(57)【要約】  鼻分泌物中の可溶性Ｐ−糖タンパク質レベルの上昇の検出に基づいて、対象、例えば、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）を有する対象を特定し、任意選択でその対象を処置するための方法。処置の方法には、治療有効量のＰ−糖タンパク質阻害剤の投与が含まれ得る。
2019504319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）を診断する方法であって、
対象から、鼻分泌物を含み、好ましくは、鼻粘液を含むサンプルを用意するステップと、
前記サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップと、
前記サンプル中のＰ−ｇｐの前記レベルを、参照Ｐ−ｇｐレベルと比較するステップと
を含み、前記参照レベルよりも高い前記サンプル中のＰ−ｇｐのレベルは、前記対象がＣＲＳを有することを示す、方法。
【請求項２】
前記サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップが、前記サンプルを、Ｐ−ｇｐに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象を、ＣＲＳを有するとして特定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象に対するＣＲＳの処置を選択および／または投与するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＲＳの処置が、治療有効量のＰ−ｇｐ阻害剤の投与である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、鼻粘液由来のエキソソームを含み、前記サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップが、前記鼻粘液由来のエキソソーム中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象から、鼻粘液由来のエキソソームを単離するステップと、
前記鼻粘液由来のエキソソーム中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップと
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤での処置のための対象を選択し、任意選択で前記対象を処置する方法であって、
対象から、鼻分泌物を含み、好ましくは、鼻粘液を含むサンプルを用意するステップと、
前記サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップと、
前記サンプル中のＰ−ｇｐの前記レベルを、参照Ｐ−ｇｐレベルと比較するステップであって、
前記参照レベルよりも高い前記サンプル中のＰ−ｇｐのレベルは、前記対象が、Ｐ−糖タンパク質阻害剤での処置により利益が得られる可能性が高いことを示す、ステップと、
Ｐ−糖タンパク質阻害剤での処置のための前記対象を選択するステップと、
前記対象に、有効量のＰ−糖タンパク質阻害剤を任意選択で投与するステップと
を含む方法。
【請求項９】
前記サンプルが、鼻粘液由来のエキソソームを含み、前記サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップが、前記鼻粘液由来のエキソソーム中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象から、鼻粘液由来のエキソソームを単離するステップと、
前記鼻粘液由来のエキソソーム中の透過性−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップと
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤が、ＰＳＣ  ８３３、Ｒ−ベラパミル、ＧＦ１２０９１８、ＶＸ−７１０、ＭＳ−２０９、ＬＹ３３５９７９、ＯＣ１４４０９３、Ｒ１０１９３３、ＸＲ９０５１、またはＸＲ９５７６である、請求項４から１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤が、全身投与されるか、または前記対象の鼻腔および副鼻腔に局所投与される、請求項４から１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤が、吸入デバイスによって、フラッシングによって、またはスプレー噴霧によって、前記対象の鼻腔および副鼻腔に送達される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤が、前記対象に、外科手術により前記対象の鼻腔または副鼻腔に留置されるＰ−糖タンパク質阻害剤溶出インプラントとして投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｐ−糖タンパク質阻害剤溶出インプラントが、生体吸収性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
鼻副鼻腔炎の存在が、内視鏡検査またはコンピュータ断層撮影法によって確認されている、請求項１から１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｐ−ｇｐ阻害剤が、コルチコステロイドおよび抗生物質のうちの一方または両方と組み合わせて、投与される、請求項４から１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、コルチゾール、ブデソニド、モメタゾン、フルチカゾン、フルニソリド、およびベタメタゾンから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗生物質が、エリスロマイシン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ペニシリン、ベータ−ラクタム、マクロライド、フルオロキノロン、セファロスポリン、およびスルホンアミドから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のうちのいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、
Ｐ−糖タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントと、任意選択で既知の量のＰ−糖タンパク質を含む対照サンプルと
を含むキット。
【請求項２１】
請求項１から２０のうちのいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、
Ｐ−糖タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントと、任意選択で既知の量のＰ−糖タンパク質を含む対照サンプルと、サンプル採取のためのスポンジ、前記スポンジを設置するための送達デバイス、サンプル保存のためのプロテアーゼ阻害剤および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む採取容器、滅菌食塩水、ならびに輸送中の標本保存のための低温パックまたはフリーザーパックのうちの１つまたは複数と
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
可溶性Ｐ−糖タンパク質レベルの上昇の検出に基づいて、対象、例えば、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）を有する対象を特定し、任意選択でその対象を処置するための方法が、本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００２】
慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）は、副鼻腔粘膜の慢性的な炎症を特徴とする。鼻ポリープ（ＮＰ）を伴うＣＲＳおよび伴わないＣＲＳといった疾患のサブタイプの臨床症状は、長い間認識されていたが、ＣＲＳの病態生理学に関する理解が進歩したことにより（Kern et al., Am J Rhinol. 22:549-559）、疾患の特徴付けのエンドタイプパラダイム（Akdis et al., J Allergy Clin Immunol. 2013;131 (6):1479-90）の採用につながった。ＣＲＳの表現型的特徴および免疫学的特徴は、特定のエンドタイプ内で多様に存在し得るが、この診断構造は、重要な予後診断情報を提供し、標的を定めた医薬療法の時代を先導してきた（Pauwels et al., Expert Rev Clin Immunol. 2015;11 (3):349-61）。
【０００３】
個別化されたＣＲＳの処置は継続的に進歩しているため、外来環境において、患者を迅速かつ外傷を伴わずに分類するためには、疾患エンドタイプの非侵襲的バイオマーカーの開発が、極めて重要となるであろう。鼻粘液は、膨大な量で分泌され、容易にサンプルを採取することができるため、天然の潜在的なそのようなバイオマーカーの宝庫に相当する。複数のグループが、すでにこれらの利点を利用しており、ＣＲＳの感受性かつ特異的なバイオマーカーとして、鼻腔内の遊離好酸球性主要塩基性タンパク質（ｅＭＢＰ）の存在について報告している（Ponikau et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2015;5 (1):28-35、Schmid et al., Otolaryngol Head Neck Surg. 2010;143 (3):386-91）。これらの発見はあるものの、ｅＭＢＰは、注意深いサンプル採取手法を必要とし、非好酸球性と考えられる患者に存在するかどうかに関して、文献にはいくつかの不一致が存在する（Ponikau et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2015;5 (1):28-35）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
非侵襲的バイオマーカーの発見を継続することは、ＣＲＳの診断および処置の能力を高めるために、極めて重要である。Ｐ−ｇｐは、生理学的条件下において、鼻粘液中に分泌されるが、分泌の上昇は、客観的指標および主観的指標の両方によって、疾患の重症度が高いことと関連付けられている。したがって、Ｐ−ｇｐ分泌上昇の存在は、新規なＣＲＳの非侵襲的バイオマーカーに相当し得、Ｐ−ｇｐ阻害性治療戦略によって利益を得ることができる患者を予測するために使用することも可能である。
【０００５】
したがって、対象において、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）、例えば、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）優勢慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）エンドタイプを診断するための方法が、本明細書において提供される。本方法は、対象から、鼻分泌物、例えば、鼻粘液を含むサンプルを用意するステップと、サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップと、サンプル中のＰ−ｇｐのレベルを参照Ｐ−ｇｐレベルと比較するステップとを含み、参照レベルよりも高いサンプル中のＰ−ｇｐのレベルは、対象が、ＣＲＳを有することを示す（また、本方法は、参照レベルよりも高いＰ−ｇｐレベルを有する対象を、ＣＲＳを有するとして特定するステップを含み得る）。一部の実施形態において、本方法は、対象を、ＣＲＳを有するとして特定するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、対象に対するＣＲＳの処置を選択および／または投与するステップを含む。一部の実施形態において、ＣＲＳの処置は、治療有効量のＰ−ｇｐ阻害剤の投与である。
【０００６】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤での処置のための対象を選択するための方法もまた、本明細書において提供される。本方法は、対象から、鼻分泌物、例えば、鼻粘液を含むサンプルを用意するステップと、サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップと、サンプル中のＰ−ｇｐのレベルを参照Ｐ−ｇｐレベルと比較するステップ（参照レベルよりも高いサンプル中のＰ−ｇｐのレベルは、対象が、Ｐ−糖タンパク質阻害剤での処置により利益を得る可能性が高いことを示す）と、Ｐ−糖タンパク質阻害剤での処置のための対象を選択するステップと、任意選択で、対象に、有効量のＰ−糖タンパク質阻害剤を投与するステップとを含む。
【０００７】
一部の実施形態において、サンプルは、鼻粘液由来のエキソソームを含み、サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップは、鼻粘液由来のエキソソーム中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、対象から鼻粘液由来のエキソソームを単離するステップと、鼻粘液由来のエキソソーム中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップとを含む。一般に、これらの実施形態において、Ｐ−ｇｐのレベルは、エキソソームサンプルにおいて判定された関連する参照レベルと比較される。
【０００８】
一部の実施形態において、サンプル中の可溶性ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のレベルを判定するステップは、サンプルを、Ｐ−ｇｐに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させるステップを含む。
【０００９】
一部の実施形態において、対象から、鼻分泌物、例えば、鼻粘液を含むサンプルを用意するステップは、鼻灌流またはスポンジもしくは他の吸収性材料を使用して、対象からサンプルを採取するステップを含む。
【００１０】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、ＰＳＣ  ８３３、Ｒ−ベラパミル、ＧＦ１２０９１８、ＶＸ−７１０、ＭＳ−２０９、ＬＹ３３５９７９、ＯＣ１４４０９３、Ｒ１０１９３３、ＸＲ９０５１、またはＸＲ９５７６である。
【００１１】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、全身投与されるか、または対象の鼻腔および副鼻腔に局所投与される。
【００１２】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、吸入デバイスによって、フラッシングによって、またはスプレー噴霧によって、対象の鼻腔および副鼻腔に送達される。
【００１３】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、対象に、外科手術により対象の鼻腔または副鼻腔に留置されるＰ−糖タンパク質阻害剤溶出インプラントとして投与される。本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤溶出インプラントは、生体吸収性である。
【００１４】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、鼻副鼻腔炎の存在は、内視鏡検査またはコンピュータ断層撮影法によって確認されている。
【００１５】
本明細書に記載される方法の一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、コルチコステロイドおよび抗生物質のうちの一方または両方と組み合わせて、投与される。一部の実施形態において、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、コルチゾール、ブデソニド、モメタゾン、フルチカゾン、フルニソリド、およびベタメタゾンから選択される。一部の実施形態において、抗生物質は、エリスロマイシン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ペニシリン、ベータ−ラクタム、マクロライド、フルオロキノロン、セファロスポリン、およびスルホンアミドから選択される。
【００１６】
先行する請求項のいずれかに記載の方法において使用するためのキットであって、Ｐ−糖タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントと、任意選択で、既知の量のＰ−糖タンパク質を含む対照サンプルと、任意選択で、サンプルを格納するための容器と、任意選択で、サンプルを採取するためのスポンジまたは他の吸収性材料とが含まれるキットもまた、本明細書において提供される。
【００１７】
一部の実施形態において、対象（例えば、鼻副鼻腔炎を有する）は、本明細書に記載される方法を使用して特定され、例えば、有効量のＰ−ｇｐ阻害剤またはＰ−ｇｐ阻害剤の使用によって強化され得るコルチコステロイドなどの他の薬剤を対象に投与することによって、処置される。鼻副鼻腔炎を有する対象は、当業者によって、公知の方法に基づいて、例えば、症状の存在の検出に基づいて、内視鏡検査によって、またはコンピュータ断層撮影法によって、さらに特定され得るか、または診断が確認され得る。処置の有効性は、当該技術分野において公知の方法によって、例えば、症状のモニタリングによって、内視鏡検査またはコンピュータ断層撮影法によって、モニタリングすることができる。
【００１８】
一態様において、鼻副鼻腔炎を有する対象は、Ｐ−ｇｐの発現および／または活性を阻害するのに十分な量のＰ−ｇｐ阻害剤で処置される。Ｐ−ｇｐ阻害剤は、第１世代の化合物、例えば、ベラパミル、シクロスポリンＡ、抗高血圧薬、レセルピン、キニジンもしくはヨヒンビン、タモキシフェン、またはトレミフェン（toremifena）であり得る。好ましくは、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書において記載される、第２世代、第３世代、または第４世代の化合物、例えば、ＰＳＣ  ８３３、Ｒ−ベラパミル、エラクリダール（elacridar）（ＧＦ１２０９１８／ＧＧ９１８）、ＭＳ−２０９、ＯＣ１４４０９３、ＸＲ９０５１、ＬＹ３３５９７９、シクロプロピルジベンゾスベランゾスキダール（ＬＹ３３５９７９）、ラニキダール（laniquidar）（Ｒ１０１９３３）、ミトタン（ＮＳＣ−３８７２１）、ビリコダール（biricodar）（ＶＸ−７１０）、ＯＮＴ−０９３、タリキダール（tariquidar）（ＸＲ９５７６）、およびＨＭ３０１８１である（例えば、Amin, Drug Target Insights. 2013; 7:27-34）、Munagala et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 22 (3):1148-1155 (2014))、Lopez and Martinez-Luis, Mar Drugs. 2014 Jan; 12 (1): 525-546、Palmeira et al., Current Medicinal Chemistry, 2012, 19, 1946-2025を参照されたい）。
【００１９】
別の態様において、鼻副鼻腔炎を有する対象は、対象の副鼻腔上皮細胞におけるＰ−ｇｐ発現を、転写的にかまたは転写後的にのいずれかで減少させるのに十分な量のＰ−ｇｐで処置される。
【００２０】
一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、全身的に投与される。他の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、吸入デバイスによって、フラッシング、スプレー噴霧、灌注、ネブライゼーション、アトマイゼーション、または薬物溶出ビヒクルによって、対象の鼻腔および副鼻腔に局所的に投与される。
【００２１】
一部の実施形態において、鼻副鼻腔炎を有する対象は、処置の効果を高めるために、他の従来的な処置、例えば、コルチコステロイドおよび／または抗生物質などの薬物と組み合わせて、Ｐ−ｇｐ阻害剤で処置される。
【００２２】
一部の実施形態において、鼻副鼻腔炎を有する対象が、鼻ポリープを有する場合、そのような鼻ポリープの外科手術による除去が、対象へのＰ−ｇｐ阻害剤の投与に加えて行われ得る。したがって、鼻副鼻腔炎を有する対象は、外科手術およびＰ−ｇｐ阻害剤での処置の両方を受けることができる。鼻ポリープを有さないが、好酸球増加性副鼻腔炎を有する対象もまた、外科手術およびＰ−ｇｐ阻害剤での処置の両方を受けることができる。
【００２３】
一部の実施形態において、鼻副鼻腔炎を有する対象は、好酸球増加性副鼻腔炎および／または他の形態の粘膜炎症を有する。
【００２４】
一部の実施形態において、対象は、副鼻腔外科手術後に、慢性副鼻腔炎の症状を経験し続け、対象における副鼻腔の開存性を維持するために、Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出インプラント、ステント、またはスペーサーが使用される。Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出デバイスは、生体吸収性材料で作製することができるため、インプラントは、埋込み後、短期間内に吸収されることになり、外科手術によるインプラントの除去は必要ない。Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出デバイスは、固体、半固体、ゲル、ポリマー、または粒子の形態であり得る。
【００２５】
一部の実施形態において、Ｐ−糖タンパク質阻害剤は、コルチコステロイドおよび／または抗生物質のうちの一方または両方と組み合わせて、投与される。コルチコステロイドは、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、コルチゾール、ブデソニド、モメタゾン、フルチカゾン、フルニソリド、およびベタメタゾンから選択され得る。抗生物質は、例えば、エリスロマイシン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ペニシリン、ベータ−ラクタム、マクロライド、フルオロキノロン、セファロスポリン、およびスルホンアミドから選択され得る。
【００２６】
一部の実施形態において、対象における鼻副鼻腔炎を処置するためのキットが、提供される。そのようなキットは、有効量のＰ−ｇｐ阻害剤を含む医薬組成物と、医薬組成物を対象の鼻腔および副鼻腔に送達するためのデバイスとを含む。デバイスは、医薬組成物を、液体形態またはエアロゾル形態で、対象の鼻腔および副鼻腔に送達し得る。一部の実施形態において、キットはまた、Ｐ−ｇｐ阻害剤と同じ医薬組成物中または別個の組成物中に、コルチコステロイドおよび／または抗生物質を含む。
【００２７】
本明細書において使用されるとき、「処置」とは、疾患または障害の症状のうちの１つまたは複数を緩和するか、または代わりに、有利なように変化させる任意の様式を意味する。本明細書において使用されるとき、特定の障害の症状の緩和は、本開示の組成物および方法による処置に帰属または関連し得る、あらゆる軽減を指し、恒久的であるか一時的であるか、継続的であるか一過的であるかは問わない。
【００２８】
「有効量」は、有益な結果または所望される結果を実現するのに十分な量である。例えば、治療量は、所望される治療効果を達成するものである。この量は、疾患または疾患症状の発生を予防するために必要な量である予防有効量と同じであってもよく、または異なってもよい。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬で投与され得る。治療用化合物の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、１日につき１回または複数回から、１週間につき１回または複数回（１日おきを含む）で投与され得る。当業者であれば、疾患または障害の重症度、これまでの処置、対象の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本明細書に記載される治療用化合物による対象の処置には、単回処置または一連の処置が含まれ得る。
【００２９】
「対象」という用語は、本発明の方法による処置が提供される、動物、ヒト、または非ヒトについて記載して、本明細書全体を通じて使用される。獣医学的適用または非獣医学的適用が、企図される。この用語には、哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、げっ歯類、例えば、マウスおよびラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギが含まれるが、これらに限定されない。典型的な対象としては、ヒト、家畜動物、ならびにネコおよびイヌなどの愛玩動物が挙げられる。
【００３０】
「鼻副鼻腔炎」という用語には、本明細書において使用されるとき、鼻ポリープの存在を伴うかまたは伴わないかのいずれかである、急性および慢性の鼻副鼻腔炎が含まれる。
【００３１】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料が、本明細書に記載されているが、当該技術分野において公知の他の好適な方法および材料もまた、使用することができる。材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先される。
【００３２】
本発明の他の特性および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１Ａ−Ｂ：Ａ．ビヒクル対照またはＬＰＳ（１２．５μｇ／ｍＬ）に２４時間曝露した後の、培地中の可溶性Ｐ−ｇｐの濃度の図である。Ｂ．ビヒクル対照に曝露した上皮細胞およびＬＰＳに曝露した上皮細胞の両方における細胞質Ｐ−ｇｐと可溶性Ｐ−ｇｐとの間の相関性の図である。ＬＰＳ刺激後の細胞質Ｐ−ｇｐおよび可溶性Ｐ−ｇｐの両方の明らかな上方制御に注目されたい。
【図２】図１において培地内で検出された可溶性Ｐ−ｇｐは、相当な割合が、天然のタンパク質の分子量と相関する１７０ｋＤａの強力なバンドによって明らかなように、インタクトで分泌されていることを確認する、ウエスタンブロットの図である。追加の分解バンドは、５０ｋＤａおよび６０ｋＤａの両方で見られる。
【図３】上皮培養物における蛍光Ｐ−ｇｐ染色強度（ＣＴＣＦ−補正全細胞蛍光）のヒストグラムであり、外因性組換えヒトＰ−ｇｐへの曝露後の用量応答を示す。画像は、ヒストグラムと同じ組換えＰ−ｇｐ用量での上皮細胞の代表的な蛍光免疫細胞化学染色を示す（差し込み図は、ビヒクル対照を表す。バー＝１０μｍ）。
【図４】組換えＰ−ｇｐ曝露後の上皮細胞におけるカルセインＡＭ機能性Ｐ−ｇｐアッセイの図である。用量応答は、カルセイン蛍光の減少によって示されるように、組換え用量が高くなると増加するＰ−ｇｐ機能により、明らかである。
【図５】図５Ａ−Ｃは、診断による臨床疾患重症度指標のヒストグラムである。
【図６】図６Ａ−Ｂは、低分泌型状況（Ａ）および高分泌型状況（Ｂ）ごとの粘液および粘膜組織のＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）レベル間の相関性の図であり、高分泌型集団における強力かつ有意な相関性を示す。
【図７】図７Ａ−Ｂは、粘液（Ａ）および粘膜組織（Ｂ）のＰ−ｇｐレベルと、慢性鼻副鼻腔炎の確立されたバイオマーカーであるｅＭＢＰとの間の相関性の図であり、両方のサンプルにおける中等度かつ統計学的に有意な相関性を示す。
【図８】低分泌型状況（分泌型Ｐ−ｇｐ  ３００ｐｃｇ未満／全タンパク質（ＴＰ）μｇ）および高分泌型状況（分泌型Ｐ−ｇｐ  ３００ｐｃｇ超／ＴＰμｇ）ごとのエンドタイプの分布の図であり、高Ｐ−ｇｐ分泌型集団におけるＣＲＳｗＮＰ患者優勢へのシフトを示す。
【図９−１】図９Ａ−Ｃは、Ｐ−ｇｐ分泌型状況ごとの臨床疾患重症度指標のヒストグラムを示す。
【図９−２】図９Ａ−Ｃは、Ｐ−ｇｐ分泌型状況ごとの臨床疾患重症度指標のヒストグラムを示す。
【図１０】図１０Ａ−Ｂは、単離方法ごとの（Ａ）タンパク質および（Ｂ）ＣＤ６３＋エキソソーム濃度の比較の図であり、超遠心分離（ＵＣＦ）を使用して強化された収率を示す。
【図１１】図１１Ａ−Ｂは、最高濃度のゾスキダール（ＺＯＳ）およびエキソソーム／ＺＯＳの８０％を上回る生存を示す、インビトロ細胞毒性アッセイの図である。
【図１２】精製した粘液エキソソーム画分内でのエキソソームテトラスパニンマーカーであるＣＤ６３とＣＤ９との間の強力かつ有意な相関性を示す、相関曲線である。
【図１３】図１３Ａ−Ｄは、粘液由来のエキソソームの特徴付けを示す。（Ａ）ＴＥＭ画像は、ａ．鼻粘液から精製したホールマウントのエキソソーム（バー５００ｎｍ）を示す。ｂ．典型的なエキソソームのサイズおよび形質学を確認する陰性対照（ｂ〜ｄについては、バー１００ｎｍ）。ｃ〜ｄ．エキソソーム膜に局在化するエキソソームマーカーＣＤ６３およびＰ−ｇｐのイムノゴールド標識。（Ｂ）ＣＲＳｗＮＰ患者と対照患者との間で類似する全エキソソーム濃度を示す、散乱／箱ひげ図（中央値および四分位範囲、バーは四分位範囲の１．５倍を表す）である。（Ｃ）対照と比較して、ＣＲＳｗＮＰ患者における優位に高いエキソソーム当たりのＰ−ｇｐ濃度を示す、散乱／箱ひげ図（中央値および四分位範囲、バーは、四分位範囲の１．５倍を表す）である。（Ｄ）精製した粘液由来のエキソソーム（１０μｇ）のＰ−ｇｐのウエスタンブロットの図であり、ＣＲＳｗＮＰと比較して、対照患者における発現が有意に弱いことを示す（組換えＰ−ｇｐは、陽性対照であり、陰性ローディング対照は示されない）。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは、自家エキソソームの上皮細胞内部移行の図である。（Ａ）自家上皮細胞によるエキソソーム取込みの低速度蛍光画像（バー５０μｍ、青色は核染色、緑色はＣＦＳＥエキソソームタンパク質染色、オレンジはＡＯエキソソームＲＮＡ染色）を示す。曝露から１０分以内に、エキソソームは、細胞の膜および細胞質内にはっきりと見ることができる。続く２０分間にわたって、タンパク質シグナルは、細胞全体に広がったが、エキソソームＲＮＡは、核の周囲に集中している（差し込み図は、時間が対応している未染色のエキソソーム陰性対照を表す）。（Ｂ）カルセインＡＭ蛍光のヒストグラム（中央値、エラーバーはＩＱＲを表す）の図であり、ゾスキダールでのＰ−ｇｐ特異的阻害によって抑制される、ＣＲＳｗＮＰ患者におけるエキソソーム曝露後のＰ−ｇｐ機能の増加の差分を、対照と比較して示す。
【図１５】図１５Ａ−Ｂ：（Ａ）エキソソーム暴露後のＩＬ−６分泌のヒストグラム（中央値、エラーバーはＩＱＲを表す）であり、ゾスキダールでのＰ−ｇｐ特異的阻害によって抑制される、ＣＲＳｗＮＰ患者における分泌の増加の差分を、対照と比較して示す。（Ｂ）エキソソーム曝露後のＩＬ−８分泌のヒストグラム（中央値、エラーバーはＩＱＲを表す）の図であり、ゾスキダールでのＰ−ｇｐ特異的阻害によって抑制される、ＣＲＳｗＮＰにおける分泌の増加の差分を、対照と比較して示す。
【図１６】研究したすべての患者間で、主観的鼻症状スコア（ＳＮＯＴ−２２）およびエキソソームＰ−ｇｐ濃度の間の有意な相関性を示す、相関曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、ＡＴＰ依存性膜貫通排出ポンプであり、２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）優勢慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）エンドタイプでは上方制御される（Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2012;2 (2):122-5、Feldman et al. Int Forum Allergy Rhinol. 2013;3 (8):684-7）。Ｐ−ｇｐは、上皮由来の炎症促進性サイトカイン分泌の発現依存性促進を通じて、ＣＲＳ関連炎症に直接的に寄与し得る（Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2014;4 (6):488-94、Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2014;5 (1):10-13）。これまでの研究により、Ｐ−ｇｐが、細胞膜内に存在し得るだけでなく、細胞外流体中にも分泌され得ることが、示されている（Chu et al., Biochem Biophys Res Commun. 1994;203 (1):506-12）。Ｐ−ｇｐは、ＣＲＳのある特定の形態において過剰発現されるため（Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2012;2 (2):122-5）、分泌形態のＰ−ｇｐを、ＣＲＳの検出のための新規なバイオマーカーとして使用することができる。
【００３５】
本明細書に提示される結果により、上皮細胞が、確かにＰ−ｇｐを分泌し、この分泌が、細胞自体に発現されるＰ−ｇｐの程度と高度に相関性があることが確認された。さらに、細胞内Ｐ−ｇｐおよび分泌型Ｐ−ｇｐの両方の濃度は、ＬＰＳによる炎症促進性刺激に対して感受性であると見られる。
【００３６】
培地中の検出可能な可溶性Ｐ−ｇｐが、これまでに報告されているように、インタクトなタンパク質と比べて、Ｐ−ｇｐ分解による副生成物を表すかどうかを判定するために、実験を行った（Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2012;2 (2):122-5）。ウエスタンブロット分析により、タンパク質分解の副生成物は、５０ｋＤａおよび６０ｋＤａで培地中に放出されたが、ＥＬＩＳＡによって検出されたＰ−ｇｐの大半は、実際に、完全な１７０ｋＤａのタンパク質であったことが確認された。したがって、本明細書に記載される方法は、完全長１７０ｋＤａタンパク質のみを検出するか、またはそれを特異的に検出することを含み得る。
【００３７】
本明細書において示されるように、分泌形態のＰ−ｇｐは、健常患者およびＣＲＳ患者のいずれの鼻粘液中にも存在している。このことにより、これまでの研究において報告されているように、細胞外Ｐ−ｇｐの存在が確認される（Chu et al., Biochem Biophys Res Commun. 1994;203 (1):506-12、Chiampanichayakul et al., Int J Hematol. 2010;92 (2):326-33. doi:10.1007/s12185-010-0668-8）。低濃度では、組織Ｐ−ｇｐレベルと粘液Ｐ−ｇｐレベルとの間に有意な相関性がないことにより、上皮細胞によるＰ−ｇｐ分泌は、何らかの目的不明な構成的生理学的プロセスを意味する可能性が高いことが示唆される。これまでの発見に部分的に基づいて（Feldman et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2013;3 (8):684-7）、全タンパク質１μｇ当たり３００ｐｃｇのＰ−ｇｐという閾値が、生理学的分泌と病理学的分泌とを区別することを可能にし、より重症度の高い疾患表現型と関連しているであろうという仮説を立てた。この閾値を上回るＰ−ｇｐレベルを有する患者は、「高分泌型」と考えた。高分泌型は、本研究に含まれるあらゆる形態のＣＲＳを有する患者のうち、２５％を占めた。さらに、これらの患者では、分泌型Ｐ−ｇｐの濃度は、組織レベルと強力かつ有意に相関し、外傷を伴わない粘液サンプル採取が、この集団内で上皮Ｐ−ｇｐ分泌を判定するための適切な代用物としての機能を果たし得ることが示唆される。
【００３８】
これまでの研究により、上皮Ｐ−ｇｐの過剰発現は、Ｔｈ２が優位なＣＲＳと相関することが示されている（Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2012;2 (2):122-5、Feldman et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2013;3 (8):684-7）。これらの結果は、高Ｐ−ｇｐ分泌の患者では、低分泌型と比較して、ＣＲＳｗＮＰ患者：ＣＲＳ患者の比率がより高かったという現在の発見に反映されている。さらに、高分泌型は、主観的エンドポイント、組織学的エンドポイント、および放射線撮影エンドポイントによって測定した場合、より重大な程度の疾患を有すると見られる。２つの群が、年齢、性別、および共存疾患に関して、それ以外は類似していたという事実により、疾患重症度における分岐点は、それらの疾患の根底にある病態生理学に内在するものに起因し得ることが示唆される。
【００３９】
現時点で、複数のＰ−ｇｐ阻害剤が存在しているため（例えば、Bleier et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2014;5 (1):10-13、Lam et al., Int Forum Allergy Rhinol. 2015;00 (0):n/a-n/a. doi:10.1002/alr.21454を参照されたい）、Ｐ−ｇｐ分泌状況はまた、Ｐ−ｇｐ阻害剤療法により利益を得ることができる患者を予測し、特定するためにも使用することができる。
【００４０】
対象の診断、または臨床試験への参加のための対象の選択、または臨床試験における対象の層別化のための方法
対象を、鼻副鼻腔炎、例えば、ＣＲＳ、または特定のエンドタイプのＣＲＳを有するとして特定し、処置のため、もしくは鼻副鼻腔炎、例えばＣＲＳの処置の臨床研究への参加のための対象を選択するか、またはその臨床研究において対象を層別化するための方法が、本明細書において提供される。そのような方法には、対象からの副鼻腔分泌物を含むサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップと、サンプル中のＰ−ｇｐのレベルを、参照Ｐ−ｇｐレベルと比較するステップと、対象を鼻副鼻腔炎（例えば、ＣＲＳ）を有するとして特定するか、または参照Ｐ−ｇｐレベルと比較して上昇したサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを有する対象を、鼻副鼻腔炎の処置の臨床試験への参加のために選択するか、またはＰ−ｇｐレベルに基づいて、臨床試験において対象を層別化するステップとが含まれ得る。一部の実施形態において、対象が、参照Ｐ−ｇｐレベルと比較して、サンプル中のＰ−ｇｐレベルに有意な変化を有さないかまたは減少を有する場合、この対象は、鼻副鼻腔炎の処置の臨床研究への参加から除外され得る。
【００４１】
鼻副鼻腔炎、例えば、ＣＲＳの処置の有効性をモニタリングする方法もまた、提供される。そのような方法は、第１の時点において対象から得られた副鼻腔分泌物を含む第１のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップと、ＣＲＳの処置を投与するステップと、少なくとも１用量の処置の投与後である第２の時点において対象から得られた副鼻腔分泌物を含む第２のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを判定するステップと、第１のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを第２のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルと比較するステップと、処置が、第１のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルと比較して減少した第２のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを有する対象では有効であったと判定するか、または第１のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルと比較して増加した第２のサンプル中のＰ−ｇｐのレベルを有するかもしくは第１のサンプルと第２のサンプルとの間でＰ−ｇｐのレベルに変化がない対象においては有効でなかったと判定するステップとを含む。
【００４２】
一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐの存在および／またはレベルが、疾患参照物中のタンパク質の存在および／またはレベルに匹敵し、対象が、鼻副鼻腔炎と関連する１つまたは複数の症状を有する場合、この対象は、鼻副鼻腔炎を有する。一部の実施形態において、対象は、明らかな鼻副鼻腔炎の兆候または症状を有さないが、評価されたタンパク質のうちの１つまたは複数のものの存在および／またはレベルが、疾患参照物中のタンパク質の存在および／またはレベルに匹敵する場合、この対象は、鼻副鼻腔炎を発症する高い危険性を有する。一部の実施形態において、ある人物が、本明細書に記載される方法を使用して、鼻副鼻腔炎を有するか、または鼻副鼻腔炎を発症する高い危険性を有すると判定されると、例えば、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載されている処置が、施され得る。
【００４３】
好適な参照値は、当該技術分野において公知の方法を使用して、例えば、標準的な臨床試験手法および統計学的分析を使用して、判定することができる。参照値は、任意の関連形式を有し得る。一部の事例において、参照物は、意味があるＰ−ｇｐレベルの所定の値、例えば、正常なＰ−ｇｐレベルを表す対照参照レベル、例えば、非罹患対象もしくは本明細書に記載される疾患を発症する危険性がない対象におけるレベル、および／または鼻副鼻腔炎と関連する状態と関連するタンパク質のレベル、例えば、鼻副鼻腔炎（例えば、ＣＲＳ）を有する対象におけるレベルを表す疾患参照物を含む。
【００４４】
所定のレベルは、単一のカットオフ値（閾値）、例えば、中央値もしくは平均、または他のセグメントとは統計学的に異なると判定される、臨床試験集団中の四分位点、三分位点、もしくは他のセグメントの上位もしくは下位の境界を定義するレベルであり得る。それは、カットオフ値（または閾値）の範囲、例えば、信頼性区間であってもよい。これは、１つの定義された群における疾患を発症する危険性もしくは疾患の存在との関連性が、別の定義された群における疾患の危険性もしくは存在よりも、倍単位で高いまたは低い（例えば、およそ２倍、４倍、８倍、１６倍、またはそれ以上）など、比較可能な複数の群に基づいて構築され得る。これは、例えば、対象集団（例えば、対照対象）を、複数の群、例として、危険性が低い群、危険性が中等度の群、および危険性が高い群、または四分位点（最も低い四分位点は、危険性が最も低い対象であり、最も高い四分位点は、危険性が最も高い対象である）、またはｎ分位点（すなわち、ｎ個の規則的に離間した間隔、最も低いｎ分位点は、危険性が最も低い対象であり、最も高いｎ分位点は、危険性が最も高い対象である）に、均等に（または不均等に）分割した、範囲であってもよい。一部の実施形態において、サンプル中のＰ−ｇｐのレベルは、サンプル中のタンパク質の量に対して正規化される。一部の実施形態において、参照レベルは、全タンパク質１μｇ当たり５０ｐｃｇ、１００ｐｃｇ、１５０ｐｃｇ、２００ｐｃｇ、２５０ｐｃｇ、３００ｐｃｇ、３５０ｐｃｇ、４００ｐｃｇ、４５０ｐｃｇ、または５００ｐｃｇのＰ−ｇｐである。
【００４５】
一部の実施形態において、所定のレベルは、例えば、異なる時点、例えば、早い時点での、同じ対象におけるレベルまたは発生である。
【００４６】
所定の値と関連付けられた対象は、典型的に、参照対象と称される。例えば、一部の実施形態において、対照参照対象は、本明細書に記載される障害（例えば、鼻副鼻腔炎）を有さない。一部の事例において、対照対象がＣＲＳを有することが望ましい場合があり、他の事例においては、対照対象がＣＲＳを有さないことが望ましい場合がある。
【００４７】
疾患参照対象は、鼻副鼻腔炎を有する（またはそれを発症する高い危険性を有する）ものである。高い危険性は、一般的な集団中の対象の危険性よりも高い危険性として定義される。
【００４８】
したがって、一部の事例において、対象におけるＰ−ｇｐのレベルが参照Ｐ−ｇｐレベル以下であることは、臨床状況の指標（例えば、本明細書に記載される障害、例えば、鼻副鼻腔炎の指標）である。他の事例において、対象におけるＰ−ｇｐのレベルが参照Ｐ−ｇｐレベル以上であることは、疾患の不在または疾患の正常な危険性の指標である。一部の実施形態において、対象におけるレベルが参照レベルよりも低くなる量は、対象を対照対象と区別するのに十分であり、任意選択で、対照対象におけるレベルよりも統計学的に有意に低い。対象におけるＰ−ｇｐのレベルが、参照Ｐ−ｇｐレベルと等しい場合、「等しい」とは、およそ等しい（例えば、統計学的に差がない）ことを指す。
【００４９】
所定の値は、選択される対象（例えば、ヒト対象）の具体的な集団に依存し得る。例えば、見かけ上健康な集団は、本明細書に記載される障害を有するか、それを有する可能性が高いか、またはそれを有する危険性が高い対象の集団とは異なる、「正常な」Ｐ−ｇｐレベルの範囲を有するであろう。したがって、選択される所定の値は、対象（例えば、ヒト対象）が含まれるカテゴリー（例えば、性別、年齢、健康状態、危険性、他の疾患の存在）を考慮し得る。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者による日常的な実験の範囲内で選択することができる。
【００５０】
尤度、または危険性を特徴付ける際、多数の所定の値が構築され得る。
【００５１】
一部の実施形態において、さらなる臨床的評価は、鼻副鼻腔炎（例えば、ＣＲＳ）を診断すること、または対象を鼻副鼻腔炎の処置の臨床研究への参加のために選択すること、または臨床研究において対象を層別化することに、役立てるために使用することができる。一部の実施形態において、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を行って、鼻副鼻腔炎を有する対象における骨炎をスコア付けすることができる。骨炎スコア、例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ骨炎スコア（ＫＯＳ）またはグローバル骨炎スコア（ＧＯＳ）を、鼻副鼻腔炎（例えば、ＣＲＳ）を診断すること、または対象を鼻副鼻腔炎の処置の臨床研究への参加のために選択すること、または臨床研究において対象を層別化することに役立てることができる。例えば、参照レベルよりも高いＧＯＳまたはＫＯＳ（参照レベルよりも高いＰ−ｇｐレベルに加えて）は、対象が、鼻副鼻腔炎（例えば、ＣＲＳ）を有し、かつ／または処置、選択、もしくは層別化を行うべきであることを示し得る。
【００５２】
臨床研究は、医療施設（例えば、病院、診療所、または研究センター）において、健康管理の専門家（例えば、医師、医師の助手、看護師、採血専門職、または検査技師）によって行われ得る。
【００５３】
対象
記載される方法および組成物は、任意の対象において使用することができるが、鼻副鼻腔炎の１つまたは複数の症状を呈する対象において、特に有用である。鼻副鼻腔炎の症状には、鼻詰まりおよび鼻閉塞、鼻水の変色、前鼻漏または後鼻漏が挙げられる。対象はまた、顔面痛または顔面圧迫感を経験することもあり、重症の場合には、嗅覚の低減または消失を患うこともある（Fokkens et al., 2012）。鼻副鼻腔炎には、急性および慢性という２つの異なる種類がある。急性鼻副鼻腔炎は、１２週間以内に症状が完全に回復する鼻副鼻腔炎であり、一方で慢性鼻副鼻腔炎は、１２週間を上回って継続し、通常、組織損傷を伴う（Fokkens et al., 2012）。鼻ポリープは、疫学的研究に基づくと、慢性鼻副鼻腔炎を有する一部の対象に存在することが多い。
【００５４】
本方法において、対象は、典型的に、哺乳動物、例えば、ヒト、または非ヒト獣医学的対象、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、もしくは他の動物である。
【００５５】
サンプルおよびアッセイ
本方法は、典型的に、当該技術分野において公知の方法を使用して得られた鼻分泌物のサンプルを使用して、行われることになる。例えば、自発的分泌物は、こう鼻の産物の採取、または鼻から出た分泌物の採取、吸引／マイクロ吸引によって、得ることができる。刺激（例えば、メタコリンまたはヒスタミンを使用）後のこう鼻または吸引の産物の採取もまた、使用することができる。例えば、灌流（洗浄または灌注とも称され得る）、組み合わせ吸引灌流、スプレー噴霧技法、鼻プール灌流、標準的な灌流、および逐次灌流など、鼻分泌物をサンプル流体中に希釈することを伴う技法もまた、使用することができる。希釈戦略、例えば、鼻腔全体（好ましくは、副鼻腔を含む）への生理食塩水灌流、例えば、少なくとも５０μＬから、最大約３０ｍＬ、例えば、５０μＬ〜１０ｍＬ、５０μＬ〜３０ｍＬ、１０〜３０ｍＬ、例えば、１８〜２５ｍＬ、例えば、２０ｍＬまでの灌流の使用を含む、完全に非侵襲的な生理食塩水灌流を使用することができる。吸収技法には、天然または合成の吸収性材料、例えば、脱脂綿、濾紙ストリップもしくは濾紙ディスク、または海綿状物質（フォームまたはスポンジ、例えば、ポリウレタンフォームまたは外科手術用天然（例えば、セルロース）もしくは合成スポンジ、例えば、圧縮ポリビニルアルコールスポンジ）の使用が含まれる。例えば、Walsh and Falsey, J Infect Dis. 1999 May;179 (5):1268-73、Riechelmann et al., European Respiratory Journal Apr 2003, 21 (4)600-605、Ruocco et al., Clin Exp Allergy. 1998 Jul;28 (7):881-8を参照されたい。好ましくは、吸収性材料は、サンプル中に存在するタンパク質に有意に結合しない。例示的なスポンジは、圧縮された滅菌の２×２×５ｍｍまたは２×３×１５ｍｍのポリ−ビニル−アルコールスポンジ（例えば、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃｓから市販されており、副鼻腔外科手術後または鼻血の状況において止血およびステント留置のために鼻内で使用するように設計されている）である。一部の実施形態において、スポンジを圧縮し、それを鼻腔の前方に挿入すると、それが毛細管作用を通じて粘液を吸収する。
【００５６】
スポンジまたは灌流液は、例えば、−８０℃で、好ましくは、バイオマーカー保存剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤またはヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮａｓｅ不活性化酵素など）の存在下において、単離まで保管することができる。
【００５７】
粘液サンプルは、例えば、遠心分離または洗浄によって、吸収性材料から抽出することができる。
【００５８】
エキソソーム
一部の実施形態において、本方法は、サンプルからエキソソームを単離するステップ、およびエキソソーム中のＰ−ｇｐのレベルをアッセイするステップを含む。エキソソームは、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有する脂質二重層に包囲された、約３０〜１５０ｎｍの小胞体である。エキソソームは、血液、リンパ、ＣＳＦ、および尿を含む、様々な体液中に検出されている（Lee et al., Semin. Immunopathol. 2011; 1-13、Lee et al., Hum. Mol. Genet. 2012; 21:125-134）。生物物理学的に、エキソソームは、脂質二重層に封入された細胞質と同等であり、膜貫通タンパク質の外部ドメインが細胞外環境に曝露されている（Schorey et al., EMBO Rep. 2015; 16: 24-43）。エキソソームの生合成は、エンドソーム輸送選別複合体によって制御されている。これらの事象は、細胞質膜にリサイクルされ、エキソソームとして放出され得る、後期エンドソーム／多胞体の発生をもたらす。このプロセスにより、エキソソームは、テトラスパニン類のＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、およびＣＤ８２を含むマーカーが極めて豊富となり、これらのマーカーを使用して、エキソソームの存在および量を検出することができる（Lee et al., Semin. Immunopathol. 2011; 1-13）。エキソソームは、成長因子およびそれらの受容体、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ならびにｍｉｃｒｏＲＮＡを含む、様々なカーゴを輸送することができる。さらなる研究により、エキソソームが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５などの内在性膜タンパク質を含むこのカーゴを（Mack et al., Nat. Med. 2000; 6: 769-775）、隣接する細胞との間で輸送することができることが示されている。エキソソームにより媒介される機能性Ｐ−ｇｐの輸送は、これまでにも、ＭＣＦ−７ヒト乳がん細胞株（Lv et al., Tumor Biol. 2014; 10773-10779）およびＣＣＲＦ−ＣＥＭヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株（Bebawy et al., Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund, U.K. 2009; 23: 1643-1649）を含む複数の細胞集団において、示されている。
【００５９】
多数の方法、例えば、遠心分離（例えば、Thery et al., Curr. Protoc. Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22に記載されている従来的な超遠心分離（ＵＣＦ））、クロマトグラフィー、濾過、ポリマーに基づく沈降、および免疫学的分離方法を使用して、鼻粘液由来のエキソソームを、サンプルから単離することができる。Yakimchik, Exosomes: isolation and characterization methods and specific markers, 2016-11-30, dx.doi.org/10.13070/mm.en.5.1450およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。ポリマーに基づくエキソソーム沈降系の例としては、Ｓｙｓｔｅｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＥｘｏＱｕｉｃｋがある。例示的なＵＣＦ法において、粘液サンプルおよび灌注液サンプルを、例えば、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１５０μＬの１倍リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈してもよい。細胞残屑は、例えば、４℃、１２，０００×ｇで４５分間の遠心分離によってペレットにすることができる。次いで、上清を、ＰＢＳ、例えば、ポリプロピレンチューブ中の４．５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、例えば、４℃、１１０，０００×ｇで２時間、超遠心分離してもよい。次いで、上清を採取し、ペレットを、ＰＢＳ、例えば、４．５ｍＬの１倍ＰＢＳ中に再懸濁してもよい。懸濁液を、例えば、０．２２−μｍのフィルターを通して濾過し、新しいチューブに採取することができる。濾過した懸濁液を、次いで、例えば、４℃、１１０，０００×ｇで７０分間、再度遠心分離してもよい。次いで、上清を採取し、ペレットを、緩衝液、例えば、ＰＢＳ、例えば、プロテアーゼ阻害剤を含む２００μｌのＰＢＳ中に再懸濁してもよい。
【００６０】
Ｐ−糖タンパク質アッセイ
Ｐ−糖タンパク質は、染色体７ｑ２１．１２上のＭＤＲ１（ＡＢＣＢ１）遺伝子によってコードされる、１７０ｋＤａの糖タンパク質であり、ＣＨＯ細胞株において最初に特定された（Fernandez et al., J Pharm. Pharm. Sci. 2004 Nov 17; 7 (3):359-71）。Ｐ−ｇｐは、ＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターファミリーのメンバーであり、様々な細胞内基質のエネルギー依存性輸送を行い得る（Golden et al., J Pharm Sci. 2003; 92 (9):1739-53）。Ｐ−ｇｐは、原形質膜内に位置し、濃度勾配に対して、生体異物物質を押し出すように機能する（Ehrhardt et al., Pharm. Res. 2003 Apr; 20 (4):545-51）。Ｐ−ｇｐの基質認識は、１２回膜貫通ヘリックスによって形成される内部チャネルにおける推定上の反応性水素結合部位に結合する電子供与基の存在を含む、様々な機序によって生じる（Golden et al., 2003）。
【００６１】
Ｐ−ｇｐは、腸粘膜細胞の頂端膜、腎近位尿細管の刷子縁、血液脳関門、および下気道上皮細胞を含む複数の細胞型において構成的に発現される（Bleier BS, Int. Forum Allergy Rhinol. 2012; 2:122-125）。薬物の出入り口に選択的に分布しているため、Ｐ−ｇｐは、生体異物の進入に対する生化学的障壁として、ならびに生体異物を脳、肝臓、腎臓などの器官から、および最終的には全身循環から排出するためのバキュームクリーナーとして、機能する（Varma et al., Pharmacological Research 2003; 48: 347-359）。この生体異物排泄機能は、様々な薬物の全身バイオアベイラビリティを低減させるＰ−ｇｐの役割を裏切る。悪性腫瘍における発現の増加および能動的な薬物排出を通じて、Ｐ−ｇｐは、化学療法耐性を付与することも示されている（Fernandez et al., 2004）。
【００６２】
当該技術分野において公知の方法を使用して、サンプル中のＰ−ｇｐのレベルを検出し、任意選択で定量化することができる。サンプルからの生物学的マーカーの特定および／または単離および／または精製のための様々な方法が、当該技術分野において周知である。「単離」または「精製」された生物学的マーカーは、生物学的マーカーが由来する細胞源または組織源由来の細胞材料または他の混入物質を実質的に含まない、すなわち、ヒトの介入を通じて、天然の状態から部分的または完全に改変されているか、または取り出されている。
【００６３】
タンパク質の存在および／またはレベルは、当該技術分野において公知の方法を使用して、例えば、ウエスタンブロット法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ビオチン／アビジン型アッセイ、タンパク質アレイ検出、放射免疫測定法、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、免疫沈降アッセイ、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）、質量分析法を含むがこれらに限定されない、タンパク質の標準的な電気泳動的および定量的な免疫アッセイ方法を使用して、評価することができる（Kim (2010) Am J Clin Pathol 134:157-162、Yasun (2012) Anal Chem 84 (14):6008-6015、Brody (2010) Expert Rev Mol Diagn 10 (8):1013-1022、Philips (2014) PLOS One 9 (3):e90226、Pfaffe (2011) Clin Chem 57 (5): 675-687）。これらの方法は、典型的に、直接的または間接的のいずれかでシグナルを提供する蛍光、化学発光、放射活性、および酵素、または色素分子といった標識を、見えるようにすることを含む。本明細書において使用されるとき、「標識」という用語は、放射活性物質またはフルオロフォアなどの検出可能な物質（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））と、抗体またはプローブとのカップリング（すなわち、物理的な連結）、ならびに検出可能な物質との反応性による、プローブまたは抗体の間接的な標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）を指す。Ｐ−ｇｐに特異的に結合するいくつかの抗体が、当該技術分野において公知であり、商業的供給源としては、Ａｂｂｅｘａ  Ｌｔｄ、Ａｂｂｉｏｔｅｃ、Ａｂｃａｍ、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ａｂｇｅｎｔ、Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＧｍｂＨ、ＡＭＳＢＩＯ  ＬＬＣ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｂｉｏｒｂｙｔ、ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＥＸＢＩＯ  Ｐｒａｈａ，ａ．ｓ．、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ、Ｎｏｒｄｉｃ  ＢｉｏＳｉｔｅ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＳＪ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌが挙げられる。
【００６４】
一部の実施形態において、ＥＬＩＳＡ法が使用され得、その場合、マイクロタイタープレートなどの表面のウェルを、試験しようとするタンパク質に対する抗体でコーティングする。次いで、生物学的マーカーを含むかまたは含むと見られるサンプルを、ウェルに適用する。抗体−抗原複合体が形成されたであろう十分な時間の後、プレートを洗浄して、あらゆる未結合部分を除去し、検出可能に標識した分子を添加する。再度、十分な時間インキュベートした後、プレートを洗浄して、あらゆる過剰な未結合分子を除去し、標識分子の存在を、当該技術分野において公知の方法を使用して判定する。競合的ＥＬＩＳＡまたは競合アッセイ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡといったＥＬＩＳＡ法の変化形もまた、当業者に周知であるため、使用することができる。
【００６５】
一部の実施形態において、ＩＨＣ法が使用され得る。ＩＨＣは、インサイチュにおいて生物学的マーカーを検出する方法を提供する。生物学的マーカーの存在および正確な細胞内での位置を、検出することができる。典型的には、サンプルを、ホルマリンまたはパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、染色およびその後の共焦点顕微鏡による検査のために、切断して切片にする。現在のＩＨＣ方法では、直接的標識または間接的標識のいずれかが使用される。サンプルはまた、ＩＨＣの変化形として、免疫蛍光法（ＩＦ）を行う場合、蛍光顕微鏡によって検査してもよい。
【００６６】
質量分析、ならびに特にマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）および表面強化レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）は、本発明のバイオマーカーの検出に有用である。（米国特許第５，１１８，９３７号明細書、同第５，０４５，６９４明細書、同第５，７１９，０６０号明細書、同第６，２２５，０４７明細書を参照されたい）。
【００６７】
本明細書に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体または抗原結合性試薬を含む事前パッケージングされた診断用キットを利用することによって、行うことができる。このキットは、例えば、臨床環境において、本明細書に記載される方法（例えば、診断、対象選択、処置選択、処置モニタリングなど）のために、便宜的に使用され得る。
【００６８】
したがって、生物学的サンプル中のＰ−ｇｐの存在を検出するためのキットもまた、本明細書において提供される。例えば、キットは、生物学的サンプル中のＰ−ｇｐタンパク質を検出することができる化合物または作用物質と、標準物とを含み得る。化合物または作用物質は、好適な容器内にパッケージングされ得る。キットは、さらに、サンプル中のＰ−ｇｐタンパク質を検出するためにこのキットを使用するための説明書、ならびに、方法を実行するため、例えば、サンプルを得るためまたはサンプルを格納するために必要な、いくつかまたは任意の品目を含み得る。使用しようとするサンプルが、鼻エキソソームを含む場合、キットには、サンプル採取のためのスポンジ、スポンジを留置するための送達デバイス、サンプル保存のためのプロテアーゼ阻害剤および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｌａｔｅｒ）を含む採取容器、滅菌生理食塩水、ならびに輸送中の標本の保存のための低温パックまたはフリーザーパックのうちの１つまたは複数が含まれ得る。
【００６９】
例えば、抗体に基づくキットについては、キットは、（１）Ｐ−ｇｐポリペプチドに結合する第１の抗体（例えば、固体支持体に付着した状態）、および任意選択で（２）Ｐ−ｇｐまたは第１の抗体のいずれかに結合し、かつ検出可能な作用物質にコンジュゲートされている、第２の異なる抗体を含み得る。一部の実施形態において、キットは、試験ストリップ、例えば、側方流動用試験ストリップを含む。多数の試験ストリップが、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許出願公開第２０１４０３７０６１６号明細書、同第２０１４０２０６１００号明細書、同第２０１３０２９５６９１号明細書、同第２０１３０１８９７９４号明細書、同第２０１３００５９３９９号明細書、同第２０１００２８５６１０号明細書、同第２０１０００２４５３０号明細書、同第２００９０２４６８８６号明細書、同第２００８０１６０５３８号明細書、同第２００８００８１３４１号明細書、同第２００７０１０５２３７号明細書、同第２００６０２７５９２０号明細書、および同第２００３０１８０８１５号明細書を参照されたい。
【００７０】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤を使用した鼻副鼻腔炎の処置
本明細書に提示されるデータにより、Ｐ−ｇｐの発現は、健常な副鼻腔分泌物中に存在するが、ＣＲＳを有する対象由来の分泌物中では有意に上昇しており、増加したレベルは重症度と相関性があることを示す。
【００７１】
一部の実施形態において、鼻副鼻腔炎または慢性鼻副鼻腔炎、例えば、特定のエンドタイプの鼻副鼻腔炎を有する対象を、本明細書に記載される方法によって特定し、副鼻腔炎の標準的な処置および／または有効量のＰ−ｇｐ阻害剤の対象への投与によって処置する。鼻副鼻腔炎の存在は、任意選択で、当業者によって、公知の方法に基づいて、例えば、症状の存在の検出に基づいて、内視鏡検査によって、またはコンピュータ断層撮影法によって、確認することができる。処置の有効性は、副鼻腔分泌物中のＰ−ｇｐのレベルの変化を検出することによってモニタリングすることができ、任意選択で、当該技術分野において公知の方法によって、例えば、症状のモニタリングによって、内視鏡検査またはコンピュータ断層撮影法によって、確認することができる。２２項目の副鼻腔予後診断試験（ＳＮＯＴ−２２）は、鼻副鼻腔炎および鼻ポリープに関する２２個の主要な症状を含むアンケートであり、対象の症状の重症度および健康関連の生活の質に及ぼす影響を測定するための貴重なツールとしての機能を果たす（Quintanilla-Dieck, et al., International Forum of Allergy & Rhinology 2012; 2 (6):437-443）。ＳＮＯＴ−２２により、１２個の鼻腔関連症状および副鼻腔関連症状（鼻詰まり、味覚および嗅覚の消失、こう鼻の必要性、くしゃみが出る、鼻水が出る、咳が出る、後鼻漏、高粘度の鼻水が出る、耳が詰まる、めまいがする、耳が痛い、および顔面の痛み／圧迫感）ならびに１０個の心理的症状および行動的症状（寝つきが悪い、夜中に目が覚める、夜よく眠れない、目が覚めたときの疲れ、疲労感、生産性の低下、集中力の低下、欲求不満／落ち着きがない／いらいらする、悲しくなる、および恥ずかしく感じる）を評価し、参加者が、前の週に関して、平均して、０（症状なし）から５（重度）のスケールで、各症状をスコア付けし、合計スコアは、０から１１０の範囲となる。ＳＮＯＴ−２２スコアは、２２個のスコアの平均である（Piccirillo et al., Otolaryngol Head Neck Surg 2002; 126:41-47）。１０個の症状に関する視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ−Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ＴＦＲによって説明されている、ＣＲＳの重い症状および軽い症状に関する診断基準に基づくアンケートである。ＶＡＳにより、前の週に経験した以下の症状のそれぞれに関する平均の対象が報告した重症度を評価した：滲出液の鼻漏、鼻閉塞／鼻詰まり、嗅覚の損傷、顔面の圧迫感／痛み、頭痛、口臭、衰弱／疲労感、歯痛、耳閉感／痛み、ならびに咳（Ryan, et al., Laryngoscope 2011; 121:674-678）。Ｌｕｎｄ−Ｋｅｎｎｅｄｙ内視鏡検査スコア付けシステムにより、ポリープ、鼻水、浮腫、瘢痕、または癒着、および痂皮形成の存在に注目して、鼻内視鏡検査によって評価される鼻および副鼻腔の病理学的状態を定量化する（Ryan, et al., 2011）。Ｌｕｎｄ  Ｍａｃｋａｙ  ＣＴスコア付けシステムは、最も広く使用されている慢性鼻副鼻腔炎のＣＴグレーディングシステムである。このスコア付けシステムは、ＣＴ撮像によって評価される、副鼻腔系および中鼻道自然口ルート（osteomeatal complex）の不透明化なし（０）、部分的に不透明化（１）、または完全な不透明化（２）に応じた、０から２のスケールからなる（Hopkins et al., Otolaryngology-Head and Neck Surgery 2007; 137:555-561）。対象の改善としては、症状スコアの向上、例えば、ＳＮＯＴ−２２スコアもしくはＶＡＳスコアの向上、内視鏡検査によって判明する炎症もしくは鼻ポリープ量の低減、例えば、Ｌｕｎｄ−Ｋｅｎｎｅｄｙスコアの向上、またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によって判明する粘膜肥厚もしくは副鼻腔不透明化の低減、例えば、Ｌｕｎｄ−Ｍａｃｋａｙスコアの向上が挙げられる。
【００７２】
一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、全身的に、例えば、経口で、静脈内、皮内、または皮下に、投与される。他の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、吸入デバイスによって、フラッシングによって、またはスプレー噴霧によって、対象の鼻腔および副鼻腔に局所投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して特定された対象は、有効量のＰ−ｇｐ阻害剤を含む点鼻薬またはスプレーで処置される。有効量のＰ−ｇｐ阻害剤は、フラッシングまたはスプレー噴霧によって液体形態で、対象の鼻腔および副鼻腔に送達することができる。有効量のＰ−ｇｐ阻害剤は、吸入デバイス、例えば、ネブライザー、インヘーラー、またはＯｐｔｉＮｏｓｅによって、エアロゾル化形態で、本明細書に記載される方法を使用して特定された対象の鼻腔および副鼻腔に送達することもできる。
【００７３】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して特定された対象は、処置の効果を高めるために、他の従来的な処置、例えば、コルチコステロイドおよび／または抗生物質などの薬物と組み合わせて、Ｐ−ｇｐ阻害剤で処置される。例えば、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、デキサメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、コルチゾール、プレドニゾン、ブデソニド、モメタゾン、フルチカゾン、フルニソリド、およびベタメタゾンから選択される、コルチコステロイドと組み合わせて使用され得る。一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、マクロライド類、例えば、エリスロマイシン；ペニシリン類、例えば、アモキシシリン、ベータ−ラクタム、アンピシリン；テトラサイクリン類、例えば、ドキシサイクリン、テトラサイクリン；スルホンアミド類、例えば、マフェナイド、スルファセタミド；フルオロキノロン類；ならびにセファロスポリン類、例えば、セフタロリンフォサミル、セフトビプロールから選択される、抗生物質と組み合わせて使用される。一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、コルチコステロイドおよび抗生物質と組み合わせて使用される。
【００７４】
一部の実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して特定された対象が、鼻ポリープも有する場合、そのような鼻ポリープの外科手術による除去が、対象へのＰ−ｇｐ阻害剤の投与に加えて行われ得る。したがって、対象は、外科手術およびＰ−ｇｐ阻害剤での処置の両方を受けることができる。
【００７５】
一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤を溶出するインプラント、ステント、またはスペーサーが、Ｐ−ｇｐを対象に送達するために使用される。副鼻腔の外科手術中に、Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出デバイスを、例えば、副鼻腔の入り口に埋め込んで、入り口が閉じないようにし、同時に、外科手術後の副鼻腔上皮の炎症を低減させるために、Ｐ−ｇｐ阻害剤を局所的に溶出させることができる。Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出デバイスは、生体吸収性材料で作製することができるため、インプラントは、埋込み後、短期間内に吸収されることになり、外科手術によるインプラントの除去は必要ない。Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出デバイスは、固体、半固体、ゲル、ポリマー、または粒子の形態であり得る。一部の実施形態において、Ｐ−ｇｐ阻害剤溶出デバイスは、アルギン酸塩ゲル（例えば、アルギン酸ナトリウム）、セルロース系ゲル（例えば、カルボキシメチルセルロースもしくはカルボキシエチルセルロース）、またはキトサン系ゲル（例えば、キトサングリセロリン酸塩、例として、Bleier et al., Am J Rhinol Allergy 23, 76-79, 2009を参照されたい）などの生体吸収性ゲルである。
【００７６】
一部の実施形態において、組織サンプル、例えば、副鼻腔粘膜生検サンプルを、鼻副鼻腔炎を有する対象から得ることができ、１つまたは複数の試験を、これらの生検サンプルに行って、本明細書に記載される方法を使用して行った診断を確認し、対象の治療法の選択に役立てることができる。例えば、副鼻腔粘膜生検サンプルを、本明細書に記載される方法を使用して特定された対象から得ることができ、光学顕微鏡法ならびにヘマトキシリンおよびエオシンによる染色を使用して、高倍率視野１つ当たりの平均好酸球数を計算することができる。本明細書において示されるように、Ｐ−ｇｐの発現レベルは、組織好酸球増加と相関し、したがって、高い組織好酸球増加レベル（すなわち、参照レベルよりも高いレベル）を、高いＰ−ｇｐ発現レベルのプロキシとして使用することができる。Ｐ−ｇｐ阻害剤の投与を含む本明細書に記載される治療法は、高倍率視野１つ当たりの平均好酸球数が、閾値（すなわち、参照レベル）よりも高いと判定された場合に、対象における鼻副鼻腔炎を処置するために選択され得る。
【００７７】
一部の実施形態において、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を行って、鼻副鼻腔炎を有する対象における骨炎をスコア付けすることができる。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ骨炎スコア（ＫＯＳ）（Lee JT, Kennedy DW, Palmer JN, Am J Rhinol 20:278-282, 2006）またはグローバル骨炎スコア（ＧＯＳ）（Georgalas C, Videler W, Freling N, Clin Otolaryngol 35:455-461, 2010）を、前述のように、副鼻腔の骨壁に関して判定することができる。本明細書において示されるように、これらの骨炎スコアは、慢性副鼻腔炎を有する患者においてＰ−ｇｐの発現レベルと相関性があり、したがって、高い骨炎スコアは、高いＰ−ｇｐ発現レベルのプロキシとして使用することができる。骨炎スコアが、閾値（すなわち、参照レベル）よりも高いと判定された場合、Ｐ−ｇｐ阻害剤の投与を含む本明細書に記載される治療法が、対象における鼻副鼻腔炎を処置するために選択され得る。
【００７８】
当業者であれば、好適な参照レベルを判定し、選択することが容易に可能であろう。例えば、参照レベルは、集団の中央値、平均、または百分位のカットオフ点（例えば、上位半分、上位三分位、上位四分位、上位五分位など）として判定することができる。ＣＲＳを有する対象、および／またはＰ−ｇｐ阻害剤での処置によって利益を得る可能性が高い対象におけるサンプル中のＰ−ｇｐの分泌レベル、好酸球増加、ＫＯＳ、またはＧＯＳを表す参照レベルが、選択され得、その参照レベルと同じレベルまたはそれよりも高いレベルは、対象が、ＣＲＳを有する、および／もしくは本明細書に記載されるＰ−ｇｐ阻害剤の投与を含む方法で処置すべきであることを示す。
【００７９】
Ｐ−糖タンパク質阻害剤
多数のＰ−ｇｐの阻害剤が、当該技術分野において公知である（Varma et al., 2003）。一般に、Ｐ−ｇｐは、（１）その基質結合部位を遮断することによって、（２）そのＡＴＰａｓｅ活性を妨害することによって（Shapiro, et al., Biochem Pharmacol 1997; 53:587-96）、または（３）その発現レベルを転写的にかもしくは転写後的にのいずれかで減少させることによって、阻害することができる。（Drori et al., Eur J Biochem 1995; 228:1020-9）。
【００８０】
特異性および親和性に基づいて、Ｐ−ｇｐ阻害剤は、４つの世代に分類される。第１世代のＰ−ｇｐ阻害剤は、臨床使用されているか、または他の適応症のために開発されたが、Ｐ−ｇｐを阻害することが示された、公知の薬理学的化合物である。これらには、ベラパミルなどのカルシウムチャネル遮断薬；シクロスポリンＡなどの免疫抑制薬；抗高血圧薬、レセルピン、キニジン、およびヨヒンビン；ならびにタモキシフェンおよびトレミフェンなどの抗エストロゲン薬が挙げられる（Varma et al., 2003）。これらの化合物の使用量は、全身投与した場合に、Ｐ−ｇｐを阻害するために必要な用量により達成される高い血清濃度に起因するそれらの毒性によって制限されている。
【００８１】
第２世代のＰ−ｇｐ調節剤は、第１世代の化合物の薬理学的活性を欠き、通常、より高いＰ−ｇｐ親和性を有する、薬剤である。第２世代のＰ−ｇｐ阻害剤としては、シクロスポリンＡの非免疫抑制性類似体、例えば、ＰＳＣ  ８３３（バルスポダール（Valspodar）：６−［（２Ｓ，４Ｒ，６Ｅ）−４−メチル−２−（メチルアミノ）−３−オキソ−６−オクテン酸］−７−Ｌ−バリン−シクロスポリンＡ）；ベラパミル異性体、例えば、ベラパミルのＤ−異性体、Ｒ−ベラパミル、およびデクスベラパミル；ならびに他の阻害剤、例えば、ＶＸ−７１０（ビリコダール：１，７−ジ（ピリジン−３−イル）ヘプタン−４−イル（２Ｓ）−１−［オキソ（３，４，５−トリメトキシフェニル）アセチル］ピペリジン−２−カルボキシレート）；ＧＦ１２０９１８（エラクリダール：Ｎ−（４−（２−（６，７−ジメトキシ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）エチル）フェニル）−５−メトキシ−９−オキソ−９，１０−ジヒドロアクリジン−４−カルボキサミド塩酸塩）；ならびにＭＳ−２０９（ドフェキダールフマレート（Dofequidar fumarate）：１−（４−（２−ヒドロキシ−３−（キノリン−５−イルオキシ）プロピル）ピペラジン−１−イル）−２，２−ジフェニルエタノン）が挙げられる（Varma et al., 2003）。しかしながら、このクラスの化合物は、２つ以上のＡＢＣトランスポーターを阻害し、一部の薬物−薬物相互作用をもたらすことが多い。
【００８２】
第３世代のＰ−ｇｐ遮断薬は、多剤耐性腫瘍の処置を向上させ、高い特異性および毒性でＰ−ｇｐを阻害するという主な目的で開発中である。第３世代のＰ−ｇｐ阻害剤の例としては、ＬＹ３３５９７９（ゾスキダール：（２Ｒ）−１−｛４−［（１ａＲ，６ｒ，１０ｂＳ）−１，１−ジフルオロ−１，１ａ，６，１０ｂ−テトラヒドロジベンゾ［ａ，ｅ］シクロプロパ［ｃ］シクロヘプテン−６−イル］ピペラジン−１−イル｝−３−（キノリン−５−イルオキシ）プロパン−２−オール三塩酸塩）；ＯＣ１４４０９３（４−［２−［４−［（Ｅ）−３−エトキシプロパ−１−エニル］フェニル］−４−［４−（プロパン−２−イルアミノ）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−Ｎ−プロパン−２−イルアニリン）；Ｒ−１０１９３３（ラニキダール：メチル１１−（１−（４−（キノリン−２−イルメトキシ）フェネチル）ピペリジン−４−イリデン）−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾ［１，２−ａ］アゼピン−３−カルボキシレート）；ＸＲ９５７６（タリキダール：Ｎ−［２−［［４−［２−（６，７−ジメトキシ−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−２−イル）エチル］フェニル］カルバモイル］−４，５−ジメトキシフェニル］キノリン−３−カルボキサミド）；ＸＲ９０５１（３−（（Ｚ）−（（Ｚ）−５−ベンジリデン−４−メチル−３，６−ジオキソピペラジン−２−イリデン）メチル）−Ｎ−（４−（２−（６，７−ジメトキシ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）エチル）フェニル）ベンズアミド）が挙げられる。一部の第３世代Ｐ−ｇｐ調節剤、例えば、ＬＹ３３５９７９、ＯＣ１４４０９３、およびＸＲ９５７６は、第１世代および第２世代の阻害剤よりも約１０倍高い効力を有する、Ｐ−ｇｐの高度に強力かつ選択的な阻害剤であることが示されている。（Varma et al., 2003）。
【００８３】
第４世代の化合物としては、天然源の化合物（例えば、Lopez and Martinez-Luis, Mar Drugs. 2014 Jan; 12 (1): 525-546に記載される海洋源のもの、またはフラボノイド類、アルカロイド類（例えば、ストリキノスアルカロイド（例えば、Munagala et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry, 22 (3):1148-1155 (2014)における化合物７）、クマリン類、カンナビノイド類、タッカロノリド類、ジテルペン類（例えば、タキサン類）、セスキテルペン類、トリテルペン類、ジンセノシド類、リグナン類、ポリエン類、ポリアセチレン類（Palmeira et al., Current Medicinal Chemistry, 2012, 19, 1946-2025に記載されている））；ペプチドおよびペプチド模倣体、例えば、レベルシン、例えばレベルシン１２１、ペプチド１５、およびジケトピペラジンＸＲ９０５１；ならびに二重リガンド、例えば、アミノ化チオキサントン類、例えば、１−［２−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル）エタンアミン］−４−プロポキシ−９Ｈ−チオキサンテン−９−オンが挙げられる。例えば、Palmeira et al., Current Medicinal Chemistry, 2012, 19, 1946-2025を参照されたい。
【００８４】
医薬組成物、投薬量、および投与の方法
本明細書に記載される処置の方法には、本明細書に記載されるＰ−ｇｐ阻害剤を活性成分として含む、医薬組成物の使用も含まれる。一部の実施形態において、本組成物はまた、その中に組み込まれる１つまたは複数の補助活性化合物、例えば、１つもしくは複数のコルチコステロイドおよび／または１つもしくは複数の抗生物質を含む。コルチコステロイドは、例えば、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、コルチゾール、ブデソニド、モメタゾン、フルチカゾン、フルニソリド、またはベタメタゾンから選択され得る。抗生物質は、例えば、エリスロマイシン、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、ペニシリン、ベータ−ラクタム、マクロライド、フルオロキノロン、セファロスポリン、およびスルホンアミドから選択され得る。医薬組成物自体もまた、含まれる。
【００８５】
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的投与に適合性のある生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。
【００８６】
医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路に適合性となるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。
【００８７】
好適な医薬組成物を製剤化する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., Allen Ed. Mack Publishing Co., Easton, PA, 2012およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)シリーズの書籍を参照されたい。例えば、非経口、皮内、または皮下での適用に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸、および等張性の調節のための薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調節することができる。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジ、または複数回用量のバイアルに封入することができる。
【００８８】
注射での使用に好適な医薬組成物には、滅菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌の注射溶液もしくは分散液の即時調製のための滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。あらゆる事例において、組成物は、滅菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下において安定である必要があり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用からの保護は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの事例において、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール類、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを、組成物中に含めることが好適であろう。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによって、もたらすことができる。
【００８９】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上述の成分のうちの１つまたは組み合わせとともに、活性化合物を、必要とされる量で、適切な溶媒中に組み込み、続いて濾過滅菌することによって、調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基礎分散培地および上述のもの以外の必要な他の成分を含む、滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の事例において、調製の好ましい方法は、活性成分に加えて任意の追加の所望される成分を事前に滅菌濾過した溶液から、粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。
【００９０】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口での治療的投与の目的で、活性化合物を、賦形剤とともに組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、洗口液として使用するための流体担体を使用して、調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分または類似の性質の化合物のうちの任意のものを含み得る：結合剤、例えば、微晶質セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Primogel）、もしくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Sterotes）；流動促進剤（glidant）、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料。
【００９１】
吸入による投与に関して、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達され得る。そのような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されているものが挙げられる。
【００９２】
本明細書に記載される治療用化合物の全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によっても行われ得る。経粘膜投与または経皮投与に関して、透過させようとする障壁に適切な透過性物質が、製剤中に使用される。そのような透過性物質は一般的に、当該技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成することができる。経皮投与に関して、活性化合物は、当該技術分野において一般的に公知のように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【００９３】
一実施形態において、治療用化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル封入型送達系を含む、制御放出製剤など、治療用化合物を急速な体外への排除から保護する担体を用いて調製される。
【００９４】
医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
【００９５】
一部の実施形態において、対象における鼻副鼻腔炎を処置するためのキットが、提供される。そのようなキットは、有効量のＰ−糖タンパク質阻害剤を含む医薬組成物と、任意選択でコルチコステロイドおよび／または抗生物質と、医薬組成物を対象の鼻腔および副鼻腔に送達するためのデバイス、例えば、ネブライザー、インヘーラー、またはＯｐｔｉＮｏｓｅとを含む。デバイスは、医薬組成物を、液体形態またはエアロゾル形態で、対象の鼻腔および副鼻腔に送達し得る。
【００９６】
非限定的な実施例において、少なくとも１つの薬学的作用物質を含有する医薬組成物は、液体（例えば、熱硬化性液体）として、固体の成分（例えば、粉末もしくは生体分解性生体適合性ポリマー（例えば、カチオン性生体分解性生体適合性ポリマー））として、またはゲルの成分（例えば、生体分解性生体適合性ポリマー）として、製剤化される。一部の実施形態において、少なくとも１つの薬学的作用物質を含有する組成物は、アルギン酸塩ゲル（例えば、アルギン酸ナトリウム）、セルロース系ゲル（例えば、カルボキシメチルセルロースもしくはカルボキシエチルセルロース）、またはキトサン系ゲル（例えば、キトサングリセロリン酸塩）の群から選択されるゲルとして、製剤化される。本明細書に記載される医薬組成物のうちのいずれかを製剤化するために使用することができる、薬物溶出性ポリマーのさらなる非限定的な例としては、カラゲナン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコールと組み合わせたデキストラン、ポリアクリル酸と組み合わせたデキストラン、ポリガラクツロン酸、ガラクツロン酸多糖類、ポリサラクチン酸（polysalactic acid）、ポリグリコール酸、タマリンドガム、キサンタンガム（xanthum gum）、セルロースガム、グアーガム（カルボキシメチルグアー）、ペクチン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、Ｎ−イソプロピルポリアクリロミド、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、プルロニック酸（pluronic acid）、ポリ乳酸、シクロデキストリン、シクロアミロース、レジリン、ポリブタジエン、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル、ポリデプシペプチド、ポリヒドロキシブチレート、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリエチレングリコール、ポリオルガノホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ無水物、ポリシラミン、ポリＮ−ビニルカプロラクタム、およびゲランが挙げられる。
【００９７】
「有効量」は、有益な結果または所望される結果を実現するのに十分な量である。例えば、治療量は、所望される治療効果を達成するものである。この量は、疾患または疾患症状の発生を予防するために必要な量である予防有効量と同じであってもよく、または異なってもよい。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬で投与され得る。治療用化合物の治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、選択される治療用化合物に依存する。組成物は、１日につき１回または複数回から、１週間につき１回または複数回（１日おきを含む）で投与され得る。当業者であれば、疾患または障害の重症度、これまでの処置、対象の全般的な健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の本明細書に記載される治療用化合物による対象の処置には、単回処置または一連の処置が含まれ得る。
【００９８】
治療用化合物の投薬量、毒性、および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手技によって判定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用することはできるが、感染していない細胞への損傷の可能性を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、そのような化合物の標的を、罹患した組織の部位に定める送達系を設計するように注意を払う必要がある。
【００９９】
細胞培養アッセイおよび動物での研究により得られたデータを、ヒトにおいて使用するための投薬量範囲を形成するために使用することができる。そのような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないかまたはまったくないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内とすることが好ましい。投薬量は、この範囲内で、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて変動し得る。本発明の方法において使用されるあらゆる化合物に関して、治療有効量は、まずは細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養物において判定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半数阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、配合され得る。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【実施例】
【０１００】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものではない。
【０１０１】
[実施例１]
インタクトな可溶性Ｐ−糖タンパク質は、副鼻腔上皮細胞によって分泌される
Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、１７０ｋＤａの膜貫通排出ポンプであり、慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）では、上方制御される。白血病における研究により、Ｐ−ｇｐは、インタクトな可溶性形態でも分泌され得ることが示されている。この研究の目的は、副鼻腔上皮細胞が、可溶性Ｐ−ｇｐを分泌することができるかどうか、およびそれが何らかの機能的役割を有するかどうかを探究することであった。
【０１０２】
方法
以下の材料および方法を、実施例１において使用した。
上皮細胞の調達
【０１０３】
ヒト副鼻腔上皮細胞培養物（ＨＳＮＥＣＣ）を生成するために使用した副鼻腔粘膜生検の調達は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｅｙｅ  ａｎｄ  Ｅａｒ  Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認を受けている。サンプルを、眼窩または頭蓋底の病変部の内視鏡副鼻腔外科手術を受けた健常な副鼻腔組織を有する患者（すなわち、対照）から、ならびにＥＰＯＳ７基準に従ってＣＲＳと診断された患者から、採取した。除外基準には、線毛機能不全、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、または任意の既知の免疫欠損が含まれた。
ヒト副鼻腔上皮細胞培養物
【０１０４】
７人の対照患者および６人のＣＲＳ患者からのＨＳＮＥＣＣを、これまでに説明されているように、成長させた８。簡単に述べると、粘膜サンプルを、洗浄し、３７℃で９０分間、Ｐｒｏｎａｓｅ中で消化させた。細胞懸濁液を、遠心分離によって粒子状物質から分離させ、気管支上皮成長培地（ＢＥＧＭ）中に再懸濁させた。細胞を、標準的な組織培養プレートに２時間蒔いて、混入している線維芽細胞を除去した。次いで、細胞を、ヒトＩＶ型コラーゲン（ヒト胎盤由来のコラーゲン、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｂ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をコーティングした７５ｃｍ２の皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で、３〜５日間増殖させた。コンフルエントになった後、ＨＳＮＥＣＣを、トリプシン化し、ヒトＩＶ型コラーゲンをコーティングした壁部が黒色の２４ウェル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）または９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウェルプレート）の組織培養プレートに、ＢＥＧＭにおいて２４時間、均等に再播種した後、分析した。ＣＲＳ由来のＨＳＮＥＣＣを、培地（ビヒクル対照）またはリポ多糖（ＬＰＳ、１２．５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に２４時間曝露した後、培地および細胞質を採取した。対照患者由来の細胞を、組換えヒトＰ−糖タンパク質（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｕｈａｎ、Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）に、１００〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の用量で２４時間曝露した後、以下に述べる、免疫組織化学またはカルセインアセトキシメチルエステル（ＡＭ）アッセイを行った。
【０１０５】
細胞質および可溶性Ｐ−糖タンパク質の定量化
ビヒクル対照またはＬＰＳに曝露した後に、ＣＲＳ由来のウェルから培地を採取した。混入している残屑および非接着細胞を、遠心分離（９５０ｒｐｍ、３分間）によって除去した。細胞質タンパク質画分を、Ｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｔｅｏｅｘｔｒａｃｔ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して単離した。培地および細胞質画分内のＰ−糖タンパク質濃度を、市販入手可能な酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して定量化した。
【０１０６】
タンパク質抽出およびウエスタンブロット分析
ウエスタンブロットを使用して、ＣＲＳ由来の上皮細胞から培地中に放出された可溶性Ｐ−糖タンパク質の分子量を判定した。上述のように、遠心分離を行って、混入している細胞および残屑を除去した後、上清中の全タンパク質の量を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して判定した。１０μｇの全タンパク質およびＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのβ−メルカプトエタノールを含む、２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、９５℃で３分間変性させ、プレキャストＮｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌｓ（１．０ｍｍ、９ウェル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離させた。タンパク質を、ｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって、フッ化ポリビニリデン膜に転写した。膜を、室温で３０分間、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水およびＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中の１％ミルクでブロッキングした。一次抗体（モノクローナル抗Ｐ−糖タンパク質クローンＦ４、１：２０００、ＴＢＳＴ中１％ミルク）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで１５分間の洗浄を３回行った後、二次抗体（ＴＢＳＴ中１％ミルクのヤギにおいて産生させた抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）-ペルオキシダーゼ抗体、Ｓｉｇｍａ）を、室温で１時間インキュベートした。再度、膜に、ＴＢＳＴで１５分間の洗浄を３回行い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、５分間適用した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で視覚化した。組換えＰ−ｇｐ（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｕｈａｎ、Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）を、対照として使用し、マウスにおいて産生させたモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ローディング対照として使用した。
【０１０７】
定量的蛍光免疫組織化学検査
組換えＰ−ｇｐに曝露した後の膜Ｐ−ｇｐの補間に関する蛍光免疫組織化学検査を、これまでに説明されている技法を使用して行った８。ブロッキングした後、Ｐ−ｇｐ細胞外エピトープに対する一次抗体（モノクローナル抗Ｐ−糖タンパク質クローンＦ４、１：２５０、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、４℃で２４時間適用した。次いで、細胞をすすいだ後、Ｃｙ３（Ｃｙ（商標）３  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ、１：１００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）またはＦＩＴＣ（抗マウスＩｇＧ［Ｆｃ特異的］Ｆ（ａｂ）２フラグメント−ＦＩＴＣ、１：１６０）コンジュゲート二次抗体を、室温で３０分間適用した。次いで、ウェルを、３回すすぎ、リン酸緩衝食塩水において画像化した。陰性対照ウェルは、一次抗体を染色手順から省略したものと考えた。
【０１０８】
蛍光染色強度を、これまでに説明されている技法に従って定量化した９。簡単に述べると、２０倍視野を選択し、画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｖ１．４９ｔで分析した。細胞および３つのバックグラウンド領域を、Ｉｍａｇｅ  Ｊにおいて、フリーハンドのセクションツールを使用して円で囲み、集約密度、選択した細胞の領域、およびバックグラウンドの平均蛍光を、関心領域（ＲＯＩ）マネージャを使用して、測定した。補正した全細胞蛍光（ＣＴＣＦ）を、集約密度-（選択した細胞の面積×バックグラウンド読み取りの平均蛍光）として計算した。ＣＴＣＦ値は、ウェルごとに平均し、患者全体でも平均した。
【０１０９】
カルセインＡＭ  Ｐ−糖タンパク質活性アッセイ
カルセインＡＭアッセイを、上述のように、組換えＰ−ｇｐ曝露の２４時間後に、補間されたＰ−ｇｐが、機能性であったかどうかを判定するために行った。予熱したカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、これまでに説明されているように、最終的なカルセイン濃度２．５μＭで、各ウェルに添加した４。１５分後に、各ウェルを、低温リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、各ウェル内のカルセイン蛍光を、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、励起波長および放出波長それぞれ４９４ｎｍおよび５１７ｎｍで、定量化した。蛍光の減少は、これまでに説明されているように、Ｐ−ｇｐ機能の増加の指標とみなした４。
【０１１０】
統計学的分析
すべての研究を、技術的に２連で行った。正規性を、シャピロ・ウイルク検定を使用して、評価した。ＬＰＳの存在下または非存在下におけるインビトロでのＰ−ｇｐ分泌を、クラスカル・ワリスのノンパラメトリック試験を使用して比較した。可溶性Ｐ−ｇｐと細胞質Ｐ−ｇｐとの間の相関性を、スピアマンの順位相関係数を使用して判定した。組換えＰ−ｇｐ曝露後のＣＴＣＦおよびカルセイン蛍光における変化を、両側スチューデントｔ検定を使用して、比較した。０．０５未満のｐ値を、有意とみなした。
【０１１１】
実施例１．１  インビトロ可溶性Ｐ−糖タンパク質分泌
ビヒクル対照のＣＲＳ由来の上皮培養物（ｎ＝６）において、可溶性Ｐ−ｇｐを、５５．４３±２６．２６ｎｇ／ｍＬ（平均±標準偏差）の濃度で検出した。Ｐ−ｇｐ分泌は、ＬＰＳでの刺激（ｎ＝６）後に、３３３．２７±３０５．９８ｎｇ／ｍＬ（ｐ＜０．００１）の濃度まで有意に増加した（図１Ａ）。すべての条件にわたって、可溶性Ｐ−ｇｐの濃度は、同じウェル内で、細胞質Ｐ−ｇｐ濃度と強力かつ有意に相関していた（ｒ＝０．５７、ｐ＝０．０００００１）（図１Ｂ）。
【０１１２】
実施例１．２  ウエスタンブロット分析
対照の初代上皮細胞とともに２４時間インキュベートした後の培養培地のウエスタンブロット分析により、１７０ｋＤａのインタクトなＰ−ｇｐのバンドが明らかとなり、これは、組換えＰ−ｇｐ陽性対照レーンと相関していた。同様に、条件培地および組換えＰ−ｇｐの両方のレーンにおいて、分解産物が、およそ５０ｋＤａおよび６０ｋＤａで観察された（図２）。
【０１１３】
実施例１．３  組換えＰ−糖タンパク質の膜補間および機能
健常患者由来の上皮細胞培養物間のベースライン平均ＣＴＣＦは、０．２９±０．２６（ｎ＝７）であった。ＣＴＣＦの継続的な用量依存性増加が、１００〜２０００ｎｇ／ｍＬの外因性組換えヒトＰ−ｇｐへの曝露後に観察された。２０００ｎｇ／ｍＬでのＣＴＣＦ（１．３４±１．８５、ｎ＝７）は、ビヒクル対照ウェルのものよりも有意に高かった（ｐ＝０．０１）（図３）。これらの発見は、定性的蛍光免疫細胞化学検査の結果と相関性があった（図３）。同様に、カルセインＡＭ機能的Ｐ−ｇｐアッセイにより、１００ｎｇ／ｍＬの用量（１２３．１１±４２．１６、ｎ＝７）と２０００ｎｇ／ｍＬの用量（８２．０３±４３．６９、ｎ＝７、ｐ＝０．０１）との間で平均蛍光における有意な低減を伴う用量応答が明らかとなった（図４）。
【０１１４】
この研究により、培養された副鼻腔上皮細胞が、インタクトな形態のＰ−ｇｐを分泌することができ、外因性Ｐ−ｇｐを細胞膜に機能的に補間することができることが示される。このＰ−ｇｐサイクリングの機序は、はっきりとしないままであるが、今回のインビトロでの発見は、可溶性Ｐ−ｇｐが、潜在的なバイオマーカーとして鼻粘液中に存在し得、ＣＲＳにおけるＰ−ｇｐの過剰発現の維持に関与している可能性があることを示唆する。今後の取組みは、インビボにおいて可溶性Ｐ−ｇｐを定量化し、その分泌および取込みに関与する経路を探究することを対象とすることになるであろう。
実施例１の参考文献
1. Chiampanichayakul S, Anuchapreeda S, Chruewkamlow N, Mahasongkram K, Thanaratanakorn P, Kasinrerk W. Production of monoclonal antibodies to P-glycoprotein: its application in detection of soluble and surface P-glycoprotein of leukemia patients. Int J Hematol. 2010;92 (2):326-33. doi:10.1007/s12185-010-0668-8.
2. Bleier BS, Article O. Regional expression of epithelial MDR1/P-glycoprotein in chronic rhinosinusitis with and without nasal polyposis. Int Forum Allergy Rhinol. 2012;2 (2):122-5. doi:10.1002/alr.21004.
3. Feldman RE, Lam AC, Sadow PM, Bleier BS. P-glycoprotein is a marker of tissue eosinophilia and radiographic inflammation in chronic rhinosinusitis without nasal polyps. Int Forum Allergy Rhinol. 2013;3 (8):684-7. doi:10.1002/alr.21176.
4. Bleier BS, Nocera AL, Iqbal H, et al. P-glycoprotein promotes epithelial T helper 2-associated cytokine secretion in chronic sinusitis with nasal polyps. Int Forum Allergy Rhinol. 2014;4 (6):488-94. doi:10.1002/alr.21316.
5. Bleier BS, Kocharyan A, Singleton A, Han X. Verapamil modulates interleukin-5 and interleukin-6 secretion in organotypic human sinonasal polyp explants. Int Forum Allergy Rhinol. 2014;5 (1):10-13. doi:10.1002/alr.21436.
6. Chu TM, Lin TH, Kawinski E. Detection of soluble P-glycoprotein in culture media and extracellular fluids. Biochem Biophys Res Commun. 1994;203 (1):506-12. doi:10.1006/bbrc.1994.2211.
7. Fokkens WJ, Lund VJ, Mullol J, et al. European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps 2012. Rhinol Suppl. 2012; (23):3 p preceding table of contents, 1-298. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22764607. Accessed February 11, 2014.
8. Bleier BS, Nocera AL, Iqbal H, Hoang JD, Feldman RE, Han X. P-glycoprotein functions as an immunomodulator in healthy human primary nasal epithelial cells. Int Forum Allergy Rhinol. 2013;3 (6):433-8. doi:10.1002/alr.21166.
9. McCloy R a., Rogers S, Caldon CE, Lorca T, Castro A, Burgess A. Partial inhibition of Cdk1 in G2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 2014;13 (9):1400-1412. doi:10.4161/cc.28401.
10. Wioland MA, Fleury-Feith J, Corlieu P, et al. CFTR, MDR1, and MRP1 immunolocalization in normal human nasal respiratory mucosa. J Histochem Cytochem. 2000;48:1215-1222. doi:10.1177/002215540004800905.
11. Kandimalla KK, Donovan MD. Localization and differential activity of P-glycoprotein in the bovine olfactory and nasal respiratory mucosae. Pharm Res. 2005;22 (7):1121-8. doi:10.1007/s11095-005-5420-3.
12. Wolking S, Schaeffeler E, Lerche H, Schwab M, Nies AT. Impact of Genetic Polymorphisms of ABCB1 (MDR1, P-Glycoprotein) on Drug Disposition and Potential Clinical Implications: Update of the Literature. Clin Pharmacokinet. 2015;54 (7):709-35. doi:10.1007/s40262-015-0267-1.
13. Henrique R, Oliveira AI, Costa VL, et al. Epigenetic regulation of MDR1 gene through post-translational histone modifications in prostate cancer. BMC Genomics. 2013;14:898. doi:10.1186/1471-2164-14-898.
【０１１５】
[実施例２]
分泌型Ｐ−糖タンパク質は、慢性鼻副鼻腔炎の非侵襲的なバイオマーカーである
慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）エンドタイプの非侵襲的バイオマーカーの発見は、予後診断情報および標的化された医療を提供する能力を進歩させるために、極めて重要である。上皮Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、ＣＲＳにおいて過剰発現され、細胞外の分泌形態で存在している。この研究の目的は、１）分泌型Ｐ−ｇｐが、鼻粘液中に検出され得るかどうか、および２）分泌型Ｐ−ｇｐの閾値を使用して、ＣＲＳエンドタイプおよび疾患重症度を予測することができるかどうかを判定することであった。
【０１１６】
方法
以下の材料および方法を、実施例２において使用した。
【０１１７】
副鼻腔粘液および粘膜組織の調達
この研究において使用したすべての患者サンプルの調達は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｅｙｅ  ａｎｄ  Ｅａｒ  Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認を受けている。粘液サンプルは、圧縮したポリビニルアルコールスポンジ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、粘膜を傷つけることもスポンジに血液が混入することもないように注意を払い、篩骨胞に５分間当てることによって、副鼻腔外科手術を受けた患者から採取した。スポンジを除去した後、粘膜組織サンプルを、隣接する篩骨胞から採取した。いずれのサンプルも、バッチ分析のために、即座に凍結させ、−８０℃で保管した。サンプルを、眼窩または頭蓋底の病変部の内視鏡副鼻腔外科手術を受けた健常な対照患者から、ならびにＥＰＯＳ１１基準に従って、鼻ポリープ（ＮＰ）を伴うかまたは伴わない慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳ）と診断された患者から、採取した。除外基準には、線毛機能不全、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、または任意の既知の免疫欠損が含まれた。
【０１１８】
副鼻腔粘液および粘膜組織のタンパク質の定量化
解凍した後、粘液サンプルを、遠心分離（４℃で３０分間、１５００ｇ）によってスポンジから抽出した。次いで、粘液を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１２００ｕＬの１倍リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に希釈した。１０分間のさらなる遠心分離（４℃で１７，０００ｇ）後に、細胞残屑を、ペレットにして除去した。粘膜組織サンプルを、解凍し、１倍ＰＢＳですすいだ後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＭＴ（Ｓｉｇｍａ、１：１００のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）を使用してタンパク質抽出を行った。組織およびＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＭＴ溶液を、６０秒間ホモジナイズし、次いで、４℃で１５分間インキュベートした。組織残屑を、４℃で１０分間、１７，０００ｇでの遠心分離によってペレットにした。次いで、上清を、分析のために採取した。粘液サンプルおよび組織サンプル内の全タンパク質濃度を、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して判定した。粘液サンプルおよび組織サンプル内のＰ−ｇｐおよびｅＭＢＰの濃度を、市販入手可能な酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｕｈａｎ、Ｃｈｉｎａ）を使用して定量化した。最終的なＰ−ｇｐおよびｅＭＢＰの濃度を、希釈に関して補正し、同じサンプル内の全タンパク質濃度に対して正規化した。
【０１１９】
臨床的な疾患重症度の定量化
疾患重症度の臨床上の指標を、これまでに説明されている方法に従って測定した。検証済みの２２項目の副鼻腔予後診断試験（ＳＮＯＴ−２２）１２を、提示の際に、すべての患者に行った。コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）による重症度スコアを、２人の独立した盲検の監視員によって、Ｌｕｎｄ−Ｍａｃｋａｙ方法に従ってグレーディングした１３。各患者における組織好酸球増加を、日常的な病理学的分析の一部として生成された２つの代表的なヘマトキシリンおよびエオシンスライドを使用して、定量化した。４００倍の高倍率視野（ｈｐｆ）５つ当たりの好酸球の数を、これまでに記載されているように、２人の独立した盲検の監視員によって、記録した７。値を平均して、各患者のｈｐｆ１つ当たりの平均好酸球スコアを生成した。
【０１２０】
統計学的分析
すべてのサンプルを、２連に分析した。正規性を、シャピロ・ウイルク検定を使用して評価し、データは、均一にノンパラメトリックであることが見出された。群間の連続型変数を、マンホイットニーのＵ検定を使用して比較した。Ｐ−ｇｐ値とｅＭＢＰ値との間の相関を、スピアマンの順位相関試験を使用して行った。群間の患者デモグラフィックを、カイ二乗検定を使用して比較した。０．０５未満のｐ値を、統計学的に有意とみなした。
【０１２１】
実施例２．１  患者デモグラフィック
集団は、診断によって予測される通り、多様な主観的および客観的疾患重症度指標を有する３８人の患者（対照が１０人、ＣＲＳが１６、およびＣＲＳｗＮＰが１２人）からなった。対照患者における平均ＳＮＯＴ−２２スコア（１２．６±１４．２、平均±標準偏差）は、ＣＲＳ患者のもの（４３．４±２２．８、ｐ＝０．００７）およびＣＲＳｗＮＰ患者のもの（５３．４±２５．５、ｐ＝０．００２）よりも有意に低かった。対照患者における平均好酸球／ｈｐｆ（０．３±０．５）は、ＣＲＳ患者のもの（５．５±７．４、ｐ＝０．００２）およびＣＲＳｗＮＰ患者のもの（７０．５±７４．２、ｐ＜０．００１）よりも有意に低かった。同様に、対照患者におけるＬｕｎｄ−Ｍａｃｋａｙスコア（０．８±１．０）は、ＣＲＳ患者のもの（４．８±４．２、ｐ＝０．００３）およびＣＲＳｗＮＰ患者のもの（１６．７±７．６、ｐ＝０．００２）よりも有意に低かった（図５Ａ〜Ｃ）。低Ｐ−ｇｐ分泌型集団と高Ｐ−ｇｐ分泌型集団とを区別するため、分泌型Ｐ−ｇｐ  ３００ｐｃｇ／全タンパク質μｇのカットオフを確立した。年齢、性別、または喘息および環境アレルギーの有病率に関して、低分泌型と高分泌型の間に有意差はなかった（表１）。
【０１２２】
【表１】
2019504319.tif 000003
【０１２３】
実施例２．２  分泌型Ｐ−糖タンパク質の定量化
分泌型Ｐ−ｇｐは、臨床診断に関係なく、試験した３８人の全患者の粘液サンプルおよび粘膜組織サンプルの両方において、検出された。低分泌性の患者（ｎ＝３１）の中で、分泌型Ｐ−ｇｐ濃度と粘膜Ｐ−ｇｐ濃度との間に有意な相関性はなかった（ｒ＝−０．２４、ｐ＝有意差なし）。しかしながら、高Ｐ−ｇｐ分泌性の患者の中では、分泌型Ｐ−ｇｐ濃度と粘膜Ｐ−ｇｐ濃度との間に、強力かつ統計学的に有意な相関性が確認された（ｒ＝０．７８、ｐ＝０．０４）（図６Ａ〜Ｂ）。分泌型Ｐ−ｇｐの濃度は、遊離粘液ｅＭＢＰのものとの中等度かつ統計学的に有意な相関性を示した（ｒ＝０．４６、ｐ＝０．００４）。同様に、組織Ｐ−ｇｐ濃度は、粘液ｅＭＢＰのものとの中等度かつ統計学的に有意な相関性を示した（ｒ＝０．４２、ｐ＝０．００８）（図７Ａ〜Ｂ）。
【０１２４】
実施例２．３  分泌型Ｐ−糖タンパク質は、疾患重症度の高感度な予測因子である
低分泌型の中での対照患者、ＣＲＳ患者、およびＣＲＳｗＮＰ患者の分布は、それぞれ、３２．３％、４１．９％、２５．８％であった。対照的に、高分泌型患者の中での相対分布は、ＣＲＳｗＮＰ患者優勢（５７．１％）にシフトし、残りの４２．９％は、ＣＲＳ患者のみからなっていた（図８）。この高分泌型の群は、あらゆる形態のＣＲＳの集団におけるすべての患者の２５％を占めた。分泌型Ｐ−ｇｐ  ３００ｐｃｇ／全タンパク質μｇのカットオフを、ＣＲＳの存在に関して、１００％の感度および２５％の特異度と関連付けた。
【０１２５】
高いＰ−ｇｐ分泌の所見は、主観的エンドポイントおよび客観的エンドポイントの両方によって測定した場合に、高い疾患重症度とも関連していた。高分泌型は、ＳＮＯＴ−２２スコア（６０±７）、好酸球／ｈｐｆ（６２±８４）、およびＬｕｎｄ−Ｍａｃｋａｙスコア（１５±８）が、低分泌型の対応物（それぞれ３４±２７、ｐ＝０．００９；１６±３６、ｐ＜０．０５；および６±８、ｐ＝０．０３）と比較して有意に高かった（図９Ａ〜Ｃ）。
実施例２の参考文献
1. Kern RC, Conley DB, Walsh W, et al. Perspectives on the etiology of chronic rhinosinusitis: an immune barrier hypothesis. Am J Rhinol. 22:549-559. doi:10.2500/ajr.2008.22.3228.
2. Akdis CA, Bachert C, Cingi C, et al. Endotypes and phenotypes of chronic rhinosinusitis: a PRACTALL document of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology and the American Academy of Allergy, Asthma & Immunology. J Allergy Clin Immunol. 2013;131 (6):1479-90. doi:10.1016/j.jaci.2013.02.036.
3. Pauwels B, Jonstam K, Bachert C. Emerging biologics for the treatment of chronic rhinosinusitis. Expert Rev Clin Immunol. 2015;11 (3):349-61. doi:10.1586/1744666X.2015.1010517.
4. Ponikau JU, Winter LA, Kephart GM, et al. An immunologic test for chronic rhinosinusitis based on free intranasal eosinophilic major basic protein. Int Forum Allergy Rhinol. 2015;5 (1):28-35. doi:10.1002/alr.21421.
5. Schmid C, Habermann W, Braun H, et al. Released intranasal eosinophilic major basic protein as a diagnostic marker for polypoid chronic rhinosinusitis. Otolaryngol Head Neck Surg. 2010;143 (3):386-91. doi:10.1016/j.otohns.2010.05.017.
6. Bleier BS, Article O. Regional expression of epithelial MDR1/P-glycoprotein in chronic rhinosinusitis with and without nasal polyposis. Int Forum Allergy Rhinol. 2012;2 (2):122-5. doi:10.1002/alr.21004.
7. Feldman RE, Lam AC, Sadow PM, Bleier BS. P-glycoprotein is a marker of tissue eosinophilia and radiographic inflammation in chronic rhinosinusitis without nasal polyps. Int Forum Allergy Rhinol. 2013;3 (8):684-7. doi:10.1002/alr.21176.
8. Bleier BS, Nocera AL, Iqbal H, et al. P-glycoprotein promotes epithelial T helper 2-associated cytokine secretion in chronic sinusitis with nasal polyps. Int Forum Allergy Rhinol. 2014;4 (6):488-94. doi:10.1002/alr.21316.
9. Bleier BS, Kocharyan A, Singleton A, Han X. Verapamil modulates interleukin-5 and interleukin-6 secretion in organotypic human sinonasal polyp explants. Int Forum Allergy Rhinol. 2014;5 (1):10-13. doi:10.1002/alr.21436.
10. Chu TM, Lin TH, Kawinski E. Detection of soluble P-glycoprotein in culture media and extracellular fluids. Biochem Biophys Res Commun. 1994;203 (1):506-12. doi:10.1006/bbrc.1994.2211.
11. Fokkens WJ, Lund VJ, Mullol J, et al. European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps 2012. Rhinol Suppl. 2012; (23):3 p preceding table of contents, 1-298. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22764607. Accessed February 11, 2014.
12. Hopkins C, Gillett S, Slack R, Lund VJ, Browne JP. Psychometric validity of the 22-item Sinonasal Outcome Test. Clin Otolaryngol. 2009;34:447-454. doi:10.1111/j.1749-4486.2009.01995.x.
13. Lund VJ, Mackay IS. Staging in rhinosinusitus. Rhinology. 1993;31 (4):183-4. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8140385.
14. Chiampanichayakul S, Anuchapreeda S, Chruewkamlow N, Mahasongkram K, Thanaratanakorn P, Kasinrerk W. Production of monoclonal antibodies to P-glycoprotein: its application in detection of soluble and surface P-glycoprotein of leukemia patients. Int J Hematol. 2010;92 (2):326-33. doi:10.1007/s12185-010-0668-8.
15. Lam A, Hoang JD, Singleton A, Han X, Bleier BS. Itraconazole and clarithromycin inhibit P-glycoprotein activity in primary human sinonasal epithelial cells. Int Forum Allergy Rhinol. 2015 Jun;5(6):477-80.
【０１２６】
[実施例３]
エキソソームＰ−糖タンパク質の上皮間輸送は、鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎において炎症を促進する
エキソソームは、直径が約３０〜１５０ｎｍの小胞体であり、少なくともいくつかは、細胞間の膜タンパク質輸送を行うことができ、それに関与する。Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、鼻ポリープを伴う慢性鼻副鼻腔炎（ＣＲＳｗＮＰ）において上皮サイトカイン分泌を促進する、膜排出ポンプである。この研究の目的は、１）ＣＲＳｗＮＰの粘液エキソソームには、Ｐ−ｇｐが豊富であるかどうか、２）エキソソームＰ−ｇｐが、自家上皮細胞に機能的に輸送され得るかどうか、および３）エキソソーム輸送が、Ｐ−ｇｐ依存性上皮サイトカイン分泌を強化するかどうかを判定することであった。
【０１２７】
方法
以下の材料および方法を、実施例３において使用した。
【０１２８】
副鼻腔粘膜および粘液のサンプル採取
組織および粘液のサンプル採取は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｅｙｅ  ａｎｄ  Ｅａｒ  Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって承認を受けている。すべてのサンプルは、副鼻腔の外科手術を受けており、採取前の少なくとも４週間の間、抗生物質にもステロイドにも曝露されていない患者から採取した。包含基準には、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｐａｐｅｒ  ｏｎ  Ｒｈｉｎｏｓｉｎｕｓｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｎａｓａｌ  Ｐｏｌｙｐｓ（ＥＰＯＳ）［１６］基準によりＣＲＳｗＮＰと診断された患者、および眼窩または頭蓋底の病変部の内視鏡副鼻腔外科手術を受けた健常な患者（すなわち、対照、１群当たりｎ＝１０人）が含まれた。除外基準には、線毛機能不全、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、または免疫欠損が含まれた。検証済みの疾患特異的な２２項目の副鼻腔予後診断試験（ＳＮＯＴ）−２２）［１７］を、すべての患者に対して得た。粘液サンプルは、圧縮したポリビニルアルコールスポンジ（ＰＶＡ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、粘膜を傷つけることもスポンジに血液が混入することもないように注意を払い、篩骨胞に５分間当てることによって、中鼻道から採取した。次いで、粘膜サンプルを、篩骨胞から採取した。
【０１２９】
全粘液からのエキソソーム精製
エキソソーム精製手順は、Ｔｈｅｒｙら［１８］によって説明されている超遠心分離（ＵＣＦ）手順から適応させた。この技法は、市販入手可能な沈降法（ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）と比較すると、ｖａｎ  Ｄｅｕｎら［１９］と合致して、より高いタンパク質およびエキソソーム収率を伴って、高い純度が得られた（図１０Ａ〜Ｂ）。粘液サンプルを、遠心分離（４℃で３０分間、１５００ｇ）によってＰＶＡスポンジから抽出した。次いで、粘液を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む１５０μＬの１倍リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に希釈した。細胞残屑を、４℃、１２，０００×ｇで４５分間の遠心分離によってペレットにした。次いで、上清を、ポリプロピレンチューブ（Ｔｈｉｎｗａｌｌ、５．０ｍＬ、１３×５１ｍｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）において、４．５ｍＬのＰＢＳ中に懸濁し、４℃で２時間、１１０，０００×ｇで超遠心分離にかけた。上清を採取し、ペレットを、４．５ｍＬの１倍ＰＢＳ中に再懸濁させた。懸濁液を、０．２２μｍのフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）に通して濾過し、新たな超遠心分離チューブに採取した。濾過した懸濁液を、次いで、４℃で７０分間、１１０，０００×ｇで、遠心分離した。上清を採取し、ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含む２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞培養物の投与の前に、各ペレットのエキソソーム濃度を、これまでに説明されているように、確立されたエキソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９（ＥｘｏＥＬＩＳＡ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に関して、市販入手可能な酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、判定した［２０］。
【０１３０】
粘液由来のエキソソームの透過電子顕微鏡分析
エキソソームの透過電子顕微鏡分析（ＴＥＭ）手順を、Ｔｈｅｒｙら［１８］から適合させた。単離したエキソソームを、室温で１時間、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）中の２％パラホルムアルデヒド中に固定した。５μＬのエキソソームを、２０分間、Ｆｏｒｍｖａｒ−カーボンコート電子顕微鏡グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に吸着させた。吸着させた後、グリッドを、ＰＢＳ中で３回すすぎ、次いで、４回の洗浄のため、ＰＢＳ／５０ｍＭグリシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）に移した。グリッドを、室温で１０分間、１倍リン酸緩衝食塩水（緩衝液）中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でブロッキングした。グリッドを、４℃で一晩、１％ＢＳＡ緩衝液中に希釈した一次抗体（１：２５、精製したマウス抗ヒトＣＤ６３クローンＨ５Ｃ６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中でインキュベートした。次いで、グリッドを、０．１％ＢＳＡ緩衝液中ですすいだ後、０．５％ＢＳＡ緩衝液中ですすいだ（６回ずつ）。次いで、５％ＢＳＡ緩衝液中の二次プロテインＧ抗体（１％ＢＳＡ緩衝液中１：２０、ＥＭグレード、１０ｎｍ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を、室温で１時間適用し、１倍ＰＢＳ中で８回すすいだ。グリッドを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）中の１％グルタルアルデヒド中で、５分間インキュベートした。脱イオン水中で８回すすいだ後、グリッドを、シュウ酸ウラニル溶液、ｐＨ７（ＵＡ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）中で、５分間、対比させた。グリッドを、濾紙にブロットし、撮像の前に空気乾燥させた。エキソソームを、デジタルＴＩＦＦファイルの画像を取得するために、ＡＭＴ  ＸＲ４１デジタルＣＣＤカメラ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に連結したＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ透過電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、Ｏｒｅｇｏｎ）を使用して、１００ｋＶの加速電圧で、観察した。ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）およびＣＤ６３ライセート（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＣＤ６３過剰発現ライセート（ネイティブ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、それぞれ、陰性対照および陽性対照として使用した。
【０１３１】
粘液由来のエキソソームＰ−ｇｐ濃度のインビボでの定量化
エキソソームＰ−ｇｐ濃度のインビボでの特徴付けのために、粘液を、対照患者およびＣＲＳｗＮＰ患者の両方から採取した（表２を参照されたい）。粘液を、ＰＶＡスポンジを使用して採取した後、上述のようにエキソソームを精製した。精製したエキソソーム画分を、Ｐ−ｇｐ、ＣＤ６３、およびＣＤ９（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ＥＬＩＳＡに供して、精製したエキソソーム画分内の相対Ｐ−ｇｐ濃度を判定した。すべての値は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、同じサンプル内の全タンパク質濃度に対して正規化した。
【０１３２】
【表２】
2019504319.tif 000004
【０１３３】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロットを使用して、粘液由来のエキソソーム画分内のＰ−ｇｐの存在をさらに検証した。上述のようにエキソソームを単離した後、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡアッセイキットを使用して、全タンパク質を判定した。１０μｇの全タンパク質およびＬａｅｍｍｌｉローディング緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯのβ−メルカプトエタノールを含む、２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、９５℃で３分間変性させ、プレキャストＮｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌｓ（１．０ｍｍ、９ウェル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離させた。タンパク質を、ｉＢｌｏｔ（登録商標）Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって、フッ化ポリビニリデン膜に転写した。膜を、室温で１時間、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水およびＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中の５％スキムミルクでブロッキングした。一次抗体（モノクローナル抗Ｐ−糖タンパク質クローンＦ４、１：１０００、ＴＢＳＴ中５％ミルク）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで１５分間ずつの洗浄を３回行った後、二次抗体（ＴＢＳＴ中５％ミルクのヤギにおいて産生させた抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）-ペルオキシダーゼ抗体、Ｓｉｇｍａ）を、室温で１時間インキュベートした。再度、膜に、ＴＢＳＴで１５分間ずつの洗浄を３回行い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、５分間適用した後、ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で視覚化した。組換えＰ−ｇｐ（ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｕｈａｎ、Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）を、対照として使用し、マウスにおいて産生させたモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ローディング対照として使用した。
【０１３４】
初代ヒト副鼻腔上皮細胞培養物
ヒト副鼻腔上皮細胞培養物（ＨＳＮＥＣＣ）を、これまでに説明されているように成長させた［２１］。簡単に述べると、粘膜生検サンプルを、洗浄し、３７℃で９０分間、Ｐｒｏｎａｓｅ中で消化させた。細胞懸濁液を、遠心分離によって粒子状物質から分離させ、気管支上皮成長培地（ＢＥＧＭ、Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁させた。細胞を、標準的な組織培養プレートに２時間蒔いて、混入している線維芽細胞を除去した。次いで、細胞を、ヒトＩＶ型コラーゲン（ヒト胎盤由来のコラーゲン、Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｂ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をコーティングした７５ｃｍ２の皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で、３〜５日間増殖させた。コンフルエントになった後、ＨＳＮＥＣＣを、トリプシン化し、ヒトＩＶ型コラーゲンをコーティングした壁部が黒色の９６ウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇの９６ウェルプレート）の組織培養プレートに、ＢＥＧＭにおいて均等に再播種し、８０％のコンフルエンスまで成長させた後、分析した。すべてのインビトロ実験は、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｋｉｔ（青色／緑色、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって判定すると、２０％未満の細胞毒性と関連していた（図１１Ａ〜Ｂを参照されたい）。
【０１３５】
インビトロでのＨＳＮＥＣＣによる粘液由来のエキソソームの内部移行の判定
自家単離エキソソームを、市販入手可能な１０倍Ｅｘｏ−Ｒｅｄ（商標）アクリジンオレンジ（ＡＯ）およびＥｘｏ−Ｇｒｅｅｎ（商標）カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）蛍光標識（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者の説明書に従って使用して染色して、同じ患者に由来するＨＳＮＥＣＣへのＲＮＡおよびタンパク質（それぞれ）の内部移行を特徴付けた。標識した後、２５μＬの精製した自家エキソソーム（１．２５×１０９個のエキソソーム／ｍＬ）を、壁面が黒色の９６ウェルプレートにおいて、ＨＳＮＥＣＣに添加した。ウェルを、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＬＥＤ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）および２０倍対物レンズを使用して、１０分ごとに３０分間撮像した。すべての時点で、同じ視野を使用した。
【０１３６】
エキソソームにより媒介される機能性Ｐ−ｇｐの輸送の定量化
カルセインアセトキシメチルエステル（ＡＭ）アッセイ［２２］を、ＨＳＮＥＣ培養物に行った後、精製した自家粘液由来のエキソソームを投与して、機能的Ｐ−ｇｐ活性の相対取得を定量化した。ＨＳＮＥＣＣを、エキソソーム（１．２５×１０９個のエキソソーム／ｍＬ）を含有するＢＥＧＭまたは０．６２５μＭの第３世代Ｐ−ｇｐ阻害剤ゾスキダール３ＨＣｌ（Ｍｅｄｋｏｏ、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ＮＣ）［２３］とともにエキソソームを含有するＢＥＧＭに曝露した。予熱したカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、これまでに説明されているように、最終的な濃度２．５μＭで、各ウェルに添加した［２２］。１５分後に、各ウェルを、低温リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、ウェルを、３連に撮像した。蛍光を、ＭｃＣｌｏｙらによってこれまでに説明されているように［２４］、補正全細胞蛍光法を使用して、定量化した。カルセイン蛍光における低減は、Ｐ−ｇｐ機能における増加に対応し、一方で蛍光の増加は、阻害の成功に対応する［２２］。
【０１３７】
上皮サイトカイン分泌のエキソソーム由来のＰ−ｇｐ制御の分析
コンフルエントなＨＳＮＥＣＣを、１時間適用した５０μＬの精製した自家エキソソーム（５．３×１０１０個のエキソソーム／ｍＬ）の存在下または非存在下において、ビヒクル対照（ＢＥＧＭ）、０．６２５μＭゾスキダールＨＣｌに２３時間曝露した。対照ウェルは、ビヒクル対照単独に曝露した。曝露した後、培地を、各ウェルから採取した。ＴＳＬＰ（胸腺間質由来リンパ球新生因子）、インターロイキン（ＩＬ）−６、およびＩＬ−８のサイトカイン濃度を、製造業者のガイドライン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って、ＥＬＩＳＡによって判定した。すべての分泌型サイトカイン濃度は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、全タンパク質濃度に対して正規化した。
【０１３８】
統計
Ｒ  ｖ３．３．０を使用して、統計学的分析を行った。正規性の評価には、シャピロ・ウイルク検定を使用した。ノンパラメトリックデータについては、クラスカル・ワリス検定を使用して、複数の群間の統計学的差を試験し、マンホイットニーの順位和検定を使用して、２つの独立した群間の統計学的差を試験した。両側スピアマンの順位相関を使用して、相関性を試験した。それぞれのデータセットの四分位範囲の１．５倍の外側の値は、外れ値とみなし、分析から無差別に除外した。結果は、０．０５以下のＰ値が得られた場合に、有意とみなした。すべてのインビトロ研究を、技術的に２連で行った。
【０１３９】
実施例３．１  エキソソームは、副鼻腔粘液中に存在し、ＣＲＳｗＮＰを有する患者ではＰ−ｇｐが豊富である
第１の一連の実験は、鼻粘液内のエキソソームの存在を定量化し、患者群ごとのエキソソームＰ−ｇｐの相対的存在量を特徴付けるように設計した。ＣＤ６３は、最も広範に利用されているエキソソームマーカーの１つであり、別のエキソソーム関連テトラスパニンであるＣＤ９と強力な相関性がある（図１２）。したがって、ＣＤ６３を、研究を通じて一次エキソソームマーカーとして使用した［１０］。対照およびＣＲＳｗＮＰの両方の精製エキソソーム画分において、ＴＥＭを使用して、エキソソームの予測された３０〜１５０ｎｍのサイズ、回転楕円形、および形質学に対応する、構造体を見出した［１２］。次いで、後続のイムノゴールド標識により、エキソソーム上部構造内にＣＤ６３およびＰ−ｇｐエピトープの両方の存在を確認した（図１３Ａ）。ＴＥＭによって鼻粘液中にＰ−ｇｐを含有するエキソソームの存在を確認した後、ＥＬＩＳＡによって、対照患者の粘膜とＣＲＳｗＮＰ患者の粘膜（１群当たりｎ＝１０人、表２を参照されたい）との間で、分泌型エキソソーム量またはＰ−ｇｐ組成に差があったかどうかを判定することを試みた。ＣＲＳｗＮＰ（１８３１．０、ＩＱＲ  ５１９．３〜３０７３．４個のエキソソーム／全タンパク質ｐｃｇ）と対照群（１４０５．３、ＩＱＲ  ９３４．４〜２４０３．７、ｐ＝０．８４）との間で、平均全エキソソーム濃度に有意差は見出されなかった（図１３Ｂ）。しかしながら、ＣＲＳｗＮＰ患者では、エキソソーム当たりの平均Ｐ−ｇｐ濃度は、対照患者のもの（７４．４、ＩＱＲ  ４１．３〜９５．０、ｐ＝０．００２）よりも、有意に高かった（１９８．５、ＩＱＲ  １２３．６〜２７０．５  ｐｃｇ  Ｐ−ｇｐ／１０９個のエキソソーム）（図１３Ｃ）。最後に、ＴＥＭ研究およびＥＬＩＳＡ研究において、エキソソームＰ−ｇｐの存在および相対存在量の両方を確認するために、ウエスタンブロットを用いたが、ここでも、精製したＣＲＳｗＮＰエキソソーム画分におけるＰ−ｇｐ、ならびに対照サンプルにおける弱いシグナルが示された（図１３Ｄ）。
【０１４０】
実施例３．２  自家エキソソームは、機能性Ｐ−ｇｐを培養副鼻腔上皮細胞に輸送することができる
対照患者およびＣＲＳｗＮＰ患者の両方からの粘液由来のエキソソーム内でのＰ−ｇｐの存在を確立した後、次に、これらのエキソソームが、粘液からナイーブな培養上皮細胞に輸送され得るかどうかを判定することを試みた。本発明者らは、細胞を、精製した自家エキソソームに曝露した後、標識したエキソソームタンパク質およびＲＮＡが、１０分程度の早い時点で、急速かつ進行的に取り込まれることを示した（図１４Ａ）。この時間スケールは、生理学的粘液毛様体クリアランストランスポートの結果としてのエキソソームの上皮間輸送の可能性と一致する。次に、これらのエキソソームの取込みが、機能性Ｐ−ｇｐの輸送と関連していたかどうかについて研究した。確立されているカルセインＡＭ  Ｐ−ｇｐ活性アッセイ［２２］を使用して、エキソソームへの曝露により、Ｐ−ｇｐ機能の増加を示すカルセイン蛍光の有意な低減をもたらしたことを見出した。低減の中央値は、ＣＲＳｗＮＰ群においては、対照（８３．８％ベースライン、四分位範囲（ＩＱＲ）７７．３％〜８７．３％、ｐ＝０．００７）と比較して、有意に高かったが（７５．６％ベースライン、ＩＱＲ７４．１％〜８１．５％）、これは、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットでの所見において明らかであったエキソソームＰ−ｇｐの相対的豊富さと一致する。さらに、この機能の増加は、Ｐ−ｇｐの高度に強力かつ特異的な阻害剤であるゾスキダールの添加によって抑制され［２２］（図１４Ｂ）、エキソソームにより媒介される機能性Ｐ−ｇｐの輸送の確実な根拠が得られた。
【０１４１】
実施例３．３  エキソソーム由来のＰ−ｇｐは、上皮由来のサイトカイン分泌を調節することができる
本グループのこれまでの研究により、Ｐ−ｇｐが、濃度依存性様式で、上皮サイトカイン分泌を調節することができることが示されている［５］。エキソソーム由来の機能性Ｐ−ｇｐ輸送を確認した後、次いで、エキソソーム曝露により、レシピエント細胞に、強化されたＰ−ｇｐ依存性サイトカイン分泌を付与することができたかどうかを試験した。エキソソーム曝露は、ＣＲＳｗＮＰ培養物において、Ｐ−ｇｐ依存性ＩＬ−６分泌（１２４．３％ベースライン、ＩＱＲ１０５．２〜１４３．４％）およびＩＬ−８分泌（９４２．６％、３４４．２〜１５４１．１％）を、対照（それぞれ、６７％、６３．７〜７０．３％、ｐ＜０．００１および７２．７％、７０．２〜７５．２％、ｐ＜０．００１）と比較して、有意に促進した。続くゾスキダールの添加によるこの分泌の抑制によって、作用が、Ｐ−ｇｐによって媒介されていたことを確認した（図１５Ａ〜Ｂ）。ＴＳＬＰ分泌は、両方の群においてすべての条件で、ＥＬＩＳＡの検出閾値（８ｐｃｇ／ｍＬ）よりも低いままであった。
【０１４２】
実施例３．４  粘液由来のエキソソームＰ−ｇｐレベルは、副鼻腔症状と相関性がある
すべての患者におけるＰ−ｇｐ／エキソソームの濃度は、ＳＮＯＴ−２２によって測定される、主観的鼻症状スコアと中等度かつ有意に相関性があった（ｒ＝０．６４１、ｐ＝０．００２）（図１６）。
【０１４３】
全体としては、実施例３において提示したデータは、ＣＲＳｗＮＰにおける炎症の維持に関する新規な機序を指摘しており、ＣＲＳｗＮＰを有する患者の鼻粘液内のエキソソームが、Ｐ−ｇｐが豊富であり、粘液毛様体流を通じて隣接する上皮細胞に機能的に輸送され得ることを示す。このＰ−ｇｐが、上皮由来のサイトカインの分泌を促進し、それによって、疾患の慢性的な炎症状態特徴が維持され得る。
実施例３の参考文献
1. Fernandez C, Buyse M, German-Fattal M, Gimenez F. Influence of the pro-inflammatory cytokines on P-glycoprotein expression and functionality. J. Pharm. Pharm. Sci. 2004; 7:359-371. 
2. Cleves AE, Kelly RB. Rehearsing the ABCs. Protein translocation. Curr. Biol. 1996; 6:276-8. 
3. Drach J, Gsur A, Hamilton G, et al. Involvement of P-glycoprotein in the transmembrane transport of interleukin-2 (IL-2), IL-4, and interferon-gamma in normal human T lymphocytes. Blood 1996; 88:1747-1754. 
4. Bleier BS, Nocera AL, Iqbal H, Hoang JD, Feldman RE, Han X. P-glycoprotein functions as an immunomodulator in healthy human primary nasal epithelial cells. Int. Forum Allergy Rhinol. 2013; 3:433-8. 
5. Bleier BS, Kocharyan A, Singleton A, Han X. Verapamil modulates interleukin-5 and interleukin-6 secretion in organotypic human sinonasal polyp explants. Int. Forum Allergy Rhinol. 2014; 5:10-13. 
6. Bleier BS, Singleton A, Nocera AL, Kocharyan A, Petkova V, Han X. P-glycoprotein regulates Staphylococcus aureus enterotoxin B-stimulated interleukin-5 and thymic stromal lymphopoietin secretion in organotypic mucosal explants. Int Forum Allergy Rhinol. 2016 Feb;6(2):169-77. Epub 2015 Dec 1. 
7. Bleier BS, Article O. Regional expression of epithelial MDR1/P-glycoprotein in chronic rhinosinusitis with and without nasal polyposis. Int. Forum Allergy Rhinol. 2012; 2:122-5. 
8. Feldman RE, Lam AC, Sadow PM, Bleier BS. P-glycoprotein is a marker of tissue eosinophilia and radiographic inflammation in chronic rhinosinusitis without nasal polyps. Int. Forum Allergy Rhinol. 2013; 3:684-7. 
9. Nocera AL, Muerer AT, Singleton A, et al. Intact Soluble P-glycoprotein is Secreted by Sinonasal Epithelial Cells. Am. J. Rhinol. Allergy 2016; 4:246-9
10. Lee TH, D’Asti E, Magnus N, Al-Nedawi K, Meehan B, Rak J. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer-the emerging science of cellular ‘debris’. Semin. Immunopathol. 2011; :1-13. 
11. Lee Y, El Andaloussi S, Wood MJ a. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Hum. Mol. Genet. 2012; 21:125-134. 
12. Schorey JS, Cheng Y, Singh PP, Smith VL. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Rep. 2015; 16:24-43. 
13. Mack M, Kleinschmidt  a, Bruhl H, et al. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membrane-derived microparticles: a mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1 infection. Nat. Med. 2000; 6:769-775. 
14. Lv MM, Zhu XY, Chen WX, et al. Exosomes mediate drug resistance transfer in MCF-7 breast cancer cells and a probable mechanism is delivery of P-glycoprotein. Tumor Biol. 2014; :10773-10779. 
15. Bebawy M, Combes V, Lee E, et al. Membrane microparticles mediate transfer of P-glycoprotein to drug sensitive cancer cells. Leuk.  Off. J. Leuk. Soc. Am. Leuk. Res. Fund, U.K 2009; 23:1643-1649. 
16. Fokkens WJ, Lund VJ, Mullol J, et al. European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps 2012. Rhinol. Suppl. 2012; :3 p preceding table of contents, 1-298. 
17. Hopkins C, Gillett S, Slack R, Lund VJ, Browne JP. Psychometric validity of the 22-item Sinonasal Outcome Test. Clin. Otolaryngol. 2009; 34:447-454.
18. Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. 2006; Chapter 3:Unit 3.22. 
19. Van Deun J, Mestdagh P, Sormunen R, et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J. Extracell. vesicles 2014; 1:1-14. 
20. Mallegol J, Van Niel G, Lebreton C, et al. T84-Intestinal Epithelial Exosomes Bear MHC Class II/Peptide Complexes Potentiating Antigen Presentation by Dendritic Cells. Gastroenterology 2007; 132:1866-1876. 
21. Bleier BS, Mulligan RM, Schlosser RJ. Primary human sinonasal epithelial cell culture model for topical drug delivery in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyposis. J. Pharm. Pharmacol. 2012; 64:449-56.
22. Bleier BS, Nocera AL, Iqbal H, et al. P-glycoprotein promotes epithelial T helper 2-associated cytokine secretion in chronic sinusitis with nasal polyps. Int. Forum Allergy Rhinol. 2014; 4:488-94. 
23. Lam A, Hoang JD, Singleton A, Han X, Bleier BS. Itraconazole and clarithromycin inhibit P-glycoprotein activity in primary human sinonasal epithelial cells. Int. Forum Allergy Rhinol. 2015; Jun;5(6):477-80.. 
24. McCloy R a., Rogers S, Caldon CE, Lorca T, Castro A, Burgess A. Partial inhibition of Cdk1 in G2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle 2014; 13:1400-1412. 
25. Wu G, Yang G, Zhang R, et al. Altered microRNA Expression Profiles of Extracellular Vesicles in Nasal Mucus From Patients With Allergic Rhinitis. Allergy Asthma Immunol Res. 2015; 7:449-457. 
26. Gudis D, Zhao K, Cohen NA. Acquired cilia dysfunction in chronic rhinosinusitis. Am. J. Rhinol. Allergy 26:1-6. 
27. Levchenko A, Mehta BM, Niu X, et al. Intercellular transfer of P-glycoprotein mediates acquired multidrug resistance in tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005; 102:1933-1938. 
28. Pasquier J, Galas L, Boulange-Lecomte C, et al. Different modalities of intercellular membrane exchanges mediate cell-to-cell P-glycoprotein transfers in MCF-7 breast cancer cells. J. Biol. Chem. 2012; 287:7374-7387. 
29. Bebawy M, Combes V, Lee E, et al. Tumor cell-derived exosomes: A message in a bottle. i 2015; 5:1-13. 
30. Tomassen P, Vandeplas G, Van Zele T, et al. Inflammatory endotypes of chronic rhinosinusitis based on cluster analysis of biomarkers. J. Allergy Clin. Immunol. 2016
【０１４４】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は、例示を意図するものであり、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲を制限することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正が、以下の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
2019504319.tif 000005
【図２】
2019504319.tif 000006
【図３】
2019504319.tif 000007
【図４】
2019504319.tif 000008
【図５】
2019504319.tif 000009
【図６】
2019504319.tif 000010
【図７】
2019504319.tif 000011
【図８】
2019504319.tif 000012
【図９−１】
2019504319.tif 000013
【図９−２】
2019504319.tif 000014
【図１０】
2019504319.tif 000015
【図１１】
2019504319.tif 000016
【図１２】
2019504319.tif 000017
【図１３】
2019504319.tif 000018
【図１４】
2019504319.tif 000019
【図１５】
2019504319.tif 000020
【図１６】
2019504319.tif 000021
【国際調査報告】
2019504319.tif 000022
2019504319.tif 000023