(57)【要約】  本発明は、水溶液中の成分の溶解性または溶解挙動を改善することについてのプロセスに関する。ゆっくりと溶解する／溶解しにくい成分の溶解特性は、負の溶解エンタルピーを有する別の成分を伴うこの成分の混合粒子を生成することにより明確に影響され得る。かかる混合粒子を調製し、添加することにより、溶解性は、化学組成を変化させることなく改善される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
所与の組成物を有する乾燥混合物の溶解性を改善するための方法であって、以下
ａ）前記乾燥混合物における1以上の難溶性成分を同定すること
ｂ）少なくとも１つの難溶性成分および負の溶液エンタルピーを有する１つの成分を含む、混合粒子を調製すること
ｃ）ステップｂ）で生成された1以上の混合粒子と、乾燥混合物の他の成分とを混合することにより、改善された溶解性を有する前記乾燥混合物を調製すること
による、前記方法。
【請求項２】
１以上の難溶性成分が、２５℃で１００ｇ／ｌを超える溶存成分を含む水溶液において、２０ｇ／ｌ未満の溶解性を有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分が、以下の群：
−プロリン
−塩化カルシウム、無水物
−硫酸マグネシウム、無水物
−酸化カルシウム、無水物
−水酸化ナトリウム
−水酸化カリウム
またはそれらの混合物
から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
負の溶解エンタルピーを有する成分が、プロリンであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
１以上の難溶性成分が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンの群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）における混合粒子の調製が、噴霧乾燥、凍結乾燥または湿式造粒により実行されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）における混合粒子の調製が、噴霧乾燥により実行されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
乾燥混合物が、乾燥粉末細胞培養培地であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
混合粒子の組成物が、負の溶液エンタルピーの量が難溶性成分の正の溶液エンタルピーの量の２倍以上となることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）において調製される混合粒子が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択される１以上の成分と組み合わされるプロリンを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
混合粒子の９０％（ｗ／ｗ）以上が、１以上の難溶性成分および負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分からなることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
水に難溶である少なくとも１つの成分および負の溶解エンタルピーを有する少なくとも１つの成分を含有する、１以上の混合粒子を含む、乾燥混合物。
【請求項１３】
乾燥混合物が、乾燥粉末細胞培養培地である、請求項１２に記載の乾燥混合物。
【請求項１４】
乾燥混合物が、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択される１以上の成分と組み合わされるプロリンを含む、混合粒子を含むことを特徴とする、請求項１２または１３に記載の乾燥混合物。
【請求項１５】
混合粒子の９０％（ｗ／ｗ）以上が、１以上の難溶性成分および負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分からなることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の乾燥混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶液中の成分の溶解性または溶解挙動を改善するための
ロセスに関する。ゆっくりと溶解する／溶解しにくい成分の溶解特性は、この成分と負の溶解エンタルピーを有する別の成分との混合粒子を生成することにより、明確に影響され得る。このような混合粒子を調製および添加することにより、化学的組成を変化させることなく、溶解性が改善される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
水溶液中で容易におよび十分に溶解するであろう、成分の乾燥粉末混合物または他の乾燥混合物を調製する際に、ある成分が、十分に溶解しない、または残りの成分について要求される混合時間に比べて長時間の混合の後にのみ溶解することができるといった問題にしばしば直面する。このような乾燥混合物についての例は、乾燥粉末細胞培養培地、栄養組成物、たとえば発泡錠、エナジードリンクの調製のための乾燥混合物、輸液などである。
【０００３】
それら乾燥混合物は、乾燥粉末、圧搾された、固体形態または任意の種類の錠剤の形態であってもよい。混合物は、典型的に、糖成分、アミノ酸、ビタミンまたはビタミン前駆体、塩、緩衝成分、補因子および／または核酸成分のようないくつかの異なる材料を含む。
このような複合乾燥混合物の一例は、細胞培養培地である。水溶液中の細胞培養培地は、細胞の成長を支持および維持する、および／またはある生成物の標的の生成に有利な所望の生理学的細胞状態を維持する、環境を提供し得る。
【０００４】
細胞培養培地は、その成長および／または標的の生理学的状態を支持するであろう、生物の種類に応じた、成分の、時には１００種を超える異なる成分の複合混合物から構成される。
哺乳動物、昆虫または植物細胞の増殖のために要求される細胞培養培地は、典型的に、細菌、酵母または真菌の成長を支持する培地より、より複雑である。
【０００５】
開発された最初の細胞培養培地は、血漿、血清、胚抽出物などの定義されていない成分もしくは他の定義されていない生物抽出物またはペプトンから成っていた。したがって、主要な進歩は、化学的に定義された培地の開発であった。化学的に定義された培地は、まったくもってこれらに限定されるものではないが、しばしばアミノ酸、ビタミン、金属塩、抗酸化剤、キレート剤、成長因子、緩衝剤、ホルモン、および当該技術分野の専門家に既知のさらに多くの物質を含む。
【０００６】
いくつかの細胞培養培地は、無菌の水性液体として提示される。液体細胞培養培地の不利な点は、その縮小された保管可能期間ならびに出荷および保管の困難性である。結果として、現在多くの細胞培養培地が、微細に粉砕された乾燥粉末混合物として提示されている。それらは、水および／または水溶液中に溶解する目的で製造されており、溶解状態において、細胞を由来とするバイオ医薬品の成長および／または生産のための実質的な栄養基質を同前記細胞に供給するために、しばしば他の補足物質を有するよう、設計されている。
【０００７】
ほとんどのバイオ医薬品生産プラットフォームは、流加細胞培養プロトコールに基づいている。その目的は、典型的に、増加する市場の需要に応じ、および製造コストを縮小する高力価の細胞培養プロセスを開発することである。高性能の組み換え細胞株の使用に加え、細胞培養培地およびプロセスパラメーターにおける改善が、最大生産能力を実現するために要求される。
【０００８】
流加プロセスにおいて、基本培地は初期の成長および生産を支持し、流加培地は栄養物の枯渇を防止し、生産段階を持続させる。培地は、異なる生産段階の間の別個の代謝の要求を受け入れるように選択される。供給戦略およびパラメーター制御を包含する、プロセスパラメーター設定は細胞の成長およびタンパク質生産のために好適な化学的および物理的環境を定義する。
流加培地の最適化は、流加プロセスの最適化における主要な側面である。
【０００９】
たいてい、流加培地は、バイオリアクターの希釈を避けるために非常に濃縮されている。栄養物の制御された添加は、培養物の成長率に直接影響する。
Invitrogen CorporationによるUS6,383,810 B2は、凝集した真核細胞の培養培地粉末を生産する方法を開示している。その方法は、溶媒で乾燥粉末細胞培養培地を湿潤すること、および次いで水分を含んだ培地を再乾燥し、潜在的に改善された溶解性を有する乾燥凝集細胞培養培地を得ることを含んでいる。
【００１０】
この手順の大きく不利な点は、すべての培地成分が水に接する必要があり、およびその後に水を取り除くために加熱される必要があるという事実である。これは、含水量が変化するにつれて、組成の変化を引き起こすだろう。加えて、培地の成分内での無視できない副作用、または培地の品質上の予期しない結果を伴う敏感な成分の破壊もしくは修飾を引き起こす可能性がある。
【００１１】
それにもかかわらず、乾燥粉末からの細胞培養培地の調製のための限定因子は、アミノ酸のような難溶解性のいくつかの成分である。Salazar A, Keusgen M, Hagen J Von. Amino acids in the cultivation of mammalian cells. Amino Acids. 2016;48(5):1161-1171. doi:10.1007/s00726-016-2181-8もまた参照のこと。その結果、他の成分に悪影響を与えることなく、および培地の組成を変化させることなく、細胞培養培地におけるこのような化合物の溶解性を改善する方法を見出すことは好都合であろう。水溶液中で乾燥成分混合物を溶解することにより調製される、ヒトまたは動物のための栄養混合物のような他の乾燥混合物についても、同じことが当てはまる。
【発明の概要】
【００１２】
発明の簡単な説明
その溶解性が改善されるだろう成分を、溶解エンタルピーが負である少なくとも１つの成分にごく接近して含む混合粒子を生成することにより、化合物の溶解性は改善され得ることが見出された。それらの混合粒子は、噴霧乾燥または共凍結乾燥（co-lyophilisation）のようなプロセスにより調製され、次いで最終乾燥混合物を生成するために他の成分と混合され得る。水性溶媒中で前記混合物を溶解する際に、難溶性成分の溶解性が改善されることが見出された。
【００１３】
おそらくこれは、負の溶解エンタルピーを有する成分により解放されるエネルギーが、混合粒子に起因して、負の溶解エンタルピーを有する成分にごく接近している難溶性成分へ少なくとも部分的に移動し得るという事実に起因する。この溶解性の改善は、細胞培養培地の化学的組成を変化させることなく、および加熱、超音波処理またはより激しい攪拌のような他の外的な手段を適用することなく達成される。本発明のプロセスが、負の溶液エンタルピーを有する少なくとも１つのアミノ酸および正の溶液エンタルピーを有する少なくとも１つのアミノ酸の混合粒子を調製することによるアミノ酸の溶解性の改善について特に好適であることが見出された。
【００１４】
したがって本発明は、以下による所与の組成物を有する乾燥混合物の溶解性の改善のための方法に指向される：
ａ）前記乾燥混合物中の１以上の難溶性成分を同定すること
ｂ）少なくとも１つの難溶性成分および負の溶液エンタルピーを有する少なくとも１つの成分を含む混合粒子を調製すること、ここで負の溶液エンタルピーを有する成分もまた乾燥混合物の所与の組成物中に存在する成分から選択される
ｃ）ステップｂ）において生成される１以上の混合粒子と、乾燥混合物の他の成分とを共に混合することにより前記乾燥混合物を調製すること。
【００１５】
好ましくは、ステップｃ）において混合粒子に混合される他の成分は、単一成分の粒子の形態で存在し、および噴霧乾燥、湿式造粒、共凍結乾燥または成分の全体または大部分を溶解および再乾燥することを含む他の技術により調製される成分の混合物の形態で存在していない。例外は、１を超える難溶性成分の溶解性が改善されるであろう事例における、本発明に従った混合粒子の第２の種類の存在であろう。好ましくは、混合成分の７０％（ｗ／ｗ）超は、単一成分粒子の形態で存在している。
【００１６】
好ましい態様において、１以上の難溶性成分は、２５℃で１００ｇ／ｌを超える溶存成分を含む水溶液中で２０ｇ未満の溶解性を有する化合物である。好ましくは、難溶性成分は正の溶液エンタルピーを有する成分である。
好ましい態様において、負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分は、以下の群：
−プロリン
−塩化カルシウム、無水物
−硫酸マグネシウム、無水物
−酸化カルシウム、無水物
−水酸化ナトリウム
−水酸化カリウム
またはそれらの混合物
から選択される。
【００１７】
最も好ましい負の溶液エンタルピーを有する成分は、プロリンである。
好ましい態様において、１以上の難溶性成分は、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンの群から選択される。
別の好ましい態様において、ステップｂ）における混合粒子の調製は、噴霧乾燥、凍結乾燥または湿式造粒により実行される。
最も好ましい態様において、ステップｂ）における混合粒子の調製は、噴霧乾燥により実行される。
【００１８】
非常に好ましくは、ステップｂ）において生成される混合粒子は、難溶性ではないか、または負の溶液エンタルピーを有さないかのいずれかである成分を、１０％（ｗ／ｗ）を超えて含有しない。これは、好ましくは混合粒子の９０％（ｗ／ｗ）以上が、１以上の難溶性成分および負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分からなることを意味する。
非常に好ましくは、ステップｂ）において生成される混合粒子は、アミノ酸のみを含有する。
【００１９】
好ましい態様において、乾燥混合物は乾燥粉末細胞培養培地である。
好ましい態様において、混合粒子の組成物は、混合粒子の溶解から生じる負の溶液エンタルピーの全量が、混合粒子中に存在する難溶性成分を溶解することから生じる正の溶液エンタルピーの２倍以上の量であるようなものである。
好ましい態様において、ステップｂ）において調製される混合粒子は、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択される１以上の成分と組み合わされて、プロリンを含む。
【００２０】
本発明はさらに、水に難溶である少なくとも１つの成分および負の溶解エンタルピーを有する少なくとも１つの成分を含有する、１以上の混合粒子を含む乾燥混合物に指向される。好ましくは、混合粒子は、水に難溶である１つの成分および負の溶解エンタルピーを有する１つの成分のみを含有する。
好ましい態様において、乾燥混合物は乾燥粉末細胞培養培地である。
別の好ましい態様において、乾燥混合物は、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンから選択される１以上の成分と組み合わされて、プロリンを含む、混合粒子を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
発明の説明
【図１】図１は、Ｌ−プロリンの初期のベースラインの傾きを補正したのちの、時間関数としての相対温度を示している。値は平均値を表している（ｎ＝２）。
【図２】図２：Ｌ−ロイシンの初期のベースラインの傾きを補正したのちの、時間関数としての相対温度。値は平均値を表している（ｎ＝２）。
【図３】図３  ２：１の比率において混合されたＬ−プロリンおよびＬ−ロイシン粉末の初期のベースラインの傾きを補正したのちの、時間関数としての相対温度。値は平均値を表している（ｎ＝３）。
【図４】図４：２：１の比率における噴霧乾燥したＬ−プロリンおよびＬ−ロイシン粉末を初期のベースラインの傾きを補正したのちの、時間関数としての相対温度。値は平均値を表している（ｎ＝３）。  図についてのさらなる詳細は、例３において見つけることができる。
【００２２】
本発明に従った乾燥混合物は、以下の１以上の群：糖成分、アミノ酸、ビタミンまたはビタミン前駆体、塩、緩衝成分、補因子および／または核酸成分、から選択される２以上の成分を含む成分の任意の混合物である。本発明に従った乾燥混合物は、水溶液中にて完全に溶解することを意味する乾燥混合物である。水溶液は、水または緩衝液のような任意の水溶液である。水溶液は、エタノールのような水に溶解する有機溶媒を２０％まで含んでもよい。しかし好ましくは、溶媒は、水または水性緩衝液であり、いかなる有機溶媒も含有しない。
典型的に、乾燥混合物の成分は、乾燥粉末の形態、乾燥粉末の任意の圧搾された形態、または錠剤の形態である。
【００２３】
用語「乾燥粉末」は、用語「粉末」と交換可能であるように使用されてもよく；しかしながら、本明細書で使用される「乾燥粉末」は、粒状にされた原料の全体の外形を単純に指し、別段の指示がない限り、原料が、複合した、または凝集した溶媒を完全に含まないことを意味することを意図しない。
好ましくは、乾燥混合物のすべての成分は、乾燥している。これは、それらが水分を含んでいる際は、それらは結晶水のみを含むが、非結合または非協調である水分子の重量で５％は超えず、好ましくは、２％を超えず、最も好ましくは、１％を超えないことを意味する。
【００２４】
粉末状の細胞培養培地は、典型的に製粉プロセスまたは凍結乾燥プロセスから生じる細胞培養培地であり得る。粒状細胞培養培地、たとえばローラー圧縮による乾燥粒状物、でもあり得る。
本発明に従った乾燥混合物は、液体細胞培養培地、または、栄養／ビタミン飲料、アイソトニック飲料、輸液などの他の液体組成物の調製を意味している成分の任意の混合物であり得る。栄養混合物についての例はUS2008/0254119にて見つけることができる。好ましくは、乾燥混合物は、乾燥粉末細胞培養培地である。
【００２５】
混合粒子は、少なくとも１つの難溶性成分および１つの負の溶液エンタルピーを有する成分を含む粒子であり、ここで混合粒子のすべての成分は、混合され、難溶性成分と負の溶液エンタルピーを有する成分との間の相互作用している接触面を拡大することを可能とするくらい徹底的に、均質に粒子は分配されている。混合粒子のサイズは、乾燥混合物の他の成分の粒子サイズに匹敵する。典型的な粒子サイズは、２００μｍ未満であり、好ましくは１００μｍ未満である。好ましいものは１５μｍと１００μｍとの間である。混合粒子中の成分の混合およびブレンド（blending）がよくなるほどよい。混合粒子は、成分の混合物の粒子を調製する任意の手段により調製され得る。これは、粉末混合物の乾燥圧搾、また好ましくは湿式造粒、噴霧乾燥もしくは凍結乾燥によるものであり得、特に好ましくは噴霧乾燥である。
【００２６】
乾燥圧搾は、典型的に２つの基本的なステップ
ａ）成分の混合粉末の形態において、成分の混合物を提供すること
ｂ）前記混合粉末をロールプレス（roll press）において圧搾すること
において実行される。
ステップａ）において、微細に製粉された成分の乾燥粉末が供給される。すべての成分は、粉末混合物のすべての部分がほぼ同じ組成を有するように、徹底的に混合される。混合物は、市販の乾燥粉末細胞培養培地として、組成の均一性の点で同じ品質を有すべきである。組成の均一性が高くなるほど、結果として生じる乾燥粒状混合物の品質はよくなる。微細に製粉された粉末を生産するために好適なミル（mills）は、例えばボールミル（ball mills）、ピンミル（pin mills）、ジェットミル（jet mills）または回転刃シーブミル（rotating blade sieve mills）である。粉末の粒子サイズは、典型的に５００μｍ未満であり、好ましくは、２００μｍ未満である。
【００２７】
ローラーコンパクター（roller compactor）とも呼ばれているロールプレスは当業者に周知である。典型的なロールプレスは、互いに約０．５〜３ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍ、の短い距離に位置する、２つの反対方向に回転するローラー（roll）を含む。好適なロールプレスは典型的に、１０と５０ｃｍとの間の幅を有する、ローラーを有し、結果として１０と５０ｃｍとの間の長さを有するローラーの間の隙間を生じる。それにもかかわらず、ローラーのサイズおよび、したがってローラーの間の隙間の長さは、ロールプレスのサイズに依拠して変わり得る。好ましい態様において、隙間は１０と１５ｃｍとの間の長さを有する。
【００２８】
混合粉末原料は、反対方向に回転するローラーの間で引っ張られ、ローラーの間の隙間で圧搾される。ローラーの間の距離およびそれらの表面構造は、結果として生じる粒状の粒子の最終的なサイズおよび構造に影響する。
本発明に従った凍結乾燥は、原料を凍結し、次いで周囲の圧力を減少させ、原料中の凍結した水および任意の他の揮発性成分を、固相から気相へ直接昇華させることにより冷凍乾燥（freeze-drying）させる。
【００２９】
本明細書において使用される「共凍結乾燥されたもの（co-lyophilised）」または「共凍結乾燥物（co-lyophilisate）」は、同じベッセル中の１を超える化合物の凍結乾燥、冷凍乾燥、クライオデシケーション（cryodessication）または真空乾燥の結果生じる生成物を指す。例えば、２つの溶液が同じ容器中で一つに合わさり、結果として生じた溶液の組み合わせを共に凍結乾燥し、それにより溶液中の成分を同時に凍結乾燥する。あるいは、２以上の化合物が、同じ液体に溶解され、その後に共に凍結乾燥され得る。このような共凍結乾燥の結果生じた生成物は、共凍結乾燥されたすべての非揮発性成分の混合物を含む固体物質からなる共凍結乾燥物を指す。
【００３０】
混合粒子が、噴霧乾燥により生成される際に、混合されるすべての成分の濃縮溶液が生成され、これは所望の比率において成分を含有する。溶液は、噴霧乾燥機のチャンバーへ注ぎ込まれ、ここで分散し、熱風を用いて溶媒が蒸発する。複合原料は、収集チャンバーから集められ、さらに加工することなく用いられることができる。
【００３１】
湿式造粒において、成分の細粒または混合粒子は、（高せん断造粒機における）羽根車、（二軸スクリュー造粒機における）スクリュー、または（流動層造粒機における）空気の影響下にある、粉末層の上へ造粒液を添加することにより形成される。剤形内の成分の湿潤を伴うシステムの結果生じるかき混ぜは、最初の粉末粒子の凝集を生じ、湿潤した細粒を生産する。造粒液は、溶媒を含有しており、ここで溶媒は乾燥により取り除かれ得るために揮発性を有し、非中毒性でなければならない。典型的な液体は、水、エタノールおよびイソプロパノールを単独または組み合わせで包含する。
【００３２】
本発明に従う細胞培養培地は、細胞のインビトロ（in vitro）での成長を維持および／もしくは支持し、ならびに／または特定の生理学的状態を支持する、成分の任意の混合物である。それは複合培地または化学的に定義された培地であってもよい。細胞培養培地は、細胞のインビトロでの成長を維持および／または支持するために必要なすべての成分、またはさらなる成分を別々に添加するためのいくつかの成分のみを含み得る。本発明に従った細胞培養培地の例は、細胞のインビトロでの成長の維持および／または支持するために必要なすべての成分を含む完全培地（full media）、培地補足物質または供給物である。好ましい態様において、細胞培養培地は、完全培地または供給物である。
【００３３】
典型的に、本発明に従った細胞培養培地は、バイオリアクター中での細胞の成長の維持および／もしくは支持する、ならびに／または特定の生理学的状態を支持するために用いられる。
哺乳動物細胞培養培地は、哺乳動物の細胞のインビトロでの成長を維持および／または支持する成分の混合物である。哺乳動物の細胞の例は、ヒトまたは動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｉ  ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＫ−１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞、またはヒト細胞である。好適な細胞培養方法は、例えば流加プロセスまたは灌流細胞培養プロセスである。
【００３４】
化学的に定義された細胞培養培地は、化学的に定義されていないいかなる物質も含まない細胞培養培地である。これは、培地に用いられているすべての化学物質の化学的組成が既知であることを意味している。化学的に定義された培地は、いかなる酵母、動物または植物組織をも含まない；それらは、フィーダー細胞、血清、抽出物もしくは消化物または化学的な定義に乏しいタンパク質を培地へと与える他の成分を含まない。化学的に定義されない、または定義に乏しい化学成分は、それらの化学組成および構造が既知でないものであり、さまざまな組成物の中に存在し、またはアルブミンもしくはカゼインのようなタンパク質の化学組成および構造の評価に匹敵する、実験的努力を伴わなければ定義され得ない
【００３５】
粉末状細胞培養培地は、製粉プロセスに起因する細胞培養培地である。それは粉末状細胞培養培地が乾燥している、微粒子状の培地であって、液体培地ではないことを意味している。
本発明に従った培地にて培養される細胞は、細菌細胞のような原核細胞または植物もしくは動物の細胞のような真核細胞であってもよい。細胞は、正常細胞、不死化細胞、異常細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞または胚細胞、樹立または形質転換細胞株もしくは自然源由来で得られるだろう任意のもの、であり得る。
【００３６】
不活性雰囲気は、典型的にそれぞれの容器または器具に不活性ガスを充填することにより生成される。好適な不活性ガスは、アルゴンのような貴ガスであり、または好ましくは窒素である。これらの不活性ガスは、非反応性であり、望ましくない化学反応が起こることを防ぐ。本発明に従うと、不活性雰囲気の生成は、たとえば、液体窒素または窒素ガスを導入することにより、酸素の濃度を絶対圧で１０％（ｖ／ｖ）未満にまで減らすことを意味する。
【００３７】
異なる種類のミルは当業者にとって既知である。
遠心衝撃ミルとも呼ばれる、ピンミルは固体を粉砕し、それによって高速で回転している円盤上の突き出ているピンが破壊エネルギーを提供する。ピンミルは例えばMunson Machinery（ＵＳＡ）、Premium Pulman（インド）、Hosokawa AlpineまたはSturtevant（ＵＳＡ）にて販売されている。
【００３８】
ジェットミルは、粒子を加速するために圧縮ガスを用い、プロセスチャンバー中で互いに対してそれらに衝撃を与えている。ジェットミルは、たとえばSturtevant（ＵＳＡ）、Hosokawa AlpineまたはPMT（オーストリア）にて販売されている。
Fitzpatrick（ＵＳＡ）により市販されている、フィッツミル（fitz mill）は、製粉のために刃を有するローターを用いる。
【００３９】
細胞培養培地は、典型的に少なくとも１以上の糖成分、１以上のアミノ酸、１以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１以上の塩、１以上の緩衝成分、１以上の補因子および１以上の核酸成分を含む。
【００４０】
培地はまた、ピルビン酸ナトリウム、インスリン、植物性タンパク質、脂肪酸および／または脂肪酸誘導体および／またはプルロニック酸および／または化学的に調製される非イオン性界面活性剤のような界面活性成分を含んでもよい。好適な非イオン性界面活性剤の１つの例は、最初のヒドロキシル基において終結している二官能性ブロック共重合体界面活性剤であり、これはポロキサマーとも呼ばれ、たとえば、ドイツのＢＡＳＦ社から商標名pluronic（登録商標）にて入手できる。かかる物質は、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドに基づくブロック共重合体である（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ブロック共重合体）。好ましく用いられるＣＡＳ番号９００３−１１−６のポロキサマーは、一般式Ｉ
【化１】
2019521697.tif 000002
式中、ｘおよびｚが好ましくは独立して２〜１３０であり、ｙが好ましくは１５〜６７である、
を有する。
【００４１】
市販されているポロキサマーは、たとえばPluronics（登録商標）またはLutrole（登録商標）、たとえば、Pluronic（登録商標）溶液、ゲルまたはPluronic（登録商標）F-127などの固体である。あるいは、ポロキサマーは、当該技術分野において既知の方法に従い原材料から作られ得る（例えば、米国特許第３，５７９，４６５号および第３，７４０，４２１号を参照する）。
特に好ましいものは、時折Pluronic F 68またはKolliphor P 188またはLutrol F 68と呼ばれるポロキサマー１８８である。
【００４２】
糖成分は、グルコース、ガラクトース、リボースもしくはフルクトース（単糖の例）またはスクロース、ラクトースもしくはマルトース（二糖の例）などのすべての単糖または二糖である。
本発明に従ったアミノ酸またはアミノ酸成分の例は、タンパク質を構成するアミノ酸、特に必須アミノ酸、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびバリンはもちろん、Ｄ−アミノ酸のようなタンパク質を構成しないアミノ酸でもある。さらなる例は、プロリンおよびバリンである。
【００４３】
ビタミンの例は、ビタミンＡ（レチノール、レチナール、様々なレチノイド、および４つのカロテノイド）、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン、ナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸、フォリン酸）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン）、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＤ（エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール）、ビタミンＥ（トコフェロール、トコトリエノール）およびビタミンＫ（フィロキノン、メナキノン）である。ビタミン前駆体もまた包含される。
【００４４】
塩の例は、ビカルボナート、カルシウム、塩化物、マグネシウム、ホスファート、カリウムおよびナトリウムなどの無機イオンまたはＣｏ、Ｃｕ、Ｆ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｓｅ、Ｓｉ、Ｎｉ、Ｂｉ、ＶおよびＺｎなどの微量元素を含む成分である。例は、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、リン酸二水素ナトリウム無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、リン酸水素二ナトリウム無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物である。
【００４５】
緩衝物の例は、ＣＯ２／ＨＣＯ３（カルボナート）、ホスファート、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳおよびＴＲＩＳである。
補因子の例は、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチドおよびその誘導体、グルタチオン、ヘムヌクレオチドホスファートおよびその誘導体である。
本発明に従った核酸成分は、シトシン、グアニン、アデニン、チミンまたはウラシルのような核酸塩基、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシンおよびチミジンのようなヌクレオシド、アデノシン一リン酸またはアデノシン二リン酸またはアデノシン三リン酸のようなヌクレオチドである。
【００４６】
言及されたすべての化合物において、化合物名はまた、任意の塩、水和物、ジ−、トリ−またはオリゴマーもしくは光学異性体を包含する。例えば、グルコースはまた、グルコース一水和物をも意味し、Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピぺラジン−１−エタンスルホン酸）はまた、Ｈｅｐｅｓナトリウム塩（４−（２−ヒドロキシエチル）ピぺラジン−１−エタンスルホン酸ナトリウム塩）をも意味する。
本発明に従った冷凍は、０℃未満の温度にまで冷却することを意味する。
【００４７】
本発明の要旨は、成分の乾燥混合物における難溶性成分の溶解性および、したがって所与の組成を有する混合物の全体の溶解性を改善することである。好ましい混合物は細胞培養培地である。所与の組成を有する粉末状細胞培養培地は、所与の溶解条件下において所与の量の水に溶解しないまたは溶解させるために温度を上昇させるような特別な処理もしくは長い時間が必要である、１またはいくつかの成分を含んでもよい。細胞培養培地の全組成を修正し、難溶性成分の量を減らし、または別の成分によりそれを代替することは、典型的に望ましくない。
【００４８】
本発明の方法を用いる、粉末状細胞培養培地および他の乾燥混合物の溶解性は、それらの化学的組成を変えることなく改善され得ることが見出された。
これは、難溶性であり、乾燥粉末混合物の容易な溶解を妨げる、１以上の成分を所与の組成物において同定することによりなされる。
細胞培養培地の分野における当業者は、典型的に細胞培養培地の典型的な材料の溶解性について知っており、材料の所与のリストにおける難溶性成分を同定することができる。
【００４９】
同定はまた、所与の組成物の材料のリストを再考すること、および溶解性のデータに基づく最も乏しい溶解性を有する１以上の成分を同定することによりなされ得る。物質の溶解性は、典型的に既知であり、公に利用できるデータベースまたはたとえば、Chemiker-Kalender. 編集者Claudia SynowietzおよびKlaus Schaefer、第３版、第２刷１９９２年、６５６ページ；Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo; Springer 1984; ISBN 978-3-540-12652-2といった教本において見出すことができる。
【００５０】
同定はまた、所与の乾燥混合物を溶解すること、および不十分な溶解の場合に、不溶性粒子を単離すること、およびたとえば、ＮＭＲ、質量分析、元素分析、クロマトグラフィ法またはそれらの組み合わせにより、それらを分析することにより実験的になされ得る。好適な方法の例は、ＩＣＰ−ＯＥＳ、（たとえば、アミノ酸についての）ＵＰＬＣ、ＩＣである。この分析から、不溶性粒子の化学組成について情報を得て、したがって難溶性成分を同定することができる。
【００５１】
本発明に従った難溶性である成分は、所与の溶解条件下で前記混合組成物におけるその溶解性が改善されるだろう、混合物の任意の成分である。難溶性成分は、しばしば２５℃の水１リットルにおいて、１０ｇ未満、特に１ｇ未満しか溶解することができない物質として記載される。本発明は、かかる難溶性物質について好適であるが、それらの溶解性のさらなる改善が必要である場合、例えばかなり多くの量を添加することが必要である場合、または物資が溶解するのに必要な時間が比較的長い場合に、２５℃の水１リットルにおいて１０ｇより多く溶解することのできる物質についてももちろん使用され得る。
【００５２】
加えて、水における物質の溶解性は、いくつかの他の溶存成分を含む混合物におけるその溶解性と異なり得る。これは、流加培地のような高濃縮溶液において、特に真実である。１００ｇ／ｌより多い溶存成分を含有する溶液において、２５℃の水において１０ｇ／ｌより多い溶解性を有する成分の溶解性は、十分ではないだろうし、そういった条件下では、かかる成分でさえ難溶性である。これは、たとえば、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびフェニルアラニンのような、純水において典型的に１０ｇ／ｌより多い溶解性を有するアミノ酸についての事例である。
【００５３】
それにもかかわらず、高濃縮流加培地において、その溶解性は、しばしば十分ではない。結果として、本発明に従った難溶性である物質は、好ましくは１００ｇ／ｌを超える溶存成分を含む水溶液１リットルにおいて、またはかかる溶液の例として２５℃の１０倍濃縮のＤＭＥＭ  Ｆ−１２細胞培養培地において、２０ｇ未満、特に１０ｇ未満しか溶解することのできない物質である。１倍のＤＭＥＭ  Ｆ１２細胞培養培地（Sigma Aldrichの製品、商品番号Ｄ２９０６）の組成は例に示されている。典型的な溶解は、２時間後、好ましくは４５分後には完了しているべきである。
【００５４】
難溶性細胞培養培地の成分の例は当業者に既知であるか、または所与の細胞培養培地の組成について上記のように同定されている。それらは細胞培養培地の種類に依存して異なっていてもよい。典型的な例は、以下：シスチン、クエン酸第二鉄（クエン酸鉄（ＩＩＩ）水和物）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物および／またはチロシンである。シスチンが水および細胞培養培地において難溶性である一方、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物は、水において十分に溶解するが、細胞培養培地においてはとても乏しい溶解性を典型的に示す成分の例である。
【００５５】
本発明に従った好ましい難溶性成分は、正の溶液エンタルピーを有する成分である。それらは糖成分、アミノ酸、ビタミンまたはビタミン前駆体、塩、緩衝成分、補因子および／または核酸成分であり得る。塩の例は、塩化カリウムおよび硝酸アンモニウムである。好ましくは正の溶液エンタルピーを有する難溶性成分は、アミノ酸である。例は、ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンである。
【００５６】
溶液エンタルピー、溶解エンタルピー、または溶液の熱は、無限希釈をもたらす定圧での溶媒中の物質の溶解に関連するエンタルピーの変化である。
溶液エンタルピーは、多くは、恒温でのｋＪ／ｍｏｌにおける変化で表現される。エネルギーは、溶質中および溶媒中の結合の吸熱破壊、ならびに溶質と溶媒の間での引力の形成の３つの部分より成り立っているとみなされ得る。
【００５７】
化合物の、溶解時のエネルギー変化、溶液エンタルピーは、その構造およびそれが溶解する溶媒に依存する。このエネルギーのうちのいくつかは、溶液中の他の分子へと移され得、これは移動エンタルピーと呼ばれ、いくつかは、周囲に失われる。この効果は、難溶性成分の溶液挙動の改善に使用され得ることが見出された。移動エンタルピーは、難溶性成分の溶解性を局所的に、分子レベルで改善することができ、エネルギーはまた、たとえば混合物全体を加熱することによる、混合物全体へのエネルギー移動の必要なしに分子レベルで移されると思われる。
【００５８】
物質を溶解する事例において、成分は、自身がエネルギーを放出するか取り込むかに基づいて、発熱性または吸熱性に分類され得る。熱エネルギーおよびエンタルピーは、式（１）および（２）を使用することにより、計算される。測定は、高希釈にてなされているため、水の熱容量は水溶液についても使用され得る。計算は以下の例により明らかにされている。
【数１】
2019521697.tif 000003
ΔＨ＝反応のエンタルピー［ｋＪ／ｍｏｌ］
ΔＱ＝熱エネルギーの変化［ｋＪ］
ｍ＝物質の質量［ｇ］
ｃｐ＝水の熱容量、４．１８［Ｊ／ｋｇＫ］
ΔＴ＝温度の変化［Ｋ］
ｎ＝物質量
例：グリシンが８００ｇの水に添加された。
【数２】
2019521697.tif 000004
【００５９】
アミノ酸の溶液エンタルピーについてのさらなる詳細は、Lou Y, Lin R. Enthalpy of transfer of amino acids from water to aqueous glucose solutions at 298 . 15 K. 1998;316:145-148およびActa T. Enthalpies of solution of L-phenylalanine in aqueous solution of amides at 298 . 15 K. 2016;(January 2013) doi:10.1016/j.tca.2012.11.004において見出される。
【００６０】
負の溶液エンタルピーを有する成分から正の溶液エンタルピーへのエネルギー移動は、成分が溶解の間にごく接近する際に、難溶性成分の溶解を支持するのに十分に効果があることが見出された。このごく接近というのは、それらの成分の混合粒子の生成により達成され得る。難溶性成分は、その結果、負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分を混合し、それらを乾燥粉末混合物に添加する前に、混合粒子を形成する。１以上の難溶性成分と負の溶液エンタルピーを有する１つの成分を混合すること、または１つの難溶性成分と負の溶解エンタルピーを有する１以上の成分を混合することは、可能である。好ましくは、１つの難溶性成分は、負の溶液エンタルピーを有する１つの成分とともに共凍結乾燥される。
【００６１】
負の溶液エンタルピーを有する好適な成分は、難溶性成分ではないものであって、組成物中でのその濃度が、難溶性成分と混合されるのに十分な量が存在しているほど十分に高い、すべての成分である。例は、ＣａＣｌ２、ＭｇＳＯ４またはＣａＯのような無機塩類、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのような塩基はもちろん、プロリンのようなアミノ酸もである。プロリンは、多くの適用、特に難溶性アミノ酸との混合粒子を調製することにおいて、好適であることが見出された。ｐＨのシフトが、成分の溶解にさらに正の影響を与えるであろう際に、好ましくは、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムといった塩基が使用される。これは、たとえば、チロシンの溶解の改善についての事例である。 
【００６２】
好ましくは、負の溶液エンタルピーを有する成分の量は、負の溶液エンタルピーの量が正の溶液エンタルピーの量の少なくとも２倍になるような量で、混合粒子において存在する。
好ましくは、混合粒子は、その溶解性が改善される１以上の難溶性成分、およびエネルギー移動により難溶性成分の溶解を支持する負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分のみを含有する。混合粒子は、好ましくは、塩化ナトリウムもしくはグルコースのような、負の溶液エンタルピーを有さないか難溶性ではないかのいずれかの成分を一切含有しないか、または少なくとも１０％ｗ／ｗを超えては含有しない。グルコースまたは塩化ナトリウムのような成分は、容易に溶解するにもかかわらず、混合粒子中のそれらの存在は、難溶性成分と負の溶液エンタルピーを有する成分との間での直接的な接触、したがってエネルギーの移動を妨げるだろう。
【００６３】
所与の組成による乾燥混合物の溶解性を改善するために、難溶性成分と合わさり混合粒子を形成する、負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分は、乾燥混合物の元の組成にもまた存在する成分から選択されることは明らかである。かかる成分の量はまた、それが乾燥混合物中に存在する元の量に相当するように選択される。そうでなければ、混合物の組成は変化するであろう。その結果、乾燥混合物の全体の組成を変化させることなく溶解性を改善することを目指す際には、本発明の方法は、負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分を含む乾燥混合物についてのみ使用され得る。そうでなければ、乾燥混合物の組成は、以前の混合物中に存在していない、負の溶液エンタルピーを有する１以上の成分を添加することにより変化せざるを得ない。典型的に、栄養組成物および細胞培養培地については、かかる乾燥混合物は十分な数および量の、負の溶液エンタルピーを有する成分を含むので、これは重要な問題ではない。
【００６４】
たとえば、乾燥圧搾、湿式造粒、凍結乾燥または噴霧乾燥により混合粒子が生成されたのちに、結果として生じる混合固体は、次いで、好ましくは、たとえば、ボールミルにおいて製粉され、均質なサイズの粒子を生成してもよい。結果として生じる粒子は、典型的に２００μｍ未満のサイズの粒子である。好ましいものは、１００μｍ未満のサイズの粒子である。好都合な粒子サイズは、１５μｍと１００μｍの間である。
混合粒子は、次いで、粒子中の成分の濃度を決定するための分析方法に供され得る。好適な方法の例は、ＩＣＰ−ＯＥＳ、ＵＰＬＣ（たとえば、アミノ酸について）、ＮＭＲ、ＩＣまたはＬＣ−ＭＳである。
最終の混合粒子は、次いで、細胞培養培地のような乾燥混合物の生産のために保管され、または使用され得る。
【００６５】
後者について、混合粒子の好適な量は、細胞培養培地の他の成分と混合される。２以上の種類の混合粒子を生成し、および２以上の種類の混合粒子と細胞培養培地の他の成分を混合することもまた可能である。成分を混合することは、乾燥粉末状細胞培養培地を生産している当業者にとって既知である。好ましくは、すべての成分は、混合物のすべての部分がほとんど同じ組成を有するように徹底的に混合される。組成物の均一性が高いほど、結果として生じる培地の品質は、均質な細胞の成長という点でよくなる。
【００６６】
その後、混合物は好ましくは製粉される。
粉末状細胞培養培地を生産するのに好適である任意の種類のミルを用いて製粉は実行され得る。典型的な例は、ボールミル、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルである。好ましいものは、ピンミル、フィッツミルまたはジェットミルであり、さらに好ましいものはピンミルである。
当業者にとって、かかるミルを動かす方法は既知である。
【００６７】
本発明は、少なくとも１つの混合粒子を含む、乾燥混合物、好ましくは乾燥粉末細胞培養培地にさらに指向している。かかる培地は、本発明に従ったプロセスにより入手することができる。
好ましくは、乾燥混合物は、１〜１０の異なる混合粒子を含む。
特に好ましいものは、プロリンおよび１以上のバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンを含む混合粒子である。最も好ましいものは、アミノ酸のみから成り立っている粒子である。
【００６８】
粉末状乾燥混合物の使用について、溶媒、好ましくは水（特に蒸留および／もしくは脱イオン化された水または精製水または注射用水）または水性緩衝液が乾燥混合物に添加され、乾燥混合物が溶媒中に完全に溶解するまで、成分は混合される。
溶媒はまた、生理食塩水、１．０〜１４．０のｐＨの範囲を提供する可溶性の酸または塩基イオン、安定剤、界面活性剤、保存剤、およびアルコールまたは他の極性有機溶媒を含んでもよい。
【００６９】
たとえば、細胞培養培地の事例において、ｐＨの調整のための緩衝物質、ウシ胎仔血清、糖などのようなさらなる物質を細胞培養培地および溶媒の混合物に添加することも可能である。結果として生じる液体細胞培養培地を、次いで細胞に接触させ、成長または維持させる。
したがって本発明は、さらに以下によって細胞を培養するためのプロセスに指向する、
ａ）混合粒子、好ましくはプロリンおよび１以上のバリン、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンを含む混合粒子を含む細胞培養培地を提供すること、
ｂ）前記細胞培養培地と水または水性緩衝液を混合すること、
ｃ）培養される細胞を培養槽中でステップｂ）の細胞培養培地と混合すること、
ｄ）ステップｃ）の混合物をインキュベートすること。
【００７０】
培養槽は、その中で細胞を培養することができる任意の容器、ベッセル、バッグまたはタンクである。インキュベーションは、典型的に好適な温度、浸透圧、エアレーション、かき混ぜなどのような好適な条件下でなされる。当業者は、細胞の成長／培養を支持するおよび／または維持するための好適なインキュベーション条件を知っている。
【００７１】
乾燥混合物の生産のために混合粒子を使用することにより、混合成分の全量、およびしたがって全混合組成はレシピに概説されたものと同じままであるが、難溶性成分が負の溶液エンタルピーを有する成分と合わさることにより、乾燥粉末混合物全体の溶解性が、混合粒子を使用せずに調製された乾燥粉末混合物と比べて著しく高くなる。本発明の方法を使用することにより、典型的に、難溶性成分の溶解性は、少なくとも５０％増大し得る。好ましくは、少なくとも１００％増大し、それは混合粒子を使用することにより、難溶性物質それ自体の使用に比べて、少なくとも倍量の難溶性成分が、同じ液体組成物に溶解できるということを意味する。
【００７２】
本発明は、さらに以下の例により説明されるが、それらに限定されるものではない。
上記または下記で引用されるすべての出願、特許、および刊行物、ならびに２０１６年７月２８日に出願された対応欧州特許出願ＥＰ１６１８１６９１．３の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
例
以下の例は、本発明の実践的な適用を表す。
ＤＭＥＭ  Ｆ１２細胞培養培地（Sigma Aldrich社の商品番号Ｄ２９０６）、乾燥粉末、一倍の組成、組成は［ｇ／Ｌ］単位である：
【表１−１】
2019521697.tif 000005
【表１−２】
2019521697.tif 000006
【００７４】
原料および方法
原料
【表２】
2019521697.tif 000007
【００７５】
２．方法
２．１．１  噴霧乾燥
２．１．１．１  BUCHI社ミニスプレードライヤーＢ−２９０
２つの物質の溶液の噴霧乾燥に、BUCHI社ミニスプレードライヤーＢ−２９０を使用した。噴霧乾燥された物質を得るために、圧力ポンプを用いて加熱空気を、２流体ノズルキャップ（０．７ｍｍ）を通して送り込んだ。溶媒（溶液または懸濁液である生成物を含有する）を、さらにノズルに注ぎ込み、噴霧器を介して乾燥チャンバー中で噴霧し、これは熱い圧縮空気によって溶媒を微小液滴へと分散させた。乾燥チャンバー内で、液滴は予熱された空気を通して気化する。収集ベッセル内に生成物を沈降させる、サイクロンを通して乾燥チャンバーにて、残った湿った空気および生成粉末を放置する。乾燥生成物を保証するために、湿った空気および湿った粒子を、排気用ファンといった手段により排除し、それは余剰分をフィルターにかける。短い乾燥時間および低い乾燥温度は、熱に敏感な生成物を乾燥することを可能にする１７。小さな乾燥粒子を保証するために、出口温度は、その可能な限り低い値に最適化される必要があり、それは乾燥生成物をさらに保証し、粒子の付着および塊の形成を避ける１８。
【００７６】
実験の設定：
−ミニスプレードライヤーを、４０ｍ３／ｈのＱ−Ｆｌｏｗに設定した。
−１３０℃の入口温度に設定し、８２℃の出口温度へと導いた１９。
−蠕動ポンプを、で１００％の溶媒を一定に吸引する、１分あたり８ｍＬのポンプ速度に調整した。
−ノズルクリーナーを、１分あたり５回に設定した。
【００７７】
２．１．２  共凍結乾燥−基本手順
バリアント１：
難溶性成分を、超純水（たとえば、Milli-Q水）に攪拌して溶解し、必要に応じて温度を上昇させた。
負の溶液エンタルピーを有する成分もまた、超純水（たとえば、Milli-Q水）に溶解する。
両方の溶液は、攪拌されて合わされる。
【００７８】
バリアント２：
担体成分を、超純水（たとえば、Milli-Q水）に溶解する。難溶性成分を、攪拌しながら加える。混合物を、かき混ぜ、必要に応じてまた難溶性成分が溶解するまで加熱する。
両方のバリアントにおいて、成分の濃度、溶解時間および温度を、成分が溶解するように調整する必要がある。当業者にとって、そうすることは可能である。
【００７９】
凍結乾燥のために、バリアント１または２に従って調製された溶液を、好適な容器（たとえば、Lyoguard）に注ぎ、凍結乾燥器に入れる。溶液の組成に依存して、約−４５℃で４〜１２時間冷却する。凝縮器（condensator）を、−９０℃まで冷却する。次いで、真空を適用し（０．１８ｍｂａｒ）、溶液を、−４５℃で６時間乾燥させる。
次いで、乾燥中に、温度を約−３０℃で約２４時間、−２０℃でさらに２４時間および最終的に約０℃でさらに１２時間と調整する。最終乾燥を、約２０℃の温度で４〜１２時間最小の真空（０．００３ｍｂａｒ）下で実行する。
時間および温度勾配は、乾燥させる溶液の量に依存して調整され得る。
【００８０】
２．２  溶解エンタルピーの測定
２．２．１  TA InstrumentsによるTAM IVマイクロカロリメータ
TAM IVマイクロカロリメータを使用して、０．００１Ｋの正確さで、試験されている物質の溶解エンタルピーから発展する溶液の温度変化を検出する。
アミノ酸の異なる製剤が、水性溶媒により取り囲まれて、アンプル中に配置される。アンプルが破裂したのち、温度変化が分析される。
【００８１】
実験の設定：
−２５０ｍｇのそれぞれの試料を、いかなる前処理もせずに周囲と同じ条件で、１ｍＬ破砕アンプルへ充填した。
−アンプルを、シリコーンストッパーおよびワックスで閉じ、溶液熱量計の攪拌部に挿入し、１００ｍＬの水に浸漬した。
−次いで、システムを２５℃で平衡化し、一方アンプルが破壊される前に５００ｒｐｍで攪拌した。
−２５０ｍＷの電力、２．５Ｊの熱パルスでのキャリブレーションを破壊の前後に実施した。
−データの評価のために、試料の破壊の前のベースラインの勾配を、曲線の微分、ゼロへのシフトおよび再積分によりゼロへ設定した。
【００８２】
２．３  アミノ酸の定量分析
２．３．１  超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）：
ＵＰＬＣを溶液中のアミノ酸の同定および定量のための分析技術として使用した。アミノ酸を、誘導体化キットを使用して誘導体化し、次いで液体クロマトグラフィにより分離した。アミノ酸を標準と比べたそれらの保持時間に従い同定した（Zimmer A, Mueller R, Wehsling M, Schnellbaecher A, Hagen J Von. Improvement and simplification of fed-batch bioprocesses with a highly soluble phosphotyrosine sodium salt. J Biotechnol. 2014;186:110-118. doi:10.1016/j.jbiotec.2014.06.026.）。
【００８３】
３．１  噴霧乾燥された多成分のアミノ酸
隣接した分子の溶解挙動および溶液のエネルギーの疎水性効果は、熱量法を介して研究され、かかるシステムの熱力学特性を研究するために特に重要である２０。
噴霧乾燥された多成分のアミノ酸について、溶液エンタルピー測定を、定温シェル（isothermal shell）を備えた特別なアンプル熱量計にて実行した。熱量測定の過程で、温度−制御システムの安定性は、１０−４Ｋ以内に一定に維持された。すべての実験を、３回実施し、５％以内で再現可能であった。
【００８４】
図１および図２は、相対温度の形態におけるプロリンおよびロイシンの溶解を示している。Ｌ−プロリンの溶液エンタルピーについて、温度において激しい増大が観察され、持続的な減少がそれに続く（図１）。Ｌ−ロイシンの溶液エンタルピーは、温度において安定して減少していることを表す（図２）。
Ｌ−プロリンおよびＬ−ロイシン粉末を２：１の比率で混合したものの溶液エンタルピーは、温度において激しい増大が明らかになり、安定した減少がそれに続く（図３）。噴霧乾燥された同じアミノ酸の組成物の温度変化は、小さな温度減少を引き起こし、次いでベースラインに沿って通っていく（図４）。
【００８５】
結果の要約：
１．エネルギーは、物質が溶解するにつれて、物質により放出または吸収される。
２．溶解エンタルピーと呼ばれる、このエネルギーは、例えばプロリンからロイシンのように、エネルギーを放出する物質からエネルギーを吸収する物質へと移動し得る。
３．該現象は、例えば噴霧乾燥のような、物質をカップリングすることにより増強され得る。
４．プロリンおよびロイシンについて、２：１の比率が、エネルギー移動のために最も効率的であることが見出された。
５．噴霧乾燥された原料の粒子サイズの分布は、変化しなかった。したがって、粒子サイズの効果は、溶解性の改善において除外され得る。
【００８６】
４．細胞培養培地の生産
上記の混合粒子は、チャイニーズハムスターの卵巣細胞のための化学的に定義された細胞培養培地の調製のために使用される。
混合粒子を使用することにより、成分の全量はレシピに概説したものとなおも同じままである。
【００８７】
混合粒子を包含する培地の全材料を混合し、ドーセージスネイル（dosage snail）およびピンミルを用いて製粉する。ドーセージスネイルにおいて、材料は液体窒素にて処理される。
製粉は以下の条件で実施される：
温度−ミル：１０℃
酸素レベル：絶対圧１０％未満
Ｒｐｍ−ミル：２８００まで  １／ｍｉｎ
混合時間：３０ｍｉｎ
Ｒｐｍドーセージスネイル：４０  １／ｍｉｎ
結果として生じる粉末状細胞培養培地は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞の培養に好適である。
【図１】
2019521697.tif 000008
【図２】
2019521697.tif 000009
【図３】
2019521697.tif 000010
【図４】
2019521697.tif 000011
【国際調査報告】
2019521697.tif 000012
2019521697.tif 000013
2019521697.tif 000014