(57)【要約】  植物は、代替発現系として登場し、標的タンパク質を産生するために産業界および学術界でますます使用されている。しかしながら、タンパク質をグリコシル化する植物の能力は、Ｎ−グリコシル化を必要としないタンパク質の重要な制限であることができる。例えば、熱帯性マラリア原虫タンパク質、またはヒト第ＸＩＩＩ因子のＡ鎖は、Ｎ結合型グリカンを保有しないか、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓｉｓの防御抗原（ＰＡ）は、糖タンパク質ではなく；しかしながら、これらのタンパク質は、エピトープのフォールディングおよび／またはマスキングの不正確／改変のために、潜在的には、低下した機能性および免疫原性をもたらす、酵母、哺乳動物、または植物系での発現の間に異常にグリコシル化されることができる潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を含む。この問題を解決するために、本発明者らは、植物における一過性発現を使用して細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）との同時発現によってインビボでタンパク質の酵素的脱グリコシル化の戦略を最近開発し（ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１７０６７８）、これは、高い透過遮断（ＴＢ）活性を提供することができる、マラリアワクチン候補Ｐｆｓ４８／４５の産生を可能にする（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）。また、他の脱グリコシル化抗原は、グリコシル化形態と比較してよりも、マウスにおいて毒素中和抗体応答の有意に高いレベルを誘導した（Ｍａｍｅｄｏｖら、原稿が提出されている）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理（インビボ脱グリコシル化）は、オリゴ糖をインタクトに取り除くが、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）への脱アミド化による脱グルコシル化タンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。この研究において、非Ｎ−グリコシル化形態の植物における標的タンパク質の産生のための戦略が開発されたが、得られた脱グリコシル化タンパク質のＮｘＳ／Ｔ部位におけるアミノ酸変化なしで、植物またはネイティブ様のフォールディングを有する他の真核生物系において、非Ｎ−グリコシル化された組換えタンパク質の産生を提供することができる。したがって、一過性発現系を使用して、植物におけるＥｎｄｏ−Ｂ−Ｎ−アセチルグリコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）との同時発現による組換えＮ−グリコシル化タンパク質のインビボ脱グリコシル化のための材料および方法が、本発明に記載される。活性なＥｎｄｏ  Ｈｉｎ植物を発現する方法も提供する。【選択図】図５
2019504638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を使用することによって目的のＮ−脱グリコシル化ポリペプチドを生成するための方法：
（ａ）細菌のＥｎｄｏ  Ｈ（Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミダーゼＨ、Ｅｎｄ  Ｈ、ＥＣ３．２．１．９６）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸、ここで、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化されると、Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドが発現される場合のようなプロモーターに操作可能に連結され；および
（ｂ）目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸、ここで、第２のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、目的のポリペプチドが発現されるようなプロモーターに操作可能に連結され、
（ｃ）およびＥｎｄｏ  Ｈポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチドは、脱グリコシド化され、得られたポリペプチドのＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアミノ酸変化なしで、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの作用とは反対に、これは、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）への脱アミド化による脱グリコシド化タンパク質標的中のアミノ酸変化を引き起こし、
（ｄ）細菌のＥｎｄｏ  Ｈ（Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ、Ｅｎｄｏ  Ｈ、ＥＣ３．２．１．９６）ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸、ここで、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、Ｅｎｄｏ  Ｈポリヌクレオチドが発現されるようなプロモーターおよび目的の標的ポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２の核酸に操作可能に連結され、
（ｅ）Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチドは、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）のアミノ酸変化なしで、脱グリコシド化され、および
（ｆ）Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチドは、脱グルコシル化され、Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチド切断が、１つのＧｌｃＮＡｃ残基がアスパラギンに結合したまま、残りのものサッカライドが荷電を与え、それによって脱グルコシド化ポリペプチドの溶解度および安定性を増加させ、および
（ｇ）非グリコシド化ワクチン抗原、治療タンパク質、抗体および細菌タンパク質（特に、ワクチン抗原候補）酵素を産生する。また、本発明は、バイオエネルギー／バイオ燃料の収率を増加させるため、並びに特に天然添加物を製造するための食品品質を改善するための、任意の真核生物系における工業的酵素、特に細菌起源の酵素の製造のために使用されることができる。
【請求項２】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物細胞が、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドは、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１および第２の核酸は、アクロバクテリウム構築物を介して細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下を使用することによって目的のＮ−脱グルコシル化ポリペプチドを生成するための方法：
（ａ）目的の細菌Ｅｎｄｏ  Ｈ（Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ、Ｅｎｄｏ  Ｈ、ＥＣ３．２．１．９６）ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸；および
（ｂ）目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸、ここで、第２のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、目的のポリペプチドが発現されるようなプロモーターに操作可能に連結され、Ｅｎｄｏ  Ｈポリヌクレオチドの作用によって、目的のポリペプチドが脱グルコシド化され、得られたポリヌクレオチドのＮｘＳ／Ｔ部位（配列）においてアミノ酸変化なしで、ＰＮＧａｓｅ  Ｆの作用と反対に、これは、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）のアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）への脱アミド化によって脱グルコシル化タンパク質標的のアミノ酸変化を引き起こし、
（ｃ）細菌Ｅｎｄｏ  Ｈ（Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ、Ｅｎｄｏ  Ｈ、ＥＣ３．２．１．９６）ポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む第１の核酸、ここで、第１のヌクレオチド配列は、プロモーターが活性化される場合、Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドが発現されるプロモーターおよびＰＡ８３またはＰｆｓ４８／４５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸に操作可能に連結され、
（ｄ）Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドの作用によって、目的のポリペプチド、ＰＡ８３またはＰｆｓ４８／４５ポリペプチドは、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアミノ酸変化なしで、脱グリコシド化され、および
（ｅ）Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドの作用によって、ＰＡ８３のポリペプチドまたはＰｆｓ４８／４５ポリペプチドは、脱グルコシル化され、Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドの切断が、１つのＧｌｃＮＡｃ残基がアスパラギン酸に結合したままであり、残りのモノサッカライドが電荷を与え、それによって脱グルコシル化ポリペプチドの溶解度および安定性を増加させ、および
（ｆ）脱グルコシド化ＰＡ８３ポリペプチドは、Ｅｎｄｏ  Ｈの作用によって生成され、同じポリペプチドのグリコシル化またはＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グルコシル化（インビボ）形態と比較してより安定であるようであり、
（ｇ）グリコシル化ＰＡ８３ポリペプチドは、ａｎｔｈｒａｘ  ｖａｃｃｍｅとしてＥｎｄｏ  Ｈの作用によって生成される。
【請求項８】
前記真核細胞が植物細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記植物細胞が、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
第１のヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
Ｅｎｄｏ  Ｈポリペプチドは、配列番号２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
第１および第２の核酸は、アクロバクテリウム構築物を介して細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
目的のワクチンの製造に使用するためにＥｎｄｏ  Ｈの目的の標的との同時発現による目的の生成物。
【請求項１４】
炭疽ワクチンの製造に使用するためのＥｎｄｏ  ＨとＰＡ８３との同時発現によって産生される生成物。
【請求項１５】
マラリアワクチンの製造に使用するためにＥｎｄｏ  Ｈとｐｆｓ４８／４５との同時発現によって産生される生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この文書は、非−Ｎ−グルコシル化形態の植物における目的の組換えタンパク質を産生するための材料および方法に関する。戦略は、非−Ｎ−グルコシル化形態の植物における標的タンパク質の生産のために開発されたが、得られた脱グリコシル化タンパク質のＮｘＳ／Ｔ部位においてアミノ酸変化なしで、ネイティブ様の折り畳みを有する植物または他の真核生物の発現系において非−Ｎ−グルコシル化組換えタンパク質の産生を提供することができる。Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）との同時発現によって組換えＮ−グリコシド化タンパク質のインビボ脱グリコシル化のための材料および方法が、一時的発現システムを使用して、記載される。植物において活性Ｅｎｄｏ  Ｈを発現する方法も提供する。
【０００２】
発明の概要
植物は、代替発現系として現われ、標的タンパク質を産生するために産業界および学術界でますます使用されている。しかしながら、タンパク質をグリコシル化する植物の能力は、Ｎ−グルコシル化を必要としないタンパク質にとって重要な制限であることができる。例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）タンパク質、またはヒト第ＸＩＩＩ因子のＡ鎖は、Ｎ結合型グリカンを保有しないか、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓｉｓの防御抗原（ＰＡ）は、糖タンパク質ではない；しかしながら、これらのタンパク質は、酵母、哺乳動物、または植物系における発現中に、異常にグリコシル化されることができる潜在的なＮ結合型グルコシル化部位を含み、エピトープの不正確／改変されたフォールディングおよび／またはマスキングのために機能性および免疫原性が低下する可能性がある。この問題を克服するために、本発明者らは、最近、一過性の発現植物と同時発現されることにより、インビボでのタンパク質の酵素的脱グルコシド化の戦略を開発し（Ｗ  ＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１７０６７８）、これは、マラリアワクチン候補Ｐｆｓ４８／４５の産生を可能にし、高い透過遮断（ＴＢ）活性を提供することができる（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）。また、他の脱グルコシル化抗原は、グリコシル化形態と比較してよりも、マウスにおいて毒素中和抗体応答の有意に高いレベルを誘導した（Ｍａｍｅｄｏｖら、原稿が提出された）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理（インビボ脱グルコシド化）は、オリゴ糖をそのまま除去するが、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）への脱アミド化による脱グルコシル化タンパク質におけるアミノ酸変化を引き起こす。この研究において、非Ｎ−グルコシル化形態の植物における標的タンパク質の産生のための戦略が開発されたが、得られる脱グルコシル化タンパク質のＮｘＳ／Ｔ部位のアミノ酸変化なしで、これは、植物またはネイティブ様の折り畳みを有する他の真核生物系の産生を提供することができる。したがって、一過性の発現系を使用して、植物におけるＥｎｄｏ−β−ＮアセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）との同時発現によって組換えＮ−グルコシル化タンパク質のインビボ脱グルコシル化のための材料および方法が、本発明に記載される。植物における活性Ｅｎｄｏ  Ｈを発現させる方法がまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
Ｎ−グリコシル化は、多くのタンパク質の正確なフォールディングおよび安定性にとって重要なＰＴＭであり、異種発現系で産生される多くの組換えタンパク質の生物学的活性は、それらのグリコシル化の状態に依存する。しかしながら、いくつかの真核生物並びに細菌タンパク質は、天然宿主内にＮ−グリカンを含まないが、これらのタンパク質が異種真核生物発現系で発現される場合、異常にグリコシル化されることができる複数の潜在的なＮ−グリコシル化部位を含み、エピトープの不正確／改変されたフォールディングまたはマスキングにより潜在的に低下した機能性および免疫原性に導く。例えば、ヒト第ＸＩＩＩ因子の熱帯熱マラリア原虫Ａ鎖のＰｆｓ４８／４５タンパク質は、Ｎ−結合グリカンを保有せず、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓｉｓの防御抗原（ＰＡ）は、糖タンパク質ではなく；しかしながら、これらのタンパク質は、酵母、哺乳動物、または植物系において発現の間に異常にグリコシル化されることができる潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含む。植物は、代替発現系として登場し、標的タンパク質を産生するために産業界および学術界でますます使用されている。しかしながら、タンパク質をグリコシル化する植物の能力はまた、植物に基づく発現系の有用性に対する重大な限界であることができる。発明者らの以前の研究において、植物における一時的発現を用いて細菌のＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ）と同時発現させることにより、インビボでのタンパク質の酵素的脱グリコシル化の戦略を開発した（ＷＩＰＯ特許出願ＷＯ／２０１２／１７０６７８）。インビボ脱グリコシル化戦略を使用して、Ｐｆｓ４８／４５タンパク質は、非Ｎ−グリコシル化形態であるＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｉｎにおいて産生され、Ｐｆｓ４８／４５タンパク質の異なるエピトープに対して産生された４つのｍＡｂ（そのうち２つは立体配座特異的であり）、それらが同じタンパク質のグリコシル化形態を認識したよりも２〜６倍良好なＰｆｓ４８／４５の脱グルコシル化形態を認識した（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）。また、最も強い結合および最大ｍＡｂＩＩＩシグナル阻害が、インビボＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グリコシル化Ｐｆｓ４８／４５のみと一緒に観察されたが、一方、Ｐｆｓ４８／４５のグリコシル化された、インビトロ脱グルコシル化（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１１年）は、ｍＡｂＩＩＩシグナルを阻害するそれらの能力において同等であった。また、これは、他の標的とも試験し、結果は、インビボ脱グリコシル化形態のみが、インビトロ脱グリコシル化およびグリコシル化形態と比較して、抗体に対して非常により強い結合を有したことを示し、異常なグルコシル化が重要なエピトープのマスキングを導くか、またはＰｆｓ４８／４５タンパク質の不正確／改変されたフォールディングを引き起こしたことを示唆する（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ、ＥＣ３．２．１．９６）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓおよび、いくつかの他のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐｅｃｉｅｓによって分泌されるグリコヒドロラーゼである（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏら、１９７６年）。これは、オリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミンコアのβ−１，４−グリコシド結合を切断し、糖タンパク質のアスパラギン残基に結合される１つのＮ−アセチルキトビオースを残す（Ｔｒｉｍｂｌｅら、１９７８年；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ １９７１年）。Ｓ. ｐｌｉｃａｔｕｓのＥｎｄｏ  Ｈ遺伝子は、９３９ｂｐ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託ＡＡＡ２６７３８．１）であり、２８．９ｋＤａのタンパク質をコードする。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓのＥｎｄｏ  Ｈは、最近、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓで発現し、共発酵および発酵後処理の両方を通じて、脱グリコシル化活性は、インビトロで実証された（Ｗａｎｇら、２０１５年）。しかしながら、Ｅｎｄｏ  Ｈによってインビボ条件でタンパク質のＮ−脱グリコシル化は、達成されていない。この研究において、一過性発現系を使用して、植物におけるＥｎｄｏ  Ｈとの共発現によって組換えＮ−グリコシル化タンパク質のインビボ脱グルコシド化が記載され、提示される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の目的
発明者らの以前の研究において、発明者らは、細菌のＰＮＧａｓｅ  Ｆとの同時発現標的タンパク質によって、インビボで標的タンパク質の脱グルコシル化を実証した（Ｍａｍｅｄｏｖ Ｔ. Ｗ０／２０１２／１７０６７８, ２０１２年；Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる脱グルコシル化（インビボまたはインビトロ）は、オリゴ糖をインタクトに除去するが、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアスパラギン（Ｎ）のアスパラギン酸（Ｄ）への脱アミド化によって、脱グリコシル化タンパク質でアミノ酸変化を引き起こす。この時点で、Ｎ結合グリカンのキトビオースコアの２つのＧｌｃＮＡｃ残基の間を切断を触媒するＥｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）などの他の脱グリコシル化酵素は、アスパラギンに結合し（図１）、ＰＮＧａｓｅ  Ｆと反対に、Ｅｎｄｏ  Ｈによる脱グリコシル化は、得られる脱グリコシド化タンパク質のＮｘＳ／Ｔ部位のアミノ酸配列に変更をもたらさない。Ｅｎｄｏ  Ｈ処理は、脱グリコシル化タンパク質をもたらす場合のアミノ酸の変化を産生しないので、発明者は、Ｅｎｄｏ  Ｈによって産生された脱グリコシド化タンパク質は、より自然なフォールディングを有し得し、したがって、同じたんぱく質のＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グリコシル化形態と比較して、より良好な機能活性（免疫原性、受容体結合、タンパク質−抗体相互作用、酵素活性等）であることを仮定する。発明者は、Ｅｎｄｏ  Ｈ切断は、アスパラギンに結合される１つのＧｌｃＮＡｃ残基を残したまま、残りのモノサッカライドは電荷を与え、それによって、脱グリコシル化タンパク質の溶解性および安定性を増加させることも仮定した。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の産業適用
上記のように、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理（インビボ脱グリコシル化）は、オリゴ糖をインタクトで除去するが、ＮｘＳ／Ｔ部位（配列）におけるアスパラギンからアスパラギン酸への脱アミド化による脱グリコシル化タンパク質におけるアミノ酸変化を引き起こす。Ｅｎｄｏ  Ｈ処理は、得られる脱グリコシル化タンパク質のＮｘＳ／Ｔ部位におけるアミノ酸変化をもたらさない。この時点で、Ｅｎｄｏ  Ｈによって産生された脱グリコシル化タンパク質は、より自然なフォールディングを有し得、それによって、同じたんぱく質のＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理形態と比較して、より良い機能活性（免疫原性、受容体結合、タンパク質−抗体相互作用、酵素活性等）を有することを仮定した。Ｅｎｄｏ  Ｈ切断は、アスパラギンに結合される１つのＧｌｃＮＡｃ残基のままであるので、残りのモノサッカライドは、電荷を与え、それによって、脱グリコシル化タンパク質の溶解性および安定性を増加させ得ることも仮説が立てられた。この研究において、発明者は、植物の脱グリコシル化細菌酵素Ｅｎｄｏ  Ｈの発現を初めて証明する。発明者はまた、Ｎ.  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるインビボでのＥｎｄｏ  Ｈによる標的タンパク質の脱グリコシル化を初めて証明する。発明者らは、組換え植物産生Ｅｎｄｏ  Ｈｉｓを完全にインビボで活性化し、ＰＡ８３およびＰｆｓ４８／４５タンパク質からＮ結合型グリカンを成功裏に切断することを証明する。また、ＰＡ８３とＥｎｄｏ  Ｈの同時発現は、細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆによってインビボグリコシル化分子のサイズに類似したＰＡ８３の蓄積をもたらした。重要なことに、発明者らの予備の安定性分析の結果は、インビボ脱グリコシル化ＰＡ８３におけるＥｎｄｏ  Ｈは、特に昇温で、同じたんぱく質のグリコシル化またはＰＮＧａｓｅ  Ｆ脱グリコシル化（インビボ）形態と比較して、より安定であるようであることを証明する。結論として、全てのこれらの結果は、Ｅｎｄｏ  Ｈ同時発現戦略は、天然型のＮ.  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａベースの一過性発現系において、非グリコシル化組換えタンパク質を産生するために使用されることができることを示唆する。また、この研究の結果は、炭疽菌およびＰｆｓ４８／４５ワクチンとしてＥｎｄｏ  Ｈ脱グリコシル化ＰＡ８３の可能性を明らかにし、前臨床開発のためのそのさらなる特徴付けを支持する。これらの結果は、Ｅｎｄｏ  Ｈは、全ての試験された糖タンパク質からＮ結合型グリカンを成功裏に切断することを証明し、Ｅｎｄｏ  Ｈ同時発現戦略は、非グリコシル化ワクチン抗原、治療タンパク質、抗体および細菌タンパク質（特にワクチン抗原候補）酵素を製造するために使用することができることを示唆する。また、本発明は、バイオエネルギー／バイオ燃料収率を増加させるため、並びに特に天然添加物を製造するための、食品品質を改善するための任意の真核生物系における工業的酵素、特に細菌起源の酵素の製造に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａは、Ｅｎｄｏ  Ｈは、オリゴ糖のジアセチルキトビオースコアの２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の間を切断し、アスパラギン（Ａｓｎ）上に１つのＧｌｃＮＡｃが残っている切断型糖分子を生成することを示す。図１Ｂは、ペプチド−Ｎ−グルコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）を示し、Ｎ−結合型糖タンパク質からの高マンノース、ハイブリッド、および複合オリゴ糖；０：Ｎ  ＧｌｃＮＡｃ；０：マンノースの最も内側のＧｌｃＮＡｃおよびアスパラギン酸残基の間を切断するアミダーゼである。
【図２】図２は、本明細書中に記載されるようなＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに発現されたＥｎｄｏ  Ｈのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。図２Ａは、細菌Ｅｎｄｏ  Ｈ遺伝ヌクレオチド配列を示し、これは、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａコドンを使用してコドン最適化された。図２Ｂは、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物で発現されるＥｎｄｏ  Ｈのアミノ酸配列を示す。ＰＲ−１ａシグナルペプチド配列（ＭＧＦＶＬＦＳＱＬＰＳＦＬＬＶＳＴＬＬＬＦＬＶＩＳＨＳＣＲＡ）をＮ末端に下線を付けて付加した。ＦＬＡＧエピトープ（アフィニティー精製タグ）に続いてＫＤＥＬ（ＥＲ保持シグナル）配列（太字）をＣ末端に付加した。
【図３】図３は、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において、Ｅｎｄｏ  Ｈのウェスタンブロット分析を示す。ｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  ＨまたはｐＧＲ−Ｍ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ構築物の浸潤されたＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、Ｅｎｄｏ  ＨおよびＰＮＧａｓｅ  Ｆを産生する。葉サンプルを５ｄｐｉで採取し、３つの体積の抽出緩衝液中でホモジナイズした。１３，０００ｇで遠心分離後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いてウェスタンブロッティングした。Ｅｎｄｏ  Ｈａｎｄ  ＰＮＧａｓｅ  Ｇをポリクロナールウサギ抗フラグタグ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４）を使用して検出した。抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４）を第２の抗体として使用した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（３５６ｋＤａ）を発現する１−Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物：Ｅｎｄｏ  Ｈ（約３０ｋＤａ）を発現する２−Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物。
【図４】図４は、ベンガミナ植物は、ｐＧＲ−Ｍ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ／ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３（１，２）またはｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  Ｈ／ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３（３−５）で浸潤されており、示されるように、ＰＮＧａｓｅ  ＦまたはＥｎｄｏ  Ｈを検出するためのポリクロナールウサギ抗フラグタグ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２３６８）を使用してウェスタンブロッドによって分析した。Ａ：６−非浸潤Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物。図４Ｂは、ｐＧＲ−Ｍ−ＰＮＧａｓｅ  Ｆ／ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３（１，２）またはｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  Ｈ／ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３（３−５）と浸潤されたＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物のウェスタンブロット分析を示す。ＰＡ８３タンパク質を検出するために、抗ＰＡ抗体（抗Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原抗体、ＢＡＰ０１０１、カタログ番号ａｂ１９８８、Ａｂｅａｍ）を使用した。
【図５】図５は、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物に示されるような細菌ＰＮＧａｓｅ  ＦおよびＥｎｄｏ  ＨとのＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ＰＡの同時発現のウェスタンブロット分析を示す。Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、脱グリコシル化ＰＡ８３の産生について、ｐＧＲ−Ｍ−ＰＮＧａｓｅ／ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３またはｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  ＨＩ  ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３構築物を浸潤させた。葉サンプルを５ｄｐｉで採取し、３体積の抽出緩衝液でホモジナイズした。１３０００ｇの遠心分離後、サンプルをＳＤＳサンプル緩衝液に１０倍に希釈した。１０μｌのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いてウェスタンブロッティングを行った。ＰＡ８３バンドを、示されるように、抗ＰＡ抗体（抗Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原抗体、ＢＡＰ０１０１、カタログ番号ａｂ１９８８、Ａｂｅａｍ）または抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ, ＢＳＡ−ｆｒｅｅ, カタログ番号３４６６０）ＱＩＡＧＥＮ）を使用して調べた。ＰＡ８３を単独（−）またはＰＮＧａｓｅ  Ｆ（＋）またはＥｎｄｏ  Ｈ（＋）と一緒に発現した。
【図６】図６は、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における細菌ＥｎｄｏとのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＰｆｓ４８／４５タンパク質の同時発現のウェスタンブロット分析を示す。Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を、脱グリコシル化ＰＡ８３の産生のために、示されるように、ｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  ＨまたはｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  Ｈ／    ｐＧＲ−Ｍ−ＰＡ８３構築物と浸潤した。葉サンプルを７ｄｐｉで採取し、３つの体積の抽出緩衝液でホモジナイズした。１３０００ｇで遠心分離後、サンプルをＳＤＳサンプル緩衝液で１０倍に希釈した。１０μｌのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、続いてウェスタンブロッティングした。Ｐｆｓ４８／４５およびＥｎｄｏ  Ｈバンドを抗ＦＬＡＧポリクロナール抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２３６８）抗体を使用して調べた。
【図７】図７は、ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製された、脱グルコシル化形態のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ，Ｂ）およびＷＢ分析（Ｃ）を示す。図７Ａは、それぞれＥｎｄｏ  ＨおよびＰＮＧａｓｅ  Ｆの同時発現によって産生された脱グリコシル化ＰＡ８３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図７Ｂは、４℃、４８時間インキュベートしたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色を示す。図７Ａ〜Ｃは、示したように、３７℃で１時間および４℃で４８時間インキュベートした脱グリコシル化ＰＡ８３タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。
【実施例】
【０００８】
例１−材料および方法
Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＥｎｄｏ  Ｈのクローニングおよび発現。Ｅｎｄｏ  Ｈ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２６７３８．１）を、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成されるＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｐｌａｎｔｓａｎｄでの発現で最適化した。Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｐｌａｎｔｓにおいてＥｎｄｏ  Ｈを一時的に発現するために、シグナルペプチド（アミノ酸１〜４２）をＥｎｄｏ  Ｈ配列から除去し、Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ  ＰＲ−１ａシグナルペプチド（ＭＧＦＶＬＦＳＱＬＰＳＦＬＬＶＳＴＬＬＬＦＬＶＩＳＨＳＣＲＡ）をＮ末端に加えた。また、ＫＤＥＬ配列（ＥＲ保持シグナル）およびＦＬＡＧエピトープ（アフィニティー精製タグ）をＣ末端に加えた。得られた配列を修飾ｐＧｒｅｅｎ  ＩＩ（ｐＧＲ−Ｍ）またはｐＢ１２１（Ｃｈｅｎら、２００３年）二次元発現ベクターに挿入して、それぞれｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  Ｈ  ＦおよびｐＢＩ−Ｅｎｄｏ  Ｈを得た。
【０００９】
Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおけるＰＮＧａｓｅ  Ｆ、ＰＡ８３およびＰｆｓ４８／４５のクローニングおよび発現。ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）およびＢ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ＰＡ（アミノ酸３０〜７６４、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ２２６３７、Ｍａｍｅｄｏｙら、２０１２年）をＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において発現のために最適化し、Ｇｅｎｅ２０ｌｉｇｏ（Ｒｏｕｉｌｌａｒｄら、２００４年；Ｍａｍｅｄｏｖら、２００７年）コンピュータプログラムを使用して９４２ｂｐＰＮＧａｓｅ  Ｆ遺伝子および２２０５ｂｐ  ＰＡ遺伝子についてオリゴヌクレオチドから合成した。Ｐｆｓ４８／４５の配列（アミノ酸２８〜４０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３６６２５１）をＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において発現のために最適化し、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって合成した。ＰＲ−１ａシグナルペプチド（ＭＧＦＶＬＦＳＱＬＰＳＦＬＬ  ＶＳＴＬＬＬＦＬ  ＶＩＳＨＳＣＲＡ）を全ての遺伝子のＮ末端に加えた。また、ＫＤＥＬ配列（ＥＲ保持シグナル）およびＦＬＡＧエピトープ（Ｅｎｄｏ  Ｈａｎｄ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、親和性精製タグについて）またはＨｉｓタグ（ＰＡ８３について）をＣ末端に加えた。得られた配列を二次元発現ベクターｓｐＧＲ−ＭまたはｐＢＩ１２１に挿入した（Ｃｈｅｎら、２００３年）。ｐＧｒｅｅｎ  ＩＩ、ｐＳｏｕｐプラスミドをＪｈｏｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）から入手した。次にｐＳｏｕｐおよびｐ１９とともに全てのプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１またはＧＶ３１０１に導入した。得られた細菌株をＢＢＬ培地（１０ｇ／Ｌの大豆加水分解物、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、および５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン）中で一晩、２８℃で増殖させた。
【００１０】
細菌を、土壌中で増殖した６週齢のＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物への手動浸潤によって導入した。浸潤の４、５、６および７日後、葉組織を採取し、乳鉢および乳棒を使用してホモジナイズした。ＡＧＬ１またはＧＶ３１０１Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株およびＰ１９プラスミドは、ＳｏｐｈｉｅｎＫａｍｏｕｎ教授（Ｔｈｅ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ, Ｎｏｒｗｉｃｈ, ＵＫ）によって親切に提供された。野生型Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａは、Ａｋｄｅｎｉｚ大学の温室で土壌に生育させた。
【００１１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析。植物産生ＰＡ８３サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、クーマシー（Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｒｏｃｋｆｏｒｄ, ＩＬ）で染色した１０％アクリルアミドゲルで行った。電気泳動およびタンパク質のフッ化ポリビニリデン膜への移送後にウェスタンブロット分析を行った。移送後、ウェスタンブロット膜をＩ−Ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ）でブロックし、組換えタンパク質は、抗４ｘＨｉｓ（Ｑｉａｇｅｎ, Ｖａｌｅｎｃｉａ, ＣＡ）ｍＡｂまたは抗Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原抗体［ＢＡＰ０１０１］（ａｂ１９８８）で検出した。次に、膜を、過剰の一次抗体を除去するために０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む１×ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（ａｂ９８７９０）または抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（ａｂ９７０５１）で標識した。シグナル発生を、化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ, Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ, Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ, ＮＹ）を用いて達成し；膜を５ｍｌのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＳｕｂｓｔｒａｔｅで５分間インキュベートし、プラスチックで包み、その後、異なる時間、ＫｏｄａｋＸ線フィルムに支持した。フィルムを暗室で、それぞれ、Ｋｏｄａｋ（登録商標）現像液および急速定着液を用いて、現像し、固定した。
【００１２】
例２−Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける細菌Ｅｎｄｏ  Ｈ遺伝子のクローニングおよび発現
３１３個のアミノ酸（シグナル配列を持たない触媒的に活性なタンパク質の完全長１〜４２アミノ酸）を包含する細菌Ｅｎｄｏ  Ｈ遺伝子配列をＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物で発現のために最適化され（図２）、ｐＧＲ−Ｍベクターにクローニングし、実験手順に記載されるようにＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物で発現させた。また、Ｅｎｄｏ  Ｈ対ＰＮＧａｓｅ  Ｆによるインビボ脱グリコシル化を比較するめに、３１４個のアミノ酸を包含する細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆ遺伝子配列をＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物で発現のために最適化し、先に記載したように発現させた（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）。Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおいてＥｎｄｏ  Ｈａｎｄ  ＰＮＧａｓｅ  Ｆの発現を、抗ＦＬＡＧモノクロナール抗体（ｍＡｂ）を使用してウェスタンブロット分析によって確認した（図３）。図３に示されるように、ＰＮＰＮＧａｓｅ  Ｆは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３５ｋＤで移動し（続いてウェスタンブロット）、これは、Ｅｎｄｏ  Ｈは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆタンパク質よりも早く約２５ｋＤａで移動する。Ｅｎｄｏ  ＨおよびＰＮＧａｓｅ  Ｆを発現するＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、目に見える症状の発症または標的の同時発現が最も高いレベルに到達したときに増殖の変化なしに、浸潤後７、８および９日（ｄｐｉ）に健康状態を維持したことに留意すべきである（図４）。
【００１３】
例３−Ｅｎｄｏ  Ｈの脱グリコシル化能力；Ｅｎｄｏ  Ｈ同時発現によるＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物における組換えＢ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓ Ｐ Ａのインビボ脱グリコシル化
ＰＡ８３を装飾するＮ結合オリゴ糖のインビボ切断を評価するために、Ｅｎｄｏ  Ｈａｎｄ  ＰＡ８３を、共耕地浸潤（ｃｏ−ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を介してＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において一時的に同時発現させた。参考として、細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆも、共耕地浸潤を介してＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において一時的に同時発現させた。Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓのＰＡは、糖タンパク質ではないが、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において発現される場合にグリコシル化される。５ｄｐｉで行ったウェスタンブロット分析は、Ｅｎｄｏ  Ｈで同時発現したＰＡ８３の移動度の急速な上昇を立証し（図５）、タンパク質脱グリコシル化を示す。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって示されるように、Ｅｎｄｏ  Ｈとの同時発現は、細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆによってインビボ脱グリコシル化分子とサイズが類似しているＰＡ８３の蓄積をもたらし（Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年）、ＰＡ８３は酵素的に脱グリコシル化されたことを示唆する（図５）。
【００１４】
例４−Ｅｎｄｏ  Ｈの脱グリコシル化能力；Ｅｎｄｏ  Ｈを同時発現することによるＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるＰｆｓ４８／４５のインビボ脱グリコシル化
Ｐｆｓ４８／４５は、透過遮断（ＴＢ）ｖａｃｃｍｅ開発の主要候補の１つである。Ｐｆｓ４８／４５を装飾するＮ結合型オリゴ糖のインビボ切断を評価するために、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの細菌Ｅｎｄｏ  ＨおよびＰｆｓ４８／４５タンパク質は、ｐＧＲ−Ｍ−Ｐｆｓ４８／４５およびｐＧＲ−Ｍ−Ｅｎｄｏ  Ｈ構築物との共耕地浸潤を介してＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において一時的に同時発現された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって示されるように、Ｅｎｄｏ  Ｈとの同時発現は、約６０ｋＤａの分子量を有するＰｆｓ４８／４５の蓄積をもたらし、これは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによってインビトロ脱グリコシド化分子のサイズに類似し（図４、Ｍａｍｅｄｏｖら、２０１２年参照）、Ｐｆｓ４８／４５は、酵素的にグルコシド化されていたことを示す（図５）。Ｅｎｄｏ  Ｈは、ＰＡ８３およびＰｆｓ４８／４５タンパク質から成功裏にＮ結合型グリカンを切断し、植物産生Ｅｎｄｏ  Ｈは、インビボで酵素的に活性であることを証明し、Ｅｎｄｏ  Ｈ同時発現戦略は、Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａベースの一過性発現系において非グルコシル化形態の治療タンパク質を産生するために使用されることができることを示唆する。
【００１５】
例５−ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂および脱グリコシル化ＰＡタンパク質の予備安定性分析を使用する脱グリコシル化ＰＡ８３タンパク質の精製
Ｅｎｄｏ  ＨおよびＰＮＧａｓｅ  Ｆは、同時発現し、ＰＡ８３の脱グリコシル化形態は、ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号８８２２）を使用して精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって示されるように（図５Ａ）、精製されたタンパク質は、高度に均質である。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび（図５Ａ）およびウェスタンブトット分析によって示されるように、Ｅｎｄｏ  Ｈとの同時発現は、細菌ＰＮＧａｓｅ  Ｆによってインビボ脱グリコシル化分子のサイズに類似するＰＡ８３の蓄積をもたらした。タンパク質の特性についてＥｎｄｏ  ＨおよびＰＮＧａｓｅ  Ｆによって脱グリコシル化の影響を評価するために、ＰＡ８３タンパク質の脱グリコシル化形態を、３７℃および４℃の処理形態で、ＰＡ８３の異なる形態の予備安定性試験を行ったところ、インビボグリコシル化ＰＡ８３のＥｎｄｏ  Ｈは、特に上昇した（３７℃）温度で、ＰＮＧａｓｅ  Ｆグリコシル化形態と比較して、わずかにより安定しているようであることがわかった。
【００１６】
例６−インビボ脱グリコシル化ＰＡ８３変異体におけるグリコシル化されたＥｎｄｏ  ＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆに対する抗ＰＡモノクロナール抗体の結合
インビボグリコシル化ＰＡ８３変異体におけるグリコシル化されたＥｎｄｏ  ＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆに対する抗ＰＡモノクロナール抗体の結合は、ＩＭＡＣ精製ＰＡ８３抗原およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原抗体（ＭＡ１−２１６７５）を使用して実施した。抗ＰＡ抗体（抗Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ防御抗原抗体、ＢＡＰ０１０１、カタログ番号ａｂ１９８８、Ａｂｃａｍ）は、インビボ脱グリコシル化ＰＡ８３タンパク質において、植物産生グリコシル化およびＥｎｄｏ  ＨまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆに同様の結合を示した（データ示さず）。
【００１７】
参考文献
IN VIVO DE-GLYCOSYLATION OF RECOMBINANT PROTEINS BY CO-EXPRESSION
WITH PNGASE F.12, 2012, W0/2012/170678.
Mamedov T, Ghosh A, Jones RM, Mett V, Farrance CE, Musiychuk K, et al. Production of non- glycosylated recombinant proteins in Nicotianabenthamiana plants by co-expressing bacterial PNGase F. Plant biotechnology journal.2012; 10: 773-782.doi: 10.1111/j.1467- 7652.2012.00694.x PMID: 22520228
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【図１Ａ】
2019504638.tif 000003
【図１Ｂ】
2019504638.tif 000004
【図２】
2019504638.tif 000005
【図３】
2019504638.tif 000006
【図４】
2019504638.tif 000007
【図５】
2019504638.tif 000008
【図６】
2019504638.tif 000009
【図７】
2019504638.tif 000010
【配列表】
2019504638000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年7月12日(2018.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、植物細胞において脱グリコシル化ポリペプチドを生成するための方法：
植物細胞の細胞質ゾルを、第１の発現制御配列に操作可能に連結された第１の発現制御配列および第１の発現可能な核酸配列を含む第１の核酸と接触させることであって、第１の発現可能な核酸は、配列番号１の核酸配列を有し；
植物細胞の細胞質ゾルを、第２の発現制御配列に操作可能に連結された第２の発現制御配列および第２の発現可能な核酸配列と接触させることであって、第２の発現可能な核酸配列は、免疫活性ポリペプチドをコードし；
脱グリコシル化ポリペプチドを生成するために植物細胞において第１の核酸および第２の核酸を同時発現させること、
ここで、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの細胞である。
【請求項２】
ポリペプチドがヒトにおいて免疫活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の核酸配列がその天然種で生成されたときにグリコシル化されていないペプチド配列をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドが、Ｐｆｓ４８／４５、ＰＡ８３、およびヒト第ＸＩＩＩ因子から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチドがＰＡ８３であり、該ポリペプチドはグリコシル化ＰＡ８３ペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、ＰＡ８３であり、該ポリペプチドはＰＮＧａｓｅ脱グリコシル化ＰＡ８３ペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
植物細胞の細胞質ゾルを接触させるステップがアグロバクテリウムを使用する植物細胞を形質転換するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
以下を含む方法によって生成された免疫活性脱グリコシル化ポリペプチドを含む、ワクチン：
植物細胞の細胞質ゾルを、第１の発現制御配列および第１の発現制御配列に操作可能に連結された第１の発現可能な核酸配列を含む第１の核酸と接触させることであって、第１の発現可能な核酸は、配列番号１の核酸配列を有し；
植物細胞の細胞質ゾルを、第２の発現制御配列に操作可能に連結された第２の発現制御配列および第２の発現可能な核酸配列を含む第２の核酸と接触させること、第２の発現可能な核酸配列は、免疫活性ポリペプチドをコードし；
脱グリコシル化免疫活性ポリペプチドを生成するために植物細胞における第１の核酸および第２の核酸を同時発現させること；
ここで、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの細胞である。
【請求項９】
ポリペプチドが、ＰＡ８３であり、該ポリペプチドはグリコシル化ＰＡ８３ペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
ポリペプチドが、ＰＡ８３であり、該ポリペプチドはＰＮＧａｓｅ脱グリコシル化ＰＡ８３ペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１１】
ポリペプチドが、Ｐｆｓ４８／４５であり、該ポリペプチドはグリコシル化Ｐｆｓ４８／４５ペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１２】
ポリペプチドが、Ｐｆｓ４８／４５であり、該ポリペプチドはＰＮＧａｓｅ脱グリコシル化Ｐｆｓ４８／４５ペプチドと比較して増加した安定性を有する、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１３】
以下を含む方法によって生成された脱グリコシル化ポリペプチド：
植物細胞の細胞質ゾルを、第１の発現制御配列に操作可能に連結された第１の発現制御配列および第１の発現可能な核酸配列を含む第１の核酸と接触させることであって、第１の発現可能な核酸は、配列番号１の核酸配列を有し；
植物細胞の細胞質ゾルを、第２の発現制御配列に操作可能に連結された第２の発現制御配列および第２の発現可能な核酸配列を含む第２の核酸と接触させることであって、第２の発現可能な核酸配列は、免疫活性ポリペプチドをコードし；
脱グリコシル化免疫活性ポリペプチドを生成するために植物細胞における第１の核酸および第２の核酸を同時発現させること；
ここで、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの細胞である。
【請求項１４】
抗原性である、請求項１３に記載の脱グリコシル化ポリペプチド。
【請求項１５】
Ｐｆｓ４８／４５、ＰＡ８３、およびヒト第ＸＩＩＩ因子から選択される、請求項１３に記載の脱グリコシル化ポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019504638.tif 000011
【図２】
2019504638.tif 000012
【図３】
2019504638.tif 000013
【図４】
2019504638.tif 000014
【図５】
2019504638.tif 000015
【図６】
2019504638.tif 000016
【図７】
2019504638.tif 000017
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2019504638000001.app
【国際調査報告】
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2019504638.tif 000019