(57)【要約】本発明は、触知覚を向上又は回復させるために皮膚に局所的に適用される、永久花の精油の使用に関する。該永久花の精油は、ヒトにおける皮膚感覚神経のニューロン突起を発達させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の触知覚を向上又は回復させるために、特に加齢による皮膚の触知覚の減退に対抗するために、皮膚に局所的に適用される、永久花の精油の化粧料的使用。
【請求項２】
前記永久花が、ヘリクリサム  イタリカム（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ｉｔａｌｉｃｕｍ）、ヘリクリサム  アレナリウム（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ａｒｅｎａｒｉｕｍ）、及びヘリクリサム  ストエカス（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ｓｔｏｅｃｈａｓ）の種から選ばれること、好ましくはヘリクリサム  イタリカムであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記精油が、顔及び／又は手の皮膚に適用されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記精油が、高齢の個体の皮膚に適用されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
前記精油が、水中油型又は油中水型のエマルジョン形態の組成物に含有されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
前記組成物が、該組成物の総重量に対して、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜２重量％の永久花の精油を含有することを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
皮膚の触知覚を向上又は回復させるための、特に加齢による皮膚の触知覚の減退に対抗するための、皮膚への永久花の精油の局所的な適用からなる、化粧料的プロセス。
【請求項８】
末梢神経障害、神経変性疾患、又は火傷等の外傷を負った後の神経終末の破壊を患っている個体の皮膚へ適用することによる、皮膚の触知覚を向上又は回復させるための処置における局所的な使用のための、永久花の精油。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の触知覚を向上又は回復させるために皮膚に局所的に適用される、永久花の精油の使用に関する。該永久花の精油は、ヒトにおける皮膚感覚神経のニューロン突起を発達させることができる。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、主要な感覚器官を構成しており、外部環境と直接的に接している。皮膚は、多様の熱的、機械的、又は化学的刺激を受け続けている。
【０００３】
皮膚において、数種の感覚受容器が同定されてきている。熱冷感度を伝達する温度受容器、痛みの受容器である侵害受容器、及び掻痒固有の受容器である掻痒受容器に加えて、種々の機械的受容器が同定されてきている。後者は、圧力及び振動感度、並びに、皮膚と僅かに接して反応する良好な判別又は接触感度を伝達し、自由終末、すなわち、基底表皮に位置するメルケル盤、乳頭真皮に位置するマイスナー小体、深層真皮に位置するパチーニ小体、及び真皮に位置するルフィニ小体、からなる。これらの受容器の分布は、無毛皮膚と有毛皮膚とでは異なる。これらの密度はまた、部位に応じて変化する。よって、手のひらには特に充分に供給されており、顔の皮膚はまた、非常に多くの受容器を含んでいる。
【０００４】
これらの機械的受容器は、無害な機械的刺激に反応する、低閾値機械受容器（ＬＴＭＲｓ）と呼ばれる感覚ニューロンによって刺激される。これらは、自身の細胞体のサイズ、軸索径、髄鞘化の度合い、及び軸伝達速度によって、種々の型に分類される。感覚ニューロンは、引き換えに適切な回答を生み出す中枢神経系に情報を与える。このように、対象物を認識し、特に本質を識別することが可能である。
【０００５】
これらの感覚ニューロンは細胞体からなり、該細胞体から神経突起（軸索及び樹状突起）が現れる。該神経突起は、通常、前記受容器、特にメルケル細胞で包まれているか又は接している。
【０００６】
しかしながら、加齢と共に及び特定の病的条件において、特に、例えば糖尿病、化学療法、又はアルコール摂取に起因する末梢神経障害、もしくは多発性硬化症等の他の神経変性疾患において、触覚減退又は感覚鈍麻が見られる。このように、フランスでは、触覚欠損症は数十万もの個体に影響を与えると考えられている。それにも関わらず、これらへの注目は異端視されている。
【０００７】
したがって、その使用は、皮膚の触知覚を回復又は向上させることが可能な手段を利用することは有用であろうと考えられる。
【０００８】
特定植物の特定抽出物を、経口投与すること（欧州特許公開第２４３８９１６号公報、米国特許公開第２００２／００４００５２号公報）又は局所投与すること（韓国特許公開第２０１３０１０７９８２号公報）により、軸索伸長が可能であることが、既に示唆されている。しかしながら、特定の神経変性疾患を処置するために、もしくは、学習、集中又は記憶の容量を向上させる目的のためにしか、この効果は有利に作用しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許公開第２４３８９１６号公報
【特許文献２】米国特許公開第２００２／００４００５２号公報
【特許文献３】韓国特許公開第２０１３０１０７９８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、軸索伸長を促進することが可能な別の植物抽出物を提供することを目的とする。本発明の別の目的は、特に化粧料製品を適用している間に、皮膚の触知覚を回復又は向上させることが可能な植物抽出物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
これに関連して、本発明は、皮膚の触知覚を向上又は回復させるために、特に加齢による皮膚の触知覚の減退に対抗するために、皮膚に局所的に適用される、永久花の精油の化粧料的、すなわち治療的でない、使用を主題とする。
【００１２】
本発明は、皮膚の触知覚を向上又は回復させるための、特に加齢による皮膚の触知覚の減退に対抗するための、皮膚への永久花の精油の局所的な適用からなる、化粧料的、すなわち治療的でない、プロセスを別の主題とする。
【００１３】
本発明はまた、末梢神経障害、神経変性疾患、又は火傷等の外傷を負った後の神経終末の破壊を患っている個体の皮膚へ適用することによる、皮膚の触知覚を向上又は回復させるための処置における局所的な使用のための、永久花の精油を主題とする。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、永久花の精油が使用される。本発明にしたがって使用され得る永久花の種としては、ヘリクリサム（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）属の全ての種が挙げられ、限定されることがないが、特に、ヘリクリサム  イタリカム（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ｉｔａｌｉｃｕｍ又はＨｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ  Ｄ．Ｃ．、カレープラント（ｃｕｒｒｙ  ｐｌａｎｔ））、ヘリクリサム  アレナリウム（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ａｒｅｎａｒｉｕｍ、砂質永久花（ｓａｎｄｙ  ｅｖｅｒｌａｓｔｉｎｇ））、及びヘリクリサム  ストエカス（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ  ｓｔｏｅｃｈａｓ）、もしくは通常の永久花が挙げられる。ヘリクリサム  イタリカムは当の亜種であるにも係らず、その精油は優先的に使用される。
【００１５】
本明細書において、「精油」という用語は、永久花のいずれかの部分又は植物全体に存在する、特に、例えば花もしくは花頭部といった、その空中部分に存在する揮発性有機化合物の、ハイドロ蒸留（ｈｙｄｒｏｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）もしくは水蒸気蒸留による生成物を意味する。
【００１６】
永久花の精油は、化粧料組成物に含有されていてよく、この場合、本発明にしたがって使用される該組成物の総重量に対して、０．００１〜５重量％、好ましくは０．０１〜２重量％の割合で存在していることが有利である。
【００１７】
後述する実施例から明らかなように、永久花の精油は、神経突起生成を促進することができ、特に、ヒトにおける皮膚感覚神経のニューロン突起を発達させることができ、その結果、皮膚の触知覚を向上又は回復させるために使用され得ることが実証された。スキンケア製品において、局所的使用のための化粧料組成物として又は該化粧料組成物内にて該永久花の精油を使用することによって、この特性を活用することができる。変形として、永久花の精油を含有する化粧料組成物は、それ自身でスキンケア製品を構成してもよい。このように、永久花の精油は、このケア製品の適用の間に、該製品が適用された個体によって感じられる触感を向上させることができ、特に、その本質又はそのグライド（ｇｌｉｄｅ）のより良好な知覚を提供することができる。永久花の精油もしくはそれからなる組成物は、体のいずれかの部位に、好ましくは、最も著しく刺激を受ける領域である顔及び／又は手の皮膚に、適用してもよい。これは特に、触感の欠損を患っている個体、特に、高齢の個体（具体的には閉経期の女性）の皮膚、もしくは、病的条件、特に、糖尿病又は化学療法に起因する末梢神経障害、多発性硬化症等の神経変性疾患、又は火傷等の外傷を負った後の神経終末の破壊を患っている個体の皮膚に適用してもよい。
【００１８】
このような組成物は、通常、生理学的に受容可能な、特に、化粧料として受容可能な媒体、すなわち化粧料的使用に不適合なうずき（ヒリヒリ感）又は赤みを起こさない媒体を含有している。この媒体は、好ましくは、油相に加えて水相を含有している。該組成物は、好ましくは、水中油型又は油中水型のエマルジョン形態である。
【００１９】
前記水相は、特に、水に加えて、水性ゲル化剤及び保湿剤等の親水性活性剤から選ばれる少なくとも１つの構成成分を含有していてもよい。
【００２０】
「水性ゲル化剤」という用語は、水分子を固定化する一方で水和して、水相の粘度を上昇させることができるポリマー化合物を示す。このようなゲル化剤は、セルロース及びその誘導体、変性スターチ、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、及びグアーガム又はローカストビーンガム等の植物ガム類等の多糖類；特には有利に架橋されるアクリル酸ナトリウムのホモポリマー、及び、好ましくは架橋されるアクリル系コポリマー、特にはアクリル酸ナトリウム及び／又はアルキル（メタ）アクリレート及び／又はヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート及び／又は（ポリエトキシ）アルキル（メタ）アクリレートと、少なくとも１つの他のモノマー、有利には２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）とのコポリマーといった、合成ポリマー；並びにこれらの混合物から選ばれてもよい。
【００２１】
脂肪相としては、永久花の精油に加えて、１つ又はそれ以上の揮発性油及び／又は非揮発性油を含んでいてよい。該揮発性油の例は、イソドデカン等のＣ１０〜Ｃ１３の分岐鎖状アルカン及びＣ１０〜Ｃ１３の直鎖状アルカンである。非揮発性油としては、特に、以下のものが挙げられる。
・Ｃ２〜Ｃ１０の（好ましくはＣ６〜Ｃ１０の）直鎖状飽和酸とＣ１０〜Ｃ１８の（好ましくはＣ１０〜Ｃ１４の）直鎖状飽和モノアルコールとのモノ及びポリエステル、Ｃ１０〜Ｃ２０の直鎖状飽和酸とＣ３〜Ｃ２０の（好ましくはＣ３〜Ｃ１０の）分岐鎖状又は不飽和モノアルコールとのモノ及びポリエステル、Ｃ５〜Ｃ２０の分岐鎖状又は不飽和酸とＣ５〜Ｃ２０の分岐鎖状又は不飽和モノアルコールとのモノ及びポリエステル、Ｃ５〜Ｃ２０の分岐鎖状又は不飽和酸とＣ２〜Ｃ４の直鎖状モノアルコールとのモノ及びポリエステルから選ばれる、酸類とモノアルコール類とのエステル類
・カプリル酸トリグリセリド類、カプリン酸トリグリセリド類、及びトリヘプタノイン等の、Ｃ６〜Ｃ１２の脂肪酸トリグリセリド類
・リノール酸、ラウリン酸、及びミリスチン酸等の、Ｃ１０〜Ｃ２０の分岐鎖状及び／又は不飽和脂肪酸類
・オクチルドデカノール及びオレイルアルコール等の、Ｃ１０〜Ｃ２０の分岐鎖状及び／又は不飽和脂肪族アルコール類
・特に、オリーブ油から抽出された植物スクアラン等のスクアラン（Ｃ３０）及びヘミスクアラン（Ｃ１５）等の、炭化水素類
・ジカプリリルカーボネート及びジエチルヘキシルカーボネート等の、ジアルキルカーボネート類
・ジカプリリルエーテル等の、ジアルキルエーテル類
・上記化合物の混合物
【００２２】
１つ又はそれ以上の前記構成成分を含有する植物油もまた、挙げられてもよい。
【００２３】
酸類とモノアルコール類とのエステル類として、特に、ココアカプレート及びココアカプリレートの混合物、エチルマカダミエート、シアバターエチルエステル、イソステアリルイソステアレート、イソノニルイソノナノエート、エチルヘキシルイソノナノエート、ヘキシルネオペンタノエート、エチルヘキシルネオペンタノエート、イソステアリルネオペンタノエート、イソデシルネオペンタノエート、イソプロピルミリステート、オクチルドデシルミリステート、イソプロピルパルミテート、エチルヘキシルパルミテート、ヘキシルラウレート、イソアミルラウレート、セトステアリルノナノエート、プロピルヘプチルカプリレート、及びこれらの混合物等のモノエステル類が挙げられる。用いてもよい他のエステル類は、ジイソプロピルアジペート、ジエチルヘキシルアジペート、ジイソプロピルセバケート、及びジイソアミルセバケート等の、酸類とモノアルコール類とのジエステル類である。
【００２４】
植物油の例は、特に、小麦麦芽、ヒマワリ、アルガン、ハイビスカス、コリアンダー、グレープシード、セサミ、コーン、アプリコット、キャスター、シアバター、アボカド、オリーブ、及び大豆の油；スイートアーモンド油；並びにヤシ、菜種、綿実、ヘーゼルナッツ、マカダミア、ホホバ、アルファルファ、ポピー、カボチャ、セサミ、マロー、クロフサスグリ、マツヨイグサ、ラベンダー、ルリジサ、雑穀、大麦、キノア、ライ麦、ベニバナ、ククイノキ、パッションフラワー、マスクローズ、エキウム、カメリナ、又はカメリアの油である。
【００２５】
脂肪相はまた、少なくとも１つの脂肪相構築剤を含んでいてよい。
【００２６】
「脂肪相構築剤」という用語は、組成物に含有される油の粘度を上昇させることができる化合物を示し、特に、ワックス、脂肪相ゲル化剤、ネバネバする脂肪族基剤、及びこれらの混合物から選ばれる。
【００２７】
本明細書において、「ワックス」という用語は、２５℃で固体の脂肪族基剤を示し、該固体の脂肪族基剤は、可逆性の固体／液体状態変化を起こし、ＤＳＣにて測定した融点が、一般に３０〜１６０℃、好ましくは５０〜９０℃のものである。ワックスの例は、特に、ミツロウ、カンデリラロウ、カルナウバロウ、又はアカシアロウ等の動物もしくは植物由来のワックス；特に水素化された菜種、大豆、ヒマワリ、ホホバ、ココナッツ、及びキャスター油等の任意にイソステアリン酸で修飾された水素化植物油；Ｃ１４〜Ｃ３０の直鎖状飽和脂肪酸とＣ１６〜Ｃ３６の直鎖状飽和脂肪族アルコールとのエステル類；Ｃ１０〜Ｃ３０の直鎖状飽和酸類；Ｃ８〜Ｃ３０の直鎖状飽和アルコール類、及びこれらの混合物である。これらのワックスは、微粒子形態であってもよい。すなわち、これらのワックスは、粒子が５０μｍ以下、特には０．５〜５０μｍの範囲、好ましくは１〜３０μｍの範囲、さらには３〜２０μｍの範囲の数平均径を有するパウダーの形態であってもよい。ここで「数平均径」は、統計的粒径分布全体を等量に２分割して得られる寸法に相当し、Ｄ５０で表される。
【００２８】
「脂肪相ゲル化剤」という用語は、３次元網目構造を形成することにより、脂肪相のレオロジーを修飾する化合物を示す。このようなタイプの化合物としては、特にジステアリルジメチルアンモニウムクロライドで疎水的に修飾されているクレイ（特に、ベントナイト及びヘクトライト）；疎水的に修飾されているヒュームドシリカ；デキストリンパルミテート及びデキストリンミリステート；ポリアミド類、オレフィン／スチレンコポリマー類、ポリ（アルキルアクリレート）類；化合物Ｎｏｍｃｏｒｔ（登録商標）ＨＫ−Ｇ等の、Ｃ１６〜Ｃ２６の（好ましくは、直鎖状飽和）脂肪酸グルセリド類；セルロース誘導体及びそれを含む混合物；並びにこれらの混合物が特に挙げられる。いくつかの水素化植物油はまた、脂肪相ゲル化剤と考えられてもよい。
【００２９】
最後に、脂肪相構築剤として用いることができる前記ネバネバする脂肪族基剤は、可逆性の液体／固体状態変化を起こし、固体の状態では異方性結晶機構を呈し、２３℃の温度では液体フラクション及び固体フラクションからなる脂肪族基剤として定義され得る。植物バターが好適に用いられる。シアバター、ココアバター、及びマンゴーバターは、このようなネバネバする脂肪族基剤の例である。
【００３０】
本発明に用いられる組成物は、さらに１つ又はそれ以上の、乳化剤、香料、防腐剤、封鎖剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、紫外線遮蔽剤、粉末充填剤、顔料、染料、及びこれらの混合物を含んでいてもよい。
【００３１】
１つの好ましい実施態様にしたがって、この組成物はまた、少なくとも１つの老化防止活性剤、特に、皺、皮膚のたるみ及び／又は色素沈着点の形成を防止するのに、並びに／もしくは、処置するのに好適な活性剤を含んでいる。このような老化防止活性剤は、特に、フリーラジカル消去剤、ケラチノサイト及び／又は線維芽細胞の分化並びに／もしくは増殖を刺激する活性剤；グリコサミノグリカン及び／又はコラーゲン及び／又は真皮表皮アンカーリングフィブリルの合成を刺激する活性剤；コラーゲン及び／又はグリコサミノグリカン及び／又は真皮表皮アンカーリングフィブリルの分解を防止する活性剤；抗糖化剤；色素除去及び／又はメラニン生成抑制剤；並びにこれらの混合物から選ばれる。変形及び／又は追加として、本発明に係る組成物は、ニューロン効果を有する少なくとも１つの活性剤を含んでいてもよい。このような活性剤は、神経原性炎症を緩和及び／又は阻止する活性剤；神経老化を防止する活性剤；神経によるアセチルコリン放出を調節する活性剤；ニューロンエキソサイトーシスを低減させる活性剤；及びこれらの混合物等である。
【００３２】
このような老化防止活性剤及び／又はニューロン効果を有する活性剤の例は、特に、アスコルビン酸、その塩、そのエーテル、及びそのエステル、特にはアスコルビルグルコシド；アデノシン；リボース；ハチミツ抽出物；プロテイン及びグリコプロテイン、特にはスイートアーモンドから抽出されたもの；加水分解植物プロテイン、特には米、ハイビスカス種、又はハウチワマメからのもの；ポリペプチド及び擬似ジペプチド、例えばカルシニンハイドロクロライド（ｃａｒｃｉｎｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、パルミトイルペンタペプチド−４（Ｐａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ）及びパルミトイルトリペプチド−３８［特にＳｅｄｅｒｍａにより、各々、Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）  ３０００及びＭａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）  Ｓｙｎｔｈｅ’６の商品名で販売］、パルミトイルトリペプチド−８［Ｌｕｃａｓ  Ｍｅｙｅｒ社により、Ｎｕｔｒａｚｅｎ（登録商標）の信用取引で販売］、ペンタペプチド−１８［Ｌｉｐｏｔｅｃ社により、Ｌｅｕｐｈａｓｙｌ（登録商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎの商品名で販売］、ＳＨ−デカペプチド−９［Ｓａｎｄｒｅａｍ社により、Ｎｅｏｅｎｄｏｒｐｈｉｎ（登録商標）の商品名で販売］、及びパルミトイルヘキサペプチド−５２［Ｉｎｆｉｎｉｔｅｃ社により、Ｘ５０  Ｍｙｏｃｅｐｔ（登録商標）  Ｐｏｗｄｅｒの信用取引で販売］；シラン類、例えばメチルシラノールマンヌロネート；アラビノキシラン類、特にはライムギ花から抽出されたもの、及び、ガラクトアラビナン類、特にはカラマツからのもの；ヒアルロン酸及びその塩；ポリフェノール類、特にはミモザから抽出されたもの；レモンから抽出されたものを含むα−ヒドロキシ酸；植物の水性抽出物、例えばミツガシワ、野生パンジー、スギナ、スコティッシュアザミ（Ｏｎｏｐｏｒｄｕｍ  ａｃａｎｔｈｉｕｍ）、ノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌｅａ  ｍｉｌｌｅｆｏｌｉｕｍ、特にＢＡＳＦ社による、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｘ（登録商標）製品に含まれるもの）、エンベリア（Ｅｍｂｅｌｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ、Ｓｅｐｐｉｃ社により販売されているものとして）、オプンティア・ウルガリス（Ｏｐｕｎｔｉａ  ｆｉｃｕｓ  ｉｎｄｉｃａ、特にＭｉｂｅｌｌｅ  ＡＧ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙにより、ＡｑｕａＣａｃｔｅｅｎ（登録商標）の商品名で販売）、セージ（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、特にＰｒｏｖｉｔａｌ  Ｇｒｏｕｐにより販売）、ニンジンボク（Ｖｉｔｅｘ  ｎｅｇｕｎｄｏ、特にＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ  Ｅｘｐａｎｓｃｉｅｎｃｅにより、Ｎｅｕｒｏｖｉｔｙ（登録商標）の信用取引で販売）、クリ、パパイヤ、アルガン木、オート麦、ヒマワリ、デイジー、ボタン、又はディル；藻類の水性抽出物、特にはサンゴ藻、Ｊａｎｉａ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｕｎｇａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆａｄａ、Ａｌａｒｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、又はＮａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａの抽出物；精油、特にはギンバイカ；グルコン酸亜鉛及び／又はグルコン酸銅；並びにこれらの混合物である。
【００３３】
変形及び／又は追加として、本発明に係る組成物は、少なくとも１つのテンションポリマーを含んでいてもよい。すなわち該ポリマーは、機械的作用によって皮膚に張りを持たせることができ、その結果、皺及び小皺の発現を低減させることができるものである。該ポリマーは、合成ポリマーであっても、天然ポリマーであってもよく、特に、多糖類、特には海藻類又はプランクトン抽出物、もしくは植物ゴムである。
【００３４】
この組成物は、皮膚への局所的な適用に適した形態であればよく、特に、ミルク、クリーム、ローション、ジェル、又はマスクの形態である。これは通常、リーブオン型組成物である。
【実施例】
【００３５】
本発明に対する理解は、以下の実施例によってさらに明らかとなるであろう。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、添付の請求項によって定義される本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【００３６】
＜実施例１：ヒト感覚ニューロン及びケラチノサイトの共培養についてのインビトロ試験＞
１．材料及び方法
１．１．ｈｉＰＳ培養及び分化
感覚ニューロンは、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）由来のものである。このｉＰＳ細胞自身は、ヒト線維芽細胞から得られる。１０％のＫｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で補足されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｐａｎｂｉｏｔｅｃｈ製）、５μＭのＣＨＩＲ  ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ製）、０．１μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ製）、１μｇ／ｍＬのＥＰＯ（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ製）、各種中枢分化経路抑制剤（ｃｅｎｔｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の混合物、及び１％のＰＳ抗生物質（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｐａｎｂｉｏｔｅｃｈ製）を構成成分とする分化培地において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標、Ｃｏｒｎｉｎｇ製）の薄層でコーティングされた６ウェルプレートに、２５００００細胞／ウェルの割合でｉＰＳ細胞を播種した。３７℃及び５％ＣＯ２の環境で、６日間に亘って細胞の培養を続けた。培地は２日毎に交換した。このような培養条件下で、ｉＰＳ細胞はヒト感覚ニューロンへと分化する。
【００３７】
この段階で、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）を用いて、３７℃で１０分間に亘って細胞を解離させた。培地を添加することにより、反応を停止させた。１２００ｒｐｍで５分間に亘って細胞懸濁液を遠心分離した。トリパンブルーで細胞をカウントして細胞生存率を確定し、分化培地において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の薄層でコーティングされた９６ウェルプレートに、２００００細胞／ウェルの割合で細胞を播種した。
【００３８】
ケラチノサイト増殖培地（Ｌｏｎｚａ製）において、トリプシン処理による解離及び凍結の前に、１サイクルに亘って、成人ドナーからのケラチノサイト（Ｌｏｎｚａ製）を前増幅させた。これらのケラチノサイトを解凍し、ケラチノサイト増殖培地において、１サイクルに亘って、再び増幅させた。
【００３９】
９６ウェルプレートにおけるニューロン接着の２４時間後に、トリプシン処理によってケラチノサイトを解離させた。細胞をカウントして細胞生存率を確定し、２／３の感覚ニューロン成熟培地及び１／３のケラチノサイト増殖培地を構成成分とする培地において、３００００細胞／ウェルの割合で、ニューロン上にケラチノサイトを播種した。この成熟培地は、１％のＮ２（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で補足されたＤＭＥＭ−Ｆ１２、１％のＰＳ、１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ製）、１０ｎｇ／ｍＬのＮＴ３（ＮｅｕｒｏＴｒｏｐｈｉｎ−３、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ製）、及び１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ製）で構成されていた。
【００４０】
１．２．永久花の精油の細胞毒性
第１の培養において、２４時間の共培養後に、試験に供する化合物あり（０．００１％〜０．０１％の範囲の種々の濃度）又はなしで、培地を、２／３の増殖因子なしのヒト感覚ニューロン成熟培地及び１／３のケラチノサイト増殖培地を構成成分とする培地に交換した。各濃度について、６ウェルで培養を行った。
【００４１】
インキュベートの４８時間後に、培地において、２％の最終濃度で、パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ製）の溶液中に細胞を固定した後、該細胞をリン酸バッファー（ＰＢＳ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ製）で２回洗浄した。環境温度で１５分間に亘って、０．１％のサポニン（Ｓｉｇｍａ製）、５％のヤギ血清（ＧＳ、ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ製）、及び１％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｐａｎｂｉｏｔｅｃｈ製）を含むＰＢＳの溶液で、非特異部位をブロックした。４℃で２時間に亘って、５％のＧＳ及び０．１％のサポニンを含むＰＢＳにおいて、１／４００倍の抗β−チューブリンマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ製）ありで、続いて細胞をインキュベートした。抗β−チューブリン抗体は、細胞体及びヒト感覚ニューロン突起をラベルする。暗中にて環境温度で１時間に亘って、５％のＧＳ、０．１％のサポニン、及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳの溶液において、１／４００倍のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ製）で、この抗体を明らかにした。第２の抗体として同じ溶液において、１／１００００倍のＨｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ製）の溶液で、核を染色した。該Ｈｏｅｃｈｓｔは、核蛍光性マーカーである。
【００４２】
自動顕微鏡（ＩｎＣｅｌｌ  ２０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にて拡大率２０倍で、培養ウェル毎に２０枚の写真を撮影した。
【００４３】
１．３．神経突起増殖に対する永久花の精油の効果についての評価
第２の培養において、２４時間の共培養後に、種々の濃度の試験に供する化合物あり又はなしで、もしくは、５０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦで構成される参考分子あり又はなしで、培地を、２／３の増殖因子なしのヒト感覚ニューロン成熟培地及び１／３のケラチノサイト増殖培地を構成成分とする培地に交換した。上皮中に天然に存在しているＮＧＦ又は神経増殖因子は、インビトロにて、神経突起伸展を刺激することが知られている。試験濃度毎に、６ウェルにて培養を行った。
【００４４】
６日間に亘って培養を続け、研究対象の化合物を含む培地を、３日間後に交換した。
【００４５】
培養の６日後に、培地を除去し、該培地において、２％の最終濃度で、パラホルムアルデヒドの溶液にて細胞を固定した後、該細胞をＰＢＳで２回洗浄した。環境温度で１５分間に亘って、０．１％のサポニン、５％のヤギ血清、及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳの溶液で、非特異部位をブロックした。４℃で２時間に亘って、５％のＧＳ及び０．１％のサポニンを含むＰＢＳにおいて、１／４００倍の抗β−チューブリンマウスモノクローナル抗体ありで、続いて細胞をインキュベートした。抗β−チューブリン抗体は、細胞体及びヒト感覚ニューロン突起をラベルする。暗中にて環境温度で１時間に亘って、５％のＧＳ、０．１％のサポニン、及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳの溶液において、１／４００倍のヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で、この抗体を明らかにした。第２の抗体として同じ溶液において、１／１００００倍のＨｏｅｃｈｓｔ（Ｓｉｇｍａ製）の溶液で、核を染色した。該Ｈｏｅｃｈｓｔは、核蛍光性ラベルであった。
【００４６】
自動顕微鏡（ＩｎＣｅｌｌ  ２０００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にて拡大率２０倍で、培養ウェル毎に２０枚の写真を撮影し、感覚ニューロンの細胞体をカウントした。また、突起の長さを測定し、ラベルされたニューロン細胞体の数に対して標準化した。評価する化合物での処置の各条件に対する結果を得て、ＮＧＦをコントロール培地と比較した。
【００４７】
１．４．統計的研究
Ｏｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ試験を用い、統計的研究を行った。
【００４８】
２．結果
２．１．永久花の精油の細胞毒性
永久花の精油は、評価濃度で、ヒト感覚ニューロンへの毒性がない。
【００４９】
２．２．神経突起増殖に対する永久花の精油の効果についての評価
永久花の精油は、評価濃度で、ヒト感覚ニューロン数に何らかの変調を起こさせない。このことは、細胞毒性研究で得られた結果と一致する。
【００５０】
ＮＧＦは５０ｎｇ／ｍＬで、ヒト感覚ニューロンの突起の長さを増大させる（＋２２．８％、ｐ＜０．０５）。この結果により、実験が立証される。
【００５１】
永久花の精油は、０．０１％、０．００５％、及び０．００１％の濃度で、感覚ニューロンの突起の長さを著しく増大させる（各々、３５．８％  ｐ＜０．００１、３０．８％  ｐ＜０．００１、及び４０．３％  ｐ＜０．００１の増大）。
【００５２】
３．結論
永久花の精油は、ケラチノサイトとの共培養におけるヒト感覚ニューロンの突起の長さを増大させることによって、神経支配の密度を増大させる。
【００５３】
＜実施例２：化粧料組成物＞
以下の組成物を、当業者が用いる従来の方法によって、すなわち、各成分を以下に示す重量割合で混合して調製した。
非イオン性乳化剤  ６．００％
シアバター        ２．００％
脂肪相増粘剤      ６．５０％
油                ８．２５％
アデノシン        ０．０４％
グリセロール      ６．００％
水相増粘剤        ２．５０％
永久花の精油      ０．０２％
水酸化ナトリウム  １．００％
防腐剤            適量
香料              適量
水                適量（全量が１００．００％となる量）
【国際調査報告】
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