(57)【要約】  本発明は、ヒト及び非ヒトＢ７‐Ｈ３に結合できる新規のＢ７‐Ｈ３結合分子、並びに特に非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）のＢ７‐Ｈ３と交差反応する上記分子を対象とする。本発明は更に、レシピエントである被験者への投与時に免疫原性の低減を示すようヒト化及び／又は脱免疫化された可変軽鎖及び／又は可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明は特に：（ｉ）上記Ｂ７‐Ｈ３結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体、３価結合分子等を含む二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。本発明はまた、少なくとも１つの薬物部分にコンジュゲートしたヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のヒトＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含む分子（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）にも関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのいずれの使用を伴う方法も対象とする。
2019520308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
Ａｂ‐（ＬＭ）m‐（Ｄ）n
を含む抗Ｂ７‐Ｈ３抗体薬物コンジュゲート（Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ）であって：
Ａｂは、ヒト化可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及びヒト化可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むＢ７‐Ｈ３に結合する抗体、又はそのＢ７‐Ｈ３結合断片であり；
Ｄは、細胞毒性薬物部分であり；
ＬＭは、前記Ａｂ及び前記Ｄを共有結合させる結合又はリンカー分子であり；
ｍは０〜ｎの整数であって、前記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのリンカー分子の数を表し；
ｎは１〜１０の整数であって、前記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子に共有結合した前記細胞毒性薬物部分の数を表す、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２】
（Ａ）（ｉ）前記ヒト化ＶＬドメインが配列番号９９のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）前記ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０４のアミノ酸配列を含むか；又は
（Ｂ）（ｉ）前記ヒト化ＶＬドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）前記ヒト化ＶＨドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含むか；又は
（Ｃ）（ｉ）前記ヒト化ＶＬドメインが配列番号３０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）前記ヒト化ＶＨドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項３】
前記ヒト化ＶＬドメインが配列番号９９のアミノ酸配列を含み、前記ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項４】
前記ヒト化ＶＬドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記ヒト化ＶＨドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項５】
前記ヒト化ＶＬドメインが配列番号３０のアミノ酸配列を含み、前記ヒト化ＶＨドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項６】
前記Ａｂが抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項７】
前記Ａｂが抗体の抗原結合断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項８】
前記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣが、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項９】
前記ヒトＩｇＧが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、請求項８に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１０】
前記Ｆｃドメインが変異型Ｆｃドメインであり、前記変異型Ｆｃドメインは：
（ａ）ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾：及び／又は
（ｂ）前記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を含む、請求項８又は９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１１】
ＦｃγＲに対する前記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する前記修飾は：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、請求項１０に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１２】
前記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる前記修飾は：Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、請求項１０又は１１に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１３】
前記ＬＭのうちの少なくとも１つがリンカー分子である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１４】
前記ＬＭリンカー分子はペプチドリンカーである、請求項１３に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１５】
前記ＬＭリンカー分子は切断可能リンカーである、請求項１３に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１６】
前記分子が式：
Ａｂ‐［Ｖ‐（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａ］‐Ｄ
を含み、ここで：
Ｖは前記切断可能ＬＭリンカー分子であり；
（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａは、ｌ，（４＋２ｎ）消去によって自己消去する、細長い自己消去性スペーサ系であり；
Ｗ及びＸはそれぞれｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサであり、同一であるか又は異なっており；
Ａは、式（Ｙ）m（ここでＹはｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサである）のスペーサ基、又は式Ｕの基であり、環化除去スペーサであり；
ｋ、１及びｍは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは０〜１０（両端を含む）の整数であり；
ただし：
Ａが（Ｙ）mである場合、ｋ＋ｌ＋ｍ≧１であり；
ｋ＋ｌ＋ｍ＝ｌである場合、ｎ＞ｌであり；
ＡがＵである場合、ｋ＋１≧１である。
Ｗ、Ｘ及びＹは独立して、以下の式：
【化１】
2019520308.tif 000064
又は以下の式：
【化２】
2019520308.tif 000065
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｑは‐Ｒ5Ｃ＝ＣＲ6‐、Ｓ、Ｏ、ＮＲ5、‐Ｒ5Ｃ＝Ｎ‐又は‐Ｎ＝ＣＲ5‐であり；
ＰはＮＲ7、Ｏ又はＳであり；
ａ、ｂ及びｃは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
Ｉ、Ｆ及びＧは独立して、式：
【化３】
2019520308.tif 000066
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここで：
Ｒx、Ｒx1及びＲx2は独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5‐20アリール基から選択され；
前記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲ9のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成し；
Ｕは、式：
【化４】
2019520308.tif 000067
【化５】
2019520308.tif 000068
を有する化合物から選択され、ここで：
ａ、ｂ及びｃは独立して、０又は１の整数となるよう選択され；
ただしａ＋ｂ＋ｃ＝２又は３であり；
Ｒ1及び／又はＲ2は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルを表し、前記アルキルは任意に、以下の基：ヒドロキシ（ＯＨ）、エーテル（ＯＲx）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲｘＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲX）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲX）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲｘ）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）のうちの１つ又は複数によって置換され、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され、前記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、又はＲ8のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成する、請求項１５に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１７】
前記ＬＭリンカー分子が：
（１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（２）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（３）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（４）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（５）ｐ‐アミノ‐ベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（６）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（７）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
（８）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（９）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐアミノベンジルオキシカルボニル；
（１０）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
（１１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１２）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１３）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１４）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１５）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）‐カルボニル；
（１６）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１７）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（１８）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（１９）ｐ‐アミノシンナミル；
（２０）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（２１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２２）ｐ‐アミノ‐シンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２３）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニル；
（２４）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２５）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；又は
（２６）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルを含む、請求項１６に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１８】
前記ＬＭリンカー分子が前記Ａｂのポリペプチド鎖のアミノ酸の側鎖にコンジュゲートされて、前記Ａｂを前記細胞毒性薬物部分Ｄの分子に結合させる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項１９】
前記細胞毒性薬物部分Ｄは、細胞毒素、放射性同位元素、免疫調節因子、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、成長因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、キレート剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２０】
前記細胞毒性薬物部分Ｄは細胞毒素を含み、ツブリシン、オーリスタチン、マイタンシノイド、カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン及びデュオカルマイシンからなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２１】
前記細胞毒性薬物部分Ｄはツブリシン細胞毒素を含み、ツブリシンＡ、ツブリシンＢ、ツブリシンＣ及びツブリシンＤからなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２２】
前記細胞毒性薬物部分Ｄはオーリスタチン細胞毒素を含み、ＭＭＡＥ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐ノルエフェドリン）及びＭＭＡＦ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐フェニルアラニン）からなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２３】
前記細胞毒性薬物部分Ｄはマイタンシノイド細胞毒素を含み、マイタンシン、ＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２４】
前記細胞毒性薬物部分Ｄはカリチアマイシン細胞毒素を含み、カリチアマイシンγ１、カリチアマイシンβ１Ｂｒ、カリチアマイシンγ１Ｂｒ、カリチアマイシンα２Ｉ、カリチアマイシンα３Ｉ、カリチアマイシンβ１Ｉ、カリチアマイシンγ１Ｉ及びカリチアマイシンΔ１Ｉからなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２５】
前記細胞毒性薬物部分Ｄはピロロベンゾジアゼピン細胞毒素を含み、バダスツキシマブ・タリリン、ＳＪＧ‐１３６、ＳＧ２０００、ＳＧ２２８５及びＳＧ２２７４からなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２６】
前記細胞毒性薬物部分Ｄはデュオカルマイシン細胞毒素を含み、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ‐１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン（Ｕ‐８０２４４）及びスピロ‐デュオカルマイシン（ＤＵＢＡ）からなる群から選択される、請求項１９に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２７】
前記ＬＭリンカー分子は、還元された鎖間ジスルフィドを介して前記Ａｂと共有結合する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
【請求項２８】
有効量の請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣと、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２９】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療における、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ又は請求項２８の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする前記疾患又は前記状態は癌である、請求項２９の使用。
【請求項３１】
前記癌は：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；副腎癌；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；Ｂ細胞癌；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；グリア芽細胞腫；血液悪性腫瘍；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病（例えば急性骨髄性白血病）；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；中皮腫咽頭癌；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）；軟組織肉腫；扁平上皮癌（例えば頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ））；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、請求項３０の使用。
【請求項３２】
前記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽細胞腫、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺部リンパ腫、中皮腫咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）、扁平上皮癌（頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））、精巣癌、甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）、並びに子宮癌からなる群から選択される、請求項３０の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／４３２，３１４号（２０１６年１２月９日出願；係属中）、米国特許出願第６２／３２３，２４９号（２０１６年４月１５日出願；係属中）、米国特許出願第６２／３２３，２２８号（２０１６年４月１５日出願；係属中）に対する優先権を主張するものであり、上記特許出願は、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００２】
［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１４３‐０１４４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１７年３月２８日作成、サイズ：１０４，７６２バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０００３】
本発明は、ヒト及び非ヒトＢ７‐Ｈ３に結合できる新規のＢ７‐Ｈ３結合分子、並びに特に非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）のＢ７‐Ｈ３と交差反応する上記分子を対象とする。本発明は更に、レシピエントである被験者への投与時に免疫原性の低減を示すようヒト化及び／又は脱免疫化された可変軽鎖及び／又は可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明は特に：（ｉ）上記Ｂ７‐Ｈ３結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体、３価結合分子等を含む二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。本発明はまた、少なくとも１つの薬物部分にコンジュゲートしたヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のヒトＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含む分子（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）にも関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのいずれの使用を伴う方法も対象とする。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍の成長及び転移は、これらが宿主の免疫監視機構を回避して宿主の防御を克服する能力に大きく左右される。ほとんどの腫瘍は、宿主の免疫系によって程度が可変であると認識できる抗原を発現するが、多くの場合、エフェクタＴ細胞の無効な活性化により、不十分な免疫応答が誘発される（非特許文献１）。
【０００５】
Ｉ．Ｂ７スーパーファミリー及びＢ７‐Ｈ３
Ｂ７‐Ｈ３はＢ７‐ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーであり、抗原提示細胞上で発現される。これはＴ細胞に結合するが、上記Ｔ細胞の表面上のＢ７‐Ｈ３対抗受容体は依然として完全には特性決定されていない。
【０００６】
Ｂ７‐Ｈ３は、主要なヒト型が２つの細胞外タンデムＩｇＶ‐ＩｇＣドメイン（即ちＩｇＶ‐ＩｇＣ‐ＩｇＶ‐ＩｇＣ）を含有する点において独特である（非特許文献２）。４免疫グロブリン細胞外ドメイン変異体（「４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３」）は、最初はＩｇドメイン（ＩｇＶ‐ＩｇＣ）を２つだけ含むと考えられていたが、上記タンパク質のより一般的なヒト型であることが同定され、発見された（非特許文献３）。しかしながら、天然のマウス型２Ｉｇ及びヒト４Ｉｇ型は、同様の機能を呈する（非特許文献４）。４Ｉｇ‐Ｂ７‐Ｈ３分子は、癌細胞のＮＫ細胞媒介性溶解を阻害する（非特許文献５）。ヒトＢ７‐Ｈ３（２Ｉｇ型）は、活性化されるＴ細胞上の推定受容体に結合することにより、Ｔ細胞の活性化及びＩＦＮ‐γ産生を促進することが報告されている（非特許文献６）が、より最近の研究は、マウス及びヒトＢ７‐Ｈ３の阻害的役割を指摘している（非特許文献７〜９）。Ｂ７‐Ｈ３  ｍＲＮＡ発現は、心臓、腎臓、精巣、肺、肝臓、膵臓、前立腺、結腸及び骨芽細胞において発見されている（非特許文献２）。タンパク質レベルでは、Ｂ７‐Ｈ３はヒトの肝臓、肺、膀胱、精巣、前立腺、乳房、膵臓及びリンパ器官に見られる（非特許文献４）。
【０００７】
Ｂ７‐Ｈ３は、休止Ｂ又はＴ細胞、単球、又は樹状細胞上では発現されないものの、ＩＦＮ‐γによって樹状細胞上に、及びＧＭ‐ＣＳＦによって単球上に誘導される（非特許文献３）。Ｂ７‐Ｈ３の作用モードは複雑であり、このタンパク質は、Ｔ細胞共刺激及び共阻害の療法を仲介することが報告されている（非特許文献４、１０、１１）。Ｂ７‐Ｈ３は、現時点で同定されていない１つ又は複数の受容体に結合して、Ｔ細胞の共阻害を仲介する。更にＢ７‐Ｈ３は、未知の１つ又は複数の受容体との相互作用によって、ＮＫ細胞及び骨芽細胞に対する阻害因子となる（非特許文献４）。この阻害は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が遺伝子転写を制御する主要なシグナリング経路のメンバー（例えばＮＦＴＡ、ＮＦ‐κＢ又はＡＰ‐１因子）との相互作用によって機能し得る。Ｂ７‐Ｈ３はまた、Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７をインビボで阻害すると考えられる（非特許文献７、１２、１３）。
【０００８】
ＩＩ．Ｂ７‐Ｈ３発現性腫瘍
Ｂ７‐Ｈ３はまた、多様な癌（例えば神経芽腫、胃癌、卵巣癌、非小細胞肺癌等、例えば非特許文献１４を参照）及び培養された癌幹様細胞上で発現されることが知られている。いくつかの独立した研究は、ヒト悪性腫瘍細胞がＢ７‐Ｈ３タンパク質の発現の著しい上昇を呈すること、この著しい発現が、疾患の重篤度の上昇に関連すること（非特許文献１５〜１８）を示しており、これはＢ７‐Ｈ３が腫瘍により、免疫回避経路として悪用されていることを示唆している（非特許文献４）。
【０００９】
Ｂ７‐Ｈ３タンパク質発現はまた、腫瘍細胞株において免疫組織学的に検出されている（非特許文献６、１９；特許文献１；非特許文献５；非特許文献２０）。
【００１０】
免疫系の阻害におけるＢ７‐Ｈ３の役割、及びヒト腫瘍上でのＢ７‐Ｈ３の発現の増大は、この分子が癌の治療のための治療標的として機能し得ることを示唆している。従って、抗Ｂ７‐Ｈ３抗体及びＢ７‐Ｈ３発現を調節する他の分子を用いて、腫瘍を治療すること、及び／又は免疫応答を上方調節することが提案されている（非特許文献２１〜２５、１４、２６、２７を参照；また、特許文献２〜２２、１、２３〜３０を参照）。
【００１１】
このような過去の全ての成功にもかかわらず、Ｂ７‐Ｈ３を発現する腫瘍細胞を標的として殺滅する更なる治療剤に対する需要が存在し続けている。本発明はこの目標、及び他の目標を対象とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００４／００１３８１号（Mather, J. et al,）
【特許文献２】米国特許第７，２７９，５６７号
【特許文献３】米国特許第７，３５８，３５４号
【特許文献４】米国特許第７，３６８，５５４号
【特許文献５】米国特許第７，５２７，９６９号
【特許文献６】米国特許第７，７１８，７７４号
【特許文献７】米国特許第８，２１６，５７０号
【特許文献８】米国特許第８，７７９，０９８号
【特許文献９】米国特許第８，８０２，０９１号
【特許文献１０】米国特許第９，１５０，６５６号
【特許文献１１】米国公開特許第２００２／０１６８７６２号
【特許文献１２】米国公開特許第２００５／０２０２５３６号
【特許文献１３】米国公開特許第２００８／００８１３４６号
【特許文献１４】米国公開特許第２００８／０１１６２１９号
【特許文献１５】米国公開特許第２００９／００１８３１５号
【特許文献１６】米国公開特許第２００９／００２２７４７号
【特許文献１７】米国公開特許第２００９／００８７４１６号
【特許文献１８】米国公開特許第２０１３／００７８２３４号
【特許文献１９】米国公開特許第２０１５／０２７４８３８号
【特許文献２０】国際公開第２００８／０６６６９１号
【特許文献２１】国際公開第２００６／０１６２７６号
【特許文献２２】国際公開第２００８／１１６２１９号
【特許文献２３】国際公開第２００１／０９４４１３号
【特許文献２４】国際公開第２００２／１０１８７号
【特許文献２５】国際公開第２００２／３２３７５号
【特許文献２６】国際公開第２００４／０９３８９４号
【特許文献２７】国際公開第２００６／０１６２７６号
【特許文献２８】国際公開第２００８／１１６２１９号
【特許文献２９】国際公開第２０１１／１０９４００号
【特許文献３０】欧州特許第１２９２６１９Ｂ号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Khawli, L.A. et al. (2008) “Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors,” Exper. Pharmacol. 181:291-328
【非特許文献２】Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands,” Genome Biol. 6:223.1-223.7
【非特許文献３】Sharpe, A.H. et al. (2002) “The B7-CD28 Superfamily,” Nature Rev. Immunol. 2:116-126
【非特許文献４】Hofmeyer, K. et al. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278
【非特許文献５】Castriconi, R. et al. “Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645
【非特許文献６】Chapoval, A. et al. (2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production,” Nature Immunol. 2:269-274
【非特許文献７】Prasad, D.V., et al. (2004) “Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells, J Immunol. 173:2500-2506
【非特許文献８】Leitner, J., et al. (2009) “B7-H3 Is A Potent Inhibitor Of Human T-Cell Activation: No Evidence For B7-H3 And TREML2 Interaction.” Eur. J. Immunol. 39:1754-1764
【非特許文献９】Veenstra, R.G., et al. (2015) “B7-H3 expression in Dnor T Cells and Host Cells Negatively Regulates Acute Graft-Versus-Host Disease Lethality,” Blood 125:3335-3346
【非特許文献１０】Martin-Orozco, N. et al. (2007) “Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity,” Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298
【非特許文献１１】Subudhi, S.K. et al. (2005) “The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition,” J. Mol. Med. 83:193-202
【非特許文献１２】Fukushima, A. et al. (2007) “B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice,” Immunol. Lett. 113:52-57
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【非特許文献１４】Modak, S., et al. (2001) “Monoclonal antibody 8H9 targets a novel cell surface antigen expressed by a wide spectrum of human solid tumors,” Cancer Res 61:4048-54
【非特許文献１５】Zang, X. et al. (2007) “The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279
【非特許文献１６】Sun, Y., et al. (2006) “B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer,” Lung Cancer 53:143-51
【非特許文献１７】Tekle, C., et al. (2012) “B7-H3 Contributes To The Metastatic Capacity Of Melanoma Cells By Modulation Of Known Metastasis-Associated Genes,” Int. J. Cancer 130:2282-90
【非特許文献１８】Wang, L., et al. (2013) “B7-H3 Mediated Tumor Immunology: Friend Or Foe?,” Int. J. Cancer 134(12):2764-2771
【非特許文献１９】Saatian, B. et al. (2004) “Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225
【非特許文献２０】Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297
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【非特許文献２２】Ahmed, M. et al. (2015) “Humanized Affinity-Matured Monoclonal Antibody 8H9 Has Potent Anti-Tumor Activity and Binds to FG Loop of B7-H3,” J. Biol. Chem. 290: 30018-30029
【非特許文献２３】Nagase-Zembutsu, A. et al. (2016) “Development of DS-5573a: A novel afucosylated monoclonal antibody directed at B7-H3 with potent antitumor activity,” Cancer Sci. 2016, doi: 10.1111/cas.12915
【非特許文献２４】Modak, S. et al. (March 1999) “Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS),” Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40:474 (90th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999
【非特許文献２５】Modak, S. et al. (March 2000) “Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9,” Proc. Am. Assoc. Cancer Res.41:724
【非特許文献２６】Steinberger, P. et al. (2004) “Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains,” J. Immunol. 172(4):2352-2359
【非特許文献２７】Xu, H. et al. (2009) “MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors,” Cancer Res. 69(15):5275-6281
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、ヒト及び非ヒトＢ７‐Ｈ３に結合できる新規のＢ７‐Ｈ３結合分子、並びに特に非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）のＢ７‐Ｈ３と交差反応する上記分子を対象とする。本発明は更に、レシピエントである被験者への投与時に免疫原性の低減を示すようヒト化及び／又は脱免疫化された可変軽鎖及び／又は可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明は特に：（ｉ）上記Ｂ７‐Ｈ３結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体、３価結合分子等を含む二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。本発明はまた、少なくとも１つの薬物部分にコンジュゲートしたヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のヒトＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含む分子（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）にも関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのいずれの使用を伴う方法も対象とする。
【００１５】
詳細には、本発明の一態様は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含むＢ７‐Ｈ３結合分子を提供し、上記可変重鎖ドメインは、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含み、上記可変軽鎖ドメインは、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲＬ３ドメインを含み、上記ドメインのうちの少なくとも３つ、上記ドメインのうちの少なくとも４つ、上記ドメインのうちの少なくとも５つ、又は上記ドメインの全ては：
（１）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲH１ドメイン；
（２）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲH２ドメイン；
（３）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲH３ドメイン；
（４）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲL１ドメイン；
（５）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲL２ドメイン；及び
（６）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲL３ドメイン；
からなる群から選択される。
【００１６】
本発明は更に、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含む上記可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む上記可変重鎖（ＶＨ）ドメインとを含む、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって：
（１）上記ＣＤＲH１ドメインは配列番号２７のアミノ酸配列を含み；
（２）上記ＣＤＲH２ドメインは配列番号２８のアミノ酸配列を含み；
（３）上記ＣＤＲH３ドメインは配列番号２９のアミノ酸配列を含む、実施形態に関する。
【００１７】
本発明は更に、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含む上記可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む上記可変重鎖（ＶＨ）ドメインとを含む、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって：
（１）上記ＣＤＲL１ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を含み；
（２）上記ＣＤＲL２ドメインは配列番号２４のアミノ酸配列を含み；及び
（３）上記ＣＤＲL３ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含む、実施形態に関する。
【００１８】
本発明は更に、上記可変重鎖（ＶＨ）ドメインが配列番号２６又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態に関する。
【００１９】
本発明は更に、上記可変軽鎖（ＶＬ）ドメインが配列番号２２又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態に関する。
【００２０】
本発明は更に、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むＢ７‐Ｈ３結合分子であって、上記ＶＬドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。
【００２１】
本発明は更に、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むＢ７‐Ｈ３結合分子であって、上記ＶＨドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。
【００２２】
本発明は更に、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含むＢ７‐Ｈ３結合分子であって、上記ＶＬドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含み、上記ＶＨドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。
【００２３】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子は抗体又はそのエピトープ結合断片である、実施形態に関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子は二重特異性抗体若しくはダイアボディ、特にダイアボディ、又はそれぞれＮ末端及びＣ末端を有する２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含むダイアボディ複合体であり、上記ポリペプチド鎖は１つ又は複数の共有結合、特に１つ又は複数の共有ジスルフィド結合によって結合される、実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子は３価結合分子であり、特に上記３価結合分子は３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子はＦｃドメインを含む、実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子はダイアボディであり、アルブミン結合ドメイン及び特に脱免疫化アルブミン結合ドメインを含む、実施形態に関する。
【００２４】
本発明は更に、Ｆｃドメインを更に含む全ての上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記Ｆｃドメインは変異型Ｆｃドメインであり、上記変異型Ｆｃドメインは、ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する、及び／又は上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の血清半減期を増大させる、１つ又は複数のアミノ酸修飾を含み、より詳細には、上記修飾は：
（ａ）Ｌ２３４Ａ；
（ｂ）Ｌ２３５Ａ；
（ｃ）Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ；
（ｄ）Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（ｅ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（ｆ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；並びに
（ｇ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ；
からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、実施形態に関する。
【００２５】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子は二重特異性である、実施形態に関し、特に、上記分子が、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む実施形態、又は上記分子が、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む実施形態に関する。
【００２６】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子は３価結合分子である、実施形態に関し、特に、上記分子が、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する第１の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する第２の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含み、上記第１の分子及び上記第２の分子はＢ７‐Ｈ３ではない、実施形態に関する。
【００２７】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子はＢ７‐Ｈ３及び第２のエピトープに同時に結合できる、実施形態に関し、特に上記第２のエピトープがエフェクタ細胞の表面上に存在する第２の分子のエピトープである（特に上記第２のエピトープがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＴＣＲ又はＮＫＧ２Ｄのエピトープである、及び最も詳細には上記第２のエピトープがＣＤ３のエピトープである）実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記エフェクタ細胞が細胞毒性Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子が第３のエピトープにも結合できる、実施形態に関し、特に上記第３のエピトープがＣＤ８のエピトープである実施形態に関する。本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子の実施形態であって、上記分子がＢ７‐Ｈ３を発現する細胞及び細胞毒性Ｔ細胞の配位結合を仲介する、実施形態に関する。
【００２８】
本発明は更に、有効量の上述のＢ７‐Ｈ３結合分子のうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明は更に、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する若しくはＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療における、又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療方法における、上述のＢ７‐Ｈ３結合分子のうちのいずれの使用を対象とし、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする上記疾患又は上記状態は癌であり、より詳細には、上記癌は：副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；副腎癌；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；Ｂ細胞癌；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌；白血病；脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌からなる群から選択される。
【００３０】
本発明の第２の態様は、少なくとも１つの薬物部分にコンジュゲートしたヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のヒトＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含む分子（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）を対象とする。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの使用を伴う方法に関する。
【００３１】
詳細には、本発明は、式：
Ａｂ‐（ＬＭ）m‐（Ｄ）n
を含む抗Ｂ７‐Ｈ３抗体薬物コンジュゲート（Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ）を提供し：
Ａｂは、ヒト化可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及びヒト化可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むＢ７‐Ｈ３に結合する抗体、又はそのＢ７‐Ｈ３結合断片であり；
Ｄは、細胞毒性薬物部分であり；
ＬＭは、上記Ａｂ及び上記Ｄを共有結合させるリンカー分子であり；
ｍは０〜ｎの整数であって、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのリンカー分子の数を表し；
ｎは１〜１０の整数であって、上記ＡＤＣに共有結合した上記細胞毒性薬物部分の数を表す。
【００３２】
本発明は更に、上記リンカー分子ＬＭが不在である（即ちｍ＝０である）上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ、並びに２つ以上の上記リンカー分子ＬＭを有し（即ちｍが２〜ｎの整数であり）、各上記リンカー分子ＬＭは、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの細胞毒性薬物部分Ｄ及び上記Ａｂを共有結合させる、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。本発明は更に、上記Ａｂが２つ以上の上記リンカー分子ＬＭと共有結合し、上記リンカー分子が全て同一である、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの上記Ａｂと共有結合する上記細胞毒性薬物部分Ｄは、全て同一であってよく、又は２つ、３つ、４つ若しくは５つ以上の同一でない上記細胞毒性薬物部分Ｄを含んでよい。本発明は更に、上記Ａｂが２つ以上の上記リンカー分子ＬＭと共有結合し、上記リンカー分子が全て同一でない、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの上記Ａｂと共有結合する上記細胞毒性薬物部分Ｄは、全て同一であってよく、又は２つ、３つ、４つ若しくは５つ以上の同一でない上記細胞毒性薬物部分Ｄを含んでよい。
【００３３】
本発明は更に：
（Ａ）（ｉ）上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号９９のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０４のアミノ酸配列を含むか；又は
（Ｂ）（ｉ）上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含むか；又は
（Ｃ）（ｉ）上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号３０のアミノ酸配列を含み；且つ
（ｉｉ）上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００３４】
本発明は更に、上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号９９のアミノ酸配列を含み、上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００３５】
本発明は更に、上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含み、上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００３６】
本発明は更に、上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号３０のアミノ酸配列を含み、上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００３７】
本発明は更に、上記Ａｂが抗体又は抗体の抗原結合断片である、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００３８】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣが、ヒトＩｇＧ（特にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃドメインを含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００３９】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣが変異型Ｆｃドメインを含み、上記変異型Ｆｃドメインは：
（ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾：及び／又は
（ｂ）上記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４０】
本発明は更に、変異型Ｆｃドメインを含む上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する上記修飾は：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４１】
本発明は更に、変異型Ｆｃドメインを含む上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、上記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる上記修飾は：Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４２】
本発明は更に、上記ＬＭのうちの少なくとも１つがリンカー分子であり、特に上記ＬＭリンカー分子はペプチドリンカー及び／又は切断可能リンカーである、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４３】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、上記分子が式：
Ａｂ‐［Ｖ‐（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａ］‐Ｄ
を含み、ここで：
Ｖは上記切断可能ＬＭリンカー分子であり；
（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａは、ｌ，（４＋２ｎ）消去によって自己消去する、細長い自己消去性スペーサ系であり；
Ｗ及びＸはそれぞれｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサであり、同一であるか又は異なっており；
Ａは、式（Ｙ）m（ここでＹはｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサである）のスペーサ基、又は式Ｕの基であり、環化除去スペーサであり；
ｋ、１及びｍは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは０〜１０（両端を含む）の整数であり；
ただし：
Ａが（Ｙ）mである場合、ｋ＋ｌ＋ｍ≧１であり；
ｋ＋ｌ＋ｍ＝ｌである場合、ｎ＞ｌであり；
ＡがＵである場合、ｋ＋１≧１である。
Ｗ、Ｘ及びＹは独立して、以下の式：
【化１】
2019520308.tif 000003
又は以下の式：
【化２】
2019520308.tif 000004
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｑは‐Ｒ5Ｃ＝ＣＲ6‐、Ｓ、Ｏ、ＮＲ5、‐Ｒ5Ｃ＝Ｎ‐又は‐Ｎ＝ＣＲ5‐であり；
ＰはＮＲ7、Ｏ又はＳであり；
ａ、ｂ及びｃは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
Ｉ、Ｆ及びＧは独立して、式：
【化３】
2019520308.tif 000005
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここで：
Ｒx、Ｒx1及びＲx2は独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
上記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲ9のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成し；
Ｕは、式：
【化４】
2019520308.tif 000006
【化５】
2019520308.tif 000007
を有する化合物から選択され、ここで：
ａ、ｂ及びｃは独立して、０又は１の整数となるよう選択され；
ただしａ＋ｂ＋ｃ＝２又は３であり；
Ｒ1及び／又はＲ2は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルを表し、上記アルキルは任意に、以下の基：ヒドロキシ（ＯＨ）、エーテル（ＯＲx）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲｘＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲX）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲX）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲｘ）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）のうちの１つ又は複数によって置換され、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され、上記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、又はＲ8のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成する、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４４】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、上記ＬＭリンカー分子が：
（１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（２）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（３）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（４）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（５）ｐ‐アミノ‐ベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（６）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（７）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
（８）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（９）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐアミノベンジルオキシカルボニル；
（１０）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
（１１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１２）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１３）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１４）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１５）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）‐カルボニル；
（１６）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１７）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（１８）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（１９）ｐ‐アミノシンナミル；
（２０）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（２１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２２）ｐ‐アミノ‐シンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２３）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニル；
（２４）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２５）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；又は
（２６）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルを含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４５】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、上記ＬＭリンカー分子が上記Ａｂのポリペプチド鎖のアミノ酸の側鎖にコンジュゲートされて、上記Ａｂを上記細胞毒性薬物部分Ｄの分子に結合させ、また特に、上記細胞毒性薬物部分Ｄは、細胞毒素、放射性同位元素、免疫調節因子、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、成長因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、キレート剤、又はこれらの組み合わせを含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４６】
本発明は更に、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、上記ＬＭリンカー分子が上記Ａｂのポリペプチド鎖のアミノ酸の側鎖にコンジュゲートされて、上記Ａｂを上記細胞毒性薬物部分Ｄの分子に結合させ、また特に、上記細胞毒性薬物部分Ｄは：ツブリシン（特にツブリシンＡ、ツブリシンＢ、ツブリシンＣ及びツブリシンＤからなる群から選択されるツブリシン細胞毒素）；オーリスタチン（特にＭＭＡＥ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐ノルエフェドリン）及びＭＭＡＦ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐フェニルアラニン）からなる群から選択されるオーリスタチン細胞毒素）；マイタンシノイド（特にマイタンシン、ＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択されるマイタンシノイド細胞毒素）；カリケアミシン（特にカリケアミシンγ１、カリケアミシンβ１Ｂｒ、カリケアミシンγ１Ｂｒ、カリケアミシンα２Ｉ、カリケアミシンα３Ｉ、カリケアミシンβ１Ｉ、カリケアミシンγ１Ｉ及びカリケアミシンΔ１Ｉからなる群から選択されるカリケアミシン細胞毒素）；ピロロベンゾジアゼピン（特にバダスツキシマブ・タリリン、ＳＪＧ‐１３６、ＳＧ２０００、ＳＧ２２８５及びＳＧ２２７４からなる群から選択されるピロロベンゾジアゼピン細胞毒素）；並びにデュオカルマイシン（特にデュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ‐１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン（Ｕ‐８０２４４）及びスピロ‐デュオカルマイシン（ＤＵＢＡ）からなる群から選択されるデュオカルマイシン細胞毒素）からなる群から選択される、細胞毒素を含む、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。
【００４７】
本発明は更に、有効量の上述のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのうちのいずれと、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明は更に、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する若しくはＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療における、又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療方法における、上述のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのうちのいずれの使用を対象とし、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする上記疾患又は上記状態は癌であり、より詳細には、上記癌は：急性骨髄性白血病；副腎癌；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；発色性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成症；胆嚢若しくは胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；神経膠芽細胞腫；膵島細胞腫；カポジ肉腫；腎臓癌；白血病；脂肪肉腫／悪性リポソーム腫瘍、肝臓癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；悪性中皮腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；非小細胞肺癌；卵巣癌；膵臓癌；咽頭癌；乳頭状甲状腺癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎細胞癌；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮細胞癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移性癌；及び子宮癌からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、それぞれＥコイル又はＫコイルヘテロ二量体促進ドメイン（選択できるヘテロ二量体促進ドメインは以下で提示する）を有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。図３Ｂに示すように、システイン残基がリンカー中及び／又はヘテロ二量体促進ドメイン中に存在してよい。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図２】図２は、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、それぞれＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する２つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖（即ち合計４つのポリペプチド鎖）からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合した４価ダイアボディの概略図である。各ペアのうちの１つのポリペプチドは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。上記２ペアのポリペプチド鎖は、同一であってよい。（図３Ａ〜３Ｂに示すように）２ペアのポリペプチド鎖が同一であり、かつＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、二重特異性であり、結合する各エピトープに対して２価である。ＶＬ及びＶＨドメインが同一のエピトープを認識する（例えば同一のＶＬドメインＣＤＲ及び同一のＶＨドメインＣＤＲを両方の鎖に対して使用する）実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、単一特異性であり、単一のエピトープに対して４価である。あるいは、上記２ペアのポリペプチドは異なっていてよい。（図３Ｃにおいて様々な陰影及びパターンで示すように）ポリペプチドの各ペアのＶＬ及びＶＨドメインが異なるエピトープを認識する実施形態では、得られた分子は４つのエピトープ結合部位を有し、四重特異性であり、結合する各エピトープに対して１価である。図３Ａは、システイン残基を含むペプチドヘテロ二量体促進ドメインを含有するＦｃドメイン含有ダイアボディを示す。図３ＢはＦｃドメイン含有ダイアボディを示し、これは、システイン残基及び（任意のシステイン残基を有する）リンカーを含む、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有する。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ領域含有ダイアボディを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、３つのポリペプチド鎖からなる２つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディ分子の概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図５】図５は、５つのポリペプチド鎖からなる４つのエピトープ結合部位を有する、代表的な共有結合ダイアボディの概略図である。上記ポリペプチド鎖のうちの２つは、連結した鎖がＦｃドメインの全体又は一部を含むＦｃドメインを形成するように、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有する。ＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体促進ドメインを更に含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図６Ａ−６Ｆ】図６Ａ〜６Ｆは、３つのエピトープ結合部位を有する、代表的なＦｃドメイン含有３価結合分子の概略図である。図６Ａ及び６Ｂはそれぞれ、ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端又はＣ末端となる異なるドメイン配向を有する、２つのダイアボディ型結合ドメイン及びＦａｂ型結合ドメインを含む３価結合分子のドメインを示す。図６Ａ及び６Ｂの分子は４つの鎖を含む。図６Ｃ及び６Ｄはそれぞれ、ＦｃドメインのＮ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを示す。図６Ｅ及び６Ｆの３価結合分子はそれぞれ、ＦｃドメインのＣ末端に２つのダイアボディ型結合ドメインと、軽鎖及び重鎖がポリペプチドスペーサを介して連結されたＦａｂ型結合ドメイン、又はｓｃＦｖ型結合ドメインとを含む、３価結合分子のドメインを、概略的に示す。図６Ｃ〜６Ｆの３価結合分子は、３つの鎖を含む。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同一の陰影又は塗り潰しパターンを用いて示される。
【図７】図７は、Ｈｓ７００Ｔ膵臓癌細胞内へと内在化できる抗Ｂ７‐Ｈ３抗体に関するスクリーンの結果を示す。
【図８Ａ−８Ｊ】図８Ａ〜８Ｊは、Ｂ７‐Ｈ３発現性ＪＩＭＴ‐１乳癌細胞（図８Ａ）、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳癌細胞（図８Ｂ）、Ａ３７５．５２黒色腫細胞（図８Ｃ）、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞（図８Ｄ）、ＮＣＩ‐Ｈ１７０３非小細胞肺癌細胞（図８Ｅ）、ＮＣＩ‐Ｈ１９７５非小細胞肺癌細胞（図８Ｆ）、ＰＡ‐１卵巣癌細胞（図８Ｇ）、Ｈｓ７００Ｔ膵臓癌細胞（図８Ｈ）、ＤＵ１４５前立腺癌細胞（図８Ｉ）、及びＢ７‐Ｈ３陰性Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞（図８Ｊ）に対するインビトロ細胞毒性を仲介する、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの能力の研究の結果を示す。
【図９】図９は、ＣＤ１ヌードマウスモデルの乳房脂肪体に移植したＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳癌腫瘍細胞に対するインビボ細胞毒性を仲介する、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの能力の研究の結果を示す。ｃｈｍＡｂ‐Ｂ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、又はビヒクル単独を用いて２５日目（矢印で示す）に腹腔内治療されたマウスに関して、腫瘍成長曲線を提示する。
【図１０Ａ−１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＣＤ１ヌードマウスモデルの皮下に移植したＮＣＩ‐Ｈ１７０３非小細胞肺癌腫瘍細胞に対するインビボ細胞毒性を仲介する、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの能力の研究の結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ（図１０Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（図１０Ｂ）、１ｍｇ／ｋｇ（図１０Ｃ）のｃｈｍＡｂ‐Ｂ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、又はビヒクル単独を用いて５２日目（矢印で示す）に腹腔内治療されたマウスに関して、腫瘍成長曲線を提示する。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣＤ１ヌードマウスモデルの皮下に移植したＰＡ‐１卵巣癌腫瘍細胞に対するインビボ細胞毒性を仲介する、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの能力の研究の結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ（図１１Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｂ）、１ｍｇ／ｋｇ（図１１Ｃ）のｃｈｍＡｂ‐Ｂ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、又はビヒクル単独を用いて４２日目（矢印で示す）に腹腔内治療されたマウスに関して、腫瘍成長曲線を提示する。
【図１２Ａ−１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＤ１ヌードマウスモデルの皮下に移植したＣａｌｕ‐６非小細胞肺癌腫瘍細胞に対するインビボ細胞毒性を仲介する、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの能力の研究の結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ（図１２Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｂ）、１ｍｇ／ｋｇ（図１２Ｃ）のｃｈｍＡｂ‐Ｂ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、又はビヒクル単独を用いて２０日目（矢印で示す）に腹腔内治療されたマウスに関して、腫瘍成長曲線を提示する。
【図１３Ａ−１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＣＤ１ヌードマウスモデルの皮下に移植したＡ３７５．Ｓ２黒色腫細胞に対するインビボ細胞毒性を仲介する、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの能力の研究の結果を示す。１０ｍｇ／ｋｇ（図１３Ａ）、３ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｂ）、１ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｃ）のｃｈｍＡｂ‐Ｂ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ‐ｖｃ‐ＭＭＡＥ、又はビヒクル単独を用いて３０日目（矢印で示す）に腹腔内治療されたマウスに関して、腫瘍成長曲線を提示する。
【図１４Ａ−１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子の薬物動態安定性の研究の結果を示す。全抗体（円）、並びにｃｈｍＡｂ‐Ｂ（図１４Ａ）、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ（図１４Ｂ）及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ（図１４Ｃ）由来の完全なＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（正方形）に関して、血清抗体濃度曲線を提示する。
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、切断可能リンカーを介してそのＡｂ部分のアミノ酸残基に連結された例示的なデュオカルマイシン部分（ＤＵＢＡ）を有するｈｍＡｂ‐Ｃ  Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（「ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ」）による、生物活性の保持を示す。図１５Ａ、Ｃａｌｕ‐６細胞；図１５Ｂ、ＮＣＩ‐Ｈ１７０３細胞；図１５Ｃ、Ｈｓ７００Ｔ細胞。対照分子はＣＤ２０に結合し、ＤＵＢＡにコンジュゲートされる（「Ｃｔｒｌ‐ＤＵＢＡ」）。
【図１６】図１６は、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞に対するｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの効力のインビボ研究の結果を示す。ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞を皮下接種したマウスの群（ｎ＝５）に導入した。複数用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ（１ｍｇ／ｋｇ×３、３ｍｇ／ｋｇ×３、又は６ｍｇ／ｋｇ×３）を、接種後２４、３１、３８及び４５日目（矢印で示す）にマウスに腹腔内投与し、これらの動物を最大６２日間、腫瘍体積に関して評価した。
【図１７】図１７は、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞に対するｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの効力のインビボ研究の結果を示す。ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞を皮下接種したマウスの群（ｎ＝７）に導入した。ある用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ）を、接種後２０日目（矢印で示す）にマウスに投与し、これらの動物を最大５５日間、腫瘍体積に関して評価した。
【図１８】図１８は、ＰＡ‐１卵巣癌細胞に対するｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの効力のインビボ研究の結果を示す。ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡを、ＰＡ‐１卵巣癌細胞を皮下接種したマウスの群（ｎ＝７）に導入した。ある用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ）を、接種後２５日目（矢印で示す）にマウスに投与し、これらの動物を最大６０日間、腫瘍体積に関して評価した。
【図１９】図１９は、Ａ３７５．Ｓ２黒色腫細胞に対するｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの効力のインビボ研究の結果を示す。ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡを、Ａ３７５．Ｓ２黒色腫細胞を皮下接種したマウスの群（ｎ＝６）に導入した。ある用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇ）を、接種後２５日目（矢印で示す）にマウスに投与し、これらの動物を最大６０日間、腫瘍体積に関して評価した。
【図２０Ａ−２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、ＭＤＡ‐ＭＢ４６８乳癌細胞の脂肪体異種移植片に対するｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの効力のインビボ研究の結果を示す。乳房脂肪体にＭＤＡ‐ＭＢ４６８乳癌細胞を接種した後７０、７４及び７８日目に、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡをマウスの群に腹腔内投与した。接種後７０日目にある用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇの単回用量）を、そして７０、７４及び７８日目に３ｍｇ／ｋｇを３用量投与し、これらの動物を最大１１０日間、腫瘍体積に関して評価した。図２０Ａは、６ｍｇ／ｋｇ（単回用量）でのビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２０Ｂは、３ｍｇ／ｋｇ（単回用量）でのビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２０Ｃは、３ｍｇ／ｋｇ（３用量）でのビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２０Ｄは、全ての結果を単一のグラフ上に示す。
【図２１Ａ−２１Ｄ】図２１Ａ〜２１Ｄは、ＰＡ‐１卵巣細胞の脂肪体皮下移植された異種移植片に対するｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの効力のインビボ研究の結果を示す。ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ若しくはＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇの単回用量）を接種後２４日目に、又は１０ｍｇ／ｋｇのｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ若しくはＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡを（接種後２４及び２８日目に）２用量、又は６ｍｇ／ｋｇのｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ若しくはＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡを（接種後２４、２８、３１及び３５日目に）４用量、腹腔内投与した。これらの動物を最大７０日間、腫瘍体積に関して評価した。図２１Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ（単回用量又は２回用量）でのビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２１Ｂは、６ｍｇ／ｋｇ（単回用量又は４回用量）でのビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２１Ｃは、３ｍｇ／ｋｇ（単回用量）でのビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２１Ｄは、全ての結果を単一のグラフ上に示す。
【図２２】図２２は、マウスにおけるｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ投与の薬物動態を示す。この図は、全ヒトＩｇＧと、３ｍｇ／ｋｇのｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの完全なＡＤＣ（ｎ＝３）とを示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｂは、カニクイザルにおけるｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ投与の薬物動態を示す。これらの図は、全ヒトＩｇＧ（図２３Ａ）と、１ｍｇ／ｋｇ（オス１頭；メス１頭）、３ｍｇ／ｋｇ（オス１頭；メス１頭）、１０ｍｇ／ｋｇ（オス１頭；メス１頭）、又は２７ｍｇ／ｋｇ（オス２頭；メス２頭）のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの完全なＡＤＣ（図２３Ｂ）とを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、ヒト及び非ヒトＢ７‐Ｈ３に結合できる新規のＢ７‐Ｈ３結合分子、並びに特に非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）のＢ７‐Ｈ３と交差反応する上記分子を対象とする。本発明は更に、レシピエントである被験者への投与時に免疫原性の低減を示すようヒト化及び／又は脱免疫化された可変軽鎖及び／又は可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明は特に：（ｉ）上記Ｂ７‐Ｈ３結合可変ドメイン；及び（ｉｉ）エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに結合できるドメインを含む、二重特異性ダイアボディ、ＢｉＴＥ、二重特異性抗体、３価結合分子等を含む二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３結合分子のいずれの使用を伴う方法も対象とする。本発明はまた、少なくとも１つの薬物部分にコンジュゲートしたヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のヒトＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含む分子（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）にも関する。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのいずれの使用を伴う方法も対象とする。
【００５１】
本発明はまた、少なくとも１つの薬物部分にコンジュゲートしたヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のヒトＢ７‐Ｈ３結合ドメインを含む分子（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）を対象とする。本発明はまた、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含有する医薬組成物、並びに癌並びに他の疾患及び状態の治療における上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの使用を伴う方法に関する。
【００５２】
本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子は、式：
Ａｂ‐（ＬＭ）m‐（Ｄ）n
を含み：
Ａｂは、ヒト化可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及びヒト化可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むＢ７‐Ｈ３に結合する抗体、又はそのＢ７‐Ｈ３結合断片であり；
Ｄは、細胞毒性薬物部分であり；
ＬＭは、上記Ａｂ及び上記Ｄを共有結合させる結合又はリンカー分子であり；
ｍは０〜ｎの整数であって、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのリンカー分子の数を表し；
ｎは１〜１０の整数であって、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子に共有結合した上記細胞毒性薬物部分の数を表す。
【００５３】
Ｉ．抗体及びその結合ドメイン
本発明の抗体は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。従って本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子は、Ｂ７‐Ｈ３又はそのＢ７‐Ｈ３結合断片に結合する抗体を含む。本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody及びantibodies）」は、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、及び以上のうちのいずれかのエピトープ結合断片を包含する。特に、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性の断片、即ちエピトープ結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものとすることができる。抗体は、ポリペプチド又はタンパク質又は非タンパク質分子に「免疫特異的に結合（immunospecifically binding）」（又はこれらの分子に「免疫特異的な様式（immunospecific manner）」で結合）できる。というのは、このような分子上に特定のドメイン又は部分又は形態（「エピトープ（epitope）」）が存在するためである。エピトープ含有分子は、免疫学的活性を有することができ、これにより、動物における抗体産生応答を誘発する。このような分子を「抗原（antigen）」と呼ぶ。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（Chan, C.E. et al. (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases,” Singapore Med. J. 50(7):663-666）。２００を超える抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。
【００５４】
本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に（immunospecifically）」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「免疫特異的結合（immunospecific binding）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「免疫特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子それぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（physiospecific）」様式で互いに結合できると言い表される。
【００５５】
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する、又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、Ｆｖ等）、単鎖（ｓｃＦｖ）結合分子、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、Kohler, G. et al. (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,” Nature 256:495-497の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production,” ILAR J. 37(3):119-125を参照）。一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、本発明の単一特異性又は多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性及び四重特異性）分子、並��に親和性最適化済み、キメラ抗体、ヒト化抗体及び／又はイヌ化抗体を生成することによって、抗体の親和性又は他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。
【００５６】
天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの「重鎖（heavy chain）」と複合体化した２つの「軽鎖（light chain）」からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬ」）及び定常ドメイン（「ＣＬ」）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（「ＶＨ」）、３つの定常ドメイン（「ＣＨ１」、「ＣＨ２」及び「ＣＨ３」）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置する「ヒンジ」領域（「Ｈ」）を含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ末端」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変ドメインを含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ末端」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジドメインを有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。
【００５７】
Ａ．抗体可変ドメインの特性決定
ＩｇＧ分子の可変ドメインは、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、及びフレームワークセグメント（「ＦＲ」）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体の軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインと呼ばれる。同様に、抗体の重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン、ＣＤＲL３ドメイン、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン、及びＣＤＲH３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象としている。従って本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ結合断片（epitope-binding fragment）」は、あるエピトープに免疫特異的に結合できる分子の断片を指す。エピトープ結合断片は、こ抗体の１、２、３、４若しくは５個のＣＤＲドメインを含有してよく、又は抗体の６個全てのＣＤＲドメインを含有してよく、このようなエピトープに免疫特異的に結合できるものの、このような抗体のエピトープとは異なるエピトープに対する免疫特異性、親和性又は選択性を呈してもよい。しかしながら好ましくは、エピトープ結合断片は、このような抗体のＣＤＲドメインのうちの６個全てを含有することになる。ある抗体のエピトープ結合断片は、単一のポリペプチド鎖（例えばｓｃＦｖ）であってよく、又はそれぞれがアミノ末端及びカルボキシ末端を有する２つ以上のポリペプチド鎖（例えばダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’2断片等）を含んでよい。明記されていない場合、本明細書に記載のタンパク質分子のドメインの順序は、「Ｎ末端からＣ末端への（N-terminal to C-Terminal）」方向である。
【００５８】
本発明は特に、本発明のヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ」）、並びにこれを含む多重特異性結合分子を包含する。単鎖可変ドメイン断片は、短い「リンカー（linker）」ペプチドを用いて一体に連結されたＶＬ及びＶＨドメインを含む。このようなリンカーは、固体支持体への薬剤の取り付けを可能とする、又はアタッチメントの取り付けを可能とする等の更なる機能を提供するために修飾できる。単鎖変異型は、組み換え又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生のために、自動合成器を使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生のためには、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞といった、好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションといった慣用の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技法を用いて単離できる。
【００５９】
本発明はまた、本発明のＢ７‐Ｈ３抗体のヒト化変異型のＣＤＲH１、ＣＤＲH２、ＣＤＲH３、ＣＤＲL１、ＣＤＲL２、ＣＤＲL３又はＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン、並びにこれを含む多重特異性結合分子を特に包含する。用語「ヒト化（humanized）」抗体は、キメラ分子であって、一般に組み換え技術を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンのエピトープ結合部位と、残りの、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく分子の免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子を指す。本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３抗体は特に、抗体ｍＡｂ‐Ａ、ｍＡｂ‐Ｂ、ｍＡｂ‐Ｃ又はｍＡｂ‐Ｄのヒト化、キメラ又はイヌ化変異型を含む。本発明の抗ヒトＰＤ‐１抗体は、抗体ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ４、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ５、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ６、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ７、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ８、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  ９、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １０、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １１、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １２、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １３、ＰＤ‐１  ｍＡｂ  １４又はＰＤ‐１  ｍＡｂ  １５の、ヒト化、キメラ又はイヌ化変異体を含む。このような抗体の可変ドメインのポリヌクレオチド配列は、上記誘導体を生成するため及び上記抗体の親和性又は他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用できる。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体のエピトープ結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば米国特許第４，８１６，５６７号；米国特許第５，８０７，７１５号；米国特許第５，８６６，６９２号；及び米国特許第６，３３１，４１５号を参照。
【００６０】
エピトープ結合部位は、定常ドメインに融合する完全可変ドメイン、又は適切なフレームワーク領域にグラフトされたこのような可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでよい。エピトープ結合ドメインは野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾してよい。これにより、ヒト個体の免疫原である定常領域が排除されるが、外来可変ドメインの可能性は残る（LoBuglio, A.F. et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224）。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、上記可変ドメインをヒト形態に可能な限り近くなるように変形させるために上記可変ドメインを修飾することにも、焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変ドメインは、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変ドメインを「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、Sato, K. et al. (1993) “Reshaping A Human Antibody To Inhibit The Interleukin 6-Dependent Tumor Cell Growth,” Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework残基 On Loop Conformation,” Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo,” Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 及びCo, M.S. et al. (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,” J. Immunol. 148:1149-1154によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。
【００６１】
非ヒト免疫グロブリン由来のエピトープ結合部位を含む多数の「ヒト化（humanized）」抗体分子が説明されており、これらは、げっ歯類又は修飾げっ歯類可変ドメインと、ヒト定常ドメインに融合した、これらに関連する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを有するキメラ抗体を含む（例えばWinter et al. (1991) “Man-made Antibodies,” Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989); Shaw et al. (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen,” J. Immunol. 138:4534-4538;及びBrown et al. (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody,” Cancer Res. 47:3577-3583を参照）。他の参照文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合する前にヒト支持性フレームワーク領域（ＦＲ）にグラフと重合される、げっ歯類ＣＤＲについて説明している（例えば、Riechmann, L. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy,” Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity,” Science 239:1534-1536;及びJones et al. (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse,” Nature 321:522-525を参照）。別の参照文献は、組み換えによってベニアリングされたげっ歯類フレームワーク領域によって支持されたげっ歯類ＣＤＲについて説明している。例えば欧州公開特許第５１９，５９６号を参照。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントのこれらの部分の治療的応用の期間及び効果を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する望ましくない免疫学的応答を最小化するよう設計される。抗体をヒト化するために利用してよい他の方法は、Daugherty et al. (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A マウスMonoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476並びに米国特許第６，１８０，３７７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第５，９９７，８６７号；及び米国特許第５，８６６，６９２号によって開示されている。
【００６２】
Ｂ．抗体定常ドメインの特性決定
１．軽鎖の定常ドメイン
上述のように、抗体の各軽鎖は、可変ドメイン（「ＶＬ」）と定常ドメイン（「ＣＬ」）とを含有する。
【００６３】
好ましくは、ＣＬドメインはヒトＩｇＧ  ＣＬκドメイン。例示的なヒトＣＬκドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 
SFNRGEC
である。
【００６４】
あるいは、例示的なＣＬドメインはヒトＩｇＧ  ＣＬλドメインである。例示的なヒトＣＬλドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP 
TECS
である。
【００６５】
２．重鎖の定常ドメイン
上述のように、抗体の重鎖は、ＣＨ１、ヒンジドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインを含み得る。抗体の２つの重鎖のＣＨ１ドメインは、抗体の軽鎖の「ＣＬ」定常ドメインと複合体化し、介在ヒンジドメインを介して重鎖ＣＨドメインに付着する。
【００６６】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号３）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【００６７】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号４）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
である。
【００６８】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号５）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
である。
【００６９】
例示的なＣＨ１ドメインは、ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号６）：
ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV
である。
【００７０】
例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ１ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号７）：EPKSCDKTHTCPPCPである。
【００７１】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ２ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ２ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号８）：ERKCCVECPPCPである。
【００７２】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ３ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ３ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号９）：
ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK 
SCDTPPPCPR CP
である。
【００７３】
別の例示的なヒンジドメインは、ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインである。例示的なヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１０）：ESKYGPPCPSCPである。本明細書に記載されているように、ＩｇＧ４ヒンジドメインは、Ｓ２２８Ｐ置換等の安定化性の突然変異を含んでよい。例示的なＳ２２８Ｐ安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１１）：ESKYGPPCPPCPである。
【００７４】
抗体の２つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインは相互作用して「Ｆｃドメイン（Fc Domain）」を形成し、このＦｃ領域は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を含むがこれに限定されない細胞Ｆｃ受容体によって認識されるドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃドメインは、そのアミノ酸配列が、他のＩｇＧアイソタイプに比べてある特定のＩｇＧアイソタイプと最も一致する場合に、当該ＩｇＧアイソタイプ、クラス又はサブクラスのＦｃドメインと呼ばれる。抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。
【００７５】
本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖の定常領域の残基の番号付与は、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed. Public Health Service、NH1、MD (1991)（「Ｋａｂａｔ」、これは参照により明示的に本明細書に援用される）によるＥＵインデックスの番号付与である。用語「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス（EU index as in Kabat）」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の番号付与を指す。免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変ドメインからのアミノ酸は、鎖内のアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは、抗体に関する多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに関するアミノ酸コンセンサス配列を識別し、また各アミノ酸に残基番号を割り当てており、ＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されているように識別される（Chothia, C. & Lesk, A. M.（(1987) “Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobrins,”. J. Mol. Biol. 196:901-917）によって定義されるＣＤＲH１は、５残基前から始まることを理解されたい）。Ｋａｂａｔの番号付与スキームは、保存されたアミノ酸を参照して、問題となる抗体を、Ｋａｂａｔ中のコンセンサス配列のうちの１つと整列させることによって、Ｋａｂａｔの概要に含まれていない抗体にまで拡張可能である。残基番号を割り当てるための上記方法は、当該技術分野において標準的なものとなっており、キメラ又はヒト化変異体を含む異なる抗体中の同等の位置のアミノ酸を容易に識別する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０位のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０位のアミノ酸と同等の位置を占有する。
【００７６】
例示的なヒトＩｇＧ１のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１２）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVKFNWYVD
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７７】
例示的なヒトＩｇＧ２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１３）：
231     240          250          260          270          280
APPVA-GPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTF   RVVSVLTVVH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPA 
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDISVE
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NVFSCSVMHE 
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７８】
例示的なヒトＩｇＧ３のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１４）：
231     240          250          260          270          280
APELLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSHED   PEVQFKWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQYNSTF   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKALPA
340          350          360          370          380
PIEKTISKTK   GQPREPQVYT   LPPSREEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE
390          400          410          420          430
WESSGQPENN   YNTTPPMLDS   DGSFFLYSKL   TVDKSRWQQG   NIFSCSVMHE
440      447
ALHNRFTQKS   LSLSPGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００７９】
例示的なヒトＩｇＧ４のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号１５）：
231     240          250          260          270          280
APEFLGGPSV   FLFPPKPKDT   LMISRTPEVT   CVVVDVSQED   PEVQFNWYVD 
290          300          310          320          330
GVEVHNAKTK   PREEQFNSTY   RVVSVLTVLH   QDWLNGKEYK   CKVSNKGLPS 
340          350          360          370          380
SIEKTISKAK   GQPREPQVYT   LPPSQEEMTK   NQVSLTCLVK   GFYPSDIAVE 
390          400          410          420          430
WESNGQPENN   YKTTPPVLDS   DGSFFLYSRL   TVDKSRWQEG   NVFSCSVMHE 
440      447
ALHNHYTQKS   LSLSLGX
であり、これはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによって番号付与されており、Ｘはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【００８０】
多型は、抗体定常領域内の多数の異なる位置（例えばＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる番号付与で２７０位、２７２位、３１２位、３１５位、３５６位及び３５８位を含むがこれらに限定されないＦｃ位置）において観察されており、従ってここで提示される配列と従来技術の配列との間にはわずかな差異が存在し得る。ヒト免疫グロブリンの多型形態は、十分に特性決定されている。現在、１８個のＧｍアロタイプが公知である：Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ，ｘ，ｆ，ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５，６，１０，１１，１３，１４，１５，１６，２１，２４，２６，２７，２８）又はＧ３ｍ（ｂ１，ｃ３，ｂ３，ｂ０，ｂ３，ｂ４，ｓ，ｔ，ｇ１，ｃ５，ｕ，ｖ，ｇ５）（Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211）。特に、本発明の抗体が、いずれの免疫グロブリン遺伝子のいずれのアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプを組み込むことができ、本明細書中で提示される配列のアロタイプ、アイソアロタイプ又はハプロタイプに限定されないと考えられる。更に、発現系によっては、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基（上記太字）は、翻訳後に除去できる。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、本発明の（Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子を含む）Ｂ７‐Ｈ３結合分子の任意のアミノ酸残基である。本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端残基が欠けた（Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子を含む）Ｂ７‐Ｈ３結合分子である。また本発明によって具体的に包含されるのは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含む構造である。
【００８１】
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞の脱顆粒化及び食作用といったエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌の調節といった免疫調節シグナルまでの、幅広い応答をもたらす。これらの全ての相互作用は、造血細胞上の特別な細胞表面、特に複数のタイプの免疫系細胞（例えばＢリンパ球、濾胞性樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞）の表面上に見られる受容体（単独では「Ｆｃγ受容体（Fc gamma receptor）」、「ＦｃγＲ」、まとめて「ＦｃγＲｓ」と呼ばれる）  に結合することによって開始される。このような受容体は、「細胞外（extracellular）」部分（従ってこれはＦｃドメインに結紮できる）、「膜貫通（transmembrane）」部分（これは細胞膜を貫通して延在する）、及び「細胞質（cytoplasmic）」部分（細胞の内部に位置する）を有する。
【００８２】
抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）及びＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）の構造的異質性に由来する。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化性受容体であり、従って、Ｆｃドメインへの結紮によって免疫系を活性化するか又は免疫応答を増強する。対照的に、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性受容体であり、Ｆｃドメインへの結紮によって免疫応答を阻害するか、又は既存の免疫応答を弱化する。更に、Ｆｃドメインと新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。ＩｇＧ１（配列番号１２）、ＩｇＧ２（配列番号１３）、ＩｇＧ３（配列番号１４）、及びＩｇＧ４（配列番号１５）の例示的な野生型Ｆｃドメインのアミノ酸配列は、既に提示されている。
【００８３】
ＣＤ１６は、活性化性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）の一般名である。ＣＤ１６は、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び凝集しているもののモノマー性ではないヒトＩｇＧに結合する組織マクロファージによって発現される（Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511）。これらの受容体は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合することによって、サイトカインの放出をトリガする。このような抗体が外来細胞（例えば腫瘍細胞）の抗原に結合すると、上記放出により、この腫瘍細胞の殺滅が仲介される。このような殺滅は抗体依存性であるため、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity （ＡＤＣＣ））と呼ばれる。
【００８４】
ＣＤ３２Ａ（ＦｃγＲＩＩＡ）（Brandsma, A.M. (2015) “Fc Receptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy,” Immunol Rev. 268(1):74-87; van Sorge, N.M. et al. (2003) “Fcgammar Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy,” Tissue Antigens 61(3):189-202; Selvaraj, P. et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors,” Immunol. Res. 29(1-3):219-230）及びＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）（Lu, S. et al. (2015) “Structural Mechanism Of High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G,” Immunol. Rev. 268(1):192-200; Swisher, J.F. et al. (2015) “The Many Faces Of FcγRI: Implications For Therapeutic Antibody Function,” Immunol. Rev. 268(1):160-174; Thepen, T. et al. (2009) “Fcgamma Receptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer,” Curr. Pharm. Des. 15(23):2712-2718; Rouard, H. et al. (1997) “Fc Receptors As Targets For Immunotherapy,” Int. Rev. Immunol. 16(1-2):147-185）は、マクロファージ、好中球、好酸球及び樹状細胞上（並びにＣＤ３２Ａに関しては血小板及びランゲルハンス細胞上）に発現される活性化性Ｆｃ受容体である。対照的に、ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）は、Ｂリンパ球（マクロファージ、好中球及び好酸球）上の阻害性Ｆｃ受容体である（Stopforth, R.J. et al. (2016) “Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB,” J. Clin. Immunol. [2016 Feb 27 Epub], pp. 1-7; Bruhns, P. et al. (2009) “Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Polymorphic Variants For Human IgG Subclasses,” Blood. 113(16):3716-3725; White, A.L. et al. (2014) “FcγRIIB As A Key Determinant Of Agonistic Antibody Efficacy,” Curr. Top. Microbiol. Immunol. 382:355-372; Selvaraj, P. et al. (2004) “Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors,” Immunol. Res. 29(1-3):219-230）。
【００８５】
異なる複数のＦｃγＲの、正反対の機能を仲介する能力は、これらの構造的差異、特に、ＦｃγＲが、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）又は免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（「ＩＴＩＭ」）のいずれを有しているかを反映する。これらの構造に対する異なる細胞質酵素の補充は、ＦｃγＲ仲介細胞応答の結果を決定づける。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡを含み、Ｆｃドメイン（例えば免疫複合体中に存在する凝集したＦｃドメイン）に結合した場合に免疫系を活性化させる。ＦｃγＲＩＩＢは、現在知られている唯一の、天然ＩＴＩＭ含有ＦｃγＲであり、これは凝集したＦｃドメインに結合した場合に、免疫系を減衰させる又は阻害する役割を果たす。ヒト好中球は、ＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体又は特異性抗体架橋によるＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと凝集させる役割を果たす。ＩＴＡＭリン酸化は、Ｓｙｋキナーゼのドッキング部位として役立ち、その活性化は、下流基質（例えばＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は、炎症促進性メディエータの放出につながる。ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子は、Ｂリンパ球上で発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であり、またＩｇＧ複合体に、区別できない様式で結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在は、ＦｃγＲの上述の阻害型サブクラスを定義する。最近、この阻害の分子的基礎が確率された。活性化ＦｃγＲと共同結紮すると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、ポリリン酸イノシトール５’‐ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを誘引し、これは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ仲介チロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を防止する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ結紮に対する活性化応答を弱め、細胞応答性を阻害し、これによってＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖及び抗体分泌を中断させる。
【００８６】
ＩＩ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ
抗体が抗原のエピトープに結合する能力は、抗体のＶＬ及びＶＨドメインの存在並びにアミノ酸配列に依存する。抗体軽鎖と重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、ＩｇＧ等の天然抗体の２つのエプトープ結合部位のうちの１つを形成する。天然抗体は、１つのエピトープ種にのみ結合できる（即ちこれらは単一特異性である）が、これらは上記種の複数の複製に結合できる（即ち２価性又は多価性を示す）。
【００８７】
抗体の機能は、２つの分離した別個の抗原（若しくは同一の抗原の異なるエピトープ）に同時に結合できる多重特異性抗体ベースの分子を生成することによって、並びに／又は同一のエピトープ及び／若しくは抗原に対して高い価数（即ち３つ以上の結合部位）を有する抗体ベースの分子を生成することによって、増強できる。
【００８８】
天然抗体より高い能力を有する分子を提供するために、幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば国際公開第２００８／００３１１６号；国際公開第２００９／１３２８７６号；国際公開第２００８／００３１０３号；国際公開第２００７／１４６９６８号；国際公開第２００９／０１８３８６号；国際公開第２０１２／００９５４４号；国際公開第２０１３／０７０５６５号を参照）、その殆どは、更なるエピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）へ若しくは上記抗体コア内に融合させるため、又は複数のエピトープ結合断片（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を融合させるために、リンカーペプチドを使用する。代替的なフォーマットは、エピトープ結合断片（例えばｓｃＦｖ、ＶＬ、ＶＨ等）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は代替となるポリペプチド等の二量体化ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（国際公開第２００５／０７０９６６号；国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号；国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号；国際公開第２００７／０４６８９３号）。国際公開第２０１３／１７４８７３号；国際公開第２０１１／１３３８８６号；及び国際公開第２０１０／１３６１７２号は、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を開示している（国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号）。国際公開第２０１３／１６３４２７号、及び国際公開第２０１３／１１９９０３号は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを含む融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。国際公開第２０１０／０２８７９７号；国際公開第２０１００２８７９６号；及び国際公開第２０１０／０２８７９５号は、Ｆｃドメインが追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２００３０１２０６９号は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。国際公開第２０１３／００６５４４号は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。国際公開第２０１４／０２２５４０号；国際公開第２０１３／００３６５２号；国際公開第２０１２／１６２５８３号；国際公開第２０１２／１５６４３０号；国際公開第２０１１／０８６０９１号；国際公開第２００８／０２４１８８号；国際公開第２００７／０２４７１５号；国際公開第２００７／０７５２７０号；国際公開第１９９８／００２４６３号；国際公開第１９９２／０２２５８３号；及び国際公開第１９９１／００３４９３号は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。
【００８９】
本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えばHolliger et al. (1993) “‘Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448;米国特許第２００４／００５８４００号（Hollinger et al.);米国特許第２００４／０２２０３８８号；国際公開第０２／０２７８１号（Mertens et al.）； Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；国際公開第０２／０２７８１  号（Mertens et al.）； Olafsen, T. et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange,” Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al.(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944を参照）。
【００９０】
ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）として公知の抗体誘導体に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを用いて連結することによって作製される。Bird et al. (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426)は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（Bird et al. (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-426）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。
【００９１】
二重特異性結合分子（例えば非単一特異性ダイアボディ）の提供は、異なるエピトープを発現する異なる複数の細胞を共連結及び／若しくは共存させるために十分な「トランス（ｔｒａｎｓ）」結合能力、並びに／又は同一の細胞が発現する異なる複数の分子を共連結及び／又は共存させるために十分な「シス（ｃｉｓ）」結合能力を含むがこれに限定されない、抗体を上回る有意な利点を提供する。従って二重特異性結合分子（例えば非単一特異性ダイアボディ）は、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。二重特異性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（Fitzgerald et al. (1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221-1225）。
【００９２】
二重特異性ダイアボディを産生する能力により、異なる細胞上に存在する受容体の共連結（例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋）によって、２つの細胞を共連結するために、上記ダイアボディを（「トランス」として）使用できるようになる（Staerz et al. (1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al. (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658）。あるいは又は更に、二重特異性ダイアボディを（「シス」として）用いて、同一の細胞の表面上に存在する受容体等の分子を共連結できる。異なる細胞及び／又は受容体の共連結は、エフェクタ機能及び／又は免疫細胞シグナリングを変調するために有用である。エピトープ結合部位を含む多重特異性分子（例えば二重特異性ダイアボディ）は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、抗原提示細胞又は他の単核細胞上で発現される、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等のいずれの免疫細胞の表面決定因子を対象としてよい。特に、免疫エフェクタ細胞上に存在する細胞表面受容体を対象とするエピトープ結合部位は、標的転換細胞殺滅を仲介できる多重特異性結合分子の生成において有用である。
【００９３】
しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止する（即ちホモ二量体化を防止する）ような方法で達成しなければならない（Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えばOlafsen et al. (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain,” Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System,” Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
【００９４】
しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えばLu, D. et al. (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672を参照）。
【００９５】
この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディと呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号；及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；並びに国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号、並びにSloan, D.D. et al. (2015) “Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells,” PLoS Pathog. 11(11):e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini, M. et al. (2015) “Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART(R)) Platform,” Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili, G.R. et al. (2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore, P.A. et al. (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma,” Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449を参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを含み、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによってこのようなポリペプチド鎖の１つ又は複数のペアを互いに共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、関与するポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、ダイアボディの結合特性に干渉することなく、得られるダイアボディを安定化させる。
【００９６】
このような分子の多数の変異型が記載されており（例えば、米国公開特許第２０１５／０１７５６９７号；米国公開特許第２０１４／０２５５４０７号；米国公開特許第２０１４／００９９３１８号；米国公開特許第２０１３／０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０／０１７４０５３号；米国公開特許第２００９／００６０９１０号；米国公開特許第２００７‐０００４９０９号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号；欧州公開特許第１８６８６５０号；及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号;国際公開第２００６／１１３６６５号を参照）、また本明細書中で提供される。
【００９７】
４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一のポリペプチド鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば米国公開特許第２００５-００７９１７０号；米国公開特許第２００７-００３１４３６号；米国公開特許第２０１０-００９９８５３号；米国公開特許第２０１１-０２０６６７号；米国公開特許第２０１３-０１８９２６３号；欧州公開特許第１０７８００４号；欧州公開特許第２３７１８６６号；欧州公開特許第２３６１９３６号；及び欧州公開特許第１２９３５１４号；国際公開第１９９９／０５７１５０号；国際公開第２００３／０２５０１８号；及び国際公開第２０１３／０１３７００号を参照）。
【００９８】
最近では、２つのダイアボディ型結合ドメインと、１つの非ダイアボディ型ドメインと、Ｆｃドメインとが組み込まれた３価構造体が記述されている（例えば国際公開第２０１５／１８４２０７号及び国際公開第２０１５／１８４２０３号を参照）。このような３価結合分子を利用して、単一特異性、二重特異性又は三重特異性分子を生成できる。３つの異なるエピトープに結合できることにより能力が増強される。
【００９９】
ＩＩＩ．ヒトＢ７‐Ｈ３
ヒトＢ７‐Ｈ３は「４Ｉｇ」形態として、及び「２Ｉｇ」形態として存在する。ヒトＢ７‐Ｈ３の代表的な「４Ｉｇ」形態のアミノ酸配列（下線を付して示されている２９アミノ酸残基シグナル配列を含む）は、ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００１０１９９０７（配列番号１６、上記２９アミノ酸残基シグナル配列は下線を付して示されている）：
MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPVVA LVGTDATLCC 
SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL 
AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE 
PNKDLRPGDT VTITCSSYQG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG 
LFDVHSILRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQ 
VPEDPVVALV GTDATLRCSF SPEPGFSLAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG 
RDQGSAYANR TALFPDLLAQ GNASLRLQRV RVADEGSFTC FVSIRDFGSA 
AVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVFWQDGQ 
GVPLTGNVTT SQMANEQGLF DVHSVLRVVL GANGTYSCLV RNPVLQQDAH 
GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVALAFVCWR KIKQSCEEEN 
AGAEDQDGEG EGSKTALQPL KHSDSKEDDG QEIA
によって提供される。
【０１００】
ヒトＢ７‐Ｈ３の「２Ｉｇ」形態のアミノ酸配列は、ヒトＢ７‐Ｈ３の「４Ｉｇ」形態内に完全に包含される。ヒトＢ７‐Ｈ３の代表的な「２Ｉｇ」形態のアミノ酸配列（下線を付して示されている２９アミノ酸残基シグナル配列を含む）は、ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿０７９５１６（配列番号１７）：
MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPVVA LVGTDATLCC 
SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL 
AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE 
PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG 
LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQ PMTFPPEALW 
VTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDG EGEGSKTALQ 
PLKHSDSKED DGQEIA
によって提供される。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子（例えばｓｃＦｖｓ、抗体、二重特異性ダイアボディ等）は、以下の基準のうちのいずれの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又は９つを特徴とする：
（１）ヒトＢ７‐Ｈ３が癌細胞の表面上に内因的に発現した際に、これに免疫特異的に結合する能力；
（２）非ヒト霊長類Ｂ７‐Ｈ３（例えばカニクイザルのＢ７‐Ｈ３）に特異的に結合すること；
（３）平衡結合定数（ＫD）１ｎＭ以下でヒトＢ７‐Ｈ３に特異的に結合すること；
（４）平衡結合定数（ＫD）１ｎＭ以下で非ヒト霊長類Ｂ７‐Ｈ３に特異的に結合すること；
（５）オンレート（ｋａ）１×１０6Ｍ-1ｍｉｎ-1以上でヒトＢ７‐Ｈ３に特異的に結合すること；
（６）オンレート（ｋａ）１×１０6Ｍ-1ｍｉｎ-1以上で非ヒト霊長類Ｂ７‐Ｈ３に特異的に結合すること；
（７）オフレート（ｋｄ）１５×１０-4ｍｉｎ-1以下でヒトＢ７‐Ｈ３に特異的に結合すること；
（８）オフレート（ｋｄ）１５×１０-4ｍｉｎ-1以下で非ヒト霊長類Ｂ７‐Ｈ３に特異的に結合すること；
（９）標的転換細胞殺滅（例えばＢ７‐Ｈ３を発現する癌細胞の殺滅）を仲介する能力。
【０１０２】
本明細書中の他の箇所に記載されているように、Ｂ７‐Ｈ３結合分子の結合定数は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析によって、表面プラズモン共鳴を用いて決定してよい。表面プラズモン共鳴データを、１：１ラングミュア結合モデル（同時ｋａ  ｋｄ）及び速度定数の比ｋｄ／ｋａから算出した平衡結合定数ＫDに対してフィッティングしてよい。このような結合定数は、１価Ｂ７‐Ｈ３結合分子（即ち単一のＢ７‐Ｈ３エピトープ結合部位を含む分子）、２価Ｂ７‐Ｈ３結合分子（即ち２つのＢ７‐Ｈ３エピトープ結合部位を含む分子）、又は価数が更に高いＢ７‐Ｈ３結合分子（即ち３つ、４つ若しくは５つ以上のＢ７‐Ｈ３エピトープ結合部位を含む分子）に関して決定してよい。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、用語「標的転換細胞殺滅（redirected cell killing）」は、免疫エフェクタ細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞等）及び標的細胞（例えば癌細胞）の表面上に存在するエピトープを結合させることによって、上記エフェクタ細胞を上記標的細胞の位置に局在化して、標的細胞の殺滅をもたらすことにより、標的細胞の殺滅を仲介する、分子の能力を指す。Ｂ７‐Ｈ３結合分子（例えば二重特異性Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３結合分子）の、標的転換細胞殺滅活性を仲介する能力は、細胞毒性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）アッセイを用いて決定してよい。このようなアッセイは当該技術分野では公知であり、以下に説明される。
【０１０４】
本発明は特に、ヒトＢ７‐Ｈ３ポリペプチドのエピトープに免疫特異的に結合する抗Ｂ７‐Ｈ３可変ドメイン（即ちＶＬ及び／又はＶＨドメイン）を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）を包含する。特段の記載がない限り、このようなＢ７‐Ｈ３結合分子は全て、ヒトＢ７‐Ｈ３に免疫特異的に結合できる。本明細書中で使用される場合、上記Ｂ７‐Ｈ３可変ドメインは、「抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬ」及び「抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＨ」のそれぞれを指す。
【０１０５】
ＩＶ．マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体及びそのヒト化誘導体
「ｍＡｂ‐Ａ」、「ｍＡｂ‐Ｂ」、「ｍＡｂ‐Ｃ」及び「ｍＡｂ‐Ｄ」と称される４つの抗Ｂ７‐Ｈ３抗体を、ヒトＢ７‐Ｈ３を発現する細胞、そのＢ７‐Ｈ３ポリペプチド又はペプチドエピトープを用いた免疫化によって生成されたハイブリドーマ細胞から単離した。抗体「ｍＡｂ‐Ｂ」、「ｍＡｂ‐Ｃ」及び「ｍＡｂ‐Ｄ」はヒト化された。
【０１０６】
抗体「ｍＡｂ‐Ｃ」及び「ｍＡｂ‐Ｄ」は、カニクイザルのＢ７‐Ｈ３に対して交差反応性であることが分かった。ｍＡｂ‐Ｃ及びｍＡｂ‐ＤのＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に提供する。一実施形態では、本発明の好ましい抗ヒトＢ７‐Ｈ３結合分子は、ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又はＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全てを有し、上記ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、マウス抗Ｂ７‐Ｈ３モノクローナル抗体ｍＡｂ‐Ｄの、キメラモノクローナル抗体ｍＡｂ‐Ｄ（「ｃｈｍＡｂ‐Ｄ」）の、又はヒト化モノクローナル抗体抗体ｍＡｂ‐Ｃ若しくはｍＡｂ‐Ｄ（「ｈｍＡｂ‐Ｃ」若しくは「ｈｍＡｂ‐Ｄ」）のＶＨ及び／又はＶＬドメインである。このような好ましい抗ヒトＢ７‐Ｈ３結合分子は、二重特異性（若しくは多重特異性）抗体、キメラ又はヒト化抗体、ＢｉＴＥ、ダイアボディ等を含み、またこのような結合分子は変異型Ｆｃドメインを有する。本発明は、Ｂ７‐Ｈ３結合分子、特にＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを形成するための、ｍＡｂ‐Ａ、ｍＡｂ‐Ｂ、ｍＡｂ‐Ｃ又はｍＡｂ‐Ｄのうちのいずれの使用を包含する。
【０１０７】
Ａ．マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ａ
「ｍＡｂ‐Ａ」と称されるマウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９５）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS 
ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQYNNYPFTFGS 
GTKLEIK
【０１０８】
ｍＡｂ‐ＡのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR 
ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS
【０１０９】
Ｂ．マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ｂ
「ｍＡｂ‐Ｂ」と称されるマウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIK
【０１１０】
ｍＡｂ‐ＢのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号９８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT
IYPGDGDTRYTQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS
【０１１１】
Ｃ．ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈｍＡｂ‐Ｂ
ｈｍＡｂ‐ＢのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号９９）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG 
GTKLEIK
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ｈｍＡｂ‐ＢのＣＤＲL１のアミノ酸配列（RASQDISNYLN）（配列番号１００）を、アミノ酸配列RASQSISSYLN（配列番号１０１）を有する代替的なＣＤＲL１で置換してよい。同様に、ｈｍＡｂ‐ＢのＣＤＲL２のアミノ酸配列（YTSRLHS）（配列番号１０２）を、アミノ酸配列YTSRLQS（配列番号１０３）を有する代替的なＣＤＲL２で置換してよい。
【０１１３】
ｈｍＡｂ‐ＢのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１０４）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRYTQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ｈｍＡｂ‐ＢのＣＤＲH２のアミノ酸配列（TIYPGDGDTRYTQKFKG）（配列番号１０５）を、アミノ酸配列TIYPGGGDTRYTQKFQG（配列番号１０６）を有する代替的なＣＤＲH２で置換してよい。
【０１１５】
Ｄ．マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ｃ
「ｍＡｂ‐Ｃ」と称されるマウス抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
dDIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG 
GGTNLEIK
【０１１６】
ｍＡｂ‐ＣのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT
INSGGSNTYYPDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD
GGAMDYWGQG TSVTVSS
【０１１７】
Ｅ．ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｈｍＡｂ‐Ｃ
抗Ｂ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ｃの可変ドメインをヒト化した。いくつかの例では、結合活性を最適化するため、及び／又は抗原性エピトープを除去するため、及び／又は潜在的に不安定なアミノ酸残基を除去するために、代替的なヒト化可変ドメインを生成してよい。
【０１１８】
ｈｍＡｂ‐ＣのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQHHYGTPPWTFG 
QGTRLEIK
【０１１９】
ｈｍＡｂ‐ＣのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMSWVRQA PGKGLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHD
GGAMDYWGQG TTVTVSS
【０１２０】
Ｆ．マウス抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ｄ
「ｍＡｂ‐Ｄ」と称されるマウス抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKQ GHSPEALIYS
ASYRYSGVPA RFTGSGSGTD FTLTISNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGG 
GTKLEIK
【０１２１】
ｍＡｂ‐ＤのＣＤＲL１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２３）：KASQNVDTNVAである。
【０１２２】
ｍＡｂ‐ＤのＣＤＲL２ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２４）：SASYRYSである。
【０１２３】
ｍＡｂ‐ＤのＣＤＲL３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２５）：QQYNNYPFTである。
【０１２４】
ｍＡｂ‐ＤのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
DVQLAESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY
ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNSLF LQMTSLRSED TAMYYCARHG
YRYEGFDYWG QGTTLTVSS
【０１２５】
ｍＡｂ‐ＤのＣＤＲH１ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２７）：SFGMHである。
【０１２６】
ｍＡｂ‐ＤのＣＤＲH２ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２８）：YISSGSGTIYYADTVKGである。
【０１２７】
ｍＡｂ‐ＤのＣＤＲH３ドメインのアミノ酸配列は、（配列番号２９）：HGYRYEGFDYである。
【０１２８】
Ｇ．ヒト化抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ｄ
抗Ｂ７‐Ｈ３抗体ｍＡｂ‐Ｄの可変ドメインをヒト化した。いくつかの例では、結合活性を最適化するため、及び／又は抗原性エピトープを除去するため、及び／又は潜在的に不安定なアミノ酸残基を除去するために、代替的なヒト化可変ドメインを生成してよい。
【０１２９】
ｈｍＡｂ‐ＤのＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIK
【０１３０】
ｈｍＡｂ‐ＤのＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY 
ISSGSGTIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARHG
YRYEGFDYWG QGTTVTVSS
【０１３１】
Ｖ．キメラ抗原受容体
本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、単鎖可変断片（「抗Ｂ７‐Ｈ３‐ｓｃＦｖ」）又はキメラ抗原受容体（「抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＣＡＲ」）等の単一特異性単鎖分子であってよい。上述のように、ｓｃＦｖは、短い連結ペプチドを介して軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを一体に連結することによって作製される。第１世代ＣＡＲは典型的には、内因性ＴＣＲからのシグナルの一時トランスミッタであるＣＤ３ζ鎖からの細胞内ドメインを有していた。第２世代ＣＡＲは、Ｔ細胞に更なるシグナルを提供するために、様々な共刺激性タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ等）から、ＣＡＲの細胞質尾部への、追加の細胞内シグナリングドメインを有していた。第３世代のＣＡＲは、ＣＤ３ｚ‐ＣＤ２８‐４１ＢＢ又はＣＤ３ｚ‐ＣＤ２８‐ＯＸ４０といった複数のシグナリングドメインを組み合わせることによって、効力を更に増強する（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood 123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
【０１３２】
本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＣＡＲは、受容体の細胞内ドメインに融合した抗Ｂ７‐Ｈ３‐ｓｃＦｖを含む。抗Ｂ７‐Ｈ３‐ｓｃＦｖの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは好ましくはｈｍＡｂ‐Ｃ  ＶＬ（配列番号２０）及びｈｍＡｂ‐Ｃ  ＶＨ（配列番号２１）であるか、又は好ましくはｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＬ（配列番号３０）及びｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨ（配列番号３１）である。
【０１３３】
本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＣＡＲの細胞内ドメインは好ましくは：４１ＢＢ‐ＣＤ３ζ、ｂ２ｃ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２８‐４‐１ＢＢ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＦｃεＲＩγ、ＣＤ２８ｍｕｔ‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＯＸ４０‐ＣＤ３ζ、ＣＤ２８‐ＯＸ４０‐ＣＤ３ζ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４‐ＣＤ３ζ、ＣＤ４‐ＦｃεＲＩγ、ＣＤ８‐ＣＤ３ζ、ＦｃeＲＩγ、ＦｃεＲＩγＣＡＩＸ、へレグリン‐ＣＤ３ζ、ＩＬ‐１３‐ＣＤ３ζ又はＬｙ４９Ｈ‐ＣＤ３ζのうちのいずれの細胞内ドメインから選択される（Tettamanti, S. et al. (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor,” Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells,” Blood  123(15): 2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia,” Blood  122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62）。
【０１３４】
ＶＩ．多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子
本発明はまた、エピトープ結合部位を含み（好ましくは、本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又は本発明の本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、又は上記抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＨドメイン及び／若しくは上記抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬドメインを含み）、更に、第２のエピトープに免疫特異的に結合する第２のエピトープ結合部位を含み、上記第２のエピトープは、（ｉ）Ｂ７‐Ｈ３の異なるエピトープ、又は（ｉｉ）Ｂ７‐Ｈ３ではない分子のエピトープである、多重特異性（例えば二重特異性、三重特異性等）Ｂ７‐Ｈ３結合分子を対象とする。このような多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は好ましくは、標的細胞又は組織タイプに対して一意である抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組み合わせを含む。特に本発明は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープと、エフェクタ細胞、特にＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞の表面上に存在する分子のエピトープとに結合できる、多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。例えば本発明のこのようなＢ７‐Ｈ３結合分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＮＫＧ２Ｄに免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むように構成してよい。
【０１３５】
本発明の一実施形態は、「第１のエピトープ」及び「第２のエピトープ」に結合できるＢ７‐Ｈ３結合分子に関し、これらのエピトープは互いに同一ではない。このような二重特異性分子は、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、及び第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメインを含む。表記法「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第１の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」はそれぞれ、このような二重特異性分子の「第２の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。ある特定のエピトープが第１のエピトープ又は第２のエピトープのいずれとして指定されるかは無関係であり、このような表記法は、本発明の結合分子のポリペプチド鎖のドメインの存在又は配向のみに関連する。一実施形態では、このようなエピトープのうちの一方はヒトＢ７‐Ｈ３のエピトープであり、他方はＢ７‐Ｈ３の異なるエピトープであるか、又はＢ７‐Ｈ３ではない分子のエピトープである。特定の実施形態では、このようなエピトープのうちの一方はヒトＢ７‐Ｈ３のエピトープであり、他方は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）のエピトープである。特定の実施形態では、二重特異性分子は、３つ以上のエピトープ結合部位を含む。このような二重特異性分子は、少なくとも１つのＢ７‐Ｈ３のエピトープ及び少なくとも１つのＢ７‐Ｈ３ではない分子のエピトープに結合することになり、更にＢ７‐Ｈ３の追加のエピトープ及び／又はＢ７‐Ｈ３ではない分子の追加のエピトープに結合してよい。
【０１３６】
本発明は特に、二重特異性、三重特異性及び多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子（例えば二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価結合分子等）であって、上記分子は、上記分子を、Ｂ７‐Ｈ３の少なくとも１つのエピトープと、Ｂ７‐Ｈ３ではない第２の分子の少なくとも１つのエピトープとに配位結合できるようにすることができる、抗体のエピトープ結合断片（例えばＶＬ及びＶＨドメイン）を有する、二重特異性、三重特異性及び多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。上記分子のポリペプチドドメインのＶＬ及びＶＨドメインの選択は、このような多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子を構成するポリペプチド鎖が集合して、Ｂ７‐Ｈ３の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な少なくとも１つの官能性エピトープ結合部位と、Ｂ７‐Ｈ３ではない分子の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な少なくとも１つの官能性エピトープ結合部位とを形成するように、調整される。好ましくは、多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、上述のように、本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＨドメインのＣＤＲHのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、及び／又は本発明の本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬドメインのＣＤＲLのうちの１つ、２つ若しくは３つ全て、又は上記抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＨドメイン及び／若しくは上記抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬドメインを含む。
【０１３７】
Ａ．二重特異性抗体
本発明は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＢ７‐Ｈ３ではない分子のエピトープに同時に結合できる二重特異性抗体を包含する。いくつかの実施形態では、Ｂ７‐Ｈ３及びＢ７‐Ｈ３ではない第２の分子に同時に結合できる上記二重特異性抗体は、国際公開第１９９８／００２４６３号、国際公開第２００５／０７０９６６号、国際公開第２００６／１０７７８６号、国際公開第２００７／０２４７１５号、国際公開第２００７／０７５２７０号、国際公開第２００６／１０７６１７号、国際公開第２００７／０４６８９３号、国際公開第２００７／１４６９６８号、国際公開第２００８／００３１０３号、国際公開第２００８／００３１１６号、国際公開第２００８／０２７２３６号、国際公開第２００８／０２４１８８号、国際公開第２００９／１３２８７６号、国際公開第２００９／０１８３８６号、国際公開第２０１０／０２８７９７、国際公開第２０１００２８７９６号、国際公開第２０１０／０２８７９５号、国際公開第２０１０／１０８１２７号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１１／０８６０９１号、国際公開第２０１１／１３３８８６号、国際公開第２０１２／００９５４４号、国際公開第２０１３／００３６５２号、国際公開第２０１３／０７０５６５号、国際公開第２０１２／１６２５８３号、国際公開第２０１２／１５６４３０号、国際公開第２０１３／１７４８７３号、及び国際公開第２０１４／０２２５４０号に記載の方法のうちのいずれを用いて産生され、上記文献はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。
【０１３８】
Ｂ．Ｆｃドメインを有しない二重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、第１のエピトープ及び第２のエピトープに結合できる二重特異性ダイアボディであって、上記第１のエピトープはヒトＢ７‐Ｈ３のエピトープであり、第２のエピトープは、Ｂ７‐Ｈ３ではない分子、好ましくはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）のエピトープである。このようなダイアボディは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含み、最も好ましくは上記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖から構成され、その配列は、上記ポリペプチド鎖が互いに対して共有結合して、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及び第２のエピトープに同時に結合できる共有結合ダイアボディを形成することを可能とする。
【０１３９】
二重特異性ダイアボディのこのような実施形態の第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬ抗B7-H3-VL又はＶＬエヒ゜トーフ゜2）；第１の介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬ抗B7-H3-VLを含有する場合は）第２のエピトープ又は（上記第１のポリペプチド鎖がＶＬエヒ゜トーフ゜2を含有する場合は）Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０１４０】
二重特異性ダイアボディのこの実施形態の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；第１又は第２のエピトープに結合できるモノクローナル抗体のＶＬドメイン（即ちＶＬ抗B7-H3-VL又はＶＬエヒ゜トーフ゜2；及び上記ＶＬドメインは上記ダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖に含まれないよう選択される）；介在スペーサペプチド（リンカー１）；（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬ抗B7-H3-VLを含有する場合は）第２のエピトープ又は（上記第２のポリペプチド鎖がＶＬエヒ゜トーフ゜2を含有する場合は）Ｂ７‐Ｈ３に結合できるモノクローナル抗体のＶＨドメイン；任意にシステイン残基を含有する第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）；ヘテロ二量体促進ドメイン；及びＣ末端を含む（図１）。
【０１４１】
第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第２のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第１の抗原（即ちＢ７‐Ｈ３又は第２のエピトープを含有する分子）に対して特異的な第１の官能性エピトープ結合部位を形成する。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬドメインは、第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと相互作用して、第２の抗原（即ち第２のエピトープを含有する分子又はＢ７‐Ｈ３）に対して特異的な第２の機能性抗原結合部位を形成する。よって、第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインの選択は、ダイアボディのこれら２つのポリペプチド鎖が合わせて、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及び第２のエピトープの両方に結合できるＶＬ及びＶＨドメインを含む（即ちこれらが合わせて、ＶＬ抗B7-H3-VL／ＶＨ抗B7-H3-VH及びＶＬエヒ゜トーフ゜2/ＶＨエヒ゜トーフ゜2を含む）ように、調整される。
【０１４２】
最も好ましくは、介在スペーサペプチド（即ち上述のＶＬドメインとＶＨドメインとを隔てる「リンカー１（Linker 1）」）の長さは、上記ポリペプチド鎖の上記ＶＬ及びＶＨドメインが互いに対して結合する（例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個の介在リンカーアミノ酸残基からなる）のを実質的に又は完全に防止するよう選択される。従って第１のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。同様に、第２のポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、互いに対して結合することが実質的に又は全くできない。好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号３２）：GGGSGGGGを有する。
【０１４３】
上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）の長さ及び組成は、上述のような二量体化を促進する１つ又は複数のポリペプチドドメイン（即ち「ヘテロ二量体促進ドメイン」）の選択に基づいて選択される。典型的には、上記第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特に、採用した１つ以上のヘテロ二量体促進ドメインがシステイン残基を含まない場合、システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）が利用される。システイン含有第２の介在スペーサペプチド（リンカー２）は、１つ、２つ、３つ又は４つ以上のシステインを含有する。好ましいシステイン含有スペーサペプチド（リンカー２）は、配列GGCGGG（配列番号３３）を有する。あるいは、リンカー２はシステインを含まず（例えば、GGG、GGGS（配列番号３４）、LGGGSG（配列番号３５）、GGGSGGGSGGG（配列番号３６）、ASTKG（配列番号３７）、LEPKSS（配列番号３８）、APSSS（配列番号３９）等）、以下で説明されるシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインが使用される。任意に、システイン含有リンカー２及びシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインの両方が使用される。
【０１４４】
ヘテロ二量体促進ドメインは、一方のポリペプチド鎖におけるGVEPKSC（配列番号４０）又はVEPKSC（配列番号４１）又はAEPKSC（配列番号４２）、及び他方のポリペプチド鎖におけるGFNRGEC（配列番号４３）又はFNRGEC（配列番号４４）であってもよい（米国特許第２００７／０００４９０９号）。
【０１４５】
ある好ましい実施形態では、ヘテロ二量体促進ドメインは、対向する電荷のタンデム反復コイルドメイン、例えば、グルタミン酸残基がｐＨ７において負の電荷を形成する「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号４５：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）と、リシン残基がｐＨ７において正の電荷形成する「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４６：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）とを含む。このような荷電ドメインの存在により、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の関連付けが促進され、従ってヘテロ二量体形成が促進される。上述のＥコイル及びＫコイルの配列の、１つ又は複数のシステイン残基を含むような修飾を含む、ヘテロ二量体促進ドメインを利用してよい。このようなシステイン残基の存在により、一方のポリペプチド鎖に存在するコイルが、他方のポリペプチド鎖に存在する相補的なコイルと共有結合し、これにより上記ポリペプチド鎖を互いに共有結合させて、ダイアボディの安定性を向上できる。特に好ましい例は、アミノ酸配列EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号４７）を有する修飾されたＥコイルと、アミノ酸配列 KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４８）を有する修飾されたＫコイルとを含む、ヘテロ二量体促進ドメインである。
【０１４６】
国際公開第２０１２／０１８６８７号に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するために、ダイアボディを、ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含有するように修飾してよい。最も好ましくは、このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ダイアボディのポリペプチド鎖のＣ末端に配置されることになる。アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは複数の小さな分子結合部位を有し、これによりアルブミンは他のタンパク質に非共有結合して血清半減期を延長できる。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定した３重螺旋束を形成する４６個のアミノ酸残基からなり、広範なアルブミン結合特異性を有する（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬物動態特性を改善するための、血清結合タンパク質の特に好ましいポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びより好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号４９）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。
【０１４７】
国際公開第２０１２／１６２０６８号（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号４９の「脱免疫化（deimmunized）」変異型は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は排除する能力を有する。組み合わさった突然変異の結果に基づいて、以下の置換の組み合わせが、このような脱免疫化ＡＢＤを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｄ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ、又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLID66NAKS70 A71EGVKALIDE ILAALP（配列番号５０）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号５１）
又はアミノ酸配列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP（配列番号５２）
を有する、変異型脱免疫化ＡＢＤが特に好ましい。というのは、このような脱免疫化ＡＢＤは、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、略野生型の結合を呈するためである。従って、ＡＢＤを有するこのようなダイアボディの上記第１のポリペプチド鎖は、好ましくはこのようなポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに対してＣ末端に位置決めされることによって、上記Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインとＡＢＤ（これは好ましくは脱免疫化ＡＢＤである）との間に介在する、第３のリンカー（リンカー３）を含有する。このようなリンカー３の好ましい配列は、配列番号３４：GGGSである。
【０１４８】
Ｃ．Ｆｃドメインを含有する多重特異性ダイアボディ
本発明の一実施形態は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及び第２のエピトープ（即ちＢ７‐Ｈ３の異なるエピトープ、又はＢ７‐Ｈ３ではない分子のエピトープ）に結合できる、Ｆｃドメインを含む多重特異性ダイアボディに関する。上記ダイアボディポリペプチド鎖のうちの一方又は両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを追加して、上記ダイアボディ鎖の複合体化によってＦｃ領域が形成されるようにすると、上記ダイアボディの生物学的半減期が増大し、及び／又は価数が変化する。このようなダイアボディは、互いに共有結合することによって、Ｂ７‐Ｈ３  のエピトープ及び第２のエピトープに同時に結合できる共有結合したダイアボディを形成できる配列を有する、２つ以上のポリペプチド鎖を含む。上記ダイアボディポリペプチドの両方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、２鎖二重特異性Ｆｃ領域含有ダイアボディの形成が可能となる（図２）。
【０１４９】
あるいは、上記ダイアボディポリペプチドのうちの一方にＩｇＧ  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを組み込むと、より複雑な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディの形成が可能となる（図３Ａ〜３Ｃ）。図３Ｃは、定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン及び定常重鎖ＣＨ１ドメインを有する代表的な４鎖ダイアボディを示すが、このようなドメインの断片及び他のポリペプチドを代わりに採用してもよい（例えば図３Ａ及び３Ｂ、米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号；米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号及び米国公開特許第２００９‐００６０９１０号；欧州公開特許第２７１４０７９号；欧州公開特許第２６０１２１６号；欧州公開特許第２３７６１０９号；欧州公開特許第２１５８２２１号、及び国際公開第２０１２／１６２０６８号；国際公開第２０１２／０１８６８７号；国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。従って例えば、ＣＨ１ドメインの代わりに、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列GVEPKSC（配列番号４０）、VEPKSC（配列番号４１）又はAEPKSC（配列番号４２）を有するペプチドを採用してよく、またＣＬドメインの代わりに、ヒトκ軽鎖のＣ末端６アミノ酸、GFNRGEC（配列番号４３）又はFNRGEC（配列番号４４）を採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なペプチドを図３Ａに示す。あるいは、又は更に、対向する電荷のタンデムコイルドメイン、例えば「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号４５：EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK又は配列番号４７：EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK）；及び「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４６：KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE又は配列番号４８：KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE）を含むペプチドを採用してよい。４鎖ダイアボディを含有する代表的なコイルドメインを図３Ｂに示す。
【０１５０】
本発明の二Ｆｃドメイン含有分子は、更なる介在スペーサペプチド（リンカー）を含んでよく、このようなリンカーは一般に、ヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル若しくはＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間、及び／又はＣＨ２‐ＣＨ３ドメインと可変ドメイン（即ちＶＨ若しくはＶＬ）との間に組み込まれる。典型的には、この追加のリンカーは３〜２０個のアミノ酸残基を含み、また任意にＩｇＧヒンジドメインの全体又は一部分（好ましくはＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分）を含有してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディ分子において採用できるリンカーとしては：GGGS（配列番号３４）、LGGGSG（配列番号３５）、GGGSGGGSGGG（配列番号３６）、ASTKG（配列番号３７）、LEPKSS（配列番号３８）、APSSS（配列番号３９）、APSSSPME（配列番号５３）、VEPKSADKTHTCPPCP（配列番号５４）、LEPKSADKTHTCPPC（配列番号５５）、DKTHTCPPCP（配列番号５６）、GGC、及びGGGが挙げられる。クローニングを容易にするために、GGG又はGGCの代わりにLEPKSS（配列番号３８）を使用してよい。更に、アミノ酸ＧＧＧ又はLEPKSS（配列番号３８）の直後にDKTHTCPPCP（配列番号５６）を続けることによって、代替リンカー：GGGDKTHTCPPCP（配列番号５７）；及びLEPKSSDKTHTCPPCP（配列番号５８）を形成してよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子は、リンカーに加えて又はリンカーに代えて、ＩｇＧヒンジドメインを組み込んでよい。例示的なヒンジドメインとしては：ＩｇＧ１からのEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号７）；ＩｇＧ２からのERKCCVECPPCP（配列番号８）；ＩｇＧ４からのESKYGPPCPSCP（配列番号１０）；及び鎖交換を低減するための安定化Ｓ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ヒンジ変異型からのESKYGPPCPPCP（配列番号１１）が挙げられる（Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスに従って番号付与）。
【０１５１】
図３Ａ〜３Ｃに提示されているように、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは４つの鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。第２及び第４のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、第１／第３のポリペプチド鎖と第２／第４のポリペプチド鎖との二量体化を促進する。第３及び第４のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメイン、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖のＶＬ及び／又はＶＨドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は四重特異性の４価結合が可能となる。表記法「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第３の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。同様に、表記法「ＶＬ４」及び「ＶＨ４」はそれぞれ、このようなダイアボディの「第４の」エピトープに結合する軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを指す。本発明の代表的な４鎖二重特異性Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表１に提示する。
【表１】
2019520308.tif 000008
【０１５２】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計４つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図３Ａ〜３Ｃ）。本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＢ７‐Ｈ３の同一のエピトープ又はＢ７‐Ｈ３の異なるエピトープに結合できる）、及び第２の分子に対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらは第２の分子の同一のエピトープ又は第２の分子の異なるエピトープに結合できる）を含む。好ましくは、第２の分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）である。
【０１５３】
更なる実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有ダイアボディは、３つのポリペプチド鎖を含んでよい。このようなダイアボディの第１のポリペプチドは、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。このようなダイアボディの第２のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。このようなダイアボディの第３のポリペプチドは、ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含む。従ってこのようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、上記第１の抗原（即ちＢ７‐Ｈ３又は第２のエピトープを含む分子）に結合できるＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合部位、及び上記第２の抗原（即ち第２のエピトープを含む分子又はＢ７‐Ｈ３）に結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位を形成する。上記第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメインのシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このような二重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図４Ａ及び４Ｂは、このようなダイアボディの構造を示す。このようなＦｃ領域含有ダイアボディは、２つの配向（表２）のうちのいずれを有してよい。
【表２】
2019520308.tif 000009
【０１５４】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、合計３つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、２価（即ち２つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである（図４Ａ〜４Ｂ）。本発明の二重特異性、２価Ｆｃ含有ダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び第２の分子に特異的な１つのエピトープ結合部位を含む。好ましくは、この第２の分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）である。
【０１５５】
更なる実施形態では、上記Ｆｃドメイン含有ダイアボディは、合計５つのポリペプチド鎖を含んでよい。ある特定の実施形態では、上記５つのポリペプチド鎖のうちの２つは、同一のアミノ酸配列を有する。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第１のポリペプチド鎖は、ＶＨ１及び重鎖定常領域を含有する抗体の重鎖であってよい。このようなダイアボディの第２及び第５のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。このようなダイアボディの上記第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、上記第１／第３のポリペプチド鎖のＶＨ１に対して相補的なＶＬ１を含有する抗体の軽鎖であってよい。上記第１、第２及び／又は第５のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって構成できる。このようなダイアボディの第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメイン；（ｉｖ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｖ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｖｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有し、上記ヘテロ二量体促進ドメインは、上記第３の鎖と上記第４の鎖との二量体化を促進する。このようなダイアボディの第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）上記ダイアボディの第３のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。
【０１５６】
従って、このようなダイアボディの上記第１及び第２のポリペプチド鎖と上記第３及び第５のポリペプチド鎖とは、互いに連結して、第１のエピトープに結合できる２つのＶＬ１／ＶＨ１エピトープ結合部位を形成する。このようなダイアボディの上記第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに連結して、第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２エピトープ結合部位、及び第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。上記第１及び第３のポリペプチドは、それぞれの定常領域のシステイン残基が関わるジスルフィド結合によって、互いに結合する。特に上記第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに複合体化して、Ｆｃドメインを形成する。このような多重特異性ダイアボディは、強度が増強されている。図５は、このようなダイアボディの構造を示す。ＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性又は三重特異性である結合が可能となることが理解されるだろう。本明細書において提示されるように、これらのドメインは好ましくは、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ、第２の分子のエピトープ、及び任意に第３の分子のエピトープに結合するように選択される。
【０１５７】
上記ポリペプチド鎖のＶＬ及びＶＨドメインは、所望のエピトープに特異的なＶＬ／ＶＨ結合部位を形成するよう選択される。上記ポリペプチド鎖の連結によって形成されるＶＬ／ＶＨ結合部位は、同一であっても異なっていてもよく、これにより、単一特異性、二重特異性、三重特異性又は四重特異性である４価結合が可能となる。特に上記ＶＬ及びＶＨドメインは、多重特異性ダイアボディが、第１のエピトープに関する２つの結合部位及び第２のエピトープに関する２つの結合部位、又は第１のエピトープに関する３つの結合部位及び第２のエピトープに関する１つの結合部位、又は（図５に示すように）第１のエピトープに関する２つの結合部位、第２のエピトープに関する１つの結合部位及び第３のエピトープに関する１つの結合部位を含むように選択してよい。本発明の代表的な５鎖Ｆｃドメイン含有ダイアボディのポリペプチド鎖の一般構造を表３に示す。
【表３】
2019520308.tif 000010
【０１５８】
ある具体的実施形態では、本発明のダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３に免疫特異的な２つのエピトープ結合部位（これらはＢ７‐Ｈ３の同一のエピトープ又はＢ７‐Ｈ３の異なるエピトープに結合してよい）、及び第２の分子に特異的な２つのエピトープ結合部位（これらは第２の分子の同一のエピトープ又は第２の分子の異なるエピトープに結合してよい）を有する、合計５つのポリペプチド鎖からなる、二重特異性、４価（即ち４つのエピトープ結合部位を有する）、Ｆｃ含有ダイアボディである。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３に免疫特異的な３つのエピトープ結合部位（これらはＢ７‐Ｈ３の同一のエピトープ又はＢ７‐Ｈ３の２つ若しくは３つの異なるエピトープに結合してよい）、及び第２の分子に特異的な１つのエピトープ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明の二重特異性、４価、Ｆｃ含有ダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３に免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び第２の分子に特異的な３つのエピトープ結合部位（これらは第２の分子同一のエピトープ又は第２の分子の２つ若しくは３つの異なるエピトープに結合してよい）を含む。上述のように、ＶＬ及びＶＨドメインは、三重特異性結合を可能とするように選択してよい。従って本発明は、三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディも包含する。本発明の三重特異性４価Ｆｃ含有ダイアボディは、Ｂ７‐Ｈ３に対して免疫特異的な２つのエピトープ結合部位、第２の分子に対して免疫特異的な１つのエピトープ結合部位、及び第３の分子に対して免疫特異的な１つのエピトープ結合部位を含む。特定の実施形態では、第２の分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）である。特定の実施形態では、第２の分子はＣＤ３であり、第３の分子はＣＤ８である。
【０１５９】
Ｄ．Ｆｃドメインを含有する３価結合分子
本発明の更なる実施形態は、第１のエピトープ、第２のエピトープ及び第３のエピトープに同時に結合できるＦｃドメインを含み、上記エピトープのうちの少なくとも１つは別のものと同一ではない、３価結合分子に関する。このような二重特異性３価結合性分子は３つのエピトープ結合部位を含み、そのうちの２つは、結合部位Ａ及び結合部位Ｂを提供するダイアボディ型結合ドメインであり、１つは、結合部位Ｃを提供するＦａｂ型結合ドメイン（又はｓｃＦｖ型結合ドメイン）である（例えば図６Ａ〜６Ｆ、並びにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号を参照）。このような３価結合分子は従って、第１のエピトープに結合できる「ＶＬ１」／「ＶＨ１」ドメイン、並びに第２のエピトープに結合できる「ＶＬ２」／「ＶＨ２」ドメイン、並びに上記３価結合分子の「第３の」エピトープに結合できる「ＶＬ３」及び「ＶＨ３」ドメインを含む。「ダイアボディ型結合ドメイン」は、ダイアボディ、特に上述のようなＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ中に存在するエピトープ結合のタイプである。「Ｆａｂ型結合ドメイン」及び「ｓｃＦｖ型結合ドメイン」はそれぞれ、イムノグロブリン軽鎖のＶＬドメインと、相補的なイムノグロブリン重鎖のＶＨドメインとの相互作用によって形成される、エピトープ結合部位である。Ｆａｂ型結合ドメインは、Ｆａｂ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合部位しか含まないが、ダイアボディ型結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖は少なくとも２つのエピトープ結合部位を含むという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。同様に、ｓｃＦｖ型結合ドメインも、これらが単一のエピトープ結合部位しか含まないという点で、ダイアボディ型結合ドメインとは異なる。よって本明細書において使用される場合、Ｆａｂ型及びｓｃＦｖ型結合ドメインは、ダイアボディ型結合ドメインとは別個である。
【０１６０】
典型的には、本発明の３価結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖を含む（図６Ａ〜６Ｂを参照）が、上記分子は、例えばこれらのポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合によって）互いに融合させることによって、又はこれらのポリペプチドを「分割（dividing）」して追加のポリペプチド鎖を形成することによって、又はより少数若しくは追加のポリペプチド鎖をジスルフィド結合によって連結することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を含むことができる。図６Ｃ〜６Ｆは、３つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことによって、本発明のこの態様を図示している。図６Ａ〜６Ｆに提示されているように、本発明の３価結合分子は、上記ダイアボディ型結合ドメインがＦｃドメインに対するＮ末端（図６Ａ、６Ｃ及び６Ｄ）又はＣ末端（図６Ｂ、６Ｅ及び６Ｆ）となる交互の配向を有してよい。
【０１６１】
特定の実施形態では、本発明のこのような３価結合分子の第１のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメイン；及び（ｉｖ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記ＶＬ１及びＶＬ２ドメインは、表３（図６Ａ及び６Ｂも参照）に提示されるように、上記ＣＨ２‐ＣＨ３含有ドメインに対してＮ末端又はＣ末端に位置する。このような実施形態の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ヘテロ二量体促進ドメインを含有する。このような実施形態の第３のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＨ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＣＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。上記第３のポリペプチド鎖は、ＶＨ３及び重鎖定常領域を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、重鎖であってよい。このような実施形態の第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；及び（ｉｉ）ＣＬ含有ドメインを含有する。上記第４のポリペプチド鎖は、上記第３のポリペプチド鎖のＶＨ３に対して相補的なＶＬ３を含有する抗体、又は上記ドメインを含有するポリペプチドの、軽鎖であってよい。上記第３又は第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいはこれらは、組み換えによって、合成によって、又は他の手段によって構成できる。
【０１６２】
上記第１及び第２のポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメインは、介在スペーサペプチドによって、このようなポリペプチド鎖の重鎖可変ドメインから隔てられ、上記介在スペーサリンカーは、これらのＶＬ１／ＶＨ２（又はこれらのＶＬ２／ＶＨ１）ドメインを一体に連結して、第１又は第２のエピトープに結合できるエピトープ結合部位を形成することを可能にするには短すぎる長さを有する。この目的のために好ましい介在スペーサペプチド（リンカー１）は、配列（配列番号３２）：GGGSGGGGを有する。上記３価結合分子の他のドメインは、任意にシステイン残基を含む、１つ又は複数の介在スペーサペプチド（リンカー）によって隔てられていてよい。特に上述のように、このようなリンカーは典型的には可変ドメイン（即ちＶＨ又はＶＬ）とペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）との間、及び上記ペプチドヘテロ二量体促進ドメイン（例えばＥコイル又はＫコイル）とＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとの間に組み込まれる。３価結合分子の生成に有用な例示的なリンカーは上で提示されており、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０８１号；及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１５／３３０７６号にも提示されている。従ってこのような３価結合分子の第１及び第２のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第１のエピトープに結合できるＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合できるＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。このような３価結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖は、一体に連結して、第３のエピトープに結合できるＶＬ３／ＶＨ３結合部位を形成する。
【０１６３】
上述のように、本発明の３価結合分子は、３つのポリペプチドを含んでよい。３つのポリペプチド鎖を含む３価結合分子は、（例えば介在スペーサペプチド（リンカー４）を用いて）第４のポリペプチドＮ末端のドメインを第３のポリペプチドのＶＨ３含有ドメインに連結することによって得ることができる。あるいは、以下の３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ３含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ３含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する本発明の３価結合分子の第３のポリペプチド鎖が利用され、ここでＶＬ３及びＶＨ３は、これらのドメインが連結してエピトープ結合部位を形成できるようにするために十分な長さ（少なくとも９以上のアミノ酸残基）を有する介在スペーサペプチドによって、互いから隔てられる。この目的に関して好ましい１つの介在スペーサペプチドは、配列：GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号５９）を有する。
【０１６４】
このような３価結合性分子のＶＬ１／ＶＨ１、ＶＬ２／ＶＨ２及びＶＬ３／ＶＨ３ドメインは異なっていてよく、それによって単一特異性、二重特異性又は三重特異性の結合が可能となることが理解されるだろう。特に、ＶＬ及びＶＨドメインは、３価結合分子が、第１のエピトープに対する２つの結合部位及び第２のエピトープに対する１つの結合部位、又は第１のエピトープに対する１つの結合部位及び第２のエピトープに対する２つの結合部位、又は第１のエピトープに対する１つの結合部位、第２のエピトープに対する１つの結合部位及び第３のエピトープに対する１つの結合部位を含むように、選択してよい。
【０１６５】
しかしながら本明細書に記載されているように、これらのドメインは好ましくは、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ、第２の分子のエピトープ及び第３の分子のエピトープに結合するよう選択される。特定の実施形態では、第２の分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）である。特定の実施形態では、第３の分子はＣＤ８である。
【０１６６】
本発明の代表的な３価結合性分子のポリペプチド鎖の一般構造を、図６Ａ〜６Ｆ及び表４で提供する。
【表４】
2019520308.tif 000011
【０１６７】
本発明の一実施形態は、Ｂ７‐Ｈ３に関する２つのエピトープ結合部位、及び第２の分子に関する１つのエピトープ結合部位を含む、３価結合分子に関する。Ｂ７‐Ｈ３に関する２つのエピトープ結合部位は、同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合してよい。本発明の別の実施形態は、Ｂ７‐Ｈ３に関する１つのエピトープ結合部位、及び第２の分子に関する２つのエピトープ結合部位を含む、二重特異性３価結合分子に関する。第２の分子に関する２つのエピトープ結合部位は、第２の分子の同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合してよい。本発明の更なる実施形態は、Ｂ７‐Ｈ３に対する１つのエピトープ結合部位、第２の分子に対する１つのエピトープ結合部位及び第３の分子に対する１つのエピトープ結合部位を含む、三重特異性３価結合分子に関する。特定の実施形態では、第２の分子は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）である。特定の実施形態では、第２の分子はＣＤ３であり、第３の分子はＣＤ８である。上述のように、このような３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含んでよい。
【０１６８】
ＶＩＩ．Ｆｃドメインの修飾
本発明のＦｃドメイン含有分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子）のＦｃドメインは、完全なＦｃドメイン（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃドメイン）、又は単にＦｃドメインの断片であってよい。任意に、本発明のＦｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、Ｃ末端リシンアミノ酸残基を含まない。
【０１６９】
従来の免疫機能では、抗体‐抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞毒性、肥満細胞脱顆粒及び食作用等のエフェクタ機能から、リンパ球増殖及び抗体分泌を制御するもの等の免疫調節性シグナルにまで及ぶ、広範な応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体又は免疫複合体のＦｃドメインの、造血細胞上の特殊化された細胞表面受容体への結合によって開始される。抗体及び免疫複合体によってトリガされる細胞応答の多様性は、３つのＦｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の構造不均質性によって得られる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち免疫系増強）受容体であり；ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は阻害性（即ち免疫系減衰）受容体である。更に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用は、エンドソームから細胞表面へのＩｇＧ分子の再循環及び血中への放出を仲介する。例示的な野生型ＩｇＧ１（配列番号１２）、ＩｇＧ２（配列番号１３）、ＩｇＧ３（配列番号１４）及びＩｇＧ４（配列番号１５）のアミノ酸配列は、既に提示されている。
【０１７０】
Ｆｃドメインの修飾は、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化、又はエフェクタ機能の変化につながり得る。従って、本発明のＦｃドメイン含有Ｂ７‐Ｈ３結合分子をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の治療におけるこのような分子の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。エフェクタ機能活性が与えられた又は変更された本発明のこのような分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。
【０１７１】
従って特定の実施形態では、本発明のＦｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、操作された可変Ｆｃドメインであってよい。本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、１つ又は複数のＦｃ受容体（例えば１つ又は複数のＦｃγＲ）に結合できる能力を有してよいが、より好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、（野生型Ｆｃドメインが呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）若しくはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が変化しており、例えばある活性化受容体への結合が増強されており、及び／又は１つ若しくは複数の阻害性受容体に結合する能力が低下しているか若しくは上記能力を有しない。従って、本発明の二重特異性Ｆｃドメイン含有分子のＦｃドメインは、完全ＦｃドメインのＣＨ２ドメインのうちのある程度若しくは全体及び／若しくはＣＨ３ドメインのうちのある程度若しくは全体を含んでよく、又は（例えば完全ＦｃドメインのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインに対する１つ若しくは複数の挿入及び／若しくは１つ若しくは複数の欠失を含んでよい）変異型ＣＨ２及び／若しくは変異型ＣＨ３配列を含んでよい。このようなＦｃドメインは、非Ｆｃポリペプチド部分を含んでよく、又は自然に発生しない完全Ｆｃドメインの部分を含んでよく、又はＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインの自然に発生しない配向を含んでよい（例えば２つのＣＨ２ドメイン若しくは２つのＣＨ３領域、若しくはＮ末端からＣ末端への方向において、ＣＨ３ドメインと、これが連結したＣＨ２ドメイン、等）。
【０１７２】
変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾は当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。表５は、活性化受容体への結合を増大させる、及び／又は阻害性受容体への結合を低下させる例示的な修飾の、（番号付与及び置換は配列番号１２のアミノ酸配列に対するものである）単一、二重、三重、四重及び五重置換のリストを示す。
【表５】
2019520308.tif 000012
【０１７３】
ＣＤ３２Ｂへの結合が低下した、及び／又はＣＤ１６Ａへの結合が増大した、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインの例示的な変異型は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせで、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン内に存在してよい。一実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記変異型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインは、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。
【０１７４】
特定の実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子のＦｃドメインに関して、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１２）が呈する結合に対して）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下している（又はこれらに略結合しない）ことが好ましい。ある具体的実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、ＡＤＣＣエフェクタ機能が低下したＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む。ある好ましい実施形態では、このようなＢ７‐Ｈ３結合分子のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、以下の置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｑ、及びＮ２９７Ｇのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む。別の実施形態では、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｎ２９７Ｇ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換又はＤ２６５Ａ置換を含有するが、それはこれらの突然変異がＦｃＲ結合を消失させるためである。あるいは、（野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号１２）が呈する結合及びエフェクタ機能に対して）ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）に対する結合が元来低い（又は略結合しない）、及び／又はエフェクタ機能が元来低い、天然のＦｃドメインのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを利用する。ある具体的実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号１３）又はＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号４）を含む。ＩｇＧ４  Ｆｃドメインを利用する場合、本発明は、上述のヒンジドメインＳ２２８Ｐ置換（例えば配列番号１１を参照）等の安定化突然変異の導入も包含する。Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ｑ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況下では、これらの置換は採用しないことが好ましい。
【０１７５】
エフェクタ機能が低下したか又は消失した、本発明のＦｃドメイン含有分子のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧ１配列は、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａの置換を含む（配列番号６０）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０１７６】
Ｆｃドメインを含むタンパク質の血清半減期は、ＦｃＲｎに関するＦｃドメインの結合親和性を増大させることによって増大させることができる。本明細書において使用される場合、用語「半減期（half-life）」は、投与後の分子の平均生存時間の尺度となる、分子の薬物動態特性を意味する。半減期は、血清中で（即ち循環半減期）又は他の組織中で測定した場合に、分子の既知の量の５０パーセント（５０％）が被検体の身体（例えばヒト患者若しくは他の哺乳類）又はその特定の体腔から排除されるために必要な時間として表すことができる。一般に、半減期の増大は、投与される分子の循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増大につながる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、変異型Ｆｃドメインを含み、上記変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対して少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、従って上記分子は、（野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して）増大した半減期を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、変異型ＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、上記変異型Ｆｃドメインは、２３８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２５６、２６５、２７２、２８６、２８８、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６からなる群から選択される１つ又は複数の位置に半減期延長アミノ酸置換を含む。Ｆｃドメイン含有分子の半減期を増大させることができる多数の突然変異が当該技術分野において公知であり、例えばＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば：米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第７，０８３，７８４号；米国特許第７，２１７，７９７号；米国特許第８，０８８，３７６号；米国公開特許第２００２／０１４７３１１号；米国公開特許第２００７／０１４８１６４号；並びに国際公開第９８／２３２８９号；国際公開第２００９／０５８４９２号；及び国際公開第２０１０／０３３２７９号（これらは参照によりその全体が本出願に援用される）に記載されている突然変異を参照。半減期が増強されたＢ７‐Ｈ３結合分子としては、Ｆｃドメイン残基２５０、２５２、２５４、２５６、２５７、２８８、３０７、３０８、３０９、３１１、３７８、４２８、４３３、４３４、４３５及び４３６のうちの２つ以上における置換、特にＴ２５０Ｑ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｋ２８８Ｄ、Ｔ３０７Ｑ、Ｖ３０８Ｐ、Ａ３７８Ｖ、Ｍ４２８Ｌ、Ｎ４３４Ａ、Ｈ４３５Ｋ及びＹ４３６Ｉから選択される２つ以上の置換を含む変異型Ｆｃドメインを有するものも挙げられる。
【０１７８】
ある具体的実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は：
（Ａ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｂ）Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；
（Ｃ）Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；
（Ｄ）Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ；
（Ｅ）Ｔ３０７Ｑ及びＮ４３４Ａ；
（Ｆ）Ａ３７８Ｖ及びＮ４３４Ａ；
（Ｇ）Ｎ４３４Ａ及びＹ４３６Ｉ；
（Ｈ）Ｖ３０８Ｐ及びＮ４３４Ａ；又は
（Ｉ）Ｋ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋ
の置換を含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する。
【０１７９】
ある好ましい実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、置換：Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅのうちのいずれの１つ、２つ又は３つを含む変異型ＩｇＧ  Ｆｃドメインを有する。本発明は更に：
（Ａ）エフェクタ機能及び／又はＦｃγＲを変化させる、１つ又は複数の突然変異；並びに
（Ｂ）血清半減期を延長させる、１つ又は複数の突然変異
を含む可変Ｆｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３結合分子を包含する。
【０１８０】
Ｆｃドメイン含有第１及び第３のポリペプチド鎖が同一ではない特定の抗体、ダイアボディ及び３価結合分子に関して、２つの第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３のドメイン間、又は２つの第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間でのホモ二量体化の発生を低減又は防止することが望ましい。このようなポリペプチド鎖のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインは配列において同一である必要はなく、有利には２つのポリペプチド鎖間の複合体形成を促進するために修飾される。例えば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（knob）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（hole）」と対合させて、ヘテロ二量体化を促進できる。このような一連の突然変異は、Ｆｃドメインを形成するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドのいずれのペアに施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えばRidgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35;及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。
【０１８１】
好ましいノブは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、ＩｇＧ  Ｆｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体を、二重特異性ヘテロ二量体Ｆｃドメイン含有分子から精製するのを補助するために、好ましくは、第３のポリペプチド鎖のホール担持ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのタンパク質Ａ結合部位を、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）におけるアミノ酸置換によって変異させる。このようにして、ホール担持第３のポリペプチド鎖ホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方で二重特異性ヘテロ二量体は、第１のポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。代替実施形態では、ホール担持第３のポリペプチド鎖は、４３４位及び４３５位にアミノ酸置換を組み込んでよい（Ｎ４３４Ａ／Ｎ４３５Ｋ）。
【０１８２】
本発明のＦｃドメイン含有分子の第１のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧアミノ酸配列は、「ノブ担持」配列（配列番号６１）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNHYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１８３】
２つのポリペプチド鎖（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖）を有する、本発明のＦｃドメイン含有分子の第２のポリペプチド鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに関する好ましいＩｇＧアミノ酸配列は、「ホール担持」配列（配列番号６２）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE 
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 
ALHNRYTQKS LSLSPGX
を有し、ここでＸはリシン（Ｋ）であるか又は不在である。
【０１８４】
上述のように、配列番号６１及び配列番号６２のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、アラニンによる２３４位の置換及びアラニンによる２３５位の置換を含み、従って、（野生型Ｆｃドメイン（配列番号１２）が示す結合と比べて）ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）又はＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）への結合が低下した（又は結合を実質的に示さない）Ｆｃドメインを形成する。本発明はまた、野生型アラニン残基、Ｆｃドメインのエフェクタ機能及び／又はＦγＲ結合活性を修正する代替的な及び／又は更なる置換を含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。本発明はまた、１つ又は複数の半減期延長アミノ酸置換を更に含む、このようなＣＨ２‐ＣＨ３ドメインも包含する。特に本発明は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅを更に含む、このようなホール担持及びノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを包含する。
【０１８５】
第１のポリペプチド鎖が、配列番号６１のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。しかしながら、理解されるように、第１のポリペプチド鎖中に「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号６２）を採用でき、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号６１）は、２つのポリペプチド鎖を有する本発明のＦｃドメイン含有分子の第２のポリペプチド鎖中（又は３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を有するＦｃドメイン含有分子の第３のポリペプチド鎖中）に採用される。
【０１８６】
他の実施形態では、本発明は、国際公開第２００７／１１０２０５号；国際公開第２０１１／１４３５４５号；国際公開第２０１２／０５８７６８号；国際公開第２０１３／０６８６７号（これらは全て、参照によりその全体が本出願に援用される）において開示されているもの等の当該技術分野で公知の突然変異を用いて、ホモ二量体化よりもヘテロ二量体化を指向するよう操作されたＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子を包含する。
【０１８７】
ＶＩＩＩ．エフェクタ細胞結合能力
本明細書に記載されているように、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子を含む本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、標的細胞又は組織タイプに対して一意である抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組み合わせを含むように操作できる。特に本発明は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープと、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞といったエフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープとに結合できる、多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子に関する。例えば本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＮＫＧ２Ｄに免疫特異的に結合するエピトープ部位を含むよう構成してよい。本発明はまた、ＣＤ３のエピトープ及びＣＤ８のエピトープに結合できる三重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子にも関する（例えば国際公開第２０１５／０２６８９４号を参照）。
【０１８８】
Ａ．ＣＤ２結合能力
一実施形態では、本発明の二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ２のエピトープに結合できる。ＣＤ２は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上に見られる細胞接着分子である。ＣＤ２は、恐らくＮＫ細胞ナノチューブ形成の促進因子として、ＮＫ細胞の細胞毒性を増強する（Mace, E.M. et al. (2014) “Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity,” Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci, C.J. et al. (2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation,” PLoS One 7(10):e47664:1-12）。ＣＤ２に特異的に結合する分子は、抗ＣＤ２抗体「Ｌｏ‐ＣＤ２ａ」を含む。
【０１８９】
Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号６３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）；
EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR
IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK
FNYRFAYWGQ GTLVTVSS
【０１９０】
Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメインのアミノ酸配列（ＡＴＣＣ受託番号：１１４２３；配列番号６４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DVVLTQTPPT LLATIGQSVS ISCRSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ 
PLIYLVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP
YTFGAGTKLE LK
【０１９１】
Ｂ．ＣＤ３結合能力
一実施形態では、本発明の二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ３のエピトープに結合できる。ＣＤ３は、４つの別個の鎖で構成されたＴ細胞共受容体である（Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14）。哺乳類では、この複合体は１つのＣＤ３γ鎖、１つのＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３の不在時、ＴＣＲは適切に集合せず崩壊する（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177).  CD3 is found bound to the membranes of all mature T-cells, and in virtually no other cell type (see, Janeway, C.A. et al. (2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer,” Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,” Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139）。ＣＤ３に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ３抗体「ＣＤ３  ｍＡｂ‐１」及び「ＯＫＴ３」が挙げられる。抗ＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１は、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）に結合できる。
【０１９２】
ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインＶＨ（１）のアミノ酸配列（配列番号６５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
【０１９３】
ＣＤ３  ｍＡｂ‐１の代替的なＶＨドメインＶＨ（２）のアミノ酸配列（配列番号６６）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインＶＨ（１）との差異は二重下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
【０１９４】
ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号６７）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG
【０１９５】
ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインＶＨ（１）（配列番号６５）をＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７）と共に用いて、本発明による官能性ＣＤ３結合分子を形成できる。同様に、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインＶＨ（２）（配列番号６６）をＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７）と共に用いて、本発明による官能性ＣＤ３結合分子を形成できる。
【０１９６】
以下に記載されるように、本発明をより良好に説明するために、二重特異性Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３結合分子を生成した。Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３構造のうちのいくつかでは、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１の変異型を採用した。変異型「ＣＤ３  ｍＡｂ‐１（Ｄ６５Ｇ）」は、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７）と、Ｄ６５Ｇ置換（Ｋａｂａｔ位置６５、配列番号６５の残基６８に対応）を有するＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインとを含む。ＣＤ３  ｍＡｂ‐１（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号６８）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、置換位置（Ｄ６５Ｇ）は二重下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS
【０１９７】
あるいは、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１の親和性変異型を組み込んでよい。変異型としては、「ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  Ｌｏｗ」と称される低親和性変異型、及び「ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  Ｆａｓｔ」と称される、より速いオフレートを有する変異型が挙げられる。ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７）は、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  Ｌｏｗ及びＣＤ３  ｍＡｂ１  Ｆａｓｔに共通であり、上で提示されている。ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  Ｌｏｗ及びＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＦａｓｔそれぞれのＶＨドメインのアミノ酸配列を以下に提示する。
【０１９８】
抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＬｏｗのＶＨドメインのアミノ酸配列(配列番号６９)を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインＶＨ（１）（配列番号６５）との差異は二重下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HGNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
【０１９９】
抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＦａｓｔのＶＨ鎖ドメインのアミノ酸配列（配列番号７０）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されており、ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＨドメインＶＨ（１）（配列番号６５）との差異は二重下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR 
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR 
HKNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS
【０２００】
利用できる別の抗ＣＤ３抗体は、抗体ムロモナブ‐ＣＤ３である（Xu et al. (2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26); Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3,” Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection,” Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678）。
【０２０１】
ＯＫＴ３のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY
INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY
DDHYCLDYWG QGTTLTVSS
【０２０２】
ＯＫＴ３のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT
SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG 
TKLEINR
【０２０３】
利用できる更なる抗ＣＤ３抗体としては、国際公開第２００８／１１９５６６号及び国際公開第２００５／１１８６３５号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
Ｃ．ＣＤ８結合能力
一実施形態では、本発明の二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ８のエピトープに結合できる。ＣＤ８は、細胞毒性Ｔ細胞上に発現される、２つの別個の鎖で構成されたＴ細胞共受容体である（Leahy, D.J., (1995) “A Structural View of CD4 and CD8,” FASEB J., 9:17-25）。ＣＤ８+  Ｔ細胞の活性化は、抗原：標的細胞の表面上に配置された主要組織適合性クラスＩ（major histocompatibility class I：ＭＨＣ  Ｉ）分子複合体と、ＣＤ８+  Ｔ細胞の表面上に配置されたＣＤ８及びＴ細胞受容体の複合体との間の、共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている（Gao, G., and Jakobsen, B., (2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC class I: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor". Immunol Today 21: 630-636）。特定の免疫系細胞のみによって発現されるＭＨＣ  ＩＩ分子とは異なり、ＭＨＣ  Ｉ分子は極めて広範に発現される。よって細胞毒性Ｔ細胞は、極めて多様な細胞タイプに結合できる。活性化された細胞毒性Ｔ細胞は、細胞毒素パーフォリン、グランザイム及びグラヌリシンを放出することにより、細胞殺滅を仲介する。ＣＤ８に特異的に結合する抗体としては、抗ＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」及び「ＴＲＸ２」が挙げられる。
【０２０５】
ＯＫＴ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY
IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF 
RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS
【０２０６】
ＯＫＴ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV 
LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY
TFGGGTKLEI KR
【０２０７】
ＴＲＸ２のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S
【０２０８】
ＴＲＸ２のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG 
TKVEIK
【０２０９】
Ｄ．ＣＤ１６結合能力
一実施形態では、本発明の多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＣＤ１６のエピトープに結合できる。ＣＤ１６はＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である。ＣＤ１６は、好中球、好酸球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び凝集しているもののモノマー性ではない組織マクロファージによって発現される（Peltz, G.A. et al. (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al. (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases,” Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp, M. et al. (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells,” Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511）。ＣＤ１６に特異的に結合する分子としては、抗ＣＤ１６抗体「３Ｇ８」及び「Ａ９」が挙げられる。ヒト化Ａ９抗体は、国際公開第０３／１０１４８５号に記載されている。
【０２１０】
３Ｇ８のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７７）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL 
AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI
NPAWFAYWGQ GTLVTVSA
【０２１１】
３Ｇ８のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号７８）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL 
LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLNIH PVEEEDTATY YCQQSNEDPY
TFGGGTKLEI K
【０２１２】
Ａ９のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号７９）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD
IYPGGGYTNY NEKFKGKATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA
SWYFDVWGAR TTVTVSS
【０２１３】
Ａ９のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８０）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG 
LIGHTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW
VFGGGTKLTV L
【０２１４】
利用できる更なる抗ＣＤ１９抗体としては、国際公開第０３／１０１４８５号及び国際公開第２００６／１２５６６８号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
Ｅ．ＴＣＲ結合能力
一実施形態では、本発明の二重特異性、三重特異性又は多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のエピトープに結合できる。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞によって天然で発現され、上記細胞が、抗原提示細胞のクラスＩ又はクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質によって結合及び提示される抗原性ペプチドを認識できるようにする。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド‐ＭＨＣ）複合体の認識により細胞免疫応答の伝播が開始され、これは抗原提示細胞のサイトカイン産生及び溶解につながる（例えばArmstrong, K.M. et al. (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534-550を参照）。ＣＤ３はＴＣＲに結合する受容体である（Thomas, S. et al. (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer,” Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex,” Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity,” Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 2009 Jun 9) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy,” Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) “T Cell Activation,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) “Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression,” Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309）。
【０２１６】
Ｔ細胞受容体に特異的に結合する分子としては、抗ＴＣＲ抗体「ＢＭＡ０３１」が挙げられる（欧州特許第０４０３１５６号；Kurrle, R. et al. (1989) “BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4366-4373）。
【０２１７】
ＢＭＡ０３１のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８１）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY
INPYNDVTKY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS
YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS
【０２１８】
ＢＭＡ０３１のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８２）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT 
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG 
TKLEIK
【０２１９】
Ｆ．ＮＫＧ２Ｄ結合能力
一実施形態では、本発明の多重特異性  Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープ及びＮＫＧ２Ｄ受容体のエピトープに結合できる。ＮＫＧ２Ｄ受容体は全てのヒト（及び他の哺乳類）ナチュラルキラー細胞上（Bauer, S. et al. (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）、及び全てのＣＤ８+  Ｔ細胞上（Groh, V. et al. (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29）で発現される。このような結合リガンド、及び特に正常な細胞上に発現されるものとしては、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、レチノイン酸初期誘導性遺伝子‐１（retinoic acid early inducible gene-1：ＲＡＥ‐１）の産物、及びマウスＵＬ１６結合タンパク質様転写物１（ＭＵＬＴ１）が挙げられる（Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells,” Blood 106:1711-1717）。ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する分子としては、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体「ＫＹＫ‐１．０」及び「ＫＹＫ‐２．０」が挙げられる（Kwong, KY et al. (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156；及び国際公開ＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１号）。
【０２２０】
ＫＹＫ‐１．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８３）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR
FGYYLDYWGQ GTLVTVSS
【０２２１】
ＫＹＫ‐１．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８４）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD
DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG 
GGTQLTVL
【０２２２】
ＫＹＫ‐２．０のＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号８５）を以下に示す（ＣＤＲH残基は下線を付して示されている）：
QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF
IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR
GLGDGTYFDYWGQGTTVTVS S
【０２２３】
ＫＹＫ‐２．０のＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号８６）を以下に示す（ＣＤＲL残基は下線を付して示されている）：
QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY 
YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV
FGGGTKLTVL
【０２２４】
ＩＸ．多重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子
Ａ．Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディ
上述のＢ７‐Ｈ３結合分子のＶＬ及びＶＨドメインを用いて、２つの共有結合したポリペプチド鎖からなるＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを構成してよい。本発明のこの態様を例示するために、上述の抗Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ‐Ｄ抗体のＶＬ及びＶＨドメインを用いて、２つの共有結合したポリペプチド鎖からなり、かつｍＡｂ‐Ｄの上述のマウス又はヒト化ＶＬ及びＶＨドメインを含む、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディを構成する。このようなＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの一般構造及びアミノ酸配列を以下に提示する。
【０２２５】
ある例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメイン（例えばｍＡｂ‐Ｄ  ＶＬ（配列番号２２）又はｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＬ（配列番号３０））；介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号３２））；抗ＣＤ３抗体のＶＨドメイン（例えばＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）（配列番号６８））；システイン含有介在スペーサペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号３３））；ヘテロ二量体促進（例えばＥコイル）ドメイン（EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号４５））；及びＣ末端を含む。
【０２２６】
このような例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；対応する抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン（例えば第１のポリペプチド鎖のＶＨドメインと会合してＣＤ３結合部位を形成するＶＬドメイン、例えばＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７））；介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号３２））；対応する抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＨドメイン（例えば第１のポリペプチド鎖のＶＬドメインと会合してＢ７‐Ｈ３結合部位を形成するＶＨドメイン、例えばｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨ（配列番号２６）又はｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨ（配列番号３１））；システイン含有介在スペーサペプチド（リンカー２：GGCGGG（配列番号３３））；ヘテロ二量体促進（例えばＫコイル）ドメイン（KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４６））；及びＣ末端を含む。
【０２２７】
本明細書中に記載されているように、代替的なリンカー及び／又は代替的なヘテロ二量体促進ドメインは、このようなダイアボディの生成に利用できる。例えば、代替的な例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号３２））；抗ＣＤ３抗体の、又は対応する抗ＣＤ３抗体のＶＨドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー２：（配列番号３７））；システイン含有ヘテロ二量体促進（例えばＫコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４６））；及びＣ末端を含んでよい。このような代替的な例示的なダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；対応する抗ＣＤ３抗体のＶＬドメイン；介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号３２））；対応する抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＨドメイン（例えばｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨ（配列番号２６）又はｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨ（配列番号３１））；介在スペーサペプチド（リンカー２：ASTKG（配列番号３７））；システイン含有ヘテロ二量体促進（例えばＥコイル）ドメイン(EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号４７））；及びＣ末端を含んでよい。
【０２２８】
１．ＤＡＲＴ‐Ｄ１
ｈｍＡｂ‐ＣのＶＨ及びＶＬドメインを含む代表的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディ（「ＤＡＲＴ‐Ｄ１」）を構成する。
【０２２９】
ＤＡＲＴ‐Ｄ１の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号８７）を以下に示す（ｈｍＡｂ‐Ｃ  ＶＬドメインの配列（配列番号２０）には下線が付されている）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASESIY SYLAWYQQKP GKAPKLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYGTPPWTFG
QGTRLEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSTYAM 
NWVRQAPGKG LEWVGRIRSK YNNYATYYAD SVKGRFTISR DDSKNSLYLQ 
MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SGGCGGGEVA 
ALEKEVAALE KEVAALEKEV AALEK
【０２３０】
ＤＡＲＴ‐Ｄ１の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号８８）を以下に示す（ｈｍＡｂ‐Ｃ  ＶＨドメインの配列（配列番号２１）には下線が付されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV KPGGSLRLSC AASGFTFSSY
GMSWVRQAPG KGLEWVATIN SGGSNTYYPD SLKGRFTISR DNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTA VYYCARHDGG AMDYWGQGTT VTVSSGGCGG GKVAALKEKV 
AALKEKVAAL KEKVAALKE
【０２３１】
２．ＤＡＲＴ‐Ｄ２
ｈｍＡｂ‐ＤのＶＨ及びＶＬドメインを含む代表的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディ（「ＤＡＲＴ‐Ｄ２」）を構成する。
【０２３２】
ＤＡＲＴ‐Ｄ２の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号８９）を以下に示す（ｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＬドメインの配列（配列番号３０）には下線が付されている）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN 
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM 
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK
【０２３３】
ＤＡＲＴ‐Ｄ２の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号９０）を以下に示す（ｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨドメインの配列（配列番号３１）には下線が付されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF 
GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SGSGTIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ 
MNSLRAEDTA VYYCARHGYR YEGFDYWGQG TTVTVSSAST KGKVAACKEK 
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【０２３４】
本明細書で提示された教示に鑑みて、異なるドメイン配向、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、リンカー、及び／又はヘテロ二量体促進ドメインを利用して、代替的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖ダイアボディを生成できることが理解されるだろう。
【０２３５】
Ｂ．Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性３鎖ダイアボディ
３つの鎖を有し、かつＦｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３ダイアボディを生成する。これは、（ｈｍＡｂ‐Ｄのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを含む）Ｂ７‐Ｈ３に対して特異的な１つの結合部位と、（ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨ及びＶＬドメインを含む）ＣＤ３に対して特異的な１つの結合部位とを含む。このダイアボディは「ＤＡＲＴ‐Ｄ３」と称される。
【０２３６】
例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性３鎖ＤＡＲＴ‐Ｄ３ダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＬドメイン（ｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＬ（配列番号３０））；介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号３２））；ＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメイン（配列番号６８）；介在スペーサペプチド（リンカー２：ASTKG（配列番号３７））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｅコイル）ドメイン（EVAACEK‐EVAALEK‐EVAALEK‐EVAALEK（配列番号４７））；介在スペーサペプチド（リンカー３：GGGDKTHTCPPCP（配列番号５７））；ノブ担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号６１）；及びＣ末端を含む。このポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号６１のＣ末端リシン残基（即ち配列番号６１のＸ）をエンコードし得るが、上述のようにこのリシン残基は、一部の発現系では翻訳後に除去され得る。従って本発明は、上記リシン残基を含有する上記第１のポリペプチド鎖（即ちＸがリシンである配列番号６１）、及び上記リシン残基を含まない第１のポリペプチド鎖（即ちＸが不在である配列番号６１）を包含する。このような第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号９１）を以下に提示する（ｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＬドメインの配列（配列番号３０）には下線が付されている）：
DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYFCQQ YNNYPFTFGQ 
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN 
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM 
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC 
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP 
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE 
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR 
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT 
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０２３７】
この例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性３鎖ＤＡＲＴ‐Ｄ３ダイアボディの第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７）；介在スペーサペプチド（リンカー１：GGGSGGGG（配列番号３２））；抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のＶＨドメイン（ｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨ（配列番号３１）；介在スペーサペプチド（リンカー２：ASTKG（配列番号３７））；システイン含有ヘテロ二量体促進（Ｋコイル）ドメイン（KVAACKE‐KVAALKE‐KVAALKE‐KVAALKE（配列番号４８））；及びＣ末端を含む。このような第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号９２）を以下に提示する（ｈｍＡｂ‐Ｄ  ＶＨドメインの配列（配列番号３１）には下線が付されている）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI 
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF 
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF 
GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SGSGTIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ 
MNSLRAEDTA VYYCARHGYR YEGFDYWGQG TTVTVSSAST KGKVAACKEK 
VAALKEKVAA LKEKVAALKE
【０２３８】
この例示的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性３鎖ＤＡＲＴ‐Ｄ３ダイアボディの第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に：Ｎ末端；スペーサペプチド（DKTHTCPPCP（配列番号５６））；ホール担持ＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号６２）；及びＣ末端を含む。このポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号６２のＣ末端リシン残基（即ち配列番号６２のＸ）をエンコードし得るが、上述のようにこのリシン残基は、一部の発現系では翻訳後に除去され得る。従って本発明は、上記リシン残基を含有する上記第３のポリペプチド鎖（即ちＸがリシンである配列番号６２）、及び上記リシン残基を含まない第３のポリペプチド鎖（即ちＸが不在である配列番号６２）を包含する。このような第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号９３）を以下に提示する：
DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED 
PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 
CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK 
GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG 
NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGX
ここでＸはリシン（Ｋ）であるか、又は不在である。
【０２３９】
本明細書で提示された教示に鑑みて、異なるドメイン配向、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、リンカー、及び／又はヘテロ二量体促進ドメインを利用して、代替的なＢ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性３鎖ダイアボディを生成できることが理解されるだろう。特にｈｍＡｂ‐ＣのＶＨドメイン及びＶＬドメイン（配列番号２０〜２１）を利用できる。
【０２４０】
Ｃ．Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３×ＣＤ８  ３価結合分子
例示的な３価「Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３×ＣＤ８」結合分子は、（上述のように親及び／又はヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬドメイン並びに対応する抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＨドメインを含む）Ｂ７‐Ｈ３に対して特異的な１つの結合部位と、（例えばＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン（配列番号６７）及び抗ＣＤ３抗体のＶＨドメイン（例えばＣＤ３  ｍＡｂ  １（Ｄ６５Ｇ）（配列番号６８））を含む）ＣＤ３に対して特異的な１つの結合部位と、（例えばＴＲＸ２のＶＨ及びＶＬドメイン（それぞれ配列番号７５及び７６）を含む）ＣＤ８に対して特異的な１つの結合部位を有する。このような３価結合分子は、２つのポリペプチド鎖（例えば図６Ｅ及び図６Ｆを参照）、３つのポリペプチド鎖（例えば図６Ｃ及び図６Ｄを参照）、４つのポリペプチド鎖（例えば図６Ａ及び図６Ｂを参照）、又は５つのポリペプチド鎖（例えば図５を参照）を有してよい。
【０２４１】
Ｘ．産生方法
最も好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、当該技術分野において公知であるように、上記ポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。
【０２４２】
本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて便利に調製できる（Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis,” Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15): 5131-5135; Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10）。
【０２４３】
ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知であり、また上述されている。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。
【０２４４】
関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子のポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド）は：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。
【０２４５】
ポリペプチド、又はタンパク質を発現する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
本発明は、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。
【０２４７】
本発明は、Ｂ７‐Ｈ３結合分子（上記分子の特性に有意な影響を及ぼさない、機能的に同等のポリペプチド、及び活性が増強した又は低下した変異型を含む）を含んでよい。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されており、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；セリン／トレオニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；リシン／アルギニン；及びフェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。
【０２４８】
本発明は、本発明の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬ及び／又はＶＨのうちの１つ又は複数を含む融合タンパク質も包含する。一実施形態では、軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖の両方を含む、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、Ｂ７‐Ｈ３と、ネイティブ分子内では上記抗体融合タンパク質が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列又は同種配列とに特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。
【０２４９】
本発明は特に、診断用又は治療用部分にコンジュゲートしたＢ７‐Ｈ３結合分子（例えば抗体、ダイアボディ、３価結合分子等）を包含する。診断目的のために、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子を、検出可能な物質と結合させてよい。このようなＢ７‐Ｈ３結合分子は、ある特定の療法の効力の決定等、臨床試験手順の一部としての疾患の発現又は進行の監視及び／又は予後判定に有用である。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼ等）、補綴基（例えばアビジン／ビオチン）、蛍光材料（例えばウンベリフェロン、フルオレセイン又はフィコエリトリン）、ルミネッセンス材料（例えばルミノール）、生物発光物質（例えばルシフェラーゼ又はエクオリン）、放射性物質（例えば炭素１４、マンガン５４、ストロンチウム８５又は亜鉛６５）、陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当該技術分野で公知の技法を用いて、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に直接、又は仲介物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合又はコンジュゲートしてよい。
【０２５０】
治療目的のために、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子を、細胞毒素（例えば細胞常食抑制剤若しくは細胞破壊剤）、治療剤又は例えばαエミッタである放射性金属イオンといった、治療用部分にコンジュゲートしてよい。細胞毒素又は細胞毒性剤としては、例えばシュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素Ａ〜Ｆ、リシン、アブリン、サポリン及びこれらの作用剤の細胞毒性断片といった、細胞に対して有害ないずれの作用剤が挙げられる。治療剤としては、障害を予防的又は治療的に処置する治療効果を有するいずれの作用剤が挙げられる。このような治療剤は、化学療法剤、タンパク質又はポリペプチド治療剤であってよく、所望の生物活性を有する、及び／又は所与の生物学的応答を修飾する、治療剤を含んでよい。治療剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、ホルモン療法剤、及び細胞増殖性障害の治療に有用な抗体が挙げられる。上記治療用部分は、当該技術分野で公知の技法を用いて、Ｂ７‐Ｈ３結合分子に直接、又は仲介物（例えばリンカー）を介して間接的に、結合又はコンジュゲートしてよい。
【０２５１】
ＸＩ．抗体薬物コンジュゲート
本発明は、治療用抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体（又はそのＢ７‐Ｈ３結合ドメイン）に関し、特に薬物にコンジュゲートされた上述の抗ヒトＢ７‐Ｈ３抗体又はそのＢ７‐Ｈ３結合ドメイン（「Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」分子）のうちのいずれに関する。このようなＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、特に癌の治療において、抗ヒトＢ７‐Ｈ３療法の細胞毒性を増強する。上述のように、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子は、式：
Ａｂ‐（ＬＭ）m‐（Ｄ）n
を含み：
Ａｂは、ヒト化可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及びヒト化可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むＢ７‐Ｈ３に結合する抗体、又はそのＢ７‐Ｈ３結合断片であり；
Ｄは、細胞毒性薬物部分であり；
ＬＭは、上記Ａｂ及び上記Ｄを共有結合させる結合又はリンカー分子であり；
ｍは０〜ｎの整数であって、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのリンカー分子の数を表し；
ｎは１〜１０の整数であって、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子に共有結合した上記細胞毒性薬物部分の数を表す。
【０２５２】
好ましい実施形態では、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、Ｂ７‐Ｈ３を発現する腫瘍細胞に結合して、受容体仲介型エンドサイトーシスによって上記細胞内に内在化される。Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣはリソソーム内に入ると、好ましくは崩壊して、上記細胞内で細胞毒性薬物部分の放出を引き起こし、細胞死をもたらす。理解されるように、この細胞死の作用の機序は、使用される細胞毒性薬物のクラス（例えばマイタンシン及びオーリスタチンといったチューブリン重合阻害剤による細胞質分裂の中断、カリケアミシン及びデュオカルマイシンといったＤＮＡ相互作用剤によるＤＮＡ損傷）等に基づいて変化し得る。バイスタンダー効果（bystander effect）として公知のプロセスにおいて、遊離薬物が死細胞によって腫瘍環境に放出されると、隣接する癌細胞も死滅し得る（Panowski, S. et al. (2014) “Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy,” mAbs 6(1):34-45; Kovtun, Y.V. et al. (2006) “Antibody-Drug Conjugates Designed To Eradicate Tumors With Homogeneous And Heterogeneous Expression Of The Target Antigen,” Cancer Res. 66:3214-3221）。
【０２５３】
本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣはＦｃドメインを含んでよく、これは天然発生のＦｃドメインであってよく、又は天然発生のＦｃドメインとは１つ又は複数の差異がある配列を有してよく、また完全Ｆｃドメイン（例えば完全ＩｇＧ  Ｆｃドメイン）又は完全Ｆｃドメインの一部分のみであってよい。このようなＦｃドメインは、いずれのアイソタイプのもの（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）であってよい。このようなＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインのＣ末端リシン残基を含んでも含まなくてもよい。本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは更に、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインを含んでよい。ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジドメインが存在する場合、これはいずれのアイソタイプのもの（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）であってよく、好ましくは所望のＦｃドメインと同一のアイソタイプのものとする。
【０２５４】
Ａ．例示的な本発明のリンカー分子
よって本発明は特に、上記リンカー分子ＬＭが不在である（即ちｍ＝０である）上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ、並びに２つ以上の上記リンカー分子ＬＭを有し（即ちｍが２〜ｎの整数であり、ｎが２〜１０の整数であり）、各上記リンカー分子ＬＭは、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの上記細胞毒性薬物部分Ｄ及び上記Ａｂを共有結合させる、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣについて考察する。
【０２５５】
本発明は更に、上記Ａｂが２つ以上の上記リンカー分子ＬＭと共有結合し、上記リンカー分子が全て同一である、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの上記Ａｂと共有結合する上記細胞毒性薬物部分Ｄは、全て同一であってよく、又は２つ、３つ、４つ若しくは５つ以上の、個々に異なる上記細胞毒性薬物部分Ｄを含んでよい。
【０２５６】
本発明は更に、上記Ａｂが２つ以上の上記リンカー分子ＬＭと共有結合し、上記リンカー分子が個々に異なってよい、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを提供する。上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの上記Ａｂと共有結合する上記細胞毒性薬物部分Ｄは、全て同一であってよく、又は２つ、３つ、４つ若しくは５つ以上の、個々に異なる上記細胞毒性薬物部分Ｄを含んでよい。
【０２５７】
ヒトＢ７‐Ｈ３に結合する抗体の例示的なヒト化ＶＨ及びＶＬドメイン、並びに本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣに含まれ得る例示的なヒト抗体定常ドメインは、既に提示されている。上述のように、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは更に、少なくとも１つの細胞毒性薬物部分を含み、これは好ましくは、上記ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン及び／又は定常ドメインのアミノ酸残基の側鎖の原子と、直接、又は上記側鎖原子と薬物部分との間に挿入されたリンカー分子を介して、共有結合する。このリンカー分子は、非ペプチド分子、又は非ペプチド部分及びペプチド部分を含む分子であってよく、又は上記リンカー分子は、アミノ酸残基のみからなる分子であってよい。いずれのこのようなリンカー分子のアミノ酸残基は、天然発生アミノ酸残基のＤバージョン、ｐ‐アセチルフェニルアラニン、セレノシステイン等を含む、天然発生の又は天然発生でないアミノ酸残基を含有してよい。任意に、又は更に、所望の側鎖（例えば‐ＣＨ2‐ＳＨ側鎖、‐ＣＨ2‐ＯＨ側鎖、‐ＣＨ（ＣＨ2）‐ＳＨ側鎖、‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐Ｓ‐ＣＨ3側鎖、‐ＣＨ2‐Ｃ（Ｏ）‐ＮＨ2側鎖、‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐Ｃ（Ｏ）‐ＮＨ2側鎖、‐ＣＨ2‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ‐側鎖、ＣＨ2‐ＣＨ2‐Ｃ（Ｏ）ＯＨ‐側鎖、‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐ＮＨ2側鎖、‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐ＣＨ2‐ＮＨ‐Ｃ（ＮＨ2）2側鎖、イミダゾール側鎖、ベンジル側鎖、フェノール側鎖、インドール側鎖等）を有する特定の残基を、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣに組み込んでよい。
【０２５８】
リンカー分子は、生理学的条件下で切断不可能であってよく、例えば、チオエーテルリンカー又はヒンダードジスルフィドリンカーを例とする加水分解安定性部分からなってよい。加水分解安定性リンカーは、水中で略安定であり、長期間にわたる生理学的条件下を含むがこれに限定されない、有用なｐＨ値の水と反応しない。対照的に、加水分解不安定性又は崩壊性リンカーは、水中、又は例えば血液を含む水溶液中で崩壊する。
【０２５９】
あるいはリンカー分子は切断可能であってよく、又は切断可能部分を含有してよい。このような切断可能部分の例としては、酸不安定性リンカー（例えばヒドラジン結合を形成する４‐（４’‐アセチルフェノキシ）ブタン酸リンカー）、切断可能ジスルフィドリンカー（還元性細胞内環境で切断される）、及びプロテアーゼ切断可能リンカーが挙げられる。酸不安定性リンカーは、血中で遭遇するｐＨレベルにおいて安定であるものの、リソソーム中の低いｐＨ環境に遭遇すると不安定となり崩壊することを意味する。またプロテアーゼ切断可能リンカーは、血液／血漿中で安定であるものの、リソソーム酵素による切断時に癌細胞中のリソソーム内において遊離薬物を迅速に放出することを意味する（Panowski, S. et al. (2014) “Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy,” mAbs 6(1):34-45）。あるいは、リンカー分子は、切断可能ペプチド（例えばリソソーム酵素によって選択的に切断されるバリン‐シトルリンジペプチドパラアミノベンジルアルコールリンカー（ｃＡＣ１０‐ｍｃ‐ｖｃ‐ＰＡＢＡ））のような、酵素切断可能基質であってよく、又は酵素切断可能基質を含有してよい。好適な切断可能リンカーは当該技術分野で公知であり、例えばde Groot, Franciscus M.H., et al. (2002) “Design, Synthesis, and Biological Evaluation of a Dual Tumor-Specific Motive Containing Integrin-Targeted Plasmin-Cleavable Doxorubicin Prodrug,” Molecular Cancer Therapeutics, 1: 901-911; Dubowchik et al., (2002) “Doxorubicin Immunoconjugates Containing Bivalent, Lysosomally-Cleavable Dipeptide Linkages.” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters12:1529-1532；米国特許第５５４７６６７号；米国特許第６，２１４，３４５号；米国特許第７，５８５，４９１号；米国特許第７，７５４，６８１号；米国特許第８，０８０，２５０号；米国特許第８，４６１，１１７号；及び国際公開第０２／０８３１８０号を参照されたい。
【０２６０】
酵素不安定性又は崩壊性リンカーを採用できる。このようなリンカーは、１つ又は複数の酵素によって崩壊する。単なる例として、ＰＥＧ及び関連するポリマーは、ポリマー骨格内又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基のうちの１つ若しくは複数との間のリンカー基内に、１つ又は複数の崩壊性リンカー分子を含むことができる。このような１つ又は複数の崩壊性リンカー分子としては、限定するものではないが、ＰＥＧカルボン酸又は活性化されたＰＥＧカルボン酸と生物活性剤上のアルコール基との反応によって形成されるエステル結合が挙げられ、このようなエステル基は一般に、生理学的条件下において加水分解して、生物活性剤を放出する。他の加水分解崩壊性リンカー分子としては、限定するものではないが：炭酸塩結合；アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合；アルコールとリン酸塩基との反応によって形成されるリン酸エステル結合：ヒドラジンとアルデヒドとの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールとの反応産物であるアセタール結合；ギ酸とアルコールとの反応産物であるオルトエステル結合；ＰＥＧ等のポリマーの末端のものを含むがこれに限定されないアミン基、及びペプチドのカルボキシル基によって形成される、ペプチド結合；並びにポリマーの末端のものを含むがこれに限定されないホスホラミダイト基、及びオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって形成される、オリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
【０２６１】
一実施形態では、本発明のリンカー分子は、国際公開第０２／０８３１８０号で開示されているような切断可能リンカー分子であるＶ‐（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａであってよく、又はこれを含んでよく、上記リンカー分子は、以下の式：
Ａｂ‐［Ｖ‐（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａ］‐Ｄ
を含み、ここで：
Ｖは任意の切断可能部分であり；
（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａは、ｌ，（４＋２ｎ）消去によって自己消去する、細長い自己消去性スペーサ系であり；
Ｗ及びＸはそれぞれｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサであり、同一であるか又は異なっており；
Ａは、式（Ｙ）m（ここでＹはｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサである）のスペーサ基、又は式Ｕの基であり、環化除去スペーサであり；
ｋ、１及びｍは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは０〜１０（両端を含む）の整数であり；
ただし：
Ａが（Ｙ）mである場合、ｋ＋ｌ＋ｍ≧１であり；
ｋ＋ｌ＋ｍ＝ｌである場合、ｎ＞ｌであり；
ＡがＵである場合、ｋ＋１≧１である。
Ｗ、Ｘ及びＹは独立して、以下の式：
【化６】
2019520308.tif 000013
又は以下の式：
【化７】
2019520308.tif 000014
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｑは‐Ｒ5Ｃ＝ＣＲ6‐、Ｓ、Ｏ、ＮＲ5、‐Ｒ5Ｃ＝Ｎ‐又は‐Ｎ＝ＣＲ5‐であり；
ＰはＮＲ7、Ｏ又はＳであり；
ａ、ｂ及びｃは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
Ｉ、Ｆ及びＧは独立して、式：
【化８】
2019520308.tif 000015
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここで：
Ｒx、Ｒx1及びＲx2は独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
上記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲ9のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成し；
Ｕは、式：
【化９】
2019520308.tif 000016
【化１０】
2019520308.tif 000017
を有する化合物から選択され、ここで：
ａ、ｂ及びｃは独立して、０又は１の整数となるよう選択され；
ただしａ＋ｂ＋ｃ＝２又は３であり；
Ｒ1及び／又はＲ2は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルを表し、上記アルキルは任意に、以下の基：ヒドロキシ（ＯＨ）、エーテル（ＯＲx）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲｘＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲX）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲX）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲｘ）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）のうちの１つ又は複数によって置換され、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され、上記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、又はＲ8のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成する。
【０２６２】
例示的な分子としては：
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノ‐ベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐアミノベンジルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）‐カルボニル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
ｐ‐アミノシンナミル；
ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
ｐ‐アミノ‐シンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；及び
ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルが挙げられる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個の細胞毒性薬物部分を含み、これらは同一であってよく、又は個々に、このＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの別の細胞毒性薬物部分と同一であってよく、若しくは異なっていてよい。一実施形態では、このような細胞毒性薬物部分はそれぞれ、別個のリンカー分子を介して、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂにコンジュゲートする。あるいは２つ以上の細胞毒性薬物部分が、同一のリンカー分子を介して、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂに付着してよい。
【０２６４】
細胞毒性薬物部分は、当該技術分野で公知の手段によって、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂにコンジュゲートしてよい（例えばYao, H. et al. (2016) “Methods to Design and Synthesize Antibody-Drug Conjugates (ADC),” Intl. J. Molec. Sci. 17(194):1-16); Behrens, C. R. et al. (2014) “Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies,” mAbs 6(1):46-53; Bouchard, H. et al. (2014) “Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs,” Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363を参照）。システインのチオール基、リシン、グルタミン若しくはアルギニンのアミノ側基、又はグルタミン酸若しくはアスパラギン酸のカルボキシル基を用いて、リンカー分子‐細胞毒性薬物部分（ＬＭ‐Ｄ）を本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂにコンジュゲートさせることができる。ネイティブの抗体は、多数のリシンコンジュゲート部位を含有し、従って抗体１つあたり複数の被コンジュゲート分子に連結できる。実際には、コンジュゲーションが、およそ２０個の異なるリシン残基において、重鎖及び軽鎖の両方に発生する（ｍＡｂひとつあたり４０個のリシン）、ペプチドマッピングが決定されている。従って、１００万を超える異なるＡＤＣ種を生成できる。システインコンジュゲーションは、１〜４つの鎖間ジスルフィド結合の還元後に発生するため、このコンジュゲーションは、ネイティブＶＬ及びＶＨドメインにおいて、８つの露出されたスルフヒドリル基に限定される。しかしながら、望ましい場合には、更なる反応性（例えばリシン、システイン、セレノシステイン等）残基を、抗体に（例えばＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン並びに／又は定常ドメイン内に）組み込んでよい。例えば１つ又は複数のネイティブアミノ酸残基を、システイン残基で置換してよい。アンバー終止コドン抑制因子ｔＲＮＡ／ａａＲＳペアを用いて、非天然アミノ酸（例えばｐ‐アセチルフェニルアラニン）を抗体に遺伝子的に組み込んでよい（例えばBehrens CR, and Liu B. (2014) “Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies,” mAbs 6(1):46-53. doi:10.4161/mabs.26632; Panowksi, S., et al. (2014) “Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy,” mAbs, 6(1), 34-45, doi:10.4161/mabs.27022；及び国際公開第２００８／０７０５９３号を参照）。あるいは、又は更に、酵素（例えばグリコトランスフェラーゼ）を用いて、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂにコンジュゲートさせてよい。グリコトランスフェラーゼプラットフォームは、糖部分を抗体上のグリコシル化部位（例えばヒトＩｇＧ抗体のＦｃドメインのＮ２９７位置）に付着させ、これは、本発明のリンカー分子として機能して、細胞毒性薬物部分（Ｄ）を本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂにコンジュゲートさせることができる。あるいは、トランスグルタミナーゼを用いて、遊離アミノ基とグルタミン側鎖との間の共有結合の形成を触媒してよい。
【０２６５】
このような目的のために好ましいのは、Streptoverticillium mobaraense由来の市販のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）である（Pasternack, R. et al. (1998) “Bacterial Pro-Transglutaminase From Streptoverticillium mobaraense - Purification, Characterisation And Sequence Of The Zymogen,” Eur. J. Biochem. 257(3):570-576; Yokoyama, K. et al. (2004) “Properties And Applications Of Microbial Transglutaminase,” Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:447-454）。この酵素は、グリコシル化抗体のＦｃドメイン中の天然発生グルタミン残基をいずれも認識しないが、ＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン並びに／又は定常ドメインに組み込むことができるテトラペプチドＬＬＱＬ（配列番号９４）を認識する（Jeger, S. et al. (2010) “Site-Specific And Stoichiometric Modification Of Antibodies By Bacterial Transglutaminase,” Angew Chem. Int. Ed. Engl. 49:9995-9997）。このような考察は、Panowski, S. et al. (2014) “Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy,” mAbs 6(1):34-45によって吟味されている。
【０２６６】
Ｂ．本発明の例示的な細胞毒性薬物部分
いくつかの実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの細胞毒性薬物部分は、細胞毒素、放射性同位元素、免疫調節因子、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、成長因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、マイクロＲＮＡ分子、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、キレート剤又はこれらの組み合わせを含む。
【０２６７】
１．ツブリシン細胞毒性薬物部分
本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、ツブリシン薬物部分を含んでよい：
【化１１】
2019520308.tif 000018
【表６】
2019520308.tif 000019
【０２６８】
ツブリシンは、マイコバクテリア種から単離された天然産物のあるクラスのメンバーである（Sasse et al. (2000) “Tubulysins, New Cytostatic Peptides From Myxobacteria Acting On Microtubuli. Production, Isolation, Physico-Chemical And Biological Properties,” J. Antibiot. 53:879-885）。細胞骨格相互作用剤として、ツブリシンは、チューブリン重合を阻害して細胞周期の停止及びアポトーシスをもたらす有糸分裂毒素である（Steinmetz et al. (2004) “Isolation, Crystal And Solution Structure Determination, And Biosynthesis Of Tubulysins--Powerful Inhibitors Of Tubulin Polymerization From Myxobacteria,” Chem. Int. Ed. 43:4888-4892; Khalil et al. (2006) “Mechanism Of Action Of Tubulysin, An Antimitotic Peptide From Myxobacteria,” ChemBioChem. 7:678-683; Kaur et al. (2006) “Biological Evaluation Of Tubulysin A: A Potential Anticancer And Antiangiogenic Natural Product,” Biochem. J. 396: 235-242）。ツブリシンは、極めて強力な細胞毒性分子であり、いずれの臨床的に関連のある従来の化学療法剤、例えばエポチロン、パクリタキセル及びビンブラスチンの細胞成長阻害を超える。更にこれらは、多剤耐性細胞株に対して強力である（Domling, A. et al. (2005) “Myxobacterial Epothilones And Tubulysins As Promising Anticancer Agents,” Mol. Diversity 9:141-147）。これらの化合物は、低ピコモル範囲のＩＣ50値を有する癌細胞株のパネルに対して試験された、高い細胞毒性を示すため、抗癌治療剤として関心を集めている。例えば国際公開第２０１２／０１９１２３号、国際公開第２０１５／１５７５９４号を参照されたい。ツブリシンコンジュゲートは、例えば米国特許第７，７７６，８１４号に開示されている。いくつかの実施形態では、ツブリシン分子又はその誘導体はプロドラッグである。
【０２６９】
２．オーリスタチン細胞毒性薬物部分
あるいは、又は更に、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、オーリスタチン細胞毒性薬物部分（例えばＭＭＡＥ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐ノルエフェドリン）及びＭＭＡＦ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐フェニルアラニン））を含んでよい。ドラスタチンは元々、アメフラシ科のDolabella auriculariaの成分として発見され、改変されて、オーリスタチンとしても知られる誘導体（例えばモノメチルオーリスタチンＥ及びＦ）が生成された。ドラスタチン及びオーリスタチンは、αチューブリン上のビンカアルカロイド結合部位と相互作用して、その重合をブロックする。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解並びに核及び細胞分裂を妨害することが示されており（Woyke et al.、Antimicrob. Agents and Chemother. 45:3580-3584 (2001)）、抗癌活性を有する（米国特許第５，６６３，１４９号、米国特許第６，８８４，８６９号、米国特許第７，９６４，５６６号）。オーリスタチン薬物部分は、ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を通して、抗体に付着させることができる（例えば国際公開第２００２／０８８１７２号を参照）。いくつかの実施形態では、オーリスタチン若しくはドラスタチン分子、その変異型又は誘導体はプロドラッグである。ＭＭＡＥは、ネイティブシステイン側鎖チオールの修飾によってタンパク質にコンジュゲートさせることができる（Senter, P.D. et al. (2012) “The Discovery And Development Of Brentuximab Vedotin For Use In Relapsed Hodgkin Lymphoma And Systemic Anaplastic Large Cell Lymphoma,” Nat. Biotechnol. 30:631-637; van de Donk, N.W. et al. (2012) “Brentuximab vedotin,” MAbs 4:458-465）。本方法は、システイン残基の、１つ又は複数の溶媒に曝露されたジスルフィド結合を、還元剤（例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）又はトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））で還元した後、得られたチオールをマレイミド含有薬物で修飾することを伴う（Behrens, C. R. et al. (2014) “Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies,” mAbs 6(1):46-53を参照）。
【化１２】
2019520308.tif 000020
【０２７０】
この方法でコンジュゲートできる例示的な細胞毒性薬物は、カテプシンＢプロテアーゼ切断部位２５（ＶＣ：バリン、シトルリン）及び自壊性リンカー（ＰＡＢ：パラアミノベンジルオキシカルボニル）を、マレイミド基（ＭＣ：マレイミドカプロイル）と細胞毒性薬物（ＭＭＡＥ）との間に組み込む（Doronina, S.O. et al. (2003) “Development Of Potent Monoclonal Antibody Auristatin Conjugates For Cancer Therapy,” Nat. Biotechnol. 21:778-784）。
【化１３】
2019520308.tif 000021
【０２７１】
あるいは、オーリスタチン細胞毒性薬物部分は、ＡｃＬｙｓ‐ＶＣ‐ＰＡＢ‐ＭＭＡＤ（アセチルリシンバリンシトルリン‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐モノメチルドラスタチン）であってよく、これは、アセチル化リシン残基の側鎖とグルタミン側鎖との間の部位特異的反応を触媒するために、酵素微生物トランスグルタミナーゼを用いて、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂ部分のＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン並びに／又は定常ドメインのグルタミン残基のＮＨ2側鎖基にコンジュゲートできる。
【化１４】
2019520308.tif 000022
【０２７２】
あるいは、ｐ‐アセチルフェニルアラニンを、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂ部分のＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン並びに／又は定常ドメインに組み込んでよく、これを用いて、オーリスタチンＦ‐オキシアミンを、オキシム結紮を介して上記ドメインにコンジュゲートさせてよい。
【化１５】
2019520308.tif 000023
【０２７３】
３．マイタンシノイド細胞毒性薬物部分
あるいは、又は更に、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、マイタンシノイド細胞毒性薬物部分、例えば塩素化ベンゼン環発色団に付着した１９員アンサマクロリド構造を特徴とするアンサマイシン抗生物質を含んでよい。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。マイタンシンは初め、東アフリカの低木であるMaytenus serrataから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、特定の微生物もマイタンシノール及びＣ‐３マイタンシノールエステル等のマイタンシノイドを生成することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノール並びにその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４，１３７，２３０号及び米国特許第４，２４８，８７０号に開示されている。マイタンシノイド薬物部分は、抗体薬物コンジュゲートにおける魅力的な薬物部分である。というのはこれらは：（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化による調製が比較的容易であり；（ｉｉ）非ジスルフィドリンカーを介した抗体へのコンジュゲートに好適な官能基での誘導体化に適しており；（ｉｉｉ）プラズマ中で安定しており；（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるためである。マイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、その作製方法及びその治療的使用は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号及び米国特許第５，４１６，０６４号並びに欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号；Liu, C. et al. (1996) “Eradication Of Large Colon Tumor Xenografts By Targeted Delivery Of Maytansinoids,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 93:8618-8623 (described immunoconjugates comprising a maytansinoid designated DM1) and Chari, R.V. et al. (1992) “Immunoconjugates Containing Novel Maytansinoids: Promising Anticancer Drugs,” Cancer Research 52:127-131で開示されている。
【０２７４】
マイタンシン、ＤＭ１及びＤＭ４は、例示的なマイタンシノイド細胞毒性薬物部分である：
【化１６】
2019520308.tif 000024
【０２７５】
マイタンシンを、リシン又はグルタミン側鎖との反応によって、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂ部分にコンジュゲートさせてよい。ＤＭ１及びＤＭ４は、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂ部分のＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン並びに／又は定常ドメインのグルタミン酸又はアスパラギン酸残基のＣＯＯＨ側鎖にコンジュゲートさせてよい（Behrens, C. R. et al. (2014) “Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies,” mAbs 6(1):46-53; Bouchard, H. et al. (2014) “Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs,” Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363を参照):
【化１７】
2019520308.tif 000025
【０２７６】
トラスツズマブエムタンシン（アド‐トラスツズマブエムタンシン、Ｔ‐ＤＭ１、商標名ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標））は、マイタンシノイドであるメルタンシン（ＤＭ１）にコンジュゲートしたモノクローナル抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））からなる、薬物コンジュゲートである。例えばLoRusso et al. (2011) “Trastuzumab Emtansine: A Unique Antibody-Drug Conjugate In Development For Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Cancer,” Clin. Cancer Res. 20:6437-6447.  An engineered thio-Trastuzumab-DM1 ADC has also been described in Junutual et al. (2010) “Engineered Thio-Trastuzumab-DM1 Conjugate With An Improved Therapeutic Index To Target Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Breast Cancer,” Clin, Cancer Res. 16:4769-4778を参照。いくつかの実施形態では、マイタンシノイド分子、その変異型又は誘導体はプロドラッグである。
【０２７７】
４．カリケアミシン細胞毒性薬物部分
あるいは、又は更に、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、カリケアミシン細胞毒性薬物部分を含んでよい：
【化１８】
2019520308.tif 000026
【０２７８】
上述のカリケアミシン系抗体コンジュゲートは、トリスルフィド親化合物のジスルフィドバージョンである。現在のところ、Ｎ‐アセチル‐ｃ‐カリケアミシンジメチルヒドラジド（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）との２つの結合方法が報告されている（Bouchard, H. et al. (2014) “Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs,” Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363）。
【０２７９】
エンジイン抗腫瘍抗生物質のカリケアミシンファミリーは、サブピコモル濃度で二本鎖ＤＮＡ切断を生成できる。カリケアミシンは、微生物Micromonospora echinospora由来のエンジイン抗生物質のクラスであり、カリケアミシンγ１  が最も有名である。他のカリケアミシンは、β１Ｂｒ、γ１Ｂｒ、α２Ｉ、α３Ｉ、β１Ｉ、γ１Ｉ、及びΔ１Ｉである（Lee, M.D. et al. (1989) “Calicheamicins, A Novel Family Of Antitumor Antibiotics. 3. Isolation, Purification And Characterization Of Calicheamicins Beta 1Br, Gamma 1Br, Alpha 2I, Alpha 3I, Beta 1I, Gamma 1I And Delta 1I.,” J. Antibiotics 42(7):1070-1087を参照）。カリケアミシンファミリーのコンジュゲートの調製に関しては、米国特許第５，７１２，３７４号、米国特許第５，７１４，５８６号、米国特許第５，７３９，１１６号、米国特許第５，７６７，２８５号、米国特許第５，７７０，７０１号、米国特許第５，７７０，７１０号、米国特許第５，７７３，００１号、及び米国特許第５，８７７，２９６号を参照されたい。使用できるカリケアミシンの構造的類似体としては、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ‐アセチル‐γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１１が挙げられる（Hinman et al. (1993) “Preparation And Characterization Of Monoclonal Antibody Conjugates Of The Calicheamicins: A Novel And Potent Family Of Antitumor Antibiotics,” Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al. (1998) “Targeted Therapy With A Novel Enediyene Antibiotic Calicheamicin Theta(I)1 Effectively Suppresses Growth And Dissemination Of Liver Metastases In A Syngeneic Model Of Murine Neuroblastoma,” Cancer Research 58:2925-2928 (1998)）。いくつかの実施形態では、カリケアミシン分子、その変異型又は誘導体はプロドラッグである。
【０２８０】
５．ピロロベンゾジアゼピン細胞毒性薬物部分
あるいは、又は更に、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、ピロロベンゾジアゼピン薬物部分（例えば天然ピロロベンゾジアゼピン及びＳＪＧ‐１３６、その誘導体）を含んでよい：
【化１９】
2019520308.tif 000027
【０２８１】
好ましいピロロベンゾジアゼピン薬物部分は、バダスツキシマブ・タリリン（ＳＧＮ‐ＣＤ３３Ａ；Seattle Genetics）である：
【化２０】
2019520308.tif 000028
【０２８２】
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）は、抗生物質又は抗腫瘍活性を有する天然産物のクラスである。これらは放線菌によって天然で生産される。これらはＤＮＡアルキル化化合物であり、一部は配列選択性である。多数のＰＢＤ及びその誘導体、例えば：ＰＢＤ二量体（例えばＳＪＧ‐１３６又はＳＧ２０００）；Ｃ２不飽和ＰＢＤ二量体；Ｃ２アリール置換基を担持するピロロベンゾジアゼピン二量体（例えばＳＧ２２８５）；加水分解によって活性化するＰＢＤ二量体プロドラッグ（例えばＳＧ２２８５）；及びポリピロロールＰＢＤ（例えばＳＧ２２７４）が当該技術分野で公知である。ＰＢＤは更に、国際公開第２０００／０１２５０７号、国際公開第２００７／０３９７５２号、国際公開第２００５／１１０４２３号、国際公開第２００５／０８５２５１号、国際公開第２００５／０４０１７０号、及び国際公開第２０１４／０５７１１９号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＰＢＤ分子、その変異型又は誘導体はプロドラッグである。
【０２８３】
６．デュオカルマイシン細胞毒性薬物部分
あるいは、又は更に、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、デュオカルマイシン薬物部分を含んでよい。デュオカルマイシンは、初めはストレプトマイセス属の微生物から単離された一連の関連天然産物のメンバーであり、強力な抗腫瘍抗生物質である（Dokter, W. et al. (2014) “Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform,” Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629; Boger, D.L. et al. (1991). “Duocarmycins - A New Class Of Sequence Selective DNA Minor Groove Alkylating Agents,” Chemtracts: Organic Chemistry 4 (5): 329-349 (1991); Tercel et al. (2013) “The Cytotoxicity Of Duocarmycin Analogues Is Mediated Through Alkylation Of DNA, Not Aldehyde Dehydrogenase 1: A Comment,” Chem. Int. Ed. Engl. 52(21):5442-5446; Boger, D.L. et al. (1995) “CC-1065 And The Duocarmycins: Unraveling The Keys To A New Class Of Naturally Derived DNA Alkylating Agents,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92(9):3642-3649; Cacciari, B. et al. (2000) “CC-1065 And The Duocarmycins: Recent Developments,” Expert Opinion on Therapeutic Patents 10(12):1853-1871を参照）。
【０２８４】
天然のデュオカルマイシンとしては、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、及びＣＣ‐１０６５が挙げられる（国際公開第２０１０／０６２１７１号；Martin, D.G. et al. (1980) “Structure Of CC-1065 (NSC 298223), A New Antitumor Antibiotic,” J. Antibiotics 33:902-903; Boger, D.L. et al. (1995) “CC-1065 And The Duocarmycins: Unraveling The Keys To A New Class Of Naturally Derived DNA Alkylating Agents,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:3642-3649）。
【化２１】
2019520308.tif 000029
【０２８５】
好適な合成デュオカルマイシン類似体としては、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン（Ｕ‐８０２４４）及びスピロデュオカルマイシン（ＤＵＢＡ）が挙げられる（Dokter, W. et al. (2014) “Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform,” Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629; Elgersma, R.C. et al. (2014) “Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985,” Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835）：
【化２２】
2019520308.tif 000030
【０２８６】
更なる合成デュオカルマイシン類似体としては、国際公開第２０１０／０６２１７１号に開示されているもの、及び特に式：
【化２３】
2019520308.tif 000031
を有する類似体、又はその薬学的に許容可能な塩、水和物若しくは溶媒和物が挙げられ、ここでＤＢはＤＮＡ結合部分であり：
【化２４】
2019520308.tif 000032
からなる基から選択され、ここで：
Ｒは脱離基であり；
Ｒ2、Ｒ2'、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ12及びＲ19は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、Ｎ3、ＮＯ2、ＮＯ、ＣＦ3、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒａ、ＳＲa、Ｓ（Ｏ）Ｒa、Ｓ（Ｏ）２Ｒa、Ｓ（Ｏ）ＯＲa、Ｓ（Ｏ）2ＯＲa、ＯＳ（Ｏ）Ｒa、ＯＳ（Ｏ）2Ｒa、ＯＳ（Ｏ）ＯＲa、ＯＳ（Ｏ）2ＯＲa、ＯＲa、ＮＨＲa、Ｎ（Ｒa）Ｒb、＋Ｎ（Ｒa）（Ｒb）Ｒc、Ｐ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＲb）、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲa）（ＯＲb）、ＳｉＲaＲbＲc、Ｃ（Ｏ）Ｒa、Ｃ（Ｏ）ＯＲa、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒa）Ｒb、ＯＣ（Ｏ）Ｒa、ＯＣ（Ｏ）ＯＲa、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒa）Ｒb、Ｎ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）Ｒb、Ｎ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）ＯＲb及びＮ（Ｒa）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒb）Ｒcから選択され、ここでＲa、Ｒb及びＲcは独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ1-3アルキル若しくはＣ1-3ヘテロアルキルから選択され、又はＲ3＋Ｒ3'及び／若しくはＲ4＋Ｒ4'は独立して、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＯＲ18、＝Ｃ（Ｒ18）Ｒ18'及び＝ＮＲ18から選択され、Ｒ18及びＲ18'は独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ1-3アルキルから選択され、Ｒ2、Ｒ2'、Ｒ3、Ｒ3'、Ｒ4、Ｒ4'及びＲ12のうちの２つ以上は、１つ又は複数の結合によって連結されて、１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成し；
Ｘ2はＯ、Ｃ（Ｒ14）（Ｒ14'）及びＮＲ14'から選択され、ここでＲ14及びＲ14'は、Ｒ7に関して定義されたものと同一の意味を有し、かつ独立して選択され、又はＲ14'及びＲ7'は不在であり、これによってＲ7'及びＲ14'を担持するよう指定された原子間に二重結合がもたらされ；
Ｒ5、Ｒ5'、Ｒ6、Ｒ6'、Ｒ7及びＲ7'は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、Ｎ3、ＮＯ2、ＮＯ、ＣＦ3、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒe、ＳＲe、Ｓ（Ｏ）Ｒe、Ｓ（Ｏ）2Ｒe、Ｓ（Ｏ）ＯＲe、Ｓ（Ｏ）2ＯＲe、ＯＳ（Ｏ）Ｒe、ＯＳ（Ｏ）2Ｒe、ＯＳ（Ｏ）ＯＲe、ＯＳ（Ｏ）2ＯＲe、ＯＲe、ＮＨＲe、Ｎ（Ｒe）Ｒf、+Ｎ（Ｒe）（Ｒf）Ｒg、Ｐ（Ｏ）（ＯＲe）（ＯＲf）、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲe）（ＯＲf）、ＳｉＲeＲfＲg、Ｃ（Ｏ）Ｒe、Ｃ（Ｏ）ＯＲe、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒe）Ｒf、ＯＣ（Ｏ）Ｒe、ＯＣ（Ｏ）ＯＲe、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒe）Ｒf、Ｎ（Ｒe）Ｃ（Ｏ）Ｒf、Ｎ（Ｒe）Ｃ（Ｏ）ＯＲf、Ｎ（Ｒe）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒf）Ｒg及び水溶性基から選択され、ここで
Ｒe、Ｒf及びＲgは独立して、Ｈ及び任意に置換された（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）eeＣＨ2ＣＨ2Ｘ13Ｒe1、Ｃ1-15アルキル、Ｃ1-15ヘテロアルキル、Ｃ3-15シクロアルキル、Ｃ1-15ヘテロシクロアルキル、Ｃ5-15アリール又はＣ1-15ヘテロアリールから選択され、ここでｅｅは１〜１０００から選択され、Ｘ13はＯ、Ｓ及びＮＲf1から選択され、またＲf1及びＲe1は独立して、Ｈ及びＣ1-3アルキルから選択され、Ｒe、Ｒf、及び／又はＲgの任意の置換基のうちの１つ又は複数は、任意に水溶性基であり、Ｒe、Ｒf及びＲgのうちの２つ以上は任意に、１つ又は複数の結合によって連結されて１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成し；
あるいはＲ5＋Ｒ5'及び／若しくはＲ6＋Ｒ6'及び／若しくはＲ7＋Ｒ7'は独立して、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＯＲe3、＝Ｃ（Ｒe3）Ｒe4及び＝ＮＲe3、Ｒe3から選択され、またＲe4は独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ1-3アルキルから選択されるか、又はＲ5'＋Ｒ6'及び／若しくはＲ6'＋Ｒ7'及び／若しくはＲ7'＋Ｒ14'は不在であり、これによってＲ5'＋Ｒ6'及び／若しくはＲ6'＋Ｒ7'及び／若しくはＲ7'＋Ｒ14'それぞれを担持するよう指定された原子間に二重結合がもたらされ、Ｒ5、Ｒ5'、Ｒ6、Ｒ6'、Ｒ7、Ｒ7'、Ｒ14及びＲ14'のうちの２つ以上は任意に、１つ又は複数の結合によって連結されて１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成し；
Ｘ1はＯ、Ｓ及びＮＲから選択され、ここでＲは、Ｈ及び任意に置換されたＣ1-8アルキル又はＣ1-8ヘテロアルキルから選択され、他のいずれの置換基と連結されず；
Ｘ3は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ15）Ｒ15'、‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐Ｃ（Ｒ15''）（Ｒ15'''）‐、‐Ｎ（Ｒ15）‐Ｎ（Ｒ15'）‐、‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐Ｎ（Ｒ15"）‐、‐Ｎ（Ｒ15"）‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐、‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐Ｏ‐、‐Ｏ‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐、‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐Ｓ‐、‐Ｓ‐Ｃ（Ｒ15）（Ｒ15'）‐、‐Ｃ（Ｒ15）＝Ｃ（Ｒ15'）‐、＝Ｃ（Ｒ15）‐Ｃ（Ｒ15'）＝、‐Ｎ＝Ｃ（Ｒ15'）‐、＝Ｎ‐Ｃ（Ｒ15'）＝、‐Ｃ（Ｒ15）＝Ｎ‐、＝Ｃ（Ｒ15）‐Ｎ＝、‐Ｎ＝Ｎ‐、＝Ｎ‐Ｎ＝、ＣＲ15、Ｎ、ＮＲ15から選択され、又はＤＢ１及びＤＢ２では、‐Ｘ3‐は‐Ｘ3a及びＸ3b‐を表し、ここでＸ3aはＸ34に接続され、Ｘ34とＸ4との間には二重結合が存在し、またＸ3bはＸ11に接続され、ここでＸ3aは独立して、Ｈ及び任意に置換された（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）eeＣＨ2ＣＨ2Ｘ13Ｒe1、Ｃ1-8アルキル又はＣ1-8ヘテロアルキルから選択され、他のいずれの置換基と連結されず；
Ｘ4は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ16）Ｒ16'、ＮＲ16、Ｎ及びＣＲ16から選択され；
Ｘ5は、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ17）Ｒ17'、ＮＯＲ17及びＮＲ17から選択され、ここでＲ17及びＲ17'は独立して、Ｈ及び任意に置換されたＣ1-8アルキル又はＣ1-8ヘテロアルキルから選択され、他のいずれの置換基と連結されず；
Ｘ6は、ＣＲ11、ＣＲ11（Ｒ11'）、Ｎ、ＮＲ11、Ｏ及びＳから選択され；
Ｘ7は、ＣＲ8、ＣＲ8（Ｒ8'）、Ｎ、ＮＲ8、Ｏ及びＳから選択され；
Ｘ8は、ＣＲ9、ＣＲ9（Ｒ9'）、Ｎ、ＮＲ9、Ｏ及びＳから選択され；
Ｘ9は、ＣＲ10、ＣＲ10（Ｒ10'）、Ｎ、ＮＲ10、Ｏ及びＳから選択され；
Ｘ10は、ＣＲ20、ＣＲ20（Ｒ20'）、Ｎ、ＮＲ20、Ｏ及びＳから選択され；
Ｘ11は、Ｃ、ＣＲ21及びＮから選択され、又はＸ11‐Ｘ3bは、ＣＲ21、ＣＲ21（Ｒ21'）、Ｎ、ＮＲ21、Ｏ及びＳから選択され；
Ｘ12は、Ｃ、ＣＲ22及びＮから選択され；
Ｘ6*、Ｘ7*、Ｘ8*、Ｘ9*、Ｘ10*及びＸ11*は、それぞれＸ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10及びＸ11に関して定義されたものと同一の意味を有し、また独立して選択され；
Ｘ34は、Ｃ、ＣＲ23及びＮから選択され；
ＤＢ６及びＤＢ７のＸ11*の環Ｂ原子は、環Ａの環式原子に接続され、これによりＤＢ６及びＤＢ７の環Ａ及び環Ｂは単一結合によって直接接続され；
ダッシュで描かれた二重結合は、指示されている結合が単一結合又は
任意に非局在化された非累積二重結合であってよいことを意味しており；
Ｒ8、Ｒ8'、Ｒ9、Ｒ9'、Ｒ10、Ｒ10'、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ15"、Ｒ15"、Ｒ16、Ｒ16'、Ｒ20、Ｒ20'、Ｒ21、Ｒ21'、Ｒ22及びＲ23はそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ2、Ｎ3、ＮＯ2、ＮＯ、ＣＦ3、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、ハロゲン、Ｒh、ＳＲh、Ｓ（Ｏ）Ｒh、Ｓ（Ｏ）2Ｒh、Ｓ（Ｏ）ＯＲh、Ｓ（Ｏ）2ＯＲh、ＯＳ（Ｏ）Ｒh、ＯＳ（Ｏ）2Ｒh、ＯＳ（Ｏ）ＯＲh、ＯＳ（Ｏ）2ＯＲh、ＯＲh、ＮＨＲh、Ｎ（Ｒh）Ｒi、+Ｎ（Ｒh）（Ｒi）Ｒj、Ｐ（Ｏ）（ＯＲh）（ＯＲi）、ＯＰ（Ｏ）（ＯＲh）（ＯＲi）、ＳｉＲhＲiＲj、Ｃ（Ｏ）Ｒh、Ｃ（Ｏ）ＯＲh、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒh）Ｒi、ＯＣ（Ｏ）Ｒh、ＯＣ（Ｏ）ＯＲh、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒh）Ｒi、Ｎ（Ｒh）Ｃ（Ｏ）Ｒi、Ｎ（Ｒh）Ｃ（Ｏ）ＯＲi、Ｎ（Ｒh）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒi）Ｒj及び水溶性基から選択され；ここで
Ｒh、Ｒi及びＲjは独立して、Ｈ及び任意に置換された（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）eeＣＨ2ＣＨ2Ｘ13Ｒe1、Ｃ1-15アルキル、Ｃ1-15ヘテロアルキル、Ｃ3-15シクロアルキル、Ｃ1-15ヘテロシクロアルキル、Ｃ5-15アリール、又はＣ1-15ヘテロアリールから選択され、Ｒh、Ｒi及び／又はＲjの任意の置換基のうちの１つ又は複数は任意に、水溶性基であり、Ｒh、Ｒi及びＲjのうちの２つ以上は任意に、１つ又は複数の結合によって連結されて１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成し；
あるいは、Ｒ8＋Ｒ8'及び／又はＲ9＋Ｒ9'及び／又はＲ10＋Ｒ10'及び／又はＲ11＋Ｒ11'及び／又はＲ15＋Ｒ15'及び／又はＲ15"＋Ｒ15'"及び／又はＲ16＋Ｒ16'及び／又はＲ20＋Ｒ20'及び／又はＲ21＋Ｒ21'は独立して、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＯＲh1、＝Ｃ（Ｒhl）Ｒh2及び＝ＮＲhlから選択され、Ｒhl及びＲh2は独立して、Ｈ及び及び任意に置換されたＣ1-3アルキルから選択され、Ｒ8、Ｒ8'、Ｒ9、Ｒ9'、Ｒ10、Ｒ10'、Ｒ11、Ｒ11'、Ｒ15、Ｒ15'、Ｒ15"、Ｒ15'"、Ｒ16、Ｒ20、Ｒ20'、Ｒ21、Ｒ21'、Ｒ22及びＲ23のうちの２つ以上は任意に、１つ又は複数の結合によって連結されて１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成し；
Ｒ8b及びＲ9bは独立して選択され、またこれらが他のいずれの置換基と連結し得ないことを除いて、Ｒ8と同一の意味を有し；
Ｒ4及びＲ4'のうちの一方と、Ｒ16及びＲ16'のうちの一方とは任意に、１つ又は複数の結合によって連結されて１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成してよく；
Ｒ2、Ｒ2'、Ｒ3及びＲ3'のうちの１つと、Ｒ5及びＲ5'のうちの一方とは任意に、１つ又は複数の結合によって連結されて１つ又は複数の任意に置換された炭素環及び／又は複素環を形成してよく；
ａ及びｂは独立して０〜１から選択され；
ＤＢ部分は、ＤＡＩ、ＤＡ２、ＤＡＩ’又はＤＡ２'部分を含まず；
ＤＢ１の環Ｂは複素環であり；
ＤＢ１のＸ3が‐Ｘ3a及びＸ3b‐を表し、かつ環Ｂが芳香族である場合、上記環Ｂ上の２つの近接した置換基は連結して、上記環Ｂに融合した、任意に置換された炭素環又は複素環を形成し；
ＤＢ２のＸ3 が‐Ｘ3a及びＸ3b‐を表し、かつ環Ｂが芳香族である場合、上記環Ｂ上の２つの近接した置換基は連結して：上記環Ｂに融合した、任意に置換された複素環；上記環Ｂに融合した、任意に置換された非芳香族炭素環；又は上記環Ｂに融合し、かつヒドロキシ基、一次アミノ基又は二次アミノ基を含有する少なくとも１つの置換基が付着した、置換された芳香族炭素環を形成し、上記一次又は二次アミンは芳香環系中の環式原子でも、アミドの一部でもなく；
ＤＢ２の環Ａが６員芳香環である場合、環Ｂ上の置換基は、環Ｂに融合した環を形成するように連結せず；
ＤＢ８の環Ａ上の２つの近接した置換基は連結して、任意に置換された炭素環又は複素環を形成し、これは上記環Ａに融合して二環式部分を形成し、これに環がこれ以上融合せず；
ＤＢ９の環Ａは、上記環Ａに融合したいずれの環と共に、少なくとも２つのヘテロ原子を含有する。
【０２８７】
上述のリンカー分子は、上で示したように、チオール‐マレイミドの化学的作用を用いて、システインチオール基にコンジュゲートできる。いくつかの実施形態では、細胞毒性デュオカルマイシン薬物部分は、プロドラッグである。例えば、プロドラッグであるｖｃ‐ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡを、切断可能ペプチド部分を介してマレイミドリンカー部分に結合した自己消去性部分にコンジュゲートできる。
【化２５】
2019520308.tif 000033
【０２８８】
この分子のマレイミドリンカー部分は、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのＡｂ部分のＶＬドメイン及び／若しくはＶＨドメイン並びに／又は定常ドメインのシステイン残基のチオール基にコンジュゲートできる。これに続く、切断可能ペプチド部分のタンパク質分解切断の後、自己消去性部分の自発的な消去が発生し、これはｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡの放出につながり、これは自然に転位して、活性薬物ＤＵＢＡを形成する：
【化２６】
2019520308.tif 000034
（Dokter, W. et al. (2014) “Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform,” Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629を参照）
【０２８９】
Ｂ７‐Ｈ３‐デュオカルマイシン薬物部分コンジュゲートの生産のための好ましい方法では、Elgersma, R.C. et al. (2014) “Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985,” Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835による方法、又は国際公開第２０１１／１３３０３９号の方法が採用される。従って、抗Ｂ７‐Ｈ３抗体又は抗体断片のＶＬ又はＶＨ鎖のチオール含有基は、マレイミドリンカー部分‐切断可能ペプチド部分‐自己消去性部分によって、ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡ又は他のプロドラッグにコンジュゲートされる（スキーム９Ａ）：
【化２７】
2019520308.tif 000035
【０２９０】
本発明はＤＵＢＡプロドラッグに関して例示されているが、代わりにスキーム９Ｂに示すように、他のプロドラッグ、例えばＣＣ‐１０６５を採用してもよい。
【化２８】
2019520308.tif 000036
【０２９１】
切断可能ペプチド部分の切断及び自己消去性部分の消去後、プロドラッグ部分は、Winstein スピロ環化を経て活性薬物を（例えばスキーム９Ｃに示すように、ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡからＤＵＢＡを）もたらすと考えられる。
【化２９】
2019520308.tif 000037
【０２９２】
ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡは、対応するＤＮＡアルキル化及びＤＮＡ結合部分（例えばElgersma, R.C. et al. (2014) “Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985,” Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835に記載されているような１，２，９，９ａ‐テトラヒドロシクロプロパ‐［ｃ］ベンゾ［ｅ］インドール‐４‐オン骨格）から調製される（Boger, D.L. et al. (1989) “Total Synthesis and Evaluation of (±)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-CBI, (±)-CBI-CDPI1, and (±)-CBI-CDPI2: CC-1065 Functional Agents Incorporating the Equivalent 1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[1,2-c]benz[1,2-e]indol-4-one (CBI) Left-Hand Subunit,” J. Am. Chem. Soc. 111:6461-6463; Boger, D.L. et al. (1992) “DNA Alkylation Properties of Enhanced Functional Analogs of CC-1065 Incorporating the 1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[1,2-c]benz[1,2-e]indol-4-one (CBI) Alkylation Subunit,” J. Am. Chem. Soc. 114:5487-5496を参照）。
【０２９３】
スキーム９Ｄは、ＤＵＢＡのためのＤＮＡ‐アルキル化部分の合成を示すことによって、本発明を例示する。ｏ‐トルアルデヒド（１）とコハク酸ジメチル（２）とを反応させて、ストッべ縮合によって酸（３ａ／３ｂ）の混合物を生成する。この酸の混合物の環の閉鎖は、トリフルオロ酢酸無水物を用いて達成でき、これによりアルコール（４）が得られ、次にこれを塩化ベンジルで保護してベンジルエーテル（５）を得る。メチルエステル基を確実に加水分解することにより、カルボン酸（６）が得られ、これをトルエン及びｔｅｒｔ‐ブチルアルコールの混合物中でクルチウス転位させて、カルバメート（７）を得る。Ｎ‐ブロモスクシンイミドでの臭素化により、臭化物（８）を得る。臭化物（８）をカリウムｔｅｒｔ‐ブトキシドの存在下において（Ｓ）‐グリシジルノシレートでアルキル化して、エポキシド（９）を得る。ｎ‐ブチルリチウムとの反応は、所望の化合物（１０）と、脱臭素化され転位された誘導体（１１）とをもたらす。溶媒としてテトラヒドロフランを用い、反応温度を-２５〜-２０℃に維持した場合、所望の化合物（１０）の収率は比較的高くなる。これらの条件下において、所望の化合物（１０）と、脱臭素化され転位された誘導体（１１）とは、およそ１：１の比率で得ることができる。ｐ‐トルエンスルホン酸での後処理により、脱臭素化され転位された誘導体（１１）が（７）へと変換され、これにより所望の化合物（１０）の回収が支援される。（１０）中のヒドロキシル基のメシル化と、これに続く塩化リチウムを用いた塩化物置換とにより、重要な中間体（１２）が得られる。
【化３０】
2019520308.tif 000038
【０２９４】
スキーム９Ｅは、ＤＵＢＡのためのＤＮＡ結合部分の合成を示すことによって、本発明を例示する。従ってチチバビン環化反応を、ブロモピルビン酸エチル（１３）と５‐ニトロピリジン‐２‐アミン（１４）との間で進行させることができ、これによりニトロ化合物（１５）が得られる。酸性条件下での亜鉛を用いたニトロ基の還元により、アミン（１６）を得る。クロロメチルメチルエーテルとの反応及びこれに続くエステル加水分解（国際公開第２００４／０８０９７９号を参照）によってメチル４‐ヒドロキシベンゾエートから調製された、メトキシメチル（ＭＯＭ）被保護４‐ヒドロキシ安息香酸（１７）との結合によって、エチルエステル（１８）が得られ、これを水性１，４‐ジオキサン中において水酸化ナトリウムで加水分解することによって、酸（１９）を得ることができる。
【化３１】
2019520308.tif 000039
【０２９５】
次に、ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡを、ＤＮＡ‐アルキル化単位（１２）及びＤＮＡ結合部分（１９）から合成する。ｔｅｒｔ‐ブトキシドカルボニル（Ｂｏｃ）保護基を酸性条件下で（１２）から除去して、アミン（２０）を形成する。アミン（２０）と化合物（１９）とのＥＤＣ仲介型結合により、被保護化合物（２１）が得られ、次にこれを２つの連続したステップ（（２２）を得るための、Ｐｄ／Ｃ、ＮＨ４ＨＣＯ２、ＭｅＯＨ／ＴＨＦを用いた、３時間、９０％のステップ、及びこれに続く、ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡ（２３）をＨＣｌ塩として提供するための、ＨＣｌ、１，４‐ジオキサン／水を用いた、１時間、９５％のステップ）で完全に脱保護する（スキーム９Ｆ）。
【化３２】
2019520308.tif 000040
【０２９６】
他の薬物のプロドラッグ、例えばＣＣ‐１０６５は、例えば国際公開第２０１０／０６２１７１号に記載されているように合成できる。
【０２９７】
プロドラッグ部分は好ましくは、スキーム９Ｇに従って、ＡＤＣの他の部分に連結される。（２４）と２‐（２‐アミノエトキシ）エタノール（２５）との縮合反応によってアルコール（２６）を得ることから始め、これを次に、４‐ニトロフェニルクロロホルメートとの反応によって反応性炭酸塩（２７）に変換することによって、マレイミドリンカー構成ブロックを合成した。Dubowchik, G.M. et al. (2002) “Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers For Lysosomal Release Of Doxorubicin From Internalizing Immunoconjugates: Model Studies Of Enzymatic Drug Release And Antigen-Specific In Vitro Anticancer Activity,” Bioconjugate Chem. 13:855-869に従って調製されたＨ‐バリン‐シトルリン‐ＰＡＢＡ（２８）に（２７）を結合させることにより、リンカー（２９）が形成され、これを炭酸ビス（４‐ニトロフェニル）で処理することによって、活性化されたリンカー（３０）を得た。
【化３３】
2019520308.tif 000041
スキーム９Ｈに示すように、ｓｅｃｏ‐ＤＵＢＡ‐ＭＯＭ（２２）を、２ステップでのコンジュゲーションのために修飾した。４‐ニトロフェニルクロロホルメート及びｔｅｒｔ‐ブチルメチル（２‐（メチルアミノ）エチル）カルバメート（３１）による（２２）の連続処理により、化合物（３２）を得る。（３２）中のＢｏｃ及びＭＯＭ保護基を除去することによって、（３３）がＴＦＡ塩として得られた。
【化３４】
2019520308.tif 000042
【０２９８】
わずかに塩基性の条件下での、活性化されたリンカー（３０）と環化スペーサ‐デュオカルマイシン構造体（３３）との反応によって、ＡＤＣを合成した。これらの条件下では、環化スペーサの自己消去及びその結果としての３ａの形成は抑制された（スキーム９Ｉ）。
【化３５】
2019520308.tif 000043
【０２９９】
このプロセスは平均して、ｍＡｂ１つあたり２つの遊離チオール基を生成し、これは、平均薬物対抗体比（drug-to-antibody-ratio：ＤＡＲ）が約２であり、かつ高分子量種及び残留したコンジュゲートしていないデュオカルマイシン部分の量が少ないＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの統計的分布をもたらす。
【０３００】
合成の複数のステップの順序は所望に応じて変更してよい。好ましくは、使用する方法は、上述のようにスキーム９Ａ〜９Ｉのものとなる。
【０３０１】
ＸＩＩ．本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子の使用
本発明は、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子（例えば、抗体、二重特異性抗体、二重特異性ダイアボディ、３価結合分子、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ等）、このような分子由来のポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをエンコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用剤を含む、医薬組成物を含む組成物を包含する。
【０３０２】
本明細書に記載されているように、本明細書に記載の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、細胞表面上に存在するＢ７‐Ｈ３に結合して、抗体依存性細胞仲介型細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／若しくは相補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を誘発する、並びに／又は標的転換細胞殺滅（例えば標的転換Ｔ細胞細胞毒性）を仲介する能力を有する。いずれの作用機序に束縛されることを意味するものではないが、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子は、腫瘍細胞が発現するＢ７‐Ｈ３に結合すると内在化され、コンジュゲートした細胞毒素の作用による腫瘍細胞の殺滅を仲介する。
【０３０３】
よって、本明細書に記載の抗Ｂ７‐Ｈ３‐ＶＬ及び／又はＶＨドメインを含む本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とするいずれの疾患又は状態を治療する能力を有する。上述のように、Ｂ７‐Ｈ３は、低分化形態を呈する高悪性度腫瘍に関連する多数の血液及び固形悪性病変において発現されるオンコ胚抗原であり、臨床転帰不良と相関する。従って限定するものではないが、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、癌、特にＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする癌の診断又は治療に採用できる。
【０３０４】
本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子で治療できる癌としては、以下の細胞：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；副腎癌；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；Ｂ細胞癌；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；グリア芽細胞腫；血液悪性腫瘍；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病（例えば急性骨髄性白血病）；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；中皮腫咽頭癌；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）；軟組織肉腫；扁平上皮癌（例えば頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ））；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする癌が挙げられる。
【０３０５】
特に本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽細胞腫、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺部リンパ腫、中皮腫咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）、扁平上皮癌（頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））、精巣癌、甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）、並びに子宮癌の治療に使用できる。
【０３０６】
本発明の二重特異性Ｂ７‐Ｈ３結合分子は、上記分子の第２の特異性（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１６、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ等）を発現する腫瘍細胞の標的転換殺滅を促進することによって、Ｂ７‐Ｈ３が提供する癌の治療を増進する。このようなＢ７‐Ｈ３結合分子は特に癌の治療に有用である。
【０３０７】
治療における有用性に加えて、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は検出可能な標識を付すことができ、癌の診断又は腫瘍及び腫瘍細胞の撮像に使用できる。
【０３０８】
ＸＩＩＩ．医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子のうちの１つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本発明はまた、特定の癌抗原に対して特異的である第２の治療用抗体（例えば腫瘍特異性モノクローナル抗体）、及び薬学的に許容可能なキャリアを更に含む、上記医薬組成物も包含する。
【０３０９】
ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（pharmaceutically acceptable）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア（carrier）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。
【０３１０】
本発明はまた、単独の又は上述のような薬学的に許容可能なキャリアと組み合わされた本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子で充填された１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを含む、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。
【０３１１】
本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。キットは、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣを含む本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子のいずれを含むことができる。このキットは更に、癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤及び／又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含むことができる
【０３１２】
ＸＩＶ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子又は本発明の融合タンパク質若しくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、げっ歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０３１３】
例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体媒介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。
【０３１４】
本発明の分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３を参照（これらはそれぞれ、参照により本出願に援用される）。
【０３１５】
本発明はまた、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子の調製物を、この分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、上記分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。
【０３１６】
凍結乾燥された本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子の調製物は、その元々のコンテナ内において２℃〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、このような分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、このようなＢ７‐Ｈ３結合分子は、液体形態で提供される場合、気密性コンテナ内に供給される。
【０３１７】
障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の上記調製物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。
【０３１８】
本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（effective amount）」は：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。
【０３１９】
有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な：ウイルスの存在の増殖（又はその影響）の低減；並びにウイルス性疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。
【０３２０】
本発明に包含されるＢ７‐Ｈ３結合分子に関して、患者に投与される投薬量は好ましくは、レシピエント被検体の体重（ｋｇ）に基づいて決定される。本発明に包含されるＢ７‐Ｈ３結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被検体の体重に対して約０．０１μｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ以上である。
【０３２１】
本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子の投与の用量及び頻度は、例えば脂質化等の改質によって分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって低減又は変更できる。
【０３２２】
患者に投与される本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。あるいは、上記分子は他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、上記分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。
【０３２３】
本発明の医薬組成物は、治療が必要な領域に局所的に投与してよく、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。
【０３２４】
本発明の組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327を参照）。
【０３２５】
治療的又は予防的有効量の本発明のＢ７‐Ｈ３結合分子を用いた被験体の治療は、単回治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、上述のようなダイアボディを用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。本発明の医薬組成物は、１日に１回投与でき、このような投与は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等の頻度で行われる。あるいは本発明の医薬組成物は１日に２回投与でき、このような投与は、１週間に１回、１週間に２回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等の頻度で行われる。あるいは本発明の医薬組成物は１日に３回投与でき、このような投与は、１週間に１回、１週間に２回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回等の頻度で行われる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。
【０３２６】
ＸＶ．本発明の実施形態
本発明は特に、以下の実施形態（ＥA及びＥB）に関する：
ＥA１．
式：
Ａｂ‐（ＬＭ）m‐（Ｄ）n
を含む抗Ｂ７‐Ｈ３抗体薬物コンジュゲート（Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ）であって：
Ａｂは、ヒト化可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及びヒト化可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含むＢ７‐Ｈ３に結合する抗体、又はそのＢ７‐Ｈ３結合断片であり；
Ｄは、細胞毒性薬物部分であり；
ＬＭは、上記Ａｂ及び上記Ｄを共有結合させる結合又はリンカー分子であり；
ｍは０〜ｎの整数であって、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣのリンカー分子の数を表し；
ｎは１〜１０の整数であって、上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子に共有結合した上記細胞毒性薬物部分の数を表す、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２．
（Ａ）（ｉ）上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号９９のアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０４のアミノ酸配列を含む；又は
（Ｂ）（ｉ）上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む；
（Ｃ）（ｉ）上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号３０のアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、ＥA１のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA３．
上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号９９のアミノ酸配列を含み、上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、ＥA１のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA４．
上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含み、上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号２１のアミノ酸配列を含む、ＥA１のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA５．
上記ヒト化ＶＬドメインが配列番号３０のアミノ酸配列を含み、上記ヒト化ＶＨドメインが配列番号３１のアミノ酸配列を含む、ＥA１のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA６．
上記Ａｂが抗体である、ＥA１〜ＥA５のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA７．
上記Ａｂが抗体の抗原結合断片である、ＥA１〜ＥA５のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA８．
上記Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣが、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む、ＥA１〜ＥA７のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA９．
上記ヒトＩｇＧが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、ＥA８のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１０．
上記Ｆｃドメインが変異型Ｆｃドメインであり、上記変異型Ｆｃドメインは：
（ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾：及び／又は
（ｂ）上記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を含む、ＥA８又はＥA９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１１．
ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する上記修飾は：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、ＥA１０のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１２．
上記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる上記修飾は：Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、ＥA１０又はＥA１１のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１３．
上記ＬＭのうちの少なくとも１つがリンカー分子である、ＥA１〜ＥA１２のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１４．
上記ＬＭリンカー分子はペプチドリンカーである、ＥA１３のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１５．
上記ＬＭリンカー分子は切断可能リンカーである、ＥA１３のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１６．
上記分子が式：
Ａｂ‐［Ｖ‐（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａ］‐Ｄ
を含み、ここで：
Ｖは上記切断可能ＬＭリンカー分子であり；
（Ｗ）k‐（Ｘ）1‐Ａは、ｌ，（４＋２ｎ）消去によって自己消去する、細長い自己消去性スペーサ系であり；
Ｗ及びＸはそれぞれｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサであり、同一であるか又は異なっており；
Ａは、式（Ｙ）m（ここでＹはｌ，（４＋２ｎ）電子カスケードスペーサである）のスペーサ基、又は式Ｕの基であり、環化除去スペーサであり；
ｋ、１及びｍは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
ｎは０〜１０（両端を含む）の整数であり；
ただし：
Ａが（Ｙ）mである場合、ｋ＋ｌ＋ｍ≧１であり；
ｋ＋ｌ＋ｍ＝ｌである場合、ｎ＞ｌであり；
ＡがＵである場合、ｋ＋１≧１である。
Ｗ、Ｘ及びＹは独立して、以下の式：
【化３６】
2019520308.tif 000044
又は以下の式：
【化３７】
2019520308.tif 000045
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｑは‐Ｒ5Ｃ＝ＣＲ6‐、Ｓ、Ｏ、ＮＲ5、‐Ｒ5Ｃ＝Ｎ‐又は‐Ｎ＝ＣＲ5‐であり；
ＰはＮＲ7、Ｏ又はＳであり；
ａ、ｂ及びｃは独立して、０〜５（両端を含む）の整数であり；
Ｉ、Ｆ及びＧは独立して、式：
【化３８】
2019520308.tif 000046
を有する化合物から選択され、ここで：
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8及びＲ9は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここで：
Ｒx、Ｒx1及びＲx2は独立して、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
上記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8又はＲ9のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成し；
Ｕは、式：
【化３９】
2019520308.tif 000047
【化４０】
2019520308.tif 000048
を有する化合物から選択され、ここで：
ａ、ｂ及びｃは独立して、０又は１の整数となるよう選択され；
ただしａ＋ｂ＋ｃ＝２又は３であり；
Ｒ1及び／又はＲ2は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキルを表し、上記アルキルは任意に、以下の基：ヒドロキシ（ＯＨ）、エーテル（ＯＲx）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲｘＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲX）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲX）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲｘ）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）のうちの１つ又は複数によって置換され、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-20ヘテロシクリル、Ｃ5-20アリール、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ（ＯＨ）、アミノ（ＮＨ2）、モノ置換アミノ（ＮＲxＨ）、ジ置換アミノ（ＮＲx1Ｒx2）、ニトロ（ＮＯ2）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＣＯＮＨ2、ＳＯ2Ｍｅ、ＣＯＮＨＭｅ、環式Ｃ1-5アルキルアミノ、イミダゾリル、Ｃ1-6アルキルピペラジニル、モルホリノ、チオール（ＳＨ）、チオエーテル（ＳＲx）、テトラゾール、カルボキシ（ＣＯＯＨ）、カルボン酸塩（ＣＯＯＲx）、スルホキシ（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ）、スルホン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）2ＯＲx）、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）2Ｒx）、スルフィキシ（Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ）、スルフィン酸塩（Ｓ（＝Ｏ）ＯＲx）、スルフィニル（Ｓ（＝Ｏ）Ｒx）、ホスホノオキシ（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2）、及びリン酸塩（ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲx）2）を表し、ここでＲx、Ｒx1及びＲx2は、Ｃ1-6アルキル基、Ｃ3-20ヘテロシクリル基又はＣ5-20アリール基から選択され、上記置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、又はＲ8のうちの２つ以上は任意に、互いに接続して１つ又は複数の脂肪族又は芳香族環式構造を形成する、ＥA１５のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１７．
上記ＬＭリンカー分子が：
（１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（２）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（３）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（４）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル；
（５）ｐ‐アミノ‐ベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（６）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（７）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
（８）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル；
（９）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐアミノベンジルオキシカルボニル；
（１０）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル；
（１１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１２）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１３）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１４）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１５）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）‐カルボニル；
（１６）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル（メチルアミノ）エチル（メチルアミノ）カルボニル；
（１７）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（１８）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（１９）ｐ‐アミノシンナミル；
（２０）ｐ‐アミノシンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；
（２１）ｐ‐アミノベンジルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２２）ｐ‐アミノ‐シンナミルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２３）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニル；
（２４）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノシンナミル；
（２５）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノベンジル；又は
（２６）ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルオキシカルボニル‐ｐ‐アミノフェニルペンタジエニルを含む、ＥA１６のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１８．
上記ＬＭリンカー分子が上記Ａｂのポリペプチド鎖のアミノ酸の側鎖にコンジュゲートされて、上記Ａｂを上記細胞毒性薬物部分Ｄの分子に結合させる、ＥA１３〜ＥA１７のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA１９．
上記細胞毒性薬物部分Ｄは、細胞毒素、放射性同位元素、免疫調節因子、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、成長因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、ペプチド、脂質、炭水化物、キレート剤、又はこれらの組み合わせを含む、ＥA１〜ＥA１８のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２０．
上記細胞毒性薬物部分Ｄは細胞毒素を含み、ツブリシン、オーリスタチン、マイタンシノイド、カリチアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン及びデュオカルマイシンからなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２１．
上記細胞毒性薬物部分Ｄはツブリシン細胞毒素を含み、ツブリシンＡ、ツブリシンＢ、ツブリシンＣ及びツブリシンＤからなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２２．
上記細胞毒性薬物部分Ｄはオーリスタチン細胞毒素を含み、ＭＭＡＥ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐ノルエフェドリン）及びＭＭＡＦ（Ｎ‐メチルバリン‐バリン‐ドライソロイイン‐ドラプロイン‐フェニルアラニン）からなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２３．
上記細胞毒性薬物部分Ｄはマイタンシノイド細胞毒素を含み、マイタンシン、ＤＭ１及びＤＭ４からなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２４．
上記細胞毒性薬物部分Ｄはカリチアマイシン細胞毒素を含み、カリチアマイシンγ１、カリチアマイシンβ１Ｂｒ、カリチアマイシンγ１Ｂｒ、カリチアマイシンα２Ｉ、カリチアマイシンα３Ｉ、カリチアマイシンβ１Ｉ、カリチアマイシンγ１Ｉ及びカリチアマイシンΔ１Ｉからなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２５．
上記細胞毒性薬物部分Ｄはピロロベンゾジアゼピン細胞毒素を含み、バダスツキシマブ・タリリン、ＳＪＧ‐１３６、ＳＧ２０００、ＳＧ２２８５及びＳＧ２２７４からなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２６．
上記細胞毒性薬物部分Ｄはデュオカルマイシン細胞毒素を含み、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、ＣＣ‐１０６５、アドゼレシン、ビゼレシン、カルゼルシン（Ｕ‐８０２４４）及びスピロ‐デュオカルマイシン（ＤＵＢＡ）からなる群から選択される、ＥA１９のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２７．
上記ＬＭリンカー分子は、還元された鎖間ジスルフィドを介して上記Ａｂと共有結合する、ＥA１〜ＥA２６のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ。
ＥA２８．
有効量のＥA１〜ＥA２７のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣと、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
ＥA２９．
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療における、ＥA１〜ＥA２７のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ又はＥA２８の医薬組成物の使用。
ＥA３０．
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする上記疾患又は上記状態は癌である、ＥA２９の使用。
ＥA３１．
上記癌は：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；副腎癌；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；Ｂ細胞癌；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；グリア芽細胞腫；血液悪性腫瘍；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病（例えば急性骨髄性白血病）；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；中皮腫咽頭癌；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）；軟組織肉腫；扁平上皮癌（例えば頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ））；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、ＥA３０の使用。
ＥA３２．
上記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽細胞腫、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺部リンパ腫、中皮腫咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）、扁平上皮癌（頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））、精巣癌、甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）、並びに子宮癌からなる群から選択される、ＥA３０の使用。
ＥB１．
ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む可変重鎖（ＶＨ）ドメインとを含み：
（１）上記ＣＤＲH１ドメインは配列番号２７のアミノ酸配列を含み；
（２）上記ＣＤＲH２ドメインは配列番号２８のアミノ酸配列を含み；
（３）上記ＣＤＲH３ドメインは配列番号２９のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２．
ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含む上記ＶＬドメインと、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む上記ＶＨドメインとを含み：
（１）上記ＣＤＲL１ドメインは配列番号２３のアミノ酸配列を含み；
（２）上記ＣＤＲL２ドメインは配列番号２４のアミノ酸配列を含み；
（３）上記ＣＤＲL３ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含む、ＥB１のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB３．
ＣＤＲL１ドメイン、ＣＤＲL２ドメイン及びＣＤＲL３ドメインを含む上記ＶＬドメインと、ＣＤＲH１ドメイン、ＣＤＲH２ドメイン及びＣＤＲH３ドメインを含む上記ＶＨドメインとを含み：
上記ドメインは：
（１）配列番号２７のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH１ドメイン；
（２）配列番号２８のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH２ドメイン；
（３）配列番号２９のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲH３ドメイン；
（４）配列番号２３のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL１ドメイン；
（５）配列番号２４のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL２ドメイン；及び
（６）配列番号２５のアミノ酸配列を含む、ＣＤＲL３ドメイン
からなる群から選択される、ＥB１のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB４．
上記ＶＨドメインが配列番号２６又は配列番号３１のアミノ酸配列を含む、ＥB１〜ＥB３のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB５．
上記ＶＬドメインが配列番号２２又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む、ＥB１〜ＥB４のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB６．
ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、上記ＶＬドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB７．
ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、上記ＶＨドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB８．
ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、上記ＶＬドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含み、上記ＶＨドメインは配列番号２１のアミノ酸配列を含む、Ｂ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB９.
上記分子は抗体又はその抗原結合断片である、ＥB１〜ＥB８のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１０．
上記分子は：
（ａ）二重特異性抗体；又は
（ｂ）ダイアボディであって、上記ダイアボディは、２つ、３つ、４つ若しくは５つのポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、ダイアボディ；又は
（ｃ）３価結合分子、上記３価結合分子は、３つ、４つ、５つ又は６つ以上のポリペプチド鎖を含む共有結合複合体である、３価結合分子
である、ＥB１〜ＥB８のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１１．
上記分子はＦｃドメインを含む、ＥB１〜ＥB１０のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１２．
上記分子はダイアボディであり、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む、ＥB１０のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１３．
上記Ｆｃドメインが変異型Ｆｃドメインであり、上記変異型Ｆｃドメインは：
（ａ）ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する１つ若しくは複数のアミノ酸修飾：及び／又は
（ｂ）上記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる１つ若しくは複数のアミノ酸修飾
を含む、ＥB１１のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１４．
ＦｃγＲに対する上記変異型Ｆｃドメインの親和性を低減する上記修飾は：Ｌ２３４Ａ；Ｌ２３５Ａ；又はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、ＥB１３のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１５．
上記変異型Ｆｃドメインの血清半減期を増大させる上記修飾は：Ｍ２５２Ｙ；Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ；Ｍ２５２Ｙ及びＴ２５６Ｅ；Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ；又はＫ２８８Ｄ及びＨ４３５Ｋの置換を含み、この番号付与は、Ｋａｂａｔにおけるものと同様のＥＵインデックスの番号付与である、ＥB１３又はＥB１４のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１６．
上記分子は二重特異性であり、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる２つのエピトープ結合部位とを含む、ＥB１〜ＥB１５のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１７．
上記分子は二重特異性であり、Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位とを含む、ＥB１〜ＥB１５のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１８．
上記分子は三重特異性であり：
（ａ）Ｂ７‐Ｈ３のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；
（ｂ）エフェクタ細胞の表面上に存在する第１の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位；及び
（ｃ）エフェクタ細胞の表面上に存在する第２の分子のエピトープに免疫特異的に結合できる１つのエピトープ結合部位
を含む、ＥB１〜ＥB１５のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB１９．
上記分子は、Ｂ７‐Ｈ３と、エフェクタ細胞の表面上に存在する分子との同時に結合できる、ＥB１〜ＥB８のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２０．
エフェクタ細胞の表面上に存在する上記分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲ又はＮＫＧ２Ｄである、ＥB１６〜ＥB１８のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２１．
上記エフェクタ細胞は細胞毒性Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、ＥB１６〜ＥB２０のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２２．
エフェクタ細胞の表面上に存在する上記分子はＣＤ３である、ＥB１６〜ＥB２０のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２３．
エフェクタ細胞の表面上に存在する上記第１の分子はＣＤ３であり、エフェクタ細胞の表面上に存在する上記第２の分子はＣＤ８である、ＥB１８のＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２４．
上記分子は、Ｂ７‐Ｈ３を発現する細胞及び細胞毒性Ｔ細胞の配位結合を仲介する、ＥB１６〜ＥB２３のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３結合分子。
ＥB２５．
有効量のＥB１〜ＥB２４のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣと、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
ＥB２６．
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする疾患若しくは状態の治療における、ＥB１〜ＥB２４のいずれか１つのＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ又はＥB２５の医薬組成物の使用。
ＥB２７．
Ｂ７‐Ｈ３の発現に関連する又はＢ７‐Ｈ３の発現を特徴とする上記疾患又は上記状態は癌である、ＥB２６の使用。
ＥB２８．
上記癌は：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；副腎癌；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；Ｂ細胞癌；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；グリア芽細胞腫；血液悪性腫瘍；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病（例えば急性骨髄性白血病）；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌（例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；中皮腫咽頭癌；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）；軟組織肉腫；扁平上皮癌（例えば頭頸部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ））；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）；及び子宮癌からなる群から選択される癌細胞の存在を特徴とする、ＥB２７の使用。
ＥB２９．
上記癌は、副腎癌、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、胃癌、グリア芽細胞腫、腎臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺部リンパ腫、中皮腫咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、腎細胞癌、小児期の小円形青色細胞腫瘍（神経芽細胞腫及び横紋筋肉腫を含む）、扁平上皮癌（頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））、精巣癌、甲状腺癌（例えば甲状腺転移癌）、並びに子宮癌からなる群から選択される、ＥB２７の使用。
【実施例】
【０３２７】
ここまで本発明について概説してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによって更に容易に理解される。以下の実施例は、本発明の診断又は治療方法における、組成物に関する様々な方法を例示する。以下の実施例は本発明の範囲の例示を目的としたものであり、本発明の範囲を限定することを目的としたものではない。
【０３２８】
実施例１
抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の生成、ヒト化及び特性決定
過去に記述されているように、生存ヒト胎児前駆細胞又は腫瘍開始／癌段階様細胞（cancer step-like cell：ＣＳＬＣ）を用いたマウスの免疫化によってモノクローナル抗体を生成した（Loo et al.  (2007) “The glycotope-specific RAV12 monoclonal antibody induces oncosis in vitro and has antitumor activity against gastrointestinal adenocarcinoma tumor xenografts in vivo” Mol Cancer Ther; 6: 856-65）。癌特異性ｍＡｂに関するＩＨＣスクリーニングにより、高分化腫瘍対正常組織結合を有する抗Ｂ７‐Ｈ３（ＣＤ２７６）反応性ｍＡｂを同定した。サポニンコンジュゲート抗マウスＦａｂを製造元のプロトコル（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って１：１又は１０：１のＦａｂ‐ＺＡＰ：試験ｍＡｂ比で用いる５日間のアッセイで実施される内在化アッセイを用いて、効率的に内在化された抗Ｂ７‐Ｈ３抗体のサブセットを同定した。図７に示すように、「ｍＡｂ‐Ｃ」及び「ｍＡｂ‐Ｄ」と称される抗Ｂ７‐Ｈ３抗体を含む多数の抗Ｂ７‐Ｈ３抗体を効率的に内在化させた。
【０３２９】
上述の抗Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ：ｍＡｂ‐Ｂ、ｍＡｂ‐Ｃ及びｍＡｂ‐Ｄを用いて、ヒト化ＶＬ及びＶＨドメインを形成する。これらのドメインのＣＤＲL及びＣＤＲHは、ヒトフレームワークドメインに融合している。これらのヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを用いて、κ軽鎖定常領域（即ち配列番号１）並びにＩｇＧ１  ＣＨ１、ヒンジ及びＦｃドメイン（即ち配列番号３、６、１２）を有するヒト化軽鎖を生成する。これらのヒト化抗体は、「ｈｍＡｂ‐Ｂ」、「ｈｍＡｂ‐Ｃ」及び「ｈｍＡｂ‐Ｄ」と称される。
【０３３０】
上記ヒト化ＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列は、既に提示されている。なお、上述のようにｈｍＡｂ‐ＢのＣＤＲを修飾することによって、代替的なヒト化ＶＨ及びＶＬドメインを生成してもよい。ｈｍＡｂ‐Ｃ及びｈｍＡｂ‐Ｄの全ヒト化軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は既に提示されている。
【０３３１】
上記ヒト化抗体の結合動態を、可溶性ヒト又はカニクイザルＢ７‐Ｈ３（４Ｉｇ）‐Ｈｉｓタグ融合タンパク質（それぞれｓｈＢ７‐Ｈ３‐Ｈｉｓ又はｓｃＢ７‐Ｈ３‐Ｈｉｓ）を不動化された抗体に通過させるＢｉａｃｏｒｅ分析を用いて調査した。簡潔に述べると、各ヒト化抗体を、不動化されたＦａｂ２ヤギ抗ヒトＦｃ表面上で捕捉し、ｓｈＢ７‐Ｈ３‐Ｈｉｓ又はｓｃＢ７‐Ｈ３‐ｈｉｓ（６．２５〜１００Ｎｍ）を用いてインキュベートし、結合の動態をＢｉａｃｏｒｅ分析によって決定した。２価結合フィッティングを用いてこれらの研究から算出されたｋa、ｋd及びＫDを表６に示す。これらの結果は、ヒト化抗体がヒト及びカニクイザルＢ７‐Ｈ３によって、様々な親和性で結合することを実証している。
【表７】
2019520308.tif 000049
【０３３２】
ヒト化抗体の組織交差反応性を、免疫組織化学（immunohistochemistry：ＩＨＣ）によって検査した。表７は、正常なヒト組織、ヒト腫瘍組織、ヒト癌細胞株、及びＢ７‐Ｈ３を発現する又は発現しないＣＨＯ細胞株に対して、ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体を指示されている抗体濃度で用いて実施した、複数のＩＨＣ研究に関する発見をまとめたものである。これらの研究の採点基準は表８に提示されている。
【表８】
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【表９】
2019520308.tif 000051
【０３３３】
これらの結果は、全てのヒト化抗体が多数のＢ７‐Ｈ３陽性腫瘍細胞への結合を示すことを実証している。ｈｍＡｂ‐Ｂは、試験した条件下において最高の腫瘍反応性を示しているが、肝細胞及び副腎組織について正常組織反応性も示す。ｈｍＡｂ‐Ｃは、ｈｍＡｂ‐Ｂに比べて腫瘍反応性が若干低いが、正常な肝細胞との反応性は有意に低く、また反応性を示す個々の試料の数が少ない。ｈｍＡｂ‐Ｄは、腫瘍及び正常細胞に対する反応性が全体的に低下している。これらの抗体は、カニクイザル組織との相当な交差反応性を示すが、ｈｍＡｂ‐ＤはこれらのＩＨＣ研究では比較的低い強度で結合する。標的外の毒性を最小化するために、本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子の生成には、ｈｍＡｂ‐Ｃ及びｈｍＡｂ‐Ｄが好ましいものとなり得る。
【０３３４】
実施例２
Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの生成
上述のマウス抗Ｂ７‐Ｈ３  ｍＡｂ：ｍＡｂ‐Ａ、ｍＡｂ‐Ｂ、ｍＡｂ‐Ｃ及びｍＡｂ‐Ｄを用いてキメラ抗体を形成した。この抗体のＶＬドメインはヒト軽鎖κ定常領域（配列番号１）に融合しており、またこの抗体のＶＨドメインはヒトＩｇＧ１  ＣＨ１‐ヒンジ‐ＣＨ２‐ＣＨ３定常領域（それぞれ配列番号３、７及び１２）に融合している。キメラ化された抗体（「ｃｈｍＡｂ‐Ａ」、「ｃｈｍＡｂ‐Ｂ」、「ｃｈｍＡｂ‐Ｃ」及び「ｃｈｍＡｂ‐Ｄ」）を、上述のような切断可能オーリスタチンＥリンカー／ペイロード「ｖｃ‐ＭＭＡＥ」（Concortis Biosystems）を用いたＢ７‐Ｈ３結合ドメインへのシステインコンジュゲーションによって、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣに変換した。
【０３３５】
実施例３
Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは強力なインビトロ活性を示す
本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの抗腫瘍活性を実証するために、上述のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）を１〜１００，０００ｐＭの濃度で、Ｂ７‐Ｈ３発現性ＪＩＭＴ‐１乳癌細胞、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳癌細胞、Ａ３７５．５２黒色腫細胞、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞、ＮＣＩ‐Ｈ１７０３非小細胞肺癌細胞、ＮＣＩ‐Ｈ１９７５非小細胞肺癌細胞、ＰＡ‐１卵巣癌細胞、Ｈｓ７００Ｔ膵臓癌細胞、ＤＵ１４５前立腺癌細胞、又はＢ７‐Ｈ３陰性Ｒａｊｉ  Ｂ細胞リンパ腫細胞と共にインキュベートした。７日後にインビトロ細胞毒性を定量した。簡潔に述べると、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ及び対照を希釈し、マイクロタイタープレート上に播種し、各ウェルに５０００個の細胞を添加して３７℃で４〜７日間インキュベートする。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬（例えばBioRad/ThermoFisher/Invitrogen）をプレートに添加し、製造元のプロトコルに従って読み取る。これらの細胞上に存在する抗体結合部分の数を、Ｂａｎｇｓ  ＱＦＡＣＳ（商標）キットを用いて決定した。
【０３３６】
この研究から得られた細胞毒性曲線を、図８Ａ〜８Ｊに提示する。ＩＣ５０値を決定し、これを表９に示す。これらの研究の結果は、試験した内在性抗Ｂ７‐Ｈ３抗体がそれぞれ、Ｂ７‐Ｈ３発現性腫瘍細胞に対してインビトロでの用量依存的細胞毒性を示したことを実証している。これらの抗体は様々な効力を示した。これらのアッセイにおける相対効力は：ｃｈｍＡｂ‐Ｃ＞ｃｈｍＡｂ‐Ｂ＞ｃｈｍＡｂ‐Ｄ＞ｃｈｍＡｂ‐Ａであった。
【表１０】
2019520308.tif 000052
【０３３７】
実施例４
Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは強力なインビボ活性を示す
本発明のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの抗腫瘍活性を更に実証するために、上述のｃｈｍＡｂ‐Ｂ  Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ  Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ及び／又はｃｈｍＡｂ‐Ｄ  Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）分子を、異なる複数の腫瘍細胞株を用いて、ＣＤ１ヌードマウスモデルにおいてインビボ毒性に関して評価した。簡潔に述べると、〜５×１０6個の腫瘍細胞（１：１培地及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）中に懸濁）を、一群のＣＤ１ヌードマウス（Charles River Laboratories）に皮下移植した。腫瘍の体積がおよそ１５０ｍｍ3に達した時にマウスをランダム化し、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ又は対照ビヒクルを腹腔内に投与した。これらの研究では、１用量のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ又は対照ビヒクルを投与した（ｑｄｘ１）。電子キャリパーを用いた直交測定によって、腫瘍を１週間に２回測定し、腫瘍体積を（長さ×幅×高さ）／２として算出した。（対照に対する）腫瘍体積を決定した（「Ｔ／Ｃ」）。処置済みの動物の腫瘍体積が研究期間中に≦５ｍｍ3まで減少するという発見は、完全応答（Complete Response：「ＣＲ」）を意味するものと考えられた。
【０３３８】
ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳癌腫瘍細胞に対するインビボ活性
乳房脂肪体に移植されたＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８乳癌腫瘍細胞に対するこの研究の結果を表１０及び図９に提示する。これは、ＭＤＡ‐ＭＢ‐４６８腫瘍細胞に対する応答性を示す。
【表１１】
2019520308.tif 000053
【０３３９】
ＮＣＩ‐Ｈ１７０３非小細胞肺癌腫瘍細胞に対するインビボ活性
皮下移植されたＮＣＩ‐Ｈ１７０３非小細胞肺癌腫瘍細胞に対するこの研究の結果を表１１及び図１０Ａ〜１０Ｃに提示する。これは、ＮＣＩ‐Ｈ１７０３腫瘍細胞に対する応答性を示す。
【表１２】
2019520308.tif 000054
【０３４０】
ＰＡ‐１卵巣癌腫瘍腫瘍細胞に対するインビボ活性
皮下移植されたＰＡ‐１卵巣癌腫瘍細胞に対するこの研究の結果を表１２及び図１１Ａ〜１１Ｃに提示する。これは、ＰＡ‐１腫瘍細胞に対する応答性を示す。
【表１３】
2019520308.tif 000055
【０３４１】
Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌腫瘍細胞に対するインビボ活性
皮下移植されたＣａｌｕ‐６非小細胞肺癌腫瘍細胞に対するこの研究の結果を表１３及び図１２Ａ〜１２Ｃに提示する。これは、Ｃａｌｕ‐６腫瘍細胞に対する応答性を示す。
【表１４】
2019520308.tif 000056
【０３４２】
Ａ３７５．Ｓ２黒色腫腫瘍細胞に対するインビボ活性
皮下移植されたＡ３７５．Ｓ２黒色腫腫瘍細胞に対するこの研究の結果を表１４及び図１３Ａ〜１３Ｃに提示する。これは、Ａ３７５．Ｓ２黒色腫細胞に対する応答性を示す。
【表１５】
2019520308.tif 000057
【０３４３】
これらの研究の結果は、試験したＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣがそれぞれ、乳房、肺及び卵巣癌並びに黒色腫のマウス異種移植片モデルにおけるＢ７‐Ｈ３陽性腫瘍に対して、有意な用量依存性インビボ抗腫瘍活性を示したことを実証している。
【０３４４】
上述のＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（ＭＭＡＥ）分子を、非腫瘍担持ＣＤ１ヌードマウスにおいて、上記分子を５ｍｇ／ｋｇの単回用量で腹腔内投与することによって評価した。血液試料を１０日間にわたって回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡを血清に対して実施して、全抗体及び完全なＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの濃度を定量した。
【０３４５】
ｃｈｍＡｂ‐Ｂ  Ｂ７‐Ｈ３  ＡＤＣ、ｃｈｍＡｂ‐Ｃ  Ｂ７‐Ｈ３  ＡＤＣ及びｃｈｍＡｂ‐Ｄ  Ｂ７‐Ｈ３  ＡＤＣに対するこの研究の代表的な結果を、図１４Ａ‐１４Ｃ及び表１５に提示する。これは、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子が極めて安定しており、およそ２．２〜３．６日の半減期を示したことを示している。これらのコンジュゲートの半減期は、コンジュゲートしていない分子の半減期に相当し、これはＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ分子がマウス内で極めて安定していることを示している。
【表１６】
2019520308.tif 000058
【０３４６】
実施例５
切断可能リンカー‐デュオカルマイシン部分を有するＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ
Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣであって、既に記載したように（スキーム９Ａ〜９Ｉを参照）、かつElgersma, R.C. et al. (2014) “Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985,” Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835（国際公開第０２／０８３１８０号；国際公開第２０１０／０６２１７１号；国際公開第２０１１／１３３０３９号；国際公開第２０１５／１０４３５９号；及び国際公開第２０１５／１８５１４２号も参照）におけるように、還元された鎖間ジスルフィドを介して上記抗体にコンジュゲートされた切断可能リンカーを介してそのＡｂ部分のアミノ酸残基に結合された例示的なデュオカルマイシン部分（ＤＵＢＡ）を有する、Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（「ｈｍＡｂ‐Ｃ  Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ」）を構成する。平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）は約２〜４、典型的には約２．７である。正確なＤＡＲは調製毎に変化し得ることが理解されるだろう。合成の複数のステップの順序は所望に応じて変更してよい。好ましくは、使用する方法は、上述のようにスキーム９Ａ〜９Ｉのものとなり、リンカー‐ＤＵＢＡは還元された鎖間ジスルフィドを介して抗体にコンジュゲートされる。
【０３４７】
実施例６
切断可能リンカー‐デュオカルマイシン部分を有するＢ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、生物活性を保持する
上述のｈｍＡｂ‐Ｃ  Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣ（切断可能リンカーを介してそのＡｂ部分のアミノ酸残基に結合された例示的なデュオカルマイシン部分（ＤＵＢＡ）を有する）（「ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ」）を、細胞と共に７日間インキュベートし、基本的に上述の通りのａｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを用いて生存率を決定した。図１５Ａ〜１５Ｃに示すように、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ構造は、Ｂ７‐Ｈ３陽性腫瘍細胞に対するその細胞毒性活性によって証明されるように、生物活性を保持した。同様の結果が、デュオカルマイシンに結合した上述のｃｈｍＡｂ‐Ｃ（「ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ」）に関して観察された。
【０３４８】
この研究及び以下に記載の追加の研究において、ＤＵＢＡにコンジュゲートされた無関係の抗原（ＣＤ２０）に結合する分子（「Ｃｔｒｌ‐ＤＵＢＡ」）を非結合対照ＡＤＣとして使用して、げっ歯類の血漿中に存在するげっ歯類特異的カルボキシルエステラーゼＣＥＳ１ｃによるインビボでの非特異的活性について考察した。
【０３４９】
実施例７
Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣは、インビボで強力な抗腫瘍活性を示す
上記分子のインビボでの有効性を評価するために、多回用量研究を実施した。Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞を、基本的に上述の通りのマウスの群（ｎ＝５）に皮下移植し、マウスは続いて、接種後２４、３１、３８及び４５日目（矢印で示す）に複数の用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ（１ｍｇ／ｋｇ×３、３ｍｇ／ｋｇ×３、又は６ｍｇ／ｋｇ×３）を投与され、これらの動物を、最長で６２日間にわたって、（基本的に上述の通りに）腫瘍体積に関して評価した。図１６に示すように、試験した全てのｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの用量は、腫瘍体積の低減又は排除に有効であることが分かった。Ｃａｌｕ‐６細胞は２＋のＩＨＣスコアを示した。細胞１個あたりの抗体結合部位（ＡＢＣ）は、表９において報告されている。
【０３５０】
第２のインビボ研究（基本的に上述の通りに実施した）では、Ｃａｌｕ‐６非小細胞肺癌細胞をマウスの群（ｎ＝７）に皮下移植し、マウスは続いて、２０日目（矢印で示す）に単回用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ）を投与された。表１６及び図１７はその結果をまとめたものであり、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを提供することによって腫瘍体積が大幅に低減されたことを示す。
【表１７】
2019520308.tif 000059
【０３５１】
第３のインビボ研究（基本的に上述の通りに実施した）では、ＰＡ‐１卵巣癌細胞をマウスの群（ｎ＝６）に皮下移植し、マウスは続いて、２５日目（矢印で示す）に単回用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（１ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ）を投与された。表１７及び図１８はその結果をまとめたものであり、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを提供することによって腫瘍体積が大幅に低減され、最高で治療対象の動物の半分が完全な寛解を達成したことを示す。
【表１８】
2019520308.tif 000060
【０３５２】
Ａ３７５．Ｓ２黒色腫細胞に対しても、強力なインビボ活性が観察された。上記細胞をマウスの群（ｎ＝７）に皮下移植し、マウスは続いて、２５日目（矢印で示す）に単回用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（１ｍｇ／ｋｇ又は３ｍｇ／ｋｇ）を投与された。表１８及び図１９はその結果をまとめたものであり、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを提供することによって腫瘍体積が大幅に低減され、試験したうちの高い方の用量において、治療対象の動物の５／７が完全な寛解を達成したことを示す。
【表１９】
2019520308.tif 000061
【０３５３】
ＭＤＡ‐ＭＢ４６８乳癌細胞に対しても、強力なインビボ活性が観察された。上記細胞を（基本的に上述の通りに）マウスの群（ｎ＝５）の乳房脂肪体に移植し、マウスは続いて、７０日目（矢印で示す）に単回用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ若しくはＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ若しくは６ｍｇ／ｋｇ）を、又は３用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ若しくはＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ）を、投与された。これらの動物を、最長で１１０日間にわたって、（基本的に上述の通りに）腫瘍体積に関して評価した。ＭＤＡ‐ＭＢ４６８細胞は２＋のＩＨＣスコアを示した。ＡＢＣは表９において報告されている。表１９及び図２０Ａ〜２０Ｄは、その結果をまとめたものである。図２０Ａは、６ｍｇ／ｋｇ（単回用量）におけるビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２０Ｂは、３ｍｇ／ｋｇ（単回用量）におけるビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２０Ｃは、３ｍｇ／ｋｇ（３回用量）におけるビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２０Ｄは、これらの結果全てを１つのグラフ上で示す。データは、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを提供することによって腫瘍体積が大幅に低減され、試験したうちの高い方の用量において、治療対象の動物の４／５が完全な寛解を達成したこと、及び用量を繰り返し提供することによって治療転帰が改善されたことを示す。
【表２０】
2019520308.tif 000062
【０３５４】
更なる研究では、ＰＡ‐１卵巣癌細胞の異種移植片（１：１培地及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）中に懸濁された〜５×１０6個の腫瘍細胞）を、マウスの群に皮下移植し、マウスは続いて、接種後２４日目にある用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ若しくはＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡ（３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇの単回用量）を、又は（接種後２４及び２８日目に）１０ｍｇ／ｋｇの用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを２回、又は（接種後２４、２８、３１及び３５日目に）６ｍｇ／ｋｇの用量のｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを４回、投与された。これらの動物を、（基本的に上述の通りに）最大７０日間、腫瘍体積に関して評価した。ＰＡ‐１細胞は２＋のＩＨＣスコアを示した。ＡＢＣは表９において報告されている。図２１Ａ〜２１Ｄは、その結果をまとめたものである。図２１Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ（単回又は２回用量）におけるｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２１Ｂは、６ｍｇ／ｋｇ（単回又は４回用量）におけるビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２１Ｃは、３ｍｇ／ｋｇ（単回用量）におけるビヒクル、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ又はＣｔｒｌ‐ＤＵＢＡに関する結果を示す。図２１Ｄは、これらの結果全てを１つのグラフ上で示す。データは、ｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡを提供することによって、治療対象の動物において腫瘍体積が大幅に低減されたことを示す。
【０３５５】
実施例８
Ｂ７‐Ｈ３‐ＡＤＣの薬物動態
上述のｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの薬物動態を、それぞれ単回用量のｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与されたマウス（ｎ＝３）における全ＩｇＧ又は完全ＡＤＣ曲線の対数線形プロットを用いて調査した。結果を図２２に示す。
【０３５６】
ｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡの薬物動態を、それぞれ単回用量のｃｈｍＡｂ‐Ｃ‐ＤＵＢＡ（１ｍｇ／ｋｇ（オス１頭；メス１頭）、３ｍｇ／ｋｇ（オス１頭；メス１頭、１０ｍｇ／ｋｇ（オス１頭；メス１頭）又は２７ｍｇ／ｋｇ（オス２頭；メス２頭））を皮下投与されたカニクイザルにおける全ＩｇＧ又は完全ＡＤＣ曲線の対数線形プロットを用いて調査した。結果を図２３Ａ（全ＩｇＧ）及び図２３Ｂは（完全ＡＤＣ）に示す。
【０３５７】
これらの研究では、全ＩｇＧはＥＬＩＳＡで決定した。簡潔に述べると、血清試料、標準及び対照を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）でコーティングしたマイクロタイタープレート上で捕捉した。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼ‐コンジュゲート済みヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃと共にインキュベートした。洗浄後、プレートを３、３’、５、５’‐テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で発色させ、リン酸で反応を停止させて、プレートを４０５ｎＭで読み取った。試験試料中の全ＩｇＧを、標準曲線から算出した。完全ＡＤＣもまたＥＬＩＳＡで決定した。簡潔に述べると、マウス抗デュオカルマイシンｍＡｂをマイクロタイタープレート上で不動化した。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼ‐コンジュゲート済みヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃと共にインキュベートした。洗浄後、プレートを３、３’、５、５’‐テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質で発色させ、リン酸で反応を停止させて、プレートを４０５ｎＭで読み取った。試験試料中の完全ＡＤＣを、標準曲線から算出した。
【０３５８】
用量５ｍｇ／ｋｇのマウス、並びに用量３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのカニクイザルに関する、薬物動態パラメータを、これらのデータを比較することによって推測した。これは表２０にまとめられている（ここでＡＵＣ  Ｌａｓｔは、始点から最終データ点までの曲線の下側の領域を意味する）。マウスにおける完全ＡＤＣの曝露は、げっ歯類特異的カルボキシルエステラーゼＣＥＳ１ｃによって限定されている。これらのデータは、前臨床的状況における大きな治療指数を示す。
【表２１】
2019520308.tif 000063
【０３５９】
実施例９
抗Ｂ７‐Ｈ３ダイアボディの特性決定
Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性２鎖及び３鎖ダイアボディを評価して、これらの、標的転換細胞殺滅、及び／又は細胞表面Ｂ７‐Ｈ３を発現する標的細胞からのサイトカイン放出を仲介する能力を実証する。標的転換細胞殺滅を、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイを用いて試験する。簡潔に述べると、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（又はＢ７‐Ｈ３の代わりに無関係な抗原に結合する陰性対照ダイアボディ）を、エフェクタｐａｎ  Ｔ細胞及び標的Ｂ７‐Ｈ３発現性腫瘍細胞（エフェクタ：標的細胞の比は１０：１）と共に、２４時間インキュベートする。％細胞毒性（即ち細胞殺滅）を、損傷した細胞による培地への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出の測定によって決定する。サイトカイン放出を同様のフォーマットを用いて試験する。簡潔に述べると、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディ（又はＢ７‐Ｈ３結合部位を含まない陰性対照ダイアボディ）を、エフェクタＰＢＭＣ細胞のみと共に、又は１０：１若しくは３０：１のエフェクタ：標的細胞比での標的腫瘍細胞（例えばＳＫ‐ＭＥＳ‐１肺癌細胞）の存在下で、インキュベートし、ＩＦＮγ、ＴＮＦ‐α及びＩＬ‐１０サイトカインの放出を決定する。この分析は、Ｂ７‐Ｈ３×ＣＤ３二重特異性ダイアボディの、標的転換細胞殺滅及びサイトカイン放出を仲介する能力を示す。
【０３６０】
本明細書中で言及されている全ての刊行物及び特許は、これらの個々の刊行物又は特許出願がそれぞれ、その全体が参照により援用されることが具体的かつ個別に指示されているかのように、参照により本出願に援用される。本発明について、その具体的な実施形態に関連して説明したが：更なる修正が可能であること；並びに本出願が、本発明の原理に基本的に従い、かつ発明が属する技術分野内での公知の又は慣例的な慣行の範囲内であるような、及びこれ以前に記載されている本質的な特徴に適合し得るような、本開示からの発展を含む、本発明のいずれの変更、使用又は改変を包含することを意図したものであることが、理解されるだろう。
【配列表フリーテキスト】
【０３６１】
配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：ヒトＩｇＧ  ＣＬκドメイン
配列番号２：ヒトＩｇＧ  ＣＬλドメイン
配列番号３：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン
配列番号４：ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン
配列番号５：ヒトＩｇＧ３  ＣＨ１ドメイン
配列番号６：ヒトＩｇＧ４  ＣＨ１ドメイン
配列番号７：ヒトＩｇＧ１ヒンジドメイン
配列番号８：ヒトＩｇＧ２ヒンジドメイン
配列番号９：ヒトＩｇＧ３ヒンジドメイン
配列番号１０：ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン
配列番号１１：Ｓ２２８Ｐ安定化ヒトＩｇＧ４ヒンジドメイン
配列番号１２：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１３：ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１４：ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１５：ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号１６：Ｂ７−Ｈ３のヒト４Ｉｇ形態
配列番号１７：Ｂ７−Ｈ３のヒト２Ｉｇ形態
配列番号１８：マウス抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｍＡｂ‐Ｃ」のＶＬドメイン
配列番号１９：マウス抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｍＡｂ‐Ｃ」のＶＨドメイン
配列番号２０：ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ‐Ｃ」のＶＬドメイン
配列番号２１：ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ‐Ｃ」のＶＨドメイン
配列番号２２：マウス抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｍＡｂ‐Ｄ」のＶＬドメイン
配列番号２３：抗体ｍＡｂ‐Ｄの軽鎖ＣＤＲ１
配列番号２４：抗体ｍＡｂ‐Ｄの軽鎖ＣＤＲ２
配列番号２５：抗体ｍＡｂ‐Ｄの軽鎖ＣＤＲ３
配列番号２６：マウス抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｍＡｂ‐Ｄ」のＶＨドメイン
配列番号２７：抗体ｍＡｂ‐Ｄの重鎖ＣＤＲ１
配列番号２８：抗体ｍＡｂ‐Ｄの重鎖ＣＤＲ２
配列番号２９：抗体ｍＡｂ‐Ｄの重鎖ＣＤＲ３
配列番号３０：ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ‐Ｄ」のＶＬドメイン
配列番号３１：ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ‐Ｄ」のＶＬドメイン
配列番号３２：ポリペプチドリンカー（リンカー１）
配列番号３３：システイン含有スペーサペプチド（リンカー２）
配列番号３４〜３９：ポリペプチドスペーサペプチド（代替的なリンカー２）
配列番号４０〜４４：ヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号４５：：ヘテロ二量体促進Ｅコイルドメイン
配列番号４６：：ヘテロ二量体促進Ｋコイルドメイン
配列番号４７：：ヘテロ二量体促進システイン含有Ｅコイルドメイン
配列番号４８：：ヘテロ二量体促進システイン含有Ｋコイルドメイン
配列番号４９：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）
配列番号５０〜５２：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異型
配列番号５３〜５９：ポリペプチドリンカー
配列番号６０：Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号６１：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの「ノブ担持」変異型、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号６２：ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの「ホール担持」変異型、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号６３：マウス抗ヒトＣＤ２  Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＨドメイン
配列番号６４：マウス抗ヒトＣＤ２  Ｌｏ‐ＣＤ２ａのＶＬドメイン
配列番号６５：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＶＨ（１）のＶＨドメイン
配列番号６６：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＶＨ（２）のＶＨドメイン
配列番号６７：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１のＶＬドメイン
配列番号６８：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１（Ｄ６５Ｇ）のＶＨドメイン
配列番号６９：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＬｏｗのＶＨドメイン
配列番号７０：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＣＤ３  ｍＡｂ‐１  ＦａｓｔのＶＨドメイン
配列番号７１：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＶＨドメイン
配列番号７２：マウス抗ヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３のＶＬドメイン
配列番号７３：マウス抗ヒトＣＤ８抗体ＯＫＴ８のＶＨドメイン
配列番号７４：マウス抗ヒトＣＤ８抗体ＯＫＴ８のＶＬドメイン
配列番号７５：マウス抗ヒトＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＨドメイン
配列番号７６：マウス抗ヒトＣＤ８抗体ＴＲＸ２のＶＬドメイン
配列番号７７：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体３Ｇ８のＶＨドメイン
配列番号７８：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体３Ｇ８のＶＬドメイン
配列番号７９：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体Ａ９のＶＨドメイン
配列番号８０：マウス抗ヒトＣＤ１６抗体Ａ９のＶＬドメイン
配列番号８１：マウス抗ヒトＴ細胞受容体抗体ＢＭＡ０３１のＶＨドメイン
配列番号８２：マウス抗ヒトＴ細胞受容体抗体ＢＭＡ０３１のＶＬドメイン
配列番号８３：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体抗体ＫＹＫ−１．０のＶＨドメイン
配列番号８４：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体抗体ＫＹＫ−１．０のＶＬドメイン
配列番号８５：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体抗体ＫＹＫ−２．０のＶＨドメイン
配列番号８６：マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体抗体ＫＹＫ−２．０のＶＬドメイン
配列番号８７：ＤＡＲＴ‐Ｄ１の第１のポリペプチド鎖
配列番号８８：ＤＡＲＴ‐Ｄ１の第２のポリペプチド鎖
配列番号８９：ＤＡＲＴ‐Ｄ２の第１のポリペプチド鎖
配列番号９０：ＤＡＲＴ‐Ｄ２の第２のポリペプチド鎖
配列番号９１：「ＤＡＲＴ‐Ｄ３」の第１のポリペプチド鎖、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号９２：「ＤＡＲＴ‐Ｄ３」の第２のポリペプチド鎖
配列番号９３：「ＤＡＲＴ‐Ｄ３」の第３のポリペプチド鎖、Ｘはリシン（Ｋ）又は不在である
配列番号９４：Streptoverticillium mobaraenseトランスグルタミナーゼのテトラペプチド基質
配列番号９５：マウス抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｍＡｂ−Ａ」のＶＬドメイン
配列番号９６：マウス抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｍＡｂ−Ａ」のＶＨドメイン
配列番号９７：マウス抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｍＡｂ−Ｂ」のＶＬドメイン
配列番号９８：マウス抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｍＡｂ−Ｂ」のＶＨドメイン
配列番号９９：ヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」のＶＬドメイン
配列番号１００：ヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１０１：代替的なヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」の軽鎖ＣＤＲ１
配列番号１０２：ヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１０３：代替的なヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」の軽鎖ＣＤＲ２
配列番号１０４：ヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」のＶＨドメイン
配列番号１０５：ヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」の重鎖ＣＤＲ２
配列番号１０６：代替的なヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ３抗体「ｈｍＡｂ−Ｂ」の重鎖ＣＤＲ２
【図１】
2019520308.tif 000069
【図２】
2019520308.tif 000070
【図３Ａ】
2019520308.tif 000071
【図３Ｂ】
2019520308.tif 000072
【図３Ｃ】
2019520308.tif 000073
【図４Ａ】
2019520308.tif 000074
【図４Ｂ】
2019520308.tif 000075
【図５】
2019520308.tif 000076
【図６Ａ】
2019520308.tif 000077
【図６Ｂ】
2019520308.tif 000078
【図６Ｃ】
2019520308.tif 000079
【図６Ｄ】
2019520308.tif 000080
【図６Ｅ】
2019520308.tif 000081
【図６Ｆ】
2019520308.tif 000082
【図７】
2019520308.tif 000083
【図８Ａ】
2019520308.tif 000084
【図８Ｂ】
2019520308.tif 000085
【図８Ｃ】
2019520308.tif 000086
【図８Ｄ】
2019520308.tif 000087
【図８Ｅ】
2019520308.tif 000088
【図８Ｆ】
2019520308.tif 000089
【図８Ｇ】
2019520308.tif 000090
【図８Ｈ】
2019520308.tif 000091
【図８Ｉ】
2019520308.tif 000092
【図８Ｊ】
2019520308.tif 000093
【図９】
2019520308.tif 000094
【図１０Ａ】
2019520308.tif 000095
【図１０Ｂ】
2019520308.tif 000096
【図１０Ｃ】
2019520308.tif 000097
【図１１Ａ】
2019520308.tif 000098
【図１１Ｂ】
2019520308.tif 000099
【図１１Ｃ】
2019520308.tif 000100
【図１２Ａ】
2019520308.tif 000101
【図１２Ｂ】
2019520308.tif 000102
【図１２Ｃ】
2019520308.tif 000103
【図１３Ａ】
2019520308.tif 000104
【図１３Ｂ】
2019520308.tif 000105
【図１３Ｃ】
2019520308.tif 000106
【図１４Ａ】
2019520308.tif 000107
【図１４Ｂ】
2019520308.tif 000108
【図１４Ｃ】
2019520308.tif 000109
【図１５Ａ】
2019520308.tif 000110
【図１５Ｂ】
2019520308.tif 000111
【図１５Ｃ】
2019520308.tif 000112
【図１６】
2019520308.tif 000113
【図１７】
2019520308.tif 000114
【図１８】
2019520308.tif 000115
【図１９】
2019520308.tif 000116
【図２０Ａ】
2019520308.tif 000117
【図２０Ｂ】
2019520308.tif 000118
【図２０Ｃ】
2019520308.tif 000119
【図２０Ｄ】
2019520308.tif 000120
【図２１Ａ】
2019520308.tif 000121
【図２１Ｂ】
2019520308.tif 000122
【図２１Ｃ】
2019520308.tif 000123
【図２１Ｄ】
2019520308.tif 000124
【図２２】
2019520308.tif 000125
【図２３Ａ】
2019520308.tif 000126
【図２３Ｂ】
2019520308.tif 000127
【配列表】
2019520308000001.app
【国際調査報告】
2019520308.tif 000128
2019520308.tif 000129
2019520308.tif 000130
2019520308.tif 000131