(57)【要約】  本発明は、二酸化チタンの少なくとも２０％がアナターゼおよび／またはルチルの結晶構造を有する二酸化チタンから本質的になるコーティングに関する。コーティングは窪みを含む粗さを有し、窪みの少なくとも５０％が１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有し、コーティングは０〜２０°の水接触角とされうる。コーティングは負に帯電するかまたは正に帯電することができる。前記コーティングは、哺乳動物組織細胞への接着性を改善し、さらにコーティングで被覆された基材が同様の非コーティング基材と比較される場合にはコーティングされた基材上ではコーティングされていない基材よりも少なくとも１００％多くの細胞が付着しているような付着性の改善を示す。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に二酸化チタンからなるコーティングであって、
二酸化チタンの少なくとも２０％がアナターゼおよび／またはルチル結晶構造を有し、
コーティングは、窪みを含む表面を有し、窪みの少なくとも５０％が１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有し、
コーティングは、０〜２０°の水接触角となるように処理され、及び、
処理されたコーティングは、接着能を有する哺乳動物組織細胞への付着性を示し、
付着性は、コーティングされ及び処理された基材が未コーティング及び未処理の同種の基材と比較される場合、未コーティング及び未処理の基材よりも少なくとも１００％多くの細胞がコーティグされ処理された基材上に付着したままであって、
細胞の付着性は、以下の方法で測定されるコーティング。
−  最大径が８ｍｍ、厚さ０．１〜１ｍｍである、コーティングされ及び処理された基材及び未コーティング及び未処理の基材である６枚の相似する板状のサンプルが使用され、
−  該サンプルは測定前に少なくとも２０時間水溶液中に保存され、
−  軟質組織細胞が、コーティングされ及び処理された基材サンプルと未コーティング及び未処理基材サンプル上で、５％二酸化炭素雰囲気中、３７℃で６時間培養され、
−  培養されたコーティングされ及び処理された基材サンプルおよび未コーティング及び未処理基材サンプルは、５０ｒｐｍのオービタルシェーカー中で、室温で１２分間、リン酸緩衝生理食塩水中のトリプシン溶液でトリプシン処理され、及び
−  残存している付着細胞がサンプルからカウントされ、６つのサンプルの平均が算出され、
ここで、トリプシンの溶液中のトリプシンの体積％は、平均して少なくとも３００細胞／ｃｍ２が未コーティング及び未処理の基材サンプルに付着したままであるように選択される。
【請求項２】
ゾル−ゲル法、水熱法、パルスレーザー堆積法、イオン注入法、エレクトロスプレー法、化学気相成長法、物理的気相成長法、レーザービーム加工法、又は三次元成長法からなる群から選択される方法を用いて製造されたことを特徴とする請求項１に記載のコーティング。
【請求項３】
少なくとも以下の一つのプロセスを含む水接触角を低減させる処理を製造工程に含む請求項１又は２に記載のコーティング。
−  過酸化水素または過酸化カルシウムによって、または表面にカルシウムを吸着させることで自然に吸着された炭化水素の表面を洗浄する、または、
−  炭化水素を洗浄し、及び、３６０ｎｍ以下のＵＶ光またはアルゴンイオンプラズマまたは酸素プラズマによって表面を光触媒励起する。
【請求項４】
水接触角が０〜１０°であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のコーティング。
【請求項５】
窪みの少なくとも６０％が１〜５０ｎｍの最大深さと１〜５０ｎｍの最大幅とを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のコーティング。
【請求項６】
水溶液中に保管されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコーティング。
【請求項７】
トリプシンの溶液中のトリプシンの体積％は、少なくとも平均１０００個の細胞／ｃｍ２が未コーティング且つ未処理の基材サンプルに付着したままであるように選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のコーティング。
【請求項８】
コーティングが、負に帯電または正に帯電するように処理されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のコーティング。
【請求項９】
水溶液が、脱イオン水および血清を含む水溶液から選択されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のコーティング。
【請求項１０】
デバイスの哺乳動物組織細胞接着性を改善するための請求項１〜９のいずれか一項に記載のコーティングの使用。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のコーティングを有する、皮膚に浸透される、または哺乳動物に移植される用途の医療または化粧用のデバイス。
【請求項１２】
デバイスは、整形外科用固定ピン、頭蓋顎顔面プロテーゼ固定ネジ、カテーテル、カニューレ、血管ステント、動脈瘤ステント、食道ステント、心臓弁のための環状リング、四肢用取り外し可能なプロテーゼインプラント、腹部カテーテル、尿道カテーテル、歯科インプラントアバットメント、組織レベルインプラントアバットメント部品、および、皮膚貫通ジュエリーからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
軟組織接着可能デバイスの製造方法であって、
本質的に二酸化チタンからなるコーティング層を製造する工程であって、二酸化チタンの少なくとも２０％が、アナターゼおよび／またはルチル結晶構造を有し、
コーティングは、窪みを含む表面を有し、窪みの少なくとも５０％は、１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有するようなコーティング層を製造する工程と、
負に帯電または正に帯電するようにコーティング処理をする工程、とを含むデバイスの製造方法。
【請求項１４】
ゾル−ゲル法、水熱法、パルスレーザー堆積法、イオン注入法、エレクトロスプレー法、化学気相成長法、物理的気相成長法、レーザービーム加工法、又は三次元成長法からなる群から選択される手段を用いてコーティング層を製造する請求項１３に記載されたデバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本質的に二酸化チタンからなるコーティングに関する。
また、本発明は本発明のコーティングで被覆された様々なデバイス、並びにそのコーティングを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二酸化チタンは、骨に取り付ける医療用インプラントをコーティングするために使用されることが知られている。二酸化チタンは、典型的には、アナターゼおよび/またはルチル型の部分的または完全な結晶構造を有し、合理的に良好な結果が達成されている。いくつかの研究によれば、ＵＶ光またはアルゴンイオンプラズマ処理（以下、Ａｒイオンプラズマ）による表面処理は、炭水化物の表面を洗浄し、表面の親水性を改善し、さらにそれを超親水性にし、骨および他の組織細胞の表面への付着、接着および増殖を促進する。
【０００３】
ＴｉＯ２の光触媒に関する研究から、アナターゼおよびルチルの表面は、超親水性にされ、且つＵＶ光励起を用いて洗浄できることが知られている。清浄な表面がタンパク質吸着および細胞付着を改善し、骨組織の成長およびインプラントの統合を改善することも示されている。
【０００４】
他の研究では、表面構造が軟組織との細胞および組織接着に有意な効果を有することが示されている。
特許文献１（国際公報ＷＯ０２／８７６４８）には、５０ｎｍ未満の表面粗さが軟組織細胞及びインプラント上の組織の接着強度を改善を可能にすることが説明されている。動物実験では、軟組織のインプラントへの接着は、しばしば組織自体の内部強度のものよりも大きく、機械的プルオフ試験において組織の凝集破壊をもたらすことが観察された。最近の臨床事例でも同じ現象が観察されている
【０００５】
細胞付着（cell attachment）は細胞接着（cell adhesion）と同等ではないことは留意されるべきである。実際、付着（attachment）とは、表面上の細胞の良好な接触、拡散および生体適合性を指す。しかしながら、そのような細胞はしばしば容易に分離される。文献中の「Attachment」は接着の強さを意味するものではない。さらに、骨への適用の場合、インプラントに固着する石灰化した骨は、細胞および組織の接着が完全にそれで覆われるような状態を作り出すために、細胞接着強度は無関係である。
【０００６】
様々な医療インプラントおよび他のデバイスが患者の軟組織に関連して配置される。いくつかの例としては、例えば、カテーテルおよびステントである。皮膚に通して両端を体外と体内に残すように配置されたカテーテルの場合、カテーテルを挿入するために作られた創傷は皮膚細胞がカテーテルの外面に十分に接着しないので感染しやすい。創傷の外からの連続的な細菌の攻撃と同様に、異物反応の結果として創傷は開いたままになり炎症を起こす。非常に似通った状況は、多数の適応、例えば、整形外科用固定ピン、歯科インプラント、顎顔面プロテーゼ固定ネジ用において生じる。
【０００７】
患者の静脈内に配置されたステントの場合、ステントの非接着は、ステント上を流れる代わりにステントをよけて流れる血液をもたらすことがある。ステントは非接着性および非一体性の結果として移動することもある。
【０００８】
上記のように合併症を直接防止することができるので、接着自体はしばしば望ましい結果である。接着はまた、間接的に他のタイプの利益をもたらす。接着した組織が、慢性の炎症応答およびインプラントの封入をもたらす異物反応を誘発しないことは、我々の以前の研究で示されている。歯科インプラントでは、炎症反応がより少なくなる結果として、軟組織に付着した歯肉領域の下の骨吸収が減少することが示されている。組織の炎症シグナルは、歯科インプラント周囲の骨組織治癒にも影響を与えることが知られている。
【０００９】
したがって、ヒトおよび哺乳動物の軟組織への様々な医療デバイスの接着を改善するための方法を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ０２／８７６４８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
すなわち、本発明の目的は、コーティングされた表面への軟組織の接着性を高めるコーティングを提供することである。
本発明の別の目的は、軟組織の接着が可能な医療デバイスを提供することである。
さらなる目的は、良好な軟組織接着特性を得るための装置をコーティングするための方法を提供することである。
さらなる目的は、良好な軟組織接着性及び良好な保管性を有するコーティングを提供することである。
さらに別の目的は、従来公知のコーティングおよび表面処理の問題を少なくとも部分的に克服するコーティングを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書は、本質的に二酸化チタンからなるコーティングに関する。典型的なコーティングでは、
本質的に二酸化チタンからなるコーティングであって、
二酸化チタンの少なくとも２０％がアナターゼおよび／またはルチル結晶構造を有し、
コーティングは、窪みを含む表面を有し、前記窪みの少なくとも５０％が１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有し、
コーティングは、０〜２０°の水接触角となるように処理され、及び、
処理されたコーティングは、接着能を有する哺乳動物組織細胞への付着性を示し、
付着性は、コーティングされ及び処理された基材が未コーティング及び未処理の同種の基材と比較される場合、未コーティング及び未処理の基材よりも少なくとも１００％多くの細胞がコーティグされ処理された基材上に付着したままであって、
細胞の付着性は、以下の方法で測定されるコーティング。
−  最大径が８ｍｍ、厚さ０．１〜１ｍｍである、コーティングされ及び処理された基材及び未コーティング及び未処理の基材である６枚の相似する板状のサンプルが使用され、
−  該サンプルは測定前に少なくとも２０時間水溶液中に保存され、
−  軟質組織細胞が、コーティングされ及び処理された基材サンプルと未コーティング及び未処理基材上で、５％二酸化炭素雰囲気中、３７℃で６時間培養され、
−  培養されたコーティングされ及び処理された基材サンプルおよび未コーティング及び未処理基材サンプルは、５０ｒｐｍのオービタルシェーカー中で、室温で１２分間、リン酸緩衝生理食塩水中のトリプシン溶液でトリプシン処理され、及び
−  残存している付着細胞がサンプルからカウントされ、６つサンプルの平均が算出される、
ここで、トリプシンの溶液中のトリプシンの体積％は、平均して少なくとも３００細胞／ｃｍ２が未コーティング及び未処理の基材サンプルに付着したままであるように選択される。
【００１３】
本明細書はまた、デバイスの軟組織細胞接着を改善するための、上記のコーティングの使用に関する。
本明細書では、また、上記のようなコーティングを含む、皮膚に浸透するか、または哺乳動物に移植されることを意図した医療または美容デバイスに関する。
【００１４】
本明細書では、さらに、軟質組織接着を可能にするデバイスの製造方法に関する。典型的な方法は、
軟組織接着可能なデバイスの製造方法であって、
本質的に二酸化チタンからなるコーティング層を製造する工程であって、
二酸化チタンの少なくとも２０％が、アナターゼおよび／またはルチル結晶構造を有し、
コーティングは、窪みを含む表面を有し、前記窪みの少なくとも５０％は、１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有する、工程と、
負に帯電または正に帯電するようにコーティング処理をする工程、とを含むデバイスの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図２】図２は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図３】図３は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図４】図４は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図５】図５は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図６】図６は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図７】図７は、インビトロ試験のいくつかの結果を示す。
【図８】図８は、試験された表面の顕微鏡画像である。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは図８に示す表面の元素分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書は、本質的に二酸化チタンからなるコーティングに関する。典型的なコーティングは、本質的に二酸化チタンからなるコーティングであって、
二酸化チタンの少なくとも２０％がアナターゼおよび／またはルチル結晶構造を有し、
コーティングは、窪みを含む表面を有し、窪みの少なくとも５０％が１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有し、
コーティングは、０〜２０°の水接触角となるように処理され、及び、
処理されたコーティングは、接着能を有する哺乳動物組織細胞への付着性を示し、
付着性は、コーティングされ及び処理された基材が未コーティング及び未処理の同種の基材と比較される場合、未コーティング及び未処理の基材よりも少なくとも１００％多くの細胞がコーティグされ処理された基材上に付着したままであって、
細胞の付着性は、以下の方法で測定されるコーティング。
−  最大径が８ｍｍ、厚さ０．１〜１ｍｍである、コーティングされ及び処理された基材及び未コーティング及び未処理の基材である６枚の相似する板状のサンプルが使用され、
−  該サンプルは測定前に少なくとも２０時間水溶液中に保存され、
−  軟質組織細胞が、コーティングされ及び処理された基材サンプルと未コーティング及び未処理基材サンプル上で、５％二酸化炭素雰囲気中、３７℃で６時間培養され、
−  培養されたコーティングされ及び処理された基材サンプルおよび未コーティング及び未処理基材サンプルは、５０ｒｐｍのオービタルシェーカー中で、室温で１２分間、リン酸緩衝生理食塩水中のトリプシン溶液でトリプシン処理され、及び
−  残存している付着細胞がサンプルからカウントされ、６つのサンプルの平均が算出される、
ここで、トリプシンの溶液中のトリプシンの体積％は、平均して少なくとも３００細胞／ｃｍ２が未コーティング及び未処理の基材サンプルに付着したままであるように選択される。
【００１７】
本発明のコーティングは、哺乳動物（ヒトまたは動物）の体内に移植されたデバイスに使用される場合、いくつかの有利な効果を有する。実際、新鮮な創傷と接触すると、当分野で知られているように、本発明のコーティングは、ナノ構造化ＴｉＯ２表面、またはＵＶまたはプラズマ機能化ＴｉＯ２、またはアナターゼまたはルチル結晶表面のいずれよりも高いレベルで細胞および組織接着を改善する。したがって、本発明のコーティングは、当該技術分野で公知のコーティングよりも良好な結果を可能にする。しかしながら、本発明者らは、この有利な効果が結晶構造と表面粗さとの特定の組み合わせによって得られるという理論に縛られるものではないと考えている。実際、骨細胞では、５０ｎｍよりも深い窪みを有する表面上で骨の成長が改善されることが示されているが、窪みの深さが５０ｎｍ以下の表面では、軟部組織細胞との細胞接着の改善が観察されている。
【００１８】
更なる利点は、デバイスが皮膚を貫通して身体の内側及び外側の両方に存在する場合に、軟組織の接着性が改善するために、デバイスを囲む創傷の治癒過程が改善することである。
さらにまた、傷がふさがりやすくなり、その結果、傷が塞がった後に細菌が傷に入ることがなくなり感染のリスクを低減する。
本発明のコーティングはまた、コーティングの周囲への骨吸収を減少させる有利な効果を有する。
本発明のコーティングの軟組織の良好な接着特性は、インプラント周囲の感染の可能性を低減し、裂開の可能性を低減し、剥離によるインプラントの移動の可能性を低減するさらなる効果を有する。
【００１９】
実際に、本実施形態のコーティングが製造され、軟組織接着性について試験された場合、処理された表面（すなわち、コーティングされた表面、すなわちコーティング）を囲む組織の臨床的に粘着性を有する断裂が観察された。組織の表面の接着力は組織自体の強度よりも高くなる。これについては、後述する実施例においてより詳細に説明される。「改善された付着」という用語が使用される場合、表面にコーティングされていない基材よりも多くの細胞が付着することを意味する。
【００２０】
接着することができる細胞は、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨芽細胞などのような細胞であると理解され、血液細胞、白血球などのように接着できない性質を有する細胞は除外される。例えば、いくつかの細胞は、例えば、神経細胞のような線維芽細胞と同じ意味で接着することができず、この場合、本実施形態においては示すことができない。本実施形態の方法によってはそれを試験することはおそらく困難であるが、発明のコーティングは、そのような細胞の接着も改善し得る。
【００２１】
コーティングの１つの特徴は、軟組織細胞を、５％二酸化炭素雰囲気中３７℃で６時間コーティング上で培養すると、この軟組織細胞がコーティングに接着することである。接着はトリプシン処理によって測定することができる。室温で１２分間、５０ｒｐｍのオービタルシェーカー内のリン酸緩衝化生理食塩水中のトリプシン溶液によるトリプシン処理は、細胞培養によって表面に付着した細胞の一部を剥がす。
残っている（すなわち、剥離しない）細胞の量は、コーティングされていない基材と比較した場合、本発明のコーティングの方が高い。
さらに、残っている細胞数は、処理された金属チタン表面よりも少なくとも４５％多く、同じ結晶構造および粗さを有する未処理の二酸化チタンコーティング表面よりも少なくとも３０％多い。
このように、良好な接着性は、結晶構造、表面粗さおよびそのような表面の処理の組み合わせによって得られる。トリプシン処理によるこの方法は、当業者に公知であるが、以下の実施例においてさらに詳細に説明される。
【００２２】
細胞の種類および系統が相違するため、トリプシン処理工程におけるトリプシンの量は、その相違を観察するために適切なレベルに設定される必要がある。実際、本発明者らは、６時間で表面に付着しているように見える細胞の量は、コーティング基材と非コーティング基材とでは同等であるが、付着力は変化しており、従って、それ以外の条件が同一である場合にはトリプシン処理はコーティングされた表面からよりも非コーティング表面から多くの細胞を剥がすことを観察された。
トリプシン（リン酸緩衝化生理食塩水中の溶液中の体積％）の量は、コーティングされていない基材試料に少なくとも300細胞/cm2以上であって2000細胞/cm2超が付着したままであるように選択される。実際に、コーティングされていない基材試料上に付着したままの細胞の量が多すぎる場合には（非トリプシン処理での細胞量のたとえば80％、典型的には6000〜8000細胞/cm2）、コーティングされていない試料とコーティングされたサンプルの間の相違（少なくとも100％）は統計分析には小さすぎる。コーティングされていないトリプシン処理群の細胞数が0に近づくと、測定可能な細胞が見られないため比較ができない可能性がある。当業者は、いくつかの簡単な試行錯誤実験によって、使用すべきトリプシンの正確な量を容易に決定することができる。好ましくは、トリプシンの量は、細胞の計数を容易にするために、約1000〜2000細胞/cm2がコーティングされていない基質試料に付着したままであるように選択される。実際、量が多すぎると、付着したままの細胞を数えることが繁雑になりすぎ検証可能な結果につながりにくい。
【００２３】
異なる材料間の直接的な比較は、コーティングされるべき種々の材料から正確に同一の試験試料を作製することが非常に困難であるので、典型的には信頼性は高くないことを留意すべきである。
本実施形態のコーティングが試験されるとき、基材の実質的に全表面がコーティングされる。基材の一部のみがコーティング被覆される場合には、その基材のコーティングされた部分とコーティングされていない部分との間で比較が行われる。
【００２４】
実際に、先行技術は高い軟組織接着強度を達成するための、５０ｎｍ未満の深さおよび幅を有する窪みを有する表面構造、ＴｉＯ２の結晶性、およびＵＶ光、Ａｒイオンプラズマまたは過酸化水素による表面の洗浄および／または励起の組み合わせは開示していない。
細胞および組織は、上記のような種類の表面に付着及び接着することができることが知られているが、これらの表面の性質および処理は単独では、組み合わせた場合と同様の高い組織接着性を達成していない。
より強い接着性への改良は、より再現性のある臨床結果および界面の機械的外傷に対するより良好な耐性をもたらすので、治療結果の有意な改善ならびに治療のためのコストの低減につながる。実際、デバイス（例えば、カテーテルまたは歯科用インプラント）が柔軟組織に十分に接着すると、細菌は創傷に侵入することができず、デバイスも容易に移動することなく、したがって一般的な治癒プロセスを改善する。
【００２５】
一実施形態によれば、測定方法で使用される水溶液は、脱イオン水および血清を含む水溶液から選択される。血清は、例えば、かなり低い濃度のタンパク質を含む、１０％希釈血清であるＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）であり得る。もちろん、測定方法で使用される溶液は、希釈されていない血清であってもよい。
【００２６】
コーティングが製造されるとき、最後の処理ステップは、コーティングされたデバイスの使用の直前に（すなわち、哺乳動物組織への移植前に）実行され得る。この場合、コーティングされたデバイスは、組織液および血液と直ちに接触し、接触状態におかれるすぐに表面と反応し始めるため、コーティングされたデバイスを保管（storage)する必要はない。
一実施形態によれば、コーティングは過酸化水素による自然吸着した炭化水素の洗浄によって負に荷電されるか、または、炭水化物を洗浄することによって正に荷電され、及び、３６０ｎｍのＵＶ光またはアルゴンイオンプラズマによって表面を光触媒的に光励起され、同時に水接触角０〜２０°となるように処理される。
【００２７】
別の実施形態によれば、コーティングの製造プロセスは、
水接触角を低下させる以下のステップを有する。
−  過酸化水素または過酸化カルシウムによって、または表面にカルシウムを吸着させることで自然に吸着された炭化水素の表面を洗浄する、または、
−  炭化水素を洗浄し、及び、３６０ｎｍ以下のＵＶ光またはアルゴンイオンプラズマまたは酸素プラズマによって表面を光触媒励起する。
【００２８】
実際、本開示によれば、コーティングの低い水接触角は、コーティング自体の処理によって達成され、トップコートなどの追加の層をその上に付加することによっては達成されない。
【００２９】
未コーティング基材と比較したとき、コーティング基材上に付着したままの細胞の量は、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも１２００％、より好ましくは少なくとも１５０％多い。その量は、例えば、少なくとも、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０または１６５％以上であり得る。もちろん、その量は２００または２５０％以上、場合によっては３００％以上など、さらに多くてもよい。その量は、任意の適切な方法によって決定され、１つの可能性は、イメージングおよび計算によるものである。この方法については、後述する実施例で詳細に述べる。
【００３０】
一実施形態によれば、コーティングは、負に帯電されるかまたは正に帯電されるように処理される。したがって、本コーティングは、例えば（希釈された）過酸化水素によって自然吸着した炭化水素の洗浄によって負に荷電されるか、または、炭水化物を洗浄することによって正に荷電され、及び、３６０ｎｍのＵＶ光またはアルゴンイオンプラズマによって表面を光触媒的に光励起され、同時に水接触角０〜２０°となるように処理される。
実際、非常に低い水接触角を達成するための様々な方法が存在する。１つの方法は、自然に吸着した炭化水素をコーティングの表面から洗浄し、コーティングを負に帯電させることである。洗浄は、例えば過酸化水素または過酸化水素プラズマで行うことができる。過酸化水素による処理は、例えば、洗浄すべき表面を液体過酸化水素に浸漬することにより、または洗浄すべき表面を液体過酸化水素から放出される酸素ラジカルに供することによって行うことができる。また、過酸化水素のように作用する、すなわち、炭水化物の表面を洗浄するが、Ｃａイオンも溶液中に放出し、負に帯電したＴｉＯ２表面によるイオンの即時吸着をもたらす過酸化カルシウムを使用することもできるとも考えられている。
【００３１】
コーティングの表面はまた、３６０ｎｍ未満の波長を有する紫外光、またはＡｒイオンプラズマまたは酸素プラズマによって光触媒励起することによって、正に帯電させることができる。したがって、コーティングは高い親水性（低い水接触角）を有するが、正または負のいずれかに帯電する。表面の電荷、すなわちそれが静電気であるという事は、軟組織細胞の表面への接着をさらに向上させると考えられる。さらに、表面が負に帯電している場合、Ｃａ２＋イオンを間質液から吸収することができると考えられる。この吸収は、表面を正に帯電し、タンパク質を表面に吸着させる。一方、表面が正に帯電すると、タンパク質を直接吸着することができる。
【００３２】
コーティングは、特定の結晶構造および表面粗さの形成を可能にする任意の適切な方法で製造することができる。製造方法のいくつかの例は、ゾルゲルプロセス、水熱プロセス、パルスレーザ堆積プロセス、イオン注入プロセス、エレクトロスプレープロセス、化学蒸着プロセス、物理蒸着プロセス、レーザビーム加工プロセス、および三次元成長プロセス等が挙げられる。
【００３３】
コーティングは、上記のように、０〜２０°の水接触角となっており親水性である。この低い水接触角は、製造方法によって直接的な方法、または、製造プロセスが上記の方法のいずれかによって水接触角を減少させる工程を含むことによってのいずれかでも達成することができる。水接触角を最大２０°まで下げる他の方法もあり得る。
【００３４】
一実施形態によれば、水接触角は０〜１０°である。水接触角はまた、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８°から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０°である。典型的には、水接触角が低いほど好ましい。
【００３５】
コーティングは、窪みを含む表面を有し、窪みの少なくとも５０％が１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有し、すなわち表面はある程度の粗さを有する。表面粗さは、例えば、高分解能走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）または原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）などの任意の適切な手段によって測定することができる。深さは、窪みの底から隣接するピークまで測定され、幅はピークからピークまで測定される。窪みは、表面が粒子または結晶でできている状況も含むと理解されるべきである。この場合、粒子または結晶は、クラスターの幅および高さが１〜５０ｎｍであるようにクラスターとして互いに付着し、そのクラスター（又は、最外表面よりも低い位置に存在するクラスター）を含まない表面の部分が存在する。
【００３６】
一実施形態によれば、窪みの少なくとも６０％は１〜５０ｎｍの最大深さと１〜５０ｎｍの最大幅を有する。さらなる実施形態によれば、定義されたサイズ（深さおよび幅）を有する窪みの割合は、５０、５５、６０、６５、７０または７５％から６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％までである。さらに別の実施形態によれば、窪みの最大深さは１、２、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は４５ｎｍから、１、２、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｍである。さらなる実施形態によれば、窪みの最大幅は、１、２、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５ｎｍから１、２、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｍである。窪みの幅および深さは、互いに独立して選択することができるだけでなく、これらの特定の寸法を有する窪みの割合（パーセンテージ）が選択可能である。
【００３７】
コーティングは、水溶液中に保管されうる。コーティングされたデバイスを水溶液中に保管しても有利な特性が保持され得ることは確かに注目されている。水溶液中での保管が不可能な場合、コーティングは、紫外光励起、アルゴンイオンプラズマ励起、酸素プラズマ励起または白色光励起、または還元等の任意の水接触角を低減させる他の適切な方法を適用することによって（必要であれば）再活性化することができる。
【００３８】
本発明のコーティングは、多くの材料に使用することができる。いくつかの好ましい材料（すなわち、試験方法における基材）としては、チタン、チタン合金、タンタル、ニオブ、コバルトとクロムの合金、スチール、ジルコニウム、酸化アルミニウム、窒化チタン、窒化ジルコニウム、窒化ジルコニウム、石英ガラス、石英、ポリマーおよびポリマー複合体が挙げられる。ポリマー複合材に関しては、複合材の成分をＴｉＯ２にすることができる。
【００３９】
本明細書はまた、デバイスの哺乳動物組織細胞への接着性を改善するためのコーティングの使用にも言及する。さらに、本明細書は本実施形態のコーティングを含む、皮膚を貫通する、または哺乳動物に移植されることを意図した医療または美容用のデバイスにも言及する。
【００４０】
一実施形態によれば、デバイスは、整形外科用固定ピン、頭蓋顎顔面プロテーゼ固定ネジ、カテーテル、カニューレ、血管ステント、動脈瘤ステント、食道ステント、心臓弁のための環状リング、四肢用取り外し可能なプロテーゼインプラント、腹部カテーテル、尿道カテーテル、歯科インプラントアバットメント、組織レベルインプラントアバットメント部品、および、皮膚貫通ジュエリーが含まれる。このデバイスは、例えば、細胞培養プレートであってもよい。 このデバイスはさらに、組織接着、創傷治癒の改善、カプセル化の欠如、インプラントの表面上の細胞のより速い成長、より低い炎症応答および/または創傷の閉鎖をもたらす任意の軟組織接触移植片であってもよい。
【００４１】
本発明はまた、軟組織の接着が可能なデバイスを製造する方法であって、
本質的に二酸化チタンからなるコーティング層を製造する工程であって、二酸化チタンの少なくとも２０％が、アナターゼおよび／またはルチル結晶構造を有し、コーティングは、窪みを含む表面を有し、前記窪みの少なくとも５０％は、１〜５０ｎｍの最大深さおよび１〜５０ｎｍの最大幅を有するようなコーティング層を製造する工程と、
コーティングの水接触角を０〜２０°になるように処理する工程と、及び
負に帯電または正に帯電するようにコーティング処理をする工程、とを含む。
【００４２】
処理工程は、上記に開示した方法のいずれかに従って実施することができる。
さらに、コーティングに関連して上記された他の実施形態および詳細のすべてが、本方法について準用される。
【００４３】
コーティング層を製造するステップ、及びコーティング層に励起をかけるステップは（コーティングが処理を行う前にはコーティング層は略存在していなければならないが）、順次行うこともできるし、ほぼ同時に行うこともできる。
【００４４】
一実施形態のコーティング層の製造は、ゾル−ゲル法、水熱法、パルスレーザー堆積法、イオン注入法、エレクトロスプレー法、化学気相成長法、物理的気相成長法、レーザービーム加工法、又は三次元成長法を使用して行うことができる。
【００４５】
理論に制限されるものではないが、本発明者らは、分子結合を切断して水素原子を引き出し、次に酸素原子を加えることによって、有機化合物を分解する酸化反応がまず進行すると考える。このプロセスでは、ＵＶ光を使用するとき、高エネルギーＵＶ放射およびラジカル酸素原子が重要な役割を果たす。低圧水銀ランプ自体がオゾンを発生させ、それを分解して活性酸素を生成する。それは表面処理のための理想的な光源である。１８５ｎｍのＵＶ光は酸素分子を分解し、オゾンＯ3を合成すると考えられている。２４５ｎｍのＵＶ光は、オゾンを分解し、高エネルギーＯ＊（活性酸素）を生成する。従って、＊ＯＨ、ＣＯＯ＊、ＣＯ＊及び＊ＣＯＯＨのようなラジカルが、増加した親水性を伴って生成される。有機分子は、ＵＶ光によって分解され、酸化され、ＵＶ光によって活性酸素が生成され得る。ＣＯ２とＨ２Ｏが形成され、表面から脱着する。したがって、表面は有機汚染物が洗浄され親水性となる。光触媒表面は、３６０ｎｍ以下の光線による同様の酸素ラジカル生成を引き起こす。したがって、最初にオゾンに変わるためには空気分子に依存しない。
【００４６】
表面のプラズマ処理は、気体種から生成されたエネルギープラズマまたは誘電体バリア放電（ＤＢＤ）プラズマの使用による表面からの不純物および汚染物質の除去を含む。アルゴン及び酸素のようなガス、空気及び水素／窒素のような混合物を使用することができる。プラズマは、大気圧プラズマも一般的であるが、低圧ガス（典型的には約１／１０００気圧）をイオン化するために高周波電圧（典型的にはｋＨｚ＞ＭＨｚ）を用いて生成される。プラズマでは、ガス原子はより高いエネルギー状態に励起され、イオン化される。
【００４７】
プラズマの活性種には、短波紫外線（真空ＵＶ、または短いＶＵＶ）の範囲内の原子、分子、イオン、電子、フリーラジカル、準安定物質および光子が含まれる。この「スープ（sopu）」は室温付近にあるが、さらにプラズマにおかれた任意の表面と相互作用する。使用されるガスが酸素である場合、プラズマはクリティカルクリーニングにとって効果的で経済的で環境に安全な方法である。ＶＵＶエネルギーは、表面汚染物質のほとんどの有機結合（すなわち、Ｃ−Ｈ、Ｃ−Ｃ、Ｃ＝Ｃ、Ｃ−ＯおよびＣ−Ｎ）の破壊において非常に有効である。これは、高分子量の汚染物質を分解するのに有用である。第２の洗浄作用は、プラズマ中に生成された酸素種（Ｏ２＋、Ｏ２−、Ｏ３、Ｏ、Ｏ＋、Ｏ−、イオン化オゾン、準安定励起酸素および自由電子）によって行われる。これらの種はＨ２Ｏ、ＣＯ、ＣＯ２および低分子量炭化水素を生成するために有機汚染物と反応する。これらの化合物は比較的高い蒸気圧を有し、処理中にチャンバーから排気される。結果として生じる表面は超清浄となる。
【００４８】
本実施形態は、以上のとおりであるが、今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は前記説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【実施例】
【００４９】
次に、本発明の実施例について説明する。尚、本発明は下記の実施例に限定して解釈されるものではない。
【００５０】
（細胞培養試験結果）
本発明のコーティングについて以下のように試験した。細胞培養試験の結果は、様々な材料が細胞の付着を可能にし、それらの表面上に互いに比較可能なレベルで広がることを示す。このことから、試験材料はすべて生体適合性があり、外科用鋼のような他の金属と比較して良好なインプラント材料であると言える。
【００５１】
制御されたプロトコール下で細胞を以下に述べる方法でトリプシン処理すると、相違が大きくなる。トリプシン処理後に、表面上に残っている細胞の数に対する付着細胞数の差は、細胞接着強度の尺度とみなすことができる。
【００５２】
本実施例では、材料表面の３つの特性によって細胞接着が増加することが示されている。４つの材料のうち２つは本質的に同じ材料、すなわち、ゾル−ゲル法で製造されたＴｉＯ２および熱水処理されたＴｉＯ２であって、いずれも５０ｎｍ以下のナノ構造を有し、アナターゼ相で結晶質である。
第３の材料は、５０ｎｍを超えるナノ構造を有する水熱法による合成表面であり、アナターゼ相において高度に結晶質である。
第４の材料は、アナターゼ結晶を有さずナノ構造を有さない機械加工されたチタンである。しかしながら、それは約３ｎｍの厚さの自然に吸着された極めて薄いＴｉＯ２層を有する。
ゾル−ゲルまたは水熱法で製造された表面は、典型的には２００ｎｍ超１０００ｎｍ未満の厚さを有する。ゾル−ゲル法材料の結晶化度は、熱水法材料の結晶化度よりわずかに低い。
【００５３】
試験サンプル（６つの相似するサンプル）は、各辺が８ｍｍの長さである正方形の板または８ｍｍの直径を有する円板である。サンプルの厚さは０．４ｍｍであった。結果は、すべて同じ形状同時の物と比較されている限り、正方形の板と円板とでは違いはなかった。
【００５４】
ＵＶ洗浄の有無の全ての材料は試験された。ＵＶ洗浄されたものは、表面の炭水化物が除去され、表面は光触媒反応に付され正に帯電された。
【００５５】
サンプル表面はＵＶ光チャンバーで１時間処理され、細胞培養試験前に脱イオン水中に２０時間保持した。試料から２ｍｍの距離で３Ｗ／ｍ２の光強度を放射することが測定される低圧Ｈｇ蛍光灯（Osram Sylvania GFT36DL/2G11/SE/OF 36WコンパクトＵＶ殺菌ランプ）が使用された。サンプルは、処理時間中に０〜５度の水接触角になったことが測定された。脱イオン水中での保管は、閉じたガラス容器内において、室温で行った。
【００５６】
表面試験は以下の通りであった。
以下において、ＴｉＶＡｌは、チタン−バナジウム（４％）とアルミニウム（６％）との混合であることを示す。これはアバットメント（abutment）に一般的に使用される材料であり、グレード５のチタンとしても見いだされる。
【００５７】
セラミックＺｒは、ダイヤモンドソーを使用して未焼成状態のＺｒＯブロックを切断し、製造業者（Metoxit ag-Dental）推奨に従って１２００℃で４時間焼結して得た純粋なＺｒＯセラミック材料の略である。
【００５８】
Ｚｒ−Ｔｉ金属合金は、Institut Straumann Agによって製造された市販のＲｏｘｏｌｉｄ（登録商標）インプラント材料を表す。それは、チタン中に約８％のＺｒを含む。円形の板は直径８ｍｍのＺｒ−Ｔｉロッドから切り出した。
【００５９】
以下の略語が使用される。
ＴｉＶＡｌ：金属チタン表面であって、処理またはコーティングなしのもの、すなわち比較材料。
ＴｉＶＡ１  ＵＶ：紫外線で処理された金属チタン表面、すなわち比較材料。
ゾル−ゲル  Ｔｉ：本明細書に記載の結晶構造および粗さを有する二酸化チタンコーティングで被覆されたゾル−ゲル法で製造された金属チタン表面。すなわち比較材料。
ゾル−ゲル  Ｔｉ  ＵＶ：紫外線で処理された、すなわち本発明にかかるゾル−ゲル表面。
ＨＴ＞５０ｎｍ：本明細書に記載したような結晶構造を有するが、５０ｎｍを超える窪み（幅および深さの両方）を有する表面粗さを有する水熱法により得られた二酸化チタンコーティングで被覆された金属チタン表面。すなわち比較材料。
ＨＴ＜５０ｎｍ：上記と同じであるが、５０ｎｍ未満の窪みを有する、すなわち比較材料。
ＨＴ＜５０ｎｍ  ＵＶ：上記と同じであって、さらに紫外線で処理された、すなわち本発明にかかる材料。
ゾル−ゲル  Ｚｒ：本明細書に記載の結晶構造および粗さを有する二酸化チタンコーティングで被覆されたセラミックスジルコニウム表面であって、ゾル−ゲル法で製造された、すなわち比較材料。
ゾル−ゲルＺｒ  ＵＶ：上記のゾル−ゲル表面であって、紫外光で処理された、すなわち本発明にかかるゾル−ゲル表面。
ＨＴ  Ｚｒ−Ｔｉ：本明細書に記載の結晶構造を有する水熱法により得られた二酸化チタンコーティングで被覆されたＺｒ−Ｔｉ表面の金属合金であって、５０ｎｍ未満（幅と深さの両方）の窪みを有する表面粗さを有するもの、すなわち比較材料。
ＨＴ  Ｚｒ−Ｔｉ  ＵＶ：本明細書に記載の結晶構造を有する水熱法により得られた二酸化チタンコーティングで被覆されたＺｒ−Ｔｉ表面の金属合金であって、５０ｎｍ（幅および深さの両方）の窪みを有する表面粗さを有し、紫外光で処理されたもの。すなわち比較材料。
Ｚｒ−Ｔｉ：機械加工された表面Ｚｒ−Ｔｉ合金。機械加工された表面の表面粗さは０．１と測定されたもの。
Ｚｒ−Ｔｉ  ＵＶ：機械加工された表面Ｚｒ−Ｔｉ合金であって紫外線光で処理されたもの。
【００６０】
トリプシン処理試験に用いた材料は以下の通りである
−  ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、１０％ウシ胎児血清（FCS）＋ペニシリン＋ストレプトマイシン（100U/μg、Gibko BRL、Life technologies、Paisley UK）
−  リン酸緩衝食塩水（PBS）
−  ホルマリン溶液、中性緩衝液、１０％
−  ＰＢＳ中で０．０００５容量％のトリプシンにＰＢＳで希釈した０．２５％トリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）
−  ヘキスト３３３４２  染色用溶液
−  ７０％エタノール（Etax Aa、Altia Oy）
【００６１】
試験されるコーティングは、最初に超音波浴を含む水中で洗浄された。まず、各試料はアセトンが入ったデカンターに入れられ、少なくとも５分間洗浄された。次に、各試料はエタノールが入ったデカンターに入れられ少なくとも５分間洗浄された。
【００６２】
次いで、試験に用いた細胞を細胞培養フラスコ中で継代した。このプロセスは、当技術分野での標準的な手順に従っている。すなわち
−  培養培地およびトリプシン−ＥＤＴＡを浴中で加温する。
−  フラスコから培地を除去する。
−  細胞を２０ｍｌのＰＢＳ（７５ｃｍ２フラスコ中）で２回洗浄する。
−  細胞を５ｍｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで分離する。
−  トリプシンが細胞の上を流れるようにフラスコを静かに振って、その後トリプシンを捨てる。
−  フラスコをインキュベーターに入れ、細胞が脱離するのを待つ（５〜１５分）。
−  新しい培地（７５ｃｍ２のフラスコ中）２０ｍｌを加えて新しいフラスコを調製する。
−  ガラスピペットで新しい培地９ｍｌを採取し、細胞を数回洗い流す。
−  ピペットで細胞と培地を吸う。
−  新しい調製した細胞培養フラスコ中の細胞の一部（典型的には１：３）を加える。
【００６３】
その後、試験試料に細胞を播種した。試料はウェル内に配置された。細胞の量は、最初にBio-Rad細胞カウンター（１０μｌの有色細胞懸濁液チップ）で測定された。チップ用着色細胞懸濁液は、色素２０μｌ＋培地からの細胞２０μｌであった。細胞の量は細胞／ｍｌとして示された。その後、各ウェルに必要な細胞の量を計算し、正確な量の細胞を新しい培地に混合した。細胞の典型的な量は１００００細胞／ｃｍ２であり、ウェル表面積は３．８ｃｍ２であり、したがって約３８０００細胞／ウェルが得られた。セルボトルをマグネチックスターラー上に保持し、絶えず混合した。新たに作製した細胞懸濁液の所望量をウェルにピペットで入れ、プレートを３７℃で６時間インキュベートした。
【００６４】
その後、細胞接着強度試験（トリプシン処理）を行った。この試験は、以下のステップからなる。
−  ＰＢＳでトリプシン−ＥＤＴＡを希釈する。
−  新鮮なウェルにサンプルを移し、ＰＢＳで満たす。
−  ＰＢＳでウェルを３回洗浄する。
−  希釈したトリプシン−ＥＤＴＡを試料にピペッティングする。
−  プレートをオービタルシェーカー（５０〜１００ｒｐｍ）に置き、３７℃で１０〜１５分間インキュベートする。
−  トリプシン−ＥＤＴＡを除去し、ウェル中のＤＭＥＭをピペッティングする。
−  ＰＢＳでウェルを３回洗浄する。
−  細胞をすぐに固定する。
【００６５】
細胞は以下の手順を用いて固定した。
−  ウェルからＰＢＳを除去する。
−  ウェルにホルマリンをピペットで注入することによりホルマリンで細胞を固定する。
−  １５分待つ。
−  ＰＢＳでウェルを２回洗浄する。
−  ウェルにＰＢＳを残す。
【００６６】
細胞は固定直後に染色するか、又はウェルを冷蔵庫に入れて後で染色した。次いで、細胞の接着を検証するために、画像化のためにウェルプレートを調製した。このステップは、固定の後に行っても、直後に行っても結果には影響しない。
【００６７】
細胞の染色は以下の工程で行った。
−  Hoechst 33342溶液の希釈液を調製する。
−  ＰＢＳを除去する。
−  ウェル中のHoechst 33342溶液をピペッティングする。
−  プレートをオービタルシェーカー（５０〜１００ｒｐｍ）に置き、１５分間インキュベートする。
−  ＰＢＳでウェルを３回洗浄する。
−  ウェル内にＰＢＳを残す。
−  光から汚れを保護するためにプレートをホイルで包む。
−  プレートをイメージングする。
【００６８】
プレートのイメージング（画像化）は以下のように行った。
細胞はHoechst 33342核酸染色で染色され、非トリプシン処理した試料およびトリプシン処理した試料を蛍光顕微鏡で画像化した。
非トリプシン処理された画像およびトリプシン処理された画像の細胞を計数し、トリプシン処理したサンプルの細胞数と非トリプシン処理したサンプルの細胞数を比較することにより、分離率を計算した。
【００６９】
コーティングが実際に光触媒的に活性であることを確認するために、水熱法でコーティングされたＴｉＶＡｌのいくつかのサンプルを相対活性測定に供した。活性は、ＵＶ照射下での水溶液からメチレンブルー（ＭＢ）を分解する能力として測定した。使用した製品は、メチレンブルー、Ｃ１６Ｈ１８Ｎ３ＳＣｌ（Merck、1.59270.0010）および精製水（抵抗率１８．２ＭΩｃｍ）であった。測定では、試料を４ｍｌのキュベットの底に置き、２ｍｌの操作溶液（１ｘ１０−５Ｍ）を試料にピペットで加えた。次いで、試料および操作溶液を含むキュベットを暗所で安定化させ、１時間後、「ゼロ値」を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計によって波長６６０ｎｍで測定した。
【００７０】
測定後、「ゼロ値」の吸光度を有する溶液を用いて、反応チャンバー内でＵＶ照射を行った。このサイクルを１時間の間隔で合計５時間繰り返した。すなわち、試料はＵＶ光を合計５時間照射され。ＵＶランプをサンプルの５〜６ｃｍ上に配置し分光光度計の測定を行った。結果は、測定された相対吸光度変化を対数スケールに変換し、線形係数（傾き）および相関係数Ｒ（相関またはピアソン）を計算することによって計算した。少なくとも３つの測定点が使用された。その後、傾きに係数１０００を掛け、操作溶液の使用量（ｍｌ）をサンプルの表面積（ＵＶ照射下の面積）および７（スケールファクタ）で割った。結果は相対運動定数対表面積（相対活性／ｃｍ２）として与えられる。
【００７１】
表１に結果を示す。全てのサンプルが光触媒活性を示した。
【００７２】
【表１】
2019511346.tif 000003
【００７３】
水熱コーティングされたＴｉＶＡｌのいくつかの試料もまた、コーティングされた試料の表面上の炭素原子の量を推定するために、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）で測定された。その結果、実際、ＵＶ処理は表面の炭素原子の量を減少させ、その効果は処理時間に依存することが示された。結果を表２に示す。表中「ｗａｔｅｒ：水」は試料を水で洗浄したことを意味し、「Ｅｔａｎｏｌ：エタノール」は試料をエタノールで洗浄したことを意味し、「ｂｅｆｏｒｅ  ＵＶ」は洗浄していない試料を意味し、残りの３つはそれぞれＵＶ処理のバリエーションを示す。サンプルは、コーティングの直後に測定された。
【００７４】
【表２】
2019511346.tif 000004
【００７５】
（インビトロ試験結果）
トリプシン処理の前後で細胞数を測定した（ａｄｈ）いくつかの試験結果を図１に示す。図１は、以下のようなサンプルを示している（上記の略語の説明）。
図１のカラム１はＨＴ＜５０ｎｍを、カラム２はＨＴ＜５０ｎｍ  ＵＶを、カラム３はＨＴ＞５０ｎｍを、カラム４はゾル−ゲルＴｉ  ＵＶを、カラム５はゾル−ゲルＴｉを、カラム６はＴｉＶＡ１  ＵＶを、カラム７はＴｉＶＡ１を、カラム８はＨＴ＜５０ｎｍ  ＵＶ  ａｄｈを、カラム９はＨＴ＜５０ｎｍａｄｈを、カラム１０は、ゾル−ゲルＵＶ  ａｄｈを、カラム１１はＴｉＶＡ  １  ＵＶ  ａｄｈを、カラム１２はゾル−ゲル  ａｄｈを、カラム１３はＴｉＶＡ  １  ａｄｈを、カラム１４はＨＴ＞５０ｎｍ  ａｄｈを表す。
【００７６】
インキュベーション後およびトリプシン処理前の付着細胞数の、より低い数から高い数への順番は次のとおりであった：
ＴｉＶＡｌ、ＴｉＶＡｌ  ＵＶ、ゾル−ゲル、ゾル−ゲル  ＵＶ、ＨＴ＞５０ｎｍ、ＨＴ＜５０  ＵＶ、ＨＴ＜５０である。
細胞接着強度の順序、すなわちトリプシン処理後の付着細胞の数は（低い方から高い方へ）：
ＨＴ＞５０ｎｍ、ＴｉＶＡｌ、ゾル−ゲル、ＴｉＶＡｌ  ＵＶ、ゾル−ゲルＵＶ、ＨＴ＜５０ｎｍ、ＨＴ＜５０ＵＶである。
【００７７】
このように、本発明による５０ｎｍ未満の表面粗さは、ＵＶによる処理と同様に、細胞接着を改善することが分かる。実際、試験基材を比較すると、以下のようになった。
１．ＨＴ＜５０ｎｍ  ｖｓ  ＨＴ＞５０ｎｍ：
どちらも細胞付着および拡散を可能にするが、ＨＴ＜５０ｎｍのみが細胞の接着も可能にした。
２．ＨＴ＜５０ｎｍ  ｖｓ  ＨＴ＜５０ｎｍ  ＵＶ：
付着し、細胞を広げたが、ＵＶ処理は接着を有意に増加させた。
３．全ての材料  ｖｓ  ＵＶ処理の全ての材料：ＵＶは細胞の接着を増加させた。異なる基材は、ＵＶ処理とは異なる程度で効果があった。
４．全てのコーティング  ｖｓ  非コーティング：
全てのコーティングは付着も接着も非コーティングに対して増加させた。ＨＴ＞５０ｎｍは、細胞の非常に低い接着性を示す例外であった。異なる基材は、コーティングとは異なる程度で効果があった。
５．ＨＴ＜５０ｎｍ  ＵＶ  ｖｓ  それ以外のもの：
ナノ構造の組み合わせ＜５０ｎｍ、高度に結晶化したアナターゼ結晶およびＵＶの組み合わせは、全てのものに最大の接着性を与える。
【００７８】
図２および３は、トリプシン処理試験の結果、すなわちトリプシン処理後に付着したままの細胞の量を示す。図２において、使用した基材はチタンであり、その結果は、Ａ：非被覆非ＵＶ処理、Ｂ：未被覆ＵＶ処理、Ｃ：ゾルーゲルコーティング非ＵＶ処理、Ｄ：ゾル―ゲルコーティング、Ｅ：ＵＶ  熱水でコーティングされた非ＵＶ処理及び、Ｆ：熱水でコーティングされＵＶ処理されたものである。
【００７９】
図３において、使用した基材はジルコニウムであり、その結果はＧ：ゾル−ゲルコーティング、非ＵＶ処理、Ｈ：ゾル−ゲルコーティング、ＵＶ処理、Ｉ：非コーティング、非ＵＶ処理、およびＪ：非コーティング、ＵＶ処理、である。
【００８０】
図４では、基材は、ジルコニウムとチタンの合金（Ｚｒ−Ｔｉ）であり、コーティングは水熱処理で作製したもの、または、ＴｉＶＡｌであり、コーティングはゾル−ゲル法で行ったものである。図中、Ｋは非ＵＶ処理されたＺｒ−Ｔｉを、ＬはＵＶ処理されたＺｒ−Ｔｉを、Ｍは非ＵＶ処理のＴｉ−Ａｌ、ＮはＵＶＡｌ、Ｏは非コーティング処理、非ＵＶ処理のＴｉＶＡｌを、Ｐは、非コーティング、ＵＶ処理のＴｉＶＡｌを、Ｑは非コーティング、非ＵＶ処理のＴｉＶＡｌを、Ｒは非ＵＶ処理Ｚｒ−Ｔｉ、ＵＶ処理を示す。ＴｉＶＡ１のいくつかのサンプルは、血液凝固（または血液凝固）法で試験された。
実際に、生理活性表面の血栓形成性は、従来記載されているように（Ｉmai&Nose、1972; Huangら、2003）、全血動態凝固時間法（whole blood kinetic clotting time method）を用いて評価した。新鮮なヒトの全血を、血小板の機能に影響を及ぼさない投薬を受けていない健常成人のボランティアから採取し、静脈穿刺によりバキュテイナーチューブに入れた。採取した血液の最初の３ｍｌを捨てて、針穿刺による組織トロンボプラスチンの混入を避けた。簡潔には、１００μｌ容量の血液を表面（ｎ＝４）に注意深く加え、これを１２ウェルプレートに入れた。すべての基質を室温で１０，２０，３０，４０，５０および６０分間インキュベートした。各時点の終わりに、基質を３ｍｌの超純水で５分間インキュベートした。各ウェルを３回（各２００μｌ）サンプリングし、９６ウェルプレートに移した。血栓に捕捉されなかった赤血球を超純水を加えて溶解させ、ヘモグロビンを水中に放出させて測定した。溶液中のヘモグロビンの濃度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定することによって評価した。血餅のサイズは、吸光度の値に反比例する。
【００８１】
結果を図５に吸光度に対する時間１０、２０、４０および６０分、で示した。試験された試料は、左列から右列に向かって並ぶ各グループ（カラム）において、非ＵＶ処理、非コーティング；非ＵＶ処理、ゾル−ゲルコーティング；非ＵＶ処理、水熱コーティング；ＵＶ処理、非コーティング；ＵＶ処理、ゾル−ゲルコーティング；ＵＶ処理、水熱コーティング、である。
図示されているように、ＵＶ処理は、各タイプの試料（コーティングまたは非コーティング）に影響を及ぼし、本明細書によるコーティングは、吸光度の減少、すなわち血液凝固の増加に対して最も大きな効果を有する。血液凝固の増加は、細胞付着をより向上させると予測される。
【００８２】
いくつかのジルコニウム試料もまた、上記の凝固試験で試験された。これらの結果を、吸光度に対して１０、２０、３０、４０、５０および６０分の時間で図６に示す。試験されたサンプルは、左から右（列）の各グループにおいて、非ＵＶ処理、非コーティング；非ＵＶ処理、ゾル−ゲルコーティング；ＵＶ処理、ゾル−ゲルコーティングとして示す。結果は、ＴｉＶＡｌを用いた場合と同様である。
【００８３】
細胞接着試験では、観察された臨床結果および個々の細胞培養試験ラウンドの間に結果を歪ませるいくつかの効果が発見されたので、さらなる試験を行った。理論に縛られることなく、本発明者らは以下のことを信じている。
【００８４】
コーティングされていないチタン表面を用いて細胞培養試験を実施すると、試験間で最も安定した結果が得られた。このような表面は最も反応性の低い部位を有しており、様々な刊行物に示されているように、その表面が空気から直接天然に存在する炭素化合物ですでに占有されているため、理解しうる結果である。
【００８５】
ＵＶで洗浄した表面は、典型的には細胞接着を可変量だけ増加させたが、その差は主に２つの群の標準偏差内であった。標準偏差は、試験中の生物学的要因のために細胞培養物を標準化することが困難であるため、実際の値に比べて必然的に大きいと理解することができる。しかし、十分に大きく、統計的に有意な差異がすべての群で観察され得る。
【００８６】
「ゾル−ゲルコーティグおよびＵＶ処理」ならびに「ＨＴ−コーティングおよびＵＶ処理」群においても、１つの結果に歪み因子が出現した。サンプルをＵＶ処理後に細胞培養物に直接置くと、ＵＶ処理サンプルは未処理のコーティングサンプルおよびコントロールサンプルと比較して非常に高い標準偏差を有することが観察された。さらに、それらの実際の値は、ある細胞培養物ごとに大きく異なる可能性があり、論理的な方法ではない。この効果は、光触媒崩壊現象（photocatalytic decay phenomenon）によって引き起こされることが判明した。この現象は、出版物に記載されており、ＵＶ光がスイッチオフされてから約２０時間存在すると仮定されている。実際には、アナターゼ含有表面は、ＵＶ処理後に電子正孔を蓄積し続け、次にそれらを放出し、酸素ラジカルを連続的に生成し、材料の表面上のすべての有機物をアタックする。
【００８７】
したがって、細胞培養は、ＵＶ処理の２０時間後、すなわち崩壊がほぼ終了した後にのみ行うべきであると結論付けられた。よって、細胞接着試験の２０時間前に全てのサンプルを脱イオン水に置くことによって細胞培養試験を行った。この試験ステップでは、コーティングされた群およびＵＶ処理された群の変動は予想通りに消失した。
【００８８】
しかし、コーティングされた群、コーティング＋ＵＶ処理されたグループとの実際の値の差は、以前より小さくなり、臨床結果に基づいて予想された。脱イオン水中での保管はＵＶ処理された表面を清潔に保ち、本発明による予想のとおりコーティングされているが未処理のグループと比較して細胞接着を増加させると結論した。しかし、予想からの効果は失われているように見える。
【００８９】
臨床的な状況への次のステップは、タンパク質を試験に加えることあった。同時に、光触媒作用の有害な影響を避けることが必要であった。光触媒崩壊現象自体はわずかであるが、バイオマスの細胞培養量に影響を及ぼすのには十分である。しかし、臨床的な状況では、周囲のバイオマスおよび流体の流れは、数千倍も高い。従って、有害な影響は、臨床的な状況において観察することができない。第二に、崩壊の半減時間は６時間である。したがって、効果の大部分は１２時間後に既に消失している。細胞接着試験は、液体容積が試料上に上がった後に細胞が接着可能になるため、６時間かかる。したがって、正常な細胞培養では、付着細胞は光触媒崩壊効果を５０％も受けるであろう。
【００９０】
その後、血清変性試験を行った。血清は、10％希釈血清であるDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）であり、従って、かなり低い濃度のタンパク質を含有している。サンプルを密閉ガラスバイアル中で暗所で20時間保管し、さらなる光触媒作用を防止した。
【００９１】
コーティング、コーティング＋ＵＶ処理されたグループおよび対照のサンプルを、細胞接着性試験前の２０時間、細胞生存性および接着のために必要なすべてのタンパク質を含む血清中に置いた。したがって、タンパク質は崩壊が進行している間に表面に吸着された。電子ホールが元の状態にまで崩壊してエネルギーが放出されるとすぐに酸素ラジカルが生成され、これが近くの有機化合物を破壊し、表面上の清浄な位置が新しい血清タンパク質によって占有された。これは、ＵＶ処理の直後に表面が血液および体液と接触する臨床的状況をも模倣する。
【００９２】
したがって、コーティングされた表面およびＵＶで洗浄された表面が、単にコーティングまたは非コーティングよりも多くの利用可能なタンパク質を吸着した部位を有する場合、これは細胞接着量としてに見られるべきである
【００９３】
結果は以下の通りであり、図７にも示す。保存時間はそれぞれ２０時間であった。図７において、各カラムは、以下の群の結果を示す。
ａは、血清中に貯蔵されたＨＴコーティング、ＵＶ処理試料、
ｂは、血清中に保存されたＨＴコーティング、非ＵＶ処理試料、
ｃは、水に保存されたＨＴコーティング、ＵＶ処理試料、
ｄは、血清中に保存されたＨＴコーティング、過酸化水素処理試料、
ｅは、血清中に保存された非コーティング、過酸化水素処理試料、
ｆは、血清中に保存された非コーティング、ＵＶ処理試料、
ｇは、血清中に保存された非コーティング、非ＵＶ処理試料、
ｈは、水に保存された非コーティング、非ＵＶ処理試料。
【００９４】
サンプルは、最良のグループから最悪のグループまで、以下のようにグループ化することができる。
グループ１：最良のサンプルは、ＨＴコーティングされ、ＵＶ処理され、血清に保存されたもの（ａ）。
グループ２：次に最良の２つのサンプルは、ＨＴ被覆、ＵＶ処理、水（ｃ）およびＨＴ被覆、過酸化水素処理および血清で保存されたもの（ｄ）。
グループ３：次の最良のサンプルは、ＨＴコーティングされ、ＵＶなし、血清中に保存されたもの（ｂ）。
グループ４：コーティングされていない試料（ｅ−ｈ）は、予想されたクリーニング方法または保存に関わらず、コーティングされた試料と比較して低い細胞接着値を示した。
【００９５】
したがって、すべての結果は、本明細書によれば予想どおりである。特に、グループ３とグループ２との間の相違は、洗浄効果、すなわち水接触角を低下させる効果の証拠である。グループ３は血清中に保存されているにもかかわらず、ＵＶ洗浄および水中保存、またはＨ２Ｏ２中での洗浄および血清中での保存後に、同じ表面よりも細胞に対して低い親和性を示す。
【００９６】
（インビボ試験結果）
本発明は、歯科治療アバットメントを用いた臨床的処置において試験された。 治療アバットメントは、スペインで市販されているDESS-アバットメントであった。
【００９７】
材料処理
治療アバットメントは、異なる方法で治療された群に分けられた。７つのアバットメントを、主として結晶アナターゼ相を含むゾル−ゲル処理されたナノポーラス表面で被覆した。ＴｉＯ２ゾルは、浸漬コーティング法を用いてコーティングを製造するために調製された。無水エタノール中にテトライソプロピルオルトチタネート（ＴＩＰＴ、Ｔｉ（ＣＨ３）２ＣＨＯ）４）を溶解し、エチレングリコールモノエチルエーテル（Ｃ２Ｈ５ＯＣＨ２ＯＨ）、脱イオン水、発煙塩酸（ＨＣｌ、３７％）およびエタノールを含む溶液と混合することによって、ゾルを０℃で２４時間熟成させた後、浸漬した。アバットメントを、アセトンおよびアルコールを用いて超音波浴中でそれぞれ５分間洗浄した。乾燥後、アバットメントをゾルに浸漬被覆した。その後、アバットメントを５００℃で１時間熱処理した。熱処理後、アバットメントをアセトンおよびアルコール中で５分間超音波洗浄した。
【００９８】
４つのアバットメントは、機械加工されたＴｉＶＡ１アバットメントとしてコーティングされなかった。すべてのアバットメントは、最終的な表面洗浄処理および移植の前にオートクレーブ処理によって滅菌した。
【００９９】
その後、最終治療を行い、以下のアバットメントを試験した：
−  さらに洗浄することのない３つのゾル−ゲルコーティングアバットメント
−  ２つのゾル−ゲルコーティングおよびＵＶ処理されたアバットメント
−  ２つのゾル−ゲル被覆およびプラズマ処理されたアバットメント
−  ２つのＵＶ処理された、コーティングされていないアバットメント
−  ２つのプラズマ処理された、コーティングされていないアバットメント。
【０１００】
Superosse ST-24066 UV光オーブン（Ushio、Japan）を使用して１２分間の洗浄サイクルで、またはYoctoタイプのアルゴンプラズマクリーナー（Diener Electronic GmbH + Co. KG、Ebhausen、Germany）を用いて移植前に１１分間４０秒のサイクルで表面を処理した（該当する場合には上記を参照）。
【０１０１】
移植
手術の日に、歯科インプラントを患者の顎骨内に配置した。この手順に従いインプラントの頂部に歯肉インプラント治癒アバットメントを配置し、インプラントを歯肉組織を貫通するように適所にねじ込む。したがって、治療アバットメントの一部はインプラント内部にあり、別の部分は歯肉組織と接触しており、上面は組織接触のない口腔内にあった。創傷を縫合して閉鎖し、少なくとも１２週間の期間にわたって治癒するために密接に接触させた。
【０１０２】
フォローアップ方法
治療アバットメントは１２〜１８週間臨床的に追跡された後、取り除かれた。
【０１０３】
治癒アバットメントは反時計回りにねじを緩めて除去された。除去されたアバットメントは移送の間ホルムアルデヒド固定溶液に入れられた。サンプルを乾燥させ、表面を覆う組織の量を走査型電子顕微鏡で調べた。接触領域を覆う組織の測定は、画像解析を用いて画像から行われた組織のエッジを画像上に描き、確定された総面積と比較した。組織は上面の隅の領域も覆っていた可能性があるが、接触領域の限界は、インプラント−アバットメントの境界面および治療アバットメントの上隅部として定義される。
【０１０４】
（ＳＥＭ画像）
全９サンプルの組織被覆率（the tissue coverage）について評価された結果を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
平均組織被覆率は、ゾル−ゲルコーティング表面（すなわち本明細書によるものではない）は３８．８％、ゾル−ゲル被覆およびＵＶまたはプラズマ処理表面では６５．５％、ＵＶまたはプラズマ処理されたチタンすなわち本明細書によるものではない）では２５．５％であった。さらに、ゾル−ゲルコーティングされた表面およびＵＶまたはプラズマ処理表面の開裂は明確に組織内で生じたが、ゾル−ゲルまたはＵＶまたはプラズマ処理それぞれ単独では、開裂は、組織内で部分的に、タンパク質層と組織との界面、ならびにアバットメント界面で部分的に生じた。本試験は、上記のトリプシン処理試験とは相違するものである。
【０１０７】
これらの結果は、組織付着の強度が、ナノ構造、結晶およびＵＶまたはプラズマ処理された表面で最大であることを示している。臨床的に最も重要な結果は、アバットメントが組織との接触を緩めるために歯肉組織が破裂しなければならないことである。ゾル−ゲルコーティング、またはプラズマまたはＵＶ処理された表面では、接触を緩めることを組織の破裂なしに部分的に達成されるため、細菌の侵入のためのゲートが存在する。したがって、この組織接着強度の差は、臨床的な結果に非常に深刻な影響を及ぼす。
【０１０８】
（元素分析）
組織構造の覆われていない表面領域には、薄い有機物の残骸があった。元素分析では、有機層が目に見えない他の領域と比較して、炭素のレベルが上昇していることが示された。これは、タンパク質の吸着およびコーティングされた表面上の接着性として解釈された。組織によって覆われた表面積は、酸化物または金属表面の上の有機物の透明な層として解釈された。図８は、試験表面の一つのマイクロスコープを示すが、異なる領域を見ることができ、図９Ａ〜９Ｃは、図８に示す３つの異なる点での元素分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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