(57)【要約】本発明は、とりわけ、炎症性および自己免疫の疾患、障害および状態を制御または処置するための方法および組成物を提供する。本発明は、構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作された調節性Ｔ細胞が疾患の処置に有効であるという驚くべき発見に部分的に基づいている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作された調節性Ｔ（「Ｔｒｅｇ」）細胞。
【請求項２】
ＳＴＡＴタンパク質を構成的に活性化するように操作されている、請求項１に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項３】
適切な参照と比較して、ＳＴＡＴタンパク質のより高いレベルまたは活性を発現するように操作されている、請求項１に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項４】
構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質を発現するように操作されている、請求項１に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項５】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、ＳＴＡＴ５ｂであるか、またはそれを含む、請求項４に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項６】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、構成的にリン酸化されている、請求項４に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項７】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、構成的に二量体化されている、請求項４に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項８】
キメラ抗原受容体をさらに発現する、請求項１に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項９】
内因性Ｔ細胞受容体をさらに発現する、請求項１に記載の操作された調節性Ｔ細胞。
【請求項１０】
炎症性または自己免疫の疾患、障害または状態に罹患している対象を処置する方法であって、構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作された調節性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
調節性Ｔ細胞を含有する対象から試料を採取する工程、
前記試料から調節性Ｔ細胞を単離する工程、
前記調節性Ｔ細胞を、構成的ＳＴＡＴ活性を含むように操作する工程、
構成的ＳＴＡＴ活性を含む前記操作された調節性Ｔ細胞を対象に投与する工程
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、内在性Ｔ細胞受容体を発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、ＳＴＡＴタンパク質を構成的に活性化するように操作されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、適切な参照と比較して、ＳＴＡＴタンパク質のより高いレベルまたは活性を発現するように操作されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質を発現するように操作されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、ＳＴＡＴ５ｂであるか、またはそれを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、構成的にリン酸化されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、構成的に二量体化されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が採取される前記対象および前記操作された調節性Ｔ細胞が投与される前記対象は、同一である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料が採取される前記対象および前記操作された調節性Ｔ細胞が投与される前記対象は、同一でない、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
免疫細胞を含有する対象から試料を採取する工程、
前記試料から免疫細胞亜集団を単離する工程、
前記単離された免疫細胞亜集団から調節性Ｔ細胞をインビトロで生成する工程、
前記調節性Ｔ細胞を、構成的ＳＴＡＴ活性を含むように操作する工程、
構成的ＳＴＡＴ活性を含む前記操作された調節性Ｔ細胞を対象に投与する工程
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫細胞亜集団は、ナイーブＣＤ４＋細胞からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、内在性Ｔ細胞受容体を発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、ＳＴＡＴタンパク質を構成的に活性化するように操作されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、適切な参照と比較して、ＳＴＡＴタンパク質のより高いレベルまたは活性を発現するように操作されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記操作された調節性Ｔ細胞は、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質を発現するように操作されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、ＳＴＡＴ５ｂであるか、またはそれを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、構成的にリン酸化されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、構成的に二量体化されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が採取される前記対象および前記操作された調節性Ｔ細胞が投与される前記対象は、同一である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料が採取される前記対象および前記操作された調節性Ｔ細胞が投与される前記対象は、同一でない、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＣＡ００８７４８、ＡＩ０３４２０６およびＧＭ０７７３９の下での米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の理解の進歩に伴い、治療のためのさらなる手段がもたらされる。免疫系を用いて疾患を処置するための新規組成物および処置方法を同定する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、免疫系の細胞の操作によって疾患、障害または状態を処置するための新規治療法を開発できるという認識を包含する。いくつかの実施形態において、本開示は、いくつかの疾患、障害または状態、例えば炎症性疾患および自己免疫疾患が過活動性およびまたは自己反応性免疫系の結果であり得ることを認識する。いくつかの実施形態において、本開示は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が過活動性およびまたは自己反応性免疫系を調節するための有用なツールであり得ることを認識する。いくつかの実施形態において、本開示は、疾患、障害または状態、例えば炎症性疾患および自己免疫疾患を処置するためのＴｒｅｇ細胞の操作に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、刺激についてＩＬ−２シグナリングの必要性に依存しないようにＴｒｅｇ細胞を操作することにより、炎症性疾患および自己免疫疾患の処置のための新規な治療法を提供し得ることを認識する。
【０００４】
いくつかの実施形態において、本開示は、構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作された調節性Ｔ細胞に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質を発現する操作されたＴｒｅｇ細胞を提供する。いくつかの実施形態において、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質は、リン酸化タンパク質（例えば、構成的にリン酸化されたタンパク質）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞は、ＳＴＡＴタンパク質を構成的に発現するように操作されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴｒｅｇ細胞は、ＳＴＡＴタンパク質を構成的に活性化するように操作されている（例えば、ＳＴＡＴタンパク質を不活性型から活性型に構成的に変換することにより、例えばリン酸化により）。いくつかの実施形態において、構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作されたＴｒｅｇ細胞は、同等の条件下において、適切な参照Ｔｒｅｇ細胞（例えば、関連する操作を欠く以外には同等のＴｒｅｇ細胞）と比較して、特定のＳＴＡＴタンパク質またはその活性型のより高いおよび／またはより時間的に一貫したレベルおよび／または活性を含有する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作されたＴｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体も発現する。代替的にまたはさらに、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作されたＴｒｅｇ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体も発現する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示は、１つ以上の疾患、障害または状態を処置するための技術を提供する。いくつかの特定の実施形態において、本開示は、炎症性疾患または自己免疫疾患の処置に関する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたＴｒｅｇ細胞において構成的ＳＴＡＴ活性を達成する（例えば、操作を欠く以外には同等のＴｒｅｇ細胞と比較して）ために、患者試料から得られた１つ以上のＴｒｅｇ細胞を操作する工程を含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の処置方法は、本明細書に記載の操作されたＴｒｅｇ細胞（すなわち構成的ＳＴＡＴ活性によって特徴付けられる操作されたＴｒｅｇ細胞）の投与であり得るか、またはそれを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】パネル（ａ）〜（ｊ）を含み、ＩＬ−２ＲβがＴｒｅｇ細胞機能に不可欠であることを示す。パネル（ａ）は、５週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスの示された器官の組織病理を示す。スケールバー、１００μｍ。分析された５対５のマウスの代表的な画像を示す。パネル（ｂ）は、５週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスのリンパ節（ＬＮ）細胞充実性を示す。パネル（ｃ）は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で５時間刺激した５週齢Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスの脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−細胞によるサイトカイン産生のフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｄ）は、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔ（青色）およびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ（赤色）マウス由来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞による示されたＩＬ−２Ｒサブユニットの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。分析された５対５のマウスの代表的な画像を示す。パネル（ｅ）は、ＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化のフローサイトメトリー分析を示す。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔ（青色）およびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ（赤色）マウス由来の脾細胞を、組換えマウスＩＬ−２（ｒｍＩＬ−２；１，０００Ｕ／ｍｌ）を伴ってまたは伴わずに２０分間培養し、ＣＤ４＋ＹＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３＋）細胞におけるチロシンリン酸化ＳＴＡＴ５の細胞内レベルをフローサイトメトリーで分析した。分析された５対５のマウスの代表的な画像を示す。パネル（ｆ）は、５週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスのＬＮにおける、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＴｒｅｇ細胞の頻度（左のグラフ）およびＦｏｘｐ３発現レベル（ＭＦＩ：平均蛍光強度）（右のグラフ）のフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｇ）は、健常なヘテロ接合体の雌性Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスにおけるＴｒｅｇ細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。示された臓器から単離した細胞をＦｏｘｐ３およびＹＦＰ発現について分析した。ＹＦＰ（Ｃｒｅ）発現および細胞内Ｆｏｘｐ３染色は、ＹＦＰ−Ｃｒｅ発現を伴うまたは伴わないＴｒｅｇ細胞を同定した。示されたゲートは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞に対するものである。パネル（ｈ）は、３週齢のヘテロ接合体の雌性Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔ（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ（赤色）マウスの示された器官における、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度（上のパネル）およびＦｏｘｐ３＋細胞中のＣｒｅ発現細胞の頻度（下のパネル）を示す。パネル（ｉ）は、３週齢のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔ（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ（赤色）マウスの示された器官での、ＹＦＰ−Ｆｏｘｐ３＋（上パネル）およびＹＦＰ＋Ｆｏｘｐ３＋（下パネル）細胞におけるＦｏｘｐ３発現レベル（ＭＦＩ）を示す。パネル（ｊ）は、３週齢のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔ（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ｗｔＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ（赤色）マウスの示された器官での、ＹＦＰ＋Ｆｏｘｐ３＋細胞における示されたマーカー（ＭＦＩ）の発現レベルおよびＣＤ１０３＋細胞の頻度を示す。
【図１−２】同上。
【図２−１】パネル（ａ）〜（ｋ）を含み、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の存在下でのＩＬ−２Ｒ欠損Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ活性の回復を示す。パネルは、（ａ）標的化構築物の概略図を示す。パネル（ｂ）は、条件付きＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ導入遺伝子の発現時のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスにおける消耗性疾患の救済を示す。マウスを４週齢で分析した。分析された１０を超えるＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ対１０のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスの代表的な画像を示す。パネル（ｃ）は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞上のＣＤ１２２およびＣＤ２５発現のレベルを示す。データは、２つの独立した実験の代表例である。パネル（ｄ）は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化のフローサイトメトリー分析を示す。示されたマウスから単離されたＬＮ細胞をｒｍＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で２０分間刺激せず（ｕｎｓｔｉｍ）または刺激し、ＣＤ４＋ＹＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３＋）細胞におけるチロシンリン酸化ＳＴＡＴ５の細胞内レベルを分析した。データは、２つの独立した実験の代表例である。パネル（ｅ）は、ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ導入遺伝子の存在下でのＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌマウスにおける消耗性疾患の救済を示す。マウスを４週齢で分析した。分析された１０を超えるＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌ対１０のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスの代表的な画像を示す。パネル（ｆ）は、インビトロでのＩＬ−２捕捉アッセイを示す。示されたマウス由来のＧＦＰ（ＹＦＰ）＋Ｔｒｅｇ細胞およびＧＦＰ（ＹＦＰ）−非Ｔｒｅｇ細胞を選別し、組換えヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）と共に２時間培養した。２時間後の培地中の残留ｈＩＬ−２の量を、フローサイトメトリーに基づくビーズアレイ分析を用いて測定し、％値として示した。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｇ）は、フローサイトメトリーによって決定された２週齢のマウスのＬＮにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉおよびＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ細胞の細胞数を示す。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｗｔ／／ｗｔ（黒色）、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌ（赤色）、およびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青色）。データは、２つの独立した実験の代表例である。パネル（ｈ）は、示されたマウスのＬＮにおいて、フローサイトメトリーによって決定される、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−細胞中のナイーブ（ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ）細胞の頻度（左の２つのパネル）、およびＣＤ４４ｈｉを活性化したＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−細胞の細胞数（右の２つのパネル）を示す。マウスを抗ＩＬ−２中和抗体または対照ＩｇＧのいずれかで出生後７日から２週間にわたって処置した。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｉ）は、ナイーブおよび活性／記憶ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制する、ＩＬ−２Ｒが十分なおよび欠損したＴｒｅｇ細胞の能力の分析を示す。野生型（Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ）マウスからＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ（ＣＤ４ナイーブ）、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ（ＣＤ８ナイーブ）およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ（ＣＤ８記憶）Ｔ細胞を選別し、示されたマウスから別個に選別されたＴｒｅｇ細胞（２×１０５細胞）と共にＴ細胞欠損（Ｔｃｒｂ−／−Ｔｃｒｄ−／−）マウスに養子移入した（各１×１０６細胞）。移入後３週間のレシピエントにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞数が示される。パネル（ｊ）は、Ｔｒｅｇ媒介性抑制に対するＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の感受性の分析を示す。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＦｏｘｐ３ＣｒｅＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスから選別し、ＴＡＴ−Ｃｒｅリコンビナーゼを用いてインビトロで処置し、非ＴｒｅｇＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現を誘導した。両方の細胞サブセットについて、組換え効率は、およそ３０％であった。処置したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞（それぞれ１×１０６細胞）を、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅまたはＦｏｘｐ３ＣｒｅＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスからそれぞれ選別した、Ｔｒｅｇ細胞を含まない（赤棒）または２×１０５の対照（黒棒）もしくはＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現Ｔｒｅｇ細胞（青棒）を含むＴ細胞欠損（Ｔｃｒｂ−／−Ｔｃｒｄ−／−）レシピエントへ共に移入した。レシピエントは、移入後３週間で分析した。全ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞サブセット内のＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞の頻度が示されている。パネル（ｋ）は、（ｊ）に記載のレシピエントマウスにおけるＩＦＮγ産生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す。対照として、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＲＯＳＡ２６ＷＴマウス（ＷＴ）マウスから選別したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３  Ｔ細胞を同様に膜透過性ＴＡＴ−Ｃｒｅタンパク質で処理し、Ｔｒｅｇ細胞を伴ってまたは伴わずに移入して、Ｔｒｅｇ媒介性抑制（白抜き棒）に対するＳＴＡＴ５ｂＣＡ非発現エフェクターＴ細胞の感受性を評価した。下の２つのグラフは、同じデータセットから計算された％で示される。データは、２つの独立した実験の代表例である。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ）。
【図２−２】同上。
【図３−１】パネル（ａ）〜（ｇ）を含み、ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＴｒｅｇ細胞の増殖および抑制活性の増加を示す。パネル（ａ）は、示された器官における、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度（上のグラフ）およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞におけるＦｏｘｐ３の発現レベル（下のグラフ）をフローサイトメトリーによって決定したことを示す。Ｓｐ：脾臓、ＳＩＬＰＬ：小腸の固有層リンパ球。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｂ）は、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスのＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３ｈｉ集団の増加を示す脾細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｃ）は、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおける脾臓Ｔｒｅｇ細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、ＫＬＲＧ−１、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、およびＧＩＴＲについて細胞を染色した。パネル（ｄ）は、示されたマウスにおける示されたマーカーの発現レベルについての脾臓Ｔｒｅｇ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｅ）は、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおける脾臓ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（上のパネル）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−（下のパネル）細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｆ）は、示されたマウスのＬＮにおけるＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩｈｉ）およびＢ細胞（Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−）上のＣＤ８０およびＣＤ８６の発現のフローサイトメトリー分析を示す。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｇ）は、ＥＬＩＳＡによって決定した、示されたマウスにおける血清および糞便ＩｇＡレベルを示す。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒点）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青点）マウスを単回のタモキシフェン処置の３ヶ月後に分析した。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す（ａ、ｄ、ｆ、ｇ）。
【図３−２】同上。
【図４】パネルａ〜ｅを含み、ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＴｒｅｇ細胞の強力なサプレッサ機能を実証する。パネル（ａ）は、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青色）マウスにおけるＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現および対照Ｔｒｅｇ細胞の存在下でのＥＡＥの分析を示す。ＥＡＥは、ＣＦＡ中のＭＯＧペプチドによる免疫化で誘導された。示されたマウスの平均疾患スコア（各グループについてｎ＝１０）。エラーバーは、＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｂ）は、フローサイトメトリーによって決定される、（ａ）に示したマウスの脳浸潤ＣＤ３＋ＣＤ４＋（左のグラフ）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋（右のグラフ）細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度を示す。パネル（ｃ）は、フローサイトメトリーによって決定される、（ａ）に示されたマウスにおける示された脳浸潤細胞サブセットの数を示す。パネル（ｄ）は、示されたマウスにおけるリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対するＴ細胞応答の分析を示す。脾臓Ｔ細胞応答をリステリア感染後８日目に分析した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度（左）。ＣＤ４＋ＴＣＲβ＋Ｆｏｘｐ３−細胞を産生するＩＦＮγ（中）およびＴＮＦα（右のグラフ）の頻度を、ＤＣの存在下で加熱死滅化したリステリアで５時間のインビトロ再刺激後に分析した。４つの独立した実験からプールされたデータが示される。パネル（ｅ）は、非複製ワクシニアウイルスに感染した、示されたマウスにおける抗ウイルスＴ細胞応答の分析を示す。脾臓Ｔ細胞応答を感染後８日目に分析した。ワクシニアＢ８Ｒペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｈ−２Ｋｂ−Ｂ８Ｒ四量体染色（左のグラフ）を用いたフローサイトメトリーによって検出された。Ｂ８Ｒペプチドまたは３つのワクシニアウイルス特異的ペプチドの混合物（ＩＳＫ、Ａ３３Ｒ、およびＢ５Ｒ）を用いた５時間のインビトロ刺激後のフローサイトメトリーにより、ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−（中央）およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（右のグラフ）細胞によるＩＦＮγ産生が決定された。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青色）マウスは、単回のタモキシフェン処置の２〜３ヶ月後、示された炎症剤で抗原投与された。各点は、個々のマウスを表す（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。
【図５−１】パネル（ａ）〜（ｆ）を含み、ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＴｒｅｇ細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析を示す。パネル（ａ）は、最も高い分散値を有する遺伝子の上位１５％を使用した、ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットの主成分分析を示す。各点は、単一のマウス由来のＲＮＡ試料に対応する。パネル（ｂ）は、対照Ｔｒｅｇ対ＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現Ｔｒｅｇ細胞における遺伝子発現のプロット（ｌｏｇ２正規化された読み取りカウントとして）を示す。対角線は、少なくとも１．５倍または０．６７倍の倍数変化を示す。有意に上方調節および下方調節された遺伝子（少なくとも１．５倍または０．６７倍の変化、調整されたＰ値≦０．０５、およびすべての遺伝子の分布に基づいた最小閾値を超える発現を有する遺伝子として定義される）は、それぞれ赤色または青色に着色され、その数が示されている。パネル（ｃ）は、選択された遺伝子のヒートマップを示す。各条件について３つの複製が順番に示される。この値は、対照ＴｒｅｇとＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現Ｔｒｅｇ細胞との間のＦＤＲ調整Ｐ値を示す。パネル（ｄ）は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ対対照Ｔｒｅｇにおけるすべての発現遺伝子のｌｏｇ２倍の変化に対する経験的累積分布関数（ＥＣＤＦ）が、Ｔｒｅｇ細胞における炎症活性化によって上方調節または下方調節された遺伝子のサブセット３３（上のグラフ）、またはＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞においてＴＣＲ依存的様式で上方調節または下方調節された遺伝子のサブセット３４（下のグラフ）についてＥＣＤＦと共にプロットされていることを示す。ＦＤＲ調整Ｐ値は、両側Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定を用いて計算した。パネル（ｅ）は、ＫＥＧＧ経路のシグナリング経路影響分析（ＳＰＩＡ）を示す。ＳＴＡＴ５ｂＣＡ対対照Ｔｒｅｇ細胞における差次的に発現された（ＤＥ）遺伝子中で強化を示す６つの最も統計的に有意な経路が示される。正味経路摂動は、経路内のＤＥ遺伝子の活性化または阻害関係に基づいて経路の状態を示す（陽性＝活性化、陰性＝阻害）。赤丸の大きさは、強化度に比例し、強化および摂動の両方を反映するＦＤＲ調整グローバルＰ値が示されている。パネル（ｆ）は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ  Ｔｒｅｇ対対照Ｔｒｅｇ細胞における有意に上方調節された遺伝子中のＧＯターム強化のネットワーク分析を示す。上方調節された遺伝子は、ＣｙｔｏｓｃａｐｅのＢｉＮＧＯを用いて過剰に表現されたＧＯタームについて分析され、得られたネットワークは、ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐを使用して計算され可視化された。同様のＧＯタームのグループは、手動で円で囲んだ。辺の太さと色とは、接続されたノード間の類似係数に比例する。ノードの色は、強化のＦＤＲ調整Ｐ値に比例する。ノードのサイズは、遺伝子セットのサイズに比例する。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために、タモキシフェン処置から４ヶ月後、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（ＳＴＡＴ５ｂＣＡ）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（対照）マウスから脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ  Ｔナイーブ細胞をＦＡＣＳ精製した。
【図５−２】同上。
【図６】パネル（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を含み、Ｔｒｅｇ細胞における増強されたＳＴＡＴ５シグナリングがＴｒｅｇ細胞とＤＣとの間の結合体形成を増加させ、ＴＣＲ非依存的な様式でサプレッサ機能を増強することを実証する。パネル（ａ）は、Ｔ細胞とＤＣとの間のインビトロ結合体形成の分析を示す。結合体形成評価のために、示されたマウス由来のＦＡＣＳ選別したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞および非Ｔｒｅｇ細胞）を、ｒｍＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、類別された数の、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスからのＭＡＣＳ選別したＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識ＣＤ１１ｃ＋ＤＣと１５０〜７２０分間共培養した。各点は、単一のウェルにおける結合体形成のフローサイトメトリー分析を表す。統計データ分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージを用いた共分散（ＡＮＣＯＶＡ）の修正分析によって行った。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意でない。３つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｂ）は、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の発現がＴＣＲシグナリングの非存在下でＴｒｅｇ細胞サプレッサ機能を増強することを示す。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（中実円）、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（中空円）、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２Ｔｃｒａｆｌ／ｆｌ（中実三角）、およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２Ｔｃｒａｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウス（中空三角）をタモキシフェンで２週間処置し、Ｔ細胞活性化、増殖活性および炎症促進性サイトカイン産生をフローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−細胞中、ＬＮ細胞充実性（左）、およびＣＤ４４ｈｉ（中左）、Ｋｉ−６７＋細胞（中右）、ＩＦＮγ＋産生細胞（右）の頻度が示されている。グラフの各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。３つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｃ）は、Ｔｒｅｇ細胞の頻度および特定分子の発現を示す。ＷＴ  ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞（それぞれ５×１０５細胞）を、タモキシフェンで２週間処置された示されたマウスから選別したＴｒｅｇ細胞（３×１０５細胞）と共にＴｃｒｂ−／−Ｔｃｒｄ−／−レシピエントに移入した。ＴＣＲで切断したＴｒｅｇ細胞をＴＣＲの発現に基づいてＦＡＣＳで精製した。ＴＣＲが十分であるＴｒｅｇ細胞を対照（Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２）マウスから選別した。レシピエントは、移入後３週間で分析した。レシピエントにおけるＴｒｅｇ細胞の頻度およびＴｒｅｇ細胞における示された分子の発現は、最初の５つのパネル（左から右）に示されている。右の２つのパネルは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の数を示す。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。
【図７】パネル（ａ）〜（ｃ）を含み、ＩＬ−２がＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏおよびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞サブセットの両方を維持することを示す。パネル（ａ）は、ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ（上のパネル）およびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ（下のパネル）のＹＦＰ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞サブセットについてゲーティングすることにより、図１ｊに示すマウスのフローサイトメトリー分析を行ったことを示す。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｂ）は、５週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスの脾臓および小腸固有層リンパ球（ＳＩＬＰＬ）における、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋中のＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４の発現（上のパネル）およびＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度（下のパネル）の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。右のグラフは、フローサイトメトリープロットの要約データを示す。パネル（ｃ）は、５週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスの脾臓ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞について示されたマーカーのフローサイトメトリー分析を示す。３つの独立した実験の代表的なデータを示す。グラフの各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す（ａ、ｂ、ｃ）。
【図８】パネル（ａ）〜（ｈ）を含み、ＩＬ−２ＲαおよびＳＴＡＴ５がＴｒｅｇ細胞機能に不可欠であることを示す。パネル（ａ）は、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌ（実線；ｎ＝２５）および対照Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｗｔ（点線；ｎ＝２０）マウスの寿命を示す。パネル（ｂ）は、４週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｗｔ／ｗｔマウスおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌマウスにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞のＬＮ細胞性、Ｆｏｘｐ３発現レベル（ＭＦＩ）および頻度（上のグラフ）、ならびにＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−細胞による炎症促進性サイトカイン産生（下のグラフ）の分析を示す。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｃ）は、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌマウスの組織病理分析を示す。４週齢のマウスの示された器官のホルマリン固定組織切片のＨ＆Ｅ染色。スケールバー、１００μｍ。分析した３匹のマウスの代表的な画像を示す。パネル（ｄ）は、６週齢のＦｏｘｐ３ＣｒｅＳｔａｔ５ａ／ｂｗｔ／ｗｔおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＳｔａｔ５ａ／ｂｆｌ／ｆｌマウスのＬＮにおけるＣＤ４  Ｔ細胞サブセットにおけるＦｏｘｐ３およびＣＤ２５発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。下のヒストグラムは、上のパネルに示されたＦｏｘｐ３＋細胞におけるＣＤ２５の発現レベルを表す。パネル（ｅ）は、ＬＮにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（上のパネル）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−（下のパネル）細胞におけるＴ細胞活性化マーカーＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４のフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｆ）は、示されたマウスから単離され、インビトロで５時間抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激された脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−細胞によるサイトカイン産生のフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｇ）は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で５時間刺激した脾臓ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３細胞によるＩＦＮγ産生のフローサイトメトリー分析を示す。データは、分析した５対５のマウスの代表値である（ｄ〜ｇ）。パネル（ｈ）は、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＳｔａｔ５ａ／ｂｆｌ／ｆｌマウスの組織病理分析を示す。４週齢のマウスの示された器官のホルマリン固定組織切片のＨ＆Ｅ染色。スケールバー、１００μｍ。分析した５匹のマウスの代表的な画像を示す。
【図９】パネル（ａ）〜（ｅ）を含み、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の発現時のＩＬ−２Ｒα欠損Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ活性の救済を示す。パネル（ａ）は、示されたマウス（４週齢）のＬＮおよび脾臓におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３およびＣＤ２５発現のフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｂ）は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化のフローサイトメトリー分析を示す。示されたマウスから単離した脾細胞をｒｍＩＬ−２（１，０００Ｕ／ｍｌ）で２０分間刺激し、ＣＤ４＋ＹＦＰ＋（Ｆｏｘｐ３＋）細胞におけるチロシンリン酸化ＳＴＡＴ５の細胞内レベルを分析した。パネル（ｃ）は、示されたマウスのＬＮにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−細胞におけるＴ細胞活性化マーカーＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４のフローサイトメトリー分析を示す。パネル（ｄ）は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で５時間刺激した脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−細胞によるサイトカイン産生を示す。３つの独立した実験の代表的なデータを示す（ａ〜ｄ）。パネル（ｅ）は、示されたマウスのＬＮにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（左のグラフ）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−（右のグラフ）細胞中のＣＤ４４ｈｉ細胞の頻度を示す。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。データは、２つの独立した実験の代表例である。
【図１０−１】パネル（ａ）および（ｂ）を含み、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の活性化に対するインビボでのＩＬ−２中和の効果を実証する。パネル（ａ）は、ＩＬ−２中和抗体または対照ＩｇＧのいずれかで処置した示されたマウスのＬＮ細胞の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。出生後７日からマウスを２週間処置した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８で５時間にわたりインビトロ刺激した後、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−細胞によるサイトカイン産生を分析した。データは、分析した１グループあたり３匹のマウスを表す。パネル（ｂ）は、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ（上の６パネル）およびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／／ｆｌ（下の８パネル）マウスのＬＮ細胞をｒｍＩＬ−２（１，０００または１０Ｕ／ｍｌ）で２０分間刺激せずまたは刺激し、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＹＦＰ＋ＣＤ２５ｈｉ）、Ｔナイーブ（ＹＦＰ−ＣＤ４４ｌｏＣＤ２５ｌｏ；ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）、およびＴｅｆｆ（ＹＦＰ−ＣＤ４４ｈｉ；ＣＤ２５ｌｏおよびＣＤ２５ｈｉ；ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）細胞におけるチロシンリン酸化ＳＴＡＴ５の細胞内レベルをフローサイトメトリーによって分析したことを示す。データは、２つの独立した実験の代表例である。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１１−１】パネル（ａ）〜（ｉ）を含み、ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＴｒｅｇ細胞を有するマウスの特徴付けを示す。パネル（ａ）は、タモキシフェン強制経口投与後のＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の増殖を示す。３匹のマウスを屠殺し、各時点で分析した。脾臓における全Ｔｒｅｇ細胞中のＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度をフローサイトメトリーにより決定した。エラーバーは、＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。パネル（ｂ）は、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスの示された器官中の全Ｔｒｅｇ細胞中のＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度を単回のタモキシフェン処置の３ヶ月後にフローサイトメトリーによって決定したことを示す。パネル（ｃ）は、タモキシフェン強制経口投与後の体重の変化を示す。４ヶ月齢のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒色、ｎ＝７）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青色、ｎ＝７）マウスにタモキシフェンを強制経口投与し、体重を次の４ヶ月でモニターした。エラーバーは、＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。パネル（ｄ）は、タモキシフェン強制経口投与から４．５ヶ月後のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青色）マウスの血清化学プロファイルを示す。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。パネル（ｅ）は、様々な組織におけるＴｒｅｇ細胞のＴＣＲ  Ｖβの用法をＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（Ｃｏｎｔ）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（ＣＡ）マウスのタモキシフェン強制経口投与の２ヵ月後にフローサイトメトリーによって分析したことを示す。ＭＬＮ、腸間膜リンパ節；ＰＰ、Ｐｅｙｅｒパッチ。２つの独立した実験の代表的なデータを示す。パネル（ｆ〜ｈ）は、単回のタモキシフェン処置の３ヶ月後のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒色）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青色）マウスのＴｒｅｇ細胞の一般的な特徴付けを示す。パネル（ｆ）は、示された器官におけるＴｒｅｇ細胞上の示された分子の発現レベルを示す。パネル（ｇ）は、示された器官におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度（上のグラフ）、およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞におけるＦｏｘｐ３の発現レベル（下のグラフ）を示す。パネル（ｈ）は、示された器官におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度を示す。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す（ｂ、ｄ、ｆ、ｇ、ｈ）。データは、２つの独立した実験の代表例である（ｆ、ｇ、ｈ）。パネル（ｉ）は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ  Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ活性の増加を示す。Ｔｒｅｇ細胞をＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（対照）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（Ｓｔａｔ５ｂＣＡ）マウスから単離し、Ｔナイーブ細胞（応答細胞）と共培養した。Ｔｒｅｇおよび応答細胞の増殖活性をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）蛍光強度の希釈に基づくフローサイトメトリーによって決定した。４：１のレスポンダー対Ｔｒｅｇ細胞比でのＴナイーブ細胞の典型的な色���希釈パターンを左の２つのパネルに示す。共培養された応答Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞の増殖を示す概略グラフが右の２つのパネルに示されている。細胞のＣＴＶ  ＭＦＩは、細胞分裂と逆相関することに留意されたい。エラーバーは、３連ウェルの＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。
【図１１−２】同上。
【図１２】パネル（ａ）〜（ｅ）を含み、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下でのＴｅｆｆ細胞集団の全身的減少を示す。パネル（ａ）および（ｂ）は、示された器官のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（ａ）およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−（ｂ）細胞中の、Ｋｉ−６７＋（上のグラフ）、ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ（中；％Ｔナイーブ）、およびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ（下；％Ｔｅｆｆ）細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定したことを示す。パネル（ｃ）は、示されたマウスの脾細胞および腸間膜ＬＮ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で５時間刺激し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−細胞中の示されたサイトカイン産生細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定したことを示す。パネル（ｄ）は、ＥＬＩＳＡによって決定した血清Ｉｇレベルを示す。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（黒点）およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（青点）マウスを単回のタモキシフェン処置の３ヶ月後に分析した（ａ〜ｄ）。パネル（ｅ）は、ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＴｒｅｇ細胞が腸の発癌に及ぼす影響を示す。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＡｐｃＭｉｎ／＋およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡＡｐｃＭｉｎ／＋マウスを４週齢でタモキシフェンで処置し、遠位小腸のポリープの数およびサイズを４ヵ月後に実体顕微鏡法を用いて評価した。各点は、単一のマウスを表す。エラーバーは、平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す（ａ〜ｅ）。
【図１３−１】パネル（ａ）〜（ｃ）を含み、図５に示されるデータを取得するために行われたＲＮＡ−ｓｅｑ分析を記載する。パネル（ａ）は、対照Ｔナイーブ対ＳＴＡＴ５ｂＣＡ  Ｔナイーブ細胞（すなわちＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスからのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞）における遺伝子発現のプロット（ｌｏｇ２正規化読み取りカウントとして）を示す。対角線は、少なくとも１．５倍または０．６７倍の倍数変化を示す。有意に上方調節および下方調節された遺伝子（少なくとも１．５倍または０．６７倍の変化、調整されたＰ値≦０．０５、およびすべての遺伝子の分布に基づいた最小閾値を超える発現を有する遺伝子として定義される）は、それぞれ赤色または青色に着色され、その数が示されている。パネル（ｂ）は、ｌｏｇ１０ＦＤＲ調整Ｐ値対ＳＴＡＴ５ｂＣＡと対照Ｔｒｅｇ細胞との間のｌｏｇ２倍変化を示す火山型プロットを示す。このプロットのｘ軸またはｙ軸の外にある遺伝子は、中空の三角として軸に示される。縦および横の灰色の線は、１．５倍または０．６７倍の変化（±ｌｏｇ２１．５＝±０．５８）およびＰ＝０．０５（−ｌｏｇ１００．０５＝１．３）をそれぞれ示す。パネル（ｃ）は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現対対照Ｔｒｅｇ細胞における有意に下方調節された遺伝子中のＧＯターム強化のネットワーク分析を示す。下方調節された遺伝子は、ＣｙｔｏｓｃａｐｅのＢｉＮＧＯを用いて過剰に表現されたＧＯタームについて分析され、得られたネットワークは、ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐを使用して計算され可視化された。同様のＧＯタームのグループは、手動で円で囲んだ。辺の太さと色とは、接続された遺伝子セット間の類似係数に比例する。ノードの色は、強化のＦＤＲ調整Ｐ値に比例する。ノードのサイズは、遺伝子セットのサイズに比例する。
【図１３−２】同上。
【図１４−１】ＳＴＡＴ５ｂＣＡ  Ｔｒｅｇ対対照Ｔｒｅｇ細胞において上方調節または下方調節された遺伝子中で強化された遺伝子オントロジータームを示す。
【図１４−２】同上。
【図１４−３】同上。
【図１５】条件付きＩＬ２ｒｂアレルの生成およびＩＬ２ｒｂ標的化のための戦略を示す。Ｃｒｅ媒介性欠失で、プロモーター領域およびＩｌ２ｒｂの第１のＡＴＧを含むエキソン２がｅＧＦＰ発現の同時活性化と共に欠失されるように標的化ベクターを構築した。上から下へ、ｉ）プロモーター領域、エキソンおよびエキソン２（Ｅ２）における翻訳開始部位を有するＩｌ２ｒｂ遺伝子座；ｉｉ）ｅＧＦＰ、三重ＳＶ４０ポリＡ部位（ｔｐＡ）、ＰＧＫ  ｎｅｏｐＡカセット、エキソン２の下流にあるＰＧＫプロモーター（Ｐｒ．）、ＴＫ遺伝子、およびｌｏｘＰおよびｆｒｔ部位を含む標的化ベクター；矢印は、方向を示す；ｉｉｉ）標的化されたＩｌ２ｒｂ遺伝子座を示す。制限部位、検出に使用されるプローブ、およびサザンブロット分析によって検出される予想される断片が示される。１４．０ｋｂの野生型バンドと共に、組み込まれた導入遺伝子の４．０ｋｂバンドを示したＸｂａＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、正しく標的化された胚性幹（ＥＳ）細胞株が同定された。３’ｌｏｘＰ部位の共組込みは、ＰＧＫプロモーターと、３’ｆｒｔ部位（フォワードプライマー）とにまたがるユニーク領域およびＪｌ２ｒｂ（リバースプライマー）のイントロン３の上流の領域にハイブリダイズするプライマーを用いたＰＣＲ分析によって確認した。
【図１６】ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡアレルの概略図および標的化戦略を示す。標的化ベクターは、ＣＡＧプロモーター駆動ＳＴＡＴ５ｂＣＡがＳＴＯＰカセットのＣｒｅ媒介性の欠失で発現されるように構築した。正確に標的化されたＥＳ細胞系は、組み込まれたトランス遺伝子の５．９ｋｂ（プローブＡ；５’側）および１１．６ｋｂ（プローブＦ；３’側）のバンドを１５．６ｋｂの野生型バンド（プローブＡおよびＦ；両側）と共に示すＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析によって同定された。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
投与：本明細書において使用される場合、「投与」という用語は、対象または系への組成物の投与を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切な経路によるものであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、投与は、気管支（気管支点滴によるものを含む）、頬側、腸内、皮下（ｉｎｔｅｒｄｅｒｍａｌ）、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、心室内、特定の器官内（例えば、肝内）、粘膜、経鼻、口腔、直腸、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、舌下、局所、気管（気管内点滴によるものを含む）、経皮、膣、および硝子体であり得る。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍内または腫瘍周囲であり得る。いくつかの実施形態において、投与は、間欠投与を含み得る。いくつかの実施形態において、投与は、少なくとも選択された期間の連続投与（例えば、灌流）を含み得る。
【００１０】
養子細胞療法：本明細書において使用される場合、「養子細胞療法」または「ＡＣＴ」は、免疫細胞、例えばＴｒｅｇの対象への移入を含む。いくつかの実施形態において、ＡＣＴは、調節性Ｔ細胞活性を有するリンパ球の使用、これらの細胞のインビトロでの多数への増殖および対象への注入を含む処置アプローチである。
【００１１】
剤：「剤」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、ポリペプチド、核酸、単糖、脂質、低分子、金属、またはそれらの組み合わせを含む任意の化学分類の化合物または実体を指し得る。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態において、剤は、細胞もしくは生物、またはその画分、抽出物もしくは成分であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態において、剤は、自然界に存在しかつ／または自然界から得られるという点で天然産物であるか、またはその天然産物を含有する。いくつかの実施形態において、剤は、ヒトの手の作用を介して設計、操作、および／もしくは製造されかつ／または自然界に存在しないという点で人工である１つ以上の実体であるか、またはその実体を含有する。いくつかの実施形態において、剤は、単離したまたは純粋な形態で利用され得、いくつかの実施形態において、剤は、粗製形態で利用され得る。いくつかの実施形態において、コレクションまたはライブラリーとして候補の剤が提供され、例えば、候補の剤は、それらの中の活性剤を特定するかまたは特徴付けするためにスクリーニングされ得る。本発明に従って利用され得る剤の一部の特定の実施形態には、低分子、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム）、ペプチド、ペプチド模倣体などが含まれる。いくつかの実施形態において、剤は、ポリマーであるか、またはポリマーを含有する。いくつかの実施形態において、剤は、ポリマーではなく、および／またはポリマーを実質的に含まない。いくつかの実施形態において、剤は、少なくとも１つのポリマー部分を含有する。いくつかの実施形態において、剤は、ポリマー部分を欠いているか、またはポリマー部分を実質的に含まない。
【００１２】
向上：本明細書において使用される場合、「向上」は、状態の予防、減少、および／もしくは緩和、または対象の状態の改善を指す。向上は、疾患、障害、または状態の完全な回復または完全な予防を含むが、必須ではない。
【００１３】
アミノ酸：本明細書において使用される場合、「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり、いくつかの実施形態において、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに共通して見出される２０の標準的なｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されるかまたは天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）および／または置換を含むが、これらに限定されない、化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシおよび／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基および／またはペプチドの循環半減期を、その活性に悪影響を及ぼすことなく変化させることができる他の化学基による置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸は、１つ以上の化学的実体（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）に関するものなどの翻訳後修飾を含み得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と交換可能に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。用語が遊離アミノ酸を指すかまたはペプチド残基を指すかは、この用語が使用される文脈から明らかであろう。
【００１４】
抗体：本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原に特異的な結合を付与するのに十分な標準免疫グロブリン配列エレメントを含むポリペプチドを指す。当技術分野で知られているように、天然に産生される未損傷の抗体は、一般に「Ｙ字型」構造と称されるものに互いに会合する、２つの同一の重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０ｋＤ）と、２つの同一の軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）とから構成されるおよそ１５０ｋＤの四量体の剤である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各約１１０アミノ酸長）−アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの幹の基部に位置する）を含む。「スイッチ」として知られている短鎖領域は、重鎖可変領域および定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを抗体の残りに連結する。このヒンジ領域内の２つのジスルフィド結合は、２つの重鎖ポリペプチドを未損傷の抗体中で互いに連結する。各軽鎖は、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメイン、続いて別の「スイッチ」によって互いに分離されたカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインの２つのドメインからなる。未損傷の抗体四量体は、重鎖および軽鎖が単一のジスルフィド結合によって互いに連結されている２つの重鎖−軽鎖二量体から構成されており、２つの他のジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに連結して、二量体が互いに連結され、四量体が形成される。天然に産生された抗体も典型的にはＣＨ２ドメイン上にグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル中に互いに対向して充填された２つのβシート（例えば、３本鎖、４本鎖または５本鎖のシート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「相補決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループおよび４つのやや不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含有する。天然の抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域は、ドメインの構造的フレームワークを提供するベータシートを形成し、重鎖と軽鎖との両方からのＣＤＲループ領域は、三次元空間に集められ、それらは、Ｙ構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を生成する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、相補系のエレメントに、および例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含むエフェクター細胞上の受容体に結合する。当技術分野で知られているように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性および／または他の結合特性は、グリコシル化または他の修飾を介して調節することができる。いくつかの実施形態において、本開示に従って生成および／または利用される抗体には、修飾または操作されたそのようなグリコシル化を有するＦｃドメインを含むグリコシル化Ｆｃドメインが含まれる。本開示の目的のために、特定の実施形態において、天然抗体に見られるような十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが、天然に産生される（例えば、抗原に反応する生物によって生成される��ものであっても、組換え操作、化学合成、または他の人工システムもしくは方法論によって産生されるものであっても、「抗体」と称し得、かつ／または「抗体」として使用することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ポリクローナルであり、いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナルである。いくつかの実施形態において、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態において、抗体配列要素は、完全にヒトであるか、または当技術分野で公知であるように、ヒト化、霊長類化、キメラなどである。さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態において（別段の記載がない限りまたは文脈から明らかでない限り）、別の提示において抗体の構造的および機能的特徴を利用するための、当技術分野で知られているまたは開発された構築物またはフォーマットのいずれかを指し得る。例えば、いくつかの実施形態において、本開示に従って利用される抗体は、未損傷のＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭ、二重または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、一本鎖Ｆｖｓ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、カメロイド抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ（「ＳＭＩＰ  ＴＭ」）、単鎖またはタンデム二重特異性抗体（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、低分子抗体、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、およびＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットであるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、抗体は、自然に産生された場合に有するであろう共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）を欠き得る。いくつかの実施形態において、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード（例えば、検出可能部分、治療部分、触媒的部分など）、または他のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコールなど））を含有し得る。
【００１５】
抗原：「抗原」という用語は、本明細書において使用される場合、免疫応答を誘発する剤、および／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示される場合）または抗体もしくは抗体フラグメントに結合する剤を指す。いくつかの実施形態において、抗原は、体液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発する。いくつかの実施形態において、抗原は、細胞応答（例えば、その受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞に関与する）を誘発する。いくつかの実施形態において、抗原は、抗体に結合し、生物において特定の生理学的応答を誘発してもしなくてもよい。一般に、抗原は、例えば、小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ポリマー（いくつかの実施形態において、生物ポリマー以外（例えば、核酸またはアミノ酸ポリマー以外）のもの）などの化学実体であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、抗原は、ポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、抗原は、グリカンであるか、またはグリカンを含む。当業者であれば、一般に、抗原は、単離されたもしくは純粋な形態で提供され得るか、または代替的に粗製形態（例えば、他の物質と共に、例えば細胞抽出物もしくは他の比較的粗製の抗原含有源の調製物などの抽出物中）で提供され得るか、または代替的に細胞上もしくは細胞内に存在し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、抗原は、組換え抗原である。
【００１６】
抗原提示細胞：「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という表現は、本明細書において使用される場合、抗原をプロセシングしてＴ細胞に提示する細胞を指す、その技術的に理解された意味を有する。例示的なＡＰＣには、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、特定の活性化上皮細胞、およびＴＣＲ刺激および適切なＴ細胞共刺激が可能な他の細胞タイプが含まれる。
【００１７】
およそまたは約：本明細書において使用される場合、目的の１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記載された参照値に類似する値を指す。ある実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、他に明記されていない限りまたは文脈から他に明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記載された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたはより小さい）に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に入る値の範囲を指す。
【００１８】
結合：「結合」という用語は、本明細書において使用される場合、典型的には、２つ以上の実体間またはその中の非共有結合を指すと理解される。「直接的」結合は、実体または部分間の物理的接触を含み、間接的結合は、１つ以上の中間実体との物理的接触を介した物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、典型的には、相互作用する実体または部分は、単独でまたはより複雑な系に関連して（例えば、担体実体と共におよび／または生物学的系もしくは細胞内において、共有結合的またはその他の方法で会合する際に）研究される場合を含む様々な文脈のいずれかにおいて評価され得る。
【００１９】
キメラ抗原受容体：本明細書において使用される場合、「キメラ抗原受容体」、または「ＣＡＲ」、または「ＣＡＲｓ」は、操作された受容体を指し、これは、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、中心記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞またはそれらの組み合わせなどのＴ細胞）にグラフトする。ＣＡＲは、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体としても知られている。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、抗原特異的標的化領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含む。
【００２０】
同等：本明細書において使用される場合、「同等」という用語は、互いに同一でなくてもよいが、それらを比較することのできる充分な類似性があり、それにより、当業者が観察された差異または類似性に基づき合理的に結論を下すことができると理解するであろう２つ以上の剤、実体、状況、条件のセットなどを指す。いくつかの実施形態において、条件、状況、個体、または集団と同等のセットは、複数の実質的に同一の特性および１つまたは少数の様々な特性によって特徴付けられる。当業者であれば、文脈において、２つ以上のこのような剤、実体、状況、条件のセットなどが任意の所与の環境下で同等とみなされるには、どの程度の同一性が必要とされるかを理解するであろう。例えば、当業者であれば、得られた結果または異なる状況、個体もしくは集団の下であるいはそれらと共に観察される現象の差異がそれらの異なる特性の変化によって引き起こされるかまたはそれを示すという妥当な結論を保証するのに十分な数およびタイプの実質的に同一の特性によって特徴付けられる場合、一連の環境、個体、または集団が互いに同等であることを理解するであろう。
【００２１】
構成的に活性：本明細書において使用される場合、「構成的に活性」という用語は、同等な条件下での適切な基準と比較して、上昇したおよび／または時間的に一貫した活性の状態を指す。特定の実施形態において、「構成的に活性な」状態は、一貫して検出可能なレベルの活性、例えば特定の閾値レベルを超えるものによって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、「構成的に活性な」状態は、目的の剤（例えば、目的のタンパク質、および／または目的のタンパク質をコードする核酸）の活性型の存在によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、「構成的に活性な」状態は、産生レベルの上昇および／または一貫性、破壊（例えば、分解）レベルの阻害および／または不定、改変されたレベルおよび／または修飾のタイミング（例えば、目的の剤の活性型を生成または破壊するための）などの１つ以上を通して達成され得る。
【００２２】
剤形：本明細書において使用される場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、処置される患者のための治療剤の物理的に別個の単位を指す。各ユニットは、所望の治療効果を産生するように計算された所定量の活性物質を含有する。しかし、組成物の総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。
【００２３】
投与レジメン：本明細書において使用される場合、「投与レジメン」という用語は、典型的には時間間隔で分離された、対象に個別に投与される単位用量のセット（典型的には２つ以上）を指す。いくつかの実施形態において、所与の治療剤は、１回以上の投与を含む推奨投与レジメンを有する。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、それぞれが同じ長さの期間によって互いに分離された複数回の投与を含み、いくつかの実施形態において、投与レジメンは、複数回の投与および個別の投与を分離する少なくとも２つの異なる期間を含む。いくつかの実施形態において、投与レジメン内のすべての用量は、同じ単位用量である。いくつかの実施形態において、投与レジメン内の異なる投与は、異なる用量の投与である。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、第１の用量での第１の投与、続いて第１の用量と異なる第２の用量での１回以上のさらなる投与を含む。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、第１の用量での第１の投与、続いて第１の用量と同じ第２の用量での１回以上のさらなる投与を含む。いくつかの実施形態において、投与レジメンは、関連集団にわたって投与される場合、所望のまたは有益な結果と相関する（すなわち治療的投与レジメンである）。
【００２４】
操作された：当業者であれば、本開示を読むことで、「操作された」という用語は、本明細書において使用される場合、人間の手によって操作され改変された態様を指すことを理解するであろう。特に、「操作された細胞」という用語は、操作に供され、その結果、その遺伝的、エピジェネティックな、および／または表現型の同一性が、そのように操作されていないこと以外には同一の細胞などの適切な参照細胞に対して改変された細胞を指す。いくつかの実施形態において、操作は、遺伝子操作であるか、または遺伝子操作を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子操作は、以下の１つ以上であるかまたはそれを含む：（ｉ）操作前に細胞内に存在しない核酸（すなわち異種核酸）の導入、（ｉｉ）操作前に細胞内に存在する核酸またはその一部の除去、および／または（ｉｉｉ）操作前に細胞内に存在する核酸またはその一部の改変（例えば、配列置換による）。いくつかの実施形態において、遺伝子操作され、いくつかの実施形態において、操作された細胞は、目的の特定の剤（例えば、タンパク質、核酸および／またはその特定の形態）を、変化した量でおよび／またはそのような適切な参照細胞に対し変化したタイミングに応じて含有および／または発現するように操作された細胞である。当業者は、本明細書中の「操作された細胞」への言及は、いくつかの実施形態において、操作が適用された特定の細胞およびそのような細胞の任意の子孫の両方を包含し得ることを理解するであろう。
【００２５】
発現：本明細書において使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からの（例えば、転写による）ＲＮＡ鋳型の産生、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端形成などによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、および／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【００２６】
融合タンパク質：本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、一般に、それぞれが（１）天然に存在し、かつ／または（２）ポリペプチドの機能的ドメインを表す、ペプチド部分に対して高度のアミノ酸同一性をそのそれぞれが示す少なくとも２つのセグメントを含むポリペプチドを指す。典型的には、少なくとも２つのこのようなセグメントを含有するポリペプチドは、２つのセグメントが（１）天然に同じペプチド中に含まれず、かつ／または（２）以前に単一のポリペプチドにおいて互いに連結されておらず、かつ／または（３）ヒトの手の作用によって互いに連結されている部分である場合、融合タンパク質として認識される。
【００２７】
遺伝子：本明細書において使用される場合、「遺伝子」という用語は、当技術分野で理解される意味を有する。「遺伝子」という用語が遺伝子調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）および／またはイントロン配列を含み得ることは当業者に理解されるであろう。遺伝子の定義には、タンパク質をコードしないが、むしろｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導剤などの機能性ＲＮＡ分子をコードする核酸への言及が含まれることがさらに理解されるであろう。明確化のため、本出願で用いられるように、「遺伝子」という用語は、一般に、タンパク質をコードする核酸の部分を指し、文脈から当業者に明らかであるように、この用語は、任意選択で調節配列を包含し得る。この定義は、「遺伝子」という用語の非タンパク質コード発現単位への適用を排除することを意図するものではなく、むしろ、ほとんどの場合、本明細書において使用されるこの用語は、タンパク質をコードする核酸を指すことを明確にすることを意図したものである。
【００２８】
遺伝子産物または発現産物：本明細書において使用される場合、「遺伝子産物」または「発現産物」という用語は、一般に、遺伝子から転写されたＲＮＡ（プロセシング前および／またはプロセシング後）または遺伝子から転写されたＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前および／または修飾後）を指す。
【００２９】
異種：本明細書において使用される場合、「異種」という用語は、本明細書に記載されるような操作の結果として（すなわち文脈への操作の適用によって）特定の状況で存在する剤（例えば、核酸、タンパク質、細胞、組織など）を指す。ごく数例を挙げると、第１の細胞型において通常または天然に見出され、第２の細胞型に見出されない核酸またはタンパク質（例えば、細菌細胞に見出され、哺乳動物細胞に見出されない、第１の組織由来の細胞に見出され、第２の組織由来の細胞に見出されない、第１の微生物種の細胞に見出されるが、第２の微生物種の細胞に見出されない等）が第２の細胞型に対して「異種」であり得る。同様に、第１の生物において通常または天然に見出され、第２の生物に見出されない細胞または組織（例えば、げっ歯類に見出され、哺乳動物に見出されない等）が第２の生物に対して「異種」であり得る。当業者であれば、本明細書において使用される「異種」という用語の範囲および内容を理解するであろう。
【００３０】
免疫応答：本明細書において使用される場合、「免疫応答」という用語は、動物において誘発される応答を指す。いくつかの実施形態において、免疫応答は、細胞免疫、体液性免疫を指し得るか、または両方に関与し得る。いくつかの実施形態において、免疫応答は、免疫系の一部に限定され得る。例えば、特定の実施形態において、免疫応答は、増加したＩＦＮγ応答であり得るか、またはそれを含み得る。特定の実施形態において、免疫応答は、（例えば、鼻および／または直腸洗浄で測定されるような）粘膜ＩｇＡ応答であり得るか、またはそれを含み得る。特定の実施形態において、免疫応答は、全身的ＩｇＧ応答であり得るか、または全身的ＩｇＧ応答を含み得る（例えば、血清中で測定される場合）。特定の実施形態において、免疫応答は、中和抗体応答であり得るか、または中和抗体応答を含み得る。特定の実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞による細胞溶解（ＣＴＬ）応答であり得るか、またはそれを含み得る。特定の実施形態において、免疫応答は、免疫細胞活性の低下であり得るか、またはそれを含み得る。
【００３１】
改善、増加または低下：本明細書において使用される場合、「改善する」、「増加する」または「減少する」という用語または文法的均等物は、当業者に理解されるように、適切な参照測定値に関連する値を示す。ごく数例を挙げると、いくつかの実施形態において、特定の処置を受けた個体に関連するそのような用語の適用は、処置を受けていない同等の個体に対する、および／または処置の施行前の関連する個体自身に対する変更を示し得る。
【００３２】
個体、対象：本明細書において使用される場合、「対象」または「個体」という用語は、特定のヒトまたは非ヒト哺乳動物生物を指し、多くの実施形態において、この用語は、ヒトを指す。いくつかの実施形態において、「個体」または「対象」は、特定の年齢群のメンバーであり得る（例えば、胎児、乳児、小児、青年、成人、または高齢者であり得る）。いくつかの実施形態において、「個体」または「対象」は、特定の疾患、障害または状態に罹患し得、またはそれに感受性であり得る（すなわち「患者」であり得る）。
【００３３】
核酸：本明細書において使用される場合、「核酸」は、その最も広い意味において、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるかまたは組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるかまたは組み込まれ得る化合物および／または物質である。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態において、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含み、いくつかの実施形態において、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であるか、１つ以上の天然核酸残基を含有するか、または１つ以上の天然核酸残基からなる。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、１つ以上の核酸類似体を含有するか、または１つ以上の核酸類似体からなる。いくつかの実施形態において、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸と異なる。例えば、いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、またはそれからなる。ペプチド核酸は、当技術分野において公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内にあるとみなされる。代替的にまたはさらに、いくつかの実施形態において、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート結合および／または５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジンなど）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、挿入塩基、およびそれらの組み合わせ）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、核酸は、天然核酸のものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、天然源からの単離、相補性鋳型に基づいた重合による（インビボまたはインビトロの）酵素的合成、組換え細胞または組換え系での複製、および化学合成の１つ以上により調製される。いくつかの実施形態において、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基長である。いくつかの実施形態において、核酸は、一本鎖であり、いくつかの実施形態において、核酸は、二本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は、ポリペプチドをコードする要素を少なくとも１つ含むヌクレオチド配列を有しているか、またはポリペプチドをコードする配列の相補鎖である。いくつかの実施形態において、核酸は、酵素活性を有する。
【００３４】
操作可能に連結された：本明細書において使用される場合、「操作可能に連結された」とは、記載される構成要素が、それらの意図される様式でそれらが機能することが可能となる関係性にある並置を指す。コード配列に「操作可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、その制御配列に適合した条件下で達成されるようにライゲートされている。「操作可能に連結された」配列としては、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、およびトランス型でまたは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を含む。本明細書において使用される場合、「発現制御配列」という用語は、それらがライゲートされているコード配列の発現およびプロセシングを生じさせるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列、スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなどの効果的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を増強させる配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強させる配列、および必要に応じてタンパク質の分泌を増強させる配列が挙げられる。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、このような制御配列は、通常、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む一方、真核生物では、典型的には、このような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングに必須である構成要素を含むことが意図されており、およびまたその存在が有益であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列を含み得る。
【００３５】
患者：本明細書において使用される場合、「患者」という用語は、疾患、障害もしくは状態に罹患しているかもしくは感受性であり、かつ／または診断、予防および／もしくは治療レジメンの投与を受ける生物を指す。多くの実施形態において、患者は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態において、患者は、１つ以上の疾患、障害または状態と診断されている。いくつかの実施形態において、障害または状態は、癌または１つ以上の腫瘍の存在であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、患者は、診断、予防（すなわち１つ以上の症状の発症および／または頻度の遅延）および／または疾患、障害または状態の処置のための特定の療法を受けているか、または受けていた。
【００３６】
ペプチド：本明細書において使用される場合、「ペプチド」という用語は、典型的には比較的短い、例えば約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指す。
【００３７】
薬学的に許容される：本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なくヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した物質を指す。
【００３８】
タンパク質：本明細書において使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわちペプチド結合によって互いに連結された少なくとも２つのアミノ酸のストリング）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであり得る）を含み得、および／または他の方法で処理もしくは修飾され得る。当業者であれば、「タンパク質」は、細胞によって産生される完全ポリペプチド鎖（シグナル配列を有するかまたは有しない）であり得るか、またはその一部であり得ることを理解するであろう。当業者であれば、タンパク質が、例えば１つ以上のジスルフィド結合によって連結されるか、または他の手段によって会合される２つ以上のポリペプチド鎖を含むことがあることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはその両方を含有し得、当技術分野で公知の様々なアミノ酸修飾または類似体のいずれかを含有し得る。有用な修飾には、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが含まれる。いくつかの実施形態において、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、およびそれらの組み合わせを含み得る。
【００３９】
参照：本明細書において使用される場合、「参照」は、比較が行われる基準または対照を説明する。例えば、いくつかの実施形態において、目的の剤、動物、個体、集団、試料、配列または値は、参照または対照の剤、動物、個体、集団、試料、配列または値と比較される。いくつかの実施形態において、参照または対照は、目的の試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。いくつかの実施形態において、参照または対照は、任意選択により有形の媒体で具体化される履歴的な参照または対照である。典型的には、当業者に理解されるように、参照または対照は、評価下のものと比較可能な条件または状況下で決定されるかまたは特徴付けられる。当業者は、どのような場合に特定の可能な参照または対照への依存および／または比較を正当化するのに十分な類似性が存在するかを理解するであろう。
【００４０】
罹患している：疾患、障害または状態（例えば、癌）に「罹患している」個体は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状を有すると診断されたか、および／または１つ以上の症状を示す。
【００４１】
症状が軽減される：本発明によると、特定の疾患、障害または状態の１つ以上の症状が大きさ（例えば、強度、重症度など）または頻度において低減される場合、「症状が軽減される」。明確化のため、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度を減少させる１つの形態と認識される。本発明は、症状が消失した場合にのみ限定されることを意図したものではない。本発明は、１つ以上の症状が、完全には排除されないが、軽減される（かつそれにより対象の状態が「改善される」）ような処置を特に企図している。
【００４２】
Ｔ細胞受容体：「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、本明細書において、Ｔ細胞の表面に存在する抗原認識分子に関して、当技術分野における典型的な理解に従って使用される。正常Ｔ細胞発達中、４つのＴＣＲ遺伝子、α、β、γ、およびδの各々は、再配列することができ、それにより、特定の個体のＴ細胞は、典型的に、非常に多様なＴＣＲタンパク質集団を発現する。
【００４３】
治療剤：本明細書において使用される場合、「治療剤」という表現は、一般に、生物に投与された場合に所望の薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態において、薬剤は、適切な集団にわたって統計的に有意な効果を示す場合、治療剤であると考えられる。いくつかの実施形態において、適切な集団は、モデル生物の集団であり得る。いくつかの実施形態において、適切な集団は、特定の年齢群、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などの様々な基準によって定義され得る。いくつかの実施形態において、治療剤は、疾患、障害および／または状態の１つ以上の症状または特徴の軽減、改善、緩和、阻害、予防、発症の遅延、重症度の軽減、および／または発生率の低減に使用できる物質である。いくつかの実施形態において、「治療剤」は、ヒトへの投与のために市販され得る前に政府機関によって承認されているか、または承認される必要がある薬剤である。いくつかの実施形態において、「治療剤」は、ヒトへの投与のために医療処方が必要とされる薬剤である。
【００４４】
治療有効量：本明細書において使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療的投与レジメンに従って、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたは感受性である集団に投与した場合にその疾患、障害および／または状態を処置するのに十分な量を意味する。いくつかの実施形態において、治療有効量は、疾患、障害、および／もしくは状態の１つ以上の症状の発生および／または重篤度を低下させる、その１つ以上の特徴を安定化する、ならびに／またはその発症を遅延させる量である。当業者であれば、「治療有効量」という用語が、実際には、特定の個体における処置成功の達成を必要としないことを理解するであろう。むしろ、治療有効量は、このような処置の必要のある患者に投与された場合、有意な数の対象において特定の所望される薬理学的応答をもたらす量であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、「治療有効量」は、本発明の療法に関連して、それを必要とする個体に投与した場合、前記個体において生じている癌支持的プロセスを遮断、安定化、減弱もしくは逆転させ、または前記個体における癌抑制プロセスを強化もしくは増強する量を指す。癌処置に関連して、「治療有効量」は、癌と診断された個体に投与される場合、個体における癌のさらなる発達を予防、安定化、阻害または低減する量である。本明細書に記載の組成物の特に好ましい「治療有効量」は、膵臓癌などの悪性腫瘍の発達を（治療的処置において）逆転させるか、または悪性腫瘍の寛解を達成もしくは延長することを促進する。その個体における癌を処置するために個体に投与される治療有効量は、寛解を促進するためまたは転移を阻害するために投与される治療有効量と同じであるかまたは異なり得る。大部分の癌療法と同様に、本明細書に記載の治療方法は、癌の「治癒」として解釈されるべきではなく、これに制限されるべきではなく、またはその他の方法でこれに限定されるべきではなく、むしろ治療方法は、癌を「処置」するための、すなわち癌を有する個体の健康に望ましいまたは有益な変化をもたらすための記載された組成物の使用に関する。このような利益は、腫瘍学の分野における技能を有する医療提供者によって認識され、患者の状態の安定化、腫瘍サイズの縮小（腫瘍の退行）、生体機能の改善（例えば、癌性組織または器官の機能の改善）、さらなる転移の減少または阻害、日和見感染症の減少、生存率の増加、疼痛の減少、運動機能の改善、認知機能の改善、エネルギー感の改善（活力、倦怠感の減少）、幸福感の改善、正常な食欲の回復、健康な体重増加の回復、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。さらに、個体における特定の腫瘍の退行（例えば、本明細書に記載の治療の結果として）は、膵臓腺癌などの腫瘍の部位から癌細胞の試料を採取すること（例えば、治療過程にわたって）、および癌細胞のより悪性度の低い表現型への退行を分子レベルで検証するため、癌細胞の状態をモニターする代謝およびシグナリングマーカーのレベルについて癌細胞を試験することによっても評価され得る。例えば、本発明の方法を用いることによって誘導される腫瘍退行は、１つ以上の前血管新生マーカーの減少、抗血管新生マーカーの増加、癌と診断された個体において異常な活性を示す、代謝経路、細胞間シグナリング経路、または細胞内シグナリング経路の正常化（すなわち癌に罹患していない正常個体に見られる状態に向けての変化）を見出すことによって示され得る。当業者であれば、いくつかの実施形態において、治療有効量は、単回投与で製剤化および／または投与され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態において、治療有効量は、例えば投与レジメンの一部として複数の用量で製剤化および／または投与され得る。
【００４５】
形質転換：本明細書において使用される場合、「形質転換」は、外因性ＤＮＡが宿主細胞に導入される任意のプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を使用して天然または人工条件下で発生し得る。形質転換は、原核宿主細胞または真核宿主細胞への、外来核酸配列の挿入のための任意の公知の方法に依存し得る。いくつかの実施形態において、特定の形質転換法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、ウイルス感染、エレクトロポレーション、交配、リポフェクションを含み得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態において、「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自己複製プラスミドとしてまたは宿主染色体の一部として複製することができるという点で安定的に形質転換される。いくつかの実施形態において、形質転換された細胞は、限定された期間、導入された核酸を一過的に発現する。
【００４６】
処置：本明細書において使用される場合、「処置」（また、「処置する」または「処置すること」）という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態（例えば、癌）の１つ以上の症状、特徴、および／または原因を部分的または完全に軽減し、改善し、緩和し、阻害し、その発症を遅延させ、その重症度を軽減し、かつ／またはその発生率を低減する物質の任意の投与を指す。そのような処置は、関連する疾患、障害および／もしくは状態の兆候を示さない対象、ならびに／または疾患、障害および／もしくは状態の初期兆候のみを示す対象の処置であり得る。代替的にまたはさらに、そのような処置は、関連する疾患、障害および／または状態の１つ以上の確立された兆候を示す対象の処置であり得る。いくつかの実施形態において、処置は、関連する疾患、障害および／または状態に罹患していると診断された対象の処置であり得る。いくつかの実施形態において、処置は、関連する疾患、障害および／または状態の発症のリスクの増加と統計的に相関する、１つ以上の感受性因子を有することが知られている対象の処置であり得る。
【００４７】
本発明は、とりわけ、修飾された調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に関連する組成物および方法、ならびにそれらの様々な疾患、障害および状態の処置における使用を提供する。具体的には、本発明は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患の処置のための操作されたＴｒｅｇの使用を企図している。
【００４８】
調節性Ｔ細胞
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、恒常性を維持し、炎症応答の大きさおよび期間を制御し、自己免疫およびアレルギー反応を予防する上で重要である。
【００４９】
フォークヘッドボックスＰ３転写因子（Ｆｏｘｐ３）は、Ｔｒｅｇの分化および活性の重要な調節因子であることが示されている。実際、Ｆｏｘｐ３遺伝子の機能喪失突然変異は、致死的なＩＰＥＸ症候群（免疫調節不全、多発性内分泌障害、腸障害、Ｘ連鎖）につながることが示されている。ＩＰＥＸを有する患者は、重度の自己免疫応答、持続性湿疹、および大腸炎に罹患している。転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、腸における炎症応答を制限する上で重要な役割を果たす（Ｊｏｓｅｆｏｗｉｃｚ，Ｓ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，４８２，３９５−Ｕ１５１０）。
【００５０】
一般に、Ｔｒｅｇｓは、免疫応答を抑制することに主に関与していると考えられており、過剰な反応を防ぐために、一部には免疫系の「自己チェック」として機能する。特に、Ｔｒｅｇｓは、自己抗原、花粉または食物などの無害な物質に対する耐性を維持すること、および自己免疫疾患を抑止することに関与している。
【００５１】
Ｔｒｅｇは、腸、皮膚、肺、および肝臓を含むが、これらに限定されない体全体に見出される。さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、脾臓、リンパ節、さらには脂肪組織などの外部環境に直接曝されない体の特定の区画にも見出され得る。これらのＴｒｅｇ細胞集団の各々は、１つ以上のユニークな特徴を有することが知られているか、またはそれが疑われており、さらなる情報は、ＬｅｈｔｉｍａｋｉおよびＬａｈｅｓｍａａ，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅｉｒ  ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，２０１３，ＦＲＯＮＴＩＥＲＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬ．，４（２９４）：１−１０に見出され得、その開示が全体として本明細書に組み込まれる。
【００５２】
典型的には、Ｔｒｅｇｓは、適切な活性化および発達のためにＴＧＦ−βおよびＩＬ−２を必要とすることが知られている。豊富量のＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）を発現するＴｒｅｇｓは、活性化Ｔ細胞によって産生されるＩＬ−２に依存している。Ｔｒｅｇｓは、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの両方を産生することが知られており、これらは、いずれも強力な免疫抑制性サイトカインである。さらに、Ｔｒｅｇは、Ｔ細胞を刺激する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の能力を阻害することが知られている。ＡＰＣ阻害のための１つの提案される機構は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇによって発現されるＣＴＬＡ−４を介するものである。ＣＴＬＡ−４は、ＡＰＣ上のＢ７分子に結合し得、これらの分子をブロックするか、またはインターナリゼーションを引き起こすことによってそれらを除去し、それによりＢ７の利用可能性を低下させ、免疫応答に十分な共刺激が提供できなくなると考えられる。Ｔｒｅｇの起源、分化および機能に関するさらなる考察は、Ｄｈａｍｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｔｈｙｍｉｃ  Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ，ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，２０１３，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４（２５３）：１−１１に見出され得、その開示が全体として本明細書に組み込まれる。
【００５３】
ＳＴＡＴ
転写シグナルトランスデューサおよびアクチベータ（ＳＴＡＴ）タンパク質ファミリーのメンバーは、細胞免疫、増殖、アポトーシスおよび分化の多くの局面を媒介する細胞内転写因子である。それらは、膜受容体関連ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）によって主に活性化される。この経路の調節不全は、原発的腫瘍において多くの場合に観察され、血管新生の増加、腫瘍生存の増強および免疫抑制につながる。遺伝子ノックアウト研究は、ＳＴＡＴタンパク質が免疫系の発達および機能に関与し、免疫耐性および腫瘍監視を維持する役割を果たすという証拠を提供している。
【００５４】
同定された哺乳動物ＳＴＡＴファミリーメンバーは、７つ存在する：ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂを含む）およびＳＴＡＴ６。
【００５５】
サイトカインまたは成長因子の細胞外結合は、ＳＨ２ドメインを介した二量体化を促進するＳＴＡＴタンパク質内の特定のチロシン残基をリン酸化する受容体関連ヤヌスキナーゼの活性化を誘導する。次いで、リン酸化された二量体は、インポーチンα／β三元複合体を介して核に能動的に輸送される。元来、ＳＴＡＴタンパク質は、リン酸化が核内保持に必要とされると考えられていたため、潜在性の細胞質転写因子として説明されていた。しかし、非リン酸化ＳＴＡＴタンパク質も細胞質ゾルと核との間を行き来し、遺伝子発現において役割を果たす。ＳＴＡＴが核に到達すると、それは、サイトカイン誘導性遺伝子のプロモーター領域におけるガンマ活性化部位（ＧＡＳ）と呼ばれるＤＮＡ認識モチーフをコンセンサスに結合し、転写を活性化する。ＳＴＡＴタンパク質は、ＳＴＡＴの不活性化およびその後のエクスポーチン−ＲａｎＧＴＰ複合体による核からの輸送をもたらす、核ホスファターゼによって脱リン酸化され得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、その発現レベルまたは活性を調節する修飾を含むＳＴＡＴタンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、そのような修飾には、とりわけ、ＳＴＡＴ二量体化に影響を与える突然変異、シグナリングパートナーへのＳＴＡＴタンパク質結合、ＳＴＡＴタンパク質局在化またはＳＴＡＴタンパク質分解が含まれる。いくつかの実施形態において、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、構成的に活性である。いくつかの実施形態において、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、構成的二量体化により、構成的に活性である。いくつかの実施形態において、本開示のＳＴＡＴタンパク質は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＯｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｊｕｌｙ１９９８  ｖｏｌ．１８  ｎｏ．７  ３８７１−３８７９に記載される構成的リン酸化により、構成的に活性である。
【００５７】
細胞工学
細胞（例えば、哺乳動物細胞、特に哺乳動物Ｔｒｅｇ細胞）の操作に利用可能な多様な技術が当業者に知られている。例えば、そのような細胞における発現および／またはそのような細胞への組込みのために核酸を導入するための様々なシステムは、細胞のエピジェネティックな修飾を達成するための様々な戦略と同様に当技術分野において周知である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本開示による使用に適切な細胞操作技術は、１つ以上の異種核酸の細胞への導入であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、異種核酸を細胞に導入する技術には、とりわけ、トランスフェクション、ヌクレオフェクションを含むエレクトロポレーション、および形質導入が含まれる。異種核酸の導入のための様々なベクター系が当技術分野で公知であり、これは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、およびウイルス系（例えば、アデノウイルスおよびレンチウイルス）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本開示による使用に適切な細胞工学技術は、１つ以上の異種タンパク質の細胞への導入であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、異種タンパク質を細胞に導入する技術には、とりわけ、トランスフェクション、細胞透過性ペプチド（例えば、ＴＡＴ）による形質導入、およびナノ粒子送達が含まれる。
【００６０】
一般に、細胞は、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質を発現するように（すなわちＳＴＡＴタンパク質の活性型のレベルおよび／または活性が構成的に細胞内に存在するように）本明細書に記載のように操作され得る。当業者であれば、様々な操作戦略がそのような構成的に活性な発現を達成し得ることを理解するであろう。例えば、ごく数例を挙げると、いくつかの実施形態において、ＳＴＡＴタンパク質変異体が導入され得、ＳＴＡＴの発現を誘導するタンパク質が導入され得、ＳＴＡＴタンパク質の安定性を増加させるタンパク質が導入され得、ＳＴＡＴの分解を低減するタンパク質が導入され得る。
【００６１】
いくつかの実施形態において、導入される核酸は、ＳＴＡＴタンパク質の一部または全部をコードする核酸をコードする配列またはそれに相補的である配列であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、導入される核酸は、構成的に発現されるＳＴＡＴタンパク質の一部または全部をコードする核酸をコードするか、またはそれに相補的な配列であり得るか、またはそれを含み得る。
【００６２】
いくつかの実施形態において、導入される核酸は、ＳＴＡＴタンパク質の一部または全部をコードする核酸、またはそれをコードする核酸に相補的な核酸の発現を調節する、細胞内で機能する調節配列であり得るか、またはそれを含み得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、導入される核酸は、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質をコードする核酸をコードする配列またはそれに相補的である配列であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態において、導入されるタンパク質は、構成的に活性なＳＴＡＴタンパク質であり得るか、またはそれを含み得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、対象自身の細胞または自家細胞の使用に関する。いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、異種細胞の使用に関する。
【００６５】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）は、開発中の操作されたＴ細胞を使用する処置方法の１つである。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、外因性抗原受容体を発現するように操作されたＴ細胞である。このような抗原受容体は、異なるタンパク質由来のドメインから構成されているため、キメラと呼ばれる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの部分は、とりわけ、抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含み得る。
【００６６】
疾患指向型の細胞操作およびＣＡＲ−Ｔ細胞の開発における努力の多くは、腫瘍または感染細胞の破壊に焦点が当てられており、当技術分野における主な焦点は、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）の修飾に関するものであった。ＣＡＲ−Ｔ細胞による現在の養子細胞療法レジメンは、ＣＡＲ−Ｔ細胞とＩＬ−２との共投与を含むことを当業者は認識している。
【００６７】
対照的に、本開示の方法および組成物は、ＩＬ−２との共投与を必要としない養子細胞療法レジメンを企図している。代替的に、本開示の方法および組成物は、ＩＬ−２との共投与を伴う養子細胞療法レジメンを企図する。本開示の方法および組成物は、様々な疾患、障害および状態の処置のためのＴｒｅｇ細胞の操作に関連する。
【００６８】
疾患、障害、および状態
いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、とりわけ、炎症によって特徴付けられる疾患、障害または状態の処置に関連する。いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、とりわけ、自己免疫によって特徴付けられる疾患、障害または状態の処置に関連する。いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、胃腸管に影響を及ぼす炎症および／または自己免疫障害の処置に関連する。いくつかの実施形態において、本開示の方法および組成物は、神経系に影響を及ぼす炎症および／または自己免疫障害の処置に関連する。
【００６９】
炎症
炎症は、本明細書において使用される場合、傷害、刺激または感染に対する血管組織の局所的な防御反応を指す。炎症症状は、発赤、腫脹、疼痛および機能喪失の１つ以上の症状によって特徴付けられる。炎症は、有害な刺激を除去し、治癒プロセスを開始する、生物による防御的試みである。感染は、微生物によって引き起こされるが、炎症は、病原体に対する生物の応答の１つである。
【００７０】
炎症は、急性または慢性のいずれかに分類することができる。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の最初の応答であり、血漿および白血球（特に顆粒球）の血液から損傷組織への増加した動きによって達成される。一連の生化学的事象は、傷害組織内の局所血管系、免疫系および種々の細胞を含む炎症応答を伝播および成熟させる。慢性炎症として知られている長期炎症は、炎症部位に存在する細胞のタイプの進行的な変化をもたらし、炎症プロセスからの組織の同時破壊および治癒によって特徴付けられる。
【００７１】
炎症は、多くの剤によって引き起こされ得、感染性病原体、毒素、化学的刺激物、物理的傷害、過敏性免疫反応、放射線、外来性刺激物（汚れ、破片など）、凍傷および火傷を含む。移植されたまたは輸血された組織、器官または血液製剤はまた、とりわけ、外来刺激物という広いカテゴリーに含まれ得る。移植片対宿主疾患は、移植されたまたは輸血された組織、器官または血液製剤からの炎症に起因する疾患、障害または状態の一例である。炎症の種類には、大腸炎、滑液包炎、虫垂炎、皮膚炎、膀胱炎、鼻炎、腱炎、扁桃炎、脈管炎および静脈炎が含まれる。
【００７２】
自己免疫
自己免疫は、自己反応性免疫応答（例えば、自己抗体、自己反応性Ｔ細胞）の存在を指す。自己免疫疾患、障害、または状態は、体内に通常存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答から生じる損傷または病理学的状態による自己免疫から生じる。自己免疫の結果としての損傷または病態は、とりわけ、組織の損傷または破壊、器官の成長の変化、および／または器官機能の変化として現れ得る。
【００７３】
自己免疫疾患、障害または状態のタイプには、Ｉ型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭動脈炎、慢性関節リウマチ、狼瘡、セリアック病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛および多発性硬化症が含まれる。
【００７４】
投与
本開示の特定の実施形態は、操作された調節性Ｔ細胞の対象への投与、または操作された調節性Ｔ細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、調節性Ｔ細胞を対象から得て、本明細書に記載のように修飾して、操作された調節性Ｔ細胞を得る。したがって、いくつかの実施形態において、操作された調節性Ｔ細胞は、免疫細胞が得られたのと同じ対象に投与される自己細胞を含む。代替的に、免疫細胞を対象から得て、本明細書に記載のように形質転換、例えば形質導入して、別の対象に同種異系的に移入された操作された調節性Ｔ細胞を得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示による使用のための調節性Ｔ細胞は、免疫細胞を含む対象から試料を採取することと、試料から調節性Ｔ細胞を単離することとによって得られる。いくつかの実施形態において、本開示による使用のための調節性Ｔ細胞は、免疫細胞を含む対象から試料を採取することと、調節性Ｔ細胞のインビトロでの生成における使用のために免疫細胞亜集団（例えば、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞など）を単離することとによって得られる。いくつかの実施形態において、本開示による使用のための調節性Ｔ細胞は、免疫細胞を含む対象から試料を採取することと、調節性Ｔ細胞のインビトロでの生成における使用のためにナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離することとによって得られる。いくつかの実施形態において、本開示による使用のための調節性Ｔ細胞は、免疫細胞を含む対象から試料を採取することと、調節性Ｔ細胞のインビトロでの生成における使用のためにナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することとによって得られる。
【００７６】
調節性Ｔ細胞のインビトロでの生成に利用可能な多様な技術が当業者に知られている。例えば、ＴＧＦ−βの存在下でのプレート結合抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８による単離された免疫細胞の活性化である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、操作された調節性Ｔ細胞は、対象に対して自己由来であり、対象は、対象から免疫細胞を単離する前に免疫学的にナイーブであるか、免疫化されるか、疾患に罹患しているか、または他の状態であり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、操作された調節性Ｔ細胞を対象に投与する前にさらなる工程を実施することができる。例えば、操作された調節性Ｔ細胞は、修飾、例えばキメラ抗原受容体および／または修飾ＳＴＡＴタンパク質の導入後であるが、対象への投与前にインビトロで増殖させることができる。インビトロでの増殖は、対象への投与前に１日以上、例えば２日以上、３日以上、４日以上、６日以上、または８日以上進めることができる。代替的にまたはさらに、対象への投与前に２１日間以下、例えば１８日間以下、１６日間以下、１４日間以下、１０日間以下、７日間以下または５日間以下だけインビトロでの増殖を進めることができる。例えば、対象への投与前に１〜７日間、２〜１０日間、３〜５日間、または８〜１４日間だけインビトロで増殖を進めることができる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、インビトロでの増殖中、操作された調節性Ｔ細胞を抗原（例えば、ＴＣＲ抗原）で刺激することができる。抗原特異的増殖は、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗Ｔａｃ抗体、抗ＣＤ２８抗体、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などのリンパ球増殖を非特異的に刺激する条件下での増殖を任意選択により増強することができる。増殖した操作された調節性Ｔ細胞は、対象に直接投与され得るか、または将来の使用のために、すなわち対象へのその後の投与のために凍結され得る。
【００８０】
特定の実施形態において、操作された調節性Ｔ細胞は、別の治療剤の投与前に、実質的に同時に、またはその後に投与される。本明細書に記載の操作された調節性Ｔ細胞は、組成物、例えば操作された調節性Ｔ細胞および薬学的に許容される担体として形成され得る。特定の実施形態において、組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つの操作された調節性Ｔ細胞、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物である。本明細書に記載される薬学的に許容される担体、例えばビヒクル、アジュバント、賦形剤および希釈剤は、周知であり、当業者にとって容易に利用可能である。好ましくは、薬学的に許容される担体は、活性剤、例えば操作された調節性Ｔ細胞に対して化学的に不活性であり、使用条件下でいかなる有害な副作用または毒性も誘発しない。
【００８１】
組成物は、例えば、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外および／または皮下投与経路などの任意の適切な経路による投与のために製剤化することができる。好ましくは、組成物は、非経口投与経路のために製剤化される。
【００８２】
非経口投与に適した組成物は、水性または非水性の等張滅菌注射溶液であり得、これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および溶質（例えば、組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にするもの）を含有し得る。水性または非水性滅菌懸濁液は、１種以上の懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および保存剤を含有し得る。
【００８３】
対象、特にヒトに投与される投与量は、特定の実施形態、使用される組成物、投与方法、ならびに処置される特定部位および対象によって変化する。しかしながら、用量は、治療応答を提供するのに十分であるべきである。当技術分野の臨床医は、特定の医学的状態を処置または予防するために、ヒトまたは他の対象に投与される組成物の治療有効量を決定することができる。治療的に有効であるために必要とされる組成物の正確な量は、当業者の考慮事項内である多くの対象特異的な考慮事項に加えて、例えば操作された調節性Ｔ細胞の特異的活性および投与経路などの多数の因子に依存する。
【００８４】
任意の適切な数の操作された調節性Ｔ細胞を対象に投与することができる。本明細書中に記載される単一の操作された調節性Ｔ細胞は、いくつかの実施形態において、治療利益を拡大して提供することができる一方、１０２以上、例えば１０３以上、１０４以上、１０５以上、または１０８以上の操作された調節性Ｔ細が投与される。代替的にまたはさらに、１０１２以下、例えば１０１１以下、１０９以下、１０７以下、または１０５以下の本明細書に記載の操作された調節性Ｔ細胞が対象に投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の１０２〜１０５、１０４〜１０７、１０３〜１０９、または１０５〜１０１０の操作された調節性Ｔ細胞が投与される。
【００８５】
本明細書に記載の操作された調節性Ｔ細胞の用量は、１回または適切な期間にわたり、例えば適切な期間、例えば必要に応じて毎日、半週、１週、２週、半月、２ヶ月、半年または１年ベースで投与される一連の副用量で哺乳動物に投与することができる。有効量の操作された調節性Ｔ細胞を含む投与単位は、単回の１日用量で投与され得、または必要に応じて、１日の全投与量は、２回、３回、４回またはそれを超えて、１日に投与される用量を分割した用量で投与され得る。
【００８６】
投与経路は、非経口、例えば注射による投与、経鼻投与、経肺投与、または経皮投与であり得る。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身投与または局所投与であり得る。
【実施例】
【００８７】
実施例１：材料および方法
本実施例には、実施例２で使用した材料および方法を記載する。
【００８８】
マウス。
Ｆｏｘｐ３ＣｒｅおよびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスは、以前に記載されていた１６、４３。Ｉｌ２ｒａｆｌマウスは、親切にもＢｉｏｇｅｎから寄贈された。Ｓｔａｔ５ａ／ｂｆｌマウスは、Ｌｏｔｈａｒ  Ｈｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ（ＮＩＨ）によって提供された。ＡｐｃＭｉｎマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｉｌ２ｒｂｆｌ（Ｕｌｆ  Ｋｌｅｉｎにより生成された）およびＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡアレルの標的化戦略を図１５および１６に示す。ＲＯＳＡ２６遺伝子座のための標的化ベクターの骨格は、Ｋｌａｕｓ  Ｒａｊｅｗｓｋｙ博士（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）によって提供された。マウスＳＴＡＴ５ｂＣＡをコードするベクターは、Ｔｏｓｈｉｏ  Ｋｉｔａｍｕｒａ博士（東京大学）によって提供された。Ｔｃｒａｆｌマウスは以前に記載されている３４。実験用マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）バックグラウンド上に生成されたか、戻し交雑され、繁殖され、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒの特定病原体の存在しない動物施設に収容され、施設ガイドラインに従って使用された。生存分析のためにマウスを毎日モニターし、不健康なマウスは、無気力状態にあることが見られ、非生存として計数されると、安楽死させた。タモキシフェン処置のために、タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を４０ｍｇ／ｍｌの濃度でオリーブ油に溶解した。マウスには、１処置あたり１００μｌのタモキシフェンエマルジョンを強制経口投与した。ＥＡＥおよび感染実験では、単回のタモキシフェン強制経口投与の２〜３ヶ月後にマウスに抗原投与し、以前に記載されるように評価した３７。
【００８９】
フローサイトメトリーおよび細胞選別。
細胞を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、またはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した蛍光標識抗体で染色し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いて分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてフローサイトメトリーデータを分析した。細胞内サイトカイン染色のために細胞をブレフェルジンＡまたはモネンシンの存在下でＣＤ３およびＣＤ２８抗体（それぞれ５μｇ／ｍｌ）で５時間刺激し、回収し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎキットで染色した。細胞内チロシンリン酸化ＳＴＡＴ５染色のために、細胞を、ｒｍＩＬ−２を伴ってまたは伴わずに２０分間刺激し、４％ＰＦＡ、続いて９０％メタノールで固定し、透過性にし、抗ＰＹ−ＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。Ｆｏｘｐ３＋およびＦｏｘｐ３−細胞の細胞選別は、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ細胞ソーターを用いたＹＦＰまたはＧＦＰ発現に基づいて行った。フローサイトメトリーには以下のモノクローナル抗体を使用した：Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＣＤ１２２（５Ｈ４）、ＣＤ１２７（Ａ７Ｒ３４）、ＣＤ１３２（ＴＵＧｍ２）、ＣＤ２５（ＰＣ６１）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、ＣＤ８（５Ｈ１０）、ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｂ９）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）、ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）、Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）、ＩＬ−１３（ｅＢｉｏ１３Ａ）、ＩＬ−１７（ｅＢｉｏ１７Ｂ７）、ＩＬ−４（１１Ｂ１１）、Ｋｉ−６７（Ｂ５６）、ＫＬＲＧ１（２Ｆ１）、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＰＹ−ＳＴＡＴ５（４７／Ｓｔａｔ５／ｐＹ６９４）、ＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）、ＴＮＦα（ＭＰ６−ＸＴ２２）、Ｖβ１０ｂ（Ｂ２１．５）、Ｖβ１１（ＲＲ３−１５）、Ｖβ１２（ＭＲ１１−１）、Ｖβ１３（ＭＲ１２−３）、Ｖβ１４（１４−２）、Ｖβ２（Ｂ２０．６）、Ｖβ３（ＫＪ２５）、Ｖβ４（ＫＴ４）、Ｖβ５．１／５．２（ＭＲ９−４）、Ｖβ６（ＲＲ４−７）、Ｖβ７（ＴＲ３１０）、Ｖβ８．１／８．２（ＭＲ５−２）、Ｖβ８．３（１Ｂ３．３）、Ｖβ９（ＭＲ１０−２）。
【００９０】
リステリアおよびワクシニア感染。
マウスに対し、０日目にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＬＭ１０４０３Ｓ；２０００細胞／マウス）を尾静脈に静脈注射し、８日目に分析した。リステリア特異的免疫応答の検出のために、ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて選別した未抗原投与Ｂ６マウス由来の脾臓ＤＣを、９６ウェルＵ底プレート（２×１０４細胞／ウェル）で加熱死滅化したリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（２×１０７細胞／ウェル）と共に６時間培養した。次いで、ブレフェルジンＡの存在下において、リステリア感染マウス（１×１０５細胞／ウェル）から得た脾臓Ｔ細胞と共に細胞を５時間共培養し、サイトカイン産生Ｔ細胞をフローサイトメトリーで検出した。ワクシニアウイルス感染のために０日目にマウスに非複製ウイルス（５×１０７ＰＦＵ／マウス）を腹腔内注射し、８日目に分析した。脾細胞をいくつかのワクシニアウイルス由来抗原ペプチド（１μｇ／ｍｌ）で５時間にわたりブレフェルジンＡの存在下で再刺激し、サイトカイン産生Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって検出した。
【００９１】
インビボでのＩＬ−２中和。
マウスに対し、２つの異なる抗ＩＬ−２モノクローナル抗体ＪＥＳ６−１およびＳ４Ｂ６−１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）のカクテル、またはアイソタイプ適合対照抗体（ラットＩｇＧ２ａ、２Ａ３；ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、出生後７日から開始して週に２回、各２００μｇ、ｉ．ｐ．注射した。
【００９２】
Ｔ細胞のＴＡＴ−Ｃｒｅタンパク質処置。
非Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現の誘導のために、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスのＬＮおよび脾臓から選別した１×１０７個のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−またはＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を、ＴＡＴ−Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；５０μｇ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの無血清ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、３７℃で４５分間インキュベートした。細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、Ｔ細胞欠損（Ｔｃｒｂ−／−Ｔｃｒｄ−／−）マウスに対し、インビボ抑制アッセイについて別個に選別されたＴｒｅｇ細胞を伴ってまたは伴わずに注射した。
【００９３】
インビトロでのＩＬ−２捕捉アッセイ。
ＬＮおよび脾臓由来のプールされた細胞は、パニングによってＢ細胞およびアクセサリー細胞を枯渇させ、Ｔ細胞を強化した。細胞を抗ＣＤ８および抗Ｂ２２０抗体で染色し、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞をＣＤ８陰性集団においてＧＦＰ（ＹＦＰ）発現のみに基づいて選別した。選別した細胞を、漸増用量の組換えヒトＩＬ−２（０．０１６〜１２Ｕ／ｍｌ）を伴ってまたは伴わず、２５μｌのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ）中の９６ウェルＶ底プレート（２×１０５細胞／ウェル）の８ウェルに分割し、続いて３７℃で２時間インキュベートした。培地からのＩＬ−２の枯渇を、ＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  ＡｒｒａｙおよびＨｕｍａｎ  ＩＬ−２  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔを用いて、製造業者（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の指示に従って評価した。
【００９４】
インビトロでのＴ−ＤＣ結合アッセイ。
Ｔｒｅｇ細胞および非Ｔｒｅｇ細胞をＩＬ−２捕捉アッセイと同じ方法で選別した。Ｆｌｔ３Ｌ分泌Ｂ１６メラノーマ細胞を注射したＢ６マウス由来のＭＡＣＳにより、脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを単離した。Ｔｒｅｇおよび非Ｔｒｅｇ細胞をＣＦＳＥで染色した。ＤＣをＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。１×１０４個のＴｒｅｇまたは非Ｔｒｅｇ細胞を、ｒｍＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下または非存在下において、９６ウェル丸底プレート中、類別された数のＤＣ（１×１０４〜１×１０５）と共に７２０分間培養した。ＤＣと結合したＴｒｅｇ細胞の頻度（％ＣＴＶ＋ＣＦＳＥ＋／ＣＦＳＥ＋）をＦＡＣＳにより分析した。
【００９５】
インビトロでの抑制アッセイ。
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（応答細胞）およびＴｒｅｇ細胞をＦＡＣＳ精製し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色した。４×１０４ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、照射、Ｔ細胞枯渇、ＣＦＳＥ染色された１×１０５個の脾臓細胞および１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体の存在下において、９６丸底プレート中、類別された数のＴｒｅｇ細胞と共に８０時間にわたり培養した。応答Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞（生ＣＦＳＥ−ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＦｏｘｐ３＋）の細胞増殖をゲート細胞のＣＴＶの蛍光強度の希釈に基づいてフローサイトメトリーによって決定した。
【００９６】
血清および糞便免疫グロブリンレベルの測定。
血清ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３およびＩｇＡレベルを、ＳＢＡ  Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたＥＬＩＳＡによって決定した。ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡは、ビオチン化抗ＩｇＥ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＨＲＰ結合ストレプトアビジンを用いて行った。糞便ＩｇＡレベルの測定のために新鮮な糞便ペレットを回収し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ；Ｒｏｃｈｅ）を含有する抽出緩衝液（ペレット１ｍｇあたり７μｌ）中に溶解した。遠心分離後に上清を集め、滴定し、ＩｇＡレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【００９７】
動物実験の統計解析
統計的分析は、両側非対比スチューデントｔ検定でＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて行った。ウェルチ補正は、Ｆ検定が陽性であった場合に適用された。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意でない。
【００９８】
ＲＮＡ配列決定。
雄の８週齢のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡ（ＳＴＡＴ５ｂＣＡ）マウスおよびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（対照）マウス、１実験群あたり９匹のマウスに対し、強制経口投与によりタモキシフェンを単回投与（４ｍｇ）した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ細胞ソーターを用いて、脾臓ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３（ＹＦＰ／ＧＦＰ）＋ＧＩＴＲｈｉＣＤ２５ｈｉ  ＴｒｅｇおよびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３（ＹＦＰ／ＧＦＰ）−ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏナイーブＴ細胞を二重選別し、合計１２の試料を生成した。同じ実験群の３匹の個々のマウスから単離した脾臓Ｔ細胞サブセットを１つの生物学的複製物にプールし、３つの生物学的複製物を各実験群についてＲＮＡ−ｓｅｑ分析に供した。全ＲＮＡを抽出し、ポリ（Ａ）の選択、および製造業者のプロトコルに従ったＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑペアエンドライブラリー調製に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００上で１試料あたり２７５０万の５０ｂｐの読み取りペアの平均深度まで試料を配列決定した。すべての試料を同時に処理し、バッチ効果を避けるために同じレーン上で配列決定した。
【００９９】
読み取りアライメントおよびプロセシングは、以前に記載された方法に従った４５。簡潔には、未処理の読み取りは、標準設定のＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ  ｖ０．３２を使用してトリミングされ、低品質の読み取りおよびアダプタ汚染が除去された４６。次に、デフォルト設定でＢｏｗｔｉｅ２  ｖ２．２．２を実装しているＴｏｐＨａｔ２  ｖ２．０．１１を使用して、トリムされた読み取りをマウスゲノム（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＧＲＣｍ３８）にアラインした。読み取りアライメントは、ＨＴＳｅｑ  ｖ０．６．１ｐ１を使用してゲノムの特徴に計数される前にＳＡＭｔｏｏｌｓ  ｖ０．１．１９で選別された。全試料にわたる全体的な読み取りアライメント率は、７４．５％であった。差次的遺伝子発現は、Ｒバージョン３．１．０４７のＤＥＳｅｑ２  １．６．３を用いて解析した。
【０１００】
ＲＮＡ−ｓｅｑのバイオインフォマティクス分析
全遺伝子にわたる読み取りカウントの分布は、二峰性であった。これが「発現した」および「発現していない」遺伝子に対応するという仮定は、ＴｒｅｇおよびＴナイーブ細胞において発現されるかまたは発現されないことが知られているマーカー遺伝子の検査によって支持された。２つのピーク間の極小値は、発現の閾値となるように選択した。約６０の正規化された読み込みのこの閾値を使用して、３９，１７９の遺伝子のうち１０，５８９が存在するとされた。ＳＴＡＴ５ｂＣＡ対対照Ｔｒｅｇ細胞間で有意に上方（３４２遺伝子）および下方調節（３１４）された遺伝子は、それぞれ少なくとも１．５倍または０．６７倍の倍数変化を有する発現遺伝子として定義され、ＦＤＲ調整Ｐ値≦０．０５であった。
【０１０１】
ＴＣＲが上方調節された（すなわちＴＣＲ依存性）遺伝子は、ＴＣＲが十分なＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞と比較したＴＣＲ欠損において下方調節された（少なくとも０．５７倍の変化）遺伝子として定義される一方、ＴＣＲが下方調節された遺伝子は、ＴＣＲ欠損ＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞（ＧＳＥ６１０７７）において上方調節された（少なくとも１．７５倍、Ｐａｄｊ≦０．００１）３４。活性化上方調節された遺伝子は、定常調節性Ｔ細胞枯渇（ＧＳＥ５５７５３）から回復しているＦｏｘｐ３ＤＴＲマウス由来のＴｒｅｇ細胞において上方調節（２倍の変化、Ｐａｄｊ≦０．０１）される遺伝子である３３。
【０１０２】
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｍｐａｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（シグナリング経路影響分析、ＳＰＩＡ）は、同名のＲパッケージを使用して実施した４８。有意に上方および下方調節された遺伝子およびその倍数変化は、２０１５年１０月５日にアクセスした９０Ｍｕｓ筋ＫＥＧＧ経路の強化および摂動について１つのセットとして分析した。観測された正味の摂動の累積、および正味の摂動の累積のヌル分布の平均およびＳＤを使用して、正味の経路の摂動Ｚスコアを計算した。ボンフェローニ補正を用いた正規反転法を用いて、グローバルＰ値を算出した。
【０１０３】
生物学的プロセス（ＢＰ）遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームの過剰発現は、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  ｖ３．２．１のＢｉＮＧＯ  ｖ３．０．３４９を用い、超幾何学的試験を採用し、ＦＤＲ調整Ｐ値の有意性カットオフ≦０．０５を適用して計算した。１０，５８９個の発現遺伝子を参照セットとして入力し、使用したＧＯオントロジーおよびアノテーションファイルを２０１５年１０月２５日にダウンロードした（図１４）。ＢｉＮＧＯの出力をＣｙｔｏｓｃａｐｅのＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐ  ｖ２．０．１５０にインポートして、冗長なＧＯタームをクラスタリングし、結果を視覚化した。０．２のＪａｃｃａｒｄ類似係数カットオフ、０．００１のＰ値カットオフ、０．００５のＦＤＲ調整カットオフを用い、および１０遺伝子未満の遺伝子セットを除外して、ＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＭａｐを生成した。ネットワークは、デフォルト設定および５００回の反復を用いて、ｐｒｅｆｕｓｅ力学モデルによるレイアウトを使用して視覚化された。同様のＧＯタームのグループは、手動で円で囲んだ。
【０１０４】
実施例２：調節性Ｔ細胞機能におけるＩＬ−２受容体およびＳＴＡＴの役割
本実施例は、ＩＬ−２捕捉がＣＤ４  Ｔ細胞の制御のために不必要であるが、ＣＤ８  Ｔ細胞活性化を制限するために重要であること、およびＩＬ−２Ｒ依存性ＳＴＡＴ５活性化がＴＣＲシグナリングから分離可能なＴｒｅｇサプレッサ機能において必須の役割を果たすことを実証する。
【０１０５】
転写因子Ｆｏｘｐ３を発現する調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、自己抗原および外来性抗原に対する免疫応答を抑制する１〜３。Ｔｒｅｇ細胞は、豊富量のインターロイキン２受容体α鎖（ＩＬ−２Ｒα；ＣＤ２５）を発現するが、ＩＬ−２を産生することはできない。ＩＬ−２は、ＩＬ−２Ｒαまたは一般的なγ鎖（γｃ）／ＩＬ−２Ｒβヘテロ二量体に低親和性で結合するが、ＩＬ−２と一緒にこれらの３つのサブユニットが複合体を形成する場合、受容体親和性は、約１，０００倍増加する４。重要なＩＬ−２Ｒ下流標的であるＩＬ−２およびＳＴＡＴ５は、胸腺におけるＴｒｅｇ細胞のＦｏｘｐ３誘導および分化に不可欠である５〜１１。ＩＬ−２Ｒβおよびγｃは、ＩＬ−１５受容体と共有され、そのシグナリングは、Ｆｏｘｐ３の誘導にも寄与し得る１２。ＩＬ−２は、ＴＧＦ−βと共同して胸腺外Ｔｒｅｇ細胞分化にも必要とされる１３。
【０１０６】
Ｆｏｘｐ３発現および胸腺におけるＴｒｅｇ細胞分化の誘導におけるＩＬ−２Ｒシグナリングの役割は、以前の研究によって十分に確立されているが、成熟Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現の重要性はよく理解されていない。ＳＴＡＴ５の欠損は、Ｆｏｘｐ３の発現を消滅させるが、抗アポトーシス分子Ｂｃｌ２の量を増加させることによって救済することができる。この発見は、ＩＬ−２の主な役割が分化しているＴｒｅｇ細胞またはその前駆体の生存にある可能性を提起した１３。Ｂｉｍ切断は、Ｔｒｅｇ細胞またはその前駆体をＩＬ−２またはＩＬ−２Ｒ欠損に関連するアポトーシスから救済し、Ｔｒｅｇ細胞数を回復させることができるが、致命的な自己免疫を予防しなかったことも報告されている１５。しかし、ＩＬ−２、Ｂｃｌ２およびＢｉｍの先天性欠損がＴｒｅｇ自己反応性エフェクターＴ細胞の分化および選択に及ぼす深刻な影響は、この観察の解釈を混乱させる。
【０１０７】
胸腺摘出マウスにおけるＩＬ−２の抗体媒介性中和は、Ｔｒｅｇ細胞数およびＴｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３発現を減少させる１６、１７。したがって、ＩＬ−２は、分化後のＴｒｅｇ細胞系統の安定性を支持する１８、１９。しかし、唯一胸腺細胞にＩＬ−２Ｒ鎖をコードする導入遺伝子の発現は、Ｉｌ２ｒｂ−／−マウスの致死的自己免疫疾患を救済することが報告され、これは、ＩＬ−２Ｒ発現が末梢Ｔｒｅｇ細胞に不可欠であることを示唆している７、１１。したがって、末梢Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２Ｒ発現およびシグナリングの役割は不明なままである。仮説上、末梢Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２Ｒの役割は、３倍になり得る：１）Ｔｒｅｇ細胞がその標的（ＩＬ−２の供給源としての役割を果たす活性化自己反応性Ｔ細胞）を感知するための誘導、２）抑制機構としてＩＬ−２のＴｒｅｇ細胞媒介性遮断、および３）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ５、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、またはＲａｓ−ＥＲＫシグナリング経路の誘発に起因するそれらの維持、増殖または機能を支持するための、分化したＴｒｅｇ細胞における細胞内因性ＩＬ−２シグナリング。以前の研究は、主にＦｏｘｐ３の誘導または維持に焦点を当てていた一方、ＩＬ−２Ｒ機能の他の側面は、前述の制限のためにあまり確立されていなかった。
【０１０８】
Ｆｏｘｐ３発現の維持のためのＩＬ−２に対するそれらの高い依存性にもかかわらず、Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−２を産生することができない。Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５の自己活性化の阻害の理由、およびこのＩＬ−２ベースのＴｒｅｇ−Ｔｅｆｆ細胞調節ループの潜在的な生物学的意義も依然として分かっていない。Ｔｒｅｇ細胞上の高親和性ＩＬ−２Ｒの「非結合」状態を維持するためにＩＬ−２の抑制が必要であり、非結合ＩＬ−２Ｒが、ＩＬ−２のＴｅｆｆ細胞を遮断することにより、Ｔｒｅｇ細胞媒介性抑制に重要な役割を果たすことが示唆されている２０〜２４が、この機構がインビボでの抑制において重複しない役割を有するかどうかは不明である。
【０１０９】
分化Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２Ｒおよび下流シグナリング経路の役割に取り組むために、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３−発現細胞においてＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−２ＲβおよびＳＴＡＴ５を切断した。ＳＴＡＴ５の構成的活性型の発現を同時に誘導することにより、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞ホメオスタシス対サプレッサ活性について、ＩＬ−２Ｒ発現およびＩＬ−２シグナリングの差次的要件を評価した。本発明者らは、ＩＬ−２Ｒの下流の連続的なＳＴＡＴ５シグナリングが高親和性ＩＬ−２Ｒの発現を維持した一方、ＳＴＡＴ５活性化がＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制のためのＩＬ−２Ｒの要件を完全に消滅させることを見出した。しかし、Ｔｒｅｇ細胞によって発現されるＩＬ−２ＲによるＩＬ−２の捕捉は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制に不可欠であった。本発明者らの研究は、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２シグナリングの下流の過剰なＳＴＡＴ５活性化がＴｒｅｇ細胞媒介性抑制に対する抵抗性を付与することを示唆している。ＳＴＡＴ５の活性化は、Ｔｒｅｇ細胞におけるＦｏｘｐ３発現レベルを増加させ、それらの増殖を促進するだけでなく、サプレッサ活性を増強した。注目すべきことに、後者は、ＴＣＲシグナリングが非存在の場合でも増加した。以前の研究の大部分において示されてきた、Ｆｏｘｐ３の発現およびＴｒｅｇ細胞数の誘導および維持におけるＩＬ−２シグナリングの重要な役割に加えて、本発明者らの研究は、分化したＴｒｅｇ細胞のインビボサプレッサ機能において、ＩＬ−２ＲおよびＳＴＡＴ５活性化にとって重要かつ異なる役割を示した。
【０１１０】
結果
ＩＬ−２Ｒは、Ｔｒｅｇ細胞機能に不可欠である
インビボでのＴｒｅｇ細胞機能におけるＩＬ−２Ｒの役割を確立するために、本発明者らは、内因性Ｆｏｘｐ３遺伝子座（Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ）により駆動されるＣｒｅリコンビナーゼを用いてＦｏｘｐ３を発現させた後、条件付きＩｌ２ｒｂアレルを作製し、その切断を誘導した。Ｉｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスは、Ｆｏｘｐ３−マウスで観察されたものより幾分穏やかではあったが、全身性の致命的な自己免疫炎症性病変およびリンパ球増殖を発症した（図１ａ〜ｃ）。ＩＬ−２Ｒα発現は、末梢ＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞において減少し（図１ｄ）、ＩＬ−２に応答するＳＴＡＴ５のチロシンリン酸化を欠如していた（図１ｅ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度および細胞あたりのＦｏｘｐ３の発現レベルは、両方とも減少した（図１ｆ）。健常なヘテロ接合性Ｉｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＦｏｘｐ３Ｃｒｅ／ＷＴ雌において、無作為Ｘ染色体不活性化のためにＩＬ−２Ｒβが十分な（ＹＦＰ＋）および欠損した（ＹＦＰ−）Ｔｒｅｇ細胞の両方が共存する場合、ＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞は、過小評価された（図１ｇ、ｈ）。ＩＬ−２は、ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ  Ｔｒｅｇ細胞サブセットの維持のために選択的に必要とされるが、ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞は不必要であることが示唆されている２５。しかし、本発明者らは、健常なヘテロ接合性の雌において、ＩＬ−２Ｒβの非存在下でＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏおよびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞サブセットの両方が有意に減少することを見出した。これらのマウスにおいて、ＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４発現に関係なく、Ｆｏｘｐ３およびＴｒｅｇ細胞の「シグネチャー」分子であるＩＬ−２Ｒα鎖（ＣＤ２５）、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲおよびＣＤ１０３の発現量を減少させた（図１ｉ、ｊおよび図７ａ）。疾患に罹患したＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウスでは、Ｔｒｅｇ細胞の大部分は、ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉであったが、ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ細胞が優勢であった部位、すなわち小腸および大腸において、Ｔｒｅｇ細胞の頻度がまた著しく低下したため、これは、重度の炎症の結果である可能性が高い（図７ｂ）。したがって、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を除く多くの特徴的なＴｒｅｇ細胞マーカーは、Ｉｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＦｏｘｐ３ＣｒｅマウスにおけるＴｒｅｇ細胞活性化の結果として上方調節された（図７ｃ）。これらの所見は、ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏおよびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞サブセット（非リンパ組織に存在するものを含む）の両方がＩＬ−２に依存していることを示唆したが、炎症状態では、後者は、ＩＬ−２Ｒ非依存性シグナルによってある程度持続し得る。Ｉｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＦｏｘｐ３Ｃｒｅマウス由来の「活性化された」ＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳおよびＣＤ１０３の上方調節にもかかわらず、依然として疾患に罹患したマウスにおける炎症を抑制することができず、Ｔｅｆｆ細胞をリンパ球のレシピエントに共移入した場合に抑制的でなかった（データは示さず）。
【０１１１】
本発明者らの所見は、ＩＬ−２Ｒαの切断が、ＩＬ−２シグナリングを促進することに加えて、Ｔｅｆｆ細胞からのその隔離を可能にするかどうかが、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスにおけるものと比較して、同様のＴｒｅｇ細胞欠損および疾患を生じるかという疑問を提起した。したがって、本発明者らは、条件付きＩｌ２ｒａアレルを生成し、同様にＴｒｅｇ細胞におけるその切断を誘導した。本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞特異的ＩＬ−２Ｒα欠損が、ＩＬ−２Ｒβ切断で観察されたものと同等の早期発症および重症度を有する疾患を生じることを見出した（図８ａ〜ｃ）。注目すべきことに、本発明者らの条件付きノックアウトマウスと同じＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのマウスにおけるＩｌ２ｒａまたはＩｌ２ｒｂの生殖系列欠損は、おそらくＴｅｆｆ細胞におけるＩＬ−２Ｒシグナリングの役割のために、発症の遅れを伴う、相当に攻撃的でない疾患を生じた（データは示さず）。本発明者らの知見は、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌマウスでは、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ−２シグナリングのみを欠損していた一方、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスではＩＬ−２およびＩＬ−１５シグナリングの両方が欠損していたが、同様に影響を受けたため、ＩＬ−１５が、分化したＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２シグナリングの喪失を効果的に補うことができなかったことを示唆する。これは、ＩＬ−１５が部分的にＦｏｘｐ３誘導に寄与し得る、胸腺におけるＴｒｅｇ細胞の分化とは対照的であった１２。ＩＬ−２Ｒは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、ＭＡＰＫおよびＪＡＫ−ＳＴＡＴ５シグナリング経路を活性化するため、本発明者らは、次に、Ｔｒｅｇ細胞におけるＩＬ−２Ｒシグナリングの下流のＳＴＡＴ５活性化の役割を評価しようとした。本発明者らは、ＩＬ−２Ｒ欠損Ｔｒｅｇ細胞を有するマウスと同様に、ＳＴＡＴ５切断が同様にＴｒｅｇ細胞機能を損ない、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＳｔａｔ５ａ／ｂｆｌ／ｆｌマウスが同様に致命的な自己免疫によって影響を受けることを見出した（図８ｄ〜ｈ）。
【０１１２】
ＳＴＡＴ５の活性化は、ＩＬ−２Ｒ欠損Ｔｒｅｇ細胞がリンパ増殖性疾患およびＣＤ４＋Ｔ細胞を抑制する能力を救済するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を抑制する能力は救済しない
上記の知見は、ＩＬ−２Ｒの下流のＳＴＡＴ５活性化がＴｒｅｇ細胞機能のために持続的に必要であることを示唆した。しかしながら、ＳＴＡＴ５欠損Ｔｒｅｇ細胞で観察されたＩＬ−２Ｒの顕著な減少（図８ｄ）は、すべてのＩＬ−２Ｒ機能の障害、すなわちＩＬ−２の検出、ＳＴＡＴ５依存性および非依存性シグナルの伝達、ならびに観察された重度のＴｒｅｇ細胞機能不全の重要な要因としてのＩＬ−２の消費および欠乏からＳＴＡＴ５の喪失を分離することを不可能にした。
【０１１３】
この主要な注意点に対処するため、およびＳＴＡＴ５対ＩＬ−２Ｒの役割を理解するため、機能獲得型のＳＴＡＴ５ｂの発現がＩＬ−２Ｒの非存在下でＴｒｅｇ細胞機能を救済できるかどうかを確認した。ＩＬ−２Ｒβの非存在下で近位ｌｃｋプロモーターによって駆動されるＳＴＡＴ５ｂ（ＳＴＡＴ５ｂＣＡ）の構成的活性型をコードする導入遺伝子を用いた以前の研究は、胸腺におけるＴｒｅｇ細胞分化の救済を示したが、リンパ増殖性症候群の救済を示さなかった９。しかしながら、胸腺形成の初期のこの導入遺伝子の発現は、白血病性リンパ球増殖につながり、これらの所見の解釈が複雑になった。さらに、近位ｌｃｋプロモーターの活性および導入遺伝子の発現の両方がこれらのマウスの末梢Ｔ細胞において減少する９。したがって、本発明者らは、ＲＯＳＡ２６「遺伝子トラップ」遺伝子座２６を利用する遺伝子標的マウス株を作製し、ここで、ＣＡＧプロモーター駆動ＳＴＡＴ５ｂＣＡ２７は、ｌｏｘＰ−隣接ＳＴＯＰカセットに先行した（図２ａ）。得られたＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおいて、ＳＴＡＴ５ｂＣＡは、ｌｏｘＰ部位がＣｒｅ媒介性組換えを受ける場合にのみ発現される。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスへのＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡアレルの導入およびＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５ｂＣＡの結果的発現は、全身性炎症および初期致命的疾患を救済した（図２ｂ）。これらのマウスにおいて、Ｔｒｅｇ細胞の頻度および数は、野生型（Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ）マウスにおけるレベルと同等またはそれを上回りさえした（図２ｃ）。注目すべきことに、ＩＬ−２Ｒα鎖の非存在にもかかわらず、ＩＬ−２Ｒα鎖の発現が増加し（図２ｃ）、これは、Ｔｒｅｇ細胞上のＩＬ−２Ｒαの発現が、ＳＴＡＴ５非依存性シグナリングによってではなく、ＳＴＡＴ５依存性シグナリングにより主に制御されることを示唆している。重要なことに、高められたＩＬ−２Ｒα発現を有するこれらのＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞は、ＩＬ−２に対して非応答性のままであった（図２ｄ）。
【０１１４】
ＩＬ−２Ｒβ欠損Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ機能の観察された回復およびＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現に対する初期致命的疾患の救済は、再導入された高ＩＬ−２Ｒαレベルがこれらの効果の原因であった可能性を提起した。しかしながら、ＳＴＡＴ５ｂＣＡの発現は、同様に、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌマウスの早期致死的疾患を救済した（図２ｅおよび図９）。重要なことに、ＩＬ−２を捕捉および消費するＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌマウスの両方において、Ｔｒｅｇ細胞の損なわれた能力は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現時に救済されなかったが（図２ｆ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応性は、これらのマウスにおいて完全に制御された（図２ｇおよび図９ｃ〜ｅ）。これらの結果は、ＩＬ−２を捕捉し、ＩＬ−２に競合する能力がＴｒｅｇ細胞媒介性のＣＤ４＋Ｔ細胞応答の抑制に必要不可欠であることを示唆した。反対に、ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に活性化ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖は、これらのマウスにおいてわずかに抑制されたに過ぎなかった（図２ｇおよび図９ｃ、ｅ）
【０１１５】
ＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉサブセットの増殖は、新生仔マウスにおいて、完全ではないものの、比較的よく制御されたが（図２ｇおよび図９ｃ）、このサブセットはまた、徐々にこれらのマウスにおいて、出生後２〜３週間で増殖を始めた（データは示さず）。Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌ  ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスの両方が早期死亡から救済され、健常対照と同等の有意に改善された臨床状態を示したが、それらは、徐々に成長できなくなり、出生後１２週目の早期に、ＬＮおよび組織における大規模に増殖した活性化ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉおよびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ  ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを伴う疾患で死亡し始めた（データは示さず）。これらの知見は、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費がＣＤ４＋Ｔ細胞の制御に不可欠である一方、ＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制に重要である可能性を提起した。
【０１１６】
Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費は、インビボでＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するその能力にとって必須である
Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費の障害がＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を説明することができるかどうかを試験するために、本発明者らは、これらのマウスおよび対照マウスに対し、ＩＬ−２中和抗体を７日齢から投与した（図２ｈおよび図１０ａ）。ＩＬ−２は、胸腺中のＴｒｅｇ細胞の分化を支持するため、ＩＬ−２中和は、マウスのすべてのグループにおいてＴｒｅｇ細胞の頻度を減少させ、対照Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｗｔマウスにおいて免疫活性化を誘導した。自然発生的に疾患を発症するＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌマウスでは、ＩＬ−２中和により、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ２サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１３産生が有意に減少した。しかし、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、最良でもわずかにのみ低下したかまたは影響を受けなかった。対照的に、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスで観察されたＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖は、処置によってほぼ完全に抑制された。
【０１１７】
Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩ２ｒｂｆｌ／ｆ  ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおけるＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉの相対的減少およびＣＤ８＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ  Ｔ細胞サブセットのより顕著な増殖は、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費の喪失が記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の抑制を選択的に損ない得る可能性を提起したが、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター細胞プールへの動員の可能性を提起しなかった。本発明者らは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞サブセットのリンパ球減少性レシピエントへの養子移入によってこの考えを試験した（図２ｉ）。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅマウスにおける観察と一致して、ＩＬ−２Ｒ欠損Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制および活性化の障害の抑制は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡによって完全に救済され、対照的に、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制するそれらの能力は回復せず、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の抑制および増殖は部分的にのみ回復した。したがって、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費は、ナイーブおよび記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方の増殖および活性化を抑制する上で重複しない役割を有するようであるが、このメカニズムは、後者のサブセットの制御において特に顕著であるようである。
【０１１８】
Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおける活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の大部分は、検出可能なレベルのＩＬ−２Ｒαを発現しなかったが（図１０ａ）、これらの細胞は、ＩＬ−２Ｒαを発現する細胞において観察されるものより少ない程度ではあるものの、ＩＬ−２に応答してＳＴＡＴ５を活性化することができた（図１０ｂ）。検出不能なＩＬ−２Ｒα発現を伴う活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合もＩＬ−２に応答したが、それらの大部分は、ＩＬ−２に応答しなかった。ＣＤ８＋ナイーブＴ（Ｔナイーブ）細胞もＩＬ−２に応答したが、ＣＤ４＋Ｔナイーブ細胞は、応答しなかった。したがって、ナイーブおよび活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方は、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもＩＬ−２に対して感受性が強く、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費は、それらの活性化に著しく影響を及ぼすように思われた。この概念の必然的な帰結は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなく、ＣＤ８＋におけるＳＴＡＴ５の活性化がＣＤ８＋をＴｒｅｇ細胞媒介性抑制に対して抵抗性にし得るということである。したがって、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞の存在下でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対するＳＴＡＴ５活性化の効果を試験した。この目的のために、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスからＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−およびＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を選別し、それらを、膜透過性ＴＡＴペプチド（ＴＡＴ−Ｃｒｅ）を含む組換えＣｒｅタンパク質で処理することにより、これらの細胞でのＳＴＡＴ５ｂＣＡの発現を誘導した。本発明者らは、処置した細胞を、Ｔｒｅｇ細胞を伴ってまたは伴わず、リンパ球減少性レシピエントに養子移入した。ＴＡＴ−Ｃｒｅ処置は、最初に、処置されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のおよそ３０％においてＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現を誘導したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の９５％以上は、移入の３週間後にＳＴＡＴ５ｂＣＡを発現し、一方でＣＤ４＋Ｔ細胞を発現するＳＴＡＴ５ｂＣＡは、４０〜５０％に増殖した（図２ｊ）。注目すべきことに、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、野生型（Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ）またはＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞のいずれかの存在下で強健に増殖した（図２ｊ、ｋ）。Ｔｒｅｇ細胞によるＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のある程度の抑制は、依然として認められたが、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ−ＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制と比較して非常に軽度であった（図２ｋ）。対照的に、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞による増殖およびサイトカイン産生は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡの発現にかかわらず、Ｔｒｅｇ細胞によって十分に制御されていた。これらの所見は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなくＣＤ８＋におけるＳＴＡＴ５活性化が細胞の強健な増殖を促し、Ｔｒｅｇ細胞媒介性抑制に対する顕著な耐性を付与することを示唆している。これらの発見と一致して、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２免疫複合体の形態でＩＬ−２が提供された機能獲得実験は、ＣＤ８＋ＴおよびＣＤ４＋Ｔｒｅｇの増殖を示したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示さなかった２８。したがって、ＩＬ−２の捕捉および競合する能力は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答のＴｒｅｇ細胞媒介性抑制に不可欠である一方、この抑制の態様は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の制御に重要であるようであり、これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも強健に過剰なＩＬ−２に応答する。
【０１１９】
Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５の自己活性化は、免疫抑制を高める
ＩＬ−２に応答する検出可能なＳＴＡＴ５活性化の欠如ならびにＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒｂｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡおよびＦｏｘｐ３ＣｒｅＩｌ２ｒａｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスの両方においてＣｒｅ媒介性組換え（対抗選択）を免れたＩＬ−２Ｒが十分なＴｒｅｇ細胞のＳＴＡＴ５ｂＣＡ−駆動性増殖の欠如は、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の発現が、Ｔｒｅｇ細胞をＩＬ−２シグナリングに対するそれらの依存性から解放したことを示した。この発見は、Ｔｅｆｆ細胞によるＩＬ−２産生からのＴｒｅｇ細胞機能の結合を解除することにより、前述のＩＬ−２依存性Ｔｒｅｇ−Ｔｅｆｆ細胞調節ネットワークの生物学的意義を探求するユニークな機会を提供した。この疑問に取り組むために、本発明者らは、ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスを生成し、これは、分化したＴｒｅｇ細胞においてＳＴＡＴ５ｂＣＡのタモキシフェン誘導性発現を可能にした１６。単回のタモキシフェン投与でのＴｒｅｇ細胞の約２０〜３０％におけるＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現の誘導に続いて、Ｔｒｅｇ細胞の非組換えＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡアレルでの消費において、その数は急激に増加した（図１１ａ、ｂ）。実験のＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスは、健常のままであった（図１１ｃ、ｄ）。これらのマウスにおいて、増殖したＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞集団は、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、およびＧＩＴＲの量の増加およびＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｈｉ対ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏ細胞の増加した割合を示し、これは、活性化または「記憶」細胞状態に向かうＴｒｅｇ細胞集団のバイアスを印加されたＳＴＡＴ５ｂＣＡを示す（図３ａ〜ｄ、図１１ｆ）。後者の可能性と一致して、ＩＬ−７Ｒ、ＫＬＲＧ１およびＣＤ１０３の発現レベルが増加した（図３ｄ）。これらの細胞が対照マウスと同様の非常に多様なＴＣＲ  Ｖβ用途を示したことは注目に値する（図１１ｅ）。ＳＴＡＴ５ｂＣＡの誘導によりＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋細胞も増加した（図１１ｈ）。活性ＳＴＡＴ５を発現する「自己」Ｔｒｅｇ細胞は、Ｋｉ−６７＋細胞およびＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ  Ｔｅｆｆ細胞の数の減少およびＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏのＴナイーブの顕著な増加によって証明されるように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの活性化および増殖活性の基礎状態を効果的に抑制した（図３ｅおよび図１２ａ、ｂ）。注目すべきことに、リンパ節（ＬＮ）およびＰｅｙｅｒパッチ（ＰＰ）では、Ｔｒｅｇ細胞は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞が優勢であったにもかかわらず、数値的に増加しなかった（図１１ｂ、ｇ）。しかし、これらの組織におけるＴｅｆｆ細胞応答も減少し（図１２ａ、ｂ）、これは、ＳＴＡＴ５の構成的活性型によって付与されるサプレッサ機能の増大を示唆している。インビトロ抑制アッセイはまた、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ活性の上昇を明らかにした（図１１ｉ）。これに対応して、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）による前炎症性サイトカイン、最も顕著にはＩＬ−４、およびＣＤ８０およびＣＤ８６のＣＤ４＋Ｔ細胞産生が減少した（図１２ｃおよび図３ｆ）。以前に、Ｔｒｅｇ細胞は、腸において全身性Ｔｈ１７型応答およびＩｇＡクラススイッチングを促進することが提案された２９、３０。しかし、本発明者らは、二次リンパ器官において応答する血清および糞便ＩｇＡならびにＴｈ１７が、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下で増加するよりもむしろ減少することを見出した（図３ｇおよび図１２ｃ）。血清ＩｇＭおよびＩｇＥも減少傾向を示したが、これは、統計的に有意ではなかった（図１２ｄ）。これらの結果は、Ｔｈ１７応答、ならびに急性Ｔｒｅｇ細胞切断時に観察されたＴｈ２型およびＴｈ１型Ｉｇクラススイッチの両方の増加と一致した３１。変化した腸内免疫応答が結腸発癌の促進に関与していることから、本発明者らは、結腸直腸癌のＡｐｃＭｉｎモデルにおいて活性化されたＳＴＡＴ５によってもたらされるＴｒｅｇ細胞サプレッサ機能の獲得の効果を調べた。ＡｐｃＭｉｎ突然変異を有するマウスは、小腸において複数の腺腫性ポリープを発症する３２。ＡｐｃＭｉｎＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスは、同等のまたはより少ない数のポリープを発症したが、平均ポリープサイズは増加した（図１２ｅ）。これらの結果は、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞による炎症の抑制が、腫瘍または前癌性病変が既に形成されると、腫瘍の増殖を促進するという考えと一致していた。しかし、結腸発癌の初期段階は促進されないようであったが、サプレッサ活性を増強したＴｒｅｇ細胞によって潜在的に抑制された。
【０１２０】
生理学的設定における基礎免疫反応性を抑制し、結腸癌発症を調節することに加えて、「自己」Ｔｒｅｇ細胞は、自己抗原誘発性自己免疫に対して優れた防御をもたらした。本発明者らは、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対して高度に耐性であることを見出した（図４ａ〜ｃ）。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の頻度は、これらのマウスの脳および脊髄で有意に増加し（図４ｂ）、好中球およびＩＬ−１７産生ＣＤ４＋Ｔｈ１７細胞を含む炎症細胞のこれらの器官への浸潤は有意に減少した（図４ｃ）。Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスでも病原体特異的応答が減少した。リステリア特異的Ｔｈ１応答は、わずかにのみ抑制されたが（図４ｄ）、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の存在下では、ワクシニアウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、著しく減少した（図４ｅ）。感染性剤に対する応答の低下および癌進行の制御についての本発明者らの観察は、Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ−２産生およびＳＴＡＴ５の自己活性化を欠いており、代わりにＩＬ−２の供給源として活性化Ｔ細胞に依存する理由について理論的根拠を提供し得る。
【０１２１】
Ｔｒｅｇ細胞遺伝子発現におけるＳＴＡＴ５シグナリングのＴＣＲ非依存的役割およびサプレッサ機能。
次に、本発明者らは、ＳＴＡＴ５シグナリングがどの程度持続的にＴｒｅｇ細胞の抑制能力を増強し得るかという疑問に取り組んだ。機能の遺伝的喪失および獲得の研究において、Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５活性は、それらの増殖能およびＩＬ−２ＲαおよびＦｏｘｐ３の発現レベルと相関した。しかし、前述のインビトロでの抑制アッセイの結果は、対照マウスよりもＴｒｅｇ細胞が少ないＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスのＬＮおよびＰＰにおける免疫活性の減少と同様に、Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスで観察された増強された免疫抑制が、単にＴｒｅｇ細胞の数値的上昇によるものではなく、１細胞あたりのサプレッサ活性も増強されたことを示唆した。本発明者らは、ゲノム全域のＦｏｘｐ３結合が、Ｆｏｘｐ３発現における増加をＳＴＡＴ５ｂＣＡによって引き起こされるものよりも顕著なものとするＴｒｅｇ細胞の活性化で変化しないことを見出したため、ＳＴＡＴ５ｂＣＡの存在下でのＦｏｘｐ３の軽度の上方調節がＴｒｅｇ細胞のサプレッサ活性の増加を説明し得る可能性も低い３３。対照と比較したＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞のＦｏｘｐ３発現レベルの上昇は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞がそのＩＬ−２依存性から解放されたという観察と一致して、ＣＤ２５ｌｏ  Ｔｒｅｇ細胞サブセットにおいて特に顕著であった（図３ｂ）。それにもかかわらず、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞は、対照マウス由来のＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞よりも、リンパ球レシピエントにエフェクターＴ細胞を共移入した場合、Ｆｏｘｐ３の同等に高い発現にもかかわらず、対照マウス由来のＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３ｈｉ  Ｔｒｅｇ細胞よりも強力なサプレッサ機能を示した（データは示さず）。したがって、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ活性の増加は、Ｆｏｘｐ３の増加したレベルに起因するものではあり得ない。
【０１２２】
持続的なＳＴＡＴ５活性化によって付与される上昇したサプレッサ機能の基礎にある潜在的機序についての洞察を得るために、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３を同等レベルで発現するＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２  およびＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウス由来の成熟Ｔｒｅｇ細胞を選別し、これらの細胞においてＲＮＡ−ｓｅｑを用いて遺伝子発現を分析した。両方のマウス群由来のＣＤ４＋Ｔナイーブ細胞の遺伝子発現プロファイルは、ほぼ同一であったが、Ｔｒｅｇ細胞遺伝子発現は、ＳＴＡＴ５の活性型によって著しく影響を受けた（図５および図１３ａ）。分析されたＴｒｅｇまたはＣＤ４＋Ｔナイーブ細胞集団のすべての発現遺伝子（約１１，０００）の中で、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞において３４２遺伝子が上方調節され、３１４遺伝子が対照細胞と比較して下方調節された（図５ｂおよび図１３ｂ）。ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞で上方調節された遺伝子セットは、細胞接着、移動、および細胞骨格の再組織化に関与する様々な細胞表面分子および受容体をコードした（図５ｃ）。Ｔナイーブ細胞と比較して対照Ｔｒｅｇ細胞において上方調節または下方調節されたいくつかの遺伝子は、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞において反対の傾向を示し、ＳＴＡＴ５ｂＣＡが単にＴｒｅｇ細胞シグネチャーを強化するものではないことを示唆した。本発明者らの最近の研究では、一過性のＴｒｅｇ細胞の枯渇に起因する炎症へのＴｒｅｇ細胞の暴露は、遺伝子発現の顕著な変化および抑制機能の強力な増加をもたらすことを示した３３。ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞の高められたサプレッサ機能と一致して、本発明者らは、ＳＴＡＴ５の構成的活性型によって与えられるこれらの細胞における遺伝子発現変化が、炎症設定において高度に活性化されたＴｒｅｇ細胞において見出されるものと相関することを見出した（図５ｄ）。以前に、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞がサプレッサ機能を発揮する能力にＴＣＲシグナリングが必要であることを発見した３４、３５。したがって、Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＣＲおよびＳＴＡＴ５依存性シグナリング経路が、その発現がＴｒｅｇ細胞抑制活性を増強するために共同で調節する遺伝子の大部分が重複するセットに作用する可能性があった。しかし、本発明者らの分析は、ＳＴＡＴ５の活性型によって影響される遺伝子セットが、ＴＣＲ依存性の様式でＴｒｅｇ細胞において発現されるものと異なることを明らかにした（図５ｄ）。したがって、ＴＣＲおよびＳＴＡＴ５シグナリング経路の両方は、主に異なるセットの遺伝子およびＴｒｅｇ細胞サプレッサ活性の可能性のある別個の局面を制御することにより、インビボでのＴｒｅｇ細胞サプレッサ活性において不可欠な役割を果たす。
【０１２３】
ＳＴＡＴ５活性化により増強されたＴｒｅｇ細胞機能の局面をよりよく理解するために、本発明者らは、シグナリング経路および分子機能強化分析を行い、これは、細胞間および細胞外マトリックス相互作用、細胞接着、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞において差次的に発現される遺伝子間の細胞移動に関与する遺伝子セットの過剰発現を明らかにした（図５ｅ、ｆ）。この結果は、Ｔｒｅｇ細胞において、ＳＴＡＴ５活性化が標的細胞とのそれらの相互作用を増強し得ることを示唆した。インビボでのＴｒｅｇ細胞の生体内イメージングは、以前にＤＣ３６とのそれらの安定な相互作用を明らかにしたため、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞における構成的に活性なＳＴＡＴ５発現の潜在的効果をインビトロでＤＣと結合体を形成する能力について評価した。遺伝子セット強化分析と一致して、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞における発現がＴｒｅｇとＤＣとの間の結合体形成を促進することを見出した（図６ａ）。インビトロでのＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞とＤＣとの相互作用の上昇は、タモキシフェン処置Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスで観察されたＤＣによる共刺激分子の発現の減少と一致した。これらの発見は、ＳＴＡＴ５活性化がＴＣＲ非依存的な様式でＴｒｅｇ細胞のサプレッサ機能を増強し得るかという疑問を提起した。この概念を試験するために、条件付きＴｃｒａアレルを発現するＦｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスを分析した。本発明者らが以前に報告したように、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ媒介性ＴＣＲ切断は、サプレッサ機能の障害から生じる免疫活性化をもたらした３４。興味深いことに、Ｔ細胞活性化および炎症誘発性サイトカイン産生の顕著な増加は、タモキシフェン処置Ｆｏｘｐ３Ｃｒｅ−ＥＲＴ２ＴＴｃｒａｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおけるＳＴＡＴ５の活性型の発現で部分的に緩和された（図６ｂ）。ＦＡＣＳで精製されたＴＣＲ欠損ＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞およびエフェクターＴ細胞がリンパ球レシピエントに養子移入された実験では、ＴＣＲで切断されたＴｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５の活性型によるＴｒｅｇ細胞サプレッサ機能のこの部分的回復も確認された（図６ｃ）。救済は不完全であったが、これらの結果は、ＳＴＡＴ５シグナリングの増強が同時ＴＣＲ依存性シグナルの非存在下でＴｒｅｇ細胞サプレッサ活性を増強し得ることを示唆した。実際に、ＴＣＲが十分なＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞で観察されたＴｒｅｇ細胞のいくつかの特徴は、ＴＣＲで切断されたＳＴＡＴ５ｂＣＡ＋Ｔｒｅｇ細胞に依然として存在していた（図６ｃ）。しかし、ＳＴＡＴ５ｂＣＡ発現は、Ｆｏｘｐ３の誘導の直後にＴＣＲ欠損が起こる場合、Ｆｏｘｐ３ＣｒｅＴｃｒａｆｌ／ｆｌＲＯＳＡ２６Ｓｔａｔ５ｂＣＡマウスにおいてサプレッサ機能を救済することができないことに留意されたい。本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞が、活性化された抗原経験の表現型およびサプレッサ機能を獲得するためにＴＣＲシグナルが必要であることを以前に示した３４。したがって、本発明者らの結果は、ＳＴＡＴ５の活性化が、既にＴＣＲ依存性成熟を受けた成熟Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＣＲ非依存性サプレッサ機能を増強することを示唆している。この観察は、ＳＴＡＴ５シグナルが許容的ＴＣＲシグナリングを経験したＴｒｅｇ前駆体の分化を促進する、胸腺におけるＴｒｅｇ細胞の分化におけるこれらの２つのシグナル、ＴＣＲおよびＩＬ−２Ｒの連続的な必要性を想到させるものである３７。
【０１２４】
考察
サプレッサ機能を有するＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの顕著な特徴であるＩＬ−２Ｒαの細胞表面量が高いことの発見により、直近の２０年にわたるＴｒｅｇ細胞生物学におけるＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒシグナリングの役割のさらなる調査のための段階を構築した。ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒサブユニットにおける生殖系欠損マウスの以前の分析は、ＩＬ−２がＦｏｘｐ３の誘導および胸腺におけるＴｒｅｇ細胞の分化に必要な重要なサイトカインであることを示した５〜１１。さらに、抗体媒介性ＩＬ−２中和および安定化ＩＬ−２抗体との免疫複合体の形態でのＩＬ−２の提供、ならびにＦｏｘｐ３遺伝子座内の調節エレメントの遺伝子解離は、成熟したＴｒｅｇ細胞の維持およびそれらの胸腺外分化中のＦｏｘｐ３発現の安定化におけるＩＬ−２の重要な役割を明らかにした１６、２８、３７。これらの知見は、ＩＬ−２ＲシグナリングがＴｒｅｇ細胞サプレッサの能力を直接的に促進することもできるかという疑問を提起し、したがって、Ｔｒｅｇ細胞のサプレッサ機能による分化および維持を結び付ける重要なつながりとしての役割を果たす。初期のインビトロ試験では、間接的な証拠に基づくＩＬ−２シグナリングの役割が示唆されている２１。さらに、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費は、ＩＬ−２遮断に起因する活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の死滅を引き起こすことによってＴｒｅｇ細胞サプレッサ機能において必須の役割を果たすことが示唆された２０〜２４。他方、いくつかの他の報告は、Ｔｒｅｇ細胞がエフェクターＴ細胞増殖を抑制する能力に関してＩＬ−２Ｒが不可欠であることを示唆している８、３９。さらに、野生型Ｔｒｅｇ細胞の養子移入で観察されたＩｌ２ｒａ−／−およびＩｌ２ｒｂ−／−マウスにおける疾患の救済は、ＩＬ−２遮断とは独立した、Ｔｒｅｇ細胞媒介性抑制の主要な機序の存在を示唆した６、７。しかし、後者の研究は、ＩＬ−２が機能的Ｔｒｅｇ細胞の非存在下での自己免疫疾患の主要な駆動剤である可能性が高いため、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２消費が、ＩＬ−２Ｒが十分なＴｅｆｆ細胞の抑制に必須であるかどうかに関して大きい疑問を残した。
【０１２５】
インビボでのその機能におけるＴｒｅｇ細胞のＩＬ−２ＲシグナリングおよびＩＬ−２消費の役割を実験的に評価する努力における主な制限要因は、適切な遺伝子ツールの欠如であった。これらの研究における生殖系ＩＬ−２Ｒ欠損を有するマウスの使用は、Ｆｏｘｐ３誘導の障害、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む造血細胞系の早期分化、Ｆｏｘｐ３発現前のＴｒｅｇ前駆体の生存、およびＴｒｅｇ  ＴＣＲレパートリーの潜在的摂動によって混乱された。本発明者らは、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の誘導発現と組み合わせて、条件付きＩｌ２ｒａおよびＩｌ２ｒｂアレルの生成およびＴｒｅｇ細胞におけるそれらの切断を介して、これらの問題に対処した。これらの新しい遺伝子ツールは、ＩＬ−２Ｒシグナリングが、成熟Ｔｒｅｇ細胞の維持およびその適応だけでなく、そのサプレッサ機能でも、細胞の本質的で重複しない役割を果たすことを明白に証明することを可能にした。さらに、Ｔｒｅｇ細胞のＳＴＡＴ５欠損は、サプレッサ機能の同様の喪失を生じ、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の発現は、ＩＬ−２Ｒ欠損に起因する致死的疾患を救済し得ることを見出した。これらの結果は、Ｔｒｅｇ細胞およびその機能の分化および維持を結び付けるＩＬ−２Ｒ−ＳＴＡＴ５シグナリングの重要な役割を示唆している。ＳＴＡＴ５は、Ｆｏｘｐ３プロモーターおよびイントロンＦｏｘｐ３調節エレメントＣＮＳ２に結合し、Ｆｏｘｐ３の誘導および維持に関与する３８。Ｒｕｎｘ−ＣＢＦβ複合体はまた、ＣＮＳ２およびＦｏｘｐ３プロモーターに結合し、Ｆｏｘｐ３発現レベルに影響を及ぼす４０。ＣＮＳ２およびＣＢＦβ欠損Ｔｒｅｇ細胞の両方は、ＳＴＡＴ５またはＩＬ−２Ｒ欠損Ｔｒｅｇ細胞のそれに類似したＦｏｘｐ３発現の減少を示すが、後者における抑制機能の障害は、はるかに深刻であった。したがって、Ｆｏｘｐ３発現の減少のみでは、ＳＴＡＴ５またはＩＬ−２Ｒの非存在下でのＴｒｅｇ細胞サプレッサ機能の重度の喪失を説明することができない。実際に、ＳＴＡＴ５の活性型の発現に与えられた遺伝子発現および機能的特徴についての本発明者らの分析は、Ｔｒｅｇ細胞がＤＣに結合し、それらの活性化を抑制する上昇した能力を指摘した。さらに、ＳＴＡＴ５の構成的活性型の発現は、ＴＣＲシグナリングの不存在下において、Ｔｒｅｇサプレッサ機能のほぼ完全な消失を部分的に救済した３４、３５。これらの結果は、胸腺におけるＦｏｘｐ３発現およびＴｒｅｇ細胞分化を回復させたにもかかわらず、近位ｌｃｋプロモーターおよびＥμエンハンサーによって駆動されるＳＴＡＴ５ｂＣＡ導入遺伝子がＩｌ２ｒｂ−／−マウスにおいて致命的なリンパ増殖性疾患を抑制することができなかったという以前の知見と相反するようである９。しかし、後者の結果の解釈は、白血病前Ｔ細胞およびＢ細胞の大規模な増殖および末梢Ｔｒｅｇ細胞におけるＳＴＡＴ５ｂＣＡ導入遺伝子の発現の減少のため、問題がある。
【０１２６】
本発明者らの研究は、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２遮断が、ＩＬ−２Ｒシグナリングが必要であるにもかかわらず、ＩＬ−２Ｒが十分なＣＤ４＋Ｔ細胞の抑制のために全く不必要であることを明らかに示した。しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞によるＩＬ−２Ｒ依存性ＩＬ−２消費は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の抑制に不可欠であった。後者の一見予想外の発見は、ナイーブおよび活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の、ＩＬ−２誘導性刺激に対する観察された絶妙な感受性を考慮すると合理的である。さらに、ＩＬ−４およびＩＦＮγなどのエフェクターサイトカインとは対照的に、ＴＣＲ関与後の数時間以内にナイーブＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化でＩＬ−２が産生され、その産生は、はるかに長い時間スケールでのＴｅｆｆ細胞へのＴナイーブ細胞分化を要した４１。これらの顕著な特徴は、ＩＬ−２消費を介したＴｒｅｇ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の制御の別個のメカニズムの必要性についての可能性のある説明を提供する。
【０１２７】
Ｔｒｅｇ細胞による局所ＩＬ−２産生の検出がそのサプレッサ機能の「ライセンシング」を可能にすることが示唆されている２１。しかしながら、ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＩＬ−２Ｒ欠損Ｔｒｅｇ細胞によるＣＤ４＋Ｔ細胞応答の抑制の救済は、活性化Ｔｒｅｇ細胞がＩＬ−２の細胞供給源を同定することなく自己免疫を抑制できることを示唆している。したがって、ＩＬ−２は、Ｔｒｅｇ細胞サプレッサ機能のためのブースターである一方、特定の標的化の手がかりとして不可欠な役割を果たし得ない。
【０１２８】
遺伝子改変Ｔ細胞は、いくつかの形態の癌において強力な治療手段として出現している。ＳＴＡＴ５の構成的活性型を発現するＴｒｅｇ細胞の観察された増強されたサプレッサ活性、およびそれらの存在下で器官特異的自己免疫の重症度を有意に低下させたことは、このようなＴｒｅｇ細胞の修飾が、様々な自己免疫疾患および炎症性疾患について、ならびに臓器移植におけるＴｒｅｇ細胞ベースの治療の最適設計を約束し得ることを示唆している。
【０１２９】
本発明者らの研究は、ＩＬ−２ＲシグナリングおよびＳＴＡＴ５活性化が、多様な生物学的設定およびポイントにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のそれらの制御のためのＴｒｅｇ細胞によるＩＬ−２のＩＬ−２Ｒ媒介性枯渇のための別個の要件に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の抑制を増強することを示唆している。本発明者らの知見は、分化したＴｒｅｇ細胞のサプレッサ機能を支持および増強し、Ｔｒｅｇ細胞の分化およびそれらのサプレッサ機能の維持を結び付けるネクサスとして作用するＩＬ−２受容体シグナリング駆動性ＳＴＡＴ５活性化の中心的役割を強調する。この点に関して、Ｆｏｘｐ３オルソログは、鳥類では同定されていないが、大量のＩＬ−２Ｒα鎖を発現するニワトリおよびアヒルＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、抑制性Ｔ細胞におけるＩＬ−２Ｒα機能の進化的保存の重要性を示唆するインビトロサプレッサ活性を有することは注目に値する４２、４３。
【０１３０】
実施例３：インビトロでのＳＴＡＴ５−ＣＡ  Ｔｒｅｇの生成
免疫細胞を含む試料、例えば血液が対象から採取される。免疫細胞は、試料の他の成分、例えば赤血球および／または血清から分離される。次いで、免疫細胞集団を、分離のために、例えば蛍光活性化細胞選別、磁気選別、または当技術分野で公知の他の方法により、別々の表現型成分、例えばナイーブ、エフェクター記憶、中央記憶、Ｔｒｅｇなどに調製する。
【０１３１】
対象から単離されたＴｒｅｇ細胞の集団は、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するように操作される（例えば、異種核酸の導入による）。次いで、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するＴｒｅｇ細胞を、それを必要とする対象に投与する。代替的に、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するＴｒｅｇ細胞は、それを必要とする対象に投与する前に培養物中で増殖させる。
【０１３２】
対象から単離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を、Ｔｒｅｇのインビトロでの生成のための条件（例えば、ＴＧＦ−βの存在下でのプレート結合抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８）下で培養する。いくつかの実施形態において、生成されたＴｒｅｇを、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するように操作し得る（例えば、異種核酸の導入による）。いくつかの実施形態において、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するＴｒｅｇ細胞を、それを必要とする対象に投与し得る。代替的にまたはさらに、いくつかの実施形態において、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するＴｒｅｇ細胞は、それを必要とする対象に投与する前に培養物中で増殖させることができる。
【０１３３】
実施例４：インビトロでのＳＴＡＴ５−ＣＡ  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの生成
Ｔｒｅｇ細胞は、構成的に活性なＳＴＡＴ５タンパク質を発現するように操作される（例えば、異種核酸の導入による）。Ｔｒｅｇ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するようにさらに操作される。ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞は、それを必要とする対象に投与する前に培養物中で増殖される。ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞が投与される対象に関して自己または異種細胞であり得る。
【０１３４】
参考文献
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３．Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｇａｖｉｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．Ｆｏｘｐ３  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，３３０−３３６（２００３）．
４．Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８，８７５−９１１（１９８９）．
５．Ｆｕｒｔａｄｏ，Ｇ．Ｃ．，Ｃｕｒｏｔｔｏ  ｄｅ  Ｌａｆａｉｌｌｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｕｔｃｈｕｋｈｉｄｚｅ，Ｎ．＆Ｌａｆａｉｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＣＤ４（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９６，８５１−８５７（２００２）．
６．Ａｌｍｅｉｄａ，Ａ．Ｒ．，Ｌｅｇｒａｎｄ，Ｎ．，Ｐａｐｉｅｒｎｉｋ，Ｍ．＆Ｆｒｅｉｔａｓ，Ａ．Ａ．Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ＩＬ−２Ｒ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＩＬ−２  ｓｈａｐｅ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｎｕｍｂｅｒｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，４８５０−４８６０（２００２）．
７．Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．，Ｙｕ，Ａ．，Ｖｉｎｃｅｋ，Ｖ．，Ｓｃｉｂｅｌｌｉ，Ｐ．＆Ｋｏｎｇ，Ｌ．ＣＤ４  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｌｅｔｈａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ＩＬ−２Ｒｂｅｔａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７，１６７−１７８（２００２）．
８．Ｆｏｎｔｅｎｏｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｇａｖｉｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｉｎ  Ｆｏｘｐ３−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，１１４２−１１５１（２００５）．
９．Ｂｕｒｃｈｉｌｌ，Ｍ．Ａ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｖｏｇｔｅｎｈｕｂｅｒ，Ｃ．，Ｂｌａｚａｒ，Ｂ．Ｒ．＆Ｆａｒｒａｒ，Ｍ．Ａ．ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＳＴＡＴ５  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８，２８０−２９０（２００７）．
１０．Ｙａｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｒｅｄｕｎｄａｎｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔ５ａ／ｂ  ｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｆｏｘｐ３．Ｂｌｏｏｄ  １０９，４３６８−４３７５（２００７）．
１１．Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．＆Ｂａｙｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｎｏｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ｃｒｕｃｉａｌｌｙ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ＩＬ−２．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，６６５−６７４（２００４）．
１２．Ｖａｎｇ，Ｋ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．ＩＬ−２，−７，ａｎｄ  −１５，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｅｉｔｉｎ，ｒｅｄｕｎｄａｎｔｌｙ  ｇｏｖｅｒｎ  ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１，３２８５−３２９０（２００８）．
１３．Ｃｈｅｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ＣＤ４＋ＣＤ２５−  ｎａｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９８，１８７５−１８８６（２００３）．
１４．Ｍａｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＡＴ５  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏ−Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１，１７１−１７９（２０１０）．
１５．Ｂａｒｒｏｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＩＬ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５，６４２６−６４３０（２０１０）．
１６．Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｉ，Ｓ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．＆Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｏｘｐ３（＋）ＣＤ２５（＋）ＣＤ４（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）−２  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ＩＬ−２  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１，７２３−７３５（２００５）．
１７．Ｒｕｂｔｓｏｖ，Ｙ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，１６６７−１６７１（２０１０）．
１８．Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｏｘｐ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ａｎｄ  ａｎ  ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｍｉｎｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，１９０３−１９０８（２００９）．
１９．Ｈｏｒｉ，Ｓ．Ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２５９，１５９−１７２（２０１４）．
２０．Ｐａｎｄｉｙａｎ，Ｐ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｓ．，Ｒｅｅｄ，Ｊ．＆Ｌｅｎａｒｄｏ，Ｍ．Ｊ．ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，１３５３−１３６２（２００７）．
２１．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｅ．Ｅ．，Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ，Ｃ．Ａ．＆Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ＩＬ−２  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，６５１９−６５２３（２００４）．
２２．Ｂａｒｔｈｌｏｔｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＣＤ２５＋  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｍｐｅｔｅ  ｗｉｔｈ  ｎａｉｖｅ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ＩＬ−２  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔ  ｉｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１０  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７，２７９−２８８（２００５）．
２３．Ｂｕｓｓｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐｓ  ｓｈａｐｅ  ＩＬ−２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｅｌｐｅｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０７，３０５８−３０６３（２０１０）．
２４．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ＣＴＬＡ−４  ａｎｄ  ＩＬ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１０，Ｅ２１１６−２１２５（２０１３）．
２５．Ｓｍｉｇｉｅｌ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＣＣＲ７  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  ＩＬ−２  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１１，１２１−１３６（２０１４）．
２６．Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＯＳＡ  ｂｅｔａ  ｇｅｏ２６  ｇｅｎｅ  ｔｒａｐ  ｓｔｒａｉｎ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，３７８９−３７９４（１９９７）．
２７．Ｏｎｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ＳＴＡＴ５  ｍｕｔａｎｔ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １８，３８７１−３８７９（１９９８）．
２８．Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．，Ｋｏｖａｒ，Ｍ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓｕｒｈ，Ｃ．Ｄ．＆Ｓｐｒｅｎｔ，Ｊ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１，１９２４−１９２７（２００６）．
２９．Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｘｐ３（＋）ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３４，４０９−４２１（２０１１）．
３０．Ｃｏｎｇ，Ｙ．，Ｆｅｎｇ，Ｔ．，Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｓｃｈｏｅｂ，Ｔ．Ｒ．＆Ｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｏ．Ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ，ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌ−ＩｇＡ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６，１９２５６−１９２６１（２００９）．
３１．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｍ．，Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，Ｊ．Ｐ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８，１９１−１９７（２００７）．
３２．Ｓｕ，Ｌ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｇｅｎｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，６６８−６７０（１９９２）．
３３．Ａｒｖｅｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５，５８０−５８７（２０１４）．
３４．Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｇ．，Ａｒｖｅｙ，Ａ．，Ｊｉｎ，Ｗ．＆Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５，１０７０−１０７８（２０１４）．
３５．Ｖａｈｌ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｏｏｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４１，７２２−７３６（２０１４）．
３６．Ｔａｄｏｋｏｒｏ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｏｎｔａｃｔｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０３，５０５−５１１（２００６）．
３７．Ｌｉｏ，Ｃ．Ｗ．＆Ｈｓｉｅｈ，Ｃ．Ｓ．Ａ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８，１００−１１１（２００８）．
３８．Ｆｅｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｃｉｓ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｘｐ３  ｌｏｃｕｓ．Ｃｅｌｌ  １５８，７４９−７６３（２０１４）．
３９．Ｔｒａｎ，Ｄ．Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−２  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＦＯＸＰ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２，２９２９−２９３８（２００９）．
４０．Ｒｕｄｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｕｎｘ−ＣＢＦｂｅｔａ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０，１１７０−１１７７（２００９）．
４１．Ｓｏｊｋａ，Ｄ．Ｋ．，Ｂｒｕｎｉｑｕｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．＆Ｓｉｎｇｈ，Ｎ．Ｊ．ＩＬ−２  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｓ  ｒａｐｉｄ，ｔｒａｎｓｉｅｎｔ，ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ＴＣＲ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２，６１３６−６１４３（２００４）．
４２．Ｓｈａｎｍｕｇａｓｕｎｄａｒａｍ，Ｒ．＆Ｓｅｌｖａｒａｊ，Ｒ．Ｋ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８６，１９９７−２００２（２０１１）．
４３．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｇ．，Ｎｉｓｓｅｎ，Ｊ．Ｋ．＆Ｂｅｔｚ，Ａ．Ｇ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｋｅｙ  Ｇａｉｎ−ｏｆ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｆｏｘｐ３  ｄｕｒｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３，１１３（２０１２）．
４４．Ｒｕｂｔｓｏｖ，Ｙ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｌｉｍｉｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｔ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８，５４６−５５８（２００８）．
４５．Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｕｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  Ｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８，１７６５−１７８６（２０１３）．
４６．Ｂｏｌｇｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．＆Ｕｓａｄｅｌ，Ｂ．Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｔｒｉｍｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３０，２１１４−２１２０（２０１４）．
４７．Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｗ．＆Ａｎｄｅｒｓ，Ｓ．Ｍｏｄｅｒａｔｅｄ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｄａｔａ  ｗｉｔｈ  ＤＥＳｅｑ２．Ｇｅｎｏｍｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，５５０（２０１４）．
４８．Ｔａｒｃａ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｍｐａｃｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，７５−８２（２００９）．
４９．Ｍａｅｒｅ，Ｓ．，Ｈｅｙｍａｎｓ，Ｋ．＆Ｋｕｉｐｅｒ，Ｍ．ＢｉＮＧＯ：ａ  Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ  ｐｌｕｇｉｎ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１，３４４８−３４４９（２００５）．
５０．Ｍｅｒｉｃｏ，Ｄ．，Ｉｓｓｅｒｌｉｎ，Ｒ．，Ｓｔｕｅｋｅｒ，Ｏ．，Ｅｍｉｌｉ，Ａ．＆Ｂａｄｅｒ，Ｇ．Ｄ．Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｍａｐ：ａ  ｎｅｔｗｏｒｋ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５，ｅ１３９８４（２０１０）．
【０１３５】
均等物
当業者は、本明細書に記載された本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはルーチン実験のみを用いてそれを確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の本明細書に限定されることを意図したものではなく、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【図１−１】
2019518460.tif 000002
【図１−２】
2019518460.tif 000003
【図２−１】
2019518460.tif 000004
【図２−２】
2019518460.tif 000005
【図３−１】
2019518460.tif 000006
【図３−２】
2019518460.tif 000007
【図４】
2019518460.tif 000008
【図５−１】
2019518460.tif 000009
【図５−２】
2019518460.tif 000010
【図６】
2019518460.tif 000011
【図７】
2019518460.tif 000012
【図８】
2019518460.tif 000013
【図９】
2019518460.tif 000014
【図１０−１】
2019518460.tif 000015
【図１０−２】
2019518460.tif 000016
【図１０−３】
2019518460.tif 000017
【図１１−１】
2019518460.tif 000018
【図１１−２】
2019518460.tif 000019
【図１２】
2019518460.tif 000020
【図１３−１】
2019518460.tif 000021
【図１３−２】
2019518460.tif 000022
【図１４−１】
2019518460.tif 000023
【図１４−２】
2019518460.tif 000024
【図１４−３】
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【図１５】
2019518460.tif 000026
【図１６】
2019518460.tif 000027
【国際調査報告】
2019518460.tif 000028