(57)【要約】本発明の課題は、抗メソセリン抗体を含む腫瘍細胞のイメージング剤の提供である。本発明者らは、前記課題を解決するために、前記メソセリンに注目し、鋭意研究した。その結果、マウスの皮下に移植したがん細胞由来の培養細胞を、標識メソセリン抗体を用いて画像化することに成功した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤。
【請求項２】
抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、請求項１記載のイメージング剤；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
【請求項３】
インビボで用いられる、請求項１または２記載のイメージング剤。
【請求項４】
抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング用キット。
【請求項５】
抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、請求項４記載のイメージング用キット；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
【請求項６】
インビボで用いられる、請求項４または５記載のイメージング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
いずれの癌も早期のうちに診断されることが望ましいが、身体的所見や自覚症状の乏しい早期癌は、健康診断などで偶発的に発見される程度である。特に胸膜や腹膜に沿って急速に広がる中皮腫、あるいは形態的に明確でない膵臓癌は検出ならびに診断が特に難しく、手遅れとなるケースが多い。
昨今、ＭＲＩ、ＣＴなどの画像診断が本邦では多用されるようになったが、体の内部を視覚化できるメリットはあるものの、画像の濃淡や形から血管壁の状況を読みとる必要があるため、早期の中皮腫や膵臓癌の検出は困難である。検査を行う医師や検査技師の技量にも左右される。また、ＭＲＩで使用する常磁性のガドリニウムや鉄及びＣＴで使用するヨード造影剤とも、副作用の発現、腎毒性があることや、ＣＴでは放射線被曝を伴うなど、患者への直接的苦痛が強いられることから、患者負担のより少ない新規の診断方法の開発が望まれている。【０００３】
細胞膜の糖タンパク質の一種であるメソセリンは、肺、心臓、胃腸、肝臓などの臓器を包む胸膜、腹膜、そして心膜などを構成する中皮細胞に限局して発現している。しかしながら、癌化した組織においては、中皮細胞（上皮型中皮腫）だけでなく、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、頭頸部癌、大腸癌、乳癌など、多岐の癌組織において、メソセリンが高発現することが分かっている(Eur. J. Cancer, 44, 46-53, 2008, Clin. Cancer Res. 10, 3937-3942, 2004)。
メソセリンは、まず全長７１ｋＤａの前駆体タンパク質として合成された後、フューリンなどのタンパク質分解酵素によって、細胞外ドメインの３４−２８６番目に相当するｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＭＰＦ）と呼ばれる約３１ｋＤａのポリペプチドと、ＧＰＩアンカーによって細胞膜上に残された４０ｋＤａのポリペプチド（成熟型メソセリン）に分解される。さらにＧＰＩアンカー型の膜型メソセリンの一部は細胞膜から切り離され、遊離していることが知られている（可溶型メソセリン）。
これらの分子的特徴を背景に、ＭＰＦと可溶型メソセリンは腫瘍マーカーとして認識され、それぞれの抗体を利用した血清測定系が開発されてきた。しかしながら、血清中の腫瘍マーカーを用いた検査は操作が簡便ではあるが、原発巣の特定、転移の有無は確認できない。また、癌が早期のうちには分泌されるＭＰＦやメソセリンの量は少なく、血清を検体とした早期発見は原理的に困難と言わざるを得ない。また、インジウム１１１で標識されたメソセリンに対するモノクローナル抗体を用いた癌画像診断の方法論が報告されているが、用いられている癌細胞は、人工的にメソセリン遺伝子を強制的に導入された細胞であり、実際の癌患者における生理的条件を満たしている保証はない（Int J Cancer.80, 559-63, 1999）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−７１８４９
【特許文献２】特許３４９０１２５号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lung Cancer. 2008 Oct;62(1):45-54. Epub 2008 Apr 3.
【非特許文献２】Int J Cancer. 1999 Feb 9;80(4):559-63.
【非特許文献３】Eur J Cancer. 2008 Jan;44(1):46-53.
【非特許文献４】Clin Cancer Res. 2004 Jun 15;10(12 Pt 1):3937-42.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、抗メソセリン抗体を含む腫瘍細胞のイメージング剤の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、上記メソセリンに注目し、鋭意研究した。その結果、マウスの皮下に移植したがん細胞由来の培養細胞を、標識メソセリン抗体を用いて画像化することに成功した。
本願は、この知見に基づき、以下の発明を提供するものである。
〔１〕抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤。
〔２〕抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、〔１〕記載のイメージング剤；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
〔３〕インビボで用いられる、〔１〕または〔２〕記載のイメージング剤。
〔４〕抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング用キット。
〔５〕抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、〔４〕記載のイメージング用キット；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
〔６〕インビボで用いられる、〔４〕または〔５〕記載のイメージング用キット。
〔７〕抗メソセリン抗体を用いる、腫瘍細胞のイメージング方法。
〔８〕抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、〔７〕記載のイメージング方法；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
〔９〕腫瘍細胞のイメージング剤の製造における、抗メソセリン抗体の使用。
〔１０〕抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、〔９〕記載の使用；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
〔１１〕腫瘍細胞のイメージング方法に使用するための、抗メソセリン抗体。
〔１２〕抗体が下記（a）〜（e）のいずれかに記載の抗体である、〔１１〕記載の抗体；
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）上記（a）または（b）に記載の重鎖、および、上記（c）または（d）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】8-wellチャンバーで培養されたBxPC-3膵臓がん細胞の免疫染色写真である。共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【図２】2-wellチャンバーで培養されたCFPAC-1膵臓がん細胞の免疫染色写真である。共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【図３】8-wellチャンバーで培養されたPANC-1膵臓がん細胞の免疫染色写真である。共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【図４】中皮腫細胞（211H）の免疫染色写真である。共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【図５】PC3前立腺がん細胞、211H中皮腫細胞、H520およびH226肺がん細胞の、11-25抗メソセリン抗体での免疫染色写真である。共焦点レーザー走査顕微鏡で観察した。
【図６】ヌードマウス皮下に移植したがんのインビボおよびインビトロイメージング写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤を提供する。また、本発明は、抗メソセリン抗体を対象に投与する工程を含む、腫瘍細胞のイメージング方法を提供する。
【００１０】
メソセリン（「ＭＳＬＮ」）は、中皮細胞と、中皮腫と、ある扁平上皮癌と、卵巣癌と、膵臓癌と、肺癌との細胞表面上で観察され（Ｃｈａｎｇら、１９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： １３６−１４０；米国特許第６，０８３，５０２号公報明細書）、前記癌に対する治療用抗体のための標的として調査中である（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｔｅｋ社による米国臨床試験第ＮＣＴ００３２５４９４号）。メソセリンは、約４０ｋＤａの分子量を有し、かつ、（ｉ）配列番号：１７の少なくとも１０個の連続するアミノ酸又はスイス−プロットのアクセッション番号Ｑ１３４２１に列挙される既知の前記バリアントか、（ｉｉ）少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基の一部分かのいずれかを含むアミノ酸配列を有する、ポリペプチドをいい、該アミノ酸残基の一部分は、配列番号：１７の２０個の連続する残基か、スイス−プロットのアクセッション番号Ｑ１３４２１に列挙される既知の前記バリアントに少なくとも９０％（好ましくは、少なくとも９５％又は１００％）一致する。メソセリンのバリアントは、検出される８個のアミノ酸、ＰＱＡＰＲＲＰＬ（配列番号：１８）のバリアントと、Ｃ末端側のＶＱＧＧＲＧＧＱＡＲＡＧＧＲＡＧＧＶＥＶＧＡＬＳＨＰＳＬＣＲＧＰＬＧＤＡＬＰＰＲＴＷＴＣＳＨＲＰＧＴＡＰＳＬＨＰＧＬＲＡＰＬＰＣ（配列番号：１９）が、ＭＱＥＡＬＳ（配列番号：２０）及び疎水性ＧＰＩリンカーモチーフ（ＧＴＰＣＬＬＧＰＧＰＶＬＴＶＬＡＬＬＬＡＳＴＬＡ）（配列番号：２１）に置換されているバリアントとを含むが、これらに限られないことが知られる。前記メソセリンは、翻訳後修飾としてのグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー及び多くのＮ−結合型糖鎖を含む場合がある。前記ＧＰＩアンカーはメソセリンを細胞膜に結合させるが、可溶型のメソセリンを提供するためのホスホリパーゼによって開裂される場合がある。
本願発明に包含される抗メソセリン抗体は、上記メソセリンに結合することを特徴とする。
【００１１】
本願発明に包含される抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（b）配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有する重鎖を含む抗体、
（c）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（d）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（e）配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を有する軽鎖を含む抗体、
（f）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（g）上記（a）〜（c）のいずれかに記載の重鎖、および、上記（d）〜（f）のいずれかに記載の軽鎖の対を有する抗体。
【００１２】
本発明の抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の調製および精製方法は、当分野で知られており、例えば Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)に記載されている。
【００１３】
本発明の抗体には、ヒト化（humanized）抗体またはキメラ（chimeric）抗体などの組換え抗体も含まれる。「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体に構造を類似させた抗体のことをいう。このようなヒト化抗体またはキメラ抗体には、ヒト型キメラ抗体（例えば抗体の一部がヒト化された抗体、CH2領域がヒト化された抗体、Fc領域がヒト化された抗体、定常領域がヒト化された抗体）、及び定常領域及び可変領域に存在するCDR（相補性決定領域）以外の部分がヒト化されたヒト型CDR移植（CDR-grafted）抗体（P.T.Johons et al., Nature 321,522(1986)）、完全ヒト化抗体などが含まれる。ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体FRを選択する方法、相同性の高いヒト化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスCDRを移植した後さらにFRのアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され（米国特許第5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第5693762号、米国特許第6180370号、欧州特許第451216号、欧州特許第682040号、特許第2828340号などを参照）、本発明のヒト型CDR移植抗体の作製に利用することもできる。
ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のH鎖可変領域の構造及び／又はL鎖可変領域の構造を有する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。
【００１４】
本発明のヒト化抗体としては、例えば、CDRが抗メソセリン抗体由来のCDRであり、FRがヒトイムノグロブリン由来のFRであり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするヒト化抗体を挙げることができる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域由来のCDR、ヒトイムノグロブリンの重鎖可変領域由来のFR、および、ヒトイムノグロブリン由来の重鎖定常領域を有する重鎖、ならびに、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域由来のCDR、および、ヒトイムノグロブリンの軽鎖可変領域由来のFR、および、ヒトイムノグロブリン由来の軽鎖定常領域を有する軽鎖、の対を有するヒト化抗体を挙げることができる。
また、本発明のキメラ抗体としては、例えば、可変領域が抗メソセリン抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であることを特徴とするキメラ抗体を挙げることができる。具体的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および、ヒトイムノグロブリン由来の重鎖定常領域を有する重鎖、ならびに、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および、ヒトイムノグロブリン由来の軽鎖定常領域を有する軽鎖、の対を有するキメラ抗体を挙げることができる。
【００１５】
以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
まず、特定の対象抗原に対するマウス抗体を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、常法に従ってcDNAを合成する。合成したcDNAをベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築する。このcDNAライブラリーから、H鎖遺伝子フラグメント及びL鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、H鎖遺伝子及びL鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にH鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断／再結合等により作製する。得られたH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒトH鎖定常領域をコードするDNAとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりH鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりL鎖発現ベクターを作製する。これらH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright & S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al., Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987))、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
【００１６】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分離する。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて利用することができる。
【００１７】
一方、ヒト型CDR移植抗体は例えば以下の方法により作製することができる。まず、上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、特定の抗原に対する抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する。併せて各CDR領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。
【００１８】
次に、CDR領域を挟んで存在するFR（フレームワーク領域）を選択する。FRの選択には、およそ三つの方法が採用できる。１つめの方法は、NEWM、REIなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Riechmann L. et al., Nature 332, 323-3Z7 (1988); Tempst, PR. et al., Protein Engineering 7, 1501-1507 (1994); Ellis JH. et al., J. Immunol 155, 925-937 (1995)）。２つめの方法は、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域をデータベースより選択し、そのFRを用いる方法である（Queen C. et al., Proc Natl Acad SciUSA 86, 10029-10033 (1989); Rozak MJ. et al., J Biol Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearman CW. et al., J.Immunol 147, 4366-4373 (1991)）。３つめの方法は、ヒト抗体のFRで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Sato K. et al., Mol Immunol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Protein Engineering 6, 971-980 (1993); Kettleborough CA. et al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991)）。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。
【００１９】
尚、選択されたヒトFRのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列であっても、最終的に得られるヒト型CDR移植抗体が対象抗原に対する特異的結合性を有する限り、FRのアミノ酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒトFRのアミノ酸の一部をCDRの由来となった抗体のFRのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能性が高い。改変されるアミノ酸の数は好ましくはFR全体の３０％以下であり、更に好ましくはFR全体の２０％以下であり、更に好ましくはFR全体の１０％以下である。
【００２０】
次に、これらいずれかの方法により選択したFRと上記CDRとを組み合わせることによりH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAを設計する。この設計を基にH鎖可変領域をコードするDNAとL鎖可変領域をコードするDNAを化学合成、生化学的切断／再結合等によりそれぞれ作製する。そしてH鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンH鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みH鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可変領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリンL鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
以上の方法で作製されたH鎖発現ベクター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al., Cancer Res.50,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987))、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
【００２２】
形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型CDR移植抗体を分離する。抗体の分離、精製は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
【００２３】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をインビトロで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。
【００２４】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等(Nature, 348:552-554 (1990))に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等(Nature, 352:624-628 (1991))及び Marks等(J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【００２５】
この点において、バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは、大きなオリゴペプチドライブラリーを検索して、ポリペプチド標的に特異的に結合する能力のあるこれらライブラリーのメンバーの同定を可能にするよく知られた技術の一つである。ファージディスプレイは、様々なポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面上のコートタンパク質に融合タンパク質として提示されることによる技術である（Scott,J.K.及びSmith G. P. (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイの有用性は、選択的にランダム化されたタンパク質変異体（又はランダムクローンｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを標的分子に高い親和性で結合するこれらの配列について素早く効果的に分類することができる点にある。ファージでのペプチド（Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378）又はタンパク質（Lowman,H.B.ら (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Nature, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363）ライブラリーのディスプレイは、特異的に結合する特性を有するものについて無数のポリペプチド又はオリゴペプチドをスクリーニングするために使用されている（Smith, G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668）。ランダム突然変異体のファージライブラリーの分類は、多数の変異体を構築して増殖させる方法、標的レセプターを用いた親和性精製の方法、及び結合増強の結果を評価する手段を必要とする（米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、同第５５７１６８９号、及び同第５６６３１４３号を参照）。
【００２６】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを使用していたが、λファージディスプレイシステム（ＷＯ９５／３４６８３；米国特許第５６２７０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイシステム（RenJ.らGene 215:439 (1998); Zhuら Cancer Researc, 58(15):3209-3214 (1998); Jiang等 Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci. 5:1833 (1996); Efimov等 Virus Genes 10:173(1995)）及びＴ７ファージディスプレイシステム（Smith及びScott Methods in Enzymology,217, 228-257(1993); 米国特許第５７６６９０５号）も知られている。
【００２７】
現在、基礎的なファージディスプレイ法は多くの改良及び変形が開発されている。これらの改良により、選択された標的分子との結合性など、ペプチドライブラリーやタンパク質ライブラリーから特性、能力などに基づいてスクリーニングする方法が改善された。ファージディスプレイ法のための組み換え反応手段については、ＷＯ９８／１４２７７に記載がある。ファージディスプレイライブラリーは、二分子相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）及び拘束性へリックスペプチドの特性（ＷＯ９８／２００３６）を分析及び制御するために使用されている。ＷＯ９７／３５１９６には、リガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、及び親和性リガンドが標的分子に結合しない第二の溶液とファージディスプレイライブラリーを接触させて結合リガンドを選択的に単離する、親和性リガンドの単離方法が記載されている。ＷＯ９７／４６２５１は、親和性精製抗体でランダムファージディスプレイライブラリーをバイオパニングし、次いで結合ファージを単離し、続いてマイクロプレートのウェルでマイクロパニングして高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌（Staphlylococcus aureus）タンパク質Ａの親和性タグとしての使用も報告されている（Li等, (1998) Mol Biotech., 9:187）。ＷＯ９７／４７３１４は、ファージディスプレイライブラリーでもよいコンビナトリアルライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイに用いる洗浄剤での使用に適した酵素を選択する方法はＷＯ９７／０９４４６に記載される。特異的に結合するタンパク質を選択する更なる方法は、米国特許第５４９８５３８号、同第５４３２０１８号、及びＷＯ９８／１５８３３に記載されている。ペプチドライブラリーの作製及びこれらのライブラリーのスクリーニングの方法は、米国特許第５７２３２８６号、同第５４３２０１８号、同第５５８０７１７号、同第５４２７９０８号、同第５４９８５３０号、同第５７７０４３４号、同第５７３４０１８号、同第５６９８４２６号、同第５７６３１９２号、及び同第５７２３３２３号に記載される。
【００２８】
さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する適当な発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ ９２／０１０４７、ＷＯ ９２／２０７９１、ＷＯ ９３／０６２１３、ＷＯ ９３／１１２３６、ＷＯ ９３／１９１７２、ＷＯ ９５／０１４３８、ＷＯ ９５／１５３８８を参考に実施することができる。
【００２９】
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553[1990])を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄのコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローニングし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として提示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
【００３０】
本発明の抗体には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、dsFv、Diabody、sc(Fv)2、及びminibody等の、抗体の機能的断片も含まれる。また、これら機能的断片の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の抗体に含まれる。
Fabは、IgGをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のH鎖の一部及びL鎖をコードするDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりFabを調製することもできる。
Fab'は、後述のF(ab')2のH鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Fab同様に、Fab'をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
F(ab')2は、IgGをペプシン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される断片（Fab'）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Fab同様に、F(ab')2をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
Fvは、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現できる（例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-2976、Better, M. &; Horwitz, A. H. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Plueckthun, A. ; Skerra, A. Methods in Enzymology（1989）178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（1989）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（1991）9, 132-137参照）。
scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからなるFvを片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適当なペプチドリンカーで連結し、一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い（GGGGS）3などを用いることができる。例えば、上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAとペプチドリンカーをコードするDNAを用いてscFv抗体をコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりscFvを調製することができる。
dsFvは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切な位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したH鎖可変領域及びL鎖可変領域をそれぞれコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりdsFvを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてscFv抗体、dsFv抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。本発明の抗体（抗体断片を含む）に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。標識物質としては125I等の放射性物質、などを用いることができる。
【００３１】
Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価(bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。Diabodyは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でＶＬ及びＶＨが、互いに結合できない位に短い、例えば、5残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、Diabodyは2つの抗原結合部位を有することとなる。Diabodyは、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードするDNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照）。
sc(Fv)2は、2つのＶＨ及び2つのＶＬをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、J Immunol. Methods 1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
minibody(低分子化抗体)とは、全長抗体(whole antibody、例えばwhole IgG等)を親抗体とし、全長抗体の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されない。
【００３２】
本発明の抗体には、本発明の抗体と他のペプチド又はタンパク質とが融合した融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【００３３】
本発明の抗体には、標識物質が結合した抗体も含まれる。
標識物質としては、酵素発光（ルシフェラーゼ）による発光、発光低分子を利用するものと、蛍光タンパクや蛍光低分子）を用いるもの、放射性核種等が挙げられるがこれらには限定されない。放射性核種としては５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、８１ｍＫｒ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌなどのγ線放出核種や、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３５ｍＣｌ、７６Ｂｒ、４５Ｔｉ、４８Ｖ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６６Ｇａ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１２４Ｉなどの陽電子放出核種などが挙げられるがこれらには限定されない。なお当業者には自明であるが"ｍ"とは核異性体を示す。
蛍光標識や発光標識としては酵素発光（ルシフェラーゼ）による発光を利用するものと、蛍光（GFP、DsRed、クサビラオレンジ等の蛍光タンパク質やFITCやCy5.5、Alexa Fluor 750などの蛍光性低分子）を用いるものとのが使用できる。
酵素発光（ルシフェラーゼ）による発光の場合は基質投与が別途必要である。
特に、動物本来の自家蛍光による影響を軽減したものが好ましく、さらには皮膚透過性の高いシグナルを発する標識が好ましい。
【００３４】
また本発明は、本発明の抗体をコードするDNA、該DNAが挿入されたベクター、及び該ベクターが導入された形質転換細胞を提供する。ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられる。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げられる。本発明の抗体をコードするDNA、該DNAが挿入されたベクター、及び該ベクターが導入された形質転換細胞は公知の技術を用いて作成される。
【００３５】
本発明の抗メソセリン抗体をコードするDNAとしては、以下のDNAが挙げられる。
（a）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖をコードするDNA、
（b）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖をコードするDNA、
（c）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードするDNA、
（d）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードするDNA。
【００３６】
発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGFP、またはpET（この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21が好ましい）などが挙げられる。
【００３７】
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
【００３８】
大腸菌以外にも、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF 、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００３９】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００４０】
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を含むことができる。
【００４１】
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、インビトロおよびインビボの産生系がある。インビトロの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００４２】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5が知られている。本発明においては、CHO-DG44、CHO-DXB11、COS7細胞、BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリポソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００４３】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
【００４４】
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。本発明のDNAにより形質転換された細胞をインビトロで培養し、当業者が通常行う方法によって精製することによって、本発明の抗体を得ることが可能である。
【００４５】
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸を含むベクターを有する宿主生物を提供する。本発明の宿主生物は、組換え型抗体の産生に有用である。本発明における宿主生物としては、ヤギなどが挙げられる。例えば、本発明のトランスジェニックヤギの作成は次のようにして行うことが可能である。即ち、抗体遺伝子が乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入された融合遺伝子を構築する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入すれば、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、本発明の抗体を取得することができる。トランスジェニックヤギから産生される本発明の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンをトランスジェニックヤギに適宜使用することも可能である（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology（1994）12, 699-702）。
【００４６】
本発明のイメージング剤は、腫瘍細胞をイメージングするために哺乳動物に投与される。
本明細書において、「イメージング」とは、抗体へ標識物質を付加することによって対象物を測定し、可視化することである。蛍光・ラジオアイソトープ標識を用いてＣＣＤカメラにより観察する方法、ＭＲＩを用いたＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、またはＣＴなども含む。
哺乳動物としては、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、サルなど）が挙げられる。本発明のイメージング剤は、腫瘍細胞の有無の診断において有用である。本発明のイメージング剤はインビボ用、インビトロ用のどちらとしても利用できる。
【００４７】
本発明のイメージング剤によってイメージングされる腫瘍細胞は、メソセリンが発現している細胞である。メソセリンが発現している細胞、すなわち、本発明のイメージング剤によってイメージングされる細胞は、肺癌、中皮腫、卵巣癌、大腸癌、扁平上皮癌、膵臓癌、子宮癌、頭頸部癌、乳癌等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明のイメージング剤は、抗メソセリン抗体に、直接、あるいは間接的に追尾できる、イメージング用標識、プローブを結合させたものである。
前記プローブを生体に生体内投与（例えば静脈内投与）した後、ＰＥＴやＳＰＥＣＴ、CCDカメラなどの画像計測装置を用いて腫瘍細胞の蓄積量や分布を測定することができる。
【００４９】
また、近年、透過性線源により、物体を走査し、そのデータをコンピュータを用いて処理することで、物体の内部画像を構成する技術コンピュータ断層撮影（Computed Tomography：以下、「CT」との記載もComputed Tomographyを意味する）の病状診断、臨床への応用がされている。
そのようなCT技術は、ポジトロン断層法 (PET)や単一光子放射断層撮影 (SPECT)、や核磁気共鳴画像法 (MRI) などの、断面像を得て、物体の（輪切りなどの）２次元断面画像を得る技術であるが、これらの検査技術は単に断面画像として用いられるだけでなく、コンピュータ画像処理技術向上によってその２次元画像を統合し3次元グラフィックスとして表示されることも多く、３次元的な病変の位置の特定、診断、手術方針決定等に有力な技術となっている。
例えば、単純CTは、造影剤を使用せずにX線照射等の撮影を行うものであり、組織の浮腫、骨の形態異常、形態など造影剤を用いなくても充分に観察でき、一方、造影CTとは、X線吸収率の高い造影剤等を血管内に注射してから撮影を行うものをいい、血管や血流が豊富な組織の形状を観察することができる。さらに、いわゆる次世代CT、例えば、線源がらせん状に動くヘリカルCT、検出器自体を体軸方向に分割した多列検出器CT (MDCT)（マルチスライスCT(MSCT)とも呼ぶ）なども開発され、それらはいずれも特に制限なく、単独又は併用で本発明のイメージング剤の検出に適用可能である。
イメージング用標識プローブ（本発明のイメージング剤）がX線吸収率の高い放射線核種である場合は、検出器としてのCTの単独使用も可能である。
【００５０】
標識物質としては酵素発光（ルシフェラーゼ）による発光、発光低分子を利用するもの、蛍光タンパクや蛍光低分子を用いるもの、放射性核種等が挙げられるがこれらには限定されない。放射性核種としては５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、８１ｍＫｒ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌなどのγ線放出核種や、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３５ｍＣｌ、７６Ｂｒ、 ４５Ｔｉ、４８Ｖ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６６Ｇａ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１２４Ｉなどの陽電子放出核種などが挙げられるがこれらには限定されない。なお当業者には自明であるが"ｍ"とは核異性体を示す。特に、インジウム−１１１、テクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１３１は、平面走査またはシングルフォトン断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のために特に好ましく使用できる。陽電子放射標識の例えばフッ素−１８、陽電子放射断層法において特に好ましく使用できる。常磁性イオンの例えばガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）は特に好ましく磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）において使用できる。
【００５１】
蛍光標識や発光標識としては、酵素（ルシフェラーゼ）による発光系を利用するものと、蛍光（GFP、DsRed、クサビラオレンジ等の蛍光タンパク質やFITCやCy5.5、Alexa Fluor 750などの蛍光性低分子）を用いるものとが使用できる。
酵素発光（ルシフェラーゼ）による発光の場合は基質投与が別途必要である。
特に、動物本来の自家蛍光による影響を軽減したものが好ましく、さらには皮膚透過性の高いシグナルを発する標識が好ましい。
【００５２】
イメージング検出器としては磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）ＰＥＴやＳＰＥＣＴが用いられるが、特に、蛍光標識プローブの観察において、低侵しゅう性の観点で、好ましくは、測定機器はCCDカメラである。
それゆえ、CCDカメラで補足可能な波長、例えばおよそ350〜900 nmの光を発する標識が好ましい。さらに生体内の光源の強さの測定には、CCDカメラによる測定動物の体表面における測定値から、該光源の強さを測定できる機械が好ましい。蛍光標識の場合、反射蛍光画像、透過蛍光画像のいずれでも良いが、両方の画像を捉えることが好ましい。また、蛍光画像を多方面（反射、透過を問わず）重ね合わせ、それに線源情報を統合して処理し、立体画像（3次元）として捉えることが、腫瘍細胞の３次元的な位置、分布を正確に構成でき、好ましい。こうして得た３次元画像は、CT画像とさらに統合することもできる。
【００５３】
イメージング用標識プローブがX線吸収率の高い放射線核種を結合したものである場合、前述したようにイメージング検出器として、CT単独でも十分使用可能であり（例えばＰＥＴやＳＰＥＣＴ）、腫瘍細胞の位置、蓄積量や分布を測定することができる。
【００５４】
一方、前記イメージング用標識プローブを生体に生体内投与（例えば静脈内投与）した後、標識された前記プローブのCT観察、又はCCDとの併用観察も可能である。併用観察の例として、蛍光標識したプローブのCCD像を、単純CT（及び/又は造影CTの像と重ね合わせる）を用いることができる。即ち、単純CTにより骨、肺などの臓器像の抽出（及び/又は造影CTの血管、組織像抽出）を行って得られたCT画像と、CCDカメラによる蛍光プローブ画像を統合し、腫瘍細胞の位置、蓄積量や分布について、３次元的な組織、血管との相対的な位置関係、腫瘍細胞の3次元（局在）イメージをより正確に把握することができる。
【００５５】
本発明のイメージング剤は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【００５６】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
【００５７】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００５８】
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【００５９】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明のイメージング剤の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、対象あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。
投与量、投与方法は、対象の体重や年齢、症状、mg抗体あたりの蛍光標識の強度・検出機械の検出感度などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【００６０】
また本発明は、抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング用キットを提供する。本発明のキットは、対象に投与されることにより、腫瘍細胞をイメージングすることを特徴とする。上記キットには、本発明の抗体に加えて、例えば、標識物質、イメージング剤投与用の注射（点滴）器具、非吸着を抑える補助剤（例えばアルブミン等）等が含まれるが、これらに制限されるものではない。
また、上記キットには、イメージングに用いるための指示書、適当な容器、コントロール試薬等、通常のキットに含まれるものを含んでいてもよい。
【００６１】
また、上述の本発明の組成物の用途は、以下（１）〜（３）のように表現することもできる。
（１）腫瘍細胞のイメージング剤の製造における、抗メソセリン抗体の使用。
（２）腫瘍細胞のイメージング方法に使用するための、抗メソセリン抗体。
（３）抗メソセリン抗体を対象に投与する工程を含む、腫瘍細胞のイメージング方法。
【００６２】
本明細書で開示した抗体の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号に従って配列表に記載されている。なお、11-25抗体は、＃11-25抗体、クローン11-25と言い換えることもできる。
<11-25抗体>
配列番号１：重鎖可変領域の塩基配列
配列番号２：重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：重鎖CDR1の塩基配列
配列番号４：重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号５：重鎖CDR2の塩基配列
配列番号６：重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号７：重鎖CDR3の塩基配列
配列番号８：重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９：軽鎖可変領域の塩基酸配列
配列番号１０：軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：軽鎖CDR1の塩基配列
配列番号１２：軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号１３：軽鎖CDR2の塩基配列
配列番号１４：軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号１５：軽鎖CDR3の塩基配列
配列番号１６：軽鎖CDR3のアミノ酸配列
【００６３】
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。
〔実施例１〕
本発明者らは、複数のがん細胞に対して、免疫染色を行った。【００６５】
使用した抗体
抗メソセリン抗体としては、5種類の抗体、すなわち、11-25抗体、IC14-30、IC7-4、IC17-35、2-9抗体を利用した。コントロールとしては、抗体を添加していないものを用いた。各抗体の入手、作製方法は以下のとおりである。
11-25抗体：参考例１及び２、特開2010-014691参照
IC14-30：特開2010-014691参照
IC7-4：参考例２参照
IC17-35：参考例２参照
2-9抗体：参考例２参照【００６６】
使用した細胞株
使用した細胞株は、NCI-H226(肺癌)、NCI-H520(肺癌)、211H（中皮腫）、PC3（前立腺癌）、PANC-1（膵臓癌）、BxPC-3（膵臓癌）、CFPAC-1（膵臓癌）である。各細胞株の入手方法は以下のとおりである。
NCI-H226：ATCC より購入（CRL-5826で検索）。
NCI-H520：ATCC より購入（HTB-182で検索）。
211H：Yuji Kashiwakura, et al. Cancer Res 2008; 68: (20). October 15: 8333-8341, 2008、Yuji Kashiwakura, et al. Circulation April 29: 2078-2081, 2003参照
PC3：Caliper Life Sciencesより入手（名称はPC-3M-luc-C6）。
PANC-1：ATCCより購入（http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/tabid/112/Default.aspxでATCC numbersカテゴリー検索でCRL-1469と入力して検索）（住商ファーマインターナショナル株式会社）、Lieber M, et al. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. Int. J. Cancer 15: 741-747, 1975参照。
BxPC-3：ATCC より購入（CRL-1687で検索）、Loor R, et al. Use of pancreas-specific antigen in immunodiagnosis of pancreatic cancer. Clin. Lab. Med. 2: 567-578, 1982参照。
CFPAC-1：ATCC より購入（CRL-1918で検索）、Schoumacher RA, et al. A cystic fibrosis pancreatic adenocarcinoma cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4012-4016, 1990参照。【００６７】
免疫染色
それぞれの細胞をラブテックII 8well（または2well）チャンバースライドにて３日間培養し、10%ホルマリン・PBSで固定後、10 mM グリシンを含むPBS（PBS-G）で洗浄、3% BSAを含むPBSでブロッキングし、抗メソセリン抗体で１時間処理した。その後0.1% BSAを含むPBSで洗浄し、TRITC標識ロバ抗マウスIgG (Santa Cruz、100倍希釈)、DAPI（4000倍希釈；核染色）、ローダミンファロイジン（molecular probe 社R415、200倍希釈）の混液で１時間処理した。洗浄後、蛍光用封入剤とカバーグラスで封入した。
オリンパス  IX71蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡  ZEISS LSM510型にて観察した。【００６８】
結果
BxPC-3膵臓がん細胞を8-wellチャンバーで培養し、抗メソセリン抗体５種でそれぞれ免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図１）。緑色は抗メソセリン抗体の結合、赤色はアクチンフィラメント、青色は核を示す。11-25抗体により細胞表面付近に著しい抗メソセリン抗体の結合が認められた。それ以外の４種類の抗メソセリン抗体では細胞への結合は検出されなかった。
CFPAC-1膵臓がん細胞を2-wellチャンバーで培養し、抗メソセリン抗体５種でそれぞれ免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図２）。緑色は抗メソセリン抗体の結合、赤色はアクチンフィラメント、青色は核を示す。細胞表面付近に強い11-25抗メソセリン抗体の結合が小さな塊状に分布しているのが認められた。他の４種類の抗メソセリン抗体では細胞への結合は検出されなかった。
PANC-1膵臓がん細胞を8-wellチャンバーで培養し、抗メソセリン抗体５種でそれぞれ免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図３）。緑色は抗メソセリン抗体の結合、赤色はアクチンフィラメント、青色は核を示す。細胞質に11-25抗メソセリン抗体の結合が認められた。それ以外の４種類の抗メソセリン抗体では細胞への結合はほとんど検出されなかった。
211H中皮腫細胞を8-wellチャンバーで培養し、抗メソセリン抗体2種（11-25抗体及び#IC14-30抗体）でそれぞれ免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図４）。細胞表面および細胞質中に11-25抗体の結合が認められたが、#IC14-30抗体の結合は認められなかった。
PC3前立腺がん細胞、211H中皮腫細胞、H520およびH226肺がん細胞の4種類について、11-25抗メソセリン抗体で染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（図５）。PC3細胞では細胞膜に抗メソセリン抗体の結合が見られた。211H細胞では、細胞膜および細胞質に抗メソセリン抗体の結合が見られた。H520細胞では細胞質に弱い抗体の結合を認めた。H226細胞では膜および細胞質に抗メソセリン抗体の結合が見られた。【００６９】
抗メソセリン抗体11-25の反応性を表１にまとめる。
［表１］
―――――――――――――――――――――――――
免疫染色（陽性部位）    インビボ
イメージング
―――――――――――――――――――――――――
211H（中皮腫）    ＋ （細胞質&膜）       ＋
PC3 (前立腺癌）   ＋/−（細胞膜）        ＋/−
NCI-H226（肺癌）  ＋ （細胞質&膜）       ＋
NCI-H520（肺癌）  ＋/−（細胞質）        −
PANC-1 (膵臓癌）  ＋/−（細胞質）        −
BxPC-3(膵臓癌）   ＋＋ （細胞膜）        ＋＋
CFPAC-1(膵臓癌）  ＋＋ （細胞膜）        ＋＋＋
―――――――――――――――――――――――――【００７０】
免疫染色に用いることができた11−25抗体について、生細胞の細胞表面に対する反応性を確認するために、フローサイトメトリーを行った。NCI-H226,NCI-H520,BxPC-3,CFPAC-1それぞれの細胞（1.0 ｘ105 Cells/sample）に対して50μlの11-25抗体（1.0 μg/ml）で4℃にて１時間の染色を行い、2次抗体にはPE標識ゴート抗マウスIgG抗体（IM0855ベックマンコールター）を用いた。フローサイトメトリーはベックマンコールターのFC500を使用した。その結果、NCI-H226, BxPC-3,CFPAC-1細胞について、11−25抗体の反応性が確認された。【００７１】
〔実施例２〕
ヌードマウス背部後方皮下に実施例１で用いた癌細胞を移植し、３週間後にマウスの尾静脈からAlexa 750 (Invitrogen)標識あるいはCy5.5 (GEヘルスケア)標識11-25抗メソセリン抗体90μgを投与し、経時的に生体蛍光発光イメージング装置IVIS200 (Xenogen)にて反射蛍光を測定した。Alexa 750標識抗体を用いた場合は、励起745nm、蛍光800nmで、Cy5.5標識抗体を用いた場合は励起675nm、蛍光740nmで測定した。【００７２】
結果
PC３前立腺がん細胞および211H中皮腫細胞を皮下に移植したヌードマウスにAlexa750標識11-25抗メソセリン抗体90μgを尾静脈投与し、48時間後の蛍光を測定した。PC3腫瘍はやや弱く、211H腫瘍は強く蛍光を発していた（図６(A)）。
NCI-H520およびNCI-H226肺がん細胞を皮下に移植したヌードマウスにCy5.5標識11-25抗体90μgを尾静脈投与し、24時間後に反射蛍光を測定した。H520腫瘍部分は特異的蛍光を示さず、H226腫瘍部分は強く蛍光を発した（図６(B)）。
BxPC-3およびPANC-1膵臓がん細胞を皮下に移植したヌードマウスにAlexa750標識11-25抗メソセリン抗体90μgを尾静脈投与し、24時間後に反射蛍光を測定した。BxPC-3腫瘍部分は強い蛍光を示していたが、PANC-1腫瘍部分には蛍光を認めなかった（図６(C)）。
NCI-520肺がん細胞およびCFPAC-1膵臓がん細胞を移植したヌードマウスにAlexa750標識11-25抗メソセリン抗体90μgを尾静脈投与し、24時間後に反射蛍光を測定した。CFPAC-1腫瘍部分は非常に強い蛍光を示したが、H520腫瘍部分には特異的蛍光を認めなかった（図６(D)）。
図６(E)は、図６（B）のマウスの腫瘍を取り出して撮影したものである。H226腫瘍は強い蛍光を示したがH520腫瘍は特異的蛍光を示さなかった。
図６(F)は、図６（C）のマウスの腫瘍を取り出して撮影したものである。BxPC-3腫瘍は強い蛍光を示したがPANC-1腫瘍は特異的蛍光を示さなかった。
図６(G)は、（D）のマウスの腫瘍を取り出して撮影したものである。CFPAC-1腫瘍は強い蛍光を示したがH520腫瘍は特異的蛍光を示さなかった。【００７３】
〔参考例１  組換えメソセリンタンパク質の生産〕
組換えメソセリンタンパク質は、５’−ＡＡＡＴＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧ−３’（配列番号：２２）と、５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：２３）というプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によってヒトメソセリン前駆体タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５８２３）の転写バリアント１をエンコードするｃＤＮＡに由来するアミノ酸２９７−５８０番目のコーディング部分を増幅することによって作成された。増幅ＤＮＡは、発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入された。クローンＮＭ００５８２３によってエンコードされるタンパク質のアミノ酸２９７−５８０番目は、Ｓｃｈｏｌｌｅｒら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９９；９６（２０）：１１５３１−６）によって説明されるヒトメソセリンのアイソフォーム１及び３に共通の配列である点に留意すべきである。前記メソセリン発現プラスミドは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションされた。メソセリンタンパク質は、トランスフェクションされた細胞の培養上清からＴＡＬＯＮ樹脂を用いて精製された。このようにして得られる精製メソセリンタンパク質はＰＢＳで２回透析され、使用時まで−８０°Ｃで保存された。【００７４】
〔参考例２  メソセリン抗体の生産〕
メソセリンに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を生産するために、４ないし６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、精製組換えメソセリンタンパク質を０日目、７日目、１４日目及び１６日目に腹腔内注射（１０マイクログラム／注射）して免疫された。４回目の免疫後１８日目に脾臓のリンパ球は採取され、５０％ポリエチレングリコール４０００溶液を用いてＰ３Ｕ１メラノーマ細胞と融合された。前記融合細胞は、１５％ ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＨＡＴ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて９６ウェルプレート上に播種された。３７°Ｃ、５％ ＣＯ２、飽和水蒸気下で１０日間の培養後に培養上清は採取され、組換えメソセリンタンパク質を用いる間接ＥＬＩＳＡによって免疫原に結合する能力がスクリーニングされた。選択された陽性ハイブリドーマコロニーは増殖され、限界希釈によってサブクローン化された。サブクローン化ハイブリドーマは培養され、サブクローン化抗体のアイソタイプはＲｏｃｈｅのアイソストリップキットを用いて決定された。抗体精製はタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって実施された。得られたクローン間の免疫原競合アッセイ後に、11-25抗体（ＩｇＧ２ｂカッパー）が、ＭＰＦのＥＬＩＳＡ検出のためのＥＬＩＳＡを構築するために選択された。11-25抗体は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＥＣＬタンパク質ビオチネーションモジュールを用いてビオチン化された。
また、１１−２５抗体と同様に、IC7-4、IC17-35、2-9抗体を作製した。【００７５】
〔参考例３  ＭＳＬＮ抗体の特徴付け〕
抗ＭＳＬＮモノクローナル抗体、１１−２５抗体のＣＤＲ領域の核酸配列を決定するために、全量ＲＮＡは、参考例２に従って生産されるＩＣ１１−２５のそれぞれを産生するハイブリドーマから採取された。採取される前記全量ＲＮＡ中のメッセンジャーＲＮＡは、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入される）オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマーを用いて相補性ＤＮＡに逆転写された。このＤＮＡから、免疫グロブリン可変領域配列のヌクレオチド配列は、１１−２５の重鎖のための５’−ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号：２４）及び５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’（配列番号：２５）プライマーと、１１−２５の軽鎖のための５’−ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：２６）及び５’−ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号：２７）プライマーとを用いるＰＣＲ技術によって増幅された。増幅ｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位に挿入された。次に、ＶＨ及びＶＬ領域の配列は遺伝子配列決定装置（３１３０／３１００−Ａｖａｎｔ（登録商標）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ａｒｒａｙｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって解析された。ＦＲ１、２、３及び４と、ＣＤＲ１、２及び３との領域の決定は、ＩｇＧ ｂｌａｓｔ（ＮＣＢＩ データベース）及びＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ、１巻、第５版、１９９１；ＮＩＨ出版第９１−３２４２頁（Ｅｌｖｉｎ Ａ． Ｋａｂａｔら）を用いて実施された。１１−２５抗体の各領域の配列は以下のとおりである。
<11-25抗体>
配列番号１：重鎖可変領域の塩基配列
配列番号２：重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：重鎖CDR1の塩基配列
配列番号４：重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号５：重鎖CDR2の塩基配列
配列番号６：重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号７：重鎖CDR3の塩基配列
配列番号８：重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号９：軽鎖可変領域の塩基酸配列
配列番号１０：軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：軽鎖CDR1の塩基配列
配列番号１２：軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号１３：軽鎖CDR2の塩基配列
配列番号１４：軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号１５：軽鎖CDR3の塩基配列
配列番号１６：軽鎖CDR3のアミノ酸配列
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明者らは、膜型メソセリンを高発現する実際の患者由来の癌を直接画像化できる試薬を開発した。本発明は、メソセリンを発現しているがん（肺がん、中皮腫、卵巣がん、大腸がん、扁平上皮がん、膵臓がん、子宮がん等）を画像化するために有用である。
【図１】
2011074621.tif 000002
【図２】
2011074621.tif 000003
【図３】
2011074621.tif 000004
【図４】
2011074621.tif 000005
【図５】
2011074621.tif 000006
【図６】
2011074621.tif 000007
【配列表】
2011074621000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年9月12日(2011.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボで用いられる、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤；
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（ｂ）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（ｄ）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（ｅ）上記（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、および、上記（ｃ）または（ｄ）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
インビボで用いられる、下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング用キット；
（ａ）ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（ｂ）重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
（ｃ）ＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（ｄ）軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
（ｅ）上記（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、および、上記（ｃ）または（ｄ）に記載の軽鎖の対を有する抗体。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
インビボで用いられる、下記に記載の抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤；
ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、並びにＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖の対を有する抗体。
【請求項８】
インビボで用いられる、下記に記載の抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング剤；
重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖の対を有する抗体。
【請求項９】
インビボで用いられる、下記に記載の抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング用キット；
ＣＤＲ１として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、並びにＣＤＲ１として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１４に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖の対を有する抗体。
【請求項１０】
インビボで用いられる、下記に記載の抗メソセリン抗体を含む、腫瘍細胞のイメージング用キット；
重鎖可変領域として配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および軽鎖可変領域として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖の対を有する抗体。
【国際調査報告】
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