(57)【要約】  本発明は、乳酸菌由来の蛋白質およびその製造方法に関する。本発明の乳酸菌由来の蛋白質は、大腸癌に対する治療効果が優れた乳酸菌（ラクトバチルスラムノサス）から分離した精製蛋白質であって、大腸疾患に対して著しい効果を立証したので、天然蛋白質大腸疾患の治療剤として医学分野で大きく活用されることが期待される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質。
【請求項２】
前記蛋白質は、配列番号２で表される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
前記蛋白質は、乳酸菌由来であることを特徴とする、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項４】
前記乳酸菌は、ラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、およびラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）からなるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項３に記載の蛋白質。
【請求項５】
前記乳酸菌は、ラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）である、請求項４に記載の蛋白質。
【請求項６】
請求項１に記載の蛋白質を有効成分として含む、大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項７】
前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項６に記載の大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項８】
前記大腸疾患は、大腸癌である、請求項７に記載の大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の蛋白質を有効成分として含む、大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１０】
前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項９に記載の大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１１】
前記大腸疾患は、大腸癌である、請求項１０に記載の大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の蛋白質を発現するように構築されたベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体。
【請求項１４】
前記形質転換体は、乳酸菌である、請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である、請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１３に記載の形質転換体を有効成分として含む、大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１７】
前記形質転換体は、乳酸菌である、請求項１６に記載の大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１８】
前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である、請求項１７に記載の大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項１９】
前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項１６に記載の大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２０】
前記大腸疾患は、大腸癌である、請求項１９に記載の大腸疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２１】
請求項１３に記載の形質転換体を有効成分として含む、大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項２２】
前記形質転換体は、乳酸菌である、請求項２１に記載の大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項２３】
前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である、請求項２２に記載の大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項２４】
前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である、請求項２１に記載の大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【請求項２５】
前記大腸疾患は、大腸癌である、請求項２４に記載の大腸疾患の予防または改善用食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌由来の蛋白質およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸疾患とは、大腸癌、大腸炎、過敏性大腸症候群、クローン病などを含むもので、大腸に発生する様々な疾病を総称する。現代は、頻繁なストレスと西欧化された食習慣、飲酒などの影響により、大腸疾患患者数が大幅に増加している。韓国国民健康保険公団の２０１２年大腸癌診療費報告書によると、大腸癌患者数は、２００７年の７万７，１９３人から２０１１年の１１万３，５０４人に増加し、大腸癌診療費は、２００７年の３，３６０億ウォンから２０１１年の５，１４８億ウォンに増加した。大腸癌治療のために、合成化合物としての５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＵＦＴ（ｔｅｇａｆｕｒ−ｕｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）などのフルオロピリミジン（ｆｌｏｕｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）系薬物とイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）などが開発されて使用されており、標的治療剤であるベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名アバスチン）およびセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、商品名アービタックス）などが開発されている。しかし、高濃度投与および長期的使用による副作用の危険が高く、天然産物由来の治療剤の開発が急務とされている。
【０００３】
一方、プロバイオティクスとは、摂取されて腸に到達した時に腸内環境に有益な作用をする菌株をいう。現在まで知られた大部分のプロバイオティクスは乳酸菌であり、乳酸菌とは、糖類を発酵してエネルギーを獲得し多量の乳酸を生成する細菌の総称である。大腸癌および大腸炎を含む大腸疾患患者に乳酸菌を投与して治療効果を期待できることが公知となり、「腸内有害酵素の活性を抑制する新たな韓国型乳酸菌およびその用途（ＫＲ１０−０２３２６３９Ｂ１）」および「腸内環境の改善効果を有するナノ型キムチ乳酸菌組成物（ＫＲ１０−２０１６−００８４８２２Ａ）」など、乳酸菌を大腸疾患治療剤として使用しようとする技術が開発されているが、乳酸菌内における有効成分としての蛋白質を確認し用いることに関する技術は、開発が微々たるのが現状である。
【０００４】
したがって、本発明は、乳酸菌由来の蛋白質およびその製造方法に関し、本発明の乳酸菌由来の蛋白質は、大腸癌に対する治療効果が優れた乳酸菌（ラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ））から分離した精製蛋白質であって、大腸疾患に対して著しい効果を立証したので、天然蛋白質大腸疾患治療剤として医学分野で大きく活用されることが期待される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、乳酸菌由来の蛋白質およびその製造方法に関する。
【０００６】
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は、以上に言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下、本願に記載の多様な具体例が図面を参照して記載される。下記の説明において、本発明の完全な理解のために、多様な特異的詳細事項、例えば、特異的形態、組成物および工程などが記載されている。しかし、特定の具体例は、これらの特異的詳細事項の１つ以上なしに、または他の公知の方法および形態とともに実行できる。他の例において、公知の工程および製造技術は、本発明を不必要に曖昧にしないようにするために、特定の詳細事項として記載されない。「一具体例」または「具体例」に関する本明細書全体にわたる参照は、具体例と結び付けて記載された特別な特徴、形態、組成または特性が本発明の１つ以上の具体例に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる多様な位置で表現された「一具体例において」または「具体例」の状況は、必ずしも本発明の同一の具体例を示すものではない。追加的に、特別な特徴、形態、組成、または特性は、１以上の具体例において、何らかの適した方法で組み合わされる。
【０００８】
明細書において特別な定義がなければ、本明細書に使われたすべての科学的および技術的な用語は、本発明の属する技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【０００９】
本発明の一具体例において、「プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）」とは、摂取されて腸に到達した時に腸内環境に有益な作用をする菌株をいう。現在まで知られた大部分のプロバイオティクスは乳酸菌であり、一部のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などを含んでいる。ロシアの科学者メチニコフ（Ｅｌｉｅ  Ｍｅｃｈｉｎｉｋｏｆｆ）は、ブルガリアの人々が長寿を享受する理由がラクトバチルスで発酵した発酵乳の摂取のためであることを突き止めてノーベル賞を受賞して以来、乳酸菌、プロバイオティクスの機能性は長い間研究されている。乳酸菌を含めた細菌がプロバイオティクスとして認められるためには、胃酸と胆汁酸で生き残り、小腸まで到達して腸で増殖し定着しなければならず、腸管内で有用な効果を示さなければならず、毒性がなく、非病原性でなければならない。
【００１０】
ヒトの腸には約１ｋｇの菌が生息しており、食べ物の量と菌の量がほぼ同一に存在し、毎日排泄する糞便の内容物も、水分を除けば約４０％を菌が占める。ヒトの糞便を顕微鏡で観察すると、ほぼ菌の塊からなることが分かり、これら菌の９９％程度は嫌気性菌である。母乳を食べる健康な赤ちゃんの場合、糞便菌の９０％以上がビフィドバクテリウムからなるが、年を取るにつれて次第にビフィドバクテリウムは減少し、腸内有害菌は増加するようになる（Ｂｉｆｉｄｏ  Ｍｉｃｒｏｆｌ７：３５−４３、１９９８）。このような正常な老化過程で腸内菌叢の分布を健康な状態に維持するように補助するのが、プロバイオティクスの機能である。
【００１１】
本発明の一具体例において、「乳酸菌（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ）」とは、ニュウ酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）とも名付け、糖類を発酵してエネルギーを獲得し多量の乳酸を生成する細菌の総称である。「乳酸菌」という名称は慣用名であり、分類学的な位置を指すものではない。乳酸菌の定義に適したものは、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの菌属である。形態的には、球菌（ラクトコッカス、ペディオコッカス、リューコノストック）と桿菌（ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム）に分けられ、グラム（Ｇｒａｍ）染色性は陽性である。いずれも酸素の少ない環境でよく発育して各種糖から乳酸を生成する。酸に耐性を示すものが多く、栄養要求性は非常に複雑で、糖類の他に多い種類のアミノ酸やビタミンを要求し、菌種、菌株によって微量栄養素を加えなければ生育できないものもある。乳酸菌は、農産物や食品からヒトや動物の体まで自然界に広く分布しており、確かな生育先が分からないものもある。ラクトコッカスは１０℃で発育するが、４５℃では発育せず、最適温度が３０℃前後の球菌で正常発酵をする。乳製品のスターター（ｓｔａｒｔｅｒ）として食品加工に用いられる菌種が多い。ペディオコッカスは正常発酵をする球菌で、四連の細胞配列をする。生育温度、乳酸の旋光性などによって８種類の菌種に分類されている。ペディオコッカスは、リューコノストックとともに、発酵に係わる主要菌であって、動物の生体とは関係が少ない。リューコノストックは、異常発酵する連鎖球菌で、糖分解、成長、生育ｐＨなどによって４種類の菌種に分類される。ラクトバチルスは、正常発酵と異常発酵をする２種類に大別されるが、生育温度、糖分解、成長、生成乳酸の旋光性などによって５５菌種１１亜菌種に分類されている。ラクトバチルスは、代表的な乳酸菌として各種発酵食品に使用され、また、腸管常在菌叢としてヒトや動物の健康と重要な関係がある。ビフィドバクテリウムは、異常発酵をする偏性嫌気性グラム陽性桿菌であって、主に乳酸と酢酸を最終産物として生産する。
【００１２】
本発明の一具体例において、「Ｐ８蛋白質（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎｏ．８）」とは、本発明の実施例に記載の製造方法により乳酸菌（ラクトバチルスラムノサス）から抽出された８ＫＤａサイズの蛋白質断片を意味する。本発明のＰ８蛋白質は、配列番号１で表される塩基配列、または配列番号２で表されるアミノ酸配列で定義され、大腸疾患の治療に有効な効果がある。
【００１３】
本発明の一具体例において、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、組換えＤＮＡ実験で、遺伝子を宿主に導入して増殖させる目的で用いられる小型の自律増殖能のあるＤＮＡを意味する。通常、プラスミドとバクテリオファージが使用される。ベクターの条件は、細胞内に効率的に挿入されること、他のＤＮＡを組込み挿入できるように制限酵素で切断できる部位があること、薬剤耐性があって選別できること、標識遺伝子がなければならないこと、などである。
【００１４】
本発明において、ベクターは、Ｐ８蛋白質またはＰ８蛋白質の活性部位をコードするＤＮＡを含むものを意味するが、これに限定するものではない。
【００１５】
本発明の一具体例において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、元の細胞が持っていたのとは異なる種類の遺伝子があるＤＮＡ鎖片またはプラスミドが細胞の間に侵入されて、元の細胞に存在していたＤＮＡと結合した結果として細胞の遺伝形質が変化することを意味する。形質転換は、細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）でよく観察され、人工的な遺伝子組換えにより行われてもよい。前記形質転換によって遺伝形質が変化した細胞または個体を「形質転換体」という。具体的には、自分のものではないＤＮＡを受け入れて形質転換が起こった細胞を形質転換受容細胞という。形質転換された受容細胞は、接合と形質導入により新たな遺伝形質を拡散させることができる。バクテリオファージのようなウイルスを媒介として形質転換されたバクテリアの新たな形質が他のバクテリアに移る場合には、形質導入、または形質移入という。形質導入は、ウイルスが関与するという点で形質転換とは異なる。
【００１６】
本発明において、形質転換体は、前記Ｐ８蛋白質またはＰ８蛋白質の活性部位をコードするＤＮＡを含むベクターの挿入によって遺伝形質が変化した細胞または個体を意味し、前記遺伝形質が変化した細胞は乳酸菌であることが好ましいが、これに限定するものではない。
【００１７】
本発明の一具体例において、「大腸疾患」とは、大腸に発生する様々な疾病を総称するもので、これに限定するものではないが、好ましくは、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、クローン病などを含む。
【００１８】
本発明の一具体例において、「薬学組成物」とは、特定の目的のために投与される組成物を意味する。本発明の目的上、本発明の薬学組成物は、配列番号２〜１０で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される１つ以上の蛋白質であってもよく、または配列番号２〜１０で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される１つ以上の蛋白質を有効成分として含む組成物であってもよく、これに関与する蛋白質および薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記の「薬学的に許容される可能な」担体または賦形剤は、政府の規制部によって承認されたものや、または脊椎動物、そしてより特別には、ヒトへの使用のための政府またはその他一般的に承認された薬局方でリストされたものを意味する。
【００１９】
非経口的な投与のために、本発明の薬学組成物は、油性または水性担体にある懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態になってもよく、固体または半固体の形態に製造されるが、最も好ましくは、液状形態であってもよい。また、本発明の薬学組成物は、懸濁剤、安定化剤、溶解剤および／または分散剤のような剤形化剤を含むことができ、滅菌される。前記薬学組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定化することができ、細菌やカビのような微生物の汚染作用に対して保存可能である。代案的に、本発明の薬学組成物は、使用前に適切な担体と再構成のために滅菌粉末形態であってもよい。薬学組成物は、単位−服用量形態で、マイクロニードルパッチに、アンプルに、またはその他の単位−服用量容器に、または多−服用量容器に存在してもよい。代案的に、薬学的組成物は、単に滅菌液体担体、例えば、使用直前に注射用水の付加を要する凍結−乾燥した（冷凍乾燥）状態で保管されてもよい。直ちに注射溶液および懸濁液は、滅菌粉末、グラニュールまたはタブレットに製造される。
【００２０】
いくつかの非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物は、液体に剤形化されてもよく、または液体中に微粒球の形態で含まれてもよい。また、ある非制限的な実施形態において、本発明の薬学組成物に適切な賦形剤は、保存剤、懸濁剤、安定化剤、染料、緩衝剤、抗菌剤、抗真菌剤、および等張化剤、例えば、砂糖または塩化ナトリウムを含むことができる。ここで使用されたもので、用語「安定化剤」は、保存寿命を増加するために、本発明の薬学的組成物に選択的に使用された化合物を言及する。非−制限的な実施において、追加的な安定化剤は、糖、アミノ酸、またはポリマーであってもよい。また、本発明の薬学組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体を含むことができ、前記担体は、溶媒または分散培地であってもよい。薬学的に許容可能な担体の非−制限的な例は、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、オイル、およびこれらの適切な混合物を含む。本発明の薬学組成物に適用される滅菌技術の非−制限的な例は、細菌−抑制フィルタを通した濾過、完全滅菌化、滅菌製剤の合体、放射線照射、滅菌ガス照射、加熱、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【００２１】
本発明の一具体例において、「投与」とは、何らかの適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる限り、一般的な経路を通して投与される。経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、硬膜内投与が行われてもよいが、本発明の有効成分として配列番号２〜１０で表されるアミノ酸配列からなる群より選択される１つ以上の蛋白質、または前記を含む組成物の場合、粉末、タブレット、カプセル、または液状剤形の形態で経口投与が最も好ましいが、これに制限されるわけではない。
【００２２】
本発明の目的とする適応症の治療方法は、前記薬学組成物を薬剤学的有効量で投与することを含むことができる。本発明において、有効量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含有された有効成分および他の成分の種類および含有量、剤形の種類および患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を含めた多様な因子に応じて調節可能である。
【００２３】
本発明の一具体例において、配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を提供し、前記蛋白質は、配列番号２で表される蛋白質を提供し、前記蛋白質は、乳酸菌由来であることを特徴とする蛋白質を提供し、前記乳酸菌は、ラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルスパラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、およびラクトバチルスブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）からなるグループより選択されたいずれか１つ以上である蛋白質を提供し、前記乳酸菌は、ラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）である蛋白質を提供する。
【００２４】
本発明の他の具体例において、配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含む大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌である大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００２５】
本発明のさらに他の具体例において、配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含む大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌である大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００２６】
本発明のさらに他の具体例において、配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を発現するように構築されたベクターを提供する。
【００２７】
本発明のさらに他の具体例において、配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を発現するように構築されたベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体を提供し、前記形質転換体は、乳酸菌である形質転換体を提供し、前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である形質転換体を提供する。
【００２８】
本発明のさらに他の具体例において、配列番号８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を発現するように構築されたベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体を有効成分として含む大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供し、前記形質転換体は、乳酸菌である大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供し、前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌である大腸疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の具体例において、配列番号８、９、および１０で表される蛋白質から構成されたグループより選択されたいずれか１つ以上のアミノ酸配列を含む蛋白質を発現するように構築されたベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体を有効成分として含む大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供し、前記形質転換体は、乳酸菌である大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供し、前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性腸疾患、赤痢、腸内血管異形成、憩室症、過敏性大腸症候群、およびクローン病から構成されるグループより選択されたいずれか１つ以上である大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供し、前記大腸疾患は、大腸癌である大腸疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【００３０】
以下、前記本発明を段階別に詳細に説明する。
【発明の効果】
【００３１】
大腸癌、大腸炎、過敏性大腸症候群、クローン病などを含む大腸疾患に対して乳酸菌を治療剤として用いることは公知の技術であるが、乳酸菌内で有効成分としての蛋白質を確認し、これを用いることに対する技術は開発が微々たるものであった。本発明は、乳酸菌由来の蛋白質およびその製造方法に関し、本発明の乳酸菌由来の蛋白質は、大腸癌に対する治療効果が優れた乳酸菌（ラクトバチルスラムノサス）から分離された精製蛋白質であって、大腸疾患に対して著しい効果を立証したので、天然蛋白質大腸疾患の治療剤として医学分野で大きく活用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施例による、ラクトバチルスラムノサス菌体破砕液をクロマトグラフィーでサイズ別に分類して蛋白質と低分子物質に分離された結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例による、本発明のＰ８蛋白質を製造するための蛋白質精製過程における段階別の結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例による、本発明のＰ８蛋白質のアミノ酸配列を分析（シーケンシング）して配列を確認した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例による、本発明のＰ８蛋白質とアミノ酸配列の相同性が高い乳酸菌由来の蛋白質間の活性部位の配列共有模式図である。
【図５】本発明の一実施例による、大腸癌細胞株ＤＬＤ−１とＨＴ−２９に本発明のＰ８蛋白質処理後の細胞成長抑制効果を確認した結果を示す図である。
【図６】本発明の一実施例による、大腸癌細胞株ＤＬＤ−１に本発明のＰ８蛋白質処理後の細胞生存能力阻害効果を確認した結果を示す図である。
【図７】本発明の一実施例による、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に本発明のＰ８蛋白質処理後の細胞毒性を確認した結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施例による、大腸癌細胞株ＤＬＤ−１に本発明のＰ８蛋白質処理後の細胞移動性抑制効果を確認した結果を示す図である。
【図９】本発明の一実施例による、大腸癌異種移植マウスモデルでＰ８蛋白質処理後の癌組織の成長抑制効果を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞を６ウェル−プレートに１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で培養し、本発明のＰ８蛋白質を１μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。これを２４時間から４８時間培養した後、リン酸緩衝溶液で２回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存性／細胞毒性キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ）１ｍｌ処理後、２０〜４０分間反応させた。前記染色によって生きた細胞は緑色、死んだ細胞は赤色に染色される。前記細胞を蛍光顕微鏡下で確認して生存性の抑制程度を確認した結果、大腸癌細胞にＰ８蛋白質処理時、陰性対照群（Ｃｏｎｔ．）に比べて細胞生存率が減少することが分かり、処理されたＰ８蛋白質の濃度が増加するほど、またはＰ８蛋白質処理時間が増加するほど、大腸癌細胞株の生存能力が阻害されることを確認した。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【００３５】
実施例１．乳酸菌由来の蛋白質の分離および精製
実施例１−１．乳酸菌由来の蛋白質の精製
多様な種類の乳酸菌培養上澄液または菌体破砕液を大腸癌細胞株のＤＬＤ−１に処理して抗癌活性を確認した。そのうち、抗癌活性が最も良いラクトバチルスラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＫＣＴＣ１２２０２ＢＰ）菌体破砕液を選別した。
【００３６】
前記ラクトバチルスラムノサス菌体破砕液から有効成分として抗癌蛋白質を精製するために、高速蛋白質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ、ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＥヘルスケア）装備でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、セファデックスＧ−２５、脱染カラム、ＧＥヘルスケア）を行って蛋白質のみを分離した。前記蛋白質と低分子物質とが分離されたピークグラフを図１に記載した。
【００３７】
蛋白質のみを分離した区画を２０ｍＭトリスバッファー（Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．０）で透析し、ハイトラップＤＥＡＥ  ＦＦ（ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＦＦ、ＧＥヘルスケア）に吸着しない蛋白質を回収して３ＫＤａサイズのメンブレンで濃縮した後、０．０５Ｍリン酸塩ｐＨ６．０の溶液で再透析し、ハイトラップＤＥＡＥ  ＳＰ（ＨｉＴｒａｐ  ＤＥＡＥ  ＳＰ、ＧＥヘルスケア）に吸着させ、０．５Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配によって順次に分離した。分離された分画物別に大腸癌細胞に処理して抗癌活性を確認し、最も抗癌活性の良い分画物を濃縮して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認する方法により８ＫＤａサイズの蛋白質を分離し、これを「Ｐ８蛋白質」と名付けた。前記Ｐ８蛋白質製造過程の段階別の結果を図２に記載した。
【００３８】
実施例１−２．乳酸菌由来の蛋白質の同定
実施例１−１の方法で精製されたＰ８蛋白質をクマシーブルー−２５０染色後、マルチ−トフ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  Ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を行って「未究明蛋白質ＬＧＧ＿０２４５２［ラクトバチルスラムノサス］」というアイディーを算出し、前記蛋白質をＰＶＤＦメンブレンに転移し、Ｎ−末端アミノ酸シーケンシングにより同定した結果、Ｎ末端アミノ酸配列はＡ−Ｔ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−Ｅ−Ｋ−Ｔ−Ｌ−Ｆであることを確認した。前記結果を図３に示した。
【００３９】
また、前記「未究明蛋白質ＬＧＧ＿０２４５２」のＤＮＡ配列を鋳型として表１のようにプライマーを作製し、ＰＣＲを行って配列分析（シーケンシング）した結果、表２のように塩基配列およびアミノ酸配列を確認した。
【００４０】
【表１】
2019521089.tif 000003
【００４１】
【表２】
2019521089.tif 000004
【００４２】
実施例１−３．乳酸菌由来の蛋白質の活性部位の同定
実施例１−１で精製されたＰ８蛋白質の活性部位を追跡するために、Ｐ８蛋白質の配列と類似の乳酸菌由来の蛋白質を探索し、その結果を表３に記載した。Ｐ８蛋白質と表３に記載の蛋白質間の配列相同性を分析して導出された活性部位３箇所の配列を表４に記載した。前記乳酸菌由来の蛋白質間の活性部位の配列共有模式図を図４に記載した。
【００４３】
【表３】
2019521089.tif 000005
【００４４】
【表４】
2019521089.tif 000006
【００４５】
実施例１−４．乳酸菌由来の蛋白質の活性部位の抗癌効果の確認
大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞を９６ウェル−プレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で培養し、実施例１−３の活性部位１〜３（配列番号８〜１０）を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。陰性対照群は、蛋白質の精製時に用いた緩衝溶液である０．１％ＰＢＳを使用した。これを２４時間培養した後、細胞生存率測定用キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８）をウェルあたり１０μｌずつ処理して、２時間反応させた。これをマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｒａｄ、米国、日本）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、測定値を細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）として算出した。その結果、陰性対照群に比べて、活性部位１〜３を処理した実験群で大腸癌細胞株ＤＬＤ−１の細胞成長が有意に抑制されたことを確認した。
【００４６】
実施例２．試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の乳酸菌由来の蛋白質（Ｐ８蛋白質）の抗癌効果の確認
実施例２−１．細胞生存率の確認
大腸癌細胞株ＤＬＤ−１とＨＴ−２９細胞それぞれを９６ウェル−プレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で培養し、実施例１のＰ８蛋白質を０．３９μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。陰性対照群は、蛋白質の精製時に用いた緩衝溶液である０．１％ＰＢＳを使用した。これを２４時間培養した後、細胞生存率測定用キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８）をウェルあたり１０μｌずつ処理して、２時間反応させた。これをマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｒａｄ、米国、日本）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、測定値を細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）として算出した。前記結果を図５に示した。
【００４７】
実験結果、Ｐ８蛋白質が大腸癌細胞株のＤＬＤ−１とＨＴ−２９に対して約２０％の細胞成長抑制効果を示し、癌細胞の成長抑制に対して効果があることが確認された。
【００４８】
実施例２−２．抗癌効果の確認
大腸癌細胞株ＤＬＤ−１細胞を６ウェル−プレートに１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で培養し、実施例１のＰ８蛋白質を１μｇ／ｍｌ、または１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。これを２４時間から４８時間培養した後、リン酸緩衝溶液で２回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生存性／細胞毒性キット（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ）１ｍｌ処理後、２０〜４０分間反応させた。前記染色によって生きた細胞は緑色、死んだ細胞は赤色に染色される。前記細胞を蛍光顕微鏡下で確認して生存性の抑制程度を確認し、その結果を図６に示した。実験結果、大腸癌細胞にＰ８蛋白質処理時、陰性対照群（Ｃｏｎｔ．）に比べて細胞生存率が減少することが分かり、処理されたＰ８蛋白質の濃度が増加するほど、またはＰ８蛋白質処理時間が増加するほど、大腸癌細胞株の生存能力が阻害されることを確認した。
【００４９】
実施例２−３．細胞毒性の確認
実施例１のＰ８蛋白質の細胞毒性の有無を確認するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ）で大量発現させたＰ８蛋白質と、陽性対照群としてＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）の細胞毒性実験を行った。
【００５０】
まず、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６ウェル−プレートに各１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルの密度で培養し、ＢＳＡと、大量発現で精製したＰ８蛋白質を０．３９μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加した。これを２４時間培養した後、細胞生存率測定用キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ  ｋｉｔ  ＷＳＴ−８）をウェルあたり１０μｌずつ処理して、２時間反応させた。これをマイクロプレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｒａｄ、米国、日本）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、測定値を細胞生存率（Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｅ）として算出した。前記結果を図７に示した。
【００５１】
実験結果、Ｐ８蛋白質処理された細胞の生存率は、ＢＳＡ処理された細胞と比較して有意な差がないので、Ｐ８蛋白質自体による細胞毒性はないことを確認した。
【００５２】
実施例２−４．大腸癌細胞の移動性抑制効果の確認
大腸癌細胞のＤＬＤ−１細胞に、実施例１のＰ８蛋白質を１μｇ／ｍｌの濃度で１日、３日、または７日を毎日処理した後、それぞれの細胞を６ウェル−プレートに分注した。
【００５３】
分注されたＤＬＤ−１細胞を一晩培養後、２００μｌのチップ（ｔｉｐ）を用いて、細胞の培養されているプレートにスクラッチを加えた。前記スクラッチによる浮遊物質を除去するために、ＰＢＳで２回洗浄した後、２４時間追加的に培養した。その結果を図８に示した。
【００５４】
実験結果、Ｐ８蛋白質を処理しなかった対照群では、スクラッチ部位が細胞でほとんど埋められるのに対し、Ｐ８蛋白質を処理した実験群では、スクラッチの埋められる速度が減少することを確認した。特に、Ｐ８蛋白質を処理した時間の持続性（１日、３日、または７日）に比例して細胞の移動速度が有意に減少することを確認した。これを統計処理して確認すると、Ｐ８蛋白質処理しなかった対照群での細胞で埋められた面積に比べて、Ｐ８蛋白質を１日処理時に１５．７％、３日処理時に４５．９％、７日処理時に５８．３％と、細胞の移動速度が低下することを確認した。
【００５５】
実施例３．生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の乳酸菌由来の蛋白質（Ｐ８蛋白質）の抗癌効果の確認
実施例３−１．大腸癌異種移植モデルの製造
ヒト由来の大腸癌細胞株（ＤＬＤ−１）をヌードマウスの皮下に移植して異種移植モデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ）を製造し、これを用いて実施例１のＰ８蛋白質の抗癌活性を評価した。
【００５６】
まず、大腸癌異種移植モデルの製造のために、１×１０７ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＤＬＤ−１細胞をヌードマウスの皮下に移植した。移植から１０〜１５日後に腫瘍細胞の移植状態を確認し、安定的な移植状態を示すマウスに対して持続的な観察を実施した。腫瘍の中心壊死（Ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ）が起こる前に、十分な血液供給で急速な癌成長を示すマウスを選別して癌組織を得た。得られた癌組織のうち主に急速な細胞分裂が発生する外角部位を一定のサイズ（３×３×３ｍｍ）に切って癌組織切片（ｔｕｍｏｒ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を作製した。次に、套管針（Ｔｒｏｃａｒ）の末端に癌組織切片を載せて用意し、動物の左側後肢の前側方を約４ｍｍ程度切開し、ここを通して用意した套管針を挿入して、左側前肢の後方の体幹側面部に末端が到達するようにした。套管針を軽く速やかに回して３６０度回転させて除去し、癌組織切片が目標の地点に位置するようにし、切除部位は消毒した。皮膚上に促進して癌組織切片の位置を確認し、週２回以上癌成長を観察して、成功的な移植状態を示すマウスのみを選別して実験に使用した。
【００５７】
実施例３−２．抗癌効果の確認
実施例３−１の方法で製造された大腸癌異種移植モデルを表５のようにグループ化し、週２回ずつ４週間、計８回腹腔に薬物を投与した。
【００５８】
【表５】
2019521089.tif 000007
【００５９】
薬物投与期間中、２日ごとに１回ずつノギス（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒｓ）を用いて腫瘍のサイズを測定し、測定された値を表６に記載の数式により体積として算出した。計８回の投与終了後、腫瘍を摘出して写真撮影し、前記体積算出グラフおよびマウスから摘出された腫瘍の写真を図９に記載した。
【００６０】
【表６】
2019521089.tif 000008
【００６１】
実験結果、処理されたすべての濃度のＰ８蛋白質実験群で、陰性対照群と比較して有意な水準の癌成長抑制効果があり、Ｐ８蛋白質が１０ｍｇ／Ｋｇ以上の濃度で処理される場合には、既存の抗癌剤に勝る水準の癌成長抑制効果を期待できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、乳酸菌由来の蛋白質およびその製造方法に関し、本発明の乳酸菌由来の蛋白質は、大腸癌に対する治療効果が優れた乳酸菌（ラクトバチルスラムノサス）から分離した精製蛋白質であって、大腸疾患に対して著しい効果を立証したので、天然蛋白質大腸疾患の治療剤として医学分野で大きく活用されることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＤＮＡ）
ａｔｇｇｃａａｃａｇ  ｔａｇａｔｃｃｔｇａ  ａａａｇａｃａｔｔｇ
ｔｔｔｃｔｃｇａｔｇ  ａａｃｃａａｔｇａａ  ｃａａｇｇｔａｔｔｔ
ｇａｃｔｇｇａｇｃａ  ａｃａｇｃｇａａｇｃ  ａｃｃｔｇｔａｃｇｔ
ｇａｔｇｃｇｃｔｇｔ  ｇｇｇａｔｔａｔｔａ  ｃａｔｇｇａａａａｇ
ａａｃａｇｃｃｇｔｇ  ａｔａｃｃａｔｃａａ  ｇａｃｔｇａａｇａａ
ｇａａａｔｇａａａｃ  ｃａｇｔｃｃｔａｇａ  ｃａｔｇｔｃｃｇａｃ
ｇａｔｇａｇｇｔｃａ  ａａｇｃｃｃｔａｇｃ  ａｇａａａａｇｇｔｔ
ｃｔｃａａｇａａｇｔ  ａａ
配列番号２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ
Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ
Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ
Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ
Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
配列番号３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ
Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ
Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ
Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ
Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ
Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ
Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
配列番号４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ
Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ
Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ
Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ
Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
配列番号５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ
Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ
Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ
Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ
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Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｌａ
Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
Ｌｙｓ  Ａｌａ
配列番号６（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ
Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ
Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ
Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｕ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ
配列番号７（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ
Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ
Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ
Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ
Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ
Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ
Ｌｙｓ
配列番号８（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ
Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ
Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ
配列番号９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ
Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ
Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ
Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ
配列番号１０（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ
Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ
Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ
Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
【図１】
2019521089.tif 000009
【図２】
2019521089.tif 000010
【図３】
2019521089.tif 000011
【図４】
2019521089.tif 000012
【図５】
2019521089.tif 000013
【図６】
2019521089.tif 000014
【図７】
2019521089.tif 000015
【図８】
2019521089.tif 000016
【図９】
2019521089.tif 000017
【配列表】
2019521089000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月15日(2019.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたアミノ酸配列からなる蛋白質又はペプチドを有効成分として含む、大腸癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
配列番号２、８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたアミノ酸配列からなる蛋白質又はペプチドを有効成分として含む、大腸癌の予防または改善用食品組成物。
【請求項３】
配列番号２、８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたアミノ酸配列からなる蛋白質又はペプチドを発現するように構築されたベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体を有効成分として含む、大腸癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
前記形質転換体は、乳酸菌である、請求項３に記載の大腸癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項５】
前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である、請求項４に記載の大腸癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項６】
配列番号２、８、９、および１０で表されるアミノ酸配列から構成されたグループより選択されたアミノ酸配列からなる蛋白質又はペプチドを発現するように構築されたベクターを含む、ヒトを除いた形質転換体を有効成分として含む、大腸癌の予防または改善用食品組成物。
【請求項７】
前記形質転換体は、乳酸菌である、請求項６に記載の大腸癌の予防または改善用食品組成物。
【請求項８】
前記乳酸菌は、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）である、請求項７に記載の大腸癌の予防または改善用食品組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【表３】
2019521089.tif 000018
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【表４】
2019521089.tif 000019
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
配列番号１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＤＮＡ）
ａｔｇｇｃａａｃａｇ  ｔａｇａｔｃｃｔｇａ  ａａａｇａｃａｔｔｇ
ｔｔｔｃｔｃｇａｔｇ  ａａｃｃａａｔｇａａ  ｃａａｇｇｔａｔｔｔ
ｇａｃｔｇｇａｇｃａ  ａｃａｇｃｇａａｇｃ  ａｃｃｔｇｔａｃｇｔ
ｇａｔｇｃｇｃｔｇｔ  ｇｇｇａｔｔａｔｔａ  ｃａｔｇｇａａａａｇ
ａａｃａｇｃｃｇｔｇ  ａｔａｃｃａｔｃａａ  ｇａｃｔｇａａｇａａ
ｇａａａｔｇａａａｃ  ｃａｇｔｃｃｔａｇａ  ｃａｔｇｔｃｃｇａｃ
ｇａｔｇａｇｇｔｃａ  ａａｇｃｃｃｔａｇｃ  ａｇａａａａｇｇｔｔ
ｃｔｃａａｇａａｇｔ  ａａ
配列番号２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ
Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ
Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ
Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ
Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
配列番号３（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ
Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ
Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ
Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ
Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ
Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ
Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
配列番号４（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ
Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ
Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ
Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ
Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ
Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
配列番号５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ
Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ
Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ
Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ
Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ
Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｌａ
Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
Ｌｙｓ  Ａｌａ
配列番号６（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ
Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ
Ｍｅｔ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ
Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｕ
Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ
配列番号７（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ
Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ
Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ
Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ
Ｈｉｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ
Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ
Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ
Ｌｙｓ
配列番号８（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ
Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ
Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ
配列番号９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ
Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ
Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ
Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ
配列番号１０（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、ＰＲＴ）
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ
Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ
Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ
Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ
Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019521089000001.app
【国際調査報告】
2019521089.tif 000020
2019521089.tif 000021
2019521089.tif 000022
2019521089.tif 000023