(57)【要約】  本発明は、２つのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）親株であって、好気性条件下で培養されるとき、その由来元であるラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）の野生型株と比べて、（ａ）アセトイン及び／又は２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）を産生する増大した能力と、（ｂ）乳酸を産生する低下した能力とを示す２つのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）親株からの２つのプロトプラストを融合するステップを含む方法によって入手可能なラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）細菌の修飾株であって、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍のアセトインを産生する増大した能力と、野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の乳酸を産生する低下した能力とを有する修飾株を提供する。さらに提供されるのは、アセトイン及び２，３−ＢＤＯを産生するための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）親株であって、好気性条件下で培養されるとき、その由来元であるラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、（ａ）アセトイン及び／又は２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）を産生する増大した能力と、（ｂ）乳酸を産生する低下した能力とを示す２つのラクトコッカス・ラクティス親株からの２つのプロトプラストを融合するステップを含む方法によって入手可能なラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株であって、好気性条件下で培養されるとき、前記野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、前記野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍のアセトインを産生する増大した能力と、前記野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の乳酸を産生する低下した能力とを有する修飾株。
【請求項２】
２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び５〜１００％の溶解酸素濃度において炭水化物リッチ培地上で培養されるとき、全発酵生成物の８０〜９５％に対応する量で２，３−ＢＤＯを産生し、且つ２０〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５及び３０〜１００％の溶解酸素濃度において炭水化物リッチ培地上で培養されるとき、前記発酵生成物の４５〜８０％に対応する量でアセトインを産生する、請求項１に記載の修飾株。
【請求項３】
受託番号ＣＥＣＴ  ９１３９下でSpanish Type Culture Collectionに寄託された株である、請求項１又は２に記載の修飾株。
【請求項４】
前記ラクトコッカス・ラクティス親株の各々は、それらの由来元である前記ラクトコッカス・ラクティスの野生型株に突然変異誘発処理を施すことによって得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾株。
【請求項５】
前記突然変異誘発処理は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を用いて実施される、請求項４に記載の修飾株。
【請求項６】
前記ラクトコッカス・ラクティスの野生型株は、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＩＭＢ  ７０２１１８である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾株。
【請求項７】
好気性条件下で培養されるとき、前記ラクトコッカス・ラクティス親株の由来元である前記ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、前記ラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、アセトインを産生する増大した能力を有し、及び他方は、２，３−ブタンジオールを産生する増大した能力を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の修飾株。
【請求項８】
前記プロトプラスト融合ステップを受ける前記２つのラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、受託番号ＣＥＣＴ  ７５１２下で前記Spanish Type Culture Collectionに寄託されたラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ４株であり、前記株は、好気性条件下で培養されるとき、その由来元である前記ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾株。
【請求項９】
前記プロトプラスト融合ステップを受ける前記２つのラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、ラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ３株であり、前記株は、好気性条件下で培養されるとき、その由来元である前記ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、２，３−ブタンジオール及びアセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾株。
【請求項１０】
２，３−ブタンジオールを産生する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法。
【請求項１１】
以下のステップ：
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び５〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された前記培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、請求項１０に記載の２，３−ブタンジオールを産生する方法。
【請求項１２】
ステップ（ｄ）から得られた前記無細胞発酵培養液中に存在する前記２，３−ブタンジオールを精製するステップをさらに含む、請求項１１に記載の２，３−ブタンジオールを産生する方法。
【請求項１３】
アセトインを産生する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法。
【請求項１４】
以下のステップ：
（ａ）請求項１〜９のいずれか一項に記載の株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５及び３０〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された前記培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、請求項１３に記載のアセトインを産生する方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）から得られた前記無細胞発酵培養液中に存在する前記アセトインを精製するステップをさらに含む、請求項１４に記載のアセトインを産生する方法。
【請求項１６】
乳酸を産生する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細菌株による炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年７月１９日に出願された欧州特許出願公開第１６３８２３４７．９号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、遺伝子操作によって得られる微生物の分野に属する。特に、本発明は、化学、医薬品及びバイオ燃料産業における広範囲の用途を有する分子である２，３−ブタンジオール及びアセトインを産生する高い能力によって特徴付けられる、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）種に属する新しい乳酸菌株に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）は、広範囲の化学物質の製造における構成要素としての使用を含む、燃料及び化学の分野において大きい可能性を示す化学物質である。それは、溶媒、不凍剤、液体燃料並びに多数の合成高分子及び樹脂の製造のための単量体として用いることができる。それは、エタノールの発熱量（２９，１００Ｊｇ−１）及びメタノールの発熱量（２２，１００Ｊｇ−１）に類似し、２７，２００Ｊｇ−１の発熱量を有することから、液体燃料及び燃料添加剤として好適となる。さらに、それは、その高オクタン数から、ガソリンにおけるオクタンブースターとして役立ち得る。２，３−ＢＤＯは、印刷インク、芳香剤、燻蒸剤、スパンデックス、湿潤剤及び柔軟剤、可塑剤の生産において、また医薬品用担体としてもさらなる有望な用途が見出される。
【０００４】
特に重要であるのは、アセトイン及びジアセチル、メチルエチルケトン、２−ブタノール、ブテン、１，３−ブタジエン及びプラスチック（ポリエステル、ポリカーボネート及びポリウレタン）を含む、貴重な化成物の合成における構成要素として、すなわち前駆物質としての２，３−ＢＤＯの使用である。それらの中で、１，３−ブタジエンは、主にタイヤの製造に使用される合成ゴムの合成のための単量体であることから、特に注目に値する。さらに、上記誘導体の一部は、オリゴマー形成、縮合及び水素付加反応により、ジェット燃料を含む（バイオ）燃料としての有望な用途を有するより高級な炭化水素に変換され得る。
【０００５】
商業的に、２，３−ＢＤＯの主な下流製品は、約４３０億ドルの販売価格で約３２００万トン／年の潜在的なグローバル市場を有する。
【０００６】
現在、２，３−ＢＤＯの工業生産は、主に複雑且つ高価なプロセスによって石油化学原料から作られる。精油中、クラックガスからのブタジエン及びイソブテンの除去後、約７７％のブテンと約２３％のブタン及びイソブタンの混合物とを含有する、Ｃ４ラフィネートＩＩと称されるＣ４炭化水素画分が得られる。塩素の水溶液によるこの画分のクロロヒドリン化と、その後のクロロヒドリンの水酸化ナトリウムによる環化とにより、以下の組成物：５５％のトランス−２，３−ブテンオキシド、３０％のシス−２，３−ブテンオキシド及び１５％の１，２−ブテンオキシドのブテンオキシド混合物が得られる。５０バールの圧力下、１６０〜２２０℃でのこの混合物の加水分解により、真空分画によって分離されるブタンジオールの混合物が得られる。この反応シークエンスにより、メソ−２，３−ブタンジオールは、トランス−２−ブテンからトランス−２，３−ブテンオキシドを介して得られ、Ｒ，Ｒ−及びＳ，Ｓ−２，３−ブタンジオールのラセミ混合物は、同様にシス−２−ブテンからシス−２，３−ブテンオキシドを介して形成される。
【０００７】
２，３−ＢＤＯは、現在、その化学合成のコストが高いため、魅力のない市場セグメントである。合成２，３−ＢＤＯを使用することの原料価格及び環境影響は、２，３−ＢＤＯのグローバル市場の成長に対する主要な障壁として作用している。これらの懸念が理由で、より環境に優しく、コスト競争力のある代替物を探求する方向へ動向が変化しており、特に２，３−ＢＤＯの生物学的生成が優位に位置しているように思われる（http://www.transparencymarketresearch.com；Butanediol (1,4 BDO & 2,3 BDO), 1,3 Butadiene and MEK Market: Applications (THF, PU, PBT, SBR, ABS, NBR etc.), Bio-based Alternatives, Downstream Potential, Market Size and Forecast, 2010-2018）。
【０００８】
多数の微生物が２，３−ＢＤＯを産生することが知られているが、それを潜在的に工業的に重要と考えるのに十分に多い量で作製するのは、そのごく一部である。最良の産生者は、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、バチルス属（Bacillus）及びセラチア属（Serratia）、特に肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）及びクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）に属する細菌である。
【０００９】
２，３−ＢＤＯの生合成に関与する代謝経路は、糖代謝から得られるピルビン酸から開始し、３つのステップを含む。最初のステップでは、チアミン依存性酵素のα−アセト乳酸シンターゼがピルビン酸の２分子の縮合を触媒し、α−アセト乳酸の分子を生成し、ＣＯ２の分子を放出する。次に、α−アセト乳酸は、α−アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒される脱炭酸反応により、アセトインに変換される。最後に、アセトインは、補助因子としてＮＡＤＨを用いて、アセトインレダクターゼ／２，３−ＢＤＯデヒドロゲナーゼによって２，３−ＢＤＯに還元される。
【００１０】
発酵による２，３−ＢＤＯの工業規模生産に関して、最良の産生者である肺炎桿菌（K. pneumoniae）及びＫ．オキシトカ（K. oxytoca）が病原菌（リスクグループ２−ＲＧ２）であるという事実は、強い懸念要因である。工業規模発酵プロセスは、以下の厳重な安全性対策を必要とし、それは、ＲＧ２微生物の使用が前記発酵プロセスの工業開発にとって障壁であることを意味する。ＲＧ２微生物を用いて１０Ｌを超える容量を発酵させるとき、Biosafety Level 2 Large Scale（ＢＳＬ２−ＬＳ）の封じ込め施設設計及び特別な操作手順を含む適切なバイオセイフティー対策が採用される必要がある。これらのすべてのバイオセイフティー対策は、産生コストを大幅に増加させることから、産生コストは、発酵槽の基準原価のみを考慮すると、封じ込めレベルにおける各増分あたり１０〜３０％増加すると見積もられている。
【００１１】
したがって、上記のＲＧ２細菌と同程度に効率的に２，３−ＢＤＯを産生可能なＲＧ１微生物（安全）に対する需要がある。幾つかのＲＧ１細菌が２，３−ＢＤＯを産生することが報告されているが、一般に、それらの効率は、経済的プロセスとして低過ぎる。一部の重要な例外としては、パエニバシラス・ポリミキサ（Paenibacillus polymyxa）（Haessler, T., et al.“Enhanced fed-batch fermentation of 2, 3-butanediol by Paenibacillus polymyxa DSM 365”Bioresource technology 2012 vol.124, pp. 237-244）及びバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（Ge, Y., et al.“Contracted but effective: production of enantiopure 2,3-butanediol by thermophilic and GRAS Bacillus licheniformis”. Green Chemistry, 2016）細菌が挙げられる。
【００１２】
代替として、２，３−ＢＤＯの産生は、細菌では大腸菌（Escherichia coli）（Nielsen, D.R., et al.“Metabolic Engineering of Acetoin and meso-2,3-Butanediol Biosynthesis in E. coli.”, Biotechnol. J. 2010, vol. 5, pp. 274-284）及び酵母では出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Lian, J., et al.“Metabolic engineering of a Saccharomyces cerevisiae strain capable of simultaneously utilizing glucose and galactose to produce enantiopure (2R, 3R)-butanediol”Metabolic engineering 2014, vol. 23, pp. 92-99）において設計されている。考慮すべき別の可能性は、それらの２，３−ＢＤＯの合成能力を改善するＲＧ１天然産生者の使用である。この最終的な代替物の範囲内において、乳酸細菌のラクトコッカス・ラクティスは、可能性のある候補と思われる。
【００１３】
Ｌ．ラクティスは、工業プロセスで用いられる幾つかの有利な特徴を示す。それは、幾つかの株において配列決定されている小型の十分に特徴付けられたゲノムを有する。広範囲のツールがその遺伝子操作のために利用可能である。それは、好気性又は嫌気性条件下のいずれかで迅速な増殖を示す。それは、高い解糖フラックスを示す。それは、かなり単純なエネルギー及び炭素代謝を有する。それは、興味深い化学物質の産生に対する異なる代謝経路を有する。それは、病原体でなく、ＧＲＡＳ（一般に安全と認識された）生物と考えられ、それにより食品用途において使用可能になる。食品用途は別にして、それは、固有の特徴を有し、これらのすべての特徴から、Ｌ．ラクティスは、発酵による貴重な化学物質の効率的な工業生産を目的とした細胞工場の開発に非常に適した宿主となる。
【００１４】
Ｌ．ラクティスは、炭水化物発酵（ホモ乳酸発酵）の主生成物として乳酸を産生することによって特徴付けられる通性嫌気性菌である。それにもかかわらず、特定の条件下では、この細菌は、２，３−ＢＤＯを含む異なる特性の代謝物を産生するヘテロ乳酸又は混酸発酵を行うこともできる。しかし、Ｌ．ラクティスは、２，３−ＢＤＯ生合成のための完全代謝経路を有するが、一般に、この代謝物の天然生成が残存する。
【００１５】
Ｌ．ラクティス（Platteeuw C, et al.“Metabolic engineering of Lactococcus lactis - influence of the overproduction of alpha-acetolactate synthase in strains deficient in lactate-dehydrogenase as a function of culture conditions”, Appl. Environ. Microbiol.1995, vol. 61, pp. 3967-71；Gaspar P, et al.“High yields of 2,3-butanediol and mannitol in Lactococcus lactis through engineering of NAD (+) cofactor recycling”, Appl. Environ. Microbiol. 2011, vol. 77, pp. 6826-35；Liu J, et al.“Combining metabolic engineering and biocompatible chemistry for high-yield production of homo-diacetyl and homo-(S,S)-2,3-butanediol”, Metabolic engineering 2016, vol. 36, pp. 57-67）及び他の乳酸菌（Enhanced pyruvate to 2,3-butanediol conversion in lactic acid bacteria、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００９／０５８８３４号）における２，３−ＢＤＯの産生を増加させるための代謝設計の使用について記述する報告が幾つか存在する。それらの全部は、一方では競合経路、特にＬ−乳酸脱水素酵素の不活性化に関与し、且つ他方では２，３−ＢＤＯ経路の遺伝子の過剰発現に関与する。
【００１６】
これらの組換え株による２，３−ＢＤＯの産生は、それらが、培地に導入される外来遺伝子材料を維持するための抗生物質及び／若しくは遺伝子発現の増強を誘導するナイシンなどの化合物、又は増殖を維持するためのヘミン及びＦｅ３＋を含有する培地中で培養されることを必要とする。いずれの場合でも、培地は、運用コストを、経済的に効率的な工業プロセスにほとんど匹敵しないレベルまで高める高価な成分を添加される必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、従来技術では、再生可能なバイオマス原料から高濃度の２，３−ＢＤＯを高い収率及び生産性で得ることを可能にするＲＧ１微生物駆動発酵による、持続可能なバイオテクノロジーによる２，３−ＢＤＯの産生についての効率的方法が欠如している。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の詳細な説明
この欠点を解決することを意図して、本発明は、２，３−ＢＤＯを産生する向上した能力を有するＲＧ１細菌株と、前記株を得るための方法と、高い収率及び生産性を有し且つ工業的に実現可能である、前記株を用いる効率的な発酵方法とを提供する。さらに、驚くべきことに、この同じ株は、用いられる培養条件に応じて他の代替的な代謝物、特にアセトイン及び乳酸を産生することが見出されている。
【００１９】
本発明は、培養条件に応じて２，３−ＢＤＯ、アセトイン及び乳酸などの代謝物を産生する高い能力を示す、ＲＧ１に属するＬ．ラクティス株を提供する。その株は、代謝物の産生に関して著しい多用途性を示し、その生存度及び機能性に影響を及ぼさない。
【００２０】
下記に例示されるように、本発明の株は、培地条件に応じて、上記代謝物の産生に関して高度に効率的且つ特異的である。例えば、炭水化物リッチ培地を発酵させるための株を用い、且つ単にｐＨ及び酸素濃度パラメータを調節することで、本発明の株は、主に２，３−ＢＤＯ、アセトイン又は乳酸のいずれかを産生することができる。これら特徴が、培地に前記生成物の合成を促進する抗生物質、ナイシンなどの化合物を添加する必要性なく達成されることを示すことは重要である。この点は、それが生成コストの低下、プロセスの処理及び発酵ステップの簡素化を可能にすることから非常に重要である。結論として、それは、代謝物の工業規模での生成を容易にする。
【００２１】
本発明の株を入手するため、本発明者らは、２つの遺伝子組換えＬ．ラクティス株のプロトプラスト融合を含む方法を開発している。この方法は、ゲノム混合として知られており、２つの突然変異体の遺伝的組換えを可能にする（Zhang YX, et al.“Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria”, Nature 2002, vol. 415, pp. 644-646）。驚くべきことに、このプロトプラスト融合により、代謝物を産生する高い能力を有するＬ．ラクティスの新しい株が見出されている。有利には、プロトプラスト融合の技術を用いることで、外因性ＤＮＡ配列の細菌への挿入又は遺伝子発現の化学誘導因子の使用のいずれも不要である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様は、ラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株を産生するための方法であって、２つのラクトコッカス・ラクティス親株であって、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、（ａ）アセトイン及び／又は２，３−ブタンジオールを産生する増大した能力と、（ｂ）乳酸を産生する低下した能力とを示す２つのラクトコッカス・ラクティス親株からの２つのプロトプラストを融合するステップを含む方法である。
【００２３】
提供される実験データによって開示される通り、この方法から得られる株は、培養条件に応じて、その親株と比較して２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、逆に乳酸を産生する低下した能力とを示し得る。
【００２４】
本発明の第１の態様の特定の実施形態では、好気性条件下で培養されるとき、アセトイン及び／又は２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する上記Ｌ．ラクティス親株の各々は、Ｌ．ラクティスの野生型株に突然変異誘発を施すことによって得られる。
【００２５】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理は、ランダム突然変異誘発によって実施される。
【００２６】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理は、化学変異原を用いて実施される。
【００２７】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を用いて実施される。
【００２８】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理は、放射線を用いて実施される。
【００２９】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理は、組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学を用いて実施される。
【００３０】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理から得られる株は、緩衝化能が低下し、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムが添加された酸性寒天栄養培地で選択される（特許フランス特許第２７７７９０５号及びスペイン特許第２３５２６３３Ｂ１号に記載の通り）。この選択培地中で成長する高乳酸産生細菌は、ピンク色コロニーを形成し、低乳酸産生者が赤色／褐色コロニーとして出現することが予想される。
【００３１】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、好気性条件下で培養されるとき、親株の一方は、アセトインを産生する増大した能力を有し、及び他方は、２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力を有する（両方とも野生型株と比較される）。
【００３２】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、突然変異誘発処理を受ける最初の野生型株は、National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria（ＵＫ）に寄託されたラクトコッカス・ラクティスＮＣＩＭＢ  ７０２１１８株である。
【００３３】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、プロトプラスト融合ステップにおいて用いられる２つの親株の一方は、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有するラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ４株である。ラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ４株は、Universidad de Valencia, Edificio de Investigacion, Campus de Burjassot, 46100 Burjasot (Valencia) Spainに位置するColeccion Espanola de Cultivos Tipo（ＣＥＣＴ）に２００９年４月２１日、ブダペスト条約に従って本出願人によって寄託された。Ｌ．ラクティスのこの株は、参照のラクトコッカス・ラクティスの亜種ラクティス（lactis）ＣＭＬ  Ｂ４として寄託者によって同定され、受託番号ＣＥＣＴ  ７５１２を受け、さらに生存可能として公表された。
【００３４】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、プロトプラスト融合ステップにおいて用いられる２つの親株の一方は、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、２，３−ＢＤＯ及びアセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有するラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ３株である。
【００３５】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、プロトプラスト融合ステップにおいて用いられる親株は、受託番号ＣＥＣＴ  ７５１２下でSpanish Type Culture Collectionに寄託されたラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ４株であり、及び好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、プロトプラスト融合ステップにおいて用いられる親株は、ラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ３株である。
【００３６】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、プロトプラスト融合ステップにおいて用いられる親株は、受託番号ＣＥＣＴ  ７５１２下でSpanish Type Culture Collectionに寄託されたラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ４株であり、及び好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、プロトプラスト融合ステップにおいて用いられる親株は、ラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ３株であり、ここで、ＣＭＬ  Ｂ４及びＣＭＬ  Ｂ３株の両方は、野生型株ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８に由来する。
【００３７】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、方法は、以下のステップを含む：１）Ｌ．ラクティス野生型株が突然変異誘発処理を受け、２）ステップ１）で得られた２つの株であって、好気性条件下で培養されるとき、野生型株と比べて、アセトイン及び／又は２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する２つの株が選択され、３）ステップ２）で選択された２つの株がプロトプラスト融合ステップにおける親株として用いられる。
【００３８】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、方法は、以下のステップを含む：１）Ｌ．ラクティス野生型株ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８が突然変異誘発処理を受け、２）ステップ１）で得られた２つの株であって、好気性条件下で培養されるとき、野生型株と比べて、アセトイン及び／又は２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する２つの株が選択され、３）ステップ２）で選択された２つの株がプロトプラスト融合ステップにおける親株として用いられる。
【００３９】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、方法は、以下のステップを含む：１）Ｌ．ラクティス野生型株ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８がＥＭＳへの曝露によって化学的突然変異誘発処理を受け、２）ステップ１）で得られた２つの株であって、好気性条件下で培養されるとき、野生型株と比べて、アセトイン及び／又は２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する２つの株が選択され、３）ステップ２）で選択された２つの株がプロトプラスト融合ステップにおける親株として用いられる。
【００４０】
本発明の第１の態様の別の特定の実施形態では、方法は、以下のステップを含む：１）Ｌ．ラクティス野生型株ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８がＥＭＳへの曝露によって化学的突然変異誘発処理を受け、２）ステップ１）で得られた２つの株であって、好気性条件下で培養されるとき、その一方は、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有し、及び他方は、２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する（両方とも野生型株と比べられる）、２つの株が選択され、３）ステップ２）で選択された２つの株がプロトプラスト融合ステップにおける親株として用いられる。
【００４１】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に記載の方法によって入手可能なＬ．ラクティス細菌の修飾株である。
【００４２】
本発明の第２の態様の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力を有する。
【００４３】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力を有する。
【００４４】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍のアセトインを産生する増大した能力を有する。
【００４５】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍のアセトインを産生する増大した能力を有する。
【００４６】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の乳酸を産生する低下した能力を有する。
【００４７】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍の乳酸を産生する低下した能力を有する。
【００４８】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の乳酸を産生する低下した能力とを有する。
【００４９】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、株は、好気性条件下で培養されるとき、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、野生型株によって産生される量の少なくとも２０倍の乳酸を産生する低下した能力とを有する。
【００５０】
本発明の第２の態様の別の特定の実施形態では、Ｌ．ラクティス細菌の株は、受託番号ＣＥＣＴ  ９１３９下でSpanish Type Culture Collection（ＣＥＣＴ）に寄託されたラクトコッカス・ラクティス４３１０３として同定されている。本発明のＬ．ラクティスの株は、Universidad de Valencia C.P 46980 Catedratico Agustin Escardino, num. 9, Paterna, Valencia (Spain)に位置するSpanish Type Culture Collection（ＣＥＣＴ）において、２０１６年４月１９日、ブダペスト条約の要件に従い、Parque Tecnologico de San Sebastian, Mikeletegi Pasealekua, num. 2, E-20009 Donostia-San Sebastian (Spain)に位置する寄託者Fundacion Tecnalia Research & Innovationによって寄託された。Ｌ．ラクティスの株は、参照の４３１０３として寄託者によって同定され、受託番号ＣＥＣＴ  ９１３９を受け、さらに生存可能として公表された。その名称は、詳細にはＬ．ラクティス４３１０３である。
【００５１】
本発明の第３の態様は、２，３−ＢＤＯを産生する方法であって、本発明の第２の態様の細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法である。
【００５２】
本発明の第３の態様の特定の実施形態では、２，３−ＢＤＯを産生する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第２の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ５．０〜７．５及び５〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
【００５３】
溶解酸素濃度が培地飽和濃度（medium saturation concentration）に対する％として表されることは注目されるべきである。
【００５４】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、２，３−ＢＤＯを産生する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第２の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ５．０〜７．５及び１０〜９０％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
【００５５】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、２，３−ＢＤＯを産生する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第２の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び５〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
【００５６】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、２，３−ＢＤＯを産生する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第２の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び１０〜９０％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
【００５７】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、２，３−ＢＤＯを産生する方法は、ステップ（ｄ）から得られた無細胞発酵培養液中に存在する２，３−ＢＤＯを精製するステップをさらに含む。
【００５８】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、連続モードである。
【００５９】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、フェドバッチモードである。
【００６０】
本発明の第３の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、バッチモードである。
【００６１】
２，３−ＢＤＯは、接種時に行われる培養の開始から１５〜４８時間、好ましくは２０〜４０時間にわたって発酵培養液中に蓄積される。微生物が炭素源として利用可能なすべての炭水化物を消費した直後に生じる最大の２，３−ＢＤＯの産生が達成されるとき、発酵は、完了したと考えることができる。発酵が完了すると、本発明の第２の態様の株の細胞は、発酵培養液から分離され得る。この過程は、好ましくは、物理的方法、例えば遠心分離、濾過又は任意の他の当該技術分野で利用可能な方法を用いて実施することができる。
【００６２】
発酵産生された２，３−ＢＤＯは、清澄化された発酵培養液中に溶解され、次に回収若しくは精製されるか、又は水溶液として使用され得、後者の場合、さらなる修飾の不在又は濃縮過程後のいずれかである。精製は、実施されるとき、限定はされないが、蒸留、透析蒸発、限外濾過、ナノ濾過、直接浸透、液体−液体抽出、固相抽出、超臨界抽出、クロマトグラフィー及びその他を含む当該技術分野で公知の任意の方法を、単独で又はその一部を組み合わせて用いて行うことができる。
【００６３】
本発明の第４の態様は、アセトインを産生する方法であって、本発明の第２の態様の細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法である。
【００６４】
驚くべきことに、本発明の第２の態様の株の代謝物の産生特性が培養条件に大きく依存することが見出されている。それは、主に、発酵が５．５〜６．０の弱酸性ｐＨ値の好気性条件下で実施されるときに２，３−ＢＤＯを産生する。しかし、発酵が、同様に好気性条件下であるが、中性付近のより高いｐＨ値で実施されるとき、主な発酵生成物は、アセトインである。「主に」は、参照される代謝物が発酵生成物全体の４５〜９５％、好ましくは６５〜９５％を占めることとして理解される。特に、発酵生成物の７０〜９５％、好ましくは８０〜９５％は、発酵がｐＨ５．５〜６．０で実施されるときの２，３−ＢＤＯに対応する。発酵がｐＨ６．５〜７．０で実施されるとき、株は、発酵生成物の４５〜９５％、好ましくは６５〜８０％に対応する量でアセトインを産生する。
【００６５】
本発明の第４の態様の特定の実施形態では、アセトインを産生する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第２の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５及び３０〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
【００６６】
本発明の第４の態様の別の特定の実施形態では、アセトインを産生する方法は、ステップ（ｄ）から得られた無細胞発酵培養液中に存在するアセトインを精製するステップをさらに含む。
【００６７】
本発明の第４の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、連続モードである。
【００６８】
本発明の第４の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、フェドバッチモードである。
【００６９】
本発明の第４の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、バッチモードである。
【００７０】
アセトインは、接種時に行われる培養の開始から１５〜４０時間、好ましくは１８〜２４時間にわたって発酵培養液中に蓄積される。微生物が炭素源として利用可能なすべての炭水化物を消費した直後に生じる最大のアセトインの産生が達成されるとき、発酵は、完了したと考えることができる。
【００７１】
本発明の第５の態様は、乳酸を産生する方法であって、本発明の第２の態様の細菌株による炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を含む方法である。
【００７２】
本発明の第５の態様の特定の実施形態では、乳酸を産生する方法は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第２の態様に定義されるような株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ６．０〜７．５及び嫌気性条件下において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む。
【００７３】
本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、乳酸を産生する方法は、ステップ（ｄ）から得られた無細胞発酵培養液中に存在する乳酸を精製するステップをさらに含む。
【００７４】
本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、連続モードである。
【００７５】
本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、フェドバッチモードである。
【００７６】
本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で実施される発酵は、バッチモードである。
【００７７】
乳酸は、接種時に行われる培養の開始から１５〜４０時間、好ましくは２０〜３０時間にわたって発酵培養液中に蓄積される。微生物が炭素源として利用可能なすべての炭水化物を消費した直後に生じる最大の乳酸の産生が達成されるとき、発酵は、完了したと考えることができる。
【００７８】
本発明の第３、第４及び第５の態様の特定の実施形態では、発酵性炭水化物は、目的を限定することなく、グルコース、キシロース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、糖蜜及びそれらの混合物の群から選択される。
【００７９】
本発明の第３、第４及び第５の態様の別の特定の実施形態では、発酵培地は、目的を限定することなく、酵母抽出物、肉抽出物、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、肉、大豆又はカゼインペプトン、タンパク質リッチな農業食品副産物からのタンパク質加水分解物、例えば大豆粕／小麦粉、乳清、穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）及びそれらの混合物の群から選択される窒素源を含有する。
【００８０】
本発明の第３、第４及び第５の態様の別の特定の実施形態では、培地は、細菌増殖を支援し、２，３−ＢＤＯの産生を促進するため、追加的な栄養分及び増殖因子、例えばビタミン及び無機塩を添加され得る。用いられるビタミンは、特にピリドキサミン、ビオチン、ニコチン酸、パントテン酸カルシウム、リボフラビン及びリポ酸（純粋なビタミンと公知の組成物との人工混合物又はそれらを含有する複雑な天然製剤又は抽出物のいずれかとして添加され得る）、例えば酵母抽出物、ＣＳＬなどを含む。無機塩は、好ましくは、リン酸塩並びにカリウム及びマグネシウム塩の群から選択され得る。
【００８１】
本発明の第３、第４及び第５の態様の別の特定の実施形態では、炭水化物リッチ培地はまた、発酵全体を通した過剰な泡状物の形成のため、必要に応じて消泡剤、例えばシリコーンに基づくもの、植物油、ポリエチレングリコールなどを当該技術分野で公知の手順に従って添加され得る。
【００８２】
本発明の第３及び第４の態様の別の特定の実施形態では、炭水化物リッチ培地中における本発明の第２の態様の株の培養は、任意の標準の好気性培養技術を用いて実施され得る。液体培地中での培養方法、特に振盪フラスコ培養又は発酵槽若しくはケモスタット様反応器内培養が好ましい。
【００８３】
本発明の第３及び第４の態様の別の特定の実施形態では、培養の好気性は、空気、純酸素又はそれらの混合物のいずれかの形態での酸素の培地への十分な供給によって達成され得る。振盪フラスコ培養の場合、酸素供給は、１００〜５００ｒｐｍ、好ましくは２００〜３００ｒｐｍの頻度での培養フラスコの振盪を通して達成される。培養反応器の場合、酸素供給は、空気、純酸素又はそれらの混合物のいずれかの流れを、溶解酸素濃度が飽和濃度の５〜１００％、好ましくは１０〜９０％であるように培地に通過させることによって達成され得る。培地の混合は、２５０〜１０００ｒｐｍ、好ましくは５００〜７５０ｒｐｍで作動する撹拌器又は羽根車のいずれかを用いて実施され得る。
【００８４】
本発明の第５の態様の特定の実施形態では、炭水化物リッチ培地中における本発明の第２の態様の株の培養は、任意の標準の嫌気性培養技術を用いて実施され得る。液体培地中での培養方法、特にフラスコ培養又は発酵槽若しくはケモスタット様反応器内培養が好ましい。
【００８５】
本発明の第５の態様の別の特定の実施形態では、培養の嫌気性は、周囲酸素から培地を単離することによって達成され得る。フラスコ培養の場合、単離は、それらを振盪しないか又は密閉することによって達成され得る。培養反応器の場合、単離は、それらを密閉し、及び／又は酸素を含まない気体の流れを培地に通過させることによって達成され得る。培養反応器内での培地の混合は、２５０〜１０００ｒｐｍ、好ましくは４００〜６００ｒｐｍで作動する撹拌器又は羽根車のいずれかを用いて実施され得る。
【００８６】
本発明の第３、第４及び第５の態様の別の特定の実施形態では、培地のｐＨ制御は、固定値でｐＨを維持することが必要である場合、緩衝剤（通常、その目的で用いられるものの中で選択されたもの）の使用、又は培養の特定要件に応じたアルカリ若しくは酸のいずれかの添加（それぞれ微生物増殖を生じさせ得る酸性化若しくはアルカリ化に対抗するため）のいずれかによって達成され得る。
【００８７】
そのため、本発明はまた、好気性条件下で培養されるとき、その由来元である野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍、好ましくは２０倍の２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力と、その由来元である野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍、好ましくは２０倍のアセトインを産生する増大した能力と、その由来元である野生型株によって産生される量の少なくとも１０倍の乳酸を産生する低下した能力とを有するラクトコッカス・ラクティスの修飾株を提供する。代替的又は追加的に、本発明の株は、培養液のｐＨに応じて主に２，３−ＢＤＯ又はアセトインを産生する。例えば、本発明の株は、炭水化物リッチ培地上において２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び５〜１００％の溶解酸素濃度で培養されるとき、全発酵生成物の７０〜９５％に対応する量で２，３−ＢＤＯを産生し、且つ炭水化物リッチ培地上において２０〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５及び３０〜１００％の溶解酸素濃度で培養されるとき、発酵生成物の４５〜８０％に対応する量でアセトインを産生する。好ましくは、本発明の株は、炭水化物リッチ培地上において２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び１０〜９０％の溶解酸素濃度で培養されるとき、全発酵生成物の８０〜９５％に対応する量で２，３−ＢＤＯを産生し、且つ炭水化物リッチ培地上において２０〜４０℃、ｐＨ６．８〜７．２（例えば、ｐＨ７）及び３０〜１００％の溶解酸素濃度で培養されるとき、発酵生成物の６５〜８０％に対応する量でアセトインを産生する。ラクトコッカス・ラクティスの野生型株は、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＩＭＢ  ７０２１１８であり得る。さらに、本発明の株は、２，３−ＢＤＯ及び／又はアセトインを過剰産生する、上に開示されるような野生型株に由来する２つのＬ．ラクティス親株のプロトプラスト融合によって入手可能である。野生型株は、ラクトコッカス・ラクティスＮＣＩＭＢ  ７０２１１８であり得る。
【００８８】
本明細書で記載される主題の明確性を高めることを意図して、以下の定義が提供され、それらは、本明細書全体を通して、特に特許請求の範囲内で適用されるべきである。
【００８９】
用語「ゲノム混合」は、本明細書で用いられるとき、プロトプラスト融合及び組換えプロセス後の２つ以上の株又は微生物の１つへのゲノムの混合に基づく方法を指す。組換えは、最終的に無作為に生じ、それにより広範囲のゲノム及び表現型を示す組換え誘導体株の大規模ライブラリーの作製が可能になる。探求された表現型の特徴及び特性が授けられた株のみを単離するため、組換え株は、選択又はスクリーニングプロセスをさらに受け得る。典型的には、「ゲノム混合」は、幾らかの遺伝的多様性を示す２つ以上の突然変異体株を用いて実施され、これら多様性の有利な組み合わせが探索される。
【００９０】
用語「野生型株」は、本明細書で用いられるとき、天然に見出されるような微生物株、すなわちその遺伝的及び表現型的特徴を修飾するように何らかの技術を通して人によって操作されていない株を指す。
【００９１】
用語「予備培養」は、本明細書で用いられるとき、発酵が行われることになる培養液に接種するために用いられる株の予備的な小規模培養を指す。本発明の第２の態様の株の予備培養は、一般的方法のセクションにおいて下記に説明される好気性培養条件下においてＹＥＣ培地中で２４時間実施され得る。
【００９２】
用語「炭水化物リッチ培地」は、本明細書で用いられるとき、本発明の第２の態様の株によって吸収可能であるエネルギー、炭素源及び窒素源を含有し、且つ株による培養条件に応じたその増殖及び２，３−ＢＤＯ、アセトイン又は乳酸のいずれかの高産生を可能にする任意の培地を指す。例えば、目的を限定することなく、好適な炭素源及びエネルギー源の中でも、グルコース、キシロース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、ラクトース、糖蜜及びそれらの混合物が見出される。好適な窒素源として、限定はされないが、酵母抽出物、肉抽出物、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、肉、大豆又はカゼインペプトン、タンパク質リッチな農業食品副産物からのタンパク質加水分解物、例えば大豆粕／小麦粉、乳清、穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）及びそれらの混合物を挙げることができる。
【００９３】
用語「プロトプラスト」は、本明細書で用いられるとき、浸透圧的に安定化された培地中で酵素処理によって細胞壁が失われた細菌細胞を指す。
【００９４】
用語「好気性発酵」は、本明細書で用いられるとき、好気性条件下、すなわち酸素の存在下で実施される発酵を指す。用語「嫌気性発酵」は、本明細書で用いられるとき、嫌気性条件下、すなわち酸素の不在下で実施される発酵を指す。発酵は、広義には、炭水化物を様々な生物学的製剤に変換する代謝過程である。
【００９５】
用語「Ｌ．ラクティスの野生型株と比べたアセトイン及び／又は２，３−ＢＤＯを産生する増大した能力」は、修飾株について本明細書で用いられるとき、上記株が、一般的方法セクションに記載の方法を用いることにより、本発明中に提示される例において検出される場合、野生型株よりも大量にかかる代謝物（アセトイン及び／又は２，３−ＢＤＯ）を産生するという事実を指す。
【００９６】
用語「Ｌ．ラクティスの野生型株と比べた乳酸を産生する低下した能力」は、修飾株について本明細書で用いられるとき、上記株が、一般的方法セクションに記載の方法を用いることにより、本発明中に提示される例において検出される場合、野生型株よりも少量にかかる代謝物（乳酸）を産生するという事実を指す。
【実施例】
【００９７】
実施例
本発明は、あくまで例示目的で与えられ、決して本発明を限定するように意図されない以下の実施例により、さらに例示される。
【００９８】
一般的方法
微生物：本発明で用いられる微生物は、Ｌ．ラクティスＣＭＬ  Ｂ４（スペイン特許第２３５２６３３Ｂ１号）、Ｌ．ラクティスＣＭＬ  Ｂ３及びＬ．ラクティス４３１０３細菌株であった。これらのすべての株は、Ｌ．ラクティス野生型株ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８に由来する。
【００９９】
培地：振盪フラスコ培養は、ＹＥＣ培地中で実施し、その組成物は、次の通りである：１０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌの酵母抽出物及び２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）。
【０１００】
発酵槽培養は、炭水化物リッチ培地中で実施した。用語「炭水化物リッチ培地」は、本明細書で用いるとき、Ｌ．ラクティス４３１０３株によって吸収可能なエネルギー、炭素源及び窒素源を含有し、且つ株による培養条件に応じたその増殖及び２，３−ＢＤＯ、アセトイン又は乳酸のいずれかの高産生を可能にする当該技術分野で公知の任意の培地を指す。具体的には、本発明で提供する実施例で用いる炭水化物リッチ培地は、１００ｇ／Ｌの初期炭水化物濃度をグルコース又はスクロース（純粋又はてんさい糖蜜由来のいずれか）の形態で含有する。
【０１０１】
培養方法：以下のタイプの培養物を、本発明全体を通して用いた。
【０１０２】
Ａ．振盪フラスコ培養：好気性振盪フラスコ培養は、室温及び２５０ｒｐｍの回転振盪において、２０ｍＬのＹＥＣ培地を含有する１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内で実施した。培養は、ＹＥＣ寒天培地のプレート上で３日間増殖させた株のコロニーの接種後、２４時間にわたって増殖させたＹＥＣ培地での予備培養として得られた１％（ｖ／ｖ）接種材料を培地に接種することによって開始した。
【０１０３】
Ｂ．発酵槽培養（バッチ）：発酵槽バッチ培養は、１Ｌ反応器を備え、炭水化物リッチ培地７５０ｍＬを含有する実験室発酵槽を用いて実施した。発酵は、３０℃及び５００又は７５０ｒｐｍの攪拌速度で実施した。好気性培養では、溶解酸素濃度は、１Ｌ／Ｌ／分の気流で単独又は酸素濃縮のいずれかで培地を通過させることにより、培地飽和濃度に対して１０〜３０％に設定した。嫌気性培養では、攪拌速度を５００ｒｐｍに設定し、供給空気を除去した。発酵ｐＨは、実験間で異なる値に設定し、５Ｍ  ＮａＯＨの自動添加を通して維持した。発酵は、−８０℃、１０％グリセロール中で保存した株のクライオバイアル１ｍＬの接種後、５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内で２４時間にわたって増殖させたＹＥＣ培地中の予備培養物１００ｍＬを培地に接種することによって開始した。
【０１０４】
Ｃ．発酵槽培養（フェドバッチ）：発酵槽フェドバッチ培養は、炭素源が消耗間近であるとき、１００ｇ／Ｌのグルコースのさらなる供給を含むこと以外、方法Ｂのように実施した。
【０１０５】
代謝物濃度の測定：発酵培養液中の２，３−ＢＤＯ、アセトイン、乳酸、酢酸、エタノール及びグルコース又はスクロースの濃度を、以下の条件：移動相、０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４；流速、０．７ｍＬ／分；カラム温度、５５℃；検出器温度、３５℃で３００×７．８ｍｍのAminex HPX-87H（Bio Rad）カラム及びMicroguard Cation H Refill Cartridgeプレカラムを用いてＨＰＬＣにより測定した。屈折率検出器を用いてピーク定量化を行った。
【０１０６】
細菌増殖の測定：ＹＥＣ培地中の細菌増殖又はバイオマス濃度を、適切に希釈した細胞懸濁液の６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）として測定した。培養を炭水化物リッチ培地中で実施したとき、バイオマスは、測定値に干渉する不可溶性粒子の培地中での存在に起因して測定できなかった。
【０１０７】
実施例１
Ｌ．ラクティス突然変異体株Ｂ３の単離
Ｌ．ラクティス野生型株ＮＣＩＭＢ  ７０２１１８の単一コロニーを、１％グルコース添加Ｍ１７培地（Terzaghi BE, Sandine WE,“Improved medium for Lactic Streptococci and their bacteriophages”, Appl. Microbiol., 1975, vol. 29, pp. 807-813；組成物：トリプトン、２．５ｇ／Ｌ；肉ペプトン、２．５ｇ／Ｌ；大豆ペプトン、５．０ｇ／Ｌ；肉抽出物、５．０ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２．５ｇ／Ｌ；グリセロリン酸ナトリウム、１９．０ｇ／Ｌ；硫酸マグネシウム、０．２５ｇ／Ｌ；及びアスコルビン酸、０．５０ｇ／Ｌ）を１０ｍＬ含有する１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内において、３０℃（２５０ｒｐｍ）で２４時間培養した。細菌細胞を１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中での遠心分離／再懸濁により２回洗浄し、最後に同じ緩衝液１ｍＬに再懸濁した。これに化学変異原エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）の濃縮細胞懸濁液１２０μＬを添加し、得られた懸濁液をゆっくりと振盪させながら２５℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞を再び同じリン酸カリウム緩衝液１０ｍＬで２回洗浄し、１％グルコースを有するＭ１７培地１０ｍＬに再懸濁し、振盪下で１時間インキュベートした。
【０１０８】
最後に、得られた細胞懸濁液の適切な希釈物を選択培地寒天プレートに蒔いた。選択培地は、より低い緩衝化能（標準的なものの場合のわずか５％）を有し、さらに１００ｍｇ／Ｌの２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムを添加した修飾Ｍ１７培地であった。この選択培地上で野生型株がピンクコロニーを形成する一方、低い乳酸産生株は、赤色／褐色コロニーとして出現することが予想される。
【０１０９】
選択培地上に蒔いた全部で２６，０００のコロニーから４つの赤色コロニーを単離し、代謝物の産生について分析した（方法Ａ）。これらの単離したコロニーの中で、Ｌ．ラクティスＢ３株は、最高の２，３−ＢＤＯ及び最低の乳酸の産生を示したことから、最終的に選択した。増殖及び代謝物の産生を表１に示す。
【０１１０】
実施例２
Ｌ．ラクティス４３１０３株の単離
Ｌ．ラクティス４３１０３株は、突然変異体株Ｌ．ラクティスＢ４及びＢ３のプロトプラストの融合を通したゲノム混合の方法を用いて得た。
【０１１１】
２０時間増殖させたＬ．ラクティスＢ４及びＢ３株のＹＥＣ培地中の振盪フラスコ培養物からそれぞれ１ｍＬを別々に採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞をＰＭ（プロトプラスト用培地（Protoplasting medium）：１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．５Ｍのスクロース）で３回洗浄し、最後に、５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム及び１００Ｕ／ｍＬのムタノリシンを添加したＰＭ６５０μＬに再懸濁した。細菌懸濁液をゆっくりと振盪させながら３７℃で２時間インキュベートし、それらの各々のプロトプラストを得た。プロトプラストをＰＭで２回洗浄し、同じ培地０．５ｍＬに再懸濁した。
【０１１２】
Ｌ．ラクティスＢ４株のプロトプラスト懸濁液の試料１００μＬをウォーターバス内において６０℃で３０分間加熱し、プロトプラストを不活性化した。
【０１１３】
１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内でＬ．ラクティスＢ４（熱不活性化したもの）及びＢ３（不活性化していないもの）株のプロトプラスト懸濁液を５０μＬずつ混合し、次に５０％ＰＥＧ６０００を添加したＰＭ９００μＬを緩やかに混合しながら添加し、３７℃で１０分間インキュベートし、プロトプラスト融合を誘導した。次に、懸濁液をＰＭで２回洗浄し、プロトプラスト融合過程を停止した。得られた全懸濁液を用いて、ＲＭ（再生培地：１％グルコース、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｍＭのクエン酸（ｐＨ７．０）、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＣａＣｌ２、２．５％ゼラチン、０．５Ｍのスクロース）５ｍＬを含有する１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに接種し、室温（１２５ｒｐｍ）で一晩培養した。
【０１１４】
上記培養の適切な希釈物を、１００ｍｇ／Ｌの２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムを添加した非緩衝ＹＥＣ培地プレート（クエン酸塩を有しない）に蒔き、コロニーの出現まで４８時間インキュベートした。異なる態様を示す全部で１８のコロニーを同じ培地の新しいプレートに単離し、次に増殖及び代謝物の産生について分析し（方法Ａ）、Ｌ．ラクティスＢ４、Ｂ３及び野生型株と比較した。すべての単離株の中で、Ｌ．ラクティス４３１０３と称されるそれらの１つは、アセトイン／２，３−ＢＤＯ／乳酸の産生に関して最良の特徴を示した。結果を表１に示す。
【０１１５】
【表１】
2019520849.tif 000002
【０１１６】
実施例３〜６
異なるｐＨ値でのＬ．ラクティス４３１０３株によるてんさい糖蜜培地の好気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Ｂに従い、Ｌ．ラクティス４３１０３株を用いて、７．０〜５．５の異なるｐＨ値において、炭素源としててんさい糖蜜を含有する炭水化物リッチ培地の一連の好気性発酵を実施した。溶解酸素濃度を３０％、攪拌速度を７５０ｒｐｍに設定した。代謝物の産生の結果を表２に示す。
【０１１７】
【表２】
2019520849.tif 000003
【０１１８】
実施例７〜１１
ｐＨ５．５並びに溶解酸素濃度及び攪拌速度の異なる値でのＬ．ラクティス４３１０３株によるてんさい糖蜜培地の好気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Ｂに従い、Ｌ．ラクティス４３１０３株を用いて、ｐＨ５．５並びに１０〜３０％の溶解酸素濃度及び５００〜７５０ｒｐｍの攪拌速度の異なる値において、炭素源としててんさい糖蜜を含有する炭水化物リッチ培地の一連の好気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表３に示し、ここで、過去に３０％の溶解酸素及び７５０ｒｐｍで得られた値を参照として含める。
【０１１９】
【表３】
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【０１２０】
実施例１２〜１４
ｐＨ５．５でのＬ．ラクティス４３１０３株による異なる炭素源を含有する培地の好気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Ｂに従い、Ｌ．ラクティス４３１０３株を用いて、ｐＨ５．５、１０％の溶解酸素濃度及び７５０ｒｐｍの攪拌速度において、炭素源として純粋なグルコース、グルコースシロップ又は純粋なスクロースのいずれかを含有する炭水化物リッチ培地の一連の好気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表４に示す。
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
実施例１５
ｐＨ６．０でのＬ．ラクティス４３１０３株によるグルコースを含有する培地の好気性フェドバッチ発酵
一般的方法セクションに記載の方法Ｃに従い、Ｌ．ラクティス４３１０３株を用いて、ｐＨ６．０、１０％の溶解酸素濃度及び７５０ｒｐｍの攪拌速度において、炭素源としてグルコースを含有する炭水化物リッチ培地のフェドバッチモード下で好気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表５に示す。
【０１２３】
【表５】
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【０１２４】
実施例１６
Ｌ．ラクティス４３１０３株によるてんさい糖蜜培地の嫌気性発酵
一般的方法セクションに記載の方法Ｂに従い、Ｌ．ラクティス４３１０３株を用いて、炭素源としててんさい糖蜜を含有する炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を実施した。代謝物の産生の結果を表５に示す。
【０１２５】
【表６】
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【０１２６】
本願中に引用される参考文献
Haessler, T., et al.“Enhanced fed-batch fermentation of 2, 3-butanediol by Paenibacillus polymyxa DSM 365”Bioresource technology 2012 vol.124, pp. 237-244
Ge, Y., et al.“Contracted but effective: production of enantiopure 2,3-butanediol by thermophilic and GRAS Bacillus licheniformis”. Green Chemistry, 2016
Nielsen, D.R., et al.“Metabolic Engineering of Acetoin and meso-2,3-Butanediol Biosynthesis in E. coli.”, Biotechnol. J. 2010, vol. 5, pp. 274-284
Lian, J., et al.“Metabolic engineering of a Saccharomyces cerevisiae strain capable of simultaneously utilizing glucose and galactose to produce enantiopure (2R, 3R)-butanediol”Metabolic engineering 2014, vol. 23, pp. 92-99
Platteeuw C, et al.“Metabolic engineering of Lactococcus lactis - influence of the overproduction of alpha-acetolactate synthase in strains deficient in lactate-dehydrogenase as a function of culture conditions”, Appl. Environ. Microbiol.1995, vol. 61, pp. 3967-71
Gaspar P, et al.“High yields of 2,3-butanediol and mannitol in Lactococcus lactis through engineering of NAD (+) cofactor recycling”, Appl. Environ. Microbiol. 2011, vol. 77, pp. 6826-35
Liu J, et al.“Combining metabolic engineering and biocompatible chemistry for high-yield production of homo-diacetyl and homo-(S,S)-2,3-butanediol”, Metabolic engineering 2016, vol. 36, pp. 57-67
ＰＣＴ／米国特許出願公開第Ｓ２００９／０５８８３４号
Zhang YX, et al.“Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria”, Nature 2002, vol. 415, pp. 644-646
フランス特許第２７７７９０５号
スペイン特許第２３５２６３３Ｂ１号
Terzaghi BE, Sandine WE,“Improved medium for Lactic Streptococci and their bacteriophages”, Appl. Microbiol., 1975, vol. 29, pp. 807-813
【０１２７】
条項
１．ラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株を産生するための方法であって、２つのラクトコッカス・ラクティス親株であって、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、（ａ）アセトイン及び／又は２，３−ブタンジオールを産生する増大した能力と、（ｂ）乳酸を産生する低下した能力とを示す２つのラクトコッカス・ラクティス親株からの２つのプロトプラストを融合するステップを含む方法。
２．ラクトコッカス・ラクティス親株の各々は、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株に突然変異誘発処理を施すことによって得られる、請求項１に記載の方法。
３．突然変異誘発処理は、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）を用いて実施される、請求項２に記載の方法。
４．好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、ラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、アセトインを産生する増大した能力を有し、及び他方は、２，３−ブタンジオールを産生する増大した能力を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５．プロトプラスト融合ステップを受ける２つのラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、アセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、受託番号ＣＥＣＴ  ７５１２下でSpanish Type Culture Collectionに寄託されたラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ４株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．プロトプラスト融合ステップを受ける２つのラクトコッカス・ラクティス親株の一方は、好気性条件下で培養されるとき、ラクトコッカス・ラクティスの野生型株と比べて、２，３−ブタンジオール及びアセトインを産生する増大した能力と、乳酸を産生する低下した能力とを有する、ラクトコッカス・ラクティスＣＭＬ  Ｂ３株である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
７．請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって入手可能なラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株。
８．受託番号ＣＥＣＴ  ９１３９下でSpanish Type Culture Collectionに寄託されている、請求項７に記載のラクトコッカス・ラクティス細菌の修飾株。
９．２，３−ブタンジオールを産生する方法であって、請求項７〜８のいずれか一項に定義される細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法。
１０．以下のステップ：
（ａ）請求項７〜８のいずれか一項に定義される株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ５．５〜６．０及び５〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、請求項９に記載の２，３−ブタンジオールを産生する方法。
１１．ステップ（ｄ）から得られた無細胞発酵培養液中に存在する２，３−ブタンジオールを精製するステップをさらに含む、請求項１０に記載の２，３−ブタンジオールを産生する方法。
１２．アセトインを産生する方法であって、請求項７〜８のいずれか一項に定義される細菌株による炭水化物リッチ培地の好気性発酵を含む方法。
１３．以下のステップ：
（ａ）請求項７〜８のいずれか一項に定義される株を予備培養するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた予備培養物を炭水化物リッチ培地に接種するステップと、
（ｃ）２０〜４０℃、ｐＨ６．５〜７．５及び３０〜１００％の溶解酸素濃度において、ステップ（ｂ）で接種された培地中に存在する炭水化物を発酵させるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）から得られた発酵培養液から細胞を分離するステップと
を含む、請求項１２に記載のアセトインを産生する方法。
１４．ステップ（ｄ）から得られた無細胞発酵培養液中に存在するアセトインを精製するステップをさらに含む、請求項１３に記載のアセトインを産生する方法。
１５．乳酸を産生する方法であって、請求項７〜８のいずれか一項に定義される細菌株による炭水化物リッチ培地の嫌気性発酵を含む方法。
【国際調査報告】
2019520849.tif 000008
2019520849.tif 000009
2019520849.tif 000010
2019520849.tif 000011
2019520849.tif 000012