(57)【要約】  試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を特異的に刺激する段階と、ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を測定する段階と、正常ＮＫ細胞対比で、ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を比較する段階と、を含むＮＫ細胞の活性度検査方法、及びＮＫ細胞の活性度検査用組成物に係わるものであり、また本発明は、該組成物を含むＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断用キットに係わるものである。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を特異的に刺激する段階と、
前記２個以上の因子の刺激により誘発された、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を測定する段階と、
正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を比較する段階と、
を含むＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項２】
前記方法は、前記試料のうち必要とするＮＫ細胞を分離する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項３】
前記因子は、細胞表面または細胞内に存在することを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項４】
前記因子は、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫｐ８０のうちから選択されたことを特徴とする請求項３に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項５】
前記刺激は、前記因子に同時にまたは順次になされることを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項６】
前記刺激は、前記因子のそれぞれまたはすべてに特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する化合物、及び可逆的または非可逆的な作用因子から選択される１以上によることを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項７】
前記因子に特異的な活性を誘発する標的細胞は、ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に対する抗体、その断片、及びそれらの組み合わせのうちから選択された１以上のものでコーティングされたものであることを特徴とする請求項６に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項８】
前記活性化程度を測定する段階は、前記因子の下位因子のリン酸化または発現程度、脱顆粒化活性、細胞毒性活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインの測定のうちから選択された１以上を含むことを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項９】
前記サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のうちから選択されたことを特徴とする請求項８に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項１０】
前記方法は、ＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断についての情報を提供するためのものであることを特徴とする請求項１に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項１１】
前記ＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患は、過敏性免疫疾患、自家免疫疾患、免疫不全疾患、免疫拒絶反応、組織球症、癌、二型糖尿病、寄生虫感染疾患及びウイルス感染疾患のうちから選択されたことを特徴とする請求項１０に記載のＮＫ細胞の活性度検査方法。
【請求項１２】
ＮＫ細胞のシナジー活性を起こす刺激物質として、前記ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子のそれぞれまたはすべてに特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する化合物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上を含むＮＫ細胞の活性度検査用組成物。
【請求項１３】
前記因子は、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫｐ８０のうちから選択されたことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出する物質として、前記因子の下位因子のリン酸化または発現程度、脱顆粒化活性、細胞毒性活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインの測定のうちから選択された１以上を検出するための抗体またはその断片をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出する物質は、パーフォリン、グランザイム、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のうちから選択された１以上に対する抗体、その断片、またはそれらの組み合わせのうちから選択された１以上であることを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を刺激し、前記ＮＫ細胞のシナジー活性を起こす刺激物質として、２個以上の因子のそれぞれまたはすべてに特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する化合物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上と、
正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞の活性化の存在または不在を検出する物質と、
を含むＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断用キット。
【請求項１７】
前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出する物質は、パーフォリン、グランザイム、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のうちから選択された１以上に対する抗体、その断片、またはそれらの組み合わせのうちから選択された１以上または蛍光染料であることを特徴とする請求項１６に記載の診断用キット。
【請求項１８】
前記因子に特異的な活性を誘発する標的細胞は、ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に対する抗体、その断片、及びそれらの組み合わせのうちから選択された１以上のものでコーティングされたことを特徴とする請求項１６に記載の診断用キット。
【請求項１９】
ＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患は、過敏性免疫疾患、自家免疫疾患、免疫不全疾患、免疫拒絶反応、組織球症、癌、二型糖尿病、寄生虫感染疾患及びウイルス感染疾患のうちから選択されたことを特徴とする請求項１６に記載の診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞の受容体シナジー活性を利用したＮＫ細胞の活性度を検査する方法、及びそれを利用したＮＫ細胞の活性と係わる疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ細胞（natural killer cell）は、先天的免疫系及び後天的（adaptive）免疫系に重要な細胞毒性リンパ球の一種類である。該ＮＫ細胞は、ウイルス感染された細胞や癌細胞に反応するが、典型的に、細胞表面のＭＨＣ（major histocompatibility complex）の異常現象を感知する。そのようなＮＫ細胞は、パーフォリン（perforin）を分泌し、感染細胞や癌細胞の細胞膜に孔を開け、そこにグランザイム（granzyme）を出し、その細胞を死滅させる細胞毒性を有する。Ｂ細胞腫患者及び多くの癌患者の場合、ＮＫ細胞の数や、抗癌活性に欠陥が発見されており、ＮＫ細胞の機能異常は、そのような癌の発生と密接な関連を有していると知られている（Annu. Rev. Immunol. 2013; 31: 227-258）。
【０００３】
該ＮＫ細胞の活性には、多様な活性化及び阻害性の受容体が関与（engage）する。支配的であると見なされる受容体のうちには、免疫受容体チロシン基盤活性モチーフ（ＩＴＡＭ：immunoreceptor tyrosine-based activation motif）関連信号伝逹分子（例えば、ＦｃＲγ鎖またはＴＣＲζ鎖）と係わるＮＫｐ４６、及び信号伝逹分子ＤＡＰ１０と係わる受容体ＮＫＧ２Ｄ（EMBO J. 2004; 23: 255.-9, Annu. Rev. Immunol. 2005; 23: 225-74) に係わるものなどがある。共同刺激性と見なされる受容体としては、２Ｂ４（ＣＤ２４４）のような信号伝逹リンパ球活性分子（ＳＬＡＭ：signaling lymphocytic activation molecule）ファミリーの構成員だけではなく、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＣＤ２及びＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１遺伝子産物）のような多様な受容体を含む。
【０００４】
ＩＴＡＭ関連分子は、ＮＫ細胞のさまざまに異なる性化受容体による信号伝逹に寄与するが、自然細胞毒性受容体（ＮＣＲ：natural cytotoxicity receptor）のうちＮＫｐ４６及びＮＫｐ３０は、ＦｃＲγ及び／またはＴＣＲζと係わり、一方、ＮＫｐ４４は、信号アダプター（adaptor）ＤＡＰ１２と関連する（EMBO J. 2004; 23: 255-9）。
【０００５】
血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ：hemophagocytic lymphohistiocytosis）は、単球（monocyte）または大食細胞（macrophage）の増殖を示す疾患であり、調節されない血球貪食現象と炎症性サイトカイン（cytokine）の過分泌現象とを示す。ここで、特に、免疫不全性Ｘ関連リンパ増殖症候群１（ＸＬＰ１：immunodeficiency Ｘ−linked lymphoproliferative disease１）は、ＨＬＨのような症状を示す疾患であり、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ：Epstein-Barr virus）に感染されて発病したり、先天的ＸＬＰ１の場合、ＳＡＰ蛋白質を作るＳＨ２Ｄ１Ａの突然変異が、ＸＬＰ１の遺伝的基盤を形成したりする。（Annu. Rev. Immunol. 2007; 25: 337-79, Annu. Rev. Immunol. 2011; 29: 665-705）。
【０００６】
２Ｂ４は、細胞質的末端（tail）に、ＩＴＳＭモチーフを含んでおり、小型アダプターＳＡＰ及びＳＡＰ関連チロシンキナーゼＦｙｎの募集を介した活性化信号を伝達する（J. Exp. Med. 202, 181-192 (2005), Immunity 36, 974-985 (2012)）。２Ｂ４の信号伝逹は、Ｖａｖ１、ｐ３８ ＭＡＰＫ、Ｅｒｋ及びＰＬＣ−ｇ２の活性化を導き出す（Nat. Immunol. 9, 495-502 (2008)）。注目する点は、機能的なＳＡＰ発現が不足した先天的ＸＬＰ１患者から得たＮＫ細胞において、２Ｂ４が活性されず、代わりに、抑制的信号を伝達することができるということである（Annu. Rev. Immunol. 25, 337-379 (2007)）。そのようなＮＫ細胞欠陥は、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染されたＢ細胞の殺害欠陥、ＩＦＮ−ｇ生産欠陥、電撃性単核症（fulminant mononucleosis）及びＢ細胞腫のような臨床的なＸＬＰ１の徴候に寄与すると考えられる。
【０００７】
一方、癌患者のＮＫ細胞において、抗癌受容体であるＮＫＧ２Ｄ（J. Immunol. 175, 5541-5550 (2005), Cancer Res. 69, 7775-7783 (2009)； J. Immunol. 189, 1360-1371 (2012)）、ＤＮＡＭ−１（Immunol. Cell Biol. 90, 109-115 (2012)）を介したＮＫ細胞活性化に欠陥が観察された。また、Ｂ型肝炎ウイルス感染患者のＮＫ細胞においても、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４の発現と機能とが低減していると知られている（PloS Pathog. 8, e1002594 (2012)）。
【０００８】
従って、ＨＬＨだけではなく、癌及びウイルス感染疾患においても、ＮＫ細胞活性も、検査を介して、前記疾患を診断しようとするが、ＮＫ細胞活性度を測定する既存の技術は、放射性同位元素または蛍光標識探針（probe）を利用したものであり、費用面や時間面において、臨床的適用に不適であり、ＮＫ細胞の活性度を簡便でであって迅速でありながらも、有意的に測定することができる方法が、多様な免疫関連疾患の早期診断及び予後判断に重要であると認識されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一様相は、試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を特異的に刺激する段階と、前記２個以上の因子に対する刺激に誘発された、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を測定する段階と、正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を比較する段階と、を含むＮＫ細胞の活性度検査方法を提供する。
【００１０】
他の様相は、ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を起こす刺激物質として、前記ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する組成物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上を含むＮＫ細胞の活性度検査用組成物を提供する。
【００１１】
さらに他の様相は、試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を刺激し、前記ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を起こす刺激物質として、２個以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する組成物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上；及び正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞の活性化の存在または不在を検出する物質を含むＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
一様相による試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を特異的に刺激する段階と、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を測定する段階と、正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を比較する段階と、を含むＮＫ細胞の活性度検査方法を利用し、既存に知られた技術より簡便であって迅速でありながらも、有意性あるように、ＮＫ細胞の活性度を検査することができ、ＮＫ細胞の活性と係わる疾患を容易に早期診断して予後判断することができる。
【００１３】
他の様相によるＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を起こす刺激物質として、前記ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する組成物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上を含むＮＫ細胞の活性度検査用組成物を利用し、ＮＫ細胞の活性と係わる疾患の早期診断、予後判断などのための方法を容易に遂行することができ、キットを容易に製造または利用することができる。
【００１４】
さらに他の様相による試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を刺激し、前記ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を起こす刺激物質として、２個以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する組成物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上；及び正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞の活性化の存在または不在を検出する物質を含むＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断用キットを利用し、既存に知られた技術より簡便であって迅速でありながらも、有意性あるように、ＮＫ細胞の活性と係わる疾患を早期診断または予後判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】区別される因子ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４を特異的に刺激した場合、ＮＦ−κＢ ｐ６５サブユニットのリン酸化程度に係わる流動細胞計測分析結果を示すグラフである。
【図２】区別される因子ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４を特異的に刺激した場合、ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを発現させる細胞の頻度に対する流動細胞計測分析結果を示すグラフである。
【図３】特定受容体を、単一刺激または共同刺激した場合、ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を細胞毒性として確認したグラフである。
【図４】健常人またはＸＬＰ１患者の供与者から獲得したＮＫ細胞を、区別される因子ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４で刺激した場合、ＮＫ細胞活性化と係わる因子の発現程度を示す図面である。
【図５】（Ａ）健常人またはＸＬＰ１患者の供与者から獲得したＮＫ細胞を、区別される因子ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４で刺激した場合、ＩＦＮ−γ発現程度を、流動細胞計測機によって分析した図面であり、（Ｂ）ＮＫ細胞に刺激を加えていない場合（ΔＩＦＮ−γ＋細胞）対比で、刺激を加えた場合（ＩＦＮ−γ＋ＮＫ細胞）、ＩＦＮ−γを発現するＮＫ細胞増加百分率を示すグラフである。
【図６】共同活性化に対するＸＬＰ１ＮＫ細胞の欠陥的細胞毒性脱顆粒化を示すものであり、（Ａ）健常人またはＸＬＰ１供与者から獲得したＮＫ細胞を、区別される因子ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４で刺激した場合、ＣＤ１０７ａの発現程度を、流動細胞計測機によって分析した図面であり、（Ｂ）ＮＫ細胞に刺激を加えていない場合（ΔＣＤ１０７ａ＋細胞）対比で、刺激を加えた場合（ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞）、ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の増加百分率を示す。
【図７】多様な血球細胞において、ＮＫＧ２Ｄ／２Ｂ４組み合わせの刺激による活性程度に係わる流動細胞計測分析結果を示す図面である。
【図８】ＮＫ細胞において、ＮＫＧ２Ｄ／２Ｂ４組み合わせの刺激による活性程度に係わる流動細胞計測分析結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一様相は、試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を特異的に刺激する段階と、前記２個以上の因子に対する刺激に誘発された、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を測定する段階と、正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を比較する段階と、を含むＮＫ細胞の活性度検査方法を提供する。
【００１７】
前記試料は、個体、例えば、ヒトを含んだ哺乳類などに由来した生物学的試料でもある。また、前記生物学的試料は、個体から分離されたものでもあり、血液、全血、血清、血漿、リンパ、小便、大便、組織、細胞、器官、骨髓、唾液、喀痰、脳脊髄液、またはそれらの組み合わせでもある。また、前記生物学的試料は、ＰＢＭＣ、精製されたＮＫ細胞、または一次性休止期の細胞（primary resting cell）（すなわち、血液から直ちに分離したもの）を含むものでもある。一具体例において、前記試料は、血液である。
【００１８】
前記用語「区別」は、細胞での位置、構造及び機能などにおいて、同等ではない全ての場合を含む。具体的には、刺激後、細胞内において誘発する信号伝逹過程を異ならせるか、細胞上の位置または因子それ自体が構造的に異なり、刺激手段または方法を異ならせなければならないか、あるいは単一刺激された場合、細胞内での役割が異なるか、効果的に有効に活性を起こすのに不足しているということを意味する。
【００１９】
前記用語「因子」は、ＮＫ細胞のシナジー活性化を起こす全ての分子的要素を意味する。具体的には、前記因子は、細胞内外の受容体、チャネル（channel）、並びに特異的なリガンドと結合することができる細胞内外のアダプター（adaptor）、蛋白質、糖蛋白質、ペプチド及びモチーフを含んでもよい。
【００２０】
一具体例において、前記因子は、受容体でもある。前記用語「受容体」は、特定物質と結合し、ＮＫ細胞の活性を変化させる全ての分子を言う。前記特定物質は、化学的組成物、体内由来または人工的な特定蛋白質、ペプチド、コレステロール、糖蛋白質を含み、他の免疫細胞またはＮＫ細胞自体によるサイトカインまたはケモキン、または標的細胞またはＮＫ細胞自体の特定受容体または膜蛋白質を含んでもよい。
【００２１】
一具体例において、前記因子は、細胞表面または細胞内に存在するものでもある。従って、例えば、前記因子が受容体である場合、ＮＫ細胞の細胞表面に位置し、特定物質と結合し、細胞内で信号伝達し、ＮＫ細胞の活性を起こす場合だけではなく、細胞膜を通過し、細胞膜内面または細胞質に存在する受容体であり、外部特定刺激物質と結合し、信号伝逹作用を起こすことができる全ての受容体を含む。
【００２２】
前記用語「刺激」は、因子に作用し、ＮＫ細胞内外の特定信号伝逹を起こすものを意味する。前記刺激を起こす方法は、前記因子の１以上に対して特異的な抗体、その断片、またはペプチド、特異的に誘導または抑制する組成物、及び可逆的または非可逆的な作用因子（agonist）または拮抗剤（antagonist）を利用することもでき、ＮＫ細胞を刺激することができる多様な標的細胞（例えば、Ｋ５６２、７２１．２２１、または特定受容体刺激抗体によってコーティングされたＰ８１５）を含む培養物と培養することを含んでもよい。
【００２３】
前記用語「シナジー」は、単一因子それぞれの効果は、ＮＫ細胞活性を効果的に有効に活性化させるのに不足するが、区別される各因子が同時または順次に共同刺激された場合、単一因子それぞれ刺激されたもの対比で、顕著に変化を誘発するか、あるいはＮＫ細胞活性を効果的に有効に活性化させることができることを意味する。従って、ＮＫ細胞の「シナジー活性」または「シナジー活性化」は、ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子をそれぞれ、及びそれらの組み合わせに対して特異的に刺激し、前記各因子、及びそれらの組み合わせに対する刺激による前記ＮＫ細胞の活性を測定し、前記各因子の刺激によるＮＫ細胞活性程度対比（望ましくは、前記各因子のうちさらに多く活性化されたＮＫ細胞活性程度対比）で、前記各因子の組み合わせの刺激によるＮＫ細胞活性程度が１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上である場合、シナジー活性が誘発されたと決定することができ、望ましくは、２倍以上である場合、シナジー活性が誘発されたと決定することができる。前記シナジー活性化程度は、本明細書に記載されているように、流動細胞計測分析、免疫ブロッティング（immunoblotting）などを利用し、下位因子のリン酸化または発現程度、脱顆粒化（degranulation）活性、細胞毒性（cytotoxicity）活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインを測定したものを基準に数値化させることができるが、それに制限されるものではない。
【００２４】
本発明のＮＫ細胞の活性度を検査する方法において、正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化を比較する段階は、具体的には、正常なＮＫ細胞を対照群として、実験群と同等な条件で、区別される２以上の因子をそれぞれまたは特定組み合わせで刺激したとき、正常なＮＫ細胞で示される相乗化された活性化現象が、実験群で顕著に高いか、示されないか、あるいはその程度が顕著に低い場合、非正常であると判断することを含む。また、単一因子を刺激した場合に比べ、共同刺激した場合、比較が容易であり、人為的にシナジー活性化を誘発し、そのデータを比較することによって判断することを含む。前記段階により、非正常的なＮＫ細胞と係わる疾患の病理学的徴候、ウイルス感染、癌細胞の存在、及び特定癌を判断し、前記疾病に対して予後予測することができる。前記「正常ＮＫ細胞」は、疾病を有さない個体が有するか、あるいはそのような個体に由来したＮＫ細胞を言い、前記疾病を有さない個体は、少なくともＮＫ細胞活性に影響を及ぼすと知られた身体的、遺伝的または外来的な条件を有さない。
【００２５】
一具体例において、前記方法は、前記試料のうち、必要とするＮＫ細胞を分離する段階をさらに含んでもよい。必要によっては、他の血球またはリンパ球と共に存在する中で、刺激後、前記段階がなされ、リンパ球としてＮＫ細胞のみを含む試料にするために、前記段階がなされた後、前記刺激する段階がなされもする。分離されＮＫ細胞の精製度、及びその試料の構成は、実験に必要なほどに多様でもある。該ＮＫ細胞は、必要によっては、試料で精製されたそのままを使用することができ、実験に適する条件または細胞量を確保するために、増殖させた後で使用することができる。
【００２６】
しかし、特定因子の組み合わせの場合、ＮＫ細胞に特異的であるので（実施例６）、本発明の方法において、前記ＮＫ細胞に特異的な因子の組み合わせを利用する場合、前記ＮＫ細胞を分離する段階は、必須でもない。
【００２７】
一具体例において、前記刺激は、前記因子に同時にまたは順次に行われもする。具体的には、前記因子に構造的に結合するか、あるいは前記因子を改造（modify）して刺激することができる。前記改造は、例えばリン酸化、ユビキチン化、スルホニル化、メチレーション（methylation）、パリレーション（parylation）または糖化（glycosylation）のような翻訳後の改造（post-translation modification）、または切断を含んでもよい。
【００２８】
一具体例において、前記因子は、ＩＴＡＭ含有信号伝逹分子（例えば、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０またはＮＫｐ４４など）、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＣＤ２及びＮＫｐ８０のうちから選択されたものでもある。Bryceson Ｙら（Blood 2006; 107: 159-166）及びKim ＨＳら（Immunity 2010; 32: 175-186）によれば、ＮＫ細胞シナジー活性化は、前記羅列された因子の多様な組み合わせによって可能であり、前記因子の組み合わせの例としては、２Ｂ４及びＤＮＡＭ−１、ＤＮＡＭ−１及びＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４及びＮＫＧ２Ｄ、または２Ｂ４、ＤＮＡＭ−１及びＮＫＧ２Ｄがあるが、それらに制限されるものではない。
【００２９】
一具体例において、前記刺激する段階において、前記刺激は、前記２個以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に誘導または抑制する化合物、及び可逆的または非可逆的な作用因子または拮抗剤のうちから選択された１以上によっても誘発される。前記因子に特異的な抗体またはその断片は、イソ型を含み、区別される２以上の因子に同時に結合することもできる。具体的には、前記区別される２以上の因子に同時結合する例として、ＣＤ２４４／２Ｂ４またはＣＤ２２６／ＤＮＡＭ−１でコーティングされたＰ８１５がある。前記作用因子または拮抗剤は、対象因子に対して構造的に特異的な性質を有する化合物でもあり、三次構造的に特異性を有するポリペプチドでもある。
【００３０】
一具体例において、前記因子に特異的な活性を誘発する標的細胞は、ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に対する抗体、断片及びそれらの組み合わせのうちから選択された１以上のものでコーティングされたものでもある。前記ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子は、前述の通りである。該抗体は、前記因子のイソ型に対する抗体でもあり、該断片は、抗体の断片として活性を起こすに十分な前記抗体の特定部分のみを含んでもよい。該コーティングは、下記実施例で敍述するように、標的細胞とのプリインキュベーション（preincubation）でも行われ、または架橋（cross-linking）技法を利用し、前記抗体、断片またはその組み合わせでコーティングすることができる。
【００３１】
一具体例において、前記活性化程度を測定する段階は、前記ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子の下位因子のリン酸化または発現程度、脱顆粒化活性、細胞毒性活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインの測定のうちから選択された１以上を含むものでもある。用語「下位因子」は、前記ＮＫ細胞上の因子が刺激される場合、影響を受けて発現が増大するか、あるいはリン酸化される細胞内蛋白質、または変化されるポリペプチドなどを意味するものであり、特に、リン酸化反応に係わる場合、前記下位因子は、基質（substrate）と同一意味でも使用される。
【００３２】
前記下位因子の発現程度は、例えば、刺激されたＮＫ細胞を溶解させた後、ＮＫ細胞活性化に関与する細胞内蛋白質のうち一つであるＥｒｋまたはｐＹ１７４−Ｖａｖ１に特異的な抗体を利用する従来周知の免疫ブロット（immunoblot）方式を利用して測定することができる。
【００３３】
前記脱顆粒化活性は、例えば、パーフォリン分泌（perforin）またはグランザイム（granzyme）分泌により、標的細胞の溶解を誘導することを意味し、それを、ＦＡＣＳを利用して分析することができる。具体的には、該試料で分離したＰＢＭＣ、あるいは純粋分離したＮＫ細胞を刺激した後、脱顆粒化と比例するＣＤ１０７ａ発現をフルオロクロム接合された抗体を利用して測定する方法を利用することができる。
【００３４】
前記細胞毒性活性は、例えば、ユウロピウム蛍光染料で標識されたＮＫ細胞を活性化させることができる標的細胞を含む培養物と培養した後、標的細胞溶解を介して排出された蛍光染料の量を、マイクロプレートリーダー（microplate reader）を利用して測定することができる。
【００３５】
一具体例において、前記サイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のうちから選択されるものでもある。前述のようなＮＫ細胞の免疫活性因子発現分析は、ＦＡＣＳ、細胞内サイトカイン染色またはＥＬＩＳＡなどを利用しても行われる。具体的には、フルオロクロム接合された特定抗体を利用してＮＫ細胞表面を染色した後、細胞を透過性化（permeabilization）させ、フルオロクロム接合された他の特定免疫活性因子（例えば、ＩＦＮ−γ）抗体で、前記サイトカインなどを染色し、ＮＫ細胞内の免疫活性因子の発現を測定する方法を利用することができる。
【００３６】
本発明の実施例によれば、サイトカイン分泌量または細胞毒性脱顆粒化程度において、患者に比べ、健常人は、２つの因子のうちさらに高く出たことを基準に、シナジー活性化を誘発した場合、２倍以上の差を示し、ＮＫ細胞のシナジー活性化を誘発した後で比較したときも、シナジー活性化されたサイトカイン分泌量または細胞毒性脱顆粒化程度の差において、２倍以上の差を示した。
【００３７】
従って、一具体例において、前記正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を比較する段階は、前記下位因子のリン酸化または発現程度、脱顆粒化活性、細胞毒性活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカイン分泌量程度の差が２倍以上、具体的には、２つの因子のうちさらに高く出たものを基準に、２倍以上である場合、前記試料において、ＮＫ細胞の活性が正常であると判断することができる。他の具体例において、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化されたサイトカイン分泌量または細胞毒性脱顆粒化程度の差が２倍以下、具体的には、正常ＮＫ細胞のシナジー活性化されたサイトカイン分泌量または細胞毒性脱顆粒化程度を基準に、２倍以下である場合、前記試料において、ＮＫ細胞の活性が非正常であると判断することができる。
【００３８】
本発明のＮＫ細胞の活性度検査方法は、ＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断に係わる情報を提供するのにも利用される。
【００３９】
本発明者らは、ＨＬＨ患者及び膵臓癌患者において、ＮＫ細胞の活性化は、誘発されることはされるが、健常人は、シナジー活性化程度が大きい一方、前記患者は、シナジー活性で失敗するか、あるいはその程度が顕著に低いということを見い出した。特に、シナジー活性化を誘発させて比較する場合、単にＮＫ細胞活性化を誘発させて比較することより、シナジー活性化を誘発させて比較することの方が、ＨＬＨまたは膵臓癌を診断するのに有意性を高め、さらに容易であって正確であるということを。従って、本発明のＮＫ細胞の活性度検査方法は、非正常的なＮＫ細胞シナジー活性を示す試料を区別し、ＨＬＨ及び膵臓癌を含んだＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断に係わる情報を提供するのに有用である。
【００４０】
一具体例において、前記ＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患は、非正常的なＮＫ細胞のシナジー活性度を示すものであり、例えば、過敏性免疫疾患、自家免疫疾患、免疫拒絶反応、免疫不全疾患、組織球症、癌、二型糖尿病、寄生虫感染疾患及びウイルス疾患でもある。前記過敏性免疫疾患は、喘息及び蓄膿症のうちから選択された１以上のものであるか、前記自家免疫疾患は、ループス、多発性硬化症（multiple sclerosis）、一型糖尿病及びリュウマチ関節炎のうちから選択された１以上のものであるか、あるいは前記組織球症は、ＨＬＨ、ＸＬＰ１及びＸＬＰ２のうちから選択されたいずれか１以上のものでもある。血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）は、第２群ランゲルハンス細胞組織球症、赤血球貪食性リンパ組織球増殖症（家族性、散発性）、感染関連性血球貪食症侯群、ウイルス関連性血球貪食症侯群、巨大リンパ節病症を伴った組織球症、または網状組織球症の意味を含んでもよい。前記「癌」は、腫瘍、血液癌または固形癌を含む意味であり、個体のＮＫ細胞のシナジー活性を損傷させたり、特定条件において、標的細胞としてＮＫ細胞のシナジー活性を起こさせたりしないものを含む。一具体例において、前記癌は、肺癌、肝臓癌、食道癌、胃癌、大腸癌、小腸癌、膵臓癌、黒色腫、乳癌、口腔癌、脳腫瘍、甲状腺癌、副甲状線癌、腎臓癌、子宮頸部癌、肉腫、前立腺癌、尿道癌、膀胱癌、睾丸癌、血液癌、リンパ腫、皮膚癌、乾癬及び線維腺症からなる群のうちから選択されたものでもある。一具体例において、前記癌は、膵臓癌またはＢ細胞腫（Ｂcell lymphoma）でもある。一具体例において、前記ウイルス疾患は、Ｂ型肝炎でもある。一具体例において、前記免疫不全疾患は、ディ・ジョージ症候群（DiGeorge synderome）またはチェディアック・ヒガシ症候群（Chedial-Higashi syndrome）でもある。
【００４１】
前記ＮＫ細胞の活性と係わる疾患に係わる情報は、正常ＮＫ細胞対比で、実験群ＮＫ細胞のシナジー活性化が検出されない場合、非正常的なＮＫ細胞と判断することができ、または、特定受容体に対してシナジー活性を喪失したＮＫ細胞が、標的細胞に対して非正常的にシナジー活性を起こしたり起こさなかったりする場合、前記標的細胞が、特定疾病と関連があると判断することができる。前記特定疾病の判断をさらに容易に行うために、前記標的細胞は、ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に係わる抗体、断片、及びそれらの組み合わせのうちから選択された１以上のものでコーティングする段階をさらに含んでもよい。
【００４２】
他の様相は、ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を起こす刺激物質として、前記ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する化合物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上を含むＮＫ細胞の活性度検査用組成物を提供する。
【００４３】
一具体例において、前記ＮＫ細胞上の因子は、ＮＫＧ２Ｄ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫｐ８０のうちから選択されたものでもある。
【００４４】
一具体例において、正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出するために、前記組成物は、前記因子の下位因子のリン酸化または発現程度、脱顆粒化活性、細胞毒性活性及びＮＫ細胞刺激によって分泌されたサイトカインの測定のうちから選択された１以上を検出するための抗体またはその断片をさらに含んでもよい。
【００４５】
一具体例において、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出する物質は、パーフォリン、グランザイム、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のうちから選択された１以上に対する抗体、断片、またはそれらの組み合わせのうちから選択された１以上のものでもある。
【００４６】
一具体例において、前記ＮＫ細胞の活性度検査用組成物は、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在の検出結果を視覚的に表示するための物質として、染料（dye）、蛍光染料、二次抗体、または生物学的または分子的な探針をさらに含んでもよい。
【００４７】
前記組成物で言及された用語または要素において請求されたＮＫ細胞の活性度検査方法に係わる説明で言及されたようなことは、請求されたＮＫ細胞の活性度検査方法で言及されたところと理解される。
【００４８】
さらに他の様相は、試料内のＮＫ細胞上において区別される２以上の因子を刺激し、前記ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を起こす刺激物質として、２個以上の因子に、それぞれまたは同時に、特異的な抗体またはその断片、特異的な活性を誘発する標的細胞またはポリペプチド、特異的に活性を誘導する化合物、及び可逆的または非可逆的な作用因子のうちから選択された１以上；及び正常ＮＫ細胞対比で、前記ＮＫ細胞の活性化の存在または不在を検出する物質を含むＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患の診断用キットを提供する。
【００４９】
一具体例において、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出する物質は、パーフォリン、グランザイム、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８及びＩＬ−１０のうちから選択された１以上に対する抗体、断片、またはそれらの組み合わせのうちから選択された１以上であるか、あるいは蛍光染料でもある。前記抗体、断片、またはそれらの組み合わせは、蛍光プローブで標識されたり標識されなかったりするものでもある。前記蛍光染料または蛍光プローブは、検出しようとする対象、前記対象の組み合わせまたは個数、所望波長、検出器などの条件によって多様であり、例えば、ペリデジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ：peridinin chlorophyll）、フィコエリスリン（ＰＥ：phycoerythrin）、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate）またはユウロピウムでもあるが、それらに制限されるものではない。本発明の実施例によれば、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに、蛍光プローブであるＦＩＴＣで標識することにより、二次的処理なしに、流動細胞計測機で、前記ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを直接検出することができる。また、本発明の実施例によれば、蛍光染料で染色した標的細胞（例えば、Ｐ８１５）に対するＮＫ細胞の活性化により、前記標的細胞が溶解されて排出される蛍光染料を測定することにより、ＮＫ細胞のシナジー活性化程度を測定することができる。従って、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在を検出する物質で蛍光染料を使用することは、細胞毒性を測定するのに、特に有利である。
【００５０】
一具体例において、前記ＮＫ細胞上の因子に特異的な活性を誘発する標的細胞は、ＮＫ細胞上において区別される２以上の因子に対する抗体、断片、及びそれらの組み合わせのうちから選択された１以上のものでコーティングされたものでもある。
【００５１】
一具体例において、前記ＮＫ細胞の活性度検査用キットは、前記ＮＫ細胞のシナジー活性化の存在または不在の検出結果を視覚的に表示するための物質として、染料、蛍光染料、二次抗体、または生物学的または分子的な探針をさらに含んでもよい。
【００５２】
一具体例において、前記ＮＫ細胞のシナジー活性と係わる疾患は、過敏性免疫疾患、自家免疫疾患、免疫拒絶反応、組織球症、癌、二型糖尿病、寄生虫感染疾患及びウイルス感染疾患のうちから選択されたものでもある。
【００５３】
前記キットで言及された用語または要素において請求されたＮＫ細胞の活性度検査方法、またはＮＫ細胞の活性度検査用組成物に係わる説明で言及されたようなことは、前記請求された方法または組成物で言及されたところと理解される。
【００５４】
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１．区別される因子であるＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化による正常ＮＫ細胞での相乗化された活性度の存在または不在の確認
【００５６】
１−１．ＮＫ細胞の獲得
峨山メディカルセンター、UCL Istitute of Child Health及びフィラデルフィア小児病院の機関審議委員会によって承認されたプロトコル下の告知に則り、健康な供与者、及びＸＬＰ１供与者からヒト血液試料を、研究を目的として採取した。密度勾配遠心分離機（リンパ球分離培地（ＬＳＭ：lymphocyte separation medium）（ＭＰ Biomedicals）を利用）により、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ：peripheral blood mononuclear cells）を血液試料から分離し、その過程を進める間、低温保存（cryopreserved）した。ヒトＮＫ細胞を、従来知られているように（Sci. Signal. 5, ra49 (2012)）、ＮＫ細胞分離キット（StemCell Technologies）を利用し、陰性選択（negative selection）により、ＰＢＭＣから精製した。それら細胞は、流動細胞計測法によって評価されたところにより、９７ないし９９％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。ヒトＮＫ細胞株であるＮＫＬ（Ｍ．Robertsonの寄贈）を１０％ ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び２００Ｕ／ｍｌ組み換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）で補充されたＲＰＭＩ１６４０で培養した。ＮＫＬ細胞を、ｒＩＬ−２なしに、２４時間、５％ ＦＢＳ及び０．５ｍＭピルビン酸ナトリウムで補充されたＲＰＭＩ１６４０で休止させた。
【００５７】
１−２．ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるＮＫ細胞の相乗化された活性の指標としてのＮＦ−κＢ ｐ６５サブユニットのリン酸化
ＮＫ−κＢは、先天的及び後天的な免疫反応において、調節子として重要な転写因子であり、ＮＫ−κＢサブユニットｐ６５ Ｓｅｒ５３６残基のリン酸化がなされる場合、ＮＫ細胞の活性が上昇する（Front Immunol. 2014; 5: 662）。従って、ＮＫ細胞の活性度因子でもって、一次休止期のＮＫ細胞内のＮＦ−κＢ ｐ６５サブユニットのリン酸化を測定した。
【００５８】
ＮＫ細胞の活性化を起こす特定因子を刺激するために、下記の受容体架橋を実施した。
【００５９】
精製されたヒト一次ＮＫ細胞またはＮＫＬ細胞を、３０分間、氷において、ＮＫ受容体（いずれも１０μｇ／ｍｌにおいて）に対して、ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４に特異的であるｍＡｂまたはイソ型対照群ｍＡｂ（ｃＩｇＧ１）とプリインキュベーションした。培地で洗浄した後、ＮＫ細胞を、５分間３７℃で、塩素抗マウスＦ（ａｂ’）２二次Ａｂで受容体架橋することによって刺激した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで、３７℃で１０分間固定させた。その後、固定された細胞を、９０％メタノールで３０分間、氷で透過性化させ（permeabilize）、０．５％ ＢＳＡで、室温で１０分間ブロッキングした。該細胞を、Alexa Fluor４８８接合された抗ｐＳ５３６ ｐ６５ Ａｂ（９３Ｈ１）またはイソ型対照群兎ＩｇＧ（ＤＡ１Ｅ）（Cell Signaling）で染色した後、ｐ６５リン酸化について、流動細胞計測分析機を利用して分析した。
【００６０】
その結果、図１から分かるように、反応する細胞の比率が、一次性ＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４に結合された刺激によって相乗化されるように上昇する一方、受容体単独に係わる反応は、共同活性化された場合より顕著に小さいということが分かった。
【００６１】
１−３．ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるＮＫ細胞の相乗化された活性の指標としての免疫活性因子測定
ＮＫ細胞が活性化される場合、免疫活性因子（または、サイトカイン）であるＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αなどを分泌する。従って、区別される特定因子の共同活性化により、サイトカインの分泌量が相乗化されるように増加するか否かということををテストした。
【００６２】
前述のように、ＮＫ細胞を採取し、ＮＫＧ２Ｄ及び／または２Ｂ４に特異的なｍＡｂまたはイソ型対照群ｍＡｂにプリインキュベーションしたＰ８１５細胞（American Type Culture Collection）でＰＢＭＣを刺激した。その後、６時間インキュベーションし、細胞表面マーカーをＣＤ３及びＣＤ５６で染色した。ＮＫ細胞によるサイトカイン生産を、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αの細胞内発現を、流動細胞計測機でもって測定した。具体的には、ＰＢＭＣ、または一次休止期のＮＫ細胞を、同一数の指定された標識細胞で、１時間３７℃で刺激した。その後、ブレフェルジンＡ（brefeldin Ａ）（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ，ＢＤ Bioscience）を添加し、総６時間に対するさらなる５時間のインキュベーションを行った。その後、細胞を、４℃暗室で、３０分間抗ＣＤ５６−ＰＥ及び／または抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ ｍＡｂｓで表面マーカーを染色した。ＦＡＣＳ緩衝液で、２回細胞を洗浄した後、それらをＢＤ Cytofix／Cytoperm溶液（ＢＤ Bioscience）で、２０分間暗室４℃でインキュベーションした。４℃暗室で、３０分間、抗ＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣまたは抗ＴＮＦ−α−ＦＩＴＣ ｍＡｂで細胞内染色した前後、細胞をＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Bioscience）で２回洗浄した。その後、細胞を、ＮＫ細胞に対してゲーティングし、流動細胞計測機によって分析した。
【００６３】
その結果、図２から分かるように、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同関与（coengagement）は、免疫活性因子であるＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを発現するＮＫ細胞の比率において、相乗化された上昇を誘発するということが分かった。
【００６４】
それらをいずれも総合すれば、そのような結果は、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４それぞれの単一な刺激では、ＮＦ−κＢ活性化をＮＫ細胞活性に有効に刺激するのにおいて、十分ではなく、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化を加えた場合、ＮＦ−κＢ活性化に対する臨界点（threshold）を克服し、ＮＫ細胞による相乗化されたサイトカイン生成を誘発するということを示す。
【００６５】
各グラフは、３回以上の独立した実験によって作製された。結果は、平均±ＳＤとして示されている。統計的分析は、GraphPad Prism softwareを利用し、両側スチューデントｔ−検定（two-tailed student’s t-test）によって行われた。
【００６６】
実施例２．区別される因子の共同活性化によるＮＫ細胞の相乗化された活性の指標としての細胞毒性測定
前記ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化により、免疫活性因子であるＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−αを発現するＮＫ細胞の比率で相乗化された上昇が誘発されるということを観察したように、相乗化された活性（シナジー活性）を測定する一方法として、細胞毒性においても、相乗化された上昇が誘発されるか否かということをテストした。
【００６７】
Ｐ８１５細胞を、ＣＤ５６、ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ並びに／または２Ｂ４、ＤＮＡＭ−１及び／または２Ｂ４に特異的なｍＡｂまたはイソ型対照群ｍＡｂでプリインキュベーションし、前記ＮＫ細胞特定受容体刺激抗体でコーティングされたＰ８１５を、ユウロピウム蛍光染料で標識した。その後、前述のように、一次性休止期ＮＫ細胞を、前記Ｐ８１５細胞で共に培養することによって刺激した。その後、遠心分離を介して培養液を回収し、細胞毒性の一指標である標的細胞溶解（lysis）を介して排出された蛍光染料量を測定した。前記培養液内の蛍光程度は、マイクロプレートリーダーを介して分析した。
【００６８】
その結果、図３から分かるように、ＣＤ１６が例外的に単一に強い細胞毒性を誘発したが、ＮＫＧ２Ｄ＋２Ｂ４及びＤＮＡＭ−１＋２Ｂ４に刺激された場合は、それぞれ刺激された場合に比べ、相乗化された細胞毒性を誘導するということが分かった。例外的な場合もあるが、それは、特定受容体刺激（例えば、前述のように、特定受容体刺激抗体の利用）として排除することができるので、区別される２つの因子を特異的に刺激し、シナジー活性測定を実現するだけではなく、単一に刺激する場合に比べ、同時刺激して誘発されたシナジー活性がＮＫ活性度を比較するのに顕著な差を有し、区別しやすいということを確認した。
【００６９】
実施例３．健常人及びＸＬＰ１患者のＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化による特定因子発現の相乗化された差を利用したＮＫ細胞活性度比較
区別される因子ＮＫＧ２Ｄ及び因子２Ｂ４を特異的に共同活性化させ、ＮＫ細胞の相乗化された活性（シナジー活性）を誘発することができることを確認した。従って、そのような相乗化された活性の存在または不在を利用し、ＨＬＨ疾患であるＸＬＰ１患者を診断することができるか否かということを確認するために、特定因子発現の相乗化された差を見ることができるウエスタンブロット（western blot）を行った。
【００７０】
３−１．ＸＬＰ１患者のＮＫ細胞獲得
前述のように、ＸＬＰ１の患者からＮＫ細胞を供与された。そこには、先天的ＸＬＰ１の対象として、遺伝性ＳＨ２Ｄ１Ａ遺伝子突然変異患者を含んでいる。患者ＮＫ細胞の供給限界のために、ＸＬＰ１患者のＮＫ細胞を、ＮＦ−κＢ活性化、及び効果子（effector）機能に対する分子的信号伝逹を研究するために、前述のように増殖させた。健常人である供与者のＮＫ細胞も増殖させ、休止期を経た後、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４で刺激し、効果子機能及び信号伝逹での相乗化された上昇を再生産させた。
【００７１】
ＸＬＰ１患者のＮＫ細胞が、疾患の指標になるか否か、ウエスタンブロットを行った。従来の公知（Nat. Rev. Immunol. 6, 56-66 (2006)）によれば、ＳＡＰは、２Ｂ４を含み、免疫刺激による活性化信号を送信するのに要求される受容体アダプター蛋白質であるが、ＸＬＰ１患者の場合、ＮＫ細胞内ＳＡＰ発現量が枯渇しているか、あるいは低減していると知られている。健常人またはＸＬＰ１患者の供与者から増殖された一次性ＮＫ細胞の総溶解物を、ＳＡＰ及びアクチンに対してウエスタンブロットし、その発現量を調べた結果、実験された４人のＸＬＰ１患者のうち、３人の患者が、ＳＡＰ発現の完全な損失を誘発するＳＨ２Ｄ１Ａ遺伝子に、マクロ欠損（macrodeletion）を有しており、１人の患者は、ＳＡＰ発現が低減しているが、完全に消失していないミスセンス（missense）突然変異を有していることを確認した。
【００７２】
３−２．Ｅｒｋ、及びリン酸化されたｐ６５の相乗化された発現程度の比較
正常ＮＫ細胞と、ＸＬＰ１患者のＮＫ細胞において、活性度差をウエスタンブロットを利用して比較した。具体的には、健常人またはＸＬＰ１患者の供与者から増殖させた後の一次性休止期ＮＫ細胞を、指定された受容体に対して特異的なｍＡｂまたはイソ型対照群ｍＡｂ（ｃＩｇＧ１）と共にプリインキュベーションした。２分間（ｐ−Ａｋｔ及びｐ−Ｅｒｋ１／２）及び５分間（ｐＳ５３６−ｐ６５及びｐＳ２７６−ｐ６５）、受容体を架橋した後、溶解物を、指定されたリン酸化で免疫ブロットした。その結果、図４から分かるように、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４がそれぞれ刺激された場合、ＮＫ細胞の活性指標であるＮＦ−κＢ活性化によるｐ６５のリン酸化が観察されることはされるが、その程度が、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるシナジーリン酸化に比べて顕著に区別されるものではない。一方、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるｐ６５のセリン５３６及びセリン２７６のシナジーリン酸化は、ＸＬＰ１ ＮＫ細胞において顕著に低減するということを確認することができる。それは、共同活性化によって誘導されたＥｒｋの相乗化されたリン酸化において、また同様に示され、ＸＬＰ１ＮＫ細胞において、頂上に比べて顕著に低減しているということが分かる。従って、ＸＬＰ１診断において、それぞれの区別される因子を刺激し、ＮＫ細胞の活性度を測定するより、共同活性化させた場合、その差が顕著に観察されるので、ＮＫ細胞の区別される因子を共同活性化させることによって誘発される相乗化された活性度を基準に、ＸＬＰ１を診断することが有利であると分かる。
【００７３】
実施例４．健常人及びＸＬＰ１患者のＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるＩＦＮ−γ発現量での相乗化された差を利用したＮＫ細胞活性比較
ＸＬＰ１診断に区別される２つの因子の刺激による相乗化された活性（シナジー活性）を比較することがさらに有利であるか否かということを調べるために、免疫活性因子のうち一つであるＩＦＮ−γの発現量を比較する試験を行った。具体的には、健常人またはＸＬＰ１患者の供与者から増殖させた後の一次性休止期ＮＫ細胞を、指定された受容体に特異的なｍＡｂとプリインキュベーションしたＰ８１５細胞と混合した。６時間インキュベーションした後、ＣＤ５６に対するフルオロクロム接合されたｍＡｂで染色し、ＩＦＮ−γで細胞内染色した後、前記敍述されたように、流動細胞計測機によって分析した。
【００７４】
その結果、図５から分かるように、ＣＤ１６刺激は、ＸＬＰ１でのＮＫ細胞活性化において意義を有さないにしても、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の結合された刺激によってＩＦＮ−γを発現するＮＫ細胞の比率が、ＸＬＰ１ＮＫ細胞において顕著に低下するということが分かった。その差は、図５Ｂでのように、指定された受容体で刺激した後、刺激がない細胞（ΔＩＦＮ−γ＋細胞）対比で、ＩＦＮ−γ＋ＮＫ細胞対比で指定された受容体で刺激した後、それぞれの健常人またはＸＬＰ１患者の供与者からのＩＦＮ−γ＋ＮＫ細胞の上昇百分率で測定した。ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４をそれぞれ単一に刺激したことに比べ、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同結合された刺激による相乗化された活性度がさらに顕著であり、明らかに差があるということが分かる。それはまた、単一な刺激後に比較することに比べ、相乗化された活性化を起こした後で比較することがさらに有為であるように判断することができるという証拠を提示する。
【００７５】
要約すれば、前記結果は、健常人及びＸＬＰ１患者のＮＫ細胞での遺伝的及び分子的な差が共同活性化刺激に対する結果と一致するということを証明しながら、ＸＬＰ１の診断に、前記実験に適用された因子の動態を判断することが十分な根拠を有するということを示し、診断において、単一因子を刺激することに比べ、相乗化された活性化を誘発することができる２以上の因子を刺激することにより、それによる相乗化された活性度を比較することがさらに有意にＸＬＰ１を診断することができる方法になる可能性があるということを示す。それだけではなく、そこで示される特定因子（Ｅｒｋ）でのみ示される相乗化されたリン酸化、特定受容体組み合わせ（ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４）による相乗化された活性化結果は、特定受容体の特異的な共同活性化を介して、少なくともＸＬＰ１、及び関連臨床予後予測を診断するのに適するということを証明する。
【００７６】
各グラフは、３回以上の独立した実験によって作製された。結果は、平均±ＳＤとして示されている。統計的分析は、GraphPad Prism softwareを利用し、両側スチューデントｔ−検定によって行われた。
【００７７】
実施例５．健常人及びＸＬＰ１患者のＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化による脱顆粒化での相乗化された差を利用したＮＫ細胞活性比較
ＮＫ細胞の活性指標のうち一つの脱顆粒化と比例するＮＫ細胞表面でのＣＤ１０７ａの発現程度を測定することにより、区別される２つの因子の刺激によって発生する相乗化された効果の差において、ＸＬＰ１を診断することができるか否かということを調べた。
【００７８】
ＮＫ細胞の脱顆粒化は、細胞表面のＣＤ１０７ａ発現及びグランザイムＢ放出（BioLegend）によって評価した。要約すれば、前述のように、健常人及びＸＬＰ１患者の一次性休止期ＮＫ細胞を増殖させた後、フルオロクロム接合された抗ＣＤ１０７ａｍＡｂ存在下で、指定された受容体に対して、特異的なｍＡｂとプリインキュベーションしたＰ８１５と混合した。その後、２時間インキュベーションし、細胞を流動細胞計測機を利用して分析した。具体的には、３０ｘｇで、３分間スピンダウンし、３７℃で二時間インキュベーションし、さらにスピンダウンした。細胞ペレット（pellet）を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）に再懸濁し、抗ＣＤ５６−ＰＥで、４℃で３０分間暗室で染色した。リンパ球を、前方散乱（forward scatter）／側傍散乱（side scatter）でゲーティングし、ＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａ発現を、流動細胞計測機及びFlowJo softwareでもって分析した。
【００７９】
その結果、図６Ａから分かるように、ＣＤ１６を刺激した場合には、相乗化された活性度の一側面である脱顆粒化において、正常ＮＫ細胞と顕著な差が観察されなかったが、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の結合された刺激によっては、顕著な差が示される脱顆粒化が誘導されるということを観察することができる。ここでまた、前記免疫活性因子であるＩＦＮ−γを測定した場合と同様に、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４をそれぞれ単一に刺激して比較するより、共同活性化による相乗化された活性度を誘発した後、その顕著な差の存在または不在を判断することが、診断方法としてさらに有意に意義を有するということが分かる。それは、刺激がない細胞であるΔＣＤ１０７ａ＋細胞対比で、ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の百分率を示す図６Ｂグラフでさらに明らかに確認することができる。
【００８０】
実施例６．ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるＮＫ細胞活性の特異性評価
ＮＫＧ２Ｄ／２Ｂ４組み合わせを利用したシナジー測定が、他の細胞においても、ＮＫ細胞にだけ特異的であるか否かということを確認するために、ＮＫ細胞の活性指標のうち一つである脱顆粒化と比例するＮＫ細胞表面におけるＣＤ１０７ａの発現程度を測定した。
【００８１】
具体的には、健常人の単核球（ＰＢＭＣ）を、フルオロクロム接合された抗ＣＤ１０７ａｍＡｂ存在下で、指定された受容体に対して特異的なリガンド（ＮＫＧ２Ｄに対してＵＬＢＰ１、及び２Ｂ４に対してＣＤ４８）を発現するＰ８１５細胞と混合した。その後、実施例５でのように、各細胞ペレットを得て再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ５６−ＰＥで、４℃で３０分間、暗室で染色した。リンパ球を、前方散乱／側傍散乱でゲーティングし、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）、ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）、残り細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６−）のＣＤ１０７ａ発現を、流動細胞計測機及びFlowJo softwareでもって分析した。
【００８２】
その結果、図７から分かるように、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４を、それぞれ単一に刺激した場合には、ＮＫ細胞を含んだ他の細胞いずれにおいても、脱顆粒化が観察されなかったが、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の結合された刺激によっては、ＮＫ細胞特異的に顕著な差を示す脱顆粒化が誘導されるということを観察することができた。従って、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４をそれぞれ単一に刺激して比較するより、共同活性化による相乗化された活性度を誘発すれば、ＮＫ細胞に特異的に活性化を誘導し、診断方法として、さらに有意に意義を有するということが分かる。
【００８３】
実施例７．癌患者におけるＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の共同活性化によるＮＫ細胞シナジー活性比較
ＮＫＧ２Ｄ／２Ｂ４組み合わせを利用したシナジー測定が、癌診断に適用可能であるか否かということを調べるため、膵臓癌患者試料を利用し、ＮＫ細胞の活性指標のうち一つである脱顆粒化と比例するＮＫ細胞表面でのＣＤ１０７ａの発現程度を測定した。
【００８４】
具体的には、健常人及び膵臓癌患者の単核球（ＰＢＭＣ）を、フルオロクロム接合された抗ＣＤ１０７ａｍＡｂ存在下で、指定された受容体に対して特異的なリガンド（ＮＫＧ２Ｄに対してＵＬＢＰ１、及び２Ｂ４に対してＣＤ４８）を発現するＰ８１５細胞と混合した。比較群として、ＮＫ細胞活性度測定に活用される血液癌細胞株であるＫ５６２を使用した。その後、実施例５でのように、各細胞ペレットを得て再懸濁し、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ５６−ＰＥで、４℃で３０分間、暗室で染色した。リンパ球を、前方散乱／側傍散乱によってゲーティングし、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）におけるＣＤ１０７ａ発現を、流動細胞計測機及びFlowJo softwareでもって分析した。
【００８５】
その結果、図８から分かるように、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の結合された刺激によっては、健常人と膵臓癌患者とで顕著な差が示されるＮＫ細胞の脱顆粒化が誘導されるということを観察することができ、従って、ＮＫＧ２Ｄ／２Ｂ４組み合わせを利用したシナジー測定が、癌診断に適用可能であるということが分かる。
【００８６】
特異的なことは、比較群であるＫ５６２でＮＫ細胞を刺激した場合には、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４を特異的に刺激した場合と異なり、健常人と膵臓癌患者とにおいて、ＮＫ細胞の脱顆粒化誘導にに特に差がないということが分かった。従って、ＮＫＧ２Ｄ及び２Ｂ４の結合された刺激のように、ＮＫ細胞上に特異的な因子の刺激によるシナジー活性化は、Ｋ５６２を使用するより、ＮＫ細胞活性度診断方法としてさらに有意に意義を有するということが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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