(57)【要約】  酵素の組み合わせ、特に好熱性セリンプロテアーゼとリパーゼとの組み合わせにより、ベーカリー製品のショートバイトを改良できることが判明した。これらの酵素を含む組成物、酵素のこの組み合わせの使用、好熱性セリンプロテアーゼとリパーゼとの組み合わせを用いてベーカリー製品を調製する方法がここで提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである第２の酵素と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記第１の酵素が好熱性セリンプロテアーゼであり、最適温度でのプロテアーゼ活性と２５℃でのプロテアーゼ活性との比が１０より大きく、好ましくは１５より大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の酵素が中性またはアルカリ性の好熱性セリンプロテアーゼである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の酵素が、好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＴａｑプロテアーゼ、好ましくはアクアリシンＩまたはアクアリシンＩＩ、より好ましくはアクアリシンＩ、更により好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＬＭＧ８９２４から単離されたアクアリシンＩである、請求項１〜３の何れかに記載の組成物。
【請求項５】
前記第１の酵素が、１００〜１２００単位／小麦粉１００ｋｇ、好ましくは２００〜９００単位／小麦粉１００ｋｇ、より好ましくは３５０〜７００単位／小麦粉１００ｋｇの量で存在する、請求項１〜４の何れかに記載の組成物。
【請求項６】
前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）から得られるリパーゼから好ましくは選択される、酵素エントリーＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼまたはトリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼである、請求項１〜５の何れかに記載の組成物。
【請求項７】
前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ５〜１００ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ０．０２３〜０．３６０ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ５０〜２００ＬＵ／小麦粉１００ｋｇの量で存在する、請求項１〜６の何れかに記載の組成物。
【請求項８】
ベーカリー用途における請求項１〜７の何れかに記載の組成物の使用。
【請求項９】
パン改良剤における請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ソフトなベーカリー製品および皮の硬いベーカリー製品、好ましくは、パン、ソフトロール、ドーナツ、バンズ、電子レンジ加熱可能なバンズ、デニッシュペストリー、クロワッサン、ハンバーガーロール、ピザおよびピタパン、ならびにケーキにおける請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜７の何れかに記載の組成物を含む、パン改良剤。
【請求項１２】
ベークド製品を調製する方法であって、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃を超える温度、好ましくは８０℃を超える温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである、前記第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである、前記第２の酵素と
を生地またはバッターに焼成前に添加する工程を含む、方法。
【請求項１３】
調製したベークド製品を破壊するのに必要な最大力が、前記第１または第２の酵素をいずれも使用せずに調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも１５％低下する、改良されたショートバイトを有するベークド製品の調製における、請求項１〜７に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
請求項１〜７の何れかに記載の組成物を含む生地またはバッターから調製されるベークド製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ベーカリー製品のショートバイト（short bite）の改良に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ベーカリー製品を購入するとき、消費者は一連のパラメータ、例えば、外観、柔らかさ、湿り気または香りを考慮する。ベーカリー製品がどのように食べられ得るかも重要であり、例えば、ベーカリー製品は、それを徹底的に噛まなくても、容易に噛み切れなくてはならず、この特定の側面が、製品の新鮮さの特性であるとみなされるためである。消費者はまた、できる限り（ラベル表示された）添加物が少ないパンを購入することも好む。
【０００３】
ベーカリー製品の特性は劣化の過程で変化する。特に、香りのプロファイルが変化し、製品は硬くなり、乾燥して、噛みにくくなり、結果的に、ベーカリー製品は、「新鮮でなくなった」とみなされる。
【０００４】
ベーカリー製品のショートバイトは、一切れのベーカリー製品をかじるまたはちぎることの容易性として定義され得る。これは、試料を破壊するのに必要な力、および飲み込むことができる稠度まで試料を噛み砕く噛嚼回数に反映される。ある意味では、ショートバイトは、噛み応えと逆のものである。更に、ショートバイトは、柔らかさと全く異なる。実際に、パンの柔らかさは、ある程度変形するまで試料を圧縮するのに必要な力に反映される。柔らかさは、硬さと逆のものでもある。したがって、パンは、ショートバイトを有さないと柔らかく、逆の場合もまた同じであり得る。
【０００５】
現在、ベーカリー製品のショートバイトを改良するために提案されたいくつかの方法がすでに存在する。ＥＰ０７７６６０４には、ショートバイトを有する電子レンジ加熱可能なサクサクしたロールパンを製造するための不飽和モノグリセリドの使用について記載されている。ＷＯ２００９１３８４４７には、ベーカリー製品のショートバイトを改良するための中間熱安定性または熱安定性セリンまたはメタロプロテアーゼの使用について記載されている。
【０００６】
しかし、これらの方法は限界があることが認められている。ヨーロッパでは、モノグリセリドまたは他の乳化剤の添加は、一部の消費者が製品を購入するのを防ぐものである、Ｅ番号をベーカリー製品に明確にラベル表示することが必要とされている。
【０００７】
中間熱安定性または熱安定性セリンまたはメタロプロテアーゼの使用により、ある程度ベーカリー製品のショートバイトが改良されるが、大量の酵素は他のベーカリー製品の特性、例えば、砕けやすさおよび弾力性を害する傾向があるため、ショートバイトのこの改良は、何らかの形で制限される。
【０００８】
したがって、ショートバイトを更に改良する新しい方法および製品が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、ベーカリー用途における、および特にパン製造における、７０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼとリパーゼとの組み合わせの使用が、ショートバイトに対して相乗効果があることを見出した。
【００１０】
したがって、第１の側面において、本発明は、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃より高い温度、好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである第２の酵素と
を含む、組成物に関する。
【００１１】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、好熱性セリンプロテアーゼであり、そこで最適温度でのプロテアーゼ活性と２５℃でのプロテアーゼ活性との比が１０より大きく、好ましくは１５より大きいことを可能にする。
【００１２】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、中性またはアルカリ性の好熱性セリンプロテアーゼであることを可能にする。
【００１３】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＴａｑプロテアーゼ、好ましくはアクアリシンＩまたはアクアリシンＩＩ、より好ましくはアクアリシンＩ、更により好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＬＭＧ８９２４から単離されたアクアリシンＩであることを可能にする。
【００１４】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、１００〜１２００単位／小麦粉１００ｋｇ、好ましくは２００〜９００単位／小麦粉１００ｋｇ、より好ましくは３５０〜７００単位／小麦粉１００ｋｇの量で存在することを可能にする。
【００１５】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）から得られるリパーゼから好ましくは選択される、酵素エントリー（ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ）ＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼまたはトリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼであることを可能にする。
【００１６】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ５〜１００ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ０．０２３〜０．３６０ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ５０〜２００ＬＵ／小麦粉１００ｋｇの量で存在することを可能にする。
【００１７】
したがって、さらなる側面において、本発明は、ベーカリー用途におけるここで開示される組成物の使用に関する。
【００１８】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、パン改良剤において用いられる。
【００１９】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、ソフトなベーカリー製品および皮の硬い（crusty）ベーカリー製品、好ましくは、パン、ソフトロール、ドーナツ、バンズ、電子レンジ加熱可能なバンズ、デニッシュペストリー、クロワッサン、ハンバーガーロール、ピザおよびピタパン、ならびにケーキにおいて用いられる。
【００２０】
したがって、さらなる側面において、本発明は、ここで開示される組成物を含むパン改良剤に関する。
【００２１】
したがって、さらなる側面において、本発明は、ベークド製品を調製する方法であって、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃より高い温度、好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである第２の酵素と、
を生地またはバッターに焼成前に添加する工程を含む、方法に関する。
【００２２】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記ベークド製品が改良されたショートバイトを示し、好ましくは、そこで、７０℃より高い温度、好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである少なくとも１種の第１の酵素を用いて、およびリパーゼである少なくとも１種の第２の酵素を用いて調製したベークド製品を破壊するのに必要な最大力が、前記第１または第２の酵素をいずれも使用せずに調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも１５％低下することを可能にする。
【００２３】
したがって、特定の態様において、ここで開示される組成物は、好ましくは、調製したベークド製品を破壊するのに必要な最大力が、前記第１または第２の酵素をいずれも使用せずに調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも１５％低下する、改良されたショートバイトを有するベークド製品の調製で用いられる。
【００２４】
特定の態様において、ここで開示される方法は、生地レオロジー、クラム構造および得られるベーカリー製品の量に悪影響が認められないことを可能にする。
【００２５】
したがって、さらなる側面において、本発明は、ここで開示される組成物を含む生地またはバッターから調製されるベークド製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】テクスチャ分析器を用いたショートバイトの評価の様々な側面を示す図である。図１Ａは、ピザテンシルリグ（ピンを有する２つのプローブ）を備えたテクスチャ分析器を示す写真である。
【図１Ｂ】テクスチャ分析器を用いたショートバイトの評価の様々な側面を示す図である。図１Ｂは実際の測定セットアップを示す写真である。図１Ｂにおいて、バンズはピザテンシルリグに取り付けられ、上部プローブはバンズが破壊されるまで一定の速度で上昇させられる。
【図１Ｃ】テクスチャ分析器を用いたショートバイトの評価の様々な側面を示す図である。図１Ｃは測定の代表的なグラフを示す写真である。図１Ｃにおいて、グラム（ｇ）で表される必要な力は時間（秒）の関数で測定される。
【詳細な説明】
【００２７】
本発明の製品、組成物、使用および方法を説明する前に、このような製品、組成物、使用および方法ならびに組み合わせが当然ながら変化し得るため、本発明が、記載の特定の製品、組成物、使用および方法または組み合わせに限定されないことを理解されるべきである。本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、ここで使用する専門用語は、限定的であると意図されるものではないことも理解されるべきである。
【００２８】
ここで使用する単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確な指示のない限り、単数と複数の両方の指示対象を含む。
【００２９】
ここで使用する用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的であるか、または制限がなく、追加の列挙されていない部材、要素または方法工程を排除しない。ここで使用する用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」を含むことが理解される。
【００３０】
端点による数値範囲の列挙は、各範囲内に包含されるすべての数および分数、ならびに列挙された端点を含む。
【００３１】
ここで使用する用語「約（ａｂｏｕｔまたはａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、時間幅などを指す場合、特定の値のまたはその値から±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、更により好ましくは±０．１％以下の変動が、開示される発明を実施するのに適当である限り、このような変動を包含することを意味する。修飾語「約（ａｂｏｕｔまたはａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が言及する値は、それ自体具体的におよび好ましく開示されると理解されるべきである。
【００３２】
「１種以上」または「少なくとも１種」、例えば、部材群の１種以上または少なくとも１種の部材は、さらなる例示によってそれ自体明確であり、該用語は、とりわけ、前記部材のいずれか１種、または前記部材のいずれか２種以上、例えば、前記部材の任意の３以上、４以上、５以上、６以上または７以上など、および前記部材のすべてまでの言及を包含する。
【００３３】
本明細書で引用されるすべての参照は、その全体が参照によりここに援用される。特に、ここで具体的に参照されるすべての参照の教示は、参照により援用される。
【００３４】
別段の定義のない限り、技術および化学用語を含む、本発明を開示するのに使用するすべての用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味を有する。さらなる指針により、本発明の教示を良好に理解するために、用語の定義が含まれる。
【００３５】
以下の節において、本発明の異なる側面を、より詳細に定義する。このように定義される各側面は、相反することが明示されない限り、任意の他の側面または複数の側面と組み合わせられてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であるとして示された任意の他の特徴または複数の特徴と組み合わせられてもよい。
【００３６】
本明細書全体で「一つの態様（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「一態様（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」についての参照は、態様に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも一つの態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所での語句「一つの態様において」または「一態様において」の出現は、必ずしもすべてが同じ態様を指すわけではないが、同じものを指していてもよい。更に、１つ以上の態様において、特定の特徴、構造または特性は、本開示から当業者に明らかになるであろう、任意の好適な様式で組み合わせられてもよい。更に、当業者により理解されるように、ここで記載されるいくつかの態様が、他の態様に含まれる特徴のいくつかを含むが含まないものもあり、異なる態様の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内であり、異なる態様を形成することを意図している。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される態様のいずれも任意の組み合わせで用いられ得る。
【００３７】
本発明者らは、驚くべきことに、酵素の新しい組み合わせ、特に好熱性セリンプロテアーゼとリパーゼとの組み合わせを使用することにより、単独で使用した場合の酵素の効果の相加に対して予想されるショートバイトの改良と比較して、はるかに顕著なショートバイトの改良を得ることが可能であることを見出した。
【００３８】
噛み応えおよび／または硬さと逆のものとして示される場合もあるショートバイトは、ベーカリー製品試料を破壊するのに必要な力、および／またはベーカリー製品試料を飲み込むことができる稠度までそれを噛み砕くのに必要な咀嚼回数を示すために用いられる。ショートバイトは、訓練を受けた味覚パネリストにより容易に測定でき、任意のショートバイトスケールを用いて合理的に定量化できる。このような技術は、食品産業で周知であり、一般に官能検査と称される。このような方法において、初期訓練期間は、試験される範囲の製品をパネリストに習熟させるように構成されている。この期間に、参照基準が提供されて、パネリストは測定されるべき製品特性間での違いを認識するように訓練される。第２の工程において、パネリストは、ショートバイトについて０〜１０のスケールで採点する必要があるいくつかの製品を受け取る。ショートバイトは、テクスチャ分析器を用いて評価されてもよい。このような方法では、バンズをピザテンシルリグに取り付ける（ピンを有する２つのプローブ（図１Ａ参照））。上部プローブを一定の速度で上昇させ、このようにしてバンズを破壊する（図１Ｂ参照）。グラム（ｇ）で表される必要な力を、テクスチャ分析器で測定する。この方法全体で、必要な力は、バンズが破壊されるまで増大し、その後、力は低下する。この測定の代表的なグラフが図１Ｃに示されている。測定された最大力（Ｆｍａｘ）は、ショートバイトを評価するための共通のパラメータである。
【００３９】
本発明者らは、驚くべきことに、十分な量の好熱性セリンプロテアーゼと十分な量のリパーゼとを生地に焼成前に同時に使用することで、ベークド製品のショートバイトの改良に対して予想外の相乗効果が示されることを見出した。
【００４０】
実際に、２種類の酵素の組み合わせにより得られるショートバイトは、個々に得られる酵素の効果の合計より大きい。ｙ量のリパーゼと組み合わせたｘ量の好熱性セリンプロテアーゼにより得られる効果は、ｘ量の好熱性セリンプロテアーゼにより得られる効果とｙ量のリパーゼにより得られる効果との合計より大きい場合、相乗効果が存在する。
【００４１】
したがって、第１の側面において、本発明は、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、好熱性セリンプロテアーゼである第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである第２の酵素と
を含む、組成物に関する。
【００４２】
特定の態様において、前記第１の酵素は、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである。
【００４３】
ここで称される好熱性セリンプロテアーゼが、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する場合、ここで称される相乗効果が特に存在することが更に判明した。
【００４４】
ここで使用する用語「プロテアーゼ」は、好ましくは酵素エントリーＥＣ３．４により定義されるポリペプチド鎖においてアミノ酸を一緒に連結するペプチド結合を加水分解する酵素（ペプチダーゼまたはプロテアーゼとも称される）を一般に指す。これらは、触媒残基によりいくつかのクラスに分類される。これらのクラスの中でも、セリンプロテアーゼ（またはセリンエンドペプチダーゼ）は、セリンが活性部位で求核アミノ酸として働く、タンパク質のペプチド結合を切断するプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、酵素エントリーＥＣ３．４．２１により定義される。セリンプロテアーゼは、トリプシン様、キモトリプシン様、トロンビン様、エラスターゼ様またはサブチリシン様として、それらの基質特異性に従って更に下位分類されてもよい。
【００４５】
本発明の文脈において、プロテアーゼ活性は、基質としてアズリン架橋カゼイン（ＡＺＣＬ−カゼイン）を用いて測定される。プロテアーゼによる加水分解は、水溶性の染色されたフラグメントを生成し、これらの放出速度（例えば、５９０ｎｍでの吸光度の増加）は酵素活性に直接関連し得る（Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠、Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）。プロテアーゼ活性測定についてのさらなる詳細は実施例に示されている。プロテアーゼ活性は、当業者に公知のプロテアーゼ活性についての他のアッセイでも測定できる。これらの中には、基質としてカゼインを使用し、続いて放出されたアミノ酸をＦｏｌｉｎ＆Ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬で検出する比色法がある。
【００４６】
ここで使用する用語「好熱性」および特に「好熱性プロテアーゼ」は、高温で活性なプロテアーゼを指す。特に、好熱性プロテアーゼは、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する。
【００４７】
ここで使用する用語「リパーゼ」は、酵素エントリーＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼまたはトリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼを一般に指す。リパーゼは、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒して、遊離脂肪酸、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロールおよびグリセロールを生成する酵素としてここで定義される。組成物で用いられるリパーゼは、酵素副活性、例えば、ホスホリパーゼ活性などを含んでいてもよい。
【００４８】
本発明の文脈において、リパーゼ活性は、基質としてパルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を用いて、ここで記載される方法に従って測定される。酵素活性は、当業者に公知のリパーゼ活性についての他のアッセイでも測定できる（参照のため、例えば、Ｓｔｏｙｔｃｈｅｖａ  Ｍ．ら、２０１２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８巻、４００頁参照）。
【００４９】
特に、リパーゼ活性は、基質としてパルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を用いて測定される。リパーゼによるパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解による黄色のｐ−ニトロフェノールの放出は、４１４ｎｍで分光光度法により測定される。１リパーゼミリ単位（ＬｍＵ）は、４５℃およびｐＨ７．５でパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルから１分あたり１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）のｐ−ニトロフェノールを放出するのに必要な酵素量として定義される。リパーゼ活性測定についてのさらなる詳細は実施例に示されている。酵素活性は、当業者に公知のリパーゼ活性についての他のアッセイでも測定できる（参照のため、例えば、Ｓｔｏｙｔｃｈｅｖａ  Ｍ．ら、２０１２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８巻、４００頁参照）。
【００５０】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、好熱性セリンプロテアーゼであり、そこで最適温度でのプロテアーゼ活性と２５℃でのプロテアーゼ活性との比が１０より大きく、好ましくは１５より大きいことを可能にする。前記比が１０より大きいことを可能にすることによって、ここで使用する好熱性セリンプロテアーゼは、ショートバイトに対する改良効果が得られることを可能にする。
【００５１】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、天然に存在する真核または原核生物からの抽出により、合成によりまたは遺伝子工学により得られることを可能にする。特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が中性またはアルカリ性の好熱性セリンプロテアーゼであることを可能にする。真菌プロテアーゼは、高温に敏感であり、細菌中性およびアルカリ性のプロテアーゼは、より高い熱処理に耐性を持つ。
【００５２】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が、好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＴａｑプロテアーゼ、好ましくはアクアリシンＩまたはアクアリシンＩＩ、より好ましくはアクアリシンＩ、更により好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＬＭＧ８９２４から単離されたアクアリシンＩであることを可能にする。
【００５３】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、１００〜１２００単位／小麦粉１００ｋｇ、好ましくは２００〜９００単位／小麦粉１００ｋｇ、より好ましくは３５０〜７００単位／小麦粉１００ｋｇの量で存在することを可能にする。アクアリシンＩは、１００〜１２００単位／小麦粉１００ｋｇ、好ましくは２００〜９００単位／小麦粉１００ｋｇ、より好ましくは３５０〜７００単位／小麦粉１００ｋｇで生地／バッターに有利には添加され、酵素活性は、ここで記載される方法を用いて得られる。
【００５４】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）から得られるリパーゼから好ましくは選択される、酵素エントリーＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼまたはトリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼであることを可能にする。
【００５５】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ５〜１００ＬＵ、好ましくは１５〜７５ＬＵ、より好ましくは２０〜６０ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ０．０２３〜０．３６０ＬＵ、好ましくは０．０９〜０．１８ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ５０〜２００ＬＵ、好ましくは９０〜１６０ＬＵ、より好ましくは約１３８ＬＵ／小麦粉１００ｋｇの量で存在し、酵素活性は、ここで記載される方法を用いて得られることを可能にする。
【００５６】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素の単位量対前記第２の酵素の単位量の比が、５〜３５（Ｔａｑプロテアーゼおよびサーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼについて）、１９５０〜７８００（Ｔａｑプロテアーゼおよびリゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼについて）および／または２〜８（Ｔａｑプロテアーゼおよびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼについて）の範囲であることを可能にする。
【００５７】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、パン改良剤、パティスリーミックスまたはパティスリープレミックス、好ましくはパン改良剤である。
【００５８】
「パン改良剤」（「生地調整剤」、「生地改良剤」もしくは「改良剤」、または「小麦粉処理剤」とも称される）は、ベークド製品のテクスチャ、量、風味および鮮度を改良し、生地の機械加工性および安定性を改良するために、典型的には生地に焼成中に添加される。典型的には、パン改良剤は、１種以上の酵素（例えば、アミラーゼ、キシラナーゼ、ホスホリパーゼ、オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼおよびラッカーゼなど）、１種以上の酸化剤もしくは還元剤（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、システインなど）、１種以上の乳化剤（例えば、モノグリセリド（またはモノグリセリドとジグリセリドとの混合物）、モノグリセリド誘導体（例えば、コハク酸化、乳酸化またはアセチル化モノグリセリド、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、モノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）、プロピレングリコールモノエステル）、ソルビタン乳化剤（モノステアリン酸ソルビタン）、ポリソルベート、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ポリグリセロールエステル、スクロースエステルおよびレシチンなど）、１種以上の脂質材料（例えば、マーガリン、バター、油、ショートニングなど）、１種以上のビタミン（例えば、パントテン酸およびビタミンＥなど）、１種以上のガム、および／または１種以上の繊維源（例えば、オート麦繊維など）を含むか、またはこれらからなる。パティスリーミックスは、典型的には、水、脂質（油、バター、マーガリン）および卵以外のパティスリー製品レシピの成分すべてを含む。パティスリープレミックスは、典型的には、小麦粉および砂糖の全部または一部が除去されたパティスリーミックスである。
【００５９】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、小麦粉と、少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で好ましくは最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである、前記第１の酵素と、少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである、前記第２の酵素とを含む生地またはバッターである。
【００６０】
特に、前記第２の酵素は、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ５〜１００ＬＵ、好ましくは１５〜７５ＬＵ、より好ましくは２０〜６０ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ０．０２３〜０．３６０ＬＵ、好ましくは０．０９〜０．１８ＬＵ／小麦粉１００ｋｇ、およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ５０〜２００ＬＵ、好ましくは９０〜１６０ＬＵ、より好ましくは約１３８ＬＵ／小麦粉１００ｋｇの量で存在し、酵素活性は、ここで記載される方法を用いて得られる。
【００６１】
さらなる態様において、ここで開示される組成物は、１種以上の酵素（例えば、アミラーゼ、キシラナーゼ、ホスホリパーゼ、オキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼおよびラッカーゼなど）、１種以上の酸化剤もしくは還元剤（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、システインなど）、１種以上の乳化剤（例えば、モノグリセリド（またはモノグリセリドとジグリセリドとの混合物）、モノグリセリド誘導体（例えば、コハク酸化、乳酸化またはアセチル化モノグリセリド、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、モノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）、プロピレングリコールモノエステル）、ソルビタン乳化剤（モノステアリン酸ソルビタン）、ポリソルベート、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ポリグリセロールエステル、スクロースエステルおよびレシチンなど）、１種以上の脂質材料（例えば、マーガリン、バター、油、ショートニングなど）、１種以上のビタミン（例えば、パントテン酸およびビタミンＥなど）、１種以上のガム、および／または１種以上の繊維源（例えば、オート麦繊維など）を更に含んでいてもよい。
【００６２】
さらなる態様において、ここで開示される組成物は、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で好ましくは最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである、前記第１の酵素と、
−  １種以上のモノグリセリドと、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである、前記第２の酵素と
を含む。
【００６３】
ここで使用する用語「モノグリセリド」は、エステル結合を介して脂肪酸に結合した１分子のグリセロールからなるグリセリドのクラスを一般に指す。モノグリセリドは、ベーカリー用途で用いられる多様な乳化剤の１種であり、これらの中には、モノグリセリド（またはモノグリセリドとジグリセリドとの混合物、食品添加物の国際番号システム（ＩＮＳ）によりＥ４７１または米国食品医薬品局により１８４．１５０５と称される）、モノグリセリド誘導体（例えば、コハク酸化、乳酸化またはアセチル化モノグリセリド、モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、モノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）、プロピレングリコールモノエステル）、ソルビタン乳化剤（モノステアリン酸ソルビタン）、ポリソルベート、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ポリグリセロールエステル、スクロースエステルおよびレシチンがある。
【００６４】
更に、さらなる側面において、本発明は、ベーカリー用途におけるここで開示される組成物の使用に関する。本発明の文脈において、ベーカリー用途は、パンとパティスリー製品の両方に関連する用途を指す。特に、前記ベーカリー製品は、ソフトなベーカリー製品および／または皮の硬いベーカリー製品、好ましくは、パン、ソフトロール、ドーナツ、バンズ、電子レンジ加熱可能なバンズ、デニッシュペストリー、クロワッサン、ハンバーガーロール、ピザおよびピタパン、ならびにケーキである。
【００６５】
特定の態様において、パン改良剤、パティスリーミックスまたはパティスリープレミックスにおけるここで開示される組成物の使用が提供される。
【００６６】
したがって、ここで開示されるように十分な量の１種以上の好熱性セリンプロテアーゼおよび十分な量の１種以上のリパーゼを生地に焼成前に添加する工程を含む、ベーカリー製品のショートバイトを改良するための本発明による組成物の使用を提供することが本発明の目的である。
【００６７】
特定の態様において、ここで開示される組成物は、ベークド製品のショートバイトの改良のために用いられる。
【００６８】
さらなる側面において、ベークド製品を調製する方法であって、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、好熱性セリンプロテアーゼである、前記第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである、前記第２の酵素と
を生地またはバッターに焼成前に添加する工程を含む、方法がここで開示される。
【００６９】
特に、前記第１の酵素は、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する、好熱性セリンプロテアーゼである。
【００７０】
本発明の文脈において、プロテアーゼ活性は、基質としてアズリン架橋カゼイン（ＡＺＣＬ−カゼイン）を用いて測定される。プロテアーゼによる加水分解は、水溶性の染色されたフラグメントを生成し、これらの放出速度（例えば、５９０ｎｍでの吸光度の増加）は酵素活性に直接関連し得る（Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠、  Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）。プロテアーゼ活性測定についてのさらなる詳細は実施例に示されている。プロテアーゼ活性は、当業者に公知のプロテアーゼ活性についての他のアッセイでも測定できる。これらの中には、基質としてカゼインを使用し、続いて放出されたアミノ酸をＦｏｌｉｎ＆Ｃｉｏｃａｌｔｅｕフェノール試薬で検出する比色法がある。
【００７１】
本発明の文脈において、リパーゼ活性は、基質としてパルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を使用して、ここで記載される方法に従って測定される。酵素活性は、当業者に公知のリパーゼ活性についての他のアッセイでも測定できる（参照のため、例えば、Ｓｔｏｙｔｃｈｅｖａ  Ｍ．ら、２０１２、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第８巻、４００頁参照）。
【００７２】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記第１の酵素が、好熱性セリンプロテアーゼであり、そこで最適温度でのプロテアーゼ活性と２５℃でのプロテアーゼ活性との比が１０より大きく、好ましくは１５より大きいことを可能にする。前記比が１０より大きいことを可能にすることによって、ここで使用する好熱性セリンプロテアーゼは、ショートバイトに対する改良効果が得られることを可能にする。
【００７３】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記第１の酵素が、天然に存在する真核または原核生物からの抽出により、合成によりまたは遺伝子工学により得られることを可能にする。特定の態様において、ここで開示される組成物は、前記第１の酵素が中性またはアルカリ性の好熱性セリンプロテアーゼであることを可能にする。
【００７４】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記第１の酵素が、好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離されたＴａｑプロテアーゼ、好ましくはアクアリシンＩまたはアクアリシンＩＩ、より好ましくはアクアリシンＩ、更により好ましくはサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＬＭＧ８９２４から単離されたアクアリシンＩであることを可能にする。
【００７５】
特定の態様において、ここで開示される方法において、前記第１の酵素、好ましくは、アクアリシンＩは、１００〜１２００単位／小麦粉１００ｋｇ、好ましくは２００〜９００単位／小麦粉１００ｋｇ、より好ましくは３５０〜７００単位／小麦粉１００ｋｇの量で生地またはバッターに添加される。アクアリシンＩは、１００〜１２００単位／小麦粉１００ｋｇ、好ましくは２００〜９００単位／小麦粉１００ｋｇ、より好ましくは３５０〜７００単位／小麦粉１００ｋｇで生地／バッターに有利には添加され、酵素活性は、ここで記載される方法を用いて得られる。
【００７６】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）から得られるリパーゼから好ましくは選択される、酵素エントリーＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼまたはトリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼであることを可能にする。
【００７７】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記第２の酵素が、サーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ５〜１００Ｕ、好ましくは１５〜７５Ｕ、より好ましくは２０〜６０Ｕ／小麦粉１００ｋｇ、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ０．０２３〜０．３６０Ｕ、好ましくは０．０９〜０．１８Ｕ／小麦粉１００ｋｇ、およびリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼ５０〜２００Ｕ、好ましくは９０〜１６０Ｕ、より好ましくは約１３８Ｕ／小麦粉１００ｋｇの量で生地またはバッターに添加され、酵素活性は、ここで記載される方法を用いて得られることを可能にする。
【００７８】
ここで開示される方法の特定の態様において、適量の酵素が、生地またはバッターにその調製中または成分の混合前に直接添加されてもよい。他の態様において、酵素は、（パン）改良剤、パティスリーミックスまたはプレミックスの一部として、好ましくはパン改良剤の一部として添加されてもよい。特に、酵素またはパン改良剤は、発酵前に添加される。
【００７９】
特定の態様において、ベークド製品を調製する方法であって、
−  少なくとも１種の第１の酵素であって、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、より好ましくは８０℃より高い温度で好ましくは最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである、前記第１の酵素と、
−  少なくとも１種の第２の酵素であって、リパーゼである、前記第２の酵素と、
−  １種以上のモノグリセリドと
を生地またはバッターに焼成前に添加する工程を含む、方法がここで開示される。
【００８０】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記ベークド製品が、改良されたショートバイトを示し、好ましくはそこで、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである少なくとも１種の第１の酵素を用いて、およびリパーゼである少なくとも１種の第２の酵素を用いて調製したベークド製品を破壊するのに必要な最大力が、前記第１または第２の酵素をいずれも使用せずに調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも１５％低下することを可能にする。特定の態様において、前記第１および第２の酵素を用いてベークド製品を破壊するのに必要な最大力は、前記第１または第２の酵素をいずれも使用せずに調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも２０％低下する。特定の態様において、ショートバイトは、焼成の翌日に測定される。
【００８１】
特定の態様において、ここで開示される方法は、前記ベークド製品が、改良されたショートバイトを示し、好ましくはそこで、７０℃より高い温度、好ましくは７５℃より高い温度、好ましくは８０℃より高い温度で最適活性を有する好熱性セリンプロテアーゼである少なくとも１種の第１の酵素を用いて、およびリパーゼである少なくとも１種の第２の酵素を用いて調製したベークド製品を破壊するのに必要な最大力が、前記第１または前記第２の酵素のいずれかを用いて調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも１５％低下することを可能にする。特定の態様において、前記第１および第２の酵素を用いてベークド製品を破壊するのに必要な最大力は、前記第１または前記第２の酵素のいずれかを用いて調製した参照ベークド製品と比較して少なくとも２０％低下する。これは、前記第１と前記第２の酵素の組み合わせにより、予想以上に改良されたショートバイトをもたらす相乗効果が得られることを示している。特定の態様において、ショートバイトは、焼成の翌日に測定される。特定の態様において、ここで開示される方法は、生地レオロジー、クラム構造および得られるベーカリー製品の量に悪影響が認められないことを可能にする。
【００８２】
更に、さらなる側面において、本発明は、ここで開示される組成物を含む生地またはバッターから調製されるベークド製品に関する。
【００８３】
本発明の文脈において、ベークド製品は、当技術分野で公知のベーカリーまたはパティスリー製品、例えば、パン、ソフトロール、ベーグル、ドーナツ、デニッシュペストリー、ハンバーガーロール、ピザ、ピタパン、チャパタ、スポンジケーキ、クリームケーキ、パウンドケーキ、マフィン、カップケーキ、蒸しケーキ、ワッフル、ブラウニー、ケーキドーナツ、イースト発酵ドーナツ、バケット、ロール、クラッカー、ビスケット、クッキー、パイ皮、ラスクおよび他のベークド製品からなる群から選択されるものなどである。より好ましくは、本発明は、パン、バケットおよびロールについて言及する。特に、前記ベークド製品は、ソフトなベーカリー製品および皮の硬いベーカリー製品、好ましくは、パン、ソフトロール、ドーナツ、バンズ、電子レンジ加熱可能なバンズ、デニッシュペストリー、クロワッサン、ハンバーガーロール、ピザおよびピタパン、ならびにケーキである。
【００８４】
［実施例］
例１
酵素活性の測定
プロテアーゼ活性を、アズリン架橋カゼイン（ＡＺＣＬ−カゼイン）上で測定する。カゼインを染色および架橋し、水中で水和するが水不溶性である材料を生成することにより調製する。プロテアーゼによる加水分解は、水溶性の染色されたフラグメントを生成し、これらの放出速度（５９０ｎｍでの吸光度の増加）は酵素活性に直接関連し得る（Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠、Ｍｅｇａｚｙｍｅ、アイルランド）。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ錠を、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ中でｐＨ７．０で６０℃にて５分間インキュベートする。一定分量の酵素（１．０ｍｌ）を添加し、反応を正確に１０分間続ける。リン酸三ナトリウムの添加（１０ｍｌ、２％ｗ／ｖ、ｐＨ１２．３）により反応を終了する。管を室温で約２分間放置し、内容物をろ過する。ろ過の吸光度を、基質ブランクに対して５９０ｎｍで測定する。
【００８５】
活性は、
ｍＵ（ミリ単位）／ｍｌ＝（３４．２＊（Ａｂｓ５９０酵素−Ａｂｓ５９０ブランク）＋０．６／希釈剤
で表される。１単位は１０００ｍＵに相当する。
【００８６】
リパーゼ活性を、基質としてパルミチン酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰＰ）を用いて測定する。リパーゼによるパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解による黄色のｐ−ニトロフェノールの放出は、４１４ｎｍで分光光度法により測定される。１リパーゼミリ単位（ＬｍＵ）は、４５℃およびｐＨ７．５でパルミチン酸ｐ−ニトロフェニルから１分あたり１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）のｐ−ニトロフェノールを放出するのに必要な酵素量として定義される。１２０μｌの１ｍＭのｐＮＰＰ溶液（０．６９Ｍのアセトンおよび０．００４９ＭのトリトンＸ−１００を含有するｐＨ７．５での０．０５ＭのＮａ−リン酸緩衝液）を６０μｌの酵素試料と混合し、４５℃で３０分間インキュベートして、試験を行う。
【００８７】
吸光度を、９６−ウェルマイクロタイターマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）で基質ブランクに対して４１４ｎｍで測定する。
【００８８】
活性を
ＬｍＵ／ｍｌ＝（（（Ａｂｓ酵素−Ａｂｓブランク）／３０）×０．１８））／（１３３８０×０．０６））×試料希釈剤×１００００００
［３０＝分での反応時間；０．１８＝ｍｌでの反応量；１３３８０＝４１４ｎｍでのモル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）；０．０６＝ｍｌでの酵素試料量；１００００００、ＬｍＵ／ｍｌに変換］
で表す。１リパーゼ単位（ＬＵ）は１０００リパーゼミリ単位（ＬｍＵ）に相当する。
【００８９】
例２
ソフトバンズ
ソフトバンズを、表１の生地組成物を用いて調製した。使用した酵素は以下のものであった：
−  ＴｌＬｉｐ：アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）で表現されるサーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（Ｎｏｏｐａｚｙｍｅ−Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）
−  ＴａＰｒｏｔ：ＷＯ２００９１３８４４７Ａ１に記載のサーマス・アクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）Ｔａｑ１プロテアーゼ（アクアリシンＩ）。酵素は、８０℃の最適温度活性を有する。
【００９０】
【表１】
2019520835.tif 000002
【００９１】
成分をスパイラルミキサーＤｉｏｓｎａタイプ（ＳＰ２４）中で低速で２分および高速で６分混合する。最終生地温度は２７℃である。５分間バルク発酵させた後、生地１５００ｇを丸め、ベーカリー温度（２５℃）および湿度（５０〜５５％）で１０分間発酵させる。Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ成形機（ｍｏｕｌｄｅｒ）を用いて５０ｇの生地片にする。これらの生地片を、Ｋｏｍａ発酵器内で３５℃で９５％の相対湿度で８５分間発酵させる。次いで、バンズを、Ｍｉｗｅ  Ｃｏｎｄｏデッキオーブン内でスチームなしで２５０℃にて９分間焼成する。当業者には、同じ最終結果が、他の業者の装置を用いて得ることができることが明らかである。
【００９２】
バンズのショートバイトを、２０ｍｍ／秒の速度で用いられるピザテンシルリグを備えたＴＡ−ＸＴ２（商標）テクスチャ分析器で、焼成の翌日に評価した。これは、力（グラム（ｇ）で表されるバンズを破壊するのに必要な最大力）の測定を可能にする。因子、例えば、小麦粉のバッチ、周囲温度および湿度、ならびに焼成から試験までの時間は、前記パラメータに影響を与える可能性があるため、測定は、並行して焼成し試験した同じ成分を使用した参照と比較される。各試験で１０個のバンズを評価した。測定値の標準偏差は３３であった。信頼区間を、５％のα−リスク値および５と等しい自由度の数を用いて得られるスチューデントの法則の係数（Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ  ｌａｗ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）で標準偏差を乗じることにより計算した。信頼区間は８５であった。
【００９３】
９５％の信頼区間を考慮して、２つの成分の同時使用の効果が、個々に得られた成分の効果の合計より大きい場合、２つの成分は相乗的に作用する。言い換えれば、（ｘｇの酵素Ａ＋ｙｇの酵素Ｂ）の効果が、ｘｇの酵素Ａの効果とｙｇの酵素Ｂの効果との合計より大きい場合、相乗効果が存在する。
【００９４】
ＴＡ−ＸＴ２（商標）テクスチャ分析器でのショートバイト測定結果を表２に列挙する。
【００９５】
【表２】
2019520835.tif 000003
【００９６】
結果は、酵素を組み合わせた場合に得られる力の実際の低下が、信頼区間の理論値の下限よりも低いことを示し（相加効果）、ショートバイトに対する相乗効果を示している。
【００９７】
また、バンズのショートバイトを、訓練されたベーカリー専門家パネリストにより、焼成の翌日に評価した。彼らは、０を最低（噛み応えがある）および１０を最高（サクサクしている（short））とする０〜１０点のラインスケールで参照に従って製品にマークを付けることが求められた。
【００９８】
知覚的ショートバイト測定値の標準偏差は、０．３である。信頼区間を、５％のα−リスク値および５と等しい自由度の数を用いるスチューデントの法則の係数で標準偏差を乗じることにより計算した。信頼区間は０．５であった。
【００９９】
結果を表３に列挙する。
【０１００】
【表３】
2019520835.tif 000004
【０１０１】
結果は、酵素を組み合わせた場合に得られるショートバイトの実際の増加が、信頼区間の理論値の上限より高いことを示し（相加効果）、ショートバイトに対する相乗効果を示している。
【０１０２】
例３ａ
他のリパーゼ（１）
ソフトバンズを、表４に列挙した酵素の組み合わせを用いて例２のレシピおよび方法に従って調製した。使用した酵素は以下の通りであった：
−  ＲｍＬｉｐ：アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）で表現されるリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（Ｐａｌａｔａｓｅ  ２０００Ｌ−Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）
−  ＴａＰｒｏｔ：例１と同様。
【０１０３】
【表４】
2019520835.tif 000005
【０１０４】
バンズのショートバイトを例１と同様の方法で評価した。テクスチャ分析の標準偏差および信頼区間は各々３８および９７と等しい。知覚分析の標準偏差および信頼区間は各々０．２および０．５と等しい。
【０１０５】
結果を表５（テクスチャ分析）および表６（知覚分析）に示す。
【０１０６】
【表５】
2019520835.tif 000006
【０１０７】
【表６】
2019520835.tif 000007
【０１０８】
例３ｂ
他のリパーゼ（２）
ソフトバンズを、表７に列挙した酵素の組み合わせを用いて例１のレシピおよび方法に従って調製した。使用した酵素は以下の通りであった：
−  ＲｏＬｉｐ：リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ（Ｂａｋｅｚｙｍｅ  Ｌ８００００Ｂ−ＤＳＭ）
−  例１と同様のＴａＰｒｏｔ。
【０１０９】
【表７】
2019520835.tif 000008
【０１１０】
バンズのショートバイトを例１と同様の方法で評価した。結果を表８に示す。
【０１１１】
【表８】
2019520835.tif 000009
【０１１２】
相乗効果が第３のリパーゼで認められる。
【０１１３】
例４
他のプロテアーゼ
ソフトバンズを、表９および１０に列挙した酵素の組み合わせを用いて例１のレシピおよび方法に従って調製した。使用した酵素は以下の通りであった：
−  ＴｌＬｉｐ：アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｏｒｙｚａｅ）で表現されるサーモマイセス・ラヌギノソス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（Ｎｏｏｐａｚｙｍｅ−Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）
−  ＳｕＰｒｏｔ：バシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のセリンプロテアーゼ（サブチリシン−Ｐ５３８０−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。酵素は、６０℃の最適温度活性を有する。
−  ＴｈＰｒｏｔ：ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のメタロプロテアーゼ（サーモリシン−Ｐ１５１２−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）
【０１１４】
【表９】
2019520835.tif 000010
【０１１５】
【表１０】
2019520835.tif 000011
【０１１６】
バンズのショートバイトを例１のテクスチャ分析法で評価した。結果を表１１および１２に示す。
【０１１７】
【表１１】
2019520835.tif 000012
【０１１８】
【表１２】
2019520835.tif 000013
【０１１９】
相乗効果は、６５℃の最適温度活性を有するプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼで認められない。
【図１Ａ】
2019520835.tif 000014
【図１Ｂ】
2019520835.tif 000015
【図１Ｃ】
2019520835.tif 000016
【国際調査報告】
2019520835.tif 000017
2019520835.tif 000018