(57)【要約】  基質接着のない懸濁培養法による多能性幹細胞の培養のための限定培地であって、当該限定培地は、有効量のプロテアーゼ阻害剤を含むもの、ＧＳＫ３β阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤およびＷＮＴ３Ａポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の薬剤を含むもの、ＷＮＴ３Ａポリペプチドとその安定化剤とを含み、当該安定化剤は脂質ベシクルではないもの、および／またはＧＳＫ３β阻害剤を含むが、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まないものである。細胞培養物およびその使用方法についても提供する。【選択図】  図２３Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のプロテアーゼ阻害剤を含む限定培養培地であって、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地。
【請求項２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である、請求項１に記載の限定培養培地。
【請求項３】
前記プロテアーゼ阻害剤が、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）である、請求項１に記載の限定培養培地。
【請求項４】
ＧＳＫ３β阻害剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項５】
ＷＮＴ３Ａポリペプチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項６】
前記ＷＮＴ３Ａの安定化剤をさらに含み、但し、前記安定化剤は脂質ベシクルではない、請求項５に記載の限定培養培地。
【請求項７】
前記培地が、０．００９μＭを超える量のＥＲＫ１／２阻害剤を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項８】
ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項９】
前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項４に記載の限定培養培地。
【請求項１０】
ＧＳＫ３β阻害剤と、プロテアーゼ阻害剤およびＷＮＴ３Ａポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の薬剤とを含む限定培養培地であって、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地。
【請求項１１】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１０に記載の限定培養培地。
【請求項１２】
前記プロテアーゼ阻害剤が、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である、請求項１０または１１に記載の限定培養培地。
【請求項１３】
前記プロテアーゼ阻害剤が、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）である、請求項１０または１１に記載の限定培養培地。
【請求項１４】
前記ＷＮＴ３Ａの安定化剤をさらに含み、但し、前記安定化剤は脂質ベシクルではない、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項１５】
前記ＣＨＩＲ９９０２１の使用濃度が、少なくとも１μＭである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項１６】
前記ＣＨＩＲ９９０２１の使用濃度が、２〜５μＭ／ｍｌの濃度範囲内である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項１７】
ＷＮＴ３Ａポリペプチドと、その安定化剤とを含む限定培養培地であって、前記安定化剤は脂質ベシクルではなく、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる、限定培養培地。
【請求項１８】
前記安定化剤が、ＧＳＫ３β阻害剤およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる群より選択されるものである、請求項１７に記載の限定培養培地。
【請求項１９】
前記ＷＮＴ３Ａポリペプチドの使用濃度が、少なくとも１ｎｇ／ｍｌである、請求項１７または１８に記載の限定培養培地。
【請求項２０】
前記ＷＮＴ３Ａポリペプチドの使用濃度が、約５〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内である、請求項１７または１８に記載の限定培養培地。
【請求項２１】
前記培地が、０．００９μＭを超えるＥＲＫ１／２阻害剤を含まない、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２２】
ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２３】
前記安定化剤がＧＳＫ３β阻害剤である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２４】
前記安定化剤がフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２５】
ＧＳＫ３β阻害剤を含む限定培養培地であって、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まず、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地。
【請求項２６】
白血病阻止因子（ＬＩＦ）をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２７】
ＩＬ６ＲＩＬ６キメラをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２８】
ＪＮＫ阻害剤を含まない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項２９】
ｐ３８阻害剤を含まない、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３０】
無血清である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３１】
１ｎｇ／ｍｌを超える量の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３２】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３３】
基質接着のない懸濁培養法による培養において、少なくとも５回の継代にわたって多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３４】
前記ＴＬＣＫの使用濃度が、前記培養培地に対して２０〜８０μＭの濃度範囲内である、請求項３〜９および１３〜１６のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３５】
前記ＴＬＣＫの使用濃度が、前記培養培地に対して４０〜６０μＭの濃度範囲内である、請求項３〜９および１３〜１６のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３６】
前記ＴＬＣＫの使用濃度が、前記培養培地に対して約５０μＭである、請求項３〜９および１３〜１６のいずれか一項に記載の限定培養培地。
【請求項３７】
細胞と、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の限定培養培地とを含む細胞培養物。
【請求項３８】
前記細胞が多能性幹細胞を含み、前記培養培地が、基質接着のない懸濁培養法による培養において、前記多能性幹細胞を多能性状態に維持することができるものである、請求項３７に記載の細胞培養物。
【請求項３９】
前記培養培地が、基質接着のない懸濁培養法による培養において、少なくとも５回の継代にわたり、前記多能性幹細胞を未分化且つ多能性の状態に維持することができる、請求項３８に記載の細胞培養物。
【請求項４０】
前記多能性幹細胞が誘導多能性幹細胞である、請求項３８または３９に記載の細胞培養物。
【請求項４１】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項３８または３９に記載の細胞培養物。
【請求項４２】
多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の細胞培養物。
【請求項４３】
基質接着のない懸濁培養法によって多能性幹細胞を培養する方法であって、
請求項１〜３６のいずれか一項に記載の限定培養培地中で前記多能性幹細胞を培養し、それによって、前記多能性幹細胞の懸濁培養を実施することを含む、方法。
【請求項４４】
前記限定培養培地が、基質接着のない懸濁培養法による培養において、少なくとも５回の継代にわたり、前記多能性幹細胞の多能性状態を維持することができる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記多能性幹細胞を、増殖性、多能性且つ未分化の状態に維持しながら、前記多能性幹細胞数を増加させるための、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その一部の実施形態において、限定培養培地に関する。より具体的には、当該培地を用いた、基質接着のない懸濁培養法による多能性幹細胞の培養方法に関するが、これに限定されるものではない。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、即ち、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）のどちらも、伝統的にはその培養および誘導にマウスＥＳＣのための従来の方法、すなわち、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加した培地および不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）からなるフィーダー層を使用する方法［Thomson et al, 1998］によって行われてきた。近年、ｈＥＳＣ用培養システムの改善のための広範囲の調査によって、次の５つの主な進歩が達成された：（１）無血清条件で細胞を増殖させる技術［Amit et al, 2000］、（２）１００％ＭＥＦ条件培地を用いた、マトリゲル（商標）マトリックス上での、細胞の未分化の状態での維持［Xu et al, 2001］、（３）選択した増殖因子を使用し、ＭＥＦ条件培地の添加なしに、フィーダー層なしの条件下におけるｈＥＳＣの長期培養［Amit et al, 2004、Xu et al, 2005、Xu et al, 2005b］、（４）フィーダー層としてのヒト胚性線維芽細胞、成熟ファローピウス管上皮［Richards et al, 2002］または包皮線維芽細胞［Amit et al, 2003、Hovatta et al, 2004］のいずれかの使用、および（５）懸濁培養による細胞の培養（Amit et al, 2010、2011）。
【０００３】
以前の研究によって、条件培地の使用を除外したフィーダー層なしの培養システムが提供された。第１のものは、マトリゲル（商標）マトリックスと、血清代替物および４０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した培地とに基づくものである［Xu et al, 2005b］。
【０００４】
著者らは、この培養方法を使用した際のバックグラウンドの分化が２８％であり、当該培養培地に７５ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンドを添加した場合の分化は２０％であると報告した。第２のものは、マトリゲル（商標）マトリックスと、４０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび０．５μｇ／ｍｌのノギンを添加した培地とに基づくものである［Xu et al, 2005］。この培養システムにおける１０％のバックグラウンド分化は、マトリゲルおよびＭＥＦ条件培地を用いて細胞を培養した際のバックグラウンド分化と同等であった。Ａｍｉｔおよびその同僚によって提言された、第３のシステムは、フィブロネクチンをマトリックスとし、２０％血清代替物、ならびに０．１２ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加した培地に基づくものである［Amit et al, 2004］。これら３つの方法の全てが、３２回を超える継代にわたってｈＥＳＣの特徴を維持しながら、ｈＥＳＣの連続培養を支援することがわかった。
【０００５】
一部の培養方法では、Ｆｌｔ３（Xu et al., 2005）および様々な阻害剤（Gafni O., et al., 2013. Nature, 504:282-6. Epub 2013 Oct 30）などの様々な因子のカクテルを培地に添加するという条件において、フィーダー層を用いずに、ＰＳＣを連続的に培養することができる。いくつかの最近の研究は、ｈＰＳＣの再生および「幹細胞」としての独自性の維持におけるいくつかの細胞内情報伝達経路の関与の可能性について考察したが、ｈＥＳＣの自己維持の基礎となる機構は依然として明らかになっていない。
【０００６】
Ｓａｔｏおよびその同僚により提供された、経路に関する第１の提案は、Ｗｎｔ経路である（Sato N., et al, 2004. "Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specific inhibitor"; Nature Medicine 10: 55-63）。彼らの研究では、ｈＥＳＣを、マトリゲルマトリックスおよび６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）を添加した培地で７日間培養した。これらの条件下で培養したＨＥＳＣは、ｈＥＳＣの特性を維持するだけでなく、ＷＮＴシグナル伝達経路の上方制御も示し、これは、ｈＥＳＣ自己再生におけるこの経路の関与を示唆している。同じグループによる後の刊行物は、ＴＧＦβ経路が、細胞運命の決定において重要な役割を果たし、ｈＥＳＣの特徴を維持する際に、Ｗｎｔシグナル伝達経路との相互接続を保持することを示している［Daylon et al, 2005］。これらの結果は、培養培地へのＴＧＦβの添加に基づく、Ａｍｉｔおよび同僚により提言されたフィーダー層なしの培養方法と一致している［Amit et al, 2004］。
【０００７】
しかしながら、これらの２次元（２−Ｄ）培養システムは、ＰＳＣの小規模生産に使用することはできるが、ＰＳＣの大規模生産を行うためには、その能力に限界がある。さらに、既知の培養条件は、いずれもＰＳＣを多能性状態に維持するためにｂＦＧＦを必要とするが、この因子は、ＰＳＣを大規模生産するには高価な添加剤である。
【０００８】
さらなる背景技術としては、国際公開第２０１５／００９１４６号、国際公開第２０１５／０５１１２２号、Kakugawa S., et al. 2015（"Notum deacylates Wnts to suppress signaling activity". Nature, 519: 187-192）が挙げられる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、有効量のプロテアーゼ阻害剤を含む限定培養培地であって、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる培養培地が提供される。
【００１０】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、ＧＳＫ３β阻害剤と、プロテアーゼ阻害剤およびＷＮＴ３Ａポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の薬剤とを含む限定培養培地であって、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地が提供される。
【００１１】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドと、その安定化剤とを含む限定培養培地であって、安定化剤は脂質ベシクルではなく、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる、限定培養培地が提供される。
【００１２】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、ＧＳＫ３β阻害剤を含む限定培養培地であって、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まず、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地が提供される。
【００１３】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、細胞と、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の限定培養培地とを含む細胞培養物が提供される。
【００１４】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、基質接着のない懸濁培養法によって多能性幹細胞を培養する方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の培養培地中で多能性幹細胞を培養し、それによって、多能性幹細胞の懸濁培養を実施することを含む、方法が提供される。
【００１５】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
【００１６】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）である。
【００１７】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中のＴＬＣＫの濃度は、２０〜８０μＭである。
【００１８】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中のＴＬＣＫの濃度は、４０〜６０μＭである。
【００１９】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中のＴＬＣＫの濃度は、約５０μＭである。
【００２０】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤をさらに含む。
【００２１】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドをさらに含む。
【００２２】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａの安定化剤をさらに含み、但し、安定化剤は脂質ベシクルではない。
【００２３】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．００９μＭを超える量のＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【００２４】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【００２５】
本発明の一部の実施形態によれば、ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【００２６】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
【００２７】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａの安定化剤をさらに含み、但し、安定化剤は脂質ベシクルではない。
【００２８】
本発明の一部の実施形態によれば、ＣＨＩＲ９９０２１の使用濃度は、少なくとも１μＭである。
【００２９】
本発明の一部の実施形態によれば、ＣＨＩＲ９９０２１の使用濃度は、２〜５μＭ／ｍｌの濃度範囲内である。
【００３０】
本発明の一部の実施形態によれば、安定化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる群より選択されるものである。
【００３１】
本発明の一部の実施形態によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの使用濃度は、少なくとも１ｎｇ／ｍｌである。
【００３２】
本発明の一部の実施形態によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの使用濃度は、約５〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内である。
【００３３】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．００９μＭを超えるＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【００３４】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【００３５】
本発明の一部の実施形態によれば、安定化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤である。
【００３６】
本発明の一部の実施形態によれば、安定化剤は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
【００３７】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、白血病阻止因子（ＬＩＦ）をさらに含む。
【００３８】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラをさらに含む。
【００３９】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＪＮＫ阻害剤を含まない。
【００４０】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ｐ３８阻害剤を含まない。
【００４１】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、無血清である。
【００４２】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、１ｎｇ／ｍｌを超える量の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない。
【００４３】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない。
【００４４】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、基質接着のない懸濁培養法による培養において、少なくとも５回の継代にわたって多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる。
【００４５】
本発明の一部の実施形態によれば、細胞は多能性幹細胞を含み、培養培地は、基質接着のない懸濁培養法による培養において、多能性幹細胞を多能性状態に維持することができるものである。
【００４６】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の培養培地は、基質接着のない懸濁培養法による培養において、少なくとも５回の継代にわたって多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる。
【００４７】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。
【００４８】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。
【００４９】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。
【００５０】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、基質接着のない懸濁培養法による培養において、少なくとも５回の継代にわたり、多能性幹細胞の多能性状態を維持することができる。
【００５１】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の方法は、多能性幹細胞の増殖性、多能性および未分化状態を維持しながら、多能性幹細胞数を増加させるためのものである。
【００５２】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する当業界における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載する方法および材料と類似するもの、または等価であるものを、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本特許明細書が支配するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、必ずしも限定を意図するものではない。
【００５３】
本発明の一部の実施形態を、添付の図面を参照しながら、ほんの一例としてここで説明する。ここで、特に図面を詳細に参照するが、ここで示す詳細は例示に過ぎず、本発明の実施形態の具体的な考察を目的としたものであることを強調する。これに関して、図面と共に行われる説明は、本発明の実施形態をどのように実行することができるかを当業者に明らかにするものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１Ａ〜Ｃは、多能性幹細胞のＳＳＥＡ４マーカーのＦＡＣＳ分析であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図１Ａ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図１Ｂ）、およびＷｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図１Ｃ）のそれぞれにおいて少なくとも１５回継代した後の分析結果である。試験培地で１５〜２５回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する特異的多能性マーカーＳＳＥＡ４に対する、フローサイトメトリー分析。
【図２】図２Ａ〜Ｌは、ＳＳＥＡ４に対する免疫染色分析の画像（図２Ｊ〜Ｌ）であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図２Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図２Ｄ〜Ｆ）、Ｗｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図２Ｇ〜Ｉ）およびｍＷｎｔ培養培地（マウスＷｎｔ）（図２Ｊ〜Ｌ）のそれぞれにおいて少なくとも１５回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも１５回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＳＳＥＡ４（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図２Ａ、２Ｄ、２Ｇおよび２Ｊ）、ＣＹ５によるＳＳＥＡ４の標識化（図２Ｂ、２Ｅ、２Ｈおよび２Ｋ）、ならびに統合画像（図２Ｃ、２Ｆ、２Ｉおよび２Ｌ）を示した。
【図３】図３Ａ〜Ｌは、Ｏｃｔ４に対する免疫染色分析の画像（図３Ｊ〜Ｌ）であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図３Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図３Ｄ〜Ｆ）、Ｗｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図３Ｇ〜Ｉ）およびｍＷｎｔ培養培地（図３Ｊ〜Ｌ）のそれぞれにおいて少なくとも１５回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも１５回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＯｃｔ４（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図３Ａ、３Ｄ、３Ｇおよび３Ｊ）、ＣＹ５によるＯｃｔ４の標識化（図３Ｂ、３Ｅ、３Ｈおよび３Ｋ）、ならびに統合画像（図３Ｃ、３Ｆ、３Ｉおよび３Ｌ）を示した。
【図４】図４Ａ〜Ｌは、Ｎａｎｏｇに対する免疫染色分析の画像（図４Ｊ〜Ｌ）であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図４Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図４Ｄ〜Ｆ）、Ｗｎｔ培養培地（Ｗｎｔ４Ａ、図４Ｇ〜Ｉ）およびｍＷｎｔ培養培地（図４Ｊ〜Ｌ）のそれぞれにおいて少なくとも１５回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも１５回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＮａｎｏｇ（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊ）、ＣＹ５によるＮａｎｏｇの標識化（図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋ）、ならびに統合画像（図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌ）を示した。
【図５】図５Ａ〜Ｌは、ＴＲＡ−１−６０に対する免疫染色分析の画像（図５Ｊ〜Ｌ）であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図５Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図５Ｄ〜Ｆ）、Ｗｎｔ培養培地（Ｗｎｔ５Ａ、図５Ｇ〜Ｉ）およびｍＷｎｔ培養培地（図５Ｊ〜Ｌ）のそれぞれにおいて少なくとも１５回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも１５回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＴＲＡ−１−６０（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図５Ａ、５Ｄ、５Ｇおよび５Ｊ）、ＣＹ５によるＴＲＡ−１−６０の標識化（図５Ｂ、５Ｅ、５Ｈおよび５Ｋ）、ならびに統合画像（図５Ｃ、５Ｆ、５Ｉおよび５Ｌ）を示した。
【図６】図６Ａ〜Ｌは、ＴＲＡ−１−８１に対する免疫染色分析の画像（図６Ｊ〜Ｌ）であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図６Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図６Ｄ〜Ｆ）、Ｗｎｔ培養培地（Ｗｎｔ６Ａ、図６Ｇ〜Ｉ）およびｍＷｎｔ培養培地（図６Ｊ〜Ｌ）のそれぞれにおいて少なくとも１５回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも１５回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＴＲＡ−１−８１（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図６Ａ、６Ｄ、６Ｇおよび６Ｊ）、ＣＹ５によるＴＲＡ−１−８１の標識化（図６Ｂ、６Ｅ、６Ｈおよび６Ｋ）、ならびに統合画像（図６Ｃ、６Ｆ、６Ｉおよび６Ｌ）を示した。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、新しい培養培地（図７Ａ〜Ｃ）および対照培養培地（図７Ｄ）を用いて懸濁培養によって培養したＰＳＣにおける凝集体を示す図である。細胞は、対照培地で懸濁培養したＰＳＣと類似した凝集体形態を維持していたことに留意されたい。図７Ａ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ含有培地、図７Ｂ：  ＰＭＳＦおよびＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）含有培地、図７Ｃ：  ＰＭＳＦおよびＷｎｔ３Ａ含有培地。サイズバー：全パネルで５０μＭ。
【図８】図８Ａ〜Ｉは、ＳＳＥＡ４に対する免疫染色分析の画像であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図８Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図８Ｄ〜Ｆ）、およびＷｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図８Ｇ〜Ｉ）のそれぞれにおいて少なくとも４０回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも４０回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＳＳＥＡ４（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図８Ａ、８Ｄ、および８Ｇ）、ＣＹ５によるＳＳＥＡ４の標識化（図８Ｂ、８Ｅ、および８Ｈ）、ならびに統合画像（図８Ｃ、８Ｆ、および８Ｉ）を示した。
【図９】図９Ａ〜Ｉは、Ｎａｎｏｇに対する免疫染色分析の画像であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図９Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図９Ｄ〜Ｆ）、およびＷｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図９Ｇ〜Ｉ）のそれぞれにおいて少なくとも４０回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも４０回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＮａｎｏｇ（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図９Ａ、９Ｄ、および９Ｇ）、ＣＹ５によるＮａｎｏｇの標識化（図９Ｂ、９Ｅ、および９Ｈ）、ならびに統合画像（図９Ｃ、９Ｆ、および９Ｉ）を示した。
【図１０】図１０Ａ〜Ｉは、ＴＲＡ−１−６０に対する免疫染色分析の画像であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図１０Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図１０Ｄ〜Ｆ）、およびＷｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図１０Ｇ〜Ｉ）のそれぞれにおいて少なくとも４０回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも４０回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＴＲＡ−１−６０（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図１０Ａ、１０Ｄ、および１０Ｇ）、ＣＹ５によるＴＲＡ−１−６０の標識化（図１０Ｂ、１０Ｅ、および１０Ｈ）、ならびに統合画像（図１０Ｃ、１０Ｆ、および１０Ｉ）を示した。
【図１１】図１１Ａ〜Ｉは、ＴＲＡ−１−８１に対する免疫染色分析の画像であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図１１Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図１１Ｄ〜Ｆ）、およびＷｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図１１Ｇ〜Ｉ）のそれぞれにおいて少なくとも４０回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも４０回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＴＲＡ−１−８１（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図１１Ａ、１１Ｄ、および１１Ｇ）、ＣＹ５によるＴＲＡ−１−８１の標識化（図１１Ｂ、１１Ｅ、および１１Ｈ）、ならびに統合画像（図１１Ｃ、１１Ｆ、および１１Ｉ）を示した。
【図１２】図１２Ａ〜Ｉは、ＯＣＴ４に対する免疫染色分析の画像であり、ＹＦＬ３培養培地（対照、図１２Ａ〜Ｃ）、ＣＨＩＲ培養培地（ＣＨＩＲ９９０２１、図１２Ｄ〜Ｆ）、およびＷｎｔ培養培地（Ｗｎｔ３Ａ、図１２Ｇ〜Ｉ）のそれぞれにおいて少なくとも４０回継代した後の分析結果である。試験培地で少なくとも４０回の継代にわたり懸濁培養したｈＰＳＣの発現する多能性マーカーＯＣＴ４（ＣＹ５で標識）に対する免疫蛍光分析。ＤＡＰＩによる核染色（図１２Ａ、１２Ｄ、および１２Ｇ）、ＣＹ５によるＯＣＴ４の標識化（図１２Ｂ、１２Ｅ、および１２Ｈ）、ならびに統合画像（図１２Ｃ、１２Ｆ、および１２Ｉ）を示した。
【図１３Ａ】図１３は、少なくとも１５回の継代（図１３Ｂ）、少なくとも４０回の継代（図１３Ａ）、または４４〜４８回の継代（図１３Ｃ）にわたり、培養培地で培養した多能性幹細胞の増殖曲線である。ＰＳＣを播種し、１４日間培養した。接種濃度は１．５×１０５細胞／ｍｌであった。２日毎に、生細胞数を計数した。
【図１３Ｂ】図１３は、少なくとも１５回の継代（図１３Ｂ）、少なくとも４０回の継代（図１３Ａ）、または４４〜４８回の継代（図１３Ｃ）にわたり、培養培地で培養した多能性幹細胞の増殖曲線である。ＰＳＣを播種し、１４日間培養した。接種濃度は１．５×１０５細胞／ｍｌであった。２日毎に、生細胞数を計数した。
【図１３Ｃ】図１３は、少なくとも１５回の継代（図１３Ｂ）、少なくとも４０回の継代（図１３Ａ）、または４４〜４８回の継代（図１３Ｃ）にわたり、培養培地で培養した多能性幹細胞の増殖曲線である。ＰＳＣを播種し、１４日間培養した。接種濃度は１．５×１０５細胞／ｍｌであった。２日毎に、生細胞数を計数した。
【図１４】図１４は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）およびＳＯＸ２に関するＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。リアルタイムＰＣＲ分析を使用して、少なくとも４０回の継代にわたり試験培地を使用して培養した細胞によるＯｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびｓｏｘ２遺伝子の発現レベルを決定した。試験培地と対照（ＹＦＬ３）との間に有意差は見出すことはできなかった。
【図１５】図１５Ａ〜Ｇは、指定した培養培地を使用して３８〜４２回の継代にわたって懸濁培養した後のＰＳＣにおける、特異的多能性マーカーＳＳＥＡ４に対するＦＡＣＳ分析の結果である。図１５Ａ：  ＹＦＬ３、図１５Ｂ：  ＰＭＳＦ、図１５Ｃ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ、図１５Ｄ：  ＰＭＳＦ＋ＷＮＴ（Ｗｎｔ３Ａ）、図１５Ｅ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ＋ＷＮＴ（Ｗｎｔ３Ａ）、図１５Ｆ：  ＰＭＳＦ＋ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）、図１５Ｇ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ＋ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）。
【図１６】図１６Ａ〜Ｌは、試験培地を使用して懸濁培養したｈＰＳＣの発現する、多能性マーカーＴｒａ１−８１およびＯｃｔ４の免疫蛍光分析を示す。図１６Ａ〜Ｄ：  細胞を、１６５回の継代にわたり、ＹＦＬ３培地中で懸濁培養した。図１６Ｅ〜Ｈ：  細胞を、５３回の継代にわたり、ＰＭＳＦ培地中で懸濁培養した。図１６Ｉ〜Ｌ：  細胞を、５０回の継代にわたり、ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ培地中で懸濁培養した。ＤＡＰＩによる核染色（図１６Ａ、１６Ｅおよび１６Ｉ）、ＴＲＡ−１−８１染色（「Ｔｒａ８１」、図１６Ｂ、１６Ｆおよび１６Ｊ）、ＯＣＴ４染色（図１６Ｃ、１６Ｇおよび１６Ｋ）、ならびにＯＣＴ４（緑色）とＴＲＡ−１−８１（「Ｔｒａ８１」、赤色）との統合画像（図１６Ｄ、１６Ｈ、および１６Ｌ）を示した。
【図１７】図１７Ａ〜Ｌは、試験培地を使用して懸濁培養したｈＰＳＣの発現する、多能性マーカーＴｒａ−１−８１およびＯｃｔ４の免疫蛍光分析を示す。図１７Ａ〜Ｄ：  細胞を、５３回の継代にわたり、ＰＭＳＦ＋ＷＮＴ（Ｗｎｔ３Ａ）培地中で懸濁培養した。図１７Ｅ〜Ｈ：  細胞を、５０回の継代にわたり、ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ＋ＷＮＴ培地中で懸濁培養した。図１７Ｉ〜Ｌ：  細胞を、４９回の継代にわたり、ＰＭＳＦ＋ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）中で懸濁培養した。ＤＡＰＩによる核染色（図１７Ａ、１７Ｅおよび１７Ｉ）、ＴＲＡ−１−８１染色（図１７Ｂ、１７Ｆおよび１７Ｊ）、ＯＣＴ４染色（図１７Ｃ、１７Ｇおよび１７Ｋ）、ならびにＯＣＴ４（緑色）とＴＲＡ−１８１（赤色）との統合画像（図１７Ｄ、１７Ｈ、および１７Ｌ）を示した。
【図１８】図１８Ａ〜Ｇは、下記の培養培地上で、少なくとも４０回の継代にわたって増殖させたＰＳＣから形成された、胚様体（ＥＢ）の画像。各図面において、上の画像（「１」と印した）は、２日目のＥＢに関するものであり、下の画像（「２」と印した）は、６日目のＥＢに関するものである。図１８Ａ：  ＹＦＬ３培地、図１８Ｂ：  ＰＭＳＦ培地、図１８Ｃ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ培地、図１８Ｄ：  ＰＭＳＦ＋Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３Ａ）培地、図１８Ｅ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ＋Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３Ａ）培地、図１８Ｆ：  ＰＭＳＦ＋Ｃｈｉｒ（ＣＨＩＲ９９０２１）培地、図１８Ｇ：  ＬＩＦを含まないＰＭＳＦ＋Ｃｈｉｒ（ＣＨＩＲ９９０２１）培地。
【図１９】図１９Ａ〜Ｄは、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上の２次元培養システム、ならびにＷＮＴ３ＡおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した培養培地によって１９回の継代にわたり培養したヒト多能性幹細胞を示す画像である。細胞を、多能性マーカーＯＣＴ４（図１９Ａ）およびＳＳＥＡ４（図１９Ｃ）に対して免疫染色し、ＤＡＰＩによる核染色によってさらに対抗染色した（図１９Ｂおよび１９Ｄ）。
【図２０】図２０Ａ〜Ｄは、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上の２次元培養システム、ならびにＷＮＴ３ＡおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した培養培地によって１９回の継代にわたり培養したヒト多能性幹細胞を示す画像である。細胞を、多能性マーカーＴＲＡ−１−６０（図２０Ａ）およびＴＲＡ−１−８１（図２０Ｃ）に対して免疫染色し、ＤＡＰＩによる核染色によってさらに対抗染色した（図２０Ｂおよび２０Ｄ）。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）上の２次元培養システム、ならびにＷＮＴ３ＡおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した培養培地によって１９回の継代にわたり培養したヒト多能性幹細胞の細胞形態を示す画像である。
【図２２】図２２は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の化学構造の略図である。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは、ＴＬＣＫ培地（ｂＦＧＦを含まない）中での未分化ｈＥＳＣの静的３Ｄ（３次元）懸濁培養を示す図である。静的３Ｄ培養プレート内、ＴＬＣＫを添加した培地（ｂＦＧＦなし）中で、未分化ｈＥＳＣ（Ｓｕｓ１６０、ＴＥ０３）を６回の継代にわたり培養した。図２３Ａ：  ６回の継代後の細胞の形態。図２３Ｂ：  代表的なＦＡＣＳ分析は、９２％を超える細胞がＯｃｔ４とＳＳＥＡ４とを同時発現し、９５％を超える細胞がＳＳＥＡ４について陽性であることを示した。
【図２４】図２４Ａ〜Ｂは、ＴＬＣＫ培地（ｂＦＧＦを含まない）中での未分化ｈＥＳＣの静的３Ｄ（３次元）懸濁培養を示す図である。静的３Ｄ培養プレート内、ＴＬＣＫを添加した培地（ｂＦＧＦなし）中で、未分化ｈＥＳＣ（Ｓｕｓ１７５、ＴＥ０３）を６回の継代にわたり培養した。図２４Ａ：  ６回の継代後の細胞の形態。図２４Ｂ：  代表的なＦＡＣＳ分析は、８３％を超える細胞がＯｃｔ４とＳＳＥＡ４とを同時発現し、９２％を超える細胞がＳＳＥＡ４について陽性であることを示した。
【図２５】図２５は、低分子（ＰＭＳＦ）を添加した本発明の一部の実施形態の培地中での、未分化ｈＥＳＣの動的３Ｄ培養システムによる培養を示す図である。スピナーフラスコ内のＰＭＳＦ添加培地中で５週間（５回の継代）にわたり凝集体（Ｍａｘｅｌｌｓ（商標））として培養した未分化ｈＥＳＣ（ＳＵＳ１６０，Ｉ３系、ＴＥ０３）の代表的なＦＡＣＳ分析を示した。９５％を超える細胞がＯｃｔ４とＳＳＥＡ４を同時発現し、９８％を超える細胞がＳＳＥＡ４を発現することに留意されたい。
【図２６】図２６は、動的３Ｄ培養システムで培養したｈＥＳＣのＦＡＣＳ特性評価を示す図である。スピナーフラスコ内の、Ｗｎｔ３ＡおよびＬＩＦ添加培地中で４週間（４回の継代）にわたり凝集体（Ｍａｘｅｌｌｓ（商標））として培養した未分化ｈＥＳＣ（ＳＵＳ１７５，Ｉ３系、ＴＥ０３）の代表的なＦＡＣＳ分析を示した。８６％を超える細胞がＯｃｔ４とＳＳＥＡ４を同時発現し、９７％を超える細胞がＳＳＥＡ４を発現することに留意されたい。
【図２７】図２７Ａ〜Ｃは、プレート上での３Ｄ静的培養条件下における、ＰＭＳＦ添加培地中で培養したＰＳＣの分化能を示す図である。ＴＥ０３細胞を、ＰＭＳＦ添加培地中またはＰＭＳＦ＋Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３Ａ）＋ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）添加培地中で凝集体（Ｍａｘｅｌｌｓ（商標））として培養し、懸濁３Ｄ培養による３５〜３７回の継代後、細胞を、胚様体（図２７Ａ〜Ｂ）に自発的に分化させるか、または脂肪細胞系（図２７Ｃ）に分化するように直接誘導した。分化条件で１６日間を経た後にＯｉｌ−Ｏレッド（赤色）で染色された脂肪細胞を示した。図２７Ａ：  細胞は、ＥＢに自発的に分化させる前に、ＰＭＳＦ添加培地中で培養した。図２７Ｂ：  細胞は、ＥＢに自発的に分化させる前に、ＰＭＳＦ＋Ｗｎｔ（Ｗｎｔ３Ａ）＋ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）添加培地中で培養した。図２７Ｃ：  細胞は、脂肪細胞系に直接誘導する前に、ＰＭＳＦ＋Ｗｎｔ＋ＣＨＩＲ（ＣＨＩＲ９９０２１）添加培地中で培養した。矢印は脂質液滴を含有する細胞を示し、したがって、前駆脂肪細胞への分化を示している。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、その一部の実施形態において、限定培養培地に関する。より具体的には、当該培地を用いた、基質接着のない懸濁培養法による多能性幹細胞の培養方法に関するが、これに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の少なくとも１種の実施形態を詳細に説明する前に、本発明はその適用において、以下の説明および／または図面による図解および／または実施例で示す、構成の詳細ならびに成分および／または方法の組み合わせに必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態を可能とするか、または様々な方法で実施もしくは実行することができる。
【００５７】
本研究で提示す懸濁培養法は、Ｗｎｔ３ａ、ＧＳＫ３βｉ（ＧＳＫ３β阻害剤）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）および／またはトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）を添加した培地に基づくが、培養培地へのｂＦＧＦの添加はない。そのような限定培養培地は、フィーダー層なしで無血清の環境、例えば懸濁培養において、ヒトＰＳＣの長期的な未分化培養を支持可能であることが示された。
【００５８】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、初期のヒト発生に関する研究へのそれらの寄与に加えて、細胞に基づく療法および工業用途のために使用することもできる。ヒト療法におけるｈＰＳＣの将来的に考えられる使用には、これら細胞のための、動物性成分を含まず、再現可能であり、値段が手頃で、大量化可能な培養システムが必要である。
【００５９】
本研究において、本発明者らは、懸濁液中での、ｈＰＳＣのための新しい培養システムを見出した。これは、血清代替物（例えば、１５％血清代替物またはその内容物）とＷｎｔ３ａとを添加した培地であって、ｂＦＧＦの添加を必要としない培地に基づくものである。この新しい処方を使用した際にｈＰＳＣは、長期培養後にもＰＳＣの特徴、即ち、３種の胚性生殖層の代表的な組織へと分化する発生能、無制限かつ未分化の増殖能、および正常な核型の維持を含む全てを維持していた。
【００６０】
ここで報告される培養システムは、Ｗｎｔ３ａ、ＧＳＫ３βｉ（ＧＳＫ３β阻害剤）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、および／またはトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）が、懸濁液中のｈＰＳＣの未分化培養を支持するのに十分であることを示す。このような単純な培地処方は、研究実務を容易にし、これら細胞の将来的な工業利用および臨床利用に必要とされるｈＰＳＣの大規模生産のためのさらなる手段を提供する。
【００６１】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、有効量のプロテアーゼ阻害剤を含む限定培養培地であって、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる培養培地が提供される。
【００６２】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、ＧＳＫ３β阻害剤と、プロテアーゼ阻害剤およびＷＮＴ３Ａポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の薬剤とを含む限定培養培地であって、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地が提供される。
【００６３】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドと、その安定化剤とを含む限定培養培地であって、安定化剤は脂質ベシクルではなく、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる、限定培養培地が提供される。
【００６４】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、ＧＳＫ３β阻害剤を含む限定培養培地であって、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まず、基質接着のない懸濁培養法による培養において、ヒト多能性幹細胞を多能性状態に維持することができる限定培養培地が提供される。
【００６５】
本明細書で使用する用語「限定培養培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」とは、人工のものであり、その成分が全て既知である培養培地を指す。
【００６６】
培養培地は、塩類、栄養素、ミネラル、ビタミン、抗生物質、アミノ酸、核酸、タンパク質（例えば、サイトカイン、増殖因子およびホルモン）のなどの物質の組合せを含む水性培地であってもよく、これら物質は全て細胞増殖に必要であり、多能性幹細胞を未分化の状態に維持することができるものである。
【００６７】
例えば、限定培養培地は、Ｋｏ−ＤＭＥＭ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（イスラエル国、ベイエメック、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、Ｍａｂ  ＡＤＣＢ培地（米国、ユタ州、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）またはＤＭＥＭ（イスラエル国、ベイエメック、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）などの合成組織培養培地に、詳細に後述する必須添加物を添加したものでもよい。本発明の培養培地中に含まれる全ての成分は実質的に純粋で、組織培養グレードであることが好ましい。
【００６８】
非限定培養培地の例は、条件培地、または条件培地を添加した培地である。したがって、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、条件培地ではない。
【００６９】
条件培地は、ある特定の培養期間後に存在する単層細胞培養物（すなわち、フィーダー細胞）の増殖培地である。条件培地は、培養物中の単層細胞によって分泌される増殖因子およびサイトカインを含む。
【００７０】
条件培地は、培養物中で単層を形成する様々な細胞から回収することができる。例としては、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）条件培地、包皮条件培地、ヒト胚性線維芽細胞条件培地、ヒトファローピウス管上皮細胞条件培地などが挙げられる。
【００７１】
記載されるように、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、有効量のプロテアーゼ阻害剤を含む。
【００７２】
本明細書で使用する語句「有効量のプロテアーゼ阻害剤」とは、多能性幹細胞を多能性状態に維持するのに十分な量のプロテアーゼ阻害剤を指す。
【００７３】
好ましくは、有効量のプロテアーゼ阻害剤は、多能性幹細胞を未分化の状態に維持するのに十分なものである。
【００７４】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、可逆的プロテアーゼ阻害剤である。
【００７５】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼを阻害する。
【００７６】
本発明の一部の実施形態の培地で使用することができる可逆的プロテアーゼ阻害剤の非限定的な例としては、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ＧＳＫ３β阻害剤、アルデヒド−ＣＨＯ、アリールケトン−ＣＯ−アリール、トリフルオロメチルケトン−ＣＯＣＦ３、およびケトカルボン酸−ＣＯＣＯＯＨが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
本発明の一部の実施形態によれば、有効量のプロテアーゼ阻害剤は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの分解を阻害することができる。
【００７８】
プロテアーゼ阻害剤がＷＮＴ３Ａの分解を阻害および／または防止することができるかどうかを決定するために使用することができるアッセイとしては、細胞内のＷＮＴ３Ａのレベルを決定するために抗ＷＮＴ３Ａ抗体を使用する、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、免疫組織化学分析、ラジオイムノアッセイなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な抗ＷＮＴ３Ａ抗体の非限定的な例は、米国、マサチューセッツ州、ａｂｃａｍ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ社から入手可能な抗Ｗｎｔ３ａ抗体（ａｂ２８４７２）である。例えば、細胞を、特定の濃度のプロテアーゼ阻害剤および足場（ｌａｎｄ）の存在下または非存在下、限定培養培地中でインキュベートし、その後、数日間（例えば、５日間）培養することができる。ＷＮＴ３Ａの分解レベルを、２つの時点の間で比較および／または定量することができる。
【００７９】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
【００８０】
ＰＭＳＦは、細胞溶解物の調製において一般的に使用されるセリンプロテアーゼ阻害剤である。ＰＭＳＦの化学構造の模式図を図２２に示した。ＰＭＳＦは、水中で急速に分解されるため、保存溶液は、通常、無水エタノール、イソプロパノール、コーン油、またはＤＭＳＯで構成される。０．１〜１ｍＭの濃度のＰＭＳＦを使用すると、タンパク質溶解の阻害が起こる。
【００８１】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地で使用するＰＭＳＦについて、ＰＭＳＦの使用濃度は、少なくとも約０．０１ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０２ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０３ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０４ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０５ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０６ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０７ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０８ｍＭ、例えば、少なくとも約０．０９ｍＭ、例えば、少なくとも約０．１ｍＭとする。
【００８２】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地中に含まれるＰＭＳＦについて、ＰＭＳＦ濃度は、０．０５ｍＭ〜１ｍＭの範囲、例えば、０．０５ｍＭ〜０．８ｍＭの範囲、例えば、０．０５ｍＭ〜０．７ｍＭの範囲、例えば、０．０５ｍＭ〜０．６ｍＭの範囲、例えば、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭの範囲、例えば、０．０６ｍＭ〜０．４ｍＭの範囲、例えば、０．０７ｍＭ〜０．３ｍＭの範囲、例えば、０．０８ｍＭ〜０．２ｍＭの範囲、例えば、０．０９ｍＭ〜０．１５ｍＭの範囲、例えば、０．０９ｍＭ〜０．１２ｍＭの範囲、例えば、０．０９ｍＭ〜０．１ｍＭの範囲、例えば、約０．１ｍＭの範囲であってもよい。
【００８３】
本発明の一部の実施形態によれば、プロテアーゼ阻害剤は、不可逆的プロテアーゼ阻害剤である。
【００８４】
本発明の一部の実施形態によれば、不可逆的プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼを阻害する。
【００８５】
本発明の一部の実施形態によれば、不可逆的プロテアーゼ阻害剤は、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）である。
【００８６】
ＴＬＣＫ（ＣＡＳ  ４２３８−４１−９）は、トリプシンおよびトリプシン様セリンプロテアーゼの不可逆的阻害剤である。
【００８７】
ＴＬＣＫは、様々な供給業者、例えば、ａｂｃａｍ（例えば、カタログ番号ａｂ１４４５４２）、Ｅｎｚｏ（カタログ番号ＢＭＬ−ＰＩ１２１−０２００）、ＧＥＮＡＸＸＯＮ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号Ｍ３３７５．０１００）などから入手することができる。
【００８８】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地で使用するＴＬＣＫの濃度は、約０．０５μＭ〜約１０００μＭ、例えば、０．５μＭから約５００μＭ、０．５μＭ〜約４００μＭ、０．５μＭ〜約３００μＭ、０．５μＭ〜約２００μＭ、０．５μＭ〜約１００μＭ、１μＭ〜約１００μＭ、５μＭ〜約１００μＭ、１０μＭ〜約１００μＭ、１０μＭ〜約９０μＭ、１０μＭ〜約８０μＭ、１０μＭ〜約７０μＭ、２０μＭ〜約７０μＭ、３０μＭ〜約７０μＭ、４０μＭ〜約７０μＭ、４０μＭ〜約６０μＭの濃度範囲内であり、例えば、約５０μＭ、約５５μＭまたは約６０μＭである。
【００８９】
本発明の一部の実施形態によれば、ＴＬＣＫの使用濃度は、２０〜８０μＭである。
【００９０】
本発明の一部の実施形態によれば、ＴＬＣＫの使用濃度は、培養培地中の濃度が約５０μＭである。
【００９１】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤をさらに含む。
【００９２】
本明細書で使用する用語「ＧＳＫ３β」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２０８４．２（配列番号１）および／またはＮＰ＿００１１３９６２８．１（配列番号２）に記載の、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３ベータタンパク質であって、そのキナーゼ活性によるＷＮＴシグナル伝達調節活性を有するものを指す。
【００９３】
本明細書で使用する用語「ＧＳＫ３β阻害剤」（「ＧＳＫ３βｉ」ともいう）は、（細胞内に存在する総ＧＳＫ３βに対する）リン酸化ＧＳＫ３βレベルの特異的阻害で表される、ＧＳＫ３βの活性阻害を行う任意の分子を指す。
【００９４】
ＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ１３８６）、ＢＩＯ（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ１６９３）、およびケンパウロン（ＴＯＣＲＩＳ−カタログ番号１３９８）が挙げられる。
【００９５】
本発明の一部の実施形態によれば、ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【００９６】
本発明の一部の実施形態によれば、ＣＨＩＲ９９０２１の使用濃度は、少なくとも０．１μＭ、例えば、少なくとも０．５μＭ、例えば、少なくとも１μＭである。
【００９７】
本発明の一部の実施形態によれば、ＣＨＩＲ９９０２１の使用濃度範囲は、約０．１〜５０μＭ、例えば、約０．２μＭ〜約５０μＭ、例えば、約０．２〜４５μＭ、例えば、約０．２〜５０μＭ、例えば、約０．２〜４５μＭ、例えば、約０．２〜４０μＭ、例えば、約０．２〜３５μＭ、例えば、約０．２〜３０μＭ、例えば、約０．２〜２５μＭ、例えば、約０．２〜２０μＭ、例えば、約０．２〜１５μＭ、例えば、約０．２〜１０μＭ、例えば、約０．２〜１０μＭ、例えば、０．３〜１０μＭ、例えば、約０．３〜６μＭ、例えば、約０．４〜１０μＭ、例えば、約０．５〜１０μＭ、例えば、約０．６〜１０μＭ、例えば、約０．７〜１０μＭ、例えば、０．８〜１０μＭ、例えば、０．９〜１０μＭ、例えば、０．９〜９μＭ、例えば、１〜８μＭ、例えば、１〜７μＭ、例えば、１〜６μＭ、例えば、１〜５μＭ、例えば、２〜５μＭ、例えば、２〜４μＭ、例えば、約３μＭである。
【００９８】
本発明の一部の実施形態によれば、ＣＨＩＲ９９０２１は、２〜５μＭ／ｍｌの濃度範囲で使用する。
【００９９】
本発明の一部の実施形態によれば、ＢＩＯの使用濃度範囲は、約０．１〜７０μＭ、例えば、約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば、約０．２〜６０μＭ、例えば、約０．２〜５５μＭ、例えば、約０．２〜５０μＭ、例えば、約０．２〜４５μＭ、例えば、約０．２〜４０μＭ、例えば、約０．２〜３５μＭ、例えば、約０．２〜３０μＭ、例えば、約０．２〜２５μＭ、例えば、約０．２〜２０μＭ、例えば、約０．２〜１５μＭ、例えば、約０．２〜１０μＭ、例えば、約０．３〜１０μＭ、例えば、約０．４〜１０μＭ、例えば、約０．５〜１０μＭ、例えば、約０．６〜１０μＭ、例えば、約０．７〜１０μＭ、例えば、０．８〜１０μＭ、例えば、０．９〜１０μＭ、例えば、０．９〜９μＭ、例えば、１〜８μＭ、例えば、１〜７μＭ、例えば、１〜６μＭ、例えば、１〜５μＭ、例えば、約５μＭ、例えば、２〜４μＭである。
【０１００】
本発明の一部の実施形態によれば、ケンパウロンの使用濃度範囲は、約０．１〜７０μＭ、例えば、約０．２μＭ〜約７０μＭ、例えば、約０．２〜６０μＭ、例えば、約０．２〜５５μＭ、例えば、約０．２〜５０μＭ、例えば、約０．２〜４５μＭ、例えば、約０．２〜４０μＭ、例えば、約０．２〜３５μＭ、例えば、約０．２〜３０μＭ、例えば、約０．２〜２５μＭ、例えば、約０．２〜２０μＭ，例えば、約０．２〜１５μＭ、例えば、約０．２〜１０μＭ、例えば、約０．３〜１０μＭ、例えば、約０．４〜１０μＭ、例えば、約０．５〜１０μＭ、例えば、約０．６〜１０μＭ、例えば、約０．７〜１０μＭ、例えば、０．８〜１０μＭ、例えば、０．９〜１０μＭ、例えば、０．９〜９μＭ、例えば、１〜８μＭ、例えば、１〜７μＭ、例えば、１〜６μＭ、例えば、１〜５μＭ、例えば、２〜４μＭ、例えば、約５μＭである。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドをさらに含む。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「ＷＮＴ３Ａ」とは、ＷＮＴ遺伝子ファミリーのメンバーを指す。ＷＮＴ遺伝子ファミリーは、分泌シグナル伝達タンパク質をコードする構造的に関連する遺伝子からなる。これらのタンパク質は、発がん性、ならびに細胞運命の調節および胚発生中のパターン形成を含むいくつかの発生プロセスへの関与が知られている。
【０１０３】
ＷＮＴ３Ａ  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３３１３１．３、配列番号３）は、ＷＮＴ３Ａポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿１４９１２２．１、配列番号４）をコードする。ＷＮＴ３Ａポリペプチドは、Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社（例えば、カタログ番号５０３６−ＷＮ−０１０）などの様々な製造業者から入手することができる。
【０１０４】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａの安定化剤をさらに含むが、当該安定化剤は脂質ベシクルではない。
【０１０５】
本明細書で使用する「ＷＮＴ３Ａ」の「安定化剤」という語句は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを安定化し、プロテアーゼを阻害する薬剤であるが、脂質ベシクルではない安定化剤を指す。
【０１０６】
脂質ベシクルである安定化剤の例としては、リポソームやミセルなど、例えば、ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＭＰＧ）およびコレステロールが挙げられ、ＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール比が、１０：１：１０であることが好ましい。
【０１０７】
本発明の一部の実施形態によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの使用濃度は、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約２ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約３ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約４ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約７ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１１ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１２ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１３ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１４ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、またはそれ以上の濃度である。
【０１０８】
本発明の一部の実施形態によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドの使用濃度範囲は、約０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１〜１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、１〜１３０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜９０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜８０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜７０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜６０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜４０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜３０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜２０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜１５ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２〜１２ｎｇ／ｍｌ、例えば、約８〜１２ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌである。
【０１０９】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「ＥＲＫ１」とは、ＭＡＰＫシグナル伝達活性を有する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２７３７．２（配列番号５）に記載のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ３（ＭＡＰＫ３）アイソフォーム１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０３５１４５．１（配列番号６）に記載のＭＡＰＫ３アイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１０３３６１．１（配列番号７）に記載のＭＡＰＫ３アイソフォーム３および／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８４４９０（配列番号８）に記載のＥＲＫ１を指す。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「ＥＲＫ２」とは、ＭＡＰＫシグナル伝達活性を有する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２７３６．３（配列番号９）および／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６２０４０７．１（配列番号１０）に記載のマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１）を指す。
【０１１２】
本明細書で使用する用語「ＥＲＫ１／２阻害剤」とは、ＥＲＫ１／２の活性を阻害することが可能な任意の分子を指し、当該活性は、リン酸化ＥＲＫ１／２タンパク質に対するウェスタンブロットタンパク質検出によって決定されるものである。
【０１１３】
ＥＲＫ１／２阻害剤の非限定的な例としては、ＰＤ０３２５９０１（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ  １４０８）、ＰＤ９８０５９（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ  １２２３）、およびＰＤ１８４３５２（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ  １３６８）、またはさらにソラフェニブもしくはＳＢ（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ  １３９７）などの、（ＥＲＫの上流にある）ＲＡＦの阻害剤が挙げられる。
【０１１４】
本明細書で使用する語句「ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない」とは、ＥＲＫ１／２阻害剤を全く含まないか、またはリン酸化ＥＲＫ１／２タンパク質の活性を阻害するには効果の無い程度に微量のＥＲＫ１／２阻害剤しか含まない培地を指し、当該活性は、リン酸化ＥＲＫ１／２タンパク質に対するウェスタンブロットタンパク質検出によって決定されるものである。
【０１１５】
本発明の一部の実施形態によれば、微量のＥＲＫ１／２阻害剤は、質量分析によって決定された値が、約０．００９μＭ未満のＥＲＫ１／２阻害剤である、例えば、約０．００５μＭ未満、約０．００１μＭ未満、約０．０００９μＭ未満、約０．０００５μＭ未満、約０．０００１μＭ未満のＥＲＫ１／２阻害剤である。
【０１１６】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、０．００９μＭを超える量のＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１１７】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、有効量のプロテアーゼ阻害剤、例えば、０．０５ｍＭ〜１ｍＭ濃度のＰＭＳＦ、を含む。
【０１１８】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、有効量の、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤およびＣＨＩＲ９９０２１（本明細書では「ＣＨＩＲ」もしくは「ＣＨＩＲ９９０２１」とも言う）などのＧＳＫ３β阻害剤を含む。
【０１１９】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０５ｍＭ〜１ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．１〜５０μＭの濃度範囲内で含む。
【０１２０】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜１０μＭの濃度範囲内で含む。
【０１２１】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０８〜０．２ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜６μＭの濃度範囲内で含む。
【０１２２】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０９ｍＭ〜０．１２ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約２〜５μＭの濃度範囲内で含む。
【０１２３】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、有効量のＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤と、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤およびＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１２４】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０５ｍＭ〜１ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．１〜５０μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１２５】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜１０μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを６０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１２６】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜１０μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１２７】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０８〜０．２ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜６μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを８０〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１２８】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０８〜０．２ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜６μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１２９】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０９〜０．１２ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約２〜５μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを９０〜１１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１３０】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばＰＭＳＦ）を０．０９〜０．１２ｍＭの濃度範囲内の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約２〜５μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１３１】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）などのプロテアーゼ阻害剤を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、且つＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤を有効量で含む。
【０１３２】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．１〜５０μＭの濃度範囲で含む。
【０１３３】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜１０μＭの濃度範囲内で含む。
【０１３４】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜６μＭの濃度範囲内で含む。
【０１３５】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約２〜５μＭの濃度範囲内で含む。
【０１３６】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１３７】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１３８】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを６０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１３９】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを８０〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１４０】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＷＮＴ３Ａポリペプチドを５〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１４１】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）などのプロテアーゼ阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１などのＧＳＫ３β阻害剤、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドの有効量で含む。
【０１４２】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．１〜５０μＭの濃度範囲、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で含む。
【０１４３】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜１０μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを６０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１４４】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜１０μＭの濃度範囲、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で含む。
【０１４５】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜６μＭ、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを８０〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１４６】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約０．３〜６μＭの濃度範囲、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で含む。
【０１４７】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約２〜５μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを９０〜１１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲内で含む。
【０１４８】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、プロテアーゼ阻害剤（例えばトシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ））を２０〜８０μＭの濃度の有効量で含み、ＧＳＫ３β阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）を約２〜５μＭの濃度範囲内で、およびＷＮＴ３Ａポリペプチドを２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む。
【０１４９】
記載のように、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤と、プロテアーゼ阻害剤およびＷＮＴ３Ａポリペプチドからなる群より選択される少なくとも１種の薬剤とを含む。
【０１５０】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と、プロテアーゼ阻害剤（例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））とを含む。
【０１５１】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）と、プロテアーゼ阻害剤［例えば、トシル−Ｌ−リシル−クロロメタンヒドロクロリド（ＴＬＣＫ）］とを含む。
【０１５２】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）とＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５３】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．１〜５０μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５４】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．３〜１０μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約６０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５５】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．３〜１０μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５６】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．３〜６μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約８０〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５７】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、０．３〜６μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５８】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、２〜５μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約９０〜１１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１５９】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、２〜５μＭの濃度範囲のＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１と、約２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドとを含む。
【０１６０】
記載のように、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドと、その安定化剤とを含むが、当該安定化剤は脂質ベシクルではない。
【０１６１】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、約０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、その安定化剤とを含むが、当該安定化剤は脂質ベシクルではない。
【０１６２】
本発明の一部の実施形態によれば、安定化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる群より選択される。
【０１６３】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドと、ＧＳＫ３β阻害剤およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）からなる群より選択される安定化剤とを含む。
【０１６４】
本発明の一部の実施形態によれば、安定化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤である。
【０１６５】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドおよび安定化剤としてのＧＳＫ３β阻害剤を含む。
【０１６６】
本発明の一部の実施形態によれば、安定化剤は、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）である。
【０１６７】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドおよび安定化剤としてのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む。
【０１６８】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約０．１〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０５ｍＭ〜１ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１６９】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約６０〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１７０】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０５〜０．５ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１７１】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約８０〜１２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０８〜０．２ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１７２】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０８〜０．２ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１７３】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約９０〜１１０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０９〜０．１２ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１７４】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、約２〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲のＷＮＴ３Ａポリペプチドと、０．０９〜０．１２ｍＭの濃度範囲のＰＭＳＦとを含む。
【０１７５】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＷＮＴ３Ａポリペプチドと、安定化剤としてのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）およびＧＳＫ３β阻害剤とを含む。
【０１７６】
本発明の一部の実施形態によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドおよびその安定化剤を含む培養培地は、０．００９μＭを超える量のＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１７７】
本発明の一部の実施形態によれば、ＷＮＴ３Ａポリペプチドおよびその安定化剤を含む培養培地は、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１７８】
記載のように、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤を含むが、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１７９】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を含み、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１８０】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を含み、ＥＲＫ１／２阻害剤は、上述したように微量しか含まない。
【０１８１】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を０．１〜５０μＭの濃度範囲で含み、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１８２】
例えば、本発明の一部の実施形態の限定培養培地は、ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を２〜５μＭの濃度範囲で含み、ＥＲＫ１／２阻害剤を含まない。
【０１８３】
本発明の一部の実施形態の培養培地は、白血病阻止因子（ＬＩＦ）をさらに含む。
【０１８４】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、ＴＬＣＫ（０．０５μＭ〜約１０００μＭ、例えば、２０〜８０μＭの範囲内の濃度）、ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１（例えば、０．１〜５０μＭの濃度範囲）およびＬＩＦ（例えば、２０００〜１０，０００単位／ｍｌの濃度）を含む。
【０１８５】
本明細書で使用する用語「白血病阻止因子（ＬＩＦ）」とは、造血分化の誘導、神経細胞分化の誘導、および腎臓の発生の際の間葉細胞から上皮細胞への転換の調節に関与し、母胎境界面での免疫寛容についても役割を担いうる、多機能サイトカインを指す。
【０１８６】
本発明の一部の実施形態の培養培地において使用されるＬＩＦは、精製、合成、または組換え発現されたＬＩＦタンパク質［例えば、ヒトＬＩＦポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２３００．１（配列番号１１）、ヒトＬＩＦポリヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２３０９．４（配列番号１２）］であってもよい。異種成分を含まない培養培地の調製のためには、ＬＩＦは、ヒトの供給源から精製されるか、または組換え発現されたものが好ましいことに留意すべきである。組換えヒトＬＩＦは、米国、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社（カタログ番号ＬＩＦ１０１００）およびＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ（米国、ノースキャロライナ州２７６０４、ローリー、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＵＳ  Ｉｎｃ．）などの様々な供給社から入手することができる。マウスＬＩＦ  ＥＳＧＲＯ（登録商標）（ＬＩＦ）を、米国、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（カタログ番号ＥＳＧ１１０７）から入手することができる。
【０１８７】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中のＬＩＦの濃度は、約２０００単位／ｍｌ〜約１０，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ〜約８，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ〜約６，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ〜約５，０００単位／ｍｌ、例えば、約２０００単位／ｍｌ〜約４，０００単位／ｍｌ、例えば、約２，５００単位／ｍｌ〜約３，５００単位／ｍｌ、例えば、約２，８００単位／ｍｌ〜約３，２００単位／ｍｌ、例えば、約２，９００単位／ｍｌ〜約３，１００単位／ｍｌ、例えば、約３０００単位／ｍｌである。
【０１８８】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中のＬＩＦの濃度は、少なくとも約２０００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２１００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２２００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２３００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２４００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２５００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２６００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２７００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２８００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２９００単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約２９５０単位／ｍｌ、例えば、少なくとも約３０００単位／ｍｌである。
【０１８９】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラをさらに含む。
【０１９０】
本明細書で使用する用語「ＩＬ６ＲＩＬ６」とは、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６−Ｒ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ８９４１０、配列番号１３に記載のヒトＩＬ−６−Ｒ）の可溶性部分（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＨ８９４１０の１１２〜３５５アミノ酸、配列番号１４に記載の可溶性ＩＬ６受容体の一部）と、インターロイキン−６（ＩＬ６）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＧ２９２９２、配列番号１５に記載のヒトＩＬ−６）またはその生物活性画分（例えば、受容体結合ドメイン）とを含むキメラポリペプチドを指す。本発明のこの態様による方法によって使用されるＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、ヒト多能性幹細胞の未分化増殖を、その多能性を維持しながら支援することができるものであることが好ましい。ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを構築する場合、２つの機能的部分（すなわち、ＩＬ６およびその受容体）を、互いに直接融合する（例えば、結合する、もしくは翻訳的に融合させる、すなわち、単一のオープンリーディングフレームによりコードされるようにする）か、または好適なリンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）を介してコンジュゲートする（結合する、もしくは翻訳的に融合させる）ことができることを理解されたい。好ましくは、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラポリペプチドは、天然に存在するＩＬ６およびＩＬ６受容体と類似する量およびパターンのグリコシル化を示す。例えば、好適なＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、配列番号１６に示したもの、および参照により本明細書に完全に組み込まれるRevel M., et al.の国際公開第９９／０２５５２号の図１１に示したものである。
【０１９１】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地に含まれるＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、少なくとも２５ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）、好ましくは少なくとも５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも３００ｐｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０１９２】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地に含まれるＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、約２５ｐｇ／ｍｌ〜約１ｎｇ／ｍｌ（ナノグラム／ミリリットル）、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約９００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約８００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約７００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約６００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約４００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約３００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２５ｐｇ／ｍｌ〜約２００ｐｇ／ｍｌ、例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜約１５０ｐｇ／ｍｌ、例えば、７０ｐｇ／ｍｌ〜約１２０ｐｇ／ｍｌ、例えば、９０ｐｇ／ｍｌ〜約１１０ｐｇ／ｍｌ、例えば、約１００ｐｇ／ｍｌ、例えば、１００ｐｇ／ｍｌ〜約６００ｐｇ／ｍｌ、例えば、２００ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌ、例えば、３００ｐｇ／ｍｌ〜約５００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲内で存在する。
【０１９３】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地に含まれるＩＬ６ＲＩＬ６キメラは、約２５ｎｇ／ｍｌ〜約３５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、２５ｎｇ／ｍｌ〜約２５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、２５ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、例えば、３０ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、例えば、５０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、例えば、７０ｎｇ／ｍｌ〜約１２０ｎｇ／ｍｌ、例えば、８０ｎｇ／ｍｌ〜約１１０ｎｇ／ｍｌ、例えば、９０ｎｇ／ｍｌ〜約１１０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する。
【０１９４】
ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの濃度は、その合成または組換え発現後のキメラポリペプチドの純度に応じて変化する場合がある点に留意すべきであり、当業者であれば、そのような純度に応じて最適濃度を調整することができる。
【０１９５】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、ＪＮＫ阻害剤を含まない。
【０１９６】
本明細書で使用する用語「ＪＮＫ」とは、増殖、分化、転写調節および発生などの様々な細胞プロセスに関与する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６２０６３７．１（アイソフォームアルファ２）（配列番号１７）、ＮＰ＿００１２６５４７６．１（アイソフォームベータ２）（配列番号１８）、ＮＰ＿６２０６３４．１（アイソフォームベータ１）（配列番号１９）、ＮＰ＿００１３１０２３１．１（アイソフォームアルファ１）（配列番号２０）に記述されているマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ８（ＭＡＰＫ８）タンパク質を指す。
【０１９７】
本明細書で使用する用語「ＪＮＫ阻害剤」とは、ＪＮＫの活性を阻害することができる任意の分子を指し、当該活性は、ＪＮＫファミリーメンバータンパク質のリン酸化に対するウェスタンブロット分析によって決定されるものである。
【０１９８】
ＪＮＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＳＰ６００１２５（ＴＯＣＲＩＳ−カタログ番号１４９６）、ＡＥＧ３４８２（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−ＡＸＯＮ  １２９１）、およびＢＩＲＢ７９６（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ  １３５８）が挙げられる。
【０１９９】
本明細書で使用する語句「ＪＮＫ阻害剤を含まない」とは、ＪＮＫ阻害剤を全く含まないか、または微量のＪＮＫ阻害剤しか含まない培地を指す。
【０２００】
本発明の一部の実施形態によれば、微量のＪＮＫ阻害剤は、約０．０１μＭ未満のＪＮＫ阻害剤であり、例えば、約０．００５μＭ未満、約０．００１μＭ未満、約０．０００９μＭ未満、約０．０００５μＭ未満、約０．０００１μＭ未満のＪＮＫ阻害剤である。
【０２０１】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、ｐ３８阻害剤を含まない。
【０２０２】
本明細書で使用する用語「ｐ３８」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１３０６．１（配列番号２１）に記載のＭＡＰＫ１４アイソフォーム１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６２０５８１．１（配列番号２２）に記載のＭＡＰＫ１４アイソフォーム２、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６２０５８２．１（配列番号２３）に記載のＭＡＰＫ１４アイソフォーム３およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６２０５８３．１（配列番号２４）に記載のＭＡＰＫ１４アイソフォーム４を含む、「ｐ３８α（アルファ）」マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１４（ＭＡＰＫ１４）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２７４２．３（配列番号２５）に記載の「ｐ３８β（ベータ）」（ＭＡＰＫ１１）、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２９６０．２（配列番号２６）に記載の「ｐ３８γ（ガンマ）」（ＭＡＰＫ１２）、および／またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２７４５．１（配列番号２７）に記載の「ｐ３８δ（デルタ）」（ＭＡＰＫ１３）を指す。これら全てがキナーゼ活性を有し、シグナル伝達に関与する。
【０２０３】
本明細書で使用する用語「ｐ３８阻害剤」とは、ｐ３８ファミリーメンバーの活性を阻害することができる任意の分子（例えば、低分子またはタンパク質）を指し、当該活性は、リン酸化ｐ３８レベルのウェスタンブロットによる定量化によって決定されるものである。
【０２０４】
ｐ３８阻害剤の非限定的な例としては、ＳＢ２０３５８０（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ  １３６３）、およびＳＢ２０２１９０（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ  １３６４）、ＬＹ２２２８８２０（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ  １８９５）、ＢＩＲＢ７９６（Ａｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ  １３５８）およびＰＤ１６９３１６（ＡＸＯＮＭＥＤＣＨＥＭ−Ａｘｏｎ  １３６５）が挙げられる。
【０２０５】
本明細書で使用する語句「ｐ３８阻害剤を含まない」とは、ｐ３８阻害剤を全く含まないか、または微量のｐ３８阻害剤しか含まない培地を指す。
【０２０６】
本発明の一部の実施形態によれば、微量のｐ３８阻害剤は、約０．０１μＭ未満のｐ３８阻害剤である、例えば、約０．００５μＭ未満、約０．００１μＭ未満、約０．０００９μＭ未満、約０．０００５μＭ未満、約０．０００１μＭ未満のｐ３８阻害剤である。
【０２０７】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、無血清である。
【０２０８】
本明細書で使用する語句「無血清」とは、ヒトまたは動物の血清を含まないことを指す。
【０２０９】
培養プロトコールにおける血清の機能は、培養細胞に、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するのと類似した環境（すなわち、細胞が由来する生物の中の環境、例えば、胚の胚盤胞）を提供することであることに留意されたい。しかしながら、動物由来（例えば、ウシ血清）またはヒト由来（ヒト血清）の血清の使用は、個体間の血清成分の顕著なばらつき、および（動物血清を使用した場合の）異種夾雑物の混入といったリスクによって制限される。
【０２１０】
本発明の一部の実施形態によれば、無血清培養培地は、血清またはその一部を含まない。
【０２１１】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の無血清培養培地は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清または動物血清から精製されるアルブミン）を含まない。
【０２１２】
特定の実施形態によれば、培養培地は、組換えヒトアルブミンなどの、組換えアルブミンを含む。
【０２１３】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、血清代替物を含む。
【０２１４】
本明細書で使用する語句「血清代替物」とは、多能性幹細胞に、その増殖および生存にとって必要な成分を提供することによって血清機能の代用となる、規定の製剤を指す。
【０２１５】
様々な血清代替物製剤が当業界で公知であり、商業的に入手可能である。
【０２１６】
例えば、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、カタログ番号１０８２８０２８）は、培養物中の未分化ＥＳ細胞を増殖させ、維持するために最適化された、規定の無血清製剤である。ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔの製剤は、動物由来であるＡｌｂｕｍａｘ（脂質に富むウシ血清アルブミン）を含むことに留意すべきである（Price, P.J. et alの国際公開第９８／３０６７９号）。しかしながら、Crook et al., 2007による刊行物（Crook JM., et al., 2007, Cell Stem Cell, 1: 490-494）は、ＦＤＡ認可済みの臨床等級の包皮線維芽細胞を使用して、ｃＧＭＰに従って製造されたＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、カタログ番号０４−００９５）中で作製した６種の臨床等級のｈＥＳＣ系を記載している。
【０２１７】
別の商業的に入手可能な血清代替物は、ビタミンＡを含まないＢ２７補給物質であり、これは米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製、カタログ番号１２５８７−０１０から入手可能である。Ｂ２７補給物質は、ｄ−ビオチン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の脂肪酸不含画分Ｖ、カタラーゼ、Ｌ−カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣｌ、Ｄ−ガラクトース（無水物）、グルタチオン（還元型）、組換えヒトインスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン−２−ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ−３／アルブミン複合体、ＤＬアルファ−トコフェロールおよびＤＬアルファトコフェロールアセテートを含む無血清製剤である。しかしながら、Ｂ２７補給物質の使用は、動物由来のアルブミンを含むため、制限される。
【０２１８】
本発明の一部の実施形態によれば、血清代替物は、動物夾雑物を含まない（完全に含まない）。そのような夾雑物は、ヒト細胞、細胞成分または動物の無細胞成分（例えば、体液）に感染し得る病原体である。
【０２１９】
動物夾雑物を含まない血清代替物を使用してヒト細胞を培養する場合、血清代替物は「ゼノフリー」と呼ばれることに留意すべきである。
【０２２０】
用語「ゼノ」は、ギリシャ語「Ｘｅｎｏｓ」、すなわち、他者、に基づく接頭辞である。本明細書で使用する語句「ゼノフリー」とは、異種（すなわち、同種ではなく、外来の種）に由来するいかなる成分／夾雑物も含まないことを指す。
【０２２１】
例えば、ヒト細胞と共に使用するためのゼノフリー血清代替物（すなわち、動物夾雑物を含まない血清代替物）は、インスリン、トランスフェリンおよびセレンの組合せを含んでもよい。上記の代わりに、または上記に加えて、ゼノフリー血清代替物は、ヒト由来または組換えによって生産されたアルブミン、トランスフェリンおよびインスリンを含んでもよい。
【０２２２】
商業的に入手可能なゼノフリー血清代替物組成物の非限定的な例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＩＴＳ（インスリン、トランスフェリンおよびセレン）プレミックス（ＩＴＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５１５００−０５６）、ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリンおよびヒト組換えインスリンを含み、増殖因子、ステロイドホルモン、糖質コルチコイド、細胞接着因子、検出可能量のＩｇおよびマイトジェンを含有しない血清代替物３（ＳＲ３、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ２６４０）、ヒト由来またはヒト組換えタンパク質のみを含有するＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ  ＸｅｎｏＦｒｅｅ［カタログ番号Ａ１０９９２−０１、Ａ１０９９２−０２、部品番号１２６１８−０１２または１２６１８−０１３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＩＢＣＯ社製］が挙げられる。
【０２２３】
本発明の一部の実施形態によれば、ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）またはＳＲ３（Ｓｉｇｍａ社製）ゼノフリー血清代替物製剤は、１×の作用濃度を達成するために１対１００の比率で希釈する。
【０２２４】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中の血清代替物［例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ  ＸｅｎｏＦｒｅｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］の濃度は、約１％［体積／体積（ｖ／ｖ）］〜約５０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）〜約４０％（ｖ／ｖ）、例えば、約５％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）〜約３０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）〜約２５％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１５％（ｖ／ｖ）、例えば、約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約３０％（ｖ／ｖ）の範囲内である。
【０２２５】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、脂質混合物をさらに含む。
【０２２６】
本明細書で使用する語句「脂質混合物」とは、多能性幹細胞を培養するために必要とされる規定の（例えば、化学的に規定された）脂質組成物を指す。脂質混合物は、通常、血清または血清代替物を含まない培養培地に添加されるため、通常は血清または血清代替物の処方に加えられる脂質の代用となることに留意されたい。
【０２２７】
本発明の一部の実施形態の培養培地中で使用することができる、商業的に入手可能な脂質混合物の非限定的な例としては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（カタログ番号１１９０５−０３１）が挙げられる。
【０２２８】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中の脂質混合物の濃度は、約０．５％［体積／体積（ｖ／ｖ）］〜約３％ｖ／ｖ、例えば、約０．５％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、例えば、約０．５％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、例えば、約１％ｖ／ｖである。
【０２２９】
限定培養培地を使用して多能性幹細胞を多能性状態に維持するための培養プロトコールは、培地への塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の添加を必要とすることが当業界では周知である。
【０２３０】
本明細書で使用する用語「塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）」とは、ヘパリンに結合し、広範にわたるマイトジェン活性および血管形成活性を有する、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのポリペプチドを指す。ｂＦＧＦ遺伝子のｍＲＮＡは、複数のポリアデニル化部位を有し、非ＡＵＧ（ＣＵＧ）開始コドンとＡＵＧ開始コドンとから択一的に翻訳され、個別の特性を有する５つの異なるアイソフォームをもたらす。ＣＵＧにより開始されるアイソフォームは、核に局在化し、内分泌効果を担うが、ＡＵＧにより開始される形態の大部分が細胞質性であり、このＦＧＦの傍分泌および自己分泌効果を担う。
【０２３１】
通常、これらの培養プロトコールは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９９７（配列番号２８）で提供されるｂＦＧＦポリペプチドを使用する。当該ｂＦＧＦポリペプチドは、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社（例えば、カタログ番号２３３−ＦＢ）、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社などの様々な製造業者から入手することができる。
【０２３２】
公知の培養プロトコールとは際だって対照的に、また、以下の実施例の項で示すように、本発明者らは、培養培地へのｂＦＧＦの添加の必要なしに、多能性幹細胞を多能性状態に維持するための培養条件を初めて見出した。これらの培養培地としては、例えば、以下が挙げられる。Ｗｎｔ３Ａ培地、Ｗｎｔ３Ａ−ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地、Ｗｎｔ３Ａ−ＬＩＦ培地、限定Ｗｎｔ３Ａ培地、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定Ｗｎｔ３Ａ培地、ＬＩＦを含む限定Ｗｎｔ３Ａ培地、ＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地、ＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地およびＬＩＦ、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地、ＰＭＳＦを含む上記培地のいずれか、ＣＨＩＲ９９０２１培地、ＬＩＦを含むＣＨＩＲ９９０２１培地、ＰＭＳＦ培地（単独）、ＰＭＳＦおよびＬＩＦ培地、ＰＭＳＦおよびＷｎｔ３Ａ培地、ＰＭＳＦおよびＣＨＩＲ９９０２１培地、ＰＭＳＦ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＬＩＦ培地、限定ＰＭＳＦ培地、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定ＰＭＳＦ培地、ＬＩＦを含む限定ＰＭＳＦ、ＳＲ３  ＰＭＳＦ培地、ＳＲ３  ＰＭＳＦ  ＬＩＦ培地、ＳＲ３  ＰＭＳＦ  ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ培地、ＴＬＣＫ培地、ＬＩＦを含むＴＬＣＫ培地、ＣＨＩＲ９９０２１を含むＴＬＣＫ培地、ＣＨＩＲ９９０２１およびＬＩＦを含むＴＬＣＫ培地、限定ＴＬＣＫ培地、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定ＴＬＣＫ培地、ＬＩＦを含む限定ＴＬＣＫ培地、ＳＲ３  ＴＬＣＫ培地、ＬＩＦを含むＳＲ３  ＴＬＣＫ培地、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  ＴＬＣＫ培地、ＴＬＣＫおよびＷｎｔ３Ａ培地、ＴＬＣＫおよびＣＨＩＲ９９０２１培地、ＣＨＩＲ９９０２１およびＬＩＦ培地を含むＴＬＣＫ培地（培地組成は以下の実施例の項に記載する）。ｂＦＧＦは、合成または組換えｂＦＧＦなどの、動物夾雑物を含まない、純粋な形態で使用されるタンパク質性薬剤であるため、培養培地へのｂＦＧＦの添加を必要としない培養培地の発見は、大量培養可能な未分化多能性幹細胞の作製に係わる費用を有意に低下させるため、多能性幹細胞の分野を発展させるであろう。
【０２３３】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、１ｎｇ／ｍｌを超える塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まず、例えば、０．９ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．８ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．７ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．６ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．５ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．４ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．３ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．２ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦ、例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦを含む。
【０２３４】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない。
【０２３５】
本明細書で使用する語句「多能性幹細胞」とは、３種の胚性生殖層（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）の全ての細胞に分化することができる細胞を指す。語句「多能性幹細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）と読むことができる。
【０２３６】
本明細書で使用する語句「胚性幹細胞」とは、懐胎後に形成される胚性組織から得られる埋込み前の細胞（例えば、胚盤胞）（すなわち、埋込み前の胚盤胞）から得られる細胞、埋込み後／原腸形成前の段階の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号を参照）、および／または懐胎中の任意の時点、好ましくは懐胎１０週目よりも前に、胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を指す。
【０２３７】
本発明の一部の実施形態によれば、本発明の多能性幹細胞は、例えば、ヒトまたは霊長類（例えば、サル）を起源とする、胚性幹細胞である。
【０２３８】
本発明の胚性幹細胞は、周知の細胞培養法を使用して得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏでの埋込み前の胚、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精させた（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単一細胞ヒト胚を、胚盤胞段階まで増殖させることができる。ヒトＥＳ細胞の単離のために、胚盤胞から透明帯を取り出し、内部細胞塊（ＩＣＭ）を免疫手術によって単離し、栄養外胚葉細胞を溶解し、穏やかなピペッティングによりインタクトなＩＣＭから取り除く。次いで、ＩＣＭを、その増殖を可能にする適切な培地を含有する組織培養フラスコに播種する。９〜１５日後、ＩＣＭ由来増殖物を、機械的解離または酵素的分解によって塊に解離した後、細胞を新鮮な組織培養培地上に再播種する。未分化形態を示すコロニーをマイクロピペットにより個別に選択し、塊に機械的に解離し、再播種する。次いで、得られるＥＳ細胞を、４〜７日毎に常習的に分割する。ヒトＥＳ細胞を調製する方法に関するさらなる詳細については、Thomson et al., ［米国特許第５，８４３，７８０号明細書、Science 282: 1145, 1998、Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995］、Bongso et al., ［Hum Reprod 4: 706, 1989］、およびGardner et al., ［Fertil. Steril. 69: 84, 1998］を参照されたい。
【０２３９】
本発明のこの態様においては、商業的に入手可能な幹細胞を使用することもできることを理解されたい。ヒトＥＳ細胞を、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリ（www.escr.nih.gov）から購入することができる。商業的に入手可能な胚性幹細胞株の非限定的な例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ０４およびＴＥ０６である。
【０２４０】
拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、受精から少なくとも９日後の原腸形成前の段階の胚盤胞から得ることができる。胚盤胞を培養する前に、［例えば、タイロード酸性溶液（米国、ミズーリー州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で］透明帯を消化し、内部細胞塊を露出させる。次いで、胚盤胞を、標準的な胚性幹細胞培養法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで、受精から９日以上１４日以下の期間にわたり（すなわち、原腸形成事象の前）に全胚として培養する。
【０２４１】
ＥＳ細胞を調製するための別の方法は、Chung et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113-117, 7 February 2008に記載されている。この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精プロセス中に胚から単一細胞を除去することを含む。胚は、このプロセスでは破壊されない。
【０２４２】
胚性生殖（ＥＧ）細胞を、当業者には公知の実験技術を使用して、（ヒト胎児の場合は）懐胎から約８〜１１週の胎児から得た始原生殖細胞から調製する。生殖隆起を解離し、小塊に切断し、その後、機械的解離によって細胞に分解する。次いで、ＥＧ細胞を、適切な培地を含む組織培養フラスコ中で増殖させる。培地を毎日交換しながら、ＥＧ細胞と一致する細胞形態が観察されるまで、典型的には、７〜３０日または１〜４回の継代にわたり、細胞を培養する。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Shamblott et al.,［Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726, 1998］および米国特許第６，０９０，６２２号明細書を参照されたい。
【０２４３】
本明細書で使用する語句「誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞」（または胚様幹細胞）とは、体細胞（例えば、成熟体細胞）の脱分化によって得られる、増殖性かつ多能性の幹細胞を指す。
【０２４４】
本発明の一部の実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣに類似した増殖能を特徴とし、したがって、ほぼ無限の時間にわたって、培養下で維持および増殖させることができる。
【０２４５】
胚性幹細胞の特徴を獲得するように再プログラミングする遺伝子操作によって、ｉＰＳ細胞に多能性を付与することができる。Yamanaka S, Cell Stem Cell. 2007, 1(1):39-49、Aoi T, et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science. 2008 Feb 14.（電子版は出版に先行）、IH Park, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008;451:141-146、K Takahashi, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861-872（それぞれ、その全体が参照により完全に組み込まれる）の記載と実質的に同様の方法で、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞などの体細胞に対して、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４およびｃ−Ｍｙｃの発現を誘導することにより、本発明のｉＰＳ細胞を作製することができる。上記の代わりに、または上記に加えて、Yu Junying et al. (Science 318:1917-1920, 2007)、およびNakagawa et al, 2008 (Nat Biotechnol.  26(1):101-106)の記載と実質的に同様の方法で、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の発現を誘導することにより、体細胞から本発明のｉＰＳ細胞を作製することもできる。体細胞の遺伝子操作（再プログラミング）は、プラスミドもしくはウイルスベクターの使用、またはゲノムへの組込みを含まない誘導［Yu J, et al., Science.  2009, 324: 797-801］などの、任意の公知の方法を使用して実施することができることに留意されたい。卵母細胞への核移植、胚性幹細胞との融合、またはレシピエント細胞が有糸分裂中に停止する場合は、受精卵への核移植により、他の胚様幹細胞を作製することができる。国際公開第０３／０４６１４１号Ａ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．５  Ｊｕｎｅ  ２００３）は、単為生殖ならびに体細胞核移植による活性化ヒト胚の作製を教示する。
【０２４６】
本発明のｉＰＳ細胞は、脱分化の誘導によって得ることができ、脱分化は胚性線維芽細胞［Takahashi and Yamanaka, 2006 Cell. 2006, 126(4):663-676、Meissner et al, 2007 Nat Biotechnol. 2007, 25(10):1177-1181］、ｈＥＳＣから形成された線維芽細胞［Park et al, 2008 Nature. 2008, 451(7175):141-146］、胎児線維芽細胞［Yu et al, 2007 Science. 2009, 324(5928):797-801、Park et al, 2008 (supra)］、包皮線維芽細胞［Yu et al, 2007 (supra)、Park et al, 2008 (supra)］、成人真皮および皮膚組織［Hanna et al, 2007 Science. 2007, 318(5858):1920-1923、Lowry et al, 2008 Proc Natl Acad Sci USA, 105(8):2883-2888］、ｂリンパ球［Hanna et al 2007 (supra)］ならびに成人肝臓および胃細胞［Aoi et al, 2008 Science. 2008 Aug 1;321(5889):699-702］に対して誘導することができる。
【０２４７】
ｉＰＳ細胞株はまた、ＷｉＣｅｌｌバンクなどの細胞バンクからも入手可能である。商業的に入手可能なｉＰＳ細胞株の非限定的な例としては、ｉＰＳ包皮クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号ｉＰＳ（包皮）−１−ＤＬ−１］、ｉＰＳＩＭＲ９０クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１−ＤＬ−１］、およびｉＰＳＩＭＲ９０クローン４［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４−ＤＬ−１］が挙げられる。
【０２４８】
本明細書で使用する語句「懸濁培養」とは、多能性幹細胞が面に接着するのではなく、培地中に懸濁される培養を指す。
【０２４９】
したがって、本発明の培養物は「基質接着がなく」、多能性幹細胞は、細胞外マトリックスの成分、ガラス微小担体またはビーズなどの外部基質への接着なしに増殖することができる。
【０２５０】
ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を培養する一部のプロトコールは、半透過性ヒドロゲル膜の内部への細胞のマイクロカプセル化を含み、当該マイクロカプセルは、栄養素、気体、および代謝産物と、カプセルを取り囲むバルク培地との交換を可能にするものであることに留意されたい（詳細については、例えば、Beardsley et al.の米国特許出願第２００９００２９４６２号明細書を参照されたい）。
【０２５１】
本発明の一部の実施形態によれば、懸濁培養を行う多能性幹細胞は、カプセル化された細胞ではない。
【０２５２】
好ましくは、容易に大量培養可能であり、細胞に基づく療法と製薬産業における使用（例えば、薬物スクリーニング、薬物標的の同定および細胞に基づく化合物送達）との両方にとって好適である、厳密に限定された、ゼノフリーのＰＳＣ培養物を得るために、本発明の一部の実施形態の培養培地は、厳密に限定され（すなわち、既知の不変的な成分を含み）、且つゼノフリーな（すなわち、異種夾雑物を含まない）ものであるべきである。
【０２５３】
本発明の一部の実施形態によれば、懸濁液中で多能性幹細胞を培養するための培養培地および／または条件は、タンパク質担体を含まない。
【０２５４】
本発明の一部の実施形態によれば、懸濁培養は、基質接着を含まず、タンパク質担体も含まない。
【０２５５】
本明細書で使用する語句「タンパク質担体」とは、培養物中の細胞へのタンパク質または栄養素（例えば、亜鉛などのミネラル）の移動に対して作用するタンパク質を指す。そのようなタンパク質担体は、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）、Ａｌｂｕｍａｘ（脂質富化アルブミン）またはプラスマネート（ヒト血漿単離タンパク質）である。これらの担体は、ヒトまたは動物由来であるため、ヒトｉＰＳ細胞培養物のｈＥＳＣにおけるその使用は、バッチ特異的なばらつきおよび／または病原体への曝露故に制限される。他方、実質的に純粋であり、動物夾雑物を含まない組換えヒトアルブミンは、非常に高価であるため、ｈＥＳＣの培養においては一般的に使用されない。したがって、タンパク質担体（例えば、アルブミン）を含まない培養培地は、組換え材料または合成材料から製造することができる真に限定された培地を可能とするため、非常に有利である。
【０２５６】
好ましくは、本発明のこの態様の方法において使用される培養培地は、無血清、ゼノフリー、フィーダー不含（すなわち、フィーダー細胞を含まず）、且つタンパク質担体不含である。
【０２５７】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、多能性幹細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞）を基質への接着を含まない懸濁培養で培養した場合に、多能性状態を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回の継代、もしくはさらに多くの継代にわたって、例えば、少なくとも約３５回の継代にわたって、例えば、少なくとも約４０回の継代にわたって、例えば、少なくとも約４５回の継代にわたって、例えば、少なくとも約５０回の継代にわたって、維持することができる。
【０２５８】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、多能性幹細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞）を基質接着がなく、タンパク質担体も含まない懸濁培養で培養した場合に、多能性状態を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回の継代、もしくはさらに多くの継代数にわたって、例えば、少なくとも約３５回の継代にわたって、例えば、少なくとも約４０回の継代にわたって、例えば、少なくとも約４５回の継代にわたって、例えば、少なくとも約５０回の継代にわたって、維持することができる。
【０２５９】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、多能性幹細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞）を基質への接着を含まない懸濁培養で培養した場合に、多能性状態を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間にわたって維持することができる。例えば、多能性幹細胞を基質への接着を含まない懸濁培養で培養した場合に、多能性状態を、少なくとも約２、約３、約４、約５、約６、または約７ヶ月間にわたって、維持することができる。
【０２６０】
本発明の一部の実施形態によれば、限定培養培地は、多能性幹細胞を、増殖性、多能性且つ未分化の状態に維持しながら、多能性幹細胞を増殖させるのに好適である。
【０２６１】
本明細書で使用する用語「増殖させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」とは、培養期間にわたって多能性幹細胞の数を（少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％、およびそれより多くに）増加させることを指す。単一の多能性幹細胞から入手することができる多能性幹細胞の数は、多能性幹細胞の増殖能に依存することを理解されたい。多能性幹細胞の増殖能を、細胞の倍加時間（すなわち、細胞培養物中で有糸分裂を行うのに必要とされる時間）および多能性幹細胞培養物を未分化の状態に維持することができる期間（これは、継代回数に各継代間の日数を掛けたものに等しい）によって算出することができる。
【０２６２】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、細胞と、本発明の一部の実施形態の限定培養培地とを含む、細胞培養物を提供する。
【０２６３】
細胞は、任意の型および由来のものでよい。例えば、細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞でよい。
【０２６４】
細胞は、体細胞でも、幹細胞でもよい。幹細胞の例としては、成体幹細胞、造血幹細胞、「若年幹細胞」（例えば、胎盤および臍帯血幹細胞）、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、間葉系幹細胞、間葉様幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２６５】
未分化幹細胞は、特有の形態を有し、当業者であれば、胚または成体由来の分化した細胞と明確に識別可能であることを理解されたい。典型的には、未分化幹細胞は、核／細胞質比が高く、顕著な核小体を有し、識別しづらい細胞接合部を有するコンパクトなコロニーを形成する。未分化幹細胞のさらなる特徴は、本明細書において後述する。
【０２６６】
本発明の一部の実施形態によれば、細胞は、多能性幹細胞を含み、培養培地は、基質接着のない、懸濁培養で培養した場合に、多能性幹細胞を多能性状態に維持することができるものである。
【０２６７】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。
【０２６８】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。
【０２６９】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。
【０２７０】
本発明の一部の実施形態の態様によれば、基質接着のない懸濁培養法によって多能性幹細胞を培養する方法であって、本発明の一部の実施形態の培養培地中で多能性幹細胞を培養し、それによって、多能性幹細胞の懸濁培養を実施することを含む、方法が提供される。
【０２７１】
本発明のこの態様における培養は、細胞の生存および増殖を促進するが、分化を制限する細胞密度で幹細胞を培養容器中に播種することによって行われる。典型的には、使用する播種密度を１ｍｌあたり約５×１０４〜２×１０５細胞とする。幹細胞の単一細胞懸濁液を通常播種するが、１０〜２００個の細胞などの小さなクラスターの使用も可能であることを理解されたい。
【０２７２】
懸濁培養中のＰＳＣに、栄養素および増殖因子の十分かつ一定の供給をもたらすために、培養培地を毎日、または２〜３日毎などの所定のスケジュールで交換することができる。培養培地の交換は、例えば、ＰＳＣ懸濁培養物を８０ｇで約３分間の遠心分離に供し、形成されたＰＳＣペレットを新鮮な培地中に再懸濁することによって実施することができる。上記の代わりに、または上記に加えて、培養培地を定期的な濾過または透析に供して、ＰＳＣへの栄養素または増殖因子の一定の供給をもたらす培養システムを用いることもできる。
【０２７３】
ＰＳＣの大きなクラスターは細胞分化を引き起こし得るため、大きなＰＳＣ凝集体を回避するための手段が執られる。好ましくは、形成されるＥＳＣ塊を５〜７日毎に解離し、単一細胞または細胞小塊を、さらなる培養容器に分割する（すなわち、継代する）か、または元の培養容器中に残すが、追加の培養培地を加える。大きいＰＳＣ塊の解離のためには、（上記の遠心分離によって得ることができる）ＰＳＣのペレットまたは単離されたＰＳＣ塊を酵素的消化および／または機械的解離に供することができる。
【０２７４】
ＰＳＣ塊の酵素的消化は、塊を、ＩＶ型コラゲナーゼ（米国、ニュージャージ州、レイクウッド、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）および／またはジスパーゼ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）および／またはトリプシン、および／またはｔｙｒｐｌＥ、および／またはアキュターゼなどの酵素に供すること（それぞれ、５〜１５分間のインキュベーションを要する）によって実施することができる。酵素とのインキュベーションの時間は、懸濁培養液中に存在する細胞塊のサイズに依存する。典型的には、懸濁培養中のｈＰＳＣ細胞塊を５〜７日毎に解離する場合、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼと２０〜６０分間インキュベートすることにより、未分化の状態でさらに培養することができる小さい細胞塊が得られる。上記の代わりに、後述する実施例の項の「一般的材料および実験方法」に記載した方法と実質的に同様に、ＰＳＣ塊を１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼと共に約２５分間インキュベートした後、１ｍｇ／ｍｌのジスパーゼと５分間インキュベートすることができる。トリプシンを用いるヒトＥＳＣの継代は、染色体の不安定化および異常をもたらし得ることに留意すべきであり（例えば、Mitalipova MM., et al., Nature Biotechnology, 23: 19-20, 2005およびCowan CA et al., N. Engl. J. of Med. 350: 1353-1356, 2004を参照）、よって、避けるべきである。
【０２７５】
好ましくは、大きい細胞塊の酵素的または機械的解離の後、解離したＥＳＣ塊を、２００μｌのＧｉｌｓｏｎ社製ピペットチップを使用して、（例えば、細胞を上下にピペッティングすることにより）小さい塊にさらに分ける。
【０２７６】
本発明の一部の実施形態によれば、全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる国際公開第２０１２／０３２５２１号の記載と実質的に同様に、ＰＳＣを単一細胞として懸濁培養法で培養する。簡単に述べると、細胞塊を機械的解離のみを使用して（酵素的解離を用いずに）単一細胞または小さいクラスター（最大２００個の細胞）に解離し、２回以上１０回以下の継代を行い、その後、細胞塊のさらに解離を必要とすることなく、単一細胞として細胞を継代する。
【０２７７】
本明細書で使用する語句「機械的解離」とは、酵素活性ではなく、物理的な力を用いることにより、多能性幹細胞塊を単一細胞に分離することを指す。
【０２７８】
本明細書で使用する語句「単一細胞」とは、多能性幹細胞が、懸濁培養中に細胞クラスターを形成しない状態を指し、当該クラスターは、約２００個を超える多能性幹細胞を含むものである。
【０２７９】
本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、懸濁培養中に細胞クラスターを形成しないものであり、当該クラスターは、約１５０個、約１００個、約９０個、約８０個、約７０個、約６０個、約５０個、約４０個、約３０個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個、約１４個、約１３個、約１２個、約１１個、約１０個、約９個、約８個、約７個、約６個、約５個、約３個、約２個、または約１個を超える数の多能性幹細胞を含むものである。
【０２８０】
本発明の一部の実施形態によれば、懸濁培養中の複数の多能性幹細胞は、それぞれが別の多能性幹細胞に接着しない。
【０２８１】
機械的解離のために、（細胞の遠心分離によって得られる）多能性幹細胞のペレットまたは単離された多能性幹細胞塊を、少量（例えば、０．２〜１ｍｌ）の培地中で細胞を上下にピペッティングすることによって、解離することができる。例えば、ピペッティングは、２００μｌまたは１０００μｌのピペットチップを使用して、数回（例えば、３〜２０回）実施することができる。
【０２８２】
上記の代わりに、または上記に加えて、大きい多能性幹細胞塊の機械的解離は、塊を所定のサイズに破壊するように設計されたデバイスを使用して実施することができる。そのようなデバイスは、スウェーデン国、ゲーテボルグ、ＣｅｌｌＡｒｔｉｓ社から入手することができる。上記の代わりに、または上記に加えて、機械的解離は、倒立顕微鏡下で塊を見ながら、針、例えば２７ｇの針（アイルランド国、ドロヘダ、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ社製）、を使用して、手動で実施することができる。
【０２８３】
本発明のこの態様の方法に従ったＰＳＣの懸濁培養に使用する培養容器は、任意の組織培養容器（例えば、ＰＳＣの培養に好適な純度等級を有するもの）であり、その中で培養するＰＳＣが接着または結合することができないように設計された表面を内部表面として有するものであってもよい（例えば、表面への結合または接着を防止するために、非組織培養処理されたセル）。大量培養可能な培養物を得るために、本発明のこの態様による培養は、好適なデバイスを使用して、温度、撹拌、ｐＨ、およびｐＯ２などの培養パラメータを自動的に実行する制御された培養システム（好ましくは、コンピュータ制御された培養システム）を使用して実施することが好ましい。一度培養パラメータが記録されると、システムは、ＰＳＣの増殖にとって必要とされる培養パラメータを自動的に調整するように設定される。
【０２８４】
本発明のこの態様の方法による培養は、動的条件下（すなわち、懸濁培養中のＰＳＣに一定の動きを加える条件下）または非動的条件下（すなわち、静的培養）で実施可能であることを理解されたい。ＰＳＣの非動的培養のためには、ＰＳＣを、コーティングされていない５８ｍｍのペトリ皿（ドイツ国、フリッケンハウゼン、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）内で培養することができる。ＰＳＣの動的培養のためには、制御ユニットに接続されて、制御された培養システムを提供する、スピナーフラスコ［例えば２００ｍｌ〜１０００ｍｌのもの、例えば、２５０ｍｌのものはドイツ国、フェルンワルド、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＣｅｌｌＳｐｉｎとして入手可、１００ｍｌのものはニュージャージー州、ヴァインランド、Ｂｅｌｌｃｏ社から入手可、１２５ｍｌの三角フラスコ（米国、ニューヨーク州、コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社製）］、または３０ｍｌの振とうフラスコ（米国、ニューヨーク州、コーニングのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ社製）］中で、ＰＳＣを培養することができる。
【０２８５】
本発明の一部の実施形態によれば、基質接着のない懸濁培養によって、ＰＳＣの培養地中での培養を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０回の継代、またはそれ以上の回数、例えば、少なくとも約３５回の継代、例えば、少なくとも約４０回の継代、例えば、少なくとも約４５回の継代、例えば、少なくとも約５０回の継代にわたって実施する。
【０２８６】
本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、全培養期間にわたり、多能性幹細胞を多能性の状態に維持することができる。
【０２８７】
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、誘導多能性幹細胞を培養するためのものである。
【０２８８】
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、胚性幹細胞を培養するためのものである。
【０２８９】
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、ヒト多能性幹細胞を培養するためのものである。
【０２９０】
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、ヒト誘導多能性幹細胞を培養するためのものである。
【０２９１】
本発明の一部の実施形態によれば、方法は、ヒト胚性幹細胞を培養するためのものである。
【０２９２】
上述したように、本発明の一部の実施形態の培養培地中で使用する任意のタンパク質性因子（例えば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ、インスリン、トランスフェリン）は、組換え発現したもの、または生化学的に合成したものでもよい。動物由来の夾雑物を含まない培養培地の調製のためには、タンパク質性因子は、ヒト供給源から精製されたものであるか、または組換え発現されたものが好ましいことに留意されたい。
【０２９３】
本発明のタンパク質性因子（例えば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）の生化学合成は、標準的な固相技術を使用して実施することができる。これらの方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合および古典的溶液合成が挙げられる。
【０２９４】
本発明のタンパク質性因子の組換え発現は、Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544、Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89、Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514、Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311、Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680、Brogli et al., (1984) Science 224:838-843、Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565およびWeissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463に記載の組換え技術を使用して作製することができる。具体的には、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを、参照により本明細書に完全に組み込まれる、Revel M., et al.およびChebath J, et al., 1997の国際公開第９９／０２５５２号に記載されたように作製することができる。
【０２９５】
本明細書で使用する用語「約」とは、±１０％を指す。
【０２９６】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０２９７】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。
【０２９８】
用語「実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、組成物、方法または構造が、追加の成分、ステップ、および／または部分を含んでいてもよいが、当該追加の成分、ステップ、および／または部分が、特許請求の範囲に記載された組成物、方法、または構造の基本的および新規な特徴を物質的に変化させない場合に限られることを意味する。
【０２９９】
本明細書で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に記述しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１種の化合物（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」には、複数の化合物（それらの混合物も）を含んでもよい。
【０３００】
本出願の全体を通して、本発明の様々な実施形態を範囲の形で提示することができる。範囲の形の記載は、単なる便宜上および簡潔さのためであり、本発明の範囲の変更不可能な限定と解釈すべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲の記述は、その範囲に含まれうる全ての部分範囲のみならず、範囲内の個々の数値をも具体的に開示するものと見なすべきである。例えば、１から６などの範囲の記述は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５、および６を具体的に開示するものと見なすべきである。これは、範囲の幅とは無関係に適用される。
【０３０１】
数値範囲が本明細書で示される場合は、示される範囲内の任意の引用された数値（分数または整数）が常に含まれるものとする。第１指示数と第２指示数との「間の範囲」、さらには、第１指示数「から」第２指示数「の範囲」という文言は、本明細書では同義に使用され、第１および第２の指示数と、それらの間の全ての分数および整数を含むものとする。
【０３０２】
本明細書で使用される「方法」という用語は、所与の仕事を実現するための手法、手段、技法、および手順を意味し、化学、薬学、生物学、生化学、および医学の分野の当業者に公知の手法、手段、技法、および手順、または当該当業者が公知の手法、手段、技法、および手順から容易に開発可能な手法、手段、技法、および手順を含むが、これらに限定されるものではない。
【０３０３】
本明細書で用いられる用語「治療する」は、病態の進行を無効化する、実質的に阻害する、減速させる、または逆転させることであって、病態に伴う臨床症状または審美的症状の実質的な改善、または病態に伴う臨床症状または審美的症状の出現の実質的な防止を含む。
【０３０４】
特定の配列表に言及する場合、このような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の変更に起因するわずかな配列の変化を有するものをも含むものであるが、但し、当該変更の頻度は、５０ヌクレオチド中１未満、あるいは、１００ヌクレオチド中１未満、あるいは、２００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、５，０００ヌクレオチド中１未満、あるいは、１０，０００ヌクレオチド中１未満であることを理解されたい。
【０３０５】
本出願に開示する配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）は、例えその配列番号の配列がＤＮＡ配列の形式のみまたはＲＮＡ配列の形式のみで表されている場合でも、その配列番号が記載される文脈に応じて、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列のいずれを示してもよいことを理解されたい。例えば、配列番号３はＤＮＡ配列の形式で表されている（例えば、チミンを表すＴを記述している）が、それはＷＮＴ３Ａ核酸配列に対応するＤＮＡ配列、またはＲＮＡ分子の核酸配列であるＲＮＡ配列を示してもよい。同様に、一部の配列は、ＲＮＡ配列の形式で（例えば、ウラシルを表すＵを記述している）が、記載される分子の実際の型に応じて、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列でも、そこに示したＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列を示してもよい。いずれにしても、任意の置換を含む配列を有するＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方が想定される。
【０３０６】
本発明の特徴であって、明確にするために個別の実施形態のとして記載したものは、組み合わせて１つの実施形態としても提供可能であることを理解されたい。逆に、簡潔にするために１つの実施形態として記載した本発明の様々な特徴を、個別に、または任意の適切な部分組合せで、または本発明で記載した他の実施形態との適切な組み合わせとして提供することもできる。様々な実施形態に関連して記載された特徴は、その特徴なしでは実施形態が動作不能でない限り、それらの実施形態の必須要件とは見なさない。
【０３０７】
上記で詳細に説明し、下記の請求の範囲内で請求する発明の様々な実施形態および態様について、以下の実施例で実験的裏付けを示す。
【実施例】
【０３０８】
本明細書において使用される命名法および本発明に使用する実験手順としては、通常、分子的技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術が挙げられる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、第４，６８３，２０２号明細書、第４，８０１，５３１号明細書、第５，１９２，６５９号明細書、および第５，２７２，０５７号明細書に記載された方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照されたい。利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広く記載されており、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、第３，８３９，１５３号明細書、第３，８５０，７５２号明細書、第３，８５０，５７８号明細書、第３，８５３，９８７号明細書、第３，８６７，５１７号明細書、第３，８７９，２６２号明細書、第３，９０１，６５４号明細書、第３，９３５，０７４号明細書、第３，９８４，５３３号明細書、第３，９９６，３４５号明細書、第４，０３４，０７４号明細書、第４，０９８，８７６号明細書、第４，８７９，２１９号明細書、第５，０１１，７７１号明細書、および第５，２８１，５２１号明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、“Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds.  (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)および"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)を参照されたい。上記文献の全てが、本参照により本明細書に完全に組み込まれるものとする。その他の一般的な参考文献は、本明細書を通じて提供される。それらに記載の手順は、当技術分野で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。それらに含まれるすべての情報が、本参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０９】
一般的材料および実験方法
多能性幹細胞（ＰＳＣ）の接着（２次元、２Ｄ）培養：  本発明者らによって開発された新規培養培地上での培養の前に、ＨＥＳＣ系Ｉ−６細胞およびＩ−３細胞［Amit and Itskovitz-Eldor, 2002］を、（ｉ）不活化ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）との培養、（ｉｉ）公知の方法（Amit et al, 2000、Amit et al 2003）によるマウス胚性幹細胞（ＭＥＦ）との培養、または（ｉｉｉ）公知の方法（Amit et al, 2001、Amit et al 2003）によるマトリゲル（商標）マトリックスとの培養を実施した。
【０３１０】
ＨＦＦ（フィーダー細胞）を共培養物として使用した場合、培養培地は、１５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（全て米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を添加した８５％ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含んでいた。
【０３１１】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養するためにマトリゲル（商標）マトリックスを使用した場合、ｍＴｅＳＲ１またはＴｅＳＲ−Ｅ８（カナダ国、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）培養培地を使用した。
【０３１２】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）の懸濁（３次元、３Ｄ）培養：  懸濁培養に移した場合、以下の培養培地の組合せを使用した。
【０３１３】
ＷＮＴ３ａに基づく培養培地：
（１）Ｗｎｔ３Ａ培地（１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ）：  １５％のノックアウト−ＳＲ（血清代替物、Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０８２８−０２８）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号５０３６−ＷＮ）を添加した８５％ＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３１４】
（２）Ｗｎ３Ａ−キメラ（ＷＮＴ３ＡおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラ）培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）および１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３１５】
（３）Ｗｎｔ３Ａ−ＬＩＦ（ＷＮＴ３ＡおよびＬＩＦ）培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａおよび３０００ｕ／ｍｌ（単位／ミリリットル）のヒト組換えＬＩＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製、カタログ番号３００−０５）を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３１６】
（４）限定Ｗｎｔ（ＷＮＴ３Ａ）培地は、以下の試薬の組合せを含有した。
【０３１７】
【表１】
2019520848.tif 000003
【０３１８】
（５）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定Ｗｎｔ３Ａ培地：  １００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定Ｗｎｔ３Ａ（表１）。
【０３１９】
（６）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定Ｗｎｔ３Ａ培地：  １００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定Ｗｎｔ３Ａ培地（表１）。
【０３２０】
（７）ＬＩＦを含む限定Ｗｎｔ３Ａ培地：  ３０００Ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦ（ヒト組換えＬＩＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した限定Ｗｎｔ３Ａ培地（表１）。
【０３２１】
（８）ＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地：  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（イスラエル国、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製や、イスラエル国、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（イスラエル国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製や、Ｓｉｇｍａ社製）、５００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（イスラエル国、Ｓｉｇｍａ社製）、１％のＳＲ３（Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、１％の限定脂質混合物（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｉｘｔｕｒｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製や、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）および１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
【０３２２】
（９）ＬＩＦを含むＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地：  ３０００Ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦ（ヒト組換えＬＩＦ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を添加したＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地。
【０３２３】
（１０）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地：  １００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加したＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地。
【０３２４】
（１１）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  Ｗｎｔ３Ａ培地：  １００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した。
【０３２５】
（１２）０．１ｍＭの最終濃度でＰＭＳＦ（ＧＯＬＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社製）を添加した全ての上記培地の処方。
【０３２６】
ＣＨＩＲ９９０２１に基づく培地
（１３）ＣＨＩＲ９９０２１培地のみ（ＬＩＦなし）：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３２７】
（１４）ＬＩＦを含むＣＨＩＲ９９０２１培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の必須アミノ酸ストック、３０００ｕ／ｍｌのＬＩＦ（ヒト組換えＬＩＦ）および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３２８】
ＰＭＳＦに基づく培養培地
（１５）ＰＭＳＦ培地（単独）：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、および０．１ｍＭのＰＭＳＦを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３２９】
（１６）ＰＭＳＦおよびＬＩＦ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび３０００ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３３０】
（１７）ＰＭＳＦおよびＷｎｔ３Ａ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３３１】
（１８）ＰＭＳＦおよびＣＨＩＲ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、０．１ｍＭのＰＭＳＦおよび３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３３２】
（１９）ＰＭＳＦ、ＣＨＩＲおよびＬＩＦ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１および３０００ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３３３】
（２０）限定ＰＭＳＦ培地：  以下の表２は、本発明の一部の実施形態における限定ＰＭＳＦ培地を示す。
【０３３４】
【表２】
2019520848.tif 000004
【０３３５】
（２１）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定ＰＭＳＦ培地：  １００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定ＰＭＳＦ培地（表２）。
【０３３６】
（２２）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定ＰＭＳＦ培地：  １００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定ＰＭＳＦ培地（表２）。
【０３３７】
（２３）ＬＩＦを添加した限定ＰＭＳＦ培地：  ３０００Ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した限定ＰＭＳＦ培地（表２）。
【０３３８】
（２４）ＳＲ３  ＰＭＳＦ培地：  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（イスラエル国、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製や、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製およびＳｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、５００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、１％のＳＲ３（Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、１％の限定脂質混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製や、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）および０．１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
【０３３９】
（２５）ＬＩＦを含むＳＲ３  ＰＭＳＦ培地：  ３０００Ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦ（ヒト組換えＬＩＦ）を添加したＳＲ３  ＰＭＳＦ培地。
【０３４０】
（２６）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  ＰＭＳＦ培地：  １００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加したＳＲ３  ＰＭＳＦ培地。
【０３４１】
（２７）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  ＰＭＳＦ培地：  １００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加したＳＲ３  ＰＭＳＦ培地。
【０３４２】
ＴＬＣＫに基づく培養培地
（２８）ＴＬＣＫ培地−１５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３４３】
（２９）ＴＬＣＫ−ＬＩＦ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫおよび３０００ｕ／ｍｌのヒト組換えＬＩＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３４４】
（３０）ＴＬＣＫ−Ｃｈｉｒ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫおよび３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３４５】
（３１）ＴＬＣＫ−Ｃｈｉｒ−ＬＩＦ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫ、３０００ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦおよび３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３４６】
（３２）限定ＴＬＣＫ培地：  表３は、本発明の一部の実施形態における限定ＴＬＣＫ培地を示す。
【０３４７】
【表３】
2019520848.tif 000005
【０３４８】
（３３）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定ＴＬＣＫ培地：  １００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定ＴＬＣＫ培地（表３）。
【０３４９】
（３４）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む限定ＴＬＣＫ培地：  １００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加した限定ＴＬＣＫ培地（表３）。
【０３５０】
（３５）ＬＩＦを含む限定ＴＬＣＫ培地：  ３０００Ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を添加した限定ＴＬＣＫ培地（表３）。
【０３５１】
（３６）ＳＲ３  ＴＬＣＫ培地：  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（９４％）（イスラエル国、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製や、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製や、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、５００μｇ／ｍｌのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、１％のＳＲ３（Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）、１％の限定脂質混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製や、Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ社製）および５０μＭのＴＬＣＫ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）。
【０３５２】
（３７）ＬＩＦを含むＳＲ３  ＴＬＣＫ培地：  ３０００Ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦを添加したＳＲ３  ＴＬＣＫ培地。
【０３５３】
（３８）ＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含むＳＲ３  ＴＬＣＫ培地：  １００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを添加したＳＲ３  ＴＬＣＫ培地。
【０３５４】
（３９）ＴＬＣＫおよびＷｎｔ３Ａ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫおよび１０ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３Ａを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３５５】
（４０）ＴＬＣＫおよびＣＨＩＲ９９０２１培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫおよび３ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３５６】
（４１）ＴＬＣＫ、ＣＨＩＲ９９０２１およびＬＩＦ培地：  １５％のノックアウト−ＳＲ、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、５０μＭのＴＬＣＫ、３ｍＭのＣＨＩＲ９９０２１および３０００ｕ／ｍｌのｈｒＬＩＦを添加した８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２。
【０３５７】
対照のために、以下の「ｙＦＬ３」培地を使用した：１５％のノックアウト血清代替物（ＳＲ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（明記したもの以外、全て、米国、ニューヨーク州、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）、および３０００ｕ／ｍｌのヒト組換え白血病阻止因子（ｈｒＬＩＦ）（米国、ミネソタ州、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有する８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（イスラエル国、ベイハイメック、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）。ｙＦＬ３培地では、ｉＰＳＣの培養をより良好に支援するために、ｂＦＧＦの濃度を１０ｎｇ／ｍｌに増加させたことに留意されたい。
【０３５８】
表４に、使用可能な販売元およびカタログ番号を列挙する。
【０３５９】
【表４】
2019520848.tif 000006
【０３６０】
懸濁培養を開始するために、以下の工程を実施した。
（１）ＰＳＣをフィーダー細胞上での培養から懸濁培養へと適応させるに際して、１回目の継代は、以下の酵素：ＴｒｙｐＬＥｘ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）、トリプシンＥＤＴＡ（ＢＩ）、アキュターゼ、Ｇｅｎｔｌｅ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ＳＣＴ）、Ｒｅｌｅａｓｅｒ（ＳＣＴ）またはＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）のいずれかを用いる酵素的分割を実施した。その後、細胞をペトリ皿に移した。
【０３６１】
細胞を（フィーダー細胞なし、且つ基質接着なしの）懸濁培養で培養した場合、継代は、（上述の）酵素的継代、または細胞クラスターを２００〜１０００μＬのＧｉｌｓｏｎチップを使用して上下にピペッティングすることによる機械的解離させる方法のいずれかによって実施した。
【０３６２】
ＰＳＣを２−Ｄ（２次元）フィーダー不含培養条件で培養した場合、上述の酵素的解離または上述の機械的解離を使用して、１回目の継代を実施した。
【０３６３】
いずれの場合も、１回目の継代の後、細胞を酵素的または機械的解離によって継代した。
【０３６４】
（２）細胞を３〜５回の継代にわたって培養し、４〜６日毎に分割した。培養は、２Ｄまたは３Ｄの培養システムで実施した。
【０３６５】
「１回目の継代」は、２−Ｄから、ペトリ皿、スピナーフラスコ、振とうフラスコまたはバイオリアクターにおける３−Ｄの懸濁培養への細胞の移動と考えられることに留意されたい。
【０３６６】
（３）懸濁培養においては、細胞をスピナーフラスコ（７５ｒｐｍ）または振とうフラスコに移した少なくとも最初の継代の後には、分割は必要ではなかった。
【０３６７】
（４）懸濁培養において、細胞をバイオリアクターに移した少なくとも最初の継代の後には、分割は必要ではなかった。
【０３６８】
懸濁培養は、本明細書に記載の限定培地を使用することを除いて、Amit et al, 2010および2011ならびに国際公開第２０１１／０５８５５８号および国際公開第２００８／０１５６８２号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる）に記載されたプロトコールに基づくものであった。
【０３６９】
免疫組織化学−懸濁培養または２Ｄ培養によって増殖させた未分化ｈＥＳＣを、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、４℃で一晩、一次抗体（１：５０）に曝露した。段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）１、３および４（米国、アイオワ州、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、ならびに腫瘍認識抗原（ＴＲＡ）１−６０およびＴＲＡ１−８１（米国、カリフォルニア州、テメキュラ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を、一次抗体として使用した。Ｃｙｓ３コンジュゲート抗体（米国、カリフォルニア州、テメキュラ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を、二次抗体（１：１００）として使用した。
【０３７０】
核型分析：  公知の方法［Amit et al, 2003］に従い、１回の試験あたり２つの試料、各試料に付き少なくとも１５〜２０個の細胞に対して、核型分析（Ｇバンディング）を実施した。核型を分析し、ヒト染色体に関する国際命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）（ＩＳＣＮ）に従って、命名した。
【０３７１】
ＥＢ形成：  ＥＢの形成のために、１０００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用してＥＳＣを小さい塊に分割し、５８ｍｍのペトリ皿（ドイツ国、フリッケンハウゼン、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）内、多能性幹細胞を未分化の状態に維持する因子を除去した、ＥＢの形成にとって好適な培地（以後、「ＥＢｓ−Ｍｅｄ」）の存在下で、懸濁培養を実施した。ＥＢｓ−Ｍｅｄは、２０％のＦＢＳｄ（米国、ユタ州、ＨｙＣｌｏｎｅ社製）、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、および１％の非必須アミノ酸ストック（ＦＢＳｄ以外、全て、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を添加した８０％のＫｏ−ＤＭＥＭからなる。１０日齢のＥＢを、ゼラチンで被覆した培養プレートに播種し、さらに少なくとも７日間培養した。ＲＮＡ単離のために細胞を採取した。１０〜２１日齢のＥＢを、ＲＮＡ単離および組織学的検査のために採取した。
【０３７２】
リアルタイムＰＣＲ：  Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（米国、モンタナ州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ社製）を製造業者の指示書に従って使用し、懸濁液中で１０〜１５回継代して増殖させたｈＰＳＣから総ＲＮＡを単離した。ＭＭＬＶ逆転写酵素ＲＮａｓｅ  Ｈマイナス（米国、ウイスコンシン州、マディソン、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用して、１μｇの総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の変性、次いで、９４℃で３０秒、アニーリング温度（表１に記載）で３０秒および７２℃で３０秒の伸長の反復サイクルを含んでいた。使用したＰＣＲプライマーおよび反応条件を、以下の表５に記載する。
【０３７３】
【表５】
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【０３７４】
増殖曲線：  試験した培養培地を用いて、１×１０５個の細胞を、懸濁液中に播種した。細胞を、５〜７日毎に計数した。
【０３７５】
ＦＡＣＳ分析：  懸濁培養したｈＰＳＣの球体を、ｔｒｙｐＬＥ（米国、ニューヨーク州、グランドアイランド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）を使用して単一細胞に解離した。細胞を、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗ｈ／ｍＳＳＥＡ４  Ａｂで染色し、フィコエリトリンにコンジュゲートしたラットＩｇＧ２Ｂをアイソタイプコントロールとして使用した（共に米国、ミネソタ州、ミネアポリス、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）。次いで、染色された細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（米国、カリフォルニア州、サンホセ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を製造業者の指示書に従って用いて分析した。
【０３７６】
フローサイトメトリー：  凝集体を、酵素的分割（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製のトリプシンＥＤＴＡ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｒｉｐｌＥｘ）を使用して単一細胞に分割した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、特異的抗体またはアイソタイプの一致するコントロールと共に室温で３０分間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、フローサイトメトリー（ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター）を使用して分析した。
【０３７７】
表６は、本明細書に記載の一部の実験において使用した抗体を列挙する。
【０３７８】
【表６】
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【０３７９】
実施例１
実験結果
Ｗｎｔ３ａに基づくいくつかの培地の処方について、ｂＦＧＦを添加せずに、それらが懸濁液中のｈＰＳＣのフィーダー層不含培養を支援する能力について試験した。試験した培地の処方は、未分化ｈＥＳＣのフィーダー層不含増殖を支援するのに好適であることがわかった。
【０３８０】
試験した培地処方中で培養した細胞は、少なくとも３０回の継代にわたり、未分化増殖、核型安定性および多能性などのＥＳＣの特徴を維持した。表面マーカーＳＳＥＡ４の発現に関する例を、図１Ａ〜Ｃに示す。興味深いことに、基質としてフィブロネクチンを使用し、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラおよびｂＦＧＦを添加した培地中で培養した場合、細胞はコロニーの外縁で分化し、フィーダー様細胞の増殖物を形成した（データは示さない）。
【０３８１】
さらに、試験した培養培地中で培養したＰＳＣは、免疫染色分析により示されるように、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１などの特異的多能性マーカーを強く発現した（図２Ａ〜２０Ｄ）。
【０３８２】
対照培地を使用したｈＰＳＣの懸濁培養物と比較した場合、試験培地で増殖させた凝集体と、対照培地を使用して増殖させたＰＳＣとの間で形態学的差異を観察することはできなかった（図７Ａ〜Ｄ）。
【０３８３】
新規培養培地による懸濁培養で培養したＰＳＣによる多能性マーカーの発現：  懸濁培養による１５継代または４０継代を超える長期培養後に、細胞を多能性マーカーについて試験した。試験した新規な培地の処方を用いて培養したＰＳＣの免疫染色分析により、典型的な多能性マーカーであるＳＳＥＡ４（図２Ａ〜Ｌ、および図８Ａ〜Ｉ）、Ｏｃｔ４（図３Ａ〜Ｌ、図１２Ａ〜Ｉ、および図１６Ａ〜Ｌ）、Ｎａｎｏｇ（図４Ａ〜Ｌ、および図９Ａ〜Ｉ）、ＴＲＡ１−６０（図５Ａ〜Ｌおよび図１０Ａ〜Ｉ）、ならびにＴＲＡ１−８１（図６Ａ〜Ｌ、図１１Ａ〜Ｉ、図１６Ａ〜Ｌ、および図１７Ａ〜Ｌ）などの発現が示され、これらの発現は、対照培地中で培養した細胞と同様に、陽性かつ強力であることがわかった。ＦＡＣＳ分析は、試験培地で培養すると、多数の細胞（９０％を超える）がＳＳＥＡ４について陽性であることを示した（図１Ａ〜Ｃおよび図１５Ａ〜Ｇ）。
【０３８４】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４遺伝子が依然として高度に発現されたことを示した（図１４）。
【０３８５】
新規培養培地による懸濁培養で培養したＰＳＣは、安定性および正常な核型を保持する：  Ｇ−バンディングによる核型分析は、新規培地を用いた１５回の継代後にも、安定な核型を示した（データは示さない）。
【０３８６】
新規培養培地による懸濁培養で培養したＰＳＣは、長期培養後に正常な増殖曲線を示す：  試験した新規な培地の処方を使用して培養したＰＳＣの増殖速度は、１５回および４０回を超える継代の後でも、対照培地と類似していた（図１３Ａ〜Ｂおよび以下の表７）。
【０３８７】
表７は、試験した培養培地のそれぞれについて、２０回の継代後の細胞数および生存率を示す。
【０３８８】
【表７】
2019520848.tif 000009
【０３８９】
新規培養培地による懸濁培養で培養したＰＳＣは、３種全ての胚性生殖層、即ち内胚葉、外胚葉および中胚葉、に分化することができた：  試験した新規処方を使用した長期培養後のＰＳＣの発生能を、胚様体（ＥＢ）の形成によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。懸濁液培養した場合、試験培地中で２０回継代した後に、ｈＰＳＣは、ＭＥＦ上で増殖させたＥＳ細胞が作製するものと同様のＥＢを形成した（図１８Ａ〜Ｇ）。これらのＥＢ内では、幹細胞は、３種の胚性生殖層を代表する細胞型に分化した。
【０３９０】
したがって、新規な試験培地の処方は、ＰＳＣの特徴を維持したｈＰＳＣの長期培養にとって好適であることがわかった。
【０３９１】
実施例２
新規培養培地は２次元培養システム上でのＰＳＣの連続培養を支援することもできる
【０３９２】
実験結果
試験培地と共に、マトリゲルマトリックス、フィブロネクチン、ラミニンまたはヒト包皮線維芽細胞無細胞マトリックスで被覆した培養皿を使用して、ＰＳＣを接着細胞として培養した。ＩＶ型コラゲナーゼを使用して、４〜７日毎に細胞を継代した。培地を毎日交換した。連続的増殖を２０回継代した後、細胞を、Ｏｃｔ４、Ｔｒａ１６０およびＴＡ１８１などの多能性マーカーについて特徴付けた。結果を図２１Ａ〜Ｃに示す。ここに示されるように、新規培養培地は、２次元培養システム上での未分化且つ多能性の幹細胞の増殖を支援することもできる。
【０３９３】
実施例３
様々なプロテアーゼ阻害剤を含む無血清限定培養培地は、ヒト多能性幹細胞の未分化増殖を支援する
【０３９４】
実験結果
いくつかの新規培養培地の処方（「一般的材料および実験方法」の項に記載した培養培地）について、ＰＳＣの未分化の懸濁培養を支援する能力を試験した。ＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、またはＷｎｔ３ａを添加し、ｂＦＧＦを添加しない培地を使用しながら、ｈＥＳＣを１８回を超える継代数にわたって、ＰＳＣの特徴を発現しながらも、未分化のものとして培養することができた。細胞形態は、懸濁培養したＰＳＣについて報告された形態と類似し（図２３Ａ〜Ｂ）、細胞の凝集体は明確な境界を有し、形状は円盤状であった（Amit et al., 2010）。ＦＡＣＳ分析は、懸濁液中での６回の継代後には、培養したＰＳＣ（Ｉ３）の９２パーセントがＯｃｔ４とＳＳＥＡ４とを同時発現することを示した。試験細胞の９５％超がＳＳＥＡ４について陽性であった（図２３Ｂ）。同様に、追加の生物学的反復の結果は、図２４Ｂに示したように、８３パーセントの細胞がこれらのマーカーを同時発現したことを示す。動的システム（スピナー）を用いる細胞培養により、細胞濃度が１ｍｌあたり６００万個を超える細胞が得られた（データは示さない）。スピナーフラスコを用いて連続的に１ヶ月（４〜５回の継代）を超えて培養した細胞は、多能性マーカーであるＯｃｔ４およびＳＳＥＡ４の発現を維持し、２回の生物学的反復において、９５％または８６％の同時発現を維持した（図２５および図２６）。さらに、試験したバージョンの培地を使用して懸濁培養した細胞は、ＥＢを形成し、図２７Ａ〜Ｃに例示したような異なる細胞系列に分化することができた。
【０３９５】
本発明をその特異的実施形態と共に記載したが、多くの代替物、改変および変更が当業者には明らかであることは明確である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および広い範囲内に入る全てのそのような代替物、改変および変更も包含することを意図する。
【０３９６】
本明細書で述べた全ての刊行物、特許、および特許出願は、当該刊行物、特許、または特許出願について具体的かつ個別に記載した場合と同様に、参照によりそれらが完全に本明細書に組み込まれるものとする。さらに、本願におけるいかなる参考文献の引用または記載も、そのような参考文献が本願に対する従来技術として存在することの自認と解釈すべきではない。セクションの見出しの使用についても、それらを必ずしも限定として解釈すべきではない。
【０３９７】
参考文献
（さらなる参考文献は本文中に引用している。）
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【配列表フリーテキスト】
【０３９８】
配列番号１６：  ＩＬ６Ｒ／ＩＬ６キメラタンパク質
【図１】
2019520848.tif 000010
【図２】
2019520848.tif 000011
【図３】
2019520848.tif 000012
【図４】
2019520848.tif 000013
【図５】
2019520848.tif 000014
【図６】
2019520848.tif 000015
【図７】
2019520848.tif 000016
【図８】
2019520848.tif 000017
【図９】
2019520848.tif 000018
【図１０】
2019520848.tif 000019
【図１１】
2019520848.tif 000020
【図１２】
2019520848.tif 000021
【図１３Ａ】
2019520848.tif 000022
【図１３Ｂ】
2019520848.tif 000023
【図１３Ｃ】
2019520848.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2019520848.tif 000029
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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