(57)【要約】  消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせ、初期化方法および適用が提供される。ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）は創始細胞として使用され、ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）は栄養膜細胞として使用され、ＦＢＰ、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、Ｂｉｘ０１２９４、ＳＢ４３１５４２またはＡ８３−０１、ＶＰＡ、ＲＧ１０８、ＰＤ０３２５９０１およびＰＳ４８（ＳＢまたはＡ８３を含む）の全てまたは複数を有する化合物の組み合わせが、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するために使用され、内胚葉幹細胞／前駆細胞は、肝細胞、膵臓ベータ細胞および腸細胞への分化を誘導するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせであって、前記低分子化合物が、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、エピジェネティック修飾因子、Ｃａ２＋チャネル活性化因子および代謝調節因子および同様の機能的な群からなる群から選択され；一般的には、ＦＢＰ、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）またはＡ８３−０１（Ａ８３）、ＶＰＡ、ＲＧ１０８（ＲＧ）、ＰＤ０３２５９０１およびＰＳ４８（ＳＢまたはＡ８３を含む）の全てまたは複数の組み合わせを含む、８個の低分子化合物（８Ｍ）を含む組み合わせである、低分子化合物の組み合わせ。
【請求項２】
８個の低分子化合物を含む前記組み合わせが、５０：１２５００：１２．５：１：１２．５：５０：１２５：８７５００のモル比のＳＢ４３１５４：ＶＰＡ：ＰＤ０３２５９０１：ＲＧ１０８：Ｂｉｘ０１２９４：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４：ＰＳ４８：ＦＢＰの組み合わせ；または１２．５：１２５００：１２．５：１：１２．５：５０：１２５：８７５００のモル比のＡ８３：ＶＰＡ：ＰＤ０３２５９０１：ＲＧ１０８：Ｂｉｘ０１２９４：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４：ＰＳ４８：ＦＢＰの組み合わせである、請求項１に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項３】
４個の低分子化合物を含む組み合わせが、ＢＢＲＳ組み合わせと呼ばれるＢｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）、またはＢＢＲＡ組み合わせと呼ばれるＡ８３−０１（Ａ８３）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）である、請求項１に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項４】
前記組み合わせ中の各化合物が、１〜１０μＭのＳＢ４３１５２、０．４〜１μＭのＡ８３、０．０１〜１μＭのＲＧ１０８、０．１〜２μＭのＢｉｘ０１２９４、１〜４μＭのＢａｙ  Ｋ  ８６４４の濃度で使用される、請求項３に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項５】
前記ＢＢＲＳ組み合わせが、５０：１：１２．５：５０のモル比のＳＢ：ＲＧ：Ｂｉｘ：Ｂａｙの各化合物の組み合わせであり、前記ＢＢＲＡ組み合わせが、１２．５：１：１２．５：５０のモル比のＡ８３：ＲＧ：Ｂｉｘ：Ｂａｙの各化合物の組み合わせであり；好ましくは各化合物が、２μＭのＳＢ４３１５２、０．５μＭのＡ８３、０．０４ＭのＲＧ１０８、０．５μＭのＢｉｘ０１２９４および２μＭのＢａｙ  Ｋ  ８６４４の濃度で使用される、請求項３または４に記載の低分子化合物の組み合わせ。
【請求項６】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化キットであって、請求項１〜５の何れか１項に記載の低分子化合物の組み合わせおよび前記化合物の使用のための説明書を含み；各化合物が個別に包装されるか、または各化合物が、８Ｍ組み合わせもしくはＢＢＲＳ組み合わせもしくはＢＢＲＡ組み合わせで混合および包装され、使用される各化合物の濃度が前記説明書に記載される、初期化キット。
【請求項７】
栄養膜細胞およびその使用のための説明書をさらに含み、前記栄養膜細胞が、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞などの消化管由来間質細胞である、請求項６に記載の初期化キット。
【請求項８】
基本培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、細胞培養のための基本的なさらなる構成成分、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）および抗生物質（ＳＰ）およびその使用のための説明書をさらに含み、グルタミンが、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して２ｍＭ（１ｘ）の濃度で使用され、前記抗生物質がペニシリン−ストレプトマイシンであり、ペニシリンが１００Ｕ／ｍＬの濃度で使用され、ストレプトマイシンがＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用され、各物質が個別に包装されるか、または挙げられた濃度に従い混合される、請求項６または７に記載の初期化キット。
【請求項９】
請求項１〜５の何れか１項に記載の低分子化合物の組み合わせを、請求項８に記載のように、基本培地および細胞培養のための基本的なさらなる構成成分とブレンドすることによって調製される、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化培地。
【請求項１０】
２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５４または０．５μＭ  Ａ８３−０１、０．５ｍＭ  ＶＰＡ、０．５μＭ  ＰＤ０３２５９０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、５μＭ  ＰＳ４８、３．５ｍＭ  ＦＢＰを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される、請求項９に記載の初期化培地。
【請求項１１】
２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１〜１０μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；好ましくは、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される、請求項９に記載の初期化培地。
【請求項１２】
２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．４〜１μＭ  Ａ８３−０１、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；好ましくは２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．５μＭ  Ａ８３−０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される、請求項９に記載の初期化培地。
【請求項１３】
胃上皮細胞および十二指腸上皮細胞、好ましくは胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、最も好ましくはＮＣＡＭ陽性ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を含む消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための、請求項１〜５の何れか１項に記載の低分子化合物の組み合わせ、または請求項６もしくは７もしくは８に記載の初期化キット、または請求項９〜１２の何れか１項に記載の初期化培地の適用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の適用の１つとしての、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための方法であって、以下、
１）創始細胞として単離初代消化管由来上皮細胞を使用して、前記消化管由来上皮細胞を増殖させ、培養する工程；
２）前記栄養膜細胞をマイトマイシン−Ｃで処理し、洗浄し、後で使用するために酵素で前記細胞を消化する工程；
３）工程２）で調製した前記栄養膜細胞を、工程１）で増殖させ、培養した前記消化管由来上皮細胞に添加し、一晩同時培養を継続する工程；
４）第２日に初期化培地に交換し、２〜３日ごとに前記培地を交換し、７〜１５日間培養して、誘導性内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のクローンを得る工程
を含む、方法。
【請求項１５】
工程１）における前記創始細胞が、胃上皮細胞および十二指腸上皮細胞を含む消化管由来上皮細胞、好ましくは胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、特に好ましくはＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）陽性胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）であり；
工程１）において、ＮＣＡＭ陽性胃上皮細胞が好ましくは創始細胞として使用され、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間、３７℃にてＫｕｂｏｔａ培地中で培養される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程２）における前記栄養膜細胞が、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞を含む消化管由来間質細胞、好ましくはヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）であり；
工程２）において、ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を好ましくはマイトマイシン−Ｃで２〜３時間処理し、前記細胞をＰＢＳで洗浄し、前記細胞をＴｒｙｐＬＥ酵素で消化する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程３）において、工程２）で調製した前記栄養膜細胞を好ましくは１〜３ｘ１０５個／ｃｍ２の密度で、工程１）で５日間にわたり培養した前記消化管由来上皮細胞に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩（１２〜１６時間）３７℃にて培養する、請求項１４または１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７の何れか１項に記載の方法によって得られる内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）。
【請求項１９】
内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の継代のための方法であって、以下：
１）継代前の準備：ウェルプレートにマイトマイシン−Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）で処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を播種するか、または約３時間前に前記ウェルプレートにおいてフィブロネクチン（ＦＮ）、Ｃｅｌｌ−ＴＡＫ（ＣＴ、細胞組織接着剤）ゲルをコーティングし、室温で乾燥させる工程；
２）継代用培地の調製：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋ＡＷＦ（Ａ８３−０１  ０．５μＭ＋Ｗｎｔ３ａ  ５０ｎｇ／ｍＬ＋ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ）またはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋Ａ（Ａ８３−０１、０．５μＭ）；
３）内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のクローンを拾い、それらを約１：３〜４の比率で小片に分割し、それらを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃のＦＮ＋ＡＷＦ、ＣＴ＋ＡＷＦまたは栄養膜［栄養膜細胞、マイトマイシン−Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）で処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）］＋Ａ培地に入れ、継代した内胚葉幹細胞／前駆細胞を得るために継代培養する工程
を含む、方法。
【請求項２０】
肝臓細胞、膵臓β細胞および腸細胞への分化誘導のための、請求項１８に記載の内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）または請求項１９に従い得られた継代内胚葉幹細胞／前駆細胞の適用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞工学技術の分野に属し、特異的な低分子化合物の組み合わせ、初期化キット、初期化で使用される初期化方法および実質細胞への分化をさらに誘導するための内胚葉幹細胞／前駆細胞の適用を含む、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞技術は、雑誌「Ｎａｔｕｒｅ」および「Ｓｃｉｅｎｃｅ」により２１世紀のライフサイエンスにおける最も有望な技術と評価されている。これは、従来からの医学的処置では力の及ばない重篤な疾患を克服する新しい医療技術である。幹細胞の自己再生および多能性分化の潜在力ゆえに、これは臓器再生、疾患モデリング、発生生物学および創薬の分野で広く使用される。幹細胞理論および技術研究は、この１０年間にわたり急速な発展を達成しており、これは、新しい疾患処置法となり、医学的処置のパラダイムシフトを促進し、新しい医学的革命につながると予想される。幹細胞に対しては多くの異なる分類法がある。発生学の視点から、幹細胞は大まかに２つのカテゴリー：胚性幹細胞（ＥＳＣ）および成体幹細胞（ＡＳＣ）に分類される。ＥＳＣは、胚盤胞期の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来し、無限に自己再生し、ヒト身体の全ての細胞型へ分化する多能性幹細胞である。１９９８年に、Ｔｈｏｍｓｏｎは、世界で初めてヒト胚性幹細胞株（ｈＥＳＣ）を樹立した［Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ，Ｓｈａｐｉｒｏ  ＳＳ，Ｗａｋｎｉｔｚ  ＭＡ，Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ  ＪＪ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＶＳら、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８；２８２：１１４５−７］。これは成体における全ての細胞型を生成させ得るので、理論的には、基礎研究、疾患処置および創薬のための理想的な細胞供給源を提供し得る。ここ数年間にわたるＥＳＣの使用によって、心筋細胞、神経細胞、血液細胞および肝臓細胞を含め、様々な機能的細胞が生み出されてきた［Ｍｕｒｒｙ  ＣＥ，Ｋｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ＆＃ｘａ０；Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｒｅｌｅｖａｎｔ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ．１３２：６６１−８０］。しかし、ＥＳＣの使用により直面する国際的な倫理的問題およびＥＳＣ由来細胞により生じる移植後の免疫拒絶および未分化ＥＳＣにより形成される奇形腫などの多くの問題により、ＥＳＣの臨床応用は大きく制限される。造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝臓幹細胞および神経幹細胞などの成体幹細胞は、出生後の様々な段階で様々な組織に存在する。ＡＳＣは、ある一定の自己再生能を有し、それらの起源の組織に関連する成熟細胞に分化し得る。これらは成体組織に由来し、特異的な系列にのみ分化し得、これらは奇形腫のリスクがなく、倫理的問題がないので、これらは臨床疾患処置のための良好なシード細胞である。しかし、ヒト組織からのみ単離され得るＡＳＣの細胞供給源の欠乏およびそれらの系列中の１つまたはいくつかの成熟細胞型しか生成させ得ないＡＳＣの分化能の制限およびＡＳＣのインビトロでの増殖能が限定的であることから、ＡＳＣの臨床応用は大きく妨げられている。ここ数年にわたり、多くの研究が、疾患処置、創薬および機序研究のためのより望ましい細胞型の発見に焦点を当ててきた。
【０００３】
従来のエピジェネティックな観点は、細胞の系列特定化および分化は一方向性であり、不可逆的な過程であり、多能性細胞の細胞運命は最終的な成熟細胞にのみ特異化され得るという考え方を有する（Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎのエピジェネティック・ランドスケープ）。誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出現はこの概念を大きく変化させた。２００６年に、山中らは、４個の多能性関連転写因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４およびｃ−ＭＹＣ（ＯＳＫＭ）を使用して線維芽細胞をＥＳＣ様多能性幹細胞ｉＰＳＣに変換することに成功したが、これにより、多能性関連転写因子の作用下で最終分化した細胞が多分化能を回復し得ることが初めて明らかになった。これは古典的な初期化技術である。［Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．１２６：６６３−７６．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｔａｎａｂｅ  Ｋ，Ｏｈｎｕｋｉ  Ｍ，Ｎａｒｉｔａ  Ｍ，Ｉｃｈｉｓａｋａ  Ｔ，Ｔｏｍｏｄａ  Ｋら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−７２］。ｉＰＳＣの出現は、節目の意義を有し：第１に、これは古典的なエピジェネティックの概観的モードを打ち破り、細胞運命変換の理論を大きく補強し、細胞運命コバージョン（ｃｏｖｅｒｓｉｏｎ）研究および幹細胞研究のパラダイムシフトにつながり、再生医療における基礎研究および臨床応用の新時代を開いた。第２に、ｉＰＳＣは、ＥＳＣの研究および応用における倫理的な論争を回避しながら、無限に自己再生し、ＥＳＣも有する身体の全ての細胞型に分化する潜在力を有する。第３に、線維芽細胞は患者自身の身体から得られ得るので、身体へのＥＳＣ分化により生じる最終的細胞の移植により引き起こされる免疫拒絶の問題も回避され得る。最後に、患者由来のｉＰＳＣは、個人化された疾患細胞モデルおよび個別化された薬物スクリーニングプラットフォームを確立し得る。ｉＰＳＣの出現は基礎研究、薬物スクリーニングのための新しい研究モデルをもたらすだけでなく、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の臨床応用も促進する。ｉＰＳＣは、様々な機能的な細胞型を生成させるために首尾よく使用されており、失明に至る眼疾患の処置のためのｉＰＳＣ由来網膜色素上皮の臨床試験が進行中である。山中は、この技術に対して２０１２年にノーベル医学生理学賞も受賞した。
【０００４】
ｉＰＳＣは多くの長所があり、非常に有望な細胞型であるにもかかわらず、ＥＳＣの同様の多能性ゆえに奇形腫のリスクを回避するのは依然として困難である。さらに、機能的細胞へのｉＰＳＣの分化中のランダムな分化の問題ゆえに、様々な望ましくない細胞型が生じる。これらの問題は、ｉＰＳＣの大規模臨床用途において安全性の問題を引き起こす。この欠点を補うために、近年、ｉＰＳＣの技術および原理に基づく系列初期化技術が注目されることが増加している。系列初期化は主に、創始細胞を関心のある細胞に直接変換するために、創始細胞、主に皮膚線維芽細胞または血液細胞において、多能性転写因子（ＯＳＫＭ）ではなく系列特異的な転写因子の過剰発現を含む。系列初期化の出現は、幹細胞分野のマイルストーンでもある。第１に、系列初期化は、多能期を迂回することによってｉＰＳＣの奇形腫リスクを回避する。第２に、系列初期化は、転写因子および培養条件に依存して、増殖能がある成熟機能的細胞または成体幹細胞を直接得ることができ、得られた標的細胞型は比較的均一である。第３に、系列初期化は、免疫学的拒絶がないｉＰＳＣの長所も有し、個別化処置も達成し得、したがって幹細胞および再生医療研究および疾患処置において幅広い応用展望を示す［Ｓａｎｃｈｏ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｉ，Ｂａｅｋ  ＳＨ，Ｉｚｐｉｓｕａ  Ｂｅｌｍｏｎｔｅ  ＪＣ  Ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｍｅｅｔ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｏｏｌｂｏｘ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２；１４：８９２−９］。最後に、系列初期化は、細胞運命変換および細胞初期化の理論を大きく補強しており、細胞運命の特殊化および制御を理解することを促し、この概念をより幅広い展望に生かす。
【０００５】
系列初期化の分野で多くのブレークスルーが達成されている。膵臓外分泌細胞から内分泌ベータ細胞への系列初期化は２００８年に最初に実現され、ここで２個の細胞が同じ胚葉由来であった［ＺＨＯＵ  Ｑ，Ｂｒｏｗｎ  Ｊ，Ｋａｎａｒｅｋ  Ａ，Ｒａｊａｇｏｐａｌ  Ｊ，Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｅｘｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５５：６２７−３２］。そして、胚葉を越える線維芽細胞から神経芽細胞への変換は２０１０年に達成された［Ｖｉｅｒｂｕｃｈｅｎ  Ｔ，Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ  Ａ，Ｐａｎｇ  ＺＰ，Ｋｏｋｕｂｕ  Ｙ，Ｓｕｄｈｏｆ  ＴＣ，Ｗｅｒｎｉｇ  Ｍ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６３：１０３５−４１］。現在、体細胞におけるウイルス介在性転写因子過剰発現を使用することによって、３つの胚葉全ての様々な細胞型における細胞運命コバージョン（ｃｏｖｅｒｓｉｏｎ）が実現され得る。外胚葉において、線維芽細胞がニューロン、神経幹細胞などに変換されており；中胚葉において、心筋細胞、心筋前駆細胞および造血幹細胞／前駆細胞が誘導されており；内胚葉において、膵臓細胞、肝細胞および肝臓幹細胞も得られている。中国人科学者は、肝臓細胞の系列初期化において大きなブレークスルーを成し遂げた。２０１１年に、Ｌｉｊｉａｎ  Ｈｕｉおよび共同研究者は、肝細胞特異的な転写因子の組み合わせを使用してマウス線維芽細胞を肝細胞に変換することに成功した［ＨＵＡＮＧ  Ｐ，Ｈｅ  Ｚ，Ｊｉ  Ｓ，Ｓｕｎ  Ｈ，Ｘｉａｎｇ  Ｄ，Ｌｉｕ  Ｃら、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１１；４７５：３８６−９］。２０１３年には、Ｙｉｐｉｎｇ  Ｈｕらが、増殖能を有し、肝細胞および胆管細胞の両方に分化し得るマウス肝臓幹細胞を得るために、転写因子の組み合わせを使用した［Ｙｕ  Ｂ，Ｈｅ  ＺＹ，Ｙｏｕ  Ｐ，Ｈａｎ  ＱＷ，Ｘｉａｎｇ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｆら、Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１３；１３：３２８−４０］。２０１５年に、Ｈｕｉ研究室およびＤｅｎｇ研究室が独立に、異なる転写因子の組み合わせを用いて、機能的肝細胞へのヒト線維芽細胞の変換の成功を報告し、肝臓疾患処置および薬物スクリーニングのための良好な細胞供給源をもたらした［Ｄｕ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｊｉａ  Ｊ，Ｓｏｎｇ  Ｎ，Ｘｉａｎｇ  Ｃ，Ｘｕ  Ｊら、Ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１４；１４：３９４−４０３．Ｈｕａｎｇ  Ｐ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｇａｏ  Ｙ，Ｈｅ  Ｚ，Ｙａｏ  Ｄ，Ｗｕ  Ｚら、Ｄｉｒｅ��ｔ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１４；１４：３７０−８４］。ここ数年にわたり系列初期化によって多くのヒトまたはマウス細胞型が誘導されており、系列初期化がｉＰＳＣの複数の欠点を補っているにもかかわらず、現在の系列初期化研究の殆どがレンチウイルスまたはレトロウイルス介在性の転写因子過剰発現に依存する。これらのウイルスベクターは、それらが標的細胞に侵入した後、宿主ゲノムに組み込まれ、これは宿主ゲノムの不安定性につながり得、したがって将来的な臨床応用に対する安全性の問題を引き起こし得る。さらに、転写因子は、研究室間で変動する複雑な手順であり、効率が低いがゆえに大規模化しにくい。したがって、多くの研究は、現在、転写因子を置き換えるためのより安全でより効率的な方法を探している。
【０００６】
転写因子と比較して、低分子化合物は多くの長所を有する。低分子化合物は細胞浸透性であり、合成し易く、廉価で非免疫原性である。これらは、ゲノム組み込みなくタンパク質レベルで作用し、作製について標準化し、大規模化し得る。タンパク質の時空間的および強度制御は、低分子処理の濃度および持続時間を変化させることによって比較的容易に達成される。近年、多くの研究者が、ｉＰＳＣの作製効率を向上させ、ｉＰＳＣの作製時間を短縮し、転写因子の使用を減少させるために低分子を熱心にスクリーニングしている。究極的なゴールは、古典的な山中の４因子を低分子に完全に置き換えて、宿主細胞におけるウイルス組み込みを回避することである［Ｌｉ  Ｗ，Ｌｉ  Ｋ，Ｗｅｉ  Ｗ，Ｄｉｎｇ  Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１３；１３：２７０−８３］。２０１３年に、Ｄｅｎｇ研究室は、この領域においてブレークスルーとなる進歩を遂げた。複数のスクリーニングを通じて、このチームは、全く外因性転写因子に依存することなくｉＰＳＣへのマウス線維芽細胞の初期化を達成するための低分子化合物の適切な組み合わせを発見した。０．２％の初期化効率および複雑な過程にもかかわらず、この発見によって、低分子に基づく初期化および系列初期化に対する理論的で実際的な基礎がもたらされた［Ｈｏｕ  Ｐ，Ｌｉ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｌｉｕ  Ｃ，Ｇｕａｎ  Ｊ，Ｌｉ  Ｈら、Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｕｓｅ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３４１：６５１−４］。低分子化合物によるｉＰＳＣの作製を研究する一方で、安全で効率的で調節可能な標的細胞を作製するために、研究者らは、系列初期化を促進するかまたは系列特異的な転写因子を置き換えるために低分子をスクリーニングすることに多大な努力を払ってきた［Ｌｉ  Ｋ，Ｚｈｕ  Ｓ，Ｒｕｓｓ  ＨＡ，Ｘｕ  Ｓ，Ｘｕ  Ｔ，Ｚｈａｎｇ  Ｙら、Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１４；１４：２２８−３６．Ｚｈｕ  Ｓ，Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｍ，Ｈａｒｂｅｌｌ  Ｊ，Ｍａｔｔｉｓ  ＡＮ，Ｗｏｌｆｅ  ＡＲ，Ｂｅｎｅｔ  ＬＺら、Ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５０８：９３−７．Ｚｈｕ  Ｓ，Ｒｕｓｓ  ＨＡ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｍａ  Ｔ，Ｘｕ  Ｔら、Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１００８０］。中国人科学者は、この分野でも目覚ましい業績を上げている。最近、Ｐｅｉ研究室は、アルツハイマー病患者由来の線維芽細胞を成熟機能的ニューロンに初期化するため��使用した低分子の組み合わせを報告した［Ｈｕ  Ｗ，Ｑｉｕ  Ｂ，Ｇｕａｎ  Ｗ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｗａｎｇ  Ｍ，Ｌｉ  Ｗら、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１５；１７：２０４−１２］。Ｄｅｎｇ研究室は、低分子の組み合わせを用いてマウス線維芽細胞をニューロンに変換することに成功した［Ｌｉ  Ｘ，Ｚｕｏ  Ｘ，Ｊｉｎｇ  Ｊ，Ｍａ  Ｙ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｄら、Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｄｒｉｖｅｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１５；１７：１９５−２０３］。Ｌｅｉ  Ｚｈａｎｇらは、低分子を用いた、機能的ニューロンへのヒト星状膠細胞の系列初期化を報告した［Ｚｈａｎｇ  Ｌ，Ｙｉｎ  ＪＣ，Ｙｅｈ  Ｈ，Ｍａ  ＮＸ，Ｌｅｅ  Ｇ，Ｃｈｅｎ  ＸＡら、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍ  Ｈｕｍａｎ  Ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１５；１７：７３５−４７］。これらのブレークスルーにより、確かな理論的基礎が確立され、成体細胞を他の型の機能的細胞または幹細胞へ変換するための低分子の完全な使用が極めて有望になった。「Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」［Ｗｅｎｃｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，２０１２  Ｐｈ．Ｄ  Ｔｈｅｓｉｓ］は、低分子化合物による、胃腸細胞から誘導性内胚葉多能性幹細胞（ｉＥＭＳＣ）への系列初期化を報告した。ＳＢ４３１５４２、ＶＰＡ、Ｙ２７６３２の低分子化合物および未公表の低分子の１＃−６＃の組み合わせを使用して、初期化効率を比較した。
【０００７】
内胚葉幹細胞／前駆細胞は、肝臓、膵臓、胃および腸などの内臓の細胞を生じさせる。内胚葉幹細胞／前駆細胞を得て、大規模に増殖させ、次いで分化するように誘導し、多数の機能的な肝細胞、膵臓細胞または腸上皮細胞を得るが、これは様々なタイプの内胚葉器官障害の処置に対して大きな意義がある。誰もが知るとおり、中国は深刻な肝臓疾患の脅威にさらされている。現在、中国には９，７００万人のＢ型肝炎ウイルス保有者および１，０００万人のＣ型肝炎ウイルス保有者が存在する。近年、中国におけるアルコール性脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪肝疾患の発生率も顕著に増加している。薬物誘発性の肝臓損傷および免疫肝臓疾患を含む他の肝臓疾患は、国民の健康を著しく脅かしている［Ｗａｎｇ  ＦＳ，Ｆａｎ  ＪＧ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｇａｏ  Ｂ，Ｗａｎｇ  ＨＹ．Ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４；６０：２０９９−１０８］。多くの肝臓疾患は、時宜を得た有効な処置がなければ、肝硬変、肝不全および肝臓癌により代表される末期肝疾患（ＥＳＬＤ）へと進行する。毎年、数十万の中国人がＥＳＬＤに罹患する。現在、ＥＳＬＤに対する処置は、依然として非常に限られている。人工肝臓は大規模に実行するには十分に成熟しておらず、一方で医療は保存的および対症療法的なアプローチしか採用し得ない。ＥＳＬＤに対する最も有効な処置は、同所性肝臓移植である。しかし、ドナー肝臓の不足によりこれは著しく限定される。３８０，０００人を超える者が中国において毎年ＥＳＬＤで死亡していると推定され、これにより、数千の家族が甚だしい苦痛を受け、社会に対して重い医学的負担がもたらされる。機能的肝細胞移植は肝臓移植に対する良好な代替物と考えられるが、これもその供給源によって限定される。さらに、世界中の他の国のように、中国でも糖尿病患者数が多く、年々一定して増加する傾向がある。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎは、糖尿病について、来たる将来、世界的に患者が３０億人を超えることを示唆している。糖尿病の最新の処置も限定的であり、転帰は様々である。特に、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）患者の場合、生涯にわたる外因性インスリンの注射が現在のところ唯一の処置である。インスリンの長期注射は高額であり、インスリン耐性の傾向があり、感染、低血糖およびアレルギー反応など、一連の共通する慢性合併症がある。Ｔ１ＤＭを治癒させるために、膵島ベータ細胞の外因性移植を使用して、注目すべき進歩がなされてきた。［Ｂｅｌｌｉｎ  ＭＤ，Ｂａｒｔｏｎ  ＦＢ，Ｈｅｉｔｍａｎ  Ａ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ｒ，Ｈｅｒｉｎｇ  ＢＪ．Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１２；１２：１５７６−８３］。しかし、外因性膵島またはベータ細胞の欠如によって、この処置の適用が大き���妨げられる。内胚葉幹細胞／前駆細胞を得ることができ、大幅に増殖させ得、次いで多数の機能的肝細胞、膵臓ベータ細胞または腸上皮細胞を得るために分化を誘導し得れば、これは、肝臓疾患の細胞処置、糖尿病の細胞処置、および腸疾患の処置に対してさえも大きな希望をもたらす。
【０００８】
多くの研究から、多能性幹細胞（ＥＳＣまたはｉＰＳＣ）から内胚葉幹細胞／前駆細胞を得たことおよび肝細胞および膵臓細胞へのこれらの細胞の分化が報告されている。［Ｓｎｅｄｄｏｎ  ＪＢ，Ｂｏｒｏｗｉａｋ  Ｍ，Ｍｅｌｔｏｎ  ＤＡ．Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｙ  ｏｒｇａｎ−ｍａｔｃｈｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４９１：７６５−８．Ｃｈｅｎｇ  Ｘ，Ｙｉｎｇ  Ｌ，Ｌｕ  Ｌ，Ｇａｌｖａｏ  ＡＭ，Ｍｉｌｌｓ  ＪＡ，Ｌｉｎ  ＨＣら、Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．２０１２；１０：３７１−８４］。しかし、これらの細胞は全て多能性幹細胞由来であるので、多能性幹細胞適用に関連する上述の問題を回避することは難しい。現在、多くの国際的研究がヒト成体細胞を、それらが由来する内胚葉前駆細胞または肝臓細胞および膵臓細胞に初期化するための低分子の使用をテーマにしている。２０１４年に、Ｓｈｅｎｇ  Ｄｉｎｇらは、山中の４因子ＯＳＫＭを使用してヒト線維芽細胞において一過性に過剰発現させ、低分子を組み合わせて、ＥＳＣまたはｉＰＳＣの多能性状態とは異なった多能性中間状態に最初に入り、次いで内胚葉の誘導状態を与え、線維芽細胞を内胚葉前駆細胞（ＥＰ）状態に初期化し、続いて肝細胞の連続的誘導を行って肝細胞様細胞を得た［Ｚｈｕ  Ｓ，Ｒｅｚｖａｎｉ  Ｍ，Ｈａｒｂｅｌｌ  Ｊ，Ｍａｔｔｉｓ  ＡＮ，Ｗｏｌｆｅ  ＡＲ，Ｂｅｎｅｔ  ＬＺら、Ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５０８：９３−７］。最近、同様のストラテジーを使用して、Ｄｉｎｇのチームが、ヒト線維芽細胞を内胚葉前駆細胞状態に初期化し、次いで、膵臓への分化を誘導して機能的ベータ細胞を得ることができた［Ｚｈｕ  Ｓ，Ｒｕｓｓ  ＨＡ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｍａ  Ｔ，Ｘｕ  Ｔら、Ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６；７：１００８０］。このストラテジーは、多能性状態を通過しないので、多能性幹細胞の催奇形性を回避するが、依然としてＯＳＫＭの４因子の最初の推進を必要とするので、これは、依然として部分的に転写因子に依存するストラテジーである。これは、低分子の役割に完全には依存していない。最新の初期化分野が内胚葉前駆細胞、肝細胞または膵臓細胞を含む上皮由来内胚葉系列細胞型を得るための系列初期化を媒介するための低分子の使用をまだ達成していない原因を分析して、発明者らは、以下に列挙するものが最も重要な科学的疑問であると考える：
【０００９】
１．創始細胞に伴う問題：第１に、これがｉＰＳＣの古典的な初期化であるかまたは系列初期化であるかにかかわらず、それらの殆どが線維芽細胞を用いて開始する。線維芽細胞は、他の成体細胞よりも比較的容易に得られ、皮膚生検により得ることができる。したがって、これらは臨床応用において大きな長所でもある。しかし、内胚葉前駆細胞、肝細胞または膵臓細胞などの所望の標的細胞に対して、線維芽細胞で始まるエピジェネティックな障壁がある。線維芽細胞は中胚葉由来細胞であり、一方で標的である内胚葉前駆細胞は内胚葉に属する。中胚葉から内胚葉への移行は、特により穏やかに作用する低分子の場合は大きな障害である。第２に、線維芽細胞は、組織学的分類においては間葉系細胞に属し、一方で内胚葉前駆細胞は上皮細胞に属する。線維芽細胞から内胚葉前駆細胞への移行は、間質上皮移行（ＭＥＴ）の過程を必要とする。ＭＥＴは、ｉＰＳＣを作製するための重要度の高い障壁であることが証明されており［Ｌｉ  Ｒ，Ｌｉａｎｇ  Ｊ，Ｎｉ  Ｓ，Ｚｈｏｕ  Ｔ，Ｑｉｎｇ  Ｘ，Ｌｉ  Ｈら、Ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１０；７：５１−６３］、これは系列初期化に対する重要な障害物でもある。
【００１０】
２．低分子の選択に伴う問題。低分子の選択は創始細胞の特徴に密接に関連し、異なる創始細胞は、内胚葉前駆細胞への移行に必要とされる低分子の組み合わせを決定する。対照として、内胚葉の何らかの細胞型を得るための低分子の完全な使用についての報告はないので、低分子の選択には詳細な研究およびスクリーニングが必要とされる。
【００１１】
３．栄養膜細胞の使用に伴う問題：栄養膜細胞は、様々なサイトカイン、可溶性細胞外マトリクスまたはマイクロＲＮＡを分泌し得、培養される細胞と密接に接触して細胞成長および生存に対する適切な細胞外微小環境をもたらす。栄養膜細胞は、幹細胞／前駆細胞の培養および初期化に必要であることが多く、最も一般的に使用される栄養膜細胞は、初期化であれ、または系列初期化であれ、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などであり、これらは基礎的な幹細胞成長環境のみをもたらし、系列特異的な支持および誘導はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための低分子化合物の組み合わせおよび消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための初期化キットおよび初期化方法を提供することである。
【００１３】
幹細胞および前駆細胞の定義は依然として論争となっている問題であり、幹細胞および前駆細胞の名称も統一されていないので、幹細胞／前駆細胞は、本発明において幹細胞または前駆細胞を指す。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明により提供される低分子化合物の組み合わせは、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化し得る。ここで、本低分子化合物は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、エピジェネティック修飾因子、Ｃａ２＋チャネル活性化因子および代謝経路制御因子および同様の機能的な群、一般的には、ＦＢＰ、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）またはＡ８３−０１（Ａ８３）、ＶＰＡ、ＲＧ１０８（ＲＧ）、ＰＤ０３２５９０１およびＰＳ４８（ＳＢまたはＡ８３を含む）の全てまたは複数の組み合わせを含む、８個の低分子化合物（８Ｍ）を含む組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
ここで、８個の低分子化合物を含む組み合わせ（８Ｍと略称）は、５０：１２５００：１２．５：１：１２．５：５０：１２５：８７５００のモル比のＳＢ４３１５４：ＶＰＡ：ＰＤ０３２５９０１：ＲＧ１０８：Ｂｉｘ０１２９４：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４：ＰＳ４８：ＦＢＰの組み合わせ；または１２．５：１２５００：１２．５：１：１２．５：５０：１２５：８７５００のモル比のＡ８３：ＶＰＡ：ＰＤ０３２５９０１：ＲＧ１０８：Ｂｉｘ０１２９４：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４：ＰＳ４８：ＦＢＰの組み合わせである。上記の比率に従う８Ｍ組み合わせを使用する場合、ＲＧ作業濃度は、０．０１〜１μＭ、好ましくは０．０４μＭであることが必要である。
【００１６】
好ましくは消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための低分子化合物の組み合わせは、４個の低分子化合物、例えばＢＢＲＳ組み合わせと呼ばれるＢｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）、またはＢＢＲＡ組み合わせと呼ばれるＡ８３−０１（Ａ８３）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）などを含む組み合わせである。
【００１７】
低分子化合物の組み合わせ中の各化合物は、それぞれ１〜１０μＭ  ＳＢ４３１５２、０．４〜１μＭ  Ａ８３、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４の濃度で使用される。
【００１８】
ここで、ＢＢＲＳ組み合わせは、５０：１：１２．５：５０のモル比のＳＢ：ＲＧ：Ｂｉｘ：Ｂａｙの各化合物の組み合わせであり、ＢＢＲＡ組み合わせは、１２．５：１：１２．５：５０のモル比のＡ８３：ＲＧ：Ｂｉｘ：Ｂａｙの各化合物の組み合わせである。好ましくは各化合物は、２μＭ  ＳＢ４３１５２、０．５μＭ  Ａ８３、０．０４Ｍ  ＲＧ１０８、０．５μＭ  Ｂｉｘ０１２９４および２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４の濃度で使用される。
【００１９】
本発明において、低分子化合物の組み合わせは、栄養膜細胞としての胃上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）または腸上皮下筋線維芽細胞（ＩＳＥＭＦ）の支持を受けて消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化し得る。
【００２０】
本発明により提供される消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための初期化キットは、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための上記の低分子化合物の組み合わせおよび化合物の使用のための説明書を含む。各化合物は、個別に包装されるか、または各化合物が混合され、８Ｍの組み合わせまたはＢＢＲＳ組み合わせまたはＢＢＲＡ組み合わせにおいて包装され、使用される各化合物の濃度範囲または具体的な濃度は説明書に記載される。
【００２１】
本初期化キットは、栄養膜細胞およびその使用のための説明書をさらに含み、この栄養膜細胞は、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞などの消化管由来間質細胞である。
【００２２】
本初期化キットは、基本培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、細胞培養のための基本的なさらなる構成成分、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）および抗生物質（ＳＰ）およびその使用のための説明書をさらに含み、ここでグルタミンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して２ｍＭ（１ｘ）の濃度で使用され、抗生物質はペニシリンおよびストレプトマイシンであり、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して、ペニシリンは１００Ｕ／ｍＬの濃度で使用され、ストレプトマイシンは０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用され、各物質は個別に包装されるか、または挙げられた濃度に従い基本培地と混合される。
【００２３】
本発明は、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための初期化培地も提供する。初期化培地は、低分子化合物の組み合わせを基本培地および細胞培養のための基本のさらなる構成成分とブレンドすることによって調製される。
【００２４】
最適化初期化培地は、２ｍＭ  グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５４、０．５ｍＭ  ＶＰＡ、０．５μＭ  ＰＤ０３２５９０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、５μＭ  ＰＳ４８、３．５ｍＭ  ＦＢＰを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される。挙げられる濃度は、使用される濃度、すなわちＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（溶媒）中の構成成分の濃度である。
【００２５】
より好ましい初期化培地は、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１〜１０μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方され；本明細書中の最も好ましい初期化培地は、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される。
【００２６】
別のより好ましい初期化培地は、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．４〜１μＭ  Ａ８３−０１、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方され；本明細書中の最も好ましい初期化培地は、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．５μＭ  Ａ８３−０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方される。
【００２７】
本発明は、上記の低分子化合物の組み合わせまたはキットまたは初期化培地の適用も提供するが、これは、栄養膜細胞として消化管由来間質細胞に基づく、上記の低分子化合物の組み合わせまたはキットまたは初期化培地を使用して消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化することである。
【００２８】
本発明により提供される消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための初期化法は、次の工程を含む：  １）創始細胞として単離初代消化管由来上皮細胞を使用して、前記消化管由来上皮細胞を増殖させ、培養する工程；  ２）栄養膜細胞をマイトマイシン−Ｃで処理し、洗浄し、後で使用するために酵素で細胞を消化する工程；  ３）工程２）で調製した栄養膜細胞を、工程１）で増殖させ、培養した消化管由来上皮細胞に添加し、一晩同時培養を継続する工程；  ４）第２日に初期化培地に交換し、２〜３日ごとに培地を交換し、７〜１５日間培養して、誘導性内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のクローンを得る工程。
【００２９】
上記の方法において、工程１）における創始細胞は、胃上皮細胞および十二指腸上皮細胞を含む消化管由来上皮細胞である。胃上皮細胞は、臨床的な収集が容易であるという観点からより容易に得られ、したがって創始細胞は好ましくは胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）および特に好ましくはＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）陽性胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）である。工程１）において、ＮＣＡＭ陽性胃上皮細胞は好ましくは創始細胞として使用され、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間、３７℃にてＫｕｂｏｔａ培地中で培養される。
【００３０】
工程２）における栄養膜細胞は、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞を含む消化管由来間質細胞、好ましくはヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）である。工程２）において、ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を好ましくはマイトマイシン−Ｃで２〜３時間処理し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで細胞をＴｒｙｐＬＥ酵素で消化する。
【００３１】
工程３）において、工程２）で調製した栄養膜細胞を好ましくは１〜３ｘ１０５個／ｃｍ２の密度で、工程１）で５日間にわたり培養した消化管由来上皮細胞に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩（１２〜１６時間）３７℃にて培養する。
【００３２】
工程４）中の初期化培地は、基本培地および細胞培養のための基本的なさらなる構成成分との低分子化合物の組み合わせの混合物であり、その具体的な組成は上記のとおりである。
【００３３】
具体的に、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための方法は以下の工程を含む：  １）創始細胞として単離初代消化管由来上皮細胞を使用し、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間、３７℃にて血清不含Ｋｕｂｏｔａ培地中で培養する工程；  ２）栄養膜細胞をマイトマイシン−Ｃで２〜３時間処理し、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞をＴｒｙｐＬＥ酵素で消化する工程；  ３）１〜３ｘ１０５個／ｃｍ２の密度で、工程２）で調製した栄養膜細胞を工程１）で４〜５日間培養した始原上皮細胞に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩（１２〜１６時間）３７℃にて同時培養する工程；  ４）第２日に初期化培地に交換し、２〜３日ごとに培地を交換し、７〜１５日間培養して、ヒト誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のクローンを得る工程。
【００３４】
上記の初期化法により得た内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）も本発明に組み込まれる。
【００３５】
本発明は、以下の工程を含む、内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の継代のための方法も提供する：  １）継代前の準備：ウェルプレート中でマイトマイシン−Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）で処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を播種するか、または約３時間前にウェルプレートにおいてフィブロネクチン（ＦＮ）、Ｃｅｌｌ−ＴＡＫ（ＣＴ、細胞組織接着）グルーをコーティングし、室温で乾燥させる工程；  ２）継代用の培地の調製：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋ＡＷＦ（Ａ８３−０１  ０．５μＭ＋Ｗｎｔ３ａ  ５０ｎｇ／ｍＬ＋ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ）またはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋Ａ（Ａ８３−０１、０．５μＭ）；  ３）内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）のクローンを手作業で拾い、それらを約１：３〜の比率で小片に分割し、それらを、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃のＦＮ＋ＡＷＦ、ＣＴ＋ＡＷＦまたは栄養膜［栄養膜細胞、マイトマイシン−Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）で処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）］＋Ａ培地中に入れ、継代した内胚葉幹細胞／前駆細胞を得るために継代培養する工程。
【００３６】
肝臓細胞、膵臓β細胞および腸細胞への分化誘導のための、内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）または上記で得られた継代内胚葉幹細胞／前駆細胞の適用も本発明に組み込まれる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明は、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための低分子化合物の組み合わせ、初期化キット、初期化培地および消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞へと初期化するための方法を提供する。本発明において、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を創始細胞として使用し、ヒト胃組織の筋肉層を単離し、栄養膜細胞として成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を得るために培養し、栄養膜細胞の支持とともに、低分子化合物の組み合わせを用いてヒト胃上皮細胞系列を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化し、これをさらに継代培養し、増殖させ得る。成熟肝臓細胞、膵臓β細胞および腸細胞を得るために対応する誘導分化系と組み合わせて、本発明またはその継代細胞により得られる内胚葉幹細胞／前駆細胞を使用し得、肝臓疾患、糖尿病および腸疾患に対する細胞療法に対する理想的なシードの供給源を提供すると予想され、これは幅広い応用展望を有する。
【００３８】
本明細書中で以後、具体的な実施形態と組み合わせて詳細に本発明をさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、創始細胞、最初の低分子および栄養膜細胞を決定した後の本発明の技術的ロードマップである。
【図２】図２は、位相差顕微鏡（スケール：１００μｍ）下での、４〜５日間培養した胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）および十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）の形態学的マップである。
【図３】図３は、位相差顕微鏡（スケール：１００μｍ）下での、継代培養した胃筋肉線維芽細胞の形態学的マップである。
【図４】図４は、胃上皮細胞における胃特異的および内胚葉前駆細胞特異的なタンパク質の発現を示す。
【図５】図５は、内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）へと初期化されたヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）の動的過程の細胞形態学的マップである（スケール：１００μｍ）。
【図６】図６は、ヒト十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）およびそれら由来の内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の形態学的マップを示す（スケール：１００μｍ）。
【図７】図７は、それぞれ、初期化過程の、創始細胞、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）（Ａ）および胃腸筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）（Ｂ）の細胞形態学的マップである（スケール：１００μｍ）。
【図８】図８は、第７日（Ａ）および第１５日（Ｂ）の異なるクローンを示すクローンの形態のパノラマスキャンであり（点線で輪郭を描く）、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆは、代表的なクローンの特異的形態である。
【図９】図９は、クローン化面積の計算における異なるサイズのクローンのグリッドの模式図である（スケール：２５０μｍ）。
【図１０】図１０は、様々な栄養膜細胞、細胞外マトリクスまたは馴化培地を用いた、低分子化合物（８Ｍ）のクローン形成の効率の棒グラフである（異なる支持条件下での初期化効率）。
【図１１】図１１は、ＭＳＣ、ＭＥＦおよびａＧＳＥＭＦ−ＣＭにより支持される細胞形態学的マップを示す（スケール：１００μｍ）。
【図１２】図１２は、８個の低分子化合物（８Ｍ）から１つずつ差し引いたクローン形成効率の棒グラフである。
【図１３】図１３は、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）の４個の低分子化合物から１つずつ差し引いたクローン形成効率の棒グラフである。
【図１４】図１４は、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）の４個の低分子から１つずつ差し引いたクローン形態学的マップである（スケール：１００μｍ）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＳＢ４３１５４２に基づき、他の３個の低分子化合物と組み合わせたクローン形成効率の棒グラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、Ａ８３−０１に基づき、他の３個の低分子化合物と組み合わせたクローン形成効率の棒グラフである。
【図１６】図１６は、ＳＢ４３１５４２に基づき、他の３個の低分子化合物と組み合わせたクローン形態学的マップである。
【図１７】図１７は、低分子化合物最適化過程のフローチャートである。
【図１８】図１８は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ創始細胞の予備的マッピング染色である（Ａ：雄由来ｈＧＥＣの初期化後のＦＩＳＨ染色；Ｂ：雌由来ｈＧＥＣの初期化後のＦＩＳＨ染色）。
【図１９】図１９は、胃前庭部組織におけるＣＤ５６（ＮＣＡＭ）の免疫蛍光染色である（スケール：５０μｍ）。
【図２０】図２０は、創始細胞−ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）のＮＣＡＭフローソーティングおよび対応するサブ集団の初期化を示す模式図である（線は異なるクローンの輪郭を縁取る）。
【図２１】図２１は、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における内胚葉前駆細胞特異的なタンパク質のフローレベル検出マップである。
【図２２】図２２は、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における胃特異的および内胚葉前駆細胞特異的なタンパク質発現の発現を示す染色の図表である。
【図２３】図２３は、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における内胚葉前駆細胞マーカー遺伝子発現分析の結果（Ａ）および胃特異的な遺伝子の発現分析の結果（Ｂ）を示す棒グラフである。
【図２４】図２４は、ＤＮＡメチル化マイクロアレイによる初期化前後の全ゲノムＤＮＡにおけるエピジェネティックな変化を示す（Ａ：ｈＧＥＣおよびｈｉＥｎｄｏＰＣのクラスター分析；Ｂ：ｈＧＥＣ低メチル化遺伝子と比較したｈｉＥｎｄｏＰＣのＧＯ分析）。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ｈＧＥＣと比較してプロモーターメチル化レベルがｈｉＥｎｄｏＰＣにおいて変化する遺伝子の数を示すボルカノプロットである。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ＦＯＸＡ２およびＧＡＴＡ４遺伝子のプロモーター領域におけるｈｉＥｎｄｏＰＣおよびｈＧＥＣのメチル化レベルの比較である。
【図２６】図２６は、ｈｉＥｄｏＰとＥＳＣ由来ＤＥ、ＰＧＴおよびＰＦＧとの間の関係を示すＲＮＡディープシーケンシングの相関分析である。
【図２７】図２７は、遺伝子発現プロファイル全体における、ｈＧＥＣ、ｈＤＥＣ、ｈＧＥＣ由来のｈｉＥｎｄｏＰＣ、ｈＤＥＣ由来のｈｉＥｎｄｏＰＣ、ＤＥおよび、ＥＳＣ由来のＧＳＥＭＦの位置関係を示すＰＣＡ分析プロットである。
【図２８】図２８は、ｈＧＥＣおよびｈｉＥｎｄｏＰＣの顕微鏡的形態学的マップである（スケール：２μｍ（Ａ〜Ｄ）、１００ｎｍ（Ｅ））。
【図２９】図２９は、初期化中のｈｉＥｎｄｏＰＣの動態を示す。Ａは、ｈｉＥｎｄｏＰＣの初期化過程中の時間の軸線マップであり、Ｂは様々な時間の増殖速度曲線であり、Ｃは、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相の細胞形態のダイナミクス変化マップである。
【図３０】図３０は、様々な支持環境下での継代後のｈｉＥｎｄｏＰＣの細胞形態学的マップである（スケール：１００μｍ）。
【図３１】図３１は、継代中のｈｉＥｎｄｏＰＣの細胞形態学的マップである（スケール：２００μｍ）。
【図３２】図３２は、ｈｉＥｎｄｏＰＣの継代数および１世代あたりの細胞数のヒストグラムである。
【図３３】図３３は、膵臓へのｈｉＥｎｄｏＰＣの分化の結果を示し、Ａは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎの三次元形態学的マップであり；Ｂは、ｈｉｓｔｉｏＰＣ−Ｐａｎ  ＤＴＺ染色マップであり；ＣおよびＤは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎ膵臓特異的タンパク質発現マップであり（スケール：５０μｍ）；Ｅは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎの膵臓特異的遺伝子発現マップであり；Ｆは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎのインスリン放出反応マップである。
【図３４】図３４は、腸へのｈｉＥｎｄｏＰＣｓの分化の結果を示し、ＡはｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔｓの形態学的マップであり；Ｂは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔの腸特異的な遺伝子発現マップであり；Ｃは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔの腸特異的なタンパク質染色マップである（スケール：５０μｍ）。
【図３５】図３５は、肝臓へのｈｉＥｎｄｏＰＣの分化誘導の結果を示し、Ａは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｈｅｐの肝臓特異的遺伝子発現マップであり；Ｂは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−ＨｅｐのＡＦＰおよびＣＫ１８染色マップであり（スケール：５０μｍ）；Ｃは、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−ＨｅｐのＡＬＢおよびＡＦＰフローレベル検出マップである。
【図３６】図３６は、甲状腺（Ａ）および肺（Ｂ）へのｈｉＥｎｄｏＰＣ分化誘導の遺伝子発現レベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
創始細胞、最初の低分子および栄養膜細胞を決定した後、本発明の技術経路（１で示す）は：創始細胞としてヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を得て、胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を栄養膜細胞としてヒト胃組織の筋肉層から単離し、適切な低分子の組み合わせをスクリーニングし、ａＧＳＥＭＦの支持を用いてｈＧＥＣを内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化することである。
【００４１】
最初に、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を単離し、系列初期化のための創始細胞として培養し、８個の低分子の組み合わせを予備的スクリーニングによって決定した：ＳＢ４３１５４２＋ＶＰＡ＋ＰＤ０３２５９０１＋ＲＧ１０８＋Ｂｉｘ０１２９４＋Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４＋ＰＳ４８＋ＦＢＰ。栄養膜細胞としてのａＧＳＥＭＦの条件下で低分子によって誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）様クローンへとｈＧＥＣを初期化し得た。内胚葉前駆細胞様クローンを発生させる能力に基づき、低分子化合物および栄養膜細胞を含む初期化系を最適化し、最終的に、Ｂｉｘ０１２９４＋Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４＋ＲＧ１０８＋ＳＢ４３１５４２（ＢＢＲＳ）の組み合わせを最適の低分子化合物の組み合わせとして決定した。そして、成功した初期化を保証した必要な低分子化合物はＳＢ４３１５４２であった。栄養膜細胞としてのヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）は最も入手し易く、したがって最適な初期化系はＢＢＲＳ＋ＧＳＥＭＦの組み合わせであった。そしてこの条件下での初期化効率は４％〜６％であった。さらに、本発明は、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）がＮＣＡＭ−陽性ｈＧＥＣ由来であったことも確認し、創始細胞の的確な局在が達成された。
【００４２】
第２に、遺伝子エクスプレション（ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ）、タンパク質エクスプレション（ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ）、エピジェネティックレベル、ゲノムワイド発現レベルおよび細胞微細形態学、細胞増殖および内胚葉分化能の展望から見たｈｉＥｎｄｏＰＣの内胚葉特異的マーカーを包括的に分析した。一般的な内胚葉前駆細胞特異的な転写因子ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、ＰＤＸ１、ＧＡＴＡ４、他の幹細胞／前駆細胞特異的なタンパク質ＣＸＣＲ４、ＥＰＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＣＫ１９および胃上皮特異的なマーカーＭＭＣ６、ＧＡＳＴＲＩＮのｈｉＥｎｄｏＰＣにおける発現を最初に検出した。ｈＧＥＣと比較した場合、内胚葉マーカー遺伝子がｈｉＥｎｄｏＰＣにおいて顕著に上方制御され、一方で胃特異的な遺伝子が発現されなかったことが分かり、これにより、内胚葉前駆細胞へのｈＧＥＣの初期化の成功が確認された。エピジェネティック分析からも初期化後の細胞における顕著な変化が示され、内胚葉前駆細胞の分子的特性を獲得していた。ディープシーケンシング分析から、ｈｉＥｎｄｏＰＣの的確な発生ステージがｈＥＳＣ由来の元の消化管（ＰＧＴ）および後方前腸（ＰＦＧ）の内胚葉発生段階の間に位置し、ＰＦＧにより近いことが明らかになった。さらに、ｈｉＥｎｄｏＰＣは、幹細胞の顕微鏡的特性の特徴を有し、４〜６回継代し得た。ｈｉＥｎｄｏＰＣの増殖能はＥＳＣまたはｉＰＳＣと比較した場合に限定的であるにもかかわらず、限定された継代数内での細胞のゲノムは比較的安定で、より安全で、将来的に細胞療法により貢献する。理論的に、初期化および４〜６倍の増幅を介して１０６個の創始細胞から１０９個の細胞を得ることができたが、これは１人分の細胞療法に十分である。発生中、インビボでの内胚葉前駆細胞は膵臓、肝臓、腸、肺および甲状腺への分化能を有するので、ｈｉＥｎｄｏＰＣを試験し、発明者らは、対応して誘導性分化状態を使用した場合、ｈｉＥｎｄｏＰＣが機能的な膵臓ベータ細胞、肝細胞および腸細胞を形成する能力を有することを確認した。
【００４３】
以下の実施例において使用される方法は、別段の指定がない限り、従来の方法である。具体的な工程については、「ＭｏｌｅｃｕＬａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｗ．，ＭｏｌｅｃｕＬａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）を参照のこと。
【００４４】
パーセンテージ濃度は、別段の指定がない限り、質量／質量（Ｗ／Ｗ、ｇ／１００ｇの単位）パーセント濃度、質量／体積（Ｗ／Ｖ、ｇ／１００ｍＬの単位）パーセント濃度または体積／体積（Ｖ／Ｖ、ｍＬ／１００ｍＬの単位）パーセント濃度である。
【００４５】
実施例に記載の様々な生体物質の利用は、具体的な開示の目的のための実験における利用を単に提供し、本発明の生体物質の供給源における限定とみなされるべきものではない。実際に、使用される生体物質の供給源は広く利用可能であり、法的および倫理的侵害なく利用可能であるあらゆる生体物質を実施例中の説明に従い、置き換え、使用し得る。
【００４６】
実施例は、本発明の技術的な解決を前提として実行され、詳細な実施形態および具体的な操作過程が与えられる。実施例は本発明を理解するための助けとなるものの、本発明における保護の範囲は以下の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４７】
低分子化合物による内胚葉前駆細胞へのヒト胃上皮細胞の変換を誘導するための系の確立
【００４８】
本発明における初期化の標的細胞は、内胚葉前駆細胞であり、肝臓、膵臓、胆道、胃、腸などは全て内胚葉由来である。同じ胚葉起源であり、エピジェネティックな類似性があり、初期化障壁がより少ないことを考慮して、発明者らは、胃細胞が適切な創始細胞型であると考えた。さらに、一部の正常な胃または十二指腸組織が医療廃棄物として必然的に捨てられる場合、大きな胃切除術または胃癌摘出などの胃腸手術から正常な胃組織を容易に得ることができた。そして、正常な胃または十二指腸組織は、胃潰瘍または十二指腸潰瘍の処置後のフォローアップ生検による胃内視鏡検査によっても入手可能であった。一般に、正常な胃組織からの創始細胞としての胃上皮細胞は実現可能なものであった。本発明において、発明者らは、胃上皮細胞および栄養膜細胞に対する培養系を確立し、次いで、栄養膜細胞としての消化管筋線維芽細胞とともに４つの主要なクラスから選択される全部で８個の低分子を使用して初期化を行った。これらの条件下で、胃上皮または十二指腸上皮細胞から内胚葉幹細胞／前駆細胞様のクローンを作製することに成功した。初期化が成功した後、低分子の最適な組み合わせおよび必須の低分子を見出すために、初期化系をさらに最適化した。最後に、創始細胞の不均一性ゆえに、発明者らは、異なるセクションに創始細胞を分離し、うまく初期化され得る創始細胞のサブセットを同定した。
【００４９】
消化管（ＧＩ管）由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための一般的なストラテジーは以下のとおりであった：
【００５０】
１．創始細胞の選択において、肝臓、膵臓、ＧＩ管および他の内臓が全て内胚葉前駆細胞由来であるので、したがって、これらは同じ起源であり、他の胚葉由来の細胞と比較した場合、より密な親和性があり、よりエピジェネティックな類似性がある。さらに、それらは全て上皮細胞型に属し、したがって、ＭＥＴ障壁が取り除かれ得、それらの間の細胞変換は、変換過程中に比較的容易である。さらに、ＧＩ管組織の細胞は頻繁に再生され、多数の細胞が活発に増殖し、増殖細胞または前駆細胞はより容易に初期化される。内臓の様々な器官を連結するチャネルとして、胃腸手術および胃十二指腸生検後に多数のＧＩ管組織を入手可能である。したがって、創始細胞としてのＧＩ管由来ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）は、エピジェネティックの類似性、上皮特性、増殖前駆細胞の数および臨床操作の実現可能性において、内胚葉前駆細胞に初期化するために広く使用される線維芽細胞を超える長所がある。
【００５１】
２．低分子の選択において、初期化を正の方向に制御可能なよく分かっている低分子の４つの群をスクリーニングする：
【００５２】
（１）シグナル伝達経路阻害剤：ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）またはＡ８３−０１（Ａ８３）は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤である。ＳＢまたはＡ８３は、転写因子、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃと組み合わせた場合、ｉＰＳＣを作製するためのＳｏｘ２に取って代わり得る。他の低分子は、ＭＡＰＫ  ＥＲＫシグナル伝達経路阻害剤、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）であり、ＰＤおよびＳＢ（またはＡ８３）の組み合わせは、初期化効率を１００倍超に上昇させ得、初期化時間を大きく短縮し得る；
【００５３】
（２）エピジェネティック修飾因子：ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤ＶＰＡ、ＶＰＡは、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃにさえ取って代わり得、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２と組み合わせた場合、ｉＰＳＣの形成を促進し得る。ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤Ｂｉｘ０１２９４（ＢＩＸ）およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤ＲＧ１０８（ＲＧ）も初期化効率を顕著に改善し得る；
【００５４】
（３）カルシウムチャネルアゴニスト：Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＢａｙおよびＢｉｘの組み合わせは、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ取って代わり得る；
【００５５】
（４）代謝経路制御因子：ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１アゴニストＰＳ４８およびホスホフルクトキナーゼアゴニストＦＢＰは、成熟細胞のエネルギー代謝のエネルギー代謝酸化的リン酸化から、幹細胞の嫌気的解糖への移行を促進し得、それにより初期化効率が改善される。
【００５６】
３．栄養膜細胞の選択において、内胚葉前駆細胞の作製および維持を促進するために、内胚葉器官と密接に関連するＧＩ管筋線維芽細胞を栄養膜細胞として選択した。これらの細胞は、内胚葉器官の発生に影響を及ぼし得、発生のより初期の段階でパラ分泌により内胚葉前駆細胞の増大を支持し得る。
【００５７】
Ｉ．胃上皮細胞の単離、培養および表現型同定
材料および方法
列挙される材料および下記方法は、原実験記録由来のものである。本発明の実際的な適用において、これは、列挙される実験により限定されることなく、産業的適用に適切な市販の材料および方法を使用して実行され得る。
【００５８】
（Ｉ）実験材料
（１）実験組織
外科手術または生検からの胃および十二指腸組織は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  Ａｒｍｙおよび３０７  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  Ａｒｍｙにより提供された。中絶胎児組織はＧｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  Ａｒｍｙにより提供された。組織を提供した全患者に情報を与え、インフォームドコンセントに署名させた。組織検体の使用は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  Ａｒｍｙおよび３０７  Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会により承認された。
【００５９】
（２）実験装置
レーザー共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）、サーモスタット水浴（長風）、冷却遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、手術用器具（手術用シャンク、ブレード、眼科用ストレート鉗子、湾曲鉗子、ハサミ）およびレーザーフォーカス用小皿（ＮＥＳＴ）。
【００６０】
（３）主な試薬および調製
１．Ｋｕｂｏｔａ培地（ＫＭ）培地の調製：１袋のＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）粉末を１Ｌの脱イオン水中で溶解させ、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン、１０−９Ｍ硫酸亜鉛七水和物（Ｓｉｇｍａ）、０．５４ｇニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）、５ｍｇインスリン（Ｓｉｇｍａ）、１０−６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）、２ｇのＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）、５ｘ１０−５Ｍ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、３０ｎＭセレン（Ｓｉｇｍａ））、遊離脂肪酸（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍＬ高密度リポタンパク質（Ｓｉｇｍａ）、１ｇウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏより購入）、５ｍｇトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏより購入）を添加した。
【００６１】
２．Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含ＰＢＳの調製：０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌおよび１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４を１Ｌの脱イオン水中で溶解させた。試薬は、調製した体積に応じて等しい割合で添加し得る。調製終了後、溶液を０．４５μＭろ過膜でろ過し、次いで使用のために、オートクレーブ処理するか、または０．２２ろ過膜を通じて直接ろ過した。
【００６２】
３．主な抗体
【００６３】
【表１】
2019521669.tif 000002
【００６４】
【表２】
2019521669.tif 000003
【００６５】
４．０．０７５ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼの調製：２０ｍｇのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）および６ｍｇのＤＮａｓｅ  Ａを２００ｍＬのＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏより購入）に添加した。
【００６６】
５．他の試薬および材料：ＴｒｙｐＬＥ消化酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入）、４％（Ｖ／Ｖ）パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａより購入）、ＤＮａｓｅＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２％（Ｖ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、Ｓｉｇｍａより購入）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、クエン酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａより購入）、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ）、免疫組織化学キット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂ）。
【００６７】
（２）実験方法および結果
（１）胃上皮細胞の取得
胃上皮細胞は直接購入し得；胃前庭部、幽門または十二指腸粘膜上皮細胞は、以下のように単離および培養することによっても得られ得る：
【００６８】
１）調製したＩＶ型コラゲナーゼを平衡化のために予め室温または３７℃に置き、ＰＢＳを氷上に置いて予備冷却し、１０００ｘペニシリン−ストレプトマイシンを調製し、手術器具を７５％（Ｖ／Ｖ）アルコールで滅菌した。
【００６９】
２）病院から胃手術後に新鮮な胃前庭部、幽門または十二指腸組織検体を入手し、それらを３０分以内にアイスボックスに入れて実験室に輸送した。
【００７０】
３）５ｘペニシリン−ストレプトマイシンを予備冷却したＰＢＳに添加して、得られた組織検体を４〜５回洗浄し、残留血液を完全に洗い流した。
【００７１】
４）洗浄後、鈍的切開を用いて胃組織の粘膜層および筋肉層を分離し、粘膜層および筋肉層をまたそれぞれ５ｘペニシリン−ストレプトマイシンを含有する冷ＰＢＳで洗浄し、次いで異なる処理を施した。
【００７２】
５）メスと組み合わせて１対のハサミを用いて粘膜層を切るかまたはすり潰し、適量のＩＶ型コラゲナーゼ（０．０７５ｍｇ／ｍＬ）をそこに添加し、２〜３分ごとに振盪しながら３７℃水浴中で消化した。氷上で２〜３分間静置しながら、８〜１０分ごとに単離物の沈降を行った。次に上清をスポイトにより慎重に回収し、残りを適量の酵素で継続的に消化した。
【００７３】
６）著しいバルク組織なく終了するまで工程５を繰り返した。
【００７４】
７）予備冷却したＰＢＳを回収した上清に添加し、４℃、１２００ｒｐｍ（回転／分）で５分間遠心分離し、３〜４回洗浄して、細胞中の残留消化酵素を完全に除去した。
【００７５】
８）８％（Ｖ／Ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１ｘペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＫＭ培地とともに細胞を適切な密度で播種して一晩付着させ、翌日無血清ＫＭ培地とともに培養した。
【００７６】
９）培養過程中、培地を２〜３日ごとに交換し、初期化を培養の４〜５日後に開始した。
【００７７】
結果：粘膜層および筋肉層は、臨床的に得られた胃または十二指腸組織を分離することによって得ることができた。胃または十二指腸上皮細胞を分離するために粘膜層を使用し、栄養膜細胞−筋線維芽細胞を分離するために筋肉層を使用した。実験手順における胃または十二指腸上皮の組織分離の方法に従って、陰窩に近い細胞が一般的に得られた。無血清上皮細胞スクリーニング培地、クボタ培地、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）および十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）中で培養すると、培養において典型的なダンス様（ｄａｎｃｅ−ｌｉｋｅ）上皮形態を示した（図２参照）。細胞数は４〜５日後に最大に到達し、次いで細胞が漸進的なアポトーシスの状態に入ったことが観察された。したがって、内胚葉前駆細胞への初期化のために創始細胞として、４〜５日間培養した細胞を通常は使用した。さらに、胃および十二指腸の数十の異なる部分における細胞の単離および培養に関する観察および分析から、胃前庭部、幽門または十二指腸由来の組織が細胞接着および増殖に関して最良であることが分かった。胃体部または胃底の組織および噴門部は殆ど付着していなかったかまたは培養が困難であった。十二指腸組織の起源は比較的少なかったので、別段の記載がない限り、胃前庭部または胃幽門の組織に由来する胃上皮細胞を単離し、続く実験において初期化創始細胞として使用した。
【００７８】
（２）筋線維芽細胞の取得
筋線維芽細胞は直接購入し得；胃腸上皮下筋線維芽細胞は、以下の付着方法によって単離および培養することもできる：
【００７９】
１）上記のようにして得られた胃または十二指腸の筋肉層を、外科用の刃を用いて小さな組織片になるように完全に潰した。小さな組織片は可能な限り小さくすべきである。１５％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する少量の高糖濃度培地またはＫＭ培地の少量を添加して組織片を湿らせ、１ｍＬの小さなスポイトを用いて組織片を１０ｃｍの培養皿に均一にコーティングし、インキュベーター中で３７℃にて３０分間逆さにして置いた。残存する間質細胞を単離し、上記のように培養した。
【００８０】
２）３０分間付着させた後、間質細胞増殖培地を培養皿の端に沿って添加し、細胞を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。
【００８１】
３）５〜７日の培養後、紡錘細胞が組織片から脱出したのが観察された。２週間後、多数の細胞が脱出し、増殖した。この時点で、細胞を継代し、凍結した。このようにして、胎児胃上皮下筋線維芽細胞（ｆＧＳＥＭＦ）、成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）、胎児腸上皮下筋線維芽細胞（ｆＩＳＥＭＦ）および胎児横隔膜間質細胞（ｆＤＣ）を得た。凍結細胞は、後の初期化のために栄養膜細胞を提供し得る。
【００８２】
結果：得られた胃または十二指腸の筋肉層を機械的に小片になるようにすり潰した。筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）を単離し、組織接着法を用いて培養した。組織は約４〜７日間接着し、紡錘細胞の組織片からの脱出が見られ、１０〜１４日中に継代を行った。継代培養した筋線維芽細胞は、（図３で示されるように）長い紡錘状線維芽細胞の典型的な形態を示した。
【００８３】
（３）胃上皮細胞の免疫蛍光検出
以下の操作を含む、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）のチャリクティゼーション（ｃｈａｒｉｃｔｉｚａｔｉｏｎ）の免疫蛍光同定を行った（一次抗体および二次抗体をそれぞれ表１および２で示した）：
【００８４】
１）細胞を４％（Ｖ／Ｖ）のパラホルムアルデヒドで１０〜１５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【００８５】
２）０．２％（Ｖ／Ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間膜を破砕し、再度ＰＢＳで洗浄した。
【００８６】
３）二次抗体属由来の血清で１時間ブロッキング処理し、再度ＰＢＳで洗浄した。
【００８７】
４）対応する一次抗体と共に４℃で一晩温置し、ＰＢＳで２〜３回洗浄した。
【００８８】
５）対応する二次抗体と共に暗所にて室温で１時間温置し、ＰＢＳで２〜３回洗浄した。
【００８９】
６）暗所にて室温で１５分間、ＤＡＰＩとともに温置した。
【００９０】
７）レーザー共焦点蛍光顕微鏡下で観察および撮像した。
【００９１】
結果：図４で示されるように、免疫蛍光染色から、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）が、ＣＫ１９、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ９、ＬＧＲ５、ＥＰＣＡＭなどの内胚葉前駆細胞マーカーを低レベルで発現し、一方で、胃の特徴的なマーカーＭＵＣ６およびＧＡＳＴを高度に発現することが分かった。
【００９２】
第１部「胃上皮細胞の単離、培養および表現型同定」は、胃前庭部または幽門における胃上皮細胞および筋線維芽細胞に対する単離および培養系を確立することに成功した。インビトロで培養したヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）は典型的な類上皮形態を示した。陰窩における細胞は通常（成熟胃細胞型と比較して）原始的であるので、ある程度の増殖が達成され得た。ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）は、胃特異的マーカーを高度に発現し、初期内胚葉前駆細胞マーカーを低レベルで発現したが、これは、発明者の以前の推測と一致した。これらは内胚葉前駆細胞においてある一定のマーカーを部分的に発現するので、内胚葉前駆細胞への初期化中の初期化障害は比較的小さく；したがって、それらは内胚葉前駆細胞への形質転換のための創始細胞の優れた供給源であった。しかし、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）の胃上皮に特徴的なマーカーは、初期化中に失われなければならなかった。創始細胞の供給源および培養の問題が解決され、その特徴も予備的に決定された。次の工程は、創始細胞としてそれらを用いて内胚葉前駆細胞に初期化することであった。
【００９３】
ＩＩ．低分子化合物および栄養膜細胞により誘導される、胃上皮細胞から内胚葉前駆細胞への変換
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）および成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を調製し、工程Ｉで保存した。
【００９４】
（２）実験装置
倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、顕微鏡グリッド、冷却遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、１２ウェルプレート。
【００９５】
（３）主な試薬および調製
１．基本試薬
Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、ＴｒｙｐＬＥ消化酵素、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ディスパーゼは全てＧｉｂｃｏ社より購入、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびマイトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ）。
【００９６】
２．低分子化合物
【００９７】
【表３】
2019521669.tif 000004
【００９８】
「使用濃度」は、溶媒としてのＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中の各化合物の濃度を意味する。
【００９９】
３．８Ｍ初期化培地の調製
処方：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）＋ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）＋ＳＢ４３１５４（２μＭ）＋ＶＰＡ（０．５ｍＭ）＋ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ））＋ＲＧ１０８（０．０４μＭ）＋Ｂｉｘ０１２９４（０．５μＭ）＋Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（２μＭ）＋ＰＳ４８（５μＭ）＋ＦＢＰ（３．５ｍＭ）。
【０１００】
処方物中の各成分の濃度は、溶媒としてのＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中のその濃度である。
【０１０１】
（２）実験方法および結果
（１）低分子化合物が介在するヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）または十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）から誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への変換
【０１０２】
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
１．創始細胞の増殖：初代単離ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）または十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）を創始細胞として使用し、Ｋｕｂｔａ培地（文献に従って調製、文献出典：Ｋｕｂｏｔａ，Ｈ．およびＲｅｉｄ，Ｌ．Ｍ．（２０００）．Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔｓ，ｃｏｍｍｏｎ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｌｉｎｅａｇｅｓ，ａｒｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７，１２１３２−１２１３７）中で３７℃にて５％ＣＯ２インキュベーター中で４〜５日間培養し、創始細胞を増殖させた。
【０１０３】
２．栄養膜細胞の調製：栄養膜細胞としての成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ、細胞を胃組織マトリクス層の分離によって得て、培養および増殖後に大量に凍結し、必要に応じて前もって蘇生させた）をマイトマイシン−Ｃで２〜３時間処理し（栄養膜細胞の有糸分裂を喪失させる目的で１０μｇ／ｍＬ）、ＰＢＳで３〜４回洗浄し、細胞をＴｒｙｐＬＥ酵素により消化し、次いで細胞を洗浄した；
【０１０４】
３．ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）または十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）を第５〜６日まで培養したとき、処理した胃上皮下筋線維芽細胞を適切な密度（一般に１〜３ｘ１０５個／ｃｍ２の密度）で培養しているヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）または十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）に添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃に一晩（１２〜１６時間）置いた；
【０１０５】
４．初期化培養：胃上皮下筋線維芽細胞添加後第２日に、培地を８Ｍ初期化培地に交換し、２〜３日ごとに交換し、連続的な観察を行った。一般に、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）は、１週間または２週間以上（７〜１５日）培養後に得られた。
【０１０６】
結果：
（１．１）ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）から誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への変換
ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）の形態は、８個の低分子化合物（表３で示すとおりの８Ｍ）を用いた栄養膜細胞として８Ｍ初期化培地および単離培養胃腸上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）の条件下で、絶えず明らかな変化が起こった。より大きな形態を持つダンス様（ｄａｎｃｅ−ｌｉｋｅ）または多数の角がある上皮の始まりから、より明確な境界を持つ小細胞クローンが第７日に出現し始めた。第１５日に、図５で示されるように、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）は、境界が明確で、小さくて締まった細胞があり、比較的均一な形態であり、大きな核細胞質を有する典型的な内胚葉幹細胞／前駆細胞様クローン（Ｇ−ｈｉＥｎｄｏＰＣ）に初期化されていた（図５の下の写真は上の写真のボックスの拡大部分であった）。
【０１０７】
（１．２）ヒト十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）から内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への変換
同様に、ヒト十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）から開始して、８Ｍ初期化培地および栄養膜細胞としての単離培養胃腸上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）の作用下で、典型的な内胚葉幹細胞／前駆細胞クローン（Ｄ−ｈｉＥｎｄｏＰＣ）も１５日間にわたる誘導後に形成された（図６で示されるように、十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）の左の写真、および十二指腸上皮細胞の初期化によって生じた内胚葉幹細胞／前駆細胞（Ｄ−ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の右の写真は、Ｇ−ｈｉＥｎｄｏＰＣと同様の形態を有する（図５））。十二指腸組織の供給源が限られているため、通常、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を初期化のための創始細胞として使用した。
【０１０８】
（１．３）創始細胞としてのヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）または胃腸上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）のみの内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への変換
内胚葉幹細胞／前駆細胞様クローンは、低分子化合物を使用せずに形成し得なかった。しかし、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）または胃腸上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）のみをそれぞれ創始細胞として使用し、それらは８Ｍ初期化培地中で１５日間培養した後に内胚葉幹細胞／前駆細胞様クローンを形成させ得ず（図７で示されるとおり）、このことから、低分子化合物（８Ｍ）、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）および胃腸上皮下筋線維芽細胞（ＧＳＥＭＦ）の組み合わせが内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の形成において不可欠な因子であったことが示された。
【０１０９】
（２）クローン形成効率の計算
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
１．クローン総数の計算
【０１１０】
２．顕微鏡格子を用いた異なるクローンの面積の計算：各顕微鏡マイクロ格子の面積は０．０６２５ｍｍ２であり、クローンによって占有される格子数に０．０６２５ｍｍ２を乗じたものが各クローンの面積であった。
【０１１１】
３．初期化効率の評価は、クローン数およびクローンの面積を組み合わせることによって行われる。
【０１１２】
結果：前述の観察において、初期化第７日に小さな細胞クローンが出現し始め、ウェルプレートのパノラマスキャンから、このような小さなクローンが明確な境界を有し、小さなクローンの数が非常に多かったこが示され（図８Ａ）、これは、古典的内胚葉幹細胞／前駆細胞クローンの形態に既に近い形態であった（図８Ｃおよび８Ｄ）ことが分かった。初期化第１５日に生じたクローン形態は最も典型的であったので（図８Ｅおよび８Ｆ）、コロニー形成効率は通常、この時点で計算した。しかし、クローンの増殖速度は第７日〜第１５日まではより速く、計算の時点で多くのクローンが一緒に融合して大きなクローンを形成したので（図８Ｂ）、計算時にクローン数はより少なかったが、総面積は増加していた。初期化効果をより客観的に反映させるために、本実験では初期化効率の計算方法として、総クローン数と、異なる面積下でのクローン数およびクローン面積を組み合わせた。顕微鏡格子を用いた異なるクローンの面積の計算：各顕微鏡マイクロ格子の面積は０．０６２５ｍｍ２であり、クローンによって占有される格子数に０．０６２５ｍｍ２を乗じたものが各クローンの面積であった。異なるサイズのクローン化面積に対する計算方法を図９で示し、計算結果を表４で示した。
【０１１３】
【表４】
2019521669.tif 000005
【０１１４】
第２部では、最初に選択された８個の低分子（８Ｍ）および栄養膜細胞としての成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）の条件下で、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の相に初期化することに成功した。初期化過程中に発生した最初の意義のある変化は細胞形態であったので、幹細胞／前駆細胞クローンの出現を初期化の成功のための初期判断として使用した。ヒト十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）も、同じ方法を用いて内胚葉幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）に初期化し得た。低分子化合物および栄養膜細胞は、初期化過程の間に必須の要素であった。発明者らは最初に発明者らの展望を実現したものの、発明者らは依然として、最良の初期化スキームを見出し、可能な限り初期化効率を改善し、低分子化合物の数を減少させる必要がある。さらに、重要な低分子の発見は、初期化機序の解析において非常に重要な役割がある。
【０１１５】
ＩＩＩ．低分子化合物および栄養膜細胞の初期化系の最適化
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
工程Ｉで、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、胎児胃上皮下筋線維芽細胞（ｆＧＳＥＭＦ）、成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）、胎児腸上皮下筋線維芽細胞（ｆＩＳＥＭＦ）、胎児横隔膜間質細胞（ｆＤＣ）を調製し；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）および成体ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＦＦ）は包皮組織に由来し、発明者らの研究室で単離および培養した。
【０１１６】
（２）実験装置
倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、顕微鏡グリッド、１２ウェルプレート。
【０１１７】
（３）主な試薬
１．基本試薬：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）はギブコより購入し；ペニシリン−ストレプトマイシン、マイトマイシン−ＣはＳｉｇｍａより購入し；ＴｒｙｐＬＥ、ディスパーゼ消化酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入し；マトリゲルゲルはＢＤより購入し；ゼラチンはＳｉｇｍａより購入した。
【０１１８】
２．低分子化合物の組み合わせ（８Ｍ）：使用したタイプおよび濃度は、第２部と同じであった（表３参照）。
【０１１９】
（２）実験方法および結果
（１）胎児腸上皮下筋線維芽細胞（ｆＩＳＥＭＦ）または成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）のための馴化培地の調製：ｆＩＳＥＭＦ細胞またはａＧＳＥＭＦ細胞を１０μｇ／ｍＬの濃度のマイトマイシンＣで２〜３時間処理し、ＰＢＳで３〜４回洗浄し、次いでＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加して培養し、培地を毎日回収し、０．２２μＭフィルターに通してろ過し、−８０℃で保存した。
【０１２０】
（２）異なる栄養膜細胞により支持される、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）から内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への初期化
【０１２１】
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
１）創始細胞（ｈＧＥＣ）としてのヒト胃上皮細胞の処理は工程ＩＩと同じであった。
【０１２２】
２）様々な栄養膜細胞の調製は、第２部と同じであった。
【０１２３】
３）初期化法は、第２部の方法と同じであった。
【０１２４】
４）低分子化合物（８Ｍ）および様々な栄養膜細胞、細胞外マトリクスまたは馴化培地の支持下でのコロニー形成効率を初期化第１５日に計算し、それによって適切な栄養膜細胞を見出した。
【０１２５】
結果：以前の実験において、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）から内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への変換は、８個の低分子化合物（８Ｍ）および成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を用いて達成された。次に、より良好な栄養膜細胞を決定したか、または栄養膜細胞なしの初期化を達成した。胎児胃上皮下筋線維芽細胞（ｆＧＳＥＭＦ）、胎児腸上皮下筋線維芽細胞（ｆＩＳＥＭＦ）、胎児横隔膜間質細胞（ｆＤＣ）を含む様々な消化管由来間質細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）などの他の一般的に使用される栄養膜細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、成体ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＦＦ）などを使用し、また、マトリゲルのゲル、ゼラチンなどの様々な細胞外マトリクス、ならびに胎児腸上皮下筋線維芽細胞（ｆＩＳＥＭＦ）および成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）由来の馴化培地も試験して、初期化についてそれぞれ比較した。８Ｍ初期化培地の条件下で、ｆＩＳＥＭＦ、ｆＧＳＥＭＦ、ａＧＳＥＭＦなどの消化管間質細胞および横隔膜間質細胞は、ｈｉＥｎｄｏＰＣを生成させるためにｈＧＥＣをうまく支持し得、胎児腸上皮下筋線維芽細胞（ｆＩＳＥＭＦ）の初期化効率が最大であったことが分かった。ＭＥＦ、ＨＦＦ、ＭＳＣ、マトリゲル、ゼラチンおよび馴化培地などの他の支持媒体は、殆どまたは全く初期化支持を有さなかった（図１０参照）。支持細胞としてのＭＳＣまたはＭＥＦの使用によって、少量の異型の上皮様細胞クローンが生じた。成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）由来の馴化培地（ａＧＳＥＭＦ−ＣＭ）中で、培養時間が長くなるにつれて細胞が連続的にアポトーシスを起こした（図１１に示されるように、右上または左上の写真は小さいボックスに対する拡大図であった）。胎児組織の供給源が限られているため、臨床的にヒト胃手術における検体が最も容易に入手可能であり、十分な成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）が得られ得、ａＧＳＥＭＦは高い初期化効率を維持し得、したがってａＧＳＥＭＦは初期化栄養膜細胞の良好なクラスであり、これは、その後の実験において栄養膜細胞として初期化される。
【０１２６】
（３）低分子の組み合わせの最適化−初期化に必要な低分子のスクリーニング
１）第２部でスクリーニングした栄養膜細胞を支持細胞として使用し、上記の８個の低分子化合物（８Ｍ）に対する培養条件に基づいて低分子を１個ずつ除去し、不可欠な低分子を最初にスクリーニングした。
【０１２７】
２）工程１）でスクリーニングした低分子化合物の組み合わせに基づいて、低分子化合物を１個ずつうまく取り除いて、（最高の初期化効率を有する）最良の低分子化合物の組み合わせおよび（クローン形成を保証する）最少の低分子化合物との組み合わせを最終的に発見した。
【０１２８】
（４）統計学的解析
全てのデータは３回以上の独立した実験から得ており、データは、別段の記述がない限り、平均±標準偏差として記載した。両側ｔ検定のためのＳＰＳＳソフトウェアを使用して、２群のデータ間の統計学的解析を行った。２群間の差は、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０１２９】
結果：工程（２）において、最も合理的な栄養膜細胞−成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）が、低分子の組み合わせの最適化のための支持細胞として同定された。８個の低分子化合物の組み合わせ（８Ｍ）に基づいて、分子を１個ずつ取り除いた。ＰＤ０３２５９０１、ＰＳ４８およびＦＢＰを取り除いた場合、クローン形成効率が上昇し、これらの低分子化合物が初期化において一定の抑制的役割を果たし、取り除かれるべきであることが示され；ＶＰＡを取り除いた場合、クローン形成効率は有意には変化せず、ＶＰＡが任意選択であり、単純化原理に基づいて取り除かれるべきであることが示されるが；Ｂｉｘ０１２９４、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＲＧ１０８を取り除いた場合、クローン形成効率は明らかに低下し、特にＳＢ４３１５４２を取り除いた場合、（図１２で示されるように）クローンは生成されず、これら４個の低分子が必要であることが示された。
【０１３０】
誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）はまた、Ｂｉｘ０１２９４、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＲＧ１０８、ＳＢ４３１５４２の上記４個の低分子化合物の組み合わせ（略してＢＢＲＳ組み合わせ）に基づいて作製され得、効率が８個の低分子化合物（８Ｍ）よりも高かった。次に、Ｂｉｘ０１２９４、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＲＧ１０８、ＳＢ４３１５４２（ＢＢＲＳ組み合わせ）に基づいて最適化を行った。Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）の何れかの低分子を取り除く場合、（図１３で示されるように）クローン形成効率は有意に低下するであろうが、クローンの形態は、ＢＢＲＳ群の場合と顕著には異ならず、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）を取り除いた場合、（図１４で示されるように）クローンは形成されなかった。したがって、初期化の最良の組み合わせは、Ｂｉｘ０１２９４、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＲＧ１０８、ＳＢ４３１５４２（ＢＢＲＳ）の組み合わせであることが決定され、ＢＢＲＳ組み合わせの条件下での初期化の効率は、（図１３で示されるように）約４％〜６％であった。
【０１３１】
ＳＢ４３１５４２が最も重要であったので、ＳＢ４３１５４２に基づいて、他の３つの低分子（Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ））の何れかと組み合わせて、ＳＢ４３１５４２が、最少の低分子の組成物とともにクローンを形成可能であったことが分かり、効率は（図１５Ａで示されるように）ＢＢＲＳの最適な組み合わせほど良くはなかったが、（図１６で示されるように）形態は顕著な差を示さなかった。ＳＢ４３１５４２の不可欠な役割は、初期化中の低分子化合物の作用機序において重要な役割を果たした。
【０１３２】
（５）初期化に必要な低分子化合物の最適化
ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）が初期化系において初期化可能な低分子化合物の最少の組み合わせであることを確認した後、ＳＢ４３１５４２はＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害剤であるので、発明者らはＴＧＦ−βシグナル伝達経路の別の阻害剤Ａ８３−０１（Ａ８３）を用いることによりＳＢを置き換えることを試みて、低分子化合物の組み合わせの最適化実験を繰り返し、その結果から、Ａ８３（０．５μＭの使用濃度）が単独または他の低分子と組み合わせる（ＢＢＲＡと呼ぶ）かの何れかで初期化の同様の、またはより良好な効果を生じさせ得ることが示された。結果を図１５Ｂで示し、ＢＢＲはそれぞれＢｉｘ０１２９４（Ｂ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂ）、ＲＧ１０８（Ｒ）の他の３つの低分子を表した。
【０１３３】
第３部では、栄養膜細胞のスクリーニングを通じて、様々な消化管由来の上皮下筋線維芽細胞が、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）から内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）への変換を支持し得ることが決定され、特に胎児由来間質細胞はより強力な支持の役割を有し、このことから、内胚葉前駆細胞の初期化のための消化管に関連した栄養膜細胞の特有の支持的役割が示唆された。十分な細胞供給源を考慮して、成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）は栄養膜細胞であることが決定された。支持細胞としてのａＧＳＥＭＦに基づいて、初期化のための最良の低分子の組み合わせ、Ｂｉｘ０１２９４、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＲＧ１０８、ＳＢ４３１５４２（ＢＢＲＳ）またはＢｉｘ０１２９４、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、ＲＧ１０８、Ａ８３−０１（ＢＢＲＡ）および必要な低分子ＳＢ４３１５４２またはＡ８３−０１（Ａ８３）を低分子についての３ラウンドの最適化によってスクリーニングした。スクリーニング過程を図１７で示した。以下の実施例３において、発明者らは、一例として、初期化の条件としてＢＢＲＳ＋ａＧＳＥＭＦを使用して、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）に初期化することについて詳細に記載した。
【０１３４】
ＩＶ．初期化のための創始細胞の正確な位置決め
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞、組織
ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）、成体ヒト胃前庭部組織（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ  Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ  Ａｒｍｙにより提供）。
【０１３５】
（２）実験装置
フローサイトメトリー（ＢＤ）、レーザー共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）、倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）。
【０１３６】
（３）主な試薬
基本試薬：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）はＧｉｂｃｏ社より購入し；ペニシリン−ストレプトマイシン、Ａｃｃｕｔａｓｅ、マイトマイシン−ＣはＳｉｇｍａ社より購入し；ＴｒｙｐＬＥ消化酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入した。
【０１３７】
低分子化合物：ＳＢ４３１５４２、Ｂｉｘ０１２９４、ＲＧ１０８、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４は全てＳｔｅｍｇｅｎｔ社より購入した。
【０１３８】
抗体：ＣＤ５６−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ウサギ抗ヒトＣＤ５６（ＮＣＡＭ）（Ａｂｅａｍ）、マウス抗ヒトＩｇＧ１  ＭＵＣ５ＡＣ（Ａｂｅａｍ）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（γ２ｂ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ヤギ抗マウスＩｇＧ１（γ１）は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入した。
【０１３９】
（２）実験方法および結果
（１）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）−創始細胞の初期の位置
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
１）初期化は、男性由来の胃上皮細胞を女性由来の栄養膜細胞に、またはその逆で接種することにより行った。
【０１４０】
２）初期化成功後、元のウェル中の細胞をメタノールおよび氷酢酸（３：１）の混合物で２０分間固定し、会社に送付後、ＸおよびＹ染色体に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。
【０１４１】
３）処理した細胞を、それぞれｈｉＥｎｄｏＰＣおよび栄養膜細胞における性染色体の染色について共焦点顕微鏡下で観察した。
【０１４２】
結果：２つのタイプの細胞、創始細胞−ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）および栄養膜細胞−成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）が初期化系に含まれたので、それらのみでは誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）に初期化され得ず、初期化がＢＢＲＳ初期化培地中での培養において上記の両方の組み合わせでのみ成功し得ることが確認された。ｈｉＥｎｄｏＰＣが実際に栄養膜細胞ではなく胃上皮細胞に由来したことをさらに確認するために、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験と組み合わせた性別不一致実験を行った：創始細胞としての男性由来ｈＧＥＣおよび栄養膜細胞としての女性由来胃腸上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を使用して初期化を行い、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の結果から、初期化により得られたｈｉＥｎｄｏＰＣのＸおよびＹ染色体が陽性であることが示され、これにより、それらが実際に男性起源であったことが示唆され、一方で栄養膜細胞はＸ染色体に対してのみ陽性であり、これによってそれが女性起源であったことが示唆された（図１８Ａ）。創始細胞としての女性由来ｈＧＥＣおよび栄養膜細胞としての男性由来胃腸上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）を使用して初期化を行った場合、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の結果から、ｈｉＥｎｄｏＰＣがＸ染色体に対してのみ陽性であったことが示され、これにより、それが女性起源であったことが示唆され、一方で栄養膜細胞中でＸおよびＹ染色体が陽性であり、これにより、それらが男性起源であったことが示唆された（図１８Ｂ）。この実験から、ｈｉＥｎｄｏＰＣが栄養膜細胞ではなく胃上皮細胞に由来することが十分に実証された。
【０１４３】
（２）創始細胞としてのヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）の表面マーカーの決定−フローソーティング、接種およびＣＤ５６マーカーの初期化
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０１４４】
１）ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）をＡｃｃｕｔａｓｅ（細胞解離溶液）で単一細胞になるように消化し、これを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【０１４５】
２）細胞をＰＢＳで１回洗浄した。
【０１４６】
３）細胞をＰＢＳ中で再懸濁し、適量のＣＤ５６−ＰＥを添加し、対照群については、ＰＥ（ＰＥ、蛍光標識色素）アイソタイプ対照抗体を添加した。
【０１４７】
４）４℃の振盪機に４５分間置いた。
【０１４８】
５）細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
【０１４９】
６）細胞を適量のＰＢＳ中で再懸濁した。
【０１５０】
７）フローサイトメトリーにより分析およびスクリーニングを行い、ＣＤ５６陽性細胞および陰性細胞がそれぞれ保持された（全過程中の無菌状態に注意を払う）。
【０１５１】
８）ＣＤ５６陽性細胞および陰性細胞を予めマイトマイシンＣ処理した成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）に同量接種し、一晩（１２〜１６時間）細胞を接着させた後に培地をＢＢＲＳ初期化培地に交換した。
【０１５２】
胃前庭部組織のＣＤ５６（ＮＣＡＭ、神経細胞接着分子、細胞膜上で発現される表面タンパク質）について免疫蛍光染色を行い、細胞免疫蛍光染色法は第１部と同じであった。
【０１５３】
結果：創始細胞が栄養膜細胞ではなく胃上皮細胞由来であったことが、ＦＩＳＨ実験によって明確に確認された。胃上皮細胞は初代細胞に属し、細胞の種類は混合されていたので、創始細胞のどのサブグループがｈｉＥｎｄｏＰＣに変換されたかをさらに明らかにするために、創始細胞を細分する必要があった。最初に、ｈＧＥＣの表面マーカーを明らかにすることが必要であった。単離ｈＧＥＣは主に胃前庭部の陰窩に由来したので、ＮＣＡＭは様々な内胚葉由来組織、特に原始細胞上に発現される表面マーカーであったことが報告された。したがって、胃前庭部組織のＮＣＡＭ  ｉｎ  ｓｉｔｕ染色から、ＮＣＡＭ（ＣＤ５６）が主に深部胃組織（すなわち陰窩部分）上で異なる程度で発現されたことが明らかになり（図１９の左側部分の赤色蛍光によって示されるとおり）、表層の胃組織では殆ど発現されなかった。表層組織は主にＭＵＣ５ＡＣを発現した（図１９の中央部において緑色蛍光で示され、図１９の右側はＮＣＡＭ染色およびＭＵＣ５ＡＣ染色についての合わせた図面であった）。したがって、ＮＣＡＭは、創始細胞に対するグループ分けのための信頼できるマーカーとして使用し得ると考えられた。
【０１５４】
選別マーカーとしてＮＣＡＭを用いて培養ｈＧＥＣをフロー分類し、ＮＣＡＭ陽性細胞およびＮＣＡＭ陰性細胞の２つの群に分けた。次にそれぞれ創始細胞としてＮＣＡＭ陽性細胞および陰性細胞を用いて初期化を行った。結果から、創始細胞としてのＮＣＡＭ陽性細胞は初期化に成功したが、（図２０で示されるように）陰性細胞は殆ど不可能であったことが示された。
【０１５５】
第４部では、創始細胞が栄養膜細胞ではなく胃上皮細胞由来であったことが、性別不一致実験によって確認された。創始細胞をサブクラス分類することによって、ＮＣＡＭ陰性ではなくＮＣＡＭ陽性の胃上皮細胞が初期化中に細胞型の変換を受け、それによって創始細胞の的確な局在化を達成したことがさらに確認された。
【実施例２】
【０１５６】
誘導性内胚葉前駆細胞の表現型同定および分化能
【０１５７】
内胚葉前駆細胞は、肝臓、膵臓、腸、胃、肺、甲状腺および他の内臓の起源であると考えられ、増殖能を有し、したがって、機能的肝細胞、膵臓細胞、腸細胞、肺および甲状腺細胞を得るための理想的なシード細胞であった。以前の研究は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から内胚葉前駆細胞を得ることが報告されており、これにより、この例における初期化された内胚葉前駆細胞の同定のための優れた基礎が構築される。実施例１において、発明者らは、ＢＢＲＳおよび成体胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）の組み合わせを使用して、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）から内胚葉幹細胞／前駆細胞様クローン（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）を生成させるのに成功した。しかし、これは単なる予備的な形態変化であり、内胚葉前駆細胞の特性をさらに確認する必要がある。したがって、ＰＣＲ、ｈｉＥｎｄｏＰＣの特徴的なマーカーを同定するために使用される免疫タンパク質染色および遺伝子チップによって検出される全ゲノム発現、メチル化チップによるエピジェネティック分析、その増殖能および電子顕微鏡によって観察される微細構造を全て行った。さらに、肝臓、膵臓、腸、肺および甲状腺への分化に対するｈｉＥｎｄｏＰＣの可能性を試験して、ｈｉＥｎｄｏＰＣが実際に内胚葉前駆細胞であったことを確認し、ｈｉＥｎｄｏＰＣ細胞の特有の特性を同定した。
【０１５８】
Ｉ．誘導性内胚葉前駆細胞におけるマーカー遺伝子の発現
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）およびＨ９ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、Ｗｉｃｅｌｌ社より購入した。
【０１５９】
（２）実験装置
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、通常のＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、リアルタイム定量９６ウェルプレートおよびブロッキング膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１２ウェルプレート、レーザー共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）、細胞免疫コンフォーカス用の小皿（ＮＥＳＴ）。
【０１６０】
（３）主な試薬
抗体は実施例１の第１部と同じであり、免疫組織化学キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ）、ＲＡおよびＬＤＮ１９３１８９はＳｉｇｍａ社より購入し；Ａ８３−０１はＳｔｅｍｇｅｎｔ社より購入し；ｂ−ＦＧＦ、Ｗｎｔ３ａ、アクチビンＡ、ＦＧＦ１０は、Ｒ＆Ｄ社より購入した。
【０１６１】
（４）プライマー配列
【０１６２】
【表５】
2019521669.tif 000006
【０１６３】
（２）実験方法および結果
（１）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における特徴的タンパク質の発現の分析
タンパク質免疫蛍光染色法は実施例１と同じであった。
【０１６４】
（２）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における特異的遺伝子の発現の分析
初期化されたクローンのＲＮＡを抽出し、逆転写し、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲを行い、具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０１６５】
１）初期化によって作製された細胞クローンを、栄養膜細胞の組み込みを回避するようにして手作業で拾い、次いでＲＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮより購入）を用いて、説明書に従って、拾った細胞に適切な溶解緩衝液ＲＬＴを添加し、細胞を完全に溶解させた。そして、以下の工程に従ってＲＮＡを抽出し続けた：
【０１６６】
２）等体積の７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを溶解液に添加し、ピペッティングにより混合した。
【０１６７】
３）沈殿物を含む混合溶液をスピンカラム（スピンカラム、ＱＩＡＧＥＮより購入）に添加し、２ｍＬの回収チューブに入れ、１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。
【０１６８】
４）７００μＬの緩衝液ＲＷ１（ＱＩＡＧＥＮより購入したＲＮＡ抽出キットにより提供）をスピンカラムに添加し、１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。
【０１６９】
５）５００μＬの緩衝液ＲＰＥ（ＱＩＡＧＥＮより購入したＲＮＡ抽出キットにより提供）をスピンカラムに添加し、１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、ろ液を廃棄した。
【０１７０】
６）５００μＬの緩衝液ＲＰＥをスピンカラムに添加し、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ろ液を廃棄し、次いでスピンカラムを１分間、空にした。
【０１７１】
７）スピンカラムを新しい１．５ｍＬの回収チューブに移し、３０μＬのＲＮｅａｓｙ不含水（リボヌクレアーゼ不含水）をスピンカラムの膜の中央に添加し、スピンカラムを１２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、スピンカラムを廃棄し、抽出したＲＮＡ溶液を回収チューブ中で得た。
【０１７２】
８）分光光度計を用いて、溶出ＲＮＡ試料の濃度を決定した。
【０１７３】
９）対応する体積のＲＮＡを１ｇのＲＮＡの総量に従って採取し、ＲＮＡ不含水（リボヌクレアーゼ不含水）を１６μＬまで添加し、６５℃で５分間加熱し、次いで遠心チューブを素早く氷に移し、チューブを氷上で遠心し、氷浴を２分間行った。
【０１７４】
１０）氷浴終了後、ＲＮＡ逆転写キット中の５ｘＲＴ逆転写試薬４μＬを添加し、通常のＰＣＲ装置を３７℃で１５分、５０℃で５分、９８℃で５分、終了のために４℃の逆転写プログラムで使用した。
【０１７５】
１１）検出用プライマーを予め９６ウェルプレートに添加し、必要に応じて、逆転写により得られたｃＤＮＡ、３回蒸留水、ＳＹＢＲを吸収させた。系を調製した後（具体的に：合計９μＬのｃＤＮＡおよび水、１０μＬのＳＹＢＲ、１μＬのプライマー）、プレート中のウェルをブロッキング処理し、プレートをリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ装置に入れた。手順：９５℃で３分、９５℃で１０秒、６０℃で３５秒、６５℃で５秒、９５℃で５秒、合計４５サイクル。
【０１７６】
（３）特有の型を有する内胚葉（ｆｉｇｕｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＤＥ）への胚性幹細胞（ＥＳＣ）の誘導および分化の指示
良好な増殖状態にあるヒト胚性幹細胞Ｈ９を、予めマトリゲルのゲルでコーティングしたウェルプレートに適切な密度で播種し、翌日、培地をＤＥ誘導培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０＋１％（Ｗ／Ｖ）Ｂ２７（無血清神経細胞添加物）＋アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔより購入）に交換し、１日培養し、第２日および第３日に、培地をＡｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０＋１％Ｂ２７＋アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）に交換した。
【０１７７】
（４）原腸（ＰＧＴ）への胚性幹細胞（ＥＳＣ）の分化誘導の指示
特有の型を有する内胚葉（ｆｉｇｕｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＤＥ）への誘導後、培地をＰＧＴ誘導培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０＋２％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０（線維形成性増殖因子１０）＋シクロパミン（０．２５μＭ）に交換し、３日内にＰＧＴが得られた。
【０１７８】
（５）前腸後部（ＰＦＧ）への胚性幹細胞（ＥＳＣ）の分化誘導の指示
特有の型を有する内胚葉（ｆｉｇｕｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＤＥ）への誘導後、培地をＰＦＧ誘導培地：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０＋ＲＡ（レチノイン酸、２μＭ）＋ＬＤＮ１９３１８９（０．２５μＭ、Ｓｉｇｍａより購入）に交換し、ＰＦＧを３日内に得た。
【０１７９】
（ＩＩＩ）統計学的解析
全てのデータは３回以上の独立した実験から得ており、データは、別段の記述がない限り、平均±標準偏差として記載した。両側ｔ検定のためのＳＰＳＳソフトウェアを使用して、２群のデータ間の統計学的解析を行った。２群間の差は、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０１８０】
結果：
（１）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における特徴的タンパク質の発現の分析
フローサイトメトリーによる初期化されたクローンにおける内胚葉特異的タンパク質の分析によって、図２１で示されるように、ｈｉＥｎｄｏＰＣが相同的に高度にＦＯＸＡ２（フォークヘッドコーディングボックスタンパク質Ａ２）、ＳＯＸ９（性決定領域Ｙ遺伝子９）、ＳＯＸ１７（性決定領域Ｙ遺伝子１７）、ＬＧＲ５（反復ロイシンリッチＧタンパク質共役型受容体５）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子）を発現することが明らかになった（アイソタイプはアイソタイプである）。ｈｉＥｎｄｏＰＣの免疫蛍光染色から、図２２で示されるように、ｈｉＥｎｄｏＰＣがもはや胃特異的マーカーであるＭＵＣ６（粘膜タンパク質−６）およびＧＡＳＴ（ガストリン）を発現せず、胃の特性を喪失し、内胚葉幹細胞／前駆細胞特異的な転写因子ＦＯＸＡ２（赤色蛍光、９６±２．６％の発現レベル）、ＳＯＸ９（赤色蛍光、９７±１．１８％の発現レベル）および他の内胚葉幹細胞／前駆細胞関連マーカー、例えばＣＸＣＲ４（緑色蛍光、９８±０．５６％の発現レベル）、ＥＰＣＡＭ（赤色蛍光、９７±２．７％の発現レベル）、ＬＧＲ５（緑色蛍光、９２±４．３％の発現レベル）、ＣＫ１９（緑色蛍光、９１±４．２％の発現レベルで）を発現し始めることが明らかになった。フローレベルでの検出は、免疫タンパク質染色と一致し、内胚葉前駆細胞としてのｈｉＥｎｄｏＰＣの特徴がさらに確認された。
【０１８１】
（２）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における特異的遺伝子の発現の分析
転写レベルでの結果からまた、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）と比較して、ＦＯＸＡ２（フォークヘッドコーディングボックスタンパク質Ａ２）、ＳＯＸ９（性決定領域Ｙ遺伝子９）、ＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ結合タンパク質４）、ＨＮＦ１Ｂ（肝細胞核因子ホメオボックスタンパク質Ｂ）、ＰＤＸ１（膵臓十二指腸ホメオボックス遺伝子１）、ＯＮＥＣＵＴ２（１つの切除ドメインタンパク質ファミリー２（ｏｎｅ  ｅｘｃｉｓｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ２））、ＨＯＸＡ３（ホメオボックスタンパク質Ａ３）などの内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における内胚葉初期発生関連遺伝子の発現が顕著に上方制御され、胚性幹細胞（ＥＳＣ）に特有の型を有する内胚葉（ｆｉｇｕｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＤＥ）、原腸（ＰＧＴ）および前腸後部（ＰＦＧ）由来の内胚葉の初期発生段階における初期内胚葉遺伝子の発現とさえも同等であり、特にＰＦＧの発現パターンに最も類似していたことも示された（図２３Ａ、図２３Ａの列群は左から右に連続して、ｈＥＣ、ＤＥ、ＰＧＴ、ＰＦＧ、ｈｉＥｎｄｏＰＣ、Ｐ１、ｈｉＥｎｄｏＰＣ、Ｐ４およびｈＧＥＣであった）。さらに、ｈｉＥｎｄｏＰＣは、ＭＵＣ６、ＰＧＣ、ＧＩＦおよびＧＡＳＴなどの胃特異的マーカーをもはや発現しなかった（図２３Ｂ、図２３Ｂの縦列群は、左から右に連続して、ｈＧＥＣ、ｈｉＥｎｄｏＰＣおよびヒト胃組織であった）。
【０１８２】
要約：創始細胞としてヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）を初期化することによって得られた誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）は、ＭＵＣ６、ＧＩＦ、ＰＧＣ、ＧＡＳＴなどの胃に特徴的なマーカーを喪失し、内胚葉初期前駆細胞における転写因子、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、ＨＮＦ１Ｂ、ＧＡＴＡ４、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ３などのマーカー、および他の内胚葉前駆細胞におけるＣＸＣＲ４、ＣＫ１９、ＬＧＲ５、ＥＰＣＡＭなどのマーカーの遺伝子を高度に発現し始めた。転写レベルおよびタンパク質発現レベルの両方が、内胚葉前駆細胞としてのｈｉＥｎｄｏＰＣの特徴を示した。しかし、ｈｉＥｎｄｏＰＣの、分子的な特徴、発生段階における特徴および時空間的局在を完全に理解するためには、遺伝子全体に対する発現またはエピジェネティック発現に対するプロファイルを分析することが必要であった。
【０１８３】
ＩＩ．誘導性内胚葉前駆細胞に対する発生段階のエピジェネティック分析および局在
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）、ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、十二指腸上皮細胞（ｈＤＥＣ）、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）、特有の型を有する内胚葉（ｆｉｇｕｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＤＥ）、原腸（ＰＧＴ）、前腸後部（ＰＦＧ）。
【０１８４】
（２）実験装置
通常のＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。
【０１８５】
（３）主な試薬
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐキット（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙ（ヒトＨＴ−１２）、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【０１８６】
（２）実験方法および結果
（１）ｈＧＥＣ、ｈｉＥｎｄｏＰＣ、ＰＧＴおよびＰＦＧに対するＲＮＡ抽出および逆転写の方法は本実施例の工程Ｉと同じであった。
【０１８７】
（２）ディープシーケンス処理および分析（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの協力を得て完遂）
抽出したｈＧＥＣ、ｈｉＥｎｄｏＰＣ、ＰＧＴおよびＰＦＧ  ＲＮＡを最初に増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐキットによって提供される手順に従って全ＲＮＡからバイオアシル化（ｂｉｏａｃｙｌａｔｅｄ）ｃＲＮＡを作製し、次いで、Ｓｅｎｔｒｉｘ  Ｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙを使用してｃＲＮＡをハイブリダイゼーションさせ、イルミナ社により提供される方法に従ってハイブリダイゼーション後の処理を行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔｕｄｉｏソフトウェアを用いてデータを処理し、生データをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓデータベースにアップロードした（受入番号ＧＳＥ６９７０６）。
【０１８８】
（３）ＤＮＡメチル化処理および分析（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの協力を得て完遂）
最初に、ＤＮＡライブラリ構築、シーケンシングおよびデータ分析を実施した。２つの異なる検体および２つの対応するｈｉＥｎｄｏＰＣの単クローンからのｈＧＥＣを回収し、ゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔで抽出し、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、商品番号Ｄ５００５）を用いて亜硫酸変換を行い、次いでハイスループットシーケンシングプラットフォームＨｉＳｅｑ  ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングを実施した。生データをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓデータベースにアップロードした（受入番号ＧＳＥ６９７０６）。
【０１８９】
結果：
（１）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における全ゲノムＤＮＡのエピジェネティック解析
工程Ｉにおいて、ｈｉＥｎｄｏＰＣの同定は、内胚葉幹細胞／前駆細胞のある種の特徴的マーカーに限定された。ｈｉＥｎｄｏＰＣおよびｈＧＥＣが実際に２つの異なるタイプの細胞であったことを確認するために、発明者らは、全ゲノムＤＮＡメチル化チップ検出を使用することによって、エピジェネティック修飾の観点からｈｉＥｎｄｏＰＣおよびｈＧＥＣを分析した。クラスター分析の結果から、ｈｉＥｎｄｏＰＣおよびｈＧＥＣが異なるエピジェネティックパターンを有することが示され（図２４Ａ）、これによって、細胞が初期化後に顕著に変化したことが明確に確認された。ジーンオントロジー（ＧＯ）分析から、低メチル化状態の遺伝子、すなわちｈｉＥｎｄｏＰＣにおける活性状態の遺伝子の分類が、ｈＧＥＣと比較して、主に胚発生または幹細胞発生に関連していることが示された（図２４Ｂ）。これは、ｈｉＥｎｄｏＰＣの初期内胚葉特性および幹細胞／前駆細胞特性と一致した。
【０１９０】
（２）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）における特徴的遺伝子のプロモーター領域のエピジェネティック修飾
メチル化分析から、ｈＧＥＣと比較して、ｈｉＥｎｄｏＰＣではプロモーター領域におけるメチル化の上方制御および下方制御のための５１９個および８５７個の遺伝子があり（図２５Ａ）、内胚葉特異的転写因子ＦＯＸＡ２（フォークヘッドコーディングボックスタンパク質Ａ２）およびＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ結合タンパク質４）におけるプロモーター領域でのメチル化レベルがｈｉＥｎｄｏＰＣにおいて有意に減少している（図２５Ｂ）ことが示され、このことから、ＦＯＸＡ２およびＧＡＴＡ４の遺伝子発現が転写的に活性化されたことが示唆されるが、これはｈｉＥｎｄｏＰＣにおけるＦＯＸＡ２およびＧＡＴＡ４遺伝子の高発現と一致した。
【０１９１】
（３）誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の発生段階の局在化
複数レベルから内胚葉幹細胞／前駆細胞としてのｈｉＥｎｄｏＰＣの特徴を確認した後、さらにその特性を明確にするためにｈｉＥｎｄｏＰＣの発生段階を位置づけることも必要であった。天然状態でのｈｉＥｎｄｏＰＣの陽性対照は得ることができなかったので、胚性幹細胞（ＥＳＣ）に由来し、発生過程に従って誘導された、よく認められている特有の型を有する内胚葉（ｆｉｇｕｒａｔｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）（ＤＥ）、原腸（ＰＧＴ）、前腸後部（ＰＦＧ）およびこのような初期内胚葉段階を陽性対照として使用して、全ゲノム発現のプロファイルを初期化によって得られたｈｉＥｎｄｏＰＣと比較した。ＲＮＡディープシーケンシングから、ｈｉＥｎｄｏＰＣがＰＧＴとＰＦＧとの間にあり、ＰＦＧにより近いことが明らかになった（図２６）。さらに、ＰＣＡ主成分分析から、胃上皮細胞由来のｈｉＥｎｄｏＰＣおよび十二指腸上皮細胞由来のｈｉＥｎｄｏＰＣが全遺伝子発現プロファイルにおいて非常に類似していることが示され（ＰＣＡ主成分分析は、より少数の重要な可変要素を選択するための複数の可変要素の線形変換による多変量統計解析法を指す）、これは、それらの細胞形態が以前に見出されたものと最も類似していることと一致し、それらの創始細胞とは異なり、またＥＳＣ由来の特有の型を有する内胚葉（ＤＥ）、栄養膜細胞（ＧＳＥＭＦ）とも顕著に異なった（図２７）。
【０１９２】
要約：全ゲノムＤＮＡのメチル化レベルの分析により、ｈＧＥＣがｈｉＥｎｄｏＰＣと顕著に異なることがさらに確認された。初期化後、ｈｉＥｎｄｏＰＣは内胚葉幹細胞／前駆細胞の分子的特徴を得たので、ｈＧＥＣからｈｉＥｎｄｏＰＣへの変換は実際に初期化過程であった。さらに、ＲＮＡディープシーケンシングによって、ｈｉＥｎｄｏＰＣが発生段階でＰＧＴとＰＦＧとの間にあり、ＰＦＧにより近いことが確認され、したがってｈｉＥｎｄｏＰＣの時間的および空間的局在化が実現された。
【０１９３】
ＩＩＩ．誘導性内胚葉前駆細胞の顕微鏡的特徴
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）。
【０１９４】
（２）実験装置
Ｈ７６５０透過型電子顕微鏡（ＨＩＴＡＣＨＩ）、Ｈ７６５０電子顕微鏡、ＡＭＴ  ＸＲ１６Ｍ  ＣＣＤデジタルカメラ（デジタルカメラの電子カプラー、ＡＭＴ）、ＡＭＴキャプチャエンジンソフトウェアバージョン６００．２５９（キャプチャエンジニアリングソフトウェア（ｃａｐｔｕｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ））、取り外し可能な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）。
【０１９５】
（３）主な試薬
Ｐｏｌｙｂｅｄ  ８１２エポキシ樹脂は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡより購入、レイノルドのクエン酸鉛（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供）、水性酢酸ウラニル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供）。
【０１９６】
（２）実験方法および結果
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０１９７】
１．ｈｉＥｎｄｏＰＣおよびｈＧＥＣを取り外し可能な９６ウェルプレートに播種した。
【０１９８】
２．細胞をＰＢＳで洗浄し、３％グルタルアルデヒドおよび０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａより購入）の固定溶液中、ｐＨ７．４で一晩（１２〜１６時間）固定した。
【０１９９】
３．細胞をカコジル酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａより購入）で３回洗浄し、次いで１％四酸化オスミウム（Ｓｉｇｍａより購入）および０．１カコジル酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａより購入）の混合物で１時間固定した。
【０２００】
４．脱イオン水で洗浄した後、脱水し、Ｐｏｌｙｂｅｄ  ８１２エポキシ樹脂に包埋した。
【０２０１】
５．組織を７０ｎｍの切片に切り、４％水性酢酸ウラニル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供）で１５分間染色し、次にレイノルドのクエン酸鉛（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｉｌｉｔａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供）で７分間染色した。
【０２０２】
６．染色した切片をＨ７６５０透過型電子顕微鏡により観察した。
【０２０３】
７．ＡＭＴ  ＸＲ１６Ｍ  ＣＣＤおよびＡＭＴ  ６００．２５９（キャプチャエンジニアリングソフトウェア（ｃａｐｔｕｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ））を使用することによってイメージングを行った。
【０２０４】
結果：図２８で示されるように（図面中、微絨毛（Ｍｖ）、アクチンマイクロフィラメントの繊維網（ＡＭ）、ミトコンドリア（Ｍｉ）、液胞（Ｖ）、小胞体（ＥＲ）、核（Ｎ）、核小体（Ｎｕ））、電子顕微鏡レベルでのｈＧＥＣおよびｈｉＥｎｄｏＰＣの観察から、ｈＧＥＣが、細胞が比較的大きいこと、細胞間密着結合、核質が比較的小さいこと、およびアクチン繊維ネットワークが多いこと（図２８Ａ）、細胞質内容物が豊富であること、大量のミトコンドリアが含有されること、微絨毛および液胞（図２８Ｂ）を含む成熟細胞の特徴を示したことが分かった。ｈｉＥｎｄｏＰＣの細胞はより小さく、接合部はより狭く、核小体はより鮮明であり、核質比はより大きく（図２８Ｃ）、細胞質含有量はより少なく、含有されるミトコンドリアはより少なく、少量のミトコンドリアおよび小胞体が核膜周辺に分布し（図２８Ｄ）、細胞接合部に未成熟細胞の指状の突出した接合部があった（図２８Ｅ）。したがって、顕微鏡分析から、ｈｉＥｎｄｏＰＣがｈＧＥＣと顕著に異なることが示され、ｈｉＥｎｄｏＰＣは幹細胞の顕微鏡的特徴を示し、一方でｈＧＥＣは最終分化成熟細胞の特徴を示した。
【０２０５】
要約：電子顕微鏡のレベルでの分析によって、ｈｉＥｎｄｏＰＣの特徴は幹細胞／前駆細胞の特徴に属し、一方でｈＧＥＣが成熟細胞の特徴を有することがさらに確認された。ｈＧＥＣからｈｉＥｎｄｏＰＣへの変換は、成熟細胞から幹細胞／前駆細胞への変換であった。
【０２０６】
４．誘導性内胚葉前駆細胞の増殖および継代増殖の特徴
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
成体ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）。
【０２０７】
（２）実験装置
倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、ＭｌｔｒａＶＩＥＷ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。
【０２０８】
（３）主な試薬
フィブロネクチン（ＦＮ）、Ｃｅｌｌ−ＴＡＫゲル（ＣＴ）はＢＤより購入し；無血清細胞凍結培地（Ｂｉｏ−Ｔｏｏｌ）；Ａ８３−０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）；ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子ｂ）、Ｗｎｔ３ａは全てＲ＆Ｄより購入し；マイトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ）；Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ディスパーゼはＧｉｂｃｏより購入した。
【０２０９】
（２）実験方法および結果
（１）ｈｉＥｎｄｏＰＣの継代
１．継代前の準備：マイトマイシン−Ｃで処理したａＧＳＥＭＦを予めウェルプレートに適切な密度で播種したか、または約３時間前に、ウェルプレートにおいてフィブロネクチン（ＦＮ）、Ｃｅｌｌ−ＴＡＫ（ＣＴ）ゲルでコーティングして室温で乾燥させた；
【０２１０】
２．継代用の培地の調製：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋ＡＷＦ（処方：Ａ８３−０１  ０．５μＭ＋Ｗｎｔ３ａ  ５０ｎｇ／ｍＬ＋ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ）またはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋Ａ（Ａ８３−０１、０．５μＭ）；
【０２１１】
３．クローンを継代時に手作業で拾い上げ、約１：３〜４の比で小片に分割し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、ＦＮ＋ＡＷＦ、ＣＴ＋ＡＷＦまたは栄養膜（栄養膜細胞）＋Ａ培地中に入れて、継代培養した。
【０２１２】
（２）ｈｉＥｎｄｏＰＣＣの凍結および蘇生
１．凍結：手作業で拾い上げたクローンを５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ酵素により３７℃で５分間消化し、小片にブローした（ｂｌｏｗｎ）。細胞を培地で２回洗浄し、次いで細胞を適量の無血清細胞凍結培地で再懸濁し、クライオチューブに入れ、直接−８０℃で保存した。
【０２１３】
２．蘇生：凍結細胞を４２℃で急速に解凍し、１０体積の培地で洗浄し、遠心分離し、次いでＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋Ａ（Ａ８３−０１  ０．５μＭ）培地中で再懸濁し、上記で調製した栄養膜細胞上に接種し、培養した。
【０２１４】
結果：
（１）初期化中のｈｉＥｎｄｏＰＣの増殖の特徴
内胚葉前駆細胞としてのｈｉＥｎｄｏＰＣの分子的特徴を確認した後、増殖の特徴を分析した。初期化中のｈｉＥｎｄｏＰＣの動態を慎重に観察し、３つの相に分けた：第０〜７日のいくつかの密で鋭い縁は細胞クローンの段階的な出現の特徴であり（第Ｉ相）；第７〜１０日にクローンについて増殖がより遅くなる過程があり（第ＩＩ相）、クローンが小型から大型に成長し；第１０〜１５日はクローンについて急速に増殖する段階であり（第ＩＩＩ相）、多くの小型のクローンが急速に凝集してより大型のクローンになり、細胞の倍加時間はこの段階で３６．１±４．７時間であった（図２９参照）。
【０２１５】
（２）ｈｉＥｎｄｏＰＣに対する継代培養条件のスクリーニング
ｈｉＥｎｄｏＰＣは内胚葉前駆細胞であったので、継代増殖に対するある一定の可能性があることはやむを得なかった。発明者らは継代条件について繰り返しスクリーニングし、最終的に、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋ＡＷＦ（Ａ８３−０１  ０．５μＭ＋Ｗｎｔ３ａ  ５０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ  １０ｎｇ／ｍＬ）、すなわちＦＮ＋ＡＷＦ（図３０Ａ）またはＣＴ＋ＡＷＦ（図３０Ｂ）と組み合わせて細胞外マトリクスとしてフィブロネクチン（ＦＮ）ゲルまたはＢＤ  Ｃｅｌｌ−ＴＡＫ（ＣＴ）ゲルの条件下および栄養膜細胞不含の同様の条件下で継代した後、クローンがよく増殖し、元のクローンの状態で維持されたと判断した。幹細胞／前駆細胞クローンの元の形態は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２＋Ａ（Ａ８３−０１  ０．５μＭ）と組み合わせた栄養膜細胞としてのａＧＳＥＭＦの条件下、すなわち栄養膜細胞＋Ａで維持された（図３０Ｃ）。ｈｉＥｎｄｏＰＣも凍結し得、クローンの元の形態は、クローンの蘇生後に栄養膜細胞＋Ａの条件下で維持し得た（図３０Ｄ、解凍後の細胞、凍結後に蘇生）。
【０２１６】
（３）ｈｉＥｎｄｏＰＣの継代増殖の特徴
ｈｉＥｎｄｏＰＣは上記継代培養条件下で約４〜６世代増殖させ得、細胞形態は継代中、基本的に変化しないままであった（図３１、下段の写真は上段の写真のボックスの拡大部分であった）。４世代後、細胞増殖速度は遅くなり、第６世代の細胞数がピークに達し、このことから、その増殖能が限定的であったことが示される。初期化およびおよそ４〜６回の増幅後、毎回利用可能なおよそ１０６個のヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）で開始して、およそ１０９個の幹細胞／前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）を得た（図３２）。
【０２１７】
要約：ｈｉＥｎｄｏＰＣは、対応する継代条件を使用して４〜６世代増殖させ得た。
【０２１８】
Ｖ．誘導性内胚葉前駆細胞の分化能の同定
材料および方法
（Ｉ）実験材料
（１）実験用細胞
ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）、誘導性内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）およびＨ９ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、Ｗｉｃｅｌｌ社より購入した。
【０２１９】
（２）実験装置
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、通常のＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、正立蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、リアルタイム定量９６ウェルプレートおよびブロッキング膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、１２ウェルプレート、レーザー共焦点蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）、倒立位相差顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、細胞免疫コンフォーカス（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｆｏｃｕｓ）用の小皿（ＮＥＳＴ）。
【０２２０】
（３）主な試薬
１．主な抗体
【０２２１】
【表６】
2019521669.tif 000007
【０２２２】
【表７】
2019521669.tif 000008
【０２２３】
２．主な培地、添加物およびマトリゲル：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／ＤＦ１２、ＭＣＤＢ１３１（低タンパク質、無血清培地１３１）、ＣＭＲＬ  １０６６、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ  １６４０、ＧｌｕｔａＭａｘ（グルタミン）、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｎ２（無血清神経細胞添加物Ｎ２）、Ｂ２７（無血清神経細胞添加物Ｂ２７）は全てＧｉｂｃｏより購入し；ＩＴＳ−Ｘ（インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン複合溶液、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｔ３、アスコルビン酸（ビタミンＣ、Ｓｉｇｍａ）；ＨＭ（肝細胞培養培地、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）；ラミニン、フィブロネクチン（ＦＮ）、コラーゲンＩＶはＢＤより購入した。
【０２２４】
３．サイトカイン：ｂ−ＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子ｂ）、Ｗｎｔ３ａ、アクチビンＡ、ＦＧＦ４（線維芽細胞増殖因子４）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）、ＯＳＭ（オストマリンＭ）、ＦＧＦ１０（線維芽細胞増殖因子１０）、ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ノギン、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）、ＩＧＦ（インスリン様増殖因子）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、インスリンはＲ＆Ｄ社より購入；ＮａＩ（ヨウ化ナトリウム、Ｓｉｇｍａ）。
【０２２５】
４．低分子化合物：ＤＥＸ（デキサメタゾン）、ＲＡ（レチノイン酸）、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＡＮＴ−１はＳｉｇｍａより購入し；ＴＰＢはＥＭＤ  ＭｉｌｌｉＰｏｒｅより購入し；ＡＬＫ５阻害剤ＩＩはＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓより購入し；γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸはＥＭＤ  ＭｉｌｌｉＰｏｒｅより購入し；Ｒ４２８はＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍより購入し；Ｃｈｉｒ９９０２１はＳｔｅｍｇｅｎｔより購入した。
【０２２６】
５．キット：ヒトアルブミンＥＬＩＳＡキット（ヒトアルブミンアッセイキット、Ｂｅｔｈｙｌより購入）。
【０２２７】
６．他の試薬：１ｍｇ／ｍＬ  ＩＣＧ（インドシアニングリーン）溶液、ヘマトキシリン、過ヨウ素酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、シッフ（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、Ｓｉｇｍａ）、クエン酸ナトリウム緩衝液、４％パラホルムアルデヒド。
【０２２８】
（４）プライマー配列
【０２２９】
【表８】
2019521669.tif 000009
【０２３０】
（２）実験方法および結果
（１）免疫蛍光染色法は上記と同じであった。
【０２３１】
（２）Ｑ−ＰＣＲ法は上記と同じであった。
【０２３２】
（３）肝細胞への分化誘導
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２３３】
１．コラーゲンＩＶ／マトリゲル／ラミニン／ＫＭを１：３：１：５の比で混合し、次いで適切な体積の混合ゲル溶液でウェルプレートを均一にコーティングし、これを室温で３〜５時間乾燥させた。
【０２３４】
２．ｈｉＥｎｄｏＰＣを手作業で拾い、適切な大きさの小片に分け、上記の処理済み培養プレートに播種し、８％（Ｖ／Ｖ）ＦＢＳおよび１０μＭ  Ｙ２７６３２を補充したヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）用の初期化培地を用いて一晩培養した（処方：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭグルタミン＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋ＳＢ４３１５４（２μＭ）＋ＲＧ１０８（０．０４μＭ）＋ＢＩＸ０１２９４（０．５μＭ）＋Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（２μＭ））。
【０２３５】
３．細胞塊が完全に接着した後、段階的方法によってｈｉＥｎｄｏＰＣを分化誘導した。第１段階：ＫＭ（処方は、実施例の最初の第１部のものを参照）＋２５ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４＋２５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ４＋５０ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａとともに３日間培養し；第２段階：ＨＭ（市販培地、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌより購入）＋２０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＯＳＭ＋１μＭのＤｅｘとともに１０〜１５日間培養した。
【０２３６】
（４）膵島β細胞への分化誘導
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２３７】
１．マトリゲル／ＫＭを１：１の比で混合し、次いで適切な体積の混合ゲル溶液でウェルプレートを均一にコーティングし、これを室温で３〜５時間乾燥させた。細胞接着方法は上記と同じであった。
【０２３８】
２．接着した細胞を４段階で膵臓に分化させるために誘導した。
【０２３９】
２．１  ＭＣＤＢ１３１培地（Ｇｉｂｃｏより購入）＋１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム＋２ｍＭ（濃度）２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（グルタミン）＋１０ｍＭ最終グルコース濃度（グルコース）＋２％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）＋０．２５ｍＭアスコルビン酸（ビタミンＣ）＋５０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７（線維芽細胞増殖因子７）＋０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１＋１μＭレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎＭ  ＬＤＮ１９３１８９＋１：２００  ＩＴＳ−Ｘ（インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン複合溶液）＋２００ｎＭ  ＴＰＢ、２日間培養。
【０２４０】
２．２  ＭＣＤＢ１３１培地＋１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０ｍＭ最終グルコース濃度＋２％  ＢＳＡ＋０．２５ｍＭアスコルビン酸＋２ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ７＋０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１＋０．１μＭレチノイン酸＋２００ｎＭ  ＬＤＮ１９３１８９＋１：２００  ＩＴＳ−Ｘ＋１００ｎＭ  ＴＰＢ、２日間培養。
【０２４１】
２．３  ２日後、第２段階の細胞を５ｍｇ／ｍＬディスパーゼで３７℃で５分間消化し、次いで機械的に小片にブロー（ｂｌｏｗ）し、培地を交換して低吸着ウェルプレートに移した：ＭＣＤＢ１３１培地＋１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２０ｍＭ最終グルコース濃度＋２％ＢＳＡ＋０．２５μＭ  ＳＡＮＴ−１＋０．０５μＭレチノイン酸＋１００ｎＭ  ＬＤＮ１９３１８９＋１：２００  ＩＴＳ−Ｘ＋１μＭ  Ｔ３（インスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン複合体溶液）＋１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋１０μＭ硫酸亜鉛＋１０μｇ／ｍＬヘパリン、３日間培養。
【０２４２】
２．４  ＣＭＲＬ１０６６＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋２％ＢＳＡ＋１００ｎＭ  ＬＤＮ１９３１８９＋１：２００  ＩＴＳ−Ｘ＋１μＭ  Ｔ３＋１０μＭ  ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋１０μＭ硫酸亜鉛＋１００ｎＭ  γ−セクレターゼ阻害剤ＸＸ＋２μＭ  Ｒ４２８、７日間以上培養。
【０２４３】
（５）腸細胞への分化誘導
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２４４】
１．ＲＰＭＩ  １６４０培地＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａ＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン＋５００ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ４（線維芽細胞増殖因子４）＋５００ｎｇ／ｍＬ  Ｗｎｔ３ａ（ＷＮＴシグナル伝達経路タンパク質リガンド３Ａ）＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（上皮増殖因子）＋３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、３日間培養。
【０２４５】
２．第１段階の細胞を手作業で拾い、機械的に小片にブローし（ｂｌｏｗｎ）、次いで３７℃で７〜１０分間マトリゲル（人工基底膜）に包埋した。凝固後にそこに培地を添加した：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＤ／Ｆ１２＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン＋１％Ｎ２（無血清神経細胞添加物Ｎ２）＋１％Ｂ２７（無血清神経細胞添加物Ｂ２７）＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（上皮増殖因子）＋１００ｎｇ／ｍＬノギン、１週間を超える培養。
【０２４６】
（６）甲状腺への分化誘導
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２４７】
１．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋Ｂ２７（１％）＋Ｎ２（１％）＋ノギン（２００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、３日間。
【０２４８】
２．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋Ｂ２７（１％）＋Ｎ２（１％）＋Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ１０（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ７（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＴＳＨ（１μｇ／ｍＬ）、３日間。
【０２４９】
３．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋Ｂ２７（１％）＋Ｎ２（１％）＋ＴＳＨ（１μｇ／ｍＬ）＋ＩＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋インスリン（５ｍｇ／ｍＬ）＋ＮａＩ（１００μＭ）、４日間。
【０２５０】
（７）肺への分化誘導
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２５１】
１．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋Ｂ２７（１％）＋Ｎ２（１％）＋ノギン（２００ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、４日間。
【０２５２】
２．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋Ｂ２７（１％）＋Ｎ２（１％）＋Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）＋ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ１０（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ７（１０ｎｇ／ｍＬ）、３日間。
【０２５３】
３．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｌ−Ｇｌｕｔａｍａｘ＋Ｂ２７（１％）＋Ｎ２（１％）＋Ｗｎｔ３ａ（１００ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ１０（１０ｎｇ／ｍＬ）＋ＦＧＦ７（１０ｎｇ／ｍＬ）＋デキサメタゾン（５０ｎＭ）、３日間。
【０２５４】
（８）Ｃペプチド含量のＥＬＩＳＡ検出
プロトコールは、Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡキットの要件に従って実施した。具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２５５】
１．作業溶液の調製：キット中の試薬を予め説明書に従って作業溶液に希釈し、室温で２０分間平衡化した。
【０２５６】
２．標準試料の調製：５つの標準試料のそれぞれに１ｍＬの脱イオン水を添加し、よく混合し、少量の試料に包装し、冷蔵庫中で−２０℃にて保存した。
【０２５７】
３．標準試料および試験しようとする細胞上清試料をそれぞれ、各ウェル２５μＬである、ｃ−ペプチド抗体でコーティングした９６ウェルプレートに、各試料に対して３つ組で添加した。
【０２５８】
４．５０μＬの緩衝液を各ウェルに添加した。
【０２５９】
５．９６ウェルプレートをミクロポア付きの振盪機に置き、８００ｒｐｍで１時間温置した。
【０２６０】
６．９６ウェルプレート中の液体を廃棄し、３５０μＬの洗浄緩衝液を各ウェルに添加し、次に洗浄溶液を捨て、ろ紙で吸い取り、４〜５回繰り返した。
【０２６１】
７．２００μＬの酵素複合溶液を各ウェルに添加した。
【０２６２】
８．ウェルプレートをミクロポア付きの振盪機に置き、８００ｒｐｍで室温にて１時間温置した。
【０２６３】
９．液体を廃棄し、３５０μＬの洗浄緩衝液を各ウェルに添加し、工程６を繰り返した。
【０２６４】
１０．２００μＬの基質ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を各ウェルに添加した。
【０２６５】
１１．ウェルプレートを振盪機上に置き、暗所で室温にて３０分間温置した。
【０２６６】
１２．５０μＬの停止溶液を各ウェルに添加し、暗所で５秒間振盪機上で振盪した。
【０２６７】
１３．３０分以内にマイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍの波長でＯＤ値を測定し、結果を計算した。
【０２６８】
９）ジチゾン（ＤＴＺ）染色
具体的な方法は以下の工程を含んだ：
【０２６９】
１．ＤＴＺ保存溶液（Ｓｉｇｍａより購入）を１：２０の比で希釈し、次いで０．４５μｍのフィルター膜に通してろ過して作業溶液を調製した。
【０２７０】
２．染色しようとする細胞をＰＢＳで洗浄した。
【０２７１】
３．調製したＤＴＺ作業溶液を染色しようとする細胞に添加し、細胞を３７℃で１０分間温置し、顕微鏡下で観察および撮像した。
【０２７２】
（１０）統計学的解析
全てのデータは３回以上の独立した実験から得ており、データは、別段の記述がない限り、平均±標準偏差として記載した。両側ｔ検定のためのＳＰＳＳソフトウェアを使用して、２群のデータ間の統計学的解析を行った。２群間の差は、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０２７３】
結果：内胚葉前駆細胞は最終的にインビボで膵臓、肝臓、腸、肺および甲状腺などの器官に発生した。ｈｉＥｎｄｏＰＣが内胚葉前駆細胞であることを確認するために、本発明はそれらが多方向に分化誘導される可能性を試験した。
【０２７４】
（１）内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）の膵臓への分化誘導
古典的膵臓分化誘導プロトコール［Ｐａｇｌｉｕｃａ  Ｆｅｌｉｃｉａ  Ｗ，Ｍｉｌｌｍａｎ  Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｒ，Ｇｕｅｒｔｌｅｒ  Ｍ，Ｓｅｇｅｌ  Ｍ，Ｖａｎ  Ｄｅｒｖｏｒｔ  Ａ，Ｒｙｕ  Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｈら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  β  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ．２０１４；１５９：４２８−３９．Ｒｅｚａｎｉａ  Ａ，Ｂｒｕｉｎ  ＪＥ，Ａｒｏｒａ  Ｐ，Ｒｕｂｉｎ  Ａ，Ｂａｔｕｓｈａｎｓｋｙ  Ｉ，Ａｓａｄｉ  Ａら、Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕＬｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３２：１１２１−３３］に従い、ｈｉＥｎｄｏＰＣを膵臓へと分化誘導した。誘導の２週間後、ｈｉＥｎｄｏＰＣ由来膵臓細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎｓ）は、インビボで膵島の三次元出芽形態を示した（図３３Ａ）。ＤＴＺ（ジチゾン）染色から、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎが赤色に見えたことが示され、このことから細胞の細胞質が膵島β細胞に特徴的な亜鉛イオンを含有していたことが示唆された（図３３Ｂ）。ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎの膵臓特異的タンパク質染色は、膵臓特異的転写因子ＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１、膵島α細胞マーカーＧＣＧ、膵島β細胞マーカーＣ−ＰＥＰおよびＰＲＯ−ＩＮＳおよび膵島δ細胞マーカーＳＳＴの顕著な発現を示した（図３３Ｃおよび３３Ｄ）。転写レベルの分析から、様々な膵臓の特徴的な遺伝子が誘導後に上方制御されることが明らかになったが（図３３Ｅ）、これは免疫染色の結果と一致した。ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎが膵島β細胞からインスリンを合成および放出する最も重要な能力を有するか否かを確認するために、様々な刺激条件下でｈｉＥｎｄｏＰＣ−ＰａｎのＣ−ペプチド放出能を調べた。高グルコースで刺激した場合、Ｃ−ペプチドの放出は低糖群と比較して顕著に増加した。他のインスリン分泌促進剤ＫＣＬおよびトルブタミドを使用した場合、Ｃペプチドの放出がまた顕著に増加した。さらに、刺激に対するｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎのインスリン放出反応は、ＥＳＣ由来の膵島細胞と同等であった（図３３Ｆ）。ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｐａｎの糖刺激反応性は、将来の糖尿病性高血糖症の処置にとって意義のある重要な臨床応用性があった。
【０２７５】
（２）ｈｉＥｎｄｏＰＣの腸細胞への分化誘導
古典的な腸細胞誘導プロトコール［Ｓｐｅｎｃｅ  ＪＲ，Ｍａｙｈｅｗ  ＣＮ，Ｒａｎｋｉｎ  ＳＡ，Ｋｕｈａｒ  ＭＦ，Ｖａｌｌａｎｃｅ  ＪＥ，Ｔｏｌｌｅ  Ｋら、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４７０：１０５−９．Ｗａｔｓｏｎ  ＣＬ，Ｍａｈｅ  ＭＭ，Ｍｕｎｅｒａ  Ｊ，Ｈｏｗｅｌｌ  ＪＣ，Ｓｕｎｄａｒａｍ  Ｎ，Ｐｏｌｉｎｇ  ＨＭら、Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４；２０：１３１０−４］に従い、ｈｉＥｎｄｏＰＣの腸管への分化を検出した。誘導の２週間後、ｈｉＥｎｄｏＰＣ由来腸オルガノイド（ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔ）は、インビトロで初代腸培養の形態学的特徴を呈することが分かった（図３４Ａ）。ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔにおける腸特異的転写因子ＣＤＸ２、小腸細胞マーカーＶＩＬ１、杯細胞マーカーＭＵＣ２、小腸内分泌細胞マーカーＣＨＧＡおよび小腸パネート細胞マーカーＬＹＳＯの発現は、誘導後に顕著に上方制御された（図３４Ｂ）。さらに、タンパク質レベルで、腸の特徴的なマーカーであるＶＩＬ１、ＭＵＣ２、ＣＤＸ２、ＬＧＲ５およびＥＣＡＤも顕著に発現され（図３５Ｃ）、これによりｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｉｎｔが当初腸の特徴を有していたことが確認された。
【０２７６】
（３）ｈｉＥｎｄｏＰＣの肝細胞への分化誘導
古典的な肝臓誘導プロトコール［Ｇｏｕｏｎ−Ｅｖａｎｓ  Ｖ，Ｂｏｕｓｓｅｍａｒｔ  Ｌ，Ｇａｄμｅ  Ｐ，Ｎｉｅｒｈｏｆｆ  Ｄ，Ｋｏｅｈｌｅｒ  ＣＩ，Ｋｕｂｏ  Ａら、ＢＭＰ−４  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；２４：１４０２−１１］を使用して、ｈｉＥｎｄｏＰＣを肝細胞に分化するように誘導し、ｈｉＥｎｄｏＰＣ由来の肝細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｈｅｐ）は、ＨＮＦ４Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＴＦ、ＡＡＴＧＧＴ、Ｇ６ＰＣ、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ７、ＭＧＴ１Ａ１、ＭＧＴ１Ａ３などを含む初代肝細胞の特徴を有する複数の機能的遺伝子を発現し始めることが分かった（図３５Ａ）。同時に、ＡＦＰ（アルファ−フェトプロテイン）およびＣＫ１８（サイトケラチン１８）の染色は、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｈｅｐにおいて陽性であり（図３５Ｂ）；フローレベルでのＡＬＢ（アルブミン）陽性細胞の割合は９０％以上と高く（図３５Ｃ）、これにより、ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｈｅｐが最初に肝細胞の特徴を保持していたことが示された。
【０２７７】
（４）ｈｉＥｎｄｏＰＣの甲状腺および肺への分化誘導
ｈｉＥｎｄｏＰＣの甲状腺への分化誘導後［Ｌｏｎｇｍｉｒｅ  ＴＡ，Ｉｋｏｎｏｍｏｕ  Ｌ，Ｈａｗｋｉｎｓ  Ｆ，ＣｈｒｉｓｔｏｄｏｕＬｏｕ  Ｃ，Ｃａｏ  Ｙ，Ｊｅａｎ  ＪＣら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１２；１０：３９８−４１１］、ｈｉＥｎｄｏＰＣ由来甲状腺細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｔｈｙｒｏｉｄ）における甲状腺および肺により共有される特異的転写因子ＮＫＸ２．１、甲状腺特異的転写因子Ｐａｘ８、サイログロブリン（Ｔｇ）および甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）の発現レベルは誘導前と比較して非常に顕著に向上した（図３６Ａ）。ｈｉＥｎｄｏＰＣ由来肺細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ−Ｌｕｎｇ）における、肺特異的転写因子ＮＫＸ２．１、肺クララ細胞マーカーＣＣ−１０、Ｉ型肺胞細胞のマーカーとしてのアクアポリンＡＱＰ５およびＩＩ型肺胞細胞のマーカーとしての界面活性タンパク質ＳＰＡ、ＳＰＢおよびＳＰＣの発現が顕著に上方制御された（図３６Ｂ）。
【０２７８】
ｈｉＥｎｄｏＰＣのエンドサイトーシス性の分化能が、膵臓、肝臓、腸、甲状腺および肺への分化促進のストラテジーによって同定された。その結果から、５方向のｈｉＥｎｄｏＰＣの分化後に、関連遺伝子の発現および蛋白質発現が顕著に向上することが示された。部分的な機能も出現し、ｈｉＥｎｄｏＰＣが内胚葉前駆細胞であることがより明確に確認され、ｈｉＥｎｄｏＰＣが糖尿病、肝疾患および腸疾患などの細胞療法に理想的なシード細胞を提供し得ることが示唆された。
【実施例３】
【０２７９】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせ
【０２８０】
誘導性内胚葉前駆細胞の生成に対する低分子組み合わせ４Ｍ中の個々の低分子濃度の変化の効果：上述のように、４個の低分子化合物のＢＢＲＳ低分子組み合わせにおいて、ＳＢ４３１５２（ＳＢ、２μＭ）、ＲＧ１０８（ＲＧ、０．０４μＭ）、Ｂｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ、０．５μＭ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ、２μＭ）の使用濃度での４個の低分子の条件下で、４〜６％の効率で初期化することによって内胚葉前駆細胞（ｈｉＥｎｄｏＰＣ）が得られ得た。この実施例において、同じ方法を用いて、ＳＢ４３１５２（１〜１０μＭ）、ＲＧ１０８（０．０１〜１μＭ）、Ｂｉｘ０１２９４（０．１〜２μＭ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（１〜４μＭ）の異なる濃度範囲での４個の低分子の条件下で、ｈｉＥｎｄｏＰＣの生成が確認され（表９参照）、同時に、Ａ８３−０１（Ａ８３、０．４〜１μＭ）でＳＢを置き換えた後、ＲＧ１０８（０．０１〜１μＭ）、Ｂｉｘ０１２９４（０．１〜２μＭ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（１〜４μＭ）の異なる濃度での他の３つの低分子と組み合わせたＡ８３−０１（Ａ８３、０．４〜１μＭ）の条件下で、ｈｉＥｎｄｏＰＣの生成が確認された（表１０）。
【０２８１】
【表９】
2019521669.tif 000010
【表１０】
2019521669.tif 000011
【０２８２】
表９および表１０の組み合わせで得られた内胚葉前駆細胞の内胚葉関連遺伝子、タンパク質、エピジェネティック修飾および分化機能を実施例２の方法により調べた。この結果から、上記組み合わせにより得られた誘導性内胚葉は内胚葉前駆細胞の特徴的なマーカーＦＯＸＡ２、ＳＯＸ９、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＯＸＡ３、ＰＤＸ１、ＣＸＣＲ４、ＥＰＣＡＭ、ＣＫ１９およびＬＧＲ５を高度に発現し、胃細胞特徴的マーカーＭＵＣ６およびＧＡＳＴを発現しないことが示された。これは、上皮性修飾の内胚葉前駆細胞の特徴を有し、肝細胞への分化後に肝細胞特異的マーカーＡＦＰ、ＡＬＢ、ＨＮＦ４Ａ、ＣＫ１８、ＣＹＰ３Ａ４などを発現し得；ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＧＣＧ、ＳＳＴおよびＩＮＳなどの膵臓特異的マーカーは、膵臓β細胞への分化後      に発現され、刺激条件下でインスリンが放出され得；ＣＤＸ２、ＭＵＣ２、ＶＩＬ１、ＣＨＧＡおよびＬＹＳＯなどの腸特異的マーカーは、腸細胞への分化誘導後に発現され；肺および甲状腺細胞への分化後、それらはそれぞれの細胞特異的マーカーを発現した。表９〜表１０で挙げられた濃度範囲の低分子によっても内胚葉前駆細胞が得られることが確認された。
【実施例４】
【０２８３】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化キットの調製
【０２８４】
本発明は、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせ、具体的には８個の低分子化合物（８Ｍ）、それぞれＦＢＰ（フルクトースジホスフェート）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、Ｂｉｘ０１２９４、ＳＢ４３１５４２またはＡ８３−０１、バルプロ酸（ＶＰＡ）、ＲＧ１０８、ＰＤ０３２５９０１およびＰＳ４８からなる低分子化合物の組み合わせ、を含む、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化キットを提供する。
【０２８５】
消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための好ましい低分子化合物の組み合わせは、以下の４個の低分子化合物を含み、ここでＢＢＲＳ組み合わせはＢｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）であり、ＢＢＲＡ組み合わせはＢｉｘ０１２９４（Ｂｉｘ）、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（Ｂａｙ）、ＲＧ１０８（ＲＧ）およびＡ８３−０１（Ａ８３）であった。
【０２８６】
本キットにおいて、各化合物を個別に包装し得るか、または各化合物を、８Ｍ組み合わせまたはＢＢＲＳ組み合わせまたはＢＢＲＡ組み合わせに従って混合して包装し得；化合物を別々に包装した場合、各化合物の使用濃度はキットの説明書に記載されており、濃度の具体的な値は実施例１および実施例３を参照し得た。
【０２８７】
本キットは、基本培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、細胞培養のための基本的なさらなる構成成分、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）および抗生物質ＳＰおよびその使用のための説明書をさらに含み、ここでグルタミンは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地に対して２ｍＭ（１ｘ）の濃度で使用され、抗生物質（例えばペニシリン−ストレプトマイシン）は、１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンの濃度で使用され、本成分は個別に包装されるか、または挙げられた濃度に従い混合された。
【０２８８】
初期化培地を形成させるために、このキットを、低分子化合物の組み合わせおよび基本培地および細胞培養用の基本的な添加成分とさらに組み合わせ得、初期化培地は以下のように処方した：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）＋ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）＋ＳＢ４３１５４（２μＭ）またはＡ８３−０１（０．５μＭ）＋ＶＰＡ（０．５ｍＭ）＋ＰＤ０３２５９０１（０．５μＭ）＋ＲＧ１０８（０．０４μＭ）＋Ｂｉｘ０１２９４（０．５μＭ）＋Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４（２μＭ）＋ＰＳ４８（５μＭ）＋ＦＢＰ（３．５ｍＭ）。
【０２８９】
好ましい初期化培地は、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、１〜１０μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；より好ましくは、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、２μＭ  ＳＢ４３１５２、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方された。
【０２９０】
別の好ましい初期化培地は、２ｍＭグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．４〜１μＭ  Ａ８３−０１、０．０１〜１μＭ  ＲＧ１０８、０．１〜２μＭ  Ｂｉｘ０１２９４、１〜４μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２；より好ましくは、２ｍＭ  グルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）、０．５μＭ  Ａ８３−０１、０．０４μＭ  ＲＧ１０８、０．５Ｍ  Ｂｉｘ０１２９４、２μＭ  Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４を含有するＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２として処方された。
【０２９１】
本キットは、栄養膜細胞およびその使用のための説明書をさらに含み得、この栄養膜細胞は、胃上皮下筋線維芽細胞または腸上皮下筋線維芽細胞などの消化管由来間質細胞であった。
【０２９２】
本キット中の細胞、化合物および試薬は全て、前の実施例で示した供給元から市販されていた。
【０２９３】
本キットはさらに使用説明書を含み、これには、関連試薬を用いて消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための初期化方法を含む本キットの実際の組成および使用方法が記載されており、その内容は、実施例での記載を指した。
【産業上の利用可能性】
【０２９４】
本発明は、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するための低分子化合物の組み合わせ、初期化方法および適用を提供する。ヒト胃上皮細胞（ｈＧＥＣ）は創始細胞として使用され、ヒト胃上皮下筋線維芽細胞（ａＧＳＥＭＦ）は栄養膜細胞として使用され、ＦＢＰ、Ｂａｙ  Ｋ  ８６４４、Ｂｉｘ０１２９４、ＳＢ４３１５４２またはＡ８３−０１、ＶＰＡ、ＲＧ１０８、ＰＤ０３２５９０１およびＰＳ４８（ＳＢまたはＡ８３を含む）の全てまたは複数を有する化合物の組み合わせが、消化管由来上皮細胞を内胚葉幹細胞／前駆細胞に初期化するために使用され、内胚葉幹細胞／前駆細胞は、肝細胞、膵臓ベータ細胞および腸細胞への分化を誘導するために使用され得る。本発明は産業上利用可能であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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