(57)【要約】  下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する制御遺伝子である。（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することを特徴とする制御遺伝子。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項２】
糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御し、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示される遺伝子によって発現することを特徴とするタンパク質。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、請求項１に記載の制御遺伝子の発現の抑制、及び請求項２に記載のタンパク質の活性の抑制の少なくともいずれかを指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
社会的にアンチエイジングに関心が高まり、その介入法の開発が望まれている。また、近年特に増加が著しいメタボリック症候群、糖尿病、高脂血症、肥満に関する新しい予防や治療法の開発が希求されている。【０００３】
従来、健康な個体の寿命を延ばすために、確立された方法は無い。カロリー制限がこの夢に向けての希望となっているが、確実な対処法かどうかは未だ不明で、過度の食事制限は万人に勧められる方法とはいい難いという問題がある。
メタボリック症候群に対しては、食生活や運動などの生活習慣の改善の他に、糖尿病や高血圧に対する薬物療法が行われている。糖尿病に対しては、インスリン投与やインスリン分泌を促進する薬及び消化管からの糖の吸収を抑制する薬が利用されている。また、高脂血症にはコレステロールや中性脂肪の合成阻害剤などが利用されている。しかし、血糖値、コレステロール値、中性脂肪値、血圧のコントロールの不良や低血糖を誘起したり、また薬剤が効かなくなる例も存在するという問題があり、そもそもこれらを共通して予防できる方法が待望されている。
これらの問題を克服するためには、新たな作用機序に基づく療法薬の開発が望まれている。【０００４】
ＣＯＸ７ＲＰ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ７ａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子は、本発明者らによって、先に単離された遺伝子である（非特許文献１参照）。この遺伝子のアミノ酸配列は、ミトコンドリアに存在するシトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）のサブユニットであるＣＯＸ７Ａと保存性が高いことから、この酵素が関与するミトコンドリアの酸化的リン酸化の反応に関わることが予想される。ミトコンドリアは、呼吸によってエネルギーを産生する主要な細胞内器官であり、糖代謝、脂質代謝などのエネルギー代謝に重要な役割を担っており、加齢、疾患に深く関わると考えられている。
しかし、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子が、子宮癌、乳癌、及び膀胱癌に関わることが知られているものの（例えば、特許文献１参照）、糖代謝、脂質代謝、肥満、寿命を制御し、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、肥満症の分子標的となり得ることは、未だ知られていないのが現状である。【０００５】
したがって、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の少なくともいずれかの分子標的となり得る、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法の提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５６１７２号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｓ，  Ｈｉｒｏｉ  Ｈ，  Ｏｒｉｍｏ  Ａ，  Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｈ，  Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｍ．、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｌｉｂｒａｒｙ．」、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１８（１）、４４２−４４９、１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の少なくともいずれかの分子標的となり得る、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子が、個体レベルで糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御する機能を有しており、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的となるという新たな知見である。【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することを特徴とする制御遺伝子である。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
＜２＞  糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御し、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示される遺伝子によって発現することを特徴とするタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
＜３＞  糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、前記＜１＞に記載の制御遺伝子の発現の抑制、及び前記＜２＞に記載のタンパク質の活性の抑制の少なくともいずれかを指標とすることを特徴とするスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、前記従来における諸問題を解決することができ、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の少なくともいずれかの分子標的となり得る、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる制御遺伝子、及び該遺伝子によって発現するタンパク質、並びに糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製に用いられたレトロウイルスベクターと、その挿入部位を示す図である。
【図２】図２は、ＣＯＸ７ＲＰがノックアウトされたことの確認ために行った、ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図３】図３は、ウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】図４は、ＣＯＸ活性の測定結果を示す図である。
【図５】図５は、ＡＴＰ産生量の測定結果を示す図である。
【図６】図６は、通常食飼育における野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）マウスの生存曲線（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｕｒｖｅｓ）を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、通常食飼育におけるオスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、通常食飼育におけるメスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、高脂肪食飼育における、オスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、高脂肪食飼育における、メスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の体重変化を示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、オスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、オスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、精巣上体周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、メスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示す図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、メスの野生型マウス（ＷＴ）及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、子宮周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、糖負荷試験の各採血時間におけるグルコース濃度示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、糖負荷試験の各採血時間におけるインスリン濃度を示す図である。
【図１１】図１１は、インスリン負荷試験の各採血時間におけるインスリン濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（制御遺伝子）
本発明の制御遺伝子は、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示され、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【００１４】
前記制御遺伝子は、ＣＯＸ７ＲＰ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ７ａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）遺伝子である。後述する試験例１〜３で示すように、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子をノックアウトしたマウスでは、野生型のマウスに比べて糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命が向上しており、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子によって、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命が制御されている。
前記ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共のデータベースを通じて容易に入手することができ、前記配列番号１で示される塩基配列は、ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００４７１８．２で入手することができる。
【００１５】
前記ストリンジェントな条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ナトリウム濃度が２５ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、２５ｍＭ〜３００ｍＭがより好ましく、温度が４２℃〜６８℃が好ましく、４２℃〜６５℃がより好ましい。例えば、５×ＳＳＣ（８３ｍＭ  ＮａＣｌ、８３ｍＭクエン酸ナトリウム）、温度４２℃が挙げられる。
前記ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列と高い配列同一性を有すると考えられる。前記高い配列同一性としては、塩基配列全体で、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましい。このような高い配列同一性を有する塩基配列は、本発明の制御遺伝子と実質的に同等の機能を有していると考えられる。
【００１６】
前記制御遺伝子の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、などが挙げられる。
【００１７】
前記ゲノムＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記制御遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリーを作製し、これを展開して、配列番号１に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列を基に調製したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製する方法、配列番号１に記載の塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことにより調製する方法、などが挙げられる。
【００１８】
前記ｃＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記制御遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、配列番号１に記載の塩基配列情報を基に作製したプローブやプライマーを用いて、コロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製する方法が挙げられる。
【００１９】
前記化学合成ＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、既存のＤＮＡ自動合成装置等を利用して合成することができる。また、合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。
【００２０】
前記制御遺伝子の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、制御遺伝子のみからなる態様、ベクターに組み込まれた態様、などが挙げられる。
前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、などが挙げられる。
【００２１】
（タンパク質）
本発明のタンパク質は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御し、下記（Ａ）及び（Ｂ）のいずれかで示される遺伝子によって発現する。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、及び、前記ＤＮＡの相補鎖のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
前記タンパク質は、前記制御遺伝子によって発現するものであるため、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができると考えられる。
【００２２】
前記タンパク質の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質を有する生物から精製する方法、前記制御遺伝子が組み込まれたベクターを含有する細胞の培養物から精製する方法、などが挙げられる。
前記精製の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過などの方法が挙げられる。
【００２３】
前記タンパク質の態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記タンパク質のみからなる態様、精製用のタグを含有する態様、などが挙げられる。
前記精製用のタグとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｈｉｓタグなどが挙げられる。
【００２４】
（スクリーニング方法）
本発明のスクリーニング方法は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、前記本発明の制御遺伝子の発現の抑制、及び前記本発明のタンパク質の活性の抑制の少なくともいずれかを指標とする。
前記スクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２５】
＜制御遺伝子の発現の抑制＞
前記本発明の制御遺伝子の発現の抑制を指標とするスクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体、及び細胞のいずれかに被験物質を投与する投与工程、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれか、及び、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかにおける、前記制御遺伝子の発現量を測定する測定工程、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記制御遺伝子の発現量が抑制されている場合に、その被験物質を選択する選択工程、を含む方法などが挙げられる。
【００２６】
−投与工程−
前記投与工程における被験物質としては、特に制限はなく、各種候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。前記被験物質の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与、などが挙げられる。
【００２７】
−測定工程−
前記測定工程における、前記制御遺伝子の発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡレベルの発現量の測定、タンパク質レベルの発現量の測定、などが挙げられる。
ｍＲＮＡレベルの発現量の評価方法、及びタンパク質レベルの発現量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ノーザンブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法、などが挙げられる。
また、前記制御遺伝子の発現量の測定では、前記制御遺伝子のプロモーター活性を測定してもよい。前記プロモーター活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ルシフェラーゼアッセイなどが挙げられる。
【００２８】
−選択工程−
前記選択工程において、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記制御遺伝子の発現量が抑制されている場合には、前記被験物質が糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質として、選択することができる。
【００２９】
＜タンパク質の発現の抑制＞
前記本発明のタンパク質の発現の抑制を指標とするスクリーニング方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体、及び細胞のいずれかに被験物質を投与する投与工程、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれか、及び、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかにおける、前記タンパク質の活性を測定する測定工程、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記タンパク質の活性が抑制されている場合に、その被験物質を選択する選択工程、を含む方法などが挙げられる。
【００３０】
−投与工程−
前記投与工程における被験物質としては、特に制限はなく、各種候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。前記被験物質の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、注射による投与、などが挙げられる。
【００３１】
−測定工程−
前記測定工程における、前記タンパク質の活性を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）の活性の測定、などが挙げられる。
【００３２】
−選択工程−
前記選択工程において、被験物質を投与されない個体、及び細胞のいずれかに比べ、被験物質を投与された個体、及び細胞のいずれかの方で、前記タンパク質の活性が抑制されている場合には、前記被験物質が糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御する作用を有する物質として、選択することができる。
【００３３】
前記指標は、前記制御遺伝子の発現の抑制を単独で使用してもよいし、前記タンパク質の活性の抑制を単独で使用してもよいし、両者を併用してもよい。
【００３４】
前記スクリーニング方法により選択された物質は、ＣＯＸ７ＲＰ阻害剤としての機能を有すると考えられる。したがって、前記スクリーニング方法により、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができる、化合物、薬品、食品添加物、などを選択することができる。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明の実施例、及び試験例を説明するが、本発明は、これらの実施例、及び試験例に何ら限定されるものではない。【００３６】
下記実施例１では、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製を示し、下記試験例１〜３では、前記ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスを解析することにより、ＣＯＸ７ＲＰが、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命の少なくともいずれかを制御することができることを示す。【００３７】
（実施例１）
＜ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製＞
ＣＯＸ７ＲＰの生体における機能を解析するため、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスを作製した。
前記ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子が産生されないように、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子の第１イントロンにレトロウイルスベクターが挿入されたＥＳ細胞を利用し、Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）によって作製された（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ＢＰ，  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ＧＡ，  Ｂｕｘｔｏｎ  ＥＣ，  Ｌｉｌｌｅｂｅｒｇ  ＳＬ，  Ｐｅｒｓｏｎ  Ｃ，  Ｓａｎｄｓ  ＡＴ．、「Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２，０００  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．」、Ｎａｔｕｒｅ．、３９２（６６７６）、６０８−６１１、１９９８）ものを使用した。
図１に、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの作製に用いられたレトロウイルスベクターと、その挿入部位を示す。
図１中、「ＬＴＲ」は長端末反復を示し、「ＳＡ」はスプライシング受容部位を示し、「ＮＥＯ」はネオマイシン耐性遺伝子を示し、「ｐＡ」はポリＡ付加シグナルを示し、「ＰＧＫ」はホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子プロモーターを示し、「ＢＴＫ」はブルトン型チロシンキナーゼを示し、「ＳＤ」はスプライシング供与部位を示し、「Ｆ」、「Ｒ」、及び「Ｌ」はプライマーを示す。【００３８】
−ノックアウトの確認−
ＣＯＸ７ＲＰがノックアウトされたことの確認は、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子のイントロン１に位置するプライマーＦ、又は挿入されたレトロウイルスベクター上に位置するプライマーＬと、プライマーＲとを用いてゲノムＤＮＡをＰＣＲすることにより野生型（ＷＴ：４８９ｂｐ）と変異型（Ｍｕｔ：２８９ｂｐ）の遺伝子型を判別し、ＣＯＸ７ＲＰ＋／＋（＋／＋）、ＣＯＸ７ＲＰ＋／−（＋／−）、及びＣＯＸ７ＲＰ−／−（−／−）のマウスを同定することにより行った。
前記プライマーＦ、Ｒ、Ｌの配列を以下に示す。
プライマーＦ：５’−ｔｃｔｇｇｔｔｇａｇｇｔｇｇｃｃｔｔｔｇｔｇａｃｔｔ−３’（配列番号２）
プライマーＲ：５’−ｔｔａｔｃｃａｇｃａｃｃａａｃｃａｔｃｔｇｃｃａｇａ−３’（配列番号３）
プライマーＬ：５’−ａａａｔｇｇｃｇｔｔａｃｔｔａａｇｃｔａｇｃｔｔｇｃ−３’（配列番号４）
図２は、前記ＰＣＲによる産物を電気泳動した結果を示す図である。【００３９】
−胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の調製−
胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）は胎生１６日の胎児より調整し、１０％ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂａｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で、５％ＣＯ２、３７℃にて培養した。【００４０】
−ウエスタンブロット解析−
胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）のタンパク質の量を同一にしたサンプル（＋／＋、＋／−、−／−）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて泳動後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へブロッティングした。タンパク質の検出には、１次抗体としてＣＯＸ７ＲＰ、２次抗体としてＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により行った。その後、Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．７、２％ＳＤＳ、１００ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）にて抗体を除去後、ローディングコントロールとして、一次抗体β−ａｃｔｉｎ（ＳＩＧＭＡ）、二次抗体ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて検出した。
前記ウエスタンブロット解析の結果を図３に示す。図３に示すようにＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＣＯＸ７ＲＰ−／−（−／−））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）では、ＣＯＸ７ＲＰタンパク質は検出されなかった。【００４１】
−ＣＯＸ活性の測定−
ＣＯＸ活性の測定は、Ｃｈｒｚａｎｏｗｓｋａ−Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒｓ  ＺＭ，  Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ＤＭ，  Ｌｉｇｈｔｏｗｌｅｒｓ  ＲＮ．、「Ａ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌｓ．」、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１４（１）、４５−４９，１９９３に記載の方法に準じて行った。
即ち、胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を０．０１％  ｓａｐｏｎｉｎ、４ｎＭ  ３，３’ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ｈｙｄｒｏｃｈｏｌｏｒｉｄｅ、１００μＭ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ、２μｇ／ｍＬ  ｃａｔａｌａｓｅを含む０．１Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）中で１５分間インキュベートし、その後、４５０ｎｍの吸光度を測定して求めた。
前記ＣＯＸ活性の測定結果を図４に示す。図４に示すようにＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＣＯＸ７ＲＰ−／−（−／−））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）では、野生型マウス（ＣＯＸ７ＲＰ＋／＋（＋／＋））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）よりもＣＯＸ活性が低下していた。【００４２】
−ＡＴＰ産生量の測定−
ＡＴＰ産生量の測定は、Ｏｊａｉｍｉ  Ｊ，  Ｐａｎ  Ｊ，  Ｓａｎｔｒａ  Ｓ，  Ｓｎｅｌｌ  ＷＪ，  Ｓｃｈｏｎ  ＥＡ．、「Ａｎ  ａｌｇａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ＡＴＰ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ａ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｏｇｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ．」、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．、１３（１１）、３８３６−３８４４、２００２に記載の方法に準じて行った。
即ち、胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、５０μｇ／ｍＬ  ｄｉｇｉｔｏｎｉｎの組成の溶液に懸濁したものに、１ｍＭ  ｍａｌａｔｅ、１ｍＭ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、１ｍＭ  ＡＤＰ、０．１５ｍＭ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｐ１，Ｐ５−ｄｉ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）ｐｅｎｔａｐｈｏｓｐｈａｔｅになるようにこれらの試薬を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、２分間煮沸して反応を停止させ、Ｅｎｌｉｔｅｎ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＡＴＰを定量した。
前記ＡＴＰ産生量の測定結果を図５に示す。図５に示すようにＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＣＯＸ７ＲＰ−／−（−／−））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）では、野生型マウス（ＣＯＸ７ＲＰ＋／＋（＋／＋））の胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）よりもＡＴＰ量が低下していた。【００４３】
前記ＣＯＸ活性の測定、及びＡＴＰ産生量の測定結果から、ＣＯＸ７ＲＰ遺伝子は、ＣＯＸ活性を制御することによって、ミトコンドリアにおけるエネルギー産生を促進することが示された。【００４４】
（試験例１）
＜通常食飼育における生存期間の測定：寿命＞
ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスとを通常の餌で飼育し、生存期間を測定した。なお、ノックアウトマウスはｎ＝１０、野生型マウスはｎ＝１２で行った。
結果を図６に示す。図６は、野生型マウス及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの生存曲線（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｃｕｒｖｅｓ）を示す。
図６から、注目すべきことに最大寿命が、野生型マウスでは７７７日であったのに対し、ノックアウトマウスでは８３０日に延長していた。【００４５】
（試験例２）
＜通常食飼育、及び高脂肪食飼育における体重変化の測定：肥満＞
−通常食飼育−
６週齢から３５週齢になるまで、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと(それぞれ、ｎ＝１０)を、通常の餌で飼育し、週１回体重を測定した。
結果を図７Ａ（オス）と図７Ｂ（メス）に示す。
図７Ａと図７Ｂから、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、通常食で飼育した状態において、統計学的に有意に野生型より体重が少ないことが明らかになった。なお、図７Ａ及び図７Ｂ中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。【００４６】
−高脂肪食飼育−
１７週齢から２７週齢になるまで、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと（それぞれ、ｎ＝１０)を、高脂肪食（Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２，  Ｃｒｅａ，）を自由給餌にて飼育し、週１回体重を測定した。
結果を図８Ａ、及び図８Ｂに示す。図８Ａは、オスの野生型マウス及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの体重変化を示し、図８Ｂは、メスの野生型マウス及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの体重変化を示す。
図８Ａ、及び図８Ｂから、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、高脂肪食で飼育した状態においても、野生型より体重が少ないことが明らかになった。
なお、図８Ａ中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示し、図８Ｂ中、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１であることを示す。【００４７】
また、前記高脂肪食飼育の測定終了時に、高脂肪食肥満モデルにおける野生型マウスとＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（それぞれ、ｎ＝７）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋、皮下脂肪組織（鼠径部）、腹腔内脂肪組織（腎周囲、精巣上体周囲、子宮周囲）の重量を測定した。
結果を図９Ａ〜図９Ｄに示す。図９Ａは、オスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示し、図９Ｂは、オスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、精巣上体周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示し、図９Ｃは、メスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の肝臓、腎臓、心臓、骨格筋の重量を示し、図９Ｄは、メスの野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ）の腎周囲、子宮周囲、及び鼠径部の脂肪組織の重量を示す。
図９Ａ〜図９Ｄから、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスの各重量は、野生型マウスの各重量よりも軽くなっており、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスは、脂肪食における肥満に対して抵抗性を有していることが明らかになった。
なお、図９Ｂ、図９Ｄ中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１であることを示す。【００４８】
（試験例３）
＜糖負荷試験（ＯＧＴＴ）、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）、並びに、トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール、及び遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の測定：糖代謝、脂質代謝＞
−糖負荷試験（ＯＧＴＴ）−
マウスを１６時間絶食させた後、グルコース（１．５ｍｇ／ｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）を経口投与し、０分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈より採血した。前記マウスとしては、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと（それぞれ、ｎ＝７)を用いた。
血糖値は、Ｇｌｕｔｅｓｔ  Ｐｒｏ  Ｒ（株式会社三和化学研究所）を用いて測定した。また、インスリン濃度は、ＥＬＩＳＡ法（生化学工業株式会社）で測定した。
結果を図１０Ａ、及び図１０Ｂに示す。図１０Ａは、各採血時間におけるグルコース濃度示し、図１０Ｂは、各採血時間におけるインスリン濃度を示す。図１０Ａ中、「＊＊」は、野生型マウスに対してＰ＜０．０１であることを示し、図１０Ｂ中、「＊」は、野生型マウスに対してＰ＜０．０５であることを示す。
図１０Ａ、及び図１０Ｂから、絶食後の血糖値は、ノックアウトマウスが野生型マウスよりも低く、さらに糖負荷試験による血糖値の上昇がノックアウトマウスにおいて低く保たれていることが明らかになり、糖代謝の改善がみられた。また、その時の血中インスリンの濃度も低く保たれていた。【００４９】
−インスリン負荷試験（ＩＴＴ）−
マウスを２．５時間絶食させた後、インスリン（０．５  ｕｎｉｔｓ／ｋｇ）を腹腔内投与し、０分後、３０分後、６０分後、１２０分後に尾静脈より採血した血液を用いてグルコース濃度を測定した。前記マウスとしては、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウス（ＫＯ、ｎ＝３）と、同腹の野生型マウス（ＷＴ、ｎ＝６）とを用いた。
前記インスリン濃度は、ＥＬＩＳＡ法（生化学工業株式会社）で測定した。
結果を図１１に示す。図１１は、各採血時間におけるインスリン濃度を示す。
図１１から、ノックアウトマウス（ＫＯ）の方が、インスリンに対する血糖低下の反応性が有意に良好であることが示され、インスリン感受性の改善が示唆された。
なお、図１１中、「＊」は、Ｐ＜０．０５であることを示す。【００５０】
−−通常飼育時の血糖濃度、及びインスリン濃度−−
前記糖負荷試験を行ったマウスについて、絶食を行っていない通常飼育時の血糖濃度、及びインスリン濃度を測定した結果を表１に示す。【００５１】
【表１】
2011087009.tif 000002
表１中、「＊」は、野生型マウスに対してＰ＜０．０５であることを示す。【００５２】
表１の結果から、絶食を行っていない通常飼育時においても、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスでは、血糖濃度、及びインスリン濃度が低く保たれていることが明らかになった。【００５３】
−トリグリセライド（ＴＧ）、コレステロール、及び遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）の測定−
前記マウスとして、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスと、同腹の野生型マウスと（それぞれ、ｎ＝７)を用い、通常食事下、及び１６時間絶食後の血中のトリグリセライド、コレステロール、遊離脂肪酸の濃度を測定した。結果を表２に示す。
前記トリグリセライドは、トリグリセライド  Ｅ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。
前記コレステロールは、コレステロール  Ｅ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。
前記遊離脂肪酸は、ＮＥＦＡ  Ｃ−テストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。【００５４】
【表２】
2011087009.tif 000003
【００５５】
表２の結果から、ＣＯＸ７ＲＰノックアウトマウスにおいてコレステロールの有意な上昇が観察され、トリグリセライドについても上昇している傾向がみられたことから、ＣＯＸ７ＲＰは脂質代謝にも関与していることが示された。【００５６】
前記試験例１〜３の結果から、ＣＯＸ７ＲＰは、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御することができる制御遺伝子であり、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的となり得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の制御遺伝子は、糖代謝、脂質代謝、肥満、及び寿命を制御することができるので、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的として好適に利用可能である。
本発明のタンパク質は、前記遺伝子によって発現するので、アンチエイジング、メタボリック症候群、糖・脂質代謝異常、及び肥満症の分子標的として好適に利用可能である。
また、本発明のスクリーニング方法により探索される物質は、アンチエイジング素材、薬剤、並びにメタボリックシンドロームとそれに関係の深い糖尿病、高脂血症、肥満症の改善及び予防に利用できる医薬や食品添加物などとして利用可能である。
【図１】
2011087009.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2011087009.tif 000010
【図７Ｂ】
2011087009.tif 000011
【図８Ａ】
2011087009.tif 000012
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2011087009.tif 000014
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2011087009.tif 000016
【図９Ｄ】
2011087009.tif 000017
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011087009.tif 000022
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