【手続補正書】
【提出日】令和3年11月25日(2021.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも９０％同一である変異体配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１の位置１８のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基で置換されている、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１の配列、または配列番号１と少なくとも９５％同一である変異体配列を含み、配列番号１の位置１８のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基によって置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号６、７、８、または９のアミノ酸配列を含むが、各配列の位置１８のアスパラギン酸残基が非負荷電アミノ酸残基によって置換されている、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも７０％同一である変異体配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号２の位置４２２のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基によって置換されている、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２と少なくとも９０％同一である変異体配列を含み、配列番号２の位置４２２のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基で置換されている、請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号４のアミノ酸配列または配列番号４と少なくとも７０％同一である変異体配列を含み、配列番号４の位置７１９のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基によって置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも７０％同一である変異体配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼであって、配列番号１２の位置４２２のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基で置換されている、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１２のアミノ酸配列、または配列番号１２と少なくとも９０％同一である変異体配列を含み、配列番号１２の位置４２２のアスパラギン酸残基または前記変異体配列において相当するアスパラギン酸残基が、非負荷電アミノ酸残基によって置換されている、請求項７に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記アスパラギン酸残基がアラニン残基で置換されている、請求項１から８のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
配列番号１０のアミノ酸配列を含み、配列番号１０の位置１８のアスパラギン酸残基がアラニンで置換されている、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
配列番号１１のアミノ酸配列を含み、配列番号１１の位置４２２のアスパラギン酸残基がアラニンで置換されている、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１または２各々に対して正確に同じ配列を有するが位置１８または位置４２２において、または前記変異体配列において相当する位置において、アスパラギン酸を有するＤＮＡポリメラーゼよりも少なくとも３０％高い鎖置換活性を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
２０ｍＭから２００ｍＭのＮａＣｌ、ＫＣｌまたはそれらの混合物の濃度範囲にわたりってＤＮＡポリメラーゼがその最大ポリメラーゼ活性の少なくとも４０％を示す、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼと緩衝液を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１６】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１３、１４または１５と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の核酸分子と、前記核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の１以上の発現ベクターまたは請求項１５または１６に記載の１以上の核酸分子を含む宿主細胞またはウイルス。
【請求項１９】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを製造する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ｉ）コードされたＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で、請求項１７に記載の組換え発現ベクターの１以上または請求項１５または１６に記載の核酸分子の１以上を含む宿主細胞を増殖培地で培養すること；および、任意選択で、
（ｉｉ）宿主細胞から、または増殖培地または増殖培地に由来する上清からＤＮＡポリメラーゼを単離または取得すること。
【請求項２０】
ヌクレオチド重合のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項２１】
核酸増幅反応または配列決定反応における、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼの使用。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが一定温度で使用される、請求項２０または２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記反応が等温核酸増幅反応である、請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼを用いたヌクレオチド重合の方法であって、以下を含む方法：
（ｉ）請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸分子、鋳型核酸分子の一部にアニーリング可能なオリゴヌクレオチドプライマー、および１以上のヌクレオチドを含む反応混合物を提供すること；
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型核酸分子にアニールし、前記ＤＮＡポリメラーゼが１以上のヌクレオチドを重合化することによって前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長する条件下で、前記反応混合物をインキュベートすること。
【請求項２５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸を増幅する方法であって、以下を含む方法：
（ｉ）  請求項１から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、鋳型核酸分子、鋳型核酸分子の一部にアニーリング可能なオリゴヌクレオチドプライマー、およびヌクレオチドを含む反応混合物を提供すること；
（ｉｉ）  オリゴヌクレオチドプライマーが鋳型核酸分子にアニールし、前記ＤＮＡポリメラーゼが１以上のヌクレオチドを重合化してポリヌクレオチドを生成することによって前記オリゴヌクレオチドプライマーを伸長する条件下で、前記反応混合物をインキュベートすること。
【請求項２６】
前記方法が一定温度で実施される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記一定温度が、０℃から４２℃の範囲内で選択される、請求項２２に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一定温度が、１０℃から２５℃の範囲内で選択される、請求項２７に記載の使用または請求項２７に記載の方法。