(57)【要約】  干渉散乱顕微鏡は、出力光の検出の前に出力光の空間フィルタリングを実行することによって適合され、出力光は、試料位置から散乱した光と試料位置から反射した照明光の両方を含む。空間フィルタリングは、反射照明光を通過させるが、所定の開口数内では、より大きい開口数におけるものよりも大きい強度の減少を伴う。これは、特に弱い散乱体である物体について、コヒーレント照明に対する画像コントラストを増強させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を試料位置に保持するための試料ホルダと、
照明光を供給するように構成された照明光源と、
検出器と、
照射光を前記試料位置に向けるように、かつ、反射した出力光を集めるように構成された光学系であって、前記出力光は、前記試料位置から散乱した光と前記試料位置から反射した照射光との両方を含み、前記光学系は前記出力光を前記検出器に向けるように構成されている、光学系と、
前記出力光をフィルタリングするように構成された空間フィルタであって、前記空間フィルタは、出力光を通過させるように構成されているが、所定の開口数内では、より大きい開口数におけるものよりも大きい強度の減少を伴う、空間フィルタと、
を含む、干渉散乱顕微鏡。
【請求項２】
前記所定の開口数は、前記出力光に含まれる前記試料位置から反射された前記照明光の開口数である、
請求項１に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項３】
前記空間フィルタは、前記所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−２以下に減少させて通過させるように構成される、
請求項１または２に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項４】
前記空間フィルタは、前記所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−４以上に減少させて通過させるように構成される、
請求項１から３のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項５】
前記所定の開口数は、１未満、好ましくは０．５未満である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項６】
前記照明光は、空間的および時間的にコヒーレントである、
請求項１から５のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項７】
前記光学系は、前記照明光と前記出力光の光路を分割するように構成されたビームスプリッタを含み、前記空間フィルタは、ビームスプリッタの一部である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項８】
前記空間フィルタは、透過型である、
請求項１から７のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項９】
前記空間フィルタは、反射型である、
請求項１から７のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１０】
前記光学系は、対物レンズを含み、前記空間フィルタは、前記対物レンズの後部開口の真後ろに配置される、
請求項１から９のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１１】
前記光学系は、対物レンズを含み、前記空間フィルタは、前記対物レンズの後部焦点面の共役焦点面に配置される、
請求項１から９のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１２】
前記試料ホルダは、５０００ｋＤａ以下の質量を有する物体を含む試料を保持する、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１３】
前記試料ホルダは、１０ｋＤａ以上の質量を有する物体を含む試料を保持する、
請求項１２に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１４】
前記試料ホルダは、前記照明光に対して１０−１７ｍ２以下の散乱断面積を有する物体を含む試料を保持する、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１５】
前記試料ホルダは、前記照明光に対して１０−２６ｍ２以上の散乱断面積を有する物体を含む試料を保持する、
請求項１２に記載の干渉散乱顕微鏡。
【請求項１６】
干渉散乱顕微鏡の出力光を検出する前に前記出力光をフィルタリングするための空間フィルタであって、前記出力光は、試料位置から散乱した光と前記試料位置から反射した照射光との両方を含み、前記空間フィルタは、前記出力光を通過させるように構成されているが、所定の開口数内では、より大きい開口数におけるものよりも大きい強度の減少を伴う、空間フィルタ。
【請求項１７】
前記所定の開口数は、前記出力光に含まれる前記試料位置から反射された前記照明光の開口数である、
請求項１６に記載の空間フィルタ。
【請求項１８】
前記空間フィルタは、前記所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−２以下に減少させて通過させるように構成される、
請求項１６または１７に記載の空間フィルタ。
【請求項１９】
前記空間フィルタは、前記所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−４以上に減少させて通過させるように構成される、
請求項１６から１８のいずれか一項に記載の空間フィルタ。
【請求項２０】
干渉散乱顕微鏡を適合させる方法であって、反射した前記出力光の空間フィルタリングを、出力光を検出する前に実行する空間フィルタを提供するステップであって、前記出力光は、試料位置で試料から散乱した光と前記試料位置から反射した照明光との両方を含み、前記空間フィルタリングは、前記出力光を通過させるが、所定の開口数内では、より大きい開口数におけるものよりも大きい強度の減少を伴う、提供するステップを含む、
方法。
【請求項２１】
前記所定の開口数は、前記出力光に含まれる前記試料位置から反射された前記照明光の開口数である、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記空間フィルタは、前記所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−２以下に減少させて通過させるように構成される、
請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記空間フィルタは、前記所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−４以上に減少させて通過させるように構成される、
請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記所定の開口数は、１未満、好ましくは０．５未満である、
請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記照明光は、空間的および時間的にコヒーレントである、
請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料ホルダは、５０００ｋＤａ以下の質量を有する物体を含む試料を保持する、
請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料ホルダは、１０ｋＤａ以上の質量を有する物体を含む試料を保持する、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料は、前記照明光に対して１０−１２ｍ２以下の散乱断面積を有する物体を含む、
請求項２０から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料は、前記照明光に対して１０−２０ｍ２以上の散乱断面積を有する物体を含む、
請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、干渉散乱顕微鏡（”interferometric scattering microscopy”：本明細書ではｉＳＣＡＴと呼ぶ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＳＣＡＴは、独自の時空間分解能を有する単一粒子追跡と単一分子レベルまでの無標識感度の両方に対する強力なアプローチとして実現した。ｉＳＣＡＴは、例えば、Ｋｕｋｕｒａらの「Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｖｉｒｕｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９  ６：９２３−９３５、およびＯｒｔｅｇａ−Ａｒｒｏｙｏらの「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ｉＳＣＡＴ）：ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  １４：１５６２５−１５６３６に開示されている。大きな可能性があるにもかかわらず、ｉＳＣＡＴの広範な応用は、カスタムメイドの顕微鏡、従来とは異なるカメラおよび複雑な試料照明の必要性によって制限されており、堅牢で正確な検出、単一分子のような小さい物体の撮像および特徴付けについてのｉＳＣＡＴの機能を制限していた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｋｕｋｕｒａら、「単一ウイルスの位置と方向の高速ナノスコピック追跡」（Ｋｕｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｖｉｒｕｓ”）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９  ６：９２３−９３５
【非特許文献２】Ｏｒｔｅｇａ−Ａｒｒｏｙｏら、「干渉散乱顕微鏡（ｉＳＣＡＴ）：超高速超高感度光学顕微鏡の新境地」（“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ｉＳＣＡＴ）：ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  １４：１５６２５−１５６３６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様によれば、干渉散乱顕微鏡であって：試料を試料位置に保持するための試料ホルダと；照明光を供給するように構成された照明光源と；検出器と；照射光を試料位置に向け、反射した出力光を集め、出力光を検出器に向けるように構成された光学系であって、出力光は、試料位置から散乱した光と試料位置から反射した照射光との両方を含む、光学系と；出力光をフィルタリングするように位置決めされた空間フィルタであって、空間フィルタは出力光を通過させるように構成されているが、所定の開口数内では、より大きい開口数におけるものよりも大きい強度の減少を伴う、空間フィルタと、を含む、干渉散乱顕微鏡が提供される。
【０００５】
顕微鏡の全体構成は従来のｉＳＣＡＴ顕微鏡と類似であり得るが、出力光に影響を与える空間フィルタがさらに提供される。具体的には、空間フィルタは出力光を通過させるが、所定の開口数内では、より大きい開口数におけるものよりも大きい強度の減少を伴う。その結果、空間フィルタは、試料位置の試料中の物体から反射する照明光と散乱する光の開口数の間の不整合を利用することによって、散乱光よりも照明光の強度を選択的に減少させる。このように、空間フィルタは、これら２つの光源の異なる指向性を利用する。反射した照明光は、典型的には比較的小さい開口数を有するのに対して、試料の表面近くのサブ回折サイズの物体は、高い開口数に光を優先的に散乱させる。したがって、低い開口数での空間フィルタによる強度の減少は、主に照明光に影響を及ぼし、散乱光には最小限の影響しか与えず、それによって画像コントラストを最大にする。
【０００６】
この効果は、所定の開口数が試料位置から反射した照明光の開口数と同一または類似するように空間フィルタを配置することによって最大化することができる。
本発明の第１の態様は、反射型で動作する顕微鏡に関する。この場合、検出器に到達する照明光は、主に試料の表面、典型的には試料と試料ホルダとの間のインターフェースから反射され、それによってその表面に近い試料中の物体との干渉をもたらす。これにより、コントラストの高い画像が得られる。この効果は、検出器に到達する照明光が試料の深さを介して透過する透過型で動作する顕微鏡とは異なる。
【０００７】
反射型の動作にはいくつかの利点があり、これらを組み合わせると、弱い散乱物体の高性能検出と定量化が可能になる。第１に、比較的少量、典型的にはわずか０．５％の照明光が一般に使用されるガラス−水インターフェースで反射する一方、インターフェースでナノスコピック物体によって散乱するかなり多量、典型的には９０％以上の光が照明方向に向かって後方散乱する。これは、透過型の幾何学的形状と比較して散乱光場と反射光場との間の比を本質的に１０００倍以上改善し、より大きな干渉コントラストをもたらす。その結果、特定の散乱体、照明強度および露光時間が与えられたうえで同じ公称信号対雑音を達成するためには、ショットノイズリミテッドである場合（ショットノイズが制限する場合）に３桁少ない光子を検出する必要がある。第２に、反射では、溶液中に存在する大きな散乱体の、前方散乱としての検出の感度がはるかに低くなり、かつ、その照明光との干渉が検出されないため、より高いバックグラウンド除去がもたらされる。
【０００８】
これらの要因は、画像品質を向上させ、それによって弱い散乱物体の高コントラスト検出を可能にする。
これらの利点は、光を非常に弱く散乱しており他の技術による正確かつ精密な撮像が不可能であるような物体の撮像に特に適用される。例えば、本発明は、５０００ｋＤａ以下の質量を有する物体に特に適している。
【０００９】
同様に、本発明は、照明光に対して１０−１７ｍ２以下の散乱断面積を有する物体を含む試料に有利に適用することができる。典型的には、そのような物体はまた、照明光に対して１０−２６ｍ２以上、すなわち１０−２６ｍ２から１０−１７ｍ２の範囲内の散乱断面積を有し得る。研究され得る物体の例には、タンパク質またはその小さな凝集体が含まれる。
【００１０】
非常に弱い散乱体である物体を画像化するために、空間フィルタは、所定の開口数内にある出力光を、強度を入射強度の１０−２以下に減少させて通過させるように構成される。典型的には、空間フィルタは、所定の開口数内にある出力光を、強度が入射強度の１０−４以上、例えば入射強度の１０−２から１０−４の範囲に減少させて通過させるように構成される。
【００１１】
照明光は、例えば光源としてレーザを使用して、空間的および時間的にコヒーレントであり得る。顕微鏡における広視野照明は、一般に、コリメートされたレーザビームを撮像対物レンズの後部焦点面に集束させることによって得られ、全体的な撮像性能への影響を最小限に抑えながら、顕微鏡内外で効率的に結合できることを意味する。
【００１２】
顕微鏡は、空間フィルタを組み込むことによって適合された既存の市販の顕微鏡であってもよい。そのような適合は非常に安価かつ簡単に実行することができ、これは既存のｉＳＣＡＴ顕微鏡―必要な感度を提供するために、例えば、光学テーブル、または高価で複雑な光学系、電子機器、および専門家による操作の要件を含む、複雑で高価な光学的および電子的設定を有するｉＳＣＡＴ顕微鏡―とは対照的であり、これらの要件は、既存の市販の顕微鏡に空間フィルタを組み込むことによって大幅に低減または回避される。それによって、本発明を極めて費用効果がある方法で実施することが可能になる。例えば、複雑な走査構成なしに、より広い視野を提供することができ、撮像性能または感度を損なうことなく低コストの撮像カメラを使用することが可能になる。
【００１３】
本発明の第２の態様によれば、干渉散乱顕微鏡の出力光をフィルタリングするための空間フィルタが提供され、空間フィルタは、第１の態様のものと同様の機能を有する。
本発明の第３の態様によれば、出力光の空間フィルタリングを実行することによって干渉散乱顕微鏡を適合させる方法が提供され、空間フィルタリングは、第１の態様で実行されたものと同様である。
【００１４】
より良い理解を可能にするために、本発明の実施形態は、添付の図面を参照して非限定的な例によって以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ｉＳＣＡＴ顕微鏡の概略図である。
【図２】図２は、ｉＳＣＡＴ顕微鏡によって捕捉された画像である。
【図３】図３は、変更されたｉＳＣＡＴ顕微鏡の概略図である。
【図４】図４は、変更されたｉＳＣＡＴ顕微鏡の概略図である。
【図５】図５は、変更されたｉＳＣＡＴ顕微鏡の概略図である。
【図６】図６は、変更されたｉＳＣＡＴ顕微鏡の概略図である。
【図７】図７は、図６に示す顕微鏡を使用して得られた、一連のタンパク質についての配列分子量に対する散乱コントラストのプロットである。
【図８】図８は、図６に示す顕微鏡を使用して得られた、ビオチンの非存在下におけるアビジンの質量ヒストグラムである。
【図９】図９は、図６に示す顕微鏡を使用して得られた、ビオチンの存在下におけるアビジンの質量ヒストグラムである。
【図１０】図１０は、図６に示す顕微鏡を使用して得られたウシ血清アルブミンの質量ヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書に記載の顕微鏡および方法では、使用される光は：（本明細書では１０ｎｍから３８０ｎｍの範囲の波長を有すると定義し得る）紫外線；（本明細書では３８０ｎｍから７４０ｎｍの範囲の波長を有すると定義し得る）可視光；（本明細書では７４０ｎｍから３００μｍの範囲の波長を有すると定義し得る）赤外光であり得る。光は波長の混合物であり得る。本明細書では、用語「光学的(optical)」および「光学系(optics)」は、方法が適用される光を全体的に指すために使用される。
【００１７】
図１は、以下のように構成されたｉＳＣＡＴ顕微鏡１を示す。
顕微鏡１は、以下により詳細に説明される空間フィルタを除いて、顕微鏡の分野において従来型の構造を有する以下の構成要素を含む。
【００１８】
顕微鏡１は、試料３を試料位置に保持するための試料ホルダ２を含む。試料３は、撮像物体を含む液体試料とすることができ、これについては以下でより詳細に説明する。試料ホルダ２は、試料３を保持するのに適した任意の形態をとることができる。典型的には、試料ホルダ２は、試料ホルダ２と試料３との間のインターフェースを形成する表面上に試料３を保持する。例えば、試料ホルダ２は、カバーガラスであってもよく、および／またはガラス製であってもよい。試料３は、例えばマイクロピペットを使用して、直接的な方法で試料ホルダ２上に提供することができる。
【００１９】
顕微鏡１は、照明光源４および検出器５をさらに備える。
照明光源４は、照明光を供給するように配置されている。照明光はコヒーレント光とすることができる。例えば、照明光源４はレーザであり得る。照明光の波長は、試料３の性質および／または検査されるべき特性に応じて選択することができる。一例では、照明光は４０５ｎｍの波長を有する。
【００２０】
任意選択で、例えばネイチャーメソッド２００９  ６：９２３−９３５のＫｕｋｕｒａらの「単一ウイルスの位置と方向の高速ナノスコピック追跡」に詳述されているように、照明光を空間的に変調して、照明およびレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去することができる。
【００２１】
検出器５は、試料位置から反射した出力光を受信する。典型的には、顕微鏡１は広視野モードで動作することができ、その場合、検出器５は試料３の画像を取り込む画像センサとすることができる。顕微鏡１は、代替的に共焦点モードで動作してもよく、その場合、検出器５は、画像センサであってもよく、またはフォトダイオードのような点状検出器であってもよく、その場合、画像を構築するために走査装置を用いて試料３の領域を走査することができる。検出器５として採用され得る画像センサの例は、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）画像センサまたはＣＣＤ（電荷結合素子）を含む。
【００２２】
顕微鏡１は、試料ホルダ２、照明光源４、および検出器５の間に配置された光学系１０をさらに含む。光学系１０は、試料３を照明するために照明光を試料位置に向け、試料位置から反射した出力光を集め、そして出力光を検出器５に向けるように次のように構成される。
【００２３】
光学系１０は、試料ホルダ２の前方に配置されたレンズ系である対物レンズ１１を含む。また、光学系１０は、集光レンズ１２およびチューブレンズ１３も含む。
集光レンズ１２は、光源１１からの照明光（図１に実線で示す）を、対物レンズ１１を介して試料３の試料位置に集光する。
【００２４】
対物レンズ１１は、（ａ）試料位置から反射した照明光（図１に実線で示す）、および（ｂ）試料位置で試料３から散乱した光（図１に点線で示す）、の両方を含む出力光を集める。反射光は、試料ホルダ２と試料３との間のインターフェースから主に反射される。典型的には、これは比較的弱い反射、例えばガラス−水反射である。例えば、反射照明光の強度は、入射照明光の強度の０．５％程度であり得る。散乱光は試料３内の物体によって散乱される。
【００２５】
従来のｉＳＣＡＴと同様に、試料の表面またはその近くの物体からの散乱光は、反射光と積極的に干渉し、したがって検出器５によって捕捉された画像において見える。この効果は、検出器に到達する照明光が試料の深さを透過し、はるかに小さい画像コントラストをもたらす透過型で動作する顕微鏡とは異なる。
【００２６】
図１に示すように、反射照明光と散乱光とは指向性が異なる。特に、反射された照明光は、光源４および光学系６によって出力された光ビームの幾何学的形状から生じる開口数を有する。散乱光は、広い範囲の角度にわたって散乱され、したがって反射された照明光より大きな開口数を満たす。
【００２７】
チューブレンズ１３は、対物レンズ１１からの出力光を検出器５に集束させる。
光学系６はまた、光源４からの照明光および検出器５に向けられた出力光の光路を分割するように構成されたビームスプリッタ１４も含む。以下に説明するような空間フィルタの提供を除いて、ビームスプリッタ１４は、そこに入射する光の部分反射および部分透過をもたらす従来の構造を有し得る。例えば、ビームスプリッタ１４は、典型的にはフィルムを備えた、光路に対して４５°に配置された金属または誘電体であり得るプレートであってもよい。あるいは、ビームスプリッタ１４は、プリズム間のインターフェースに部分反射フィルムを有する整合対のプリズムによって形成されたキューブビームスプリッタであってもよい。あるいは、ビームスプリッタ１４は、ビームスプリッタ１４と試料３との間で１／４波長板と組み合わせて使用される偏光ビームスプリッタであってもよい。
【００２８】
図１に示す例では、光源４からの照明光がビームスプリッタ１４によって対物レンズ１１内に反射されるように、光源４は対物レンズ１１の光路からオフセットされており、反対に、試料位置からの出力光がビームスプリッタ１４を通って検出器５に向かって透過されるように、検出器５は対物レンズ１１の光路と位置合わせされる。
【００２９】
従来の構造であり得る上述の構成要素に加えて、顕微鏡１は空間フィルタ２０を含む。図１に示す例では、空間フィルタ２０は、ビームスプリッタ１４上に形成され、それによって対物レンズ１１の後部開口の後ろ、つまり対物レンズ１１の後部焦点面１５の真後ろに配置される。したがって、空間フィルタ２０は、位相差顕微鏡のように対物レンズに入れることなく実現することができる。（例えば、以下に説明するように）共役平面内ではなく対物レンズの入射開口の真後ろに空間フィルタを配置することは、高開口数顕微鏡対物レンズ内の多数のレンズから生じる後方反射を強く抑制するという明確な利点を有する。これは結局、画像ノイズを減少させ、非干渉背景を小さくし、そして実験の複雑さ、光学系の数および光路長を減少させ、それにより光学設定の安定性、ひいては画質を向上させる。
【００３０】
しかしながら、この位置は必須ではなく、同等の機能を有する空間フィルタを以下に説明するように他の場所に設けてもよい。
これにより、空間フィルタ２０は、検出器５を通過する出力光をフィルタリングするように位置決めされる。検出器５が対物レンズ１１の光路と位置合わせされている図１に示す例では、空間フィルタ２０は透過性である。
【００３１】
空間フィルタ２０は部分的に透過性であり、したがって反射照明光を含む出力光を通過させつつも強度は減少させる。空間フィルタ２０も光軸と位置合わせされ、所定の開口数内で強度が減少するように所定の開口を有する。本明細書では、開口数は、通常の方法で、出力光が由来する試料位置に対する角度範囲を特徴付ける無次元量として定義される。具体的には、開口数ＮＡは、式ＮＡ＝ｎ・ｓｉｎ（θ）によって定義されてもよく、θは、集光半角であり、ｎは、出力光が通過する材料（例えば、光学系６の構成要素の材料）の屈折率である。
【００３２】
空間フィルタ２０は、所定の開口数の範囲外では強度を低下させない。あまり望ましくないとはいえど、原理上は、代替的に、空間フィルタ２０はその所定の開口の外側では、所定の開口数内の強度の減少よりも小さい強度の減少を提供することができる。
【００３３】
空間フィルタ２０は、任意の適切な方法で形成することができ、典型的には堆積材料の層を含む。材料は、例えば、銀などの金属とすることができる。堆積は、任意の適切な技術を用いて行うことができる。
【００３４】
インターフェース付近のサブ回折サイズの物体は、反射された照明光よりも大きい開口数に優先的に光を散乱させるので、空間フィルタ２０によって提供される強度の減少は、散乱光よりも反射照明光の検出における強度を優先的に減少させる。したがって、低い開口数での空間フィルタ２０による強度の減少は、反射された照明光に主に影響を及ぼし、散乱光に対する影響を最小限に抑え、それによって捕捉画像内のコントラストを最大にする。増強された画像コントラストは、弱い散乱体である物体の高コントラスト検出を可能にする。
【００３５】
コントラストの増強は以下のように理解することができる。空間フィルタ２０が出力光の一部を所定の開口数で通過させる（すなわち、この例では部分的に透過性である）と、照明光および散乱光場の一部は検出器に到達し、十分にコヒーレントな照明光源に対して干渉する。検出器に到達する光強度Ｉｄｅｔは、Ｉｄｅｔ＝｜Ｅｉｎｃ｜２｛ｒ２ｔ２＋｜ｓ｜２＋２ｒｔ｜ｓ｜ｃｏｓΦ｝で与えられ、ここでＥｉｎｃは入射光場、ｒ２はインターフェースの反射率、ｔ２は空間フィルタ２０の透過率、ｓは物体の散乱振幅、Φは透過した照明光と散乱光との位相差である。したがって、検出された光子の総数を犠牲にしても、散乱コントラストは増強される。
【００３６】
したがって、コントラストは従来のｉＳＣＡＴと同様の方法で提供されるが、さらに空間フィルタの透過率によって制御される。これは、標準のｉＳＣＡＴの場合のようにガラス−水インターフェースの反射率によって固定されるのとは対照的に、空間フィルタ２０の透過率ｔ２の選択を通して直接参照フィールドの振幅を調整する能力を提供する。空間フィルタ２０が堆積材料の層である場合には、透過率ｔ２は、材料および／または層の厚さの選択によって選択することができる。そのような調整は、例えば、関心のある散乱物体、カメラの全ウェル容量および倍率にしたがって実行することができる。
【００３７】
ｉＳＣＡＴに対するこれらの有益な効果を最大にするために、所定の開口数は、出力光内の反射照明光の開口数であり得るが、それは必須ではない。例えば、所定の開口数が反射照明光の開口数よりわずかに小さいか、または大きい場合、同様の性質の利点が達成され得る。
【００３８】
空間フィルタ２０の使用は、所与の物体、入射光強度および露光時間による散乱に対して達成可能な感度限界またはＳＮＲ（信号対雑音比）を本質的には変えない。しかしながら、コントラストを向上させ、検出される全体の光子束を減らすことによって、ｉＳＣＡＴの実装を劇的に簡素化して、所与の感度またはＳＮＲを実現する。既存のｉＳＣＡＴ顕微鏡は、例えば光学テーブル、高価で複雑な光学系、電子機器を必要とするなど、複雑で高価な構成要素を有し、さらに熟練した操作を必要とする。このような要求は、空間フィルタ２０の使用によって大幅に緩和される。例えば、上述の複雑で高価な構成要素を有さない既存の市販の顕微鏡に単に空間フィルタ２０を追加することによって、既存のｉＳＣＡＴ顕微鏡と同等の性能を達成することができる。空間フィルタ２０自体はもちろん単純で安価な構成要素である。さらに、空間フィルタ２０は、画像感度を損なうことなく低い全ウェル容量を有する標準的なＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラの使用を可能にする。
【００３９】
したがって、顕微鏡１は、空間フィルタ２０を組み込むことによって適合された既存の市販の顕微鏡であってもよい。そのような適合は、非常に安価かつ簡単に実行され得る。適合は、例えばミラーを顕微鏡に組み込むために使用される国際公開第２０１５／０９２７７８号公報に開示されているアダプタと同様の方法で、既存の市販の顕微鏡のアクセサリスロットに収容されるように構成されたアダプタに空間フィルタを形成することによって実行することができる。
【００４０】
代替的に、顕微鏡１は、特に空間フィルタ２０とともに使用するために設計されてもよい。
顕微鏡１の一例を使用して得られた画像が図２に示されている。この例では、コヒーレント明視野照明光が提供され、空間フィルタ２０は、１×１０−２の反射光強度を透過するように直径３．５ｍｍの溶融シリカ上に堆積された厚さ１８０ｎｍの銀の層からなる。これは、（１０フレーム／秒の画像捕捉率、１０ｋＷ／ｃｍ２の照明光の強度で）単一の３９５ｋＤａタンパク質について１％の散乱コントラストおよび１０のＳＮＲをもたらす。図２は、検出器５として低コストＣＭＯＳカメラを使用して捕捉された画像である。図から分かるように、高コントラスト画像が達成される。さらに、明視野照明は、通常は対物レンズから生じる最も強い不要な後方反射が検出器５から離れるように向けられることを確実にし、画像背景を最小にし、照明光のビームの複雑な走査なしに広い視野を可能にする。
【００４１】
増強されたコントラストの利点は、光をあまり散乱せず、他の技術による画像化が困難である物体の画像化を可能にする。例えば、本発明は、５０００ｋＤａ以下の質量を有する物体を含む試料に有利に適用することができる。典型的には、本発明は、１０ｋＤａ以上の質量を有する物体、例えば１０ｋＤａから５０００ｋＤａの範囲内の質量を有する物体を含む試料に適用することができる。
【００４２】
代替的にまたは同様に、本発明は、照明光に対して１０−１２ｍ２以下、またはより好ましくは１０−１７ｍ２以下の散乱断面積を有する物体を含む試料に適用することができる。典型的には、そのような物体はまた、照明光に対して散乱断面積を有し得る。典型的には、そのような物体はまた、照明光に対して１０−２０ｍ２、またはより好ましくは１０−２６ｍ２以上、例えば１０−１７ｍ２から１０−２６ｍ２の範囲内の散乱断面積を有し得る。散乱断面積は、測定に使用される技術とは無関係に、特定の波長の入射光に対する物体の有効サイズに関する基本的な測定可能な特性である。散乱断面積は、例えば、暗視野顕微鏡法によって測定することができる。
【００４３】
本発明が適用され得る物体の例としては、タンパク質もしくはその小さな凝集体、またはそれらの結合パートナーが挙げられる。
比較的弱い散乱体である物体を画像化するために、空間フィルタ２０は、所定の開口数内にあって強度が減少させられる反射照明光を、入射強度（この文脈では、空間フィルタ２０に入射する出力光の強度）の１０−２から１０−４までの範囲の強度に減少させて通過させるように構成され得る。
【００４４】
他の点では、顕微鏡１は、空間フィルタ２０を参照することなく設計および操作されてもよい。例えば、視野は、照明光の集束条件を変えることによって調整可能である。同様に、マルチカラー画像形成は、ファイバが照明光を供給するために使用される場合、追加のレーザ光源をシングルモードファイバに結合するだけでよい。概して、顕微鏡１は、例えばＫｕｋｕｒａらの「Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｖｉｒｕｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９  ６：９２３−９３５、およびＯｒｔｅｇａ−Ａｒｒｏｙｏらの「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ｉＳＣＡＴ）：ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２０１２  １４：１５６２５−１５６３６に開示されているように、ｉＳＣＡＴについて知られている他の構成要素および技術を使用するように適合することができる。
【００４５】
顕微鏡１に対して行われ得る具体的な変更のいくつかの例が、これらの例に限定されないが、図３から図５を参照して説明される。顕微鏡１は、以下に説明する変更を除いて、上述したものと同様の構成および動作を有する。簡潔にするために、共通の構成要素には同じ参照符号が付されており、それらの上記の説明は繰り返されない。
【００４６】
図３は、対物レンズ１１の後部開口の後ろではなく、対物レンズ１１の後部焦点面１５の共役焦点面２１に空間フィルタ２０を配置するように変更した顕微鏡１を示す。対物レンズ１１の後部焦点面１５の共役焦点面２１は、チューブレンズ１３の後方に位置する一対の望遠鏡レンズ２２、２３の間に形成される。光路内の第１の望遠鏡レンズ２２は、対物レンズ１１の後部焦点面１５を結像して共役焦点面２１を形成し、第２の望遠鏡レンズ２３は共役焦点面２１を検出器５上に結像する。
【００４７】
空間フィルタ２０は、共役焦点面２１に設けられ、透明板２４上に形成されている。空間フィルタ２０の構成および動作は、図１を参照して上述したものと同じであり、例えば光軸と整列しており、上記のように所定の開口数内で強度の減少をもたらすように所定の開口を有する（ただし、空間フィルタ２０は、光路に対して４５°ではなく、光路に対してほぼ垂直である）。
【００４８】
図４は、空間フィルタ２０が透過型ではなく反射型である変更をした顕微鏡１を示す。この変更において、光源４と検出器５の位置が逆になっており、光源４からの照明光がビームスプリッタ１４を通過して対物レンズ１１に入り、反対に、試料位置からの出力光はビームスプリッタ１４によって検出器５に向かって反射される。
【００４９】
空間フィルタ２０は、ビームスプリッタ１４上に形成されているが、光源４と検出器５の反転を考慮すると、空間フィルタ２０は反射性である。反射性であるにもかかわらず、空間フィルタ２０は上記と同じ方法で動作するように構成されている。すなわち、空間フィルタ２０は、検出器５へ通過する出力光をフィルタリングし、出力光をその強度を減少させて通過させる。この場合、部分的に反射させることによって達成されるが、空間フィルタ２０の構成および動作は、他の点では同じであり、例えば、上述のように、光軸と位置合わせされ、所定の開口数内で強度を減少させるように所定の開口を有する。
【００５０】
図５は、対物レンズ１１の後部開口の後ろではなく、対物レンズ１１の後部焦点面１５の共役焦点面２５に空間フィルタ２０を位置決めするために図３と同様の変更をし、さらに、空間フィルタ２０が透過性ではなく反射性である修正をした顕微鏡１を示す。対物レンズ１１の後部焦点面１５の共役焦点面２５は、図３の変形と同様に、チューブレンズ１３の後方に位置する一対の望遠鏡レンズ２２、２３の間に形成されている。しかしながら、反射板２６は、共役焦点面２５において望遠鏡レンズ２２、２３の間に設けられているが、反射板２６での反射が光路を９０°そらせるように光路を偏向させるために４５°に配置されている。空間フィルタ２０は、反射板２６上に形成されることにより共役焦点面２５に設けられているので、透過性ではなく反射性である。反射性であるにもかかわらず、空間フィルタ２０は、上述したのと同じ方法で、すなわち図４の変更と同様の方法で動作するように構成されている。
【００５１】
図６は、対物レンズ１１の後部開口の後ろではなく、対物レンズ１１の後部焦点面の共役焦点面２１に空間フィルタ２０を配置するように変更した顕微鏡１を示す。対物レンズ１１の後部焦点面１５の共役焦点面２１は、図３の変形と同様に、チューブレンズ１３の後方に位置する一対の望遠鏡レンズ２２、２３の間に形成されている。しかしながら、図３の変形と比較して、以下のさらなる変更もまた行われる―図６の変更のそれぞれが互いに独立して適用され得ることに留意されたい。
【００５２】
音響光学偏向器３２は、光源４の後に配置されて照明光の走査を提供する。音響光学偏向器３２は、上述のように、試料３の領域を走査して画像を構築し、および／または照明とレーザノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するための空間変調を提供するように動作する。
【００５３】
集光レンズ１２は、音響光学偏向器３２におけるビーム経路に対するあらゆる変更を結像対物レンズの後部焦点面に結像する機能を果たす一対のテレセントリックレンズ３０および３１によって置き換えられる。
【００５４】
図４の変更と同様に光源４と検出器５の位置が逆になっているので、光源４からの照明光はビームスプリッタ１４を透過して対物レンズ１１に入射し、反対に、試料位置からの出力光は、ビームスプリッタ１４によって検出器５に向かって反射される。
【００５５】
ビームスプリッタ１４は、偏光ビームスプリッタであり、ビームスプリッタ１４と試料３との間に１／４波長板３３が配置されているので、ビームスプリッタ１４は光を分割する。
【００５６】
ミラー３４は、ビームスプリッタ１４によって反射された出力光を偏向するように配置されている。これは単に、顕微鏡１のよりコンパクトな構成を提供するためのものである。
【００５７】
顕微鏡１は、単分子検出を含む広範囲の用途についてｉＳＣＡＴを実行するために使用され得る。一般に、コントラストの増強は有益であり、サブ回折および弱散乱の物体のすべての撮像に適用することができる。特定の用途は、弱い散乱体の無標識撮像―関心のある物体は常に大きな背景の上で検出されなければならず、画像コントラストを低下させる撮像―である。顕微鏡１は、例えば屈折率の任意の変化―例えば、単一分子の結合／結合解除、相転移、クラスタリング、集合／分解、凝集、タンパク質／タンパク質相互作用、タンパク質／小分子相互作用、高感度無標識撮像を含む―を測定するための広範囲の研究および測定に使用することができる。
【００５８】
したがって、顕微鏡１には、基礎研究から工業的用途、例えば製薬業界における用途まで、多数の用途がある。特に、それはｉＳＣＡＴを実行するために現在必要とされる複雑な実験的設定によって排除された分野にｉＳＣＡＴを開拓する。一例として、ｉＳＣＡＴは現在世界で最も高感度の無標識単一分子撮像バイオセンサーであり、例えば表面プラズモン共鳴センシング市場に大きな影響を与える可能性がある。さらに、それは研究および産業における多くの用途で、溶液中での、正確で、精密でそして高分解能である単一分子質量分析計として機能する。
【００５９】
例
正確性、分解能および精度の重要な性能パラメータは、以下のように、図６に示される構成を有する顕微鏡において一連のタンパク質試料を用いて定量化される。
【００６０】
分子量測定における機器正確性の定量化は、標準ＰＢＳ緩衝液に１０ｎＭ濃度で溶解した一連のタンパク質の散乱コントラストを記録することにより行った（タンパク質は、ストレプトアビジン−５３ｋＤａ、ウシ血清アルブミン−６６ｋＤａ、アルコールデヒドロゲナーゼ−〜１４６ｋＤａ、β−アミラーゼ−２２４ｋＤａ、ＨＳＰ  １６．５−３９５ｋＤａ、ＨＡＬＯタグで修飾された非筋肉ミオシンＩＩｂ−５９８ｋＤａ、チログロブリン−６６９ｋＤａ、ＧｒｏＥＬ−８０２ｋＤａである）。結果は図７に示されており、これは散乱コントラスト対配列分子量および関連するエラーバーのプロットである。物体の体積に対するｉＳＣＡＴコントラストの線形依存性、およびすべてのタンパク質が同じアミノ酸プールから作られており、同様に共通の屈折率を有し、したがって散乱断面積を有するという事実を考慮すると予想されるように、結果は非常に線形的な挙動を示す。予想された分子量と測定された分子量との間で観察された変動は、決定されるべき質量の平均３％程度である。これは、顕微鏡１を使用して単一タンパク質分子の分子量を決定する際の高度の正確性を実証する。
【００６１】
顕微鏡１は、アミノ酸、脂質または炭水化物に関する組成とは無関係に、質量の５％より良い正確性で単一タンパク質と同じくらい小さい物体の質量を定量化することができると予想される。
【００６２】
顕微鏡１は、例えば５０００ｋＤａ未満から１０ｋＤａまでの質量を有する、既存の技術よりも小さい物体の質量の変化を定量化することができると予想される。機器精度の定量化は以下のようにして行った。本明細書に記載の手法を使用して物体の質量を決定する際の精度は、散乱コントラストの分布の中心を決定する能力によって統計的に制限される。記録された分布がショットノイズリミテッドプロセスに対して予想されるようにガウスプロファイルを示すと考えると、精度はｓＮ−１／２としてスケーリングすることがよく知られており、ｓは対象分布の標準偏差であり、Ｎは採取される試料の数である。その結果、質量測定の精度は分解能や正確性によって制限されないが、原則として測定数を増やすことによって任意に高めることができる。これを説明するために、溶液中の飽和ビオチンの非存在下（６８３９事象）および存在下（６６０９事象）でアビジンの質量ヒストグラムを記録し、結果は図８および図９にそれぞれ示される。結合した４つのビオチン分子について予想される９７０Ｄａと比較して、９５０±３３０Ｄａのビオチン存在下での質量増加が測定された。
【００６３】
機器の分解能、特に分解能限界の定量化は、ウシ血清アルブミンの図６に示した結果から得られた較正を用いて質量ヒストグラムを記録することによって行われた。得られたヒストグラムは図１０に示され、溶液中のモノマー、ダイマーおよびトリマーの個々の識別可能なピークを示し、２８ｋＤａのモノマーピークのｆｗｈｍが３４ｋＤａの分解能をもたらす。この値は、検出された光子の総数の関数であり、したがってより高い光強度を使用することによって改善することができる。これは、顕微鏡１の高度な質量分解能を実証する。まとめると、これらの結果は、顕微鏡１が、小分子の結合および分極率による物体質量の正確かつ精密な特徴付けの両方によって引き起こされるものと同程度に小さい質量差を定量化できることを示す。現在のところ、これにより、４０ｋＤａまでの単一タンパク質の検出と、それらの配列質量の５％以内のそれらの分子量の正確な決定が可能である（図７）。高いＳＮＲは、例えば、検出された分子の数によってのみ制限される精度での結合事象を通じた、質量の変化の特徴付けをさらに可能にし（図８および９）、現在２５０Ｄａに達している。さらに、達成可能な高いＳＮＲにより、溶液中のタンパク質の異なるオリゴマー状態の明確な検出が可能になり、タンパク質凝集の詳細な特徴付けが可能になる（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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