(57)【要約】本開示は、心臓の発生および／または機能にｉｎ  ｖｉｖｏで関与する転写因子に変異を有する操作された心筋細胞の開発を提供する。これらの細胞集団は、哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏの有害作用と関連する変異を含む。本開示の操作された心筋細胞の変異は、したがって、哺乳動物、例えばマウスまたはヒトにおける実証された生理効果に基づいて合理的に設計される。一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のＧＡＴＡ４変異を有する、人工多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｉＰＳＣ−心筋細胞）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された心筋細胞の集団であって、前記細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞から生成され、前記細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏの心臓表現型に関連した少なくとも１つの変異を含む、操作された心筋細胞の集団。
【請求項２】
前記ｉｎ  ｖｉｖｏの心臓表現型が心筋症である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記細胞が、ヒト多能性幹細胞から生成される、請求項１および２に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記細胞が、ヒト人工多能性幹細胞から生成される、請求項１、２および３に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記人工多能性幹細胞が、心筋症の被験体に由来する、請求項４に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記細胞が、心臓の発生および／または筋収縮のために必要とされる遺伝子に付随するスーパーエンハンサーエレメントにおけるＧＡＴＡ４および／またはＴＢＸ５結合の破壊を引き起こす１つまたは複数の変異を含む、請求項１〜５に記載の細胞集団。
【請求項７】
前記操作された心筋細胞が、ＰＩ３Ｋ経路に少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜５に記載の細胞集団。
【請求項８】
前記操作された心筋細胞が、ＧＡＴＡ４遺伝子に少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜７に記載の細胞集団。
【請求項９】
前記操作された心筋細胞が、ＧＡＴＡ４とＴＢＸ５の間の相互作用を阻害する少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜８に記載の細胞集団。
【請求項１０】
心臓の発生および／または筋収縮のために必要とされる遺伝子に付随するスーパーエンハンサーエレメントにおけるＧＡＴＡ４および／またはＴＢＸ５結合の破壊を引き起こす少なくとも１つの変異を含む、操作された哺乳動物胚性幹細胞。
【請求項１１】
前記幹細胞が、齧歯動物である、請求項１０に記載の胚性幹細胞。
【請求項１２】
前記幹細胞が、ヒトである、請求項１０に記載の胚性幹細胞。
【請求項１３】
操作された心筋細胞において力発生を増加させるための方法であって、前記細胞にＰＩ３Ｋの活性化因子を投与するステップを含む、方法。
【請求項１４】
ＧＡＴＡ４遺伝子に変異を有する操作された心筋細胞において拍動速度を増加させるための方法であって、前記細胞にＰＩ３Ｋの活性化因子を投与するステップを含む、方法。
【請求項１５】
候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、
前記候補薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された心筋細胞と接触させるステップであって、前記操作された心筋細胞が、心臓の発生および／または筋収縮のために必要とされる遺伝子に付随するスーパーエンハンサーエレメントにおけるＧＡＴＡ４および／またはＴＢＸ５結合の破壊を引き起こす少なくとも１つの変異を含む、ステップと、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、前記操作された心筋細胞の表現型に対する前記候補薬剤の効果を検出するステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
前記操作された心筋細胞が、ＧＡＴＡ４とＴＢＸ５の間の相互作用を阻害する少なくとも１つの変異を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記操作された心筋細胞が、ＧＡＴＡ４遺伝子に少なくとも１つの変異を含む、請求項１５および１６に記載の方法。
【請求項１８】
候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、
前記候補薬剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作された心筋細胞と接触させるステップであって、前記操作された心筋細胞がＰＩ３Ｋ経路に少なくとも１つの変異を含む、ステップと、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、前記操作された心筋細胞の表現型に対する前記候補薬剤の効果を検出するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学、多能性幹細胞および細胞分化の分野に一般的に関する。本発明は、神経先駆細胞の集団およびその治療的使用を開示する。
【０００２】
連邦政府によって資金供与を受けた研究開発
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金番号ＨＬ０８９７０７の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
相互参照
この出願は、２０１６年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５４，９３７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００４】
以下の議論では、ある特定の物品および方法が背景および紹介目的のために記載される。本明細書に含まれるものは、いずれも先行技術の「承認」と解釈されるべきでない。出願人は、該当する場合、本明細書で参照される物品および方法が適用可能な法律の条項の下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
【０００５】
細胞の同一性および機能は、正確な転写因子局在化を必要とする。心細胞運命機構の多数の転写およびエピジェネティックな調節因子が出現しているが（ＭｃＣｕｌｌｅｙおよびＢｌａｃｋ、２０１２年；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、２００６年）、ほとんどの同定された転写因子は心臓の組織において排他的に発現されない。代わりに、それらは物理的および機能的に相互作用して、心臓の発生および機能を共調節する（Ｈｅら、２０１１年；Ｌｕｎａ−Ｚｕｒｉｔａら）。しかし、遺伝子調節ネットワークの相互作用のどのような特異的破壊がヒト疾患に寄与するかは、未知のままである。
心血管系の状態、疾患および損傷の臨床管理は、臨床上の必要性がかなり満たされていない領域のままである。したがって、向上した有効な処置および心血管疾患に対処するための治療剤を同定する方法への差し迫った必要性がまだある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｄ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ（２００６）１、１９９〜２１３
【非特許文献２】Ｈｅ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１１）１０８、５６３２〜５６３７
【非特許文献３】Ｌｕｎａ−Ｚｕｒｉｔａ，Ｌ，ら、Ｃｅｌｌ，１６４，９９９〜１０１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この概要は、発明を実施するための形態において下でさらに記載される簡略化された形の概念の選択を紹介するために提供される。この概要は特許請求される主題のカギとなるまたは必須の特色を同定することを意図するものでなく、特許請求される主題の範囲を制限するために使用されることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特色、詳細、有用性および利点は、付随の図面に図示され、添付の特許請求の範囲に規定される態様を含む、以下の発明を実施するための形態の文書から明らかになる。
【０００８】
本開示は、心臓の発生および／または機能を破壊する転写因子および／またはシグナル伝達経路に変異を有する操作された心筋細胞の発生を提供する。これらの細胞集団は、哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏの有害な心臓効果と関連する変異を含む。本開示の操作された心筋細胞の変異は、哺乳動物、例えばマウスまたはヒトにおける実証された生理効果に基づいて合理的に設計される。
【０００９】
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のＧＡＴＡ４変異を有する、人工多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｉＰＳＣ−心筋細胞）を提供する。他の態様では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のＧＡＴＡ４変異を有する、多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｐＳＣ−心筋細胞）を提供する。具体的な態様では、これらの細胞は、哺乳動物、例えば、齧歯動物またはヒトである。これらの細胞集団は、心臓の発生および／または機能に対するそれらの効果について候補薬剤をスクリーニングするのに有益である。
【００１０】
他の態様では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のＴＢＸ５変異を有する、人工多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｉＰＳＣ−心筋細胞）を提供する。具体的な態様では、これらの細胞は、哺乳動物、例えば、齧歯動物またはヒトである。他の態様では、本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数のＴＢＸ５変異を有する、多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｐＳＣ−心筋細胞）を提供する。これらの細胞集団は、心臓の発生および／または機能に対するそれらの効果について候補薬剤をスクリーニングするのに有益である。
【００１１】
具体的な態様では、本開示は、本明細書に記載されるＰＩ３Ｋシグナル伝達経路に１つまたは複数の変異を有する、人工多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｉＰＳＣ−心筋細胞）を提供する。他の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＰＩ３Ｋシグナル伝達経路の分子に１つまたは複数の変異を有する、多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｐＳＣ−心筋細胞）を提供する。具体的な態様では、これらの細胞は、哺乳動物、例えば、齧歯動物またはヒトである。これらの細胞集団は、心臓の発生および／または機能に対するそれらの効果について候補薬剤をスクリーニングするのに有益である。
【００１２】
ある特定の態様では、本発明は、本明細書に開示される生理的に関連する変異の１つまたは複数を含む操作された心筋細胞集団を使用して、治療用薬物候補をスクリーニングするための方法に関する。候補薬剤によるこれらのスクリーニング方法は、薬剤の心毒性を評価するためにも有益である。
【００１３】
したがって、本開示は、治療的使用のための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、ＧＡＴＡ４に変異を含む少なくとも１つの操作された心筋細胞を候補薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、変異なしの少なくとも１つの操作された心筋細胞を含む対照と比較した、操作された心筋細胞の少なくとも１つの細胞特性の変化に基づいて、候補薬剤の効果を決定するステップとを含み、変異なしの細胞と比較して、候補薬剤が、変異体細胞の細胞特性に対して正の生理効果を有する場合、治療的使用のための実現性がある候補薬剤として同定される、方法を提供する。
【００１４】
本開示は、治療的使用のための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、ＴＢＸ５に変異を含む少なくとも１つの操作された心筋細胞を候補薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、変異なしの少なくとも１つの操作された心筋細胞を含む対照と比較した、操作された心筋細胞の少なくとも１つの細胞特性の変化に基づいて、候補薬剤の効果を決定するステップとを含み、変異なしの細胞と比較して、候補薬剤が、変異体細胞の細胞特性に対して正の生理効果を有する場合、治療的使用のための実現性がある候補薬剤として同定される、方法をさらに提供する。
【００１５】
本開示は、治療的使用のための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の遺伝子に変異を含む少なくとも１つの操作された心筋細胞を候補薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、変異なしの少なくとも１つの操作された心筋細胞を含む対照と比較した、操作された心筋細胞の少なくとも１つの細胞特性の変化に基づいて、候補薬剤の効果を決定するステップとを含み、変異なしの細胞と比較して、候補薬剤が、変異体細胞の細胞特性に対して正の生理効果を有する場合、治療的使用のための実現性がある候補薬剤として同定される、方法をさらに提供する。
【００１６】
本開示の操作された心筋細胞集団は、薬剤の心毒性を評価するために使用することもできる。例えば、対照と比較して、薬剤が少なくとも１つの操作された心筋細胞に負の効果を過度に発揮する場合、薬剤は心毒性であると考えることができる。薬剤が、使用のために安全であると考えることができないような程度に、少なくとも１つの電気生理学的特性を増加または減少させる場合、薬剤は心毒性であると考えることもできる。例えば、フィールド電位持続時間（ｆｉｅｌｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）（ＦＰＤ）、最小フィールド電位（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｆｉｅｌｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）（Ｆｐｍｉｎ）、伝導速度および／または拍動頻度を過度に増加させる薬剤は、安全である可能性が低い。あるいは、フィールド電位持続時間（ＦＰＤ）、最小フィールド電位（Ｆｐｍｉｎ）、伝導速度および／または拍動頻度を過度に減少させる（例えば、ほぼ平らな線になる）薬剤は、安全である可能性が低い。さらに、拍動リズムの規則性の変化、例えば不規則な拍動リズムを引き起こす場合、薬剤は心毒性であると考えることもできる。心血管療法以外の治療的適用を有する薬剤（すなわち、非心血管剤）の心毒性を評価することもできる。
【００１７】
他の態様では、本発明は、候補薬剤の投与の後に被験体における心筋症のリスクおよび／または素因を予測するための方法であって、被験体に由来した少なくとも１つの操作された心筋細胞を提供するステップと、少なくとも１つの操作された心筋細胞を候補薬剤と接触させるステップと、候補薬剤の投与の後に被験体の心筋症のリスクを決定するステップとを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに、方法は、薬剤の投薬量および／または投薬量範囲を選択するために使用することができる。人工多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞は、適する投薬量および／または投薬量範囲を選択するための有益なモデルである。例えば、薬剤の様々な投薬量の効果を前記対照と比較して、前記効果を発揮することが可能な薬剤の適する投薬量または投薬量範囲を選択することができる。特に、適する投薬量および／または投薬量範囲は、最小限の心毒性で治療的に有効である可能性がある効果を発揮するものであろう。
【００１９】
本開示は、治療的使用のための候補薬剤として薬剤をスクリーニングするための方法であって、ＧＡＴＡ４に変異を含む少なくとも１つの操作された心筋細胞を異なる投薬量の候補薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、薬剤なしの少なくとも１つの操作された心筋細胞を含む対照と比較した、異なる投薬量の薬剤と接触させた操作された心筋細胞の少なくとも１つの細胞特性の変化に基づいて、候補薬剤の効果を決定するステップとを含み、治療薬のための候補薬剤の治療有効投薬量が、薬剤なしの細胞と比較して変異体細胞の細胞特性に対して正の生理効果を有する投薬量を同定することによって決定される、方法も提供する。
【００２０】
本開示は、治療的使用のための候補薬剤として薬剤をスクリーニングするための方法であって、ＴＢＸ５に変異を含む少なくとも１つの操作された心筋細胞を異なる投薬量の候補薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、薬剤なしの少なくとも１つの操作された心筋細胞を含む対照と比較した、異なる投薬量の薬剤と接触させた操作された心筋細胞の少なくとも１つの細胞特性の変化に基づいて、候補薬剤の効果を決定するステップとを含み、治療薬のための候補薬剤の治療有効投薬量が、薬剤なしの細胞と比較して変異体細胞の細胞特性に対して正の生理効果を有する投薬量を同定することによって決定される、方法も提供する。
【００２１】
本開示は、治療的使用のための候補薬剤として薬剤をスクリーニングするための方法であって、ＰＩ３Ｋ経路の遺伝子に変異を含む少なくとも１つの操作された心筋細胞を異なる投薬量の候補薬剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップと、薬剤なしの少なくとも１つの操作された心筋細胞を含む対照と比較した、異なる投薬量の薬剤と接触させた操作された心筋細胞の少なくとも１つの細胞特性の変化に基づいて、候補薬剤の効果を決定するステップとを含み、治療薬のための候補薬剤の治療有効投薬量が、薬剤なしの細胞と比較して変異体細胞の細胞特性に対して正の生理効果を有する投薬量を同定することによって決定される、方法も提供する。
【００２２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ウイルスまたは非ウイルスベースの方法によって胚性状態に再プログラミングすることを含むがこれだけに限定されない、任意の方法によって成体の体細胞から生成することができる。これらのｉＰＳＣは、自己再生能力および操作された心筋細胞を含む様々な細胞型への分化能力において、胚性幹細胞に似ている。例えば、ｉＰＳＣは、任意の方法によって心筋細胞様細胞にさらに分化させることができる。そのような人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の操作された心筋細胞（ｉＰＳＣ−心筋細胞）は、薬物候補としての薬剤をスクリーニングするための有益なモデルであることが見出された。特定の態様により、ヒト人工多能性幹細胞由来の操作された心筋細胞（ｈｉＰＳＣ−心筋細胞）を誘導するために、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を使用することができる。
【００２３】
本開示は、治療用薬物候補としての薬剤のスクリーニングでの使用のための、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の操作された心筋細胞（複数可）にも関する。ある特定の態様では、薬剤をスクリーニングするための本開示のアッセイは、個々の被験体のためにカスタマイズされる。したがって、被験体からの幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）に由来する操作された心筋細胞は、被験体のための候補治療剤をスクリーニングするために使用することができる。
【００２４】
本開示を読むと当業者にとって明らかになる通り、操作された心筋細胞は、当技術分野で利用可能な任意の方法を使用して生成することができる。一態様では、心筋細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞、例えば、齧歯動物またはヒトの多能性幹細胞から生成される。例えば、目的の変異を含む多能性幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の、操作された心筋細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の過程によって、細胞を生成することができる。別の例では、人工多能性幹細胞は、正常なまたは病的な哺乳動物被験体から単離された体細胞の再プログラミングの過程によって生成し、その後、操作された心筋細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることができる。本開示は、薬物候補としての薬剤のスクリーニングでの使用のための、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の操作された心筋細胞（複数可）にも関する。
【００２５】
ある特定の態様では、本開示は、心臓の発生および／または筋収縮のために必要とされる遺伝子に付随するスーパーエンハンサーエレメントにおけるＧＡＴＡ４および／またはＴＢＸ５結合を破壊する変異を有する被験体からのｉＰＳ由来の操作された心筋細胞を提供する。本明細書に示されるように、これらの細胞は、障害のある収縮性、カルシウム調節および代謝活性を提示する。
【００２６】
具体的な態様では、本開示は、ＧＡＴＡ４−Ｇ２９６Ｓ変異を有する被験体からのｉＰＳ由来の操作された心筋細胞を提供する。これらの細胞は、障害のある収縮性、カルシウム調節および代謝活性を提示する。ＧＡＴＡ４−Ｇ２９６Ｓ変異は、ＧＡＴＡ４と心臓エンハンサーを共占有することが示された別の心臓性転写因子ＴＢＸ５の動員を混乱させた。ＧＡＴＡ４−Ｇ２９６Ｓ変異は非心臓遺伝子へのＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５の誤った局在化につながり、これらの遺伝子座、特に内皮／心内膜プロモーターにおける開放クロマチン状態を強化した。それに応じて、ＧＡＴＡ４変異体は、細胞の同一性のより広い調節不全の一部として内皮／心内膜遺伝子発現を抑制することができなかった。
【００２７】
これらの態様ならびに本発明の他の特色および利点は、下でより詳細に記載される。当業者は、単にルーチンの実験操作を使用して、本明細書に記載された発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができる。そのような同等物は、下の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異を有する４人の被験体および変異のない４人のファミリーメンバーにおけるＧＡＴＡ４変異分布を示す概略図である。女性は円で示し、男性は四角で示す。太字の縁は、ＣＲＩＳＰＲ補正ｉＰＳ株を表す。ＷＴ、野生型家族性対照；Ｇ２９６Ｓ、ＧＡＴＡ４にこの変異を有する患者；ｃｍｙ、心筋症；ＡＳＤ、心房中隔欠損症；ＶＳＯ、心室中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｔｅｃｔ）、ＡＶＳＤ、房室中隔欠損症；ＰＳ、肺動脈弁狭窄。最下部は、ＧＡＴＡ４タンパク質ドメインの概略図を示す。ＴＡＤ、トランス活性化ドメイン；ＺＦ、ジンクフィンガードメイン；ＮＬＳ、核局在化シグナル。
【００２９】
【図２】図２は、図１に示すファミリーメンバーのドナー状態およびＧＡＴＡ４遺伝子状態を要約するチャートである。
【００３０】
【図３】図３は、野生型とＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異体のヒトの間の差を実証する心エコー図である。無関係な正常な小児およびＧＡＴＡ  Ｇ２９６Ｓ患者からの経胸心尖部四腔断層像心エコー図（ｔｒａｎｓｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｐｉｃａｌ  ｆｏｕｒ−ｃｈａｍｂｅｒ  ｖｉｅｗ  ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｍ）からの代表的な静止画像を示す。矢印は、変異を有する心臓の右心室（ＲＶ）の本体および尖部における高密度小柱形成を示す。ＲＡ、右心房；ＬＶ、左心室；ＬＡ、左心房。
【００３１】
【図４】図４は、ＧＡＴＡ４に点変異を有するｉＰＳ細胞における点変異を補正するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９方法を示す概略図である。戦略は、二重ニッカーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびドナーＤＮＡカセットを使用する。
【００３２】
【図５】図５は、図４に図示する方法を使用したｉＰＳ細胞における点変異の補正を実証したシークエンシングクロマトグラムである。
【００３３】
【図６】図６は、ＣＲＩＳＰＲ編集の後の細胞株の組織形態を示す写真のセットである。
【００３４】
【図７】図７は、図１および２に記載したドナーの８つの樹立されたｉＰＳ細胞株の一連の核型である。
【００３５】
【図８】図８は、図１および２に記載したドナーの８つの樹立されたｉＰＳ細胞株における選択された転写物の発現を示す。
【００３６】
【図９】図９は、図１および２に記載したドナーの８つの樹立されたｉＰＳ細胞株における多能性マーカーの染色を示す一連の写真である。
【００３７】
【図１０】図１０は、図１および２に記載したドナーの８つの樹立されたｉＰＳ細胞株の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで３つ全ての生殖細胞系列の組織に分化する能力を示す一連の写真である。
【００３８】
【図１１】図１１は、図１および２に記載したドナーの樹立されたｉＰＳ細胞株のＲＮＡ−ｓｅｑプロットである。
【００３９】
【図１２】図１２は、ｉＰＳ細胞から心筋細胞を生成するための細胞分化過程の後の、心筋細胞マーカーの発現を示す一連の写真である。
【００４０】
【図１３】図１３は、心筋細胞分化を経ているｉＰＳ細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析、ＧＯ分析およびシグナル伝達経路分析を示す。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００４１】
【図１４】図１４は、中胚葉、心臓の前駆細胞（ＣＰＣ）および心筋細胞を代表する選択された遺伝子のためのステージ特異的遺伝子発現のシグネチャーを示す一連のグラフである。
【００４２】
【図１５】図１５は、サルコメアおよび筋原線維のマーカーの高レベルの発現により、ｉＰＳ心筋細胞がヒト心筋細胞と類似の遺伝子発現を提示したことを示す一連の２枚の写真である。
【００４３】
【図１６】図１６は、膜電気生理および自発的に収縮するｉＰＳ心筋細胞の能力を図示する。
【００４４】
【図１７】図１７は、ｈｉＰＳ細胞由来の心筋細胞のカルシウムフラックス測定およびイソプロテレノール（βアドレナリン作用性アゴニスト）と続くカルバコール（コリン作用性アゴニスト）への予想される応答を示すグラフである。
【００４５】
【図１８】図１８は、ミトコンドリア、Ｚ線およびサルコメアを示す代表的なｉＰＳ由来の心筋細胞の電子顕微鏡写真である。
【００４６】
【図１９】図１９は、乳酸精製の後の代表的なＷＴおよびＧ２９６Ｓ細胞からのｃＴｎＴ＋心筋細胞および分化のＦＡＣＳ分析を示す。
【００４７】
【図２０】図２０は、単一細胞のアレイとしてパターン化された心筋細胞（上側）、生理的基質（剛性（１０ｋＰａ）および表面積（２０００μｍ２））においてα−アクチニンまたはＦ−アクチンについて免疫染色した心筋細胞（下側）を示す。細胞は、成熟したサルコメアの器質化を示す。
【００４８】
【図２１】図２１は、マイクロパターンでの収縮測定を示すグラフのセットである。ＷＴおよびＧ２９６Ｓ細胞における１Ｈｚ電気ペーシングに正確に応答する単一の心筋細胞の百分率を、左に示す。１Ｈｚペーシングに正確に応答する全ての心筋細胞の細胞変位の関数としての力生成の牽引力顕微鏡検査測定を、右に示す。全ての測定は、２つの患者株から独立して生成された心筋細胞により三連で実行した。
【００４９】
【図２２】図２２は、ＷＴおよびＧ２９６Ｓ心筋細胞における低下した収縮時間を示すグラフである。
【００５０】
【図２３】図２３は、ＷＴおよびＧ２９６Ｓ心筋細胞の活動電位測定を示すグラフのセットである。オーバーシュート電位（ＯＳＰ）は、到達した最も高い膜電位である；ｄＶ／ｄｔｍａｘは、最大アップストローク速度である；ＡＰＤ９０は、９０％再分極の活動電位の持続時間である。示すデータは、２つのＷＴおよび２つのＧ２９６Ｓ細胞株からの平均±ＳＥＭである。＊は、ｐ＜０．０５（マン−ホイットニー検定）を表す。
【００５１】
【図２４】図２４は、マイクロクラスターでのカルシウムフラックス測定、Ｆ／Ｆ０（最大）、活動電位間のベースライン蛍光に対するピーク振幅を示すグラフである。示すデータは、２つのＷＴおよび２つのＧ２９６Ｓ細胞株からの平均±ＳＥＭである。＊は、ｐ＜０．０５（マン−ホイットニー検定）を表す。
【００５２】
【図２５】図２５は、単一の心筋細胞マイクロパターンのミトコンドリア染色強度を示すグラフである（上側）。細胞面積と比較したＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ赤色強度を定量化した（下側）。示すデータは、２つのＧ２９６Ｓ細胞株からの平均±ＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．００５（ｔ検定）。
【００５３】
【図２６】図２６は、解糖機能のｓｅａｈｏｒｓｅ測定を示すグラフである。同質遺伝子型心筋細胞データは、平均±ＳＥＭである。＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５（ｔ検定）。
【００５４】
【図２７】図２７は、ＷＴおよびＧ２９６Ｓ細胞からのｍｔＤＮＡのゲノム配列決定の後の新規ｍｔＤＮＡ変異を示すグラフである。
【００５５】
【図２８】図２８は、ＲＮＡ−ｓｅｑプロファイルに基づく全ての分化時間経過試料のためのスピアマン相関スコアの階層的クラスタリングを示すヒートマップである。ｈＥＳ、Ｈ７、ｈｉＰＳ、ＷＴ１、ＷＴ＿ＭＥＳ、ＷＴ１。暗灰色、ＧＡＴＡ４変異体；１のスコア（薄灰色）は、完全な相関を表す。
【００５６】
【図２９】図２９は、ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルに基づく全ての分化時間経過試料のためのヒト胎児組織予測マトリクスである。暗灰色、ＧＡＴＡ４変異体、１のスコア（薄灰色）は、最も高い類似性を表す。
【００５７】
【図３０】図３０は、任意の時点で異なって発現された２，２２８遺伝子の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。暗灰色および薄灰色は、それぞれ低下したおよび増加した発現（Ｌｏｇ２ＦＣ）を表す。
【００５８】
【図３１】図３１は、ＣＰＣ、Ｄ１５−心筋細胞およびＤ３２−心筋細胞において異なって発現された遺伝子の下方制御（左）および上方制御（右）を示すベン図のセットである。
【００５９】
【図３２】図３２は、ＣＰＣから成熟した心筋細胞への分化の間の下方および上方制御された遺伝子のＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００６０】
【図３３】図３３は、ＣＰＣから成熟した心筋細胞への分化の間の異なって発現された遺伝子の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。値は、相対的な発現を示すために行でスケーリングされている。暗灰色および薄灰色は、それぞれ高レベルおよび低レベルである。代表的な下方および上方制御された遺伝子を列挙する。
【００６１】
【図３４】図３４は、ＧＡＴＡ因子結合が富化され、ｐ３００およびＰＲＣ２複合体によって発生的に調節され、心血管の発生および機能にとって重要である遺伝子を示すＮｅｔｗｏｒｋ２Ｃａｎｖｅｓ分析を示す。
【００６２】
【図３５】図３５は、ＣＰＣにおいて異なって発現された遺伝子の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。値は、相対的な発現を示すために行でスケーリングされている。暗灰色および薄灰色は、それぞれ高レベルおよび低レベルである。代表的な下方および上方制御された遺伝子を列挙する。
【００６３】
【図３６】図３６は、ＣＰＣにおいて下方および上方制御された遺伝子のＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００６４】
【図３７】図３７は、平均３．１の近傍物および４．８の経路長による１００ノードのスケールフリーのネットワークである。ノードは、心筋細胞分化の間にＧ２９６Ｓ  ＣＰＣにおいて下方制御される遺伝子である。
【００６５】
【図３８】図３８は、Ｄ１５心筋細胞において異なって発現された遺伝子の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。値は、相対的な発現を示すために行でスケーリングされている。暗灰色および薄灰色は、それぞれ高レベルおよび低レベルである。代表的な下方および上方制御された遺伝子を列挙する。
【００６６】
【図３９】図３９は、Ｄ１５心筋細胞において下方および上方制御された遺伝子のＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００６７】
【図４０】図４０は、Ｄ３２心筋細胞において異なって発現された遺伝子の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。値は、相対的な発現を示すために行でスケーリングされている。暗灰色および薄灰色は、それぞれ高レベルおよび低レベルである。代表的な下方および上方制御された遺伝子を列挙する。
【００６８】
【図４１】図４１は、Ｄ３２心筋細胞において下方および上方制御された遺伝子のＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００６９】
【図４２】図４２は、ＷＴ対Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における細胞呼吸遺伝子の低減を示すＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（ＧＳＥＡ）のグラフである。
【００７０】
【図４３】図４３は、平滑筋において異なって発現された遺伝子の階層的クラスタリングを示すヒートマップである。
【００７１】
【図４４】図４４は、心臓（上側）および内皮／心内膜（下側）発生に関する遺伝子セットのＧＳＥＡ分析を示す。ＮＥＳ、正規化富化スコア。ＦＤＲ、偽発見率。正のＮＥＳは、ｉＷＴ細胞におけるより高い発現を意味する。負のＮＥＳは、Ｇ２９６Ｓ細胞におけるより高い発現を意味する。
【００７２】
【図４５】図４５は、ＷＴ（黒色）およびＧ２９６Ｓ（暗灰色）細胞からの正規化ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルがＥＮＣＯＤＥ−ＯＨＳ（薄灰色領域）からの正規化シグナルに一致することを示す、第１４染色体：２３６９３０１５〜２４１６８０５９でのＩＧＶブラウザートラックである。
【００７３】
【図４６】図４６は、ｉＷＴ  ＣＰＣにおいて同定されたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの、ＥＮＣＯＤＥ−ＤＨＳ；Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｄ５ＣＰＣ）（Ｓｔｅｒｇａｃｈｉｓら、２０１３年）±中心周囲１ｋｂからの正規化された読み取り数のヒートマップである。白色および灰色は、それぞれ低いおよび高いシグナル強度である。
【００７４】
【図４７】図４７は、１４５３２個のｉＷＴ  ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの遺伝子本体、上流および下流分布（上側）ならびにコードおよび非コード遺伝子分布（下側）を示す円チャートである。
【００７５】
【図４８】図４８は、ＷＴ（黒色）とＧ２９６Ｓ（暗灰色）の間の減少したおよび増加した（薄灰色領域）ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを示す、ＴＢＸ５（上側）およびＳＯＸ１７（下側）遺伝子座でのＩＧＶブラウザートラックである。スケールは、読み取り／１００万／２５ｂｐを表す。
【００７６】
【図４９】図４９は、心臓（上側）および内皮（下側）発生に関する遺伝子セットのｉＷＴ（黒色）およびＧ２９６Ｓ（暗灰色）の正規化ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナル±ＴＳＳ周囲５ｋｂのメタ遺伝子プロットを示すグラフである。
【００７７】
【図５０】図５０は、Ｇ２９６Ｓ  ＣＰＣにおいて上方制御されたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークが富化された公知のコンセンサスを示す。
【００７８】
【図５１】図５１は、一般のピークを除外した後の下方制御（上側）および上方制御（下側）されたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークのＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す２つの棒グラフのセットである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００７９】
【図５２】図５２は、ｉＷＴ細胞（黒色）およびＧ２９６Ｓ細胞（灰色）における選択された異なって発現されたＮＯＴＣＨ（上側）およびＮＦＡＴ（下側）標的遺伝子のＦＰＫＭ値を示す４つの棒グラフのセットである。データは、平均±ＳＤである。＊ＦＤＲ＜０．０５。
【００８０】
【図５３】図５３は、ＷＴ心筋細胞における公知の標的遺伝子座（ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ）での、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５；Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のためのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのＩＧＶブラウザートラックを示す。灰色のボックス、ＭＡＣＳ２によって同定された有意なピーク。スケールは、読み取り／１００万／２５ｂｐを表す。
【００８１】
【図５４】図５４は、ＷＴ心筋細胞におけるさらなる標的遺伝子座（ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ１）での、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５；Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のためのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのＩＧＶブラウザートラックを示す。灰色のボックス、ＭＡＣＳ２によって同定された有意なピーク。スケールは、読み取り／１００万／２５ｂｐを表す。
【００８２】
ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルは、遺伝子発現レベルとも正に相関していた（図５５）。全体として、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＨ３Ｋ２７ａｃが最も強力なものを共有し（図５６）、ＧＡＴＡ４部位のほぼ半分はＴＢＸ５によって共結合していた（図５６、５７）。ヒトＧ４Ｔ５によって共結合した２４２８部位は、ＧＡＴＡ４またはＴＢＸ５単独によって結合した部位より高いＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを有していた（図５８）。共結合した部位の大部分は、筋原線維アセンブリー、心筋発生および収縮、ＣＨＤならびに心筋症に関する遺伝子のイントロン（４８％）および遺伝子間（３５％）エンハンサー部位にマッピングされた（図５９、６０）。
【００８３】
【図５５】図５５は、ＷＴ心筋細胞におけるゲノム占有の重複のための、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３についての正規化ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのメタ遺伝子プロットである。
【００８４】
【図５６】図５６は、ＷＴ心筋細胞において同定された２４２８のＧ４Ｔ５共結合部位（±．５ｋｂ）での、ＥＮＣＯＤＥ−ＤＨＳ；ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３からの正規化された読み取り数のヒートマップである。白色および灰色は、それぞれ低いおよび高いシグナル強度である。
【００８５】
【図５７】図５７は、ＴＢＸ５によって共結合したＧＡＴＡ４部位を示すベン図である。
【００８６】
【図５８】図５８は、単一の転写因子の結合に対してＧ４Ｔ５共結合した部位での、正規化されたＧＡＴＡ４（左）またはＴＢＸ５（右）シグナルのためのグラフのセットである。ボックスプロットおよびひげは、平均値、２５および７５パーセンタイル、続いて５および９５パーセンタイルを示す。＊＊＊＊ｐ＜０．００００５（コルモゴロフ−スミルノフ検定）。
【００８７】
【図５９】図５９は、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５の遺伝子のイントロン（４８％）および遺伝子間（３５％）の共結合部位エンハンサー部位を図示する。
【００８８】
【図６０】図６０は、筋原線維アセンブリー、心筋発生および収縮、ＣＨＤ、心筋症などにおける下方および上方制御された遺伝子のＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００８９】
【図６１】図６１は、ＷＴ心筋細胞における２４２８のＧ４Ｔ５共結合部位が富化されたコンセンサスモチーフである。
【００９０】
【図６２】図６２は、Ｇ２９６心筋細胞におけるＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５の遺伝子の共結合エンハンサー部位を示すベン図である。
【００９１】
【図６３】図６３は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞において同定された２４２８のＧ４Ｔ５共結合部位（±．５ｋｂ）での、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のための正規化されたＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのメタ遺伝子プロットである。
【００９２】
【図６４】図６４は、ＷＴ細胞とＧ２９６Ｓ細胞の間の、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５またはＧ４Ｔ５結合部位における変化を示すベン図（上側）である。ＷＴで失われた（Ｌ）、Ｇ２９６Ｓで増加した（Ｅ）、および不変の（Ｕ）部位の数を示す。相対的な（Ｇ２９６Ｓ／ＷＴ）ＣｈＩＰ−ｓｅｑ占有率±Ｌ、ＵまたはＥである部位周囲３ｋｂのメタ遺伝子の凡例。下側、Ｌ、ＵまたはＥ部位でのＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＨ３Ｋ２７ａｃ占有率における相対的変化。
【００９３】
【図６５】図６５は、ｉＷＴ（黒色）およびＧ２９６Ｓ（灰色）の心臓分化の間の、Ｇ４Ｔ５Ｌ部位、Ｇ４Ｔ５Ｕ部位およびＧ４Ｔ５Ｅ部位の±２０ｋｂのマッピングされたＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＫ２７ａｃのＦＰＫＭ値を示すグラフのセットである。ボックスプロットおよびひげは、平均値、２５および７５パーセンタイル、続いて５および９５パーセンタイルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００５（ウィルコクソンの符号付順位検定）。
【００９４】
【図６６】図６６は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞におけるＧ４Ｔ５Ｅ部位およびＧ４Ｔ５Ｅ部位のコンセンサスモチーフを示す。
【００９５】
【図６７】図６７は、Ｄ１５およびＤ３２心筋細胞におけるＧ４Ｔ５共結合遺伝子の異なる発現を示す一連のベン図である。
【００９６】
【図６８】図６８は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における低下したＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５結合を有する遺伝子の発現レベルの下方制御を示すグラフである。
【００９７】
【図６９】図６９は、ＡＴ（黒色の線）対Ｇ２９６Ｓ（灰色の線）心筋細胞におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のためのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを示すグラフのセットである。
【００９８】
【図７０】図７０は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における８２個の上方制御された内皮遺伝子のＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【００９９】
【図７１】図７１は、ＷＴ心筋細胞における５，０４０個の推定上のエンハンサーにわたるＭＥＤ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルの分布を示すグラフである。２１３個のＳＥは、例外的に高いＭＥＤ１結合を示す。２１３個のＳＥの２０ｋｂ内の代表的遺伝子は、標識される。
【０１００】
【図７２】図７２は、４７ｋｂのＳＥエレメントを示すＭＹＨ６およびＭＹＨ７遺伝子座での、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５、ＭＥＤ１、Ｈ３Ｋ２７ａｃのためのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのＩＧＶブラウザートラックを示す。ＳＴＡＵ２での１．３ｋｂの一般的なエンハンサー（ＴＥ）を、比較のために示す。スケールは、読み取り／１００万／２５ｂｐを表す。
【０１０１】
【図７３】図７３は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における公知の標的遺伝子座での、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５；ＭＥＤ１およびＨ３Ｋ２７ａｃのためのＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのＩＧＶブラウザートラックを示す。スケールは、読み取り／１００万／２５ｂｐを表す。
【０１０２】
【図７４】図７４は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞におけるＭＥＤ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルと遺伝子発現レベルの間の正の相関を実証するグラフである。
【０１０３】
【図７５】図７５は、ＴＥおよびＳＥのエンハンサー長（左）および最も近い（２０ｋｂ）遺伝子発現（右）を示すグラフのセットである。ボックスプロットおよびひげは、平均値、２５および７５パーセンタイル、続いて５および９５パーセンタイルを示す。＊＊＊＊ｐ＜０．００００５（ｔ検定）。
【０１０４】
【図７６】図７６は、正規化されたＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルによって実証された、ＳＥエレメントにおけるＭＥＤ１、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５結合の強化された結合を図示するグラフである。
【０１０５】
【図７７】図７７は、ＷＴ心筋細胞におけるＳＥエレメント内の成分エンハンサーが富化された公知のコンセンサスモチーフを示す。
【０１０６】
【図７８】図７８は、２１３個のＳＥエレメントのＧＯ分析（ＢｉｏＰｒｏ／疾患／経路）を示す棒グラフである。有意性は、多重仮説補正の後の−Ｌｏｇ１０ボンフェローニｐ値として示す。
【０１０７】
【図７９】図７９は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における全５，０４０個のエンハンサーにわたるＭＥＤ２  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルの分布を示すグラフである。１７２個のＳＥは、例外的に高いＭＥＤ１結合を示す。１７２個のＳＥの２０ｋｂ内の代表的遺伝子は、標識される。
【０１０８】
【図８０】図８０は、ＷＴ（黒色の円）とＧ２９６Ｓ（灰色）の間のＭＥＤ−１結合ＳＥエレメントにおける変化を示すベン図（上側）である。ＷＴで失われた（Ｌ）、Ｇ２９６Ｓで増加した（Ｅ）、または不変の（Ｕ）部位の数を示す。
【０１０９】
【図８１】図８１は、ＷＴ（黒色の線）およびＧ２９６Ｓ（灰色の線）心筋細胞でＬ、ＵまたはＥであるＳＥ内の正規化されたＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５のＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルのメタ遺伝子プロットである。
【０１１０】
【図８２】図８２は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルによって実証された、ＷＴおよびＧ２９６Ｓ心筋細胞におけるＳＥＬ、ＳＥＵおよびＳＥＥエレメントにおけるＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＫ２７ａｃ結合を示す一連のグラフである。
【０１１１】
【図８３】図８３は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における、Ｌ、ＵまたはＥであるＳＥエレメントの２０ｋｂ内の選択された遺伝子を示す。
【０１１２】
【図８４】図８４は、ｉＷＴ（黒色）およびＧ２９６Ｓ（灰色）の心臓分化の間のＳＥ周囲の±２０ｋｂのマッピングされた遺伝子のＦＰＫＭ値を示すグラフである。ボックスプロットおよびひげは、平均値、２５および７５パーセンタイル、続いて５および９５パーセンタイルを示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００００５（ウィルコクソン符号付順位検定）。
【０１１３】
【図８５】図８５は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞におけるＳＥエレメントを有する遺伝子の％を示す棒グラフである。
【０１１４】
【図８６】図８６は、心筋細胞におけるＳＥエレメントのノックダウンの後の収縮性の減少を示す棒グラフである。
【０１１５】
【図８７】図８７は、心筋細胞におけるＳＥエレメントのノックダウンの後のカルシウムフラックスにおける異常を示す棒グラフである。
【０１１６】
【図８８】図８８は、心筋細胞におけるＳＥエレメントのノックダウンの後のミトコンドリア質量の減少を示す棒グラフである。
【０１１７】
【図８９】図８９は、ＭＡＬＡＴ１およびＫＬＦ９の枯渇のための、コアの心臓の転写ネットワークの崩壊を図示する。
【０１１８】
【図９０】図９０は、平均６．６個の近傍物および４．３の経路長による２，３５３個のエッジで接続された７１６ノードのスケールフリーのネットワークである。ノードは、異なって発現されるか、またはＧ４Ｔ５共結合しているか、またはＭＥＤ−１  ＳＥエレメントを有する遺伝子である。エッジは、ＳＴＲＩＮＧから抽出されたノード間の物理的または機能的相互作用である。ハブは、５つのサブネットワークに分類される。
【０１１９】
【図９１】図９１は、遺伝子記号によって命名された、抽出されたトップ２０のハブのサブネットワークプロットである。全体のＧＲＮからのエッジの数は、各ノードの脇に示す。ひし形、四角および円は、Ｇ４Ｔ５結合が増加もしくは減少した、または不変の遺伝子をそれぞれ表す。太字の縁は、ＳＥエレメントを有する遺伝子を表す。
【０１２０】
【図９２】図９２は、ＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５制御遺伝子調節ネットワークにおける発現に関する遺伝子オントロジー分析を示すバーチャートである。
【０１２１】
【図９３】図９３は、ＰＩ３Ｋ阻害剤（左）またはＰＩ３Ｋ活性化因子（右）で処置した操作された心筋細胞の力発生を示すグラフのセットである。ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害（円）または活性化（三角形）の後のｉＷＴ（黒色）とＧ２９６Ｓ（灰色）心筋細胞の間の力発生における相対的な変化。１Ｈｚペーシングに正確に応答するＣＭの牽引力顕微鏡検査（ＴＦＭ）測定。データは、平均±ｓｅｍ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５（マン−ホイットニー検定）である。
【０１２２】
【図９４】図９４は、野生型（上側）およびＧ２９６Ｓ変異体（下側）心筋細胞における仮定されたタンパク質間相互作用を図示する概略図である。ＰＩ３Ｋシグナル伝達の阻害（円）または活性化（三角形）の後のｉＷＴ（黒色）とＧ２９６Ｓ（灰色）心筋細胞の間の拍動速度測定。１Ｈｚペーシングに正確に応答する心筋細胞のＴＦＭ測定。データは、平均±ｓｅｍ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５（マン−ホイットニー検定）である。
【０１２３】
【図９５】図９５は、ＰＩ３Ｋ阻害剤（左）またはＰＩ３Ｋ活性化因子（右）で処置した野生型およびＧ２９６Ｓの操作された心筋細胞の拍動速度に対する効果を示すグラフのセットである。上側、ＷＴにおける心臓遺伝子の遺伝子座は開放的であり、転写を活性化するＭＥＤ１結合ＳＥエレメントでのＧ４Ｔ５結合を許容する；さらに、Ｇ４Ｔ５は、内皮遺伝子での異常な開放クロマチンおよび転写に結合し、阻止する。下側、ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓの転写およびエピジェネティックな結果。
【０１２４】
【図９６】図９６は、単一細胞ＲＮＡ配列決定データのＴＳＮＥプロットであり、各細胞は単一の点によって表され、別個の群にクラスター化される。左側のパネルは７日間心筋細胞系統に向かって分化した正常なヒトｉＰＳ細胞からの細胞を表し、右側のパネルはＧＡＴＡ４変異を担持するヒト細胞のそれである。差は単一細胞レベルで観察することができ、最も明らかなものは変異体細胞のないクラスターである。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
定義
当業者によって理解される通り、本明細書で使用される用語は、平易で通常の意味を有するものである。以下の定義は本発明を理解することにおいて読者を助けるものであるが、特に示されない限り、そのような用語の意味を変えるかさもなければ制限するものではない。
【０１２６】
用語「抗体」は、エピトープに適合し、認識する特異的形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を含むことが意図され、１つまたは複数の非共有結合的結合相互作用が分子構造とエピトープの間の複合体を安定化させる。抗体はいくつかの様式で改変することができるので、用語「抗体」は、要求される特異性を有する結合性ドメインを有する任意の特異的結合性メンバーまたは物質を包含すると解釈するべきである。したがって、この用語は、天然でも完全合成でも部分合成でも、免疫グロブリン結合性ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体断片、誘導体、抗体の機能的同等物および相同体を包含する。二重特異的抗体が使用される場合、これらは従来の二重特異的抗体であってよく、それらは様々な様式で製造する（ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３年８月；４巻（４号）：４４６〜９頁）、例えば、化学的に、もしくはハイブリッドハイブリドーマから調製することができ、または上記の二重特異的抗体断片のいずれかであってもよい。完全な抗体ではなく、むしろｓｃＦｖダイマーまたはダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）を使用することが好ましいことがある。ダイアボディおよびｓｃＦｖダイマーは、可変ドメインだけを使用してＦｃ領域なしで構築することができ、抗イディオタイプ反応の効果を潜在的に低減する。二重特異的抗体の他の形態には、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  Ａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１年１２月；１０巻（１２号）：３６５５〜９頁に記載される単鎖の「ヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」が含まれる。そのような抗体には、抗原への高い親和性結合を提供するキレート化抗体であるＣＲＡｂ、Ｄ．  Ｎｅｒｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２４６巻、３６７〜３７３頁、およびＷｕ  Ｃら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７年１１月；２５巻（１１号）：１２９０〜７頁、Ｅｐｕｂ２００７年１０月１４日に記載される二重可変ドメイン抗体も含まれる。
【０１２７】
本明細書で使用する「候補薬剤」は、疾患またはその症状を処置するための候補である任意の薬剤を指す。本開示の方法において使用することができる候補薬剤の例には、小分子；ペプチド；タンパク質（誘導体化または標識されたタンパク質を含む）；ｓｉＲＮＡ分子；ＣＲＩＳＰＲをベースとした治療剤；抗体またはその断片；アプタマー；炭水化物および／または他の非タンパク質結合性部分；天然に存在する結合パートナーの誘導体および断片；ならびにペプチド様物質（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）が含まれるが、これらだけに制限されない。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、用語「遺伝子薬剤」は、ポリヌクレオチドおよびその類似体であって、該薬剤が、細胞への遺伝子薬剤の添加によって本発明のスクリーニングアッセイにおいて試験される、ポリヌクレオチドおよびその類似体を指す。遺伝子薬剤の導入は、細胞の全体の遺伝組成の変更をもたらす。ＤＮＡなどの遺伝子薬剤は、一般的に染色体への配列の組み入れを通して、細胞のゲノムにおける実験的に導入された変化をもたらすことができる。遺伝的変化は、外因性配列が組み入れられないが、エピソーム剤として維持される一過性のものであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの遺伝子薬剤は、ｍＲＮＡの転写または翻訳に干渉することによって、細胞の遺伝子型を変えることなくタンパク質の発現に影響することもできる。遺伝子薬剤の効果は、細胞中の１つまたは複数の遺伝子生成物の発現を増加または減少させることである。
【０１２９】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」には、薬学的投与に適合する任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが含まれるものである。適する担体は、分野における標準の参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載され、それは参照により本明細書に組み込まれる。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。そのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。いかなる従来の媒体または薬剤も本明細書で提供される薬剤と相容れない場合を除き、組成物でのその使用が企図される。
【０１３０】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合形態を指し、それらには、コード化および非コード化アミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変されたか、標識されたか、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含めることができる。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「ペプチド様物質」は、ペプチドを模倣するように設計されたタンパク質様鎖を指す。それらは、分子の特性を変更するために、既存のペプチドの改変から一般的に生じる。例えば、それらは、分子の安定性、生物学的活性または生物学的利用能を変更するための改変から生じることができる。
【０１３２】
用語「小分子」は、医薬品において一般的に使用される有機分子と同等のサイズの分子を指す。用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を排除する。好ましい小有機分子のサイズは、最大で約５０００Ｄａ、より好ましくは最大で２０００Ｄａ、最も好ましくは最大で約１０００Ｄａの範囲にわたる。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および／または生理的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止する点から予防的であってよく、ならびに／または、疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用のための部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってよい。「処置」は、本明細書で使用する場合、動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因を有し得るが、それを有するとまだ診断されていない被験体において疾患が起こることを阻止すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を抑止すること；および（ｃ）疾患を軽減すること、例えば疾患の退行を引き起こすこと、例えば疾患の症状を完全にまたは部分的に除去することを含む。
【０１３４】
発明の詳細な説明
本明細書に記載される方法および組成物の実施は、別途指示がない限り、製薬化学、薬物製剤技術、投薬レジメンおよび生化学の従来の技術を用いることができ、その全ては当分野の実践者の技術の範囲内である。そのような従来の技術は、本明細書に記載される方法；公知の従来の療法と組み合わせて使用される補助療法の製剤のためのテクノロジー、ならびに／または心疾患および障害の処置のための新しい療法、本発明の組成物のために有益である送達方法などを含むが、これらに限定されない治療レジメンの組み合わせの使用を含む。
【０１３５】
適する技術の具体的な例示は、本明細書の実施例を参照して得ることができる。しかし、当然ながら、他の同等の従来の手法を使用することもできる。そのような従来の技術および記載は、標準の実験室マニュアルに見出すことができ、例えば、本発明の実施では、特に明記しない限り、当分野の技術の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミックスおよび組換えＤＮＡの従来の技術を用いる。ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第４版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１４年）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編、（２０１７年））；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．  Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．  Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＧ．  Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５年））、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（２０１４年）ならびにＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ  ：  Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ、第７版（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（２０１６年））を参照。
【０１３６】
本発明の実施において有益な一般的な技術のさらなる精緻化のために、実務者は細胞生物学、組織培養、発生学および心臓生理学における標準の教科書およびレビューを参照することができる。組織培養および胚性幹細胞に関しては、読者は、ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（ＮｏｔａｒｉａｎｎｉおよびＥｖａｎｓ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．２００６年）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（ＴＨＥ  ＢＡＳＩＣＳ）、Ｍ  Ｂｕｔｌｅｒ（２００４年）第２版；ＨＵＭＡＮ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）Ｋ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（２０１５年）；ＨＵＭＡＮ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＧＵＩＤＥ  Ｓ  ＰｅｔｅｒｓｏｎおよびＪＦ．  Ｌｏｒｉｎｇ（２０１２年）；ならびにＨＵＭＡＮ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ（ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（ＢＩＯＳ））、Ｒ．ＰｅｄｅｒｓｅｎおよびＪｏｎ  Ｏｄｏｒｉｃｏ（２００７年）を参照するとよい。心臓細胞の培養に関しては、標準参考文献には、Ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｅｌｌ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａ．  Ｐｉｎｓｏｎ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ１９８７年）、Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ（第Ｉ＆ＩＩ巻、ＰｉｐｅｒおよびＩｓｅｎｂｅｒｇ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）、Ｈｅａｒｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＨａｒｖｅｙおよびＲｏｓｅｎｔｈａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８年）が含まれる。
【０１３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈が明らかに別に指示しない限り、複数形が含まれることに留意する。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、様々な多能性および発現パターンを有する１つまたは複数の細胞を指し、「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及には、当業者に公知である同等のステップおよび方法などへの言及が含まれる。
【０１３８】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書で挙げられる全ての刊行物は、本記載の発明に関連して使用することができるデバイス、製剤および方法論を記載し、開示するために、参照により組み込まれる。
【０１３９】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値、およびその明記される範囲内の任意の他の明記されるかまたは介在する値は、本発明の中に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、より小さな範囲の中に独立して含まれてもよく、明記される範囲内の任意の特異的に排除される制限に従って、本発明の中に同様に包含される。明記される範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の両方とも除いた範囲も本発明に含まれる。
【０１４０】
以下の記載では、本発明のより完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が示される。しかし、これらの具体的な詳細の１つまたは複数がなくても本発明を実施することができることは、当業者に明らかになる。他の場合には、本発明を不明瞭にすることを回避するために、当業者に周知である周知の特色および手法は記載されていない。
【０１４１】
概説での本発明
本開示は、異常な転写因子調節、特にＰＩ３Ｋ経路、例えばＧＡＴＡおよび／またはＴＢＸ５の異常な調節をモジュレートする方法を提供する。
【０１４２】
ＧＡＴＡ４は、心筋、心内膜および内胚葉細胞の発生を通して高度に発現される転写因子である（Ｃｉｒｉｌｌｏら、２００２年；Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏら、１９９４年；Ｚｅｉｓｂｅｒｇら、２００５年）。ＧＡＴＡ４、心臓性転写因子におけるヘテロ接合の変異は、未知の機構を通して先天性の心臓欠損および心筋症を引き起こす。マウスにおけるＧａｔａ４欠失は、胚体外および前腸内胚葉における奇形を引き起こし（Ｋｕｏら、１９９７年；Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎら、１９９７年）、Ｇａｔａ４は、操作された心筋細胞（心筋細胞）の増殖および心室中隔発生の調節において必須である（Ｒｏｊａｓら、２００８年；Ｚｅｉｓｂｅｒｇら、２００５年）。条件付きで欠失したＧａｔａ４のマウスは、心筋細胞アポトーシスから心臓の代償障害を受け（Ｏｋａら、２００６年）、ＧＡＴＡ４＋／−マウスは心臓の形成不全および圧力過負荷への低減した肥大性応答を有する（Ｂｉｓｐｉｎｇら、２００６年）。したがって、ＧＡＴＡ４は、マウスにおける心臓の発生およびホメオスタシスのために必須である。
【０１４３】
メディエーター複合体および細胞運命決定転写因子によって高密度に占有されている推定上のエンハンサーのクラスターであるスーパーエンハンサー（ｓｕｐｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）（ＳＥ）は、発生および疾患における細胞の同一性の中心的な調節因子として示唆されている。ＳＥは、サイズ、転写因子モチーフ密度および転写活性化能力において一般的なエンハンサー（ＴＥ）と異なる（Ｗｈｙｔｅら、２０１３年）。転写因子結合エンハンサー部位の高密度クラスタリングおよび活性化補助因子の富化は、ＳＥをＴＦ複合体のモル濃度の変化により感受性にする（Ａｄａｍら、２０１５年）。ＳＥ遺伝子調節は、Ｂ細胞ゲノム安定性（Ｍｅｎｇら、２０１４年）、Ｔ細胞特異化（Ｖａｈｅｄｉら、２０１５年）、毛包幹細胞可塑性（Ａｄａｍら、２０１５年）および急性骨髄性白血病（Ｐｅｌｉｓｈら、２０１５年）に関与している。しかし、本発明は、心臓転写因子によるＳＥ遺伝子調節がヒト心臓の発生または疾患に重要な役割を有することの最初の実証である。
【０１４４】
ヘテロ接合のＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５変異は、重複する表現型を有する家族性先天性心臓欠損を引き起こし、これらの因子は過剰発現させると共免疫沈降することが示された（Ｂｅｓｓｏｎら、１９９７年；Ｇａｒｇら、２００３年；Ｌｉら、１９９７年）。第２のジンクフィンガーの基部の残基に影響する疾患を引き起こすＧＡＴＡ４  Ｇ２９６８ミスセンス変異は、ＧＡＴＡ４とＴＢＸ５の間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ相互作用を損なったことが、以前に報告された（Ｇａｒｇら、２００３年）。複合ヘテロ接合のＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５変異を有するマウスは房室中隔欠損症（ＡＶＳＤ）を発症し、それらの相互作用の遺伝的証拠を提供し（Ｍａｉｔｒａら、２００９年）、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５は症例の概ね５％で散発性のＣＨＤにおいて変異を起こし（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、２００７年：Ｗａｎｇら、２０１３年）、より最近になって心筋症と関連付けられている（Ｌｉら、２０１３年；Ｚｈａｏら、２０１４年）。
【０１４５】
ヒト心臓の発生および機能におけるＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５調節機構をより良好に解明するために、患者由来の人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞による学際的なアプローチを使用した。ヘテロ接合のＧＡＴＡ４−Ｇ２９６Ｓ変異は、心臓の遺伝子プログラムの正常な発現を損ない、代替的な運命の遺伝子、特に内皮系統の遺伝子を不適切に上方制御した。これらには、心臓発生および筋収縮のために必要な遺伝子に付随するＳＥエレメントでのＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５結合への破壊、ならびに内皮遺伝子座でのクロマチン閉鎖（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｃｌｏｓｕｒｅ）不全が伴った。コンピュータ予測は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達をＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５制御遺伝子調節ネットワークにおける「ハブ」として同定し、機能試験はＧＡＴＡ４変異体における異常なＰＩ３Ｋエピソームを検証した。
【０１４６】
コンピュータ予測は、ＰＩ３Ｋシグナル伝達をＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５制御ネットワークにおけるハブとして同定し、機能試験で裏付けられた。これらの結果は、ヒト疾患を引き起こす変異が転写コードをどのように破壊して、異常なクロマチン状態および細胞機能不全をもたらすかを明らかにする。ＧＡＴＡ４は、別の心臓性転写因子ＴＢＸ５と心臓エンハンサーを共占有した。ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異は、ヒト心臓スーパーエンハンサーへのＴＢＸ５の動員を混乱させ、心臓遺伝子発現の減少をもたらした。逆に、ＧＡＴＡ４−Ｇ２９６Ｓ変異は非心臓遺伝子へのＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５の誤った局在化につながり、これらの遺伝子座、特に内皮／心内膜プロモーターにおける開放クロマチン状態を強化した。それに応じて、ＧＡＴＡ４変異体は、細胞の同一性のより広い調節不全の一部として内皮／心内膜遺伝子発現をサイレンシングすることができなかった。
【０１４７】
本発明の方法における治療的使用のための候補薬剤には、心臓の発生および／または機能に関連した標的分子を選択的にモジュレートする任意の分子が含まれる。本発明のために、候補薬剤は、タンパク質シグナル伝達複合体のメンバーとの分子の結合を促進する化合物、またはその標的への分子の結合に干渉する化合物であってよい。
【０１４８】
本開示は、生理的に妥当な細胞培養モデルおよび使用方法を提供する。本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成され、哺乳動物の疾患、特にヒトの心筋症と関連したＧＡＴＡ遺伝子、ＴＢＸ５遺伝子および／またはＰＩ３Ｋ経路における変異を含む、哺乳動物の操作された心筋細胞を提供する。
【０１４９】
本開示は、生理的に妥当な細胞培養モデルおよび使用方法も提供する。本開示は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成され、哺乳動物の疾患、特にヒトの心筋症と関連したＧＡＴＡ遺伝子における変異を含む、哺乳動物の操作された心筋細胞を提供する。
【０１５０】
重要なことに、正常なＧＡＴＡ４活性は、ヒト心筋細胞におけるＰＩ３Ｋシグナル伝達を制限するという知見は、調節不全のＰＩ３Ｋシグナル伝達を呈するＧＡＴＡ４変異体では、例えば心臓組織におけるＰＩ３Ｋ活性をモジュレートするためにＬＹ２９４００２などの阻害剤を使用することによるＰＩ３Ｋシグナル伝達のモジュレーションが、この機能不全を改善し得ることを示唆する。したがって、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、遺伝的心筋症を含むが、これだけに限定されない、心筋症の様々な形態を処置することができるかもしれない。他の態様では、心臓組織の心臓機能をモジュレートするために、例えばインスリン受容体基質（ＩＲＳ）合成ペプチドを使用してＰＩ３Ｋ経路を活性化することを使用することもできる。
【０１５１】
疾患関連の操作された心筋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養の生成および使用のための方法であって、操作された心筋細胞が、上記のように、心疾患に関連した変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含む人工ヒト多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化させられる、方法が提供される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多くの異なる疾患関連の操作された心筋細胞を含む、そのような操作された心筋細胞のパネルが提供される。一部の実施形態では、操作された心筋細胞が複数の候補薬剤または候補薬剤の複数の用量に供される、そのような操作された心筋細胞のパネルが提供される。候補薬剤には、目的のＲＮＡの発現、電気的変化などを増加または減少させる小分子、すなわち、薬物、遺伝子構築物が含まれる。
【０１５２】
疾患関連の操作された心筋細胞に対する候補薬剤の活性を決定するための方法であって、候補薬剤を、心疾患に関連した変異をコードする少なくとも１つの対立遺伝子を含む人工ヒト多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）から分化させた操作された心筋細胞の１つまたはパネルと接触させるステップと；カルシウムトランジェント振幅、細胞内Ｃａ２＋レベル、細胞サイズ収縮力生成、拍動速度、サルコメアのα−アクチニン分布および遺伝子発現プロファイリングを限定されずに含む、形態学的、遺伝的または機能的パラメーターに対する薬剤の効果を決定するステップとを含む方法も提供される。
【０１５３】
小分子のスクリーニングアッセイでは、培養中の細胞への候補薬剤の添加の効果が、細胞のパネルおよび細胞環境で試験され、細胞環境は、イオン性の変化を含む電気刺激、薬物刺激などの１つまたは複数を含み、細胞のパネルは、遺伝子型、目的の環境への事前の曝露、提供される薬剤の用量などにおいて異なってもよく、通常少なくとも１つの対照、例えば陰性対照および陽性対照が含まれる。細胞の培養は、無菌の環境で、例えば、９２〜９５％の加湿された空気／５〜８％ＣＯ２の雰囲気を含有しているインキュベーター内において３７℃で一般的に実行される。細胞培養は、ウシ胎仔血清などの規定されていない体液を含有する栄養混合物、または完全に規定された無血清培地で実行することができる。環境を変更することの効果は、形態学的、機能的および遺伝的変化を含む、複数の出力パラメーターをモニタリングすることによって評価される。
【０１５４】
遺伝子薬剤のためのスクリーニングアッセイでは、細胞の遺伝組成を変更するために、パネルの細胞の１つまたは複数にポリヌクレオチドを添加する。表現型に変化があるかどうか決定するために、出力パラメーターがモニタリングされる。このように、目的の経路におけるタンパク質の発現をコードするかまたはそれに影響する遺伝子配列が同定される。スクリーニング結果データセットを提供するために、結果をデータ処理装置に入力することができる。異なる条件の下で得られたスクリーニング結果の比較および分析のために、アルゴリズムが使用される。
【０１５５】
分析のための方法には、細胞に適当な色素を負荷し、目的の条件のカルシウムに曝露させ、例えば共焦点顕微鏡で画像化する、カルシウム画像化が含まれる。Ｃａ２＋応答を定量化することができ、継続したＣａ２＋トランジェントのタイミングの不規則性について、およびトランジェントごとの全体のＣａ２＋流入について、時間依存的Ｃａ２＋応答を次に分析した。各トランジェントの間に放出された全体のＣａ２＋は、ベースラインに対する各波の下の面積を積分することによって決定した。
【０１５６】
収縮力を測定するために、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用することができる。拍動細胞は、カンチレバーを使用したＡＦＭによって調べる。力を測定するために、細胞をカンチレバー先端と静かに接触させ、その後、カンチレバー先端は、たわみデータを収集する間隔にわたり、その位置にとどまる。力、拍動の間隔、および各細胞の各収縮の持続時間について、統計値を計算することができる。
【０１５７】
細胞は微小電極アレイ（ＭＥＡ）によって分析することもでき、拍動する操作された心筋細胞がＭＥＡのプローブにプレーティングされ、フィールド電位持続時間（ＦＰＤ）が測定および決定されて電気生理学的パラメーターを提供する。
【０１５８】
単一細胞レベルでの分析方法は、例えば、上記のような、原子間力顕微鏡法、微小電極アレイ記録、パッチクランピング、単一細胞ＰＣＲ、カルシウム画像化、フローサイトメトリーなどが、特に目的のものである。
【０１５９】
疾患が拡張型心筋症（ＤＣＭ）である場合、候補薬剤と接触させる前、その間または後に、操作された心筋細胞はβアドレナリン作用性アゴニストなどの正の変力性ストレスで刺激することができる。一部の実施形態では、βアドレナリン作用性アゴニストは、ノルエピネフリンである。ＤＭＣの操作された心筋細胞は、正の変力性ストレスに応答して、当初、正の変時性効果を有するが、それは、後に、低減した拍動速度、損なわれた収縮、および異常なサルコメアのα−アクチニン分布を有する大幅に多くの細胞などの不全の特徴で負になることが本明細書に示される。β−アドレナリン遮断薬処置および筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ（Ｓｅｒｃａ２ａ）の過剰発現は、機能を向上させる。ＤＣＭの操作された心筋細胞は、心臓発生、インテグリンおよび細胞骨格シグナル伝達を促進する因子を含む経路ならびにユビキチン化経路において、遺伝子薬剤で試験することもできる。同じファミリーコホートの中の対照の健康な個体と比較して、ＤＣＭの操作された心筋細胞は、低下したカルシウムトランジェント振幅、低下した収縮性および異常なサルコメアのα−アクチニン分布を示す。
【０１６０】
疾患が肥大性心筋症（ＨＣＭ）である場合、候補薬剤と接触させる前、その間または後に、操作された心筋細胞はβアドレナリン作用性アゴニストなどの正の変力性ストレスで刺激することができる。そのような条件の下で、ＨＣＭの操作された心筋細胞はより高い肥大性応答を示し、それはβ−アドレナリン遮断薬によって反転させることができる。健康な個体と比較して、ＨＣＭの操作された心筋細胞は、増加した細胞サイズおよびＨＣＭ関連遺伝子の上方制御、ならびに、二次性の未熟なトランジェントによって特徴付けられる、より高い頻度の異常なＣａ２＋トランジェントを含む未熟な拍動によって特徴付けられる収縮におけるより多くの不規則性を示す。これらの操作された心筋細胞は、増加した細胞内Ｃａ２＋レベルを、および一部の実施形態では、カルシニューリンまたはカルシウム親和性に関連した他の標的を標的とする候補薬剤を有する。
【０１６１】
目的の候補薬剤は、多数の化学クラス、主に有機分子を包含する生物学的活性薬剤であり、それらは有機金属分子、無機分子、遺伝子配列などを含むことができる。本発明の重要な態様は、候補薬物を評価し、好ましい生物学的応答機能を有する候補治療剤を選択することである。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、一般的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を、しばしば官能化学基の少なくとも２つを含む。候補薬剤は、上記の官能基の１つまたは複数で置換された、環式炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造をしばしば含む。候補薬剤は、ペプチド、ポリヌクレオチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組み合わせを含む、生体分子の中にも見出される。
【０１６２】
候補薬剤を含む化合物は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様の供与源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、生体分子を含む多種多様の有機化合物のランダムな、および指向性合成のために、多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物のライブラリーが利用可能であるかまたは容易に生成される。さらに、天然のまたは合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を通して容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用することができる。公知の薬理学的薬剤は、構造類似体を生成するために、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、指向性またはランダムな化学的改変に供することができる。
【０１６３】
配列を欠く細胞においてコードされた生成物を発現させるかまたは生成物を過剰発現させるために、ポリペプチドをコードする発現ベクターの導入を使用することができる。構成的であるかまたは外部からの調節を受ける様々なプロモーターを使用することができ、後者の状況では、遺伝子の転写をオンまたはオフにすることができる。これらのコード配列は、完全長ｃＤＮＡまたはゲノムクローン、それに由来する断片、または天然に存在する配列を他のコード配列の機能的もしくは構造的なドメインと合わせたキメラを含むことができる。あるいは、導入される配列は、アンチセンス配列をコードする；アンチセンスオリゴヌクレオチド；ＲＮＡｉである、ドミナントネガティブ変異、または天然の配列のドミナントなもしくは構成的に活性な変異；変更された調節配列などをコードすることができる。
【０１６４】
アンチセンスおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法によって化学的に合成することができる。好ましいオリゴヌクレオチドは、それらの細胞内安定性および結合親和性を増加させるために、天然のホスホジエステル構造から化学改変される。骨格、糖または複素環式塩基の化学を変更するいくつかのそのような改変は、文献に記載されている。骨格化学における有益な変化には、ホスホロチオエート；非架橋酸素の両方が硫黄で置換されるホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートがある。アキラルなリン酸誘導体には、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートが含まれる。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステル骨格全体をペプチド連結で置き換える。安定性および親和性を強化するために、例えばモルホリノオリゴヌクレオチド類似体の、糖改変も使用される。天然の直角位相−アノマーに対して塩基が反転される、デオキシリボースの直角位相−アノマーを使用することができる。リボース糖の２’−ＯＨを変更して２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成することができ、これは親和性を損なうことなく分解への抵抗性を提供する。
【０１６５】
例えばβアドレナリン作用性アゴニストによる刺激の後、電気的または機械的刺激の後などに、１つまたは複数の環境条件で薬剤を少なくとも１つの、および通常複数の細胞に添加することによって、薬剤を生物学的活性についてスクリーニングする。薬剤に応答したパラメーターリードアウトの変化を測定し、望ましくは正規化し、結果として生じるスクリーニング結果は、参照スクリーニング結果との比較によって、例えば目的の他の変異を有する細胞、正常な操作された心筋細胞、他のファミリーメンバーに由来する操作された心筋細胞などによって、次に評価することができる。参照スクリーニング結果は、異なる環境変化の存在および非存在下でのリードアウト、公知の薬物などを含んでも含まなくてもよい他の薬剤で得られるスクリーニング結果を含むことができる。
【０１６６】
薬剤は、溶液または易溶性の形態で、培養中の細胞の培地に便利に添加される。薬剤は、フロースルー系で、ストリームとして、間欠的もしくは連続的に、あるいは化合物のボーラスを１回でまたは徐々に、さもなければ静止溶液に添加して、添加することができる。フロースルー系では、２つの流体が使用され、一方は生理的に中性の溶液であり、他方は試験化合物を添加した同じ溶液である。第１の流体が細胞の上を通過し、その後第２の流体が続く。単一溶液の方法では、試験化合物のボーラスを、細胞周囲の培地の容量に添加する。培養培地の構成成分の全体の濃度は、ボーラスの添加により、またはフロースルー方法の２つの溶液間で大幅に変化するべきでない。
【０１６７】
好ましい薬剤製剤は、製剤全体に有意な効果を有することができる、保存剤などのさらなる構成成分を含まない。したがって、好ましい製剤は、生物学的に活性な化合物および生理的に許容される担体、例えば水、エタノール、ＤＭＳＯなどから本質的になる。しかし、化合物が、溶媒を含まない液体である場合、製剤は化合物それ自体から本質的になることができる。
【０１６８】
様々な濃度への異なる応答を得るために、異なる薬剤濃度と並行して複数のアッセイを実行することができる。当技術分野で公知であるように、薬剤の有効濃度を決定することは、１：１０の、または他のｌｏｇスケールの希釈からもたらされるある範囲の濃度を一般的に使用する。必要に応じて、濃度は、第２の系列の希釈でさらに洗練することができる。一般的に、これらの濃度の１つは、ゼロ濃度で、または薬剤の検出レベル未満で、または表現型の検出可能な変化を与えない薬剤濃度もしくはそれ未満で、陰性対照としての役目をする。単一細胞および多細胞多重アッセイの両方が、発明（ａｄｖｅｎｔｕｒｅ）の開示での使用に適合する。
【０１６９】
候補薬剤の検出のために、核酸、特にメッセンジャーＲＮＡの定量化を使用することもできる。これらは、配列技術、例えばＲＮＡ−ｓｅｑ；アレイをベースとした検出方法およびポリメラーゼ連鎖反応方法を含む、核酸ヌクレオチドの配列に依存するハイブリダイゼーション技術によって測定することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２０００年；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２６巻（１号）：１１２〜２２５頁；Ｋａｗａｍｏｔｏら（１９９９年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ９巻（１２号）：１３０５〜１２頁；およびＣｈｅｎら（１９９８年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５１巻（３号）：３１３〜２４頁を参照。
【０１７０】
試験化合物から得たスクリーニング結果と参照スクリーニング結果（複数可）の比較は、適する推論プロトコール、ＡＩ系、統計的比較などの使用によって達成される。好ましくは、スクリーニング結果は、参照スクリーニング結果のデータベースと比較する。参照スクリーニング結果のデータベースは、コンパイルすることができる。これらのデータベースは、公知の薬剤または薬剤の組み合わせを含むパネルからの参照結果、ならびに、単一のもしくは複数の環境条件またはパラメーターが除去されるかもしくは特異的に変更される環境条件の下で処置される細胞の分析からの参照を含むことができる。参照結果は、特異的細胞経路を選択的に標的とするかまたはモジュレートする遺伝子構築物を有する細胞を含有するパネルから生成することもできる。
【０１７１】
アッセイのリードアウトは、平均値（ｍｅａｎ）、平均（ａｖｅｒａｇｅ）、中央値または分散、または測定値に関連した他の統計的もしくは数学的に導いた値であってよい。パラメーターリードアウト情報は、対応する参照リードアウトとの直接比較によってさらに洗練することができる。同一の条件下で各パラメーターのために得られる絶対値は、生きている生物学的系で固有である変動性を示し、かつ個体の細胞変動性ならびに個体間の固有の変動性も反映する。
【０１７２】
本発明は、ヒト疾患を引き起こすことが知られているＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞集団において収縮性、カルシウム調節および代謝活性を損なうとの解明に基づく。サルコメア遺伝子および代謝遺伝子の広い調節不全は、ヒト心筋細胞で観察された欠損のための生理的な理論的根拠を提供する。それは、心臓機能の疾患、例えば心筋症を有する患者の処置のための新しい標的も提供する。
【０１７３】
本明細書に示されるように、ＧＡＴＡ４は、ＣＰＣにおける心臓および内皮細胞遺伝子の調節のために重大である。心臓発生の正の駆動因子としてのＧＡＴＡ４の機能は一義的であるが、心内膜／内皮細胞運命のリプレッサーとしてのその潜在能力はこれまで未知であった。Ｓｃｌ／Ｔａｌ１は、血液生成内皮における造血遺伝子プログラムを促進し、心筋原性運命への誤った特異化を阻止する（Ｖａｎ  Ｈａｎｄｅｌら、２０１２年）。本明細書で提供されるデータは、心臓発生を通常は促進する転写因子の疾患を引き起こす変異が、ヒト心筋細胞分化の間に異所性内皮遺伝子プログラムを誘導することを示す。実際、ＴＡＬ１は、Ｇ２９６Ｓ  ＣＰＣにおいて３．５倍上方制御され、異常な内皮遺伝子発現に寄与することができる。さらに、Ｇ４Ｔ５部位は、血液生成性内皮の主要調節因子、ＦＯＸＯ１  ｍｄ  ＨＯＸＢ４のモチーフが富化され、Ｇ４Ｔ５占有率はこれらの部位での遺伝子発現の抑制と通常関連していた。しかし、ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異体では、不適切に開放的なクロマチンの遺伝子座は、内皮調節因子、例えばＦＯＸ０１および多数のＥＴＳ因子のモチーフが富化され、これらの部位でのＧ４Ｔ５抑制の減少を示唆した。
【０１７４】
本開示は、マウス心筋細胞で観察されるものと整合して、ヒト心臓の遺伝子プログラムの活性化のために必要とされるコンビナトリアル転写因子結合コードを実証し（Ｌｕｎａ−Ｚｕｒｉｔａら）、先天性の心臓奇形および心筋症に関連付けられたＧＡＴＡ４ミスセンス変異の、エピジェネティックなかつ転写上の結果を明らかにする。開放クロマチンシグネチャーのＡＴＡＣ−ｓｅｑ分析ならびにＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５結合部位のゲノムワイドプロファイリングは、ヒトにおける転写因子結合心臓エンハンサーの詳細なカタログを提供する。この情報は、ヒト心臓の発生および機能において重要な役割を演ずることができる、公知のおよび未知の転写調節因子ならびに長い非コードＭＡを正確に指摘する。
【０１７５】
興味深いことに、ＴＥは、ＳＥと異なる転写因子結合コードを有するようである。ＧＡＴＡ４変異体では、ＴＢＸ５結合はＳＥで低下したが、多くのＴＥで増加した。この差は、根底にあるシス配列および／または局所的なクロマチン構成によって決定づけられる、様々なエンハンサー部位での係合規則の多様なセットを通して心臓転写因子が作動することと整合している（ＳｐｉｔｚおよびＦｕｒｌｏｎｇ、２０１２年）。
【０１７６】
本開示は、心筋細胞の機能を維持し、内皮／心内膜遺伝子発現を抑制することにおける、ヒトＧＡＴＡ４の必要条件の根底にある機構を記載する。実際、中隔形成および房室中隔発生は、ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における調節不全の遺伝子の上位ＧＯカテゴリーの中に存在する。
【０１７７】
以下の参考文献が本明細書に引用され、および／または本開示の中の教示のために有益であり得る。
【化１】
2019520074.tif 000002
【化２】
2019520074.tif 000003
【実施例】
【０１７８】
以下の実施例は、本発明を作成および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために示され、発明者らが、彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではなく、実施例は、下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すものでも暗示するものでもない。広く記載されるように、本発明の精神または範囲を逸脱しない範囲で、特定の態様で示すように、多数の変更および／または改変を本発明に加えることができることが、当業者に理解される。したがって、本態様は、あらゆる点で例示的であり、限定的でないと考えるべきである。
【０１７９】
使用する数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱も考慮するべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧は大気圧またはその近くである。
【０１８０】
（実施例１：患者特異的ｉＰＳ細胞および機能的な操作された心筋細胞の生成）
ヒトＧＡＴＡ４におけるヘテロ接合のｃ．８８６Ｇ＞Ａ変異は、１００％の穿通性心房または心室中隔欠損症、ＡＶＳＤおよび肺動脈弁狭窄（ＰＳ）に関連付けられた（図１および２）（Ｇａｒｇら、２００３年）。変異体ＧＡＴＡ４は、ＤＮＡ結合およびタンパク質間相互作用に関与する領域であるジンクフィンガードメインに隣接しているＧ２９６Ｓミスセンス置換に翻訳される（図１、下側）。１０代に遅発性の心筋症を発症した数人のＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ患者が同定された。これは、左心室における乳頭筋の深い小柱形成および肥厚を伴う、低下した左心室収縮期機能および右心室のまれな心エコー所見によって特徴付けられた（図３）。深い小柱形成は、非圧縮として知られ、心室心筋細胞の成熟不全を反映すると考えられている状態に一般的である（ＨｕｔｃｈｉｎｓおよびＳｃｈａｅｆｅｒ、２０１２年）。この臨床上の観察は、ヘテロ接合のＧＡＴＡ４変異と、主要転写複合体の摂動を通した心筋細胞の同一性および機能の広い誤調節を結びつけた。
【０１８１】
用量感受性のミスセンス変異がヒト心臓の発生および機能における欠損を引き起こす機構を、ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異を有した４名の被験体および変異のない４名のファミリーメンバーから得られた、患者特異的ｉＰＳ細胞への、再プログラミングされた皮膚線維芽細胞によって調査した（Ｏｋｉｔａら、２０１１年）（図１）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用し、患者４のｉＰＳ細胞においてその野生型配列（Ｇ）に点変異（Ａ）を逆編集して、同質遺伝子型野生型対照（ｉＷＴ）を得た（図４および５）。全てのｉＰＳ細胞株およびＣＲＩＳＰＲ編集クローンは堅固に繁殖し、ＥＳ細胞様組織形態、正常な核型を有し、自己再生マーカーを発現し、サイレンシングされたＨＤＦマーカーを有した（図６〜９）。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）は、ＥＳとｉＰＳ細胞の間の遺伝子発現シグネチャーにおけるゲノムワイド相関を確認した（図１０）。全てのｉＰＳ株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで多能性を示す３つの胚葉に分化した（図１１）。
【０１８２】
段階的分化プロトコールを使用して、上記のｉＰＳ細胞株から精製された心筋細胞を生成した（図１２）（Ｌｉａｎら、２０１２年；Ｔｏｈｙａｍａら、２０１３年）。様々な時点のＲＮＡ−ｓｅｑは、各段階で富化された予想された遺伝子オントロジー（ＧＯ）を有する、中胚葉、心臓前駆細胞（ＣＰＣ）および心筋細胞を表す段階特異的遺伝子シグネチャーを示した（図１３および１４）。ｉＰＳ心筋細胞は自発的に収縮し、高レベルのサルコメアおよび筋原線維マーカーを発現し、ヒト心筋細胞に類似の膜電気生理および遺伝子発現を有した；３０％は二核だった（図１５および１６）。カルシウムフラックス測定は適切な薬物応答を示したが、電子顕微鏡法は規定のＺ線およびサルコメアを有する豊富なミトコンドリアを示した（図１７および１８）。したがって、プロトコールは、細胞の同一性および機能のより綿密な調査に適した機能的なヒト心筋細胞を生成した。
【０１８３】
（実施例２：ＧＡＴＡ４変異体の操作された心筋細胞における損なわれた収縮性、カルシウム調節、代謝活性）
ｃＴｎＴ＋Ｄ３２心筋細胞は、野生型（野生型）、Ｇ２９６ＳおよびＣＲＩＳＰＲ補正の同質遺伝子型ｉＰＳ細胞から生成したが（図１９）、変異体株は自発収縮の開始にわずかな遅れを示した（図Ｓ３Ａ〜Ｂ）。成熟した心筋細胞の収縮特性をより正確にモデル化するために、単一ｉＰＳ由来の心筋細胞のための生理的マイクロパターン化プラットホームを作出した（図２０）（Ｒｉｂｅｉｒｏら、２０１５年）。野生型心筋細胞の７０％と比較して、パターン化されたＧ２９６Ｓ心筋細胞のわずか５０％が１Ｈｚの電気ペーシングに正確に応答したが、野生型細胞は１Ｈｚより高い周波数でもペーシングに応答せず、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞の２０％はこのより速い速度で拍動することが可能だった（図２１）。患者における心筋症表現型と整合して、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞は、減少した収縮時間で、細胞運動あたりの大幅に低減した収縮力発生も有した（図２１、２２）。パッチクランプ研究では、最大アップストローク速度にも活動電位持続時間にも変更がなく、Ｇ２９６Ｓ細胞はオーバーシュート電位の増加を有し（図２３）、変異体心筋細胞におけるより脱分極した膜を示唆した。細胞クラスターにおけるカルシウムトランジェントは増加した相対的ピーク振幅を有し、カルシウムイオン調節における欠損を示唆した（図２４）。
【０１８４】
いかなる特定の理論にも束縛されることなく、収縮力低減は、ミトコンドリア機能または代謝活性における欠損を起源とするかもしれない。実際、マイクロパターン上の単一のＧ２９６Ｓ心筋細胞は、低下したミトコンドリア染色（図２５）ならびに低下した解糖能力および解糖リザーブ（図２６）を有した。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）ヘテロプラスミーは神経病原性に関連付けられたが（ＳｔｅｗａｒｔおよびＣｈｉｎｎｅｒｙ、２０１５年）、Ｇ２９６Ｓ細胞からのｍｔＤＮＡのゲノム配列決定は、新規のｍｔＤＮＡ変異の増加を示さなかった（図２７）。これらの知見は、主要心筋細胞機能がＧＡＴＡ４変異体において損なわれていることを実証し、心筋症の機構的基礎をさらに精査するためにこれらの患者由来のｉＰＳ心細胞を使用することの理論的根拠を確認する。
【０１８５】
（実施例３：変異体ＣＰＣおよび心筋細胞での減衰した心臓遺伝子プログラム）
７日目にＣＰＣへの心臓の分化の間に同質遺伝子型ｉＰＳ細胞でＲＮＡ−ｓｅｑを実行し、乳酸精製の前（Ｄ１５）および後（Ｄ３２）に心筋細胞を収縮させた（図２８）。ＬＡＳＳＯ回帰アルゴリズム（Ｒｏｏｓｔら、２０１５年）は、本発明者らのｉＷＴ心筋細胞データが他のヒト組織ではなく心臓のトランスクリプトーム（０．６〜１）を表すことを正確に予測したが、ＣＰＣ、Ｄ１５心筋細胞およびＤ３２心筋細胞からのＧ２９６Ｓトランスクリプトームはより低い心臓スコア（＜０．６）を一貫して有した（図２９）。３時点のうちの少なくとも１つの間に２２２８遺伝子はＧ２９６Ｓ細胞において異なって発現され、ＣＰＣから成熟した心筋細胞にかけて大幅な動的変化があった（図３０、３１）。一貫して下方または上方制御された、Ｗｎｔ−ＰＣＰ経路または血管系、心内膜、心臓の発生および心臓前駆体分化に関与する３８遺伝子があった（図３２、３３）。Ｎｅｔｗｏｒｋ２Ｃａｎｖｅｓ分析（Ｔａｎら、２０１３年）は、これらの３８遺伝子はＧＡＴＡ因子結合が富化され、ｐ３００およびＰＲＣ２複合体によって発生的に調節され、心血管の発生および機能にとって重要であることを示した（図３４）。
【０１８６】
Ｇ２９６Ｓ  ＣＰＣでは、下方制御された遺伝子は、心臓発生、心臓腔形態形成（ｃａｒｄｉａｃ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）、筋原線維アセンブリー、心臓収縮および心臓前駆体分化に高度に関係し、関与しており（例えば、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＴＴＮ、ＲＹＲ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５およびＴＢＸ１８）、心筋遺伝子プログラムの不完全な活性化を示唆した（図３５、３６、３７）。対照的に、上方制御された遺伝子は、脈管構造発生、血管新生、細胞外マトリクス組織化、インテグリン相互作用およびカルシニューリン−ＮＦＡＴ転写について富化されていた。これらには、ＴＡＬ１、ＥＴＳ１、ＲＯＢＯ４、ＷＡＲＳ、ＫＬＦ５、ＳＯＸ１７、ＴＩＥ１、ＫＤＲおよびＣＸＣＲ４が含まれ、その多くは心内膜／内皮遺伝子プログラムの主要シグナル伝達または転写調節因子である。ＣＤ３１陽性の内皮細胞の百分率は、変異体ＣＰＣでは増加しなかった。多能性ＣＰＣは心筋細胞運命を採用するので、上方制御された内皮／心内膜遺伝子プログラムはおそらく遺伝子サイレンシングの不全によるものであることをこのことは示唆した。
【０１８７】
Ｇ２９６Ｓ  Ｄ１５心筋細胞では、下方制御された遺伝子は、器官形態形成、心臓発生および解糖にとって重要だった（図３８、３９）。解糖関連遺伝子の下方制御は、解糖活性における機能的障害と整合している。ＣＰＣ段階で見られる異常と類似して、Ｄ１５に上方制御された遺伝子は、血管発生、細胞間情報交換ならびにインテグリンおよびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達経路に関与した。ＩＳＬ１などの一部の心臓前駆遺伝子の持続的発現および一部の平滑筋遺伝子の上方制御は、変質性運命遺伝子の異常な活性化が、それらが成熟したときであっても心筋細胞中で持続したというさらなる証拠を提供した。
【０１８８】
ラクトースＨＩグルコースＬＯ培地によって精製されたＤ３２心筋細胞では、異なって発現された遺伝子は、心臓の遺伝子プログラムの減衰および内皮／心内膜遺伝子プログラムの持続的な上方制御を示し続けた（図４０、４１）。具体的には、心臓発生、筋収縮、心筋症および心臓の中隔発生に相当するＧＯ  ｔｅｒｍは、下方制御された遺伝子が富化され、上方制御された遺伝子は脈管構造発生、血管新生およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達について富化されていた。血管およびニューロンの経路探索（ｐａｔｈｆｉｎｄｉｎｇ）の両方に関与する遺伝子は、神経形成ＧＯカテゴリーにおいて最も上方制御された。Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（ＧＳＥＡ）は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における細胞呼吸遺伝子の低減を示し（図４２）、代謝活性の低下と整合した（図２６）。さらに、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞は室心筋遺伝子（ｃｈａｍｂｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｇｅｎｅ）を下方制御し、房室管心筋および平滑筋関連遺伝子を上方制御し（図４３）、細胞の同一性におけるより広い誤った特異化（ｍｉｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を示唆した。房室弁を囲む専門化した心筋の主要な転写調節因子ＴＢＸ２の上方制御は、「作動」心筋遺伝子のリプレッサーおよび房室弁発生のための必要条件としてのその機能を考慮すると、注目に値した（Ａａｎｈａａｎｅｎら、２０１１年）。これらの結果は、ＧＡＴＡ４の１つのコピーにおける単一のアミノ酸置換が、ヒト心筋細胞遺伝子プログラムの完全な取得および維持を著しく混乱させ、図２１、２３〜２６に記載される機能的な差への鍵となる機構の説明を提供することを明らかにする。
【０１８９】
（実施例４：ＧＡＴＡ４変異体ＣＰＣにおける開放クロマチン異常）
クロマチンアクセス性は、転写因子占有率および転写出力に緊密に関係する（ＺａｒｅｔおよびＣａｒｒｏｌｌ、２０１１年）。開放クロマチン状態におけるゲノムワイドの変更が、Ｇ２９６Ｓ細胞における心臓発生遺伝子の下方制御および内皮／心内膜遺伝子の不適当な上方制御の原因であるかどうか決定するために（図４４）、トランスポザーゼがアクセス可能なクロマチンをｉＷＴおよびＧ２９６Ｓ  ＣＰＣにおいてディープシークエンシング（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）によって分析した（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏら、２０１３年）。ｉＷＴ  ＣＰＣでは、１４，５３２個の同定されたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークは、ヒト心筋細胞またはＥＳ由来のＣＰＣからのＥＮＣＯＤＥ  ＤＮアーゼに高度に感受性の部位（ＤＨＳ）と８８％の重複を有し、ゲノム領域でトランスポザーゼがアクセス可能であると予想された（図４５、４６）。さらに、＞７５％は転写活性化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）のヒストンマークを有していたが抑制（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）では有さず、タンパク質コード遺伝子（８２％）の主にイントロン（４３％）に局在化した（図４６、４７）。Ｇ２９６Ｓ  ＣＰＣでは、開放クロマチン状態は、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７（図４Ｂ、黒色のボックス）およびＴＢＸ５（図４８）で低下したＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルが示すように、心臓の遺伝子で低減され、それらの低下した発現と整合した（図３Ｄ）。開放クロマチン状態は、血液生成内皮の主要調節因子ＳＯＸ１７では逆に増加した（Ｃｌａｒｋｅら、２０１３年）。ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルは異なって発現された８６個の心臓および９９個の内皮遺伝子で首尾一貫して変更されたので、これは２、３の遺伝子に特有でなかった（図４９）。
【０１９０】
増加したＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを有するピークは、内皮細胞のマスター調節因子（ＳＯＸ１７、ＫＬＦ５、ＦＯＸＯ１、ＳＴＡＴ６）およびＥＴＳ因子（ＧＡＢＰＡ、ＥＬＦ５、ＥＲＧ）のＤＮＡモチーフに関して富化され、心内膜／内皮遺伝子プログラムをＧ２９６Ｓ  ＣＰＣにおいてサイレンシングされなかったというさらなる証拠を提供した（図５０）。これらのピークは、ＡＶ弁形態形成、冠状動脈脈管形成および心内膜床発生に関与する遺伝子にマッピングされ（図５１）、ＧＡＴＡ４変異を有する個体におけるＡＶＳＤ診断と整合した（図１）。Ｈｅｙ１およびＨｅｙ２コリプレッサーは、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞において下方制御されたＧＡＴＡ４相互作用タンパク質であり（Ｋａｔｈｉｒｉｙａら、２００４年）、内皮／心内膜遺伝子でのクロマチン閉鎖の不全に寄与することができるが、ＮＦＡＴｃ（心内膜の転写調節因子）に依存する遺伝子は上方制御された（図５２）。したがって、ＧＡＴＡ４変異体ＣＰＣにおける不完全な心臓遺伝子活性化および内皮遺伝子プログラムの完全なサイレンシングの失敗は、一部、心臓遺伝子での低下したクロマチンアクセス性および内皮遺伝子座での増加したアクセス性による。
【０１９１】
（実施例５：ヒト細胞でのＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５のゲノムワイド共占有率）
ＧＡＴＡ４ならびに活性プロモーター（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）、抑制されたプロモーター（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）、転写伸長（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）および活性エンハンサー（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）のヒストンマークのゲノムワイド占有率を、ＴＢＸ５の占有率とともに調べた。野生型心筋細胞では、内因性タンパク質に対する抗体を使用したクロマチン免疫沈降およびディープシークエンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）は、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５の多くの直接的なヒト標的を検証した（図５３、５４）（Ｈｅら、２０１１年）。これらの遺伝子標的は、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５（Ｇ４Ｔ５）が共結合し、高レベルのＨ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３およびＨ３Ｋ３６ｍｅ３を有したが、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は検出不能であった。ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルは、遺伝子発現レベルとも正に相関していた（図５５）。全体的に、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＨ３Ｋ２７ａｃはゲノム占有率において最も強い重複を共有し（図５６）、ＧＡＴＡ４部位のほぼ半分はＴＢＸ５が共結合した（図５６、５７）。ヒトＧ４Ｔ５が共結合した２４２８部位は、ＧＡＴＡ４またはＴＢＸ５単独が結合した部位より高いＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを有していた（図５８）。共結合部位の大部分は、筋原線維アセンブリー、心筋発生および収縮、ＣＨＤならびに心筋症に関する遺伝子のイントロン（４８％）および遺伝子間（３５％）エンハンサー部位にマッピングされた（図５９、６０）。ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５のモチーフがＧ４Ｔ５部位のモチーフ分析で上位にランク付けされたことは、ＣｈＩＰ−ｓｅｑの忠実度をさらに裏付ける（図６１）。ＴＥＡＤ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＮＫＸ２．５、ＩＳＬ１、ＳＲＦおよびＳＭＡＤ２／３のためのモチーフは富化され、心臓遺伝子プログラムを維持する転写因子コードを示した。内皮調節因子、ＦＯＸＯ１およびＨＯＸＢ４に関して、Ｇ４Ｔ５部位の近くのモチーフも富化され、これらの部位でのＧ４Ｔ５の潜在的抑制効果を示唆した。
【０１９２】
ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５またはＧ４Ｔ５が結合した部位を、野生型と比較してＧ２９６Ｓ細胞において系統的に分析した（図６４；上）。ＧＡＴＡ４部位では、変異体において部位の５４％は失われ（Ｌ）、４６％は不変であり（Ｕ）、１６％は異所性部位が増加し（Ｅ）、多くの部位でのＤＮＡ結合および他への再分布の用量感受性を示唆した。ＴＢＸ５部位では、部位の２６％は失われ（Ｌ）、７４％は不変であり（Ｕ）、２４％は異所的に増加した（Ｅ）。Ｇ４Ｔ５の共結合ピークは、野生型心筋細胞よりＧ２９６Ｓにおいて３４％少なく（ｌｅｓｓ  ａｂｕｎｄａｎｔ）（図５７、６２〜６３）、４８％は失われ（Ｌ）、５２％は不変であり（Ｕ）、２１％は増加した（Ｅ）。
【０１９３】
ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＨ３Ｋ２７ａｃの相対的占有率について、Ｌ、ＵおよびＥ部位を解析した（図６４；下側）。Ｇ２９６Ｓ  ＧＡＴＡ４の低減したＤＮＡ結合親和性と整合して、ＧＡＴＡ４占有率はＧ４ＬおよびＧ４Ｔ５Ｌ部位で特に低下し、特にＴ５ＥおよびＧ４Ｔ５Ｌでの増加したＴＢＸ５占有率と相関した。ＴＢＸ５占有率における広い増加は、他の部位でのＴＢＸ５占有率の減少が低下したＴＢＸ５遺伝子発現による可能性が低かったことを示唆する。活性エンハンサーマークＨ３Ｋ２７ａｃは、Ｇ４Ｅ、Ｔ５ＥおよびＧ４Ｔ５Ｅ部位で最も大幅に増加した。変化のほぼ全ては統計的に有意であり（図６５）、ＧＡＴＡ４、ＴＢＸ５およびＨ３Ｋ２７ａｃはランダムなゲノム部位に誤って局在化しなかった。ＲＮＡ−ｓｅｑデータから、Ｇ４Ｔ５Ｌ部位にマッピングされた遺伝子は、ＣＰＣ、０１５心筋細胞および０３２心筋細胞においてほとんど下方制御された（図５Ｆ、Ｓ５Ｄ）。損なわれた心臓遺伝子プログラムと整合して、Ｇ４Ｔ５Ｌ遺伝子は、ＧＯ機能、例えば収縮繊維、心筋収縮、心臓中隔欠損症および心筋症において富化されていた（図５Ｇ）。モチーフ分析は、Ｇ４Ｔ５Ｌ部位におけるＴＢＸ：ＳＭＡＤ、ＨＮＦ４Ａ、ＰＢＸ１、ＮＦＡＴＣ１、ＴＣＦ３モチーフ、およびＧ４Ｔ５Ｅ部位におけるＴＥＡＤ４、ＥＧＲ１、ＨＩＦ１Ａ、ＭＥＩＳ１／３ｐ−ＴＢＸ５モチーフを同定し（図６６）、その多くは、非心臓系統におけるＧＡＴＡ４／ＴＢＸ５の結合パートナーのための転写因子モチーフに相当する。
【０１９４】
ヒト心筋細胞におけるＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５の推定上の直接的標的を分類するために、全ての異なって発現された遺伝子および２０ｋｂ内のＧ４Ｔ５部位を有する遺伝子を調べた（図６７）。減少したＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５結合を有する遺伝子（Ｇ４ＤＯＷＮ＿Ｔ５ＤＯＷＮ）は、それらの発現レベルの下方制御を経験し（図６８）、異なる遺伝子発現が直接的にＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５によるＤＮＡ結合異常によることを示唆した。４１４個の推定上の標的でＧＡＴＡ４結合は減少し、ＴＢＸ５結合は同時に増加した（図６９）。ＧＡＴＡ４結合は、８２個の上方制御された内皮遺伝子の近くの部位の４９％で低減した（図７０）。Ｇ２９６Ｓ  ＣＰＣにおけるＴＢＸ５モチーフの富化と整合して（図４Ｇ）、ＴＢＸ５結合は、これらの内皮の局所解剖学的に関連するドメインの中の２０７個のＴＢＸ５部位の６４％で増加し、誤って局在化したＴＢＸ５、およびおそらく他の活性化補助因子による異常転写活性化を示唆した。これは、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における内皮ＴＳＳでの増加したＨ３Ｋ４ｍｅ３および減少したＨ３Ｋ２７ｍｅ３マークと相関した（図６９）。上方制御された内皮遺伝子の近位プロモーターも、ＧＡＴＡ、ＦＯＸＯおよびＥＴＳファミリータンパク質のための結合部位において富化されていた（図７０）。簡単にいえば、ヒト心筋細胞において心臓遺伝子プログラムを維持し、内皮遺伝子プログラムを抑制するために、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５を含むコンビナトリアル転写因子結合コードが必要とされ、ＴＢＸ５をＧＡＴＡ４に適切に繋ぎ止めることができないと、異所性ＴＢＸ５結合および心内膜／内皮遺伝子プログラムの活性化がもたらされる。
【０１９５】
（実施例６）
ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５は、ヒト心臓スーパーエンハンサーを共調節する
高密度の転写因子モチーフを含有する数キロベースにわたる高いＭＥＤ１（メディエーター複合体）占有率の領域がＳＥを特色付けると示唆されている（Ｗｈｙｔｅら、２０１３年）。しかし、ＭＥＤ１で分類されるＳＥは、ヒト心筋細胞のためにはまだ記載されていなかった。ＳＥを同定するために使用されている別のクロマチンマークであるＨ３Ｋ２７ａｃ富化（Ａｄａｍら、２０１５年）の、Ｇ２９６Ｓ変異体における誤った局在化は（図６４）、ＧＡＴＡ４変異がＳＥにおいて変更されたクロマチン状態をもたらす可能性があるとの仮説につながった。野生型心筋細胞においてＭＥＤ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑによって規定された２１３個のＳＥ（上位４％に相当する）（図７１）。これらは、Ｇ４Ｔ５の複数の成分および頑強なＨ３Ｋ２７ａｃエンハンサーマークを有する、心臓で富化された遺伝子、例えば、ＲＢＭ２０、ＭＹＨ６／７、ＴＴＮ、ＮＫＸ２．５、ＧＡＴＡ４、ＳＲＦ、ＨＡＮＤ２、ｍｉＲ１−２、ＩＧＦ１Ｒに近位であった（図７２、７３）。ＭＥＤ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルは、遺伝子発現レベルと正に相関していた（図７４）。平均すると、心臓のＳＥは、ＭＥＤ１結合ＴＥより１１倍高いＭＥＤ１結合を有し、より長く（３〜８０ｋｂ；平均１０ｋｂ）、４倍高い遺伝子発現を有した（図６Ｃ、Ｓ６Ｃ）。予想通り、全て心細胞運命の決定的な調節因子であるＭＥＦ２Ｃ、ＳＲＦ、ＴＥＡＤ４、ＳＭＡＤ２／３、ＭＥｌＳ１およびＮＫＸ２．５のためのモチーフと同様に（図７７）、ＧＡＴＡ４およびＴＢＸ５結合はＳＥエレメントにおいて強く富化されていた（図７５、７６）。新規モチーフには、ＣＲＸ、ＣＲＥＢおよびＰＲＤＭ１４が含まれた。ＳＥエレメントは、横紋筋発生、心筋症、心臓発生および心筋収縮に関与する遺伝子に近かった（図７８）。
【０１９６】
対照的に、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞におけるＭＥＤ１  ＣｈＩＰ−ｓｅｑは、わずか１７２個のＳＥエレメントを同定した（図７９）。ＳＥエレメントの比較は、変異体心筋細胞において３４％の減少（ＳＥＬ）を示し、６６％は不変（ＳＥＵ）、１２％は異所的に増加した（ＳＥＥ）（図８０）。同等のＧＡＴＡ４結合にもかかわらず、ＳＥＬおよびＳＥＵエレメントにおけるＴＢＸ５結合は著しく低減し（図８１、８２）、これは、最も高い可能性としては、ＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５相互作用の破壊およびＧＡＴＡ４がＴＢＸ５を心臓のＳＥに動員することができなかったことによるものである。ＳＥエレメントが失われた主要心臓遺伝子には、ＩＧＦ１Ｒ、ＲＢＭ２０、ＳＭＹＤ１およびＳＲＦが含まれた（図８３）。変異体におけるプライミングされた内皮遺伝子プログラムと一致して、ＨＥＳ１およびＪＵＮＢはＳＥエレメントが増加した。ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、変異体ＣＰＣ、Ｄ１５心筋細胞およびＤ３２心筋細胞においてＳＥエレメントを有する遺伝子の変更された発現レベルを示した（図８４）。ＳＥＬエレメントは、ＭＥＦ２Ａ、ＴＥＡＤ４およびＮＦＡＴＣ２モチーフにおいて富化され、ＳＥＥエレメントはＭＡＸ：ＭＹＣ、ＭＥＩＳ１およびＧＡＴＡ４モチーフにおいて富化されていた（図Ｓ６Ｆ）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータからの下方制御された遺伝子は、ＳＥエレメントが不釣合いに富化されていた（図８５）。さらに、ＳＥエレメントは、いくつかの長い非コードＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１、ＨＥＣＴＤ２ａｓ、ＬＩＮ００８８１、ＮＥＡＴ１）および未決定の心臓機能を有する転写因子（ＨＥＳ１、ＫＦＬＦ９）にマッピングされた。心筋細胞におけるそれらのノックダウンは、収縮性、カルシウムフラックスおよびミトコンドリア質量における異常をほとんど誘導した（図８６〜８８）。ＭＡＬＡＴ１およびＫＬＦ９の枯渇は、コアの心臓の転写ネットワークの崩壊をさらに誘導した（図８９）（Ｈｅら、２０１１年）。これらのデータは、予測されたＳＥエレメントが決定的な心臓機能を果たすことができること、およびそれらの誤調節はＧＡＴＡ４変異の重要な結果であることを示す。
【０１９７】
（実施例７：ＰＩ３Ｋシグナル伝達を中心にしたＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５ネットワークの中の調節ハブ）
より広く破壊された遺伝子調節ネットワークを解明するために、転写因子局在化、メディエーター富化および転写物アバンダンスのゲノムワイドマップを使用した系−生物学アプローチを使用した。ＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５制御遺伝子調節ネットワークを構築するために、Ｇ２９６Ｓの操作された心筋細胞において下方制御および上方制御された遺伝子、野生型またはＧ２９６Ｓ心筋細胞におけるＧ４Ｔ５結合遺伝子、ならびにスーパーエンハンサーエレメントを有する遺伝子を下に示すＳＴＲＩＮＧデータセットで統合した。
【０１９８】
平均６．６個の近傍物および４．３の経路長を有する２，３５３個のエッジによって接続された７１６個のノードの「スケールフリー」ネットワーク（ＢａｒａｂａｓｌおよびＡｌｂｅｒｔ、１９９９年）（図９０）。ノードは、物理的（タンパク質間）または機能的（遺伝的、共発現、共起）相互作用を表すエッジによって接続された。２０個の調節「ハブ」によって接続された少なくとも５つのサブネットワークが同定された。上位２０のハブは、７０個のエッジによって接続されたサブネットワークとして抽出され、各々２７〜５３個の近傍物を有し、これは遺伝子調節ネットワークにおける平均ノードより４〜８倍多かった（図９１）。このサブネットワークは、ｐ＜６．５ｅ−１１の統計的に有意な相互作用を有した。興味深いことに、上位４のハブは、ＰＩ３Ｋシグナル伝達に関連付けられた以下のＧ４Ｔ５共結合遺伝子であった：ＰＩＫ３ＣＡ（α触媒性サブユニット）、ＰＩＫ３Ｒ１（調節サブユニット）およびＰＴＫ２およびＥＧＦＲ、上流のシグナル伝達構成成分。ＰＴＫ２では、Ｇ４Ｔ５共占有率はＧＡＴＡ４変異体において減少した（図９１）。ＩＴＧＡ２、ｌＴＧＡ９およびＫＤＲもハブであり、ＰＩ３Ｋシグナル伝達に関与した。遺伝子オントロジー分析は、インテグリン、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ、ホスファチジルイノシトールおよびＥＧＦシグナル伝達について大幅な富化を示し、ＰＩ３Ｋシグナル伝達の正味の増大が予測された（図９２）。重要なことに、操作された心筋細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）で処置したとき、ｉＷＴ心筋細胞は力発生の大幅な減少を示したが、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞は非感受性であったか、または力生成の増加を有した（図９３）。反対に、ＰＩ３Ｋシグナル伝達を活性化するインスリン受容体基質（ＩＲＳ）合成ペプチドによる処置は、Ｇ２９６Ｓ心筋細胞における力発生を激減させた（図９３、右）。Ｐｌ３Ｋ阻害剤は野生型細胞における拍動速度に効果を有さなかったが、ＩＲＳペプチドはＧ２９６Ｓ心筋細胞における拍動速度をｉＷＴ心筋細胞より３倍大きく増加させ、ＰＩ３Ｋ経路活性化への高度な感受性と整合した（図９３〜９５）。心臓遺伝子の遺伝子座は、低減された開放クロマチン、および転写を低減するＳＥエレメントへのＴＢＸ５結合を有する。異常に開放的なクロマチンは、ＥＴＳ因子および他の内皮調節因子のためのモチーフに加えて、ＴＢＸ５が富化され、結果として内皮遺伝子および他の部位での転写をサイレンシングできない（図９５）。
【０１９９】
いかなる機構的理論によっても束縛されることなく、本明細書で提供される経験的証拠は、主要心原性遺伝子の転写を活性化するために、現在の適切な心臓の発生および機能が、ＭＥＤ１に結合し、Ｈ３Ｋ２７ａｃにマークされたＳＥエレメントにおけるＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５共占有率のために、開放クロマチンシグネチャーを必要とすることを示す（図９４；上）。タンパク質間相互作用に影響するミスセンス変異を含むＧＡＴＡ４ヘテロ接合性での、主要心臓遺伝子の転写を活性化する、Ｍｅｄ１に結合し、Ｈ３Ｋ２７ａｃにマークされたＳＥエレメントにおけるＴＢＸ５共占有率の減少（図９４、上）。ＳＥエレメントへのＴＢＸ５の動員は、開放クロマチンの維持の失敗および主要心臓遺伝子の転写の減少と関連する（図９４；下側）。ＧＡＴＡ４  Ｇ２９６Ｓ変異は、ＴＢＸ５の誤った局在化、およびおそらく他の転写活性化因子（例えば、ＥＴＳ因子）と関連し、内皮プロモーターでの開放クロマチンシグネチャーをもたらし、不適当な内皮遺伝子発現および代替系統の異常な活性化につながる。これらの研究は、ＴＦ複合体が遺伝子発現の活性化および抑制を正確に制御するためにトランス活性化因子のゲノムワイド局在化を協力して調節する方法、ならびにこれがヒトの疾患を引き起こす変異によってどのように破壊され得ることかを実証する。
【０２００】
簡単にいえば、ＧＡＴＡ４変異体心筋細胞が、調節不全のＰＩ３Ｋシグナル伝達を示すという実験的証拠は、コンピュータにより予測されたネットワークのこの態様と整合しており、病的なＧＡＴＡ４−ＴＢＸ５遺伝子調節ネットワークを部分的に補正するための潜在的ノードを提供する。
【０２０１】
（実施例８：ヒトｉＰＳ−ＣＰＣの単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑのｔ−ＳＮＥプロット）
ＷＴおよびＧ２９６Ｓ＋／−細胞の両方を、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用した単一細胞発現分析に供した。Ｓｅｕｒａｔソフトウェアパッケージを使用して、データのためにｔ−ＳＮＥプロットを生成した。例えば、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２０１３年、１４巻：３０２号、ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−１４−３０２を参照。ｔ−ＳＮＥプロットは、各データポイントに二次元または三次元マップにおける位置を与えることによって、ＲＮＡ−ｓｅｑ単一細胞データの可視化を可能にした。このデータの結果は、図９６に示す。
【０２０２】
本発明の好ましい態様に関連して詳細に記載されるように、本発明は多くの異なる形態の態様によって満たされるが、本開示は、本発明の原理の例示と考えるべきであり、本明細書に図示、記載される特定の態様に本発明を限定するものでないことが理解される。本発明の精神から逸脱することなく、当業者は多くの変更を加えることができる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって測定される。それらの目的が管轄当局ならびに公衆が本発明の一般的な性質を速やかに決定することを可能にすることであるので、要約およびタイトルは本発明の範囲を限定するものと解釈するべきでない。本明細書で引用される全ての参考文献は、全ての目的のためにその全体が組み込まれる。続く特許請求の範囲では、「手段」という用語が使用されない限り、米国特許法第１１２条６項に基づいてその中で列挙される特色またはエレメントのいずれもＭｅａｎｓ−ｐｌｕｓ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎの制限と解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【国際調査報告】
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2019520074.tif 000100
2019520074.tif 000101
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