(57)【要約】本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することを目的とする。本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８０〜７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８０〜７．５０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項２】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項３】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項４】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．４５〜６．８５である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項５】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項４記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項６】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４又は５記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項７】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０の分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．００〜６．７５である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ０の分析方法。
【請求項８】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項７記載のヘモグロビンＡ０の分析方法。
【請求項９】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項７又は８記載のヘモグロビンＡ０の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるヘモグロビン類の分析は現在広く行われており、糖尿病診断ではグリコヘモグロビンの一種であるヘモグロビンＡ１ｃの定量や異常ヘモグロビンの分析等に用いられている。例えば、特許文献１には、血液検体を溶血希釈して調製した試料中のヘモグロビン類を、陽イオン交換法により、ヘモグロビン成分毎に異なるプラス荷電状態の違いを利用して分離する液体クロマトグラフィーを用いた方法が開示されている。近年の糖尿病患者の増加に伴い、ヘモグロビンＡ１ｃの測定件数も増加傾向にあり、ＨＰＬＣでの測定においても高精度測定と測定時間の短縮が求められている。【０００３】
生体内において、ヘモグロビン類には、酸素が結合したオキシヘモグロビン、二酸化炭素が結合したデオキシヘモグロビン、ヘムに含まれている鉄が酸化されて三価の鉄イオンとなったメトヘモグロビンが存在する。また、アジ化物やシアン化物が共存している場合、アジ化物やシアン化物がメトヘモグロビンの三価の鉄イオンに結合し、アジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビンとなって安定化することが知られている。しかしながら、陽イオン交換液体クロマトグラフィーを用いるＨＰＬＣでは、オキシヘモグロビンの溶出時間と、これらのアジドメトヘモグロビンやシアンメトヘモグロビンの溶出時間とに違いが生じることがある。これらのヘモグロビン類の電荷の違いはわずかであるため、ピークが完全分離できずにブロード化したり二峰性を示したりする。【０００４】
ＨＰＬＣを用いたヘモグロビン類の分析は、糖尿病診断の他に主に貧血を引き起こす異常ヘモグロビン症やサラセミアといった診断にも使用されている。なかでも、ヘモグロビンＳは最も多くみられる異常ヘモグロビンであり、重篤な貧血症状を引き起こす鎌状赤血球症の原因物質であるため、分離、検知の需要は大きい。また、糖尿病のマーカーであるヘモグロビンＡ１ｃを測定する際には、ヘモグロビンＳをはじめとした異常ヘモグロビンを分離することが望ましく、ピークがブロード化したり二峰性となっていたりしては正常ヘモグロビンとの分離が困難となるとともに、測定値への悪影響が懸念されるため、シャープなピークとして分離させることが好ましい。一方、サラセミアの診断ではヘモグロビンＡ２を測定する必要があるが、微量成分であるとともに、多量に存在しているヘモグロビンＡ０と隣接して溶出されることが多いため、ヘモグロビンＡ０、Ａ２ともにシャープなピークとして分離させることが好ましい。しかしながら、陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて、陽イオン交換カラムとの保持力が比較的強い成分は、ピークがブロード化したり二峰性となったりしやすいという問題がある。
また、新鮮血よりも劣化血の方がブロードや二峰性のピークを生じやすい傾向がある。これは劣化により生じるメトヘモグロビンが増加することが原因である。そのため、再検査等で保存検体の分析を行う場合に測定値への影響が懸念されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−１１１５３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明１は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．８０〜７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。
本発明２は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．４５〜６．８５である溶離液を用いるヘモグロビンＡ２の分析方法である。
本発明３は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ０の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．００〜６．７５である溶離液を用いるヘモグロビンＡ０の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。【０００８】
従来、保持力の強いヘモグロビン類を分離する場合、通常、ｐＨ６未満の溶離液が使用されており、本発明者らは、このｐＨ範囲がピークの形状に大きく影響を及ぼしていることを見出した。
そこで本発明者らは、特定の濃度でアジ化物又はシアン化物を配合することによってメトヘモグロビンを安定化させた溶離液のｐＨをヘモグロビンの等電点付近の特定の範囲に調整することにより、保持力の強いヘモグロビン類であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
なお、本明細書において「保持力の強いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の強いヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳを意味する。ヘモグロビンＡ０、ヘモグロビンＡ２、ヘモグロビンＳの等電点は６．９５〜７．４５の範囲内であることが知られている。また、本明細書において「保持力の弱いヘモグロビン類」とは、陽イオン交換カラムに対する保持力の弱いヘモグロビン類を意味し、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられる。なお、保持力はヘモグロビンの立体構造によっても変化するため、イオン交換クロマトグラフィーにおいて、等電点と溶出順は必ずしも一致するとは限らない。【０００９】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法では、アジ化物又はシアン化物を含有する溶離液を用いる。
上記溶離液が上記アジ化物又は上記シアン化物を含有することにより、メトヘモグロビンを安定化させることができる。なお、一般的にヘモグロビン類の定量は４１５ｎｍ付近の吸光度により測定しているが、オキシヘモグロビンと、アジドメトヘモグロビン及びシアンメトヘモグロビンとの４１５ｎｍ付近の吸光度スペクトルにはほとんど差はなく、定量性に支障はないと考えられる。一方、溶離液中にアジ化物又はシアン化物が含まれていない場合、メトヘモグロビンとして存在し、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーでは溶出時間が大幅に遅くなることが知られている。また、外部環境による異なるが、吸光度の極大値が４０５ｎｍ付近となるため、４１５ｎｍの波長では定量性に悪影響を及ぼすことがある。【００１０】
上記アジ化物としては、例えば、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４−ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４−アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。【００１１】
上記シアン化物としては、例えば、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。【００１２】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液中の上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度の下限は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、上限は５０ｍｍｏｌ／Ｌである。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度が０．１ｍｍｏｌ／Ｌであると、メトヘモグロビンを安定化する効果が充分に得られない。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度が５０ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、過度なメト化の進行やヘモグロビン類の分解が発生する。上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度の好ましい下限は０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい下限は１ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１０ｍｍｏｌ／Ｌである。【００１３】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＳであっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。【００１４】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．８０、上限は７．５０である。上記溶離液のｐＨが６．８０未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＳを測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが７．５０を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明１のヘモグロビンＳの分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．９５、好ましい上限は７．４５、より好ましい下限は７．００、より好ましい上限は７．４０である。【００１５】
また、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＡ２であっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。【００１６】
本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．４５、上限は６．８５である。上記溶離液のｐＨが６．４５未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＡ２を測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが６．８５を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．５０、好ましい上限は６．８０である。【００１７】
更に、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法を用いれば、保持力の強いヘモグロビンＡ０であっても、対称性の高いシャープなピークで分離することができる。【００１８】
本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液のｐＨの下限は６．００、上限は６．７５である。上記溶離液のｐＨが６．００未満であると、ＨＰＬＣを用いてヘモグロビンＡ０を測定した際のピークのリーディングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。上記溶離液のｐＨが６．７５を超えると、陽イオン交換カラムとの保持が弱まり溶出時間が極端に早くなるほか、ピークのテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰性を示したりする。本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液のｐＨの好ましい下限は６．２０、好ましい上限は６．７０、より好ましい下限は６．４０、より好ましい上限は６．６５である。【００１９】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液としては、上記アジ化物又は上記シアン化物の濃度、及び、ｐＨが上述した範囲内であれば特に限定されず、例えば、有機酸及びその塩類、アミノ酸類、無機酸及びその塩類、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有する公知の緩衝液を用いることができる。
上記有機酸としては、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
上記無機酸としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、必要に応じて、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。【００２０】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液の緩衝剤濃度は特に限定されないが、好ましい下限は５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記緩衝剤濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、緩衝作用が充分に得られないことがある。上記緩衝剤濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、緩衝剤の析出が起こりＨＰＬＣの流路を詰まらせる原因となったり、溶離液の切り替え効率が低下して平衡化に時間がかかる原因となったりする。上記緩衝剤濃度のより好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２１】
上記溶離液は、ヘモグロビン類のピーク溶出を最適化することを目的として、過塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム等の無機塩類を含有してもよい。【００２２】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、上記溶離液中における塩の濃度は特に限定されないが、好ましい上限は５００ｍｍｏｌ／Ｌである。上記塩の濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌを超えると、塩が析出してシステムに悪影響を及ぼすことがある。上記塩の濃度のより好ましい上限は２００ｍｍｏｌ／Ｌである。【００２３】
上記溶離液は、ｐＨ調整剤として、公知の酸、塩基を含有してもよい。上記酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が挙げられ、上記塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。【００２４】
上記溶離液は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒を含有していてもよい。上記水溶性有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。【００２５】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法において、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０は上述した溶離液で分離するが、保持力の弱いヘモグロビン類は、上述した溶離液に先立って、上述した溶離液よりもｐＨの低い他の溶離液を用いて溶出してもよい。その場合、各溶離液は同一の成分を含む緩衝液を用いるものであることが好ましいが、溶離液を切り替える際の検出器出力のベースライン変動が測定値に悪影響を与えなければ、必ずしも同一の成分を含む緩衝液を用いるものに限定されない。
更に、ベースライン変動をより小さくするために、緩衝剤濃度も同一であるものを用いることがより好ましい。【００２６】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法では、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーを用いる。上記陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーとしては、公知の方法を用いることができる。例えば、ポンプを用いて溶離液を送液し、デガッサーを通した後に陽イオン交換カラムに送り、陽イオン交換カラムに保持されたヘモグロビン類を分離させて、陽イオン交換カラムから溶出してきた移動相を検出する方法を用いることができる。【００２７】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法で用いる陽イオン交換カラムは、カラム本体に固定相が充填されたものである。固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。
上記充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。
上記無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。
上記有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。【００２８】
上記固定相としては、陽イオン交換基を有する固定相を用いることが好ましい。
上記陽イオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。【００２９】
本発明１のヘモグロビンＳの分析方法、本発明２のヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、本発明３のヘモグロビンＡ０の分析方法における測定条件は、使用する測定試料、陽イオン交換カラム等の種類によって適宜選択できるが、上記溶離液の流速の好ましい下限は０．０５ｍＬ／分、好ましい上限は５ｍＬ／分、より好ましい下限は０．２ｍＬ／分、より好ましい上限は３ｍＬ／分である。ヘモグロビン類の検出波長は４１５ｎｍが好ましいが、特にこれのみに限定されるわけではない。測定試料は、通常、界面活性剤等の溶血活性を有する物質を含む溶液により溶血された溶血液を希釈したものを用いる。試料注入量は、血液検体の希釈倍率により異なるが、好ましくは０．１〜１００μＬ程度である。
【発明の効果】
【００３０】
本発明によれば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ヘモグロビンＳの溶出時間が５０秒となる溶離液のｐＨと過塩素酸ナトリウムの濃度との関係を示した図である。
【図２】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液２を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図３】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液３を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図４】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液４を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図５】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液５を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図６】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液６を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図７】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液７を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図８】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液８を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図９】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液９を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図１０】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１０を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図１１】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１１を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図１２】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１２を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図１３】０．５分を超え１．０分までの溶出に溶離液１３を用いた（ａ）測定検体Ａのクロマトグラム、（ｂ）測定検体Ｂのクロマトグラム、及び、（ｃ）測定検体Ｃのクロマトグラムである。
【図１４】測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２のシンメトリー係数との関係を示した図である。
【図１５】溶離液２〜１３のｐＨと、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差との関係を示した図である。
【図１６】測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２の分離度との関係を示した図である。
【図１７】測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨと、ピーク１とピーク２との谷落ち高さとの関係を示した図である。
【図１８】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１６を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図１９】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１７を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図２０】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１８を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図２１】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液１９を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図２２】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液２０を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図２３】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液２１を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図２４】０．７分を超え１．１分までの溶出に溶離液２２を用いた測定検体Ｄのクロマトグラムである。
【図２５】測定検体Ｄにおける溶離液１６〜２２のｐＨとピーク４のシンメトリー係数との関係を示した図である。
【図２６】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２５を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図２７】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２６を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図２８】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２７を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図２９】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２８を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図３０】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液２９を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図３１】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液３０を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図３２】０．６分を超え１．０分までの溶出に溶離液３１を用いた測定検体Ｅのクロマトグラムである。
【図３３】測定検体Ｅにおける溶離液２５〜３１のｐＨとピーク１のシンメトリー係数との関係を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
【００３３】
（実施例１）
測定検体には以下の３種を用いた。
ヘモグロビンＳを含む血液を希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で１００倍に希釈したものを測定検体Ａとした。
ＡＦＳＣコントロール（ヘレナ研究所社製）を（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で５０倍に希釈したものを測定検体Ｂとした。
測定検体Ａと測定検体Ｂとを１：１で混合したものを測定検体Ｃとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．５分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．５分を超え１．０分までは表１に示した溶離液２にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。溶離液２では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。
検出波長は４１５ｎｍで行った。
【００３４】
（実施例２〜５、及び、比較例１〜７）
０．５分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表１に示した溶離液３〜１３を用いたこと以外は実施例１と同様にして測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃを測定した。溶離液３では緩衝剤濃度を調整することで測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が約５０秒となるよう設定した。また、溶離液４〜１３は、測定検体Ａを測定した時にヘモグロビンＳの溶出時間が５０秒となるようにｐＨと塩濃度を調整した（図１）。
【００３５】
＜評価＞
実施例１〜５、及び、比較例１〜７において、溶離液２〜１３を送液している０．５分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ａ、Ｂ、及び、Ｃのクロマトグラムを図２〜１３に示す。図２〜１３において、ピーク１はヘモグロビンＡ０、ピーク２はオキシ状態のヘモグロビンＳ、ピーク３はアジドメトヘモグロビンＳを示す。なお、一般的にヘモグロビンＳを含む検体は測定検体Ａと同様のクロマトグラムを示し、オキシ状態のヘモグロビンがリッチな状態である。測定検体Ｂはほとんどのヘモグロビンがメト化しているものであり、メトヘモグロビンがリッチな状態である。これは通常検体を極端に劣化させた場合と同様の状態である。測定検体Ｃはオキシ状態のヘモグロビンとメトヘモグロビンをそれぞれ同程度の比率で存在した状態であり、ピークの二峰性が生じやすい条件を設定するために用いた。
図２〜１３より、溶離液２〜６を用いた場合、測定検体Ａのピーク２がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、測定検体Ｃにおいては溶離液７〜１１を用いた場合にピーク２、３からなる二峰性ピークが確認された。
【００３６】
（ピーク形状）
測定検体Ａにおけるピーク２のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。通常、シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いるが、本例ではピーク２の前にピーク１が隣接しているため、５％位置のピーク幅が算出できなかったことから、半値幅を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２のシンメトリー係数との関係を図１４に示した。図１４より、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の７に近づくほどシンメトリー係数が１に近づき、ピークの対称性が高まることが分かる。
更に、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差を算出した。測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３の溶出時間差はオキシ状態のヘモグロビンＳとアジドメトヘモグロビンの溶出時間差を示しており、この差が小さいほど溶出時間が近づき単一ピークとなるため、シンメトリー係数と合わせてピーク形状の判断指標として用いた。結果を表２に示した。また、測定検体Ａと測定検体Ｂの測定結果から算出した、溶離液２〜１３のｐＨと、測定検体Ａのピーク２と測定検体Ｂのピーク３との溶出時間差との関係を図１５に示した。図１５より、ｐＨ７付近でピーク２とピーク３の溶出時間が最も近づくことが分かる。
【００３７】
（隣接ピーク間の分離程度）
測定検体Ａにおけるピーク２の分離度を、ＪＰ（日本薬局方）法を用いて算出した。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク２の分離度との関係を図１６に示した。図１６より、ヘモグロビンの等電点付近のｐＨが７に近づくほど分離度が向上しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
更に、測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さを算出した。測定検体Ａにおけるピーク１とピーク２との谷落ち高さは隣接ピーク間の分離程度を示す指標として分離度と合わせて用いた。なお、ピーク１とピーク２との谷落ち高さとはピーク１とピーク２の間で最も高さが低い位置を示す。結果を表２に示した。また、測定検体Ａにおける溶離液２〜１３のｐＨとピーク１とピーク２との谷落ち高さとの関係を図１７に示した。図１７でもｐＨが７に近づくことで谷落ち高さが低下しており、ピーク１とピーク２の分離が向上していることが確認された。
【００３８】
【表１】
2011096420.tif 000002
【００３９】
【表２】
2011096420.tif 000003
【００４０】
（比較例８）
ヘモグロビンＡ２凍結乾燥品（シグマ社製、「Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ２，  Ｆｅｒｒｏｕｓ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｗｄｅｒ」）５ｍｇに精製水１００μＬを加えて溶解させた後、５ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｄとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．７分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．７分を超え１．１分までは表３に示した溶離液１６にて溶出し、１．１分を超え１．２分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．２分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
【００４１】
（実施例６、７、及び、比較例９〜１２）
０．７分を超え１．１分までの溶出に用いる溶離液として表３に示した溶離液１７〜２２を用いたこと以外は比較例８と同様にして測定検体Ｄを測定した。
【００４２】
＜評価＞
実施例６、７、及び、比較例８〜１２において、溶離液１６〜２２を送液している０．７分を超え１．１分までの領域を抜粋した測定検体Ｄのクロマトグラムを図１８〜２４に示す。図１８〜２４において、ピーク４はヘモグロビンＡ２を示す。
図１８〜２４より、溶離液１８及び溶離液１９を用いた場合、測定検体Ｄのピーク４がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液１６、１７、２０〜２２を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
【００４３】
（ピーク形状）
測定検体Ｄにおけるピーク４のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｄにおける溶離液１６〜２２のｐＨとピーク４のシンメトリー係数との関係を図２５に示した。図２５より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．２５〜６．７０で１に近づくことが分かる。
【００４４】
【表３】
2011096420.tif 000004
【００４５】
（比較例１３）
グリコヘモグロビンコントロール  レベルＩ（シスメックス社製）に精製水２００μＬを加えて溶解させた後、１０ｍＬの希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．００））で希釈したものを測定検体Ｅとした。
陽イオン交換カラムとして陽イオン交換樹脂充填品を用い、ＨＰＬＣ装置には、検出器としてＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）、送液ポンプとしてＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）、デガッサーとしてＤＧＵ−２０Ａ５（島津製作所社製）、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）、オートサンプラーとしてＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）を用い、流速を１．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長を４１５ｎｍ、試料注入量を１０μＬとして、０〜０．６分は溶離液１（６０ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．３５））にて溶出し、０．６分を超え１．０分までは表４に示した溶離液２５にて溶出し、１．０分を超え１．１分までは溶離液１４（０．８重量％トリトンＸ−１００、３００ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌアジ化ナトリウムを含む４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．００））にて溶出し、１．１分を超え１．５分までは溶離液１にて溶出して測定を行った。
【００４６】
（実施例８〜１０、及び、比較例１４〜１６）
０．６分を超え１．０分までの溶出に用いる溶離液として表４に示した溶離液２６〜３１を用いたこと以外は比較例１３と同様にして測定検体Ｅを測定した。
【００４７】
＜評価＞
実施例８〜１０、及び、比較例１３〜１６において、溶離液２５〜３１を送液している０．６分を超え１．０分までの領域を抜粋した測定検体Ｅのクロマトグラムを図２６〜３２に示す。図２６〜３２において、ピーク１はヘモグロビンＡ０を示す。
図２６〜３２より、溶離液２８〜３０を用いた場合、測定検体Ｅのピーク１がシャープとなるクロマトグラムが得られた。また、溶離液２５〜２７、３１を用いた場合、ピークのリーディングやテーリングが大きくなったり、ピークがブロードになったり、二峰化したりすることが確認された。
【００４８】
（ピーク形状）
測定検体Ｅにおけるピーク１のシンメトリー係数を算出した。シンメトリー係数は１に近いほどピーク形状が正規分布に近いことを示しており、ピーク形状の判断指標として用いた。シンメトリー係数の算出にはピーク高さの５％位置のピーク幅を用いた。測定検体Ｅにおける溶離液２５〜３１のｐＨとピーク１のシンメトリー係数との関係を図３３に示した。図３３より、ｐＨが高いほどシンメトリー係数が低下し、ｐＨ６．６０〜７．００で１に近づくことが分かる。
【００４９】
【表４】
2011096420.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーにおいて、保持力の強いヘモグロビンＳ、ヘモグロビンＡ２、及び、ヘモグロビンＡ０であっても対称性の高いシャープなピークで分離することができるヘモグロビンＳの分析方法、ヘモグロビンＡ２の分析方法、及び、ヘモグロビンＡ０の分析方法を提供することができる。
【符号の説明】
【００５１】
１  ヘモグロビンＡ０
２  オキシ状態のヘモグロビンＳ
３  アジドメトヘモグロビンＳ
４  ヘモグロビンＡ２
【図１】
2011096420.tif 000006
【図２】
2011096420.tif 000007
【図３】
2011096420.tif 000008
【図４】
2011096420.tif 000009
【図５】
2011096420.tif 000010
【図６】
2011096420.tif 000011
【図７】
2011096420.tif 000012
【図８】
2011096420.tif 000013
【図９】
2011096420.tif 000014
【図１０】
2011096420.tif 000015
【図１１】
2011096420.tif 000016
【図１２】
2011096420.tif 000017
【図１３】
2011096420.tif 000018
【図１４】
2011096420.tif 000019
【図１５】
2011096420.tif 000020
【図１６】
2011096420.tif 000021
【図１７】
2011096420.tif 000022
【図１８】
2011096420.tif 000023
【図１９】
2011096420.tif 000024
【図２０】
2011096420.tif 000025
【図２１】
2011096420.tif 000026
【図２２】
2011096420.tif 000027
【図２３】
2011096420.tif 000028
【図２４】
2011096420.tif 000029
【図２５】
2011096420.tif 000030
【図２６】
2011096420.tif 000031
【図２７】
2011096420.tif 000032
【図２８】
2011096420.tif 000033
【図２９】
2011096420.tif 000034
【図３０】
2011096420.tif 000035
【図３１】
2011096420.tif 000036
【図３２】
2011096420.tif 000037
【図３３】
2011096420.tif 000038
【手続補正書】
【提出日】平成23年7月4日(2011.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８０〜７．５０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項２】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項３】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項４】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．４５〜６．８５である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項５】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項４記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項６】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４又は５記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明１は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．８０〜７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。
本発明２は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．４５〜６．８５である溶離液を用いるヘモグロビンＡ２の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。
【手続補正書】
【提出日】平成24年3月28日(2012.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．８８〜７．５０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項２】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項３】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＳの分析方法。
【請求項４】
陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、
アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨが６．６０〜６．８０である溶離液を用いることを特徴とするヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項５】
溶離液の塩濃度が、５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることを特徴とする請求項４記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
【請求項６】
溶離液の緩衝剤濃度が、５〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項４又は５記載のヘモグロビンＡ２の分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明１は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＳの分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．８８〜７．５０である溶離液を用いるヘモグロビンＳの分析方法である。
本発明２は、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンＡ２の分析方法であって、アジ化物又はシアン化物を０．１〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ含有し、かつ、ｐＨがヘモグロビンの等電点付近の６．６０〜６．８０である溶離液を用いるヘモグロビンＡ２の分析方法である。
以下に本発明を詳述する。
【国際調査報告】
2011096420.tif 000039
2011096420.tif 000040
2011096420.tif 000041
2011096420.tif 000042