(57)【要約】  本発明は、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）によって引き起こされる又は関連する疾患又は障害、特にH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸障害、の予防又は治療における、免疫原性組成物及びその使用に関する。さらに、本発明は、対象中のH.ピロリ感染を検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）
（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される一つのアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）（ｉ）の免疫原性変異体、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の免疫原性断片を含む、少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチド、又は
（ｂ）項目（ａ）に記載の１つの単離された（ポリ）ペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸分子、
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
該単離された（ポリ）ペプチドが組換え（ポリ）ペプチドである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
該免疫原性断片が細胞外ドメイン又はその断片を含む、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
該免疫原性変異体が、配列番号１〜７からなる群から選択される１つのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原をさらに含み、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、その免疫原性断片、及びこれらのタンパク質若しくは断片をコードする核酸分子から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
該単離された（ポリ）ペプチドが融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
該融合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される第一アミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び好ましくは異なる配列番号１〜７からなる群から選択される第二アミノ酸配列又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、又は
（ｉｉ）配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原であって、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、及びその免疫原性断片からなる群から選択される、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される第一アミノ酸配列又はその免疫原性変異体又は前記いずれかの免疫原性断片、好ましくは異なる配列番号１〜７からなる群から選択される第二アミノ酸配列又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原であって、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、及びその免疫原性断片からなる群から選択される、
を含む、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
該免疫原性組成物が項目（ａ）に記載の少なくとも２つの異なる単離された（ポリ）ペプチド、又は項目（ｂ）に記載の少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
該核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡであって、好ましくは該核酸分子がベクターに含まれている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
免疫原性組成物がワクチンである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
医薬用免疫原性組成物である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
H.ピロリにより引き起こされる又は関連する疾患又は障害を予防又は治療する方法に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物であって、好ましくは該疾患又は障害がH.ピロリ感染症及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択される、免疫原性組成物。
【請求項１４】
該胃十二指腸の障害が、胃炎、慢性胃炎、胃又は十二指腸潰瘍、胃癌、及びＭＡＬＴリンパ腫からなる群から選択される、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
対象のH.ピロリ感染を検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜４、６、及び７のいずれか１項に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドであって、好ましくは、該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドが固体支持体に固定されている、少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを供給する工程、
（ｂ）該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを対象から得られた生物学的試料と接触させる工程、及び
（ｃ）該生物学的試料中に該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドと特異的に結合する抗体の有無を決定する工程であって、抗体の存在が対象のH.ピロリ感染を意味する、
の工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）によって引き起こされる又は関連する疾患又は障害、特にH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸障害、の予防又は治療における、免疫原性組成物及びその使用に関する。さらに、本発明は、対象中のH.ピロリ感染を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori；H.ピロリ）は、微好気性グラム陰性細菌であり、人間の胃の中で生涯存続することができる。H.ピロリ感染は最も好発するヒトの細菌感染疾患である：地域の社会経済状況に依存し、世界中の人口の半分がH.ピロリに感染している （非特許文献１）。 この感染症は、慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃又は胃癌及び粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫等の多数の胃疾患に関連する（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。H.ピロリは２０１１年において世界中９８３，０００ケースで３番めに最も好発するタイプの胃癌の主な原因である（非特許文献６）。
【０００３】
胃癌はかなりの社会経済的コストと関連している。胃癌患者１人を治療するには現在、約５０，０００ユーロの費用がかかる。胃癌の予防には、H.ピロリによる感染の早期治療が含まれる。推定によると、H.ピロリによる感染症の患者の少なくとも３分の１は治療が必要である。現在、どの患者がH.ピロリ感染に関連するその後の疾患の発症を予測することは困難である。多数の研究の結果に基づいて、胃癌の予防のためのH.ピロリ感染の一般的治療は、９５％を超える症例を予防すると考えられるため、費用効果が高い（非特許文献７）。胃潰瘍患者、前癌性または確定性胃癌患者、胃癌患者の親戚、並びに、非ステロイド性抗炎症薬（循環器疾患用アスピリン含む）による長期治療を必要とする患者の治療法が明確に示されている。日本では高い胃癌率のために、H.ピロリに感染したすべての患者の治療が推奨されているが、抗生物質耐性率が着実に増加している（非特許文献８）。
【０００４】
現在のH.ピロリによる感染の標準的な治療は、オメプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤と組み合わせた２種の抗生物質からなる。１週間の治療の費用は、１患者あたり約２００ユーロである。この治療は、一部の患者において重大な副作用があり、耐性病原体の急激な増加をもたらす。２次治療及び３次治療はしばしば失敗するため、全患者の１０％以上は治療できなくなり（非特許文献９）、２０２０年までに推定６０％に上昇する可能性がある。H.ピロリに対するワクチンが入手可能な場合、何百万人もの患者に利益をもたらし、医療費を大幅に削減することができる。ワクチンは、蔓延している感染症との戦いにおいて非常に有効である。事実、アメリカ疾病予防管理センターはワクチン接種を感染症予防の最も効果的な方法とみなした（非特許文献１０）。しかしながら、現在、利用可能なH.ピロリに対するヒト用の有効なワクチンは存在しない。３つの抗原（CagA、VacA、NapA）に基づくH.ピロリワクチンを使用する、ノバルティス社の第ＩＩ相臨床試験は２０１０年に完了し、不成功に終わったものと考えられた。これらの抗原は非常に可変であり、H.ピロリ株のうちのいくつかにだけよく見られることから、部分的な保護しか期待できなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Perez-Perez et al., 2004
【非特許文献２】Nomura et al., 1994
【非特許文献３】Forman, 1996
【非特許文献４】Parsonnet et al.,1991
【非特許文献５】Blaser et al., 1995
【非特許文献６】Jemal et al., 2011
【非特許文献７】Graham & Shiotani, 2005
【非特許文献８】Shiota et al., 2010
【非特許文献９】Gao et al., 2010
【非特許文献１０】U.S. CDC, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
すなわち、本発明の一つの目的は、対象において免疫応答を誘導し、かつ、H.ピロリに対する汎予防ワクチンとして適している、H.ピロリのポリペプチドを同定することであった。本発明のさらなる目的は、これらのポリペプチド／抗原の１つ以上を含み、H.ピロリによって引き起こされる若しくはH.ピロリに関連する疾患若しくは障害の予防又は治療に使用することができる、免疫原性組成物を提供することであった。本発明のさらに別の目的は、H.ピロリ感染のバイオマーカーとして使用可能なポリペプチド／抗原を同定すること、並びにそれらの使用に基づいて対象におけるH.ピロリ感染を検出するための方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様において本発明は、 
（ａ）
（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される一つのアミノ酸配列、又は
（ｉｉ）（ｉ）の免疫原性変異体、又は
（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の免疫原性断片を含む、少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチド、又は
（ｂ）項目（ａ）に記載の１つの単離された（ポリ）ペプチドをコードする、少なくとも１つの核酸分子、
を含む免疫原性組成物に関する。
【０００８】
一態様において、該単離された（ポリ）ペプチドは組換え（ポリ）ペプチドである。
一態様において、該免疫原性断片は細胞外ドメイン又はその断片を含む。
【０００９】
一態様において、該免疫原性変異体は、配列番号１〜７からなる群から選択される１つのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一態様において、該免疫原性組成物は、少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原をさらに含み、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、その免疫原性断片、及びこれらのタンパク質若しくは断片をコードする核酸分子から選択されるものである。
【００１１】
一態様において、該単離された（ポリ）ペプチドは融合タンパク質である。
【００１２】
一態様において、該融合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される第一アミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び好ましくは異なる配列番号１〜７からなる群から選択される第二アミノ酸配列又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、又は
（ｉｉ）配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原であって、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、及びその免疫原性断片からなる群から選択される、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される第一アミノ酸配列又はその免疫原性変異体又は前記いずれかの免疫原性断片、好ましくは異なる配列番号１〜７からなる群から選択される第二アミノ酸配列又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原であって、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、及びその免疫原性断片からなる群から選択される、
を含む。
【００１３】
一態様において、該免疫原性組成物が項目（ａ）に記載の少なくとも２つの異なる単離された（ポリ）ペプチド、又は項目（ｂ）に記載の少なくとも２つの異なる核酸分子を含む。
一態様において、該核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡであって、好ましくは該核酸分子がベクターに含まれている。
【００１４】
一態様において、該免疫原性組成物が少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。
【００１５】
一態様において、該免疫原性組成物がワクチンである。
【００１６】
さらなる一態様において、本発明は医薬として使用される免疫原性組成物に関する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、H.ピロリにより引き起こされる又は関連する疾患又は障害を予防又は治療する方法において使用される、本明細書に記載の免疫原性組成物又は単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドに関し、好ましくは、該疾患又は障害はH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択される。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は本明細書に記載の免疫原性組成物又は項目（ａ）に記載の（ポリ）ペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドの、H.ピロリにより引き起こされる又は関連する疾患又は障害を予防又は治療するための医薬の製造における使用に関し、好ましくは、該疾患又は障害はH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択される。
【００１９】
別の態様において、本発明はH.ピロリにより引き起こされる又は関連する疾患又は障害を予防又は治療する方法に関し、好ましくは該疾患又は障害がH.ピロリ感染症及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択され、該方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物、又はそれを必要とする対象に項目（ａ）に記載の単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドを投与すること、を含む。
【００２０】
一態様において、該胃十二指腸の障害が、胃炎、慢性胃炎、胃又は十二指腸潰瘍、胃癌、及びMALTリンパ腫からなる群から選択される。
【００２１】
別の態様において、本発明は本明細書に記載の免疫原性組成物を含むキットに関する。
別の態様において、本発明は対象のH.ピロリ感染を検出する方法に関し、該方法は、
（ａ）本明細書に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドであって、好ましくは、該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドが固体支持体に固定されている、少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを供給する工程、
（ｂ）該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを対象から得られた生物学的試料と接触させる工程、
（ｃ）該生物学的試料中に該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドと特異的に結合する抗体の有無を決定する工程であって、抗体の存在が対象のH.ピロリ感染を意味する、
の工程を含む。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される一つのアミノ酸配列、又は（ｉｉ）（ｉ）の免疫原性変異体、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の免疫原性断片を含む、（ポリ）ペプチドの使用に関し、又はH.ピロリ感染用バイオマーカーとして該（ポリ）ペプチドに特異的に結合する抗体の使用に関する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを含むキットに関し、好ましくは、本明細書に記載の複数の異なる単離された（ポリ）ペプチドを含むキットに関する。
【００２４】
一態様において、本明細書に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチド又は本明細書に記載の複数の異なる単離された（ポリ）ペプチドが固体支持体に固定されている。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は対象のH.ピロリ感染を検出するための上記キットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、表面タンパク質を削ることによるワクチン候補の同定を示す模式図である。
【図２】図２は、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、新たに同定したワクチン候補のクマシー染色したSDSゲルを示す。
【図３】図３は、試験されたワクチン候補のそれぞれが体液性免疫応答を誘導することができることを示す、新たに同定したワクチン候補の酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）データを示す。
【図４】図４は、それぞれの試験されたワクチン候補が細胞表面に曝されることを確認するフローサイトメトリーを示す（B及びCを参照）。ワクチン候補及び対照タンパク質に対する特異的抗体がｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化によって惹起された。
【図５】図５は、jhp_0775単独で（C）及びH.ピロリガンマ-グルタミルトランスペプチターゼ（HPG）との組合せで（D）免疫化することにより細菌負荷の有意な減少をもたらすことを確認するマウスにおけるワクチン研究を示す。実験の仕組みをA及びBに示す。
【図６】図６は、 jhp_0775単独及びHPGとの組み合わせで免疫化した時のマウスにおける体液性応答を示す酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）を示す（B）。検査法の基礎となる検出様式をAに示す。
【図７】図７は、マウスでのjhp_0775での免疫化が特異的T細胞応答を誘導することを示す脾臓細胞の細胞内サイトカイン染色（ICCS）を示す（A及びB参照）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は上記や下記のとおり詳細に記載されるが、これらが変更可能なため、本発明が本明細書に記載される特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されるべきである。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２８】
以下に、本発明のいくつかの要素が記載される。これらの要素は、特定の実施態様と共に列挙することができるが、追加の実施態様を生み出すために任意の方法及び任意の数で組み合わせることができることが理解されるべきである。様々に記載された実施例及び好ましい実施態様から、本発明を明示的に記載された実施態様のみに限定するものと解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載された実施態様を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組合わせた実施態様をサポートし包含すると理解すべきである。また、本出願において記載された全ての要素の任意の順列及び組合せは、文脈が別段のことを示さない限り、本出願の記載により開示されると考えられるべきである。
【００２９】
好ましくは、本明細書で使用される用語は「A multilingual glossary of biotechnological terms (IUPACRecommendations)」H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 及び H. Koelbl, Eds., Helvetica ChimicaActa, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)の記載で定義される。
【００３０】
本発明の実施には、他に指示がなければ、化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び本分野の文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, J. Sambrook etal. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2000を参照）で説明されている組換えDNA技術の従来の方法を用いる。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上別途必要な場合を除き、「含む（comprise）」という語、及び「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、記載された構成要素、整数、又は工程、又は構成要素、整数、又は工程の群を含むことを意味すると理解され、他の構成要素、整数又は工程、又は構成要素、整数、又は工程の群を除外するものではないが、ある態様においてはそのような他の構成要素、整数又は工程、または構成要素、整数、又は工程の群を除外することができる、すなわち、主題は、記載された構成要素、整数又は工程、又は構成要素、整数、又は工程の群を含むことから構成される。本発明を説明する文脈（特に請求項の文脈）で使用される用語「a」及び「an」及び「the」及び類似の参照は、本明細書中に別段の指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内の各々の値を別個に参照する略式の方法として役立つことを単に意図するものである。本明細書中で他に示されない限り、個々の各値は、本明細書中に個別に列挙されているものとして明細書に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示がない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される、任意の及び全ての例、又は例示的な言い回し（例えば「〜のような」）の使用は、単に本発明をより良く説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠である請求項に記載されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００３２】
いくつかの文献が本明細書の文章中で引用されている。本明細書中で引用される各々の文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書等）は、上記又は下記にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明による開示よりも先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本発明者らはH.ピロリに対する適切なワクチン候補としてのタンパク質を同定するために表面タンパク質を削る方法を使用した。該タンパク質は繰り返し外膜タンパク質（OMPs）であり、通常、免疫系にとって魅力的な標的である。これらのタンパク質は大腸菌内でクローン化され、組換え産生され、精製され、そしてマウスにおいて体液性免疫応答を誘導するために首尾よく試験された。これらのタンパク質はH.ピロリで高度に保存されていることから、これらのタンパク質はH.ピロリに対して汎防御免疫を付与することが期待される。
【００３３】
本発明は、（ａ）（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列；又は（ｉｉ）その免疫原性変異体（すなわち、（ｉ）の免疫原性変異体）；又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の免疫原性断片、を含む又はからなる、少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチド、又は
（ｂ）項目（ａ）に記載の単離された（ポリ）ペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子、を含む免疫原性組成物を提供する。
【００３４】
本明細書で使用する「免疫原性」は、対象において、免疫応答を引き起こす能力があること、すなわち、体液性及び／又は細胞媒介免疫応答を誘導するものであることを意味する。「体液性免疫応答」は、細胞外体液中で見られる巨大分子、例えば分泌された抗体、補体タンパク質、及び抗菌ペプチドによって媒介される。「細胞媒介免疫応答」は貪食細胞の活性化、抗原特異的Ｔリンパ球の活性化、抗原に応答する種々のサイトカインの放出を包含する。一態様において、免疫応答は抗体によって媒介される（抗体応答）。本明細書において使用される「免疫原性断片」とは、好ましくは断片が由来する（ポリ）ペプチドに特異的な免疫応答を誘導することができる断片をいう。
【００３５】
本明細書で使用される用語「対象」は、任意の生物に関し、脊椎動物、特に、ヒト及びその他の哺乳動物（例えば、げっ歯類、ウサギ、サル）を含む哺乳動物に関する。げっ歯類は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はチンチラであってもよい。好ましくは、対象はヒトである。一態様において、対象は本明細書において「患者」とも呼ばれる疾患、特に本明細書に開示される疾患を有する若しくは有すると疑われる対象である。
【００３６】
用語「（ポリ）ペプチド」はペプチド又はポリペプチドをいう。
【００３７】
用語「ペプチド」は一般的に、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、又は少なくとも１４、及び好ましくはペプチド結合で一緒に連結される８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、５０、又は１００連続アミノ酸を含む物質に関する。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は大きいペプチド、好ましくは１００以上のアミノ酸を有するペプチドに関するが、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は本明細書において一般的に相互交換可能に使用される。
【００３８】
用語「単離された（ポリ）ペプチド」は、（ポリ）ペプチドがその天然環境から分離されていることを意味する。単離された（ポリ）ペプチドは本質的に精製された及び／又は純粋な状態であってもよい。用語「本質的に精製された」又は「本質的に純粋」とは、（ポリ）ペプチドが本質的に他の物質、例えば、天然又はインビボにおいて存在している及び／又は関連している、例えば他のタンパク質、核酸、脂質、及び炭水化物、から取り除かれているものであることを意味する。
【００３９】
一態様において、単離された（ポリ）ペプチドは組換え（ポリ）ペプチドである。
【００４０】
本明細書で使用される用語「組換え（ポリ）ペプチド」は、生細胞内の組換え核酸分子（例えばＤＮＡ）の発現、例えば特定の発現ベクターによって、生じる（ポリ）ペプチドを指すことを意味する。組換え核酸分子は研究室の遺伝子組換え手法によって形成される核酸分子である。
【００４１】
一態様において、単離された（ポリ）ペプチドは宿主細胞、好ましくは真核生物宿主細胞、例えば大腸菌において産生される。
【００４２】
任意で、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列はそのＮ末端分泌配列（本明細書においてシグナル配列又はシグナルペプチド配列ともいう）、例えば、配列番号１のアミノ酸１〜３３、配列番号２のアミノ酸１〜２２、配列番号３の１〜４３、配列番号４のアミノ酸１〜３１、配列番号５の１〜２２、を欠く。
【００４３】
一態様において、本明細書において単離された（ポリ）ペプチドは検出可能な標識又はタグをさらに含む。
【００４４】
本明細書において使用される用語「検出可能な標識又はタグ」とは、検出及び／又は単離及び／又は単離された（ポリ）ペプチドの固定を可能にする検出可能な標識又はタグをいい、これらの目的のため当業者に知られる任意の標識／タグを含むことを意味する。特に好ましくは、アフィニティータグ、例えば、キチン結合タンパク質（CBP）、マルトース結合タンパク質（MBP）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）、ポリ（His）（例えば、６ｘHis又はHis６）、ストレップ-タグ（登録商標）（Strep-tag）、ストレップ−タグＩＩ（登録商標）（Strep-tag II）及びツイン−ストレップ−タグ（登録商標）（Twin-Strep-tag）；可溶化タグ, 例えばチオレドキシン（TRX）、ポリ（NANP）及び SUMO；クロマトグラフィータグ、例えば、フラッグタグ；エピトープタグ、例えば、V5タグ、ｍｙｃタグ及びＨＡタグ；蛍光標識又はタグ（すなわち、蛍光色素／フルオロフォア）、例えば、蛍光タンパク質（例えばGFP、YFP、RFP等）及び蛍光染色（例えば、FITC、TRITC、クマリン、及びシアニン）；発光標識又はタグ、例えば、ルシフェラーゼ；及び（他の）酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、又はグルコースオキシダーゼ）である。また、上記標識又はタグの任意の組み合わせを含む。
【００４５】
（ポリ）ペプチド標識又はタグのアミノ酸配列は本明細書で記載される単離された（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列の任意の位置に導入してもよい。例えば、アミノ酸側鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に付加（例えば、リジンへのＥＤＣ−ＮＨＳ結合による）してもよい。非ペプチド標識又はタグにおいても同様である。
【００４６】
本発明に係る単離された（ポリ）ペプチドは該単離された（ポリ）ペプチドの安定性及び／又は凝集防止を増大させる１以上の修飾をさらに含んでもよい。単離された（ポリ）ペプチドの「安定性」の用語は、例えばインビボでの、特に、その「半減期」に関する。「半減期」は、分子の量又は数の半分を除去するのに必要な時間に関する。凝集の防止は、単離された（ポリ）ペプチドの貯蔵安定性を増大もさせる。
【００４７】
単離された（ポリ）ペプチドは、例えば、半減期拡張モジュールに融合又は結合させてもよい。そのようなモジュールは当業者に知られており、例えば、アルブミン、アルブミン結合ドメイン、免疫グロブリンのＦｃ領域／ドメイン、免疫結合ドメイン、ＦｃＲｎ結合モチーフ及びポリマーを含む。特に好ましいポリマーは、ポリエチレングリコール（PEG）、ヒドロキシエチルデンプン（HES）、ヒアルロン酸、ポリシアル酸、及びＰＥＧ模倣ペプチド配列（PEG-mimetic peptide sequences）を含む。単離された（ポリ）ペプチドの凝集防止修飾は当業者に知られており、例えば、１以上の疎水性アミノ酸、好ましくは表面露出疎水性アミノ酸を１以上の親水性アミノ酸での置換を含む。
一態様において、単離された（ポリ）ペプチド、好ましくは、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は上記いずれかの免疫原性断片は、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２、好ましくは５、４、３、又は２までの置換、疎水性アミノ酸、好ましくは表面露出疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸での置換を含む。好ましくは、単離された（ポリ）ペプチドのその他特徴及び／又は上記構成要素、例えば、その免疫原性、は置換によって損なわれない。
【００４８】
本発明に係る単離された（ポリ）ペプチドは、免疫応答、特に高力価の抗体、を引き起こすことを可能又は促進する方法で対象の免疫系にそれぞれの抗原を存在させるため、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ＢＳＡ、オボアルブミン等の担体材料と融合又は結合してもよい。
【００４９】
本明細書で使用される用語「融合する」とは、特に、遺伝子的に融合、例えば組換えＤＮＡ技術によるものをいう。
【００５０】
本明細書において使用される用語「結合する」とは、特に、安定な共有鎖を生じる化学的及び／又は酵素的結合をいう。
【００５１】
本発明に係る単離された（ポリ）ペプチドは、該単離された（ポリ）ペプチドを所与の細胞、組織、器官へ標的導入可能とするようなアミノ酸配列、好ましくは該単離された（ポリ）ペプチドを特定の細胞タイプ、例えば、樹状細胞を標的とするアミノ酸配列をさらに含んでもよい。適切なアミノ酸は、例えば、Sioud et al., 2013、及びApostolopoulos et al., 2013に記載されており、例えば、アミノ酸配列NWYLPWLGTNDW （配列番号２９）を有するペプチドが含まれる。
【００５２】
用語「部分」又は「断片」は相互交換可能に使用され、連続要素をいう。
例えば、アミノ酸配列又はタンパク質等の構造の部分は、前記構造の連続要素をいう。タンパク質配列の部分又は断片は、好ましくは、該タンパク質配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、又は少なくとも２００の連続アミノ酸配列を含む。
【００５３】
一態様において、本明細書で定義される（ポリ）ペプチドは、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列の免疫原性断片、又はその免疫原性変異体を含み、該（ポリ）ペプチドは、好ましくは、配列番号１〜７のアミノ酸配列それぞれのＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸配列又はその免疫原性変異体を免疫原性断片と連続してさらに含まない。
【００５４】
一態様において、免疫原性断片はＮ末端分泌配列を欠く。
【００５５】
一態様において、免疫原性断片は配列番号１のアミノ酸３４〜２０１、又は配列番号２のアミノ酸２３〜２８５、又は配列番号３のアミノ酸４４〜２６８、又は配列番号４のアミノ酸３２〜２２９、又は配列番号５のアミノ酸２１〜４７７、からなる。
【００５６】
一態様において、免疫原性断片は細胞外ドメイン又はその断片を含む又はからなる。そのような配列／ドメインは当業者に知られる標準的なバイオインフォマティクスツール及び／又は公開データベースを使用することによって同定されてもよい。
【００５７】
本明細書において使用される用語「細胞外ドメイン」は、細胞質ではない又は膜内に埋め込まれていないタンパク質の部分をいうことを意味し、細胞の表面又は細胞膜周辺腔に位置する／露出する部分を含む。
【００５８】
本発明に係る用語「変異体」は、特に、突然変異体、スプライシング変異体、立体構造変異体、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体、及びホモログ、特にこれらの天然に生じるものをいう。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列の変化に関連し、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、しばしば、所与の遺伝子について多数の対立遺伝子変異体を同定する。ホモログは、所与の核酸配列又はアミノ酸配列とは異なる起源の種（又は株）での核酸又はアミノ酸配列である。用語「変異体」は任意の翻訳後修飾された変異体及び立体構造変異体を包含する。
【００５９】
本発明の目的のため、アミノ酸配列の「変異体」はアミノ酸の挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体、及び／又はアミノ酸置換変異体を含む。アミノ酸欠失変異体は、そのタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端での欠失、いわゆるＮ末端及び／又はＣ末端欠失変異体を含む。
【００６０】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１つ又は２つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入があるアミノ酸配列変異体の場合、アミノ酸配列中の特定の部位に１つ以上のアミノ酸残基が挿入されるが、得られる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
【００６１】
アミノ酸付加変異体は、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０又はそれ以上のアミノ酸のような１つ以上のアミノ酸のＮ末端及び／又はＣ末端融合を含む。
【００６２】
アミノ酸欠失変異体は、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０又はそれ以上のアミノ酸の除去などにより、配列から１つ以上のアミノ酸を除去することを特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置、例えばＮ末端及び／又はＣ末端であってもよい。
【００６３】
一態様において、免疫原性変異体はＮ末端分泌配列を欠く。
【００６４】
アミノ酸置換変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されることを特徴とする。一態様において、アミノ酸置換変異体は、１０、９、８、７、６、５、４、３または２までのアミノ酸の置換を含む。ホモログタンパク質又はペプチド間で保存されていない、及び／又は類似の特性を有する他のアミノ酸とアミノ酸を置換するアミノ酸配列中の位置での改変が好ましい。好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸の同一ファミリーの別のもの、すなわちそれらの側鎖に関連する（例えば、電荷及び／又は大きさの点で）アミノ酸でのアミノ酸の置換を含む。天然に存在するアミノ酸は一般に４つのファミリーに分けられる：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）及び、無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）のアミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは場合によっては芳香族アミノ酸に分類されることもある。しかしながら、単離された（ポリ）ペプチドの凝集を低減又は阻害するために、例えば、１つ以上の（表面に露出した）疎水性アミノ酸を１つ以上の親水性アミノ酸で置換するなど、異なる特性を有する他のアミノ酸でアミノ酸を置換することも可能であり、好ましくは、これらの（ポリ）ペプチドの他の特性、例えばそれらの免疫原性は、そのようなアミノ酸置換によって損なわれない。
【００６５】
配列番号１〜７のアミノ酸配列を持つタンパク質はH.ピロリ株J99（ATCC700824）に由来するタンパク質である。これらの命名及びアクセッション番号は表１で与えられる。
【００６６】
一態様において、免疫原性変異体は別のH.ピロリ株由来の等価タンパク質である。一態様において、該等価タンパク質はホモログであり、好ましくはオルソログである。
【００６７】
「オルソログ」は、単一の祖先遺伝子／タンパク質からの種分化を介したものであり、遺伝子重複によるものではないホモログ遺伝子／タンパク質である。
【００６８】
好ましくは、所定の参照アミノ酸配列（例えば、配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、任意でそのＮ末端分泌配列を欠く）と前記所定のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列の類似性、好ましくは同一性は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。類似性及び同一性は好ましくは参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％であるアミノ酸領域に対して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなる場合、類似性又は同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、少なくとも約６０アミノ酸、少なくとも約８０アミノ酸、少なくとも約１００アミノ酸、少なくとも約１２０アミノ酸、少なくとも約１４０アミノ酸、少なくとも約１６０アミノ酸、少なくとも約１８０アミノ酸、少なくとも約２００アミノ酸、好ましくは連続アミノ酸について与えられる。一態様において、類似性又は同一性の程度／パーセンテージは、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、公知のツール、好ましくは最良な配列アライメントを用いて、例えば、Alignを用いて、標準の設定、好ましくはEMBOSS::needle、Matrix: Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5を用いて行うことができる。
【００６９】
「配列類似性」は同一であるか又は保存的アミノ酸置換となっているアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００７０】
一態様において、免疫原性変異体は、配列番号１〜７からなる群から選択される１つのアミノ酸配列と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み、すなわち、
免疫原性変異体は、配列番号１と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み；又は
免疫原性変異体は、配列番号２と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み；又は
免疫原性変異体は、配列番号３と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み；又は
免疫原性変異体は、配列番号４と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み；又は
免疫原性変異体は、配列番号５と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み；又は
免疫原性変異体は、配列番号６と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含み；又は
免疫原性変異体は、配列番号７と、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％（例えば、９７％、又は９８％、又は９９％）同一である、アミノ酸配列を含む。
【００７１】
一態様において、免疫原性組成物は少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原を含む。
【００７２】
本明細書において使用される用語「H.ピロリ由来の付加的な抗原」は、剤、すなわち、上記項目（ａ）及び（ｂ）に記載の単離された（ポリ）ペプチド及び核酸分子とは異なる抗原を好ましくはいう。
【００７３】
好ましい一態様において、付加的な抗原は、H.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、その免疫原性断片及びそれらのタンパク質又は断片をコードする核酸分子からなる群から選択される。
【００７４】
用語「外膜タンパク質」はH.ピロリの外膜に関連し、膜内在性タンパク質並びに脂質のＮ末端に結合することにより膜に固定されるリポタンパク質を含む。これらの構造及び機能はKoebnik et al., 2000にさらに記載されている。本発明で使用するための特に好ましいH.ピロリの外膜タンパク質は、BabA、HpaA、Omp18、Omp22及びSabAからなる群から選択される。
【００７５】
本明細書で使用される用語「病原性因子タンパク質」は、例えば、H.ピロリの病原性に貢献する（例えば、Kalali et al.,2014参照）酵素等の機能性タンパク質のようなタンパク質をいう。本発明の特に好ましい病原性因子タンパク質は、H.ピロリのγグルタミルトランスペプチダーゼ（gGT）（HPGGT又はHPGともいう）。適切なHPGタンパク質は、例えば、WO 2008/046650 A1に記載されており、不活性型のHPG（S451／452A）を含み、任意で、Ｎ末端分泌配列を欠いている。
【００７６】
付加的な抗原は本発明の免疫原性組成物の部分であってもよく、US2007/0042448 A1又はWO2004/094467 A2にも記載される。一態様において、単離された（ポリ）ペプチドは融合タンパク質である。
【００７７】
用語「融合タンパク質」は２以上の別個の（ポリ）ペプチド又はタンパク質を結合することによって作製され、好ましくは頭部と尾部（すなわちＮ末端とＣ末端又はその逆）が結合する形態で、互いの元となるタンパク質に由来する機能特性を持つ単一のタンパク質を生じる。
【００７８】
一態様において、融合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される第一アミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び好ましくは異なる配列番号１〜７からなる群から選択される第二アミノ酸配列又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、又は
（ｉｉ）配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原であって、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、及びその免疫原性断片からなる群から選択される、又は
（ｉｉｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される第一アミノ酸配列又はその免疫原性変異体又は前記いずれかの免疫原性断片、好ましくは異なる配列番号１〜７からなる群から選択される第二アミノ酸配列又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び少なくとも１つのH.ピロリ由来の付加的な抗原であって、好ましくは該付加的な抗原はH.ピロリの外膜タンパク質及び病原性因子タンパク質、及びその免疫原性断片からなる群から選択される、
を含む。
【００７９】
例えば、上記（ｉ）及び（ｉｉｉ）の代替として、
該第一アミノ酸配列は配列番号１であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号２〜７からなる群から選択されてもよい；又は
該第一アミノ酸配列は配列番号２であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号１及び３〜７からなる群から選択されてもよい；又は
該第一アミノ酸配列は配列番号３であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号１、２及び４〜７からなる群から選択されてもよい；又は
該第一アミノ酸配列は配列番号４であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号１〜３、及び５〜７からなる群から選択されてもよい；又は
該第一アミノ酸配列は配列番号５であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号１〜４、及び６〜７からなる群から選択されてもよい；又は
該第一アミノ酸配列は配列番号６であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号１〜５及び７からなる群から選択されてもよい；又は
該第一アミノ酸配列は配列番号７であってよく、かつ、該第二アミノ酸配列は配列番号１〜６からなる群から選択されてもよい。
【００８０】
一態様において、融合タンパク質は、（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体、又は前記いずれかの免疫原性断片、及び、（ｉｉ）所与の細胞、組織、又は器官への融合タンパク質の標的導入可能とするアミノ酸配列であって、好ましくは該融合タンパク質を本明細書に記載される特定の細胞タイプ、例えば樹状細胞に標的化するアミノ酸配列、を含む。
【００８１】
本発明は本明細書に記載の融合タンパク質も提供する。
【００８２】
一態様において、免疫原性組成物は、項目（ａ）に記載の少なくとも２つの異なる単離された（ポリ）ペプチド、又は項目（ｂ）に記載の少なくとも２つの異なる核酸分子、を含む。
【００８３】
核酸分子は、本発明によれば、分子の形態であってもよく、該分子は単鎖又は二本鎖及び線状又は共有結合的に閉じて円を形成する。一態様において、核酸分子はＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００８４】
本発明に照らして、用語「ＤＮＡ」はデオキシリボヌクレオチド残基を含み及び好ましくはデオキシリボヌクレオチド残基から完全に又は実質的に構成される分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位でヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。用語「ＤＮＡ」は、部分的又は完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び組換え産生ＤＮＡ、のような単離されたＤＮＡを含み、また、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は変化によって天然に生じるＤＮＡとは異なる修飾されたＤＮＡを含む。そのような変化は非ヌクレオチド物質を、例えばＤＮＡの末端へ又は内部に（例えばＤＮＡの１以上のヌクレオチドで）付加することを含むことができる。ＤＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチドのような非標準的なヌクレオチドを含むこともまたできる。これらの改変されたＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡの類似体又は誘導体と呼ぶことができる。
【００８５】
本発明に照らして、用語「ＲＮＡ」はリボヌクレオチド残基を含み及び好ましくはリボヌクレオチド残基から完全に又は実質的に構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位でヒドロキシル基を持つヌクレオチドに関する。
用語「ＲＮＡ」は、部分的又は完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び組換え産生ＲＮＡ、のような単離されたＲＮＡを含み、また、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は変化によって天然に生じるＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡを含む。そのような変化は非ヌクレオチド物質を、例えばＲＮＡの末端へ又は内部に（例えばＲＮＡの１以上のヌクレオチドで）付加することを含むことができる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチドのような非標準的なヌクレオチドを含むこともまたできる。これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体又は誘導体と呼ぶことができる。本発明によれば、「ＲＮＡ」は単鎖ＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡをいう。一態様において、ＲＮＡはｍＲＮＡである。一態様において、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）又は合成ＲＮＡである。
【００８６】
本発明は、該核酸分子はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記項目（ｂ）に記載の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子も包含する。
【００８７】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、5×SSC／5×デンハルト溶液／1.0％SDS中において68℃でハイブリダイズさせ、0.2×SSC／0.1％SDS中において室温で洗浄することを含み、又は当業者が同等と認識するもの（例えば、ハイブリダイゼーションを2.5×SSCバッファー中において60℃で行い、続いて低濃度バッファーで37℃で数回洗浄する条件）を含む。塩濃度及び温度のパラメーターは、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の最適な同一性のレベルを達成するように変化させることができる。このような条件のガイダンスは、当業者に利用可能であり、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, J. Sambrook etal. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 2000や、Ausubel et al. (eds.), 1995, CurrentProtocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, N.Y.) at Unit 2.10.が挙げられる。
【００８８】
一態様において、核酸分子は、例えば、H.ピロリ以外の細菌、例えば大腸菌、での発現、真核細胞、例えば哺乳動物細胞（CHO細胞、BHK細胞、COS細胞及びHEK293細胞）での発現 、又は昆虫細胞（例えば、SF9細胞、SF21細胞、及びHigh Five（商標） 細胞）に使用するために、コドンが最適化されている。
【００８９】
一態様において、核酸分子はベクターに包含され／含まれている。
【００９０】
本明細書で使用される用語「ベクター」は当業者に知られるいかなるベクターも包含し、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えばラムダファージ、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター又はバキュロウイルスベクター、又は人工染色体ベクター、例えば細菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）又はP1人工染色体（PAC）を含む。前記ベクターは発現ベクター及びクローニングベクターを含む。発現ベクターはプラスミド及びウイルスベクターを含み、通常所望のコード配列と特定の宿主生物（例えば、細菌、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物）又はインビトロ発現システムで作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を一般に含む。クローニングベクターは一般に所望のＤＮＡ断片を操作して増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
【００９１】
一態様において、免疫原性組成物は少なくとも１つのアジュバントをさらに含む。
【００９２】
用語「アジュバント」は、抗原、例えば上記項目（ａ）及び（ｂ）の（ポリ）ペプチド、又は本明細書に記載のH.ピロリ由来の付加的抗原を、例えば免疫系の一般的な刺激を提供することによって免疫応答を増強する物質をいう。適切なアジュバントは当業者に知られており、トキシンベースアジュバント、TLRリガンドベースアジュバント、核酸／ベクターベースアジュバント、タンパクベースアジュバント、ポリマーベースアジュバント、粘膜アジュバント、ISCOMマトリックス及び前記いずれかの組み合わせを含む。特定のアジュバントとしては、限定されないが、ポリカチオン性ポリマー／ペプチド、免疫刺激性デオキシヌクレオチド（ODNs）、合成KLKペプチド、神経活性化合物（例えば、ヒト成長ホルモン）、アルミニウム、フロイント完全又は不完全アジュバント、コレラ毒素（CT）、CTA1-DD、易熱性エンテロトキシン（LT）、CT又はLTの突然変異体、ポリIC、樹状細胞（DC）結合ペプチド及びC3d融合タンパク質を含む。一態様において、 TLRリガンドベースアジュバントは WO2010/050903 A1、Mori et al., 2012 及びSong et al., 2015に記載されているような、細菌性フラゲリンの群に例えば由来する、TLR5リガンドである。一態様において、アジュバントは、コレラ毒素（CT）、CTA1-DD及び易熱性エンテロトキシン（LT）からなる群から選択される。
【００９３】
本発明によれば、免疫原性組成物は、所望の反応又は所望の効果を産生するための、有効量の活性剤、すなわち、本明細書に記載の（ポリ）ペプチド又は核酸分子を含む。
【００９４】
本発明の免疫原性組成物は、好ましくは無菌である。免疫原性組成物は、均一な剤形で提供することができ、自体公知の方法で調製することができる。本発明の免疫原性組成物は、例えば、溶液又は懸濁液の形態であってもよい。
【００９５】
免疫原性組成物は、１つ以上の担体及び／又は賦形剤をさらに含んでもよく、その全てが好ましくは薬学的に許容される。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、好ましくは免疫原性組成物の活性物質の作用と相互作用しない物質の非毒性をいう。
【００９６】
用語「担体」は 、適用を容易にし、増強し又は可能にするために活性成分が組み合わされる、天然又は合成の有機又は無機成分をいう。本発明によれば、用語「担体」は、対象への投与に適している、１つ以上の適合性の固体又は液体充填剤、希釈剤又はカプセル化物質をも含む。
【００９７】
非経口投与可能な担体物質（希釈剤）は、例えば、滅菌水、リンゲル液、乳酸加リンゲル液、生理食塩水、静菌性生理食塩水（例えば、０．９％ベンジルアルコール含有生理食塩水）、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）、ハンクス液、不揮発性油、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン及び生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。得られる溶液又は懸濁液は、好ましくは、レシピエントの血液に対して等張性である。
【００９８】
本明細書で使用される用語「賦形剤」は、本発明の免疫原性組成物のような医薬組成物中に存在してよいものであって、活性成分ではない、例えば、塩、結合剤（例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール）、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、着香剤、又は着色剤の、全ての物質を意図するものである。
【００９９】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用してもよく、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、限定されるものではないが、以下の酸から調製される：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。薬学的に許容される塩はまた、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩として調製されてもよい。イオン強度又は浸透圧を調整するために塩を添加してもよい。
【０１００】
医薬組成物に使用される適切な保存剤は、抗酸化剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、システイン、メチオニン、パラベン及びチメロサールを含む。
【０１０１】
医薬組成物に使用される適切な緩衝剤は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、及び塩中のリン酸を含む。他の適切な緩衝剤は、アルギニン塩酸塩及びアルギニンリン酸を含む。
【０１０２】
適切な安定剤には、グリセロール、アスコルビン酸塩及びヒスチジンが含まれる。
【０１０３】
本発明の免疫原性組成物はUS6,838,089 B1及びUS6,372,260 B1に記載のとおり製剤化されてもよい。
【０１０４】
本発明の免疫原性組成物は、場合により上記のような１種以上の賦形剤を含む適切な希釈剤で再構成された安定な凍結乾燥製品として製剤化することもできる。
【０１０５】
一態様において、免疫原性組成物はワクチン又はワクチンに含まれる。
【０１０６】
用語「ワクチン」は 特定の疾患に対して免疫を付与又は改善する製剤をいう。本発明のワクチンは、特に本明細書に記載の特定の疾患、H.ピロリによって引き起こされる又は関連する疾患又は障害に対して免疫を付与又は改善する。
【０１０７】
本発明は医薬として使用するための本明細書に記載の免疫原性組成物をさらに提供する。
【０１０８】
本明細書において「医薬」は、治療、すなわち疾患又は障害の予防又は治療に使用される物質／組成物をいう。本発明によれば、用語「疾患」又は「障害」はあらゆる病態をいう。
【０１０９】
本発明の別の態様は、H.ピロリによって引き起こされる又は関連する疾患又は障害を予防又は治療する方法に使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物又は項目（ａ）に記載の単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドに関するものであって、好ましくは、該疾患又は障害はH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択される。
【０１１０】
一態様において、本発明はH.ピロリによって引き起こされる又は関連する疾患又は障害の治療又は予防のための医薬の製造における、本明細書に記載の免疫原性組成物又は項目（ａ）に記載の単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドの使用に関するものであって、好ましくは、該疾患又は障害はH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択される。
【０１１１】
別の態様において、本発明はH.ピロリによって引き起こされる又は関連する疾患又は障害の治療又は予防の方法に関するものであって、好ましくは、該疾患又は障害はH.ピロリ感染及びH.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸の障害からなる群から選択され、該方法は必要とする対象への本明細書に記載の免疫原性組成物又は項目（ａ）に記載の単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合するポリペプチドリガンドの投与を含む。 
【０１１２】
本明細書で使用される用語「治療」は、健康状態を改善し、及び／又は患者の寿命を延ばす（増加させる）、あらゆる治療に関する。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「感染」は、疾患を引き起こす病原体（ここではH.ピロリ）による対象の身体組織の侵襲、それらの増殖、及びこれらの病原体及びそれらが産生する毒素に対する組織の反応をいう。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「胃十二指腸障害」（又は単に「胃障害」）は胃及び隣接する十二指腸に影響を与える疾患をいう。「H.ピロリによって引き起こされる胃十二指腸障害」は当業者に知られており、例えば、胃炎、慢性胃炎、胃萎縮症、胃又は十二指腸潰瘍、胃癌（胃がんとも呼ばれる）及びＭＡＬＴリンパ腫を含む。
【０１１５】
一態様において、ポリペプチドリガンドは抗体、抗体派生物、及び抗体模倣物からなる群から選択される。 
【０１１６】
用語「抗体」（免疫グロブリン、Igともいう）は、ジスルフィド結合で相互に連結されている、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質をいう。それぞれの重鎖には重鎖可変領域（本明細書では省略してVHという）及び重鎖定常領域が含まれる。それぞれの軽鎖には軽鎖可変領域（本明細書では省略してVLという）及び軽鎖定常領域が含まれる。VH及びVL領域は、高頻度可変性の領域が相補鎖決定領域（CDR）と呼ばれ、点在するより保存された領域がフレームワーク領域（FR）と呼ばれ、より細分化され得る。以下の順番でアミノ末端からカルボキシ末端に３つのCDR及び４つのFRで構成される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用し結合するドメインを含む。抗体の定常領域は、様々な細胞の免疫系（エフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Clq）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介する可能性がある。
【０１１７】
本明細書で使用される用語「抗体派生物」は、少なくとも１つの抗体可変ドメインを含み、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY、又はIgWのような抗体の全構造を有するものではないが、標的分子に結合可能なままである分子をいう。前記抗体派生物は、これに限定されるものではないが、機能的（すなわち、標的に結合する、特に特異的に標的に結合する）抗体断片、例えば、Fab、Fab2、scFv、Fv、又はその部分、又は例えば、ナノボディー、ダイアボディー、ミニボディー、ラクダ化単一ドメイン抗体、単一ドメイン又はFab断片、可変領域の重鎖及び軽鎖のドメイン（例えば、Fd、Vラムダ及びVカッパを含むVL、 VH、VHH）、並びに少なくとも２つの構造的ループによって結合されている免疫グロブリンドメインの２つのベータ鎖ミニドメイン等の免疫グロブリンのその他派生物又は組み合わせであってもよい。好ましくは抗体派生物は一価である。より好ましくは抗体派生物は単一鎖抗体、最も好ましくは、VLペプチドリンカーVH又はVHペプチドリンカーVL構造を有する。本明細書で使用される「抗体模倣物」は、抗原に特異的に結合できるが、構造的には抗体と関連しない抗体等の人工的な（ポリ）ペプチドをいう。これらは通常抗体よりも非常に小さく約３〜２０kDaのモル質量を有する。抗体模倣物の例は、これに限定されるものではないが、アフィボディー（affibodies）、アフィリン（affilins）、アフィマー（affimers）、アフィチン（affitins）、アンチカリン（anticalins）、アヴィマー（avimers）、DARPin、フィノマー（fynomers）、Kunits ドメインペプチド、モノボディー、プロテインAのZドメイン、ガンマBクリスタリン、ユビキチン、シスタチン（cystatin）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）由来Sac7D、リポカリン、膜受容体のＡドメイン、アンキリンリピートモチーフ、FynのSH3ドメイン、プロテアーゼ阻害剤のKunitsドメイン、フィブロネクチンの１０番目タイプＩＩＩドメイン、又は、例えば（ランダムな）ペプチドライブラリーに由来する合成ペプチドリガンドである。合成ペプチドリガンドは特定の標的分子に結合するように機能する天然に存在しないアミノ酸配列を有する。 
【０１１８】
本明細書で使用される「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、別の標的に結合するものと比較して特異的で、強力な、例えば結合剤（ポリペプチドリガンド（例えば抗体）等）が結合するエピトープのような標的に結合することを意味する。「強力な結合」は例えば低い解離定数（KD）によって特徴づけられてもよい。一態様において、結合剤が、他の標的に結合することができないが、前記所定の標的に結合することができる場合、所定の標的に特異的である。一態様において、標的に「特異的に結合する」結合剤は、標的に対して10-5 M未満（例えば、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、及び10-12よりすくない）のKD値を有する。所与の結合剤のKD値は、結合剤のオン及びオフ速度の両方に影響され、温度によって変化する。本発明に照らし、KD値が室温で示された値よりも低いことが好ましい。結合条件は好ましくは生理的な条件である。KD値を決定するための様々なアッセイ方法が当業者に知られている。好ましいアッセイ系は競合アッセイである。
【０１１９】
本明細書に記載の剤及び組成物はいかなる従来の経路、例えば、経腸投与によって、注射や注入を含む非経口によって投与されてもよい。一態様において、投与は非経口的、例えば、皮内、皮下、又は筋肉内である。一態様において、粘膜投与、例えば、経口又は舌下が使用される。
【０１２０】
本明細書に記載の剤及び組成物は有効量で投与される。「有効量」は、所望の反応又は所望の単独効果又はさらなる用量での併用効果を達成する量をいう。
特定の疾患又は特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に、疾患の進行を中断又は逆行させることを含む。疾患又は状態の治療における所望の反応は、前記疾患又は状態の発症の遅延又は発症の予防であってもよい。本明細書に記載の剤又は組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、以下を含む個々の対象のパラメーター：対象の年齢、生理学的状態、大きさ及び体重、治療期間、付随する治療（存在する場合）、特定の投与経路及び同じ要因、に依存する。したがって、本明細書に記載の剤の投与量は、そのようなパラメーターの様々なものに依存し得る。対象における反応が初回用量では不十分である場合、より高い用量（又は異なるより局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用することができる。
【０１２１】
本発明は本明細書に記載の免疫原性組成物を含むキットをさらに提供する。
【０１２２】
本明細書で使用される「部品のキット（略してキット）」は、１以上の容器及び、任意で、データキャリアを含む製造品をいう。前記１以上の容器は、本明細書に記載の１つ以上の手段又は試薬で満たされてもよい。付加的な容器はキットの中に、例えば、希釈剤、バッファー、及びさらなる試薬を含んでもよい。前記データキャリアは、非電子データキャリア、例えば、情報冊子、情報シート、バーコード又はアクセスコードなどのグラフィックデータキャリア、又は電子データキャリア、例えば、フロッピーディスク、コンパクトディスク（CD）、デジタル多目的ディスク（DVD）、マイクロチップ又は他の半導体ベースの電子データキャリアであってもよい。アクセスコードは、データベース、例えば、インターネットデータベース、集中データベース、又は分散データベースへのアクセスを可能にすることができる。前記データキャリアは本発明のキットの使用のための指示書を含んでもよい。
【０１２３】
本発明は、対象のH.ピロリ感染を検出する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドであって、好ましくは、該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドが固体支持体に固定されている、少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを供給する工程、
（ｂ）該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドを対象から得られた生物学的試料と接触させる工程、及び
（ｃ）該生物学的試料中に該少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドと特異的に結合する抗体の有無を決定する工程であって、抗体の存在が対象のH.ピロリ感染を意味する、
の工程を含む、方法をさらに提供する。
一態様において、該方法は、H.ピロリ由来の少なくとも１つの付加的な抗原の使用を含むものであって、好ましくは、該少なくとも１つの付加的な抗原が固体支持体上に固定化されているものである。
【０１２４】
一態様において、本明細書に記載の異なる複数の単離された（ポリ）ペプチドが、例えば、本明細書に記載の異なる複数の単離された（ポリ）ペプチドを含むパネルの形態で上記方法に使用される。一態様において、該パネルは少なくとも１つの付加的なH.ピロリ由来抗原をさらに含む。
【０１２５】
一態様において、 対象におけるH.ピロリ感染は、好ましくは、本明細書に記載の少なくとも１つの複数の異なる単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合する抗体の存在によって示される。
【０１２６】
本明細書で使用される用語「固体支持体」（固相ともいう）は、好ましくは、本明細書に記載の単離された（ポリ）ペプチドに結合可能な任意の固体支持体をいう。そのような固体支持体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、天然の又は修飾されたセルロース（例えば、ニトロセルロース）、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトのような物質を含んでもよい。固体支持体はそこに分子が結合できる限り任意の可能な構造配置を有してよく、本明細書に記載の単離された（ポリ）ペプチドは固体支持体のそれぞれの結合パートナーに結合することができる。適切な構成では、球状構成（例えば、ビーズ）、試験容器又はウェル（ELISAプレートのようなマルチウェルプレートの一部であってもよい）の内部及び／又は底部のような円筒構成、又は試験紙（例えば、ニトロセルロース紙）等の平らな構成を含む。
【０１２７】
本発明に係る「生物学的試料」は体液及び／又は細胞試料を含む組織試料であってもよく、パンチ生検を含む組織生検によって、及び血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便又は他の体液の除去によるなどの従来の方法で得ることができる。用語「生物学的試料」は本発明の生物学的試料の画分も含む。特に好ましくは本発明の生物学的試料は体液であり、例えば、血清及び血漿である。
【０１２８】
「生物学的試料における少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチドに特異的に結合する抗体の有無を決定する」工程を実行する可能性は当業者に知られている。
【０１２９】
本発明によれば、好ましくは固相免疫測定法において、結合パートナーの直接的又は間接的な結合を用いて、免疫測定法で抗体が検出されることが好ましい。検出はELISA、放射免疫測定法（RIA）、又は蛍光若しくは化学発光免疫測定法で行うことができる。これらの検出方法の手順は当業者に知られている。一態様において、抗体は、本明細書に記載の検出可能な標識を含む抗ヒト免疫グロブリン抗体である結合パートナーを使用することによって検出される。
【０１３０】
本発明では、凝集試験又はゲル拡散試験において抗体を検出することも可能である。これらの検出方法も当業者に知られている。
【０１３１】
一態様において、検出方法は、工程（ｂ）の後、かつ工程（ｃ）の前に、結合しない抗体を除去する工程（洗浄工程）を含む。 
【０１３２】
本発明は（ｉ）配列番号１〜７からなる群から選択されるアミノ酸配列；又は、（ｉｉ）（ｉ）の免疫原性変異体；又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の免疫原性断片、又は（ポリ）ペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片又はその変異体を含む（ポリ）ペプチドのH.ピロリ感染のバイオマーカーとしての使用をさらに提供する。
【０１３３】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」は、工程、事象又は状態の特徴的な生物学的又は生物学的に誘導される指標をいう。
【０１３４】
本発明は本明細書に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチド、好ましくは本明細書に記載の複数の異なる単離された（ポリ）ペプチドを含むキットをさらに提供する。
【０１３５】
一態様において、本明細書に記載の少なくとも１つの単離された（ポリ）ペプチド又は本明細書に記載の複数の異なる単離された（ポリ）ペプチドは固体支持体に固定されている。
【０１３６】
一態様において、キットはH.ピロリ由来の少なくとも１つの付加的な抗原を含む。
【０１３７】
本発明は、対象におけるH.ピロリ感染を検出するための上記キットの使用をさらに提供する。
【０１３８】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：表面タンパク質を削ることによる新規H.ピロリワクチン候補の同定
【０１４０】
表面タンパク質を削ること（surfome shaving）において、生きた細菌培養物をトリプシンで処理し、処理なしの培養物と比較する。この培養物をトリプシン及び／又ははプロテイナーゼＫで処理することにより、プロテアーゼは細菌表面からすべてのタンパク質を削り取り、細菌表面を露出させアクセスしやすくする。次に、得られたペプチドを質量分析法によって分析し、個々のタンパク質を同定する(Rodriguez-Ortega et al., 2006).タンパク質強度は、定量的質量分析を用いてプロテオームワイドで定量化され(Cox and Mann, 2008)、異なる存在量を有するタンパク質を同定することによって試料の直接比較が可能になる。得られたタンパク質のリストは、汎保護ワクチン候補について合理的な基準を用いて絞り込まれ、理想的には同じ種内で９０％を超えて保存されている (Moffit et al., 2011)。次に、得られたタンパク質を大腸菌で組換え産生し、インビボワクチン研究におけるその保護特性について試験される（図１参照）。
【０１４１】
上記アプローチを用いて、本発明者らはH.ピロリの表面タンパク質を解析し、７つの新規ワクチン候補を同定した。該ワクチン候補は、同種内で９０％以上の同一配列であり、及び／又は病態形成に重要な役割を担うと考えられるものであり、下記表１にリストした。
【０１４２】
【表１】
2019504875.tif 000002
表１  アクセッション番号と割り当てられた配列番号を含む同定されたワクチン候補のリスト。ｔｒｘＡタンパク質はUniProt 参照クラスター内の同一性の参考として役立つ。アクセス時（２０１４年８月）、H.ピロリの２６５株が UniProt で注釈付けされていた。
【０１４３】
表２で一覧表にしたタンパク質コンストラクト（予想Ｎ末端シグナル配列を欠くワクチン候補の切断型を含む；配列番号１５〜１９を参照）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で組換え発現させた。続いて、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製を行い、等張性かつ等水溶液のバッファー中において−８０℃で保存した。図２は精製されたタンパク質のクマシー染色ＳＤＳゲルを示す。
【０１４４】
【表２】
2019504875.tif 000003
表２  免疫研究に使用されたタンパク質コンストラクトのリスト
【０１４５】
ナイーブマウスにおける免疫研究のため、粘膜アジュバントとして１０μｇのコレラ毒素（CT）と共に０、７、１４及び２１日目に各タンパク質３０μｇを腹腔内に４回投与した。 ELISAプレートを対応するタンパク質でコーティングし、マウスから得た抗血清とインキュベートした。吸着されたタンパク質に結合する血清抗体は、二次抗マウス抗体結合体（conjugate）によって検出された。全ての抗血清は応答を示したが、CT対照及び２次抗体対照は応答を示さなかった（図３）。ELISAは、試験された全てのタンパク質が、アジュバントとしてのCTでの免疫後に体液性免疫応答を誘導できることを示した、すなわち、全ての試験されたワクチン候補の免疫原性が証明された。
【０１４６】
ワクチン候補が表面に露出していることを確認するために、H.ピロリJ99の表面を、それぞれのタンパク質を認識する特異的抗体で染色した。30μgの抗原及びアジュバントとしての１０μｇのCTを野生型ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内（i.p.）で１週間間隔で４回免疫することによって候補に対して抗血清が惹起された（図４Ａ）。続いて、対応する血清を全血から調製し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製し、そして単離された抗体の濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調整した。 H.ピロリJ99をCFDA-SE標識し、抗体とインキュベートした。抗体ー抗原相互作用は、二次マウスeFluor（登録商標）６６０抗体で標識し、その後のフローサイトメトリー分析で検出した（図４Ｂ）。本実験は、H.ピロリの外膜タンパク質としてよく知られるＨｐａＡ(HPA；UniProt ID B5Z7F9)、細胞質及び外膜小胞の内部に位置するタンパク質ＨＰＧ(UniProt ID O25743)、及び抗原なしのＣＴのみ（「CT免疫」）、での免疫に由来する抗体によって調節された。
【０１４７】
ワクチン候補特異的抗体での染色では、試験されたすべてのワクチン候補についてＣＴ免疫化カットオフ対照よりもかなり高い蛍光強度の増加を示し、その表面露出が確認された（図４Ｃ）。ＨＰＡ及びＨＰＧ対照は、それぞれ、有意な増加又はほとんど蛍光強度の増加を示さず、それにより実験の設定が確認された。
【０１４８】
実施例２：jhp_0775のインビボ有効性
【０１４９】
jhp_0775の治療有効性を試験するために、マウスを治療設定でワクチン接種した。野生型ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目、２日目及び４日目に１０８ H.ピロリSS1を経口感染させた。続いて、２８日目に動物を経口免疫し、経口と組み合わせて腹腔内（i.p.）に ３５日目及び４２日目に投与した（図５Ａ）。jhp_0775及びＨＰＧと組み合わせたjhp_0775の経口免疫はそれぞれ１００μｇの抗原及び３０μｇの抗原であり、１０μｇのＣＴＦと一緒に投与し、又は腹腔内（i.p.）免疫では３０μｇ抗原を１０μｇのＣＴＦと一緒に投与した。７０日目に、マウスを屠殺し、胃から細菌を抽出し、寒天プレート上に蒔いた。５日後、コロニー形成単位 (CFU) を計数した（図５Ｂ）。図５のＣ、Ｄは、中央値が示され、ｐ値はマン・ホイットニーのＵ検定で決定された。jhp_0775単独での免疫及びjhp_0775とＨＰＧとの組み合わせでの免疫はそれぞれ、ｐ値が0.0030 及び0.0067であり、有意に細菌負荷を低下させた。これらの結果は、jhp_0775単独及びjhp_0775とＨＰＧとの組み合わせのワクチンとしての有効性を確証するものである。
【０１５０】
血清は上記と同じ実験の全血から調製された（図５Ａ）。抗原特異的ＥＬＩＳＡによる体液性応答を分析するために、抗原を９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングした。続いて、ウェルをブロッキングし、血清を１：１００〜１：１０００００まで段階希釈した。次に２次抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体を加えた（図６Ａ）。恒温放置後、ＴＭＢ基質溶液を加え、酵素反応を２ＮＨ２ＳＯ４で停止した。恒温放置工程中にＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄を４回行った。jhp_0775を投与された両群は、抗jhp_0775 ELISAで希釈すると高吸収が減少することを示した、一方でバックグランドは一定に低いままであった（図６Ｂ）。これらの結果は免疫時のjhp_0775の免疫原性を示す。
【０１５１】
細胞内サイトカイン染色（ICCS）によるjhp_0775に対する細胞免疫応答を解析するために、脾臓細胞が上記と同じ実験から単離された（図５Ａ）。続いて、組換え抗原を細胞に加え、２時間培養した。次にサイトカイン分泌を抑制するために、 GolgiPlug（商標）を加え、それらの細胞内蓄積を引き起こした。それから、ＥＭＡ（生存率）、及びＣＤ４、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１７に対する抗体パネルで細胞を染色した。続いて、細胞をフローサイトメトリーで分析し（図７Ａ）、ＣＤ４＋細胞をゲーティングし、少なくとも１０００００細胞を計数した。データは平均値を±ＳＤとして示し、ｐ値はＳｉｄａｋ多重比較検定によって決定され、アスタリスクは群間の有意な違い（****p<0.0001、*p<0.05）を示す。jhp_0775とＨＰＧで免疫した群のＣＤ４＋細胞はサイトカインＴＮＦａ及びＩＬ−１７の有意な産生を示した。これはマウスへの免疫に対するＴ細胞応答を誘導するjhp_0775の能力を実証する。
【０１５２】
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18.         Song,H. et al., 2015. A novel chimeric flagellum fused with the multi-epitopevaccine CTB-UE prevents Helicobacter pylori-induced gastric cancer in a BALB/cmouse model. Appl Microbiol Biotechnol., 99(22),pp.9495-9502. 
19.         UnitedStates Centers for Disease Control and Prevention (2011). “A CDC framework forpreventing infectious diseases”, accessed 20.12.2012.
【０１５３】
図面の用語
図１
Shaving the bacterial surface with trypsin：トリプシンで細菌表面を削る
Quantitative mass spectrometry using Q Exactive &MaxQuant：Q Exactive &MaxQuant使用定量的質量分析
Intensity：強度
Identification of conserved proteins：保存タンパク質の同定
Production of potential vaccine candidates：潜在的ワクチン候補の産生
Therapeutic and prophylactic vaccination：治療的及び予防的ワクチン接種
Challenge：検証
Identification of protective candidates：予防候補の同定
Bacterial load：細菌負荷
Control：対照
図２
Marker：マーカー
図３
Serum dilution：血清希釈
control ：対照
図４
Immunization：免疫化
Analysis：解析
Day：日
Flow cytometry：フローサイトメトリー
2nd mouse ab-eFluor(R)660：２次マウス抗体-eFluor（登録商標）660
Antigen specific Abs from mouse serum：マウス血清由来抗原特異的抗体
Surface exposed antigen：表面露出抗原
CFDA-SE label H. pylori：CFDA-SE標識H.ピロリ
図５
Infection：感染
Immunization：免疫化
Analysis：解析
Day：日
Stomach preparation & plating：胃の調製とプレーティング
CFU Readout：CFU読み出し
V1-3B2-03 Therapeutic Efficacy of jhp_0775：V1-3B2-03jhp_0775の治療効果
Stomach：胃
V1-3B2-01 & 03 Therapeutic Efficacy ofjhp_0775 & HPG
図６
2nd mouse Ab-HRP：２次マウス抗体−HRP
Antigen specific Abs from mouse serum：マウス血清由来抗原特異的抗体
Antigen：抗原
Absorption：吸収
no antigen：抗原なし
Serum dilution：血清希釈
図７
Spleenocytes isolation & cell culture：脾臓細胞単離及び細胞培養
Restimulate with antigen & flow cytometry：抗原再刺激及びフローサイトメトリー
CD4+ antigen specific T-cells：CD4+抗原特異的Ｔ細胞
ICCS:jhp_0775 specific T-cells：ICCS:jhp_0775特異的Ｔ細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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