(57)【要約】本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）からなる群から選択されるインターロイキンを安定的に発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞またはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）からなる群から選択されるインターロイキンを安定的に発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞またはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を含む組成物。
【請求項２】
インターロイキン−２（ＩＬ−２）を安定的に発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該細胞が、構成的様式で該インターロイキンを安定的に発現するように遺伝的に修飾されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
該細胞が、誘導的に該インターロイキンを安定的に発現するように遺伝的に修飾されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項５】
該細胞が、該インターロイキンをコードする導入遺伝子および自殺遺伝子を発現するように修飾されており、該導入遺伝子および自殺遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
該細胞が、好ましくはレンチウイルスベクターである組込みウイルスベクターにより修飾されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
該細胞が、Ｃｒｓｐｒ−Ｃａｓ９システム、Ｚｉｎｇフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはメガヌクレアーゼなどの導入遺伝子の組み込みを可能にするシステムにより修飾されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
該細胞がポリクローナル細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
該細胞が、該細胞を抗原特異的またはリガンド特異的にする標的分子を該インターロイキンと共に共発現するように修飾されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
該細胞がヒト細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
該インターロイキン−２が、デス−アラニルセリン−１２５ヒトインターロイキンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
該インターロイキン−２が、ヒト成熟ＩＬ２タンパク質（配列番号３）に対して、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ１０９Ｃ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆ、Ｄ８４Ｇ、またはＤ８４Ｉからなる群から選択されるアミノ酸置換を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
患者における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するのに使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴｒｅｇの組成物。
【請求項１４】
患者における移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するのに使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴｒｅｇの組成物。
【請求項１５】
患者における癌または感染症を治療するのに使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＴｅｆｆの組成物。
【請求項１６】
該細胞が、治療する患者にとって自己由来または同種異系である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞療法の分野に関する。本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）からなる群から選択されるインターロイキンを安定的に発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞またはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を含む組成物を提供する。かかる修飾Ｔｒｅｇ組成物は、免疫成分を有する疾患、例えば、自己免疫および／または炎症性疾患、アレルギー、移植拒絶、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防するのに有用である。修飾Ｔｅｆｆ組成物は、癌および感染症の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−２は、当初、Ｔｅｆｆの活性化および機能をサポートすると記載された薬物である。同様に、ＩＬ−２は癌免疫療法に高投与量で使用される。これらの高投与量で、ＩＬ−２はＴｅｆｆを活性化する。
【０００３】
制御性細胞（Ｔｒｅｇ）がそれらの発達、機能および生存についてインターロイキン２（ＩＬ−２）に依存することが最近示された（ＫｌａｔｚｍａｎｎおよびＡｂｂａｓ，２０１５，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（５）：２８３−９４）。マウスにおけるＩＬ−２をコードする遺伝子のノックアウトは、予測される免疫不全よりもむしろ、重度のリンパ球増殖および自己免疫をもたらした。この知見のすぐ後に、ＩＬ−２受容体のβ鎖（ＩＬ−２Ｒβ；ＣＤ１２２とも呼ばれる）またはＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５とも呼ばれる）をコードする遺伝子のノックアウトを有するマウスの類似表現型が記載された。Ｔｒｅｇの標準的な表現型マーカーとしてのＣＤ２５の記載は、ＩＬ−２シグナル伝達の欠陥がＴｒｅｇに影響し、自己免疫を引き起こす可能性があることを示唆していた。これは、ＴｒｅｇがＩＬ−２欠損マウスまたはＩＬ−２Ｒ欠損マウス中に存在しないこと、および正常マウスからのこれらの細胞の養子導入が該欠損マウスにおける自己免疫を予防することができることを示すことにより確認された。これらのノックアウトマウス研究の結論は、ＩＬ−２シグナル伝達の喪失が免疫寛容および恒常性の破壊をもたらすので、ＩＬ−２の主な役割はＴｒｅｇの維持であり、エフェクターおよびメモリーＴ細胞の発達ではないということである。
【０００４】
しかしながら、Ｔｒｅｇは本質的にＩＬ−２を産生することができず、これは主として非Ｔｒｅｇ活性化Ｔ細胞により提供される。実際、免疫応答の間、活性化Ｔｅｆｆは制御ループにおいてＴｒｅｇを「増強する」（Ｇｒｉｎｂｅｒｇ−Ｂｌｅｙｅｒら，２０１０，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１２０（１２）：４５５８−６８）。エフェクター免疫応答が低下する傾向があるとき、Ｔｒｅｇは効率的であるのに十分なＩＬ２を見出さない場合がある。
【０００５】
Ｔｒｅｇは自己免疫疾患および炎症を調節し、かつすべての免疫応答を制御する。従って、Ｔｒｅｇに基づく治療法は、自己免疫疾患および／または炎症性疾患、またはアレルギーの治療に大きな可能性を有する（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ＆Ａｂｂａｓ，前出）。これは、例えば低投与量のＩＬ２により、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴｒｅｇを拡大および活性化することにより達成されることができる（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ＆Ａｂｂａｓ，前出）。またこれは、天然のまたは修飾されたＴｒｅｇを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大されたＴｒｅｇ（ＧｉｔｅｌｍａｎおよびＢｌｕｅｓｔｏｎｅ，２０１６，Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ７１：７８−８７）を用いた細胞療法によっても達成することができる。しかしながら、これは大量のＴｒｅｇの反復注射を必要とすることがあり、面倒である。
【０００６】
また、Ｔｅｆｆに基づく治療法が、特に癌の分野において開発されている。かかる治療法は、「腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）」から採取することができるものとして、天然の抗癌Ｔｅｆｆ、またはＣＡＲ−Ｔ細胞などの人工的Ｔｅｆｆのいずれかを含むことができる（Ｆｅｌｄｍａｎら，２０１５  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．４２（４）：６２６−３９）。
【０００７】
ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆを培養することは、培養培地に大量のＩＬ−２を添加することを含む。ＩＬ−２との培養の数日または数週間後、これらの培養条件と比較して比較的ＩＬ−２が乏しい環境を表す患者において、特に、正常個体よりも遺伝的に調節された低いＩＬ−２生産をしばしば有する自己免疫疾患患者のために、これらの細胞は再注射される（ＫｌａｔｚｍａｎｎおよびＡｂｂａｓ，前出）。これは、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの生存および機能に影響を及ぼし得る。
【０００８】
従って、改善されたＴ細胞療法に対する要望がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）からなる群から選択されるインターロイキンを安定的に発現する制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞またはエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を提供する。
【００１０】
本発明の主題は、ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆを含む組成物である。
【００１１】
ＩＬ−２を分泌するＴｒｅｇがさらにより好ましい。
【００１２】
好ましい実施形態において、該細胞は、構成的様式で該インターロイキンを安定的に発現するように遺伝的に修飾されている。
【００１３】
別の実施形態において、該細胞は、誘導的様式で該インターロイキンを安定的に発現するように遺伝的に修飾されている。
【００１４】
好ましい態様において、該細胞は、該インターロイキンをコードする導入遺伝子および自殺遺伝子を発現するように修飾されており、該導入遺伝子および自殺遺伝子は該細胞のゲノムに組み込まれている。
【００１５】
好ましい態様において、該細胞は、好ましくはレンチウイルスベクターである組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ウイルスベクターにより修飾されている。別の態様において、該細胞は、Ｃｒｓｐｒ−Ｃａｓ９システム、Ｚｉｎｇフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼなどの導入遺伝子の組み込みを可能にするシステムにより修飾されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、「ｈＩＬ−２−２Ａ−ＣＤ−２Ａ−ＧＦＰ」ベクターの地図である。この修飾レンチウイルスプラスミドｐＢＬ２４９は自己不活性化レトロウイルスゲノムを有し、自殺遺伝子（シトシンデアミナーゼ（ＣＤ））およびレポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））と関連するｈＩＬ−２導入遺伝子を含有する。全ての導入遺伝子発現はＥＦ１アルファプロモーター下にある。該３つの導入遺伝子は「２Ａ」配列により連結されており、従って単一のＲＮＡから発現される。ペプチド介在配列２Ａは、ｍＲＮＡの次の開始コドンへのリボソームジャンプを引き起こし、単一のＲＮＡからの全ての導入遺伝子の共発現を可能にする。該ベクターにより発現されるＧＦＰ遺伝子は、該実験の追跡調査を容易にする目的のためである。それは、目的の任意の導入遺伝子により、特にＣＡＲなどの標的化部分により、またはＩＬ−１０もしくはＴＧＦ−ベータなどのＴｒｅｇ抑制に関与する遺伝子により有利に置き換えられることができる。
【００１７】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、外因性ＩＬ−２の非存在下（図２Ａ）または存在下（図２Ｂ）で培養された、ＩＬ２形質導入またはＧＦＰ形質導入Ｔｒｅｇ対非形質導入Ｔｒｅｇの拡大の動態曲線を示す（３回の独立した実験の平均）。全ての細胞が外因性ＩＬ−２の存在下で増殖するのに対して、ＩＬ−２形質導入細胞のみがその非存在下で増殖する。図２Ｃは、外因性ＩＬ−２の存在下で最初の６日間培養し、次いでその非存在下で培養したＩＬ２−形質導入またはＧＦＰ−形質導入Ｔｒｅｇの拡大の動態曲線を示す。ＩＬ−２形質導入細胞は外因性ＩＬ−２の非存在下で増殖し続ける一方、非形質導入細胞は増殖を停止して死滅する。図２Ｄおよび２Ｅは、ＩＬ−２使用停止後、新鮮な未培養Ｔｒｅｇと比較した、２Ｃにおけるのと同様に培養された細胞におけるＦｏｘＰ３、ＣＤ２５およびｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）マーカーの発現を示す。図２Ｄにおいて、ＧＦＰのみを産生する生存Ｔｒｅｇ（ＴｒｅｇＧＦＰ）（中央パネル）は、対照の新鮮Ｔｒｅｇ（左パネル）よりも少ないＦｏｘｐ３およびＣＤ２５を発現する。対照的に、ＩＬ−２を産生するＴｒｅｇ（ＴｒｅｇＩＬ２）は、対照の新鮮Ｔｒｅｇと比較してさらにより高レベルのＦｏｘＰ３およびＣＤ２５を発現し、それらが活性化されることを示す。図２Ｅにおいて、対照の新鮮ＴｒｅｇまたはＧＦＰのみを産生するＴｒｅｇは、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒとの相互作用により誘導されるｐＳＴＡＴ５を発現しない。対照的に、ＩＬ−２を産生するＴｒｅｇは高レベルのｐＳＴＡＴ５を発現し、さらにそれらが高度に活性化されることを示す。まとめると、図２Ａから２Ｅは、内因性ＩＬ−２を産生するように形質導入されたＴｒｅｇがｉｎ  ｖｉｔｒｏで十分なＩＬ−２であり、かつ活性化されることを実証する。
【００１８】
【図３】図３Ａから３Ｃは、内因性ＩＬ−２を産生するＴｒｅｇの抑制活性を示す。ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）を細胞分裂中に希釈される色素と共にインキュベートする。活性化の際、それらは該色素（Ａ）を失い、分裂を示した。色素で染色されていないＴｒｅｇが示される（Ｂ）。ＴｅｆｆがＩＬ−２の非存在下で培養されたＴｒｅｇＩＬ２と示された比率で混合されると、Ｔｅｆｆ分裂の投与量依存的な阻害がある。最も高い比率で、阻害は完了し、かつＴｅｆｆの増殖は１／８の比率で再び現れ始める（Ｃ）。これは、ＩＬ−２の非存在下で増殖されたＴｒｅｇＩＬ２が非常に抑制的であることを示す。
【００１９】
【図４】図４Ａから４Ｃは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴ細胞を欠くレシピエントマウスに養子導入されたｈＩＬ−２−２Ａ−ＧＦＰ（ＴｒｅｇＩＬ２）ベクターで形質導入されたヒトＴｒｅｇの選択的優位生存を示す。該ｈＩＬ−２−２Ａ−ＧＦＰで形質導入されたヒトＴｒｅｇの集団を、Ｔ細胞を欠くマウスに注射する。注射時の形質導入細胞の割合はＴｒｅｇＩＬ２の約８％である。この割合は２５日目に６０％に増加し、これは、ＩＬ−２産生Ｔｒｅｇの増殖の利点を示す（４Ａ）。図４ＢおよびＣは、Ｔ細胞を欠くレシピエントマウスに養子導入された該形質導入細胞の割合（４Ｂ）および数（４Ｃ）の変動を示す。該導入されたヒト細胞を最初に同定および計数し、そして次に、これらの細胞内のＧＦＰを発現する細胞の割合を決定する。ＧＦＰのみを発現する形質導入細胞（ＴｒｅｇＧＦＰ）の割合は安定したままであり、一方、ＴｒｅｇＩＬ２の割合は経時的に連続的に増加する（４Ｂ）。これは数の観点からも当てはまる（４Ｃ）。ＴｒｅｇＧＦＰの数は連続的に減少し、一方、ＴｒｅｇＩＬ２の数は３５日目まで連続的に増加し、次いで減少する。結果は、ＴｒｅｇＧＦＰについて６匹のマウスおよびＴｒｅｇＩＬ２について７匹のマウスの平均±ＳＥＭに由来する。ノンパラメトリックマンホイットニー検定は、図４Ｂおよび４Ｃについてｐ＜０．０１で強い有意性を示す。
【００２０】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、Ｔ細胞を欠くマウスに注射されたヒトＴｒｅｇの表現型を示す。ＴｒｅｇＩＬ２およびＴｒｅｇＧＦＰは、Ｔ細胞を欠き、従って、それらの環境中にＩＬ−２を全く有さない（またはごくわずかに有する）マウスに養子導入されている。該注射された細胞集団は精製されておらず、従って、形質導入細胞（約２０％）と非形質導入細胞との混合物を表す。注射後１４日目に、最初に、該注射された細胞は、ヒトＣＤ４５マーカーの発現により分析される（Ａ、左パネル）。該ＣＤ４５＋細胞は、該ＴｒｅｇＧＦＰ（上部パネル）よりも該ＴｒｅｇＩＬ２（下部パネル）についてより多数である。次いで、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３の発現が、これらの細胞において観察される（Ａ、右パネル）。わずかな生存ＴｒｅｇＧＦＰのほとんどは、依然としてＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を発現するが、一見低レベルである。また、より多数のＴｒｅｇＩＬ２は、ＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を高レベルで発現する。ＴｒｅｇＩＬ２における、ＴｒｅｇＧＦＰにおけるよりも高い強度のＣＤ２５発現（Ｂ、左パネル）およびＦｏｘＰ３発現（Ｂ、右パネル）が、ヒストグラムとして示される。図５Ｃおよび５Ｄは、該マウスを安楽死させた後の３５日目の養子導入細胞を示す。図５Ｃは、５Ａと同じ結果を報告し、かつＴｒｅｇＩＬ２（下部パネル）の方がＴｒｅｇＧＦＰ（上部パネル）よりもはるかに高いという、生存細胞数のさらにより顕著な差を示す。図５Ｄは、異なる組織における該養子導入細胞の存在を示す。ＴｒｅｇＧＦＰは組織中で少数であり、一方ＴｒｅｇＩＬ２は脾臓、肝臓および肺中で多数検出される。全ての場合において、それらは高レベルのＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を発現する。
【００２１】
【図６】図６は、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）による、シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子を発現する形質導入細胞の調節の効率を示すグラフである。該ｈＩＬ−２−２Ａ−ＣＤ−２Ａ−ＧＦＰベクターで形質導入したＴｅｆｆは、フローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について精製される。これらの細胞または非形質導入対照細胞は、増加する５−ＦＣ濃度の存在下で培養される。結果は細胞増殖の阻害率を示す。これらの結果は、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子を発現するＴｅｆｆ細胞の増殖の９８％を超える阻害を示す。
【００２２】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、実験的移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のモデルにおけるＩＬ−２を発現するＴｅｆｆ（ＴｅｆｆＩＬ２）のより高い効率を示す。Ｔ細胞を欠くＮＳＧマウスは、ＴｅｆｆＧＦＰ単独またはＴｅｆｆＩＬ２により養子導入される。Ｔｅｆｆを受けていない対照マウスは体重が増加する一方、Ｔｅｆｆを養子導入したマウスは、３週間で体重が減少し始めた。ＴｅｆｆＩＬ２を受けているマウスは、ＴｅｆｆＧＦＰを受けているマウスよりも体重が減った（７Ａ）。肝臓のＴ細胞浸潤は、ＴｅｆｆＧＦ２を受けているマウスよりもＴｅｆｆＩＬ２を受けているマウスの方がはるかに顕著であり、より顕著なＧＶＨＤを示す。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明者は、生存および機能に関して改善された性質を有するＴｒｅｇまたはＴｅｆｆを使用することによりＴ細胞療法が改善されることができるという仮説を立てた。
【００２４】
その見通しにおいて、本発明者は、ＩＬ−２をコードする（またはＩＬ−１５をコードする）遺伝子を安定的に発現するＴｒｅｇまたはＴｅｆｆを使用して、ＩＬ−２の非存在下での生存および機能を裏付けすることを提案する。
【００２５】
本発明によれば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５を分泌することにより、かかるＴｒｅｇまたはＴｅｆｆは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生存の利点および／またはそれらの抑制活性の増強を有し得る。これは、自己分泌様式で形質導入された細胞自体に、および外分泌様式で隣接するバイスタンダー細胞に関係し得る。
【００２６】
定義
導入遺伝子の「安定的な形質導入」または「安定的な発現」は、該導入遺伝子が細胞のゲノム中へ組み込まれることを意味する。安定的に形質導入された細胞の顕著な特徴は、該外来遺伝子が該ゲノムの一部になり、それ故複製されることである。従って、これらの形質導入細胞の子孫もまた、該新規遺伝子を発現するであろう。
【００２７】
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫抑制活性を有するＴリンパ球である。通常、天然のＴｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞、好ましくはＣＤ１２７（低）、ＣＤ４＋、ＣＤ２５（高）、Ｆｏｘｐ３＋細胞として特徴付けられる。かかる疾患におけるそれらの作用機序は完全には理解されていないが、Ｔｒｅｇは炎症性疾患の制御において主要な役割を果たす。
【００２８】
事実、ほとんどの炎症性疾患において、Ｔｒｅｇの枯渇は疾患を悪化させる一方、Ｔｒｅｇの添加はそれを減少させる。抑制活性を有するＣＤ８＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔリンパ球のまれな集団も存在するが、ほとんどのＴｒｅｇはＣＤ４＋細胞である。
【００２９】
本出願の文脈内で、「エフェクターＴ細胞」（または「Ｔｅｆｆ」）なる語は、１つ以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現し、かつエフェクター機能（例えば、細胞傷害活性、サイトカイン分泌、抗自己認識など）を実行する、Ｔｒｅｇ以外の従来のＴリンパ球（時には文献においてＴｃｏｎｖとも呼ばれる）を指す。本発明に記載されるヒトＴｅｆｆの主な集団は、ＣＤ４＋Ｔヘルパーリンパ球（例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ９、Ｔｈ１７）およびＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を含み、それらは自己または非自己抗原に特異的であることができる。
【００３０】
本発明の文脈内で、「ＩＬ−２」なる語は、例えばヒト、マウス、ラット、霊長類、およびブタなどの哺乳動物起源を含む、ＩＬ−２の任意の起源を指し、天然であるか、または天然ＩＬ−２ポリペプチドの活性変異体であってもよい。ヒトＩＬ−２のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０００５８６に開示される。本発明は、より好ましくはヒトＩＬ−２を使用する。ｈＩＬ−２のヌクレオチド配列は配列番号１として提供され、対応するアミノ酸配列は配列番号２である。シグナルペプチドは配列番号２のアミノ酸１〜２０であり、成熟ペプチド（配列番号２の２１位のアラニンで始まる）は、配列番号３として示される。ＩＬ−２の活性変異体は文献に開示されている。該天然ＩＬ−２の変異体は、その断片、類似体、および誘導体であることができる。該変異体のいくつかは、ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆに対する改善された活性を有してもよく、従ってそれらの細胞において好ましく使用されるであろう。「断片」により、インタクトなポリペプチド配列の一部のみを含むポリペプチドが意図される。「類似体」は、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する天然のポリペプチド配列を含むポリペプチドを指す。参照ＩＬ−２ポリペプチドの活性変異体は、一般に、該参照ＩＬ−２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体ＩＬ−２ポリペプチドが活性であるかどうかを決定するための方法は、当技術分野において利用可能であり、本発明において具体的に記載される。活性変異体は、最も好ましくは、Ｔｒｅｇを活性化する変異体である。
【００３１】
例えば、ＩＬ−２変異体の例は、特許または特許出願ＥＰ１０９７４８、ＥＰ１３６４８９、ＵＳ４，７５２，５８５；ＥＰ２００２８０、またはＥＰ１１８６１７、ならびにＵＳ６，３４８，１９２、ＷＯ９９／６０１２８、ＥＰ２９７０４２３、ＷＯ１６／１６４９３７に開示される。好ましい実施形態において、該ＩＬ−２変異体タンパク質はＣ１２５Ｓ置換を示し、さらに好ましくは、それはデス−アラニル１、セリン−１２５ヒトインターロイキン−２（配列番号３として示される成熟ヒトＩＬ−２ペプチドを参照）である。別の好ましい実施形態において、該ＩＬ−２変異タンパク質は、ヒト成熟ＩＬ２タンパク質（配列番号３）に対して、Ｌ１２Ｇ、Ｌ１２Ｋ、Ｌ１２Ｑ、Ｌ１２Ｓ、Ｑ．１３Ｇ、Ｅ１５Ａ、Ｅ１５Ｇ、Ｅ１５Ｓ、Ｈ１６Ａ、Ｈ１６Ｄ、Ｈ１６Ｇ、Ｈ１６Ｋ、Ｈ１６Ｍ、Ｈ１６Ｎ、Ｈ１６Ｒ、Ｈ１６Ｓ、Ｈ１６Ｔ、Ｈ１６Ｖ、Ｈ１６Ｙ、Ｌ１９Ａ、Ｌ１９Ｄ、Ｌ１９Ｅ、Ｌ１９Ｇ、Ｌ１９Ｎ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ１９Ｓ、Ｌ１９Ｔ、Ｌ１９Ｖ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｅ、Ｄ２０Ｆ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｇ、Ｄ２０Ｗ、Ｍ２３Ｒ、Ｍ２３Ｒ、Ｒ８１Ｇ、Ｒ８１Ｓ、Ｒ８１Ｔ、Ｄ８４Ａ、Ｄ８４Ｅ、Ｄ８４Ｇ、Ｄ８４Ｉ、Ｄ８４Ｍ、Ｄ８４ＱのＤ８４Ｒ、Ｄ８４Ｓ、Ｄ８４Ｔ、Ｓ８７Ｒ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｅ、Ｎ８８Ｆ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｍ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｓ、Ｎ８８Ｖ、Ｎ８８Ｗ、Ｖ９１Ｄ、Ｖ９１Ｅ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ｓ、Ｖ９１Ｋ、Ｉ９２Ｋ、Ｉ９２Ｒ、およびＥ９５Ｇ、ならびにＤ１０９Ｃ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆからなる群、なおより好ましくは、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ１０９Ｃ、Ｑ１２６Ｌ、Ｑ１２６Ｆ、Ｄ８４Ｇ、またはＤ８４Ｉからなる群から選択される置換を有するヒトＩＬ−２を含む。野生型ＩＬ−２よりもＴｒｅｇに対する良好な選択性を有する活性変異体は、Ｔｒｅｇにおける使用に好ましく、一方、Ｔｅｆｆに対して、野生型ＩＬ−２よりも良好な選択性を有する活性変異体は、Ｔｅｆｆにおける使用に好ましい。
【００３２】
ＩＬ−１５は、ＩＬ−２と構造的に類似するサイトカインである。本発明の文脈内で、「ＩＬ−１５」なる語は、例えばヒト、マウス、ラット、霊長類、およびブタなどの哺乳動物起源を含む、ＩＬ−１５の任意の起源を指し、天然であるか、または天然ＩＬ−１５ポリペプチドの活性変異体であってもよい。ヒトＩＬ−２のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｙ０９９０８に開示される。ｈＩＬ−１５のヌクレオチド配列は、配列番号４として提供される。対応するアミノ酸配列は配列番号５である。より好ましくは、本発明はヒトＩＬ−１５を使用する。天然ＩＬ−１５の変異体は、それらの断片、類似体、および誘導体であることができる。「断片」により、インタクトなポリペプチド配列の一部のみを含むポリペプチドが意図される。「類似体」は、１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する天然ポリペプチド配列を含むポリペプチドを指す。参照ＩＬ−２ポリペプチドの活性変異体は、一般に、該参照ＩＬ−２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する。変異体ＩＬ−１５ポリペプチドが活性であるかどうかを決定するための方法は、当技術分野において利用可能であり、本発明において具体的に記載される。活性変異体は、最も好ましくは、Ｔｒｅｇを活性化する変異体である。
【００３３】
ＩＬ−２と同様に、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β鎖から構成される複合体に結合し、かつそれを介してシグナル伝達する。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞活性化および増殖、特にＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ細胞活性化および増殖を誘導し、また、抗原の非存在下でメモリー細胞を維持するための生存シグナルを提供し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に有利に働き、単球を活性化する。
【００３４】
Ｔリンパ球は「その特異的破壊を可能にする分子」を発現する。これは、導入遺伝子によりコードされる分子、または該Ｔリンパ球により天然に発現される分子であってもよい（後者が同種異系である場合）。「特異的破壊」なる語は、ＧＶＨ反応の発症を防止するために、または注射された細胞によるあらゆる有害反応を止めるために、患者に投与されるＴリンパ球のみが破壊されるであろうことを意味する。該「その特異的破壊を可能にする分子」は、例えば、ＨＬＡ系の抗原、分子Ｔｈｙ−１、ＮＧＦ受容体もしくは該受容体の切断型、または免疫原性ではなく、かつ該Ｔリンパ球により天然に発現されない抗原であってもよい。これらの分子のいずれかを保有するＴリンパ球は、次いで、該ＨＬＡ分子に特異的な抗リンパ球血清、または該抗原に対して特異的に向けられた抗体により特異的に破壊されることができる。
【００３５】
また、Ｔリンパ球の「特異的破壊を可能にする分子」は「自殺遺伝子」によりコードされる分子であってもよい。「自殺遺伝子」なる語は、条件付きで、それを発現する細胞にとって毒性のある分子をコードする遺伝子を意味する。
【００３６】
治療される「対象」または「患者」は、任意の哺乳動物、好ましくはヒトであってもよい。該ヒト対象は子供、成人または高齢者であってもよい。他の実施形態において、該対象は、猫、犬、馬などの非ヒト哺乳動物である。
【００３７】
「治療すること」または「治療」なる語は、示される疾患におけるあらゆる改善を意味する。それは、疾患の発生または再発を予防すること、少なくとも１つの症状を軽減すること、または疾患の重症度もしくは発症を減少させることを含む。特に、それは急性発作（フレア）の危険性、発生または重症度を減らすことを含む。「治療すること」または「治療」なる語は、疾患の進行を減少させることを包含する。特に本発明は、疾患の進行を予防または遅延させることを包含する。「治療すること」または「治療」なる語は、特に無症候性であるが「危険性がある」と診断されている対象において、危険性を低減させるまたは疾患の発症を遅らせることによる予防的治療をさらに包含する。
【００３８】
修飾するためのＴｒｅｇおよびＴｅｆｆ
本発明に従って修飾されることができるＴｒｅｇおよびＴｅｆｆは、ポリクローナル細胞または特定の細胞であってもよい。「特異的」は、該ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆが標的疾患の病態生理学に関与する抗原を特異的に認識し、結合することを意味する。特に治療する疾患が自己免疫疾患である場合、特異的Ｔｒｅｇが好ましい。特異的ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆは、ＩＬ−２またはＩＬ−１５を、該細胞を抗原特異的またはリガンド特異的にする、例えば特定の組織タイプを標的化する標的化分子と共発現させることにより得られてもよい。また特異的Ｔｒｅｇは、細胞集団の全体的な特異性を意味してもよい。これは、例えば、特定の細胞を含有する可能性が高い部位（すなわち、癌の場合はＴＩＬ）から細胞を採取することにより、または特定の抗原または同種抗原による刺激などの特定の条件下で細胞を培養することにより得られることができる。またこれは、特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、有利には既知の特異性を有するＴＣＲのα鎖およびβ鎖の両方を発現することにより、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の設計に使用されているような任意の標的化部分を発現することにより達成されることができる。
【００３９】
特に関心のあるＴｒｅｇおよびＴｅｆｆサブセットは、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ６２Ｌ＋であるセントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−であるエフェクターメモリーＴ細胞、またはＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＣＲ７−ＣＤ６２Ｌ−であるエフェクター細胞として古典的に定義される活性化またはメモリー細胞の中で見出されてもよい。特に関心のあるさらなるＴｒｅｇおよびＴｅｆｆサブセットは、特定の標的組織またはそれらの流入リンパ節（すなわち、膵臓または膵臓リンパ節）、または腫瘍において見出されてもよい。
【００４０】
本発明に従って修飾されることができるＴｒｅｇおよびＴｅｆｆは、自己由来、すなわち治療される患者から採取されてもよく、または同種異系、すなわち治療する対象とは別の対象から得られてもよい。好ましい実施形態において、該ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆは治療する対象と同じ種のものである。好ましくは、それらはヒト細胞である。
【００４１】
従って、ドナーは好ましくはヒトであり、胎児、新生児、子供、成人であってもよい。
【００４２】
ＴｒｅｇまたはＴｅｆｆ調製物は、例えば、末梢血、リンパ球除去の血液製剤、末梢リンパ節、脾臓、胸腺、臍帯血などから得られる。
【００４３】
Ｔリンパ球の遺伝的修飾
本発明によれば、ＴｒｅｇまたはＴ細胞はＩＬ−２またはＩＬ−１５を安定的に発現するように修飾されている。
【００４４】
かかる安定的な発現は、発現するように導入遺伝子を構成する、ＩＬ−２またはＩＬ−５をコードするヌクレオチド配列の細胞のゲノム中への組込みにより達成されることができる。
【００４５】
導入遺伝子の安定的な組込みのための方法は、当技術分野において既知である。
【００４６】
限定するものではないが、レトロウイルス（例えば、オンコレトロウイルス、スプマウイルスまたはレンチウイルス）などの組込みウイルスベクターが使用されてもよい。
【００４７】
「レンチウイルス」なる表現は、本発明に特に好ましいレトロウイルスのカテゴリーを意味する。レンチウイルスの例は、ＨＩＶ（特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）などのヒトレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）およびＶＩＳＮＡウイルスを含むがこれらに限定されない。
【００４８】
発現するためのポリヌクレオチドをコードするＩＬ−２またはＩＬ−１５は、典型的に、プロモーターなどの制御発現エレメントに作動可能に連結される。本発明において、細胞、特に哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）中の標的ポリヌクレオチドの発現を促進することができる任意のプロモーターが、本発明の範囲内に含まれる。従って、プロモーターは有利には外因性プロモーターである。かかる外因性プロモーターは、例えば、伸長因子１−ａ（ＥＦ１−ａ）、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ベータグロビンおよびＰＧＫを含むことができる。
【００４９】
本発明において、使用されるレンチウイルス粒子は、有利に、複製欠損である、すなわち、一度該レンチウイルス粒子が細胞中へ入ると、それは単独で複製して新しい粒子を形成することはできない。従って、該ウイルスの複製に必要なウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、該レンチウイルス粒子中に存在しないかまたは欠損する。典型的に、かかる欠損は遺伝物質中の１つ以上のウイルス構造および複製機能（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子）の変異および／または欠失によるものであってもよい。複製におけるその欠損のために、本発明の複製欠損レンチウイルス粒子は、トランスコンプリメンテーションシステム（ベクター／パッケージングシステム）により得ることができる。
【００５０】
レンチウイルス粒子は、該レンチウイルス粒子を調製するために使用されるレンチウイルスのエンベロープタンパク質、あるいは標的とされる細胞に関して選択される異種エンベロープタンパク質を用いて偽型化されてもよい。特定の実施形態において、これらのエンベロープタンパク質は両種性（広い宿主範囲）である。好ましい実施形態において、該レンチウイルスベクターはＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化される。該ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、異なる血清型のベシクロウイルスに由来してもよい。別の実施形態において、該レンチウイルス粒子は、ＭｕＬＶ両種性エンベロープ、モコラエンベロープ、ＥｂｏＺエンベロープ、エボラ−レストン（ＥｂｏＲ）エンベロープ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）エンベロープ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＦおよびＧ、ベネズエラウマ脳炎、西ウマ脳炎および狂犬病ウイルスエンベロープタンパク質ならびにＣＭＶエンベロープタンパク質からなる群から選択される、リンパ球の感染を媒介することができるタンパク質で偽型化される。
【００５１】
レンチウイルス粒子を宿主細胞（プロデューサー細胞または標的細胞）および組み込まれる遺伝物質と接触させることを可能にする形質導入の条件の例は、当技術分野において周知であり、実験の節において記載される。
【００５２】
また、伝統的な遺伝子導入アプローチに加えて、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、Ｚｉｎｃフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＣｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼタンパク質（Ｃａｓ）システムは、二本鎖切断をし、かつ遺伝子ターゲティングの頻度を高めることができるので、それらを使用してもよい。
【００５３】
また、メガヌクレアーゼが使用されてもよい。これらは、古細菌や始原細菌、バクテリア、ファージ、真菌、酵母、藻類、およびいくつかの植物オルガネラなどのさまざまな単細胞生物に由来する配列特異的エンドヌクレアーゼである。
【００５４】
ＩＬ−２またはＩＬ−１５の発現は、構成的または誘導的いずれかであることができる。
【００５５】
第一の実施形態において、導入遺伝子の発現は構成的である。かかる構成的発現は、いくつかの技術により、例えば、ＩＬ−２またはＩＬ−１５をコードする核酸を、構成的発現を有するプロモーターの調節下に置くことにより達成されてもよい。該プロモーターは、ＥＦ１ａまたはＣＭＶプロモーターなどの高い遺伝子発現を駆動するもの、またはＰＧＫなどの低い発現を駆動するものの中から選択されることができる。
【００５６】
別の実施形態において、導入遺伝子の発現は誘導性であってもよい、すなわち該導入遺伝子は外部刺激に応答してのみ発現される。
【００５７】
誘導性プロモーターの例は、以下であってもよい：
・テトラサイクリン制御プロモーター：該システムの要素のいくつかは、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、およびＴｅｔＲと単純ヘルペスウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）活性化配列との融合であるテトラサイクリントランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む；
・ステロイド制御プロモーター：該システムの要素のいくつかは、ラットグルココルチコイドレセプター（ＧＲ）；ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）；異なるガ種に由来するエクジソン受容体；またはステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーターをカバーする種々のエンティティーの使用を含む。
・熱、冷たさまたは光により活性化されるプロモーターなどの物理的に活性化されるプロモーター。
【００５８】
Ｇｉｒｙ−Ｌａｔｅｒｒｉｅｒｅら，２０１１，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２２（１０）：１２５５−６７は、薬物誘導性遺伝子発現のためのレンチウイルスベクターの例を記載する。
【００５９】
これらのＴｒｅｇおよびＴｅｆｆは、例えば、それらの標的化を調節するために、それらの特異性を変化させるであろうタンパク質を発現するようにさらに遺伝的に修飾されることができる。これは、特定のＴＣＲ（例えば、既知の特異性を有するＴｒＣＲのα鎖およびβ鎖の両方）、またはＣＡＲ−Ｔ細胞を設計するために使用されているような任意の標的化部分（例えば、Ｏｌａｄａｐｏ  ＹｅｋｕおよびＲｅｎｉｅｒ  Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．（２０１６）４４，４１２−４１８を参照）を発現することにより達成されることができる。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞構築物は、典型的に、既知の抗原に対する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる。
【００６０】
またそれらは、その特異的破壊を可能にする分子を発現することができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞の特異的破壊を可能にする分子をコードする導入遺伝子を発現するように、該Ｔ細胞は修飾される。
【００６１】
特に、導入遺伝子は「自殺」遺伝子である。例えば、それは、ヌクレオシド類似体を一リン酸分子（それ自体、細胞酵素により、ポリメラーゼの効果下で伸長中に核酸中へ組み込まれることができる三リン酸ヌクレオチドに変換可能であり、該効果は鎖伸長の中断である）にリン酸化することができる分子をコードする遺伝子であってもよい。該ヌクレオチド類似体は、例えばアシクロビルまたはガンシクロビルであってもよい。該「自殺」遺伝子により発現される該分子は、特に、単純ヘルペスウイルス１型のチミジンキナーゼ（ＴＫ）であってもよい。該単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１  ＴＫ）は、問題の細胞において十分な濃度で存在する場合、アシクロビル（９−（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル］グアニン）またはガンシクロビル（９［１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル］グアニン）などのヌクレオチド類似体を一リン酸分子（それ自体、細胞酵素により該細胞内でポリメラーゼの効果下で伸長中に核酸中へ組み込まれることができる三リン酸ヌクレオチドに変換可能であり、該効果は、鎖伸長の中断およびそれに続く細胞死である）にリン酸化することができる。任意の有害反応の場合、該ヌクレオチド類似体（例えばガンシクロビル）は、次いで患者に投与される。また該自殺遺伝子は、毒性のない５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を毒性のある５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換するシトシンデアミナーゼであることができ、または、それは誘導性カスパーゼ−９自殺遺伝子であることができる。
【００６２】
形質導入プロトコルの例は、国際特許出願ＷＯ２００９／０５３６２９に記載される。
【００６３】
ＩＬ−２の発現は、Ｔｒｅｇの抑制機能を増大させる。ＩＬ−２を発現するＴｒｅｇは、より良好に生存するだけでなく、ＩＬ−２を発現しないＴｒｅｇよりも良好に機能するであろう。Ｔｒｅｇ機能の他の改善は、ＩＬ１０、ＴＧＦβなどの抑制性サイトカインをコードする遺伝子を共発現させることにより達成されることができる。
【００６４】
細胞療法
本発明に従って修飾されたＴｒｅｇおよびＴｅｆｆは、細胞療法において有用である。
【００６５】
特に、患者における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するための方法が記載され、該方法は、かかるＴｒｅｇを含む組成物の有効量を投与することを含む。
【００６６】
自己免疫疾患または炎症性疾患は、限定するものではないが、Ｉ型真性糖尿病（Ｔ１Ｄ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、グレーブス病、橋本病、アジソン病および自己免疫性胃炎および自己免疫性肝炎、慢性関節リウマチおよび脊椎関節炎を含むリウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症およびその変種、多発性筋炎および皮膚筋炎、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、乾癬およびぶどう膜炎からなる群から選択されてもよい。当業者は、所望により、本発明の方法をこれらのまたは他の自己免疫疾患に適用できることを理解する。
【００６７】
喘息、食物または皮膚アレルギーを含むがこれらに限定されないアレルギーの治療も包含される。
【００６８】
別の態様において、患者における移植片拒絶または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険性を予防または低減するための方法が提供され、該方法は、本明細書に記載されるように修飾されたＴｒｅｇを該患者に投与することを含む。
【００６９】
典型的に、患者は造血幹細胞移植を必要としていてもよい。該患者は実際に、ＨＳＣの移植により治療されてもよい任意の疾患に罹患していてもよい。これは、特に、悪性血液疾患などの癌、ならびに遺伝性疾患、造血系および／または免疫系に影響する疾患を含んでもよい。
【００７０】
特定の実施形態において、Ｔｒｅｇは、国際特許出願ＷＯ２００９／０５３６３１に開示されるように、造血幹細胞の同種移植などの造血幹細胞の移植前の患者の「コンディショニング」中に投与されてもよい。
【００７１】
処方および投与方法を含む細胞療法は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載されるＴ制御性細胞およびベクターに適用されることができる。例えば、ＥＰ１１５３１３１を参照のこと。
【００７２】
別の実施形態において、患者における癌を治療するための方法が記載され、該方法は、かかる修飾Ｔｅｆｆを含む組成物の有効量を投与することを含む。
【００７３】
癌は、固形腫瘍または悪性血液疾患であってもよい。
【００７４】
固形腫瘍のうち、肺癌、皮膚癌、腎臓癌、膀胱癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、頭頸部癌などが挙げられてもよい。
【００７５】
悪性血液疾患のうち、急性白血病、骨髄異形成症、またはリンパ増殖性症候群（慢性リンパ性白血病、骨髄腫、リンパ腫など）、骨髄異形成、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、および急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、リンパ腫、または骨髄腫が挙げられてもよい。
【００７６】
患者は、特に腫瘍の再発、例えば悪性血液疾患の再発に罹患していてもよい。
【００７７】
さらに別の態様において、患者における感染症を治療するための方法が提供され、該方法は、かかる修飾Ｔｅｆｆを含む組成物の有効量を投与することを含む。該感染症は、任意の病原体による感染症、例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ならびにＥＢＶまたはＣＭＶなどのウイルス感染症であってもよい。
【００７８】
大量の修飾Ｔ細胞およびＴｒｅｇは、様々な商業的および臨床的適用に有用である。これは、例えば少なくとも１，０００，０００個の細胞を含む。特定の実施形態において、細胞調製物は少なくとも５×１０９個のＴ細胞を含む。
【００７９】
所望の量を得るために、ＴｒｅｇおよびＴｅｆｆは、一度遺伝的に修飾されると、適切な培養培地中で培養されてもよい。
【００８０】
典型的に、Ｔ細胞の組成物は静脈内経路により投与される。投与するＴｒｅｇおよびＴｅｆｆの量は、対象の年齢、体重および性別、ならびに治療する特定の疾患に依存してもよい。範囲の例は、１００，０００から１０億個以上の細胞、好ましくは１００万から１０億個以上のＴ細胞である。
【００８１】
以下の実施例は本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００８２】
実施例１：ＩＬ−２を発現するレンチウイルスベクターの設計
レンチウイルスを用いて、ヒトＴｒｅｇにＩＬ−２遺伝子を導入し、恒久的かつ構成的に発現させた。
【００８３】
ベクターの地図を図１として示す。実験に関連する目的のために、例えば、形質導入細胞を容易に同定するために、ＧＦＰ導入遺伝子を組み込む。臨床適用のために、該ＧＦＰ導入遺伝子は、存在しないか、またはさらなる所望の機能性（すなわち、標的化または追加の抑制機能）を提供する任意の他の導入遺伝子により置換されることができる。
【実施例２】
【００８４】
実施例２：ｈＩＬ２を形質導入されたＴｒｅｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの自給
ヒトＴｒｅｇを精製し、実施例１に記載されるレンチウイルスベクター（これはヒトＩＬ−２およびＧＦＰをコードする）で形質導入した。
【００８５】
その目的のために、抗ＣＤ２５抗体およびＭＡＣＳで被覆された磁気ビーズを使用して、ＣＤ２５高発現に基づいて、健康なドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＴｒｅｇを精製した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５  高  ＣＤ１２７  低  Ｔｒｅｇの純度は、＞９０％である。
【００８６】
次いで、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズによる活性化の後、外因性ＩＬ−２（６００ＵＩ／ｍＬ）およびラパマイシン（１００ｎＭ）の存在下でＴｒｅｇを０．５〜１×１０６細胞／ｍＬで４８時間培養した。次いで、細胞を洗浄し、２５のＭＯＩでレンチウイルス上清で形質導入した。次いで、細胞をインキュベーター中３７℃で培養した。
【００８７】
陰性対照として、他のヒトＴｒｅｇを、ＧＦＰをコードするベクター単独で感染させるか（ベクター対照）、または感染させずに使用した（ＮＩ）。ＴｒｅｇのＩＬ−２依存性を観察するために、Ｔｒｅｇを、外因性ＩＬ−２を補足した、または外因性ＩＬ−２を補足しない培地中で９日間、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する。Ｔｒｅｇの拡大の動態曲線を図２Ａ、２Ｂに示す。
【００８８】
外因性ＩＬ−２の非存在下で、ＩＬ−２をコードする遺伝子（ｈＩＬ−２−２Ａ−ＧＦＰ）で形質導入されたＴｒｅｇは、６日目から１５日目の間に増殖し、一方、非形質導入Ｔｒｅｇ（ＮＩ）またはＧＦＰ対照ベクターで形質導入されたＴｒｅｇは増殖しなかった（図２Ａ）。形質導入細胞または対照細胞は、外因性ＩＬ−２の存在下で同様に増殖する（図２Ｂ）。
【００８９】
類似の実験において、細胞を最初に全てＩＬ−２の存在下で６日間増殖させ、次いでＩＬ−２なしで培養する。ＴｒｅｇＧＦＰおよびＴｒｅｇＩＬ２は外因性ＩＬ２の存在下で同様に増殖する一方、ＴｒｅｇＩＬ２のみがその非存在下で増殖し続ける（図２Ｃ）。これらの結果は、ｈＩＬ−２遺伝子を形質導入されたＴｒｅｇが自立性であり、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大することを示す。
【００９０】
さらに、表現型研究（図２ＤおよびＥ）は、ＴｒｅｇＩＬ２が高度に活性化され、かつ抑制的であることを示す。外因性ＩＬ−２なしで培養されたＴｒｅｇＧＦＰは、対照の新鮮Ｔｒｅｇと同じレベルのＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を発現し、ｐＳＴＡＴ５を発現しない。対照的に、ＴｒｅｇＩＬ２は、対照の新鮮Ｔｒｅｇよりも高レベルのＣＤ２５およびｆｏｘｐ３を発現し、ｐＳＴＡＴ５も高度に発現し、全てが高度に活性化された状態を示す。
【００９１】
この高い抑制活性を図３に示す。Ｔｒｅｇに対する古典的抑制アッセイを、各細胞分裂で次第に失われる蛍光色素で染色されたＴｅｆｆに対し、増加量のＴｒｅｇを添加することにより行う。Ｔｒｅｇの非存在下で、より小さい強度の異なるピークにより示されるように（図３Ａ）、約６０％のＴｅｆｆが分裂する。Ｔｒｅｇを加えると、Ｔｅｆｆの分裂は１／８  Ｔｒｅｇ／ｔｅｆｆの比率まで抑制され、ここで、Ｔｅｆｆの約６％が分裂され、１／１６の比率でＴｅｆｆの約１２％が分裂される（図３Ｃ）。
【実施例３】
【００９２】
実施例３：ｈＩＬ２を形質導入されたＴｒｅｇのｉｎ  ｖｉｖｏでの自給
ｈＩＬ−２を形質導入されたＴｒｅｇの生存および自給を、免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマｃ  ＫＯ（ＮＳＧ）マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで研究した。
【００９３】
該ＮＳＧマウスは、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞を完全に欠いており、ＩＬ−２を産生しない。この実験モデルを、ＩＬ−２を発現するＴｒｅｇのｉｎ  ｖｉｖｏでの自給を検証するために選択した。
【００９４】
従って、ＩＬ−２をコードする遺伝子を形質導入されたＴｒｅｇを、ＮＳＧマウスに導入した。注射された細胞は、約１０％のＧＦＰ＋細胞（故に、ＩＬ−２を発現している）を含有し、残りは非形質導入細胞であった。
【００９５】
まず、これら全ての細胞の生存を、末梢血中でモニターした（図４）。
【００９６】
０日目に養子導入した場合、ＩＬ−２およびＧＦＰをコードするベクターで形質導入されたＴ細胞集団は、１０％の形質導入細胞（すなわちＧＦＰを発現した）を含有し、ＧＦＰのパーセンテージは、該マウスの２５日の追跡調査中、連続的に上昇する（図４Ａ）。
【００９７】
独立した実験において、ＴｒｅｇＩＬ２およびＴｒｅｇＧＦＰ細胞の生存を比較した。養子導入細胞の集団内の形質導入細胞のパーセンテージは、ＧＦＰのみを形質導入されたＴｒｅｇについて安定したままであり、これは、該ＧＦＰ形質導入細胞が非形質導入細胞を上回る増殖／生存の利点を有さないことを示す。対照的に、養子導入細胞の集団内の形質導入細胞のパーセンテージは、ＩＬ２（＋ＧＦＰ）を形質導入されたＴｒｅｇについて漸進的に増加し、これは、該ＩＬ２形質導入細胞が非形質導入細胞を上回る増殖／生存の利点を有することを示す（図４Ｂ）。形質導入された養子導入細胞を数えると、該数はＴｒｅｇＧＦＰについて急速に減少するが、一方でＴｒｅｇＩＬ２について最初は増加することが示される（図４Ｃ）。
【００９８】
まとめると、これらの結果は、ｈＩＬ−２遺伝子を発現するＴｒｅｇだけが自立性であり、かつｉｎ  ｖｉｖｏで生存することができることを示す。
【００９９】
養子導入細胞の表現型は、ＴｒｅｇＩＬ２が高度に活性化されることを示す。導入後１４日目に、ＴｒｅｇＧＦＰよりもはるかに多くの生存ＴｒｅｇＩＬ２が存在し（図５Ａ左パネル）、それらはわずかな生存ＴｒｅｇＧＦＰよりも高レベルのＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を発現する（図５Ａ右パネルおよび図５Ｂ）。生存細胞数の差は、マウスを安楽死させた時点で、３５日目でさらにより顕著であり（図５Ｃ）、養子導入細胞の生存を組織内でモニターした（図５Ｄ）。生存ＴｒｅｇＧＦＰは肝臓でしか見出すことができず、それらは低レベルのＣＤ２５およびＦｏｘｐ３を発現する。対照的に、多くのＴｒｅｇＩＬ２細胞は脾臓、肝臓および肺で検出されることができ、それらが組織で再増殖することを可能にするＴｒｅｇＩＬ２の生存の利点を強調する。注目すべきことに、これらの細胞はＣＤ２５およびＦｏｘｐ３も高度に発現する。
【実施例４】
【０１００】
実施例４：シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）遺伝子の機能性
５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、シトシンの２つのヌクレオシド類似体である。５−ＦＣは不活性であるが、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）の存在下で５−ＦＵに代謝される。次いで、５−ＦＵは、ウリジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）により５−ＦＵ一リン酸（５−ＦＵ−ＭＰ）に変換される。５ＦＵ−ＭＰは、タンパク質合成を阻害することにより５−ＦＣ三リン酸にリン酸化されてＲＮＡ中へ組み込まれることができるか、または、ＤＮＡ合成に必須のチミジル酸シンテターゼを阻害するＵＰＲＴの存在下で５−フルオロデオキシウリジン一リン酸に変換されることができる。ＣＤ自殺遺伝子の機能性を検証するために、形質導入されたＴリンパ球をＧＦＰ発現に基づいて精製し、次いで、５−ＦＣの存在下で４日間培養した。細胞増殖を、トリチウム化チミジンの取り込みにより決定した（図６）。
【実施例５】
【０１０１】
実施例５：ｈＩＬ２を形質導入されたＴｅｆｆの優れた機能性
実験的移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のモデルにおいて、ＩＬ−２を発現するＴｅｆｆ（ＴｅｆｆＩＬ２）の効率を評価した。Ｔ細胞を欠くＮＳＧマウスに、ＴｅｆｆＧＦＰまたはＴｅｆｆＩＬ２を養子導入する。肝臓の重量減少および細胞浸潤は、この実験で分析されるＧＶＨＤの２つの主な徴候である。Ｔｅｆｆを受けていない対照マウスは体重が増加する一方、Ｔｅｆｆを養子導入したマウスは３週間で体重減少が開始した。ＴｅｆｆＩＬ２を受けているマウスは、ＴｅｆｆＧＦＰを受けているマウスよりも体重が減った（７Ａ）。肝臓のＴ細胞浸潤は、ＴｅｆｆＧＦＰを受けているマウスよりもＴｅｆｆＩＬ２を受けているマウスの方がはるかに顕著であった（７Ｂ）。体重減少および肝細胞浸潤は、ＴｅｆｆＩＬ２により誘導されたＧＶＨＤがＴｅｆｆＧＦＰにより誘導されたものよりも顕著であることを示し、同様に、ＴｅｆｆＧＦＰと比較してＴｅｆｆＩＬ２の優れた機能性を示す。
【図１】
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【図２（１）】
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【図２（２）】
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【図２（３）】
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【図３】
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【図４】
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【図５（１）】
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【図５（２）】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019518804.tif 000013