(57)【要約】本発明は、概して、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーであるＯＸ４０に特異的に係合する分子に関する。より具体的には、本発明は、少なくともＯＸ４０に結合する多価多重特異性分子に関する。【選択図】図５Ａ
2019504062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＯＸ４０に結合し、複数の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）結合ドメイン（ＴＢＤ）を含む単離されたポリペプチドであって、少なくとも第一のＴＢＤ（ＴＢＤ１）がＯＸ４０に結合する、前記単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ＰＤＬ１に結合し、複数のポリペプチド結合ドメイン（ＢＤ）を含む単離されたポリペプチドであって、少なくとも第一のＢＤ（ＢＤ１）がＰＤＬ１に結合する、前記単離されたポリペプチド。
【請求項３】
ＰＤＬ１及びＯＸ４０に結合し、複数のポリペプチド結合ドメイン（ＢＤ）及び複数の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）結合ドメイン（ＴＢＤ）を含む単離されたポリペプチドであって、少なくとも第一の結合ドメイン（ＢＤ１）がＰＬＤ１に結合し、少なくとも第一のＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＴＢＤ１）がＯＸ４０に結合する、前記単離されたポリペプチド。
【請求項４】
単一特異性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
多重特異性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
二重特異性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、少なくとも第二のＴＢＤ（ＴＢＤ２）を含み、これが第二のＴＮＦＲＳＦメンバーに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記複数のＴＢＤの中のＴＢＤの各々がＯＸ４０に結合する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記複数のＴＢＤが、ＯＸ４０上の同じエピトープに結合する、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記複数のＴＢＤの中の少なくとも２つのＴＢＤが、ＯＸ４０上の異なるエピトープに結合する、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記複数のＴＢＤが、少なくとも４つのＴＢＤを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記複数のＴＢＤが、少なくとも６つのＴＢＤを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、少なくとも第二のＢＤ（ＢＤ２）を含み、これが第二の抗原に結合する、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
前記複数のＢＤの中の各ＢＤがＰＤＬ１に結合する、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
前記複数のＢＤが、ＰＤＬ１上の同じエピトープに結合する、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１６】
前記複数のＢＤの中の少なくとも２つのＢＤが、ＰＤＬ１上の異なるエピトープに結合する、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
前記複数のＢＤが少なくとも４つのＢＤを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
前記複数のＢＤが少なくとも６つのＢＤを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
前記複数のＴＢＤの中のＴＢＤの各々、または前記複数のＢＤの中のＢＤの各々が、リンカーポリペプチドを介して作動可能に連結される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
標的に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドであって、前記標的が、ＴＮＦＲＳＦメンバーではないことを条件とする、前記単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
前記複数のＴＢＤの中の前記ＴＢＤの少なくとも１つが、ＤＲ５、ＧＩＴＲ、及びＣＤ１３７からなる群から選択される第二のＴＮＦＲＳＦメンバーに結合する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
ヘテロ二量体化ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
免疫グロブリンＦｃ領域のポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のポリペプチドが、配列番号１〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２５】
前記複数のＴＢＤの中の少なくとも１つのＴＢＤまたは前記複数のＢＤの中の少なくとも１つのＢＤが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２６】
前記複数のＴＢＤの中の各ＴＢＤまたは前記複数のＢＤの中の各ＢＤが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨである、請求項２５または請求項２６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合断片がｓｄＡｂである、請求項２５または請求項２６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２９】
前記ｓｄＡｂが、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
前記ｓｄＡｂが、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、人工的に作り出されたＶＨドメイン、または人工的に作り出されたＶＫドメインである、請求項２８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
前記ｓｄＡｂが、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成される、請求項３０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
前記結合ドメインの少なくとも１つが、非抗体骨格タンパク質を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
前記非抗体骨格タンパク質が、アンキリンリピートタンパク質、ｄａｒｐｉｎ、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、またはフィノマーである、請求項３２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択される、ＯＸ４０に結合するアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、ＯＸ４０に結合し、配列番号３０、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３１、３５、及び３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号３２〜３４、４８〜４３、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、配列番号５２〜５７からなる群から選択される、ＰＤＬ１に結合するアミノ酸配列を含む、請求項２または請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、ＰＤＬ１に結合し、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９、６２、６５、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号６０、６３、６６〜６８、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含む、請求項２または請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３８】
前記ポリペプチドが、配列番号５２〜５７からなる群から選択される、ＯＸ４０に結合する第一のアミノ酸配列、及び配列番号５２〜５７からなる群から選択される、ＰＤＬ１に結合する第二のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、ＯＸ４０に結合し、配列番号３０、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３１、３５、及び３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号３２〜３４、４８〜４３、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むアミノ酸配列を含み、かつ、前記ポリペプチドが、ＰＤＬ１に結合し、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９、６２、６５、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、ならびに配列番号６０、６３、６６〜６８、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが四価である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、構造：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃを含み、前記ＶＨＨが、ヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である、請求項４０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが六価である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、構造：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃを含み、前記ＶＨＨが、ヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である、請求項４２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
ＯＸ４０及びＰＤＬ１に結合する単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号３８７〜３９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
新生物の治療のための請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４６】
腫瘍の破壊を増進するように免疫細胞を調節するための請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４７】
炎症性疾患の治療のための請求項１〜４４のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１月１１日に出願された、米国仮出願第６２／２７７，０２７号の利益を主張する。当該仮出願の各々の内容は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して、ＯＸ４０、すなわち、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーに特異的に係合する分子に関する。より具体的には、本発明は、少なくともＯＸ４０に結合する多価多重特異性分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーは、いくつかの構造的に関連する細胞表面受容体からなる。多量体リガンドによる活性化は、これら受容体の多くの共通の特徴である。ＴＮＦＲＳＦの多くのメンバーは、適切に活性化された場合、非常に多くの病変に治療的有用性を有する。この受容体ファミリーのアゴニズムは、多くの場合高次のクラスター形成を要し、従来の二価抗体はこれに適していない。従って、より強力なＴＮＦＲＳＦのアゴニスト分子に対する治療上の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、少なくともＯＸ４０（別名腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）及び／またはＣＤ１３４）に結合する、多価多重特異性ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）結合融合ポリペプチドを提供する。「ＯＸ４０」という用語の使用は、その任意の変形、例えば、非限定的な例として、ＯＸ−４０を包含することを意図しており、すべての変形は本明細書において互換的に使用される。少なくともＯＸ４０に結合するこれらの分子は、本明細書では、「ＯＸ４０標的化分子」もしくは「ＯＸ４０標的化融合物」もしくは「ＯＸ４０標的化タンパク質」もしくは「ＯＸ４０標的化融合ポリペプチド」または「ＯＸ４０標的化融合タンパク質」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、該ＯＸ４０標的化分子は、多価の分子、例えば、多価ＯＸ４０標的化融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＯＸ４０標的化分子は、多重特異性分子、例えば、多重特異性ＯＸ４０標的化融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＯＸ４０標的化分子は、多価多重特異性分子、例えば、多価多重特異性ＯＸ４０標的化融合タンパク質である。本明細書で使用される、「融合タンパク質」もしくは「融合ポリペプチド」もしくは「ＯＸ４０標的化融合タンパク質」または「ＯＸ４０標的化融合ポリペプチド」という用語は、特に明記しない限り、多価融合タンパク質、多重特異性融合タンパク質、または多価多重特異性融合タンパク質が挙げられるがこれに限定されない本開示の任意の融合タンパク質の実施形態を指す。
【０００５】
本開示はまた、少なくともプログラム死リガンド１（ＰＤＬ１）、別名ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４、Ｂ７ホモログ１、及び／またはＢ７−Ｈ１に結合する多価多重特異性融合ポリペプチドを提供する。「ＰＤＬ１」という用語の使用は、その任意の変形、例えば、非限定的な例として、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤＬ−１を包含することを意図しており、すべての変形は本明細書において互換的に使用される。少なくともＰＤＬ１に結合するこれら分子は、本明細書では、「ＰＤＬ１標的化分子」もしくは「ＰＤＬ１標的化融合物」もしくは「ＰＤＬ１標的化タンパク質」もしくは「ＰＤＬ１標的化融合ポリペプチド」または「ＰＤＬ１標的化融合タンパク質」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１標的化分子は、多価の分子、例えば、多価ＰＤＬ１標的化融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１標的化分子は、多重特異性分子、例えば、多重特異性ＰＤＬ１標的化融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１標的化分子は、多価多重特異性分子、例えば、多価多重特異性ＰＤＬ１標的化融合タンパク質である。本明細書で使用される、「融合タンパク質」もしくは「融合ポリペプチド」もしくは「ＰＤＬ１標的化融合タンパク質」または「ＰＤＬ１標的化融合ポリペプチド」という用語は、特に明記しない限り、多価融合タンパク質、多重特異性融合タンパク質、または多価多重特異性融合タンパク質が挙げられるがこれに限定されない本開示の任意の融合タンパク質の実施形態を指す。
【０００６】
本開示はまた、少なくともＰＤＬ１及びＯＸ４０に結合する多価多重特異性融合ポリペプチドを提供する。少なくともＰＤＬ１に結合するこれら分子は、本明細書では、「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化分子」もしくは「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合物」もしくは「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化タンパク質」もしくは「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合ポリペプチド」または「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合タンパク質」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化分子は、多価の分子、例えば、多価ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化分子は、多重特異性分子、例えば、多重特異性ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化分子は、多価多重特異性分子、例えば、多価多重特異性ＰＤＬ１標的化融合タンパク質である。本明細書で使用される、「融合タンパク質」もしくは「融合ポリペプチド」もしくは「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合タンパク質」または「ＰＤＬ１ｘＯＸ４０標的化融合ポリペプチド」という用語は、特に明記しない限り、多価融合タンパク質、多重特異性融合タンパク質、または多価多重特異性融合タンパク質が挙げられるがこれに限定されない本開示の任意の融合タンパク質の実施形態を指す。
【０００７】
ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーを標的とする従来の抗体は、ＤＲ４、ＤＲ５、ＧＩＴＲ、及びＯＸ４０に対する抗体の活性のためのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）の必要性からも明らかなように、十分なアゴニスト活性を達成するために外因性の架橋を必要とすることが示されている（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ  ２００１  ａｌ  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７，９５４−９６０，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｒｅｓ．６９，６９−８２、Ｐｕｋａｃ  ｅｔ  ａｌ  ２００５  Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２，  １４３０−１４４１、Ｙａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９，  １０６０−１０６７、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２５１：１４６−１５７、Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  ＪＥＭ  ２１０（９）：１６８５、Ｂｕｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９２：４７５−４８０）。ＦｃγＲを介した架橋に加えて、オリゴマーリガンドまたは抗体結合実体（例えば、プロテインＡ及び二次抗体）の付加を含めた他の外因性の要因が、抗ＴＮＦＲＳＦ抗体のクラスター形成及び下流シグナル伝達を高めることが実証されている。例えば、ＤＲ５リガンドＴＲＡＩＬの付加は、抗ＤＲ５抗体のアポトーシス誘導能を高めた（Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６：１７７−１８９）。これらの知見は、ＴＮＦＲＳＦの二量体を超えるクラスター形成の必要性を示唆している。
【０００８】
本開示は、２つ以上のＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン（ＴＢＤ）を含み、少なくとも１つのＴＢＤがＯＸ４０に結合する、多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、新生物の治療に有用である。
【０００９】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、２つ以上の異なるＴＢＤを含み、各ＴＢＤがＯＸ４０に結合する。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの複数のコピーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの少なくとも２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの少なくとも３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの少なくとも４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの少なくとも５つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの少なくとも６つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＯＸ４０に結合するＴＢＤの６つ以上のコピーを含む。
【００１０】
他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＯＸ４０ならびに第二のＴＮＦＲＳＦメンバー、例えば、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＴＮＦＲ２、及び／またはＣＤ４０に結合する。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、腫瘍の破壊の強化につながる免疫細胞を調節する。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、炎症状態の治療に有用である。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、炎症性傷害の抑制につながる免疫細胞を調節する。例えば、ＴＮＦＲ２を特異的に刺激することで、免疫抑制につながるＴｒｅｇ増殖を高めることができる。
【００１１】
本開示の融合タンパク質は、非架橋二価抗体と比較して、ＴＮＦＲＳＦメンバーのクラスター形成を高めることができる。本開示の融合タンパク質が仲介するＴＮＦＲＳＦメンバーのクラスター形成の強化により、非架橋二価抗体と比較して、ＴＮＦＲＳＦ依存性のシグナル伝達の強化が誘導される。ほとんどの実施形態では、該融合タンパク質は、２つより多くのＴＢＤ、例えば、３つ、４つ、５つ、または６つを組み込む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、多重特異性であり、ＴＢＤ及び第二の抗原に対する結合ドメインを含む。これらの実施形態では、第二の抗原に結合することで、さらなる架橋機能を提供することができ、ＴＮＦＲＳＦ活性化は、１つまたは２つのＴＢＤのみで達成することができる。これらの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦのシグナル伝達は、該第二の抗原の存在によって高められ、集中される。これらの多重特異性ＴＢＤ含有融合タンパク質は、所定のＴＮＦＲＳＦメンバーの条件付きシグナル伝達を達成するための有用な手段である。
【００１３】
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨを含めた抗体または抗体断片由来である。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。該ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、人工的に作り出されたＶＨまたはＶＫドメイン由来の場合がある。ＶＨＨは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成することができる。慣例的にヘテロ二量体ＶＨ及びＶＫドメインから単量体のｓｄＡｂを生成するため、界面工学及び特定の生殖細胞系列ファミリーの選択を含め、様々な方法が実行されている。他の実施形態では、該単離されたポリペプチドは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号３０、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３１、３５、及び３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号３２〜３４、４８〜４３、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【００１７】
本開示は、多価融合タンパク質を提供し、これは２つ以上の結合ドメイン（ＢＤ）を含み、少なくとも１つのＢＤがＰＤＬ１に結合する。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、新生物の治療に有用である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、２つ以上の異なるＢＤを含み、各ＢＤがＰＤＬ１に結合する。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの複数のコピーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの少なくとも２つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの少なくとも３つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの少なくとも４つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの少なくとも５つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの少なくとも６つのコピーを含む。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１に結合するＢＤの６つ以上のコピーを含む。
【００１９】
本開示は、ＯＸ４０に特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨを含めた抗体または抗体断片由来である。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。該ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、人工的に作り出されたＶＨまたはＶＫドメイン由来の場合がある。ＶＨＨは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成することができる。慣例的にヘテロ二量体ＶＨ及びＶＫドメインから単量体のｓｄＡｂを生成するため、界面工学及び特定の生殖細胞系列ファミリーの選択を含め、様々な方法が実行されている。他の実施形態では、該単離されたポリペプチドは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号４６〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号５２〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号４６〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号５２〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号５９、６２、６５、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号６０、６３、６６〜６８、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本開示は、少なくともＯＸ４０及びＰＤＬ１に特異的に結合する単離されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドにおける各結合ドメイン（ＢＤ）は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、またはＶＨＨを含めた抗体または抗体断片由来である。いくつかの実施形態では、各ＢＤは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。該ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、人工的に作り出されたＶＨまたはＶＫドメイン由来の場合がある。ＶＨＨは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成することができる。慣例的にヘテロ二量体ＶＨ及びＶＫドメインから単量体のｓｄＡｂを生成するため、界面工学及び特定の生殖細胞系列ファミリーの選択を含め、様々な方法が実行されている。他の実施形態では、該単離されたポリペプチドは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択される４Ｂ１１に結合する第一のアミノ酸配列、ならびに配列番号４６〜５７からなる群から選択されるＰＤＬ１に結合する第二のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択される４Ｂ１１に結合する第一のアミノ酸配列、ならびに配列番号５２〜５７からなる群から選択されるＰＤＬ１に結合する第二のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択される４Ｂ１１に結合するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第一のアミノ酸配列、ならびに配列番号４６〜５７からなる群から選択されるＰＤＬ１に結合するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第二のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択される４Ｂ１１に結合するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第一のアミノ酸配列、ならびに配列番号５２〜５７からなる群から選択されるＰＤＬ１に結合するアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である第二のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、該単離されたポリペプチドは、（ｉ）４Ｂ１１に結合し、配列番号３０、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３１、３５、及び３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号３２〜３４、４８〜４３、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む第一のアミノ酸配列、ならびに（ｉｉ）ＰＤＬ１に結合し、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９、６２、６５、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、ならびに配列番号６０、６３、６６〜６８、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む第二のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本開示の結合ドメイン（ＢＤ）は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＮＡＲ、もしくはＶＨＨを含めた抗体または抗体断片由来である。いくつかの実施形態では、該ＢＤは、ヒトまたはヒト化ｓｄＡｂである。該ｓｄＡｂ断片は、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、人工的に作り出されたＶＨまたはＶＫドメイン由来の場合がある。ＶＨＨは、ラクダ科動物の重鎖のみの抗体から生成することができる。ＶＮＡＲは、軟骨魚類の重鎖のみの抗体から生成することができる。慣例的にヘテロ二量体ＶＨ及びＶＫドメインから単量体のｓｄＡｂを生成するため、界面工学及び特定の生殖細胞系列ファミリーの選択を含め、様々な方法が実行されている。他の実施形態では、該ＢＤＢは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００３０】
概して、本開示の融合タンパク質は、リンカーポリペプチドを介して作動可能に連結された少なくとも２つ以上のＢＤからなる。本開示の融合タンパク質内の特定のＢＤとしてのｓｄＡｂ断片の利用は、多くの二重／多重特異性抗体手法に共通の重鎖：軽鎖誤対合の問題を回避する利点を有する。さらに、本開示の融合タンパク質は、多くの二重特異性抗体が必要とする長いリンカーの使用を回避する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のすべてのＴＢＤは、所定のＴＮＦＲＳＦメンバー上の同じエピトープを認識する。例えば、本開示の融合タンパク質は、ＯＸ４０に対して同じ特異性を備えた２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＴＢＤを組み込んでもよい。他の実施形態では、該融合タンパク質は、所定のＴＮＦＲＳＦメンバー上の異なるエピトープを認識するＴＢＤを組み込む。例えば、本開示の融合タンパク質は、ＯＸ４０上の様々なエピトープに対して異なる認識特異性を備えた２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＴＢＤを組み込んでもよい。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、特定のＴＮＦＲＳＦメンバーの異なる領域を標的とする複数のＴＢＤを含む。いくつかの実施形態では、該ＴＢＤは、同じＴＮＦＲＳＦメンバー上の異なるエピトープを認識しても、異なるＴＮＦＲＳＦメンバー上のエピトープを認識してもよい。例えば、本開示は、ＧＩＴＲ及びＯＸ４０またはＣＤ１３７及びＯＸ４０に結合するＴＢＤを組み込む多重特異性融合タンパク質を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のすべてのＢＤは、ＰＤＬ１上の同じエピトープを認識する。例えば、本開示の融合タンパク質は、ＰＤＬ１に対して同じ特異性を備えた２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＢＤを組み込んでもよい。他の実施形態では、該融合タンパク質は、ＰＤＬ１上の異なるエピトープを認識するＢＤを組み込む。例えば、本開示の融合タンパク質は、ＰＤＬ１上の様々なエピトープに対して異なる認識特異性を備えた２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＢＤを組み込んでもよい。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、ＰＤＬ１上の異なる領域を標的とする複数のＢＤを含む。いくつかの実施形態では、該ＢＤは、ＰＤＬ１上の異なるエピトープを認識してもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態では、該多重特異性融合タンパク質は、ＯＸ４０及びＰＤＬ１を標的とする二重特異性分子であり、配列番号３８７〜３９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、該多重特異性融合タンパク質は、ＯＸ４０及びＰＤＬ１を標的とし、配列番号３８７〜３９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、二重特異性分子である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、単一のポリペプチドからなる。他の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、複数のポリペプチドからなる。例えば、その場合、該融合タンパク質にはヘテロ二量体化ドメインが組み込まれ、非対称融合タンパク質が構築される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域が該融合タンパク質に組み込まれた場合、当該ＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化ドメインとして使用してもよいし、該ＣＨ３二量体界面領域を変異させ、ヘテロ二量体化を可能にしてもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＢＤを両端に含む。例えば、該ＢＤは、該融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部分及び該融合タンパク質のカルボキシ末端（Ｃ末端）部分の両方に位置する。他の実施形態では、すべてのＴＢＤが該融合タンパク質の同じ末端に存在する。例えば、ＢＤは、該融合タンパク質のアミノまたはカルボキシ末端部分のいずれかに存在する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、該リンカーポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、該免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプ、及びＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプである。
【００３８】
2019504062.tif 000003
【００３９】
いくつかの実施形態では、該免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号１のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、該融合タンパク質のグリコシル化を防ぐため、アミノ酸Ａｓｎ２９７（配列番号１〜４において四角で囲まれている、Ｋａｂａｔナンバリング）で、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）またはＡｓｎ２９７Ａｓｐ（Ｎ２９７Ｄ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Ｌｅｕ２３５（配列番号１において太字、Ｋａｂａｔナンバリング）で、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）またはＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Ｌｅｕ２３４（配列番号１において太字、Ｋａｂａｔナンバリング）で修飾され、例えば、Ｆｃ受容体相互作用を変更するため、アミノ酸Ｌｅｕ２３４（四角で囲まれている、Ｋａｂａｔナンバリング）で、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）である。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、アミノ酸２３４及び２３５の両方で、例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）またはＬｅｕ２３４Ｖａｌ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ）に変更される。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減するため、以下の位置の１つ以上でアミノ酸を欠損している：Ｇｌｕ２３３（Ｅ２３３、配列番号１において太字）、Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、またはＬｅｕ２３５（Ｌ２３５）。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減するため、Ｇｌｙ２３５で変更される。例えば、その場合、Ｇｌｙ２３５は、該融合タンパク質から削除される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、ＣＤ３２Ａとの相互作用を高めるため、アミノ酸Ｇｌｙ２３６（配列番号１において四角で囲まれている）で、例えば、Ｇｌｙ２３６Ａｌａ（Ｇ２３６Ａ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域は、Ｌｙｓ４４７を欠損している（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００４１】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減するため、以下の位置の１つ以上で変更される：Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）、またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）、またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、該Ｆｃ領域内での修飾は、Ｆｃ受容体ガンマ受容体への結合を低減する一方、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合にはわずかな影響しか及ぼさない。
【００４２】
2019504062.tif 000004
【００４３】
いくつかの実施形態では、該免疫グロブリンＦｃ領域またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ１ポリペプチド配列を含む。
【００４４】
2019504062.tif 000005
【００４５】
いくつかの実施形態では、該融合物またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号３のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ２ポリペプチド配列を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域は、該抗体のグリコシル化を防ぐため、アミノ酸Ａｓｎ２９７（配列番号１、３、４、及び５において四角で囲まれている）で、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域は、配列番号３の残基２１７に対応するＬｙｓ４４７を欠損している（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００４７】
2019504062.tif 000006
【００４８】
いくつかの実施形態では、該抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ３ポリペプチド配列を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域は、該抗体のグリコシル化を防ぐため、アミノ酸Ａｓｎ２９７（配列番号１〜４において四角で囲まれている、Ｋａｂａｔナンバリング）で、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域は、半減期を延長するため、アミノ酸４３５で、例えば、Ａｒｇ４３５Ｈｉｓ（Ｒ４３５Ｈ、配列番号３において四角で囲まれている）に修飾される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域は、配列番号４の残基２１８に対応するＬｙｓ４４７を欠損している（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００５０】
2019504062.tif 000007
【００５１】
いくつかの実施形態では、該抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。
【００５２】
他の実施形態では、該ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体相互作用を変更するため、アミノ酸２３５で、例えば、Ｌｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、該抗体のグリコシル化を防ぐため、アミノ酸Ａｓｎ２９７（配列番号１〜４において四角で囲まれている、Ｋａｂａｔナンバリング）で、例えば、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、配列番号４の残基２１８に対応するＬｙｓ４４７を欠損している（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００５３】
2019504062.tif 000008
【００５４】
いくつかの実施形態では、該抗体またはその免疫学的に活性な断片は、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヒトＩｇＧ４ポリペプチド配列を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を高めるように修飾される。ＦｃＲｎに対する結合を高めるＦｃ変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（それぞれ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｋａｂａｔナンバリング、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ  ２００６、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌ．２８１（３３）２３５１４−２３５２４）、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ及びＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ｓ）（Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖｏｌ．２８（２）１５７−１５９）、またはＭｅｔ２５２Ｉｌｅ、Ｔｈｒ２５６Ａｓｐ、Ｍｅｔ４２８Ｌｅｕ（それぞれ、Ｍ２５２Ｉ、Ｔ２５６Ｄ、Ｍ４２８Ｌ）、（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）である。Ｍｅｔ２５２は、配列番号１、４、及び５における残基２３ならびに配列番号３における残基２２に対応する。Ｓｅｒ２５４は、配列番号１、４、及び５の残基２５ならびに配列番号３における残基２４に対応する。Ｔｈｒ２５６は、配列番号１、４、及び５における残基２７ならびに配列番号３における残基２６に対応する。Ｍｅｔ４２８は、配列番号１、４、及び５における残基１９９ならびに配列番号３における残基１９８に対応する。Ａｓｎ４３４は、配列番号１、４、及び５における残基２０５ならびに配列番号３における残基２０４に対応する。本開示の融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含むいくつかの実施形態では、該Ｆｃポリペプチドは、変異または修飾される。これらの実施形態では、該変異または修飾されたＦｃポリペプチドは、以下の変異を含む：Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ及びＭｅｔ４２８Ｌｅｕ（Ｍ２５２Ｙ、Ｍ４２８Ｌ）。
【００５６】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更するように、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６８（１０）：３８６３−７２、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６（４）：２５７１−５、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ｍＡｂｓ，２（２）：１８１−１８９、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  ＰＮＡＳ，１０３（１１）：４００５−４０１０，Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  ＪＢＣ，２７６（９）：６５９１−６６０４、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２−８８９０、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ａｄｖａｎ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．，４８：１５２−１６４、Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：３４６１−３４６８、Ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｋａｎｅｋｏ  ａｎｄ  Ｎｉｗａ，２０１１  Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２５（１）：１−１１に記載のアミノ酸修飾に修飾される。ＡＤＣＣを高める変異の例としては、Ｓｅｒ２３９及びＩｌｅ３３２で、例えば、Ｓｅｒ２３９Ａｓｐ及びＩｌｅ３３２Ｇｌｕ（Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ）の修飾が挙げられる。ＣＤＣを高める変異の例としては、配列番号１、４、及び５の残基９７ならびに配列番号３の残基９６に対応するＬｙｓ３２６、ならびに配列番号１、４、及び５の残基１０４ならびに配列番号３の残基１０３に対応するＧｌｕ３３３での修飾が挙げられる。いくつかの実施形態では、該Ｆｃ領域は、これらの位置の少なくとも一方または両方で、例えば、Ｌｙｓ３２６Ａｌａ及び／またはＧｌｕ３３３Ａｌａ（Ｋ３２６Ａ及びＥ３３３Ａ）に修飾される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ヘテロ二量体化を誘導するように修飾される。例えば、ＣＨ３ドメイン内にＴｈｒ３６６でアミノ酸修飾を有することは、これがより嵩高いアミノ酸、例えば、Ｔｒｐで置換された場合（Ｔ３６６Ｗ）に、配列番号１、４、及び５の残基１３７ならびに配列番号３の残基１３６に対応する位置Ｔｈｒ３６６、配列番号１、４、及び５の残基１３９ならびに配列番号３の残基１３８に対応するＬｅｕ３６８の位置、ならびに配列番号１、４、及び５の残基１７８ならびに配列番号３の残基１７７に対応するＴｙｒ４０７の位置であまり嵩高くないアミノ酸へのアミノ酸修飾、例えば、それぞれ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、及びＶａｌ（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）を有する第二のＣＨ３ドメインと選択的に対を形成することができる。ＣＨ３の修飾を介したヘテロ二量体化は、ジスルフィド結合の導入によって、例えば、反対側のＣＨ３ドメイン上で、配列番号１、４、及び５の残基１２５ならびに配列番号３の残基１２４に対応するＳｅｒ３５４をＣｙｓに（Ｓ３５４Ｃ）、ならびに配列番号１、４、及び５の残基１２０ならびに配列番号３の残基１１９に対応するＴｙｒ３４９をＣｙｓに（Ｙ３４９Ｃ）変えることによってさらに安定化することができる（Ｃａｒｔｅｒ，２００１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８：７−１５に概説されている）。これらの実施形態のいくつかでは、該Ｆｃ領域を、該ヘテロ二量体の一方のメンバーのプロテインＡ結合部位で修飾し、プロテインＡの結合を防ぎ、それにより、当該ヘテロ二量体融合タンパク質のより効果的な精製を可能にしてもよい。この結合部位内での例示的な修飾は、Ｉｌｅ２５３であり、これは、配列番号１、４、及び５の残基２４ならびに配列番号３の残基２３に対応し、例えば、Ｉｌｅ２５３Ａｒｇ（Ｉ２５３Ｒ）である。例えば、該Ｉ２５３Ｒの修飾は、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖの修飾またはＴ３６６Ｗの修飾のいずれかと組み合わせてもよい。該Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ修飾Ｆｃは、Ｔ３３６Ｗ修飾Ｆｃの場合にあるような二量体形成面の立体妨害がないため、ホモ二量体を形成することができる。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２５３Ｒの修飾は、形成された可能性がある任意のホモ二量体Ｆｃの精製をさせないように、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ修飾Ｆｃと組み合わせる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、該ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、二量体化を防ぐように修飾される。これらの実施形態では、本開示の融合タンパク質は単量体である。例えば、残基Ｔｈｒ３６６における荷電残基への修飾、例えば、Ｔｈｒ３６６Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３６６Ａｒｇ、Ｔｈｒ３６６Ａｓｐ、またはＴｈｒ３６６Ｇｌｕ（それぞれ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｒ、Ｔ３６６Ｄ、またはＴ３６６Ｅ）は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防ぐ。
【００５９】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体結合を低減するため以下の位置の１つ以上で変更される：Ｌｅｕ２３４（Ｌ２３４）、Ｌｅｕ２３５（Ｌ２３５）、Ａｓｐ２６５（Ｄ２６５）、Ａｓｐ２７０（Ｄ２７０）、Ｓｅｒ２９８（Ｓ２９８）、Ａｓｎ２９７（Ｎ２９７）、Ａｓｎ３２５（Ｎ３２５）、またはＡｌａ３２７（Ａ３２７）。例えば、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ）、Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ）、Ａｓｐ２６５Ａｓｎ（Ｄ２６５Ｎ）、Ａｓｐ２７０Ａｓｎ（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｅｒ２９８Ａｓｎ（Ｓ２９８Ｎ）、Ａｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ）、Ａｓｎ３２５Ｇｌｕ（Ｎ３２５Ｅ）、またはＡｌａ３２７Ｓｅｒ（Ａ３２７Ｓ）。好ましい実施形態では、該Ｆｃ領域内での修飾は、Ｆｃ受容体ガンマ受容体への結合を低減する一方、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合にはわずかな影響しか及ぼさない。
【００６０】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、免疫グロブリンヒンジ領域由来のポリペプチドを含む。該ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧアイソタイプのいずれかから選択することができる。例えば、該融合タンパク質は、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号７）の配列を有する修飾ＩｇＧ１ヒンジを含んでよく、この場合、軽鎖Ｃ末端システインとジスルフィドを形成するＣｙｓ２２０はセリン、例えば、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ（Ｃ２２０Ｓ）に変異される。他の実施形態では、該融合タンパク質は、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号８）の配列を有する切頭ヒンジを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣ（配列番号９）の配列を有するＩｇＧ４由来の修飾ヒンジを有し、これは、鎖交換を防ぐまたは低減するため、例えば、Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ）に修飾される。いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、１つ以上のリンカーポリペプチドを含む。他の実施形態では、該融合タンパク質は、１つ以上のリンカー及びヒンジポリペプチドを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質は、Ｎ２９７でＮ結合グリカン鎖に結合したフコースを欠損しているか、これが減少している。フコシル化を防ぐには、ＦＵＴ８欠損細胞株の産生、哺乳類細胞培養培地への阻害剤、例えば、カスタノスペルミン、２−デオキシフコース、２−フルロフコースの添加、フコシル化経路が天然に低下した生産細胞株、及び該生産細胞株の代謝工学の使用が挙げられるがこれらに限定されない多くの方法がある。
【００６３】
いくつかの実施形態では、該単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、もしくはヒト化単一ドメイン抗体、またはヒト単一ドメイン抗体は、ヒトで見られる既存の抗体による認識を排除するように操作される。いくつかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、Ｌｅｕ１１の位置の変異、例えば、Ｌｅｕ１１Ｇｌｕ（Ｌ１１Ｅ）またはＬｅｕ１１Ｌｙｓ（Ｌ１１Ｋ）によって修飾される。他の実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、カルボキシ末端領域の変化によって修飾される。例えば、該末端配列は、ＧＱＧＴＬＶＴＶＫＰＧＧ（配列番号１４）もしくはＧＱＧＴＬＶＴＶＥＰＧＧ（配列番号１５）またはその修飾からなる。いくつかの実施形態では、本開示の単一ドメイン抗体は、位置１１の変異によって、及びカルボキシ末端領域の変化によって修飾される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質のＴＢＤは、アミノ酸リンカーを介して作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、主にアミノ酸グリシン及びセリンで構成され、本明細書ではＧＳリンカーとして示される。本開示の融合タンパク質のＧＳリンカーは、様々な長さ、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０アミノ酸長のものであることができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、該ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）２（配列番号１０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）３（配列番号１１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）４（配列番号１２）、及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）５（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、該多価結合融合タンパク質は、四価である。いくつかの実施形態では、該四価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。いくつかの実施形態では、該四価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＢＤ。
【００６７】
いくつかの実施形態では、該四価融合タンパク質のＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該四価融合タンパク質の各ＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該四価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。いくつかの実施形態では、該四価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＶＨＨ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、四価である。いくつかの実施形態では、該四価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。いくつかの実施形態では、該四価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＴＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＴＢＤ。
【００６９】
いくつかの実施形態では、該四価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質のＴＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質の各ＴＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、四価である。いくつかの実施形態では、該四価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。いくつかの実施形態では、該四価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＶＨＨ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、該ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）２（配列番号１０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）３（配列番号１１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）４（配列番号１２）、及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）５（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、該四価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質のＴＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質の各ＴＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多価融合タンパク質は、六価である。いくつかの実施形態では、該六価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。いくつかの実施形態では、該六価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＢＤ、またはＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤ。
【００７２】
いくつかの実施形態では、該六価融合タンパク質のＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該六価融合タンパク質の各ＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該六価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。いくつかの実施形態では、該六価融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＶＨＨ、またはＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、六価である。いくつかの実施形態では、該六価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ。いくつかの実施形態では、該六価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＴＢＤ、またはＴＢＤ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ。
【００７４】
いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、六価である。いくつかの実施形態では、該六価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。いくつかの実施形態では、該六価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、以下の構造を有する：ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＶＨＨ、またはＶＨＨ−リンカー−ヒンジ−Ｆｃ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ、ここで、ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、該多価融合タンパク質は、Ｆｃ領域を欠損している。これらの実施形態のいくつかでは、該融合タンパク質は、四価であり、以下の構造ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカーを有する。これらの実施形態のいくつかでは、該融合タンパク質は、五価であり、以下の構造ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカーＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤを有する。これらの実施形態のいくつかでは、該融合タンパク質は、六価であり、以下の構造ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカー−ＢＤ−リンカーＢＤを有する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、Ｆｃ領域を欠損している。これら実施形態のいくつかでは、該ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、四価であり、以下の構造ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカーを有する。これらの実施形態のいくつかでは、該ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、五価であり、以下の構造ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカーＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤを有する。これらの実施形態のいくつかでは、該ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、六価であり、以下の構造ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカー−ＴＢＤ−リンカーＴＢＤを有する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、多価融合タンパク質の該ＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多価融合タンパク質は、Ｆｃ領域を欠損している。これらの実施形態のいくつかでは、該融合タンパク質は、四価であり、以下の構造ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカーを有する。これらの実施形態のいくつかでは、該融合タンパク質は、五価であり、以下の構造ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨを有する。これらの実施形態のいくつかでは、該融合タンパク質は、六価であり、以下の構造ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨを有する。これらの実施形態のいずれかにおいて、該ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質のＴＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、Ｆｃ領域を欠損している。これらの実施形態では、該ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、四価であり、以下の構造ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカーを有する。これらの実施形態では、該ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、五価であり、以下の構造ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカーＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨを有する。これらの実施形態では、該ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質は、六価であり、以下の構造ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカー−ＶＨＨ−リンカーＶＨＨを有する。これらの実施形態では、該ＶＨＨはヒト化または完全ヒトＶＨＨ配列である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、該ＧＳリンカーは、ＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）２（配列番号１０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）３（配列番号１１）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）４（配列番号１２）、及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、すなわち、（ＧＧＳ）５（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、多重特異性であり、ＴＢＤ及び第二の抗原に対する結合ドメインを含む。これらの実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該ＴＢＤに対して該分子内の多くの位置に配置することができる。いくつかの実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、Ｎ末端ＴＢＤに位置する。他の実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該ＴＢＤに対してＣ末端に位置する。他の実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該ＴＢＤを含む第一のポリペプチドと会合する別のポリペプチド上に位置する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、多重特異性であり、抗ＯＸ４０結合ドメイン及び第二の抗原に対する結合ドメインを含む。これらの実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該抗ＯＸ４０結合ドメインに対して該分子内の多くの位置に配置することができる。いくつかの実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、Ｎ末端抗ＯＸ４０結合ドメインに位置する。他の実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該抗ＯＸ４０結合ドメインに対してＣ末端に位置する。他の実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該抗ＯＸ４０結合ドメインを含む第一のポリペプチドと会合する別のポリペプチド上に位置する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、多重特異性であり、抗ＰＤＬ１結合ドメイン及び第二の抗原に対する結合ドメインを含む。これらの実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該抗ＰＤＬ１結合ドメインに対して該分子内の多くの位置に配置することができる。いくつかの実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、Ｎ末端抗ＰＤＬ１結合ドメインに位置する。他の実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該抗ＰＤＬ１結合ドメインに対してＣ末端に位置する。他の実施形態では、該第二の抗原の結合ドメインは、該抗ＰＤＬ１結合ドメインを含む第一のポリペプチドと会合する別のポリペプチド上に位置する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内のＴＢＤは、単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内のＴＢＤは、抗体可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖領域からなる。いくつかの実施形態では、該ＴＢＤのＶＨ及びＶＬは、リンカー領域を介して連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、該ＴＢＤのＶＨ及びＶＬは、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを介して会合するＦＡＢ断片としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、非抗体ヘテロ二量体化ドメインを使用し、該ＴＢＤのＶＨ及びＶＬの適切な会合を可能にする。いくつかの実施形態では、該多価ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内のＴＢＤは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内のＴＢＤは、ＯＸ４０に結合する単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内の抗ＯＸ４０結合ドメインは、抗体可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖領域からなる。いくつかの実施形態では、該抗ＯＸ４０結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、リンカー領域を介して連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、該抗ＯＸ４０結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを介して会合するＦａｂ断片としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、非抗体ヘテロ二量体化ドメインを使用し、該抗ＯＸ４０結合ドメインのＶＨ及びＶＬの適切な会合を可能にする。いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内の抗ＯＸ４０結合ドメインは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、該多重特異性融合タンパク質内の結合ドメインは、ＰＤＬ１に結合する単一ドメイン抗体またはＶＨＨである。いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質内の抗ＰＤＬ１結合ドメインは、抗体可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖領域からなる。いくつかの実施形態では、該抗ＰＤＬ１結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、リンカー領域を介して連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、該抗ＰＤＬ１結合ドメインのＶＨ及びＶＬは、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを介して会合するＦａｂ断片としてフォーマットされる。いくつかの実施形態では、非抗体ヘテロ二量体化ドメインを使用し、該抗ＰＤＬ１結合ドメインのＶＨ及びＶＬの適切な会合を可能にする。いくつかの実施形態では、該多重特異性融合タンパク質内の抗ＰＤＬ１結合ドメインは、非抗体骨格タンパク質、例えば、これらに限定されないが、設計アンキリンリピートタンパク質（ｄａｒｐｉｎ）、アビマー、アンチカリン／リポカリン、センチリン、及びフィノマー由来である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、該多重特異性ＴＮＦＲＳＦ結合融合タンパク質の抗ＯＸ４０結合ドメインは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、該多重特異性融合タンパク質の抗ＰＤＬ１結合ドメインは、二重特異性抗体またはその抗原結合断片である。
【００８８】
これらの実施形態のいずれかにおいて、該二重特異性抗体またはその抗原断片は、非限定的な例として、抗体断片、例えば、Ｘ−Ｌｉｎｋ  Ｆａｂ、架橋Ｆａｂ断片、ｔａｓｃＦｖ／ＢｉＴＥ、タンデムｓｃＦｖ／二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒ）、Ｄｂ、二重特異性抗体、ｔａＤｂ、タンデム二重特異性抗体に基づくフォーマット、Ｆｃ融合物、例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、二重特異性抗体−Ｆｃ融合物、ｔａＤｂ−Ｆｃ融合物、タンデム二重特異性抗体−Ｆｃ融合物、ｔａＤｂ−ＣＨ３、タンデム二重特異性抗体−ＣＨ３融合物、（ｓｃＦｖ）４−Ｆｃ、テトラｓｃＦｖ−Ｆｃ融合物、ＤＶＤ−Ｉｇ、二重可変ドメイン免疫グロブリンに基づくフォーマット、ＩｇＧフォーマット、例えば、ノブ−穴及びＳＥＥＤ、鎖交換操作ドメイン、ＣｒｏｓｓＭａｂ、重鎖及び軽鎖ドメイン交換と組み合わせたノブ−穴、ｂｓＡｂ、クアドローマ由来二重特異性抗体、ｓｄＡｂ、単一ドメインベースの抗体、ならびにカッパ−ラムダ体、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／０２３０５３号に記載のものを含めた当技術分野で既知の任意の適切な二重特異性フォーマットでよい。
【００８９】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＴＢＤは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９０】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＴＢＤは、配列番号３０、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３１、３５、及び３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号３２〜３４、４８〜４３、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。
【００９１】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＢＤは、配列番号４６〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＢＤは、配列番号５２〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９３】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＢＤは、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９、６２、６５、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、ならびに配列番号６０、６３、６６〜６８、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【００９４】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＴＢＤは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのＢＤは、配列番号４６〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９５】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＴＢＤは、配列番号１６〜２９及び３７７〜３８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、少なくとも１つのＢＤは、配列番号５２〜５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９６】
上記実施形態のいずれかにおいて、少なくとも１つのＴＢＤは、配列番号３０、３６、及び４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号３１、３５、及び３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、ならびに配列番号３２〜３４、４８〜４３、及び４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、少なくとも１つのＢＤは、配列番号５８、６１、及び６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号５９、６２、６５、及び６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、ならびに配列番号６０、６３、６６〜６８、及び７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本開示の例示的な多価多重特異性融合タンパク質の概略図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ＯＸ４０の単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）が細胞表面ＯＸ４０に結合する能力を示すグラフである。結合は、ＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【図３】ＯＸ４０の単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）がＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの間の相互作用を遮断する能力を示すグラフである。２Ｅ４は、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの間の相互作用を遮断するが、他の単一ドメイン抗体は遮断しない。ＧＩＴＲに結合する単一ドメイン抗体は、陰性対照として含めた。遮断は、ＯＸ４０Ｌシトリン融合タンパク質を用いたフローサイトメトリーで評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【図４】ＯＸ４０の単一ドメイン抗体がカニクイザルのＯＸ４０に結合する能力を示すグラフである。結合は、ｃｙｎｏＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【図５】図５Ａは、多価ＯＸ４０結合融合タンパク質のフォーマット及び推定分子量を示す概略図である。図５Ｂは、多価ＯＸ４０結合融合タンパク質の還元及び非還元条件下でのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図６】ＯＸ４０のシグナル伝達の強化が、より高い価数の結合によって仲介されることを示すグラフである。ここに示すのは、本開示の融合タンパク質を用いたＯＸ４０の四価及び二価の結合の間の比較である。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。ＴＢＤとして１Ｄ１０を組み込んだ融合タンパク質をこれらのアッセイに用いた。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、ＯＸ４０のシグナル伝達の強化が、より高い価数の結合によって仲介されることを示すグラフである。図７Ａに示すのは、本開示の融合タンパク質を用いたＯＸ４０の四価及び六価の結合の間の比較である。図７Ｂに示すのは、本開示の融合タンパク質を用いたＯＸ４０の六価結合と六量体のＯＸ４０Ｌ融合タンパク質（ＵＳ＿７９５９９２５に記載）の間の比較である。本開示の多価ＯＸ４０結合融合タンパク質は、該六量体のＯＸ４０Ｌ融合タンパク質と比較して、同等または強化されたＯＸ４０アゴニスト活性を示す。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。ＴＢＤとして１Ｄ１０を組み込んだ融合タンパク質をこれらのアッセイに用いた。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、四価（図８Ａ）及び六価（図８Ｂ）１Ｄ１０に関するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）からの溶出プロファイルを示す一連のグラフである。保持容量（標準曲線）に基づいて計算した分子量も示す。
【図９】Ｆｃ領域に連結された３つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた六価、Ｆｃ領域に連結された２つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価、ならびにＦｃ領域に離間されたＮ末端及びＣ末端のＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価を含めた本開示の融合タンパク質の様々な多価フォーマットによって仲介されるＯＸ４０のシグナル伝達を示すグラフである。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。ＴＢＤとして１Ｄ１０を組み込んだ融合タンパク質をこれらのアッセイに用いた。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、本開示の二重特異性ＰＤＬ１−ＯＸ４０標的化融合タンパク質によって仲介されるＰＤＬ１依存性ＯＸ４０アゴニズムを示す。図１０Ａ及びＢは、二重特異性融合タンパク質が、ＰＤＬ１発現細胞が結合（図１０Ｂ）しない限りわずかなＯＸ４０アゴニスト特性（図１０Ａ）しか有さないことの概念図である。図１０Ｃは、ＰＤＬ１陽性細胞（ここではＰＤＬ１トランスフェクトＣＨＯ細胞）がＯＸ４０のシグナル伝達を仲介する能力があること及びＰＤＬ１陰性細胞（ここでは非トランスフェクトＣＨＯ細胞）がＯＸ４０のシグナル伝達を仲介する能力がないことを示すグラフである。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。この図では、多くの異なる二重特異性融合タンパク質を示し、各々が異なるＯＸ４０結合ＶＨＨ（例えば、Ｇ３、２Ｅ４、３Ｇ９、１Ｄ１０）及び同じＰＤＬ１  ＶＨＨ、すなわち２８Ａ１０を含む。
【図１１】本開示の二重特異性ＦＲａ−ＯＸ４０標的化融合タンパク質によって仲介されるＦＲα依存性ＯＸ４０アゴニストのシグナル伝達を示す。ＦＲαを発現する卵巣がん細胞株、すなわち、ＳＫＯＶ３をこれらのアッセイに用いた。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。この図では、多くの異なる二重特異性融合タンパク質を示し、各々が異なるＦＲα結合ＶＨＨ（例えば、１Ｇ１０、１Ａ３、５７、５）及び同じＯＸ４０  ＶＨＨ、すなわち、１Ｄ１０を含む。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、ヒト化ＯＸ４０の単一ドメイン抗体がヒトＯＸ４０及びカニクイザルＯＸ４０に結合する能力を示す一連のグラフである。結合は、ＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、ヒト化ＯＸ４０の単一ドメイン抗体が様々なＴＮＦＲＳＦメンバーに結合する能力を示す一対のグラフである。これらのアッセイのため、四価及び六価分子にＴＢＤとして本開示の様々なヒト化ｓｄＡｂを用いた。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＯＸ４０のシグナル伝達が、Ｆｃ領域に連結された３つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた六価、Ｆｃ領域に連結された２つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価、ならびにＦｃ領域に離間されたＮ末端及びＣ末端のＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価を含めた本開示の融合タンパク質の様々な多価フォーマットによって仲介されることを示す一対のグラフである。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。これらのアッセイのため、四価及び六価分子にＴＢＤとして本開示の様々なヒト化ｓｄＡｂを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
発明の詳細な説明
本明細書で言及するすべての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が具体的かつ個別に参照することにより組み込まれることが示された場合と同じ程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００９９】
定義
他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質及びオリゴまたはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリッド形成に関連して使用される命名法及びそれらの技術は、当技術分野で周知の一般に使用されるものである。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的な技術を用いる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当技術分野で一般に達成される通り、もしくは本明細書に記載の通りに実施される。前述の技術及び手順は、概して、当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用及び議論されている様々な一般的ならびにより具体的な参考文献に記載の通りに実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品及び薬化学と関連して使用される命名法、ならびにそれらの実験手順及び技術は、当技術分野で周知の一般に用いられているものである。化学合成、化学分析、医薬品調製、処方、及び送達、ならびに患者の治療には標準的な技術が用いられる。
【０１００】
本開示に従って使用される以下の用語は、別段の指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【０１０１】
本明細書で使用される、「二重標的化融合タンパク質」及び「抗体」という用語は、同義語であり得る。本明細書で使用される、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」もしくは「〜と免疫反応する」または「〜に対する」は、当該抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応しかつ他のポリペプチドとは反応せず、またははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ発現ライブラリ、ならびに単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片、例えば、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、人工的に作り出されたＶＨまたはＶＫが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの相同対からなり、各対は、１つの「軽」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を画定する。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に含まれる重鎖の性質が互いに異なるクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤのいずれかに関連している。ある特定のクラスはなおサブクラス（別名アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等を有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖の場合もラムダ鎖の場合もある。
【０１０３】
本明細書で使用される、「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物及び特有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子のただ１つの分子種を含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、該集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、当該抗原の特定のエピトープと免疫反応することができ、それに対する特有の結合親和性を特徴とする抗原結合部位を含む。
【０１０４】
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。該抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐した範囲は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより大きな程度に保存された隣接範囲間に入れられる。従って、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域間、及びこれらに隣接して天然に見いだされるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間で互いに関連して配置され、抗原結合表面を形成する。該抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（１９８７及び１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【０１０５】
本開示の融合タンパク質の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片部分は、本明細書では互換的に本明細書の標的化ポリペプチドと呼ばれる。
【０１０６】
本明細書で使用される、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはその断片、またはＴ細胞受容体に対して／によって特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定基を含む。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に対して／によって特異的に結合することが可能な任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面集団からなり、通常、特定の３次元構造特性及び特定の荷電特性を有する。抗体は、解離定数が≦１ｍＭ、例えば、いくつかの実施形態では、≦１μＭ、例えば、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、または≦１ｎＭである場合に抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１０７】
本明細書で使用される、「免疫学的結合」及び「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子及び該免疫グロブリンが特異的な抗原の間に生じるタイプの非共有結合性相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）を単位として表現することができ、より小さいＫｄはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。１つのかかる方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度の測定を伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、「オン速度定数」（ｋｏｎ）及び「オフ速度定数」（ｋｏｆｆ）の両方は、濃度及び会合と解離の実際の速度の計算によって決定することができる（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３）参照）。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの相殺を可能にし、解離定数Ｋｄに等しい（一般的に、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３参照）。本開示の抗体は、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー結合アッセイ、または当技術分野で知られる同様のアッセイ等のアッセイで測定して、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１ｍＭ、いくつかの実施形態では、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、または≦１００ｐＭ〜約１ｐＭの場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１０８】
本明細書で使用される、「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源の、またはそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドであって、その起源に基づいて、該「単離されたポリヌクレオチド」が（１）ポリヌクレオチドのすべてまたは一部と会合していないもの、この場合、該「単離されたポリヌクレオチド」は天然に見いだされるものである、（２）天然には結合していないポリヌクレオチドと作動可能に連結されているもの、または（３）より大きな配列の一部として天然には生じないものを意味するものとする。
【０１０９】
本明細書で言及する「単離されたタンパク質」という用語は、ｃＤＮＡ、組み換えＲＮＡ、もしくは合成起源の、またはそれらのいくつかの組合せのタンパク質であって、その起源または誘導源に基づいて、該「単離されたタンパク質」が（１）天然に見いだされるタンパク質と会合していないもの、（２）同じ起源由来の他のタンパク質を含まない、例えば、海洋タンパク質を含まないもの、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるもの、または（４）天然に生じないものを意味する。
【０１１０】
属名としての「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、天然タンパク質、断片、またはポリペプチド配列の類似体を指すために使用される。従って、天然タンパク質断片、及び類似体は、ポリペプチド属の種である。
【０１１１】
本明細書で使用される、対象物に適用される「天然に存在する」という用語は、対象物が天然に見出され得るという事実を指す。例えば、天然の起源から単離することができる生物（ウイルスを含む）に含まれるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列であり、実験室やその他で人間によって意図的に改変されていないものは、天然に存在するものである。
【０１１２】
本明細書で使用される、「作動可能に連結される」という用語は、そのように記載された成分の位置が、意図的にそれらが機能できるようにする関係にあることを指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、該制御配列に適合する条件下で該コード配列の発現が達成されるような方法で結合される。
【０１１３】
本明細書で使用される、「制御配列」という用語は、それらが結合されるコード配列の発現及びプロセシングを達成するのに必須のポリヌクレオチド配列を指す。かかる制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に応じて異なり、かかる制御配列は、真核細胞においては一般にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、一般に、かかる制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。「制御配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須であるすべての成分を最低限含むことを意図し、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナーの配列も含むことができる。本明細書で言及する、「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態のポリマーホウ素を指す。該用語は、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【０１１４】
本明細書で言及される「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する、及び天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって連結された、天然に存在するヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドのサブセットである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜６０塩基であり、いくつかの実施形態では、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは、通常、一本鎖であるが、例えば、遺伝子変異体の構築用の、例えば、プローブに関しては、オリゴヌクレオチドは二本鎖の場合がある。本開示のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかである。
【０１１５】
本明細書で言及される「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換糖基等を備えたヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレルロエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｒｌｏａｔｅ）、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホロンミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｎｍｉｄａｔｅ）等のオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）、Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））、Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，１５１，５１０号、Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、検出用の標識を含むことができる。
【０１１６】
本明細書で言及される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本開示のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びそれらの断片は、不特定の核酸に対する検出可能な結合の相当量を最小限にするハイブリッド形成及び洗浄条件下において、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。当技術分野で知られ、本明細書で論じるように、高厳密性条件を用いて選択的ハイブリッド形成条件を達成することができる。概して、本開示のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及び断片と、目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％の高い相同性を伴う。２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合、相同である。例えば、８５％相同とは、当該２つの配列を最大一致のために整列させた場合に該アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（一致させる２つの配列のいずれかでの）は、一致の最大化において許容され、ギャップ長は５以下が好ましく、２以下がより好ましい。別の方法として、２つのタンパク質配列（または長さ少なくとも３０アミノ酸の、それら由来のポリペプチド配列）は、それらが、変異データマトリクス及びギャップペナルティ６以上のプログラムＡＬＩＧＮを用いてアラインメントスコアが５を超える（標準偏差単位で）場合、この用語が本明細書で使用される通り相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））及びこの巻に対する追補２、ｐｐ．１−１０を参照されたい。該２つの配列またはそれらの一部は、それらのアミノ酸を、該ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列させた場合に５０％以上同一であればより好ましく相同である。「〜に対応する」という用語は、本明細書では、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部に対して相同（すなわち、同一、厳密には進化的に関連しない）であること、または、ポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。対照的に、「〜と相補的」という用語は、本明細書では、当該相補配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【０１１７】
以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の配列関係を説明するために使用される：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性パーセンテージ」、及び「実質同一性」。「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる定義された配列であり、参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長ｃＤＮＡまたは配列表に挙げられる遺伝子配列のセグメントでもよいし、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は長さ少なくとも１８ヌクレオチドまたは６アミノ酸であり、しばしば長さ少なくとも２４ヌクレオチドまたは８アミノ酸、多くの場合、長さ少なくとも４８ヌクレオチドまたは１６アミノ酸である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は各々、（１）該２分子間で同様の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の部分）を含み、（２）さらに、該２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列間で相違する配列を含む場合があるため、２つ（またはそれを超える）分子間の配列比較は、該２つの分子の配列を「比較ウインドウ」にわたって比較することによって通常は行われ、配列の類似性の局所領域を同定及び比較する。本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、少なくとも１８の連続ヌクレオチドまたは６アミノ酸配列からなる参照配列と比較され得る少なくとも１８の連続ヌクレオチド位置または６アミノ酸の概念的セグメントを指し、該比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントについて参照配列（これは付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセント以下の付加、欠失、置換、及び同類のもの（すなわち、ギャップ）を含んでよい。比較ウインドウを整列させるための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）の類似法の検索によって、これらアルゴリズムのコンピュータによる実現（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソン）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、もしくはＭａｃＶｅｃｔｏｒソフトウェアパッケージ）によって、または目視検査によって行われてもよく、これら様々な方法によって生成された最もよいアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたり相同性の最高パーセンテージをもたらす）が選択される。
【０１１８】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウインドウにわたり同一（すなわち、ヌクレオチドごとまたは残基ごとのベースで）であることを意味する。「配列同一性パーセンテージ」という用語は、２つの最適に整列させた配列を比較ウインドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）または残基が両方の配列に生じる位置の数を判定して一致した位置の数を得、比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で一致した位置の数を割り、その結果に１００をかけて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算される。本明細書で使用される「実質同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を意味し、この場合、該ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウインドウにわたり、しばしば少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウインドウにわたり、参照配列と比較して、少なくとも８５パーセントの配列同一性、例えば、少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、該配列同一性パーセンテージは、該参照配列を、該比較ウインドウにわたり合計で該参照配列の２０パーセント以下になる欠失または付加を含み得る配列と比較することによって計算される。該参照配列は、より大きな配列のサブセットでもよい。
【０１１９】
本明細書で使用される、２０個の従来型アミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７  Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。該２０個の従来型アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸もまた、本開示のポリペプチドにとって適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の同様のアミノ酸ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記では、標準的用法及び慣例に従って、左手方法はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【０１２０】
同様に、他に特定しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’の付加方向は、転写方向と呼ばれ、該ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域であって、該ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるものは、「上流配列」と呼ばれ、該ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖の配列領域であって、該ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるものは、「下流配列」と呼ばれる。
【０１２１】
ポリペプチドに適用される、「実質同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、例えば、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって、デフォルトのギャップウェイトを用いて最適に整列された場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、例えば、少なくとも９０パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０１２３】
保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、イオウ含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システイン及びメチオニンである。適切な保存的アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。
【０１２４】
本明細書で論じられる、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかな変化は、該アミノ酸配列の該変化が少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％を維持するという条件で、本開示によって包含されるものと企図される。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、それらの側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般にファミリーに分類される。すなわち、（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びスレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。他のアミノ酸ファミリーとしては、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーであるセリン及びスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギン及びグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、ならびに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。例えば、イソロイシンもしくはバリンによるロイシンの単独の置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の単独の置換、セリンによるスレオニンの単独の置換、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換は、特に該置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合に、得られる分子の結合や特性に大きな影響を与えないことを期待するのは合理的である。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、当該ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることで容易に判定することができる。アッセイは本明細書で詳細に記載される。抗体もしくは免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者によって容易に調製され得る。断片または類似体の適切なアミノ及びカルボキシ末端は、機能ドメインの境界付近に生じる。構造及び機能ドメインは、公開されている、または独自の配列データベースに対する該ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列データの比較によって同定することができる。いくつかの実施形態では、コンピュータによる比較法を用いて、既知の構造及び／または機能の他のタンパク質に生じる配列モチーフもしくは予測タンパク質構造ドメインを同定する。既知の３次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法は知られている。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。従って、上述の例は、当業者には、本発明に従って、構造及び機能ドメインを決定するために使用され得る配列モチーフならびに構造的配置を認識することができることを示す。
【０１２５】
適切なアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低くする、（２）酸化に対する感受性を低くする、（３）タンパク質複合体形成のための結合親和性を変える、（４）結合親和性を変える、及び（４）かかる類似体のその他の物理化学的もしくは機能的特性を付与するまたは改変するものである。類似体には、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質が含まれ得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外のポリペプチドの部分）にて行ってもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的に変化するべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるらせんを壊す傾向も、親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向もあるべきでない）。当技術分野において承認されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
【０１２６】
本明細書で使用される「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残余のアミノ酸配列が、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列における対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は通常、少なくとも５、６、８、または１０アミノ酸長、例えば、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、または少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用される「類似体」という用語は、推定アミノ酸配列の一部と実質同一性を有し、適切な結合条件下でＣＤ４７との特異結合を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す。通常、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。類似体は、通常、少なくとも２０アミノ酸長、例えば、少なくとも５０アミノ酸長以上であり、多くの場合、完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであることができる。
【０１２７】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものと類似の特性を備えた非ペプチド薬として製薬工業で一般に用いられている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃ（ペプチド模倣薬）」または「ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ（ペプチド模倣薬）」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６），Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）、及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。かかる化合物は、多くの場合、コンピュータによる分子モデリングを活用して開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣体を用いて同等の治療または予防効果が得られる場合がある。一般に、ペプチド模倣体は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド）、例えば、ヒト抗体と構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法で、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シス及びトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、ならびに−ＣＨ２ＳＯ−−からなる群から選択される結合で任意に置換される１つ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同種のＤ−アミノ酸による系統的置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を用いてより安定なポリペプチドを生成してもよい。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変化を含む拘束されたペプチドは、当技術分野で既知の方法（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２））によって、例えば、該ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することが可能な内部システイン残基を付加することによって生成してもよい。
【０１２８】
「薬剤」という用語は、本明細書では、化合物、化合物の混合物、生体高分子、及び／または生物材料からなる抽出物を示すために使用される。
【０１２９】
本明細書で使用される「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射性標識アミノ酸の導入、または標識アビジン（例えば、光学的方法もしくは熱量測定法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合によって、検出可能なマーカーの導入を指す。ある特定の状況では、該標識またはマーカーはまた、治療的である場合がある。ポリペプチド及び糖タンパク質の様々な標識方法が当技術分野で知られており、これらを用いることができる。ポリペプチド用の標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光法による、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対の配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するため、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。本明細書中で使用される「医薬品または調合薬」という用語は、患者に対して適切に投与された場合に所望の治療効果を誘導することができる化合物または組成物を指す。
【０１３０】
「抗新生物薬」という用語は、本明細書では、ヒトにおける新生物、特に、悪性（がん性）病変、例えば、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、または白血病の発生または進行を阻害する機能的特性を有する薬剤を指すために使用される。転移の阻害は、抗新生物薬の特性であることが多い。
【０１３１】
本明細書で使用される「ｔｒｅａｔ（治療する）」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ（治療すること）」、「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（治療）」等の用語は、障害及び／またはそれに関連する症状を軽減及び／または改善することを指す。「ａｌｌｅｖｉａｔｅ（緩和する）」及び／または「ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ（緩和すること）」とは、例えば、がん等の疾患の発生または進行を縮小、抑制、軽減、減少、停止及び／または安定化させることを意味する。障害または状態を治療することは、該障害、状態、またはそれに関連する症状が完全に排除されることを必要としないがこれを除外しないことが理解されよう。
【０１３２】
本明細書における他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））に例示されているように、当技術分野における従来の使用法に従って使用される。
【０１３３】
本明細書で使用される「実質的に純粋」とは、対象種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル基準で、それが当該組成物におけるあらゆる他の個別の種より豊富である）ことを意味し、いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、該対象種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を構成する組成物である。
【０１３４】
一般に、実質的に純粋な組成物は、該組成物に含まれるすべての高分子種を約８０パーセントより多く、例えば、約８５％、９０％、９５％、及び９９％より多くを含む。いくつかの実施形態では、該対象種は、当該組成物が本質的に単一の高分子種からなる、本質的な均一性まで（従来の検出方法によって該組成物中に混入物質種が検出できない）精製される。
【０１３５】
本開示では、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」等は、米国特許法におけるそれらに帰する意味を有することができ、「ｉｎｃｌｕｄｅ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」等を意味することができ、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（〜から本質的になる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ（〜から本質的になる）」という用語は同様に、米国特許法に帰する意味を有し、これらの用語は、オープンエンドであり、列挙されたものの基本的または新規な特徴が、列挙されたが従来技術の実施形態を除くもの以外の存在によって変化しない限り、列挙されたもの以外の存在を許可する。
【０１３６】
「有効量」とは、未治療の患者と比較して、疾患の症状を改善するために必要な量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するのに使用される活性化合物（複数可）の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、及び全身的な健康に応じて異なる。最終的には、主治医または獣医師が、適切な量および投与計画を決定する。かかる量が「有効」量と呼ばれる。
【０１３７】
「対象」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、げっ歯類、ヒツジ、霊長類、ラクダ科の動物、またはネコが挙げられるがこれらに限定されない哺乳類を意味する。
【０１３８】
本明細書で使用される「投与」という用語は、治療薬を、かかる治療薬による治療を必要とする対象に対して、移動させる、送達する、導入する、または輸送する任意の方法を指す。かかる方法としては、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内及び皮下投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の部分を意味する。この部分は、例えば、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
【０１４０】
本明細書に提供する範囲は、該範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群から任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
【０１４１】
特に記載のない限り、または文脈上明らかでない限り、本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、単数形または複数形であると理解される。特に記載のない限り、または文脈上明らかでない限り、本明細書で使用される「または」という用語は、包括的であると理解される。
【０１４２】
特に記載のない限り、または文脈上明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解することができる。文脈から別に明白でない限り、本明細書に提供するすべての数値は、「約」という用語によって修飾される。
【０１４３】
ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）標的化
ＯＸ４０は、活性化Ｔ細胞で主に発現し、副刺激分子として機能を果たすＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。ＯＸ４０の係合は、ＣＴＬＡ−４の下方制御を誘導することが示されている。ＯＸ４０の遮断薬は、免疫反応を抑制することが可能である一方、ＯＸ４０のアゴニストは、免疫反応を高める。ＯＸ４０のアゴニストは、抗腫瘍免疫を高める可能性を有する。結晶学的研究によって、ＯＸ４０のリガンド（ＯＸ４０Ｌ）は３量体として存在することが明らかである。さらに、ＦｃγＲ発現及び欠損マウスを使用したＯＸ４０アゴニスト抗体の抗腫瘍活性を比較するマウス研究で、ＦｃγＲの係合の必要性が示され、抗体架橋の必要性が示唆された。ＯＸ４０のシグナル伝達は、制御性Ｔ細胞の抑制能力を抑え、エフェクターＴ細胞を共刺激することが示唆されている。ＯＸ４０のアゴニズムは、記憶Ｔ細胞への分化を推進し、記憶Ｔ細胞を保護するために重要であることが示されている。
【０１４４】
2019504062.tif 000009
2019504062.tif 000010
2019504062.tif 000011
2019504062.tif 000012
2019504062.tif 000013
2019504062.tif 000014
2019504062.tif 000015
【０１４５】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、少なくとも第一の結合ドメイン、例えば、ＴＢＤ、及び、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に対する第二の結合ドメインを含む多重特異性である。これらの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に対する結合は、さらなる架橋機能を提供することができ、ＴＮＦＲＳＦの活性化は、１つまたは２つのＴＢＤのみで達成される。これらの実施形態では、該ＴＮＦＲＳＦのシグナル伝達は、ＰＤ−Ｌ１発現細胞の存在により強化され集中される。
【０１４６】
ＰＤＬ１は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、その受容体プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、別名ＣＤ２７９と複合体を形成する。Ｔ細胞上でのＰＤＬ１とその受容体ＰＤ１の係合は、ＩＬ−２産生及びＴ細胞増殖のＴＣＲ媒介活性化を阻害するシグナルを送る。ＰＤＬ１及びＰＤＬ１関連シグナル伝達の異常な発現及び／または活性は、多くの疾患及び障害、例えば、がん、炎症、ならびに自己免疫の発病に関与している。
【０１４７】
2019504062.tif 000016
2019504062.tif 000017
2019504062.tif 000018
2019504062.tif 000019
【０１４８】
2019504062.tif 000020
【０１４９】
いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１結合ドメインは、既知の抗ＰＤＬ１抗体配列もしくはその抗原結合断片を含むか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態では、該ＰＤＬ１結合ドメインは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４９２０１号に開示の抗体配列を含むか、またはそれに由来する。当該公開の内容は、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
2019504062.tif 000021
2019504062.tif 000022
【０１５１】
2019504062.tif 000023
【０１５２】
2019504062.tif 000024
2019504062.tif 000025
【０１５３】
2019504062.tif 000026
2019504062.tif 000027
2019504062.tif 000028
【０１５４】
2019504062.tif 000029
【０１５５】
2019504062.tif 000030
2019504062.tif 000031
2019504062.tif 000032
【０１５６】
2019504062.tif 000033
2019504062.tif 000034
2019504062.tif 000035
【０１５７】
2019504062.tif 000036
【０１５８】
2019504062.tif 000037
2019504062.tif 000038
2019504062.tif 000039
2019504062.tif 000040
【０１５９】
2019504062.tif 000041
【０１６０】
2019504062.tif 000042
【０１６１】
2019504062.tif 000043
2019504062.tif 000044
2019504062.tif 000045
2019504062.tif 000046
2019504062.tif 000047
【０１６２】
2019504062.tif 000048
【０１６３】
2019504062.tif 000049
2019504062.tif 000050
2019504062.tif 000051
2019504062.tif 000052
【０１６４】
2019504062.tif 000053
【０１６５】
2019504062.tif 000054
2019504062.tif 000055
2019504062.tif 000056
2019504062.tif 000057
【０１６６】
2019504062.tif 000058
【０１６７】
2019504062.tif 000059
2019504062.tif 000060
2019504062.tif 000061
【０１６８】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、ＴＢＤ及び葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に対する結合ドメインを含む多重特異性である。これらの実施形態では、ＦＲαに対する結合は、さらなる架橋機能を提供することができ、ＴＮＦＲＳＦの活性化は、１つまたは２つのＴＢＤのみで達成され得る。これらの実施形態では、該ＴＮＦＲＳＦのシグナル伝達は、ＦＲα発現細胞の存在により強化され集中される。
【０１６９】
2019504062.tif 000062
2019504062.tif 000063
【０１７０】
いくつかの実施形態では、該融合タンパク質は、腫瘍、細菌、またはウイルス抗原（ワクチン配列）に融合したＴＢＤを含む。これらの実施形態では、該ＴＢＤに対する結合は、該ワクチン配列の免疫原性の強化を促進し、それにより、該ワクチン配列を発現する腫瘍、細菌、またはウイルスに対する獲得免疫を促進する。いくつかの実施形態では、該ＴＢＤとワクチンは融合されておらず、別々に導入されてもよい。これらの実施形態では、該ワクチンは、核酸配列、タンパク質配列、または全細胞、例えば、腫瘍細胞、細菌細胞、もしくはウイルスでよい。ワクチンは、ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ（１価）（ｕｎｉｖａｌｅｎｔ（１価）とも呼ばれる）でもｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ（多価）（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ（多価）とも呼ばれる）でもよい。１価ワクチンは、単一の抗原または単一の微生物もしくはがん型に対して免疫性を与えるように設計される。多価ワクチンは、同じ微生物もしくはがん型の２つ以上の株に対して、または２つ以上の異なる微生物もしくはがん型に対して免疫性を与えるように設計される。
【０１７１】
本開示を以下の実施例においてさらに説明する。これら実施例は、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１７２】
実施例１．ＯＸ４０標的化単一ドメイン抗体はＯＸ４０に結合する
本明細書で１Ａ０６（配列番号１６）、２Ｂ０７、２Ｃ０９（配列番号１９）、１Ｄ１０（配列番号２２）、２Ｅ４（配列番号１８）、２Ｈ０６（配列番号１７）、３Ｅ１１（配列番号２３）、３Ｇ９（配列番号２４）、及びＧ３（配列番号２５）と呼ばれるＯＸ４０標的化単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、ＣＨＯ細胞上で発現する細胞表面ＯＸ４０に結合する（図２Ａ〜２Ｂ）。結合は、ＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【０１７３】
本明細書で１Ｄ１０、Ｇ３、及び３Ｅ１１と呼ばれるＯＸ４０標的化ｓｄＡｂを同様に、ＣＨＯ細胞上で発現するカニクイザルＯＸ４０に結合するそれらの能力について評価した（図４）。結合は、ｃｙｎｏＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【０１７４】
Ｆｃ領域に結合したＯＸ４０標的化ｓｄＡｂの様々なヒト化型を同様に、ヒトＯＸ４０及びカニクイザルＯＸ４０に結合するそれらの能力について評価した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。結合は、ＯＸ４０を発現するＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【０１７５】
実施例２．ＯＸ４０標的化単一ドメイン抗体はＯＸ４０を遮断する
【０１７６】
本明細書で１Ｄ１０（配列番号２２）、２Ｅ４（配列番号１８）、Ｇ３（配列番号２５）、３Ｅ１１（配列番号２３）、及びＨ１１と呼ばれるＯＸ４０標的化単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの間の相互作用を遮断する。図３に示すように、２Ｅ４は、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌの間の相互作用を遮断するが、他の単一ドメイン抗体は遮断しない。ＧＩＴＲに結合する単一ドメイン抗体は、陰性対照として含めた。遮断は、ＯＸ４０Ｌシトリン融合タンパク質を用いたフローサイトメトリーにより評価し、データは蛍光強度の中央値で示す。
【０１７７】
実施例３．多価ＯＸ４０標的化分子
例えば、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）等の結合ドメインの複数のコピーを作動可能に連結し、多価ＯＸ−４０標的化分子を産生することができる。いくつかの実施形態では、複数のＯＸ４０標的化ＶＨＨをＦｃ領域のポリペプチドと作動可能に連結し、多価ＯＸ４０標的化分子を産生する。
【０１７８】
図５Ａは、多価ＯＸ４０結合融合タンパク質の様々な実施形態のフォーマット及びそれぞれの推定分子量を示す概略図である。図５Ｂは、多価ＯＸ４０結合融合タンパク質の還元及び非還元条件下でのクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【０１７９】
該ＯＸ４０多価分子は、ＯＸ４０のシグナル伝達の強化が、より高い価数の結合によって仲介されることを示す。図６は、本開示の融合タンパク質を用いたＯＸ４０の四価及び二価の結合の間の比較を示す。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。ＴＢＤとして１Ｄ１０結合ドメイン（配列番号２２）を組み込んだ融合タンパク質をこれらのアッセイに用いた。
【０１８０】
図７Ａは、本開示の融合タンパク質を用いたＯＸ４０の四価及び六価の結合の間の比較を示す。図７Ｂは、本開示の融合タンパク質を用いたＯＸ４０の六価結合と、米国特許第７，９５９，９２５号に記載の既知の六量体のＯＸ４０Ｌ融合タンパク質の間の比較を示す。本開示の多価ＯＸ４０結合融合タンパク質は、該六量体のＯＸ４０Ｌ融合タンパク質と比較して、同等または強化されたＯＸ４０アゴニスト活性を示した。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。ＴＢＤとして１Ｄ１０を組み込んだ融合タンパク質をこれらのアッセイに用いた。
【０１８１】
図８Ａ及び８Ｂは、四価（図８Ａ）及び六価（図８Ｂ）１Ｄ１０に関するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）からの溶出プロファイルを示す一連のグラフである。保持容量（標準曲線）に基づいて計算した分子量も示す。
【０１８２】
図９は、Ｆｃ領域に連結された３つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた六価、Ｆｃ領域に連結された２つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価、ならびにＦｃ領域に離間されたＮ末端及びＣ末端のＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価を含めた本開示の融合タンパク質の様々な多価フォーマットによって仲介されるＯＸ４０のシグナル伝達を示すグラフである。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。ＴＢＤとして１Ｄ１０を組み込んだ融合タンパク質をこれらのアッセイに用いた。
【０１８３】
図１４Ａ及び１４Ｂは、ＯＸ４０のシグナル伝達が、Ｆｃ領域に連結された３つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた六価、Ｆｃ領域に連結された２つのタンデムＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価、ならびにＦｃ領域に離間されたＮ末端及びＣ末端のＯＸ４０  ＶＨＨを備えた四価を含めた本開示の融合タンパク質の様々な多価フォーマットによって仲介されることを示す一対のグラフである。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。これらのアッセイのため、四価及び六価分子にＴＢＤとしてｈｚＧ３ｖ９を組み込んだ融合タンパク質を用いた。
【０１８４】
図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、本開示の二重特異性ＰＤＬ１−ＯＸ４０標的化融合タンパク質によって仲介されるＰＤＬ１依存性ＯＸ４０アゴニズムを示す。図１０Ａ及びＢは、二重特異性融合タンパク質が、ＰＤＬ１発現細胞が結合（図１０Ｂ）しない限りわずかなＯＸ４０アゴニスト特性（図１０Ａ）しか有さないことの概念図である。図１０Ｃは、ＰＤＬ１陽性細胞（ここではＰＤＬ１トランスフェクトＣＨＯ細胞）がＯＸ４０のシグナル伝達を仲介する能力があること及びＰＤＬ１陰性細胞（ここでは非トランスフェクトＣＨＯ細胞）がＯＸ４０のシグナル伝達を仲介する能力がないことを示すグラフである。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。この図では、多くの異なる二重特異性融合タンパク質を示し、各々が異なるＯＸ４０結合ＶＨＨ（例えば、Ｇ３、２Ｅ４、３Ｇ９、１Ｄ１０）及び同じＰＤＬ１  ＶＨＨ、すなわち２８Ａ１０を含む。
【０１８５】
図１１は、本開示の二重特異性ＦＲａ−ＯＸ４０標的化融合タンパク質によって仲介されるＦＲα依存性ＯＸ４０アゴニストのシグナル伝達を示す。ＦＲαを発現する卵巣がん細胞株、すなわち、ＳＫＯＶ３をこれらのアッセイに用いた。ＯＸ４０のシグナル伝達は、ＯＸ４０を発現するＮＦ−ｋＢレポーター２９３細胞株を用いて観察した。この図では、多くの異なる二重特異性融合タンパク質を示し、各々が異なるＦＲα結合ＶＨＨ（例えば、１Ｇ１０、１Ａ３、５７、５）及び同じＯＸ４０  ＶＨＨ、すなわち、１Ｄ１０を含む。
【０１８６】
図１３Ａ及び１３Ｂは、様々なヒト化ＯＸ４０単一ドメイン抗体が様々なＴＮＦＲＳＦメンバーに結合するかどうかを示す一対のグラフである。これらのアッセイのため、四価及び六価分子にＴＢＤとして本開示の様々なヒト化ｓｄＡｂを用いた。
【図１】
2019504062.tif 000064
【図２】
2019504062.tif 000065
【図３】
2019504062.tif 000066
【図４】
2019504062.tif 000067
【図５】
2019504062.tif 000068
【図６】
2019504062.tif 000069
【図７】
2019504062.tif 000070
【図８】
2019504062.tif 000071
【図９】
2019504062.tif 000072
【図１０】
2019504062.tif 000073
【図１１】
2019504062.tif 000074
【図１２】
2019504062.tif 000075
【図１３】
2019504062.tif 000076
【図１４】
2019504062.tif 000077
【配列表】
2019504062000001.app
【国際調査報告】
2019504062.tif 000078
2019504062.tif 000079
2019504062.tif 000080
2019504062.tif 000081