(57)【要約】  本開示は、同位体的に修飾されたアミノ酸、および医薬タンパク質ベースの処方の安定化、長寿命タンパク質、およびアルツハイマー病などの疾患の予防または治療におけるそれらの薬学的または栄養的使用に関する。【選択図】図１
2019521083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基を含み、前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基が重水素原子を含む、安定性が増大したタンパク質薬物。
【請求項２】
前記重水素原子が前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基のアルファ炭素に位置する、請求項１に記載のタンパク質薬物。
【請求項３】
前記重水素原子が側鎖メチレン基に位置する、請求項１または２に記載のタンパク質薬物。
【請求項４】
前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基が少なくとも２つの重水素原子を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質薬物。
【請求項５】
前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基が少なくとも３つの重水素原子を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質薬物。
【請求項６】
前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基が重水素原子をどの水素位置にも含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質薬物。
【請求項７】
前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度が、重水素原子を有しないＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度より少なくとも５０％低下している、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質薬物。
【請求項８】
ヒト対象に投与した後において、重水素原子を前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい半減期を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質薬物。
【請求項９】
重水素原子を前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい安定性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質薬物。
【請求項１０】
タンパク質における１つもしくは複数のＡｓｐ残基または１つもしくは複数のＡｓｎ残基のラセミ化によって引き起こされる疾患をヒト対象において処置する、改善する、または予防する方法であって、効果的な量の重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎを前記ヒト対象に投与することを含む方法。
【請求項１１】
前記ヒト対象における前記タンパク質の少なくとも１０％が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、前記１つもしくは複数のＡｓｐ残基または前記１つもしくは複数のＡｓｎ残基において重水素化される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質における前記１つもしくは複数のＡｓｐ残基または前記１つもしくは複数のＡｓｎ残基のラセミ化が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、少なくとも１０％低下する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記疾患がアルツハイマー病である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質がアミロイド−βである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のＡｓｐ残基が、アミロイド−β−４２のＡｓｐ１、Ａｓｐ７およびＡｓｐ２３を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のＡｓｐ残基が、アミロイド−β−４２のＡｓｎ２７を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎが毎日投与される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
重水素化Ｌ−Ａｓｐ残基または重水素化Ｌ−Ａｓｎ残基を含む製造物であって、製造物中の重水素の量が、天然に存在するレベルを超えている、製造物。
【請求項１９】
液体形態であるとき、製造物内の前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基のラセミ化が少なくとも１０％低下する、請求項１８に記載の製造物。
【請求項２０】
タンパク質である、請求項１８または１９に記載の製造物。
【請求項２１】
メチルＬ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニナートである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の製造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年５月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３３０６８８号の利益を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、同位体的に修飾されたアミノ酸、および医薬タンパク質ベースの処方の安定化、長寿命タンパク質、およびアルツハイマー病などの疾患の予防または治療におけるそれらの薬学的または栄養的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質およびペプチドの分解をもたらす最も一般的な自発的化学反応の１つは、Ｌ−アミノ酸のラセミ化である。ラセミ化の速度は各アミノ酸残基によって異なり、アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基は特に影響を受けやすい。アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基のラセミ化は、貯蔵および使用中のタンパク質医薬品の機能の喪失のみならず、タンパク質、特に眼レンズおよび赤血球における長期生存種のタンパク質機能の喪失の原因となる可能性がある。ヒト歯のエナメル質の安定なタンパク質中のＬ−アスパラギン酸およびＬ−アスパラギンから生じるＤ−アスパラギン酸は、年齢と共に蓄積し、６０歳までにアスパラギン酸プロテイン全体の約８％に達し、ヒト眼レンズクリスタリンのＤ−アスパラギン酸は７０年の生涯で全アスパラギン酸／アスパラギン残基の１０％にまで増加する。タンパク質Ｄ−アスパルチル残基は、ほとんどの生物および細胞タイプに存在する酵素であるタンパク質修復Ｌ−イソアスパラギン酸−（Ｄ−アスパラギン酸）Ｏ−メチルトランスフェラーゼによって認識することができる。しかしながら、この反応はＤ−イソアスパラギン酸残基の形成をもたらし、したがってラセミ化を増強し得る。
【０００４】
Ｄ−アスパラギン酸はまた、いくつかのヒトの病状において凝集する傾向のあるタンパク質に蓄積する可能性がある。褐色白内障由来のタンパク質は、同等の年齢の非白内障レンズと比較して、Ｄ−Ａｓｐ／Ｌ−Ａｓｐ比が約２倍増加する。さらに、アルツハイマー病の脳の老人斑ベータアミロイドのアスパラギン酸残基およびイソアスパラギン酸残基は、約１１％のＤ／Ｌ比を有する。ラセミ化されたアスパラギン酸残基およびイソアスパラギン酸残基の豊富さは、これらの脳由来の血管β−アミロイドにおいてかなり少なく、血管アミロイド凝集物は老人斑アミロイドプラークよりも「若い」ことを示唆している。これらの知見および他の知見は、長寿命タンパク質、特にアスパラギン酸残基およびイソアスパラギン酸残基から生じるアミノ酸残基のラセミ化が、加齢に伴う器官／組織機能の喪失およびタンパク質蓄積を伴う疾患の進行に寄与し得ることを示唆する。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書中に開示されるいくつかの実施形態は、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基を含む安定性の増加したタンパク質薬物を提供し、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基は重水素原子を含む。いくつかの実施形態において、重水素原子は、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のアルファ炭素上に位置する。いくつかの実施形態において、重水素原子は、側鎖メチレン基上に位置する。いくつかの実施形態において、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基は、少なくとも２つの重水素原子を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基は、少なくとも３つの重水素原子を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基は、すべての水素位置に重水素原子を含む。いくつかの実施形態において、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度は、重水素原子を有さないＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度より少なくとも５０％低い。いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に重水素原子をもたない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい、ヒト対象への投与後の半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質薬物は、Ｌ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に重水素原子を有さない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％高い安定性を有する。
【０００６】
本明細書中に開示されるいくつかの実施形態は、ヒト対象において疾患が１以上のＡｓｐ残基または１以上のＡｓｎ残基のタンパク質におけるラセミ化によって引き起こされる疾患を治療、改善または予防する方法を提供し、重水素化されたＬ−Ａｓｐまたは重水素化されたＬ−Ａｓｎを人対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後に、ヒト対象のタンパク質の少なくとも１０％が１つ以上のＡｓｐ残基または１つ以上のＡｓｎ残基で重水素化される。いくつかの実施形態では、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後に、タンパク質中の１つまたは複数のＡｓｐ残基または１つ以上のＡｓｎ残基のラセミ化が少なくとも１０％低下する。いくつかの実施形態では、疾患はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、タンパク質はアミロイド−βである。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡｓｐ残基は、アミロイド−β−４２のＡｓｐ１、Ａｓｐ７およびＡｓｐ２３を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡｓｎ残基は、アミロイド−β−４２のＡｓｎ２７を含む。いくつかの実施形態では、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎを毎日投与する。
【０００７】
本明細書中に開示されるいくつかの実施形態は、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎ残基を含む製造物を提供し、製造物中の重水素の量は天然に存在するレベルよりも高い。いくつかの実施形態では、製造物が液状である場合、製造物中のＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化が少なくとも１０％減少する。いくつかの実施形態では、生成物はタンパク質である。いくつかの実施形態では、製造物はメチルＬ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニナートである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、（Ａ）アルファ炭素原子上のプロトンを除去した後に形成されるカルバニオンの安定化を示すアスパラギン脱アミド化のスクシンイミド生成物の共鳴形態（Ｒａｄｋｉｅｗｉｃｚら、１９９６）、（Ｂ）ＶＹＰＮＧＡペプチドに組み込まれた重水素化Ａｓｎ残基の構造、（Ｃ）ペプチド合成のための重水素化されたＡｓｎ保護基質であるｄ３−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒ）−ＯＨの構造。
【０００９】
【図２】図２は、合成ペプチド中の重水素化アスパラギンの脱アミド化が、イソアスパラギン酸残基および正常アスパラギン酸残基含有ペプチドの生成をもたらすことを示す。逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣカラムでのプロトン化（破線の黒い線）または重水素化（破線の赤い線）を含む年月を経ていないＶＹＰＮＧＡの共溶出。３８．７８時間３７℃およびｐＨ７．４でのインキュベーション後、アスパラギン含有ペプチドの量は、Ａｓｐ−およびｉｓｏＡｓｐ含有ペプチドに変換されるにつれて減少する。これらのペプチドのＬ型およびＤ型は、これらの条件下で分離されない。
【００１０】
【図３】図３は、側鎖メチレン炭素上の重水素およびアスパラギン残基のアルファ炭素は、合成ペプチド中のその脱アミド速度にほとんど影響を及ぼさないことを示す。水素化（上パネル）または重水素化（下パネル）アスパラギン残基を有するペプチドＶＹＰＮＧＡを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中、３７℃で種々の時間インキュベートした。残りのアスパラギン含有ペプチドの相対量（白丸）は、図２に示すように逆相Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣによるペプチドの分離中に２１０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量化した。いくつかは２つの独立したエージング実験から組み合わせたため、重なりのため隠れているが、各パネルは２４のデータポイントを有する。各パネルのラインは、一次反応式［Ａ］＝［Ａ］０ｅ−ｋｔおよび最小二乗分析を用いてデータポイントに適合させた。ペプチドの半減期はベストフィットラインから計算した。
【００１１】
【図４】図４は、重水素化アスパラギンを含有するペプチドが、ラセミ化アスパラギン酸／イソアスパラギン酸／スクシンイミド、水素化ペプチドよりもはるかに遅い速度で蓄積することを示す。水素化または重水素化アスパラギンのいずれかを含むＶＹＰＮＧＡを、３７℃およびｐＨ７．４で様々な時間インキュベートし、次いで酸加水分解した。加水分解物中のＤ−アスパラギン酸およびＬ−アスパラギン酸の量を、オルトフタルアルデヒドおよびＮ−アセチル−Ｌ−システインを用いた誘導体化および得られた蛍光ジアステレオマーを逆相ＨＰＬＣによる分離して定量し、アスパラギン酸塩全体に対するＤ−アスパラギン酸の画分をグラフ化した（白抜きの丸印）。各データセットは、２つの独立したエージング実験から組み合わせた２４の測定値を含む。これらのデータポイントの一部は、重なりのために見えない。ラインは、以前に公表された動力学定数で出発するアスパラギン残基の脱アミド化に関与する反応のコンピューターシミュレーション、およびスクシンイミド中間体のラセミ化速度を変化させて、最小二乗分析によって決定される最適線を与えることによって得られた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（定義）
用語「神経変性疾患」は、本明細書中で使用される場合、ニューロンの悪変によって引き起こされる任意の神経系の疾患または異常（ニューロンの死滅および神経伝達物質の機能的損失を含む）を示す。神経変性疾患についての限定されない例として、アルツハイマー病およびパーキンソン病が挙げられる。用語「食品組成物」は、本明細書中で使用される場合、それぞれの組成物を飲食する対象において毒性症状を引き起こすことなく飲食可能である任意の組成物を示す。
【００１３】
用語「遅発型アルツハイマー病」は、本明細書中で使用される場合、高齢者における、特に６５歳以上の人々におけるアルツハイマー病の発症を示す。
【００１４】
用語「早期発症型アルツハイマー病」は、本明細書中で使用される場合、６５歳未満の人々におけるアルツハイマー病の発症を示す。
【００１５】
「対象」は、本明細書中で使用される場合、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味し、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類または鳥類（例えば、ニワトリ）、同様にまた、任意の他の脊椎動物または無脊椎動物を意味する。
【００１６】
用語「哺乳動物」は、その通常の生物学的意味で使用される。したがって、この用語は具体的には、サル類（チンパンジー、類人猿、サル）およびヒトを含む霊長類、ウシ類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、齧歯類、ラット、マウス、モルモットなどを包含し、しかし、これらに限定されない。
【００１７】
「効果的な量」または「治療効果的な量」は、本明細書中で使用される場合、疾患または状態の症状の１つまたは複数をある程度軽減するために効果的である、あるいは、疾患または状態の症状の１つまたは複数を発症する可能性を低下させるために効果的である治療剤の量を示す。「治癒する」は、疾患または状態の症状が取り除かれることを意味しており、しかしながら、ある種の長期または永続的な影響が、治癒が得られた後でさえ存在する場合がある（例えば、広範な組織損傷などが存在する場合がある）。
【００１８】
「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書中で使用される場合、化合物または医薬組成物を予防目的および／または治療目的のために対象に投与することを示す。用語「予防的処置」は、疾患または状態の症状を未だ示していない対象ではあるが、特定の疾患または状態に罹りやすい、あるいは、他の場合には特定の疾患または状態の危険性がある対象を処置することを意味しており、したがって、予防的処置は、この患者がそのような疾患または状態を発症するであろう可能性を低下させる。用語「治療的処置」は、何らかの疾患または状態に既に罹患している対象に処置を施すことを示す。
【００１９】
Ｌ−アスパラギニル残基およびＬ−アスパルチル残基の部位でのタンパク質およびペプチドにおけるラセミ化が、とりわけ生物学的な経時変化プロセスにおいてはそれらの自発的分解の一因となり得る。アミノ酸のラセミ化では、アルファ炭素の脱プロトン化と、プロトンが逆の立体配置で置き換えられることが伴う。この反応は、アスパラギン酸／アスパラギンについては他のアミノ酸の場合よりもはるかに速く、これは、これらの残基が、プロトンを失うことから生じるカルバニオンが共鳴によって安定化されるスクシンイミド環を形成するからである。アルファ炭素上の水素原子を重水素原子で置換することにより、ラセミ化速度の低下、したがって、ポリペプチドの安定化がもたらされ得るであろうかどうかを明らかにするために、アスパラギニル残基内の３つの炭素結合プロトンが重水素原子で置換されたヘキサペプチドＶＹＰＮＧＡを合成した。このペプチドをｐＨ７．４の緩衝液において３７℃でインキュベーションしたとき、スクシンイミド中間体を経由する脱アミド化の速度が重水素原子の存在によって変わらないことが見出された。しかしながら、このスクシンイミドのラセミ化および加水分解から生じるｄ−アスパルチル形態およびｄ−イソアスパルチル形態の蓄積が、生理学的な温度およびｐＨでの２０日間にわたるインキュベーションにおいて、重水素化ペプチドでは１／５未満に低下した。加えて、重水素化アスパラギン化ペプチドの分解から生じるスクシンイミド中間体は、イソアスパラギン酸の立体配置に開環することが、プロトン化スクシンイミドが開環するよりもわずかに起こりにくいことが見出された。したがって、重水素がアスパラギン残基に存在することから生じる反応速度同位体効果により、ペプチドおよびタンパク質が経時変化する際に生じる分解生成物のいくつかの蓄積が制限されるかもしれない。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの重水素がアスパラギンまたはアスパラギン酸に存在することは、ペプチドおよびタンパク質が経時変化する際に生じる分解生成物を妨げ、またはそのような分解生成物の量を減らすことに役立ち得る。
【００２０】
（同位体修飾されたタンパク質薬物）
本明細書中に開示されるいくつかの実施形態は、安定性が増大したタンパク質薬物を提供する。本明細書中に記載されるタンパク質は、同位体修飾されたＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基は重水素原子を含む。いくつかの実施形態において、前記重水素原子は前記Ｌ−Ａｓｐ残基または前記Ｌ−Ａｓｎ残基のアルファ炭素に位置する。いくつかの実施形態において、タンパク質は１つまたは複数の位置で重水素化される。いくつかの実施形態において、タンパク質は側鎖メチレン基において重水素化される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるタンパク質は、同位体修飾されたＬ−Ａｌａ残基、同位体修飾されたＬ−Ｖａｌ残基、同位体修飾されたＬ−Ｌｅｕ残基、同位体修飾されたＬ−Ｉｌｅ残基、同位体修飾されたＬ−Ｐｒｏ残基、同位体修飾されたＬ−Ｐｈｅ残基、同位体修飾されたＬ−Ｔｙｒ残基、同位体修飾されたＬ−Ｔｒｐ残基、同位体修飾されたＬ−Ｓｅｒ残基、同位体修飾されたＬ−Ｔｈｒ残基、同位体修飾されたＬ−Ｃｙｓ残基、同位体修飾されたＬ−Ｍｅｔ残基、同位体修飾されたＬ−Ｇｌｎ残基、同位体修飾されたＬ−Ｌｙｓ残基、同位体修飾されたＬ−Ａｒｇ残基、同位体修飾されたＬ−Ｈｉｓ残基、同位体修飾されたＬ−Ｇｌｕ残基、または、それらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるタンパク質は、同位体修飾されたＬ−Ｓｅｒ残基を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるタンパク質のＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度が、重水素原子を有しないＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度よりも少なくとも５０％低下している。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるタンパク質のＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度が、重水素原子を有しないＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度よりも少なくとも８０％低下している。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示されるタンパク質のＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度が、重水素原子を有しないＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化速度よりも少なくとも１０％低下している、少なくとも２０％低下している、少なくとも３０％低下している、少なくとも４０％低下している、少なくとも５０％低下している、少なくとも６０％低下している、少なくとも７０％低下している、少なくとも８０％低下している、少なくとも９０％低下している、少なくとも９５％低下している、少なくとも９９％低下している。
【００２３】
いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、ヒト対象に投与した後において、重水素原子をＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい半減期を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、ヒト対象に投与した後において、重水素原子をＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも５０％大きい半減期を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、ヒト対象に投与した後において、重水素原子をＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい半減期を有する、少なくとも３０％大きい半減期を有する、少なくとも４０％大きい半減期を有する、少なくとも５０％大きい半減期を有する、少なくとも６０％大きい半減期を有する、少なくとも７０％大きい半減期を有する、少なくとも８０％大きい半減期を有する、少なくとも９０％大きい半減期を有する、少なくとも１００％大きい半減期を有する、少なくとも２００％大きい半減期を有する、少なくとも５００％大きい半減期を有する、少なくとも１，０００％大きい半減期を有する、少なくとも２，０００％大きい半減期を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、重水素原子をＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい安定性を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、重水素原子をＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも５０％大きい安定性を有する。いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、重水素原子をＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基に有しない対応するタンパク質薬物よりも少なくとも２０％大きい安定性を有する、少なくとも３０％大きい安定性を有する、少なくとも４０％大きい安定性を有する、少なくとも５０％大きい安定性を有する、少なくとも６０％大きい安定性を有する、少なくとも７０％大きい安定性を有する、少なくとも８０％大きい安定性を有する、少なくとも９０％大きい安定性を有する、少なくとも１００％大きい安定性を有する、少なくとも２００％大きい安定性を有する、少なくとも５００％大きい安定性を有する、少なくとも１，０００％大きい安定性を有する、少なくとも２，０００％大きい安定性を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、血液因子、血栓溶解剤、ホルモン、造血成長因子、インターフェロン、インターロイキン系産物、ワクチン、抗体などであることが可能である。いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は、アバタセプト、アレファセプト、エリスロポエチン、エタネルセプト、デニロイキンジフチトクスなどであることが可能である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、タンパク質薬物は抗体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、どのような形態の抗体またはそのフラグメントであれ、例えば、特異的な標的抗原に結合して、所望の生物学的活性を示す抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体（全長型モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ナノボディ、ダイアボディ、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ならびに、ｓｃＦｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２（これらに限定されない）を含めて抗体フラグメントであることが可能である。いくつかの実施形態において、抗体は、可能性のあるヒト以外の相補性決定領域（ＣＤＲ）領域を除いて、ヒト起源の配列を含む抗体であることが可能であり、しかも、抗体は、Ｉｇ分子の完全な構造が存在することを暗示しておらず、最小限の免疫原性効果をヒトにおいて有することだけを暗示する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ  ベドチン、カナキヌマブ、セツキシマブ、セルトリズマブ  ペゴール、ダクリズマブ、ダラツムマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、インフリキシマブ、イピリムマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、ナタリズマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペンブロリズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ（またはアトリズマブ）、トシツモマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブまたはベドリズマブであることが可能である。
【００２８】
（疾患の処置方法、改善方法または予防方法）
本明細書中に開示されるいくつかの実施形態は、疾患をヒト対象において処置する、改善する、または予防する方法であって、疾患が、タンパク質における１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基のラセミ化によって引き起こされる、方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、効果的な量の同位体修飾された化合物をヒト対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、同位体修飾された化合物は重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎであることが可能である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、疾患は神経変性疾患である。いくつかの実施形態において、疾患はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態において、タンパク質はアミロイド−βペプチドである。いくつかの実施形態において、タンパク質は、下記の配列を含むアミロイド−β−４２ペプチドである：Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＡｓｐ残基は、アミロイド−β−４２のＡｓｐ１、Ａｓｐ７およびＡｓｐ２３を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＡｓｎ残基は、アミロイド−β−４２のＡｓｎ２７を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ヒト対象における前記タンパク質の少なくとも１０％が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基において重水素化される。いくつかの実施形態において、ヒト対象における前記タンパク質の少なくとも２０％が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基において重水素化される。いくつかの実施形態において、ヒト対象における前記タンパク質の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基において重水素化される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質における１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基のラセミ化が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、少なくとも１０％低下する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質における１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基のラセミ化が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、少なくとも２０％低下する。いくつかの実施形態において、前記タンパク質における１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基のラセミ化が、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの投与後、少なくとも１０％低下する、少なくとも２０％低下する、少なくとも３０％低下する、少なくとも４０％低下する、少なくとも５０％低下する、少なくとも６０％低下する、少なくとも７０％低下する、少なくとも８０％低下する、少なくとも９０％低下する、少なくとも９５％低下する。
【００３２】
重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎは好ましくは、治療効果的な投薬量で投与される。本明細書中に記載される重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎについてのヒト投薬量レベルは変化する場合があるが、一般には、重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎの１日用量（または１日に２回、３回もしくは４回の服用）は、対象が典型的にはその食事において摂取し、正常な代謝を介して生じるであろう対応する非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎとほぼ同じである場合があり、あるいは、対象が典型的にはその食事において摂取し、正常な代謝を介して生じるであろう対応する非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの０．１倍、０．１５倍、０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１．２倍、１．４倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上である場合があり、これにより、非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの一部または大部分またはすべてが置き換わる。重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎが、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの対象の１日摂取量の少なくとも１０％、２０％または５０％を構成することが好ましく、また、Ｌ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの対象の１日摂取量の最大でも１００％、２００％、５００％またはそれ以上を構成し得ることが好ましい。治療の目的は、体内のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの有意な量を同位体修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎあるいはそれらの代謝産物により置き換え、その結果、体内におけるＬ−ＡｓｐまたはＬ−ＡｓｎあるいはＬ−Ａｓｐ代謝産物またはＬ−Ａｓｎ代謝産物の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれ以上が同位体修飾されるようにすることである。言い換えれば、同位体修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎを患者に繰り返し投与し、その結果、体内（または目的とする局所的部位）におけるＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎあるいはそれらの代謝産物の有意な割合が同位体修飾されるようにすることによって、修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎが、タンパク質における１つまたは複数のＡｓｐ残基あるいは１つまたは複数のＡｓｎ残基のラセミ化に対して抵抗性となるであろう。
【００３３】
いくつかの実施形態において、対象に投与される同位体修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量が、対象が摂取する非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％または２００％である。いくつかの実施形態において、対象に投与される同位体修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量が、対象が摂取する非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量の約１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、１００％超、１２０％超、１５０％超、１８０％超または２００％超である。いくつかの実施形態において、対象に投与される同位体修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量が、対象が摂取する非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量の約１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、１００％未満、１２０％未満、１５０％未満、１８０％未満または２００％未満である。いくつかの実施形態において、対象に投与される同位体修飾されたＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量が、対象が摂取する非修飾のＬ−ＡｓｐまたはＬ−Ａｓｎの量の約１％〜２００％の範囲であり、１０％〜２００％の範囲であり、１０％〜１００％の範囲であり、または２０％〜１００％の範囲である。
【００３４】
本明細書中に開示される重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎあるいは組成物の投与は、経口的、皮下的、静脈内、鼻腔内、局所的、経皮的、腹腔内、筋肉内、肺内、膣内、直腸または眼内（これらに限定されない）を含めて、類似する有用性を果たす様々な薬剤のための容認された投与様式のいずれかを介してであることが可能である。経口投与および非経口投与が、好ましい実施形態の主題である適応症を処置することにおいて慣例となっている。
【００３５】
上記で記載されるように有用である重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎは、医薬組成物、栄養補助組成物または食品補助剤に配合することができる。様々な標準的な製薬配合技術が使用され、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）、これはその全体が参照によって組み込まれる）に開示される技術などが使用される。したがって、いくつかの実施形態には、（ａ）本明細書中に記載される化合物（そのエナンチオマー、ジアステレオ異性体、互変異性体、多形体および溶媒和物を含む）またはその医薬的に許容され得る塩の安全かつ治療効果的な量と、（ｂ）医薬的に許容され得るキャリア、希釈剤、賦形剤またはそれらの組合せとを含む医薬組成物が含まれる。
【００３６】
上記で記載されるように有用である選択された重水素化Ｌ−Ａｓｐまたは重水素化Ｌ−Ａｓｎに加えて、いくつかの実施形態では、医薬的に許容され得るキャリアを含有する組成物が含まれる。用語「医薬的に許容され得るキャリア」または用語「医薬的に許容され得る賦形剤」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。様々な医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用がこの技術分野において周知である。従来の媒体または薬剤はどのようなものであれ、有効成分との適合性がない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。加えて、様々な補助剤、例えば、この技術分野において一般に使用される補助剤などが含まれる場合がある。様々な成分を医薬組成物に含めるための検討事項が、例えば、Ｇｉｌｍａｎ他（編）（１９９０）；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ）に記載される（これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【００３７】
医薬的に許容され得るキャリアまたはその成分として役立ち得る様々な物質のいくつかの例として、糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよびメチルセルロースなど；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；固体滑剤、例えば、ステアリン酸およびステアリン酸マグネシウムなど；硫酸カルシウム；植物油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ脂など；ポリオール、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；アルギン酸；乳化剤、例えば、各種ＴＷＥＥＮなど；湿潤化剤、そのようなラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；香味矯臭剤；錠剤化剤；安定剤；酸化防止剤；保存剤；発熱物質非含有水；等張性生理食塩水；ならびにリン酸塩緩衝剤溶液が挙げられる。
【００３８】
主題化合物と併せて使用されることになる医薬的に許容され得るキャリアの選択は基本的には、当該化合物が投与されることになる方法によって決定される。
【００３９】
本明細書中に記載される組成物は好ましくは、単位投薬形態物で提供される。本明細書中で使用される場合、「単位投薬形態物」は、動物（好ましくは哺乳動物対象）に正当な医療行為に従って単回服用で投与するために好適である量の化合物を含有する組成物である。しかしながら、単回投薬形態物または単位投薬形態物の調製は、当該投薬形態物が１日あたり１回、または１回の一連の治療あたり１回投与されることを意味していない。そのような投薬形態物は、１日あたり１回、２回、３回またはそれ以上で投与されることが意図され、また、一定の期間（例えば、約３０分から、約２時間〜６時間までの期間）にわたって注入として投与される場合があり、または連続注入として投与される場合があり、また、１回だけの投与が特に除外されることはないが、１回の一連の治療の期間中に２回以上与えられる場合がある。当業者は、配合物は一連の治療の全体を特に意図しておらず、そのような決定は、処方の当業者ではなく、むしろ処置の当業者に委ねられることを認識するであろう。
【００４０】
上記で記載されるように有用である組成物は、投与のための様々な経路（例えば、経口投与経路、鼻腔投与経路、直腸投与経路、局所投与経路（経皮投与経路を含む）、眼投与経路、脳内投与経路、頭蓋内投与経路、クモ膜下腔内投与経路、動脈内投与経路、静脈内投与経路、筋肉内投与経路または他の非経口投与経路）のための様々な好適な形態のいずれかであり得る。当業者は、経口用および鼻腔用の組成物が、吸入によって投与される、かつ、利用可能な方法論を使用して作製される組成物を含むことを理解するであろう。所望される特定の投与経路に依存して、この技術分野において周知である様々な医薬的に許容され得るキャリアが使用される場合がある。医薬的に許容され得るキャリアには、例えば、固体または液体の充填剤、希釈剤、ヒドロトロピー剤、表面活性剤およびカプセル化用物質が含まれる。化合物の阻害活性を実質的に妨害しない随意的な医薬活性物質が含まれる場合がある。化合物と併せて用いられるキャリアの量は、当該化合物の単位用量物あたりの投与のための実用的な量の物質を提供するために十分である。本明細書中に記載される方法において有用である投薬形態物を製造するための様々な技術および組成物が、下記の参考文献に記載される（これらはすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、第４版、第９章および第１０章（編者：Ｂａｎｋｅｒ＆Ｒｈｏｄｅｓ、２００２年）、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ他、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（１９８９年）、および、Ａｎｓｅｌ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第８版（２００４年）。
【００４１】
様々な経口投薬形態物を使用することができ、これらには、錠剤、カプセル剤、顆粒および混合散剤のような固体形態が含まれる。錠剤は、圧縮、湿製錠剤化、腸溶性被覆、糖衣、フィルムコーティングまたは多重圧縮され得、好適な結合剤、滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香味矯臭剤、流動誘発剤および溶融剤を含有し得る。液体の経口投薬形態物には、水溶液、乳化物、懸濁物、非発泡性顆粒から再構成される溶液および／または懸濁物、ならびに、発泡性顆粒から再構成される発泡性調製物が含まれ、この場合、これらは、好適な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味剤、溶融剤、着色剤および香味矯臭剤を含有する。
【００４２】
経口投与用の単位投薬形態物を調製するために好適である医薬的に許容され得るキャリアがこの技術分野において周知である。錠剤は典型的には、従来の医薬的に適合し得る補助剤であって、不活性な希釈剤としての補助剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトースおよびセルロースなど）、結合剤としての補助剤（例えば、デンプン、ゼラチンおよびスクロースなど）、崩壊剤としての補助剤（例えば、デンプン、アルギン酸およびクロスカルメロースなど）、滑剤としての補助剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびタルクなど）を含む。流動促進剤（例えば、二酸化ケイ素など）を、粉末混合物の流動特性を改善するために使用することができる。着色剤（例えば、ＦＤ＆Ｃ色素など）を外観のために加えることができる。甘味剤および香味矯臭剤（例えば、アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミントおよび果実香料など）が、咀嚼錠のための有用な補助剤である。カプセル剤は典型的には、上記で開示される１つまたは複数の固体希釈剤を含む。キャリア成分の選択は、重要でない味覚、コストおよび貯蔵安定性のような二次的な検討事項に依存しており、当業者によって容易に行うことができる。
【００４３】
経口用組成物にはまた、液体溶液、乳化物および懸濁物などが含まれる。そのような組成物を調製するために好適である医薬的に許容され得るキャリアはこの技術分野において周知である。シロップ剤、エリキシル剤、乳化物および懸濁物のためのキャリアの典型的な成分には、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液状スクロース、ソルビトールおよび水が含まれる。懸濁物の場合、典型的な懸濁化剤には、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５９１、トラガカントおよびアルギン酸ナトリウムが含まれ、典型的な湿潤化剤には、レシチンおよびポリソルベート８０が含まれ、典型的な保存剤には、メチルパラベンおよび安息香酸ナトリウムが含まれる。経口用の液体組成物はまた、１つまたは複数の成分（例えば、上記で開示される甘味剤、香味矯臭剤および着色剤など）を含有する場合がある。
【００４４】
そのような組成物はまた、主題化合物が胃腸管において所望の局所適用の近傍で放出されるように、または所望の作用を延長するために様々な時間で放出されるように、従来の方法によって、典型的にはｐＨ依存性被覆剤または時間依存性被覆剤により被覆される場合がある。そのような投薬形態物には典型的には、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、Ｅｕｄｒａｇｉｔ被覆剤、ワックスおよびシェラックの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書中に記載される組成物は必要に応じて、他の薬物活性物質を含む場合がある。
【００４６】
主題化合物の全身送達を達成するために有用である他の組成物には、舌下投薬形態物、口内投薬形態物および鼻腔投薬形態物が含まれる。そのような組成物は典型的には、可溶性充填剤物質（例えば、スクロース、ソルビトールおよびマンニトールなど）および結合剤（例えば、アラビアゴム、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）の１つまたは複数を含む。上記で開示される流動促進剤、滑剤、甘味剤、着色剤、酸化防止剤および香味矯臭剤もまた含まれる場合がある。
【００４７】
本明細書中に開示される医薬組成物において使用され得る保存剤には、塩化ベンザルコニウム、ＰＨＭＢ、クロロブタノール、チメロサール、フェニル水銀  酢酸塩、および硝酸フェニル水銀が含まれるが、これらに限定されない。有用な界面活性剤が、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０である。同様に、様々な有用なビヒクルが、本明細書中に開示される眼用調製物において使用される場合がある。これらのビヒクルには、ポリビニルアルコール、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよび精製水が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
局所的使用のために、本明細書中に開示される化合物を含有するクリーム、軟膏、ゲル、溶液または懸濁物などが用いられる。局所用配合物は一般には、医薬用のキャリア、共溶媒、乳化剤、浸透増強剤、保存剤系および皮膚軟化剤から構成される場合がある。
【００４９】
静脈内投与のために、本明細書中に記載される化合物および組成物は、医薬的に許容され得る希釈剤（例えば、生理食塩水またはデキストロース溶液など）に溶解または分散される場合がある。好適な賦形剤が、所望のｐＨを達成するために含められる場合があり、これらには、ＮａＯＨ、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＣｌおよびクエン酸が含まれるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、最終的な組成物のｐＨが２〜８の範囲であり、または、好ましくは４〜７の範囲である。酸化防止賦形剤には、重亜硫酸ナトリウム、アセトン重亜硫酸ナトリウム、ナトリウムホルムアルデヒド  スルホキシラート、チオ尿素およびＥＤＴＡが含まれる場合がある。最終的な静脈内組成物において見出される好適な賦形剤の他の限定されない例には、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、クエン酸、酒石酸、ゼラチンおよび炭水化物（例えば、デキストロース、マンニトールおよびデキストランなど）が含まれる場合がある。さらなる許容され得る賦形剤が、Ｐｏｗｅｌｌ他、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ、ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈ、１９９８、５２  ２３８〜３１１、および、Ｎｅｍａ他、Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｏｌｅ  ｉｎ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｕｓａｇｅ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ、ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈ、２０１１、６５  ２８７〜３３２に記載される（これらの両方がその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。抗菌剤もまた、静菌性または静真菌性の溶液を達成するために含められる場合があり、抗菌剤には、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾールおよびクロロブタノールが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
静脈内投与用の組成物は、好適な希釈剤（例えば、滅菌水、生理食塩水またはデキストロース水溶液など）により投与直前に再構成されるもう一つの固体の形態で介護者に提供される場合がある。他の実施形態において、組成物は、直ちに非経口投与できる溶液として提供される。さらに他の実施形態において、組成物は、投与前にさらに希釈される溶液で提供される。本明細書中に記載される化合物と、別の薬剤との組合せを投与することを含む実施形態において、当該組合せが混合物として介護者に提供される場合があり、または介護者が投与前にこれら２つの薬剤を混合する場合があり、またはこれら２つの薬剤が別々に投与される場合がある。
【００５１】
（製造物）
いくつかの実施形態が、重水素化Ｌ−Ａｓｐ残基または重水素化Ｌ−Ａｓｎ残基を含む製造物であって、当該製造物における重水素の量が、天然に存在するレベルを超えている、製造物に関連する。いくつかの実施形態において、製造物におけるＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化が、当該製造物が液体形態であるとき、少なくとも１０％低下する。いくつかの実施形態において、製造物におけるＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化が、当該製造物が液体形態であるとき、少なくとも２０％低下する。いくつかの実施形態において、製造物におけるＬ−Ａｓｐ残基またはＬ−Ａｓｎ残基のラセミ化が、当該製造物が液体形態であるとき、少なくとも１０％低下する、少なくとも２０％低下する、少なくとも３０％低下する、少なくとも４０％低下する、少なくとも５０％低下する、少なくとも６０％低下する、少なくとも７０％低下する、少なくとも８０％低下する、少なくとも９０％低下する、少なくとも９５％低下する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される製造物は、同位体修飾されたＬ−Ａｌａ残基、同位体修飾されたＬ−Ｖａｌ残基、同位体修飾されたＬ−Ｌｅｕ残基、同位体修飾されたＬ−Ｉｌｅ残基、同位体修飾されたＬ−Ｐｒｏ残基、同位体修飾されたＬ−Ｐｈｅ残基、同位体修飾されたＬ−Ｔｙｒ残基、同位体修飾されたＬ−Ｔｒｐ残基、同位体修飾されたＬ−Ｓｅｒ残基、同位体修飾されたＬ−Ｔｈｒ残基、同位体修飾されたＬ−Ｃｙｓ残基、同位体修飾されたＬ−Ｍｅｔ残基、同位体修飾されたＬ−Ｇｌｎ残基、同位体修飾されたＬ−Ｌｙｓ残基、同位体修飾されたＬ−Ａｒｇ残基、同位体修飾されたＬ−Ｈｉｓ残基、同位体修飾されたＬ−Ｇｌｕ残基、または、それらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載されるタンパク質は、同位体修飾されたＬ−Ｓｅｒ残基を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、製造物はタンパク質であることが可能である。いくつかの実施形態において、製造物はペプチドまたはその誘導体であることが可能である。いくつかの実施形態において、製造物は二ペプチド（ｂｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ）またはその誘導体であることが可能である。いくつかの実施形態において、製造物はメチルＬ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニナートであることが可能である。
【実施例】
【００５４】
アスパラギン酸残基およびアスパラギン残基がラセミ化に対して特に影響を受けやすい機構は、側鎖カルボニル基と、その次の残基のペプチド結合窒素との間における反応により、スクシンイミド環が生じることが関係する（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ（１９８７）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６２（２）：７８５〜７９４）。プロトンがこの化学種のアルファ炭素から失われ、共鳴により安定化された平面状カルバニオン（これは、どちらの側からでも再プロトン化されて、Ｌ−スクシンイミドおよびＤ−スクシンイミドの混合物を与えることができる）を形成した後で、ラセミ化が生じる（図１ａ）。アルファ炭素上のプロトンのｐＫａにおける変化が初めの研究によって裏づけられている（Ｒａｄｋｉｅｗｉｃｚ他（１９９６）、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１１８（３８）：９１４８〜９１５５）。このスクシンイミドはまた、その２つのカルボニル炭素のどちらにおいても加水分解を受けやすい。以前にはペプチドの骨格に存在したカルボニルにおける加水分解が７５％〜８０％の割合で（少なくともペプチド内で）起こり、その結果、ペプチド骨格が今度はアミノ酸の旧側鎖を経由するＬ−イソアスパラギン酸残基またはＤ−イソアスパラギン酸残基が生じる（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、上掲；ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＣｌａｒｋｅ（１９８９）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６４（１１）：６１６４〜６１７０；Ｍａｎｎｉｎｇ他（１９８９）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ、６（１１）：９０３〜１８）。残りの割合で、加水分解が旧側鎖カルボニルにおいて起こり、これにより、Ｌ−アスパラギン酸残基またはＤ−アスパラギン酸残基のどちらかが生成する。最近の研究では、ラセミ化がラジカル機構を介して起こり得ることもまた示唆されている（Ｔａｍｂｏ他（２０１３）、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、７７：４１６〜４１８）。
【００５５】
本技術は、細胞内のタンパク質における、同様にまた、治療用のペプチド調製物およびタンパク質調製物におけるラセミ化した残基の潜在的に有害な蓄積が軽減され得る方法に関する。古典的な速度論的同位体効果（ＫＩＥ）が、原子がその重い同位体（例えば、２Ｈまたは１３С）によって置き換えられるときに生じる。非酵素反応について、重水素ＫＩＥは典型的には２〜９の間である（すなわち、炭素−重水素結合の開裂が、同等な炭素−プロトン結合より２〜９倍遅くなる）（Ｗｅｓｔｈｅｉｍｅｒ（１９６１）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、６１：２６５〜２７３）。生体分子の損傷を受けやすい部位における重水素化は、水素引抜きが律速段階であるならば、様々なプロセスを減速させ得るかもしれないことが提案された（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ（２００７）、Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０：４７〜５９）。近年、様々なポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）における特定部位の重水素化により、脂質の過酸化が阻害されること、また、サッカロミセス・セレビジアエ細胞および培養哺乳動物細胞（Ｈ９Ｃ２）に重水素化ＰＵＦＡを補うことにより、これらの細胞が酸化ストレスから保護されることが認められている（Ｈｉｌｌ他（２０１２）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、５３（４）：８９３〜９０６；Ａｎｄｒｅｙｅｖ他（２０１５）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、８２：６３〜７２）。この保護効果は、前記ＰＵＦＡの２０％もの少量が重水素原子を１つだけ有するときにでさえ見られる（Ｈｉｌｌ他、上掲）。したがって、ポリペプチド内のＬ−アスパラギン残基の側鎖メチレンおよびアルファ炭素に結合するプロトンを重水素原子により置き換えることは潜在的には、この残基がスクシンイミド形成を介して脱アミド化する速度、Ｌ−スクシンイミドがＤ−スクシンイミド形態にラセミ化する速度、および、前記スクシンイミドが、アスパラギン酸形態ではなく、むしろイソアスパラギン酸形態に開環する傾向を変化させることができるであろう。これらの重水素原子が、求核攻撃に関与する骨格窒素の求核性および／またはガンマ・カルボニル炭素の求電子性を変化させるならば、スクシンイミド形成速度における変化が生じるであろう。前記スクシンイミドのラセミ化は、アルファ炭素におけるプロトンが失われることを介して進行するので、この水素を重水素原子により置き換えることは、ラセミ化しやすいカルバニオンの濃度を低下させるにちがいない（Ｒａｄｋｉｅｗｉｃｚ他、上掲）。側鎖のベータ炭素における重水素原子が、環構造によってもたらされる共鳴形態を変化させ得るであろうこともまた、可能性がある。最後に、スクシンイミド環内のメチレン基を重水素で置き換えることは潜在的には、その２つのカルボニル基の感受性を、共鳴を変化させることによって、または立体的理由のために変えることができるであろう。
【００５６】
重水素の存在が、どのような影響を、アスパラギニル残基の脱アミノ化、ラセミ化およびイソアスパラギン基形成に及ぼし得るであろうかを明らかにするために、L-Val-L-Tyr-L-Pro-L-Asn-Gly-L-Alaの配列を有する様々なペプチドを作製した：１つのペプチドを通常の方法で作製し、別のペプチドを、アルファ炭素および側鎖メチレン基における水素が重水素原子により置換されるアスパラギン誘導体を使用して作製した（図１ｂ）。このアミノ酸配列は、このペプチドのアスパラギン形態、アスパラギン酸形態およびイソアスパラギン酸形態の分離および定量が逆相ＨＰＬＣによって可能であるために、また、プロトン化ペプチドのスクシンイミド形成速度およびエピマー化速度が測定されているために選んだ（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、上掲；ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＣｌａｒｋｅ、上掲）。スクシンイミド形成速度に対しては重水素化の影響が何ら見出されず、また、スクシンイミド加水分解速度に対するほんの小さい影響が確認されただけにもかかわらず、Ｄ−アスパラギン酸形成速度が１／５に低下したことが検出され、このことから、重水素化はラセミ化からの保護をもたらし得ることが示唆された。
【００５７】
（一般的方法）
（ペプチド合成のための重水素化されたアスパラギン保護誘導体の調製）
ｄ３−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒ）−ＯＨ（図１ｃ）を、文献に記載される一般的手順に従って合成されるｄ３−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ・０．５Ｈ２ＯおよびＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ）スクシンイミドから白色結晶として調製した（０．１２５ｇ、７７％）（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．（２０００）、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ（第１版）、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、８４８頁、ＩＳＢＮ０−８２４７−０３５９−６）。Ｍ．ｐ．２０８〜２１０℃。ＴＬＣ：Ｒｆ  ０．３５（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ、９４：５：１）。ｄ３−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨについての１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの両方を、室温で、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−４００装置でＣＤＣｌ３において記録した。化学シフトが、内部標準として使用される残留溶媒ピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６についての参照値：１Ｈ：２．５０ｐｐｍ、１３Ｃ：３９．４３ｐｐｍ）とともにＴＭＳに対してｐｐｍで報告される。１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを１００．６ＭＨｚでの完全プロトンデカップリングにより記録した。
【００５８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１２．７３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），８．６４（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｓ，１Ｈ），７．４７−７．１１（ｍ，１９Ｈ），４．４４−４．１１（ｍ，３Ｈ）．１３С  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ＝１７３．１，１６８．７，１５５．７，１４４．６（×３），１４３．７（×２），１４０．６（×２），１２８．５（×６），１２７．６（×２），１２７．３（×６），１２７．０（×２），１２６．３（×３），１２５．１（×２），１２０．０（×２），６９．３，６５．６，４６．６．
【００５９】
（ペプチド合成）
ＶＹＰＮＧＡペプチドを、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧｍｂＨ（ドイツ）によるトリフルオロ酢酸塩（９５％超の純度、２２０ｎｍでの検出を伴う直線グラジエントによるＣ１８逆相ＨＰＬＣによって求められる場合）としての上記の重水素化Ｆｍｏｃ  Ａｓｎ誘導体または標準的なＦｍｏｃ  Ａｓｎ誘導体のどちらかを用いて合成した。エレクトロスプレーイオン化を使用する質量分析法による分析により、両ペプチドの構造を、重水素化ペプチド（計算値、６２２．６８）については６２３．３［Ｍ＋Ｈ］＋、１２４４．６［２Ｍ＋Ｈ］、および、非重水素化ペプチド（計算値、６１９．６８）については６２０．３［Ｍ＋Ｈ］＋、１２４０．６［２Ｍ＋Ｈ］＋のイオンにより確認した。
【００６０】
（インビトロでのペプチド経時処理）
重水素化ペプチドＶＹＰＮＧＡおよびプロトン化コントロールペプチドを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４４）に２３℃で溶解した。これらの溶液を、０．２μｍの細孔のシリンジフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ）に通すことによって滅菌し、４０ｎｍｏｌのペプチドを含有する５０μＬのアリコートを２００μＬのＰＣＲチューブに入れ、これを２０．６日までの様々な期間にわたって３７℃でインキュベーションした。この温度において、リン酸緩衝液のｐＨは７．４０に非常に近い。インキュベーション終了時に、４．５μＬの１Ｍ塩酸をそれぞれのチューブに加え、ｐＨを約４に下げて、アスパラギニル残基のさらなる脱アミドを最小限に抑えた。その後、これらの経時処理サンプルをＨＰＬＣによる分析まで−２０℃で貯蔵した。
【００６１】
（ペプチド加水分解物におけるＤ−アスパラギン酸の定量）
最初に、１０μＬのアリコート（３．２７ｎｍｏｌ）を経時処理サンプルから取り出し、小さなガラス試験管において乾燥させた。これらの試験管を加水分解バイアルに入れ、３００μＬの６Ｍ塩酸を、サンプル管に直接入れるのではなく、バイアルに加えた。バイアルにＴｅｆｌｏｎコック栓で蓋をし、その後、窒素フラッシングを行い、バイアルを、ＰｉｃｏＴａｇ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して真空下で密封した。この方法は、酸蒸気のみがペプチドに接触することを可能にし、これにより、外因性アスパラギン酸による混入を最小限にする。加水分解が３時間の比較的短時間にわたって１１０℃で進行した。この時間は、酸触媒によるラセミ化を最小限に抑えながら、アスパラギニル残基／アスパルチル残基の大部分をペプチドから遊離させるためには十分に長い（ＢｒｕｎａｕｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、１９８６）。その後、加水分解物中のＤ−アスパラギン酸およびＬ−アスパラギン酸をｏ−フタルアルデヒドおよびＮ−アセチル−Ｌ−システインにより修飾して、蛍光性ジアステレオマーとし、蛍光分析（Ａｓｗａｄ、１９８４）による逆相ＨＰＬＣを使用して定量した（これらを、Ｗａｒｍａｃｋ他（２０１６）によって改変されるように行った）。
【００６２】
（ラセミ化速度定数の決定）
ラセミ化速度定数の推定値を得るために、同じ配列のペプチドについてＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ（１９８７）によって求められる速度定数を使用し、ただし、プロトン化アスパラギンでは、以下の式を使用した（それぞれのｋ値が、分−１の単位を有する）：
Ｌ−Ａｓｎ＝Ｌａｓｎ−（Ｌａｓｎ＊０．０００３４００）
Ｌ−イミド＝Ｌイミド＋（Ｌａｓｎ＊０．０００３４００）＋（ＬＡｓｐ＊０．０００００９９）＋（Ｌｉｓｏ＊０．０００００９９）＋（Ｄイミド＊０．０００２９６７）−（Ｌイミド＊０．０００２９６７）−（Ｌイミド＊０．００３９３３３）−（Ｌイミド＊０．００１０７６７）
Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ＝Ｌｉｓｏ＋（Ｌイミド＊０．００３９３３３）−（Ｌｉｓｏ＊０．０００００９９）
Ｌ−Ａｓｐ＝Ｌｉｓｏ＋（Ｌイミド＊０．００３９３３３）−（Ｌｉｓｏ＊０．０００００９９）
Ｄ−イミド＝Ｄイミド＋（ＤＡｓｐ＊０．００００１２５）＋（Ｄｉｓｏ＊０．００００１２５）＋（Ｌイミド＊０．０００２９６７）−（Ｄイミド＊０．０００２９６７）−（Ｄイミド＊０．００１９３３３）−（Ｄイミド＊０．０００６２５０）
Ｄ−ｉｓｏＡｓｐ＝Ｄｉｓｏ＋（Ｄイミド＊０．００１９３３３）−（Ｄｉｓｏ＊０．００００１２５）
Ｄ−Ａｓｐ＝Ｄａｓｐ＋（Ｄイミド＊０．０００６２５０）−（Ｄａｓｐ＊０．００００１２５）
【００６３】
時間ゼロにおいて、ｌ−アスパラギニル含有ペプチドは１．０の量に設定され、分解生成物のすべてが、０の量を有すると考えられる。その後、これらの式を解いて、１分後に存在するペプチドの量を得て、その後、これらの量を使用して、その次の１分についてペプチドを解く。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを使用して、これらの計算を、２０．６日後に存在するそれぞれのペプチドの量が求められるまで繰り返した。
【００６４】
（実施例１：ＶＹＰＮＧＡ内のアスパラギニル残基のプロトンを重水素原子により置換することはｐＨ７．４および３７℃においてその脱アミド化速度に影響しない。）
重水素化ＶＹＰＮＧＡおよび非重水素化ＶＹＰＮＧＡを０．１Ｍリン酸ナトリウムにおける生理学的なｐＨおよび温度でのインビトロ経時処理に供した。アスパラギン残基の脱アミド化速度を、ペプチドを、逆相ＨＰＬＣを使用してその分解生成物から分離し、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を、ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ（上掲）のアプローチを使用して測定することによって求めた。アスパラギンがそのままである重水素化ペプチドが、水素化ペプチドと同じ緩衝液グラジエント位置で溶出することが認められた（図２）。ｐＨ７．４および３７℃でインキュベーションした場合、重水素化アスパラギニル残基の自発的脱アミド化の主たる生成物、すなわち、Ｌ−イソアスパラギン酸含有ペプチドおよびＬ−アスパラギン酸含有ペプチドもまた、相当する水素化ペプチドと同じ位置で溶出した（図２）。早く溶出する方の脱アミド化生成物の正体がＬ−イソアスパラギン酸含有ペプチドであることが、合成標準物についてＧｅｒｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ（上掲）によって求められる溶出位置と類似するその溶出位置、および、この生成物が、アスパラギン含有ペプチドの後に溶出する通常のアスパラギン酸含有ペプチドよりもほぼ３倍多いという観測結果によって裏づけられた。この同定が、早く溶出するペプチドのみが組換えヒトＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼのための基質であったことを示すことによって水素化ペプチドおよび重水素化ペプチドの両方について確認された（データは示されず）。アスパラギン含有ペプチドの消失を時間に関してプロットすることにより（図３）、重水素化アスパラギン残基の脱アミド化（ｔ１／２＝１．３９日）が、水素化残基（ｔ１／２＝１．３５日）とほぼ同じ速度で進行したことが示され、この速度は、水素化ペプチドについて以前に報告されている値（ｔ１／２＝１．４２日、ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、上掲；ｔ１／２＝１．１４日、ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＣｌａｒｋｅ、上掲）と非常に類似していた。このことは、グリシル残基の骨格窒素の求核性およびアスパラギニル残基の側鎖カルボニル炭素の求電子性が、スクシンイミドを形成する求核反応の速度が変化するようには重水素原子によって影響されないことを示唆する。
【００６５】
図２は、合成ペプチドにおける重水素化アスパラギンの脱アミド化により、イソアスパラギン酸含有ペプチドおよび通常のアスパラギン酸含有ペプチドが生成することを示す。経時処理を受けていない水素化アスパラギン残基含有ＶＹＰＮＧＡ（１．３ｎｍｏｌ）（黒色点線）および重水素化アスパラギン残基含有ＶＹＰＮＧＡ（１．３ｎｍｏｌ）（灰色点線）は、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０シリーズＩＩ液体クロマトグラフィーシステムを使用し、かつ、ＵＶ吸収を２１０ｎｍでモニターした場合、逆相Ｃ１８  ＨＰＬＣカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ｅｃｏｎｏｓｐｈｅｒｅ、５μｍビーズ、２５０×４．６ｍｍ）で共溶出することが見出された。３７℃およびｐＨ７．４で３８．８時間インキュベーションした後では、水素化アスパラギン含有ペプチド（黒色実線）および重水素化アスパラギン含有ペプチド（灰色実線）（１．３ｎｍｏｌ）の量が、これらのペプチドがアスパラギン酸含有ペプチドおよびイソアスパラギン酸含有ペプチドに変換されるにつれて減少した。これらのペプチドのｌ−形態およびｄ−形態はこれらの条件のもとでは分離しなかった。これらのＨＰＬＣ操作を、１００％の緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸水溶液）から８６％緩衝液Ａ／１４％緩衝液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸、０．９％水、９９％アセトニトリル）に至る２８分での直線グラジエントを用いて行った。
【００６６】
（実施例２：重水素原子の存在はスクシンイミド中間体の２つのカルボニル炭素における加水分解の相対的速度をわずかに変化させる。）
イソアスパラギン酸含有ペプチドおよび通常のアスパラギン酸含有ペプチドの両方が、ｐＨ  ７．４および３７℃でインキュベーションしたとき、重水素化アスパラギン残基の自発的脱アミド化から生じた（図２）。このことから、この脱アミド化反応は、水素化ＶＹＰＮＧＡに関して以前に認められていたようなスクシンイミド中間体（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、上掲）を介して進行することが示唆された。スクシンイミド環は２つのカルボニル炭素を含有しており、これらの両方が自発的加水分解の部位である。生理学的なｐＨおよび温度におけるこの中間体の半減期が約２．３１時間であることが以前に示されている（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、上掲）。図２において認められるように、スクシンイミド環の加水分解は、生成物においては通常のアスパラギン酸よりもイソアスパラギン酸の生成に有利であった。イソアスパラギン酸含有ペプチドおよび通常のアスパラギン酸含有ペプチドの量を、３７℃で少なくとも２４時間にわたって経時処理されたすべてのサンプルのＨＰＬＣ実験において測定したとき、イソアスパラギン酸含有ペプチドの平均相対量（ｉｓｏＡｓｐ／（ｉｓｏＡｓｐ＋Ａｓｐ））が、水素化された脱アミド化生成物については０．７９３であり（ｎ＝１８；標準偏差、０．００９）、重水素化された脱アミド化生成物については０．７７０である（ｎ＝１７；標準偏差＝０．０１２）ことが見出された。スチューデントのｔ検定を用いた統計学的分析では、これらの値が有意に異なっていることが示された（ｐ＝４．２×１０−７）。したがって、本発明者らのペプチドにおける水素化アスパラギン残基および重水素化アスパラギン残基の脱アミド化ではともに、イソアスパラギン酸残基が、水素化ペプチドについて以前に報告されたように約７８．５％の割合で（Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ／（Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ＋Ｌ−Ａｓｐ）＝０．７８５；ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、１９８７）、通常のアスパラギン酸残基よりも頻繁に形成しており、しかし、水素ではなく、むしろ重水素がスクシンイミド中間体に存在することにより、旧側鎖カルボニル炭素における加水分解が増進し、これにより、環加水分解時における通常のアスパラギン酸含有ペプチドの生成が約２．３％増大することが見出された。
【００６７】
図３において、アスパラギン残基の側鎖メチレン炭素およびアルファ炭素における重水素は、合成ペプチドにおいてその脱アミド化速度に対して影響をほとんど有していなかった。水素化アスパラギン残基（上段パネル）または重水素化アスパラギン残基（下段パネル）のどちらかを有するペプチドＶＹＰＮＧＡを、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）において３７℃で様々な時間にわたってインキュベーションした。残存するアスパラギン含有ペプチドの相対量（白丸）を、図２に示されるように逆相Ｃ１８カラムを使用するＨＰＬＣによるペプチドの分離の期間中に２１０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量した。いくつかが重複のために隠れたが、２つの独立した経時処理実験から組み合わされた、２４点のデータ点がそれぞれのパネルに存在した。それぞれのパネルにおける線は、一次反応式［Ａ］＝［Ａ］０ｅ−ｋｔおよび最小二乗分析を使用してデータ点に合わせたものである。ペプチドの半減期を最適線から計算した。
【００６８】
（実施例３：アスパラギン残基における重水素の存在はそのラセミ化速度を有意に低下させる。）
ラセミ化に対するアスパラギン残基重水素化の影響を調べるために、ペプチドを上記のように３７℃およびｐＨ７．４で経時処理し、Ｄ−アスパラギン酸の量を酸加水分解後に求めた。ペプチド結合を切断して、遊離アミノ酸を放出するのと同時に、酸加水分解はまた、アスパラギン残基、スクシンイミジル残基およびイソアスパラギン酸残基を遊離アスパラギン酸に変換する。図４において認められ得るように、重水素化アスパラギン残基を含有するペプチドは、ラセミ化に対する抵抗性が水素化ペプチドよりもはるかに大きい。Ｄ−Ａｓｘ残基（Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−ｉｓｏＡｓｐおよびＤ−スクシンイミド）の蓄積を、ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ（１９８７）によって得られる値を使用してデータ点を適合させるために「材料および方法」の節に記載されるような速度定数を使用し、この適合を、スクシンイミドのラセミ化についての速度定数を変化させることによって最大にしてモデル化した。最小二乗分析を使用して、モデル化されたＤ−Ａｓｘ蓄積を本発明者らの実験測定値と比較すると、水素化ペプチドについて、３．４×１０−４ｍｉｎ−１のラセミ化速度定数が求められ、この値は、以前に測定された値よりも約１．１４倍大きい値であった（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、上掲）。重水素化アスパラギンペプチドについてのデータを同様に分析したとき、７．４×１０−５ｍｉｎ−１のラセミ化速度定数（この値は、水素化ペプチドについて見出されるラセミ化速度定数のほぼ１／５である）が見出された。
【００６９】
ラセミ化した残基が水素化ペプチドおよび重水素化ペプチドの両方において蓄積した速度が、二相性であることが図４において認められる；蓄積は、最初の４日間は急速であり、その後、６日〜２０日の間では遅くなっている。これは、水素化ペプチドＶＹＰＮＧＡ内のアスパラギン残基がＶＹＰＤＧＡ内のアスパラギン酸残基よりも約３７倍速くスクシンイミド化学種を形成するために生じている（ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＣｌａｒｋｅ、上掲）。図２に示されるように、水素化アスパラギン残基および重水素化アスパラギン残基は３日後には８０％が脱アミド化され、６日後には約９５％が脱アミド化されており、したがって、このような６日後におけるラセミ化残基のより遅い蓄積は、このときには優勢なアスパラギン酸残基およびイソアスパラギン酸残基のより遅いスクシンイミド形成を反映している。生理学的条件のもとでの経時処理の初日のうちに、アスパラギン残基の半分が脱アミド化されるよりもかなり前に、水素化ペプチドのラセミ化速度が重水素化ペプチドのラセミ化速度よりも３．６５倍速くなっている。経時処理の４日までに、ペプチドの約１４％だけが脱アミド化されないままであるとき、水素化ペプチドにおけるＡｓｎ残基／Ａｓｐ残基／ｉｓｏＡｓｐ残基は５％がＤ−立体配置にラセミ化され、一方、重水素化されたＡｓｎ残基／Ａｓｐ残基／ｉｓｏＡｓｐ残基は１％のみがラセミ化される。
【００７０】
図４において、重水素化アスパラギンを含有するペプチドでは、ラセミ化されたアスパラギン酸／イソアスパラギン酸／スクシンイミドが、水素化ペプチドよりもはるかに遅い速度で蓄積した。水素化アスパラギンまたは重水素化アスパラギンのどちらかを含有するＶＹＰＮＧＡを３７℃およびｐＨ７．４で様々な時間にわたってインキュベーションし、その後、酸加水分解した。加水分解物中のｄ−アスパラギン酸およびｌ−アスパラギン酸の量を、オルト−フタルアルデヒドおよびＮ−アセチル−ｌ−システインを用いた誘導体化を行い、得られた蛍光性ジアステレオマーを逆相ＨＰＬＣによって分離した後で定量し、総アスパラギン酸に対するｄ−アスパラギン酸の割合（白丸）としてグラフ化した。それぞれのデータセットには、２つの独立した経時処理実験から組み合わされる２４点の測定値が含まれた（これらのデータ点の一部が重複のために視認できなかった）。ラインは、以前に発表された速度論定数（ＧｅｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ、１９８７）から出発し、スクシンイミド中間体のラセミ化速度を変えて、最小二乗分析により求められるような最適線を得る、アスパラギニル残基の脱アミド化に関与する反応のコンピューターシミュレーションによって得られた。
【００７１】
重水素がアルファ炭素から脱離したとき、この重水素と置き換わるプロトンがアルファ炭素の同じ側に戻り、これにより、Ｌ−スクシンイミドを再生し得る可能性は５０％であり、しかし、この場合には、メチレン基上の２つの重水素のみが残留する。したがって、この場合には、３つの重水素を有するＬ−スクシンイミドと、２つの重水素を有するＬ−スクシンイミドとの混合物が存在することになり、これらは加水分解して、３つの重水素および２つの重水素を有するＬ−イソアスパルチル残基およびＬ−アスパルチル残基をそれぞれ形成することができる。重水素は、水素よりもアルファ炭素から脱離しにくいので、ラセミ化を遅くしている。しかしながら、重水素が脱離した後、水からのプロトンによって置き換えられると、ラセミ化速度は、ＧｕｉｇｅｒおよびＣｌａｒｋｅ（上掲）によって以前に報告されたラセミ化速度にまで増大することになる。重水素が離脱した後、プロトンは、Ｌ−スクシンイミドを再生する可能性が５０％であり、また、重水素化メチレン基を有すること以外にアルファ水素を有するこのＬ−スクシンイミドは、完全にプロトン化されたＬ−スクシンイミドがラセミ化するであろうのと同じくらい迅速にラセミ化しうる。
【００７２】
重水素化メチレン基を有すること以外にアルファ水素を有するこのｌ−スクシンイミドは、完全にプロトン化されたｌ−スクシンイミドと同じくらい迅速にラセミ化しうる。しかしながら、重水素化ペプチドにおけるアスパラギン酸残基／イソアスパラギン酸残基／スクシンイミジル残基は２１日間のインキュベーションの後ではほんの１．４９％だけがＤ−立体配置にラセミ化されているので、このインキュベーションの期間中に生じたスクシンイミド化学種の２×１．４９％＝２．９８％のみが重水素をアルファ炭素から失っている。この脱アミド化ペプチドの９７％超は依然としてアルファ炭素が重水素化されているという事実が、９日間のインキュベーションと、２２日間のインキュベーションとの間におけるより遅いラセミ化速度によって図４において認められた。脱アミド化された重水素化ペプチドについてはこの線の傾きが約１．７０×１０−４日−１であり、脱アミド化されたプロトン化ペプチドについては傾きが６．７７×１０−４日−４であった。したがって、ｌ−アスパラギン酸残基／ｌイソアスパラギン酸残基のラセミ化速度が、これらの残基が重水素化ｌ−アスパラギニル残基から生じるときには約１／４に低下した。
【００７３】
（結論）
ここで、水素原子を重水素原子で置換することにより、モデルアスパラギンペプチドにおける自発的ラセミ化の程度が著しく減少することが示された。しかし、そのような置換は、脱アミド化速度および異性化残基の形成速度を低下させない。しかしながら、異性化損傷は、Ｌ−イソアスパラギン酸残基を通常のＬ−アスパラギン酸残基に変換する際のタンパク質修復メチルトランスフェラーゼの作用によって容易に逆転され得る。しかし、Ｄ−アスパラギン酸残基の修復はずっと効率が低く、Ｄ−イソアスパラギン酸残基の生成をもたらすため（ＬｏｗｅｎｓｏｎおよびＣｌａｒｋｅ（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７（９）：５９８５−９５、Ｙｏｕｎｇら（２００５）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（２８）：２６０９４−８）、重水素化による最初のＤ−アスパラギン酸基形成の防止は、タンパク質およびペプチド医薬品および細胞タンパク質の安定化において重要であり得る。ここに報告された知見は、被害を最小限に抑えるための潜在的な介入戦略を示唆している。
【００７４】
個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み入れられると示されているのと同じ程度に、本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
前述の実施形態の少なくとも一部において、実施形態で使用される１つ以上の要素は、そのような置換が技術的に実現可能でない限り、別の実施形態で互換的に使用することができる。クレームされた主題の範囲から逸脱することなく、上記の方法および構造に対して様々な他の省略、追加および改変を行うことができることは、当業者には理解されるであろう。そのような改変および変更のすべては、添付の特許請求の範囲によって規定される主題の範囲内に入ることが意図される。
【００７６】
本明細書中の実質的に任意の複数形および/または単数形の用語の使用に関して、当業者は、複数形から単数形、および/または単数形から複数形へ、文脈および/または応用が適切であるように翻訳される。様々な単数/複数の置換は、明瞭にするために本明細書に明示的に記載されてもよい。単数形「a」、「an」および「the」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及が含まれる。「または」への言及は、他に記載がない限り、「および/または」を包含するものとする。
【００７７】
一般に、本明細書で使用される用語、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）は、一般的に、「オープンな」用語（例えば、「有する」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む」という用語は、「含むがそれに限定されない」などと解釈されるべきである）。特定の数の導入された請求項の記載が意図されている場合、そのような意図は、請求項に明示的に記載され、そのような記載がない場合、そのような意図が存在しないことは、当業者にはさらに理解されるであろう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」の導入句の使用を含み、請求の列挙を導入することができる。しかしながら、そのような語句の使用は、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」によるクレーム記載の導入が、そのようなクレームを含む特定のクレームを、そのような記載を１つだけ含む実施形態に限定することを意味すると解釈されるべきではない。「１つ以上」または「少なくとも１つ」の冒頭の語句および「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも一つ」又は「１つ又はそれ以上」を意味すると解釈されるべきである）。クレーム記述を導入するために使用される明細書の使用についても同様である。さらに、特定の数の導入されたクレームの記載が明示的に列挙されていても、当業者は、そのような記載が、少なくとも列挙された数を意味すると解釈すべきであることを認識するであろう（例えば、他の修飾語は、少なくとも２つの列挙、または２つ以上の列挙を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣなどの少なくとも１つ」に類似する規約が使用される場合、一般に、このような構成は、当業者が（例えば、「Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣ、および／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒に有する系を含む、など）。「Ａ、Ｂ、またはＣなどの少なくとも１つ」に類似した慣例が使用される場合、一般に、そのような構成は、当業者が慣例（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡおよびＢ一緒、ＡおよびＣ一緒、ＢおよびＣ一緒および／またはＡ、Ｂ、およびＣを一緒にするなど）。明細書、特許請求の範囲、または図面のいずれにおいても、２つ以上の代替用語を提示する事実上任意の論理和語および／または語句は、用語の１つを含む可能性を意図すると理解されるべきであり、いずれかの用語、または両方の用語。例えば、「ＡまたはＢ」という語句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解される。
【００７８】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本開示がまた、マーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関して記載されることを認識するであろう。
【００７９】
当業者には理解されるように、記載された説明を提供するという点のような任意の目的のために、本明細書に開示された全ての範囲はまた、そのすべての可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも同等の半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解されることを十分に記述し、可能にすることを容易に認識することができる。下位の１／３、中位の１／３、上位の１／３などの中に入る。当業者には理解されるように、「〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」およびｌｉｋｅは、引用された数字を含み、上記のように部分的な範囲に分割することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は各個々の部材を含む。したがって、例えば、１〜３個の物品を有するグループは、１個、２個または３個の物品を有するグループを指す。同様に、１〜５個の記事を有するグループは、１，２，３，４または５個の記事を有するグループなどを指す。
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態は当業者には明らかであろう。本明細書に開示された様々な態様および実施形態は、例示のためのものであり、本発明の真の範囲および精神は、以下の請求項によって示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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