(57)【要約】本発明は、細胞培地添加剤として使用されるポロキサマーの精製に関する。活性炭は、細胞培養添加剤としてのポロキサマーの効率を低減する疎水性の高分子量成分を除去するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）効率が改善されるポロキサマーを提供すること、
ｂ）ａ）ステップのポロキサマーを溶媒に溶解し、活性炭にそれらを接触させること、
ｃ）活性炭および溶媒を除去し、改善された効率を有するポロキサマーを得ること、
によって、細胞培養における細胞生存率を増加するためのポロキサマーの効率を増加する方法。
【請求項２】
溶媒が、水、アセトン、ＴＨＦまたはエタノールと水との混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶解されたポロキサマーが、活性炭と１分間から２４時間接触されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｃ）において、活性炭が濾過および／または遠心分離によって除去されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）において提供されるポロキサマーが１３，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する成分を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ポロキサマーが、７６８０と９５１０ｇ／ｍｏｌの間の平均分子量を有するポロキサマーであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
活性炭が、有機ポリマー材料の熱分解によって得られた活性炭であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
活性炭が、２と８００μｍの間の中程度の粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ポロキサマーを溶媒に溶解し、それを活性炭と接触させ、その後、活性炭と溶媒を除去することによって、ポロキサマーから疎水性の高分子量成分を除去する方法。
【請求項１０】
ポロキサマーを含む水性培地において細胞を培養することによって細胞培養を行うための方法であって、ポロキサマーはそれらを細胞培地に加える前に、
ａ）ポロキサマーを溶媒に溶解し、活性炭とそれらを接触させること、
ｂ）活性炭と溶媒を除去すること、
によって処理される、前記方法。
【請求項１１】
溶解されたポロキサマーが、活性炭に２〜２４時間接触されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｃ）において、活性炭が濾過および／または遠心分離によって除去されることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ）において提供されるポロキサマーが、１３，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する成分を含むことを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ポロキサマーが、７６８０と９５１０ｇ／ｍｏｌの間の平均分子量を有するポロキサマーであることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
活性炭が２と８００μｍの間の中程度の粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培地添加剤として使用されるポロキサマーの精製に関する。活性炭は、細胞培養添加剤としてのポロキサマーの効率を低減する疎水性高分子量成分を除去するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
ポロキサマー、特にポロキサマー１８８は、多くの工業的適用、化粧品および医薬品に使用されている。それらはまた、細胞培地プロセスにも使用されている。ポロキサマー、特にポロキサマー１８８の細胞培地への添加は、細胞生存率を著しく改善する。高い細胞生存率は、最適なタンパク質生産のために重要である。ポロキサマーが細胞生存率を改善する理由は完全には理解されていない。ポロキサマーはせん断応力を減少させ、このようにして細胞を損傷から保護すると考えられている。非イオン性界面活性剤であるポロキサマーは、気泡／培地界面に集中しやすく、気泡への細胞付着を防止することができ、このようにして、気泡が破裂するときに細胞が損傷するのを防ぐ。また、気泡が破裂するときの衝撃を緩和し得る。いくつかの出版物は、ポロキサマーがガスから液相への酸素移動速度を改善すると主張しているが、他の出版物はこれらの知見と矛盾する。また、ポロキサマーが細胞膜の小さな欠陥を「修復」し得るという指摘もある。
【０００３】
細胞培地に使用された場合、ポロキサマー１８８のような市販のポロキサマーには、顕著なロット間のばらつきが観察される。結果として、いくつかのロットは、損傷／死滅から細胞を十分に保護しないから、細胞培養における使用に適さない。これに対する理由は、いまだ完全には理解されていない。結果として、悪いロットが使用された場合、細胞の生存率は著しく低い。
【０００４】
そのほかの適用に対しても、ポロキサマーは時には精製される必要がある。
ポロキサマーを精製するいくつかの方法が、示唆されている。
ＷＯ１２０９１３６１において、有機金属不純物が識別され、活性炭を使用してポロキサマーのロットから除去されている。有機金属不純物の除去は、薬物送達システムとして使用される鎖伸長による多重ブロックコポリマーの合成に必要である旨主張されている。
【０００５】
ＷＯ２００２０１４３８０において、ポロキサマーは分別によって精製されている。低分子量成分（モノおよびジブロック成分など）は、有害として識別され、水性二相抽出法によって除去される。
【０００６】
ＷＯ０２０１５１４８７３６において、特に不良性能ロットの細胞培養におけるポロキサマーの性能を改善する方法が記載されている。温度処理は、不良性能ロットの性能を改善すると識別された。なぜ温度処理がロットを改善するか、またはどのような不純物が排除されるのかに関する明確な結論は得られなかった。
【０００７】
ＷＯ２０１４１９４１３７には、ポロキサマー１８８などの細胞培養添加剤のロット性能を評価するための方法を記載している。かかる添加剤中の高分子量成分および／または高度に疎水性の成分の存否が、細胞のせん断損傷を防ぐための添加剤の効率を示している。
【０００８】
それでも、ポロキサマーのどのロットが細胞培養で十分に細胞を保護できないかについて不確実であり、さらに、それらの不良性能ロットがどのようにしてそれらを良好な性能のロットにするために処理され得るかについての不確実である。
【０００９】
不良性能のポロキサマーロットの性能は、活性炭で処理することによって増加させることができることが見出されている。この処理により、これらのロット中の高分子量疎水性化合物の量が減少することがさらに分かった。より多くの活性炭が添加されるほど、より高分子量の成分が除去され（ＳＥＣデータ参照）、細胞培養における性能がより良好になる（細胞培養における生存率の増加を参照）。
【００１０】
本発明は、こうして、
ａ）その効率が改善されるポロキサマーを提供すること、
ｂ）ステップａ）のポロキサマーを溶媒に溶解し、活性炭にそれらを接触させること、
ｃ）活性炭および溶媒を除去し、改善された効率を有するポロキサマーを得ること、
によって、細胞培養における細胞生存率を増加するために、ポロキサマーの効率を増加する方法に関する。
【００１１】
当業者にとって、最適な効率を示すロットはさらに改善されることができないことは明らかである。その効率が改善されるポロキサマーは、細胞培養における細胞生存率を増加させるためのその効率がその他のポロキサマーロットの効率よりも低いものである。これは、細胞生存率アッセイにおいて例えば試験され得る。好適なアッセイおよびその適用の例は、例６に提供されている。
【００１２】
好ましい態様において、溶媒は、水、アセトン、ＴＨＦ、またはエタノールと水との混合物である。
別の態様において、溶解されたポロキサマーは活性炭とフロースルーまたはバッチで行われるかに依存して、１分間から２４時間接触される。
別の好ましい態様において、ステップｃ）において、活性炭は遠心分離、および／または濾過によって除去される。
好ましい態様において、ステップａ）で提供されるポロキサマーはＳＥＣによって測定された１３，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する成分を含む。
【００１３】
好ましい態様において、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８に対する薬局方で定義され、無水フタル酸−ピリジン溶液を用いた滴定による薬局方に従って測定される、７６８０と９５１０ｇ／ｍｏｌの間の平均分子量を有するポロキサマーである。
別の態様において、活性炭は有機ポリマー材料、好ましくはポリスチレンの熱分解によって得られる活性炭である。
【００１４】
本発明はさらに、それらを溶媒に溶解し、溶液を活性炭と接触させることによってポロキサマーから疎水性の高分子量成分を除去する方法に関する。その後、溶媒および活性炭は除去される。
【００１５】
本発明はさらに、ポロキサマーを含む水性培地中で細胞を培養することによって細胞培養を行う方法であって、そのポロキサマーは、それらを細胞培地に添加する前にポロキサマーの効力を増加させて上記のような細胞培養の細胞生存率を増加させる方法によって処理されているものに関する。
【００１６】
本発明は、こうしてポロキサマーを含む水性培地において細胞を培養することによって細胞培養を行うための方法にも関し、ポロキサマーを細胞培地に加える前に、ポロキサマーは、
ａ）ポロキサマーを溶媒に溶解し、活性炭とそれらを接触させること、
ｂ）活性炭と溶媒を除去すること、
によって処理されている。
【００１７】
好ましい態様において、溶媒は、水、アセトン、ＴＨＦ、またはエタノールと水の混合物である。
別の好ましい態様において、溶解されたポロキサマーは活性炭と１分間から２４時間接触される。
別の好ましい態様において、ステップｃ）において、活性炭は、遠心分離および／または濾過によって除去される。
好ましい態様において、ステップａ）において提供されたポロキサマーはＳＥＣによって決定された１３，０００ｇ／ｍｏｌを超える分子量を有する成分を含む。
【００１８】
好ましい態様において、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８に対する薬局方で定義され、無水フタル酸−ピリジン溶液を用いた滴定による薬局方に従って決定される、７６８０と９５１０ｇ／ｍｏｌの間の平均分子量を有するポロキサマーである。
別の態様において、活性炭は、有機ポリマー材料、好ましくはポリスチレンの熱分解によって得られる活性炭である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】不良な性能のロットＡならびに例２および６ｂに記載されているように、エタノール／水中の０、５、１０、２０、４０および１００重量％の活性炭による精製後細胞生存率。炭素０％はブランク値に対応する。ロットＡに対するブランク値のわずかな偏差は、測定の誤差範囲内にある。
【００２０】
【図２】中程度の性能のロットＢならびに例２および６ｂに記載されているように、エタノール／水中の０、１０、２０、４０および１００重量％の活性炭による精製後の細胞生存率。炭素０％はブランク値に対応する。ロットＢに対するブランク値のわずかな偏差は、測定の誤差範囲内にある。
【００２１】
【図３】良好な性能のロットＤならびに例２および６ｂに記載されているように、エタノール／水中の０、１０、２０、４０および１００重量％の活性炭による処理後の細胞生存率。炭素０％はブランク値に対応する。ロットＤに対するブランク値のわずかな偏差は、測定の誤差範囲内にある。
【００２２】
【図４】ポロキサマー１８８のロットＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのサイズ排除クロマトグラム（Ｉ：フルクロマトグラム、ＩＩ：拡大）
【００２３】
【図５】不良な性能ロットＡ（実線）および例２において記載されているようにエタノール／水中１０、２０、および１００重量％の活性炭で精製後（破線）のサイズ排除クロマトグラム（拡大）
【００２４】
【図６】中程度の性能ロットＢ（実線）および例２において記載されているようにエタノール／水中１０、および１００重量％の活性炭で精製後（破線）のサイズ排除クロマトグラム（拡大）
【００２５】
【図７】良好な性能ロットＤ（実線）および例２において記載されているようにエタノール／水中１０、および４０重量％の活性炭で処理後（破線）のサイズ排除クロマトグラム（拡大）。活性炭４０％に対して〜１１０００ｇ／ｍｏｌにて観察された小さな偏差は、残留活性炭に起因し得る（完全には除去されない）。  図面に関するさらなる詳細は、例中に見出し得る。
【００２６】
［定義］
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、かように変化し得ると理解されるべきである。本明細書および添付された特許請求の範囲に使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を包含する。こうして、例えば「ポロキサマー」の参照は、複数のポロキサマーなどを包含する。
【００２７】
他に定義されていなければ、本明細書に使用されている全ての技術的および科学的用語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書に記載されるように本発明の目的ために定義される。
【００２８】
本明細書で使用される「バイオリアクター」という用語は、生物学的に活性な環境を支持する任意の製造または操作されたデバイスまたはシステムをいう。場合によっては、バイオリアクターは、生物またはかかる生物に由来する生化学的に活性な物質に関わる細胞培養プロセスが実施される容器である。かかるプロセスは、好気性または嫌気性のいずれかであってもよい。一般的に使用されるバイオリアクターは、典型的な円筒状で、サイズは、数リットルから数立方メートルの範囲であり、多くはステンレススチール製である。本明細書に記載のいくつかの態様において、バイオリアクターは、スチール以外の材料で作られた使い捨て可能な構成要素を含み得、使い捨て可能である。いくつかの態様において、それは生物学的に活性な環境で維持される使い捨て可能なバッグである。バイオリアクターの全容積は、特定のプロセスに応じて、１００ｍＬから１０，０００リットルまで、あるいはそれ以上の範囲の任意の容積であり得ることが考えられる。
【００２９】
本発明によるポロキサマーに含まれる高分子量の疎水性成分または化合物は、それが含まれる明細書による標的ポロキサマーよりも疎水性であり、それが含まれるポロキサマーの平均分子量よりも高い分子量を有する成分である。その成分は、本発明による活性炭で処理によってポロキサマーから除去される場合、より疎水性である。より高い分子量は、例えば、ＳＥＣによって示され得る。
【００３０】
好ましくは、高分子量の疎水性成分は、例えば、ポロキサマー１８８のような、本明細書によるポロキサマーよりも高分子量およびより高いＰＰＯ／ＰＥＯ比を有するポロキサマーである。ＳＥＣ−ＦＴＩＲ測定は、典型的にはポロキサマータイプのブロックコポリマーでもある高分子量成分を識別した。このことは、細胞培養におけるポロキサマーロットの低い性能は、より疎水性でより高分子量のポロキサマー成分の存在に起因し得ることを示している（例えば、ポロキサマー１８８が本明細書による標的ポロキサマーの場合、それは、ポロキサマー１８８よりも高い分子量および高いＰＰＯ／ＰＥＯ比を有するポロキサマーである）。
【００３１】
薬局方による平均分子量は、無水フタル酸−ピリジン溶液を使用する滴定によって決定される。
【００３２】
ＳＥＣによって決定される平均分子量は、以下のように決定される：
重量平均分子量：Ｍｗ＝ΣｉＮｉＭｉ２／（ΣｉＮｉＭｉ）
数平均分子量：Ｍｎ＝ΣｉＮｉＭｉ／（ΣＮｉ）
ピーク分子量：Ｍｐ＝最大Ｎｉにおける分子量
Ｎｉ＝フラクションｉにおけるポリマー種の数
Ｍｉ＝フラクションｉにおけるポリマー種の分子量
ＳＥＣ条件：
較正標準：ＰＥＧ（詳細は例７参照）
溶離液：ＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
注入容量：１００μｌ
カラム：粒子サイズ＝５μｍ、材料＝スチレン−ジビニルベンゼン
温度：４０℃
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明の要旨は、細胞生存率の増強剤としてのポロキサマーの適合性が、疎水性の高分子量化合物の存否に依存し、これらの疎水性の高分子量化合物は、可溶化されたポロキサマーを活性炭と接触させることによって除去され得るという発見である。
【００３４】
活性炭は、広範な非特異的吸着特性を有する材料であり、化学物質および食品の製造、下水処理または排水処理、水の濾過、ならびに低分子薬物の製造などの産業分野において吸着剤または脱色剤として使用されている。
【００３５】
用語「活性炭」または「活性化炭素」または「活性化チャコール」は本明細書において互換的に使用され、孔構造を増大するプロセスに供された炭素質材料を言う。活性炭は、非常に高い表面積を有する多孔質固体である。それらは、石炭、木、ココナッツ殻、ナッツシェル、泥炭および有機ポリマーをも包含する種々の供給源に由来し得る。
【００３６】
活性炭は、制御された雰囲気下の加熱を伴う物理的活性化、または強酸、塩基、もしくは酸化剤を使用する化学活性化を使用してこれらの材料から製造され得る。活性化プロセスは、活性炭に不純物除去のための高容量を付与する高表面積を有する多孔質構造を製造する。活性化プロセスは、表面の酸性を制御するように変性され得る。
【００３７】
有機ポリマーから得られた活性炭はまた、本発明による疎水性の高分子量化合物を除去するのに適していることが見出された。有機ポリマーは、化学的に定義された任意の合成有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリビニルまたはポリプロピレンである。
【００３８】
活性炭は、球状の活性炭粒子を含むか、球状の活性炭粒子からなり得る。すなわち、それらは、全ての３つの空間次元において本質的に同様の延長部を有する。球形の他に、２つの異なる空間次元の延長部が３倍より大きく、好ましくは２倍未満の差異がなければ、立方体、平行六面体または円筒形状が想像できる。
【００３９】
有機ポリマーから得られた活性炭は、球状有機材料、例えばポリスチレンの熱分解によって製造され得る。しかしながら、Int. J. Electrochem. Sci., Vol. 4, 2009, pages 1063 to 1073に記載のように、グルコース溶液の熱分解も可能である。球状の活性炭の製造は、さらに、ＵＳ  ２００６０１４８６４５およびＵＳ  ２００８１７１６４８に開示されている。
【００４０】
かかる活性炭ポリマー粒子を製造する例示的な方法は、ポリマーボール、ポリマー構造が分離可能な官能基、特にスルホニル基および／またはカルボキシル基を遊離体として含有する、特にイオン交換ボールを使用することである。多孔質ポリマーボールは熱分解され、場合により熱分解されたポリマーボールは活性化ステップに供される。官能基の分離は、好ましくは、５％〜１５％の残留含有量（使用される官能基の重量分率と呼ばれる）まで起こる。この第１の熱処理の温度は、適切には２００℃〜３５０℃の範囲で１０分間〜６０分間である。雰囲気は原則として任意である。次の熱分解ステップは、第１の熱処理の最終温度に本質的に対応する温度で開始し、好ましくは６００℃〜８００℃で終了する。加熱速度は、好適には５Ｋ／分〜０．５Ｋ／分の範囲であり、それから熱分解ステップの時間が直ちに計算されることができる。活性化ステップは重要ではなく、従来の方法で起こる。
【００４１】
好適な活性炭は、例えば、ＣＡＳ  ７４４０−４４−０であり、好適な球状の活性炭は、ＡＫ  １５００（Felgentrager）である。
好適な球状活性炭は、また、SARATECH (TM) 100562, SARATECH (TM) 100772およびSARATECH (TM) 101373 (Blucher GmbH, Erkrath, ドイツ)として入手可能である。
【００４２】
活性炭は、好ましくは１０〜１０，０００ｍ２／ｇ、より好ましくは１００〜５０００ｍ２／ｇ、最も好ましくは３００〜２０００ｍ２／ｇの表面積を有する。
活性炭の平均粒子サイズは、好ましくは少なくとも２μｍ、より好ましくは２〜８００μｍである。
【００４３】
粒子のキャラクタリゼーションは当該技術分野において公知であり、好ましくはふるい分けによって行われる。これは、I. C. Edmundson, Particle-size analysis, H. S. Bean, A. H. Beckett and J. E. Carles (eds) in: Advances in Pharmaceutical Sciences vol.2, Academic Press, London 1967, 95-174に記載されている。
【００４４】
生成物フラクションの平均粒子サイズは、ＥＤＡＮＡ推奨試験方法Ｎｏ．ＷＳＰ  ２２０．２−０５「粒子サイズ分布」を用いて決定することができ、ここで、スクリーンフラクションの質量割合は累積された形でプロットされ、平均粒子サイズはグラフで決定される。ここでの平均粒子サイズは、累積５０重量％を生じるメッシュサイズの値である。
【００４５】
特定の粒子サイズ範囲、例えば２〜８００μｍを有する活性炭の割合は、活性炭全体の好ましくは少なくとも９０重量％、より好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％である。
ポロキサマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）トリブロックコポリマーである。
【００４６】
ポロキサマー、ＣＡＳ番号９００３−１１−６は、一般式Ｉ：
【化１】
2019511606.tif 000002
を有し、ｘおよびｚは好ましくは独立して５〜１５０であり、およびｙは好ましくは１５〜６７である。
【００４７】
それらは市販されている（Pluronics(登録商標)またはLutrole（登録商標）、例えば、Pluronic(登録商標)溶液、ゲル、Pluronic(登録商標) F-68などの固体）。代わりに、ポロキサマーは、当該分野で公知の方法に従って原料から製造され得る（例えば、米国特許３，５７９，４６５号および３，７４０，４２１号参照）。
【００４８】
ポロキサマーに関するさらなる情報は、Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, volume 9 “Stoffe P-Z”, 1994, 282〜284頁に見出し得る。
【００４９】
好ましい態様において、本発明に従って精製され使用されるポロキサマーは、ポロキサマー１８８である。ポロキサマー１８８は、７６８０と９５１０ｇ／ｍｏｌの間の平均分子量を有する（薬局方に従って定義および決定される）。式Ｉにおいて、ポロキサマー１８８に対してｘおよびｚは約８０であり、ｙは約２７である。この化合物は、ポロキサマー１８８、Pluronic（登録商標）F68、Kolliphor（登録商標）P188、Lutrol（登録商標）F68、SYNPERONIC（登録商標）PE/F68またはPLONON＃188Pとして市販されている。
【００５０】
当業者は、細胞培地中の成分としてポロキサマーを使用する方法を知っている。彼は、使用するのに適した量とフォーマットを認識している。しかし、時には、細胞培養は、標準的な手順および処方に従って調製されたとしても、典型的にそうであるほど良好に機能しない。これはポロキサマーに起因し得ることが判明している。かかる場合、今まで、ポロキサマーの全ロットを捨てなければならなかった。本発明は、かかる不良なロットを精製後に細胞培養成分として使用することができるように簡便かつ効率的に精製する方法を提供する。
【００５１】
期待と同様の性能を発揮しないポロキサマーのロットの同定は、例えば、細胞培養において行われ得る。ポロキサマーを含む細胞培養物が期待される細胞生存率および性能を示さない場合、使用前にポロキサマーを本発明による活性炭とインキュベートすることによって精製することにより、この改善を試みるかもしれない。
【００５２】
期待どおりの性能を発揮しないいかなる細胞培養も、本発明によるポロキサマーの精製を引き起こし得る。実際の細胞培養に先立って、細胞培養試験を行うことも可能である。細胞培養の性能を調査するための実験的手順は、以下のとおりであり得る：
【００５３】
好適な実験的手順は、Haofan Peng et al., Biotechnol. Prog., 2014, Vol. 30 (6), 1411 - 1418に記載された小スケールのバッフル付き振とうフラスコモデルである。
さらなる詳細は、例６に見出し得る。
【００５４】
当業者にとって、
−異なる濃度のポロキサマーが使用され得る（典型的には０．１と５ｇ／Ｌの間）
−任意のタイプのＣＨＯ細胞またはその他の細胞が使用され得る
−任意のタイプの選択された細胞株に適した細胞培地が使用され得る
−培養は、好ましくは環状シェーカーで行われ、速度とスロー（投入）は、選択された細胞株と培養条件に合わされる必要があり得る。
−上記の選択されたパラメータに依存して、２時間と５日の間の適切な時点で生存率の低下を測定され得る、
ことは明確である。
本発明による細胞生存率の定義は、例えば、Beckman-Coulter ViCell XRまたは類似のものにおけるTrypanブルーアッセイによって決定されるような溶液中の生存細胞の百分率である。
【００５５】
低性能の原因である成分が高分子量の疎水性成分であることを見出したので、使用前にポロキサマーの各ロットを分析することも可能である。高分子量の疎水性成分が存在する場合、そのロットは、本発明による活性炭とインキュベートすることによって使用前に精製される。分析は、例えば、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）によって行うことができる。
活性炭との接触のために、ポロキサマーは、溶媒に溶解される必要がある。
【００５６】
ポロキサマー、特にポロキサマー１８８を溶解し、後で除去することができる任意の溶媒または溶媒混合物を使用することができ、それらは好適な溶媒である。透明な溶液を得るべきであるが、わずかな濁度は許容できる。後で除去する必要があるため、容易に蒸発できる溶媒を選択することを勧める。例えば、溶媒として水の場合、ポロキサマーは、凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。好ましい溶媒は、アセトン、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、エタノール、メタノール、ＴＨＦ、アセトニトリルおよび水または水とエタノールとの混合物のような、それらの混合物である。
【００５７】
少量の水を他の溶媒に添加することにより、ポロキサマーの溶解性を改善することができる。濁度を低下させ、粘度を低下させる等のためにポロキサマーの量と比較して、より多量の溶媒を使用することも可能である。ポロキサマーが十分に溶解する限り、溶媒の量は、活性炭との処理後に除去されるので、一般的には重要ではない。
以下に、好適な溶媒のいくつかの例と必要とされる量が与えられる。
【００５８】
１ｇのポロキサマー１８８あたりに使用される必要である溶媒の最小量は、ポロキサマーを溶解させるのに必要とされる最小量によって定義される。
１ｇのポロキサマー１８８を溶解するのに必要な溶媒および典型的な量の例は以下の通りである：
【００５９】
水：≧６．５ｍｌ（６．５ｍｌ／ｇにて非常に粘性→粘度低下のために大量の水が推奨される）
ＴＨＦ：５０ｍｌ／ｇ→透明溶液
メタノール：８０ｍｌ／ｇ→透明溶液
アセトニトリル：３０ｍｌ／ｇ→わずかに濁り  ４０ｍｌ／ｇ→透明溶液
ＤＭＳＯ：６０ｍｌ／ｇ→わずかに濁り
（６０ｍｌ ＤＭＳＯ＋８００μｌ 水）／ｇ→透明溶液
アセトン：６０ｍｌ／ｇ→わずかに濁り
（６０ｍｌ アセトン＋８００μｌ 水）→透明溶液
エタノール：（５０ｍｌ エタノール＋１ｍｌ 水）→透明溶液
プロパノール：（１２０ｍｌ プロパノール＋６ｍｌ 水）→透明溶液
１−ブタノール：（１５０ｍｌ １−ブタノール＋８ｍｌ 水）→透明溶液
２−ブタノール：：（１５０ｍｌ ２−ブタノール＋９ｍｌ 水）／ｇ→透明溶液
２−メチル−１−プロパノール：（１５０ｍｌ ２−メチル−１−プロパノール＋７ｍｌ 水）／ｇ→透明溶液
【００６０】
次いで、溶解したポロキサマーを含む溶液を活性炭と接触させる。活性炭を最初に溶媒と混合し、その後ポロキサマーを添加することも可能である。可溶化ポロキサマーの活性炭とのインキュベーションは、バッチ式または連続式で行うことができる。
【００６１】
溶媒、ポロキサマーおよび活性炭を含む混合物の接触時間は、典型的には１分間と２４時間の間である。インキュベーションがバッチモードで行われる場合、好ましくは３時間と１５時間の間行われる。
ポロキサマーを含有する液体を活性炭に流して接触を連続的に行う場合、接触時間は典型的には１分と３０分の間である。このために、活性炭は、カラム、カートリッジ、フィルタまたは他の好適なデバイスに充填されてもよい。好ましくは、デバイス内の液体の滞留時間は１と１０分間の間である。連続的な精製を行うのに適したシステムは、Stax AKS Sytem（Pall）である。
【００６２】
インキュベーションがバッチ式で行われる場合、成分は混合され、混合物は好ましくは接触時間中に、例えば、撹拌または振とうさせることにより撹拌される。典型的には、懸濁液のインキュベーションは室温で行われる。
【００６３】
活性炭の量は、除去する必要のある高分子量成分の量に従って調整することができる。より高分子量の成分を除去する必要があるほど、より多く活性炭を使用する必要があることが見出された。典型的には、活性炭は、１：１と１：１０（活性炭の重量：ポロキサマーの重量）の間の量で使用される。
【００６４】
その後、活性炭を懸濁液から除去する。液体を活性炭から分離することは、例えば、沈降、遠心分離および／または好ましくは濾過によって行うことができる。典型的には、活性炭を可能な限り完全に除去するために、２つ以上の濾過ステップが使用される。当業者は、フィルターの孔サイズを活性炭の粒子サイズに調整することができる。
活性炭を除去した後、液体はポロキサマーを含む溶液から除去される。これは、例えば、蒸発、噴霧乾燥または凍結乾燥によって行うことができる。
【００６５】
蒸発は、好ましくは、中程度の温度で減圧下で行われる。蒸発は、典型的には、蒸留タイプの装置を用いて行われる。小規模では回転式蒸発器を用いて容易に行うことができる。
典型的な条件は、例えば：
アセトン：５５５ｈＰａ、４０℃
アセトニトリル：２４０ｈＰａ、４０℃
ＴＨＦ：３５５ｈＰａ、４０℃
エタノール：１７５ｈＰａ、４０℃
メタノール：３３５ｈＰａ、４０℃
水：７０ｈＰａ、４０℃
【００６６】
温度が４０℃未満または４０℃を超える場合は、それに応じて圧力を調整する必要がある。５０℃を超える温度に長時間さらされることは避けてるべきである。
必要に応じて、オーブンまたは真空オーブン内で追加の乾燥を行うことができる。
凍結乾燥またはフリーズドライのために、材料は、例えば液体窒素中で凍結され、および溶媒は周囲圧力を低下させることによって昇華される。
【００６７】
精製され乾燥されたポロキサマーは、その後、細胞培養に使用され得る。その粒子サイズが調整される必要がある場合は、細胞培地に添加する前に、任意に粉砕され得る。
【００６８】
細胞培養は細胞が培養される任意の手順である。
細胞培養は、ペトリ皿、接触プレート、ボトル、チューブ、ウェル、容器、バッグ、フラスコおよび／またはタンクなどの細胞の培養に適した任意の容器で行うことができる。好ましくは、それはバイオリアクター内で行われる。典型的には、容器は使用前に殺菌される。培養は、典型的には、環境からの外来微生物による汚染を制限する、適切な温度、浸透圧、通気、撹拌などの適切な条件下で、水性細胞培地中で細胞のインキュベーションによって行われる。当業者は、細胞の増殖／培養を支持または維持するための適切なインキュベーション条件を認識している。
【００６９】
本発明による細胞培地（同義語として使用される：培地）は、細胞のin vitro増殖を維持および／または支持し、および／または特定の生理学的状態を支持する成分の任意の混合物である。それは、予備濃縮培養ならびに維持培地としての使用にも適している。好ましくは、それは、化学的に明確な培地である。細胞培地は、細胞のインビトロ増殖を維持および／または支持するのに必要なすべての成分を含み得るか、または別々に添加されるさらなる成分と組み合わせて、または組み合わせずに、選択された成分を添加するために使用され得る（培地補足）。好ましくは、細胞培地は、細胞のin vitro増殖を維持および／または支持するために必要なすべての成分を含む。
【００７０】
in vitroでの増殖を維持および／または支持するのに必要な全ての成分を含む細胞培地は、典型的には、少なくとも１つ以上の糖成分、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミンまたはビタミン前駆体、１つ以上の塩、１つ以上の緩衝成分、１つ以上の補因子、および１つ以上の核酸成分（窒素含有塩基）またはそれらの誘導体を含む。それは、また、組換えタンパク質、例えば、ｒインスリン、ｒＢＳＡ、ｒトランスフェリン、ｒサイトカインなどの化学的に定義された生化学物質を含み得る。
【００７１】
細胞培地は、水性液体の形態であっても、または使用のために水もしくは水性緩衝液に溶解される乾燥粉末の形態であってもよい。
当業者は、特定の想定される目的のために適切な細胞培地を選択することができる。
実験データは、ポロキサマー１８８よりもより疎水性である高分子量成分を有するポロキサマー１８８ロット（典型的にはより高いＰＰＯ／ＰＥＯ比のため）のみが細胞生存率に悪影響を及ぼし、活性炭で除去できることを示している。
【００７２】
約１３０００と５００００ｇ／ｍｏｌの間の分子量を有し、例えば、ポロキサマー１８８と同様の疎水性を有する高分子量成分（類似のＰＰＯ／ＰＥＯ比）は、細胞生存率に負の影響を及ぼさず、活性炭によって除去することができない（図３および７）。
ポロキサマーが２つの親水性ブロックと疎水性ブロックを中央に有する両親媒性ポリマーであるという事実を考慮すると、活性炭は実際にはより疎水性で高分子量のポロキサマー成分を選択的に吸着することができ、一方で、実際のポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）は極めて少ない吸着が起こるということは幾分驚くべきことである。これは、良好な収率で細胞培養に適したポロキサマーの首尾良い精製を可能にする。
【００７３】
使用される活性炭の量に基づいて、特に活性炭が過剰に使用される場合、本発明の方法は、ポロキサマーから疎水性、高分子量成分の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％を除去するのに適し、一方で、典型的には標的ポロキサマーの８０％、好ましくは少なくとも９０％より大きく活性炭処理後に回収することができる。
【００７４】
上記及び下記に引用された全ての出願、特許および刊行物並びに２０１６年３月１７日に出願された対応する特許出願ＥＰ１６１６０８１１．２の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
例
例１：水中の活性炭によるポロキサマーの精製
活性炭を１９５ｇの脱イオン水に添加した（添加した活性炭の量については以下の表を参照）。５．０ｇのポロキサマー１８８をそれぞれ懸濁液に加えた（下記の表参照）。懸濁液を一晩混合した後、Pall VacuCap（登録商標）（０．２μｍ）を通して濾過して活性炭を除去した。濾液を凍結乾燥した。
【００７６】
【表１】
2019511606.tif 000003
【００７７】
例２：エタノール／水中の活性炭による精製
５．０ｇのポロキサマー１８８を１９５ｇのエタノール、各２．５重量％の水に添加し、各々はポロキサマー１８８を溶解するために添加した。１時間混合後、活性炭を添加した（以下の表参照）。
【表２】
2019511606.tif 000004
【００７８】
懸濁液を一晩混合したのち、２．５μｍのフィルター（製品番号 1005-070, Whatman、２．５μm孔サイズ）を有するフリットＰ４を通して濾過した。濾過物中の残留炭素は２．５μｍのフィルター（製品番号 1005-070, Whatman、２．５μm 孔サイズ）を有する吸引フィルターを使用して第二濾過によって除去した。溶媒は、ポロキサマーが乾燥されるまで回転式蒸発器で蒸発させた。
【００７９】
例３：エタノール／水中球状活性炭による精製
エタノール／水（９７．５：２．５）中の５．０ｇのポロキサマー１８８の溶液に、以下の量の球状活性炭（Felgentrager、表面積：１０００〜２０００ｍ２／ｇ、粒子サイズ：０．３〜０．８ｍｍ）を添加した（以下の表参照）：
【表３】
2019511606.tif 000005
【００８０】
一晩混合した後、懸濁液を２．５μｍフィルター（製品番号１００５−０７０、Whatman、２．５μｍ孔サイズ）を有するフリットＰ４を通して濾過した。球状の活性炭は、１回の濾過ステップで容易に除去されたので、第２の濾過は不要であった。ポロキサマーが乾燥するまで回転式蒸発器で溶媒を蒸発させた。
【００８１】
例４：ＴＨＦ中の活性炭による精製
５．０ｇのポロキサマー１８８を２５０ｍｌのＴＨＦに溶解した。以下の量の活性炭を添加した。
【表４】
2019511606.tif 000006
【００８２】
懸濁液を一晩混合した後、２．５μmフィルター（製品番号１００５−０７０、Whatman、２．５μm孔サイズ）を有するフリットＰ４を通して濾過した。濾過物中の残留炭素を、２．５μmフィルター（製品番号１００５−０７０、Whatman、２．５μm孔サイズ）を有する吸引フィルターを使用する第２の濾過によって除去した。ポロキサマーが乾燥するまで回転式蒸発器で溶媒を蒸発させた。
【００８３】
例５：アセトン中の活性炭による精製
５．０ｇのポロキサマー１８８を３００ｍｌのアセトンに溶解した。以下の量の活性炭を添加した：
【表５】
2019511606.tif 000007
【００８４】
懸濁液を一晩混合した後、２．５μmフィルター（製品番号１００５−０７０、Whatman、２．５μm孔サイズ）を有するフリットＰ４を通して濾過した。濾過物中の残留炭素を、２．５μmフィルター（製品番号１００５−０７０、Whatman、２．５μm孔サイズ）を有する吸引フィルターを使用する第２の濾過によって除去した。ポロキサマーが乾燥するまで回転式蒸発器で溶媒を蒸発させた。
【００８５】
例６：小スケール細胞アッセイで決定された細胞生存率
細胞アッセイは、Haofan Peng et al., Biotechnol. Prog., 2014, Vol. 30 (6), 1411 - 1418と同様に行われた。細胞培養は潜在的に細胞を損傷する剪断力を誘発するために、バッフル付き振とうフラスコ内で行われた。ＣＨＯ−Ｓ細胞およびCellvento(TM) CHO-220培地が使用される。ポロキサマー濃度は１ｇ／Ｌである。細胞培地は、約１００万細胞／ｍＬの生存細胞密度にて、選択の細胞を植え付けする。培養は、軌道上で振とうされたインキュベーター中で行われる。Beckman-Coulter ViCell XRでのトリパンブルーアッセイにより、4時間後に細胞生存率（溶液中の生存細胞の百分率）が決定される。各ロットは３回測定される。以下の平均細胞生存率が、ポロキサマー１８８ロットＡ、Ｂ，ＣおよびＤについて決定された：
【表６】
2019511606.tif 000008
【００８６】
ポロキサマー１８８ロットＡおよびＣは非常に不良な性能のロットであり、ロットＢは中程度の性能のロットであり、ロットＤは良好な性能のロットである。一般に、＞９０％は十分に良好な生存率であると考えられる。
【００８７】
例６ａ：例１において記載の精製ポロキサマーロットを使用する細胞生存率
例６に記載のとおり行われた細胞アッセイ。例１に記載の精製ポロキサマーロットの性能。
【表７】
2019511606.tif 000009
【００８８】
元のロットの性能が悪いほど（細胞生存率が低いほど）、水中の活性炭２０重量％を用いた精製後の細胞生存率の改善がより顕著になる。不良な性能のロットＡおよびＣに対する細胞生存率は、それぞれ４５％および１３８％改善する。中程度の性能のロットＢの細胞生存率は１４％改善する。２０重量％の活性炭を用いた良好な性能のロットＤの処理は、精製するものがないので効果がない。
【００８９】
例６b：例２に記載の精製ポロキサマーロットを使用した細胞生存率
例６に記載のとおり行われたアッセイ。例２に記載の精製ポロキサマーロットの性能。
【表８】
2019511606.tif 000010
【００９０】
最初のロットが細胞培養においてより不良であればあるほど（細胞生存率が悪いほど）、＞９０％の良好な生存率を達成するためには、より多くの活性炭が精製に必要である。非常に不良な性能のロットＡ（４９％生存率）の場合、１００％活性炭が＞９０％の細胞生存率を達成するために十分にロットを精製するのに必要である（図１も参照のこと）。中程度の性能のロットＢ（８７％の生存率）では、＞９０％の細胞生存率を達成するために、ただの２０重量％の活性炭を精製に使用すればよい（図２も参照）。
ロットＤの性能は９６％の生存率で非常に良好である。活性炭による処理はロットの性能に影響を及ぼさない（サンプル間の小さな偏差は測定誤差内である）、図３も参照されたい。これは、ポロキサマーロットＤ中の高分子量成分が疎水性ではなく、したがって、活性炭によって除去されないことを暗示する。ＳＥＣのデータはこれらの知見を支持している（図７）。
【００９１】
例６c：例３に記載の精製ポロキサマーロットを使用した細胞生存率
例６に記載のとおり行われたアッセイ。例３に記載の精製ポロキサマーロットの性能。
【表９】
2019511606.tif 000011
【００９２】
活性炭を用いた処理による不良な性能のポロキサマーロットの改善は、球状活性炭および標準活性炭（例６ｂ参照）について同様である。１００重量％球状活性炭を使用した精製は、ロットＡおよびＢについてそれぞれ９９％および９８％の細胞生存率をもたらす。これは、ロットＡについては１００％以上、ロットＢについては１３％の改善に相当する。
【００９３】
例６ｄ：例４に記載の精製ポロキサマーロットを使用した細胞生存率
例６に記載のとおり行われたアッセイ。例４に記載の精製ポロキサマーロットの性能。
【表１０】
2019511606.tif 000012
【００９４】
ＴＨＦ中１００重量％の活性炭を用いた非常に不良性能のロットＡの精製は、例えば水またはエタノール／水中で行われた精製と同様に、細胞生存度の顕著な改善をもたらす（例６ａ〜６ｃ参照）。
【００９５】
例６ｅ：例５に記載の精製ポロキサマーロットを使用した細胞生存率
例６に記載のとおり実施されたアッセイ。例５に記載の精製ポロキサマーロットの性能。
【表１１】
2019511606.tif 000013
【００９６】
アセトン中の活性炭を用いた非常に不良の性能のロットＡの精製は、細胞生存率の顕著な改善をもたらすが、例えば、水、エタノール／水またはＴＨＦにおけるほど顕著ではない（実施例６ａ−ｄ参照）。
【００９７】
例７
全てのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、以下のように行われる：
較正標準：ＰＥＧ(Ｍｐ:４３０、９８２、１９６０、３０２０、６６９０、１２３００、２６１００および４４０００ｇ／ｍｏｌ)
溶離液：ＴＨＦ
流速：１ｍｌ／分
注入体積：１００μｌ
カラム：粒子サイズ＝５μｍ、材料＝スチレン−ジビニルベンゼン
温度：４０℃
検知器：屈折率（ＲＩ）
【００９８】
例７ａ：
ポロキサマー１８８ロットＡ、Ｂ，ＣおよびＤのサイズ排除クロマトグラフィー測定（図４）。高分子量成分は約１３，０００と４０，０００ｇ／ｍｏｌの間に観察される（図４ＩＩ）。
【００９９】
例７ｂ：
例２に記載されているように、エタノール／水中の１０、２０および１００重量％の活性炭で精製した不良な性能のロットＡのサイズ排除クロマトグラフィー測定（図５参照）。精製により、〜２９０００ｇ／ｍｏｌにおける疎水性高分子量成分が除去される。１００重量％の活性炭により、疎水性高分子量成分は完全に除去される。結果として、細胞生存率が著しく改善され、精製されたロットが細胞培養における使用に適している（例６ｂおよび図１）。
【０１００】
例７ｃ：
例２に記載されているようにエタノール／水中の活性炭１０および１００重量％で精製された中程度の性能のロットＢをサイズ排除クロマトグラフィー測定（図６参照）。精製は、〜１６０００ｇ／ｍｏｌの高分子量成分の疎水性部分を除去し、〜１６０００ｇ／ｍｏｌにおける高分子量ピークの強度の著しい減少をもたらす。結果として、細胞生存率が著しく改善され、精製されたロットが細胞培養における使用に適している（実施例６ｂおよび図２）。
【０１０１】
例７ｄ：
例２に記載されているように、エタノール／水（点線）中の１０、２０および４０重量％の活性炭で処理した良好に機能するロットＤのサイズ排除クロマトグラフィー測定（図７参照）。活性炭処理後に高分子量ピーク（〜１５０００ｇ／ｍｏｌ）に有意な変化は観察されない。〜１１０００ｇ／ｍｏｌの４０％活性炭に対して観察された小さな偏差は、残留活性炭（完全に除去されていない）に起因し得る。これは、ロットＤ中の高分子量成分がポロキサマー１８８よりも高い疎水性を有さず、したがって除去されないことを暗示する。ポロキサマー１８８（類似のＰＰＯ／ＰＥＯ比）と同様の疎水性を有する高分子量成分は、細胞生存率に負の効果を有さず、活性炭によって除去することができない（ロットＤ、例６ｂおよび図３）。
【０１０２】
例８：フロースルーにおけるアセトン中の活性炭によるポロキサマーの精製
底部にフリットを有するガラスカラム（高さ１９０ｍｍ、内径１０ｍｍ）に、５．０ｇの球状活性炭（Felgentrager、表面積１０００〜２０００ｍ２／ｇ、粒子サイズ０．３０〜０．８ｍｍ）を充填した。カラムは、底端で密封され、アセトンで満たされ、気泡を除去するために注意深く旋回された。カラム中の活性炭床を一晩放置した。５．０ｇのポロキサマー１８８ロットＡを３００ｍｌのアセトンに溶解した。ポロキサマー溶液をカラムに注入し、底部シールを除去した。ポロキサマー溶液は４．６ｍｌ／分の流速でカラムを通過させた後に集められた。ポロキサマーが乾燥するまで回転式蒸発器で溶媒を蒸発させた。
例６に記載したようにして行われた細胞アッセイ。精製ポロキサマーロットの性能：
【表１２】
2019511606.tif 000014
フロースルーにおけるアセトン中の活性炭による非常に不良な性能のロットＡの精製は、細胞生存率の顕著な改善をもたらす。この改善は、標準活性炭を使用するバッチモードよりも優れている（実施例６ｅ参照）。
【０１０３】
例９：短混合時間を使用した活性炭による精製
ポロキサマー１８８ロットＡの精製は、例２に記載のように行われたが、懸濁液は１５分間だけ混合された。
【表１３】
2019511606.tif 000015
【０１０４】
混合時間１５分のエタノール／水中１００重量％の活性炭を用いた非常に不良な性能のロットＡの精製は、一晩混合して実施した精製（例６ｂ参照）と同様に、細胞生存率の顕著な改善をもたらす。
【図１】
2019511606.tif 000016
【図２】
2019511606.tif 000017
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019511606.tif 000021
【図７】
2019511606.tif 000022
【国際調査報告】
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2019511606.tif 000024
2019511606.tif 000025