(57)【要約】  がんを有する対象を処置する組成物及び方法が本明細書に開示される。組成物及び方法は、腫瘍細胞の死滅をもたらす免疫応答細胞を利用する。
2019525898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記ポリペプチド構築物が複合体化されていないHLA分子に結合せず、前記ポリペプチド構築物が細胞上で発現されるか又は合成される、組成物。
【請求項２】
前記HLA分子が、HLA-A血清型又はそのバリアントである、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記HLA-A血清型が、HLA-A*24である、請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記HLA-A*24が、HLA-A*24:02である、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
前記複合体が、前記HLA分子のクラスター形成を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記複合体が、K-立体構造を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記K-立体構造が、同等の正常細胞と比較した場合、前記HLA分子の差次的な特有の分布又は差次的なクラスター形成のうちの少なくとも1つを含む、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチド構築物が、少なくとも1つの共受容体に結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも1つの共受容体が、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択される、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも1つの共受容体が、CD8である、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの共受容体が、CD8アルファ又はCD8ベータのうちの少なくとも1つを含む、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
前記標的細胞が、がん細胞である、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記がん細胞が、前記HLA分子を異常に発現している、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記異常な発現が、前記標的細胞上での前記K-立体構造を含み、前記異常な発現及び前記複合体化が、同等の正常細胞上には存在しない、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
前記異常な発現が、同等の正常細胞上の異常に発現していないHLAと比較して、構造、可動性、フレキシビリティー、又は区画化のうちの少なくとも1つを含む、請求項13に記載の組成物。
【請求項１６】
前記複合体化が、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によって検出される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記がん細胞が、前記同等の正常細胞と比較して、前記HLAを過剰発現している、請求項12から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記過剰発現が、フローサイトメトリーによって検出する場合、前記がん細胞の集団における約1%から約100%の発現を含む、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記過剰発現が、免疫組織化学(IHC)分析による前記HLA分子の陽性検出を含む、請求項17又は18に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチド構築物が、免疫細胞上で発現される、請求項1から19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記免疫細胞が、骨髄又はリンパ系統に由来する、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
前記免疫細胞が、リンパ系統に由来する、請求項21に記載の組成物。
【請求項２３】
リンパ系統由来の前記免疫細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞のうちの少なくとも1つである、請求項22に記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫細胞が、複数のT細胞である、請求項20から23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記複数のT細胞が、遺伝子操作されたαβT細胞である、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
前記免疫細胞が、前記ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されている、請求項20から25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫細胞が、前記ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されていない、請求項20から26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチド構築物が、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部をコードする、請求項1から27のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
TCRの前記少なくとも一部が、遺伝子操作されたTCRである、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
前記TCRが、γδTCRである、請求項28又は29に記載の組成物。
【請求項３１】
前記γδTCRが、γ9δ2TCR又はγ5δ1TCRである、請求項30に記載の組成物。
【請求項３２】
前記γδTCRが、前記免疫細胞にとって外因性である、請求項30又は31に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫細胞が増殖される、請求項20から32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記免疫細胞が、それを必要とする対象に投与される、請求項20から33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
それを必要とする前記対象が、前記免疫細胞の前記投与前に、リンパ球枯渇レジメンを受けた、請求項34に記載の組成物。
【請求項３６】
前記リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミド、フルダラビン、放射線、又はそれらの組合せの投与を含む、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ポリペプチド構築物が、γ-TCRのポリペプチド配列、δ-TCRのポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ポリペプチド構築物が、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント及び断片を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ポリペプチド構築物が、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、少なくとも約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含む、請求項1から38のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせて、それを必要とする前記対象に投与される、請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
医薬組成物である、請求項1から40のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
a.請求項1から41のいずれか一項に記載の組成物と、
b.賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの少なくとも1つと
を含む医薬組成物。
【請求項４３】
単位剤形で投与される、請求項40に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
錠剤、液体剤、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻内製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、及びそれらの任意の組合せの形態である、請求項42又は43に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
輸液剤の形態で投与される、請求項44に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記医薬組成物の前記投与が、それを必要とする前記対象の疾患又は状態を少なくとも部分的に緩和する、請求項45に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記緩和が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、少なくとも約30%の腫瘍サイズの低減を含む、請求項46に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記緩和が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させることを含む、請求項47に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
それを必要とする対象を処置する方法であって、少なくとも1つのさらなるヒト白血球抗原(HLA)分子と複合体化されたHLA分子に結合するポリペプチド構築物を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しない、方法。
【請求項５０】
前記HLA分子が、HLA-A血清型のもの又はそのバリアントである、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記HLA-Aが、HLA-A*24である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記HLA-A*24が、HLA-A*24:02である、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリペプチド構築物が、γ-TCRポリペプチド配列、δ-TCRポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含む、請求項49から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリペプチド構築物が、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含む、請求項49から53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリペプチド構築物が、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含む、請求項49から54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
サイトカイン、化学療法、放射線、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを、それを必要とする前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項49から55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記サイトカインが、インターロイキン2である、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記化学療法が、シクロホスファミド又はフルダラビンのうちの少なくとも1つを含む、請求項56又は57に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリペプチド構築物が、凍結乾燥されている、請求項49から58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
アジュバント、希釈剤、担体、又はそれらの組合せをさらに含む、請求項49から59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
異常なHLA-A*24発現を含む疾患を処置する方法であって、ヒト白血球抗原(HLA)-A*24の少なくとも一部に結合する第1の治療剤を投与する工程、及びそれに続いて前記第1の治療剤を再投与する工程と、第2の治療剤を投与する工程とのうちの少なくとも一方の工程を含む方法。
【請求項６２】
前記第1の治療剤が、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部を含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
TCRの前記少なくとも一部が、αβTCR又はγδTCRである、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記TCRが、γδTCRである、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記第1の治療剤が、前記γδTCRを発現する遺伝子操作された細胞である、請求項61から64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記遺伝子操作された細胞が、リンパ系統又は骨髄系統に由来する、請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
前記遺伝子操作された細胞が、リンパ系統に由来し、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞から選択される、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
前記遺伝子操作された細胞が、T細胞である、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
前記第1の治療剤が、HLA-A*24が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、がん細胞に結合する、請求項61から68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記再投与が、前記第1の治療剤を投与する工程の約24時間から約1年後に行われる、請求項61から69のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
定量PCR(qPCR)又はフローサイトメトリーのうちの少なくとも1つによって、前記第1の治療剤のレベルを検出する工程をさらに含む、請求項61から70のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記第2の治療剤が、化学療法剤、放射線療法、又は免疫療法剤からなる群から選択される、請求項61から71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第2の治療剤が、免疫療法剤である、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上で少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物をコードするゲノム変化を含む遺伝子操作された細胞であって、前記ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しない、遺伝子操作された細胞。
【請求項７５】
前記HLAが、クラスI、クラスII、又はそれらの組合せを含む、請求項74に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項７６】
前記HLAが、クラスI(HLA-I)を含む、請求項75に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項７７】
前記HLA-Iが、HLA-Aを含む、請求項76に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項７８】
前記HLA-Aが、HLA-A*24である、請求項77に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項７９】
前記HLA-A*24対立遺伝子が、HLA-A*24:02を含む、請求項78に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８０】
前記ゲノム変化が、前記ポリペプチド構築物のウイルスによる導入を含むノックインを含む、請求項74から79のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８１】
前記ウイルスによる導入が、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるウイルスを含む、請求項80に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８２】
前記ウイルスによる導入が、レトロウイルスを含む、請求項81に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８３】
前記ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項74から82のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８４】
前記γδTCRが、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列、表2及び表5のリストから選択されるδTCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント及び断片を含む、請求項83に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８５】
前記ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのさらなるペプチド及び/又は少なくとも1つの共受容体の存在下で、前記標的細胞上の前記HLAに選択的に結合する、請求項74から84のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８６】
前記少なくとも1つの共受容体が、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択される、請求項85に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８７】
前記少なくとも1つの共受容体が、CD8である、請求項86に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８８】
前記少なくとも1つの共受容体が、CD8アルファ又はCD8ベータの少なくとも1つを含む、請求項87に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項８９】
請求項74から88のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞を含む細胞の集団。
【請求項９０】
前記遺伝子操作された細胞の約60%から約100%が、前記ポリペプチド構築物を発現している、請求項89に記載の集団。
【請求項９１】
前記遺伝子操作された細胞が、複数のαβT細胞である、請求項89又は90に記載の集団。
【請求項９２】
前記集団がそれを必要とする対象に投与される場合、がんが制御、低減、又は排除される、請求項89から91のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９３】
前記集団がそれを必要とする対象に投与される場合、ウイルス感染が、制御、低減、又は排除される、請求項89から92のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９４】
前記投与が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍サイズを少なくとも30%低減するのに効果的である、請求項93に記載の集団。
【請求項９５】
前記投与が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の10%未満の変化と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させるのに効果的である、請求項93に記載の集団。
【請求項９６】
約5×104から約1×1012個の細胞が、それを必要とする前記対象に投与される、請求項92から95のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９７】
前記投与が、それを必要とする前記対象の寿命を、未処置の対象と比較して約1週間から約50年間延長する、請求項92から96のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９８】
前記遺伝子操作された細胞が、抗体の結合によって阻害される、請求項89から97のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９９】
前記抗体の結合が、前記遺伝子操作された細胞の前記投与に関連する毒性を低減する、請求項98に記載の集団。
【請求項１００】
配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、又は配列番号5のアミノ酸21〜293のうちの少なくとも1つのポリペプチド配列をコードする配列と少なくとも90%、95%、97%又は99%同一である配列を含むポリ核酸。
【請求項１０１】
配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、又は配列番号5のアミノ酸21〜293のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である受容体配列を含む遺伝子操作された細胞。
【請求項１０２】
配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293及び配列番号6から配列番号428のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を有する受容体の少なくとも一部を含む遺伝子操作された細胞。
【請求項１０３】
増殖されて遺伝子操作された細胞の集団になっている、請求項102に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１０４】
遺伝子操作された細胞の前記集団が、医薬組成物に製剤化されている、請求項103に記載の遺伝子操作された細胞。
【請求項１０５】
ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチドであって、複合体化されていないHLA分子に結合しない、ポリペプチド。
【請求項１０６】
前記HLA分子が、HLA-A血清型又はそのバリアントであり、好ましくは、前記HLA-A血清型がHLA-A*24であり、より好ましくは、前記HLA-A*24がHLA-A*24:02である、請求項105に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
前記標的細胞が、がん細胞であり、好ましくは、前記がん細胞が、前記HLA分子を異常に発現する、請求項105又は106に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分であり、前記δT細胞受容体鎖又はその部分が、配列番号3、配列番号5のアミノ酸21〜293、又は配列番号6から237のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表される、請求項105から107のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
CDR3領域を含むγT細胞受容体鎖又はその部分であり、前記δT細胞受容体鎖又はその部分が、配列番号2、配列番号4のアミノ酸19〜309、又は配列番号238から428のアミノ酸のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表される、請求項105から107のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
a.請求項108に規定のδT細胞受容体鎖又はその部分、及び
b.請求項109に規定のγT細胞受容体鎖又はその部分
を含むT細胞受容体(TCR)、好ましくは、遺伝子操作されたTCR。
【請求項１１１】
請求項105から109のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項110に記載のTCRをコードする核酸分子。
【請求項１１２】
請求項111に記載の核酸分子を含む核酸構築物。
【請求項１１３】
請求項112に記載の核酸構築物を含む細胞。
【請求項１１４】
医薬として使用するための、請求項105から109のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項110に記載のTCR、請求項111に記載の核酸分子、請求項112に記載の核酸構築物又は請求項113に記載の細胞。
【請求項１１５】
がん又は感染に対する医薬として使用するための、請求項105から109のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項110に記載のTCR、請求項111に記載の核酸分子、請求項112に記載の核酸構築物又は請求項113に記載の細胞。
【請求項１１６】
請求項74から88のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞、又は請求項113に記載の細胞の投与に関連する毒性を低減する方法であって、少なくとも1つの抗体又はその部分の、それを必要とする対象への投与を含む、方法。
【請求項１１７】
前記抗体が、遮断抗体又は中和抗体である、請求項116に記載の方法。
【請求項１１８】
前記抗体又はその部分が、前記遺伝子操作された細胞又は前記細胞の、HLA-A*24:02を発現する細胞への結合を阻害する、請求項116又は117に記載の方法。
【請求項１１９】
前記HLA-A*24:02を発現する細胞が、がん細胞又は同等の正常細胞のうちの少なくとも1つである、請求項118に記載の方法。
【請求項１２０】
少なくとも1つの抗体又はその部分の前記投与が、それを必要とする前記対象のサイトカイン放出症候群(CRS)、B細胞形成不全、及び腫瘍崩壊症候群(TLS)のうちの少なくとも1つのレベルを低減する、請求項116から119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記少なくとも1つの抗体が、前記HLA-A*24:02に完全に又は部分的に結合する、請求項116から120のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はその断片若しくはバリアントである、請求項121に記載の方法。
【請求項１２３】
前記バリアントが、scFv又はscFabである、請求項122に記載の方法。
【請求項１２４】
所定の相対湿度を有する雰囲気中で、所定の時間、25℃又は4℃で密封容器中に保存した場合に、活性を保持する、請求項1から48のいずれか一項に記載の組成物又は医薬組成物。
【請求項１２５】
前記所定の相対湿度が、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%又は95%の相対湿度である、請求項124に記載の組成物又は医薬組成物。
【請求項１２６】
前記所定の時間が、少なくとも1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、1.5年、2年、2.5年又は3年である、請求項124又は125に記載の組成物又は医薬組成物。
【請求項１２７】
少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化するHLA分子への結合によって決定する場合、少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%の活性を保持する、請求項124から126のいずれか一項に記載の組成物又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2017年6月9日に作成された前記ASCIIコピーの名称は51887-705_601_SL.txtであり、156,305バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００２】
がんは、全世界の社会により重大な影響を有する。2016年には、米国のみで推定1,685,210件の新たながんの症例が診断されることとなり、595,690人の人がこの疾患で死ぬことになる。Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)によると、2005年の1170万人(26人に1人)から増えて、2020年までに、1820万人のアメリカ人、おおよそ19人に1人が、がん患者又はがん生存者となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第20040101519号
【特許文献２】米国特許出願公開第20060034810号
【特許文献３】米国特許第5,350,674号
【特許文献４】米国特許第5,585,362号
【特許文献５】US2005/0255105
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)
【非特許文献２】Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年
【非特許文献３】Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年
【非特許文献４】Computer Analysis of Sequence Data、第I部、Griffin, A. M.、及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年
【非特許文献５】Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heine, G.、Academic Press、1987年
【非特許文献６】Sequence Analysis Primer、Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991年
【非特許文献７】Carillo, H.、及びLipman, D.、SIAM J. Applied Math.、48:1073頁(1988年)
【非特許文献８】Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12 (1):387頁(1984年)
【非特許文献９】Altschul, S. F.ら、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁(1990年))
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
がん免疫療法の圧倒的な臨床成功に鑑みて、腫瘍浸潤性γδT細胞が多くのがん型にわたる臨床成績の主要な予測因子であるため、γδT細胞は目的となる注目を浴びている。いくつかの手法が前臨床モデルで試験されてきており、多数の臨床試験が現在進行中である。γδT細胞を臨床にもたらすための多大な努力にもかかわらず、これらの使用はほとんど効果的ではなかった。したがって、これらの抗腫瘍効率を利用する新たなモダリティが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
幅広い種類のがんに対する代わりの且つ有効な処置への差し迫った必要性が存在する。本発明は、この必要性に対処し、関連する利益も同様に提供する。したがって、本発明は処置方法を開示する。
【０００７】
ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、標的細胞上のHLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物（コンストラクト）を含む組成物であって、ポリペプチド構築物が複合体化されていないHLA分子と結合しない組成物が本明細書に開示される。ある特定の場合には、複合体化されていないHLA分子は、少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていないHLA分子である。一部の場合には、ポリペプチド構築物は細胞上で発現されるか又は合成される。一部の場合には、HLA分子は、HLA-A血清型又はそのバリアントであり得る。一部の場合には、HLA-A血清型は、HLA-A*24であり得る。HLA-A*24は、HLA-A*24:02であり得る。一部の場合には、本明細書に記載のポリペプチドによって認識されるHLA分子は、複数のHLA分子と複合体を形成し得る。特定の場合には、複合体化されたHLA分子は、任意選択でクラスターを形成し得る。ポリペプチド構築物は、少なくとも1つの共受容体に結合し得る。一部の場合には、少なくとも1つの共受容体は、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択され得る。一部の場合には、少なくとも1つの共受容体は、CD8であり得る。少なくとも1つの共受容体は、CD8アルファ又はCD8ベータのうちの少なくとも1つを含み得る。一部の場合には、標的細胞は、がん細胞であり得る。がん細胞は、HLA分子を異常に発現する場合がある。異常な発現は、標的細胞上での複合体化を含む可能性があり、異常な発現及び複合体化は、同等の正常細胞上には存在しない場合がある。異常な発現は、同等の正常細胞上の異常に発現していないHLAと比較して、構造、可動性、フレキシビリティー、又は区画化のうちの少なくとも1つを含み得る。複合体化は、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によって検出され得る。がん細胞は、同等の正常細胞と比較して、HLAを過剰発現し得る。過剰発現は、フローサイトメトリーによって検出する場合、がん細胞の集団における約1%から約100%の発現を含み得る。過剰発現は、免疫組織化学(IHC)分析によるHLA分子の陽性検出を含み得る。ポリペプチド構築物は、免疫細胞上で発現され得る。免疫細胞は、骨髄又はリンパ系統に由来し得る。一部の場合には、免疫細胞は、リンパ系統に由来し得る。リンパ系統由来の免疫細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞のうちの少なくとも1つであり得る。一部の場合には、免疫細胞は、複数のT細胞であり得る。複数のT細胞は、遺伝子操作されたαβT細胞であり得る。一部の場合には、免疫細胞は、ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されていてもよい。一部の場合には、免疫細胞は、ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されていなくてもよい。ポリペプチド構築物は、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部をコードし得る。一部の場合には、TCRの少なくとも一部は、遺伝子操作されたTCRであり得る。TCRは、γδTCRであり得る。γδTCRは、γ9δ2TCR又はγ5δ1TCRであり得る。γδTCRは、免疫細胞にとって外因性であり得る。免疫細胞は増殖され得る。免疫細胞は、それを必要とする対象に投与され得る。それを必要とする対象は、免疫細胞の投与前に、リンパ球枯渇（lymphodepleting）レジメンを受けていてもよい。リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミド、フルダラビン、放射線、又はそれらの組合せの投与を含むことができる。ポリペプチド構築物は、γ-TCRのポリペプチド配列、δ-TCRのポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含むことができる。ポリペプチド構築物は、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含むことができる。ポリペプチド構築物は、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、少なくとも約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含むことができる。組成物は、少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与され得る。組成物は、医薬組成物であり得る。
【０００８】
請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物と、賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの少なくとも1つとを含む医薬組成物が本明細書に開示される。医薬組成物は、単位剤形で投与することができる。医薬組成物は、錠剤、液体剤、シロップ剤、経口製剤、静脈内製剤、鼻内製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、及びそれらの任意の組合せの形態であり得る。医薬組成物は、輸液剤の形態で投与することができる。一部の場合には、医薬組成物の投与は、それを必要とする対象の疾患又は状態を少なくとも部分的に緩和する。緩和は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、少なくとも約30%までの腫瘍サイズの低減を含むことができる。緩和は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させることを含むことができる。
【０００９】
それを必要とする対象を処置する方法であって、少なくとも1つのさらなるヒト白血球抗原(HLA)分子と複合体化されたHLA分子に結合するポリペプチド構築物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与する工程を含み、ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しない、方法が本明細書に開示される。ある特定の場合には、ポリペプチド構築物は、HLA分子が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていない場合、HLA分子に結合しない。HLA分子は、HLA-A血清型又はそのバリアントを有し得る。HLA-Aは、HLA-A*24であり得る。HLA-A24は、HLA-A*24:02であり得る。ポリペプチド構築物は、γ-TCRポリペプチド配列、δ-TCRポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含むことができる。ポリペプチド構築物は、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含むことができる。ポリペプチド構築物は、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、少なくとも約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含むことができる。一部の場合には、方法は、サイトカイン、化学療法、放射線、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを、それを必要とする対象に投与する工程をさらに含むことができる。サイトカインは、インターロイキン2であり得る。一部の場合には、化学療法は、シクロホスファミド又はフルダラビンのうちの少なくとも1つを含むことができる。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、凍結乾燥され得る。一部の場合には、方法は、アジュバント、希釈剤、担体、又はそれらの組合せをさらに含むことができる。
【００１０】
異常なHLA-A*24発現を含む疾患を処置する方法であって、ヒト白血球抗原(HLA)-A*24の少なくとも一部に結合する第1の治療剤を投与する工程、及びそれに続いて前記第1の治療剤を再投与する工程と、第2の治療剤を投与する工程とのうちの少なくとも一方の工程を含む方法が本明細書に開示される。第1の治療剤は、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部を含むことができる。一部の場合には、TCRの少なくとも一部は、αβTCR又はγδTCRであり得る。TCRは、γδTCRであり得る。第1の治療剤は、γδTCRを発現する遺伝子操作された細胞であり得る。遺伝子操作された細胞は、リンパ系統又は骨髄系統に由来し得る。遺伝子操作された細胞は、リンパ系統に由来し得、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞から選択することができる。遺伝子操作された細胞は、T細胞であり得る。第1の治療剤は、HLA-A*24が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化することができる場合、がん細胞に結合することができる。一部の場合には、再投与は、第1の治療剤を投与する工程の約24時間から約1年後に実施することができる。一部の場合には、方法は、定量PCR(qPCR)又はフローサイトメトリーのうちの少なくとも1つによって、第1の治療剤のレベルを検出する工程をさらに含むことができる。第2の治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、又は免疫療法剤からなる群から選択され得る。第2の治療剤は、免疫療法剤であり得る。
【００１１】
ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上で少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物コードするゲノム変化を含む遺伝子操作された細胞であって、前記ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しないか、又は前記HLA分子が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていない場合、前記HLA分子に結合しない、遺伝子操作された細胞が本明細書に開示される。HLAは、クラスI、クラスII、又はそれらの組合せを含むことができる。HLAは、クラスI(HLA-I)を含むことができる。HLA-Iは、HLA-Aを含むことができる。HLA-Aは、HLA-A*24であり得る。HLA-A*24対立遺伝子（アレル）は、HLA-A*24:02を含むことができる。一部の場合には、ゲノム変化は、前記ポリペプチド構築物のウイルスによる導入を含むノックインを含むことができる。ウイルスによる導入は、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるウイルスを含むことができる。ウイルスによる導入は、レトロウイルスを含むことができる。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、少なくとも1つのγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。γδTCRは、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列、表2及び表5のリストから選択されるδTCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含むことができる。ポリペプチド構築物は、少なくとも1つのさらなるペプチド及び/又は少なくとも1つの共受容体の存在下で、標的細胞上のHLAに選択的に結合することができる。一部の場合には、少なくとも1つの共受容体は、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択することができる。少なくとも1つの共受容体は、CD8であり得る。少なくとも1つの共受容体は、CD8アルファ又はCD8ベータの少なくとも１つであり得る。
【００１２】
請求項72から86のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞を含む細胞集団が本明細書に開示される。一部の場合には、遺伝子操作された細胞の約60%から約100%は、ポリペプチド構築物を発現することができる。遺伝子操作された細胞は、複数のαβT細胞であり得る。集団は、がんを制御、低減、又は排除するためにそれを必要とする対象に投与することができる。一部の場合には、集団がそれを必要とする対象に投与され得る場合、ウイルス感染は、制御、低減、又は排除され得る。遺伝子操作された細胞の投与は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍サイズを少なくとも30%低減するのに効果的であり得る。投与は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させるのに効果的であり得る。一部の場合には、約5×104から約1×1012個の細胞が、それを必要とする対象に投与され得る。一部の場合には、投与は、それを必要とする対象の寿命を、未処置の対象と比較して約1週間から約50年延長することができる。一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、抗体の結合によって阻害され得る。抗体の結合は、遺伝子操作された細胞の投与に関連する毒性を低減することができる。バリアントは、ヒト化バリアントであり得る。一部の場合には、バリアントは、scFv、又はscFabである。
【００１３】
配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、又は配列番号5のうちの少なくとも1つのポリペプチド配列をコードする配列と少なくとも90%、95%、97%又は99%同一である配列を含むポリ核酸が本明細書に開示される。
【００１４】
配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、又は配列番号5のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である受容体配列を含む遺伝子操作された細胞が本明細書に開示される。
【００１５】
配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を有する受容体の少なくとも一部を含む遺伝子操作された細胞が本明細書に開示される。一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作された細胞の集団に増殖され得る。遺伝子操作された細胞の集団は、医薬組成物に製剤化され得る。
【００１６】
ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、複合体化されていないHLA分子に結合しないか、又は前記HLA分子が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていない場合、前記HLA分子に結合しないポリペプチドが本明細書に開示される。一部の場合には、HLA分子はHLA-A血清型又はそのバリアントであり得、好ましくは、HLA-A血清型はHLA-A*24であり得、より好ましくは、HLA-A*24はHLA-A*24:02であり得る。標的細胞はがん細胞であり得、好ましくは、がん細胞はHLA分子を異常に発現し得る。一部の場合には、ポリペプチドは、CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分であり得、δT細胞受容体鎖又はその部分は、アミノ酸配列である配列番号3、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号5又は配列番号6から237のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表され得る。一部の場合には、ポリペプチドは、CDR3領域を含むγΤ-細胞受容体鎖又はその部分、アミノ酸配列である配列番号2、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号4又は配列番号238から428のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるγΤ-細胞受容体鎖又はその部分であり得る。
【００１７】
δT細胞受容体鎖又はその部分、及びγT細胞受容体鎖又はその部分を含む、T細胞受容体(TCR)、好ましくは、遺伝子操作されたTCRが本明細書に開示される。
【００１８】
ポリペプチド又はTCRをコードする核酸分子が本明細書に開示される。
【００１９】
核酸分子を含む核酸構築物が本明細書に開示される。
【００２０】
核酸構築物を含む細胞が本明細書に開示される。
【００２１】
医薬として使用するための、ポリペプチド、TCR、核酸分子、核酸構築物、又は細胞が本明細書に開示される。
【００２２】
がん又は感染に対する医薬として使用するための、ポリペプチド、TCR、核酸分子、核酸構築物、又は細胞が本明細書に開示される。
【００２３】
遺伝子操作された細胞、又は細胞の投与に関連する毒性を低減する方法であって、少なくとも1つの抗体又はその部分のそれを必要とする対象への投与を含む、方法が本明細書に開示される。一部の場合には、抗体は、遮断抗体又は中和抗体であり得る。抗体又はその部分は、遺伝子操作された細胞又は細胞のHLA-A*24:02を発現する細胞への結合を阻害することができる。HLA-A*24:02を発現する細胞は、がん細胞又は同等の正常細胞のうちの少なくとも1つであり得る。少なくとも1つの抗体又はその部分の投与は、それを必要とする対象のサイトカイン放出症候群(CRS)のレベルを低減し得る。
【００２４】
非常に安定した貯蔵寿命を有する組成物及び医薬組成物が本明細書に提供される。一部の場合には、本明細書に記載の少なくとも1つのポリペプチド又は本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞を含有する本明細書に記載の組成物又は医薬組成物は、25℃又は4℃で密封容器中に保存され、容器は、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%又は95%の相対湿度を有する雰囲気に置かれる。1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、1.5年、2年、2.5年又は3年後に、組成物又は医薬組成物の少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%が、標準プロトコールによって決定された状態のままである。
【００２５】
参照による組込み
本明細書におけるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における用語と組み込まれた参照における用語の間に矛盾がある場合には、本明細書における用語が支配する。
【００２６】
本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本開示の原理を利用することができる例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面を参照することにより本開示の特徴及び利点のより良い理解が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは、本明細書に記載のγδT細胞のクローンをSW480、EBV-LCL、及びPBMCと共に共培養する場合のELISPOTアッセイの結果を示すグラフである。15,000個のγδT細胞当たりのIFNγスポットが示されている。図１Ｂは、SW480、EBV-LCL、及びPBMCと共に共培養した疑似形質導入された細胞及び本明細書に記載のγδTCR細胞のELISPOTアッセイの結果を示すグラフである。15,000個のγδT細胞当たりのIFNγスポットが示されている。
【図２】本明細書に記載のγδTCR細胞をLCL-TM、DAUDI、U266、OPM2、及びSW480腫瘍細胞株と共に共培養した場合のELISPOTアッセイの結果を示すグラフである。IFN-γのELIspot数が示される。
【図３】図３Ａは、本明細書に記載のγδTCRをCOS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示すグラフである。図３Ｂは、Cyto Dで前処理した本明細書に記載のγδ-TCRをCOS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示す。
【図４】図４Ａは、本明細書に記載のγδTCRをCOS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示すグラフである。図４Ｂは、本明細書に記載のγδTCRを固定した標的:COS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】HLA-A*02:01(配列番号439)とHLA-A*24:02(配列番号440)の間の配列アラインメントを示す図である。
【図６】図６Ａは、HLA-A*02の構造を示す図である。HLA-A*02は灰色で示される。β2Μは黄色で示され、ペプチドは黒色で示され、遺伝子多型は赤色で示される。図６Ｂは、HLA-A*02の構造を示す図である。HLA-A*02  は灰色で示される。β2Μは黄色で示され、ペプチドは黒色で示され、遺伝子多型は赤色で示される。
【図７】図７Ａは、HLA-A*02の構造を示す図である。図７Ｂは、HLA-A*02の構造を示す図である。
【図８】図８Ａは、本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞によるSW480及びLCL-TMの認識に関するFE-11様ハイブリドーマ上清による遮断効果を示すグラフである。図８Ｂは、αβTCR WT1が形質導入されたT細胞によるWT1ペプチドを負荷したSW480の認識に関するFE-11様ハイブリドーマ上清による遮断効果を示すグラフである。図８Ｃは、LABScreen Single Antigen HLAクラスIビーズをHLAに結合する抗体と共にインキュベートし、ここで、前記抗体はハイブリドーマから精製され、HLAに完全に又は部分的に、及び二次的なα-mlgG-PEに結合され、Luminexを使用して測定された。
【図９】単離したクローンが、γδTCR反応性腫瘍細胞又はDaudi陰性対照に特異的に結合する抗体を産生する例示的スクリーニング方法を示すグラフである。
【図１０−１】図１０Ａは、異なるHLA遺伝子型を有するEBV-LCLにより本明細書に記載のγδTCR及び陰性対照としてDaudiが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。
【図１０−２】図１０Ｂは、HLA-A*24:02又はHLA-A*02:01標的細胞によりγδTCR FE11が形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図１０Ｃは、γδTCR FE11が形質導入されたT細胞の活性化に関するHLA-A*24:02陽性標的細胞のβ2m KOの効果を示すグラフである。
【図１０−３】図１０Ｄは、異なる、ホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかの、HLA-A*24:02発現を有するEBV-LCLによりγδTCR FE11が形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図１０Ｅは。未処理又はモネンシンで終夜処理したK562 HLA-A*24:02細胞により本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。
【図１０−４】図１０Ｆは、LCL-TM又はA2拘束WT1ペプチドを負荷したT2細胞により本明細書に記載のγδTCR又はαβTCR WT1(対照)が形質導入されたJurma細胞の活性化を示すグラフである。プレートに結合したα-CD3 mAbのクローンであるOKT-3によるCD3架橋は陽性対照としての役割を果たす。
【図１１】認識の低下が、β2-マイクログロブリン(β2m)KOの割合に匹敵することを示すグラフである。認識されたLCL内の(β2m)のCRISPR/Cas9 KOは、対照と比較してTEG011の認識を低減する。
【図１２】図１２Ａは、悪性細胞及び健常T細胞における本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図１２Ｂは、EBVにより形質転換され、本明細書に記載のγδTCR又は疑似形質導入されたT細胞と共に共培養された健常ドナーのB細胞を示すグラフである。認識は、ELISAを使用してIFNγ分泌を測定することによって評価された。
【図１３−１】図１３Ａは、HLA-A*24:03陽性又は陰性標的細胞により本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の、インターフェロン-ガンマ発現を介した活性化を示すグラフである。図１３Ｂは、2つの非相同性アミノ酸を赤色で示すHLA-A*24:02(配列番号441)、02:01(配列番号442)、24:03(配列番号443)、及び25:01(配列番号444)のアラインメントを示す図である。
【図１３−２】図１３Ｃは、HLA-A24:02(pdb:3wl9)の構造上にマッピングされたHLA-A*02:01とHLA-A24:02の間の差を示す図であり、HLA-A*24:02とHLA-A*24:03の間の2つの非相同アミノ酸を赤色の円で示す。
【図１３−３】図１３Ｄは、負荷していないか又はA*24拘束ウイルスペプチドNEF(134-10)若しくはCMV(pp65 341-349)を負荷した、HLA-A*24:02が形質導入されたTAP欠乏T2細胞により、本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図１３Ｅは、WT1 TCR、NY-ESOl TCR及びTCRが形質導入されたT細胞に結合するWT1四量体、NY-ESOl五量体及びCMV五量体を示すグラフである。
【図１３−４】図１３Ｆは、γδTCRが形質導入されたT細胞の活性化に関するHLA-A*24:02が形質導入された標的細胞のボルテゾミブ処置の効果を示すグラフである。図１３Ｇは、フローサイトメトリーFRETによってHLA-A*24:02陽性と認識された細胞及び認識されなかった細胞に関して、ホモ二量体化について評価したことを示すグラフである。
【図１３−５】図１３Ｈは、HLA-A*24:02が形質導入されたCOS-7及びK562又はHLA-A*02:01(対照)により本明細書に記載のγδTCR又はαβTCR WT1(対照)が形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。ここで、示された標的細胞は、共にインキュベートされる前に固定された。ここで、示された標的細胞は、WT1ペプチドと共にインキュベートされた。
【図１４−１】図１４Ａは、クローンFE11及びγδTCRが形質導入されたαβT細胞上のCD8α又はCD8β発現を示す図である。
【図１４−２】図１４Ｂは、本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたCD4+及びCD8+αβT細胞を選別し、示された標的細胞と共に共培養したことを示すグラフである。T細胞の活性化をIFNγのELISPOTによって評価した。図１４Ｃは、本明細書に記載のγδTCRを発現するCD4+及びCD8+αβT細胞を(A)のように、しかし、対照抗体又はCD8α若しくはCD8βに対する遮断抗体の存在下で、SW480標的細胞と共にインキュベートしたことを示すグラフである。
【図１４−３】図１４Ｄは、CD69上方調節によって測定したHLA-A*24:02陽性及び陰性標的細胞により本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたJurma細胞の活性化を示すグラフである。図１４Ｅは、HLA-A*02拘束WT1ペプチドを負荷したHLA-A*02:01陽性標的細胞によるαβTCR WT1が形質導入されたJurma細胞の活性化を示すグラフである。プレートに結合したα-CD3 mAbのクローンであるOKT-3によるCD3架橋は陽性対照(D+E)としての役割を果たす。
【図１４−４】図１４Ｆは、CD4+、CD8+、CD4+CD8α+及びCD4+CD8α'+T細胞集団を選別した後に、αβT細胞には、FE11  γδTCRと一緒に、野生型CD8α又は切断した、シグナル伝達欠損CD8αバリアント(CD8α')が形質導入されたことを示す図である。健常なPBMC及びSW480並びにEBV-LCL腫瘍標的の認識を、ELISPOTを使用するIFNγ分泌を測定することによって評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下の説明及び実施例は、本開示の実施形態を詳細に例証する。この開示は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、それ自体変更可能であることが理解されるべきである。当業者は、本開示には、その範囲内に包含される多数の変形及び修正が存在することを認識するであろう。他に指示されなければ、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００２９】
すべての用語は、当業者によって理解されるように理解されることを意図する。他に定義されていなければ、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、他に指示されていなければ、本明細書における一部の発明の実施形態は、数値範囲を意図する。この発明の様々な態様は、範囲形式で表すことができる。範囲形式での記載は、単に簡便性及び簡潔性のためであり、本発明の範囲に関する変更できない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲についての記載は、具体的に開示したすべての可能な下位範囲及びその範囲内の個々の数値をまるではっきりと書き出したかのように有するものとみなされるべきである。例えば、1から6までなどの範囲についての記載は、例えば、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの具体的に開示された下位範囲、並びにその範囲内個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、及び6を有するものとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。範囲が存在する場合、その範囲は範囲の終点を含む。
【００３１】
以下の定義は、当技術分野における定義を補足するものであり、本出願を対象とし、任意の関連する又は関連しない事例に、例えば、任意の共同所有の特許又は出願に帰するべきではない。本明細書に記載のものと同様の又は等しい任意の方法及び材料は、本開示について試験するための実践において使用され得るが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。したがって、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであって、限定として解釈されるべきではない。
【００３２】
定義
本明細書で使用する場合、他に指定されていなければ、冠詞「a」は、他に明確に提供されていなければ、1つ又は複数を意味する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、他に指定されていなければ、「含有する(contain)」、「含有すること(containing)」、「含む(include)」、「含むこと(including)」などの用語は「含むこと(comprising)」を意味する。
【００３４】
用語「活性化」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、それによって細胞が休止状態から活性状態に遷移するプロセスを指すことができる。このプロセスは、抗原に対する応答、機能的に活性な状態への移行、及び/又は表現型若しくは遺伝子の変化を含むことができる。
【００３５】
「抗原」は、本明細書で使用する場合、抗原結合単位によって特異的に認識され、結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、及び脂質、それらの部分並びにそれらの組合せを含むことができる。「抗原」は、免疫応答を惹起する分子も指すことができる。この免疫応答は、抗体産生、若しくは特異的免疫担当細胞の活性化、又はその両方に関与してもよい。当業者は、実質的にすべてのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役割を果たすことができることを理解するであろう。
【００３６】
用語「自己の」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、同一の存在に由来することを指すことができる。例えば、試料(例えば、細胞)を除去し、処理し、後で同一の対象(例えば、患者)に戻すことができる。自己のプロセスは、ドナー及びレシピエントが異なる対象である同種間のプロセスと区別される。
【００３７】
この明細書及び請求項で使用する場合、単語「含むこと(comprising)」(及び「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの含むの任意の形態)、「有すること(having)」(「有する(have)」及び「有する(has)」などの有するの任意の形態)、「含むこと(including)」(「含む(includes)」及び「含む(include)」などの含むの任意の形態)又は「含有すること(containing)」(「含有する(contains)」及び「含有する(contain)」などの含有の任意の形態)は、包括的又はオープンエンドであり、さらなる、記載されていない要素又は方法の工程を除外するものではない。この明細書において議論される任意の実施形態は、本発明の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物を使用して本発明の方法を達成することができる。
【００３８】
用語「エピトープ」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、抗体、B細胞、T細胞又は本明細書に記載のポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞によって認識することができる抗原の一部又は部分又は断片を指すことができる。例えば、エピトープは、TCR、例えば、本明細書に記載のガンマデルタTCRによって認識されるがんエピトープであり得る。抗原内の多数のエピトープを認識することもできる。エピトープには変異が入る場合もある。
【００３９】
用語「遺伝子操作された」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、核酸、例えば、生物のゲノム内の又はポリペプチドの核酸の1つ又は複数の変更を指すことができる。用語「遺伝子操作された（engineered）」は、遺伝子又はポリペプチドの変更、付加、及び/又は欠失を指すことができる。遺伝子操作された細胞は、付加、欠失及び/又は変更した遺伝子又はポリペプチドを有する細胞を指すこともできる。
【００４０】
用語「細胞」又は「遺伝子操作された細胞」及びそれらの文法的同等物は、本明細書で使用する場合、ヒト又は非ヒト動物起源の細胞を指すことができる。遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作されたエフェクター細胞を指すこともできる。ある特定の場合には、遺伝子操作された細胞は、本明細書に記載のポリペプチド構築物を発現するよう遺伝子操作されたエフェクター細胞を指す。
【００４１】
用語「医薬品適正製造基準(good manufacturing practices)」(GMP)及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、FDAに従い、安全、効果的、又は純粋である製品を指すことができる。GMPはまた、「cGMP」と称される場合もあり得る。「c」は、「現行の(current)」の略語である。製品の製造には、GMP製品の規制に準拠するために最新の技術及びシステムを用いることができる。GMPに適合する製品は、典型的には、研究の設定と対照的に臨床の設定で利用される。
【００４２】
用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用する場合、外来核酸の真核細胞への導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈殿、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、電気穿孔、微量注入、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及び微粒子銃を含む当技術分野で公知の様々な手段によって達成されてよい。
【００４３】
用語「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトされた」は、外来の核酸、DNA又はRNAのトランスフェクトされた細胞のゲノムへの導入及び組込みを指す。用語「安定なトランスフェクタント」は、外来DNAがゲノムDNAに安定に組み込まれた細胞を指す。
【００４４】
核酸及び/又は核酸配列は、それらが、共通の祖先の核酸又は核酸配列に、天然に又は人工的に由来する場合、「相同」である。タンパク質(又はポリペプチド)及び/又はタンパク質(ポリペプチド)配列は、それらをコードするDNAが、共通の祖先の核酸又は核酸配列に、天然に又は人工的に由来する場合、相同である。
【００４５】
本発明の文脈では、ポリペプチドは、アミノ酸配列によって表される。好ましいポリペプチドは、本明細書で説明される抗腫瘍応答を媒介する、δT細胞及び/若しくはγT細胞受容体鎖又はその部分である。本発明の文脈では、このようなδT細胞及び/又はγT細胞受容体鎖又はその部分をコードする核酸分子としての核酸分子は、このようなポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列によって表される。核酸分子は、調節領域を含んでもよい。所与の配列識別番号(配列番号)によって、本明細書で特定される各核酸分子又はポリペプチド又は構築物は、開示された特定の配列に限定されないことが理解されるべきである。この出願全体を通して、所与のポリペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列の配列番号(例として、配列番号Xとする)について言及する度に、そのヌクレオチド配列は、以下に定義する相同ヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい:i  配列番号Xと少なくとも60%の配列同一性若しくは類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列;ii  その相補鎖が(i)の配列の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列;(iii)その配列が、遺伝子コードの退化により、(i)若しくは(ii)の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列;又は、(iv)配列番号Xのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも60%のアミノ酸同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。この出願全体を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号(例として、配列番号Yとする)について言及する度に、そのアミノ酸配列は、配列番号Yのアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドによって置き換えられてもよい。本明細書に記載の各ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、それぞれ、所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との同一性又は類似性の割合(少なくとも60%)により、さらに好ましい実施形態では、それぞれ、所与のヌクレオチド又はアミノ酸配列と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれより高い同一性又は類似性の同一性又は類似性を有する。好ましい実施形態では、配列同一性又は類似性は、本明細書で特定される配列の全長を比較することによって
決定される。本明細書で他に特定されていなければ、所与の配列番号に関する同一性又は類似性は、前記配列の全長(すなわち、その全体の長さ又は全体として)に基づく同一性又は類似性を意味する。
【００４６】
相同分子は、相同体と称することができる。例えば、本明細書に記載の、任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発方法によって改変することができる。発現した場合、この突然変異誘発された核酸は、元の核酸によってコードされるタンパク質と相同であるポリペプチドをコードする。相同性は、一般的に、2つ又はそれより多い核酸又はタンパク質(又はその配列)間の配列同一性から推測される。相同性を確立するのに有用である配列間の同一性の正確な割合は、問題となっている核酸及びタンパク質に関して変化するが、相同性を確立するために、日常的に、25%程度の低い配列同一性が使用される。よりレベルの高い、例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%若しくは99%又はそれより高い配列同一性を使用して相同性を確立することもできる。少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%の同一性が本明細書において包含される。
【００４７】
「配列同一性」は、配列を比較することによって決定される、2つ若しくはそれより多いアミノ酸(ポリペプチド若しくはタンパク質)配列又は2つ若しくはそれより多い核酸(ポリヌクレオチド)配列間の関係として本明細書において定義される。2つのアミノ酸又は2つの核酸配列間の同一性は、好ましくは、本明細書で特定した配列番号全体又はその部分内のそれらの同一性を評価することによって定義される。その部分は、配列番号の長さの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%を意味してもよい。当技術分野では、「同一性」は、場合によって、このような配列のストリング間のマッチによって決定される、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の度合いも意味する。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列と、1つのポリペプチドの第2のポリペプチド配列に対する保存的アミノ酸置換とを比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されないが、(Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年;Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年;Computer Analysis of Sequence Data、第I部、Griffin, A. M.、及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Ileine, G.、Academic Press、1987年;及びSequence Analysis Primer、Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991年;並びにCarillo, H.、及びLipman, D.、SIAM J.  Applied Math.、48:1073頁(1988年))に記載のものを含む公知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。2つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法として、例えば、GCG program package(Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12 (1):387頁(1984年))、BestFit、BLASTP、BLASTN、及びFASTA(Altschul, S. F.ら、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁(1990年))が挙げられる。BLAST Xプログラムは、NCBI及び他の供給源(BLAST Manual、Altschul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda、MD 20894頁;Altschul, S.ら、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁(1990年))から一般に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。ポリペプチド配列の比較に関して好ましいパラメータとして以下が挙げられる:アルゴリズム:Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol. 48:44〜453頁(1970年);比較マトリックス: Ilentikoff及びIlentikoffからのBLOSSUM62、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915〜10919頁(1992年);ギャップペナルティ:12;及びギャップ長ペナルティ:4。これらのパラメータに関して有用なプログラムは、Madison, WIに位置するGenetics Computer Groupからの「Ogap」プログラムとして一般に利用可能である。前述のパラメータは、アミノ酸比較に対するデフォルトパラメータである(エンドギャップに対するペナルティなしで)。核酸比較に対する好ましいパラメータとして以下が挙げられる:アルゴリズム:Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol. 48:443〜453頁(1970年);比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0;ギャップペナルティ:50;ギャップ長ペナルティ:3。Madison、Wisに位置するGenetics Computer GroupからのGapプログラムとして利用可能。核酸比較に���するデフォルトパラメータは上記に与えられている。任意選択で、アミノ酸類似性の度合いを決定する際に、当業者は、当業者にとって明らかとなるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮にいれてもよい。保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリジン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり;脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり;並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、及びアスパラギン-グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列の少なくとも1つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は、以下の通りである:AlaからSer;ArgからLys;AsnからGin又はHis;AspからGlu;CysからSer又はAla;GinからAsn;GluからAsp;GlyからPro;HisからAsn又はGin;IleからLeu又はVal;LeuからIle又はVal;LysからArg、Gin又はGlu;MetからLeu又はIle;PheからMet、Leu又はTyr;SerからThr;ThrからSer;TrpからTyr;TyrからTrp又はPhe;及びValからIle又はLeu。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、及び「をコードするDNA」は、デオキシリボ核酸のストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序により、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。したがって、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００４９】
用語「対象」は、本明細書で使用する場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋類を指す。本発明の対象として、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他のタイプのマカク)、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽が挙げられる。
【００５０】
用語「レシピエント」及びそれらの文法的同等物は、本明細書で使用する場合、治療又は処置を受けるヒト又は非ヒト動物を指すことができる。
【００５１】
用語「末梢血リンパ球」(PBL)及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、血中(例えば、末梢血中）を循環するリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、器官に位置していないリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、T細胞、NK細胞、B細胞、又はこれらの任意の組合せを含むことができる。
【００５２】
用語「免疫応答細胞」は、これらに限定されないが、T細胞、B細胞、及びNK細胞、それらのそれぞれの前駆細胞並びにその後代を含む、免疫応答を誘発することができる細胞を指すことができる。免疫応答細胞は、リンパ系統又は骨髄系統の細胞を指すこともできる。
【００５３】
用語「T細胞」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、任意の器官に由来するT細胞を指すことができる。例えば、T細胞は、初代T細胞、例えば、自己T細胞、細胞株などであり得る。T細胞は、ヒト又は非ヒトのものでもあり得る。
【００５４】
用語「T細胞活性化」又は「T細胞誘発」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、十分に刺激され、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生及び/又は検出可能なエフェクター機能を誘導したT細胞の状態を指すことができる。一部の場合には、「十分なT細胞活性化」は、T細胞の細胞傷害性を誘発することに類似し得る。T細胞活性化は、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。前記アッセイは、サイトカイン分泌を測定するためのELISA、ELISPOT、細胞内サイトカイン発現(CD107)を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、増殖を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、標的細胞除去を決定するための細胞傷害性アッセイ(51Cr放出アッセイ)であり得る。
【００５５】
用語「配列」及びその文法的同等物は、使用する場合、DNA又はRNAを包含することができ、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得るヌクレオチド配列(配列表の配列番号)を指す。核酸配列には、変異が入ることがある。核酸配列は、任意の長さ、例えば、2から1,000,000の間又はそれより多いヌクレオチド長(又はそれらの間若しくはそれらを超えるの任意の整数)、例えば、約100から約10,000ヌクレオチドの間又は約200から約500ヌクレオチドの間であり得る。
【００５６】
本明細書で定義するように、ポリペプチド構築物は、好ましくは、標準の分子生物学技術によって構築され、天然に存在しない遺伝子操作されたポリペプチド又は組換えポリペプチドである。表現「ポリペプチド構築物」は、単語ポリペプチドで置き換えられてもよい。
【００５７】
単語「約」は、整数に付随して使用される場合(約10)、好ましくは、その値が、その値より1多いか又は少ない所与の値10であってよく、約10は、好ましくは、9から11を意味する。単語「約」は、数値に付随して使用される場合(約10.6)、好ましくは、値10.6より1%多いか又は少ない所与の値10.6であってよい。
【００５８】
本発明の文脈では、病的な、がんの、異常な、悪性の又は感染した細胞と比較して、健常な、正常な、又は非がん性の若しくは非感染の細胞について述べられている。健常な、正常な、非がん性の又は非感染のという用語のそれぞれは同義であり、互換的に使用されてよい。病的な、異常なという用語のそれぞれは同義であり、がんの、悪性の又は感染したと互換的であり得る。
【００５９】
本発明の文脈では、核酸の又は核酸配列の又はポリペプチドの又はポリペプチド配列の又はエピトープの又はエピトープ配列の一部又は断片又は部分は、その配列の長さの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%を意味する。
【００６０】
用語「ベクター」及びその文法的同等物は、単離した核酸を含み、使用して単離した核酸を細胞の内部に送達することができる物質の組成物を指すことができる。これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、用語「ベクター」は、自律複製プラスミド又はウイルスを含む。この用語は、核酸の細胞内への移行を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含むものとも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例として、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
【００６１】
標的組成物及びその使用方法
ヒト白血球抗原（HLA)受容体が細胞表面上で検出される場合、抗腫瘍応答を媒介するHLA特異的受容体の組成物が本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、1つ又は複数のHLA特異的受容体を包含するポリペプチド構築物、例えば、抗腫瘍応答を媒介することができるγδTCR断片又はそのバリアントを含む組成物である。本明細書に記載のポリペプチドを利用して、立体構造的に制約されたHLA分子に選択的に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、非がん細胞上の対応するHLA分子と比較して、がん細胞で発現されるHLA分子に選択的に結合することができる。本明細書に記載のポリペプチド構築物は、表2、表4及び表5のいずれか1つに開示された配列又はその部分を含む少なくとも1つの受容体を含むことができる。一部の場合には、1つ又は複数のHLA特異的受容体を包含することができるポリペプチド構築物、例えば、抗腫瘍応答を媒介することができるγδTCR断片又はそのバリアントを含む組成物を本明細書で提供することができる。本明細書に開示されるポリペプチドを利用して、立体構造的に制約されたHLA分子に選択的に結合することができる。例えば、本明細書に開示されるポリペプチド構築物は、前記HLA分子が、標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化することができる場合、標的細胞上のHLA分子又はその部分に選択的に結合することができる。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、複合体化されていないHLA分子に結合しない。一部の実施形態では、複合体化されていないHLA分子は、少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていないHLA分子である。ポリペプチド構築物は、遺伝子操作された細胞で発現され、合成され得る。
【００６２】
一部の場合には、本明細書に記載のHLA受容体を含むポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法である。例えば、方法は、細胞を用意する工程、γδTCR鎖又はその断片若しくはバリアントをコードする核酸配列を用意する工程、核酸配列を細胞内に導入し、HLAへの特異性を示すγδTCR受容体、その断片若しくはバリアントを有する遺伝子操作された細胞を提供する工程を含むことができる。
【００６３】
一部の実施形態では、HLA分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物である。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていないHLA分子(本明細書において、ある特定の実施形態では、複合体化されていないHLA分子とも称される)に結合しない。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、遺伝子操作された細胞で発現され、合成され得る。
【００６４】
本明細書に記載のポリペプチド構築物によって含まれる種々の形態の結合単位が本明細書に開示され得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチド構築物によって構成される結合単位は、例えば、表2、表4及び表5のうちの少なくとも1つに開示される配列を含むγδTCRであり得る。γδTCRは、主要組織適合複合体分子(MHC)に結合したペプチド抗原を認識するαβTCRとは異なり、インタクトなタンパク質又は非ペプチド化合物の形態の抗原を直接認識することができる。ガンマ-デルタT細胞(γδT細胞)は、一部の場合には、1つのγ鎖及び1つのδ鎖からなる特有のT細胞受容体(TCR)を発現することができる。各T細胞受容体は、1つのアルファ及び1つのベータ鎖又は1つのデルタ及び1つのガンマ鎖からなる二量体であり得る。単一の細胞では、T細胞受容体の位置は、デルタ、ガンマ、ベータ、及びアルファの順で再配列され、発現される。ガンマの位置には、V(可変)、J(接合)、及びC(定常)セグメントが含まれる。
【００６５】
例えば、一部の場合には、γδT細胞のクローンは、HLA-DR7、HLA-A2、HLA-A*24を含むクラスI又はクラスIIのMHCを認識することができる(Spitsら、1990年、Cytotoxic activity and lymphokine production of T cell receptor (TCR)-αβ+ and TCR-γδ+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) clones recognizing HLA-A2 and HLA-A2 mutants、The Journal of Immunology 144:4156〜4162頁、及びCiccone ら、1989年、Specificity of human T lymphocytes expressing a γ/δ T cell antigen receptor.  European Journal of Immunology 19: 1267〜1271頁)。しかし、前述の言及に対する直接的対比では、本明細書に記載のγδT細胞組成物は、悪性細胞及び健常でないカウンターパート細胞によって発現されたHLA-A*24:02を認識し、その認識は、細胞の固定化によって阻害される場合があり、このことは、認識プロセスの間の空間的及び立体構造的変化について示唆することができ、これは、αβT細胞の古典的なアロ反応性又はペプチド反応性とも異なる。
【００６６】
本明細書に記載の実施形態では、ポリペプチド構築物は、がんを標的とすることができるγδTCRを含む。γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞を含む、遺伝子操作されたT細胞で標的とされ得る種々のがんの例として、これらに限定されないが、肝臓がん、胃がん、食道がん、肺がん、乳がん、頭頚部がん、卵巣がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、膵臓がん、脂肪肉腫、精巣非セミノーマ胚細胞がん(testicular noneminomatous germ cell cancer)、黒色腫、腺腫、副腎がん、シュワン腫、悪性腫瘍、線維性組織球腫(fibrous histiochytoma)、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。さらに、本明細書に開示されるγδTCR発現T細胞などの、本明細書に開示される免疫応答細胞を利用して、卵巣癌、胆管細胞癌、中皮腫、乳がん、肺扁平上皮癌、子宮頸部上皮内腫瘍、子宮頸部の扁平上皮癌、肝内及び肝外がん、胆嚢癌、浸潤性乳管癌、明細胞癌、膨大細胞種、乳頭癌、腺癌、乳頭癌、並びに乳房の小葉癌及び髄様癌を標的とすることができる。
【００６７】
一部の場合には、γδTCRは、HLAの処理及び提示を必要とすることなく、腫瘍上に発現した抗原又はその部分、例えば、HLA-A*24:02を標的とすることができる。本明細書に記載のγδTCRは、生殖系列コード化受容体レパートリーに結合することができる。例えば、γδTCRは、一部の微生物、例えば、ウイルスによって分泌され得るか又は腫瘍細胞で過剰産生され得る、ストレス誘導性自己抗原、脂質、又はピロリン酸を認識し、結合することができる。γδTCRは、さらに、細胞の表面に発現したタンパク質又はその部分に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、DNA損傷経路により発現され得るタンパク質又はその部分に結合することもできる。一部の場合には、本明細書に記載のγδTCRは、がん細胞上に発現した脂質又はその部分に結合することもできる。
【００６８】
一部の場合には、HLA-A*24:02は、がんで過剰発現する場合があり、正常組織では低減しているか又は発現していない。一部の場合には、がんの特異的抗原及びそのエピトープは、γδTCR又は内因性若しくは外因性のαβTCRにより標的化され得る。抗原は、幅広い種類の腫瘍抗原、例えば、変異により生じる腫瘍由来の腫瘍抗原、共通腫瘍特異的抗原、分化抗原、及び腫瘍で過剰発現した抗原に由来してもよい。
【００６９】
一部の場合には、ペプチドは、健常な、ストレスを受けていないか、又は形質転換されていない細胞と異なる可能性のある、HLA、例えば、HLA-A*24:02における空間の及び/又は立体構造の変化(標的-立体構造、短い:T立体構造)と組み合わせた任意の自己ペプチドであり得る。一部の場合には、がん細胞は、K-立体構造において、HLA-Aタンパク質を異常に発現する場合がある。一部の場合には、HLA-Aの複合体化は、腫瘍細胞表面上でのHLA分子のクラスター形成を含むことができる。一部の場合には、複合体化は、K-立体構造を含む。K-立体構造は、同等の正常細胞、例えば、非腫瘍性の同等の細胞と比較した場合、腫瘍細胞上でHLA分子の差次的な特有の分布又は差次的なクラスター形成のうちの少なくとも1つを含むことができる。
【００７０】
一部の場合には、所望の抗原と免疫反応性であり得る抗原結合単位を特定する方法を本明細書で提供することができる。このような方法は、以下の工程に関与することができる:(a)抗原結合単位の遺伝学的に多様なライブラリーを調製する工程であって、ライブラリーが少なくとも1つの対象抗原結合単位を含むことができる工程;(b)抗原結合単位のライブラリーを所望の抗原と接触させる工程;(c)抗原結合単位と抗原の間の特異的結合を検出し、それによって、所望の抗原と免疫反応性であり得る抗原結合単位を特定する工程。
【００７１】
抗原又はT-立体構造の組織発現(両方が標的又は「その標的」であり得る）を、免疫組織化学(IHC)分析及び/又はフローサイトメトリー分析によって測定してもよい。組織発現は、定量的PCR(qPCR)によるコピー数に関して測定することもできる。一部の場合には、標的抗原は、がんの細胞表面上で発現される場合がある。γδTCRは、非MHC拘束方式で細胞表面の抗原を標的としてもよい。過剰発現は、IHC、qPCR、又はフローサイトメトリーによって測定した場合、正常組織上の発現に対して、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、若しくは最大100倍であり得るか又は約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、若しくは最大100倍であり得る。
【００７２】
所望の抗原又は標的に特異的に結合する抗原結合単位の能力は、当技術分野で十分に確立された様々な手順によって試験することができる。Harlow及びLane (1988年) Antibodies: A Laboratory Manual  Cold Spring Harbor Laboratory  New York;Gherardiら(1990年) J. Immunol. Meth. 126:61〜68頁を参照のこと。典型的には、所望の結合特異性を示す抗原結合単位は、免疫アッセイ、例えば、標識した抗原結合単位を固体支持体又は基質上に固定化した抗原と反応させることによって、直接検出され得る。一般的に、抗原が付着できる基質は、免疫アッセイの間に低レベルの非特異的結合を示す材料を用いて製作され得る。例の固体支持体は、以下のタイプの材料のうちの1つ又は複数から作製することができる:プラスチックポリマー、ガラス、セルロース、ニトロセルロース、半電導性材料、及び金属。一部の例では、基質は、ペトリ皿、クロマトグラフィービーズ、磁気ビーズなどであり得る。
【００７３】
このような固相アッセイでは、未反応の抗原結合単位を洗浄することによって除去することができる。しかし、液相アッセイでは、未反応の抗原結合単位は、一部の他の分離技術、例えば、濾過又はクロマトグラフィーによって除去することができる。抗原を標識した抗原結合単位に結合させた後、結合した標識の量を決定することができる。この技術の変形は、抗原が元の結合分子による飽和まで結合され得る競合アッセイであり得る。対象の抗原結合単位の集団を複合体に導入することができる場合、より高い結合親和性を示すものだけが競合することができ、したがって、抗原に結合したままである。
【００７４】
或いは、所与の抗原又は所与の標的に対する特異的結合は、選別される細胞上に所望の抗原を提示し、次いで、標的細胞を検出可能な薬剤にカップリングされ得る抗原結合単位で標識し、その後、細胞選別機において、標識された細胞を未標識細胞から分離することに関与する細胞選別によって評価することができる。高性能の細胞分離方法は、蛍光標識細胞分取(FACS)であり得る。
【００７５】
溶出した抗原又は標的結合単位の次の分析は、アミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を描写するためのタンパク質シークエンシングに関与してもよい。次いで、推測したアミノ酸配列に基づき、抗体ポリペプチドをコードするcDNAを、PCR、ライブラリースクリーニング、既存の核酸データベースにおける相同性検索、又はこれらの任意の組合せを含む組換えクローニング方法によって得ることができる。通常用いられるデータベースとして、これらに限定されないが、GenBank、EMBL、DDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS、及びHTGSが挙げられる。
【００７６】
遺伝子コードの退化により、ポリペプチド構築物をコードする配列のヌクレオチド、並びに本明細書に開示されるポリヌクレオチド及びベクターの構築に適する配列にかなりの変異が存在し得る。配列バリアントは、修飾DNA又はアミノ酸配列、1つ若しくは複数の置換、欠失、又は付加を有する場合があり、その正味の効果は、所望の結合活性を保持することであり得る。例えば、コードされたアミノ酸を変化させないか又は保存的変化を生じるかのいずれかの種々の置換が、コード領域においてなされ得る。これらの置換が、本発明において包含され得る。保存的アミノ酸置換として、以下の群内の置換を挙げることができる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。保存的置換は、産生されるポリペプチドに含有される1つ又は複数のアミノ酸残基を有効に変化させない場合があるが、置換によって、産生される得られる抗原結合単位の抗原結合活性は妨げられない場合がある。コードされるアミノ酸残基を変化させない可能性のあるヌクレオチドの置換は、異なる系の遺伝子発現を最適化するのに有用であり得る。適切な置換は当業者に公知であり、例えば、発現系における好ましいコドンの使用を反映するためになされる。一部の場合には、結合単位に対する修飾が、標的の結合活性を変化させるためになされる場合がある。
【００７７】
一部の場合には、ポリペプチド構築物における所望の結合単位は、アルファベータTCR(αβ-TCR)であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物によって構成されるT細胞受容体(TCR)は、T細胞の表面上で対合してヘテロ二量体受容体を形成する多数の鎖(αβ又はγδ)からなる。
【００７８】
αβTCRは、体内のほとんどのT細胞上で発現することができ、特異的MHC拘束抗原の認識に関与することが知られ得る。各α及びβ鎖は、2つのドメインからなる:タンパク質を細胞膜に固定し、CD3シグナル伝達装置のインバリアントサブユニットと関連する定常ドメイン(C);及び相補性決定領域(CDR)と称される6つのループを介して抗原認識を付与する可変ドメイン(V)。Vドメインのそれぞれは、超可変領域としてのCDR3と共に、3つのCDR、例えば、CDR1、CDR2及びCDR3を含む。これらのCDRは、主要組織適合複合体(pepMHC)(例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB 1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、又はHLA-DRB1複合体)によってコードされるタンパク質に結合される抗原ペプチド間に形成される複合体と相互作用する。一部の場合には、定常ドメインは、定常ドメインを可変ドメインに接続する接合領域をさらに含む。一部の場合には、ベータ鎖は、接合領域の部分を構成する短い多様性領域をさらに含む。
【００７９】
一部の場合には、γδT細胞は、αβT細胞のリガンドと異なる可能性のあるリガンドに結合することができる。例えば、γδT細胞認識は、一部の場合には、抗原処理を利用せず、一部の場合には、γδT細胞はタンパク質を直接認識することができる(Chienら、1996年、Recognition by γ/δ T cells, Annual Review of Immunology 14: 511〜532頁)。αβTCRと対照的に、γδTCRは、1つのγ鎖と1つのδ鎖からなる。αβT細胞より体内にはるかに少ない量しか存在しないが、γδT細胞は、広範に発現した腫瘍関連分子の認識に関する有効な抗腫瘍エフェクター機能と結びつき、したがって、がん免疫療法の臨床応用に対する強力な候補物質である。γδT細胞の大多数は、MHC非依存的様式で活性化され、抗原処理を必要とせず、MHC拘束αβT細胞と対照的である。代わりに、γδT細胞は、抗原提示細胞との細胞間接触に依拠し、インタクトなタンパク質又は非ペプチド化合物の形態で抗原を直接認識する。標的細胞上でのTCR媒介抗原認識によるγδT細胞の活性化により、サイトカイン及びケモカインの産生並びに標的細胞(例えば、腫瘍細胞)の細胞溶解を導くことができる。
【００８０】
一部の場合には、HLA-A*02とHLA-A*24の間の差は、ペプチド結合クレフト、α1及びα2ヘリックス、又はこれらの組合せに存在し得る。一部の場合には、変化する可能性のある残基は、HLA-A*02構造におけるW107、A185、S207、又はこれらの組合せであり得る。他の場合には、HLA-A*24タンパク質は、これらの位置で、それぞれ、G、P及びGの置換基を有してもよい。遺伝子多型は、HLA-A*24タンパク質全体にわたって存在することができる。例えば、遺伝子多型は、C末端、N末端、又はこれらの組合せ上に存在することができる。
【００８１】
一部の場合には、遺伝子多型は、HLA-Aタンパク質においてプロットすることができる。例えば、HLA- A*02は、アルファ3ドメイン上に遺伝子多型を有することができる。一部の場合には、遺伝子多型は、結合に関する効果を有することができる。一部の場合には、HLA-Aタンパク質、例えば、HLA-A*24上の遺伝子多型は、CD4対CD8結合部位における結合に差を生じる場合がある。
【００８２】
ヒト末梢血中の主要なγδT細胞サブセットであるVγ9Vδ2 T細胞は、Vγ9及びVδ2鎖からなるγδTCRを発現することができ、イソペンテニルピロリン酸(IPP)などの哺乳動物のメバロン酸経路又は微生物の2-C-メチル-D-エリスリトール4-ホスフェート(MEP)経路の中間体によって特異的に活性化される。細胞内ホスホ抗原(pAg)レベルは、メバロン酸経路の調節不全により、又は微生物感染に際して腫瘍細胞中に蓄積し、形質転換細胞又は感染細胞のVγ9Vδ2細胞による標的化を可能とする。同様に、細胞内ｐAgレベルは、アミノビスホスホネート(ABP)などのメバロン酸経路阻害剤で細胞を処理することによって薬学的に増加する可能性があり、それによって、Vγ9Vδ2 T細胞による認識に対して細胞を感作させることができる。一部の場合には、Vγ5Vδ1 TCRを本発明で提供される組成物中で利用することができる。
【００８３】
任意のYγ Vδ TCR、好ましくはYγ5Vδ1 TCR又は他のVδ2neg γδ TCRを単離し、T細胞、好ましくはαβT細胞中に導入することができる。一部の場合には、αβT細胞の内因性TCRが存在したままである。他の場合には、内因性αβTCRは、Vγ5Vδ1 TCR又は他のVδ2neg γδTCRの導入前、導入と同時に、又は導入後にゲノムが破壊される。
【００８４】
成体の末梢血では、γδT細胞サブセットは、Vδ2及びVγ9遺伝子セグメントを含むTCRを発現することができ、Vδ2pos γδΤ細胞と称することができる。対照的に、上皮組織に存在するγδT細胞は、多様なVγ鎖と対合するVδ1又はVδ3鎖から主になるTCRを発現し、これらのγδT細胞の比率により、Vδ2neg γδΤ細胞と称することができるCD8αα又はCD8αβが発現される。CD8αα又はCD8αβは、白血病反応性Vδ1 TCRに対する同時刺激の役割を果たすことができることが実証された(Scheperら、2013年、γδ T cells elicited by CMV reactivation after allo-SCT cross-recognize CMV and leukemia、Leukemia 27:1328〜1338頁)。一部の場合には、Vδ2neg γδΤ細胞は、CMV感染及び白血病に取り組むためのツールとして使用されてもよい。他の場合には、CD8αα、CD8αβ、又は他の分子は、がん細胞によって発現されるHLA-A*24に対して反応性であるγδT細胞に対する同時刺激の役割を果たすことができる。
【００８５】
一部の場合には、共受容体は、本明細書に記載のポリペプチド構築物のHLA相互作用に関与してもよい。例えば、共受容体は、HLAの文脈では又はHLAとは無関係に、TCRペプチド結合に動員されるか又は関与してもよい。種々の共受容体が関与してもよい。例えば、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4のうちの少なくとも1つが関与してもよい。CD受容体は、TCR-HLA相互作用に対する共受容体であってもよい。例えば、CD4は、HLA-クラスIIに結合することができる場合、TCRに対する共受容体として作用する。CD8は、HLA-クラスIに結合することができる場合、TCRに対する共受容体として作用する。CD4受容体は、特に、「ボールオンスティック」モデルに従ってHLAクラスIIと相互作用することができ、ここで、Phe-43ボールは、保存された疎水性α2及びβ2ドメイン残基にフィットする。クラスIIとの結合の間、CD4は独立した構造を維持し、TCR受容体といずれの結合も形成しない可能性がある。一部の場合には、共受容体は、CD8、例えば、CD8アルファであり得る。
【００８６】
一部の場合には、可溶性結合単位は、本明細書に記載のポリペプチド構築物の部分として生成され、含まれ得る。TCRリガンド相互作用の親和性は、抗体と比較して比較的低い可能性がある。この差に関する理由の1つは、結合活性であり得る。例えば、抗体は、結合の促進を導く、1つの分子上の2つのリガンド結合部位を有することができる。抗体は、一部の場合には、1から10個のリガンド結合部位を有することができる。例えば、いくつかのTCR抗体キメラを、所望のキメラに到達する前に生成し、試験することができる。例えば、γδ可変ドメインを抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインに置き換えることができる。結合の促進に加え、抗体のFcドメインは、Fcγ受容体陽性免疫細胞及び/又は補体系を介して細胞傷害性を媒介することができる。一部の場合には、TCR抗体のキメラは、HEK293細胞を使用して生成され、次に、プロテインA親和性クロマトグラフィーと、その後のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することができる。キメラの適切なフォールディングは、γ及びδ可変ドメインを標的とすることができる立体構造特異的抗体を使用して探索することができる。キメラは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)及び補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイで使用して、HLA-A*24:02腫瘍細胞に対する機能効率を決定することができる。in vitroアッセイを実施した後、TCR抗体のキメラの機能効率をin vitro及び/又はin vivoで試験することができる。
【００８７】
一部の場合には、ポリペプチド構築物の可溶性形態は、複合体化されたHLA-A*24又はその部分を認識することができる。ポリペプチド構築物は、結合実体に対する種々の形態、例えば、TCR、抗体、scFv、BCR、又はこれらの任意の組合せを含むことができる。一部の場合には、TCRの少なくとも一部、例えば、Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1は、生成されて、医薬組成物において利用することができる。Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1の可溶性形態は、複合体化されたHLA-Aを認識し、結合することができる。一部の場合には、Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1の可溶性形態は、腫瘍細胞上の複合体化されたHLA-A*24を認識し、結合することができる。一部の場合には、Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1の可溶性形態は、複合体化されたHLA-A*24:02を認識し、結合することができる。ポリペプチドの可溶性形態は、同等の健常細胞上で異常に発現していないHLA-A*24と比較して、異常な構造、異常な可動性、異常なフレキシビリティー、又は異常な区画化のうちの少なくとも1つを含む可能性のあるHLA-A*24の異常発現を認識し、結合することもできる。一部の場合には、複合体化は、HLA分子のクラスター形成を含むことができる。一部の場合には、複合体化は、K-立体構造を含む。K-立体構造は、同等の正常細胞と比較して、前記HLA分子の差次的な特有の分布又は差次的なクラスター形成のうちの少なくとも1つを含むことができる。一部の場合には、本明細書に開示される組成物は、K-立体構造におけるHLA-A*24:02を標的とし、結合することができる。
【００８８】
ヒト白血球抗原(HLA)
HLA-Aは、HLAクラスI重鎖パラログに属する。このクラスI分子は、重鎖及び軽鎖を含むヘテロ二量体であり得る(ベータ-2ミクログロブリン)。重鎖は、膜内に固定することができる。クラスI分子は、小胞体内腔に由来するペプチドを提示することによって免疫系で役割を果たすことができる。これらは、ほぼすべての細胞内で発現され得る。重鎖は、およそ45kDaであり得、その遺伝子は、8個のエクソンを含有することができる。エクソン1はリーダーペプチドをコードすることができ、エクソン2及び3は、両方ともペプチドに結合することができるアルファ1及びアルファ2ドメインをコードすることができ、エクソン4はアルファ3ドメインをコードすることができ、エクソン5は膜貫通領域をコードすることができ、エクソン6及び7は細胞質尾部をコードすることができる。エクソン2及びエクソン3内の遺伝子多型は、各クラス1の分子のペプチド結合特異性の要因となり得る。数百ものHLA-A対立遺伝子が記載されてきた。例えば、細胞に導入することができる予め規定された特異性を有するγδTCR又はその断片又はそのバリアントを含むポリペプチド構築物が本明細書で提供される。ある特定の場合には、γδTCRは、表1のHLA-A若しくはその残基及び/又はその遺伝子多型の1つ若しくは複数に対して特異的であり得る。好ましくは、γδTCRは、配列番号1の少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%の同一性に対して特異的であり、結合することができる。
【００８９】
【表１Ａ】
2019525898.tif 000003
【表１Ｂ】
2019525898.tif 000004
【表１Ｃ】
2019525898.tif 000005
【００９０】
HLA-A*24:02に結合することができるγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むポリペプチド構築物が本明細書で提供される。一部の場合には、本明細書に記載のγδTCR又はその断片若しくはバリアントは、遺伝子操作されたαβT細胞において発現することができる。一部の場合には、HLAに拘束される、γδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むポリペプチド構築物は、がんで発現されたHLAにのみ結合し、健常組織で発現されたHLAには結合しない場合がある。HLA-Aを発現する健常又は正常組織は、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、十二指腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、膀胱、又はこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、HLA-Aタンパク質は、健常組織でのその発現に対して、がんで差次的に発現され得る。一部の場合には、がんでのHLA-A発現は、HLA-Aの異常発現であり得る。異常発現として、同等の細胞上で発現されたHLAと比較して、可動性、フレキシビリティー、フォールディング、及び/又は区画化に関しての異常を挙げることができる。例えば、がん細胞は、非がん性の同等の細胞と比較して、HLA-Aの異常発現を有する場合がある。異常発現には、TCRの結合に影響を及ぼす可能性のあるがん細胞表面上でのHLA-Aの可動性の差が含まれ得る。同様に、異常発現は、がん細胞上のHLAタンパク質、例えば、HLA-Aのフレキシビリティーに影響を及ぼし得る。標的細胞上のHLA-Aの異常発現により、同等の細胞上には存在しない可能性のある特有の結合部位又は特有の結合立体構造が作成され得る。本明細書に開示される組成物は、異常なHLA-A発現を利用するために遺伝子操作されたポリペプチド構築物、又はこのようなポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞を含み、非特異的結合を低減する腫瘍標的療法を提供することができる。
【００９１】
一部の場合には、本明細書に開示されるポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されないHLA-A及び/又はその遺伝子多型の1つ若しくは複数に対して特異的であり得るγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。一部の場合には、本明細書に開示されるポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されないHLA-A*24:2及びその対立遺伝子に対して特異的であり得るγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。一部の場合には、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されない1つ又は複数のHLA-A形状に対して特異的であり得る。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されないHLA-A*24:02に対して特異的であってもよい。ポリペプチド構築物は、悪性に形質転換した細胞を認識し、結合することができる。一部の場合には、悪性に形質転換した細胞は、HLA-A*24:02陽性であり得る。一部の場合には、γδTCRは、HLA-A*24タンパク質のCD8結合部位に結合する。一部の場合には、結合することができる残基は、W107、A185、S207、及びこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、結合することができる残基は、G、P及びG、並びにこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、HLA-A*24タンパク質のC末端残基に結合することができる。他の場合には、HLA-A*24タンパク質のN末端残基に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、HLA-A*24タンパク質のペプチド結合クレフトに結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、ペプチド結合クレフトの「A」ポケットに結合することができる。
【００９２】
本明細書に記載のポリペプチド構築物は、表2、表4、表5、及び表6のいずれか1つに開示された配列又はその一部を含むか又はそれからなる、又はそれに由来する少なくとも1つの受容体鎖を含むことができる。少なくとも1つのCDRを含む抗原結合単位、例えば、γδTCR又はその部分が本明細書に開示される。一部の態様では、抗原結合単位は、軽鎖CDRを含むことができる。軽鎖CDRは、抗原結合単位の軽鎖の相補性決定領域であり得る。軽鎖CDRは、非相補性決定領域、例えば、フレームワーク領域によって分離され、任意選択でそれらに隣接するアミノ酸残基の連続配列、又はアミノ酸残基の2つ若しくはそれより多い隣接配列を含むことができる。一部の例では、軽鎖CDRは、軽鎖CDR-1、CDR-2などと称することができる、2つ又はそれより多い軽鎖CDRを含む。一部の態様では、抗原結合単位は、重鎖CDRを含むことができる。重鎖CDRは、抗原結合単位の重鎖の相補性決定領域であり得る。重鎖CDRは、非相補性決定領域、例えば、フレームワーク領域によって分離され、任意選択でそれらに隣接するアミノ酸残基の連続配列、又はアミノ酸残基の2つ若しくはそれより多い隣接配列を含むことができる。一部の例では、重鎖CDRは、重鎖CDR-1、CDR-2などと称することができる、2つ又はそれより多い重鎖CDRを含む。一部の場合には、CDR3配列を利用してもよい。標的に結合することができるCDR配列、例えば、CDR3配列を生成する方法も本明細書に開示される。例えば、FE11様CDR3配列を生成することができる。FE11又はFE11様CDR3配列は、HLA-A*24に結合することができる抗体又はその結合部分であり得る。FE11様CDR3配列は、FE11ポリペプチド又はFE11をコードする核酸分子との相同性の少なくとも一部を共有する抗体又はその結合部分であり得る。一部の場合には、FE11様CDR3配列は、立体構造、結合、アミノ酸配列の差、すなわち、配列の一部の差を有する場合がある。基準FE11の活性は、前記FE11又はFE11様CDR3配列において少なくともある程度まで保持される。基準FE11の活性は、HLA-A*24に対する結合であってもよい。このような結合は、当業者に公知の技術を使用して評価することができる。この文脈内では、「少なくともある程度」は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%若しくは少なくとも100%又はそれより多いことを意味する。FE11又はFE11様CDR3配列の別の活性は、抗腫瘍又は抗がん又は抗感染活性又は応答であり得る。
【００９３】
抗腫瘍応答は、本明細書で特定されるガンマ及び/又はデルタ配列を発現するT細胞を腫瘍細胞と接触させることによって評価されてもよい(すなわち、いわゆる遺伝子操作されたT細胞)。使用される前記T細胞が、δT細胞受容体鎖の生物学的関連を評価するためにγT細胞受容体鎖も発現すべきであることは、当業者にとって明らかである。言い換えれば、γδTCRは、好ましくは、前記T細胞で発現され、δTCRは、本明細書で特定されたものである。或いは、γδTCRは、好ましくは、前記T細胞で発現され、γTCRは、本明細書で特定されたものである。代替として、γδTCRは、好ましくは、前記T細胞で発現され、各TCR鎖は、本明細書で特定されたものである。好ましい実施形態では、δT細胞(又はγT細胞)受容体鎖をコードする核酸分子又はその部分は、T細胞における発現ベクター中、又はレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター中で提供される。T細胞は、δT及び/又はγT細胞受容体鎖をコードする核酸の移入前又は後に増殖されてもよい。好ましくは、増殖は移入後であり、その結果、移入される必要のある核酸の量は可能な限り少ない。前記T細胞のこの増殖は、IL-2の存在下で、抗CD3/CD28 Dynabeadsによる刺激によって実施されてもよい。遺伝子操作されたγδT細胞受容体を含む増殖された細胞は、例えば、選択マーカーを介して選択されてもよく、例えば、実施例に記載されるMACS分離システムを使用して、CD4抗原及びCD8抗原の提示に対してさらに選択されてもよい。次に、遺伝子操作されたT細胞は、参照により本明細書に組み込まれるRiddel及びGreenberg、1990年  J Immunol Methods. 128(2):189〜201頁に記載されるREPプロトコールを使用して、又はそれと同様の増殖方法をさらに使用して、さらに増殖されてもよい。簡潔には、増殖方法は、T細胞活性化分子、例えば、TCR、CD3及びCD28並びに/又は支持細胞並びに/又は刺激性サイトカインを対象とする抗体を使用することに関与する。
【００９４】
δT細胞(又はγT細胞)受容体鎖を発現する前記T細胞の抗腫瘍応答は、当業者に公知の任意の技術を使用して評価されてもよい。δT細胞受容体鎖は、δ2-T細胞受容体鎖であってもよい。γT細胞受容体鎖は、γ9-T細胞受容体鎖であってもよい。抗腫瘍活性を決定する工程は、腫瘍細胞分裂速度、すなわち、腫瘍細胞が分裂する速度、細胞死、腫瘍細胞への結合、IFNy、IL-2又はTNFαなどのサイトカイン産生の誘導に関する効果を有するなど、抗腫瘍効果が決定される任意のアッセイを含んでもよい。腫瘍細胞は、任意の種類の腫瘍細胞であってもよい。例えば、患者由来の原発性腫瘍細胞。腫瘍細胞は、細胞株、例えば、当技術分野で周知である、Daudi、RPMI8226/S、OPM2、LME1、K562、Saos2、MZ1851 RC、SCC9、Fadu、MDA-MB231 、MCF7、BT549、SW480という名称の実施例で列挙された細胞株由来の腫瘍細胞であってもよい。腫瘍細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、Virginia)などから容易に入手することができる。
【００９５】
好ましい実施形態では、抗腫瘍応答を決定することは、前記遺伝子操作されたT細胞を腫瘍細胞と接触させること及び腫瘍細胞を溶解させ及び/又はIFN-γ、IL-2又はTNFαなどのサイトカイン産生を誘導するその能力を測定することを含む。この接触させる工程、培養する工程又はインキュベーション工程は、10時間から1、2、3、4、5日までの期間を有してもよい。腫瘍細胞を溶解させる能力は、前記T細胞が接触される固定量の腫瘍細胞を提供することを含み、インキュベーション期間の後、生存可能な腫瘍細胞数が計数される。インキュベーション工程の終わりに、生存可能な腫瘍細胞数が、インキュベーション工程の開始時の初期腫瘍細胞数の90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満である場合に、抗腫瘍応答は特定されるか又は決定されていてもよい。或いは、遺伝子操作されたT細胞とのインキュベーション工程の終わりに、生存可能な腫瘍細胞数が、共有される、特定された配列で遺伝子操作されていない対照T細胞との同様のインキュベーション工程の終わりの腫瘍細胞数より少ない場合に、抗腫瘍応答が特定されるか又は決定されていてもよい。この文脈では、より少ないとは、少なくとも10%より少ない、少なくとも20%より少ない、少なくとも30%より少ない、少なくとも40%より少ない、少なくとも50%より少ない、少なくとも60%より少ない、少なくとも70%より少ない、少なくとも80%より少ない、少なくとも90%より少ないことを意味してもよい。
【００９６】
インキュベーション工程の終わりに生存可能な腫瘍細胞数を計数することに加えて、又はその代替として、当業者に公知である51クロム放出アッセイが実施されてもよい。51クロム放出量は、溶解された細胞数の尺度である。同様に、IFN-γ、IL-2若しくはTNFαなどのサイトカイン産生又は活性化マーカーの分泌若しくは発現も、例えば、抗体染色、ELISA及び/又は発現したmRNAに対する定量的PCRを介して決定されてもよい。IFN-γ、IL-2又はTNFαなどのサイトカイン産生を決定するためのアッセイは、広く市販されている。IL-2、TNFα又はIFNγなどのサイトカイン産生が検出される場合、前記T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。或いは及び好ましくは、遺伝子操作されたT細胞と接触させる工程の終わりに生じたIFNγ、IL-2又はTNFαの量が、腫瘍細胞が対照のT細胞と接触した場合に生じたIFNγ  IL-2又はTNFαの量より多い(好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%又はそれより多い)場合、T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。対照のT細胞は、本発明で特定されたδT細胞(又はγT細胞)受容体鎖を含むアミノ酸をコードする規定の核酸分子を発現しない。抗腫瘍応答は、インキュベーション工程の終わりに、遺伝子操作されたT細胞の腫瘍細胞への結合を評価することによって決定されてもよい。遺伝子操作されたT細胞の腫瘍細胞への結合が、接触させる工程の終わりに検出される場合、T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。或いは及び好ましくは、接触させる工程の終わりのT細胞の結合が、対照のT細胞(前出の定義を参照のこと)の同一腫瘍細胞への結合より多い(好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%又はそれより多い)場合、T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。接触させる工程は、ホスホ抗原、例えば、パミドロン酸の存在下で行われてもよい。
【００９７】
標的に結合することができるCDR配列を生成する方法は、数ある技法の中で、変異、置換、欠失、挿入を含むことができる。例えば、FE11様CDR3配列は、アミノ酸置換によって生成することができる。任意の数のアミノ酸が置換され得る。アミノ酸置換は、約1から約1000個を含むことができる。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、又は最大約1000個のアミノ酸が置換され得る。アミノ酸置換数は、以下の方法のうちの1つにおいて定義されてもよい:検討される分子内に存在する10、15、20、25個のアミノ酸当たり少なくとも1個のアミノ酸置換を有する方法、置換アミノ酸の少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%を有する方法。
【００９８】
アミノ酸置換は、CDR領域に種々の効果を有することができる。一部の場合には、置換又は変異は、ドメインの安定性に影響を及ぼし得る。他の場合には、置換又は変異は、発現レベルに影響を及ぼし得る。CDR3などのCDR領域の置換又は変異は、構造に影響を及ぼし得る。CDR3領域への変化は、可変ドメイン、定常ドメイン、又はこれらの組合せを含むことができる。一部の場合には、置換又は変異は、リガンド結合に影響を及ぼし得る。置換、変異、欠失、又は挿入は、Jγ1及び/又はJδ1セグメントの少なくとも一部で実施され得る。一部の場合には、置換又は変異は、リガンド結合に影響を及ぼし得る。置換、変異、欠失、又は挿入は、アミノ酸配列のC末端、N末端、又は両方の末端で実施され得る。一部の場合には、基準ポリペプチドと比較して変異したポリペプチド又は少なくとも1つの置換を有するポリペプチドであって、前記変異したポリペプチドは、配列番号2から配列番号428のうちのいずれか1つを含むことができる。好ましい実施形態では、アミノ酸配列である配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428のうちのいずれかと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるポリペプチドが提供される。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。
【００９９】
一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、配列番号6から配列番号428のうちの少なくとも1つと少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列によってコードされる受容体の少なくとも一部(a portion of or a part of)を含むことができる。好ましくは、同一性は、全体の長さに対して評価される。一部の場合には、変異配列は、TCRのガンマ又はデルタ鎖内に見出すことができる。
【０１００】
本明細書に開示されるある特定の方法では、γ9T細胞受容体又はγ9陰性γT細胞受容体鎖及びδ2T細胞受容体又はδ2陰性δT細胞受容体鎖のCDR3領域は修飾され、組み合わされて、本明細書に開示されるHLA立体構造に選択的に結合する新規γ9δ2TCRを形成することができる。より好ましい実施形態では、CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分が提供され、前記δT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号6から237のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含む。好ましくは、同一性は、少なくとも少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。別のより好ましい実施形態では、CDR3領域を含むγT細胞受容体鎖又はその部分が提供され、前記γT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号238から428のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含む。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、γ9陰性γT細胞受容体鎖、δ2T細胞受容体、及び/又はδ2陰性δT細胞受容体鎖を含むポリペプチド構築物である。設計されたγδTCRは、T細胞中に提供され、好ましくは、組み込むことができ、次に細胞表面でγδTCRを発現することができる。したがって、CTEにより遺伝子操作されたT細胞の抗腫瘍応答が決定される。このように、多数の組合せについて試験することができ、各組合せについて、抗腫瘍応答を決定することができる。抗腫瘍応答を決定した後、活性の高い抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞受容体を特定することができる。本明細書に開示されるある特定の方法では、γ5T細胞受容体鎖及びδ1T細胞受容体鎖のCDR3領域を修飾し、組み合わせて、本明細書に開示されるHLA立体構造に選択的に結合する新規γ5δ1TCRを形成することができる。ある特定の実施形態では、表2、表4及び表5のうちの1つ又は複数に開示されたγ5T細胞受容体鎖及び/又はδ1T細胞受容体鎖を含むポリペプチド構築物である。設計されたγ5δ1TCRは、T細胞中に提供され、好ましくは、組み込むことができ、次に細胞表面でγ5δ1TCRを発現することができる。したがって、CTEにより遺伝子操作されたT細胞の抗腫瘍応答が決定される。このように、多数の組合せについて試験することができ、各組合せについて、抗腫瘍応答を決定することができる。抗腫瘍応答を決定した後、活性の高い抗腫瘍応答を媒介するγ5δ1T細胞受容体を特定することができる。したがって、TCR、好ましくは、CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分を含む遺伝子操作されたTCRが提供され、前記δT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号3、及び配列番号6から237のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含み、γT細胞受容体鎖又はその部分はCDR3領域を含み、前記γT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号2、及び配列番号238から428のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含む。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の態様では、対象の抗原結合単位は、HLA-A*24:02の少なくとも一部に特異的に結合する。HLA-A*24:02は、本明細書で使用される場合、公知のHLA-A*24:02配列の相同分子種、相同体、コドン最適化形態、切断形態、断片化形態、変異形態、又は任意の他の公知の誘導体形態を指すこともできる。例えば、HLA-A*24:02はヒトHLA-A*24:02であり得る。HLA-A*24:02はマウスのHLA-A*24:02であり得る。一部の場合には、MHCは、いくつか例を挙げると、チンパンジー、ブタ、ゴリラ、ニワトリ、ウシ、ヤギなどの哺乳動物に由来し得る。
【０１０２】
一部の場合には、γδTCRは、表6由来の配列番号2、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号4又は配列番号238〜428に対して、約10%から又は10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%までの相同性を含むことができる。一部の場合には、γδTCRは、表5由来の配列番号3、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号5又は配列番号6〜237に対して、約10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%までの相同性を含むことができる。一部の場合には、γδTCRは、配列番号4のアミノ酸19〜309及び配列番号5のアミノ酸21〜293の両方を含むことができる。一部の場合には、γδTCRは、表5及び表6由来の配列を含むことができる。
【０１０３】
本明細書に記載のポリペプチドを利用して、立体構造的に制約されたHLA分子に選択的に結合することができる。例えば、立体構造的に制約されたHLA分子は、同等の細胞上の正常なHLA分子と比較して、異常な立体構造を有するHLA、腫瘍細胞上に発現したHLAを含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、非がん細胞上の対応するHLA分子と比較して、がん細胞上に発現したHLA分子に選択的に結合することができる。一部の場合には、がんによって発現したHLAは、健常組織に発現したHLAと比較して、立体構造的に異なる場合がある。例えば、悪性腫瘍は、HLAに、γδTCRによって認識され得る腫瘍細胞表面にクラスターを形成させる場合がある。腫瘍細胞上でのクラスター形成によってHLAにおける立体構造の変化が誘導され、γδTCRによる検出が可能となる場合がある。細胞表面でのクラスター形成には、少なくとも2つのHLAタンパク質の接触が含まれてもよい。一部の場合には、クラスター形成は、互いに隣接する少なくとも2つのHLAタンパク質を含むことができる。一部の場合には、クラスター形成は、細胞表面でのタンパク質の密度によって測定することができる。
【０１０４】
立体構造の変化は、クラスター形成されない場合に存在しない可能性のあるHLA上の新たな結合部位を作成することができる。一部の場合には、クラスター形成されないタンパク質と比較して、クラスター形成されたHLAタンパク質上には、1から100個の新たな結合部位が存在してもよい。一部の場合には、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個の新たな結合部位が存在してもよい。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLAタンパク質上の新たな結合部位に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLA-Aに結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLA-A*24に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLA-A*24:02に結合することができる。
【０１０５】
一部の場合には、免疫金標識抗原の走査フォース顕微鏡によって検出されるマイクロメートル範囲の受容体間距離によって特徴付けられるHLAクラスター形成は、腫瘍細胞の表面に提示され得る。一部の場合には、電子顕微鏡を使用して、細胞表面のHLAクラスター形成を検出及び測定することができる。一部の場合には、走査フォース顕微鏡を使用して、クラスター形成を検出及び測定することができる。一部の場合には、顕微鏡技法において、30及び15nmの免疫金ビーズを利用して、クラスター形成を測定及び検出することができる。例えば、直径約5nmから、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、又は100nmまでの任意のサイズのビーズを使用することができる。ビーズは、一部の場合には、実質的に球形であり得る。一部の場合には、HLAのクラスター化は、無作為の場合を表すポアソン分布由来のそれらの空間的分布の偏差によって検出される、その内部に提示される抗原、ビーズ、又はペプチドの分布によって検出することができる。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)測定を使用して、別の階層レベルのHLA分子のクラスター形成を示すこともできる。例えば、約2から10nmのフォルスター距離範囲によって特徴付けられるFRETによって、受容体の分子構成の詳細を提供することができる。他の場合には、HLAクラスターを検出するために使用することができるフォルスター距離範囲は、約0.5nmから、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm、10nm、10.5nm、11nm、11.5nm、12nm、12.5nm、13nm、13.5nm、14nm、14.5nm、15nm、15.5nm、16nm、16.5nm、17nm、17.5nm、18nm、18.5nm、19nm、19.5nm、又は20nmまでであり得る。
【０１０６】
細胞の工学的操作
細胞の工学的操作のプロセス又は方法の部分として、免疫細胞の供給源は対象から得ることができる。免疫細胞は、骨髄又はリンパ起源であり得る。一部の場合には、T細胞、B細胞、又はナチュラルキラー(NK)細胞を使用することができる。T細胞は、細胞株、例えば、SupT-1、Jurkat、若しくはRaji細胞又は任意の他の広範囲に利用可能な細胞株であってもよい。初代細胞又は任意の他の細胞株である任意の細胞型を利用することができる。一部の場合には、T細胞受容体を発現する細胞、すなわち、FACS選別においてαβTCRに対して陽性であるような細胞が企図されてもよい。また、γδTCRと共に提供される場合、機能的TCR複合体を形成し、例えば、機能的細胞傷害性応答及び/又はサイトカイン産生を発揮することが可能であり得る任意の細胞又は細胞集団が企図されてもよい。提供され得る細胞は、前駆細胞、好ましくは、血液前駆細胞、例えば、胸腺細胞又は血液幹細胞であってもよく、これらは、右の刺激と共に提供された後、T細胞又は遺伝子操作されたT細胞に発達することができる。それ故に、γδTCRと共に細胞を提供することは、これらが遺伝子操作されたT細胞に発達するように、前駆細胞を提供すること、これらをγδTCRと共に提供すること及びこれらの前駆細胞を刺激することを含んでもよいことが理解され得る。
【０１０７】
末梢血単核球(PBMCs)、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の供給源からT細胞を得ることができる。当技術分野で利用可能な任意の数のT細胞株が使用されてもよい。T細胞は、Ficoll(商標)分離などの当業者に公知の任意の数の技法を使用して対象由来の採血単位から得ることができる。一部の場合には、個体の循環血由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、及び血小板を含有し、一実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、次の処理工程のために、細胞を適当な緩衝液又は媒体に置く。一部の場合には、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。一部の場合には、洗浄溶液はカルシウムを欠如してもよく、マグネシウムを欠如してもよく、又はすべての二価のカチオンではないにしても多くを欠如してもよい。洗浄工程は、製造業者の説明書に従って、半自動化「フロースルー」遠心分離(例えば、the Cobe 2991 cell processor、the Baxter CytoMate、又はthe Haemonetics Cell Saver 5)を使用することなどによって当業者に公知の方法によって達成されてもよい。洗浄工程の後、単離した細胞は、緩衝液の有無にかかわらず、例えば、Ca3+を含まないか、Mg2+を含まないPBS、PlasmaLyte A、又は他の生理食塩水などの様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁されてもよい。或いは、アフェレーシス試料の任意の望ましくない構成成分を除去して、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。一部の場合には、T細胞は、例えば、PERCOLL(商標)勾配による遠心分離によってか又は向流遠心溶出によって、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離することができる。T細胞の具体的な亜集団、例えば、CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及びCD45RO+T細胞は、陽性又は陰性の選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一実施形態では、T細胞は、所望のT細胞の陽性選択に対して十分な期間、抗CD3/抗CD28(すなわち、3×28)-コンジュゲートビーズ、例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tを用いるインキュベーションによって単離される。一実施形態では、期間は、約30分である。一部の場合には、期間は、約30分から36時間又はそれより長い期間及びその間のすべての整数値の範囲である。さらなる実施形態では、期間は、少なくとも1、2、3、4、5、又は6時間である。別の場合には、期間は、約10時間から約24時間である。一部の場合には、期間は24時間であり得る。白血病を有する患者由来のT細胞の単離に対して、24時間などのより長いインキュベーション時間の使用により、細胞収率が増加し得る。より長いインキュベーション時間を使用して、腫瘍組織又は免疫無防備状態の個体由来の腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を単離する際のように、他の細胞型と比較して、T細胞がほとんど存在しない任意の状況でT細胞を単離してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間の使用によって、CD8+T細胞の捕捉効率を増加させることができる。したがって、単に、時間を短くしたり延ばしたりすることによって、T細胞をCD3/CD28ビーズに結合させることが可能となり、及び/又はT細胞に対するビーズの比を増加���せるか又は低下させることによって(本明細書でさらに記載されるように)、T細胞の亜集団を、培養開始時又はプロセス間の他の時点で、優先的に選択することができる。さらに、ビーズ又は他の表面上の抗CD3及び/又は抗CD28抗体の比を増大又は低下させることによって、T細胞の亜集団は、培養開始のために若しくはそれに対して又は他の所望の時点で優先的に選択することができる。当業者は、この発明の文脈で、複数ラウンドの選択を使用することができると認識するであろう。
【０１０８】
一部の場合には、陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーを対象とする抗体の組合せにより達成することができる。1つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用してもよい陰性磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び/又は選択であり得る。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD 14、CD20、CD l1b、CD 16、HLA-DR、及びCD8に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的には、CD4+、CD25+、CD62L+、GITR+、及びFoxP3+を発現する調節T細胞を濃縮するか又は陽性選択することが望ましい。或いは、ある特定の実施形態では、T調節細胞は、抗CD25コンジュゲートビーズ又は他の同様の選択方法によって枯渇される可能性がある。
【０１０９】
陽性又は陰性選択による所望の細胞集団の単離に関して、細胞及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態では、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させ(すなわち、細胞の濃度を増加させ)、細胞とビーズの最大接触を確保することが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、1ml当たり20億個の濃度の細胞を使用することができる。一実施形態では、1ml当たり10億個の濃度の細胞を使用することができる。さらなる実施形態では、1ml当たり1億個の濃度の細胞を使用することができる。さらなる実施形態では、1ml当たり1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、又は5000万個の濃度の細胞を使用することができる。さらに別の実施形態では、1ml当たり7500、8000、8500、9000、9500万、又は1億個の濃度の細胞を使用することができる。さらなる実施形態では、1ml当たり1億2500万又は1億5000万個の濃度の細胞を使用することができる。高濃度を使用することにより、細胞収率、細胞の活性化、及び細胞の増殖の増加をもたらすことができる。刺激するために、洗浄工程の後、T細胞を凍結させることもできる。
【０１１０】
凍結及び次の解凍工程により、細胞集団において、顆粒球及びある程度まで単球を除去することにより、より均一な生成物を提供することができる。血漿及び血小板を除去することができる洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で公知であり、この文脈で有用である場合があるが、1つの方法は、20%のDMSOと8%のヒト血清アルブミンを含有するPBS、又は10%のデキストラン 40及び5%のデキストロース、20%のヒト血清アルブミン及び7.5%のDMSO、若しくは31.25%のPlasmaiyte-A、31.25%のデキストロース  5%、0.45%のNaCl、10%のデキストラン 40及び5%のデキストロース、20%のヒト血清アルブミン、及び7.5%のDMSOを含有する培養培地又は、例えば、Hespan及びPlasmaLyte Aを含有する他の適切な細胞凍結媒体を使用することに関与し、次いで、細胞を1分当たり1度の割合で-80℃まで凍結させて、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保存してもよい。凍結を制御する他の方法を、-20℃又は液体窒素中における未制御の直ちに凍結する方法と同様に使用してもよい。ある特定の実施形態では、凍結保存した細胞を本明細書に記載されるように解凍及び洗浄し、活性化前に、室温で1時間休ませてもよい。
【０１１１】
本明細書に記載されるように、増殖された細胞が必要とされる前の期間に、対象由来の血液試料又はアフェレーシス産物の採取を企図することもできる。一実施形態では、血液試料又はアフェレーシスを概して健常な対象から得ることができる。ある特定の実施形態では、血液試料又はアフェレーシスを、疾患を発症するリスクを有する可能性があるが、未だ疾患を発症していない概して健常な対象から得ることができ、目的の細胞を単離して、後の使用のために凍結することができる。一部の場合には、T細胞を増殖し、凍結して、後で使用してもよい。一部の場合には、試料は、本明細書に記載されるように、特定の疾患の診断直後であるが、任意の処置の前に、患者から採取される。一部の場合には、これらに限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びFK506などの免疫抑制剤、抗体、又はCAMPATHなどの免疫アブレーション剤、抗CD3抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、及び放射線照射を含む任意の数の関連する処置モダリティの前に対象由来の血液試料又はアフェレーシスから細胞を単離してもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼ  カルシニューリンを阻害するか(シクロスポリン及びFK506)又は成長因子に誘導されるシグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害するか(ラパマイシン)のいずれかである。
【０１１２】
一部の場合には、骨髄又は幹細胞移植、フルダラビン、外部ビーム放射療法(XRT)、シクロホスファミドなどの化学療法剤、又はOKT3若しくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを使用するT細胞アブレーション療法と併せた(例えば、前に、同時に又は後に）、後の使用のために、細胞を患者ごとに単離し、凍結することができる。別の実施形態では、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのB細胞アブレーション療法後の処置のために、前もって細胞を単離し、後の使用のために凍結することができる。
【０１１３】
一部の場合には、T細胞を、処置の後、患者から直接得ることができる。これに関して、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損傷する薬物による処置の後であって、患者が通常処置から回復している期間の処置直後に、得られるT細胞の品質が、ex vivoで増殖するそれらの能力に関して最適であるか又は改善されている場合があることが観察されてきた。同様に、本明細書に記載の方法を使用するex vivo操作後に、これらの細胞は、生着及びin vivoでの増殖の促進に対して好ましい状態にある場合がある。したがって、本発明の文脈内では、この回復期の間に、T細胞、樹状細胞、又は造血系の他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある特定の実施形態では、特に、後の療法の規定の時間枠の間に、可動化(例えば、GM-CSFによる可動化)及び馴化レジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び/又は増殖が好まれる可能性のある対象の状態を創出することができる。例証となる細胞型として、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
【０１１４】
細胞の単離の後、免疫細胞、例えば、T細胞を、T細胞に付着する表面と、CD3 TCR複合体に関連するシグナルを刺激する薬剤及びT細胞の表面の同時刺激分子を刺激するリガンドと接触させることによって増殖させることができる。特に、例えば、表面に固定された抗CD3抗体、若しくはその抗原結合断片、又は抗CD2抗体と接触させることによって、又はカルシウムイオノホアと併せて、プロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによって、本明細書に記載されているように、T細胞集団を刺激してもよい。T細胞表面のアクセサリー分子の同時刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適当な条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞又はCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するための、抗CD3抗体及び抗CD28抗体。抗CD28抗体の例として9.3,B-T3が挙げられ、当技術分野で通常知られている他の方法(Bergら、Transplant Proc. 30(8):3975〜3977頁、1998年;Haanenら、J. Exp. Med. 190(9):13191328頁、1999年;Garlandら、J. Immunol Meth. 227(1-2):53〜63頁、1999年)を使用できるように、XR-CD28(Diacione、Besancon、France)を使用することができる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、T細胞に対する一次刺激シグナル及び同時刺激シグナルは、異なるプロトコールによって提供されてもよい。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中に存在するか、又は表面にカップリングされてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面(すなわち、「cis」構造)又は別の表面(すなわち、「trans」構造)にカップリングされてもよい。或いは、1つの薬剤が表面にカップリングされ、他の薬剤が溶液中に存在してもよい。一実施形態では、同時刺激シグナルを与える薬剤は、細胞表面に結合させることができ、一次活性化シグナルを与える薬剤は、溶液中に存在するか又は表面にカップリングされてもよい。ある特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中に存在してもよい。別の実施形態では、薬剤は可溶性形態であってもよく、次いで、表面、例えば、Fc受容体若しくは抗体を発現する細胞又は薬剤に結合することになる他の結合剤に架橋してもよい。これに関しては、例えば、本発明においてT細胞を活性化及び増殖させる際の使用を企図する人工抗原提示細胞(aAPC)に対する米国特許出願公開第20040101519号及び米国特許出願公開第20060034810号を参照のこと。
【０１１６】
一部の場合には、本明細書に記載の細胞を成長させるために使用することができる培養培地は、多数の添加剤を含むことができる。一部の例では、添加剤として、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子又は腫瘍壊死因子を挙げることができる。一部の場合には、ケモカインは、細胞の移動を誘導する化学誘引物質としての役割を果たし、4つのサブファミリー:CXC、CC、CX3C、及びXCに分類される。例示的ケモカインは、CCサブファミリー:CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(又はCCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、及びCCL28;CXCサブファミリー:CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、及びCXCL17;XCサブファミリー:XCL1及びXCL2;並びにCX3Cサブファミリー  CX3CL1由来のケモカインを含む。インターフェロン(IFN)は、インターフェロン型I(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、及びIFN-ω)、インターフェロン型II(例えば、IFN-γ)、及びインターフェロン型IIIを含むことができる。一部の実施形態では、IFN-αは、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、及びIFNA21を含む約13個の亜型にさらに分類される。インターロイキンは、白血球(leukocyte）又は白血球細胞(white blood cell）によって発現されることが可能であり、T及びBリンパ球及び造血細胞の発達及び分化を促進する。例示的インターロイキンは、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35、及びIL-36を含む。一部の場合には、腫瘍壊死因子(TNF)を培養培地に導入することができる。TNFは、アポトーシスをモジュレートするサイトカインの一群であり得る。一部の例では、これらに限定されないが、TNFα、リンホトキシン-アルファ(LT-アルファ)、リンホトキシン-ベータ(LT-ベータ)、T細胞抗原gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、及びTNF-関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)を含むTNFファミリー内の約19個のメンバーが存在する。コロニー刺激因子(CSF)は、造血幹細胞の表面の受容体タンパク質と相互作用する分泌糖タンパク質であり、次に、細胞増殖及び特定の種類の血液細胞への分化をモジュレートすることができる。一部の例では、CSFは、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)又はプロメガプロテインを含む。
【０１１７】
一部の場合には、ガンマ-デルタTCRをコードするポリペプチドを免疫細胞に導入することができる。外因性ガンマ-デルタTCRを発現する免疫細胞を増殖させることができる。一部の場合には、免疫細胞を遺伝子操作する方法は、細胞を準備する工程と、細胞表面で、少なくとも1つの外因性ガンマ-デルタTCRを発現する工程とを含む。ガンマ-デルタTCRをコードするポリヌクレオチドを、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって、細胞に導入してもよい。例えば、一過性形質転換方法として、例えば、微量注入、電気穿孔又は微粒子銃を挙げることができる。ガンマ-デルタTCRをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスによって又はウイルスによらずに導入することができる。ウイルスによる導入には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はこれらの組合せを利用することができる。
【０１１８】
ポリ核酸を挿入することができるベクターも本明細書において提供することができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それらが、導入遺伝子の長期的な、安定した組込みと、娘細胞におけるその伝播を可能とすることができるため、長期的な遺伝子移入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに対して、それらが、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入され得るという点でさらなる利点を有する。レンチウイルスベクターは、免疫原性が低いというさらなる利点も有する。
【０１１９】
本明細書に記載の方法及び組成物に対して有用なポリヌクレオチドベクターは、医薬品適正製造基準(GMP)に適合するベクターであり得る。例えば、GMPベクターは、非GMPベクターより純粋であり得る。一部の場合には、生物汚染度によって純度を測定することができる。例えば、生物汚染度は、ベクター組成物中の好気性菌、嫌気性菌、胞子菌、真菌、又はこれらの組合せの有無であり得る。一部の場合には、純粋なベクターは、エンドドキシンが低いか又はエンドドキシンを含まない場合がある。純度は、二本鎖プライマーウォーキングシークエンスによっても測定することができる。プラスミドの同一性は、ベクターの純度を決定する原因でもあり得る。本発明のGMPベクターは、非GMPベクターより10%から99%純度が高い可能性がある。GMPベクターは、生物汚染度、エンドドキシン、シークエンス、又はこれらの組合せの存在によって測定される場合、非GMPベクターより10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%純度が高い可能性がある。
【０１２０】
γδTCRをコードする核酸配列も提供することができる。核酸は、単離された核酸であり得る。γδTCRをコードすることができる核酸は、DNA又はRNA形態であり得る。例えば、γδTCRをコードするDNAベクターを本明細書において提供することができる。γδTCRをコードするDNAミニサークルも本明細書において提供することができる。一部の場合には、γδTCRは、mRNAの形態であり得る。例えば、細胞に、γδTCRをコードするmRNAを電気穿孔することができる。核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の核酸は、短い直鎖状DNA(ドギーボーン)ベクターであり得る。
【０１２１】
核酸は、多数の型のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。ベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンシングベクターも含むことができる。さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、(2001年、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)、及び他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般的に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ又は複数の選択マーカーを含有する。多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入に対して開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に対する簡便なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技法を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、in vivo又はex vivoのいずれかで、対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が当技術分野で公知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーにより、転写開始頻度を調節することができる。典型的には、多数のプロモーターが、開始部位の下流に機能的要素を含有することが最近示されているが、これらのプロモーター要素は、同様の開始部位の30〜110bp上流の領域に位置する。プロモーター要素間の間隔はフレキシブルであることが多く、その結果、要素が互いに対して入れ替わるか
又は移動する場合にもプロモーター機能は保存され得る。プロモーターによって、個々の要素が、協同的に又は独立して機能し、転写を活性化することができる。適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列であり得る。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルに駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1a(EF-1a)である。しかし、これらに限定されないが、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス前初期プロモーター、Rous肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列を使用してもよい。さらに、誘導性プロモーターも企図される。誘導性プロモーターは、このような発現が望まれる場合に、作動可能に連結することができるポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望まれない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供することができる。誘導性プロモーターの例として、これらに限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。ガンマ-デルタポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトされるか又は感染されると考えられる細胞集団からの発現している細胞の特定及び選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又はその両方を含有することもでき、別の態様では、選択マーカーは別々のDNA片に運ばれ、同時トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方は、適当な調節配列と共に隣接し、宿主細胞における発現を可能としてもよい。有用な選択マーカーとして、例えば、ネオマイシンなどの抗生物質
耐性遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)、eGFP、ルシフェラーゼ、GUSなどが挙げられる。
【０１２２】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性のある細胞を特定するため、及び調節配列の機能性を評価するためにも使用される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含んでもよい。適切な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製するか又は市場で入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小限の5'フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させて、薬剤が、プロモーターに駆動される転写をモジュレートする能力を評価するために使用してもよい。細胞に遺伝子を導入して発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターの文脈で、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞に、当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、電気穿孔などが挙げられる。ベクター及び/又は外因性核酸を含む細胞を製造するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチド導入のための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションであり得る。目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクター及びRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号及び米国特許第5,
585,362号を参照されたい。
【０１２３】
一部の場合には、第1の遺伝子プログラムの終わりのターミネーター配列を使用することができる。ターミネーター配列は、第2のプログラムを開始する前に、転写が終わることを保証することができる。例えば、発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含有することができる。このような配列は、通常、真核生物又はウイルスDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、mRNAの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有することができる。発現ベクターを含む細胞を、in vivo又はin vitroのいずれかで、所望のポリペプチドの発現をもたらす条件下で成長させる。
【０１２４】
一部の場合には、ベクターのポリヌクレオチドによってコードされた第1のポリペプチドの末端で、スペーサー配列を使用することができる。他の場合には、ベクターの第2の遺伝子の末端で、スペーサー配列を使用することができる。スペーサー配列は、ベクターの第1の遺伝子及び第2の遺伝子の後に使用することもできる。
【０１２５】
これらのベクターは、遺伝子によってコードされたポリペプチドポリペプチド、又は目的の遺伝子の部分を発現するために使用することができる。部分の遺伝子又は遺伝子は、任意の方法を使用して、ウイルス又は非ウイルスにより挿入することができる。例えば、方法は、非ウイルスベースの技法であってもよい。
【０１２６】
宿主細胞に外因性核酸を導入するか、又はそうでなければ、細胞を本明細書に記載のポリペプチド構築物に曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えDNA配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施されてもよい。このようなアッセイとして、例えば、当業者に周知の「分子生物学」アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCR; 例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)によって又は本発明の範囲内の薬剤を特定するために本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの有無を検出することなどの「生化学」アッセイが挙げられる。
【０１２７】
一部の場合には、ガンマ-デルタTCRなどの外因性受容体は、細胞集団の割合で発現され得る。例えば、集団における約10%から、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、又は100%の細胞が、ガンマ-デルタTCRを発現してもよい。ガンマ-デルタTCRなどの外因性受容体の発現の測定は、フローサイトメトリー分析によってなされてもよい。
【０１２８】
一部の場合には、ガンマ-デルタTCRをウイルスによらずに導入することができる。ガンマ-デルタTCRをコードするポリヌクレオチドは、DNA又はRNAとして導入することができる。一部の場合には、ガンマ-デルタTCRは、DNAとして導入することができる。他の場合には、ガンマ-デルタTCRはRNAとして導入することができる。ガンマ-デルタTCRは、mRNAとして導入することができる。mRNAは、例えば、電気穿孔によって、細胞に直接導入することができる。電気穿孔のために、CytoPulse技術を利用することができる。CytoPulse技術は、パルス出力電界を使用して、ガンマ-デルタTCRなどの物質の送達のために、生細胞を一過的に透過処理することができる。この技術により、パルス持続期間、強度及びパルス間の間隔の制御を可能とすることができる。最小限の死亡率で、高いトランスフェクション効率に対して理想的な条件とするために、これらのパラメータはすべて改変され得る。一部の場合には、トランスフェクション効率及び/又は細胞生存能を最適化するために、電気穿孔のパルス電圧を変化させてもよい。一部の場合には、トランスフェクション効率及び/又は細胞生存能を最適化するために、電気穿孔のパルス数を変化させてもよい。一部の場合には、トランスフェクション効率及び/又は細胞生存能を最適化するために、電気穿孔に対する開始細胞密度を変化させてもよい。
【０１２９】
したがって、TCR、好ましくは遺伝子操作されたTCRを含むか又は発現する細胞、好ましくはT細胞、より好ましくは遺伝子操作されたT細胞が提供され、前記TCR又は遺伝子操作されたTCRは、以下を含む:
-  CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分であり、前記δT細胞受容体鎖又はその部分が、アミノ酸配列である配列番号3及び配列番号6から237のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるδT細胞受容体鎖又はその部分
-  CDR3領域を含むγΤ-細胞受容体鎖又はその部分であり、アミノ酸配列である配列番号2及び配列番号238から428のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるγΤ-細胞受容体鎖又はその部分。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。
【０１３０】
処置
効果的な養子細胞移入ベースの免疫療法(ACT)は、がん(例えば、転移性がん)患者の処置に有用であり得る。一部の場合には、ACTを利用して、ウイルス感染を処置することもできる。レシピエントの疾患(例えば、がん又はウイルス感染)を処置する方法であって、外因性TCR、例えば、ガンマ-デルタTCRを発現する1つ又は複数の遺伝子操作されたT細胞をレシピエントに移植する工程を含む方法を本明細書に記載することができる。一部の場合には、いくつか例を挙げると、ヒトパピローマウイルス(HPV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、B型肝炎(HBV)及びC型肝炎(HCV)、カポジ肉腫-関連ヘルペスウイルス(KSHV)、ヒトT-リンパ増殖性ウイルス-1(HTLV)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)などによるウイルス感染が、がんをもたらし得る。本明細書に開示される組成物を利用して、前述のウイルス感染のうちのいずれか1つに感染した対象を処置することができる。
【０１３１】
対象の抗HLA-A*24:02により遺伝子操作されたT細胞を医薬組成物に製剤化し、疾患、例えば、がんと診断されたそれを必要とするヒト又は哺乳動物を処置するために使用することができる。対象の抗HLA-A*24により遺伝子操作されたT細胞を医薬組成物に製剤化し、ウイルス感染と診断されたそれを必要とするヒト又は哺乳動物を処置するために使用することができる。これらの薬学的医薬は、1つ又は複数の化学療法剤又は化学療法化合物と一緒に、ヒト又は哺乳動物に同時投与することができる。用語「薬学的医薬」は、用語「医薬組成物」又は「医薬」と置き換えることができる。
【０１３２】
遺伝子操作されたT細胞、例えば、HLA-A*24:02に特異的なγδTCRを発現するように遺伝子操作されたαβT細胞を、当業者に公知の技法を使用して、対象に投与するために製剤化してもよい。遺伝子操作された細胞の集団を含む製剤には、薬学的に許容される賦形剤が含まれてもよい。製剤中に含まれる賦形剤は、例えば、使用されるT細胞の亜集団及び投与方式によって異なる目的を有することとなる。一般的に使用される賦形剤の例として、これらに限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝液及び防腐剤、等張剤、充填剤、及び滑剤が挙げられる。遺伝子操作された細胞の集団を含む製剤をあらゆる非ヒト構成成分、例えば、動物の血清の非存在下で調製及び培養してもよい。製剤は、遺伝子操作された細胞の1つの集団、又は1つより多い、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれより多い遺伝子操作された細胞の集団を含んでもよい。例えば、製剤は、遺伝子操作された細胞の1つの集団、又は1つより多い、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれより多い遺伝子操作された細胞の集団を含んでもよい。例えば、1つより多い外因性受容体が細胞中で発現されてもよい。他の場合には、異なる外因性受容体をそれぞれ発現する細胞の2つの集団を組み合わせて、単一製剤とする。
【０１３３】
本明細書に記載の製剤は、抗酸化剤、金属キレート剤、チオール含有化合物及び他の一般的な安定剤から利益を得てもよい。このような安定剤の例として、これらに限定されないが、(a)約0.5%から約2%w/vのグリセロール、(b)約0.1%から約1%w/vのメチオニン、(c)約0.1%から約2%w/vのモノチオグリセロール、(d)約1mMから約10mMのEDTA、(e)約0.01%から約2%w/vのアスコルビン酸、(f)0.003%から約0.02%w/vのポリソルベート80、(g)0.001%から約0.05%w/vのポリソルベート20、(h)アルギニン、(i)ヘパリン、(j)デキストラン硫酸、(k)シクロデキストリン、(1)多硫酸ペントサン及び他のヘパリノイド、(m)マグネシウム及び亜鉛などの二価のカチオン;又は(n)これらの組合せが挙げられる。
【０１３４】
一部の場合には、結合剤を使用してもよい。結合剤は、粘着性を付与することができ、例えば、アルギン酸及びその塩;セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース(例えば、Methocel(登録商標))、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース(例えば、Klucel(登録商標))、エチルセルロース(例えば、Ethocel(登録商標))、及び微結晶セルロース(例えば、Avicel(登録商標));微結晶デキストロース;アミロース;ケイ酸アルミニウムマグネシウム;多糖酸(polysaccharide acid);ベントナイト;ゼラチン;ポリビニルピロリドン/酢酸ビニル共重合体;クロスポビドン;ポビドン;デンプン;アルファ化デンプン;トラガカント、デキストリン、糖、例えば、ショ糖(例えば、Dipac(登録商標))、グルコース、デキストロース、モラセス、マンニトール、ソルビトール、キシリトール(例えば、Xylitab(登録商標))、及びラクトース;天然又は合成ゴム、例えば、アカシア、トラガカント、ガティガム、イサポール殻(isapol husk)の粘液、ポリビニルピロリドン(例えば、Polyvidone(登録商標)CL、Kollidon(登録商標)CL、Polyplasdone(登録商標)XL-10)、カラマツアラビノガラクタン(larch arabogalactan)、Veegum(登録商標)、ポリエチレングリコール、ロウ、アルギン酸ナトリウムなどを含む。
【０１３５】
「担体」又は「担体材料」として、医薬品において一般的に使用される任意の賦形剤が挙げられ、これらは、本明細書に開示される化合物、例えば、イブルチニブ及び抗がん剤との適合性、並びに所望の剤形の放出プロフィール特性に基づいて選択されるべきである。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。「薬学的に適合性の担体材料」としては、これらに限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン(PVP)、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロース及びセルロースコンジュゲート、糖類  ステアロイルラクチル酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどを挙げられる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版(Easton, Pa.:Mack Publishing Company、1995年);Hoover, John E.、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania  1975年;Liberman, H.A.及びLachman, L.編、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Decker, New York、N.Y.、1980年;及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第7版(Lippincott Williams & Wilkins  1999年)を参照のこと。
【０１３６】
「分散剤」、及び/又は「粘度調整剤」としては、液体媒体又は造粒法若しくはブレンド法によって薬物の拡散及び均質性を制御する材料が挙げられる。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティング又は浸食性マトリックスの有効性を促進する。例示的な拡散促進剤/分散剤としては、例えば、親水性ポリマー、電解質、Tween(登録商標)60若しくは80、PEG、ポリビニルピロリドン(PVP;Plasdone(登録商標)として商業的に公知)、及び炭水化物系分散剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース(例えば、HPC、HPC-SL、及びHPC-L)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(例えば、HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M、及びHPMC K100M)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート(HPMCAS)、非結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール(PVA)、ビニルピロリドン/酢酸ビニル共重合体(S630)、エチレンオキシドとホルムアルデヒドの4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノールポリマー(チロキサポールとしても公知)、ポロキサマー(例えば、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロック共重合体である、Pluronics F68(登録商標)、F88(登録商標)、及びF108(登録商標));及びポロキサミン(例えば、エチレンジアミンへのプロピレンオキシド及びエチレンオキシドの逐次付加から誘導された四官能性ブロック共重合体である、Poloxamine 908(登録商標)としても公知の、Tetronic 908(登録商標)(BASF Corporation、Parsippany、N.J.))、ポリビニルピロリドンK12、ポリビニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、又はポリビニルピロリドンK30、ポリビニルピロリドン/酢酸ビニル共重合体(S-630)、ポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールは約300から約6000、又は約3350から約4000、又は約7000から約5400の分子量を有し得る、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート-80、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えば、トラガカントゴム及びアカシアゴム、グアーゴム、キサンタン(キサンタンゴムを含む)など、糖類、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、ポリソルベート-80、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール(PVA)、アルギネート、キトサン及びこれらの組合せが挙げられる。セルロース又はトリエチルセルロースなどの可塑剤も分散剤として使用され得る。リポソーム分散液及び自己乳化分散液において特に有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール及びミリスチン酸イソプロピルである。
【０１３７】
遺伝子操作された細胞の集団を含む製剤は、当業者に公知の方式及び技法を使用して、対象に投与されてもよい。例示的な方式として、これらに限定されないが、静脈内注射が挙げられる。他の方式として、限定されないが、腫瘍内、皮内、皮下(S.C.、s.q.、sub-Q、Hypo)、筋肉内(i.m.)、腹腔内(i.p.)、動脈内、髄内、心臓内、関節内(関節)、関節滑液嚢内(関節滑液領域)、頭蓋内、脊髄内、及び髄構内(脊髄液)が挙げられる。このような投与を行うために、製剤の輸液剤の腹腔内注射に有用な任意の公知のデバイスを使用することができる。
【０１３８】
一部の場合には、約5×l010個の遺伝子操作されたT細胞を対象に投与することができる。一部の実施形態では、約5×1010個の細胞は、対象に投与された細胞量の中央値を表すことができる。一部の実施形態では、約5×l010個の細胞は、対象における治療応答に影響を及ぼすのに必要である。一部の実施形態では、少なくとも約l×l06個の細胞、少なくとも約2×l06個の細胞、少なくとも約3×l06個の細胞、少なくとも約4×l06個の細胞、少なくとも約5×l06個の細胞、少なくとも約6×l06個の細胞、少なくとも約6×l06個の細胞、少なくとも約8×l06個の細胞、少なくとも約9×l06個の細胞、少なくとも約l×l07個の細胞、少なくとも約2×l07個の細胞、少なくとも約3×l07個の細胞、少なくとも約4×l07個の細胞、少なくとも約5×l07個の細胞、少なくとも約6×l07個の細胞、少なくとも約6×l07個の細胞、少なくとも約8×l07個の細胞、少なくとも約9×l07個の細胞、少なくとも約l×l08個の細胞、少なくとも約2×l08個の細胞、少なくとも約3×l08個の細胞、少なくとも約4×l08個の細胞、少なくとも約5×l08個の細胞、少なくとも約6×l08個の細胞、少なくとも約6×l08個の細胞、少なくとも約8×l08個の細胞、少なくとも約9×l08個の細胞、少なくとも約l×l09個の細胞、少なくとも約2×l09個の細胞、少なくとも約3×l09個の細胞、少なくとも約4×l09個の細胞、少なくとも約5×l09個の細胞、少なくとも約6×l09個の細胞、少なくとも約6×l09個の細胞、少なくとも約8×l09個の細胞、少なくとも約9×l09個の細胞、少なくとも約l×l010個の細胞、少なくとも約2×l010個の細胞、少なくとも約3×l010個の細胞、少なくとも約4×l010個の細胞、少なくとも約5×l010個の細胞、少なくとも約6×l010個の細胞、少なくとも約6×l010個の細胞、少なくとも約8×l010個の細胞、少なくとも約9×l010個の細胞、少なくとも約l×l011個の細胞、少なくとも約2×l011個の細胞、少なくとも約3×l011個の細胞、少なくとも約4×l011個の細胞、少なくとも約5×l011個の細胞、少なくとも約6×l011個の細胞、少なくとも約6×l011個の細胞、少なくとも約8×l011個の細胞、少なくとも約9×l011個の細胞、又は少なくとも約l×l012個の細胞。例えば、約5xl010個の細胞を対象に投与してもよい。別の例では、3×106個の細胞から出発して、細胞は、約5×l010個の細胞まで増殖され、対象に投与されてもよい。一部の場合には、細胞は、療法に対して十分な数まで増殖される。例えば、5×l07個の細胞は急速な増殖を受け、治療用途に対して十分な数を生じることができる。一部の場合では、治療用途に十分な数は、5×l010個であり得る。任意の数の細胞が、治療用途に対して注入され得る。例えば、対象は、l×l06個から5×l012個の間(末端値を含む)の細胞数で注入されてもよい。一部の実施形態では、治療応答に影響を及ぼすのに必要な遺伝子操作された細胞の量を計算することは、ガンマ-デルタTCRが細胞、例えば、アルファ-ベータT細胞のゲノムに組み込まれた細胞の生存能及び/又は効果を含む。一部の実施形態では、対象の治療応答に影響を及ぼすために、対象に投与された細胞は生細胞であってもよい。一部の実施形態では、対象に治療応答をもたらすために、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、少なくとも約70%、少なくとも約65%、少なくとも約60%、少なくとも約55%、少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくと���約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約20%、少なくとも約15%、少なくとも約10%の細胞が生細胞である。一部の実施形態では、対象における治療応答に影響を及ぼすために、対象に投与された細胞は、細胞のゲノムに組み込むことに成功した1つ又は複数の導入遺伝子を有していた細胞であってもよい。一部の実施形態では、対象に治療応答をもたらすために、少なくとも約95%、少なくとも約90%、少なくとも約85%、少なくとも約80%、少なくとも約75%、少なくとも約70%、少なくとも約65%、少なくとも約60%、少なくとも約55%、少なくとも約50%、少なくとも約45%、少なくとも約40%、少なくとも約35%、少なくとも約30%、少なくとも約25%、少なくとも約20%、少なくとも約15%、少なくとも約10%の細胞が、細胞のゲノムに組み込むことに成功した1つ又は複数のTCRを有していた。
【０１３９】
一部の場合には、対象に、外因性ガンマ-デルタTCRを発現する遺伝子操作されたT細胞を投与することができ、ここで、投与することができる外因性ガンマ-デルタTCRを発現する遺伝子操作されたT細胞は、約1から約35日齢であってもよい。例えば、投与された細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、又は最大約40日齢であってもよい。遺伝子操作されたT細胞の年齢は、刺激の時間から検討することができる。遺伝子操作された細胞の年齢は、アフェレーシスの時間から検討することができる。遺伝子操作された細胞の年齢は、形質導入の時間から検討することができる。一部の実施形態では、対象に投与することができる遺伝子操作された細胞は、約10から約14又は約20日齢までである。一部の場合には、遺伝子操作された細胞の「年齢」は、テロメア長によって決定することができる。例えば、「若い」細胞は、「消耗した」又は「老いた」細胞より長いテロメア長を有することができる。特定の理論に拘束される訳ではないが、免疫応答細胞は、培養中、1週間当たり推定約0.8kbのテロメア長を失っており、若い細胞培養物は、約44日齢である免疫応答細胞より約1.4kb長いテロメアを有することができると考えることができる。特定の理論に拘束される訳ではないが、より長いテロメア長が、患者の目的の陽性臨床応答及びin vivoでの細胞の存続に関連し得ると考えられる。
【０１４０】
一部の場合には、細胞は、核酸(例えば、遺伝子又はcDNA)によりトランスフェクトされた対象生物から単離され、再注入により対象に戻される。
【０１４１】
本明細書に開示される方法は、移植する工程を含むことができる。移植は、外因性γδTCRを発現するT細胞を含む細胞生成物の養子移植を指すことができる。移植する工程は、
自家移植すること、同種間移植すること、異種移植すること、又は任意の他の移植することであり得る。例えば、移植する工程は、異種移植することであり得る。移植する工程は、同種間移植することでもあり得る。
【０１４２】
移植前、移植後、及び/又は移植中に、細胞(例えば、遺伝子操作された細胞又は遺伝子操作された初代T細胞)は、機能的であり得る。例えば、移植された細胞は、移植後の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、若しくは100日間又は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、若しくは100日間、機能的であり得る。移植された細胞は、移植後の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12カ月間又は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12カ月間、機能的であり得る。移植された細胞は、移植後の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、若しくは30年間又は少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、若しくは30年間、機能的であり得る。一部の場合には、移植された細胞は、レシピエントの寿命までの間、機能的であり得る。
【０１４３】
さらに、移植された細胞は、それらの正常な意図される機能の100%で機能することができる。正常な意図される機能は、遺伝子操作された細胞を遺伝子操作されていない細胞と比較することによって測定することができる。例えば、IL-2などのサイトカインのレベルは、ELISAアッセイによって検出することができ、遺伝子操作された集団と遺伝子操作されていない集団の間で比較される。移植された細胞は、それらの正常な意図される機能の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、又は最大約100%機能することができる。移植された細胞は、それらの正常な意図される機能の100%を超えて機能することもできる。例えば、移植された細胞は、それらの正常な意図される機能の110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、又は最大約5000%機能することができる。正常な意図される機能を超えて機能する移植された細胞は、一部の場合には、超生理学的レベルのサイトカイン産生を有する場合がある。他の場合には、正常細胞を超えて機能する移植された細胞は、存続又は増殖の増加を有する場合がある。
【０１４４】
移植する工程は、任意のタイプの移植する工程によるものであり得る。部位として、これらに限定されないが、肝被膜下空間、脾臓被膜下空間、腎被膜下空間、大網、胃又は腸粘膜下組織、小腸の血管セグメント、血管嚢、精巣、脳、脾臓、又は角膜を挙げることができる。例えば、移植する工程は、被膜下移植することであり得る。移植する工程は、筋肉内移植することでもあり得る。移植する工程は、門脈内移植することであり得る。一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、腫瘍に直接注射される。
【０１４５】
一部の場合には、対象は、免疫抑制療法を受けてもよい。免疫抑制療法は、細胞生成物の同種間異系の注入を伴ってもよい。他の場合には、細胞生成物、例えば、遺伝子操作されたT細胞の性能を改良するために、免疫抑制を実施してもよい。
【０１４６】
一部の場合には、宿主のリンパ球減少症は、遺伝子操作された細胞の増殖を促進させる場合がある。一方で、リンパ球減少症は、接近する養子移入された細胞に対して「空間」を作出することができ、他方で、それらの恒常的増殖を誘導することができる。後者の効果は、エフェクター細胞の増殖を制限することができる阻害性サイトカイン(例えば、TGF-β及びIL-10)を通常分泌することができる内因性調節T細胞、例えば、遺伝子操作されたT細胞の化学療法による除去を介して媒介され得る傾向にある。一部の場合には、リンパ球低減処置により、リンパ球低減処置なしの遺伝子操作された細胞による処置に対して、約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、又は最大20倍まで、in vivoで遺伝子操作されたT細胞の増殖を改良することができる。
【０１４７】
さらに、普通は、制限量で存在する場合がある、IL-7及びIL-15などのT細胞成長恒常性サイトカインは、リンパ球新生間質細胞による低い競合及び産生の増加により、容易に利用可能となり得る。したがって、遺伝子操作された細胞生成物の注入前のリンパ球低減の誘導は、対象の処置における遺伝子操作された細胞の効果を増加させるために実施されてもよい。一部の場合には、リンパ球低減処置は、腫瘍低減により測定された場合の抗腫瘍効果を改善するか又はリンパ球低減処置なしの処置に対して約10%から約100%まで制御する可能性がある。例えば、リンパ球低減処置は、リンパ球低減処置なしの処置に対して、約10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%まで、抗腫瘍効果を改善する場合がある。
【０１４８】
抗HLA-A*24細胞は、細胞傷害性/抗腫瘍剤及び抗血管新生剤を含む、他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。
【０１４９】
一部の場合には、γδT細胞とそれらの細胞リガンドの間の相互作用の妨害を使用して、炎症性脱髄性疾患を診断及びモジュレートすることができる(Chienら、2005年、US2005/0255105を参照のこと)。細胞リガンドは、非古典的及び古典的MHC分子の両方、非タンパク質リガンドなどを含むことができる。γδT細胞とHLA-A*24発現細胞などの標的の間の相互作用を崩壊させて、毒性に関連する処置を低減する方法が本明細書に記載され得る。一部の場合には、本明細書に記載の組成物で処置した対象は、毒性を発揮する場合がある。対象に投与された遺伝子操作された細胞を抑止及び排除するための複数のモダリティが存在する。例えば、一部の場合には、抗体は導入され、遺伝子操作された細胞に結合してもよい。抗体は、投与後に、ポリペプチド構築物の結合を阻害することができる。例えば、処置に関連する毒性を低減するために与えられる抗体は、中和抗体又は遮断抗体であってもよい。他の場合には、「自殺」又は「排除」遺伝子により修飾された細胞の非特異的免疫抑制又は選択的枯渇は、処置関連毒性を抑止するために実施することができる。例えば、抗HLA-A*24をコードするポリ核酸は、誘導性Fas又はカスパーゼ9などの自殺遺伝子をコードしてもよい。毒性を低減する方法は、抗体又はその部分を投与する工程を含むことができる。他の場合には、抗体は、細胞上でγδTCRに結合し、その細胞の標的に対する結合を阻害してもよい。例えば、疾患又は感染は、細胞受容体、例えば、FE11又はFE11様受容体に結合することができる抗体又はその部分の投与によって処置することができる。一部の場合には、抗体の受容体に対する結合は、受容体を中和するか又は遮断することができ、受容体のそのリガンド結合に関連する毒性を妨げる可能性がある。一部の場合には、対象における毒性は、サイトカイン放出症候群(CRS)B細胞形成不全、及び腫瘍崩壊症候群(TLS)のうちの少なくとも1つであり得る。CRSは、T細胞の生着及び増殖に関連する、IL-10、IL-6、及びIFN-γなどのサイトカイン上昇により生じる炎症症状のレベルによって決定することができる。ほとんどの対象では、CRS症状は穏やかで、発熱及び筋肉痛を伴うインフルエンザ様である。しかし、一部の対象は、多臓器システム不全、及び
死をもたらす、血管漏出、低血圧、肺水腫、及び凝固障害を含む重篤な炎症症候群を経験し得る。一部の場合には、CRSを有する対象は、IL-6が増加していてもよい。一部の場合には、抗IL-6処置が投与されてもよい。
【０１５０】
外因性γδTCRを発現する遺伝子操作されたT細胞の投与など、養子免疫療法の効果は、複数のモダリティを使用して評価することができる。効果は、腫瘍、例えば、HLA-A*24陽性腫瘍が制御されるか、低減されるか、又は排除される程度であり得る抗腫瘍効果を指すことができる。処置効果は、遺伝子操作された細胞の増殖、持続、腫瘍標的化、及びこれらの任意の組合せも指すことができる。
【０１５１】
養子細胞療法、例えば、抗HLA-A*24T細胞療法を投与することができる対象は、注入中、注入の直後、又は注入の最大数年後まで評価され得る。例えば、処置された対象は、約1日から対象の人生の長さまでの期間、評価のためにクリニックに戻ることができる。処置した対象は、遺伝子操作された細胞生成物の最初の投与の1から、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、又は90年後まで評価され得る。一部の場合には、評価スケジュールは、毎日のモニタリング、毎週のモニタリング、毎月のモニタリング、又は毎年のモニタリングを含むことができる。一部の場合には、対象は、臨床的に指示された場合、より頻繁に観察され得る。評価は、身体検査、化学評価、全血球数、甲状腺パネル、毒性評価、身体領域のコンピュータ断層撮影(CT)スキャン、アフェレーシス、及びこれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１５２】
一部の場合には、アフェレーシスは、遺伝子操作された細胞の輸液剤の投与前と約1から約10週後に実施されてよい。他の時点では、Ficoll勾配での遠心分離を使用する精製によって、対象の末梢血リンパ球(PBL)を全血から得ることができる。細胞機能の免疫学的モニタリングのために、末梢血単核球(PBMC)のアリコートを凍結保存することができる。一部の場合には、様々な試験は、特定の溶解及びサイトカイン放出の評価、メタボローム及び生体エネルギー論の研究(Seahorseを使用する)、サイトカイン産生の細胞内FACS、ELISA-スポットアッセイを含むことができ、リンパ球サブセット分析を使用して、遺伝子操作された細胞性生物の免疫学的相関を評価してもよい。一般的に、これらのアッセイにおける約2から約3倍の差が、真の生物学的差を示している可能性がある。一部の場合には、遺伝子操作された細胞を遺伝子操作されていない細胞と比較した場合に、in vitroアッセイの活性の約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、最大約5倍の差が、処置効果を示す可能性がある。
【０１５３】
一部の場合には、遺伝子操作されたT細胞を利用した養子免疫療法は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン又はMRIにより測定された場合、腫瘍サイズを少なくとも30%低減することができる。遺伝子操作された細胞による処置は、腫瘍サイズを、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は最大約100%低減することができる。遺伝子操作された細胞による処置は、CTスキャンにより測定された場合、腫瘍を排除することができる。一部の場合には、抗HLA-A*24:02免疫応答細胞による処置は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させることができる。例えば、腫瘍は、抗HLA-A*24:02免疫応答細胞の投与後、サイズを拡大しない可能性がある。一部の場合には、安定化は、処置前の測定値と比較して、腫瘍サイズの10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、又は1%未満の変化とみなされてもよい。
【０１５４】
一部の場合には、抗HLA-A*24:02免疫応答細胞の効果は、対象の生存時間に関して考慮され得る。例えば、抗HLA-A24免疫応答細胞、例えば、抗HLA-A24:02 T細胞で処置される対象は、未処置の対象又は異なる療法で処置された対象よりも長く生存することができる。
【０１５５】
処置応答は、固形がんの治療効果判定のための(RECIST)新ガイドライン(the revised Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST)guideline)(第1.1版)によって提唱される国際基準を使用して評価することができる。腫瘍病変の最大直径(1次元の測定値)及び悪性リンパ節の場合の最小直径の変化は、RECIST基準で使用することができる。例えば、測定可能な病変は、臨床検査により胸部レントゲンで>20mmとして、CTスキャンで>10mmとして、又はカリパスで>10mmとして、少なくとも1つの寸法(記録される最大直径)で正確に測定され得る病変として定義されたものであり得る。病理学的に肥大し、測定可能であるとみなされるために、リンパ節は、CTスキャンで評価した場合、短軸で>15mmであり得る。小さな病変(最大直径が<10mm又は短軸が≧10から<15mmの病理学的リンパ節)を含む他の病変はすべて(又は疾患の部位）、測定不能な疾患とみなすことができる。骨病変、軟膜の疾患、腹水、胸水/心膜液貯留、皮膚/肺リンパ管炎、炎症性乳房疾患は、測定不能とみなされ得る。
【０１５６】
すべての関与する器官を代表して、最大で器官当たり2つの病変及び合計5つの病変までのすべての測定可能な病変は、標的病変として特定され、記録され、ベースラインで測定され得る。標的病変は、それらのサイズ(病変の最大直径)に基づいて選択され、すべての関与する器官の代表であり得るが、さらに、それらに再生可能な反復計測値を与えるものであるべきである。時折、最大病変は、再生可能に測定され得る次の最大病変が選択されるべき状況で、それ自体に再生可能な測定値を与えない場合であってもよい。すべての病変に対する直径(非結節性病変に対して最大、結節性病変に対して短軸)の合計は、ベースライン合計直径として計算及び報告され得る。リンパ節が合計に含まれるべきである場合には、短軸のみを合計に加えることができる。ベースライン合計直径は、疾患の測定可能寸法における任意の目的の腫瘍退縮をさらに特徴付ける基準として使用されることとなる。
【０１５７】
一部の場合には、臨床病変は、カリパスを使用して評価した場合に、表層(例えば、皮膚結節及び蝕知可能なリンパ節)にあり、直径が約10mmである場合に測定可能とみなすことができる。病変を測定するためにカリパスを使用できない場合、CTスキャン又はMRIを使用することもできる。一部の場合には、CTスキャンによって、約5mm又はそれより薄い組織スライスを得ることができる。CTスキャンは、一部の場合には、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm又は0.5mmのスキャン厚さを有することができる。CTスキャンが5mmより大きなスライス厚さを有する場合、測定可能な病変に対する最小サイズは、スライス厚さの2倍であり得る。一部の場合には、対象を評価するためにMRIを実施することもできる。理想的には、処置効果を決定する場合、同じタイプのスキャナーが使用されるべきであり、画像獲得プロトコールはスキャン前と可能な限り近接して続けるべきである。体のスキャンは、可能であれば、息止めスキャン技法により実施すべきである。一部の場合には、フルオロデオキシグルコース(FDG)-ポジトロン断層撮影(PET)を使用して処置効果を測定することができる。
【０１５８】
対象を評価したら、標的病変を安定疾患(SD)、進行性疾患(PD)、部分応答(PR)、及び/又は完全応答(CR)に群分けすることができる。SDは、PRと認定するのに十分な収縮もPDと認定するのに十分な増加をないとみなされ、基準として、最小の直径の合計を得ることができる。PDは、標的病変の直径の合計の少なくとも20%の増加と考えられ、基準として最小の合計を得ることができる(最小である場合、これはベースラインの合計を含むことができる)。一部の場合には、約20%の相対的増加に加えて、合計は、少なくとも約5mmの絶対増加も実証しなければならない。PRは、標的病変の直径の合計が少なくとも約30%低下し、基準として、直径のベースラインの合計を得ることができる。CRは、標的病変の排除であり得る。
【０１５９】
キット
本明細書に記載のポリペプチド構築物の組成物を含むキットが本明細書に開示され得る。がん、病原体感染、免疫障害の処置又は防止のためのキットも本明細書に開示され得る。本明細書に記載の組成物を含むキットを使用して、幹細胞又は実質臓器移植を受けた対象を処置することができる。一実施形態では、キットは、単位剤形に、有効量のガンマ-デルタT細胞の組成物を含有する治療又は予防組成物を含むことができる。一部の実施形態では、キットは、ガンマ-デルタT細胞の治療組成物を含有してもよい滅菌容器を含み、このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当技術分野で公知の他の適切な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬を保持するのに適切な他の材料から作製され得る。一部の場合には、ガンマ-デルタT細胞は、がん、病原体感染、免疫障害又は同種間移植を有するか又は発症するリスクを有する対象に細胞を投与するための使用説明書と共に提供することができる。使用説明書は、一般的に、がん、病原体感染、免疫障害の処置又は防止のための組成物の使用についての情報を含むことができる。一部の場合には、キットは、約1×104個の細胞から約1×1012個の細胞を含むことができる。一部の場合には、キットは、少なくとも約l×105個の細胞、少なくとも約l×106個の細胞、少なくとも約l×107個の細胞、少なくとも約4×107個の細胞、少なくとも約5×107個の細胞、少なくとも約6×107個の細胞、少なくとも約6×107個の細胞、少なくとも約8×107個の細胞、少なくとも約9×107個の細胞、少なくとも約l×108個の細胞、少なくとも約2×108個の細胞、少なくとも約3×108個の細胞、少なくとも約4×108個の細胞、少なくとも約5×108個の細胞、少なくとも約6×108個の細胞、少なくとも約6×108個の細胞、少なくとも約8×108個の細胞、少なくとも約9×108個の細胞、少なくとも約l×109個の細胞、少なくとも約2×109個の細胞、少なくとも約3×109個の細胞、少なくとも約4×109個の細胞、少なくとも約5×109個の細胞、少なくとも約6×109個の細胞、少なくとも約6×109個の細胞、少なくとも約8×109個の細胞、少なくとも約9×109個の細胞、少なくとも約l×1010個の細胞、少なくとも約2×1010個の細胞、少なくとも約3×1010個の細胞、少なくとも約4×1010個の細胞、少なくとも約5×1010個の細胞、少なくとも約6×1010個の細胞、少なくとも約6×1010個の細胞、少なくとも約8×1010個の細胞、少なくとも約9×1010個の細胞、少なくとも約l×10個の細胞、少なくとも約2×1011個の細胞、少なくとも約3×1011個の細胞、少なくとも約4×1011個の細胞、少なくとも約5×1011個の細胞、少なくとも約6×1011個の細胞、少なくとも約6×1011個の細胞、少なくとも約8×1011個の細胞、少なくとも約9×1011個の細胞、又は少なくとも約l×1012個の細胞を含むことができる。例えば、約5×1010個の細胞がキットに含まれてもよい。別の例では、キットは、3×106個の細胞を含んでもよく、細胞は、約5×1010個の細胞まで増殖され、対象に投与されてもよい。
【０１６０】
一部の場合には、キットは、同種間異系細胞を含んでもよい。一部の場合には、キットは、ゲノム修飾を含む可能性のある細胞を含んでもよい。一部の場合には、キットは、「既製の」細胞を含んでもよい。一部の場合には、キットは、臨床用途のために増殖される可能性のある細胞を含んでもよい。一部の場合には、キットは、調査目的の内容物を含有してもよい。
【０１６１】
一部の場合には、使用説明書は以下のうちの少なくとも1つを含む:治療剤についての説明;新生物、病原体感染、免疫障害若しくはその症状の処置若しくは防止のための投薬スケジュール及び投与;用法注意;警告;指示;カウンターインディケーション;過量服用情報;有害反応;動物薬理学;臨床研究;及び/又は参照。使用説明書は、容器(存在する場合)に直接印刷されるか、又はラベルとして容器に適用されるか、又は個別のシート、パンフレット、カード、若しくはホルダーとして容器内若しくは容器と共に供給されてもよい。一部の場合には、使用説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9,10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は最大2日、3日、4日、5日、6日、又は7日後にガンマ-デルタT細胞を投与するための手順を提供する。一部の場合には、使用説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも24時間後にガンマ-デルタT細胞を投与するための手順を提供する。遺伝子操作されたT細胞は、静脈内注射用に製剤化することができる。遺伝子操作されたT細胞は、輸液剤用に製剤化することができる。一部の場合には、キットは、小児の投薬量の製品を含有してもよい。
【実施例】
【０１６２】
本発明は、以下の実験的実施例を参照してさらに詳細に説明される。これらの実施例は、例証のみを目的として提供され、他に特定されていなければ、制限することを意図するものではない。したがって、本発明は、いかなるようにも、以下の実施例に制限されるものとして解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなる任意及びすべての変形を包含するものとして解釈されるべきである。
【０１６３】
(実施例1)
レトロウイルス上清の生成及び確認
偽型の一過的な上清を生成するために、γδTCR導入遺伝子をコードするベクターを有するPhoenix Eco細胞株(American Type Culture Collection SD3444)を使用して、PG13細胞(テナガザル白血病ウイルスシュードタイピングパッケージング細胞株;American Type Culture Collection CRL-10686)を形質導入する。γδTCR導入遺伝子は、イディオタイプ抗体による形質導入したPG13細胞でのFACS分析によって検出される。単細胞クローニングの後、各ベクターに対する高力価のクローンを使用してマスター細胞バンクを確立する。臨床用途のためのクローンを安全性試験及びベクターシークエンシングの後にのみ放出し、複製-コンピテントレトロウイルスが生産されないことを確認する。最終のウイルス上清を-80℃で保存し、臨床放出前に試験する。ウイルス力価は、1ml当たり6×105から1.6×106個のウイルス粒子の範囲である。
【０１６４】
(実施例2)
外因性γδTCRを発現するための細胞の形質導入
LeukoPak由来の末梢血単核球(PBMC)の単離
正常な末梢血から採取したLeukoPaksを本発明において使用した。血液細胞を冷却したIX PBSで3倍に希釈した。希釈した血液を50mlのコニカル中の15mLのLYMPHOPREP(Stem Cell Technologies)に対して滴下添加した。細胞を400×Gで休みなく25分間スピンさせた。バフィーコートをゆっくりと除去し、滅菌コニカルに移した。細胞を冷却した1×PBSで洗浄し、400×Gで10分間スピンさせた。上清を除去し、培地に再懸濁させた細胞を計数し、凍結培地(45mLの熱により不活性化したFBS及び5mLのDMSO)中に生きたまま凍結させた。
【０１６５】
CD3+T細胞の単離
PBMCを解凍し、培養培地(RPMI-1640(フェノールレッドを含まない)、20%のFBS(熱による不活性化)、及びIX Gluta-MAX)中に1〜2時間置いた。細胞を採取し、計測し、細胞密度を1mL当たり5×107個に調整し、滅菌した14mLのポリスチレン丸底チューブに移した。EasySep Human CD3 cell Isolation Kit(Stem Cell Technologies)を使用して、50uL/mLの単離カクテルを細胞に添加した。混合物をピペッティングによって混合し、室温で5分間インキュベートした。インキュベーション後、RapidSpheresを30秒間ボルテックスし、50uL/mLで試料に添加し、ピペッティングによって混合した。4mL未満の試料に対して5mLまで混合物を満たすか又は4mL未満の試料に対して10mLまで混合物を満たした。滅菌ポリスチレンチューブを「Big Easy」マグネットに加え、室温で3分間インキュベートした。マグネットとチューブは、1回の連続動作で、反転させ、濃縮細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに注いだ。
【０１６６】
CD3+T細胞の活性化及び刺激
単離したCD3+T細胞を計数し、24ウェルのプレートに1mL当たり2×106個の細胞密度でプレートアウトした。0.2%のBSAを含む1×PBSで洗浄した後、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 beads(Gibco、Life Technologies)をダイナマグネットを使用して、3:1(ビーズ:細胞)で細胞に添加した。IL-2(Peprotech)を300IU/mLの濃度で添加した。細胞を48時間インキュベートし、次いで、ビーズをダイナマグネットを使用して除去した。細胞を、電気穿孔又はヌクレオフェクション前に、さらに6〜12時間培養した。
【０１６７】
CD3+T細胞のレトロウイルスによる形質導入
刺激したT細胞を、組換えフィブロネクチン断片(FN CH-296、Retronectin Takara)で予めコーティングした24ウェルプレートで3日目までに形質導入する。レトロウイルスによる形質導入後、T細胞を、OKT3抗体によるさらなる刺激を加えずに、毎週2回添加したrhIL-2(50〜100U/ml)の存在下で、ex vivoで増殖させる。
【０１６８】
【表２】
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【０１６９】
(実施例3)
免疫表現型検査
γδ修飾Tリンパ球を、CD3、CD4、CD8、CD62L、CD45RA、CD45RO、CCR7、及びCD28(Becton Dickinson)に対して、モノクローナル抗体で染色する。本発明者らは、4つの蛍光シグナルに対するフィルターセットを備えたFACScan Flow Cytometer(Becton Dickinson)を使用して細胞を分析した。
【０１７０】
(実施例4)
細胞傷害性アッセイ
標的腫瘍細胞を回収し、37℃で60分間50μCi Na251 CrO4で標識し、3回洗浄し、96ウェルのU底マイクロタイタープレートにおける10%のFBSを補充した最終体積が150μlのIMDM中の種々の数のエフェクター抗FE11 γδ修飾Tリンパ球に添加する。FE11-K562(陽性対照)及びK562(陰性対照)を発現する腫瘍細胞を使用する。37℃及び5%のCO2での標的細胞及びエフェクター細胞の4又は8時間のインキュベーション後に、25μlの上清を回収し、ルミネセンスカウンター(Topcount-NXT;Packard Instrument Co.)で測定する。三連のウェルの特異的溶解の平均パーセンテージを以下のように計算した：特異的溶解=[(実験による放出-自発的放出)/(最大放出-自発的放出)]×100。
【０１７１】
(実施例5)
増殖アッセイ
標的細胞(FE11-K562、FE11+)又は対照細胞(K562、FE11-)に曝露した後に、抗FE11 T細胞の増殖をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル希釈アッセイによって決定する。
【０１７２】
形質導入の1週間後に、対照のTリンパ球と抗FE11αβT細胞を1.5μmol/Lのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE;Invitrogen)で標識し、エフェクター対標的(E:T)比5:1で照射した腫瘍標的(FE11-K562及びK562)でプレーティングする。CFSE希釈を、共培養の4日目に、フローサイトメトリーによって、CD4+及びCD8+T細胞に関して測定する。
【０１７３】
(実施例6)
本明細書に記載のHLA立体構造に結合するポリペプチド構築物を含むT細胞クローンの生成
バルクγδT細胞を、TCRγ/δ＋T Cell Isolation MACS Kit(Miltenyi Biotec)を使用して、健常ドナーのPBMCから単離し、以前に記載した急速増殖プロトコール(Riddell SR、Greenberg PD. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. J Immunol Methods.1990年;128(2):189〜201頁)を使用して増殖させた。簡潔には、γδT細胞を1μg/mlのPHA-L(Sigma-Aldrich)、50U/mlのIL-2(Novartis Pharma)、5ng/mlのIL-15(R&D Systems)、並びに放射線照射した同種間異系PBMC、Daudi及びEBV-LCLで2週間刺激した。新鮮なIL-2を週に2回添加した。γδT細胞のクローンを、限界希釈によって、バルクγδT細胞から生成し、急速増殖プロトコールを使用して2週間ごとに増殖させた。
【０１７４】
本明細書に記載のγδTCRのクローニング
所望のγδT細胞のクローンの全RNAをNucleospin RNA-IIキット(Macherey-Nagel)を使用して単離し、SuperScript-II逆転写酵素(Invitrogen)を使用して逆転写した。TCRのγ及びδ鎖を、Vδ1(5'-GATCAAGTGTGGCCCAGAAG-3')(配列番号429)及びVγ2-5(5'-CTGCCAGTCAGAAATCTTCC-3')(配列番号430)センスプライマー、並びにCδ(5'-TTCACCAGACAAGCGACA-3')(配列番号431)及びCγ(5'-GGGGAAACATCTGCATCA-3')(配列番号432)アンチセンスプライマーを使用して、PCRによって増幅させた。PCR産物をシークエンシングし、次に、所望のγδTCRのコドン最適化配列をGeneart(登録商標)(Life Technologies)によって合成し、レトロウイルスpBulletベクターにサブクローニングした。
【０１７５】
TCR及びHLAのレトロウイルスによる形質導入
本明細書に記載のVγ5Vδ1-TCRのクローンとHLA-A*0201拘束WT1 126-134-特異的αβTCRをαβT細胞に形質導入した。簡潔には、Phoenix-Amphoのパッケージング細胞を、Fugene-HD(Promega)を使用して、TCRγ/β鎖-IRESネオマイシン又はTCRδ/α鎖-IRESピューロマイシンを含有するgag-pol(pHIT60)、env(pCOLT-GALV)及びpBulletレトロウイルス構築物でトランスフェクトした。α-CD3(30ng/ml)(クローンOKT3、Janssen-Cilag)及びIL-2(50U/ml)により予め活性化したPBMCを、50U/mlのIL-2及び4μg/mlのポリブレン(Sigma-Aldrich)の存在下で、48時間以内にウイルス上清で2回形質導入した。形質導入したT細胞を、α-CD3/CD28 Dynabeads(106個の細胞に対して0.5×106個のビーズ)(Invitrogen)とIL-2(50U/ml)による刺激によって増殖させ、800μg/mlのゲネチシン(Gibco)と5μg/mlのピューロマイシン(Sigma-Aldrich)で1週間選択した。CD4+TCRを形質導入したT細胞を、CD4-マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)を使用するMACS選別により単離した。形質導入の後、形質導入したT細胞を1μg/mlのPHA-L(Sigma-Aldrich)、50U/mlのIL-2(Novartis Pharma)、5ng/mlのIL-15(R&D Systems)、並びに放射線照射した同種間異系PBMCs、Daudi及びLCL-TM細胞で2週間ごとに刺激した。新鮮なIL-2を週に2回添加した。支持される場合、CD4+、CD8+、CD4+CD8αα+及びCD4+CD8αβ+TCR-形質導入T細胞を>99%の純度に対して、FACSAria II(BD)フローサイトメトリーを使用して選別した。選択後、TCR-形質導入T細胞を、急速増殖プロトコールを使用して2週間ごとに刺激した。CD8α変異体の発現レベルを2種の異なる抗CD8α抗体のクローン(クローンRPA-T8及びG42-8)を使用して、フローサイトメトリーによって測定した。トランスジェニックTCR発現及びCD4+集団の純度を、フローサイトメトリーによって、日常的に評価した。
【０１７６】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーに使用される抗体は以下を含んだ:γδTCR-PE(クローンIMMU510、Beckman Coulter)、CD4-PE-Cy7(クローンRPA-T4、BD)、CD8α-APC(クローンRPA-T8、BD)、CD8α-PerCP-Cy5.5(クローンRPA-T8、Biolegend)、CD8α-FITC(クローンG42-8、BD)、及びCD8αβ-PE(クローン2ST8.5H7、BD)。NY-ESOl(HLA-A*02:0 SLLMWITQV)(配列番号433)R-PEで標識したPro5 MHC Pentamer(Proimmune)及びCMV(HLA-A*24:02 QYDPVAALF)(配列番号434)R-PEで標識したPro5 MHC Pentamer(Proimmune)を、製造業者の使用説明書に従って使用した。試料をFACSCanto-II及びLSRFortessaサイトメーター(BD)によって測定し、FACSDiva software(BD)で分析した。
【０１７７】
(実施例7)
HLAモノクローナル抗体の生成
モノクローナル抗体(mAb)を、脾臓細胞の標準的融合を実施してハイブリドーマを生成した後、SW480及びLCL-TMによるC57BL/6マウスの免疫化によって生成した。モノクローナル性は、アイソタイプ決定を、α-mIgG1 APC(Pierce)、α-mIgG2b RPE(Jackson)、α-mIgG2c dylight 405(Jackson)、及びα-mIgG3 PerCP(Jackson)を使用するフローサイトメトリーによって決定した後、2倍の限界希釈によるクローニングによって達成した。mAb産生として、ハイブリドーマのものを、無血清ハイブリドーマ培地中で1週間、1mL当たり約5×105から約8×105個の細胞で培養した。mAbを、製造業者の使用説明書に従って、プロテインG HP SpinTrapカラム(GE healthcare)を使用して精製した。
【０１７８】
タンパク質の分離及び消化
試料を4〜12%のBis-Tris ID SDS-PAGEゲル(BioRad)に2.5時間ランし、コロイド状クマジー色素G-250(Gel Code Blue Stain Reagent、 Thermo Scientific)で染色した。レーンを3つのバンドとして切り出し、還元のために6.5mMのジチオトレイトール(DTT)を用いて60℃で1時間、アルカリ化のために54mMのヨードアセトアミドを用いて30分間処理した。タンパク質を、トリプシン(Promega)を用いて37℃で終夜消化した。ペプチドを100%のアセトニトリルで抽出し、真空濃縮器で乾燥させた。
【０１７９】
質量分析:RP-nanoLC-MS/MS
試料を10%のギ酸中で再構築し、Reprosil pur C18トラップカラム(100μm×2cm、 3μm)及びPoroshell 120 EC C18(Agilent Technologies)分析カラム(75μm×50cm、2.7μm)を備えた逆相(C18)で操作するAgilent 1290 Infinity System(Agilent Technologies)に連結したOrbitrap Q-Exactive Plus(ThermoFisher Scientific、Bremen)上のnano-LC-MS/MSによって分析した。100%の溶媒A(H2O中0.1%のFA)で10分間トラッピングした後、13%から40%で35分、40%から100%で3分の溶媒B(0.1%のFA、80%のACN)からなる段階勾配でペプチドを溶出した。Q-Exactive Plusを以下の設定を使用するデータ依存型獲得モードで操作した: 35 000解像度でフルスキャン自動利得制御(AGC)標的3e6;スキャン範囲375〜1600m/z;Orbitrapフルスキャン最大注入時間10ms; 17 500解像度でのMS2スキャンAGC標的5e4;最大注入 120ms;正規化した衝突エネルギー25;動的除外時間10秒;単離窓1.5mz;フルスキャン当たり10 MS2スキャン。
【０１８０】
質量分析のデータ解析
生のファイルをProteome Discoverer 1.4(バージョン1.4.1.14、ThermoScientific、Bremen、Germany)を使用して処理した。試料当たり3つのバンドの生ファイルを、Uniprotデータベース(Homo Sapiens、2015年4月)に対して、1回の検索で組み合わせた。以下のパラメータを使用した:システインのカルバミドメチル化を固定修飾として設定し、メチオニンの酸化を可変修飾として設定した。トリプシンを酵素として特定し、最大2回のミス切断を許容した。偽陽性率0.01を使用した。Proteome Discovererによって処理したデータセットをContaminant Repository for Affinity Purification(CRAPome)に提出し、特定したタンパク質をSignificance Analysis of INTeractome(SAINT)スコア、及び倍数変化スコアFC-A又はFC-Bによって選別した。使用した対照は、核細胞株の非特異的抗体で実施した対照免疫沈降から得た。SAINT確率が0.9より高いタンパク質をスコアの高い相互作用とみなした。最良の相互作用の最終的選択は、特異的抗体に対する細胞株の公知の応答に基づいた(Mellacheruvu D、 Wright Z、 Couzens AL、 Lambert JP、 St-Denis NA、 Li Tら  The CRAPome:a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods.  2013年;10(8):730〜6頁)。
【０１８１】
(実施例8)
抗HLA-A*24:02により遺伝子操作されたαβT細胞の臨床的増殖
多数の形質導入されたT細胞を生成するために、急速増殖プロトコール(REP)を使用して増殖させるために細胞を誘導する。REPで使用する前に、T細胞は、抗CD3、抗CD28及びIL-2共に培養を開始し、上記で詳述したように、培養開始の2日後に形質導入する。細胞を75cm2のフラスコ中で37℃及び5%CO2で培養する。細胞を計数し、細胞の培養が保たれる時間を確認するために、2日ごとに、300IU/mLのIL-2を含む新鮮なT細胞培地中に、1mL当たり0.5×106個の濃度で懸濁する。
【０１８２】
(実施例9)
ELISPOTアッセイ
αβT細胞により再確立した腫瘍細胞認識における本明細書に記載のγδTCRの導入
腫瘍細胞によって特異的に誘発される抗原特異的応答を分析するために、γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞又は疑似形質導入されたT細胞を、ELISPOTアッセイによって、DAUDI、SW480、EBV-LCL、又はPBMC細胞に対して特異的なIFN-γ放出について、最初に試験した。簡潔には、15、000個のFE11 TCRにより形質導入したT細胞又は疑似形質導入されたT細胞及び50,000個の標的細胞(比0.3:1)を、α-IFNγ抗体(クローン1-DlK)(Mabtech)で予めコーティングしたニトロセルロース底の96ウェルプレート(Millipore)中で18時間共培養した。プレートを洗浄し、第2のビオチン化抗IFNγ抗体(クローン7-B6-1)(Mabtech)、続いて、ストレプトアビジン-HRP(Mabtech)と共にインキュベートした。IFNγスポットをTMB基質(Sanquin)で可視化し、スポット数をELISPOT Analysis Software(Aelvis)を使用して定量した。腫瘍細胞とのインキュベーション後、γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞は、抗原特異的方式で、多量のIFN-γサイトカインを分泌した、図1A及び図1B。結果は、γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞が、特異的方式で腫瘍細胞を殺傷することができることを示唆する。
【０１８３】
WT1 αβTCRにより形質導入したT細胞を試験するために、HLA-A2+細胞株T2、SW480及びK562 HLA-A*02:01を10μΜのWT1 126-134(RMFPNAPYL)(配列番号435)ペプチドでパルス刺激した。
【０１８４】
HLA-A*24:02に依存する腫瘍細胞認識
腫瘍細胞によって特異的に誘発されるHLA-A*24:02特異的応答を分析するために、γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞を、ELISPOTアッセイにより、LCL-TM、DAUDI、U266 OPM2又はSW480に対して特異的なIFN-γ放出について試験した。腫瘍細胞とのインキュベーション後、γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞は、HLA-A*24:02に特異的な方式で、大量のIFN-γサイトカインを分泌した、図2及び表3。結果は、γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞がHLA-A*24:02陽性腫瘍細胞を殺傷することができることを示唆する。
【０１８５】
【表３】
2019525898.tif 000007
【０１８６】
(実施例10)
ELISAアッセイ
アクチン重合の遮断は、COS7 HLA-A *24:02標的細胞認識を遮断する
標的腫瘍細胞の認識が腫瘍細胞表面のHLA-A*24:02のクラスター形成により媒介されるかどうかを評価するために、アクチン重合遮断アッセイを実施した。腫瘍細胞COS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT及びPBMCを、γδTCR-FE11とのインキュベーションの前に、広く使用されたアクチン動態の阻害剤であるサイトカラシン D(CytoD)で処理した。結果は、アクチン重合の遮断が、γδTCR-FE11によるCOS7の認識を遮断することを示す、図3A及び図3B。
【０１８７】
標的細胞のパラホルムアルデヒド固定が認識を阻害する
標的腫瘍細胞の認識が腫瘍細胞表面のHLA-A*24:02のクラスター形成により媒介されるかどうかを評価するために、共培養アッセイの前に、腫瘍細胞のパラホルムアルデヒド固定を実施した。腫瘍細胞COS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT及びPBMCを、γδTCR-FE11とのインキュベーションの前に、パラホルムアルデヒドで処理した。結果は、γδTCR-FE11との共培養前の腫瘍細胞の固定がγδTCR-FE11による認識を阻害することを示す、図4A及び図4B。
【０１８８】
(実施例11)
本明細書に記載のポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞の臨床投与及び評価
評価されるがんを有する患者は、末梢血単核球を単離するためにアフェレーシスを受ける。リンパ球を単離し、本明細書に記載のTCRを含むポリペプチド構築物をウイルスにより形質導入し、増殖し、免疫学的試験のためにアリコートを得る。T細胞投与の7及び6日前に、患者は、予備レジメン、すなわち、1時間にわたり、60mg/kg日×2日のシクロホスファミドのIVを受ける。細胞投与の7及び3日前に、患者は、予備レジメン、すなわち、30分にわたり、25mg/m2/日のフルダラビンのIVPBを毎日5日間受ける。準備レジメンの間、患者は、全血球計算(CBC)試験を毎日受ける。
【０１８９】
第I相試験の第１部では、1群当たり1人の患者を利用して、患者当たり109個の遺伝子操作されたT細胞で出発する、用量漸増を開始する。個々の患者を半対数増分で処理する。したがって、以下の用量を利用することになる:109、3×l09個の細胞、1010個の細胞、3×1010個の細胞、及び最大1×1011個の細胞。本明細書に記載のポリペプチド構築物を発現する自己T細胞は、無濾過のチュービングにより、20から30分かけて静脈内に投与される。
【０１９０】
全患者は、細胞生成物の投与の6週間後に、評価のためにクリニックに戻る。
【０１９１】
(実施例12)
定量的PCR
Q-PCRを使用し、T細胞注入前及び注入後の異なる時点で採取したPBMC中のγδTCR導入遺伝子を検出することによって、γδ修飾Tリンパ球に対するレトロウイルスの組込みを定量する。QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)によるDNA抽出後に、ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)を使用して、γδTCR導入遺伝子に特異的なプライマーとTaqManプローブ(Applied Biosystems)を用いて三連でDNAを増殖させる。ベースライン範囲を、ベースライン蛍光を超える10SDの閾値を有する、サイクル6から15に設定する。DNA標準物質を生成するために、γδTCR導入遺伝子カセットをコードするDNAプラスミドの連続希釈を使用する。
【０１９２】
(実施例13)
腫瘍クラスター形成の検出
0.5%のパラホルムアルデヒドを用いる4℃で1時間の穏やかな固定の前後に、新たに回収した腫瘍細胞を標識する。細胞懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)中で2回洗浄した後、細胞ペレットを100μlのPBSに再懸濁させ、100μg/mlのFITC又はTRITCコンジュゲートmAbと共に4℃で40分間インキュベートする。免疫金標識前に第1の抗体としてFITCコンジュゲート抗体を使用することが、抗体結合をチェックするのに有用である。標識した細胞を冷却PBS中で2回洗浄し、この調製点で固定する。走査フォース顕微鏡(SFM)及び透過電子顕微鏡(TEM)測定のために、細胞懸濁液を、IgG Fc及び全分子をそれぞれ対象とする10μlのAurogamig G-30(Amersham;直径、30±3nm)又はポリクローナルヤギ抗マウス抗体を保有する10μlの金標識ヤギ抗マウスIg(Sigma Aldrich;直径、15μm±2nm)を用いてさらにインキュベートする。一部の実験では、IgG Fcに対するAurogamig G-15(Amersham;直径、15±1nm)を使用することもできる。氷上での40分のインキュベーション後、細胞を洗浄し、4℃で保存する。金ビーズの過剰な価数を、第2のmAb及び第2の金ビーズを適用する前に、多量のマウスIgGを添加することによって中和する。二価の抗体を用いる標識手順による受容体の人為的なクラスター形成の可能性は、適用される抗体ごとにFab断片を試験することによって排除される。さらに、標識の前後に、0.5%のパラホルムアルデヒド中で細胞を固定することは、結果に影響を及ぼさない。
【０１９３】
(実施例14)
フローサイトメトリーのエネルギー転移測定
HLAの二量体化を研究するために、細胞を、それぞれ、Alexa594-コンジュゲートα-HLA-A(ドナー)とAlexa647-コンジュゲートα-HLA-A(アクセプター)で標識した。ドナーの蛍光をFACS LSRFortessa flow cytometer(BD)を使用して測定し、ここで、二重標識した健常試料のドナーの蛍光を二重標識した悪性試料のものと比較した。FRET効率を、アクセプターの存在下で、ドナーの蛍光のわずかな減少から計算した。FRET効率を、Sebestyenと共同研究者(Sebestyen Z、Nagy P、Horvath G、Vamosi G、Debets R、Gratama JWら Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 2002年;48(3):124〜35頁)による方程式を用いて計算し、ここで、ドナーの蛍光は488nmで励起し、576±26nmで検出され、アクセプターの蛍光は635nmで励起し、780±60nmで検出され、一方、FRET強度は488nmで励起し、780±60nmで検出された。異なる蛍光のチャネル間のスペクトル重複に対する補正係数は、非標識及び単一標識細胞で測定したデータから得られた。
【０１９４】
(実施例15)
CRISPRゲノム編集
HEK293FT細胞を、レンチウイルスヘルパー構築物VSVG and pspax2と一緒にβ2m(Sigma-Aldrich)を含有するレンチウイルス構築物を用いるFugene-HD(Promega)を使用してトランスフェクトした。LCL-TM細胞は、ウイルス上清により形質導入され、フローサイトメトリーによってノックダウンが確認された。gRNA配列(GAGTAGCGCGAGCACAGCTA)(配列番号436)のβ2m遺伝子特異的領域を、Zhang lab(http://crispr.mit.edu/)からのCRISPR設計ツールにより設計した。対照gRNAとして、eGFP遺伝子(GGAGCGCACCATCTTCTTCA)(配列番号437)を標的とした。
【０１９５】
(実施例16)
γδTCR様抗体と古典的HLA分子の役割
TCRリガンドを特定するために、TCR様抗体、すなわち、γδTCRと同じエピトープを認識する抗体を生成し、免疫沈降及び質量分析によってリガンドを特定するために使用した。これらの抗体を産生するために、C57BL/6マウスをγδTCRによって認識された完全細胞株SW480及びLCL-TMで免疫化し、その後、骨髄腫細胞にマウスのB細胞を融合させることによって、ハイブリドーマを生成した。これらのハイブリドーマを限界希釈によってクローニングし、そこから、抗体結合スクリーニングにおいて、γδTCR反応性腫瘍細胞に特異的に結合した抗体を生成したクローンを単離した(図8A)。抗体のリガンド特異性をさらに決定するために、γδTCR標的SW480及びLCL-TMをハイブリドーマ上清と共に前培養し、次に、共培養で使用してTEG011を刺激した。13個の抗体(又はハイブリドーマ上清)がTEG011の活性化を実質的に遮断したが、一方、少なくとも2つのクローンが、IFN-γELISpotによって測定した場合、LCL-TMの認識を阻害することなく、SW480の認識を部分的に阻害した(図8A)。これらのデータは、複数の産生された抗体が、γδTCRのリガンドへの結合を部分的又は完全に妨げることができることを示唆する。対照的に、ハイブリドーマはいずれも、WT1 RMFPNAPYL(配列番号435)(0201)ペプチドを負荷したSW480のWT1 TCRが形質導入されたαβΤ細胞による認識をブロックすることができる抗体を産生せず(図8B)、これは、T細胞活性化に、一般的に必要とされる分子への結合、例えば接着により、遮断が誘導されなかったことを示す。ハイブリドーマから、活性を完全に遮断する1つの抗体と活性を部分的に遮断する1つの抗体が、抗体の産生及び精製に関して選択された。これらの精製した抗体をストレプトアビジンビーズにカップリングさせ、次に、SW480細胞又はLCL-TM細胞のいずれかの細胞溶解液中でのリガンド免疫沈降のために使用した。ほとんどがMHCクラスI分子のパネルの特定において(表4)、両方の抗体で得られた質量分析は、一般的な仮定と対照的に、古典的HLA分子が、特定のγδTCRに対する腫瘍細胞の認識に関与することを示唆する。産生された抗体が古典的HLAに対して特異的であることを確認するために、本発明者らは、LABScreen Single Antigen HLA クラスIビーズを選択した抗体と共にインキュベートし、Luminexでビーズを測定してHLA特異性を決定した。図8Cは、本明細書に記載のポリペプチドの結合を完全に遮断する抗体は、亜群HLA-A対立遺伝子に対する制限された反応性を有し、一方、部分的に遮断する抗体は、LABScreenビーズに存在するすべてのHLAクラスIに対するより広い特異性を有することを示す。
【０１９６】
【表４】
2019525898.tif 000008
【０１９７】
γδTCRを含む本明細書に記載のポリペプチド構築物による標的細胞の認識はHLA-A*24:02に依存する
本明細書に記載のγδTCRによって認識されるHLAの型をさらに狭めるために、EBV形質転換B細胞株(EBV-LCLs)の多量の回収物を多種多様なHLAハプロタイプを有するいくつかのファミリー系統から得た。TEG011を、LABScreenビーズ(図8C)によって示唆された複数の可能なHLA分子を網羅する7つの異なるCEPH EBV-LCL、Daudi及びLCL-TMと共にインキュベートし、IFN-γ放出を測定することによって反応性を評価した。TEG011の反応性を異なるHLA型と相関させることにより、HLA-A*02:01又はHLA-A*03:01ではなくHLA-A*24:02ハプロタイプ(図10A)が認識に関与することが示唆された。HLA-A*24:02が媒介する認識を正式に確認するために、本発明者らは、HLA- A*24:02又はHLA-A*02:01(対照)のいずれかをHLA陰性細胞株COS-7(アフリカミドリザルの腎臓の線維芽細胞様)及びK562(リンパ芽球の慢性骨髄性白血病)にレトロウイルスによって導入した。両方の細胞株で、HLA-A*02:01ではなく、HLA-A*24:02の導入によって、TEG011の顕著な活性化が生じた(図10B)。逆に、認識されたLCL(図11)内のβ2ミクログロブリン(β2m)の部分的CRISPR/Cas9 KOにより、期待された通り、TEG011の活性化が低減した。β2mの再導入は、標的細胞認識の再確立を導き、観察された効果がオフターゲットCRISPR/Cas9 KOによっては引き起こされたかったことを確認した。
【０１９８】
リガンドの密度が、本明細書に記載のγδTCRによる標的の認識に重要であるかどうかを試験するために、本発明者らは、HLA-A*24:02に対してホモ接合性であるか又はヘテロ接合性であるLCL細胞株に対するTEG011の活性を比較した。細胞表面におけるリガンドの密度が機能的な結合活性を促進するという仮定を有する株では、実際に、HLA-A*24:02にホモ接合性である細胞株に対して、より高い反応性のTEG011が観察された(図10D)。さらに、モネシンによるHLA発現の低減が、HLA発現と標的の認識を低減した(図10E)。TEGは、導入されたγδTCRの優勢による内因性αβTCRの下方調節により、アロ反応性を失うことが報告された。しかし、TEG形式内の内因性αβTCRの任意の活性を正式に除外するために、本発明者らは、本明細書に記載のγδTCR、又はWT1 αβTCR(対照)のいずれかをTCRβ陰性Jurma細胞株に導入した。形質導入されたJurma細胞をWT1ペプチドを負荷したT2又はLCL-TM 腫瘍細胞株と共にインキュベートし、ここで、T細胞の標的特異的活性化を、フローサイトメトリーによるT細胞上の活性化マーカーCD69を測定することによって決定した。予期されるように、γδTCRが形質導入されたJurmasは、HLA-A*24:02を発現するLCL-TMによってのみ活性化され、一方、WT1 αβTCRが形質導入されたJurmasは、WT1を負荷したT2細胞によってのみ活性化された(図10F)。結論として、γδTCR FE11による標的細胞認識は、HLA-A*24:02に決定的に依存する。
【０１９９】
(実施例17)
本明細書に記載のγδTCRを含むポリペプチド構築物が、悪性細胞では発現されるが、健常細胞では発現されないHLA-A*24:02を選択的に認識する
認識がHLA-A*24:02陽性形質転換細胞に制限されるかどうかを評価するために、TEG011を、HLA- A*24:02に対して陽性又は陰性のいずれかである健常初代T細胞と共にインキュベートした。HLA-A*24:02陽性のCOS-7又はK562腫瘍細胞と対照的に、健常初代細胞は、それらがHLA-A*24:02に対して陽性である場合でさえも、TEG011によって認識されなかった(図12A)。さらに、EBV形質転換を使用することによって不死化されたHLA-A*24:02陽性B細胞は、TEG011を顕著に活性化し、一方、同じドナーの形質転換されていないPBMCは認識されず、このことは、HLA-A*24:02対立遺伝子の発現に加えて、悪性形質転換が、本明細書に記載のγδTCRの活性化に必須であることを示した(図12B)。
【０２００】
本明細書に記載のγδTCRを含むポリペプチド構築物の結合部位
ポリペプチドの推定結合部位をさらにマッピングするために、HLA-A*24:02へのより高い相同性を有する、異なるHLAの上位型及びHLA型に分類される、HLA-A*24:02とHLA-A*02:01の間の構造上の非相同性、並びにこれらの異なるHLA型を網羅するCEPHライブラリー由来のEBV-LCLの範囲に対するTEG011の機能的活性(図13A)が使用された。反応性は、HLA-A*24:02陽性細胞に対して観察され、相同性の強力なHLA-A*24:03 EBV-LCL-71に対しては観察されなかった。配列アラインメント(図14B)により、位置168及び169のα2ヘリックスにおける2つのアミノ酸(それぞれ、アスパラギン及びグリシン)が、TEG011によるHLA-A*24:02の認識に使用されることが明らかとなった位置168及び169の推定結合部位の構造解析は、非常に近接したペプチド結合溝を示した(図14C)。HLA-A*24:02とHLA-A*02:01の間の配列アラインメントを図5に示す。
【０２０１】
本明細書に記載のγδTCRを含むポリペプチド構築物によるHLA-A*24:02認識におけるペプチドの関与
推定結合部位のペプチド結合溝への近接(図13C)により、本明細書に記載のγδTCRによるHLA-A*24:02の認識におけるペプチドの役割が評価された。TAP欠乏細胞株T2を、RYPLTFGWCF(配列番号438)(24:02)及びRMFPNAPYL(配列番号435)(02:01)ペプチドを負荷したか又は負荷していないHLA-A*24:02及びHLA-A*02:01(対照)により形質導入した。ペプチドによるHLAの負荷が成功したことを確認するために、T2細胞の表面のHLAの安定化を評価し、負荷したか又は負荷していないT2トランスフェクタントをTEG011と共にインキュベートした。ウイルスペプチドがHLAを安定化させることができたという事実にもかかわらず、HLA MFI、FE11 TCRの増加によって示されるように、T細胞は、負荷されていないか又は負荷されたHLA-A*24:02が形質導入されたT2細胞に対して反応せず(図14D)、このことは、HLA-A*24:02が単独で存在しても十分ではなく、内因的に提示されたペプチド又はペプチド群の提示が反応性を確立するために重要であることを示す。本明細書に記載のγδTCRのHLA-A*24:02結合がさらなるペプチドによって強化され得るという仮説を確認するために、TEG011が、CMV pp65 HLA-A*24:02拘束五量体と共にインキュベートした。対照である、それぞれ反応性の四量体又は五量体を有するWT1 αβ TCR-及びNY-ESO-1 αβTCRが形質導入されたT細胞は陽性に染色したが(図13E)、TEG011は、HLA-A*24:02拘束五量体単独では染色されなかった。
【０２０２】
内因的に処理されたペプチドが細胞ペプチド処理機構の反応性に関して利用されることをさらに示すために、プロテアソームを阻害することによってその機構を妨げた。これを達成するために、本発明者らは、認識された細胞をプロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブで予め処理し、TCR T細胞の反応性に関する影響を評価した。ボルテゾミブ処理によって、HLA-A*24:02が形質導入されたCOS-7とK562の両方の認識が著しく低下し(図13F)、これは、HLA-ABC MFIによって測定した場合、HLA発現の低下によっては引き起こされなかった。
【０２０３】
認識に対する要因としての区画化
以前に記載したフローサイトメトリーを使用するForster共鳴エネルギー転移(FRET)。FRETデータは、HLAが、PBMCのような認識されない細胞上でホモ二量体化することを示すが、一方、HLA-A24:02陽性K562上では、ホモ二量体化は観察することができない(図13G)。HLA-A24:02の膜可動性がγδTCR-HLAによる認識にとって重要であるが、αβTCR-HLAによる認識には重要でないことを正式に試験するために、本発明者らは、標的細胞のパラホルムアルデヒド固定の効果を評価した。WT1 αβTCRが形質導入されたT細胞とWT1ペプチドが負荷された標的細胞の認識は、固定によって影響を受けなかったが、TEG011細胞及びHLA-A*24:02が形質導入された標的細胞による相互作用は完全に消失し、これは、区画化における差が存在することを示した(図13H)。
【０２０４】
(実施例18)
本明細書に記載のγδTCRは、悪性細胞では発現するが健常細胞では発現しないHLA-A*24:02を選択的に認識する
γδTCR-HLA相互作用が、古典的なHLA αβTCRの相互作用と実質的に異なることを示すために、共受容体の可能な役割を評価した。HLA-I拘束による1つの候補物質は、CD8ααであった。最初に、以前に報告された株におけるオリジナルクローンのCD8発現(図14A)が決定された。SW480、LCL-TM又はPBMC(対照)と共培養する前にのCD4及びCD8発現に関してγδTCRが形質導入されたαβTCR細胞を選別することによって、γδTCRが形質導入されたT細胞は、オリジナルクローンと同様に、CD8の同時発現に依存する(図14B)。FE11γδT細胞のクローンと対照的に、ほとんどのαβT細胞が、同時刺激を与えるためにCD8α及びCD８βのヘテロ二量体としてCD8を発現する。γδTCRが形質導入されたT細胞上のCD8αβヘテロ二量体の役割は、CD8α又はCD8β鎖のいずれかに対する遮断抗体を使用することによって評価された。CD8αだけでなく、CD8β遮断抗体も、SW480の認識を完全に阻害し(図14C)、このことは、CD8αα又はCD8αβのいずれかが、認識に対して非常に有益であることを示した。
【０２０５】
これらのデータは、本明細書に記載のγδTCRを発現するCD8陽性及びCD8陰性Jurma細胞(図14D又はαβTCR WT1(対照、図14E)を比較することによって確認された。MHCクラスI拘束αβTCRの同時刺激のために、CD8αβは2つの異なる役割を果たすことができ、TCR-MHC相互作用を安定化させる接着分子として作用し、LCKを介するシグナル伝達による活性化の役割を果たすことができる。γδTCR FE11が形質導入されたT細胞に対するCD8ααの役割を調査するために、LCKに結合できないことによりシグナル伝達に乏しいCD8αの切断バリアントが生成された。本明細書に記載のγδTCRと切断CD8α(CD8α')の両方をαβT細胞に導入した後、本発明者らは、これらをSW480と共に共培養した。CD8α野生型バリアントと比較して、CD8α'バリアントのIFN-γスポットの量の減少を観察することができ(図14F)、このことは、CD8ααが、実際に、共刺激の役割を果たすことを示す。
【０２０６】
(実施例19)
本明細書に記載のポリペプチドに関連する配列
所望のHLA立体構造に選択的に結合する、本明細書に記載のポリペプチドに有用であり得るさらなる配列を作成するために、部位特異的突然変異誘発が、重複伸長PCR、Ho、S.N.ら、Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene、1989年  77(1):51〜9頁、又はプルーフリーディングポリメラーゼ(Phusion;Bioke)を使用する、全体プラスミドの突然変異誘発、Miyazaki、K.、MEGA WHOP cloning:a method of creating random mutagenesis libraries via megaprimer PCR of whole plasmids. Methods Enzymol、2011年498: 399〜406頁によって実施される。変異は、Jγ1及びJδ1セグメント全体を含むCDR3γ及びCDR3δ領域の両方で実施される。変異したγ又はδTCR鎖は、レトロウイルスベクターpBulletにライゲートされ、シークエンシングされる。
【０２０７】
【表５Ａ】
2019525898.tif 000009
【表５Ｂ】
2019525898.tif 000010
【表５Ｃ】
2019525898.tif 000011
【表５Ｄ】
2019525898.tif 000012
【表５Ｅ】
2019525898.tif 000013
【表５Ｆ】
2019525898.tif 000014
【表５Ｇ】
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【表５Ｈ】
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【０２０８】
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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【表６Ｃ】
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【表６Ｄ】
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【表６Ｅ】
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【表６Ｆ】
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【表６Ｇ】
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【０２０９】
(実施例20)
固形悪性腫瘍又は血液悪性腫瘍のマウスモデル
NOD.Cg-Prkcdscid IL2rgtmlWjl/SzJ(NSG)マウスをJackson Laboratory(Bar Harbor、ME、USA)から入手し、NOD.Cg-Prkdc I12rg Tg(HLA-A24)3Dvs/Sz(NSG-A24)マウスは、Leonard D. Shultz(The Jackson Laboratory)によって用意された。すべてのマウスは、ユトレヒト大学のCentral Animal Facilityのspecific pathogen-free(SPF)飼育ユニットに収容された。実験は、地域の倫理委員会からの許可を得て、動物実験に関する現行のオランダの法律に従った後、行政のガイドラインに従って行う。マウスは、TEG又は疑似TCRが形質導入されたT細胞で処置した後、致死量以下の全身放射線照射と、それに続くヒト血液腫瘍細胞の注射又はヒト固形腫瘍細胞の移植を受ける。ルシフェラーゼ陽性腫瘍を生物ルミネセンスイメージングによって、in vivoで可視化する。マウスは、イソフルランで麻酔された後、ルシフェリン(Promega)のi.p.注射を受ける。生物ルミネセンスイメージを、第3世代の冷却GaAs高感度電荷結合素子カメラによって得て、Photo Visionソフトウェアで制御し、M3 Visionソフトウェアで解析する(すべての入手先はPhoton Imager;Biospace Laboratory、Paris、France)。腫瘍成長、無腫瘍生存及び全生存を使用して、疑似TCR T細胞と比較したTEG抗腫瘍活性を評価する。末梢血中のTEG持続をフローサイトメトリーによって毎週測定する。週に2回、体重測定を含む臨床症状をスコア化する。予め定義したヒトポイントに達する場合、又は実験が終了する場合、マウスは剖検及び病理学的スクリーニングのために安楽死させる。
【０２１０】
(実施例21)
Vδ1 γδTCRライブラリーの作成
RNeasyキット(Qiagen)を使用して健常ドナーのPBMCからMACS単離によって得たγδT細胞から、RNAを抽出する。δTCR及びγTCRに特異的なcDNAを、δTCR又はγTCRの3'定常領域に特異的なプライマーを使用して、Superscript(登録商標) II Reverse Transcriptase(Thermo fisher)を用いて合成する。Vδ1 TCR DNAを、Vδ1遺伝子に特異的な5'プライマーと3'定常領域プライマーを使用して増幅する。このDNAを、δTCR遺伝子と同じプロモーターの下で、ピューロマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウイルス発現プラスミド中でライゲートする。同様の戦略をδTCR遺伝子について行う。Vγ2/4、Vγ3/5及びVγ8に遺伝子特異的な5'プライマーと3'定常領域プライマーを使用して、これらのγTCR遺伝子を増幅する。PCR産物を、γTCR遺伝子と同じプロモーターの下で、ネオマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウイルス発現プラスミド中でライゲートする。ライゲーションミックスを使用して、ヒートショックプロトコールを使用して、化学コンピテント大腸菌(E.coli)DH5α細胞を形質転換する。形質転換した大腸菌を使用して、プラスミドDNAの抽出のために終夜培養物を接種する。
【０２１１】
Vδ1-Vγ TCRライブラリーを使用するJurkat細胞の形質導入
Phoenix ampho細胞を、Vδ1 TCR遺伝子及びVγ遺伝子を含有するレトロウイルス発現プラスミド並びにレトロウイルスヘルパープラスミドpHit60及びpColtGalVでトランスフェクトする。トランスフェクションの48時間後に、Jurkat細胞の形質導入のために、ウイルス含有培養培地を使用する。このプロセスをもう一度繰り返す。形質導入に成功したJurkat細胞を、800μg/mlのG418と1μg/mlのピューロマイシンを使用して選択する。さらなるγδTCR MACS単離を行い、対合したγ及びδTCR鎖を発現するJurkat細胞を含める。
【０２１２】
K562-HLA-A*24:02反応性Vδ1 γδTCRに対するスクリーニング
Vδ1 γδTCRライブラリーを用いて形質導入したJurkat細胞をK562細胞と共に、1:3の比で終夜インキュベートする。細胞を、抗CD69-APC及び抗CD3-PEで染色し、フローサイトメトリーを使用して選別する。選別した非活性化Jurkat細胞(CD3+CD69-)を休ませ、HLA-A*24:02が形質導入されたK562細胞による終夜の刺激前の1週間増殖させる。細胞を、抗CD69-APC及び抗CD3-PEで再度染色し、CD3+CD69+細胞は、96ウェルプレートにおいて選別された単一細胞である。Vδ1 γδTCR Jurkatクローンを、K562-HLA-A*24:02に対する反応性及びK562細胞に対する非反応性について再度評価する。真にK562-HLA-A*24:02反応性であるVδ1 γδTCR Jurkatクローンをシークエンシングして、γ及びδTCR配列を決定する。
【０２１３】
(実施例22)
安定性試験:
本明細書に記載の少なくとも1つのポリペプチド又は細胞、例えば、本明細書に記載のポリペプチドを発現する遺伝子操作された細胞を含有する、本明細書に記載の組成物又は医薬組成物を、密封容器中、25℃又は4℃で保存し、容器を、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%又は95%の相対湿度を有する雰囲気に置く。1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、1.5年、2年、2.5年又は3年後、少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%の医薬組成物は、標準プロトコールによって決定されたままである。
【０２１４】
本発明の具体的実施形態を本明細書において示し、記載してきたが、このような実施形態は例としてのみ与えられることは当業者にとって自明である。多数の変形、変更、及び置換が、本発明から逸脱することなく、現在も当業者に生じよう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する種々の代替が本発明の実践において用いられてもよいことが理解されるべきである。以下の請求項は本発明の範囲を定義し、これらの請求項の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が本発明によって網羅されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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