(57)【要約】  本発明は、新規なエピトープであって、タグを含む目的のポリペプチドの迅速かつ効果的な特徴付け、精製、及び細胞内局在のための方法に使用するためのタグとして使用することができる、エピトープに関する。前記タグは、エピトープ特異的抗体によって特異的に認識され、前記エピトープ特異的抗体は、本発明のエピトープでタグ付けされている目的のポリペプチドを検出、捕捉、定量化、及び／又は精製するために使用され得る。
2019504637.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
8〜25個のアミノ酸を有する単離されたエピトープペプチドであって、前記アミノ酸の配列が、配列番号1に定義された配列（RX4X5AX7SX9W）を含み、ここで、
X4は、K又は置換とすることができ；
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ；
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ、並びに
X9は、H又はHの保存的置換とすることができ、
ここで、前記単離されたエピトープペプチドが、少なくとも9個のアミノ酸を含む場合、配列番号3により定義されたアミノ酸配列（RKAAVSHW）を含まない、単離されたエピトープペプチド。
【請求項２】
12〜25個のアミノ酸を有する、請求項１に記載の単離されたエピトープペプチドであって、前記アミノ酸の配列が、配列番号32により定義された配列（X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12）を含み、ここで、
X1は、P又はAとすることができ、
X2は、D又はDの保存的置換とすることができ；
X11及びX12は、Q又はQの保存的置換とすることができる、
単離されたエピトープペプチド。
【請求項３】
配列番号3により定義されたアミノ酸配列（RKAAVSHW）を有するか；又は
配列番号5により定義されたアミノ酸配列（PVRSAALSQWSS）を有するか、又は
配列番号33により定義されたアミノ酸配列（PDRVRAVSHWSS）を有するか、又は
配列番号34により定義されたアミノ酸配列（ADRVRAVSHWSS）を有する、
請求項１に記載の単離されたエピトープペプチド。
【請求項４】
N末端又はC末端エピトープタグとしてのエピトープペプチドの使用であって、前記エピトープペプチドが、8〜25個のアミノ酸を有し、かつ、前記アミノ酸の配列が、配列番号1により定義された配列（RX4X5AX7SX9W）を含み、ここで、
X4は、K又は置換とすることができ；
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ；
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ、並びに
X9は、H又はHの保存的置換とすることができる、使用。
【請求項５】
ポリペプチド及びそのN末端又はC末端にある少なくとも１つのエピトープペプチドからなるコンストラクトであって、前記エピトープペプチドが、8〜25個のアミノ酸を有し、かつ、前記アミノ酸の配列が、配列番号1により定義された配列（RX4X5AX7SX9W）を含み、ここで、
X4は、K又は置換とすることができ；
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ；
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ、並びに
X9は、H又はHの保存的置換とすることができる、コンストラクト。
【請求項６】
前記エピトープペプチドが、12〜25個のアミノ酸を有し、前記アミノ酸の配列が、配列番号32により定義された配列（X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12）を含み、ここで、
X1は、P又はAとすることができ、
X2は、D又はDの保存的置換とすることができ；
X11及びX12は、Q又はQの保存的置換とすることができるか；あるいは
前記エピトープペプチドが、配列番号3により定義されたアミノ酸配列（RKAAVSHW）；又は配列番号5により定義されたアミノ酸配列（PVRSAALSQWSS）、又は配列番号33により定義されたアミノ酸配列（PDRVRAVSHWSS）、又は配列番号34により定義されたアミノ酸配列（ADRVRAVSHWSS）を有する、
請求項４に記載の使用又は請求項５に記載のコンストラクト。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に定義された単離されたエピトープペプチドをコードする核酸であって；任意により、RNA、DNA、PNA、又はLNAである、核酸。
【請求項８】
少なくとも１つの請求項７に記載の核酸、並びに任意により目的のポリペプチド及び／又は少なくとも１つのリンカーをコードする核酸、を含む核酸発現コンストラクト。
【請求項９】
リンカーをさらに含む、請求項８に記載の核酸発現コンストラクトであって、前記リンカーが任意により、請求項７に記載の核酸に隣接して位置する切断部位又は酵素によって認識される部位をコードする核酸配列を含み、ここで、任意により前記切断部位がプロテアーゼ酵素によって認識される、核酸発現コンストラクト。
【請求項１０】
請求項７に定義された核酸、あるいは請求項８又は９のいずれか一項に定義された核酸発現コンストラクトを含む宿主細胞であって；任意により、以下、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、線虫細胞、鳥類細胞、魚細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞、を含む群から選択される、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項７に定義された核酸、あるいは請求項８又は９のいずれか一項に定義された核酸発現コンストラクトを、宿主細胞に導入するための方法であって、前記核酸が、宿主細胞において目的のポリペプチドをコードする核酸と融合され、以下、CRISPR/Casゲノム編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いたゲノム編集方法、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、又はメガヌクレアーゼ、陽イオン性脂質、リン酸カルシウム、若しくはDEAE-デキストランなどの試薬を用いる試薬ベースの方法、形質導入、トランスフェクション、並びに、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びレーザーフェクション（laserfection）などの機器ベースの方法を含む群から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれか一項に定義されたエピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの存在、細胞内局在及び／又は量を決定するイン・ビトロの方法であって、以下のステップ：
a）エピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドを、試料に、請求項１０に定義された宿主細胞に、又は請求項１０に定義された宿主細胞の細胞溶解物に投与し、ここで任意により、前記親和性リガンドは検出可能部分を含み；
b）任意により、ステップa）の親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築された複合体に結合することができる少なくとも二次結合パートナーを投与し、ここで、前記二次結合パートナーは、検出可能部分及び／又は固定化された部分若しくは固定化可能部分を含み；
c）前記検出可能部分を検出することによって、エピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの存在、細胞内局在及び／又は量を決定すること、
を含む、方法。
【請求項１３】
前記検出可能部分が蛍光標識であって、決定が蛍光レベルを測定することによって行われるか；あるいは、
エピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの存在及び／又は量の決定がウェスタンブロットによって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項５に定義されたコンストラクト、又は請求項１から６のいずれか一項に定義されたエピトープペプチドを含む目的のポリペプチドの精製方法であって、以下のステップ、
a）コンストラクト又は目的のポリペプチドを含む試料を、エピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドと接触させ、ここで、任意により結合の前又は後に、前記親和性リガンドが固体支持体に付着され；
b）任意により、ステップa）の後に得られた試料を、ステップa）の親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築された複合体に結合することができる二次結合パートナーと接触させ、ここで、結合前又は後の前記二次結合パートナーが固体支持体に付着され；
c）ステップa）又はb）の固体支持体を洗浄して、未結合及び非特異的結合成分を除去し；並びに任意により 
d）コンストラクト又は目的のポリペプチドを溶出させること、
を含む、方法。
【請求項１５】
ステップa）の試料が、請求項８又は９に定義された核酸コンストラクトを含む請求項１０に定義された宿主細胞の溶解物である、請求項１４に記載の方法であって、さらに、請求項１４のステップd）に続いて又はステップd）に代えてステップe）を含み、ステップe）では、エピトープペプチドがプロテアーゼによる切断によって目的のポリペプチドから除去される、方法。
【請求項１６】
前記親和性リガンドが抗体であり、ここで、前記抗体がナノボディ、好ましくはBC2-Nbであり、ここで、前記ナノボディが、フレームワーク領域1、CDR1、フレームワーク領域2、CDR2、フレームワーク領域3、CDR3、及びフレームワーク領域4を含むアミノ酸配列を含み、ここで、CDR3が配列番号12に定義されたアミノ酸配列を有しており、かつ、システインがフレームワーク領域2に存在し、前記システインがCDR3に存在するシステインとジスルフィド架橋を形成することができる、１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドを捕捉及び／又は検出するためのキットであって、以下、
a）請求項７に定義された核酸、あるいは請求項８又は９のいずれか一項に定義された核酸発現コンストラクト；
b）請求項１から６のいずれか一項に定義されたエピトープペプチドに特異的に結合する親和性リガンドであって、前記親和性リガンドは任意により検出可能部分を含み、ここで、任意により前記検出可能部分は蛍光標識であり；任意により請求項１６に定義された親和性リガンドである、親和性リガンド；
c）任意により、親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築された複合体に特異的な二次結合パートナーであって、検出可能部分及び／又は固定化された部分若しくは固定化可能部分を含む、二次結合パートナー；並びに
d）請求項１２から１６のいずれか一項に定義された方法に必要な緩衝液及び試薬、
を含む、キット。
【請求項１８】
ポリペプチドを捕捉及び／又は精製するためのキットであって、以下、
a）請求項７に定義された核酸、あるいは請求項８又は９のいずれか一項に定義された核酸発現コンストラクト；
b）請求項１から６のいずれか一項に定義されたエピトープペプチドに特異的に結合する親和性リガンドであって、任意により、固体支持体に付着される、親和性リガンド；
c）任意により、親和性リガンド、タグ付けされたポリペプチド、又はその両方から構築される複合体に特異的な二次結合パートナーであって、固体支持体に付着され又は固定化可能である、二次結合パートナー；並びに
d）任意により、請求項１から６のいずれか一項に定義された単離されたエピトープペプチド；
e）任意により、固体支持体であって、任意により、以下、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、セルロース、デキストラン、合成ポリマー及びコポリマー、ラテックス、シリカ、アガロース、金属、ガラス、及び炭素、を含む群から選択される、固体支持体；並びに
f）請求項１２から１６のいずれか一項に定義された方法に必要な緩衝液及び試薬、
を含む、キット。
【請求項１９】
フレームワーク領域1、CDR1、フレームワーク領域2、CDR2、フレームワーク領域3、CDR3、及びフレームワーク領域4を含むアミノ酸配列を含むナノボディの使用であって、CDR3が配列番号12に定義されたアミノ酸配列を有しており、かつ、システインがフレームワーク領域2に存在し、前記システインがCDR3に存在するシステインとジスルフィド架橋を形成することができる、請求項１から６のいずれか一項に定義された少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドを検出、捕捉、及び／又は精製するための、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物医学研究、生化学及び細胞生物学の分野に関する。新規なエピトープが提示され、これは、タグを含む目的のポリペプチドの迅速かつ効果的な特徴付け、精製、及びイン・ビボ局在における使用のためのタグとして使用することができる。このタグはエピトープ特異的抗体によって特異的に認識され、抗体-タグ相互作用を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
背景
ポストゲノム時代において、プロテオミクスの分野は劇的に成長した。分析からハイコンテントイメージング（high-content imaging）にわたる多数の用途のために、親和性ベースのアッセイが不可欠である。親和性ベースのアッセイは、受容体とリガンドとの間、例えば抗体と抗原との間のタンパク質-タンパク質-相互作用（PPI）の検出に依存している。抗原-抗体-相互作用のモニタリングの場合、アッセイは、免疫親和性アッセイとも呼ばれる。免疫親和性アッセイは、目的のポリペプチドの同一性、量、及び／又は局在を試験するための選択方法である。しかしながら、適切な抗体が利用できない場合がある。免疫親和性ベースのアッセイのこの欠点は、「エピトープタグ付け」と呼ばれる方法によって克服することができ、当該方法では、タンパク質はエピトープ、すなわち抗原タンパク質の結合部分でタグ付けされる。
【０００３】
エピトープタグ付けは、既知のエピトープが遺伝子工学によって組み換えタンパク質に融合される技術である。抗体が利用可能であるエピトープを選択することによって、その技術は抗体が利用できないタンパク質の検出を可能にする。1980年代後半にエピトープタグ付けは、クローニングされた遺伝子のタンパク質産物の迅速かつ効果的な特徴付け、精製、及びイン・ビボ局在を可能にするための標準的な分子遺伝学的方法となった。
【０００４】
プロテオミクスの初期において、最初の市販のタグはもともと、タンパク質精製のために設計された。これら初期のタグの例は、FLAG、6 × HIS及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）系である。6 × HISタグは金属親和性に依存し、GST系はGSTのグルタチオンへの親和性に依存している。FLAGは商業的に使用された最初のエピトープタグの１つである。
【０００５】
その後、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光タンパク質レポーターの発見が、二次試薬を必要としない細胞内でのタンパク質の検出を可能にした。この場合、目的のタンパク質がGFPの全長タンパク質配列でタグ付けされ、タグ付けされた目的のタンパク質を蛍光性にする。
【０００６】
しかしながら、全長タンパク質、例えばGSTマルトース結合タンパク質（MBP）又はGFPを含むタグによる問題は、それらが時には細胞内タンパク質局在又はフォールディングと立体的に干渉するということであり、この問題は分析されるべきタンパク質の本来の機能を損なうか又は無効にし得る。
【０００７】
それゆえ、多数の小ペプチドベースのエピトープタグ、例えばc-myc、V5、HA、CBP又はFLAGが開発されている。このようなタグは、合成起源（FLAG）を有するか、あるいは、ウイルス（HA、V5）又は内在性哺乳動物（c-myc、CBP）タンパク質に由来するかのいずれかである。それらは、8〜26個のアミノ酸残基のサイズを特徴とし、古典的なIgG（ポリクローナル又はモノクローナル）によって検出される。内在性タンパク質に由来するタグによる１つの問題は、タグ特異的抗体が一般に内在性タンパク質にも結合するという事実である。タグと抗体との間の相互作用が特異的でない場合、アッセイは偽陽性を与え得る。抗体のための結合パートナーとしてのタグ付けされたタンパク質と内在性タンパク質との間の競合のために、アッセイはあまり効率的ではないであろう。
【０００８】
多くの免疫親和性捕捉システムが、タグ特異的抗体を用いて利用可能であるが、低い親和性結合、非特異的相互作用、バッチ間変動又は固体表面への共有結合の際の抗体の低減した機能性に起因して、依然として深刻な問題がある。
【０００９】
さらに、既知の免疫親和性検出及び／又は捕捉システムの特異的な問題は、エピトープタグ付けされたタンパク質を検出する脊椎動物の免疫系によって発生した従来の抗体に対するそれらの依存性である。
【発明の概要】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、高い親和性、特異性、及び再現性を特徴とする免疫親和性検出及び／又は捕捉システムを提供することであった。
【００１１】
また、本発明の目的は、特異的に、確実に、再現性よく、かつ高い親和性で、エピトープ特異的抗体と相互作用することができるエピトープタグを提供することであった。本発明のさらなる目的は、例えば細胞イメージング又は直接抗原検出に使用することができる、目的のポリペプチドを確実に、特異的に、かつ効率的に検出するのに適している免疫親和性ベースのアッセイに必要な構成要素を提供することであった。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、確実に、特異的に、かつ効率的に目的のポリペプチドを精製するのに適している免疫親和性ベースのアッセイに必要な構成要素を提供することであった。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、捕捉及び／又は検出のためのシステム、特に、とりわけ顕微鏡及び生化学的研究による複合分析のための異なるタイプの分析に使用することができるシステムを提供することであった。
【００１４】
さらなる目的は、非変性又は変性条件の使用を可能にする組み換えタンパク質のための堅牢な精製方法を提供することであった。
【００１５】
以下の図面を参照して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図1は、BC2-ナノボディ（BC2-Nb）及びBC2-Nb/BC2T複合体の構造解析を示す。（a）は、BC2-Nb/BC2T骨格相互作用を示す。BC2-ペプチド（BC2T）（ピンク色）はβ-鎖に折り畳まれ、β-鎖は、相補性決定領域3（CDR3、青色）及びフレームワーク領域2及び3（灰色）によって形成されたβ-シート構造の一部である。13個の骨格-骨格水素結合（黒い点線）が示され、そのうちの１つが水（赤丸）によって媒介される。CDR3はこれら相互作用の８つに、そしてフレームワーク領域は５つに寄与する。CDR1（淡黄色）及びCDR2（黄色）は結合に関与していない。（b）は、いわゆる「ヘッドロック（Headlock）」相互作用を示す。CDR3（青色）のArg106とFR2におけるGlu44との間の電荷媒介相互作用は、BC2-Nb/BC2T複合体を安定化している。これらアミノ酸側鎖は、ペプチド（ピンク色）に達し、その結合部位にペプチドを固定する塩橋を形成する。（c）は、特異的なBC2-Nb/BC2T相互作用を示す。骨格相互作用に加えて、側鎖によって媒介される少数の相互作用が、BC2Tペプチド配列のための特異性を生じさせる。BC2T残基W10は、Cys50とのCH-π相互作用（点線）に関与している。水分子（赤丸）は、ペプチドアミノ酸S8（ピンク色）、Tyr109、２つのカルボニル基及び１つのアミン基によって結合している。ペプチドに達するArg106（CDR3）とGlu44の側鎖（FR2）との間の電荷媒介相互作用も示されている。
【図２】図2は、BC2T結合特異性を媒介する残基の同定を示す。BC2T位置配列変異体ライブラリーを、セファロース上に固定化されたBC2-Nb（黒色バー）、BC2-NbR106S（薄灰色）、及びBC2-NbR106E（濃灰色）とインキュベートした（n=3）。沈殿後、上清を液体クロマトグラフィー、次いで質量分析に供した。BC2-Nb又は示された変異体の上清、及び非BC2T関連対照Nb（GFP特異的Nb）の上清中のペプチドによって生じたシグナルの比を計算することによって、特異的に沈殿した配列変異体を同定した。（a）BC2TR3X,（b）BC2TA6X,（c）BC2TS8X、及び（d）BC2TW10Xの配列変異体ライブラリーについての結果を示している（全結果については表1を参照）。様々な位置が、BC2T配列におけるXとして示されている。アミノ酸は、その側鎖の物理化学的特性：非極性、極性、及び荷電、に従ってグループ化されている。ガンマ-アミノ酪酸を、ライブラリー合成においてシステインの代わりに使用した。３つの独立した実験の平均及び標準偏差（s.d.；エラーバー）を示している。
【図３】図3は、BC2ナノトラップを用いたBC2タグ付けされたタンパク質の１ステップ精製を示す。（a）免疫沈降のために、GFPをC末端BC2タグと共に（GFPBC2T）又はGFPを単独で発現する細胞溶解物の可溶性タンパク質画分を、アガロース上に固定化されたBC2-Nbと共にインキュベートした（BC2ナノトラップ）。インプット（I）、非結合（NB）及び結合画分（B）をSDS-PAGEにより分離し、クーマシーブルーにより（上）又はイムノブロット分析によって（下）のいずれかで可視化した。（b）BC2ナノトラップは厳しい条件（harsh conditions）下で効率的にそのエピトープに結合する。細菌抽出物に由来するGFPBC2Tを、SDS（0〜2%）、尿素（0〜4 M）又は塩酸グアニジニウム（0〜3 M）の上昇濃度でインキュベートし、（a）に記載したように沈殿させた。示された条件でのインプット（I）及び結合画分を示している。（c）BC2タグ付けされたタンパク質は、アルカリ性pH又はペプチド溶出を用いて効率的に放出される。BC2ナノトラップに結合したGFPBC2Tを、チオシアン酸ナトリウムでの溶出（NaSCN、1〜3 M）、酸性溶出（0.2 M グリシン、pH 1〜2.5）、アルカリ性溶出（pH 10〜12）又はペプチド溶出（0〜1 mM）のいずれかに供した。放出（R）及び結合（B）画分のアリコートを、抗GFP抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。（d）BC2ナノトラップは、BC2タグがN-又はC-末端に位置しているか否かに関わらず、ヒト細胞溶解物からのBC2タグ付けされたタンパク質に結合する。BC2タグ付けされたタンパク質の免疫沈降のために、BC2TeGFP、eGFPBC2T又は単独でeGFPを発現するHEK293T細胞の可溶性タンパク質画分を、（a）に記載されたようにBC2ナノトラップとインキュベートした。インプット（I）、非結合（NB）及び結合画分（B）をSDS-PAGEによって分離し、クーマシーブルー染色（上）又はイムノブロット分析（下）のいずれかによって可視化した。
【図４】図4は、蛍光標識されたBC2ナノボディを用いた免疫細胞化学実験の結果を示す。（a）は、BC2タグ付けされた融合タンパク質、及び共局在研究に用いられる蛍光標識されたBC2-Nbsの模式図を示す。BC2T配列は、mCherry-Vimentin（mCherry-VIMBC2T）及びeGFP-PCNA（eGFP-PCNABC2T）のC-末端に遺伝的に融合された。（b）mCherry-VIMBC2T又はeGFP-PCNABC2Tを異所的に発現するHeLa細胞を、それぞれメタノール又はPFAのいずれかで固定し、示された蛍光標識BC2-Nbs及びDAPIでの染色に続く。スケールバー25 μm。
【図５】図5は、リガンド非結合BC2-Nbの構造及び対応するBC2-Nb/BC2T複合体を示す。（a）は、リガンド非結合BC2-Nb構造のリボン図面を示す。２つのジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基がマークされている。リガンド結合構造においてペプチドとの接触に寄与し、かつ結合時にアミノ酸フリップを受けるCDR3が、オレンジ色で強調されている。（b）は、リガンド非結合及びリガンド結合BC2-Nb構造の重ね合わせを示す。２つの構造の比較は、２つのアミノ酸による180度のフリップを明らかにしている。BC2-Nb構造において、Arg106はGlu108のカルボニル基と相互作用し、Tyr107はArg45との陽イオンπ-相互作用に関与している（オレンジリボントレース）。Arg106のβ-炭素はNbに向かって、及びTyr107はNbから離れて配向している。ペプチド結合複合体構造では、それは逆である（青色リボントレース）。Arg106は「ヘッドロック」結合に関与し、かつTyr107はArg104のカルボニル基と水素結合を形成している。
【図６】図6は、BC2-NbとのBC2-ペプチドの相互作用のスキームを示す。BC2-ペプチドはピンク色の側鎖で示されている。そのアセチル化されたN-末端が最上部にあり、アミド化されたC-末端が最下部にある。3.5 Å以内の全ての極性相互作用は黒い点線で表され、BC2-Nbからのそれらの相互作用パートナーは骨格については緑色、及び側鎖相互作用については黄色である。水分子は青色で示される。4.0 Å以内の関連する疎水性相互作用は、灰色の点線で表される。
【図７】図7は、ヘッドロックモチーフの突然変異が、BC2ナノボディの増大したオフレート（off-rates）をもたらすことを示している。表面プラズモン共鳴分光法（SPR）ベースの親和性測定のために、C末端BC2-タグ（GFPBC2T）（a - c）を有するGFP又は単独のGFP（d）をCM5-チップ上に固定化した。8 nM〜250 nMの範囲の６つの濃度のBC2-Nb（a）、BC2-NbR106S（b）又はBC2-NbR106E（c）を注入することによって、動態測定を行った。得られたデータセットを、物質移動を伴う1：1ラングミュア結合モデルを用いて評価した。対照として、GFPのみ（d）への結合についてBC2-Nbを試験した。BC2-Nb及び対応する突然変異体について決定された解離定数（KD）及び、会合（kon）及び解離速度定数（koff）によって表された得られた親和性を、表3に要約する。
【図８】図8は、BC2ナノトラップによって捕捉されたタンパク質が、ネイティブ条件（native conditions）下で溶出できることを示している。細菌溶解物に由来するGFPBC2Tは、BC2ナノトラップにより結合され、図3 cに記載された緩衝液条件を用いた溶出に供される。放出されたGFPBC2Tの蛍光シグナル強度を、レーザースキャナを用いて可視化及び定量した。上部パネルは、完全溶解物との比較における溶出したGFPBC2Tの蛍光強度を示す。下部パネル：異なる溶出条件について得られたGFP-蛍光の定量。非処理溶解物から得られたGFP-蛍光を1に設定した。３つの独立した実験の平均及びs.d.（エラーバー）を示している（R1 - R3）。
【図９】図9は、BC2-Nbが、BC2タグ付けされたタンパク質の免疫沈降及び検出のために機能的であることを示している。（a）免疫沈降のために、eGFP-PCNA（対照）又はBC2タグ付けされたeGFP-PCNA（eGFP-PCNABC2T）（左パネル）あるいはmCherry-Vimentin（mCherry-VIM、対照）又はBC2タグ付けされたmCherry-VIM（mCherry-VIMBC2T）のいずれかを発現するHEK293T細胞の可溶性タンパク質画分を、BC2ナノトラップとインキュベートした。インプット（I）、非結合（NB）、及び結合画分（B）をSDS-PAGEにより分離し、抗PCNA又は抗Vimentin抗体（上部パネル）を用いたイムノブロット分析によって可視化した。ローディングコントロール（loading control）として、ブロットを抗GAPDH抗体でプローブした（下部パネル）。（b）蛍光標識されたBC2-Nb（BC2-NbAF488）を用いたウェスタンブロット検出のために、示された量のインプット画分（（a）に示されるように）をSDS-PAGE及びイムノブロッティングに供した。ウェスタンブロットをBC2-Nb488でプローブし、次いで抗PCNA（左パネル）又は抗Vimentin（右パネル）抗体で検出した。ローディングコントロールとして、ブロットを抗GAPDH抗体（下部パネル）でプローブした。（c）は、BC2ナノトラップが、過剰発現したBC2タグ付けされたタンパク質と比較して、少量の内在性β-カテニンしか沈降させないことを示している。図3 dの（a）に記載された試料を、抗β-カテニン抗体を用いたイムノブロット分析に供した。矢印はβ-カテニン特異的シグナルを示す。
【図１０】図10は、蛍光標識されたBC2ナノボディを用いて免疫細胞化学によって得られた結果を示す。（a）は、BC2-NbAF488とmCherry-VimentinBC2Tとの共焦点撮像を示す。mCherry-VIMBC2Tを異所的に発現するHeLa細胞を、メタノールで固定し、次いで蛍光標識されたBC2-Nb及びDAPIで染色した。図4bの上部パネルの左下隅における細胞の最大投影画像（7パネルのz-stack）を示している。スケールバー10 μm。（b）は、BC2-NbAF488及びBC2-NbATTO647の特異性を示す。タグ付けされていないmCherry-VIM又はeGFP-PCNAを異所的に発現するHeLa細胞を、メタノール又はPFAでそれぞれ固定し、示された蛍光標識BC2-Nbs及びDAPIで染色した。スケールバー25 μm。
【図１１】図11は、本発明のBC2タグの変形を示している。元のBC2T配列（PDRKAAVSHWQQ；配列番号4）を全ての位置の50パーセントで修飾して、配列 PVRSAALSQWSS（BC2Tmut；配列番号5）をもたらした。タグの元のバージョンと修飾されたバージョンの両方を、GFPにC末端融合した。BC2タグを有さないGFPを陰性対照として使用した。タンパク質を大腸菌（E. coli）で発現した。溶解物を調製し、100 μgの総溶解物を、アガロース上に固定化されたBC2ナノボディで免疫沈降させた。インプット（I）、非結合（NB）、及び結合（B）画分を、SDS-PAGEにより分析し、クーマシー染色（上部パネル）又は抗GFP抗体を用いたイムノブロッティング（下部パネル）に続いた。
【図１２】図12は、BC2タグの長さの変形を示す。元のBC2T配列（PDRKAAVSHWQQ；配列番号4）を短縮して、配列PDRKAAVSHW（BC2T-10；配列番号14）及びRKAAVSHW（BC2T-8；配列番号3）を得た。タグの短縮バージョン及び元のバージョンを、GFPにC末端融合した（GFP-BC2T-10；GFP-BC2T-8、GFP-BC2T）。陰性対照として、BC2タグを有さないGFPを使用した。タンパク質を大腸菌で発現した。溶解物を調製し、100 μgの総溶解物を、アガロースビーズ上に固定化されたBC2ナノボディで免疫沈降させた。インプット（I）、非結合（NB）及び結合（B）画分を、SDS-PAGEにより分析し、抗GFP抗体を用いたウェスタンブロッティングに続く。結果は、C末端タグとしてのBC2T-10配列（PDRKAAVSHW；配列番号14）又はBC2T-8配列（RKAAVSHW）が、エピトープ特異的BC2ナノボディによって、元のBC2T（PDRKAAVSHWQQ）の12個のアミノ酸と同じくらい効率的に認識されることを示している。
【図１３】図13は、野生型BC2タグを超える改善された結合親和性を有するBC2タグの２つの変形を示す。バイオレイヤー干渉法（BLI）ベースの親和性測定を使用して、元のBC2T配列の２つの改善された変形（a：PDRVRAVSHWSS、pTag1配列番号33；b：ADRVRAVSHWSS、pTag2配列番号34）を、元のBC2T配列（c：BC2T配列番号4）との比較において、評価した。BC2T及びその改善された変形を、エチレングリコールリンカーを介して結合されたN末端ビオチンを有するペプチドとして合成し、ストレプトアビジンバイオセンサー上に固定化した。結合動態を、4〜5つの濃度のBC2-Nb（5〜50 nM）と固定化されたペプチドをインキュベートすることによって分析し、1：1結合モデルを用いて評価した。得られた解離定数（KD）、会合（kon）及び解離速度定数（koff）を、表5に要約する。
【図１４】図14は、タンパク質精製及び免疫沈降への、BC2タグの改善された変形の適用を示す。（a）タンパク質精製：BC2ナノトラップを、元のBC2タグ BC2T（配列番号4）又はその改善された変形（pTag1配列番号33及びpTag2配列番号34）でN末端又はC末端にタグ付けされたタンパク質mCherryと共にインキュベートした。その後、結合したタンパク質を、100 μMの濃度での対応する遊離ペプチドを用いて溶出した。インプット（I）、非結合タンパク質（NB）、ペプチド溶出によって放出されたタンパク質（R）及び溶出後に依然として結合していたタンパク質（B）の画分を、SDS-PAGE及びクーマシー染色を用いて分析した。（b）免疫沈降：BC2ナノトラップを使用して、ヒト細胞株HEK293T、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）昆虫細胞株High5及び酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の溶解物から、BC2タグ変形pTag1配列番号33とN末端融合したタンパク質mCherryを沈降させた。インプット（I）及び結合タンパク質（B）の画分を、SDS-PAGE及びクーマシー染色を用いて分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書及び特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるものとする多数の用語が参照されることになる：
【００１８】
用語「エピトープペプチド」又は「エピトープタグ」は、タグとして使用される本発明のペプチド配列を指すものとし；両方の用語は互換的に使用される。本発明のエピトープペプチドは、請求項１に定義されたように配列番号1の少なくとも8個のアミノ酸配列を含む任意のペプチドであって、ここで、単離されたエピトープペプチドが少なくとも9個のアミノ酸を含む場合、配列番号3により定義されたアミノ酸配列（RKAAVSHW）を含まない。エピトープペプチド又はエピトープタグは、単離された配列であっても、又は配列の一部であってもよい。
【００１９】
用語「ポリペプチド」は、任意のタイプのポリペプチド又はタンパク質を指し、かつ、アミノ酸がペプチド結合を介して接続されている任意のアミノ酸配列を含み、例えば少なくとも10アミノ酸長のアミノ酸配列を含み、エピトープタグ及びポリペプチドのコンストラクトがβ-カテニンでないことを条件とする。ポリペプチドという用語は、本願において非常に一般的に使用され、オリゴペプチドなどのペプチドも含むものとする。ポリペプチド及びタンパク質という用語は互換的に使用される。
【００２０】
用語「目的のポリペプチド」又は「目的のタンパク質」は、生理学的活性分子のような機能又は特性を有する任意のタイプのポリペプチド又はタンパク質を指すものとし、所望の特性又は機能を有する全ての構造変異体及び配列変異体を含む。特に、当該用語は任意のタイプのペプチド及びタンパク質並びに融合タンパク質を包含するものとする。両方の用語は互換的に使用される。
【００２１】
用語「融合タンパク質」又は「融合ポリペプチド」は、２つ以上のポリペプチド又は少なくとも１つのポリペプチド及び少なくとも１つのペプチド又は少なくとも１つのポリペプチド及び少なくとも１つのオリゴペプチドの接合によって生成された、タンパク質又はポリペプチドを指すものとする。例えば、「融合タンパク質」は、エピトープペプチドのアミノ酸配列と融合されたタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指すことができる。融合タンパク質又は融合ポリペプチドは、１つ又は複数のポリペプチド及び１つ又は複数のエピトープペプチドを含むことができる。また、融合したペプチドは、架橋又はリンカー配列を介して接合され得る。エピトープペプチドは好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列のN-又はC末端に、直接又はリンカー分子を介して、融合している。
【００２２】
リンカーは、２つの核酸、２つのペプチド又はタンパク質、タグ及び目的のタンパク質、又はヌクレオチド、ペプチド若しくはタンパク質及び担体などの、分子の２つの部分を接続する任意の単位である。この目的のために知られている任意の単位は、分子の機能と干渉しない限り、使用することができる。リンカーは、接続されるメンバーが核酸、例えば3〜150ヌクレオチドである場合には、ヌクレオチドからなり、あるいは、２つの部分の少なくとも１つがペプチド又はタンパク質である場合、１個のアミノ酸又は2〜50個のアミノ酸を有するアミノ酸配列であり得るか、あるいは別の架橋分子であり得る。
【００２３】
本発明のエピトープペプチドの変異体は、少なくとも8個のアミノ酸を含むペプチドであって、少なくとも8個のアミノ酸は、1、4、6、及び8位に配列番号3のアミノ酸1、4、6及び8を有する一方で、残りのアミノ酸が配列番号3のアミノ酸であり得、かつそれらの少なくとも１つが、サイズ、極性及び／又は電荷に関して、配列番号3の「元の」アミノ酸と類似している別のアミノ酸である、ペプチドである。換言すれば、用語「変異体（variant）」は、本明細書で使用される場合、配列番号3に由来するか又は配列番号3に対応する配列を指し、ここで、アミノ酸の少なくとも12.5 %及び最大で25、又は37.5、又は50 %が、保存的置換のような置換によって置換されている。例えば、リシンは、ペプチドの機能を変化させることなくセリンによって置換することもできる。本発明の変異体は、上記で定義されたようなエピトープペプチドであり得、ここでは、配列番号3の配列の8個のアミノ酸のうち4個が、ペプチドの機能を実質的に変化させることなく、置換され得る。37.5 %保存的に置換された変異体をもたらす、3つの保存的置換を含む8個のアミノ酸残基を有する本発明のエピトープペプチドの変異体は、実施例において活性であることが示されている。
【００２４】
本発明のエピトープタグがC末端又はN末端に位置しているということは、目的のポリペプチドの配列に由来する他のアミノ酸残基が、N末端にあるエピトープタグの配列に先行せず、あるいは、C末端にあるエピトープタグの配列に続かないことを意味する。しかしながら、目的のポリペプチドの元の配列に由来しない配列、例えばさらなるタグ又はリンカー配列が、本発明のC-又はN末端タグに続いて又は先行することができる。
【００２５】
用語「精製」又は「精製する」とは、本願で使用される場合、生化学物質などの物質からの、目的の化学又は生化学物質の、任意のタイプの物理的分離を指すものとする。一例は、組織又は培養液のような生化学物質からのポリペプチドの精製である。精製された物質は単離物と呼ぶこともできる。タンパク質又はポリペプチド精製は、試料から１つ又は少数のタンパク質を単離又は富化することを意図した、１つのステップ又は一連のステップを含むことができる。精製は、目的のタンパク質の機能、構造及び相互作用の特性評価に不可欠である。精製は、試料の非タンパク質部分からタンパク質を分離すること、又は他のタンパク質から所望のタンパク質を分離することからなり得る。精製の結果は、単離されたタンパク質、又はポリペプチドが富化されている試料であり得る。本願において、用語「精製」は全てのタイプの分離を包含し、かつ単離並びに富化を包含する。
【００２６】
用語「試料」は、任意のタイプの決定又は精製方法に使用される標本又は量を指す。試料は、目的のタグ及び／又はタンパク質を含み、それは液体又は固体であり得る。本発明の文脈において、試料はしばしば、目的のタンパク質を含む複合混合物、例えば細胞、組織又は細胞溶解物であり得る。試料はまた、細胞を含む液体の遠心分離によって得られた上清であってもよく、ここで、細胞は液体に目的のタンパク質を分泌することができる。試料はまた、血液、尿、液（liquor）、汗、尿等のような、任意のタイプの体液の標本であってもよい。
【００２７】
用語「二次結合パートナー」とは、直接的に、あるいはポリペプチド又は抗体のような親和性リガンドに提供された単位を介してのいずれかで、タグ付けされたポリペプチド、抗体のようなエピトープ特異的親和性リガンド、又は一次結合パートナーとしての両方によって形成された複合体に、特異的に又は非特異的に結合することができる化合物を指す。結合対についての一例は、エピトープ特異的抗体の定常部及びFc特異的抗体である。結合対についての別の例は、タグ付けされたポリペプチド又はエピトープ特異的抗体上に存在するビオチン部分と、ストレプトアビジンである。二次結合パートナーとしてのさらなる例は、複合体に対する抗体である。二次結合パートナーは、複合体を単離するため、及び／又は複合体を検出するために使用することができる。この目的のために、二次結合パートナーは、固定可能な基、検出可能な基などを担持することができる。
【００２８】
本発明の説明
本発明は、配列番号1によって定義されるエピトープペプチド配列に関する。
【００２９】
驚くべきことに、配列番号3（RKAAVSHW）の少なくとも８個のアミノ酸を含むペプチド配列又はその変異体が、エピトープタグとして有用であるということが見出された。その抗体のエピトープに対する親和性が、特異的かつ信頼性のあるタグとの相互作用を確実にするのに十分高いので、このアミノ酸配列は特異的結合のために十分である。さらに、本発明のエピトープペプチドに基づく捕捉及び／又は検出のためのシステムが、非常に望ましい特性を有することが見出された。例えば、エピトープタグ付けされたタンパク質は、〜1.4 nMのKDでエピトープ特異的抗体によって結合されることが示されており、これは、FLAG、HA、c-myc又はナノボディ由来のEPEA-システムなどの先行技術で利用可能なシステムと比較して、〜10〜100倍高い親和性に変換される。本発明のエピトープペプチドは非常に用途が広く；それは、C末端又はN末端タグとして使用することができ、かつ温和な又は厳しい条件下での対応する抗体への強い結合を示す。１つ又は複数のタグが使用され、これはタグの少なくとも１つが本発明のエピトープタグである限り同じでも異なっていてもよく、かつ、ポリペプチドの異なる末端に位置してもよいか、あるいはタンデム状（tandem-like）又は任意の他の順序で配置されてもよい。特に、本発明の検出及び／又は捕捉のためのシステムは、その独特の結合特性のために、非常に強い親和性及び結合効率を示す。
【００３０】
また、驚くべきことに、配列番号3の４個のアミノ酸（配列番号3のアミノ酸残基を参照して、1位におけるR、4位におけるA、6位におけるS、及び8位におけるW）のみが、タグ特異的抗体の特異的結合に不可欠であること、並びに、残りの位置が、例えば別のアミノ酸によって置換され得、当該別のアミノ酸は、結合特異性及び親和性に顕著に負の影響を与えることなく、サイズ、極性及び／又は電荷に関して、「元の」アミノ酸と類似しており、好ましくは保存的に置換されていることが、見出された。配列番号4に定義されたポリペプチドに含まれるアミノ酸の最大50%の置換、好ましくは保存的置換を含むエピトープタグは依然として、効率的かつ信頼性のあるタグ付けされたタンパク質とタグ特異的抗体との相互作用を確実にすることが見出されている。一端又は両端に付加的なアミノ酸を有するペプチドが、効率的かつ信頼性のあるタグ特異的抗体との相互作用を提供することも見出されている。一例として、アミノ酸配列PVRSAALSQWSS（配列番号5）を有する修飾されたタグ又はエピトープペプチドが、タグ付けされたGFPタンパク質を効率的に精製するために使用された（図11参照）。修飾されたタグ又はエピトープペプチドのさらなる例は、配列番号33により定義されたアミノ酸配列（PDRVRAVSHWSS）、又は配列番号34により定義されたアミノ酸配列（ADRVRAVSHWSS）を有する。
【００３１】
本発明のエピトープタグは、中央タグ配列に隣接するさらなるアミノ酸を含むことができることが見出された。25個を超えるアミノ酸の長さを有するタグ配列を使用することができたが、タグと融合されたポリペプチド又はタンパク質の細胞内局在、フォールディング、又は機能とタグとの干渉を最小限にするために、小さなタグを提供することが有利であり；したがって、タグを含む本発明のエピトープペプチドは、25個を超えるアミノ酸を含むべきではない。
【００３２】
それゆえ、本発明のエピトープペプチド又はタグは、8〜25個のアミノ酸を有し、好ましくは8〜25個のアミノ酸からなり、ここで、アミノ酸配列は、配列番号1に定義された配列（RX4X5AX7SX9W）を含み、ここで、
X4は、K又は置換とすることができ；
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ；
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ、並びに
X9は、H又はHの保存的置換とすることができ；
ここで、単離されたエピトープペプチドが、少なくとも9個のアミノ酸を含む場合、配列番号3により定義されたアミノ酸配列（RKAAVSHW）を含まない。
【００３３】
好ましい実施形態では、X4は、Kの保存的置換又はセリンであり得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明のエピトープペプチドは、12〜25個のアミノ酸を有し、好ましくは12〜25個のアミノ酸からなり、ここで、アミノ酸配列は、配列番号32で定義された配列（X1X2RX4X5AX7SX9WX11X12）を含み、ここで、
X1は、P又はAとすることができ；
X2は、D又はDの保存的置換とすることができ；
X4は、K又は置換とすることができ；
X5は、A又はR、あるいはA又はRの保存的置換とすることができ；
X7は、V又はVの保存的置換とすることができ；
X9は、H又はHの保存的置換とすることができ；並びに
X11及びX12は、Q又はQの保存的置換とすることができ；
ここで、単離されたエピトープペプチドが、配列番号3により定義されたアミノ酸配列（RKAAVSHW）を含まない。
【００３５】
好ましい実施形態では、X4は、Kの保存的置換又はセリンであり得る。
【００３６】
「保存的置換」とは、１つのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を指し、その置換はサイレント変化（silent alteration）をもたらす。これは、本発明のエピトープペプチド配列内の１つ又は数個のアミノ酸残基が、機能的等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得ることを意味する。配列内のアミノ酸についての置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（すなわち保存的置換）。例えば、１つの極性アミノ酸は、別の極性アミノ酸によって置換することができ、１つの正又は負に荷電したアミノ酸はそれぞれ、別の正又は負に荷電したアミノ酸によってそれぞれ置換することができることなどである。アミノ酸のクラスは例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む非極性（疎水性）アミノ酸；グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む極性中性アミノ酸；アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む正に荷電した（塩基性）アミノ酸；アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む負に荷電した（酸性）アミノ酸、である。
【００３７】
本発明のエピトープペプチドは単離された形態で提供され、これは、動物又は人間の体内に含まれていないことを意味する。エピトープペプチドは、単離されたペプチドとして提供され得るか、あるいは、コンジュゲート、架橋、結合、又は接続された形態で使用することができ、例えば、少なくとも１つのエピトープがポリペプチド、特に目的のタンパク質又はポリペプチドに融合されている融合タンパク質において、あるいは、任意によりリンカー、スペーサー、又は他の接続メンバーによって連結又は接続された、少なくとも１つの本発明のエピトープ及びポリペプチドを含むコンストラクトにおいて、使用され得る。リンカー、スペーサー又は他の接続メンバーは、当該技術分野で知られている任意の配列であり得る。それは例えば切断部位を提供する配列であってもよく、あるいは、単にスペーサー、すなわちエピトープとポリペプチドとの間の距離を調節するメンバー、又は所望の機能に寄与する接続メンバーであってもよい。
【００３８】
驚くべきことに、このエピトープペプチドは、エピトープタグとして効率的かつ確実に使用することができ、当該エピトープタグは、特異的かつ効率的にタグ特異的抗体と相互作用することができることが見出された。
【００３９】
「エピトープタグ付け（Epitope tagging）」とは、既知のエピトープが組み換えタンパク質などのポリペプチドに、例えば遺伝子工学によって、融合される技術である。エピトープタグは、ポリペプチド、例えば目的のタンパク質を検出するために、このエピトープタグに特異的な抗体と組み合わせて使用することができる。エピトープタグとして有用であるために、ペプチドは特異的抗体の選択的結合のための領域を提供すべきであり、タグがポリペプチドに連結されるか、ポリペプチドと融合されていても、タグ領域は結合に利用可能であるべきであり、そして、非特異的結合は可能な限り避けられるべきである。エピトープタグと対応する抗体との間の結合は、強く、信頼性があり、かつ選択的でなければならない。エピトープタグと対応する抗体との好適な組み合わせを選択することによって、当該技術は、抗体が利用可能でないタンパク質を検出することを可能にする。これは、新たに発見されたタンパク質及び低免疫原性のタンパク質の特徴付けに特に有用である。本発明は、エピトープ及び抗体の対を含むシステムを提供し、当該システムは、多数の実験的用途、例えばウェスタンブロット分析、免疫沈降、免疫（組織）化学、免疫蛍光研究、タンパク質-タンパク質相互作用研究、ELISA、及び親和性精製、に使用することができる。
【００４０】
内在性タンパク質であるβ-カテニンに由来するにも関わらず、驚くべきことに、本発明のタグと融合されたタンパク質は、内在性タンパク質と抗体との任意の相互作用からの有意な影響なしに、タグ特異的抗体で特異的かつ確実に検出されることが見出された。この理論に縛られることなく、これは、内在性β-カテニンが、いわゆる接着結合を形成するタンパク質複合体の一部であり、従ってタグ特異的抗体との効率的な相互作用に利用可能でないことに起因することが企図される。さらに、タグ特異的抗体BC2-Nbは、内在性β-カテニンに対するBC2-Nbの親和性（3.7 nM）と比較して、エピトープタグに対する増加した親和性（1.4 nM）を有することが見出され、タグ付けされたポリペプチドに対する抗体の結合は、内在性β-カテニンに対する抗体の結合に好ましいことを示唆している。
【００４１】
ポリペプチド、例えば目的のポリペプチド又はタンパク質であって、本発明のエピトープタグと融合されたか、又は連結され若しくは接続されているポリペプチドは、例えば以下に詳細に記載されるように、タグ特異的抗体を用いて特異的かつ確実に検出することができる。タグ付けされたポリペプチドはまた、免疫親和性ベースの捕捉アッセイによって、特異的、効率的かつ確実に、精製することができる。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、ポリペプチド、及びポリペプチドのN末端又はC末端にある上記で定義した少なくとも１つのエピトープペプチドからなるコンストラクトである。用語「ポリペプチド及び少なくとも１つのエピトープペプチドからなるコンストラクト」とは、「融合タンパク質」とも呼ばれる、非自然発生のポリペプチドを指す。コンストラクトに含まれるポリペプチドは、少なくとも目的のタンパク質及び任意により連結配列を含むことができ；それはまた、さらなる機能的配列及び／又はさらなるタグを含むことができる。コンストラクトは、１つ又は複数の本発明のエピトープタグを含むことができる。コンストラクトが複数のタグを含む場合、それらは、タンデム状に配置されてもよく、連続しても、間隔を開けても、又は両端にあってもよい。加えて、コンストラクトはさらなるタグを含んでもよく、さらなるタグは任意の有用な位置にあり得る。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸に関する。核酸は、RNA、DNA、PNA、又はLNAであり得る。
【００４４】
本発明の核酸コンストラクトは、少なくとも１つの本発明のエピトープペプチドをコードする核酸配列を含む。これら核酸コンストラクトは、原核生物又は真核生物起源、例えば細菌、哺乳動物、酵母、真菌、線虫、魚、鳥類、ウイルス、若しくは昆虫起源のものであり得る。任意により、本発明の核酸コンストラクトはまた、目的のタンパク質などのタグ付けされるべきポリペプチドの核酸配列を含む。本発明のエピトープペプチドをコードする核酸配列は、タグ付けされるべきポリペプチドをコードする核酸配列の下流及び／又は上流にあり得、C末端及び／又はN末端にタグ付けされたポリペプチドをもたらす。驚くべきことに、本発明のエピトープペプチドはC末端に並びにN末端に使用することができることが見出された。これは、エピトープペプチド又はそれをコードする核酸それぞれの非常に多用途な使用を可能にする。本発明のコンストラクトは、１つのエピトープペプチドをコードする核酸、あるいはエピトープペプチドの複数のコピー、例えば２つ又は３つのコピーをコードする核酸を含むことができる。複数のコピーは末端タグに隣接させることができ、又はタグはN及びC末端それぞれにあり得る。
【００４５】
本発明のコンストラクトはまた、核酸発現コンストラクトであり得、かつ、エピトープタグをコードする少なくとも１つの核酸、及びタグ付けされるべきポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含み、ここで、両者は互いに直接隣接して配置され得るか、あるいは、適切な長さのリンカー配列、例えば約3〜150核酸塩基によって分離され得る。他の機能的配列も含まれ得る。例えば、リンカーは、エンドヌクレアーゼのための認識部位、又はプロテアーゼのための認識部位をコードする核酸配列を含み得る。プロテアーゼについての例は、TEVプロテアーゼ、トロンビン、第Xa因子プロテアーゼ、又はPreScissionプロテアーゼである。
【００４６】
本発明の核酸コンストラクト又は核酸発現コンストラクトは、さらなるタグ、例えばHIS-タグをコードする核酸配列をさらに含むことができる。
【００４７】
本発明の核酸コンストラクト又は核酸発現コンストラクトは、複数のタグ、例えばタンデム（tandem）タグをコードする核酸配列を含むことができる。タンデムタグは、配列内の２つのタグの組み合わせである。タンデムタグは、本発明のエピトープタグの少なくとも２つのコピー、又は少なくとも１つの本発明のエピトープタグ及び少なくとも１つの他のタグを含み得る。コンストラクトはまた、必要に応じて、多数の同じ又は異なるタグを含み得る。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸又は核酸発現コンストラクトを含む宿主細胞に関する。「宿主細胞」は、本発明のエピトープタグをコードする核酸配列を含む細胞である。宿主細胞は、安定なトランスフェクタントであり得るか、あるいはエピトープタグをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトで一過性にトランスフェクトされ得る。
【００４９】
宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、植物、真菌、線虫、魚、又は鳥類細胞であり得る。細胞は一次細胞又は細胞株であり得る。宿主細胞は個々の単一細胞であってもよく、又は組織の一部である細胞であってもよい。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸又は核酸発現コンストラクトを宿主細胞に導入するための方法に関する。この導入により、本発明の少なくとも１つのエピトープタグをコードする核酸が、宿主細胞内で少なくとも目的のポリペプチドをコードする核酸に接続される。それゆえ、宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのエピトープタグをコードする核酸を含み、発現すると本発明のエピトープタグを含むことになる。
【００５１】
核酸を宿主に導入するための方法は、この目的のために当該技術分野で知られている任意の方法であってもよく、特に当該方法は、以下、CRISPR/Casゲノム編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用いたゲノム編集方法、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、又はメガヌクレアーゼ、陽イオン性脂質、リン酸カルシウム、若しくはDEAE-デキストランなどの試薬を用いる試薬ベースの方法、形質導入、トランスフェクション、及び機器ベースの方法、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、及びレーザーフェクション（laserfection）、を含む群から選択され得る。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、N末端又はC末端エピトープタグとしての本発明のエピトープペプチドの使用に関する。本発明のエピトープタグをコードする核酸を含む宿主細胞は、ポリペプチド、例えば目的のポリペプチド/タンパク質を発現することになり、当該ポリペプチドはエピトープタグと連結されているか、又はエピトープタグに融合されている。核酸発現コンストラクトの配列及び／又はエピトープタグをコードする核酸を導入する方法に応じて、宿主への導入は、N末端に又はC末端にタグ付けされたポリペプチドをもたらすことになる。末端タグがより容易にタグ特異的抗体との相互作用に利用可能となるので、C末端又はN末端タグは内部タグと比較して好ましい。しかしながら、本発明のエピトープペプチドは、タグ付けされた目的のタンパク質が立体配座を示し、ここで、内部タグが結合パートナーとの相互作用に利用可能であることを条件として、内部タグとしても使用することができる。例えば、目的のタンパク質はループ構造を示すことができ、ここで、内部タグはループ構造を形成する配列の一部である。この場合、内部タグは、結合パートナーとの相互作用に利用可能となる。
【００５３】
本願によれば、用語「親和性リガンド」とは、斯かるリガンドに特異的な部分又は斯かるリガンドに対する抗体のいずれかに非常に高い親和性で結合することができる分子を指す。例としては、ビオチン（リガンド）-ストレプトアビジン（部分）、ジゴキシゲニン（リガンド）-抗-DIG-抗体及びさらなるタグ特異的抗体が挙げられる。本発明に係る「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、特にポリクローナル単一特異的抗体（すなわち異なる可変領域を有する抗体であるが、特異的本発明のエピトープタグを全て認識する抗体）、キメラ抗体、並びに上記タイプの抗体の断片又は変異体を含む。用語「抗体」は本明細書において、遺伝的に操作された抗体をさらに含み、好ましい実施形態では、用語「抗体」は、ラクダ又はラマのようなラクダ科（Camelidae）に見られるような重鎖抗体を指す。これら抗体の結合要素は、単一ポリペプチドドメイン、すなわち重鎖ポリペプチドの可変領域（VHH）からなる。これら抗体は、軽鎖を天然に欠いており、重鎖可変ドメインが完全な抗原結合部位を形成する。対照的に、従来の抗体は、２つのポリペプチドドメインを含む結合要素を有する（重鎖の可変領域（VH）及び軽鎖の可変領域（VL））。構造的及び機能的完全性を維持するための軽鎖可変ドメインとの相互作用に対する依存性の欠如は、産生の容易さ及び溶液中での挙動に関して、これらVHHドメインに他の小さな抗体断片を超える実質的な利点を与える。特に、VHH断片は、それらの異常な安定性、及び抗原の溶出中にしばしば起こる完全な変性後に効率的にリフォールディングするそれらの能力のために、免疫親和性精製に好ましいタイプの分子である。VHH抗体は、単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体とも呼ばれる。VHH抗体の断片は、「ナノボディ」とも称される。抗体の断片は当該技術分野でよく知られており、エピトープ結合活性を有する任意の断片を、本発明のシステムにおいて又は相互作用のために「抗体」として使用することができる。
【００５４】
本発明の意味における用語「抗体」とは、典型的には、前述した抗体並びに以下に定義された変異体の全長抗体及び抗体断片を指す。全長抗体の全てのドメイン又は領域を含まない抗体は、本発明の意味の範囲内で抗体の断片である。したがって、用語「抗体」は、任意のタイプの抗体、その断片及び変異体、並びに、抗体、断片、及び／又は変異体の混合物を包含するものとする。
【００５５】
任意の抗体であって、本発明のエピトープペプチドに対する親和性を有し、かつ本発明のエピトープペプチドに特異的であり、かつ高い結合活性又は親和性を提供する、任意の抗体を使用することができる。それは従来の抗体又は重鎖抗体、あるいは従来の抗体の又はラクダ科動物抗体の断片であってもよく、それはまた、抗体、断片及び／又は変異体の混合物であってもよい。好ましい抗体又は抗体断片は、重鎖抗体、例えばラクダ科動物抗体、及びナノボディ又はNbと呼ばれるラクダ科動物抗体断片に由来する。
【００５６】
前述した抗体の全ては、結合形態又は可溶性形態で存在してもよく、かつ検出可能部分又は「標識」を含んでもよく（例えば蛍光マーカー、放射性同位体、コロイド金マーカー、共役酵素等）、及び／又は固相上に固定化するためのペプチド、基、又はリンカーを担持してもよい。用語「結合」とは、膜結合抗体と、固体支持体又は担体材料に固定化された抗体との両方を指す。抗体の文脈において用語「可溶性」とは、当業者によく理解されているように、膜又は固体支持体に結合していない抗体を指す。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態は、上記及び特許請求の範囲で定義されたように、ポリペプチドと、そのN末端又はC末端にある少なくとも１つのエピトープペプチドとからなるコンストラクトである。ポリペプチドは上記で概説した任意のポリペプチドであってもよく、例えば少なくとも目的のタンパク質及び任意によりさらなる機能的配列、例えばさらなるタグを含んでもよい。コンストラクトは、上記で説明したように、１つ又は複数のエピトープタグを含むことができる。
【００５８】
このコンストラクト又はタグ付けされたポリペプチドは、タグ特異的親和性リガンド、例えばタグ特異的抗体の相互作用を測定することによって捕捉及び／又は検出することができ、当該タグ特異的親和性リガンドは、検出可能部分を含んでもよく、及び／又はタグ付けされたポリペプチドにより固体支持体に結合できるか又は結合可能であり得る。目的のコンストラクト又はタグ付けされたポリペプチドは、精製又は富化のために、タグ特異的親和性リガンド、例えばタグ特異的抗体で捕捉することができ、次いで、タグ付けされたポリペプチドは任意により、既知の手段、例えば二次検出リガンドによって検出及び／又は定量することができ、当該二次検出リガンドは、好ましくは検出可能部分、例えば蛍光標識を含み、そして目的のポリペプチドと相互作用し、又は好ましくはタグ特異的親和性リガンド、例えばタグ特異的抗体と相互作用する。
【００５９】
検出のために、タグ付けされたポリペプチド及び／又はタグ特異的親和性リガンド、例えば特異的抗体は、検出可能部分、又は検出可能部分の導入を可能にする部分、又はいくつかの種類のシグナルを生じる部分を含み得る。検出可能な部分、並びに部分/シグナルを検出及び／又は定量するための方法は、当該技術分野でよく知られている。目的のポリペプチドを富化し、その後、タグ付けされたポリペプチドの結合パートナー、量、及び目的の他の特性を分析することも可能である。
【００６０】
それゆえ、好ましい一実施形態における本発明は、検出及び／又は捕捉のための方法、例えば捕捉によってポリペプチドを精製するための方法、及び／又は、検出可能なシグナルを捕捉及び／又は測定することによって、あるいはポリペプチドを富化しそして得られた組成物中のポリペプチドを分析することによって、ポリペプチドを検出するための方法に関する。
【００６１】
本発明の検出方法は、本発明のエピトープペプチド又はエピトープタグを含むポリペプチドの存在、細胞内局在、及び／又は量を決定するのに適しており、好ましくはイン・ビトロ法である。
【００６２】
検出、配置及び／又は定量されるべきタグ付けされたポリペプチド又はタンパク質は、宿主細胞において、例えば細胞核において、細胞膜又は別の細胞コンパートメントにおいて、その細胞内位置で検出することができる。検出及び／又は定量されるべきタグ付けされたポリペプチド又はタンパク質はまた、タグ付けされたポリペプチド又はタンパク質を含む溶液、例えば宿主細胞又は宿主細胞を含む組織から得られた細胞溶解物中で検出することができる。
【００６３】
検出方法の第１ステップにおいて、親和性リガンド、例えば本発明のエピトープペプチドに特異的に結合する抗体は、タグ付けされたポリペプチド又はタンパク質を含む試料に投与される。試料は、宿主細胞、組織、宿主細胞の細胞溶解物を含む溶液、又はタグ付けされたポリペプチドを含む任意の他の試料、例えば宿主細胞を含む液体の遠心分離後に得られた上清であって、宿主細胞が目的のポリペプチドを液体又は体液のような別の標本中に分泌することができる、上清であり得る。
【００６４】
この投与ステップは、親和性リガンド、例えば抗体及びそのエピトープタグの特異的相互作用を可能にする条件で行われる。そのような条件は当業者によく知られている。洗浄ステップは典型的には、その抗原への抗体の投与に続き、当業者は前記洗浄ステップをどのように、いつ適用するかを知っている。
【００６５】
一実施形態では、タグ付けされたポリペプチド又はタンパク質は、親和性リガンド、例えば抗体及びそのエピトープタグの相互作用を検出することによって、検出、定量及び／又は配置される。検出は、当該技術分野で知られているように行うことができる。一実施形態では、両方の相互作用パートナーの少なくとも１つ、通常はエピトープタグ特異的親和性リガンド、例えば抗体は、検出可能部分を含む。
【００６６】
試料、例えば宿主細胞又は細胞溶解物を含む溶液、又は細胞上清への投与時に、親和性リガンド、例えば抗体は、タグ付けされたタンパク質と特異的に相互作用することになる。この相互作用は、検出可能部分から得られたレポーターシグナルを測定又は観察することによって、検出、モニタリング及び定量することができる。例えば、検出可能部分が蛍光標識である場合、蛍光は、励起時に測定及び観察することができる。
【００６７】
別の実施形態では、検出方法は、以下を用いて行われる：
エピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体、これは本実施形態では、検出可能部分を含む必要はない；
少なくとも１つの二次結合パートナー、これは、エピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体、タグ付けされたタンパク質、又は両方によって構築された複合体に結合することができる。二次結合パートナーは、検出可能部分を含むことができ、及び／又は固定化可能であり得る。
【００６８】
第１ステップでは、エピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体が、本明細書に開示された試料、例えば宿主細胞又は宿主細胞溶解物を含む溶液に投与される。第２ステップでは、二次結合パートナーが、エピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体に結合したタグ付けされたポリペプチド又はタンパク質を含む、試料、例えば宿主細胞又は宿主細胞溶解物を含む溶液に投与され得る。
【００６９】
タグ付けされたポリペプチド又はタンパク質の存在、量及び／又は局在は、二次結合パートナーに含まれる検出可能部分から得られたレポーターシグナルを測定又は観察することによって、検出又は決定することができる。
【００７０】
２つのタイプの結合パートナーを用いる２ステップの検出方法の利点は、タグ特異的相互作用が実際の検出ステップから分離されることである。これは、タグ特異的親和性リガンド、例えば抗体が、検出可能部分を含む必要がないので、変化しないままであることを可能にする。検出可能部分はタグ及びその親和性リガンド、例えばその抗体の相互作用に影響を及ぼし得るので、このことは、検出可能部分を含む抗体などのタグ特異的親和性リガンドと比較して、その特異性又は親和性を増強し得る。したがって、検出方法の信頼性及び効率も同様に増強され得る。さらに、捕捉及び検出抗体のような捕捉及び検出親和性リガンドとしてではなく、単に捕捉抗体のような捕捉親和性リガンドとして、抗体のようなタグ特異的親和性リガンドを使用することは、タグ付けされたタンパク質又はポリペプチドの存在及び量のみが決定されるべき場合に、捕捉及び検出ステップの分離を可能にする。それゆえ、タグ特異的親和性リガンド、例えばタグ特異的抗体を用いる第１ステップは、単離又は富化ステップに続き、捕捉された目的のタグ付きタンパク質又はポリペプチドを得ることができる。単離又は精製ステップは本願の以下でさらに議論されることになる。次に、検出ステップは、単離及び／又は富化されたタグ付きタンパク質に対して行われ、得られた定量の信頼性の向上、及び検出ステップのより容易な取り扱いにつながり得る。
【００７１】
エピトープタグ/抗体相互作用を定性的に検出するのに適した生物物理学的又は生体分子検出方法は、当該技術分野で知られている任意の好適な方法を含む。そのような方法としては、これらに限定されることなく、定性的又は定量的アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ELISPOTアッセイ、ウェスタンブロット、又はイムノアッセイに適用されるような方法が挙げられる。そのような方法は、 例えば光学、放射性又はクロマトグラフィー法、好ましくは上記標識のいずれかを使用する場合、マーカー又はリンカー、より好ましくは、蛍光検出法、放射能検出法、クーマシーブルー染色、銀染色又は他のタンパク質染色法、電子顕微鏡法、免疫組織化学による又は直接若しくは間接免疫蛍光法による組織切片を染色するための方法等を含む。そのような方法は、抗体とともに適用されてもよく、あるいは、タグ付けされたポリペプチド、抗体、又は複合体の一部に特異的に結合するさらなるツールの使用、例えば二次結合パートナーの使用を含んでもよい。
【００７２】
使用される抗体のサイズに応じて、タグ付けされたポリペプチド又は目的のタンパク質の細胞内局在も決定され得る。例えば、検出抗体が十分に小さい場合、別個の細胞内構造、例えば中間経フィラメントのネットワーク（intermediate filamentous network）又は複製機構の本質的部分を可視化及びモニタリングできる。
【００７３】
本発明の本態様では、検出抗体は好ましくはナノボディである。なぜなら、ナノボディは、従来の抗体と比較して減少したそのサイズに起因して、細胞内局在にあるタンパク質、例えばクロマチン内に深く埋め込まれた構造と相互作用することができるためである。可変軽鎖が存在しないために、従来の抗体に存在する６つのCDRと比較して、ナノボディは３つの超可変ループ（相補性決定領域、CDR）のみを有する。３つのCDRは4つのフレームワーク領域（FR）によって挟まれている。CDRの欠損を補うために、Nbsは、それらのCDR構造及び抗原結合様式に関して独特の特徴を示す。600〜800 Åの十分に大きな抗原相互作用表面を提供するために[1]、ほとんどのナノボディは実質的に伸長したCDR3ループを示す[2]。場合によっては、そのような長いループの増加した柔軟性は、追加のジスルフィド結合によってそれらをNbに固定することによって弱められる[3]。
【００７４】
したがって、典型的なナノボディは、以下の領域を含むアミノ酸配列として模式的に示すことができる：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
【００７５】
特に好ましい抗体は、非常に高い親和性、強い結合、及び多様性のような好ましい特性を示すBC2ナノボディ（BC2-Nb）である。BC2-Nbは、以下のアミノ酸配列によって定義された、フレームワーク領域1、CDR1、フレームワーク領域2、CDR2、フレームワーク領域3、CDR3、及びフレームワーク領域4からなる、ラクダ科の重鎖抗体の可変領域を含む（122 aa）：
【００７６】
【表１】
2019504637.tif 000003
【００７７】
【表２】
2019504637.tif 000004
【００７８】
主にCDR3が本発明のエピトープペプチドの強い結合に関与していることが見出されている。BC2-Nbのアミノ酸配列の別の重要な部分は、FR2に存在するシステイン（配列番号6の50位）である。このシステインはCDR3のシステインとジスルフィド架橋を形成し、したがって、CDR3の正確なフォールディングに関与している。それゆえ、任意のナノボディであって、CDR3としてBC2のCDR3配列を含み、かつフレームワーク領域2にCDR3のシステインとジスルフィド架橋を形成することができるシステインを含む、ナノボディは、エピトープタグ/ナノボディ相互作用の１つのパートナーとして適している。好ましい実施形態では、FR2のシステインとCDR3のシステインとの間に約45〜55個、例えば約50又は51個のアミノ酸残基がある。BC2-Nbの場合、FR2のシステインは50位にあり、かつCD3のシステインは102位にある（位置マーカーは、上記に示した配列番号6の位置を参照している）。それゆえ、フレームワーク領域2のシステインとCDR3のシステインとの間に位置する51個のアミノ酸残基がある。
【００７９】
ナノボディBC2-Nb又は、少なくともBC2-NbのCDR3及びFR2におけるシステインを含むその機能的変異体はまた、エピトープタグ付けされた目的のポリペプチドの非常に信頼性のある効率的な結合パートナーであることが示されているので、全ての開示された精製及び／又は検出方法、及び本願に開示された使用において、本発明のエピトープタグとの好ましい相互作用パートナーである。BC2-Nb及びその機能的変異体はまた、本願に開示されたキットの好ましい構成要素である。本発明の１つの好ましい実施形態はまた、本発明のエピトープタグを含むポリペプチドの細胞内局在を検出、定量、決定し、あるいは精製するための、BC2-Nb又はその機能的変異体の使用である。
【００８０】
BC2-Nbの機能的変異体は、本発明のエピトープタグに親和性を有する任意の抗体又は断片であり、その親和性は少なくとも80 %、より好ましくは少なくとも90 %又は少なくとも95 %又はさらに99 %であるか、あるいはBC2-Nbを超える。変異体及びBC2-Nbの親和性は、当該技術分野で知られているように測定することができ、結果は当業者に知られているように公知のアッセイにより、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）によって、又は他のタンパク質-タンパク質相互作用モニタリングアッセイによって、比較することができる。
【００８１】
１つの好ましい実施形態において本発明は、精製方法、又は捕捉及び精製方法に関する。精製方法は、分析、半分取（semi-preparative）及び分取方法に使用することができる。
【００８２】
したがって、本発明のさらなる態様は、ポリペプチド、例えば少なくとも１つの本発明のエピトープタグを含む目的のタンパク質の精製方法に関する。
【００８３】
本態様において、当該方法は、タグ付けされたポリペプチドを含む試料、例えば溶液を、本発明のエピトープタグに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体と接触させる、捕捉ステップを含む。本発明のエピトープペプチドに特異的に結合する親和性リガンドは好ましくは、抗体、及び最も好ましくはナノボディBC2-Nb又は上記で定義されたその変異体である。
【００８４】
タグ特異的抗体と接触されることになる試料は、タグ付けされたポリペプチドを含む任意のタイプの試料であってもよく、ポリペプチドを分離するために処理されてもよい。好ましくは、試料は、タグ付けされたポリペプチドを含む溶液、例えば宿主細胞の溶解物又は体液、あるいは上清、例えばコンストラクト又はタグ付けされたポリペプチドを含む宿主細胞を含む液体の遠心分離によって得られた上清であって、宿主細胞が液体中にタグ付けされたポリペプチドを分泌し又は別の方法で輸送することができる、上清である。
【００８５】
ポリペプチド、例えば目的のタンパク質を精製するために本発明の方法で使用される抗体、断片又は変異体は、溶液で使用されるか又は固定化され得る。本発明のエピトープタグ又は断片若しくはその変異体に対する親和性リガンド、例えば抗体を固定化するために、親和性リガンド、例えば抗体、断片又は変異体、又はその混合物は、試料担体、固体支持体、又はマトリックスに結合され得る。この固定化ステップは、エピトープタグへの親和性リガンド、例えば抗体の結合の前又は後に行うことができる。親和性リガンド、例えば抗体及びその部分を固定化するための方法は、当業者によく知られており、結合特性を損なうことなく固定化を可能にする任意の方法を使用することができる。
【００８６】
本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体が固体支持体に固定化されていない場合、当該方法は任意により、複合体を単離するためのさらなるステップを含むことができ、例えばその単離は、例えば複合体又は（エピトープ特異的抗体がIgG抗体である場合）抗体の定常部に特異的である二次抗体のような、複合体のための結合パートナーを用いることによって行われる。二次結合パートナーは溶液であるか、あるいは固体支持体に固定化され又は固定化可能であり得る。
【００８７】
用語「固体支持体」又は「マトリックス」は、本発明の文脈において、親和性リガンド、例えば抗体又はその部分の固定化に使用することができる任意のタイプの担体材料を指すものとし、そして当該用語は、粒子（例えば抽出カラムに一般的に使用されるビーズ又は顆粒）又はシート状（例えば膜又はフィルター、ガラス又はプラスチックスライド、マイクロタイターアッセイプレート、ディップスティック（dipstick）、毛細管充填装置など）であって、扁平、ひだ状、又は中空繊維又は管であり得る、シート状の材料を指すことができる。好適かつよく知られているマトリックスは、網羅的ではないが；シリカ（多孔性非晶質シリカ）、アガロース又はポリアクリルアミド支持体、又はマクロポーラスポリマーである。例としては、デキストラン、コラーゲン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、メタクリレート、セルロース、アルギン酸カルシウム、制御多孔ガラス（controlled pore glass）、アルミニウム、チタン及び多孔質セラミック、合成ポリマー及びコポリマー、ラテックス、シリカ、アガロース、金属、ガラス、炭素が挙げられる。あるいは、固体表面は、質量依存性センサー、例えば、表面プラズモン共鳴検出器の一部を含んでもよい。好都合には、固体表面に結合又は固定化された本発明のエピトープタグに特異的に結合することができる、複数の個別の親和性リガンド、例えば抗体又は抗体断片を含むアレイが提供される。このアレイは、固定化された親和性リガンド、例えば抗体又は抗体断片と溶液とが接触するとすぐに、溶液に含まれるタグ付けされたポリペプチドを捕捉するために使用することができる。
【００８８】
捕捉ステップ後のさらなるステップにおいて、タグ付けされたポリペプチドに結合した固定化されたタグ特異的親和性リガンドを含む固体支持体は、任意により、未結合及び非特異的結合成分を除去するために洗浄される。リガンド及びポリペプチドの固定化された複合体はこの形態で使用することができる。
【００８９】
任意により、さらなるステップにおいて、タグ付けされたポリペプチドは、単離されたポリペプチド、例えば目的のタンパク質を得るために溶出され得る。固定化された抗体に結合したタグ付きタンパク質の溶出は、当該技術分野で知られている方法によって達成することができる。例えば、タグ付けされたタンパク質は、本発明の単離されたエピトープペプチドとの競合溶出によって溶出することができる。次に、この単離されたエピトープペプチドは、タグ付けされたポリペプチドと競合して、固定化されタグ特異的抗体に結合することになる。単離されたポリペプチドが余剰濃度で添加される場合、結合の反応バランスは、単離されたエピトープタグと固定化された抗体の結合にシフトすることになる。これは、タグ付けされたポリペプチドの放出をもたらす。次に、放出されたポリペプチドをさらに精製するための付加的なステップ、例えば当業者によく知られている方法ステップが任意により追加されてもよい。
【００９０】
タグ付けされたポリペプチドはまた、固体支持体、例えばビーズに固定化されたままであってもよく、溶出ステップ無しに質量分析のような下流適用でさらに処理されてもよい。
【００９１】
別の好ましい実施形態では、切断部位を有するリンカーを含むタグ付けされたタンパク質、例えばタグ付けされたポリペプチドが、適切な手段、例えばタグを除去するためのプロテアーゼで切断されてもよく、それによって、ポリペプチドは固定化された抗体から放出され、そしてポリペプチドをその天然形態で得ることができる。この実施形態のために、ポリペプチドをコードする核酸配列は、エピトープタグをコードする配列だけでなく、破断可能な部位、例えばプロテアーゼによって認識される切断部位を有するリンカーをコードする配列も含むべきである。酵素的切断による放出ステップは溶出ステップに代えても、又は溶出ステップに続いてもよい。
【００９２】
本発明はまた、本発明の方法を実施するために必要な構成要素を含むキットを含む。
【００９３】
一実施形態では、タグ付けされたポリペプチドの捕捉及び／又は検出のためのキットが提供される。
【００９４】
本発明の捕捉及び／又は検出の方法を実施するために適した本発明のキットは、以下の構成要素を含む：
−  本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクト；
−  本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体；
−  任意により検出可能部分；並びに
−  本発明の捕捉及び／又は検出方法に必要な緩衝液及び試薬。
【００９５】
本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクトは、上記のように及び当業者に知られているように、宿主細胞に導入されることになる。キットはこれに関して、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクトを宿主細胞に導入するのに必要な緩衝液及び試薬も含む。
【００９６】
本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンドは、好ましくは抗体、最も好ましくはナノボディBC2-Nb又は上記で定義したその変異体である。
【００９７】
本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体は、少なくとも１つの検出可能部分を含むことができる。キットはまた、少なくとも１つの二次結合パートナーを含むことができ、当該少なくとも１つの二次結合パートナーは、複合体又はその構成要素の１つの上に設けられたユニットに結合することができる、例えば、複合体又はその構成要素の１つがビオチン化されている場合にはアビジン又はストレプトアビジン、あるいは、タグ付けされたポリペプチドと抗体のような親和性リガンドとから構築された複合体を捕捉するための二次及び三次抗体である。これらさらなる抗体は、例えばポリペプチド又はエピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体の他の部分に特異的であり、あるいは、ポリペプチド、親和性リガンド、例えば抗体又は複合体に設けられたユニットに特異的であり、例えば本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる一次親和性リガンド又は抗体の定常部に特異的である。さらなる抗体はまた、検出可能部分を含む。
【００９８】
本願で定義された親和性リガンド、例えば抗体は、本発明のエピトープペプチドを含むポリペプチドを検出、捕捉、及び／又は精製するために特に有用である。それゆえ、本発明の一態様は、本明細書に定義したエピトープ特異的親和性リガンド、例えば抗体の使用であって、特に、本発明のエピトープペプチドを含むポリペプチドを検出、捕捉、及び／又は精製するためのナノボディの使用である。
【００９９】
キットはさらに、固体支持体を含むことができ、当該固体支持体は、固体支持体に固定化又は付着した本発明のエピトープペプチドに特異的に結合する親和性リガンド、例えば抗体を含む。
【０１００】
検出可能部分は、上記で定義した任意の検出可能部分であり得る。好ましくは、検出可能部分は蛍光標識である。
【０１０１】
さらなる実施形態では、タグ付けされたポリペプチドの捕捉及び精製のためのキットが提供される。
【０１０２】
タグ付けされたポリペプチドの精製のためのキットは、以下の構成要素を含む：
−  本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクト；
−  本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体；
−  任意により固体支持体；並びに
−  本発明の捕捉及び精製方法に必要な緩衝液及び試薬。
【０１０３】
本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクトは、上記のように及び当業者に知られているように宿主細胞に導入されることになる。キットはこれに関して、本発明のエピトープペプチドをコードする核酸又は核酸発現コンストラクトを宿主細胞に導入するのに必要な緩衝液及び試薬も含む。
【０１０４】
本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体は、好ましくはナノボディBC2-Nb又は上記で定義したその変異体である。
【０１０５】
本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体は、溶液であるか、あるいは固体支持体に固定化又は付着され得る。キットはまた、上記に概説したさらなる結合パートナーを含むことができる。さらなる結合パートナーはまた、検出可能部分を含み得る。
【０１０６】
固体支持体は上記で定義した任意の固体支持体であってもよく、親和性リガンド、例えば抗体の固体支持体への固定化又は付着の好適な方法は当業者によって選択され得る。
【０１０７】
キットはまた、本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体から捕捉されたタグ付きポリペプチドを放出するのに適した試薬を含むことができる。したがって、キットは例えば、単離された本発明のエピトープペプチドを含むことができる。当該キットは酵素を含むこともでき、当該酵素は、ポリペプチドからタグを切断することによって、本発明のエピトープペプチドに特異的に結合することができる親和性リガンド、例えば抗体から捕捉されたタグ付きポリペプチドを放出することができる。例えば、酵素は、プロテアーゼ、例えばTEVプロテアーゼ、トロンビン、第Xa因子プロテアーゼ、又はPreScission プロテアーゼであり得る。
【実施例】
【０１０８】
実施例
本発明の好ましい実施形態を以下の実施例で概説するが、実施例は本発明の範囲又は趣旨を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１０９】
実施例1：概要
一価のBC2-Nbを固体マトリックスに共有結合することによって、BC2ナノトラップを生成した。これは、先に記載されたGFPナノトラップに類似した非常に効率的なプルダウン試薬として役立ち[4]、GFPナノトラップは細胞溶解物からGFPタグ付けされた複合体を精製するために広く使用されるようになる[5]。BC2ナノトラップの優れた結合特性は、例えば結合反応においてカオトロピック剤（最大4 Mの尿素又は1.5 MのGdmCl）又は変性界面活性剤（2% SDS）を用いる高度競合結合条件を適用する、プロテオーム解析に好ましい[6]。結合したタンパク質が変性条件下でのみ放出されるGFPナノトラップとは対照的に、BC2ナノトラップ-結合タンパク質は、単に少量のBC2-ペプチド（0.1〜1 mM）を用いるペプチド競合によって、機能的立体配座で溶出することができる。位置クローニングは、N又はC末端に配置されたBC2-タグが、BC2ナノトラップによって等しく十分に認識されることを明らかにした。N末端にタグ付けされたGFPのために、非結合画分における追加のバンドを観察した。これは、BC2-タグが細胞溶解時にタンパク質分解的に除去されたかもしれないことを示し、この現象は哺乳動物発現系における他のエピトープタグについて既に記載されている[7]。
【０１１０】
本研究で説明されたBC2ベースの捕捉及び検出システムは、現在利用可能なエピトープ-タグシステムに代わる魅力的な選択肢である。BC2-Nbが〜1.4 nMのKDでBC2-エピトープタグ付けされたタンパク質に結合し、従って、利用可能なFLAG、HA、c-myc又はナノボディ由来EPEA-システムと比較して〜10〜100倍高い親和性を示すことが、本発明の発明者らによって示された[8-10]。
【０１１１】
近年、β-カテニンのアミノ酸配列内の異なるエピトープを認識するβ-カテニンに対するナノボディが生成された。これら抗体は、細胞内の内在性β-カテニンをモニタリングするために使用された[11]。これらNbsの１つは、BC2-Nbと呼ばれ、β-カテニンのaa 16 - 27に対応する短い線状エピトープを認識する。
【０１１２】
ここでは、BC2-Nbの詳細な構造的及び生化学的分析、並びにそのペプチドエピトープとの相互作用（以後、BC2-タグ（BC2T）と称する）が提供される。データは、「ヘッドロック結合」と称される、伸長したCDR3及びBC2-Nbのフレームワークによって媒介された独自の結合機構を明らかにしている。BC2-Nbの高親和性結合特性に基づいて、新規なBC2-タグ精製及び検出システムを開発し、特徴づけた。固定化されたBC2-Nbは、ネイティブに折りたたまれた状態で細菌及び哺乳動物細胞抽出物から、BC2タグ付けされたタンパク質を効率的に捕捉及び精製することが示されている。共局在分析によって、初めて、蛍光標識されたナノボディを用いたペプチドタグ付けされた細胞タンパク質の検出を示すことができた。現在、この多用途な捕捉及び検出システムは、この小さな不活性ペプチドタグを含む多くの種類のタンパク質の生化学分析及び顕微鏡分析の独自の組み合わせを可能にする。
【０１１３】
非常に高い親和性（KD〜1.4 nM）で短い線状ペプチドに結合するナノボディを生成した。BC2-Nb/BC2-ペプチド複合体の構造分析は、BC2ペプチドが付加的な逆平行p-鎖を形成する独自の結合様式を明らかにし、ここで、当該付加的な逆平行p-鎖は、CDR3及びフレームワーク領域によって形成されたβ-シート構造に挿入される。多数の骨格水素結合が親和性を提供し、CDR3のArg106とFR2のGlu44との間の塩橋が、ヘッドロック様の様式で結合したペプチドを受け入れる。タンパク質データバンク（PDB）で利用可能な全てのナノボディ複合体との比較は、そのような結合様式が、81個の既知の結晶化複合体のいずれにおいてもこれまでに観察されていないことを示している。ヘッドロック突然変異BC2-Nbsの親和性測定値は、〜10倍低下した結合親和性及びより高いoff-rateを示す。これらのデータは明らかに、ヘッドロックの主要な機能がナノボディに既に結合したペプチドを固定することにあることを示唆している。
【０１１４】
位置走査ペプチドライブラリーを用いたエピトープ分析は４つの特異性決定残基の小さなセットを明らかにし、最も重要なのはW10であった。対照的に、他の残基は、主にそれらが接触に関与していないために、結合特異性に寄与していない。親和性を生じるための多くの骨格相互作用への依存性及び特異性のためのわずか４つのアミノ酸側鎖が、BC2T/BC2-Nbシステムを特に多用途にしている。BC2T残基のほとんどが結合効率を犠牲にすることなく置換され得、これは個々の用途のためのタグの直接的な適合を可能にし、電荷修飾、280 nmでの吸光度増大のためのトリプトファン残基の付加、又はプロテアーゼ切断部位の導入又は標識目的のための独自のアミノ酸も挙げられる。
【０１１５】
最後に、BC2-Nbが細胞イメージングのための新たな機会を提供することを研究は示している。基本的に、ナノボディは、利用可能な有機色素の全範囲を用いた部位特異的標識によって容易に修飾することができ、かつ、検出のための二次抗体を必要とすることなく細胞構造の直接イメージングに適用される。近年、光活性化局在性顕微鏡法（PALM）-適合性有機色素、例えばAlexaFluor 647（AF647）で標識されたGFP-及びRFP-特異的ナノボディが、高解像度顕微鏡で蛍光融合タンパク質を効率的に可視化することが実証された。立体障害あるいは大きなタグ、例えばGFP-又はRFPに由来する潜在的な連結誤差を最小限に抑えるために、より小さなエピトープを認識するナノボディに対する継続的な要求が依然として存在する。本研究において、蛍光標識されたペプチド-特異的ナノボディを、別個の細胞内構造、例えば中間経フィラメントのネットワーク又は複製機構の本質的部分の可視化に用いることができることが初めて実証された。これらの発見に基づいて、BC2媒介検出システムが現在利用可能な手法と比較して独自の利点を提供することが、本発明者らによって提唱された。第１に、その小さなサイズにより（12 aa、1.4 kDa）、BC2-タグは、異所的に発現されたタンパク質の細胞内局在又はフォールディングを妨げない。第２に、小さなナノボディ（2 x 4 nm）の使用は、検出シグナルを対応する抗原に直接リンクさせる。第３に、BC2ナノボディは、例えば適切な高解像度適合色素を用いた部位特異的標識のために、容易に修飾することができる。要約すると、BC2タグ付けされたコンストラクトのナノボディ媒介標識は、現在、最小限のエピトープタグを有機色素の高い光子収率及び最小限の連結誤差と組み合わせる。
【０１１６】
実施例2：エピトープ結合の構造的基礎
記載されたNbsのほとんどが立体配座エピトープを有するので、観察された高親和性結合の根底にある分子機構を、BC2-Nb単独（1.8 Åの分解能）及びBC2Tとの複合体（1.0 Å）での高分解能結晶構造を解くことによって調査した。以後、結果の提示及び考察を容易にするために、BC2Tアミノ酸を１文字コードで、及びBC2-Nbアミノ酸を３文字コードで参照することにする。アミノ酸位置は、配列番号4に定義されたように、12個のアミノ酸からなるエピトープタグにおけるアミノ酸残基の位置を参照している（PDRKAAVSHWQQ）。
【０１１７】
BC2-Nbは、典型的な免疫グロブリンフォールドをとり、これは、ループによって及びCys22とCys96との間の保存されたジスルフィド結合によって連結された２つのβ-シートを形成する９つのβ-鎖からなる（図5 a）。他のナノボディ構造と同様に、BC2-Nbは特に長いCDR3を特徴とし、このCDR3は14個のアミノ酸を含み、かつCys102（CDR3に位置する）とCys50（フレームワーク領域2（FR2）に位置する）との間に形成された付加的なジスルフィド結合によって安定化される（図5 a）。BC2Tは伸長立体配座でBC2-Nbに結合し、BC2-NbのCDR3とFR2及びFR3との間の溝に挿入される。ペプチドはBC2-Nb構造に組み込まれ、β-シート内に鎖を形成する（図1 a）。これは、隣接する二次構造要素にペプチドを固定する多数の骨格水素結合をもたらす。特に、CDR1もCDR2もBC2Tとの相互作用に関与していない（図1 a、以下の表2）。
【０１１８】
【表３】
2019504637.tif 000005
【０１１９】
未結合及び結合BC2-Nb構造は類似しており、かつ原子位置0.4 Åの小さな全体の平均二乗偏差（root mean square deviation ）（RMSD）で重ね合わせることができる（Phenix構造比較）。CDR3ループは、ほぼ180度反転している２つのアミノ酸（Arg106及びTyr107）を除いて、特に類似した配向を有する（図5b）。リガンド非結合BC2-Nbにおいて、Arg106のβ-炭素は、Nbのコア構造に向かって配向しており、同時に、Arg106側鎖はGlu108の骨格カルボニル基と及びTyr109のπ-電子系と相互作用する。Tyr107のβ-炭素はNbから離れて位置しており、芳香環はArg45とのカチオン-π相互作用に関与している。複合体において、残基Arg106及びTyr107は、それらのβ-炭素及びそれらの側鎖が反対側を向いているので、反転している。Arg106はここでは、FR2に位置するGlu44の側鎖との電荷媒介相互作用に関与している（図1b）。本発明者らによって「ヘッドロック」と称されるこの独自の相互作用は、結合したペプチド上に達し、それを所定の位置にしっかりとロックする。いくつかの直接的かつ水媒介性の相互作用は、ペプチドをその結合部位に固定する（図1 c）。しかしながら、BC2T残基の小さなサブセットのみがこれらの接触に関与している：R3はAsp110と塩橋を形成し、S8はLys103のカルボニル基との水素結合に関与し、また、Tyr109と一緒になって水分子を複合させ、そして、W10は、Cys50とのCH-π 相互作用並びにCys102のカルボニル基との水素結合の両方を形成する疎水性ポケットに埋め込まれる（全ての相互作用の完全な概要を図6に示す）。
【０１２０】
BC2-Nbの結合特性に対する点突然変異の影響を調査した。まず、CDR3及びFR2を接続する付加的なジスルフィド結合を、Cys50をアラニンで、そしてCys102をセリンで置換することによって除去した（BC2-NbC50A_C102S）。C末端ペプチドタグとしてBC2Tを含む修飾GFP（GFPBC2T）を用いた結合研究は、この突然変異が完全な結合の消失をもたらすことを明らかにした（データは示さず）。この結果に対する最も可能性のある説明は、ジスルフィド架橋が、BC2Tとの接触の大部分に寄与するCDR3の構造を維持するために必要であるということである。次に、結合に対する「ヘッドロック」モチーフの寄与を分析した。Arg106をセリン（BC2-NbR106S）又はグルタミン酸（BC2-NbR106E）のいずれかで置換し、表面プラズモン共鳴（SPR）測定をGFPBC2Tコンストラクトを用いて行った。両方の突然変異タンパク質は、〜11 nMのKD値を生じ、これはBC2-Nb（KD：1.4 nM）と比較して約10倍低い（以下の表3、図7）。興味深いことに、wt及び突然変異タンパク質は同様のon-rateを示したが、一方で両方の突然変異体において有意により高いoff-rateが観察された（表3）。要約すると、親和性におけるわずかな変化は構造解析と一致する。伸長したペプチドの１３の骨格相互作用が、相互作用の高い親和性に明らかに寄与している。「ヘッドロック」は、wtタンパク質のより低い解離速度によって示されたように、結合したペプチドを固定するのに役立つ可能性が最も高い。
【０１２１】
【表４】
2019504637.tif 000006
【０１２２】
実施例3：合成位置走査ペプチドライブラリーを用いた詳細なエピトープ分析
高親和性結合及び反応速度論は観察された構造的特徴によって説明することができるが、複合体形成の特異性は他になければならない。BC2T残基のサブセットのみがNbとの特異的な側鎖媒介性接触に関与しているので、位置走査ペプチドライブラリーを用いた結合のためのこれら個々のアミノ酸の寄与を調べた。合計で、ペプチドの１つの単一位置に20個全てのタンパク質構成（proteinogenic）アミノ酸を示す12個の異なるBC2Tライブラリーを、免疫沈降実験に使用した。BC2Tライブラリーを、液体クロマトグラフィー、次いで固定化されたBC2-Nb、BC2-NbR106S又はBC2-NbR106Eによる免疫沈降の前後に質量分析に供した。プルダウン後の非結合画分に残っているペプチドを決定することによって、非結合ペプチドの組成及びこれに対応する不変アミノ酸位置（以下の表4）をマッピングした。具体的には、BC2-Nb又はその突然変異体の上清、及び非BC2T関連対照Nb（GFP-特異的Nb）の上清におけるペプチドの比較分析によって、沈降したペプチドを同定した。GFP-Nbとの直接的な比較は、標識された標準を必要とせずに、ペプチド捕捉の定量的な程度の決定を可能にした。したがって、ペプチドがBC2-Nbによって捕捉されなかった場合、図2に与えられた比は１であるか又は１に近い。より多くのペプチドが捕捉されるほど、値は0に近づく。イソロイシン（I）とロイシン（L）ペプチドバージョンとは、これらペプチドが同重体であるために、区別することができなかった。しかしながら、I/Lを含む２つのペプチドバージョンは分割され、従って２つの値が結果として与えられる。
【０１２３】
分析は、配列番号4の1、2、4、5、7、9、11、及び12位のBC2T残基が、エピトープ結合特性に影響することなく置換され得ることを示している（以下の表4）。これらの結果は、８つ全ての残基の側鎖がNbから外側を向いていることを示す構造と一致している。しかしながら、R3、A6、S8及びW10のBC2Tライブラリーの上清の分析は、これら位置での他のアミノ酸に対するナノボディの交差反応性がほとんどないことを明らかにした（図2 a - d）。特に、R3のBC2Tライブラリー（BC2TR3X）からの結合ペプチドは、塩基性を有するいずれかの残基、すなわち K3若しくはH3又はより小さな側鎖を含む残基、すなわちT3若しくはV3を有する（図2 a）。この観察は、R3とAsp110との間の塩橋がH3又はK3によって形成される可能性もあるので、結晶構造と一致している。システイン、バリン、トレオニン及びセリン置換体がライブラリーから効率的に取り出されたので、BC2TA6Xライブラリーの分析は、6位の小さなアミノ酸に対するBC2-Nbの有意性を明らかにした。この位置にグリシン、ロイシン又はイソロイシンを含むペプチドはより少ない量で取り出された（図2b）。これらの結果は、A6側鎖がBC2-Nbの小さな疎水性ポケットに向いている結晶構造と一致している。より大きなアミノ酸（すなわちロイシン、イソロイシン）の結合は、立体配座の再編成を必要とすることになり、グリシンは付加的な柔軟性を導入することになる。同様の効果がBC2TS8X-ライブラリーについて観察された。アラニン、システイン、トレオニン及びバリンはS8を置換することができ、一方で他の残基が軽度に捕捉された（図2c）。S8のヒドロキシル基は、ナノボディのLys103のカルボニル基と水素結合を形成する。システイン及びトレオニンは、幾分類似した生産的相互作用に関与することができ、一方でバリンは少なくとも適応され得る。W10置換体のいずれもBC2-Nbによって捕捉されなかったので、10位のトリプトファンは本発明者らのペプチドスキャニング研究では不変の特異性決定アミノ酸であると思われる（図2d）。これは、W10側鎖がナノボディ上の疎水性ポケットに深く挿入されることを示す構造解析と非常に一致している。
【０１２４】
突然変異体BC2-NbR106S及びBC2-NbR106Eについてのエピトープスキャンニングの結果は、１つの注目すべき例外を除いてBC2-Nbとほぼ同一である。BC2TA6Xライブラリーの分析は、BC2-Nbとは対照的に、突然変異Nbsが6位にリシン又はアルギニンを有するBC2T変異体もわずかに沈降したことを明らかにした（図2b）。この観察は、ヘッドロック形成Arg45のSer又はGluによる突然変異が、幾分低いペプチド特異性をもたらすことを示唆している。要約すると、限られたアミノ酸の可変性を有するか又はアミノ酸可変性を有さないBC2Tの４つの位置が同定された。結果は、R3、S8及びW10の側鎖がBC2-Nb相互作用に直接的に関与しており、一方で、A6の置換体がおそらく立体的に不利であり、かつヘッドロック結合の形成を妨げ得ることを示す、構造に一致している。まとめると、この分析は、側鎖相互作用の小さなサブセットがBC2T配列についてのBC2-Nbの特異性を決定するのに役立つことを確認する。
【表５−１】
2019504637.tif 000007
【表５−２】
2019504637.tif 000008
【表５−３】
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【０１２５】
実施例4：BC2Tベースの捕捉システムの生成
BC2-Nbの独自のリガンド結合様式に基づいて、BC2Tベースの親和性システムを開発することを目的とした。精製BC2-Nbをセファロースビーズに共有結合させ、「BC2ナノトラップ」と呼ばれる親和性マトリックスを生成した。まず、粗溶解物から直接BC2Tタグ付けされたタンパク質を沈殿させるBC2ナノトラップの能力を試験した。それゆえ、C末端にタグ付けされたGFP（GFPBC2T）又はwtGFP（対照）のいずれかを発現する大腸菌細胞の可溶性タンパク質画分をBC2ナノトラップとインキュベートし、インプット、非結合及び結合画分を、SDS-PAGE次いでクーマシー染色及びイムノブロッティングによって分析した（図3a）。得られたデータは、BC2ナノトラップが定量的にGFPBC2Tを沈殿させることを示している。次に、BC2T精製を、様々な非変性界面活性剤（NP-40、Triton X100、CHAPS又はTween 20、0.1〜1% w/v）の存在下又は増加する塩濃度（0〜500 mM NaCl、2 - 50 mM KCl、2〜20 mM MgCl2）で行った。これら試薬のいずれも結合効率に影響を及ぼさないようであった（データは示さず）。さらに、抗原結合を、結合緩衝液中のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）又はカオトロピック剤（GdmCl；尿素）の濃度を上昇させることによって変性条件下で試験した。BC2ナノトラップが、2% SDS、4 Mの尿素又は最大で1.5 MのGdmClの存在下でその抗原を効率的に沈殿させることが観察された（図3b）。これは、BC2ナノトラップが厳しい条件下で機能的に活性なままであることを示している。
【０１２６】
いくつかの場合には、厳しい結合及び溶出条件は高純度のタンパク質を得るために好ましいかもしれないが、結合したタンパク質のほとんどがおそらく変性され、かつ生物学的活性を維持しない。従って、より穏やかな溶出条件を、MgCl2（0.5 M〜4 M）、チオシアン酸ナトリウム（NaSCN、1〜3 M）又はpH媒介放出（酸性；pH 1〜2.5又はアルカリ性；pH 10〜12）を用いて試験した。結合したGFPBC2Tの遊離は、BC2ペプチドの増加する濃度（PDRKAAVSHWQQ、0.01〜1 mM）を添加する競合溶出によっても試験した。MgCl2とのインキュベーションはGFPBC2Tを溶出せず（データは示さず）、一方で、高濃度のNaSCN又は酸性溶出（pH 1.5）による処理は、結合したタンパク質の30%〜40%の放出をもたらした（図3c、上部パネル）。対照的に、高pH（pH 11及び12）を用いたアルカリ性溶出は、40〜80%のより効率的な放出を明らかにした。特に、競合溶出は〜60%と非常に効率的であり、GFPBC2Tの〜80%がそれぞれ0.1 mM及び1 mMのBC2ペプチドの添加後の溶出画分に検出された（図3c、下部パネル）。また、GFPの蛍光はNaSCN又は酸性pHによる処理時に劇的に影響を受けたが、アルカリ性pH又はペプチド溶出は完全な蛍光GFPを得た（図8）。これらの結果は、BC2ペプチドがBC2-結合タンパク質をそれらのネイティブに折りたたまれた状態で効率的に置換することができることを示している。
【０１２７】
BC2-捕捉システムを、ヒト細胞に由来する組み換えタンパク質の１ステップ精製についてさらに分析した。具体的には、BC2-タグの末端位置が結合に影響を与えるかどうかを調査した。この目的のために、N-末端（BC2TeGFP）又はC-末端（eGFPBC2T）のいずれかにBC2-タグを含む修飾GFPを、陰性対照としてタグ付けされていないeGFPを用いて、ヒト胎児腎臓（HEK）293T細胞で発現した。トランスフェクションの２日後、 可溶性タンパク質画分を生成し、BC2ナノトラップを用いて免疫沈降に供した。インプット、非結合及び結合画分を、SDS-PAGE、次いでクーマシー染色及びイムノブロッティングによって分析した（図3 d）。結果は、N及びC末端にBC2タグ付けされたGFPコンストラクトはいずれもBC2ナノトラップによって効率的に沈降したが、陰性対照ではGFPは検出されなかったことを示す。わずかに小さいGFP断片がBC2TeGFPの非結合画分に現れた。このバンドは結合レーンには現れていないので、それは細胞溶解手順の間にN末端BC2-タグのプロテアーゼ媒介性除去によって現れたと仮定される。
【０１２８】
次に、BC2ナノトラップが、中間径フィラメント又は核複製機構のBC2タグ付けされた細胞成分を沈降させることができるかどうかを試験した。BC2TをmCherry-ビメンチン（mCherry-VIMBC2T）又はeGFP-PCNA（eGFP-PCNABC2T）のいずれかと遺伝的に融合し、両方のコンストラクトをHEK293T細胞で発現した。対照として、BC2-タグを含まない対応するコンストラクトを使用した。可溶性タンパク質抽出物をBC2ナノトラップとインキュベートし、全溶解物（インプット）、非結合及び結合画分を、抗ビメンチン又は抗PCNA抗体を用いるイムノブロッティングによって分析した。結果は、mCherry-VIMBC2T及びeGFP-PCNABC2TのいずれもBC2ナノトラップにより効率的に沈降したが、タグ付けされていないタンパク質の結合画分ではシグナルは検出されなかったことを示している（図9a）。次の問題は、BC2-NbもイムノブロッティングにおいてBC2タグ付けされたタンパク質を検出することができるかどうかであった。従って、精製ナノボディを有機色素AlexaFluor488に化学的に結合させることによって、蛍光標識されたBC2-Nbを生成し（BC2-NbAF488）、それを使用して、eGFP-PCNA、eGFP-PCNABC2T、mCherry-VIM又はmCherry-VIMBC2Tを発現する細胞の可溶性タンパク質画分でイムノブロットをプローブした。結果は、BC2-NbAF488がBC2タグ付けされたタンパク質に高度に特異的である一方で、タグ付けされていないタンパク質は検出されなかったことを示す（図9 b）。最後に、BC2-NbがBC2タグ付けされたタンパク質の存在下で内在性β-カテニンも認識するかを問うた。BC2-NbAF488によるウェスタンブロットではβ-カテニンについてのシグナルは検出されなかったが（図9 b）、過剰発現されたBC2タグ付きタンパク質と比較してわずかな量のβ-カテニンがBC2ナノトラップでの沈殿後に結合画分に見出された（図9 c）。
【０１２９】
要約すると、結果は、BC2T/BC2-Nb親和性システムが、ネイティブな（すなわち非変性）及び変性条件下での異なる発現系からのBC2タグ付き組み換えタンパク質の堅牢かつ便利な１ステップ精製を可能にすることを示す。イムノブロット検出において観察された機能性と組み合わせて、システムは、広範囲の生化学的分析のためのBC2タグ付けされたタンパク質の捕捉及び検出の全範囲をカバーする。
【０１３０】
実施例5：蛍光標識されたBC2-Nbを用いた免疫細胞化学
多数のナノボディが、細胞表面に位置する疾患関連抗原の分子イメージングについて記載されている[12-14]。今までのところ、細胞イメージングのためにナノボディを使用した研究はほとんどない[15]。それゆえ、蛍光標識されたBC2-Nb（有機色素AlexaFluor488又はATTO647と結合された（BC2-NbAF488；BC2-NbATTO647））がBC2タグ付けされた細胞タンパク質を可視化するのに適しているかを試験した。関連する細胞標的構造を生成するために、以前に記載された融合コンストラクトmCherry-VIMBC2T又はGFP-PCNABC2Tをヒト細胞で発現した（図4 a）。ビメンチンの蛍光コンストラクトは、細胞中間径フィラメントネットワークに組み込まれ、一過性細胞発現時に細胞質内でビメンチン繊維を可視化する一方で[16]、GFP-PCNAはDNA複製部位で見出され、細胞周期のS期中に核内で特徴的なスポット状の構造を形成する[17]。適用された融合タンパク質の特徴的なパターンは、色素標識BC2-Nbsによる免疫細胞化学を用いた共局在研究の実施を可能にする。
【０１３１】
BC2-NbAF488でmCherry-VIMBC2Tを発現するHeLa細胞を染色することによって、赤色チャネルで示された細胞質ビメンチン構造に沿った緑色ナノボディシグナルの強い共局在（図4 b、図10 a）が観察された。相応して、BC2-NbATTO647は、S期中の複製焦点（replication foci）でGFP-PCNABC2Tとの明らかな共局在を示した。GFP-PCNABC2T及びBC2-NbATTO647両方のシグナルはもっぱら核内に見られ、BC2-Nbの結合特異性を実証した。BC2-タグを欠いたmCherry-VIM又はGFP-PCNA コンストラクトを発現する細胞において、ナノボディシグナルは検出されなかった（図10b）。これらデータは、蛍光標識されたBC2-Nbが異所的に発現したBC2T融合タンパク質に特異的に結合し、それゆえ、免疫細胞化学における直接抗原検出に適用することができることを実証している。
【０１３２】
実施例6：プルダウンアッセイにおけるBC2-Nbの結合効率に対する複数突然変異又はBC2タグ内での切断の影響の分析
実施例3で概説したように、配列番号4の1、2、4、5、7、9、11及び12位のBC2T残基は置換することができることが実証された。これは、ペプチドの１つの単一位置に20個のタンパク質構成アミノ酸を全て表示する位置走査ペプチドライブラリーを用いて示された。
【０１３３】
結合特性に対するBC2T内のアミノ酸残基の複数の交換の影響をより詳細に研究するために、６つのアミノ酸残基を同時に交換することによってBC2Tの突然変異型を生成した。従って、2位のAsp（D）をVal（V）に、4位のLys（K）をSer（S）に；7位のVal（V）をLeu（L）に；9位のHis（H）をGln（Q）に；11位のGln（Q）をSer（S）に、そして12位のGln（Q）をSer（S）に、置換した。これによって、BC2T配列（配列番号5）として最初に同定されたアミノ酸残基の合計50%が変更された。得られたアミノ酸配列をBC2Tmutと呼ぶ。これらアミノ酸残基の同時交換が、突然変異BC2-タグ（BC2mut）を含むタンパク質のプルダウン効率に影響を及ぼすかどうかを試験するために、BC2TmutをGFPに遺伝的に融合した（GFPBC2Tmut）。プルダウン分析のために、wtGFP（対照）、C末端にBC2タグ付けされたGFP（GFPBC2T）又はGFPBC2Tmutのいずれかを発現する大腸菌細胞の可溶性タンパク質画分をBC2ナノトラップとインキュベートし、インプット、非結合、及び結合画分を、SDS-PAGE、次いでクーマシー染色及びイムノブロッティングによって分析した（図11参照）。得られたデータは、BC2ナノトラップがGFPBC2T並びにGFPBC2Tmutを定量的に沈殿させることを示す。このことから、示された位置でのアミノ酸残基の複数交換が、BC2ナノトラップに対する突然変異BC2Tの相互作用及び結合能に影響しないと結論付けることができる。
【０１３４】
次に、BC2TのN又はC末端切断がBC2-Nbへの結合特性に影響を与えるかどうかを分析した。それゆえ、２つのコンストラクトを生成した。第１のコンストラクト（BC2T-10と呼ぶ）では、BC2TのC-末端に位置する最後の２つのGln（Q）残基を欠失させ、配列PDRKAAVSHWを生じた。第２のコンストラクトについては、 BC2TのN-末端に位置する最初の２つのアミノ酸残基Pro（P）及びAsp（D）をさらに欠失させた（BC2T-8；RKAAVSHW）。結合研究のために、BC2T-10及びBC2T-8をGFPに遺伝的に融合した（GFPBC2T-10；GFPBC2T-8）。プルダウン分析のために、wtGFP（対照）、C末端にBC2タグ付けされたGFP（GFPBC2T）、GFPBC2T-10又はGFPBC2T-8のいずれかを発現する大腸菌細胞の可溶性タンパク質画分をBC2ナノトラップとインキュベートし、インプット、非結合及び結合画分をSDS-PAGE、次いで抗GFP抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した（図12参照）。得られたデータは、BC2ナノトラップが元のBC2Tでタグ付けされたGFP（GFPBC2T）と同等に、GFPBC2T-10並びにGFPBC2T-8を沈殿させることを示す。これは、BC2TのN又はC末端のいずれかに隣接する２つのアミノ酸残基の欠失が、BC2ナノトラップに対する切断BC2Tの相互作用及び結合能に影響を与えないことを実証する。
【０１３５】
実施例7：BC2Tの改善された変形の開発
合理的な設計アプローチを用いて、BC2Tの変形を、BC2-Nbに対するBC2タグの親和性をさらに改善することを目的として開発した。この目的のために、配列番号4の1、4、5、11及び12位のBC2T残基を、図1及び表4における構造的及び生化学的データ、並びに分子モデリングに基づいて置換した。
【０１３６】
pTag1配列番号33及びpTag2配列番号34と呼ばれるBC2Tの２つの変形が設計され、元のBC2T配列よりもBC2-Nbに対して高い親和性を示すことが見出された（表5、図13）。バイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry）を用いて、解離定数KDは、BC2-NbとpTag1配列番号33及びpTag2配列番号34との間の相互作用について、それぞれ、0.7 nM及び1.9 nMであると決定した。対照的に、元のBC2T（配列番号4）について、BC2-Nbとの相互作用についてのKDは、2.6 nMである（バイオレイヤー干渉法を用いて決定した）。特に、解離速度定数koffは元のBC2TについてよりもpTag1配列番号33 について7倍遅く（表5）、pTag1配列番号34についてのBC2-Nbの異常に高い親和性を説明する。
【０１３７】
これらBC2Tの改善された変形は、タンパク質精製及び免疫沈降における適用に有効である（図14）。タンパク質mCherryを、BC2T変形pTag1配列番号33及びpTag2配列番号34（及び比較のために元のBC2T配列番号4も）と、N末端又はC末端のいずれかで融合し、BC2ナノトラップとインキュベートした（図14a）。その後、捕捉した融合タンパク質を、100 μMの濃度で対応するペプチドを用いて溶出した。インプット、非結合タンパク質、溶出タンパク質、及び溶出後にBC2ナノトラップに依然として結合しているタンパク質の画分のSDS-PAGE分析は（図14a）、改善されたBC2タグがタグの位置に関わらず融合タンパク質の捕捉を可能にすることを示している。また、捕捉されたタンパク質は、遊離ペプチドを用いて、すなわちネイティブな、非変性条件下で溶出され得る。したがって、BC2Tの改善された変形は、そのようなBC2T変形に融合された目的のタンパク質の１ステップタンパク質精製に適用することができる。元のBC2Tと比較して、BC2-NBに対する改善されたBC2T変形の高い親和性は、タグ付けされたタンパク質のより効率的な捕捉をもたらし、最大で100 %のタンパク質が結合する（図14a）。
【０１３８】
BC2Tの改善された変形に融合した目的のタンパク質は、BC2ナノトラップを用いてある範囲の生物から沈殿させることができる。図14bに示されるように、タンパク質mCherryへのpTag1配列番号33のN末端融合は、BC2ナノトラップを用いて、ヒト細胞株HEK293T、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）昆虫細胞株High5、及び酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の溶解物からのこの融合タンパク質の高度に特異的な回復を可能にする。本実験（図14b）は当該技術分野で一般的な細胞株を使用し、これは、組み換え発現の関連システムからのタンパク質精製及び沈殿に対する、BC2T変形pTag1配列番号33を用いたタンパク質タグ付けとの併用におけるBC2ナノトラップの適用性を例示している。
【０１３９】
【表６】
2019504637.tif 000010
【０１４０】
表の凡例：BC2T（配列番号4）及び２つの改善されたその変形（pTag1配列番号33及びpTag2配列番号34）に対するBC2-Nbの結合を、バイオレイヤー干渉法を用いて分析した（生データについては図13を参照）。解離定数（KD）、会合（kon）及び解離（koff）速度定数並びに1：1 結合モデルのフィットの質のマーカー（χ2、R2）が列挙されている。動態は異なる方法を用いて分析されたため、元のBC2Tについて報告された定数は表1に列挙されたものと異なる。
【０１４１】
要約すると、合理的な設計アプローチは、BC2-Nbに対するより高い親和性を特徴とするBC2Tの改善された変形の開発を可能にした。これら改善された変形は、目的のタンパク質のN-末端又はC-末端に融合することができ、様々な生物からのそのような融合タンパク質の効率的な精製を可能にする。また、元のBC2Tのように、これら改善されたBC2Tタグは、ネイティブな非変性条件を用いてBC2ナノトラップから溶出することができる。
【０１４２】
実施例8：材料及び方法
発現プラスミド
C末端BC2タグ付きGFP（GFPBC2T）の細菌発現のために、pEGFP-C1（Clontech）を鋳型として使用した。GFPBC2Tをコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、オリゴヌクレオチドプライマーGFPBC2T_for（5´-GCA CCA TGG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G-3´；配列番号15）及びGFPBC2T_rev（5‘-GAC GTC GAC TTA CTG CTG CCA GTG ACT AAC A-3´；配列番号16）を用いて増幅した。PCR断片を、pTRC2A（Life Technologies）のNcoI/SalI制限部位にクローニングした。N末端His6-タグを有するC末端BC2タグ付きGFP（His6-GFPBC2T）の発現のために、GFPBC2Tをコードする配列を、PCRによって、オリゴヌクレオチドプライマーHis6-GFPBC2T_for（5´-CAG GGA TCC GAG TGA GCA AGG GC -3´；配列番号17）及びHis6-GFPBC2T_rev（5´-CAG GGT ACC TTA CTG CTG CCA GTG ACT AA -3´；配列番号18）を用いて増幅した。PCR断片をpRSET B（Invitrogen）のBamHI/KpnI制限部位にクローニングし、N末端His6-タグを付加する。
【０１４３】
50%修飾されたBC2タグを含むGFP融合コンストラクトを生成するために、pEGFP-C1（Clontech）を鋳型として使用した。GFPBC2Tmutをコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、オリゴヌクレオチドプライマーGFPBC2Tmut _for（5'-GGA TCC GAT GGT GAG CAA GGG CGA G-3'；配列番号19）及びGFPBC2Tmut_rev（5‘-GGT ACC TTA GCT GCT CCA CTG GCT CAG CGC CGC GCT CCG GAC CGG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC-3'；配列番号20）を用いて増幅した。PCR断片を、先に生成したGFPBC2T発現コンストラクトのBamHI/KpnI制限部位にクローニングした。
【０１４４】
N末端His6-タグ及びC末端短縮バージョンのBC2T（BC2T-10又はBC2T-8）を有するGFPをコードする細菌発現ベクターを生成するために、GFPBC2T-10又はGFPBC2T-8をコードする配列を、pEGFP-C1（Clontech）を鋳型として用いてPCRによって増幅した。PCRのために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した：His6-GFPBC2T-10_for：（5´-cccc GGA TCC GAT GGT GAG CAA GGG CGA GG-3´；配列番号21）及びHis6-GFPBC2T-10_rev（5´-cccc GGT ACC TTA CCA ATG TGA CAC CGC TGC TTT GCG GTC AGG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3´；配列番号22）又は His6-GFPBC2T-8_for（5´-cccc GGA TCC GAT GGT GAG CAA GGG CGA GG-3´；配列番号23）及びHis6-GFPBC2T-8_rev（5´-cccc GGT ACC TTA CCA GTG GGA AAC GGC TGC TTT ACG CTT GTA CAG CTC GTC CAT G-3´；配列番号24）。
【０１４５】
C末端BC2タグ付きGFPの哺乳動物発現のために、 pEGFP-C1を鋳型として使用した。哺乳動物eGFPBC2T コンストラクトをコードする配列を、PCRによってオリゴヌクレオチドプライマーeGFPBC2T_for（5´-AAG CTA GCG CTA CCG GTC GCC ACC ATG -3´；配列番号25）及びeGFPBC2T_rev（5´-AAG GTA CCT TAT TGC TGC CAG TGA CTA ACA GCC GCT TTT CTG TCT GGC TTG TAC AGC TCG TC -3´：配列番号26）を用いて増幅した。PCR断片を、pEGFP-C1ベクターのNheI/KpnI部位にクローニングした。
【０１４６】
N末端BC2タグ付きGFP（BC2TGFP）の哺乳動物発現のために、NheI及びBglII制限部位をそれぞれ有するBC2-Tag（5´-GCT AGC ATG CCC GAT CGT AAG GCT GCG GTC TCT CAT TGG CAA CAG AGA TCT-3´；配列番号27）をコードするヌクレオチド配列を合成した（MWG）。その後、タグをpEGFP-N1（Clontech）のNheI/BglII部位にクローニングした。得られたプラスミドをXhoI及びNheIで消化し、Klenow酵素（Roche）を用いて平滑末端化し、再連結して、所望のコンストラクトを得た。
【０１４７】
mCherry-VimentinBC2Tの哺乳動物発現のために、mCherry-Vimentinコンストラクト[18]を鋳型として使用した。mCherry-VimentinBC2Tをコードするヌクレオチド配列を、PCRによってオリゴヌクレオチドプライマーmCherry-VimentinBC2T_for（5´-AAA AGC TTA GGT GGA GGA GGT TCT TCC ACC AGG TCC GTG TC-3´；配列番号28）及びmCherry-VimentinBC2T_rev（5´-AAG GTA CCC TAT TGC TGC CAG TGA CTA ACA GCC GCT TTT CTG TCT GGT TCA AGG TCA TCG TG-3´；配列番号29）を用いて増幅した。PCR断片を、mCherry-VimentinベクターのHindIII/KpnI部位にクローニングした。
【０１４８】
GFP-PCNABC2Tの哺乳動物発現のために、GFP-PCNA [17]を鋳型として使用した。GFP-PCNABC2Tをコードする配列を、PCRによってオリゴヌクレオチドプライマーGFP-PCNABC2T_for（5´-GTA TGG CTT CGT GGG GAT CCC CG-3´；配列番号30）及びGFP-PCNABC2T_rev（5´-GGG GTC TAG ACT AAA GGT ACC CTA TTG CTG CCA GTG ACT AAC AGC CGC TTT TCT GTC TGG AGA TCC TTC TTC ATC CTC-3´；配列番号31）を用いて増幅した。PCR断片を、GFP-PCNAベクターのBamHI/XbaI制限部位にクローニングした。
【０１４９】
N末端His6-タグ及びC末端BC2T又はその変形を有するmCherryをコードする細菌発現ベクターを生成するために、BC2Tをコードする配列（配列番号4）及び変形pTag1配列番号33及びpTag2配列番号34をオリゴヌクレオチドとして合成し、アニーリングして、プラスミドベクターpRSET-B_mCherry（ThermoFisher Scientific）のBrsGI及びHindIII制限部位にクローニングした。この目的のために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：mCherry_BC2T_fw（5’-GTA CAG TGG TCC GGA TCG CAA AGC GGC GGT GAG CCA TTG GCA GCA GTA AA-3’：配列番号35）及びmCherry_BC2T_rv（5’-AGC TTT TAC TGC TGC CAA TGG CTC ACC GCC GCT TTG CGA TCC GGA CCA CT-3’；配列番号36）；mCherry_SEQ33_fw（5’-GTA CAG TGG TCC GGA TCG CGT GCG CGC GGT GAG CCA TTG GAG CAG CTA AA-3’；配列番号37）及びmCherry_SEQ33_rv（5’- AGC TTT TAG CTG CTC CAA TGG CTC ACC GCG CGC ACG CGA TCC GGA CCA CT-3’；配列番号38）；mCherry_SEQ34_fw（5’- GTA CAGT GGT GCG GAT CGC GTG CGC GCG GTG AGC CAT TGG AGC AGC TAA A-3’；配列番号39）及びmCherry_SEQ34_rv（5’- AGC TTT TAG CTG CTC CAA TGG CTC ACC GCG CGC ACG CGA TCC GCA CCA CT-3’：配列番号40）。
【０１５０】
C末端His6-タグ及びN末端BC2T又はその変形を有するmCherryをコードする細菌発現ベクターを生成するために、BC2T（配列番号4）及び変形pTag1配列番号33及びpTag2配列番号34をコードする配列を、オリゴヌクレオチドとして合成し、アニーリングし、C末端His6-タグをコードするプラスミドベクターpRSET-B_mCherry（ThermoFisher Scientific）の修飾された変形のNdeI及びBamHI制限部位にクローニングした。この目的のために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：mCherry_BC2T_fw2（5’-TAT G CC GGA TCG CAA AGC GGC GGT GAG CCA TTG GCA GCA GGG CTC G-3’；配列番号41）及びmCherry_BC2T_rv2（5’-GAT CCG AGC CCT GCT GCC AAT GGC TCA CCG CCG CTT TGC GAT CCG GCA-3’；配列番号42）；mCherry_SEQ33_fw2（5’-TAT GCC GGA TCG CGT GCG CGC GGT GAG CCA TTG GAG CAG CGG CTC G-3’；配列番号43）及びmCherry_SEQ33_rv2（5’-GAT CCG AGC CGC TGC TCC AAT GGC TCA CCG CGC GCA CGC GAT CCG GCA-3’；配列番号44）；mCherry_SEQ34_fw2（5’-TAT GGC GGA TCG CGT GCG CGC GGT GAG CCA TTG GAG CAG CGG CTC G-3’；配列番号45）及びmCherry_SEQ34_rv2（5-GAT CCG AGC CGC TGC TCC AAT GGC TCA CCG CGC GCA CGC GAT CCG CCA-3’；配列番号46）。
【０１５１】
タンパク質産生及び精製
BC2ナノボディの発現及び精製を、先に記載されたように実施した[11]。wtGFP又はその修飾されたバージョンの発現及び精製を、先に記載されたように実施した[19]。全てのタンパク質の精製は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析に基づいて、少なくとも95%であると評価された。タンパク質濃度を分光学的に決定した。
【０１５２】
複合体形成
複合体形成のために、2 mg/mlのBC2-Nb溶液を混合し、10 mM Tris/HCl pH 7.4、100 mMのNaCl緩衝液中の3倍モル過剰のペプチドと、1時間室温でインキュベートした。過剰のペプチドをサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200 increase、GE Healthcare）によって除去した。複合体形成を液体クロマトグラフィー質量分析によって、Phenomenex Kinetex（2.6 u C18 100 Å）カラムを備えたShimadzu LCMS 2020を用いて確認した。複合体を13.7 mg/mlに濃縮し、結晶化実験に使用した。
【０１５３】
結晶化
ハンギングドロップ蒸気拡散を用いて、3.2 mg/mlのタンパク質溶液と結晶化緩衝液（0.1 M MES/イミダゾールpH 6.7、12.5% [v/v] 2-メチル-2,4-ペンタジオール（MPD）、7.5% [w/v] PEG 1000、7.5% [w/v] PEG 3350、3 mM アルコール混合物）とを、1：1比で20℃で混合することによって、リガンド非結合BC2-Nbを結晶化した。ハンギングドロップ蒸気拡散を用いて、13.7 mg/mlの複合体溶液と、結晶化緩衝液（0.1 M MES/イミダゾールpH 6.5、12.5% [v/v] 2-メチル-2,4-ペンタジオール（MPD）、12.5% [w/v] PEG 1000、12.5% [w/v] PEG 3350、4 mM アミノ酸混合物）とを、1：1比で20℃で混合して、BC2-Nb/BC2T複合体を結晶化した。いずれの場合にも、結晶を凍結保護のための30% [v/v] MPDを含有する結晶化溶液に移し、30秒間のインキュベーション後に液体窒素でフラッシュ冷却（flash cooled）した。BC2-Nbからの１つのデータセット、及び異なる位置におけるBC2-Nb/BC2T複合体の同じ結晶からの４つのデータセットを、Helmholtz-Zentrum Berlin（HZB）のBESSY IIのビームラインMX 14.2で0.918409 Åのビーム波長で収集した。
【０１５４】
X線データは減少し、BC2-Nb/BC2T複合体の場合、XDSパッケージを用いてマージされた[20]。BC2-Nbデータについての初期段階は、コア領域のみを含むナノボディ（PDB ID：2X1O）のCHAINSAW [22,23]修飾モデルを有するPHASER [21]を用いて、分子置換によって得られた。次にBC2-Nb/BC2T複合体の構造を、分子置換における探索モデルとしてリガンド非結合BC2-Nb構造を用いて解明した。両方の構造をPHENIX.refine [24]、REFMAC5 [25]及びCOOT [26]を用いて精錬した。２つの構造をMOLPROBITY [27]で検証した。ラマチャンドランプロットは、100%（BC2-Nb）、98.1%（BC2-Nb/BC2T複合体）の好ましい領域及び100%の許容領域を示す。
【０１５５】
構造の可視化及び解析
構造の重ね合わせ及びRMSD値の計算を、構造比較を用いて行った。結晶構造の画像をPyMol（http：//www.pymol.org）で作成した。
【０１５６】
合成位置走査ペプチドライブラリーによる結合特異性の質量分析
BC2T及び由来する突然変異体の結合特異性を調べるために、配列PDRKAAVSHWQQ（配列番号4）の各アミノ酸位置についてのペプチドライブラリーを、N-末端又はC-末端にそれぞれ位置するアセチル基及びアミド基を用いて合成した（Intavis）。アガロースビーズ上に固定化された2 μlのBC2-Nbと単一位置ライブラリーの60 pmolのペプチドをインキュベートして、沈降研究を行った。インキュベーションを、300 μlのPBS/0.01% CHAPS中で1時間、HulaMixer（Life Technologies）上で行った。遠心分離ステップに続いて、10 μlの上清をLC-MS手順で分析した。ペプチドを、C18 PepMap100 μ-Precolumn（300 μm x 5 mm；粒径：5 μm；孔径：100 Å - Thermo Scientific）及びC18分析カラム（Acclaim Rapid Separation LC（RSLC）Column：150 mm x 5 mm；粒径：2.2 μm；孔径：100 Å - Thermo Scientific）から成る、UltiMate3000 RSLCnano System（Thermo Scientific）を用いて分離した。段階勾配を、8%で開始し、20分後に30%で終わる溶離剤B（80%アセトニトリル、20% H2O、0.1%ギ酸）に適用した。Q Exactive Plus質量分析計（Thermo Scientific）によって検出されたFULL-MS法を用いてペプチドを分析した。最大注入時間として、AGC targetを3E6に設定しながら、100 msを選択した。解像度を70.000に設定した。最大半量（Half-maximal）シグナル領域を参照して、アガロースビーズ上に固定化されたGFP-特異的ナノボディを用いて沈降アプローチを制御した。全ての実験は三連で行った。
【０１５７】
細胞培養及びトランスフェクション
10% FCS、2 mMのL-グルタミン及びPen Strep（全てGibco, Life Technologiesから）で補充したDMEM（高グルコース、ピルビン酸）中で、HEK293T及びHeLa細胞を培養した。細胞を、37℃で加湿チャンバー内5% CO2雰囲気で培養し、継代のためにトリプシン処理した。P100皿に一過性トランスフェクションのためのDNA/PEI複合体を生成するために、24 μgのDNAと、750 μlのOpti-MEM（Gibco、Life Technologies）で予め希釈した108 μlのポリエチレンイミン（PEI、Sigma Aldrich）とを混合し、10分間室温でインキュベートした。96-ウェルプレートでの細胞のトランスフェクションのために、200 ngのDNA及び1.5 μlのPEIを使用した。
【０１５８】
細菌細胞からの可溶性タンパク質画分の生成
1 L培養物に由来するGFP又はGFPBC2Tを発現する大腸菌細胞のペレットを、0.1 mg/mlのリゾチーム、5 μg/mlのDNaseI、50 μg/mlのPMSF及び1xのプロテアーゼインヒビターミックスB（Serva）を含有する500 μlのPBS中で、90分間4℃でホモジナイズし、超音波処理に続く（10 x 10 秒パルス）。遠心分離ステップ（10分、18.000 x g、4℃）後、可溶性タンパク質画分を新しいカップに移し、製造業者のプロトコルに従ってCoomassie Plus（Thermo Fisher Scientific）を用いて各溶解物のタンパク質濃度を決定した。
【０１５９】
表面プラズモン共鳴
GFPBC2Tに対するBC2ナノボディ及びその示された突然変異体の親和性測定を、表面プラズモン共鳴分光法を用いてBiacore 3000 instrument（GE-Healthcare）で行った。GFPBC2Tを、500 RUの応答レベルにCM5センサーチップ（GE Healthcare）のデキストラン繊維上に共有結合した。１つのフローセルを、バックグラウンドを決定するためにタンパク質の非存在下で活性化及びブロックし、別のフローセルを非特異的結合に対する対照としてタグ付けされていないGFPでロードした。動態測定のために、BC2-Nb、BC2-NbR106S又はBC2-NbR106Eのいずれかの7.8125 nM〜250 nMの範囲の６つの濃度を注入した。各測定を二連で行った。ランニング/希釈緩衝液として、10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%界面活性剤Tweenを使用した。測定は25℃で行った。BC2-Nbの会合のために50 μl/分の流速を15秒間、及び解離のために50 μl/分の流速を600秒間適用した。30 μl/分の流速での23 μlの再生溶液の注入によって、再生を誘導した。再生溶液として、10 mMのグリシン-HCl pH 2.0を使用した。ソフトウェアBia evaluation 4.1、及び物質移動を伴う1：1 ラングミュア結合モデルを用いて、データを評価した。
【０１６０】
SDS-PAGE及びイムノブロッティング 
変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を標準的な手順に従って行った。タンパク質試料を、2x SDS-試料緩衝液（60 mM Tris/HCl、pH 6.8；2%（w/v）SDS；5%（v/v）2-メルカプトエタノール、10%（v/v）グリセロール、0.02% ブロモフェノールブルー）中で煮沸した。イムノブロッティングのために、タンパク質をニトロセルロース膜（Bio-Rad Laboratories）に転写した。
【０１６１】
抗体
イムノブロッティングのために、以下の一次抗体を使用した：抗GFPクローン3H9（ChromoTek）、抗PCNAクローン16D10（ChromoTek）、抗VimentinクローンV9（Sigma Aldrich）、抗GAPDH（abcam）、抗β-カテニンクローン14（BD-Biosciences）。検出のために、蛍光色素分子標識された種特異的二次抗体（Alexa-647、ヤギ-抗-ウサギ、ヤギ-抗-ラット；ヤギ-抗-マウスLife Technologies）を使用した。Typhoon-Trioレーザースキャナ（GE Healthcare）でブロットをスキャンした。
【０１６２】
BC2タグ付けされたタンパク質の免疫沈降
eGFP、eGFPBC2T又はBC2TeGFP、eGFP-PCNA、eGFP-PCNABC2T、mCherry-Vimentin、mCherry-VimentinBC2Tを一過性に発現するHEK293T細胞を、洗浄して、リン酸緩衝液生理食塩水（PBS）中で回収し、液体窒素中で瞬間凍結（snap-frozen）して、−20℃で保存した。細胞ペレットを、200 μlの溶解緩衝液（10 mM Tris/Cl pH 7.5、150 mM NaCl、0.5% NP40、1 μg DNaseI、2 mM MgCl2、2 mM PMSF、1x プロテアーゼインヒビターミックスM（Serva）中で、40分間氷上で繰り返しピペッティングすることによって、ホモジナイズした。遠心分離ステップ（10分、18.000 x g）後、各溶解物のタンパク質濃度を、製造業者のプロトコルに従ってPierce BCAタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific）を用いて決定し、タンパク質溶液を、希釈緩衝液（10 mM Tris/Cl pH 7.5、150 mM NaCl、2 mM PMSF）を用いて1 mg/mlの濃度に調整した。上清の2%をSDS-含有試料緩衝液に添加した（インプットと称する）。100 μlの上清につき50 μlのBC2ナノトラップ（スラリー）を添加し、回転ローター（end-over-end rotor）で4℃で1時間のインキュベーションに続く。遠心分離ステップ（2分、2500 x g）後に、前もって除去した上清を新しいカップに移した。2%をSDS-含有試料緩衝液に添加した（非結合と称する）。４回の洗浄ステップ後、50 μlのSDS-試料緩衝液中でビーズを煮沸することによって、又は指示された溶出緩衝液とのインキュベーションによって、BC2ナノトラップ 結合タンパク質を溶出した。試料をSDS-PAGE、次いでイムノブロッティングによって分析した。イムノブロットを示された抗体でプローブした。
【０１６３】
厳しい条件での免疫沈降
各条件について、50 μlのビーズ-スラリーを、大腸菌溶解物からの可溶性タンパク質の100 μl（c=1 mg/ml）、及び界面活性剤又はカオトロピック剤のいずれかを含有する溶液の150 μlと混合し、以下に示されるような最終濃度をもたらした。カオトロピック剤として、尿素（0 M、1 M、2 M、4 M）及び塩化グアニジニウム（0 M、0.375 M、0.75 M、1.5 M、3 M）を使用し、界面活性剤として、SDS（0%、0.1%、0.5%、1%、2%）を使用した。回転ローター上で１時間4℃でのインキュベーション、及び遠心分離ステップ（2分、2500 x g、4℃）後に、上清を捨て、残りのビーズをPBSで2回洗浄した後、50 μl 2 x試料緩衝液中で煮沸した。各ビーズ結合（B）画分の10%を、SDS-PAGE及び抗GFP抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
【０１６４】
結合したBC2タグ付きタンパク質の溶出
溶出実験のために、BC2ナノトラップ（スラリー）の40 μlを、GFPBC2Tを発現する大腸菌細胞に由来する400 μlの可溶性タンパク質抽出物（c=1mg/ml）と、1時間4℃で、回転ローター上でインキュベートした。遠心分離ステップ（2500 x g、4℃、2分）後、上清を捨て、ビーズを、2回目の洗浄ステップの後のカップの交換を含めて、4回氷冷PBS中で洗浄した。その後、ビーズをペレット化し、示された溶出条件の80 μlと15分間室温でインキュベートした。以下の溶出条件を試験した：ペプチド溶出：0.2 M Tris/Cl pH 7.4、150 mM NaClに溶解した、0 mM、0.01 mM、0.1 mM又は1 mMのBC2-ペプチド；酸性溶出：pH 1、pH 2又はpH 3に調整した0.2 Mのグリシン-HCl；アルカリ性溶出：0 mM、1 mM、10 mM又は100 mMのNaOH；チオシアン酸ナトリウムによる溶出：0 M、1 M、2 M、又は3 MのNaSCN。溶出液を収集し、1 x SDS含有試料緩衝液中で煮沸し、残りのビーズをPBSで2回洗浄した後、40 μl 2 x 試料緩衝液中で煮沸した。各溶出（放出、R）及びビーズ結合（結合、B）画分の10%を、SDS-PAGE及び抗GFP 抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
【０１６５】
蛍光標識されたナノボディによる免疫蛍光染色
精製したBC2 ナノボディ（1 mg）を、NHS-活性化蛍光色素Alexa488（Life technologies）又はAtto647（Atto-Tec）を用いて、製造業者のガイドラインに従って標識した。カップリング後、PD-10 Desalting Columns（GE Healthcare）で分離することによって未結合色素を除去した。イムノブロット分析のために、BC2-NbAF488の5 μgを、4 mlの3%BSA（TBSで希釈）、0.05% Tween20で希釈し、ウェスタンブロットを1時間室温でインキュベートした。
【０１６６】
免疫細胞化学のために、μClear 96ウェルプレート（Greiner）のウェル当たり5〜10 x 103 付着HeLa細胞を、C末端にBC2タグ付けされたビメンチン又はPCNAをコードするプラスミドでトランスフェクトした。24時間後、細胞をPBSで1回洗浄し、そして、PBS中の4% w/vパラホルムアルデヒド（PFA）で15分間室温で固定するか、又はメタノールで15分間−20℃で固定した。固定剤の除去及びPBSでの2回洗浄後に、細胞をブロックし、PBS中の3% w/v BSA及び0,1% v/v Triton X-100で、1時間室温で透過処理した。その後、 4℃での一晩インキュベーションのために、標識BC2ナノボディを10〜15 μg/mlの最終濃度で、及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、Sigma Aldrich）を1 μg/mlの最終濃度で添加した。未結合ナノボディ及びDAPIを、PBSと5 M NaCl水溶液との混合物（後者が6% v/v）で3回洗浄することによって除去した。図4b及び図10bの画像を、Image Xpress micro XLシステムで取得した。図10の共焦点画像をImageXpress Micro Confocalで取得した。
【０１６７】
蛍光分光法
蛍光アッセイを、96ウェルマイクロプレート（Nunc）をTyphoon Trio（GE Healthcare Life Sciences）、励起：488 nm、発光フィルター設定：520 nm BP 40でスキャンすることによって行った。
【０１６８】
バイオレイヤー干渉法
BC2T及び改善された変形pTag1及びpTag2に対するBC2-Nbの親和性測定を、BLItzシステム装置（forteBIO）を用いるバイオレイヤー干渉法を用いて行った。BC2T及びその変形のビオチン化ペプチドをストレプトアビジンバイオセンサー（forteBIO）に固定化した。こうして用意したセンサを、ベースラインシグナルを決定するためにBLItz緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水、0.1%（m/v）BSA、0,02%（v/v）Tween20）に120秒間、会合を決定するためにBLItz緩衝液（5〜50 nMの濃度）中のBC2-Nbの溶液に120秒間、そして解離を決定するためにBLItz緩衝液に600秒間、浸漬した。振とう速度は1200 rpmであった。参照として、各ペプチドをまた、上記プロトコルに従ってBLItz緩衝液のみとインキュベートした。対照実験では、ストレプトアビジンバイオセンサーを、事前のペプチド固定化なしにBC2-Nbとインキュベートした。（3回繰り返して）10mMのグリシンpH 2.0及びBLItz緩衝液に順次浸漬することによって、センサを再生した。生データを、ソフトウェアBLItz Pro（forteBio）及び1：1結合モデルを用いて分析した。
【０１６９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
2019504637.tif 000020
【図９ｂ】
2019504637.tif 000021
【図９ｃ】
2019504637.tif 000022
【図１０】
2019504637.tif 000023
【図１１】
2019504637.tif 000024
【図１２】
2019504637.tif 000025
【図１３】
2019504637.tif 000026
【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019504637.tif 000029
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