(57)【要約】  本発明は、有機化合物の化学、薬理学、及び医学に関し、そして、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−Ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンの新規塩形を使用する、骨組織及び／又は軟骨組織の代謝障害に関連するヒト及び動物の疾患、特に筋骨格系の疾患、例えば変形性関節炎又は骨粗鬆症の予防及び治療に関する。本化合物と４−メチルベンゼンスルホン酸との塩（Ｉ）（その水和物及び溶媒和物、並びに該塩、水和物、及び溶媒和物の同質異像を含む）は、Srcファミリーのキナーゼ、Sykキナーゼ、及び他の処置的に重要なキナーゼの阻害の有効性の増大、並びに許容し得る薬物動態パラメータを特徴とする。また、本発明は、処置的に有効な量の本発明に係る塩を含有する医薬組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩:
【化７】
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その水和物、溶媒和物、又は前記塩、水和物、若しくは溶媒和物の同質異像。
【請求項２】
水和物又は水和物の同質異像である、請求項１記載の塩。
【請求項３】
水和物の同質異像が、単位格子の以下のパラメータ：ａ＝１０．９８±０．０５Å、ｂ＝２８．４８±０．０５Å、ｃ＝１０．６０±０．０５Å、β＝１１３．７±０．１°、Ｖ＝３，０３７．５±０．５Å３；空間群Ｐ２１／ｃを特徴とする結晶相である、請求項２記載の塩。
【請求項４】
水和物の同質異像が、１．５４０６Åの波長のＣｕＫα１線を使用して２５±５℃の温度で粉末Ｘ線回折法によって得られた、回折角（２θ）６．２；８．８；９．６；１０．７；１１．０；１１．６；１２．４；１５．３；１６．２；１６．５；１７．０；１７．４；１７．６；１７．９；１８．３；１８．６；１９．３；１９．３；１９．６；２０．６；２０．９；２３．５；２５．２；２６．２；２６．５；２７．２；２７．６、及び３０．２におけるデバイ回折パターンにおける固有ピークを特徴とする結晶相である、請求項２記載の塩。
【請求項５】
水和物の同質異像が、単位格子の以下のパラメータ：ａ＝１１．０９±０．０５Å、ｂ＝１４．３８±０．０５Å、ｃ＝１０．５３±０．０５Å、α＝９０．０６±０．１°、β＝１１４．６±０．１°、γ＝９１．１±０．１°、Ｖ＝１，５２５．９±０．５Å３；空間群
【化８】
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を特徴とする結晶相である、請求項２記載の塩。
【請求項６】
水和物の同質異像が、１．５４０６Åの波長のＣｕＫα１線を使用して２５±５℃の温度で粉末Ｘ線回折法によって得られた、回折角（２θ）６．１；８．８；１０．６；１１．０；１１．５；１２．３；１５．０；１５．２；１５．５；１５．８；１６．１；１６．３；１７．３；１７．６；１７．９；１８．５；１９．５；２０．５；２０．７；２０．８；２４．６；２４．８；２５．１；２６．１；２６．５；２６．９；３０．１、及び４３．０におけるデバイ回折パターンにおける固有ピークを特徴とする結晶相である、請求項２記載の塩。
【請求項７】
異常なキナーゼ活性に関連する障害を予防及び／又は治療するための、請求項１〜６のいずれか記載の塩の使用。
【請求項８】
前記キナーゼが、非受容体タンパク質キナーゼであることを特徴とする、請求項７記載の使用。
【請求項９】
非受容体タンパク質キナーゼが、Sykキナーゼ又はSrcファミリーのキナーゼから選択されることを特徴とする、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
Srcファミリーのキナーゼが、c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Yrk、Lyn、Blk、Hck、又はLckのキナーゼであることを特徴とする、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
異常なキナーゼ活性に関連する障害を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、処置的に有効な量の請求項１〜６のいずれか記載の塩と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る補助物質とを含有する医薬組成物。
【請求項１２】
補助物質が、担体及び／又は賦形剤であることを特徴とする、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記キナーゼが、非受容体タンパク質キナーゼである、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
非受容体タンパク質キナーゼが、Sykキナーゼ又はSrcファミリーのキナーゼから選択されることを特徴とする、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Srcファミリーのキナーゼが、c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Frk、Lyn、Blk、Hck、又はLckのキナーゼであることを特徴とする、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
異常なキナーゼ活性に関連する障害が、骨及び／又は軟骨の代謝の障害に関連する疾患であることを特徴とする、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１７】
骨及び／又は軟骨の代謝の障害に関連する疾患が、筋骨格疾患であることを特徴とする、請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
筋骨格疾患が、変形性関節炎、骨粗鬆症、又は骨軟骨症であることを特徴とする、請求項１７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機化合物の化学、薬理学、及び医学、すなわち、骨及び／又は軟骨の代謝の障害に関連する筋骨格疾患、特に、骨粗鬆症、変形性関節炎、及び骨軟骨症の処置に有望な化合物の塩形及びその結晶形（多形）に関する。
【０００２】
背景技術
骨粗鬆症、変形性関節炎、及び骨軟骨症等の筋骨格疾患の発生率の増大の問題が次第に現実的なものとなりつつある。これは、この問題をテーマとする多数の刊行物に示されている。様々な分野の専門家の尽力にもかかわらず、この問題は解決からは程遠い。
【０００３】
骨粗鬆症は、最も一般的なヒト骨疾患である。これは、骨強度の低下及び病的骨折のリスク増大につながる恐れがある骨量の減少及び骨組織の微細構造の劣化の進行を特徴とする慢性全身性疾患である。現在、骨粗鬆症は、原発性及び続発性の骨粗鬆症である２つの基本的な種類に分類される。骨粗鬆症の処置に使用される薬物は、骨吸収阻害剤（エストロゲン、選択的エストロゲン受容体調節因子、選択的組織エストロゲン活性制御因子、カルシトニン、ビスホスホナート、及び他の薬物（オダナカチブ、デノスマブ等））；骨形成刺激物質（フッ化物、成長ホルモン、アナボリックステロイド、アンドロゲン）；多機能薬（ラネリック酸ストロンチウム、エルゴカルシフェロールの活性代謝物、オセイン−ヒドロキシアパタイト化合物）である。
【０００４】
骨粗鬆症処置の問題は、広範な承認薬が存在するにもかかわらず依然として話題の課題である。長期にわたる薬物投与によって誘発される重篤な副作用及び長期にわたる処置に対するコンプライアンスが低いことが、既存の処置の主な問題点である。
【０００５】
変形性関節炎（ＯＡ）は、病理過程が全ての関節要素：軟骨、軟骨下骨板、滑膜、靭帯、包、及び筋肉を含むときの器官病変、すなわち、関節全体の障害であると考えられる。
【０００６】
変形性関節炎の処置は、疾患の症状の回復、すなわち、疼痛の緩和、関節機能の改善、及び病状進行の阻止を依然として行おうとしている。多くのガイドラインで立案されている非薬理学的方法と薬理学的な方法との組み合わせによって対症効果は得られる。ほとんどの場合、既存の処置法では、関節組織の新生、病状進行の阻止、又は疾患進行の少なくとも長期かつ安定的な減速は達成されない。
【０００７】
したがって、骨粗鬆症、変形性関節炎、及び骨軟骨症等の骨及び／又は軟骨の代謝の障害に関連する筋骨格疾患を処置する他の方法と共に、新たな有効な薬物を開発する必要がある。細胞内シグナル伝達経路の調節は、最も興味深いトレンドの１つであると考えられる。
【０００８】
タンパク質キナーゼは、重要な細胞プロセスの制御にとって重要なタンパク質ファミリーであり；これらタンパク質の活性の障害の結果、様々な疾患が生じることがある。タンパク質キナーゼの異常な活性に関連する疾患の処置に対する有望なアプローチは、その活性を阻害するために低分子量化合物を使用することである。診療用に承認されているこのような阻害剤の例は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブである。キナーゼ阻害剤である多くの薬物候補が、現在臨床試験段階又は前臨床段階にある。
【０００９】
c-Srcキナーゼ（癌原遺伝子チロシン−タンパク質キナーゼ）は、胚発生及び細胞成長のプロセスに関与する非受容体チロシンキナーゼである。c-Srcキナーゼの阻害は、様々なインビトロモデルにおいてアクチン環の形成をブロックし、そして、破骨細胞によって媒介される骨破壊を防ぐことが証明された。更に、c-Srcキナーゼは、この組織におけるジストロフィ変性プロセスに関連する疾患に特徴的な、異常な軟骨代謝に関連する軟骨細胞の肥大性変化を引き起こすシグナル伝達経路に関与している。
【００１０】
サラカチニブは、インビトロにおいて骨組織の吸収を阻害するSrcキナーゼの新規競合的阻害剤であることが既に証明されている。第Ｉ相臨床試験の過程で、サラカチニブが、全く有害事象なしに健常人の骨組織の破骨細胞によって媒介される吸収を阻害することが立証された（R. A. Hannon, G. Clack, M. Rimmer et al. Effects of the Srcキナーゼ inhibitor saracatinib (AZD0530) on bone turnover in healthy men: a randomized, doubleblind, placebo-controlled, multiple ascending dose phase I trial.// J Bone Miner Res. 2010. V. 25. No. 3. P. 463 - 71.）。しかし、更なる臨床試験は、処置的に有効な用量に毎日曝露すると、サラカチニブの高い毒性によって、筋骨格疾患を処置するための診療においてこの薬物を使用できなくなることが示された。
【００１１】
したがって、c-Srcキナーゼの阻害は、病因が骨及び軟骨の異常な代謝に関連する骨粗鬆症、変形性関節炎、及び他の筋骨格疾患を管理する非常に有望なストラテジである。
【００１２】
しかし、Srcキナーゼ阻害剤に基づく薬物は、現在、筋骨格疾患を処置の診療において利用することができない。したがって、骨粗鬆症、変形性関節炎、及び他の筋骨格疾患を処置するための新たな有効な薬物、すなわち、c-Srcキナーゼ阻害剤を研究及び開発するという課題が生じる。
【００１３】
発明の開示
本発明の目的は、有効な筋骨格疾患処置のため、特に、骨粗鬆症及び変形性関節炎を処置するための、許容し得る薬物動態を有する新規薬物の開発である。
【００１４】
本発明の技術的結果は、有効なキナーゼ阻害剤、特にc-Srcキナーゼ阻害剤であって、骨及び軟骨の代謝の障害を引き起こす異常なキナーゼ活性に関連する疾患を処置するためにこの阻害剤を使用することを可能にする、すなわち、筋骨格疾患、特に変形性関節炎及び骨粗鬆症を処置するために使用することを可能にする動物及びヒトの血液中における高い阻害活性及び薬物動態パラメータ、特に高い最高及び１日平均の濃度並びに高いAUC∞値（濃度−時間曲線下面積）を有する阻害剤の開発及び調製である。
【００１５】
更なる技術的結果は、生成及び精製のプロセスが容易にスケーラブルであること、並びに生成された化合物の最小数の精製段階で高純度の生成物が得られることを特徴とする、キナーゼ阻害剤、特にc-Srcキナーゼ阻害剤の開発及び調製である。
【００１６】
指定の技術的結果は、Srcファミリーのキナーゼ、特にc-Srcキナーゼ及びSykキナーゼの異常な活性を阻害することができる、４メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩
【化１】
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又は塩の水和物、溶媒和物に加えて、同質異像を生成することによって達成される。
【００１７】
本発明の特定の実施態様では、４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩は、その水和物及び同質異像である。
【００１８】
本発明の特定の実施態様は、４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の一水和物及びその同質異像を示す。
【００１９】
本発明の最も好ましい実施態様の１つは、ａ＝１０．９８±０．０５Å、ｂ＝２８．４８±０．０５Å、ｃ＝１０．６０±０．０５Å、β＝１１３．７±０．１°に等しい１．５４０６Åの波長及びＶ＝３，０３７．５±０．５Å３の体積を有するＣｕＫα１線を使用して２５±５℃でＸ線粉末回折（XRD）の方法によって決定された、単位格子の以下のパラメータを有する結晶相である、４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の一水和物の同質異像である。空間群Ｐ２１／ｃ。この同質異像のデバイ回折パターンにおける固有ピークの位置（２θ）：６．２；８．８；９．６；１０．７；１１．０；１１．６；１２．４；１５．３；１６．２；１６．５；１７．０；１７．４；１７．６；１７．９；１８．３；１８．６；１９．３；１９．３；１９．６；２０．６；２０．９；２３．５；２５．２；２６．２；２６．５；２７．２；２７．６；３０．２。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施態様は、ａ＝１１．０９±０．０５Å、ｂ＝１４．３８±０．０５Å、ｃ＝１０．５３±０．０５Å、α＝９０．０６°、β＝１１４．６±０．１°、γ＝９１．１°に等しい１．５４０６Åの波長及びＶ＝１，５２５．９±０．５Å３の体積を有するＣｕＫα１線を使用して２５±５℃でXRDによって決定された、単位格子の以下のパラメータを有する結晶相である、４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の一水和物の同質異像である。空間群
【化２】
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この同質異像のデバイ回折パターンにおける固有ピークの位置（２θ）：６．１；８．８；１０．６；１１．０；１１．５；１２．３；１５．０；１５．２；１５．５；１５．８；１６．１；１６．３；１７．３；１７．６；１７．９；１８．５；１９．５；２０．５；２０．７；２０．８；２４．６；２４．８；２５．１；２６．１；２６．５；２６．９；３０．１；４３．０。
【００２１】
また、本発明は、異常なキナーゼ活性の阻害剤としての本発明に係る塩、又はその水和物、溶媒和物、及び同質異像の使用を網羅する。更に、本発明の幾つかの実施態様では、該キナーゼは、非受容体タンパク質キナーゼであり、特に、該キナーゼは、Sykキナーゼ又はSrcファミリーのキナーゼから選択される。Srcファミリーのキナーゼは、c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Yrk、Lyn、Blk、Hck、又はLckのキナーゼである。
【００２２】
また、指定の技術的結果は、本発明に係る塩、又はその水和物、溶媒和物、及び同質異像を使用して異常なキナーゼ活性に関連する障害を予防及び／又は治療するための医薬組成物を生成することによって達成される。更に、本発明の幾つかの実施態様では、該キナーゼは、非受容体タンパク質キナーゼであり、特に、該キナーゼは、Sykキナーゼ又はSrcファミリーのキナーゼから選択される。Srcファミリーのキナーゼは、c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Yrk、Lyn、Blk、Hck、又はLckのキナーゼである。
【００２３】
更に、本発明は、有効量の本発明に係る塩と、少なくとも１つの薬学的に許容し得る補助物質とを含有することを特徴とする、異常なキナーゼ活性に関連する障害を予防及び／又は治療するための医薬組成物を示す。本発明の幾つかの実施態様では、該補助物質は、薬学的に許容し得る担体及び／又は賦形剤である。これら組成物は、非受容体タンパク質キナーゼであるキナーゼの活性を調節するために設計され、特に、該キナーゼは、Sykキナーゼ又はSrcファミリーのキナーゼから選択される。Srcファミリーのキナーゼは、c-Src、Yes、Fyn、Fgr、Yrk、Lyn、Blk、Hck、又はLckのキナーゼである。
【００２４】
また、本発明は、本発明に係る医薬組成物を身体に投与することを含む、この身体における異常なキナーゼ活性に関連する障害を予防及び／又は治療する方法を含む。該異常なキナーゼ活性に関連する障害は、骨及び軟骨の代謝の障害に関連する疾患、特に筋骨格疾患である。本発明の幾つかのオープンエンドな実施態様では、筋骨格疾患は、変形性関節炎又は骨粗鬆症である。本発明の特定の実施態様では、該身体は、ヒト又は動物である。本発明の幾つかの実施態様では、該動物は、ネコ、イヌ、又はウマである。
【００２５】
また、指定の技術的結果は、以下の段階を含む本発明に係る化合物を結晶化する方法によって達成される：
ａ．有機溶媒又は溶媒混合物中の２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンの懸濁液又は溶液に、有機溶媒中の４−メチルベンゼンスルホン酸又はその水和物を導入する段階であって；４−メチルベンゼンスルホン酸又はその水和物が、室温で導入されてもよく、そして、各成分を加熱又は冷却して導入されてもよく；該試薬が逆の順序で混合されてもよい段階と；
ｂ．得られた塩を結晶化する段階と；
ｃ．該溶媒から塩の結晶を分離する段階。
【００２６】
本発明の幾つかの実施態様では、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン用の懸濁媒体として使用される段階（ａ）の溶媒は、アセトンである。
【００２７】
本発明の特定の実施態様では、４−メチルベンゼンスルホン酸又はその水和物を溶解させるために使用される段階（ａ）の溶媒は、エタノールである。
【００２８】
本発明の幾つかの実施態様では、該塩は、段階（ｃ）の後に更に再結晶化される。
【００２９】
本発明の幾つかの他の特定の実施態様では、溶液から塩が得られたときに結晶化を開始させる段階が更に使用される。結晶化は、４−メチルベンゼンスルホン酸塩及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の結晶を溶液に導入するか、又は任意の他の公知の方法によって開始させることができる。
【００３０】
本発明の特定の実施態様では、段階（ａ）の前に、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基を硫酸、塩酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、２−メチルベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、クエン酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、４−ニトロベンゼンスルホン酸、テトラフルオロホウ酸、ヘキサフルオロリン酸、又は他の酸の塩に変換し、そして、続いて、この塩から２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基を得、そして、この塩基から４−メチルベンゼンスルホン酸との塩を繰り返し合成することによる、該塩基を精製する追加の段階が行われる。
【００３１】
遊離塩基２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンは公知であり、そして、露国特許第２５０９７７０号に記載されている。
【００３２】
発明の詳細な開示
実施した研究の結果として、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン（以後、化合物１と称する）が、ナノモル範囲内の最大量の半分の阻害濃度で、Srcキナーゼのファミリーに対する、特にヒトc-Srcキナーゼに対する調節活性を有することが見出された。同時に、この化合物の薬物動態が、異常な骨及び軟骨の代謝を引き起こす異常なキナーゼ活性に関連する疾患を処置するための薬物としての診療における該化合物の使用にとって許容できないことが立証された。具体的には、３０mg/kgの用量でラットに経口投与された化合物１の薬物動態試験は、動物の血漿中の最高濃度が有効性の試験で確立された最低有効濃度よりも１００倍低いことを示した（実施例部分の詳細を参照）。
【００３３】
この問題は、本発明に記載されている通り、４−メチルベンゼンスルホン酸及び塩基としての化合物１の塩である新規塩形の開発及び調製によって解決される。
【００３４】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩は、大部分は、c-Srcキナーゼ活性の阻害において有効である（IC50＝１４nmol/L）ことが見出された。更に、本発明者らは、骨組織の異化に対するこの化合物１の塩の明らかな阻害効果を見出した。指定の効果は、成熟ヒト破骨細胞を使用したモデル系におけるインビトロの実験によって証明された、骨組織の破骨細胞によって媒介される吸収の阻害に関連している。本発明に係る化合物は、異常な骨代謝に関連する筋骨格疾患を処置する、特に他の処置方法に耐性を示す疾患を処置するのに有望である。このような疾患の例は、骨粗鬆症、特に続発性骨粗鬆症、そして、特に関節リウマチに続発する骨粗鬆症を含む。それに加えて、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩、並びにその水和物（特に一水和物）及び／又は同質異像は、骨塩量及び密度の減少、骨の微細構造の劣化に起因する骨質の低下、微小損傷の蓄積、骨石灰化の障害、及び骨リモデリング速度に関連する疾患を処置するために使用することができる。
【００３５】
研究の過程において、予想外にも、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩、並びにその溶媒和物、水和物（特に一水和物）、及び同質異像が好適な薬物動態を有し、そして、異常な骨及び軟骨の代謝を特徴とする疾患を処置するために使用できることが立証された。予想外なことに、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の単回投与は、化合物１の他の塩形と比べて、必要な処置効果を達成するのに必要な用量が著しく低いことが見出された。
【００３６】
また、インビボにおける実験は、ウイスターラットに薬物を胃内投与すると、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物が広範囲に及ぶ用量内で線形の薬物動態を有することも示した。標的器官（骨及び軟骨の組織）における化合物１の１日平均濃度は、動物の血漿中の化合物１の１日平均濃度を３倍超超えている。
【００３７】
それに加えて、本発明に係る化合物１の塩形の生物活性の試験によって、変形性関節炎に特徴的であり、そして、アグリカン発現の著しい増加として顕在化する異常な軟骨代謝に関連する軟骨細胞におけるIL-1β誘発性の肥大性変化に対する、明らかな用量依存性の正の効果を立証することができた。この効果は、アグリカンが軟骨要素の１つである間、アグリカンの生成の４倍超の増加に関連する軟骨同化作用の加速を引き起こす。
【００３８】
したがって、単剤療法のための薬物として又は筋骨格疾患を処置するための他の方法と組み合わせて本発明に係るSrcファミリーのキナーゼの阻害剤、特にc-Srcキナーゼ阻害剤を使用すると、著しくかつ長期にわたる寛解を達成することができる。本発明に係るc-Srcキナーゼ阻害剤は、このような処置を必要としている患者において起こり得る再発を防ぐ機能を有する支持療法剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−１】化合物１の塩、１００mgの結晶化。
【図１−２】化合物１の塩、１００mgの結晶化。
【図１−３】化合物１の塩、１００mgの結晶化。
【図２】化合物１の塩、２，０００mgの結晶化。
【図３−１】化合物１の塩形の元素分析の結果。対応する塩の一水和物の計算値を括弧内に与える。
【図３−２】化合物１の塩形の元素分析の結果。対応する塩の一水和物の計算値を括弧内に与える。
【図４】塩酸及び化合物１の塩の粉末のＸ線回折パターン：ａ）S-3-10-B-HClサンプル；ｂ）S-3-11-C2-HClサンプル。
【図５】臭化水素酸及び化合物１の塩の粉末のＸ線回折パターン（S-3-8-B-HBrサンプル）。
【図６】硫酸及び化合物１の塩の粉末のＸ線回折パターン（S-3-16-D-SAサンプル）。
【図７】ショウノウ酸及び化合物１の塩の粉末のＸ線回折パターン（S-3-9-B-CSAサンプル）。
【図８】メタンスルホン酸及び化合物１の塩の粉末のＸ線回折パターン（S-3-17-D-MSAサンプル）。
【図９】４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の一水和物のＸ線回折パターン：ａ）S-3-12-A1-TSAサンプル、同質異像Ａ；ｂ）SYK 91/1サンプル、同質異像Ｂ。
【図１０】４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の一水和物のTGA（熱重量分析）及びDSC（示差走査熱量測定）の曲線（S-3-12-A1-TSAサンプル、同質異像Ａ）。
【図１１】４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の単位格子の独立部分の一般図：ａ）S-3-12-A1-TSAサンプル、同質異像Ａ；ｂ）SYK 91/1サンプル、同質異像Ｂ。
【図１２】ヒトc-Srcキナーゼ活性に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物（同質異像Ａ）の影響。
【図１３】４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１塩の水和物（同質異像Ａ）の1H及び13C NMRスペクトル：ａ）1H NMRスペクトル（Bruker DRX500,13400、５００．１３MHz、DMSO-d6)；ｂ）13C NMRスペクトル（Bruker DRX500、１２５．７６MHz、DMSO-d6)。
【図１４】４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１塩の水和物（同質異像Ｂ）の1H及び13Cスペクトル：ａ）1H NMRスペクトル（Bruker DRX500,13、５００．１３MHz、DMSO-d6)；ｂ）13C NMRスペクトル（Bruker DRX500,13、１２５．７６MHz、DMSO-d6)。
【図１５】化合物１の遊離塩基のサンプルのHPLC曲線。
【図１６】メタンスルホン酸及び化合物１の塩のサンプルのHPLC曲線。
【図１７】４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物のサンプルのHPLC曲線：ａ）同質異像Ａ；ｂ）同質異像Ｂ。
【図１８】石灰化したマトリクスの相対吸収に対するサラカチニブ、ボスチニブ、及び化合物１の影響。
【図１９】３０mg/kgの用量の遊離塩基を単回経口投与した後のウイスターラットの血漿中における化合物１の平均濃度。各時点についての平均値は、３頭の動物で得られた個々のデータに基づいて求められる。
【図２０】３０mg/kgの用量（遊離塩基当量）の化合物１のメシル酸塩を単回経口投与した後のウイスターラットの血漿中における化合物１の平均濃度。各時点についての平均値は、３頭の動物で得られた個々のデータに基づいて求められる。
【図２１】２１mg/kgの用量（遊離塩基当量）の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物（同質異像Ａ）を単回経口投与した後のウイスターラットの血漿中における化合物１の平均濃度。各時点についての平均値は、６頭の動物で得られた個々のデータに基づいて求められる。
【００４０】
用語及び定義
この文書の目的上、化合物１という用語は、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンを指し、これは、構造式：
【化３】
2019515053.tif 000005
としても提示される。
【００４１】
Ｃという用語は、温度に関して使用されるとき、百分目盛り又は摂氏温度目盛りを意味する。
【００４２】
IC50という用語は、キナーゼ活性の最大の半分阻害が達成される、試験された化合物の濃度を意味する。
【００４３】
懸濁液という用語は、液体媒体、通常水又は有機溶媒に懸濁している固体物質を指す。
【００４４】
この文書における調節という用語は、キナーゼの触媒活性の調節を指す。特に、調節とは、キナーゼの触媒活性の活性化又は阻害を指す。
【００４５】
同質異像という用語は、結晶構造における分子の様々な位置及び／又は立体構造に起因して、幾つかの異なる形態を有し得る固体物質相を指す。同質異像は、通常、異なる化学的及び物理的な特性を有する。それに加えて、同質異像という用語は、化合物の溶媒和物、水和物（すなわち、溶媒又は水を含有する結晶形）に加えて、様々な非溶媒和及び非水和の結晶形も指す。
【００４６】
溶媒和物という用語は、本発明に係る化合物と薬理学的に許容し得る溶媒の１つ以上の分子、例えばエタノールとを含有する分子複合体を説明するために使用される。水和物という用語は、水が溶媒として使用される場合に使用される。
【００４７】
粉末Ｘ線回折パターン又はPXRDパターンという用語は、実験的に観察される回折パターン又はそれから得られるデータを指す。一般的に、粉末Ｘ線回折パターンは、ピークの（ｘ軸における）位置及び（ｙ軸における）強度によって特徴付けられる。ピーク強度という用語は、特定のＸ線回折パターンにおけるシグナルの相対強度を指す。相対ピーク強度に対して影響を与える要因は、サンプルの厚み及び好ましい配向（すなわち、結晶粒子の分布が偶発的ではない）である。本願の目的上、ピーク位置という用語は、粉末回折実験で測定及び観察されるＸ線反射位置の位置を指す。ピーク位置は、単位格子の寸法に直接関連する。その対応する位置によって特定されるピークは、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩の様々な多形についての回折パターンに基づいて得られる。
【００４８】
２−シータ値又は２θという用語は、Ｘ線回折の実験データに基づくピーク位置（度）を指す。一般的に、これは、回折パターンのｘ軸の測定単位である。θは、特定の波長についての回折条件が満たされる角度である。回折されたビームの方向と初期ビームとの間の角度が２θを形成する。本願では、特定の多形についての２θの特定の値が、本願に開示されるＸ線回折の実験条件を使用して測定される２θの値（度）を示すことを理解すべきである。
【００４９】
この文書におけるキナーゼの異常な活性という用語は、病状が存在しないときの細胞におけるキナーゼ活性の基本レベルとは著しく異なるキナーゼ活性を意味する。該異常な活性は、キナーゼの発現レベルの変化、キナーゼを活性化させるプロセスの異常、分解経路の調節解除、及び他の要因から生じ得る。
【００５０】
補助物質という用語は、必要な物理的及び化学的な特性を薬物に付与するために該薬物の組成物中に含まれるか又は薬物生産のプロセスにおいて使用される非有機性又は有機性の任意の薬学的に許容し得る物質を意味する。
【００５１】
AUC（曲線下面積）という用語は、全観察期間内の血漿中の薬物の合計濃度を特徴付ける薬物動態パラメータを意味する。これは、時間に対する血漿中の薬物濃度の関数（薬物動態曲線）の０→∞の積分として数学的に求められ、そして、該薬物動態曲線と座標軸とによって形成される図形の面積に等しい。
【００５２】
Srcキナーゼのファミリーは、c-Srcキナーゼのうちの１つに類似の構造を有する、哺乳類の非受容体チロシン−タンパク質キナーゼのファミリーである。脊椎動物では、Srcファミリーの９種のキナーゼが知られている：Src、Yes、Fgr、Fyn、Lyn、Hck、Lck、Blk、Frk。このファミリーのキナーゼは、細胞成長の制御、細胞内シグナル伝達、そして、特にＴ細胞及びＢ細胞の受容体のシグナル伝達経路、細胞間の接着相互作用等に関与している。Srcファミリーのキナーゼは、骨及び軟骨の代謝に関連するプロセス、並びに自己免疫炎症プロセスの進行において積極的な役割を果たしている。c-Srcキナーゼは、骨の吸収に必要な独自の破骨細胞の細胞骨格であるアクチン環の形成において重要な役割を果たす。
【００５３】
Sykキナーゼ（脾臓チロシンキナーゼ）は、抗原及びFc受容体、BCR及び他の受容体によるシグナルの伝達に関与する非受容体細胞質チロシンキナーゼである。Sykキナーゼは、造血細胞（例えば、マクロファージ、肥満細胞、白血球細胞、血小板、及び赤血球細胞）での最も強力に発現し；上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、肝細胞等における発現はそれほど強くない（Yanagi, S., et al., Biochem BiophysRes Commun, 2001, 288, 495 - 8）。Sykキナーゼは、獲得免疫の発現に関与し、そして、血小板、食細胞、線維芽細胞、及び破骨細胞を含む補給型細胞の機能において重要な役割を果たす。Sykキナーゼは、破骨細胞の分化及び機能において役割を果たす。それに加えて、Sykキナーゼは、溶骨プロセスにおいて特定の役割を果たす。
【００５４】
処置、療法という用語は、哺乳類、好ましくはヒトにおける病的状態の管理を網羅し、そして、この用語が適用される疾患若しくは病態、又はこの疾患若しくは病態の１つ以上の症状のａ）緩和；ｂ）疾患進行のブロック（停止）；ｃ）疾患重篤度の軽減、すなわち、疾患後退の誘導；ｄ）逆行を含む。
【００５５】
予防、防止という用語は、臨床病期疾患の発現の可能性を低減することを目的とする、リスク要因の排除、及び哺乳類、好ましくはヒトにおける疾患の無症候段階の予防的処置を網羅する。予防的処置の患者は、臨床病期疾患が発症するリスクを増加させることが知られている要因に基づいて、一般集団と比較して選択される。予防的処置は、ａ）一次予防及びｂ）二次予防を含む。一次予防は、疾患が未だ臨床病期に進行していない患者の予防的処置として定義される。二次予防は、疾患の再発又は類似の臨床状態の予防を意味する。
【００５６】
本発明の化合物は、骨及び／又は軟骨における原発性の病理学的変化によって条件付けられるか又は様々な疾患若しくは幾つかの薬物の長期投与に関連するものを含む、任意の病因の、そして、任意の全身性又は局所性の、これら組織の代謝の障害並びにこれら組織におけるジストロフィ変性プロセスに関連する筋骨格疾患、特に、骨粗鬆症、変形性関節炎（関節の変形）、及び骨軟骨症を処置するために有望である。幾つかの特定の実施態様では、本発明に係る化合物は、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、薬物誘発性骨粗鬆症、癌患者における骨粗鬆症、関節リウマチに続発する骨粗鬆症、膝関節症、股関節症、腰、胸及び頸椎の領域の骨軟骨症等を処置するために使用することができる。
【００５７】
塩形
適切な薬物に好適な塩の探索は、薬物研究の前臨床相にとって重要である。活性成分の塩形の変更は、その構造を変化させずに化学的及び生物学的な特性を改変するために一般的に使用されている。特定の塩形の選択は、薬物の物理的及び化学的な特性（例えば、溶解速度、溶解度、安定性、及び吸湿性）に対して著しい影響を有し得る。薬物のある塩形を別の塩形に置き換えると、大規模生産のための剤形の最適な組成にとって最も重要な処置の有効性、安全性、及び／又は品質を変化させることができる。しかし、薬物の生物活性に対する活性成分の塩形の変更の効果を正確に予測するための信頼できる方法は存在しない。更に、同じ塩基性剤の多くの塩を調製した後でさえも、所望の薬物動態、溶解度、及び製剤化プロファイルを示す可能性が最も高い塩の選択を容易にするために有効なスクリーニング技術は存在しない。簡潔に述べると、剤形中の塩基性化合物の挙動に対する特定の塩の種類の影響を予測する信頼できる方法は存在しない（Berge et al., Pharmaceutical Salts// Journal Pharm. Sci., 1977, Vol. 66, No. 1; Verbeeck et al. Generic substitution: The use of medicinal products containing different salts and implications for safety and efficacy // EP Journal Pharm. Sci, 28, 2006, 1 - 6）。
【００５８】
固体塩形は、通常、経口投与に好ましいが、その理由は、必要な物理的特性を示す可能性が高いためであり；そして、塩基性薬物の場合、酸付加塩が好ましい塩形であることが多い。既に上で述べた通り、異なる塩形は、その必要な特性を付与する能力（例えば、保管時の安定性、生産及び精製のプロセスの容易さ、薬物動態パラメータ）の観点で広く異なり、そして、これら特性は、十分正確に予測することができない。例えば、一部の塩は、周囲温度で固体であるが、他の塩は、液体、粘性油状物、又は樹脂状物である。それに加えて、一部の塩形は、応力、熱、及び光に曝露された際に安定であるが、他の塩形は、穏和な条件でさえも容易に分解される。したがって、医薬組成物で使用するための塩基性剤の酸付加塩の適切な形態の開発は重要であり、そして、常に予測できる訳ではないプロセスである。
【００５９】
薬物動態パラメータは、薬物として使用するための固体塩形（又は特定の同質異像）の適性を決める最も重要な特性である。動物及びヒトの血中における薬物の１日平均及び最高の濃度は、塩形の含量及び同質異像に大きく依存し得る。原薬の選択された塩形の大規模生産の可能性及び生産された生成物の純度（又は精製の複雑さ）は、選択された塩形に本質的に依存する重要な特性である。更に、原薬を含有する医薬組成物は、適切な保管期間を有しなければならず、好適な塩形は、長期にわたって保管されたときに物理的及び化学的な特性（化学組成、含水量、密度、吸湿性、溶解度等）が著しく変化してはならない。
【００６０】
薬学的活性化合物を含む固体物質は、多くの場合、１つを超える結晶形を有し；この特性は、多形性として知られている。多形性は、多くの場合、結晶充填の観点で異なる複数の異なる固相に化合物が結晶化するときに生じることが多い。同質異像（多形）は、通常、溶解度、物理的及び化学的な安定性を含む異なる物性を有する。同じ原薬の様々な固体塩形、更には、同じ固体塩形の様々な多形は、薬物の放出速度、塩形の固体段階安定性、及び医薬品生産に対する適性が異なる場合がある。
【００６１】
したがって、商業的に実現可能であり、そして、薬学的に許容し得る医薬組成物を生産するために、薬物を本質的に安定な結晶形（又は形）で提供する（可能な場合）ことが重要である。
【００６２】
化合物を処置的に使用する方法
また、本発明の目的は、対応する処置を必要としている被験体に、処置的に有効な量の本発明に係る化合物を投与することを含む。処置的に有効な量とは、処置に対する所望の応答（予防）が患者において生じる可能性が最も高い、患者に導入又は投与される化合物の量を意味する。正確な必要量は、年齢、体重、及び全身状態、疾患の重篤度、薬物の投与経路、他の薬物との組み合わせ等に依存して様々な患者で異なり得る。
【００６３】
本発明に係る化合物又は該化合物を含有する医薬組成物は、治療又は予防において有効な、任意の量（好ましくは、活性成分の日用量が、１日あたり患者１人あたり１．５ｇ以下になる；最も好ましくは、日用量が１日あたり２００〜５００mgになる）で、そして、任意の投与経路（好ましくは、経口）によって患者の身体に導入され得る。
【００６４】
薬物を特定の適切かつ薬学的に許容し得る担体と所望の比率で混合したとき、本発明の本質である組成物は、例えば経口的に、非経口的に、局所的にヒト又は動物の身体に導入され得る。
【００６５】
薬物は、単回投与として、及び１日、１週間（又は任意の他の時間間隔）に数回、又は時々投与され得る。それに加えて、該化合物は、特定の期間（例えば、２〜１０日間）毎日患者の身体に導入し、続いて、投与しない期間（例えば、１〜３０日間）を設けてよい。
【００６６】
本発明に係る化合物を併用療法レジメンの一部として使用する場合、併用療法の各成分の用量を、必要な処置期間中投与する。該化合物を含む併用療法は、全ての成分を含有する剤形として及び成分の個々の剤形としてのいずれでも、同時に患者の身体に導入され得る。
【００６７】
医薬組成物
また、本発明は、本発明に係る化合物（又はプロドラッグ形態若しくは他の薬学的に許容し得る誘導体）と、本発明の本質である化合物と共に患者の身体に導入され得、そして、この化合物の薬理活性を付与することなくかつ処置的な量の該化合物を送達するのに十分な投薬量で投与されたときに毒性作用を有しない１つ以上の薬学的に許容し得る担体、補助剤、溶媒、及び／又は賦形剤とを含有する医薬組成物を網羅する。
【００６８】
本発明において公表される医薬組成物は、本発明と、特定の剤形に好適な任意の溶媒、希釈剤、分散剤又は懸濁剤、界面活性剤、等張剤、ゲル化剤、乳化剤、防腐剤、結合剤、滑沢剤等を含み得る薬学的に許容し得る担体との組み合わせを含有する。薬学的に許容し得る担体として好適な物質は、単糖及びオリゴ糖、並びにこれらの誘導体；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、坐剤用のカカオ油及びワックス；油、例えば、落花生油、綿実油、サフロール、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及びダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；アガー；緩衝剤、例えば、水酸化ナトリウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張溶液；リンゲル液；エチルアルコール、及びリン酸緩衝溶液を含むが、これらに限定されるわけではない。また、該組成物は、他の非毒性適合性滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、分離液、成膜材料、甘味剤、風味剤、防腐剤、及び抗酸化剤を含有していてもよい。
【００６９】
また、本発明は、処置的に有効な用量を身体に導入する特定の経路、例えば、経口、局所、肺内経路、例えば吸入スプレー、又は静脈内、鼻腔内経路、皮下経路、筋肉内、及び推奨用量の注入に内容物が最適化された剤形、すなわち、医薬組成物の分類を網羅する。
【００７０】
本発明の剤形は、リポソーム、マイクロカプセル化、ナノフォーム製剤、及び製薬分野において公知の他の方法を使用することによって得られる内容物を有し得る。
【００７１】
組成物が錠剤の形態を有するとき、例えば、活性物質を１つ又は幾つかの医薬賦形剤、例えば、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、アカシア、マンニトール、微結晶性セルロース、ヒプロメロース、又は類似の化合物と混合する。
【００７２】
錠剤をスクロース、セルロース誘導体、又はコーティングするのに好適な他の物質でコーティングしてもよい。錠剤は、様々な方法、例えば、直接圧縮、乾式若しくは湿式の造粒又は熱溶解によって得ることができる。
【００７３】
ゼラチンカプセルの形態の医薬組成物は、活性成分を溶液と混合し、そして、得られた混合物を軟カプセル又は硬カプセルに充填することによって得ることができる。
【００７４】
薬物を非経口的に投与するためには、薬学的に適合し得る剤、例えば、プロピレングリコール又はブチレングリコールを含有する様々な水懸濁液、等張生理食塩水、又は滅菌注射液が使用される。
【００７５】
医薬組成物の例
本発明に記載される物質は、以下に提示される組成物の形態でヒト又は動物の疾患を予防及び／又は治療するために使用され得る（上記物質は、活性成分を意味する）：
錠剤Ｉ                                        mg/錠剤
物質．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５０
ラクトースPh.Eur．．．．．．．．．．．．．． ２２３．７５
クロスカルメロースナトリウム．．．．．．．．．６．０
コーンスターチ．．．．．．．．．．．．．．．．１５
ポリビニルピロリドン（５％w/v ペースト）．．．２．２５
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．３．０
【００７６】
錠剤II                                        mg/錠剤
物質．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．２００
ラクトースPh.Eur．．．．．．．．．．．．．．．１８２．７５
クロスカルメロースナトリウム．．．．．．．．．１２．０
コーンスターチ（５％w/v ペースト）．．．．．．２．２５
ステアリン酸マグネシウム．．．．．．．．．．．３．０
【００７７】
カプセル                                      mg/カプセル
物質．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１０
ラクトースPh.Eur．．．．．．．．．．．．．．．４８８．５
硫酸マグネシウム．．．．．．．．．．．．．．．１．５
【００７８】
注射用組成物Ｉ                                （５０mg/mL）
物質．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５．０％w/v
１M 水酸化ナトリウム溶液．．．．．．．．．．．１５．０％w/v
１M 塩酸溶液    pH７．６になるように添加
ポリエチレングリコール４００．．．．．．．．．４．５％w/v
注射用水    １００％になるまで添加
【００７９】
軟膏                                          mL
物質．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．４０mg
エタノール．．．．．．．．．．．．．．．．．．３００μL
水．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３００μL 
１−ドデシルアザシクロヘプタノン．．．．．．．５０μＬ
プロピレングリコール．．．．．．．．．．．．．１mLになるように添加
【００８０】
これら組成物は、標準的な製薬技術に従って調製することができる。錠剤（Ｉ）〜（II）は、例えば、酢酸フタル酸セルロースを使用する腸溶性コーティングを有していてよい。
【００８１】
実施例
本発明に係る化合物の入手
２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン（化合物１）の合成
撹拌し、そして、３０℃を超えない温度を維持しながら、３０分間以内に、氷酢酸 ２，０００mL中２，４−ジクロロトリアジン １６５ｇ溶液（１．１mol）及び無水酢酸ナトリウム ９８．５ｇ（１．２mol）に、６−アミノ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン １９３．２ｇ（１mol）を少しずつ添加する。反応混合物を一晩静置し、沈殿物を濾過し、フィルタ上において酢酸（２×５００mL）、中性反応が生じるまで水ですすぎ、そして、乾燥させる。６−（（４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２，２−ジメチル−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン ２２０ｇが得られる。
【００８２】
激しく撹拌しながら、６−（（４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２，２−ジメチル−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン ３０６．７ｇ（１mol）及び３，４，５−トリメトキシアニリン ３８４．７ｇ（２．１mol）を、脱気したエチレングリコール ３Ｌに添加する。その後、反応混合物を１１０℃まで加熱し、そして、この温度で４時間撹拌する。４時間後、反応混合物の温度を１２５℃に上昇させ、撹拌を４時間継続する。次いで、反応混合物を６０℃に冷却し、沈殿物を濾過し、エチレングリコール（２×５００mL）、続いてアセトン（３×６００mL）及び水（４×１，５００mL）ですすぎ、次いで、乾燥させる。生成量は、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン ３６５ｇである。
【００８３】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩の一水和物（同質異像Ａ）の合成
エタノール ２０mL中４−メチルベンゼンスルホン酸水和物の溶液 ２０ｇ（〜０．１０５mol）を、アセトン １，２００mL中２，２−ジメチル−６−（［４−［（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ］−１，３，５−トリアジン−２−イル］アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン ４５．３ｇ（０．１mol）の沸騰懸濁液に一度に添加する。混合物を３０分間沸騰させ、次いで、該混合物を周囲温度までゆっくり冷却し、そして、一晩静置する。沈殿物を濾過し、フィルタ上においてアセトン（２×５０mL）、続いてジエチルエーテル（２×１００mL）ですすぎ、次いで、乾燥させる。生成物の生成率は、９０％である。
1H NMRスペクトル（400 MHz, DMSO-d6): 11.13 (s, 1H), 8.57 (s, 1H) 7.52-7.44 (m, 3H) 7.12 (d, 2H, J＝8 Hz) 7.02 (s, 2H), 4.4-3.9 (bs, 4H), 3.8 (s, 6H), 3.7 (s, 3H), 2.3 (s, 3H), 1.5 (s, 6H)
質量スペクトル、m/z: 454.18 ([M+nH]+)
【００８４】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩の一水和物（同質異像Ａ）の1H及び13C NMRスペクトルを図１３に与える。
【００８５】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩の一水和物（同質異像Ｂ）の合成
４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩の一水和物（同質異像Ａ） ６４．４ｇ（０．１mol）を温度 １１０〜１１５℃及び残圧 ６mbarで２時間維持し、次いで、真空中で冷却する。生成物の生成率は、１００％である。
【００８６】
同質異像Ａをエタノール又は他の溶媒で処理することによって、４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩の一水和物の同質異像Ｂを得ることもできる。
1H NMRスペクトル（400 MHz, DMSO-d6): 11.13 (s, 1H), 8.57 (s, 1H) 7.52-7.44 (m, 3H) 7.12 (d, 2H, J＝8 Hz) 7.02 (s, 2H), 4.4-3.9 (bs, 4H), 3.8 (s, 6H), 3.7 (s, 3H), 2.3 (s, 3H), 1.5 (s, 6H)
質量スペクトル、m/z: 454.18 ([M+nH]+).
【００８７】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基の塩の一水和物（同質異像Ｂ）の1H及び13C NMRスペクトルを図１４に与える。
【００８８】
化合物１の塩形の最適化
最適な生物学的及び物理学的な特性を有する形を得るために、化合物１の様々な塩形を合成した。塩形の最適化の主な目的は、薬理学的に許容し得る対イオン（好ましくはアニオン）を使用し、そして、低毒性の有機溶媒を使用して、以下の特性：結晶化度、組成の安定性、処置有効性、安全性、生産プロセスのスケーラビリティの容易さを有する化合物１の塩形を得ることであった。高極性かつ低毒性の有機溶液（クラス３）を使用して化合物１の塩形を得た。薬理学的許容性及び高い酸強度（pKaが３．２５を超えない）に基づいて、対イオンを使用した。高い酸強度の要件は、化合物１のピリジンのプロトン化窒素原子がpKa４を有する弱塩基であるという事実によって条件付けられる。
【００８９】
第１の段階では、選択された有機溶液への主な塩基の可溶性について試験した。この試験用の溶媒の最高体積は、後続プロセスのスケーリングを考慮して塩基 １００mgあたり１０mLと選択された。選択された有機溶液への主な塩基の可溶性の結果を表１に与える。
【表１】
2019515053.tif 000006
【００９０】
試験の第２の段階では、２，２−ジメチル−６−（（４−（（３，４，５−トリメトキシフェニル）アミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル）アミノ）−２Ｈ−ピリド［３，２−ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン塩基 １００mgに基づいて塩を生成することを試みた。この開発段階では、サンプルが溶媒に完全に溶解し、そして、塩を添加した後に沈殿するか、又は酸を添加した後に系が均質化し、そして、系を周囲温度に冷却した後に沈殿することが確実になるように溶媒及び酸の対を選択した。化合物１の塩の結晶化試験の結果を図１に与える。実施した試験に基づいて以下の溶媒−酸対を選択した：エタノール−HCl、アセトン−４−メチルベンゼンスルホン酸、並びにｎ−ブタノール及びジオキサンとメタンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、HBr、HCl、及びH2SO4。
【００９１】
第３の段階では、塩基 ２，０００mgに基づいて、選択された溶媒−酸系中の塩を得た。濾過プロセスのスケーラビリティを評価した。これら試験の結果を図２に与える。濾過プロセスが容易にスケーラブルであると考えられるサンプルを、元素分析（組成の安定性及び化学量論を立証するため）及び粉末Ｘ線回折法による分析（構造の結晶化度を試験するため）に供した。本明細書における全ての回折パターンは、２５℃（±５℃）及び相対空気湿度〜７０％で、ニッケルフィルタ（CuKα1線、波長＝１．５４０６Å）及びLynxEye位置敏感検出器を備えるBragg-Brentano解析におけるBruker D8 Advance粉末Ｘ線回折システム（アノード体積 ４０kV、電流 ４０mA）を使用して、サンプリング間隔＝０．０２°２θ、角度範囲＝４〜６５°２θで得られた。得られた回折パターンをBruker TOPAS5ソフトウェア適合を使用して精密化した。
【００９２】
対応する塩形の生産プロセスの適切なスケーラビリティに基づいて、本発明者らは、酸添加時又は溶液冷却時に沈殿が生じ、そして、得られた沈殿物が容易に濾過される溶媒−対イオン（酸）対を選択した。これら対を後続の試験に供した。したがって、以下のサンプルを以下の試験についてスクリーニングした：S-3-1-B-TSA（以後、S3-1）、S-3-2-B-HBr（S3-2）、S-3-4-B-HCl（S3-4）、S-3-8-B-HBr（S3-8）、S-3-9-B-CSA（S3-9）、S-3-10-B-HCl（S3-10）、S-3-11-C2-HCl（S3-11）、S-3-12-A1-TSA（S3-12）、S-3-16-D-SA（S3-16)、及びS-3-17-D-MSA（S3-17)。
【００９３】
これら化合物のサンプルを元素分析に供した。その結果、化合物１及び４−メチルベンゼンスルホン酸の塩の一水和物のサンプルが、計算された元素組成に対して結果の最良の再現性を示すことが立証された（図３）。
【００９４】
粉末Ｘ線回折によるサンプルの結晶化度の更なる試験によって、試験したサンプル（S-3-1-B-TSA（以後、S3-1）、S-3-2-B-HBr（S3-2）、S-3-4-B-HCl（S3-4）、S-3-8-B-HBr（S3-8）、S-3-9-B-CSA（S3-9）、S-3-10-B-HCl（S3-10）、S-3-11-C2-HCl（S3-11）、S-3-12-A1-TSA（S3-12）、S-3-16-D-SA（S3-16）、及びS-3-17-D-MSA（S3-17））の組成が結晶相を含むことが証明された。様々なピークの広幅化及び１つの単位格子による相の反射を使用して回折パターンを特徴付けることが不可能であることは、試験したサンプル中に幾つかの結晶相が存在することを示した（図４〜８を参照）。サンプルは、類似の結晶相を有していなかった：ピーク位置及び強度が、異なるサンプルで異なっていた。S-3-17-D-MSAサンプル中の結晶子のサイズは小さく、ラインは著しく広がっているが、これは恐らく物質の結晶構造の破壊に起因するものであった（図８を参照）。残りのサンプルでは、大きな結晶子サイズを有するピークの割合がより高い。
【００９５】
サンプルS-3-10-B-HClは、個々の結晶相であるが、サンプルの大きなライン幅及び低い反射力に起因して、割り当てはあいまいである。単位格子の最確パラメータ：ａ＝１０．９９±０．０５Å；ｂ＝２８．５３±０．０５Å；ｃ＝１０．６２±０．０５Å；α＝９５．９８±０．１°；β＝９５．８５±０．１°；γ＝９２．７４±０．１°。空間群
【化４】
2019515053.tif 000007
【００９６】
サンプルS-3-11-C2-HClも結晶相であり、そして、異なる方法で割り当てられ得る。予測される格子：ａ＝１０．３６±０．０５Å；ｂ＝１８．２０±０．０５Å；ｃ＝２８．０８±０．０５Å；α＝８７．３６±０．１°；β＝８７．５４±０．１°；γ＝９２．２９±０．１°。空間群
【化５】
2019515053.tif 000008
【００９７】
サンプルS-3-12-A1-TSAは、以下の格子パラメータを有する個々の結晶相である：ａ＝１０．９８±０，０５Å；ｂ＝２８．４８±０，０５Å、及びｃ＝１０．６０±０．０５Å、β＝１１３．７±０．１°、Ｖ＝３，０３７．５±０．５Å３。空間群Ｐ２１／ｃ。結晶相に関連しないピークが約２２．７°２θに観察され、それはカプトン塩基に関連している（図９ａを参照）。表２は、S-3-12-A1-TSAサンプルのデバイ回折パターンにおける視覚的に区別された固有ピークの位置及び強度を示す。図１１ａは、同質異像Ａにおける４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物（S-3-12-A1-TSAサンプル）の単位格子の独立部分の一般図を表す。
【表２】
2019515053.tif 000009
【００９８】
したがって、S-3-10-B-HCl（S3-10）、S-3-11-C2-HCl（S3-11）、及びS-3-12-A1-TSA（S3-12）の３つのサンプルのみが結晶質物質であり、そして、S-3-12-A1-TSA（S3-12）サンプルのみが、明確に割り当てられた空間群の種類を有する。元素分析のデータに基づいて、S-3-12-A1-TSAサンプルは一水和物である。組成を確認するために、示差走査熱量測定（DSC）及び熱重量分析（TGA）を使用してサンプルを解析した。DSCは、NETZSCH DSC 204 F1装置を使用して実施した。測定システムは、参照物質の相転移パラメータに対してISO 11357-1に従って較正された（C6H12；Hg；安息香酸；Ga；KNO3；In；Sn；Bi；CsCl；純度９９．９９％）。温度較正の系統誤差（Inを使用して決定）は、０．１°になる。３０℃〜３００℃の範囲内の温度の合成空気流（２０mL／分）中、そして、１０°／分の加熱速度で、穴を有するキャップで圧着された標準的なアルミニウムセル（Ｖ＝５６mm3、ｄ＝６mm）（セルの底面積の穴面積に対する比は約４０であった）においてサンプルを試験した。アルミニウムホルダ、保護スクリーン、及びＰ型の温度センサを備えるNETZSCH TG 209 F1熱天秤を使用してTGA測定を実施した。参照物質の融点に対してこの装置を較正した（Ag；Al；Bi；In；Sn；純度９９．９９％）。はかりの誤差は０．１％を超えない（CaC2O4・2H2O参照物質に対して決定）。３０℃〜３００℃の範囲の温度の合成空気流中、そして、１０°／分の加熱速度で、標準的なアランダム容器（Ｖ＝８５mm3、ｄ＝６．７mm）において実験を実施した。ISO/CD 11358規格に従って、NETZSCH Proteus分析ソフトウェアスイートを使用して実験データを処理した。精度が±０．０１mgのAND GH 202化学天秤を使用してサンプルを計量した。脱水を避けるために、測定前に材料を機械的処理に供することはしなかった。
【００９９】
サンプル試験の結果を図１０に与える。DSC曲線における初期の重量喪失及び効果に対応する転移の特徴は、結晶水の喪失と一致している。DSC曲線における最後の効果及び対応する重量喪失は、サンプルの融解、それに続く分解に関連する。この結論は、試験したサンプルの最終的な外観の目視観察に基づいて導くことができる。
【０１００】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１塩基の塩の水和物の結晶構造に対する熱処理の効果の更なる試験は、残圧６mbarで２時間位内に同質異像Ａを１１０〜１１５℃に加熱した結果、該塩の結晶構造が変化し、そして、同質異像Ｂ（SYK 91/1サンプル）が形成されることを示した。粉末Ｘ線回折によるサンプルの結晶化度の更なる試験によって、該サンプルが、単位格子の以下のパラメータを有する個々の結晶相であることが証明された：ａ＝１１．０９±０．０５Å；ｂ＝１４．３８±０．０５Å、及びｃ＝１０．５３±０．０５Å、α＝９０．０６±０．１°；β＝１１４．６±０．１°、及びγ＝９１．１±０．１°、Ｖ＝１，５２５．９±０．５Å３、並びに空間群
【化６】
2019515053.tif 000010
（図９ｂを参照）。表３は、SYK 91/1サンプルのデバイ回折パターンにおける視覚的に区別された固有ピークの位置及び強度を示す。図１１ｂは、同質異像Ｂの４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物（SYK 91/1サンプル）の単位格子の独立部分の一般図を表す。
【表３】
2019515053.tif 000011
【０１０１】
実施した試験に基づいて、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩が、容易にスケーラブルな方法を使用して低毒性の有機溶媒中で生成され得、そして、薬理学的に許容し得る対イオンを含有する、化合物１の唯一の結晶塩形であることが立証された。
【０１０２】
様々な化合物１の塩形中の不純物の分析
得られた化合物１の塩形の品質を評価するために、様々な塩形中の不純物の含有量の分析を実施した。HPLC法によって不純物を決定した。保持時間の観点のブランククロマトグラムにおけるピーク及び対イオンのピークに対応するピークの面積に関係なく、単一の不純物の含有量を計算した。単一の不純物の結果を足し合わせることによって、合計不純物含有量を計算した。
【０１０３】
試験の第１の段階で不純物測定のためのHPLC手順を開発した。次いで、化合物１の遊離塩基及び幾つかの塩形のサンプルを不純物について分析した。試験の結果を図１５〜１７及び表４〜７に提示する。
【表４】
2019515053.tif 000012
【表５】
2019515053.tif 000013
【表６】
2019515053.tif 000014
【表７】
2019515053.tif 000015
【０１０４】
遊離塩基の形態の化合物１のサンプル中の不純物についての分析の結果、高含有量の様々な未同定の不純物がサンプル中にみられた；この不純物の含有量は、この化合物が薬物としてヒト又は動物の身体に導入された結果として毒性作用及び有毒事象を惹起する恐れがある。したがって、化合物１を薬物候補として使用するために追加の精製段階が必要になる。追加の精製段階は、必然的により複雑なプロセスフローになり、そして、最終的な薬物生産コストが増大する。
【０１０５】
メタンスルホン酸及び化合物１の塩のサンプル中の不純物についての分析の結果、遊離塩基（化合物１）中の不純物の含有量と比べて多少少ない含有量の様々な未同定の不純物がみられた。しかし、図１６及び表５でみられるように、２つの不純物の含有量は０．５％を超えない。ＩＣＨ（協調国際会議）及びロシアの規制文書の要件によればこのような不純物の含有量が薬物生産にとって許容可能であるという事実にもかかわらず、この高濃度の不純物は、ヒト又は動物の身体に投与されたときに毒性作用を引き起こす恐れがあり；したがって、このような塩の診療における使用は、この不純物の毒性試験の結果及び／又は塩精製の追加の段階に基づいてのみ可能である。
【０１０６】
４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物のサンプル中の不純物の分析は、予想外に、０．１％を超える不純物を示さなかった。低品質の４−メチルベンゼンスルホン酸を使用するとき、４メチルベンゼンスルホン酸及び遊離塩基の塩の水和物は０．１５％以下のオルト−トルエンスルホン酸を含有し得るが、この不純物は、４−メチルベンゼンスルホン酸の再結晶化によって容易に除去されることに留意すべきである。規制文書によれば、このような低濃度（０．１％未満）の不純物は安全であると考えられ、そして、不純物の構造の同定も追加の精製段階も必要としない。
【０１０７】
したがって、様々な化合物１の塩形のサンプル中の不純物の分析は、予想外に、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物が、試験した塩の中で最も高い純度を有し、そして、０．１５％を超える不純物を含有しないことを示した。
【０１０８】
本発明に係る化合物の生物活性の特徴
本発明の目的である４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩及びその結晶形の生物活性を試験するために様々な実験を実施した。
【０１０９】
インビトロにおけるヒトキナーゼ酵素活性に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の効果の試験
インビトロにおけるヒトキナーゼ酵素活性に対する本発明に係る化合物の効果の試験によって、様々なヒト組み換えチロシンキナーゼ、特にヒトc-Srcチロシンキナーゼに対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩（同質異像Ａとして）の直接阻害効果が初めて明らかになった。
【０１１０】
ヒト組み換えチロシンc-Srcキナーゼに対する化合物１の効果を以下の通り測定した：ペプチド基質を０．２mg/mLの濃度になるように反応バッファに溶解させた。組み換えc-Srcキナーゼの溶液を２nMの濃度になるように添加し、そして、試験する化合物を必要な濃度（１nM〜１０nMの範囲内）になるように添加した。33P-ATPの溶液を１０μMの濃度になるように添加した（該溶液の最終比活性は０．０１μCiである）。１２０分間インキュベートした後、反応混合物をイオン交換紙に適用し、これを十分なリン酸ですすいだ。反応生成物の放射活性に基づいて反応の程度を求めた。
【０１１１】
実施した試験は、０．５μmol/Lの濃度の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩が、以下のキナーゼの活性を５０％超阻害することを示した：Blk、c-Src、Syk、Fgr、Frk、Fyn、Hck、Lck、Lyn、Yes。触媒活性の最も著しい阻害は、Srcキナーゼのファミリーで検出され；０．５μmol/Lの濃度の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の効果は、Srcキナーゼのファミリーの残存活性を対照値の２５％以下に低下させる。具体的には、０．５μmol/Lの濃度の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の存在下におけるc-Srcキナーゼの残存活性は対照値の６％になり、該残存活性は、Yes及びLckのキナーゼの１２％、Lynキナーゼの１３％、Blkの２０％、Fgrの２３％、Fyn及びHckのキナーゼの２５％であった。
【０１１２】
キナーゼ酵素活性の半量阻害濃度（IC50）を求めて、得られたデータを精密化した。その結果、ヒト組み換えチロシンキナーゼc-Srcに対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の阻害効果（図１２を参照）がナノモル範囲の濃度で証明された（IC50＝１４nmol/L）。更に、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩は、ナノモル範囲の濃度でSykキナーゼも阻害する（IC50＝４０nmol/L）。
【０１１３】
遊離塩基及び化合物Ｉの塩形の薬物動態の比較
薬物としての適性を評価するために、得られた化合物１の塩形の薬物動態パラメータを試験した。
【０１１４】
第１の段階では、３０mg/kgの投与量でウイスターラットに経口投与した後、化合物１の遊離塩基の薬物動態を試験した。試験結果を図１９及び表９に与える。提示された結果が示す通り、血漿中の物質の最高濃度は４．１２ng/mLになり、これは９．１nmol/Lに対応し、そして、該物質の１日平均濃度は４．８nmol/Lになる。同時に、化合物１の生物活性の試験は、遊離塩基の有効濃度が約１μmol/Lになることを示した。したがって、遊離塩基の薬物動態パラメータによればそれを薬物として使用することはできないが、その理由は、必要な処置効果を得るために高投与量の化合物１が必要になるためである。これは、技術的及び実用的な実施のためにはいくぶん現実的ではなく、著しく物質を消費させ、そしてまた、毒性の胃腸有害事象を発生させる。
【表８】
2019515053.tif 000016
【０１１５】
３７mg/kgの用量（３０mg/kg 遊離塩基と等価）でウイスターラットに経口投与した後に、幾つかの化合物１の塩形の薬物動態を試験した。図２０及び表１０は、メタンスルホン酸及び化合物１の塩の薬物動態試験の結果を示す。提示された結果が示す通り、メタンスルホン酸及び化合物１の塩は、遊離塩基よりも著しく好ましい薬物動態パラメータを有する。血漿中の物質の最高濃度は、３３３ng/mLになり、これは７３５nmol/lに対応し、そして、該物質の１日平均濃度は１０４nmol/lになる。同時に、化合物１の生物活性の試験は、化合物１の有効濃度が約１μmol/Lになることを示した。したがって、メタンスルホン酸及び化合物１の塩を薬物として使用するためには、著しく高い物質の投与量又は複数回投与が必要である。
【表９】
2019515053.tif 000017
【０１１６】
ウイスターラットに経口投与した後の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の薬物動態試験は、予想外に、化合物１の遊離塩基及び他の試験した塩形に対してこの塩形が最適な薬物動態パラメータを有することを示した。図２１及び表１１は、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の薬物動態試験の結果を示す。４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物を３０mg/kgの用量（２１mg/kg 遊離塩基と等価）でウイスターラットに投与したとき、血漿中の物質の最高濃度は４１６ng/mLになり、これは約１μmol/Lに対応し、そして、該物質の１日平均濃度は２００nmol/Lを超えた。
【表１０】
2019515053.tif 000018
【０１１７】
ラットにおける４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の更なる薬物動態試験は、薬物が血液に急速に吸収されて１．１〜１．３時間後に最高濃度に達し、そして、器官及び組織の至る所に分布することを示した。骨及び軟骨の組織における物質の１日平均濃度は、動物の血漿中の該物質の１日平均濃度を３倍超超える。４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物は、広範囲に及ぶ用量内で線形の薬物動態を有する。３０〜２００mg/kgの投与量で４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物を胃内に投与したとき、ラットの血漿中の化合物１の濃度は用量に比例して増大する。試験した全ての組織の大部分で高濃度の化合物１がみられ、そして、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の投与後２〜４時間で最高に達した。標的器官（骨及び軟骨の組織）における化合物１の１日平均濃度は、動物の血漿中の化合物１の１日平均濃度を３倍超超える。化合物１の最低濃度は、筋肉で記録された。
【０１１８】
５０mg/kgの用量でウサギに単回投与された４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の薬物動態試験では、ウサギの血漿中の物質の濃度が８．６μg/mL（〜１６μmol/L）に達し、そして、排出半減期が７時間超になることが証明された。
【０１１９】
様々な化合物１の塩形の薬物動態試験は、予想外に、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩が化合物１の最適な塩形であるので、化合物１の他の試験した塩形よりも著しく低い用量で単回投与が可能であることを示した。
【０１２０】
骨組織の破骨細胞によって媒介される吸収に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の効果の試験
この実験は、骨組織の破骨細胞によって媒介される吸収に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物（同質異像Ａ）の効果を初めて明らかにした。この試験は、以下の方法に従って実施された：CD15+単球（破骨細胞前駆細胞）を増殖培地（２５ng/mL マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）を含むIglaα変法最小必須培地／ウシ胎仔血清（αMEM/FCS）、１０％）中で３日間培養した。この段階中、M-CSFは、核因子κBの受容体活性化因子（RANK、カッパ−Ｂ、Ｉ型膜タンパク質）の増殖及び発現を促進した。増殖培地を除去し、そして、分化培地（１００ng/mL RANKL及び２５ng/mL M-CSFを含むαMEM/FCS-１０％）中で細胞を分化させた。培養中（試験の４日目）に成熟破骨細胞が検出されたとき、細胞を収集し、そして、合成の石灰化したマトリクスでコーティングされた９６ウェルプレートに再接種した。破骨細胞の吸収を評価するために、（試験した化合物の存在下で）４８時間培養を継続した。次いで、成熟破骨細胞の数及び吸収の程度を評価した。成熟破骨細胞の濃度及び吸収の程度に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の濃度の効果を、対照サンプル（ポジティブコントロール、０．３％ DMSO溶媒）及び参照阻害剤、すなわち、サラカチニブ及びボスチニブと比較して評価した（図１８を参照）。対照サンプル（ポジティブコントロール、溶媒）における１ウェルあたりの成熟破骨細胞の平均数（４８８±４３及び４５１±１１）及び石灰化したマトリクスの吸収の平均程度（３２．６２±１．１６％及び３５．５３±２．４０％）の値が類似していることから、溶媒が破骨細胞の生存及び破骨細胞によって媒介される吸収に対して効果を有しないことが確認された。実施した試験は、石灰化したマトリクスの破骨細胞によって媒介される吸収に対して化合物１が用量依存的阻害効果を有することを証明した。１．１μM及び１０μMの濃度の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の一水和物において重大な統計的に有意な阻害効果がみられた（図１８を参照）。
【０１２１】
また、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物を同質異像Ｂとして１．０μMの濃度で使用したときも、石灰化したマトリクスの破骨細胞によって媒介される吸収に対して統計的に有意な用量依存的阻害効果がみられた。
【０１２２】
軟骨の代謝に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の効果の試験
４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の一水和物（同質異像Ａ）を使用して、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の効果が初めて証明された。この試験は以下の方法に従って実施された：若年ラット（３週齢、Sprague Dawley系統）の膝関節軟骨から軟骨細胞を単離した。培養培地（ダルベッコ変法Igla最小必須培地／ウシ胎仔血清（DMEM/FCS）、１０％、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、２５mM）中の単離された軟骨細胞を、−８０℃で冷凍保存した。得られた軟骨細胞を実験の前日に解凍し、１２ウェルプレートに接種し、そして、２４時間単層として培養した。２４時間インキュベートした後、軟骨細胞のIL-1β誘発性の活性化及び試験した化合物による処理を開始し、そして、３日間継続した。
【０１２３】
実施した試験は、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物（同質異像Ａ）が、アグリカンの発現の著しい増加として顕在化する軟骨細胞のIL-1β誘発性の肥大性変化に対して統計的に有意な正の効果を示すことを示した。
【０１２４】
したがって、実施した試験の結果に基づいて、骨及び軟骨の組織に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の明らかな保護効果がみられた。これら効果は、満足のいく薬物動態パラメータを有する化合物１の塩形を使用することによってのみ達成することができる。化合物１の遊離塩基の薬物動態パラメータから、骨組織における破骨細胞によって媒介される代謝及び軟骨細胞におけるIL-1β誘発性の肥大性変化を阻止するためにこの化合物を使用することはできないことが見出された。同時に、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩、特にその一水和物は、適切な薬物動態パラメータを有し、そして、異常な骨及び軟骨の代謝に関連する疾患を処置するために使用することができる。
【０１２５】
ヨウ化酢酸ナトリウムの関節内誘導によって誘導される変形性関節炎のラットモデルにおける膝関節の破壊に対する４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の効果の試験
動物で実施されたこの試験によって、ヨウ化酢酸ナトリウムの関節内誘導によって誘導される変形性関節炎のSprague-Dawleyラットモデルにおける膝関節の破壊に対する、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の一水和物（同質異像Ａ）としての４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の直接薬理効果が証明された。好気的解糖阻害剤（ヨウ化酢酸ナトリウム）の関節内誘導の結果、軟骨細胞の死及び滑液腔における急性炎症反応が生じる。処置しないと、病状誘導から１０日目に特定の症例において軟骨破壊及び慢性炎症の発現に起因する慢性疼痛の発生が観察される［J Musculoskel Neuron Interact 2001; 1(4):363 - 376］。病状誘導前に測定されたバックグラウンド測定値に対して、ヨウ化酢酸ナトリウムの誘導後の肢の痛覚感受性閾値を比較することによって、ラットにおける変形性関節炎の発現の程度を評価した。von Freyフィラメントを使用する機械的アロディニア試験によって、痛覚感受性の閾値を評価した（表８を参照）。
【０１２６】
この試験の目的上、体重 １５０〜２００ｇの雄ラットを選択した。全ての動物を１４日間の順化に供した。GOST R 53434-2009に従ってCharles River laboratories Incによって製造された３Ｈ型のポリカーボナートケージで動物を飼育した。１２時間明条件レジメンを維持した。動物は、食餌及び水に自由にアクセスできた。ヨウ化酢酸ナトリウム ２mgを含有する溶液 ５０μLを動物の膝関節の滑液腔に導入することによって、病状を誘導した。０．０６ｇ〜２３．９６ｇの重量のvon Freyフィラメントを使用して、機械的刺激によって誘導される接触性アロディニアを評価した。１〜２秒間隔で各フィラメントにつき５回試験を繰り返した。５回の繰り返しのうちの１回で肢の引っ込めを惹起した最低反応閾値を感受性閾値とみなした。
【０１２７】
表８は、ヨウ化酢酸ナトリウムの関節内誘導によって誘導される変形性関節炎のラットモデルにおける膝関節の破壊に対する、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の一水和物（同質異像Ａ）の投与の効果の評価結果を含む。
【表１１】
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【０１２８】
病状誘導日に開始した１００及び５００mg/kgの用量、並びに病状誘導後７日目に開始した５００mg/kgの用量の４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩の水和物の投与によって、機械的アロディニアの発生が完全に阻止された。実施した実験に基づいて、この化合物が異常な骨及び軟骨の代謝を阻害し、そして、これが次に変形性関節炎のラットモデルにおいて機械的アロディニアの発現を阻止し、そして、痛覚感受性閾値を低下させると結論付けることができる。
【０１２９】
したがって、実施した実験は、４−メチルベンゼンスルホン酸及び化合物１の塩に加えて、その水和物（特に一水和物）、溶媒和物、並びに該塩、水和物、又は溶媒和物の同質異像が、Sykキナーゼ及びSrcキナーゼのファミリー、特にc-Srcキナーゼの有効な阻害剤であり、そして、異常な骨及び軟骨の代謝を引き起こす異常なキナーゼ活性に関連する疾患、特に、変形性関節炎、骨粗鬆症、及び骨軟骨症を処置するためにヒト又は動物の身体に導入するために指定の塩を薬物として使用することを可能にする薬物動態パラメータを有することを示した。
【０１３０】
本発明は、開示される実施態様を参照して記載されているにもかかわらず、具体的な詳細な実験は本発明を説明する目的のためだけに与えられ、そして、本発明の範囲を何らかの形で限定すると解釈されてはならないことがこの分野の専門家には明らかであるはずである。本発明の本質から逸脱することなく様々な変形例が可能であることは明らかであるはずである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ）】
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【図１１ｂ）】
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【図１２】
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【図１３ａ）】
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【図１３ｂ）】
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【図１４ａ）】
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【図１４ｂ）】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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