(57)【要約】  本発明は、改善された核酸送達ビヒクル、特に広範囲の宿主認識能力を有するビヒクルを調製するためのプラットフォームに関する。本発明はさらに改善されたビヒクル、組成物及びその用途を提供する。【選択図】図３Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つの宿主認識要素又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供し、前記核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル、及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、
ｂ．前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞に伝播し、及び／又はパッケージした得られた送達ビヒクルバリアントを回収し、
ｃ．第２宿主細胞（複数可）をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアントに接触させ、
ｄ．前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞を選択し、
ｅ．少なくとも１つの宿主認識要素（複数可）又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞（複数可）から単離し、及び／又は特徴付けして、少なくとも１つの前記第２宿主細胞、及び目的の前記標的細胞（複数可）、又は同標的細胞をコードする核酸配列に適合性の少なくとも１つの宿主認識要素を得ることを含む、目的の標的細胞に適合する宿主認識要素（複数可）を調製し、識別し、及び／又は単離する方法。
【請求項２】
前記方法がステップ（ａ）で提供された前記複数の核酸分子を変異誘発し、それにより少なくとも１つの変異した宿主認識要素をコードする複数の核酸分子を得ることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つが少なくとも１回以上繰り返される請求項１及び２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記送達ビヒクルが少なくとも１つのバクテリオファージである請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記バクテリオファージが少なくとも１つのＴ７様ウイルスである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２宿主細胞及び目的の前記標的細胞の少なくとも１つが原核生物及び真核生物宿主細胞の何れか１つである請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記原核生物細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス菌種、ブドウ球菌種、連鎖球菌種、サルモネラ菌種、赤痢菌種、クロストリジウム種、腸球菌種、クレブシエラ菌種、アシネトバクター菌種、エルシニア菌種及びエンテロバクター菌種、又は変異体、バリアント単離体又はその組み合わせの少なくとも１つの細菌細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２宿主細胞が目的の前記標的細胞（複数可）と同一又は類似する請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主認識要素が前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含む請求項３から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バクテリオファージの尾領域に存在する前記少なくとも１つのタンパク質が尾タンパク質及び繊維タンパク質の少なくとも１つである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択可能な要素が抗生物質耐性遺伝子であり、前記選択ステップ（ｄ）が前記抗生物質の存在下で前記宿主細胞を増殖させることを含む請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ａ．少なくとも１つの宿主認識要素又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供し、前記核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル、及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、
ｂ．前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する少なくとも１つの送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞にパッケージし、及び／又は伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収し、
ｃ．第２宿主細胞をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアントに接触させ、
ｄ．前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞（複数可）を選択し、
ｅ．少なくとも１つの宿主認識要素又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞（複数可）から単離し、及び／又は特徴付けして、前記第２宿主細胞、又は同宿主細胞をコードする核酸配列に適合性の少なくとも１つの前記宿主認識要素を得て、
ｆ．ステップ（ｅ）で得た前記適合性の宿主認識要素をコードする少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つの核酸配列を第３宿主細胞に導入し、前記第３宿主細胞（複数可）を少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、それにより目的の核酸分子を目的の標的細胞に送達することができる少なくとも１つの前記適合性の宿主認識要素を含む送達ビヒクルバリアントを得るステップを含む核酸送達ビヒクルの調製方法。
【請求項１３】
前記方法がステップ（ａ）で提供された前記複数の核酸分子を変異誘発し、それにより少なくとも１つの変異した宿主認識要素をコードする複数の核酸分子を得ることをさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つが少なくとも１回以上繰り返される請求項１２及び１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記送達ビヒクルが少なくとも１つのバクテリオファージである、請求項１２から１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２宿主細胞及び目的の前記標的細胞の少なくとも１つが原核生物及び真核生物宿主細胞である請求項１２から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２宿主細胞が目的の前記標的細胞（複数可）と同一又は類似する請求項１２から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主認識要素が前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含む請求項１２から１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第３宿主細胞（複数可）が少なくとも１つのパッケージングシグナルに操作可能に結合してもよい少なくとも１つの目的の核酸分子をさらに含み、ステップ（ｆ）で得た前記送達ビヒクルがそこにパッケージされた目的の前記核酸分子をさらに含む請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
ａ．少なくとも１つのパッケージングシグナルに操作可能に結合してもよい目的の核酸分子の少なくとも１つを提供し、
ｂ．少なくとも１つの宿主認識要素（複数可）又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を提供し、前記認識要素は目的の前記標的細胞に適合することができ、
ｃ．（ａ）の核酸分子、（ｂ）の核酸配列、又は（ａ）の核酸分子を含む核酸配列、及び（ｂ）の核酸配列を宿主細胞（複数可）に導入して、目的の核酸分子を含む宿主細胞（複数可）及び適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を含む宿主細胞（複数可）を得て、
ｄ．ステップ（ｃ）で得た前記宿主細胞（複数可）を、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、
ｅ．（ｄ）の感染した宿主細胞から、そこにパッケージした目的の前記核酸分子を含む送達ビヒクル（複数可）を回収し、前記送達ビヒクル（複数可）は、目的の前記標的細胞に適合性の前記宿主認識要素（複数可）を含み、
ｆ．対象、組織、臓器、表面、前記標的細胞（複数可）を含む物質及び物品の少なくとも１つの目的の標的細胞（複数可）を、有効量のステップ（ｅ）で得た前記送達ビヒクル（複数可）の少なくとも１つに接触させ、それにより目的の前記核酸分子を目的の前記標的宿主細胞に形質導入することを含む目的の核酸分子を目的の標的宿主細胞に形質導入する方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）で提供される少なくとも１つの適合性の宿主認識要素（複数可）をコードする前記核酸配列（複数可）が、
ａ．少なくとも１つの宿主認識要素又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供し、前記核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル、及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、
ｂ．前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞にパッケージし、及び／又は伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収し、
ｃ．第２宿主細胞（複数可）をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアント（複数可）に接触させ、
ｄ．前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞（複数可）を選択し、
ｅ．宿主認識要素（複数可）又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から単離し、及び／又は特徴付けして、前記目的の標的細胞又は前記標的細胞をコードする核酸配列に適合性の宿主認識要素を得るステップを含む方法によって得た請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記適合性の宿主認識要素（複数可）が請求項２から１１の何れか一項に規定される方法によって調製する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
目的の前記核酸配列が、
ａ．少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化され、通常はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含む少なくとも１つの感作成分であり、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、目的の標的宿主細胞の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特異的に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲ標的の少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特異的に不活性にし、
ｂ．少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの核酸配列の何れか１つを含む請求項２０から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
目的の前記標的宿主細胞（複数可）を含む細胞集団を操作する請求項２１から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ａ．少なくとも１つの宿主認識要素又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子であって、前記核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル、少なくとも１つの核酸配列及び選択可能な要素をコードする配列をさらに含み、
ｂ．少なくとも１つの不完全な宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する少なくとも１つの送達ビヒクル、
ｃ．前記選択可能な要素を有する細胞を選択するための少なくとも１つの化合物を含むキット。
【請求項２６】
前記送達ビヒクルが少なくとも１つのバクテリオファージである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記宿主認識要素が前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項２５から２６の何れか一項に記載のキット。
【請求項２８】
核酸送達ビヒクルの宿主範囲を拡張する又は調整する方法において使用する請求項２５から２７の何れか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記送達ビヒクルが請求項１２から１９の何れか一項に規定される方法によって調製される請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
ａ．少なくとも１つの改変した宿主認識要素（複数可）又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントであって、前記改変した認識要素は目的の前記標的細胞に適合することができ、任意に
ｂ．目的の少なくとも１つの核酸分子を含む改変バクテリオファージ。
【請求項３１】
目的の前記標的細胞（複数可）が原核生物及び真核生物宿主細胞（複数可）の何れか１つである、請求項３０に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３２】
バクテリオファージが少なくとも１つのＴ７様ウイルスである請求項３０から３１の何れか一項に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３３】
前記宿主認識要素が前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含む請求項３０から３２の何れか一項に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３４】
前記バクテリオファージが広い又は改変した宿主範囲を有し、請求項１２から１９の何れか一項に記載の方法によって調製した請求項３０に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３５】
目的の前記核酸配列が、
ａ．少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくともＣＲＩＳＰＲアレイを含む少なくとも１つの感作成分であり、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、目的の標的細胞の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特異的に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲ標的の少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特異的に不活性にし、
ｂ．少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの核酸配列の何れか１つを含む請求項３０から３４の何れか一項に記載の改変バクテリオファージ。
【請求項３６】
対象、組織、臓器、表面、前記標的細胞（複数可）を含む物質及び物品の少なくとも１つの細胞集団を、有効量の少なくとも１つの送達ビヒクル又はキット、系又は前記送達ビヒクルを含む組成物に接触させるステップを含み、前記送達ビヒクルは、
ａ．前記標的細胞（複数可）又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントに適合性の少なくとも１つの宿主認識要素、及び
ｂ．目的の前記核酸分子の少なくとも１つを含む前記細胞集団の内部に含まれる標的細胞（複数可）に目的の少なくとも１つの核酸配列を形質導入することによって細胞集団を操作する方法。
【請求項３７】
前記送達ビヒクルが請求項１２から１９の何れか一項に規定される方法によって調製される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞集団が原核生物細胞及び真核生物細胞の少なくとも１つの集団である請求項３６から３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記バクテリオファージが
ａ．少なくとも１つの改変した宿主認識要素、及び任意に
ｂ．目的の少なくとも１つの核酸分子を含む少なくとも１つの改変バクテリオファージ又は改変バクテリオファージのカクテルもしくは混合物を含む組成物。
【請求項４０】
前記改変バクテリオファージが請求項３０から３５の何れか一項に規定される請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記対象に治療有効量の少なくとも１つの送達ビヒクル又はキット、系又は前記送達ビヒクルを含む組成物を投与するステップを含み、前記送達ビヒクルは、
ａ．前記病因細胞（複数可）そのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントに適合性の少なくとも１つの宿主認識要素、及び
ｂ．目的の少なくとも１つの核酸分子を含む少なくとも１つの改変バクテリオファージ又は改変バクテリオファージのカクテルもしくは混合物を含む病因細胞（複数可）によって生じた、又は関連する対象の病的障害の発症を治療、予防、改善、抑制又は遅延する方法。
【請求項４２】
前記送達ビヒクルに含まれる少なくとも１つの適合性の宿主認識要素（複数可）が、
ａ．少なくとも１つの宿主認識要素又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供し、前記核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル、及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、
ｂ．前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞にパッケージし、及び／又は伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収し、
ｃ．第２宿主細胞（複数可）をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアント（複数可）に接触させ、前記第２宿主細胞は、前記対象の試料から得た前記病因細胞であり、
ｄ．前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞（複数可）を選択し、
ｅ．宿主認識要素（複数可）又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞（複数可）から単離し、及び／又は特徴付けして、前記病因細胞（複数可）又は前記病因細胞をコードする核酸配列に適合性の宿主認識要素を得るステップを含む方法によって得る請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
目的の前記核酸配列が、
ａ．少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくともＣＲＩＳＰＲアレイを含む少なくとも１つの感作成分であり、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、前記病因細胞の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特異的に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特異的に不活性にし、
ｂ．少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの核酸配列の何れか１つを含む請求項４１及び４２の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明に至る研究は、欧州連合第７次フレームワークプログラム（ＥＰ７／２００７−２０１３）／ＥＲＣ贈与契約（ｇｒａｎｔ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）Ｎｏ．３３６０７９の下、欧州研究評議会からの助成を受けた。
【０００２】
本開示は、送達ビヒクルの宿主範囲を拡張し、調整するプラットフォームに関する。より具体的には、本発明は、核酸分子を目的の標的宿主細胞に形質導入するときに送達ビヒクルとして使用するバクテリオファージバリアントを調製し、単離する方法及びキットを提供する。本発明は、本明細書に開示する送達ビヒクル及び方法の産業的、治療及び診断適用をさらに提供する。
【０００３】
背景として本開示の主題に関係があると考えられる参考文献を以下に列挙する。
［１］Ｃｉｔｏｒｉｋ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｉｍｅｅ，Ｍ．＆  Ｌｕ，Ｔ．Ｋ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｒｎａ−ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１４）
［２］Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．等Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２，１１４６−１１５０（２０１４）
［３］Ｙｏｓｅｆ，Ｉ．，Ｍａｎｏｒ，Ｍ．，Ｋｉｒｏ，Ｒ．＆  Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ａｎｄ  ｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｔｏ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ  ａｎｄ  ｋｉｌｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２，７２６７−７２７２（２０１５）
［４］Ｅｄｇａｒ，Ｒ．，Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｎ．，Ｍｏｌｓｈａｎｓｋｉ−Ｍｏｒ，Ｓ．＆  Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｅｎｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７８，７４４−７５１（２０１２）
［５］Ｙｏｓｅｆ，Ｉ．，Ｋｉｒｏ，Ｒ．，Ｍｏｌｓｈａｎｓｋｉ−Ｍｏｒ，Ｓ．，Ｅｄｇａｒ，Ｒ．＆  Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ４，ｅ２８４９１（２０１４）
［６］Ｇｏｒｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｙｏｓｅｆ，Ｉ．Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．Ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｕｐｄａｔｅｓ  ３０：１−６（２０１７）
［７］Ｇａｒｃｉａ，Ｅ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｒａｍａｎｃｕｌｏｖ，Ｅ．，Ｃｈａｉｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｏｌｉｎｅｕｘ，Ｉ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  φＡ１１２２  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｉｎｔｉｍａｔｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｌｉｐｈａｇｅ  Ｔ３  ａｎｄ  Ｔ７  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８５，５２４８−５２６２（２００３）
［８］Ｌａｚａｒｕｓ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｕｎｎｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂ．Ｔｈｅ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｅｓｔｉｓ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｏｎ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，ａｎｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ５３，７０５−７１４（１９４７）
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［１３］Ｃｈｕｎｇ，Ｙ．Ｂ．＆  Ｈｉｎｋｌｅ，Ｄ．Ｃ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ．Ｉ．Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  Ｔ７  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔ７  ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅｄ  ｉｎｔｏ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１６，９１１−９２６（１９９０）
［１４］Ｇａｒｃｉａ−Ｄｏｖａｌ，Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．ｖａｎ  Ｒａａｉｊ，Ｍ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ｔａｉｌ  ｆｉｂｅｒｓ．ＰＮＡＳ  １０９（２４）９３９０−９３９５（２０１２）
［１５］Ｂａｂａ  Ｔ，Ａｒａ  Ｔ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｍ，Ｔａｋａｉ  Ｙ，Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｙ，Ｂａｂａ  Ｍ，Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｔｏｍｉｔａ  Ｍ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ，Ｍｏｒｉ  Ｈ（２００６）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｉｎ−ｆｒａｍｅ，ｓｉｎｇｌｅ−ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ  Ｋｅｉｏ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ  ２：１−１１
［１６］Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，Ｗａｎｎｅｒ  ＢＬ（２０００）Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（１２）：６６４０−６６４５
［１７］Ｋｉｒｏ  Ｒ，Ｍｏｌｓｈａｎｓｋｉ−Ｍｏｒ  Ｓ，Ｙｏｓｅｆ  Ｉ，Ｍｉｌａｍ  ＳＬ，Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ＨＰ，Ｑｉｍｒｏｎ  Ｕ（２０１３）Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ０．４  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１０（４８）：１９５４９−１９５５４
［１８］Ｙｏｓｅｆ，Ｉ．，Ｇｏｒｅｎ，Ｍ．Ｇ．，Ｋｉｒｏ，Ｒ．，Ｅｄｇａｒ，Ｒ．，  ａｎｄ  Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．Ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８，２０１３６−２０１４１（２０１１）
［１９］Ｑｉｍｒｏｎ，Ｕ．，Ｍａｒｉｎｔｃｈｅｖａ，Ｂ．，Ｔａｂｏｒ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｃ．（２００６）．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｇｅｎｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｔ７  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３，１９０３９−１９０４４
本明細書に記載の参考文献の謝辞は、本開示の主題の特許性に何らかの関連性があることを意味して推論されるものではない。
【背景技術】
【０００４】
病原体の抗生物質耐性は、ヒトの健康に対してますます脅威になっている。バクテリオファージ又はファージとしても知られる細菌ウイルスは、この脅威（１−３）を克服するための古典的で新しいアプローチにおけるツールとして再出現している。
【０００５】
バクテリオファージ又はファージとしても知られる細菌ウイルスは、この脅威（２、３）を克服するための伝統的で新しいアプローチにおけるツールとして再出現している。テンペレートファージ及び形質導入ファージは、最近では、抗生物質耐性細菌に対する治療的又は予防的治療のために、細菌の中にＤＮＡを効果的に移行することが分かっている。これらの新しい技術は、ファージによって操作したＤＮＡを注入すること（ＤＮＡ形質導入）が、時には、（例えば溶菌ファージによって）直接的に細菌を殺すことに優れていることを実証する。重要なこととして、ＤＮＡ形質導入は、選択的に耐性病原体を標的にし、「望ましくない」細菌と効果的に戦うためのツールを備えた「望ましい」細菌を提供することができる。Ｌｕ及びＭａｒｒａｆｆｉｎｉのグループの２つの別々の研究は、最近、特別に適合させたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を移行するファージを使用して、インビボとエクスビボの両方でマイクロバイオームを編集することができることを示した（１、２）。また、以前には、本発明の発明者は、細菌を抗生物質に敏感にするために、ファージを使用して優性感受性遺伝子又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ要素の何れかを移行し、したがって治療表面の細菌集団を変化させることができることを示した（３−６）。
【０００６】
これらの新規のファージ関連技術は、ＤＮＡを望ましい細菌宿主株に形質導入することができるファージの能力に依存する。しかしながら、ファージは、狭い範囲の宿主にしか相互作用しないことが多い。ファージの宿主範囲を遠い宿主にまで拡張することによって、この限界を克服することが、前述の技術の使用を容易にすることができる。認識ドメインを変化することによって特定のファージの範囲を拡張することは、異なる宿主を認識するファージのカクテルを使用することよりも優れ、単一のファージを調整し、制御することがより可能になる。
【０００７】
前世紀には、ファージの宿主範囲を拡張する努力がなされてきた。様々な研究が、望ましい宿主を多数のファージに感染させ、結果として変異によって望ましい宿主に伝播することを可能にする変異体ファージを選択することによって、ファージ宿主範囲を拡張することができることを示してきた（例えば、７、８、９を参照のこと）。
【０００８】
より最近では、Ｌｕと同僚がＴ７基のファージを望ましい宿主を認識することができるようにプログラムすることができることを示した。Ｔ７ファージの尾／尾繊維タンパク質が異なる宿主（１０）の認識を決定するため、Ｌｕと同僚は異なる源から尾／尾繊維をスワッピングすることで、ファージが異なる宿主を認識することができるという仮説を立てた。この目的のために、彼らは異なるＰＣＲフラグメント（１１）のギブソン・アセンブリに基づいて、ユニークな合成生物学プラットフォームによって異なる宿主ゲノムを構築した。構築されたゲノムを尾／尾繊維遺伝子を異なるファージからスワップし、酵母細胞に複製した（１０、１２）。その後、得られたファージゲノムをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに形質転換し、異なる宿主を感染させる能力について試験を行った感染性ハイブリッド粒子を産生した。しかしながら、前述の宿主範囲を拡張する技術は、ＤＮＡを形質導入するファージの能力というより、望ましい宿主に伝播するファージの能力に依存する。ファージ伝播は、吸着、ＤＮＡ注入、ＤＮＡ複製、その伝播に欠かせない宿主の因子への依存、宿主防御機序の克服、及び宿主細胞の溶解という複数のステップに依存する。必要とされる様々な鍵となるステップのために、Ｔ７ファージは、そのＤＮＡが宿主に形質導入されても、多くの宿主に伝播することができない。ファージ伝播と異なり、ファージによるＤＮＡ形質導入は、吸着、防御機序の克服、及びＤＮＡ注入能力のみを必要とする。このことは、ファージ伝播を支持しなくても、より多くの宿主がＤＮＡ形質導入をしやすい理由を説明する。しかしながら、ファージ宿主範囲間の結合及びＤＮＡを形質導入する能力が最初に確立されるため、このような宿主を識別することは複雑である。ファージがＤＮＡを新しい宿主に形質導入することができるプラットフォームは、宿主範囲を著しく拡張し、進歩した遺伝子操作及び解析に道を開くだろう。
【０００９】
したがって、目的の核酸分子を制限宿主に形質導入するためのバクテリオファージ等の送達ビヒクルの宿主範囲を拡張するためのプラットフォームを確立することが、この技術分野に必要とされる。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、目的の標的細胞に適合性の宿主認識要素（複数可）を調製し、識別し、及び／又は単離する方法に関する。より特定の実施形態において、方法は以下のステップを含む。
【００１１】
第１ステップ（ａ）は、少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供することを伴う。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことに留意されたい。次のステップ（ｂ）において、複数の核酸分子を含む第１宿主細胞を、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質もしくはフラグメントをコードする不完全な核酸配列を有する送達ビヒクルに接触させる。前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で、宿主細胞が不完全なビヒクルに接触することに留意されたい。このステップは、第１宿主細胞（複数可）に伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収することによってさらに達成される。
【００１２】
次のステップ（ｃ）は、第２宿主細胞をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアントに接触させることを伴う。次のステップ（ｄ）では、前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞を選択する。次のステップ（ｅ）は、少なくとも１つの宿主認識要素又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から単離し、及び特徴付けして、適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を得ることを伴う。
【００１３】
別の態様によって、本開示は、核酸送達ビヒクルを調製する方法を提供する。より特定の実施形態において、方法は、第１ステップ（ａ）において、少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供することを含む。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことに留意されたい。次のステップ（ｂ）は、複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させることを伴う。このステップは、次に、第１宿主細胞（複数可）に伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収する。次にステップ（ｃ）において、第２宿主細胞をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアントに接触させる。その後、これらの第２宿主細胞は、選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た又は生じた細胞について、ステップ（ｄ）で選択される。次のステップ（ｅ）は、少なくとも１つの宿主認識要素又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞（複数可）から単離し、及び／又は特徴付けして、第２宿主細胞（複数可）に適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を得ることを伴う。最後に、ステップ（ｆ）において、ステップ（ｅ）で得た前記適合性の宿主認識要素をコードする少なくとも１つの核酸配列を第３宿主細胞に導入し、これらの第３宿主細胞を、前記宿主又はそのタンパク質もしくはフラグメントの少なくとも１つをコードする不完全な核酸配列を有する送達ビヒクルに接触させ、それにより目的の核酸分子を目的の標的細胞に送達することができる前記適合性の宿主認識要素を含む送達ビヒクルバリアントを得る。
本発明のさらなる態様は、目的の核酸分子を目的の標的宿主細胞（複数可）に形質導入する方法に関し、方法は、以下のステップを含む。
【００１４】
第１のステップ（ａ）において、少なくとも１つのパッケージングシグナルに操作可能に結合してもよい目的の核酸分子を提供する。次のステップ（ｂ）は、少なくとも１つの宿主認識要素（複数可）、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を提供することを伴う。特定の実施形態において、認識要素は目的の前記標的細胞に適合性であることに留意されたい。次のステップ（ｃ）は、第１宿主細胞（複数可）を（ａ）の核酸分子及び（ｂ）の核酸配列で形質転換して、目的の核酸分子及び適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を含む宿主細胞を得ることを伴う。次にステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）で得た形質転換した宿主細胞（複数可）を、宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントの少なくとも１つをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させる。次に、ステップ（ｅ）において、（ｄ）の感染した宿主細胞から、宿主細胞にパッケージされた目的の核酸分子を含む送達ビヒクル（複数可）を回収する。送達ビヒクルが適合性の宿主認識要素（複数可）を含むことに留意されたい。特定の実施形態において、宿主認識要素は、送達ビヒクルとして本発明で使用するバクテリオファージにトランスに提供されてもよい。次のステップ（ｆ）は、目的の標的細胞（複数可）を含む対象、組織、臓器、表面、物質及び物品の少なくとも１つの目的の標的細胞（複数可）を、ステップ（ｅ）で得た前記送達ビヒクル（複数可）の少なくとも１つの有効量に接触させ、それにより目的の前記核酸分子を目的の標的宿主細胞に伝達することを伴う。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、（ａ）少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を含むキットに関する。核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。（ｂ）少なくとも１つの前記宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する少なくとも１つの送達ビヒクル（バクテリオファージ）、任意に（ｃ）前記選択可能な要素を有する細胞を選択するために少なくとも１つの化合物。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、目的の少なくとも１つの核酸配列を前記細胞集団に含まれる標的細胞（複数可）に形質導入することによって、少なくとも１つの細胞集団を操作する方法を提供する。いくつかの特定の実施形態において、方法は、標的細胞（複数可）も含む対象、組織、臓器、表面、物質及び物品の少なくとも１つに存在しうる細胞集団を、有効量の送達ビヒクル又はキット、系、又は同送達ビヒクルを含む組成物の少なくとも１つに接触させるステップを含むことができる。いくつかの実施形態において、このような送達ビヒクルは、（ａ）標的細胞（複数可）、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントに適合性の少なくとも１つの宿主認識要素、及び（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子を含むことができる。
【００１７】
本発明は、その別の態様において、少なくとも１つの改変バクテリオファージ又は改変バクテリオファージのカクテルもしくは混合物を含む組成物をさらに提供する。より具体的には、このようなバクテリオファージは、（ａ）少なくとも１つの改変した宿主認識要素、及び任意に（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子を含むことができる。
【００１８】
別の態様において、本発明は、病因細胞（複数可）によって生じる、又は関連する対象の病的障害の発症を治療、予防、改善、抑制、又は遅らせる方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、前記対象に送達ビヒクル又はキット、系又は同送達ビヒクルを含む組成物の少なくとも１つの治療有効量を投与するステップを含む。より具体的には、本発明の方法によって投与される送達ビヒクルは、（ａ）前記病因細胞（複数可）、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントに適合性の少なくとも１つの宿主認識要素、及び（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子を含むことができる。
【００１９】
本発明のこれらの他の態様は、以降の記述によって明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本明細書に開示する主題をより良く理解し、いかにして実行することができるのかを例示するために、添付の図面を参照して、単に非限定的な例によって、実施形態を記述する。詳細な図面を特に参照して、示される特徴は、例示であり、本発明の実施形態の例示的な検討のためにあることを強調する。この点に関して、図面と共にある記述は、本発明の実施形態の実施方法を当業者に明らかにする。
図面において、
【図１】図１Ａ−図１Ｆは、ＤＮＡを様々な宿主に形質導入する拡張した能力を有するＴ７ファージを選択するためのアプローチの模式図を示す。〔図１Ａ〕宿主受容体（遺伝子１１、１２、１７）に対する特異性をコードする遺伝子を欠失しているＴ７ファージを、これらの遺伝子のランダムに変異したライブラリをパッケージ可能なプラスミド上でコードするＥ．ｃｏｌｉ宿主に伝播する。〔図１Ｂ〕得られたファージ可溶化液は、変異した尾遺伝子をコードするプラスミドをパッケージしたファージの多くのバリアントを含む。〔図１Ｃ〕これらのファージを必ずしもファージの増殖を支持しない宿主株と混合する。この宿主を認識する適合性の尾タンパク質を有するファージをプラスミドに注入する。〔図１Ｄ〕プラスミドを獲得する宿主を、プラスミドによってコードされた抗生物質マーカーによる抗生物質含有プレート上で選択する。プラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に形質転換し、新しい宿主を感染させる最適化した尾遺伝子産物を選択するために、この手順を数回繰り返す。プラスミドをシークエンシングし、最適化した変異を識別する。〔図１Ｅ〕変異した尾コード遺伝子を、その後、パッキングシグナルを有する望ましいプラスミドと共に使用して、新しい宿主受容体に適合性のファージを調製する。〔図１Ｆ〕これらのファージは、望ましいパッケージ可能なプラスミドを望ましい宿主株に形質導入する。
【図２】Ｔ７ハイブリッド粒子の形質導入効率の向上を示す。ｗｔ−Ｇｐ１７プラスミドを内部に有する非変異誘発のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３宿主からの可溶化液を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｗａａＣΔｔｒｘＡを感染させた。
【図３Ａ】ＤＮＡを新しい宿主に形質導入することができるハイブリッドＴ７粒子の識別を示す。手順の模式図を示す。Ｉ．尾遺伝子を欠失しているＴ７ファージを、パッケージ可能なプラスミドの様々な源から尾をコードするＥ．ｃｏｌｉ宿主に産生する。ＩＩ．得られた粒子可溶化液は、新しい尾遺伝子（及びＴ７ゲノムをパッケージするハイブリッド粒子、図示せず）を有するハイブリッドＴ７粒子を含む。ＩＩＩ．これらの粒子は、Ｔ７ファージ伝播を必ずしも支持しない宿主株でインキュベートする。この宿主を認識する適合性の尾タンパク質を有する粒子をプラスミドに注入する。ＩＶ．プラスミドを獲得する宿主を抗生物質含有プレート上で選択する。形質導入効率をその後確認する。
【図３Ｂ】ＤＮＡを新しい宿主に形質導入することができるハイブリッドＴ７粒子の識別を示す。異なるハイブリッド粒子による異なる宿主のＤＮＡ形質導入を示す。バーは、指示したハイブリッド粒子（ファージＴ７、Ｔ３、ＹｐｓＰ−Ｇ、１３ａ、ＹｐＰ−Ｒ、Ｖｉ０６、ｇｈ−１、φＳＧ−ＪＬ２、Ｋ１１、φＥａｐ−１、Ｅ−２、ＫＰ３２、ＫＰ３４、ＫｐＶ２８９、φＫＭＶに由来する尾でハイブリダイズしたＴ７コアカプシド）によって、指示した宿主に形質導入したコロニーのｍｌ（ＴＦＵ／ｍｌ）当たりの数の平均±ＳＤを表す。実験は、宿主の各組について少なくとも３回個別に繰り返した。ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡ；Ｓｓｏ４７２７、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｓｏｎｎｅｉ４７２７；Ｓｅｎ４５１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｔｒ．ＳＡＲＣ  ５；Ｋｐｎ４７１８、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  １００３１；Ｋｐｎ４８００ＩＩ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  ９９９７；Ｅｃｌ４７２３、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ亜種ｃｌｏａｃａｅ  ＡＴＣＣ  １３０４７（図３Ｂ）；Ｓｅｎ４００１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＬＴ２；Ｋ３９０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌種３９０；Ｅａｅ４７３９、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ５１６９７；Ｓｅｎ４５１３、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  ＰＴ４；Ｋｐｎ４７１９、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ１３８８２；Ｅｃｏ４５０７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２（図３Ｂ−１）。
【図４Ａ】新しい宿主にＤＮＡ形質導入を行うハイブリッドＴ７粒子の能力の向上を示す。ＧＯＴｒａＰの模式図を示す。Ｉ．尾遺伝子を欠失しているＴ７ファージを使用して、パッケージ可能なプラスミドのランダムに変異した尾をコードするＥ．ｃｏｌｉ宿主を感染させる。ＩＩ．得られたファージ可溶化液は、変異した尾遺伝子をコードするプラスミドをパッケージした粒子の多くのバリアントを含む。ＩＩＩ．これらの粒子は、ファージ伝播を必ずしも支持しない宿主株でインキュベートする。この宿主を改善した効率で認識する適合性の尾タンパク質を有する粒子は、親又は他の変異体尾よりも良好にプラスミドを注入する。ＩＶ．プラスミドを獲得した宿主を、プラスミドによってコードされた抗生物質マーカーによる抗生物質含有プレート上で選択する。プラスミドを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に形質転換し、変異する。この手順を、新しい宿主を感染させる最適化した尾遺伝子産物を選択するために数回繰り返す。Ｖ．プラスミドをシークエンシングし、形質導入を改善する変異を識別した。
【図４Ｂ】新しい宿主にＤＮＡ形質導入を行うハイブリッドＴ７粒子の能力の向上を示す。ＧＯＴｒａＰを使用した異なるハイブリッド粒子の形質導入効率の向上を示す。指示した尾（青いフォント）をコードするプラスミドを内部に有する野生型Ｅ．ｃｏｌｉに産生した粒子状の可溶化液を、ＥＭＳを使用して変異した。可溶化液を使用して、指示した宿主（太字のフォント）を形質導入した。形質導入体を抗生物質含有寒天プレートに蒔き、数を数えた。これらの形質導入体からプラスミドを抽出し、変異させ、新鮮な野生型Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。これらの宿主を使用して、指示した宿主を形質導入する役割を担う新しい粒子状可溶化液を産生した。未処理の可溶化液（サイクル０）及び指示したサイクル数（サイクル１、２、及び３）を受けている可溶化液中の形質導入した細菌の数を数えた。バーは、３つの独立した実験において、参照株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡΔｗａａＣ及びＳｓｏ４７２７についてはＥ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡ；Ｋｐｎ４８００ＩＩについてはＳｓｏ４７２７）の同ハイブリッド粒子の形質導入効率に正規化した形質導入した細菌の平均数±標準偏差を表す。
【図４Ｃ】新しい宿主にＤＮＡ形質導入を行うハイブリッドＴ７粒子の能力の向上を示す。得られた変異のＤＮＡ形質導入に与える効果の検証を示す。親尾遺伝子（ＷＴ）又は指示した変異体遺伝子の何れかをコードするプラスミドを内部に有するＥ．ｃｏｌｉを使用して、ハイブリッド粒子を調製した。バーは、３つの独立した実験において、前述の参照株におけるハイブリッド粒子の形質導入効率に正規化した形質導入した細菌の平均数±標準偏差を表す。
【図５Ａ】特定の宿主へのプラスミドの形質導入のためのハイブリッド粒子の産生を示す。手順の模式図を示す。ハイブリッド粒子を産生するために使用したＥ．ｃｏｌｉ細胞は、２つのプラスミド、１つは（パッケージングシグナルのない）尾タンパク質をコードするプラスミド、もう１つはＴ７パッケージングシグナルをコードするプラスミドを内部に有した。生成したハイブリッド粒子可溶化液を使用してＤＮＡを指示した宿主に形質導入した。その後、パッケージングシグナルを有するプラスミドが耐性を与える抗生物質を補充したＬＢ寒天プレートに、宿主を播種した。
【図５Ｂ】特定の宿主へのプラスミドの形質導入のためのハイブリッド粒子の産生を示す。親（野生型）によって支持された尾と、改善された変異した尾によって支持された尾の形質導入効率の比較を示す。バーは、３つの独立した実験において、参照株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡΔｗａａＣ及びＳｓｏ４７２７についてはＥ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡ；Ｋｐｎ４８００ＩＩについてはＳｓｏ４７２７）の同ハイブリッド粒子の形質導入効率に正規化した形質導入した細菌の平均数±標準偏差を表す。
【図６】特定のプラスミドを特定の宿主に形質導入するハイブリッド粒子の産生を示す。（ストレプトマイシン耐性を与える）指示した尾タンパク質をコードするプラスミド、及び（カナマイシン耐性を与える）Ｔ７パッケージングシグナルをコードするプラスミドを内部に有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を使用して、ハイブリッド粒子を産生した。これらのハイブリッド粒子を使用してＤＮＡを指示した宿主に形質導入した。その後、カナマイシン（灰色バー）又はストレプトマイシン（黒色バー）を補充したＬＢ寒天プレートに、宿主を播種した。バーは、２つの独立した実験において、形質導入した細菌の平均数±標準偏差を表す。
【図７】図７Ａ−７Ｂは、ＧＯＴｒａＰを使用したハイブリッド粒子の形質導入効率の向上を示す。〔図７Ａ〕Ｔ７（ｇｐ１１−１２）及びＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）の尾をコードするプラスミドを内部に有する野生型Ｅ．ｃｏｌｉにおいて粒子状可溶化液の生成にＥＭＳ変異原性を使用した。ハイブリッド可溶化液を使用してＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０２８を形質導入した。形質導入体を抗生物質含有寒天プレートに蒔き、数を数えた。これらの形質導入体からプラスミドを抽出し、変異させ、新鮮な野生型Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。これらの宿主を使用して、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０２８を再び形質導入する役割を担う新しい粒子状可溶化液を生成して、サイクルを終了した。未処理の可溶化液（サイクル０）及び指示した数のサイクル数を受けている可溶化液中の形質導入した細菌の数を数えた。バーは、３つの独立した実験において、参照株Ｓｅｎ４５１０に与える同ハイブリッド粒子の形質導入の効率性に正規化した形質導入した細菌の平均数±ＳＤを表す。〔図７Ｂ〕（ＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７のＡＴＧスタートコドンに関する）−９位及び−１０位の変異のＤＮＡ形質導入に与える影響の検証を示す。親プラスミド（野生型）又は指示した変異を有するプラスミドを内部に有するＥ．ｃｏｌｉを使用してハイブリッド粒子を調製した。バーは、３つの独立した実験において、前述の参照株に対するハイブリッド粒子の形質導入効率に正規化した形質導入した細菌の平均数±ＳＤを表す。
【図８】図８Ａ−８Ｂは、本発明の方法によるＤＮＡ形質導入粒子と比較した先行技術の溶菌ハイブリッドファージの産生を示す。〔図８Ａ〕先行技術（１０）に記載のハイブリッド溶菌ファージの産生を示す。ステップは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）にクローニングする全体のファージゲノムのギブソン・アセンブリ、酵母への形質転換、構築されたゲノムの抽出、ハイブリッドファージの産生を支持するＥ．ｃｏｌｉ宿主へのゲノムの形質転換から成る。その後、ファージをクロロホルムによって放出し、支持宿主に感染させるために使用して、ハイブリッド溶菌ファージを得る。〔図８Ｂ〕本発明によるハイブリッド形質導入粒子の産生を示す。ステップは、尾遺伝子を有するプラスミドのみの合成、ファージの増殖を支持するＥ．ｃｏｌｉ宿主への形質転換から成る。その尾が宿主にトランスに供給される不完全なファージをこの宿主に感染させ、目的のＤＮＡを形質導入するハイブリッドファージ粒子を産生する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
バクテリオファージに基づく適用を用いる際の大きな限界は、その宿主範囲の狭さである。宿主範囲を拡張するアプローチは、ファージ制限的な宿主にＤＮＡを形質導入する能力を拡張するアプローチよりも、主にその伝播を支持する宿主における溶菌ファージに焦点を当てている。
【００２２】
より具体的には、形質導入粒子は、ファージを上回るいくつかの重要な技術的利点も示す。ファージの産生と違い、パッケージされたファージゲノムの統合性は、形質導入粒子の産生に必須ではない。実際には、唯一の必要条件は、ファージ粒子の全ての成分が（シス又はトランスの何れかで）産生宿主にコードされることである。トランスのいくつかの成分の発現は、ハイブリッド粒子の生成を劇的に単純にし、これは、これらの成分がスワップしたファージゲノムを生成するために先行技術で使用した面倒で費用のかかる合成生物学的技術（１０）より、通常の分子生物学的技術を使用して構築されるプラスミドに発現することができるためである。先行技術の方法を上回る本発明のプラットフォームの利点を図８に明白に説明する。形質導入粒子を産生するために使用するファージゲノムは、（トランスで発現する重要な遺伝子が存在しないため）自家伝播能力を欠いている。そのため、形質導入粒子の産生はより安全で、より制御可能であり、結果として、規制機関によるより緩やかな承認手続きを必要としてもよい。したがって、形質導入粒子は、いくつかの技術的態様において、感染性ファージの使用より優れている。
【００２３】
伝播を支持しない宿主にＤＮＡを形質導入するファージを単離するために、本発明の発明者は、初めに、宿主認識要素（複数可）を有するハイブリッドカプシド、特に、様々な病因宿主の異なるファージに由来する尾／尾繊維（簡潔さのために、尾／尾繊維はここでは「尾（ｔａｉｌ）」と呼ぶ）の形質導入能力を測定した。本発明の発明者は、実質的に、これらのハイブリッド粒子のいくつかの初期の媒体−形質導入効率も改善した。このために、本発明の発明者は、ＧＯＴｒａＰ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を開発し、ＧＯＴｒａＰとは、表現型（すなわちＤＮＡの形質導入）をこの形質導入を可能にする望ましい遺伝子型（すなわち尾コード遺伝子の変異）に結合するプラットフォームである。重要なこととして、ＧＯＴｒａＰは望ましい宿主に適合性の尾を有するファージを選択することができる。本発明の発明者は、パッケージングシグナルをコードする望ましいＤＮＡが病原株に形質導入することができることを見つけ、したがって、ＤＮＡが本発明のプログラムされた形質導入粒子を用いて特に形質導入することができることを実証する。
【００２４】
より具体的には、本開示は、尾適合性を有するＤＮＡ形質導入能力を新しい宿主に結合するプラットフォームを確立した。以下に示すように、このプラットフォームは、自然にはファージの増殖を支持しない宿主に適合する尾を有するファージの選択を可能にする。このプラットフォームを使用して、適切な選択スキームがあれば、真核生物であっても如何なる理論に縛られることなく、望ましい核酸分子又は配列を遠縁の細菌に注入するファージを選択することができる。
【００２５】
したがって、第一の態様において、本発明は、目的の標的細胞に適合性の宿主認識要素（複数可）を識別し、及び／又は単離し、及び／又は最適化する方法を提供する。より特定の実施形態において、方法は、少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供することを含む第１ステップ（ａ）を含む。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことに留意されたい。次のステップ（ｂ）において、複数の核酸分子を含む第１宿主細胞を、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質もしくはフラグメントをコードする不完全な核酸配列を有する送達ビヒクルに接触させる。前記送達ビヒクルの伝播及び／又はパッケージングを可能にする条件下で、宿主細胞が不完全なビヒクルに接触することに留意されたい。このステップは、第１宿主細胞（複数可）に伝播又はパッケージした結果として得られる送達ビヒクルバリアントを回収することによってさらに達成される。次のステップ（ｃ）は、第２宿主細胞をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアントに接触させることを伴う。次のステップ（ｄ）では、前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞を選択する。次のステップ（ｅ）は、少なくとも１つの宿主認識要素（複数可）又は少なくとも１つの宿主認識要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から単離し、及び／又は特徴付けして、いくつかの実施形態では第２宿主細胞（複数可）と適合性であってもよく、及び／又は目的の標的宿主細胞と適合性であってもよい宿主認識要素又は同要素をコードする核酸配列を得ることを伴う。
【００２６】
特定の実施形態において、ステップ（ｂ）から（ｅ）の少なくとも１つ、例えば、ステップ（ｂ）から（ｄ）又はステップの他の組み合わせを、前述のようにさらにもう１回以上繰り返してもよい。
【００２７】
前述のように、本開示は、宿主認識要素（複数可）又は目的の標的細胞に適合性のそのタンパク質を識別し、最適化し、改善し及び／又は単離する方法を提供する。「識別する」とは、目的の標的細胞に適合性の宿主認識要素（複数可）を決定、分類、発見、最適化及び／又は選択の少なくとも１つを意味する。少なくとも１つの宿主認識要素をコードする核酸配列において、「単離する」及び「特徴付ける」は、少なくとも１つの宿主認識要素をコードする及びその核酸配列を決定する核酸配列（複数可）を自然環境から分離し、それによって特徴付けることを意味する。
【００２８】
「単離される」は、核酸配列が精製された範囲を必ずしも反映していない。しかしながら、ある程度にまで精製されたこのような分子は「単離される」ことが理解される。核酸は、全細胞、細胞可溶化液、送達ビヒクル、又は部分的に精製され又は実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、自然環境に通常関連するその他の細胞成分から精製されるとき、「単離される」又は「実質的に純粋になる」。核酸を単離するために、以下の標準的技術：アルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び技術分野で周知の他の技術を使用することができる。
【００２９】
本発明の他の態様に関連して以降に詳しく説明するように、本発明の方法によって識別され、提供され、調製され、最適化され、及び／又は特徴付けされた宿主認識要素（複数可）は、いくつかの実施形態において使用されて、少なくとも１つの目的の標的宿主細胞に適合性であり、そのためこのような標的細胞に目的の核酸分子の少なくとも１つを形質導入するのに適しうる送達ビヒクルを調製することができる。
【００３０】
前述のように、宿主細胞と核酸送達ビヒクルとの物理的相互作用は、宿主細胞と送達ビヒクルとの認識を決定し、送達ビヒクルの宿主細胞に進入する（又は感染する）能力を規定する。したがって、本開示の文脈における「適合性の」という用語は、特定の宿主認識要素が、送達ビヒクルに含まれるとき、当該要素を有する送達ビヒクルと目的の特定の標的宿主細胞との認識を可能にすることを意味する。「認識」は、本明細書で使用する場合、本明細書では「第２宿主細胞」と示される目的の標的宿主細胞に、送達ビヒクルが結合、付着、吸収、浸透することも含む。言い換えれば、適合性の宿主認識要素を含む送達ベクターは、進入することができ、それにより特定の宿主細胞に形質導入することができる。
【００３１】
いくつかの特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、少なくとも１つの変異原に供し、それにより少なくとも１つの変異した宿主認識要素をコードする複数の核酸分子（複数可）を得ることによって、ステップ（ａ）で提供される複数の核酸分子を変異誘発することをさらに含む。
【００３２】
実施例１、２及びとりわけ図３Ｂにも示されるように、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、数回のラウンドの選択及び富化を含んでもよく、したがって、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）、あるいはステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つを、少なくとも１回以上繰り返すオプションをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ステップ（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を少なくとも１回以上繰り返すことを含んでもよい。図４Ｂに示すように、これらのステップを繰り返すことで、本発明の方法によって調製した宿主認識要素（複数可）を含むビヒクルの形質導入効率を改善する。これらの送達ビヒクル、その調製方法は、本発明の他の態様と関連して以降に詳しく説明する。これらステップは、少なくとも１回以上、２、３、４、５、６、７、８、９、２０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００回以上繰り返すことができることが理解される。本発明の方法が、ステップ（ａ）で提供される少なくとも１つの宿主認識要素をコードする複数の核酸分子を、少なくとも１つの変異原に暴露する、あるいは以降に記載する他の方法によって当該核酸配列（複数可）を変異誘発することを伴う場合、このステップは少なくとも１回以上繰り返してもよいことが理解される。核酸配列の変異原への暴露は、細胞内（第１又は第３宿主細胞）又は細胞外の何れかで行うことができる。
【００３３】
技術分野で周知のように、宿主細胞と核酸送達ビヒクルとの物理的相互作用は、宿主細胞と送達ビヒクルとの認識を決定し、送達ビヒクルの宿主細胞に進入する（又は感染する）能力を規定する。
【００３４】
例えば、ファージの生存は、ファージ進入の最中にその細菌宿主を感染する能力に依存する。バクテリオファージ及び細菌宿主において、ファージの宿主認識要素と細菌受容体の共進化は、細菌宿主範囲、ファージ進入のメカニズム及び他の感染パラメータを決定する。
【００３５】
本来は制限的で、すなわち、特定の種類の送達ビヒクルに許容的ではなく、送達ビヒクルが伝播することができない宿主（又は目的の標的細胞）に、ＤＮＡを移行させる核酸送達ビヒクル（例えばバクテリオファージ）を単離するために、表現型、すなわち、宿主認識を可能にする望ましい遺伝子型に連結する方法を開発しなければならない。
【００３６】
このために、本明細書に記載の方法は、とりわけ、宿主認識要素またはそのフラグメント、ならびに少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を含む第１宿主細胞をコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルの使用を含む。前述のように、これらの核酸分子は、（不完全な宿主認識要素を有する）ビヒクルならびにその選択及び識別を可能にする選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列に、当該核酸分子をパッケージングするのを容易にする少なくとも１つのパッケージングシグナルをさらに含む。
【００３７】
前述のように、本発明の方法のステップ（ｂ）において、「第１宿主細胞（複数可）」は、複数の認識要素を含み、本明細書では「産生細胞（複数可）」として使用され、不完全な認識要素をコードする不完全な核酸配列を有する送達ビヒクルに接触する。前述の文脈において「不完全な」という用語は、本明細書に規定する宿主認識要素の少なくとも１つをコードする送達ビヒクルの未変性の核酸配列（複数可）が欠失しており、（遺伝子のコード領域又は非コード領域の何れかで）変異され、部分的又は不完全に損なわれ、又はあるいは少なくとも１つの不完全な宿主認識要素をコードする核酸が、送達ビヒクルゲノムから完全に失われている（それにより、このようなビヒクルは宿主認識要素をコードする核酸配列を欠失している）ことを意味する。したがって、不完全な核酸配列は、望ましい宿主細胞又は任意の宿主細胞の認識を支持することができない不完全な、損なわれた、変異した又は完全ではない（または失われてもいる）宿主認識要素をコードする。いくつかの実施形態において、本発明は、ビヒクル、特に（複数の核酸配列として提供される）宿主認識要素をコードする核酸配列（複数可）のパッケージングに必要とされる要素のみを含みうる本発明に開示する送達ビヒクルを含むことに留意されたい。例えば、送達ビヒクルは、これらの核酸配列をパッケージする能力以外のその他の特性又は活動を欠いている。しかしながら、いくつかの代替又は追加の実施形態において、（例えば、宿主認識要素をコードする核酸配列が不完全ではない）不完全ではない送達ビヒクル（複数可）又は野生型の送達ビヒクルであっても、その使用が本発明に適用可能であることも留意されたい。
【００３８】
少なくとも１つの宿主認識要素（又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメント）をコードする複数の核酸分子、さらに前述の送達ビヒクルによるパッケージング要素を含む第１宿主細胞（複数可）を接触することで、宿主細胞によって運ばれる宿主認識要素を結果として得られる送達ビヒクル（複数可）にパッケージングする。このプロセスは、それぞれ少なくとも１つの宿主認識要素（又はそのバリアント、タンパク質又は変異体）を含む送達ビヒクルバリアントの集団を得ることを容易にし、それにより新しい表現型／遺伝子型を獲得する。これらの要素の少なくともいくつかは、拡張した範囲の標的宿主細胞に感染／インターフェースするのに適合可能である。前述のように、これらのバリアントは、目的の標的宿主に適合性でありうる宿主細胞認識要素を有する送達ビヒクルのためにさらに選択される。以降に詳しく説明するように、本明細書では「産生細胞」としても呼ばれる「第３宿主細胞」は、細胞または部分又はその小器官を模倣する人工細胞、小胞又は系をさらに含みうる。
【００３９】
より具体的には、本明細書に規定し、本発明の方法のステップ（ｂ）で得られる「送達ビヒクルバリアント」という用語は、それぞれがユニークな遺伝子型／表現型を含む送達ビヒクル種の集団又は複数を指す。送達ビヒクルバリアントは、その核酸配列の含量及び／又はそのタンパク質のアミノ酸配列によって、互いに異なっていてもよい。送達ビヒクルバリアントは、相同又は異種、ハイブリッド、未変性、変異した又はその組み合わせでありうる宿主認識要素（複数可）をコードする核酸配列を有することができる。特に、これらのバリアントは、目的の標的宿主細胞に適合性の望ましい宿主認識要素を有することができる。
【００４０】
本開示の文脈において「核酸送達ビヒクル」という用語は、本明細書で使用する場合、最も広義に使用する。「ビヒクル」又は「送達ビヒクル」は、本発明で使用する場合、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、ウイルス、統合可能なＤＮＡフラグメント及びその他のビヒクル等のベクターを含み、核酸分子を望ましい標的宿主細胞に移行させることができ、いくつかのさらなる実施形態において、当該形質導入された核酸分子を標的細胞に発現することを導く。
【００４１】
ベクターは、典型的には自己複製するＤＮＡ又はＲＮＡ構築物であり、望ましい核酸配列、及び適切な宿主細胞において認識され、望ましい遺伝子の翻訳に影響を与える操作可能に結合された遺伝的制御要素を含む。概して、遺伝的制御要素は、原核生物のプロモーター系又は真核生物のプロモーター発現制御系を含むことができる。このような系は、典型的には、転写プロモーター、ＲＮＡ発現のレベルを高める転写エンハンサーを含む。ベクターは、通常、宿主細胞を独立して複製することができる複製の起源を含む。
【００４２】
したがって、制御及び制御要素という用語は、プロモーター、ターミネーター及び他の発現制御要素を含む。このような制御要素は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；［Ｇｏｅｄｄｅｌ．，等、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）］に記述がある。例えば、ＤＮＡ配列に操作可能に連結するとき、ＤＮＡ配列の発現を制御する多様な発現制御配列は、本発明の方法を使用して望ましいタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現するために、これらのベクターに使用することができる。
【００４３】
ベクター又は送達ビヒクルは、さらに、ベクター含有細胞を選択するために、適切な制限部位、抗生物質耐性又は他のマーカーを含みうる。プラスミドが最も多く使用されるベクターの形態であるが、同様の機能を提供し、技術分野で知られている又は知られるようになったベクターの他の形態も本明細書での使用に適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ等、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８５  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．；ａｎｄ  Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ，等（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ（１９８８）を参照のこと、本文献は参照により本明細書に援用される。送達ビヒクル（複数可）のこの定義は、本発明の他の態様に記載するステップ又は組成物に関連する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本開示に係る方法で使用する送達ビヒクルは、少なくとも１つのバクテリオファージであってもよい。したがって、いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、送達ビヒクルとして使用して、本発明の宿主認識要素を調製し、識別することができる。さらなるいくつかの実施形態において、バクテリオファージは、本発明の方法によって得た宿主認識要素（複数可）を含む送達ビヒクルの調製のために、本明細書で使用することもできる。このような送達ビヒクルは、目的の望ましい標的細胞及び／又は本明細書で使用する第２宿主細胞に適合可能である。いくつかの実施形態において、第２宿主細胞（複数可）は、目的の標的宿主細胞（複数可）に同一であっても、類似していてもよい。
【００４５】
「バクテリオファージ」という用語は、細菌等の原核生物の内部で感染し、複製し、構築するウイルスを意味する。「バクテリオファージ」という用語は、「ファージ」という用語と同義であることに留意されたい。ファージは、ＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを被包するタンパク質から成り、数百個の遺伝子しかコードすることができず、それにより比較的単純又は精巧な構造を有するウイルス粒子を産生する。ファージは、核酸の形態及び種類（ＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖、直線又は環状）を検討する国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）に従って分類される。これまで、細菌及び／又は古細菌（古細菌として以前に分類された原核生物ドメイン）を感染させる約１９個のファージファミリーが認識されてきた。多くのバクテリオファージが細胞の特定の属又は種又は株に特異的である。本開示の方法、キット及び組成物によって、適したファージを送達ビヒクルとして使用してもよいことが理解される。
【００４６】
いくつかの非限定的な実施形態において、本開示の主題のバクテリオファージは、（例えば、ポドウイルス科、ミオウイルス科又はシホウイルス科のファミリーに対する）カウドウイルス目又は（例えば、リポスリクスウイルス科又はルディウイルス科のファミリーに対する）リガメンウイルス目に属する。他のファミリーのファージ、例えば、ほんの２、３例であるが、アンプラウイルス科、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ及びＣｌａｖａｖｉｒｉｄａｅも本発明に含まれる。
【００４７】
他の実施形態において、本開示に係るバクテリオファージは、（限定されないが）バクテリオファージファミリー、ポドウイルス科、マイオウイルス科又はシホウイルス科、リポスリクスウイルス科又はルディウイルス科の１つである。
【００４８】
特定の実施形態において、本開示に係るバクテリオファージはＴ７様ウイルス又はＴ４様ウイルスの少なくとも１つである。
【００４９】
さらなる特定の実施形態において、本発明の方法による送達ビヒクルとして使用されるファージ、ならびに改変バクテリオファージ、以降に記述する本開示のキット及び組成物は、Ｔ７様ウイルス、特に腸内細菌ファージＴ７であってもよい。バクテリオファージＴ７は、溶菌ライフサイクルを有するＤＮＡウイルスである。
【００５０】
より具体的には、本開示に係るファージは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉファージＴ７（前述のカウドウイルス目（尾ファージ）のポドウイルス科ファミリーのメンバー）であってもよい。Ｔ７は、頂点の１つに２０ｎｍの短い尾を有する正二十面体カプシドから成る。カプシドは、シェルタンパク質遺伝子産物（ｇｐ）１０によって形成され、４０ｋｂのＤＮＡを囲む。ｇｐ１４、ｇｐ１５、及びｇｐ１６から成る円柱構造がカプシドの内部に存在し、ｇｐ８（８、１０）の環状の十二量体であるコネクタによって形成される特別な頂点に付着する。タンパク質ｇｐ１１及びｇｐ１２は尾を形成し、ｇｐ１３、ｇｐ６．７、及びｇｐ７．３は、また、その位置は確立されていないが、ウイルス粒子の部分であり、感染に必要であることが分かっている。尾の主要な部分は、６つのコピーが存在する大きなタンパク質であるｇｐ１２から成り、小さいｇｐ１１タンパク質も尾に位置する。６つの繊維が尾に付着し、それぞれｇｐ１７タンパク質の３つのコピーを含む。
【００５１】
本開示の方法、キット及び組成物による送達ビヒクルとして使用するファージは、ファミリーポドウイルス科の他のグループメンバー、例えば、限定されないが、Ｔ３ファージ、φ２９、Ｐ２２、Ｐ−ＳＰＰ７、Ｎ４、ε１５、Ｋ１Ｅ、Ｋ１−５及びＰ３７を含んでもよい。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本開示の方法、キット及び組成物による送達ビヒクルとして使用するファージは、限定されないが、腸内細菌ファージＴ７、腸内細菌ファージ１３ａ、エルシニアファージＹｐｓＰ−Ｇ、腸内細菌ファージＴ３、エルシニアファージＹｐＰ−Ｒ、サルモネラファージｐｈｉＳＧ−ＪＬ２、サルモネラファージＶｉ０６、シュードモナスファージｇｈ−１、クレブシエラファージＫ１１、エンテロバクターファージｐｈｉＥａｐ−１、エンテロバクターファージＥ−２、クレブシエラファージＫＰ３２、クレブシエラファージＫＰ３４、クレブシエラファージｖＢ＿ＫｐｎＰ＿ＫｐＶ２８９及びシュードモナスファージｐｈｉＫＭＶを含んでもよい。
【００５３】
別の例において、バクテリオファージは、限定されないが、プロテオバクテリア、ファーミキューテス、バクテロイデス門の何れか１つを含む細菌を感染させることができるバクテリオファージを含む。
【００５４】
さらなる例において、バクテリオファージは限定されないが、以下の属：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、シュードモナス、連鎖球菌、ブドウ球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、クロストリジウム、腸球菌、クレブシエラ属アシネトバクター及びエンテロバクターに属する細菌を感染させることができるバクテリオファージを含む。
【００５５】
特に「ＥＳＫＡＰＥ」病原体を特に標的にするバクテリオファージが特に興味深い。本明細書で使用する場合、これらの病原体として、限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒが挙げられる。
【００５６】
ほんの２、３例であるが、これらのバクテリオファージとして、限定されないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、特にｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍｙ  Ｄ１、ｖＢ＿Ｓａｕ  Ｍｙ  １１４０、ｖＢ＿ＳａｕＭ  １４２、Ｓｂ−１、ｖＢ＿ＳａｕＭ  ２３２、ｖＢ＿ＳａｕＳ  １７５、ｖＢ＿ＳａｕＭ  ５０、ｖＢ＿Ｓａｕ  ５１／１８、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．１，ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．３、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．４、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．５、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．６、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．７、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．８、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｓ．９、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．１０、ｖＢ＿Ｓａｕ．Ｍ．１１の少なくとも１つに特異的なバクテリオファージが挙げられる。いくつかのさらなる実施形態において、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的なバクテリオファージも、本発明に適用することができる。さらに特定の実施形態において、これらのファージとして、ｖＢ＿Ｋｌｐ  １、ｖＢ＿Ｋｌｐ  ２、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．１、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．３、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．４、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．５、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．６、ｖＢ＿Ｋｌｐ．７、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．８、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．９、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．１０、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．１１、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．１２、ｖＢ＿Ｋｌｐ．１３、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｐ．１４、ｖＢ＿Ｋｌｐ．１５、ｖＢ＿Ｋｌｐ．Ｍ．１６も挙げられる。さらに特定の実施形態において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに特異的なバクテリオファージは、本発明の送達ビヒクルとして、あるいは異種宿主認識要素の源として適用することができる。このようなバクテリオファージの非限定的な例として、限定されないが、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｓｈｉｓ  １、ｖＢ＿ＰｓａＭ  ＰＡＴ  ５、ｖＢ＿ＰｓａＰ  ＰＡＴ  １４、ｖＢ＿ＰｓａＭ  ＰＡＴ  １３、ｖＢ＿ＰｓａＭ  ＳＴ−１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ２７、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４４  Ｋ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４４  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  １６、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｓ−１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ８−４０、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３５  Ｋ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ４４、ｖＢ＿Ｐｓａ  １、ｖＢ＿Ｐｓａ  ９、ｖＢ＿Ｐｓａ  ６−１３１  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ３７、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４５  Ｓ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４５  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  １６  ＭＵ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４４  ＭＵ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  ４３、ｖＢ＿Ｐｓａ  ст  １１  Ｋ、ｖＢ＿Ｐｓａ  １６３８、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｓ−２、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３５  ＣＴ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３５  Ｍ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｓ．Ｃｈ．Ｌ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｒ１、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＳＡＮ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｌ２４、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｆ８、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−４、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−２（８）、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−１（１０）、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−４−１６、ｖＢ＿Ｐｓａ  ＢＴ−５、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｆ−２、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｂ−ＣＦ、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ７／３２、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ７／６３、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ５／３２、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ８／１６、ｖＢ＿Ｐｓａ  Ｐｈ１１／１、ｖＢ＿Ｐｓａ、ｖＢ＿Ｐｓａ  ３、ｖＢ＿Ｐｓａ  ４、ｖＢ＿Ｐｓａ  ５、ｖＢ＿Ｐｓａ  ６、ｖＢ＿Ｐｓａ  ７、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｐ．１５、ｖＢ＿Ｐｓａ．１７、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．��８、ｖＢ＿Ｐｓａ．２８、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ  ３、ｖＢ＿Ｐｓａ．２３、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｐ．８、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．ＰＳＴ７、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ．Ｃ５、ｖＢ＿Ｐｓａ．Ｍ  Ｄ１０３８が挙げられる。さらなる実施形態において、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉに特異的なバクテリオファージも、本発明に適用することができる。このような容菌ファージ又はテンペレートファージは、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｂ３７、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｇ８６５、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｇ８６６、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｕ７、ｖＢ＿Ａｂａ  Ｕ８、ｖＢ＿Ａｃｂ  １、ｖＢ＿Ａｃｂ  ２の何れか１つを含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、エンテロバクターに特異的なバクテリオファージ、特に、ｖＢ＿Ｅｂ  １、ｖＢ＿Ｅｂ  ２、ｖＢ＿Ｅｂ  ３、ｖＢ＿Ｅｂ  ４バクテリオファージの何れか１つを本発明のキット及び方法に使用してもよい。いくつかのさらなる実施形態において、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ特異的バクテリオファージを使用してもよい。いくつかの非限定的な例として、ｖＢ＿Ｅｃ  １、ｖＢ＿Ｅｃ  ２、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．４、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．５バクテリオファージの何れか１つを含む。
【００５７】
いくつかのさらなる実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特異的に感染するバクテリオファージ、例えば、ｖＢ＿ＢａＫ１、ｖＢ＿ＢａＫ２、ｖＢ＿ＢａＫ６、ｖＢ＿ＢａＫ７、ｖＢ＿ＢａＫ９、ｖＢ＿ＢａＫ１０、ｖＢ＿ＢａＫ１１、ｖＢ＿ＢａＫ１２、ｖＢ＿ＢａＧａ４、ｖＢ＿ＢａＧａ５、ｖＢ＿ＢａＧａ６も本発明に適用することができる。さらに、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓに特異的なバクテリオファージとして、例えば、Ｔｂ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＩＶ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  Ｖ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＶＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＶＩＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＶＩＩＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＩＸ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  Ｘ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＸＩＩ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １２（ｂ）、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ＢＡ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ５４４、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １４１я、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １４１ｍ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １９я、ｖＢ＿ＢｒａＰ  １９ｍ、ｖＢ＿ＢｒａＰ  ９、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓに特異的なバクテリオファージとして、特にｖＢ＿ＢｒｃＰ  １０６６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｉｇｅｎｅｓＡ．Ｂ．Ｃ．Ｄ．Ｅに特異的なバクテリオファージとして、例えば、ｖＢ＿ＣｐＰＩ、ｖＢ＿ＣｐＩＩ、ｖＢ＿ＣｐＩＩＩ、ｖＢ＿ＣｐＩＶ、ｖＢ＿Ｅｃ  １、ｖＢ＿Ｅｃ  ２、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．４、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．５、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓに特異的なバクテリオファージとして、ｖＢ＿ＤｖＲＣＨ１／Ｍ１、ｖＢ＿ＤｖＨ／Ｐ１５、ｖＢ＿ＤｖＨ／Ｍ１５、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓに特異的なバクテリオファージとして、ｖＢ＿Ｅｃ  １、ｖＢ＿Ｅｃ  ２、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．４、ｖＢ＿Ｅｎｆ．Ｓ．５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに特異的なバクテリオファージとして、特に、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．ｐｏｄ  ９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｐｏｄ  ４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｍｙ  ２、ＰｈＩ−１、ＰｈＩ−２、ＰｈＩ３、ＰｈＩ４、ＰｈＩ５、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ５、ＤＤＩＩ、ＤＤＶＩ、ＤＤＶＩＩ、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ７／２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １１６１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １１／２４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ３／１４、ｖＢ＿Ｓａｕ  Ａ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｇ、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  Ｗ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＧＥ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ９０／２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ５／２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １２／２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｈ、Ｔ３、Ｔ６、Ｔ７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １２１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ＢａＫ２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ｌ７−１０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  Ф８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ２７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ＭＹ、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １３、���Ｂ＿Ｅｓｃｈｃ  １７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  １９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２６、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ２９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３２、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３７、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３８、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ３９、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ  ４６、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｍ．１、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｍ．２、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．３、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．４、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．５、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．６、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．７、ｖＢ＿Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｐ．８、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉに特異的なファージとして、特に、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  １、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  ２、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  ３、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  ３ｂ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｊｅｒｓｅｙ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｂｅｅｃｌｅｓ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｔａｕｎｔｏｎ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  ＤｉａｇＢ．Ａ．Ｏ．Ｒ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｄｕｎｄｅｅ、ｖＢ＿  ＳＰＢＤｉａｇＷｏｒｋｓｏｐ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｅ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｄ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｆ、ｖＢ＿  ＳＰＢ  Ｄｉａｇ  Ｈ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ  ａｂｄｏｍｉｎａｌｉｓに特異的なファージとして、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ａ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｂ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｂ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ３、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ４、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ５、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ６、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｃ７、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ１，ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ４、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ５、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ６、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ７、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｄ８、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ５、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｅ１０、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｆ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｆ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｆ５、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｇ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｈ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｊ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｊ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｋ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｌ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｌ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｍ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｍ２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｎ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｏ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｔ、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  Ｖｉ１、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ２７、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ２８、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ３８、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ３９、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ４０、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ４２、ｖＢ＿  Ｓｔａ  Ｄｉａｇ  ４６、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐ���ｉｍｕｒｉｕｍ、特に、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｍｙ  １１、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｍｙ  ２８、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｓｈｉｓ  １３、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｍｙ  ７６０、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｓｈｉｓ  １、ＩＲＡ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  １９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ２０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ２１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ２９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  ５１２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  Ｉ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＶ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  Ｖ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＶＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＶＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＶＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＩＸ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  Ｘ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＶ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＶＩＩＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＩＸ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＸ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ＸＸＩ、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  １９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ２９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ３９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ４９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５５、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５６、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５７、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５８、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ５９、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６０、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６１、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６２、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａ���  ６３、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６４、ｖＢ＿Ｓｔｍ  Ｄｉａｇ  ６５、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．１、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．２、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．３、ｖＢ＿Ｓｔｍ．Ｐ．４、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉに特異的なファージとして、特に、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐｏｄ  ３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ７／２０、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １１６１、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６３、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  ８９６２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＧＥ２５、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  Ｗ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｇ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ３／１４、ｖＢ＿Ｅｓｃｈｃ．Ｓｈｉｓ  １８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８  Г、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８  Ｙ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１８８  Ｘ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ５５１４、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−４、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−５、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｌ７−１１、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｋ３、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＴｕＩ  Ａ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｏｘ２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＳＣＬ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  Ｂａｋ  Ｃ２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ４／１１８８，ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ８９６２、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ８９６３、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ＸＩＶ、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １１６、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １０６／８、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ２０、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ９０／２５、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  ８７／２５、ｖＢ＿Ｓｈｉｓ  １６／２５、ｖＢ＿Ｓｈｓ  ７、ｖＢ＿Ｓｈｓ  ３８、ｖＢ＿Ｓｈｓ  ９２、ｖＢ＿Ｓｈｓ  １３９１、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐ．１、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐ．２、ｖＢ＿Ｓｈｓ．Ｐ．３が挙げられる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法によって宿主認識要素を調製するための送達ビヒクルとして本明細書に挙げられ、開示されたバクテリオファージの使用を含み、本発明の態様（複数可）にも定義されるように、当該宿主認識要素を含む送達ビヒクルの調製にも適していることが理解される。さらにいくつかの実施形態において、本発明の方法及び改変バクテリオファージに適用可能な認識要素は、尾及び繊維タンパク質に関連して以降に記述されるように、本明細書に挙げたバクテリオファージ又は本発明に開示したバクテリオファージ、その組み合わせ、変異体、バリアント又はオルソログに由来してもよい。
【００５９】
本発明は、宿主認識要素を識別し、最適化し、調製する方法を提供する。本発明のいくつかのさらなる態様において、これらの宿主認識要素は、目的の標的宿主細胞（複数可）に適合性の改善された送達ビヒクルを調製するために使用することができる。
【００６０】
「宿主認識要素」という用語は、本明細書で使用する場合、「宿主決定タンパク質」とも呼ばれ、すなわち、送達ビヒクルと宿主との相互作用を媒介する要素である送達宿主認識に関連するビヒクル要素を含む。特に、宿主認識要素という用語は、バクテリオファージの尾末端に局在化したバクテリオファージ成分を指す。さらに、「宿主認識要素」は、本明細書において最も広義に解釈することができ、したがって、いくつかの実施形態において、宿主認識、宿主への付着、核酸分子（又は他の形質導入した物質）の注入、さらに宿主内に注入された物質（例えば、宿主制限酵素等への耐性）、又は本明細書に記載のプロセスのステージに関係する要素、又はその組み合わせの少なくとも１つに関係し、容易にし、改善する送達ビヒクルの要素を含むことができる。本発明は、したがって、宿主認識要素又は宿主認識、付着、浸透、注入及び注入された物質（例えば核酸分子）の安定性の少なくとも１つに関係する要素の調製、単離、識別、改善及び最適化の少なくとも１つを行う効果的な方法を提供する。
【００６１】
前述のように、本発明の方法は、宿主認識要素（複数可）をコードする複数の核酸配列を変異誘発することを含みうる。「改変する」又は「変異する」又は「変異誘発する」という用語は、少なくとも１つの宿主認識要素をコードする未変性の核酸配列が変化し、修正され又は変異することを意味する。核酸配列を変異するための技術分野で周知の手順は、変異した核酸配列を得るために使用することができ、特に、その方法の例として、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、ＭＰ６等の変異誘発プラスミド、又は他の変異原、又はＤＮＡ合成又は修復に関連する低フィデリティータンパク質（複数可）の使用が挙げられる。「変異原」という用語は、所与の生命システム、例えば宿主細胞において、システムの変異の自然発生レベル以上にまで変異を誘発し、又は変異速度を増加する剤を指す。いくつかの例示的な変異原として、限定されないが、塩基類似体、脱アミノ剤（例えば亜硝酸）、挿入剤（例えば臭化エチジウム）、アルキル化剤（例えばエチルニトロソウレア）、トランスポゾン、臭素、アジド塩、ソラレン、ベンゼン、３−クロロ−４−（ジクロロメチル）−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン（ＭＸ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７７４３９−７６−０）、０，０−ジメチル−Ｓ−（フタルイミドメチル）ホスホロジチオ酸（ｐｈｏｓ−ｍｅｔ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７３２−１１−  ６）、ホルムアルデヒド（ＣＡＳ  ｎｏ．５０−００−０）、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド（ＡＦ−２）（ＣＡＳ  ｎｏ．３６８８−５３−７）、グリオキサール（ＣＡＳ  ｎｏ．１０７−２２−２）、６−メルカプトプリン（ＣＡＳ  ｎｏ．５０−４４−２）、Ｎ−（トリクロロメチルチオ）−４−シクロヘキサン−１，２−ジカルボキシイミド（カプタン）（ＣＡＳ  ｎｏ．１３３−０６−２）、２−アミノプリン（ＣＡＳ  ｎｏ．４５２−０６−２）、メチルメタンスルホナート（ＭＭＳ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．６６−２７−３）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）（ＣＡＳ  Ｎｏ．５６−５７−５）、Ｎ４−アミノシチジン（ＣＡＳ  ｎｏ．５７２９４−７４−３）、アジ化ナトリウム（ＣＡＳ  ｎｏ．２６６２８−２２−８）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７５９−７３−９）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）（ＣＡＳ  ｎｏ．８２０−６０−０）、５−アザシチジン（ＣＡＳ  ｎｏ．３２０−６７−２）、クメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）（ＣＡＳ  ｎｏ．８０−１５−９）、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）（ＣＡＳ  ｎｏ．６２−５０−０）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＥＮＮＧ）（ＣＡＳ  ｎｏ．４２４５−７７−６）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７０−２５−７）、５−ジアゾウラシル（ＣＡＳ  ｎｏ．２４３５−７６−９）及びｔ−ブチルヒドロペロキシド（ＢＨＰ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７５−９１−２）が挙げられる。追加の変異原を使用することができ、本発明にはこの観点に限定されず、例えば、本発明の複数の核酸配列を電離放射線又は紫外線照射に供することができる。さらに、いくつかの実施形態において、宿主認識要素又はそのタ���パク質をコードする核酸配列をＭＰ６等の変異誘発プラスミドを使用して変異することができる。より具体的には、ＭＰ６プラスミド（Ｂａｄｒａｎ  ＡＨ１  ａｎｄ  Ｌｉｕ  ＤＲ、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５  ６：８４２５）は、基底レベルを上回る３２２，０００倍の変異を高めるＥ．ｃｏｌｉの強力な、誘導性、広域のベクターに基づく変異原性系である。ＸＬ１−Ｒｅｄ等の変異誘発株も本明細書に適用可能である。これらのシステムは、染色体、インビボのエピソーム及びウイルスの広域変異原性を可能にし、細菌とバクテリオファージ媒介性実験室進化プラットフォームの両方に適用することができ、したがって、本発明の方法によってステップ（ａ）で提供される複数の核酸配列を変異誘発するために適用することができる。
【００６２】
変異原又は変異原の組み合わせを、所与の核酸集団の望ましい変異速度を誘発する濃度又は暴露レベルで使用するべきであることもさらに留意されたい。
【００６３】
本発明の方法のステップ（ａ）の複数の核酸配列によって提供され、本明細書に記載の方法によって調製される宿主認識要素は、同時に、又は前述に開示した少なくとも１つの変異原を使用して変異させることができる。いくつかの実施形態において、得られた変異誘発した核酸配列は、少なくとも１つの変異を含みうる宿主認識要素をコードする。「変異」という用語は、本明細書で使用する場合、１つ（点変異体）以上のヌクレオチドの交換を指す。変異は、本明細書で使用する場合、点変異（複数可）、ナンセンス変異、ミスセンス変異、アミノ酸産物を変化させないサイレント変異、欠失（複数可）、挿入（複数可）、トランケーション（複数可）又は再編成を含むことが理解される。特定の実施形態において、このような変異によって、１つ以上のアミノ酸残基に対して得られたアミノ酸残基を交換することができる。この用語は、コード配列及び非コード配列、例えば、制御配列（例えば、表７に開示されるクローン＃１、＃２及び＃３の変異体に例示されるように、リボソーム結合部位であるシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列）等の変異を含むことが理解される。
【００６４】
変異は、したがって、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入又はその組み合わせになることができる。そのため、得られるタンパク質は不完全であり、又はさもなくば非機能的又は部分的に機能的なタンパク質になりうる。いくつかのさらなる代替の実施形態において、変異（複数可）は、得られるポリペプチド、この場合は宿主認識要素の機能を修正することができ、したがって、異なる宿主及び特に目的の宿主細胞（複数可）に対する宿主の特異性、又は競合能力を修正、及び／又は拡張、増加、向上させることができる。
【００６５】
アミノ酸「置換」は、１つのアミノ酸を、類似の又は異なる構造的及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸に置換した結果であり、すなわち、保存的アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は関与する残基の両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニン；中極性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン酸；正電荷（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ；負電荷（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【００６６】
例えば、置換は、脂質アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ又はＶ）が基の別の員で置換され、又は例えば、リジンについてアルギニン、アスパラギン酸についてグルタミン酸、又はアスパラギンについてグルタミンというように、極性残基を別の残基に置換して行うことができる。以下の８つの基のそれぞれが、互いにとって保存的な置換である他の例示的なアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
【００６７】
保存的核酸置換は、前述のように保存的アミノ酸置換になる核酸置換である。
【００６８】
「挿入」又は「欠失」は、本明細書に規定する宿主認識要素のアミノ酸配列にアミノ酸残基を加えること、又は同アミノ酸配列からアミノ酸残基を削除することを指す。挿入は、例えば、約１〜１０個の範囲のアミノ酸、特に１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸で行われる。より具体的には、約１、２又は３個のアミノ酸が挿入又は欠失する。アミノ酸の追加は、通常はせいぜい１００個、より具体的にはせいぜい８０個、より具体的にはせいぜい５０個、より具体的にはせいぜい２０個のアミノ酸が、本開示の宿主認識要素に加えられる、及び／又は挿入される。
【００６９】
「改変」は、以降に詳しく説明するように、例えば前述のように、本発明の方法によって調製した送達ビヒクルによって実行される本発明の宿主認識要素の未変性の核酸又はアミノ酸配列の変化である。
【００７０】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法のステップ（ａ）で提供される複数の核酸分子は、変異誘発し、例えば、第１宿主細胞に形質転換される前に又は後に変異原に供される。
【００７１】
前述のように、本発明の方法は、ステップ（ａ）で提供される複数の核酸分子を変異原に供することを含むことができ、それにより少なくとも１つの変異した宿主認識要素をコードする複数の核酸分子を得る。特定の実施形態において、得られる宿主認識要素のそれぞれ１つは、宿主認識要素の内部に含まれる繊維又は尾タンパク質（複数可）の少なくとも１つを変異又は改変することを少なくとも１つ含んでもよい。本発明の方法によって調製した宿主認識要素、例えば、ＧＯＴｒａＰを用いて、核酸配列を変異原に暴露するステップを用いて、調製した送達ビヒクルの特定の非限定的な例を図４Ｃ、５Ｂ及び７に開示する。より具体的には、本発明の宿主認識要素は、少なくとも１つの変異したＴ７  ｇｐ１７タンパク質、特に５４０位において変異を行う変異したＴ７遺伝子１７を含んでもよく、特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２３に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含むＤ５４０Ｎ変異体に示されるように、アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）をアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２４に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によって示されるように、核酸によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、５４０位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１７を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６２に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含みうるＤ５４０Ｙ変異体に示されるように、アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）をチロシン（Ｙ又はＴｙｒ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６３に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、５４１位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１７を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６４に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含みうるＳ５４１Ｒ変異体に示されるように、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）をアルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６５に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、４７９位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１７を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２５に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体によって示されるように、アミノ酸配列を含みうるＧ４７９Ｓ変異体に示されるように、グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）をセリン（Ｓ又はＳｅｒ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２６に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらに、宿主認識要素は、ファージＴ７に由来する変異した尾繊維ｇｐ１２、特に、７３３位において変異を有するＴ７  ｇｐ１２を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２７に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体によって示されるように、��ミノ酸配列を含みうるＧ７３３Ｄ変異体に示されるように、グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）をアスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２８に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、１０６位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１１を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含みうる  Ｒ１０６Ｑ変異体に示されるように、アルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）をグルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３０に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、宿主認識要素は、４０位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１１を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３１に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含みうる  Ａ４０Ｔ変異体に示されるように、アラニン（Ａ又はＡｌａ）をスレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３２に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、４８７位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１２を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３３に示す核酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含みうるＤ４８７Ｎ変異体に示されるように、アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）をアスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）で置換する。さらなるいくつかの実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３４に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、６９４位において変異を行う変異したＴ７遺伝子１２を含んでもよく、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５８又はその誘導体によって示されるように、アミノ酸配列を含みうるＳ６９４Ｐ変異体に示されるように、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）をプロリン（Ｐ又はＰｒｏ）で置換する。いくつかのさらなる実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５９に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらに、宿主認識要素は、変異したＴ７遺伝子１２を含んでもよく、Ｔ７遺伝子１２は、６９４位において変異を有し、特に、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）をプロリン（Ｐ又はＰｒｏ）で置換し、及び７３３位における追加の変異を有し、、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６０に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体によって示されるように、アミノ酸配列を含みうる変異体であるＳ６９４Ｐ−Ｇ７３３Ｄ変異体に示されるように、グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）をアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）で置換する。いくつかのさらなる実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６１に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施��態において宿主認識要素は、５８０位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１２を含んでもよい。しかしながら、この変異は同位置のリジン残基（Ｋ５８０Ｋ）になるサイレント変異である。いくつかの実施形態において、このＴ７遺伝子１２  Ｋ５８０Ｋは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３５に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において宿主認識要素は、６９４位及び４８７位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１２、特にＳ６９４Ｐ、Ｄ４８７Ｎ変異を含んでもよい。このような変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０９に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１０に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において宿主認識要素は、６９４位、４８７位及び５８０位において変異を有する変異したＴ７遺伝子１２、特にＳ６９４Ｐ、Ｄ４８７Ｎ及び変異Ｋ５８０Ｋを含んでもよい。このような変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０９に示すアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、前記アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１１に示す核酸又はそのバリアントもしくは誘導体によってコードされてもよい。さらに、いくつかの実施形態において、本発明の変異体は、非コード領域に変異を有してもよい。より具体的には、いくつかの実施形態において、本発明の宿主認識要素をコードする核酸配列は、ＹｐｓＰ−Ｇバクテリオファージ又はそのバリアントもしくは変異体に由来するｇｐ１７遺伝子、例えば、ｇｐ１７の開始ＡＴＧコドンに対して−９ｂｐ上流のＧ（グアニン）からＡ（アデニン）の変異を有するｇｐ１７遺伝子を含んでもよい。さらにいくつかの実施形態において、ｇｐ１７遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３６によって示す核酸配列を含んでもよい。さらなるいくつかの他の実施形態において、本発明の宿主認識要素は、ＹｐｓＰ−Ｇバクテリオファージに由来するｇｐ１７遺伝子、例えば、ｇｐ１７の開始ＡＴＧコドンに対して−１０ｂｐ上流のＡ（アデニン）からＧ（グアニン）の変異を有するｇｐ１７遺伝子を含んでもよい。さらにいくつかの実施形態において、前記ｇｐ１７遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３７によって示す核酸配列を含んでもよい。本発明の送達ビヒクルに関連してより詳細に説明するように、特に、本発明の改変バクテリオファージ、その宿主認識要素は、未変性であっても、本明細書に開示する変異の少なくとも１つ、又はその組み合わせを含んでもよい異なるバクテリオファージの異なるタンパク質（例えば、ｇｐ１１、１２、１７）を含んでもよい。
【００７２】
本明細書に記載の方法、キット及び組成物のいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも２つのタンパク質、少なくとも３つのタンパク質又はそれ以上の数のタンパク質、特に、宿主受容体と相互作用する構造的バクテリオファージタンパク質（複数可）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、このような構造的バクテリオファージタンパク質は、バクテリオファージの尾領域に存在するタンパク質（複数可）であってもよい。技術分野で周知のように、バクテリオファージにおいて、尾は、大多数のファージに存在するタンパク質複合体であり、宿主認識及びゲノム送達に関与する。２つの主要な特徴が尾構造によってもたらされる。尾は、ＤＮＡ放出のチャンネルを形成する中心管状構造を有し、宿主認識の最初のステップに欠かせない繊維又はスパイクによって囲まれている。例えば、Ｔ７ファージの尾は、ｇｐ１１（アダプター）の十二量体（すなわち１２個のコピー）、及びｇｐ１２（ノズル）の六量体（すなわち６個のコピー）から構築され、そこにｇｐ１７の６つの三量体が付着する。Ｔ７の６つの尾繊維がアダプターとノズルの間のインターフェースに付着し、そのため、両方のタンパク質に接触する。アダプターリングは、ｇｐ８（８）の１２個のサブユニットから成るポータルと相互作用することによって、前形成された尾をプロヘッドに付着させる役割を担う。バクテリオファージの尾末端で局在化したバクテリオファージ成分は、「尾タンパク質」又は「尾−チューブタンパク質」（例えば、ｇｐ１１及びｇｐ１２を指す）及び尾繊維（ｇｐ１７を指す）として分類することができる。前述のように、本発明の宿主認識要素は、変異の組み合わせ、特に、本発明に開示する変異の組み合わせを含みうる本発明に開示するバクテリオファージに由来するこれらのタンパク質の少なくとも１つを含みうる。
【００７３】
したがって、バクテリオファージの尾末端で局在化したバクテリオファージ成分は、尾タンパク質（例えば、ｇｐ１１及びｇｐ１２を指す）及び尾繊維（ｇｐ１７を指す）として分類することができる。特定の実施形態において、本発明の宿主認識要素は、少なくとも１つの尾繊維又は少なくとも１つの尾タンパク質を含んでもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質は、尾タンパク質及び繊維タンパク質であってもよい。
【００７５】
特定の実施形態において、本明細書に記載の宿主認識要素は、ｇｐ１１、ｇｐ１２及びｇｐ１７の少なくとも１つ、又はその組み合わせを含んでもよい。いくつかの特定の非限定的な実施形態において、これらのタンパク質は、限定されないが、Ｔ７  ｇｐ１７、ｇｐ１１又はｇｐ１２、本明細書に記載のその変異体、又は以下に説明する未変性又は変異した異種バリアント、又はその組み合わせであってもよい。
【００７６】
本明細書に規定する標的細胞を感染させる自然発生のバクテリオファージの尾領域に存在するタンパク質は、特に、本発明の宿主認識要素の部分として、及びその組み合わせとして本開示に含まれる。特に、本開示は、Ｔ７様バクテリオファージの尾領域（例えば、「尾タンパク質」又は「尾−チューブタンパク質」）に存在するタンパク質に関する。
【００７７】
様々なバクテリオファージ（Ｔ７  ｇｐ１７異種タンパク質）の繊維タンパク質のアミノ酸配列の特定の非限定的な例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５５、６１、６７、７３及び７９によって示す。以降に開示する方法において、本明細書で使用する本発明の方法によって単離され、識別される宿主認識要素は、ｇｐ１７タンパク質、又は任意の相同体、オルソログ、又はその改変（複数可）又はバリアントを指してもよい。このようなｇｐ１７について特定の非限定的な例を表２に提供する（実験手順の節で開示し、それぞれのコード核酸配列を添付の配列表に記載する）。
【００７８】
言い換えれば、いくつかの実施形態において、本開示に係る宿主認識要素は、ＮＰ＿０４２００５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示される）、ＹＰ＿００２００３９７９．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で示される）、ＡＦＫ１３５３４．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示される）、ＮＰ＿５２３３４２．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示される）、ＡＦＫ１３４３８．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示される）、ＹＰ＿００１９４９７９０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示される）、ＹＰ＿００４３０６６９１．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示される）、ＮＰ＿８１３７８１．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示される）、ＹＰ＿００２００３８３０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５で示される）、ＹＰ＿００９１９６３７９．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９で示される）、ＹＰ＿００９２２６２１５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示される）、ＹＰ＿００３３４７５５５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１で示される）、ＹＰ＿００３３４７６４３．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７で示される）、ＹＰ＿００９２１５４９８．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３で示される）、ＮＰ＿８７７４７７．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９で示される）から選択される受託番号を有するアミノ酸配列を含む繊維タンパク質ｇｐ１７又はその改変もしくはフラグメントを含んでもよい。
【００７９】
前述のｇｐ１７様タンパク質のアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（腸内細菌ファージＴ７）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（腸内細菌ファージ１３ａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７（エルシニアファージＹｐｓＰ−Ｇ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８（腸内細菌ファージＴ３）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９（エルシニアファージＹｐＰ−Ｒ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０（サルモネラファージｐｈｉＳＧ−ＪＬ２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１（サルモネラファージＶｉ０６）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２（シュードモナスファージｇｈ−１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３（クレブシエラファージＫ１１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０（エンテロバクターファージｐｈｉＥａｐ−１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６（エンテロバクターファージＥ−２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２（クレブシエラファージＫＰ３２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８（クレブシエラファージＫＰ３４）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４（クレブシエラファージｖＢ＿ＫｐｎＰ＿ＫｐＶ２８９）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０（シュードモナスファージｐｈｉＫＭＶ）によって示される。特定の実施形態において、本明細書に規定する繊維タンパク質は、ｇｐ１７であってもよい。
【００８０】
特定の実施形態において、本開示の宿主認識要素は、Ｔ７遺伝子産物１７（ｇｐ１７）を含みうる。Ｔ７  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５によって示される核酸配列によってコードされ、６つの尾繊維を形成し、それぞれがｇｐ１７のホモ三量体から成る。ｇｐ１７尾繊維は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＬＰＳに最初に特異的に付着する役割を担うと考えられる。タンパク質三量体は、アミノ−末端尾−付着ドメイン、細長いシャフト、及びいくつかのノジュール（１０）から成るカルボキシル末端ドメインから成る捻じれた繊維を形成する。
【００８１】
したがって、本発明の宿主認識要素は、以前に記述した変異したｇｐ１７、あるいは自然発生又は変異した異種ｇｐ１７タンパク質、例えば、表２に開示するｇｐ１７タンパク質のそれぞれを含んでもよい。本発明の第２態様で詳細に示すように、これらの宿主認識要素は、本発明で調製した送達ビヒクルにトランスで提供してもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に規定する本発明の宿主認識要素の内部に含まれる尾タンパク質は、ｇｐ１１及びｇｐ１２の少なくとも１つであってもよい。
【００８３】
様々なバクテリオファージ（Ｔ７  ｇｐ１１及びｇｐ１２異種タンパク質）の尾タンパク質のアミノ酸配列の特定の非限定的な例を、実験手順において、以下の表２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、４７、５１、５３、５７、５９、６３、６５、６９、７１、７５及び７７に示す（核酸配列をコードするそれぞれを添付の配列表に記述し、表により示す）。
【００８４】
言い換えれば、本開示の宿主認識要素は、ＮＰ＿０４１９９９．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示される）、ＹＰ＿００４３０６６８５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で示される）、ＹＰ＿００１９４９７８４．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示される）、ＮＰ＿８１３７７５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示される）及びＹＰ＿００２００３８２４．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示される）、ＹＰ＿００９１９６３７３．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５で示される）、ＹＰ＿００９２２６２２１．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１で示される）、ＹＰ＿００３３４７５４９．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７で示される）、ＹＰ＿００３３４７６３８．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３で示される）、ＹＰ＿００９２１５４９２．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９で示される）及びＮＰ＿８７７４７２．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５で示される）から選択される受託番号を有するアミノ酸配列を有する尾タンパク質ｇｐ１１又はその改変、バリアントもしくはフラグメントを含んでもよい。
【００８５】
特定の実施形態において、前述のｇｐ１１様タンパク質のアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４（腸内細菌ファージＴ７）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５（サルモネラファージＶｉ０６）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６（サルモネラファージｐｈｉＳＧ−ＪＬ２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７（シュードモナスファージｇｈ−１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８（クレブシエラファージＫ１１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６（腸内細菌ファージｐｈｉＥａｐ−１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２（腸内細菌ファージＥ−２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８（クレブシエラファージＫＰ３２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４（クレブシエラファージＫＰ３４）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０（クレブシエラファージｖＢ＿ＫｐｎＰ＿ＫｐＶ２８９）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６（シュードモナスファージｐｈｉＫＭＶ）によって示される。
【００８６】
さらに、実施形態は、ＮＰ＿０４２０００．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示される）、ＹＰ＿００４３０６６８６．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で示される）、ＹＰ＿００１９４９７８５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で示される）、ＹＰ＿００２００３８２５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で示される）及びＮＰ＿８１３７７６．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される）、ＹＰ＿００９１９６３７４．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７で示される）、ＹＰ＿００９２２６２２０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３で示される）、ＹＰ＿００３３４７５５０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９で示される）、ＹＰ＿００３３４７６３９．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５で示される）、ＹＰ＿００９２１５４９３．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１で示される）及びＮＰ＿８７７４７３．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７で示される）から選択される受託番号を有するアミノ酸配列を有する尾タンパク質ｇｐ１２又はその改変、又はフラグメントを含む本開示の宿主認識要素を指す。
【００８７】
いくつかの実施形態において、前述のｇｐ１２様タンパク質のアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９（腸内細菌ファージＴ７）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０（サルモネラファージＶｉ０６）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１（サルモネラファージｐｈｉＳＧ−ＪＬ２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２（クレブシエラファージ  Ｋ１１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３（シュードモナスファージ  ｇｈ−１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８（腸内細菌ファージｐｈｉＥａｐ−１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４（腸内細菌ファージＥ−２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０（クレブシエラファージＫＰ３２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６（クレブシエラファージＫＰ３４）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２（クレブシエラファージｖＢ＿ＫｐｎＰ＿ＫｐＶ２８９）及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８（シュードモナスファージｐｈｉＫＭＶ）によって示される。
【００８８】
本開示の他の特定の実施形態において、宿主認識要素は、Ｔ７遺伝子産物１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で示されるアミノ酸配列を有し、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４で示される核酸配列でコードするＴ７  ｇｐ１１）及び／又はＴ７遺伝子産物１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示されるアミノ酸配列を有し、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９で示される核酸配列でコードするｇｐ１２）を含みうる。
【００８９】
前述のように、本明細書に規定する尾及び繊維タンパク質は、同じバクテリオファージ（又は他の送達ビヒクル）、特に変異した、さもなくば修飾タンパク質の何れかであってもよい。あるいは、認識要素の内部に含まれるこれらの尾又は繊維タンパク質は、本明細書に規定する少なくとも１つのバクテリオファージに由来してもよく、したがって、使用する宿主認識要素を含むバクテリオファージに対して異種性のタンパク質（複数可）として考えてもよい。これらのバクテリオファージは、本発明の他の態様に関連して本明細書により詳細に記述する。このような異種タンパク質は、変異されてもよいし、未変性の野生型形態であってもよい。
【００９０】
尾及び繊維タンパク質は、本発明によって開示されるバクテリオファージ、特に送達ビヒクル及びその組み合わせとして本明細書に示すバクテリオファージに由来してもよいことが理解される。
【００９１】
本発明の宿主認識要素が、変異体、特に本発明に開示する変異体又は本明細書に開示する組み合わせ又は変異体を含んでもよいことがさらに理解される。そのため、本発明の宿主認識要素は、本明細書に開示するタンパク質、特に、バクテリオファージのｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７、特に本明細書に開示するｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７又はその相同体を含んでもよい。「相同体」という用語は、本発明に規定するアミノ酸配列に最小の相同性、特に、例えば、認識要素のアミノ酸配列、又はｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７、又は前述に構造的に規定した本明細書に開示する変異体と、具体的には少なくとも約５０％、より具体的には少なくとも約７５％、さらに具体的には少なくとも約８５％、最も具体的には少なくとも約９５％の全体配列の相同性を保持するアミノ酸配列（ポリペプチド）を規定するために使用される。
【００９２】
前述に示すように、本開示は、前述のように、少なくとも１つの宿主認識要素又はそのタンパク質（例えば、ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７又はその組み合わせの少なくとも１つ）、又はその変異体、バリアント又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。「複数」という用語は、本明細書に規定するように、少なくとも１つ、少なくとも２つ、３つ、又はそれ以上の核酸分子、特に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００又はそれ以上、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又はそれ以上、１０、０００、２０、０００、３０、０００、４０、０００、５０、０００、６０、０００、７０、０００、８０、０００、９０、０００、１００、０００又はそれ以上、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０又はそれ以上の核酸分子を指す。ステップ（ａ）で提供する核酸分子は、直線又は環状のプラスミドＤＮＡとして提供することができる。さらなる実施形態において、当該分子は、プラスミドライブラリ、ファージミドライブラリ又は組み合わせのライブラリとして提供することができる。
【００９３】
前述に示したように、本発明で提供する核酸分子は、少なくとも１つの宿主認識要素、パッケージングシグナル及び少なくとも１つの選択可能な要素、又は前記要素をコードする核酸分子を含む、及び／又は発現する細胞を識別し、及び／又は選択することができる指示要素を含む。したがって、このような選択可能な要素は、検出可能部分、検出器、又は指示器であってもよく、あるいは、選択可能なマーカー又は要素であってもよい。選択的要素（本明細書では「選択可能な要素」とも記述する）は、利点、例えば増殖の利点、又は生存の利点、又は他のパラメータを提供する遺伝子（又は複数の遺伝子）であってもよい。非限定的な例は、選択可能なマーカーとして抗生物質耐性遺伝子の使用に関する。これらの遺伝子は、耐性を提供し、又は言い換えれば、細胞、特に細菌の抗菌薬に対する感受性を阻害、減少、抑制又は弱める。
【００９４】
「抗菌薬」という用語は、本明細書で使用する場合、抗菌作用（殺菌性又は静菌性の何れか）、すなわち、増殖を抑制し、及び／又は細菌、例えばグラム陽性菌及びグラム陰性菌を殺傷する能力を有する属性を指す。抗菌薬は、抗菌薬がない場合と比べて、少なくとも約１０％、２０％、３０％又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％又は少なくとも約７０％又は７０％以上、例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、又は３０％と７０％以上の間の整数の細菌の増殖を抑制し、生存率を減少させる薬剤であってもよい。別の方法で言い換えれば、抗菌薬は、抗菌薬がない場合と比べて、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％又は少なくとも約７０％又は７０％以上、又は３０％と７０％以上の間の整数の細菌等の細菌集団を減少させる剤である。一実施形態において、抗菌薬は、特に細菌細胞を標的にする剤である。別の実施形態において、抗菌薬は、細菌細胞に特に発現する経路を改変（すなわち阻害、又は活性化又は増加）する。抗菌薬として、化学物質、ペプチド（すなわち抗菌ペプチド）、ペプチド模倣、属性又は部分、又はそのハイブリッドの類似体、限定されないが、合成及び自然発生の非タンパク質性属性を含むことができる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、抗菌薬は化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分は、非置換又は置換アルキル、芳香族又はマクロライドを含むヘテロシクリル部分、レプトマイシン及び関連する自然産物又はその類似体を含む。抗菌薬は、望ましい作用及び／又は特性を有することが知られている属性であってもよく、又は多様な化合物のライブラリから選択することができる。
【００９６】
したがって、いくつかの実施形態において、複数の核酸分子として提供される核酸分子は、前述のように少なくとも１つの宿主認識要素、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び少なくとも１つの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【００９７】
「抗生物質耐性遺伝子」というフレーズは、本明細書で使用する場合、例えば、前記抗生物質化合物を破壊する酵素のためにコードすることによって、抗生物質化合物が細菌に進入するのを防ぎ、活性して抗生物質化合物を排出する表面タンパク質のためにコードすることによって、又は抗生物質の標的の変異形態になり、それによって抗生物質機能を防ぐことによって、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を指す。
【００９８】
本発明に係る選択的要素として有用な抗生物質耐性遺伝子として、限定されないが、ホスホマイシン耐性遺伝子ｆｏｓＢ、テトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＭ、カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼａａｄＤ、二官能基アミノグリコシド修飾酵素遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｃａｔ、ムピロシン耐性遺伝子ｉｌｅＳ２、バンコマイシン耐性遺伝子ｖａｎＸ、ｖａｎＲ、ｖａｎＨ、ｖｒａＥ、ｖｒａＤ、メチシリン耐性因子ｆｅｍＡ、ｆｍｔＡ、ｍｅｃｌ、ストレプトマイシンアデニリルトランスフェラーゼｓｐｃｌ、ｓｐｃ２、ａｎｔｌ、ａｎｔ２、ペクチノマイシンアデニリルトランスフェラーゼｓｐｄ、ａｎｔ９、ａａｄＡ２、テルル酸耐性遺伝子ｔｅｈＡ、ｔｅｈＢ、ｋｉｌＡ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子ｈｐｔ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ耐性遺伝子ｎｐｔ  ＩＩ、栄養要求性選択可能マーカー遺伝子ＵＲＡ３、ＭＥＴ１５／１７、ＬＹＳ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１及びＭＥＴ１５、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子ＡＰＲＴ、チミジンキナーゼ遺伝子ＴＫ１、ゼオシン耐性遺伝子ｓｈ  ｂｌｅ及び他の耐性遺伝子が挙げられる。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の選択可能な要素が抗生物質耐性遺伝子である場合、選択ステップ（ｄ）は、当該宿主細胞、特に、前記抗生物質再選択可能なマーカーの存在下で「第２宿主細胞」を増殖させることを含みうる。
【０１００】
選択的要素という用語は選択的条件（複数可）、例えばｌａｃ遺伝子下において、別の増殖利点を提供する遺伝子（又は複数の遺伝子）も含むことが理解される。このように、選択ステップ（ｄ）は、対応する条件（例えば、ラクトース、Ｘ−ｇａｌ等）、又は真核生物の宿主細胞ではチミジンキナーゼ下で前記宿主細胞を増殖させることを含む。
【０１０１】
さらに、本発明は、視覚化され、又は測定され、指示器として本明細書で使用される他の選択可能な要素又はマーカーを含んで、選択可能要素及び核酸分子を望ましい宿主細胞に形質導入することができる付着した適合性の宿主認識要素を含み、又は有する細胞を区別し、識別し、及び／又は選択することができることが理解される。
【０１０２】
「選択する」という用語は、本明細書で記述する場合、送達ビヒクル（例えばバクテリオファージ）バリアントによる選択可能な要素を含む核酸配列を注入し、又は形質導入することによって得られる選択可能な要素を含む宿主細胞（特に「第２宿主細胞（複数可）」）を単離するプロセスを指す。選択可能な要素を含む宿主細胞の選択は、例えば、抗生物質耐性遺伝子を有するバクテリオファージ（複数可）によって感染した宿主細胞を選択するために、抗生物質を含む培地を用いることによって、送達ビヒクルによって運ばれる選択可能な要素に対応する選択条件下で、行うことができる。指示器である選択可能な要素の場合、第２宿主細胞は、セルソーティングに適した方法、又は選択可能な要素を含む細胞を細胞分離する又は富化する方法によって、選択することができる。
【０１０３】
前述のように、本発明が提供する核酸配列は、パッケージングシグナルを含む。「パッケージングシグナル」という用語は、本明細書に規定する場合、例えば、ウイルス又はバクテリオファージゲノムを、感染サイクルの最中に事前に形成されたカプシド（エンベロープ）にパッケージングすることを指示するウイルス又はバクテリオファージゲノムのヌクレオチド配列を指す。
【０１０４】
いくつかの特定の実施形態において、パッケージングシグナルは、Ｔ７パッケージングシグナル、特に、以下にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で示されるＴ７  １６１−２０７、Ｔ７  ３８９８１−３９３６４及びＴ７  ３９７１８−３９９３７又はその組み合わせであってもよい。組み合わせについて非限定的な例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で示される。前述のパッケージングシグナルは、特にＴ７に適合性のパッケージングシグナルについての非限定的な例である。これらのパッケージングシグナルは、したがって、本発明の他の態様と関連して記述するように、特に、本発明の宿主認識要素を含む送達ビヒクルに関して、Ｔ７を本発明の送達ビヒクルとして使用する場合に、使用することができる。しかしながら、本発明に開示するバクテリオファージは、送達ビヒクルとして使用することができ（例えば、Ｍ１３、Ｐ１、ブドウ球菌ファージ等）、したがって、使用するファージ（複数可）に適合性のパッケージングシグナルを適用することができ、当該パッケージングシグナルは本発明に含まれることが理解される。
【０１０５】
前述のように、少なくとも１つの宿主認識要素又はそのバリアントもしくは変異体をコードする核酸分子は、当該宿主認識要素のタンパク質又はフラグメントもコードすることができる。
【０１０６】
より具体的には、核酸配列は、前に開示した尾及び繊維タンパク質、又はその組み合わせの少なくとも１つをコードすることができる。例えば、ｇｐ１１，ｇｐ１２及びｇｐ１７の少なくとも１つ；少なくとも１つのｇｐ１１、少なくとも１つのｇｐ１２及び少なくとも１つのｇｐ１７；少なくとも１つのｇｐ１１及び少なくとも１つのｇｐ１２；少なくとも１つのｇｐ１１及び少なくとも１つのｇｐ１７；少なくとも１つのｇｐ１２及び少なくとも１つのｇｐ１７、又はその変異体、バリアント、フラグメントもしくは組み合わせ、特に本発明に開示するバリアント又は変異体。
【０１０７】
「フラグメント」は、本明細書で使用する場合、特定の領域のアミノ酸又はＤＮＡ配列の部分を構成する。ペプチド配列のフラグメントは、特定の領域より短い少なくとも１つのアミノ酸であり、ＤＮＡ配列のフラグメントは、特定の領域より短い少なくとも１つの塩基対である。「バリアント」及び「変異体」は、本明細書で使用する場合、変異原の使用と関連する前に、本明細書で示される少なくとも１つの変異又は置換を有する宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質を指すことがさらに理解される。しかしながら、変異体という用語は、本明細書で使用する場合、変異原が存在しない場合に発生しうる（又は富化ステップの最中に単離されうる）自発的な変異も含む。
【０１０８】
さらに、本発明の方法は、本明細書に規定する複数の核酸分子を含む第１宿主細胞を、前記送達ビヒクルの伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの前記宿主認識要素又はそのタンパク質もしくはフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞に伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収するステップを伴う。
【０１０９】
「接触する」という用語は、バクテリオファージが宿主細胞に直接的又は間接的に接触するように、送達ビヒクル、例えば、本発明のバクテリオファージの位置を決めることを指す。そのため、本発明は、本発明で使用する送達ビヒクルを望ましい表面に適用することと、及び／又は細菌細胞に直接適用することの両方を考慮している。このような接触によって、送達ビヒクル、特に本発明で使用するバクテリオファージによる宿主細胞の感染を導く。
【０１１０】
「伝播」という用語は、本明細書に規定する場合、新しい個別の生物（すなわち、送達ビヒクル、例えばバクテリオファージ）が、その「親」から産生されるプロセスを指す。本明細書で使用する送達ビヒクルの伝播を可能にする条件は、とりわけ、温度は（例えば、ファージ及び宿主に応じて、４〜１００℃の範囲の温度、特に、Ｔ７の場合は１０〜４２℃の範囲の温度、より具体的には３７℃）、インキュベーション時間は、使用するファージ及び宿主に応じて１０分〜４８時間（Ｔ７の場合は１０〜１２０分のインキュベーション時間を適用することができる）、培地は、以下の実施例に示すように、送達ビヒクル（例えばファージ）による宿主細胞の感染に適した技術分野で周知の培地で、送達ビヒクルに受動的な第１宿主細胞を、少なくとも１つの送達ビヒクルでインキュベート又は接触させることを指す。
【０１１１】
伝播したファージの回収（又は収集）は、例えば、クロロホルム及び以下に例示する遠心分離を使用して、技術分野で周知の方法で実施することができる。人工的又はインビトロ系を「第１宿主細胞」として使用する場合、パッケージした得られたバリアント（例えば、インビトロパッケージング）はその後回収することが理解される。
【０１１２】
本開示の方法は、選択的条件下、又は選択可能な要素を検出することができる条件下で、本明細書に記載の方法によって得られる潜在的に適合性の送達ビヒクルバリアントに第２宿主細胞を接触させ、それによって目的の核酸分子を目的の標的細胞に送達することができる少なくとも１つの適合性の宿主認識要素を含む送達ビヒクルバリアント（複数可）を単離することをさらに伴う。「適合性の」という用語は、送達ビヒクル（例えば、バクテリオファージ）が、認識することができる宿主認識要素を運び、それにより本発明が提供する第２宿主細胞によって表される標的宿主細胞を感染させることを意味する。このようなバクテリオファージは、目的の核酸分子を標的細胞に形質導入することもできる。
【０１１３】
前述のように、本開示は、宿主認識要素又はステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から少なくとも１つの宿主認識要素をコードする核酸配列を単離し、特徴付け、第２宿主細胞及び獲得した選択的要素をこれらの細胞に感染させることを可能にすることに関する。それにより、適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を得る。より具体的には、「特徴付け」は、本明細書で使用する場合、適合性の認識要素を単離、精製、（例えば、制限マップを使用した）マッピング、シークエンシングすることを伴う方法を含む。
【０１１４】
本発明は、適合性であり、したがって、望ましい分子を認識し、目的の標的宿主細胞（複数可）に送達することができる少なくとも１つの宿主認識要素の調製、識別、特徴付け、改善及び最適化する方法を提供する。以下に記述する宿主細胞は、宿主認識要素を単離する態様、ならびに本発明に記載の態様及び方法、例えば、本発明の宿主認識要素を含む送達ビヒクル（複数可）を調製する方法に適用することができる。
【０１１５】
前述のように、本発明は、目的の望ましい標的宿主細胞に適合性の本発明の宿主認識要素を含む送達ビヒクルの効率的な調製方法を提供する。いくつかの実施形態において、適切な宿主認識要素を選択するために、「第２宿主細胞」を望ましい標的宿主細胞についてのモデルとして使用する。したがって、さらにいくつかの実施形態において、第２宿主細胞は、目的の標的細胞（複数可）に同一であっても、類似していてもよい。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、本開示に係る第２宿主細胞及び目的の前記標的細胞の少なくとも１つは、原核生物及び真核生物宿主細胞の何れか１つである。
【０１１７】
「宿主細胞」は、本明細書で使用する場合、技術分野で周知の手順を使用して、裸のＤＮＡ又は本明細書に規定する送達ビヒクルで、組み換えで形質転換し、形質導入し、又はトランスフェクトすることができる技術分野で周知の細胞を指す。「形質転換」及び「トランスフェクション」は、核酸媒介性遺伝子導入によって、核酸、例えば裸のＤＮＡ又は本明細書に規定する送達ビヒクルをレシピエント細胞に導入することを意味する。
【０１１８】
本開示に係る宿主細胞、特に目的の標的宿主細胞は、原核生物（膜結合核又は他の膜結合小器官を欠失している単細胞生物、例えば、細菌、例えば真正細菌及び古細菌）又は真核生物（動物細胞、植物細胞及び真菌細胞を含む膜内部に囲まれた核及び他の小器官を含む細胞）であってもよい。「真核生物細胞」という用語は、本明細書で使用する場合、技術分野で知られており、細胞質に特別な小器官、染色体に組織化された遺伝物質を封入している膜結合核、及び有糸分裂又は減数分裂による分裂の精巧なシステムを含む細胞を有する生物を指す。真核生物細胞の例として、限定されないが、動物細胞、植物細胞、真菌及び原生生物が挙げられる。より具体的には、動物とは動物界（後生動物とも呼ぶ）の多細胞、真核生物であり、脊椎動物と無脊椎動物に大きく分けることができる。脊椎動物は、背骨又は脊椎（脊柱）を有し、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳動物が挙げられる。背骨のない無脊椎動物として、軟体動物（二枚貝、カキ、タコ、イカ、カタツムリヘビ）；節足動物（ヤスデ、ムカデ、昆虫、クモ、サソリ、カニ、ロブスター、エビ）；環形動物（ミミズ、ヒル）、線虫（フィラリア、鉤虫）、扁形動物（条虫、肝蛭）、刺胞動物（クラゲ、イソギンチャク、サンゴ）、有櫛動物（クシクラゲ）及び海綿が挙げられる。したがって、本明細書で使用する動物細胞は、前に開示した動物細胞、特に哺乳動物細胞に由来する細胞に関する。
【０１１９】
さらに、本発明に係る真核生物の宿主細胞は、植物細胞であってもよい。植物は、主に多細胞であり、植物界の光合成の真核生物を主とする。この用語は、今日では、概して、顕花植物、針葉樹及び他の裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類、コケ及び緑藻を含むが紅藻及び褐藻は除外する、緑色植物「ｃｌａｄｅ  Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ」に限定される。植物細胞は、セルロース、ヘミセルロース及びペクチンを含む液胞及び細胞壁を特徴とする。さらに、本発明の方法で標的細胞として使用する真核生物の宿主細胞は、菌類であってもよい。菌類又は真菌類は、酵母及びカビ及びマッシュルーム等の微生物を含む真核生物のグループのメンバーである。
【０１２０】
さらなるいくつかの実施形態において、本発明で使用される宿主細胞は原生生物であってもよい。原生生物という用語は、顕微鏡生物、ならびにケルプ、紅藻及び粘菌等の特定の大きな多細胞真核生物のために保持される。本発明の態様で使用することができる原核生物の細胞を以下に記述する。
【０１２１】
本発明の方法、及び本発明の態様に記述する方法は、以降で、その異なるステップにおいて宿主細胞を使用することを伴う。これらの宿主細胞は、本発明では、「第１」、「第２」及び「第３」宿主細胞、ならびに目的の標的宿主細胞を指すが（第３宿主細胞は、本発明の宿主認識要素を含む送達ビヒクルの調製に関する他の態様に関連して記述される）、異なる宿主細胞であっても、あるいは同じ宿主細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、「第１」宿主細胞又は「産生宿主細胞」は、本発明の方法のステップ（ａ）で提供する複数の核酸分子によって運ばれ、又は形質転換し、又はトランスフェクションされる細胞である。これらの細胞を宿主認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントの多様性を示すため、異なる宿主認識要素の最初のパッケージングのために使用して、宿主認識要素の少なくとも１つのバリアント又はそのタンパク質をそれぞれ有する様々な送達ビヒクル、特にバクテリオファージを得る。いくつかの実施形態において、これらの第１宿主細胞は、本発明で使用する送達ビヒクルに許容的であってもよい。これらのバリアントバクテリオファージは、「第２」宿主細胞を使用して次のステップで選択される。
【０１２２】
いくつかのさらなる実施形態において、「第２」宿主細胞は、本明細書で使用する場合、目的の標的宿主細胞であってもよく、又は少なくとも、目的の標的細胞と充分に類似する細胞である。より特定の実施形態において、本発明の方法は、目的の核酸分子を認識し、「第２」宿主細胞によって表される標的細胞に形質導入することができる少なくとも１つの宿主認識要素を有する送達ビヒクルバリアントを識別することに関し、識別することを目的とする。これらの細胞は選択ステップで使用する。これらの「第２」宿主細胞又は目的の宿主細胞は、（前述の）真核生物細胞であってもよいし、原核生物細胞であってもよいことに留意されたい。いくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法で使用する「第２」宿主細胞は、標的細胞と同一であっても、類似していてもよい。宿主細胞の非限定的な例は、以下の実施例で使用するΔｔｒｘＡΔｗａａＣであってもよい。さらにいくつかの特定の非限定的な実施形態において、「第２宿主細胞」は、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡ；Ｓｓｏ４７２７、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｓｏｎｎｅｉ４７２７；Ｓｅｎ４５１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｔｒ．ＳＡＲＣ  ５；Ｋｐｎ４７１８，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  １００３１；Ｋｐｎ４８００ＩＩ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  ９９９７；Ｅｃｌ４７２３、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ亜種ｃｌｏａｃａｅ  ＡＴＣＣ  １３０４７；Ｓｅｎ４００１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＬＴ２；Ｋ３９０、クレブシエラ菌種３９０；Ｅａｅ４７３９、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ５１６９７；Ｓｅｎ４５１３、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ＰＴ４；Ｋｐｎ４７１９、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ１３８８２；及びＥｃｏ４５０７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２であってもよい。本明細書で使用するこれらの宿主細胞は、望ましい目的の標的宿主細胞である臨床的単離体を表すことができる。いくつかの実施形態において、目的の標的宿主細胞を反映することができる「第２宿主細胞」は、特徴付けられた又は特徴付けられていない細胞の同種集団、又は（少なくとも２つの異なる種類、株、単離体等を含む）あるいは特徴付けられた又は特徴付けられていない細胞の異種集団又は混合物を含んでもよい。これらの細胞は、目的の宿主細胞を反映して、周知で識別された細胞又は知られていない細胞であってもよく、目的の宿主細胞を含む生物学的又は環境的試料（感染した対象から得た試料、又はこれらの細胞を含む物質、表面又は物品から得た試料）から単離してもよい。
【０１２３】
さらに、特定の実施形態において、本発明の他の態様に関連して使用される「第３」宿主細胞は、本発明の送達ビヒクル、特に標的宿主細胞に適合性の少なくとも１つの宿主認識要素を有する改変バクテリオファージをパッケージング及び作製するための本発明の方法で使用する。いくつかの実施形態において、これらの「第３」宿主細胞は、本発明で作製したビヒクル（例えば改変バクテリオファージ）によって形質導入されるはずの目的の核酸分子を、標的宿主細胞にパッケージングするためにさらに使用することができる。これらの「第３宿主細胞」は、本明細書では、「産生細胞」としても示される（例えば図５Ａ）。
【０１２４】
前述のように、「第１」、「第２」及び「第３」宿主細胞及び目的の標的宿主細胞は、前述のように真核生物細胞、又はあるいは原核生物細胞、特に細菌細胞の何れかであってもよい。
【０１２５】
いくつかのさらなる実施形態において、「第２」宿主細胞及び目的の「標的宿主細胞」は、原核生物細胞、特に細菌細胞であってもよい。
【０１２６】
本開示に係る原核生物細胞は細菌細胞を含む。この文脈における「細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）」（単数形は「ｂａｃｔｅｒｉｕｍ」）は、単一細胞の微生物の種類を指す。本明細書では、用語「細菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）」と「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は同じ意味である。この用語は、基本的な形状、すなわち、球状（球菌）、桿体（桿菌）、らせん状（スピリルム）、コンマ（ビブリオ）又はコルク抜き（スピロヘータ）ならびに対、鎖又はクラスターで単一細胞として存在する細菌に従う一般的なクラスに属する細菌を含む。
【０１２７】
「細菌」という用語は、本明細書で使用する場合、単一細胞として、又は単一細胞のクラスター又は凝集体に存在する原核生物の微生物を指す。より特定の実施形態において、「細菌」という用語は、特に、グラム陽性、グラム陰性又は抗酸性生物を指す。グラム陽性細菌は、細菌分化のグラム染色法で使用するクリスタルバイオレット株を保持するものであると認識することができ、したがって、顕微鏡で紫色に見える。グラム陰性細菌は、陽性識別を可能にするクリスタルバイオレットを保持しない。言い換えれば、「細菌」という用語は、細胞膜の外側の細胞壁のより厚みのあるペプチドグリカン層を有する細菌（グラム陽性）、及び内側の細胞質細胞膜と細菌外膜との間で挟まれた細胞壁の薄いペプチドグリカン層を有する細菌（グラム陰性）に適用する。この用語は、さらに厚いペプチドグリカン層があるためにグラム陽性を染色するディノコッカス等のいくつかの細菌に適用するが、外細胞膜も有し、ｍｏｎｏｄｅｒｍ（グラム陽性）とｄｉｄｅｒｍ（グラム陰性）間の移動の中間体として示唆される。マイコバクテリウムのような抗酸性生物は、グラム染色等の通常の方法によって染色に抵抗するミコール酸と呼ばれる細胞壁の内側に脂質物質を大量に含む。
【０１２８】
目的の標的宿主細胞（「第２」宿主細胞としても使用する）の特に興味深い点は、院内感染に関与する細菌又はこのような細菌の混合物でありうることである。「院内感染」という用語は、病院での感染を指し、すなわち、病院環境、例えば、表面及び／又は医療従事者による発症が流行する感染症であり、入院中の患者に感染する。院内感染は、抗生物質に耐性のある生物によって潜在的に発生する感染症である。院内感染は、罹患率及び死亡率に影響を与え、かなりの経済的負荷が掛かる。抗生物質耐性の増加レベル及び入院患者の病気の重症率の増加の点で、この問題は早急の解決策を必要とする。
【０１２９】
一般的な院内の生物として、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｃｉ、耐性Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ及びＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａが挙げられる。
【０１３０】
院内感染病原体は、グラム陽性細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、グラム陽性球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、グラム陰性桿状生物（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ）、グラム陰性桿菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、好気性グラム陰性桿菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）及びグラム陰性好気性桿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａとして知られているＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）に分けることができる。その中でも、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａが非常に重要な院内グラム陰性好気性桿状病原体である。特に、非限定的な実施形態において、目的のこのような標的細胞は、抗生物質耐性標的細胞、又は当該細胞を含む混合物もしくは集団でありうる。「ＥＳＫＡＰＥ」病原体に適合性の宿主認識要素（複数可）を識別することが特に興味深い。本明細書に示されるように、これらの病原体として、限定されないが、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒが挙げられる。
【０１３１】
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種（特にＥＳＫＡＰＥ細菌）の少なくとも１つの株の細菌でありうる標的宿主細胞に関する。
【０１３２】
特定の実施形態において、細菌は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅ、Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの何れか１つであってもよい。
【０１３３】
さらなる実施形態において、本発明で示す細菌として、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓが挙げられる。
【０１３４】
他の特定の実施形態において、目的の標的細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ株、特に、Ｏ１５７：Ｈ７、腸管凝集性（ＥＡＥＣ）、腸管出血性（ＥＨＥＣ）、腸管侵入性（ＥＩＥＣ）、腸管病原性（ＥＰＥＣ）、腸内毒素原性（ＥＴＥＣ）、びまん付着性（ＤＡＥＣ）Ｅ．ｃｏｌｉであってもよい。
【０１３５】
さらなる実施形態において、本開示に係る原核生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、シュードモナス菌種、特に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、スタフィロコッカス種、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、連鎖球菌、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、サルモネラ菌種、シゲラ菌種、クロストリジウム菌種、特にＣｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、エンテロコッカス菌種、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、クレブシエラ菌種、特にＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、アシネトバクター菌種、特にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉ、エルシニア菌種、特にＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種又はその変異体、バリアント単離体又は組み合わせの少なくとも１つの細菌細胞であってもよい。さらにいくつかの実施形態において、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  Ｊｅｊｕｎｉ又はその単離体又はバリアントは、「第２細胞」及び／又は本発明に係る目的の標的細胞として、本明細書で使用することができる。
【０１３６】
いくつかのさらなる実施形態において、本明細書で使用する第２宿主細胞は、制限宿主であってもよく、当該細胞を感染させるバクテリオファージバリアント（すなわち、使用する送達ビヒクル）は、（自然では）当該制限宿主で伝播することができない。特定の実施形態において、本明細書で使用する「第２宿主細胞」によって表されるように、標的宿主細胞（第２宿主細胞と同一、又は充分に類似するかの何れかである）は制限宿主であってもよいことが理解される。言い換えれば、特定の実施形態において、本明細書に記載の標的細胞は、制限宿主細胞である。いくつかのさらなる実施形態において、本明細書の方法ステップ（ｃ）で使用する第２宿主細胞は、目的の標的細胞、又はその混合物もしくは集団、又は目的の標的細胞と充分に類似する細胞の何れかである細胞であってもよい。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、「第１」宿主細胞は、目的の標的細胞と異なる宿主細胞であってもよいと理解される。いくつかの実施形態において、第１宿主細胞は細菌細胞である。同様に、「第３」宿主細胞は、目的の宿主細胞と異なっていてもよく、それにより、細菌細胞であってもよいが、「第２」宿主細胞と異なっていてもよい。さらなる実施形態において、「第１」及び「第３」宿主細胞は、類似又は同一の細菌細胞であってもよい。それにもかかわらず、本明細書に記述したように、「宿主細胞」という用語は、本発明の方法、組成物、改変バクテリオファージ及びキットの何れかで使用する宿主細胞を指す場合、人工細胞又は細胞、小胞、細胞小器官及びインビトロのパッケージング系を模倣した系の使用をさらに含む。
【０１３８】
本発明は、本発明の方法によって調製し、又は生じた宿主認識要素をさらに含むことが理解される。さらなるいくつかの特定の実施形態において、本発明は、本発明で開示する宿主認識要素又はハイブリッド又は本明細書に開示する変異体をさらに含む。本発明は、本明細書で提供する宿主認識要素の内部に含まれるタンパク質、特に、本明細書で開示する変異ｇｐ１１、ｇｐ１２及びｇｐ１７変異タンパク質の何れかをさらに含む。
【０１３９】
別の態様によって、本発明は、核酸送達ビヒクルを調製する方法に関する。特に、広い宿主範囲を有する送達ビヒクルに関する。より特定の実施形態において、方法は、第１ステップ（ａ）において、少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子（複数可）を提供することを含んでもよい。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含むことに留意されたい。次のステップ（ｂ）は、前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞を、前記送達ビヒクルの伝播及び／又はパッケージングを可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な認識要素又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する少なくとも１つの送達ビヒクルに接触させることを伴う。このステップは、次に、これらの第１宿主細胞に伝播し、及び／又はパッケージした結果として得られる送達ビヒクルバリアントを回収する。次にステップ（ｃ）において、第２宿主細胞（複数可）をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアントに接触させる。その後、これらの第２宿主細胞は、選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得られる又は生じた細胞について、ステップ（ｄ）で選択される。次のステップ（ｅ）は、少なくとも１つの宿主認識要素又は同要素をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から単離し、及び／又は特徴付けして、第２宿主細胞（複数可）に適合性の少なくとも１つの宿主認識要素をコードする核酸配列を得ることを伴う。最後に、ステップ（ｆ）において、ステップ（ｅ）で得た適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を、第３宿主細胞に導入する。核酸配列の細胞への導入は、以降に詳細に説明するように、技術分野で周知の方法（例えば、トランスフェクション、形質導入及び形質転換）によって行うことができることに留意されたい。その後、これらの宿主細胞を、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素又はそのタンパク質（複数可）又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列を有する少なくとも１つの送達ビヒクルに接触させる。この関連において、以前に規定し、開示した送達ビヒクルは、本明細書に適用することができる。これは、いくつかの実施形態において、ステップ（ｅ）で得た適合性の宿主認識要素を含む前記送達ビヒクルのパッケージング及び／又は伝播を可能にする条件下で行う。したがって、このステップにより、いくつかの実施形態において、第３宿主細胞（複数可）によってトランスに提供されうる当該適合性の宿主認識要素を少なくとも１つ含む送達ビヒクルバリアント（複数可）を得る。本発明の方法で得た送達ビヒクルバリアントは、目的の核酸分子を目的の標的細胞に送達することができる。
【０１４０】
前述に説明したように、本開示は、とりわけ、本明細書に記載の複数の核酸分子を含む第１宿主細胞を送達ビヒクルに接触させ、第３宿主細胞を、本開示の方法で得た適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列で形質転換することに関する。いくつかの実施形態において、第１及び第３宿主細胞は、以下に記載し、特に本発明の発明者によって例示されるように、細菌細胞であってもよい。いくつかのさらなる実施形態において、宿主細胞は、同種又は株の細菌細胞であってもよい。第１及び第３宿主細胞は、「産生細胞」として、本明細書（例えば図３Ａ、５Ａ）にも示される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、第３宿主細胞は、少なくとも１つの宿主認識要素（複数可）（同一であっても異なっていてもよい）をコードする少なくとも１つの核酸配列を含みうる。そのため、本発明は、そのいくつかの実施形態において、このステップで得られ、少なくとも１つ以上の同一又は異なる宿主認識要素を含む送達ビヒクルをさらに含む。特に、少なくとも部分的に、互いに同一であっても異なっていてもよい少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上、より具体的には１〜１０個、さらに特定すると６つの異なる宿主認識要素を含む。少なくとも２つの異なる宿主認識要素を含む場合において、本発明の方法で調製した送達ビヒクルは、目的の少なくとも１つ以上の宿主細胞（複数可）に適合性であってもよい。このような場合では、当該ビヒクルの宿主範囲は拡張しうる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、「第１宿主細胞（複数可）」及び「第３宿主細胞（複数可）」の少なくとも１つは、本明細書では、「産生細胞」と呼ぶことができることに留意されたい。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、送達ビヒクルの伝播を支持し、したがって、そのパッケージング及び／又は調整及び回収のために使用する。さらにいくつかの実施形態において、本発明の方法は、望ましい標的細胞に適合性の送達ビヒクルを調製するために使用する。いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法で使用する「第２宿主細胞（複数可）」は、望ましい標的宿主細胞のモデルとして、目的の望ましい標的宿主細胞と同一又は充分に類似しうる。そのため、本発明の方法は、目的の望ましい標的宿主に特に適合性の送達ビヒクルの調製を目的としている。
【０１４３】
しかしながら、「細胞」（例えば、第１、第２、第３、産生細胞及び目的の宿主細胞（複数可））という場合、本発明は、本発明で例示し、開示する真核生物又は原核生物細胞のアドオンで、いくつかの実施形態では、細胞を模倣し、真似る他の系、人工細胞、小胞等を含むことが理解される。
【０１４４】
ステップ（ｂ）において、宿主認識要素（複数可）をコードする複数の核酸配列を含む細胞に送達ビヒクルを接触させるステップを示す場合、インビトロのパッケージング系も本発明に含まれることが理解される。したがって、いくつかの実施形態において、複数の核酸配列のパッケージングを可能にする条件で、複数の核酸配列を当該送達ビヒクルに接触させ又は暴露することも可能である。より具体的には、インビトロのパッケージングは、「細胞」として提供することができる水−油エマルジョンに水を滴下しても生じさせることができる。この方法は、ＩＣＶ（（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ばれ、タンパク質のインビトロの進化［（Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．Ｍａｎ−ｍａｄｅ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６、６５２−６５６（１９９８）］に開発されたが、ファージパッケージングのプラットフォームとしても使用することができる。したがって、いくつかの実施形態において、これらの系は、本発明に適用することができる人工的な系の非限定的な例でありうる。
【０１４５】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、前記送達ビヒクルの宿主範囲を拡張し、又は調整することに特に適用することができることに留意されたい。
【０１４６】
本明細書で使用する場合に、宿主範囲の文脈で「拡張する」又は「調整する」という用語は、特定の核酸送達ビヒクルの能力に影響を与え、変化させ、向上させ、調整し、又は変化させて、目的の核酸を認識し、その自然の宿主であるとは考えられない特定の宿主細胞に形質導入することを意味する。
【０１４７】
より具体的には、いくつかの実施形態において、核酸送達ビヒクルは、本発明に開示するように、宿主認識要素（複数可）、そのタンパク質、又はその組み合わせの少なくとも１つによって、宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントの少なくとも１つを置き換えるとき、自然の宿主ではない宿主を認識することができる。特に、他の自然発生の送達ビヒクル（複数可）（例えば異種宿主認識要素又はそのタンパク質）から、あるいは本発明のＧｏＴｒａＰプラットフォームによって実施した変異した又は変化した宿主認識要素で置き換えることによって、宿主認識要素を得る。本発明は、前述の組み合わせ、特に、そのコード領域又は非コード領域の何れかで、少なくとも１つの変異又は少なくとも２つの変異の組み合わせを有することができるハイブリッドビヒクルの使用をさらに含むことが理解される。
【０１４８】
より具体的には、このような置換は、（いくつかの実施形態において、不完全な認識要素を有する）本発明の送達ビヒクルによって、宿主認識要素をパッケージングする結果であってもよく、次に、その自然の宿主ではない宿主細胞の認識を可能にし、容易にすることができる。前述したように、置換宿主認識要素は、異なる宿主に特異的な異なる送達ビヒクルから生じた異種要素（複数可）、あるいは、変異され、又は変化して、宿主又は両方の宿主の組み合わせを認識する変化した同種認識要素（複数可）の何れかであってもよい。いくつかの特定の実施形態において、宿主認識要素又は少なくともいくつかの認識要素（複数可）を置換することによって、核酸送達ビヒクルは、その自然の宿主ではない宿主を認識することができる。さらなる実施形態において、このような非自然の宿主は、制限宿主又は非許容宿主であってもよい。
【０１４９】
「制限」又は「非許容」という用語は、本明細書で使用するとき、特定の核酸送達ビヒクルによる感染又は浸透、及び／又はその伝播を許容しない又は可能にしない宿主を指す。制限宿主細胞は、特定の核酸送達ビヒクルの浸透を禁止する細胞である。
【０１５０】
特定の実施形態において、目的の標的細胞に適合性の宿主認識要素（複数可）を識別し、及び／又は単離する方法では、前記第２宿主細胞は、目的の前記標的細胞（複数可）に同一又は類似してもよい。
【０１５１】
選択的ステップ（ｄ）における「第２宿主細胞」について、標的宿主細胞（例えば、臨床株、例えば、Ｓｓｏ４７２７、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｓｏｎｎｅｉ４７２７；Ｓｅｎ４５１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｔｒ．ＳＡＲＣ５；Ｋｐｎ４７１８、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１００３１；Ｋｐｎ４８００ＩＩ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ９９９７；Ｅｃｌ４７２３、ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ亜種ｃｌｏａｃａｅ  ＡＴＣＣ１３０４７；Ｓｅｎ４００１、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＬＴ２；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＡＴＣＣ１４０２８）；Ｋ３９０，クレブシエラ菌種３９０；Ｅａｅ４７３９、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ５１６９７；Ｓｅｎ４５１３、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓＰＴ４；Ｋｐｎ４７１９、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１３８８２；Ｅｃｏ４５０７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２、その組み合わせ、又は本発明で開示する細菌細胞）を使用することができる。あるいは、前記望ましい標的宿主細胞と類似性を示す宿主細胞モデル（例えば、ファージの増殖を支持せず、ファージ受容体を欠失しているΔｔｒｘＡΔｗａａＣ等の宿主株）を使用してもよい。さらに、特定の実施形態において、「第２宿主細胞」のように、臨床生物試料から得ることができる、特徴付けられた又は特徴付けられていない細胞の使用も本発明に含まれる。
【０１５２】
前述のように、本発明は、核酸送達ビヒクルの宿主範囲を拡張する又は調整する方法に関する。本開示に係る核酸送達ビヒクルの宿主範囲の調整は、とりわけ、宿主ビヒクル認識プラットフォームを変化させ、拡張し、又は調整するために、核酸送達ビヒクル、特にバクテリオファージを調整し、置き換え、又は変化させることによって可能となる。本発明は、さらに、少なくとも１つの宿主認識要素を、同一の又は異なる宿主認識要素に置き換え、それにより、同一又は異なっていてもよい少なくとも２つ以上の認識要素を含むビヒクルを提供し、さらに標的宿主（複数可）を認識しうることを含む。
【０１５３】
技術分野で周知のように、感染又は形質導入を開始するために、ファージは、宿主表面に吸着し、細胞壁を貫通し、遺伝物質を宿主に注入する必要がある。ファージゲノムの注入の前に細菌宿主への接続を開始するために使用するメカニズムは、尾として呼ばれ、特定の宿主認識に専念する吸着機構は、尾末端に局在化する。ファージと宿主の相互作用は、タンパク質又はリポ多糖（ＬＰＳ）であるファージ尾タンパク質と細菌受容体の間で生じる。これらの相互作用は、バクテリオファージの宿主特異性及び宿主範囲を決定する。
【０１５４】
バクテリオファージ等の送達ビヒクルの宿主範囲を拡張し、変化させるために、本発明は、少なくとも１つの宿主認識要素又はそのタンパク質もしくは部分を置き換えることに基づいて、適合性であり、そのため目的の宿主の認識を可能にする宿主認識要素を有する所与のバクテリオファージの方法を提供する。したがって、本開示は、少なくとも１つの宿主認識要素又はタンパク質、そのフラグメント部分、又はそのバリアントもしくは変異体をコードする複数の核酸分子を提供する。前述のように、これらの核酸分子は、バクテリオファージにパッケージングすることが可能な少なくとも１つのパッケージングシグナルをさらに含む。これらの核酸分子は、適切で、適合性の宿主認識要素を選択することを可能にする選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。
【０１５５】
いくつかの非限定的な実施形態において、核酸送達ビヒクルは、「適合性」であってもよく、又は他の自然発生の送達ビヒクルから得た宿主認識要素によって、送達ビヒクル、特にバクテリオファージにおいて、少なくとも１つの宿主認識要素を置き換えるときに、自然に許容されない（「制限的」又は非許容宿主）宿主細胞を認識してもよい。すなわち、少なくとも１つの宿主認識要素を、未変性であっても、改変されてもよい異種要素によって、置き換える。
【０１５６】
バクテリオファージ又はそのタンパク質、部分もしくはフラグメントの宿主認識要素を、（望ましい宿主の認識を可能にする）少なくとも１つの異種宿主認識要素で置き換えることに関して、これらの宿主認識要素がバクテリオファージに由来する要素であってもよいことが理解される。より具体的には、これらの宿主認識要素（複数可）は、前に本明細書で開示したバクテリオファージに由来してもよい。さらにいくつかの実施形態において、これらの認識要素は、（異種要素の場合は）未変性形態、あるいは変化形態、例えば、（異種又は同種要素の場合には）変異又はトランケートした形態、又はその組み合わせの何れかで使用してもよい。そのため、いくつかの他の非限定的な実施形態において、核酸送達ビヒクルは、以下に詳細に説明する宿主認識要素（複数可）の少なくとも１つを改変し又は変異するときに、自然では許容しない宿主に適合性であっても、認識してもよい。本発明の方法は、以前に規定した送達ビヒクルの調製に適しうる。
【０１５７】
さらなる実施形態において、本発明の方法によって調製される送達ビヒクルは、少なくとも１つのバクテリオファージであってもよい。前述のように、バクテリオファージは、例えば、ポドウイルス科、ミオウイルス科又はシホウイルス科、リポスリクスウイルス科又はルディウイルス科に由来しうる。
【０１５８】
いくつかのさらなる実施形態において、ビヒクルとして使用するバクテリオファージ及び／又は本発明の方法によって調製される改変バクテリオファージは、Ｔ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスの少なくとも１つでありうる。
【０１５９】
本発明で開示するバクテリオファージは、この態様にも適用することができることに留意されたい。
【０１６０】
特定の実施形態において、第２宿主細胞（複数可）及び目的の標的細胞（複数可）の少なくとも１つは、原核生物及び真核生物宿主細胞（複数可）の何れか１つであってもよい。
【０１６１】
より特定の実施形態において、このような原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、シゲラ菌種（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、サルモネラ菌種（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種又はその変異体、バリアント又はその組み合わせ又は混合物、又は試料に存在する特徴付けされた又は特徴付けされていない細胞の混合物の少なくとも１つの細菌細胞であってもよい。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、第１及び第３宿主細胞は細菌細胞である。いくつかのさらなる実施形態において、前記細胞は、同種株の細菌細胞であってもよい。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法で使用する第２宿主細胞は、制限宿主であってもよい。このように、前記宿主を感染させるバクテリオファージバリアントは、前記制限宿主では伝播することができない。
【０１６４】
さらなる実施形態において、宿主認識要素又はそのタンパク質もしくはフラグメントは、本発明で提供し、（未変性又は変化した）異種要素あるいは変化した又は変異した同種要素の何れかであってもよい。したがって、前述のように、本発明の方法は、特にＧｏＴｒａＰプラットフォームとして本明細書で示される場合、ステップ（ａ）で提供される複数の核酸分子を変異原に供することをさらに含むことができ、それにより少なくとも１つの変異した宿主認識要素をコードする複数の核酸分子を得ることが理解される。特定の実施形態において、本発明の方法の前記バージョンにおけるステップは、少なくとも１回、特に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００回以上繰り返してもよいことに留意されたい。特定の実施形態において、前記宿主認識要素のそれぞれは、少なくとも１つの変異又は改変を含む。
【０１６５】
さらに、特定の実施形態において、本発明の送達ビヒクルを調製するために、本明細書で使用する宿主認識要素は、バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含みうる。より具体的には、前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質は、尾タンパク質及び繊維タンパク質の少なくとも１つであってもよい。さらにいくつかの実施形態において、宿主認識要素は、線維、特にｇｐ１７を含みうる。いくつかのさらなる実施形態において、尾タンパク質は、ｇｐ１１及びｇｐ１２の少なくとも１つを含みうる。
【０１６６】
しかし、特定の実施形態において、本発明の方法で調製した送達ビヒクルの内部に含まれる宿主認識要素は、ｇｐ１１、ｇｐ１１及びｇｐ１７又はその組み合わせを含みうることが理解される。このような組み合わせの特定の非限定的な例として、本明細書に開示するバクテリオファージに由来する、及び／又は本発明に開示する変異及びその組み合わせを含むｇｐ１１、ｇｐ１２及びｇｐ１７；ｇｐ１１、ｇｐ１２及びｇｐ１７、ｇｐ１１及びｇｐ１２の１つ；ｇｐ１１及びｇｐ１７；ｇｐ１２及びｇｐ１７が挙げられる。
【０１６７】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法で提供する核酸分子は、宿主認識要素の他に、抗生物質耐性遺伝子でありうる選択可能な要素も含む。
【０１６８】
いくつかの特定の実施形態において、第２宿主細胞は、目的の標的細胞（複数可）に同一であっても、類似していてもよい。
【０１６９】
いくつかのさらなる実施形態において、第３宿主細胞（複数可）は、少なくとも１つのパッケージングシグナルに操作可能に連結してもよい目的の核酸分子を少なくとも１つさらに含んでもよい。したがって、このような実施形態において、ステップ（ｆ）で得た送達ビヒクルは、そこにパッケージされた目的の当該核酸分子さらに含んでもよい。
【０１７０】
本発明のさらなる態様は、目的の核酸分子を目的の標的宿主細胞に形質導入する方法に関し、方法は、以下のステップを含む。第１のステップ（ａ）において、少なくとも１つのパッケージングシグナルに操作可能に結合してもよい目的の核酸分子を提供する。次のステップ（ｂ）は、少なくとも１つの宿主認識要素（複数可）、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を提供することを伴う。特定の実施形態において、認識要素は目的の前記標的細胞に適合性であることに留意されたい。次のステップ（ｃ）は、（ａ）の核酸分子及び（ｂ）の核酸配列を産生宿主細胞（複数可）に導入して、目的の核酸分子及び目的の宿主に適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を含む宿主細胞を得ることを伴う。次にステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）で得た形質転換した宿主細胞（複数可）を、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させる。次に、ステップ（ｅ）において、（ｄ）の感染した宿主細胞から、宿主細胞にパッケージされた目的の核酸分子を含む送達ビヒクル（複数可）を回収する。回収した送達ビヒクルが、目的の標的細胞に適合性である適合性の宿主認識要素（複数可）を含むことに留意されたい。特定の実施形態において、宿主認識要素は、送達ビヒクルとして本発明によって使用されるバクテリオファージにトランスに提供されてもよい。
【０１７１】
次のステップ（ｆ）は、目的の標的細胞（複数可）を含む対象、組織、臓器、表面、物質及び物品の少なくとも１つの目的の標的細胞（複数可）を、ステップ（ｅ）で得た前記送達ビヒクル（複数可）の少なくとも１つの有効量に接触させ、それにより目的の前記核酸分子を目的の標的宿主細胞に伝達することを伴う。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）において、本明細書で使用する場合の「産生宿主細胞」は、本発明の他の態様と関連して、前述の「第３宿主細胞」と同等でありうる。本明細書のステップ（ｃ）で使用する場合の「宿主細胞に導入すること」という用語は、外因性ＤＮＡをこれらの細胞に組み込むことを指す。外因性ＤＮＡを宿主細胞に導入する非限定的な方法として、形質転換、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性形質転換及びリポソーム媒介性形質転換、電気穿孔法及びウイルスベクター形質導入が挙げられる。技術分野で認識されている外因性ＤＮＡ送達方法を使用して、目的の核酸分子及び／又は本発明の方法によって単離した宿主認識要素をコードする核酸配列を宿主細胞に導入することができる。さらに非限定的な例として、直接注入、アミノ酸媒介性遺伝子送達、遺伝子銃遺伝子送達及びヒートショックといった外因性ＤＮＡ送達方法を使用して、目的の核酸分子を導入することができる。
【０１７３】
前述のように、本発明の方法は、本発明の改善された送達ビヒクルを使用して、目的の少なくとも１つの核酸配列を望ましい宿主細胞に形質導入することを目的とする。
【０１７４】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」又は「核酸分子」という用語は、本明細書では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸のポリマーを指す。本明細書で使用する場合、「核酸（複数可）」（核酸分子又はヌクレオチドとも呼ばれる）は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成したフラグメント及びライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、及び一本鎖又は二本鎖の何れかのエキソヌクレアーゼ作用を指す。核酸分子は、（ＤＮＡ及びＲＮＡ等の）自然発生のヌクレオチド、又は（自然発生のヌクレオチドのα−エナンチオマー形態といった）自然発生ヌクレオチドの類似体、又は修飾ヌクレオチド又はその組み合わせから構成することができる。本明細書において、この用語は、ｃＤＮＡ、すなわち、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によるＲＮＡテンプレートから生成した相補的又はコピーＤＮＡも含む。
【０１７５】
本明細書で規定する「目的の核酸分子」という用語は、特定の非許容的宿主において、目的の標的宿主細胞（複数可）に望まれる挿入の核酸配列を指す。目的の核酸配列は、宿主細胞への形質導入が、性質、量、パーセンテージ、生存率、安定性、分布、位置、又は目的の標的細胞を含む細胞又は細胞集団の他のパラメータを操作することができるタンパク質産物又は産物をコードする制御配列又は配列の何れかでありうることに留意されたい。
【０１７６】
特定の実施形態において、目的の核酸配列は、以降に本明細書に開示するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含んでいてもよく、あるいは、望ましい物質、例えば、治療的、診断的又は産業上の利用性を有する物質をコードしてもよい。本発明が提供するプラットフォームの適用をいくつかを例証するいくつかの非限定的な実施形態は、本発明のビヒクル及び方法によって送達することができ、以降に本明細書に開示する有用な「目的の核酸配列」のいくつかの非限定的な実施形態も説明する。
【０１７７】
本発明は、核酸分子の送達に特に適合するビヒクルに関するが、本発明は、タンパク質、ポリペプチド及び小分子（又は、本発明のビヒクルによってパッケージすることができる他の物質）を目的の標的細胞に送達するための本発明の送達ビヒクルの使用をさらに含むことが理解される。
【０１７８】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法は、送達ビヒクル、特に本発明の改変バクテリオファージを有する標的細菌細胞を含む表面、物質又は物品、特に固体もしくは液体表面、物品又は物質において、標的細胞を接触させるステップを伴う。
【０１７９】
「接触する」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明のバクテリオファージが細菌細胞に直接的又は間接的に接触するように、本発明のバクテリオファージの位置を決めることを指す。そのため、本発明は、本発明のバクテリオファージを望ましい表面に適用することと、及び／又は細菌細胞に直接適用することの両方を考慮している。本発明で開示するバクテリオファージ、又はキット及びその組成物に表面を接触させることは、噴霧、拡散、湿潤、浸漬、液浸、塗布、超音波溶接、溶接、結合又は接着を含む技術分野で周知の方法を用いて行うことができる。本発明のこの態様に適用可能な様々な表面（生物学的又は非生物学的表面）は、本発明の方法及びビヒクルによる、細胞集団を操作する態様と関連して、本明細書の以降に記述する。
【０１８０】
さらに、本発明の方法は、目的の標的細胞を有効量のバクテリオファージ、本発明のキット及び組成物に接触させることをさらに含み、また、細胞は、対象、特に哺乳動物の対象の細胞である。そのため、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、必要とする対象に、有効量の本発明のバクテリオファージ、キット及び組成物を投与するステップをさらに含みうる。様々な適用可能な投与モードを、本発明の他の態様と関連して本明細書の以降に記述し、当該モードはこの態様にも全て適用することができる。
【０１８１】
特定の実施形態において、ステップ（ｂ）で提供される少なくとも１つの適合性の宿主認識要素（複数可）をコードする核酸配列（複数可）は、以下のステップを含む方法によって得ることができることに留意されたい。第１ステップ（ａ）では、少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含みうることに留意されたい。次のステップ（ｂ）では、前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルの伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞（複数可）に伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収する。次のステップ（ｃ）は、第２宿主細胞をステップ（ｂ）で得た／回収した送達ビヒクルバリアントに接触させることを伴う。ステップ（ｄ）では、前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞（複数可）のコロニーを選択し、ステップ（ｅ）では、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から宿主認識要素（複数可）をコードする核酸配列を単離し、特徴付けを行って、前記目的の標的細胞に適合性の適合する宿主認識要素をコードする核酸配列を得る。
【０１８２】
いくつかのさらなる実施形態において、適合性の宿主認識要素（複数可）は、本明細書に開示する実施形態において、本発明で規定する方法で提供することができる。
【０１８３】
いくつかの特定の実施形態において、オプション（ａ）で示すように、本発明の方法によって形質導入した目的の核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ系に基づいていてもよい。より具体的には、このような核酸配列は、目的の標的宿主細胞、例えば、細菌において、望ましくない又は病原性遺伝子を標的にする少なくとも１つの感作成分を含んでいてもよく、同時に、目的の形質導入された標的宿主細胞に選択的な利点を提供する。より具体的には、このような成分は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、細菌の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲ標的の少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特に不活性にすることに留意されたい。
【０１８４】
オプション（ｂ）に示す特定の代替又は追加の実施形態において、目的の核酸配列を本明細書で使用して、少なくとも１つのプロトスペーサー、特に、本明細書（オプション（ａ））に記載の感作成分のスペーサーによって標的にされた少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの核酸配列を含む本発明の改変バクテリオファージビヒクルを含む選択的成分を作製することができる。したがって、いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法は、選択的要素を調製するのに適用することができる。
【０１８５】
本発明は、本明細書に開示する少なくとも１つの選択的成分及び少なくとも１つの感作成分の組み合わせを含むキットをさらに提供することが理解される。
【０１８６】
さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明の方法は、目的の前記標的宿主細胞（複数可）を含む細胞集団を操作するために使用することができる。
【０１８７】
本発明は、本発明の方法によって調製した送達ビヒクルをさらに含むことが理解される。いくつかの特定の実施形態において、本発明は、本発明で開示する送達ビヒクルを含む。
本発明のさらなる態様は、以下を含むキットに関する。
【０１８８】
（ａ）少なくとも１つの宿主認識要素、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子。核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列、（ｂ）少なくとも１つの不完全な認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする不完全な核酸配列（複数可）を有する少なくとも１つの送達ビヒクル（バクテリオファージ）、任意に（ｃ）前記選択可能な要素を有する細胞を選択するために少なくとも１つの化合物をさらに含む。
【０１８９】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のキットで使用する送達ビヒクルは、少なくとも１つのバクテリオファージであってもよい。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、Ｔ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスの少なくとも１つであってもよい。
【０１９１】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットで使用する複数の核酸分子は、少なくとも１つの変異した宿主認識要素をコードしてもよい。特定の実施形態において、前記宿主認識要素又はそのタンパク質（複数可）のそれぞれは、少なくとも１つの変異又は改変を含む。
【０１９２】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のキットの宿主認識要素は、前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含みうる。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質は、尾タンパク質及び繊維タンパク質であってもよい。さらなる特定の実施形態において、繊維タンパク質は、ｇｐ１７であってもよい。いくつかのさらなる実施形態において、尾タンパク質は、ｇｐ１１及びｇｐ１２の少なくとも１つであってもよい。さらなる実施形態において、本発明の認識要素は、本明細書に開示する繊維と尾タンパク質の組み合わせを含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書に開示するバクテリオファージに由来する本明細書に開示する尾及び繊維タンパク質は、本発明のキットにも適用することができることが理解される。
【０１９４】
さらなる実施形態において、本発明のキットで使用する選択可能な要素は、抗生物質耐性遺伝子であってもよい。本発明の方法に関連して、本発明に開示する抗生物質耐性遺伝子又は選択可能な要素もこの態様に適用することができることが理解される。本発明は、本発明のキットの成分について容器又は他のパッキング方法をさらに含むことが理解される。このようなキットは、本発明の送達ビヒクルを調製するための説明書、方法、試薬、材料、酵素、バッファ、培地又は選択可能な要素をさらに含んでもよい。
【０１９５】
さらなる実施形態は、核酸送達ビヒクルの宿主範囲を拡張し、又は調整する方法において、前述の本発明のキットの使用を提供する。さらに特定の実施形態において、本発明のキットは、特に、前に指定した実施形態に開示したように、本発明の方法のために使用することができる。
【０１９６】
本発明は、新規の改変バクテリオファージ、特に、ＤＮＡを新しい望ましい宿主に形質導入するＴ７ハイブリッド粒子の設計を開示する。重要なこととして、このアプローチは、これらの宿主におけるファージの伝播を必要としない。したがって、先行技術の方法とは対照的に、このアプローチを宿主のスペクトルをファージの伝播を支持しないスペクトルにまで拡張するために使用することができる。これらの宿主は、（例えば表６に開示する）宿主のレパートリーのかなりの割合を構成する。これまで、ファージの伝播能力の依存性は、新しいファージ−宿主相互作用の検出を限定した。例えば、Ｌｕのグループによる最近の研究では、異なるファージ（１０）の尾を有するハイブリッドＴ７ファージカプシドを構築することに成功した。この研究は、これらのハイブリッド粒子の宿主範囲をＥ．ｃｏｌｉ以外の宿主の２、３個の株（クレブシエラの１つの株及びエルシニアの２つの株）にまで拡張しようとした。重要なこととして、本発明は、どれもＴ７伝播を支持しないため、Ｌｕのアプローチによって識別することができなかったクレブシエラ、サルモネラ、エシェリキア、シゲラ及びエンテロバクターのいくつかの種の宿主のスペクトル拡大した（表６）。本発明は、ハイブリッド粒子をＬｕの研究で識別された同クレブシエラにＤＮＡ形質導入することも実証した（図３Ｂ、Ｋ３９０）。本発明の発明者は、最適化したＤＮＡ形質導入ハイブリッド粒子を選択するプラットフォームであるＧＯＴｒａＰを開発することによって、新しい宿主に形質導入する効率性も最適化した。最後に、我々は、ハイブリッド粒子を、特にＤＮＡを望ましい宿主に移行するようにプログラムすることができることを実証した。
【０１９７】
ハイブリッド粒子は、ＤＮＡも有することができる自然のテンペレートファージを上回るいくつかの主要な利点を有する。第一に、このようなモジュラーのファージ粒子をカスタマイズすることは、それぞれの宿主について自然のテンペレートファージを単離し、特徴付けを行うよりも有効である。第二に、ハイブリッド粒子は望ましいプラスミドＤＮＡのみを有するが、複製コンピテントなファージＤＮＡは形質導入されない。このことは、潜在的に望ましくない副作用を有するファージ遺伝子も標的に運ばれるテンペレートファージによるＤＮＡ送達とは対照的である。第三に、モジュラーのハイブリッド粒子の単一の種類は、産生、制御及び生物学的モニタリングの容易性といったいくつかの異なるファージのカクテルを使用することに関連する多くの課題を克服する。
【０１９８】
本発明は、宿主受容体との尾の適合性を変化させることによって、ＤＮＡ形質導入の最適化を実証した。それにもかかわらず、宿主の制限酵素等のその他の因子がＤＮＡ形質導入の障害にもなりうる。これらの障害もＧＯＴｒａＰによって克服することができ、それはＧＯＴｒａＰが根本的なメカニズムに関わらず、ＤＮＡ形質導入の効率性を向上する変異体を選択するためである。これらの障害を克服する変異体の選択は、形質導入したＤＮＡと、いわゆる形質導入の有効性を増加させる表現型との結合によって可能となる。したがって、制限認識部位がＤＮＡの効率的な移行をブロックする場合、この部位において変異を獲得しているプラスミドがより良く形質導入し、富化する。さらに、この方法を使用して、制限酵素阻害因子（例えば、Ｔ７ファージの遺伝子０．３）をコードする遺伝子の代わりにプラスミドコード尾遺伝子を用いることによって、制限酵素の改善した阻害因子を単離することができる。この結合によって、その産物が効率的な形質導入を行う最適な遺伝子をコードする最適な形質導入したＤＮＡを富化することができる。したがって、ＧＯＴｒａＰは、ＤＮＡ形質導入効率の多くの態様を潜在的に解決することができる対象範囲の広い技術である。
【０１９９】
そのため、さらなる態様において、本発明は、本明細書において「本発明のビヒクル」とも呼ばれる改変バクテリオファージを提供する。より具体的には、改変バクテリオファージ又は本発明の送達ビヒクルは、（ａ）少なくとも１つの改変した宿主認識要素、及び任意に（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子を含むことができる。特定の実施形態において、改変した宿主認識要素は、目的の標的細胞に適合性でありうることに留意されたい。特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、目的の核酸分子を目的の標的細胞に形質導入することができる。
【０２００】
さらに、目的の標的宿主細胞は、特定の実施形態において、制限宿主となりうる。より具体的には、これらの実施形態において、本発明のバクテリオファージは、このような制限宿主を伝播することはできない。
【０２０１】
さらに、目的の標的細胞（複数可）は、原核生物及び真核生物の宿主細胞（複数可）、又はその混合物もしくは組み合わせの何れか１つであってもよい。
【０２０２】
特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージによって標的にされた原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、サルモネラ菌種、シゲラ菌種、Ｃｌｏｓｔｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ種又はその変異体、バリアント又はその組み合わせ又は混合物の少なくとも１つの細菌細胞であってもよい。
【０２０３】
特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、目的の核酸配列を望ましい宿主細胞に送達し、又は形質導入するために適合することができることに留意されたい。特に、方法、キット及び組成物の何れか１つと関連して、本発明に開示する宿主細胞の何れか１つを本明細書の前後で開示する。より特定すると、いくつかの実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、目的の少なくとも１つの宿主細胞又は目的のいくつかの宿主細胞又は目的の細胞の混合物と適合性となりうる「宿主認識要素」を含んでもよい。したがって、改変バクテリオファージは、少なくとも１つの宿主細胞又は様々な宿主細胞と適合性の宿主認識要素又はそのタンパク質もしくはフラグメントの組み合わせを含みうる。異なる宿主に適合性の異なる要素を組み合わせることによって、本発明の方法は、本発明の送達ビヒクルの宿主範囲をさらに拡張する。
【０２０４】
特定の実施形態において、本発明で使用する改変バクテリオファージは、Ｔ７様ウイルス及びＴ４様ウイルスの少なくとも１つであってもよい。より特定の実施形態において、バクテリオファージはＴ７様ウイルスであり、より具体的には、少なくとも１つの腸内細菌ファージＴ７である。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、本発明の改変バクテリオファージの宿主認識要素は、前記バクテリオファージの尾領域に存在する少なくとも１つのタンパク質を含みうる。いくつかの実施形態において、このようなタンパク質は、尾タンパク質及び繊維タンパク質の少なくとも１つであってもよい。
【０２０６】
さらなるより特定の実施形態において、繊維タンパク質は、ｇｐ１７であってもよい。さらなるいくつかの実施形態において、尾タンパク質は、ｇｐ１１及びｇｐ１２又はその組み合わせの少なくとも１つであってもよく、特に、本発明に開示するバクテリオファージに由来してもよい。
【０２０７】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージの宿主認識要素は、（同種又は異種の）変異した宿主認識要素であってもよい。
【０２０８】
さらなる実施形態において、本発明のバクテリオファージは、（目的の１つの標的宿主細胞又は複数の宿主細胞に特異的な）拡張し、又は改変した宿主範囲を有し、本発明の方法、特に本明細書に開示した実施形態に記載の方法によって調製してもよい。いくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、本発明に開示するバクテリオファージであってもよいし、本発明の方法で調製した改変バクテリオファージであってもよい。
【０２０９】
実施例によって説明し、前述で示したように、本発明は、本発明の改変バクテリオファージとしても呼ばれるハイブリッド形質導入粒子を提供する。前述のように、これらのハイブリッド粒子は、宿主認識要素又は本発明に開示する異種又は同種ファージに由来するタンパク質から成る本発明に開示するバクテリオファージから構成される、又は基づいていてもよい。図３Ｂは、異なる宿主細胞を効率的に形質導入するものとしても実証したこのようなハイブリッド粒子のいくつかの非限定的な例を示す。図３Ｂに表すハイブリッド粒子を以下に記述する。本発明の特定の実施形態は、本発明の宿主認識要素を含む様々な改変バクテリオファージを提供する。簡潔にするために、宿主認識要素を本明細書では「尾（複数可）」として示す。そのため、いくつかの特定の実施形態において、本発明は、ファージＴ７、特に未変性であっても、変異したものでもよいｇｐ１７、ｇｐ１１及びｇｐ１２タンパク質、又はその組み合わせに少なくとも部分的に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、Ｔ７  ｇｐ１１タンパク質を含むＴ７バクテリオファージであってもよい。いくつかのより特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０によって示されるアミノ酸配列を含むＴ７  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、尾として、Ｔ７  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５によって示されるアミノ酸配列を含むＴ７  ｇｐ１２を含む宿主認識要素、又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。本発明で提供する別の代替のＴ７粒子は、Ｔ７  ｇｐ１７タンパク質、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１によって示されるアミノ酸配列を含むｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡ）；Ｓｓｏ４７２７（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｓｏｎｎｅｉ４７２７）；Ｓｅｎ４５１０（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ａｒｉｚｏｎａｅ  ｓｔｒ．）ＳＡＲＣ５）；Ｋｐｎ４７１８（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ１００３１）；Ｋｐｎ４８００ＩＩ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＡＴＣＣ９９９７）；及びＥｃｌ４７２３（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ亜種クロアカＡＴＣＣ１３０４７）宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２１０】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＴ３に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｔ３  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。さらにいくつかの特定の実施形態において、このようなＴ３  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４によって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−Ｔ３ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｋｐｎ４８００ＩＩ及びＥｃｌ４７２３宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２１１】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＹｐｓＰ−Ｇに由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、ＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。さらにいくつかの特定の実施形態において、このようなＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３によって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。さらなるいくつかの実施形態において、このような特定のＴ７−ＹｐｓＰ−Ｇハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｋｐｎ４８００ＩＩ及びＥｃｌ４７２３宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２１２】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージ１３ａに由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、１３ａ  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。さらにいくつかの特定の実施形態において、このような１３ａ  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２によって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−１３ａハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｋｐｎ４８００ＩＩ及びＥｃｌ４７２３宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２１３】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＹｐＰ−Ｒに由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、ＹｐＰ−Ｒ  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。さらにいくつかの特定の実施形態において、このようなＹｐＰ−Ｒ  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５によって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−ＹｐＰ−Ｒハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｋｐｎ４８００ＩＩ宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２１４】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＶｉ０６に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｖｉ０６  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１によって示されるアミノ酸配列を含むＶｉ０６  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、Ｖｉ０６  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６によって示されるアミノ酸配列を含むＶｉ０６  ｇｐ１２を含む尾又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、Ｖｉ０６  ｇｐ１７に少なくとも部分的に由来する尾として、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７によって示されるアミノ酸配列を含むＶｉ０６  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−Ｖｉ０６ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｋｐｎ４８００ＩＩ；Ｓｅｎ４００１（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃ亜種ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＬＴ２）；Ｅｃｏ４５０７（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２）宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２１５】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージｇｈ−１に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、ｇｈ−１  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３によって示されるアミノ酸配列を含むｇｈ−１  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ｇｈ−１  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９によって示されるアミノ酸配列を含むｇｈ−１  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、このようなハイブリッドファージは、ｇｈ−１に少なくとも部分的に由来する尾として、ｇｈ−１  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８によって示されるアミノ酸配列を含むｇｈ−１  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−ｇｈ−１ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｋｐｎ４８００ＩＩ；Ｅｃｌ４７２３宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２１６】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージφＳＧ−ＪＬ２に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、φＳＧ−ＪＬ２  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２によって示されるアミノ酸配列を含むφＳＧ−ＪＬ２  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、φＳＧ−ＪＬ２  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７によって示されるアミノ酸配列を含むφＳＧ−ＪＬ２  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、φＳＧ−ＪＬ２  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６によって示されるアミノ酸配列を含むφＳＧ−ＪＬ２  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。さらなるいくつかの実施形態において、このような特定のＴ７−  φＳＧ−ＪＬ２ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０；Ｋｐｎ４７１８；Ｅｃｌ４７２３；Ｓｅｎ４００１；Ｓｅｎ４５１３（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓＰＴ４；Ｋｐｎ４７１９；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ１３８８２）宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２１７】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＫ１１に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｋ１１  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。いくつかのより特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４によって示されるアミノ酸配列を含むＫ１１  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、Ｋ１１  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８によって示されるアミノ酸配列を含むＫ１１  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、Ｋ１１  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９によって示されるアミノ酸配列を含むＫ１１ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−  Ｋ１１ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｋ３９０（クレブシエラ菌種）３９０）；宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２１８】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージφＥａｐ−１に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、φＥａｐ−１  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４５によって示されるアミノ酸配列を含むφＥａｐ−１  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、φＥａｐ−１  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４７によって示されるアミノ酸配列を含むφＥａｐ−１  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、φＥａｐ−１  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４９によって示されるアミノ酸配列を含むφＥａｐ−１  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−φＥａｐ−１ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｅａｅ４７３９（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  ５１６９７）宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２１９】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＥ−２に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｅ−２  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５１によって示されるアミノ酸配列を含むＥ−２  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、Ｅ−２  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５３によって示されるアミノ酸配列を含むＥ−２  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、Ｅ−２  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５５によって示されるアミノ酸配列を含むＥ−２  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−Ｅ−２ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２２０】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＫＰ３２に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、ＫＰ３２  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５７によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰ３２  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ＫＰ３２  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５９によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰ３２  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ＫＰ３２  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６１によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰ３２  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このような特定のＴ７−ＫＰ３２ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２２１】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＫＰ３４に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、ＫＰ３４  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６３によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰ３４  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ＫＰ３４  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６５によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰ３４  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ＫＰ３４  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６７によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰ３４  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。
【０２２２】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージＫＰＶ２８９に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、ＫＰＶ２８９  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６９によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰＶ２８９  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ＫＰＶ２８９  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７１によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰＶ２８９  ｇｐ１２タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、ＫＰＶ２８９  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７３によって示されるアミノ酸配列を含むＫＰＶ２８９  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。さらなるいくつかの実施形態において、このような特定のＴ７−ＫＰＶ２８９ハイブリッド粒子は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ；Ｓｓｏ４７２７；Ｓｅｎ４５１０宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２２３】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも部分的にファージφＫＭＶに由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、φＫＭＶ  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５によって示されるアミノ酸配列を含むφＫＭＶ  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、φＫＭＶ  ｇｐ１２、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７７によって示されるアミノ酸配列を含むφＫＭＶ  ｇｐ１２又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。あるいは、又は追加で、このようなハイブリッドファージは、φＫＭＶ  ｇｐ１７、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７９によって示されるアミノ酸配列を含むφＫＭＶ  ｇｐ１７又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。
【０２２４】
特定の実施形態において、本発明は、そのいくつかの実施形態において、本発明の方法のステップ（ａ）で提供する複数の核酸分子を、少なくとも１つの変異原（例えば、ＥＭＳ又はＭＰ６プラスミド）に供することを伴うＧＯＴｒａＰ技術によって改変バクテリオファージを提供する。この技術は、したがって、変異を、宿主範囲を拡張するハイブリッド粒子に導入することを伴う。本発明のこのような改変バクテリオファージについて、いくつかの非限定的な例は、Ｔ７ハイブリッドであるバクテリオファージを含んでもよい。いくつかの実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ファージＴ７に少なくとも部分的に由来する尾を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｄ５４０Ｎ変異を有するＴ７  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２３によって示されるアミノ酸配列を含むＤ５４０Ｎ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１７タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２４によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードされてもよい。さらなるいくつかの実施形態において、このようなＤ５４０Ｎ変異ハイブリッド粒子を有する特定のＴ７  ｇｐ１７タンパク質は、目的の望ましい核酸配列を、ＢＷ２５１１３Δｔｒｘ宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２２５】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＧＯＴｒａＰ技術によって、ファージＴ７に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｇ４７９Ｓ変異を有するＴ７  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２５によって示されるアミノ酸配列を含むＧ４７９Ｓ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１７タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２６によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードすることができる。いくつかのさらなる実施形態において、このようなＧ４７９Ｓ変異ハイブリッド粒子を有するＴ７  ｇｐ１７タンパク質は、目的の望ましい核酸配列を、Ｓｓｏ４７２７、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｓｏｎｎｅｉ４７２７宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２２６】
いくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明は、ＧＯＴｒａＰ技術によって、ファージＴ７に少なくとも部分的に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｔ７及びＧ７３３Ｄ変異を有するファージＴ７の繊維タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２７によって示されるアミノ酸配列を含むＧ７３３Ｄ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２８によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードすることができる。いくつかのさらなる実施形態において、このようなＧ７３３Ｄ変異ハイブリッド粒子を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質は、目的の望ましい核酸配列を、Ｋｐｎ４８００ＩＩ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亜種ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ  ９９９７宿主細胞の少なくとも１つに効率的に形質導入することができる。
【０２２７】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＧＯＴｒａＰ技術によって、ファージＴ７に少なくとも部分的に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｒ１０６Ｑ変異を有するＴ７  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９によって示されるアミノ酸配列を含むＲ１０６Ｑ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３０によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ａ４０Ｔ変異を有するＴ７  ｇｐ１１タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３１によって示されるアミノ酸配列を含むＡ４０Ｔ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１１タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３２によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードされてもよい。さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＧＯＴｒａＰ技術によって、Ｄ４８７Ｎ変異を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３３によって示されるアミノ酸配列を含むＤ４８７Ｎ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３４によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、Ｓ６９４Ｐ変異を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５８によって示されるアミノ酸配列を含むＳ６９４Ｐ変異タンパク質を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。特定の実施形態において、当該変異Ｔ７  ｇｐ１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５９によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードされてもよい。さらに本明細書に適用することができるＴ７  ｇｐ１２、例えばＳ６９４Ｐ−Ｇ７３３Ｄは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６０によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６１によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２２８】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＧＯＴｒａＰ技術によって、ＹｐｓＰ−Ｇバクテリオファージに少なくとも部分的に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。いくつかの特定の実施形態において、Ｔ７ハイブリッドは、遺伝子の非コード領域に変異を有するＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ｇｐ１７の開始ＡＴＧコドンに対して−９上流に位置するＧからＡの点変異を有するＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７核酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、このような変異したバクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３６によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのより特定の実施形態において、改変バクテリオファージは、ｇｐ１７の開始ＡＴＧコドンに対して−１０上流に位置するＡからＧの点変異を有するＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７核酸配列を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、このような変異したバクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３７によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。
【０２２９】
さらなるいくつかの実施形態において、このような特定のＴ７変異ハイブリッド粒子は、特に、非コード領域に指示した点変異を有するＴ７  ｇｐ１１Ｒ１０６Ｑ、Ｔ７ｇｐ１１Ａ４０Ｔ、Ｔ７ｇｐ１２Ｄ４８７Ｎ、ＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７の何れか１つであり、目的の望ましい核酸配列をＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ宿主細胞に効率的に形質導入することができる。
【０２３０】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、ＧＯＴｒａＰ技術によって、ファージＴ７ハイブリッドに少なくとも部分的に由来する尾を含むＴ７ハイブリッドであってもよい改変バクテリオファージを提供する。このようなファージは、サイレントＫ５８０Ｋ変異を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質を含んでもよい。より特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３５によって示される核酸配列又はそのバリアントもしくは変異体によってコードされてもよいＫ５８０Ｋ変異を有するＴ７  ｇｐ１２タンパク質を含んでもよい。本発明で提供するさらなるファージバリアントは、Ｓ６９４ＰとＤ４８７Ｎ変異の両方を含む  Ｔ７  ｇｐ１２タンパク質を含んでもよく、このようなｇｐ１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０９によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１０によって示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。さらなる実施形態において、本発明で提供するファージバリアントは、Ｓ６９４ＰとＤ４８７Ｎ及びＫ５８０Ｋ変異を含む  Ｔ７  ｇｐ１２タンパク質を含んでもよく、このようなｇｐ１２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０９によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１１によって示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２３１】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明で提供するＴ７バクテリオファージは、（本発明の方法のステップ（ａ）で提供される）複数の核酸配列を変異誘発プラスミドＭＰ６に暴露することによって得た変異した宿主認識要素を含むことができる。いくつかの特定の実施形態において、このような変異したバクテリオファージは、Ｄ５４０Ｙ変異を含むＴ７  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、このようなＴ７  ｇｐ１７  Ｄ５４０Ｙ変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６２によって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このようなＴ７  ｇｐ１７  Ｄ５４０Ｙ変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６３によって示される核酸配列によってコードされてもよい。
【０２３２】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明で提供するＴ７バクテリオファージは、ゾル化サイクルの最中に自発的に得られる変異した宿主認識要素を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、このような変異したバクテリオファージは、Ｓ５４１Ｒ変異を含むＴ７  ｇｐ１７タンパク質を含んでもよい。いくつかの特定の実施形態において、このようなＴ７  ｇｐ１７  Ｓ５４１Ｒ変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６４によって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは変異体を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このようなＴ７  ｇｐ１７  Ｓ５４１Ｒ変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６５によって示される核酸配列によってコードされてもよい。
【０２３３】
前述のように、送達ビヒクル（複数可）として提供する本発明の改変バクテリオファージは、前に開示した繊維又は尾タンパク質、その源又は組み合わせの宿主認識要素として含んでもよい。特定の実施形態において、このような改変バクテリオファージは、本明細書に開示する変異、特に、少なくとも２つ以上の組み合わせ、特にＴ７  ｇｐ１７  Ｄ５４０Ｎの１、２、３、４、５、６、７、８、９、２０、１１、１２、Ｔ７  ｇｐ１７  Ｇ４７９Ｓ、Ｔ７  ｇｐ１２  Ｇ７３３Ｄ、Ｔ７  ｇｐ１１  Ｒ１０６Ｑ、Ｔ７  ｇｐ１１  Ａ４０Ｔ、Ｔ７  ｇｐ１２  Ｄ４８７Ｎ、Ｔ７  ｇｐ１２  Ｓ６９４Ｐ、Ｔ７  ｇｐ１２  Ｋ５８０Ｋ、Ｔ７  ｇｐ１７  Ｄ５４０Ｙ、Ｔ７  ｇｐ１７  Ｓ５４１Ｒ、ｇｐ１７の開始コドンＡＴＧに対して−９上流に位置するＧからＡの点変異を有するＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７核酸配列、ｇｐ１７の開始コドンＡＴＧに対して−１０上流に位置するＡからＧの点変異を有するＹｐｓＰ−Ｇ  ｇｐ１７核酸配列、及びその組み合わせ又は他の変異体又はバリアントを有するその組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態においてこれらの組み合わせは、得られるビヒクルの宿主範囲を拡張する。さらに、異なる変異を有する異なるバクテリオファージの繊維又は尾タンパク質の組み合わせを含む認識要素についてのいくつかの例示的な非限定的な実施形態として、限定されないが、Ｔ７（ｇｐ１１−Ｒ１０６Ｑ、ｇｐ１２）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）が挙げられ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６６（本明細書ではクローン＃１としても呼ばれる）によってコードされる核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２９、１５又は１５８及び３；Ｔ７（ｇｐ１１−Ａ４０Ｔ、ｇｐ１２）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６７（本明細書ではクローン＃２としても呼ばれる）によってコードされる核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３１、１５又は１５８及び３；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２−Ｄ４８７Ｎ、Ｋ５８０Ｋ）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６８（本明細書ではクローン＃３としても呼ばれる）によってコードされる核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１３３又は２１３及び３［ＩＮＶＥＮＴＯＲ  ＰＬＥＡＳＥ  ＣＯＮＦＩＲＭ  ＳＥＱ  ＩＤ  １３３  ＨＥＲＥ］；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）及びｇｐ１７の開始コドンＡＴＧに対してＧ＝＞Ａ９ｂｐ上流の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６９（本明細書ではｍｕｔ１としても呼ばれる）によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び３；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）及びｇｐ１７の開始コドンＡＴ��に対してＡ＝＞Ｇ１０ｂｐ上流の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７０（本明細書ではｍｕｔ２としても呼ばれる）によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び３；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２、及びｇｐ１７Ｇ４７９Ｓ）の何れか１つによってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８９によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び１２５；Ｔ７  ｇｐ１２  Ｓ６９４Ｐに点変異を含むＴ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）発明者ｗｔ−Ｔ７の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７１によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び１；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７−Ｄ５４０Ｎ）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７２によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び１２３；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７−Ｄ５４０Ｙ）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７３によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び１６２；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７−Ｓ５４１Ｒ）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７４によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び１６４；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２）１３ａ（ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７５によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び２；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２）Ｔ３（ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７６によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び４；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２）ＹｐＰ−Ｒ（ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７７によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び５；Ｔ７（ｇｐ１１、ｇｐ１２）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７８によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１５又は１５８及び３；Ｖｉ０６（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７９によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１、１６又は７；ｇｈ−１（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８０によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３、１９及び８；ｐｈｉＳＧ−ＪＬ２（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８１によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１２、１７及び６；Ｋ１１（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８２によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４、１８及び９；ｐｈｉＥａｐ−１（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８３によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４５、４７及び４９；Ｅ−２（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８４によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５１、５３及び５５；ＫＰ３２（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８５によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５７、５９及び６１；ＫＰ３４（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８６によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６３、６５及び６７；ＫｐＶ２８９（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよ���、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８７によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６９、７１及び７３；ｐｈｉＫＭＶ（ｇｐ１１、ｇｐ１２、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１８８によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．７５、７７及び７９；Ｔ７（ｇｐ１１）１３ａ（Ｇ７３３Ｄ、ｇｐ１７）の何れか１つによって示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしてもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９０によって示される核酸配列によってコードされてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、これらの核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１０、１２７又は１６０及び２の何れか１つによって示されるアミノ酸配列又はそのバリアントもしくは誘導体を含むタンパク質をコードしてもよい。本発明で提供する特定のバクテリオファージは、本明細書では、非限定的な実施形態としてのみ示し、本明細書に開示する変異体又は本発明の方法によって得ることができる追加の変異体とさらに組み合わせることができる。これらの組み合わせは、いくつかの実施形態において、宿主細胞Ａに適合性の変異と、宿主細胞Ｂに適合性の変異を組み合わせることによって、特定のバクテリオファージの宿主範囲を拡張し、バクテリオファージは、宿主細胞ＡとＢに適合性となりうる両方の変異を含む。本発明は、いくつかの実施形態において、本発明の方法によって得られる宿主認識要素又はその組み合わせを含む本発明の方法によって調製した改変バクテリオファージを含むことがさらに理解される。
【０２３４】
本発明の改変バクテリオファージは、本明細書では、「改変した粒子」、「形質導入粒子」、「プログラムされた形質導入粒子」、「形質導入ビヒクル」、「本発明のビヒクル」、「バクテリオファージ又はファージ粒子」、「送達ビヒクル」等とも呼ぶことができ、全ては、本発明の方法によって調製したビヒクルに関する。
【０２３５】
前述に指定したように、本発明の改変バクテリオファージは目的の核酸配列を望ましい宿主細胞に形質導入するために使用される。
【０２３６】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、目的の核酸配列を含んでいてもよく、そのため、当該核酸配列を標的細胞に形質導入することができる。いくつかの特定の実施形態において、このような目的の核酸配列は、少なくとも１つの感作成分を含んでもよい。より具体的には、このような成分は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、標的宿主細胞、特に細菌の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特異的に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲ標的の少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特異的に不活性にすることを留意されたい。
【０２３７】
より具体的には、本発明の方法によって調製した送達ビヒクルの内部に含まれる宿主認識要素の高い特異性によって、本発明のこれらの改変バクテリオファージは、目的の核酸配列を特定の望ましい標的宿主細胞又は目的のいくつかの宿主細胞に特異的に送達するための強力なツールとして使用することができる。いくつかの実施形態において、例えば、特定の細胞亜集団の標的化削除、及び／又は望ましい亜集団による置換によって、あるいは、本発明の送達ビヒクルを用いて目的の核酸配列で形質導入される細胞の特定のサブグループによって、特定の物質の発現を誘導する（例えば、代謝経路、特定のペプチド又はタンパク質の発現の調整）ことによって、本発明の改変バクテリオファージは、異なる細胞集団、例えば、細菌細胞集団の組成物及び含有量を操作し、又は編集するための方法に使用することができる。いくつかの特定の実施形態において、本発明のビヒクルは、抗生物質耐性遺伝子を有する細菌細胞の特定の削除、及び抗生物質に感受性の亜集団又は細胞に置き換えるために使用することができる。他の実施形態において、本発明のビヒクルは、バイオフィルム形成に関与する細菌遺伝子を標的化することができる。さらにいくつかの他の実施形態において、本発明のビヒクルは、匂い物質を産生する細菌細胞を無臭の細胞に特別に置き換えるために使用することができる。いくつかの特定の実施形態において、標的細胞、例えば、抗生物質耐性遺伝子、又は毒性、病原性又は望ましくない産物をコードする遺伝子において、核酸配列を標的化削除及び破壊するために設計された特定のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、「目的の核酸」として使用し、本発明の送達ビヒクル（例えば、本発明に記載の改変バクテリオファージ）の内部にパックされてもよい。この技術において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、例えば、抗生物質耐性を与える特定のＤＮＡを破壊し、同時に抗生物質感作性細菌に対する選択的利点を与えるために使用する。選択的利点によって、本発明の送達ビヒクルによって形質導入されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有しない未処理の細菌に対して選択することによって、集団を抗生物質感作性細菌に効率的に置き換えることができる。より具体的には、いくつかの実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、有用であり、したがって、２つの成分を含むキット又は系に含めることができる。第１成分（ｉ）は、少なくとも１つのプロトスペーサーを含む核酸配列を含む選択的成分である。したがって、このような改変バクテリオファージに含まれる「目的の核酸配列」は、前記少なくとも１つのプロトスペーサーを含んでもよい。さらにいくつかの実施形態において、第２成分（ｉｉ）は、少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくとも１つのクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）アレイを含む少なくとも１つの感作成分を含む。ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、標的宿主細胞、特に細菌の病原性又は望ましくない遺伝子（細菌病原性又は望ましくない遺伝子）の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にして、標的宿主細胞の病原性又は望ましくない遺伝子を特に不活性にすることに留意されたい。さらに、さらなる実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分を特に不活性にするために、（ｉ）の選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にする。より特定の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーは、標的宿主細胞、特に細菌の少なくとも１つの病変性又は望ましくない遺伝子（又は当該遺伝子の部分）に含まれる核酸配列に充分に相補的であってもよく、このスペーサーは、当該細菌の少なくとも１つの病原性又は望ましくない遺伝子を標的にし、不活性にするように「プロトスペーサー」としても呼ばれる。これらの成分のそれぞれ（例えば、感作成分又は選択的成分）が本発明の送達ビヒクルの内部に「目的の核酸配列」として含まれてもよく、したがって、本発明のビヒクルによって、特定の標的宿主細胞に送達し、形質導入することができることが理解される。
【０２３８】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明のバクテリオファージは、目的の核酸配列として、（ａ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子を含む少なくとも１つの感作成分及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲアレイの何れか１つを含むことができる。いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、目的の標的細胞の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特異的に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲ標的の少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特に不活性にする。これらの配列を含む改変バクテリオファージは、感作成分として使用することができる。
【０２３９】
さらにいくつかの他の実施形態において、本発明のバクテリオファージは、目的の核酸配列として、（ｂ）少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの核酸配列を含むことができる。このようなプロトスペーサーは、トキシンをコードする遺伝子の内部に含まれうる。これらのバクテリオファージは、本明細書では、選択的成分として使用することができる。
【０２４０】
「選択的成分」は、本明細書で使用する場合、細菌細胞の特定の集団、特に、本発明のｃａｓ−ＣＲＩＳＰＲ系を有する細胞集団、より具体的には、本発明の感作成分を有する細菌細胞の集団を選択し（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ、ｃｈｏｏｓｉｎｇ、ｅｌｅｃｔｉｎｇ）又は富化するように作用することを可能にする、容易にする、導く本発明の系の要素又は成分を指す。選択的成分は、例えば、選択した望ましい集団（特定の実施形態においては、本発明の感作成分を有する集団又は細胞）の生存のみを可能にする条件を課すことによって、望ましい集団に選択的利点を提供する。
【０２４１】
「感作成分」は、本明細書で使用する場合、特定の物質、例えば、抗生物質に対して、前記要素又は成分を有する生物の感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ又はｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を増加し、及び／又は耐性を減少させることができる本発明の系の要素を指す。いくつかのさらなる実施形態において、感作成分は、望ましくない産物（複数可）（例えば、バイオフィルム形成又は匂い物質に関与するトキシン、タンパク質）を産生する形質導入された細菌の能力を除くことができる。より特定の実施形態において、本発明の感作成分は、病原性細菌遺伝子又は望ましくない産物をコードする遺伝子、例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子、又は毒性化合物をコードする遺伝子、又は匂い形成に関与する産物をコードする遺伝子を特異的に標的にし、不活性にし、及び／又は破壊することによって、細胞の感作及びその復帰の耐性を低下させ、より感受性のある細胞又は望ましくない産物を産生しない細胞にすることができる。特定の実施形態において、「標的化」は、選択された（ｅｌｅｃｔｅｄ又はｃｈｏｏｓｅｄ）対象（複数可）又は要素が、攻撃され、取られ、分解され、不活性にされ、又は破壊される場合に、要素又は対象又は要素もしくは対象、標的のグループに、そこで作用する要素又は対象、標的のグループを選択させる（ｅｌｅｃｔ又はｃｈｏｏｓｅ）ことであると理解される。
【０２４２】
さらに、本発明のＣＲＩＳＰＲアレイの少なくとも１つのスペーサーは、「不活性にする」が選択的要素の活性を遅らせる、低下させる、阻害する、除く、弱くする又は停止させることを意味する場合、選択的成分を標的にし、不活性にするように、本発明の改変バクテリオファージビヒクルの選択的成分又はそのキットもしくは系の内部に、目的の核酸配列として含まれる核酸配列（又はプロトスペーサー）に充分に相補的でありうる。このような不活性化が、前記感作要素を含む細菌を、本発明の改変バクテリオファージビヒクルの選択的成分又はそのキットもしくは系に対して、非感受性にし、耐性にすることに留意されたい。充分な相補性は、本明細書で使用する場合、約１０％〜１００％相補的、より具体的には、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％相補的であることを示す。
【０２４３】
特定の実施形態において、「相補性」は、鍵と鍵穴モデルにそれぞれ従った２つの構造の関係を指す。本質的に、相補性は、２つのＤＮＡ又はＲＮＡに与えられる特性であるため、ＤＮＡ複製及び転写の基本原理であり、ＤＮＡ又はＲＮＡが互いに逆平行に配列されると、配列の各位置の核酸塩基が相補的になる（例えばＡとＴ又はＵ、ＣとＧ）。
【０２４４】
さらに、特定の実施形態において、本発明の感作要素は、目的の核酸配列として、（いくつかの実施形態において、プロトスペーサー、又は溶菌バクテリオファージの必須遺伝子を含むトキシンをコードするバクテリオファージであってもよい）前記選択的成分の内部に含まれる少なくとも１つの核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサー、及び前記少なくとも１つの病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれる核酸配列を標的にする少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲスペーサーを含む本発明の遺伝子改変のバクテリオファージを含むことができる。このように、本発明の感作成分は、選択的成分として働く溶菌ファージ（複数可）と目的の病原性又は望ましくない遺伝子の両方を標的にし、及び／又は不活性にすることができる。
【０２４５】
特定の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、選択的成分としても使用することができることに留意されたい。いくつかの実施形態において、このような改変バクテリオファージは、目的の核酸配列として、少なくとも１つのプロトスペーサーを含みうる。特に、本発明の感作成分によって標的化される少なくとも１つのプロトスペーサー。いくつかの実施形態において、このようなプロトスペーサーは、トキシンをコードする遺伝子の部分でありうる。このような実施形態において、本発明の感作成分によって形質導入されなかった細胞は、トキシン（又は溶菌ファージ）によって殺される。本発明の感作成分を含む形質導入された細胞は、感作粒子によって提供されたＣＲＩＳＰＲによってこれらのトキシンから保護される。いくつかの実施形態において、本発明の系に使用する本発明の改変バクテリオファージは、選択的及び／又は感作成分の何れかとして、細菌の病原性タイプ、又は混合した細菌集団において異なる種類の細菌を感染させることができるある種類の細菌を選択的に感染させるハイブリッド粒子であってもよい。
【０２４６】
他の特異的な実施形態において、本発明の改変バクテリオファージは、目的の核酸配列として、病原性又は望ましくない遺伝子を標的にするＣＲＩＳＰＲ系を含みうる。このようなバクテリオファージは、感作成分として使用される。いくつかのさらなる実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ系によって標的にされた細菌の標的病原性又は望ましくない遺伝子、又はそこから転写されたＲＮＡは、細菌外因性遺伝子でありうる。「外因性遺伝子」は、本明細書で使用する場合、特定の生物、この場合では、細菌から生じるＤＮＡを指し、したがって、染色体ＤＮＡの一部でありうることに留意されたい。
【０２４７】
他の実施形態において、細菌の標的病原性又は望ましくない遺伝子は、染色体外（ｅｐｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）であってもよい。いくつかの特定の非限定的な実施形態において、このような非外因性遺伝子は、水平伝播によって得ることができる。「染色体外（ｅｐｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）遺伝子」は、本明細書で使用する場合、遺伝子物質、特に細菌のＤＮＡ、例えばプラスミドの単位に関係し、染色体外（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）ＤＮＡとして独立して複製することもでき、又は特定の実施形態において、宿主染色体に統合されてもよい。
【０２４８】
いくつかの特定の実施形態において、細菌の少なくとも１つの標的病原性又は望ましくない遺伝子は、病原性因子又はトキシンをコードする遺伝子であってもよく、それによって前記細菌を病原性にする。「病原性の」という用語は、本明細書で使用する場合、細菌疾患又は感染を起こしうる細菌を意味する。いくつかの特定の実施形態において、病原性細菌は、易感染性の免疫系を有しないヒト対象、又は限定されないが、げっ歯類、鳥類、爬虫類、昆虫又は植物を含む他の生物において、細菌疾患又は感染を起こす細菌である。典型的には、病原性細菌は、「病原性因子」として呼ばれる特定のタンパク質を産生する。病原性細菌は、１つ以上の宿主の健康な宿主」組織を通常コロニー形成する細菌とは区別され、後者の細菌は、病原性因子を通常は発現せず、又は病原性細菌に関連する病原性因子を定量しか発現しないため、通常の治療的状況下で殺すことは望ましくない。前述のように、本開示は、いくつかの実施、病原性因子又は望ましくない産物をコードする細菌ＤＮＡ配列に関する標的ＲＮＡをコードする配列を含むＣＲＩＳＰＲ系を含む。このような、病原性因子として、病原性の付着、コロニー形成、進入、バイオフィルム形成又は免疫応答阻害物質又はトキシンに関与する細菌タンパク質が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。病原性遺伝子として、限定されないが、トキシン（例えば、志賀毒素及びこれら毒素）、ヘモリジン、線毛性付着及び非線毛性付着、プロテアーゼ、リパーゼ、エンドヌクレアーゼ、内毒素及び外毒素細胞障害性因子、ミクロシン及びコリシン、ならびに技術分野で識別された遺伝子が挙げられる。これらの及び他の病原性因子をコードする広い配列の細菌種の細菌遺伝子の配列は、技術分野で知られている。病原性因子は、細菌染色体、又は細菌のプラスミド、又はその両方にコードすることができる。いくつかの特定の実施形態において、病原性因子は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｓｅｋ遺伝子といった非限定的な例であるスーパー抗原エンテロトキシン遺伝子等の細菌スーパー抗原遺伝子によってコードすることができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓについての追加の病原性因子として、限定されないが、α−ヘモリジン、β−ヘモリジン、γ−ヘモリジン、ロイコシジン、Ｐａｎｔｏｎ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ｌｅｕｋｏｃｉｄｉｎ（ＰＶＬ）等の細胞溶解性トキシン；毒素性ショック症候群毒素１（型）（ＴＳＳＴ−１）等の外毒素；ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣｎ、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ＳＥＧ、ＳＥＨ、及びＳＥＩ等のエンテロトキシン、ならびにＥＴＡ及びＥＴＢ等の表皮剥脱毒素が挙げられる。他の種類の細菌によって発現するこれらのトキシンの全ての相同体は、同様に、病原性遺伝子標的として本明細書で考慮される。
【０２４９】
より具体的には、「トキシン」という用語は、本明細書で使用する場合、外毒素又は内毒素の何れかとして分類することができる細菌によって生成される物質を意味する。外毒素は生成され、活発に分泌され、内毒素は細菌の部分を保持する。通常、外毒素は、細菌外膜の部分であり、細菌が免疫系によって殺されるまで放出されない。
【０２５０】
本発明のいくつかの特定の非減的な実施形態において、本発明の送達ビヒクルによって送達されるＣＲＩＳＰＲ系によって標的にされうる細菌病原性遺伝子は、ａｃｔＡ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３２１０．１）、Ｔｅｍ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９９８０）、Ｓｈｖ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９６４８）、ｏｘａ−１（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＷ＿１３９４４０）、ｏｘａ−７（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ７５５６２）、ｐｓｅ−４（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｊ０５１６２）、ｃｔｘ−ｍ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０８７０）、ａｎｔ（３’’）−Ｉａ（ａａｄＡ１）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＤＱ４８９７１７）、ａｎｔ（２’’）−Ｉａ（ａａｄＢ）ｂ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＤＱ１７６４５０）、ａａｃ（３）−ＩＩａ（ａａｃＣ２）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０８８６）、ａａｃ（３）−ＩＶ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＤＱ２４１３８０）、ａｐｈ（３’）−Ｉａ（ａｐｈＡ１）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００７６８２）、ａｐｈ（３’）−ＩＩａ（ａｐｈＡ２）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０１７０）、ｔｅｔ（Ａ）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００５３２７）、ｔｅｔ（Ｂ）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＦＪ４１１０７６）、ｔｅｔ（Ｃ）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０５５８）、ｔｅｔ（Ｄ）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０５５８）、ｔｅｔ（Ｅ）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｍ３４９３３）、ｔｅｔ（Ｙ）（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＢ０８９６０８）、ｃａｔＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００５７７３）、ｃａｔＩＩ  ＮＣ＿０１０１１９、ｃａｔＩＩＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ０７８４８）、ｆｌｏＲ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９１４０）、ｄｈｆｒＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２５２５）、ｄｈｆｒＶ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０４８８）、ｄｈｆｒＶＩＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＤＱ３８８１２６）、ｄｈｆｒＩＸ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１０４１０）、ｄｈｆｒＸＩＩＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９６２）、ｄｈｆｒＸＶ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｚ８３３１１）、ｓｕＩＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９１３）、ｓｕＩＩＩ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９１３）、インテグロンクラス１  ３’−ＣＳ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＪ８６７８１２）、ｖａｔ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１１７４２）、ｖａｔＣ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ０１５６２８）、ｖａｔＤ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６８３０２）、ｖａｔＥ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＣ＿００４５６６）、ｖｇａ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１７２５９）、ｖｇｂ（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１７２５８）、及びｖｇｂ��（例えば、ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＡＦ０１５６２８）から成る群から選択することができる。
【０２５１】
前述のように、本発明の改変バクテリオファージビヒクル又はそのキットもしくは系は、病原性又は望ましくない細菌遺伝子、例えば、耐性を提供し、言い換えれば、抗菌薬に対する細菌の感受性を阻害し、減少し、抑制し、又は軽減する遺伝子を特異的に標的にすることができる。
【０２５２】
前述のように、本発明のキット、系及び方法の感作要素は、抗生物質耐性を提供する遺伝子を標的にすることができる。本明細書で使用する場合、「耐性」という用語は、細菌細胞集団が、特定の抗生物質化合物に対して１００％耐性であることを示していないが、抗生物質又はその誘導体に耐性のある細菌を含む。より具体的には、「細菌耐性遺伝子（複数可）」という用語は、抗生物質化合物からの約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％の保護を与える遺伝子（複数可）を指し、それにより、前記抗生物質化合物に対する感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ及びｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を逆転する。
【０２５３】
したがって、いくつかの実施形態において、細菌病原性又は望ましくない遺伝子は、前述の抗細菌化合物に対する耐性を提供する遺伝子であってもよい。
【０２５４】
さらに、他の実施形態において、細菌の少なくとも１つの病原性又は望ましくない遺伝子は、抗生物質耐性因子をコードする遺伝子であってもよい。
【０２５５】
「抗生物質耐性遺伝子」というフレーズは、本明細書で使用する場合、例えば、前記抗生物質化合物を破壊する酵素のためにコードすることによって、抗生物質化合物が細菌に進入するのを防ぎ、活性して抗生物質化合物を排出する表面タンパク質のためにコードすることによって、又は抗生物質の標的の変異形態になり、それによって抗生物質機能を防ぐことによって、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を指す。
【０２５６】
多様な細菌が有する抗生物質耐性遺伝子は、技術分野で知られており、特定の細菌の抗生物質耐性遺伝子の配列は、望ましい場合、決定することができる。特定の非限定的な実施形態において、本開示は、抗生物質耐性遺伝子を含む細菌ＤＮＡ配列に関する標的ＲＮＡをコードするスペーサーを含むＣＲＩＳＰＲ系を含む。いくつかの実施形態において、耐性遺伝子は、抗生物質のペニシリンクラスの狭域性β−ラクタム抗生物質に対する耐性を与える。他の実施形態において、耐性遺伝子は、メチシリン（例えば、メチシリン又はオキサシリン）又はフルクロキサシリン又はジクロキサシリン、又はこれらの抗生物質のいくつかもしくは全てに対する耐性を与える。そのため、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系は、実際に、ペニシリンの多く又は全てに非感受性である、又は減少した感受性を有するＳ．ａｕｒｅｕｓの株を指す口語的にメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）として知られている耐性遺伝子を選択的に標的にするのに適している。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系は、バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）のバンコマイシン耐性を標的にするのに適している。特定の実施形態において、バンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、リネゾリド（ＺＹＶＯＸ（商標））、ダプトマイシン（ＣＵＢＩＣＩＮ（商標））及びキヌプリスチン／ダルホプリスチン（ＳＹＥＲＣＩＤ（商標））の少なくとも１つにも耐性でありうる。
【０２５７】
追加の抗生物質耐性遺伝子として、限定されないが、ホスホマイシン耐性遺伝子ｆｏｓＢ、テトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＭ、カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラーゼａａｄＤ、二官能性アミノグリコシド修飾酵素遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼｃａｔ、ムピロシン耐性遺伝子ｉｌｅＳ２、バンコマイシン耐性遺伝子ｖａｎＸ、ｖａｎＲ、ｖａｎＨ、ｖｒａＥ、ｖｒａＤ、メチシリン耐性因子ｆｅｍＡ、ｆｍｔＡ、ｍｅｃｌ、ストレプトマイシンアデニリルトランスフェラーゼ  ｓｐｃｌ、ｓｐｃ２、ａｎｔｌ、ａｎｔ２、ペクチノマイシン  アデニリルトランスフェラーゼ  ｓｐｄ、ａｎｔ９、ａａｄＡ２及び他の耐性遺伝子が挙げられる。
【０２５８】
いくつかの特定の実施形態において、病原性又は望ましくない遺伝子は、β−ラクタム抗生物質化合物に対する耐性を与える遺伝子をコードする遺伝子であってもよい。さらなる特定の実施形態において、このような遺伝子は、少なくとも１つのβ−ラクタマーゼをコードすることができる。本明細書で使用する場合、「β−ラクタマーゼ」という用語は、β−ラクタム含有分子（β−ラクタム抗生物質等）又はその誘導体等のβ−ラクタマーゼ基質の切断を触媒することができるタンパク質を示す。
【０２５９】
β−ラクタマーゼは、そのアミノ酸配列に基づいて４つの分子クラス（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）に組織化される。クラスＡ酵素は、約２９ｋＤａの分子量を有し、好ましくはペニシリンを加水分解する。クラスＡ酵素の例として、ＲＴＥＭ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのβ−ラクタマーゼが挙げられる。クラスＢ酵素は、β−ラクタマーゼの他のクラスよりも広い基質特性を有する金属酵素を含む。クラスＣ酵素は、約３９ｋＤａの分子量を有し、グラム陰性細菌の染色体セファロスポリナーゼを含み、多様な古い及び新しく設計された抗生物質の両方に対してグラム陰性細菌の耐性を担う。さらに、クラスＣ酵素は、Ｐ９９  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅのＰ９９のラクタマーゼも含み、このエンテロバクター種を、米国の病因で最も広まった細菌製剤の１つにする役割を担う。クラスＤ酵素は、セリンヒドロラーゼであり、ユニークな基質特性を示す。前述のように、より特定の実施形態において、本発明のキット及び系は、β−ラクタム抗生物質に対する耐性を与えることができる遺伝子に関するものでありうる。「β−ラクタム」又は「β−ラクタム抗生物質」という用語は、本明細書で使用する場合、その分子構造において、ｂ−ラクタム環を含む抗菌薬を指す。β−ラクタム抗生物質は、未変性の半合成ペニシリン、クラブラン酸、カルバペネム、ペニシリン誘導体（ペナム）、セファロスポリン（セファム）、セファマイシン及びモノバクタム等の異なるクラスを含む抗生物質の広いグループであり、すなわち、その分子構造にβ−ラクタム環を含む抗菌薬である。β−ラクタム又はβ−ラクタム抗生物質は、最も広く使用される抗生物質のグループである。本当の抗生物質ではないが、β−ラクタマーゼ阻害剤は、このグループに含まれることが多い。β−ラクタム抗生物質は、発生期のペプチドグリカン層の前駆体ＮＡＭ／ＮＡＧペプチドサブユニット上のＤ−アラニル−Ｄ−アラニン末端アミノ酸残基の類似体である。β−ラクタム抗生物質とＤ−アラニル−Ｄ−アラニンとの構造的類似性は、発生期のペプチドグリカン層の最後の架橋（ペプチド転移）を防ぎ、細胞壁の合成を破壊する。通常の状況下において、ペプチドグリカン前駆体は、細菌細胞壁の再編成を合図し、結果として、自己溶菌細胞壁ヒドロラーゼの活性化を起こす。β−ラクタムによる架橋の阻害により、ペプチドグリカン前駆体の構築が生じ、新しいペプチドグリカンを産生せずに、自己溶菌ヒドロラーゼによる既存のペプチドグリカンの消化を起こす。結果として、β−ラクタム抗生物質の殺菌作用がさらに高まる。概して、β−ラクタムは分類され、そのコアリング構造に従ってグループ化され、それぞれのグループを異なるカテゴリーに分けることができる。「ペナム」という用語は、ペニシリン抗生物質、いわゆるチアゾリジン環を含むβ−ラクタムのメンバーのコア骨格を示すために使用される。ペニシリンは、環の原子の１つが硫黄であり、環が完全飽和される場合、５員環に縮合されたβ−ラクタム環を含む。ペニシリンは、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン（ペニシリンＧ）、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、プロカインペニシリン及びオキサシリン等の狭いスペクトルのペニシリンを含むことができる。狭いスペクトルのペニシリナーゼ耐性ペニシリンは、メチシリン、ジクロキサシリン及びフルクロキサシリンを含む。狭いスペクトルのβ−ラクタマーゼ耐性ペニシリンはテモシリンを含む。中程度のスペクトルのペニシリンとして、例えば、アモキシシリン及びアンピシリンが挙げられる。広いスペクトルのペニシリンは、アモキシシリン・クラブラン酸カリウム合剤（ｃｏ−ａｍｏｘｉｃｌａｖ）（アモキシシリン＋クラブラン酸）を含む。最後に、ペニシリンのグループとして、拡張したスペクトルのペニシリン、例えば、アズロシリン、カルベニシリン、チカルシリン、メズロシリン及びピペラシリンも挙げられる。このクラスの他のメンバーとして、ピバンピシリン、ヘタシリン、バカンピシリン、メタンピシリン、タランピシリン、エピシリン、カルベニシリン、カリンダシリン、チカルシリン、アズロシリン、ピペラシリン、メズロシリン、メシリナム、ピブメシリナム、スルベニシリン、クロメトシリン、プロカインベンジルペニシリン、アジドシリン、ペナメシリン、プロピシリン、フェネチシリン、クロキサシリン及びナフシリンが挙げられる。ピロリジン環を含むβ−ラクタムは、カルバペナムと呼ばれる。カルバペネムは、飽和カルバペネムであるβ−ラクタム化合物である。それらは、カルバペネム抗生物質の軌道に生合成中間体として主に存在する。カルバペネムは、β−ラクタマーゼに高い耐性を与える構造を有し、したがって、β−ラクタム抗生物質の最も広いスペクトルとして考えられる。カルバペネムは、構造的にペニシリンに非常に類似しているが、構造の１位の硫黄原子は炭素原子で置換されており、したがって基の名前、カルバペネムである。カルバペネム抗生物質は、ストレプトマイセスカトレアの自然由来産物であるチエナマイシンから元来生じた。カルバペネム群として、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム及びＰＺ−６０１である。２，３−ジヒドロチアゾール環を含むβ−ラクタムは、ペネムと呼ばれる。ペネムは、カルバペネムと構造が類似している。しかしながら、ペネムが硫黄を有する場合、カルバペネムは別の炭素を有する。自然発生のペネムがなく、その全ては合成して作製されている。ペネムの例はファロペネムである。３，６−ジヒドロ−２Ｈ−１，３−チアジン環を含むβ−ラクタムは、セフェムと呼ばれる。セフェムは、ｂ−ラクタム抗生物質のサブグループであり、セファロスポリン及びセファマイシンを含む。セファロスポリンは、７−アミノセファロスポラン酸の核を提供する広いスペクトルの半合成抗生物質である。第１世代セファロスポリンは、中程度のスペクトルとしても考えられ、セファレキシン、セファロチン及びセファゾリンが挙げられる。抗ヘモフィルス活性を有する中程度のスペクトルを有すると考えられる第２世代セファロスポリンは、セファクロル、セフロキシム及びセファマンドールを含みうる。抗嫌気的活性を有する中程度のスペクトルを示す第２世代セファマイシンは、セフォテタン及びセフォキシチンを含む。広い活性スペクトルを有すると考えられる第３世代セファロスポリンは、セフォタキシム及びセフポドキシムを含む。
【０２６０】
最後に、グラム陽性細菌及びβ−ラクタマーゼに対する高い活性を有する広いスペクトルとして考えられる第４世代セファロスポリンは、セフェピム及びセフピロムを含む。セファロスポリンクラスは、さらに、セファドロキシル、セフィキシム、セフプロジル、セファレキシン、セファロチン、セフロキシム、セファマンドール、セフェピム及びセフピロムをさらに含む。
【０２６１】
セファマイシンは、セファロスポリンに非常に類似しており、セファロスポリンとして分類されることもある。セファロスポリンのように、セファマイシンはセフェム核に基づいている。セファマイシンは、元来ストレプトマイセスによって産生されたが、合成したものも産生された。セファマイシンは、７−α位にメトキシ基を有し、セフォキシチン、セフォテタン、セフメタゾール及びフロモキセフを含む。
【０２６２】
１，２，３，４−テトラヒドロピリジン環を含むβ−ラクタムは、カルバセフェムと呼ばれる。カルバセフェムは、セファロスポリン、セフェムの構造に基づいて、合成して作製された抗生物質である。カルバセフェムは、セフェムに類似しているが、硫黄を置換する炭素を有する。カルバセフェムの例は、ロラカルベフである。
【０２６３】
モノバクタムは、ｂ−ラクタム化合物であり、β−ラクタム環は単独であり、（２つの環を有する多くのβ−ラクタムとは対照的に）別の環に縮合されない。モノバクタムは、グラム陰性細菌に対してのみ働く。モノバクタムの他の例は、チゲモナム、ノカルディシンＡ及びタブトキシンである。
【０２６４】
３，６−ジヒドロ−２Ｈ−１、３−オキサジン環を含むβ−ラクタムは、オキサセフェム又はクラバムと呼ばれる。オキサセフェムは、セフェムと同様の分子であるが、硫黄を置換する酸素を有する。したがって、オキサセフェムとしても知られる。オキサセフェムの例は、クラブラン酸である。オキサセフェムは、合成して作製された化合物であり、自然では見つかっていない。オキサセフェムの他の例として、モキサラクタム及びフロモキセフが挙げられる。
【０２６５】
β−ラクタム抗生物質の別のグループは、β−ラクタマーゼ阻害剤、例えば、クラブラン酸である。β−ラクタム抗生物質の別のグループは、無視することができない抗抗生物質活性を示すが、β−ラクタム環を含む。唯一の目的は、β−ラクタマーゼに結合することによってβ−ラクタム抗生物質の不活性化を防ぎ、このように、β−ラクタム抗生物質と共投与する。臨床使用におけるβ−ラクタマーゼ阻害剤は、（通常アモキシシリン又はチカルシリンと組み合わせて）クラブラン酸及びそのカリウム塩、スルバクタム及びタゾバクタムを含む。
【０２６６】
本発明の系は、本発明の改変バクテリオファージによって送達されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによって、抗生物質耐性遺伝子を標的にし、破壊することによって、前に示した抗生物質化合物の細菌集団の感作を導くことが理解される。このような感受性は、前記化合物に対する細菌の感作を増加させ、それにより、必要とされる量の減少を導きうる有効性を高めることが理解される。本発明の系及び本明細書に開示する抗生物質化合物の併用治療も本発明において考慮される。いくつかのさらなる実施形態において、本発明のキット及び系は、感作成分を含む送達ビヒクルの他に、選択的成分及び少なくとも１つの抗生物質化合物も含む。より特定の実施形態において、このような化合物は、本発明に開示する抗生物質化合物であってもよい。
【０２６７】
より特定の実施形態において、抗生物質耐性因子又は遺伝子は、本発明のキットについて標的病原性遺伝子又は望ましくない遺伝子であり、拡張スペクトルβラクタマーゼ耐性因子（ＥＳＢＬ因子）、カルバペネマーゼ、ＣＴＸ−Ｍ−１５、βラクタマーゼ、ニューデリーメタロ−β−ラクタマーゼ（ＮＤＭ）−１，２，５，６，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネマーゼ（ＫＰＣ）−１，２，３，４，５，ＯＸＡ−４８カルバペネマーゼ、ベロナインテグロンコードメタロ−β−ラクタマーゼ（ＶＩＭ）、ＩＭＰメタロ−β−ラクタマーゼの１つであってもよい。新しいニューデリーメタロ−β−ラクタマーゼ（ＮＤＭ−１）は、細菌を本発明で使用する全てのβ−ラクタム抗生物質に対して耐性にする酵素である。ＮＤＭ−１耐性スペクトルは、抗生物質耐性細菌感染の治療の柱であるカルバペネムファミリーの抗生物質を含む。ＮＤＭ−１についての遺伝子は、カルバペネマーゼと呼ばれるβ−ラクタマーゼ酵素をコードする大きな遺伝子ファミリーの一員である。カルバペネマーゼを産生する細菌は、処理するのが非常に困難である。重要なこととして、ＮＤＭ−１についての遺伝子は、遺伝子水平伝播によって、ある細菌株から別の細菌株へ核酸することができ、したがって、容易に拡散させることができる。特定の非限定的な実施形態において、ＮＤＭ−１タンパク質は、タンパク質ＩＤ  ＣＡＺ３９９４６．１のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅメタロ−β−ラクタマーゼ遺伝子ｂｌａＮＤＭ−１であってもよい。いくつかの特定の実施形態において、前記ＮＤＭ−１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９１によって示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明のＮＤＭ−１タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９２によって示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２６８】
さらに、ＣＴＸ−Ｍ−１５は、本明細書で使用する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びサルモネラ菌種に最初に記述された拡張したスペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）のＣＴＸ−Ｍファミリー（セフォタキシマーゼ（ＣＴＸ−Ｍ−ａｓｅｓ））のメンバーであるが、他のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含むＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ種に急速に現れる。このファミリーとしてＣＴＸ−Ｍ−３、ＣＴＸ−Ｍ−９、ＣＴＸ−Ｍ−１４及びＣＴＸ−Ｍ−１５酵素が挙げられる。いくつかの特定の実施形態において、本発明のキットについて標的として使用するＣＴＸ−Ｍ−１５は、タンパク質ＩＤ  ＡＡＬ０２１２７．１のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  β−ラクタマーゼＣＴＸ−Ｍ−１５であってもよい。いくつかの特定の実施形態において、前記ＣＴＸ−Ｍ−１５タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３８によって示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよい。さらにいくつかの特定の実施形態において、本発明のＣＴＸ−Ｍ−１５タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１３９によって示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【０２６９】
さらにいくつかの他の特定の非限定的な実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、特にその感作成分は、本発明の送達ビヒクル（改変バクテリオファージ）によって送達され、ＣＴＸ−Ｍ−１５の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的にする少なくとも１つのスペーサーを含みうる。より特定の実施形態において、このようなプロトスペーサー（複数可）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０、１４１及び１４２の何れか１つ又はその組み合わせ（本明細書ではそれぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３とも呼ばれる）によって示される核酸配列を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、特にその感作成分は、ＮＤＭ−１の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的にする少なくとも１つのスペーサーを含んでもよく、特にこのようなプロトスペーサーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３、１４４及び１４５の何れか１つ又はその組み合わせ（本明細書ではそれぞれＮ１、Ｎ２及びＮ３とも呼ばれる）によって示される核酸配列を含んでもよい。
【０２７０】
本発明の改変バクテリオファージ（本明細書では送達ビヒクルとも呼ばれる）を選択的成分として使用する場合、そこにパッケージされた「目的の核酸配列」は、前に示されたプロトスペーサー、特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０、１４１及び１４２、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３、１４４及び１４５の何れか１つを含んでもよい。ＮＤＭに使用されるスペーサーの非限定的な例は、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１２及び２１３によって示されるスペーサーを含む。ＣＴＸ−Ｍに有用なスペーサーの非限定的な例は、核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１４及び２１５によって示されるスペーサーを含む。
【０２７１】
いくつかのさらなる実施形態において、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅルバペネマーゼ（ＫＰＣ）産生細菌は、顕著な罹患率及び死亡率に関連する感染症を引き起こす高度に薬剤耐性グラム陰性桿菌を出現させるグループである。
【０２７２】
ＯＸＡ−４８カルバペネマーゼは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの流行において最初に述べた。さらに、ＯＸＡ−４８は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ及びＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉにおいて識別された。この酵素は、ペニシリン及びカルバペネムを加水分解することができるが、広いスペクトルのセファロスポリンに対しての活性が乏しい。ＯＸＡ−４８産生株の多剤耐性は、様々な耐性メカニズム、特に拡張したスペクトルβ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）及び他の耐性決定因子から生じることが多い。このように、これらのカルバペネマーゼは、本発明の送達ビヒクルによって含まれる目的の核酸配列によって標的にされてもよい。
【０２７３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の感作要素は、ＡＡＧ１３４１０．１、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９３によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９４（ＡＦ２９７５５４）によって示されるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネム加水分解β−ラクタマーゼＫＰＣ−１を標的にすることができる。さらに、このような標的カルバペネマーゼは、ＡＡＫ７０２２０．１によって示されるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネム加水分解β−ラクタマーゼＫＰＣ−２であってもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９５のアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９６（ＡＹ０３４８４７）によってコードされる。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の感作要素は、ＡＡＬ０５６３０．１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９７によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９８（ＡＦ３９５８８１）によって示されるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅカルバペネム加水分解β−ラクタマーゼＫＰＣ−３を標的にすることができる。
【０２７４】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の感作要素は、ＡＡＵ０６３６２．１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１９９によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２００（ＡＹ７００５７１）によってコードされるエンテロバクター種Ｅ６２４カルバペネム加水分解β−ラクタマーゼＫＰＣ−４を標的にすることができる。さらに、このような標的カルバペネマーゼは、ＡＢＹ９１２４０．１によって示されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  β−ラクタマーゼＫＰＣ−５であってもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０１のアミノ酸配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０２（ＥＵ４００２２２．２）によってコードされる。さらなる実施形態は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０３によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２０４（ＡＹ２３６０７３．２）によってコードされるＡＡＰ７００１２．１のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＯＸＡ−４８に関する。さらに別の実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１６によって示され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１７（ＮＧ＿０５０４１７．１）によってコードされるＷＰ＿０４９５８９８６８．１のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅホスホエタノールアミン−脂質ＡトランスフェラーゼＭＣＲ−１である。さらなる実施形態は、ＷＰ＿０６５４１９５７４．１によって示されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉホスホエタノールアミン−脂質ＡトランスフェラーゼＭＣＲ−２に関するものであってもよく、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１８を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２１９（ＮＧ＿０５１１７１．１）によってコードされる。
【０２７５】
さらにいくつかの他の特定の非限定的な実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ系、特にその感作成分は、本発明の送達ビヒクル（改変バクテリオファージ）によって送達され、ＫＰＣ−１、２、３、４、５又はＯＸＡ−４８の少なくとも１つのプロトスペーサーを標的にする少なくとも１つのスペーサーを含みうる。より特定の実施形態において、このようなスペーサー（複数可）は、（ＫＰＣ−１、２、３、４、５について）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５及び２０６又はその組み合わせの何れか１つによって示される核酸配列を含んでもよい。より特定の実施形態において、このようなスペーサー（複数可）は、（ＯＸＡ−４８について）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７及び２０８又はその組み合わせの何れか１つによって示される核酸配列を含んでもよい。
【０２７６】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の送達ビヒクルは、目的の核酸配列として、望ましくない産物をコードする細菌遺伝子を標的にするＣＲＳＰＲ−Ｃａｓ系に基づく少なくとも１つの感作成分を含んでもよい。いくつかの特定の非限定的な実施形態において、このような望ましくない細菌遺伝子は、例えば、酪酸又は好ましくない匂いを有するチオアルコール化合物等の産物を形成する経路に属するリパーゼをコードすることができる。さらにいくつかの他の代替実施形態において、本発明のビヒクルによって送達されるＣＲＩＳＰＲ系は、バイオフィルム形成、例えば、ｐｓｔＳタンパク質等に属するタンパク質をコードする遺伝子を標的にすることができる。前述のように、本発明が提供する系の感作成分として提供する本発明の改変バクテリオファージは、ｃａｓ遺伝子と共に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）アレイを含み、ＣＲＩＳＰＲ系を形成する。本明細書で使用する場合、ＳＰＩＤＲ（Ｓｐａｃｅｒ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲアレイは、特定の細菌種に通常特異的な本発明に記載のＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲアレイは、Ｅ．ｃｏｌｉで最初に認識されたｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＳＳＲ）の固有のクラスである。さらに時代を下ると、同様のＣＲＩＳＰＲアレイが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａならびに他の細菌及び古細菌で見つかった。本発明は、知られているＣＲＩＳＰＲ系、特に本明細書開示するＣＲＩＳＰＲ系の使用を考慮する。
【０２７７】
本明細書で使用する場合、「ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチド」は、充分なＣＲＩＳＰＲリピートを含むＤＮＡ又はＲＮＡセグメントを指し、相補的遺伝子をダウンレギュレートする（例えば、切断、標的にする）ことができる。
【０２７８】
一実施形態において、本発明のビヒクルにおける目的の核酸配列として含まれるＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、その間に１つのスペーサーを有する少なくとも２つのリピートを含む。いくつかのさらなる実施形態において、本発明の感作成分のＣＲＩＳＰＲアレイは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上、特に１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００以上のスペーサーを含む。本発明の感作成分のスペーサーは同じスペーサーであっても、異なるスペーサーであってもよいことがさらに理解される。さらなる実施形態において、これらのスペーサーは、同一の又は異なる標的細菌病原性もしくは望ましくない遺伝子（複数可）の何れかを標的にすることができる。さらにいくつかの他の実施形態において、このようなスペーサーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上の病原性又は望ましくない細菌遺伝子（複数可）を標的にすることができる。
【０２７９】
例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲアレイポリヌクレオチドは、全てのＣＲＩＳＰＲリピートを含み、第１のＣＲＩＳＰＲリピートの第１のヌクレオチドから始まり、最後の（終端の）リピートの最後のヌクレオチドで終わる。
【０２８０】
本明細書で使用する場合、「スペーサー」という用語は、ＣＲＩＳＰＲアレイの複数の短い直接的なリピート（すなわちＣＲＩＳＰＲリピート）の間で見られる非反復スペーサー配列を指す。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、２つの同一のＣＲＩＳＰＲリピートの間に位置する。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲスペーサーは、回文構造の２つの同じ、短い直接的なリピートに自然に存在する。本発明のスペーサーは、２つの同一の又は同一でないリピートの間に位置する、又は存在することができ、さらに、これらのスペーサーは、病原性又は望ましくない細菌遺伝子の内部のプロトスペーサー、及び／又は選択的成分の内部のプロトスペーサーを標的にするｃｒＲＮＡをコードすることに留意されたい。
【０２８２】
本明細書で使用する場合、「ｃａｓ遺伝子」という用語は、概して、Ｃａｓタンパク質をコードする隣接しているＣＲＩＳＰＲアレイに連結し、結合し、又は接して、もしくはその近くにある遺伝子を指す。
【０２８３】
ＣＲＩＳＰＲアレイは、通常、ｃａｓ１〜ｃａｓ４と名付けた４つの遺伝子の近くに見られる。これらの遺伝子の最も多い配置は、ｃａｓ３−ｃａｓ４−ｃａｓｌ−ｃａｓ２である。Ｃａｓ３タンパク質は、ヘリカーゼであるように見え、Ｃａｓ４は、エキソヌクレアーゼのＲｅｃＢファミリーに似ており、ＤＮＡ結合を思わせるシステインが豊富なモチーフを含む。ｃａｓ１遺伝子（ＮＣＢＩ  ＣＯＧデータベースコード：ＣＯＧ１５１８）は、特に注目すべき遺伝子であり、（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉｉを除く全てのＣＲＩＳＰＲ系に接続する）ＣＲＩＳＰＲ系の普遍的なマーカーとしての役割を担う。ｃａｓ２は、特徴付けされていないままである。ｃａｓｌ−４は、通常、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のすぐそばにあり、細菌及び古細菌種にわたって広く分布することが特徴付けられている。全てのｃａｓｌ−４遺伝子がＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合しているわけではないが、ｃａｓｌ−４遺伝子は全て複数のサブタイプに見られる。
【０２８４】
さらに、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系：Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型の３つの主要な種類を示す。本発明の改変バクテリオファージの内部にパッケージされた目的の核酸が、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系の種類に由来するＣＲＩＳＰＲ系（例えば、ｃａｓタンパク質及びスペーサーをコードする遺伝子）を含みうることが理解される。
【０２８５】
より具体的には、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系は、ｃａｓ３遺伝子を含み、異なる組成物を有するカスケード様複合体をおそらく形成するタンパク質をコードする遺伝子の他に、別個のヘリカーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ活性で、大きいタンパク質をコードする。これらの複合体は、ｒｅｐｅａｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＡＭＰ）に含まれている多くのタンパク質を含み、Ｃａｓタンパク質の大きいスーパーファミリーを形成し、少なくとも１つのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ；フェレドキシンフォールドドメインとしても知られる）及び特徴的なグリシンが豊富なループを含む。ＲＡＭＰスーパーファミリーは、広範囲な配列及び構造的比較に基づいて、大きいＣａｓ５及びＣａｓ６ファミリーを含む。さらに、Ｃａｓ７（ＣＯＧ１８５７）タンパク質は、ＲＡＭＰスーパーファミリーの別の固有の大きいファミリーを示す。
【０２８６】
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系は、標的の切断がＣａｓ３のＨＤヌクレアーゼドメインによって触媒される場合に、ＤＮＡを標的にするように思われる。Ｃａｓ４のＲｅｃＢヌクレアーゼドメインは、いくつかのＩ型ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ系のＣａｓ１に縮合するため、Ｃａｓ４は、代わりにスペーサーの取得の役割を潜在的に担う。Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、本発明、特にＩ−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ型の何れか１つに適用することができることに留意されたい。
【０２８７】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、「ＨＮＨ」型系（連鎖球菌様；ナイセリア・メニンギティディス血清型Ａ  ｓｔｒ．Ｚ２４９１又はＣＡＳＳ４）を含み、Ｃａｓ９、単一の非常に大きいタンパク質は、遍在性のＣａｓ１及びＣａｓ２の他に、ｃｒＲＮＡを生成し、標的ＤＮＡを切断するのに充分であると思われる。Ｃａｓ９は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン、アミノ末端に近いＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びタンパク質の中間のＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインを含むが、これらのドメインの機能は解明されていない。しかしながら、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、制限酵素に豊富にあり、エンドヌクレアーゼ活性を有し、標的の切断を担う可能性がある。
【０２８８】
ＩＩ型システムは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート部分との間に二本鎖形成を伴う普通でないメカニズムによってｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを切断し、次にｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセッシング経路の第１切断が、このリピート領域で起こる。この切断は、Ｃａｓ９の存在下で、ハウスキーピング、二本鎖ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＩＩＩによって触媒される。さらに、ＩＩ型系は、ｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２  ｃｓｎ２及びｃａｓ４遺伝子の少なくとも１つを含む。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、本発明、特にＩＩ−Ａ型又はＢ型の何れか１つに適用することができることに留意されたい。
【０２８９】
ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＲＡＭＰの少なくともいくつかがカスケード複合体に類似してスペーサーリピート転写物のプロセッシングに関与していると思われるポリメラーゼ及びＲＡＭＰモジュールを含む。ＩＩＩ型系は、さらにサブタイプＩＩＩ−Ａ（Ｍｔｕｂｅ又はＣＡＳＳ６としても知られる）及びＩＩＩ−Ｂ（ポリメラーゼ−ＲＡＭＰモジュールとしても知られる）に分けることができる。サブタイプＩＩＩ−Ａ系は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについてインビボで実証されたように、プラスミドを標的にすることができ、このサブタイプ（ＣＯＧ１３５３）にコードされるポリメラーゼ様タンパク質のＨＤドメインが、標的ＤＮＡの切断に関与しうると思われる。ｆｕｒｉｏｓｕｓのサブタイプＩＩＩ−Ｂ系について示されるように、少なくともインビトロで、ＩＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−;Ｃａｓ系がＲＮＡを標的にすることができるという強力な証拠がある。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に属するｃａｓ遺伝子、例えば、ｃａｓ６、ｃａｓ１０、ｃｓｍ２、ｃｓｍ３、ｃｓｍ４、ｃｓｍ５、ｃｓｍ６、ｃｍｒ１、ｃｍｒ３、ｃｍｒ４、ｃｍｒ５、ｃｍｒ６、ｃａｓ１及びｃａｓ２の何れか１つが本発明の目的に使用することができることが理解される。さらにＩＩＩ−Ａ型又はＩＩＩ−Ｂ型系の何れか１つを本発明のキット、成分及び方法に使用することができる。特に興味深いこととして、特に、外因性病原性又は望ましくない遺伝子が、本発明の系及び方法によって標的にされる場合、本発明の方法、ＩＩＩ−Ｂ系を使用することができる。
【０２９０】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のビヒクルに、目的の核酸配列として使用するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の少なくとも１つのｃａｓ遺伝子は、Ｉ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ系の少なくとも１つのｃａｓ遺伝子であってもよい。「ＩＥ型ＣＲＩＳＰＲ」系は、Ｋ型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを原産とする系を指す。ＩＥ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ファージ感染を阻害し、プラスミドを硬化し、接合要素伝達を防ぎ、細胞を殺すことが示されている。ＣＲＩＳＰＲ機構を使用して、残りのＤＮＡを無傷のまま、誘導性及び標的化様式で、特定の細胞内ＤＮＡを分解することができる。
【０２９１】
いくつかの他の実施形態において、本発明の改変バクテリオファージビヒクルの内部に含まれる少なくとも１つのＩ−Ｅ型ｃａｓ遺伝子は、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、ｃａｓ６ｅ及びｃａｓ３遺伝子の少なくとも１つでありうる。特定の実施形態において、ｃｓｅ１、ｃｓｅ２、ｃａｓ７、ｃａｓ５、ｃａｓ６ｅ及びｃａｓ３遺伝子の少なくとも１つの他に、本発明の感作成分は、ｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子の少なくとも１つをさらに含むことができる。
【０２９２】
いくつかの特定の実施形態において、本発明のビヒクルにおける目的の核酸配列として含まれる感作成分は、ｃｓｅ１遺伝子を含む。より特定の実施形態において、このようなｃｓｅ１遺伝子は、タンパク質ＩＤ  ＡＡＣ７５８０２．１によって示されるように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のＣｓｅ１タンパク質をコードする。より特定の実施形態において、前記ｃｓｅ１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４６によって示されるように、核酸配列を含むことができる。より特定の実施形態において、前記ｃｓｅ１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４７によって示されるように、アミノ酸配列を含むＣｓｅ１タンパク質をコードする。いくつかのさらなる実施形態において、本発明の感作成分は、ｃｓｅ２遺伝子を含む。より特定の実施形態において、このようなＣｓｅ２タンパク質は、タンパク質ＩＤ  ＡＡＣ７５８０１．１によって示されるように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５であってもよい。さらなる実施形態において、本発明で使用するＣｓｅ２タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４８によって示される核酸配列によってコードされてもよい。より特定の実施形態において、前記ｃｓｅ２タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１４９によって示されるアミノ酸配列を含んでもよい。さらに、特定の実施形態において、本発明の感作成分は、ｃａｓ７を含むことができる。より特定の実施形態において、前記ｃａｓ７タンパク質は、タンパク質ＩＤ  ＡＡＣ７５８００．１によって示されるように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５  Ｃａｓ７であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ７タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５０によって示される核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１によって示されるアミノ酸配列を含むＣａｓ７タンパク質に関する。
【０２９３】
さらに、本発明の感作成分は、ｃａｓ５を含むことができる。より具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５  Ｃａｓ５  タンパク質ＩＤ  ＡＡＣ７５７９９．２である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ５タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５２によって示される核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態において、Ｃａｓ５タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３によって示されるアミノ酸配列を含む。
【０２９４】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の感作成分は、ｃａｓ６ｅを含むことができる。より特定の実施形態において、ｃａｓ６ｅタンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５  Ｃａｓ６ｅ  タンパク質ＩＤ  ＡＡＣ７５７９８．１であってもよい。特定の実施形態において、本発明で使用する  Ｃａｓ６ｅタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５４によって示される核酸配列によってコードすることができる。さらなる実施形態において、Ｃａｓ６ｅタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５によって示されるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態において、本発明のビヒクルにおける目的の核酸配列は、ｃａｓ３遺伝子をさらに含むことができる。より特定の実施形態において、ｃａｓ３遺伝子は、ＩＤ  ＡＡＣ７５８０３．１のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５  Ｃａｓ３タンパク質をコードする。さらなる実施形態において、Ｃａｓ３タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５６によって示される核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態において、Ｃａｓ３タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７によって示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【０２９５】
ＤＮＡ形質導入のために新しいファージ粒子の生成を分子生物学に使用して、例えば、現在の遺伝子操作系を使用することができない宿主について、形質導入系を確立することができる。重要なこととして、本発明に記載の原理を使用して、ＤＮＡ送達のための他のプラットフォームを細菌宿主の他のグループに生成することができる。例えば、潜在的に、グラム陽性宿主を感染させるファージを発現させて、本発明の技術を用いて、グラム陽性細菌の全体のグループを形質導入することができる。本発明は、さらに、酵母等の真核生物及びさらに高次の生物を形質導入するために、特定の操作されたファージカプシドを使用し、ＤＮＡを望ましい動物細胞に形質導入するための刺激的で新しいプラットフォームを作製することを予想している。
【０２９６】
いくつかの最適化したＴ７粒子で様々な宿主を形質導入する能力によって、特異的にも効率的にも、特定の細菌集団を容易に編集することができる。本発明の発明者等は、前に開示したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（１、２、３）を使用して細菌集団を全体的に編集することを実証した。これらの戦略において、粒子を形質導入することは、テーラーメイドのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を移行して、患者又は病院表面に見られる又は皮膚及び腸等の天然のフローラに由来する病原体の抗生物質耐性決定因子を除くことができる。そのため、本明細書に記載のプラットフォームによって得た粒子をこれらの設定に適用し、抗生物質耐性病原体に対する縮小しつつある武器庫に重要な新しい武器を提供することができる。
【０２９７】
したがって、追加の態様において、本発明は、目的の少なくとも１つの核酸配列を前記細胞集団に含まれる標的細胞（複数可）に形質導入することによって、細胞集団を操作する方法を提供する。いくつかの特定の実施形態において、方法は、対象、組織、臓器、表面、物質及び標的細胞（複数可）も含む物品の少なくとも１つに存在しうる細胞集団を、有効量の送達ビヒクル又はキット、系、又は同送達ビヒクルを含む組成物の少なくとも１つに接触させるステップを含むことができる。いくつかの実施形態において、このような送達ビヒクルは、（ａ）標的細胞（複数可）、又はバリアント、変異体又はそのフラグメントに適合性の少なくとも１つの宿主認識要素、及び（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子（複数可）を含むことができる。
【０２９８】
いくつかの特定の実施形態において、細胞集団を操作するために本発明で使用する送達ビヒクルは、本発明の方法によって調製されるビヒクルであってもよい。いくつかのさらなる実施形態において、このようなバクテリオファージは、本発明に記載の改変バクテリオファージであってもよい。
【０２９９】
いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法は、原核生物の細胞集団、真核生物の細菌集団又はその組み合わせもしくは混合物を操作するのに特に適しうる。本発明に開示する原核生物細胞又は真核生物細胞は、同様にこの態様に適用することもできることが理解される。
【０３００】
前述のように、本発明は、特定の標的細胞を特に標的にし、目的の核酸配列（複数可）を標的細胞に形質導入する強力な方法を提供する。この方法は、さらに、対象又は表面物品もしくは物質の何れかに目的の標的細胞を含む異なる細胞集団を操作し、編集することができる。標的細胞は、望ましい化合物を発現し、又は分泌するために操作することができ、あるいは、対象又は表面、物品又は物質（生物学的、人工的又は環境的の何れか）の何れかの標的細胞集団の組成物及び分布を置き換え、変化させる選択的利点を提供することによって、操作することができる。いくつかの特定の実施形態において、本発明の方法は、必要とする対象のマイクロバイオームを操作し、編集し、変化させるために使用することができる。
【０３０１】
「マイクロバイオーム」という用語は、本明細書で使用する場合、試料の共生の、相利共生の又は病原微生物の生態群集を指す。本開示で使用することができるマイクロバイオームの例として、限定されないが、皮膚マイクロバイオーム、臍マイクロバイオーム、膣マイクロバイオーム、結膜マイクロバイオーム、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）マイクロバイオーム、胃マイクロバイオーム、腸（ｇｕｔ）マイクロバイオーム及び口腔マイクロバイオーム、鼻腔マイクロバイオーム、消化器官マイクロバイオーム及び尿生殖路マイクロバイオームが挙げられる。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、対象の腸マイクロバイオームの操作に適用することができる。「腸（ｇｕｔ）マイクロバイオーム」（口語では腸管内菌叢）は、動物（この場合は哺乳動物）の消化管に住んでいる微生物種の複雑な群集を含む。この文脈において、腸（ｇｕｔ）は、微生物叢及びミクロフローラを有する腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）及びフローラと同義である。腸マイクロバイオームは、腸微生物叢のゲノムを指す。哺乳動物の宿主は、腸フローラがなくともほとんどおそらく生存することができるが、この２者の関係は、単なる共生ではなく（無害の共存）、相利共生である。哺乳動物の腸ミクロフローラは、使用していないエネルギー基質の消化、細胞成長に刺激を与えること、有害な微生物の成長を抑制すること、病原体にのみ反応するように免疫系を訓練すること、及びいくつかの疾患に対して防御することを含む様々な有用な機能を満たしている。特定の条件において、しかしながら、いくつかの種は、感染を作り出し、又は癌のリスクを増加させることで、疾患を発症させることができる。したがって、腸マイクロバイオームの特定の亜集団を標的にすることによって、本発明は、腸マイクロバイオームの部分である特定の微生物によって生じる条件を調整するためのテーラーメイドのツールを提供する。
【０３０３】
哺乳動物の腸マイクロバイオームの組成物は、優位にその大部分が嫌気的グラム陽性及びグラム陰性株についての細菌から成り、真菌、原虫及び古細菌の範囲を減少させる。細菌種の集団は、異なる個体ごとに広く変化するが、経時的には個体の内部で相対的に一定であるが、生活様式、食事及び年齢と共にいくらか変化しうる。腸マイクロバイオームの組成物の一般的な進化のパターンがヒト個体の寿命の間に観察されている。腸マイクロバイオーム組成物及び含有量は、長期の食事に従って変化する可能性があるが、地理的起源にも依存する。
【０３０４】
より具体的には、ヒトマイクロバイオーム又は微生物叢の組成物又は含有量を指すとき、４つの優勢な細菌門、すなわちファーミキューテス門、バクテロイデス門、放線菌門及びプロテオバクテリアに関する組成物を意味し、あるいは、優勢な細菌属、すなわちバクテロイデス属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、ユーバクテリウム属、ルミノコッカス属、ペプトコッカス属、ペプトストレプトコッカス属及びビフィドバクテリウム属に関する組成物を意味する。特に、バクテロイデス属が最も優勢であり、宿主の機能に重要となりうる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等の他の属は、少ない範囲で存在するが、宿主の機能に寄与することが分かった。
【０３０５】
さらに、特にヒト腸マイクロバイオームに関連するのが、年齢、ジェンダー、体重、又は国の区分に依存しない、細菌学的生態系に基づいたエンテロタイプ分類がある。３つのヒトエンテロタイプがあり、１型は、高レベルのバクテロイデス属（グラム陰性）を特徴とし、２型は、バクテロイデス属をほとんど有しないが、プレボテラ属（グラム陰性）が一般的であり、３型は高レベルのルミノコッカス属（グラム陽性）を特徴とする。エンテロタイプは、しかしながら、長期間の食事の影響を受ける可能性があり、例えば、高タンパク質及び脂肪を摂取している人は、１型エンテロタイプが優勢であり、食事パターンが高炭水化物の食事に長期間変化すると、２型エンテロタイプになる。
【０３０６】
そのため、本発明の方法は、質的、量的側面を含む哺乳動物の腸マイクロバイオームを構成する細菌種の全範囲に関する。本発明の方法は、偏在性の低いマイクロバイオーム成分に関し、例えば、カンジダ属、サッカロミセス属、アスペルギルス属及びアオカビ属を含む周知の属、ならびに古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）（古細菌（Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ）とも）のドメインに属する微生物、さらに培養することができない未分類の種がある。
【０３０７】
本発明に戻ると、特定の実施形態において、目的の核酸配列を標的にし、マイクロバイオーム内部の特定の宿主細胞に、特異的に形質導入することによる本発明の方法及び組成物は、哺乳動物の腸マイクロバイオームの組成物又は含有量に影響し、それによって、そこに不随する条件の範囲を調整する手段を提供することを意味する。この文脈において、「条件」という用語は、生物、特に哺乳動物の機能性及び代謝効率の観点での「健康状態」を示す。ヒトの場合、「条件」という用語は、身体的、精神的又は社会的困難に直面したとき、適応し、自己管理する能力をさらに示す。
【０３０８】
しかしながら、本発明は、動物の健康、特に獣医学が網羅する哺乳動物の健康状態にも関係することが理解される。
【０３０９】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法及びビヒクルによって細胞集団を操作することが、特に哺乳動物の対象の腸マイクロバイオームの細菌集団を変化させて、ビタミン、ペプチド、糖類、脂肪等の特定の有益な物質を産生することに適用することができる。これらの有益な物質は、目的の核酸配列によってコードすることができ、あるいは目的の核酸配列は、その合成に関与する産生物をコードすることができる。目的のこれらの核酸配列を本発明のビヒクル及び方法によって、特定の標的細胞に形質導入する。より具体的には、腸微生物は、広範囲の産生物を産生することができ、その生成は、養分可給性及び管腔環境、特にｐＨを含む多くの要因に依存しうる。微生物産物は、消化管の組織によって摂取され、潜在的には循環及び他の組織に到達し、尿及び呼吸に排出することができる。大腸の細菌による繊維及びタンパク質の発酵により、多くの豊富な生理学的に重要な産物のいくつか、すなわち、結腸直腸の組織及び細菌のエネルギーの鍵となる源として作用し、組織統合性を維持する細胞メカニズムを促進する短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）になる。ＳＣＦＡは循環に到達し、免疫機能及び肺等の組織の炎症に影響を与える。健康への影響について言及に値する他の産物が多く存在する。ビフィズス菌等の細菌はビタミン（例えば、Ｋ、Ｂ１２、ビオチン、葉酸、チアミン）を生成することができる。ヒトにおいて脂質の輸送及びターンオーバーの重要な成分である二次胆汁酸の合成は、ラクトバチルス、ビフィズス菌及びバクテロイデスを含む細菌を介して媒介する。生物学的作用を有する多くの脂質が、組織の炎症を引き起こしうるグラム陰性細菌の細胞壁の成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）を含む細菌によって産生される。ビフィズス菌等の細菌は、酢酸の生成によって、病原性感染を予防するのを助けることもできる。
【０３１０】
微生物が産生した多くの酵素は、消化及び健康に影響する。確かに、ヒトの腸における細菌の多様性の多くは、栄養素を分解するのに必要な微生物酵素能力のスペクトル、特に、ヒトが消化する複合多糖の多くの形態に起因しうる。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｍｉｃｒｏｎ等のいくつかの細菌は、炭水化物の分解に必要な酵素のアレイを産生する能力を有する。大腸の細菌フィターゼは、穀物に存在するフィチン酸を分解し、フィチン酸と複合化されたカルシウム、マグネシウム及びリン酸塩等のミネラルを放出し、これらを宿主組織（骨）に使用することができるようにする。ムチンを分解する酵素は、エネルギーの必要性を満足するように細菌を助け、腸の内側の粘液バリアの正常なターンオーバーを補助する。そのため、本明細書に開示する方法及びビヒクルによって、マイクロバイオームを操作することによって、本発明は、対象の内部の必須物質の産生、濃度及び性質に影響を与える方法を提供する。いくつかの特定の非限定的な実施形態において、このような物質は、本明細書に開示する細菌によって生成される物質であってもよい。
【０３１１】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法及びビヒクルによる細胞集団の操作は、例えば、膣マイクロバイオームにおいて、受胎調節のアプローチとして適用することができる。より具体的には、いくつかの種類の膣群集（群集状態タイプ）は、正常な健康な女性に存在し、それぞれが顕著に異なる細菌種生成物を有する。これらの群集は、４つのラクトバチルス菌種（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｉｎｅｒｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ及びＬ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）の１つによって占有されているか、それほど多くラクトバチルスを含まないが、厳しい通性嫌気性菌の多様なアレイを有する。最近の研究では、無症候性、さもなくば健康な女性２０〜３０％が、認識できる数のラクトバチルスを損なっている膣群集を有するが、いくらか高いｐＨ（５．３〜５．５）に関連する通性又は厳しい嫌気性細菌の多様なアレイを含むことが分かった。これらの微生物叢は、とりわけ、アトポビウム属、コリネバクテリウム属、アネロコッカス属、ペプトニフィラス属、プレボテラ属、ガードネレラ属、スネシア属、エガセラ属、モビルンカス属、ファインゴルディア属のメンバーを含む。
【０３１２】
本発明の方法は、受胎調節レジメン、より具体的には、男性避妊薬としての役割を果たす受胎調節レジメンの部分であってもよい。そのため、特定の実施形態において、本発明のビヒクル及び方法を用いて、膣マイクロバイオームの内部の特定の細胞を標的にすること、及び目的の核酸配列を形質導入することを使用して、卵子もしくは精子の生存率又は安定性又は精子の運動性に影響する物質を生成する細菌を産生することができ、したがって可逆的な避妊具として使用することができる。そのため、いくつかの実施形態において、本発明は、殺精子産物をコードし、又は殺精子産物の形成及び合成に関係する産物をコードする目的の核酸配列で、膣マイクロバイオームの細菌細胞を特に形質導入送達ビヒクルを提供することができる。本発明の殺精子核酸送達ビヒクル及び当該ビヒクルを含む避妊組成物が、当業者に周知の方法で、雌の哺乳動物の膣に送ることができることが理解される。組成物の送達について典型的な形態として、例えば、クリーム、ローション、ゲル、丸剤、エアロゾル、泡、海綿、女性用コンドームを含むコンドーム、坐剤及びフィルム等の膣内装置が挙げられる。さらに、本発明の殺精子組成物は、例えば、コンドーム潤滑剤等のパーソナルケア製品として使用することができる。
【０３１３】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法は、対象の皮膚マイクロバイオームの操作に適用することができる。多くの皮膚細菌は、４つの門：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａに分けられる。これらの４つの優勢な門は、内側の粘膜面（消化器管及び口腔）に見られる微生物叢も構築する。しかしながら、その割合は大きく異なり、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのメンバーは皮膚により豊富に存在し、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓのメンバーは、消化器管により豊富に存在する。腸及び皮膚微生物群集の共通の特徴は、門のレベルでは多様性が低いが、種のレベルでは多様性が高いように思われることである。したがって、本明細書で使用する場合、「皮膚マイクロバイオーム」という用語は、限定されないが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓス種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、及びその組み合わせを含む。さらに、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ種として、限定されないが、Ｐ．ａｃｎｅｓ、Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐ．ａｖｉｄｕｍ及びその組み合わせが挙げられる。ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含む。より具体的には、皮膚は、多くは有益又は無害である多くの微生物によってコロニー形成される。しかしながら、尋常性ざ瘡等の疾患は、マイクロバイオームの強い変化に関連する。ニキビは、特に、ヒト皮膚マイクロバイオームの歪みに関係すると考えられている。この歪みは、皮膚細菌Ｐ．ａｃｎｅｓの特定のサブセットによって生じる可能性がある。本明細書で使用する場合、「尋常性ざ瘡」及び「ニキビ」は、同義に使用し、未成年者に特に流行性の皮膚病態を指す。ニキビは、皮膚の炎症性及び非炎症性病変の形成に多くは関連する。ニキビは、ヒト皮膚マイクロバイオームの歪みに関係すると考えられている。この歪みは、皮膚細菌Ｐ．ａｃｎｅｓの特定の株によって生じうる。したがって、皮膚マイクロバイオームを操作し、Ｐ．ａｃｎｅｓを特異的に標的にすることによって、本発明は、ニキビ等の皮膚障害を予防し、治療するための方法及び組成物を提供する。
【０３１４】
本発明の態様のいくつかのさらなる実施形態において、本発明のビヒクル及び方法によって細胞集団を操作することは、化粧品用途も有しうる。より具体的には、匂いを生じさせる細菌を、本発明の方法によって、匂いのない細菌又は匂い発生物質と戦う細菌に置き換えることができる。
【０３１５】
いくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明の送達ビヒクルによって送達される目的の核酸配列は、例えば、匂いの形成に関与する産物をコードする細菌性の望ましくない遺伝子、例えば、本明細書に開示するリパーゼをコードする遺伝子に向けられるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含むことができる。（特に、選択的要素と共に感作要素として）このような系は、リパーゼを産生する細菌を、例えば、不完全なリパーゼ、又はしたがって匂いの形成に関係することができないリパーゼのない細菌に置き換えることができる。
【０３１６】
ヒトにおいて、身体の匂いは、主に、皮膚腺の分泌及び細菌活性によって形成される。異なる種類の皮膚腺の間で、ヒトの身体の匂いは、主に、皮膚フローラ（すなわち、微生物又は細菌）にとって必要な多数の化学化合物を分泌して、匂い物質に代謝するアポクリン汗腺が発したものである。
【０３１７】
身体の匂いは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのメンバーを含む皮膚フローラの活動の影響を受け、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのメンバーは、汗の脂質を分解するリパーゼと呼ばれる酵素を生成して、酪酸のような小分子を作る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓも、匂いに寄与するチオアルコール化合物を生成することが知られている。これらの小分子は匂いがし、身体の匂いに特徴的な香りを与える。汗の試料の多くにプロピオン酸（プロパン酸）が存在する。この酸は、青年及び成人の皮脂腺の管に成長するｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａによるいくつかのアミノ酸の分解産物である。プロピオン酸は、匂いを含む同様の特徴を有する酢酸と化学的に類似しており、身体の匂いは、特定の人にはビネガーのような匂いを有すると判断されうる。イソ吉草酸（３−メチルブタン酸）は、いくつかの強いチーズの種類にも存在する細菌のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの活動結果として生じる身体の匂いの他の源である。
【０３１８】
したがって、特定の実施形態において、本発明は身体の匂いを抑制する剤をさらに提供する。本発明の身体の匂いを抑制する剤は、ローション、エアロゾルスプレー、通常のスプレー、スティック、粉末、ロールオン、クリーム、ゲル、エマルジョン、シート（紙）、（ボディシャンプー及び棒状の石鹸等の）ボディソープ及び（シャンプー及びリンス等の）洗髪用化粧品等の様々な形態に調製することができる。本発明の身体の匂いを抑制する剤、一般的に知られている調製方法で、剤形に調製することができる。本発明の身体の匂いを抑制する剤を適用することができる身体領域の例として、必ずしも限定されないが、腋窩、腕、脚、踵、首、胸及び臀部が挙げられる。多くはヒト対象に適用することができるが、本発明の匂いを抑制する剤は、限定されないが、強い匂いを発するコンパニオンアニマル（ペット）、家畜、実験用動物、仕事用動物、及びスポーツ用動物を含む動物に適用することもできることに留意されたい。
【０３１９】
より具体的には、動物の匂いは、細菌及び酵母代謝分泌物、特に皮脂によって生じることが最も多い。皮膚が湿気を帯びる場所は、口腔内、耳、皮膚の重なり、尾の下であり、最も高濃度の酵母及び細菌ならびに最も強い匂いを有する。酵母及び細菌は、健康なペットであっても動物の皮膚に存在し、これらの生物の数は、皮膚が健康な場合、最小限に維持される。
【０３２０】
特に、本発明の送達ビヒクル及び方法によって個別化医療のためのツールとして、マイクロバイオームを操作し、編集する治療用途の他に、細胞集団の特異的な標的化操作も、例えば農業及び食品業界において産業上の利用可能性を示すことができる。したがって、いくつかの非限定的な実施形態において、本発明の送達ビヒクル及び方法は、食物の消化を改善し、乳の生産及び／又は肉の品質を改善するために、反芻動物の消化系の細菌集団を操作するのに有効となりうる。
【０３２１】
反芻動物の前胃は、宿主動物が摂取した飼料を一緒に分解し、発酵させる非常に多様な原核生物（細菌、古細菌、ウイルス）及び真核生物（原虫及び真菌）微生物を含む。反芻動物は、飼料の摂取についての微生物叢、結果としてその生存率に完全に依存する。常在性ルーメン細菌分類群の組成物と豊富さと宿主の生理学的パラメータとの繋がりがはっきりと示された。例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門に対するＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門の比と乳脂肪率の強い相関は知られている。したがって、ルーメンマイクロバイオームの調整は、細菌群集の設計によって、より良い農業収率に有用となりうる。
【０３２２】
改善された飼料の使用、より良い飼料転換効率及び動物の生産性のために、ルーメン細菌株の選択及び改善にかなりの範囲が存在する。ルーメン細菌生態系は、糞中の未消化の飼料の計測可能な部分の存在及び動物によるエネルギー源として使用することができるルーメンの大量のメタンガスの生成から、自明のこととして未消化の飼料の消化にとって効率的に充分ではない。
【０３２３】
遺伝子的ルーメン操作によって、セルロース分解等の望ましい活動の導入又は増加、及びタンパク質分解、脱アミノ化及びメタン生成等の望ましくない活動の減少を可能にする。この目的のために、１つのアプローチは、望ましい遺伝子を選択し、優勢なルーメン細菌に当該遺伝子を発現させることであると思われる。本発明の改変バクテリオファージを使用して、ルーメンに自然に存在する微生物を遺伝子的に改変して、規定した機能の能力を高め、又は新しい機能を加えることができる。多様な遺伝子を腸微生物に導入することは、広く発見されている。遺伝子改変微生物は、繊維成分及び飼料のリグニンを消化するか、又はトキシンを分解し、必須アミノ酸を合成し、反芻動物のメタン生成を減少させ、酸を許容することができるかの何れかである。
【０３２４】
本発明で考慮する反芻動物として、例えば、ウシ（例えば乳牛）、ヤギ、ヒツジ、アメリカバイソン、ヨーロッパバイソン、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、ウシカモシカ、アンテロープ、プロングホーン及びニルガイが挙げられる。
【０３２５】
いくつかの実施形態において、反芻動物のマイクロバイオームは、以下の微生物のリスト：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、ＲＦ３９、Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ、（科）Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃａｔｏｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ（目）Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、（科）Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ、Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ、（目）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、（目）ＹＳ２、（目）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ科、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、（科）Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｍｏｒｙｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、（科）Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、（目）Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆ１６科、Ｂｕｌｌｅｉｄｉａ、ｐ−７５−ａ５、Ｍｉｔｓｕｏｋｅｌｌａ及びｓｕｃｃｉｎｉｃｌａｓｔｉｃｕｍの少なくとも１つを含む。
【０３２６】
さらに、本明細書に開示するプラットフォームは、様々な産業的用途に使用する細胞集団を操作するためのツールを提供する。より具体的には、バイオテクノロジー業界は、燃料、食物、医薬、ホルモン、酵素、タンパク質及び核酸を含むヒトの存在に有用な生物学的物質の製造のために、細菌細胞を使用する。バイオテクノロジーの可能性は、遺伝子蓄積及び細菌の遺伝子的能力を考えると、無限である。
【０３２７】
宿主細菌に関して、本発明は、産業製品の製造に使用する、又は産業プロセスにおいて使用する細菌、特に、プロテオバクテリア門、ファーミキューテス門、バクテロイデス門に属する細菌に適用することができる。
【０３２８】
より具体的には、医薬業界において、細菌は、臨床的に有用な抗生物質及び酵素の主要な生産者であり、細菌は、かつて恐れられた疾患のワクチンの源であり、細菌は、哺乳動物の健康を向上させるプロバイオティクスである。実際に、多くの抗生物質が土壌に生きる細菌から作製されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ等の放線菌は、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、リファマイシン及びイベルメクチンを産生する。バチルス及びパエニバチルス種は、バシトラシン及びポリミキシンを産生する。細菌産物は、感染性疾患に対する免疫化のワクチンの製造に使用される。ジフテリア、百日咳、テタヌス、腸チフス及びコレラに対するワクチンは、それぞれの疾患を引き起こす細菌の成分から作製されている。
【０３２９】
バイオテクノロジーは、インスリン等のホルモン、ストレプトキナーゼ等の酵素、及びインターフェロン及び腫瘍壊死因子等のヒトタンパク質を製造している。これらの製品は、糖尿病、心発作、結核、ＡＩＤＳ及びＳＬＥを含む様々な医学的病態及び疾患の治療に使用される。ボツリヌストキシンは医療において、ＢＴ殺虫剤は防除に使用される細菌産物である。
【０３３０】
細菌のバイオテクノロジーの適用は、生物のスーパー株の遺伝子的構築を伴って、環境における特定の代謝タスクを実施する。例えば、石油製品を分解するように遺伝子操作された細菌は、石油流出の清掃及び他のバイオレメディエーションの試みに使用される。
【０３３１】
本発明の特定の実施形態は、本発明の送達ビヒクルを使用して、集団における有益な細菌、すなわち、治療用タンパク質、ビタミン、ワクチン、酵素、バイオ燃料及びその他の溶媒、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ属の異なる株を産生する細菌の増殖を促進する方法に関する。さらなる実施形態において、本発明の方法は、生物乳化剤を製造する細菌に適用することができる。特定の実施形態は、アシネトバクター属の異なる株に関する。さらなる実施形態は、生分解性プラスチックを生成する細菌について本発明の方法及び送達ビヒクルの使用を含む。特定の実施形態は、ビブリオ属の株に関する。本発明のさらなる実施形態は、バイオレメディエーションにおいて現れる細菌についての方法に関する。このような細菌について非限定的な例として、シュードモナス及びステノトロホモナス属の異なる株が挙げられる。
【０３３２】
より具体的には、食品業界において、細菌は、乳製品及び多くの他の食品の発酵に主に関係する。ラクトバチルス、ラクトコッカス及び連鎖球菌等の乳酸細菌は、カッテージチーズ及びクリームチーズを含むチーズ、発酵バター、サワークリーム、バターミルク、ヨーグルト及びケフィア等の乳製品の製造に使用する。乳酸細菌及び酢酸細菌は、オリーブ、キュウリのピクルス及びザワークラウト等のピクルスの工程で使用する。細菌発酵は、紅茶、コーヒー、ココア、醤油、ソーセージ及び我々の日々の生活における驚くほど多様な食品を加工するときに使用する。
【０３３３】
したがって、より特定の実施形態において、本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ及びＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属の何れか１つの株の細菌に適用することができる。
【０３３４】
さらなる実施形態は、本発明の方法の利用性をラクトコッカスの異なる株に拡張する。ラクトコッカスは、発酵乳製品の工業生産に広く使用される球状のグラム陽性細菌である。Ｌ．ｌａｃｔｉｓを完全に調査し、多くの用途に使用する。Ｌ．ｌａｃｔｉｓはいくつかの発酵経路を有するが、最も重要な目的は、チーズ及びミルク等の乳製品を製造するその性質である。Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、乳酸を排出する乳酸脱水素酵素に特殊化し、食品を保存し、食品の保存期間を延長させるために使用する。乳業は、環境及び細胞の挙動を操作することによって、Ｌ．ｌａｃｔｉｓの活動及び有効性を改善し続ける。
【０３３５】
さらに、本発明が提供する方法及びビヒクルによって細菌集団を操作することは、生物防除におけるいくつかの実施形態に適用することができる。より具体的には、シュードモナス属の特定のメンバー（例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ及びＰ．ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ）を穀物の種子に適用する、又は作物の病原体の増殖もしくは確立を防ぐ方法として、土壌に直接適用しており、この実践を概して、生物防除と呼ぶ。生物防除の下では、細菌は宿主植物の全身抵抗を誘発することができ、そのため、真の病原体による攻撃に良好に抵抗することができ、細菌は、例えば、鉄を取り込む競合優位性を与えるシデロホアによって、他の（病原性）土壌微生物を打ち負かすことができ、細菌は、フェナジン型抗生物質又はシアン化水素等の他の土壌微生物に拮抗性の化合物を産生することができる。
【０３３６】
例えば、腸マイクロバイオームの細胞集団を操作することは、プロバイオティクスの利用性も有することができる。そのため、さらなる実施形態において、本発明の方法は、異なる株のラクトバチルスに適用することができる。ラクトバチルスは、桿状のグラム陽性、発酵性、有機栄養生物細菌である。ラクトバチルスの株は、特定の条件下で、らせん状又は球桿菌状形状を形成することができるが、通常は直線的である。ラクトバチルスは、長さを変化させる対又は鎖で見られることが多い。乳酸桿菌は、乳酸細菌として分類され、ホモ乳酸発酵の最中に、グルコースを乳酸塩に転換することから、ほぼ全てのエネルギーを引き出す。乳酸桿菌、特にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、プロバイオティクス用途を有すると考えられている。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌は、糞便細菌叢の重要な部分である感受性の有益な微生物を増殖させることができる乳酸の生成によって腸のｐＨレベルを維持することを助け、そうすることで、重い抗生物質を使用した後でも腸管の有用な細菌を交換することを助けることができる。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌は、過敏性腸症候群、肝性脳症、喘息、高コレステロール、乳糖不耐症及び壊死性腸炎と戦うときの用途も有する。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、特定の酵素の産生によって、食物の消化を助けると思われるため、家畜の飼料の添加物としても使用する。
【０３３７】
バイオテクノロジーの別の領域は、遺伝子操作によって植物の品質の改善に関わる。本発明の送達ビヒクル及び本明細書では、植物が特定の害虫、除草剤及び疾患に耐性があるように、望ましい宿主細胞としても示される遺伝子操作した植物細胞によって、その植物に遺伝子を導入することができる。
【０３３８】
前述のように、本発明が提供する系は、表面、物品及び物質に存在する細胞集団を操作するために適用することができる。非限定的な例は、望ましい核酸配列として、抗生物質耐性遺伝子又はその他の望ましくない遺伝子を標的にする前述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有する本発明の改変バクテリオファージに関し、したがって、抗生物質耐性細菌の細菌集団を抗生物質治療に感受性の細菌集団に置き換えるために使用する。より具体的には、このような送達ビヒクルは、例えば、病院表面を処理するため、手の消毒石鹸又は医療関係者の皮膚フローラを標的にするための他の液体に使用することができる。耐性病原体について選択する抗生物質及び消毒薬とは対照的に、提案する治療は、感受性の病原体について豊富にし、選択する。特に、この戦略は、抗生物質耐性が生命脅威の状態にある免疫無防備の患者が入院する場合に、医療部門をさらに広げることができる。いくつかのさらなる実施形態において、この戦略は、高齢者、例えば、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染し、抗生物質耐性が原因で合併症を発症するかもしれない対象に適用することもできる。
【０３３９】
本発明は、布、繊維、泡、フィルム、コンクリート、石工、ガラス、金属、プラスチック、ポリマー等を含む多様な表面を、本発明のバクテリオファージに接触させることを含む。
【０３４０】
特定の実施形態において、バクテリオファージが病院、ホスピス、高齢者住宅又は他のケア施設にある表面に接触する。
【０３４１】
健康に関係する他の表面として、水質浄化、貯水及び送水、及び食品加工に関係する物品の内面及び外面が挙げられる。そのため、本発明は、食品又は飲料工場の固体表面をコーティングすることを含む。
【０３４２】
健康に関係する表面として、栄養、衛生又は疾患予防を提供することに関係する家庭用品の内面及び外面も挙げられる。したがって、本発明のバクテリオファージは、便器、カテーテル、ＮＧチューブ、吸入器等を消毒するために使用することもできる。より具体的には、カテーテルの内側表面又は装置の他の部分に細菌がコロニー形成することは、深刻な合併症を引き起こす可能性があり、移植した装置を取り除く、及び／又は置き換える、ならびに二次感染病態を厳しく治療する必要性を含む。
【０３４３】
本発明のキット及び系でコーティング、洗浄、フラッシング又は保管することができる医療装置は、概して、ポリエチレン、ダクロン、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ラテックス、シリコンエラストマー等の熱可塑性又はポリマー材料から成る表面を有する。金属表面を有する装置も本発明のキット、又は当該キットを含む溶液もしくは材料で、コーティング、洗浄又は保管することができる。本発明のキットの適用に特に適した特定の装置として、血管内、腹膜、胸膜、及び泌尿器科カテーテル、心臓弁、心臓ペースメーカー、血管シャント及び整形外科の、眼内又は陰茎補綴物が挙げられる。
【０３４４】
さらに、精製されている又は精製されていない通常の水道水を送る小孔管、歯科用ユニット等の固定具、内部顕微鏡管、カテーテル管、無菌充填口、及び無菌製造、食品加工等に使用される管には、周知のように、内面に細菌の増殖及び細菌耐性が生じる。本発明のキット及び系が、本明細書に記載の小孔管における細菌耐性を防ぎ、減少させるために使用することができることが理解される。
【０３４５】
他の実施形態において、本発明の（例えば、感作成分及び／又は選択的成分を有する）改変バクテリオファージを含むキット及び系は、治療対象の近位に適用することができる。いくつかの特定の実施形態において、キット又は系は、治療対象の近位の表面、装置又は物体に適用することができる。「治療対象の近位」という表現は、抗生物質耐性遺伝子（複数可）を水平伝播することを防ぐために、本発明に係るキット又は系を適用することができる前記対象のペリメータ周囲に関する。したがって、「前記対象の近位」は、前記対象の少なくとも約１センチメートル（ｃｍ）、２ｃｍ、３ｃｍ、４ｃｍ、５ｃｍ、６ｃｍ、７ｃｍ、８ｍ、９ｍ、１０ｃｍ、２０ｃｍ、３０ｃｍ、４０ｃｍ、５０ｃｍ、６０ｃｍ、７０ｃｍ、８０ｃｍ、９０ｃｍ、１メートル（ｍ）、２ｍ、３ｍ、４ｍ、５ｍ、６ｍ、７ｍ、８ｍ、９ｍ、１０ｍ、１１ｍ、１２ｍ、１３ｍ、１４ｍ、１５ｍ、１６ｍ、１７ｍ、１８ｍ、１９ｍ、２０ｍ、３０ｍ、４０ｍ又は５０ｍもの範囲に存在する物体全てを含む。「前記対象の近位」という用語は、また、本発明の改変バクテリオファージビヒクル又は本発明のキットもしくは系を治療対象の前記範囲に配置する前に、適用される物体に関する。
【０３４６】
いくつかの実施形態において、本発明のキット又は成分又はバクテリオファージは、１２時間毎、毎日、週に６回、週に５回、週に４回、週に３回、週に２回、又は週に１回でも固体表面に適用することができる。
【０３４７】
いくつかの実施形態において、本発明のビヒクルを含むキット及び系は、食品業界で使用する表面に使用し、適用することができ、又は食品又は食料製品に接触させる。例えば、食品又は食料製品として、限定されないが、ブタ、ウシ、子牛、マトン、ラム、ヒツジ、ヤギ、バイソン、ヘラジカ、シカ、アンテロープ、ウマ、イヌ、家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥、カモ、ガン、ホロホロチョウ、ダチョウ、ウズラ、ハト（ｄｏｖｅ）、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、エミュー、クジャクの雌等）又は他の哺乳動物もしくはトリ（鳥類）に由来する適切な肉又は肉製品が挙げられる。「牛肉製品」は、ウシ、バッファロー、バイソン及びクーズーを含むサブファミリーウシ亜科の成人哺乳動物の肉を含む。「豚肉製品」はブタの肉を含む。「鶏肉加工品」は、ニワトリ、カモ、ガン、七面鳥、ダチョウ、エミュー、ハト（ｄｏｖｅ）、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ウズラ、キジ、クジャク又はホロホロチョウ等の鳥類の肉を含む。「肉」は、全筋又はひいた筋肉又は臓器（例えば肝臓）を含むことに留意されたい。
【０３４８】
動物を屠殺することは、相互汚染によって製造された肉に重い細菌負荷が生じる厳しい衛生問題による課題がある。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のキットは、肉又は肉製品を準備し、保管する屠殺場又はスーパーで使用される表面又は物品、特に、容器、ステンレス鋼の箱、牛肉テンダライザ、グラインダー、包丁、ミキサー、腸詰め器具、プラスチックの箱、フロア及びドレインに適用することができる。屠殺場において、このような表面として腸詰め器具、プラットフォーム、フロア及びドレインが挙げられる。いくつかのさらなる実施形態において、本発明の改変バクテリオファージビヒクル又はキットもしくは系は、食品業界で使用される生物学的又は非生物学的表面、特に、肉製品を準備し、送り、保管することに関係する表面に適用することができる。より具体的には、屠殺場における表面として、ブタ、ウシ及び他の家畜の屠殺体を本発明のキットで処理をして、細菌負荷を減少させ、抗生物質に対する感受性を増加させることができる。より具体的には、動物の屠殺体全体を、本発明の改変バクテリオファージ、又は本発明に係るキットもしくは系を含む溶液又は液体に漬ける又は噴霧することができる。
【０３４９】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のキット及び系は、容器及び食料品をつかむための食品取り扱い器具に適用することができ、食品を含む、包装する、覆う、保管する、表示する、加工する、切る、せん断する、突き刺す、こねる、操作する、又は取り扱うことを含み、食品容器又は器具の表面は、食品に接触する。
【０３５０】
前述のように、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、食品、特に肉を保管する又は送るために使用される表面に適用することができる。包装は、通常の肉包装手段であってもよく、肉製品を、トレイ、収縮包装又はサラン等の透明フィルム、又はワックスのかかっていない又はワックスのかかった紙を含む紙で入れること、又は肉製品に適した方法で、包むこと、袋に入れること、箱に入れること、缶詰めすること、又は瓶詰めすることを含む。
【０３５１】
より具体的には、容器及び器具は、食品をつかむことができる使い捨て（すなわち１回だけの使用）又は使い捨てではない（すなわち複数回使用）の構造である。これらの構造として、限定されないが、せん断ラップ、シート、紙、ワックスのかかった紙、袋、カートン、トレイ、皿、ボウル、覆われた及び覆われていない保管容器、食べ物を出す皿、カップ、缶、瓶、ボトル、又は特定の食品について他の適切な容器の構造が挙げられる。食品を取り扱う目的に有用な追加の構造として、限定されないが、グローブ又はミトン、フォーク、スプーン、ナイフ、スライサー、プロセッサー、ジューサー、グラインダー、チッパ、フック、プレス、スクリュー、オープナー、カッター、ピーラー、トング、スクープ、カップ、シュート又はスパチュラ等の用具；カッティングボード、こねるためのボード、混合用ボウル、乾燥又は冷却ラック、又は棚が挙げられる。
【０３５２】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、シーフードに使用される表面又は容器に使用することができる。特に、シーフードとして、海水又は淡水水生生物、例えば、様々な魚類（例えば、ツナ、サーモン、オヒョウ、タラ、サメ、メカジキ、バス、ニシン、イワシ、トラウト、鯉、白身魚、及びパーチ）、軟体動物（例えば、貝、ホタテガイ、カキ、ムール貝、カタツムリ、タコ及びイカ）又は甲殻類（例えば、カニ、エビ、ロブスター及びザリガニ）が挙げられる。
【０３５３】
卵も特にサルモネラ菌といった汚染の対象であり、ニワトリの卵の汚染は、多くの方法で汚染される可能性がある。ニワトリの卵は、産まれる前に水平感染する可能性があり、卵が雌鳥の卵管にある最中に、細菌が生育中の卵に移動する。
【０３５４】
細菌汚染は、産卵過程において垂直感染によって生じる可能性もある。雌鳥は、多くの細菌のコモンキャリアであり、その多くはサルモネラ菌のように、消化管に存在する。卵は、生殖管、尿管及び腸管の末端としての役割を担う構造の排泄腔を通って産みつけられるときにこれらの細菌に汚染される可能性がある。概して、ニワトリの表面及び体内に存在する細菌（病原性フローラと正常なフローラの両方）は、卵と一緒に産みつけられ、接触すると、細菌は外層（角質）が硬化する前に、殻を通過することもできる。卵は、産みつけられると、環境細菌にも接触しうる。これらの細菌は、殻を通過し、特に、産まれて短時間に汚染が発生し、又は殻に蓄積しうると、結果的に殻に浸透する。殻に蓄積する細菌は、加工中に殻に浸透しうる。より具体的には、卵は、市販用卵の洗浄及び殺菌の最中にしばしば起こる温度変化に曝されると、卵の中身が感染し、負圧勾配を作りだし、細菌を効果的に殻及び外膜に運ぶ。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のキットは、卵に振りかけることができる。あるいは、卵は、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系を含む粉末の中で回転する、又は同ビヒクル又はそのキットもしくは系を含有する溶液に浸漬してもよい。
【０３５５】
さらに、いくつかの実施形態において、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、筐体システム、産卵している雌鳥に使用される、及び接触するケージ及び装置に適用することができる。
【０３５６】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、ペットフードの食品添加物として使用して、抗生物質耐性病原体がヒトに伝播することを減少させ、必要な場合、抗生物質で効率的にヒトを治療することができ、本明細書に記載の産物は、また、本質的に家畜化され、又は飼いならされた動物又は鳥、例えば、ウサギ、モルモット、熱帯魚及び鳥類によって消費されることを意図した食品に又はその添加物として、使用することをもできる。「ペットフード」という用語は、本明細書で使用する場合、概して、ペットによって消費されることを意図した食品を指す。特に、「ペットフード添加物」は、本明細書で使用する場合、概して、例えば、食品を消費している最中に、又は消費する直前に、ペットフードに添加する（例えば、組み込む及び／又は適用される）ことを意図した産物を指す。
【０３５７】
いくつかの実施形態において、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、生体表面又は組織に、特に、このような表面の細菌細胞集団を操作するために、適用することができることが理解される。いくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、粘膜表面に適用することができる。より具体的には、粘膜表面又は粘膜（１つの粘膜）は、本明細書で使用する場合、粘液を分泌する粘膜上皮を指し、消化器官、呼吸器官、生殖路、及び尿生殖路を覆い、これらの臓器：膵臓、目の結膜及び涙腺、唾液腺及び授乳乳腺の乳腺に関連する外分泌腺にも存在する。ガス交換（肺）、食物吸収（腸）、知覚性活動（目、鼻、口及び喉）及び生殖（子宮、膣及び乳房）の生理学的機能のために、粘膜表面は、必要に応じて、身体の内部に対して動的な、薄い、浸透性のバリアになる。これらの特性は、粘膜組織を病原体による破壊及び侵害に特に脆弱にする。したがって、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系を粘膜表面に適用することで、このような生体表面の細胞集団を操作することができ、例えば、（選択的成分による）細菌負荷を減少させ、（感作成分による）残っている病原体を感作し、それによって、細菌感染及び関連の病態の抗生物質治療を高めることができる。本明細書で使用する場合、細菌負荷の減少は、約１％〜１００％、特に約１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜４０％、約４０％〜４５％、約４５％〜５０％、約５０％〜５５％、約５５％〜６０％、約６０％〜６５％、約６５％〜７０％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％、約８５％〜９０％、約９０％〜９５％、約９５％〜９９％、又は約９９％〜９９．９％以上、特に１００％の細菌負荷の何れか１つを指す。
【０３５８】
いくつかのさらなる特定の実施形態において、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系を粘膜表面、例えば、（例えば、吸引器を使用して）肺組織に適用することは、慢性呼吸器感染症をり患している患者に特に適用することができる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）は、嚢胞性線維症を有する個体の気道から通常単離され、これらの患者の肺機能の加速度的な低下に関連し、したがって、本発明のキットを使用して抗生物質治療に対するこれらの細菌の感受性を増加させることで、ＣＦ患者の病態及び関連する症状を改善し、軽減することができる。より具体的には、嚢胞性線維症（ＣＦとしても知られる）は、本明細書で使用する場合、膵臓倍部の特徴的な瘢痕（線維症）及び嚢胞の形成を指す。呼吸困難が最も深刻な症状であり、抗生物質及び他の治療薬によって治療するが、治癒しない多くの肺感染症から生じる。副鼻腔感染症、乏しい成長、下痢及び不妊症を含む他の症状の多くは、身体の他の部分に対するＣＦの影響から生じる。ＣＦは、タンパク質嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の遺伝子の変異によって発症し、常染色体劣性遺伝疾患として考えられている。前述のように、本発明のキットをＣＦ患者の肺組織に適用することで、患者の病態が改善しうる。
【０３５９】
さらに、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、慢性肺コロニー形成及び気管支拡張症、気管支樹の疾患、慢性閉塞性肺疾患、気道が狭くなり、気流の異常を特徴とする疾患にも生じることもある感染症に適用することができる。さらに、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、入院患者、特に機械的に換気される患者の肺炎にも適用することができる。
【０３６０】
いくつかのさらなる実施形態において、泌尿生殖器又は生殖器に本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系を適用することは、尿路感染症にも適用することができる。本発明のキットは、粘膜組織に接触する表面、例えば、パッド、タンポン等に適用することもできることが理解される。
【０３６１】
さらに、生体表面として、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系は、特に創傷した皮膚、例えば、火傷の場合に、皮膚に適用する、又は噴霧することができる。したがって、本発明のキット（複数可）を含有する軟膏、クリーム、懸濁液、ペースト、ローション、粉末、溶液、油状物、ゲル又は粉末、又は本発明に開示するキットを含有する噴霧可能なエアロゾルもしくは蒸気を発症した皮膚領域に噴霧する、又は局所投与する、又はドレッシングすることも本発明に含まれる。通常の薬学的担体、水溶液、粉末又は油性基剤、増粘剤等が必要又は望ましい場合もある。「局所的用される」又は「局所投与される」という用語は、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、クリーム、皮膚軟化薬、バーム、ローション、溶液、軟膏（ｓａｌｖｅ）、軟膏（ｕｎｇｕｅｎｔ）又は他の薬学的剤形を、細菌感染性疾患又は皮膚に関係する他の症状の１つ以上の症状を発症するもしくは発症した、又は示すもしくは示した患者の皮膚の部分のいくらか又は全てに適用することを意味する。本発明のキットは、皮膚障害を治療するために使用されるマトリックス、布又は包帯に適用することができ、それにより抗生物質治療に対して細菌集団を感作することが理解される。
【０３６２】
前述のように、本発明のビヒクル又はそのキットもしくは系又はその成分を、粘膜組織に接触しうる表面、装置、容器又は器具に適用することができることが理解される。さらにいくつかの特定の例において、コンタクトレンズ（ＣＬ）ＣＬ保管ケース及びケア溶液の細菌によって生じる目の感染症は、ＣＬ関連角膜感染症のリスクファクターであり得、ＣＬ保管ケースの生物の持続性を説明しうる。異なる種類のレンズ装着様式は、コンタクトレンズ保管ケース、及び一晩の保管及び消毒のためのケア溶液の使用を必要とする。しかしながら、コンタクトレンズ保管ケース及び保管溶液は、細菌によって汚染される可能性がある。衛生行動以外の因子として、微生物耐性があり、コンタクトレンズの保管ケース及びケア溶液の持続的な微生物汚染に関連しうる。保管中に、レンズが、様々な細菌株及び他の微生物によるコロニー形成の影響を受けやすく、この問題は、レンズが過酸化水素、クロルヘキシジン、ビグアナイド又は四級アンモニウム化合物を含む消毒溶液に保管していても、存在する。コンタクトレンズの使用に関連する多くの深刻な感染症は細菌性角膜炎でありうるが、レンズケアシステムの汚染が目に影響を及ぼしうる毒素の産生につながりうる。効率的な感作キット（複数可）を提供することによって、本発明は、コンタクトレンズを保管する組成物及び方法を提供し、したがって、角膜感染症を抑制し、減少させ又は除く方法も含む。前述の方法は、本発明のキット（複数可）又は素の成分でコーティングしたレンズ保管容器を提供し、あるいは、さらに本発明のキットを含むケア溶液（保管溶液）を提供し、コンタクトレンズを本発明のキットでコーティングした容器に挿入し、及び／又は本発明の有効量のキットを含む溶液でコンタクトレンズを洗浄するステップを含みうる。
【０３６３】
本発明は、したがって、本発明の改変バクテリオファージビヒクル又はそのキットもしくは系でコーティングし、適用し、又は含有するコンタクトレンズ保管ケース（複数可）を提供することがさらに理解される。いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、本発明のキットを含むコンタクトレンズ保管及びケア溶液を提供する。
【０３６４】
さらに、本発明は、任意に、少なくとも１つの抗生物質化合物（特に前に開示した抗生物質）と組み合わせて、本発明の改変バクテリオファージビヒクルの治療有効量又はそのキットもしくは系を、感染性疾患をり患している対象に投与するステップを含む治療的方法をさらに提供する。本発明のキット又はその成分の適用が感染性疾患又は病態をり患している対象の補完治療を形成することができることをさらに留意されたい。
【０３６５】
本発明は、その別の態様において、少なくとも１つの改変バクテリオファージ又は改変バクテリオファージのカクテルもしくは混合物の有効量を含む組成物をさらに提供する。
より具体的には、このようなバクテリオファージは、（ａ）少なくとも１つの改変した宿主認識要素、及び任意に（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子を含むことができる。
【０３６６】
より特定の実施形態において、本発明の組成物に使用される改変バクテリオファージは、本発明に開示される実施形態に規定することができる。
【０３６７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、スプレー、スティック、塗料、ゲル、クリーム、洗浄、ふき取り、泡、石鹸、油、溶液、ローション、軟膏、手指消毒薬又はペーストとして配合することができる。
【０３６８】
「有効量」という用語は、当該組成物を投与した場合に、予測した生理学的反応を与えるように治療を受け、操作された個体の活性部位に望ましいレベルの活性剤を提供するために必要な組成物、特に、本明細書に記載の本発明の核酸送達ビヒクルに存在する活性剤の量に関する。正確な量は、多くの要因、例えば、活性剤、組成物の活動、使用する送達装置、組成物の物理的特徴、意図した患者への使用（すなわち、１日に投与する投与数）、疾患対象の場合の患者の配慮に依存し、本明細書で提供する情報に基づいて当業者によって、容易に決定することができる。本発明の核酸送達ビヒクルの「有効量」は、合計の有効量の１回の投与、又は複数回の投与によって投与することができる。有効量は、適量及び投与のタイミングを決定する標準的な臨床手順を用いて、決定することができる。「有効量」は、治療ヘルスケア専門家及び／又は個人によって、経験的及び／又は個別（ケースバイケース）の決定の結果になりうる。
【０３６９】
本発明の医薬組成物は、良好な医療行為に従って、本発明の方法によって、全身に、例えば、非経口、例えば、胸腺内に、骨髄及び静脈内、腹腔内、皮下、経皮的、局所的、筋肉内、関節内、結膜下、又は粘膜、例えば、経口、鼻腔内又は眼内投与によって、投与する及び服用することができる。
【０３７０】
治療を必要とする領域への局所投与は、例えば、手術中の局所適用、局所提供、特定の臓器に直接注射することによって達成することができる。より具体的には、前述の本発明の方法で使用する組成物は、非経口、腹腔内、経皮的、（頬側又は舌下を含む）経口、直腸、（頬側又は舌下を含む）局所、膣内、鼻腔内及びその他の適切な経路による投与に適合させることができる。このような製剤は、薬学の分野で周知の方法によって、例えば、有効成分を担体（複数可）又は賦形剤（複数可）と関連させて調製することができる。
【０３７１】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の組成物は、さらに、薬学的に許容される担体（複数可）、賦形剤（複数可）、添加物（複数可）、希釈剤（複数可）及びアジュバント（複数可）の少なくとも１つを含んでもよい。
【０３７２】
より具体的には、本発明に従って必要とする対象を治療するために使用する医薬組成物は、通常は単位剤形で存在してもよく、医薬業界で周知の通常の技術に従って調製してもよい。このような技術は、有効成分を担体（複数可）又は賦形剤（複数可）と関連させるステップを含む。概して、製剤は、有効成分、特に本発明の核酸送達ビヒクルを液体担体又は微細な固体担体又はその両方と均一に密に関連させて、必要な場合、製品を形成することによって調製する。組成物は、例えば、限定されないが、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟化ゲル、座薬及び浣腸剤等の多くの可能な剤形に製剤化することができる。本発明の組成物は、水性、非水性又は混合培地の懸濁液として配合することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含むことができる。懸濁液は、安定化剤も含んでもよい。本発明の医薬組成物は、限定されないが、エマルジョン、及びリポソーム含有製剤も含む。
【０３７３】
さらに、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤を使用してもよい。医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、粒剤、軟膏、溶液、座薬、注入薬、吸入剤、ゲル、微粒子及びエアロゾル等の固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に配合してもよい。活性剤は、投与後に全身性であってもよく、又は領域投与、壁内投与の使用、又は移植部位において活性用量を維持するように作用する移植片の使用によって局所化してもよい。活性剤は、即座の活性のために製剤化されても、徐放性に製剤化されてもよい。
【０３７４】
前述のように、本発明は、産業的及び治療的用途を有する送達ビヒクルの調製のためのプラットフォームを提供する。したがって、本発明は、細菌集団が関与する障害の治療のために、本発明のビヒクルの方法及び用途を提供する。より具体的には、核酸配列を目的の標的細胞に形質導入する改変したビヒクルを提供することによって、本発明は、特別に適合させた治療のための強力なプラットフォームを提供し、そのため、細胞によって生じた又は関連する病態をり患している対象の特定の細胞又は細胞集団を標的にする個別化医療に関する。細胞は、前述で特徴付けされていてもいなくとも、対象から単離することができ、患者の特定の病因細胞を標的にする特定の送達ビヒクルは、本明細書に記載のように調製することができる。
【０３７５】
したがって、いくつかのさらなる態様において、本発明は、病因細胞（複数可）によって生じた、又は関連する対象の病的障害の発症を治療、予防、改善、抑制又は遅延する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、前記対象に治療有効量の送達ビヒクル又はキット、系又は同送達ビヒクルを含む組成物の少なくとも１つを投与するステップを含む。より具体的には、送達ビヒクルは、（ａ）前記病因細胞（複数可）、又はそのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントに適合性の少なくとも１つの宿主認識要素、及び（ｂ）目的の少なくとも１つの核酸分子を含むことができる。
【０３７６】
いくつかの実施形態において、送達ビヒクルの内部に含まれる少なくとも１つの適合性の宿主認識要素（複数可）は、本発明の方法によって得ることができる。特に、最初の（ａ）では、少なくとも１つの宿主認識要素、そのバリアント、変異体、タンパク質又はフラグメントをコードする複数の核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、少なくとも１つのパッケージングシグナル及び選択可能な要素をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。ステップ（ｂ）では、前記複数の核酸分子を含む第１宿主細胞（複数可）を、前記送達ビヒクルの伝播を可能にする条件下で、少なくとも１つの不完全な宿主認識要素（複数可）又はそのタンパク質又はフラグメントをコードする核酸配列（複数可）を有する送達ビヒクルに接触させ、前記第１宿主細胞に伝播した得られた送達ビヒクルバリアントを回収する。次のステップ（ｃ）は、第２宿主細胞（複数可）をステップ（ｂ）で回収した送達ビヒクルバリアント（複数可）に接触させることを伴う。いくつかの実施形態において、「第２宿主細胞」として、前記対象の試料から得られる病因細胞を使用することができることに留意されたい。次のステップ（ｄ）では、前記選択可能な要素を含むステップ（ｃ）で得た宿主細胞（複数可）のコロニーを選択する。ステップ（ｅ）では、宿主認識要素（複数可）をコードする核酸配列を、ステップ（ｄ）で選択した宿主細胞から単離し、及び／又は特徴付けして、前記病因細胞（複数可）に適合性の宿主認識要素をコードする核酸配列を得る。その後、パッケージされたこれらの特定の宿主認識要素治療用核酸配列を含むビヒクルを調製することができる。これらのビヒクルは、対象に特別に適合される。「第２宿主細胞」は、対象の試料、体液、組織又はその臓器の試料から得ることができることに留意されたい。これらの細胞は、対象の周囲の表面、物品又は物質から取り出される環境的試料から得ることもできる。
【０３７７】
いくつかのさらなる実施形態において、本発明の方法で使用するバクテリオファージに含まれる目的の核酸配列は、（ａ）少なくとも１つのｃａｓ遺伝子及び少なくともＣＲＩＳＰＲアレイを含む少なくとも１つの感作成分であり、前記ＣＲＩＳＰＲの少なくとも１つのスペーサーは、前記病因細胞（複数可）の病原性又は望ましくない遺伝子の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記病原性又は望ましくない遺伝子を特異的に不活性にし、前記ＣＲＩＳＰＲ標的の少なくとも１つのスペーサーは、選択的成分の内部に含まれるプロトスペーサーを標的にし、前記選択的成分を特異的に不活性にし；又は（ｂ）少なくとも１つのプロトスペーサーを含む少なくとも１つの核酸配列の何れか１つを含みうる。
【０３７８】
感染性病態に関連する障害に係る「治療」という用語は、前記感染性病態に関連する障害の強度又は頻度をなくすこと、低下又は減少させることの１つ以上を指してもよい。治療は、前記感染症に関連する障害が発症したときに行われ、又は前記病態にかかりやすい個体の感染性病態の発生を予防し、又は減少させるために、例えば、１〜１４日毎に投与するといった連続投与であってもよい。
【０３７９】
「予防」という用語は、生物学的又は医学的事象の発生リスク、特に、感染性疾患に関連する障害の発生又は再発を予防する、又は低下させることを指し、研究者、獣医、医者又はその他の臨床医によって、組織、系、動物又はヒトにおいて予防することが求められ、「予防的有効量」という用語は、この目的を達成する医薬組成物の量を意味することを意図している。したがって、特定の実施形態において、本発明の方法は、予防、すなわち感染性疾患に関連する病態の予防に特に有効である。したがって、前記組成物を投与された対象は、過去にすでに感染性病態を経験した対象における再発の可能性の低い感染性病態に関連する症状を経験する可能性が低い。
【０３８０】
本明細書に示す「改善」という用語は、本発明に係る組成物及び方法によって、症状の減少、引き起こされた対象の病態の改善に関係し、前記改善は、細菌感染に感染する病理過程の抑制、その規模の著しい減少、又は疾患の対象の病理学的状態の改善という形態で明白にすることができる。
【０３８１】
「抑制」という用語及びこの用語の全てのバリエーションは、前記病理過程症状又は過程が関連する病的症状の進行及び悪化、又は病理過程の進行の制限又は禁止を含むことを意図する。
【０３８２】
「除く」という用語は、任意に以下に記載の本発明の方法に従って、病的症状及びおそらく病因の実質的な根絶又は除去に関する。
【０３８３】
「遅延」、「発症を遅延させる」、「遅延させる」という用語及びその全てのバリエーションは、病的障害又は感染性疾患及びその症状の進行及び／又は悪化を緩慢にすること、さらに進行、さらに悪化又は発症を緩慢にし、本発明に係る治療がない場合よりも遅延したように見えることを意図する。
【０３８４】
「方法」という用語は、本明細書で使用する場合、限定されないが、化学、薬学、生物学、生化学及び医療分野の当業者が周知の方法、手段、技術及び手順から、知られる又は容易に開発される様式、手段、技術及び手順を含む、所与の仕事を達成するための様式、手段、技術及び手順を指す。
【０３８５】
「治療する」という用語は、本明細書で使用する場合、病態の進行を廃する、実質的に抑制する、又は逆転させる、病態の臨床的又は審美的症状を実質的に改善する、又は病態の臨床的又は審美的症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０３８６】
「疾患、「障害」、「病態」等は、本明細書で使用する場合、対象の健康に関係し、同義に使用し、当該用語のそれぞれ及び全てに帰する意味を有する。
【０３８７】
本発明は、必要とする対象又は患者の治療に関する。「患者」又は「必要とする対象」は、前述の病原体に感染しうる生物及び本明細書に記載の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ、ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）キット（複数可）系（複数可）及び方法を望む者を意味し、ヒト、イヌ科及びネコ科、ウシ、サル、ウマ及びマウス対象、げっ歯類、家畜用鳥類、水産養殖、魚類、及び外来種の観賞魚等の家畜及び非家畜哺乳動物を含む。治療対象は、爬虫類又は動物園の動物であってもよい。より具体的には、本発明のキット（複数可）及び方法（複数可）は、哺乳動物の病態を予防することを意図する。「哺乳動物対象」は、示した治療が望まれる哺乳動物を意味し、ヒト、サル、イヌ、及びネコ対象、多くは特にヒトを含む。特に、非ヒト対象に場合、本発明の方法は、注射、飲料水、食事、スプレー、経管栄養及び必要とする対象の消化器官に直接注入による投与を用いて実施することができるに留意されたい。
【０３８８】
さらに、本発明は、本発明のキット及びその成分を細菌集団に適用することによって、前記細菌集団を感作し、又は少なくとも１つの抗生物質化合物に対する前記集団の感作を増加させる方法をさらに提供する。
【０３８９】
いくつかのさらなる態様において、本発明は、本発明のキット及びその成分を使用して少なくとも１つの抗生物質化合物に対する細菌又は細菌集団（複数可）の耐性を防ぎ又は減少させる方法を提供する。
【０３９０】
本発明は、本発明のキット又はその成分を、前記細菌を含む表面に適用することによって、病原性細菌の発生を処理する方法を提供する。
【０３９１】
前述のように、本発明は、望ましい標的細胞を特異的に形質導入する非常に特別で効率的なビヒクルを提供する。そのため、この特異性は、診断用途に使用することができる。より具体的には、本発明のビヒクルは、特定の病原体に専ら向けられ、特に、前記標的病原体にレポーター遺伝子を導入するように設計することができる。生物学的又は環境試料におけるこの病原体の診断は、レポーター遺伝子、特に、前記レポーター遺伝子によって形成された検出可能なシグナルによって決定することができる。したがって、いくつかのさらなる実施形態において、本発明は、生物学的又は環境試料を望ましい病原体、及びレポーター遺伝子をコードする核酸配列に向けた宿主認識要素を含む本発明の送達ビヒクルに接触させることを伴う診断方法を提供する。レポーター遺伝子によって生成されたシグナルの検出は、試料における前記病原体の存在を示す。「レポーター遺伝子」という用語は、ポリペプチドをコードする遺伝子に関し、その発現は、様々な周知のアッセイで検出することができ、検出したシグナルのレベルは、レポートされたものの存在を示す。レポーター遺伝子の非限定的な例は、ルシフェラーゼ、ＮａｎｏＬＵＣルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）、赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ）、分泌アルカリホスファターゼ（ｓｅａｐ）、βガラクトシダーゼ（ｇｕｓ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、及びクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（ｃａｔ）をコードし、発現する遺伝子である。
【０３９２】
本発明の特定の特性は、明白にするために、別々の実施形態の文脈に記載し、１つの実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、本発明の特定の特性は、簡潔にするために、１つの実施形態の文脈に記載し、別々に、又は適切な副組み合わせで、又は本発明に記載の他の実施形態において適切に提供することもできる。様々な実施形態の文脈に記載する特定の特性は、これらの実施形態の実施にこれらの要素が必須でない限り、実施形態の基本的な特性と考えない。
【０３９３】
前述し、以下の請求項において請求する本発明の様々な実施形態及び態様の実験的支持が、以下の例において分かる。
【０３９４】
本明細書で使用する全ての科学用語及び技術用語は、他に断りがない限り、技術分野で一般的に使用される意味を有する。本明細書が提供する定義は、本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするためにあり、本開示の範囲を限定することを意味していない。
【０３９５】
「約」という用語は、本明細書で使用する場合、最大１％、より特定すると５％、より特定すると１０％、より特定すると１５％逸脱する値、いくつかの場合では指示値より最大２０％より高いか低い値を示し、偏移範囲は整数値を含み、適用可能な場合、非整数値も含み、連続範囲を構成する。本明細書で使用する場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【０３９６】
「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、「有する」という用語及びその複合体は、「限定されないが〜を含む」ことを意味する。この用語は、「〜から成る」及び「本質的に〜から成る」という用語を含む。「本質的に〜から成る」というフレーズは、組成物又は方法が、追加の成分及び／又はステップを含みうるが、追加の成分及び／又はステップが、請求する組成物又は方法の基本的な新規特徴を物質的に変化させない場合に限られる。本明細書、実施例、以下の請求項の全体を通じて、文脈において別のことを要求しない限り、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）及びその変化形（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、記載の整数もしくはステップ、又は整数もしくはステップの群を含むことを意味するが、その他の整数もしくはステップ、又は整数もしくはステップの群を除外しないことが理解される。
【０３９７】
本発明の様々な実施形態が、範囲のフォーマットで示すことができることに留意されたい。範囲のフォーマットにおける記述は、利便性及び簡潔性のためだけにあり、本発明の範囲を堅固に限定するものとして考えるべきではないことが理解される。したがって、範囲の記述は、可能な全ての部分範囲及びその範囲の内部の個別の数値を特別に開示していると考えられるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記述は、特に、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、ならびにその範囲の内部の個別の数字、例えば、１、２、３、４、５、及び６を特に開示していると考えるべきである。この記述は、範囲の幅にかかわらず適用する。数値範囲を本明細書で示す場合はいつでも、指示範囲の内部に示される数値（分数又は積分）を含むことを意味する。第１指示数字と第２指示数字との「間の範囲」ならびに第１指示数字「から」第２指示数字「まで」の「範囲」は、本明細書では同義に使用し、第１指示数字及び第２指示数字、ならびにその間の全ての分数及び積分数値を含むことを意味する。
【０３９８】
開示し、記載してきたように、本発明は、当該方法のステップ及び組成物はいくらか変化しうるように、本明細書に開示する特定の例、方法、ステップ及び組成物に限定されない。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを記述する目的で使用し、本発明の範囲が、添付の請求及びその等価物によってのみ限定されるため、限定することを意図していないことが理解される。
【０３９９】
本明細書及び添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈でそうではないと断りがない限り、複数指示物を含むことに留意されたい。
【０４００】
以下の例は、本発明の態様を実施する上で本発明の発明者が使用する技術の代表例である。これらの技術は本発明を実施するための好ましい実施形態の例であるが、当業者は、本開示の観点から、本発明の趣旨及び意図する範囲から逸脱することなく、多く修正することができることを認識していることが理解される。
【実施例】
【０４０１】
以下の実施例は、前述と共に非限定的な様式で本発明のいくつかの実施形態を説明する。
【０４０２】
概して、本明細書で使用する命名法及び実験室の手順は、分子的、生化学的、微生物学的及び組み換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、‘‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ’’Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）；‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’’Ｉ−ＩＩＩ巻  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ等、‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’’，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，‘‘Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ’’，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ等、‘‘Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ’’、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ等（編）‘‘Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ’’、１−４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；４，６８３，２０２号；４，８０１，５３１号；５，１９２，６５９号及び５，２７２，０５７号に記載の方法；‘‘Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ’’、Ｉ−ＩＩＩ巻  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；‘‘Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ’’  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、３編；‘‘Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’Ｉ−ＩＩＩ巻  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ等（編）、‘‘Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’（８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（編）、‘‘Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ’’、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは、特許及び科学文献に広く記述され、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；３，８３９，１５３号；３，８５０，７５２号；３，８５０，５７８号；３，８５３，９８７号；３，８６７，５１７号；３，８７９，２６２号；３，９０１，６５４号；３，９３５，０７４号；３，９８４，５３３号；３，９９６，３４５号；４，０３４，０７４号；４，０９８，８７６号；４，８７９，２１９号；５，０１１，７７１号及び５，２８１，５２１号；‘‘Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ’’Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，編（１９８４）；‘‘Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ’’  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，編（１９８５）；‘‘Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ���ｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ’’Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，編（１９８４）；‘‘Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ’’Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，編（１９８６）；‘‘Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ’’ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；‘‘Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ’’Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）及び‘‘Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ’’１−３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；‘‘ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ等、‘‘Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ’’ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照こと；これらは、あたかも本明細書に全文が記載されているように参照により援用される。その他の一般的な参照は、本明細書に提供する。前記の手順は技術分野で周知と考えられ、読者の利便性のために提供する。本明細書に含まれる全ての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０３】
実験手順
試薬、株及びプラスミド
Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、及びＮａＣｌ５ｇ／Ｌ）及び寒天は、Ａｃｕｍｅｄｉａ製であった。２ＹＴ培地は、Ｂａｃｔｏ−トリプトン１．６％（ｗ／ｖ）（Ａｃｕｍｅｄｉａ）、Ｂａｃｔｏ−酵母抽出物（Ａｃｕｍｅｄｉａ）１％（ｗ／ｖ）、及び蒸留水中のＮａＣｌ０．５％（ｗ／ｖ）（Ａｃｕｍｅｄｉａ）を含んだ。抗生物質、リゾチーム、Ｌ‐アラビノース及びマルトースは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍに由来した。制限酵素、ライゲーション酵素、ＤＮＡ修飾酵素、及びＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製であった。本発明で使用する細菌株及びファージは、表１に列挙する。
【０４０４】
2019520075.tif 000003
【０４０５】
プラスミドの構築
標準的な分子生物学技術を用いてプラスミドを構築した。ＤＮＡセグメントはＰＣＲで増幅した。標準ＤＮＡ消化及びライゲーションは、製造者の指示に従って行った。本発明で使用するファージ尾遺伝子を表２に列挙し、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって最適化し、合成したコドンであった。本研究で使用したプラスミドを表３に列挙し、構築に使用したオリゴヌクレオチドを表４に挙げ、構築に使用したプライマー及びテンプレートを表５に挙げた。
【０４０６】
2019520075.tif 000004
【０４０７】
2019520075.tif 000005
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【０４０８】
2019520075.tif 000008
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【０４０９】
2019520075.tif 000010
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【０４１０】
株の構築
ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ：：ｋａｎをＫｅｉｏコレクション（１５）から得た。ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡΔｗａａＣをｐＣＰ２０１６）を用いてカナマイシン耐性マーカーを切除することによって構築した。得た株（ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ）をドナー株としてＫｅｉｏコレクションのＢＷ２５１１３ΔｗａａＣ：：ｋａｎを用いてＰ１形質導入のアクセプター株として使用した。Ｐ１形質導入は、Ｙｏｓｅｆ等，２０１１（１８）に記載のように実施した。
【０４１１】
エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）変異原を用いたプラスミドライブラリの調製
一晩、Ｔ７パッケージングプラスミドを内部に有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３の培養物を適切な抗生物質を含むＬＢ培地５ｍｌに１：５０に希釈した。培地を３７℃で数時間曝気した。中間対数期に到達したときに、細胞を２回洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。その後、ＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を培地に１％加え、細胞を３７℃で１時間曝気した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、適切な抗生物質を補充した５０ｍｌのＬＢに再懸濁し、３７℃で１６時間曝気した。一晩の培地を使用して、以下に記載のＴ７ファージのライブラリを調製した。この手順は、本発明のパッケージングプラスミド、例えば、パッケージングプラスミドｐＩＹＰＥ１９（その核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４に記載）を調製するために使用し、パッケージングプラスミドｐＩＹＰＥ１９は、尾繊維タンパク質ｇｐ１１、ｇｐ１２及びｇｐ１７の少なくとも１つ（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、３９、２５に記載）、パッケージングシグナル（複数可）（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、２１、２２又は２３）及び抗生物質耐性遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４４に記載）の少なくとも１つをコードする核酸配列を特異的に変異する配列を含み、適切な抗生物質を含む２ＹＴ培地に１：５０で希釈した。
【０４１２】
ｇｐ１１、ｇｐ１２、及びｇｐ１７を欠失したバクテリオファージＴ７の調製
遺伝子１７の代わりにｔｒｘＡ−ＦＬＰを有するＴ７ファージを前述（１７）の相同組み換えによって構築した。端的には、ｐＧＥＭＩＹ３９８Ｆ（ｇｐ１７をコード）及びｐＣＡＩＹ３９６（遺伝子１７の末端に対して隣接する相同配列でｔｒｘＡ−ＦＬＰをコード）を有するＢＷ２５１１３細胞を一晩培養した。その後、ｔｒｘＡをコードするファージをＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ／ｐＧＥＭＩＹ３９８Ｆで選択した。ＦＬＰリコンビナーゼを使用して、ｔｒｘＡ遺伝子をＢＷ２５１１３／ｐＧＥＭＩＹ３９８Ｆ／ｐＡＣ−ＦＲＴのファージの連続的伝播によって、Ｔ７Δ１７ｔｒｘＡ−ＦＬＰファージからｔｒｘＡ遺伝子を切除した。最後に、Ｔ７Δ１７ファージを（１７）に記載のように単離した。
【０４１３】
Ｔ７Δｇｐ（１１−１２−１７）を構築するために、遺伝子１１−１２を同様の手順を用いてファージＴ７Δ１７から削除した。端的には、ｐＧＥＭ３ＲＣＦ（ｇｐ１１、ｇｐ１２及びｇｐ１７をコード）及びプラスミドｐＣＡＩＹ４０５（遺伝子１１−１２の末端に隣接する相同配列でｔｒｘＡ−ＦＬＰをコード）を有するＢＷ２５１１３細胞を使用して、遺伝子１１−１２をｔｒｘＡ−ＦＬＰで置換した。その後、ｔｒｘＡをコードするファージをＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ／ｐＧＥＭ３ＲＣＦで選択した。ＦＬＰリコンビナーゼを使用して、ＢＷ２５１１３／ｐＧＥＭ３ＲＣＦ／ｐＡＣ−ＦＲＴのファージの連続的伝播によって、Ｔ７Δｇｐ１７Δｇｐ（１１−１２）：ｔｒｘＡ−ＦＲＴファージからｔｒｘＡ遺伝子を切除した。最後に、Ｔ７Δ（１１−１２−１７）ファージを（１７）に記載のように単離した。
【０４１４】
形質導入形成ユニット（ＴＦＵ）を含む可溶化液の調製
Ｔ７パッケージングシグナル及び尾タンパク質をコードするプラスミドを内部に有するドナー株Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３を一晩培養したものをＬＢで１：５に希釈し、３７℃で追加の時間、曝気した。細胞を遠心分離で洗浄し、新鮮なＬＢで再懸濁した。培養物を約２の感染効率（ＭＯＩ）で、Ｔ７Δ（１１−１２−１７）の約５＊１０８ＰＦＵで感染させた。感染させた培養物を溶解が発生するまで、３７℃で１．５〜２時間曝気した。溶解した後、クロロホルムを添加し、可溶化液を最大速度で２分間遠心分離にかけた。得られた可溶化液は、ファージＤＮＡを粒子の約半分及びプラスミドコーディング遺伝子１１、１２、及び１７を含む粒子の半分を含んでいた。プラスミドの形質導入の特異性を決定するための実験において、２つのプラスミド：Ｔ７パッケージングシグナルを有するプラスミド、及びパッケージングシグナルを欠失している尾タンパク質を内部に有する追加のプラスミドの一晩の培養物がＥ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３を有していたことを除いて、可溶化液を前述のように調製した。
【０４１５】
ＴＦＵアッセイ
抗生物質を補充した無菌ＬＢを、ｔｒｘＡ遺伝子（ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ又はΔｔｒｘＡΔｗａａＣ）（１６）を欠失しているレシピエントＥ．ｃｏｌｉ株の単一コロニーに接種させた。培養物を３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで振盪した。次の朝、新鮮な一晩の培養物を、抗生物質を補充した５ｍｌのＬＢに１／５０で希釈し、約０．５のＯ．Ｄに達するまで３７℃で振盪した。レシピエント培養物を使用するまで氷の上で保管した。
【０４１６】
可溶化液を連続希釈するために、９６ウェルプレートを使用した（可溶化液が高力価である場合、最大１０−９の希釈、そうでなければ最大１０−７の希釈で調製するべきである）。次に、前述のように調製した１０μｌの可溶化液を１０μｌのレシピエント培養物と混合した。プレートを強く振盪させて３７℃で１時間置いた。回収時間の間、抗生物質を補充したＬＢプレートをフードで１時間乾燥させた。最後に、１０μｌの得られた培養物を乾燥したプレートに、所々に置いた。プレートを一晩（Ｏ．Ｎ．）３７℃で培養した。コロニーの数を数え、ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡのＴＦＵ力価を、宿主のファージ伝播を可能にするために使用し、測定した。
【０４１７】
形質導入アッセイ
指数関数的培養期のレシピエント細胞を、前述のように調製したＴ７  ＴＦＵ可溶化液の連続希釈で、１：１比（ｖ／ｖ）で混合した。培養物を振盪しながら３７℃で６０分間インキュベートした。次に、培養物を適切な抗生物質を含むＬＢ−寒天プレートに置き、３７℃で一晩インキュベートした。ＴＦＵ／ｍｌを、示した参照株で得られた１０８形質導入体に正規化した。
【０４１８】
ハイブリッドＴ７粒子の新しい宿主（ＧＯＴｒａＰ）にＤＮＡ形質導入を行う能力の向上
総量１０ｍｌのレシピエント細胞及びＴ７  ＴＦＵ可溶化液による形質導入アッセイを前述のように行った。形質導入体を選択的プレートからプールし、プラスミドを抽出した。精製したプラスミド（１００ｎｇ）をＢＷ２５１１３に再形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充したＬＢプレートに播種した。形質転換体を一晩のインキュベーション（約１＊１０６）の後に回収し、前述のようにＥＭＳで変異誘発させた。Ｔ７可溶化液をＥＭＳ処理細胞から調製し、レシピエント細胞を形質導入するために使用した。Ｔ７可溶化液は、レシピエント細胞のＴＦＵを正規化するために、参照株を形質導入するためにも使用した。
【０４１９】
実施例１
野生型パッケージプラスミドからの許容的Ｔ７受容体結合タンパク質の選択
Ｔ７ファージの尾タンパク質が、Ｔ７ファージによる異なる宿主の認識を示すことを以前に示した（１０）。ファージの宿主範囲を拡張する以前の試みは、宿主のファージの増殖を指示する能力に依存した（１０）。ユニークな選択圧力下で、これらの尾タンパク質の定向進化によって、これらの宿主に伝播するファージの能力に関わらず、核酸（例えばＤＮＡ）を望ましい宿主に挿入するために使用することができることが推測される。
【０４２０】
このために、Ｔ７ファージ粒子のプラスミドＤＮＡをパッケージし、形質導入する能力を使用した。このようなパッケージングは、プラスミドが適切なパッケージング配列をコードする場合に生じる（１３）。パッケージされたＤＮＡは、抗生物質耐性を与え、したがってパッケージされたＤＮＡを内部に有する細菌を適切な抗生物質で選択することができる。ユニークな選択圧力下で、これらの尾タンパク質の定向進化によって、これらの宿主に伝播するファージの能力に関わらず、ＤＮＡを望ましい宿主に挿入するために使用することができることが推測される。
【０４２１】
この特徴を用いて、Ｔ７受容体結合タンパク質をコードする尾遺伝子（主に遺伝子ｇｐ１１、ｇｐ１２及び１７）をパッケージする。遺伝子ｇｐ１１、ｇｐ１２及び１７をコードするプラスミドをパッケージするために使用するファージは、これらの尾遺伝子を欠失しており、したがって、ＤＮＡ形質導入は、プラスミドから発現した受容体結合タンパク質に依存する。パッケージされたＤＮＡは、コードした受容体結合タンパク質が、宿主受容体と適合性にする変異を有する場合にのみ、挿入することができることがさらに推測される。受容体が野生型尾タンパク質に適合しない宿主は、変異した適合性の尾タンパク質が形質導入されたプラスミドでコードされる場合にしか形質導入されない。したがって、系は、望ましい宿主を認識する変異した尾遺伝子の選択を可能にする。形質導入されたプラスミドを抽出し、この手順を繰り返すことで、図１の例について実証したように、高い形質導入の有効性を有する尾タンパク質がさらに選択される。
【０４２２】
系が確かに、新しい宿主について、受容体結合タンパク質をコードする遺伝子を選択することができることを本発明者の発明者が最初に確認した。これは、制限標的宿主のモデルとして提供されるｗａａＣ受容体及びｔｒｘＡを欠失しているＥ．ｃｏｌｉ株について実証した。この宿主は、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの本質的なサブユニットであるｔｒｘＡを欠失しているため、Ｔ７の増殖を支持しない。この宿主は、ＬＰＳ生合成に必要な遺伝子であるｗａａＣを欠失しているため、認識可能なＴ７受容体も欠失している。したがって、この宿主は、Ｔ７ファージの増殖又はＤＮＡ形質導入を支持しない。適合性の尾タンパク質を有するＴ７ファージは、ＤＮＡを伝播することができないが、形質導入することができ、一方では野生型Ｔ７は、ＤＮＡを形質導入することも伝播することもできない。
【０４２３】
操作していないパッケージラスミドの集団からプラスミドを選択することを最初に説明した。そのため、Ｔ７ファージは、野生型のパック可能なプラスミドを内部に有するＢＷ２５１１３  Ｅ．ｃｏｌｉ株に伝播した。（図１Ｂに画像で示すように）得られた可溶化液を用いて、図１Ｃに示す「臨床株」（本明細書では「標的宿主」又は「望ましい株」とも呼ばれる）のモデルとして役割を担う制限的Ｅ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡ  ΔｗａａＣを形質導入した。この可溶化液を使用した形質導入は、コロニーを生成し、そのいくつかは、おそらく、本明細書では「宿主認識要素」とも呼ばれる適合性の受容体結合タンパク質をコードするプラスミドを内部に有した。これらのコロニーをプールし、プラスミドを抽出し、ＢＷ２５１１３に形質転換した。これらの細胞を別のパッケージングサイクルに供した。この可溶化液を使用した形質導入は、少なくとも２回以上コロニーを生成し、２回以上繰り返したサイクルで、１０４倍以上のコロニーを生成し、形質導入されたプラスミドが、結果的にＴ７ファージによってパッケージされ、再形質導入され、適合性の受容体結合タンパク質を有するプラスミドをコードする（図２）。
【０４２４】
この推測をさらに検証するために、異なるサイクルから精製したプラスミドを配列決定した。注目すべきことに、遺伝子１７の変異（Ｓ５４１Ｒ）を確認し、ｗａａＣ遺伝子を欠失しているＥ．ｃｏｌｉの受容体の認識が向上した。独立した実験では、同じ独立した変異が生じ、プラットフォームの再現性及び新しい宿主に適合性を有する新しい尾を生成する効率性を実証した。したがって、選択スキーム及び結果としての富化は、確かに、望ましい表現型を生み出す変異を有する粒子を直接的に発達させた。
【０４２５】
実施例２
ハイブリッドＴ７ファージはＤＮＡを新しい宿主に効率的に形質導入する
本明細書の実施例１に示し、実証したように、Ｔ７ファージはプラスミドをパッケージし、形質導入するため、本発明の発明者は、異なる尾が異なる宿主の特異性を決定し、上手くこれらの宿主に伝播させるファージの能力に関わらず、望ましい宿主にＤＮＡ形質導入することができると仮説を立てた。ここで、プラスミドをパッケージするために使用するＴ７ファージは、その尾遺伝子（遺伝子１１、１２、及び１７）を欠失していた。結果として、形質導入粒子への成熟は、形質導入されたプラスミドによってトランスに産生される尾遺伝子に依存する。したがって、プラスミド形質導入は、尾遺伝子産物がハイブリッド粒子に構築される場合にのみ、及びこの尾遺伝子産物が形質導入した宿主の受容体を認識する場合にのみ、生じる可能性がある（図３Ａ）。望ましいハイブリッドは、抗生物質耐性を標的宿主に与えるプラスミド形質導入を可能にする。さらに、本発明の発明者の仮説を支持する本発明のプラットフォームを確立するために、前述の表２に記載の１５個の異なるファージの尾遺伝子、ならびに抗生物質耐性マーカー及びＴ７パッケージング配列をコードするプラスミドを設計した（１３）。
【０４２６】
前述の実施例１に示した設計と同じように、１５個の異なるハイブリッド粒子可溶化液を異なるプラスミドを内部に有するＥ．ｃｏｌｉで調製した。図３Ｂに示すように、産生したハイブリッド粒子可溶化液の形質導入効率を、図に示す１２個の異なる標的宿主で試験を行った。形質導入効率は、形質導入されたプラスミドによってコードした抗生物質耐性マーカーを獲得するコロニー形成ユニットの数を数えることとで決定した。
【０４２７】
ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ宿主株は、ｔｒｘＡを欠失しているためにＴ７ファージの伝播を支持しないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２の誘導体であり（Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼサブユニットをコードする宿主遺伝子［［Ｍｏｄｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎｖｉｔｒｏ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ａｎ  ａｎ  ｅｍｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ−  ａｎｄ  ｈｏｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５０、５５１５−５５２２（１９７５）］を標的宿主として使用した。図３Ｂに示すように、Ｔ７尾タンパク質をコードする宿主において産生するハイブリッド粒子は、効率的にＤＮＡをＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡ宿主株に形質導入した。さらに、前（１０）に示したように、ＫｌｅｂｓｉｅｌｌａファージＫ１１を示すハイブリッド粒子は、ＤＮＡをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ菌種３９０に効率的に形質導入した。
【０４２８】
（図３に示すように）試験を行ったその他のＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ株は、図３Ｂに示すように、ハイブリッド粒子の少なくとも１つによってＤＮＡ形質導入を示した。Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（図３Ｂに示す）も、いくつかのハイブリッド粒子によって、低から中程度の効率で形質導入した。細菌の同属の内部の適合性のハイブリッドの数の偏差は、劇的に変化することができる（例えば、Ｓｅｎ４５１３対Ｓｅｎ４５１０）。いくつかの宿主は、単一のハイブリッド粒子によってしか形質導入されなかったが、このことは、複数のハイブリッドの試験が、少なくとも１つのハイブリッド粒子と新しい宿主の適合性の組み合わせを見つけるために欠かせないことを示している。一方で、いくつかの宿主は、複数のハイブリッド粒子によって効率的に形質導入され（例えば、Ｓｓｏ４７２７は、試験対象の１５個のハイブリッド粒子のうち１２個によって形質導入された）、このことは、適合性のハイブリッド粒子を見つけることは、多くの細菌宿主にとっておそらく実行可能であることを示している。まとめると、これらの実験は、このアプローチが、ＤＮＡを新しい宿主に形質導入するために、ファージの使用を著しく拡張すれば、本発明のプラットフォームの実行性が明らかに確立する。この目的は、ファージの伝播を必要とする先行技術研究では、取り組みも実証することもできなかった。したがって、図８の模式図にも示すように、本発明のプラットフォームは、先行技術の方法を上回る明らかな利点を示している。
【０４２９】
実施例３
変異誘発した野生型パッケージプラスミドからの許容的Ｔ７受容体結合タンパク質の選択
さらに、適合性のプラスミド（すなわち、適合性の受容体結合タンパク質をコードするプラスミド）を変異したパッケージプラスミドの集団から選択し、尾タンパク質のバリアントをコードすることを次に実証した。本発明の発明者は、コードする改変した尾遺伝子によってより効率的に形質導入されたプラスミドを選択することによって、形質導入効率を改善することができるという仮説を立てた。より具体的には、本発明の発明者は、ＤＮＡ形質導入の実験において、このような改変した尾をコードするプラスミドが親の尾をコードするプラスミドよりも効率的に形質導入され、その理由は、改変した尾をコードするプラスミドを示す粒子が、親の尾を示す粒子よりも優れてＤＮＡを形質導入するためであると推測した。以下のいくつかの形質導入サイクルに従って、形質導入したプラスミドを回収し、使用して、より多くのハイブリッド粒子を産生し、高い形質導入能力を有する尾タンパク質をコードする変異体プラスミドの単離が可能になる（図４Ａ）。この原理は、本明細書に記載の手順「ＧＯＴｒａＰ」を発展させることに基づいていた。
【０４３０】
ＧＯＴｒａＰ手順（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を、表現型（すなわちＤＮＡの形質導入）をこの形質導入を可能にする望ましい遺伝子型（すなわち尾コード遺伝子の変異）に結合するプラットフォームとして開発し、変異原の存在下で、図４Ａに模式的に説明した手順を含む。
【０４３１】
ＧＯＴｒａＰの実現可能性試験として、変異原ＥＭＳを使用して、前述のように尾タンパク質１１、１２及び１７をコードするパッケージ可能なプラスミドにランダムな変異を生成した。遺伝子１１、１２及び１７を欠失しているＴ７ファージをこれらのプラスミドを内部に有する宿主で伝播させた。その後、得られた可溶化液を使用して、実施例１に記載のＥ．ｃｏｌｉ  ΔｔｒｘＡΔｗａａＣ（ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡΔｗａａＣ）を形質導入した。この宿主は、ｔｒｘＡを欠失しているためＴ７ファージの伝播を支持せず、ＬＰＳ生合成（１９）に必要な遺伝子であるｗａａＣを欠失しているため、Ｔ７宿主受容体、リポ多糖（ＬＰＳ）をコードしない。したがって、この宿主は、Ｔ７ファージの増殖又はＤＮＡ形質導入を支持しない。次に、ＤＮＡを形質導入することができる変化した適合性の尾タンパク質でＴ７粒子を単離することを目的として、さらなる実験を行った。ＥＭＳ変異原性を使用して、Ｔ７尾タンパク質をコードするパッケージ可能なプラスミドにランダムな変異を生成した。その後、これらのプラスミドを内部に有するＥ．ｃｏｌｉ宿主を使用して、プラスミドをコードした変異体尾を示す粒子を生成した。その後、得られた粒子を使用して、制限的Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＷ２５１１３ΔｔｒｘＡΔｗａａＣを形質導入した。抗生物質を使用して、形質導入体を選択して、数を数えた（図４Ｂ、サイクル０）。これらの形質導入体をプールし、そのプラスミドを抽出し、粒子を形質導入するための追加の可溶化液を生成するために使用する新鮮なＥ．ｃｏｌｉ宿主に形質転換した。この可溶化液を用いて形質導入すると、最初の可溶化液（図４Ｂ、サイクル１）よりも１０４倍以上のコロニーを生成し、２回以上サイクルを繰り返すと、最初の可溶化液（図４Ｂ）よりも約１０７倍以上のコロニーを生成した。これらの結果は、形質導入したプラスミドがＴ７ファージによって再パッケージされ、再び形質導入され、制限宿主に対して変異した適合性の尾をコードすることを示している。この推測を検証するために、サイクル３から精製したプラスミドを配列決定した。前述の結果と同様に、遺伝子１７の変異を、Ｔ７ファージをＥ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳ変異体（１９）に吸着することができることが知られる残基の隣の位置のすなわちＤ５４０Ｎで識別した。
【０４３２】
確かに、この特異的変異で導入されたプラスミドは、図４Ｃに示した親プラスミドよりも約１０６倍以上の形質導入の効率性を増加させた。この結果は、識別された変異が観察した表現型に関与することを確認した。４つの独立した実験では、同じ独立した変異が生じ、ＧＯＴｒａＰの再現性及び新しい宿主に適合性の新しい尾を発達させる効率を実証した。Ｄ５４０をチロシン残基（Ｄ５４０Ｙ）に置換する同位置の変異は、変異体プラスミドＭＰ６を使用したときに明らかになった。興味深いこととして、実施例１に示す選択スキーム及び結果的な富化によって、変異原（例えばＤ５４１Ｒ）を使用して得られた同様の位置に、望ましい表現型を生み出す変異を有する粒子を直接的になんとか発達させた。
【０４３３】
ＧＯＴｒａＰをＥ．ｃｏｌｉ以外の株にも適用することをさらに示すために、前述のアッセイを使用して、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ（Ｔ７ファージ伝播を支持しない株、表６）の臨床単離体を中程度の効率で形質導入した粒子の形質導入効率を改善した。このために、Ｔ７尾タンパク質をコードする変異したプラスミドをＳ．ｓｏｎｎｅｉ（すなわちＳｓｏ４７２７）に形質導入し、抽出し、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主に戻って形質転換した。これらの宿主は、結果として新しい可溶化液を生成するために使用した。新しい可溶化液を使用して、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉを再び形質導入し、これらのサイクルを３回繰り返した。１回目、２回目及び３回目サイクルに従って、おそらく変異したプラスミドを高い形質導入効率で富化するため、最初の効率性より約５０、１２０及び１５０倍の粒子を形質導入する力価の増加を、それぞれ連続してモニターした（図４Ｂ）。この効率は、おそらく全てのプラスミドが増加した形質導入効率で変異体になった場合に、３回目のサイクルで安定した。
【０４３４】
抽出したプラスミドのＤＮＡシーケンシングは、遺伝子１７の変異を明らかにし、４７９位でグリシンをセリンに置換した。確かにこの変異が形質導入効率の増加を担う唯一の変異であることを検証するために、親プラスミドをこの位置で変異させ、その形質導入効率を変異していないプラスミドと比較してモニターした。興味深いこととして、変異したプラスミドは、図４Ｃに示した親プラスミドよりも約１５０倍以上、形質導入効率を増加させた。この結果は、識別された変異が観察した表現型に関与することを確認した。
【０４３５】
さらに、以下に示すように、非Ｔ７尾を含むハイブリッド粒子は、ＧＯＴｒａＰアッセイによって最適化することもできる。Ｔ７カプシド及び尾から構成されるが、ファージ１３ａに由来する尾繊維を有するハイブリッドを、さらにＤＮＡをＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ４８００ＩＩに形質導入するように最適化した。この場合も同様に、図４Ｂに示すようにハイブリッド粒子の形質導入効率を著しく改善するのに充分な３回のサイクルを実施した。この場合では、遺伝子１２に変異を識別し、７３３位において、グリシンをアスパラギン酸置換した。確かに、前述の特異的変異で構築された変異プラスミドは、図４Ｃに示す対照プラスミドよりも形質導入効率を増加させた。全体として、これらの結果は、ＧＯＴｒａＰアッセイが複数の細菌属にわたって、粒子のＤＮＡ形質導入効率を著しく増加させることができることを示す。
【０４３６】
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【０４３７】
実施例４
望ましい核酸分子の目的のレシピエント標的宿主細胞への形質導入
前述のように、望ましい宿主を認識する適切な尾及び尾タンパク質を選択することで望ましいＤＮＡ送達を可能にすると思われる。これらの尾タンパク質をパッケージングシグナルのないプラスミドにクローンする。追加のプラスミド、すなわち、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又は他の抗生物質感作要素、又はパッケージングシグナルをコードする望ましいＤＮＡを含む送達される構築物を同時導入する。これらのファージを有する２つのプラスミドを内部に有する宿主の感染によって、望ましいＤＮＡを望ましい宿主に注入する適合性の尾タンパク質を有するハイブリッドファージにする。
【０４３８】
したがって、尾遺伝子をコードしない望ましいプラスミドを新しい宿主に形質導入することができる再プログラムファージカプシドの能力を以下に詳細に説明した。このために、２つのプラスミド、１つはＧＯＴｒａＰアッセイで得た親又は変異した尾遺伝子をコードするパッケージすることができないプラスミド、もう１つは、図５Ａに模式的に示した抗生物質マーカーを有するパッケージ可能なプラスミドを、粒子を産生するために使用したＥ．ｃｏｌｉ宿主に形質導入した。
【０４３９】
前述に示した結果から、変異した尾をコードする宿主に産生されるパッケージ可能なプラスミドを内部に有する産生した粒子は、このプラスミド（すなわち、パッケージ可能なプラスミド）を、親の尾で産生されたプラスミドよりも効率的に形質導入することが推測された。可溶化液を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉΔｔｒｘＡΔｗａａＣ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ４７２７、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ４８００ＩＩを形質導入した。結果として、形質導入したプラスミドが耐性を与える抗生物質を補充したプレートに株を播種し、次の日に数を数えた。
【０４４０】
図５Ｂに示すように、パッケージ可能なプラスミドの形質導入は、測定した親及び変異体尾の形質導入効率に対応した。
【０４４１】
パッケージングシグナル（尾遺伝子ではない）をコードするプラスミドの移行を、図６に示すこの研究において識別した適合性の尾をコードする宿主で産生したその他のハイブリッド粒子を使用して観察した。特異性の対照として、形質導入した細胞を、尾をコードしたプラスミドによって与えられた抗生物質耐性を含むプレートに播種した。パッケージすることができないプラスミドは、パッケージングシグナルを有するプラスミドより、少なくとも１００倍低い効率で形質導入され、このことは、パッケージ可能なプラスミドが、パッケージすることができないプラスミドよりも少なくとも１００倍以上、特別に送達されることを示している（図６）。これらの実験は、ハイブリッド粒子カプシドが、確かにプログラムされ、望ましいＤＮＡプラスミドを新しい宿主に形質導入することを効率的、特別に促すことができることを示す。
【０４４２】
本発明の発明者は、ＧＯＴｒａＰプロトコルをレシピエントＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＡＴＣＣ  １４０２８株にさらに適用した。レシピエントは、ＢＷ２５１１３／ＭＧＰ４１８７で調製したファージハイブリッド粒子［Ｔ７（ｇｐ１１−１２）ＹｐｓＰ−Ｇ（ｇｐ１７）］で形質導入した。形質導入したプラスミドを回収し、より多くのハイブリッド粒子を産生するために使用する１０回の形質導入サイクルの後、最初の可溶化液よりも１０３倍以上のコロニーを産生する可溶化液を得た（図７）。これらの結果は、形質導入したプラスミドがＴ７ファージによって再パッケージされ、再び形質導入され、制限宿主に対して変異した適合性の尾をコードすることを示している。このことを検証するために、サイクル１０の可溶化液で形質導入した後に、いくつかのＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍクローンの尾遺伝子をシーケンシングした。いくつかの変異が、遺伝子１１、遺伝子１２、及び遺伝子１７に対して上流領域で識別された（表７）。
【０４４３】
遺伝子１７の上流で変異の効果を確認するために、親プラスミドをこれらの位置（ｍｕｔ１及びｍｕｔ２、表７）で変異させ、親プラスミドと比較して形質導入効率をモニターした。このために、それぞれがｇｐ１７のＡＴＧ開始コドンに対して−９位又は−１０位上流の点変異を有する２つのプラスミドを構築した。変異したプラスミドは、親プラスミドよりも約５０倍以上、形質導入効率を増加させた（図７Ｂ）。この結果は、これらの変異が観察した表現型に部分的に関与していることを明白に示している。
【０４４４】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｂ−１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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