起源の種に依存して変動するＰＡＭ配列のＤＮＡ結合特異性は、制約を与える。現在、制限が最小であり最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であり、これは、配列ＮＧＧを認識し、したがって、ゲノム中の、２つのグアノシンヌクレオチドが後に続く任意の独自の２１ヌクレオチド配列（Ｎ２０ＮＧＧ）が標的化され得る。タンパク質構成要素によって課される利用可能な標的化空間の増大は、変更されたＰＡＭ要件を有する新規Ｃａｓ９タンパク質の発見および使用に制限され（Congら（２０１３年）Science  ３３９巻：８１９〜８２３頁；Houら（２０１３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１１０巻（３９号）：１５６４４〜９頁）、または突然変異誘発もしくは定向進化を介した新規Ｃａｓ９バリアントの生成を待っている。ＣＲＩＳＰＲシステムの第２の技術的制約は、５’グアノシンヌクレオチドにおけるｇＲＮＡ発現の開始から生じる。ＩＩＩ型クラスのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの使用は、ｇＲＮＡ発現のために特に受け入れられてきたが、それは、これらの短い非コード転写物が十分に規定された末端を有し、１＋ヌクレオチドを除く転写に必要な全てのエレメントが上流プロモーター領域中に含有されるからである。しかし、一般的に使用されるＵ６プロモーターは、転写を開始するためにグアノシンヌクレオチドを必要とするので、Ｕ６プロモーターの使用は、ゲノム標的化部位をＧＮ１９ＮＧＧへとさらに制約している（Maliら（２０１３年）Science  ３３９巻：８２３〜８２６頁；Dingら（２０１３年）Cell  Stem  Cell  １２巻：３９３〜３９４頁）。代替的手法、例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プロモーターによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写もまた、開始グアノシンヌクレオチド（複数可）を必要とする（Adhyaら（１９８１年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ７８巻：１４７〜１５１頁；Meltonら（１９８４年）Nucleic  Acids  Res.  １２巻：７０３５〜７０５６頁；Pleissら（１９９８年）RNA  ４巻：１３１３〜１３１７頁）。
【０１９９】
本開示の主題は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（すなわち、Ｈ１プロモーターを使用するＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ；その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／１９５６１）の改善を含む組成物および方法に関する。かかる修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｈ１プロモーター領域への修飾を含み得る。一部の実施形態では、この修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、５’ＵＴＲ修飾を使用してＨ１双方向ｐｏｌ  ＩＩ発現を増強することを含む。一部の実施形態では、この修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｈ１プロモーターの異なるオルソロガスな配列の使用を介して双方向発現をモジュレートすることを含む。一部の実施形態では、この修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩの両方の活性を有する新規のコンパクトな双方向プロモーター（コンパクトおよびオルソロガスなプロモーターを含む）配列（例えば、７ｓｋ、５’ＵＴＲ、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、またはそれらの組合せ）を含む。
【０２００】
一部の実施形態では、この修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、リボ核タンパク質酵素活性またはＲＮＡ配向型ヌクレアーゼを調節できる条件的ｐｏｌ  ＩＩ／ｐｏｌ  ＩＩＩ双方向プロモーター（コンパクトおよびオルソロガスなプロモーターを含む）発現（例えば、ＴｅｔＲおよびＴｅｔＯ部位）を含む。一部の実施形態では、これらの改善は、突然変異を修正する（例えば、相同性配向型修復（ＨＤＲ））ためのドナー鋳型配列の追加を含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、コンパクトな双方向プロモーターには、ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ヒト）、ＳＲＰ−ＲＰＳ２９、７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４、ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１、ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２、ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７、ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３、ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９、ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９またはＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０２】
一部の実施形態では、オルソロガスな双方向プロモーターには、ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（マウス）もしくはＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ラット）、またはａｉｌｕｒｏｐｏｄａ  ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ、ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ、ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ、ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ  ｈｏｆｆｍａｎｎｉ、ｄａｓｙｐｕｓ  ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ、ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ  ｏｒｄｉｉ、ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ、ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ  ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ、ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ、ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ、ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ、ｏｃｈｏｔｏｎａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ、ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ、ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、ｐｒｏｃａｖｉａ  ｃａｐｅｎｓｉｓ、ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｖａｍｐｙｒｕｓ、ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ｔａｒｓｉｕｓ  ｓｙｒｉｃｈｔａ、ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ、ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ、ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓに由来するプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【表３】
2019520078.tif 000002
ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ヒト）：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCC（配列番号７１）
ＳＲＰ−ＲＰＳ２９：
CTTGCTCTCAGCAGTGCAACGAGGTAAAAGGAAGAAGCTGGCCCACGCATGCGCTCTTCAAATTTTTGAGACAGTTTACCCAGAATGCAGTGCTCAAAGGAAACGCGTGCGCAGTGTGGTCAGGTTGTTTCGCTGGGTGAGTAAAATGAAATCTTAGAGGCGTTGTGGGCTGGCCCAGTTGATGACGTCACCATACCACAGCTTCTAGTGCTATTCTGCGCCGGTATCCGACC（配列番号７２）
７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４：
AGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC（配列番号７３）
ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１：
GTCTCTCTCTTAGCGGGATATCTTCCGCAAGCACTGGGAATGTGGACATGGAAAGTAAATTGAGTCTCCGTGGGGGAGTGAGACAGGGAGTGAGGGGTGTTGGACGCGGCACGGGAACCTGGCCAGAGTCAGCGGACCCAATTGGCTGCTCTCTCTCAGATGCAGTTCCCCTTCCTCCCTCCAGGGGGCGCCACGGAACGCAGGGCCCTCACTGGCCCTGGGGACTGGGTGACGTCAGGGATGAGCCTCTTGTGATTGGCTCCATCACCCTGCGTAAGATCAAAGGGAAGAAAGGATGGGCCCGACAA（配列番号７４）
ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２：
GTCTCTCTCTTAGCGGGATATCTTCCGCAAGCACTGGGGATGTGGACATGGAAAGTAAATTGAGTCTCCGTGGGGGAGTGAGACAGGGAGTGAGGGGTGTTGGACGCGGCACGGGAACCCGGCCGGAGTCAGCGGACCCAATTGGCTGCTCTCTCTCAGATACAGTTCCCCTTCCTCCCTCCAGGGGGCGCCACGGAACGCAGGGCCCTCACTGGCCCTGGGGACTGGGTGACGTCAGGGGTGAGCCTCTCCTGATTGGCTCCATCACCCTGCGTAAGGTCAAAAGGAAGAAAGGAGATCCCCGACAC（配列番号７５）
ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７：
TGCCGGCCCACGGGTGGAGGGATCGGGCGGGCGGTGCCGAAGCGGTCCGGCATTGGCCGGCCGCCCCAACGCGCACGCGCACGCGAGCAGGCCGGCCGGCTCCGGGGAGGCCACGCCCACTCCCCGTAGGGCGGGGCCAGACCATATTTGCATAAGATAGTGTCATTCTAGCTTTCCTGTATTTGTTCATTTCGTGTCTATTAGCTATTCTGCTAGCCACAATGCCTCTGAAAGCCTATAGTCTTAGAAAGTTATGCCCGAAAACGGTTTTTTTAATCTCACGCCACCAACTTTCTCACCCTAATCATAAAACACAATTTCTTTAGGGCTATAAAATACTACTCTGTGAAGCTGAGGACGT（配列番号７６）
ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３：
TCTTTCCGCTCCAGGACCGCCCTGGGCCTGCAGGATCCTGGGCGGGAGCCCAGGTGTCCGGGATCTGGGCCACTAGGGACTGGGGAGGAACCTCTCAGAGAAGCCCATAGCCCGCAGCGGCCCCGCGCGGCCGGTTCCGGCGCCGCACTGTTCCAGCCTCTACTATGGTACAGTCCCTGCGTCGCAGCCTCGGCGGGGGCTCTAAGAACGGGAGGCAGAAAAAGCTCAATCAGCAGCAGGCGAGCTTCACCCGCTGCTTCCAAATCTGTGCCAAAATATTCTATGCTGCACAGATAAAATCCTCTGTCGGTTCTACAAGCCTGGCTTTTCCTATAGAGAACCCTCTTATAAGCAAAAAGTAAAGCTCTCGTGAAGA（配列番号７７）
ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：
GAGGGCAGTCACCAGCTCCTGGCCCGTGCGCCAAGCTCAGCGGGCGTCCGCGGTGCGATCTTCCCTAGCGCCTCGGGTCTGGCGCCGCCATCTTCCTCGGTAACAACCAGTCGCCTGAGGCGTGGGGCCGCCTCCCAAAGACTTCTGGGAGGGCGGTGCGGCTCAGGCTCTGCCCCGCCTCCGGGGCTATTTGCATACGACCATTTCCAGTAATTCCCAGCAGCCACCGTAGCTATATTTGGTAGAACAACGAGCACTTTCTCAACTCCAGTCAATAACTACGTTAGTTGCATTACACATTGGGCTAATATAAATAGAGGTTAAATCTCTAGGTCATTTAAGAGAAGTCGGCCTATGTGTACAGACATTTGTTCCAGGGGCTTTAAATAGCTGGTGGTGGAACTCAATATTC（配列番号７８）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９：
TAACCGCTCAGCTGACCTCAGGAGGGCAGGGGTGCCTTCTAAAGGGTCCAGAGAGCCTCCATTCCAGCTGCAGGCGTGGGACACAGACCGGGACGTGGGGCGGCGGCCGGACTGGGCAGGTCGTCCCGGGTCCAGCGGCGCCTCACGGTCGCGGCTCCATGCCCGGGACTGCGACCCCGGAAGTGGCGGGAGCGGGGGACGACAGCCGCGGCGGACACAGGGGACCCGCCGGCTCAGGCACCTTTGACCCGGAAGTTGAGCGACCCAGGCGGCGGCCTGGGATTGGACACCACCAGGCACGTACCAAGGCGTCCGCGGCGCTTGGGGGGGAGCCCGCGGCGCGGCGGCCTAAGGTGCGTAACGCCCCATGAACGACATCTTCCGGTGGGTTAGGGAGAGACACCCCCCTGTGACTTGGTATCACTCAGTCAAACCCATGATCCCCCACTATTAAGGATATCCGGAGAGGATGCTACCTATCAGG（配列番号７９）
ＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１：
TCCTGACTGCAGCACCAGAAGGCTGGTCTCTCCCACAGAACGAGGATGGAGGCGGGGAGGGATCCGTTGAAGAGGGAAGGAGCGATCACCCAAAGAGAACTAAAATCAAATAAAATAAAACAGAGAGATGTCTTGGAGGAGGGGGCGAGTCTGACCGGGATAAGAATAAAGAGAAAGGGTGAACCCGGGAGGCGGAGTTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGTGAGACTCCGTCTCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATAAAGAGGAAAGGACGCAAGAAAGGGAAAGGGGACTCTCAGGGAGTAAAAGAGTCTTACACTTTTAACAGTGACGTTAAAAGACTACTGTTGCCTTTCTGAAGACTAAAAAGAAAAAAAACTTAAAAATTTAAAGAAATAAACTTCTGAGCCATGTCACCAACTTAACCACCCCCAGGTACCTGCAACGGCTCGCGCCCGCCGGTGTCTAACAGGATCCGGACCTAGCTCATATTGCTGCCGCAAAACGCAAGGCTAGCTTCCGCCAGTACTGCCGCAACACCTTCTTATTTCACGACGTATGGTCGTAAAGCAATAAAGATCCAGGCTCGGGAAAATGACGGAGAGGTGGAACTATAGAGAATAAATTTGCATATATAATAATCCGCTCGCTAATTGTGTTTCTGTTTTCCTTTGCTAAGGTAGAAACAAAAGAATAATCACAGAATCTCAGTGGGACTTTGAAAATATCCAGGATTTTATACGTGAAGAATGGATGTATCGCATTACGGTAGTCACCCTATGTGTAAATTAGTGGCACATACTTGGCACTCCTTAATGTCAACTATAAGATG（配列番号８０）
ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９；
GCCTCCCAGCGTCGCGCCCTAACGACCCGCAAGTGTCCGAGGGCGCCTCCCGGCCGCCATCGGCCGCCCTCGCAGCCGCCGCTCTCCTCACGGCCTCCCGGCCGCCGCCGCCATCTTCCGCTTTCTCGTCCGGCTGCGGCGCTGCTGACGCTAGCGAGTCGCCACGCCGGGCAAGAGCGGCCCCCCTGCGCCCGCAGAGAACGCTGGGATGCCAGCGGCGCCCGCGGAGGCCTCACCCCCTACCTCGGCCGCTCCAGGGGGCGGGCCTGCATCTGGGCCACCTCTTTTGCATATTGGCACCCACAATCCACCGCGGCTATGAGGCCAGTATAAGGCGGTAAAATTACGATAAGATATGGGATTTTACGTGATCGAAGACATCAAAGTAAGCGTAAGCACGAAAGTTGTTCTGCAACATACCACTGTAGGAAATTATGCTAAATATGAAACCGACCATAAGTTATCCTAACCAAAAGATGATTTGATTGAAGGGCTTAAAATAGGTGTGACAGTAACCCTTGAGTC（配列番号８３）
【表４】
2019520078.tif 000003
ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（マウス）：
CGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCC（配列番号８１）
ＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２（ラット）：
GGCTGATGAGCTTCCCCCGCCCACTAGGAGTGTGAAGACCTGCCGCCATAATAAGACTCCAAAAGACAGTGAATTTAACACTTACGGTGACTTCCCACAAAGCACAGCGTGTAATTTGCATGCGCTCTAGCCCAGGCTCCAGCTCCGGACCAGAAGCCCGCGCATCCCGGCAAAGGGTGATGACGTCGTCCTTCAAGCGCT（配列番号８２）
【０２０３】
一部の実施形態では、これらの修飾は、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ）に対して行われる。一部の実施形態では、このヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、転写後細胞周期調節を介して修飾される（例えば、ジェミニン（Ｇｅｍ）またはＣｄｔ１を含む融合タンパク質）。一部の実施形態では、このヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ヌクレアーゼがＤＮＡ切断なしに結合できるように部分的標的部位を操作することによって修飾される。一部の実施形態では、このヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、Ｎ末端アミノ酸同一性を使用してその半減期をモジュレートすることによって修飾される。
【０２０４】
かかる修飾されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、より高い有効性、安全性および正確さで、ゲノム部位を正確に標的化でき、または欠損ゲノム部位の修復を促進できる。さらに、この修飾は、既存のＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガー技術を超えた、癌遺伝子のより高解像度の標的化を可能にするコンパクトなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを提供する。
【０２０５】
本発明の他の態様は、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩおよびＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩの両方の活性を有するさらなる双方向プロモーターについての発現スクリーンを含む方法に関する。
【０２０６】
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムの改善／修飾。
Ａ．組成物
【０２０７】
一部の実施形態では、本開示の主題は、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの改善を含む組成物に関する。かかる改善は、ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、オルソロガスなＨ１プロモーターまたは７ｓｋ）であって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、修飾されたＣａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）であって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ヌクレアーゼシステムを含む。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号１２または３２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、マウスまたはラットに由来する。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９からなる群に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、ヒト、マウスまたはラットの７ｓｋプロモーターである。一部の実施形態では、この７ｓｋは、７ｓｋ１（内因性ＧＳＴＡ４  ５’ＵＴＲを使用する７ｓｋのバリアント１）、７ｓｋ２（５’ＵＴＲ中のｋｏｚａｋ配列だけを使用する７ｓｋのバリアント２）および７ｓｋ３（ベータグロビン５’ＵＴＲを使用する７ｓｋのバリアント）からなる群から選択される。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ１は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％���９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ１は、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ２は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ２は、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ３は、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ３は、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターまたは７ｓｋプロモーターは、少なくとも１つの修飾を有する。一部の実施形態では、このプロモーターの少なくとも１つの修飾は、条件的調節を可能にするエレメントを含む。一部の実施形態では、このエレメントはｔｅｔ応答性プロモーターである。一部の実施形態では、このｔｅｔ応答性プロモーターは、Ｈ１プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む。一部の実施形態では、このＴｅｔＲは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＴｅｔＯは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＨ１−ＴｅｔＯは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターの少なくとも１つの修飾は、自己調節を可能にする部位を含む。一部の実施形態では、この自己調節部位は、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、配列番号１２０〜１３０からなる群から選択される任意の核酸である。一部の実施形態では、この少なくとも１つのターミネーター配列は、ＳＶ４０または合成ポリＡ（ＳＰＡ）配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＶ４０の１２０（配列番号１２３）または２４０（配列番号１２２）塩基対の配列である。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＰＡの４９塩基���の配列である。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列をさらに含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列は、配列番号１または２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態では、このＲＮＡ配列は、６．９４７または６．９６７からなる群から選択される（Wellensiek I.（２０１３年）Nature Methods、１０巻：７４７〜７５０頁）。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、少なくとも１つの修飾を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９中の少なくとも１つの修飾は、切断配列中の変更を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３ａ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２およびＣ２ｃ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、この切断配列中の変更は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、このＴ２Ａは、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＥ２Ａは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＦ２Ａは、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９中の少なくとも１つの修飾は、細胞における発現のために最適化されたコドンを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、細胞周期依存的タンパク質とインフレームで作動可能���融合したリンカー配列（Ｃａｓ９融合物）をさらに含む。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質は、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、５３ＢＰ１、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＣｔＩＰ、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、Ｐｉｎ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はジェミニンである。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトジェミニンである。一部の実施形態では、このヒトジェミニンは、１〜１１０位のアミノ酸を含む（ｈＧｅｍ（１−１１０））。一部の実施形態では、このｈＧｅｍ（１−１１０）は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はＣｄｔ１である。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトＣｄｔ１である。一部の実施形態では、このヒトＣｄｔ１は、３０〜１２０位のアミノ酸を含む（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））。
一部の実施形態では、このｈＣｄｔ１（３０−１２０）は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９融合物は、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、ユビキチンとインフレームで作動可能に融合している（Ｕｂ−Ｃａｓ９）。一部の実施形態では、このＵｂ−Ｃａｓ９は、少なくとも１つのＮ末端修飾を有する。一部の実施形態では、このＮ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９は、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このユビキチンタンパク質は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、ＳａＣａｓ９ニッカーゼをさらに含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、ドナー鋳型配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのベクターは、配列番号６２または６７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このドナー鋳型配列は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を修正する。一部の実施形態では、この少なくとも１つの遺伝子突然変異は、ｒｄ１０またはｒｄ１２である。一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６３または６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６５または６６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧ、ＧＮ１９ＮＧＧ、ＣＮ１９ＮＧＧまたはＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞は網膜光受容体細胞である。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
表５：オルソロガスなＨ１配列の例
ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ
TTCAGGATGTAGACCGGCCGCCACTATAAGGCTCGAAAGAGGAATAAATTTTTCGTTTAGGGTGATTTCCCACAAAGCACAGCGCGTAATTTGCATGCGCTCTACCCCAGGCTCCTGTGCTAGACAAGAAGCCCGCGCATCCGGGCAAGGGATGATGACGTCGTCCTTCAAGAGCG（配列番号８４）
ｒａｔｔｕｓ＿ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ
AGGAGTGTGAAGACCTGCCGCCATAATAAGACTCCAAAAGACAGTGAATTTAACACTTACGGTGACTTCCCACAAAGCACAGCGTGTAATTTGCATGCGCTCTAGCCCAGGCTCCAGCTCCGGACCAGAAGCCCGCGCATCCCGGCAAAGGGTGATGACGTCGTCCTTCAAGCGCT（配列番号８５）
ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ＿ｏｒｄｉｉ
AGGAAAGACTTCGCTGAGGCAGACTTTATAAGGCTCCCGCGCAGAAAGAAACTTTATAGTTATGGTGATTTCCCACAAGCCACTGCGTCATGCAAATAAAGCAGGGTACGGCTTCCATGTACCTTAAGGTTTTTTTCTAGGCCGCGTACGCTCTGCGTATTCAGCCACGTGACCCTGAGCCAGTGGTTGTTGGGAGCACGTTGTGGACCTCTGCGTTTGGATTCC（配列番号８６）
ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ＿ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ
GAAAGGGACTCCGCACAAGCAGAGTTTATAAGGCTCCCATCTGTACAGCCATTTCTCGGTCATGGTAACTACCCACAACACACAGCGATATGCAAATATAGCAGAGCGTGTCTTCCCGCGCGCGCCTGGTCGTCTCGGCGCCGGCGCGCTGCGTGGGGCGGAACTGTGACAGAGACCCTGCGATTCCTGGGAGCTGGCTGATGACATCAGTGTCTAACCTCC（配列番号８７）
ｃａｖｉａ＿ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ
GAGAAAGAAAGGCTCAAACCTAGCCTTATAAGGCTCCCAAATGTCGGTATATTTTTTGGTTATGGTGACTTCCCACAATGCATAGCGATATGTAGATATTGCCAGGAGTACCTCCCACTTCTGGTCCTGTCAGCTCTTTTCTAGGACGCGCGCGCTGCAGGTTTCCAGCCTGTGATTGGGCCAGCAATTCCGGGAATGAATTGATGACGTCAGCGTTTGAATTCC（配列番号８８）
ｏｃｈｏｔｏｎａ＿ｐｒｉｎｃｅｐｓ
GGGGGAAGCTGGGCTCGATCAGCCTTTATAAAGCTCCAAAAACTCAAGACATTTTTCTGTTACGGTGGCTTCCCACAGTACACAGCGACATGCAAATAGCTTGCCAATGAATTCGCGGACCGCTTCCCGCCCCGGCGCAGGCGCGCGGACGCTGTCTCCCCTGGACGCGCGCTCGCGGTTCCCGGGAGCTGGCTGATGACGTTCGGTCTCC（配列番号８９）
ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ＿ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ
GGGGAGAGGTGGATCCGAACAGACTTTATAAAGCTCCGAAAGCCCAAGGCATCTTTCCCTTACGGTAGCTTCCCACAAGACATAGCGACATGCAAATTTCTTGAAGTATGCTTCAGACGCGCTTCTCGCCACAGCGCAAGCGCGCTGTGTGCTGACGCGGGAACGGGCCAGGGCGCGGTTCCCGGGAGCGGGTTGATGACGTTAGATCTCC（配列番号９０）
ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ＿ｊａｃｃｈｕｓ
GAGGAAAAGTAGTCCCACAGACAACTTATAAGATTCCCATACCCTAAGACATTTCACGATTATGGTGACTTCCCAGAAGACACAGCGACATGCAAATATTGCAGGTCGTGTTTCGCCTGTCCCTCACAGTCGTCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTTTCCCGCCAACTGACGCTGGGCTCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTTGAATTCC（配列番号９１）
ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ＿ｓａｂａｅｕｓ
GGGGAAGGGTGGTCCCTTACAGAACTTATAAGATTCCCAAACTCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGACTTCCCAGAAGACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGTCACACCCCTCTCCCTCACAGTCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCTCGCGTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９２）
ｍａｃａｃａ＿ｍｕｌａｔｔａ
GGGGAAGGGTGGTCCCACACAGAACTTATAAGATTCCCATACTCAAAGACATTTCTCGTTTATGGTGACTTCCCAGAAGACACAGCGACATGCAAATATTGTAGGGCGTCACACCCCTGTCCCTCACAGTCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCGTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９３）
ｐａｐｉｏ＿ａｎｕｂｉｓ
GGGGAAAGGTGGTACCATACAGAACTTATAAGATTCCCATACTCAAAGACATTTCACGATTATGGTGACTTCCCAGAAGACACAGCGACATGCAAATATTGTAGGGCGTCACACCCCCTGTCCCTCACAGTCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCGTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９４）
ｇｏｒｉｌｌａ＿ｇｏｒｉｌｌａ
GGGAAAGGGTGGTCCCACACAGAACTTATAAGACTCCCATATCCAAAGACATTTCACGGTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGTAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCAGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９５）
ｈｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ
GGGAAAAAGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９６）
ｐａｎ＿ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ
GGGAAAGGGTGGTGCCACACAGAACTTATAAGATTCCCATATGCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACTGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９７）
ｐｏｎｇｏ＿ａｂｅｌｉｉ
GAGAAAGGGTGGTCCCGTCCAGAACTTATAAGATTCCCATACCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGACTTCCCAGAATGCATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGTCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCCCGCGCGCTGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCACGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGCTCGTATTCC（配列番号９８）
ｎｏｍａｓｃｕｓ＿ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ
GGGGAAAAGTAGTAGACCTTATAAGATTCCCAAACCCAAAGACATTTCTCGTTTATGGTGACTTCCCAGAAGACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTCGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTCC（配列番号９９）
ｔａｒｓｉｕｓ＿ｓｙｒｉｃｈｔａ
GCGAGAGGGTGGGTCCACACAGAGCTTATAAGGTTCACAAGTAAAGATATTTCACGGTGACGGTGACTTCCCACAATACACTGCGACATGCAAATATAGCCGGGCGTGCCTCCCCGATCCCGGAAGAGCGACTCCTAGCCAGTGCGCACGCGCGCTGCGTGTTCGCGTCCTAGGTCGCTGGGCCCGCGGTTCCTGGGAGCGGGTGGTGACGTCAGCGGCCCAGCTTC（配列番号１００）
ｏｔｏｌｅｍｕｒ＿ｇａｒｎｅｔｔｉｉ
GCCTAAAAGGGCGCTTGCACAGAATTTATAAGGTTCCCAAACAGAGACACATTTCATTATTATGGTGACTTCCCACAATGCACAGCGCCATGCAAATATGCTAGGACGCCTCCCCCCGCTACCTTAAGGTCGTCAACTAACCAGTGCGCGCGCGCACTGCGCGTTTCCCGCCGGTGACTCAATGCCCGCGTTTGGTGGGAGCTAGTTGGTGACCTCAGTTCTGGAGGCTC（配列番号１０１）
ｔｕｐａｉａ＿ｂｅｌａｎｇｅｒｉ
GGGGGAAGCTGGGTCCACTGAGTTCTTATAAGGTTTCCAGTCCTAGAGCGATTTTACCATTGCGGTGATTTCCCAGCATCCGTAGCTACATGCAAATAGCGCGGGGCGCGTCTCTCAGGTCCCTCCCCGCCCTCTCACTGTACGTACCCGCGTCCTAGGGACGCCGCGCCCGGGGTTCCCGGACGTCAGCGTTCCGACGCA（配列番号１０２）
ａｉｌｕｒｏｐｏｄａ＿ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ
AGGGAAAGCCGCGCCTGGGGCGGATTTATAAGGCTTCCATATCTAAAGGCATTTCACAGTCATGGTGACTTCCCACAATACATAGCAACATGCAAATATCGCGGGGAGAACCTCCCCTGTCCCTTGTACGCGGCTTCTAAAGACGCACGCGCGCTCTGTGTTCCCGCCCTGTGACTCTAGGCGGGCAATTCCTGGGACAGTGTTCTGACGGGAACGTTCAGGCTCC（配列番号１０３）
ｍｕｓｔｅｌａ＿ｐｕｔｏｒｉｕｓ＿ｆｕｒｏ
GGGAAAGGGTGGACCCACCGAGCATTTATAAGGCTCCCGCATCTAAAGACATTTTACAGTTATGGTGACTTCCCACAACGCGTAGCAACATGCAAATATCGTGGAGAGTACCGCCCCTGTCCCATGCACGCGTCTTCTCAGCAGCACGCACGCGCGCTGTGTTCCCGCCCTGTGACTCCAGGCGGGTATTTCCAGGGGCGGGTTGCTGACAGGAACGTTCAGGCTTC（配列番号１０４）
ｃａｎｉｓ＿ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ
GCAGCGCAGCCCTCTCGCCGCTTATAAAGTGCCGCCCGCACGGCCCTTCTCGCTCACGGCGACTTCCCATAACACACAGCAGCATGCAAATACCGCGGGGAGCCCCGCCCCGCCCCGGCCCCCGCACCGCCTCGGGACGCATGCGCCGGCTCTCCGTTCCCGCCTTGGGCCGGCGGCGGGCGGGCGGGCGAGCGGGCGGGAGCGGCTCCGGCGGGGACGAGCGGGCGCC（配列番号１０５）
ｆｅｌｉｓ＿ｃａｔｕｓ
GGGAAAGGGTGGCCCCGCCGAGCATTTATAAGACTCCCATACCTAAAGACATTTCTCAGTTATGGTGATTTCCCACAACACACAGCAACATGCAAATATCGAGGGGTGTACCGCCCCTGTCCTTTGTAGACGTCTTCTCTCCAGGACGCACGCGCGCTGTATTCCCGCCTTGTGACTCTAGGCGGGCGATTCCTGGGAGAGGGTTGATGACGTCCAAGTTCTGGCTTC（配列番号１０６）
ｅｑｕｕｓ＿ｃａｂａｌｌｕｓ
GGGGGAAAACAGCCCATGGCTGCATTTATAAGACTCACAGATCTAAAGCCATTTCACGAATAGGGTGACTTCCCACAATACACAGCGACATGCAAACATAGCGGGGCGTGCCTTTCCTGTACCCTGTGGGCATCTCTCCTGGACGCACGCGCGCCGGGTGTTCCCGCGCTGTGACTCTAGGCAAGCGCTTCCTGGGAGAGAGTTGATGACGGCAGCATTCGGGCTCC（配列番号１０７）
ｍｙｏｔｉｓ＿ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ
GGGAGAAGGAGGCGTAGAGGATATATAAGGCCCCCTTATGTGTAGTCCTTTTACGGTTAGGGTGACTTCCCACAACGCATAGCGACATGCAAATTTGACGGGCGTGCCTCCTCTGTCCCTGCGGGCAACTTCTCTCCTGGACGCGCGCGCGCTGCGTGTTCCCGCCTTTTGACTCCAGCCGAGCGAATCCTGGGAGAGGGCAGGTGACGTCAACAGTCAGGCTCG（配列番号１０８）
ｐｔｅｒｏｐｕｓ＿ｖａｍｐｙｒｕｓ
GCGAGAAAAATTCTTCACGCAGAATATATAAGGATCCCATATCTGAAGACATTTTACGATTACGGCGATTTCCCACAACACATAGCGACATGTAAATGTAGTGGGGCATGCCTCCCCTGTCCCTTGTGGGCAGCTTCTCGCCAGAACGCACGCGCGGTGCGTGTTCCCGCCTTGTGACTAAGTTGGCGAGTCAGGGAGGAGATTGATGACGTCAGCTCACCCGCTCC（配列番号１０９）
ｂｏｓ＿ｔａｕｒｕｓ
GGCAAACACCGCACGCAAATAGCACTTATAATGTGCTCATACCTAGAGCCACTTTTCGGTTACGGTGACTTCTCAAAAAGACAGTGGAACATGCAAATATTACAGTGCGTCCCGCCCCTGGTAGGTCTACGCTAGGACGCACGCGCACTACGGTTCCCGCCTATAGACTGCGCTGGCGATTCCTGGGAGCGGACTGATGACGTCAGCGTTCGGGATCC（配列番号１１０）
ｏｖｉｓ＿ａｒｉｅｓ
GGCGAACAATGCGCGCAAACAGCATTTATAATGAGCTCATACCTAAAGCCACTTTACGGTTACGGTGACTTCCCACAAGACATTGCGGCATGCAAATATTTTAGTGCGTCCCGCCCCTGGTAGTTCCACGCTAGGACGCACACGCACTACGGTTCCCGCCTTTAGACTGCGCTGGCGATTCCAGGAGCGGACTGATGACGTCAGCGTTGGGGCTCC（配列番号１１１）
ｔｕｒｓｉｏｐｓ＿ｔｒｕｎｃａｔｕｓ
GCCGAAAACCAGGCTCAAGCCACATTTATAAGGCTCCCAAATCTAAGTACATTTGTCGGTTATGGTGACTTCCCGCACCACATTGCGACATGCAAATACTGCGGAGCGTCCCTCCCCTGGCAACTCCTCGCTGGGACGCACGCGCGCTACGTGCTCCCGCCTTTTGACTGCGCCGGCGATACTTGGGAGAGGGTTGATGACGTCAGCGTTCTGGCTCC（配列番号１１２）
ｖｉｃｕｇｎａ＿ｐａｃｏｓ
GGGAAAGGGTGGGCTCACGCAGCCTTTATAAGACTCCCAAACTTAAAGACATTTCTCGGTTATGGCGACTTCCCACAAGACATAGCGACATGCAAATACTGCAGGGCGCCGACCCGGTCCTGTGCAGCCATCTTTCGGCTGGGACGCACGCGCGCTGCGTGTTCCCGCCCTGTGACTGCGCCGGCGATTACTGGGAGAGGATTGATGACGTCAACGTTCGGGTTCC（配列番号１１３）
ｓｕｓ＿ｓｃｒｏｆａ
GTAGGAAAACTGCTTCTGTGAGCACTTATAAAACTCCCATAAGTAGAGAGATTTCATAGTTATGGTGATTTCCCATAAGACATTGCGACATGCAAATATTGTGGCGCGTTCGTCCCCGTCCGGTGCAGGCAGCTTCGCTCCAGGACGCACGCGCAATACATGTTCCCGCCTTGAGACTGCGCCGGCAGATTCCTAGGAAGTGGTTGATGACGTCGATGTTAGGGATCC（配列番号１１４）
ｅｒｉｎａｃｅｕｓ＿ｅｕｒｏｐａｅｕｓ
GCCTAAACCGGCTCTTTCGACAGACTTATAAGGACCTCTTATCTTAGGACATTTTTTTGTTAGGGTAACTTCCCACGATGCATAGCGATATGTAAATATGGCGCCGCGAGTCTCTCCTAGGCGTCTCCCCAGGACGCAGGCGCACTGCTTGTTCCCGCGTTAACATTGCTGATTCTGGGAGACTGCTGATGACGTCAGCGTCCAGTCTAC（配列番号１１５）
ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ＿ｈｏｆｆｍａｎｎｉ
AGAAAAAAATAGTTTATGCTGGATTTATAAGATTCCCAAATCTAAAGCCATTTCACAGTTACGGTGATTCCCCACTACACACGGCGATATGCAAATATAGCGGAAGTGTTCCTGAGGCGTGGTAAAGCGCGCGCGCGCTGAGAGTTCCCGCCCTGTGGTGCTGGGCTGGAGATGCCTGAGAACTGGCTGATGACGGCAACGTTCGGGCTCC（配列番号１１６）
ｄａｓｙｐｕｓ＿ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ
AAAGCGATAGTTTTTTAAACTGGACTTATAAGGCACCCATATCTACGTATATTTCATGGTTAGGGTGATTTCCCACAACACATAGCGAAATGCAAATATTGGAGGGCGCTGAGGCGTGGTCGGGCGCAAGCGCGCTGCGACTTCCCGCCTTTCGGCCCTAGGCCCCAGATTCCTGGGAGCTGGATGATGACGTTGACGTTCGGATACC（配列番号１１７）
ｌｏｘｏｄｏｎｔａ＿ａｆｒｉｃａｎａ
GGGAAGGAACAAATTCGTCAGGATTTATAAGACTCTCAGAGCTGTAGACATTTCACAGTTAGGGCGATGTCCCACAATACATAGCAACATGCAAATATTCTAGGAGGCCAGCCTCCCCGTCCGCGTGGTCATCTTCTCGCTAGGGCGCACGCCCGCTGCGTGTTCCCGCTCTGTGACCAGGCAGGCGATTCCTGAGAACCGCTTGGTGACGTCAGTGTTCTGGCTCC（配列番号１１８）
ｐｒｏｃａｖｉａ＿ｃａｐｅｎｓｉｓ
AGGGTAAATCGGCGCTGCTCAGCATTTAAAAGAATCCCAAATGTGTCGCCATTTTACGCTTAGGGTGATATCCCACAAGACACAGCGACATGCAAATATCGTGAGTCTCTGTTTCCCTGTCCACGAGGGCGTCCTCTCGCTGGGGCGCACGCGCGGTGTGTGTGCCCCCGTTGTGTGTTCCCGCGATTCCAAAGAACTGGTTGATAACGTTAGACTTCCGGCTGC（配列番号１１９）
表６：ターミネーターの例
ＳＰＡ
AATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG（配列番号１２０）
ＳＰＡおよびＰａｕｓｅ
AATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGAATCGATAGTACTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAAACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTGCAGGTGCCAGAACATTTCTCT（配列番号１２１）
ＳＶ４０（２４０ｂｐ）
ATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA（配列番号１２２）
ＳＶ４０−ｍｉｎｉ（１２０ｂｐ）
TTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAT（配列番号１２３）
ｂＧＨポリＡ
CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG（配列番号１２４）
ＴＫポリＡ
GGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAG（配列番号１２５）
ｓＮＲＰ１
GGTATCAAATAAAATACGAAATGTGACAGATT（配列番号１２６）
ｓＮＲＰ１ａ
AAATAAAATACGAAATGTGACAGATT（配列番号１２７）
ヒストンＨ４Ｂ
GGTTGCTGATTTCTCCACAGCTTGCATTTCTGAACCAAAGGCCCTTTTCAGGGCCGCCCAACTAAACAAAAGAAGAGCTGTATCCATTAAGTCAAGAAGC（配列番号１２８）
ＭＡＬＡＴ−１
GATTCGTCAGTAGGGTTGTAAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAAACAACCTTTTGTTTTCTCAGGTTTTGCTTTTTGGCCTTTCCCTAGCTTTAAAAAAAAAAAAGCAAAAGACGCTGGTGGCTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAGTCCCTGCGGTGTCTTTGCTT（配列番号１２９）
ＭＡＬＡＴ−ｃｏｍｐ１４
AAAGGTTTTTCTTTTCCTGAGAAATTTCTCAGGTTTTGCTTTTTAAAAAAAAAGCAAAAGACGCTGGTGGCTGGCACTCCTGGTTTCCAGGACGGGGTTCAAGTCCCTGCGGTGTCTTTGCTT（配列番号１３０）
【０２０８】
用語「相同な」とは、「％相同性」を指し、本明細書で、本明細書の用語「％同一性」と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインした場合の、核酸配列同一性のレベルに関する。
【０２０９】
例えば、本明細書で使用される場合、８０％相同性とは、規定されたアルゴリズムによって決定された８０％配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列のホモログは、所与の配列の長さにわたって、８０％よりも高い配列同一性を有する。配列同一性の好ましいレベルには、配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列に対する約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％またはそれよりも高い配列同一性が含まれるがこれらに限定されない。配列同一性の例示的なレベルには、配列番号１〜８２に示されるヌクレオチド配列に対する約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％またはそれよりも高い配列同一性が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている主題は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む組成物であって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する組成物を利用する。
【０２１１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている主題は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、真核生物細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、真核生物細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む組成物であって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質はＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される組成物を利用する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０２１２】
本明細書に開示されている主題は、双方向Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを含む組成物であって、この双方向Ｈ１プロモーターは、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメントであって、このｇＲＮＡは、真核生物細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、真核生物細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメント；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントであって、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質はＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、制御エレメントを含む、組成物を利用する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０２１３】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞（例えば、真核生物細胞）の核中の検出可能な量でのＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を駆動するのに十分な強度の、１つまたは複数の核局在化配列を含む。理論に束縛されることは望まないが、核局在化配列は、真核生物におけるＣＲＩＳＰＲ複合体活性には必要ないが、かかる配列を含むことは、特に、核において核酸分子を標的化することについて、このシステムの活性を増強すると考えられている。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム酵素である。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素である。一部の実施形態では、このＣａｓ９酵素は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９であり、これらの生物に由来する突然変異したＣａｓ９を含み得る。この酵素は、Ｃｐｆ１またはＣａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．などのＣａｓ９ホモログまたはオルソログであり得る。
【０２１４】
一般に、本明細書を通じて、用語「ベクター」とは、それが連結した別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターには、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖である核酸分子；１つまたは複数の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方を含む核酸分子；および当該分野で公知のポリヌクレオチドの他の変種が含まれるがこれらに限定されない。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが標準的な分子クローニング技術などによってその中に挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の型のベクターは、ウイルスに由来するＤＮＡまたはＲＮＡ配列がウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）中へのパッケージングのためにベクター中に存在する、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、宿主細胞中へのトランスフェクションのためにウイルスによって運搬されるポリヌクレオチドもまた含む。
【０２１５】
ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動的に連結した遺伝子の発現を方向付けることが可能である。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
【０２１６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で本開示の主題の核酸を含み得、これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動的に連結した、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つまたは複数の調節エレメントを含むことを意味する。
【０２１７】
組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結した」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおける、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞における）を可能にする様式で、調節エレメント（複数可）に連結したことを意味する意図である。
【０２１８】
用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列）を含む意図である。かかる調節エレメントは、例えば、Goeddel（１９９０年）Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego、Calif.に記載されている。調節エレメントには、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるエレメント、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の構成的発現を方向付けるエレメント（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、目的の所望の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現を主に方向付け得る。調節エレメントはまた、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的様式または発生段階依存的様式で発現を方向付け得、これは、組織特異的または細胞型特異的であってもなくてもよい。
【０２１９】
一部の実施形態では、ベクターは、１つもしくは複数のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、１つもしくは複数のｐｏｌ  ＩＩプロモーター、１つもしくは複数のｐｏｌ  Ｉプロモーター、またはそれらの組合せを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例には、Ｕ６およびＨ１プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例には、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを伴う）（例えば、Boshartら（１９８５年）Cell  ４１巻：５２１〜５３０頁）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【０２２０】
エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲ中のＲ−Ｕ５’セグメント（Takebeら（１９８８年）Mol.  Cell.  Biol.８巻：４６６〜４７２頁）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβ−グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列（O'Hareら（１９８１年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.  ７８巻（３号）：１５２７〜３１頁）もまた、用語「調節エレメント」によって包含される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望される発現のレベルなどの因子に依存し得ることが、当業者に理解される。ベクターは、宿主細胞中に導入され得、それによって、本明細書に記載されている核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチド（例えば、クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、それらの突然変異体形態、それらの融合タンパク質など）を含む転写物、タンパク質またはペプチドを産生する。有利なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、かかるベクターの型は、特定の型の細胞を標的化するためにも選択され得る。
【０２２１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連鎖分析から規定された遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列には、非ヌクレオチド構成要素が割り込み得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾され得る。
【０２２２】
本開示の主題の態様では、用語「キメラＲＮＡ」、「キメラガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ」、「単一のガイドＲＮＡ」、「合成ガイドＲＮＡ」および「ｃｒＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。用語「ガイド配列」とは、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、用語「ガイド」または「スペーサー」と互換的に使用され得る。
【０２２３】
本明細書で使用される場合、用語「野生型」とは、当業者が理解する当該分野の用語であり、突然変異体またはバリアント形態から識別されて天然に存在する、生物、系統、遺伝子または特徴の典型的な型を意味する。
【０２２４】
本明細書で使用される場合、用語「バリアント」は、天然に存在するものから外れたパターンを有する質の提示を意味すると解釈すべきである。
【０２２５】
用語「天然に存在しない」または「操作された」は、互換的に使用され、人の手の関与を示す。これらの用語は、核酸分子またはポリペプチドを指す場合、その核酸分子またはポリペプチドが、それらが自然界で天然に関連するおよび自然界で見出される少なくとも１つの他の構成要素を、少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０２２６】
「相補性」とは、伝統的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型または他の非伝統的な型のいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合を形成（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）し得る、核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続する残基が全て、第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」とは、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％である相補性の程度を指す、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【０２２７】
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションについて「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対する相補性を有する核酸がその標的配列と優勢にハイブリダイズし、非標的配列には実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に、配列依存的であり、いくつかの因子に依存して変動する。一般に、配列が長くなるほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen（１９９３年）、Laboratory  Techniques  In  Biochemistry  And  Molecular  Biology-Hybridization  With  Nucleic  Acid  Probes  第１部、第２章「Overview  of  principles  of  hybridization  and  the  strategy  of  nucleic  acid  probe  assay」、Elsevier、N.Y.に詳細に記載されている。
【０２２８】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化された複合体を形成する反応を指す。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合によって、または任意の他の配列特異的様式で生じ得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数本鎖の複合体を形成する３つもしくはそれよりも多くの鎖、単一の自己ハイブリダイズする鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より詳細なプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断におけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズすることが可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と呼ばれる。
【０２２９】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ転写物へと）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、「遺伝子産物」と集合的に呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０２３０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用されて、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。このポリマーは、直鎖または分岐鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、このポリマーには、非アミノ酸が割り込み得る。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションもまた包含する。
【０２３１】
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む、天然のおよび／または非天然もしくは合成のアミノ酸を含む。
【０２３２】
本開示の主題の実施は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を使用する（Sambrook、FritschおよびManiatis（１９８９年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第２版；Ausubelら編（１９８７年）Current  Protocols  in  Molecular  Biology）；MacPhersonら編（１９９５年）Methods  in  Enzymology  （Academic  Press,  Inc.）:  PCR  2:  A  Practical  Approach）；HarlowおよびLane編（１９８８年）Antibodies,  A  Laboratory  Manual；Freshney編（１９８７年）Animal  Cell  Culture）。
【０２３３】
本開示の主題のいくつかの態様は、１つもしくは複数のベクターを含むベクターシステム、またはそのようなベクターに関する。ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質または酵素）の発現のために設計され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Goeddel（１９９０年）Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego、Calif.でさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳され得る。
【０２３４】
ベクターは、原核生物中に導入され、そこで繁殖され得る。一部の実施形態では、原核生物は、真核生物細胞中に導入されるベクターのコピーを増幅するため、または真核生物細胞中に導入されるベクターの産生（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）における中間体ベクターとして、使用される。一部の実施形態では、原核生物は、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のための１つまたは複数のタンパク質の源を提供するために、ベクターのコピーを増幅し、１つまたは複数の核酸を発現させるために使用される。原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を方向付ける構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて実施される場合が最も多い。
【０２３５】
融合ベクターは、それらがコードするタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。かかる融合ベクターは、（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させるため；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を増加させるため；および（ｉｉｉ）親和性精製における配位子として作用することによって組換えタンパク質の精製を補助するためなどの、１つまたは複数の目的を果たし得る。しばしば、融合発現ベクター中には、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との接合部において導入されて、融合タンパク質の精製に引き続く、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。かかる酵素、およびそれらの同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例には、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；SmithおよびJohnson（１９８８年）Gene  ６７巻：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）が含まれる。
【０２３６】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Amrannら（１９８８年）Gene  ６９巻：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ  １１ｄ（Studierら（１９９０年）Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego、Calif.）が含まれる。
【０２３７】
一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら（１９８７年）EMBO  J.  ６巻：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（KuijanおよびHerskowitz（１９８２年）Cell  ３０巻：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら（１９８７年）Gene  ５４巻：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【０２３８】
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞における１つまたは複数の配列の発現を駆動することが可能である。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Seed（１９８７年）Nature  ３２９巻：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら（１９８７年）EMBO  J.  ６巻：１８７〜１９５頁）が含まれる。哺乳動物細胞で使用する場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つまたは複数の調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、サルウイルス４０、ならびに本明細書で開示されるおよび当該分野で公知の他のウイルスに由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現システムについては、例えば、Sambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual.第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２３９】
一部の実施形態では、この組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に、核酸の発現を方向付けることが可能である（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸を発現させるために使用される）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら（１９８７年）Genes  Dev.  １巻：２６８〜２７７頁）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton（１９８８年）Adv.  Immunol.  ４３巻：２３５〜２７５頁）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore（１９８９年）EMBO  J.  ８巻：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリンのプロモーター（Baneijiら（１９８３年）Cell  ３３巻：７２９〜７４０頁；QueenおよびBaltimore（１９８３年）Cell  ３３巻：７４１〜７４８頁）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle（１９８９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら（１９８５年）Science  ２３０巻：９１２〜９１６頁）ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（KesselおよびGruss（１９９０年）Science  ２４９巻：３７４〜３７９頁）およびα−フェトプロテインプロモーター（CampesおよびTilghman（１９８９年）Genes  Dev.  ３巻：５３７〜５４６頁）もまた包含される。
【０２４０】
一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントの発現を駆動するように、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントに作動可能に連結している。一般に、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型ダイレクトリピート（SPacer  Interspersed  Direct  Repeat））としても公知のＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的間隔短鎖回文リピート）は、特定の細菌種に対して通常特異的なＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。このＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて認識された別個のクラスの散在型の短い配列リピート（ＳＳＲ）（Ishinoら（１９８７年）J.  Bacteriol.、１６９巻：５４２９〜５４３３頁；およびNakataら（１９８９年）J.  Bacteriol.、１７１巻：３５５３〜３５５６頁）、および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲは、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、ＡｎａｂａｅｎａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおいて同定されている（Groenenら（１９９３年）Mol.  Microbiol.、１０巻：１０５７〜１０６５頁；Hoeら（１９９９年）Emerg.  Infect.  Dis.、５巻：２５４〜２６３頁；Masepohlら（１９９６年）Biochim.  Biophys.  Acta  １３０７巻：２６〜３０頁；およびMojicaら（１９９５年）Mol.  Microbiol.、１７巻：８５〜９３頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、短鎖規則的間隔リピート（short  regularly  spaced  repeat）（ＳＲＳＲ）と名付けられたリピートの構造によって、他のＳＳＲとは異なる（Janssenら（２００２年）OMICS  J.  Integ.  Biol.、６巻：２３〜３３頁；およびMojicaら（２０００年）Mol.  Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。一般に、これらのリピートは、実質的に一定の長さの独自の介在配列によって規則的に間隔があいたクラスターで存在する短いエレメントである（Mojicaら（２０００年）Mol.  Microbiol.、３６巻：２４４〜２４６頁）。リピート配列は系統間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、系統によって異なる（van  Embdenら（２０００年）J.  Bacteriol.、１８２巻：２３９３〜２４０１頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｒｘ、Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚａｒｃｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅ���ｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａが含まれるがこれらに限定されない、４０を上回る原核生物において同定されている（例えば、Jansenら（２００２年）Mol.  Microbiol.、４３巻：１５６５〜１５７５頁；およびMojicaら（２００５年）J.  Mol.  Evol.  ６０巻：１７４〜８２頁）。
【０２４１】
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列を含むＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するもしくはその活性を方向付ける転写物および他のエレメント、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連では、「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列および転写物を、集合的に指す。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連では、プロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。
【０２４２】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成との関連では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対する相補性を有するように設計される配列を指し、ここで、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在する限り、完全な相補性は必ずしも必要ではない。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質中に位置する。一部の実施形態では、この標的配列は、真核生物細胞のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体内にあり得る。標的配列を含む標的化される遺伝子座中への組換えに使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。本開示の主題の態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と呼ばれ得る。本開示の主題のある態様では、この組換えは相同組換えである。
【０２４３】
一部の実施形態では、ベクターは、１つまたは複数の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの挿入部位）が、１つまたは複数のベクターの１つまたは複数の配列エレメントの上流および／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物が、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化するために使用され得る。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれよりも多くのガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのかかるガイド配列含有ベクターが提供され得、任意選択で細胞に送達され得る。
【０２４４】
一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結した調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３ａ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの修飾バージョンが含まれる。これらの酵素は公知である；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて見出され得る。一部の実施形態では、未修飾のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９であり得る。
【０２４５】
一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置における、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補体内での、一方または両方の鎖の切断を方向付ける。一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００またはそれよりも多くの塩基対以内での、一方または両方の鎖の切断を方向付ける。一部の実施形態では、突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、ベクターは、対応する野生型酵素に関して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。
【０２４６】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、真核生物細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化されている。この真核生物細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌもしくは非ヒト霊長類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物などの特定の生物のものであり得るまたはそれに由来し得る。一般に、コドン最適化とは、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０またはそれよりも多くのコドン）を、ネイティブアミノ酸配列を維持したままその宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、目的の宿主細胞における増強された発現のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間でのコドン使用の差異）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関する場合が多く、これは次に、とりわけ、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、いくつかの方法で適応され得る。Nakamuraら（２０００年）Nucl.  Acids  Res.  ２８巻：２９２頁を参照のこと。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムもまた入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ、Ｐａ．）もまた入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列中の１つまたは複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれよりも多くの、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンと対応する。
【０２４７】
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を方向付けるのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する、任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインした場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムの使用によって決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（soap.genomics.org.cnにおいて入手可能）およびＭａｑ（maq.sourceforge.netにおいて入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５またはそれよりも多くのヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２もしくはそれよりも少ないヌクレオチド長未満である。
【０２４８】
標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を方向付けるガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって調査され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され得、その後、例えば、本明細書に記載されているＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって、標的配列内の優先的な切断が調査される。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験されるガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素を提供すること、ならびに試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間で、標的配列における結合、または切断の速度を比較することによって、試験管中で評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者に明らかである。
【０２４９】
ガイド配列は、任意の標的配列を標的化するために選択され得る。一部の実施形態では、この標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列には、標的ゲノム中で独自の配列が含まれる。
【０２５０】
一部の実施形態では、このＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列、および任意選択で、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例には、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうち１つまたは複数を有するタンパク質ドメインが含まれるがこれらに限定されない：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーター遺伝子の例には、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるがこれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物が含まれるがこれらに限定されない、ＤＮＡ分子を結合するまたは他の細胞性分子を結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。一部の実施形態では、タグ化されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置を同定するために使用される。
【０２５１】
本開示の主題のある態様では、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が含まれるがこれらに限定されないレポーター遺伝子は、遺伝子産物の発現の変更または修飾を測定するためのマーカーとして機能する遺伝子産物をコードするために、細胞中に導入され得る。本開示の主題のさらなる実施形態では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子は、ベクターを介して細胞中に導入され得る。本開示の主題の好ましい実施形態では、この遺伝子産物はルシフェラーゼである。本開示の主題のさらなる実施形態では、この遺伝子産物の発現は減少する。
【０２５２】
一般に、本開示の主題のプロモーター実施形態は、以下を含む：１）ＴＡＴＡボックス、近位配列エレメント（ＰＳＥ）および遠位配列エレメント（ＤＳＥ）を含む、完全なＰｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに２）リバース配向でＤＳＥの５’末端に融合したＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター。そのヌクレオチド配列にちなんで名付けられたＴＡＴＡボックスは、Ｐｏｌ  ＩＩＩ特異性の主要な決定因子である。これは通常、転写される配列に対してヌクレオチド−２３と−３０との間の位置に位置し、転写される配列の開始の主要な決定因子である。ＰＳＥは通常、ヌクレオチド−４５と−６６との間に位置する。ＤＳＥは、基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの活性を増強する。Ｈ１プロモーター中には、ＰＳＥとＤＳＥとの間にギャップは存在しない。
【０２５３】
双方向プロモーターとは、ヘッド−テイル−テイル−ヘッド様式で配向した任意のプロモーター（典型的にはｐｏｌ  ＩＩ）−多様な転写を方向付ける基本的に任意の制御領域を指す。一部の実施形態では、この双方向Ｈ１プロモーターは、ｐｏｌ  ＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩもしくはｐｏｌ  ＩＩＩおよびｐｏｌ  ＩＩＩ、またはそれらの組合せであり得る。Ｈ１双方向性、ならびに７Ｓｋおよび本明細書に記載されている他のものは、双方向性であるという点で独自であり、それ自身は真核生物ゲノム中でまれであるが、本明細書で最も重要なことに、一方の側でタンパク質コード遺伝子を方向付け（ｐｏｌ  ＩＩ）、他方の側でＲＮＡ遺伝子を方向付ける（ｐｏｌ  ＩＩＩ）。
【０２５４】
一部の実施形態では、双方向プロモーターは、以下からなる：１）３つの外部制御エレメント：ＤＳＥ、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含有する、完全な従来の一方向Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター；ならびに２）リバース配向でＤＳＥの５’末端に融合したＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター。ＴＡＴＡ結合タンパク質によって認識されるＴＡＴＡボックスは、プロモーター領域にＰｏｌ  ＩＩＩを動員するために重要である。ＴＡＴＡボックスへのＴＡＴＡ結合タンパク質の結合は、ＳＮＡＰｃとＰＳＥとの相互作用によって安定化される。合わせると、これらのエレメントは、Ｐｏｌ  ＩＩＩが発現される配列を転写できるように、Ｐｏｌ  ＩＩＩを正確に位置付ける。ＤＳＥはまた、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの完全な活性に重要である（Murphyら（１９９２年）Mol.  Cell  Biol.  １２巻：３２４７〜３２６１頁；Mittalら（１９９６年）Mol.  Cell  Biol.  １６巻：１９５５〜１９６５頁；FordおよびHernandez（１９９７年）J.Biol.Chem.、２７２巻：１６０４８〜１６０５５頁；Fordら（１９９８年）Genes,  Dev.、１２巻：３５２８〜３５４０頁；Hovdeら（２００２年）Genes  Dev.  １６巻：２７７２〜２７７７頁）。転写は、転写因子Ｏｃｔ−１および／またはＳＢＦ／Ｓｔａｆと、ＤＳＥ内のそれらのモチーフとの相互作用によって、最大１００倍増強される（KunkelおよびHixon（１９９８年）Nucl.  Acid  Res.、２６巻：１５３６〜１５４３頁）。フォワードおよびリバース配向の基本的プロモーターは、二本鎖ＤＮＡ鋳型の対向する鎖上の配列の転写を方向付けるので、リバース配向の基本的プロモーターのプラス鎖は、ＤＳＥのマイナス鎖の５’末端に付け加えられる。Ｈ１プロモーターの制御下で発現された転写物は、４Ｔまたは５Ｔの連続した配列によって終結される。
【０２５５】
Ｈ１プロモーター中では、ＤＳＥは、ＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスに隣接する（Myslinskiら（２００１年）Nucl.  Acid  Res.  ２９巻：２５０２〜２５０９頁）。配列反復を最小化するために、リバース方向での転写がＵ６プロモーターに由来するＰＳＥおよびＴＡＴＡボックスを付け加えることによって制御されるハイブリッドプロモーターを創出することによって、このプロモーターを双方向性にした。双方向Ｈ１プロモーターの構築を促進するために、小さいスペーサー配列もまた、リバース配向の基本的プロモーターとＤＳＥとの間に挿入され得る。
【０２５６】
細胞周期依存的タンパク質の例は、以下のいずれかを含み得る：
（ａ）染色体ＤＮＡ複製の開始および複製フォークの進行を含む染色体ＤＮＡ複製反応
Ｍｃｍ１０、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、Ｃｄｃ６、Ｃｄｔ１、ジェミニン、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ５、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｃｄｃ４５、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、ＲＰＡ７０、ＲＰＡ３４、ＰＣＮＡ、Ｅｌｇ１、リガーゼ１、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、トポイソメラーゼＩ、ＴＤＰ１、Ｏｒｃ２、Ｏｒｃ４、Ｏｒｃ５、Ｏｒｃ６、Ｍｃｍ２、Ｄｂｆ４、ＴｏｐＢＰ１、Ｓｌｄ５、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ２、ＲＦＣ１、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、Ｐｉｆ１、Ｐｏｌｄ  ｐ５０、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ２、トポイソメラーゼＩｉａ、トポイソメラーゼＩｉｂ、ＲＰＡＩ４、ＦＥＮ１、ＤＮＡ２、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｄ  ｐ６８、Ｐｏｌｄ  ｐ１２、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４
（ｂ）ＤＮＡ損傷チェックポイント
ＡＴＲ、Ｃｈｋ１、ＮＢＳ１、Ｈｕｓ１、Ｒａｄ１、Ｍａｄ２、ＢｕｂＲ１、ＡＴＭ、Ｒａｄ５０、Ｍｒｅ１１、Ｍｄｃ１、５３ＢＰ１、Ｒａｄ１７、ＢｕｂＲ１、ＡＴＲＩＰ、Ｃｈｋ２、Ｈ２ＡＸ、ＲＦＣ１、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、１４−３−３エータ、１４−３−３シグマ、ｃｄｃ２５Ａ、ｃｄｃ２５ｃ、ｗｅｅ１、ＡＴＲ、ＡＴＲＩＰ、Ｒａｄ１７、ＲＦＣ２、ＲＦＣ３、ＲＦＣ４、ＲＦＣ５、ＨＵＳ１、Ｒａｄ１、Ｒａｄ９、Ｐ５３、Ｒａｄ５０、Ｍｒｅ１１、ＮＢＳ１、ＴｏｐＢＰ１、５３ＢＰ１、Ｈ２ＡＸ
（ｃ）姉妹染色分体の凝集および分離
Ｃｔｆ１８、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｄｃｃ１、Ｔｒｆ４−１、Ｔｒｆ４−２、Ｓｍｃ１、Ｓｍｃ３、Ｐｄｓ１（セキュリン）、Ｍａｄ−２、ＢｕｂＲ１、Ｅｓｐ１
（ｄ）塩基除去修復
ＵＮＧ、ＭＢＤ４、ＴＤＧ、ＮＴＨ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＡＰＥ２、ＰＡＲＰ１、ＰＮＫ、Ｐｏｌｂ、ＯＧＧ１、ＡＰＥ１、ＸＲＣＣ１、リガーゼ３、ＳＭＵＧ１、ＴＤＧ、ＭＹＨ、ＭＰＧ、ＮＥＩＬ１、ＡＤＰＲＴ、ＡＤＰＲＴＬ２、ＭＧＭＴ、ＡＢＨ１、ＡＢＨ２、ＡＢＨ３
（ｅ）ミスマッチ除去修復
ＭＳＨ２、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＭＬＨ３、エキソヌクレアーゼ１、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＭＳＨ５、ＭＬＨ１、ＭＳＨ４、ＰＭＳ２Ｌ３、Ｔｒｅｘ１、Ｔｒｅｘ２、ＰＭＳ２Ｌ４
（ｆ）ヌクレオチド除去修復
ＸＰＣ、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、ＣＳＡ、ＣＳＢ、ＸＰＧ、ＸＰＦ、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＸＡＢ２、ＸＰＢ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＤ、ＸＰＡ、ＤＤＢ２、Ｍｍｓ１９、ＣＥＴＮ２、ＲＰＡ７０、ＲＰＡ３４、ＲＰＡＩ４、ＧＴＦ２Ｈ１、ＧＴＦ２Ｈ２、ＧＴＦ２Ｈ３、ＧＴＦ２Ｈ４、ＣＤＫ７、ＣＣＮＨ、ＭＮＡＴ１、リガーゼＩ、ＣＳＡ、ＣＳＢ
（ｇ）相同組換え修復
Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｌ１、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｒａｄ５１Ｌ３、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣ２、ＸＲＣＣ３、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５４Ｌ、Ｒａｄ５４Ｂ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｒａｄ５０、Ｍｒｅ１１、ＮＢＳ１、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、ＷＨＩＰ、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱ１、ＲｅｃＱ５
（ｈ）非相同末端結合修復（非相同組換え修復）
Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡ−ｐｋ、リガーゼ４、ＸＲＣＣ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＷＲＮ
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ切断修復
Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｘｒｃｃ２、Ｒａｄ５４、ＢＲＣＡ１、Ｋｕ８０、ＸＲＣＣ４、Ｒａｄ５２、Ｒａｄ５１Ｃ、Ｄｍｃ１、Ｒａｄ５４Ｂ、ＤＮＡ−ｐｋ、Ｋｕ７０、リガーゼ４、Ｒａｄ５１Ｂ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ２、Ａｒｔｅｍｉｓ
（ｊ）ＤＮＡ複製後修復（ＤＮＡ損傷トレランス）
Ｒａｄ６Ａ、Ｒａｄ６Ｂ、Ｒａｄ１８、Ｕｂｃ１３、ＦＢＨ１
（ｋ）ＤＮＡ架橋損傷修復
ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ
（ｌ）ＤＮＡ−タンパク質架橋損傷修復
ＴＤＰ１
（ｍ）ＤＮＡポリメラーゼ
Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｈ、Ｐｏｌｑ、Ｐｏｌｋ、Ｐｏｌｚ（ＲＥＶ３）、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｒｅｖ１、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｇ、Ｐｏｌｄ  ｐ５０、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、ＲＥＶ７、Ｐｏｌｎ、Ｐｏｌａ  Ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ２、Ｐｏｌｄ  ｐ６８、Ｐｏｌｄ  ｐ１２、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ２、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４
（ｎ）ヌクレオチドクレンジング（Nucleotide Cleansing）
ＭＴＨ１、ＤＵＴ、ｐ５３Ｒ２
（ｏ）クロマチン構造維持
Ｈ２ＡＸ、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）
（ｐ）テロメア構造維持
Ｔｉｎ２、Ｓｉｒ２、ｈＴｅｒｔ、ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、タンキラーゼ、Ｐｏｔ１、Ｒａｐ１、Ｐｉｆ１
【０２５７】
上述の機能（ａ）〜（ｐ）の各々と関連する遺伝子の好ましい例には、以下の実施例に記載される遺伝子が含まれる。より具体的には、かかる遺伝子の例は以下の通りである：ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４。
【０２５８】
本明細書に記載されている遺伝子名は、広く一般に公知の名称であるので、当業者は、遺伝子名に基づいて、公的参照データベースまたは遺伝子データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）から、前記遺伝子のヌクレオチド配列に関するデータを適切に獲得できる。
Ｂ．方法
【０２５９】
一部の実施形態では、本開示の主題は、真核生物細胞または非真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、ＷＯ２０１５／１９５６２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に以前に記載された改善され修飾された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップを含む方法もまた提供する。かかる改善は、ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、オルソロガスなＨ１プロモーターまたは７ｓｋ）であって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、修飾されたＣａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９）であって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ヌクレアーゼシステムを含む。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号１２または３２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、マウスまたはラットに由来する。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９からなる群に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、ヒト、マウスまたはラットの７ｓｋプロモーターである。一部の実施形態では、この７ｓｋは、７ｓｋ１（内因性ＧＳＴＡ４  ５’ＵＴＲを使用する７ｓｋのバリアント１）、７ｓｋ２（５’ＵＴＲ中のｋｏｚａｋ配列だけを使用する７ｓｋのバリアント２）���よび７ｓｋ３（ベータグロビン５’ＵＴＲを使用する７ｓｋのバリアント）からなる群から選択される。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ１は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ１は、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ２は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ２は、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ３は、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ３は、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターまたは７ｓｋプロモーターは、少なくとも１つの修飾を有する。一部の実施形態では、このプロモーターの少なくとも１つの修飾は、条件的調節を可能にするエレメントを含む。一部の実施形態では、このエレメントはｔｅｔ応答性プロモーターである。一部の実施形態では、このｔｅｔ応答性プロモーターは、Ｈ１プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む。一部の実施形態では、このＴｅｔＲは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＴｅｔＯは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＨ１−ＴｅｔＯは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターの少なくとも１つの修飾は、自己調節を可能にする部位を含む。一部の実施形態では、この自己調節部位は、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、この少なくとも１つのターミネーター配列は、ＳＶ４０または合成ポリＡ（ＳＰＡ）配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＶ４０の１２０（配列番号１２３）ま���は２４０（配列番号１２２）塩基対の配列である。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＰＡの４９塩基対の配列である。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列をさらに含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列は、配列番号１または２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態では、このＲＮＡ配列は、６．９４７または６．９６７からなる群から選択される。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、少なくとも１つの修飾を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９中の少なくとも１つの修飾は、切断配列中の変更を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３ａ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２およびＣ２ｃ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、この切断配列中の変更は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、このＴ２Ａは、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＥ２Ａは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＦ２Ａは、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９中の少なくとも１つの修飾は、細胞における発現のために最適化されたコドンを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、���胞周期依存的タンパク質とインフレームで作動可能に融合したリンカー配列（Ｃａｓ９融合物）をさらに含む。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質は、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はジェミニンである。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトジェミニンである。一部の実施形態では、このヒトジェミニンは、１〜１１０位のアミノ酸を含む（ｈＧｅｍ（１−１１０））。一部の実施形態では、このｈＧｅｍ（１−１１０）は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はＣｄｔ１である。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトＣｄｔ１である。一部の実施形態では、このヒトＣｄｔ１は、３０〜１２０位のアミノ酸を含む（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））。一部の実施形態
では、このｈＣｄｔ１（３０−１２０）は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９融合物は、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、ユビキチンタンパク質とインフレームで作動可能に融合している（Ｕｂ−Ｃａｓ９）。一部の実施形態では、このＵｂ−Ｃａｓ９は、少なくとも１つのＮ末端修飾を有する。一部の実施形態では、このＮ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９は、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このユビキチンタンパク質は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、ＳａＣａｓ９ニッカーゼをさらに含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、ドナー鋳型配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのベクターは、配列番号６２または６７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このドナー鋳型配列は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を修正する。一部の実施形態では、この少なくとも１つの遺伝子突然変異は、ｒｄ１０またはｒｄ１２である。一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６３または６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６５または６６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧ、ＧＮ１９ＮＧＧ、ＣＮ１９ＮＧＧまたはＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞は網膜光受容体細胞である。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。一部の実施形態では、この細胞は網膜神経節細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞はがん性細胞である。一部の実施形態では、このがん性細胞において細胞増殖は阻害または低減される。一部の実施形態では、このがん性細胞においてこのアポトーシスは増強または増加される。
【０２６０】
一部の実施形態では、本開示の主題は、細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更するステップを含む方法もまた提供する。
【０２６１】
一部の実施形態では、本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、Ｈ１プロモーター；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、真核生物細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更されるステップを含む方法もまた提供する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらに別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０２６２】
本開示の主題は、真核生物細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、この細胞は、１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、この方法は、双方向Ｈ１プロモーターを含むベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを細胞中に導入するステップであって、この双方向Ｈ１プロモーターは、ａ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメントであって、このｇＲＮＡは、ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメント；およびｂ）ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントであって、それによって、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断し、それによって、１つまたは複数の遺伝子産物の発現が変更される、制御エレメントを含むステップを含む方法もまた提供する。一態様では、この標的配列は、任意のヌクレオチドで始まる標的配列、例えば、Ｎ２０ＮＧＧであり得る。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＧＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＣＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＴＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧまたはＧＮ１９ＮＧＧを含む。別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらに別の態様では、このＣａｓ９タンパク質は、真核生物細胞における発現のためにコドン最適化されている。さらなる態様では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。
【０２６３】
一部の態様では、本開示の主題は、１つまたは複数のポリヌクレオチド、例えばまたは本明細書に記載されている１つもしくは複数のベクター、１つもしくは複数のその転写物、および／またはそれから転写された１つもしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、本開示の主題は、かかる方法によって産生された細胞、およびかかる細胞を含むまたはかかる細胞から産生される生物（例えば、動物、植物または真菌）をさらに提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（任意選択でガイド配列と複合体化した）ＣＲＩＳＰＲ酵素が、細胞に送達される。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法が、哺乳動物細胞または標的組織中に核酸を導入するために使用され得る。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素をコードする核酸を、培養物中または宿主生物中の細胞に投与するために使用され得る。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載されているベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソーム性のゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療手順のレビューについては、Anderson（１９９２年）Science  ２５６巻：８０８〜８１３頁；NabelおよびFelgner（１９９３年）TIBTECH  １１巻：２１１〜２１７頁；MitaniおよびCaskey（１９９３年）TIBTECH  １１巻：１６２〜１６６頁；Dillon（１９９３年）TIBTECH  １１巻：１６７〜１７５頁；Miller（１９９２年）Nature  ３５７巻：４５５〜４６０頁；Van  Brunt（１９９８年）Biotechnology  ６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁；Vigne（１９９５年）Restorative  Neurology  and  Neuroscience  ８巻：３５〜３６頁；KremerおよびPerricaudet（１９９５年）British  Medical  Bulletin  ５１巻（１号）：３１〜４４頁；Haddadaら（１９９５年）Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology.  DoerflerおよびBohm（編）；ならびにYuら（１９９４年）Gene  Therapy  １巻：１３〜２６頁を参照のこと。
【０２６４】
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤により増強されるＤＮＡ取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオン性および中性の脂質には、Felgner、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４の脂質が含まれる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ投与）または標的組織（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）への送達であり得る。
【０２６５】
標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体、例えば、イムノリピド（immunolipid）複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal（１９９５年）Science  ２７０巻：４０４〜４１０頁；Blaeseら（１９９５年）Cancer  Gene  Ther.  ２巻：２９１〜２９７頁：Behrら（１９９４年）Bioconjugate  Chem.  ５巻：３８２〜３８９頁；Remyら（１９９４年）Bioconjugate  Chem.  ５巻：６４７〜６５４頁；Gaoら（１９９５年）Gene  Therapy  ２巻：７１０〜７２２頁；Ahmadら（１９９２年）Cancer  Res.  ５２巻：４８１７〜４８２０頁；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号）。
【０２６６】
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、身体中の特異的細胞にウイルスを標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得（ｉｎ  ｖｉｖｏ）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処置するために使用され得、修飾された細胞は、患者に任意選択で投与され得る（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベースのシステムは、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。宿主ゲノムにおける組み込みは、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる場合が多い、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法を用いて可能である。さらに、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察されている。
【０２６７】
レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を取り込み、標的細胞の潜在的標的集団を増大させることによって変更され得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させ、典型的には高いウイルス力価を生じることができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力を有するシス作用性の長末端リピートで構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これらのベクターは次いで、恒久的な導入遺伝子発現を提供するために、標的細胞中に治療遺伝子を組み込むために使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくベクターが含まれる（例えば、Buchscherら（１９９２年）J.  Virol.  ６６巻：２７３１〜２７３９頁；Johannら（１９９２年）J.  Virol.  ６６巻：１６３５〜１６４０頁；Sommnerfeltら（１９９０年）J.  Virol.  １７６巻：５８〜５９頁；Wilsonら（１９８９年）J.  Virol.  ６３巻：２３７４〜２３７８頁；Millerら（１９９１年）J.  Virol.  ６５巻：２２２０〜２２２４頁；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００）。一過的な発現が好まれる適用では、アデノウイルスベースのシステムが使用され得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価およびレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に産生できる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、細胞を標的核酸で形質導入するためにも使用され得る（例えば、Westら（１９８７年）Virology  １６０巻：３８〜４７頁；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin（１９９４年）Human  Gene  Therapy  ５巻：７９３〜８０１頁；Muzyczka（１９９４年）J.  Clin.  Invest.  ９４巻：１３５１頁）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら（１９８５年）Mol.  Cell.  Biol.  ５巻：３２５１〜３２６０頁；Tratschinら（１９８４年）Mol.  Cell.  Biol.  ４巻：２０７２〜２０８１頁；HermonatおよびMuzyczka（１９８４年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  ８１巻：６４６６〜６４７０頁；ならびにSamulskiら（１９８９年）J.  Virol.  ６３巻：０３８２２〜３８２８頁を含むいくつかの刊行物中に記載されている。
【０２６８】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞系を産生することによって生成される。これらのベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主中への引き続く組み込みに必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるポリヌクレオチド（複数可）のための発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みに必要な、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。この細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスもまた感染し得る。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって低減され得る。細胞への核酸の送達のためのさらなる方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００３００８７８１７を参照のこと。
【０２６９】
一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターで一過的または非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、対象中に天然に存在しながらトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される。一部の実施形態では、この細胞は、対象から採取された細胞、例えば細胞系に由来する。組織培養のための広範な種々の細胞株が、当該分野で公知である。細胞株の例には、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨｅＬａ  Ｂ、ＨｅＬａ  Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３  Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ  ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ  Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ  Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−ＭｅＩ  １−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＤＣＫ  ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ  ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ  ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック変種が含まれるがこれらに限定されない。細胞株は、当業者に公知の種々の源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ、Ｖａ．）を参照のこと）。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１つまたは複数のベクター由来配列を含む新たな細胞系を樹立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素で一過的にトランスフェクトされ（例えば、１つもしくは複数のベクターの一過的なトランスフェクション、またはＲＮＡによるトランスフェクションによって）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を介して修飾された細胞は、修飾を含有するが任意の他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞系を樹立するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つもしくは複数のベクターで一過的もしくは非一過的にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株は、１つまたは複数の試験化合物を調査する際に使用される。
【０２７０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている１つまたは複数のベクターは、非ヒトトランスジェニック動物を産生するために使用される。一部の実施形態では、このトランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラットまたはウサギである。ある特定の実施形態では、生物または対象は植物である。トランスジェニック動物を産生するための方法は、当該分野で公知であり、一般に、本明細書に記載されているような細胞トランスフェクションの方法で始まる。
【０２７１】
一態様では、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る、真核生物細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ヒトまたは非ヒト動物から細胞または細胞の集団を試料採取するステップ、および細胞（単数または複数）を修飾するステップを含む。培養するステップは、任意の段階でｅｘ  ｖｉｖｏで行われ得る。細胞（単数または複数）はさらに、非ヒト動物中に再導入され得る。
【０２７２】
一態様では、本開示の主題は、真核生物細胞において標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすために標的ポリヌクレオチドにＣＲＩＳＰＲ複合体を結合させ、それによって、標的ポリヌクレオチドを修飾するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０２７３】
一態様では、本開示の主題は、真核生物細胞におけるポリヌクレオチドの発現を修飾する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、結合がポリヌクレオチドの発現の増加または減少を生じるように、ポリヌクレオチドにＣＲＩＳＰＲ複合体を結合させるステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０２７４】
一態様では、本開示の主題は、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数のエレメントを使用するための方法を提供する。本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを修飾するための有効な手段を提供する。本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多様な細胞型において標的ポリヌクレオチドを修飾（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）することを含む広範な種々の有用性を有する。このように、本開示の主題のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患診断および予後判定において、広範な適用を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体化したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
【０２７５】
ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核生物細胞にとって内因性または外因性の任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、この標的ポリヌクレオチドは、真核生物細胞の核中に存在するポリヌクレオチドであり得る。この標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列または非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に束縛されることは望まないが、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列と会合すべきであると考えられる。ＰＡＭについての正確な配列および長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素に依存して異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２〜５塩基対の配列である。ＰＡＭ配列の例は、以下の実施例のセクションで与えられ、当業者は、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素との使用のためのさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
【０２７６】
標的ポリヌクレオチドの例には、生化学的シグナル伝達経路と関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。標的ポリヌクレオチドの例には、疾患関連遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。「疾患関連」遺伝子またはポリヌクレオチドとは、非疾患対照の組織または細胞と比較して、疾患罹患組織に由来する細胞において異常なレベルまたは異常な形態で転写または翻訳産物を生じている、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。これは、異常に高いレベルで発現される遺伝子であり得る；これは、異常に低いレベルで発現される遺伝子であり得、ここで、変更された発現は、疾患の出現および／または進行と相関する。疾患関連遺伝子は、疾患の原因を直接担うまたは疾患の原因を担う遺伝子（複数可）と連鎖不平衡である、突然変異（複数可）または遺伝的変異を保有する遺伝子もまた指す。転写されたまたは翻訳された産物は、既知または未知であり得、正常または異常なレベルであり得る。
【０２７７】
本開示の主題の実施形態は、遺伝子をノックアウトすること、遺伝子を増幅すること、およびＤＮＡ反復不安定性および神経学的障害と関連する特定の突然変異を修復することに関する方法および組成物にも関する（Robert  D.  Wells、Tetsuo  Ashizawa、Genetic  Instabilities  and  Neurological  Diseases、第２版、Academic  Press、２０１１年１０月１３日-Medical）。タンデムリピート配列の特定の態様は、２０よりも多いヒト疾患を担うことが見出されている（McIvorら（２０１０年）RNA  Biol.  ７巻（５号）：５５１〜８頁）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ゲノム不安定性のこれらの欠損を修正するために利用され得る。
【０２７８】
本開示の主題のさらに別の態様では、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、Traboulsi編（２０１２年）Genetic Diseases of the Eye、第２版、OxfordUniversity Pressにさらに記載されているいくつかの遺伝的突然変異から生じる眼の欠損を修正するために使用され得る。
【０２７９】
本開示の主題のいくつかのさらなる態様は、広範な遺伝性疾患と関連する欠損を修正することに関する。例えば、遺伝性脳疾患には、副腎白質ジストロフィー、脳梁無形成、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病および他のトリプレットリピート障害、リー病、レッシュ・ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチーならびにＮＩＮＤＳ脳梁欠損症が含まれ得るがこれらに限定されない。
【０２８０】
一部の実施形態では、この状態は、新生物であり得る。一部の実施形態では、この状態は、加齢性黄斑変性症であり得る。一部の実施形態では、この状態は、統合失調症であり得る。一部の実施形態では、この状態は、トリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態では、この状態は、脆弱Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態では、この状態は、セクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態では、この状態は、プリオン関連障害であり得る。一部の実施形態では、この状態は、ＡＬＳであり得る。一部の実施形態では、この状態は、薬物依存であり得る。一部の実施形態では、この状態は、自閉症であり得る。一部の実施形態では、この状態は、アルツハイマー病であり得る。一部の実施形態では、この状態は、炎症であり得る。一部の実施形態では、この状態は、パーキンソン病であり得る。
【０２８１】
パーキンソン病と関連するタンパク質の例には、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１およびＮＵＲＲ１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２８２】
依存関連タンパク質の例には、例えば、ＡＢＡＴが含まれ得る。
【０２８３】
炎症関連タンパク質の例には、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によってコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によってコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によってコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも呼ばれる）またはＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によってコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質が含まれ得る。
【０２８４】
心血管疾患関連タンパク質の例には、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）またはＣＴＳＫ（カテプシンＫ）が含まれ得る。
【０２８５】
アルツハイマー病関連タンパク質の例には、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によってコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によってコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）またはＵＢＡ３遺伝子によってコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）が含まれ得る。
【０２８６】
自閉症スペクトラム障害と関連するタンパク質の例には、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によってコードされるベンゾジアゼピン（benzodiazapine）受容体（末梢）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子によってコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）（ＭＦＲ２とも呼ばれる）、ＦＸＲ１遺伝子によってコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）またはＦＸＲ２遺伝子によってコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）が含まれ得る。
【０２８７】
黄斑変性症と関連するタンパク質の例には、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によってコードされるＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）またはＣＣＬ２遺伝子によってコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）配位子２タンパク質（ＣＣＬ２）が含まれ得る。
【０２８８】
統合失調症と関連するタンパク質の例には、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、およびそれらの組合せが含まれ得る。
【０２８９】
腫瘍抑制に関与するタンパク質の例には、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症突然変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症およびＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３またはＮｏｔｃｈ４が含まれ得る。
【０２９０】
セクレターゼ障害と関連するタンパク質の例には、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（前咽頭欠損１ホモログＢ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））またはＢＡＣＥ１（ベータ−部位ＡＰＰ切断酵素１）が含まれ得る。
【０２９１】
筋萎縮性側索硬化症と関連するタンパク質の例には、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫において融合（fused in sarcoma））、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）およびＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、ならびにそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【０２９２】
プリオン病と関連するタンパク質の例には、ＳＯＤＩ（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫において融合）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）およびＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、ならびにそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【０２９３】
プリオン障害における神経変性状態と関連するタンパク質の例には、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗性転写因子）、ＡＣＰＰ（酸性ホスファターゼ前立腺）、ＡＣＴＡ２（アクチンアルファ２平滑筋大動脈）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）またはＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体またはアルファ−１Ｄアドレノレセプター）が含まれ得る。
【０２９４】
免疫不全と関連するタンパク質の例には、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；またはＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］が含まれ得る。
【０２９５】
トリヌクレオチドリピート障害と関連するタンパク質の例には、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチンチン）、またはＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィー−タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が含まれる。
【０２９６】
神経伝達障害と関連するタンパク質の例には、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（ニューロン））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン、アルファ−２Ａ−、受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン、アルファ−２Ｃ−、受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）またはＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が含まれる。
【０２９７】
神経発達関連配列の例には、例えば、Ａ２ＢＰ１（アタキシン２結合タンパク質１）、ＡＡＤＡＴ（アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＡＮＡＴ（アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＡＢＡＴ（４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１）またはＡＢＣＡ１３（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１３）が含まれる。
【０２９８】
本発明のシステムで処置可能な好ましい状態のさらなる例は、以下から選択され得る：アイカルディ・グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン・ハーンドン・ダドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩ型およびＩＩＩ型）；アルストレーム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−サラセミア；両側性視神経萎縮症および（乳幼児）視神経萎縮症１型；網膜芽細胞腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１（ＣＯＦＳ１）；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ランゲ症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群（Fryns Syndrome）；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸代謝異常症（Organic Acidemias）；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群；ムコリピドーシスＩＩ；乳幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性；ジャーベル・ランゲニールセン症候群；接合部型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（乳幼児）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群およびＮＡＲＰ；レッシュ・ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルベーガー症候群スペクトラム；脳の鉄沈着障害を伴う神経変性；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン・ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ  １／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン・マクダーミド症候群；糖原病ＩＩ型（ポンペ病）（乳幼児）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス・レムリ・オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症、乳幼児発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；タナトフォリック骨異形成症１型；ＶＩ型コラーゲン関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ・ヒルショルン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；ならびに色素性乾皮症。
ＩＩ．神経変性疾患を処置するための方法
【０２９９】
本開示の主題は、それを必要とする対象において網膜ジストロフィー、角膜ジストロフィー、マイクロサテライト増大疾患、がんおよび神経変性疾患からなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、（ａ）ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーター（例えば、オルソロガスなＨ１プロモーターまたは７ｓｋ）であって、このｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼ（例えば、修飾されたＣａｓ９タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）９（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、非Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ−１システムなど）を提供するステップであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに（ｂ）有効量のこのシステムを対象に投与するステップを含む方法もまた提供する。一部の実施形態では、このシステムは、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、配列番号１２または３２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、マウスまたはラットに由来する。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターは、配列番号８４〜１１９からなる群に示されるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＨ１プロモーターは、ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；およびｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメントを含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、ヒト、マウスまたはラットの７ｓｋプロモーターである。一部の実施形態では、この７ｓｋは、７ｓｋ１（内因性ＧＳＴＡ４  ５’ＵＴＲを使用する７ｓｋのバリアント１）、７ｓｋ２（５’ＵＴＲ中のｋｏｚａｋ配列だけを使用する７ｓｋのバリアント２）および７ｓｋ３（ベータグロビン５’Ｕ���Ｒを使用する７ｓｋのバリアント）からなる群から選択される。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ１は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ１は、配列番号６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ２は、配列番号４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ２は、配列番号７に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヒト７ｓｋ３は、配列番号５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このマウス７ｓｋ３は、配列番号８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このオルソロガスなＨ１プロモーターまたは７ｓｋプロモーターは、少なくとも１つの修飾を有する。一部の実施形態では、このプロモーターの少なくとも１つの修飾は、条件的調節を可能にするエレメントを含む。一部の実施形態では、このエレメントはｔｅｔ応答性プロモーターである。一部の実施形態では、このｔｅｔ応答性プロモーターは、Ｈ１プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む。一部の実施形態では、このＴｅｔＲは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＴｅｔＯは、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＨ１−ＴｅｔＯは、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターの少なくとも１つの修飾は、自己調節を可能にする部位を含む。一部の実施形態では、この自己調節部位は、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、この少なくとも１つのターミネーター配列は、ＳＶ４０または合成ポリＡ（ＳＰＡ）配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＶ４０の１２０（配列番号１２３）または２４０（配列番号１２２）塩基対の���列である。一部の実施形態では、このターミネーター配列は、ＳＰＡの４９塩基対の配列である。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列をさらに含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む。一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列は、配列番号１または２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態では、このＲＮＡ配列は、６．９４７または６．９６７からなる群から選択される。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、少なくとも１つの修飾を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９中の少なくとも１つの修飾は、切断配列中の変更を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１３ａ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２およびＣ２ｃ３からなる群から選択される。一部の実施形態では、この切断配列中の変更は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択される。一部の実施形態では、このＴ２Ａは、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＰ２Ａは、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＥ２Ａは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＦ２Ａは、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９中の少なくとも１つの修飾は、細胞における発現のために最適化されたコドンを含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、細胞周期依存的タンパク質とインフレー���で作動可能に融合したリンカー配列（Ｃａｓ９融合物）をさらに含む。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質は、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はジェミニンである。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトジェミニンである。一部の実施形態では、このヒトジェミニンは、１〜１１０位のアミノ酸を含む（ｈＧｅｍ（１−１１０））。一部の実施形態では、このｈＧｅｍ（１−１１０）は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はＣｄｔ１である。一部の実施形態では、この細胞周期依存的タンパク質はヒトＣｄｔ１である。一部の実施形態では、このヒトＣｄｔ１は、３０〜１２０位のアミノ酸を含む（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））。一部の実施形態では、このｈＣｄｔ１（３０−１２０）
は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９融合物は、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このＣａｓ９は、ユビキチンタンパク質とインフレームで作動可能に融合している（Ｕｂ−Ｃａｓ９）。一部の実施形態では、このＵｂ−Ｃａｓ９は、少なくとも１つのＮ末端修飾を有する。一部の実施形態では、このＮ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９は、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このユビキチンタンパク質は、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、ＳａＣａｓ９ニッカーゼをさらに含む。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、ドナー鋳型配列をさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのベクターは、配列番号６２または６７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このドナー鋳型配列は、少なくとも１つの遺伝子突然変異を修正する。一部の実施形態では、この少なくとも１つの遺伝子突然変異は、ｒｄ１０またはｒｄ１２である。一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６３または６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、この少なくとも１つのベクターは、配列番号６５または６６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、このプロモーターは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している。一部の実施形態では、この標的配列は、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧ、ＧＮ１９ＮＧＧ、ＣＮ１９ＮＧＧまたはＴＮ１９ＮＧＧを含む。一部の実施形態では、この細胞は、真核生物細胞または非真核生物細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞は網膜光受容体細胞である。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物はロドプシンである。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。一部の実施形態では、このシステムは、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する。一部の実施形態では、このヌクレアーゼシステムは、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す。一部の実施形態では、この１つまたは複数の遺伝子産物の発現は減少する。一部の実施形態では、この細胞は網膜神経節細胞である。一部の実施形態では、この真核生物細胞はがん性細胞である。一部の実施形態では、このがん性細胞において細胞増殖は阻害または低減される。一部の実施形態では、このがん性細胞においてこのアポトーシスは増強または増加される。一部の実施形態では、この疾患は角膜ジストロフィーである。一部の実施形態では、この疾患は網膜ジストロフィーである。一部の実施形態では、この網膜ジストロフィーは、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される。一部の実施形態では、この角膜ジストロフィーは、上皮基底膜ジストロフィー、上皮反復性びらんジストロフィー、上皮下粘液性角膜ジストロフィー、メースマン角膜ジストロフィー、リッシュ角膜上皮ジストロフィー、膠様滴状角膜ジストロフィー、ライス・ビュックラー角膜ジストロフィー、ティール・ベーンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー１型（古典的）、格子状角膜ジストロフィー２型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩ型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩ／ＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩＶ型、多形性（角膜）アミロイドーシス、顆粒状角膜ジストロフィー１型、顆粒状角膜ジストロフィー２型、斑状角膜ジストロフィー、シュナイダー角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、角膜斑点状ジストロフィー、後部無定形角膜ジストロフィー、フランソワ中心部雲状変性、プレデスメ角膜ジストロフィー、フックス角膜内皮ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィーおよびＸ連鎖角膜内皮ジストロフィーからなる群から選択される。一部の実施形態では、このマイクロサテライト増大疾患は、眼裂狭小、眼瞼下垂および眼角贅皮逆位合指症、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性中枢性低換気症候群、ハダド症候群、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、フックス角膜内皮ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ振戦失調症候群）、手足性器症候群、ＨＤ（ハンチントン病）、全前脳胞症、成長ホルモン分泌不全を伴う精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウエスト症候群、パーティントン症候群、眼咽頭型筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）および合多指症からなる群から選択される。一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、移植、注射またはウイルスによって行われる。一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、網膜下注射によって行われる。一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、外用的に、血管内に、皮内に、経真皮的に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、鼻腔内に、皮下に、局部的に、経皮的に、気管内に、腹腔内に、動脈内に、膀胱内に、腫瘍内に、腫瘍周囲に、吸入により、全身的に、灌流により、洗浄により、注射を介して直接、または投与および製剤を介して経口で行われる。一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、眼の表面に外用的に行われる。一部の実施形態では、この対象に投与するステップは、角膜、強膜上もしくはその外側で、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後空間に、または眼瞼中もしくはその周囲で行われる。一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される。一部の実施形態では、この抗がん剤は、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される。一部の実施形態では、この対象は、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される。一部の実施形態では、この抗がん療法は、放射線療法、化学療法または手術である。一部の実施形態では、このがんは固形腫瘍である。一部の実施形態では、このがんは、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、このがんは脳がんである。一部の実施形態では、この全身投与は、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される。一部の実施形態では、この対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、この哺乳動物はヒトである。
【０３００】
一部の実施形態では、本開示の主題は、それを必要とする対象において眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、（ａ）ｉ）ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したＨ１プロモーターであって、このｇＲＮＡは、対象の細胞においてＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、このＤＮＡ分子は、細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、Ｈ１プロモーター；およびｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメントを含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを提供するステップであって、構成要素（ｉ）および（ｉｉ）は、このシステムの同じまたは異なるベクター上に位置し、このｇＲＮＡは、標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、このＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子を切断して、１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップ；ならびに（ｂ）有効量のこのシステムを対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０３０１】
「神経変性疾患、障害または状態」とは、ニューロンまたは他の神経細胞、例えば、網膜光受容体細胞の変性または機能不全と関連する疾患、障害または状態（ニューロパチーを含む）を意味する。神経変性疾患、障害または状態は、ニューロンの減少した機能もしくは機能不全、またはニューロンもしくは他の神経細胞の喪失が生じ得る、任意の疾患、障害または状態であり得る。
【０３０２】
かかる疾患、障害または状態には、緑内障、および神経系の神経変性疾患、障害または状態、例えば以下、または以下と関連するもの：筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、仮性球麻痺、進行性球麻痺、脊髄性筋萎縮症、遺伝性筋萎縮症、無脊椎動物椎間板症候群（invertebrate disk syndrome）、頚椎症、神経叢障害、胸郭出口破壊症候群（thoracic outlet destruction syndrome）、末梢神経障害、ポルフィリン症（prophyria）、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、パーキンソンプラス病（Parkinson's-plus disease）、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、前頭側頭葉型認知症、脱髄性疾患、ギラン・バレー症候群、多発性硬化症、シャルコー・マリー・トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ピック病、てんかんおよびＡＩＤＳ認知症複合（AIDS demential complex）が含まれるがこれらに限定されない。
【０３０３】
神経系の他の神経変性疾患、障害または状態、例えば以下、または以下と関連するもの：アルコール依存症、アレキサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病（Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease）としても公知）、カナバン病、コケイン症候群、糖尿病性ニューロパチー、前頭側頭葉変性症、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（脊髄小脳失調症３型）、ウェット型またはドライ型黄斑変性症、ニーマン・ピック病、ペリツェウス・メルツバッハ病、光受容体変性疾患、例えば、網膜色素変性症および関連疾患、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する脊髄の亜急性連合変性症、シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病（バッテン病としても公知）、脊髄小脳失調症（変動する特徴を有する複数の型）、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病ならびに脊髄ろう。
【０３０４】
眼関連神経変性の例には、緑内障、格子状ジストロフィー、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、ウェット型またはドライ型ＡＭＤと関連する光受容体変性、他の網膜変性症、例えば、網膜色素変性症（ＲＰ）、視神経ドルーゼン、視神経症、および視神経炎、例えば、多発性硬化症から生じる視神経炎が含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、この眼の神経変性疾患は、緑内障、網膜変性症および加齢性黄斑変性症からなる群から選択される。一部の実施形態では、この眼の神経変性疾患は網膜色素変性症（ＲＰ）である。
【０３０５】
本開示の主題に従って予防または処置され得る異なる型の緑内障の非限定的な例には、原発性緑内障（原発性開放隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障、慢性単純緑内障および単性緑内障としても公知）、低眼圧緑内障、原発性閉塞隅角（angle-closure）緑内障（原発性閉塞隅角（closed-angle）緑内障、狭隅角緑内障、瞳孔ブロック緑内障および急性うっ血性緑内障としても公知）、急性閉塞隅角緑内障、慢性閉塞隅角緑内障、間欠性閉塞隅角緑内障、慢性開放閉塞隅角（open-angle  closure）緑内障、色素性緑内障、落屑緑内障（偽落屑緑内障または嚢性緑内障としても公知）、発達緑内障（例えば、原発性先天性緑内障および乳児緑内障）、続発性緑内障（例えば、炎症性緑内障（例えば、ブドウ膜炎およびフックス虹彩異色性毛様体炎（Fuchs  heterochromic  iridocyclitis）））、水晶体起因性（phacogenic）緑内障（例えば、成熟白内障を伴う閉塞隅角緑内障、水晶体嚢の破裂に続発する水晶体過敏性（phacoanaphylactic）緑内障、水晶体毒性網目構造遮断（phacotoxic  meshwork  blockage）に起因する水晶体融解性緑内障、および水晶体の亜脱臼）、眼内出血に続発する緑内障（例えば、前房出血、および溶血緑内障としても公知の溶血性緑内障（hemolytic  glaucoma））、外傷性緑内障（例えば、隅角後退緑内障、外傷性前房隅角後退（traumatic  recession  on  anterior  chamber  angle）、術後緑内障、無水晶体瞳孔ブロック（aphakic  pupillary  block）および毛様体ブロック緑内障）、血管新生緑内障、薬物誘導性緑内障（例えば、コルチコステロイド誘導性緑内障およびアルファ−キモトリプシン緑内障）、中毒性緑内障（toxic  glaucoma）、ならびに眼内腫瘍、網膜剥離、眼の重症化学熱傷および虹彩萎縮症と関連する緑内障が含まれる。ある特定の実施形態では、神経変性疾患、障害または状態は、過剰な血管新生と関連しない疾患、障害または状態、例えば、血管新生緑内障ではない緑内障である。
【０３０６】
本明細書で使用される場合、用語「障害」とは一般に、同定された標的もしくは経路のうち１つに対する化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量によって処置され得る任意の疾患、障害または状態を含む、同定された標的または経路のうち１つに対する化合物による処置から利益を得る任意の状態を指す。
【０３０７】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」は、かかる用語が適用される疾患、障害もしくは状態（例えば、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を引き起こす疾患または障害）、またはかかる疾患、障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状もしくは所見の進行を逆転、緩和、阻害すること、それらを予防すること、もしくはその可能性を低減させることを含み得る。一部の実施形態では、処置は、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を低減させる。例えば、処置は、処置を受ける前の対象または処置を受けない対象における網膜光受容体細胞の機能不全および／または死と比較して、網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６６％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも大きく低減させ得る。一部の実施形態では、処置は、対象における網膜光受容体細胞の機能不全および／または死を完全に阻害する。本明細書で使用される場合、「網膜光受容体細胞」は、光伝達が可能な、網膜中で見出される専門化した型のニューロンである。一部の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子産物はロドプシンである。
【０３０８】
一部の実施形態では、このシステムは、対象に投与するステップの前に、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる。一部の実施形態では、対象に投与するステップは、網膜下注射によって行われる。処置、投与または治療は、継続的または間欠性であり得る。継続的な処置、投与または治療とは、１または複数日の処置の中断を伴わない、少なくとも毎日の処置を指す。間欠性の処置もしくは投与、または間欠性様式での処置もしくは投与とは、継続的ではなく事実上周期性の処置を指す。本明細書に開示されている方法に従う処置は、疾患、障害もしくは状態の完全な解放もしくは治癒、または疾患、疾患もしくは状態の１つもしくは複数の症状の部分的寛解を生じ得、一時的または恒久的であり得る。用語「処置」は、予防、治療および治癒も包含する意図である。
【０３０９】
用語「有効量」または「治療有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療有効量は、対象および処置されている疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうち１つまたは複数に依存して変動し得、これらは、当業者によって容易に決定され得る。この用語は、本明細書に記載されているイメージング方法のいずれか１つによって検出のためのイメージを提供する用量にも適用される。具体的な用量は、選択される特定の薬剤、従うべき投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングされる組織、それが運搬される物理的送達システムのうち１つまたは複数に依存して変動し得る。
【０３１０】
用語「対象」および「患者」は、本明細書で互換的に使用される。その多くの実施形態において本明細書に開示されている方法によって処置される対象は、望ましくはヒト対象であるが、本明細書に記載されている方法は、用語「対象」に含まれることが意図される全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解すべきである。したがって、「対象」は、医学的目的、例えば、既存の状態もしくは疾患の処置、または状態もしくは疾患の発症を予防するための予防的処置のためにはヒト対象、あるいは医学的、獣医学的目的のため、または開発目的のためには動物対象を含み得る。適切な動物対象には、霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿など；ウシ（bovine）、例えば、ウシ（cattle）、雄ウシ（oxen）など；ヒツジ（ovine）、例えば、ヒツジ（sheep）など；ヤギ（caprine）、例えば、ヤギ（goat）など；ブタ（porcine）、例えば、ブタ（pig）、雄ブタ（hog）など；ウマ（equine）、例えば、ウマ（horse）、ロバ、シマウマなど；ヤマネコおよびイエネコを含むネコ（feline）；イヌ（dog）を含むイヌ（canine）；ウサギ、ノウサギなどを含むウサギ類；ならびにマウス、ラットなどを含むげっ歯類が含まれるがこれらに限定されない哺乳動物が含まれる。動物は、トランスジェニック動物であり得る。一部の実施形態では、この対象は、胎児、新生児、乳児、若年および成人対象が含まれるがこれらに限定されないヒトである。さらに、「対象」は、状態もしくは疾患に罹患しているまたは状態もしくは疾患に罹患していることが疑われる患者を含み得る。
ＩＶ．一般的定義
【０３１１】
本明細書で具体的な用語が使用されているが、これらは、一般的で記述的な意味でのみ使用され、限定目的で使用されるのではない。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示の主題が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０３１２】
長年の特許法の慣習に従い、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「この（the）」とは、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、「１つの（a）対象」に対する言及は、文脈が明らかに逆（例えば、複数の対象）を指さない限り、複数の対象を含む、などである。
【０３１３】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」および「含む（comprising）」は、文脈上他のものを要求しない限り、非排他的な意味で使用される。同様に、用語「含む（include）」およびその文法的変化形は、リスト中の項目の列挙が、列挙された項目を置換し得るまたは列挙された項目に追加され得る他の同様の項目の排除にならないように、非限定的であることを意図する。
【０３１４】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、特に示さない限り、量、サイズ、寸法、割合、形状、処方、パラメーター、パーセンテージ、パラメーター、数量、特徴を表す全ての数字、ならびに本明細書および特許請求の範囲において使用される他の数値は、用語「約」がその値、量または範囲と共に明示的に出現していない場合であっても、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。したがって、逆が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示される数的パラメーターは、正確ではなく正確である必要もないが、許容範囲、変換係数、四捨五入、測定誤差など、および本開示の主題によって得ることが求められる所望の特性に依存する当業者に公知の他の因子を反映して、おおよそ、および／または所望よりも大きいもしくは小さくてもよい。例えば、用語「約」は、値に言及する場合、特定された量から、一部の実施形態では±１００％、一部の実施形態では±５０％、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し得、したがって、変動は、開示されている方法を実施するためまたは開示されている組成物を使用するために適切である。
【０３１５】
さらに、用語「約」は、１つまたは複数の数字または数的範囲と合わせて使用される場合、ある範囲内の全ての数字を含む全てのかかる数字を指し、示された数値の上および下の境界を拡張することによってその範囲を修飾すると理解すべきである。終点による数的範囲の列挙は、その範囲内に含まれる全ての数、例えば、それらの分数を含む全整数（例えば、１〜５の列挙は、１、２、３、４および５、ならびにそれらの分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）、およびその範囲内の任意の範囲を含む。
【実施例】
【０３１６】
以下の実施例は、当業者に本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための手引きを提供するために含めたものである。本開示および当業者の一般的なレベルに照らして、当業者には、以下の実施例が単に例示的なものであること、ならびに、本開示の主題の範囲から逸脱することなく多数の変化、修飾、および変更を使用することができることが理解されよう。総合的な説明およびそれに従う特定の実施例は、単に例証するためのものであり、本開示の化合物を他の方法によって作製することをいかなる様式でも限定すると解釈されるものではない。
（実施例１）
背景
【０３１７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術の開発により、遺伝子編集の分野が改革され、遺伝子疾患を処置するための極めて大きく新しい手法がもたらされた。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを配列特異的に標的に送り込むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）で構成される。ＣＲＩＳＰＲ系による切断には、ｇＲＮＡのＤＮＡ配列に対する相補的な塩基対合、および標的部位の３’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである必要なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が必要である（Dalkara, D.ら、Science translational medicine、５巻、１８９ｒａ１７６頁（２０１３年）；Berns, KIら、Fundamental Virology（B.N. FieldsおよびKnipe, D.M.編）、５４５〜５６２頁（Raven Press、１９８６年））。現在、制限が最小であり最も一般的に使用されるＣａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であり、これは、配列ＮＧＧを認識し、したがって、ＣＲＩＳＰＲが標的にする配列は、Ｎ２０ＮＧＧである。多数の試験により、疾患突然変異をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて効率的に標的にできることが示されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９に基づく治療薬の開発は、安全性に関する懸念および送達に関する制約によって妨害されている。
【０３１８】
疾患突然変異のＣＲＩＳＰＲによる標的化は、多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏの状況において有効であること、ならびにマウスおよび他の動物試験を通じてｉｎ  ｖｉｖｏにおいても有効であることが示されているが、現行の手法は全て、主に送達に関する制約に起因して、まだ臨床使用には程遠い。ＡＡＶベクターは、眼への遺伝子療法注射に最も頻繁にかつ首尾よく使用されているウイルスベクターである（Swiech, L.ら、Nature biotechnology、３３巻、１０２〜１０６頁（２０１５年）；Jinek, M.ら、Science、３３７巻、８１６〜８２１頁（２０１２年）；Cong, L.ら、Science、３３９巻、８１９〜８２３頁（２０１３年）；Mali, P.ら、Science、３３９巻、８２３〜８２６頁（２０１３年））。いくつかの特徴により、ＡＡＶが最も魅力的な選択になっている：このウイルスは非病原性であり、分裂細胞および非分裂細胞のどちらにも感染し、発現を長期間持続させることができ、また、その臨床試験における安全性、有効性、および、全般的に毒性がないことの履歴に特に注目すべきである。さらに、特定のＡＡＶ血清型は、網膜下注射後に光受容体細胞を標的にすることに関して有効である。ＡＡＶベクターは、治療用ＣＲＩＳＰＲ構成成分を送達する安全な手段をもたらすものであるが、そのサイズが、ＡＡＶベクターの有用性を限定する１つの主要な技術的障害になっている。野生型ＡＡＶゲノムは、長さが約４．７ｋｂであり、組換えウイルスは、約５．２ｋｂまでをパッケージングすることができる（Mancuso, K.ら、Nature、４６１巻、７８４〜７８７頁（２００９年）；Beltran, WAら、Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America、１０９巻、２１３２〜２１３７頁（２０１２年））。このパッケージング容量により、単一のウイルスベクターに対して使用することができるＤＮＡの上限が規定される。
【０３１９】
従来の方法によってＣａｓ９およびｇＲＮＡを発現させるために必要なＤＮＡは、５．２ｋｂを超える：Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（約０．５ｋｂ）、ＳｐＣａｓ９（約４．１ｋｂ）、Ｐｏｌ  ＩＩターミネーター（約０．２ｋｂ）、Ｕ６プロモーター（約０．３ｋｂ）、およびｇＲＮＡ（約０．１ｋｂ）。ＡＡＶ送達挑戦のための１つの手法は、２ベクター手法である：Ｃａｓ９を送達するための１つのＡＡＶベクター、およびｇＲＮＡのための別のＡＡＶベクター（Petrs-Silva, H.ら、Molecular therapy : thejournal of the American Society of Gene Therapy、１９巻、２９３〜３０１頁（２０１１年））。しかし、２重ＡＡＶ手法では、杆体を重要な例外として網膜細胞において発現することが見出されている遺伝子である低分子マウスＭｅｃｐ２プロモーターを利用し（Song, C.ら、Epigenetics & chromatin、７巻、１７頁（２０１４年）；Jain, D.ら、Pediatric neurology、４３巻、３５〜４０頁（２０１０年））、これにより、ウイルスによる送達の負荷量が増加することに起因する潜在的な毒性に加えて、共送達手法では、推測的に、ＬＣＡ突然変異の大部分を標的にできない可能性が高い。これは、他の遺伝子療法により媒介されるゲノム編集のために潜在的に実行可能な手法であるが、本明細書では、網膜の遺伝子編集のために、効率が上昇し、光受容体が特異的に標的にされ、かつ、ウイルス負荷送達による潜在的な毒性が低減されるはずである、単一ベクター手法を提供する。
【０３２０】
ｇＲＮＡ転写を方向付けるために、より伝統的に使用されているＵ６プロモーターではなく、Ｈ１プロモーターを使用することにより、利用可能なＣＲＩＳＰＲ遺伝子標的化の余地をほぼ倍増させることが可能になることが最近報告された（Ranganathan, Vら、Nature communications、５巻、４５１６頁（２０１４年））。注目すべきことに、オフターゲットカットの傾向が低いことも検出され、これにより、Ｈ１プロモーターが治療手法としてより好都合なものであることが示唆される。これらの試験中、ゲノムにおいて内在性Ｈ１ＲＮＡ遺伝子のごく近くにタンパク質コード遺伝子（ＰＡＲＰ−２）が存在することが認められた（Baer, M.ら、Nucleic acids research、１８巻、９７〜１０３頁（１９９０年）；Myslinski, E.ら、Nucleic acids research、２９巻、２５０２〜２５０９頁（２００１年）；Ame JCら、J Biol Chem. ２７６巻（１４号）：１１０９２〜９頁（２００１年））。Ｈ１ＲＮＡ（ｐｏｌ  ＩＩＩ  ＲＮＡ転写物）の開始とＰＡＲＰ−２遺伝子（ｐｏｌ  ＩＩ転写物）の開始の間の配列は２３０ｂｐであり（図２）、これにより、この比較的小さな配列が小型の双方向プロモーターとして機能し得ることが示される。Ｈ１プロモーターのこれらの思いがけない性質により、ＣＲＩＳＰＲ構成成分の両方を単一のＡＡＶ中にパッケージングすることのサイズに関するハードルが克服され得ることが仮定された。
【０３２１】
Ａ．５’ＵＴＲ修飾を使用したＨ１双方向ｐｏｌ  ＩＩ発現の増強。
【０３２２】
Ｈ１を双方向ｐｏｌ  ＩＩ／ＩＩＩプロモーターとして開発するため、また、ｐｏｌｌ  ＩＩＩ活性はすでによく特徴付けられているので、ｅＧＦＰレポーター構築物を創出して、そのｐｏｌ  ＩＩ活性をより良く最適化した（図１Ａ）。ヒト細胞（ＨＥＫ２９３）およびマウス細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）では、弱いが明白に検出可能なＧＦＰ蛍光が実証され、これにより、Ｈ１プロモーターによりｐｏｌ  ＩＩ発現を方向付けることができることが示される。このＧＦＰレポーター系を使用し、系内の３つの変動する構成成分：（ａ）プロモーター配列、（ｂ）５’ＵＴＲ、および（ｃ）ターミネーター配列を評価することによって、小型であることを維持しながらｐｏｌ  ＩＩ発現を増大させるための実験を実施した。
【０３２３】
異なるターミネーター配列を評価するために、７つの異なる配列を試験した。ＳＶ４０（２４０ｂｐおよび１２０ｂｐ）ターミネーターおよび４９ｂｐの合成ポリ（Ａ）配列（ＳＰＡ）はどちらもＧＦＰ発現、発現について機能的であるが、ＳＰＡ配列は同様には機能しないことが見出された。
【０３２４】
５’ＵＴＲの修飾によって翻訳効率を最適化することによりレポーター発現が改善されるかどうかを探究した。ベータ−グロビン５’ＵＴＲ配列から取得した５０ｂｐの配列を挿入することにより、レポーター発現を有意に改善することができることが見出され、この概念と一致して、強力なＫｏｚａｋ配列をコードする９塩基（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’配列番号１）を単純に挿入することがこれらのレベルに近づけるのに十分であった。
【０３２５】
また、翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列であると同定された配列を使用すること（Wellensiekら、Nature Methods、１０巻、７４７〜７５０頁（２０１３年））も有効であった（６．９４７、および６．９６７）。
【０３２６】
Ｋｏｚａｋ配列に焦点を当てて、強力な９塩基コンセンサス（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’配列番号１）またはより小さな６塩基コンセンサス（５’−ＧＣＣＡＣＣ−３’配列番号２）によりＧＦＰ発現を増強することができることが見出された（図１）。異なるＨ１双方向配列にわたって一貫して、９塩基配列がわずかにより良好であった。
【０３２７】
Ｂ．異なるオルソロガス配列の使用による双方向発現のモジュレート。
【０３２８】
異なる生物体に由来するＨ１プロモーター配列を試験することにより、マウス配列（１７６ｂｐ）およびラット配列（２０７ｂｐ）のどちらによってもヒトＨ１プロモーターよりも強力なＧＦＰ発現（それぞれ約７倍および約６倍）を駆動することができることが示された。この結果は、ヒト配列がより高レベルで発現したことが報告された他の試験、例えば、Hungら、（２００６年）、Biochemical and Biophysical ResearchCommunication、３３９巻：１０３５〜１０４２頁で報告された結果に反する。
【０３２９】
Ｈ１プロモーター配列を使用し、３６の真獣類哺乳動物のオルソロガスな領域のゲノムアラインメントを実施した。これらにより、双方向発現を微調整するために使用することができる追加的な配列（配列番号８４〜１１９）がもたらされる。
Ｃ．ｐｏｌ  ＩＩ活性およびｐｏｌ  ＩＩＩ活性の両方を有する新規の小型の双方向プロモーター配列
【０３３０】
Ｈ１双方向プロモーター配列により、ｐｏｌ  ＩＩ遺伝子およびｐｏｌ  ＩＩＩ遺伝子の両方の発現を有効に方向付けることができることを同定した後、他の潜在的に小型の双方向配列のゲノムを検索した。
【０３３１】
カスタムパールスクリプトを開発して、ｐｏｌ  ＩＩＩ遺伝子の５’転写開始部位とｐｏｌ  ＩＩ遺伝子の５’転写開始部位を比較した。結果を、反対方向に向いたもの（多岐にわたる転写）についてフィルタリングした。入力ファイルをゲノムファイルまたは転写データ（ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩ  ＣｈＩＰ部位）にアノテートすることができる。ヒトゲノムから同定されたＣｈＩＰ部位の一部として、これだけに限定されないが：
ＡＬＯＸＥ３−ｔＲＮＡ（ｌｙｓ）：
TCTTTCCGCTCCAGGACCGCCCTGGGCCTGCAGGATCCTGGGCGGGAGCCCAGGTGTCCGGGATCTGGGCCACTAGGGACTGGGGAGGAACCTCTCAGAGAAGCCCATAGCCCGCAGCGGCCCCGCGCGGCCGGTTCCGGCGCCGCACTGTTCCAGCCTCTACTATGGTACAGTCCCTGCGTCGCAGCCTCGGCGGGGGCTCTAAGAACGGGAGGCAGAAAAAGCTCAATCAGCAGCAGGCGAGCTTCACCCGCTGCTTCCAAATCTGTGCCAAAATATTCTATGCTGCACAGATAAAATCCTCTGTCGGTTCTACAAGCCTGGCTTTTCCTATAGAGAACCCTCTTATAAGCAAAAAGTAAAGCTCTCGTGAAGA;
Ｃ８ｏｒｆ４１−ＳＮＯＲＤ１３：
TCCTGACTGCAGCACCAGAAGGCTGGTCTCTCCCACAGAACGAGGATGGAGGCGGGGAGGGATCCGTTGAAGAGGGAAGGAGCGATCACCCAAAGAGAACTAAAATCAAATAAAATAAAACAGAGAGATGTCTTGGAGGAGGGGGCGAGTCTGACCGGGATAAGAATAAAGAGAAAGGGTGAACCCGGGAGGCGGAGTTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACTCCAGCCTGGGCGACAGAGTGAGACTCCGTCTCAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATAAAGAGGAAAGGACGCAAGAAAGGGAAAGGGGACTCTCAGGGAGTAAAAGAGTCTTACACTTTTAACAGTGACGTTAAAAGACTACTGTTGCCTTTCTGAAGACTAAAAAGAAAAAAAACTTAAAAATTTAAAGAAATAAACTTCTGAGCCATGTCACCAACTTAACCACCCCCAGGTACCTGCAACGGCTCGCGCCCGCCGGTGTCTAACAGGATCCGGACCTAGCTCATATTGCTGCCGCAAAACGCAAGGCTAGCTTCCGCCAGTACTGCCGCAACACCTTCTTATTTCACGACGTATGGTCGTAAAGCAATAAAGATCCAGGCTCGGGAAAATGACGGAGAGGTGGAACTATAGAGAATAAATTTGCATATATAATAATCCGCTCGCTAATTGTGTTTCTGTTTTCCTTTGCTAAGGTAGAAACAAAAGAATAATCACAGAATCTCAGTGGGACTTTGAAAATATCCAGGATTTTATACGTGAAGAATGGATGTATCGCATTACGGTAGTCACCCTATGTGTAAATTAGTGGCACATACTTGGCACTCCTTAATGTCAACTATAAGATG;
ＣＧＢ１：
GTCTCTCTCTTAGCGGGATATCTTCCGCAAGCACTGGGAATGTGGACATGGAAAGTAAATTGAGTCTCCGTGGGGGAGTGAGACAGGGAGTGAGGGGTGTTGGACGCGGCACGGGAACCTGGCCAGAGTCAGCGGACCCAATTGGCTGCTCTCTCTCAGATGCAGTTCCCCTTCCTCCCTCCAGGGGGCGCCACGGAACGCAGGGCCCTCACTGGCCCTGGGGACTGGGTGACGTCAGGGATGAGCCTCTTGTGATTGGCTCCATCACCCTGCGTAAGATCAAAGGGAAGAAAGGATGGGCCCGACAA;
ＣＧＢ２：
GTCTCTCTCTTAGCGGGATATCTTCCGCAAGCACTGGGGATGTGGACATGGAAAGTAAATTGAGTCTCCGTGGGGGAGTGAGACAGGGAGTGAGGGGTGTTGGACGCGGCACGGGAACCCGGCCGGAGTCAGCGGACCCAATTGGCTGCTCTCTCTCAGATACAGTTCCCCTTCCTCCCTCCAGGGGGCGCCACGGAACGCAGGGCCCTCACTGGCCCTGGGGACTGGGTGACGTCAGGGGTGAGCCTCTCCTGATTGGCTCCATCACCCTGCGTAAGGTCAAAAGGAAGAAAGGAGATCCCCGACAC;
ＤＰＰ９−ｔＲＮＡ（ｇｌｙ）：
TAACCGCTCAGCTGACCTCAGGAGGGCAGGGGTGCCTTCTAAAGGGTCCAGAGAGCCTCCATTCCAGCTGCAGGCGTGGGACACAGACCGGGACGTGGGGCGGCGGCCGGACTGGGCAGGTCGTCCCGGGTCCAGCGGCGCCTCACGGTCGCGGCTCCATGCCCGGGACTGCGACCCCGGAAGTGGCGGGAGCGGGGGACGACAGCCGCGGCGGACACAGGGGACCCGCCGGCTCAGGCACCTTTGACCCGGAAGTTGAGCGACCCAGGCGGCGGCCTGGGATTGGACACCACCAGGCACGTACCAAGGCGTCCGCGGCGCTTGGGGGGGAGCCCGCGGCGCGGCGGCCTAAGGTGCGTAACGCCCCATGAACGACATCTTCCGGTGGGTTAGGGAGAGACACCCCCCTGTGACTTGGTATCACTCAGTCAAACCCATGATCCCCCACTATTAAGGATATCCGGAGAGGATGCTACCTATCAGG;
ＭＥＤ１６−ＲＮＵ６−９：
GAGGGCAGTCACCAGCTCCTGGCCCGTGCGCCAAGCTCAGCGGGCGTCCGCGGTGCGATCTTCCCTAGCGCCTCGGGTCTGGCGCCGCCATCTTCCTCGGTAACAACCAGTCGCCTGAGGCGTGGGGCCGCCTCCCAAAGACTTCTGGGAGGGCGGTGCGGCTCAGGCTCTGCCCCGCCTCCGGGGCTATTTGCATACGACCAT
が挙げられる。
【０３３２】
これを検証するために、７ｓｋ双方向プロモーター、またはＧＳＴＡ４遺伝子（ｐｏｌ  ＩＩ遺伝子）とＲＮ７ＳＫ遺伝子（ｐｏｌ  ＩＩＩ遺伝子）の間の領域を、我々のＧＦＰレポーターアッセイを使用して試験した。このプロモーターのｐｏｌ  ＩＩＩ活性は、文書により十分に立証されている。
【０３３３】
５’ＵＴＲのいくつかのバリアントを同時に試験した；内因的に、ヒトＧＳＴＡ４遺伝子のアノテートされた５’ＵＴＲはイントロンによって分割されており、これを、我々のレポーター系（７ｓｋ１）へのクローニング時に融合した。短くなった形態の５’ＵＴＲまたはベータグロビン５’ＵＴＲも試験した（７ｓｋ３）。使用した構築物の全てに、強力な９塩基Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’配列番号１）（７ｓｋ２）を組み入れた。
【０３３４】
レポーターアッセイにより、この領域がｐｏｌ  ＩＩ発現を方向付けることができることが示され、これにより、双方向プロモーター領域としての機能を果たす能力が確認される。この領域はＨ１双方向プロモーター領域よりもわずかに大きいが、より活性であることが見出された。
【０３３５】
オルソロガス配列の発現を方向付ける能力を試験した。マウス配列も活性であり、ヒト配列よりもわずかに強力であった。
【０３３６】
これらの結果から、ｐｏｌ  ＩＩ活性およびｐｏｌ  ＩＩＩ活性の両方を有する双方向プロモーターの存在、および、この領域のゲノム配列を検索できることが確認された。
【０３３７】
Ｄ．ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩおよびＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ活性の両方を有する双方向プロモーターの発現スクリーン。
バイオインフォマティクス：
【０３３８】
双方向プロモーター配列を、ｐｏｌ  ＩＩ／ｐｏｌ  ＩＩＩ活性の異なるバリアントを同定するための出発点として使用することができた。カスタムパールスクリプトを開発して、ｐｏｌ  ＩＩＩ遺伝子の５’転写開始部位とｐｏｌ  ＩＩ遺伝子の５’転写開始部位を比較した。結果を、反対方向に向いたもの（多岐にわたる転写）についてフィルタリングした。入力ファイルをゲノムファイルまたは転写データ（ｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩ  ＣｈＩＰ部位）にアノテートすることができる。この情報を使用し、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩ活性およびＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ活性の両方を有する双方向プロモーターを同定した。これらの配列を使用して誘導体配列を生成することができた。
標的化転写因子結合部位：
【０３３９】
プロモーター配列を使用して、転写結合部位を同定することができた、または、多数のプロモーター配列をアラインメントして、今度は双方向プロモーターを設計するために使用することができる転写因子結合部位を同定することができた。転写結合因子部位の同定は、コンセンサスによって、または、示差的な距離行列または多次元尺度化を使用することによって決定することができた（De Bleser Pら、Genome Biol.、２００７年；８巻（５号）：Ｒ８３頁）。
ランダムな配列ライブラリー：
【０３４０】
あるいは、ランダムな配列の合成ライブラリーを出発点として使用して、双方向活性を有する配列をスクリーニングすることができた。ランダム化、シャッフリング、または突然変異性双方向配列により、異なるｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター活性を有するＤＮＡ配列を検索することができる。
【０３４１】
ｐｏｌ  ＩＩ活性およびｐｏｌ  ＩＩＩ活性を読み取るために、ｑＰＣＲまたは蛍光を使用したスクリーンを設計することができる。単純な蛍光スクリーンでは、記載されているレポーター（ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなど）、および、ＤＦＨＢ１−１Ｔのような小分子の存在下で蛍光になるＢｒｏｃｃｏｌｉなどのＲＮＡアプタマーを使用する。スクリーンには、薬物耐性（例えば、抗生物質）、抗原性ペプチド、または細胞表面マーカーなどのタンパク質読み取りを使用することができる。
【０３４２】
代替レポーターは、タンパク質およびＲＮＡの両方で構成される機能複合体であり得る。例えば、ＭＳ２コートタンパク質結合ステムループをＲＮＡに組み入れることができ、ｐｏｌ  ＩＩ転写によりＭＳ２コートタンパク質をコードすることができ、ＭＳ２コートタンパク質が今度はＲＮＡ配列に結合する。２つの結合部位をＲＮＡに組み入れる場合には、蛍光相補性（スプリットタンパク質相補性）を読み取りとして使用することができる。
【０３４３】
スクリーンは、ｐｏｌ  ＩＩ活性を分離および調査し、次いで、ｐｏｌ  ＩＩＩ活性を分離および調査することによって実施することもできる。最後に、これらの配列を次にＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩまたはＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩの両方による多岐にわたる転写を可能にする様式で組み合わせることもできる。
方法
【０３４４】
プラスミド構築：ＧＦＰレポータープラスミドをＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら、（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）により、わずかな修飾を伴って構築した。
【０３４５】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（熱失活）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３４６】
Ｎ２Ａ細胞系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３４７】
細胞に各構築物をトランスフェクトした（リポフェクタミン３０００）。フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現を解析した。
ヒト７ｓｋ１（Ｋｏｚａｋを伴うＧＳＴＡ４  ５’ＵＴＲ）
GGTGGCGGCGATAGCTTTTCAGGCTTTCTGGAGTCCACTCGGAGGCCTGGAGCCGCACAAAGCGCCAGGTCAGCGGTCCCGGCTGGGTGAGACCAGCAGGCGGCTCTAGCGCGCGGGAGCTGGGCGAGGCTCCGGGACGACCTCACCAATGGAGACTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC（配列番号３）
ヒト７ｓｋ２（短い５’ＵＴＲ）：
GGTGGCGGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC（配列番号４）
ヒト７ｓｋ３（ベータ−グロビン５’ＵＴＲ）：
GGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC（配列番号５）
マウス７ｓｋ１（Ｋｏｚａｋを伴うＧＳＴＡ４  ５’ＵＴＲ）：
GGTGGCGGCCTCGTATGGGACCGCACCGGACACGGGCGCCTGGGCCAGGAGCAGAGCCGGGCCGTAGAATAGACATGGCCGTCGGGGGCGGGGCTTCGGAAGGTTTAACCAATCCAAACTGTTGTATTTTGCATAGCCCCAAAGCATTTTGGTTAACAGTAAAAACATCCTAAATTTAAGTATTTTAATTTAAACTTAGAACGAAGCGAGTATAAAAAGGATTATTTAACCCTAAAACGGATTCAGGATTTGTTATAATATCAAGTACAGTCGGCTACATAAGGTCACCACATGTGTAAAGTTACAAAATTCTATGGCCTTATATACCTACCAAGAGCCTGCTTACTCTC（配列番号６）
マウス７ｓｋ２（短い５’ＵＴＲ）：
GGTGGCGGCAGACATGGCCGTCGGGGGCGGGGCTTCGGAAGGTTTAACCAATCCAAACTGTTGTATTTTGCATAGCCCCAAAGCATTTTGGTTAACAGTAAAAACATCCTAAATTTAAGTATTTTAATTTAAACTTAGAACGAAGCGAGTATAAAAAGGATTATTTAACCCTAAAACGGATTCAGGATTTGTTATAATATCAAGTACAGTCGGCTACATAAGGTCACCACATGTGTAAAGTTACAAAATTCTATGGCCTTATATACCTACCAAGAGCCTGCTTACTCTC（配列番号７）
マウス７ｓｋ３（ベータ−グロビン５’ＵＴＲ）：
GGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAGACATGGCCGTCGGGGGCGGGGCTTCGGAAGGTTTAACCAATCCAAACTGTTGTATTTTGCATAGCCCCAAAGCATTTTGGTTAACAGTAAAAACATCCTAAATTTAAGTATTTTAATTTAAACTTAGAACGAAGCGAGTATAAAAAGGATTATTTAACCCTAAAACGGATTCAGGATTTGTTATAATATCAAGTACAGTCGGCTACATAAGGTCACCACATGTGTAAAGTTACAAAATTCTATGGCCTTATATACCTACCAAGAGCCTGCTTACTCTC（配列番号８）
【化１−１】
2019520078.tif 000004
【化１−２】
2019520078.tif 000005
（実施例２）
【０３４８】
リボ核タンパク質酵素活性またはＲＮＡ配向型ヌクレアーゼを調節するための条件的ｐｏｌ  ＩＩ／ｐｏｌ  ＩＩＩ双方向プロモーター発現
【０３４９】
以前の研究により、Ｈ１プロモーターのｐｏｌ  ＩＩＩ活性をｔｅｔ応答性プロモーターに操作し、テトラサイクリンによって調節することができることが実証されている。Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）の存在下では、Ｈ１プロモーターに操作されたＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）配列にＴｅｔＲが結合し、ｐｏｌ  ＩＩＩ発現を抑圧する。
【０３５０】
この系は、以前には、ｐｏｌ  ＩＩ転写物およびｐｏｌ  ＩＩＩ転写物の調節を可能にすることができる系であるＨ１プロモーターの双方向構成成分と組み合わされていない。リボ核タンパク質酵素またはＲＮＡ配向型ヌクレアーゼは、操作された双方向プロモーター系を使用し、テトラサイクリンによって調節することができる。
【０３５１】
本明細書において、Ｈ１のｐｏｌ  ＩＩ活性はＴｅｔＯオペレーター部位の存在によって激変しないことが示された。これにより、リボ核タンパク質酵素またはＣａｓ９／ｇＲＮＡなどのＲＮＡ配向型ヌクレアーゼの誘導性活性についての機構がもたらされる。さらに、ＴｅｔＯ部位の設置を、ｐｏｌ  ＩＩ転写物もしくはｐｏｌ  ＩＩＩ転写物のいずれか、または両方が特異的に抑圧されるように置くことができる。
【０３５２】
かかる系には、ＡＡＶウイルスによって送達されるＣＲＩＳＰＲ活性の調節に関して極めて大きな臨床的利点があり、他の小型の双方向プロモーターに使用することができる。
１．Matthessら、Oncogene、２００５年４月２１日；２４巻（１８号）：２９７３〜８０頁。
方法
【０３５３】
プラスミド構築：ＧＦＰレポータープラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら、（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）により、わずかな修飾を伴って構築した。
【０３５４】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を１０％ウシ胎仔血清（熱失活）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３５５】
Ｎ２Ａ細胞系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３５６】
細胞に各構築物をトランスフェクトした（リポフェクタミン３０００）。フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現を解析した。
ｍｍ０７９標的配列：ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡ（配列番号９）
【化２−１】
2019520078.tif 000006
ＴｅｔＯ部位：ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ（配列番号１１）
Ｈ１＿ｗｔ：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCC（配列番号１２）
【化２−２】
2019520078.tif 000007
ＴｅｔＲ配列：
MSRLDKSKVINSALELLNEVGIEGLTTRKLAQKLGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAIEMLDRHHTHFCPLEGESWQDFLRNNAKSFRCALLSHRDGAKVHLGTRPTEKQYETLENQLAFLCQQGFSLENALYALSAVGHFTLGCVLEDQEHQVAKEERETPTTDSMPPLLRQAIELFDHQGAEPAFLFGLELIICGLEKQLKCESGSAYSGSREF（配列番号１４）
（実施例３）
Ａ．転写後細胞周期の調節による、ゲノム操作ヌクレアーゼの調節
【０３５７】
新しいＲＮＡ配向型ヌクレアーゼの出現により、ゲノム編集技術が改革され、生物学的研究が転換した。これらの技術は、ゲノムを正確に修飾するための前例のない手段をもたらすものであるが、ＤＮＡ切断がどのように修復されるかをモジュレートする細胞プロセスによって制約される。ゲノム操作の適用に関しては、特に、ＤＮＡ切断に対する細胞応答をモジュレートできることが極めて重要である（Gutschnerら、（２０１６年）、Cell Reportsを参照されたい）。
【０３５８】
ＤＮＡ切断に対する細胞応答は、主に、２つの競合経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または相同性配向型修復（ＨＤＲ）のうちの一方を通じて起こる。ＮＨＥＪは、一般に、切断点周囲の配列の変化をもたらすエラープローン経路であると考えられる。一般に、ＮＨＥＪは、ＤＮＡ修復のための、より効率的または優性の経路である。他方では、ＨＤＲ経路は、エラープローンはかなり少ないが、鋳型および修復に対するひと続きの相同性が必要である。
【０３５９】
両方の経路が異なる転帰に好都合な性質を有する。例えば、遺伝子を「ノックアウト」したい場合、ＮＨＥＪでは、その遺伝子のＤＮＡ切断により配列の変化が大きくもたらされるので、ＮＨＥＪが好ましい経路である。実験室においては、多くの遺伝的スクリーンが、遺伝子機能を排除することに依存するものであり、また、治療手法に関しては、優性または機能獲得型突然変異を有する遺伝子の完全な破壊が高度に望ましい。しかし、特異的な配列変化を導入したい場合（「ノックイン」）、ＨＤＲ経路を通じた修復が選ばれ、したがって、的確なカットアンドペースト転帰が可能になるよう試みる。この経路により、的確な突然変異修復が可能になり得るので、多くの科学的適用および大多数の臨床的適用に対して、この経路が好都合である。
【０３６０】
ＤＮＡ切断に対する細胞応答が細胞周期によってモジュレートされることも公知である（図９Ａ）；細胞周期の相がＤＮＡ経路の選択に大きく影響する（図９Ｂ）。ＮＨＥＪは、細胞周期のＧ１を通じて優勢であるが、ＨＤＲは、Ｓ期およびＧ２期中に優勢である。したがって、細胞周期に関してＤＮＡ切断のタイミングをモジュレートできることは、細胞を特定の修復経路に偏らせるための強力な方法であり得る。
【０３６１】
多くのタンパク質は、大部分は転写調節および転写後機構、特に、ユビキチンにより媒介されるタンパク質分解により、細胞周期依存的に調節される。一般に、転写機構による調節は、より遅く、一方、タンパク質分解性機構は迅速である。ゲノム編集への適用に関して、タンパク質分解性機構により、より好都合な調節方法がもたらされる可能性が高い。
【０３６２】
ジェミニン（Ｇｅｍ）およびＣｄｔ１は、細胞における発現が対立する、したがって、変動する、よく特徴付けられたタンパク質の２種である。Ｃｄｔ１は、細胞周期のＧ１期に蓄積するが、一方、Ｇｅｍは、Ｓ／Ｇ２／Ｍ期に蓄積する。細胞周期の調節に必要な、これらのタンパク質の特定の領域がマッピングされている：ｈＣｄｔ１についてはアミノ酸３０〜１２０、およびｈＧｅｍについてはアミノ酸１〜１１０（Sakaue-Sawano Aら、Cell、１３２巻、４８７〜４９８頁（２００８年））。さらに、それぞれのｍＲＮＡが細胞周期全体を通して絶えず転写されていたとしても、これらのドメインと融合したタンパク質を作製して細胞周期依存性調節を示すことができる。本質的に、細胞タンパク質は、細胞周期の特定の相の間にのみドメインを認識し、その結果、融合タンパク質のユビキチン化、次いで、迅速な分解がもたらされる。
【０３６３】
本明細書において、ＲＮＡ配向型ヌクレアーゼなどのゲノム編集技術をｈＧｅｍまたはｈＣｄｔ１ドメインのいずれかと融合し、それにより、これらのタンパク質の細胞周期依存性調節をもたらすことができることが示された（図９Ｃ）。したがって、この調節により、極めて異なるＤＮＡ修復転帰がもたらされる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を使用し、ＮＨＥＪ経路およびＨＤＲ経路のいずれも、ｈＧｅｍまたはｈＣｄｔ１のいずれかと融合したＣａｓ９を使用することで増強または抑制されることが示された。この系は、ＨＤＲのレベルをＮＨＥＪよりも大きなレベルまで上昇させることができるほど頑強であり、これは、ＨＤＲが細胞においてはるかに効率が低いことを考えると、非常に重要である。
【０３６４】
さらに、記載されている方法は、エレガンスおよび簡易性が非常に強力である。ゲノム編集技術の転帰を調節するための他の試みでは、細胞を細胞周期のある特定の相で静止させる煩わしい方法、その後に、タンパク質／ＲＮＡ送達を方向付ける技術的に困難かつ非効率的な方法が利用されている。その代わりに、本明細書に記載の方法は、それぞれの調節配列との融合物をコードするプラスミド、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の単純な送達に依拠するものである。
方法
【０３６５】
プラスミド構築：細胞周期調節型ヌクレアーゼタンパク質を生成するために、Ｃａｓ９：Ｔ２Ａ：ＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  ４４７１９）由来のヒトコドン最適化されたＣａｓ９遺伝子を修飾して、Ｔ２Ａをより良好な切断性Ｐ２Ａ配列で置き換えた。次に、ＧＦＰ蛍光レポーターを、ｍＫａｔｅ２蛍光タンパク質をコードする配列で置き換えた。次に、ベクターを直鎖化し、ｈＧｅｍ（１−１１０）またはｈＣｄｔ１（３０−１２０）ドメインのいずれかと融合した柔軟な１５アミノ酸配列リンカーをコードするｇＢｌｏｃｋをインフレームで挿入して、Ｃａｓ９：リンカー：ｈＧｅｍおよびＣａｓ９：リンカー：ｈＣｄｔ１（それぞれＣａｓ９−ＧｅｍまたはＣａｓ９−Ｃｄｔと称される）を生成した。全てのクローニングステップを、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら、（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）を、わずかに修飾して使用して実施した。
【０３６６】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３６７】
ロドプシンを標的にするｇＲＮＡ（ｈｓ０８６１７２１７５：ＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＡＡＧＧＧＧ（配列番号６８））（Jaskula-Ranga, V.およびZack, D. J.（２０１６年）、grID: A CRISPR-Cas9 guide RNA Database and Resource forGenome-Editing. bioRxiv, 097352）を、アニーリングし、二段階増幅Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＰＣＲによって増幅し、その後、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒカラムを使用して精製したオリゴをオーバーラップさせることによって生成した。次いで、精製されたＰＣＲ産物をＨ２Ｏに再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｇＲＮＡ発現構築物を、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を、わずかに修飾して使用して生成した（Gibsonら、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁（２００９年））。総反応体積を２０μｌから２μｌに減少させた。
【０３６８】
ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９（無修飾、または細胞周期調節型）およびロドプシンを標的にするｇＲＮＡ構築物を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを回収し、標的カット部位の周囲の配列を、下に列挙されているプライマーに従って増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量化した後、Ｔ７  Ｅｎｄｏ  Ｉアッセイを実施した。簡単に述べると、ＰＣＲ産物２００ｎｇを変性させ、次いで、ゆっくりと再アニーリングさせてヘテロ二本鎖を形成させ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩをＰＣＲ産物に添加し、３７℃で２５分間インキュベートしてヘテロ二本鎖を切断し、反応をローディング色素中でクエンチし、および最後に、反応物を６％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルに流して産物を分解した。ゲルをＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色し、可視化し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度を、二項方程式を使用して算出した：
【数１】
2019520078.tif 000008
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。ＨＤＲ頻度を算出するために、上記と同じＰＣＲ産物を、ヘテロ二本鎖形成の前に、ＥｃｏＲＩと１時間にわたって混合し、次いで、ローディング色素中でクエンチし、最後に、反応物を６％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルに流して産物を分解した。
【０３６９】
ＨＤＲ頻度を、以下の方程式を使用して算出した：
【数２】
2019520078.tif 000009
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。
【化３】
2019520078.tif 000010
Ｔ７ＥＩプライマー：
Rho_HDR_F; TGGAGCCCTGAGTGGCTGAG（配列番号１６）
Rho_HDR_R; CCACCTAGGACCATGAAGAGGTCAG（配列番号１７）
タンパク質配列：
ｈＣｄｔ１（３０−１２０）
PSPARPALRAPASATSGSRKRARPPAAPGRDQARPPARRRLRLSVDEVSSPSTPEAPDIPACPSPGQKIKKSTPAAGQPPHLTSAQDQDTI（配列番号１８）
ｈＧｅｍ（１−１１０）
MNPSMKQKQEEIKENIKNSSVPRRTLKMIQPSASGSLVGRENELSAGLSKRKHRNDHLTSTTSSPGVIVPESSENKNLGGVTQESFDLMIKENPSSQYWKEVAEKRRKAL（配列番号１９）
Ｃａｓ９：リンカー：ｈＣｄｔ１
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEE
VVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIRE
VKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKVRGGGGSGGGGSGGGGSPSPARPALRAPASATSGSRKRARPPAAPGRDQARPPARRRLRLSVDEVSSPSTPEAPDIPACPSPGQKIKKSTPAAGQPPHLTSAQDQDTI（配列番号２０）
Ｃａｓ９：リンカー：ｈＧｅｍ
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIRE
VKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKVRGGGGSGGGGSGGGGSMNPSMKQKQEEIKENIKNSSVPRRTLKMIQPSASGSLVGRENELSAGLSKRKHRNDHLTSTTSSPGVIVPESSENKNLGGVTQESFDLMIKENPSSQYWKEVAEKRRKAL（配列番号２１）
Ｃｄｔ１：リンカー：Ｃａｓ９
MPSPARPALRAPASATSGSRKRARPPAAPGRDQARPPARRRLRLSVDEVSSPSTPEAPDIPACPSPGQKIKKSTPAAGQPPHLTSAQDQDTIGGGGSGGGGSGGGGSDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKVR（配列番号２２）
Ｇｅｍ：リンカー：Ｃａｓ９
MNPSMKQKQEEIKENIKNSSVPRRTLKMIQPSASGSLVGRENELSAGLSKRKHRNDHLTSTTSSPGVIVPESSENKNLGGVTQESFDLMIKENPSSQYWKEVAEKRRKALGGGGSGGGGSGGGGSDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQEL
DINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDSRADPKKKRKVR（配列番号２３）
Ｃａｓ９：Ｃｄｔ１：
ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGC
TGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAA
GACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGA
AGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGG
CGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAA
AGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGCAGCCCATCTCCTGCCAGACCTGCTCTGAGAGCCCCTGCCTCTGCCACAAGCGGCAGCAGAAAGAGAGCCAGACCTCCTGCCGCCCCTGGCAGAGATCAGGCTAGACCTCCAGCTCGGCGGAGACTGAGACTGAGCGTGGACGAGGTGTCCAGCCCTAGCACACCTGAGGCCCCTGATATCCCCGCCTGTCCTAGCCCTGGCCAGAAGATCAAGAAGTCCACCCCTGCCGCCGGACAGCCTCCTCATCTGACATCTGCCCAGGACCAGGACACCATC（配列番号２４）
Ｃａｓ９：Ｇｅｍ：
ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGC
TGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATG
TAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAA
GACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGA
AGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGG
CGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAA
AGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGCAGCATGAACCCTAGCATGAAGCAGAAGCAGGAAGAGATCAAAGAGAACATCAAGAACAGCAGCGTGCCCAGACGGACCCTGAAGATGATCCAGCCTAGCGCCAGCGGCAGCCTCGTGGGCAGAGAGAATGAACTGTCTGCCGGCCTGAGCAAGCGGAAGCACAGAAACGACCACCTGACCAGCACCACCAGCAGCCCTGGCGTGATCGTGCCTGAGAGCAGCGAGAACAAGAACCTGGGCGGCGTGACCCAGGAATCCTTCGACCTGATGATCAAAGAAAACCCCAGCAGCCAGTATTGGAAAGAGGTGGCCGAGAAGCGGCGGAAGGCCCTG（配列番号２５）
Ｃｄｔ１：リンカー：Ｃａｓ９
ATGCCATCTCCTGCCAGACCTGCTCTGAGAGCCCCTGCCTCTGCCACAAGCGGCAGCAGAAAGAGAGCCAGACCTCCTGCCGCCCCTGGCAGAGATCAGGCTAGACCTCCAGCTCGGCGGAGACTGAGACTGAGCGTGGACGAGGTGTCCAGCCCTAGCACACCTGAGGCCCCTGATATCCCCGCCTGTCCTAGCCCTGGCCAGAAGATCAAGAAGTCCACCCCTGCCGCCGGACAGCCTCCTCATCTGACATCTGCCCAGGACCAGGACACCATCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGCAGCGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAG
GGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGG（配列番号２６）
Ｇｅｍ：リンカー：Ｃａｓ９
ATGAACCCTAGCATGAAGCAGAAGCAGGAAGAGATCAAAGAGAACATCAAGAACAGCAGCGTGCCCAGACGGACCCTGAAGATGATCCAGCCTAGCGCCAGCGGCAGCCTCGTGGGCAGAGAGAATGAACTGTCTGCCGGCCTGAGCAAGCGGAAGCACAGAAACGACCACCTGACCAGCACCACCAGCAGCCCTGGCGTGATCGTGCCTGAGAGCAGCGAGAACAAGAACCTGGGCGGCGTGACCCAGGAATCCTTCGACCTGATGATCAAAGAAAACCCCAGCAGCCAGTATTGGAAAGAGGTGGCCGAGAAGCGGCGGAAGGCCCTGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGGGGCAGCGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAG
TACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGA
AGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGAGG（配列番号２７）
（実施例４）
部分的な標的部位を操作することによるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの自己調節
【０３７０】
ＲＮＡ配向型ヌクレアーゼ活性を低下させることは、オフターゲット効果の潜在性を低下させるために有益であり得る。臨床の場では、これは、持続的または生存期間にわたる発現を特徴とする、ＡＡＶなどのウイルスによる送達方法で極めて重要である。
【０３７１】
本明細書において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣａｓ９を発現させるための、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現系自体にコードされる不完全な標的部位の使用に依拠する自己調節系を記載する。Ｃａｓ９の結合（切断を伴わない）が遺伝子発現の調節に有効であることが多数の試験により示されている。大多数の試験では切断活性を妨げるためにＣａｓ９のヌクレアーゼデッドバージョンが使用されているが、切断および自己調節を可能にする系が高度に望ましい。
【０３７２】
部分的な標的部位に対応する操作された配列を使用することにより、Ｃａｓ９のカット活性と結合活性を分離することができる；部分的な配列相補性により、ＤＮＡ切断を伴わずにＣａｓ９を結合させることが可能になる。この結合傾向を使用することで、Ｃａｓ９をまたそれ自体の発現を調節するように方向付けることができる。ＳｐＣａｓ９に関しては、一般に相補性が１７ｎｔを下回る部位では切断が生じず、高忠実度または高特異性Ｃａｓ９突然変異体を用いると、単一のミスマッチであっても切断が生じない可能性がある。
【０３７３】
重要なことに、この調節は全て、最小の配列の変化を伴って、かつ、追加的な結合因子、融合物、または他のタンパク質は伴わずに起こり、発現カセットサイズはＡＡＶによる送達のために十分に小さいまま維持される。
方法
【０３７４】
プラスミド構築：ＧＦＰレポータープラスミドを、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら、（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）により、わずかな修飾を伴って構築した。
【０３７５】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を１０％ウシ胎仔血清（熱失活）（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３７６】
Ｎ２Ａ細胞系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３７７】
細胞に各構築物をトランスフェクトした（リポフェクタミン３０００）。フローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現を解析した。
ｍｍ０７９標的配列：ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡ（配列番号２８）
ｍｍ０７９ゲノム標的部位：ＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＡＧＧ（配列番号２９）
Ａｕｔｏ１部位：ＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＴ（配列番号３０）
Ａｕｔｏ２部位：ＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＴＴ（配列番号３１）
Ｈ１＿ｗｔ：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCC（配列番号３２）
Ｈ１＿Ａｕｔｏ１：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAAGTTCGAGATCTCAGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCCC（配列番号３３）
Ｈ１＿Ａｕｔｏ２：
GGAATTCGAACGCTGACGTCATCAACCCGCTCCAAGGAATCGCGGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACACCCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTGTTCGAGATCTCAGGGTTTTCCC（配列番号３４）
（実施例５）
【０３７８】
メチオニン（Ｍｅｔ）、その後のグリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、またはシステイン（Ｃｙｓ）は、Ｎ末端ｍｅｔを切断するメチオニンアミノペプチダーゼによってプロセシングされる（図１Ａ）。次いで、２位のアミノ酸の同一性により、タンパク質全体が安定化されるか、または不安定化される。したがって、第２のアミノ酸の同一性を変化させることにより、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼを通じて一部のタンパク質半減期を変更することができる。
【０３７９】
生物体間で異なり、タンパク質間でも変動するが、Ｎ末端規則が、細胞内でのタンパク質半減期の推定として役立つ（図１７Ｂ）。タンパク質レベルは、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質分解系によってモジュレートされる。ユビキチンは、一般にはタンパク質分解に関連する７６アミノ酸の高度に保存されたタンパク質である；Ｕｂ分子を標的タンパク質とコンジュゲートし、これらのタンパク質にプロテアソームによる破壊について印をつける。
【０３８０】
直鎖状ポリ−ユビキチンが細胞内で個々のＵｂペプチドを切断する脱ユビキチン化酵素によって認識される。このプロセスを利用して、Ｕｂと任意のタンパク質のＮ末端を融合することによって特定のＮ末端残基を生成することができる（図１８）。細胞の内部に入ったら、脱ユビキチン化酵素によりＵｂ部分が認識され、切断され、それにより、融合したタンパク質が放出される。このプロセスを使用して、所与のタンパク質上に的確なＮ末端アミノ酸残基を生成することができ、その同一性はタンパク質半減期を決定する。
【０３８１】
一般的に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡのいずれかの発現を調節することにより、ホロ酵素複合体全体をモジュレートすることができる；ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系に関しては、これは、Ｃａｓ９またはｇＲＮＡのレベルを調節することによって行うことができる。さらに、Ｍｅｔ−アミノペプチダーゼ、脱ユビキチン化、または代替方法のいずれかによるＮ末端アミノ酸の単純な変化により、この調節を実現することができる（図１９Ａ）。
【０３８２】
Ｃａｓ９半減期を低下させることは、オフターゲット効果の潜在性を低下させるために有益であり得る。臨床の場では、これは、持続的または生存期間にわたる発現を特徴とする、ＡＡＶなどのウイルスによる送達方法で極めて重要である。逆に、非効率的な送達方法を用いると、効果を引き出すためにタンパク質半減期を増大させることが望ましいまたは必要な場合がある。種々の多様な状況において、ヌクレアーゼのレベルを調整できることが高度に望ましい。さらに、調節のためのこの手法は、単純であり、また、デグロン、誘導性デグロン、またはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼのスプリットバリアントなどの他の形態の調節と併せて使用することができる。
【０３８３】
本明細書において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣａｓ９のレベルを、Ｎ末端アミノ酸の同一性によってヌクレアーゼについての有意な発現の範囲である８〜１０倍と同程度にモジュレートすることができることが示された（図１９Ａ）。細胞内のタンパク質レベルをモジュレートするために、一般に使用される２Ａペプチドをどのように活用することができるかも示されている（図２０）。
方法
【０３８４】
プラスミド構築：ユビキチンと融合したＣａｓ９タンパク質を生成するために、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）（Gibsonら、（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）をわずかに修飾して使用して、ユビキチンをＣａｓ９のＮ末端に融合した。簡単に述べると、全２０種のアミノ酸をコードするプライマーを使用して、ユビキチンをコードするｇＢｌｏｃｋを増幅し、次いでそれをＣａｓ９とインフレームでクローニングした。全ての構築物について配列決定して検証した。
【０３８５】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３８６】
細胞に、各構築物を２０００ｎｇ、５００ｎｇ、または１２５ｎｇのいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、細胞をタンパク質について回収し、次いで、Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｉｍｏｎ機械でＣａｓ９発現または対照としてＧＡＰＤＨについて分析した。値を正規化するため、およびタンパク質安定性を決定するために比を使用した。
【化４】
2019520078.tif 000011
【表１】
2019520078.tif 000012
表2:一般に使用される2A配列の一覧
P2A: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (配列番号35)
T2A: GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (配列番号36)
E2A: GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (配列番号37)
F2A: GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (配列番号38)
タンパク質配列
【化５−１】
2019520078.tif 000013
【化５−２】
2019520078.tif 000014
【化５−３】
2019520078.tif 000015
【化５−４】
2019520078.tif 000016
【化５−５】
2019520078.tif 000017
【化５−６】
2019520078.tif 000018
【化５−７】
2019520078.tif 000019
【化５−８】
2019520078.tif 000020
【化５−９】
2019520078.tif 000021
【化５−１０】
2019520078.tif 000022
【化５−１１】
2019520078.tif 000023
【化５−１２】
2019520078.tif 000024
【化５−１３】
2019520078.tif 000025
【化５−１４】
2019520078.tif 000026
【化５−１５】
2019520078.tif 000027
【化５−１６】
2019520078.tif 000028
【化５−１７】
2019520078.tif 000029
【化５−１８】
2019520078.tif 000030
【化５−１９】
2019520078.tif 000031
ＤＮＡ配列
Ｕｂ：
ACCACCTCTCAGACGCAGGACCAGGTGCAGGGTCGACTCCTTCTGGATGTTGTAGTCAGAAAGAGTGCGGCCATCTTCCAGCTGCTTGCCTGCAAAGATGAGCCTCTGCTGGTCGGGAGGGATGCCTTCTTTATCCTGGATCTTGGCCTTCACATTTTCGATGGTGTCACTGGGCTCCACTTCCAGGGTGATGGTCTTGCCGGTCAGGGTCTTCACGAAGATCTGCAT（配列番号６０）
Ｃａｓ９：
GACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACCATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAGAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGACTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTTCACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTCTCAGATTTCAGAAAGGACTTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGGTCTCCCGAAGATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG（配列番号６１）
（実施例６）
ＲＮＡ配向型ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、およびＨＤＲ鋳型を単一のＡＡＶウイルスによって送達するための、双方向プロモーターの使用
【０３８７】
ＲＮＡ配向型ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、およびＨＤＲ鋳型の単一のＡＡＶウイルスによる送達。ＣＲＩＳＰＲとして公知の革命的なゲノム編集技術は、生物学的研究を変換するものであり、遺伝子薬の新時代の先駆けである。我々の体内の各細胞は、ＤＮＡの塩基対を３０億含有し、単一の変化−または突然変異−であってさえ、多種多様な遺伝性または後天性疾患を引き起こす可能性がある。ゲノム手術であるＣＲＩＳＰＲ技術に類似したプロセスにより、研究者が疾患に関連する突然変異を前例のない精度で標的にし、それにより、疾患をそれらの根本原因に関して処置することが可能になる。
【０３８８】
世界中の研究所で、ＣＲＩＳＰＲにより疾患突然変異を効率的に標的にできることが示されているが、これまで、ヒトへの使用のためのＣＲＩＳＰＲに基づく治療薬の開発は、送達に関する制約によって妨害されてきた。組織特異的ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法のための好ましい送達選択は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶには、安全性、有効性、および、毒性がないことの注目すべき履歴があり、これは、増加している、この手法を使用したＦＤＡに認可された試験−世界的に、ＡＡＶを使用した試験が１５０件存在する−によってさらに例示される。これらの小型のウイルスでは、材料を高い効率および特異性で多種多様な細胞型に送達することができる一方で、安全な、それらの小さなサイズにより、ＣＲＩＳＰＲ構成成分のパッケージングに関して著しい障害が示される。
【０３８９】
優性疾患は、人が１つの悪い遺伝子を遺伝によって受け継ぎ、それから、正常なコピーが悪影響を受けた時に生じる。これらの突然変異は、遺伝子療法技術では処置不能であるが、突然変異を破壊し、他の正常な遺伝子が機能することを可能にするＣＲＩＳＰＲを使用することで抑制することができる。我々は、小型のＨ１双方向プロモーターを使用してＣＲＩＳＰＲ構成成分の両方を単一のＡＡＶウイルスにパッケージングするための方法を以前に開示した。
【０３９０】
他方では、劣性突然変異は、２つの悪い遺伝子のコピーが遺伝によって受け継がれた結果である。これらの疾患では、ＣＲＩＳＰＲならびに突然変異周囲のＤＮＡの長いひと続き（鋳型）を送達し、その結果、細胞が正確な配列をコピーすることによって突然変異を編集削除できることが必要である。疾患の大部分はこのカテゴリーに入るが、ＡＡＶのサイズ限定に起因して、ＣＲＩＳＰＲ構成成分および鋳型ＤＮＡを単一のＡＡＶウイルスによって送達する手段は存在しない。
【０３９１】
歴史的に、ＡＡＶは、部位特異的ＤＮＡ変化のための鋳型を送達するための方法としての機能を果たした。他の公知の方法と比較して、ＡＡＶ鋳型は、最も組換え誘導性であるが、率は、なお低く、遺伝子編集方法の前におよそ１０４に１未満である。ＤＮＡ切断が高度に組換え誘導性であること、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９とＡＡＶ鋳型の共送達に高頻度で組換え能力があることが分かっている。４０〜６０ｎｔほどの小ささのｓｓＤＮＡ鋳型が、２００ｎｔおよびそれよりも大きいｄｓＤＮＡ鋳型と同様に非常に有効なＨＤｒ鋳型であることも分かっている。残念ながら、ＣＲＩＳＰＲ構成成分およびＨＤＲ鋳型を１つのＡＡＶウイルスで送達する手段は存在しない。
【０３９２】
しかし、Ｈ１双方向プロモーター系は非常に小型であるので、カットエレメント（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）およびペーストエレメント（ＨＤＲ鋳型）を単一のＡＡＶウイルスによって送達することが可能である。このクラスの疾患に対する治療的潜在性は、処置可能な疾患および人の数に関してはるかに大きなものである。
【０３９３】
本明細書において、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、ガイドＲＮＡ、およびドナー鋳型配列を発現させるためにＨ１プロモーターを使用して突然変異をｉｎ  ｖｉｖｏで修正するためのＡＡＶベクター設計が示された。突然変異修正の２つの例が、例１）ｒｄ１２突然変異に対してＳａＣａｓ９ニッカーゼを２種のｇＲＮＡおよび鋳型修正と共に使用すること（図２５Ｂ）、ならびに２）ｒｄ１０突然変異のＳｐＣａｓ９修正（図２７）として例示されている。
方法
【０３９４】
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞系２９３Ｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２で維持した。
【０３９５】
構築物の設計。図２８参照。マウスＨ１プロモーターを使用してＳｐＣａｓ９およびｇＲＮＡの両方を発現させるために、構築物を設計した。ＨＤＲ鋳型：左側のＨＤＲに対してはＫｐｎＩ、および右側のＨＤＲに対してはＨｐａＩのＧｉｂｓｏｎクローニングを可能にするために、２つの制限部位を隣接するＮｏｔＩ部位の前に組み入れた。ＫｐｎＩ消化後の挿入のために、以下の配列５’−ＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＮＮＮＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号６９）（配列中、Ｎは鋳型領域を表す）を使用する、またはＨｐａＩ消化後、以下の配列５’−ＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣ−３’（配列番号７０）（配列中、Ｎは鋳型領域を表す）を使用する。
【０３９６】
ｇＲＮＡ（Jaskula-Ranga, V.およびZack, D. J.（２０１６年）、grID: A CRISPR-Cas9 guideRNA Database and Resource for Genome-Editing. bioRxiv, 097352）を、アニーリングし、二段階増幅Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してＰＣＲによって増幅し、その後、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒカラムを使用して精製したオリゴをオーバーラップさせることによって生成した。次いで、精製されたＰＣＲ産物をＨ２Ｏに再懸濁させ、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｇＲＮＡ発現構築物を、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）をわずかに修飾して使用して生成した（Gibsonら、（２００９年）、Nature Methods、６巻：３４３〜３４５頁）。総反応体積を２０μｌから２μｌまで減少させた。クローンをＳａｎｇｅｒ配列決定によって検証した。
【０３９７】
ＨＥＫ２９３細胞に、Ｃａｓ９（無修飾、または細胞周期調節バージョン）およびロドプシンを標的にするｇＲＮＡ構築物を同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ゲノムＤＮＡを回収し、付録に列挙されているプライマーに従って標的カット部位の周囲の配列を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を精製し、定量化した後、Ｔ７  Ｅｎｄｏ  Ｉアッセイを実施した。簡単に述べると、ＰＣＲ産物２００ｎｇを変性させ、次いで、ゆっくりと再アニーリングさせてヘテロ二本鎖を形成させ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩをＰＣＲ産物に添加し、３７℃で２５分間インキュベートしてヘテロ二本鎖を切断し、反応をローディング色素中でクエンチし、最後に、反応物を６％ＴＢＥ  ＰＡＧＥゲルに流して産物を分解した。ゲルをＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄで染色し、可視化し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。ＮＨＥＪ頻度を、二項方程式を使用して算出した：
【数３】
2019520078.tif 000032
（式中、「ａ」および「ｂ」の値は、バックグラウンド除去後の切断された断片の積分面積と等しく、「ｃ」は、バックグラウンド除去後の切断されていないＰＣＲ産物の積分面積と等しい）。
配列
ｍＳＰＡ＿ＨＤＲ  ＳｐＣａｓ９進入プラスミド
CCTGCTGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGGTCGATTCTTGTTTCATAGAGCCCCGTAATTGACTGATGAATCAGTGTGGCGTCCAGGACCTCCTTTGTAGAGGTGTACCGCTTTCTGTCTATGGTGGTGTCGAAGTACTTGAAGGCTGCAGGCGCGCCCAAGTTGGTCAGAGTAAACAAGTGGATAATGTTTTCTGCCTGCTCCCTGATGGGCTTATCCCTGTGCTTATTGTAAGCAGAAAGCACCTTATCGAGGTTAGCGTCGGCGAGGATCACTCTTTTGGAGAATTCGCTTATTTGCTCGATGATCTCATCAAGGTAGTGTTTGTGTTGTTCCACGAACAGCTGCTTCTGCTCATTATCTTCGGGAGACCCTTTGAGCTTTTCATAGTGGCTGGCCAGATACAAGAAATTAACGTATTTAGAGGGCAGTGCCAGCTCGTTACCTTTCTGCAGCTCGCCCGCACTAGCGAGCATTCGTTTCCGGCCGTTTTCAAGCTCAAAGAGAGAGTACTTGGGAAGCTTAATGATGAGGTCTTTTTTGACCTCTTTATATCCTTTCGCCTCGAGAAAGTCGATGGGGTTTTTTTCGAAGCTTGATCGCTCCATGATTGTGATGCCCAGCAGTTCCTTGACGCTTTTGAGTTTTTTAGACTTCCCTTTCTCCACTTTGGCCACAACCAGTACACTGTAAGCGACTGTAGGAGAATCGAATCCGCCGTATTTCTTGGGGTCCCAATCTTTTTTGCGTGCGATCAGCTTGTCGCTGTTCCTTTTCGGGAGGATACTTTCCTTGGAGAAGCCTCCGGTCTGTACTTCGGTCTTTTTAACGATGTTCACCTGCGGCATGGACAGGACCTTCCGGACTGTCGCGAAATCCCTACCCTTGTCCCACACGATTTCTCCTGTTTCTCCGTTTGTTTCGATAAGTGGTCGCTTCCGAATCTCTCCATTGGCCAGTGTAATCTCGGTCTTGAAAAAATTCATAATATTGCTGTAAAAGAAGTACTTAGCGGTGGCCTTGCCTATTTCCTGCTCAGACTTTGCGATCATTTTCCTAACATCGTACACTTTATAGTCTCCGTAAACAAATTCAGATTCAAGCTTGGGATATTTTTTGATAAGTGCAGTGCCTACCACTGCATTCAGGTAGGCATCATGCGCATGGTGGTAATTGTTGATCTCTCTCACCTTATAAAACTGAAAGTCCTTTCTGAAATCTGAGACCAGCTTAGACTTCAGAGTAATAACTTTCACCTCTCGAATCAGTTTGTCATTTTCATCGTACTTGGTGTTCATGCGTGAATCGAGAATTTGGGCCACGTGCTTGGTGATCTGGCGTGTCTCAACAAGCTGCCTTTTGATGAAGCCGGCTTTATCCAACTCAGACAGGCCACCTCGTTCAGCCTTAGTCAGATTATCGAACTTCCGTTGTGTGATCAGTTTGGCGTTCAGCAGCTGCCGCCAATAATTTTTCATTTTCTTGACAACTTCTTCTGAGGGGACGTTATCACTCTTCCCTCTATTTTTATCGGATCTTGTCAACACTTTATTATCAATAGAATCATCTTTGAGAAAAGACTGGGGCACGATATGATCCACGTCGTAGTCGGAGAGCCGATTGATGTCCAGTTCCTGATCCACGTACATGTCCCTGCCGTTCTGCAGGTAGTACAGGTAGAGCTTCTCATTCTGAAGCTGGGTGTTTTCAACTGGGTGTTCCTTAAGGATTTGGGACCCCAGTTCTTTTATACCCTCTTCAATCCTCTTCATCCTTTCCCTACTGTTCTTCTGTCCCTTCTGGGTAGTTTGGTTCTCTCGGGCCATCTCGATAACGATATTCTCGGGCTTATGCCTTCCCATTACTTTGACGAGTTCATCCACGACCTTAACGGTCTGCAGTATTCCCTTTTTGATAGCTGGGCTACCTGCAAGATTAGCGATGTGCTCGTGAAGACTGTCCCCCTGGCCAGAAACTTGTGCTTTCTGGATGTCCTCCTTAAAGGTGAGAGAGTCATCATGGATCAACTGCATGAAGTTCCGGTTGGCAAATCCATCGGACTTAAGAAAATCCAGGATTGTCTTTCCACTCTGCTTGTCTCGGATCCCATTGATCAGTTTTCTTGACAGCCGCCCCCATCCTGTATATCGGCGCCTCTTGAGCTGTTTCATGACTTTGTCGTCGAAGAGATGAGCGTAAGTTTTCAAGCGTTCTTCAATCATCTCCCTATCTTCAAACAACGTAAGGGTGAGGACAATGTCCTCAAGAATGTCCTCGTTCTCCTCATTGTCCAGGAAGTCCTTGTCTTTAATGATTTTCAGGAGATCGTGATACGTTCCCAGGGATGCGTTGAAGCGATCCTCCACTCCGCTGATTTCAACAGAGTCGAAACATTCAATCTTTTTGAAATAGTCTTCTTTGAGCTGTTTCACGGTAACTTTCCGGTTCGTCTTGAAGAGGAGGTCCACGATAGCTTTCTTCTGCTCTCCAGACAGGAATGCTGGCTTTCTCATCCCTTCTGTGACGTATTTGACCTTGGTGAGCTCGTTATAAACTGTGAAGTACTCGTACAGCAGAGAGTGTTTAGGAAGCACCTTTTCGTTAGGCAGATTTTTATCAAAGTTAGTCATCCTTTCGATGAAGGACTGGGCAGAGGCCCCCTTATCCACGACTTCCTCGAAGTTCCAGGGAGTGATGGTCTCTTCTGATTTGCGAGTCATCCACGCGAATCTGGAATTTCCCCGGGCGAGGGGGCCTACATAGTAGGGTATCCGAAATGTGAGGATTTTCTCAATCTTTTCCCTGTTATCTTTCAAAAAGGGGTAGAAATCCTCTTGCCGCCTGAGGATAGCGTGCAGTTCGCCCAGGTGAATCTGGTGGGGGATGCTTCCATTGTCGAAAGTGCGCTGTTTGCGCAACAGATCTTCTCTGTTAAGCTTTACCAGCAGCTCCTCGGTGCCGTCCATTTTTTCCAAGATGGGCTTAATAAATTTGTAAAATTCCTCCTGGCTTGCTCCGCCGTCAATGTATCCGGCGTAGCCATTTTTAGACTGATCGAAGAAAATTTCCTTGTACTTCTCAGGCAGTTGCTGTCTGACAAGGGCCTTCAGCAAAGTCAAGTCTTGGTGGTGCTCATCATAGCGCTTGATCATACTAGCGCTCAGCGGAGCTTTGGTGATCTCCGTGTTCACTCGCAGAATATCACTCAGCAGAATGGCGTCTGACAGGTTCTTTGCCGCCAAAAAAAGGTCTGCGTACTGGTCGCCGATCTGGGCCAGCAGATTGTCGAGATCATCATCGTAGGTGTCTTTGCTCAGTTGAAGCTTGGCATCTTCGGCCAGGTCGAAGTTAGATTTAAAGTTGGGGGTCAGCCCGAGTGACAGGGCGATAAGATTACCAAACAGGCCGTTCTTCTTCTCCCCAGGGAGCTGTGCGATGAGGTTTTCGAGCCGCCGGGATTTGGACAGCCTAGCGCTCAGGATTGCTTTGGCGTCAACTCCGGATGCGTTGATCGGGTTCTCTTCGAAAAGCTGATTGTAAGTCTGAACCAGTTGGATAAAGAGTTTGTCGACATCGCTGTTGTCTGGGTTCAGGTCCCCCTCGATGAGGAAGTGTCCCCGAAATTTGATCATATGCGCCAGCGCGAGATAGATCAACCGCAAGTCAGCCTTATCAGTACTGTCTACAAGCTTCTTCCTCAGATGATATATGGTTGGGT
ACTTTTCATGGTACGCCACCTCGTCCACGATATTGCCAAAGATTGGGTGGCGCTCGTGCTTTTTATCCTCCTCCACCAAAAAGGACTCCTCCAGCCTATGGAAGAAAGAGTCATCCACCTTAGCCATCTCATTACTAAAGATCTCCTGCAGGTAGCAGATCCGATTCTTTCTGCGGGTATATCTGCGCCGTGCTGTTCTTTTGAGCCGCGTGGCTTCGGCCGTCTCCCCGGAGTCGAACAGGAGGGCGCCAATGAGGTTCTTCTTTATGCTGTGGCGATCGGTATTGCCCAGAACTTTGAATTTTTTGCTCGGCACCTTGTACTCGTCCGTAATGACGGCCCAGCCGACGCTGTTTGTGCCGATATCGAGCCCAATGGAGTACTTCTTGTCCATGGTGGCGGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTAACGCGGCCGCCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAG
GCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAGCGGCCGCGGTACCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATT
TCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGTCAGC（配列番号６２）
ｍＳＰＡ＿ＨＤＲ  ｒｄ１０（２５０）右側
CTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGC
TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAAC
CCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGC
TACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCA
TTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGC
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ｍＳＰＡ＿ＨＤＲ  ｒｄ１０（２５０）左側
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AGCTTTCTTCTGCTCTCCAGACAGGAATGCTGGCTTTCTCATCCCTTCTGTGACGTATTTGACCTTGGTGAGCTCGTTATAAACTGTGAAGTACTCGTACAGCAGAGAGTGTTTAGGAAGCACCTTTTCGTTAGGCAGATTTTTATCAAAGTTAGTCATCCTTTCGATGAAGGACTGGGCAGAGGCCCCCTTATCCACGACTTCCTCGAAGTTCCAGGGAGTGATGGTCTCTTCTGATTTGCGAGTCATCCACGCGAATCTGGAATTTCCCCGGGCGAGGGGGCCTACATAGTAGGGTATCCGAAATGTGAGGATTTTCTCAATCTTTTCCCTGTTATCTTTCAAAAAGGGGTAGAAATCCTCTTGCCGCCTGAGGATAGCGTGCAGTTCGCCCAGGTGAATCTGGTGGGGGATGCTTCCATTGTCGAAAGTGCGCTGTTTGCGCAACAGATCTTCTCTGTTAAGCTTTACCAGCAGCTCCTCGGTGCCGTCCATTTTTTCCAAGATGGGCTTAATAAATTTGTAAAATTCCTCCTGGCTTGCTCCGCCGTCAATGTATCCGGCGTAGCCATTTTTAGACTGATCGAAGAAAATTTCCTTGTACTTCTCAGGCAGTTGCTGTCTGACAAGGGCCTTCAGCAAAGTCAAGTCTTGGTGGTGCTCATCATAGCGCTTGATCATACTAGCGCTCAGCGGAGCTTTGGTGATCTCCGTGTTCACTCGCAGAATATCACTCAGCAGAATGGCGTCTGACAGGTTCTTTGCCGCCAAAAAAAGGTCTGCGTACTGGTCGCCGATCTGGGCCAGCAGATTGTCGAGATCATCATCGTAGGTGTCTTTGCTCAGTTGAAGCTTGGCATCTTCGGCCAGGTCGAAGTTAGATTTAAAGTTGGGGGTCAGCCCGAGTGACAGGGCGATAAGATTACCAAACAGGCCGTTCTTCTTCTCCCCAGGGAGCTGTGCGATGAGGTTTTCGAGC
CGCCGGGATTTGGACAGCCTAGCGCTCAGGATTGCTTTGGCGTCAACTCCGGATGCGTTGATCGGGTTCTCTTCGAAAAGCTGATTGTAAGTCTGAACCAGTTGGATAAAGAGTTTGTCGACATCGCTGTTGTCTGGGTTCAGGTCCCCCTCGATGAGGAAGTGTCCCCGAAATTTGATCATATGCGCCAGCGCGAGATAGATCAACCGCAAGTCAGCCTTATCAGTACTGTCTACAAGCTTCTTCCTCAG
ATGATATATGGTTGGGTACTTTTCATGGTACGCCACCTCGTCCACGATATTGCCAAAGATTGGGTGGCGCTCGTGCTTTTTATCCTCCTCCACCAAAAAGGACTCCTCCAGCCTATGGAAGAAAGAGTCATCCACCTTAGCCATCTCATTACTAAAGATCTCCTGCAGGTAGCAGATCCGATTCTTTCTGCGGGTATATCTGCGCCGTGCTGTTCTTTTGAGCCGCGTGGCTTCGGCCGTCTCCCCGGAGTCGAACAGGAGGGCGCCAATGAGGTTCTTCTTTATGCTGTGGCGATCGGTATTGCCCAGAACTTTGAATTTTTTGCTCGGCACCTTGTACTCGTCCGTAATGACGGCCCAGCCGACGCTGTTTGTGCCGATATCGAGCCCAATGGAGTACTTCTTGTCCATGGTGGCGGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTGTTCTGTCTATAGGTAAGCTGACAAATAACAAATAGGCACATAGAAAATCTAGTAAGTAGTACCACCTGATATCTCACTTTGCTGCAGGCAGGATTCCCCTCTGGCTCACTGGCAGTCTCCTCCGGTGTGGGCCAGGGCTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCTTTCTATCACCTGTTTGATGGACAAGCCCTTTTGCACAAGTTTGACTTCAAGGAGGGCCATGTCACATACCACAGAAGGTAAGTCCATGAACGCGGCCGCCTAGAGTCGAC（配列番号６５）
ｍＳＰＡ＿ＨＤＲ  ｒｄ１２（２５０）左側
ATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTTCACACCTTCCTCTTCTTCTTGGGGTCAGCCCTGCTGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGGTCGATTCTTGTTTCATAGAGCCCCGTAATTGACTGATGAATCAGTGTGGCGTCCAGGACCTCCTTTGTAGAGGTGTACCGCTTTCTGTCTATGGTGGTGTCGAAGTACTTGAAGGCTGCAGGCGCGCCCAAGTTGGTCAGAGTAAACAAGTGGATAATGTTTTCTGCCTGCTCCCTGATGGGCTTATCCCTGTGCTTATTGTAAGCAGAAAGCACCTTATCGAGGTTAGCGTCGGCGAGGATCACTCTTTTGGAGAATTCGCTTATTTGCTCGATGATCTCATCAAGGTAGTGTTTGTGTTGTTCCACGAACAGCTGCTTCTGCTCATTATCTTCGGGAGACCCTTTGAGCTTTTCATAGTGGCTGGCCAGATACAAGAAATTAACGTATTTAGAGGGCAGTGCCAGCTCGTTACCTTTCTGCAGCTCGCCCGCACTAGCGAGCATTCGTTTCCGGCCGTTTTCAAGCTCAAAGAGAGAGTACTTGGGAAGCTTAATGATGAGGTCTTTTTTGACCTCTTTATATCCTTTCGCCTCGAGAAAGTCGATGGGGTTTTTTTCGAAGCTTGATCGCTCCATGATTGTGATGCCCAGCAGTTCCTTGACGCTTTTGAGTTTTTTAGACTTCCCTTTCTCCACTTTGGCCACAACCAGTACACTGTAAGCGACTGTAGGAGAATCGAATCCGCCGTATTTCTTGGGGTCCCAATCTTTTTTGCGTGCGATCAGCTTGTCGCTGTTCCTTTTCGGGAGGATACTTTCCTTGGAGAAGCCTCCGGTCTGTACTTCGGTCTTTTTAACGATGTTCACCTGCGGCATGGACAGGACCTTCCGGACTGTCGCGAAATCCCTACCCTTGTCCCACACGATTTCTCCTGTTTCTCCGTTTGTTTCGATAAGTGGTCGCTTCCGAATCTCTCCATTGGCCAGTGTAATCTCGGTCTTGAAAAAATTCATAATATTGCTGTAAAAGAAGTACTTAGCGGTGGCCTTGCCTATTTCCTGCTCAGACTTTGCGATCATTTTCCTAACATCGTACACTTTATAGTCTCCGTAAACAAATTCAGATTCAAGCTTGGGATATTTTTTGATAAGTGCAGTGCCTACCACTGCATTCAGGTAGGCATCATGCGCATGGTGGTAATTGTTGATCTCTCTCACCTTATAAAACTGAAAGTCCTTTCTGAAATCTGAGACCAGCTTAGACTTCAGAGTAATAACTTTCACCTCTCGAATCAGTTTGTCATTTTCATCGTACTTGGTGTTCATGCGTGAATCGAGAATTTGGGCCACGTGCTTGGTGATCTGGCGTGTCTCAACAAGCTGCCTTTTGATGAAGCCGGCTTTATCCAACTCAGACAGGCCACCTCGTTCAGCCTTAGTCAGATTATCGAACTTCCGTTGTGTGATCAGTTTGGCGTTCAGCAGCTGCCGCCAATAATTTTTCATTTTCTTGACAACTTCTTCTGAGGGGACGTTATCACTCTTCCCTCTATTTTTATCGGATCTTGTCAACACTTTATTATCAATAGAATCATCTTTGAGAAAAGACTGGGGCACGATATGATCCACGTCGTAGTCGGAGAGCCGATTGATGTCCAGTTCCTGATCCACGTACATGTCCCTGCCGTTCTGCAGGTAGTACAGGTAGAGCTTCTCATTCTGAAGCTGGGTGTTTTCAACTGGGTGTTCCTTAAGGATTTGGGACCCCAGTTCTTTTATACCCTCTTCAATCCTCTTCATCCTTTCCCTACTGTTCTTCTGTCCCTTCTGGGTAGTTTGGTTCTCTCGGGCCATCTCGATAACGATATTCTCGGGCTTATGCCTTCCCATTACTTTGACGAGTTCATCCACGACCTTAACGGTCTGCAGTATTCCCTTTTTGATAGCTGGGCTACCTGCAAGATTAGCGATGTGCTCGTGAAGACTGTCCCCCTGGCCAGAAACTTGTGCTTTCTGGATGTCCTCCTTAAAGGTGAGAGAGTCATCATGGATCAACTGCATGAAGTTCCGGTTGGCAAATCCATCGGACTTAAGAAAATCCAGGATTGTCTTTCCACTCTGCTTGTCTCGGATCCCATTGATCAGTTTTCTTGACAGCCGCCCCCATCCTGTATATCGGCGCCTCTTGAGCTGTTTCATGACTTTGTCGTCGAAGAGATGAGCGTAAGTTTTCAAGCGTTCTTCAATCATCTCCCTATCTTCAAACAACGTAAGGGTGAGGACAATGTCCTCAAGAATGTCCTCGTTCTCCTCATTGTCCAGGAAGTCCTTGTCTTTAATGATTTTCAGGAGATCGTGATACGTTCCCAGGGATGCGTTGAAGCGATCCTCCACTCCGCTGATTTCAACAGAGTCGAAACATTCAATCTTTTTGAAATAGTCTTCTTTGAGCTGTTTCACGGTAACTTTCCGGTTCGTCTTGAAGAGGAGGTCCACGATAGCTTTCTTCTGCTCTCCAGACAGGAATGCTGGCTTTCTCATCCCTTCTGTGACGTATTTGACCTTGGTGAGCTCGTTATAAACTGTGAAGTACTCGTACAGCAGAGAGTGTTTAGGAAGCACCTTTTCGTTAGGCAGATTTTTATCAAAGTTAGTCATCCTTTCGATGAAGGACTGGGCAGAGGCCCCCTTATCCACGACTTCCTCGAAGTTCCAGGGAGTGATGGTCTCTTCTGATTTGCGAGTCATCCACGCGAATCTGGAATTTCCCCGGGCGAGGGGGCCTACATAGTAGGGTATCCGAAATGTGAGGATTTTCTCAATCTTTTCCCTGTTATCTTTCAAAAAGGGGTAGAAATCCTCTTGCCGCCTGAGGATAGCGTGCAGTTCGCCCAGGTGAATCTGGTGGGGGATGCTTCCATTGTCGAAAGTGCGCTGTTTGCGCAACAGATCTTCTCTGTTAAGCTTTACCAGCAGCTCCTCGGTGCCGTCCATTTTTTCCAAGATGGGCTTAATAAATTTGTAAAATTCCTCCTGGCTTGCTCCGCCGTCAATGTATCCGGCGTAGCCATTTTTAGACTGATCGAAGAAAATTTCCTTGTACTTCTCAGGCAGTTGCTGTCTGACAAGGGCCTTCAGCAAAGTCAAGTCTTGGTGGTGCTCATCATAGCGCTTGATCATACTAGCGCTCAGCGGAGCTTTGGTGATCTCCGTGTTCACTCGCAGAATATCACTCAGCAGAATGGCGTCTGACAGGTTCTTTGCCGCCAAAAAAAGGTCTGCGTACTGGTCGCCGATCTGGGCCAGCAGATTGTCGAGATCATCATCGTAGGTGTCTTTGCTCAGTTGAAGCTTGGCATCTTCGGCCAGGTCGAAGTTAGATTTAAAGTTGGGGGTCAGCCCGAGTGACAGGGCGATAAGATTACCAAACAGGCCGTTCTTCTTCTCCCCAGGGAGCTGTGCGATGAGGTTTTCGAGCCGCCGGGATTTGGACAGCCTAGCGCTCAGGATTGCTTTGGCGTCAACTCCGGATGCGTTGATCGGGTTCTCTTCGAAAAGCTGATTGTAAGTCTGAACCAGTTGGATAAAGAGTTTGTCGACATCGCTGTTGTCTGGGTTCAGGTCCCCCTCGATGAGGAAGTGTCCCCGAAATTTGATCATATGCGCCAGCGCGAGATAGATCAACCGCAAGTCAGCCTTATCAGTACTGTCTACAAGCTTCTTCCTCAGATGATATATGGTTGGGTACTTTTCATGGTACGCCACCTCGTCCACGATATTGCCAAAGATTGGGTGGCGCTCGTGCTTTTTATCCTCCTCCACCAAAAAGGACTCCTCCAGCCTATGGAAGAAAGAGTCATCCACCTTAGCCATCTCATTACTAAAGATCTCCTGCAGGTAGCAGATCCGATTCTTTCTGCGGGTATATCTGCGCCGTGCTGTTCTTTTGAGCCGCGTGGCTTCGGCCGTCTCCCCGGAGTCGAACAGGAGGGCGCCAATGAGGTTCTTCTTTATGCTGTGGCGATCGGTATTGCCCAGAACTTTGAATTTTTTGCTCGGCACCTTGTACTCGTCCGTAATGACGGCCCAGCCGACGCTGTTTGTGCCGATATCGAGCCCAATGGAGTACTTCTTGTCCATGGTGGCGGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGC
TTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTAACGCGGCCGCCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGC
TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCT
CACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAA
GATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGT
GTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAGCGGCCGCGGTTCTGTCTATAGGTAAGCTGACAAATAACAAATAGGCACATAGAAAATCTAGTAAGTAGTACCACCTGATATCTCACTTTGCT
GCAGGCAGGATTCCCCTCTGGCTCACTGGCAGTCTCCTCCGGTGTGGGCCAGGGCTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCTTTCTATCACCTGTTTGATGGACAAGCCCTTTTGCACAAGTTTGACTTCAAGGAGGGCCATGTCACATACCACAGAAGGTAAGTCCATGGTACCCACACAAAAAACCAACACACAG（配列番号６６）
ｍＳＰＡ＿ＨＤＲ  ＳａＣａｓ９  進入プラスミド
GCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAGCGGCCGCGGTACCCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTAGGCTGATCAGCGAGCTCTAGGAATTCTTAGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTTTTCGTGGCCGCCGGCCTTTTGCCCTTTTTGATGATCTGAGGGTGCTTCTTAGATTTCACTTCATACAGGTTGCCCAGAATGTCTGTGCTGTACTTCTTAATGCTCTGGGTCTTGGAGGCGATTGTCTTAATGATCCTGGGGGGCCTCTTGTCGTTCATGTTTTCCAGGTACTCGCGGTAGGTGATGTCGATCATGTTCACTTCGATCCGGTTCAGCAGGTCGTTGTTCACGCCGATCACTCTATACAGCTCGCCGTTGATCTTGATCAGATCGTTGTTGTAGAAGGAGGCGATAAACTCGGCCTGGTTGCTGATCTTCTTCAGCTTCTTAGCTTCCTCATAGCACTTGCTATTCACTTCGTAGTAGTTTTCTTTTTTGATCACATCCAGATTCTTCACGGTCACGAACTTGTACACGCCATTGTCCAGGTACACGTCGAATCTGTAGGGCTTCAGGGACAGCTTCACGACCTTGTTTCTGCTGTTGGGGTAGTCGTCGGTGATGTCCAGATGGGCGTTCAGTTTGTTGCCGTAATACTTAATCTTCTTGATCACGGGGCCGTTGTCCTTTTTGGAGTACTTGGTCAGGTAGTTCCCGGTTTCCTCGTAGTACTTGTACAGGGGATTCTTCTCGTCGCCGTACTGTTCCATAATCAGCTTCAGTTTCTGGTAGGTCTGGGGGTCGTGGTGGTACATCAGCAGCTTTTCGGGGCTCTTGTTGATCAGCTTTTTCAGCTTGTCATTGTCCTTGTCGTACAGGCCGTTCAGATTGTTCACGATCAGGGTGTTGCCCTTGTCGTCCTTCCGGGTGGAGTACAGGGTGTCGTTAATCAGCTCTCTATTAGGCTTCTTGTCCACCCGGTGGCTGTACTTGTAGTCCTTGAAGTCCTTAATGTGCTTGATCTGGTGGGGGGTGATGAAGATCTCTTTGTACTCCTGCTCGGTTTCGATCTCGGGCATGCTCTCGGCCTGCTTTTCCTCGAACATCTGGTTTTCCATCACTTTTTTGGCCTTGTCCAGTTTCTTCCACTCTTTGAAGATGAAATCGGCGTTGGCAATGATCAGGGCGTCCTCGGCGTGGTGCTTGTACCCCTTGTTCCGCTCTTTCTTAAACTTCCACTTCCGCCGCAGAAAGCTGGTGAAGCCGCCATTGATGGACTTCACTTTCACGTCCAGGTTGTTCACTCTGAAGTAGCTCCGCAGCAGGTTCATCAGGCCTCTGGTGGCGTATCTGGTATCCACCAGGTTCCGGTTGATGAAGTCTTTCTGCACGGAGAACCTGTTGATGTCCCGTTCTTCCAGCAGATACTCTTTCTTGGTCTTGCTGATTCTGCCCTTGCCCTTGGCCAGATTCAGGATGTGCTTCTTGAAGGTTTCGTAGCTGATCTTGCTGTCGCTGCTGCTCAGGTACTGGAATGGGGTCCGGTTGCCCTTCTTGCTGTTTTCTTCCTGCTTCACGAGCACCTTGTTGTTGAAGCTGTTGTCGAAGGACACGCTTCTGGGGATGATGTGGTCCACCTCATAGTTGAAGGGGTTGTTCAGCAGATCTTCCAGAGGGATGGCTTCCAGGCTGTACAGGCACTTGCCTTCCTGCATGTCGTGCAGCTTGATCTTCTCGATCAGGTACTTGGCGTTCTCTTTGCCGGTGGTCCGGATGATTTCCTCGATCCGCTCGTTGGTCTGCCGGTTCCGCTTCTGCATCTCGTTGATCATTTTCTGGGCGTCCTTGGAGTTCTTCTCGCGGGCCAGCTCGATAATGATGTCGTTGGGCAGGCCGTACTTCTTGATGATGGCGTTGATCACTTTGATGCTCTGGATGAAGCTTCTCTTCACGACGGGGCTCAGGATGAAGTCGTCCACCAGGGTGGTGGGGATCTCTTTCTGCTGGGACAGGTCCACCTTCTTGGGCACCAGCTTCAGCCGGTTGAAGATAGCGATCTGGTTGTCGTTGGTGTGCCACAGCTCGTCCAGGATCAGGTTGATGGCCTTCAGGCTCAGGTTGTGGGTGCCGGTATAGCCCTTCAGATTAGAGATCTGCTCGATCTCTTCCTGGGTCAGCTCGGAGTTCAGATTGGTCAGTTCTTCCTGGATGTCCTCGCTGCTCTGGTAGATGGTCAGGATCTTGGCAATCTGATCCAGCAGCTCGGCGTTCTCAATAATCTCTTTCCGGGCGGTAATGTCCTTGATGTCGTGGTACACCTTCAGGTTGGTGAACTCGGGCTTGCCGGTGCTGGTCACTCTGTAGCCCTTAATATCCTCTTCGTTCACGAGGATTTCTTTGGCGATCTGCTTCAGGGTGGGCTTCTTCTTCTGCTTGAACACGTTCTCGATGATCTGGAACTTCTCGTAATATTCCAGCTTCTCGTTCTCGTCCCTGGTGATCACGAGATTGTTCAGGTCGTTCAGGGCGTTGTACAGGTCGGCGTTGTAGGCGTACTTCACGCTCCGCAGTTCCTCGGGGAAGTAGGTGCAGTGGCCCATCAGCATCTCGTACCATTCTTTGATGTCCTTCCAGCCGAAGGGGCTGCCCTCGCCAGGTCCCTCATAGTAGGTCCGCCGGGTTTCCAGCAGGTCGATGTAGGTGTCGATGAAGCTCTGGTCCAGCTGGTGGTAGGCCTTCTGCACCTTCAGCAGCTGTTTGGCTTCTTTCACGTAGTCGCTGGTCTTGAATCTGTTGATGCTGCCCCGCACTTCGCCGTCTTTCTTCAGCCGTTCCAGCTGCAGTTCGGCCACGTATTTCTCTTCCAGGGCCTTGCTGTTCCGGCTGATCTGCTCTTTGGTGGACAGCTCGTTGCCGGTGTCCTCTTCCACCTCGTTCACGTTGT
GCACGCCTCTTCTCTTGGCCAGGTGCAGCAGGGCGGCAGAGAACTCTTCCTCGCTCAGCTTCTGGCTCAGGCCCTTCACTCTGGCCTCGTAGGGGTTGATGCCGCTCAGCTCGCTGTGGTCGGTCAGCAGGTTGTAGTCGAACAGCAGCTTCTTCACTCTCTGGATTCTATGCCGCCTCCGCCGCTTCAGCCTTCTGGCGCCTCTCTTGCTCCGCCTGCCCTCGTTGTTTTCCACGTTGGCCTCTTTGAACAGCCGCACGCCGGCATCGATCACGTCCCGTGTCTCGTAGTCGATGATGCCGTAGCCCACGCTGGTGATGCCGATGTCCAGGCCCAGGATGTAGTTCCGCTTGGCTGCTGGGACTCCGTGGATACCGACCTTCCGCTTCTTCTTTGGGGCCATGTGGCGGCTCTTGAAGGACGACGTCATCATCCCTTGCCCGGATGCGCGGGCTTCTTGTCTAGCACAGGAGCCTGGGGTAGAGCGCATGCAAATTACGCGCTGTGCTTTGTGGGAAATCACCCTAAACGAAAAATTTATTCCTCTTTCGAGCCTTATAGTGGCGGCCGGTCTACATCCTAGGTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTGTTAACGCGGCCGCCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAA（配列番号６７）
参考文献
【０３９８】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示の主題が関係する分野の当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献のそれぞれが具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じくものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。いくつもの特許出願、特許、および他の参考文献が本明細書で言及されているが、かかる参考文献は、これらの文書のいずれも当技術分野における共通する一般的知見の一部を形成することの容認を構成するものではないことが理解されよう。
【０３９９】
前述の主題は理解を明瞭にするために図表および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および修飾を行うことができることが当業者には理解されよう。
【図１−１】
2019520078.tif 000033
【図１−２】
2019520078.tif 000034
【図１−３】
2019520078.tif 000035
【図１−４】
2019520078.tif 000036
【図２−１】
2019520078.tif 000037
【図２−２】
2019520078.tif 000038
【図３Ａ−１】
2019520078.tif 000039
【図３Ａ−２】
2019520078.tif 000040
【図３Ｂ−１】
2019520078.tif 000041
【図３Ｂ−２】
2019520078.tif 000042
【図３Ｂ−３】
2019520078.tif 000043
【図４−１】
2019520078.tif 000044
【図４−２】
2019520078.tif 000045
【図５−１】
2019520078.tif 000046
【図５−２】
2019520078.tif 000047
【図５−３】
2019520078.tif 000048
【図５−４】
2019520078.tif 000049
【図５−５】
2019520078.tif 000050
【図６−１】
2019520078.tif 000051
【図６−２】
2019520078.tif 000052
【図７−１】
2019520078.tif 000053
【図７−２】
2019520078.tif 000054
【図８−１】
2019520078.tif 000055
【図８−２】
2019520078.tif 000056
【図９Ａ】
2019520078.tif 000057
【図９Ｂ】
2019520078.tif 000058
【図９Ｃ】
2019520078.tif 000059
【図１０−１】
2019520078.tif 000060
【図１０−２】
2019520078.tif 000061
【図１０−３】
2019520078.tif 000062
【図１０−４】
2019520078.tif 000063
【図１０−５】
2019520078.tif 000064
【図１１−１】
2019520078.tif 000065
【図１１−２】
2019520078.tif 000066
【図１１−３】
2019520078.tif 000067
【図１２Ａ】
2019520078.tif 000068
【図１２Ｂ】
2019520078.tif 000069
【図１３】
2019520078.tif 000070
【図１３−１】
2019520078.tif 000071
【図１４】
2019520078.tif 000072
【図１５−１】
2019520078.tif 000073
【図１５−２】
2019520078.tif 000074
【図１６】
2019520078.tif 000075
【図１７−１】
2019520078.tif 000076
【図１７−２】
2019520078.tif 000077
【図１８】
2019520078.tif 000078
【図１９−１】
2019520078.tif 000079
【図１９−２】
2019520078.tif 000080
【図２０】
2019520078.tif 000081
【図２１−１】
2019520078.tif 000082
【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
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【図２２−１０】
2019520078.tif 000094
【図２２−１１】
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【図２２−１２】
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【図２２−１３】
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【図２３】
2019520078.tif 000098
【図２４−１】
2019520078.tif 000099
【図２４−２】
2019520078.tif 000100
【図２５−１】
2019520078.tif 000101
【図２５−２】
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【図２６−１】
2019520078.tif 000103
【図２６−２】
2019520078.tif 000104
【図２７】
2019520078.tif 000105
【図２８】
2019520078.tif 000106
【図２９−１】
2019520078.tif 000107
【図２９−２】
2019520078.tif 000108
【図３０−１】
2019520078.tif 000109
【図３０−２】
2019520078.tif 000110
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月6日(2019.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結した、７ｓｋ、ＳＲＰ−ＲＰＳ２９、ＳＮＡＲ−Ｇ−ｌ−ＣＧＢｌ、ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２、ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７、ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３、ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９、ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９、ＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１、マウスＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２、ラットＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２、ならびにａｉｌｕｒｏｐｏｄａ  ｍｅｌａｎｏｌｅｕｃａ、ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ、ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ、ｃｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ  ｓａｂａｅｕｓ、ｃｈｏｌｏｅｐｕｓ  ｈｏｆｆｍａｎｎｉ、ｄａｓｙｐｕｓ  ｎｏｖｅｍｃｉｎｃｔｕｓ、ｄｉｐｏｄｏｍｙｓ  ｏｒｄｉｉ、ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ、ｅｒｉｎａｃｅｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ、ｆｅｌｉｓ  ｃａｔｕｓ、ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ、ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、ｉｃｔｉｄｏｍｙｓ  ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ、ｌｏｘｏｄｏｎｔａ  ａｆｒｉｃａｎａ、ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、ｍｕｓｔｅｌａ  ｐｕｔｏｒｉｕｓ  ｆｕｒｏ、ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ、ｎｏｍａｓｃｕｓ  ｌｅｕｃｏｇｅｎｙｓ、ｏｃｈｏｔｏｎａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ、ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ、ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ、ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ、ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、ｐｒｏｃａｖｉａ  ｃａｐｅｎｓｉｓ、ｐｔｅｒｏｐｕｓ  ｖａｍｐｙｒｕｓ、ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、ｔａｒｓｉｕｓ  ｓｙｒｉｃｈｔａ、ｔｕｐａｉａ  ｂｅｌａｎｇｅｒｉ、ｔｕｒｓｉｏｐｓ  ｔｒｕｎｃａｔｕｓ、ｖｉｃｕｇｎａ  ｐａｃｏｓに由来するＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２プロモーターからなる群から選択されるプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の一方または両方の鎖を切断する、ヌクレアーゼシステム。
【請求項２】
ＣＲＩＳＰＲである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
ドナー鋳型をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、請求項２に記載のシステム。
【請求項８】
少なくとも１つのＫｏｚａｋ配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記プロモーターが、７ｓｋ１、７ｓｋ２および７ｓｋ３からなる群から選択される７ｓｋプロモーターである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記７ｓｋ１、７ｓｋ２または７ｓｋ３プロモーターが、ヒトまたはマウスに由来する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記７ｓｋ１、７ｓｋ２または７ｓｋ３プロモーターが、配列番号３〜８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の一方または両方の鎖を切断し、
前記プロモーターは、条件的調節または自己調節を可能にするエレメントを含む少なくとも１つの修飾を含む、システム。
【請求項１４】
前記エレメントがｔｅｔ応答性プロモーターである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記ｔｅｔ応答性プロモーターが、前記プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
（ａ）前記ＴｅｔＲが、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか；
（ｂ）前記ＴｅｔＯが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；または  （ｃ）前記プロモーターがＨ１であり、前記Ｈ１−ＴｅｔＯが、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記自己調節部位が、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１８】
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子の一方または両方の鎖を切断し、
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼのヌクレオチド配列は、コードされる前記ゲノム標的化ヌクレアーゼの安定性を、
ｉ）前記ヌクレアーゼに２Ａペプチドを融合させるか；
ｉｉ）前記ヌクレアーゼにユビキチンタンパク質を融合させるか；または
ｉｉｉ）前記ヌクレアーゼに細胞周期調節に必要なタンパク質の領域を融合させること
によって変更する修飾を含む、システム。
【請求項１９】
前記２Ａペプチドが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択されるか、または前述のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記タンパク質が、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ  ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ヒトジェミニンの１〜１１０位（ｈＧｅｍ（１−１１０））のアミノ酸、またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記タンパク質が、ヒトＣｄｔ１の３０〜１２０位のアミノ酸（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））、またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ヌクレアーゼに融合したユビキチンが、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２４】
前記ヌクレアーゼがＳａＣａｓ９ニッカーゼである、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
それを必要とする対象において網膜ジストロフィー、角膜ジストロフィー、マイクロサテライト増大疾患およびがんからなる群から選択される疾患を処置するための、請求項１に記載の天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、有効量の前記システムが前記対象に投与されることを特徴とする、システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９９】
前述の主題は理解を明瞭にするために図表および実施例によっていくらか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内である特定の変化および修飾を行うことができることが当業者には理解されよう。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
ａ）ヌクレアーゼシステムガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したプロモーターであって、前記ｇＲＮＡは、細胞においてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズし、前記ＤＮＡ分子またはＲＮＡは、前記細胞において発現される１つまたは複数の遺伝子産物をコードする、プロモーター；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、細胞において作動可能な調節エレメント
を含む１つまたは複数のベクターを含む天然に存在しないヌクレアーゼシステムであって、構成要素（ａ）および（ｂ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置し、前記ｇＲＮＡは、前記標的配列を標的化し、かつそれとハイブリダイズし、前記ヌクレアーゼは、前記ＤＮＡ分子またはＲＮＡを切断して、前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する、ヌクレアーゼシステム。
（項目２）
ＣＲＩＳＰＲである、項目１に記載のシステム。
（項目３）
単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中にパッケージングされる、項目１に記載のシステム。
（項目４）
前記アデノ随伴パッケージングウイルスが、アデノウイルス血清型２、アデノウイルス血清型５またはアデノウイルス血清型３５から選択される、項目３に記載のシステム。
（項目５）
前記アデノ随伴パッケージングウイルスがアデノウイルス血清型５である、項目７に記載のシステム。
（項目６）
１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、項目１に記載のシステム。
（項目７）
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、項目１に記載のシステム。
（項目８）
前記プロモーターが、Ｈ１プロモーター、７ｓｋ、ヒトＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２、ＳＲＰ−ＲＰＳ２９、７ｓｋ１−ＧＳＴＡ４、ＳＮＡＲ−Ｇ−１−ＣＧＢ１、ＳＮＡＲ−ＣＧＢ２、ＲＭＲＰ−ＣＣＤＣ１０７、ｔＲＮＡ（Ｌｙｓ）−ＡＬＯＸＥ３、ＲＮＵ６−９−ＭＥＤ１６：ｔＲＮＡ（Ｇｌｙ）−ＤＰＰ９、ＲＮＵ６−２−ＴＨＥＭ２５９、ＳＮＯＲＤ１３−Ｃ８ｏｒｆ４１、マウスＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２およびラットＲＰＰＨ１−ＰＡＲＰ２からなる群から選択される、項目１に記載のシステム。
（項目９）
前記プロモーターがＨ１プロモーターである、項目８に記載のシステム。
（項目１０）
前記Ｈ１プロモーターが、配列番号１２または３２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目９に記載のシステム。
（項目１１）
前記Ｈ１プロモーターが、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載のシステム。
（項目１２）
前記Ｈ１プロモーターが、配列番号３２に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載のシステム。
（項目１３）
前記プロモーターが、前記Ｈ１プロモーターに対してオルソロガスである、項目９から１２のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１４）
前記オルソロガスなＨ１プロモーターが、マウスまたはラットに由来する、項目１３に記載のシステム。
（項目１５）
前記Ｈ１プロモーターが双方向性である、項目９から１４のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１６）
前記Ｈ１プロモーターが、
ａ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の１つの方向での転写を提供する制御エレメント；および
ｂ）ゲノム標的化ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の反対方向での転写を提供する制御エレメント
を含む、項目９から１５のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１７）
前記プロモーターが７ｓｋプロモーターである、項目８に記載のシステム。
（項目１８）
前記７ｓｋプロモーターが、ヒト、ラットまたはマウスに由来する、項目１７に記載のシステム。
（項目１９）
前記７ｓｋプロモーターが、７ｓｋ１、７ｓｋ２および７ｓｋ３からなる群から選択される、項目１７から１８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２０）
前記７ｓｋプロモーターが７ｓｋ１である、項目１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記７ｓｋ１が、ヒトに由来する、項目２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記ヒト７ｓｋ１が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１７から２１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２３）
前記ヒト７ｓｋ１が、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目２２に記載のシステム。
（項目２４）
前記７ｓｋ１が、マウスに由来する、項目１９に記載のシステム。
（項目２５）
前記マウス７ｓｋ１が、配列番号６に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目２４に記載のシステム。
（項目２６）
前記マウス７ｓｋ１が、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目２４から２５のいずれか一項に記載のシステム。
（項目２７）
前記７ｓｋプロモーターが７ｓｋ２である、項目１９に記載のシステム。
（項目２８）
前記７ｓｋ２が、ヒトに由来する、項目２７に記載のシステム。
（項目２９）
前記ヒト７ｓｋ２が、配列番号４に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目２８に記載のシステム。
（項目３０）
前記ヒト７ｓｋ２が、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目２９に記載のシステム。
（項目３１）
前記７ｓｋ２が、マウスに由来する、項目２７に記載のシステム。
（項目３２）
前記マウス７ｓｋ２が、配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３１に記載のシステム。
（項目３３）
前記マウス７ｓｋ２が、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目３２に記載のシステム。
（項目３４）
前記７ｓｋプロモーターが７ｓｋ３である、項目１９に記載のシステム。
（項目３５）
前記７ｓｋ３が、ヒトに由来する、項目３４に記載のシステム。
（項目３６）
前記ヒト７ｓｋ３が、配列番号５に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３５に記載のシステム。
（項目３７）
前記ヒト７ｓｋ３が、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目３６に記載のシステム。
（項目３８）
前記７ｓｋ３が、マウスに由来する、項目３４に記載のシステム。
（項目３９）
前記マウス７ｓｋ３が、配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目３８に記載のシステム。
（項目４０）
前記マウス７ｓｋ３が、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目３９に記載のシステム。
（項目４１）
前記プロモーターが、少なくとも１つの修飾を有する、項目８から４０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目４２）
前記プロモーターの前記少なくとも１つの修飾が、条件的調節を可能にするエレメントを含む、項目４１に記載のシステム。
（項目４３）
前記エレメントがｔｅｔ応答性プロモーターである、項目４２に記載のシステム。
（項目４４）
前記ｔｅｔ応答性プロモーターが、前記Ｈ１プロモーター中に操作されたＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）を含む、項目４３に記載のシステム。
（項目４５）
前記ＴｅｔＲが、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目４４に記載のシステム。
（項目４６）
前記ＴｅｔＲが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、項目４５に記載のシステム。
（項目４７）
前記ＴｅｔＯが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４５に記載のシステム。
（項目４８）
前記ＴｅｔＯが、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目４７に記載のシステム。
（項目４９）
前記Ｈ１−ＴｅｔＯが、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目４４に記載のシステム。
（項目５０）
前記Ｈ１−ＴｅｔＯが、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含む、項目４９に記載のシステム。
（項目５１）
前記プロモーターの前記少なくとも１つの修飾が、自己調節を可能にする部位を含む、項目４１に記載のシステム。
（項目５２）
前記自己調節部位が、配列番号３３または３４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記自己調節部位が、配列番号３３に示されるヌクレオチド配列を含む、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
前記自己調節部位が、配列番号３４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目５２に記載のシステム。
（項目５５）
少なくとも１つのターミネーター配列をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目５６）
前記少なくとも１つのターミネーター配列が、ＳＶ４０または合成ポリＡ（ＳＰＡ）配列からなる群から選択される、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
前記ターミネーター配列が、ＳＶ４０の１２０（配列番号１２３）または２４０（配列番号１２２）塩基対の配列である、項目５６に記載のシステム。
（項目５８）
前記ターミネーター配列が、ＳＰＡの４９塩基対の配列である、項目５６に記載のシステム。
（項目５９）
５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目６０）
Ｋｏｚａｋ配列をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目６１）
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１または２に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目６０に記載のシステム。
（項目６２）
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む、項目６１に記載のシステム。
（項目６４）
翻訳のｃａｐ非依存的開始を媒介するＲＮＡ配列をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目６５）
前記ＲＮＡ配列が、６．９４７または６．９６７からなる群から選択される、項目６４に記載のシステム。
（項目６６）
前記ゲノム標的化ヌクレアーゼがＣａｓ９タンパク質である、項目１に記載のシステム。
（項目６７）
前記Ｃａｓ９が、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目６６に記載のシステム。
（項目６８）
前記Ｃａｓ９が、配列番号６１に示されるヌクレオチド配列を含む、項目６７に記載のシステム。
（項目６９）
前記Ｃａｓ９が、少なくとも１つの修飾を含む、項目６６から６８のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７０）
前記Ｃａｓ９中の前記少なくとも１つの修飾が、切断配列中の変更を含む、項目６９に記載のシステム。
（項目７１）
前記切断配列中の前記変更が、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＦ２Ａからなる群から選択される、項目７０に記載のシステム。
（項目７２）
前記Ｔ２Ａが、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目７１に記載のシステム。
（項目７３）
前記Ｔ２Ａが、配列番号３６に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記Ｐ２Ａが、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目７１に記載のシステム。
（項目７５）
前記Ｐ２Ａが、配列番号３５に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、項目７４に記載のシステム。
（項目７６）
前記Ｅ２Ａが、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目７１に記載のシステム。
（項目７７）
前記Ｅ２Ａが、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
前記Ｆ２Ａが、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目７１に記載のシステム。
（項目７９）
前記Ｆ２Ａが、配列番号３８に示されるヌクレオチド配列を有するアミノ酸配列を含む、項目７８に記載のシステム。
（項目８０）
前記Ｃａｓ９中の前記少なくとも１つの修飾が、前記細胞における発現のために最適化されたコドンを含む、項目６９に記載のシステム。
（項目８１）
前記Ｃａｓ９が、細胞周期依存的タンパク質とインフレームで作動可能に融合したリンカー配列（Ｃａｓ９融合物）をさらに含む、項目６６から８０のいずれか一項に記載のシステム。
（項目８２）
前記細胞周期依存的タンパク質が、ＡＰＥ２、ＡＴＲ、ＢＲＣＡ１、Ｃｈｋ１、Ｃｄｃ５、Ｃｄｃ６、Ｃｄｃ７、Ｃｄｃ４５、Ｃｄｔ１、ＣＳＡ、ＣＳＢ、Ｃｔｆ１８、ＤＤＢ１、ＤＤＢ２、ＤＮＡ２、ＤＵＴ、Ｅｌｇ１、ＥｎｄｏＶ、Ｅｓｐ１、エキソヌクレアーゼ１、ＦＢＨ１、ＦＥＮ１、ジェミニン、Ｈｕｓ１、ＫＮＴＣ２（ＮＤＣ８０）、Ｋｕ８０、リガーゼ１、Ｍａｄ２、ＭＢＤ４、Ｍｃｍ３、Ｍｃｍ４、Ｍｃｍ５、Ｍｃｍ６、Ｍｃｍ７、Ｍｃｍ８、Ｍｃｍ１０、ＭＧＭＴ、ＭＬＨ３、Ｍｍｓ４、ＭＰＧ、ＭＳＨ２、Ｍｕｓ８１、ＮＢＳ１、ＮＥＩＬ２、ＮＥＩＬ３、ＮＴＨ１、Ｏｒｃ１、Ｏｒｃ３、ＰＡＲＰ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｆ１、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２、ＰＮＫ、Ｐｏｌａ  ｐ１８０、Ｐｏｌａ
ｐ７０、Ｐｏｌａ  Ｓｐｐ１（Ｐｒｉｍ２ａ）、Ｐｏｌｂ、Ｐｏｌｄ  ｐ１２５、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ３、Ｐｏｌｅ  Ｄｐｂ４、Ｐｏｌｅ  Ｐｏｌ２、Ｐｏｌｉ、Ｐｏｌｌ、Ｐｏｌｍ、Ｐｓｆ１、Ｐｓｆ２、Ｐｓｆ３、Ｒａｄ１、Ｒａｄ１８、Ｒａｄ２３Ａ、Ｒａｄ２３Ｂ、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５１Ｄ、Ｒａｄ５４、Ｒａｄ６Ａ、ＲＰＡ３４、ＲＰＡ７０、Ｓｃｃ１、Ｓｃｃ３、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ１（サーチュイン）、ＴＤＧ、ＴＤＰ１、ＴＩＭＥＬＥＳＳ、Ｔｉｎ２、トポイソメラーゼＩ、トポイソメラーゼＩＩＩａ、トポイソメラーゼＩＩＩｂ、Ｕｂｃ１３、ＵＮＧ、ＸＡＢ２、ＸＰＣ、ＸＰＦ、ＸＰＧ、Ｘｒｃｃ２およびＸＲＣＣ４からなる群から選択される、項目８１に記載のシステム。
（項目８３）
前記細胞周期依存的タンパク質がジェミニンである、項目８２に記載のシステム。
（項目８４）
前記細胞周期依存的タンパク質がヒトジェミニンである、項目８３に記載のシステム。
（項目８５）
前記ヒトジェミニンが、１〜１１０位のアミノ酸を含む（ｈＧｅｍ（１−１１０））、項目８４に記載のシステム。
（項目８６）
前記ｈＧｅｍ（１−１１０）が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目８５に記載のシステム。
（項目８７）
前記ｈＧｅｍ（１−１１０）が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含む、項目８６に記載のシステム。
（項目８８）
前記細胞周期依存的タンパク質がＣｄｔ１である、項目８２に記載のシステム。
（項目９０）
前記細胞周期依存的タンパク質がヒトＣｄｔ１である、項目８８に記載のシステム。
（項目９１）
前記ヒトＣｄｔ１が、３０〜１２０位のアミノ酸を含む（ｈＣｄｔ１（３０−１２０））、項目９０に記載のシステム。
（項目９２）
前記ｈＣｄｔ１（３０−１２０）が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目９１に記載のシステム。
（項目９３）
前記ｈＣｄｔ１（３０−１２０）が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む、項目９２に記載のシステム。
（項目９４）
前記Ｃａｓ９融合物が、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目８１から９３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目９５）
前記Ｃａｓ９融合物が、配列番号２０〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目９４に記載のシステム。
（項目９６）
前記Ｃａｓ９が、ユビキチンタンパク質とインフレームで作動可能に融合している（Ｕｂ−Ｃａｓ９）、項目６６から９５のいずれか一項に記載のシステム。
（項目９７）
前記Ｕｂ−Ｃａｓ９が、少なくとも１つのＮ末端修飾を有する、項目９６に記載のシステム。
（項目９８）
前記Ｎ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９が、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目９７に記載のシステム。
（項目９９）
前記Ｎ末端修飾されたＵｂ−Ｃａｓ９が、配列番号３９〜５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目９８に記載のシステム。
（項目１００）
前記ユビキチンタンパク質が、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目９６に記載のシステム。
（項目１０１）
前記ユビキチンタンパク質が、配列番号６０に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１００に記載のシステム。
（項目１０２）
ＳａＣａｓ９ニッカーゼをさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目１０３）
ドナー鋳型配列をさらに含む、項目１０２に記載のシステム。
（項目１０４）
少なくとも１つのベクターが、配列番号６２または６７に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１０２から１０３のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１０５）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６２に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１０４に記載のシステム。
（項目１０６）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６７に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１０４に記載のシステム。
（項目１０７）
前記ドナー鋳型配列が、少なくとも１つの遺伝子突然変異を修正する、項目１０３から１０６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１０８）
前記少なくとも１つの遺伝子突然変異が、ｒｄ１０またはｒｄ１２である、項目１０７に記載のシステム。
（項目１０９）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６３または６４に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１０８に記載のシステム。
（項目１１０）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６３に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１０９に記載のシステム。
（項目１１１）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１０９に記載のシステム。
（項目１１２）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６５または６６に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目１０８に記載のシステム。
（項目１１３）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６５に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１１２に記載のシステム。
（項目１１４）
前記少なくとも１つのベクターが、配列番号６６に示されるヌクレオチド配列を含む、項目１１２に記載のシステム。
（項目１１５）
前記プロモーターが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のｇＲＮＡに作動可能に連結している、項目８から５４のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１１６）
前記標的配列が、ヌクレオチド配列ＡＮ１９ＮＧＧ、ＧＮ１９ＮＧＧ、ＣＮ１９ＮＧＧまたはＴＮ１９ＮＧＧを含む、項目１に記載のシステム。
（項目１１７）
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、項目１に記載のシステム。
（項目１１８）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目１１７に記載のシステム。
（項目１１９）
前記真核生物細胞が網膜光受容体細胞である、項目５に記載のシステム。
（項目１２０）
前記１つまたは複数の遺伝子産物がロドプシンである、項目１に記載のシステム。
（項目１２１）
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、項目１に記載のシステム。
（項目１２２）
細胞において１つまたは複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞は、前記１つまたは複数の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を含み、項目１に記載の天然に存在しないヌクレアーゼシステムを前記細胞中に導入するステップを含む、方法。
（項目１２３）
前記システムが、１つまたは複数の遺伝子産物を不活性化する、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記ヌクレアーゼシステムが、少なくとも１つの遺伝子突然変異を切り出す、項目１２２に記載の方法。
（項目１２５）
前記１つまたは複数の遺伝子産物の発現が減少する、項目１２２に記載の方法。
（項目１２６）
前記細胞が、真核生物細胞または非真核生物細胞である、項目１２２に記載の方法。
（項目１２７）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記細胞が網膜光受容体細胞である、項目１２２に記載の方法。
（項目１２９）
前記細胞が網膜神経節細胞である、項目１２２に記載の方法。
（項目１３０）
前記真核生物細胞ががん性細胞である、項目１２７に記載の方法。
（項目１３１）
前記がん性細胞において細胞増殖が阻害または低減される、項目１３０に記載の方法。
（項目１３２）
前記がん性細胞においてアポトーシスが増強または増加される、項目１３０に記載の方法。
（項目１３３）
それを必要とする対象において網膜ジストロフィー、角膜ジストロフィー、マイクロサテライト増大疾患およびがんからなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、
（ａ）項目１に記載の天然に存在しないヌクレアーゼシステムを提供するステップ；および
（ｂ）有効量の前記システムを前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
（項目１３４）
前記疾患が角膜ジストロフィーである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３５）
前記疾患が網膜ジストロフィーである、項目１３３に記載の方法。
（項目１３６）
前記網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、網膜色素変性症（ＲＰ）および緑内障からなる群から選択される、項目１３３に記載の方法。
（項目１３７）
前記角膜ジストロフィーが、上皮基底膜ジストロフィー、上皮反復性びらんジストロフィー、上皮下粘液性角膜ジストロフィー、メースマン角膜ジストロフィー、リッシュ角膜上皮ジストロフィー、膠様滴状角膜ジストロフィー、ライス・ビュックラー角膜ジストロフィー、ティール・ベーンケ角膜ジストロフィー、格子状角膜ジストロフィー１型（古典的）、格子状角膜ジストロフィー２型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩ型、格子状角膜ジストロフィーＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩ／ＩＩＩＡ型、格子状角膜ジストロフィーＩＶ型、多形性（角膜）アミロイドーシス、顆粒状角膜ジストロフィー１型、顆粒状角膜ジストロフィー２型、斑状角膜ジストロフィー、シュナイダー角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、角膜斑点状ジストロフィー、後部無定形角膜ジストロフィー、フランソワ中心部雲状変性、プレデスメ角膜ジストロフィー、フックス角膜内皮ジストロフィー、後部多形性角膜ジストロフィー、先天性遺伝性内皮ジストロフィーおよびＸ連鎖角膜内皮ジストロフィーからなる群から選択される、項目１３３に記載の方法。
（項目１３８）
前記マイクロサテライト増大疾患が、眼裂狭小、眼瞼下垂および眼角贅皮逆位合指症、鎖骨頭蓋骨異形成、先天性中枢性低換気症候群、ハダド症候群、ＤＭ（筋強直性ジストロフィー）、ＦＲＡＸＡ（脆弱Ｘ症候群）、ＦＲＡＸＥ（脆弱ＸＥ精神遅滞）、ＦＲＤＡ（フリードライヒ運動失調症）、フックス角膜内皮ジストロフィー、ＦＸＴＡＳ（脆弱Ｘ振戦失調症候群）、手足性器症候群、ＨＤ（ハンチントン病）、全前脳胞症、成長ホルモン分泌不全を伴う精神遅滞、精神遅滞、てんかん、ウエスト症候群、パーティントン症候群、眼咽頭型筋ジストロフィー、ＳＢＭＡ（球脊髄性筋萎縮症）、ＳＣＡ１（脊髄小脳失調症１型）、ＳＣＡ１２（脊髄小脳失調症１２型）、ＳＣＡ１７（脊髄小脳失調症１７型）、ＳＣＡ２（脊髄小脳失調症２型）、ＳＣＡ３（脊髄小脳失調症３型またはマシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ６（脊髄小脳失調症６型）、ＳＣＡ７（脊髄小脳失調症７型）、ＳＣＡ８（脊髄小脳失調症８型）および合多指症からなる群から選択される、項目１３３に記載の方法。
（項目１３９）
前記対象に投与するステップが、移植、注射またはウイルスによって行われる、項目１３３に記載の方法。
（項目１４０）
前記対象に投与するステップが、網膜下注射によって行われる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）
前記対象に投与するステップが、外用的に、血管内に、皮内に、経真皮的に、非経口で、静脈内に、筋肉内に、鼻腔内に、皮下に、局部的に、経皮的に、気管内に、腹腔内に、動脈内に、膀胱内に、腫瘍内に、腫瘍周囲に、吸入により、全身的に、灌流により、洗浄により、注射を介して直接、または投与および製剤を介して経口で行われる、項目１３３に記載の方法。
（項目１４２）
前記対象に投与するステップが、眼の表面に外用的に行われる、項目１４１に記載の方法。
（項目１４３）
前記対象に投与するステップが、角膜、強膜上もしくはその外側で、眼内、結膜下、テノン嚢下もしくは眼球後空間に、または眼瞼中もしくはその周囲で行われる、項目１３３に記載の方法。
（項目１４４）
前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん剤で処置される、項目１３３に記載の方法。
（項目１４５）
前記抗がん剤が、パクリタキセル、シスプラチン、トポテカン、ゲムシタビン、ブレオマイシン、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、トポテカン、シクロホスファミド、トラベクテジン、オラパリブ、タモキシフェン、レトロゾールおよびベバシズマブからなる群から選択される、項目１３４に記載の方法。
（項目１４６）
前記対象が、少なくとも１つのさらなる抗がん療法で処置される、項目１４４から１４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４７）
前記抗がん療法、放射線療法、化学療法または手術である、項目１４６に記載の方法。
（項目１４８）
前記がんが固形腫瘍である、項目１３３に記載の方法。
（項目１４９）
前記がんが、脳がん、胃腸がん、口腔がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、咽喉がん、胃がんおよび腎臓がんからなる群から選択される、項目１３３に記載の方法。
（項目１５０）
前記がんが脳がんである、項目１４９に記載の方法。
（項目１５１）
前記全身投与が、経口、静脈内、皮内、腹腔内、皮下および筋肉内投与からなる群から選択される、項目１４１に記載の方法。
（項目１５２）
前記対象が哺乳動物である、項目１３３から１５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
前記哺乳動物がヒトである、項目１５４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019520078000001.app
【国際調査報告】
2019520078.tif 000111
2019520078.tif 000112
2019520078.tif 000113