(57)【要約】  本発明は、高レベルのグルコース、コレステロール、尿酸、および体脂肪の低減、損傷を受けた器官の細胞保護、代謝および細胞増殖の活性化のための、天然起源の化合物およびそれらの薬学的に許容される活性な混合物に関する。処方物Ｉの化合物を薬学的有効量で含む医薬組成物、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ系およびｉｎ  ｖｉｖｏ系におけるその方法が例示される。処方物Ｉおよびその変形を、高血糖値症、痛風、脂質異常症、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病、尿崩症、１型糖尿病、２型糖尿病、微小血管合併症、大血管合併症、脂質障害、糖尿病前症、不整脈、心筋梗塞、腎臓および膵臓合併症、心血管合併症を治療するために使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物およびヒトにおける高レベルの体脂肪、コレステロール、尿酸およびグリセミック指数を低下させるための方法であって、薬学的有効量の、許容される化学形態のアミノ酸グリシン、アルギニンおよびシステイン、ならびに薬学的有効量の、許容される化学形態（水和物、エステル、アミド、多形体、異性体もしくはプロドラッグまたはそれらの組合せ）のレスベラトロールまたはその誘導体を含有する組成物を投与することで、対象におけるメタボリックシンドローム症状の矯正を実現することを含む、方法。
【請求項２】
適用される組成物が、以下の比率の生物学的に活性な成分（処方物Ｉ）：レスベラトロール１００〜２，５００ｍｇ、グリシン３，０００〜７，０００ｍｇ、アルギニン３００〜５，０００ｍｇおよびシステイン２００〜２，５００ｍｇを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的に活性な成分の組成物が、水性懸濁剤、錠剤、ポリマーカプセル剤として適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組成物が、患者の血液中の総血清コレステロールレベルを低下させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組成物が、患者の血液中の尿酸の濃度を低下させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、患者の動脈中のプラークの体積を減少させるのに有効な量である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組成物が、患者の体脂肪の量を減少させるのに有効な量である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組成物が、患者の血液中の高グルコース濃度を低下させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
他のアミノ酸が適用される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
疾患が、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症、肥満症、糖尿病、痛風、またはそれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が、血清コレステロール、グルコース、尿酸、体脂肪、またはそれらの組合せのレベルの異常な上昇に関連する疾患の進行重症度を低下させるのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症、肥満症、糖尿病、老化、またはそれらの組合せにより損傷を受けた器官の細胞保護剤、代謝および細胞増殖刺激物質として作用するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタボリックシンドローム、糖尿病および老化を治療するための医薬組成物および提案された方法の定義に焦点を合わせたものである。天然起源の化合物および組成物が説明において開示される。より詳細には、本発明は、薬学的に許容される用量の、処方物Ｉの一部である化合物を用いて細胞系および哺乳動物生物体（動物およびヒト）において発生する応答、例えば、代謝および細胞成長の制御などの使用に基づいて疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
以前はシンドロームＸとして公知であったメタボリックシンドロームは、正常な代謝と２型糖尿病の中間の状態である。メタボリックシンドロームは、人々を、他の病態の中でも心臓および冠状動脈疾患、ならびに慢性腎不全にかかりやすくする一連の代謝的危険因子であると定義された、新興の流行病である。メタボリックシンドロームは、グルコース障害、すなわち糖尿病を伴うまたは伴わない、腹部肥満、アテローム発生性脂質異常症、高血圧症、炎症促進性および血栓形成促進性の状態に関連付けられる。症状は、高トリグリセリドレベル、低高密度リポタンパク質レベル、血圧の上昇または高血圧症およびグルコースレベルの上昇、ならびに炎症症状に関連する。これらの特性はそれぞれ、血管機能障害および心血管疾患、腎疾患および肝疾患の発生にとって重要な危険因子である（Eckel R. H et al、Lancet、2005、365: 1415）。メタボリックシンドロームにより、早期死亡のリスクが増大し、したがって、リスクが高い大集団に利益をもたらすためには、心血管代謝変更因子の減少を補助するため、および症候群を制御するための有効かつ手頃な戦略が重要な目標である。
【０００３】
現在、メタボリックシンドロームの人々を治療するための主要な手法は、根本原因を低減すること、高血圧症および他の心血管危険因子を低減すること、ならびにインスリン抵抗性を制御することを目的とするものである。メタボリックシンドロームの治療は、薬物治療と共に、生活様式の変化を含む。メタボリックシンドロームの基礎をなす多くの機構に取り組むために、食事ガイドラインおよび適切な身体活動を実行するメタボリックシンドロームの治療に加えて、病態の顕在化に伴う代謝産物のレベルの変化を制御するために設計された一連の薬物適用が開発されており、同じ目標をもつ種々の生物学的に活性な栄養化合物が組み入れられている。栄養上の影響、特に、異なる分子標的に対する食事中のアミノ酸およびポリフェノールに関する機能的知見により、肥満症、メタボリックシンドローム、糖尿病および老化を治療するための、天然に存在する化合物の組成物を開発することが可能になっている。本発明の主題に関連するいくつかの概念および特許を下に記載する。
【０００４】
LodderおよびCassis（Lodder R AおよびCassis L A、米国特許第2015/9060962号、Jun. 23. 2015）は、アテローム性動脈硬化症、メタボリックシンドローム、肥満症または糖尿病を予防または治療するための、スチルベンまたはスチルベノイドを伴ってまたは伴わずにＤ−タガトースをまたはその誘導体を含む、医薬組成物の特許を取得した。植物において産生される天然のフェノールおよびフィトアレキシンの一種であるレスベラトロール（３，５，４−トリヒドロキシ−トランス−スチルベン）などのスチルベノイドが、病原体による攻撃または他の傷害に対する応答中に適用された。異なる種類のベリー、ブドウ、クランベリーなどにおいて大量のレスベラトロールを見出すことができる（Fremont、Life Sci、2000、66: 663）。当該特許の前に、Baur et al（J. A. Baur et al、Nature、2006、444 (7117). 337）およびDo et al（Do G M et al、Biochem Biophys Res Commun、2008、374 (1). 55）により、レスベラトロールの、他の能力の中でも、高カロリー食のマウスの健康および生存を改善する効果、コレステロールレベルの変化を制御する効果が報告された。レスベラトロールと化学的に関連する別の化合物であり、３，５−ジメトキシ−４’ヒドロキシスチルベンとして知られるプテロスチルベンは、レスベラトロールと同様の効果を示すことを特徴とする。
【０００５】
サーチュインは、心血管疾患、老化およびストレス抵抗性の発生に関与する代謝経路を調節する、ヒストン脱アセチル化酵素活性およびいくらかの転写因子活性を有する酵素である（Jiang W J Biochem. Biophys. Res. Commun.、2008、373 (3): 341）。レスベラトロールは、ＳＩＲＴ１（ＮＡＤ依存性サーチュイン−１脱アセチル化酵素）およびＰＧＣ−１（ペルオキシソーム増殖因子によって活性化されるガンマ受容体活性化補助因子）を直接または間接的に活性化し、ミトコンドリアの機能に影響を及ぼすと考えられている（Lagouge M. et al、Cells、2006、127 (6):1109；Alcain F JおよびVillalba J M、Expert Opin Ther Pat、2009、19 (4):403； Beher D. et al、Chem Biol Drug Des、2009、74 (6):619）。レスベラトロールで処理された細胞では、超酸化物を減少させるＳＯＤ２（ＭｎＳＯＤ）作用（スーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア、マンガン依存性スーパーオキシドジスムターゼとしても公知）が増大し、これは、いくつかの疾患におけるミトコンドリア機能不全、透過性遷移、およびアポトーシスによる死亡に対する抵抗性に関与する。レスベラトロールは、ＧＰＥＲアゴニスト（ＧＰＲ３０）（Ｇタンパク質共役型エストロゲン受容体１、Ｇタンパク質共役受容体３０としても公知）としても作用することが見いだされている（Prossnitz E. R.およびBarton M.、Mol. Cell. Endocrin. 2014、389 (1-2): 71）。レスベラトロールの可能性のある作用機構は、オートファジー調節（機能障害性機構成分の排除を目的とするオートファゴサイトーシス）に起因し得る（Ghosh H. S. et al、PLoS ONE、2010、5 (2). e9199）。実験動物により、レスベラトロールの抗糖尿病治療としての正の効果が示されている（Baur J A et al、Nature、2006、444 (7117):337；Lagouge M. et al、Cells、2006、127 (6). 1109.）。この化合物は、ＰＰＡＲガンマアゴニストとして作用し（グリタゾン受容体またはＲ１Ｃ３（核受容体サブファミリー１、グループＣ、メンバー３）としても知られるペルオキシソーム増殖因子（ＰＰＡＲ−γまたはＰＰＡＲＧ）によって活性化されるガンマ受容体はＩＩ型核受容体である）、２型糖尿病を治療するための薬理学的標的と考えられている（L. Wang et al、Biochem Pharmacol 2014、92 (1):73）。ペルオキシソームは、適正に機能しない間に疾患および老化プロセスが引き起こされる可能性がある細胞小器官である。内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性を刺激し、血小板凝集を阻害する能力は、レスベラトロールに起因する（Vita J. A. Duffy S J、Curr Opinion Lipid、2003、14 (1). 21；Olas B.およびWachowicz B.、Platelets、2005、16 (5):251）。
【０００６】
植物抽出物は、抗酸化剤の供給源、レスベラトロール類似体と考えられ得る。Romero T.の米国特許第2016/9,278,104号、Mar. 8、2016では、メタボリックシンドロームに関連する１つまたは複数の危険因子を低減および／または排除するための、Nelumbo nuciferaの葉抽出物の使用が確立された。当該組成物では、種々の生きている生物体の筋肉および神経細胞に位置する、アミノ酸構造によく似た、窒素を有する有機酸であるクレアチニンの存在が考慮される。クレアチニンは、肝臓、膵臓および腎臓において、アルギニン、グリシンおよびメチオニンなどのアミノ酸から、１日当たりクレアチン１ｇの速度で天然に合成される。クレアチニンは、ＡＴＰを輸送し、筋肉の筋原線維にエネルギーを供給するための即時かつ直接のベクターと考えられる。
【０００７】
Gokaraju G. R. et alは、米国特許第2016/9,241,964号、Jan. 26、2016において、Sphaeranthus indicusおよび／またはGarcinia mangostanaに由来する、医薬用途または栄養補助食品としての植物化学物質画分の組成物を確立している。当該組成物は、肥満症、メタボリックシンドローム、糖尿病および他の代謝障害の制御、予防および治療のため、ならびに哺乳動物におけるエネルギー消費量を調節するため、冠状動脈および腹大動脈の動脈硬化巣を予防するため、インスリン感受性を増大させるため、グルコースレベル、トリグリセリドレベルを制御するため、およびグルコースレベルを平衡化するために適用される。他の成分の中でもアミノ酸を含有する抽出物が言及されているが、それらは開示されていない。
【０００８】
ヒト代謝に関与する種々のタンパク質の合成においてアミノ酸が重要な部分であることは広く知られている。この発明は、組成物がメタボリックシンドローム、肥満症、糖尿病、および老化の治療および予防のために選択され得る理由になると考えられる。
【０００９】
Varfolomeev S. D.およびGurevich K. G.（Russian Chemical Bulletin、2001、50 (10):1709）は、バイオコンピュータ解析を実施し、それにより、種々の酵素ファミリーにおいて、一次配列の定義された位置にグリシンアミノ酸が最も頻繁に見いだされる（３７．５％）ことが実証された。当該著者らは、この性質を、酵素アーキテクチャにおけるグリシンの役割：タンパク質鎖の運動および柔軟性を可能にするキラル原子を有するアミノ酸であることに帰するものとした。これにより、代謝に対するグリシンの重要性が実証される。続く５種のアミノ酸は、アスパラギン酸（１２．９％）、システイン（６．７％）、ヒスチジン（６．２％）およびアルギニン（５．５％）である。システインは、硫黄架橋の形成に起因して、種々のタンパク質のコンフォメーションの維持に関与する。ヒスチジンおよびアルギニンは、アスパラギン酸と同じく、触媒部位において中核作用物質および求電子試薬として役割を果たすことにより、酵素活性部位によく見られる。
【００１０】
アルギニンの場合では（Wu G. A. B. et al、Curr Opin Clin Nutr Metabol Care、2000、3 (1):59）、インスリン抵抗性の低下を補助する能力が報告されており、それにより、糖尿病の治療においてインスリンの量を減少させること、２型糖尿病において耐糖能を増大させること、およびインスリン感受性を改善することが可能になる。
【００１１】
システインは、ウイルス、細菌、真菌、発がん物質、ならびに他の病態からの細胞の保護に関与するグルタチオン合成の制限基質である。いかなる他の成分も伴わずに適用される経口システインは、胃腸管の通過時に毒性の状態に急速に異化されるので、推奨されない。システインは、酸化還元反応に関与するチオールの能力に起因して抗酸化性を有する。これらのシステインの抗酸化性は、大部分はトリペプチドグルタチオンにおいて発現する。経口グルタチオンの利用可能性は不十分なものであり、したがって、それを構成するアミノ酸−システイン、グリシンおよびグルタミン酸から生合成されなければならず、システインが制限基質になる。実験室での実験により補足された異なる試験により、老化が、血漿システインおよびグルタチオン細胞内濃度の進行性の低下に直接関連することが示された。この低下により、加齢性酸化ストレスが導かれる。通常の食事を上回るシステイン補充により、骨および筋肉系が補助され、それにより炎症およびサイトカインのレベルが低下することによって種々の老化プロセスが低減する（L. Wang et al、Biochem. Pharmacol. 2014、92 (1):73）。
【発明の概要】
【００１２】
細胞増殖の制御は、あらゆる生物体が適切に機能するために必須である。この調節の変化が、遺伝子突然変異に起因する制限されていないおよび制御されていない細胞増殖を伴うがんなどの疾患の原因である。逆に、細胞増殖ができなくなることは老化を引き起こす要因の１つである。
【００１３】
細胞周期マイトジェン、いくつかの増殖因子、ならびに生存因子によって、細胞分裂の細胞外制御を実施することができる。マイトジェンは、細胞分裂を刺激し、それにより、周期進行を遮断する細胞内停止機構（Ｒｂ）を打ち消すタンパク質である。
【００１４】
あらゆる生物体または器官の成長は、成長および細胞分裂の両方に依存する。細胞が成長せずに分割する必要がある場合、細胞は毎回小さくなる。増殖因子は、タンパク質および他の巨大分子の合成および阻害を促進することによって細胞成長（細胞塊の増大）を刺激する。細胞成長は細胞周期に依存しない。例えば、神経および筋肉細胞は、特に細胞分裂後に成長する。大多数のマイトジェンと同様に、増殖因子は、細胞表面受容体に結合し、次いでそれにより種々の細胞内シグナル伝達経路が活性化し、それにより、タンパク質合成の増大またはタンパク質分解の低減が誘導され得る。これらは全て細胞成長を導くものである。
【００１５】
生存因子は、細胞内死プログラムまたはアポトーシスを抑制することによって細胞生存を促進する。生存のための他の細胞からのこれらのシグナルの要求が、細胞が必要な時に必要な場所でのみ生存するのに役立つ。例えば、ニューロンが過剰に産生され、それらが増殖因子を得ることについて互いと競合し、増殖因子を最も大量に有するものが生存する。マイトジェンおよび増殖因子と同様に、生存因子は、細胞膜受容体に結合する傾向があり、それにより、通常はＢｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質を調節することによって細胞死を阻害する細胞内シグナル伝達経路が活性化する。いくつかの生存因子は、ＩＬ−３、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１であり、これらは、主に、肝臓により、成長ホルモン（ＧＨ）からのシグナルに応答して分泌される。
【００１６】
上記に基づいて、上記の問題を解決するために、本発明の目的は、レスベラトロール、グリシン、アルギニンおよびシステインからなり、成分の濃度の範囲がArtemia salinaモデルの試験に基づいて設定される処方物の使用を提供することである。この場合に特許を受けるのは、処方物の使用、およびそれを疾患の治療に適用する方法である。処方物は、遺伝毒性の証拠は伴わずに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物およびリンパ球の増殖を刺激する新規の効果を有し、これにより、糖尿病になるように誘導された健康な実験動物において観察される内臓脂肪の形成を低減する能力、アロキサン誘導性糖尿病のモデルにおいて示された、より少ないインスリンを用いたまたはインスリンを用いないグリセミック指数の可制御性、アロキサンで処置した動物の膵臓において示される治療の細胞保護効果、６カ月の期間にわたって治療された患者におけるメタボリックシンドロームおよび肥満症の症状の矯正が明らかになる。下記の実施例では、処方物が、エネルギー生成、酸素代謝の回復、ならびに糖、脂肪酸およびコレステロール代謝に関連する種々の酵素サイクルの再活性化のレベルで作用し、細胞において増殖の増大の観点で表される機能性および生命力の増大のために利用可能なエネルギーを増大させる再活性化成分を有することが実証される。実施例は、前記処方物を動物およびヒトに適用すると、糖尿病、肥満症および／またはメタボリックシンドロームの負の因子に関連する機能が正常化されることを実証するものである。これらの実施例によると、設計された処方物を用いた治療は、老化、メタボリックシンドローム、肥満症および糖尿病を制御する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】異なる濃度で適用したレスベラトロール（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ａ）およびシステイン（Ｃ）成分によって示された、A. salinaの死亡率の観点で表された毒性。
【図２】異なる濃度の処方物Ｉの存在下でのA. salinaの生存率。
【図３】異なる濃度の処方物Ｉで処理した試料中のリンパ球の数（上）およびそれらの生存率（下）。
【図４】単核細胞（リンパ球）における、異なる濃度で適用した処方物Ｉの試験遺伝毒性。上−電気泳動プレート；中央−組み込まれたＤＮＡの百分率（頭部）（＊ＲＰＭＩを用いた対照に対してｐ＜０．０５）；下−電気泳動試料末端の結果に基づく算出（＊０．１ｍＭのＨ２Ｏ２を用いた陽性対照に対してｐ＜０．０５）。
【図５】ヒト胎児由来腎臓細胞株ＨＥＫ−２９３細胞培養物（上）およびアフリカミドリザル（Ｖｅｒｏ）腎臓細胞培養物の生存率に対する異なる濃度の処方物Ｉの効果。
【図６】処方物Ｉを用いて処置した動物および処置していない動物における血液化学パラメータの値のグラフ表示である：上−雄ウサギ；下−雄ラット、単回投薬を適用する前および１０００ｍｇ／Ｋｇを１４日間適用した後。
【図７】処置：Ｉ−インスリン、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ−処方物Ｉ用量：の処置に供したウサギ目動物の種々の群における体重変化ダイナミクス（上）およびグルコース濃度（毛細血管血糖）（下）。
【図８】Ｉ−インスリン、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ−処方物Ｉ用量：を用いた処置に供した齧歯類の種々の群における体重変化ダイナミクス（上）およびグルコース濃度（毛細血管血糖）（下）。
【図９】処方物Ｉおよびインスリンを用いて処置した誘導性糖尿病を有するウサギならびに無処置の誘導性糖尿病を有するウサギにおいて膵臓レベルで観察された組織学的変化の比較。上−インスリンのみで処置した雌膵臓から取り出した組織の組織学的切片、器官の完全な破壊が実証された：血管がうっ血した脂肪組織および反応性変化を伴う２つのリンパ節のみが見いだされ、可能性のある膵組織を同定せずに意図的な検索を実施した。下−処方物Ｉのみで処置した雌膵組織の組織学的切片（１０×）（左）、関連する組織学的変化を伴わない排出部分膵臓保護腺房が同定されるが、内分泌成分は同定されない（膵島細胞）；画像（４０×）は、膵臓の排出部分（腺房）を統合するアプローチに対応する（右）。
【図１０】処方物Ｉおよびインスリンを用いて処置した誘導性糖尿病を有するウサギならびに無処置の誘導性糖尿病ウサギにおいて腎臓レベルで観察された組織学的変化の比較。上−インスリンのみで処置した雌の腎組織の組織学的切片：糸球体レベルで、硬化した小結節の形成を伴わない血管壁の非定型、限局性肥厚を伴わないメサンギウム細胞の増加を伴い、これは、メサンギウムのわずかな増加を特徴とする初期の糖尿病性腎症に対応する（左）；インスリンのみで処置した雄の腎臓カット片、骨皮質の良好な保護、わずかな鬱血を伴い良好な細胞充実性を伴う豊富な糸球体を伴い、硬化の変化はない。尿細管成分では、凝固性壊死および核濃縮による変化が存在する（右）。中央−インスリンおよび９０ｍｇ／ｋｇまでの処方物Ｉで処置した雌の組織学的腎臓カット片、良好な骨皮質保存が示され、ごくわずかな鬱血を伴い良好な細胞充実性を伴う豊富な糸球体が同定され、硬化の変化はない。尿細管成分では、最初の変化は凝固性壊死および核濃縮によって見られる。下−７０ｍｇ／ｋｇまでの処方物Ｉで処置した雄のうっ血性腎組織の組織学的切片（左−１０×）、髄質および皮質における赤血球血管外遊出（顕微鏡レベルの出血）が伴う、非定型、わずかな鬱血を伴わない糸球体メサンギウム細胞の増加を示す構造が同定される；図は、うっ血性糸球体のアプローチに対応する（右−４０×）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の特徴的な詳細は、処方物Ｉを定義すること、その適用、異なるレベル（細胞、健康な動物または糖尿病が誘導された、ヒト生物体）で生物系における生物学的効果を定義することからなる。以下の段落には、本発明を定義する目的を記載し、本発明の新規性および有用性を例示するが、その範囲を限定せず、それを不当に限定するものではない。以下の実施例は、処方物Ｉを定義するため、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ系およびｉｎ  ｖｉｖｏ系におけるそれらの効果を試験するために実施された試験に基づく。
【００１９】
本発明による、本発明を考慮した基本的な組成物および調製物を含む処方物の説明を表１に示す。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
請求項１に記載の組成物は、進行疾患の症例に対する治療効果がより高い、本発明の化合物の潜在的な組合せの複数の実施形態のうちの１つを含むこと、ならびに投薬レジメンを低減するナノ粒子の実施形態を統合することをさらに特徴とする。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
実施例１
アッセイを実施して、処方物Ｉのために提案された成分（レスベラトロール、グリシン、アルギニンおよびシステイン）のArtemia salinaノープリウスに対する毒性を評価した。Artemia salinaは、生物学的活性および全く異なる化学構造を有する広範囲の化合物に感受性の甲殻類である。Michael et al（Michael A. S. et al、Science、1956、123:464）およびVanhaecke et al（Vanhaecke et al、Ecotoxicol Environ Saf 1981、5:382）により、毒性試験のための、その使用が提案された。これは、性質が異なる物質の毒性試験を実際に経済的に行うことを可能にする試験である。他の特定の細胞傷害性試験と非常に良好な相関が存在している。このモデルは、ＦＤＡ（Food Drug Administration）およびEPA（Environmental Protection Agency in 2002）により、医薬品および／または食品の毒性および生態毒性を評価するための試験として認められている。
【００２４】
処方物Ｉ成分のそれぞれを異なる希釈度で使用し、標準化された方法に従ってアッセイを実施した。Artemia salina孵化器中、Artemia salinaの嚢胞０．５ｇを人工海水中３７ｇ／Ｌ、温度２７℃で、一定の通気を伴って２４時間にわたって孵化させた。９６ウェルプレートのうちの５ウェルそれぞれに、人工海水（３７ｇ／Ｌ）０．１ｍＬを、孵化器から分離し、１０ノープリウスの正確な分離が実現されるように１つずつ計数した１０ノープリウスと共にシングルチャネルピペットを用いて適用した。レスベラトロール、グリシン、アルギニンおよびシステインのストック溶液２０００ｐｐｍから段階希釈物を作製した。マルチチャネルマイクロピペットを使用して、プレート中で調製した溶液０．１ｍＬを添加し、ノープリウスの５つのウェルごとに６２．５ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、５００ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの最終濃度を実現した。ブランク試料として、１０の無処理のノープリウスを０．２ｍＬ体積の人工海水（３７ｇ／Ｌ）に入れた。マイクロプレートを２５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション期間後、A. salinaノープリウスの生死を実体顕微鏡で計数し、％死亡率を決定した。Gualdron et alの尺度を考慮し、毒性をA. salinaノープリウスのパーセント死亡率として表した：０〜１０％は無毒性、１１〜５０％は中程度の毒性、５１〜９０％は強毒性および１００％は極度の毒性。（Gualdron R. et al、Chem Rev. Col. Farm、1997、26:15 to 19）。処方物Ｉの成分溶液を５倍で試験した。Statistical Package Graph Pad Prismバージョン６を用い、分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験およびＴｕｋｅｙ多重比較（ｐ＜０．０５）によってデータを解析した。
【００２５】
データ解析の結果を±標準偏差平均として表し、図１に示した。グリシン、アルギニンおよびシステインは、試験したいずれの濃度においても毒性はなく、したがって、毒性が生じたとしても１０００ｐｐｍを上回ってやっとであり得ることが示唆される（図１）。レスベラトロールについては、６２．６ｐｐｍ溶液で３８％の死亡率（中程度の毒性）が存在したが、ＬＣ５０（５０％ノープリウスの致死濃度）は８９．４８ｐｐｍと推定され、レスベラトロールはこの濃度から強毒性であることが示唆される。このデータを考慮して処方物Ｉを定義した：レスベラトロール濃度はＣＬ５０を下回るように選択した；アミノ酸に関しては、１０００ｐｐｍを下回る任意の濃度を使用することができる。
【００２６】
実施例２
ここで例示されている処方物Ｉとして、以下の生物学的に活性な成分の組成物を考慮する：哺乳動物（ヒトを含む）または細胞培養物への使用に関して、それぞれ体重１ｋｇ当たりまたは溶媒１ｋｇ当たり、レスベラトロール５．７ｍｇ、グリシン７４．３ｍｇ、アルギニン５．７ｍｇおよびシステイン２．９ｍｇ。レスベラトロール濃度は、実施例１において定義された結果を考慮して選択した、すなわち、毒性の顕在化を防止するために、そのＣＬ５０の約１５分の１未満とした。アルギニン重量はレスベラトロールと同等にし、システインはレスベラトロールのおよそ２分の１未満にし、グリシンはレスベラトロールの重量の１３倍にした。処方物Ｉは、生物学的に活性な成分の混合物の例であり、本発明の範囲を限定するべきではない。この場合は、処方物Ｉ用量は８８．６ｍｇ／ｋｇに定義される。
【００２７】
処方物Ｉを使用し、実施例１に記載のものと同様のアッセイを実施して、その毒性の範囲を定義した。結果を図２に示す。５００ｐｐｍ以下の濃度では、A. salinaノープリウスの１００％が生存し続け、１０００ｐｐｍの処方物Ｉでは５８％のみが生存することが示されている。これにより、適用されたモデルによると、処方物Ｉは最大５００ｐｐｍの濃度までは非毒性であるが、最大１０００ｐｐｍの高濃度では中程度の毒性挙動が示される。これにより、処方物Ｉを使用することにより、その濃度は、毒性がないことを考慮して広範囲の濃度および用量で変動し得ることが実証される。
【００２８】
実施例３
処方物Ｉを、ヒト細胞に対するそれらの効果、すなわち、成長効果を刺激する（分裂促進効果）または細胞死を引き起こす（細胞傷害効果）効果を決定するための試験に適用した。
【００２９】
このアッセイのために、末梢血単核細胞−末梢ヒトリンパ球に由来する単核細胞培養物を使用する生物学的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用した。この系は、白血球の２５％から３５％までを形成し、また、外来抗原を認識し、細胞免疫応答メディエーターを活性化し、それにより、内因性または外因性の刺激の前に増殖または抑制現象を引き起こすことから主要な免疫応答促進細胞であるので、この系を選択した。これらの培養物は、様々な化合物の効果を評価するための研究に広く使用されている（Marti-Centelles R. et al、J. Med Chem Eur、2015、103:488）。細胞増殖に対する効果を評価し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒトリンパ球に対する処方物ＩのＬＣ５０およびＬＣ１００（生細胞の量がそれぞれ５０％および１００％減少する濃度）を決定した。陽性対照として、リンパ球における有糸分裂を誘導し、クローン増殖をそれにより引き起こす植物起源の球状タンパク質であるコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）を用いた試験を実施した（Ganem and Martin Gonzalez Baez F A O.、Universo Diagnostico、2000、1 (1):1）。RPMI-1640（処理を伴わない培地）を用いたアッセイをブランクとして実施した。２００ｐｐｍから２０００ｐｐｍまでの濃度範囲で適用した処方物Ｉの効果を、トリパンブルー色素で染色した細胞および死細胞の総数を計数することによって評価した。
【００３０】
１０％FBSを補充し、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンＢ（SIGMA社製）の１×溶液１ｍｌを添加し、０．２２ミクロンのメンブレンを使用した濾過滅菌ユニット（Corning社製）を通して滅菌してＲＰＭＩ−１６４０培地培養物（SIGMA社製）１Ｌを調製した。２０００ｐｐｍの処方物Ｉのストック溶液からの段階希釈物、２００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、８００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍおよび２０００ｐｐｍを調製した。
【００３１】
健康な志願者ドナーから末梢血３０ｍＬを静脈穿刺によって得、これを、抗凝固薬としてＥＤＴＡを含有するプラスチックチューブ中に収集した。次いで、２５℃、毎分１２００回転（ｒｐｍ）で３０分間遠心分離することにより、Ficoll-Hypaque密度勾配（Sigma-Aldrich社製）によって単離した末梢血（ＰＢＭＣ）由来の単核細胞を得た。ＰＢＭＣをPBS１×で２回洗浄し、最終的な細胞ペレットを培養培地に再懸濁させた。ＰＢＭＣは単球およびリンパ球からなった。単核球細胞は、増殖潜在性を欠く付着細胞であることを特徴とする。他の点では、これらは、懸濁液中で、内因性または外因性の刺激後に増殖することが可能な細胞であるリンパ球である。リンパ球から単球を分離するために、得られたＰＢＭＣを２５ｃｍ３の箱の中で、単球が表面に接着するように、３７℃、加湿雰囲気、５％ＣＯ２雰囲気中で５時間にわたって水平方向に培養した。インキュベート時間後、リンパ球−懸濁液中の残りの細胞を滅菌１．５ｍｌチューブ中に分離し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し（Eppendorf Centrifuge 5810-R）、次いで、培養培地１ｍＬを細胞パッケージに添加した。エッペンドルフチューブ中、１ｍＬ当たり細胞５００，０００個の懸濁液を調製し、それに異なる濃度の処方物Ｉ（２００ｐｐｍ、４００ｐｐｍ、６００ｐｐｍ、８００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍおよび２０００ｐｐｍ）を添加し、加えて、１．２５ｍｇ／ｍＬの陽性対照コンカナバリンＡ−細胞増殖の誘導因子およびブランク−無処理の細胞、培養培地を添加した。試料を３７℃、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２で４８時間にわたって、リンパ球が完全に細胞分裂し、産物により同様の陽性対照増殖（Ｃｏｎ  Ａ）が示されるまたはそうでなければ細胞毒性が引き起こされるのに十分にインキュベートした。インキュベーションを終了したら、異なる試料を含有するエッペンドルフチューブを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞パックをRPMI-1640  １ｍＬに再懸濁させた。
【００３２】
４０×対物レンズを備えた光学顕微鏡を使用した。Neubauerチャンバーを用い、PBS１×０．４ｍＬに再懸濁させた試料それぞれの懸濁液０．０５ｍＬおよびトリパンブルー０．０５ｍＬを使用して細胞を計数した。アッセイを３つの独立した事象で３連で実施した。結果を、SPSSバージョン１６を用いて分散分析試験（ＡＮＯＶＡ）によって分析し、次いで、ダネット検定を適用して、ｐ＜０．０５の値を有意とみなし、対照と実験処置の間に差異が存在するかどうかを見分けた。
【００３３】
図３に、試験結果を示す。２００ｐｐｍで適用した処方物Ｉの細胞の濃度の上昇に対する効果は、ブランク無処置と比較すると、１５％まで有意（ｐ＜０．０５）であることが明らかであった（１ミリリットル当たりの細胞の数）：それぞれ６，３７２，３３３ｃｅｌ／ｍＬおよび５，５１８，３３３ｃｅｌ／ｍＬ。コンカナバリンＡでは６５％までの細胞の数の増加が計数されて１ｍＬ当たり細胞９，１０１，６６７個が得られ（図３）、これにより、その分裂促進活性が確認される。他方では、１０００ｐｐｍおよび２０００ｐｐｍの濃度の処方物Ｉ存在下では、細胞数の減少が観察された：それぞれ１ｍＬ当たり細胞４，２９１，６６７個および１ｍＬ当たり細胞３，５４０，３３３個。
相対的な細胞生存率（ＶＣＲ）の百分率を算出し、２００ｐｐｍ、４００ｐｐｍおよび６００ｐｐｍの濃度の存在下では、細胞の９７％がブランクおよび陽性対照におけるものと同様に生存することが見出された。８００ｐｐｍから、ならびに１０００ｐｐｍおよび２０００ｐｐｍの処方物Ｉによりヒトリンパ球の細胞生存率は有意に低下し（図３、下）、それぞれ百分率は９０．５８％、８４．３８％および６４．９６％であった。処方物ＩのＬＣ５０およびＬＣ１００はそれぞれ２，７２６．８ｐｐｍおよび５，１６５．８２ｐｐｍと推定された。この値は、A. salinaを用いた試験において検出された値よりも有意に高く、これにより、適用した用量の処方物Ｉには細胞傷害性がないことが証明される。両方の試験によると、処方物Ｉは、５０〜９０ｐｐｍの用量では細胞傷害性ではない。これらの用量は、リンパ球増殖を刺激する範囲内であり、これにより、老化治療の方法に対するその重要な効果が確認される。
【００３４】
実施例４
以下の実施例は、実施例３において示された増殖効果および阻害効果が、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）損傷のレベルには関連しないことを示すものである。この目的のために、損傷の程度をデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のレベルで測定するための、迅速であり、感度が高く、単純かつ数量化可能な方法であるコメットアッセイを展開した。このアッセイは、ＤＮＡ修復に対して有害な化合物または作用を調査するためのツールとして認められている（Azqueta A.およびA. R. Arch Toxicol Collins、2013、87:949）。このアッセイは、異なる科学的学問分野において、遺伝毒性試験、前臨床試験および臨床試験、生態毒性遺伝子検査、細胞遺伝学的検査、光遺伝毒性検査などのために、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける系で使用されている。
【００３５】
単核細胞およびヒト末梢血リンパ球を、実施例３に記載されているものと同じ方法体系に従って分離した。培養培地を使用することにより、細胞濃度を１ｍＬ当たり細胞１×１０６個に調整した。得られた細胞をEppendorfバイアルに１ｍＬ当たり細胞３×１０４個の密度で播種し、３７℃、および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートして安定化させた。その後、バイアルを２２℃、１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を７．８１ｐｐｍ、１５．６３ｐｐｍ、３１．２５ｐｐｍ、６２．５０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、および１０００ｐｐｍ（それぞれｎ＝４）の処方物Ｉの溶液で置き換えた。ブランク試験細胞を培養培地に再懸濁させ（ｎ＝８）、他のものを０．１ｍＭの過酸化水素に再懸濁させた（陽性対照、ｎ＝８）。細胞を２４時間インキュベートし、その後、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって沈殿させ、３７℃および５％ＣＯ２でトリプシン（０．２５％）０．１ｍＬを用いて３分間処理した。細胞をRPMI 1640培地１ｍＬに再懸濁させ、１２００ｒｐｍで５分間再遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を溶解溶液（２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、および１％Triton）１ｍＬと一緒に４℃で２４時間インキュベートした。２４時間後に、バイアルを１２００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、中和緩衝液（０．４ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）１ｍｌを用いて４℃で５分間処理し、バイアルを４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をローディング緩衝液（ブロモフェノールブルー０．２５％、グリセロール５０％、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび５０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）０．０２ｍＬに再懸濁させた。アガロースゲルを、加熱プレート中、１００℃で１％をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させることによって調製した。溶解したら、６０℃で、Gelred（蛍光色素ＤＮＡ化合物）０．０１ｍＬを添加した。この混合物を水平電気泳動チャンバーに入れて６０分間置いた。溶解した細胞をアガロースゲルにローディングし、電気泳動溶液（１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡおよび３００ｍＭのＮａＯＨ、ｐＨ１３．５）と一緒に４℃で２０分間インキュベートした。電気泳動を４℃、２５Ｖおよび３００ｍＡで３０分間実施した。ゲルを電気泳動チャンバーから取り出し、蛍光シグナル分析チャンバー中で明らかにした。生成した画像を高分解能デジタルカメラで取得し（図４、上）、ImageQuant TL v8.1ソフトウェアで解析した。インタクトなＤＮＡを表すコメット頭部の面積を濃度測定分析によって数量化し、陰性対照（培養培地）に対する百分率としてプロットした（図４、中央）。損傷を受けたＤＮＡを表すコメットの尾部をミリメートル単位で測定し、陽性対照（Ｈ２Ｏ２）に対する百分率として表した。データを、平均±平均標準偏差として表した（図４、下）。得られたデータを、GraphPad Prism v6.0ソフトウェアを使用して分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析し、何らかの差異があった場合にはポストホックチューキー検定を使用しｐ＜０．０５とした。
【００３６】
結果（図４）から、１０％FBSを補充したRPMI 1640培養培地中、種々の濃度の処方物Ｉで処理したヒト末梢血単核細胞がｄｓＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の損傷を示さなかったことが示される。コメット頭部（インタクトなＤＮＡ）には明らかな損傷は生じなかった（図４、中央）。対照的に、遺伝毒性作用を発揮することが知られる過酸化水素（０．１ｍＭ）では、はるかに迅速なｄｓＤＮＡ拡散（図４、上下）が検出される挙動が示され、これは、遺伝毒性を指し示すものであり、この現象に起因して、読み取り測定面積はブランクと比較してはるかに大きくなる（図４、下）。処方物Ｉで処理した試料の挙動はブランクと同様であり、これにより、処方物Ｉで２４時間処理することにより単核末梢血液細胞ＤＮＡに対する有害作用は生じないことが示される（図４）。さらに、過酸化水素によって誘導される遺伝毒性作用（Azqueta A.およびA. R. Collins、Arch Toxicol、2013、87:949）が再現され、これにより、実験条件下で、開発された方法体系が、感度が高く信用できるものであることが示される。処方物Ｉは、ヒト単核細胞ＤＮＡに対する有害作用を生じさせることなく細胞成長に対する効果を引き起こすものである。
【００３７】
実施例５
異なる濃度の処方物Ｉの効果をヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ−２９３）細胞株およびＶｅｒｏ細胞株（アフリカミドリザル腎臓細胞）において３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）を用いた微量希釈アッセイを使用して評価した（Mosmann T.、J. Immunol Methods、1983、65(1-2.):55）。ＭＴＴ法は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドの還元に基づき、細胞代謝機能を反映するアッセイである。ＭＴＴは、黄色の色素であり、生存細胞の呼吸鎖の一部であるミトコンドリアデヒドロゲナーゼにより還元されてホルマザン（青色の色素）になる（Hwa et al、2015）。ＭＴＴは、哺乳動物細胞の生存および増殖能力を決定するために適用される定量的比色定量微量希釈法に使用される（Mosmann T.、J. Immunol Methods、1983、65(1-2):55）。これは、生存細胞集団に関して単純であり、効率的であり、経済的であり、再現性があり、感度が高く、安全であり、かつ有効であるので、細胞増殖および細胞傷害性の評価に適したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験である。
【００３８】
１０％ウシ胎仔血清（FBS）および抗生物質の混合物（２００，０００ＩＵのペニシリンおよび０．５ｇのストレプトマイシン）１ｍＬを補充したダルベッコ改変イーグル最小必須培養培地／F12（DMEM/F12）を使用した。トリプシン溶液（Difco）０．２５％を調製した。２０００ｐｐｍの処方物Ｉのストック溶液およびTriton X-100からDMEM/F12を溶媒として段階希釈物を調製した。１．９５ｐｐｍ、３．９１ｐｐｍ、７．８１ｐｐｍ、１５．６３ｐｐｍ、３１．２５ｐｐｍ、６２．５０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、５００ｐｐｍおよび１０００ｐｐｍの濃度が得られるように各希釈物１ｍＬを調製した。各細胞培養物の細胞を、DMEM/F12  ２５ｃｍ３培養プレートを使用してプレート表面上に集密な単層が得られるまで成長させた。細胞培養のために使用した条件は、３７℃、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２であった。集密な細胞単層を２５ｃｍ３プレートから０．２５％トリプシンを使用して取り出した。これは以下の通り行った：DMEM/F12培地を除去し、次いで、単層をリン酸緩衝生理食塩水１×で１〜３回洗浄し、次いで、０．２５％トリプシン０．５ｍＬを添加し、内容物を３７℃、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２で５分間インキュベートした。DMEM/F12  ３ｍｌを取り出した細胞に添加し、細胞を０．１〜１ｍＬのマイクロピペットで再懸濁させ、１５ｍＬの滅菌円錐管に入れ、その後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。DMEM/F12を円錐管から除去した。DMEM/F12  ３ｍｌを細胞パックに添加し、細胞を再懸濁させ、Neubauerチャンバー中で計数を行った。次いで、１ｍＬ当たり細胞２５０，０００個の細胞懸濁液を調製した。ウェルマイクロプレート細胞懸濁液当たり、１ｍＬ当たり細胞２５０，０００個０．１ｍＬを９６ウェルマイクロプレートの全てのウェルに添加し、マイクロプレートを３７℃、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。各ウェルのDMEM/F12培地を真空で取り出し、単層を各ウェルの底部で維持し、次いで、処方物ＩおよびTriton X-100から調製した各希釈物（１．９５ｐｐｍ、３．９１ｐｐｍ、７．８１ｐｐｍ、１５．６３ｐｐｍ、３１．２５ｐｐｍ、６２．５０ｐｐｍ、１２５ｐｐｍ、２５０ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍおよび２０００ｐｐｍ）０．１ｍＬを添加した。さらに８ウェルに無処理の細胞を残し、細胞生存率についての対照として使用し（無処理の細胞培養培地−ブランク）、それに、DMEM/F12  ０．１ｍＬを添加した。その後、マイクロプレートを３７℃、加湿雰囲気中、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、DMEM/F12培地を処方物ＩおよびTriton X-100の試料と共に取り出し、ウェルをリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄した。０．０２ｍＬを５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液に添加し、内容物を３７℃で２時間インキュベートして、生細胞ミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるＭＴＴのホルマザンへの完全な還元プロセスを行った。その後、ＭＴＴ溶液を取り出し、形成されたホルマザン塩を保持し、次いで、それにイソプロピルアルコール０．１ｍＬを添加し、５４０ｎｍにおける吸光度をSynergy HTマイクロプレートリーダーでGEN5埋込式ソフトウェアを用いて読み取った。細胞生存率の百分率の算出において、無処理の培養培地で増殖した細胞を伴うウェルにおいて検出された吸光度を生細胞１００％とみなした。処方物Ｉ溶液は５連で試験し、陽性対照溶液は３連で試験した。試験を３つの別々の事象で行った。処方物ＩおよびTriton X-100のＬＣ５０データを、Graph Pad Prismバージョン６統計学的パッケージを使用し、スチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）によって推定した。データ解析の結果が平均±標準偏差として表されている（図５）。
【００３９】
５００ｐｐｍよりも低い濃度の処方物Ｉに関しては、ＨＥＫ−２９３細胞株およびＶｅｒｏ細胞株の増殖およびミトコンドリア活性の刺激が観察されたことが示された。増大は、ＨＥＫ−２９３株では１．９５ｐｐｍで１４０％であり、６２．５ｐｐｍ濃度では４０％を超えたが、Ｖｅｒｏ細胞の場合では、ブランクと比較してたった１０％であった。この結果から、処方物Ｉの細胞増殖を刺激する効果が証明される。
【００４０】
５００ｐｐｍを超えると、処方物Ｉ濃度が上昇するにしたがって細胞生存率の低下（図５）が観察されたことから、用量依存的な細胞傷害効果が観察された。
【００４１】
どちらの細胞株においても、陽性対照（Triton X-100）では、この物質が細胞傷害性化合物であることから予測されたものと一致して、この物質の濃度の上昇によって吸光度の低減が観察されたので、用量依存的効果が示され、試験したいずれの濃度でも生存率のいかなる増大（１００％を超える値）も伴わなかったが、ブランク（無処理）と比較して吸光度の低減が検出された。
【００４２】
処方物ＩおよびTriton X-100のＬＣ５０は、それぞれＨＥＫ−２９３細胞株については２，４１７．００±６５．７７ｐｐｍおよび７６４．１０±２１．９３ｐｐｍの値、ならびにＶｅｒｏ細胞株については４，２８９．００±２８９．９０ｐｐｍおよび４２．８０±１．６０ｐｐｍの値であると推定された。
【００４３】
得られた結果から、５０〜９０ｐｐｍの範囲の濃度で処方物Ｉの細胞傷害性は観察されないことが証明される。この用量では、細胞代謝刺激が観察される。観察された現象は、実施例３に記載されているものと同様であり、処方物Ｉが成長および細胞代謝因子−促進剤であるとみなされるべきであることを実証するものである。
【００４４】
実施例６
高用量−実施例２に記載されているA. salinaアッセイのＬＣ５０（１０００ｍｇ／ｋｇおよび１３５０ｍｇ／ｋｇ）よりも高い用量を用いた急性毒性アッセイ（単回適用、１４日間のモニタリング）、ならびに亜慢性毒性試験（毎日適用、１日２回、９０日間、５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇおよび９０ｍｇ／ｋｇ用量）において、齧歯類およびウサギ目モデル（ウィスターラットおよびニュージーランドウサギ）などの健康な実験動物における処方物Ｉの効果が観察された。各動物種の陰性対照動物においてプラセボ（精製水）の添加、体重および血糖の測定の同じ手順を並行して実施した。
【００４５】
実験動物に対して実施した全ての試験において、処置は、それぞれ齧歯類およびウサギ目に対する通常飼育による飼料消費後に、体重依存的に、経口胃カニューレを通じて経口投与で行った（Commission of the European Communities in Off. J. Eur. Comm (L 383 A)、1992、35:110）。
【００４６】
動物を個々のケージ内に保持し、処方物Ｉの投与後最初の２４時間にわたって持続的に観察し、観察を継続し、あらゆる動物応答について各試験期間に必要であった中間の獣医学的ケアを日誌に記録した。実験の開始時および実験の終了時に体重を測定し、記録した。ウサギの場合にはまた、各試験の前後に臨床検査を実施した：血液生体計測、血液化学ならびにトランスアミナーゼ酵素：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（TGP）およびトランスペプチダーゼガンマグルタミルトランスアミナーゼ（GGT）の活性。ラットでは、失血を防ぐためにこれらのパラメータを試験の最後にだけ決定した。最後に、動物に一連の麻酔薬および塩化カリウム（ＫＣｌ）を適用する安楽死ステップを進行した。その後、それぞれの場合に応じて、心臓、腎臓、脾臓、膵臓、肺、肝臓、卵巣および精巣を主に含む器官および基本組織の肉眼検査および剖検を行った。取得した試料を、病理組織学的試験を実施するために送付した。
【００４７】
急性毒性アッセイにおいて試験した最大用量は１３５０ｍｇ／ｋｇであった。これは、経口胃カニューレによって適用される最大体積が、齧歯類およびウサギ目に対して、それぞれ１ｍｌまたは３ｍｌであり、また、高用量の使用では、経口胃カニューレを通過させるのが難しい粘性の高い溶液が得られることが理由であった。試験した濃度では、実験動物のいかなる死亡も観察されず、したがって、ＬＤ５０値は決定されなかった。本発明に関して、肝酵素の重量および活性ならびに血液生体計測を含む評価されたパラメータの大部分について、処置前と処置後で、ならびにブランク（無処置）と比較して、有意差は示されないことが示された。しかし、処置した動物では、グルコースレベルの低下、尿酸およびコレステロールの減少（図６）が認められた。これらのパラメータはメタボリックシンドローム、痛風および糖尿病に関連するので、この試験結果により、単回、高用量の処方物Ｉを適用することにより、上記の代謝産物レベルの低下が導かれることが示され、言及された病状に対してこの処置を使用することの効果が確認される。
【００４８】
亜慢性毒性試験の結果の場合にも同じ傾向が観察された。処方物Ｉを種々の用量で適用することで、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニンおよび肝酵素のレベルの低下が観察された。しかし、統計学的に証明される差異はグルコース制御でのみ得られ、一方、他のパラメータの変化は、試験される動物の個体差に関連して標準偏差が大きいことを特徴とする。処置した動物の場合、体重の増加は対照よりも少なかった。さらに、肝酵素活性の反復的な低下が観察され、これは、処方物Ｉの肝臓活性を改善する効果の証拠と考えることができる。剖検実施中の特徴的な観察は、処方物Ｉで処置した動物では肉眼評価で顕著な筋肉の発達および体脂肪のわずかな発達が見られ、同様に、脂肪肝は示されなかった。９０日間にわたってケージ内での非常にわずかな動きで、すなわち、運動を伴わず体重および年齢に応じた通常の食物摂取で保持されたにもかかわらず全てこうであった。これらの結果からも、処方物Ｉの適用により、健康な哺乳動物において血液生体計測および肝機能を変化させることなく、脂肪組織の量の減少、グルコース制御、および時には血液化学の他の特性によって媒介される体重制御が可能になることが確認される。
【００４９】
実施例７
さらに、アロキサン誘導性糖尿病を有するラットおよびウサギにおける試験を実施した。この試験、ならびに亜慢性毒性試験では、処置は、３つの用量の処方物Ｉ（５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇおよび９０ｍｇ／ｋｇ）を適用した。処置を伴う動物の５つの群（インスリン＋３つの言及された用量の処方物Ｉ、７０ｍｇ／ｋｇの処方物Ｉおよびインスリン単独）を調査した。インスリングラルギンを０．７Ｕ／ｋｇの用量、２４時間ごとに単回の朝投与で皮下投与した。
【００５０】
アッセイの開始時および終了時の、糖尿病が誘導されたウサギにおける血液化学の分析結果の比較により、処置下であっても血糖が高レベルで顕在化することが見出された。尿素およびクレアチニンの増加が観察され、これにより、腎損傷が確認される。しかし、処方物Ｉを用いて処置したウサギの場合では、尿酸およびコレステロールのレベルの低下が観察された。
【００５１】
処置を適用する前および２１日間適用した後のウサギ血液の血液生体計測結果により、動物における誘導性糖尿病の結果として単球および血小板およびヘモグロビンが存在することに関連するパラメータの低減が示された。単球増加症は、単球として知られる白血球細胞の一種の存在が増大する状態である。単球は、骨髄において形成され、免疫系の正常な機能において重要な役割を果たす。血小板は、血液凝固に関与し、傷害の場合に出血を止めるのに役立つ。観察された変化により、アロキサン誘導性糖尿病の治療の間、血液障害または骨髄が形成された。
【００５２】
臨床的モニタリングの間、いくつかのウサギ検体で、あらゆる糖尿病の体で予測される臨床データである、食物および水の摂取の変化に伴う体重減少（多飲症を伴う食欲不振の期間）が示された。９０ｍｇ／ｋｇの処方物Ｉおよびインスリンを用いて処置した動物の群の一部のウサギでは、全ての他の動物と同様に体重減少は検出されず、体重増加の証拠さえあり、これにより、処方物Ｉが臓器保護を示すことが示される。図７（上）は、本試験で試験した動物の種々の群における体重変化の傾向を示す。処方物Ｉの適用により、体重減少の低減が導かれることが理解される。処方物Ｉおよびインスリンを用いて処置した群に関しては、９０ｍｇ／ｋｇの適用群においてより大きな体重増加が観察される。これにより、効果が用量依存的であることが示される。
【００５３】
同様に、インスリンおよび処方物Ｉを用いて処理した全ての検体では、実施例５および６と同様に、低血糖効果が示されることが確証された。図７（下）は、処置を適用してからの異なる日数での毛細血管グルコースレベルの平均値を示す。効果が、用量が異なると変動し、５０ｍｇ／ｋｇおよび７０ｍｇ／ｋｇでは９０ｍｇ／ｋｇと比較して大きいことが示されている。
【００５４】
図８（上）は、誘導性糖尿病を有するラットの群当たりの体重変化の平均値を示す。純粋なインスリン（Ｉ）を用いて処置した動物の群の場合では、体重減少の低減の傾向は、試験処置を用いて試験した他の群と比較してはるかに目に見えるものである。図８（下）は、グルコース濃度（毛細血管グルコース）の変化の平均値を示す。インスリンのみで処置したラットに関しては、１９日間の処置まで毛細血管グルコースが増加する傾向が見られた。この期間に、７０ｍｇ／ｋｇの処方物Ｉのみを適用することによりグルコースの増加がより効率的に制御されることが理解される。１型糖尿病動物におけるグルコースレベルの最も大きな低下は７０ｍｇ／ｋｇの用量で観察された。
【００５５】
誘導性糖尿病（１型糖尿病）を有するラットの臨床的モニタリングにおいて、インスリンのみまたは処方物Ｉのみで処置した群の検体では、ウサギの場合と同様に食物および水の摂取の変化が示され（多飲症を伴う食欲不振の期間）、これらの臨床データはあらゆる糖尿病の体で予測される。しかし、処方物Ｉ＋インスリンを用いた処置に供した群ではこれらの臨床データは示されず、したがって、言い換えれば、処置の適用が動物の生活の質の改善に役立ったこと、および、インスリンと併せた管理により、糖尿病を有する動物の臨床的な状態を改善することができたことが明らかであり、本発明において特許請求された効果が示される。
【００５６】
５０ｍｇ／ｋｇおよび７０ｍｇ／ｋｇの処方物Ｉ＋インスリン（グラルギン）を用いて処置したラットにおけるグルコースレベルは正常化する傾向があった（図８、下）。９０ｍｇ／ｋｇおよびインスリン（グラルギン）で処置した群のモニタリングに関しては、この短期間の曝露では血糖が正常化する傾向はなかったが、同じ用量の処置を行ったウサギ目種で得られたデータと非常に類似したデータが観察された（図７）。どちらの場合でも、結果から、処方物Ｉが糖尿病を有する哺乳類の臓器保護を示すことが実証される。
【００５７】
本試験のラットの種々の群間での血液化学分析結果の比較により、まだ処置中でも、血糖が高レベルで顕在化し、高い値の尿素およびクレアチニンが観察されたことが判明し、これにより、腎臓に対する損傷が確認される。血液生体計測結果から、試験した種々の群間で有意差は示されなかった。
【００５８】
１型糖尿病を有するウサギおよびラットの剖検後の肉眼試験では、サプリメントまたはインスリンのみで処置した群では最も重症の膵臓の変化が示されたことが観察され、病理組織学的切片において確認されている（図９）。したがって、アロキサンは糖尿病誘導因子として、この器官に影響を及ぼし、変化は全ての動物において予測されるものであった。しかし、処方物Ｉおよびインスリンを用いて処置した動物では、肉眼で検出可能な変化は示されなかった。レスベラトロールの、インスリン受容体の感受性を増大させる効果が知られている（Chachay V. S. et al、Br J Clin Pharmacol、2011、72 (1):27）。しかし、本発明の説明では、処方物Ｉは、インスリンの存在下で作用した場合に、動物器官に対するさらなる細胞保護効果および損傷を受けた組織の回復効果も示す。
【００５９】
糖尿病を誘導した動物の試料を用いて実施した病理組織検査結果によると、腎損傷（結果は血液化学分析と整合性があった）が観察される。しかし、インスリンおよび処方物Ｉを用いて処置した群の検体では、処方物Ｉまたはインスリン単独のみで処置した検体よりも少ない腎損傷が観察された。体重制御および毛細血管血糖の結果と共に、これらの結果により、試験期間（２１日）の間、処方物Ｉとインスリンを一緒に適用した処置により、腎臓および膵臓などの器官の、糖尿病によって引き起こされる変化からの保護が導かれることが証明される。
【００６０】
ここに示す実施例では、処方物Ｉの、インスリンと共に適用した場合に１型糖尿病哺乳動物の器官を悪化から保護する能力が確認される。さらに、血糖を制御する能力が認められ、これは、インスリンの存在下で増強され、また、この効果により、コレステロールおよび尿酸は低減しながら、体重増加が維持されることが認められる。
【００６１】
実施例８
４８歳の男性が胸部不快感を示し、その後、メタボリックシンドロームを有すると診断された。身体検査により、その人物は、体重８７ｋｇ、身長１７０ｃｍ、ＢＭＩ  ３２ｋｇ／ｍ２の肥満であることが示された。血圧（ＢＰ）は１６０／１１０ｍｍ  Ｈｇ、であり、空腹時血漿グルコース（ＧＡ）は１５０ｍｇ／ｄＬであり、トリグリセリド（Ｔｇ）は２１５ｍｇ／ｄＬであり、総コレステロール（ＴＣ）は３２０ｍｇ／ｄＬであり、ＬＤＬ−Ｃは２１２ｍｇ／ｄＬであり、ＨＤＬ−Ｃは３７ｍｇ／ｄＬであり、ＨｂＡｌｃは８．４６％であった。この患者を、次の６カ月にわたって実施例２に記載の処方物Ｉを１日３回、各食物摂取後に用いた処置に供した。処方物Ｉの適用形態をコップ１杯の水またはジュース懸濁液として調製した。療法の親和性を推定するためおよびあらゆる副作用を回避するために周期的な評価を行った。この処方物Ｉを用いた処置期間の後、生化学的試験の実施に進んだ。検出された値は、ＧＡ  １１５ｍｇ／ｄＬ、ＨｂＡｌｃ  ６．６９％、ＴＣ  ２３５ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−Ｃ  １２３．７ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ−Ｃ  ４０ｍｇ／ｄＬ、Ｔｇ  １１９ｍｇ／ｄＬであり、彼の体重は７４ｋｇに減少した。１１−デヒドロトロンボキサンＢ２および血小板凝集のレベルは、ベースラインと比較してそれぞれ７５％および９０％低下した。療法に対する応答は１００％であった。この手順により、患者のメタボリックシンドロームの危険因子が相当に修正された。
【００６２】
最後に、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満症を治療または予防するため、ならびに抗老化治療としての、グリシン、システイン、アルギニンおよびレスベラトロールの使用は上記の処方物Ｉおよび実施形態に限定されず、当業者は、本明細書に記載の教示により、範囲が特許請求の範囲によってのみ確立される本発明の治療用組成物を変化させるように訓練される。
【００６３】
参考文献
【００６４】
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【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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