(57)【要約】本明細書に記載するのは、１００ｍｇ未満の無細胞ＤＮＡを含む試料から無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉する方法であって、試料をライブラリ調製に供して、それに続く無細胞メチル化ＤＮＡの配列決定を可能にするステップ、第１の量のフィラーＤＮＡを試料に添加するステップであって、フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化されているステップ、試料を変性させるステップ、及びメチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いて無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉するステップを含む、方法である。【選択図】図２
2019521315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００ｎｇ未満の無細胞ＤＮＡを含む試料から無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉する方法であって、
ａ．前記試料をライブラリ調製に供して、それに続く前記無細胞メチル化ＤＮＡの配列決定を可能にするステップ、
ｂ．第１の量のフィラーＤＮＡを前記試料に添加するステップであって、前記フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化されているステップ、
ｃ．前記試料を変性させるステップ、及び
ｄ．メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いて無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記捕捉された無細胞メチル化ＤＮＡを増幅し、続いて配列決定するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が５０ｎｇ未満の無細胞ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の量のフィラーＤＮＡが、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％メチル化フィラーＤＮＡ、好ましくは５％〜５０％、１０％〜４０％、又は１５％〜３０％メチル化フィラーＤＮＡを含み、残りが非メチル化フィラーＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の量のフィラーＤＮＡが２０ｎｇ〜１００ｎｇ、好ましくは３０ｎｇ〜１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇ〜１００ｎｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試料からの前記無細胞ＤＮＡと前記第１の量のフィラーＤＮＡが一緒に、少なくとも５０ｎｇの全ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの全ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フィラーＤＮＡが５０ｂｐ〜８００ｂｐ長、好ましくは１００ｂｐ〜６００ｂｐ長、より好ましくは２００ｂｐ〜６００ｂｐ長である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記フィラーＤＮＡが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記フィラーＤＮＡがジャンクＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記フィラーＤＮＡが内在又は外来ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記フィラーＤＮＡが非ヒトＤＮＡ、好ましくはλＤＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記フィラーＤＮＡがヒトＤＮＡとのアラインメントがない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合剤が、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質がＭＢＤ２タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）が、前記無細胞メチル化ＤＮＡを抗体を用いて免疫沈降させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも０．０５μｇ、好ましくは少なくとも０．１６μｇの前記抗体を免疫沈降のために前記試料に添加するステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が５−ＭｅＣ抗体又は５−ヒドロキシメチルシトシン抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
免疫沈降反応を確認するためにステップ（ｂ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加するステップを更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
無細胞メチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、ステップ（ｂ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを前記試料に添加するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料内のＤＮＡメチル化プロファイルを測定するための請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２１】
前記プロファイルを腫瘍組織の公知のメチル化プロファイルと相関させることによって前記試料内の癌細胞由来の無細胞ＤＮＡの存在を確認するための、請求項２０に記載のＤＮＡメチル化プロファイルの使用。
【請求項２２】
前記プロファイルを特定の組織の公知のメチル化プロファイルと相関させることによって前記試料内の前記無細胞ＤＮＡの起源組織を特定するための、請求項２０に記載のＤＮＡメチル化プロファイルの使用。
【請求項２３】
前記試料内の前記無細胞ＤＮＡ内の前記癌細胞の起源組織を特定するための請求項２２に記載の使用を更に含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
免疫療法をモニターするための請求項２０から２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
自己免疫状態の診断のための請求項２０から２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記試料が採取された対象における細胞回転を測定するための請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、その全体を本明細書に援用する２０１６年５月３日に出願された米国仮特許出願第６２／３３１，０７０号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、無細胞ＤＮＡの分野、より具体的には無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉する方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡの共有結合修飾であり、クロマチン構造において重要な役割を果たす安定な遺伝子調節機構である。ヒトにおいては、ＤＮＡメチル化は、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシン残基で主に発生する。他のジヌクレオチドとは異なり、ＣｐＧは、ゲノム全体に均等に分布せず、その代わり、ＣｐＧ島と呼ばれる短いＣｐＧリッチＤＮＡ領域に濃縮されている。ＤＮＡメチル化は、以下の２つの主な機序によって遺伝子を抑制し得る：１）メチル結合ドメインタンパク質を補充し、メチル結合ドメインタンパク質は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を補充することができる、及び２）ｃ−ＭＹＣなどの転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）の結合部位へのアクセスを遮断する（非特許文献１）。
【０００４】
一般に、ゲノム中のＣｐＧ部位の大部分はメチル化されており、ＣｐＧ島の大部分は、正常発生中及び分化組織中で非メチル化されたままである（非特許文献１）。それでも、正常一次組織においてＤＮＡメチル化の組織特異的パターンを明らかにすることができる（非特許文献２）。さらに、悪性転換中、全体的なＤＮＡ低メチル化、及びＣｐＧ島における限局的な高メチル化が頻繁に認められる（非特許文献１）。実際には、ＤＮＡメチル化パターンは、癌患者を多数の癌タイプの中でも、グリア芽細胞腫（非特許文献３）、上衣腫（非特許文献４）、結腸直腸（非特許文献５）、乳房（非特許文献６、７）における予後予測因子（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ）を有する臨床的に関連するサブグループに層別化するのに使用された。
【０００５】
正常分化及び癌などの疾患におけるその安定性及び役割のために、ＤＮＡメチル化は、腫瘍特性及び表現状態を表すのに使用することができる良好なバイオマーカーであり、したがって個別化医療で高い可能性がある。多数の試料タイプが、ＤＮＡメチル化マッピングに、また、とりわけ新しいＦＦＰＥ腫瘍組織、血球、尿、唾液、便を含めたバイオマーカー発見に適している（非特許文献８）。より最近では、特にゲノム識別が癌（体細胞変異）（非特許文献９）、移植片（ドナー対レシピエントＤＮＡ）（非特許文献１０）、妊娠（胎児対母ＤＮＡ）（非特許文献１１、１２）などに存在する状況では、バイオマーカーとしての循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ：ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ）の使用が加速している。バイオマーカーとしてのｃｆＤＮＡのＤＮＡメチル化マッピングの使用は、起源組織の同定を可能にし、癌患者を低侵襲で層別化することができるので、重大な影響を有し得る。さらに、それは、免疫応答、神経変性疾患又は心筋梗塞のモニタリングなどのゲノム識別が存在しない状況において、バイオマーカーとしてのｃｆＤＮＡの使用を可能にすることができ、エピジェネティックな異常をｃｆＤＮＡ中に検出することができる。
【０００６】
さらに、ｃｆＤＮＡの全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングを使用すると、疾患を証明するＸ線像がない初期癌の患者において循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ：ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ）を検出する際の重要な感度の問題を克服することができる。既存のｃｔＤＮＡ検出法は、変異の配列決定に基づくが、腫瘍と正常循環ｃｆＤＮＡを識別するのに利用可能な反復突然変異の数が限られるため、感度が幾分限定される（非特許文献１３、１４）。一方、全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を正常循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）から識別するのに使用することができる多数のエピジェネティックな変化を活用する。例えば、上衣腫などの一部の腫瘍タイプは、重要な反復体細胞変異なしに広範なＤＮＡメチル化異常を有し得る（非特許文献４）。
【０００７】
さらに、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の全癌データは、実質的にすべての腫瘍タイプにわたって腫瘍と正常組織の間の多数のＤＭＲを示している（非特許文献１５）。したがって、これらの知見によって強調されることは、癌特異的ＤＮＡメチル化変化をｃｔＤＮＡから回収するのに成功したアッセイが、悪性疾患を低配列決定関連コストで検出、分類及びモニターする極めて高感度のツールとして役立ち得るということである。
【０００８】
しかし、ｃｆＤＮＡ中のＤＮＡメチル化の全ゲノムマッピングは、入手可能なＤＮＡの量が少なく、ｃｆＤＮＡが２００ｂｐ長未満に断片化されることから、極めて困難である（非特許文献１６）。このため、少なくとも５０〜１００ｎｇのＤＮＡを必要とする従来のＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（非特許文献１７）、又は断片化されていないＤＮＡを必要とするＲｅｄｕｃｅｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）（非特許文献１８）を行うことは不可能である。ｃｆＤＮＡ中のＤＮＡメチル化をマッピングする別の問題は、正常ｃｆＤＮＡ内の目的ＤＮＡの量が少ないことである（非特許文献１９）。このため、少量のＤＮＡを捕捉するのに十分な深さの配列決定のコストが法外であるので、ＷＧＢＳを行うことは非現実的である。一方、メチル化しやすいＣｐＧリッチな特徴部を選択的に濃縮する方法は、１つのリードで入手可能な有用情報量を最大にし、コストを削減し、ＤＮＡ損失を減少させる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｍａ，  Ｓ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｔ．  Ｋ．  ＆  Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．  Ａ．  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３１，  ２７−３６，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｐ２２０  （２０１０）．
【非特許文献２】Ｖａｒｌｅｙ，  Ｋ．  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｙｎａｍｉｃ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２３，  ５５５−５６７，  ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１４７９４２．１１２  （２０１３）．
【非特許文献３】Ｓｔｕｒｍ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｏｔｓｐｏｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｈ３Ｆ３Ａ  ａｎｄ  ＩＤＨ１  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２，  ４２５−４３７，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｒ．２０１２．０８．０２４  （２０１２）．
【非特許文献４】Ｍａｃｋ，  Ｓ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｌｅｔｈａｌ  ＣＩＭＰ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａｓ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｃｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５０６，  ４４５−４５０，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３１０８  （２０１４）．
【非特許文献５】Ｈｉｎｏｕｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２，  ２７１−２８２，  ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１１７５２３．１１０  （２０１２）．
【非特許文献６】Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６，  ５８９９，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ６８９９  （２０１５）．
【非特許文献７】Ｆａｎｇ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔｈｙｌｏｍｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａｎ  ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３，  ７５ｒａ２５，  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００１８７５  （２０１１）．
【非特許文献８】Ｍｉｋｅｓｋａ，  Ｔ．  ＆  Ｃｒａｉｇ，  Ｊ．  Ｍ．  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．  Ｇｅｎｅｓ  （Ｂａｓｅｌ）  ５，  ８２１−８６４，  ｄｏｉ：１０．３３９０／ｇｅｎｅｓ５０３０８２１  （２０１４）．
【非特許文献９】Ｄｉａｚ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｊｒ．  ＆  Ｂａｒｄｅｌｌｉ，  Ａ．  Ｌｉｑｕｉｄ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ：  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２，  ５７９−５８６，  ｄｏｉ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１２．４５．２０１１  （２０１４）．
【非特許文献１０】Ｓｎｙｄｅｒ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｋｈｕｓｈ，  Ｋ．  Ｋ．，  Ｖａｌａｎｔｉｎｅ，  Ｈ．  Ａ．  ＆  Ｑｕａｋｅ，  Ｓ．  Ｒ．  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  ６２２９−６２３４，  ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３９２４１０８  （２０１１）．
【非特許文献１１】Ｃｈｉｕ，  Ｒ．  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｅｎａｔａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，  ２０４５８−２０４６３，  ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１０６４１１０５  （２００８）．
【非特許文献１２】Ｆａｎ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ，  Ｙ．  Ｊ．，  Ｃｈｉｔｋａｒａ，  Ｕ．，  Ｈｕｄｇｉｎｓ，  Ｌ．  ＆  Ｑｕａｋｅ，  Ｓ．  Ｒ．  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  ｂｙ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｂｌｏｏｄ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，  １６２６６−１６２７１，  ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０８３１９１０５  （２００８）．
【非特許文献１３】Ｎｅｗｍａｎ，  Ａ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｖｅｒａｇｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０，  ５４８−５５４，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９  （２０１４）．
【非特許文献１４】Ａｒａｖａｎｉｓ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．  ＆  Ｋｌａｕｓｎｅｒ，  Ｒ．  Ｄ．  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ  １６８，  ５７１−５７４，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１７．０１．０３０  （２０１７）．
【非特許文献１５】Ｈｏａｄｌｅｙ，  Ｋ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｆｏｒｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２  ｃａｎｃｅｒ  ｔｙｐｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ．  Ｃｅｌｌ  １５８，  ９２９−９４４，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０６．０４９  （２０１４）．
【非特許文献１６】Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｂ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  （ＣＮＡｓ）  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ−ａ  ｓｕｒｖｅｙ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７７５，  １８１−２３２，  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｃａｎ．２００６．１０．００１  （２００７）．
【非特許文献１７】Ｔａｉｗｏ，  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ＤＮＡ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ７，  ６１７−６３６，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．０１２  （２０１２）．
【非特許文献１８】Ｇｕ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ−ｓｃａｌｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ６，  ４６８−４８１，  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１０．１９０  （２０１１）．
【非特許文献１９】Ｈｕｎｇ，  Ｅ．  Ｃ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｒ．  Ｗ．  ＆  Ｌｏ，  Ｙ．  Ｍ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｅｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ６２，  ３０８−３１３，  ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｃｐ．２００７．０４８４７０  （２００９）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様によれば、１００ｎｇ未満の無細胞ＤＮＡを含む試料から無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉する方法であって、試料をライブラリ調製に供して、それに続く無細胞メチル化ＤＮＡの配列決定を可能にするステップ、第１の量のフィラーＤＮＡを試料に添加するステップであって、フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化されているステップ、試料を変性させるステップ、及びメチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いて無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉するステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
本発明の実施形態は、以下の記述及び添付図面を参照すると最も良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。少なくとも１つのエピ変異をｃｔＤＮＡ濃度（列）、検査ＤＭＲ数（行）及び配列決定深さ（ｘ軸）の関数として検出する確率のコンピュータシミュレーション。
【図１Ｂ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６細胞系由来の１〜１００ｎｇの入力ＤＮＡのＤＮＡメチル化シグナルの全ゲノムピアソン相関。各濃度は、２つの生物学的複製を有する。
【図１Ｃ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。ＨＣＴ１１６由来の異なる濃度の入力ＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑから得られるＤＮＡメチル化プロファイル（緑のトラック）＋ＥＮＣＯＤＥ（ＥＮＣＳＲ０００ＤＦＳ）から得られるＲｅｄｕｃｅｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）ＨＣＴ１１６データ及びＧＥＯ（ＧＳＭ１４６５０２４）から得られるＷｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＧＢＳ）ＨＣＴ１１６データ。ヒートマップ（ＲＲＢＳトラック）では、黄色はメチル化を意味し、青色は非メチル化を意味し、灰色はカバー度０を意味する。
【図１Ｄ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。多発性骨髄腫（ＭＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ）細胞系ＭＭ１．Ｓ中へのＣＲＣ細胞系ＨＣＴ１１６の段階希釈。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを純粋ＨＣＴ１１６  ＤＮＡ（１００％ＣＲＣ）、純粋ＭＭ１．Ｓ  ＤＮＡ（１００％ＭＭ）、並びにＭＭ  ＤＮＡ中に希釈された１０％、１％、０．１％、０．０１％及び０．００１％ＣＲＣ  ＤＮＡにおいて行った。すべてのＤＮＡを血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化した。本発明者らは、観察と予想（Ｄ）ＤＭＲ数及び（Ｅ）これらＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナル（ＲＰＫＭ単位）のほぼ完全な線形相関（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）を認めた。
【図１Ｅ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。多発性骨髄腫（ＭＭ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ）細胞系ＭＭ１．Ｓ中へのＣＲＣ細胞系ＨＣＴ１１６の段階希釈。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを純粋ＨＣＴ１１６  ＤＮＡ（１００％ＣＲＣ）、純粋ＭＭ１．Ｓ  ＤＮＡ（１００％ＭＭ）、並びにＭＭ  ＤＮＡ中に希釈された１０％、１％、０．１％、０．０１％及び０．００１％ＣＲＣ  ＤＮＡにおいて行った。すべてのＤＮＡを血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化した。本発明者らは、観察と予想（Ｄ）ＤＭＲ数及び（Ｅ）これらＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナル（ＲＰＫＭ単位）のほぼ完全な線形相関（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）を認めた。
【図１Ｆ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。同じ希釈系列においては、公知の体細胞変異は、バックグラウンド配列決定装置及びポリメラーゼ誤り率を超える超深度（＞１０，０００×）標的配列決定によって１／１００対立遺伝子割合においてのみ検出可能である。ＣＲＣ細胞系における各変異の部位に各塩基又は挿入／欠失を含むリードの割合を示す。
【図１Ｇ】ｃｆＤＮＡのメチローム分析が少量の入力ＤＮＡ中のｃｔＤＮＡを濃縮し、検出する高感度な手法であることを示す図である。２名の結腸直腸癌患者からの患者由来の異種移植片（ＰＤＸ：ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を有するマウスの血漿中の総ｃｆＤＮＡ（ヒト＋マウス）に対する割合としてのｃｔＤＮＡ（ヒト）の頻度。
【図２】ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑプロトコルの略図である。
【図３Ａ−１】配列決定飽和（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）分析及び品質管理を示す図である。図は、血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６  ＤＮＡからの各入力濃度に対する各複製からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータを分析するＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＭＥＤＩＰＳの飽和分析の結果を示す。
【図３Ａ−２】配列決定飽和（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）分析及び品質管理を示す図である。図は、血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６  ＤＮＡからの各入力濃度に対する各複製からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータを分析するＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＭＥＤＩＰＳの飽和分析の結果を示す。
【図３Ａ−３】配列決定飽和（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）分析及び品質管理を示す図である。図は、血漿ｃｆＤＮＡを模倣するように断片化されたＨＣＴ１１６  ＤＮＡからの各入力濃度に対する各複製からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータを分析するＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＭＥＤＩＰＳの飽和分析の結果を示す。
【図３Ｂ】配列決定飽和（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）分析及び品質管理を示す図である。ＨＣＴ１１６細胞系の４つの開始ＤＮＡ濃度（１００、１０、５及び１ｎｇ）の２つの複製において手順を試験した。反応の特異性をメチル化及び非メチル化添加シロイヌナズナＤＮＡを用いて計算した。濃縮倍率比を断片化ＨＣＴ１１６  ＤＮＡのゲノム領域（メチル化精巣特異的Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ０及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）のプライマー）を用いて計算した。水平の点線は、濃縮倍率比閾値２５を示す。エラーバーは、±１ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図３Ｃ】配列決定飽和（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）分析及び品質管理を示す図である。配列決定試料のＣｐＧ濃縮スコアは、入力対照に比べて免疫沈降試料からのゲノム領域内のＣｐＧの堅牢な濃縮を示す。ＣｐＧ濃縮スコアは、領域のＣｐＧの相対頻度をヒトゲノムのＣｐＧの相対頻度で除算することによって得られた。エラーバーは、±１ｓ．ｅ．ｍ．である。
【図４Ａ】段階希釈からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑからの品質管理を示す図である。ＭＭ  ＤＮＡ（ＭＭ１．Ｓ）中へのＣＲＣ  ＤＮＡ（ＨＣＴ１１６）希釈の略図。
【図４Ｂ】段階希釈からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑからの品質管理を示す図である。各希釈の反応の特異性をメチル化及び非メチル化添加シロイヌナズナＤＮＡを用いて計算した。
【図４Ｃ】段階希釈からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑからの品質管理を示す図である。配列決定試料のＣｐＧ濃縮スコアは、免疫沈降試料からのゲノム領域内のＣｐＧの強力な濃縮を示す。ＣｐＧ濃縮スコアは、領域のＣｐＧの相対頻度をヒトゲノムにおけるＣｐＧの相対頻度で除算することによって得られた。
【図４Ｄ−１】段階希釈からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑからの品質管理を示す図である。図は、各希釈ポイントからの飽和分析の結果を示す。
【図４Ｄ−２】段階希釈からのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑからの品質管理を示す図である。図は、各希釈ポイントからの飽和分析の結果を示す。
【図５Ａ】ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法が膵臓腺癌患者から得られる循環ｃｆＤＮＡ上の数千の差次的メチル化領域を同定可能であることを示す図である。実験計画。
【図５Ｂ】ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法が膵臓腺癌患者から得られる循環ｃｆＤＮＡ上の数千の差次的メチル化領域を同定可能であることを示す図である。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを用いた膵癌（症例、ｎ＝２４）対健常ドナー（対照、ｎ＝２４）からの循環ｃｆＤＮＡのボルケーノプロット。赤い点は、多重検定補正後に有意になった窓を示す。
【図５Ｃ】ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法が膵臓腺癌患者から得られる循環ｃｆＤＮＡ上の数千の差次的メチル化領域を同定可能であることを示す図である。健常ドナー及び膵癌患者由来の血漿ＤＮＡ中で同定された３８，０８５個のＤＭＲのヒートマップ。階層的クラスタリング方法：Ｗａｒｄ。
【図５Ｄ】ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法が膵臓腺癌患者から得られる循環ｃｆＤＮＡ上の数千の差次的メチル化領域を同定可能であることを示す図である。血漿（症例対対照）中で同定されたＤＭＲと原発腫瘍組織（原発腫瘍対正常組織）中で同定された癌特異的ＤＭＣの予想対観察重複の頻度を推定する順列分析。ボックスプロットは、重複の帰無分布を表す。菱形は、原発腫瘍組織と循環ｃｆＤＮＡからのＤＮＡメチル化の重複の実験的に観察された数である。赤い菱形は、重複の観察数が偶然に予想よりも有意に多いことを意味する。緑の菱形は重複の観察数が偶然に予想よりも有意に少ないことを意味し、青い菱形は有意でない。本発明者らは４つの可能な重複を計算した：原発腫瘍組織における高メチル化と循環ｃｆＤＮＡにおける高メチル化（濃縮、Ｐ値：６．４×１０−２２）；腫瘍組織における高メチル化と循環ｃｆＤＮＡにおける低メチル化（欠乏、Ｐ値：９．４３×１０−１７）；腫瘍組織における低メチル化と循環ｃｆＤＮＡにおける低メチル化（濃縮、Ｐ値：１．８８×１０−２８３）；腫瘍組織における低メチル化と循環ｃｆＤＮＡにおける高メチル化（Ｐ値：０．１０５）。
【図５Ｅ】ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法が膵臓腺癌患者から得られる循環ｃｆＤＮＡ上の数千の差次的メチル化領域を同定可能であることを示す図である。血漿（症例対対照）中で同定されたＤＭＲと原発腫瘍組織（原発腫瘍対正常ＰＢＭＣ）中で同定された癌特異的ＤＭＣの予想対観察重複の頻度を推定する順列分析。
【図６Ａ】膵臓腺癌患者（症例）由来の循環ｃｆＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの品質管理を示す図である。各症例試料の反応の特異性をメチル化及び非メチル化添加シロイヌナズナＤＮＡを用いて計算した。濃縮倍率比は、利用可能なＤＮＡの量が極めて限られたために計算されなかった。
【図６Ｂ】健常ドナー（対照）由来の循環ｃｆＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの品質管理を示す図である。各対照試料の反応の特異性をメチル化及び非メチル化添加シロイヌナズナＤＮＡを用いて計算した。濃縮倍率比は、利用可能なＤＮＡの量が極めて限られたために計算されなかった。
【図６Ｃ】膵臓腺癌患者（症例）由来の循環ｃｆＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの品質管理を示す図である。配列決定試料のＣｐＧ濃縮スコアは、免疫沈降試料からのゲノム領域内のＣｐＧの強力な濃縮を示す。
【図６Ｄ】健常ドナー（対照）由来の循環ｃｆＤＮＡからのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの品質管理を示す図である。配列決定試料のＣｐＧ濃縮スコアは、免疫沈降試料からのゲノム領域内のＣｐＧの強力な濃縮を示す。
【図７Ａ】上位百万の最も変わりやすい全ゲノム窓を用いた健常ドナー及び初期膵臓腺癌患者からの４８の血漿ｃｆＤＮＡメチル化についてのＰＣＡを示す図である。各窓では、データの中央値からの絶対偏差の中央値を返す堅牢な測定である平均絶対偏差（ＭＡＤ：Ｍｅａｎ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）測定規準によって可変性を計算した。この場合、データは、所与の窓に対する全４８試料にわたるＲＰＫＭ値である。ＰＣ１対ＰＣ２（左）及びＰＣ１対ＰＣ３（右）を示す。
【図７Ｂ】各主成分の変動率。
【図７Ｃ】ＲＲＢＳを用いた膵臓腺癌患者由来の腫瘍対正常ＬＣＭ組織のボルケーノプロット。同定された差次的メチル化ＣｐＧ（ＤＭＣ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ）の総数を示す。赤い点は、多重検定補正後に有意になった、絶対的メチル化差違（絶対的デルタベータ）＞０．２５の窓を示す。
【図７Ｄ】各重複窓のＤＮＡメチル化差違の有意性を示す散布図。Ｘ軸は、ＲＲＢＳデータからの原発膵臓腺癌腫瘍対正常組織のｌｏｇ１０ｑ値を示す。領域が腫瘍において高メチル化されている場合、有意性は正のスケールで示される。低メチル化領域は負のスケールで示される。Ｙ軸は、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータからの膵臓腺癌患者対健常ドナーからの血漿ｃｆＤＮＡメチル化のｌｏｇ１０ｑ値を示す。青い点は、どちらも有意である。赤い線は、傾向線を示す。
【図７Ｅ】各重複窓のＤＮＡメチル化差違を示す散布図。Ｘ軸は、ＲＲＢＳデータからの原発膵臓腺癌腫瘍対正常組織のＤＮＡメチル化差違を示す。Ｙ軸は、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータからの膵臓腺癌患者対健常ドナーからの血漿ｃｆＤＮＡメチル化のＤＮＡメチル化差違を示す。青い線は、傾向線を示す。
【図７Ｆ】ＲＲＢＳを用いたＬＣＭ膵臓腺癌組織対正常ＰＢＭＣのボルケーノプロット。同定された差次的メチル化ＣｐＧ（ＤＭＣ）の総数を示す。赤い点は、多重検定補正後に有意になった、絶対的メチル化差違（絶対的デルタベータ）＞０．２５の窓を示す。
【図７Ｇ】各重複窓のＤＮＡメチル化差違の有意性を示す散布図。Ｘ軸は、ＲＲＢＳデータからの原発膵臓腺癌腫瘍対正常ＰＢＭＣのｌｏｇ１０ｑ値を示す。領域が腫瘍において高メチル化されている場合、有意性は正のスケールで示される。低メチル化領域は負のスケールで示される。Ｙ軸は、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータからの膵臓腺癌患者対健常ドナーからの血漿ｃｆＤＮＡメチル化のｌｏｇ１０ｑ値を示す。青い点は、どちらも有意である。赤い線は、傾向線を示す。
【図７Ｈ】各重複窓のＤＮＡメチル化差違を示す散布図。Ｘ軸は、ＲＲＢＳデータからの原発膵臓腺癌腫瘍対正常ＰＢＭＣのＤＮＡメチル化差違を示す。Ｙ軸は、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑデータからの膵臓腺癌患者対健常ドナーからの血漿ｃｆＤＮＡメチル化のＤＮＡメチル化差違を示す。
【図８Ａ】循環ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを使用して、転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）フットプリントを同定し、起源組織中の活性転写ネットワークを推測できることを示す図である。複数のヒト組織にわたる健常ドナー由来のｃｆＤＮＡ中の低メチル化された領域（対照における低メチル化フットプリント）においてそのモチーフが（ソフトウェアＨＯＭＥＲ２０を用いて）濃縮されたすべてのＴＦ（ｎ＝３３）の発現プロファイル。発現データを遺伝子型−組織発現（ＧＴＥｘ：Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロジェクトから得た２１。造血系において優先的に発現される幾つかのＴＦを同定した（ＰＵ．１、Ｆｌｉ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＫＬＦ１）。
【図８Ｂ】循環ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを使用して、転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）フットプリントを同定し、起源組織中の活性転写ネットワークを推測できることを示す図である。対照における低メチル化モチーフを有するすべてのＴＦの発現プロファイル（ｎ＝３３）対全血中の３３個のＴＦの無作為な１，０００セットの発現プロファイル（ＧＴＥｘデータ）。
【図８Ｃ】循環ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを使用して、転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）フットプリントを同定し、起源組織中の活性転写ネットワークを推測できることを示す図である。膵臓腺癌患者由来のｃｆＤＮＡ中の低メチル化された領域（症例における低メチル化フットプリント）においてそのモチーフが濃縮されたすべてのＴＦ（ｎ＝８５）の発現プロファイル。幾つかの膵臓特異的又は膵癌関連ＴＦを同定した。さらに、膵癌の分子サブタイプを駆動するホールマークＴＦも同定された。
【図８Ｄ】循環ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを使用して、転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）フットプリントを同定し、起源組織中の活性転写ネットワークを推測できることを示す図である。症例における低メチル化モチーフを有するすべてのＴＦの発現プロファイル（ｎ＝８５）対正常膵臓中の８５個のＴＦの無作為な１，０００セットの発現プロファイル（ＧＴＥｘデータ）。
【図８Ｅ】循環ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを使用して、転写因子（ＴＦ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）フットプリントを同定し、起源組織中の活性転写ネットワークを推測できることを示す図である。症例における低メチル化モチーフを有するすべてのＴＦの発現プロファイル（ｎ＝８５）対膵臓腺癌組織中の８５個のＴＦの無作為な１，０００セットの発現プロファイル（ＴＣＧＡデータ）。
【図９】免疫沈降前に、それぞれ９０ｎｇ、９５ｎｇ及び９９ｎｇのフィラーＤＮＡと組み合わせた、又はフィラーＤＮＡのない、１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの開始癌無細胞ＤＮＡ量（ｎ＝３）を用いたｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ後の添加非メチル化シロイヌナズナＤＮＡの回収％を示す図である。使用フィラーＤＮＡは、免疫沈降前の最終量を１００ｎｇに増加させるために、人工メチル化％と存在する非メチル化ラムダＤＮＡ％の組成が異なった。所望の添加非メチル化ＤＮＡの回収％は＜１．０％であり、回収の低いほど、反応の特異性％が高くなる。
【図１０】免疫沈降前に、それぞれ９０ｎｇ、９５ｎｇ及び９９ｎｇのフィラーＤＮＡと組み合わせた、又はフィラーＤＮＡのない、１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの開始癌無細胞ＤＮＡ量（ｎ＝３）を用いたｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ後の添加メチル化シロイヌナズナＤＮＡの回収％を示す図である。使用フィラーＤＮＡは、免疫沈降前の最終量を１００ｎｇに増加させるために、人工メチル化％と存在する非メチル化ラムダＤＮＡ％の組成が異なった。所望の添加メチル化ＤＮＡの最低回収％は２０％である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明者らは、異なる割合のｃｔＤＮＡ０．００１％〜１０％との混合物を生物情報学的にシミュレートした（図１Ａ、列の面）。本発明者らは、ｃｔＤＮＡが正常ｃｆＤＮＡに比べて１、１０、１００、１０００又は１００００個のＤＭＲ（差次的メチル化領域）を有するシナリオもシミュレートした（図１Ａ、行の面）。次いで、リードを様々な配列決定深さで各遺伝子座においてサンプリングした（１０×、１００×、１０００×及び１００００×）（図１Ａ、ｘ軸）。本発明者らは、癌ｃｔＤＮＡの存在量が少なく、カバー度が浅いときでも、ＤＭＲ数が増加すると少なくとも１つの癌特異的事象の検出確率が高くなることを見いだした（図１Ａ）。
【００１４】
これらの難題を克服するために、本発明者らは、無細胞ＤＮＡを用いて全ゲノムＤＮＡメチル化マッピングを行うｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（無細胞メチル化ＤＮＡ免疫沈降及びハイスループット配列決定）と呼ばれる新しい方法を開発した。ここで記述するｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法は、１００ｎｇの入力ＤＮＡまで堅牢である既存の低入力ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順１７の改変によって開発された。しかし、血漿試料の大部分は、１００ｎｇよりはるかに少ないＤＮＡを生成する。この難題を克服するために、本発明者らは、開始ＤＮＡの量を１００ｎｇに人為的に膨張させるために、外来λＤＮＡ（フィラーＤＮＡ）をアダプター連結ｃｆＤＮＡライブラリに添加した（図２）。これは、抗体による非特異的結合の量を最小にし、プラスチック製品との結合のために失われるＤＮＡの量も最小にする。フィラーＤＮＡは、アダプター連結ｃｆＤＮＡライブラリにサイズが類似したアンプリコンからなり、非メチル化ＤＮＡ及びメチル化レベルの異なるインビトロメチル化ＤＮＡで構成された（図９及び図１０）。異なる患者は異なる量のｃｆＤＮＡを生成するので、このフィラーＤＮＡの添加は、実用にも役立ち、入力ＤＮＡ量を１００ｎｇに規準化することができる。これによって、利用可能なｃｆＤＮＡの量にかかわらず、下流の手順がすべての試料で確実に正確に同じままである。
【００１５】
一態様によれば、１００ｎｇ未満の無細胞ＤＮＡを含む試料から無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉する方法であって、
ａ．試料をライブラリ調製に供して、それに続く無細胞メチル化ＤＮＡの配列決定を可能にするステップ、
ｂ．第１の量のフィラーＤＮＡを試料に添加するステップであって、フィラーＤＮＡの少なくとも一部がメチル化されているステップ、
ｃ．試料を変性させるステップ、及び
ｄ．メチル化ポリヌクレオチドに選択的な結合剤を用いて無細胞メチル化ＤＮＡを捕捉するステップ
を含む、方法を提示する。
【００１６】
一部の実施形態においては、この方法は、捕捉された無細胞メチル化ＤＮＡを増幅し、続いて配列決定するステップを更に含む。
【００１７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、続いてサンガー配列決定法などの様々な配列決定技術が当業者に知られている。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）配列決定法、Ｒｏｃｈｅ４５４配列決定法、Ｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭ配列決定法、ＳＯＬｉＤ配列決定法を含めて種々の配列決定技術を含む、ハイスループット配列決定法としても知られる次世代配列決定（ＮＧＳ：ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技術も利用可能である。ＮＧＳは、ＤＮＡ及びＲＮＡの配列決定を以前に使用されたサンガー配列決定法よりもはるかに迅速で安価にすることができる。一部の実施形態においては、前記配列決定は、ショートリード配列決定に対して最適化される。
【００１８】
無細胞メチル化ＤＮＡは、血流中で自由に循環しているＤＮＡであり、ＤＮＡの様々な公知領域でメチル化されている。試料、例えば、血漿試料は、無細胞メチル化ＤＮＡを分析するために採取することができる。
【００１９】
本明細書では「ライブラリ調製」は、リスト末端修復（ｌｉｓｔ  ｅｎｄ−ｒｅｐａｉｒ）、Ａテーリング、アダプター連結、又は後続のＤＮＡ配列決定を可能にするために無細胞ＤＮＡ上で行われる任意の他の調製を含む。
【００２０】
本明細書では「フィラーＤＮＡ」は、非コードＤＮＡとすることができ、又はアンプリコンからなることができる。
【００２１】
ＤＮＡ試料は、例えば十分な熱を用いて、変性することができる。
【００２２】
一部の実施形態においては、試料は、５０ｎｇ未満の無細胞ＤＮＡを含む。
【００２３】
一部の実施形態においては、第１の量のフィラーＤＮＡは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％メチル化フィラーＤＮＡを含む。好ましい実施形態においては、第１の量のフィラーＤＮＡは、約５０％メチル化フィラーＤＮＡを含む。
【００２４】
一部の実施形態においては、第１の量のフィラーＤＮＡは２０ｎｇ〜１００ｎｇである。好ましい実施形態においては、３０ｎｇ〜１００ｎｇのフィラーＤＮＡ。より好ましい実施形態においては、５０ｎｇ〜１００ｎｇのフィラーＤＮＡ。試料からの無細胞ＤＮＡと第１の量のフィラーＤＮＡが併用されるときには、少なくとも５０ｎｇの全ＤＮＡ、好ましくは少なくとも１００ｎｇの全ＤＮＡを含む。
【００２５】
一部の実施形態においては、フィラーＤＮＡは５０ｂｐ〜８００ｂｐ長である。好ましい実施形態においては１００ｂｐ〜６００ｂｐ長、より好ましい実施形態においては２００ｂｐ〜６００ｂｐ長。
【００２６】
フィラーＤＮＡは二本鎖である。例えば、フィラーＤＮＡをジャンクＤＮＡとすることができる。フィラーＤＮＡを内在又は外来ＤＮＡとすることもできる。例えば、フィラーＤＮＡは、非ヒトＤＮＡ、好ましい実施形態においてはλＤＮＡである。本明細書では「λＤＮＡ」とは、腸内細菌ファージλＤＮＡを指す。一部の実施形態においては、フィラーＤＮＡは、ヒトＤＮＡとのアラインメントがない。
【００２７】
一部の実施形態においては、結合剤は、メチルＣｐＧ結合ドメインを含むタンパク質である。１種のこうした例示的なタンパク質は、ＭＢＤ２タンパク質である。本明細書では「メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ：Ｍｅｔｈｙｌ−ＣｐＧ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）」とは、約７０残基長であるタンパク質及び酵素のある種のドメインを指し、１つ以上の対称的メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡに結合する。ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４及びＢＡＺ２のＭＢＤは、ＤＮＡとの結合を媒介し、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１及びＭＢＤ２の場合には、メチル化ＣｐＧとの結合を優先的に媒介する。ヒトタンパク質ＭＥＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３及びＭＢＤ４は、メチルＣｐＧ結合ドメイン（ＭＢＤ）の各々における存在によって関連づけられる核タンパク質ファミリーを含む。これらのタンパク質の各々は、ＭＢＤ３を除いて、メチル化ＤＮＡに特異的に結合することができる。
【００２８】
別の実施形態においては、結合剤は抗体であり、無細胞メチル化ＤＮＡの捕捉は、無細胞メチル化ＤＮＡを抗体を用いて免疫沈降させることを含む。本明細書では「免疫沈降」とは、特定の抗原（ポリペプチド、ヌクレオチドなど）に特異的に結合する抗体を用いて、該抗原を溶液から沈降させる技術を指す。このプロセスは、特定のタンパク質又はＤＮＡを試料から単離し、濃縮するのに使用することができ、抗体が手順のある時点で固体基質に結合する必要がある。固体基質としては、例えば、磁気ビーズなどのビーズが挙げられる。別のタイプのビーズ及び固体基質が当該技術分野で知られている。
【００２９】
例示的一抗体は５−ＭｅＣ抗体である。免疫沈降手順では、一部の実施形態においては、少なくとも０．０５μｇの抗体を試料に添加し、より好ましい実施形態においては、少なくとも０．１６μｇの抗体を試料に添加する。免疫沈降反応を確認するために、一部の実施形態においては、本明細書に記載の方法は、ステップ（ｂ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加するステップを更に含む。
【００３０】
別の例示的一抗体は、５−ヒドロキシメチルシトシン抗体である。
【００３１】
別の実施形態においては、本明細書に記載の方法は、無細胞メチル化ＤＮＡの捕捉を確認するために、ステップ（ｂ）の後に第２の量の対照ＤＮＡを試料に添加するステップを更に含む。
【００３２】
本明細書では「対照」は、正と負の対照の両方、又は少なくとも正の対照を含むことができる。
【００３３】
更なる一態様によれば、試料内のＤＮＡメチル化プロファイルを測定するための本明細書に記載の方法の使用を提供する。
【００３４】
更なる一態様によれば、プロファイルを腫瘍組織の公知のメチル化プロファイルと相関させることによって試料内の癌細胞由来の無細胞ＤＮＡの存在を確認するための本明細書に記載の方法の使用を提供する。
【００３５】
更なる一態様によれば、プロファイルを特定の組織の公知のメチル化プロファイルと相関させることによって試料内の無細胞ＤＮＡの起源組織を特定するための本明細書に記載のＤＮＡメチル化プロファイルの使用を提供する。
【００３６】
一部の実施形態においては、試料内の無細胞ＤＮＡ内の癌細胞の起源組織を特定するための本明細書に記載の使用を更に含む使用。
【００３７】
更なる一態様によれば、免疫療法をモニターするための本明細書に記載の使用を提供する。
【００３８】
更なる一態様によれば、自己免疫状態の診断のための本明細書に記載の使用を提供する。
【００３９】
更なる一態様によれば、試料が採取された対象における細胞回転を測定するための本明細書に記載の使用を提供する。
【００４０】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明するものであって、本明細書に開示される本発明の広範な態様を限定するものではない。
【実施例】
【００４１】
方法
ドナー補充及び試料取得
膵臓腺癌（ＰＤＡＣ）患者試料をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ＢｉｏＢａｎｋから入手し、健常対照をカナダ、トロントのＭｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ）のＦａｍｉｌｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｒｅから補充した。患者が同意して収集された全試料を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ及びカナダ、トロントのＭｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌからの施設承認の下に得た。
【００４２】
検体処理−精製腫瘍及び正常細胞
原発性ＰＤＡＣ試料の場合、検体を切除後すぐに処理し、代表的な切片を使用して、診断を確認した。新たな液体窒素凍結組織試料のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ：Ｌａｓｅｒ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）をＬｅｉｃａ  ＬＭＤ７０００機器上で行った。手短に述べると、気相液体窒素中で維持された凍結組織をＯＣＴ切断媒体に包埋し、クライオトームで８μｍ厚切片に切り出した。切片をＰＥＮ膜スライド（Ｌｅｉｃａ）に載せ、ヘマトキシリンで軽く染色して、腫瘍領域の顕微鏡同定を容易にした。切片を切断して核酸の劣化を最小にした同じ日にＬＣＭを行った。
【００４３】
顕微解剖腫瘍細胞を重力によって無菌リボヌクレアーゼフリー微量遠心管のキャップに収集した。約１５０，０００〜２００，０００個の腫瘍細胞をＤＮＡ試料用に収集し、更なる処理まで−８０℃で貯蔵した。ＬＣＭは、一般に、十分な量の精製腫瘍細胞を収集するのに１症例当たり１〜２日かかった。Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した。スライドガラス上の非染色凍結切片を適切なＤＮＡ抽出緩衝剤中にこすり取ることによって、組織学的に精査された対応正常参照組織を各患者で凍結十二指腸又は胃粘膜から収集した。
【００４４】
検体処理−ｃｆＤＮＡ
ＥＤＴＡ及びＡＣＤ血漿試料をＢｉｏＢａｎｋ及びカナダ、トロントのＭｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＳＨ）のＦａｍｉｌｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｒｅから入手した。全試料を使用まで−８０℃又は気相液体窒素中で貯蔵した。無細胞ＤＮＡを０．５〜３．５ｍｌの血漿からＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。抽出ＤＮＡを使用前にＱｕｂｉｔによって定量化した。
【００４５】
検体処理−ＰＤＸ  ｃｆＤＮＡ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮｅｔｗｏｒｋのＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄによって認可されたようにＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｂｉｏｂａｎｋから患者の同意の下で得られたヒト直腸結腸腫瘍組織を、コラゲナーゼＡを用いて単細胞に消化した。単細胞を４〜６週齢ＮＯＤ／ＳＣＩＤ雄性マウスに皮下注射した。マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させた後、心臓穿刺によって採血し、ＥＤＴＡ管に貯蔵した。収集血液試料から、血漿を単離し、−８０℃で貯蔵した。無細胞ＤＮＡを０．３〜０．７ｍｌの血漿からＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。すべての動物の作業をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ＮｅｔｗｏｒｋのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可された倫理規定に従って行った。
【００４６】
ＲＲＢＳ
無細胞ＤＮＡが得られた同じ患者由来のＬＣＭ濃縮腫瘍及び正常試料から抽出されたゲノムＤＮＡを軽微な変更を加えたＧｕら、２０１１年１８の手順に従ってＲＲＢＳに供した。手短に述べると、Ｑｕｂｉｔによって測定された１０ｎｇのゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｓｐＩで消化し、次いで末端修復、Ａテーリング、及びＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑメチル化アダプターとのアダプター連結に供した。次いで、調製されたライブラリをＺｙｍｏ  ＥＺ  ＤＮＡメチル化キットを用いて製造者の手順に従って亜硫酸水素塩変換に供し、続いて１６０ｂｐ〜３００ｂｐの断片のゲルサイズ選択に供した。各精製ライブラリを増幅する最適サイクル数をｑＰＣＲを使用して決定し、その後、試料をＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｕｒａｃｉｌ＋Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて増幅し、ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。最終ライブラリをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析に供した後、ＵＨＮ  Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＣｅｎｔｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００で配列決定した。
【００４７】
外来腸内細菌ファージλＰＣＲ産物の調製
腸内細菌ファージλＤＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を表１に示したプライマーを用いて増幅し、６種の異なるＰＣＲアンプリコン産物を生成した。ＰＣＲ反応をＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを用いて以下の条件で行った：９５℃３分間の酵素の活性化、３０サイクルの９８℃２０秒間、６０℃１５秒間、７２℃３０秒間、及び７２℃１分間の最終伸長。ＰＣＲアンプリコンをＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、ゲル上に流して、サイズ及び増幅を検証した。１ＣｐＧ、５ＣｐＧ、１０ＣｐＧ、１５ＣｐＧ及び２０ＣｐＧＬのアンプリコンをＣｐＧ  Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｍ．ＳｓｓＩ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてメチル化し、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ＰＣＲアンプリコンのメチル化を制限酵素ＨｐｙＣＨ４ＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｎａｄａ）を用いて試験し、ゲル上に流して、そのメチル化を確実にした。非メチル化（２０ＣｐＧＳ）及びメチル化（１ＣｐＧ、５ＣｐＧ、１０ＣｐＧ、１５ＣｐＧ、２０ＣｐＧＬ）アンプリコンのＤＮＡ濃度をＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いて測定した後、５０％メチル化及び５０％非メチル化λＰＣＲ産物と一緒に貯蔵した。
【００４８】
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順の略図を図２に示す。ｃｆＭｅＤＩＰ前に、ＤＮＡ試料をＫａｐａ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてライブラリ調製に供した。一部変更した製造者手順に従った。手短に述べると、目的ＤＮＡを０．２ｍＬ  ＰＣＲ管に添加し、末端修復及びＡテーリングに供した。アダプター連結は、ＮＥＢＮｅｘｔアダプター（Ｉｌｌｕｍｉｎａキット用ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて最終濃度０．１８１μＭで従い、２０℃で２０分間インキュベートし、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて精製した。溶出ライブラリをＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｎａｄａ）で消化し、続いてＭｅＤＩＰ前にＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【００４９】
調製ライブラリを貯蔵メチル化／非メチル化λＰＣＲ産物と組み合わせて、最終ＤＮＡ量１００ｎｇとし、一部変更したＴａｉｗｏら、２０１２年１７の手順を用いてＭｅＤＩＰに供した。ＭｅＤＩＰでは、Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ  ＭａｇＭｅＤＩＰキット（Ｃａｔ＃Ｃ０２０１００２１）を一部変更した製造者の手順に従って使用した。０．３ｎｇの対照メチル化及び０．３ｎｇの対照非メチル化シロイヌナズナＤＮＡ、（ＤＮＡの総量［ｃｆＤＮＡ＋フィラー＋対照］を１００ｎｇにするための）フィラーＤＮＡ並びに緩衝剤をアダプター連結ＤＮＡを含むＰＣＲ管に添加後、試料を９５℃に１０分間加熱し、次いですぐに氷水浴中に１０分間置いた。各試料を２個の０．２ｍＬ  ＰＣＲ管に分配した。一方は１０％入力対照用であり、他方は免疫沈降に供される試料である。ＭａｇＭｅＤＩＰキットからの含まれる５−ｍＣモノクローナル抗体３３Ｄ３（Ｃａｔ＃Ｃ１５２０００８１）を希釈抗体混合物の生成前に１：１５希釈し、試料に添加した。洗浄磁気ビーズ（製造者の指示に従う）も４℃で１７時間のインキュベーション前に添加した。試料をＤｉａｇｅｎｏｄｅ  ｉＰｕｒｅ  Ｋｉｔを用いて精製し、５０μｌの緩衝剤Ｃ中に溶出させた。次のステップに進む前に、反応（ＱＣ１）の成功を、添加シロイヌナズナＤＮＡの存在を検出するｑＰＣＲによって検証し、非メチル化添加ＤＮＡの回収％＜１％及び反応の特異性％＞９９％（１−［添加非メチル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］によって計算）を確認した。各ライブラリを増幅する最適サイクル数をｑＰＣＲを使用して決定し、その後、試料をＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘを用いて増幅し、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓを最終濃度０．３μＭまで添加した。ライブラリの増幅に使用されるＰＣＲ設定は以下の通りであった：９５℃で３分間活性化、続いて所定のサイクルの９８℃２０秒間、６５℃１５秒間及び７２℃３０秒間、並びに７２℃１分間の最終伸長。増幅されたライブラリをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラムを用いて精製し、次いでゲルサイズを３％Ｎｕｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロースゲルを用いて選択して、アダプター二量体を除去した。配列決定に供する前に、メチル化ヒトＤＮＡ領域（精巣特異的Ｈ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ）及び非メチル化ヒトＤＮＡ領域（ＧＡＰＤＨプロモーター）の濃縮倍率を、無細胞ＤＮＡ（ＡＴＣＣから得られる細胞系、マイコプラズマフリー）を模倣するように剪断されたＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡから生成されるＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ及びｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑライブラリについて測定した。最終ライブラリをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析に供した後、ＵＨＮ  Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＣｅｎｔｒｅにおいてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００で配列決定した。
【００５０】
フィラーＤＮＡにおける異なるメチル化％
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを手順のフィラー成分におけるメチル化と非メチル化ラムダＤＮＡの異なる％を用いて以下のように実施した。
【００５１】
【表１】
2019521315.tif 000003
【００５２】
図９及び１０に示すように、免疫沈降前の最終量を１００ｎｇに増加させるのに使用されたフィラーＤＮＡ（ラムダＤＮＡ）は、メチル化ＤＮＡの回収の点で良好な収率を依然として得ながら（図１０）、最小回収非メチル化ＤＮＡを有するために（図９）、好ましくは、幾らかの人工メチル化ＤＮＡをその組成物中に含むべきである（１００％〜１５％）。本発明者らが１００％非メチル化フィラーＤＮＡを有する、又は存在するフィラーＤＮＡがない試料においては、メチル化ＤＮＡの回収は本当に高いが、非メチル化ＤＮＡの回収％も高い。これは、フィラーＤＮＡ中の追加のメチル化ＤＮＡが反応中に存在する過剰の抗体を占有するのを助け、試料中に存在する非メチル化ＤＮＡとの非特異的結合の量を最小にすることを示している。メチル化ＤＮＡが試料全体でどのくらい存在するかは不明であり、これは試料ごとに大きく異なり得るので、異なる無細胞ＤＮＡ試料を使用する場合には抗体量の最適化があまり経済的でなく、又は可能でさえないことを考慮すると、このフィラーＤＮＡは、異なる開始量を規準化するのを助け、異なる無細胞ＤＮＡ試料を同様に処理することができ（すなわち、等量の抗体を使用する）、それでも、良好なメチル化データをそれから回収することができる。
【００５３】
点変異検出のための超深度標的配列決定
本発明者らは、ＱＩＡｇｅｎ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄキットを使用して、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅにおいて初期臨床試験登録前に作成された対応腫瘍組織分子プロファイリングデータを有する患者由来の約２０ｍＬの血漿（４〜５×１０ｍＬ  ＥＤＴＡ採血管）から無細胞ＤＮＡを単離した。ＤＮＡを細胞系（ＣＲＣ及びＭＭ細胞系の希釈）からＰｕｒｅＧｅｎｅ  Ｇｅｎｔｒａキットを用いて抽出し、Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理器を用いて約１８０ｂｐに断片化し、より大きいサイズ断片をＡｍｐｕｒｅビーズを用いて排除して、無細胞ＤＮＡの断片サイズを模倣した。ＤＮＡ塩基配列決定ライブラリを８３ｎｇの断片化ＤＮＡからＮＥＸＴｆｌｅｘ−９６  ＤＮＡ  Ｂａｒｃｏｄｅアダプター（Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、オースティン、ＴＸ）アダプターを利用するＫＡＰＡ  Ｈｙｐｅｒ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウィルミントン、ＭＡ）を用いて構築した。既知の変異を含むＤＮＡ断片を単離するために、本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｎｅｌを用いて臨床検査室によって試験された４８の遺伝子から変異ホットスポットを標的にしたビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブ（ｘＧｅｎ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍｉｎｉ  Ｐｏｏｌ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を設計した。バーコードライブラリをプールし、次いでカスタムハイブリッド捕捉ライブラリを製造者の指示（ＩＤＴ  ｘＧＥＮ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎ手順バージョン２．１）に従って適用した。これらの断片をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００機器を用いて＞１０，０００×リードカバー度まで配列決定した。得られたリードをｂｗａ−ｍｅｍを用いて整列させ、変異をＳＡＭｔｏｏｌｓ及びｍｕＴｅｃｔバージョン１．１．４を用いて検出した。
【００５４】
腫瘍特異的特徴の数と配列決定深さによる検出確率との関係のモデル化
本発明者らは、１４５，０００個のシミュレートされたゲノムを作製した。癌特異的メチル化ＤＭＲの割合は、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％及び１０％に設定され、それぞれ１、１０、１００、１０００及び１００００個の独立したＤＭＲからなった。本発明者らは、１４，５００個の二倍体ゲノム（１００ｎｇのＤＮＡに相当する）をこれらの最初の混合物から採取し、１０、１００、１０００及び１００００リード／遺伝子座を更に採取して、これらの深さにおける配列決定カバー度を表した。このプロセスをカバー度、存在量及び特徴数の各組合せで１００回繰り返した。本発明者らは、パラメータの各組合せで少なくとも１つのＤＭＲの検出成功頻度を推定し、確率曲線をプロットして（図１Ａ）、配列決定深さを条件とする検出成功確率に対する特徴数の影響を視覚的に評価した。
【００５５】
膵癌患者及び健常ドナーのｃｆＤＮＡからの差次的メチル化領域の計算及び可視化
２４名の膵癌（ＰＣ：Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）患者及び２４名の健常ドナーからのｃｆＤＮＡ試料間の差次的メチル化領域（ＤＭＲ）をＭＥＤＩＰＳ  Ｒパッケージを用いて計算した２５。各試料について、ＢＡＭアラインメント（対ヒトゲノムｈｇ１９）ファイルを使用して、ＭＥＤＩＰＳ  Ｒ対象を作製した。次に、２セットの試料からのＲＰＫＭをｔ検定で比較することによってＤＭＲを計算した。ｔ検定からの生のｐ値をＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順によって調節した。次いで、ＤＭＲを調節ｐ値が０．１未満であるすべての窓として定義した。３８，０８５個の総ＤＭＲが見いだされ、６，６５１個が膵癌患者におけるＨｙｐｅｒ、３１，５４４個がＨｙｐｏであった。これらのＤＭＲからのスケール付きＲＰＫＭ値をヒートマップとして示した（図５Ｃ）。このヒートマップは、距離関数「ユークリッド」、列方向クラスタリングに対するクラスタリング関数「ｗａｒｄ」、及び行方向クラスタリングの「ａｖｅｒａｇｅ」で作成された。
【００５６】
２４個の膵癌組織及び５個の正常ＰＢＭＣからのＲＲＢＳ試料の比較
ＲＲＢＳによってプロファイルされた５個の正常ＰＢＭＣ試料をＧＥＯからダウンロードして（受託ＩＤ  ＧＳＥ８９４７３の全対照試料）、それらのメチル化プロファイルを２４個の膵癌組織ＲＲＢＳ試料と比較した。ダウンロードしたＢＥＤファイルをＲ  ｍｅｔｈｙｌＫｉｔパッケージで構文解析し、処理した２６。次いで、これらの５個の試料を２４名の膵癌患者からの同様に処理されたＲＲＢＳ試料と比較した。カスタム機能を使用して、２４個のＰＣ試料のうち少なくとも１８個、及び５個のＰＢＭＣ試料のうち４個中に存在するＣｐＧを抽出し、常染色体中のＣｐＧのみが保持され、１，８０６，８０８個のＣｐＧのバックグラウンドセットを作製した。これらから、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇで調節されたｐ値＜０．０１及びデルタベータ＞０．２５の基準を用いてＤＭＣを得た。１３４，０２１個のＤＭＣは、膵癌においてＰＢＭＣに比べてＨｙｐｅｒであることがわかった。同様に、同じｑ値カットオフ及びデルタベータ＜−０．２５を用いて、本発明者らは１７９，６６２個のＨｙｐｏ  ＤＭＣを得た。合計３１３，６８３個のＤＭＣを対応するボルケーノプロットにおいて赤い点で示し（図７Ｆ）、ｑ値の負のｌｏｇ１０をデルタベータに対してプロットした（負のｌｏｇ１０ｑ値＝２における水平線は、ＤＭＣをコールするためのｑ値カットオフであり、垂直点線はデルタベータカットオフである）。
【００５７】
原発腫瘍対正常ＰＢＭＣからの、並びに膵癌患者及び健常ドナーのｃｆＤＮＡからの差次的メチル化シグナルの重複の評価
順列分析を行って、血漿中で同定されたＤＭＲ（本発明者らのｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順に供された循環ｃｆＤＮＡ）と原発腫瘍組織中で同定された癌特異的ＤＭＣ（ＲＲＢＳ）の予想対観察重複の頻度を比較した。本発明者らは、可能性のある４つの例を調べた：Ｈｙｐｅｒ  ＤＭＲと重複するＨｙｐｅｒ  ＤＭＣ、Ｈｙｐｏ  ＤＭＲと重複するＨｙｐｅｒ  ＤＭＣ、Ｈｙｐｏ  ＤＭＲと重複するＨｙｐｏ  ＤＭＣ、及び最後にＨｙｐｅｒ  ＤＭＲと重複するＨｙｐｏ  ＤＭＣ。各例では、Ｈｙｐｅｒ又はＨｙｐｏ  ＤＭＣをＨｙｐｅｒ又はＨｙｐｏ  ＤＭＲと重ねて、「生物学的交差」数を得た。次いで、ＤＭＣの各セットを１，８０６，８０８個のＣｐＧのバックグラウンドセット全体にわたって無作為に１０００回混合し、ＤＭＲの各セットと再度重複させた。これらの無作為な生物学的交差をＺスコアを用いて同じスケール上に置き、それぞれボックスプロット及び菱形で示した（図５Ｅ）。これらのプロットにおける水平の点線は、ボンフェローニ補正から誘導されるｑ値０．０５に関連するカットオフＺスコアである。
【００５８】
２４個の膵癌組織及び２４個の正常組織からのＲＲＢＳ試料の比較、これらの組織から並びに膵癌患者及び健常ドナーのｃｆＤＮＡからの差次的メチル化シグナルの重複の評価
５個の正常ＰＢＭＣ試料と比較した２４個のＰＣ試料を同じ患者由来の２４個の正常組織とも別々に比較した。バックグラウンドセット（７６３，８７４個のＣｐＧ）及びＰＣ中のＤＭＣ  Ｈｙｐｅｒ＆Ｈｙｐｏ（それぞれ３４，０１３＆１１，１６０）を同じ方法で計算し、これらを使用して、ボルケーノプロット（図７Ｃ）とボックスプロット（図５Ｄ）を同様に作成した。
【００５９】
２４個のＰＣ及び２４個の健常ｃｆＤＮＡ試料上のＰＣＡプロット
本発明者らは、上位百万の最も変わりやすい全ゲノム窓を用いた２４個のＰＣ及び２４個の健常ｃｆＤＮＡ試料についてのＰＣＡによる目的変数なしのクラスタリング分析を行った（図７Ａ〜Ｂ）。各窓について、可変性を平均絶対偏差（ＭＡＤ）測定規準によって計算した。これは、データの中央値から絶対偏差の中央値を返す堅牢な測定であり、データは、所与の窓に対するこれら４８試料にわたるＲＰＫＭ値である。
【００６０】
２４個のＰＣ及び２４個の健常ｃｆＤＮＡ試料において低メチル化されたモチーフに関連するＴＦのＧＴＥｘ発現プロファイルを有するヒートマップ
ＲＮＡ−ＳｅｑデータをＧＴＥｘデータベースから全ヒト遺伝子に対する組織による中央値ＲＰＫＭの形で得た（ファイルＧＴＥｘ＿Ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｖ６ｐ＿ＲＮＡ−ｓｅｑ＿ＲＮＡ−ＳｅＱＣｖ１．１．８＿ｇｅｎｅ＿ｍｅｄｉａｎ＿ｒｐｋｍ．ｇｃｔ．ｇｚ  ｕｎｄｅｒ  ｈｔｔｐｓ：／／ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｄａｔａｓｅｔｓから得た）。目的ＴＦをそれらの遺伝子名と適合させ、ヒートマップ（図８Ａ、８Ｃ）を全組織にわたってスケール付けされた各ＴＦの中央値ＲＰＫＭを用いて作成した。距離関数「ｍａｎｈａｔｔａｎ」及びクラスタリング関数「ａｖｅｒａｇｅ」を行方向クラスタリングと列方向クラスタリングの両方に使用した。
【００６１】
２４個のＰＣ及び２４個の健常ｃｆＤＮＡ試料において低メチル化されたモチーフに関連するＴＦのＧＴＥｘ発現プロファイルを有するバイオリンプロット
本発明者らが症例対対照における低メチル化領域において有意に濃縮されたモチーフを検出したＴＦが、膵癌試料において有意に上方制御されるかどうか推定するために、本発明者らはｓｓＧＳＥＡスコアを検定統計量とした無作為化検定を使用した。各試料について、本発明者らは、低メチル化モチーフに有意に関連することが判明した８５個のＴＦ、及び８５個のＴＦの無作為な１，０００セットを用いてスコアを計算した（全ヒトＴＦのリストをｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｆｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．ｏｒｇ／ｄａｔａ／にあるファイルＴＦＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔ＿ｄｏｗｎｌｏａｄ＿１８０５１５．ｔｘｔから得た）。ＴＣＧＡ上の１７８名の膵臓腺癌患者からの発現レベルを使用した。
【００６２】
これらのスコアの分布を関連バイオリンプロットに見ることができる（図８Ｅ）。
【００６３】
次いで、ウィルコクソン順位和検定を使用して、不規則分布と観察分布を比較して、ｐ値＜２．２ｅ−１６を得た。
【００６４】
同じ分析を正常膵臓のＧＴＥｘデータに対して行った（図８Ｄ）。全血のＧＴＥｘデータに対してそのモチーフが健常ドナーからの血漿ｃｆＤＮＡにおける低メチル化フットプリントとして同定されたＴＦ（ｎ＝３３）でも分析を繰り返した（図８Ｂ）。
【００６５】
結果／考察
ｃｆＤＮＡメチル化マッピングに適切な全ゲノム方法
ここで記述するｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ法は、１００ｎｇの入力ＤＮＡまで堅牢である既存の低入力ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順１７の改変によって開発された。しかし、血漿試料の大部分は、１００ｎｇよりはるかに少ないＤＮＡを生成する。この難題を克服するために、本発明者らは、開始ＤＮＡの量を１００ｎｇに人為的に膨張させるために、外来λＤＮＡ（フィラーＤＮＡ）をアダプター連結ｃｆＤＮＡライブラリに添加した（図２）。これは、抗体による非特異的結合の量を最小にし、プラスチック製品との結合のために失われるＤＮＡの量も最小にする。フィラーＤＮＡは、アダプター連結ｃｆＤＮＡライブラリにサイズが類似したアンプリコンからなり、非メチル化ＤＮＡ及びＣｐＧ密度の異なるインビトロメチル化ＤＮＡで構成された。異なる患者は異なる量のｃｆＤＮＡを生成するので、このフィラーＤＮＡの添加は、実用にも役立ち、入力ＤＮＡ量を１００ｎｇに規準化することができる。これによって、利用可能なｃｆＤＮＡの量にかかわらず、下流の手順がすべての試料で確実に正確に同じままである。
【００６６】
本発明者らは、まず、ｃｆＤＮＡで認められたものと類似の断片サイズに剪断されたヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６からのＤＮＡを用いて、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順を確認した。ＨＣＴ１１６を選択したのは、公的ＤＮＡメチル化データが入手可能だからであった。本発明者らは、１００ｎｇの剪断細胞系ＤＮＡを用いた最も基準となるＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順１７と１０ｎｇ、５ｎｇ及び１ｎｇの同じ剪断細胞系ＤＮＡを用いたｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順を同時に行った。これを２つの生物学的複製において行った。すべての条件で、本発明者らは、９９％を超える反応の特異性（１−［添加非メチル化対照ＤＮＡの回収／添加メチル化対照ＤＮＡの回収］）、及び非メチル化領域（ＧＡＰＤＨ）を超える公知メチル化領域（ＴＳＨ２Ｂ０）の極めて高い濃縮を得た（図３Ｂ）。
【００６７】
ライブラリを約３０００〜７０００万リード／ライブラリ（表２）で飽和まで配列決定した（図３Ａ）。生のリードをヒトゲノムとλゲノムの両方と整列させ、λゲノムと実質的にアラインメントがないことが判明した（表３Ａ及び３Ｂ）。したがって、フィラーＤＮＡとしての外来λＤＮＡの添加は、配列決定データの生成を妨害しなかった。最後に、本発明者らは、免疫沈降ステップの品質管理手段としてＣｐＧ濃縮スコアを計算する２５。すべてのライブラリはＣｐＧに対して類似の濃縮を示したが、入力対照は、予想通り、濃縮を示さず（図３Ｃ）、極低入力（１ｎｇ）でも本発明者らの免疫沈降の有効性を確認した。
【００６８】
異なる入力ＤＮＡレベルを比較する全ゲノム相関推定によれば、ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（１００ｎｇ）法とｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ（１０、５及び１ｎｇ）法の両方が極めて堅牢であり、ピアソン相関が任意の２つの生物学的複製間で少なくとも０．９４であった（図１Ｂ）。分析の更に示すところによれば、５及び１０ｎｇの入力ＤＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、従来のＭｅＤＩＰ−ｓｅｑによって１００ｎｇで得られるメチル化プロファイルを堅牢に再現することができる（少なくとも０．９のペアワイズピアソン相関）（図１Ｂ）。１ｎｇの入力ＤＮＡにおけるｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑの性能は、１００ｎｇにおけるＭｅＤＩＰ−ｓｅｑよりも低下するが、それでも＞０．７の強いピアソン相関を示す（図１Ｂ）。本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順が、最も基準となるＲｅｄｕｃｅｄ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）及びＷｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＧＢＳ）を用いたＨＣＴ１１６のＤＮＡメチル化プロファイルを再現することも認めた（図１Ｃ）。要するに、発明者らのデータが示唆するところによれば、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、循環ｃｆＤＮＡなどの断片化された低入力ＤＮＡ材料の全ゲノムメチル化マッピングの堅牢な手順である。
【００６９】
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、腫瘍由来のｃｔＤＮＡの検出で高感度を示す
ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ手順の感度を評価するために、本発明者らは、結腸直腸癌（ＣＲＣ）ＨＣＴ１１６細胞系ＤＮＡを多発性骨髄腫（ＭＭ）ＭＭ１．Ｓ細胞系ＤＮＡに段階希釈した。どちらもｃｆＤＮＡサイズを模倣するように剪断された。本発明者らは、ＣＲＣ  ＤＮＡを１００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％から０％に希釈し、これらの希釈の各々についてｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを行った（図４Ａ〜Ｄ）。本発明者らは、同じ試料における３点変異の検出のために超深度（１０，０００×中央値カバー度）標的配列決定も行った。５％偽陽性率（ＦＤＲ：Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ）閾値を用いた各ＣＲＣ希釈ポイント対純粋ＭＭ  ＤＮＡで同定されたＤＭＲの観察数は、希釈係数に基づくＤＭＲの予想数と０．００１％希釈までほぼ完全に線形（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）であった（図１Ｄ）。さらに、これらのＤＭＲ内のＤＮＡメチル化シグナルも、観察対予想シグナルでほぼ完全な線形性を示す（ｒ２＝０．９９、ｐ＜０．０００１）（図１Ｅ）。それに対して、１％希釈を超えると、超深度標的配列決定は、ＰＣＲ又は配列決定誤差のために、ＣＲＣ特異的変異体と偽変異体を確実に識別することができなかった（図１Ｆ）。したがって、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、癌由来のＤＮＡの検出感度に優れ、標準手順を用いた超深度標的配列決定による変異体検出の性能を超える。
【００７０】
癌ＤＮＡは、ＣｐＧリッチ領域において頻繁に高メチル化される１。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑはメチル化ＣｐＧリッチ配列を特異的に標的にするので、本発明者らは、ｃｔＤＮＡが免疫沈降手順中に優先的に濃縮されると仮定した。これを試験するために、本発明者らは、２名の結腸直腸癌患者から患者由来の異種移植片（ＰＤＸ：ｐａｔｉｅｎｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）を作製し、マウス血漿を収集した。腫瘍由来のヒトｃｆＤＮＡは、入力試料中の総ｃｆＤＮＡプール内で１％未満の頻度で存在し、免疫沈降後２倍の存在量で存在した（図１Ｇ）。これらの結果の示唆するところによれば、ｃｔＤＮＡの偏りのある配列決定によって、ｃｆＭｅＤＩＰ手順は、ｃｔＤＮＡ検出感度を更に増加させることができた。
【００７１】
血漿ｃｆＤＮＡのメチローム分析は、初期膵臓腺癌患者を健常ドナーから識別する
本発明者らは、血漿ｃｆＤＮＡのメチローム分析を初期癌におけるｃｔＤＮＡの検出に使用できるかどうか検討することにした。本発明者らは、２４名の初期膵癌患者（症例）並びに２４名の年齢及び性別対応健常ドナー（対照）の手術前血漿のメチローム分析を行った（表４Ａ、４Ｂ及び５）。各患者について、高腫瘍純度のレーザーキャプチャー顕微解剖（ＬＣＭ：ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）腫瘍試料及び正常組織試料を調べた。ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを腫瘍及び正常組織上の循環ｃｆＤＮＡ及びＲＲＢＳに対して行った（図５Ａ及び図６、表６Ａ及び６Ｂ）。ｔ検定及びＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を多重検定に使用して、本発明者らは、症例と対照ｃｆＤＮＡの間で３８，０８５個のＤＭＲを得た（ｐ＜０．０１、ｑ＜０．１）（図５Ｂ〜Ｃ）。
【００７２】
症例と対照のｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの相違がｃｔＤＮＡの存在によるかどうか評価するために、外科的切除後に同じ患者から得られた原発腫瘍及び正常組織のＤＮＡメチル化パターンをＲＲＢＳによってマップした。本発明者らは、腫瘍（ｎ＝２４）と正常（ｎ＝２４）組織の間で４５，１７３個の差次的メチル化ＣｐＧ（ＤＭＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＣｐＧ）を同定した（図７Ａ〜Ｃ）。
【００７３】
それらの最初の腫瘍のメチル化プロファイルを再現する際のｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの有用性を、腫瘍中のＤＭＣとｃｆＤＮＡ中のＤＭＲの組合せ（どちらも高メチル化、どちらも低メチル化、一方が高メチル化で他方が低メチル化）についてバックグラウンドに対する濃縮を調べることによって試験した。本発明者らは、ｃｆＤＮＡにおける一致方向の腫瘍特異的高メチル化及び低メチル化部位の有意な濃縮を認めたが、腫瘍特異的高メチル化部位はｃｆＤＮＡ低メチル化ＤＭＲでは提示不足であった（図５Ｄ）。実際、腫瘍中の所与の領域のＤＮＡメチル化状態と血漿ｃｆＤＮＡにおけるメチル化プロファイルは相関する（図７Ｄ〜Ｅ）。
【００７４】
最後に、特に初期の、癌患者における血漿ｃｆＤＮＡ分子の大部分は、非腫瘍由来であり、血球から放出される可能性があるので１４、本発明者らは、膵臓腺癌腫瘍組織と正常末梢血単核球（ＰＢＭＣ：Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌ）のＤＮＡメチル化差違を評価した。本発明者らは、腫瘍（ｎ＝２４）とＰＢＭＣ（ｎ＝５）の間で３１３，６８３個のＤＭＣを同定した（図７Ｆ）。本発明者らは、ｃｆＤＮＡにおける一致方向の腫瘍特異的高メチル化及び低メチル化部位の有意な濃縮を認めたが、腫瘍特異的高メチル化部位はｃｆＤＮＡ低メチル化ＤＭＲでは提示不足であった（図５Ｅ）。ここでも、腫瘍中の所与の領域のＤＮＡメチル化状態と血漿ｃｆＤＮＡにおけるメチル化プロファイルは相関する（図７Ｇ〜Ｈ）。
【００７５】
要するに、これらの結果の示唆するところによれば、症例と対照の循環ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの相違は、主として循環系における腫瘍由来のＤＮＡの存在によるものであった（図５Ｄ〜Ｅ及び図７Ｃ〜Ｈ）。
【００７６】
血漿ｃｆＤＮＡメチロームは、腫瘍関連活性転写因子ネットワークの推定を可能にする
症例と対照の間のＤＭＲは、腫瘍由来のＤＭＲでは高度に濃縮されるので（図５Ｄ〜Ｅ）、本発明者らは、ｃｆＤＮＡメチロームが腫瘍特異的又は組織関連活性転写因子に関連したモチーフの濃縮を明らかにすると仮定した。これらのｃｆＤＮＡメチロームを使用して、これらのＤＮＡ分子の起源組織における活性転写ネットワークを推測することができた。ＴＦの大部分が標的配列のＤＮＡメチル化状態に基づく可変の結合を示すので２８、活性転写ネットワークを推測するために、本発明者らは、ｃｆＤＮＡ中のＤＭＲが転写因子（ＴＦ）フットプリントの濃縮を明らかにし得るかどうか検討した。モチーフ分析をＨＯＭＥＲソフトウェア２０を用いて低メチル化ＤＭＲに対して、健常ドナー（図８Ａ）と膵癌患者（図８Ｃ）で別々に行って２０、潜在的ＴＦフットプリントを明らかにした。
【００７７】
本発明者らは、膵臓腺癌症例に比べて健常ドナーにおいて３３個のモチーフを低メチル化フットプリントとして同定し、健常ドナーに比べて膵臓腺癌症例において８５個のモチーフを低メチル化フットプリントとして同定した。
【００７８】
健常ドナーにおいて低メチル化フットプリントとして同定された３３個のモチーフのうち、本発明者らは、ＰＵ．１、Ｆｌｉ１、ＳＴＡＴ５Ｂ及びＫＬＦ１を含めて、造血系統において優先的に発現される幾つかのＴＦを同定した（図８Ａ〜Ｂ）。
【００７９】
同様に、膵臓腺癌症例において低メチル化フットプリントとして同定された８５個のモチーフのうち、本発明者らは、ＲＢＰＪＬ、ＰＴＦ１ａ、Ｏｎｅｃｕｔ１（ＨＮＦ６）及びＮＲ５Ａ２を含めて、膵臓において優先的に発現される幾つかのＴＦを同定した（図８Ｃ〜Ｄ）。膵臓腺癌症例において低メチル化フットプリントとして同定されたＴＦモチーフは、ＴＣＧＡからの膵臓腺癌患者においても頻繁に過剰発現された（図８Ｅ）。さらに、本発明者らは、膵癌の各分子サブタイプのドライバーとして以前に同定されたＴＦに対応する、膵臓腺癌症例における幾つかの低メチル化フットプリントを同定することができた２４。これらには、ｃ−ＭＹＣ及びＨＩＦ１ａ（扁平上皮サブタイプドライバー）、ＮＲ５Ａ２、ＭＡＦＡ、ＲＢＰＪＬ及びＮＥＵＲＯＤ１（ＡＤＥＸドライバー）並びに最後にＦＯＸＡ２及びＨＮＦ４Ａ（膵臓前駆細胞サブタイプ）が含まれた。
【００８０】
要するに、これらの結果の示唆するところによれば、循環ｃｆＤＮＡのメチローム分析を使用して、差次的メチル化ＴＦフットプリントに基づく腫瘍内の活性転写ネットワークを推測することができ、健常ドナーと癌患者の間の免疫細胞集団の全身的シフトを同定できる可能性がある。
【００８１】
ここで、発明者らは、循環無細胞ＤＮＡなどの超低入力、断片化ＤＮＡに適した新規全ゲノムＤＮＡメチル化法を示す。本発明者らは、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑが低レベルの入力ＤＮＡにおいて極めて堅牢であり、ライブラリの迅速な作製を可能にすることを示すことができた。さらに、本発明者らの方法はメチル化ＤＮＡの濃縮に依拠するので、ライブラリを飽和まで配列決定するには、約３０００万〜７０００万リード／ライブラリしか必要でなく、全ゲノム配列決定を不要にし、関連コストをかなり削減する。比較的低コストに加えて短い所要時間によって、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑを臨床現場に素早く移すことができる。
【００８２】
さらに、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、ゲノム情報ではなくエピジェネティック情報に依拠するので、非悪性疾患の広範なセットにおいて組織損傷を非侵襲的にモニターするのに使用できる可能性がある。例えば、それを使用して、感染に対する、又は癌免疫療法後の、免疫応答をモニターすることができ、心筋梗塞後の循環中の心臓ＤＮＡ、又は神経変性疾患初期の脳ＤＮＡをモニターすることができる。
【００８３】
最後に、腫瘍学に関連して、複数の癌タイプが臨床的に異なるサブグループを有することが判明した。これらのサブグループは、多数の癌タイプの中でも、グリア芽細胞腫３、上衣腫４、結腸直腸５、乳房６、７及び膵癌２４における予後予測因子を有する異なるＤＮＡメチル化プロファイルによって層別化することができる。最近のデータの示唆するところによれば、膵癌患者を幾つかの機序によって駆動される４つのサブグループに層別化することができる２４：扁平上皮、膵臓前駆細胞、免疫原性、及び内分泌外分泌異常分化（ＡＤＥＸ：ａｂｅｒｒａｎｔｌｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｅｘｏｃｒｉｎｅ）。膵癌患者の循環ｃｆＤＮＡメチロームにおいては、本発明者らは、これらのサブタイプを駆動するＴＦからの低メチル化フットプリントを同定することができた。例えば、本発明者らは、扁平上皮サブタイプにおいて濃縮された２つの経路ＭＹＣ及びＨＩＦ１アルファ（低酸素誘導因子１−アルファ）を同定した２４。本発明者らは、前駆細胞サブタイプにおいて濃縮された２つのＴＦ、ＨＮＦ４Ａ及びＦＯＸＡ２を同定することもできた２４。最後に、本発明者らは、ＡＤＥＸサブタイプにおいて濃縮された３つのＴＦ、ＮＲ５Ａ２、ＲＢＰＪＬ及びＭＡＦＡを同定することもできた２４。これが示唆するところによれば、ｃｆＭｅＤＩＰ−ｓｅｑは、癌患者を低侵襲手法で層別化するバイオマーカーとして使用することもできた。
【００８４】
本発明を特定の実施形態に関して記述した。本発明の精神及び範囲内にありながら変化及び変更を加え得ることは、当業者に明白であろう。本明細書に開示される特定の実施形態は、保護範囲を限定することを意図したものではなく、保護範囲は、特許請求の範囲によってのみ決定されるべきである。本明細書に開示されるすべての刊行物及び参考文献を参照によりその全体を援用する。
【００８５】
【表２】
2019521315.tif 000004
【００８６】
【表３】
2019521315.tif 000005
【００８７】
【表４】
2019521315.tif 000006
【００８８】
【表５】
2019521315.tif 000007
【００８９】
【表６】
2019521315.tif 000008
【００９０】
【表７】
2019521315.tif 000009
【００９１】
【表８】
2019521315.tif 000010
【００９２】
【表９】
2019521315.tif 000011
【００９３】
【表１０】
2019521315.tif 000012
【００９４】
参考文献
【００９５】
【表１１】
2019521315.tif 000013
【００９６】
【表１２】
2019521315.tif 000014
【００９７】
【表１３】
2019521315.tif 000015
【図１Ａ】
2019521315.tif 000016
【図１Ｂ】
2019521315.tif 000017
【図１Ｃ】
2019521315.tif 000018
【図１Ｄ】
2019521315.tif 000019
【図１Ｅ】
2019521315.tif 000020
【図１Ｆ】
2019521315.tif 000021
【図１Ｇ】
2019521315.tif 000022
【図２】
2019521315.tif 000023
【図３Ａ−１】
2019521315.tif 000024
【図３Ａ−２】
2019521315.tif 000025
【図３Ａ−３】
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【図３Ｂ】
2019521315.tif 000027
【図３Ｃ】
2019521315.tif 000028
【図４Ａ】
2019521315.tif 000029
【図４Ｂ】
2019521315.tif 000030
【図４Ｃ】
2019521315.tif 000031
【図４Ｄ−１】
2019521315.tif 000032
【図４Ｄ−２】
2019521315.tif 000033
【図５Ａ】
2019521315.tif 000034
【図５Ｂ】
2019521315.tif 000035
【図５Ｃ】
2019521315.tif 000036
【図５Ｄ】
2019521315.tif 000037
【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
2019521315.tif 000039
【図６Ｂ】
2019521315.tif 000040
【図６Ｃ】
2019521315.tif 000041
【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2019521315.tif 000043
【図７Ｂ】
2019521315.tif 000044
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2019521315.tif 000047
【図７Ｆ】
2019521315.tif 000048
【図７Ｇ】
2019521315.tif 000049
【図７Ｈ】
2019521315.tif 000050
【図８Ａ】
2019521315.tif 000051
【図８Ｂ】
2019521315.tif 000052
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
2019521315.tif 000056
【図１０】
2019521315.tif 000057
【国際調査報告】
2019521315.tif 000058
2019521315.tif 000059