(57)【要約】  本発明は、免疫療法において使用される、ペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号２４、および配列番号１〜配列番号２４と少なくとも８８％相同的なその変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド、およびその薬学的に許容可能な塩であって；前記変異型が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、および／またはＴ細胞を前記変異型ペプチドと交差反応させ；前記ペプチドが完全長ポリペプチドでない、ペプチド。
【請求項２】
ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣに結合した際に、ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができるようになる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
そのアミノ酸配列が、配列番号１〜配列番号２４のいずれか１つに記載の一続きのアミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載のペプチドまたはその変異型。
【請求項４】
前記ペプチドまたはその変異型が、８〜１００、好ましくは８〜３０、より好ましくは８〜１６のアミノ酸の全長を有し、最も好ましくは前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号２４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型。
【請求項５】
前記ペプチドが、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型。
【請求項６】
前記ペプチドが、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質の一部である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型をエンコードして、任意選択的に異種プロモーター配列に連結する、核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を発現する能力がある、または発現している、発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸または請求項８に記載の発現ベクターを含んでなり、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞である、組換え宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６に記載のペプチドを提示し、または請求項７に記載の核酸を発現し、または請求項８に記載の発現ベクターを含んでなる請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたはその変異型を前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を生産する方法。
【請求項１１】
Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に、または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子に、前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化させるのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を生産するインビトロ法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項１１に記載の方法によって生産される活性化Ｔリンパ球。
【請求項１３】
請求項１２で定義される活性Ｔ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞が、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する患者において、標的細胞を死滅させる方法。
【請求項１４】
ＭＨＣ分子と結合した際に、好ましくは請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を特異的に認識する、特に可溶性または膜結合抗体である、抗体。
【請求項１５】
医療で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
がんの診断および／または治療で使用される、またはがんに対する薬剤の製造で使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
前記がんが、配列番号１〜配列番号２４のペプチドがそれに由来するタンパク質の過剰発現を示す、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、およびその他の腫瘍の群から選択され、前記がんが、群から選択される（ｗｈｅｒｅｉｎ  ｓａｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｗｈｅｒｅｉｎ  ｓａｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ）、請求項１６に従って使用される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球または請求項１４に記載の抗体。
【請求項１８】
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド若しくはその変異型、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の細胞、請求項１２に記載の活性化Ｔリンパ球、または請求項１４に記載の抗体を含有する医薬組成物を溶液または凍結乾燥形態で含んでなる容器；
（ｂ）任意選択的に、前記凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；
（ｃ）任意選択的に、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される少なくとももう１つのペプチド、および
（ｄ）任意選択的に、（ｉ）前記溶液の使用、または（ｉｉ）前記凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキット。
【請求項１９】
（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（ｖ）フィルター、（ｖｉ）針、または（ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ペプチドが、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２１】
ＨＬＡリガンドと反応する、好ましくは可溶性または膜結合性ＴＣＲまたはその機能性断片である、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記リガンドが、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する、または前記アミノ酸配列が配列番号１〜配列番号２４からなる、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞受容体が、可溶性分子として提供され、任意選択的に抗体断片、免疫刺激ドメインおよび／または毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する、請求項２１に記載のＴ細胞受容体。
【請求項２３】
前記ＴＣＲが、αおよびβ鎖定常ドメイン配列を含んでなるα／βヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記定常ドメイン配列が、例えば、どちらかのＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間で、天然ジスルフィド結合によって連結する、請求項２１または２２に記載のＴ細胞受容体。
【請求項２４】
前記ＴＣＲが、検出可能標識、治療薬、ＰＫ修飾部分またはそれらの任意の組み合わせと結合する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体。
【請求項２５】
前記治療薬が、前記ＴＣＲのα鎖またはβ鎖のＣ末端またはＮ末端に共有結合する抗ＣＤ３抗体である、請求項２４に記載のＴ細胞受容体。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体をコードする核酸であって、任意選択的に、異種プロモーター配列、または前記核酸を発現できる発現ベクターに連結する、核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸、または請求項１４に記載の抗体をコードする核酸、または請求項２６に記載の発現ベクターを含んでなる、好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞である、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２７に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記Ｔ細胞受容体を前記宿主細胞および／またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体を生産する方法。
【請求項２９】
ａ）前記個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；
ｂ）ａ）で同定された前記ペプチドを、正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および／または過剰提示について予備選別されたペプチド貯蔵庫と比較するステップと；
ｃ）少なくとも１つのペプチドを、前記患者において同定されたＴＵＭＡＰと一致する前記貯蔵庫から選択するステップと；
ｄ）ステップｃ）に基づいて、前記個別化ワクチンまたは化合物ベースのまたは細胞療法を作成および／または処方するステップとを含んでなる、個々の患者のための化合物ベースのおよび／または細胞療法のための個別化抗がんワクチンを生産する方法。
【請求項３０】
前記ＴＵＭＡＰが、
ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；
ａ２）前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップと
によって同定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
結合ペプチドを前記腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から溶出させて、前記溶出したリガンドを配列決定することで、ＭＨＣリガンドの配列が同定される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍サンプルの組織型に対応する前記正常組織が、前記同一患者から得られる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドが、
ａａ．正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ａｂ．ステップａａで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ａｃ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用した生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップ；
ｂａ．ＨＬＡリガンドを前記腫瘍サンプルから質量分析を使用して同定するステップと；
ｂｂ．正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ｂｃ．前記同定されたＨＬＡリガンドを前記遺伝子発現データと比較するステップと；
ｂｄ．ステップｂｃで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ｂｅ．ステップｂｄから選択されたＴＵＭＡＰを腫瘍組織上で再検出し、健常組織上の検出欠如または希な検出が、ｍＲＮＡレベルにおける過剰発現の関連性を裏付けるステップと；
ｂｆ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用した生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップと
に基づいて同定される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドの免疫原性が、生体外免疫原性アッセイ、個々のＨＬＡ結合についての患者免疫モニタリング、ＭＨＣ多量体染色、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび／または細胞内サイトカイン染色を含んでなる方法によって判定される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記貯蔵庫が、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される複数のペプチドを含んでなる、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも１つの変異を同定するステップと、前記ワクチンに包含するために、または細胞療法を作成するために、前記変異に関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなる、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの変異が、全ゲノム配列決定によって同定される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ａ）配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択されるペプチド；
ｂ）ａ）に記載のペプチドおよび／または前記ペプチドＭＨＣ複合体と反応性のＴ細胞受容体；
ｃ）ａ）に記載のペプチドと、前記ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端のアミノ酸１〜８０とを含んでなる融合タンパク質；
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかをコードする核酸、または前記核酸を含んでなる発現ベクター；
ｅ）ｄ）の発現ベクターを含んでなる宿主細胞；
ｆ）Ｔ細胞を、抗原特異的様式で前記Ｔ細胞を活性化するのに十分な時間にわたり、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるａ）に記載のペプチドと生体外で接触させるステップを含んでなる方法、ならびにこれらの活性化Ｔ細胞を自己または他の患者に移入する方法によって得られる、活性化Ｔリンパ球；
ｇ）ａ）に記載のペプチドおよび／または前記ペプチド−ＭＨＣ複合体および／またはａ）に記載のペプチドを提示する細胞と反応性であり、例えば、免疫活性化ドメインまたは毒素との融合によって潜在的に修飾される、抗体、または可溶性Ｔ細胞受容体；
ｈ）配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択されるペプチドを認識し、および／または配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択されるペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する、アプタマー；
ｉ）ａ）〜ｈ）のいずれかに記載のコンジュゲートされまたは標識されたペプチドまたはスキャフォールド
からなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分と、薬学的に許容できる担体、および任意選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、好ましくはＭＨＣ分子と結合している請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を特異的に認識する、アプタマー。
【請求項４０】
請求項３８に記載の医薬品組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、がんを治療する方法。
【請求項４１】
前記がんが非小細胞肺がんである、請求４１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、免疫療法で使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本明細書は、がんの免疫療法に関する。本明細書は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激しまたは生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。
【０００２】
本明細書は、がん細胞を標的とするための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成するための上記ペプチドの使用、それを発現するＴ細胞の生成、およびそれを使用してがんを治療する方法にさらに関する。ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ分子に由来する、新規ペプチド配列およびそれらの変異型は、抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物中で、または薬理的／免疫学的活性化合物および細胞の開発のための標的として、使用され得る。好ましいのは、アミノ酸配列ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）を有するペプチドである。
【背景技術】
【０００３】
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、顕微鏡下における観察時のがん細胞のサイズに応じて命名され、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）と区別されなければならない。ＮＳＣＬＣは、全ての肺がんの約８５％?９０％を占める（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１５）。
【０００４】
双方の肺がん（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）は、男性および女性の双方で２番目に頻度の高いがんである。肺がんはがん死亡の主要原因であり、約２５％を占める。したがって、毎年、結腸がん、乳がん、および前立腺がんを合わせたよりも多くの人々が、肺がんで死亡する。さらに、双方の肺がんは、全ての新規がんの約１３％（１８０万例以上）を占める。肺がんは、主に高齢者に発生する。診断時の平均年齢は、約７０歳である。全ての症例の２％未満が、４５歳未満の人々において診断される。
【０００５】
４つの主要なタイプのＮＳＣＬＣ、すなわち、腺がん、扁平上皮がん、気管支肺胞がん、および大細胞がんがある。腺がんおよび扁平上皮がんは、細胞形態に基づくＮＳＣＬＣの最も一般的なタイプである（Ｔｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３６１−３９５，１９９６）。腺がんは、肺のより辺縁の位置にあることで特徴付けられ、しばしばＫ−ｒａｓがん遺伝子に変異を有する（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１４，２６１−２６７，１９９４）。扁平上皮がんは、典型的に、より中心に位置し、しばしばにｐ５３遺伝子変異を有する（Ｎｉｋｌｉｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｌｉａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．，３９，１４７−１４８，２００１）。
【０００６】
肺がんの発症および進行に関連する多くの遺伝子変異が報告されているが、正確な分子機序は不明なままである（Ｓｏｚｚｉ，Ｇ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３７：６３−７３（２００１））。ＮＳＣＬＣの大部分は、ｒａｓ変異の存在によって特徴付けられ、それによって、患者は既知のキナーゼ阻害剤による治療に対して、比較的非感受性になる。その結果、現在の肺がん治療は、一般に、細胞毒性薬、手術、および放射線療法に限定される。過去１０年間に、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、およびビノレルビンをはじめとする、新たに開発された細胞毒性薬が登場し、進行したＮＳＣＬＣを有する患者に複数の治療選択肢が提供されるようになった；しかし、新しいレジメンのそれぞれは、シスプラチンベースの治療法と比較して、軽微な生存利益しか提供し得ない（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：９２−９８（２００２）；Ｋｅｌｌｙ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９：３２１０−３２１８（２００１））。したがって、分子標的薬の開発などの新たな治療ストラテジーが、臨床医によって熱心に待たれている。
【０００７】
がんの免疫療法は、がん細胞を特異的に標的化しながら副作用を最小化する選択肢に相当する。がん免疫療法は、腫瘍関連抗原の存在を利用する。
【０００８】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の現在の分類は、以下の群に分類され得る：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る、最初に同定されたＴＡＡはこのクラスに属し、元々はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍において発現し、正常組織では精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ  ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーおよびＮＹ−ＥＳＯ−１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、黒色腫および正常メラノサイトに見いだされる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現ＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍において検出され、多数の正常組織においても概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示されるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、以前確立された免疫寛容を破壊することにより、抗がん応答を始動し得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β−カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的（関連）イソ型を有するタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性（または関連性）はまた、ペプチドが腫瘍（関連）エクソンに由来する場合に生じてもよい。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、特異的でなく腫瘍において過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍において主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍にＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターン、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシングのような事象から生じる。
ｆ）オンコウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程において重要な役割を果たしてもよく、外来性である（ヒト由来でない）ため、それらはＴ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんにおいて発現される、ヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。
【０００９】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的とする。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞において発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。
【００１０】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は、ペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される結合溝をもたらす。ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見いだされる。それらは、主に、内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見いだされる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される（Ｂｒｏｓｓａｒｔ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ，１９９７；Ｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に主に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣによって取り込まれ、続いてプロセシングされる、外因性タンパク質または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。
【００１１】
ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。
【００１２】
ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答を誘導し維持する上で重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である（Ｇｎｊａｔｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞が、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和性サイトカイン環境を維持して（Ｍｏｒｔａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、例えば、ＣＴＬ、ナチュラル、キラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００１３】
炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系の細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが判明している（Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。伸長された（より長い）本明細書のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。
【００１４】
ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を統合するのに重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。
【００１５】
例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であってさえも、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１；Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＣＤ４  Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある（Ｂｒａｕｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００１６】
ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかし、Ｄｅｎｇｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、いくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを腫瘍から直接、成功裏に同定した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。
【００１７】
ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。
【００１８】
ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８〜１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。
【００１９】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応において、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。
【００２０】
タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞当たりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、（ｕｎｄ）したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい（Ｓｉｎｇｈ−Ｊａｓｕｊａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。
【００２１】
したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイル、またはペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。それは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本明細書の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。
【００２２】
本明細書による特異的ＴＣＲ（例えば可溶性ＴＣＲ）および抗体またはその他の結合分子（スキャフォールド）によってペプチドＭＨＣを標的化する場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。
【００２３】
ＴＡＡに関する基礎的および臨床的研究の著しい進歩にもかかわらず（Ｒｏｓｅｎｂｅｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：３２１−７（１９９８）；Ｍｕｋｈｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８０７８−８２（１９９５）；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２４７９−８３（１９９６））、がんの治療のための候補ＴＡＡは、限られた数しか利用できない。がん細胞で豊富に発現され、同時に発現ががん細胞に限定されるＴＡＡは、免疫療法標的として有望な候補であろう。さらに、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新規ＴＡＡの同定は、様々ながん型におけるペプチドワクチン接種ストラテジーの臨床的使用を促進すると期待されている（Ｂｏｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：７２５−９（１９９６）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−７（１９９１）；Ｂｒｉｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９−９５（１９９３）；Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７−５２（１９９４）；Ｓｈｉｃｈｉｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２７７−８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１９１４−８（１９９７）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８８：１４４２−５（１９９６）；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３１３４−４２（１９９９）；Ｖｉｓｓｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５５５４−９（１９９９）；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５６：３３０８−１４（１９９６）；Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４４６５−８（１９９７）；Ｆｕｊｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８０：１６９−７２（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：４５９−６６（１９９９）；Ｏｉｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：３８７−９４（１９９９））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
さらに、がん治療のための分子標的薬の開発が進展しているものの、応答する腫瘍型の範囲、ならびに治療の有効性は依然として非常に限られている。したがって、悪性細胞に高度に特異的な分子を標的化し、有害反応が最小限または皆無である、新たな抗がん剤を開発することが急務である。がんのより良い診断、予後の評価、および治療成功の予測につながる、がん全般、特にＮＳＣＬＣのためのバイオマーカーに相当する要素を同定する必要性もある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
一態様では、本明細書は、配列番号１〜配列番号２４、または配列番号１〜配列番号２４と少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも８５％相同的な（好ましくは少なくとも７５％または少なくとも８５％同一の）それらの変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、ペプチドに関し、前記変異型は、ＭＨＣと結合し、および／またはＴ細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【００２６】
本明細書は、配列番号１〜配列番号２４、または配列番号１〜配列番号２４と少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％相同的な（好ましくは少なくとも７５％または少なくとも８５％同一の）その変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、本明細書のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４アミノ酸の全長を有し、前記ペプチドまたは変異型は、ＭＨＣに結合し、および／またはＴ細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導する。
【００２７】
以下の表は、本明細書によるペプチド、およびそれらの各配列番号を示す。
【００２８】
【表１】
2019515650.tif 000002
【００２９】
別の態様では、本明細書は、例えば、以下の一般式Ｉに記載のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドなどのＭＡＧ−００３ペプチドに関し；
Ｘ１Ｘ２ＬＥＨＶＶＲＸ３（配列番号５）
式Ｉ
式中、Ｘ１はアミノ酸ＫおよびＹから選択され、Ｘ２はアミノ酸Ｖ、Ｌ、およびＡから選択され、Ｘ３はＶ、Ｌ、Ａ、およびＩから選択され、前記ペプチドは、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合し、および／またはＴ細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導する。一態様では、前記ペプチドは、その基礎となる全長ポリペプチドではない。
【００３０】
本明細書は、さらに、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどの増殖性疾患の治療で使用するための本明細書によるペプチドに一般に関する。
【００３１】
特に好ましいのは、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される、本明細書による単独のまたは組み合わされたペプチドである。より好ましいのは、配列番号１〜配列番号２４（表１を参照されたい）からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチドと、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、好ましくは神経膠芽腫、胃がん、肺がん、肝細胞がん、結腸直腸がん、膵臓がん、食道がん、卵巣がん、および非小細胞肺がんの免疫療法におけるそれらの使用である。
【００３２】
本明細書は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有し、または長さ変異型などの伸長形態では、ＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有する、本明細書によるペプチドにさらに関する。
【００３３】
本明細書は、本明細書によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは（それぞれ）配列番号１〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になる。
【００３４】
本明細書は、本明細書によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む。
【００３５】
本明細書は、本明細書によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体（またはその配列中）に融合した、融合タンパク質の一部である。
【００３６】
本明細書は、本明細書によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本明細書は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本明細書による核酸にさらに関する。
【００３７】
本明細書は、本明細書による核酸を発現でき、および／または発現する、発現ベクターにさらに関する。
【００３８】
本明細書は、疾患の治療および医療で、特にがんの治療で使用するための本明細書にるペプチド、本明細書による核酸、または本明細書による発現ベクターにさらに関する。
【００３９】
本明細書は、本明細書によるペプチドに対して、または前記本発明によるペプチドとＭＨＣの複合体に対して特異的な対抗と、それらを生産する方法とにさらに関する。
【００４０】
本明細書は、前述のような本明細書による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【００４１】
本明細書は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本明細書による宿主細胞にさらに関する。
【００４２】
本明細書は、本明細書による宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本明細書によるペプチドを生産する方法にさらに関する。
【００４３】
本明細書は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子上に抗原が負荷される、本明細書による方法にさらに関する。
【００４４】
本明細書は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号２４を含有する、好ましくは配列番号１〜配列番号２４または変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現する能力がありおよび／または発現する、発現ベクターを含んでなる、本明細書による方法にさらに関する。
【００４５】
本明細書は、本明細書による方法によって生産される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本明細書によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。
【００４６】
本明細書は、本明細書によって生産されるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本明細書による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【００４７】
本明細書は、薬剤としてのまたは薬剤の製造における、記載される任意のペプチド、本明細書による核酸、本明細書による発現ベクター、本明細書による細胞、本明細書による活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体または抗体またはその他のペプチド結合分子および／またはペプチド−ＭＨＣ結合分子の使用にさらに関する。好ましくは、前記薬剤は、がんに対して有効である。
【００４８】
好ましくは、前記薬剤は、可溶性ＴＣＲまたは抗体に基づく、細胞療法、ワクチンまたはタンパク質である。
【００４９】
本明細書は、本明細書による使用にさらに関し、前記がん細胞は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、好ましくは非小細胞肺がんである。
【００５０】
本明細書は、がん、好ましくは非小細胞肺がんの診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本明細書によるペプチドをベースとするバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的とする免疫療法である、治療の成功確率を予測するために使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。任意選択的に、抗体は、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。
【００５１】
本明細書は、前記標的の少なくとも１つを認識するＴＣＲを同定するための、好ましくはＴ細胞を活性化する前記ＴＣＲを同定するための、これらの新規標的の使用にさらに関する。
【００５２】
本明細書はまた、がん治療の文脈におけるこれらの新規標的の使用に関する。
【００５３】
本発明はさらに、ＴＣＲ、個々のＴＣＲサブユニット（単独または組み合わせ）、およびそのサブドメイン、特に可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）およびクローニングされたＴＣＲを生産するための本発明のペプチドの使用にさらに関し；前記ＴＣＲは自己由来または同種異系Ｔ細胞に組み込まれ、同ＴＣＲ、ならびに前記ＴＣＲを保有しまたは前記ＴＣＲと交差反応するその他の細胞を生産する方法にさらに関する。
【００５４】
本明細書は、ＴＣＲタンパク質、個々のＴＣＲサブユニット（単独または組み合わせ）、およびそのサブドメインにさらに関し、特に、ＴＣＲα鎖可変ドメインおよびＴＣＲβ鎖可変ドメインを含んでなるＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）−ＨＬＡ−Ａ＊０２複合体と結合する、可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）およびクローン化ＴＣＲＰにさらに関する。
【００５５】
本明細書は、本明細書のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離核酸にさらに関する。本明細書はさらに、ＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を含む組換え発現ベクターに関する。本明細書は、本明細書に従って生産されたＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を含んでなる組換え発現ベクターにさらに関する。
【００５６】
本明細書はさらに、本明細書のＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を発現する組換え発現ベクターを含んでなる、単離された宿主細胞に関する。
【００５７】
本明細書は、本明細書の組換え発現ベクターを含んでなる単離された宿主細胞にさらに関し、好ましくはその中で細胞は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。
【００５８】
本明細書は、本明細書の組換え発現ベクターを含んでなる単離されたＰＢＬにさらに関し、その中でＰＢＬは、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００５９】
本明細書は、本明細書の少なくとも１つの宿主細胞を含んでなる細胞集団にさらに関する。
【００６０】
本明細書は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどの増殖性疾患の治療で使用するための本明細書のＴＣＲタンパク質にさらに関する。
【００６１】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて腫瘍増殖に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。
【００６２】
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【００６３】
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞毒性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然のペプチド提示標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
【００６４】
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短くあり得て、１０、１１、または１２以上に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本明細書のペプチドの伸長された変異型）の場合、それらは１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上に長くあり得る。
【００６５】
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内で塩ではないので、本明細書によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態がペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。
【００６６】
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープが保持されれば、本明細書にとって重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。
【００６７】
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本明細書にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
【００６８】
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本明細書における「免疫原」である）。本明細書では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本明細書では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
【００６９】
クラスＩ  Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ  ＭＨＣ受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
【００７０】
ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、およびＨＬＡ−Ｂ＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
【００７１】
【表２−１】
2019515650.tif 000003
【表２−２】
2019515650.tif 000004
【００７２】
ＭＡＧＥＡ４遺伝子は、ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、互いに５０?８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。ＭＡＧＥＡ遺伝子のプロモーターおよび第１のエクソンは、かなりの変動性を示し、この遺伝子ファミリーの存在が、異なる転写制御下で同じ機能を発現できるようにすることが示唆される。ＭＡＧＥＡ遺伝子は、染色体位置Ｘｑ２８でクラスター化する。それらは、先天性角化異常症などのいくつかの遺伝性疾患に関与するとされている。同一タンパク質をコードする少なくとも４つの変異型が、この遺伝子について判明している。［ＲｅｆＳｅｑ提供、２００８年７月］
ＭＡＧＥＡ４の局在化は、細胞質性として記載されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかし、ＭＡＧＥＡ４染色はまた核内でも検出されており、高分化度がんと低分化型化ガンとの対比では、核と細胞質の間で示差的分布が示された。（Ｓａｒｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００７３】
ＭＡＧＥＡ４は、雄生殖細胞マーカーとして使用される。これは、精原細胞では発現されないが、前精原細胞および成熟胚細胞で発現される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００７４】
ＭＡＧＥＡ４は、がん胎児性タンパク質またはがん精巣抗原である。ＭＡＧＥＡ４の直接的な腫瘍促進効果に関する、明確な証拠はない。１つの研究は、ＭＡＧＥＡ４の過剰発現が、細胞周期停止およびアポトーシスを阻害することによって、自然に形質転換した正常な口腔ケラチノサイトの増殖を促進することを提案する（Ｂｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかし、他の報告は、過剰発現がアポトーシスおよびカスパーゼ−３活性を増加させた一方で、ＭＡＧＥＡ４サイレンシングはカスパーゼ−３活性の低下をもたらしたことから、ＭＡＧＥＡ４の生体外腫瘍抑制効果を示唆する（Ｐｅｉｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。他の研究者らは、ＭＡＧＥＡ４のＣ末端断片が、生体外でアポトーシス促進活性を有すること（Ｓａｋｕｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、およびそれが腫瘍性タンパク質ガンキリンとの相互作用を通じて、足場非依存性増殖を阻害すること（Ｎａｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を報告した。
【００７５】
腫瘍転移との関連性についての散発的な証拠がある：ＭＡＧＥＡ４発現は、食道扁平上皮がんにおけるリンパ節転移（Ｆｏｒｇｈａｎｉｆａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、膀胱がんにおける筋肉浸潤性がんへの進行（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、および外陰がんにおけるリンパ節転移（Ｂｅｌｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と関連付けられている。
【００７６】
ＭＡＧＥＡ４とがん幹様細胞との関連性についての明確な証拠はない。しかし、ＭＡＧＥＡ４発現は、肺、結腸、および乳房をはじめとする様々ながん細胞株由来のサイドポピュレーション細胞（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、およびホジキンリンパ腫腫瘍サンプル（Ｓｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）で検出されている。さらに、ＭＡＧＥＡ４は、未分化ヒト胚性幹細胞ならびにそれらの分化誘導体、奇形がん細胞で記載されている（Ｌｉｆａｎｔｓｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００７７】
がんにおけるＭＡＧＥＡ４の過剰発現−ＭＡＧＥＡ４の発現は、多数の様々ながん型で記載されている。特定のがん組織の詳細については、下のサブセクションを参照されたい。ここに掲載されているのは、以下の特定のセクションでカバーされていないがん型に関する、いくつかのさらなる情報のみである。
【００７８】
原発性黒色腫では、ＭＡＧＥＡ４の発現は、免疫組織化学検査によって、腫瘍の１０?３０％、遠隔転移の最大４４％で検出されている（Ｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌｕｆｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。頭頸部の原発性粘膜黒色腫は、ＭＡＧＥＡ４染色に対して、最大６０％の陽性を示した（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００７９】
膀胱がんでは、ＭＡＧＥＡ４は、非筋肉浸潤性腫瘍の３８％、筋肉浸潤性腫瘍の４８％、原位置がん腫の６５％、およびリンパ節転移の７３％において観察された（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。別の研究では、いくらか低頻度の膀胱がんにおけるＭＡＧＥＡ４の発現が記載されており、腺がん（４／１５、２７％）、肉腫様がん（（４／１４、２９％）、小細胞がん（５／２０、２５％）または移行上皮がん（２８１／１，５２２、１９％）と比較して、最高頻度は扁平上皮がん（２５／５５、４６％）であった（Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。尿路上皮がんでは、ＭＡＧＥＡ４の発現は、免疫組織化学検査によって６４％の症例で、ＲＴ−ＰＣＲによって５８％の症例で検出された。（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＭＡＧＥＡ４は、ＲＴ−ＰＣＲによって、頭頸部扁上皮がんサンプルの４０?６０％においてで検出された（Ｃｕｆｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＭＡＧＥＡ４発現は、口腔扁平上皮がんサンプルの５７％で検出された（Ｍｏｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。分析された７０個の良性および悪性の甲状腺腫瘍サンプルのいずれでも、免疫組織化学検査によってＭＡＧＥＡ４発現は検出されなかった（Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＭＡＧＥＡ４の発現は、古典的セミノーマでのみ見いだされたが、非セミノーム性精巣胚細胞腫瘍では見られなかった（Ａｕｂｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＭＡＧＥＡ４の発現は、１４％（５／３５）の消化管間質性性（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｏｍａｌ）腫瘍（において検出された（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【００８０】
小児髄芽腫では、ＭＡＧＥＡ４  ｍＲＮＡは、２８％（７／２５）で検出されたが、免疫反応性は４％（１／２５）のサンプルでのみ観察された（Ｏｂａ−Ｓｈｉｎｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。別の研究では、１８％（２／１１）の髄芽腫において弱いＭＡＧＥＡ４  ｍＲＮＡが見いだされた（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００８１】
１つの研究では、ＭＡＧＥＡ４が成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫サンプルの６０％で発現されたことが見いだされた（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。別の報告では、非ホジキンリンパ腫サンプルの５％（２／３８）のはるかに低い発現頻度、およびホジキン病サンプルの２０〜３０％の頻度が報告されている。ホジキンリンパ腫では、リード・シュテルンベルク細胞が最も強く染色された細胞であったのに対して、周辺の細胞は染色されなかった（Ｃｈａｍｂｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＭＡＧＥＡ４発現は、３９個の多発性骨髄腫サンプルにおいて検出されなかった（Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００８２】
ＭＡＧＥＡ４免疫反応性は、子宮頸部扁平上皮がんの３３％（２０／６０）において検出可能であった（Ｓａｒｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００８３】
ＭＡＧＥＡ４の発現は、免疫組織化学検査によって、類内膜腺がんの１２％、子宮乳頭状漿液がんの６３％、子宮がん肉腫の９１％に存在することが見いだされた。腫瘍集団内で、ＭＡＧＥＡ４発現の程度は、がん肉腫において最も高かった（Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００８４】
免疫組織化学検査によって検出されるＭＡＧＥＡ４染色は不均一であり、腫瘍細胞の５０％超で、陽性腫瘍の一部のみがＭＡＧＥＡ４を発現する（Ｒｅｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓａｒｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００８５】
様々ながん型におけるＭＡＧＥＡ４の発現を報告する多数の研究とは対照的に、ＭＡＧＥＡ４と、転帰および予後との関連性についての証拠は、より限定的である。しかしながら、いくつかの報告は、ＭＡＧＥＡ４発現と臨床パラメータとの相関を見いだしている。頭頸部扁上皮がんでは、ＭＡＧＥＡ４発現は芳しくない全生存と相関しており、転帰不良の独立した予後指標であった（Ｃｕｆｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。膀胱がんでは、ＭＡＧＥＡ４発現は、再発および筋肉浸潤性がんへの進行と相関し（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、強力なＭＡＧＥＡ４染色は、生存率低下と関連付けられている（Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。消化管間質腫瘍では、ＭＡＧＥＡ４の発現は、その他のがん精巣抗原と共に、再発と相関し（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、外陰がんでもまた、ＭＡＧＥＡ４は、再発性腫瘍においてより頻繁に検出された（Ｂｅｌｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００８６】
ＭＡＧＥＡ４発現と進行した腫瘍ステージとの関連性についての証拠は、様々ながん型を包含するいくつかの報告によって提供される：悪性黒色腫において、ＭＡＧＥＡ４発現は、進行性疾患で原発性腫瘍の９％から遠隔転移の４４％まで増加した（Ｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。また、外陰がんにおいても、ＭＡＧＥＡ４発現は、リンパ節転移を伴う腫瘍においてより頻度が高かった（Ｂｅｌｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに、ＭＡＧＥＡ４発現は、子宮内膜がん（Ｃｈｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、子宮頸部扁平上皮がん（Ｓａｒｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、および膀胱がん（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）において、高悪性度腫瘍または進行した段階に関連していた。
【００８７】
ＭＡＧＥＡ４は、腫瘍細胞によって発現されるようであり、間質細胞、血管細胞、免疫細胞またはその他の腫瘍関連細胞における発現の証拠はない。さらに、ＭＡＧＥＡ４発現は、胃がん細胞株（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、食道がん細胞株（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、膵臓がん腫細胞株（Ｋｕｂｕｓｃｈｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、００４）、および頭頸部扁上皮がん細胞株（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）などの培養腫瘍細胞株においても検出された。
【００８８】
【表３】
2019515650.tif 000005
【００８９】
治療標的としてのＭＡＧＥＡ４−免疫療法標的（ワクチン、アジュバント、ＣＡＲ）
進行した食道がん、胃がんまたは肺がんを有する２０人の患者に、３００μｇのタンパク質を含有するＭＡＧＥＡ４ワクチンが、６回の投与で皮下投与された。１回のワクチン接種サイクルを完了した１５人の患者のうち４人がＭＡＧＥＡ４特異的体液性応答を示し、これらの患者は抗体応答のない患者よりも全生存期間が長いことが示された。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答がそれぞれ３人の患者および６人の患者で観察され、ＣＤ４Ｔ細胞ではなくＭＡＧＥＡ４特異的ＩＦＮγ産生ＣＤ８Ｔ細胞の誘導を有する患者は、誘導のない患者より長く生存した（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００９０】
ＯＫ４３２およびモンタニドと共に融合ペプチドＭＡＧＥ−Ａ４−Ｈ／Ｋ−ＨＥＬＰ（グリシンリンカーによってＭＡＧＥ−Ａ４（１４３−１５４）キラーエピトープに融合されたＭＡＧＥ−Ａ４（２７８−２９９）ヘルパーエピトープ）で治療された、肺転移を有する結腸がん患者についての症例報告がある。治療は、ＭＡＧＥＡ４特異的Ｔｈ１およびＣＴＬ免疫応答と、ＭＡＧＥＡ４特異的ＩｇＧとを誘導した。最終診断えは、腫瘍増殖およびがん胎児性抗原腫瘍マーカーが減少した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００９１】
第Ｉ相臨床試験では、食道がん患者において、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２に結合したＭＡＧＥＡ４（１４３−１５１）に対して反応性のＴＣＲ操作自己ＣＴＬの養子免疫伝達が調査された。患者には、予備調節治療なしでＴＣＲ形質導入リンパ球が１回投与され、それに続いて２週間および４週間後に、ＭＡＧＥＡ４ペプチドで皮下免疫化された。おそらくは、リンパ枯渇レジメンおよびＩＬ２の投与の欠如のために、客観的な腫瘍退縮は観察されなかった（Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。マウスにおける前臨床試験は、移入されたＴ細胞が、マウスに接種されたＭＡＧＥＡ４発現腫瘍細胞株の増殖を阻害し、さらなるペプチドワクチン接種がこの抗腫瘍活性を増強することを実証した（Ｓｈｉｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００９２】
ＥＢＶ陰性ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の治療選択肢として、養子ＣＴＬ移入を用いたＭＡＧＥＡ４の標的化が提案されている。ＥＢＶ由来ペプチドを標的とする注入ＣＴＬは、ＥＢＶ（＋）リンパ腫患者において完全な寛解を誘導すると記載されている。したがって、ＭＡＧＥＡ４をはじめとするリンパ腫によって発現されるその他の抗原を標的化することは、可能な治療選択肢として調査されている（Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００９３】
いくつかの研究は、重複ペプチド貯留でパルス処理された自己由来抗原提示細胞との培養後における、健常ドナーおよびがん患者からのＭＡＧＥＡ４特異的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の生成を実証している（Ｃｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｏｈｋｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００９４】
ＭＡＧ−００３、すなわち、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）は、ＭＡＧＥＡ４（アミノ酸２８６〜２９４）のＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープである。その内容全体が本明細書に参照により援用される（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。一態様では、ＭＡＧ−００３は、生体外とＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂ遺伝子組換えマウスの双方において、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−陽性ＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘発する。別の態様では、誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束様式で標的細胞を溶解し、ＭＡＧ−００３が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ＣＴＬエピトープであり、治療的抗腫瘍ワクチン接種の標的の役割を果たすことが実証される。その内容全体が参照により本明細書に援用される（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【００９５】
さらに、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩルーチン（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）は、絶対スコア２５および相対スコア０．６９でのＭＡＧ−００３のＡ＊０２：０１への結合を予測する。本発明者らは、同定の１００％が、ＭＡＧ−００３のＡ＊０２陽性サンプルへの結合に由来することを確認した。
【００９６】
【表４】
2019515650.tif 000006
【００９７】
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のＴＡＡの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟ＴＣＲなどの安全性リスクが高い治療選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。
【００９８】
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された。腫瘍組織標本が手術直後にスナップ凍結され、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化された。ＴＲＩ試薬（独国ダルムシュタットのＡｍｂｉｏｎ）を使用して、これらのサンプルから全ＲＮＡが調製され、ＲＮｅａｓｙ（独国ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施された。
【００９９】
腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、ＣｅＧａＴ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、次世代配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって実施された。簡単に述べると、配列決定ライブラリーは、ＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｖ４試薬キットを使用して、販売業者（米国カリフォルニア州サンディエゴのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）のプロトコルに従って作成される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、５０ｂｐのシングルエンドリードが生成される。処理された読み取りは、ＳＴＡＲソフトウェアを使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされる。発現データは、ｅｎｓｅｍｂｌ配列データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌ７７）の注釈に基づいて、ＲＰＫＭ（１００万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たり読み取り、ソフトウェアＣｕｆｆｌｉｎｋｓによって作成される）として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで（全読み取り、ソフトウェアＢｅｄｔｏｏｌｓによって作成される）提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、ＲＰＫＭ値が得られる。
【０１００】
表５〜７は、様々ながんにおけるＭＡＧ−００３発現のＲＮＡＳｅｑデータ（発現スコア）を示す。
【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
【表７】
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【０１０４】
様々ながん型におけるＭＡＧＥＡ４の発現を報告している多数の研究とは対照的に、ＭＡＧＥＡ４と転帰および予後との関連性についての証拠は、より限定的である。しかしながら、いくつかの報告は、ＭＡＧＥＡ４発現と臨床パラメータとの相関を見いだしている。頭頸部扁上皮がんでは、ＭＡＧＥＡ４発現は芳しくない全生存と相関しており、転帰不良の独立した予後指標であった（Ｃｕｆｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。進行期のＮＳＣＬＣがん（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）および卵巣がん（Ｙａｋｉｒｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）において、ＭＡＧＥ−Ａ４発現と患者生存との間に逆相関が見いだされた。膀胱がんでは、ＭＡＧＥＡ４発現は、再発および筋肉浸潤性がんへの進行と相関し（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、強力なＭＡＧＥＡ４染色は、生存率低下と関連付けられている（Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。消化管間質性性（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｏｍａｌ）腫瘍では、その他のがん精巣抗原と共にＭＡＧＥＡ４の発現が再発と相関し（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、外陰がんにおいても、ＭＡＧＥＡ４が再発性腫瘍でより頻繁に検出された（Ｂｅｌｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１０５】
高悪性度漿液性卵巣がんのＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）研究では、中央値未満のＭＡＧＥＡ８発現が、ＰＦＳ産生の１１．４ヶ月の増加に関連していたが、これは最も強力な検証可能な効果であった。ＭＡＧＥ  Ａ８の高発現は、高ＣＤ３腫瘍を有する患者のより芳しくないＰＦＳと関連しており、免疫抑制性Ｔｒｅｇの活性化などを通じた、ＭＡＧＥＡ８の免疫抑制的役割が潜在的に示唆される（Ｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１０６】
結腸がん患者の高リスク群および低リスク群は、個々の治療のための参照を提供する８つのバイオマーカー（ＺＢＴＢ３２、ＯＲ５１Ｂ４、ＣＣＬ８、ＴＭＥＦＦ２、ＳＡＬＬ３、ＧＰＳＭ１、ＭＡＧＥＡ８、およびＳＡＬＬ１）によって区別された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１０７】
ヒト扁平上皮がん細胞株実験において、ＭＡＧＥ−Ａ５およびＭＡＧＥ−Ａ８は、パニツムマブを用いた抗ＥＧＦＲ療法の負の予測因子として報告された。（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１０８】
ＭＡＧＥＡ４発現と進行した腫瘍ステージとの関連性についての証拠は、様々ながん型を包含するいくつかの報告によって提供される：悪性黒色腫において、ＭＡＧＥＡ４発現は、進行性疾患で原発性腫瘍の９％から遠隔転移の４４％まで増加した（Ｂａｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。また外陰がんにおいても、ＭＡＧＥＡ４発現は、リンパ節転移を伴う腫瘍においてより頻度が高かった（Ｂｅｌｌａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに、ＭＡＧＥＡ４発現は、子宮内膜がん（Ｃｈｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、子宮頸部扁平上皮がん（Ｓａｒｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、および膀胱がん（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｋｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）において、高悪性度腫瘍または進行した段階に関連していた。
【０１０９】
一実施形態では、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。
【０１１０】
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本明細書のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーとから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。
【０１１１】
本明細書の用法では「ペプチドをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【０１１２】
本明細書の用法では「ＴＣＲタンパク質をコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用なＴ細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むＴＣＲタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【０１１３】
本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。
【０１１４】
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
【０１１５】
コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。
【０１１６】
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【０１１７】
コード配列に言及する場合、「断片」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
【０１１８】
「ＤＮＡセグメント」という用語は、別々の断片の形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、セグメントおよびその構成ヌクレオチド配列が、同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このようなセグメントは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。
【０１１９】
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３'−ＯＨ末端を提供する。
【０１２０】
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
【０１２１】
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。一態様では、このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないという点で依然として単離されている。
【０１２２】
本明細書によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図され、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。
【０１２３】
本明細書によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本明細書を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性断片」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与すると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列の断片を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性断片」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
【０１２４】
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「セグメント」、および「断片」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列はより大型の配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、セグメントまたは断片に相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
【０１２５】
本明細書によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
（ｉｖ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
【０１２６】
比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
【０１２７】
したがって上述したように、本明細書は、配列番号１〜配列番号２４、または配列番号１〜配列番号２４と８５％相同的であるその変異型、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。本明細書のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子または前記ペプチドの伸長バージョンをクラスＩＩに結合する能力を有する。
【０１２８】
本明細書では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。
【０１２９】
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ａｐｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１３０】
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号２４からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様にＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ＊０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化Ｔ細胞のＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。同様に、ＴＣＲタンパク質は、ＨＬＡ−Ａ＊０２またはＨＬＡ−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）複合体と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、Ｔ細胞を活性化する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
【０１３１】
これらのＴ細胞は、本明細書の態様で定義されているように、引き続いて細胞と交差反応して、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）などの同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的にアンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって、当業者は、既知のアンカー残基を保つことで、配列番号１〜配列番号２４に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）複合体に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本明細書の変異型は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）複合体に結合する能力を維持する。本明細書の変異型を発現するＴ細胞は、引き続いて、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）などの同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を滅殺し得る。
【０１３２】
本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドまたはＴＣＲタンパク質は、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、前記ペプチドのアミノ酸鎖の末端に位置する。ＴＣＲタンパク質では、好ましくは、これらの置換は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の可変領域に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【０１３３】
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性、負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性、正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族、非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【０１３４】
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するが、サイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、過激な置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「過激な」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。
【０１３５】
もちろんこのような置換には、通常のＬ−アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本明細書の抗原性ペプチドに通常見いだされるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用されて、本明細書による免疫原および免疫原性ポリペプチドが生産されてもよい
【０１３６】
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つ超える位置が、同時に置換されることはない。
【０１３７】
本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較すると、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が、実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。
【０１３８】
ＴＣＲとの相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、その他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異型を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。
【０１３９】
【表８】
2019515650.tif 000010
【０１４０】
より長い（伸長された）ペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は実際のエピトープであるが、プロセシング中に実際のエピトープを曝露するのに必要なタンパク質分解性切断に実質的に影響を及ぼさない残基である可能性もある。
【０１４１】
記載のペプチドは、４つまでのアミノ酸によって伸長され得て、すなわち、１、２、３または４つのアミノ酸が、８?１１アミノ酸長の任意の組み合わせで、どちらかの末端に付加され得て、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質からのペプチドプロセシングによって生成される。４：０?０：４の間の側面に位置する残基が好ましい。本明細書による伸長の組み合わせは、表１０にある。
【０１４２】
【表９】
2019515650.tif 000011
【０１４３】
伸長／延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
【０１４４】
したがって本明細書のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
【０１４５】
代案の実施形態では、ペプチドは、４つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大３０アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをもたらしてもよい。ＭＨＣクラスＩＩへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。
【０１４６】
したがって、本明細書は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、伸長されたクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。
【０１４７】
もちろん、本明細書によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異型のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
【０１４８】
好ましくは、本明細書によるペプチドに特異的なＴ細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増加の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＴ細胞によって認識されることもまた好ましい。
【０１４９】
腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増強とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく（Ａｌｅｋｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｋｕｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異型タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性であるＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られているプロセスにおいて胸腺内で負に選択され（Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｒｕｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）、すなわち、自己抗原に対する低親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のみが残留する。したがって、ＭＡＧ−００３に対する本明細書のＴＣＲまたは変異型の親和性は、以下に記載されるように、当該技術分野で周知の方法によって増強された。
【０１５０】
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。
【０１５１】
医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドまたはＴＣＲタンパク質を含んでなる（上記もまた参照されたい）。本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性塩または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基（典型的には中性形態の薬物が中性の−ＮＨ２基を有する）から酸性塩が調製される。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を使用して調製される。
【０１５２】
本発明の別の実施形態は、非天然ペプチドに関し、前記ペプチドは、配列番号１〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になり、薬学的に許容可能な塩として合成的に生産される（例えば、合成される）。ペプチドを合成的に生産する方法は、当該技術分野で周知である。生体内で産生されるペプチドは塩でないため、本発明によるペプチドの塩は、ペプチドの生体内での状態と実質的に異なる。ペプチドの非天然塩形態は、特に、ペプチドを含んでなる医薬組成物、例えば、本明細書で開示されるペプチドワクチンなどの文脈で、ペプチドの溶解性を媒介する。治療される対象にペプチドを効率的に提供するためには、ペプチドの十分で少なくとも実質的な溶解性が必要である。好ましくは、塩は、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。本発明によるこれらの塩としては、ア二オンとしてのＰＯ４３−、ＳＯ４２−、ＣＨ３ＣＯＯ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、Ｉ−、ＳＣＮ−、およびカチオンとしてのＮＨ４＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋およびＢａ２＋を含んでなるホフマイスター系列の塩類などのアルカリ塩およびアルカリ土類塩類が挙げられる。特に塩類は、（ＮＨ４）３ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ、ＮＨ４Ｃｌ、ＮＨ４Ｂｒ、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４ＣＩＯ４、ＮＨ４Ｉ、ＮＨ４ＳＣＮ、Ｒｂ３ＰＯ４、Ｒｂ２ＨＰＯ４、ＲｂＨ２ＰＯ４、Ｒｂ２ＳＯ４、Ｒｂ４ＣＨ３ＣＯＯ、Ｒｂ４Ｃｌ、Ｒｂ４Ｂｒ、Ｒｂ４ＮＯ３、Ｒｂ４ＣＩＯ４、Ｒｂ４Ｉ、Ｒｂ４ＳＣＮ、Ｋ３ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＫＣＨ３ＣＯＯ、ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＮＯ３、ＫＣｌＯ４、ＫＩ、ＫＳＣＮ、Ｎａ３ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＮａＣＨ３ＣＯＯ、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＮＯ３、ＮａＣＩＯ４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＺｎＣＩ２Ｃｓ３ＰＯ４、Ｃｓ２ＨＰＯ４、ＣｓＨ２ＰＯ４、Ｃｓ２ＳＯ４、ＣｓＣＨ３ＣＯＯ、ＣｓＣｌ、ＣｓＢｒ、ＣｓＮＯ３、ＣｓＣＩＯ４、ＣｓＩ、ＣｓＳＣＮ、Ｌｉ３ＰＯ４、Ｌｉ２ＨＰＯ４、ＬｉＨ２ＰＯ４、Ｌｉ２ＳＯ４、ＬｉＣＨ３ＣＯＯ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＮＯ３、ＬｉＣｌＯ４、ＬｉＩ、ＬｉＳＣＮ、Ｃｕ２ＳＯ４、Ｍｇ３（ＰＯ４）２、Ｍｇ２ＨＰＯ４、Ｍｇ（Ｈ２ＰＯ４）２、Ｍｇ２ＳＯ４、Ｍｇ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＢｒ２、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＣｌＯ４）２、ＭｇＩ２、Ｍｇ（ＳＣＮ）２、ＭｎＣｌ２、Ｃａ３（ＰＯ４），、Ｃａ２ＨＰＯ４、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＣａＣｌ２、ＣａＢｒ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＣｌＯ４）２、ＣａＩ２、Ｃａ（ＳＣＮ）２、Ｂａ３（ＰＯ４）２、Ｂａ２ＨＰＯ４、Ｂａ（Ｈ２ＰＯ４）２、ＢａＳＯ４、Ｂａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ＢａＣｌ２、ＢａＢｒ２、Ｂａ（ＮＯ３）２、Ｂａ（ＣｌＯ４）２、ＢａＩ２、およびＢａ（ＳＣＮ）２から選択される。特に好ましいのは、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのＮＨ酢酸塩、ＭｇＣｌ２、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ２である。
【０１５３】
特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩としてのペプチドまたはＴＣＲタンパク質を含んでなる。
【０１５４】
本明細書のさらなる態様は、本明細書のペプチドまたはペプチド変異型をコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）、およびＴＣＲタンパク質およびＴＣＲ変異型を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、単鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本明細書のなおもさらなる態様は、本明細書によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
【０１５５】
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡセグメントが連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
【０１５６】
１つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、米国コネチカット州ニューヘイブンのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．をはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。
【０１５７】
本明細書のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限部位を遺伝子操作することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
【０１５８】
次に、ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）が適切な宿主において発現され、本明細書のペプチドまたは変異型を含んでなるポリペプチドが産生されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本明細書のペプチドまたは変異型をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本明細書のポリペプチドの発現および生産のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０１５９】
本発明明細書の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
【０１６０】
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
【０１６１】
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
【０１６２】
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。
【０１６３】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞（ｐｌａｎＴ−ｃｅｌｌｓ）、動物細胞、および昆虫細胞（ｉｎｓｅｃＴ−ｃｅｌｌｓ）をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【０１６４】
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部と、ネオマイシンなどの耐性マーカーとを有する、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターを含んでなる。一例は、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
【０１６５】
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞において、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞における高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。ＣＭＶベクターは、例えば、細菌細胞におけるｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞において使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
【０１６６】
別の実施形態では、本明細書の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトと同様）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ  ＩとＭＨＣ  ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。
【０１６７】
本明細書はまた、本明細書のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、米国メリーランド州ベセスダのＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト線維芽細胞株および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  ＢａｌｂａｓおよびＡｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ  Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２６２−９、および当業者に知られているその他の文献にある。
【０１６８】
本明細書のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに依存する周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、米国郵便番号２０８７７メリーランド州ゲイザースバーグのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞（ｙｅａｓＴ−ｃｅｌｌ）、細菌細胞、昆虫細胞（ｉｎｓｅｃＴ−ｃｅｌｌｓ）、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０１６９】
成功裏に形質転換された細胞、すなわち本明細書のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。
【０１７０】
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞（ｉｎｓｅｃＴ−ｃｅｌｌｓ）などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子中に負荷されてもよいように、本明細書のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本明細書は、本明細書による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【０１７１】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１７２】
本明細書のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、ペプチドまたはその変異型を生産する方法を提供する。
【０１７３】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲタンパク質、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ．、ｉ．ｄ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１７４】
活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
【０１７５】
本明細書の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本明細書の薬剤で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリン由来ＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ  ＩＭＰ３２１、ＩＬ−２やＬ−１３やＩＬ−２１などのインターロイキン、インターフェロン−αまたは−βまたはそれらのＰＥＧ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ−５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ  ＱＳ２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体、およびＲｉｂｉ’ｓ  ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様の補助剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ−ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ−）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、およびＩＬ−４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β）として作用することと、直接関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１７６】
ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を増強することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘導性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を増強し、ＣＤ４  Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化の促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ  ＴＬＲ９拮抗薬は、本明細書の医薬組成物の好ましい構成要素である、Ｍｏｌｏｇｅｎ（独国ベルリン）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節剤）である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。
【０１７７】
有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ−Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。
【０１７８】
好ましいアジュバントは、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ−ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子調合物である。
【０１７９】
本明細書による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。
【０１８０】
本明細書による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明明細書による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。
【０１８１】
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、風味、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。
【０１８２】
本明細書によるワクチンによって引き起こされる免疫応答は、異なる細胞分裂期および異なる発生段階のがんを攻撃することを理解することが重要である。さらに、異なるがん関連シグナル伝達経路が攻撃される。これは、１つまたは少数の標的のみに対処して、攻撃に対する腫瘍の容易な適応（腫瘍エスケープ）を引き起こすこともある、ワクチンに優る利点である。さらに個々の腫瘍の全てが、同一パターンの抗原を発現するとは限らない。したがって、いくつかの腫瘍関連ペプチドの組み合わせによって、ありとあらゆる腫瘍が標的の少なくとも一部を有することが確実になる。組成物は、それぞれの腫瘍が抗原のいくつかを発現することを予期して設計され、腫瘍の増殖と維持に必要ないくつかの独立した経路をカバーする。したがって、ワクチンは、より大きな患者集団のために、容易に「出来合」で使用され得る。これは、ワクチンで治療される患者の予備選択が、ＨＬＡタイピングに限定され得て、抗原発現に関する任意の追加的なバイオマーカーアセスメントを必要としないことを意味するが、いくつかの標的が誘導免疫応答によって同時に攻撃されることはなおも確実であり、これは有効性にとって重要である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１８３】
本明細書の用法では、「スキャフォールド」という用語は、（例えば、抗原性）決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、スキャフォールドはまた、それが付着する実体（例えば、（第２の）抗原結合部分）を例えば、抗原決定基（例えば本出願書に記載のペプチドとＭＨＣの複合体）を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、キャフォールドは、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を通じて、シグナル伝達を活性化できる。スキャフォールドとしては、抗体およびそれらの断片、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、（可溶性）ＴＣＲ、および同種または自己由来Ｔ細胞などの（改変）細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合するスキャフォールドであるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。
【０１８４】
「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を殺滅できる活性分子を装備したスキャフォールドが、特異的標的は有しないがその他のペプチド−ＭＨＣ複合体を提示する別の細胞を殺滅できない程度に、スキャフォールドがその他の天然ペプチド−ＭＨＣ−複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド−ＭＨＣ−複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド−ＭＨＣのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトＨＬＡ−ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド−ＭＨＣ提示を有する標的細胞（初代細胞または細胞株）、または天然に存在するペプチド−ＭＨＣレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。
【０１８５】
各スキャフォールドは標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合スキャフォールドが検出され得ることを提供する。例えば、スキャフォールドは、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。
【０１８６】
各スキャフォールドは、例えば、ＩＬ−２１、抗−ＣＤ３、および抗−ＣＤ２８などの第２の活性分子にコンジュゲートされ得る。
【０１８７】
ポリペプチドスキャフォールドに関するさらなる情報については、例えば国際公開第２０１４／０７１９７８Ａ１号パンフレットの背景セクション、およびその中で引用される参考文献を参照されたい。
【０１８８】
本明細書は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい）は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。
【０１８９】
細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。
【０１９０】
ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。
【０１９１】
さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。
【０１９２】
アプタマーは、診断および治療目的で有用である。一態様では、少なくとも１つまたはそれ以上のアプタマーが腫瘍細胞に取り込まれ、したがってｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の腫瘍細胞への標的化送達のための分子ビヒクルとして機能し得る。
【０１９３】
アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を用いて、本明細書のＭＨＣ分子の記述に従って、細胞および組織などの複雑な標的、そしてペプチド複合体に対して選択され得る。
【０１９４】
本明細書のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され、開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織の大きさと正確な位置確認の判定を助け得る。
【０１９５】
したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を生産する方法を提供することが、本明細書のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；ｍＲＮＡ分子を前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；少なくとも１つのファージを前記ファージディスプレイライブラリーから単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。
【０１９６】
ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本明細書のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。
【０１９７】
このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を生産するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を生産するためのその他のツールは、本明細書の目的で、その内容全体が参照により全て明示的に援用される、国際公開第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、および文献（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ａ；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３ｂ；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）で開示される。
【０１９８】
好ましくは、抗体は、２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本明細書の文脈で「特異的」とも見なされる。
【０１９９】
本明細書は、ＭＡＧ−００３に特異的に結合する、ＴＣＲタンパク質またはその変異型または機能性断片に関する。
【０２００】
本明細書は、本明細書よるＴＣＲタンパク質にさらに関し、その中でＴＣＲタンパク質は（化学的に）修飾されおよび／または非ペプチド結合を含む。
【０２０１】
本発明は、ＴＣＲタンパク質が完全な（全）ヒトタンパク質でないという条件で、本明細書によるＴＣＲタンパク質をコードする核酸にさらに関する。
【０２０２】
本明細書は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本明細書による核酸にさらに関する。
【０２０３】
本明細書は、本明細書による核酸を発現できる、発現ベクターにさらに関する。
【０２０４】
本明細書は、医療、特に非小細胞肺がんの治療で使用するための本明細書によるＴＣＲタンパク質、本明細書による核酸、または本明細書による発現ベクターにさらに関する。
【０２０５】
本明細書は、本明細書による核酸または本明細書による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【０２０６】
本明細書は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である、本明細書による宿主細胞にさらに関する。
【０２０７】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲタンパク質を生産する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ＭＡＧ−００３モノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２０８】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲタンパク質を生産する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌモノマーと共に培養するステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共に培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２０９】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲタンパク質を生産する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣＡ２／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌモノマーと共に培養するステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共に培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２１０】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲタンパク質を生産する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する、遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをＭＡＧ−００３で免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２１１】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲタンパク質を生産する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する、遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをｐ２８６−１Ｙ２Ｌで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２１２】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲタンパク質を生産する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する、遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２１３】
本明細書は、その標的細胞がＭＡＧ−００３を異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法にさらに関し、方法は、本明細書による有効数のＴ細胞を患者に投与するステップを含んでなる。
【０２１４】
本明細書は、記載される任意のＴＣＲタンパク質、本明細書による核酸、本明細書による発現ベクター、本明細書による細胞、または本明細書による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本明細書は、薬剤ががんに対して有効である、本明細書による使用にさらに関する。
【０２１５】
本明細書は、本明細書による使用にさらに関し、前記がん細胞は、非小細胞肺がん細胞；または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道などのその他の固形または血液学的腫瘍細胞である。
【０２１６】
本明細書は、小細胞肺がんの診断および／または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本明細書によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本明細書はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
【０２１７】
「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。無処理または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、本明細書による所望の特性（例えば、非小細胞肺がんマーカー（ポリ）ペプチドの特異的結合、がんマーカー遺伝子を増大レベルで発現する非小細胞肺がん細胞への毒素の送達、および／または非小細胞肺がんマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、断片（例えば、ＣＤＲ、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦｃ断片）、またはこれらの免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンのポリマーもまた含まれる。
【０２１８】
可能な場合は常に、本明細書の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本明細書の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、本明細書の抗体を生成するために、完全長非小細胞肺がんマーカーポリペプチドまたはその断片のどちらを使用してもよいことを理解するであろう。本明細書の抗体を作製するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して生成されてもよい。
【０２１９】
当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの作製が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性を有する抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験される（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の作製および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４）を参照されたい）。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはウエスタンブロット、ホルマリン固定がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色で試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。
【０２２０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を指し；すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在してもよい可能な自然発生変異以外は同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を特に含む（その内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。
【０２２１】
本明細書のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。
【０２２２】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって生産されるものであってもよい。本明細書のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって）。
【０２２３】
インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体断片、特にＦａｂ断片を作製するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位を有するＦａｂ断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片とを典型的に生じる。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２断片およびｐＦｃ’断片をもたらす。
【０２２４】
抗体断片は、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、断片の活性が非修飾抗体または抗体断片と比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体断片は、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体断片をエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。
【０２２５】
本明細書の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見いだされない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中ではＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。
【０２２６】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、それは典型的に「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では実質的に完全でないヒト可変ドメインが、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中ではいくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。
【０２２７】
免疫化に際して、内因性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。
【０２２８】
本明細書の抗体は、好ましくは薬学的に許容できる担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて、製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路と濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。
【０２２９】
抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。
【０２３０】
抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような判定をすることは、当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日当たり約１（μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。好ましくは非小細胞肺がんを治療するための抗体投与に続いて、治療用抗体の効力が、熟練した実務家に良く知られている様々な方法で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象におけるがんの大きさ、数、および／または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こるであろう疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発生を予防する、治療的に投与された抗体は、がん治療のための有効な抗体である。
【０２３１】
特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を生産する方法を提供することもまた、本明細書のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的とする変異誘発によって増加され得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、および抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。別の態様では、それは養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞において発現される。例えば、その内容全体が参照により援用される、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレット、国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレット、および国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットを参照されたい。
【０２３２】
さらに本明細書のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。
【０２３３】
抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、腫瘍が位置確認され得るように、免疫シンチグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらの断片は、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
【０２３４】
診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の２つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
本発明を以下の実施例で、それでもなお非限定的にさらに説明する。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。
【図１】ＭＡＧＥＡ４上のＭＡＧ−００３のエクソン発現を示す（腫瘍と健常との対比、ＲＮＡＳｅｑデータ）。健常組織上のＭＡＧＥＡ４中のＭＡＧＥ−００３エクソン発現は、様々な固形腫瘍（赤色バー）上のものと比較された。健常組織サブタイプは、高リスク（濃緑色のバー）、中程度のリスク（淡緑色のバー）、および低リスクの組織（灰色のバー）に分類される。各バーは、単一サンプルを表す。正常組織における高発現は、胎盤および精巣においてのみ見られた（低リスク）。（ＲＰＫＭ＝１００万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たりの読み取り）
【図２】ＭＡＧＥＡ８上のＭＡＧ−００３のエクソン発現を示す（腫瘍と健常との対比、ＲＮＡＳｅｑデータ）。健常組織ＭＡＧＥＡ８上のエクソン発現は、様々な固形腫瘍（赤色バー）上のものと比較された。健常組織サブタイプは、高リスク（濃緑色のバー）、中程度のリスク（淡緑色のバー）、および低リスクの組織（灰色のバー）に分類された。各バーは、単一サンプルを表す。正常組織における高発現は、胎盤においてのみ見られた（低リスク）。（ＲＰＫＭ＝１００万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たりの読み取り）
【図３】本明細書中で開示される配列番号１の１位〜９位にＭＡＧ−００３ペプチド（配列番号１）または様々なＭＡＧ−００３アラニン置換変異型が負荷された標的細胞との同時培養後における、ＭＡＧ−００３特異的ＴＣＲのαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を示す。
【図４】同上
【図５】同上
【図６】図６は、実施例７によるＭＡＧＥＡ４の発現を示す。ＭＡＧＥＡ４  ｍＲＮＡは、提示されたがん検体において検出可能である。発現レベルは、頭頸部がんおよび非小細胞肺がん検体（ＨＮＳＣＣ０６２Ｔ１、ＨＮＳＣＣ０６４Ｔ１、およびＮＳＣＬＣ００４Ｔ１）におけるかなりの発現から、非小細胞肺がんおよび卵巣がん検体（ＮＳＣＬＣ００６Ｔ１およびＯＣ０３６Ｔ１）におけるかなり低い発現までの範囲をカバーする。
【実施例】
【０２３６】
アロ反応性設定を使用して自己免疫寛容を回避し、自己由来設定、すなわち、患者に由来するＴ細胞と比較した際により高い結合活性を有する、Ｔ細胞もをたらし得る。このような設定の例としては、アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｄｏｖｎｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｗｉｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、およびヒトＭＨＣまたはヒトＴＣＲについて遺伝子組換えであるマウスの免疫化（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）が挙げられる。
【０２３７】
実施例１
アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）
告知に基づく同意を得た後、ＨＬＡ−Ａ＊０２陰性の健常ドナー由来のＰＢＭＣを使用した。組換えビオチン化ＨＬＡ−Ａ２クラスＩモノマーと、ＭＡＧ−００３を含有するＡ２蛍光性四量体をＭＢＬＩ（マサチューセッツ州ウーバン）から得た。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗ＣＤ２０ＳＡと共に、ＰＢＭＣを室温で１時間培養し、洗浄して、ビオチン化Ａ２／ＭＡＧ−００３モノマーと共に室温で３０分間培養し、洗浄して、２４ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清添加ＲＰＭＩに、３×１０６細胞／ウェルで播種した。インターロイキン７（ＩＬ−７；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を１日目に１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ＩＬ−２（英国ヘアフィールドのＣｈｉｒｏｎ）を４日目に１０Ｕ／ｍＬで添加した。５週間にわたり、細胞を新鮮なＰＢＭＣで毎週再刺激し、応答性細胞と１：１の比で混合して、２４ウェルプレートに３×１０６／ウェルで播種した。
【０２３８】
高結合活性Ｔ細胞を得るために、およそ１０６のＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧ−００３四量体フィコエリトリン（ＰＥ）（ＭＢＬＩから得た）と共に、３７°Ｃで３０分間培養し、それに続いて抗ＣＤ８イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と共に４°Ｃで２０分間培養し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析がそれに続いた。選別は、ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ（英国オックスフォード市カウリーのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。ウェル当たり、２×１０５の選別された細胞、フィーダーとしての２×１０６照射Ａ２陰性ＰＢＭＣ、２×１０４のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ／ｍＬ（ノルウェイ国オスロのＤｙｎａｌ）、およびＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）を使用して、選別された四量体陽性細胞を２４ウェルプレート内で増殖させた。次に、当該技術分野で周知の方法を使用して、アミノ酸／ＤＮＡ配列決定および発現ベクターへのクローニングのために、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用してＴＣＲを同定し、単離した。
【０２３９】
実施例２
ヒト−ＨＣまたはヒトＴＣＲについて遺伝子組換えであるマウスの免疫化
ＭＡＧ−００３を使用して、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）について遺伝子組換えであるマウスを免疫化した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。高親和性Ｔ細胞を得るために、遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共に培養し、上記のような細胞選別がそれに続いた。次に、当該技術分野で周知の方法を使用して、アミノ酸／ＤＮＡ配列決定および発現ベクターへのクローニングのために、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用してＴＣＲを同定し、単離した。
【０２４０】
一態様では、ＭＡＧ−００３およびその変異型、すなわち、ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ（２つのアミノ酸置換を有する、配列番号２）およびｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌ（３つのアミノ酸置換を有する、配列番号３）は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に対して強力な結合親和性および安定性を示す。特に、ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌは、一態様では健常ドナーとＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂ遺伝子組換えマウスの双方のＰＢＭＣに由来する標的がん細胞を溶解する、特異的ＣＴＬを誘導する能力を示した。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を参照されたい。
【０２４１】
ＭＨＣＩまたはＩＩ／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌまたはｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌ複合体に対する高結合活性を得るために、これらのペプチドは、実施例１および２に記載される方法で使用され得る。次に、当該技術分野で周知の方法を使用して、アミノ酸／ＤＮＡ配列決定および発現ベクターへのクローニングのために、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用してＴＣＲを同定し、単離した。
【０２４２】
高親和性ＴＣＲ変異型はまた、酵母、ファージまたはＴ細胞ディスプレイによって、ＣＤＲ変異型のライブラリーから選択され得る（ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。したがって、候補ＴＣＲ変異型は、ＴＣＲのＣＤＲの変異を設計して、高結合活性のＴＣＲ変異型を得るための指針を提供する（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｚｏｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０２４３】
実施例３：ＴＣＲのクローニング
ＴＣＲのクローニング法は、例えば、前記方法に関してその内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１００号明細書に記載されるように、当該技術分野で公知である。制限部位ＮｄｅＩをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドＡ１、細菌における発現の効率的な開始のために導入されたメチオニン、および制限部位ＳａｌＩをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドＡ２を使用して、α鎖可変領域を増幅した。β鎖の場合、例えばＮｄｅＩなどの制限部位をコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチド、細菌における発現の効率的な開始のために導入されたメチオニン、および例えばＡｇｅＩなどの制限部位をコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドＢ２を使用して、β鎖可変領域を増幅した。
【０２４４】
αおよびβ可変領域は、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）で記載される標準的な方法によってＣαまたはＣβのどちらかを含有する、ｐＧＭＴ７ベースの発現プラスミドにクローン化した。プラスミドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０×１  ＤＮＡ分析装置を用いて配列決定した。
【０２４５】
ＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＧＭＴ７＋Ｃαベクターにライゲートし、それをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断した。ＴＣＲβ鎖をコードするＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで切断し、別個のｐＧＭＴ７＋Ｃβベクターにライゲートし、それもまたＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで切断した。ライゲートされたプラスミドをコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ／寒天プレート上に播種する。３７℃で一晩インキュベートした後、単一コロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬＢ中で一晩３７℃で振盪しながら増殖させる。クローン化プラスミドをＭｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、挿入断片を自動ＤＮＡ配列決定装置（Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定する。
【０２４６】
実施例４：自己Ｔ細胞の遺伝子操作
Ｔ細胞は、高結合活性ＴＣＲ（いわゆるＴＣＲ療法）、またはＭＨＣＩ／ＭＡＧ−００３複合体またはＭＨＣＩＩ／ＭＡＧ−００３複合体に対する抗原特異性が増強されたタンパク質融合由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、遺伝子操作し得る。一態様では、このアプローチは、中枢および末梢寛容に関連するいくつかの制限を克服し、患者における新生Ｔ細胞活性化の必要なしに、腫瘍の標的化においてより効率的なＴ細胞を生じる。
【０２４７】
本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、実施例１〜３に記載されるように同定され単離された腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸を、γ−レトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化した。組換えウイルスが生成し、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験した。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）を形質導入し、それを患者への輸液前に増殖させる。
【０２４８】
末梢Ｔ細胞に導入されたＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ表面発現に必要であるＣＤ３複合体との結合について、内因性ＴＣＲ鎖と競合してもよい。高レベルのＴＣＲ表面発現は、標的腫瘍抗原を発現する細胞による始動のための適切な感受性を付与するのに必須であることから（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌａｂｒｅｃｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現レベルを増強するストラテジーは、ＴＣＲ遺伝子治療における重要な考慮事項である。
【０２４９】
本明細書のＴＣＲの発現を増加させるために、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス型幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β−アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、伸長因子（ＥＦ）−１ａ（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター（Ｊｏｓｅｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）などの強力なプロモーターを本明細書において使用し得る。
【０２５０】
強力なプロモーターに加えて、多くのＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）をはじめとする、導入遺伝子発現を増強し得る追加的な要素を含有する
【０２５１】
高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方を高レベルで転写する必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の生成を確実にする単一転写物から生成されるので、ＴＣＲ−α鎖とＴＣＲ−β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０２５２】
ＴＣＲ導入遺伝子発現を増加させるのに有益であることが証明された別の修飾は、コドン最適化である。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現を有意に高めることが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２５３】
さらに、導入ＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は、重大な自己免疫リスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２５４】
誤対合を減少させるために、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性ＴＣＲと対形成する能力が低下するように、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域を修飾してもよい。これらのストラテジーとしては、ヒトＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換すること；導入ＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することによって、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を生成すること（システイン修飾）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖のＣ末端領域内の相互作用残基を交換すること（「ノブ・イン・ホール」）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させること（ＣＤ３ζ融合）（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）が挙げられる。
【０２５５】
本発明は、がん／腫瘍、好ましくはＭＡＧ−００３を過剰にまたは排他的に提示する、非小細胞肺がんの治療に有用なＴＣＲタンパク質を提供する。
【０２５６】
実施例５：同種異系Ｔ細胞の遺伝子操作
病原体に対する防御の第一線に関与する非従来的なＴリンパ球エフェクターであるガンマデルタ（γδ）Τ細胞は、受容体、特に、ＴＣＲ−γおよびＴＣＲ−δ鎖を活性化することで、ＭＨＣ非依存的様式で腫瘍細胞と相互作用して、腫瘍細胞を根絶し得る。これらのγδＴ細胞は、活性化に際して、迅速なサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）および強力な細胞毒性応答細胞傷害性応を可能にする前活性化表現型を示す。これらのＴ細胞は多くのがんに対して抗腫瘍活性を有し、γδＴ細胞媒介免疫療法が実行可能であり、客観的な腫瘍応答を誘導し得ることが示唆される。（Ｂｒａｚａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０２５７】
固定化抗原、作動性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、腫瘍由来人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、または活性化ｍＡｂとａＡＰＣの組み合わせを用いる近年の進歩は、オリゴクローナルまたはポリクローナルＴＣＲレパートリーありまたはなしで、γδＴ細胞を増殖させるのに成功している。例えば、固定化主要組織適合性複合体クラスＩ鎖関連Ａは、ＴＣＲδ１アイソタイプを発現するγδＴ細胞に対する刺激であり、プレート結合活性化抗体は、生体外でＶδ１およびＶδ２細胞を増殖させた。臨床的に十分な量のＴＣＲδ１、ＴＣＲδ２、およびＴＣＲδ１ｎｅｇＴＣＲδ２ｎｅｇがａＡＰＣ上の共培養後に生成し、これらのサブセットは、生体外および生体内で、記憶表現型および腫瘍に対する反応性に差を示した。（Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【０２５８】
さらに、γδＴ細胞は、ＴＣＲ−α鎖およびＴＣＲ−β鎖の導入によって証明されるように、遺伝子修飾に適している。（Ｈｉａｓａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。本明細書の別の態様は、ＭＡＧ−００３に結合するＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βを発現するγδＴ細胞の生成に関する。これを行うために、γδＴ細胞をＤｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４によって記載される方法によって増殖させ、（実施例３に記載されるような）ＭＡＧ−００３に結合するＴＣＲを発現する組換えウイルスを、増殖させたγδＴ細胞に形質導入することがそれに続いた。次に、ウイルス形質導入γδＴ細胞を患者に輸液する。
【０２５９】
実施例６：免疫原性および機能性Ｔ細胞データ
医薬品の製造手順を模倣するプロトコルを用いて、ＭＡＧ−００３の免疫原性を試験した。健常ドナーについて、ＭＡＧ−００３特異的Ｔ細胞のプライミングが観察された。生成されたＴ細胞はペプチド負荷標的細胞を殺滅でき、それらの機能性が実証された。データは、１）ＭＡＧ−００３が免疫原性標的であり、２）ＭＡＧ−００３に対して生成されたＴ細胞が機能性であることを実証した。
【０２６０】
生成された追加的データは、ＭＡＧ−００３がＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対する非常に良好な結合を有するペプチドであるという証拠を提供した。
【０２６１】
実施例７：組織におけるＭＡＧＥＡ４  ｍＲＮＡ発現
原位置ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を用いて、ホルマリン固定または凍結組織切片において直接、ｍＲＮＡ発現を検出する。その高い感度とその空間分解能のために、それは細胞型特異的標的発現およびがん組織切片中の標的発現の分布または頻度を判定するのに適した方法である。
【０２６２】
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ）によって開発されたＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）技術を使用してＩＳＨが実施されており、ＭＡＧＥＡ４  ｍＲＮＡが検出されている。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）技術は、１〜４対（ｏｎ  ｔｏ  ｆｏｕｒ  ｐａｉｒｓ）のＺ形オリゴヌクレオチドプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに基づいている。シグナル増幅は、オリゴヌクレオチドの複数のハイブリダイゼーション過程に基づく分枝ＤＮＡ増幅によって達成され、最終的に分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ツリーが構築される。最後に、多数の標識プローブがｂＤＮＡツリーの分枝にハイブリダイズし、増強されたシグナルが検出され得る。発色性ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）検出キット（ＲＥＤ）は、酵素（アルカリホスファターゼ）に連結した標識プローブを含む。シグナル検出は、元のシグナルをさらに増幅させる、発色基質ＦａｓｔＲｅｄの酵素的変換に依存する。ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）は非常に感度の高い技術であるが、それはたとえ部分的に架橋または分解されていたとしても、標的ｍＲＮＡへのＺプローブ対の感度および堅固な結合と対になった、シグナル増幅の効率的な過程のためである。ＡＣＤによれば、検出可能なＩＳＨシグナルを生成するには、１つの単一プローブ対の各単一ｍＲＮＡ分子への結合で十分である。
【０２６３】
各ＩＳＨ実験は、１）標的検索のための組織前処理と、２）標的ハイブリダイゼーション、シグナル増幅および検出との２つの方法論的プロセスに細分される。最適な前処理条件は、ＦＦＰＥ組織切片における成功裏の標的検出のために重要である。固定化過程は、細胞および組織中のタンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡの架橋を誘導し、それによってハイブリダイゼーション部位をマスクする。したがって、標的ｍＲＮＡのアクセスしやすさおよびプローブセットの適切な結合を保証するためには、標的ハイブリダイゼーションの前に、これらの架橋を除去しなければならない。組織の前処理には、１）過酸化水素処理による内因性アルカリホスファターゼのブロック、２）標的検索試薬中で煮沸することによる標的検索、および３）プロテアーゼ消化による標的検索の３つの別個のステップが含まれる。異なるＦＦＰＥブロック間では、固定化および架橋の程度が変動してもよいので、最適な標的検索条件は個々のＦＦＰＥブロックについて実験的に決定しなければならない。したがって、組織切片は異なる沸騰およびプロテアーゼ消化時間に曝露され、陽性対照セットおよび陰性対照プローブセットとのハイブリダイゼーションがそれに続いた。最適条件は、陽性対照における特異的シグナル強度と、陰性対照における非特異的背景と、組織形態との顕微鏡評価によって判定した。組織の前処理は、製造業者のプロトコルに従って行った。前処理試薬は、ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）試薬キットに含まれる。様々な前処理過程の完了後、特異的プローブセットの目的ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションと、引き続く分岐ＤＮＡシグナル増幅および発色または蛍光シグナル検出によって、標的発現を評価した。全てのアッセイは、製造業者のプロトコルに従って実施した。
【０２６４】
【表１０】
2019515650.tif 000012
【０２６５】
参考文献一覧
Adair SJ, Hogan KT (2009).Treatment of ovarian cancer cell lines with 5-aza-2'-deoxycytidine upregulatesthe expression of cancer-testis antigens and class I major histocompatibilitycomplex-encoded molecules. Cancer Immunol. Immunother. 58, 589-601.
Alves PM, Levy N, Bouzourene H,Viatte S, Bricard G, Ayyoub M, Vuilleumier H, Givel JC, Halkic N, Speiser DE,Romero P, Levy F (2007). Molecular and immunological evaluation of theexpression of cancer/testis gene products in human colorectal cancer. CancerImmunol. Immunother. 56, 839-847.
Andrade VC, Vettore AL, Felix RS,Almeida MS, Carvalho F, Oliveira JS, Chauffaille ML, Andriolo A, Caballero OL,Zago MA, Colleoni GW (2008). Prognostic impact of cancer/testis antigenexpression in advanced stage multiple myeloma patients. Cancer Immun. 8, 2.
Aubry F, Satie AP, Rioux-LeclercqN, Rajpert-De ME, Spagnoli GC, Chomez P, De BO, Jegou B, Samson M (2001).MAGE-A4, a germ cell specific marker, is expressed differentially in testiculartumors. Cancer 92, 2778-2785.
Bar-Haim E, Paz A, Machlenkin A, Hazzan D, Tirosh B,Carmon L, Brenner B, Vadai E, Mor O, Stein A, Lemonnier FA, Tzehoval E,Eisenbach L (2004). MAGE-A8 overexpression in transitional cell carcinoma ofthe bladder: identification of two tumour-associated antigen peptides. Br. JCancer 91, 398-407.
Barrow C, Browning J, MacGregorD, Davis ID, Sturrock S, Jungbluth AA, Cebon J (2006). Tumor antigen expressionin melanoma varies according to antigen and stage. Clin Cancer Res 12, 764-771.
Bellati F, Napoletano C, TarquiniE, Palaia I, Landi R, Manci N, Spagnoli G, Rughetti A, Panici PB, Nuti M(2007). Cancer testis antigen expression in primary and recurrent vulvarcancer: association with prognostic factors. Eur. J Cancer 43, 2621-2627.
Bergeron A, Picard V, LaRue H,Harel F, Hovington H, Lacombe L, Fradet Y (2009). High frequency of MAGE-A4 andMAGE-A9 expression in high-risk bladder cancer. Int. J Cancer 125, 1365-1371.
Bhan S,Chuang A, Negi SS, Glazer CA, Califano JA (2012). MAGEA4 induces growth in normal oral keratinocytes by inhibiting growtharrest and apoptosis. Oncol Rep. 28,1498-1502.
Bode PK, Thielken A, Brandt S,Barghorn A, Lohe B, Knuth A, Moch H (2014). Cancer testis antigen expression intesticular germ cell tumorigenesis. Mod. Pathol. 27, 899-905.
Cabezon T, Gromova I, Gromov P,Serizawa R, Timmermans W, V, Kroman N, Celis JE, Moreira JM (2013). Proteomicprofiling of triple-negative breast carcinomas in combination with a three-tierorthogonal technology approach identifies Mage-A4 as potential therapeutictarget in estrogen receptor negative breast cancer. Mol. Cell Proteomics. 12, 381-394.
Cesson V, Rivals JP, Escher A,Piotet E, Thielemans K, Posevitz V, Dojcinovic D, Monnier P, Speiser D, Bron L,Romero P (2011). MAGE-A3 and MAGE-A4 specific CD4(+) T-cells in head and neckcancer patients: detection of naturally acquired responses and identificationof new epitopes. Cancer Immunol. Immunother. 60, 23-35.
Chambost H, Van BN, Brasseur F,Godelaine D, Xerri L, Landi SJ, Theate I, Plumas J, Spagnoli GC, Michel G,Coulie PG, Olive D (2000). Expression of gene MAGE-A4 in Reed-Sternberg cells.Blood 95, 3530-3533.
Chen CH, Huang GT, Lee HS, Yang PM, Yan MD, Chen DS,Sheu JC (1999). High frequency of expression of MAGE genes in humanhepatocellular carcinoma. 1999. Liver 19,110-114.
Chitale DA, Jungbluth AA,Marshall DS, Leitao MM, Hedvat CV, Kolb D, Spagnoli GC, Iversen K, Soslow RA(2005). Expression of cancer-testis antigens in endometrial carcinomas using atissue microarray. Mod. Pathol. 18,119-126.
Coral S, Parisi G, Nicolay HJ,Colizzi F, Danielli R, Fratta E, Covre A, Taverna P, Sigalotti L, Maio M(2013). Immunomodulatory activity of SGI-110, a5-aza-2'-deoxycytidine-containing demethylating dinucleotide. Cancer Immunol.Immunother. 62, 605-614.
Cruz CR, Gerdemann U, Leen AM,Shafer JA, Ku S, Tzou B, Horton TM, Sheehan A, Copeland A, Younes A, Rooney CM,Heslop HE, Bollard CM (2011). Improving T-cell therapy for relapsedEBV-negative Hodgkin lymphoma by targeting upregulated MAGE-A4. Clin Cancer Res17, 7058-7066.
Cuffel C, Rivals JP, Zaugg Y,Salvi S, Seelentag W, Speiser DE, Lienard D, Monnier P, Romero P, Bron L,Rimoldi D (2011). Pattern and clinical significance of cancer-testis geneexpression in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J Cancer 128, 2625-2634.
Daudi S, Eng KH,Mhawech-Fauceglia P, Morrison C, Miliotto A, Beck A, Matsuzaki J, Tsuji T,Groman A, Gnjatic S, Spagnoli G, Lele S, Odunsi K (2014). Expression and immuneresponses to MAGE antigens predict survival in epithelial ovarian cancer. PLoS.ONE. 9, e104099.
Duffour MT, Chaux P, Lurquin C,Cornelis G, Boon T, van der Bruggen P (1999). A MAGE-A4 peptide presented byHLA-A2 is recognized by cytolytic T lymphocytes. Eur. J Immunol. 29, 3329-3337.
De PE, Arden K, Traversari C, Gaforio JJ, Szikora JP,De SC, Brasseur F, van der Bruggen P, Lethe B, Lurquin C, . (1994). Structure,chromosomal localization, and expression of 12 genes of the MAGE family.Immunogenetics 40, 360-369.
Doyle JM, Gao J, Wang J, Yang M, Potts PR (2010).MAGE-RING protein complexes comprise a family of E3 ubiquitin ligases. Mol Cell39, 963-974.
Eng KH, Weir I, Tsuji T, Odunsi K (2015).Immunostimulatory/regulatory gene expression patterns in advanced ovariancancer. Genes and Cancer.
Forghanifard MM, Gholamin M,Farshchian M, Moaven O, Memar B, Forghani MN, Dadkhah E, Naseh H, Moghbeli M,Raeisossadati R, Abbaszadegan MR (2011). Cancer-testis gene expressionprofiling in esophageal squamous cell carcinoma: identification of specifictumor marker and potential targets for immunotherapy. Cancer Biol Ther. 12, 191-197.
Gerdemann U, Katari U, ChristinAS, Cruz CR, Tripic T, Rousseau A, Gottschalk SM, Savoldo B, Vera JF, HeslopHE, Brenner MK, Bollard CM, Rooney CM, Leen AM (2011). Cytotoxic T lymphocytessimultaneously targeting multiple tumor-associated antigens to treat EBVnegative lymphoma. Mol.Ther. 19, 2258-2268.
Gunda V,Cogdill AP, Bernasconi MJ, Wargo JA, Parangi S (2013). Potential role of 5-aza-2'-deoxycytidine induced MAGE-A4 expression inimmunotherapy for anaplastic thyroid cancer. Surgery 154, 1456-1462.
Gure AO, Chua R, Williamson B,Gonen M, Ferrera CA, Gnjatic S, Ritter G, Simpson AJ, Chen YT, Old LJ, AltorkiNK (2005). Cancer-testis genes are coordinately expressed and are markers ofpoor outcome in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 11, 8055-8062.
Hartmann S, Meyer TJ, Brands RC,Haubitz IR, Linz C, Seher A, Kubler AC, Muller-Richter UD (2015). MAGE-Aexpression clusters and antineoplastic treatment in head and neck cancer. Int.J Mol. Med. 35, 1675-1682.
Hasegawa H, Mori M, Haraguchi M, Ueo H, Sugimachi K,Akiyoshi T (1998). Expression spectrum of melanoma antigen-encoding gene familymembers in colorectal carcinoma. Arch. Pathol. Lab Med. 122, 551-554.
Hussein YM, Morad FE, Gameel MA,Emam WA, El Sawy WH, El Tarhouny SA, Bayomy ES, Raafat N (2012). MAGE-4 genem-RNA and TGF in blood as potential biochemical markers for HCC in HCV-infectedpatients. Med. Oncol 29, 3055-3062.
Jacobs JF, Grauer OM, Brasseur F,Hoogerbrugge PM, Wesseling P, Gidding CE, van de Rakt MW, Figdor CG, Coulie PG,de Vries IJ, Adema GJ (2008). Selective cancer-germline gene expression inpediatric brain tumors. J Neurooncol. 88,273-280.
Jia ZC, Ni B, Huang ZM, Tian Y,Tang J, Wang JX, Fu XL, Wu YZ (2010). Identification of two novelHLA-A*0201-restricted CTL epitopes derived from MAGE-A4. Clin Dev. Immunol. 2010, 567594.
Kageyama S, Ikeda H, Miyahara Y,Imai N, Ishihara M, Saito K, Sugino S, Ueda S, Ishikawa T, Kokura S, Naota H,Ohishi K, Shiraishi T, Inoue N, Tanabe M, Kidokoro T, Yoshioka H, Tomura D,Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Katayama N, Shiku H (2015). Adoptive Transferof MAGE-A4 T-cell Receptor Gene-Transduced Lymphocytes in Patients with RecurrentEsophageal Cancer. Clin. Cancer Res.
Kang J, Lee HJ, Kim J, Lee JJ,Maeng LS (2015). Dysregulation of X chromosome inactivation in high gradeovarian serous adenocarcinoma. PLoS. ONE. 10,e0118927.
Kawagoe H, Yamada A, Matsumoto H,Ito M, Ushijima K, Nishida T, Yakushiji M, Itoh K (2000). Serum MAGE-4 proteinin ovarian cancer patients. Gynecol. Oncol 76,336-339.
Kim K, Cho YM, Park BH, Lee JL,Ro JY, Go H, Shim JW (2015). Histological and immunohistochemical markers forprogression prediction in transurethrally resected high-grade non-muscleinvasive bladder cancer. Int. J Clin Exp. Pathol. 8, 743-750.
Kobayashi T, Lonchay C, Colau D,Demotte N, Boon T, van der Bruggen P (2003). New MAGE-4 antigenic peptiderecognized by cytolytic T lymphocytes on HLA-A1 tumor cells. Tissue Antigens 62, 426-432.
Kocher T, Zheng M, Bolli M, SimonR, Forster T, Schultz-Thater E, Remmel E, Noppen C, Schmid U, Ackermann D,Mihatsch MJ, Gasser T, Heberer M, Sauter G, Spagnoli GC (2002). Prognosticrelevance of MAGE-A4 tumor antigen expression in transitional cell carcinoma ofthe urinary bladder: a tissue microarray study. Int. J Cancer 100, 702-705.
Kubuschok B, Xie X, Jesnowski R,Preuss KD, Romeike BF, Neumann F, Regitz E, Pistorius G, Schilling M,Scheunemann P, Izbicki JR, Lohr JM, Pfreundschuh M (2004). Expression of cancertestis antigens in pancreatic carcinoma cell lines, pancreatic adenocarcinomaand chronic pancreatitis. Int. J Cancer 109,568-575.
Li J, Yang Y, Fujie T, Tanaka F,Mimori K, Haraguchi M, Ueo H, Mori M, Akiyoshi T (1997). Expression of the MAGEgene family in human gastric carcinoma. Anticancer Res 17, 3559-3563.
Li M,Yuan YH, Han Y, Liu YX, Yan L, Wang Y, Gu J (2005). Expression profile of cancer-testis genes in 121 human colorectal cancertissue and adjacent normal tissue. Clin Cancer Res 11, 1809-1814.
Lifantseva N, Koltsova A, KrylovaT, Yakovleva T, Poljanskaya G, Gordeeva O (2011). Expression patterns ofcancer-testis antigens in human embryonic stem cells and their cell derivativesindicate lineage tracks. Stem Cells Int. 2011,795239.
Luftl M, Schuler G, Jungbluth AA(2004). Melanoma or not? Cancer testis antigens may help. Br. J Dermatol. 151, 1213-1218.
Lin J, Lin L, Thomas DG, Greenson JK, Giordano TJ,Robinson GS, Barve RA, Weishaar FA, Taylor JM, Orringer MB, Beer DG (2004).Melanoma-associated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification ofnovel MAGE-A10 splice variants. Clin Cancer Res 10, 5708-5716.
Liu W, Cheng S, Asa SL, Ezzat S (2008). Themelanoma-associated antigen A3 mediates fibronectin-controlled cancerprogression and metastasis. Cancer Res 68,8104-8112.
Marcar L, Ihrig B, Hourihan J, Bray SE, Quinlan PR,Jordan LB, Thompson AM, Hupp TR, Meek DW (2015). MAGE-A Cancer/Testis AntigensInhibit MDM2 Ubiquitylation Function and Promote Increased Levels of MDM4.PLoS. ONE. 10, e0127713.
Marcar L, Maclaine NJ, Hupp TR, Meek DW (2010a). Mage-Acancer/testis antigens inhibit p53 function by blocking its interaction withchromatin. Cancer Res 70,10362-10370.
Marcar L, Maclaine NJ, Hupp TR, Meek DW (2010b). Mage-Acancer/testis antigens inhibit p53 function by blocking its interaction withchromatin. Cancer Res 70,10362-10370.
Melo DH, Mamede RC, Neder L,Saggioro FP, Figueiredo DL, da Silva WAJ, Jungbluth AA, Zago MA (2011).Expression of MAGE-A4 and MAGE-C1 tumor-associated antigen in benign andmalignant thyroid diseases. Head Neck 33,1426-1432.
Mischo A, Kubuschok B, Ertan K,Preuss KD, Romeike B, Regitz E, Schormann C, de BD, Wadle A, Neumann F, SchmidtW, Renner C, Pfreundschuh M (2006). Prospective study on the expression ofcancer testis genes and antibody responses in 100 consecutive patients withprimary breast cancer. Int. J Cancer 118,696-703.
Mitchell RT, Camacho-Moll E,MacDonald J, Anderson RA, Kelnar CJ, O'Donnell M, Sharpe RM, Smith LB, GrigorKM, Wallace WH, Stoop H, Wolffenbuttel KP, Donat R, Saunders PT, Looijenga LH(2014). Intratubular germ cell neoplasia of the human testis: heterogeneousprotein expression and relation to invasive potential. Mod. Pathol. 27, 1255-1266.
Miyahara Y, Naota H, Wang L,Hiasa A, Goto M, Watanabe M, Kitano S, Okumura S, Takemitsu T, Yuta A, MajimaY, Lemonnier FA, Boon T, Shiku H (2005). Determination of cellularly processedHLA-A2402-restricted novel CTL epitopes derived from two cancer germ linegenes, MAGE-A4 and SAGE. Clin Cancer Res 11,5581-5589.
Montoro JR, Mamede RC, Neder SL,Saggioro FP, Figueiredo DL, Silva WA, Jr., Jungbluth AA, Spagnoli GC, Zago MA(2012). Expression of cancer-testis antigens MAGE-A4 and MAGE-C1 in oralsquamous cell carcinoma. Head Neck 34,1123-1128.
Monte M, Simonatto M, Peche LY, Bublik DR, Gobessi S,Pierotti MA, Rodolfo M, Schneider C (2006). MAGE-A tumor antigens target p53transactivation function through histone deacetylase recruitment and conferresistance to chemotherapeutic agents. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103, 11160-11165.
Nagao T, Higashitsuji H,Nonoguchi K, Sakurai T, Dawson S, Mayer RJ, Itoh K, Fujita J (2003). MAGE-A4interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenicactivity. J Biol Chem 278, 10668-10674.
Naota H, Miyahara Y, Okumura S,Kuzushima K, Akatsuka Y, Hiasa A, Kitano S, Takahashi T, Yuta A, Majima Y,Shiku H (2006). Generation of peptide-specific CD8+ T-cells byphytohemagglutinin-stimulated antigen-mRNA-transduced CD4+ T-cells. J Immunol.Methods 314, 54-66.
Nishikawa H, Maeda Y, Ishida T,Gnjatic S, Sato E, Mori F, Sugiyama D, Ito A, Fukumori Y, Utsunomiya A, InagakiH, Old LJ, Ueda R, Sakaguchi S (2012). Cancer/testis antigens are novel targetsof immunotherapy for adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood 119, 3097-3104.
Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, ItohK (1997). Expression of MAGE genes in colorectal carcinomas. Nihon RinshoMeneki. Gakkai Kaishi 20, 95-101.
Oba-Shinjo SM, Caballero OL,Jungbluth AA, Rosemberg S, Old LJ, Simpson AJ, Marie SK (2008). Cancer-testis(CT) antigen expression in medulloblastoma. Cancer Immun. 8, 7.
Ohkuri T, Wakita D, Chamoto K,Togashi Y, Kitamura H, Nishimura T (2009). Identification of novel helperepitopes of MAGE-A4 tumor antigen: useful tool for the propagation of Th1cells. Br. J Cancer100, 1135-1143.
Ottaviani S,Colau D, van der Bruggen P, van der Bruggen P (2006). A new MAGE-4 antigenic peptide recognized by cytolytic T lymphocytes onHLA-A24 carcinoma cells. Cancer Immunol. Immunother. 55, 867-872.
Otte M, Zafrakas M, Riethdorf L,Pichlmeier U, Loning T, Janicke F, Pantel K (2001). MAGE-A gene expressionpattern in primary breast cancer. Cancer Res 61, 6682-6687.
Peikert T, Specks U, Farver C,Erzurum SC, Comhair SA (2006). Melanoma antigen A4 is expressed in non-smallcell lung cancers and promotes apoptosis. Cancer Res 66, 4693-4700.
Peng JR, Chen HS, Mou DC, Cao J,Cong X, Qin LL, Wei L, Leng XS, Wang Y, Chen WF (2005). Expression ofcancer/testis (CT) antigens in Chinese hepatocellular carcinoma and itscorrelation with clinical parameters. Cancer Lett. 219, 223-232.
Perez D, Herrmann T, JungbluthAA, Samartzis P, Spagnoli G, Demartines N, Clavien PA, Marino S, Seifert B,Jaeger D (2008). Cancer testis antigen expression in gastrointestinal stromaltumors: new markers for early recurrence. Int. J Cancer 123, 1551-1555.
Prasad ML, Jungbluth AA, PatelSG, Iversen K, Hoshaw-Woodard S, Busam KJ (2004). Expression and significanceof cancer testis antigens in primary mucosal melanoma of the head and neck.Head Neck 26, 1053-1057.
Quillien V, Raoul JL, HeresbachD, Collet B, Toujas L, Brasseur F (1997). Expression of MAGE genes inesophageal squamous-cell carcinoma. Anticancer Res. 17, 387-391.
Rammensee HG, Bachmann J,Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHCligands and peptide motifs. Immunogenetics 50,213-219.
Rammensee HG, Bachmann J,Stevanovic S (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. (Heidelberg, Germany:Springer-Verlag).
Resnick MB, Sabo E, Kondratev S,Kerner H, Spagnoli GC, Yakirevich E (2002). Cancer-testis antigen expression inuterine malignancies with an emphasis on carcinosarcomas and papillary serouscarcinomas. Int. J Cancer 101,190-195.
Ries J, Schultze-Mosgau S, NeukamF, Diebel E, Wiltfang J (2005). Investigation of the expression of melanomaantigen-encoding genes (MAGE-A1 to -A6) in oral squamous cell carcinomas to determinepotential targets for gene-based cancer immunotherapy. Int. J Oncol. 26, 817-824.
Roch N, Kutup A, Vashist Y, Yekebas E, Kalinin V,Izbicki JR (2010). Coexpression of MAGE-A peptides and HLA class I molecules inhepatocellular carcinoma. Anticancer Res 30,1617-1623.
Saito T,Wada H, Yamasaki M, Miyata H, Nishikawa H, Sato E, Kageyama S, Shiku H, Mori M,Doki Y (2014). High expression of MAGE-A4 andMHC class I antigens in tumor cells and induction of MAGE-A4 immune responsesare prognostic markers of CHP-MAGE-A4 cancer vaccine. Vaccine 32, 5901-5907.
Sakurai T, Itoh K, HigashitsujiH, Nagao T, Nonoguchi K, Chiba T, Fujita J (2004). A cleaved form of MAGE-A4binds to Miz-1 and induces apoptosis in human cells. J Biol Chem 279, 15505-15514.
Sarcevic B, Spagnoli GC,Terracciano L, Schultz-Thater E, Heberer M, Gamulin M, Krajina Z, Oresic T,Separovic R, Juretic A (2003). Expression of cancer/testis tumor associatedantigens in cervical squamous cell carcinoma. Oncology 64, 443-449.
Schirmer U, Fiegl H, Pfeifer M,Zeimet AG, Muller-Holzner E, Bode PK, Tischler V, Altevogt P (2013). Epigeneticregulation of L1CAM in endometrial carcinoma: comparison to cancer-testis(CT-X) antigens. BMC. Cancer 13, 156.
Shafer JA, Cruz CR, Leen AM, KuS, Lu A, Rousseau A, Heslop HE, Rooney CM, Bollard CM, Foster AE (2010).Antigen-specific cytotoxic T lymphocytes can target chemoresistantside-population tumor cells in Hodgkin lymphoma. Leuk. Lymphoma 51, 870-880.
Sharma P, Shen Y, Wen S, BajorinDF, Reuter VE, Old LJ, Jungbluth AA (2006). Cancer-testis antigens: expressionand correlation with survival in human urothelial carcinoma. Clin Cancer Res 12, 5442-5447.
Shichijo S, Hoshino T, Koufuji K,Hayashi A, Kawamoto M, Kikuchi M, Higuchi T, Ichiki M, Oizumi K, Itoh K (1997).Detection of MAGE-4 protein in sera of lung cancer patients. Jpn. J Cancer Res 88, 414-419.
Shigematsu Y, Hanagiri T, ShiotaH, Kuroda K, Baba T, Mizukami M, So T, Ichiki Y, Yasuda M, So T, Takenoyama M,Yasumoto K (2010). Clinical significance of cancer/testis antigens expressionin patients with non-small cell lung cancer. Lung Cancer 68, 105-110.
Shirakura Y, Mizuno Y, Wang L,Imai N, Amaike C, Sato E, Ito M, Nukaya I, Mineno J, Takesako K, Ikeda H, ShikuH (2012). T-cell receptor gene therapy targeting melanoma-associated antigen-A4inhibits human tumor growth in non-obese diabetic/SCID/gammacnull mice. CancerSci. 103, 17-25.
Simpson AJ, Caballero OL, Jungbluth A, Chen YT, Old LJ(2005). Cancer/testis antigens, gametogenesis and cancer. Nat Rev. Cancer 5, 615-625.
Soga N, Hori Y, Yamakado K, IkedaH, Imai N, Kageyama S, Nakase K, Yuta A, Hayashi N, Shiku H, Sugimura Y (2013).Limited expression of cancer-testis antigens in renal cell carcinoma patients. Mol. Clin Oncol 1, 326-330.
Su C,Xu Y, Li X, Ren S, Zhao C, Hou L, Ye Z, Zhou C (2015). Predictive and prognostic effect of CD133 and cancer-testis antigens instage Ib-IIIA non-small cell lung cancer. Int. J Clin Exp. Pathol. 8, 5509-5518.
Takahashi N, Ohkuri T, Homma S,Ohtake J, Wakita D, Togashi Y, Kitamura H, Todo S, Nishimura T (2012). Firstclinical trial of cancer vaccine therapy with artificially synthesized helper/killer-hybrid epitope long peptide of MAGE-A4 cancer antigen. Cancer Sci. 103, 150-153.
Tahara K, Mori M, Sadanaga N, Sakamoto Y, Kitano S,Makuuchi M (1999b). Expression of the MAGE gene family in human hepatocellularcarcinoma 1999. Cancer 85, 1234-1240.
Tanaka F, Mori M, Li J, Fujie T,Mimori K, Haraguchi M, Tanaka Y, Mafune K, Akiyoshi T (1997). High frequency ofthe expression of the MAGE gene family in human esophageal carcinoma. Int. JOncol 10, 1113-1117.
Tsuzurahara S, Sata M, Iwamoto O,Shichijo S, Kojiro M, Tanikawa K, Itoh K (1997). Detection of MAGE-4 protein inthe sera of patients with hepatitis-C virus-associated hepatocellular carcinomaand liver cirrhosis. Jpn. J Cancer Res 88,915-918.
Wang M, Li J, Wang L, Chen X,Zhang Z, Yue D, Ping Y, Shi X, Huang L, Zhang T, Yang L, Zhao Y, Ma X, Li D,Fan Z, Zhao L, Tang Z, Zhai W, Zhang B, Zhang Y (2015). Combined cancer testisantigens enhanced prediction accuracy for prognosis of patients with hepatocellularcarcinoma. Int. J Clin Exp. Pathol. 8,3513-3528.
Wilson EM (2010). Androgen receptor molecular biologyand potential targets in prostate cancer. Ther. Adv. Urol. 2, 105-117.
Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, Dowsett M, McShane LM,Allison KH, Allred DC, Bartlett JM, Bilous M, Fitzgibbons P, Hanna W, JenkinsRB, Mangu PB, Paik S, Perez EA, Press MF, Spears PA, Vance GH, Viale G, HayesDF (2013). Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testingin breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of AmericanPathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol 31, 3997-4013.
Wong PP, Yeoh CC, Ahmad AS, Chelala C, Gillett C,Speirs V, Jones JL, Hurst HC (2014). Identification of MAGEA antigens as causalplayers in the development of tamoxifen-resistant breast cancer. Oncogene 33, 4579-4588.
Wu ZY, Gao YF, Wu YH, Liu W, SunM, Zhai MX, Qi YM, Ye Y (2011). Identification of a novel CD8+ T-cell epitopederived from cancer-testis antigen MAGE-4 in oesophageal carcinoma. Scand. JImmunol. 74, 561-567.
Yakirevich E, Sabo E, Lavie O,Mazareb S, Spagnoli GC, Resnick MB (2003). Expression of the MAGE-A4 andNY-ESO-1 cancer-testis antigens in serous ovarian neoplasms. Clin Cancer Res 9, 6453-6460.
Yang B, O'Herrin SM, Wu J, Reagan-Shaw S, Ma Y, BhatKM, Gravekamp C, Setaluri V, Peters N, Hoffmann FM, Peng H, Ivanov AV, SimpsonAJ, Longley BJ (2007). MAGE-A, mMage-b, and MAGE-C proteins form complexes withKAP1 and suppress p53-dependent apoptosis in MAGE-positive cell lines. CancerRes 67, 9954-9962.
Yamada R, Takahashi A, Torigoe T,Morita R, Tamura Y, Tsukahara T, Kanaseki T, Kubo T, Watarai K, Kondo T,Hirohashi Y, Sato N (2013). Preferential expression of cancer/testis genes incancer stem-like cells: proposal of a novel sub-category, cancer/testis/stemgene. Tissue Antigens 81, 428-434.
Yoshida N, Abe H, Ohkuri T,Wakita D, Sato M, Noguchi D, Miyamoto M, Morikawa T, Kondo S, Ikeda H,Nishimura T (2006). Expression of the MAGE-A4 and NY-ESO-1 cancer-testisantigens and T-cell infiltration in non-small cell lung carcinoma and theirprognostic significance. Int. J Oncol 28,1089-1098.
Zhang Y, Stroobant V, Russo V,Boon T, van der Bruggen P (2002). A MAGE-A4 peptide presented by HLA-B37 isrecognized on human tumors by cytolytic T lymphocytes. Tissue Antigens 60, 365-371.
Zimmermann AK, Imig J, Klar A,Renner C, Korol D, Fink D, Stadlmann S, Singer G, Knuth A, Moch H, Caduff R(2013). Expression of MAGE-C1/CT7 and selected cancer/testis antigens inovarian borderline tumours and primary and recurrent ovarian carcinomas. VirchowsArch. 462, 565-574.
【図１】
2019515650.tif 000013
【図２】
2019515650.tif 000014
【図３】
2019515650.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2019515650000001.app
【国際調査報告】
2019515650.tif 000019
2019515650.tif 000020
2019515650.tif 000021
2019515650.tif 000022
2019515650.tif 000023
2019515650.tif 000024