(57)【要約】  異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを包含する融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが条件的発現ドメインである、融合タンパク質が、本明細書において提供される。したがって、この融合タンパク質は、次の３つの必須要素を含む：条件的発現ドメイン、対象のタンパク質を含有するドメイン、およびこれら２つを隔てるプロテアーゼ切断ドメイン。抗Ｂ細胞改変Ｔ細胞を用いてＢ細胞を標的化することにより、対象の自己抗体および同種異系抗体媒介疾患または状態を処置する方法も、本明細書において提供される。一実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞は、対象において養子移入後に選択的に除去される。一時的に調節されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む医薬組成物も、本明細書において提供される。
2019518424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、膜貫通タンパク質であり、前記条件的発現ドメインが、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第一のレベルに関連する第一の状態と、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第二のレベルに関連する第二の状態とを有し、前記第二のレベルが、例えば、発現化合物の存在下で前記第一のレベルと比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２０または３０倍、上昇する、融合タンパク質。
【請求項２】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが膜貫通タンパク質であり、前記異種プロテアーゼ切断部位が、フューリン切断部位であり、但し、前記フューリン切断部位がアミノ酸配列ＳＡＲＮＲＱＫＲ（配列番号９８１）を含まないことを条件とする、融合タンパク質。
【請求項３】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、融合タンパク質。
【請求項４】
前記条件的発現ドメインが、分解ドメインである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記条件的発現ドメインが、凝集ドメインである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、分解ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、対象のタンパク質である、融合タンパク質。
【請求項７】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、分解ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、膜貫通タンパク質である、融合タンパク質。
【請求項８】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、分解ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、融合タンパク質。
【請求項９】
前記分解ドメインが、エストロゲン受容体（ＥＲ）ドメイン、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）から選択される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記分解ドメインが、エストロゲン受容体（ＥＲ）からのものである、請求項４または６〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記分解ドメインが、エストロゲン受容体（ＥＲ）からのものであり、配列番号５８または１２１のいずれかと少なくとも９０、９５、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４または６〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記分解ドメインが、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）からのものである、請求項４または６〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記分解ドメインが、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）からのものであり、配列番号５６と少なくとも９０、９５、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４、６〜９、または１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記分解ドメインが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）からのものである、請求項４または６〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記分解ドメインが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）からのものであり、配列番号５７と少なくとも９０、９５、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４、６〜９、または１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記分解ドメインが、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第一のレベルに関連する第一の状態と、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第二のレベルに関連する第二の状態とを有し、前記第二のレベルが、例えば、安定化化合物の存在下で前記第一のレベルと比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２０または３０倍、上昇する、請求項４または６〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質が、エストロゲン受容体由来の分解ドメインを含む場合、前記安定化化合物が、バゼドキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）から選択される、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が、ＦＫＢタンパク質由来の分解ドメインを含む場合、前記安定化化合物が、Ｓｈｉｅｌｄ−１である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、凝集ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、膜貫通タンパク質であり、前記凝集ドメインが、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第一のレベルに関連する第一の状態と、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第二のレベルに関連する第二の状態とを有し、前記第二のレベルが、例えば、脱凝集化合物の存在下で前記第一のレベルと比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２０または３０倍、上昇する、融合タンパク質。
【請求項２０】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、凝集ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが膜貫通タンパク質であり、前記異種プロテアーゼ切断部位が、フューリン切断部位であり、但し、前記フューリン切断部位がアミノ酸配列ＳＡＲＮＲＱＫＲ（配列番号９８１）を含まないことを条件とする、融合タンパク質。
【請求項２１】
異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが凝集ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、融合タンパク質。
【請求項２２】
前記凝集ドメインが、二量体化ドメイン、例えば、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化ドメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くの反復を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記凝集ドメインが、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）からのものである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記凝集ドメインが、ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍドメインである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記凝集ドメインが、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）からのものであり、配列番号９７５または９７６のいずれかと少なくとも９０、９５、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の凝集ドメインをさらに含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の凝集ドメインが、前記第一の凝集ドメインと同じタイプの凝集ドメインである、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記凝集ドメインが、同じ凝集ドメインとホモ二量体を形成する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
複数の凝集ドメインを含み、前記複数が、１タイプより多くの、例えば２タイプの凝集ドメインを含み、第一のタイプの凝集ドメインが、第二のタイプの凝集ドメインとヘテロ二量体を形成する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
２、４、６、８または１０個の凝集ドメインを含み、ならびに同数の第一のタイプの凝集ドメインと第二のタイプの凝集ドメインを含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
前記凝集ドメインが、第一のタイプと第二のタイプが交互になる順序、例えば、第一、第二、第一、第二、または第二、第一、第二、第一の順序で、前記融合タンパク質内に配置されている、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記融合タンパク質が、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）、例えばＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ、由来の凝集ドメインを含む場合、前記脱凝集化合物が、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２、ＡＰ２１９９８およびＳｈｉｅｌｄ−１から選択される、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
前記異種切断部位が、哺乳動物細胞内プロテアーゼにより切断される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記切断部位が、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼおよびエラスターゼ１からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断される、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記切断部位が、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）および［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
前記切断部位が、フューリンにより切断される、請求項３４または３５に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
ＲＴＫＲ（配列番号１２３）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）、またはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）から選択されるフューリン切断部位を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）のフューリン切断部位を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記異種プロテアーゼ切断部位が、哺乳動物細胞外プロテアーゼにより切断される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記哺乳動物細胞外プロテアーゼが、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼおよびエラスターゼ１からなる群から選択される、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
前記切断部位が、Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）および［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項３９に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
前記第二のタンパク質ドメインが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項４２に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項４３に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項４３または４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
前記１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメインのうちの１つが、ＣＤ３−ゼータ共刺激ドメインを含む、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つまたは複数が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質からの細胞内ドメインである、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
前記共刺激シグナル伝達ドメインのうちの１つまたは複数が、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
前記共刺激ドメインのうちの１つまたは複数が、ＣＤ２８共刺激ドメインを含む、請求項４７に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ−型レクチン様分子−１、ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞突然変異（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原［（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）］；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺セリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）とエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）とからなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨ糖セラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖類部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ  ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異型遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ  ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ［膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子］；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス（ｒｅｎａｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異型（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）からなる群から選択される抗原に結合する、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記抗原が、ＣＤ１９である、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
配列番号３５６〜３６８または３８１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む、請求項５２に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
配列番号８９７、９０２、９０７、９１２、９１７、９２２、９２７、９３２、９３７、９４２、９４７、９５２、９５６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項５２に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
前記抗原が、ＣＤ１２３である、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５６】
配列番号７５１、７５６、７６１または７６６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５７】
配列番号７５０、７５５、７６０または７６５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項５５に記載の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記抗原が、ＢＣＭＡである、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５９】
配列番号３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、４６２、４６６、４７０、４７４、４７８、４８２、４８６、４９０、４９４、４９８、５０２、５０６、５１０、５１４、５１８、５２２、５２８、５３１、５３４または５３７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。
【請求項６０】
配列番号７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８２７、８２９、８３１、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７または８５９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項５８に記載の融合タンパク質。
【請求項６１】
前記抗原が、ＣＤ２０である、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項６２】
配列番号３０３３の４７０〜７１２位または４７０〜９３９位に位置するアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６３】
配列番号３０３３のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む、請求項６１に記載の融合タンパク質。
【請求項６４】
前記条件的発現ドメイン、例えば、凝集ドメインまたは分解ドメインが、
ａ）前記第二のタンパク質ドメインのＮ末端、または
ｂ）前記第二のタンパク質ドメインのＣ末端
に位置する、請求項１〜６３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
シグナルペプチドをさらに含む、例えば、前記条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインまたは分解ドメインのＮ末端側にシグナルペプチドを含む、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
前記シグナルペプチドと前記融合タンパク質の別のドメインとの間に位置する、例えば、前記シグナルペプチドと前記条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインまたは分解ドメインとの間に位置するリンカーをさらに含む、請求項６５に記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
前記リンカーが、表２３および２４に収載されているいずれかの融合タンパク質中のリンカーである、請求項６６に記載の融合タンパク質。
【請求項６８】
表２２、２３および２４に収載されているいずれかの融合タンパク質のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項６９】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項７０】
請求項６９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７１】
ウイルスベクターである、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７２】
レンチウイルスベクターである、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７３】
請求項７０〜７２のいずれか一項に記載のベクターを含む、ウイルス粒子。
【請求項７４】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項６９に記載の核酸または請求項７０〜７２のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞、例えば宿主細胞。
【請求項７５】
ヒトエフェクター細胞、例えば、ヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞である、請求項７４に記載の細胞、例えば宿主細胞。
【請求項７６】
前記異種プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをさらに含む、請求項７４または７５のどちらかに記載の細胞、例えば宿主細胞。
【請求項７７】
発現化合物、例えば安定化化合物の非存在下で、前記融合タンパク質が、細胞内分解経路により分解され、例えば、前記融合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くが分解される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７８】
発現化合物、例えば脱凝集化合物の非存在下で、前記融合タンパク質が、細胞内で、例えば小胞体またはサイトゾル内で、凝集した状態である、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くが凝集した状態である、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７９】
発現化合物、例えば安定化化合物をさらに含む、請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８０】
前記条件的発現ドメイン、例えば分解ドメインが、前記発現化合物、例えば安定化化合物の存在下で、前記発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する耐性が高いコンフォメーションをとる、請求項７９に記載の細胞。
【請求項８１】
前記融合タンパク質のコンフォメーションが、前記発現化合物、例えば安定化化合物の存在下で、前記発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して異種プロテアーゼ切断部位での切断に対する許容性が高い、請求項７９または８０のどちらかに記載の細胞。
【請求項８２】
前記融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルが、発現化合物、例えば安定化化合物を含まない細胞における前記融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルより高い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高い、請求項７９または８０のどちらかに記載の細胞。
【請求項８３】
発現化合物、例えば脱凝集化合物をさらに含む、請求項７４〜７８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８４】
前記条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインが、前記発現化合物、例えば脱凝集化合物の存在下で、前記発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較してオリゴマー化または凝集に対する耐性が高いコンフォメーションをとる、請求項８３に記載の細胞。
【請求項８５】
前記融合タンパク質のコンフォメーションが、前記発現化合物、例えば脱凝集化合物の存在下で、前記発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して異種プロテアーゼ切断部位での切断に対する許容性が高い、請求項８３または８４のどちらかに記載の細胞。
【請求項８６】
前記融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルが、発現化合物、例えば脱凝集化合物を含まない細胞における前記融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルより高い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高い、請求項８３または８４のどちらかに記載の細胞。
【請求項８７】
対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを細胞の表面で条件的に発現させる方法であって、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質を含む細胞（例えば、請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の細胞）を、発現化合物と接触させることを含み、
（ａ）前記発現化合物の存在下では、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲの表面発現が、前記発現化合物の非存在下での前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲの表面発現のレベルと比較して上昇し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高く、および
（ｂ）前記発現化合物の非存在下では、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲの表面発現が、前記発現化合物の存在下での前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲの表面発現のレベルと比較して実質的に低下し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０分の１である、
方法。
【請求項８８】
前記発現化合物の存在が、前記条件的発現ドメインの第一のフォールディング状態から第二のフォールディング状態へのコンフォメーションの変化に関連しており、例えば、そのような変化を引き起こし、前記第一のフォールディング状態が、前記第二のフォールディング状態と比較して分解、例えば細胞内分解、または凝集を受けやすい、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記発現化合物の存在が、前記プロテアーゼ切断部位を、例えば、前記発現化合物の非存在下での前記プロテアーゼ切断部位の露出と比較して大きい程度に、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍大きく、露出させる、請求項８７または８８のどちらかに記載の方法。
【請求項９０】
対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを条件的に発現させる方法であって、細胞、例えば請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の細胞を、発現化合物、例えば安定化化合物または脱凝集化合物と接触させることを含み、
（ａ）前記発現化合物の存在下では、前記条件的発現ドメインが、発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して異種プロテアーゼ切断部位の切断に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲから前記条件的発現ドメインが切断され、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記発現化合物の非存在下では、前記条件的発現ドメインが、発現化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して異種プロテアーゼ切断部位の切断に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが分解または凝集することになる、
方法。
【請求項９１】
前記細胞を前記発現化合物とエクスビボで接触させる、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞を前記発現化合物とインビボで接触させる、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを条件的に発現させる方法であって、細胞、例えば請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の細胞を、安定化化合物と接触させることを含み、
（ａ）前記安定化化合物の存在下では、
（ｉ）前記分解ドメインが、前記安定化化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲから前記分解ドメインが切断され、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記安定化化合物の非存在下では、前記分解ドメインが、安定化化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが分解することになる、
方法。
【請求項９４】
前記細胞を前記安定化化合物とエクスビボで接触させる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞を前記安定化化合物とインビボで接触させる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを条件的に発現させる方法であって、細胞、例えば請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の細胞を、脱凝集化合物と接触させることを含み、
（ａ）前記脱凝集化合物の存在下では、
（ｉ）前記凝集ドメインが、前記脱凝集化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲから前記凝集ドメインが切断され、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記脱凝集化合物の非存在下では、前記凝集ドメインが、脱凝集化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが凝集することになる、
方法。
【請求項９７】
前記細胞を前記脱凝集化合物とエクスビボで接触させる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞を前記脱凝集化合物とインビボで接触させる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、細胞の有効量、例えば、請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の細胞の有効量を、前記対象に投与することを含み、前記第二のタンパク質が、キメラ抗原受容体であり、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、前記腫瘍抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項１００】
自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、細胞の有効量、例えば、請求項７４〜８６のいずれか一項に記載の細胞の有効量を、前記対象に投与することを含み、前記第二のタンパク質が、キメラ抗原受容体であり、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、前記自己抗体または同種異系抗体疾患に特有の抗原に特異的に結合する、方法。
【請求項１０１】
前記細胞が、前記対象にとって自己である、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記細胞が、前記対象にとって同種異系である、請求項９９または１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記細胞を発現化合物と接触させ、
（ａ）前記発現化合物の存在下では、
（ｉ）前記条件的発現ドメインが、前記発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解または凝集に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から前記条件的発現ドメインが切断され、前記ＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記発現化合物の非存在下では、前記条件的発現ドメインが、前記発現化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解または凝集に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記融合タンパク質が分解または凝集することになる、
請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記細胞、例えば宿主細胞を、安定化化合物と接触させ、
（ａ）前記安定化化合物の存在下では、
（ｉ）前記分解ドメインが、前記安定化化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から前記分解ドメインが切断され、前記ＣＡＲが発現されることになり、および
（ｂ）前記安定化化合物の非存在下では、前記分解ドメインが、前記安定化化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記融合タンパク質が分解することになる、
請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記融合タンパク質が、エストロゲン受容体由来の分解ドメインを含む場合、前記安定化化合物が、バゼドキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）から選択される、請求項９０〜９８および１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記融合タンパク質が、ＦＫＢタンパク質由来の分解ドメインを含む場合、前記安定化化合物が、Ｓｈｉｅｌｄ−１である、請求項９０〜９８または１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記細胞を脱凝集化合物と接触させ、
（ａ）前記脱凝集化合物の存在下では、
（ｉ）前記凝集ドメインが、脱凝集化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から前記凝集ドメインが切断され、前記ＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記脱凝集化合物の非存在下では、前記凝集ドメインが、前記脱凝集化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記融合タンパク質が凝集することになる、
請求項９９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記融合タンパク質が、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）、例えばＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ、由来の凝集ドメインを含む場合、前記脱凝集化合物が、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２およびＡＰ２１９９８から選択される、請求項９０〜９８および１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記自己抗体疾患または状態が、水疱性類天疱瘡；後天性表皮水疱症；ｐ２００類天疱瘡；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；他の類天疱瘡群疾患；疱疹状皮膚炎；セリアック病；重症筋無力症；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎および他のＡＮＣＡ＋血管炎を伴う肉芽腫症；自己免疫性辺縁系脳炎；抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体脳症；視神経脊髄炎；自己免疫性溶血性貧血；ループスおよび他の結合組織疾患における自己抗体関連終末器官損傷（抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏおよび他の自己抗体に起因する）；グレーブスおよび橋本甲状腺炎；糖尿病における抗インスリン抗体；自己免疫性低血糖における抗インスリン受容体抗体；クリオグロブリン血症；関節リウマチ；多発性硬化症；シェーグレン症候群；皮膚筋炎；慢性特発性蕁麻疹における抗Ｆｃ−イプシロン受容体抗体；肺動脈性高血圧症における抗葉酸受容体抗体、抗内皮受容体または抗アドレナリン受容体抗体；難治性高血圧症；拡張型心筋症；ならびに自己炎症性症候群からなる群から選択される、請求項１００〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記同種異系抗体疾患または状態が、臓器移植、輸血、妊娠、またはタンパク質補充療法に応答しての免疫応答である、請求項１００〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
腫瘍抗原の発現に関連する前記疾患が、がんである、請求項９９〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記がんが、中皮腫（例えば、悪性胸膜中皮腫）、例えば、以前の少なくとも１標準治療時に進行した対象におけるもの、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺扁平上皮がん、もしくは大細胞肺がん）、膵臓がん［例えば、膵管腺癌もしくは転移性膵管腺癌（ＰＤＡ）、例えば、以前の少なくとも１標準治療時に進行した対象におけるもの］；食道腺癌、卵巣がん（例えば、漿液性上皮性卵巣がん、例えば、以前の少なくとも１標準治療レジメン後に進行した対象におけるもの）、乳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、またはそれらのあらゆる組合せである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
腫瘍抗原の発現に関連する前記疾患が、血液がん、例えば、白血病またはリンパ腫から選択される血液がんである、請求項９９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記がんが、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症に関連するＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型もしくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫／脾性白血病、びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病−バリアント、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖病、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病の際に生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または分類不能リンパ腫から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記がんが、ＭＣＬ、ＣＬＬ、ＡＬＬ、ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、または多発性骨髄腫から選択される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１６】
医薬品として使用するための、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、ウイルス粒子または細胞。
【請求項１１７】
腫瘍抗原の発現に関連する疾患、例えばがんの処置に使用するための、請求項１〜１１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、組成物または方法。
【請求項１１８】
それを必要とする対象の自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、改変Ｔ細胞を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記改変Ｔ細胞が、自殺遺伝子と、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、方法。
【請求項１１９】
それを必要とする対象の自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、改変Ｔ細胞を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記改変Ｔ細胞が、二量体化ドメインと、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードする核酸を含む、方法。
【請求項１２０】
前記自殺遺伝子が、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記自殺遺伝子が、配列番号３０１３および３０１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体化ドメインをさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記二量体化ドメインが、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２３】
前記二量体化ドメインが、配列番号９８０のアミノ酸配列を含むフューリン切断部位をさらに含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＣＡＲが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記シグナルペプチドが、配列番号３０３５のアミノ酸配列を含む、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記有効量を投与することが、Ｂ細胞に対する細胞毒性機能を果すために前記改変Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記改変Ｔ細胞の細胞死を誘導するために、前記自殺遺伝子の自殺遺伝子産物を活性化することをさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２８】
前記自殺遺伝子産物を活性化することが、前記自殺遺伝子産物の二量体化を促進するために二量体化剤を投与することをさらに含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記自殺遺伝子産物を活性化することが、前記改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮した後に行われる、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記自殺遺伝子産物を活性化することが、前記対象における前記改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に行われる、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
前記改変Ｔ細胞の細胞死を抑止するために、前記自殺遺伝子の自殺遺伝子産物の活性化を抑止することをさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記自殺遺伝子産物の活性化を抑止することが、前記自殺遺伝子産物の二量体化を防止するために可溶化剤を投与することをさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記可溶化剤を投与することが、前記改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、前記改変Ｔ細胞がＢ細胞に対する細胞毒性機能を発揮しているときに継続する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記可溶化剤を投与することが、前記対象における前記改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に中止される、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ＣＡＲの抗Ｂ細胞結合ドメインが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、単鎖可変フラグメント、およびそれらの抗原結合フラグメントからなる群から選択される抗体を含む、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＣＡＲの抗Ｂ細胞結合ドメインが、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＢ細胞マーカーに特異的に結合する、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ＣＡＲの抗Ｂ細胞結合ドメインが、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、これらの任意の組合せからなる群から選択されるＢ細胞マーカー、ならびにプロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞および形質細胞上で選択的に見出される少なくとも１つの表面マーカーに、特異的に結合する、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ＣＡＲの細胞内ドメインが、二重シグナル伝達ドメインを含む、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
共刺激ドメインが、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、それらの任意の誘導体または変異体、同じ機能的な能力を有するそれらの任意の合成配列、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ＣＡＲの二量体化を防止するために可溶化剤を投与することをさらに含む、請求項１１９または１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記可溶化剤を投与することが、前記改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、前記改変Ｔ細胞がＢ細胞に対する細胞毒性機能を発揮しているときに継続する、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記可溶化剤を投与することが、前記対象における前記改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に中止される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
前記自己抗体疾患または状態が、水疱性類天疱瘡；後天性表皮水疱症；ｐ２００類天疱瘡；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；他の類天疱瘡群疾患；疱疹状皮膚炎；セリアック病；重症筋無力症；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎および他のＡＮＣＡ＋血管炎を伴う肉芽腫症；自己免疫性辺縁系脳炎；抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体脳症；視神経脊髄炎；自己免疫性溶血性貧血；ループスおよび他の結合組織疾患における自己抗体関連終末器官損傷（抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏおよび他の自己抗体に起因する）；グレーブスおよび橋本甲状腺炎；糖尿病における抗インスリン抗体；自己免疫性低血糖における抗インスリン受容体抗体；クリオグロブリン血症；関節リウマチ；多発性硬化症；シェーグレン症候群；皮膚筋炎；慢性特発性蕁麻疹における抗Ｆｃ−イプシロン受容体抗体；肺動脈性高血圧症における抗葉酸受容体抗体、抗内皮受容体または抗アドレナリン受容体抗体；難治性高血圧症；拡張型心筋症；自己炎症性症候群；視神経脊髄炎；グッドパスチャー症候群；抗ＮＭＤＡＲ脳炎：ＡＩＨＡ；ＩＴＰ；ＴＴＰ；グレーブス／橋本病；原発性胆汁性肝硬変；新生児ループス；Ｔ細胞破壊を誘発する母体自己抗体；肺胞タンパク症；抗葉酸受容体；慢性炎症性脱髄性多発神経炎；ならびに特発性膜性腎症からなる群から選択される、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記同種異系抗体疾患または状態が、臓器移植、輸血、妊娠、またはタンパク質補充療法に応答しての免疫応答である、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記改変Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖、主要組織適合複合体タンパク質およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される遺伝子を欠失させることによりさらに改変される、請求項１１８または１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記改変Ｔ細胞が、それを必要とする対象への投与の前にさらに改変される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記改変Ｔ細胞が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを誘導することによりさらに改変される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
自殺遺伝子をコードする核酸と、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む改変Ｔ細胞を含む、請求項１１８の方法に使用するために製剤化された医薬組成物。
【請求項１４９】
二量体化ドメインと、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードする核酸を含む改変Ｔ細胞を含む、請求項１１９の方法に使用するために製剤化された医薬組成物。
【請求項１５０】
前記自殺遺伝子が、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記自殺遺伝子が、配列番号３０１３および３０１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体化ドメインをさらに含む、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記二量体化ドメインが、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記二量体化ドメインが、配列番号９８０のアミノ酸配列を含むフューリン切断部位をさらに含む、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記ＣＡＲが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記シグナルペプチドが、配列番号３０３５のアミノ酸配列を含む、請求項１５４に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記自殺遺伝子の活性化を誘導するための誘導剤をさらに含む、請求項１４８に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記改変Ｔ細胞が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖および主要組織適合複合体タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠く、請求項１４８または１４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５８】
（ｉ）配列番号３００１〜３００４からなる群から選択される核酸配列を含む自殺遺伝子と（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含む核酸配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項１５９】
配列番号３０１８、３０２０、３０２４、３０２６、３０２８または３０３０を含む、請求項１５８に記載の単離された核酸配列。
【請求項１６０】
（ｉ）自殺遺伝子によりコードされたアミノ酸配列であって、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６１】
配列番号３０１９、３０２１、３０２６、３０２８、３０３０または３０３４のアミノ酸配列を含む、請求項１６０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６２】
（ｉ）二量体化ドメインをコードする核酸、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離された核酸配列。
【請求項１６３】
前記二量体化ドメインが、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む、請求項１６２に記載の単離された核酸配列。
【請求項１６４】
配列番号９７７または３０３２を含む、請求項１６２に記載の単離された核酸配列。
【請求項１６５】
（ｉ）二量体化ドメイン、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１６６】
配列番号９７８または３０３３のアミノ酸配列を含む、請求項１６５に記載の単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年４月１５日付けで出願された米国特許出願第６２／３２２，９３１号および２０１７年４月３日付けで出願された米国特許出願第６２／４８１，０９４号の優先権を主張するものであり、これらの出願の各々の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。２０１７年４月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｎ２０６７−７１２８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズは２，３２６，０２７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
対象の所望されるタンパク質の選択的発現を可能にするために様々なコンストラクトが開発されてきた。安定化リガンドの非存在下で分解するように加工されたドメインを含有する新しいコンストラクト（「デグロン」として当業界公知）が、試験されている。他のコンストラクトは、脱凝集リガンドの非存在下で凝集するように加工されたドメイン（例えば、凝集ドメイン）を含有する。そのようなドメインを対象のタンパク質と融合させて、安定化または脱凝集リガンドの存在下でのみ、そのようなタンパク質の選択的発現を可能ならしめることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当業界公知のデグロンおよび凝集ドメインは、ある特定の状況では、融合タンパク質のサイズおよび／またはコンフォメーションに起因して対象のタンパク質の望ましい機能の破壊と関連するある特定の欠点を有する。そのような欠点は、対象のタンパク質が膜貫通タンパク質である場合、特に顕著であり得る。それ故に、デグロン／凝集ドメイン技術を向上させる必要がある。さらに、これらに限定されないが、がん、自己免疫疾患および同種異系免疫などの、様々な疾患および状態を処置するために、免疫系を永久に改変または抑制することなくＴ細胞を改変する方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、異種プロテアーゼ切断部位（例えば、哺乳動物細胞内または細胞外プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断部位）によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを包含する融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメイン、例えば、分解ドメインまたは凝集ドメインであり、第二のタンパク質が、対象のタンパク質、例えば、膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＲ）である、融合タンパク質を特徴とする。
【０００６】
一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、分解ドメイン、例えば、本明細書で説明されるような分解ドメインである。理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態において、分解ドメインは、発現化合物、例えば安定化化合物の非存在下では、不安定であり、および／またはフォールディングして安定なコンフォメーションになることができない。ミスフォールディングした／アンフォールディングした分解ドメインは、融合タンパク質の他のドメインと一緒に細胞内分解経路により分解され得る（例えば、図２５参照）。発現化合物の存在下では、分解ドメインは、フォールディングして安定なコンフォメーションになることができ、例えば発現化合物の非存在下での分解ドメインと比較して、細胞内分解経路を受けにくい。したがって、融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルおよび／または率は、発現化合物の非存在下と比較して発現化合物の存在下では、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍または３０倍、向上される。一部の実施形態において、融合タンパク質の分解ドメインが適切なコンフォメーションをとると、異種切断部位が露出され、その結果、分解ドメインが除去されることになり、したがって、第二のタンパク質ドメインが遊離されることになる。
【０００７】
他の実施形態において、条件的発現ドメインは、凝集ドメインである。理論に縛られることは望まないが、発現化合物、例えば脱凝集化合物の非存在下での一部の実施形態において、融合タンパク質の凝集ドメインは、１つまたは複数の他の凝集ドメインと会合してオリゴマーおよび凝集体になる（例えば、図２６参照）。凝集した融合タンパク質を細胞区画内に隔離することができ、その区画内で融合タンパク質は凝集している。発現化合物、例えば脱凝集化合物の存在下では、凝集ドメインは互いから解離し、融合タンパク質は可溶化される（例えば、単量体構成をとる）。したがって、融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルおよび／または率は、発現化合物の非存在下と比較して発現化合物の存在下では、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍または３０倍、向上される。一部の実施形態において、融合タンパク質の凝集ドメインが可溶化されると、異種切断部位は露出され、その結果、凝集ドメインが除去されることになり、したがって、第二のタンパク質ドメインが遊離されることになる。
【０００８】
上述の態様および実施形態のいずれかにおいて、融合タンパク質は、条件的発現ドメイン、例えば、分解ドメインもしくは凝集ドメインであるかまたはそれを含む第一のタンパク質ドメインと、対象のタンパク質、例えば膜貫通タンパク質（例えば、ＣＡＲ）であるかそれを含む第二のタンパク質ドメインとを包含し、前記融合タンパク質の第一のドメインと第二のドメインは、異種プロテアーゼ切断部位（例えば、哺乳動物細胞内または細胞外プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断部位）によって隔てられている。一部の実施形態において、条件的発現ドメイン、例えば、分解または凝集ドメインは、第二のタンパク質ドメインのＮ末端側に位置する。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、分解ドメインのＮ末端側にシグナルペプチドをさらに包含する。
【０００９】
一態様において、本発明は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、膜貫通タンパク質であり、前記条件的発現ドメインが、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第一のレベルに関連する第一の状態と、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第二のレベルに関連する第二の状態とを有し、前記第二のレベルが、例えば、発現化合物の存在下で前記第一のレベルと比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２０または３０倍、上昇する、融合タンパク質に関する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが膜貫通タンパク質であり、前記異種プロテアーゼ切断部位が、フューリン切断部位であり、但し、前記フューリン切断部位がアミノ酸配列ＳＡＲＮＲＱＫＲ（配列番号９８１）を含まないことを条件とする、融合タンパク質に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、融合タンパク質に関する。
【００１２】
一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、分解ドメインである。
【００１３】
一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、凝集ドメインである。
【００１４】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第一のもの（本明細書では第一のタンパク質ドメインとも称される）は、分解ドメイン、例えば、本明細書で説明されるような分解ドメインであるか、またはそれを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第二のもの（本明細書では第二のタンパク質ドメインとも称される）は、対象のタンパク質である。一実施形態において、対象のタンパク質は、膜貫通タンパク質、例えばＣＡＲである。
【００１５】
一部の実施形態において、分解ドメインは、エストロゲン受容体（ＥＲ）ドメイン、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）ドメインまたはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）から選択される。
【００１６】
一部の実施形態において、分解ドメインは、融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第一のレベルに関連する第一の状態と、融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第二のレベルに関連する第二の状態とを有し、前記第二のレベルは、例えば、安定化化合物の存在下で前記第一のレベルと比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２０または３０倍、上昇する。
【００１７】
ある特定の実施形態において、分解ドメインは、エストロゲン受容体に由来する。例えば、分解ドメインは、配列番号５８もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、または配列番号１２１もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５８または配列番号１２１から選択されるアミノ酸配列を含む。分解ドメインがエストロゲン受容体に由来する場合、安定化化合物は、バゼドキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）から選択することができる。一部の実施形態において、安定化化合物は、バゼドキシフェンである。タモキシフェンおよびバゼドキシフェンは、ＦＤＡ承認薬であり、したがって、ヒトに使用しても安全である。
【００１８】
ある特定の実施形態において、分解ドメインは、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する。例えば、分解ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含むことができる。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５６を含む。分解ドメインがＦＫＢＰに由来する場合、安定化化合物は、Ｓｈｉｅｌｄ−１であり得る。
【００１９】
一部の実施形態において、分解ドメインは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に由来する。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５７から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５７を含む。分解ドメインがＤＨＦＲに由来する場合、安定化化合物は、トリメトプリムであり得る。
【００２０】
他の実施形態において、分解ドメインは、ＦＫＢタンパク質にもエストロゲン受容体にも由来しない。
【００２１】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第一のもの（本明細書では第一のタンパク質ドメインとも称される）は、凝集ドメイン、例えば、本明細書で説明されるような凝集ドメインであるか、またはそれを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第二のもの（本明細書では第二のタンパク質ドメインとも称される）は、対象のタンパク質である。一実施形態において、対象のタンパク質は、膜貫通タンパク質、例えばＣＡＲである。
【００２２】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものは、凝集ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものは、膜貫通タンパク質であり、前記凝集ドメインは、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第一のレベルに関連する第一の状態と、前記融合タンパク質の表面発現および／または細胞外発現の第二のレベルに関連する第二の状態とを有し、前記第二のレベルは、例えば、脱凝集化合物の存在下で前記第一のレベルと比べて少なくとも２、３、４、５、１０、２０または３０倍、上昇する。
【００２３】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものは、凝集ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものは、膜貫通タンパク質であり、前記異種プロテアーゼ切断部位は、フューリン切断部位であり、但し、前記フューリン切断部位がアミノ酸配列ＳＡＲＮＲＱＫＲ（配列番号９８１）を含まないことを条件とする。
【００２４】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、異種プロテアーゼ切断部位によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを含み、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものは、凝集ドメインであり、前記タンパク質ドメインのうちの第二のものは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【００２５】
一部の実施形態において、凝集ドメインは、二量体化ドメイン、例えば、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化ドメインの、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くの反復を含む。
【００２６】
一部の実施形態において、凝集ドメインは、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）からのものである。
【００２７】
一部の実施形態において、凝集ドメインは、ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍドメインである。
【００２８】
一部の実施形態において、凝集ドメインは、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）からのものであり、配列番号９７５または９７６のいずれかと少なくとも９０、９５、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の凝集ドメインをさらに含む。
【００３０】
一部の実施形態において、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の凝集ドメインは、第一の凝集ドメインと同じタイプの凝集ドメインである。
【００３１】
一部の実施形態において、凝集ドメインは、同じ凝集ドメインとともにホモ二量体を形成する。
【００３２】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、複数の凝集ドメインを含み、前記複数が、１タイプより多く、例えば２タイプ、の凝集ドメインを含み、第一のタイプの凝集ドメインは、第二のタイプの凝集ドメインとヘテロ二量体を形成する。
【００３３】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、２、４、６、８または１０個の凝集ドメインを含み、前記融合タンパク質は、同数の第一のタイプの凝集ドメインと第二のタイプの凝集ドメインを含む。
【００３４】
一部の実施形態において、凝集ドメインは、第一のタイプと第二のタイプが交互になる順序、例えば、第一、第二、第一、第二、または第二、第一、第二、第一の順序で、融合タンパク質内に配置されている。
【００３５】
一部の実施形態において、融合タンパク質がＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）、例えばＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ、由来の凝集ドメインを含む場合、前記脱凝集化合物は、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２、ＡＰ２１９９８およびＳｈｉｅｌｄ−１から選択される。
【００３６】
一部の実施形態において、前記異種切断部位は、哺乳動物細胞内プロテアーゼにより切断される。
【００３７】
一部の実施形態において、前記切断部位は、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼおよびエラスターゼ１からなる群から選択されるプロテアーゼにより切断される。
【００３８】
一部の実施形態において、前記切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）および［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）からなる群から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを含む。
【００３９】
一部の実施形態において、前記切断部位は、フューリンにより切断される。
【００４０】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）、またはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）から選択されるフューリン切断部位を含む。
【００４１】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、またはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）から選択されるフューリン切断部位を含む。
【００４２】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）のフューリン切断部位を含む。
【００４３】
一部の実施形態において、前記異種プロテアーゼ切断部位は、哺乳動物細胞外プロテアーゼにより切断される。
【００４４】
一部の実施形態において、前記哺乳動物細胞外プロテアーゼは、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼおよびエラスターゼ１からなる群から選択される。
【００４５】
一部の実施形態において、前記切断部位は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）および［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００４６】
上述の態様および実施形態のいずれかにおいて、異種切断部位は、フューリン、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ５、ＰＣＳＫ６、ＰＣＳＫ７、カテプシンＢ、グランザイムＢ、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼまたはエラスターゼ１により切断される。例えば、プロテアーゼ切断部位は、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ、ＲＲＸコンセンサスモチーフ、Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｘコンセンサスモチーフ（配列番号３５）、Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）または［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）から選択される切断モチーフを有するポリペプチドを包含し得る。ある特定の実施形態において、哺乳動物細胞外プロテアーゼは、第ＸＡ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ソルターゼ、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、またはエラスターゼ１から選択される［例えば、切断部位は、Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）、ＬＰＸＴＧ／Ａコンセンサスモチーフ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）、Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）または［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含し得る］。
【００４７】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、フューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、表２０に収載されているフューリン切断部位のいずれか１つを包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、あるいはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、あるいはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列のフューリン切断部位を包含する。
【００４８】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）またはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）のフューリン切断部位を包含する。
【００４９】
一部の実施形態において、条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインまたは分解ドメインは、前記第二のタンパク質ドメインのＮ末端側にまたは前記第二のタンパク質ドメインのＣ末端側に位置する。
【００５０】
一部の実施形態において、前記融合タンパク質は、前記条件的発現ドメイン、例えば、凝集ドメインまたは分解ドメインのＮ末端側にシグナルペプチドをさらに含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、シグナルペプチドと前記条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインまたは分解ドメインとの間に位置するリンカーをさらに含む。一部の実施形態において、リンカーは、表２３および２４に収載されているいずれかの融合タンパク質中のリンカーである。
【００５１】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、表２２、２３または２４に収載されているいずれかの融合タンパク質のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
上述の態様および実施形態のいずれかにおいて、タンパク質ドメインのうちの第二のものは、膜貫通タンパク質（例えば、膜貫通受容体）である。上述の態様のいずれかにおいて、膜貫通受容体は、例えば、合成タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体）であり得る。キメラ抗原受容体は、例えば、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを包含し得る。シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン）および、適宜、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメイン［例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＡＭ−１、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ２８７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドから選択される共刺激タンパク質からの細胞内ドメイン］を包含してもよい。
【００５３】
上記実施形態のいくつかにおいて、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。また、抗原結合ドメインは、次のものから選択される抗原に結合することができる：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ−型レクチン様分子−１、ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞突然変異（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原［（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）］；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺セリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）を包含する癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨ糖セラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖類部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合��、座位Ｋ  ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＣＲ  Ｇａｍｍａ  Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異型遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（XＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ  ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ［膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子］；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス（ｒｅｎａｌ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異型（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；または免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
【００５４】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ１９に結合する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３５６〜３６８または３８１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号８９７、９０２、９０７、９１２、９１７、９２２、９２７、９３２、９３７、９４２、９４７、９５２、９５６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
【００５５】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ１２３に結合する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７５１、７５６、７６１または７６６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７５０、７５５、７６０または７６５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
【００５６】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＢＣＭＡに結合する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、４６２、４６６、４７０、４７４、４７８、４８２、４８６、４９０、４９４、４９８、５０２、５０６、５１０、５１４、５１８、５２２、５２８、５３１、５３４または５３７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８２７、８２９、８３１、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７または８５９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
【００５７】
一部の実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ２０に結合する抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３０３３の４７０〜７１２位または４７０〜９３９位に位置するアミノ酸配列を含む抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３０３３のアミノ酸配列を含むキメラ抗原受容体を含む。
【００５８】
融合タンパク質を作製する細胞、核酸および方法
別の態様において、本発明は、上述の融合タンパク質のいずれか１つを包含する細胞、例えば宿主細胞を特徴とする。一部の実施形態において、細胞、例えば宿主細胞は、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞である。一部の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞またはNK細胞である。
【００５９】
さらに別の態様において、本発明は、上述の融合タンパク質のいずれか１つをコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を特徴とする。別の態様において、本発明は、そのような核酸を含有するベクター［例えば、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）］を特徴とする。本発明は、そのようなウイルスベクターを包含するウイルス粒子も特徴とする。
【００６０】
さらに別の態様において、本発明は、上述のベクター、核酸または融合タンパク質のいずれかを含有する細胞、例えば宿主細胞（例えば、ヒトＴ細胞）を特徴とする。
【００６１】
ある特定の実施態様において、細胞は、異種プロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼをさらに包含する。ある特定の実施態様において、宿主細胞は、安定化化合物［例えば、バゼドキシフェン、Ｓｈｉｅｌｄ１または１μＭ  ４−ＯＨＴ（４−ヒドロキシタモキシフェン）］をさらに包含することができ、前記分解ドメインは、前記安定化化合物の非存在下では細胞内分解を許容するコンフォメーションをとる。
【００６２】
一部の実施形態において、発現化合物、例えば安定化化合物の非存在下では、融合タンパク質は、細胞内分解経路により分解され、例えば、融合タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くが分解される。
【００６３】
一部の実施形態において、発現化合物、例えば脱凝集化合物の非存在下では、融合タンパク質は、細胞内で、例えば、小胞体またはサイトゾル内で凝集した状態であり、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多くが凝集した状態である。
【００６４】
一部の実施形態において、前記細胞は、発現化合物、例えば安定化化合物をさらに含む。
【００６５】
一部の実施形態において、条件的発現ドメイン、例えば分解ドメインは、発現化合物、例えば安定化化合物の存在下で、発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する耐性が高いコンフォメーションをとる。
【００６６】
一部の実施形態において、融合タンパク質のコンフォメーションは、発現化合物、例えば安定化化合物の存在下で、発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して異種プロテアーゼ切断部位での切断に対する許容性が高い。
【００６７】
一部の実施形態において、融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルは、発現化合物、例えば安定化化合物を含まない細胞における融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルより高い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高い。
【００６８】
一部の実施形態において、前記細胞は、発現化合物、例えば脱凝集化合物をさらに含む。
【００６９】
一部の実施形態において、条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインは、発現化合物、例えば脱凝集化合物の存在下で、発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較してオリゴマー化または凝集に対する耐性が高いコンフォメーションをとる。
【００７０】
一部の実施形態において、融合タンパク質のコンフォメーションは、発現化合物、例えば脱凝集化合物の存在下で、発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して異種プロテアーゼ切断部位での切断に対する許容性が高い。
【００７１】
一部の実施形態において、融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルは、発現化合物、例えば脱凝集化合物、を含まない細胞における融合タンパク質の細胞表面発現または細胞外発現のレベルより高い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高い。
【００７２】
さらに別の態様では、本明細書で説明されるような融合タンパク質を作製する方法が開示される。この方法は、発現に好適な条件下に細胞、例えば本明細書で説明されるような宿主細胞、例えば、上述のベクター、核酸または融合タンパク質のいずれかを含む宿主細胞を置くことを包含する。
【００７３】
別の態様において、本発明は、対象のタンパク質を条件的に発現させる方法も特徴とする。一実施形態において、対象のタンパク質は、膜貫通タンパク質、例えばＣＡＲである。
【００７４】
一部の実施形態において、本発明は、対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを細胞（例えば、免疫細胞、例えば宿主細胞）の表面で条件的に発現させる方法も特徴とする。この方法は、
融合タンパク質（例えば、本明細書で説明される融合タンパク質のいずれか）を含むまたは前記融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞、例えば免疫細胞（例えば、宿主細胞）を用意すること、
融合タンパク質、または前記融合タンパク質を含む細胞を、発現化合物と接触させること
を包含し、
（ａ）前記発現化合物の存在下では、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質またはＣＡＲの表面発現は、参照値と比較して、例えば、前記発現化合物の非存在下での前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質またはＣＡＲの表面発現のレベルと比較して上昇し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高く、および
（ｂ）前記発現化合物の非存在下では、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲの表面発現は、参照値と比較して、例えば、発現化合物の存在下での前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲの表面発現のレベルと比較して実質的に低下し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０分の１である。
【００７５】
一部の実施形態において、前記発現化合物の存在は、条件的発現ドメインの第一のフォールディング状態から第二のフォールディング状態へのコンフォメーションの変化に関連しており、例えば、そのような変化を引き起こし、前記第一のフォールディング状態は、前記第二のフォールディング状態と比較して分解、例えば細胞内分解、または凝集を受けやすい。
【００７６】
一部の実施形態において、前記発現化合物の存在は、異種プロテアーゼ切断部位を、例えば、前記発現化合物の非存在下での前記プロテアーゼ切断部位の露出と比較して大きい程度に、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍大きく、露出させる。
【００７７】
一部の実施形態において、本発明は、対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを条件発現させる方法であって、細胞、例えば、本明細書で説明される宿主細胞および／細胞を、安定化化合物と接触させることを含み、
（ａ）前記安定化化合物の存在下では、
（ｉ）前記分解ドメインが、前記安定化化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲから前記分解ドメインが切断され、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記安定化化合物の非存在下では、前記分解ドメインが、安定化化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが分解することになる、
方法も特徴とする。
【００７８】
一部の実施形態では、前記細胞を前記安定化化合物とエクスビボで接触させる。
【００７９】
一部の実施態様では、前記細胞を前記安定化化合物とインビボで接触させる。
【００８０】
一部の実施形態において、本発明は、対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲを条件発現させる方法であって、細胞、例えば、本明細書で説明される宿主細胞および／または細胞を、脱凝集化合物と接触させることを含み、
（ａ）前記脱凝集化合物の存在下では、
（ｉ）前記凝集ドメインが、前記脱凝集化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲから前記凝集ドメインが切断され、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記脱凝集化合物の非存在下では、前記凝集ドメインが、前記脱凝集化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記対象のタンパク質、膜貫通タンパク質、またはＣＡＲが凝集することになる、
方法も特徴とする。
【００８１】
一部の実施形態では、前記細胞を前記脱凝集化合物とエクスビボで接触させる。
【００８２】
一部の実施態様では、前記細胞を前記脱凝集化合物とインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で接触させる。
【００８３】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、第二のタンパク質が、キメラ抗原受容体であり、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを包含し、抗原結合ドメインが、前記腫瘍抗原に特異的に結合する、上述の宿主細胞のいずれかの有効量を、前記対象に投与することを包含する方法を特徴とする。さらに別の態様において、本発明は、自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、第二のタンパク質が、キメラ抗原受容体であり、Ｎ末端からＣ末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、抗原結合ドメインが、前記自己抗体または同種異系抗体疾患に特有の抗原に特異的に結合する、上述の宿主細胞の有効量を、前記対象に投与することを含む方法を特徴とする。そのような方法において、宿主細胞は、対象にとって自己のものであってもよく、または非自己のもの、例えば同種異系のものであってもよい。そのような方法は、宿主細胞をインビボまたはエクスビボで上述の安定化化合物と接触させる工程をさらに包含することができる。
【００８４】
一部の実施態様では、細胞を発現化合物と接触させ、
（ａ）前記発現化合物の存在下では、
（ｉ）前記条件的発現ドメインは、前記発現化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解または凝集に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から前記条件的発現ドメインが切断され、前記ＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記発現化合物の非存在下では、前記条件的発現ドメインは、前記発現化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解または凝集に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記融合タンパク質が分解または凝集することになる。
【００８５】
一部の実施態様では、細胞、例えば宿主細胞を、安定化化合物と接触させ、
（ａ）前記安定化化合物の存在下では、
（ｉ）前記分解ドメインは、前記安定化化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から前記分解ドメインが切断され、前記ＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記安定化化合物の非存在下では、前記分解ドメインは、前記安定化化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して細胞内分解に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記融合タンパク質が分解することになる。
【００８６】
一部の実施形態において、融合タンパク質が、エストロゲン受容体由来の分解ドメインを含む場合、前記安定化化合物は、バゼドキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）から選択される。
【００８７】
一部の実施形態において、融合タンパク質が、ＦＫＢタンパク質由来の分解ドメインを含む場合、前記安定化化合物は、Ｓｈｉｅｌｄ−１である。
【００８８】
一部の実施態様では、細胞を脱凝集化合物と接触させ、
（ａ）前記脱凝集化合物の存在下では、
（ｉ）前記凝集ドメインは、前記脱凝集化合物の非存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する耐性が高いコンフォメーションをとり、
それによって、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）から前記凝集ドメインが切断され、前記ＣＡＲが発現することになり、および
（ｂ）前記脱凝集化合物の非存在下では、前記凝集ドメインは、前記脱凝集化合物の存在下でのコンフォメーションと比較して凝集またはオリゴマー化に対する許容性が高いコンフォメーションをとり、それによって、前記融合タンパク質が凝集することになる。
【００８９】
一部の実施形態において、融合タンパク質がＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）、例えばＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ、由来の凝集ドメインを含む場合、前記脱凝集化合物は、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２およびＡＰ２１９９８から選択される。
【００９０】
一部の実施形態において、自己抗体疾患または状態は、水疱性類天疱瘡；後天性表皮水疱症；ｐ２００類天疱瘡；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；他の類天疱瘡群疾患；疱疹状皮膚炎；セリアック病；重症筋無力症；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎および他のＡＮＣＡ＋血管炎を伴う肉芽腫症；自己免疫性辺縁系脳炎；抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体脳症；視神経脊髄炎；自己免疫性溶血性貧血；ループスおよび他の結合組織疾患における自己抗体関連終末器官損傷（抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏおよび他の自己抗体に起因する）；グレーブスおよび橋本甲状腺炎；糖尿病における抗インスリン抗体；自己免疫性低血糖における抗インスリン受容体抗体；クリオグロブリン血症；関節リウマチ；多発性硬化症；シェーグレン症候群；皮膚筋炎；慢性特発性蕁麻疹における抗Ｆｃ−イプシロン受容体抗体；肺動脈性高血圧症における抗葉酸受容体抗体、抗内皮受容体または抗アドレナリン受容体抗体；難治性高血圧症；拡張型心筋症；自己炎症性症候群；視神経脊髄炎；グッドパスチャー症候群；抗ＮＭＤＡＲ脳炎：ＡＩＨＡ；ＩＴＰ；ＴＴＰ；グレーブス／橋本病；原発性胆汁性肝硬変；新生児ループス；Ｔ細胞破壊を誘発する母体自己抗体；肺胞タンパク症；抗葉酸受容体；慢性炎症性脱髄性多発神経炎；ならびに特発性膜性腎症からなる群から選択される。一部の実施形態において、同種異系抗体疾患または状態は、臓器移植、輸血、妊娠、またはタンパク質補充療法に応答しての免疫応答である。
【００９１】
一部の実施形態において、がんは、中皮腫（例えば、悪性胸膜中皮腫）、例えば、以前の少なくとも１標準治療時に進行した対象におけるもの、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺扁平上皮がん、もしくは大細胞肺がん）、膵臓がん［例えば、膵管腺癌もしくは転移性膵管腺癌（ＰＤＡ）、例えば、以前の少なくとも１標準治療時に進行した対象におけるもの］、食道腺癌、卵巣がん（例えば、漿液性上皮性卵巣がん、例えば、以前の少なくとも１標準治療レジメン後に進行した対象におけるもの）、乳がん、結腸直腸がん、膀胱がん、またはそれらのあらゆる組合せである。
【００９２】
一部の実施形態において、腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、がんである。
【００９３】
一部の実施形態において、腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、血液がん、例えば、白血病またはリンパ腫から選択される血液がんである。
【００９４】
一部の実施形態において、がんは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症に関連するＤＬＢＣＬ、慢性骨髄性白血病、骨髄増殖性新生物、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型もしくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ組織型節外性辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレーム型マクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾リンパ腫／脾性白血病、びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病−バリアント、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖病、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性辺縁帯リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病の際に生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または分類不能リンパ腫から選択される。
【００９５】
一部の実施形態において、がんは、ＭＣＬ、ＣＬＬ、ＡＬＬ、ホジキンリンパ腫、ＡＭＬ、または多発性骨髄腫から選択される。
【００９６】
さらに別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本明細書で説明される融合タンパク質、細胞、核酸、ウイルス粒子またはベクターを特徴とする。
【００９７】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍抗原を発現する疾患の処置に使用するための、本明細書で説明される融合タンパク質、細胞、核酸、ベクターまたは方法を特徴とする。
【００９８】
自己抗体または同種異系抗体疾患の処置に使用するための方法および組成物
一態様において、本発明は、それを必要とする対象の自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、改変Ｔ細胞を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記改変Ｔ細胞が、自殺遺伝子と、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む、方法を特徴とする。別の態様において、本発明は、それを必要とする対象の自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、改変Ｔ細胞を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、前記改変Ｔ細胞が、二量体化ドメインと、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードする核酸を含む、方法を特徴とする。
【００９９】
一部の実施形態において、自殺遺伝子は、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【０１００】
一部の実施形態において、自殺遺伝子は、配列番号３０１３および３０１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体化ドメインをさらに含む。
【０１０１】
一部の実施形態において、二量体化ドメインは、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態において、二量体化ドメインは、配列番号９８０のアミノ酸配列を含むフューリン切断部位をさらに含む。
【０１０３】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３０３５のアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
一部の実施形態において、有効量を投与することは、Ｂ細胞に対する細胞毒性機能を果すために改変Ｔ細胞を活性化することを含む。
【０１０６】
一部の実施形態において、方法は、改変Ｔ細胞の細胞死を誘導するために自殺遺伝子の自殺遺伝子産物を活性化することをさらに含む。
【０１０７】
一部の実施形態において、自殺遺伝子産物を活性化することは、自殺遺伝子産物の二量体化を促進するために二量体化剤を投与することをさらに含む。
【０１０８】
一部の実施形態において、自殺遺伝子産物を活性化することは、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮した後に行われる。
【０１０９】
一部の実施形態において、自殺遺伝子産物を活性化することは、対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に行われる。
【０１１０】
一部の実施形態において、方法は、改変Ｔ細胞の細胞死を抑止するために自殺遺伝子の自殺遺伝子産物の活性化を抑止することをさらに含む。
【０１１１】
一部の実施形態において、自殺遺伝子産物の活性化を抑止することは、自殺遺伝子産物の二量体化を防止するために可溶化剤を投与することをさらに含む。
【０１１２】
一部の実施形態において、可溶化剤を投与することは、改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対する細胞毒性機能を発揮しているときに継続する。
【０１１３】
一部の実施形態において、可溶化剤を投与することは、対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に中止される。
【０１１４】
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗Ｂ細胞結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、単鎖可変フラグメント、およびそれらの抗原結合フラグメントからなる群から選択される抗体を含む。
【０１１５】
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗Ｂ細胞結合ドメインは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるＢ細胞マーカーに特異的に結合する。
【０１１６】
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗Ｂ細胞結合ドメインは、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、これらの任意の組合せからなる群から選択されるＢ細胞マーカー、ならびにプロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞および形質細胞上で選択的に見出される少なくとも１つの表面マーカーに、特異的に結合する。
【０１１７】
一部の実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメインを含む。
【０１１８】
一部の実施形態において、共刺激ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＰＤ１、ＰＤ１Ｌ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、それらの任意の誘導体または変異体、同じ機能的な能力を有するそれらの任意の合成配列、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０１１９】
一部の実施形態において、方法は、ＣＡＲの二量体化を防止するための可溶化剤を投与することをさらに含む。
【０１２０】
一部の実施形態において、可溶化剤を投与することは、改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対する細胞毒性機能を発揮しているときに継続する。
【０１２１】
一部の実施形態において、可溶化剤を投与することは、対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に中止される。
【０１２２】
一部の実施形態において、自己抗体疾患または状態は、水疱性類天疱瘡；後天性表皮水疱症；ｐ２００類天疱瘡；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；他の類天疱瘡群疾患；疱疹状皮膚炎；セリアック病；重症筋無力症；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎および他のＡＮＣＡ＋血管炎を伴う肉芽腫症；自己免疫性辺縁系脳炎；抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体脳症；視神経脊髄炎；自己免疫性溶血性貧血；ループスおよび他の結合組織疾患における自己抗体関連終末器官損傷（抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏおよび他の自己抗体に起因する）；グレーブスおよび橋本甲状腺炎；糖尿病における抗インスリン抗体；自己免疫性低血糖における抗インスリン受容体抗体；クリオグロブリン血症；関節リウマチ；多発性硬化症；シェーグレン症候群；皮膚筋炎；慢性特発性蕁麻疹における抗Ｆｃ−イプシロン受容体抗体；肺動脈性高血圧症における抗葉酸受容体抗体、抗内皮受容体または抗アドレナリン受容体抗体；難治性高血圧症；拡張型心筋症；ならびに自己炎症性症候群からなる群から選択される。
【０１２３】
一部の実施形態において、同種異系抗体疾患または状態は、臓器移植、輸血、妊娠およびタンパク質補充療法に応答しての免疫応答である。
【０１２４】
一部の実施形態において、改変Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖、主要組織適合複合体タンパク質およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される遺伝子を欠失させることによりさらに改変される。
【０１２５】
一部の実施形態において、改変Ｔ細胞は、それを必要とする対象への投与前にさらに改変される。
【０１２６】
一部の実施形態において、改変Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを誘導することによりさらに改変される。
【０１２７】
一態様において、本発明は、本明細書で説明される方法に使用するために製剤化された医薬組成物であって、自殺遺伝子をコードする核酸と、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸とを含む改変Ｔ細胞を含む医薬組成物を特徴とする。
【０１２８】
一態様において、本発明は、本明細書で説明される方法に使用するために製剤化された医薬組成物であって、二量体化ドメインと、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードする核酸を含む改変Ｔ細胞を含む医薬組成物を特徴とする。
【０１２９】
一部の実施形態では、自殺遺伝子は、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。
【０１３０】
一部の実施形態において、自殺遺伝子は、配列番号３０１３および３０１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体化ドメインをさらに含む。
【０１３１】
一部の実施形態において、二量体化ドメインは、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
一部の実施形態において、二量体化ドメインは、配列番号９８０のアミノ酸配列を含むフューリン切断部位をさらに含む。
【０１３３】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号３０３５のアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
一部の実施形態において、組成物は、自殺遺伝子の活性化を誘導するための誘導剤をさらに含む。
【０１３６】
一部の実施形態において、改変Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖および主要組織適合複合体タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を欠く。
【０１３７】
一態様において、本発明は、（ｉ）配列番号３００１〜３００４からなる群から選択される核酸配列を含む自殺遺伝子、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含む、核酸配列を含む、単離された核酸配列を特徴とする。
【０１３８】
一部の実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号３０１８、３０２０、３０２４、３０２６、３０２８または３０３０を含む。
【０１３９】
一態様において、本発明は、（ｉ）自殺遺伝子によりコードされたアミノ酸配列であって、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離されたポリペプチドを特徴とする。
【０１４０】
一部の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号３０１９、３０２１、３０２６、３０２８、３０３０または３０３４のアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
一態様において、本発明は、（ｉ）二量体化ドメインをコードする核酸、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離された核酸配列を特徴とする。
【０１４２】
一部の実施形態において、二量体化ドメインは、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
一部の実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号９７７または３０３２を含む。
【０１４４】
一態様において、本発明は、（ｉ）二量体化ドメイン、および（ｉｉ）抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、単離されたポリペプチドを特徴とする。
【０１４５】
一部の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号９７８または３０３３のアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、初代ヒトＴ細胞におけるＰＣＳＫ（プロタンパク質転換酵素）ファミリーメンバーの発現を示すグラフである。ＰＣＳＫファミリーメンバーの発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ビーズでの刺激後０、４および１１日目に正常ドナーＴ細胞からＲＮＡを採取した。追加の群には培養中に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充し、１１日目にＲＮＡを採取した。
【図２】図２は、示されているフューリン分解ドメインに融合した抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクト（ＦＫＢＰＦＤ、ＥＲαＦＤ、またはＤＨＦＲＦＤ）が形質導入され、その後、対応する安定化化合物で処置されたジャーカットＴ細胞における化合物依存性ＣＡＲ発現を示す一連のグラフである。ＦＫＢＰＦＤ  １μＭのＳｈｉｅｌｄ１で処置された形質導入細胞；ＥＲαＦＤ  １μＭのバゼドキシフェンで処置された形質導入細胞；ＤＨＦＲＦＤ  １ｍＭのトリメトプリム（ＴＭＰ）で処置された形質導入細胞。抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶの発現を安定化化合物により誘導することができる。黒色＝ＵＴＤ（非形質導入細胞）；灰色＝化合物処置なしのコンストラクト；白色＝化合物で処置したコンストラクト。
【図３】図３は、示されているフューリン分解ドメインに融合した抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクト（ＦＫＢＰＦＤまたはＥＲαＦＤ）が形質導入され、その後、安定化化合物が添加されたジャーカット細胞におけるＣＡＲ発現の動態を示すグラフである。ＦＫＢＰＦＤ形質導入細胞を１μＭのＳｈｉｅｌｄ１で処置し、ＥＲαＦＤ形質導入細胞を、示されている時間、１μＭの４−ＯＨＴ（４−ヒドロキシタモキシフェン）で処置し、ＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。
【図４】図４は、フューリンデグロンドメインＥＲαＦＤが、初代ヒトＴ細胞においてバゼドキシフェン依存性の方式でＣＡＲ１９発現を調節することができること、および安定化がＩＬ−２の存在下、インビトロで強化されること示す、一連のヒストグラムである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。１０日目にバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。
【図５】図５は、フューリン分解ドメインに融合したＣＡＲコンストラクトが形質導入された初代Ｔ細胞における化合物洗浄除去後のＣＡＲ発現の動態を示す１対のグラフである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合した示されているフューリン分解ドメイン（ＦＫＢＰＦＤまたはＥＲαＦＤ）を、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。１０日目にバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、十分に洗浄し、示されている時間、培養下に置き、その後、ＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。
【図６】図６は、複数のＥＲα標的化薬物がＦｕｒＯｎ  ＣＡＲＴを安定化することを示す一連のプロットである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤ分解ドメインをジャーカットＴ細胞に形質導入し、その後、示されている化合物で２４時間処置した。使用したＥＲα標的化薬物は、１０μＭ  ４−ＯＨＴ、１μＭ  バゼドキシフェン、または１μＭ  ラソホキシフェンであった。
【図７】図７は、バゼドキシフェンに対するＥｒαＦＤ融合ＣＡＲ発現の用量応答を示すグラフである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤ分解ドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている濃度のバゼドキシフェンとともに４８時間、培養下に置いた。ＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。
【図８】図８は、ＥＲ−アルファに基づくＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴによる化合物依存性標的特異的細胞殺滅を示す１対のグラフである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤ分解ドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている発光処理（ｌｕｄｉｆｅｒｉｚｅｄ）細胞株標的、Ｋ５６２（ＣＤ１９−）またはＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）とともに２０時間インキュベートした。残存ルシフェラーゼ活性の分析によりパーセント殺滅を決定した。
【図９】図９は、ＦＫＢＰに基づくＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴによる化合物依存性標的特異的細胞殺滅を示す１対のグラフである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＦＫＢＰＦＤフューリン分解ドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびＳｈｉｅｌｄ１を添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている発光処理細胞株標的、Ｋ５６２（ＣＤ１９−）またはＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）とともに２０時間インキュベートした。残存ルシフェラーゼ活性の分析によりパーセント殺滅を決定した。
【図１０】図１０は、ＥＲ−アルファＦｕｒＯｎ  ＣＡＲＴの化合物依存性サイトカイン産生を示す１対のグラフである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤフューリン分解ドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている細胞株標的とともに２０時間インキュベートした。上清を採取し、サイトカインビーズアレイにより分析した。
【図１１】図１１は、ＥＲ−アルファＦｕｒＯｎ  ＣＡＲＴの化合物依存性増殖を示すグラフである。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤ分解ドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている細胞株標的とともに４日間インキュベートした。Ｔ細胞ＦｕｒＯＮ−ＣＡＲ数をＦＡＣＳにより分析した。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＥＲα−ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９コンストラクトにおいて試験した様々なフューリン切断部位にわたってのフューリン切断度を示す代表免疫ブロットである。試験したフューリン切断部位は、＃１０５  −  ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、＃１０６  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、＃１０７  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、＃１０８  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、＃１０２  −  ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）、＃１０３  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、＃１０４  −  ＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）、＃７３  −  ＲＴＫＲ（配列番号１２３）である。
【図１３】図１３は、ｆｕｒｏｎ（フューリンデグロン）ドメインが、ヒト初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ１９発現を安定化化合物依存性の方式で調節するが、細胞生存率および細胞増殖に影響を及ぼさないことを示す表である。
【図１４】図１４は、フューリンデグロンドメインを有するＣＡＲ１９が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を安定化化合物用量依存性の方式で殺滅することおよび親ＣＡＲコンストラクトに劣らないことを示す、一連の折れ線グラフである。
【図１５】図１５は、ＥＲαＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現する初代ヒトＴ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物用量依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式でＩＦＮγを分泌することを示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、ＥＲαＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現する初代ヒトＴ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲ１９コンストラクトに劣らない方式で増殖することを示す一連の棒グラフである。
【図１７】図１７は、試験したＦｕｒＯＮドメインが、ジャーカット細胞において化合物依存性の方式で、突然変異の数に関係なく、ＣＡＲ１９発現を調節すること、およびＣＡＲ表面発現が、安定化化合物の非存在下で検出されないことを示す、一連のグラフである。
【図１８】図１８は、ＦｕｒＯＮドメインが、ヒト初代Ｔ細胞において安定化化合物依存性およびＩＬ２依存性の方式でＣＡＲ１９発現を調節することを示す表である。ＦｕｒＯＮ部分がＣＡＲ１９に融合されているとき、安定化化合物バゼドキシフェンの非存在下で表面ＣＡＲ発現は検出されない。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、限定数の突然変異をデグロンドメインに含むＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現するＣＡＲＴ細胞が、安定化化合物依存性および標的依存性の方式でＣＤ１９＋腫瘍細胞を殺滅すること、および親ＣＡＲコンストラクトに劣らないことを示す、折れ線グラフである。
【図２０】図２０は、限定数の突然変異をデグロンドメインに含むＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現するＣＡＲＴ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式でサイトカインを分泌することを示す棒グラフである。
【図２１】図２１は、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を含むＣＤ３＋Ｔ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式で増殖することを示す棒グラフである。
【図２２】図２２は、ＦｕｒＯＮドメインが、初代ヒトＴ細胞において安定化化合物依存性の方式でＣＡＲ１２３発現を調節することを示す、一連のグラフである。
【図２３】図２３は、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１２３を発現するＣＡＲＴ細胞が、安定化化合物依存性および標的依存性の方式でＣＤ１２３＋腫瘍細胞を殺滅することならびに親ＣＡＲコンストラクトに劣らないことを示す、一連の棒グラフである。
【図２４】図２４は、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１２３を発現するＣＡＲＴ細胞が、ＣＤ１２３＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式でサイトカインを分泌することを示す、一連の棒グラフである。
【図２５】図２５は、分解ドメイン（デグロン）とプロテアーゼ切断部位と第二のタンパク質ドメイン（ＣＡＲ）とを含む例示的融合タンパク質、および該融合タンパク質の薬物、例えば安定化化合物、の存在下での分解の変化を示す概略図である。
【図２６】図２６は、凝集ドメイン（ＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｍ）の４つのコピーとプロテアーゼ切断部位(フューリン部位）と第二のタンパク質ドメイン（細胞質側テールを有するＳｃＦｖ）とを含む例示的融合タンパク質、および該融合タンパク質の化合物、例えば脱凝集化合物、の存在下での凝集の変化とを示す概略図である。この図は、細胞表面発現およびしたがってＣＡＲの機能を制御するためのさらに別の実施形態である、調節性ｏｎ−ＣＡＲシステム（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｏｎ−ＣＡＲ  ｓｙｓｔｅｍ）の例示的図解である。ＣＡＲは、フューリン部位によって隔てられている改変ＦＫＢＰ１２ドメインの下流で発現される。可溶化化合物が存在しないと、ＣＡＲ分子は、小胞体内で自発的に凝集し、Ｔ細胞の表面に出て行くことができるＣＡＲ分子の数が低減される、例えば、それができるＣＡＲ分子がない。この結果、ＣＡＲ媒介Ｔ細胞機能が低下することになる、例えば、ＣＡＲ媒介Ｔ細胞機能がなくなる。可溶化化合物が存在する場合、ＣＡＲ凝集ドメインは分離され、凝集が防止される。ｓｃＦｖのＮ末端に位置するフューリン部位は、切断に利用しやすくなる。後期ゴルジ体におけるフューリンによる凝集ドメインの除去後、ＣＡＲ分子はＴ細胞の表面に出て行き、ＣＡＲ媒介Ｔ細胞機能が生じ得る。
【図２７】図２７は、完全な、しかし一時的なＢ細胞枯渇を引き起こすように設計された、ＣＤ１９  ｓＣＡＲまたはＣＤ２０  ｓＣＡＲと総称される、自殺スイッチ（誘導性カスパーゼ−９またはｉＣａｓｐ９またはｉＣ９）を有する抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体コンストラクトの図解である。ＣＤ１９／ＣＤ２０  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、融合するとＢ細胞を枯渇させることによりそれらの治療効果を発揮する。小分子化合物でのその後の処置は、カスパーゼ−９を二量体化させ、カスパーゼ活性を活性化してＣＤ１９／ＣＤ２０  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞の自殺を誘導し、それによって、Ｂ細胞再増殖が起き得るようになる。
【図２８】図２８は、カスパーゼ−９自殺カセットの別の実施形態である、可逆的カスパーゼ−９自殺カセットの図解である。このＣＤ１９／ＣＤ２０  ｒｅｖＣＡＲシステムにおいて、カスパーゼ−９は、構成的に発現され、自発的に二量体化し、かくしてＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞においてデフォルトとしてアポトーシスを誘導する。カスパーゼ−９分子を可溶化する（すなわち、二量体化を阻害する）小分子化合物の存在下では、カスパーゼ活性が阻害される。したがって、小分子可溶化剤処置は、ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大および融合中のカスパーゼ−９活性を阻害し、小分子可溶化剤の使用中止は、カスパーゼ−９活性の活性化およびｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞の自殺をもたらし、それによって、Ｂ細胞再増殖が起き得るようになる。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｆは、初代ヒトＴ細胞におけるＣＤ１９  ｓＣＡＲ、ＣＤ１９ｒｅｖＣＡＲ、およびＣＤ２０  ＣＡＲコンストラクトの効率的発現を示す一連のグラフである。
【図３０】図３０は、ＣＤ１９  ｓＣＡＲによるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での特異的殺滅を示すグラフである。Ｎａｌｍ６は、ＣＤ１９を発現するＢ細胞である（ｗｔ、野生型）。ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６細胞を殺滅したが、非形質導入（ＮＴＤ）Ｔ細胞、または対照ｓＣＡＲを発現するＴ細胞（陰性対照）は、Ｎａｌｍ６  ｗｔ細胞を認識しなかった。
【図３１】図３１は、ＡＰ２０１８７でのカスパーゼ−９自殺スイッチの活性化後のＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的な強い除去を示すグラフである。ＣＡＲ  Ｔ細胞を示されている濃度のＡＰ２０１８７の存在下で１６時間、３７℃でインキュベートした。死細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤバイオレット色素で検出し、フローサイトメトリーにより定量した。誘導性カスパーゼを発現したＴ細胞のみが除去された（ＦＭＣ６３  ｉＣ９またはＣＤ１９  ｓＣＡＲ、ならびにｉＣ９対照ＣＡＲ）。対照ＣＡＲを発現しなかったＴ細胞は、影響を受けなかった（非形質導入、ＮＴＤ、またはｉＣ９を発現しない対照ＣＡＲ）。
【図３２】図３２は、誘導性カスパーゼ−９を発現するＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞がインビボで有効であることを示すグラフである。ＮＳＧマウスに１ｘ１０６個のＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６細胞を注射した。５日後、誘導性カスパーゼ−９を発現するＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞、または非形質導入対照Ｔ細胞のいずれかで、マウスを処置した。
【図３３】図３３は、生着を示す、インビボ実験の終わりのフローサイトメトリーによる誘導性カスパーゼ−９を発現するＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞の血液および脾臓における検出を示すグラフである。
【図３４】図３４は、 殺滅アッセイ：ＣＤ２０ｓＣＡＲ、２０ｒｅｖＣＡＲおよびＣＤ２０  ｏｎＣＡＲを図示する一連のグラフである。ＣＤ２０を発現するように事前に加工されたＮａｌｍ６細胞の殺滅を査定するための４時間クロム放出アッセイ。Ｋｗｔ＝Ｋ５６２野生型細胞（該細胞は、ＣＤ２０陰性であり、特異的殺滅を実証するための無関係の標的として役立つ）。ＣＤ２０ｓＣＡＲ、２０ｒｅｖＣＡＲおよびＣＤ２０  ｏｎＣＡＲは、ＣＤ２０＋標的細胞に対する同等かつ特異的な殺滅を示す。Ｏｎ−ＣＡＲを５００ｎＭ  Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下で試験した。
【図３５】図３５は、可溶化ＦＫＢＰリガンド（例えば、ｓｈｉｅｌｄ−１）の非存在がＣＡＲ機能を阻害することを実証する一連のヒストグラムである。５００ｎＭ  ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下での殺滅と比較してｓｈｉｅｌｄ−１の非存在下での殺滅パーセント低下が示されている。Ｊｅｋｏ細胞は、ＣＤ２０を発現する。より低いＥ：Ｔ比で、Ｏｎ−ＣＡＲ機能は、ＦＫＢＰリガンドが存在しない場合、強く阻害される。
【図３６】図３６は、ＦＫＢＰリガンドＳｈｉｅｌｄ−１でのＣＡＲ表面発現のモジュレーションを例証する一連のグラフである。ＣＤ２０  ｏｎ−ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＡＲ発現について染色し、ＣＡＲシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ、フローサイトメトリーにより査定したもの）をＳｈｉｅｌｄ−１濃度に対してプロットした。Ｓｈｉｅｌｄ−１は、ＣＡＲ発現の用量依存性増加をもたらす。Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在は、ＣＤ２０  ｏｎ−ＣＡＲ発現の約６０％低下をもたらす（下のグラフ）。
【図３７】図３７は、ＣＤ１９ｒｅｖ  ＣＡＲにおけるＳｈｉｅｌｄ−１の力価を図示する一連のフローサイトメトリーグラフである。ＣＤ１９ｒｅｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（約３８％形質導入されたもの）を異なるＳｈｉｅｌｄ−１用量で２４時間インキュベートして、用量依存性カスパーゼ−９活性化を査定した。残存ＣＡＲ＋細胞をフローサイトメトリーにより定量した。ＣＤ１９ｒｅｖＣＡＲシステムでは、Ｓｈｉｅｌｄ−１の用量が低いほど、カスパーゼ−９活性化が高度になり、アポトーシスが増加されることになる（ＣＡＲ＋細胞の割合が小さくなる）。
【図３８】図３８は、抗ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞におけるアポトーシス効率のインビボ評定を図示するグラフである。ＣＤ１９陽性であるＮａｌｍ６細胞（コメツキムシルシフェラーゼを発現する）を０日目にＮＳＧマウスに注射（ｉ．ｖ．）した。４日目に、ＣＤ１９標的化ｒｅｖＣＡＲ、１９ｓＣＡＲまたは無関係（非形質導入）Ｔ細胞をマウスに注射した。示されている時点でＮａｌｍ６細胞の生物発光シグナルを定量した。示されている時点で１０ｍｇ／ｋｇのａｑｕａｓｈｉｅｌｄ−１を２回、ｒｅｖＣＡＲ処置マウスに注射した。これらの注射は、ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞を生かしておくには不十分であると予想された。そのため、ｒｅｖＣＡＲおよびＮＴＤマウスについての生物発光曲線は、非常に重なり合っており、これは、ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞の十分なインビボアポトーシスを示す。
【図３９】図３９は、ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボ効能を示す、一連の模式的タイムラインおよびグラフである。ＣＤ１９陽性であるＮａｌｍ６細胞（コメツキムシルシフェラーゼを発現する）を０日目にＮＳＧマウスに注射（ｉ．ｖ．）した。４日目に、ａｑｕａｓｈｉｅｌｄ−１を２０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で分泌するための浸透圧注入ポンプをマウスに埋め込んだ。ポンプ埋め込み成功の４時間後にＣＤ１９ｒｅｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射した（下のグラフ、黒色矢印）。示されている時点でＮａｌｍ６細胞の生物発光シグナルを定量した。注入ポンプが７日間にわたってａｑｕａｓｈｉｅｌｄ−１を分泌し、その後、Ｎａｌｍ６細胞の生物発光が上昇し始めた（ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ曲線）。
【図４０】図４０は、自殺活性化が、末梢の自殺ＣＡＲ  Ｔ細胞枯渇をもたらすことを図示する一連のフローサイトメトリーグラフである。マウスにＮａｌｍ６細胞を注射し、５日後に１９ｓ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。注射前にｓｃＦＶ発現に基づいてＣＤ１９ｓ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を選別した。フロープロットは、８日目および２６日目に末梢Ｔ細胞（ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋）を示す。ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、１０日目にＡＰ１９０３（１０ｍｇ／ｋｇ）の注射により枯渇された。ＡＰ１９０３処置マウスに関する左側の２つのプロットは、Ｔ細胞が自殺活性化後にほとんど検出できないことを示し、溶媒処置マウスに関する右側の２つのプロットは、安定なＴ細胞百分率を示した。
【図４１】図４１は、自殺活性化が、末梢のｓＣＡＲ  Ｔ細胞枯渇をもたらすことを実証する一連のグラフである。数匹のマウスからのＴ細胞の定量を行った。ｓＣＡＲ  Ｔ細胞を枯渇させるために１０日目にＡＰ１９０３でマウスを処置した。処置後、溶媒処置群とは対称的にＡＰ１９０３群ではＴ細胞百分率が降下した。
【図４２】図４２は、自殺活性化が、リンパ器官からのｓＣＡＲ  Ｔ細胞枯渇をもたらすことを実証する一連の画像およびグラフである。上の画像部分：マウスの脾臓をＡＰ１９０３処置の２週間後以降に採取し、ヒトＣＤ３について染色した。ＡＰ１９０３処置マウスでは、溶媒処置マウスとは対照的にＴ細胞が検出されない。下のグラフ：定量的ＰＣＲを行って、ＡＰ１９０３および溶媒処置マウスの脾臓においてｓＣＡＲ  Ｔ細胞を検出し、その結果、大部分のマウスにおけるほぼ完全なｓＣＡＲ非存在を実証した。
【図４３】図４３は、宿主としてのＢＴ（骨髄、肝臓、胸腺）マウスの使用が、ＴＣＲおよびＭＨＣＩ発現を欠く「ユニバーサル」Ｔ細胞を必要とすることを示す、一連の模式的タイムラインおよびグラフである。活性化後１日目にＴ細胞にＣＤ１９  ｓＣＡＲをコードするレンチウイルスを形質導入し、３日目にそれらの細胞にＣａｓ９ガイドＲＮＡをエレクトロポレーションし（１０ｕｇ／１０＾６細胞）、４日目に、ＴＣＲベータ鎖およびベータ−２ミクログロブリンを標的とするガイドＲＮＡを再びエレクトロポレーションした。フロープロットは、活性化の１０日後の細胞の４５．２％のｓＣＡＲ１９発現、ならびに細胞の約２０％におけるＴＣＲベータおよびベータ−２ミクログロブリンについてのダブルノックアウトを示す。この概略図は、Ｔ細胞産生のタイムラインの概要を示す。
【図４４】図４４は、本発明のインビボ実験の実験計画の模式的タイムラインである。非腫瘍学マウスモデルにおけるユニバーサルｓＣＡＲ機能の査定のためのＢＴ（骨髄、肝臓、胸腺）マウスの使用。ヒト胎児骨髄および胸腺を９１日前にＮＳＧマウスに移植した。生着の検証を２７日前にフローサイトメトリーにより行った。ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞を発現するユニバーサルＴ細胞を０日目に注射し、Ｂ細胞枯渇を１０日目に査定し、マウスをＡＰ１９０３（１０ｍｇ／ｋｇを用いる３回の連日注射）で処置した。ｓＣＡＲ生存をｑＰＣＲで評定した。
【図４５】図４５は、「ユニバーサル」ｓＣＡＲ  Ｔ細胞が非自己ＢＴ（骨髄、肝臓および胸腺）マウスにおいて末梢Ｂ細胞を枯渇させることを図示する、一連のフローサイトメトリーグラフである。ユニバーサルＣＡＲ  Ｔ細胞は、非がんヒト化マウスモデルにおいてヒトＢ細胞を枯渇させることができた。０日目および１０日目のフロープロットは、末梢循環におけるＣＤ１９陽性細胞の完全な非存在を明示する。
【図４６】図４６は、ユニバーサルｓＣＡＲ  Ｔ細胞をＡＰ１９０３処置で枯渇させることができることを示すグラフである。定量的ＰＣＲを行って、ＡＰ１９０３および溶媒処置マウスの末梢血においてｓＣＡＲ  Ｔ細胞を検出し、その結果、２／３のマウスにおけるほぼ完全なｓＣＡＲ非存在を実証した。ＡＰ１９０３処置の４週間後、ｇＤＮＡを用いて末梢血ＷＰＲＥコピー数からのｑＰＣＲを行った。
【図４７】図４７は、ＣＡＲＴ１９を注入したまたはＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９を注入してＢＺＡで処置したマウスであって、ＩＬ−２で共処置したまたはしていないマウスにおいて、ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６腫瘍成長が阻害されたことを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
一般に、本発明は、組換え融合タンパク質の調節性発現を特徴とする。この調節は、条件的発現ドメイン、例えば、分解ドメイン（当業界では「デグロン」と称されることが多い）または凝集ドメインと融合した対象のタンパク質を含有する、融合タンパク質の発現を特徴とする。典型的に、そのような分解ドメインは、特異的リガンド（例えば、可溶性リガンド、または融合タンパク質に繋留されたリガンド）の存在下でのみ、フォールディングして安定なコンフォメーションになる。そのようなリガンドの非存在下では、分解ドメインは、無秩序な構造をとり、その結果、天然型の細胞内機構により融合タンパク質全体の分解に至る。典型的に、そのような凝集ドメインは、特異的リガンド（例えば、可溶性リガンド、または融合タンパク質に繋留されたリガンド）の非存在下では会合してオリゴマーおよび／または凝集体になり、その結果、融合タンパク質全体の凝集および／または隔離に至る。本発明は、安定化条件下（例えば、安定化化合物の存在下）または脱凝集条件下（例えば、脱凝集化合物の存在下）で発現されたとき、分解ドメインまたは凝集ドメインを切断部位（例えば、プロテアーゼ切断部位）により対象のタンパク質から分離することができるという見識に基づく。したがって、対応するプロテアーゼの非存在下では、分解ドメインを含む融合タンパク質は、安定化化合物の存在下でのみ分解を回避することになり、凝集ドメインを含む融合タンパク質は、脱凝集化合物の存在下でのみ凝集を回避することになる。しかし、切断部位が対応するプロテアーゼにより切断されると、安定化化合物または脱凝集化合物の存在は、対象のタンパク質の分解または凝集の回避を可能にするためにもはや必要でない。なぜなら、対象のタンパク質は、もはや、分解ドメインとも凝集ドメインとも会合していないからである。したがって、最初の発現の時点では、分解ドメインを含む融合タンパク質は分解を受けやすく、凝集ドメインを含む融合タンパク質は凝集を受けやすいが、切断が起こってしまうと、結果として生じる対象のタンパク質は、その非融合タンパク質対応物と別様に区別できなくなり得る。
【０１４８】
それ故、本発明の融合タンパク質は、次の３つの必須要素を有する：条件的発現ドメイン（例えば、分解ドメインまたは凝集ドメイン）；対象のタンパク質を含有するドメイン；これら２つを隔てる切断ドメイン。これらの要素の各々の中の特定のドメインは代替可能であり、下記で論じられる。注目すべきことに、条件的発現ドメインが対象のタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側のいずれかに位置するように、融合タンパク質を構成することができる。しかし、ある特定の実施形態において、条件的発現ドメインは、対象のタンパク質のＮ末端側にある。条件的発現ドメインが分解ドメインである、そのような実施形態において、分解ドメインは、秩序が乱された場合、切断ドメインの切断の前に融合タンパク質全体を分解の標的とする。Ｃ末端融合の場合、プロテアーゼ切断部位を、プロテアーゼが存在する区画に向かわせなければならない。フューリンについての特定の場合、Ｃ末端デグロンは、小胞体およびゴルジの内腔に向いている必要がある。
【０１４９】
定義
本明細書で使用される場合、用語「条件的発現ドメイン」は、第一の状態および第二の状態、例えば、凝集状態またはコンフォメーション状態、例えば、安定化／不安定化状態、またはフォールディング／ミスフォールディング状態を有する、融合タンパク質のドメインを指す。第一の状態は、第一の率もしくはレベルでの融合タンパク質の１つもしくは複数（例えば、全て）の部分の細胞表面発現もしくは細胞外発現に関連しており、それを引き起こし、またはそれを媒介し、第二の状態は、第二の率もしくはレベルでの融合タンパク質の１つもしくは複数（例えば、全て）の部分の細胞表面発現もしくは細胞外発現に関連している、それを引き起こす、またはそれを媒介する。対象の細胞において発現されたとき、発現化合物が非存在である限り、条件的発現ドメインを含む融合タンパク質の大部分は、細胞表面においても細胞外でも検出できない。逆に言うと、発現化合物の存在下では、融合タンパク質の１つまたは複数（例えば全て）のドメインの表面発現および／または細胞外発現が実質的に上昇する。したがって、条件的発現ドメインは、次の特徴により同定することができる：（１）条件的発現ドメインは、融合タンパク質の状況下では天然に存在しない；（２）表面発現および／または細胞外発現は、同時翻訳でまたは翻訳後に調節される；（３）表面発現率および／または細胞外発現率は、発現化合物の存在下で実質的に上昇する。実施形態において、条件的発現ドメインは、例えば本明細書で説明されるような、分解ドメインである。他の実施形態において、条件的発現ドメインは、例えば本明細書で説明されるような、凝集ドメインである。実施形態において、条件的発現ドメインを含む融合タンパク質は、例えば本明細書で説明されるような、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。実施形態において、融合タンパク質は、条件的発現ドメインと第二のドメインの間に配置された異種プロテアーゼ切断部位を含む。そのような実施形態において、発現化合物の非存在下では、融合タンパク質の大部分についてのプロテアーゼ切断部位に対応するプロテアーゼは接近できず、融合タンパク質の細胞運命は、条件的発現ドメインによって決まる。発現化合物の存在下では、融合タンパク質の大部分についてのプロテアーゼ切断部位は、対応するプロテアーゼに接近可能になり、条件的発現ドメインは、融合タンパク質から切断され、融合タンパク質の残部の細胞運命は、条件的発現ドメインにより中断されないので、進行する。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、用語「凝集ドメイン」は、融合タンパク質の細胞内凝集を引き起こす、融合タンパク質のドメインを指す。対象の細胞において発現されたとき、脱凝集化合物が非存在である限り、凝集ドメインを含む融合タンパク質の大部分は、凝集体、例えば、成熟発現に達する前に、例えば、細胞の表面に発現される前に、または細胞外に分泌される前に、細胞内に隔離される凝集体の中に存在する。逆に言うと、脱凝集化合物の存在下では、融合タンパク質の１つまたは複数（例えば全て）のドメインの表面発現および／または細胞外発現が実質的に上昇する。したがって、凝集ドメインは、次の特徴により同定することができる：（１）凝集ドメインは、融合タンパク質の状況下では天然に存在しない；（２）表面発現および／または細胞外発現は、同時翻訳でまたは翻訳後に調節される；（３）表面発現率および／または細胞外発現率は、脱凝集化合物の存在下で実質的に上昇する。実施形態において、凝集ドメインは、二量体化ドメインの１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、またはそれより多くの反復を含む。実施形態において、二量体化ドメインは、ホモ二量体化ドメインである。他の実施形態において、二量体化ドメインは、ヘテロ二量体化ドメインである。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、用語「発現化合物」は、条件的発現ドメインを含む融合タンパク質を発現する細胞に添加されたとき、条件的発現ドメインと結合し、融合タンパク質の１つまたは複数（例えば全て）のドメインの表面発現および／または細胞外発現の増加をもたらす化合物を指す。発現化合物は、天然に存在するものであってもよく、または合成のものであってもよい。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、用語「脱凝集化合物」は、凝集ドメインを含む融合タンパク質を発現する細胞に添加されたとき、凝集ドメインと結合し、融合タンパク質の１つまたは複数（例えば全て）のドメインの表面発現および／または細胞外発現の増加をもたらす化合物を指す。脱凝集化合物は、天然に存在するものであってもよく、または合成のものであってもよい。
【０１５３】
用語「分解ドメイン」とは、安定化化合物の存在下で発現されたとき、安定なコンフォメーションをとる融合タンパク質のドメインを意味する。対象の細胞において発現されたとき、安定なコンフォメーションが非存在である限り、分解ドメインの大部分（および、典型的には、分解ドメインが融合している任意のタンパク質）は、内因性細胞内機構により分解されることになる。注目すべきことに、分解ドメインは、タンパク質の天然に存在するドメインではなく、むしろ、安定化化合物との接触がない限り不安定であるように加工されている。したがって、分解ドメインは、次の特徴により同定することができる：（１）分解ドメインは、天然に存在しない；（２）分解ドメインの発現は、分解率の増加または減少によって同時翻訳でまたは翻訳後に調節される；（３）分解率は、安定化化合物の存在下で実質的に低下する。一部の実施形態において、分解ドメインは、融合タンパク質の凝集をもたらさない。一部の実施形態において、安定化化合物が非存在である限り、融合タンパク質の分解ドメインまたは他のドメインを細胞内でも細胞上でも実質的に検出できない。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、用語「脱凝集」および「解凝集」は、同義的に使用される。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」は、２つ以上の異種タンパク質ドメインを合体させて単一の連続したタンパク質にすることによって作出されたタンパク質を指す。
【０１５６】
用語「異種」とは、ドメイン（例えば、タンパク質ドメイン）であって、それが融合している１つまたは複数のタンパク質ドメインとは異なる起源を有する（すなわち、天然に存在せず、言及した他のドメインのうちの少なくとも１つに融合している）ドメインを意味する。さらに、「異種プロテアーゼ切断部位」とは、融合タンパク質の内部に存在するいずれのドメインによっても切断されないプロテアーゼ切断部位を意味する。
【０１５７】
「プロテアーゼ」とは、切断されることになるタンパク質中の切断部位の存在に基づいて別のタンパク質を切断するタンパク質を意味する。
【０１５８】
「細胞内プロテアーゼ」とは、対象の細胞内で自然に発現されるプロテアーゼを意味する。
【０１５９】
「細胞外プロテアーゼ」とは、生物（例えば、哺乳動物）において自然に発現され、細胞の外部に（例えば、血液中または皮膚の表面）に分泌または露出される、プロテアーゼを意味する。
【０１６０】
「安定化化合物（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「安定化化合物（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、分解ドメインを発現する細胞に添加されたき、分解ドメインを安定化し、その後、それが分解される率を低下させる化合物を意味する。安定化化合物（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）または安定化化合物（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、天然に存在するものであってもよく、または合成のものであってもよい。
【０１６１】
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、文法上の目的語である物品が１つであるか、または１つより多く（すなわち、少なくとも１つの）であることを指す。一例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【０１６２】
用語「約」は、量、一時的な持続時間、および同種のものなどの測定可能な値を指す場合、規定された値から、±２０％の変動、またはいくつかの場合において±１０％の変動、またはいくつかの場合において±５％の変動、またはいくつかの場合において±１％の変動、またはいくつかの場合において±０．１％の変動を包含することを意味しており、これはなぜなら、このような変動は開示された方法を行うのに適切であるためである。
【０１６３】
用語「キメラ抗原受容体」またはその代わりに「ＣＡＲ」は、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、下記で定義されるような刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを少なくとも含む、組換えポリペプチドコンストラクトを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲポリペプチドコンストラクト中のドメインは、同じポリペプチド鎖中にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲポリペプチドコンストラクト中のドメインは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中、例えば、調節可能なキメラ抗原受容体（ＲＣＡＲ）中にある。
【０１６４】
一態様において、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合しているゼータ鎖である。一態様において、細胞質内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一態様において、細胞質内シグナル伝達ドメインは、下記で定義されるような少なくとも１つの共刺激分子由来の１つまたは複数の機能的なシグナル伝達ドメインをさらに含む。一態様において、共刺激分子は、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、および／またはＣＤ２８から選択される。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の共刺激分子由来の２つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つまたは複数の共刺激分子由来の少なくとも２つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一態様において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒ）に任意のリーダー配列を含む。一態様において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端にリーダー配列をさらに含み、このリーダー配列は、細胞内プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在中に抗原認識ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から適宜切断される。
【０１６５】
本明細書で説明されるものなどの、特異的抗原Ｘを標的とする、例えばそれと結合する、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、またはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲ、Ｘ−ＣＡＲ、またはＸ標的化ＣＡＲとも称される。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。
【０１６６】
用語「シグナル伝達ドメイン」は、第２メッセンジャーを生成したり、またはこのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能化したりすることにより規定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために、細胞内の情報を伝えることによって作用するタンパク質の機能的な部分を指す。一部の態様において、本明細書で説明されるＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、本明細書で説明される刺激分子もしくは共刺激分子由来のものであるか、または合成されたもしくは加工されたシグナル伝達ドメインである。
【０１６７】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルの、複数もしくは単一の鎖の、または無傷の免疫グロブリンであってもよく、自然源由来でもよいし、または組換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。
【０１６８】
用語「抗体フラグメント」は、無傷の抗体の少なくとも一部分、またはその組換え変異体を指し、ならびに無傷の抗体の抗原結合ドメイン、例えば抗原性決定可変領域であって、抗原などの標的に対する抗体フラグメントの認識および特異的結合を付与するために十分である前記ドメインを指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ｓｃＦｖ抗体フラグメント；線形抗体；単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）；ラクダ化ＶＨＨドメイン；ならびにヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体；ならびに抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに取り込まれていてもよい（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照）。抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとした足場にグラフト化することもできる（フィブロネクチンポリペプチドのミニボディを説明している米国特許第６，７０３，１９９号を参照）。
【０１６９】
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質であって、前記軽鎖および重鎖可変領域が、短いフレキシブルなポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、単一鎖のポリペプチドとして発現することができ、ならびにｓｃＦｖが、その元となった無傷の抗体の特異性を保持している、融合タンパク質を指す。特段の規定がなければ、ｓｃＦｖは、本明細書で使用される場合、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれの順番で有していてもよく、例えばポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の終端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでいてもよいし、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでいてもよい。
【０１７０】
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性と結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸配列を指す。例えば、一般的に、各重鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）および各軽鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）がある。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって説明されたもの、またはそれらの組合せなどの多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、一部の実施形態において、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームによれば、一部の実施形態において、ＶＨにおけるＣＤＲのアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬにおけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組合せでは、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ、またはその両方の一部であるアミノ酸残基に相当する。例えば、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば哺乳動物のＶＨ、例えばヒトＶＨにおいて、アミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）；ならびにＶＬ、例えば哺乳動物のＶＬ、例えばヒトＶＬにおいて、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）に相当する。
【０１７１】
抗体またはその抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの一部は、抗原結合ドメインが連続するポリペプチド鎖の一部として発現される様々な形態で存在することができ、そのような形態は、例えば、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線形抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ化ＶＨＨドメイン、ヒト化抗体、二重特異性抗体、抗体コンジュゲートを包含する（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、用語「結合ドメイン」または「抗体分子」［本明細書では「抗標的（例えば、ＣＤ１９）結合ドメイン」とも称される］は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施形態において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、前記複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第一のエピトープへの結合特異性を有し、前記複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第二のエピトープへの結合特異性を有する。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
【０１７３】
用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
【０１７４】
用語「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１７５】
用語「組換え抗体」は、例えばバクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子（このＤＮＡ分子は抗体タンパク質を発現する）、または抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体も意味すると解釈されるものとし、この場合、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当業界で利用可能であり周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【０１７６】
用語「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、本明細書で使用される場合、抗体として機能するタンパク質の１クラスと定義される。Ｂ細胞により発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称されることもある。タンパク質のこのクラスに包含される５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥである。ＩｇＡは、身体の分泌物、例えば、唾液、涙、母乳、消化管分泌物、ならびに呼吸器および尿生殖器の粘液分泌物中に存在する、一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象における一次免疫応答で生じる主要免疫グロブリンである。ＩｇＭは、凝集、補体結合および他の抗体応答において最も効果がある免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは、分っている抗体機能はないが、抗原受容体として役立ち得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露時にマスト細胞および好塩基球からメディエーターを放出させることにより即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【０１７７】
用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を惹起する分子を指す。この免疫応答は、抗体産生または特異的な免疫担当細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含み得る。当業者であれば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを包含するあらゆる高分子が抗原として役立つ可能性があることを理解しているものと予想される。さらに抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡ由来であってもよい。当業者であれば、免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、結果的に本明細書において抗原という用語が使用される場合と同様の「抗原」をコードすることを理解しているものと予想される。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされるわけではないことを理解しているものと予想される。本開示は、これらに限定されないが、１つより多くの遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を包含すること、さらに望ましい免疫応答を惹起するポリペプチドがコードされるように、これらのヌクレオチド配列は様々な組合せで配置されることが容易に理解される。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも「遺伝子」によってコードされていなくてもよいことを理解しているものと予想される。抗原は、生成されてもよく、または生体サンプル由来であってもよく、またはポリペプチド以外にも高分子であってもよいことが容易に理解される。このような生体サンプルとしては、これらに限定されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を含む流体を挙げることができる。
【０１７８】
用語「自己抗原」は、本発明に従って、免疫系により異物と認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、これらに限定されないが、細胞タンパク質、リン酸化タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質を含み、細胞表面受容体を包含する。
【０１７９】
「自己抗体」は、自己抗原に特異的なＢ細胞により産生される抗体を指す。
【０１８０】
用語「自己抗体疾患」は、本明細書で使用される場合、自己抗体免疫応答の結果として生じる障害と定義される。自己抗体疾患は、自己抗体の不適切かつ過剰な応答生成の結果である。自己抗体疾患の例としては、これらに限定されないが、数ある中でも特に次のものが挙げられる：水疱性類天疱瘡；後天性表皮水疱症；ｐ２００類天疱瘡；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；他の類天疱瘡群疾患；疱疹状皮膚炎；セリアック病；重症筋無力症；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎および他のＡＮＣＡ＋血管炎を伴う肉芽腫症；自己免疫性辺縁系脳炎；抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体脳症；視神経脊髄炎；自己免疫性溶血性貧血；ループスおよび他の結合組織疾患における自己抗体関連終末器官損傷（抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏおよび他の自己抗体に起因する）；グレーブスおよび橋本甲状腺炎；糖尿病における抗インスリン抗体；自己免疫性低血糖における抗インスリン受容体抗体；クリオグロブリン血症；関節リウマチ；多発性硬化症；シェーグレン症候群；皮膚筋炎；慢性特発性蕁麻疹における抗Ｆｃ−イプシロン受容体抗体；肺動脈性高血圧症における抗葉酸受容体抗体、抗内皮受容体または抗アドレナリン受容体抗体；難治性高血圧症；拡張型心筋症、ならびに自己炎症性症候群、例えばＩｇＧ４関連疾患。
【０１８１】
用語「自己免疫疾患」は、本明細書で使用される場合、自己抗原に対する抗体媒介自己免疫応答の結果として生じる障害または状態と定義される。自己免疫疾患は、自己抗原（ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎ）または自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）に対して不適切に産生されるおよび／または過剰に産生される、自己抗体の産生をもたらす。
【０１８２】
用語「自己」は、後でそれが再導入されることになる個体と同じ個体由来のあらゆる材料を指す。
【０１８３】
用語「抗腫瘍効果」または「抗腫瘍活性」は、様々な手段により明らかにされ得る生物学的効果を指し、そのような生物学的効果としては、これらに限定されないが、例えば、腫瘍容量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の増加、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の低下、またはがんの状態に関連する様々な生理的症状の改善が挙げられる。「抗腫瘍効果」は、初期の段階で腫瘍の発生を防止する本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにされることもあり得る。
【０１８４】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる材料を指す。２以上の個体は、１つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系といわれる。いくつかの態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分な程度、遺伝学的に異なっていてもよい。
【０１８５】
用語「異種」は、異なる種の動物由来のグラフトを指す。
【０１８６】
用語「アフェレーシス」は、本明細書で使用される場合、ドナーまたは患者の血液をドナーまたは患者から除去し、選択された特定の成分を取り出す装置に通し、残ったものをドナーまたは患者の循環に例えば自己輸血によって戻す、体外プロセスを指す。したがって、「アフェレーシスサンプル」に関しては、アフェレーシスを使用して得られたサンプルを指す。
【０１８７】
用語「切断」は、共有結合、例えば、核酸分子の主鎖中の共有結合の破断、またはペプチド結合の加水分解を指す。切断は、これらに限定されないがホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を包含する、様々な方法によって開始させることができる。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能である。二重鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断の結果として、平滑末端が生じることになることもあり、またはねじれ型末端が生じることになることもある。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、切断された二本鎖ＤＮＡへの標的化に使用され得る。
【０１８８】
用語「がん」または「腫瘍」は、異常な細胞の制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。がんは、病理組織学的タイプまたは侵襲性ステージに関係なく、あらゆるタイプのがん性成長または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換された細胞、組織もしくは臓器を包含する。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して体の他の部分に蔓延する可能性がある。様々ながんの例が本明細書で説明されており、これらに限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんおよび同種のものが挙げられる。
【０１８９】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ」、「クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピートシステム」、または「ＣＲＩＳＰＲ」は、塩基配列の短い反復を含有するＤＮＡ遺伝子座を指す。各反復の後に、ウイルスへの以前の曝露からのスペーサーＤＮＡの短いセグメントが続く。細菌および古細菌は、短鎖ＲＮＡを使用して外来核酸の分解を指示する、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと称される、適応免疫防御を発達させた。細菌の場合、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断により、侵入する外来ＤＮＡに対する獲得免疫をもたらす。
【０１９０】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムの場合、外来ＤＮＡの短いセグメントであって、「スペーサー」と称されるセグメントが、ＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に統合され、転写され、プロセシングされて短鎖ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニーリングし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的切断およびサイレンシングを指示する。最近の研究により、Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列と、ｃｒＲＮＡ結合領域の上流の保存ジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とが必要であることが明らかになった。
【０１９１】
Ｃａｓ９に対象の配列を切断するように指示するために、ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＡ融合転写物（本明細書では以降「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称される）をヒトＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターから設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳにより媒介されるゲノム編集および調節は、基礎科学、細胞工学および治療学に変革を起こすその可能性を強調した。
【０１９２】
用語「ＣＲＩＳＰＲｉ」は、転写レベルなどでの遺伝子発現の配列特異的遺伝子抑制または阻害のためのＣＲＩＳＰＲシステムを指す。
【０１９３】
「由来の」は、この用語が本明細書で使用される場合、第一の分子と第二の分子との関係を示す。これは一般的に、第一の分子と第二の分子との構造的な類似性を指し、第二の分子由来の第一の分子におけるプロセスまたは源の限定を意味したりまたは包含したりしない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインのケースにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するのに十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを生産する特定のプロセスへの限定を意味したりまたは包含したりすることはなく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から開始して不要な配列を欠失させたりまたは突然変異を付与したりして、細胞内シグナル伝達ドメインを得なければならないことを意味しない。
【０１９４】
成句「本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連する疾患」は、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連する疾患、または本明細書で説明されるような腫瘍抗原を発現する細胞に関連する状態；あるいは本明細書で説明されるような腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。一態様において、本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連するがんは、血液がんである。一態様において、本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連するがんは、固形がんである。さらに、本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、これらに限定されないが、例えば、本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患を包含する。本明細書で説明されるような腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連の徴候は、これらに限定されないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）および移植を包含する。
【０１９５】
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体または抗体フラグメントの結合特徴に有意に影響を与えたりまたは変更したりしないアミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの当業界公知の標準的な技術によって本発明の抗体または抗体フラグメントに導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。したがって、本明細書で説明されるＣＡＲ内の１つまたは複数のアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよく、変更されたＣＡＲは、本明細書で説明される機能アッセイを使用してテストすることができる。
【０１９６】
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）とその同起源のリガンド（またはＣＡＲの場合は腫瘍抗原）との結合により誘導される一次応答を指し、それによって、これらに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達、またはＣＡＲの適切なＮＫ受容体もしくはシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などの、シグナル伝達事象が媒介される。刺激は、ある特定の分子の発現の変化、例えば、ＴＧＦ−βの下方調節、および／または細胞骨格構造の再構築、および同種のものを媒介することもある。
【０１９７】
用語「刺激分子」は、免疫エフェクター細胞シグナル伝達経路、例えば、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様に関して、刺激の形で免疫エフェクター細胞の活性化を調節する細胞質内シグナル伝達配列をもたらす免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを提示したＭＨＣ分子との結合によって始動する一次シグナルであり、それにより、これらに限定されないが、増殖、活性化、分化、および同種のものなどのＴ細胞応答の媒介が起こる。刺激の形態で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列（また、「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、シグナル伝達モチーフを含有していてもよく、これは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている。本発明において特定の用途を有する一次細胞質内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても公知）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明のいずれか１つまたは複数のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１８として提供される配列であるか、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号２０で提供される配列であるか、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。
【０１９８】
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、および同種のもの）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識する可能性がある。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示させる。
【０１９９】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞における、免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性、およびサイトカインの分泌はじめとするヘルパー活性が挙げられる。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用される場合もあるが、多くの場合において鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、このようなトランケートされた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば無傷の鎖の代わりに使用することができる。したがって細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆるトランケートされた部分を包含することを意味する。
【０２００】
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。典型的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激、または抗原依存性刺激（antigen dependent simulation）に関与する分子由来のものが挙げられる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含んでいてもよい。典型的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナル、または抗原非依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、合成されるか、または加工される。例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞の場合、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質内配列を含んでいてもよいし、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質内配列を含んでいてもよいし、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、補助受容体または共刺激分子からの細胞質内配列を含んでいてもよい。
【０２０１】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質内シグナル伝達配列の例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。
【０２０２】
用語「ゼータ」またはその代わりに「ゼータ鎖」、「ＣＤ３−ゼータ」もしくは「ＴＣＲ−ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１として提供されるタンパク質、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基と定義され、「ゼータ刺激ドメイン」またはその代わりに「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞の活性化に必要な最初のシグナルを機能的に伝えるのに十分な、ゼータ鎖の細胞質内ドメインからのアミノ酸残基と定義される。一態様において、ゼータの細胞質内ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１の残基５２から１６４、またはそれらの機能的なオーソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基を含む。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１８として提供される配列である。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号２０として提供される配列である。本明細書で説明されるアミノ酸配列、例えば配列番号２０、に対する１つまたは複数の突然変異を含むＣＤ３ゼータドメインも、ここに包含される。
【０２０３】
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、これらに限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同起源の結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫応答に必要な、抗原受容体以外の細胞表面分子またはそれらのリガンドである。共刺激分子としては、これらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０２０４】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体もしくは天然型細胞内シグナル伝達ドメイン全体、またはそれらの機能的なフラグメントを含んでいてもよい。
【０２０５】
用語「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２として提供される配列アミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーの一員、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基を指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８．２のアミノ酸残基２１４〜２５５、または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基と定義される。一態様において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号１４として提供される配列または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。
【０２０６】
用語「免疫応答」は、本明細書で使用される場合、リンパ球が、抗原分子を異物として識別し、抗原を除去するために抗体の形成を誘導するとおよび／またはリンパ球を活性化すると起こる、抗原に対する細胞の応答と定義される。
【０２０７】
「免疫学的有効量」、「自己免疫疾患阻害有効量」または「治療量」が指示される場合、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して医師または研究者により決定され得る。
【０２０８】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書において使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、ならびに骨髄系由来の食細胞が挙げられる。
【０２０９】
「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えば、免疫エフェクター細胞の、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の成長または増殖の殺滅または阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞のケースにおいて、一次刺激および副刺激が、免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０２１０】
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン分泌などのヘルパー活性であり得る。
【０２１１】
用語「コード（すること）」は、ヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の規定の配列またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、およびそれにより生じる生物学的な特性を指す。したがって、細胞または他の生物系中で、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によりタンパク質が産生される場合、その遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称することができる。
【０２１２】
特に他の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列や同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを包含する。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という成句は、いくつかの場合においてそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンを含有し得る程度にイントロンを包含していてもよい。
【０２１３】
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書で説明されるような化合物、調合物、材料または組成物の量を指す。
【０２１４】
用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来の材料、またはそれらの内部で産生されたあらゆる材料を指す。
【０２１５】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入された材料、またはそれらの外部で産生されたあらゆる材料を指す。
【０２１６】
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【０２１７】
用語「トランスファーベクター」は、単離された核酸を含み、細胞内部に単離された核酸をデリバリーするのに使用できるものの組成物を指す。多数のベクターが当業界公知であり、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスなどが挙げられる。したがって、用語「トランスファーベクター」は、自律複製型プラスミドまたはウイルスを包含する。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソーム、および同種のものなどの、細胞への核酸のトランスファーを容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに包含するとも解釈されるものとする。ウイルストランスファーベクターの例としては、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、および同種のものが挙げられる。
【０２１８】
用語「発現ベクター」は、発現しようとするヌクレオチド配列に機能するように連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいし、またはインビトロでの発現系中に供給されてもよい。発現ベクターは、当業界公知のあらゆるものを包含し、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込んでいる、コスミド、プラスミド（例えば、裸の状態の、またはリポソーム中に含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【０２１９】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属の１つを指す。レンチウイルスは、レトロウイルスのなかでも非分裂細胞に感染することができるという点で独特であり、これらは、宿主細胞のＤＮＡに相当な量の遺伝情報をデリバリーすることができることから、遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶが、レンチウイルスの全ての例である。
【０２２０】
用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)で示されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。診療施設で使用される可能性があるレンチウイルスベクターの他の例としては、これらに限定されないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子デリバリー技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系および同種のものが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者公知であると予想される。
【０２２１】
用語「相同」または「同一性」は、２つの高分子間の、例えば２つの核酸分子間の、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間の、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２つの配列間の相同性は、マッチした位置または相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニット中の５個の位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個のうち９個）がマッチしているかまたは相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【０２２２】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの抗体フラグメント［例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列］である。大抵の場合、ヒト化抗体およびそれらの抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体または抗体フラグメント）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体でも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに洗練させて最適化する可能性がある。一般的に、ヒト化抗体またはそれらの抗体フラグメントは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全部のまたはかなりの部分がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むと予想される。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【０２２３】
「完全にヒト」は、分子全体がヒト由来であるか、または抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態に同一なアミノ酸配列からなる場合の、免疫グロブリン、例えば抗体または抗体フラグメントを指す。
【０２２４】
用語「単離された」は、天然状態から変更された、または天然状態から除去されたことを意味する。例えば、生きた動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」が、同じ核酸またはペプチドでもその天然状態において共存する材料から部分的または完全に分離されていれば、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在していてもよいし、または例えば宿主細胞などの非天然の環境中に存在していてもよい。
【０２２５】
本開示の内容では、以下に示す通常存在する核酸塩基の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０２２６】
用語「機能するように連結した」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列とが機能的に連結されて、結果として後者の発現をもたらすことを指す。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列と機能するように連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能するように連結している。機能するように連結したＤＮＡ配列は、互いに連続していてもよく、例えば２つのタンパク質のコード領域を合体させることが必要な場合、同じリーディングフレーム内にあってもよい。
【０２２７】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）もしくは胸骨内注射、腫瘍内、または点滴技術を包含する。
【０２２８】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態または二本鎖形態いずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に他の指定がない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドンの置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、および相補配列、加えて明確に提示された配列も事実上包含する。具体的に言えば、縮重コドンの置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混成の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成される可能性がある［Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)］。
【０２２９】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有していなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合で合体した２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を包含する。この用語は、本明細書で使用される場合、当業界では一般的に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖と、当業界では一般的に多くのタイプが存在するタンパク質と称されるそれより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」としては、例えば、なかでも生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチド、またはそれらの組合せが挙げられる。
【０２３０】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要な、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列、または導入された合成機構を指す。
【０２３１】
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に機能するように連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。いくつかの場合において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節因子を包含していてもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方式で遺伝子産物を発現するプロモーター／調節配列であってもよい。
【０２３２】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと機能するように連結している場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下において細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０２３３】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと機能するように連結している場合、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在するときだけ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０２３４】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されたポリヌクレオチドと機能するように連結されている場合、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときだけ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０２３５】
用語「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」は、全体的にまたはフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）としてのいずれかで、がん細胞の表面で発現され、がん細胞への医薬物質の優先的な標的化に有用である、分子（典型的にはタンパク質、炭水化物または脂質）を同義的に指す。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞とがん細胞の両方によって発現されるマーカー、例えば系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞と比較してがん細胞において過剰発現される、例えば、正常細胞と比較して１倍の過剰発現、２倍の過剰発現、３倍の過剰発現またはそれ以上である、細胞表面分子である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子であり、例えば、正常細胞上で発現される分子と比較して欠失、付加または突然変異を含有する分子である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、全体が、またはフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として、排他的にがん細胞の細胞表面で発現され、正常細胞の表面では合成も発現もされない。一部の実施形態において、例示的な腫瘍抗原としては、以下のものが挙げられる：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ−型レクチン様分子−１、ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞突然変異（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原［（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）］；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；癌胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ−２；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；前立腺セリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）とエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）とからなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ��；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；グロボＨ糖セラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖類部分；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ  ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異型遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ  ２）；黒色腫がん精巣抗原−１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原−２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原−１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫のアポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ［膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子］；Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラ���ゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異型（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬ  Ｔ３）；ＣＤ１０；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２１；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２４；ＣＤ２５；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ５３；ＣＤ７２；ＣＤ７３；ＣＤ７４；ＣＤ７５；ＣＤ７７；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８２；ＣＤ８３；ＣＤ８４；ＣＤ８５；ＲＯＲ１；ＢＣＭＡ；ＣＤ８６；ＣＤ１７９ｂ；ＣＤ１ａ；ＣＤ１ｂ；ＣＤ１ｃ；ＣＤ１ｄ；ＣＤ２；ＣＤ５；ＣＤ６；ＣＤ９；ＣＤ１１ａ；ＣＤ１１ｂ；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１７；ＣＤ１８；ＣＤ２６；ＣＤ２７；ＣＤ２９；ＣＤ３０；ＣＤ３１；ＣＤ３２ａ；ＣＤ３２ｂ；ＣＤ３５；ＣＤ３８；ＣＤ３９；ＣＤ４０；ＣＤ４４；ＣＤ４５；ＣＤ４５ＲＡ；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ４５ＲＣ；ＣＤ４５ＲＯ；ＣＤ４６；ＣＤ４７；ＣＤ４８；ＣＤ４９ｂ；ＣＤ４９ｃ；ＣＤ４９ｄ；ＣＤ５０；ＣＤ５２；ＣＤ５４；ＣＤ５５；ＣＤ５８；ＣＤ６０ａ；ＣＤ６２Ｌ；ＣＤ６３；ＣＤ６３；ＣＤ６８  ＣＤ６９；ＣＤ７０；ＣＤ８５Ｅ；ＣＤ８５Ｉ；ＣＤ８５Ｊ；ＣＤ９２；ＣＤ９５；ＣＤ９７；ＣＤ９８；ＣＤ９９；ＣＤ１００；ＣＤ１０２；ＣＤ１０８；ＣＤ１１９；ＣＤ１２０ａ；ＣＤ１２０ｂ；ＣＤ１２１ｂ；ＣＤ１２２；ＣＤ１２４；ＣＤ１２５；ＣＤ１２６；ＣＤ１３０；ＣＤ１３２；ＣＤ１３７；ＣＤ１３８；ＣＤ１３９；ＣＤ１４７；ＣＤ１４８；ＣＤ１５０；ＣＤ１５２；ＣＤ１６２；ＣＤ１６４；ＣＤ１６６；ＣＤ１６７ａ；ＣＤ１７０；ＣＤ１７５；ＣＤ１７５ｓ；ＣＤ１８０；ＣＤ１８４；ＣＤ１８５；ＣＤ１９２；ＣＤ１９６；ＣＤ１９７；ＣＤ２００；ＣＤ２０５；ＣＤ２１０ａ；ＣＤｗ２１０ｂ；ＣＤ２１２；ＣＤ２１３ａ１；ＣＤ２１３ａ２；ＣＤ２１５；ＣＤ２１７；ＣＤ２１８ａ；ＣＤ２１８ｂ；ＣＤ２２０；ＣＤ２２１；ＣＤ２２４；ＣＤ２２５；ＣＤ２２６；ＣＤ２２７；ＣＤ２２９；ＣＤ２３０；ＣＤ２３２；ＣＤ２５２；ＣＤ２５３；ＣＤ２５７；ＣＤ２５８；ＣＤ２６１；ＣＤ２６２；ＣＤ２６３；ＣＤ２６４；ＣＤ２６７；ＣＤ２６８；ＣＤ２６９；ＣＤ２７０；ＣＤ２７２；ＣＤ２７４；ＣＤ２７５；ＣＤ２７７；ＣＤ２７９；ＣＤ２８３；ＣＤ２８９；ＣＤ２９０；ＣＤ２９５；ＣＤ２９８；ＣＤ３００ａ；ＣＤ３００ｃ；ＣＤ３０５；ＣＤ３０６；ＣＤ３０７ａ；ＣＤ３０７ｂ；ＣＤ３０７ｃ；ＣＤ３０７ｄ；ＣＤ３０７ｅ；ＣＤ３１４；ＣＤ３１５；ＣＤ３１６；ＣＤ３１７；ＣＤ３１９；ＣＤ３２１；ＣＤ３２７；ＣＤ���２８；ＣＤ３２９；ＣＤ３３８；ＣＤ３５１；ＣＤ３５２；ＣＤ３５３；ＣＤ３５４；ＣＤ３５５；ＣＤ３５７；ＣＤ３５８；ＣＤ３６０；ＣＤ３６１；ＣＤ３６２；ＣＤ３６３；ならびにＭＨＣ上に提示されるこれらの抗原のいずれかについてのペプチド。特に好ましい抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＢＣＭＡ、ＣＳ−１、ＣＤ１３８、ＣＬＤＮ６、メソセリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、ＣＤ３３およびＣＬＬ−１が挙げられる。一部の実施形態において、本開示のＣＡＲは、ＭＨＣ提示ペプチドと結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）を含むＣＡＲを包含する。通常、内因性タンパク質由来のペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットを満たしており、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての有核細胞によって構成的に発現される。がんにおいて、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の特有なクラスの代表である。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況においてウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が、説明されている［例えば、Sastry et al., J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva et al., Bood, 2011 117(16):4262-4272；Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい］。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示型ライブラリーなどのライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。したがって、本開示は、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ＭＡＧＥ−Ａ１およびＲＡＧＥ−１の群から選択される分子のＭＨＣ提示ペプチドと結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。
【０２３６】
用語「フレキシブルなポリペプチドリンカー」または「リンカー」は、ｓｃＦｖの状況で使用される場合、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独で、または組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、フレキシブルなポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎを含み、式中ｎは、１に等しいかまたは１より大きい正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９またはｎ＝１０（配列番号２８）である。一実施形態において、フレキシブルなポリペプチドリンカーとしては、これらに限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２９）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）が挙げられる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の反復を包含する（配列番号３１）。参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１３８４７５で説明されているリンカーも本発明の範囲内に包含される。
【０２３７】
５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡｍ７Ｇキャップともいう）は、本明細書で使用される場合、転写開始直後に真核性メッセンジャーＲＮＡの「前部」または５’末端に付加された改変されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮアーゼからの保護にとって極めて重要である。キャップの付加は転写とカップリングされ、それぞれ他方に影響を与えるようにともに転写されることによって実行される。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップを合成する複合体に結合される。この酵素的な複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング部分を改変して、その安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
【０２３８】
「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロの転写ベクターから生成される。インビトロの転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するのに使用される鋳型を含む。
【０２３９】
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着した一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの好ましい実施形態において、ポリＡは、５０から５０００個の間（配列番号３２）であり、好ましくは６４個より多く、より好ましくは１００個より多く、最も好ましくは３００または４００個より多い。ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に改変して、局在化、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性をモジュレートしてもよい。
【０２４０】
「ポリアデニル化」は、本明細書で使用される場合、ポリアデニリル部分またはその改変された変異体をメッセンジャーＲＮＡ分子に共有結合で連結させることを指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素のポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介してプレ−ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチドの長い配列（しばしば数百にもなる）である。より高次の真核生物において、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写物上に付加される。ポリ（Ａ）テールとそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。またポリアデニル化は、転写終結、細胞核外へのｍＲＮＡ輸送、および翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＲＮＡへのＤＮＡ転写直後に細胞核で起こるが、それに加えて後に細胞質内でも起こる可能性がある。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通常、切断部位付近における塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位において遊離の３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０２４１】
「一過性」は、本明細書で使用される場合、数時間、数日または数週間にわたり統合されていない導入遺伝子が発現されることを指し、ここで発現期間は、宿主細胞中でゲノムに統合されているかまたは安定なプラスミドレプリコン内に含有されている場合の遺伝子の発現期間より短い。
【０２４２】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、１種または複数の治療（例えば、１種または複数の治療剤、例えば本発明のＣＡＲ）の投与の結果として生じる、増殖性障害の進行、重症度および／もしくは期間の低減もしくは改善、または増殖性障害の１種もしくは複数の症状（好ましくは、１種もしくは複数の認識可能な症状）の改善を指す。特定の実施形態において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、患者により必ずしも認識され得るとは限らない、腫瘍の成長などの、増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を指す。他の実施形態では、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、例えば認識可能な症状の安定化により物理的に、例えば物理的パラメーターの安定化により生理的に、または両方により、増殖性障害の進行を抑制することを指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、腫瘍サイズまたはがん細胞数の低減または安定化を指す。
【０２４３】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係を指す。成句「細胞表面受容体」は、シグナルを受けて細胞膜を通過してシグナルを伝えることができる分子および分子複合体を包含する。
【０２４４】
用語「対象」は、免疫応答を惹起させることができる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を包含することが意図される。「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、ヒトであってもよく、または非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、家畜およびペット、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミ科哺乳動物が挙げられる。好ましくは、対象はヒトである。
【０２４５】
用語「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。また実質的に精製された細胞は、通常その天然に存在する状況で共存する他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種の集団を指す。他の例において、この用語は単に、それらの天然の状態において自然に共存する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、このような細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、このような細胞は、インビトロで培養されない。
【０２４６】
用語「自殺遺伝子」は、本明細書で使用される場合、構成的であってもよくまたは誘導性であってもよいプロモーターに機能するように連結した自殺またはアポトーシス誘導遺伝子を指す。自殺遺伝子の例としては、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、Ｆａｓの細胞質内ドメイン、カスパーゼ、例えばカスパーゼ−８またはカスパーゼ−９、シトシンデアミナーゼ、Ｅ１Ａ、ＦＨＩＴ、および他の公知の自殺またはアポトーシス誘導遺伝子が挙げられる。
【０２４７】
用語「自殺遺伝子産物」または「自殺ドメイン」は、本明細書で使用される場合、自殺遺伝子の発現産物を指す。
【０２４８】
用語「治療（の）」は、本明細書で使用される場合、処置を意味する。治療効果は、病状の軽減、抑制、寛解または除去によって得られる。
【０２４９】
用語「寛容」または「免疫寛容」は、本明細書で使用される場合、対象が通常は応答する特異的抗原または抗原群に対する対象の免疫応答が低下しているまたは存在しない状態を指す。寛容は、免疫応答を抑制する状態下で実現されるものであり、免疫応答の単なる非存在ではない。ある実施形態において、対象における寛容は、次のうちの１つまたは複数を特徴とし得る：未処置の対象と比較して、特異的免疫学的応答（例えば、抗原特異的エフェクターＴリンパ球、Ｂリンパ球もしくは抗体によって媒介されるもの）のレベルの低下；特異的免疫学的応答の開始もしくは進行の遅れ；または特異的免疫学的応答の開始もしくは進行リスクの低下。
【０２５０】
用語「発症予防」は、本明細書で使用される場合、疾患または病状の予防または予防的処置を意味する。
【０２５１】
用語「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」は、宿主細胞に外因性核酸を移入または導入させるプロセスを指す。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」された細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換した、または形質導入された細胞である。細胞は、対象の初代細胞およびその後代を包含する。
【０２５２】
用語「特異的に結合する」は、サンプル中に存在する同起源の結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激および／または共刺激分子）タンパク質を認識してそれと結合する抗体またはリガンドを指すが、これらの抗体またはリガンドは、サンプル中の他の分子を実質的に認識したりまたはそれと結合したりしない。
【０２５３】
「難治性」は、本明細書で使用される場合、疾患、例えば処置に応答しないがんを指す。実施形態において、難治性がんは、処置の前または開始時に、処置に対して耐性である可能性がある。他の実施形態において、難治性がんは、処置中に耐性になる可能性がある。難治性がんはまた、耐性がんとも呼ばれる。
【０２５４】
「再発した」または「再発」は、本明細書で使用される場合、改善または応答性の期間後の、例えば、治療、例えばがん治療の以前の処置後の、疾患（例えば、がん）の、またはがんなどの疾患の徴候および症状の、回帰または再出現を指す。初期応答性期間は、がん細胞のレベルが、ある特定の閾値未満、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満に低下することを含み得る。再出現は、がん細胞のレベルが、ある特定の閾値より高く、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％より高く上昇することを含み得る。例えば、例えばＢ−ＡＬＬの状況において、再出現は、例えば、完全応答後の血液、骨髄（＞５％）またはいずれかの髄外部位における芽球の再出現を含み得る。この文脈での完全応答は、＜５％ＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、ある実施形態において、応答（例えば、完全応答または部分応答）は、検出可能なＭＲＤの非存在（最小の残留疾患）を含み得る。ある実施形態において、初期応答期間は、少なくとも１、２、３、４、５もしくは６日、少なくとも１、２、３もしくは４週間、少なくとも１、２、３、４、６、８、１０もしくは１２カ月、または少なくとも１、２、３、４もしくは５年続く。
【０２５５】
範囲：本開示全体にわたり、本発明の様々な態様は、範囲の様式で示される場合がある。範囲の様式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるものとする。したがって、範囲の記載は、全ての可能性のある部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、１から６などの範囲の記載は、例えば１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの具体的に開示された部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を有するとみなされると予想される。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する何かを包含し、さらに、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％の同一性などの部分範囲を包含する。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０２５６】
融合タンパク質
異種プロテアーゼ切断部位（例えば、哺乳動物細胞内または細胞外プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断部位）によって隔てられている２つのタンパク質ドメインを包含する融合タンパク質であって、前記タンパク質ドメインのうちの第一のものが、条件的発現ドメイン、例えば、分解ドメインまたは凝集ドメインである、融合タンパク質が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、次の３つの必須要素を含む：条件的発現ドメイン、例えば分解ドメインまたは凝集ドメイン；対象のタンパク質を含有するドメイン；これら２つを隔てるプロテアーゼ切断ドメイン。条件的発現ドメイン、例えば、分解ドメインまたは凝集ドメインが、対象のタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側のいずれかに位置するように、これらの要素を配置することができる。
【０２５７】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、フューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、表２０に収載されているフューリン切断部位のいずれか１つを包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列；ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列；ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列；ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列；あるいはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、あるいはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列のフューリン切断部位を包含する。
【０２５８】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）またはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）から選択されるフューリン切断部位を含む。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）から選択されるフューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）のフューリン切断部位を包含する。
【０２５９】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、小分子リガンドの非存在下では適切なコンフォメーションを獲得することができない突然変異したタンパク質ドメインであるデグロンまたは分解ドメインと、フューリン切断部位という、２つの成分を含む、フューリンデグロン（ＦｕｒＯＮ）ドメインを包含する。フューリンデグロンドメインは、小胞体において発現される対象のタンパク質に融合していてもよい。対象のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端は、フューリンデグロンドメインが小胞体の内腔に向いていることを条件に、融合部位として使用することができる。対象のタンパク質は、膜タンパク質であってもよく（膜貫通ドメインの数を問わない）、または可溶性タンパク質であってもよい。デグロンドメインに対するフューリン切断部位の配向は、切断の結果としてフューリンデグロンドメインと対象のタンパク質が分離されるような配向であるべきである。小分子リガンドまたは安定化化合物の非存在下では、フューリンデグロンドメインは、融合タンパク質全体の不安定化または分解をもたらす。小分子リガンドまたは安定化化合物の存在下では、フューリンタンパク質は、分解を免れる。フューリンデグロンドメインは、その天然内因性リガンドへの親和性が消失されるように、小分子リガンドまたは安定化化合物への親和性が保存されるように、および小分子が非存在である場合にタンパク質不安定性が付与されるように、突然変異される。
【０２６０】
一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、表２１に収載されているタンパク質に由来する。一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、エストロゲン受容体に由来する。一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、配列番号５８もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、または配列番号１２１もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、配列番号５８または配列番号１２１から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２６１】
一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
【０２６２】
一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に由来する。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５７から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５7から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、デグロンまたは分解ドメインは、ＦＫＢタンパク質、エストロゲン受容体、またはＤＨＦＲに由来しない。
【０２６３】
対象のタンパク質
本発明の融合タンパク質は、事実上、対象のあらゆるタンパク質を包含し得る。ある特定の好ましい実施形態において、対象のタンパク質は、膜貫通タンパク質(例えば、膜貫通受容体）であってもよい。本発明の融合タンパク質の形式は、そのような膜貫通タンパク質において特に役立つ。なぜなら、膜貫通受容体のＮ末端に無傷の条件的発現ドメイン、例えば分解ドメインまたは、例えば凝集ドメインを含めることにより、結果として対象のタンパク質の活性を壊すことになる可能性があり、その一方で、Ｃ末端に含めることにより、結果として対象のタンパク質が調節不良になることがあるからである（なぜなら、例えば、膜への統合により、結果として、タンパク質または分解ドメインの安定化が分解および／または凝集を回避するのに十分なものになることがあるからである）。対象のタンパク質のクラスの一例は、下記のセクションで説明されるようなキメラ抗原Ｔ細胞受容体である。
【０２６４】
キメラ抗原受容体
一部の実施形態において、対象のタンパク質は、本明細書で説明されるような腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント、ＴＣＲもしくはＴＣＲフラグメント）と、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）と、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン）［例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される共刺激ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される一次シグナル伝達ドメイン）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン］とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。本開示に関するＣＡＲ核酸コンストラクト、コードされたタンパク質、含有するベクター、宿主細胞、医薬組成物、ならびに投与および処置方法は、参照によりその全体が組み入れられる国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５１４２６７５に詳細に開示されている。
【０２６５】
一部の実施形態において、対象のタンパク質は、腫瘍支持抗原（例えば、本明細書で説明されるような腫瘍支持抗原）と結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体もしくは抗体フラグメント、ＴＣＲもしくはＴＣＲフラグメント）と、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）と、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン）［例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される共刺激ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される一次シグナル伝達ドメイン）を含む細胞内シグナル伝達ドメイン］とを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。一部の実施形態において、腫瘍支持抗原は、間質細胞または骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に存在する抗原である。他の態様において、本発明は、そのような核酸によってコードされているポリペプチド、ならびにそのような核酸および／またはポリペプチドを含有する宿主細胞を特徴とする。
【０２６６】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメイン、またはそれらの任意の組合せから選択される、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＩＣＯＳから選択される１つまたは複数の共刺激分子から選択される少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２６７】
本発明は、一部の態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および自殺遺伝子を用いてＴ細胞を改変する方法も包含する。したがって、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸、またはＣＡＲを含む改変Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲが、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを包含する、前記核酸または改変Ｔ細胞を包含する。
【０２６８】
ＣＡＲの例は、米国特許第８，９１１，９９３号、同第８，９０６，６８２号、同第８，９７５，０７１号、同第８，９１６，３８１号、同第９，１０２，７６０号、同第９，１０１，５８４号および同第９，１０２，７６１号において説明されており、これらの特許文献の全ては、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６９】
ＣＡＲ分子の一部となり得る様々な成分の非限定的な例の配列は、表２に収載されており、この表中、「ａａ」は、アミノ酸を表し、「ｎａ」は、対応するペプチドをコードする核酸を表す。
【０２７０】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０２７１】
特定の態様において、ＣＡＲコンストラクトは、ｓｃＦｖドメインを含み、この場合、ｓｃＦｖの前に、配列番号２で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号１２で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１２０または配列番号１２４のいずれか１つを包含する細胞内シグナル伝達ドメイン、および配列番号１８または配列番号２０を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、前記ドメインは連続しており、同じリーディングフレーム内にあって、単一の融合タンパク質を形成する。
【０２７２】
一態様において、例示的なＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書で説明される抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、および細胞内刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内刺激ドメイン）を含む。一態様において、例示的なＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、本明細書で説明されるリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、本明細書で説明される抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、本明細書で説明されるヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される共刺激シグナル伝達ドメイン）および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０２７３】
例示的なリーダー配列は、配列番号２として提供される。例示的なヒンジ／スペーサー配列は、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０として提供される。例示的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号１２として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号１４として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号１６として提供される。ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号１２０として提供される。ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号１２４として提供される。例示的なＣＤ３ゼータドメイン配列は、配列番号１８または配列番号２０として提供される。
【０２７４】
所望の分子をコードする核酸配列は、当業界公知の組換え方法を使用して得ることができ、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、核酸分子を包含することがわかっているベクターからその核酸分子を抽出すること、またはその遺伝子を含有する細胞および組織から標準的な技術を使用して直接単離することなどによって得ることができる。その代わりに、対象の核酸は、クローニングされるのではなく合成的に産生されてもよい。
【０２７５】
抗原結合ドメイン
一態様において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、他に抗原結合ドメインと称される、標的特異的結合要素を含む。部分の選択は、標的細胞表面を規定するリガンドのタイプおよび数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカー、例えば、特定のがんと関連する腫瘍抗原（例えば、腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメイン）として作用するリガンドを認識するように選択することまたは加工することができる。他の実施形態において、抗原結合ドメインは、正常Ｂ細胞または標的Ｂ細胞集団（例えば、Ｂ細胞抗原と結合する抗原結合ドメイン）を枯渇させるために、正常Ｂ細胞、またはＢ細胞の亜集団を認識するように、選択されるか、または加工される。
【０２７６】
抗原結合ドメインは、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、コンジュゲート抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびこれらの機能的なフラグメント［これらに限定されないが、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物由来のナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および可変ドメイン（ＶＨＨ）を包含する］を包含する抗体と結合する、ならびに組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、親和性が増強された組換えＴＣＲ、またはそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ、および同種のものなどの、抗原結合ドメインとして機能することが当業界公知の代替足場と結合する、あらゆるドメインであり得る。いくつかの場合において、抗原結合ドメインにとって、ＣＡＲが最終的に使用されると予想される同じ種由来であることは有益である。例えば、ヒトに使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインにとって、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインにヒトまたはヒト化残基を含むことは有益であり得る。
【０２７７】
一部の実施形態において、コードされたＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、抗体、抗体フラグメント、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＳＤＡＢ）、ＶＨもしくはＶＬドメイン、ラクダ科動物ＶＨＨドメインまたは二重機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur.J. Immunol.17, 105 (1987)］を含む。
【０２７８】
一部の実施形態において、コードされたＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含む。いくつかの場合において、ｓｃＦｖは、当業界公知の方法に従って調製することができる［例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426 and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい］。ｓｃＦｖ分子は、フレキシブルなポリペプチドリンカーを使用してＶＨおよびＶＬ領域を共に連結することにより産生することができる。
【０２７９】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、その元となったｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されているｓｃＦｖ抗体フラグメントである。
【０２８０】
一態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列が哺乳動物細胞での発現にコドン最適化された核酸分子によってコードされている。一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクト全体は、その配列全体のコドンが哺乳動物細胞での発現に最適化された核酸分子によってコードされている。コドンの最適化は、コードＤＮＡ中の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。このようなコドンの縮重は、同一なポリペプチドを様々なヌクレオチド配列でコードすることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当業界公知であり、例えば、少なくとも米国特許第５，７８６，４６４号および６，１１４，１４８号で開示された方法が挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、Ｂ細胞と結合する抗原結合ドメインを含む。Ｂ細胞上で選択的に見出される細胞表面マーカーは、ＣＡＲの抗原結合ドメインと結合する抗原として作用することができる。抗Ｂ細胞抗原結合ドメインは、Ｂ細胞と結合するあらゆるドメインを包含することができ、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、およびそれらのあらゆるフラグメントを包含し得る。したがって、一実施形態において、抗原結合ドメイン部分は、哺乳動物抗体またはそのフラグメント、例えば、短鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。抗原結合ドメインは、１つまたは複数の抗原、例えば、プロＢ細胞、プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、成熟Ｂ細胞、メモリーＢ細胞および形質細胞などのＢ細胞上で選択的に見出されるあらゆる表面マーカー（しかし、これらに限定されない）に結合することができる。一実施形態において、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの抗原、例えば、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、およびこれらのあらゆる組合せに結合する。別の実施形態において、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの抗原、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、およびこれらのあらゆる組合せに結合する。いくつかの場合において、抗原結合ドメインが由来する種が、ＣＡＲが最終的に使用されることになる種と同じ種であることは有益である。例えば、ヒトに使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインがヒト抗体、本明細書の他の箇所で説明されるようなヒト化抗体、またはそのフラグメントを含むことは有益であり得る。
【０２８１】
腫瘍抗原
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、腫瘍抗原を特異的に標的とする。ＣＡＲの標的とされ得る２クラスの腫瘍抗原（腫瘍抗原、ＴＡ）がある：（１）がん細胞の表面に発現される腫瘍抗原；および（２）それ自体は細胞内にある腫瘍抗原だが、そのような抗原のフラグメント（ペプチド）がＭＨＣ（主要組織適合複合体）によりがん細胞の表面に提示される、腫瘍抗原。
【０２８２】
一実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞上でもがん細胞上でも発現されるが、正常細胞上での方が低レベルで発現される。一実施形態において、方法は、ＣＡＲを発現するように加工された細胞が、腫瘍抗原を発現するがん細胞に結合し、そのようながん細胞を殺滅することを可能にするが、例えば本明細書で説明されるアッセイにより判定して、腫瘍抗原を発現する正常細胞の３０％以上、２５％、２０％、１５％、１０％、５％またはそれ以上を殺滅しない親和性で、腫瘍抗原に結合するＣＡＲを選択することをさらに含む。例えば、Ｃｒ５１  ＣＴＬに基づくフローサイトメトリーなどの殺滅アッセイを使用することができる。一実施形態において、選択されるＣＡＲは、標的抗原に対して１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗原結合ドメインを有する。一実施形態において、選択される抗原結合ドメインは、参照抗体、例えば、本明細書で説明される抗体の少なくとも５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、５０分の１、１００分の１または１０００分の１である結合親和性を有する。
【０２８３】
したがって、以下の例示的な腫瘍抗原のいずれか１つを標的とすることができる、例えば、それと結合することができる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを発現するように、細胞を加工することができる：ＣＤ１２３、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１  （ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｔｎ  Ａｇ、ｓＴｎ  Ａｇ、Ｔｎ−Ｏ−糖ペプチド、Ｓｔｎ−Ｏ−糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸（Ｐｌｙｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３突然変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ突然変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ８６、ならびにＣＤ１７９ｂ。本明細書で説明されるＣＡＲの標的とされ得る他のＢ細胞抗原としては、以下のものが挙げられる：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６３、ＣＤ６３、ＣＤ６８  ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１０８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３０、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１９２、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ２００、ＣＤ２０５、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３２、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７７、ＣＤ２７９、ＣＤ２８３、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１９、ＣＤ３２１、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３８、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、およびＭＨＣ上に提示されるこれらの抗原のペプチド。
【０２８４】
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書では固形腫瘍関連抗原と称される、固形腫瘍と関連する、例えば固形腫瘍細胞により発現される、腫瘍抗原、例えば、中皮腫（例えば、悪性胸膜中皮腫）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺扁平上皮がん、もしくは大細胞肺がん）、膵臓がん（例えば、膵管腺癌）、食道腺癌、卵巣がん、乳がん、結腸直腸がんおよび膀胱がん、またはそれらのあらゆる組合せに関連する抗原を標的とする。一実施形態において、疾患は、膵臓がん、例えば転移性膵管腺癌（ＰＤＡ）、例えば、以前の少なくとも１標準治療時に進行した対象におけるものである。一実施形態において、疾患は、中皮腫(例えば、悪性胸膜中皮腫）、例えば、以前の少なくとも１標準治療時に進行した対象におけるものある。一実施形態において、疾患は、卵巣がん、例えば漿液性上皮性卵巣がん、例えば、以前の少なくとも１標準治療レジメン後に進行した対象におけるものである。
【０２８５】
腫瘍関連抗原（例えば、固形腫瘍抗原）の例としては、限定ではないが、以下のものが挙げられる：ＥＧＦＲｖＩＩＩ、メソセリン、ＧＤ２、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ−Ｏ−糖ペプチド、ｓＴｎ−Ｏ−糖ペプチド、ＰＳＭＡ、ＣＤ９７、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、レグマン（ｌｅｇｕｍａｎ）、ＧＤ３、ＣＤ１７１、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＳＳＥＡ−４、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ（例えば、ＥＲＢＢ２）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、エフリンＢ２、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｓＬｅ、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＦＡＰ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６もしくはＥ７、ＭＬ−ＩＡＰ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、Ｆｏｓ関連抗原、好中球エラスターゼ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、精子タンパク質１７、ベータヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＡＦＰ、サイログロブリン、ＰＬＡＣ１、ｇｌｏｂｏＨ、ＲＡＧＥ１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ  ７０−２、ＮＡ−１７、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＰＲ２０、Ｌｙ６ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＧＦＲα４、ならびにＭＨＣ上で提示されるこれらの抗原のいずれかについてのペプチド。
【０２８６】
ある実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒトメソセリンと結合する。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトメソセリンと結合するマウスｓｃＦｖドメイン、例えば、表３に示すＳＳ１である。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメント、例えば、マウスＳＳ１  ｓｃＦｖ由来のｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトメソセリンと結合するヒト抗体または抗体フラグメントである。メソセリンと結合する例示的なヒトｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列）およびマウスＳＳ１  ｓｃＦｖを表３に提供する。ＣＤＲ配列は、下線付きである。表３に提供するｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する。ＶＬおよびＶＨは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）（例えば、ＳＳ１  ｓｃＦｖドメインに示されているようなもの）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）（例えば、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ５、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２、Ｍ１３、Ｍ１４、Ｍ１５、Ｍ１６、Ｍ１７、Ｍ１８、Ｍ１９、Ｍ２０、Ｍ２１、Ｍ２２、Ｍ２３もしくはＭ２４  ｓｃＦｖドメインに示されているようなもの）を含むリンカーによって付着している。表３に収載されているｓｃＦｖドメインは、次の配向である：ＶＬ−リンカー−ＶＨ。
【０２８７】
【表７】
2019518424.tif 000009
【表８】
2019518424.tif 000010
【表９】
2019518424.tif 000011
【表１０】
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【表１１】
2019518424.tif 000013
【０２８８】
表３に提供されているメソセリン抗原結合ドメインのｓｃＦｖドメインのＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインについては表４に、軽鎖可変ドメインについては表５に示す。
【０２８９】
【表１２】
2019518424.tif 000014
【表１３】
2019518424.tif 000015
【０２９０】
【表１４】
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【表１５】
2019518424.tif 000017
【０２９１】
例えば公知の抗体、二重特異性分子またはＣＡＲからの、いずれの公知抗メソセリン結合ドメインも、本発明のＣＡＲにおける使用に好適であり得る。例えば、メソセリンに対する抗原結合ドメインは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１５／０９０２３０において説明されている、抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬであるか、またはそれに由来し得る。実施形態において、メソセリンに対する抗原結合ドメインは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ１９９７／０２５０６８、ＷＯ１９９９／０２８４７１、ＷＯ２００５／０１４６５２、ＷＯ２００６／０９９１４１、ＷＯ２００９／０４５９５７、ＷＯ２００９／０６８２０４、ＷＯ２０１３／１４２０３４、ＷＯ２０１３／０４０５５７、またはＷＯ２０１３／０６３４１９において説明されている、抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬであるか、またはそれに由来する。
【０２９２】
一実施形態において、メソセリン結合ドメインは、本明細書で説明される、例えば表３もしくは５に提供されている、メソセリン結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明される、例えば、表３もしくは４に提供されている、メソセリン結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。一実施形態において、メソセリン結合ドメインは、表５に提供されているいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表４に提供されているいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、の１つ、２つまたは全てを含む。
【０２９３】
一実施形態において、メソセリン結合ドメインは、本明細書で（例えば表３で）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表３で）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、メソセリン結合ドメインは、表３に収載されているアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、メソセリン結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表３に提供されている軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表３に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表３に提供されている重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表３に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０２９４】
一実施形態において、メソセリン結合ドメインは、配列番号２０１〜２２５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかに対する少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、メソセリン結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表３で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表３で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、メソセリン結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは４（配列番号９６７）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０２９５】
ある実施形態において、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞により発現されるＣＡＲの、抗原結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩと結合する。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩと結合するマウスｓｃＦｖドメイン、例えば、ｍｕ３１０Ｃである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、マウスｍｕ３１０Ｃ  ｓｃＦｖ由来のヒト化抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖドメインである。ＥＧＦＲｖＩＩＩと結合する例示的なヒト化ｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列）およびマウスＳＳ１  ｓｃＦｖを表６に提供する。
【０２９６】
ある実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒトクローディン６（ＣＬＤＮ６）と結合する。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＬＤＮ６と結合するマウスｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントである。ＣＬＤＮ６と結合する例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列）を表６に提供する。表６に提供するｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する。ＶＬおよびＶＨは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）を含むリンカーにより、例えば次の配向で付着している：ＶＬ−リンカー−ＶＨ。
【０２９７】
【表１６】
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【表１７】
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【０２９８】
一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、本明細書で説明される、例えば表６に提供されている、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明される、例えば、表６に提供されている、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。
【０２９９】
一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、本明細書で（例えば表６で）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表６で）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、表６に収載されているアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表６に提供されている軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表６に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表６に提供されている重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表６に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０３００】
一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、配列番号３４４〜３５２のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかに対する少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表６で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表６で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは４（配列番号９６７）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０３０１】
一実施形態において、クローディン６結合ドメインは、本明細書で説明される、例えば表６に提供されている、クローディン６結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明される、例えば、表６に提供されている、クローディン６結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。
【０３０２】
一実施形態において、クローディン−６結合ドメインは、本明細書で（例えば表６で）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表６で）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、クローディン−６結合ドメインは、表６に収載されているアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、クローディン−６結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表６に提供されている軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表６に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表６に提供されている重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表６に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０３０３】
一実施形態において、クローディン６結合ドメインは、配列番号３５３〜３５５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかに対する少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、クローディン６結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表６で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表６で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、クローディン６結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは４（配列番号９６７）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０３０４】
一実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Mujoo et al., Cancer Res. 47(4):1098-1104 (1987)；Cheung et al., Cancer Res 45(6):2642-2649 (1985)；Cheung et al., J Clin Oncol 5(9):1430-1440 (1987)；Cheung et al., J Clin Oncol 16(9):3053-3060 (1998)；Handgretinger et al., Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204 (1992)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。一部の実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、ｍＡｂ  １４．１８、１４Ｇ２ａ、ｃｈ１４．１８、ｈｕ１４．１８、３Ｆ８、ｈｕ３Ｆ８、３Ｇ６、８Ｂ６、６０Ｃ３、１０Ｂ８、ＭＥ３６．１、および８Ｈ９から選択される抗体の抗原結合部分である。例えば、ＷＯ２０１２０３３８８５、ＷＯ２０１３０４０３７１、ＷＯ２０１３１９２２９４、ＷＯ２０１３０６１２７３、ＷＯ２０１３１２３０６１、ＷＯ２０１３０７４９１６、およびＷＯ２０１３８５５５２を参照されたい。一部の実施形態において、ＧＤ２に対する抗原結合ドメインは、米国特許出願公開第２０１００１５０９１０号またはＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１１１６０１１９において説明されている抗体の抗原結合部分である。
【０３０５】
一実施形態において、Ｔｎ抗原、ｓＴｎ抗原、Ｔｎ−Ｏ−糖ペプチド抗原またはｓＴｎ−Ｏ−糖ペプチド抗原に対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１７８３６５号、米国特許第８，４４０，７９８号、欧州特許第２０８３８６８号Ａ２、Brooks et al., PNAS 107(22):10056-10061 (2010)、およびStone et al., OncoImmunology 1(6):863-873(2012)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３０６】
一実施形態において、ＰＳＭＡに対する抗原結合ドメインは、例えばParker et al., Protein Expr Purif 89(2):136-145 (2013)において説明されている抗体、例えば米国特許出願公開第２０１１０２６８６５６号において説明されている抗体（Ｊ５９１  ＳｃＦｖ）、例えばFrigerio et al, European J Cancer 49(9):2223-2232 (2013)において説明されている抗体（ｓｃＦｖＤ２Ｂ）、例えばＷＯ２００６１２５４８１において説明されている抗体（ｍＡｂｓ  ３／Ａ１２、３／Ｅ７および３／Ｆ１１）および短鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ  Ａ５およびＤ７）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３０７】
一実施形態において、ＣＤ９７に対する抗原結合ドメインは、例えば米国特許第６，８４６，９１１号において説明されている抗体、例えばde Groot et al., J Immunol 183(6):4127-4134 (2009)において説明されている抗体、またはＲ＆Ｄからの抗体ＭＡＢ３７３４の、抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３０８】
一実施形態において、ＴＡＧ７２に対する抗原結合ドメインは、例えばHombach et al., Gastroenterology 113(4):1163-1170 (1997)において説明されている抗体、およびＡｂｃａｍ  ａｂ６９１の、抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３０９】
一実施形態において、ＣＤ４４ｖ６に対する抗原結合ドメインは、例えばCasucci et al., Blood 122(20):3461-3472 (2013)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１０】
一実施形態において、ＣＥＡに対する抗原結合ドメインは、例えばChmielewski et al., Gastoenterology 143(4):1095-1107 (2012)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１１】
一実施形態において、ＥＰＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、ＭＴ１１０、ＥｐＣＡＭ−ＣＤ３二重特異性Ａｂ（例えば、clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596を参照されたい）；エドレコロマブ；３６２２Ｗ９４；ＩＮＧ−１；およびアデカツムマブ（ＭＴ２０１）から選択される抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１２】
一実施形態において、ＫＩＴに対する抗原結合ドメインは、例えば、米国特許第７９１５３９１号、米国特許出願公開第２０１２０２８８５０６号において説明されている抗体、およびいくつかの商業用カタログ抗体、の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１３】
一実施形態において、ＩＬ−１３Ｒａ２に対する抗原結合ドメインは、例えばＷＯ２００８／１４６９１１において説明されている抗体、例えばＷＯ２００４０８７７５８において説明されている抗体、いくつかの商業用カタログ抗体および例えばＷＯ２００４０８７７５８において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１４】
一実施形態において、ＣＤ１７１に対する抗原結合ドメインは、例えばHong et al., J Immunother 37(2):93-104 (2014)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１５】
一実施形態において、ＰＳＣＡに対する抗原結合ドメインは、例えばMorgenroth et al., Prostate 67(10):1121-1131 (2007)において説明されている抗体（ｓｃＦｖ  ７Ｆ５）、例えばNejatollahi et al., J of Oncology 2013(2013), article ID 839831において説明されている抗体（ｓｃＦｖ  Ｃ５−ＩＩ）および例えば米国特許出願公開第２００９０３１１１８１号において説明されている抗体の、抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１６】
一実施形態において、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２、米国特許第７６３５７５３号において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１７】
一実施形態において、葉酸受容体アルファに対する抗原結合ドメインは、抗体ＩＭＧＮ８５３、または米国特許出願公開第２０１２０００９１８１号において説明されている抗体、米国特許第４８５１３３２号において説明されている抗体、ＬＫ２６：米国特許第５９５２４８４号において説明されている抗体の、抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１８】
一実施形態において、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）に対する抗原結合ドメインは、抗体トラスツズマブまたはペルツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３１９】
一実施形態において、ＭＵＣ１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＳＡＲ５６６６５８の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２０】
一実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗原結合ドメインは、抗体セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブまたはマツズマブの抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２１】
一実施形態において、ＮＣＡＭに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン２−２Ｂ：ＭＡＢ５３２４（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２２】
一実施形態において、ＣＡＩＸに対する抗原結合ドメインは、抗体クローン３０３１２３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２３】
一実施形態において、Ｆｏｓ関連抗原１に対する抗原結合ドメインは、抗体１２Ｆ９（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２４】
一実施形態において、ＳＳＥＡ−４に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＣ８１３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）または他の市販の抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２５】
一実施形態において、ＰＤＧＦＲ−ベータに対する抗原結合ドメインは、抗体Ａｂｃａｍ  ａｂ３２５７０の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２６】
一実施形態において、ＡＬＫに対する抗原結合ドメインは、例えばMino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 16(5):1561-1571 (2010)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２７】
一実施形態において、ポリシアル酸（ｐｌｙｓｉｃａｌｉｃ  ａｃｉｄ）に対する抗原結合ドメインは、例えばNagae et al., J Biol Chem 288(47):33784-33796 (2013)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２８】
一実施形態において、ＰＬＡＣ１に対する抗原結合ドメインは、例えばGhods et al., Biotechnol Appl Biochem 2013 doi:10.1002/bab.1177において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３２９】
一実施形態において、ＧｌｏｂｏＨに対する抗原結合ドメインは、抗体ＶＫ９、または例えばKudryashov V et al, Glycoconj J.15(3):243-9 (1998)において説明されている抗体、例えばLou et al., Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487 (2014) において説明されている抗体、例えばBremer E-G et al. J Biol Chem 259:14773-14777 (1984)において説明されている抗体ＭＢｒ１の、抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３０】
一実施形態において、ＮＹ−ＢＲ−１に対する抗原結合ドメインは、例えばJager et al., Appl Immunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83 (2007)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３１】
一実施形態において、精子タンパク質１７に対する抗原結合ドメインは、例えば、Song et al., Target Oncol 2013 Aug 14 (PMID: 23943313)；Song et al., Med Oncol 29(4):2923-2931 (2012)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３２】
一実施形態において、ＴＲＰ−２に対する抗原結合ドメインは、例えばWang et al, J Exp Med. 184(6):2207-16 (1996)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３３】
一実施形態において、ＣＹＰ１Ｂ１に対する抗原結合ドメインは、例えばMaecker et al, Blood 102 (9): 3287-3294 (2003)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３４】
一実施形態において、ＲＡＧＥ−１に対する抗原結合ドメインは、抗体ＭＡＢ５３２８（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３５】
一実施形態において、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素に対する抗原結合ドメインは、抗体カタログ番号ＬＳ−Ｂ９５−１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３６】
一実施形態において、腸カルボキシルエステラーゼに対する抗原結合ドメインは、抗体４Ｆ１２：カタログ番号ＬＳ−Ｂ６１９０−５０（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３７】
一実施形態において、ｈｓｐ７０−２に対する抗原結合ドメインは、抗体Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：モノクローナル：カタログ番号ＬＳ−Ｃ１３３２６１−１００（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗原結合部分、例えばＣＤＲある。
【０３３８】
一実施形態において、ＭＡＤ−ＣＴ−２に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＭＩＤ：２４５０９５２；米国特許第７６３５７５３号において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３３９】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０３４０】
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、骨髄腫瘍上で発現される抗原（表面抗原またはＭＨＣにより提示される抗原のいずれか）である腫瘍抗原を標的とし、そのようなＣＡＲを含む細胞は、骨髄腫瘍抗原を認識する。
【０３４１】
ある実施形態において、骨髄腫瘍抗原は、骨髄腫瘍細胞の表面で優先的にまたは特異的に発現される抗原である。
【０３４２】
一実施形態において、骨髄腫瘍集団を標的とするような、ＣＡＲの抗原結合ドメインを選択することができる。あるいは、１つより多くのタイプの骨髄腫瘍への標的化が所望される場合、標的となる１つより多くの、例えば全ての骨髄腫瘍により発現される骨髄腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを選択することができる。
【０３４３】
ＣＡＲは、次のさらなる腫瘍抗原を標的とすることができる：ＣＤ１２３、ＣＤ３４、Ｆｌｔ３、ＣＤ３３およびＣＬＬ−１。実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ１２３、ＣＤ３３およびＣＬＬ−１から選択される。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ１２３である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ３３である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ３４である。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、Ｆｌｔ３である。実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＬＬ−１である。実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト抗原を標的とする。
【０３４４】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１２３、例えばヒトＣＤ１２３と結合する。いずれの公知ＣＤ１２３結合ドメインを本発明において使用してもよい。一実施形態において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１３０６３５において説明されている、抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬである。一実施形態において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０２８８９６において説明されている、抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬである。一実施形態において、ＣＤ１２３に対する抗原結合ドメインは、例えば、次の特許文献において説明されている抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの、抗原結合部分、例えばＣＤＲである：国際公開ＷＯ１９９７／０２４３７３、ＷＯ２００８／１２７７３５（例えば、２６２９２、３２７０１、３７７１６もしくは３２７０３のＣＤ１２３結合ドメイン）、ＷＯ２０１４／１３８８０５（例えば、ＣＳＬ３６２のＣＤ１２３結合ドメイン）、ＷＯ２０１４／１３８８１９、ＷＯ２０１３／１７３８２０、ＷＯ２０１４／１４４６２２、ＷＯ２００１／６６１３９、ＷＯ２０１０／１２６０６６（例えば、Ｏｌｄ４、Ｏｌｄ５、Ｏｌｄ１７、Ｏｌｄ１９、Ｎｅｗ１０２もしくはＯｌｄ６のいずれかについてのＣＤ１２３結合ドメイン）、ＷＯ２０１４／１４４６２２、ＷＯ２０１６／０２８８９６、または米国特許出願公開第２００９／０２５２７４２号。実施形態において、抗原結合ドメインは、マウス抗ヒトＣＤ１２３結合ドメインであるか、またはそれに由来する。実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１２３と結合するヒト抗体または抗体フラグメントである。実施形態において、抗原ドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する、ｓｃＦｖドメインである。ＶＬおよびＶＨは、例えば配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を含む、本明細書で説明されるリンカーによって付着していてもよく、およびいずれの配向、例えば、ＶＬ−リンカー−ＶＨ、またはＶＨ−リンカー−ＶＬであってもよい。
【０３４５】
一部の実施形態において、ＣＤ１２３と結合する抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖドメインである。一部の実施形態において、ＣＤ１２３と結合する抗原結合ドメインは、マウスｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、ＣＤ１２３と結合する抗原結合ドメインは、ヒトまたはヒト化ｓｃＦｖドメインである。ＣＬＤＮ６と結合する例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列）は、表１９に提供する。表１９に提供するｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する。ＶＬおよびＶＨは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）を含むリンカーにより、例えば次の配向で付着している：ＶＬ−リンカー−ＶＨ。一実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号７５１、７５６、７６１もしくは７６６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかに対する少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または配列番号７５１、７５６、７６１もしくは７６６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。
【０３４６】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ３３、例えばヒトＣＤ３３と結合する。いずれの公知ＣＤ３３結合ドメインを本発明において使用してもよい。一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４５７６または米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１において説明されている、抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬであり、前記特許文献の内容は、それら全体が本明細書に組み入れられる。一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、ゲムツズマブ・オゾガマイシンの、またはそれ由来の（例えば、ゲムツズマブ・オゾガマイシンのｓｃＦｖ配列の、重鎖可変ドメインの１つもしくは複数、例えば、１つ、２つもしくは３つのＣＤＲおよび／または軽鎖可変ドメインの１つもしくは複数、例えば、１つ、２つもしくは３つのＣＤＲ、またはＶＨもしくはＶＬ、またはｓｃＦｖ配列を含む、抗原結合ドメインを含む）（以前にマイロターグとして販売されていた）抗原結合部分、例えば、Bross et al., Clin Cancer Res 7(6):1490-1496 (2001)(ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ｈＰ６７．６）である。一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＡＭ４０２９７４．１によりコードされているｓｃＦｖ配列の、またはそれ由来の（例えば、重鎖可変ドメインの１つもしくは複数、例えば、１つ、２つもしくは３つのＣＤＲおよび／または軽鎖可変ドメインの１つもしくは複数、例えば、１つ、２つもしくは３つのＣＤＲ、またはＶＨもしくはＶＬ、またはｓｃＦｖ配列を含む、抗原結合ドメインを含む）抗原結合部分である［例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Wang et al., Mol. Ther., vol. 23:1, pp. 184-191 (2015)を参照されたい］。一実施形態において、ＣＤ３３に対する抗原結合ドメインは、例えばCaron et al., Cancer Res 52(24):6761-6767 (1992)において説明されている抗体（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ、ＨｕＭ１９５）、例えばLapusan et al., Invest New Drugs 30(3):1121-1131 (2012)において説明されている抗体（ＡＶＥ９６３３）、例えばAigner et al., Leukemia 27(5): 1107-1115 (2013)において説明されている抗体（ＡＭＧ３３０、ＣＤ３３  ＢｉＴＥ）、例えばDutour et al., Adv hematol 2012:683065 (2012)において説明されている抗体、および例えばPizzitola et al., Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62 (2014)において説明されている抗体の、抗原結合部分、例えばＣＤＲである。実施形態において、抗原結合ドメインは、マウス抗ヒトＣＤ３３結合ドメインであるか、またはそれに由来する。実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ３３と結合するヒト抗体または抗体フラグメントである。実施形態において、抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する、ｓｃＦｖドメインである。ＶＬおよびＶＨは、例えば配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を含む、本明細書で説明されるリンカーにより付着していてもよく、および任意の配向、例えば、ＶＬ−リンカー−ＶＨ、またはＶＨ−リンカー−ＶＬであってもよい。
【０３４７】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＬＬ−１、例えばヒトＣＬＬ−１と結合する。いずれの公知ＣＬＬ−１結合ドメインを本発明において使用してもよい。一実施形態において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４５３５または米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１において説明されている、抗体、抗原結合フラグメントまたはＣＡＲの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬであり、前記特許文献の内容は、それら全体が本明細書に組み入れられる。一実施形態において、ＣＬＬ−１に対する抗原結合ドメインは、Ｒ＆Ｄ、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｂｃａｍから入手できる抗体、例えば、ＰＥ−ＣＬＬ１−ｈｕ  カタログ番号３５３６０４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；およびＰＥ−ＣＬＬ１（ＣＬＥＣ１２Ａ）カタログ番号５６２５６６（ＢＤ）、の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。実施形態において、抗原結合ドメインは、マウス抗ヒトＣＬＬ−１結合ドメインであるか、またはそれに由来する。実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＬＬ−１と結合するヒト抗体または抗体フラグメントである。実施形態において、抗原結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する、ｓｃＦｖドメインである。ＶＬおよびＶＨは、例えば配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を含む、本明細書で説明されるリンカーにより付着していてもよく、およびいずれの配向、例えば、ＶＬ−リンカー−ＶＨ、またはＶＨ−リンカー−ＶＬであってもよい。
【０３４８】
一部の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞抗原を標的とする。ある実施形態において、Ｂ抗原は、Ｂ細胞の表面で優先的にまたは特異的に発現される抗原である。抗原を、次のいずれか１つの型のＢ細胞の表面に発現させることができる：前駆Ｂ細胞（例えば、プレＢもしくはプロＢ細胞）、早期プロＢ細胞、後期プロＢ細胞、大型プレＢ細胞、小型プレＢ細胞、未成熟Ｂ細胞、例えばナイーブＢ細胞、成熟Ｂ細胞、形質Ｂ細胞、形質芽細胞、メモリーＢ細胞、Ｂ−１細胞、Ｂ−２細胞、辺縁帯Ｂ細胞、濾胞性Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞、または調節性Ｂ細胞（Ｂｒｅｇ）。
【０３４９】
本開示は、以下の抗原を標的とし得るＣＡＲを提供する：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１；Ｃ型レクチン様分子−１；ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異型ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；がん胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ２；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）とからなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化型リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ  ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein）（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異型遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ  ２）；黒色腫がん精巣抗原１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原１、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫由来アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス（renal ubiquitous）１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異型（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８��、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＲＯＲ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ８６およびＣＤ１７９ｂ。本明細書で説明されるＣＡＲの標的とされ得る他のＢ細胞抗原としては、以下のものが挙げられる：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３５、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６３、ＣＤ６３、ＣＤ６８  ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ９２、ＣＤ９５、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０２、ＣＤ１０８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３０、ＣＤ１３２、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１９２、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤ２００、ＣＤ２０５、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３２、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７７、ＣＤ２７９、ＣＤ２８３、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９５、ＣＤ２９８、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１９、ＣＤ３２１、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３８、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、およびＣＤ３６３。
【０３５０】
別の実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＦｃＲｎ５、ＦｃＲｎ２、ＣＳ−１およびＣＤ１３８から選択される。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＣＤ１９である。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＣＤ２０である。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＣＤ２２である。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＢＣＭＡである。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＦｃＲｎ５である。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＦｃＲｎ２である。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＣＳ−１である。ある実施形態において、ＣＡＲの標的とされる抗原は、ＣＤ１３８である。
【０３５１】
一実施形態において、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞（例えば、ＣＡＲも発現する細胞）によって発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、好ましいＢ細胞集団を標的にするように選択することができる。例えば、調節性Ｂ細胞への標的化が所望される実施形態において、調節性Ｂ細胞上で発現されるが他のＢ細胞集団、例えば形質Ｂ細胞およびメモリーＢ細胞上では発現されない抗原を標的とする抗原結合ドメインが、選択される。調節性Ｂ細胞上で発現される細胞表面マーカーとしては、ＣＤ１９、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３８もしくはＣＤ８６、またはHe et al., 2014, J Immunology Research, Article ID 215471において説明されているマーカーが挙げられる。１つより多くの型のＢ細胞への標的化が所望される場合、標的となる全てのＢ細胞により発現される抗原を標的とする抗原結合ドメインを選択することができる。
【０３５２】
ある実施形態において、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞により発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１９と結合する。ＣＤ１９は、プロ／プレＢ細胞期からの最終分化した形質細胞期までの系列の分化を通じてＢ細胞上で見出される。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９と結合するマウスｓｃＦｖドメイン、例えば、ＣＴＬ０１９（例えば、配列番号３５６）である。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、マウスＣＴＬ０１９  ｓｃＦｖ由来のヒト化抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＣＤ１９と結合するヒト抗体または抗体フラグメントである。ＣＤ１９と結合する例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列、例えば、ＣＤＲ、ＶＬおよびＶＨ配列）は、表７および表１５Ａに提供する。表７に提供するｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する。ＶＬおよびＶＨは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３０）を含むリンカーによる、例えば次の配向で付着している：ＶＬ−リンカー−ＶＨ。
【０３５３】
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０３５４】
表７に提供されているＣＤ１９抗原結合ドメインのｓｃＦｖドメインのＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインについては表８および１５Ｂに、軽鎖可変ドメインについては表９および１５Ｃに示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を表す。
【０３５５】
【表２１】
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【０３５６】
【表２２】
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【０３５７】
ある実施形態において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、例えばｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表１０に収載されている可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖と可変軽鎖を合体させるリンカー配列は、本明細書で説明されるリンカー配列のいずれであってもよく、またはその代わりに、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３７８）であってもよい。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０３５８】
【表２３】
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【０３５９】
一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で説明される、例えば表７もしくは９に提供されている、ＣＤ１９結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明される、例えば、表７もしくは８に提供されている、ＣＤ１９結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる表９に提供されているいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表８に提供されているいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、の１つ、２つまたは全てを含む。
【０３６０】
一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば表７もしくは１０で）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表７もしくは１０で）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、表７または１０に収載されているアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表７もしくは１０に提供されている軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表７もしくは１０に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表７もしくは１０に提供されている重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表７もしくは１０に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０３６１】
一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、配列番号３５６〜３６８および３８１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または前述の配列いずれかに対する少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表７または１０で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表７または１０で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、ＣＤ１９結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは４（配列番号９６７）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０３６２】
当業界における、任意の公知ＣＡＲ、例えば、任意の公知ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインを、本発明に従って使用して、ＣＡＲを構築することができる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許第８，３９９，６４５号；米国特許第７，４４６，１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013)；Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011)；Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010)；Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013)；および16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10で説明されるＣＡＲである。一実施形態において、ＣＤ１９に対する抗原結合ドメインは、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１５３２７０；Kochenderfer, J.N. et al., J. Immunother. 32 (7), 689-702 (2009)；Kochenderfer, J.N., et al., Blood, 116 (20), 4099-4102 (2010)；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０３１６８７；Bejcek, Cancer Research, 55, 2346-2351, 1995；または米国特許第７，４４６，１９０号において説明されているＣＡＲ、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原結合部分、例えば、ＣＤＲである。
【０３６３】
ある実施形態において、ＣＡＲ、例えば、本発明の細胞により発現されるＣＡＲの、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡと結合する。ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球において優先的に発現されるのが認められる。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡと結合するマウスｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡに結合する、ヒト化抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖドメインである。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＢＣＭＡと結合する、ヒト抗体または抗体フラグメントである。ＢＣＭＡと結合する例示的なｓｃＦｖドメイン（およびそれらの配列、例えば、ＣＤＲ、ＶＬおよびＶＨ配列）を表１１、表１２、表１３および表１４に提供する。表１１および表１２に提供するｓｃＦｖドメイン配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を包含する。ＶＬおよびＶＨは、リンカーによって、例えば次の配向で付着している：ＶＨ−リンカー−ＶＬ。
【０３６４】
【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【０３６５】
一部の実施形態において、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０１６３８０５（この特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）からのＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成される。一部の実施形態において、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４５６５（この特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）からのＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成される。一部の実施形態において、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１２２１４４（この特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）からのＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成される。一部の実施形態において、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／０１４７８９（この特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）からのＣＡＲ分子ならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成される。一部の実施形態において、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０８９３３５（この特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）からのＣＡＲ分子ならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成される。一部の実施形態において、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／１４０２４８（この特許文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）からのＣＡＲ分子ならびに／またはＶＨおよびＶＬ配列を使用して生成される。
【０３６６】
一部の実施形態において、表１２において見出されるＶＨおよびＶＬ配列を使用して、追加の例示的なＣＡＲコンストラクトを生成することもできる。ＶＨおよびＶＬドメインならびにリンカー配列を含む例示的なｓｃＦｖドメイン、および完全長ＣＡＲのアミノ酸配列も、表１２において見出される。
【０３６７】
【表５０】
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【表５１】
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【０３６８】
ｓｃＦｖドメインのヒトＣＤＲ配列は、重鎖可変ドメインについて表１３に、軽鎖可変ドメインについて表１４に示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を表す。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従って示すが、他の規定、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ定義または複合Ｋａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ定義のもとでのＣＤＲを上記ＶＨおよびＶＬ配列に基づいて容易に演繹することができる。
【０３６９】
【表５２】
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【表５３】
2019518424.tif 000055
【表５４】
2019518424.tif 000056
【０３７０】
【表５５】
2019518424.tif 000057
【表５６】
2019518424.tif 000058
【０３７１】
一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で説明される、例えば表１１、１２もしくは１４に提供されている、ＢＣＭＡ結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明される、例えば、表１１、１２もしくは１３に提供されている、ＢＣＭＡ結合ドメインの１つもしくは複数（例えば、３つ全て）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）を含む。一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる表１１に提供されているいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１つ、２つまたは全て、ならびに表１１に提供されているいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、の１つ、２つまたは全てを含む。
【０３７２】
一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、本明細書で（例えば表１１もしくは１２で）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば表１１もしくは１２で）説明される重鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、表１１または１２に収載されているアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１１もしくは１２に提供されている軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表１１もしくは１２に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１１もしくは１２に提供されている重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、または表１１もしくは１２に提供されているアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０３７３】
一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメイン質は、配列番号３８２、３８６、３９０、３９４、３９８、４０２、４０６、４１０、４１４、４１８、４２２、４２６、４３０、４３４、４３８、４４２、４４６、４５０、４５４、４５８、４６２、４６６、４７０、４７４、４７８、４８２、４８６、４９０、４９４、４９８、５０２、５０６、５１０、５１４、５１８、５２２、５２８、５３１、５３４もしくは５３７のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかに対する少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば表１１または１２で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば本明細書で説明されるリンカーを介して、本明細書で、例えば表１１または１２で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。一実施形態において、ＢＣＭＡ結合ドメインは、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーを包含し、ここで、ｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは４（配列番号９６７）である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、次の配向のいずれであってもよい：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域。
【０３７４】
当業界における、任意の公知ＣＡＲ、例えば、任意の公知ＣＡＲのＢＣＭＡ抗原結合ドメインを、本発明に従って使用して、ＣＡＲを構築することができる。例えば、本明細書において説明されるもの。
【０３７５】
一実施形態において、ＲＯＲ１に対する抗原結合ドメインは、例えば、Hudecek et al., Clin Cancer Res 19(12):3153-3164 (2013)；ＷＯ２０１１１５９８４７；および米国特許出願公開第２０１３０１０１６０７号において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３７６】
一実施形態において、ＣＤ２２に対する抗原結合ドメインは、例えば、Haso et al., Blood, 121(7): 1165-1174 (2013)；Wayne et al., Clin Cancer Res 16(6): 1894-1903 (2010)；Kato et al., Leuk Res 37(1):83-88 (2013)；Creative BioMart (creativebiomart.net): MOM-18047-S(P)において説明されている抗体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。
【０３７７】
一実施形態において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブもしくはＧＡ１０１またはそれらの誘導体の抗原結合部分、例えばＣＤＲである。一実施形態において、ＣＤ２０に対する抗原結合ドメインは、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／１６４７３１において説明されている抗原結合部分である。
【０３７８】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上記に列挙されている抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または上記に列挙されている腫瘍抗原に結合する抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上記に列挙されている腫瘍抗原に結合する抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０３７９】
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。一態様において、このような抗体フラグメントは、それらが等価の結合親和性を保持する、例えば、それらがその元となったＩｇＧ抗体と同等の効力で同じ抗原に結合するという点において、機能的である。他の実施形態において、抗体フラグメントは、その元となった抗体より、低い結合親和性を有する、例えば、低い結合親和性で同じ抗原に結合するが、本明細書で説明される生物学的応答を提供する点において機能的である。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、標的抗原に対して１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば、１０−６Ｍまたは１０−７Ｍの結合親和性ＫＤを有する抗体フラグメントを含む。一実施形態において、抗体フラグメントは、参照抗体、例えば、本明細書で説明される抗体の少なくとも５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、５０分の１、１００分の１または１０００分の１である結合親和性を有する。
【０３８０】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、非ヒト抗体または抗体フラグメント、例えば、マウス抗体または抗体フラグメントを含む。
【０３８１】
別の実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体または抗体フラグメントを含む。一部の態様において、非ヒト化抗体は、ヒト化されており、この場合、該抗体の特異的な配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体またはそのフラグメントに対する類似性が増加するように改変されている。一態様において、抗原結合ドメインは、その元となった抗体または抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖのマウス配列と比較してヒト化されている。
【０３８２】
ヒト化抗体は、当業界公知の様々な技術を使用して産生することができ、そのような技術としては、ＣＤＲグラフト化（例えば、欧州特許第２３９，４００号、国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７、および米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェーシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（例えば、欧州特許第５９２，１０６号および欧州特許第５１９，５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814；およびRoguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、鎖シャフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたく、この参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）、ならびに、例えば、米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開番号ＷＯ９３１７１０５；Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002)；Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)；Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000)；Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)；Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)；Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)；Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)；Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)；およびPedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)（これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）において開示されている技術が挙げられるが、これらに限定されない。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変化させる、例えば向上させるために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されることになる。これらのフレームワーク置換は、当業界周知の方法により、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためにＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置の通常のものではないフレームワーク残基を同定するための配列比較により、同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、およびRiechmann et al., 1988, Nature, 332:323を参照されたく、これらの参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる）。
【０３８３】
ヒト化抗体または抗体フラグメントには、非ヒトである源からの１つまたは複数アミノ酸残基が残存している。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入」残基と称されることが多く、これらの残基は、通常は「移入」可変ドメインから得られる。本明細書で提供される場合、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、非ヒト免疫グロブリン分子からの１つまたは複数のＣＤＲと、フレームワーク領域とを含み、前記フレームワークを含むアミノ酸残基は、完全にまたは主としてヒト生殖系列に由来する。抗体または抗体フラグメントについての複数のヒト化技術が当業界周知であり、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］に従って、齧歯動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換すること、すなわち、ＣＤＲグラフト化［欧州特許２３９，４００号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７、および米国特許第４，８１６，５６７号、同第６，３３１，４１５号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第６，５４８，６４０号（これらの特許文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる）］によって行われる。そのようなヒト化抗体および抗体フラグメントの場合、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。ヒト化抗体は、一部のＣＤＲ残基およびことによると一部のフレームワーク（ＦＲ）残基が齧歯動物抗体内の類似の部位からの残基により置換されているヒト抗体であることが多い。抗体および抗体フラグメントのヒト化は、ベニアリングもしくはリサーフェーシング（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498；Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994)；およびRoguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)）または鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）によって達成することもでき、前記参考文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３８４】
ヒト化抗体の作製に使用されることになるヒト可変ドメイン、軽と重両方、の選択は、抗原性を低下させることである。いわゆる「ベストフィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列が、公知ヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。そのとき、齧歯動物のものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受入れられる［Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)（前記参考文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる）］。別の方法には、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用されることもある［例えば、Nicholson et al. Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)；Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照されたく、前記参考文献の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる］。一部の実施形態において、重鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば４つ全てのフレームワーク領域は、ＶＨ４＿４−５９生殖系列配列に由来する。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば対応するマウス配列におけるアミノ酸からの、１、２、３、４または５つの改変、例えば置換を含んでいてもよい。一実施形態において、軽鎖可変領域のフレームワーク領域、例えば４つ全てのフレームワーク領域は、ＶＫ３＿１．２５生殖系列配列に由来する。一実施形態において、フレームワーク領域は、例えば対応するマウス配列におけるアミノ酸からの、１、２、３、４または５つの改変、例えば置換を含んでいてもよい。
【０３８５】
一部の態様において、ＣＡＲの抗体フラグメントは、標的抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保持してヒト化される。本発明の一態様によれば、ヒト化抗体および抗体フラグメントは、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析プロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者に知られている。選択された候補免疫グロブリン配列のほぼ確実な三次元コンフォメーション構造を図示および表示するコンピュータプログラムを利用することができる。これらの表示の調査により、候補免疫グロブリン配列が機能する際の残基の可能性の高い役割の分析、例えば、標的抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する親和性増大などの所望の抗体または抗体フラグメント特性が達成されるようにＦＲ残基をレシピエントおよび移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに直接かつ最も大きく関与する。
【０３８６】
ヒト化抗体または抗体フラグメントは、元の抗体と同様の抗原特異性、例えば、本開示では、本明細書で説明されるような腫瘍抗原にヒトのものを結合させる能力を保持することができる。一部の実施形態において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、本明細書で説明されるような腫瘍抗原への結合の親和性および／または特異性向上を有することができる。一部の実施形態において、ヒト化抗体または抗体フラグメントは、本明細書で説明されるような腫瘍抗原または本明細書で説明されるようなＢ細胞抗原に対するより低い親和性および／または特異性を有することができる。
【０３８７】
一態様において、本発明の抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、一態様において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲの一部は、本明細書で説明されるような腫瘍抗原に特異的に結合する。
【０３８８】
一態様において、抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、短鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様において、本明細書で説明されるような抗腫瘍抗原の結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または二重機能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体［例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)］である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型のまたは増強された親和性で、本明細書で説明される腫瘍抗原に結合する。
【０３８９】
いくつかの場合において、ｓｃＦｖは、当業界公知の方法に従って調製できる［例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照］。ｓｃＦｖ分子は、フレキシブルなポリペプチドリンカーを使用してＶＨおよびＶＬ領域を一緒に連結することによって産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにフォールディングして相互作用するかに大きく影響を与える可能性がある。実際、短いポリペプチドリンカーが採用される場合（例えば、５〜１０アミノ酸の間）、鎖内のフォールディングが予防される。鎖間のフォールディングは、２つの可変領域を一緒に架橋して機能的なエピトープ結合部位を形成するのにも必要である。リンカーの方向およびサイズの例に関しては、例えば、参照により本明細書に組み入れられるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８およびＷＯ２００７／０２４７１５を参照されたい。
【０３９０】
ｓｃＦｖは、そのＶＬとＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸残基、またはそれより多くのアミノ酸残基のリンカーを含んでいてもよい。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸であるグリシンおよびセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、一連のグリシンおよびセリン反復を含み、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ここで式中ｎは、１以上の正の整数である（配列番号２２）。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２９）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）であってもよい。リンカーの長さを変化させることで、活性を保持したりまたは強化したりすることが可能であり、それにより活性研究において優れた効能がもたらされる。
【０３９１】
別の態様において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）、加工されたＴＣＲまたはそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。そのようなＴＣＲを作製する方法は、当業界公知である。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000)；Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004)；Aggen et al, Gene Ther.19(4):365-74 (2012)を参照されたい（参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、リンカー（例えば、可動性ペプチド）により連結されているＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含有するｓｃＴＣＲを加工することができる。このアプローチは、それ自体が細胞内にあるがん関連標的だが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントがＭＨＣによりがん細胞の表面に提示される、がん関連標的に対して、非常に有用である。
【０３９２】
一態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、本明細書で説明される抗原結合ドメインアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、前記抗原結合ドメインは、本明細書で説明される抗原結合ドメインの所望の機能的特性を保持する。
【０３９３】
一つの特異的態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、抗体フラグメントは、ｓｃＦｖを含む。さらなる態様において、抗体フラグメントは、可変重鎖（ＶＨ）のみを含む。
【０３９４】
様々な態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域（例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ）内の、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の、１つまたは複数のアミノ酸を改変することにより加工される。１つの特異的態様において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、抗体フラグメントは、ｓｃＦｖを含む。
【０３９５】
本発明の抗体または抗体フラグメントを、アミノ酸配列の点では（例えば、野生型と）異なるが、所望の活性の点では異ならないようにさらに改変することができることは、当業者には理解されるであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基のアミノ酸置換につながる追加のヌクレオチド置換をタンパク質に対して行ってもよい。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えてもよい。別の実施形態において、アミノ酸の紐を、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似の紐で置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる保存的置換を行ってもよい。
【０３９６】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。
【０３９７】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関して、パーセント同一性は、同じである２つ以上の配列を指す。２つの配列は、下記の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは手動アラインメントおよび目視検査によって測定して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって比較し、最大に一致するようにアラインメントしたときに、同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定百分率（例えば、指定領域にわたって、または指定されていないときには配列全体にわたって、６０％同一性、適宜、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性）を有する場合、「実質的に同一」である。適宜、同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは長さが１００から５００もしくは１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、２００アミノ酸以上）の領域にわたって存在する。
【０３９８】
配列比較のために、通常は、１つの配列が試験配列を比較する参照配列としての役割を果す。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を必要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することができる。すると、配列比較アルゴリズムが、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列アラインメントの方法は、当業界周知である。比較のための最適な配列アランメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動アラインメトおよび目視検査（例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biologyを参照のこと）によって行うことができる。
【０３９９】
パーセント配列同一性および配列類似性の決定に好適であるアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402、およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410において説明されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手できる。
【０４００】
２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０残基質量表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、決定することもできる。加えて、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、決定することができる。
【０４０１】
一態様において、本開示は、機能的に等価の分子を生成する出発抗体またはフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の改変を意図している。例えば、ＣＡＲに含まれている本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、のＶＨまたはＶＬを、本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ、の出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性が保持されるように改変することができる。本開示は、機能的に等価の分子を生成するための、ＣＡＲコンストラクト全体の改変、例えば、ＣＡＲコンストラクトの様々なドメインの１つまたは複数のアミノ酸配列における改変を意図している。ＣＡＲコンストラクトは、出発ＣＡＲコンストラクトの少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％，８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように改変することができる。
【０４０２】
二重特異性ＣＡＲ
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、オーバーラップしている。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、オーバーラップしていない。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第二のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体、および第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体、またはそれらのフラグメント、および第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体、またはそれらのフラグメントを含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはそれらのフラグメント、および第二のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖ、またはそれらのフラグメントを含む。
【０４０３】
ある特定の実施形態において、抗体分子は、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体分子である。二重特異性またはヘテロ二量体抗体分子を生成するためのプロトコールは、当業界公知であり、これらに限定されないが、例えば以下のもの包含する：例えば米国特許第５７３１１６８号において説明されている、「ノブ・イン・ホール」アプローチ；例えばＷＯ０９／０８９００４、ＷＯ０６／１０６９０５およびＷＯ２０１０／１２９３０４において説明されているような、静電ステアリングＦｃ対合；例えばＷＯ０７／１１０２０５において説明されているような、鎖交換加工ドメイン（Ｓｔｒａｎｄ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ）（ＳＥＥＤ）ヘテロ二量体形成；例えば、ＷＯ０８／１１９３５３、ＷＯ２０１１／１３１７４６およびＷＯ２０１３／０６０８６７において説明されているような、Ｆａｂアーム交換；米国特許第４４３３０５９号において説明されているような、例えば、アミン反応性基とスルフヒドリル反応性基とを有するヘテロ二重機能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート；例えば米国特許第４４４４８７８号において説明されているような、二重鎖間のジスルフィド結合の還元と酸化のサイクルによって異なる抗体からハーフ抗体（重鎖−軽鎖対またはＦａｂ）を組換えることにより生成される二重特異性抗体決定基；例えば米国特許第５２７３７４３号において説明されているような、三重機能性抗体、例えば、スルフヒドリル反応性基によって架橋された３つのＦａｂフラグメント；例えば米国特許第５５３４２５４号において説明されているような、生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テールによって架橋された、好ましくは、ジスルフィドまたはアミン反応性化学架橋によって架橋された、ｓｃＦｖ対；例えば米国特許第５５８２９９６号において説明されているような、二重機能性抗体、例えば、定常ドメインに取って換わったロイシンジッパー（例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ）によって二量体化された、異なる結合特異性を有するＦａｂフラグメント；例えば米国特許第５５９１８２８号において説明されているような、二重特異性およびオリゴ特異性（ｏｌｉｇｏｓｐｅｄｉｆｉｃ）一価およびオリゴ価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅｎｔ）受容体、例えば、ある抗体のＣＨ１領域と、通常は軽鎖と会合している他の抗体のＶＨ領域とが、ポリペプチドスペーサーによって連結されている２つの抗体（２つのＦａｂフラグメント）のＶＨ−ＣＨ１領域；例えば米国特許第５６３５６０２号において説明されているような、二重特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖片による抗体またはＦａｂフラグメントの架橋；例えば米国特許第５６３７４８１号において説明されているような、二重特異性融合タンパク質、例えば、２つのｓｃＦｖを含有し、それらと完全コンストラクト領域間に親水性ヘリカルペプチドリンカーがある、発現コンストラクト；例えば米国特許第５８３７２４２号において説明されているような、一般にダイアボディと称される、多価かつ多重特異性の結合タンパク質、例えば、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域がある第一のドメインと、Ｉｇ軽鎖可変領域の結合領域がある第二のドメインとを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性または四重特異性分子を生じる、より高次の構造も包含される）；例えば米国特許第５８３７８２１号において説明されているような、ＶＬおよびＶＨ鎖が連結されており、それがさらにペプチドスペーサーで抗体ヒンジ領域およびＣＨ３領域に接続されている、ミニボディコンストラクトであって、二量体化して二重特異性／多価分子を形成することができるミニボディコンストラクト；短いペプチドリンカー（例えば、５もしくは１０アミノ酸）でまたは全くリンカーなしで、いずれかの配向で連結されているＶＨおよびＶＬドメインであって、二量体化して二重特異性ダイアボディを形成することができるＶＨおよびＶＬドメイン；例えば米国特許第５８４４０９４号において説明されているような、三量体および四量体；例えば米国特許第５８６４０１９号において説明されているような、Ｃ末端にペプチド結合により架橋性基が接続されており、さらにＶＬドメインと会合して一連のＦＶ（またはｓｃＦｖ）を形成する、ＶＨドメイン（またはファミリーメンバーのＶＬドメイン）の紐；ならびに例えば米国特許第５８６９６２０号において説明されているように、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメイン両方を有する一本鎖結合ポリペプチドを非共有結合性または化学的架橋によって組み合わせて多価構造にして、例えば、両方のｓｃＦＶまたはダイアボディタイプの形式を使用してホモ二価、ヘテロ二価、三価および四価構造を形成する。追加の例示的な多重特異性および二重特異性分子ならびにそれらを作製する方法は、例えば、米国特許第５９１０５７３号、米国特許第５９３２４４８号、米国特許第５９５９０８３号、米国特許第５９８９８３０号、米国特許第６００５０７９号、米国特許第６２３９２５９号、米国特許第６２９４３５３号、米国特許第６３３３３９６号、米国特許第６４７６１９８号、米国特許第６５１１６６３号、米国特許第６６７０４５３号、米国特許第６７４３８９６号、米国特許第６８０９１８５号、米国特許第６８３３４４１号、米国特許第７１２９３３０号、米国特許第７１８３０７６号、米国特許第７５２１０５６号、米国特許第７５２７７８７号、米国特許第７５３４８６６号、米国特許第７６１２１８１号、米国特許出願公開第２００２００４５８７号Ａ１、米国特許出願公開第２００２０７６４０６号Ａ１、米国特許出願公開第２００２１０３３４５号Ａ１、米国特許出願公開第２００３２０７３４６号Ａ１、米国特許出願公開第２００３２１１０７８号Ａ１、米国特許出願公開第２００４２１９６４３号Ａ１、米国特許出願公開第２００４２２０３８８号Ａ１、米国特許出願公開第２００４２４２８４７号Ａ１、米国特許出願公開第２００５００３４０３号Ａ１、米国特許出願公開第２００５００４３５２号Ａ１、米国特許出願公開第２００５０６９５５２号Ａ１、米国特許出願公開第２００５０７９１７０号Ａ１、米国特許出願公開第２００５１００５４３号Ａ１、米国特許出願公開第２００５１３６０４９号Ａ１、米国特許出願公開第２００５１３６０５１号Ａ１、米国特許出願公開第２００５１６３７８２号Ａ１、米国特許出願公開第２００５２６６４２５号Ａ１、米国特許出願公開第２００６０８３７４７号Ａ１、米国特許出願公開第２００６１２０９６０号Ａ１、米国特許出願公開第２００６２０４４９３号Ａ１、米国特許出願公開第２００６２６３３６７号Ａ１、米国特許出願公開第２００７００４９０９号Ａ１、米国特許出願公開第２００７０８７３８１号Ａ１、米国特許出願公開第２００７１２８１５０号Ａ１、米国特許出願公開第２００７１４１０４９号Ａ１、米国特許出願公開第２００７１５４９０１号Ａ１、米国特許出願公開第２００７２７４９８５号Ａ１、米国特許出願公開第２００８０５０３７０号Ａ１、米国特許出願公開第２００８０６９８２０号Ａ１、米国特許出願公開第２００８１５２６４５号Ａ１、米国特許出願公開第２００８１７１８５５号Ａ１、米国特許出願公開第２００８２４１８８４号Ａ１、米国特許出願公開第２００８２５４５１２号Ａ１、米国特許出願公開第２００８２６０７３８号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１３０１０６号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１４８９０５号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１５５２７５号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１６２３５９号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１６２３６０号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１７５８５１号Ａ１、米国特許出願公開第２００９１７５８６７号Ａ１、米国特許出願公開第２００９２３２８１１号Ａ１、米国特許出願公開第２００９２３４１０５号Ａ１、米国特許出願公開第２００９２６３３９２号Ａ１、米国特許出願公開第２００９２７４６４９号Ａ１、欧州特許第３４６０８７号Ａ２、ＷＯ０００６６０５Ａ２、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１、ＷＯ９１０３４９３Ａ１、ＷＯ９３２３５３７Ａ１、ＷＯ９４０９１３１Ａ１、ＷＯ９４１２６２５Ａ２、ＷＯ９５０９９１７Ａ１、ＷＯ９６３７６２１Ａ２、ＷＯ９９６４４６０Ａ１において見出される。上記参照の出願の内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０４０４】
二重特異性抗体分子の各抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）内で、ＶＨは、ＶＬの上流にあってもよく、または下流にあってもよい。一部の実施形態において、上流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ１）の上流にそのＶＨ（ＶＨ１）があるように配置され、下流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ２）の上流にそのＶＬ（ＶＬ２）があるように配置され、したがって、全体としての二重特異性抗体分子は、ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２という配置を有する。他の実施形態において、上流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＨ（ＶＨ１）の上流にそのＶＬ（ＶＬ１）があるように配置され、下流の抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）は、そのＶＬ（ＶＬ２）の上流にそのＶＨ（ＶＨ２）があるように配置され、したがって、全体としての二重特異性抗体分子は、ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２という配置を有する。適宜、リンカーは、コンストラクトがＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２として配置される場合、２つの抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）間、例えば、ＶＬ１とＶＬ２の間に配置されるか、またはコンストラクトがＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２として配置される場合、ＶＨ１とＶＨ２の間に配置される。リンカーは、本明細書で説明されるようなリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎリンカーであってもよく、ここでｎは、１、２、３、４、５または６、好ましくは４（配列番号９６７）である。一般に、２つのｓｃＦｖ間のリンカーは、２つのｓｃＦｖのドメイン間の誤対合を回避するのに十分な長さであるべきである。リンカーは、第一のｓｃＦｖのＶＬとＶＨ間に配置されてもよい。リンカーは、第二のｓｃＦｖのＶＬとＶＨ間に配置されてもよい。複数のリンカーを有するコンストラクトの場合、リンカーのいずれか２つ以上が同じであってもよく、または異なってもよい。したがって、一部の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＶＬ、ＶＨおよび適宜１つまたは複数のリンカーを本明細書で説明されるような配置で含む。
【０４０５】
一態様において、キメラ抗原受容体は、二重特異性抗原結合ドメインと、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明されるようなもの）と、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるようなもの）とを含む。実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、抗原、例えば、本明細書で説明されるような抗原に結合する第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えば（本明細書において、例えば表６または表１２において説明される、ＣＤ１９結合ドメインまたはＢＣＭＡ結合ドメイン）、例えばｓｃＦｖを含み（または本明細書で説明されるｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／もしくは重鎖ＣＤＲを含み）、かつ本明細書で説明される１つまたは複数の抗原に対する結合特異性を有する第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えばｓｃＦｖを含み（または本明細書で説明されるｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／もしくは重鎖ＣＤＲを含む）、例えば、本明細書で説明されるようなｓｃＦｖを含み、例えば、メソセリン結合ドメインまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメイン（例えば、表２または表５において説明されているようなもの）を含む。実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ１９結合ドメイン、および本明細書で説明されるメソセリン結合ドメインを含む。実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、本明細書で説明されるＢＣＭＡ結合ドメイン、および本明細書で説明されるメソセリン結合ドメインを含む。実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、本明細書で説明されるＣＤ１９結合ドメイン、および本明細書で説明されるＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含む。実施形態において、二重特異性抗原結合ドメインは、本明細書で説明されるＢＣＭＡ結合ドメイン、および本明細書で説明されるＥＧＦＲｖＩＩＩ結合ドメインを含む。別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるような二重特異性ＣＡＲ、例えば、本明細書で説明される２つの抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＡＲを発現する（例えば、含む）ように加工されている、例えば本明細書で説明されるような、細胞（例えば、細胞の集団）、例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を提供する。いかなる理論にも縛られることはないが、そのような二重特異性ＣＡＲ（例えば本明細書で説明されるような、例えば２つの抗原結合ドメインを含むもの）を発現する細胞は、本明細書で説明される方法および組成物において有用であると考えられる。
【０４０６】
キメラＴＣＲ
一態様において、本明細書で説明される抗原結合ドメイン、例えば、抗体および抗体フラグメント、例えば、本明細書における表で提供されるものを、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１つまたは複数の定常ドメインにグラフト化して、本明細書で説明される腫瘍抗原と特異的に結合するキメラＴＣＲを作り出すことができる。理論に縛られることはないが、キメラＴＣＲは、抗原に結合するとＴＣＲ複合体経由でシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書で開示されるような、メソセリンもしくはＣＤ１９  ｓｃＦｖまたはその断片、例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメインを、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、定常ドメイン、例えば、細胞外定常ドメインの少なくとも一部、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインにグラフト化してもよい。別の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲ、例えば、本明細書で提供される表において説明されるような任意の抗体または抗体フラグメントのＣＤＲを、ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ鎖にグラフト化して、本明細書で説明される腫瘍抗原と特異的に結合するキメラＴＣＲを作り出してもよい。例えば、本明細書で開示されるＬＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインにグラフト化してもよいし、本明細書で開示されるＨＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインにグラフト化してもよく、または逆もまた同様である。そのようなキメラＴＣＲを当業界公知の方法によって産生することができる（例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377；Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496；Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74）。
【０４０７】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメイン、例えば抗原結合ドメイン、に付着している膜貫通ドメインを含むように、ＣＡＲを設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域と会合している１つまたは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が由来したタンパク質の細胞内領域と会合している１つまたは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸）を包含し得る。一態様において、膜貫通ドメインはＣＡＲの他のドメインの１つと会合しているものであり、例えば、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激ドメインと同じタンパク質からのものである。いくつかの場合において、膜貫通ドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合しないように、例えば、受容体複合体の他の一員との相互作用が最小化されるように、膜貫通ドメインを選択してもよいし、またはアミノ酸置換によって改変してもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲを発現する細胞表面上で別のＣＡＲとホモ二量体化することができる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲ発現細胞に存在する天然型の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変または置換されていてもよい。
【０４０８】
膜貫通ドメインは、天然源から得てもよいし、または組換え源から得てもよい。源が天然である場合、そのドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであってもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときはいつでも細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本発明において特定の用途を有する膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を包含していてもよい。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくとも膜貫通領域、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃと特異的に結合するリガンドを包含していてもよい。
【０４０９】
いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに付着していてもよい。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジ、またはＣＤ８ａヒンジであってもよい。一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号４のアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一態様において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の膜貫通ドメインを含む（例えば、からなる）。
【０４１０】
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列（配列番号６）のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列（配列番号８）のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
【０４１１】
一態様において、膜貫通ドメインは組換えであってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと予想される。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組は、組換え膜貫通ドメインのそれぞれの末端で見出すことができる。
【０４１２】
ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質内領域との間で、長さが２から１０アミノ酸の間の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが連結を形成していてもよい。グリシン−セリンの二つ組が特に好適なリンカーを付与する。例えば、一態様において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号１１）のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０４１３】
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０４１４】
細胞質内ドメイン
ＣＡＲの細胞質内ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを包含する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般に、ＣＡＲが導入された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌をはじめとするヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を実行するように指示する、タンパク質の部分を指す。通常は全細胞内シグナル伝達ドメインを利用することができるが、多くの場合、全ての鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、このようなトランケートされた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば無傷の鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆるトランケートされた部分を包含することを意味する。
【０４１５】
本発明のＣＡＲに使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のおよび補助受容体の細胞質側配列、ならびに同じ機能的能力を有する、これらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の組換え配列が挙げられる。
【０４１６】
ＴＣＲ単独により生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、さらに二次的および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、細胞質内シグナル伝達配列の２つの別個のクラス：ＴＣＲを介した抗原依存性の一次活性化を開始させるクラス（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）および抗原非依存性の方式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するクラス（二次細胞質内ドメイン、例えば共刺激ドメイン）によって媒介されるということができる。
【０４１７】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激による方式または阻害による方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次的な活性化を調節する。刺激による方式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有していてもよい。
【０４１８】
本発明において特に有用なＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても公知）ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄの上記ドメインが挙げられる。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−ゼータ、例えば、本明細書で説明されるＣＤ３−ゼータ配列の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０４１９】
一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が変更された（例えば、増加または減少した）、突然変異したＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／またはトランケートされたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのＩＴＡＭモチーフを含む。
【０４２０】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインそれ自身を含んでいてもよいし、または本発明のＣＡＲの状況において有用な他のあらゆる所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖の部分、および共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ならびに同種のものが挙げられる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、インビトロにおけるヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能、および生存を強化し、インビボにおけるヒトＴ細胞の持続性および抗腫瘍活性を増大させることが実証されている［Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706］。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０４２１】
本発明のＣＡＲの細胞質内部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順番または特定の順番で互いに連結されていてもよい。例えば長さが２から１０アミノ酸の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の連結を形成していてもよい。一実施形態において、好適なリンカーとして、グリシン−セリンの二つ組を使用することができる。一実施形態において、好適なリンカーとして、単一のアミノ酸、例えばアラニン、グリシンを使用することができる。
【０４２２】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上、例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるように設計される。ある実施形態において、２つ以上、例えば、２、３、４、５、またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えば本明細書で説明されるリンカー分子によって隔てられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リンカー分子は、グリシン残基である。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン残基である。
【０４２３】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号１４のシグナル伝達ドメインである。一態様において、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号１８のシグナル伝達ドメインである。
【０４２４】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、配列番号１７の核酸配列によってコードされる。
【０４２５】
一態様において、細胞内のものは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号１１１３の核酸配列によってコードされる。
【０４２６】
一態様において、細胞内のものは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号１１１１の核酸配列によってコードされる。
【０４２７】
一態様において、本発明の、例えば、本明細書で説明される細胞、例えば、２つの異なるＣＡＲを発現する細胞は、本明細書で説明される標的抗原と結合する抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、一次シグナル伝達ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインとを各々が包含する、ＣＡＲを包含する。上述の態様の実施形態において、２つの異なるＣＡＲの共刺激ドメインは、同じであってもよく、または異なってもよい。実施形態において、２つの異なるＣＡＲの１つまたは複数は、１つより多くの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。他の態様において、本発明の、例えば、本明細書で説明される細胞、例えば、２つの異なるＣＡＲを発現する細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含するが共刺激シグナル伝達ドメインを包含しない、第一のＣＡＲと、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインとを包含するが一次シグナル伝達ドメインを包含しない、第二のＣＡＲとを包含する。
【０４２８】
一態様において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、２つの異なるＣＡＲを発現する細胞は、別の、例えば第三のＣＡＲ、例えば同じ標的または異なる標的（例えば、本明細書で説明される腫瘍抗原以外の標的、または本明細書で説明される異なる腫瘍抗原）に対する、異なる抗原結合ドメインを包含する、例えば別のＣＡＲを、さらに含むことができる。例えば、本発明の細胞が、第二の標的腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメインを含む第三のＣＡＲを発現する、実施形態において、第三のＣＡＲは、第一または第二のＣＡＲが標的とする腫瘍抗原と同じがん細胞型を発現した標的に対する抗原結合ドメインを包含する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第一の腫瘍抗原を標的とする第一のＣＡＲであって、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第二の異なる腫瘍抗原を標的とする第三のＣＡＲであって、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第三のＣＡＲとを含む。理論に縛られることは望まないが、第一のＣＡＲ上に共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０を、および第三のＣＡＲ上に一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータを配置することで、両方の標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を限定することができる。一実施形態において、本発明の細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインとを包含する第一のＣＡＲ、および異なる標的抗原（例えば、第一の標的抗原と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲを含む。別の実施形態において、本発明の細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する第一のＣＡＲ、および第一の標的抗原以外の腫瘍抗原（例えば、第一の標的抗原と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲと含む（すなわち、それらを発現するように遺伝子操作されている）。別の実施形態において、本発明の細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する第一のＣＡＲ、および第一の標的抗原以外の腫瘍抗原（例えば、第一の標的抗原と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインと一次刺激シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲを含む（すなわち、それらを発現するように遺伝子操作されている）。第一および第二のＣＡＲ両方が共刺激シグナル伝達ドメインを包含する実施形態において、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、同じタンパク質に、例えば、本明細書で説明される共刺激タンパク質、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８またはＩＣＯＳに由来してもよい。他の実施形態において、第一のＣＡＲおよび第二のＣＡＲの共刺激シグナル伝達ドメインは、異なるタンパク質に由来してもよく、例えば、第一のＣＡＲは、例えば４−１ＢＢの、本明細書で説明される共刺激シグナル伝達ドメインを包含し、第二のＣＡＲは、例えばＣＤ２８の、本明細書で説明される異なる共刺激シグナル伝達ドメインを包含する。
【０４２９】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲ、および阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、がん細胞ではなく正常細胞、例えば、標的抗原に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲの標的とされる腫瘍抗原も発現する正常細胞上で見出すことができる抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであってもよい。
【０４３０】
一実施形態において、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものであってもよい。例えば、第一および第二のＣＡＲを発現する細胞は、例えばフラグメント、例えばｓｃＦｖとして、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインとの会合を形成しない第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを有していてもよく、例えば、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
【０４３１】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を包含する単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を含む。例としては、重鎖可変ドメイン、天然に軽鎖を欠く結合分子、通常の４鎖抗体に由来する単一ドメイン、抗体に由来するもの以外の加工されたドメインおよび単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当該技術の単一ドメイン分子のいずれかであってもよく、または任意の将来の単一ドメイン分子であってもよい。ＳＤＡＢ分子は、これらに限定されるものではないがマウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを包含する、いずれの種に由来してもよい。この用語は、ラクダ科およびサメ以外の種の、天然に存在する単一ドメイン抗体分子も包含する。
【０４３２】
一態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清において発見された新規抗原受容体（ＮＡＲ）として公知の免疫グロブリンアイソタイプに由来するものなどの、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を生成する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909において説明されている。
【０４３３】
別の態様によれば、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として公知の、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al.(1993) Nature 363:446-448において開示されている。明確にするために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの通常のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨまたはナノボディと称される。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種から、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて得ることができる。ラクダ科以外の他の種が、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生することもあり、そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０４３４】
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲグラフト化された、ヒト化された、ラクダ化された、脱免疫化された、および／またはインビトロで産生された（例えば、ファージディスプレイにより選択された）ものであり得る。
【０４３５】
抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞であって、該受容体の抗原結合ドメイン間で相互作用する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１つまたは複数のその同種抗原への結合能力を阻害するため、望ましくないものであり得ることも発見した。したがって、そのような相互作用を最小にする抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞が本明細書において開示される。そのような相互作用を最小にする抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸、ならびにそのような細胞および核酸を作製および使用する方法も、本明細書において開示される。ある実施形態において、前記第一および前記第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科動物、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトもしくはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。
【０４３６】
別の態様において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現することができる。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子、例えばＰＤ１は、一部の実施形態において、免疫エフェクター応答を開始するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータが挙げられる。
【０４３７】
一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で説明される分子であり、例えば、正のシグナルを細胞に提供する第二のポリペプチド、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン、と会合している第一のポリペプチド、例えば阻害分子、を含む薬剤である。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータ、またはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）などの阻害分子の第一のポリペプチド、ならびに本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインである［例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明されるような４１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む］第二のポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも包含するＣＤ２８受容体ファミリーの阻害性の一員である。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現される（Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75）。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２つのリガンドは、ＰＤ１に結合したときのＴ細胞の活性化を下方調節することが示されている（Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8； Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトがんにおいて豊富である（Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、回復させることができる。
【０４３８】
一実施形態において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム死１（ＰＤ１：Programmed Death 1）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータなどの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合させる（また本明細書では、ＰＤ１ＣＡＲとも称される）。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、本明細書で説明されるＸＣＡＲと組み合わせて使用される場合、Ｔ細胞の持続性を向上させる。一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２６において下線で示されたＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、以下に示される配列番号３９のアミノ酸配列を含む。
【０４３９】
一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えば本明細書で説明されるＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲに関する核酸配列は、表１の配列番号２７に示され、ＰＤ１  ＥＣＤに関する配列は下線で示される。
【０４４０】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞の集団を提供する。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、本明細書で説明される抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一の細胞、および異なる抗原結合ドメイン、例えば、本明細書で説明される異なる抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一の細胞によって発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインが結合する腫瘍抗原とは異なる本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞、および本明細書で説明されるような腫瘍抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲ発現細胞、および二次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲ発現細胞を包含する。
【０４４１】
別の態様において、本開示は、集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書で説明される腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子、例えばＰＤ−１は、一部の実施形態において、免疫エフェクター応答を開始するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で説明される分子であり、例えば、正のシグナルを細胞に提供する第二のポリペプチド、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン、と会合している第一のポリペプチド、例えば阻害分子、を含む薬剤である。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータなどの阻害分子の第一のポリペプチド、またはこれらのうちいずれかのフラグメント、ならびに本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインである［例えば、共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８、例えば、本明細書で説明されているようなもの）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］第二のポリペプチドを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１の第一のポリペプチドまたはそのフラグメント、および本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドを含む。
【０４４２】
一態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞の集団、例えば、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を、別の薬剤、例えば、キナーゼ阻害剤、例えば、本明細書で説明されるキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。別の態様において、本開示は、集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書で説明される腫瘍抗原の抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を、別の薬剤、例えば、キナーゼ阻害剤、例えば、本明細書で説明されるキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【０４４３】
例示的なＣＡＲ分子
本明細書で開示されるＣＡＲ分子は、標的、例えば本明細書で説明されるような標的、と結合する結合ドメインと、膜貫通ドメイン、例えば、本明細書で説明されるような膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書で説明されるような細胞内シグナル伝達ドメインとを含むことができる。実施形態において、結合ドメインは、本明細書で説明される重鎖結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書で説明される軽鎖結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）を含む。
【０４４４】
他の実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明されるＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１において説明されているＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えばＣＴＬ０１９を含む。実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１に示されているアミノ酸を含むか、または前記特許文献に示されているヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一の（例えば、それと少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれを超えて同一の）配列を有する。
【０４４５】
一実施形態において、ＣＤ１９と特異的に結合するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＵＳＡＮ名ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ−Ｔを有する。ＣＴＬ０１９は、Ｔ細胞の遺伝子改変によって作製され、この改変は、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下のＣＴＬ０１９導入遺伝子を含有する自己不活性化、複製欠損レンチウイルス（ＬＶ）ベクターでの形質導入による安定的挿入によって媒介される。ＣＴＬ０１９は、パーセント導入遺伝子陽性Ｔ細胞に基づいて対象にデリバリーされる導入遺伝子陽性Ｔ細胞と導入遺伝子陰性Ｔ細胞の混合物であってもよい。
【０４４６】
一実施形態において、ＣＡＲ１９分子は、表１５Ａに提供するような、または参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年３月１５日に出願された国際公開番号ＷＯ２０１４／１５３２７０の表３に提供されているようなアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。ＣＤ１９  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば１、２、３つのＶＨ  ＣＤＲ、および１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを包含する）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１４／１５３２７０おいて指定されている。実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１５３２７０に示されているアミノ酸を含むか、または前記特許文献に示されているヌクレオチド配列、または前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、前述のＣＤ１９  ＣＡＲ配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれを超えて同一の）配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、配列番号８９７、９０２、９０７、９１２、９１７、９２２、９２７、９３２、９３７、９４２、９４７、９５２、９５６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または配列番号８９７、９０２、９０７、９１２、９１７、９２２、９２７、９３２、９３７、９４２、９４７、９５２、９５６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは３０の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし６０、５０もしくは４０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または配列番号８９７、９０２、９０７、９１２、９１７、９２２、９２７、９３２、９３７、９４２、９４７、９５２、９５６のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。
【０４４７】
一実施形態において、親マウスｓｃＦｖ配列は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００（参照により本明細書に組み入れられる）において提供されている、および本明細書において表１５Ａに提供する、ＣＡＲ１９コンストラクトである。一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、ＷＯ２０１２／０７９０００において説明されている、および本明細書において表１５Ａに提供する、ｓｃＦｖである。
【０４４８】
一実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００において配列番号１２として提供されているアミノ酸配列を含む。実施形態において、アミノ酸配列は、
MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号８９１）であるか、またはそれと実質的に同一の（例えば、それと少なくとも８５％、９０％もしくは９５％またはそれより高度に同一の）配列であって、大文字で示されているシグナルペプチド配列を有するもしくは有さない配列である。
【０４４９】
実施形態において、アミノ酸配列は、
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号８９２）であるか、またはそれと実質的に相同の（例えば、それと少なくとも８５％、９０％もしくは９５％またはそれより高度に同一の）配列である。
【０４５０】
実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明されるＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるヒト化ＣＡＲ分子、例えば、表１５Ａのヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲ分子、または表１５Ｂおよび１５Ｃに記載のＣＤＲを有するヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲ分子である。
【０４５１】
実施形態において、ＣＡＲ分子は、本明細書で説明されるＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるマウスＣＡＲ分子、例えば、表１５ＡのマウスＣＤ１９  ＣＡＲ分子、または表１５Ｂおよび１５Ｃに記載のＣＤＲを有するマウスＣＤ１９  ＣＡＲ分子である。
【０４５２】
一部の実施形態において、ＣＡＲ分子は、表１５Ｂおよび１５Ｃのマウスまたはヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲの、重鎖可変領域からの１、２および／もしくは３つのＣＤＲならびに／または軽鎖領域からの１、２および／もしくは３つのＣＤＲを含む。
【０４５３】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書において列挙される抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または本明細書において列挙される抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、本明細書において列挙または説明される抗体の重鎖可変領域および／または可変軽鎖領域を含む。
【０４５４】
例示的なＣＤ１９  ＣＡＲとしては、本明細書において、例えば、本明細書で説明される１つもしくは複数の表（例えば、表１５Ａ）において説明されるＣＤ１９  ＣＡＲもしくは抗ＣＤ１９結合ドメインのいずれか、例えば、Xu et al. Blood 123.24(2014):3750-9、Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39、Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73、ＮＣＴ００５８６３９１、ＮＣＴ０１０８７２９４、ＮＣＴ０２４５６３５０、ＮＣＴ００８４０８５３、ＮＣＴ０２６５９９４３、ＮＣＴ０２６５０９９９、ＮＣＴ０２６４０２０９、ＮＣＴ０１７４７４８６、ＮＣＴ０２５４６７３９、ＮＣＴ０２６５６１４７、ＮＣＴ０２７７２１９８、ＮＣＴ００７０９０３３、ＮＣＴ０２０８１９３７、ＮＣＴ００９２４３２６、ＮＣＴ０２７３５０８３、ＮＣＴ０２７９４２４６、ＮＣＴ０２７４６９５２、ＮＣＴ０１５９３６９６、ＮＣＴ０２１３４２６２、ＮＣＴ０１８５３６３１、ＮＣＴ０２４４３８３１、ＮＣＴ０２２７７５２２、ＮＣＴ０２３４８２１６、ＮＣＴ０２６１４０６６、ＮＣＴ０２０３０８３４、ＮＣＴ０２６２４２５８、ＮＣＴ０２６２５４８０、ＮＣＴ０２０３０８４７、ＮＣＴ０２６４４６５５、ＮＣＴ０２３４９６９８、ＮＣＴ０２８１３８３７、ＮＣＴ０２０５０３４７、ＮＣＴ０１６８３２７９、ＮＣＴ０２５２９８１３、ＮＣＴ０２５３７９７７、ＮＣＴ０２７９９５５０、ＮＣＴ０２６７２５０１、ＮＣＴ０２８１９５８３、ＮＣＴ０２０２８４５５、ＮＣＴ０１８４０５６６、ＮＣＴ０１３１８３１７、ＮＣＴ０１８６４８８９、ＮＣＴ０２７０６４０５、ＮＣＴ０１４７５０５８、ＮＣＴ０１４３０３９０、ＮＣＴ０２１４６９２４、ＮＣＴ０２０５１２５７、ＮＣＴ０２４３１９８８、ＮＣＴ０１８１５７４９、ＮＣＴ０２１５３５８０、ＮＣＴ０１８６５６１７、ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ０２６８５６７０、ＮＣＴ０２５３５３６４、ＮＣＴ０２６３１０４４、ＮＣＴ０２７２８８８２、ＮＣＴ０２７３５２９１、ＮＣＴ０１８６０９３７、ＮＣＴ０２８２２３２６、ＮＣＴ０２７３７０８５、ＮＣＴ０２４６５９８３、ＮＣＴ０２１３２６２４、ＮＣＴ０２７８２３５１、ＮＣＴ０１４９３４５３、ＮＣＴ０２６５２９１０、ＮＣＴ０２２４７６０９、ＮＣＴ０１０２９３６６、ＮＣＴ０１６２６４９５、ＮＣＴ０２７２１４０７、ＮＣＴ０１０４４０６９、ＮＣＴ００４２２３８３、ＮＣＴ０１６８０９９１、ＮＣＴ０２７９４９６１、またはＮＣＴ０２４５６２０７において説明されている抗ＣＤ１９  ＣＡＲが挙げられ、前記参考文献の各々は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４５５】
本明細書で説明される方法に使用することができる例示的なＣＤ１９  ＣＡＲおよび抗原結合ドメインコンストラクトは、表１５Ａに示す。Ｋａｂａｔによる軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列を太字かつ下線付きの文字列により示し、そしてまた表１５Ａ〜Ｃに要約する。シグナル配列およびヒスチジンタグの位置も下線付きである。実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲ配列およびそれらの抗原結合フラグメントは、シグナル配列および／またはヒスチジンタグ配列を包含しない。
【０４５６】
実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、マウスまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み、前記抗ＣＤ１９結合ドメインは、表１５Ａ〜Ｃに収載されているいずれかの抗ＣＤ１９重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれを超えて同一の（例えば、５、４、３、２未満もしくは１つのアミノ酸置換、例えば保存的置換を有する）配列を含む。
【０４５７】
一実施形態において、抗ＣＤ１９結合ドメインは、本明細書で（例えば、表１５Ａで）説明される軽鎖可変領域、および／または本明細書で（例えば、表１５Ａで）説明される重鎖可変領域、あるいはそれらと少なくとも８５％、９０％、９５％またはそれを超えて同一の配列を含む。
【０４５８】
一実施形態において、コードされた抗ＣＤ１９結合ドメインは、表５のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖またはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％以上同一の配列を含む、ｓｃＦｖである。
【０４５９】
ある実施形態において、ヒトまたはヒト化抗ＣＤ１９結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１５Ａに提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれを超えて同一の配列を含む軽鎖可変領域、および／あるいは表１５Ａに提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２もしくは３つの改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし３０、２０もしくは１０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれを超えて同一の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０４６０】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１９抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１９と特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む。
【０４６１】
例示的なＣＡＲ１９分子を表１５Ａ（およびまた表７）に提供する。表１５ＡにおけるＣＡＲ分子は、ＣＤ１９抗原結合ドメイン、例えば、表７または１０に提供されているいずれかのＣＤ１９抗原結合ドメインのアミノ酸配列を含む。
【０４６２】
【表５７】
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【表５８】
2019518424.tif 000060
【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【０４６３】
一部の実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲまたは結合ドメインは、ＣＴＬ０１９のアミノ酸配列を包含するか、あるいはリーダー配列もしくはｈｉｓタグを有するもしくは有さない表５によるＣＴＬ０１９のヌクレオチド配列、またはそれと実質的に同一（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９５％またはそれより高度な同一性）の配列によってコードされる。
【０４６４】
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、またはこれらの組合せに従って定義される。
【０４６５】
ｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列は、重鎖可変ドメインについて表１５Ｂに、軽鎖可変ドメインについて表１５Ｃに示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
【０４６６】
【表８２】
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【０４６７】
【表８３】
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【０４６８】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（例えば、ＢＣＭＡ、例えばヒトＢＣＭＡ、と特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含むＣＡＲ分子を含む。
【０４６９】
例示的なＣＡＲ分子は、表１６に、もしくはＷＯ２０１６／０１４５６５の表１に提供されている、または別様に本明細書において説明される通りである。表１６におけるＣＡＲ分子は、ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン、例えば、表１１または１２に提供されているいずれかのＢＣＭＡ抗原結合ドメインのアミノ酸配列を含む。
【０４７０】
【表８４】
2019518424.tif 000086
【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
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【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
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【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
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【表９６】
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【表９７】
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【表９８】
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【表９９】
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【表１００】
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【表１０１】
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【表１０２】
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【表１０３】
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【表１０４】
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【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
2019518424.tif 000115
【表１１４】
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【表１１５】
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【表１１６】
2019518424.tif 000118
【表１１７】
2019518424.tif 000119
【表１１８】
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【表１１９】
2019518424.tif 000121
【表１２０】
2019518424.tif 000122
【表１２１】
2019518424.tif 000123
【表１２２】
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【表１２３】
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【表１２４】
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【０４７１】
一実施形態において、ＣＡＲは、表１６に提供した、もしくはＷＯ２０１６／０１４５６５の表１に提供されている、または別様に本明細書において説明されるようなアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８２７、８２９、８３１、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または配列番号７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８２７、８２９、８３１、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは３０の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし６０、５０もしくは４０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または配列番号７８９、７９１、７９３、７９５、７９７、７９９、８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１５、８１７、８１９、８２１、８２３、８２５、８２７、８２９、８３１、８３３、８３５、８３７、８３９、８４１、８４３、８４５、８４７、８４９、８５１、８５３、８５５、８５７、８５９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列との８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。
【０４７２】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、メソセリン抗原結合ドメイン（例えば、メソセリンと特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む。
【０４７３】
メソセリンを標的とする例示的なＣＡＲ分子は、本明細書で説明され、表１７に提供す。表１７におけるＣＡＲ分子は、メソセリン抗原結合ドメイン、例えば、表３に提供されているいずれかのメソセリン抗原結合ドメインのアミノ酸配列を含む。リーダー配列は、太字かつ下線付きであり、ＣＤＲは、下線付きであり、抗原結合領域の重鎖と軽鎖の間のリンカー配列は、灰色の陰影付きである。
【０４７４】
【表１２５】
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【表１２６】
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【表１２７】
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【表１２８】
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【表１２９】
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【表１３０】
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【表１３１】
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【０４７５】
一実施形態において、メソセリンに結合するＣＡＲ分子は、表１７に提供した、または参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年１２月１９日に出願された国際公開番号ＷＯ２０１５／０９０２３０の表２に提供されているようなアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、配列番号７２４〜７４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または配列番号７２４〜７４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは３０の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし６０、５０もしくは４０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または配列番号７２４〜７４８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。
【０４７６】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合ドメイン（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩと特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む。
【０４７７】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とする例示的なＣＡＲ分子は、本明細書で説明され、表１８に提供し、またはＷＯ／２０１４／１３０６５７の表２に提供されており、またはＷＯ２０１６／０１４７８９において説明されているとおりである。
【０４７８】
【表１３２】
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【表１３３】
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【表１３４】
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【表１３５】
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【表１３６】
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【表１３７】
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【表１３８】
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【表１３９】
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【表１４０】
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【０４７９】
一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するＣＡＲ分子は、表１８に提供されているようなアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するＣＡＲは、配列番号７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または配列番号７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは３０の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし６０、５０もしくは４０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または配列番号７７０、７７２、７７４、７７６、７７８、７８０、７８２、７８４、７８６、７８８のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。
【０４８０】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ１２３抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ１２３と特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む。ＣＤ１２３を標的とする例示的ＣＡＲ分子としては、表１９に提供されているもの、ならびにＷＯ２０１６／０２８８９６の表２、６および９に提供されているものが挙げられる。ＣＤ１２３を標的とする他の例示的なＣＡＲ分子は、ＷＯ／２０１４／１３０６３５（例えば、ＷＯ／２０１４／１３０６３５の表１）において説明されている。ＣＤ１２３を標的とする他の例示的なＣＡＲ分子は、ＷＯ／２０１４／１４４６２２において説明されている。
【０４８１】
一実施形態において、ＣＤ１２３に結合するＣＡＲ分子は、表１９に提供するようなアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一実施形態において、ＣＤ１２３に結合するＣＡＲは、配列番号７５０、７５５、７６０、７６５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列；または配列番号７５０、７５５、７６０、７６５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０もしくは３０の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）、しかし６０、５０もしくは４０以下の改変（例えば、置換、例えば保存的置換）を有するアミノ酸配列；または配列番号７５０、７５５、７６０、７６５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。
【０４８２】
【表１４１】
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【表１４２】
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【表１４３】
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【表１４４】
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【表１４５】
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【０４８３】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＤ３３抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ３３と特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む。ＣＤ３３を標的とする例示的なＣＡＲ分子は、本明細書において説明され、ＷＯ２０１６／０１４５７６に、例えば、ＷＯ２０１６／０１４５７６の表２に提供されている。
【０４８４】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ＣＬＬ−１抗原結合ドメイン（例えば、ＣＬＬ−１と特異的に結合するマウス、ヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメント）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む。ＣＬＬ−１を標的とする例示的なＣＡＲ分子は、本明細書で説明され、ＷＯ／２０１６／０１４５３５に、例えば、ＷＯ２０１６／０１４５３５の表２に提供されている。
【０４８５】
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）ＣＡＲ
ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１つまたは複数の成分を含む。ＮＫＲ成分は、以下のナチュラルキラー細胞受容体のいずれからの、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質内ドメインであってもよい：キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１、およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、およびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；ならびにＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃ。本明細書で説明されるＮＫＲの成分を含むＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用する可能性がある。ＮＫＲ構成要素を含むＣＡＲ分子の例示的な配置および配列は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる国際公報ＷＯ２０１４／１４５２５２号で説明されている。
【０４８６】
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、参照により本明細書に組み入れられる公報ＷＯ２０１４／０５５４４２およびＷＯ２０１４／０５５６５７においてより詳細に説明されている。簡単に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第一の抗原結合ドメインと共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）とを有する第一のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第二の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）とを有する第二のＣＡＲも発現する。細胞が第一の抗原と遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞は増殖する。細胞が第二の抗原と遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞殺滅活性が開始される。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全に活性化される。実施形態において、第一の抗原結合ドメインは、本明細書で説明される抗原を認識し、例えば、本明細書で説明される抗原結合ドメインを含み、第二の抗原結合ドメインは、本明細書で説明される第二の抗原を認識する。
【０４８７】
本発明の一時的に発現されるＣＡＲの例示的な特徴
一部の実施形態において、抗原結合ドメインが、ＣＡＲの別のドメイン、例えば、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメイン（両方とも本明細書の他の箇所で説明される）に機能するように連結していることは、細胞内での発現に有益である。一実施形態において、抗原結合ドメインをコードする核酸は、膜貫通ドメインをコードする核酸、および細胞内ドメインをコードする核酸に、機能するように連結している。
【０４８８】
ＣＡＲの抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、スペーサードメインを組み込んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「スペーサードメイン」は、一般に、膜貫通ドメインを抗原結合ドメインまたはポリペプチド鎖内の細胞内ドメインのいずれかに連結するように機能する、任意のオリゴまたはポリペプチドを意味する。一実施形態において、スペーサードメインは、３００以下のアミノ酸、好ましくは１０〜１００のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０のアミノ酸を含み得る。別の実施形態において、好ましくは長さが２〜１０アミノ酸の間の、短鎖オリゴまたはポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内ドメインの間の連結を形成し得る。リンカーの例としては、グリシン−セリンの二つ組が挙げられる。
【０４８９】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。一実施形態において、シグナルペプチドは、ＡＴＧＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧまたは配列番号３０３４を含む、核酸配列を含む。別の実施形態において、シグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰまたは配列番号３０３５を含む、アミノ酸配列を含む。
【０４９０】
一部の実施形態において、ＣＡＲは、二量体化ドメイン、例えば、ＦＫＢＰまたは類似の分子からの二量体化ドメインをさらに含む。そのような実施形態において、改変Ｔ細胞の表面のＣＡＲ分子の存在は、細胞内の細胞質または他の内部位置におけるＣＡＲ分子の自発的凝集により妨げられる。
【０４９１】
さらに別の実施形態において、二量体化ドメインは、
CGGGGCGTGCAGGTTGAGACAATTTCCCCAGGAGATGGGCGAACGTTCCCCAAGCGCGGACAGACATGCGTTGTGCACTACACAGGAATGTTGGAGGACGGAAAGAAAATGGACAGTTCAAGAGATCGGAACAAACCATTCAAATTCATGTTGGGAAAACAGGAAGTGATACGGGGCTGGGAAGAGGGTGTAGCGCAAATGTCCGTTGGTCAACGAGCAAAACTCACGATAAGTCCCGATTATGCTTACGGCGCAACCGGTCACCCGGGCATCATACCGCCTCATGCGACTTTGGTCTTTGATGTGGAGCTGTTGAAACTTGAAACTCGCGGAGTACAGGTTGAAACAATATCACCCGGGGACGGGCGGACTTTTCCGAAGAGAGGTCAGACCTGCGTCGTCCATTATACCGGTATGCTGGAGGACGGAAAGAAAATGGACAGCTCACGGGACCGAAATAAACCATTCAAATTTATGTTGGGGAAACAAGAGGTTATCAGGGGCTGGGAGGAGGGTGTGGCCCAGATGTCTGTCGGTCAGCGCGCGAAACTCACAATCTCTCCGGATTATGCGTATGGGGCGACAGGGCATCCGGGAATTATCCCTCCCCACGCTACCTTGGTTTTCGATGTTGAGCTTCTGAAGTTGGAGACCAGAGGAGTTCAAGTGGAGACAATATCTCCTGGGGATGGACGGACGTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGTGTAGTCCACTACACAGGGATGCTTGAAGACGGAAAAAAGATGGATAGCAGTAGAGATCGCAACAAACCATTTAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTAATACGCGGCTGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGAGTGTTGGTCAACGGGCCAAACTTACTATTTCTCCCGATTATGCGTATGGAGCCACCGGGCACCCTGGCATTATCCCACCCCATGCCACATTGGTTTTTGACGTTGAATTGCTTAAATTGGAGACCAGGGGAGTCCAAGTGGAAACAATATCACCGGGGGATGGTCGGACTTTTCCTAAAAGGGGCCAAACCTGTGTAGTCCATTATACCGGAATGCTCGAAGACGGAAAGAAAATGGACTCTTCTAGAGACCGCAATAAGCCCTTCAAGTTCATGTTGGGTAAGCAAGAGGTGATCCGGGGCTGGGAAGAGGGGGTCGCTCAAATGTCCGTCGGTCAGCGAGCTAAACTGACTATTTCCCCAGACTACGCATATGGAGCGACTGGCCACCCCGGTATTATTCCTCCCCATGCGACTCTCGTGTTCGACGTAGAACTCTTGAAATTGGAAACGまたは配列番号３０１５を含む、核酸配列を含む。
【０４９２】
別の実施形態において、二量体化ドメインは、RGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETまたは配列番号９８０（本明細書の他の箇所で説明される）を含む、アミノ酸配列を含む。
【０４９３】
細胞にまたは細胞を含む哺乳動物に投与される可溶化剤での二量体化ドメインの可溶化は、二量体化を防止し、分泌系経由でのコンストラクトの放出を可能にし、この分泌系においてコンストラクトは機能的な細胞表面ＣＡＲを発現するようにフューリン切断によってプロセシングされる。
【０４９４】
可溶化剤の存在下では、ＣＡＲ分子が分離され、凝集が防止される。可溶化剤の投与は、ＣＡＲ分子の二量体化または凝集を防止し、ＣＡＲ分子をＴ細胞の表面に提示できるようにする。一実施形態において、フューリン切断部位は、ＴＣＡＧＣＣＣＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡまたは配列番号３０１６を含む、核酸配列を含む。別の実施形態において、フューリン切断部位は、アミノ酸配列ＳＡＲＮＲＲＫＲまたは配列番号３０１７を含む。
【０４９５】
組成物
一実施形態において、本発明は、配列番号３００１〜３００４からなる群から選択される核酸配列を含む自殺遺伝子を含む核酸配列；および抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲをコードする核酸配列を含む、単離された核酸配列を包含する。一部の実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号３０１８、３０２０、３０２４、３０２６、３０２８または３０３０を含む。
【０４９６】
一実施形態において、本発明は、自殺遺伝子によりコードされたアミノ酸配列であって、配列番号３００５〜３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列；および抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲを含む、単離されたポリペプチドを含む。一部の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号３０１９、３０２１、３０２６、３０２８、３０３０または３０３４のアミノ酸配列を含む。
【０４９７】
別の実施形態において、本発明は、二量体化ドメインをコードする核酸；および抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲを含む、単離された核酸配列を包含する。一部の実施形態において、二量体化ドメインは、配列番号９８０のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、単離された核酸配列は、配列番号９７７または３０３２を含む。
【０４９８】
さらに別の実施形態において、本発明は、二量体化ドメイン；および抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むＣＡＲを含む、単離されたポリペプチドを包含する。一部の実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号９７８または３０３３のアミノ酸配列を含む。
【０４９９】
シグナルペプチド
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに包含する。シグナルペプチドは、タンパク質に分泌経路を辿らせることが望ましい場合、有用である。好ましい実施形態において、このシグナルペプチドは、融合タンパク質の最Ｎ末端に存在するように加工されることになる。例示的なシグナルペプチドは、下記である：
ＣＤ８：  ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号２）
ＧＭＣＳＦＲ：  ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号４３）
ＩＬ２：  ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号４４）
ＩｇＫ鎖：  ＭＡＱＶＫＬＱＥＳＧＴＥＬＡＫＰＧＡＡＶＫ（配列番号４５）
ＮＰＣ２：  ＭＲＦＬＡＡＴＦＬＬＬＡＬＳＴＡＡＱＡ（配列番号４６）
ＬＡＭＢ１：  ＭＧＬＬＱＬＬＡＦＳＦＬＡＬＣＲＡＲＶＲＡ（配列番号１１１４）
Ｐ３ＩＰ１：  ＭＬＬＡＷＶＱＡＦＬＶＳＮＭＬＬＡＥＡＹＧ（配列番号１１１５）
ＤＭＫＮ：  ＭＫＦＱＧＰＬＡＣＬＬＬＡＬＣＬＧＳＧＥＡ（配列番号１１１６）
ＴＰＡ：  ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号１１１７）
ＰＣＳＫ９：  ＭＧＴＶＳＳＲＲＳＷＷＰＬＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＰＡＧＡＲＡＱＥＤＥＤ（配列番号１１１８）
【０５００】
対象のタンパク質がＥＲ常在タンパク質である場合、対象のタンパク質の最Ｃ末端のＫＤＥＬ（配列番号４７）またはＫＫＸＸおよび誘導体を加工することができる。これらの配列をシグナルペプチドと一緒に挿入しなければならない。
【０５０１】
マンノース−６−リン酸受容体による内在化およびエンドソーム／リソソーム系への標的化のためのグリコシル化パターンを包含するように、対象のタンパク質を加工することができる。これらのグリコシル化パターンは、対象のタンパク質がその区画に常在するタンパク質である場合、対象のタンパク質自体に包含されるはずである。Ｎ−グリコシル化のコンセンサスは、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒであり、ここでのＸは、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）およびスレオニン（Ｔｈｒ）を除く任意のアミノ酸である。
【０５０２】
興味があるタンパク質をペルオキシソームに標的化することが望ましい実施形態において、Ｃ末端ペルオキシソーム標的化シグナル（例えば、ＰＴＳ１：−ＳＫＬ）を包含するように融合タンパク質を加工することができる。
【０５０３】
切断部位
本発明の各融合タンパク質は、切断部位を包含する。切断部位は、自己切断部位および／またはプロテアーゼ切断部位であり得る。対象の細胞において条件的発現ドメイン、例えば、分解ドメインまたは凝集ドメインを切断除去するのに妥当なレベルで（組換え発現または内因性発現のいずれかによって）発現される任意の部位特異的プロテアーゼにより切断されるように、切断部位を設計することができる。本発明の重要な態様において、天然に（または細胞の加工によって）、対象のタンパク質の発現に関連する細胞区画内に存在するプロテアーゼに対応するようにプロテアーゼ切断部位が選択される。すなわち、プロテアーゼの細胞内輸送は、用いられる条件的発現ドメイン、例えば分解ドメインまたは凝集ドメイン、を含有する対象のタンパク質の細胞内輸送とオーバーラップまたは部分的にオーバーラップしなければならない。例えば、対象のタンパク質が細胞表面に位置する場合、それを切断するための酵素であって、細胞に対して外因性の酵素を添加することができる。
【０５０４】
対象のタンパク質がエンドソーム／リソソーム系内に常在する場合、それらの区画内に常在の酵素のプロテアーゼ切断部位を使用することができる。そのようなプロテアーゼ／コンセンサスモチーフとしては、例えば、以下のものが挙げられる：
フューリン：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ１：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ５：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ６：ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒコンセンサスモチーフ
ＰＣＳＫ７：ＲＸＸＸ［ＫＲ］Ｒコンセンサスモチーフ
カテプシンＢ：ＲＲＸ
グランザイムＢ：Ｉ−Ｅ−Ｐ−Ｄ−Ｘ（配列番号３５）
第ＸＡ因子：Ｉｌｅ−Ｇｌｕ／Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
エンテロキナーゼ：Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３６）
ゲネナーゼ：Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ（配列番号３７）
ソルターゼ：ＬＰＸＴＧ／Ａ
ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ：Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３８）
トロンビン：Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４０）
ＴＥＶプロテアーゼ：Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｙ−Ｆ−Ｑ−Ｇ（配列番号４１）
エラスターゼ１［ＡＧＳＶ］−ｘ（配列番号４２）
【０５０５】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、フューリン切断部位を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、表２０に収載されているフューリン切断部位のいずれか１つを包含する。
【０５０６】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、あるいはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択される、フューリン切断部位を包含する。
【０５０７】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＲＴＫＲ（配列番号１２３）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）またはＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）から選択される、フューリン切断部位を包含する。
【０５０８】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、あるいはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択される、フューリン切断部位を包含する。
【０５０９】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）またはＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）から選択される、フューリン切断部位を包含する。
【０５１０】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）のフューリン切断部位を包含する。
【０５１１】
【表１４６】
2019518424.tif 000148
【０５１２】
条件的発現ドメイン
本発明の融合タンパク質は、条件的発現ドメインを包含することができる。一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、第一の状態および第二の状態、例えば、凝集状態またはコンフォメーション状態、例えば、安定化／不安定化状態、またはフォールディング／ミスフォールディング状態を有する。第一の状態は、第一の率もしくはレベルでの融合タンパク質の１つもしくは複数（例えば、全て）の部分の細胞表面発現もしくは細胞外発現に関連しており、それを引き起こし、またはそれを媒介し、第二の状態は、第二の率もしくはレベルでの融合タンパク質の１つもしくは複数（例えば、全て）の部分の細胞表面発現もしくは細胞外発現に関連している、それを引き起こす、またはそれを媒介する。ある実施形態において、第二の状態は、第一の状態の率またはレベルより高い、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０倍高いレベルまたは率を有する。ある実施形態において、状態の一方、例えば第二の状態は、発現化合物の存在に関連する、それによって維持される、またはそれに起因する。ある実施形態において、発現化合物の存在は、物理的特性の変化に関連していること、それを引き起こすこと、またはそれを媒介することがあり、例えば、第二の状態は、物理的特性のレベルの変化に関連しており、例えば、発現化合物の存在は、物理的特性の第一の値を有する第一の状態の、物理的特性の第二の値を有する第二の状態への変換に関連しており、それを引き起こし、またはそれを媒介し、例えば、この場合、前記特性は、分子量、安定性、予め選択された波長での吸光度、別の分子と相互作用する能力、または溶解度を含み得る。ある実施形態において、発現化合物の存在は、例えば対象の細胞における、第一のフォールディング状態の、第二のフォールディング状態への、例えば、ミスフォールディングした状態からより適切にフォールディングした状態への、例えば、分解を受けやすい第一の状態の、第一の状態より分解を受けにくい第二の状態への、または第一の分解レベルを有する第一のフォールディング状態から、第二のより低い分解レベルを有する第二のフォールディング状態への変換に関連していること、それを引き起こすこと、またはそれを媒介することがある。ある実施形態において、発現化合物の存在は、第一および第二の条件的発現ドメインの、例えば、より高次の会合からより低次の会合への、例えば、二量体から単量体への、または四量体からより低次の構造、例えば二量体もしくは単量体への、解離または解凝集に関連していること、それを引き起こすこと、またはそれを媒介することがある。ある実施形態において、発現化合物の存在は、溶解度の変化に関連していること、それを引き起こすこと、またはそれを媒介することがあり、例えば、第二の状態は、より高い溶解レベルに関連しており、例えば、発現化合物の存在は、より低い溶解度を有する第一の状態の、より高い溶解度を有する第二の状態への変換に関連している、それを引き起こす、またはそれを媒介する。ある実施形態において、発現化合物の存在は、融合タンパク質の１つもしくは複数または全ての部分の局在または区画化の第一の状態の、融合タンパク質の１つもしくは複数または全ての部分の局在または区画化の第二の状態への、例えば、ゴルジまたはＥＲから、別の区画または所在、例えば、サイトゾル、膜、細胞表面または細胞外空間への、変換に関連していること、それを引き起こすこと、またはそれを媒介することがある。
【０５１３】
ある実施形態において、発現化合物の存在は、例えば対象の細胞における、第一のフォールディング状態からの、または第一のフォールディング状態の、第二のフォールディング状態への、例えば、ミスフォールディングした状態からより適切にフォールディングした状態への、例えば、分解を受けやすい第一の状態の、第一の状態より分解を受けにくい第二の状態への、または第一の分解レベルを有する第一のフォールディング状態から、第二のより低い分解レベルを有する第二のフォールディング状態への変換に関連していること、それを引き起こすこと、またはそれを媒介することがある。
【０５１４】
ある実施形態において、状態の一方、例えば第二の状態は、切断部位での切断に関連する、それを引き起こす、またはそれを媒介する。理論に縛られることは望まないが、一部の実施形態において、切断は、融合タンパク質の１つまたは複数（例えば、全て）の部分の細胞表面発現または細胞外発現をもたらす、またはそれに関連すると考えられる。ある実施形態において、対象の細胞において発現されたとき、発現化合物が非存在である限り、条件的発現ドメインを含む融合タンパク質、例えば融合タンパク質の第一のレベル、例えば大部分は、例えば、別の実体、例えば条件的発現ドメイン、による切断の立体障害によって、細胞表面においても細胞外でも検出できない。逆に言うと、発現化合物の存在下では、融合タンパク質の１つまたは複数（例えば、全て）のドメインの表面発現および／または細胞外発現は、第一のレベルより高い第二のレベルに変換され、例えば、第一のレベルと比べて実質的に、例えば、２、３、４、５もしくは１０倍上昇し、または例えば、第一のレベルと比べて少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００％上昇する。したがって、ある実施形態において、条件的発現ドメインは、次の特徴によって同定することができ、または特徴づけられる：（１）条件的発現ドメインは、融合タンパク質の状況下では天然に存在せず、例えば、条件的発現ドメインは、組換えまたは加工されものである、（２）表面発現および／または細胞外発現は、同時翻訳でまたは翻訳後に調節される、（３）表面発現率および／または細胞外発現率は、発現化合物の存在下で実質的に上昇する。
【０５１５】
ある実施形態において、複数の細胞、例えば、宿主細胞、または本明細書において説明される融合タンパク質を含む細胞への、発現化合物、例えば、脱凝集化合物または安定化化合物の添加は、複数未満の細胞の第一の状態から第二の状態への、例えば、本明細書で説明されるような、凝集状態またはコンフォメーション状態、例えば、安定化／不安定化状態、またはフォールディング／ミスフォールディング状態の変換を引き起こす。ある実施形態において、発現化合物、例えば、脱凝集化合物または安定化化合物の非存在下では、前記複数の中の細胞の１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満が第二の状態を含み、前記複数の中の細胞の９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％以上が第一の状態を含む。ある実施形態において、発現化合物、例えば、脱凝集化合物または安定化化合物の存在下では、前記複数の中の細胞の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％以上が第二の状態を含み、前記複数の中の細胞の２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満が第一の状態を含む。ある状態を含む複数の中の細胞の百分率の決定は、本明細書を通して説明される、例えば、図４で使用されているような、方法を使用して行うことができる。
【０５１６】
実施形態において、条件的発現ドメインは、例えば本明細書で説明されるような、分解ドメインである。他の実施形態において、条件的発現ドメインは、例えば本明細書で説明されるような、凝集ドメインである。ある実施形態において、条件的発現ドメインは、分解ドメインを含まない。ある実施形態において、条件的発現ドメインは、凝集ドメインを含まない。実施形態において、条件的発現ドメインを含む融合タンパク質は、例えば本明細書で説明されるような、膜貫通タンパク質、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、分解ドメインである。一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、凝集ドメインである。
【０５１７】
凝集ドメイン
一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、凝集ドメインである。発現化合物、例えば脱凝集化合物、の非存在下で細胞内凝集を引き起こす凝集ドメインを生成する方法は、当業界公知であり、下記でさらに論じられる。
【０５１８】
本開示は、あらゆる天然に存在するタンパク質由来の凝集ドメインを包含する。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、脱凝集化合物が対象の細胞区画において天然に発現されないまたは備わっていない凝集ドメインを包含することになる。例えば、融合タンパク質がＴ細胞における発現用に設計される場合、Ｔ細胞中に天然に存在しない脱凝集化合物と対になっている凝集ドメインを選択することが好ましい。したがって、凝集ドメインは、対象の細胞において発現されたとき、脱凝集化合物の存在下でしか脱凝集されないことになる。注目すべきことに、この特性は、天然に発現される／存在する脱凝集化合物にもはや結合しないように凝集ドメインを加工すること（この場合、凝集ドメインは合成化合物の存在下でのみ脱凝集されることになる）、または天然に発現される／存在するリガンドがない区画において凝集ドメイン（例えば、融合タンパク質が発現されることになる種以外の種に由来し得る凝集ドメイン）を発現させること、いずれかによって操作することができる。
【０５１９】
凝集ドメイン−脱凝集化合物対は、いずれの天然に存在するタンパク質由来であってもよく、またはいずれの合成により開発されたタンパク質由来であってもよい。脱凝集化合物は、いずれの天然に存在する化合物であってもよく、またはいずれの合成化合物であってもよい。ある特定の実施形態において、脱凝集化合物は、既存の処方薬または市販薬であるであろう。凝集ドメインの特性を有するように加工することができるタンパク質の例は、対応する脱凝集化合物とともに下に記載される。
【０５２０】
一実施形態において、凝集ドメインは、二量体化ドメインであり、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する。一部の実施形態において、凝集ドメインは、配列番号９７５もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、または配列番号９７６もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、凝集ドメインは、配列番号９７９もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、または配列番号９８０もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。凝集ドメインがＦＫＢＰに由来する場合、脱凝集化合物を、当業界公知であり、Rollins et al 2000 PNAS vol. 97 no. 13, 7096-7101、ＷＯ／２０００／０２３６００、およびRivera, V. M., et al. (2000) Regulation of protein secretion through controlled aggregation in the endoplasmic reticulum. Science 287: 826-30において説明されている、ＡＰ２１９９８またはＡＰ２２５４２から選択することができる。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により組み入れられる。理論に縛られることは望まないが、Ｆ３６Ｍ置換を含むＦＫＢＰドメインは、会合して二量体になる。ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ二量体を、リガンド、例えば、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２、ＡＰ２１９９８またはＳｈｉｅｌｄ−１の添加により解離させる、例えば、脱凝集することができる。
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号９７５） 
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号９７６）
RGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLET（配列番号９７９）
RGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLET（配列番号９８０）
【０５２１】
別の実施形態において、凝集ドメインは、ＵＶＲ８タンパク質に由来する。ＵＶＲ８は、植物光受容体タンパク質である（Chen et al. 2013. J. Cell. Biol. v201 no. 4: 631-640；Rizzini, L., et al. 2011. Science. 332:103-106；Christie, J.M., et al. 2012. Science. 335:1492-1496；Wu, D., et al. 2012. Nature. 484:214-219）。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により組み入れられる。ＵＶＲ８は、紫外Ｂ（ＵＶＢ）線（２８０〜３２０ｎｍ）の吸収により解離する光解離性ホモ二量体を構成的に形成する。ある実施形態において、凝集ドメインは、ＵＶＲ８ドメインに由来し、脱凝集化合物は、好適な線量のＵＶＢ線である。ある実施形態において、好適な線量のＵＶＢ線は、ＵＶＲ８ホモ二量体の少なくとも２５、５０、７５、または１００％を解離させるのに十分なものである。ある実施形態において、好適な線量のＵＶＢは、融合タンパク質を含む細胞に対する毒性がほとんどない。
【０５２２】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインまたは分解ドメインの複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのコピーを含む。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くの凝集ドメインを含む。
【０５２３】
一部の実施形態において、複数の凝集ドメインの各々は、同じ凝集ドメインのコピーである。そのような凝集ドメインは、互いに結合してホモオリゴマー、例えばホモ二量体を形成することになる。
【０５２４】
一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、複数の、例えば１つより多くの、凝集ドメインを含み、この場合の複数は、凝集ドメインの１つより多くのタイプ、例えば、第一のタイプおよび第二のタイプを含む。一部の実施形態において、第一のタイプの凝集ドメインは、第二のタイプの凝集ドメインと会合して、例えば結合して、オリゴマー化または凝集を促進し、そのような会合は、凝集ドメインの、例えばヘテロ二量体への、ヘテロマー会合（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）またはヘテロオリゴマー化を意味する。一部の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、２、４、６または８つの凝集ドメインを含み、この場合、融合タンパク質は、各タイプのうちの少なくとも１つ、例えば、第一のタイプおよび第二のタイプの凝集ドメインを含む。一実施形態において、複数の凝集ドメインを含む融合タンパク質であって、前記複数が、１タイプより多くの、例えば、第一のタイプおよび第二のタイプの凝集ドメインを含む、融合タンパク質は、同数の各タイプの凝集ドメインを含む。融合タンパク質が４つ以上（例えば、６、８、１０、またはそれより多く）の凝集ドメインを含む一部の実施形態において、凝集ドメインは、融合タンパク質中に交互パターン、例えば、タイプ１、タイプ２、タイプ１、タイプ２で配置されている。融合タンパク質が４つ以上（例えば、６、８、１０、またはそれより多く）の凝集ドメインを含む一部の実施形態において、凝集ドメインは、融合タンパク質中にブロックパターン、例えば、タイプ１、タイプ１、タイプ２、タイプ２で配置されている。一部の実施形態において、第一のタイプの凝集ドメインは、第一のタイプの凝集ドメインの他のコピーと認識可能に会合せず、第二のタイプの凝集ドメインは、第二のタイプの凝集ドメインの他のコピーと認識可能に会合しない。一部の実施形態において、第一のタイプの凝集ドメインは、第一のタイプの凝集ドメインの他のコピーのみと認識可能に会合し、第二のタイプの凝集ドメインは、第二のタイプの凝集ドメインの他のコピーのみと認識可能に会合する。
【０５２５】
一部の実施形態において、発現化合物、例えば、脱凝集化合物は、ＡＰ２１９９８またはＡＰ２２５４２である（化学構造をここに示す；ＡＰ２１９９８およびＡＰ２２５４２は、破線の左側の部分が同じであり、破線の右側の部分が異なる）。ＡＰ２１９９８およびＡＰ２２５４２の調製および使用は、当業界において、また、Rollins et al. 2000、Amara, J. F., et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10618-10623、Clackson, T., et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10437-10442、およびYang, W., et al. (2000) J. Med. Chem. 43, 1135-1142において見出すことができる。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により組み入れられる。
【０５２６】
【化１】
2019518424.tif 000149
【０５２７】
一部の実施形態において、発現化合物、例えば脱凝集化合物は、ＦＫ５０６（タクロリムス）またはラパマイシン（シロリムス）である。一部の実施形態において、条件的発現ドメイン、例えば凝集ドメインは、ＦＫＢＰに由来し、発現化合物、例えば脱凝集化合物は、ＦＫ５０６（タクロリムス）またはラパマイシン（シロリムス）である。ＦＫ５０６およびラパマイシンの調製および使用は、当業界において見出すことができる。
【０５２８】
一部の実施形態において、発現化合物、例えば脱凝集化合物は、凝集ドメイン間の相互作用を阻害する。脱凝集化合物がＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２またはＡＰ２１９９８である、一部の実施形態において、脱凝集化合物は、ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ由来の凝集ドメインを含む融合タンパク質間の相互作用を阻害する。
【０５２９】
例示的な凝集ドメイン−脱凝集化合物対は、生成されており、本発明において特徴づけられる（配列番号９７７（核酸）および９７８（アミノ酸））。この凝集ドメインは、“A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions.” Rollins et al.  PNAS vol. 97 no. 13, 7096-7101、およびＷＯ／２０００／０２３６００において説明されているような、ＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍドメインを含む。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本書に組み入れられる。
【０５３０】
ＣＤ１９ｂｂｚ  ｏｎ−ＣＡＲヌクレオチド配列、ＣＤ１９  ｏｎ−ＣＡＲ（配列番号９７７）
シグナルペプチド−条件的凝集ドメイン（４リピート）−フューリン部位−ＦＭＣ６３ｂｂｚ
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCCGGGGCGTGCAGGTTGAGACAATTTCCCCAGGAGATGGGCGAACGTTCCCCAAGCGCGGACAGACATGCGTTGTGCACTACACAGGAATGTTGGAGGACGGAAAGAAAATGGACAGTTCAAGAGATCGGAACAAACCATTCAAATTCATGTTGGGAAAACAGGAAGTGATACGGGGCTGGGAAGAGGGTGTAGCGCAAATGTCCGTTGGTCAACGAGCAAAACTCACGATAAGTCCCGATTATGCTTACGGCGCAACCGGTCACCCGGGCATCATACCGCCTCATGCGACTTTGGTCTTTGATGTGGAGCTGTTGAAACTTGAAACTCGCGGAGTACAGGTTGAAACAATATCACCCGGGGACGGGCGGACTTTTCCGAAGAGAGGTCAGACCTGCGTCGTCCATTATACCGGTATGCTGGAGGACGGAAAGAAAATGGACAGCTCACGGGACCGAAATAAACCATTCAAATTTATGTTGGGGAAACAAGAGGTTATCAGGGGCTGGGAGGAGGGTGTGGCCCAGATGTCTGTCGGTCAGCGCGCGAAACTCACAATCTCTCCGGATTATGCGTATGGGGCGACAGGGCATCCGGGAATTATCCCTCCCCACGCTACCTTGGTTTTCGATGTTGAGCTTCTGAAGTTGGAGACCAGAGGAGTTCAAGTGGAGACAATATCTCCTGGGGATGGACGGACGTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGTGTAGTCCACTACACAGGGATGCTTGAAGACGGAAAAAAGATGGATAGCAGTAGAGATCGCAACAAACCATTTAAGTTCATGCTGGGGAAGCAGGAAGTAATACGCGGCTGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGAGTGTTGGTCAACGGGCCAAACTTACTATTTCTCCCGATTATGCGTATGGAGCCACCGGGCACCCTGGCATTATCCCACCCCATGCCACATTGGTTTTTGACGTTGAATTGCTTAAATTGGAGACCAGGGGAGTCCAAGTGGAAACAATATCACCGGGGGATGGTCGGACTTTTCCTAAAAGGGGCCAAACCTGTGTAGTCCATTATACCGGAATGCTCGAAGACGGAAAGAAAATGGACTCTTCTAGAGACCGCAATAAGCCCTTCAAGTTCATGTTGGGTAAGCAAGAGGTGATCCGGGGCTGGGAAGAGGGGGTCGCTCAAATGTCCGTCGGTCAGCGAGCTAAACTGACTATTTCCCCAGACTACGCATATGGAGCGACTGGCCACCCCGGTATTATTCCTCCCCATGCGACTCTCGTGTTCGACGTAGAACTCTTGAAATTGGAAACGTCAGCCCGGAACAGGCGGAAGAGAGGATCCGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTCCGGAATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
【０５３１】
ＣＤ１９ｂｂｚ  ｏｎ−ＣＡＲアミノ酸配列（配列番号９７８）
シグナルペプチド−条件的凝集ドメイン（４リピート）−フューリン部位−ＦＭＣ６３ｂｂｚ
MALPVTALLLPLALLLHAARPGSRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSARNRRKRGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSASTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSGIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRZ
【０５３２】
分解ドメイン
一部の実施形態において、条件的発現ドメインは、分解ドメインである。安定化化合物の存在下で選択的に安定している分解ドメインを生成する方法は、当業界公知であり、下記でさらに論じられる。いくつかのそのようなドメイン安定化化合物対が今日までに生成されており、本発明で特徴づけられる。これらには、A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules." Banaszynski, L. A.; Chen, L.-C.; Maynard-Smith, L. A.; Ooi, A. G. L.; Wandless, T. J.  Cell, 2006, 126, 995-1004において説明されているような、ＦＫＢＰに基づく分解ドメイン（例えば、「Ｓｈｉｅｌｄ」安定化化合物を使用する）；A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Iwamoto, M.; Bjoerklund, T.; Lundberg, C.; Kirik, D.; Wandless, T. J. Chemistry & Biology, 2010, 17, 981-988において説明されているような、ＤＨＦＲに基づくドメイン（例えば、トリメトプリムを安定化化合物として使用する）；およびDestabilizing domains derived from the human estrogen receptor Y Miyazaki, H Imoto, L-c Chen, TJ Wandless J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 3942-3945において説明されているような、エストロゲン受容体アルファに基づくドメイン（例えば、この場合、４ＯＨＴが安定化化合物として使用される）が包含される。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により組み入れられる。
【０５３３】
本開示は、あらゆる天然に存在するタンパク質由来の分解ドメインを包含する。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、対象の細胞区画において天然に発現されるリガンドがない分解ドメインを包含することになる。例えば、融合タンパク質がＴ細胞における発現用に設計される場合、Ｔ細胞中に天然に存在するリガンドがない分解ドメインを選択することが好ましい。したがって、分解ドメインは、対象の細胞において発現されたとき、外から加えられた化合物の存在下でのみ安定化されることになる。注目すべきことに、この特性は、天然に発現されるリガンドにもはや結合しないように分解ドメインを加工すること（この場合、分解ドメインは合成化合物の存在下でのみ安定していることになる）、または天然に発現されるリガンドが存在しない区画において分解ドメイン（例えば、融合タンパク質が発現されることになる種以外の種に由来し得る分解ドメイン）を発現させること、いずれかによって操作することができる。
【０５３４】
分解ドメイン−安定化化合物対は、いずれの天然に存在するタンパク質由来であってもよく、またはいずれの合成により開発されたタンパク質由来であってもよい。安定化化合物は、いずれの天然に存在する化合物であってもよく、または合成化合物であってもよい。ある特定の実施形態において、安定化化合物は、既存の処方薬または市販薬であろう。分解ドメインの特性を有するように加工することができるタンパク質の例は、対応する安定化化合物とともに下の表２１に記載される。
【０５３５】
一部の実施形態において、分解ドメインは、表２１に収載されているタンパク質に由来する。
【０５３６】
一部の実施形態において、分解ドメインは、エストロゲン受容体（ＥＲ）に由来する。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５８もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列、または配列番号１２１もしくはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５８、または配列番号１２１から選択されるアミノ酸配列を含む。分解ドメインがエストロゲン受容体に由来する場合、安定化化合物は、バゼドキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）から選択することができる。一部の実施形態において、安定化化合物は、バゼドキシフェンである。タモキシフェンおよびバゼドキシフェンは、ＦＤＡ承認薬であり、したがって、ヒトに使用しても安全である。
【０５３７】
一部の実施形態において、分解ドメインは、ＦＫＢタンパク質（ＦＫＢＰ）に由来する。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。分解ドメインがＦＫＢＰに由来する場合、安定化化合物は、Ｓｈｉｅｌｄ−１であり得る。
【０５３８】
一部の実施形態において、分解ドメインは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）に由来する。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５７またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、分解ドメインは、配列番号５７から選択されるアミノ酸配列を含む。分解ドメインがＤＨＦＲに由来する場合、安定化化合物は、トリメトプリムであり得る。
【０５３９】
一部の実施形態において、分解ドメインは、ＦＫＢタンパク質、エストロゲン受容体、またはＤＨＦＲに由来しない。
【０５４０】
【表１４７】
2019518424.tif 000150
【表１４８】
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【表１４９】
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【表１５０】
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【表１５１】
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【表１５２】
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【表１５３】
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【表１５４】
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【表１５５】
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【表１５６】
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【表１５７】
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【表１５８】
2019518424.tif 000161
【０５４１】
分解ドメインは、当業界公知の様々な通例の方法のいずれかによって公知のタンパク質（例えば、上記表に記載のタンパク質）から加工することができる。一般に、そのような方法は、第一に、例えば天然に存在するタンパク質由来のタンパク質を包含する対象のライブラリーの作出を利用する。第二に、個々のライブラリーコンストラクトからのタンパク質を発現する細胞または細胞集団を、元となったタンパク質の発現が所望の安定化化合物の存在に依存するかどうかに基づいて選択することになる。誘導および選択プロセスを、好適な候補を同定するために必要なだけのサイクル数で反復することができる。
【０５４２】
例えば、選択される化合物のタンパク質ドメインの種々の構造および推定的親和性のサンプリングに基づく合理的タンパク質設計によってライブラリーを作出することができる。あるいは、標的タンパク質のランダム突然変異誘発によりライブラリーを生成することができる。いずれの場合も、例えば、ジャーカット細胞にコンストラクトから生成されたレンチウイルスライブラリーを形質導入することができる。次いで、ジャーカット細胞をＦＡＣＳ選別ラウンドに付して、対象のタンパク質を構成的に発現する細胞を除去することができる。次の段階では、選別された細胞が選択された化合物とともに２４時間インキュベートされ、陽性細胞がＦＡＣＳ選別される。これらの細胞が単一細胞クローニングによって拡大される。そこから、個々の形質導入クローンは、化合物依存性方式での、対象のタンパク質の発現を誘導する能力について査定されることになる。
【０５４３】
自殺遺伝子およびドメイン
本発明は、一部は、養子移入後に対象からの改変Ｔ細胞を選択的に除去または活性化する方法にＣＡＲ技術を利用する。一実施形態において、改変ＣＡＲ  Ｔ細胞は、その改変Ｔ細胞内の自殺ドメインの活性化を誘導することにより対象体内で選択的に除去される。別の実施形態において、改変Ｔ細胞は、治療中の改変ＣＡＲ  Ｔ細胞のアポトーシスを積極的に防止することにより対象体内で選択的に活性化される。さらに別の実施形態において、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲコンストラクトの細胞表面発現を可能にすることにより対象体内で選択的に活性化される。
【０５４４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞による非標的細胞認識の潜在的副作用の一部は、ＣＡＲ  Ｔ細胞内の自殺遺伝子の共発現により克服することができる。加えて、自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置するために、Ｂ細胞を枯渇の標的とした後、ＣＡＲ  Ｔ細胞を選択的に除去することができる。
【０５４５】
本発明は、自殺遺伝子を含む単離された核酸を包含する。自殺遺伝子の例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、Ｆａｓの細胞質内ドメイン、カスパーゼ、例えばカスパーゼ−８またはカスパーゼ−９、シトシンデアミナーゼ、Ｅ１Ａ、ＦＨＩＴ、および他の公知の自殺またはアポトーシス誘導遺伝子（Straathof et al., 2005, Blood 105:4247-4254；Cohen et al., 1999, Leuk. Lymphoma 34:473-480；Thomis et al., 2001, Blood 97:1249-1257；Tey et al., 2007, Biol. Blood Marrow Transplant 13:913-924；およびDi Stasi et al., 2011, N. Engl. J. Med. 365:1673-1683）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４６】
自殺遺伝子を、誘導性プロモーター配列などのプロモーターに機能するように連結させることができる。誘導性プロモーターの例としては、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター、および当業界公知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一態様において、本発明は、自殺遺伝子とキメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む核酸配列を含む、単離された核酸配列を包含する。別の態様において、本発明は、自殺遺伝子とキメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む核酸配列を含む、単離された核酸配列を包含する。一実施形態において、自殺遺伝子は、以下のものからなる群から選択される核酸を含む：
ATGCTCGAGGGGGTTCAGGTGGAGACTATCAGCCCGGGCGACGGACGGACATTCCCAAAGCGCGGGCAGACGTGTGTGGTGCATTACACCGGGATGCTTGAGGACGGAAAGAAAGTGGACTCTTCCCGAGACCGAAATAAACCATTCAAGTTCATGTTGGGCAAGCAGGAGGTTATCAGAGGGTGGGAGGAGGGCGTCGCTCAGATGAGTGTCGGACAGAGGGCCAAGCTCACGATCTCCCCTGATTACGCCTACGGGGCAACTGGTCACCCCGGAATCATCCCCCCTCACGCAACCCTCGTGTTCGACGTCGAGCTGCTCAAACTGGAATCAGGCGGAGGCAGTGGCGCTAGCGGGTTTGGCGATGTCGGTGCCCTTGAAAGCTTGAGAGGAAATGCCGATCTCGCTTACATCTTGAGCATGGAGCCCTGTGGGCACTGTCTGATCATCAACAATGTTAACTTTTGCCGGGAGTCCGGCCTGCGCACACGCACAGGCTCCAACATTGACTGCGAAAAACTTCGAAGGAGGTTTAGCTCTCTGCATTTCATGGTAGAGGTGAAGGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTTCTCGCCCTTCTCGAGCTTGCGCAGCAGGACCATGGAGCGCTTGACTGTTGTGTCGTTGTGATACTGAGCCATGGCTGTCAGGCTTCCCATCTCCAGTTTCCAGGGGCCGTGTACGGAACCGATGGATGCCCTGTGTCAGTTGAAAAGATCGTAAACATCTTTAACGGAACATCTTGCCCGAGCCTCGGCGGTAAACCGAAGCTTTTTTTTATCCAGGCCTGCGGCGGTGAACAGAAAGATCATGGCTTCGAGGTTGCCAGTACCAGCCCTGAAGACGAATCCCCCGGGTCAAATCCTGAACCAGATGCGACCCCTTTCCAGGAAGGACTCCGCACTTTTGACCAGCTTGACGCCATTTCCTCCCTGCCAACACCTTCCGACATATTTGTAAGCTACTCCACCTTTCCAGGATTCGTGAGCTGGCGCGACCCAAAATCCGGCAGTTGGTATGTTGAAACCCTGGACGATATTTTCGAACAATGGGCCCACAGTGAGGACCTGCAGTCCCTTCTTCTGCGCGTAGCCAATGCCGTGTCAGTCAAAGGGATTTACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTTAATTTCCTGCGCAAGAAACTGTTTTTTAAGACCAGTまたは配列番号３００１； 
CGGACGGACATTCCCAAAGCGCGGGCAGACGTGTGTGGTGCATTACACCGGGATGCTTGAGGACGGAAAGAAAGTGGACTCTTCCCGAGACCGAAATAAACCATTCAAGTTCATGTTGGGCAAGCAGGAGGTTATCAGAGGGTGGGAGGAGGGCGTCGCTCAGATGAGTGTCGGACAGAGGGCCAAGCTCACGATCTCCCCTGATTACGCCTACGGGGCAACTGGTCACCCCGGAATCATCCCCCCTCACGCAACCCTCGTGTTCGACGTCGAGCTGCTCAAACTGGAATCAGGCGGAGGCAGTGGCGGGTTTGGCGATGTCGGTGCCCTTGAAAGCTTGAGAGGAAATGCCGATCTCGCTTACATCTTGAGCATGGAGCCCTGTGGGCACTGTCTGATCATCAACAATGTTAACTTTTGCCGGGAGTCCGGCCTGCGCACACGCACAGGCTCCAACATTGACTGCGAAAAACTTCGAAGGAGGTTTAGCTCTCTGCATTTCATGGTAGAGGTGAAGGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTTCTCGCCCTTCTCGAGCTTGCGCAGCAGGACCATGGAGCGCTTGACTGTTGTGTCGTTGTGATACTGAGCCATGGCTGTCAGGCTTCCCATCTCCAGTTTCCAGGGGCCGTGTACGGAACCGATGGATGCCCTGTGTCAGTTGAAAAGATCGTAAACATCTTTAACGGAACATCTTGCCCGAGCCTCGGCGGTAAACCGAAGCTTTTTTTTATCCAGGCCTGCGGCGGTGAACAGAAAGATCATGGCTTCGAGGTTGCCAGTACCAGCCCTGAAGACGAATCCCCCGGGTCAAATCCTGAACCAGATGCGACCCCTTTCCAGGAAGGACTCCGCACTTTTGACCAGCTTGACGCCATTTCCTCCCTGCCAACACCTTCCGACATATTTGTAAGCTACTCCACCTTTCCAGGATTCGTGAGCTGGCGCGACCCAAAATCCGGCAGTTGGTATGTTGAAACCCTGGACGATATCTTCGAACAATGGGCCCACAGTGAGGACCTGCAGTCCCTTCTTCTGCGCGTAGCCAATGCCGTGTCAGTCAAAGGGATTTACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTTAATTTCCTGCGCAAGAAACTGTTTTTTAAGACCAGTTGAGTCGACGGAGGAGGAGまたは配列番号３００２；
GGGGTTCAGGTGGAGACTATCAGCCCGGGCGACGGACGGACATTCCCAAAGCGCGGGCAGACGTGTGTGGTGCATTACACCGGGATGCTTGAGGACGGAAAGAAAGTGGACTCTTCCCGAGACCGAAATAAACCATTCAAGTTCATGTTGGGCAAGCAGGAGGTTATCAGAGGGTGGGAGGAGGGCGTCGCTCAGATGAGTGTCGGACAGAGGGCCAAGCTCACGATCTCCCCTGATTACGCCTACGGGGCAACTGGTCACCCCGGAATCATCCCCCCTCACGCAACCCTCGTGTTCGACGTCGAGCTGCTCAAACTGGAATCAGGCGGAGGCAGTGGCGGGTTTGGCGATGTCGGTGCCCTTGAAAGCTTGAGAGGAAATGCCGATCTCGCTTACATCTTGAGCATGGAGCCCTGTGGGCACTGTCTGATCATCAACAATGTTAACTTTTGCCGGGAGTCCGGCCTGCGCACACGCACAGGCTCCAACATTGACTGCGAAAAACTTCGAAGGAGGTTTAGCTCTCTGCATTTCATGGTAGAGGTGAAGGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTTCTCGCCCTTCTCGAGCTTGCGCAGCAGGACCATGGAGCGCTTGACTGTTGTGTCGTTGTGATACTGAGCCATGGCTGTCAGGCTTCCCATCTCCAGTTTCCAGGGGCCGTGTACGGAACCGATGGATGCCCTGTGTCAGTTGAAAAGATCGTAAACATCTTTAACGGAACATCTTGCCCGAGCCTCGGCGGTAAACCGAAGCTTTTTTTTATCCAGGCCTGCGGCGGTGAACAGAAAGATCATGGCTTCGAGGTTGCCAGTACCAGCCCTGAAGACGAATCCCCCGGGTCAAATCCTGAACCAGATGCGACCCCTTTCCAGGAAGGACTCCGCACTTTTGACCAGCTTGACGCCATTTCCTCCCTGCCAACACCTTCCGACATATTTGTAAGCTACTCCACCTTTCCAGGATTCGTGAGCTGGCGCGACCCAAAATCCGGCAGTTGGTATGTTGAAACCCTGGACGATATCTTCGAACAATGGGCCCACAGTGAGGACCTGCAGTCCCTTCTTCTGCGCGTAGCCAATGCCGTGTCAGTCAAAGGGATTTACAAGCAGATGCCAGGCTGCTTTAATTTCCTGCGCAAGAAACTGTTTTTTAAGACCAGTTGAまたは配列番号３００３；および
AGAGGCGTGCAGGTGGAAACCATCTCTCCCGGCGACGGCAGAACCTTCCCTAAGAGGGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGCATGCTGGAAGATGGCAAGAAGATGGACAGCTCCCGGGACCGGAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGCAAGCAGGAAGTGATCCGGGGCTGGGAAGAGGGCGTGGCACAGATGTCTGTGGGCCAGAGAGCCAAGCTGACCATCAGCCCCGATTACGCCTACGGCGCCACAGGCCACCCTGGCATCATTCCTCCACACGCCACACTGGTGTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAAACCCGGGGAGTGCAGGTGGAAACAATCAGCCCTGGCGACGGCCGGACCTTTCCAAAACGGGGACAGACATGTGTGGTGCATTATACAGGGATGCTGGAAGATGGGAAAAAAATGGATAGCAGCCGCGACCGCAACAAACCTTTTAAGTTTATGCTGGGGAAACAGGAAGTGATTAGAGGCTGGGAAGAGGGGGTGGCACAGATGAGCGTGGGACAGCGGGCCAAACTGACAATCTCCCCCGACTATGCCTATGGGGCCACCGGACACCCCGGAATCATCCCACCTCATGCTACCCTGGTGTTTGACGTGGAACTGCTGAAACTGGAAACAAGCGGCGGAGGCAGCGGCGGCTTTGGAGATGTGGGAGCCCTGGAAAGCCTGCGGGGCAATGCCGATCTGGCCTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGCCTGATTATCAACAACGTGAACTTCTGCAGAGAGAGCGGCCTGCGGACCAGAACCGGCAGCAACATCGACTGCGAGAAGCTGCGGCGGAGATTCAGCAGCCTGCACTTCATGGTGGAAGTGAAGGGGGACCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTCTGCTGGAACTGGCCCAGCAGGATCATGGCGCCCTGGACTGTTGCGTGGTCGTGATCCTGAGCCACGGCTGCCAGGCCAGCCATCTGCAGTTTCCCGGCGCTGTGTATGGCACCGATGGCTGCCCTGTGTCCGTGGAAAAGATCGTGAATATCTTCAACGGCACCAGCTGCCCCAGCCTGGGCGGAAAGCCTAAGCTGTTCTTTATTCAAGCCTGTGGGGGCGAGCAGAAGGACCACGGATTTGAGGTGGCCAGCACCTCCCCCGAGGATGAGAGCCCTGGCAGCAACCCTGAGCCTGACGCCACCCCATTCCAGGAAGGACTGCGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATCTCTAGCCTGCCCACCCCCAGCGACATCTTCGTGTCCTACAGCACCTTCCCTGGCTTTGTGTCCTGGCGGGACCCCAAGTCCGGCTCTTGGTACGTGGAAACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCCCATAGCGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGAGGGTGGCCAATGCCGTGTCCGTGAAGGGCATCTACAAGCAGATGCCCGGCTGCTTCAACTTCCTGCGGAAGAAGCTGTTTTTCAAGACCAGCまたは配列番号３００４。
【０５４７】
別の実施形態において、自殺遺伝子は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする：
MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGASGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSまたは配列番号３００５；
GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSまたは配列番号３００６；および
RGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETRGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLETSGGGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSまたは配列番号３００７。さらに別の実施形態において、自殺遺伝子は、誘導性プロモーターを有する。
【０５４８】
一部の実施形態において、自殺遺伝子は、発現ベクター内にある。例示的な実施形態において、本発明は、配列番号３００１、３００２、３００３または３００４を含む自殺遺伝子を含む核酸配列を含むベクターを包含する。発現ベクターは、他の遺伝子、例えば、本明細書の他の箇所で開示されるキメラ抗原受容体および／またはＣＲＩＳＰＲシステムも包含し得る。
【０５４９】
本発明は、自殺遺伝子を含む細胞も包含する。例示的な態様において、本発明は、配列番号３００５、３００６および３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする自殺遺伝子を含む核酸とキメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む改変細胞を包含する。別の態様において、本発明は、配列番号３００１、３００２、３００３および３００４からなる群から選択される自殺遺伝子を含む核酸とキメラ抗原受容体をコードする核酸とを含む改変細胞を包含する。一実施形態において、自殺遺伝子は、配列番号３００５、３００６および３００７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする。別の実施形態において、自殺遺伝子は、誘導性プロモーターを有する。
【０５５０】
一実施形態において、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、本明細書の他の箇所で説明されるＣＡＲコンストラクトとは別の核酸配列として自殺遺伝子をコードする核酸を含む。例えば、ＨＳＶ−ＴＫ、ｉ−Ｃａｓｐ９、Ｆａｓの細胞質内ドメイン、またはカスパーゼを、ＣＡＲコンストラクトとは別の遺伝子操作されたＴ細胞に組み込むことができる。別の実施形態において、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸と同じコンストラクト内に自殺遺伝子を含む。この実施形態において、自殺遺伝子を含む核酸は、ＣＡＲをコードする核酸の上流にあってもよく、または下流にあってもよい。
【０５５１】
一実施形態において、自殺遺伝子の発現は、細胞内で、該細胞にまたは該細胞を含む哺乳動物に投与された誘導剤と該細胞を接触させることにより、活性化される。そのとき、誘導剤が誘導性プロモーターを活性化して、自殺遺伝子を発現させる。そのような実施形態において、誘導剤は、自殺遺伝子の発現を誘導するために対象に投与される。
【０５５２】
別の実施形態において、自殺遺伝子から発現される自殺遺伝子産物は、二量体化剤などの活性化剤によって活性化される。例えば、ＡＰ２０１８７などの二量体化剤は、カスパーゼ−９分子の二量体化および活性化を促進する。
【０５５３】
自殺遺伝子の構成的発現を伴う一部の実施形態において、細胞内の自殺遺伝子の発現を、該細胞にまたは該細胞を含む哺乳動物に投与された阻害剤と該細胞を接触させることにより、止めることができる。阻害剤は、発現を選択的に止める。例えば、カスパーゼ−９は、細胞において構成的に発現され、阻害剤の添加は、カスパーゼ−９の発現または活性化を抑止する。一実施形態において、阻害剤は、自殺遺伝子の発現を抑止するために対象に投与される。
【０５５４】
自殺遺伝子の構成的発現を伴う一部の実施形態において、自殺遺伝子産物の活性化を、細胞内で、該細胞にまたは該細胞を含む哺乳動物に投与された阻害剤、例えば可溶化剤、と該細胞を接触させることにより、抑止することができる。阻害剤は、自殺遺伝子産物の活性化を、例えば、カスパーゼ−９分子の二量体化を防止することによって抑止する。一実施形態において、可溶化剤は、自殺遺伝子産物の活性化を抑止するために対象に投与される。
【０５５５】
一部の態様において、自殺遺伝子は、自殺遺伝子を含む細胞または自殺遺伝子を保有する宿主に対して免疫原性でない。チミジンキナーゼ（ＴＫ）を利用してもよいが、チミジンキナーゼは免疫原性であり得る。代替的に、宿主に対して免疫原性でない自殺遺伝子の例としては、カスパーゼ−９、カスパーゼ−８、およびシトシンデアミナーゼが挙げられる。
【０５５６】
さらに別の実施形態において、自殺遺伝子発現は、並行して１つまたは複数の二量体化ドメインに関連づけられ、これは、自殺ドメインと二量体化ドメインとを含有する融合タンパク質の凝集を引き起こし、その結果、自殺遺伝子の細胞表面発現およびしたがって機能が妨げられる。
【０５５７】
さらに別の実施形態において、自殺遺伝子と連結している二量体化ドメインをコードする核酸配列は、
GGAAGCGGCGCCACCAATTTCAGCCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGCCCTまたは配列番号３００８；AGTGGCTCCGGCGCAACAAATTTCTCCTTGCTGAAACAGGCAGGCGACGTTGAGGAAAATCCCGGCCCAまたは配列番号３００９；GGCTCCGGCGCAACAAATTTCTCCTTGCTGAAACAGGCAGGCGACGTTGAGGAAAATCCCGGCCCAまたは配列番号３０１０；GGGGTTCAGGTGGAGACTATCAGCCCGGGCGAまたは配列番号３０１１；およびGGCTCCGGCGCAACAAATTTCTCCTTGCTGAAACAGGCAGGCGACGTTGAGGAAAATCCCGGCCCAまたは配列番号３０１２からなる群から選択される核酸配列を含む。別のそのような実施形態において、自殺ドメインと連結している二量体化ドメインは、ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰまたは配列番号３０１３、およびＲＫＲＲＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰまたは配列番号３０１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０５５８】
細胞にまたは細胞を含む哺乳動物に投与される可溶化剤での二量体化ドメインの可溶化は、凝集を防止し、分泌系経由でのコンストラクトの放出を可能にする。
【０５５９】
本明細書で説明されるように、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および自殺遺伝子を用いてＴ細胞を改変する方法を包含する。したがって、本発明は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内ドメインとを包含するＣＡＲをコードする核酸、または前記ＣＡＲを含む改変Ｔ細胞をコードする核酸を包含する。
【０５６０】
ＣＡＲの１つまたは複数のドメインまたはドメインのフラグメントは、ヒトのものであってもよい。一実施形態において、本発明は、完全ヒトＣＡＲを包含する。所望のドメインをコードする核酸配列は、例えば、標準的な技術を使用して、遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによる、遺伝子を、それらを包含することが公知のベクターから誘導することによる、またはそれらを含有する細胞および組織から直接単離することによるような、当業界公知の組換え方法を使用して、得ることができる。あるいは、対象の遺伝子を、クローン化分子としてではなく、合成により産生することができる。
【０５６１】
ＣＡＲの例は、米国特許第８，９１１，９９３号、同第８，９０６，６８２号、同第８，９７５，０７１号、同第８，９１６，３８１号、同第９，１０２，７６０号、同第９，１０１，５８４号および同第９，１０２，７６１号において説明されており、これらの特許文献のすべては、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０５６２】
核酸およびベクター
別の態様において、本発明は、本明細書で説明される融合タンパク質のいずれかをコードする核酸、またはそのような核酸を含むベクターに関する。一実施形態において、ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターから選択される。一実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【０５６３】
一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、フューリン切断部位をコードする配列を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１１１２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６もしくは１３８のいずれか１つ、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１１１２、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６または１３８のいずれか１つを包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１２６または配列番号１２８を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１２６を包含する。
【０５６４】
一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、条件的発現ドメイン、例えば、凝集ドメインまたは分解ドメインをコードする配列を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、ＦＫＢＰ、例えばＦＫＢＰ  Ｆ３６Ｍ、由来の凝集ドメインをコードする配列を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、エストロゲン受容体（ＥＲ）由来の分解ドメインをコードする配列を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１１１０もしくは配列番号１２２、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１１１０または配列番号１２２を包含する。一部の実施形態において、本明細書で説明される核酸は、配列番号１２２を包含する。
【０５６５】
本開示は、本開示のＤＮＡが挿入されるベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来ベクターは、導入遺伝子の長期にわたり安定な統合および娘細胞中でのその増殖を可能にすることから、長期にわたる遺伝子移入を達成するためのツールとして好適である。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに勝る追加の利点を有する。またレンチウイルスベクターは、低い免疫原性という追加の利点も有する。またレトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（Ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１つまたは複数の（例えば、２つの）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を包含していてもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖなどのウイルスの構造遺伝子（gens）を欠失していてもよい。例示的なガンマレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、およびそれら由来のベクターが挙げられる。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713で説明されている。
【０５６６】
別の実施形態において、本発明の所望の融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、キメラ分子をコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ｃｒｉｓｐｅｒ、ＣＡＳ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。下記を参照されたく、June et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716は参照により本明細書に組み入れられる。
【０５６７】
核酸を多数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドをはじめとする、ベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、および配列決定ベクターが挙げられる。
【０５６８】
インビトロで転写されたＲＮＡキメラ分子を産生する方法が、本明細書において開示される。本開示はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができる、キメラ分子をコードするＲＮＡコンストラクトを包含する。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを生成する方法は、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップならびに／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現されることになる核酸、ならびにポリＡテールを含有する、典型的に長さが５０〜５０００塩基のコンストラクト（配列番号３２）を産生するための、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含み得る。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一態様において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。
【０５６９】
ＣＡＲを含む融合タンパク質をコードする核酸コンストラクト
本開示は、本明細書で説明される抗原を標的とするＣＡＲコンストラクトの１つまたは複数を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。一態様において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。一態様において、核酸分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。
【０５７０】
したがって、一態様において、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲが、本明細書で説明される抗原と結合する抗原結合ドメインと、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン）と、刺激ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される共刺激シグナル伝達ドメイン）、および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される一次シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書で説明されるゼータ鎖）を含む、細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含む、核酸分子に関する。一実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインである。一実施形態において、膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃの膜貫通領域を少なくとも包含し得る。
【０５７１】
一実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１２の配列、またはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒンジ領域、例えば本明細書で説明されるヒンジにより、膜貫通ドメインに接続されている。一実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号４もしくは配列番号６もしくは配列番号８もしくは配列番号１０、またはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列を含む。一実施形態において、単離された核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。一実施形態において、共刺激ドメインは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択されるタンパク質の機能的なシグナル伝達ドメインである。そのような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｃが挙げられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的なシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ゼータの機能的なシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１４、１６、１２０もしくは１２４の配列、またはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列、および配列番号１８もしくは配列番号２０の配列、もしくはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む前記配列は、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
【０５７２】
別の態様において、本発明は、配列番号２のリーダー配列を含むＣＡＲコンストラクトを包含するドメインと、本明細書で説明されるようなｓｃＦｖドメインと、配列番号４または配列番号６または配列番号８または配列番号１０（またはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列）のヒンジ領域と、配列番号１２の配列（またはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列）を有する膜貫通ドメインと、配列番号１４の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号１６の配列（もしくはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列）を有するＣＤ２７共刺激ドメイン、配列番号１２０の配列（もしくはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列）を有するＩＣＯＳ共刺激ドメイン、または配列番号１２４の配列を有するＣＤ２８共刺激ドメインと、配列番号１８または配列番号２０の配列（またはそれと９５〜９９％の同一性を有する配列）を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインとを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子に関する。
【０５７３】
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば、標準的な技術を使用して、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることによる、遺伝子を、それらを包含することが公知のベクターから誘導することによる、またはそれらを含有する細胞および組織から直接単離することによるような、当業界公知の組換え方法を使用して、得ることができる。あるいは、対象の遺伝子をクローニングするのではなく、合成により産生することができる。
【０５７４】
本開示は、本開示の核酸が挿入されるベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、導入遺伝子の長期にわたる安定な統合および娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期にわたる遺伝子移入を達成するためのツールとして好適である。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに勝る追加の利点を有する。またレンチウイルスベクターは、低い免疫原性という追加の利点も有する。
【０５７５】
別の実施形態において、本発明のＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ｃｒｉｓｐｒ／ＣＡＳ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。下記を参照されたく、June et al. 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０５７６】
簡単にまとめると、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部をコードする核酸をプロモーターに機能するように連結して、そのコンストラクトを発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物の複製および統合に好適であってもよい。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
【０５７７】
本開示の発現構築物は、標準的な遺伝子デリバリープロトコールを使用する、核酸免疫処置および遺伝子療法にも使用することができる。遺伝子デリバリー方法は、当業界公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたく、これらの特許文献はそれら全体が参照により本明細書に組み入れられる。別の実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
【０５７８】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドなどのベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター（probe generation vector）、および配列決定ベクターが挙げられる。
【０５７９】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に供給されてもよい。ウイルスベクター技術は当業界周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYや他のウイルス学および分子生物学マニュアルで説明されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般的に、好適なベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６，３２６，１９３号）。
【０５８０】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のための多数のウイルスベース系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子デリバリー系に便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当業界公知の技術を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子中にパッケージ化してもよい。次いで組換えウイルスを単離して、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞にデリバリーしてもよい。多数のレトロウイルス系が当業界公知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当業界公知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０５８１】
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。これらは、典型的には開始部位上流の領域３０〜１１０ｂｐに配置されるが、多数のプロモーターが開始部位の下流に同様に機能的な要素を含有することが示されている。要素が互いに逆転または移動したときにプロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔はフレキシブルであることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が衰退し始める手前の５０ｂｐの間隔まで大きくすることができる。個々の要素は、転写を活性化するために、プロモーターに応じて協調的または独立的のいずれかによって機能する可能性があることが考えられる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。
【０５８２】
ＣＡＲをコードする核酸分子を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を哺乳動物Ｔ細胞において発現させることができるプロモーターの一例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然型のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的デリバリーに関与する伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドに広く使用されおり、レンチウイルスベクターにクローニングされた核酸分子からの、ＣＡＲを包含するドメインを含む融合タンパク質である、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質の発現の駆動において有効であることが示されている。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。一態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１で提供される配列を含む。
【０５８３】
プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能するように連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら他の構成的プロモーター配列も使用が可能であり、このような構成的プロモーター配列としては、これらに限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、加えてヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１□プロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。さらに本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、分子スイッチを提供し、このような分子スイッチは、分子スイッチが機能するように連結したポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に、そのポリヌクレオチド配列の発現を開始させ、または発現が望ましくない場合に、その発現を停止させることができる。誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０５８４】
プロモーターの別の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。実施形態において、トランケートされたＰＧＫプロモーター（例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較した場合、１つまたは複数の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００、または４００個のヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター）が望ましい場合がある。例示的なＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列を以下に示す。
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT（配列番号１８５）
例示的なトランケートされたＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG（配列番号１８６）
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG（配列番号１８７）
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG（配列番号１８８）
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG（配列番号１８９）
【０５８５】
ベクターはまた、例えば、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からの）、エピソームの複製および原核生物における複製を可能にする要素（例えばＳＶ４０オリジンおよびＣｏｌＥ１または当業界において公知の他のもの）ならびに／または選択を可能にする要素（例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー）を包含していてもよい。
【０５８６】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質の発現を査定するために、細胞に導入することになる発現ベクターはまた、ウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染させようとした細胞の集団から発現する細胞を同定および選択を助長するための選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含有していてもよい。他の態様において、選択マーカーは、ＤＮＡの別の断片に搭載させてコトランスフェクション手法で使用されてもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子はどちらも、宿主細胞で発現できるように適切な調節配列を端部に有していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子および同種のものが挙げられる。
【０５８７】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性がある細胞を同定するために、さらには調節配列の機能性を評価するために使用することができる。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれらによって発現されない遺伝子であり、さらに、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって証明されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエントの細胞に導入された後の好適な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。好適な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製してもよいし、または商業的に入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最大レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を有するコンストラクトは、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されて、プロモーターによって駆動された転写を調整する能力に関して薬剤を評価するために使用することができる。
【０５８８】
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質、をコードする核酸配列を含むベクターは、ＣＡＲ分子を包含するドメインを含むポリペプチドをコードする、例えば、ＣＡＲ分子を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質の活性化を増加させる薬剤をコードする、第二の核酸配列をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態において、単一の核酸分子、または前記核酸分子を含むベクターは、本明細書で説明されるＣＡＲを包含するドメインを各々が含む、例えば本明細書で説明されるような、複数の融合タンパク質をコードする。一部の実施形態において、第一の融合タンパク質をコードする核酸は、（例えば、本明細書で説明されるプロモーターによる）第二の融合タンパク質をコードする核酸とは別の（例えば、本明細書で説明されるプロモーターによる）調節性制御下にある。他の実施形態において、２つ以上の核酸配列は、同じフレーム内の単一のポリペプチド鎖として単一の核酸分子によりコードされる。この態様において、ＣＡＲを包含するドメインを各々が含む、例えば本明細書で説明されるような、２つ以上の融合タンパク質を、例えば、１つまたは複数のペプチド切断部位（例えば、自己切断部位、または細胞内プロテアーゼの基質）により隔てることができる。ペプチド切断部位の例としては、以下のものが挙げられ、ここでのＧＳＧ残基は任意である：
Ｔ２Ａ：（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９０）
Ｐ２Ａ：（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１９１）
Ｅ２Ａ：（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１９２）
Ｆ２Ａ：（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１９３）
【０５８９】
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は当業界公知である。発現ベクターの場合において、ベクターは、当業界のあらゆる方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって宿主細胞に移入させることができる。
【０５９０】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および同種のものが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は当業界周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYを参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチドの好ましい導入方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびエレクトロポレーションである。
【０５９１】
宿主細胞に対象のポリヌクレオチドを導入する生物学的な方法としては、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法になりつつある。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、ならびに同種のもの由来のものであってもよい。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０５９２】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどの脂質ベースの系が挙げられる。インビトロおよびインビボでのデリバリー媒体として使用するための典型的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。最先端の核酸の標的化デリバリーの他の方法が利用可能であり、例えば、標的化ナノ粒子を用いたポリヌクレオチドのデリバリー、または他の好適なサブミクロンサイズのデリバリーシステムなどが挙げられる。
【０５９３】
非ウイルスデリバリーシステムが利用されるケースにおいて、典型的なデリバリー媒体は、リポソームである。脂質調合物の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）を意図している。別の態様において、核酸は、脂質と会合していてもよい。脂質に会合した核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていてもよいし、リポソームの脂質二重層内に点在させてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着していてもよいし、リポソーム中に閉じ込められていてもよいし、リポソームと複合体化していてもよいし、脂質を含有する溶液中に分散されていてもよいし、脂質と混合されてもよいし、脂質と組み合わされていてもよいし、脂質中の懸濁液として含有されてもよいし、ミセルとともに含有されるかもしくはミセルと複合体化していてもよいし、またはそれ以外の方法で脂質と会合していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターが会合した組成物は、溶液中におけるいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、上記組成物は、二重層構造で、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在していてもよい。また上記組成物は、単に溶液中に点在した状態であってもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然に存在する可能性がある脂肪性の物質であるか、または合成脂質である。例えば、脂質としては、細胞質中で自然に発生する脂肪の小滴、加えて長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、ならびにアルデヒドなどを含有する化合物のクラスが挙げられる。
【０５９４】
使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層の脂質小胞（lipid vehicles）を包括する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過量の水溶液中に懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再構成を経て、水を閉じ込め、脂質二重層の間に溶質を溶解させる（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包括される。例えば、脂質は、ミセル構造であると推定することができ、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性もある。また、リポフェクトアミン−核酸複合体も考慮される。
【０５９５】
宿主細胞に外因性核酸を導入するのに使用される方法、またはそれとは別に細胞を本開示の阻害剤に晒す方法にかかわらず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために様々なアッセイを行うことができる。このようなアッセイとしては、例えば、当業者周知の「分子生物学的な」アッセイ、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的な」アッセイ、例えば、免疫学的な手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）による、または本発明の範囲内に含まれる薬剤を同定するための本明細書で説明されるアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在の検出などが挙げられる。
【０５９６】
本開示は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターをさらに提供する。一実施形態において、ベクターは、例えば本明細書で説明されるような、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む。一実施形態において、ベクターは、２つのＣＡＲをコードする核酸分子を含む。一態様において、１つまたは複数のＣＡＲベクター（例えば、第一のＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクター、第二のＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクター、または第一のＣＡＲをコードする核酸と第二のＣＡＲをコードする核酸の両方を含むベクター）を細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入することができる。一態様において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクター、例えば、これらに限定されないが、１つまたは複数のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルスおよびレンチウイルスコンストラクトを包含する、ベクターである。一態様において、ベクターは、哺乳動物免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）においてＣＡＲコンストラクトを発現させることができる。
【０５９７】
ＣＡＲを包含するドメインを各々が含む、例えば本明細書で説明されるような、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）の融合タンパク質の安定的発現が所望される、一実施形態において、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）のＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターは、免疫エフェクター細胞に形質導入される。例えば、ＣＡＲを包含するドメインを各々が含む、例えば本明細書で説明されるような、２つの融合タンパク質が安定して発現している免疫エフェクター細胞を、レンチウイルスベクターを使用して生成することができる。ＣＡＲを包含するドメインを各々が含む、例えば本明細書で説明されるような、２つの融合タンパク質の安定的発現を示す細胞は、形質導入後、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、３カ月、６カ月、９カ月または１２カ月間、ＣＡＲを発現する。
【０５９８】
ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）の融合タンパク質の一過性発現が所望される一実施形態において、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）の融合タンパク質をコードする核酸分子は、免疫エフェクター細胞にトランスフェクトされる。ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）の融合タンパク質コードする核酸分子は、１つもしくは複数（例えば、１つもしくは２つ）のＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターであってもよく、インビトロ転写ＲＮＡ１つもしくは複数（例えば、１つもしくは２つ）のＣＡＲであってもよい。インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲおよび免疫エフェクター細胞へのトランスフェクション方法は、下記でさらに説明される。１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）のＣＡＲ一過性発現を示す細胞は、トランスフェクション後、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、１つまたは複数（例えば、１つまたは２つ）のＣＡＲを発現する。
【０５９９】
ＲＮＡトランスフェクション
ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードするインビトロで転写されたＲＮＡを産生する方法が、本明細書において開示される。本開示は、細胞に直接トランスフェクトすることができるＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明される、融合タンパク質をコードするＲＮＡコンストラクトも包含する。トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを生成する方法は、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、発現されることになる核酸、ならびにポリＡテールを含有する、典型的に長さが５０〜５０００塩基のコンストラクト（配列番号３２）を産生するために、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含み得る(配列番号)３２。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一態様において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。
【０６００】
一態様において、本開示の、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされる。一態様において、本明細書で説明されるＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に導入される。
【０６０１】
一実施形態において、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードするインビトロで転写されたＲＮＡは、一過性トランスフェクション形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成した鋳型を使用したインビトロでの転写によって産生される。あらゆる源からの対象のＤＮＡを、インビトロでの適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用したｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接ＰＣＲで変換させることができる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他のあらゆる適切なＤＮＡ源であってもよい。インビトロでの転写に望ましい鋳型は、本明細書で説明されるＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質である。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、本明細書で説明される抗原に対する抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域と、ヒンジ領域（例えば、本明細書で説明されるヒンジ領域）と、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書で説明される膜貫通ドメイン、例えばＣＤ８ａの膜貫通ドメイン）と、例えばＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインを包含する、細胞質内領域とを含む。
【０６０２】
一実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有する。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であってもよい。一実施形態において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を包含していてもよい。核酸は、エキソンおよびイントロンを包含していてもよい。一実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを包含するヒト核酸配列である。その代わりにＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。典型的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒にライゲートされる遺伝子の一部を含有する配列である。一緒にライゲートされるＤＮＡの一部は、単一の生物由来であってもよいし、または１種より多くの生物由来であってもよい。
【０６０３】
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロでの転写のための鋳型を生成するために使用される。ＰＣＲを行う方法は当業界周知である。ＰＣＲで使用するためのプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用しようとするＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、プライマー配列中の塩基の大部分または全部が相補的であるか、または１つもしくは複数の塩基が非相補的であるかもしくはミスマッチであるヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、意図したＤＮＡ標的にアニールしたり、または意図したＤＮＡ標的とハイブリダイズしたりすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれかの部分に実質的に相補的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを包含する、細胞中で正常に転写される核酸（オープンリーディングフレーム）の一部が増幅されるように設計することができる。プライマーは、対象の特定のドメインをコードする核酸の一部が増幅されるように設計することもできる。一実施形態において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全部または一部を包含するヒトｃＤＮＡのコード領域が増幅されるように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当業界周知の合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的である相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、コード鎖を基準にして、増幅しようとするＤＮＡ配列の５位を指すものとして本明細書では使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、コード鎖を基準にして、増幅しようとするＤＮＡ配列の３’位を指すものとして本明細書では使用される。
【０６０４】
本明細書で開示される方法において、ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
【０６０５】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用が可能である。ＲＮＡは、好ましくは、５’および３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは、長さが１から３０００ヌクレオチドの間である。コード領域に付加しようとする５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーを設計することなど様々な方法によって変更することができる。このアプローチを使用すれば、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
【０６０６】
５’および３’ＵＴＲは、対象の核酸にとって、天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであってもよい。その代わりに、フォワードおよびリバースプライマーにＵＴＲ配列を取り入れることによって、または鋳型の他のあらゆる改変によって、対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列を付加してもよい。対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を改変するのに有用な可能性がある。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を減少させる可能性があることが知られている。それゆえに、当業界周知のＵＴＲの特性に基づき転写されたＲＮＡの安定性を増加させるには、３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
【０６０７】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含有していてもよい。その代わりに、対象の核酸にとって内因性ではない５’ＵＴＲを上述したようにＰＣＲによって付加しようとする場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列の設計を改めてもよい。コザック配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要であるとは考えられていない。多くのｍＲＮＡにとってのコザック配列の必要条件は当業界公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡのゲノムが細胞中で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであってもよい。他の実施形態において、様々なヌクレオチド類似体は、３’または５’ＵＴＲにおいて、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を妨害するのに使用できる。
【０６０８】
遺伝子クローニングを必要とすることなくＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするためには、転写プロモーターは、転写しようとする配列の上流でＤＮＡ鋳型に付着すると予想される。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加される場合、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写しようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り入れられるようになる。好ましい一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他所で説明したように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、これらに限定されないが、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当業界公知である。
【０６０９】
好ましい実施形態において、ｍＲＮＡは、５’末端上のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有しており、これらがリボソーム結合、翻訳開始および細胞中でのｍＲＮＡの安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現には好適ではない長いコンカテマー様の生成物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、正常なサイズのｍＲＮＡをもたらすが、これは転写後にポリアデニル化されたとしても真核性のトランスフェクションにおいて有効ではない。
【０６１０】
直鎖状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を過ぎても転写物の３’末端を伸長することができる［（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)］。
【０６１１】
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に統合する従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドを不安定化する可能性があり、これが、なぜ細菌細胞から得られたプラスミドのＤＮＡ鋳型に、欠失や他の異常が高度に混入していることが多いのかの理由である。そのため、クローニング手法は面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないものになっている。これが、クローニングを用いずにポリＡ／Ｔ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築が可能になる方法が極めて望ましい理由である。
【０６１２】
転写のＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴテール、例えば１００Ｔテール（配列番号９６８）［サイズは、５０〜５０００Ｔであり得る（配列番号９７４）］を含有するリバースプライマーを使用することによってＰＣＲ中に産生してもよいし、またはこれらに限定されないがＤＮＡライゲーションまたはインビトロでの組換えを包含する他のいずれかの方法によってＰＣＲ後に産生してもよい。またポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡに安定性ももたらし、それらの分解を少なくする。一般的に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００から５０００アデノシンの間である（配列番号８２）。
【０６１３】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、Ｅ．コリのポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、インビトロでの転写の後にさらに伸長させることができる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから、３００〜４００ヌクレオチド（配列番号９６９）に増加させることにより、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍の増加が得られる。加えて、３’末端への異なる化学基の付着は、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。このような付着は、改変された／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有していてもよい。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに取り入れられてもよい。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増加させることができる。
【０６１４】
また５’キャップは、ＲＮＡ分子に安定性ももたらす。好ましい実施形態において、本明細書で開示された方法によって産生されたＲＮＡは、５’キャップを包含する。５’キャップは、当業界公知の技術や本明細書で説明される技術を使用してもたらされる［Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)］。
【０６１５】
本明細書で開示された方法によって産生されたＲＮＡはまた、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含有していてもよい。ＩＲＥＳ配列は、あらゆるウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってもよく、これは、キャップ非依存性のｍＲＮＡへのリボソーム結合を開始させて翻訳開始を容易にするものである。細胞のエレクトロポレーションに好適なあらゆる溶質、すなわち糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、および界面活性剤などの細胞の透過性および生存能力を助長する因子を含有し得る溶質が包含されていてもよい。
【０６１６】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば市販の方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション［Amaxa Nucleofector-II(Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ)］、［ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．］またはジーンパルサーＩＩ（BioRad、Denver、Colo.）、マルチポレーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ、Ｈａｍｂｕｒｇ  Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマーのカプセル封入、ペプチド介在トランスフェクション、または遺伝子銃粒子デリバリー系、例えば「ジーンガン」［例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照］が挙げられる。
【０６１７】
非ウイルスデリバリー方法
一部の態様において、非ウイルス方法は、細胞または組織または対象に本明細書で説明されるキメラ分子または融合タンパク質をコードする核酸をデリバリーするために使用することができる。
【０６１８】
一部の実施形態において、非ウイルス方法としては、トランスポゾン（転移因子とも呼ばれる）の使用が挙げられる。一部の実施形態において、トランスポゾンは、ゲノム中の位置にそれ自身を挿入することができるＤＮＡの断片、例えば、自己増殖してそのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片、またはより長い核酸からプライシングしてゲノム中の別の場所に挿入することができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転移のための遺伝子の端にある逆方向反復配列で構成されるＤＮＡ配列を含む。
【０６１９】
一部の実施形態において、例えば本明細書で説明されるような、キメラ分子または融合タンパク質を発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用する遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または加工されたメガヌクレアーゼを再加工したホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用する遺伝学的編集との組合せを使用することによって生成される。
【０６２０】
一部の実施形態において、デリバリーの非ウイルス方法の使用は、細胞、例えばＴまたはＮＫ細胞の再プログラミング、および細胞の対象への直接注入を許容する。非ウイルスベクターの利点としては、これらに限定されないが、患者集団を満たすのに必要となる十分な量を生産するのが容易かつ比較的低コストであること、貯蔵中の安定性、および免疫原性の欠如が挙げられる。
【０６２１】
宿主細胞
例えば本明細書で説明されるような、核酸分子、融合タンパク質分子またはベクターを含む、細胞、例えば免疫エフェクター細胞（例えば、細胞の集団、例えば、免疫エフェクター細胞の集団）も、本明細書において提供される。一部の実施形態において、提供される細胞は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質、ＣＡＲを包含するドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子、またはそれらを含むベクターを含む。
【０６２２】
ある特定の態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの、当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から収集した血液のユニットから得ることができる。１つの好ましい態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球、および血小板を含有する。一態様において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、それに続く処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地中に適宜、置くことができる。一実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、マグネシウムを含んでいなくもよく、または２価カチオンの全てとはいかないまでもその多くを含んでいなくてもよい。
【０６２３】
カルシウムの非存在下における初期の活性化工程により、活性化を増大させることができる。当業者であれば容易に認識するものと予想されるが、洗浄工程は、当業者公知の方法によって、例えば半自動の「流水式」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造元の説明書に従って使用することによって達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えばＣａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａなど、または他の緩衝液含有または非含有食塩水に再懸濁されもよい。その代わりに、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
【０６２４】
適用方法は、５％またはそれ未満、例えば２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、公知の培養培地条件および組成、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31で説明されるものを採用できることが認識されている。
【０６２５】
一態様において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解することおよび単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって、または向流遠心水簸によって、末梢血リンパ球から単離される。
【０６２６】
本明細書で説明される方法は、例えば、免疫エフェクター細胞の特定の部分集団、例えば、調節性Ｔ細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋枯渇細胞であるＴ細胞の選択であって、例えば本明細書で説明される、例えば陰性選択技術を使用する選択を包含していてもよい。好ましくは、調節性Ｔ細胞枯渇集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
【０６２７】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去される。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンドは、支持体、例えばビーズにコンジュゲートされているか、または別の方法で支持体、例えばビーズにコーティングされている。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、またはそのフラグメントは、本明細書で説明されるような支持体にコンジュゲートされている。
【０６２８】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して、集団から除去される。一実施形態において、ＣＤ２５枯渇試薬に対する細胞の比率は、２０μＬに対して細胞１×１０７個、または１５μＬに対して細胞１×１０７個、または１０μＬに対して細胞１×１０７個、または５μＬに対して細胞１×１０７個、または２．５μＬに対して細胞１×１０７個、または１．２５μＬに対して細胞１×１０７個である。一実施形態において、例えば調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋枯渇の場合、細胞５億個／ｍｌより多くが使用される。さらなる態様において、細胞６億、７億、８億、または９億個／ｍｌの細胞濃度が使用される。
【０６２９】
一実施形態において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９個のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。他の態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９から１×１０１０個、およびその間のあらゆる整数値のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。一実施形態において、結果得られた調節性Ｔ細胞枯渇集団は、２×１０９個またはそれ未満の調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７個、またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する。
【０６３０】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムを例えばチュービング１６２−０１などの枯渇チュービングセットとともに使用して、集団から除去される。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムは、例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２．１などの枯渇設定で実行される。
【０６３１】
特定の理論に縛られることは望まないが、アフェレーシスの前の対象において、またはＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞生成物の製造中に、免疫細胞の負の調節因子のレベルを低下させること（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、対象の再発リスクを低減させることができる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当業界公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（本明細書で説明される抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５枯渇、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０６３２】
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞の製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減すること（例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させること）を含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルを、抗ＧＩＴＲ抗体および／もしくは抗ＣＤ２５抗体（もしくはそれらのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンド）と接触させることを含む。
【０６３３】
ある実施形態において、対象は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞生成物の製造のための細胞の収集の前に、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１種または複数の治療で前処置され、それによって、対象が、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞の処置を受けて再発するリスクを低下させる。ある実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇の１つまたは複数、またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられるが、これに限定されない。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇の１つまたは複数、またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲ発現細胞生成物の注入の前に行ってもよく、その間に行ってもよく、またはその後に行ってもよい。
【０６３４】
ある実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞生成物の製造のための細胞の収集の前にシクロホスファミドで前処置され、それによって、対象が、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞の処置を受けて再発するリスクを低下させる。ある実施形態において、対象は、ＣＡＲ発現細胞生成物の製造のための細胞の収集の前に抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それによって、対象がＣＡＲ発現細胞処置を受けて再発するリスクを低下させる。
【０６３５】
一実施形態において、除去される細胞の集団は、調節性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、別の様式でＣＡＲＴ細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５、または免疫抑制細胞によって発現される可能性がある他のマーカーを発現する細胞の拡張および／または機能に負の影響を与える細胞である。一実施形態において、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／もしくは腫瘍細胞と同時に、または前記枯渇の後に、または別の順番で除去されることが想定される。
【０６３６】
本明細書で説明される方法は、１つより多くの選択工程、例えば１つより多くの枯渇工程を包含していてもよい。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択された細胞に独特な表面マーカーに向けられた抗体の組合せを用いて達成することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に提示される細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによるセルソーティングおよび／もしくは選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を包含していてもよい。
【０６３７】
本明細書で説明される方法は、腫瘍抗原、例えば、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する集団からの細胞を除去して、それによって、ＣＡＲ、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ、を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質の発現に好適である、調節性Ｔ枯渇、例えば、ＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することをさら包含していてもよい。一実施形態において、腫瘍抗原を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメント、および抗腫瘍抗原抗体またはそれらのフラグメントは、同じ基質、例えば細胞を除去するのに使用できるビーズに付着することができ、または抗ＣＤ２５抗体もしくはそれらのフラグメント、または抗腫瘍抗原抗体もしくはそれらのフラグメントは、別々のビーズに付着することができ、それらの混合物は、細胞を除去するのに使用することができる。他の実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去、および腫瘍抗原を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
【０６３８】
また、集団から、チェックポイント阻害剤、例えば本明細書で説明されるチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞、およびＴＩＭ３＋細胞の１種または複数を除去することによって、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞、およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを包含する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤としては、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＰＤ１、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡおよびＬＡＩＲ１が挙げられる。一実施形態において、チェックポイント阻害剤発現細胞は、調節性Ｔ、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメント、および抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去することができ、または抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメント、および抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに付着させることができ、その混合物を使用して細胞を除去することができる。他の実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去、およびチェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
【０６３９】
本明細書で説明される方法は、陽性選択工程を包含し得る。例えば、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたり、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）がコンジュゲートしたビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔとインキュベートすることによって、Ｔ細胞を単離することができる。一実施形態において、期間は、約３０分である。さらなる態様において、期間は、３０分から３６時間の範囲またはそれより長く、およびその間の全ての整数値である。さらなる実施形態において、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。さらに別の実施形態において、期間は、１０から２４時間、例えば２４時間である。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合のように、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかしかないあらゆる状況においてＴ細胞を単離するためには、より長いインキュベート時間が使用される可能性がある。さらに、より長いインキュベート時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短くしたりまたは長くしたりすることによって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることができ、および／またはＴ細胞に対するビーズの比率（本明細書でさらに説明されるように）を増加または減少させることによって、培養開始時またはプロセス中の他のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面に対する抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。
【０６４０】
一実施形態において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢ、およびパーフォリンの１種または複数、または他の適切な分子、例えば他のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択する場合がある。細胞発現に関してスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２で説明されている方法によって決定することができる。
【０６４１】
陽性または陰性選択によって細胞の所望の集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は様々であってもよい。ある特定の態様において、細胞およびビーズの接触を最大にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容量を有意に減少させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様において、細胞１００億個／ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍｌ、または５０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、細胞１０億個／ｍｌの濃度が使用される。さらなる一態様において、１ｍｌあたり、細胞７５００万個以上、８０００万個以上、８５００万個以上、９０００万個以上、９５００万個以上、または１億個の細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度が使用できる。
【０６４２】
高濃度の使用は、細胞収量、細胞の活性化、および細胞拡大の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（例えば、白血病の血液、腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０６４３】
関連する態様において、より低い細胞の濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を相当に希釈することによって、粒子と細胞との相互作用を最小化する。それにより、粒子に結合させるために、大量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ２８を発現するが、薄い濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一態様において、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌから１×１０６／ｍｌまで、およびその間のあらゆる整数値であってもよい。
【０６４４】
他の態様において、細胞は、回転器で、様々な長さの時間にわたり、様々な速度、２〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートすることができる。
【０６４５】
刺激のためのＴ細胞を洗浄工程後に凍結してもよい。理論に縛られるつもりはないが、凍結工程とそれに続く融解工程は、細胞集団中の顆粒球とある程度の単球を除去することによってより均一な生成物をもたらす。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁してもよい。多くの凍結のための溶液およびパラメーターが当業界公知であり、この状況において有用であると予想されるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンならびに７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばヘスパンおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の好適な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１度／分の速度で−８０℃に凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存することを含む。他の制御冷凍方法を使用してもよいし、同様に−２０℃で即座に、または液体窒素中で非制御冷凍してもよい。
【０６４６】
ある特定の態様において、凍結保存した細胞を融解させて、本明細書で説明したようにして洗浄し、本発明の方法を使用して活性化する前に室温で１時間そのまま置く。
【０６４７】
また、本発明の状況では、本明細書で説明したようにして拡大させた細胞が必要になるかもしれないときの前の期間に、対象から血液サンプルまたはアフェレーシス産物を収集することも考慮される。そのようなものとして、拡大させようとする細胞の源を必要なあらゆる時点で収集することができ、さらに、本明細書で説明されるものなどの免疫エフェクター細胞治療によって利益を得ると予想される多数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞治療で後に使用するために、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離して凍結してもよい。一態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、全般的に健康な対象から採取される。ある特定の態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症させる危険性があるが、まだ疾患を発症させていない、全般的に健康な対象から採取され、さらに、後の使用のために対象の細胞を単離して凍結してもよい。ある特定の態様において、Ｔ細胞は、後の時点で拡大、凍結、および使用されてもよい。ある特定の態様において、本明細書で説明したような特定の疾患の診断の直後に、ただしいかなる処置の前に、サンプルが患者から収集される。さらなる態様において、これらに限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブなどの薬剤、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩、およびＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤（immunoablative agents）、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、および放射線照射での処置などの多数の関連する処置様式の前に、細胞が、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離される。
【０６４８】
本発明のさらなる態様において、対象に機能的なＴ細胞を残す処置の後に、患者から直接Ｔ細胞を得る。これに関して、ある特定のがん処置の後、特定には、免疫系にダメージを与える薬物での処置の後、患者が通常処置から回復すると予想される期間中の処置の直後に、得られたＴ細胞の品質が、エクスビボで拡大するそれらの能力に関して最適であるかまたは向上している可能性があることが観察されている。同様に、本明細書で説明される方法を使用したエクスビボでの操作の後、これらの細胞は、生着およびインビボでの拡大の強化にとって好ましい状況にある可能性がある。したがって、本開示の文脈の中では、この回収期間中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血細胞系の他の細胞を包含する血液細胞を収集することが意図される。さらに、ある特定の態様において、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを用いた動員）および前処置レジメン（conditioning regimen）を使用して、特に療法後の規定の時間帯中に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、および／または拡大にとって好都合な対象における状態を作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および他の免疫系細胞が挙げられる。
【０６４９】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する免疫エフェクター細胞は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得られる。一実施形態において、対象における、または対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞が少なくとも一時的に増加した状態になるように、十分な時間の後、または十分な免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に、ＣＡＲを発現するように加工される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団が回収される。
【０６５０】
他の実施形態において、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現するように加工されたまたは加工されることになる免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、の集団は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させる、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触により、エクスビボで処置することができる。
【０６５１】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（diaglycerol kinase）（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するか、または低減または阻害されたＤＧＫ活性を有する。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、ＤＧＫ発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。代替として、ＤＧＫ欠損細胞は、本明細書で説明されるＤＧＫ阻害剤での処置によって生成することができる。
【０６５２】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するか、または低減または阻害されたイカロス活性を有する。イカロス欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、イカロス発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。代替として、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処置によって生成することができる。
【０６５３】
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現しないか、または低減もしくは阻害されたＤＧＫおよびイカロス活性を有する。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、本明細書で説明される方法のいずれかによって生成することができる。
【０６５４】
一実施形態において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
【０６５５】
追加の発現される薬剤
別の実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する免疫エフェクター細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現することができる。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子の例としては、例えば本明細書で説明されるような、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメインと会合している、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含む。一実施形態において、薬剤は、例えば、阻害分子、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４もしくはＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメントの、第一のポリペプチドと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば、本明細書で説明されているような、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］である、第二のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１またはそのフラグメントの第一のポリペプチドと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０または４−ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドとを含む。
【０６５６】
一実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ、例えば、例えば同じ標的（例えば、上記で説明された標的）または異なる標的に対する、異なる抗原結合ドメインを包含する第二のＣＡＲ、を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、第二の融合タンパク質をさらに含んでいてもよい。一実施形態において、第二のＣＡＲは、第一のＣＡＲの標的と同じがん細胞型上で発現される標的に対する抗原結合ドメインを包含する。一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、第一の抗原を標的する第一のＣＡＲであって、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第二の異なる抗原を標的とする第二のＣＡＲであって、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。
【０６５７】
理論に縛られることは望まないが、第一のＣＡＲ上に共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０を、および第二のＣＡＲ上に一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータを配置することで、両方の標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を限定することができる。一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば上記で説明された標的を標的とする抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインとを包含する第一のＣＡＲ、および第一のＣＡＲの標的とされる抗原以外の抗原（例えば、第一の標的と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、例えば上記で説明された標的を標的とする抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する第一のＣＡＲ、および第一のＣＡＲの標的とされる抗原以外の抗原（例えば、第一の標的と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲを含む。
【０６５８】
一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、本明細書で説明されるＣＡＲ、例えば、上記で説明した標的に対するＣＡＲ、および阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、がん細胞ではなく正常細胞、例えば、同じく標的を発現する正常細胞上で見出される抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインの例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４またはＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであり得る。
【０６５９】
一実施形態において、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、本明細書で説明されるような腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメインを含む第一のＣＡＲと、ＰＤ１細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む第二のＣＡＲとを含む。
【０６６０】
一実施形態において、細胞は、上記で説明されたような阻害分子をさらに含む。
【０６６１】
一実施形態において、細胞内の第二のＣＡＲは、阻害性ＣＡＲであり、前記阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。阻害分子は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５のうちの１つまたは複数から選択することができる。一実施形態において、第二のＣＡＲ分子は、ＰＤ１の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む。
【０６６２】
実施形態において、細胞内の第二のＣＡＲ分子は、一次シグナル伝達ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０６６３】
他の実施形態において、細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的なドメインを含む一次シグナル伝達ドメインと、４−１ＢＢの機能的なドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。
【０６６４】
一実施形態において、細胞内の第二のＣＡＲ分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【０６６５】
ある特定の実施形態において、第一のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第二のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含まない。例えば、第一のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、第二のＣＡＲ分子の抗原結合ドメインは、ラクダ化ＶＨＨドメインを含む。
【０６６６】
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２およびＷＯ２０１４／０５５６５７においてより詳細に説明されている。簡単に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第一の抗原結合ドメインと共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）とを有する第一のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第二の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）とを有する第二のＣＡＲも発現する。細胞が第一の抗原と遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞は増殖する。細胞が第二の抗原と遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞を殺滅する活性が開始する。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全に活性化される。
【０６６７】
複数のＣＡＲ発現
一態様において、本明細書で説明されるＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞は、ＣＡＲ、例えば、例えば同じ標的または異なる標的（例えば、本明細書で説明されるがん関連抗原または本明細書で説明される異なるがん関連抗原以外の標的）に対する、異なる抗原結合ドメインを包含する第二のＣＡＲ、を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、第二の融合タンパク質をさらに含んでいてもよい。一実施形態において、第二のＣＡＲは、がん関連抗原と同じがん細胞型上で発現される標的に対する抗原結合ドメインを包含する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第一の抗原を標的する第一のＣＡＲであって、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第二の異なる抗原を標的とする第二のＣＡＲであって、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。理論に縛られることは望まないが、第一のＣＡＲ上に共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７またはＯＸ−４０を、および第二のＣＡＲ上に一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータを配置することで、両方の標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を限定することができる。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインとを包含する第一のがん関連抗原ＣＡＲ、および異なる標的抗原（例えば、第一の標的抗原と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、本明細書で説明される標的抗原に結合する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを包含する第一のＣＡＲ、および第一の標的抗原以外の抗原（例えば、第一の標的抗原とがん同じ細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインとを包含する、第二のＣＡＲを含む。
【０６６８】
一部の実施形態において、請求項記載の本発明は、第一および第二のＣＡＲを含み、前記第一のＣＡＲおよび前記第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含まない。一部の実施形態において、前記第一のＣＡＲおよび前記第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖでない。一部の実施形態において、前記第一のＣＡＲおよび前記第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科動物、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメイン、またはヒトもしくはマウス配列由来の単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態において、前記第一のＣＡＲおよび前記第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。一部の実施形態において、前記第一のＣＡＲおよび前記第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。
【０６６９】
同種異系細胞
本明細書で説明される実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種異系の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であってもよい。例えば、細胞は、同種異系のＴ細胞、例えば、機能的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩまたはベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が欠失した同種異系のＴ細胞であってもよい。
【０６７０】
機能的なＴＣＲを欠くＴ細胞は、例えば、その表面にいかなる機能的なＴＣＲも発現しないように加工されていてもよく、機能的なＴＣＲ、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３ＧもしくはＣＤ３Ｄを含む１つもしくは複数のサブユニットを発現しないように加工されていてもよく、またはその表面で機能的なＴＣＲをほとんど産生しないように加工されていてもよい。代替として、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１つまたは複数の突然変異またはトランケートされた形態の発現によって、実質的に機能が損なわれたＴＣＲを発現することができる。用語「実質的に機能が損なわれたＴＣＲ」は、このＴＣＲが、宿主において有害な免疫反応を惹起しないと予想されることを意味する。
【０６７１】
本明細書で説明されるＴ細胞は、例えば、その表面上に機能的なＨＬＡを発現しないように加工されていてもよい。例えば、本明細書で説明されるＴ細胞は、ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラス１および／もしくはＨＬＡクラスＩＩ、またはＨＬＡ発現のサブユニットもしくは調節因子、例えばＢ２Ｍの細胞表面発現が下方調節されるように加工されていてもよい。
【０６７２】
本明細書で説明されるＴ細胞は、例えば、その表面に機能的なＢ２Ｍを発現しないように加工されていてもよい。例えば、本明細書で説明されるＴ細胞は、Ｂ２Ｍの細胞表面発現が下方調節されるように加工されていてもよい。
【０６７３】
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、機能的なＴＣＲおよび機能的なＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩを欠失していてもよい。
【０６７４】
機能的なＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現が欠失した改変Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１つまたは複数のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンなどのあらゆる好適な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用した、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを包含していてもよい。
【０６７５】
一部の実施形態において、同種異系の細胞は、例えば本明細書で説明されるいずれかの方法によって阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞であってもよい。例えば、細胞は、阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞、例えば、ＣＡＲを発現する細胞の免疫エフェクター応答を展開する能力を減少させることができる細胞であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが挙げられる。阻害分子の阻害、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲを発現する細胞の性能を最適化することができる。実施形態において、阻害核酸、例えば、本明細書で説明される阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が使用できる。
【０６７６】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
一部の実施形態において、ＴＣＲ発現および／またはＨＬＡもしくはＢ２Ｍ発現は、Ｔ細胞内のＴＣＲおよび／またはＨＬＡをコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害することができる。
【０６７７】
ＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ」は、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピートのセット、またはリピートのこのようなセットを含むシステムを指す。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡまたはＢ２Ｍ遺伝子をサイレンシングするためにまたは突然変異させるために使用することができる、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ由来のシステムを指す。
【０６７８】
当業界公知の技術、例えば、米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823において説明されている技術を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムを産生することができる。ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する他の人工ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムであって、当業界公知である、例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号および同第８，６９７，３５９号において説明されている人工ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムを生成することもできる。
【０６７９】
ＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ」は、ＨＬＡまたはＢ２Ｍおよび／またはＴＣＲ遺伝子を編集するために使用することができる人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
【０６８０】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより人工的に生成される。ＨＬＡまたはＴＣＲ遺伝子の一部を包含する任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔ（ＴＡＬＥ）を加工することができる。加工されたＴＡＬＥとＤＮＡ切断ドメインを組み合わせることにより、ＨＬＡまたはＴＣＲ配列を包含する、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的である制限酵素を産生することができる。次いで、これらを細胞に導入することができ、そこでそれらをゲノム編集に使用することができる。Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6；およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12；Moscou et al. (2009) Science 326: 3501。
【０６８１】
モジュラー成分を使用する様々なスキームを包含する当業界公知の任意の方法を使用して、ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮを構築することがきる。Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53；Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509。
【０６８２】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するジンクフィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲに対するＺＦＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲを阻害するＺＦＮ」とは、ＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子またはＢ２Ｍ遺伝子を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、ジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。
【０６８３】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮは、当業界公知の任意の方法を使用して構築することがきる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815；Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349；Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7；Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許出願公開第２０１１／０１５８９５７号、および米国特許出願公開第２０１２／００６０２３０号を参照されたい。
【０６８４】
テロメラーゼの発現
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、いくつかの実施形態において、患者における治療的Ｔ細胞の持続性は、Ｔ細胞におけるテロメアの短縮に起因して短期間であり、したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを長くし、患者におけるＴ細胞の持続性を改善する可能性がある。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)を参照されたい。したがって、ある実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所的に発現する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることを含む方法を提示する。細胞は、ＣＡＲをコードするコンストラクトと接触させる前に、核酸と接触させることもでき、これと並列して接触させることもでき、この後で接触させることもできる。
【０６８５】
拡大および活性化
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を一般に使用して、活性化および拡大することができ、前記特許文献の各々は、その全体が参照により組み入れられる。
【０６８６】
一般に、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを付着させた表面と接触させることによって、免疫エフェクター細胞集団、例えば調節性Ｔ細胞枯渇細胞を拡大させることができる。特定には、本明細書で説明したようにして、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメント、または抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアとともにプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、Ｔ細胞集団を刺激してもよい。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するため、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、これらは、一般的に当業界で知られている他の方法と同様にして使用することができる［Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999］。
【０６８７】
ある特定の態様において、Ｔ細胞に関する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって供給することができる。例えば、各シグナルを供給する薬剤は、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面にカップリングされてもよいし（すなわち、「シス」形成）、または別の表面に（すなわち、「トランス」形成）カップリングされてもよい。その代わりに、１種の薬剤が表面にカップリングされ、他の薬剤が溶解した状態であってもよい。一態様において、共刺激シグナルを供給する薬剤が細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを供給する薬剤が、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。ある特定の態様において、両方の薬剤が溶解した状態であってもよい。一態様において、薬剤は、可溶性の形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞などの表面に、または薬剤に結合すると予想される抗体もしくは他の結合剤に架橋されていてもよい。これに関して、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化して拡大させることに使用することが意図された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関する米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照されたい。
【０６８８】
一態様において、２種の薬剤が、同じビーズ上、すなわち「シス」、または別のビーズ上、すなわち「トランス」のいずれかでビーズ上に固定される。一例として、一次活性化シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、どちらの薬剤も、等しい分子の量で同じビーズにともに固定される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大およびＴ細胞成長のために、ビーズに結合した１：１の比率の各抗体が使用される。本発明のある特定の態様において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較してＴ細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率が使用される。特定の一態様において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較して、約１から約３倍の増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１から１：１００の範囲、およびその間の全ての整数値である。一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比率は１未満である。ある特定の態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体との比率は、２：１より大きい。特定の一態様において、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる態様において、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。好ましい一態様において、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる一態様において、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。
【０６８９】
Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために、１：５００から５００：１まで、およびその間のあらゆる整数値の粒子と細胞との比率を使用することができる。当業者であれば容易に認識できるように、粒子と細胞との比率は、標的細胞に対する粒度によって決まる可能性がある。例えば、小さいサイズのビーズは、わずかな数の細胞としか結合できないが、より大きいビーズは多くと結合できる。ある特定の態様において、細胞と粒子との比率は、１：１００から１００：１の範囲、およびその間のあらゆる整数値であり、さらなる態様において、この比率は、１：９から９：１、およびその間のあらゆる整数値を含み、Ｔ細胞を刺激するのにも使用することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がカップリングされた粒子とＴ細胞との、Ｔ細胞の刺激をもたらす比率は上述したように様々なであってよいが、ある特定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、および１５：１が挙げられ、１つの好ましい比率は、粒子とＴ細胞とが少なくとも１：１である。一態様において、１：１またはそれ未満の粒子と細胞との比率が使用される。特定の一態様において、好ましい粒子：細胞の比率は、１：５である。さらなる態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の日に応じて変更することができる。例えば、一態様において、粒子と細胞との比率は、１日目では１：１から１０：１であり、その後、毎日または１日おきに最大１０日まで細胞に追加の粒子が添加され、最終的には１：１から１：１０の比率である（添加した日の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には１：１であり、刺激の３日目および５日目には１：５に調整される。一態様において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：５にする。一態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には２：１であり、刺激の３日目および５日目には１：１０に調整される。一態様において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：１０にする。当業者であれば、様々な他の比率が本発明で使用するのに適している可能性があることを認識するものと予想される。特定には、比率は、粒度ならびに細胞のサイズおよびタイプに応じて様々であると予想される。一態様において、使用のための最も典型的な比率は、１日目に１：１、２：１および３：１の付近である。
【０６９０】
さらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わされ、その後ビーズおよび細胞を分離して、次いで細胞を培養する。代替の態様において、培養の前に薬剤でコーティングしたビーズと細胞とを分離せずに、一緒に培養する。さらなる態様において、まず磁力などの力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮し、その結果として細胞表面マーカーのライゲーションを増加させることにより、細胞の刺激を誘導する。
【０６９１】
一例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着している常磁性ビーズ（３×２８個のビーズ）をＴ細胞に接触させることによって、細胞表面タンパク質をライゲートさせることができる。一態様において、細胞（例えば、１０４から１０９個のＴ細胞）およびビーズ［例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズを１：１の比率で］を、緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの２価カチオンを含まない）中で組み合わせる。ここでも、あらゆる細胞濃度が使用できることは、当業者であれば容易に認識することができる。例えば、標的細胞は、サンプル中で極めて希少であってもよいし、サンプルのわずか０．０１％しか含んでいなくてもよいし、またはサンプル全体（すなわち、１００％）が対象の標的細胞を構成していてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の内容に含まれる。ある特定の態様において、細胞と粒子とが最大限に接触するように、粒子および細胞が一緒に混合されている容量を有意に減少させること（すなわち、細胞の濃度を増加させること）が望ましい場合がある。例えば、一態様において、細胞約２０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、１ｍｌあたり１億個より多くの細胞が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個の細胞の濃度が使用される。さらなる一態様において、１ｍｌあたり細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個の細胞の濃度が使用される。例えば、一態様において、１ｍｌあたりの細胞約１００億個、１ｍｌあたりの細胞９０億個、１ｍｌあたりの細胞８０億個、１ｍｌあたりの細胞７０億個、１ｍｌあたりの細胞６０億個、１ｍｌあたりの細胞５０億個、または１ｍｌあたりの細胞２０億個の濃度を使用する。一態様において、１ｍｌあたりの細胞１億個超を使用する。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞のより効率的な捕獲を可能にする。ある特定の態様において、このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０６９２】
一実施形態において、ＣＡＲ、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ、を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸で形質導入した細胞を、例えば、本明細書で説明される方法により拡大する。一実施形態において、細胞を、培養物中で、数時間（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８、２１時間）〜約１４日間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間）にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、４〜９日間にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、８日間またはこれ未満、例えば、７、６、または５日間にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞より強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞の殺滅、サイトカインの産生、活性化、遊走、またはこれらの組合せにより規定することができる。一実施形態において、細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＤ１９  ＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、抗原刺激時に、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、細胞倍加の少なくとも１、２、３、または４倍の増加を示す。一実施形態において、細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、高度な炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ−γレベルおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを呈示する。一実施形態において、細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＡＲ細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ−γレベルおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの、ｐｇ／ｍｌ単位で、少なくとも１、２、３、４、５、１０倍、またはこれを超える増加を示す。
【０６９３】
またＴ細胞の培養時間が６０日間またはそれより長くなるように、数サイクルの刺激が望ましい場合がある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−αなどの増殖および生存能力に必要な因子、または当業者公知の細胞成長に関する他のあらゆる添加剤を含有していてもよい適切な培地［例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、Ｘ−ｖｉｖｏ  １５、（Ｌｏｎｚａ）］が挙げられる。細胞成長に関する他の添加剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）または規定された一連のホルモン、および／またはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインが補充されたかのいずれかの、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養の場合のみに包含され、対象に注入しようとする細胞の培養の場合は包含されない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気および５％ＣＯ２）などの成長を支持するのに必要な条件下で維持される。
【０６９４】
一実施形態において、細胞を、１つまたは複数のインターロイキンを含む、適切な培地（例えば、本明細書で説明される培地）中で拡大させ、これにより、１４日間の拡大期間にわたり、例えば、フローサイトメトリーなど、本明細書で説明される方法により測定される通り、細胞の、少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増加を結果としてもたらす。一実施形態において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下において拡大させる。
【０６９５】
実施形態において、本明細書で説明される方法、例えば、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞の製造方法は、例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去することを含む。細胞集団から調節性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去する方法は、本明細書で説明される。実施形態において、方法、例えば製造方法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞などの調節性Ｔ細胞が枯渇された細胞集団、または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント、もしくはＣＤ２５結合リガンドと以前に接触したことがある細胞集団）をＩＬ−１５および／またはＩＬ−７と接触させることをさらに含む。例えば、細胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント、またはＣＤ２５結合リガンドと以前に接触したことがある細胞集団）をＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下において拡大させる。
【０６９６】
一部の実施形態において、本明細書で説明される、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造中に、例えば、エクスビボで、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、またはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５の両方の組合せを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０６９７】
一実施形態において、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を含むドメインを含む融合タンパク質は、エクスビボにおける拡大時に、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触する。ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施形態において、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一実施形態において、接触させることは、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖を結果としてもたらす。
【０６９８】
様々な刺激時間に晒されたＴ細胞は、異なる特徴を示す可能性がある。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。エクスビボでのＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞拡大は、約８〜９日目の前には主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、よりいっそう多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置目的に応じて、主としてＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的なサブセットが単離された場合、このようなサブセットは、このサブセットをより高度に拡大させるのに有益な場合がある。
【０６９９】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞拡大プロセスの経過中、他の表現型マーカーが有意に、ただし大部分は再生可能に変化する。したがって、このような再現性は、活性化されたＴ細胞産物を特定の目的に合わせる能力を可能にする。
【０７００】
例えば、本明細書で説明されるＣＡＲを含むドメインを含む融合タンパク質が構築されたら、これらに限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を拡大させて再刺激の非存在下でＴ細胞の拡大を維持する能力、および適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗癌活性などの分子の活性を評価するために、様々なアッセイを使用することができる。本開示のＣＡＲの作用を評価するためのアッセイは、以下のさらなる詳細で説明される。
【０７０１】
初代Ｔ細胞における例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ発現を含むドメインを含む融合タンパク質のウェスタンブロット分析は、単量体および二量体の存在を検出するために使用することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。極簡単に言うと、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物）を１０日より長い間インビトロで拡大させ、その後、溶解し、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す。完全長ＴＣＲ−ζ細胞質内ドメインと内因性ＴＣＲ−ζ鎖とを含有するＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用してウェスタンブロッティングにより検出する。同じＴ細胞サブセットを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用して、共有結合性二量体の形成を評価できるようにする。
【０７０２】
抗原刺激後の、ＣＡＲ  Ｔ細胞、例えばＣＡＲ＋Ｔ細胞を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質＋のインビトロでの拡大を、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて分析しようとするプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを移入させる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣ、またはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。培養から６日目に、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいてＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。その代わりに、０日目に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボゾームスキッピング配列（ribosomal skipping sequence）を使用してｅＧＦＰとともにＣＡＲを発現するバイシストロン性のレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲで形質導入する。培養物は、洗浄の後、本明細書で説明されるようながん関連抗原＋Ｋ５６２細胞（本明細書で説明されるようながん関連抗原を発現するＫ５６２）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）のいずれかで再刺激する。１日おきに外因性ＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌで培養に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーによって数えられる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009)を参照されたい。
【０７０３】
再刺激の非存在下において持続される、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ、例えばＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大を含むドメインを含む融合タンパク質＋もまた、測定することができる。例えば、［Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)］を参照されたい。略述すると、０日目における、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズによる刺激、および１日目における、表示のＣＡＲの形質導入に続き、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ粒子カウンター、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ  Ｖｉｓｉｏｎ、またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｃｅｐｔｅｒを使用して、培養の８日目に、平均Ｔ細胞容量（ｆｌ）を測定する。
【０７０４】
ＣＡＲＴ活性を測定するために動物モデルを使用することもできる。例えば、本明細書で説明されるヒトがん関連抗原に特異的なＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用して免疫不全マウスの原発性ヒトプレＢ  ＡＬＬを処置する異種移植モデルを使用することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。極簡単に言うと、ＡＬＬの確証後、マウスを処置群に無作為に割り付ける。がん関連抗原に特異的な、ＣＡＲが加工された異なる数のＴ細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ−／−マウスが有するＢ−ＡＬＬに１：１比でコンジュゲートする。マウスからの脾臓ＤＮＡにおけるがん関連抗原特異的ＣＡＲベクターのコピー数を、Ｔ細胞注射後様々な時点で評価する。動物を１週間間隔で白血病について査定する。末梢血の本明細書で説明されるようながん関連抗原＋Ｂ−ＡＬＬ芽細胞数を、本明細書で説明されるがん関連抗原−ζ  ＣＡＲ＋Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を注射したマウスにおいて測定する。ログランク検定を使用して、群の生存曲線を比較する。加えて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−γ−／−マウスにおけるＴ細胞注射の４週間後の絶対末梢血ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数も分析することができる。マウスに白血病細胞を注射し、３週間後、ｅＧＦＰに連結されたＣＡＲをコードする２シストロン性レンチウイルスベクターによりＣＡＲを発現するように加工されたＴ細胞を注射する。細胞を注射前のモック形質導入細胞と混合することによりＴ細胞を４５〜５０％インプットＧＦＰ＋Ｔ細胞に正規化し、フローサイトメトリーによって確認する。動物を１週間間隔で白血病について査定する。ログランク検定を使用して、ＣＡＲ＋Ｔ細胞群の生存曲線を比較する。
【０７０５】
ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような融合タンパク質の、用量依存性の処置応答を、評価することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。例えば、２１日目にＣＡＲ  Ｔ細胞を注射した、当量数のモック形質導入Ｔ細胞を注射した、またはＴ細胞を注射していないマウスにおいて白血病を確証した３５〜７０日後に末梢血を採取する。末梢血の本明細書で説明されるようながん関連抗原＋ＡＬＬ芽細胞数の決定のために各群からのマウスから無作為に採血し、その後、それらのマウスを３５および４９日目に殺傷する。残りの動物を５７および７０日目に評価する。
【０７０６】
細胞増殖およびサイトカイン産生の査定は、以前に、例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)で説明されている。簡単に言うと、ＣＡＲ媒介増殖の査定は、マイクロタイタープレートにおいて、洗浄したＴ細胞を、本明細書で説明されるがん関連抗原（Ｋ１９）またはＣＤ３２およびＣＤ１３７（ＫＴ３２−ＢＢＬ）を発現するＫ５６２細胞と２：１の最終Ｔ細胞：Ｋ５６２比に混合することによって行う。使用前にＫ５６２細胞にガンマ線を照射する。ＫＴ３２−ＢＢＬ細胞のシグナルはエクスビボでの長期ＣＤ８＋Ｔ細胞拡大を支持するのでＴ細胞増殖に対する刺激の陽性対照として役立てるためのＫＴ３２−ＢＢＬ細胞とともに、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）および抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、培養物に添加する。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびフローサイトメトリーを製造業者による説明通りに使用して、培養物中のＴ細胞の数を数える。ｅＧＦＰ−２Ａに連結されたＣＡＲを発現するレンチベクターを用いて加工されたＴ細胞を使用して、ＧＦＰ発現によりＣＡＲ＋Ｔ細胞を同定する。ＧＦＰを発現しないＣＡＲ＋Ｔ細胞については、本明細書で説明されるようながん関連抗原のビオチン処理された組換えタンパク質および二次アビジン−ＰＥコンジュゲートを用いてＣＡＲ＋Ｔ細胞を検出する。Ｔ細胞上でのＣＤ４＋およびＣＤ８＋発現も特異的モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で同時に検出する。ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリックビーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して、再刺激の２４時間後に収集した上清を用いてサイトカイン測定を行う。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して蛍光を評定し、製造業者の指示に従ってデータを分析する。
【０７０７】
細胞毒性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより査定することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。簡単に言うと、標的細胞（Ｋ５６２系および初代プロＢ−ＡＬＬ細胞）に５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、として）を３７℃で２時間、高頻度で撹拌しながら投入し、完全ＲＰＭＩで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞をウェル内で完全ＲＰＭＩ中の標的細胞と様々なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で混合する。培地のみが入っている追加のウェル（自然放出、ＳＲ）またはトリトンＸ１００界面活性剤の１％溶液が入っている追加のウェル（全放出、ＴＲ）も調製する。３７℃で４時間のインキュベーション後、各ウェルからの上清を回収する。次いで、放出された５１Ｃｒを、ガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して測定する。各条件を少なくとも３回ずつ行い、次の式を使用して溶解百分率を計算する：％溶解＝（ＥＲ−ＳＲ）／（ＴＲ−ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件についての放出された平均５１Ｃｒを表す）。
【０７０８】
イメージング技術を使用して、腫瘍を有する動物モデルにおけるＣＡＲの特異的輸送および増殖を評価することができる。そのようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)において説明されている。簡単に言うと、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−（ＮＳＧ）マウスにＮａｌｍ−６細胞をＩＶ注射し、続いて７日後に、ＣＡＲコンストラクトのエレクトロポレーションの４時間後にＴ細胞を注射した。Ｔ細胞にレンチウイルスコンストラクトを安定的にトランスフェクトして、ホタルルシフェラーゼを発現させ、マウスを生物発光についてイメージングする。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植モデルにおけるＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回注射の治療効果および特異性を、次のように測定することができる：ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたＮａｌｍ−６をＮＳＧマウスに注射し、続いて７日後に、本開示のＣＡＲがエレクトロポレーションされたＴ細胞の単回尾静脈注射を行う。注射後様々な時点で動物をイメージングする。例えば、５日目（処置の２日前）および８日目（ＣＡＲ＋ＰＢＬの２４時間後）に代表マウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度ヒートマップを生成することができる。
【０７０９】
本明細書における実施例セクションで説明されるアッセイはもちろん当業界公知のアッセイも包含する他のアッセイも、本明細書で説明されるＣＡＲを評価するために使用することができる。
【０７１０】
ＣＡＲ発現細胞を作製する方法
別の態様において、本発明は、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞またはその集団）を作製する方法であって、ＣＡＲ、例えば本明細書で説明されるＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸を含むベクター、またはＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ、をコードする核酸を含むベクターを、細胞、例えば、本明細書で説明されるＴ細胞またはＮＫ細胞に導入すること（例えば、形質導入すること）を含む方法に関する。
【０７１１】
方法における細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはその組合せ）である。一部の実施形態において、方法における細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ｄｉａｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ）（ＤＧＫ）および／またはイカロス欠損である。
【０７１２】
一部の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸分子を導入することは、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを形質導入すること、またはＣＡＲをコードする核酸分子であって、インビトロで転写されたＲＮＡである核酸分子をトランスフェクトすることを含む。
【０７１３】
一部の実施形態において、方法は、
免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団を用意すること、および
前記集団から調節性Ｔ細胞を除去することによって、調節性Ｔ細胞枯渇集団を提供すること
をさらに含み、工程ａ）およびｂ）は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸を前記集団に導入する前に行われる。
【０７１４】
方法の実施形態において、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を含み、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントを使用して細胞集団から除去される。抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントは、支持体、例えば、ビーズにコンジュゲートされていてもよい。
【０７１５】
他の実施形態において、工程（ｂ）から得られる調節性Ｔ細胞枯渇集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
【０７１６】
さらに他の実施形態において、方法は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸を前記集団に導入する前に、ＣＤ２５を含まない腫瘍抗原を発現する細胞を集団から除去して、調節性Ｔ細胞が枯渇しかつ腫瘍抗原が枯渇した細胞の集団を提供することをさらに含む。腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４もしくはＣＤ１１ｂまたはそれらの組合せから選択することができる。
【０７１７】
他の実施形態において、方法は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸を前記集団に導入する前に、チェックポイント阻害剤を発現する細胞を集団から除去して、調節性Ｔ細胞が枯渇しかつ阻害分子が枯渇した細胞の集団を提供することをさらに含む。チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ１６０、Ｐ１Ｈ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、およびＬＡＩＲ１から選択することができる。
【０７１８】
本明細書で開示されるさらなる実施形態は、免疫エフェクター細胞の集団を提供することを包含する。提供される免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよび／またはＣＤ４５ＲＯのうちの１つまたは複数の発現に基づいて選択することができる。ある特定の実施形態において、提供される免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３＋および／またはＣＤ２８＋である。
【０７１９】
方法のある特定の実施形態において、方法は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子を導入した後、細胞の集団を拡大させることをさらに含む。
【０７２０】
実施形態において、細胞の集団は、８日以下の間、拡大される。
【０７２１】
ある特定の実施形態において、細胞の集団は、５日間、培養で拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下での９日間の培養で拡大された同じ細胞より強力である。
【０７２２】
他の実施形態において、細胞の集団は、５日間、培養で拡大され、抗原刺激時に、同じ培養条件下での９日間の培養で拡大された同じ細胞と比較して、細胞倍加の少なくとも１、２、３、または４倍の増加を示す。
【０７２３】
さらに他の実施形態において、細胞の集団は、５日間、培養で拡大され、結果として得られる細胞は、同じ培養条件下での９日間の培養で拡大された同じ細胞と比較して高い炎症誘発性ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを示す。
【０７２４】
他の実施形態において、細胞の集団は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤および／または細胞の表面の共刺激分子を刺激するリガンドの存在下で細胞を培養することにより、拡大される。薬剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはそのフラグメントおよび／または抗ＣＤ２８抗体もしくはそのフラグメントがコンジュゲートされているビーズであってもよい。
【０７２５】
他の実施形態において、細胞の集団は、１つまたは複数のインターロイキンを包含する適切な培地中で拡大され、その結果、フローサイトメトリーによって測定して、１４日の拡大期間にわたって細胞が少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍または３５０倍増加することになる。
【０７２６】
他の実施形態において、細胞の集団は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下で拡大される。
【０７２７】
ある特定の実施形態において、方法は、適切な拡大期間後に細胞の集団を凍結保存することをさらに含む。
【０７２８】
さらに他の実施形態において、本明細書で開示される作製方法は、免疫エフェクター細胞の集団と、テロメラーゼサブユニット、例えばｈＴＥＲＴ、をコードする核酸とを接触させることをさらに含む。テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡであってもよい。
【０７２９】
本開示はまた、ＲＮＡが加工された細胞、例えば、本明細書で説明される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）であって、外因性ＲＮＡを一過性発現する細胞の集団を生成する方法を提供する。方法は、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、前記ＲＮＡは、本明細書で説明される、ＣＡＲ分子を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸を含む。
【０７３０】
別の態様において、本発明は、対象に抗腫瘍免疫を与える方法あって、ＣＡＲ分子を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を含む細胞、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を前記対象に投与することを含む方法に関する。一実施形態において、細胞は、自己ＴまたはＮＫ細胞である。一実施形態において、細胞は、同種異系ＴまたはＮＫ細胞である。一実施形態において、対象はヒトである。
【０７３１】
一態様において、本発明は、例えば本明細書で説明されるような、ＣＡＲ分子を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターがトランスフェクトまたは形質導入されている自己細胞の集団を含む。一実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。一実施形態において、ベクターは、本明細書の他の箇所で説明されるような自己不活性化レンチウイルスベクターである。一実施形態において、ベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に（例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより）デリバリーされ、前記ベクターは、ｍＲＮＡ分子として転写される、本明細書で説明される本開示のＣＡＲをコードする核酸分子を含み、本開示のＣＡＲは、ＲＮＡ分子から翻訳され、細胞の表面に発現される。
【０７３２】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現する細胞、例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）、の集団を提供する。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の集団は、本明細書で説明されるような第一の腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一の細胞と、本明細書で説明されるような第二の腫瘍抗原と結合する異なる抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二の細胞とを包含していてもよい。別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、本明細書で説明されるような腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞と、本明細書で説明されるような腫瘍抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞とを包含していてもよい。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞と、二次シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメイン、を包含するＣＡＲを発現する第二の細胞とを包含する。
【０７３３】
別の態様において、本開示は、集団内の少なくとも１つの細胞が、本明細書で説明されるような腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質を発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが挙げられる。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で説明される分子であり、例えば、正のシグナルを細胞に提供する第二のポリペプチド、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン、と会合している第一のポリペプチド、例えば阻害分子、を含む薬剤である。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、２Ｂ４およびＴＩＧＩＴなどの阻害分子またはこれらのうちいずれかのフラグメントの第一のポリペプチドと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば、例えば本明細書で説明されるような、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］である第二のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１またはそのフラグメントの第一のポリペプチドと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０または４−ＩＢＢシグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドとを含む。
【０７３４】
一実施形態において、例えば本明細書で説明されるような、本開示分子のＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質をコードする核酸分子は、ｍＲＮＡ分子として発現される。一実施形態において、本発明の遺伝子改変されたＣＡＲを発現する細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、所望のＣＡＲをコードする（例えば、ベクター配列のない）ＲＮＡ分子の細胞へのトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって生成することができる。一実施形態において、本開示分子のＣＡＲは、組み込まれ、組換え細胞の表面に発現されると、ＲＮＡ分子から翻訳される。
【０７３５】
トランスフェクションに使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、本明細書で説明される３’および／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、本明細書で説明される５’キャップ）ならびに／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、本明細書で説明されるＩＲＥＳ）、発現されることになる核酸、ならびにポリＡテールを含有する、典型的に長さが５０〜５０００塩基のコンストラクト（配列番号３２）を産生するために、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含む。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一実施形態において、鋳型は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質に関する配列を包含する。ある実施形態において、ベクターである、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、ＲＮＡ融合タンパク質は、エレクトロポレーションにより細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に形質導入される。
【０７３６】
一実施形態において、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質は、例えばインビトロでの転写を使用して、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入され、対象（例えば、ヒト）は、ＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質、本発明の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の初回投与を受け、そしてＣＡＲを包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質、本発明の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回または複数回の後続投与を受け、前記１回または複数回の後続投与は、前の投与後１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２日未満に投与される。一実施形態において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の週に１回より多くの投与が対象（例えば、ヒト）に対して行われ、例えば、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の週に２、３または４回の投与が行われる。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の週に１回より多くの投与（例えば、週に２、３または４回の投与）（本明細書ではサイクルとも称される）を受け、その後、１週間はＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の投与を受けず、次いで、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回または複数回のさらなる投与［例えば、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の週に１回より多くの投与］が前記対象に対して行われる。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１サイクルより多くのサイクルのＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を受け、各サイクルの間の期間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日間未満である。一実施形態において、ＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１日おきの週に３回の投与が行われる。一実施形態において、本発明のＣＡＲ免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間またはそれより長く投与される。
【０７３７】
一態様において、ＣＡＲ発現細胞は、レンチウイルスなど、レンチウイルスベクターを使用して生成される。このようにして生成された細胞、例えばＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有することになる。
【０７３８】
一態様において、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴは、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、本明細書で説明されるガンマレトロウイルスベクターなどの、ウイルスベクターを使用して生成される。これらのベクターを使用して生成されたＣＡＲＴは、安定なＣＡＲ発現を有することができる。
【０７３９】
一態様において、ＣＡＲＴは、ＣＡＲベクターを、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターのデリバリーにより果すことができる。一態様において、ＣＡＲ  ＲＮＡは、エレクトロポレーションによりＴ細胞に形質導入される。
【０７４０】
ＣＡＲを一過性に発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を使用して（特に、マウスｓｃＦｖを有するＣＡＲＴを用いて）処置された患者において生じ得る潜在的な問題は、複数回の処置後のアナフィラキシーである。
【０７４１】
この理論に縛られることは望まないが、そのようなアナフィラキシー応答は、患者が体液性抗ＣＡＲ応答、すなわち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を発生させることにより引き起こされる可能性があると考えられる。抗原への曝露が１０日から１４日中断（ｂｒｅａｋ）されると、患者の抗体産生細胞が、ＩｇＧアイソタイプ（アナフィラキシーを引き起こさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを起こすと考えられる。患者が、一過性ＣＡＲ療法の過程で抗ＣＡＲ抗体応答（例えば、ＲＮＡ形質導入により起こるもの）を起こすリスクが高い場合は、ＣＡＲＴの注入中断が１０〜１４日より長く続かないほうがよい。
【０７４２】
タンパク質を条件的に発現させる方法および治療応用
融合タンパク質（例えば、ＣＡＲポリペプチドを含むもの）を条件的に発現させる方法も本明細書において提供される。そのような方法は、本明細書で説明される融合タンパク質のいずれかまたはそのような融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、発現化合物、例えば、脱凝集化合物または安定化化合物と接触させることを包含し得る。
【０７４３】
安定化化合物の存在下では、融合タンパク質の分解ドメインは、細胞内分解に対して耐性のコンフォメーションをとり、プロテアーゼは、融合タンパク質内のプロテアーゼ切断部位を切断し、それによって、所望のタンパク質から分解ドメインが切断され、所望のタンパク質が発現される結果となる。安定化化合物の非存在下では、融合タンパク質の分解ドメインは、細胞内分解を許容するコンフォメーションをとり、その結果、融合タンパク質は分解されることになる。一部の実施形態において、宿主細胞を安定化化合物とインビボで接触させる。一部の実施形態において、宿主細胞を安定化化合物とエクスビボで接触させる。
【０７４４】
脱凝集化化合物の存在下では、融合タンパク質の脱凝集ドメインは、オリゴマー化（例えば、二量体化）に対して耐性のコンフォメーションをとり、これに起因して、融合タンパク質はプロテアーゼが接近可能な単量体状態に入り、プロテアーゼは融合タンパク質内のプロテアーゼ切断部位を切断し、それによって、所望のタンパク質から凝集ドメインが切断され、所望のタンパク質が発現されることになる。脱凝集化合物の非存在下では、融合タンパク質の脱凝集ドメインは、二量体化を許容するコンフォメーションをとり、それに起因して、融合タンパク質はオリゴマー状態、例えば二量体状態、例えば凝集状態に入る。オリゴマー状態、例えば二量体状態、例えば凝集状態は、融合タンパク質の細胞区画間の移動、または分泌を妨げる。オリゴマー状態、例えば二量体状態、例えば凝集状態にはプロテアーゼが接近できない。一部の実施形態において、宿主細胞を脱凝集化合物とインビボで接触させる。一部の実施形態において、宿主細胞を脱凝集化合物とエクスビボで接触させる。
【０７４５】
安定化化合物は、分解ドメインに基づいて選択することができる。例えば、分解ドメインがエストロゲン受容体に由来する場合、安定化化合物は、バゼドキシフェンまたは４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）から選択することができる。タモキシフェンおよびバゼドキシフェンは、ＦＤＡ承認薬であり、したがって、ヒトに使用しても安全である。分解ドメインがＦＫＢタンパク質に由来する場合、安定化化合物は、Ｓｈｉｅｌｄ１であり得る。
【０７４６】
脱凝集化化合物は、脱凝集ドメインに基づいて選択することができる。例えば、脱凝集ドメインがＦＫＢＰに由来する場合、脱凝集化合物は、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ＡＰ２２５４２またはＡＰ２１９９８から選択することができる。
【０７４７】
別の態様において、本開示は、本発明の融合タンパク質を治療として投与することを含む方法を提供する。典型的に、そのような投与は、本発明の融合タンパク質を発現する宿主細胞（例えば、自己または同種異系宿主細胞）の形態での対象への投与になる。したがって、対応する安定化化合物を（インビボまたはエクスビボのいずれかで）投与することによって、治療薬（すなわち、分解ドメインの切断後に残存するタンパク質）の発現を調節することができる。したがって、対応する脱凝集化合物を（インビボまたはエクスビボのいずれかで）投与することによって、治療薬（すなわち、凝集ドメインの切断後に残存するタンパク質）の発現を調節することができる。それ故、公知の合成治療用タンパク質または膜貫通受容体（例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を包含するドメインを含む、例えば本明細書で説明されるような、融合タンパク質）の発現を調節することができる。一実施形態において、対象は、本明細書で説明される障害を有し、例えば、対象は、がんを有し、例えば、対象は、本明細書で説明される標的抗原を発現するがんを有する。一実施形態において、対象はヒトである。
【０７４８】
本明細書で説明される融合タンパク質のいずれかまたはそのような融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞の有効量を対象に投与することにより、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向に、腫瘍抗原に特異的に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、そして１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は、対象にとって自己である。一部の実施形態において、宿主細胞は、前記対象にとって同種異系である。一部の実施形態において、宿主細胞を発現化合物、例えば、安定化化合物または脱凝集化合物と接触させる。安定化化合物の存在下では、融合タンパク質の分解ドメインは、細胞内分解に対して耐性のコンフォメーションをとり、プロテアーゼは、融合タンパク質内のプロテアーゼ切断部位を切断し、それによって、所望のタンパク質から分解ドメインが切断され、所望のタンパク質が発現されることになる。安定化化合物の非存在下では、融合タンパク質の分解ドメインは、細胞内分解を許容するコンフォメーションをとり、その結果、融合タンパク質は分解されることになる。脱凝集化合物の存在下では、融合タンパク質の凝集ドメインは、オリゴマー化または凝集に対して耐性のコンフォメーションをとり、プロテアーゼは、融合タンパク質内のプロテアーゼ切断部位を切断し、それによって、所望のタンパク質から凝集ドメインが切断され、所望のタンパク質が発現されることになる。脱凝集化合物の非存在下では、融合タンパク質の凝集ドメインは、オリゴマー化または凝集を許容するコンフォメーションをとり、その結果、融合タンパク質は凝集することになる。
【０７４９】
別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるがん関連抗原の発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質、を含む細胞の有効量を前記対象に投与することを含む方法に関する。
【０７５０】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍抗原（例えば、本明細書で説明される抗原）の発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）の有効量を前記対象に投与することを含み、前記ＣＡＲ分子が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインが、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含み、前記抗原結合ドメインが、疾患に関連する腫瘍抗原、例えば、本明細書で説明されるような腫瘍抗原と結合する、方法を特徴とする。
【０７５１】
関連態様において、本発明は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を有する対象を処置する方法を特徴とする。方法は、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）の有効量を、免疫細胞の効力を増大させる薬剤と組み合わせて前記対象に投与することを含み、前記免疫細胞の効力を増大させる薬剤は、
（ｉ）プロテインホスファターゼ阻害剤、
（ｉｉ）キナーゼ阻害剤、
（ｉｉｉ）サイトカイン、
（ｉｖ）免疫阻害分子の阻害剤、または
（ｖ）ＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を低下させる薬剤
のうちの１つまたは複数から選択される。
【０７５２】
別の態様において、本発明は、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質（例えば、本明細書で説明されるようなＣＡＲ分子を含む融合タンパク質）を含む免疫エフェクター細胞（例えば、免疫エフェクター細胞の集団）を含む組成物であって、腫瘍抗原の発現に関連する疾患、例えば、本明細書で説明されるような障害を有する対象の処置に使用するための組成物を特徴とする。
【０７５３】
上述の方法または使用のいずれかについてのある特定の実施形態において、腫瘍抗原、例えば本明細書で説明される腫瘍抗原に関連する疾患は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態、から選択されるか、あるいは本明細書で説明される腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連の徴候である。一実施形態において、疾患は、本明細書で説明されるがん、例えば、本明細書で説明される標的に関連すると本明細書で説明されるがんである。一実施形態において、疾患は、血液がんである。一実施形態において、血液がんは、白血病である。一実施形態において、がんは、これらに限定されないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する、１種または複数の急性白血病；これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する、１種または複数の慢性白血病；これらに限定されないが、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに骨髄血液細胞の産生不良（または異形成）によってまとめられた血液学的状態の多種多様な集合体である「前白血病状態」を包含する、追加の血液がんもしくは血液学的状態からなる群から選択され、本明細書で説明される腫瘍抗原の発現に関連する疾患としては、本明細書で説明されるような腫瘍抗原を発現する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態もしくは増殖性疾患、ならびにそれらのあらゆる組合せが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本明細書で説明される腫瘍抗原に関連する疾患は、固形腫瘍である。
【０７５４】
ある特定の実施形態において、方法または使用は、免疫エフェクター細胞の効力を増大させる薬剤、例えば、本明細書で説明されるような薬剤と組み合わせて行われる。
【０７５５】
上述の方法または使用のいずれかにおいて、腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、腫瘍抗原の発現に関連する増殖性疾患、前がん状態、がんおよび非がん関連の徴候からなる群から選択される。
【０７５６】
がんは、血液がん、例えば.、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型もしくは大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、または前白血病のうちの１つまたは複数から選択されるがんであり得る。
【０７５７】
がんは、また、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸がん、食道がん、黒色腫、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、小児固形腫瘍、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、前記がんの組合せ、および前記がんの転移性病変から選択することもできる。
【０７５８】
本明細書で説明される方法または使用についてのある特定の実施形態において、細胞は、該細胞の効力を増大させる薬剤、例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、サイトカイン、免疫阻害分子の阻害剤のうちの１つ若しくは複数；またはＴＲＥＧ細胞のレベルもしくは活性を低下させる薬剤と、組み合わせて投与される。
【０７５９】
本明細書で説明される方法または使用についてのある特定の実施形態において、プロテインホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤および／またはＳＨＰ−２阻害剤である。
【０７６０】
本明細書で説明される方法または使用についての他の実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）、ＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブもしくはＲＮ−４８６）、ｍＴＯＲ阻害剤［例えば、ラパマイシンもしくはエベロリムス（ＲＡＤ００１）］、ＭＮＫ阻害剤、または二重Ｐ１３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤のうちの１つまたは複数から選択される。一実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン−２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低下または阻害しない。
【０７６１】
本明細書で説明される方法または使用についての他の実施形態において、免疫阻害分子を阻害する薬剤は、阻害分子の発現を阻害する、抗体もしくは抗体フラグメント、阻害核酸、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。
【０７６２】
本明細書で説明される方法または使用についての他の実施形態において、ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる薬剤は、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、またはそれらの組合せから選択される。
【０７６３】
本明細書で説明される方法または使用についてのある特定の実施形態において、免疫阻害分子は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５からなる群から選択される。
【０７６４】
他の実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、阻害分子またはそのフラグメントを含む第一のポリペプチドと、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチドとを含み、前記第一および第二のポリペプチドは、ＣＡＲを含有する免疫細胞上に発現され、この場合、（ｉ）前記第一のポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲベータ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３およびＣＥＡＣＡＭ−５、もしくはそのフラグメントを含み、ならびに／または（ｉｉ）第二のポリペプチドは、一次シグナル伝達ドメインおよび／もしくは共刺激シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的なドメインを含み、ならびに／または共刺激シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ、ＣＤ２７およびＣＤ２８から選択されるタンパク質の機能的なドメインを含む。
【０７６５】
他の実施形態において、サイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８もしくはＩＬ−２１、またはそれらの組合せから選択される。
【０７６６】
他の実施形態において、融合タンパク質を含む免疫エフェクター細胞と第二のもの、例えば、本明細書で開示される併用療法薬のいずれか（例えば、免疫エフェクター細胞の効力を増大させる薬剤）は、実質的に同時にまたは別々に投与される。
【０７６７】
他の実施形態において、融合タンパク質を含む免疫細胞は、ＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態において、ＧＩＴＲを標的とするおよび／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子は、ＣＡＲ発現細胞もしくは細胞集団の前に、またはアフェレーシスの前に投与される。
【０７６８】
一実施形態において、本発明の少なくとも１つのＣＡＲ発現細胞を含むリンパ球輸液、例えば、同種異系リンパ球輸液が、がんの処置に使用される。一実施形態において、本明細書で説明される少なくとも１つのＣＡＲ発現細胞を含む自己リンパ球輸液が、がんの処置に使用される。
【０７６９】
一実施形態において、細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ｄｉａｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ）（ＤＧＫ）欠損である。一実施形態において、細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞は、イカロス欠損である。一実施形態において、細胞はＴ細胞であり、該Ｔ細胞は、ＤＧＫ欠損でもあり、イカロス欠損でもある。
【０７７０】
一実施形態において、方法は、本明細書で説明されるようなＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞を、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤と組み合わせて投与することを包含し、前記薬剤は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、またはそれらの組合せである。サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与と組み合わせて、例えば、その投与と同時に、またはその投与の直後にデリバリーすることができる。あるいは、サイトカインは、ＣＡＲ発現細胞の投与後、長期の期間の後に、例えば、ＣＡＲ発現細胞に対する対象の応答の査定の後にデリバリーすることができる。一実施形態において、サイトカインは、対象に、請求項６１〜８０のいずれかに記載の細胞または細胞集団の投与と同時に投与される（例えば、同じ日に投与される）か、または前記細胞もしくは細胞集団の投与の直後に投与される（例えば、投与の１日、２日、３日、４日、５日、６日もしくは７日後に投与される）。他の実施形態において、サイトカインは、対象に、請求項６１〜８０のいずれかに記載の細胞または細胞集団の投与後の長期の（例えば、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、もしくはそれより長い）期間の後に投与されるか、または細胞に対する前記対象の応答の査定後に投与される。
【０７７１】
他の実施形態において、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する薬剤と組み合わせて投与される。ＣＡＲ発現細胞に関連する副作用は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または血液貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）から選択することができる。
【０７７２】
上述の方法または使用のいずれかについての実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、腫瘍抗原の発現に関連する疾患を処置する薬剤、例えば、本明細書で開示される第二または第三の治療薬のいずれかと組み合わせて投与される。追加の例示的な組合せは、以下のものの１つまたは複数を包含する。
【０７７３】
別の実施形態において、例えば本明細書で説明されるような、ＣＡＲ発現分子を発現する細胞は、別の薬剤、例えば、本明細書で説明されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することができる。ある実施形態において、ＣＡＲ分子を発現する細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現することができる。
【０７７４】
例えば、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、阻害分子（例えば、免疫阻害分子）を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータが挙げられる。
【０７７５】
一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである阻害核酸である。実施形態において、阻害核酸は、ＣＡＲ分子の成分をコードする核酸に連結されている。例えば、阻害分子は、ＣＡＲ発現細胞上に発現され得る。
【０７７６】
別の実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、例えば、本明細書で説明される分子であり、例えば、正のシグナルを細胞に提供する第二のポリペプチド、例えば本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン、と会合している第一のポリペプチド、例えば阻害分子、を含む薬剤である。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４もしくはＴＧＦＲベータなどの阻害分子またはこれらのいずれかについてのフラグメント（例えば、これらのいずれかについての細胞外ドメインの少なくとも一部）の第一のポリペプチドと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン［例えば、共刺激ドメイン（例えば本明細書で説明されるような、例えば４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］である第二のポリペプチドとを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１またはそのフラグメント（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）の第一のポリペプチドと、本明細書で説明される細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書で説明されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／または本明細書で説明されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドとを含む。
【０７７７】
一実施形態において、本発明の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、以前に幹細胞移植、例えば、自己幹細胞移植を受けたことがある対象に投与される。
【０７７８】
一実施形態において、本発明の細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、以前にメルファラン用量を受けたことがある対象に投与される。
【０７７９】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の効力を増大させる薬剤、例えば、本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
【０７８０】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。理論に縛られることは望まないが、免疫を増強する低い用量（例えば、免疫系を完全に抑制するのには不十分だが、免疫機能を向上させるのには十分である用量）での処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加により達成されると考えられる。ＰＤ−１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との会合により疲弊されることもあるが、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞では、そのようなことは起きない。
【０７８１】
ある実施形態において、このアプローチを使用して、対象における本明細書で説明されるＣＡＲ細胞の性能を最適化することができる。理論に縛られることは望まないが、ある実施形態において、内因性の非改変免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の性能が向上されると考えられる。理論に縛られることは望まないが、ある実施形態において、標的抗原ＣＡＲ発現細胞の性能が向上されると考えられる。他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように加工されたまたは加工されることになる細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させる、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触により、エクスビボで処置され得る。
【０７８２】
ある実施形態において、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えばアロステリック阻害剤、例えばＲＡＤ００１、または触媒性阻害剤の投与は、本明細書で説明されるＣＡＲ発現細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の投与の前に開始される。ある実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率が、少なくとも一時的に増加してしまうような、十分な時間の後に、またはｍＴＯＲ阻害剤の十分な投与後に投与される。
【０７８３】
ある実施形態において、ＣＡＲを発現するように加工される細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、対象における、または対象から採取された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベル、またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率が、少なくとも一時的に増加してしまうような、十分な時間の後に、または十分な免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に採取される。
【０７８４】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に関連する１つまたは複数の副作用を改善する薬剤、例えば、本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
【０７８５】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、本明細書で説明されるようながん関連抗原に関連する疾患を処置する薬剤、例えば、本明細書で説明される薬剤と組み合わせて投与される。
【０７８６】
一実施形態において、例えば本明細書で説明されるような、ＣＡＲ分子を含む２つ以上の融合タンパク質を発現する細胞は、がんを処置するためにそれを必要とする対象に投与される。一実施形態において、例えば本明細書で説明されるような、ＣＡＲ発現細胞を含む融合タンパク質を包含する細胞の集団は、がんを処置するためにそれを必要とする対象に投与される。
【０７８７】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、本明細書で説明される用量および／または投与スケジュールで投与される。
【０７８８】
一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質は、例えばインビトロ転写を使用して、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入され、対象（例えば、ヒト）は、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞の初回投与、およびＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞の１回または複数回の後続投与を受け、前記１回または複数回の後続投与は、先行投与後１５日未満、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日未満に行われる。一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞の週に１回より多くの投与が対象（例えば、ヒト）に行われ、例えば、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞の週に２、３、または４回の投与が行われる。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞の週に１回より多くの投与（例えば、週に２、３、または４回の投与）（本明細書ではサイクルとも称される）を受け、続いて１週間にわたり、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞を投与がなく、次いで、ＣＡＲ分子を含む細胞の１回または複数回のさらなる投与（例えば、ＣＡＲ分子を含む細胞の週に１回より多くの投与）が対象に対して行われる。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞の１サイクルより多くを受け、各サイクルの間の期間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日間未満である。一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞は、週に３回の投与のために隔日で投与される。一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を含む細胞は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはそれより長く投与される。
【０７８９】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、疾患、例えばがん、例えば本明細書で説明されるがんのための第一選択の処置として投与される。別の実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を発現する細胞は、疾患、例えばがん、例えば本明細書で説明されるがんのための、第二、三、四選択の処置として投与される。
【０７９０】
一実施形態において、本明細書で説明される細胞の集団が投与される。
【０７９１】
別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるようなキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて医薬品として使用するための、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を発現する細胞と組み合わせて医薬品として使用するための、本明細書で説明されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤に関する。
【０７９２】
別の態様において、本発明は、ＣＡＲの標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置において、本明細書で説明されるようなサイトカイン、例えばＩＬ−７、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２１と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、ＣＡＲの標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるサイトカインに関する。
【０７９３】
別の態様において、本発明は、ＣＡＲの標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置において、本明細書で説明されるようなキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞に関する。別の態様において、本発明は、ＣＡＲの標的とされる腫瘍抗原を発現する疾患の処置において、本明細書で説明されるＣＡＲ分子を含む融合タンパク質を発現する細胞と組み合わせて使用するための、本明細書で説明されるキナーゼ阻害剤および／またはチェックポイント阻害剤に関する。
【０７９４】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質を投与すること、またはＣＡＲ分子、例えば本明細書で説明されるＣＡＲ分子、を含む融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞を投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、対象は、本明細書で説明される障害を有し、例えば、対象は、がんを有し、例えば、対象は、がんを有し、本明細書で説明される腫瘍支持抗原を発現する腫瘍支持細胞を有する。一実施形態において、対象はヒトである。
【０７９５】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、ＣＡＲ分子を含む融合タンパク質は、別の薬剤と組み合わせて投与される。一実施形態において、薬剤は、キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＢＴＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＮＫ阻害剤、または二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、およびそれらの組合せであってもよい。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書で説明されるＣＤＫ４阻害剤、例えば６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン塩酸塩（パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１とも称される）などの、例えばＣＤ４／６阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えばイブルチニブなどの、例えば本明細書で説明されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ−０２７などの、例えば本明細書で説明されるｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、本明細書で説明されるｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤であってもよい。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、例えば４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなどの、本明細書で説明されるＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａおよび／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であってもよい。二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２であってもよい。
【０７９６】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５、２−（２−シクロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル］−４−クロメノン；クリゾチニブ（ＰＦ−０２３４１０６６）；２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−３−ピロリジニル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、塩酸塩（Ｐ２７６−００）；１−メチル−５−［［２−［５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−４−ピリジニル］オキシ］−Ｎ−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−アミン（ＲＡＦ２６５）；インジスラム（Ｅ７０７０）；ロスコビチン（ＣＹＣ２０２）；パルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）；ジナシクリブ（ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）（ＳＣＨ７２７９６５）；Ｎ−［５−［［（５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル）メチル］チオ］チアゾール−２−イル］ピペリジン−４−カルボキサミド（ＢＭＳ  ３８７０３２）；４−［［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−ｄ］［２］ベンゾアゼピン−２−イル］アミノ］−安息香酸（ＭＬＮ８０５４）；５−［３−（４，６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンゾイミダゾール−２−イル）−１Ｈ−インダゾール−５−イル］−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン（ＡＧ−０２４３２２）；４−（２，６−ジクロロベンゾイルアミノ）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸Ｎ−（ピペリジン−４−イル）アミド（ＡＴ７５１９）；４−［２−メチル−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−Ｎ−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−ピリミジンアミン（ＡＺＤ５４３８）；およびＸＬ２８１（ＢＭＳ９０８６６２）から選択される、ＣＤＫ４阻害剤である。
【０７９７】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えばパルボシクリブ（ＰＤ０３３２９９１）であり、パルボシクリブは、約５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ（例えば、７５ｍｇ、１００ｍｇまたは１２５ｍｇ）の用量で、ある期間にわたって毎日、例えば、２８日サイクルの１４〜２１日間、毎日、または２１日サイクルの７〜１２日間、毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ超のサイクルのパルボシクリブが投与される。
【０７９８】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。一実施形態において、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン−２誘導性キナーゼ（ＩＴＫ）のキナーゼ活性を低下または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４、ＲＮ−４８６、ＣＧＩ−５６０、ＣＧＩ−１７６４、ＨＭ−７１２２４、ＣＣ−２９２、ＯＮＯ−４０５９、ＣＮＸ−７７４およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０７９９】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えばイブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）であり、イブルチニブは、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇまたは５６０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたって毎日、例えば、２１日サイクルの間、毎日、または２８日サイクルの間、毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ超のサイクルのイブルチニブが投与される。
【０８００】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＩＴＫのキナーゼ活性を阻害しないＢＴＫ阻害剤、例えばＲＮ−４８６であり、ＲＮ−４８６は、約１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、２１０ｍｇ、２２０ｍｇ、２３０ｍｇ、２４０ｍｇ、２５０ｍｇ（例えば、１５０ｍｇ、２００ｍｇまたは２５０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたって毎日、例えば、２８日サイクルの間、毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７またはそれ超のサイクルのＲＮ−４８６が投与される。
【０８０１】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス、リダホロリムス（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシル・ジメチルホスフィネート、別名ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９；エベロリムス（ＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９）；セマピモド（ｓｉｍａｐｉｍｏｄ）；（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２）；およびＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アルパルチルＬ−セリン−（配列番号９８２）、分子内塩（ＳＦ１１２６）；およびＸＬ７６５から選択される、ｍＴＯＲ阻害剤である。
【０８０２】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンであり、ラパマイシンは、約３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ（例えば、６ｍｇ）の用量で、ある期間にわたって毎日、例えば、２１日サイクルの間、毎日、または２８日サイクルの間、毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ超のサイクルのラパマイシンが投与される。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムスであり、エベロリムスは、約２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ（例えば、１０ｍｇ）の用量で、ある期間にわたって毎日、例えば、２８日サイクルの間、毎日投与される。一実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ超のサイクルのエベロリムスが投与される。
【０８０３】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８、４−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニルアミノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ＣＧＰ５７３８０）、セルコスポラミド、ＥＴＣ−１７８０４４５−２、および４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンから選択される、ＭＮＫ阻害剤である。
【０８０４】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−［ｔｒａｎｓ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ−０４６９１５０２）；Ｎ−［４−［［４−（ジメチルアミノ）−１−ピペリジニル］カルボニル］フェニル］−Ｎ’−［４−（４，６−ジ−４−モルホリニル−１，３，５−トリアジン−２−イル）フェニル］尿素（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）；２−メチル−２−｛４−［３−メチル−２−オキソ−８−（キノリン−３−イル）−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］フェニル｝プロパンニトリル（ＢＥＺ−２３５）；アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）；２，４−ジフルオロ−Ｎ−｛２−（メチルオキシ）−５−［４−（４−ピリダジニル）−６−キノリニル］−３−ピリジニル｝ベンゼンスルホンアミド（ＧＳＫ２１２６４５８）；８−（６−メトキシピリジン−３−イル）−３−メチル−１−（４−（ピペラジン−１−イル）−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２（３Ｈ）−オンマレイン酸（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）；３−［４−（４−モルホリニルピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル］フェノール（ＰＩ−１０３）；５−（９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル）ピリミジン−２−アミン（ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３）；およびＮ−［２−［（３，５−ジメトキシフェニル）アミノ］キノキサリン−３−イル］−４−［（４−メチル−３−メトキシフェニル）カルボニル］アミノフェニルスルホンアミド（ＸＬ７６５）から選択される、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）とｍＴＯＲの二重阻害剤である。
【０８０５】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質を含む細胞は、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、本明細書で説明されるプロテインチロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。一実施形態において、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、例えばスチボグルコン酸ナトリウムなどの、本明細書で説明されるＳＨＰ−１阻害剤である。一実施形態において、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−２阻害剤である。
【０８０６】
本明細書で説明される方法または使用についての一実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質を含む細胞は、別の薬剤と組み合わせて投与され、前記薬剤は、サイトカインである。サイトカインは、例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはそれらの組合せであってもよい。別の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質を含む細胞は、チェックポイント阻害剤、例えば、本明細書で説明されるチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。例えば、一実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦＲベータから選択される阻害分子を阻害する。
【０８０７】
一態様において、本明細書で説明される融合タンパク質は、本明細書で説明されるような腫瘍抗原を発現する正常細胞を除去するために使用することができ、それによって細胞移植前の細胞調整療法（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）としての使用に適用できる。一態様において、本明細書で説明されるような腫瘍抗原を発現する正常細胞は、正常幹細胞であり、細胞移植は、幹細胞移植である。
【０８０８】
自己抗体または同種異系抗体状態の処置方法
本発明は、抗Ｂ細胞改変Ｔ細胞を用いて、自己抗体または同種異系抗体を産生するＢ細胞をはじめとするＢ細胞を標的化することにより、対象の自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法を包含する。一実施形態において、改変Ｔ細胞によるＢ細胞枯渇後に、または改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に、前記改変Ｔ細胞は、前記改変Ｔ細胞に挿入された自殺遺伝子を活性化することにより対象体内で選択的に除去される。
【０８０９】
一態様において、本発明は、それを必要とする対象の自己抗体または同種異系抗体疾患または状態を処置する方法であって、改変Ｔ細胞を含む医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む方法を包含する。改変Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む核酸、及び抗Ｂ細胞結合ドメインと膜貫通ドメインと共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む。
【０８１０】
一部の実施形態において、方法は、改変Ｔ細胞の細胞死を誘導する自殺遺伝子産物を産生するために自殺遺伝子の発現を誘導することをさらに含む。１つのそのような実施形態において、誘導剤の投与は、自殺遺伝子の発現を誘導する。別の実施形態において、自殺遺伝子の発現の誘導は、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮した後、または対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後、行われる。
【０８１１】
別の実施形態において、方法は、改変Ｔ細胞の細胞死を誘導するために、自殺遺伝子の自殺遺伝子産物を活性化することをさらに含む。１つのそのような実施形態において、自殺遺伝子産物を活性化するために、自殺遺伝子産物の二量体化を促進するための活性化剤を投与すること。別の実施形態において、自殺遺伝子産物の活性化は、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮した後、または対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後、または治療効果が達成された後、行われる。
【０８１２】
さらに別の実施形態において、方法は、改変Ｔ細胞の細胞死を阻害するために、自殺遺伝子の発現を阻害することをさらに含む。１つのそのような実施形態において、阻害剤の投与は、自殺遺伝子の発現を阻害する。別の実施形態において、阻害剤の投与は、改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮しているときに継続し、対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後に中止され得る。
【０８１３】
さらに別の実施形態において、方法は、改変Ｔ細胞の細胞死を抑止するために、自殺遺伝子の自殺遺伝子産物の活性化を抑止することを含む。１つのそのような実施形態において、可溶化剤の投与は、自殺遺伝子産物の二量体化を防止して、自殺遺伝子産物の活性化を防止する。別の実施形態において、可溶化剤の投与は、改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮しているときに継続し、対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後、または治療効果が達成された後に中止され得る。
【０８１４】
さらに別の実施形態において、方法は、ＦＫＢＰまたは類似の分子の二量体化ドメインなどの二量体化ドメインに連結されるＣＡＲの二量体化を防止するために可溶化剤を投与することをさらに含む。そのような実施形態において、ＣＡＲ分子は、細胞質または他の内部位置において自発的に凝集し、それによって改変Ｔ細胞の表面へのＣＡＲ分子の提示が防止される。別の実施形態において、可溶化剤の投与は、改変Ｔ細胞の投与と同時に行われ、改変Ｔ細胞がＢ細胞に対して細胞毒性機能を発揮しているときに継続し、対象における改変Ｔ細胞に対する有害反応の開始後、または治療効果が達成された後に中止され得る。
【０８１５】
改変Ｔ細胞は、自己免疫疾患もしくは状態または同種異系抗体疾患もしくは状態によく見られるものなどの免疫応答を抑制するために、動物、好ましくは哺乳動物、さらにいっそう好ましくはヒトに投与することができる。
【０８１６】
加えて、本発明の改変Ｔ細胞は、疾患を処置または緩和するために免疫応答、特に細胞媒介免疫応答の低下または別様の阻害が所望される任意の状態の処置に使用することができる。一態様において、本発明は、対象の自己抗体または同種異系抗体疾患などの状態の処置であって、本明細書で説明される改変Ｔ細胞を含む医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む処置を包含する。
【０８１７】
自己抗体疾患または状態の例としては、水疱性類天疱瘡；後天性表皮水疱症；ｐ２００類天疱瘡；線状ＩｇＡ水疱性皮膚症；他の類天疱瘡群疾患；疱疹状皮膚炎；セリアック病；重症筋無力症；グッドパスチャー症候群；多発性血管炎および他のＡＮＣＡ＋血管炎を伴う肉芽腫症；自己免疫性辺縁系脳炎；抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体脳症；視神経脊髄炎；自己免疫性溶血性貧血；ループスおよび他の結合組織疾患における自己抗体関連終末器官損傷（抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏおよび他の自己抗体に起因する）；グレーブスおよび橋本甲状腺炎；糖尿病における抗インスリン抗体；自己免疫性低血糖における抗インスリン受容体抗体；クリオグロブリン血症；関節リウマチ；多発性硬化症；シェーグレン症候群；皮膚筋炎；慢性特発性蕁麻疹における抗Ｆｃ−イプシロン受容体抗体；肺動脈性高血圧症における抗葉酸受容体抗体、抗内皮受容体または抗アドレナリン受容体抗体；難治性高血圧症；拡張型心筋症；ならびに自己炎症性症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【０８１８】
同種異系抗体疾患または状態の例としては、以下のことに起因する免疫応答が挙げられるが、これら限定されない：臓器移植、輸血ならびにドナー特異的ＨＬＡおよび／もしくはｂ２−ミクログロブリン抗体産生、血液型若しくはＲＨ抗原に対する妊娠時の感作、またはタンパク質補充療法、例えば、Gorzelany, et al. (Sci. Transl. Med., 5(178):178s10, 2013)に収載されている補充タンパク質を包含するがこれらに限定されない、第ＶＩＩＩ因子、α−Ｌ−イズロニダーゼ、ＶＩＩ型コラーゲンなどを用いるタンパク質補充療法。
【０８１９】
一実施形態において、疾患または状態は、天疱瘡である。処置中の天疱瘡患者におけるＢ細胞レパートリーの縦断的分析により、活動性疾患の際に観察されるのと同じ抗Ｄｓｇ  Ｂ細胞クローンを有する天疱瘡患者が再発することが明らかになった。総合的に見て、これらのデータは、汎Ｂ細胞マーカー、例えばＣＤ２０または代替的にＣＤ１９を標的とすることにより全ての抗Ｄｓｇ  Ｂ細胞クローンを除去する単回の、しかし本当に完全な、Ｂ細胞枯渇によって、天疱瘡患者が治癒し得ることを示す。病的クローンは除去されることになり、健常Ｂ細胞レパートリーが再形成されることになり、別の稀な寛容破綻が再発する可能性が低い。
【０８２０】
類推により、この同じアプローチは、任意のＢ細胞または抗体媒介疾患、例えば、輸血または妊娠中の感作、臓器移植を複雑にするドナー特異的ＨＬＡ同種異系抗体、および遺伝性疾患に対するタンパク質補充療法の結果として生じる同種異系抗体によって引き起こされる疾患にも有効であるはずである。たとえ同種異系抗体が、同種異系抗原への再曝露に起因して再発したとしても、一時的にだが完全にＢ細胞（そしてその結果として同種異系抗体）を除去するための断続的な再処置は、これらの疾患において有益であるであろう。
【０８２１】
医薬組成物
本開示の医薬組成物は、任意の融合タンパク質、本明細書で説明されるような、そのような融合タンパク質をコードする核酸、および１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。このような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および同種のもの；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでいてもよい。本開示の組成物は、一態様において、静脈内投与用に製剤化される。
【０８２２】
本開示の医薬組成物は、処置（または予防）すべき疾患に適している方式で投与することができる。投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度といった因子によって決定されることになるが、適切な投薬量を臨床試験により決定してもよい。
【０８２３】
一態様において、本発明は、本明細書で説明されるような方法に使用するために製剤化された医薬組成物であって、自殺遺伝子をコードする核酸と、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体とをコードする核酸を含む改変Ｔ細胞を含む医薬組成物を包含する。
【０８２４】
別の態様において、本発明は、本明細書で説明されるような方法に使用するために製剤化された医薬組成物であって、二量体化ドメインと、抗Ｂ細胞結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードする核酸を含む改変Ｔ細胞を含む医薬組成物を包含する。
【０８２５】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、内毒素、マイコプラスマ、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地の成分、ベクターのパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群より選択される汚染物質を実質的に含まず、例えば、それらのレベルが検出可能ではない。一実施形態において、細菌は、アルカリゲネス・フェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ａ群からなる群より選択される少なくとも１つである。
【０８２６】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が提示される場合、投与しようとする本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を医師が検討することによって決定することができる。本明細書で説明される免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物を、範囲内の全ての整数値を含めて、細胞１０４〜１０９個／ｋｇ体重の投薬量、いくつかの場合において細胞１０５〜１０６個／ｋｇ体重の投薬量で投与してもよいということが一般に言える。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法で一般的によく知られている注入技術を使用することによって投与してもよい（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319:1676, 1988を参照されたい）。
【０８２７】
ある特定の態様において、対象に活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を投与し、その後続いて再度採血し（またはアフェレーシスを行ってしまい）、それからの免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を本発明に従って活性化し、これらの活性化され拡大された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を前記患者に再注入することが望ましいこともある。このプロセスを数週間ごとに複数回実行してもよい。ある特定の態様において、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取された血液から、免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）を活性化することができる。ある特定の態様において、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取された血液から、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化する。
【０８２８】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、埋め込みまたは移植によるものを包含する、いずれの従来の方式で行ってもよい。本明細書で説明される組成物を患者に経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、鼻腔内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により投与、または腹腔内投与してもよい。一態様において、本開示の細胞組成物は、患者に皮内または皮下注射により投与される。一態様において、本開示の細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射により投与される。免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の組成物を、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射してもよい。
【０８２９】
特定の例示的な態様において、白血球がエクスビボで収集、濃縮、または枯渇されるリューカフェレーシスに対象を付して、対象の細胞、例えばＴ細胞を選択および／または単離することができる。これらのＴ細胞単離物を、当業界公知の方法によって拡大させ、本発明の１つまたは複数のＣＡＲコンストラクトを導入することによって本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞を作出することができるように処置することができる。それを必要とする対象は、その後、高用量の化学療法による標準的な処置に続いて末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の態様において、移植後に、または移植と同時に、対象は、本発明の拡大させたＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる態様において、拡大させた細胞は、手術の前または後に投与される。
【０８３０】
患者に投与されることになる上記の処置の投与量は、処置される状態の正確な性質および処置のレシピエントに応じて変ることになる。ヒトへの投与のための投薬量の調整は、当業界の慣例に従って行うことができる。
【実施例１】
【０８３１】
実施例１〜１３の材料および方法
コンストラクト
表２２に示す以下のコンストラクトを実施例１〜１３で使用した。
【０８３２】
本発明は、重鎖の配向と軽鎖の配向の両方を包含するすることに留意されたい。
【０８３３】
【表１５９】
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【表１６０】
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【表１６１】
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【表１６２】
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【表１６３】
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【表１６４】
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【表１６５】
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【表１６６】
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【表１６７】
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【表１６８】
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【表１６９】
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【表１７０】
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【表１７１】
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【表１７２】
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【表１７３】
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【表１７４】
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【表１７５】
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【表１７６】
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【表１７７】
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【表１７８】
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【表１７９】
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【表１８０】
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【表１８１】
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【表１８２】
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【表１８３】
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【表１８４】
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【０８３４】
一般的方法
以下の一般的材料および方法を実施例１〜１３で説明するアッセイに使用した。
【０８３５】
ＣＡＲコンストラクトの生成
実施例３で査定するＣＡＲコンストラクトに使用したｓｃＦｖは、上記で説明した抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ配列に基づいて独立して合成した。ＶＨドメインとＶＬドメインを接続するフレキシブルなリンカー［例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２９）］を有するｓｃＦｖを、４−１ＢＢモジュールおよびＣＤ３ゼータ分子とともにＣＤ８ヒンジ領域を含有するベクター骨格に、重鎖から軽鎖方向にクローニングした。このために、不安定化ドメインに融合したＮ末端フューリン切断部位をｓｃＦｖの上流に付加した。実施例４〜５で査定するフューリン−デグロンコンストラクトに使用したタンパク質は、公的に入手可能な配列データに基づいて独立して合成した。このために、不安定化ドメインに融合したＮ末端フューリン切断部位をタンパク質の上流に付加した。
【０８３６】
細胞株および細胞形質導入
ジャーカット細胞をＡＴＣＣから得て、供給業者の推奨基準に従って培地で維持した。タンパク質−フューリンドメイン調節プラスミドＤＮＡを使用してｐＥＬＰＳをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からのレンチウイルス上清をスピノキュレーションによりジャーカット細胞株に形質導入した。
【０８３７】
がん細胞
ＮＡＬＭ６およびＫ５６２細胞株をＡＴＣＣから得て、供給業者の推奨基準に従って培地で維持した。Ｔ細胞殺滅アッセイのための生物発光モデルを産生するために、全ての細胞にルシフェラーゼレンチウイルスコンストラクトで形質導入し、抗生物質選択下に置いた。
【０８３８】
フローサイトメトリー
細胞をインビトロでの培養物から単離し、０．５％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳで１回洗浄し、ビオチン処理プロテインＬの使用に続く蛍光色素コンジュゲートストレプトアビジン試薬とインキュベーション、または所与の標的抗原を認識する抗体の使用のいずれかにより、氷上で染色した。全ての分析において、前方対側方散乱特性に基づいて対象の集団をゲートし、続いてシングレットをゲートし、そして生細胞をゲートした。４レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーを行った。
【０８３９】
化合物処置
全ての場合、４−ＯＨＴまたはＳｈｉｅｌｄ１のいずれかをエタノールに再懸濁させた。トリメトプリム（ＴＭＰ）をＤＭＳＯに再懸濁させた。濃度を示さない全ての場合、フローサイトメトリーによる分析の前に、合計で２４時間にわたって化合物を添加した。３μＭ  ４−ＯＨＴ（ＥＲα）、１μＭ  Ｓｈｉｅｌｄ１（ＦＫＢＰ）、または１００μＭ  ＴＭＰ（ｅｃＤＨＦＲ）を使用した。
【０８４０】
殺滅アッセイ
簡単に言うと、ルシフェラーゼを形質導入した標的細胞株を、エフェクターＣＤ１９ＣＡＲまたはＣＤ１９ＣＡＲ−ＦｕｒＯＮ  Ｔ細胞とともに、示す比率で、１８時間インキュベートした。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することにより発光リーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で残存ルシフェラーゼ活性を測定した。陰性対照を使用して殺滅率を計算した。
【０８４１】
サイトカイン分泌
１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中でエフェクターおよび標的細胞を３：１比で１８時間インキュベートした。３−Ｐｌｅｘ  Ａｒｒａｙにより、その製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、上清を分析した。
【実施例２】
【０８４２】
フューリンは初代ヒトＴ細胞において最も高度に発現されるプロタンパク質転換酵素である
文献ソースは、フューリン（ＦＵＲ、ＰＡＣＥ、ＰＣＳＫ３、ＳＰＣ１）が広い発現プロファイルを有することを示した［Seidah, et al Nature Reviews Drug Discovery 11, 367-383 (May 2012)］。プロタンパク質転換酵素ファミリーメンバーの発現をｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８活性化ビーズでの刺激後０、４および１１日目に正常ドナーＴ細胞からＲＮＡを採取した。追加の群には培養中に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充し、１１日目にＲＮＡを採取した。これらのデータは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズでの活性化後にフューリンｍＲＮＡがプロタンパク質転換酵素ファミリーの他のメンバーより高度に発現されることを実証する（図１）。
【実施例３】
【０８４３】
化合物添加により制御されるＣＤ１９  ＣＡＲの発現
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したフューリンデグロンドメイン（ＦＫＢＰＦＤ、ＥＲαＦＤ、またはＤＨＦＲＦＤ）をジャーカットＴ細胞に形質導入し、その後、対応する化合物で処置した。ＦＫＢＰＦＤを形質導入した細胞は、１μＭ  Ｓｈｉｅｌｄ１で処置した。ＥＲαＦＤを形質導入した細胞は、１μＭ  バゼドキシフェンで処置した。ＤＨＦＲＦＤを形質導入した細胞は、１ｍＭ  ＴＭＰで処置した。抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶの発現を化合物の存在下で誘導することができる(図２）。黒色＝ＵＴＤ；灰色＝化合物なしのコンストラクト；白色＝化合物ありのコンストラクト。これらのデータは、複数のデグロンドメインが、フューリン切断ドメインと組み合わせられたとき、ＣＡＲ  １９発現の厳重な化合物依存性調節をもたらすことを実証する。
【実施例４】
【０８４４】
化合物添加後のジャーカット細胞におけるＣＡＲ発現の動態
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合した、示されているフューリンデグロンドメイン（ＦＫＢＰＦＤまたはＥＲαＦＤ）を、ジャーカットＴ細胞に形質導入した。これらの細胞を、示されている時間、１μＭ  Ｓｈｉｅｌｄ１または１μＭ  ４−ＯＨＴのいずれかで処置し、ＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。これらのデータは、フューリンデグロンＣＡＲ  １９を使用する発現の誘導が、化合物添加後に迅速に起こり、化合物処置期間を通して安定していることを実証する（図３）。
【実施例５】
【０８４５】
初代ヒトＴ細胞における化合物誘導性ＣＡＲ発現
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαフューリンデグロンドメイン（ＥＲαＦＤドメイン）を初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。１０日目にバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。これらのデータは、フューリンデグロンドメイン（例えば、ＥＲαＦＤドメイン）が、初代ヒトＴ細胞におけるＣＡＲ  １９発現を、化合物依存性の方式で調節することができること（図４）、および安定化がインビトロでＩＬ−２の存在下で増強されること（図４）を実証する。
【実施例６】
【０８４６】
化合物洗浄除去後の初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現の動態
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合した、示されているフューリンデグロンドメイン（ＦＫＢＰＦＤまたはＥＲαＦＤ）を、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。１０日目にバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、十分に洗浄し、示されている時間にわたって培養下に置き、その後、ＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。これらのデータは、化合物の除去が、フューリンデグロンドメインを使用するＣＡＲ  １９発現の低減をもたらすことを実証する（図５）。
【実施例７】
【０８４７】
複数のＥＲ−アルファ標的化薬がＥＲ−アルファＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴを安定化する
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤ分解ドメインをジャーカットＴ細胞に形質導入し、その後、示されている化合物で２４時間処置した。化合物を４−ＯＨＴについては１０μＭで、バゼドキシフェンについては１μＭで、またはラソホキシフェンについては１μＭで使用した。これらのデータは、複数のＥＲアルファ標的化化合物が、エストロゲン受容体に基づくフューリンデグロン（ＦｕｒＯＮ）システムを使用するＣＡＲ  １９発現を誘導することができることを実証する（図６）。
【実施例８】
【０８４８】
ヒトＴ細胞におけるバゼドキシフェンに関する用量応答
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤフューリンデグロンドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている濃度のバゼドキシフェンとともに４８時間、培養下に置いた。ＣＡＲ発現をＦＡＣＳにより判定した。これらのデータは、生理的に適切な濃度のバゼドキシフェンが、親ＣＡＲ  １９と同様であるレベルでフューリンデグロンＣＡＲ１９発現を安定化することができることを実証する（図７）。
【実施例９】
【０８４９】
ＥＲ−アルファＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴによる化合物依存性標的特異的細胞殺滅
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤフューリンデグロンドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている発光処理細胞株標的、Ｋ５６２（ＣＤ１９−）またはＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）とともに２０時間インキュベートした。殺滅率を残存ルシフェラーゼ活性の分析により決定した。これらのデータは、エストロゲン受容体に基づくフューリンデグロンドメインを有するＣＡＲ１９が、化合物依存性でありかつ親ＣＡＲ１９に劣らない方式で、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を特異的に殺滅することを実証する（図８）。
【実施例１０】
【０８５０】
ＦＫＢＰ  ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴによる化合物依存性標的特異的細胞殺滅
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＦＫＢＰＦＤフューリンデグロンドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびＳｈｉｅｌｄ１を添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている発光処理細胞株標的、Ｋ５６２（ＣＤ１９−）またはＮＡＬＭ６（ＣＤ１９＋）とともに２０時間インキュベートした。殺滅率を残存ルシフェラーゼ活性の分析により決定した。これらのデータは、ＦＫＢＰに基づくフューリンデグロンドメインを有するＣＡＲ１９が、化合物依存性でありかつ親ＣＡＲ１９に劣らない方式で、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を特異的に殺滅することを実証する（図９）。
【実施例１１】
【０８５１】
ＥＲ−アルファ  ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴの化合物依存性サイトカイン産生
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤフューリンデグロンドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている細胞株標的とともに２０時間インキュベートした。上清を採取し、サイトカインビーズアレイにより分析した。これらのデータは、エストロゲン受容体に基づくフューリンデグロンドメインを有するＣＡＲ１９が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、化合物依存性でありかつ親ＣＡＲ１９に劣らない方式で、サイトカインを特異的に産生することを実証する（図１０）。
【実施例１２】
【０８５２】
ＥＲ−アルファ  ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴの化合物依存性増殖
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトまたは親ＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトに融合したＥＲαＦＤフューリンデグロンドメインを、初代ヒトＴ細胞に形質導入した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズでの活性化後９日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２およびバゼドキシフェンを添加し、１１日目にＴ細胞を凍結した。Ｔ細胞を融解し、示されている細胞株標的とともに４日間インキュベートした。Ｔ細胞ＦｕｒＯＮ−ＣＡＲの数をＦＡＣＳにより分析した。これらのデータは、エストロゲン受容体に基づくフューリンデグロンドメインを有するＣＡＲ１９が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、化合物依存性でありかつ親ＣＡＲ１９に劣らない方式で、特異的に増殖することを実証する（図１１）。
【実施例１３】
【０８５３】
実施例１４〜２６の材料および方法
以下の一般的材料および方法を実施例１４〜２６で説明するアッセイに使用した。
【０８５４】
ＦｕｒＯｎコンストラクト
一部の実施形態において、本明細書で説明される融合タンパク質は、次の２成分を含むフューリンデグロン（ＦｕｒＯＮ）ドメインを包含する：小分子リガンドの非存在下では適切なコンフォメーションを獲得することができない突然変異したタンパク質ドメインであるデグロンまたは分解ドメイン、およびフューリン切断部位。小胞体において発現される対象のタンパク質にフューリンデグロンドメインを融合させることができる。対象のタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端は、フューリンデグロンドメインが小胞体の内腔に向いていることを条件に、融合部位として使用することができる。対象のタンパク質は、膜タンパク質であってもよく（膜貫通ドメインの数を問わない）、または可溶性タンパク質であってもよい。デグロンドメインに対するフューリン切断部位の配向は、切断の結果としてフューリンデグロンドメインと対象のタンパク質が分離されるような配向であるべきである。小分子リガンドまたは安定化化合物の非存在下では、フューリンデグロンドメインは、融合タンパク質全体の不安定化または分解をもたらす。小分子リガンドまたは安定化化合物の存在下では、フューリンタンパク質は、分解を免れる。フューリンデグロンドメインを、その天然内因性リガンドへの親和性が消失されるように、小分子リガンドまたは安定化化合物への親和性が保存されるように、および小分子が非存在である場合、タンパク質不安定性が付与されるように、突然変異させる。
【０８５５】
フューリンデグロンドメイン内に異なる突然変異および異なるフューリン切断部位を含むいくつかのコンストラクトを作出し、抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ  ＣＡＲまたは抗ＣＤ１２３  ｓｃＦｖ  ＣＡＲのＮ末端に融合させた。ｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の配向に関係なく、フューリンデグロンドメインの融合がシグナルペプチドリーダーとｓｃＦｖ間で起こる。フューリンデグロンドメイン内の選択された突然変異タンパク質は、エストロゲン受容体アルファのトランケートされたバージョンであった。フューリンデグロンドメインを安定化するために選んだ小分子リガンドは、選択的エステロゲン受容体モジュレーターまたはダウンレギュレーターのファミリーに属する。
【０８５６】
ＣＡＲ構造を不安定化または安定化する点でのフューリンデグロンドメインの効力を、小分子リガンドの非存在または存在下で評定した。フューリンデグロンドメインを融合させたときのＣＡＲＴ細胞エフェクター機能の作用強度も小分子リガンドの非存在下または存在下で評価し、親ＣＡＲ１９コンストラクトと比較した。同じドナーＴ細胞拡大からの非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を加えたＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に細胞を正規化した。次いで、正規化された集団を共培養アッセイに使用して、ＣＡＲ媒介細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を測定した。
【０８５７】
ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲコンストラクトの生成
実施例で査定するＣＡＲコンストラクトに使用するｓｃＦｖは、上記で説明した抗ＣＤ１９または抗ＣＤ１２３  ｓｃＦｖ配列に基づいて独立して合成した。ＶＨドメインとＶＬドメインを接続するフレキシブルなリンカー（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、配列番号２９）を有するｓｃＦｖを、４−１ＢＢモジュールおよびＣＤ３ゼータ分子とともにＣＤ８ヒンジ領域を含有するベクター骨格に、軽鎖から重鎖方向に（抗ＣＤ１９）または重鎖から軽鎖方向に（抗ＣＤ１２３）クローニングした。このために、不安定化ドメインに融合したＮ末端フューリン切断部位をｓｃＦｖの上流に付加した。全てのコンストラクトをレンチウイルスベクター内に生成する。様々なＦｕｒＯＮ  ＣＡＲコンストラクトおよびそれらの成分の配列を表２３において提供する。
【０８５８】
【表１８５】
2019518424.tif 000188
【表１８６】
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【表１８７】
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【表１８８】
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【表１８９】
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【表１９０】
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【表１９１】
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【表１９２】
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【表１９３】
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【表１９４】
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【表１９５】
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【表１９６】
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【表１９７】
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【表１９８】
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【表１９９】
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【表２００】
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【表２０１】
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【表２０２】
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【表２０３】
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【表２０４】
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【表２０５】
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【表２０６】
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【表２０７】
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【表２０８】
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【表２０９】
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【表２１０】
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【表２１１】
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【表２１２】
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【表２１３】
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【表２１４】
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【表２１５】
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【表２１６】
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【表２１７】
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【表２１８】
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【０８５９】
細胞株および細胞形質導入
ジャーカット細胞をＡＴＣＣから得て、供給業者の推奨基準に従って培地で維持した。様々なプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からのレンチウイルス上清をスピノキュレーションによってジャーカット細胞株に形質導入した。
【０８６０】
がん細胞
ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、Ｍｏｌｍ１３細胞株をＡＴＣＣから得て、供給業者の推奨基準に従って培地で維持した。Ｔ細胞殺滅アッセイのための生物発光モデルを産生するために、全ての細胞にルシフェラーゼレンチウイルスコンストラクトで形質導入し、抗生物質選択下に置いた。
【０８６１】
化合物処置
４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）をエタノールに再懸濁させた。バゼドキシフェンおよびラロキシフェンをＤＭＳＯに再懸濁させた。濃度を示さない全ての場合、フローサイトメトリーによる分析の前に、２４時間にわたって１ｕＭの化合物を添加した。
【０８６２】
フローサイトメトリー
細胞をインビトロでの培養物から単離し、０．５％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳで１回洗浄し、ビオチン処理プロテインＬの使用に続く蛍光色素コンジュゲートストレプトアビジン試薬とのインキュベーション、または所与の標的抗原を認識する抗体の使用のいずれかにより、氷上で染色した。全ての分析において、前方対側方散乱特性に基づいて対象の集団をゲートし、続いてシングレットをゲートし、そして生細胞をゲートした。４レーザーＦｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメトリーを行った。
【０８６３】
腫瘍殺滅アッセイ
簡単に言うと、ルシフェラーゼを形質導入した標的細胞株を、バゼドキシフェンの存在または非存在下でエフェクターＣＤ１９ＣＡＲ、ＦｕｒＯＮ−ＣＤ１９ＣＡＲ、ＣＤ１２３ＣＡＲ、ＦｕｒＯＮ−ＣＤ１２３  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に、示されている比率で２０時間、共培養した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することにより発光リーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ）で残存ルシフェラーゼ活性を測定した。陰性対照を使用して殺滅率を計算した。
【０８６４】
サイトカイン分泌
１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中でエフェクターおよびルシフェラーゼ形質導入標的細胞株を３：１比で２０時間、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。３−Ｐｌｅｘ  Ａｒｒａｙにより、その製造業者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、上清を分析した。
【０８６５】
増殖アッセイ
エフェクターおよび被照射標的細胞を４日間、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。次いで、細胞を採取し、洗浄し、抗ＣＤ３抗体および／またはプロテインＬ試薬で染色してＣＡＲ表面発現を検出した。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。固定容量のＡｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを各サンプルに添加する。サンプルをＦｏｒｔｅｓｓａ  ＦＡＣＳ分析装置にかけ、全てのサンプルについてＣｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓゲート内の同数の事象を収集した。
【実施例１４】
【０８６６】
ＣＡＲ１９に関してのフューリンデグロンドメイン内の異なるフューリン切断部位（抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ  ＣＡＲ）の評価
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲに融合した、先行してＴ７プロモーターがあるフューリンデグロンドメインを含む、遺伝子フラグメントを、インビトロで転写／翻訳に付した。遺伝子フラグメント間の差異は、注釈を施した通り作出したフューリン切断部位に存する。インビトロで合成したタンパク質を示されている通りのフューリンとともに３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを還元ＳＤＳ−ＰＧＡＥゲル上に負荷し、抗ＣＤ３ζ抗体を使用して免疫ブロッティングにより分析した。
【０８６７】
図１２Ａ〜１２Ｂは、ＣＡＲ１９に関して試験した様々なフューリン切断部位にわたってのフューリン切断度を示す。試験したフューリン切断部位は、＃１０５  −  ＬＱＷＬＥＱＱＶＡＫＲＲＴＫＲ（配列番号１２９）、＃１０６  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＤＶＧ（配列番号１２５）、＃１０７  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧＧ（配列番号１３１）、＃１０８  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲＳＬＧ（配列番号１３３）、＃１０２  −  ＳＬＮＬＴＥＳＨＮＳＲＫＫＲ（配列番号１３５）、＃１０３  −  ＧＴＧＡＥＤＰＲＰＳＲＫＲＲ（配列番号１２７）、＃１０４  −  ＣＫＩＮＧＹＰＫＲＧＲＫＲＲ（配列番号１３７）、＃７３  −  ＲＴＫＲ（配列番号１２３）である。親ＣＡＲ１９由来の遺伝子フラグメントを対照（Ｃｔｒｌ）として使用し、切断は観察されなかった（図１２Ａ〜１２Ｂ）。
【実施例１５】
【０８６８】
初代ヒトＴ細胞における化合物誘導性ＣＡＲ発現
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクト(コンストラクト＃１０６）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）および親ＣＡＲ１９を対照として使用した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェン（ＢＺＡ）を８日目に添加した。１０日目に、細胞を凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定した。細胞数、サイズおよび生存率も査定した。
【０８６９】
データは、ＣＡＲのＭＦＩ（平均蛍光強度）が親ＣＡＲコンストラクトと比較して低いことから、フューリンデグロンドメインが、ヒト初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ１９発現を、安定化化合物依存性の方式で調節することを実証した（図１３）。また、フューリンデグロンドメインは、細胞生存率および細胞増殖に影響を与えなかった（図１３）。
【実施例１６】
【０８７０】
化合物依存性ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ媒介腫瘍殺滅
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（コンストラクト＃１０６）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１９コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大する。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェンを８日目に添加した（サンプルＣＤ１９ＣＡＲ＋およびＦｕｒＯＮ  １０６＋）かまたは入れなかった（サンプルＣＤ１９ＣＡＲおよびＦｕｒＯＮ  １０６）。細胞を１０日目に凍結した。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株（ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６細胞またはＣＤ１９−Ｋ５６２細胞）およびバゼドキシフェンとともに、２０時間、共培養した。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。パーセント腫瘍溶解を、残存ルシフェラーゼ活性の分析により決定した。
【０８７１】
これらのデータは、フューリンデグロンドメインを有するＣＡＲ１９が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞を、安定化化合物用量依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式で、殺滅することを実証した（図１４）。
【実施例１７】
【０８７２】
ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲによる化合物依存性および腫瘍依存性サイトカイン分泌
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（コンストラクト１０６）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１９コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェン（ＢＡＺ）を８日目に添加した（サンプルＣＤ１９ＣＡＲ＋ＢＡＺおよびＦｕｒＯＮ  １０６＋ＢＡＺ）かまたは入れなかった（サンプルＣＤ１９ＣＡＲおよびＦｕｒＯＮ  １０６）。細胞を１０日目に凍結した。Ｔ細胞を融解し、発光処理ＮＡＬＭ６、ＣＤ１９＋標的細胞株とともに２０時間、および示されている通りのバゼドキシフェンとともに、共培養した。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。上清を採取し、ＩＦＮγのレベルについて評価した。
【０８７３】
これらのデータは、ＥＲα  ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現する初代ヒトＴ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物用量依存性でありかつ親ＣＡＲ１９コンストラクトに劣らない方式で、ＩＦＮγを分泌することを実証した(図１５）。
【実施例１８】
【０８７４】
ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲの化合物依存性および腫瘍依存性増殖
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（コンストラクト１０６）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１９コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェン（Ｂａｚ）を８日目に添加した（サンプルＣＤ１９ＣＡＲ＋ＢＡＺおよびＦｕｒＯＮ  １０６＋ＢＡＺ）かまたは入れなかった（サンプルＣＤ１９ＣＡＲおよびＦｕｒＯＮ  １０６）。細胞を１０日目に凍結した。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株（ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６細胞またはＣＤ１９−Ｋ５６２細胞）およびバゼドキシフェンとともに共培養した。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。４日後、サンプルをＦＡＣＳにより分析し、全てのサンプルについてカウントビーズゲート内の３０００事象を収集した。
【０８７５】
これらのデータは、ＥＲα  ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現する初代ヒトＴ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲ１９コンストラクトに劣らない方式で、増殖することを実証した(図１６）。
【実施例１９】
【０８７６】
ジャーカットＴ細胞における化合物誘導性ＣＡＲ発現
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合した２つのフューリンデグロンドメインのうちの一方をジャーカットＴ細胞に形質導入した。２つのコンストラクトは、同じフューリン切断配列を共有するが、分解ドメインの突然変異数が異なる（表２３に示したＥＲｍｕｔ１またはＥＲｍｕｔ２）。突然変異が多いほうのコンストラクトがＦｕｒＯＮＣＡＲＴ１９＃１０６（ＥＲｍｕｔ１を有する）であり、突然変異が少ないほうのコンストラクトがＦｕｒＯＮＣＡＲＴ１９＃１３０（ＥＲｍｕｔ２を有する）であった。形質導入細胞を、示されている濃度の４−ＯＨタモキシフェン、バゼドキシフェンまたはラロキシフェンとともに４２時間インキュベートした。抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖの発現を、プロテインＬを使用してＦＡＣＳにより判定した。
【０８７７】
これらのデータは、試験したフューリンデグロンドメインが、安定化化合物依存性の方式で、突然変異の数に関係なく、ＣＡＲ１９発現を調節することができること、およびＣＡＲ表面発現が、化合物の非存在下で検出されないことを実証した（図１７）。
【実施例２０】
【０８７８】
ヒト初代Ｔ細胞における化合物誘導性ＣＡＲ発現
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクト(コンストラクト＃１３０）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）および親ＣＡＲ１９を対照として使用した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。７日目に１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を添加し、または入れず、８日目にバゼドキシフェン（ＢＺＡ）を添加した。１０日目に、細胞の凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定した。
【０８７９】
これらのデータは、ＦｕｒＯＮドメイン−デグロンドメインに限定数の突然変異を含む−が、安定化化合物依存性およびＩＬ−２依存性の方式でヒト初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ１９発現を調節することを実証した（図１８）。また、ＦｕｒＯＮ部分がＣＡＲ１９に融合されているとき、安定化化合物バゼドキシフェンの非存在下で表面ＣＡＲ発現は検出されない（図１８）。
【実施例２１】
【０８８０】
化合物依存性ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ媒介腫瘍殺滅
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクト(コンストラクト＃１３０）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１９コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加した。バゼドキシフェン（ＢＺＡ）を８日目にＦｕｒＯＮ  １３０  ＢＺＡサンプルの画分に添加したため、１０日目に、細胞を凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定することができる。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株（ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６細胞またはＣＤ１９−Ｋ５６２細胞）とともに２０時間、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。図１９Ａ〜１９Ｂのｘ軸に示されているような異なる比率のＣＡＲＴ（「エフェクター」）と標的細胞を使用する。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。パーセント腫瘍溶解を、残存ルシフェラーゼ活性の分析により決定した。
【０８８１】
これらのデータは、ＦｕｒＯＮ  ＣＤ１９を発現するＣＡＲＴ細胞が、デグロンドメインに限定数の突然変異を含むＣＤ１９＋腫瘍細胞を、安定化化合物依存性および標的依存性の方式で殺滅し、親ＣＡＲコンストラクトに劣らないことを実証した（図１９Ａ〜１９Ｂ）。
【実施例２２】
【０８８２】
ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲによる化合物依存性および腫瘍依存性サイトカイン分泌
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクト(コンストラクト＃１３０）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１９コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加した。バゼドキシフェン（ＢＺＡ）を８日目にＦｕｒＯＮ  １３０  ＢＺＡサンプルの画分に添加したため、１０日目に、細胞を凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定することができる。細胞を１０日目に凍結した。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株（ＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６細胞）とともに２０時間、５：１のエフェクター：標的比で、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。上清を採取し、ＩＦＮγのレベルについて評価した。
【０８８３】
これらのデータは、限定数の突然変異をデグロンドメインに含む、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を発現するＣＡＲＴ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式で、サイトカインを分泌することを実証した（図２０）。
【実施例２３】
【０８８４】
化合物依存性および腫瘍依存性Ｔ細胞増殖
抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ（コンストラクト＃１３０）に融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１９コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加した。バゼドキシフェンを８日目にＦｕｒＯＮ  １３０  ＢＺＡサンプルの画分に添加したため、１０日目に、細胞を凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定することができる。細胞を１０日目に凍結した。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株とともに４日間、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。４日後、サンプルをＦＡＣＳにより分析した。全てのサンプルについてカウントビーズゲート内の３０００事象を収集する。
【０８８５】
これらのデータは、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９を含むＣＤ３＋Ｔ細胞が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式で、増殖することを実証した(図２１）。
【実施例２４】
【０８８６】
初代ヒトＴ細胞における化合物誘導性ＣＡＲ１２３発現
抗ＣＤ１２３  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）および親ＣＡＲ１２３を対照として使用した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェン（ＢＺＡ）を８日目に添加した（Ｆｕｒｏｎ１２３＋ＢＺＡ）かまたは入れなかった（Ｆｕｒｏｎ  １２３）。１０日目に、細胞を凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定した。
【０８８７】
これらのデータは、ＦｕｒＯＮドメインが、初代ヒトＴ細胞において安定化化合物依存性の方式でＣＡＲ１２３発現を調節することを実証した（図２２）。
【実施例２５】
【０８８８】
化合物依存性ＣＡＲ１２３媒介腫瘍殺滅
抗ＣＤ１２３  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトに融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１２３コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェン（ＢＺＡ）を８日目に添加した（ＦｕｒＯＮ１２３＋ＢＺＡ）かまたは入れなかった（ＦｕｒＯＮ１２３）。１０日目に、細胞の凍結凝固させる前に、プロテインＬ染色を使用してＦＡＣＳによりＣＡＲ発現を判定した。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株とともに２０時間、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。Ｍｏｌｍ１３は、ＣＤ１２３＋細胞株であり、Ｋ５６２細胞においてＣＤ１２３＋の非常に低度の発現が観察された。図２５のｘ軸（Ｅ：Ｔ比）に示されているような異なる比率のＣＡＲＴと標的細胞を使用した。ＣＡＲＴ細胞をＣＡＲ発現細胞の同じ百分率に正規化した。パーセント腫瘍溶解を、残存ルシフェラーゼ活性の分析により決定した。
【０８８９】
これらのデータは、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１２３を発現するＣＡＲＴ細胞が、安定化化合物依存性および標的依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式で、ＣＤ１２３＋腫瘍細胞を殺滅することを実証した（図２３）。
【実施例２６】
【０８９０】
ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１２３による化合物依存性および腫瘍依存性ＩＦＮ−γサイトカイン分泌
抗ＣＤ１２３  ｓｃＦｖ  ＣＡＲに融合したフューリンデグロンドメインを初代ヒトＴ細胞に形質導入した。非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を対照として使用した。親ＣＡＲ１２３コンストラクトを完全ＣＡＲ機能活性のベンチマークとして包含した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激ビーズの存在下で１０日間拡大した。１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を７日目に添加し、バゼドキシフェン（ＢＺＡ）を８日目に添加した（ＦｕｒＯＮ１２３＋ＢＺＡ）、または入れなかった（ＦｕｒＯＮ１２３）。細胞を１０日目に凍結した。Ｔ細胞を融解し、発光処理標的細胞株とともに２０時間、５：１のエフェクター対標的比で、バゼドキシフェンの存在または非存在下で共培養した。Ｍｏｌｍ１３は、ＣＤ１２３＋細胞株であり、ＣＤ１２３＋の非常に低度の発現がＫ５６２細胞において観察された。上清を採取し、ＩＦＮγのレベルについて評価した。
【０８９１】
これらのデータは、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１２３を発現するＣＡＲＴ細胞が、ＣＤ１２３＋腫瘍細胞の存在下で、安定化化合物依存性でありかつ親ＣＡＲコンストラクトに劣らない方式で、サイトカインを分泌することを実証した（図２４）。
【実施例２７】
【０８９２】
ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９は動物モデルにおいてバゼドキシフェンを投与したときにのみＣＤ１９＋腫瘍細胞に対して有効である
細胞株
ＮＡＬＭ６（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００９２）は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が１９７６年に再発した１９歳男性の末梢血に由来するヒト白血病細胞株である。１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＭＰＩ培地で細胞を成長させた。この細胞株は、組織培養フラスコ内で浮遊状態で成長する。この細胞株は、マウスの静脈内に埋め込んだとき、存続し、拡大する。ＮＡＬＭ６細胞は、ルシフェラーゼを発現するように改変されており、したがって、マウスをイメージングすることにより腫瘍細胞の成長をモニターすることもできる。
【０８９３】
マウス
６週齢ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから受け取った。動物を実験前に少なくとも３日間、ＮＩＢＲ動物施設で馴化させた。動物をＮｏｖａｒｔｉｓ  ＡＣＵＣ規則およびガイドラインに従って取り扱った。動物の識別のための電子トランスポンダーを腫瘍埋め込みの前日に左側腹部に埋め込んだ。
【０８９４】
腫瘍埋め込み
対数成長期のＮＡＬＭ６細胞を採取し、５０ｍｌファルコンチューブ内で、１２００ｒｐｍで５分間、増成長培地で１回、冷滅菌ＰＢＳで２回、洗浄した。細胞をＰＢＳに１ｍｌ当り５ｘ１０６個の濃度で再懸濁させ、氷上に置き、直ちにマウス注射した。２００ｕｌの腫瘍細胞を尾静脈経由で静脈内注射した。ＮＡＬＭ６モデルは、ＣＤ１９を内因性発現するので、ＣＤ１９指向性ＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボでの効力を試験するために使用することができる。このモデルは、マウスの静脈内に埋め込まれたときによく成長し、腫瘍量測定のためにイメージングすることができる。
【０８９５】
インビボ研究のためのＣＡＲＴ１９およびＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９細胞の調製
Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の陰性選択によりナイーブＴ細胞を得るアフェレーシスを受けた正常ドナーからの血液を用いて開始することにより、ＣＡＲＴ細胞を生成した。これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、Ｔ細胞培地［ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓおよび５５μＭ  ２−メルカプトエタノール］中、１：３（Ｔ細胞対ビーズ）の比でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより活性化した。Ｔ細胞を、２４ウェルプレートの１ウェル当り１ｍＬの培地中、Ｔ細胞（ＵＴＤ）４×１０６個または５×１０６個（ＣＡＲＴ１９およびＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９）で培養した。２４時間後、Ｔ細胞が芽球化しているときに、０．５ｍＬの非濃縮ウイルス上清、またはより少容量の濃縮ウイルス上清を添加し、Ｔ細胞に５の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。Ｔ細胞は、対数成長パターンで分裂し始めた。それを、１ｍＬ当りの細胞数を測定することによりモニターし、Ｔ細胞を２日ごとに新鮮な培地で希釈する。７日目に１００Ｕ／ｍｌのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）および１ｕＭ  バゼドキシフェンを培養物に添加する。９日目に１ｕＭ  バゼドキシフェンを添加する。１０日目に細胞を収集し、形質導入された（細胞表面にＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現する）細胞の百分率をＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）でのフローサイトメトリー分析により決定した。ウイルス形質導入は、同様の形質導入効率を示し、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ１９の表面発現（平均蛍光強度、ＭＦＩ）は、ＣＡＲＴ１９について観察されたものより低い。全てのＣＡＲ  Ｔ細胞を研究グレード（すなわち、非臨床グレード）製造条件で産生した。
【０８９６】
ＣＡＲＴ１９またはＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９細胞での処置
ルシフェラーゼを発現するＣＤ１９＋ＮＡＬＭ６腫瘍細胞をＮＳＧマウスに注入した。７日後、腫瘍量を全身の生物発光により測定し、動物を処置群（１群当り５匹）に無作為に割り付け、ＰＢＳ（溶媒）、ＣＡＲＴ１９（ＣＡＲ＋Ｔ細胞１ｘ１０６個もしくは５ｘ１０６個）、ＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９細胞（ＣＡＲ＋Ｔ細胞５ｘ１０６個）、または非形質導入Ｔ細胞（ＵＴＤ）を側方尾静脈経由で静脈内注入した。全ての動物に同じ用量の全Ｔ細胞（１６．４ｘ１０６個／マウス）を投与した。一部の処置群には、線により示されている通りに、バゼドキシフェン（ＢＺＡ）、バゼドキシフェン＋インターロイキン２（ＢＺＡ／ＩＬ２）、または溶媒を投与した。ＢＺＡは、１０日間投与した（単回用量２００ｍｇ／ｋｇ；ｐ．ｏ．）。ＩＬ２は、５日間投与し、２日間休薬し、再び３日間投与した（単回用量１８ｘ１０６ＩＵ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）。腫瘍成長および動物の健康状態を経時的にモニターした。全ての処置群の平均生物発光を図２７にプロットする。矢印は、ＢＺＡおよびＩＬ２の投与を中止したときを示す。
【０８９７】
結果
図４７に示されているように、陰性対照マウス、およびＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９のみで処置したマウスでは腫瘍が進行したが、ＣＡＲＴ１９を注入したマウス、またはＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９を注入し、ＢＺＡ単独でまたはＢＺＡとＩＬ２の両方で処置したマウスでは、腫瘍成長が阻害された。バゼドキシフェンおよびＩＬ２の投与を中止すると、最高用量での構成的に活性なＣＡＲＴ１９のみが、腫瘍成長を制御することができた。ＢＺＡは同じ用量および投薬レジメンでＮＡＬＭ６腫瘍細胞の成長に対して効果がないことを以前に示した（データを示さない）。したがって、バゼドキシフェンの存在下でのＦｕｒＯＮ  ＣＡＲＴ１９は、陽性対照ＣＡＲＴ１９と同等の腫瘍阻害活性を示す。
【実施例２８】
【０８９８】
追加のＦｕｒＯＮ  ＣＡＲ配列
【０８９９】
【表２１９】
2019518424.tif 000222
【表２２０】
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【表２２１】
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【表２２２】
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【表２２３】
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【表２２４】
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【表２２５】
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【表２２６】
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【表２２７】
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【表２２８】
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【表２２９】
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【表２３０】
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【表２３１】
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【表２３２】
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【表２３３】
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【表２３４】
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【表２３５】
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【表２３６】
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【表２３７】
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【表２３８】
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【表２３９】
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【表２４０】
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【表２４１】
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【表２４２】
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【表２４３】
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【表２４４】
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【表２４５】
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【表２４６】
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【表２４７】
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【表２４８】
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【表２４９】
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【表２５０】
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【表２５１】
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【表２５２】
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【表２５３】
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【表２５４】
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【表２５５】
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【表２５６】
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【表２５７】
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【表２５８】
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【表２５９】
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【表２６０】
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【表２６１】
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【表２６２】
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【表２６３】
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【表２６４】
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【表２６５】
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【表２６６】
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【表２６７】
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【表２６８】
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【表２６９】
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【表２７０】
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【表２７１】
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【表２７２】
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【表２７３】
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【表２７４】
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【表２７５】
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【表２７６】
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【表２７７】
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【表２７８】
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【表２７９】
2019518424.tif 000282
【表２８０】
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【表２８１】
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【表２８２】
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【表２８３】
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【表２８４】
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【表２８５】
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【表２８６】
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【表２８７】
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【表２８８】
2019518424.tif 000291
【実施例２９】
【０９００】
一時的に制御される全Ｂ細胞枯渇。
これらの実験で利用した材料および方法を次に説明する。
【０９０１】
自殺遺伝子を包含するＣＡＲコンストラクトの構築。ＦＭＣ６３（抗ＣＤ１９）短鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用するコンストラクトは、以下のようにカスパーゼ−９発現を改変した前述のベクター（ヒトＥＦ１アルファプロモーターを有するｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ｇｅｎｅ−ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ−ＷＰＲＥ）を使用した。
【０９０２】
１．ＦＭＣ６３−ｂｂｚ  ＣＡＲの３’での誘導性カスパーゼ９の発現のために、膜貫通ドメインおよび細胞質側テールをＥｃｏＲＶおよびＳａＩＩでの消化により除去し、同じ膜貫通ドメインおよび細胞質側テール、続いて２Ａ部位およびＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖ、続いて短いＧＳリンカーそしてカスパーゼ９プロ分子ドメインをコードする、遺伝子ブロック（ＩＤＴ）で置き換えた。
【０９０３】
２．ＦＭＣ６３−ｂｂｚ  ＣＡＲの５’での誘導性カスパーゼ９の発現のために、シグナルペプチドとＦＭＣ６３  ＳｃＦｖの一部とをＸｂａＩおよびＴｔｈ１１１Ｉでの消化により除去し、１．で説明したのと同じ誘導性カスパーゼ-９ドメイン、続いて２Ａ部位、そして元のプラスミドの前に除去した部分をコードする配列をコードする、遺伝子ブロック（ＩＤＴ）で置き換えた。
【０９０４】
３．ＦＭＣ６３−ｂｂｚ  ＣＡＲの３’での可逆的カスパーゼ９の発現のために、膜貫通ドメインおよび細胞質側テールをＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩでの消化により除去し、同じ膜貫通ドメインおよび細胞質側テール、続いて２Ａ部位および２反復のＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｍ、続いて短いＧＳリンカー（ＳＧＧＧＳ、配列番号３０３６）そしてカスパーゼ９プロ分子ドメインをコードする、遺伝子ブロック（ｇｅｎｅａｒｔ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で置き換えた。
【０９０５】
４．抗ヒトＣＤ２０  ＳｃＦｖの発現のために、ＦＭＣ６３  ＳｃＦｖおよびＣＤ８ヒンジを１〜３で説明したコンストラクトから除去し、ベルツズマブのアミノ酸配列をコードするコドン最適化遺伝子ブロック（ＩＤＴ）で置き換えた。
【０９０６】
条件的凝集ドメインを包含するＣＡＲコンストラクトの構築。ＦＭＣ６３−ｂｂｚ  ＣＡＲの５’での条件的凝集ドメインの発現のために、ＢａｍＨＩを用いてプラスミドをシグナルペプチドとＳｃＦｖの間で切断し、４反復のＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｍ、続いてフューリン認識配列をコードする遺伝子ブロック（ｇｅｎｅａｒｔ）をシグナルペプチドとＳｃＦｖの間に挿入した。
【０９０７】
レンチウイルス産生。第４世代パッケージグシステムを使用して、ＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルス粒子を産生した。９０％コンフルエンスの２９３Ｔ細胞に、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との複合体の状態の、ｐＲＲＬＳＩＮ．ｃＰＰＴ．ＥＦ１α−ｇｅｎｅ−ｏｆ  −ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＷＰＲＥと、エンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５２）と、パッケージングプラスミドｐＲＳＶＲｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５３）およびｐＭＤＬｇｍ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃１２２５１）との混合物をトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する上清を２４および４８時間後に採取し、０．４マイクロメートルＰＥＳ膜に通して濾過し、１２，０００ｘｇで１２時間、４℃で濃縮し、−８０℃で保管した。
【０９０８】
初代ヒトＴ細胞の刺激および拡大。初代ヒトＴ細胞をＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で培養した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、バルクＴ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を、３：１のビーズ：細胞比で刺激した。培養培地に１００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン２を補充した。刺激の２４時間後、Ｔ細胞１０６個に、様々なＣＡＲコンストラクトもしくは対照コンストラクトをコードするレンチウイルス粒子で形質導入したか、またはモックトランスフェクトした。Ｔ細胞の拡大を８〜１２日間、細胞容量および濃度の測定（Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりモニターした。ヒトまたはマウス重鎖および軽鎖に対するポリクローナル抗体を用いて、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＬＳＲＩＩ）により、ＣＡＲコンストラクトの細胞表面発現を検証した。ＣＡＲ染色を２５分間、室温で行った。全ての染色手順を飽和条件下で行った。一部の実験については、形質導入Ｔ細胞を９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ中で事前に凍結した。刺激後、細胞が休止状態（すなわち、＜４５０ｆｌの容量）であるときに、実験を行った。
【０９０９】
インビトロでの細胞毒性およびサイトカインアッセイ。Ｎａｌｍ−６細胞のインビトロでの殺滅を、５１Ｃｒ放出アッセイで試験した。標的細胞５ｘ１０５個に、５０□ＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を９０〜１２０分間、負荷し、２回洗浄し、５％ＦＢＳを含有する、フェノールレッド不含の培地に再懸濁させた。ＣＡＲ、対照ＣＡＲ、またはモックトランスフェクトＴ細胞（最初の活性化の８〜１０日後）と負荷した標的細胞とを４時間、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でコインキュベートし、上清へのクロムの放出をＭｉｃｒｏＢｅｔａ２プレートカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。標的細胞による（エフェクター細胞なしでの）自然放出を同じ容量で分析し、最終濃度５％のＳＤＳで標的細胞を溶解することにより最大放出を査定した。パーセント比溶解＝［（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］＊１００。全ての実験を、少なくとも３反復で行った。
【０９１０】
ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の除去。ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞を、示されている濃度のＡＰ２０１８７の存在下で１６時間、３７℃でインキュベートした。死細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤバイオレット色素で検出し、フローサイトメトリーにより定量した。
【０９１１】
ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで生物学的効力を保持する。マウスを２日間、６００ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．の用量のＩＶＩＧ（Ｐｒｉｖｉｇｅｎ、ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）で前処置して、単球および好中球上のＦｃ□Ｒｓをブロックした。次いで、生物発光検出を可能にするために、コメツキムシルシフェラーゼを発現するＣＤ１９＋Ｎａｌｍ６細胞１ｘ１０６個をＮＳＧマウスに注射した。５日後、誘導性カスパーゼ９を発現するＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞５ｘ１０６個、または非形質導入対照Ｔ細胞のいずれかで、マウスを処置した。末梢血を後眼窩採血によって採取し、ＢＤ  ＴｒｕＣＯＵＮＴ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）チューブを製造業者の説明書に記載の通りに使用してフローサイトメトリーによりＢ細胞およびＴ細胞生着の存在を判定した。腹腔内投与ＩＶＩＧ（６００ｍｇ／ｋｇ）と併せたＢ細胞注射後５、６、７、１０、１３および１８日目に、生物発光を査定した。地方ＩＡＣＵＣガイドラインに従って臓器採取のためにマウスを安楽死させ、骨髄、脾臓および血液サンプルをフローサイトメトリーにより査定した。
【０９１２】
これらの実験の結果を次に説明する。
【０９１３】
１００％完全ならばＢ細胞枯渇によって尋常性天疱瘡（ＰＶ）および他の抗体媒介疾患が治癒するはずである。なぜなら、病的Ｂ細胞が除去されるはずであり、真新しいＢ細胞レパートリーが形成されるに違いないからである。自己免疫を防止する複数の寛容チェックポイントを考えれば、Ｂ細胞自己活性が再発することになる可能性は低い。
【０９１４】
ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞アプローチの利点は、任意のＢ細胞または抗体媒介疾患の処置に対するユニバーサルアプローチである点、およびヒト臨床試験においてＣＤ１９＋Ｂ細胞枯渇に非常に有効であることが検証されている点である。したがって、疾患の標的抗原を知る必要がない。この治療アプローチは、Ｂ細胞またはそれらが産生する抗体が自己免疫または疾患の原因となるあらゆる疾患に利用することができるだろう。加えて、ＣＤ１９  ＣＡＲは、臨床使用または開発において、臓器移植からのＨＬＡもしくはベータ２ミクログロブリン抗体、輸血もしくは妊娠からの血液型もしくはＲｈ抗体、または第ＶＩＩＩ因子、α−Ｌ−イズロニダーゼ、および他の多くのタンパク質補充療法薬などの、遺伝性疾患の機能的なレスキューを妨げる非自己タンパク質に対する同種異系抗体を除去するために使用することができるだろう。
【０９１５】
ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ヒト臨床試験において有意なオフターゲット細胞毒性なくＢ細胞枯渇に対する効力を示したが、Ｂ細胞枯渇は永続的であり、その結果、生涯にわたる免疫抑制をもたらす。ＣＤ２０もまたＢ細胞枯渇の臨床標的である。したがって、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０  ＣＡＲ設計への自殺遺伝子の組み込み（ｓＣＡＲ）、またはＣＡＲ−Ｔ機能の（可逆的自殺カセットもしくはＣＡＲの条件的発現による）選択的活性化は、重要な安全性手段としてのＣＡＲ媒介Ｂ細胞枯渇の一時的制御を可能にすることになる。
【０９１６】
ｓＣＡＲ中の自殺遺伝子の例としては、ＡＰ１９０３などの合成二量体化薬への曝露時の条件的二量体化を可能にする、改変ヒトＦＫ結合タンパク質へのヒトカスパーゼ９の融合体が挙げられる。二量体化すると、カスパーゼ９が活性化され、自殺遺伝子を発現する細胞が死滅することになる。したがって、ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞の注入は、完全なＢ細胞枯渇をもたらすことになり、それによりＢ細胞または抗体媒介疾患が治癒されることになる。ＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７または類似の薬剤での自殺遺伝子のその後の活性化によりｓＣＡＲ  Ｔ細胞が除去され、それによってＢ細胞の再増殖が起き得るようになり、その結果、正常免疫機能が再生される。ｒｅｖＣＡＲにおけるリバース自殺遺伝子（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）の例としては、そのデフォルト状態が二量体化であり、自殺遺伝子を発現する細胞の死滅を引き起こす、改変ヒトＦＫ結合タンパク質へのヒトカスパーゼ９の融合体が挙げられる。二量体化ドメインが可溶化すると、カスパーゼ９活性が阻害され、細胞死が防止され、それによってＣＡＲ  Ｔ細胞機能の発生が可能になる。調節性ｏｎ−ＣＡＲシステムの例としては、そのデフォルト状態が二量体化であり、細胞の分泌系におけるタンパク質の凝集および分解を引き起こす、改変ヒトＦＫ結合タンパク質ドメインとＣＡＲの融合体が挙げられる。二量体化ドメインの可溶化は、細胞の分泌系におけるＣＡＲの放出およびプロセシングを可能にし、これは、ＣＡＲの機能的な細胞表面発現を可能にするＦＫＢＰドメインからのＣＡＲのフューリン切断を包含する。
【０９１７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞機能の一時的な制御のためのこれらのアプローチを評価するために、以下のいくつかのコンストラクトを加工した：一実施形態については、ＣＡＲの前に自殺遺伝子があるもの、およびＣＡＲコンストラクトの後に自殺遺伝子があるもの（図２７）。別の実施形態については、リバース自殺遺伝子（ＣＡＲコンストラクトの前または後のいずれかにある）（図２８）。さらに別の実施形態については、調節性ｏｎＣＡＲ（図２６）。初代ヒトＴ細胞は、ＣＤ１９  ｓＣＡＲ、ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ、およびＣＤ２０ＣＡＲを効率的に発現することが明らかになり（図２９Ａ〜２９Ｆ）、ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、それらの所期の標的に対する特異的細胞毒性を示した（図３０）。加えて、ＣＤ１９  ｓＣＡＲを発現する初代ヒトＴ細胞は、インビトロでＡＰ２０１８７での自殺スイッチの活性化により特異的に殺滅されたが、非形質導入Ｔ細胞は、ＡＰ２０１８７処置後に細胞死を示さなかった（図３１）。加えて、ＣＤ１９  ｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボマウスモデルにおいてＣＤ１９＋Ｂ細胞を除去する点で有効なままであり（図３２）、生着を示した（図３３）。
【０９１８】
図３４における殺滅アッセイから分るように、ＣＤ２０ｓＣＡＲ、２０ｒｅｖＣＡＲおよびＣＤ２０  ｏｎＣＡＲは、ＣＤ２０＋標的細胞に対する等価の特異的殺滅を示す。Ｏｎ−ＣＡＲを５００ｎＭ  Ｓｈｉｅｌｄ−１の存在下で試験した。
【０９１９】
図３５から分るように、可溶化ＦＫＢＰリガンド（例えば、Ｓｈｉｅｌｄ−１）の非存在は、ＣＡＲ機能を阻害する。より低いＥ：Ｔ比で、Ｏｎ−ＣＡＲ機能は、ＦＫＢＰリガンドが存在しない場合、強く阻害される。
【０９２０】
図３６から分るように、ＣＡＲ表面発現をＦＫＢＰリガンドＳｈｉｅｌｄ−１でモジュレートすることができた。Ｓｈｉｅｌｄ−１は、ＣＡＲ発現の用量依存的増加をもたらしたが、Ｓｈｉｅｌｄ−１の非存在は、ＣＤ２０  ｏｎ−ＣＡＲ発現の約６０％低減をもたらした。
【０９２１】
図３７から分るように、Ｓｈｉｅｌｄ−１をＣＤ１９ｒｅｖ  ＣＡＲシステムにおいて滴定したところ、より低い用量のＳｈｉｅｌｄ−１は、より高いカスパーゼ−９活性化およびアポトーシス増加をもたらした。
【０９２２】
図３８から分るように、抗ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞におけるアポトーシス効率のインビボでの査定は、ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞の十分なインビボアポトーシスを示した（図３８）。ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボでの効力も評価した（図３９）。
【０９２３】
図４０、４１および４２から分るように、自殺遺伝子活性は、自殺ＣＡＲ  Ｔ細胞の末梢性枯渇（例えば、図４２におけるリンパ器官からのｓＣＡＲ  Ｔ細胞の枯渇）をもたらした。
【０９２４】
図４３の略図に本発明のＴ細胞産生についてのタイムラインを示し、図４４の略図に本発明のインビボ実験の実験計画についてのタイムラインを示す。
【０９２５】
図４５から分るように、「ユニバーサル」ｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、非自己ＢＴマウスにおいて末梢Ｂ細胞を、および非がんヒト化マウスモデルにおいてヒトＢ細胞を枯渇させることができる。さらに、図４６は、ユニバーサルｓＣＡＲ  Ｔ細胞をＡＰ１９０３処置で枯渇させることができることを実証する。
【０９２６】
本明細書において提示する一部の実験結果の関連配列は、以下の通りである：
ＣＤ１９  ｓＣＡＲ：
自殺遺伝子に続いてＣＤ１９  ＣＡＲ（ｎｔ）
自殺遺伝子に続いてＣＤ１９  ＣＡＲ（ａａ）
ＣＤ１９  ＣＡＲに続いて自殺遺伝子（ｎｔ）
ＣＤ１９  ＣＡＲに続いて自殺遺伝子（ａａ）
【０９２７】
ＣＤ２０  ＣＡＲおよびｓＣＡＲ：
ＣＤ２０ｂｂｚ  ＣＡＲ（ｎｔおよびａａ）
ＣＤ２０  ＣＡＲに続いて自殺遺伝子（ｎｔおよびａａ）
自殺遺伝子に続いてＣＤ２０  ＣＡＲ（ｎｔおよびａａ）
【０９２８】
ＣＤ１９  ｒｅｖＣＡＲ：
ＣＤ１９  ＣＡＲに続いて可逆的自殺カセット（ｎｔおよびａａ）
【０９２９】
ＣＤ１９  ｏｎＣＡＲ：
ＣＤ１９  ｏｎ−ＣＡＲ（ｎｔおよびａａ）
【０９３０】
ＣＤ２０  ｒｅｖＣＡＲ：
ＣＤ２０  ＣＡＲに続いて可逆的自殺カセット（ｎｔおよびａａ）
【０９３１】
ＣＤ２０  ｏｎＣＡＲ：
ＣＤ２０  ｏｎ−ＣＡＲ（ｎｔおよびａａ）
【０９３２】
自殺遺伝子＝誘導性カスパーゼ９（小分子活性化剤と二量体化するとアポトーシスを活性化する）
２Ａ部位＝リボソームスキッピング部位
ＣＤ８膜貫通ドメインと、ＣＤ１３７およびＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３−ゼータはＣＤ２４７としても公知であり、集合的にＣＤ１３７−ＣＤ３ゼータはｂｂｚとしても公知である）細胞質内シグナル伝達ドメインとを含む、ＣＤ１９  ＣＡＲ。
【０９３３】
【表２８９】
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【０９３４】
【表２９０】
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【０９３５】
【表２９１】
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【０９３６】
【表２９２】
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【０９３７】
【表２９３】
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【０９３８】
【表２９４】
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【０９３９】
【表２９５】
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【０９４０】
【表２９６】
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【０９４１】
【表２９７】
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【表２９８】
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【０９４２】
【表２９９】
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【０９４３】
【表３００】
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【表３０１】
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【０９４４】
【表３０２】
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【０９４５】
【表３０３】
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【表３０４】
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【０９４６】
【表３０５】
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【０９４７】
【表３０６】
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【表３０７】
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【０９４８】
【表３０８】
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【０９４９】
【表３０９】
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【表３１０】
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【０９５０】
【表３１１】
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【０９５１】
他の実施形態
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願、および出版物の開示は、それによってそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明を具体的な実施形態を参照しながら開示してきたが、本発明の他の実施形態およびバリエーションが、本発明の真の本質および範囲から逸脱することなく当業者によって考え出され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような実施形態および等価なバリエーションの全てを包含するものと解釈されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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