(57)【要約】  本出願は、ビスホスホネートとキノロンを含むことができ、分離可能にそのキノロンをそのビスホスホネートに結合することができるビスホスホネート・キノロン複合体及びそれらの医薬製剤について説明する。本出願は前記ビスホスホネート・キノロン複合体及びそれらの医薬製剤の製造方法及び使用方法も提供する。【選択図】図１
2019518792.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（６）の化合物：
【化１】
2019518792.tif 000098
。
【請求項２】
式（６）の化合物及び医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物：
【化２】
2019518792.tif 000099
。
【請求項３】
骨感染症の治療を必要とする対象に特定量の請求項１に記載の化合物又は請求項２に記載の医薬製剤を投与することを含む、骨感染症の治療を必要とする対象において骨感染症を治療する方法。
【請求項４】
ビスホスホネート、及び
キノロン化合物
を含み、
前記キノロン化合物が、リンカーを介して、前記ビスホスホネートに分離可能に結合している化合物。
【請求項５】
置換されていても置換されていなくてもよい、ヒドロキシルフェニルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルフェニルアリールビスホスホネート、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシピリジルアルキルビスホスホネート、ピリジルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルイマダゾイルアルキルビスホスホネート、イミダゾイルアルキルビスホスホネート、エチドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート、ミノドロネート、及びそれらの混合物からなる群より前記ビスホスホネートが選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記キノロン化合物がフルオロキノロンである、請求項４〜請求項５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
アラトロフロキサシン、アミフロキサシン、バロフロキサシン、ベシフロキサシン、カダゾリド、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、デラフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フィナフロキサシン、フレロフロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、イバフロキサシン、ＪＮＪ−Ｑ２、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、ペフロキサシン、プラドフロキサシン、プルリフロキサシン、ルフロキサシン、サラフロキサシン、シタフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン、ザボフロキサシン、ネモノキサシン、及びそれらの混合物からなる群より前記キノロン化合物が選択される、請求項４〜請求項６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記キノロン化合物が式Ａの構造を有する、請求項４〜請求項７のいずれか一項に記載の化合物：
【化３】
2019518792.tif 000100
（式中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基からなる群より選択される１又は複数の置換基であり、
Ｒ２はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基からなる群より選択され、
Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基からなる群より選択され、且つ、
Ｒ４はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基からなる群より選択される）。
【請求項９】
前記リンカーがカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカーがアリールカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記リンカーがＯ−チオアリールカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記リンカーがＳ−チオアリールカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記リンカーがフェニルカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記リンカーがチオカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記リンカーがＯ−チオカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項１０及び請求項１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記リンカーがＳ−チオカルバメートリンカーである、請求項４〜請求項１０及び請求項１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記リンカーが式ＡのＲ１基に結合している、請求項４〜請求項１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
エチリデンビスホスホネートのα位がヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードによって置換されている、請求項４〜請求項１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
ビスホスホネートがｐ−ヒドロキシフェニルエチリデン基又はその誘導体を含む、請求項４〜請求項１８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
エチリデンビスホスホネートがα位にα−ヒドロキシを含まない、請求項４〜請求項１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
式（１２）で表される、請求項４に記載の化合物：
【化４】
2019518792.tif 000101
。
【請求項２２】
式（１３）で表される、請求項４に記載の化合物：
【化５】
2019518792.tif 000102
。
【請求項２３】
式（１５）で表される、請求項４に記載の化合物：
【化６】
2019518792.tif 000103
。
【請求項２４】
特定量の請求項４〜請求項２３のいずれか一項に記載の化合物、及び
医薬的に許容可能なキャリア
を含む医薬製剤。
【請求項２５】
前記化合物の量が細菌の殺菌又は抑制に有効な量である、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
前記化合物の前記特定量が、骨髄炎、骨壊死、インプラント周囲炎、又は歯周炎の治療又は予防に有効な量である、請求項２４〜請求項２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
骨髄炎の治療を必要とする対象に、特定量の請求項１及び請求項４〜請求項２３のいずれか一項に記載の化合物又は請求項２及び請求項２４〜請求項２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を投与することを含む、骨髄炎の治療を必要とする対象において骨髄炎を治療する方法。
【請求項２８】
インプラント周囲炎又は歯周炎の治療を必要とする対象に、特定量の請求項１及び請求項４〜請求項２３のいずれか一項に記載の化合物又は請求項２及び請求項２４〜請求項２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を投与することを含む、インプラント周囲炎又は歯周炎の治療を必要とする対象においてインプラント周囲炎又は歯周炎を治療する方法。
【請求項２９】
糖尿病足の治療を必要とする対象に、特定量の請求項１及び請求項４〜請求項２３のいずれか一項に記載の化合物又は請求項２及び請求項２４〜請求項２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を投与することを含む、糖尿病足の治療を必要とする対象において糖尿病足を治療する方法。
【請求項３０】
骨移植材料と、
請求項１及び請求項４〜請求項２３のいずれか一項に記載の化合物又は請求項２及び請求項２４〜請求項２６のいずれか一項に記載の医薬製剤とを含み、
前記化合物又は前記医薬製剤が、前記骨移植材料に付着しているか、前記骨移植材料と一体化しているか、前記骨移植材料に化学吸着されているか、又は前記骨移植材料と混合されている、骨移植組成物。
【請求項３１】
前記骨移植材料が自家移植骨材料、同種移植骨材料、異種移植骨材料、合成骨移植材料、又はそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の骨移植組成物。
【請求項３２】
骨移植を必要とする対象に請求項３０〜請求項３１のいずれか一項に記載の骨移植組成物を移植することを含む方法。
【請求項３３】
バイオフィルム感染の予防を必要とする対象に請求項１及び請求項４〜請求項２３のいずれか一項に記載の化合物又は請求項２及び請求項２４〜請求項２６のいずれか一項に記載の医薬製剤を投与することを含む、骨手術部位又はインプラント手術部位、又は骨移植が実施されている手術部位におけるバイオフィルム感染を予防する方法。
【請求項３４】
バイオフィルム感染の予防を必要とする対象に請求項３０〜請求項３１のいずれか一項に記載の骨移植組成物を移植することを含む、骨手術部位又はインプラント手術部位、又は骨移植が実施されている手術部位におけるバイオフィルム感染を予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１６年６月３日に出願された「骨標的化治療薬及び診断薬（ＢＯＮＥ  ＴＡＲＧＥＴＥＤ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ）」という標題の同時係属中の米国仮特許出願第６２／３４５３７０号の利益とその仮特許出願に基づく優先権を主張するものであり、その仮出願の内容の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本願は２０１６年７月１日に出願された「ビスホスホネート・キノロン・バイオコンジュゲート及びそれらの使用（ＢＩＳＰＨＯＳＰＨＯＮＡＴＥ  ＱＵＩＮＯＬＯＮＥ  ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ）」という標題の同時係属中の米国仮特許出願第６２／３５７７２７号の利益とその仮特許出願に基づく優先権も主張するものであり、その仮出願の内容の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００３】
本願は２０１７年１月１９日に出願された「ビスホスホネート・キノロン・バイオコンジュゲート及びそれらの使用（ＢＩＳＰＨＯＳＰＨＯＮＡＴＥ  ＱＵＩＮＯＬＯＮＥ  ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ）」という標題の同時係属中の米国仮特許出願第６２／４４８０６０号の利益とその仮特許出願に基づく優先権も主張するものであり、その仮出願の内容の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００４】
合衆国政府の助成による研究又は開発に関する陳述
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＤＣＲによって支給された研究助成番号第１Ｒ４１ＤＥ０２５７８９−０１号の政府支援によって行われた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
感染性骨疾患は骨髄炎、顎骨感染症、及び他の骨感染症とも呼ばれ、ヒト及び動物の健康における重大な問題であり、その結果は四肢欠損から死亡までにわたる深刻なものであり得る。骨に特有の問題のため、骨髄炎及び他の骨感染症の治療は長期にわたり、且つ、困難であることが典型的であり、外科的介入を必要とすることが多い。したがって、あらゆる形態又は臨床亜型の骨髄炎及び他の骨感染症の治療法の改善について長く望まれながらも達成されていなかった要求が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
幾つかの態様では、本明細書はキノロン、例えばシプロフロキサシンに対して分離可能に複合体化可能であるビスホスホネート（ＢＰ）を含有し得るＢＰキノロン複合体を提供する。複数の実施形態において前記ＢＰキノロン複合体は対象においてキノロンを骨、骨移植片、及び／又は代替骨移植片へ選択的に送達することができる（すなわち、骨、骨移植片、又は代替骨移植片を標的とすることができる）。幾つかの実施形態では前記ＢＰキノロン複合体は前記キノロンを分離することができる。本明細書はＢＰキノロン複合体の合成方法及び本明細書において提供される１又は複数の前記ＢＰキノロン複合体を使用する骨髄炎又は他の骨感染症の治療方法又は予防方法も提供する。
【０００７】
幾つかの態様では、前記複合体は式（６）の化合物であり得る。
【０００８】
【化１】
2019518792.tif 000003
【０００９】
本明細書は式（６）の化合物及び医薬的に許容可能なキャリアを含有する医薬組成物も提供する。
【００１０】
本明細書は、必要とする対象において骨感染症を治療する方法であって、骨感染症の治療を必要とする対象に特定量の式（６）の前記化合物又は式（６）の化合物を含有する医薬製剤を投与する工程を含み得る前記方法も提供する。
【００１１】
本明細書は、ビスホスホネート（ＢＰ）及びキノロン化合物を含有する化合物であって、前記キノロン化合物がリンカーを介して前記ビスホスホネートに分離可能に結合している前記化合物も提供する。前記ＢＰは、置換されていても置換されていなくてもよい、ヒドロキシルフェニルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルフェニルアリールビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｏｒ  ａｒｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ  （ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシピリジルアルキルビスホスホネート、ピリジルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルイマダゾイルアルキルビスホスホネート、イミダゾイルアルキルビスホスホネート、エチドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート、ミノドロネート、及びそれらの混合物からなる群より選択され得る。前記キノロン化合物はフルオロキノロンであり得る。前記キノロン化合物はアラトロフロキサシン、アミフロキサシン、バロフロキサシン、ベシフロキサシン、カダゾリド、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、デラフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フィナフロキサシン、フレロフロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、イバフロキサシン、ＪＮＪ−Ｑ２、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、ペフロキサシン、プラドフロキサシン、プルリフロキサシン、ルフロキサシン、サラフロキサシン、シタフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン、ザボフロキサシン、ネモノキサシン、及びそれらの混合物からなる群より選択され得る。
【００１２】
前記キノロン化合物は式Ａで記載される構造を有し得る。
【００１３】
【化２】
2019518792.tif 000004
【００１４】
式中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、
Ｒ２はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、
Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、且つ、
Ｒ４はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得る。
【００１５】
１つ又は複数の態様においては、前記リンカーはカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはアリールカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＯ−チオアリールカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＳ−チオアリールカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはフェニルカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはチオカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＯ−チオカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＳ−チオカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーは式ＡのＲ１基に結合し得る。
【００１６】
１つ又は複数の態様においては、前記エチリデンビスホスホネートのα位はヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードによって置換され得る。幾つかの態様では、前記ビスホスホネートはｐ−ヒドロキシフェニルエチリデン基又はその誘導体を含み得る。幾つかの態様ではエチリデンビスホスホネートはα位にα−ヒドロキシを含まない。
【００１７】
幾つかの態様では、前記化合物は式（１２）の式を有する。
【００１８】
【化３】
2019518792.tif 000005
【００１９】
幾つかの態様では、前記化合物は式（１３）の式を有する。
【００２０】
【化４】
2019518792.tif 000006
【００２１】
幾つかの態様では、前記化合物は式（１５）の式を有する。
【００２２】
【化５】
2019518792.tif 000007
【００２３】
本明細書は、ビスホスホネートとキノロン化合物と医薬的に許容可能なキャリアを含有し得る医薬製剤であって、前記キノロン化合物がリンカーを介して、前記ビスホスホネートに分離可能に結合している前記医薬製剤も提供する。前記ビスホスホネートは、置換されていても置換されていなくてもよい、ヒドロキシルフェニルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルフェニルアリールビスホスホネート、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート、ヒドロキシピリジルアルキルビスホスホネート、ピリジルアルキルビスホスホネート、ヒドロキシルイマダゾイルアルキルビスホスホネート、イミダゾイルアルキルビスホスホネート、エチドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート、ミノドロネート、及びそれらの混合物からなる群より選択され得る。前記キノロン化合物はフルオロキノロンであり得る。前記キノロン化合物はアラトロフロキサシン、アミフロキサシン、バロフロキサシン、ベシフロキサシン、カダゾリド、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、デラフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フィナフロキサシン、フレロフロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、イバフロキサシン、ＪＮＪ−Ｑ２、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、ペフロキサシン、プラドフロキサシン、プルリフロキサシン、ルフロキサシン、サラフロキサシン、シタフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン、ザボフロキサシン、ネモノキサシン、及びそれらの混合物からなる群より選択され得る。
【００２４】
前記キノロン化合物は式Ａで記載される構造を有し得る。
【００２５】
【化６】
2019518792.tif 000008
【００２６】
式中、Ｒ１はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、
Ｒ２はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、
Ｒ３はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、且つ、
Ｒ４はアルキル基、置換アルキル基、アルケニル基、置換アルケニル基、アルキニル基、置換アルキニル基、フェニル基、置換フェニル基、アリール基、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得る。
【００２７】
１つ又は複数の態様では、前記リンカーはカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはアリールカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＯ−チオアリールカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＳ−チオアリールカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはフェニルカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはチオカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＯ−チオカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーはＳ−チオカルバメートリンカーであり得る。前記リンカーは式ＡのＲ１基に結合し得る。
【００２８】
幾つかの態様では、前記エチリデンビスホスホネートのα位はヒドロキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードによって置換され得る。幾つかの態様では前記ビスホスホネートはｐ−ヒドロキシフェニルエチリデン基又はその誘導体を含み得る。幾つかの態様ではエチリデンビスホスホネートはα位にα−ヒドロキシを含まない。
【００２９】
幾つかの態様では、前記化合物は式（１２）の式を有する。
【００３０】
【化７】
2019518792.tif 000009
【００３１】
幾つかの態様では、前記化合物は式（１３）の式を有する。
【００３２】
【化８】
2019518792.tif 000010
【００３３】
幾つかの態様では、前記化合物は式（１５）の式を有する。
【００３４】
【化９】
2019518792.tif 000011
【００３５】
前記医薬製剤中の前記化合物の量は、細菌の殺菌又は抑制に有効な量であり得る。前記医薬製剤中の前記化合物の量は骨髄炎、骨壊死、インプラント周囲炎、及び歯周炎の治療又は予防に有効な量であり得る。
【００３６】
本明細書は、必要とする対象において骨髄炎を治療する方法であって、骨髄炎の治療を必要とする前記対象に特定量の本明細書において提供される化合物又はその医薬製剤を投与する工程を含み得る前記方法も提供する。
【００３７】
本明細書は、必要とする対象においてインプラント周囲炎又は歯周炎を治療する方法であって、インプラント周囲炎又は歯周炎の治療を必要とする前記対象に特定量の本明細書において提供される化合物又はその医薬製剤を投与することを含む前記方法も提供する。
【００３８】
本明細書は、必要とする対象において糖尿病足を治療する方法であって、糖尿病足の治療を必要とする前記対象に特定量の本明細書において提供される化合物又はその医薬製剤を投与することを含む前記方法も提供する。
【００３９】
本明細書は、骨移植材料と本明細書に記載される化合物又はその医薬製剤を含み得る骨移植組成物であって、前記化合物又はその医薬製剤が前記骨移植材料に付着している、前記骨移植材料と一体化している、前記骨移植材料に化学吸着されている、又は前記骨移植材料と混合されている前記骨移植組成物も提供する。前記骨移植材料は自家移植骨材料、同種移植骨材料、異種移植骨材料、合成骨移植材料、又はそれらのあらゆる組合せであり得る。
【００４０】
本明細書は、必要とする対象において本明細書に記載される骨移植組成物を移植する工程を含み得る方法も提供する。
【００４１】
本明細書は、骨手術部位又はインプラント手術部位、又は骨移植が実施されている手術部位におけるバイオフィルム感染を予防する方法であって、バイオフィルム感染の予防を必要とする対象に本明細書に記載される化合物を投与する工程を含み得る前記方法も提供する。
【００４２】
本明細書は、骨手術部位又はインプラント手術部位、又は骨移植が実施されている手術部位におけるバイオフィルム感染を予防する方法であって、バイオフィルム感染の予防を必要とする対象に本明細書に記載される骨移植組成物を移植する工程を含み得る前記方法も提供する。
【００４３】
ナノワイヤーテンプレート合成用製造システムについての本開示の他の化合物、組成物、製剤、方法、特徴、及び利点は、以下の図面及び発明を実施するための形態を検討することで当業者に明らかとなろう。全てのそのような追加の系、方法、特徴、及び利点がこの説明の中に含まれ、本開示の範囲内にあり、且つ、添付されている特許請求の範囲によって保護されるものとする。
【００４４】
添付図面と併せて本開示の様々な実施形態の詳細な説明を検討すれば、本開示のその他の態様が容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】骨表面の内側及び外側にコロニー形成している特徴的な重層的マトリックス封入バイオフィルムを示す慢性骨髄炎の患者由来の外科標本の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ；１００倍の倍率）を示す図である。上右隅の挿入図は原因のスタフィロコッカスバイオフィルム病原体の高倍率図（５０００倍の倍率）である。（本試料はＳＥＭ用に処理され、プラチナでスパッタコーティングされ、そして二次電子像モードにおいて５ｋＶで作動するＸＬ  ３０Ｓ  ＳＥＭ（ＦＥＧ；ＦＥＩ社、ヒルズボロ、オレゴン州）によって画像撮影された。）
【００４６】
【図２Ａ】フェニルカルバメートＢＰ−シプロフロキサシン複合体の一般的な合成スキームを示す図である。
【図２Ｂ】フェニルカルバメートＢＰ−シプロフロキサシン複合体の一般的な合成スキームを示す図である。
【図３】一団の臨床黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）骨髄炎病原体に対するシプロフロキサシン及びＢＰ−シプロフロキサシンのＡＳＴとＭＩＣの結果を示す表である。
【図４】インビトロ抗菌物質感受性試験において使用された様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシン複合体についての０時間及び２４時間におけるトリプチケースソイブロス微生物用培地中の前記複合体の分光分析の結果を示すグラフである。インビトロ抗菌試験の典型的な実験期間である２４時間の後に分解が観察されず、前記抗菌物質の優れた安定性が示されている。（＊０．２４〜３．９ｍｃｇ／ｍＬの結果（赤色のバー）は高い「ブランク」測定値のために不確定である。）
【図５】ＨＡ球状体を添加したトリプチケースソイブロス微生物用培地中の１つのＢＰ−シプロフロキサシン複合体（ＢＰ−カルバメート−シプロフロキサシン、ＢＣＣ、化合物６）の分光分析の結果を示すグラフである。複合体を吸着したＨＡ球状体を含まずに上清だけが測定されるため、０時間から２４時間までの大きな減少によりＨＡへの複合体の吸着が確認される。（１．９５〜２５０ｍｃｇ／ｍＬの結果は全て統計学的に有意である（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ；三回の複製実験）。＊０．１２〜０．４８ｍｃｇ／ｍＬの結果（赤色のバー）は高い「ブランク」測定値のために不確定である。）
【図６】黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株のプランクトン型培養物に対するＢＰ−シプロフロキサシンの抗菌物質感受性試験の結果を示すグラフであり、改善された殺菌プロファイルを塩基性ｐＨ（左のグラフ）よりも酸性ｐＨ（右のグラフ）において示している。
【図７】強い殺菌活性を示す確定されたＭＩＣの１倍（赤色の線）及び１／２倍（黒色の線）のＢＰ−シプロフロキサシン（複合体）の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株（右のグラフ）及びＭＲＳＡ  ＭＲ４−ＣＩＰＳ株（左のグラフ）に対する１時間及び最大で２４時間の時点での時間殺菌の結果を示すグラフである。
【図８】基材としてのポリスチレン上に形成された黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株（上のグラフ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＴＣＣ−１５４４２株（下のグラフ）のバイオフィルムに対するＢＰ−シプロフロキサシンの抗菌物質感受性試験の結果を示すグラフである。
【図９】基材としてのＨＡディスク上に形成された黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株（左のグラフ）及び緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株（右のグラフ）のバイオフィルムに対するＢＰ−シプロフロキサシンの抗菌物質感受性試験の結果を示すグラフである。シプロフロキサシン単体（赤色のバー）を含む全ての試験濃度の前記複合体（オレンジ色のバー）によって統計学的に有意な殺菌活性が黄色ブドウ球菌に対して生じた（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験）。
【図１０】ＨＡ球状体を予めＢＰ−シプロフロキサシンで被覆し、次にそれらの球状体に黄色ブドウ球菌を接種する予防実験の結果を示すグラフである。対照（Ｃ：赤色のバー）はＨＡを含まずに培養され、複合体で処理されていない細菌を表し、上清を測定するとプランクトン型増殖の予期された著しい増大が２４時間後に観察される。対照＋ＨＡ（Ｃ＋ＨＡのバー）はＨＡと共に培養されたがそれでも処理されていない細菌を表し、２４時間後に細菌の増殖が幾らか観察されるが、細菌がＨＡに付着し、ＨＡを含まない上清中には測定されないバイオフィルムを形成するため、その増殖はＨＡ陰性対照（赤色のバー）と同程度には観察されない。これらの対照を処理区と比較すると前記複合体が７．８〜２５０ｍｃｇ／ｍＬであるときに２４時間後に細菌の完全な抑制が存在することを見ることができる。０．１２〜３．９ｍｃｇ／ｍＬの比較的に低い濃度では細菌がわずかに増殖したが、それでも大いに抑制された。
【図１１】ＢＰ−シプロフロキサシン被覆ＨＡディスクの存在下で２４時間培養された後のバイオフィルム細菌の生存率を示す表である。
【図１２】細菌量の減少についての試験化合物の効力を示すインビボ動物試験の抗菌成績を示すグラフである。前記複合体は複数回の投与で投与された総計０．９ｍｇ／ｋｇの用量で最も高い効力を示し、回復可能な細菌が存在しなかった。次に１０ｍｇ／ｋｇという単回用量の前記複合体は陰性対照と比較して１０の２乗倍の減少（９９％殺菌活性）を示し、１０の１乗倍の減少を示すシプロフロキサシン単体の複数回投与処方と比較してほぼ１０の１乗倍高い殺菌活性を示した。
【図１３】ＢＰキノロン複合体ターゲティング戦略の概略を示す図である。
【図１４】標的化と分離を可能とするＢＰキノロン複合体の戦略の概略を示す図である。
【図１５】ＢＰ−ＦＱ複合体の実施形態を示す図である。
【図１６】ＢＰ−ＦＱ複合体の合成スキームを示す図である。
【図１７】一団の臨床的に妥当な黄色ブドウ球菌骨髄炎病原体に対して試験されたシプロフロキサシン、ＢＣＣ（化合物６）及びＢＰ−アミド−シプロフロキサシン（ＢＡＣ、化合物１１）の抗菌物質感受性試験の結果を示す図である。（ＭＳＳＡ＝メチシリン感受性黄色ブドウ球菌；ＭＲＳＡ＝メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）
【図１８】ＨＡ球状微粒子を添加した微生物用培地中のＢＣＣ（化合物６）の分光分析の結果を示すグラフである。複合体を吸着したＨＡ球状体を含まずに上清だけが測定されるため、０時間から２４時間までの大きな減少により明らかであるようにＨＡへの複合体の吸着が確認される（１．９５〜２５０ｍｃｇ／ｍＬの結果は全て統計学的に有意である（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ；三回の複製実験）。＊０．１２〜０．４８ｍｃｇ／ｍＬの結果（赤色のバー）は高い「ブランク」測定値のために不確定である。）
【図１９】細菌量の減少、又は組織１グラム当たりの平均ＣＦＵの減少についてのＢＣＣ（化合物６）の効力を示すグラフである。対照と比較すると前記複合体が単回高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のときに最も高い効力が再び観察された（＊ｐ＝０．０００５；独立ｔ検定；エラーバーは標準誤差を表す）。
【図２０】追加のＢＰ−Ａｂ複合体デザインを示す図である。
【図２１】Ｏ−チオカルバメートリンカーを含むＢＰ−Ａｂ複合体の合成の合成スキームの一実施形態を示す図である。
【図２２】α−ＯＨ保護ＢＰエステルの合成のスキームの一実施形態を示す図である。
【図２３】ＢＰ３−リンカー３−シプロフロキサシンの合成のスキームの一実施形態を示す図である。
【図２４】プランクトン型黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対するＯ−チオカルバメートＢＰ複合体のＭＩＣ評価の結果を示すグラフと画像である。陰性対照＝培地＋複合体処理されていない微生物；陽性対照＝微生物を含まない滅菌培地。
【図２５】基材としてのポリスチレン上に形成された黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株のバイオフィルムに対する前記チオカルバメート複合体の抗菌活性又は細菌量減少の評価の結果を示すグラフである。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物；陽性対照＝微生物を含まない滅菌希釈物。
【図２６】基材としてのハイドロキシアパタイト上の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８の形成済みバイオフィルムに対して試験されたＯ−チオカルバメートＢＰ複合体の抗菌活性の評価の結果を示すグラフである。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験；対照薬＝対照）。
【図２７】黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８のバイオフィルム形成を防止する能力を評価するＯ−チオカルバメートＢＰ複合体処理済みハイドロキシアパタイトディスクを使用する試験の結果を示すグラフである。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験；対照薬＝対照）。
【図２８】黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８のバイオフィルム形成を防止する能力を評価するＯ−チオカルバメートＢＰ複合体処理済みハイドロキシアパタイトパウダーを使用する試験の結果を示すグラフである。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験；対照薬＝対照）。
【図２９】α−ヒドロキシ改変リセドロネート及びゾレドロネートを示す図である。
【図３０】（１）α−ヒドロキシ基を置換又は除去することにより改変されたＢＰ（ｐ−ＰｙｒＥＢＰ）、（２）ピリジン環のパラ位において置換を行うことにより改変されたＢＰ（ｐ−ＲＩＳ）を示す図である。円で囲まれたＨは前記ビスホスホネート置換炭素鎖のα炭素に結合している。
【００４７】
【図３１】カルバメート結合と対照的にアミド結合を有するＢＰ−シプロフロキサシン複合体（ＢＡＣ、化合物１１）の合成スキームを示す図である。
【図３２】微量希釈法を用いる８株の黄色ブドウ球菌に対する６及び１１の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイの結果を示すグラフである。
【図３３】基材としてのＨＡディスク上に形成された黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株（上のグラフ）及び緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株（下のグラフ）のバイオフィルムに対する６の抗菌物質感受性試験を示すグラフである。全ての試験濃度の６（上のグラフの点付きバー）及び親抗生物質であるシプロフロキサシンによって統計学的に有意な殺菌活性が黄色ブドウ球菌に対して生じた；ｃ＝陰性対照薬。緑膿菌に対して６は生理的ｐＨにおいて８μｇ／ｍＬの濃度で最も有効であり、酸性ｐＨにおいてもこの濃度で有効であったが、シプロフロキサシンは対照と比較して酸性条件又は生理的条件のどちらでも不活性であった。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験）。
【図３４】基材としてのＨＡ上に形成された黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株のバイオフィルムに対する濃度が上昇する１１の抗菌物質感受性試験（上のグラフ）の結果を示すグラフである。濃度対照Ｃ＋と比較するとどの濃度においても有意な活性が観察されない（ｐ＞０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験）。下のグラフはＨＡを予め１１又は親抗生物質であるシプロフロキサシンで処理し、次にそのＨＡに黄色ブドウ球菌を接種する予防実験を示しており、これにもまた抗菌活性が１１に認められない。比較的に高用量の４００μｇ／ｍＬの親薬品で大きな減少が見られるだけである（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験）。
【図３５】ＨＡ上で増殖したアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスＤ７Ｓ−５株のバイオフィルムに対する６の抗菌感受性を示すグラフであり、１５μｇ／ｍＬを超える濃度の複合体６について有効な抗菌プロファイルを示している。
【図３６】インビボ動物試験の抗菌成績を示すグラフである。データは細菌量の減少についての試験化合物の効力を示している。単回高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）の６で最も高い効力が観察され、陰性対照と比較して１０の２乗倍の減少（９９％殺菌活性）が見られた。
【図３７】第２の動物実験の抗菌成績を示すグラフである。データは細菌量の減少、又は組織１グラム当たりの平均ＣＦＵの減少についての６の効力（Ｙ軸）を示している。対照及び複数回低用量投与群（０．３ｍｇ／ｋｇ×３回）と比較して前記複合体が単回高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のときに最も高い効力が観察された（＊ｐ＝０．０００５；独立ｔ検定；エラーバーは標準誤差を表す）。
【図３８】ＢＰ−カルバメート−モキシフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図３９】ＢＰ−カルバメート−ガチフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４０】ＢＰ−ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４１】ＢＰ−ＯＨ−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４２】ＢＰ−Ｏ−チオカルバメート−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４３】ＢＰ−Ｓ−チオカルバメート−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４４】ＢＰ−レゾルシノール−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４５】ＢＰ−ヒドロキノン−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示す図である。
【図４６】ＢＰ−フルオロキノロン類の構造の１つの実施形態を示す図である。
【図４７−１】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４７−２】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４７−３】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４７−４】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４７−５】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４７−６】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４７−７】様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示す図である。
【図４８】アリール基を含有するホスホネート類の構造の１つの実施形態を示す図である。
【図４９−１】ＸがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり得る様々なＢＰを示す図である。
【図４９−２】ＸがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり得る様々なＢＰを示す図である。
【図４９−３】ＸがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり得る様々なＢＰを示す図である。
【図５０】末端一級アミンを有する様々なＢＰを示す図である。
【図５１】末端ヒドロキシル官能基及びアミン官能基を含有するリンカーに結合し、式中、Ｒがリセドロネート、ゾレドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、又はアレンドロネートであり得るリンカーに結合している様々なＢＰを示す図である。
【図５２−１】様々なＢＰ−パミドロネート−シプロフロキサシン複合体を示す図である。
【図５２−２】様々なＢＰ−パミドロネート−シプロフロキサシン複合体を示す図である。
【図５２−３】様々なＢＰ−パミドロネート−シプロフロキサシン複合体を示す図である。
【００４８】
【図５３】様々なＢＰ−アレンドロネート−シプロフロキサシン複合体を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本開示をさらに詳細に説明する前に、本開示は説明される特定の実施形態に限定されず、したがって当然変化し得ることを理解されたい。本明細書において使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定を意図するものではないことも理解されたい。
【００５０】
数値の範囲が提供されている場合、文脈によって別途明確に指示されない限り下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値の間にある各介在値、及びその記載範囲内の他の任意の記載値又は介在値が本開示に包含されると理解される。これらの小範囲の上限値と下限値は独立してそれらの小範囲に含まれてよく、また本開示に包含されるが、その記載範囲中の特に除外される任意の限界値が優先される。記載範囲が前記限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度の一方又は両方を除外する範囲もまた本開示に含まれる。
【００５１】
別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用途は本開示が属する技術分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同等又は均等であるどんな方法及び材料も本開示の実施又は検討において使用可能であるが、好ましい方法及び材料をこれより説明する。
【００５２】
本明細書の中で引用される全ての刊行物及び特許は、それぞれ個々の刊行物又は特許が参照により援用されると具体的、且つ、個別に示されたかのように参照により本明細書に援用され、且つ、引用されたそれらの刊行物が関連する方法及び／又は材料を開示及び記載するために参照により本明細書に援用される。どの刊行物の特記も本願の出願日よりも前のその刊行物の開示のためのものであり、先行開示のために本開示がその刊行に先行するという資格が無いと認めたと解釈されてはならない。さらに、提示される刊行日は独立して確認される必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性がある。
【００５３】
本開示を読めば当業者には明らかになるように、本明細書において記載及び例示される個々の実施形態のそれぞれが、本開示の範囲又は主旨から逸脱することなく他の幾つかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分けられる、又はいずれかの特徴と組み合わせられる別個の要素及び特徴を有する。列挙されるあらゆる方法を列挙された順序で実施することも論理的に可能である他のあらゆる順序で実施することも可能である。
【００５４】
本開示の実施形態は別途指示されない限り分子生物学、微生物学、ナノテクノロジー、薬理学、有機化学、生化学、植物学等の技術であって当分野の技術内にある技術を使用する。そのような技術は文献中に充分に説明されている。
【００５５】
定義
本明細書において別途明示されない限り、以下の定義が提供される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「約」、「およそ」等が数値変数と共に使用されるとその言葉はその変数の値、及び表示されている値の実験誤差内（例えば平均値の９５％信頼区間内）か、又は±１０％の範囲内のどちらか大きい方の範囲内にあるその変数の全ての値を指すことが一般的である。
【００５７】
本明細書において互換的に使用される場合、「対象」、「個体」、又は「患者」は脊椎動物、好ましくは哺乳類動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳類動物にはネズミ、類人猿、ヒト、家畜、競技動物、及び愛玩動物が含まれるがこれらに限定されない。「愛玩動物」という用語にはイヌ、ネコ、モルモット、マウス、ラット、ウサギ、フェレット等が含まれる。「家畜」という用語にはウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ブタ、ウシ、ロバ、リャマ、アルパカ、七面鳥等が含まれる。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「対照」は比較目的のために実験に使用され、且つ、独立変数以外の変数の効果を最小限にする、又は区別するために含まれる代わりの対象又は試料を指すことができる。
【００５９】
本明細書において使用される場合、本明細書に記載されるビスホスホネートの類似体などの「類似体」はその親分子の構造的に近縁のメンバー又はビスホスホネートなどの別記された親分子を指すことができる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「複合体化」は１又は複数の共有結合又は非共有結合を介した２又は複数の化合物の相互直接結合を指すことができる。本明細書において使用される「複合体化」という用語はリンカーなどの介在性化合物を介した２又は複数の化合物の相互間接結合も指すことができる。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「医薬製剤」は組成物を試験管内、生体内、又は生体外での診断用使用、治療用使用、又は予防用使用に適切なものにする活性薬剤、化合物、又は成分と医薬的に許容可能なキャリア又は賦形剤との組合せを指す。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「医薬的に許容可能なキャリア又は賦形剤」は全般的に安全であり、非毒性であり、且つ、生物学的にも他の点でも有害ではない医薬製剤の調製に有用であるキャリア又は賦形剤を指し、ヒト用の製薬用途と同様に獣医向け用途にも許容可能なキャリア又は賦形剤を含む。本明細書及び特許請求の範囲において使用される「医薬的に許容可能なキャリア又は賦形剤」には１つのそのようなキャリア又は賦形剤と１つより多くのそのようなキャリア又は賦形剤の両方が含まれる。
【００６３】
本明細書において使用される場合、「医薬的に許容可能な塩」は、それらの塩を医薬品としての用量で投与する対象にとって非毒性である対イオンを有するあらゆる酸付加塩又は塩基付加塩を指す。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「活性薬剤」又は「活性成分」は効果の全体又は一部の原因であると考えられる組成物の一成分又は複数の成分を指す。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「用量」、「単位用量」、又は「投与量」は対象における使用に適切な物理的に別個の単位を指しており、それぞれの単位はその投与に関連して所望の応答又は所望の複数の応答を生じるように計算された所定の量の本明細書に記載されるＢＰキノロン複合体などのＢＰ複合体、組成物、又は製剤を含有する。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「誘導体」は、ある化合物と同じ、又は類似のコア構造を有するが、１又は複数の原子又は官能基の置換、欠失、及び／又は付加を含む少なくとも１つの構造上の差を有するあらゆる化合物を指す。「誘導体」という用語は出発物質又は中間体のどちらかとしての親化合物から誘導体が合成されるように思えるが、そのような意味ではない。「誘導体」という用語は親化合物のプロドラッグ又は代謝物を含み得る。誘導体には親化合物中の遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホンアミド、ベンズオキシカルボアミド、ｔ−ブチルオキシカルボアミド、チオウレタン型誘導体、トリフルオロアセチルアミド、クロロアセチルアミド、又はホルムアミドを形成する化合物が含まれる。誘導体には親化合物中のカルボキシル基が誘導体化されてメチル及びエチルエステル、又は他のタイプのエステル、アミド、ヒドロキサム酸、又はヒドラジドを形成する化合物が含まれる。誘導体には親化合物中のヒドロキシル基が誘導体化されてＯ−アシル誘導体、Ｏ−カルバモイル誘導体、又はＯ−アルキル誘導体を形成する化合物が含まれる。誘導体には供与基親化合物中の水素結合供与基がＯＨ、ＮＨ、又はＳＨなどの別の水素結合供与基によって置き換えられている化合物が含まれる。誘導体は親化合物中の水素結合受容基をエステル、エーテル、ケトン、カーボネート、第三級アミン、イミン、チオン、スルホン、三級アミド、及びスルフィドなどの別の水素結合受容基で置き換えることを含む。「誘導体」には一例として飽和若しくは不飽和シクロヘキサン又は他のより複雑な環、例えば窒素含有環によるシクロペンタン環の置換による拡大部分、及び様々な基によるこれらの環の拡大部分も含まれる。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「投与すること」は経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、経皮投与、筋肉内投与、関節内投与、非経口投与、細動脈内投与、皮内投与、脳室内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、傷害内投与、鼻腔内投与、直腸投与、膣内投与、吸入による投与、又は移植貯留槽を介した投与を指す。「非経口」という用語には皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、傷害内、及び頭蓋内の注射又は注入技法が含まれる。
【００６８】
本明細書において使用される「置換された」という用語は本明細書に記載される化合物の全ての許容可能な置換基に当てはまる。広義では許容可能な置換基には有機化合物の非環式置換基及び環式置換基、分岐型置換基及び非分岐型置換基、炭素環置換基及び複素環置換基、芳香族置換基及び非芳香族置換基が含まれる。例となる置換基はハロゲン、ヒドロキシル基、又はあらゆる数の炭素原子、例えば１〜１４個の炭素原子を含有する他のあらゆる有機基を含むがこれらに限定されず、所望により直鎖状、分岐型、又は環状の構造形式で酸素、硫黄、又は窒素などの１又は複数のヘテロ原子を含んでもよい。代表的な置換基にはアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基が挙げられる。
【００６９】
本明細書において使用される場合、「適切な置換基」は化学的及び医薬的に許容可能な基、すなわち本発明の化合物の調製をあまり妨害しない、又は本発明の化合物の効力を大きく損なわない部分を意味する。そのような適切な置換基は当業者によって日常的に選択され得る。適切な置換基には次のもの、すなわちハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニル、（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜Ｃ７ヘテロシクロアルキル、（Ｃ３〜Ｃ７ヘテロシクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ６アルキル、（Ｃ３〜Ｃ７ヘテロシクロアルキル）Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、（Ｃ３〜Ｃ７ヘテロシクロアルキル）Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、ヒドロキシ、カルボキシ、オキソ、スルファニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルスルファニル、アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキル、ヘテロアラルキル、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、ニトロ、シアノ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノ、ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノ、カルバモイル、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）カルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ）カルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノカルボニル、ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）アミノカルボニル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）スルホニル、及びアリールスルホニルが含まれるがこれらに限定されない。適切な置換基として上に挙げられた基は以下に定義される通りであるが、適切な置換基はさらに所望により置換されなくてもよいことを例外とする。
【００７０】
「アルキル」という用語は飽和脂肪族基のラジカル（すなわち、１個の水素原子が取り除かれたアルカン）を指し、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む。
【００７１】
幾つかの実施形態では、直鎖又は分岐鎖アルキルはその骨格中に３０個以下の炭素原子（例えば、直鎖についてはＣ１〜Ｃ３０、及び分岐鎖についてはＣ３〜Ｃ３０）を有し得る。他の実施形態では、直鎖又は分岐鎖アルキルはその骨格中に２０個以下、１５個以下、又は１０個以下の炭素原子を含み得る。同様に、幾つかの実施形態では、シクロアルキルはそれらの環構造中に３〜１０個の炭素原子を有し得る。これらの実施形態のうちの幾つかでは、シクロアルキルは環構造中に５個、６個、又は７個の炭素を有し得る。
【００７２】
本明細書において使用される「アルキル」（又は「低級アルキル」）という用語は「非置換アルキル」と「置換アルキル」の両方を含むものとされ、後者は炭化水素骨格の１又は複数の炭素上の水素を置換する１又は複数の置換基を有するアルキル部分を指す。そのような置換基にはハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、又はアシル等）、チオカルボニル（チオエステル、チオアセテート、又はチオホルマート等）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィナート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族若しくは複素芳香族部分が含まれるがこれらに限定されない。
【００７３】
炭素数が別途明示されない限り、本明細書において使用される「低級アルキル」は、その骨格構造中に１〜１０個の炭素を有することを除いて上で定義された通りのアルキル基を意味する。同様に、「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」は同様の鎖長を有する。
【００７４】
炭化水素鎖上の置換された部分はそれ自体が適切な場合に置換され得ることを当業者は理解する。例えば、置換アルキルの置換基はハロゲン、ヒドロキシ基、ニトロ基、チオール基、アミノ基、アジド基、イミノ基、アミド基、ホスホリル基（ホスホネート及びホスフィナートを含む）、スルホニル基（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイル及びスルホネートを含む）、及びシリル基、並びにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、及びエステル）、−ＣＦ３、−ＣＮ等を含み得る。シクロアルキルは同様に置換され得る。
【００７５】
「ヘテロアルキル」という用語は本明細書において使用される場合に少なくとも１個のヘテロ原子を含有する直鎖又は分岐鎖又は環状の炭素含有ラジカル、又はそれらの組合せを指す。適切なヘテロ原子にはＯ、Ｎ、Ｓｉ、Ｐ、Ｓｅ、Ｂ、及びＳが含まれるがこれらに限定されず、リン原子及び硫黄原子は所望により酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は所望により四級化されてもよい。ヘテロアルキルはアルキル基について上で定義されたように置換され得る。
【００７６】
「アルキルチオ」という用語は上で定義された通りのアルキル基であって、それに硫黄ラジカルが結合したものを指す。好ましい実施形態では「アルキルチオ」部分は−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、及び−Ｓ−アルキニルのうちの１つによって表現される。代表的なアルキルチオ基にはメチルチオ、エチルチオ等が挙げられる。「アルキルチオ」という用語はシクロアルキル基、アルケン及びシクロアルケン基、並びにアルキン基も包含する。「アリールチオ」はアリール基又はヘテロアリール基を指す。アルキルチオ基はアルキル基について上で定義されたように置換され得る。
【００７７】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、長さ及び置換可能性の点で上記のアルキルと類似しているが、それぞれ少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含む不飽和脂肪族基を指す。
【００７８】
「アルコキシル」又は「アルコキシ」という用語は本明細書において使用される場合に上で定義された通りのアルキル基であって、それに酸素ラジカルが結合したものを指す。代表的なアルコキシル基にはメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等が挙げられる。「エーテル」は酸素によって共有結合された２つの炭化水素である。したがって、アルキルの置換基であって、そのアルキルをエーテルにする、又はアルコキシル様のものにする置換基は−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、及び−Ｏ−アルキニルのうちの１つによって表現可能である。「アロキシ」及び「アリールオキシ」という用語は本明細書において互換的に使用される場合に−Ｏ−アリール又はＯ−ヘテロアリールによって表現可能であり、アリール及びヘテロアリールは下で定義される通りである。アルコキシ基及びアロキシ基はアルキルについて上に記載されたように置換され得る。
【００７９】
「アミン」及び「アミノ」（及びそのプロトン化形）という用語が当技術分野において理解されており、且つ、非置換型と置換型の両方のアミン、例えば次の一般式によって表現可能な部分を指す。
【００８０】
【化１０】
2019518792.tif 000012
【００８１】
式中、Ｒ、Ｒ’、及びＲ”はそれぞれ独立して水素、アルキル、アルケニル、又は−（ＣＨ２）ｍ−ＲＣを表し、又はＲとＲ’が結合しているＮ原子と一緒になって環構造中に４〜８個の原子を有する複素環を完成し、ＲＣはアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、複素環、又は多重環を表し、ｍは０又は１〜８の範囲の整数である。幾つかの実施形態ではＲ又はＲ’のうちの一方だけがカルボニルであり得、例えば、Ｒ、Ｒ’、及び窒素が一緒にイミドを形成することがない。他の実施形態では「アミン」という用語はアミドを包含せず、その場合に例えばＲ及びＲ’のうちの一方がカルボニルを表す。その他の実施形態ではＲ及びＲ’（及び所望によりＲ”）はそれぞれ独立して水素、アルキル若しくはシクロアルキル、アルケニル若しくはシクロアルケニル、又はアルキニルを表す。したがって、本明細書において使用される「アルキルアミン」という用語は上で定義された通りのアミン基であって、それに（アルキルについて上に記載されたような）置換アルキル又は非置換アルキルが結合したもの、すなわちＲ及びＲ’のうちの少なくとも一方がアルキル基であるものを意味する。
【００８２】
「アミド」という用語はアミノ置換カルボニルとして当技術分野において理解されており、且つ、次の一般式によって表現可能である部分を含む。
【００８３】
【化１１】
2019518792.tif 000013
【００８４】
式中、Ｒ及びＲ’は上で定義された通りである。
【００８５】
本明細書において使用される場合、「アリール」はＣ５〜Ｃ１０員の芳香族環系、複素環系、融合芳香族環系、融合複素環系、二芳香族環系、又は二複素環系を指す。広く定義すると、「アリール」は本明細書において使用される場合に０〜４個のヘテロ原子を含んでもよい５員、６員、７員、８員、９員、及び１０員の単環式芳香族基、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン等を含む。環構造中にヘテロ原子を有するアリール基は「アリール複素環」又は「複素芳香族」と呼ばれることもある。芳香族環は環の１又は複数の位置においてハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ（又は四級化アミノ）、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族若しくは複素芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ、及びそれらの組合せを含むがこれらに限定されない１又は複数の置換基によって置換され得る。「アリール」という用語はフェニルを含む。
【００８６】
「アリール」という用語は、２又は複数の炭素が２つの隣接する環の間で共通である２又は複数の環状環を有する多重環系（すなわち、「融合環」）であって、それらの環のうちの少なくとも１つが芳香族である多重環系も含み、例えば他の環状環又は他の複数の環状環はシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、及び／又は複素環であり得る。複素環の例にはベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニル、及びキサンテニルが挙げられるがこれらに限定されない。それらの環のうちの１、又は複数が「アリール」について上で定義されたように置換され得る。
【００８７】
「アラルキル」という用語は、本明細書において使用される場合、アリール基（例えば芳香族基又は複素芳香族基）で置換されたアルキル基を指す。
【００８８】
「アラルキルオキシ」という用語は−Ｏ−アラルキルによって表現可能であり、その場合にアラルキルは上で定義された通りである。
【００８９】
「炭素環」という用語は、本明細書において使用される場合、環の各原子が炭素である芳香族環又は非芳香族環を指す。
【００９０】
「複素環」又は「複素環の」という用語は、本明細書において使用される場合に、〜１０個の環原子、幾つかの実施形態では５〜６個の環原子を含有する単環式又は二環式の構造体であって、それらの環原子が炭素及び１〜４個のヘテロ原子であり、各ヘテロ原子が非過酸化物性酸素、硫黄、及びＹが存在しないか、又はＨ、Ｏ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、フェニル若しくはベンジルであるＮ（Ｙ）からなる群より選択され、且つ、所望により１〜３個の二重結合を含んでよく、且つ、所望により１又は複数の置換基で置換されてもよい前記構造体を指す。複素環の例にはベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ−インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキセパニル、オキセタニル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４−ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニル、及びキサンテニルが含まれるがこれらに限定されない。所望により複素環基はアルキル及びアリールについて上で定義されたように１又は複数の位置において１又は複数の置換基、例えば、ハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィナート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族若しくは複素芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ、又はそのようなもので置換され得る。「複素環」又は「複素環の」という用語は、ヘテロサイクル又は複素環を含み得る化合物を説明するために使用され得る。
【００９１】
「カルボニル」という用語が当技術分野において理解されており、且つ、次の一般式によって表現可能であるような部分を含む。
【００９２】
【化１２】
2019518792.tif 000014
【００９３】
式中、Ｘは結合であるか、又は酸素若しくは硫黄を表し、Ｒ及びＲ’は上で定義された通りである。Ｘが酸素であり、且つ、Ｒ又はＲ’が水素ではない場合、前記式は「エステル」を表す。Ｘが酸素であり、且つ、Ｒが上で定義された通りである場合、前記部分は本明細書においてカルボキシル基と呼ばれ、特にＲが水素であるときに前記式は「カルボン酸」を表す。Ｘが酸素であり、且つ、Ｒ’が水素である場合、前記式は「ホルマート」を表す。上の式の酸素原子が硫黄によって置き換えられる場合、一般的に前記式は「チオカルボニル」基を表す。Ｘが硫黄であり、且つ、Ｒ又はＲ’が水素ではない場合、前記式は「チオエステル」を表す。Ｘが硫黄であり、且つ、Ｒが水素である場合、前記式は「チオカルボン酸」を表す。Ｘが硫黄であり、且つ、Ｒ’が水素である場合、前記式は「チオホルマート」を表す。他方、Ｘが結合であり、且つ、Ｒが水素ではない場合、上の式は「ケトン」基を表す。Ｘが結合であり、且つ、Ｒが水素である場合、上の式は「アルデヒド」基を表す。
【００９４】
本明細書において使用される「ヘテロ原子」という用語は、炭素又は水素以外のあらゆる元素の原子を意味する。例となるヘテロ原子にはホウ素、窒素、酸素、リン、硫黄、ケイ素、ヒ素、及びセレンが挙げられるがこれらに限定されない。窒素などのヘテロ原子はそれらのヘテロ原子の価数に当てはまる水素置換基、及び／又は本明細書に記載される有機化合物からなるあらゆる許容可能な置換基を有し得る。「置換」又は「置換された」という用語にはそのような置換が置換原子及び置換基の許された価数に合致すること、及びその置換によって安定な化合物、すなわち自然に再構成、環化、脱離等のような変質を起こすことがない化合物が生じるという暗黙の条件が含まれることが理解される。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「ニトロ」という用語は−ＮＯ２を指し、「ハロゲン」という用語は−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉを指し、「スルフヒドリル」という用語は−ＳＨを指し、「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨを指し、「スルホニル」という用語は−ＳＯ２−を指す。
【００９６】
本明細書において使用される場合、カルバミン酸（ＮＨ２ＣＯＯＨ）に由来する化合物を指すために「カルバメート」という用語を使用することができ、その用語はカルバメートエステルを含むことができる。「カルバメート」は次の一般構造を有することができる。
【００９７】
【化１３】
2019518792.tif 000015
【００９８】
式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はあらゆる許容可能な置換基であり得る。
【００９９】
本明細書において使用される場合、「有効量」は研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家が求めている組織、系、動物、植物、原生生物、細菌、酵母、又はヒトの望ましい生物学的応答又は医学的応答を誘発することになる本明細書に記載される組成物又は本明細書に記載される医薬製剤の量を指すことができる。その所望の生物学的応答は骨の形成及び／又は再構築の調整であり得、それには骨吸収の調整及び／又は本明細書に記載されるＢＰキノロン複合体などのＢＰ複合体の取り込みの調整が含まれるがこれらに限定されない。有効量は前記組成物又は医薬製剤の正確な化学構造、感染の原因因子及び／又は感染の重症度、治療又は予防される疾患、障害、症候群、又はそれらの症状、投与経路、投与期間、排出速度、薬品の組合せ、担当医師の判断、剤形、並びに治療を受ける対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び／又は食事に応じて変化する。「有効量」は細菌又は細菌集団を含むがこれらに限定されない微生物の増殖又は繁殖を抑制するのに有効である本明細書に記載される組成物の量を指すことができる。「有効量」は細菌又は細菌集団を含むがこれらに限定されない微生物を殺菌する本明細書に記載される組成物の量を指すことができる。「有効量」は必要とする対象において骨髄炎を治療及び／又は予防するのに有効である本明細書に記載される組成物の量を指すことができる。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「治療的」という用語は通常、疾患、障害、体調、又は副作用の治療、治癒、及び／又は改善、又は疾患、障害、体調、若しくは副作用の進行速度の減少に関連し得る。前記用語は正常な生理的機能、一時緩和的治療、及び疾患、障害、体調、副作用、又はそれらの症状の部分的治療の強化もその範囲内に含む。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「治療すること」及び「治療」という用語は通常、所望の薬理学的及び／又は生理学的硬化を得ることに関連し得る。その効果は疾患、症状、又はそれらの状態の防止又は部分的防止の点で予防的であり得る。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「相乗的効果」、「相乗作用」、又は「相乗」という用語は、２又は複数の分子、化合物、物質、因子、又は組成物の間で生じる効果であって、それらの個々の効果の合計よりも大きな効果、又はその合計とは異なる効果を指す。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「相加的効果」は２又は複数の分子、化合物、物質、因子、又は組成物の間で生じる効果であって、それらの個々の効果の合計に等しい効果、又はその合計と同一である効果を指す。
【０１０４】
本明細書において使用される場合に「生体適合性」という用語は、受容者にとって概ね非毒性であり、且つ、受容者に重大な悪性効果を引き起こさない材料とそのあらゆる代謝物又は分解産物に関連する。一般的に言うと生体適合性材料は患者に投与されたときに重大な炎症応答又は免疫応答を誘発しない材料である。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、骨髄炎という用語は、急性又は慢性の骨髄炎、及び／又は糖尿病足性骨髄炎、糖尿病性慢性骨髄炎、人工関節感染症、歯周炎、インプラント周囲炎、骨壊死、及び／又は血液原性骨髄炎及び／又は他の骨感染症を指すことができる。
【０１０６】
考察
感染性骨疾患、すなわち骨髄炎は、ヒト医療及び獣医医療における世界的な大問題であり、四肢欠損に関わる後遺症及び死亡の可能性のために深刻な問題であり得る。骨髄炎に対する治療アプローチは主に抗菌剤によるものであり、長期間のアプローチであることが多く、多くの症例で感染を管理するために外科的介入を伴う。長骨骨髄炎の大半の症例における原因病原体は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のバイオフィルムであり、それらの黄色ブドウ球菌はそれらのプランクトン型（浮遊型）の対応物と対照的に骨に結合する。他の骨感染症が広範囲のグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方から生じることが知られている。
【０１０７】
多くのバイオフィルム病原体が培養不可能であり、且つ、（それらのプランクトン型の対応物と比較すると）増殖速度及び抗菌剤耐性に関して変化した表現型を示すため、骨髄炎のバイオフィルム介在性は臨床上及び実験上の設定において重要である。整形外科領域における感染症について比較的に高い成功率の抗菌剤治療が一般的に未だに実現していない理由は耐性バイオフィルム病原体の発生、骨内での抗菌剤の低い浸透度、及び全身毒性に関連付けられている有害事象と共に従来の抗生物質によってバイオフィルムを根絶することが困難であるということによって部分的に説明される。
【０１０８】
骨髄炎治療に伴う多くの困難を克服するため、全身曝露を最小限にしながら抗生物質の比較的に高い、又は比較的に持続的な局所的治療濃度を骨において達成するための骨標的複合体を使用する薬物送達アプローチに関心が高まっている。ビスホスホネート（ＢＰ）、例えば骨吸着性ＢＰに複合体化されたフルオロキノロン抗生物質及び非フルオロキノロン抗生物質は各成分の安全性についての長期の実績及びそれらの有利な生化学的特性のために有望なアプローチである。この状況におけるフルオロキノロンファミリーの初期の研究の中でシプロフロキサシンはＢＰに結合しているときに最良の結合特性及び微生物学的特性を示した。シプロフロキサシンはこの状況での目的再設定に対して幾つかの利点を有する。すなわち、シプロフロキサシンでは経口投与又は静脈内投与が可能であり、それらの投与は生物学的に見て比較的に同等であり、シプロフロキサシンは最も一般的に出会う骨髄炎病原体を含む広範囲の抗菌活性を有し、シプロフロキサシンは臨床的に達成可能な用量において殺菌活性を示し、シプロフロキサシンはフルオロキノロンファミリーの中で最も安価な薬品である。
【０１０９】
ＢＰファミリーは、その特異的な骨標的特性のため、骨髄炎薬物療法における骨への抗生物質の導入にとって理想的なキャリアとなっている。ＢＰはカルシウムと強力な二座配位結合及び三座配位結合を形成し、結果としてハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、特に代謝活性が高い部位、又は感染及び炎症部位のハイドロキシアパタイトに濃縮される。ＢＰは化学的分解と生物学的分解の両方に対する例外的な安定性も示す。ＢＰとの複合体化を介して骨をシプロフロキサシンの標的とするという考えが年とともに多数の報告書の中で考察されている。
【０１１０】
ＢＰ及びフルオロキノロン類、例えばシプロフロキサシンのこれらの肯定的な属性にもかかわらず、ＢＰ及びフルオロキノロン類、例えばシプロフロキサシンを含有するプロドラッグを作製する現在の試みは成功していない。大半の試みが、たいていファーマコフォア要件に抵触することによって複合体のどちらの構成要素も不活性化することが分かっている全身的に不安定なプロドラッグか切断不可能な複合体のどちらかになって終わった。
【０１１１】
現在のＢＰフルオロキノロン複合体の欠点を念頭に置いて、キノロン、例えばシプロフロキサシンに対して分離可能に複合体化可能であるＢＰを含有し得るＢＰキノロン複合体を本明細書において説明する。複数の実施形態において前記ＢＰキノロン複合体は対象においてキノロンを骨、骨移植片、及び／又は代替骨移植片へ選択的に送達することができる（すなわち、骨、骨移植片、又は代替骨移植片を標的とすることができる）。幾つかの実施形態では前記ＢＰキノロン複合体は前記キノロンを分離することができる。本明細書はＢＰキノロン複合体の合成方法及び本明細書において提供される１又は複数の前記ＢＰキノロン複合体を使用する骨髄炎又は他の骨感染症の治療方法又は予防方法も提供する。
【０１１２】
以下の図面、発明を実施するための形態、及び実施例を検討すると本開示の他の組成物、化合物、方法、特徴、及び利点が当業者に明らかになる。全てのそのような追加の組成物、化合物、方法、特徴、及び利点がこの説明の中に含まれ、且つ、本開示の範囲内にあるものとする。
【０１１３】
ビスホスホネート（ＢＰ）キノロン複合体及びそれらの製剤
ＢＰキノロン複合体  
本明細書はＢＰキノロン複合体及びそれらの製剤を提供する。ＢＰはリンカーを介してキノロンに複合体化され得る。複数の実施形態において前記リンカーは分離可能リンカーである。前記キノロンはリンカーを介して分離可能に前記ＢＰに結合し得る。したがって、幾つかの実施形態では前記ＢＰキノロン複合体は骨、骨移植片、又は代替骨移植片に、又はその近傍に前記キノロンを選択的に送達し、且つ、分離することができる（図１３）。換言すると、前記ＢＰフルオロキノロン複合体は骨及び／又は骨の近接領域へのフルオロキノロン類の標的化送達を提供することができる。本明細書において提供される前記ＢＰキノロン複合体のＢＰはあらゆるＢＰであり得、そのＢＰにはヒドロキシルフェニルアルキル又はアリールビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｏｒ  ａｒｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ  （ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、アミノフェニル（又はアリール）アルキルヒドロキシルビスホスホネート（ａｍｉｎｏ  ｐｈｅｎｙｌ（ｏｒ  ａｒｙｌ）  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、ヒドロキシルアルキルヒドロキシルビスホスホネート（ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｌｋｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）（前記化合物の全てがさらに置換されていないか、又はさらに置換されている）、エチドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート、アレンドロネート、イバンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート、ヒドロキシメチレンビスホスホネート、及びそれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。ビスホスホネートはホスホノホスフ���ン酸又はホスホノカルボン酸の代わりにもなり得る。複数の実施形態において前記ＢＰは、改変されていなくても本明細書に記載されるように改変されてもよい、パミドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、ゾレドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート、エチドロネートであり得る。
【０１１４】
前記ＢＰはα−ヒドロキシ基（例えばα−ヒドロキシ改変リセドロネート及びゾレドロネート；図２９）を含有するように改変され得る。他のＢＰも同様に改変可能である。幾つかの実施形態では前記ＢＰはα−ヒドロキシ基を置換又は除去することにより改変され得る（図３０；例えばｐ−ＰｙｒＥＢＰ）。前記α−ヒドロキシル基の除去又は置換によって未改変の同等のＢＰと比較して前記ＢＰの骨吸収抑制効果を低減又は削減することができる。したがって、幾つかの実施形態では本明細書において提供される前記ＢＰ複合体は前記α−ヒドロキシ基を有しないか、又は置換α−ヒドロキシ基を有するＢＰを含有し得る。α−ヒドロキシ基の適切な代わりにはＨ、アルキル、アリール、アルキルアリールが含まれ得るがこれらに限定されない。前記ＢＰに複合体化されるその他の追加的な分子も骨吸収抑制効果に影響し得る。例えば、前記キノロン及び／又はリンカーがパラ位置換サイドチェンジを有する前記ＢＰに結合しているとき、骨吸収抑制効果が大いに低減又は削減され得る。幾つかの実施形態では前記ＢＰはαヒドロキシル欠失又は置換とパラ位置換側鎖の両方を含むように改変され得る。
【０１１５】
アリール又はフェニルを含有するＢＰではそのアリール又はフェニルは環上のあらゆる位置で適切な置換基によって置換され得る。幾つかの実施形態では前記ＢＰのアリール環又はフェニル環は１又は複数の電子供与種（例えばＦ、Ｎ、及びＣｌ）によって置換される。
【０１１６】
ＢＰ作用が無いフルオロキノロン送達目的で薬理学的に不活性のＢＰ変異体を使用してもよい。
【０１１７】
前記キノロンはあらゆるキノロンであり得、そのキノロンにはアラトロフロキサシン、アミフロキサシン、バロフロキサシン、ベシフロキサシン、カダゾリド、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、デラフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フィナフロキサシン、フレロフロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、イバフロキサシン、ＪＮＪ−Ｑ２、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、ペフロキサシン、プラドフロキサシン、プルリフロキサシン、ルフロキサシン、サラフロキサシン、シタフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン、ザボフロキサシン、ネモノキサシン及びそれらのあらゆる組合せが含まれるがこれらに限定されない。前記キノロンはフルオロキノロンであり得る。
【０１１８】
前記キノロンは式１の一般構造を有することが可能であり、式中、Ｒ１はアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、Ｒ２はアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、Ｒ３はアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得、且つ、Ｒ４はアルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、フェニル、置換フェニル、アリール、置換アリール基、ヘテロアリール基、置換ヘテロアリール基、ハロ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、置換アルコキシ基、フェノキシ基、置換フェノキシ基、アロキシ基、置換アロキシ基、アルキルチオ基、置換アルキルチオ基、フェニルチオ基、置換フェニルチオ基、アリールチオ基、置換アリールチオ基、シアノ基、イソシアノ基、置換イソシアノ基、カルボニル基、置換カルボニル基、カルボキシル基、置換カルボキシル基、アミノ基、置換アミノ基、アミド基、置換アミド基、スルホニル基、置換スルホニル基、スルホン酸基、ホスホリル基、置換ホスホリル基、ホスホニル基、置換ホスホニル基、ポリアリール基、置換ポリアリール基、Ｃ３〜Ｃ２０環基、置換Ｃ３〜Ｃ２０環基、複素環基、置換複素環基、アミノ酸基、ペプチド基、及びポリペプチド基をはじめとする置換基であり得る。
【０１１９】
【化１４】
2019518792.tif 000016
【０１２０】
前記ＢＰは分離可能リンカーを介して前記フルオロキノロンに複合体化され得る。幾つかの実施形態では前記分離可能リンカーはフェニルカルバメートリンカーであり得る。前記分離可能リンカーはアリールカルバメートリンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記リンカーはアリールチオカルバメートリンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記リンカーはフェニルチオカルバメートリンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記チオカルバメートリンカーはＯ−チオカルバメートリンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記チオカルバメートリンカーはＳ−チオカルバメートリンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記リンカーはカーボネートリンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記リンカーは尿素リンカーであり得る。幾つかの実施形態では前記リンカーはアリールジチオカルバメートリンカーであり得る。
【０１２１】
ＢＰキノロン複合体医薬製剤
本明細書は本明細書中のどこかに記載される量のＢＰキノロン複合体を含有し得る医薬製剤をはじめとする製剤も説明する。その量は有効量であり得る。その量は細菌の増殖及び／又は繁殖を抑制するのに有効であり得る。その量は細菌を殺菌するのに有効であり得る。医薬製剤を含む製剤は様々な経路を介した送達向けに製剤化能であり、且つ、医薬的に許容可能なキャリアを含有し得る。全般的にＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅａｄｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ペンシルバニア州（第２０版、２０００年）の中に技術と製剤を見出すことができ、その開示全体を参照により本明細書に援用する。全身投与には筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、及び皮下注射を含む注射が有用である。注射用に本発明の治療組成物は溶液中に、例えばハンクス液又はリンゲル液などの生理学的に適合する緩衝液中に製剤可能である。さらに、前記ＢＰキノロン複合体及び／又はそれらの構成要素は固形形態で製剤され、使用直前に再溶解又は懸濁され得る。凍結乾燥形態も含まれる。前記ＢＰキノロン複合体の医薬製剤を含む製剤は少なくとも無菌であり、且つ、発熱性物質を含まないことを特徴とし得る。これらの製剤はヒト用及び獣医用に使用される製剤を含む。
【０１２２】
適切な医薬的に許容可能なキャリアには水、塩溶液、アルコール、アラビアガム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、又はデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンが含まれるがこれらに限定されず、これらはＢＰキノロン複合体に対して害となるように反応することがない。
【０１２３】
前記医薬製剤は滅菌可能であり、前記ＢＰキノロン複合体に対して害となるように反応することがない助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、着香剤、及び／又は芳香物質等と所望により混合可能である。
【０１２４】
別の製剤は骨髄炎、インプラント周囲炎又はプロテーゼ周囲感染症の予防又は治療のため、及び抜歯窩の維持のための骨移植材料又は骨間隙充填材にＢＰキノロン複合体を添加することを含む。
【０１２５】
医薬製剤はその意図する投与経路と適合するように製剤可能である。投与経路の例には非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮（局所）投与、経粘膜投与、及び直腸内投与が挙げられる。非経口的適用、皮内適用、又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の構成成分、すなわち注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、及び塩化ナトリウム又はブドウ糖などの浸透圧調節剤を含み得る。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基によって調節可能である。非経口製剤はガラス製又はプラスチック製のアンプル瓶、使い捨て注射筒、又は複数回投与用バイアル瓶の中に封入可能である。
【０１２６】
注射用途に適切な医薬製剤を含む製剤は無菌水性溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び無菌注射溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉剤を含み得る。静脈内投与のため、適切なキャリアには生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＭ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ得る。注射可能医薬製剤は無菌であり得、良好な注射針通過特性が存在する限り流体であり得る。注射可能医薬製剤は製造時及び保存時の状態で安定であり得、且つ、細菌及び真菌などの微生物の汚染混入活動に対抗して保存されなければならない。前記キャリアは、例えば水、エタノール、グリセロールのような医薬的に許容可能なポリオール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適正な流動性が、例えば、レシチンなどの被覆の使用、分散剤の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の活動の防止は様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。幾つかの実施形態では前記組成物の中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含めることが有用であり得る。
【０１２７】
無菌注射溶液は必要に応じて本明細書において列挙された成分のうちの１つ、又はそれらの成分の組合せを含む適切な溶媒中に特定量の本明細書に記載されるＢＰキノロン複合体のうちのいずれかを組み入れ、続いてフィルター滅菌することにより調製され得る。概して分散体は基礎分散媒体及び本明細書において列挙された成分に由来する必要な他の成分を含有する無菌ベヒクルの中にＢＰキノロン複合体を組み入れることにより調製され得る。無菌注射溶液調製用の無菌粉剤の場合では、前記活性成分とあらゆる望ましい追加成分の予め濾過滅菌された溶液からそれらの粉末を産出する真空乾燥及び凍結乾燥が有用な調製方法の例である。
【０１２８】
全身投与は経粘膜手段又は経皮手段による可能性もある。経粘膜投与又は経皮投与のため、透過される障壁にとって適切な浸透剤を前記製剤中に使用することができる。そのような浸透剤は当技術分野において一般的に知られており、例えば経粘膜投与向けの浸透剤には界面活性剤、胆汁塩、及び流動性酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は点鼻スプレー剤又は坐剤の使用を介して達成され得る。経皮投与のため、前記ＢＰキノロン複合体は当技術分野において一般的に知られている軟膏、膏薬、ゲル剤、又はクリーム剤に製剤され得る。幾つかの実施形態では前記ＢＰキノロン複合体は経皮送達系を介して適用可能であり、それらの経皮送達系は前記ＢＰキノロン複合体を経皮吸収のためにゆっくりと放出することができる。透過増強剤を使用して条件媒体中の活性因子の経皮浸透を促進することができる。経皮送達用パッチは例えば米国特許第５，４０７，７１３号、第５，３５２，４５６号、第５，３３２，２１３号、第５，３３６，１６８号、第５，２９０，５６１号、第５，２５４，３４６号、第５，１６４，１８９号、第５，１６３，８９９号、第５，０８８，９７７号、第５，０８７，２４０号、第５，００８，１１０号、第４，９２１，４７５号に記載されている。
【０１２９】
経口投与のため、本明細書に記載される製剤はカプセル剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、又は懸濁剤若しくは水剤として提供され得る。その製剤はラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、又はジャガイモデンプンなどの従来の添加物；結合剤、クリスタリンセルロース、セルロース誘導体、アカシアガム、トウモロコシデンプン、ゼラチン、崩壊剤、ジャガイモデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、無水第二リン酸カルシウム、又はデンプングリコール酸ナトリウム、滑沢剤、及び／又はステアリン酸マグネシウムを含有し得る。
【０１３０】
非経口投与（すなわち、消化管以外の経路を介した投与）のため、本明細書に記載される前記製剤は対象の血液と等張である無菌水性溶液と混合され得る。そのような製剤は、水溶液を作製するために塩化ナトリウム、グリシン等のような生理学的に適合可能な物質を含有し、且つ、生理的条件に適合可能である緩衝化されたｐＨを有する水の中に活性成分（例えば前記ＢＰキノロン複合体）を溶解し、そしてその溶液を無菌にすることで調製され得る。その製剤は単位投与用容器又は複数回投与用容器、例えば密封アンプル瓶又はバイアル瓶の中に入れて提供され得る。その製剤は注射、点滴、又は当技術分野において知られている他の手段によって送達され得る。
【０１３１】
経皮投与のため、本明細書に記載される前記製剤をプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、イソプロパノール、エタノール、オレイン酸、Ｎ−メチルピロリドン等のような皮膚浸透増強剤と組み合わせることが可能であり、それらの皮膚浸透増強剤によって本発明の核酸ベクターに対する皮膚の透過性が上昇し、且つ、それらの核酸ベクターが皮膚を通過して血流中に浸透する。本明細書に記載される前記製剤及び／又は組成物をエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン／ビニル酢酸、ポリビニルピロリドン等のような高分子物質とさらに混合してゲル状の組成物を提供することが可能であり、そのゲル状の組成物を塩化メチレンなどの溶媒に溶解し、所望の粘度まで水分を抜き、そしてパッチ剤を提供するための下地材料に添加することが可能である。
【０１３２】
局所的術後感染症又は術後移植片生着不全を防止し、且つ、移植部位における抗生物質の持続性局所的放出を提供するための代替骨移植片又は骨間隙充填材の中に含めるため、本明細書に記載される前記製剤は異種移植材料（ウシ）、自己移植材料（自己）又は同種移植材料（人間の死体）又は合成代替骨と組み合わせ可能である。例えば、担当外科医又は臨床医は市販されているあらゆる既存の代替骨移植片、又は自己移植片と粉末製剤を予め混合することができる。この製剤をこれまでに説明されたあらゆる製剤とさらに組み合わせることができ、且つ、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、コラーゲン、脂肪族ポリエステル（ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、メタクリレート、ポリメチルメタクリレート、樹脂、モノマー、ポリマー、海綿骨同種移植片、ヒトフィブリン、高血小板血漿、高血小板フィブリン、焼き石膏、燐灰石、合成ハイドロキシアパタイト、サンゴ性ハイドロキシアパタイト、珪灰石（ケイ酸カルシウム）、硫酸カルシウム、生体活性ガラス、セラミック、チタン、失活骨マトリックス、非コラーゲン性タンパク質、コラーゲン、及び骨細胞自己融解済み抗原性低下人骨を含む製品と組み合わせることができる。この実施形態ではＢＰキノロン複合体と組み合わせられる前記骨移植材料はペースト、粉末、パテ、ゲル、ヒドロゲル、マトリックス、顆粒、粒子、凍結乾燥粉末、凍結乾燥骨、脱ミネラル化凍結乾燥骨、生鮮又は生鮮凍結骨、皮質海綿骨ミックス、ペレット、ストリップ、プラグ、メンブレン、湿餅を形成するために水でもどされる凍結乾燥粉末、球状体、スポンジ、ブロック、モーセル、スティック、ウェッジ、セメント、又は非晶質粒子からなる製剤の状態であり得る。これらの多くは注射可能製剤の状態で存在してもよく、又は２又は複数の前述の製剤の組合せ（例えばスポンジと注射可能ペースト）として存在してもよい。
【０１３３】
別の実施形態では、ＢＰ−キノロン複合体はトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などの天然型又は組換え型の増殖因子を含有する因子系骨移植片と組み合わせ可能である。別の実施形態ではＢＰキノロン複合体は胚性幹細胞及び／又は成体幹細胞、組織特異的幹細胞、造血性幹細胞、表皮性幹細胞、上皮性幹細胞、歯肉性幹細胞、歯根膜性幹細胞、脂肪幹細胞、骨髄幹細胞、及び血液幹細胞をはじめとする再生医療及び歯科医術において使用される細胞系骨移植片と組み合わせ可能である。したがって、骨伝導性、骨誘導性、骨促進性、骨形成性、又はそれらのあらゆる組合せを有する骨移植片は臨床用途又は治療用途のＢＰキノロン複合体と組み合わせ可能である。
【０１３４】
剤形
本明細書に記載される前記ＢＰキノロン複合体及びその製剤は錠剤、カプセル剤、単回投与注射バイアル、又は単回投与注入バイアルなどの単位剤形で、又は上記製剤の場合のように骨移植材料と混合するための所定の用量として提供され得る。適切な場合、本明細書に記載される剤形はマイクロカプセル化され得る。いずれかの成分の放出を長期化するように、又は持続させるように前記剤形を調製することも可能である。幾つかの実施形態では放出が遅くなっている成分は前記複合型活性薬剤であり得る。他の実施形態では補助成分の放出が遅くなっている。成分の放出を遅くするための適切な方法には前記成分をポリマー、ワックス、ゲル等の材料で被覆すること、又はその材料の中に包埋することが含まれるがこれらに限定されない。遅延放出製剤は、例えば“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ  ｔａｂｌｅｔｓ，”  ｅｄｓ．Ｌｉｂｅｒｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ−Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０００、及び“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）などの標準的な参照文献の中に記載されているように調製され得る。これらの参照文献は賦形剤、材料、装置、並びに錠剤及びカプセル剤の調製方法、並びに錠剤及びペレット剤、カプセル剤、及び顆粒剤の遅延放出剤形についての情報を提供する。その遅延放出はどこでも約１時間〜約３か月又はそれ以上の期間にわたり得る。
【０１３５】
所望の放出プロファイルを生成するために、異なる比率の水溶性重合体、水不溶性重合体、及び／又はｐＨ依存性重合体を使用して水不溶性／水溶性非重合体賦形剤と共に、又は水不溶性／水溶性非重合体賦形剤を使用せずに被覆を形成してもよい。どちらの被覆も（被覆ビーズと共に打錠されるか、又は被覆ビーズを使用せずに打錠された）錠剤、（被覆ビーズを含むか、又は含まない）カプセル剤、ビーズ、粒状組成物、限定されないが懸濁剤形又は散布剤形として製剤される「現状態の成分」を含むがこれらに限定されない剤形（マトリックス型又は簡易型）に対して実施され得る。
【０１３６】
適切な被覆材の例には酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及び酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース重合体；酢酸フタル酸ポリビニル、アクリル酸重合体及び共重合体、並びにＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（Ｒｏｔｈ  Ｐｈａｒｍａ、ヴェスターシュタット、ドイツ）の商品名で市販されているメタクリル酸樹脂、ゼイン、シェラック、及び多糖類が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３７】
有効量
前記製剤は（細菌の抑制及び／又は殺菌に有効な）有効量の本明細書に記載されるＢＰキノロン複合体を含有し得る。幾つかの実施形態ではその有効量は本明細書に記載される前記ＢＰキノロン複合体の約０．００１ｐｇ〜約１，０００ｇ又はそれ以上までの範囲にある。幾つかの実施形態では本明細書に記載される前記ＢＰキノロン複合体の有効量は体重に対して約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１，０００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。さらに他の実施形態では前記ＢＰキノロン複合体の有効量は製剤全体の％（重量／重量）、％（重量／体積）、又は％（体積／体積）で約１％〜約９９％又はそれ以上までの範囲であり得る。幾つかの実施形態では前記ＢＰキノロン複合体の有効量は骨髄炎及びその全ての亜型（例えば糖尿病足骨髄炎）、顎骨壊死、及び歯周炎の原因因子であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａのあらゆる株又は種を含むがこれらに限定されない細菌を殺菌するのに有効である。
【０１３８】
ＢＰキノロン複合体の使用方法
有効量を含む特定量の本明細書に記載される前記ＢＰキノロン複合体及びそれらの製剤はそれらを必要とする対象に投与可能である。幾つかの実施形態ではそれらを必要とする前記対象は骨感染症、骨疾患、骨障害、又はその症状を有する可能性がある。幾つかの実施形態ではそれらを必要とする前記対象は骨感染症、骨疾患、骨障害、又はその症状を有することが疑われる可能性があるか、他の場合としてそのようなものを有する傾向を持つ可能性がある。幾つかの実施形態ではそれらを必要とする前記対象は骨髄炎、骨壊死、プロテーゼ周囲感染症、及び／又はインプラント周囲炎を発症する危険性を有する場合がある。複数の実施形態において前記疾患又は障害は骨髄炎及びその全ての亜型、骨壊死、インプラント周囲炎、又は歯周炎であり得る。幾つかの実施形態ではそれらを必要とする前記対象は細菌などの微生物が感染している骨を有する。幾つかの実施形態では前記細菌はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａのあらゆる株又は種であり得る。幾つかの実施形態では前記細菌はバイオフィルムを形成し得る。幾つかの実施形態では必要とする対象に特定量、例えば有効量の本明細書に記載されるＢＰキノロン複合体又はその製剤を投与することにより前記対象において骨髄炎を治療することが可能である。幾つかの実施形態では本明細書において提供される前記組成物及び化合物は骨壊死の治療及び／又は予防、骨延長法、口唇口蓋裂修復、重症の歯槽上欠損の修復、顎骨再構築、並びに骨及び／又は関節の他のあらゆる再構築又は修復に使用可能である。
【０１３９】
前記ＢＰキノロン複合体の投与は単一の経路に限定されず、複数の経路による投与を包含し得る。例えば、複数の経路による例となる投与には何よりも皮内投与と筋肉内投与の組合せ、又は皮内投与と皮下投与の組合せが挙げられる。複数回の投与は順次投与又は同時投与であり得る。複数の経路による他の適用モードが当業者に明らかになる。
【０１４０】
インビボで対象に対して前記医薬製剤がその効果を発揮することを可能にするあらゆる適切な方法によって前記対象に前記薬剤を投与することが可能である。例えば、経口投与、舌下又はバッカル投与、非経口投与、経皮投与、吸入、経鼻送達、膣内投与、直腸内投与、及び筋肉内投与を含むがこれらに限定されない公知の方法によって前記対象に本明細書に記載される前記製剤及び他の組成物を投与することが可能である。本明細書に記載される前記製剤又は他の組成物は筋膜上送達、嚢内送達、皮内送達、皮下送達、皮内送達、髄腔内送達、筋肉内送達、腹腔内送達、胸骨内送達、血管内送達、静脈内送達、実質送達、及び／又は舌下送達によって非経口的に投与可能である。送達は注射、点滴、カテーテル送達、又は他の幾つかの手段、例えば錠剤又はスプレーによるものであり得る。送達はハイドロキシアパタイト、又は手術部位の抗感染性骨移植材料の場合は骨などのキャリアによるものでもあり得る。送達は骨移植材料との結合又は他の接触によるものであり得る。
【実施例】
【０１４１】
これまでに本開示の実施形態を述べてきたが、以下の実施例は概して幾つかの追加的な本開示の実施形態を説明する。以下の実施例及び対応する文章と図との関連で本開示の実施形態を説明するが、本開示の実施形態をこの説明に限定するつもりはない。反対に本開示の実施形態の主旨及び範囲内に含まれる全ての代替物、改変物、及び均等物を包含するつもりである。
【０１４２】
実施例１
イントロダクション
感染性骨疾患、すなわち骨髄炎は、ヒト医療及び獣医医療における世界的な大問題であり、四肢欠損に関わる後遺症及び死亡の可能性のために深刻な問題であり得る（Ｌｅｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００４；３６４：３６９−７９；  Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｌｉｍｂ  ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ．Ｖｅｔ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍ  Ｐｒａｃｔ  ２０１４；３０：１４３−５５；  Ｓｔｏｏｄｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｐｒａｃｔ  ２０１１；２２：５５８−６３；  Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｌｄｅｒｌｙ：  ａ  ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ  Ｇｅｒｉａｔｒ  ２０１６；１６：７２）。骨髄炎に対する治療アプローチは主に抗菌剤によるものであり、長期間のアプローチであることが多く、多くの症例で感染を管理するために外科的介入を伴う。長骨骨髄炎の大半の症例における原因病原体が黄色ブドウ球菌のバイオフィルムであり、定義によるとこれらの微生物はそれらのプランクトン型（浮遊型）の対応物と対照的に骨（図１）に結合する（Ｗｏｌｃｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  ２００８；２９９：２６８２−２６８４）。
【０１４３】
多くのバイオフィルム病原体が培養不可能であり、且つ、（それらのプランクトン型の対応物と比較すると）増殖速度及び抗菌剤耐性の表現型が変化するため、骨髄炎のバイオフィルム介在性（ｂｉｏｆｉｌｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎａｔｕｒｅ）は臨床上及び実験上の設定において重要である（Ｊｕｎｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｒｅ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｄｅｓｔｒｏｙ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２０１５；７３：４５１−６４；  Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２；  ４５：２３３８−４１）。整形外科領域における感染症について比較的に高い成功率の抗菌剤治療が一般的に未だに実現していない理由は、耐性バイオフィルム病原体の発生、骨内での抗菌剤の低い浸透度、及び全身毒性に関連付けられている有害事象と共に従来の抗生物質によってバイオフィルムを根絶することが困難であるということによって部分的に説明される（Ｂｕｘｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｓｋｅｌｉｔｅ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｏｃａｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｂｏｎｅ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００４；９１：１１９２−６）。
【０１４４】
骨髄炎治療に伴う多くの困難を克服するため、全身曝露を最小限にしながら抗生物質の比較的に高い、又は比較的に持続的な局所的治療濃度を骨において達成するための骨標的複合体を使用する薬物送達アプローチに関心が高まっている（Ｐａｎａｇｏｐｏｕｌｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｏｃａｌ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｆｏｏｔ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：  Ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  Ｂｅｙｏｎｄ？  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｌｏｗ  Ｅｘｔｒｅｍ  Ｗｏｕｎｄｓ  ２０１５；１４：８７−９１；  Ｐｕｇａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｔ  ｍｅｌｔ  ｐｏｌｙ−ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ／ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ．Ａｃｔａ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ  ２０１２；８：１５０７−１８）。骨吸着性ビスホスホネート（ＢＰ）に複合体化されたフルオロキノロン抗生物質は、各成分の安全性についての長期の実績及びそれらの有利な生化学的特性のために有望なアプローチであるＢｕｘｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｓｋｅｌｉｔｅ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｏｃａｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｂｏｎｅ．Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００４；９１：１１９２−６）。この状況におけるフルオロキノロンファミリーの初期の研究の中で、シプロフロキサシンはＢＰに結合しているときに最良の結合特性及び微生物学的特性を示した（Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４５：２３３８−４１）。シプロフロキサシンはこの状況での目的再設定に対して幾つかの利点を有する。すなわち、シプロフロキサシンでは経口投与又は静脈内投与が可能であり、それらの投与は生物学的に見て比較的に同等であり、シプロフロキサシンは最も一般的に出会う骨髄炎病原体を含む広範囲の抗菌活性を有し、シプロフロキサシンは臨床的に達成可能な用量において殺菌活性を示し、シプロフロキサシンはフルオロキノロンファミリーの中で最も安価な薬品である（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５１：６９５５−６９）。
【０１４５】
ＢＰファミリーは、その特異的な骨標的特性により、骨髄炎薬物療法における骨への抗生物質の導入にとって理想的なキャリアとなっている（Ｚｈａｎｇ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，’Ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔｓ’  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ２００７；３６：５０７−３１）。ＢＰはカルシウムと強力な二座配位結合及び三座配位結合を形成し、結果としてハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、特に代謝活性が高い部位、又は感染及び炎症部位のハイドロキシアパタイトに濃縮される（Ｃｈｅｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａｒｅａｓ  ｏｆ  ｔｏｏｔｈ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２０１４；７２：２４６１−８）。ＢＰは化学的分解と生物学的分解の両方に対する例外的な安定性も示す（Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ  ２００８；１９：７３３−５９）。ＢＰとの複合体化を介して骨をシプロフロキサシンの標的とするというコンセプトが、年来多数の報告書の中で考察されている（Ｄａｖｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ［（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｃ  ａｃｉｄｓ］：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｃｉｄ−ｂａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ  ２０１３；４２：２４１４−２２；  Ｆａｒｄｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｔｅ−ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１４；２２：４０４９−６０；  ＥＵＣＡＳＴ：  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＣｓ  ａｎｄ  ｚｏｎｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒｓ．２０１５．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｓｒｃ／ｍｅｄｉａ／ＰＤＦｓ／ＥＵＣ；  ＣＬＳＩ．Ｍ１００−Ｓ２５  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｆｔｈ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２０１５；  Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；１６：９２１７−２９；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１２；４７：６１５−８）。しかしながら、初期の試みは、ファーマコフォア要件に抵触することによってたいてい複合体内のどちらの構成要素も不活性化することが見出される全身的に不安定なプロドラッグか切断不可能な複合体のどちらかになって終わった。フルオロキノロンの分野では、シプロフロキサシン成分の重要な抗グラム陽性細菌特性が安定なＢＰ連結同類物と複合体化されると失われるという顕著な例がＨｅｒｃｚｅｇｈらによって記載された（Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００２；  ４５：２３３８−４１）。この分野でのその後の研究により、これらの複合体だけでは親抗生物質の切断を行わずに顕著な抗菌作用を発揮することはできないことが解明された（Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００２；  ４５：２３３８−４１；  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００８；  ５１：６９５５−６９）。Ｈｏｕｇｈｔｏｎらは例えば様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を合成及び試験し、そしてフェニルプロパノンガチフロキサシンプロドラッグとアシルオキシアルキルカルバメートガチフロキサシンプロドラッグが一度骨に結合するとそれらのプロドラッグはおそらく親薬品を再生することができ、したがって前記抗生物質を分離することができないビスホスホノエチル誘導体、ビスホスホノプロピオニル誘導体、及びアミド誘導体などの単純な複合体よりも高い抗菌活性を示すことを見出した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００８；  ５１：６９５５−６９）。
【０１４６】
まとめると、ＢＰ−フルオロキノロンの抗菌活性は複雑であり、試験した病原体の特定の株、抗生物質及び共有結合したＢＰ部分の選択、それらの２成分の間のテザー長、前記ＢＰの骨結合親和性、前記ＢＰの吸着脱離平衡、並びに複合体化に使用された結合スキームの安定性／易変性及びカイネティクスに関連付けられることがこの分野の現在までの研究知見から示される（Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００２；  ４５：２３３８−４１；  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００８；  ５１：６９５５−６９；  Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；  １６：９２１７−２９；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１２：４７：６１５−８）。したがって、より多くの最適化の機会と成功の機会がこの状況で「ターゲット・リリース」リンカー戦略によって提供され得ることが、蓄積されつつある証拠から示唆される。したがって、我々は代謝により加水分解可能なカルバメートリンカーを介したフェニルＢＰ部分へのシプロフロキサシンの複合体化によって骨髄炎薬物療法における抗生物質の骨への投与に見られる問題が軽減されるはずであると仮説を立てた。その切断可能カルバメート結合と構造モチーフが特定の組織における標的化と分離に適うように設計された多数の薬品における重要な機能であり、酸性かつ酵素的環境（ａｃｉｄｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）が存在する中で血清中の安定性及び感染骨表面での易変性などの薬物動態上の利点をもたらす（Ｏｓｓｉｐｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ２０１５；１２：１４４３−５８；  Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，ｐＨ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１３；３４：４５４４−５４；  Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂａｍａｔｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１５；５８：２８９５−９４０）。
【０１４７】
骨ターゲット・リリース戦略を利用した最近の一つの明確な成功事例が認められており、その事例ではＭｏｒｉｏｋａらが比較的に安定なアミドペプチド結合の切断可能変異体（カルバメート）を使用することでエストラジオール類似体が骨を標的とし、且つ、骨において分離するように設計した（Ｍｏｒｉｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；１８：１１４３−８）。この結合の幾つかのバージョンが、薬理学的に活性を有する変異体（フェニルカルバメート）が見つかる前に試みられた。重要なことに、彼らは単体で投与されたエストラジオールの骨に対する効果と同様の効果が１０００倍低い単回用量の同様に連結されたＢＰ−エストラジオール複合体によって生じることを実証した（Ｍｏｒｉｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；  １８：１１４３−８）。子宮組織において効果が最小であったことから、前記複合体はより高い治療指数又は改善された安全性も提供した。Ａｒｎｓらが完成させた薬物動態学的研究はフェニルカルバメート連結ＢＰ−プロスタグランジンに関連するこの劇的な効力増強と一致する（Ａｒｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｏｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｕａｌ−ａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１２；２０：２１３１−４０）。抗菌分野におけるこのアプローチの合成例がマクロライド系について報告されている。しかしながら、アルキルカルバメートが調べられただけであり、その他の成功例が存在しないことから、ターゲット・リリース戦略は生化学的標的に依存すると同時に（各構成成分の官能基の適合性を考慮すると）化学的分類に依存するようであり、そしてその戦略を使用するためにはいずれか特定の化学分類に適うような設計をする必要があることが示唆される（Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ２０１０；２０：１３５５−９）。
【０１４８】
本実施例は、フェニルカルバメートＢＰ−シプロフロキサシン複合体、及び当該複合体のインビトロにおける一般的な骨髄炎病原体に対する抗菌活性の系統的評価を示しており、本実施例によってインビボ安全性と効力がインプラント周囲骨髄炎の動物モデルにおいて評価された。重要なことに、本明細書において提示されるそれらのインビトロ試験とインビボ試験は、プランクトン型培養物に加えてこの分野において現在まで実施されておらず、且つ、比較的に高い臨床上の妥当性を提供するはずであるバイオフィルムモデルとバイオフィルム方法論に基づいている。本試験は感染性骨疾患の治療において達成されていなかった医療上の要求を具体的に扱っており、したがって技術移転上の重要性に適うように設計されている。
【０１４９】
結果と考察
化学：
１つのＢＰ−シプロフロキサシン複合体（ＢＣＣ、化合物６）の全体的な合成経路が図２Ａ〜２Ｂのスキームに示されている。出発点として我々のプロジェクトチームはこの複合体化のために不活性４−ヒドロキシフェニルエチリデンＢＰを確認した。このＢＰ設計の論理的根拠は、不必要な前記ＢＰ部分の骨吸収抑制活性を抑制しながらその骨探索能力を保持し、交絡因子を最小限にし、且つ、一意的に親シプロフロキサシン化合物に起因する抗菌作用の評価に集中することであった。ＢＰリガンドは、解剖学的感染部位において抗菌作用に加えて骨組織保護という二重作用を提供することが必要である場合は（様々な効力の）骨吸収抑制機能性を有するように設計可能である。弱い結合親和性によって標的化効率が低下すること、及び前記フルオロキノロンと前記ＢＰ官能基との間の距離を長くすることにより、加水分解と前記親化合物の再生を減速することが可能であることが、これまでの研究から実証されているため、我々はこのフェニルＢＰも骨結合親和性とテザー長を考慮して選択した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８；  ５１：６９５５−６９；  Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８，１６：９２１７−２９；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１２，４７：６１５−８）。最も重要なことは、アリールカルバメートをリンカーとして使用することによって、これまでのＢＰ−Ｆキノロン複合体と比べてこの生化学的標的に関して血漿中で最適化された安定性と骨での適切な分離が提供され得る、と我々が考えたことである。したがって、４−ヒドロキシフェニルエチリデンＢＰのテトラエチルエステル（４）をこれまでに記載されたように調製した（Ｄａｖｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ［（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｉｃ  ａｃｉｄｓ］：  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｃｉｄ−ｂａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ  ２０１３；４２：２４１４−２２）。その後、ＢＰ（４）のフェノール基をｐ−ニトロフェニルクロロホルマートで活性化して保護化シプロフロキサシン（７）との複合体化のための化合物（５）を形成した（Ｆａｒｄｅａｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｔｅ−ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃ���ｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１４；２２：４０４９−６０）。二炭酸ジ−ｔ−ブチル（Ｂｏｃ２Ｏ）反応を介してシプロフロキサシン（６）をベンジル（Ｂｎ）基で保護した。加水分解とブロモトリメチルシラン（ＴＭＳＢｒ）による前記複合体（８）の最後の脱保護化によって生化学的評価及び抗菌性評価にすぐに使用可能な我々の第１のフルオロキノロンフェニルカルバメートＢＰ−シプロフロキサシンプロドラッグ（９）が生じる。
【０１５０】
微生物学：
我々が着手した最初の調査では、骨感染症に関連する一団の１４黄色ブドウ球菌臨床株（メチシリン感受性：ＭＳＳＡ及びメチシリン耐性：ＭＲＳＡ）に対する前記複合体の抗菌活性を標準的な実験室用プランクトン型培養システム中で評価することを目的とした。ＥＵＣＡＳＴ（欧州薬剤感受性試験委員会）ガイドラインに従うと、ディスク拡散阻止帯分析法の結果は２５〜４０ｍｍの範囲（平均値：３１．５、ＳＤ：±５）の直径を示し、全ての株がＥＵＣＡＳＴブレイクポイントに従う抗菌薬感受性を示した（ＥＵＣＡＳＴ：  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＣｓ  ａｎｄ  ｚｏｎｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒｓ．２０１５．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｓｒｃ／ｍｅｄｉａ／ＰＤＦｓ／ＥＵＣ）。微量希釈法を用いる１４株全てに対して試験されたＢＰ−シプロフロキサシンのＭＩＣの結果が図３に示されている。基準とするために親化合物であるシプロフロキサシン単体のＭＩＣを同時に決定し（表１を表す）、それらのＭＩＣが確定済み臨床ブレイクポイント２６と矛盾しないことを見出した。この分類のプロドラッグは当該プロドラッグ自体の顕著な抗菌活性を失っており、且つ、どのＢＰ関連抗菌作用も無視できる程度であることが既に証明されており、したがって親薬品の分離があらゆる認知可能な抗菌活性、例えばここで報告される抗菌活性を観察するための前提条件である（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１：６９５５−６９）。
【０１５１】
前記複合体とシプロフロキサシンの両方がプランクトン型黄色ブドウ球菌病原体に対して殺菌活性を有すること、及び複合体化がインビトロでシプロフロキサシンの抗菌活性に影響し、ＭＩＣに到達するためにシプロフロキサシン単体よりもわずかに高い濃度の複合体が必要とされることが、ＡＳＴ及びＭＩＣのデータから示されている。複合体化はＢＰと骨に送達されるべき抗生物質の両方の化学的改変に基づくことが充分に証明されており、結果として治療効果を含む親薬品の特性がそのような改変によって変化する可能性があるので、この結果は予期されるものである。我々の結果は、複合体化に成功した機能的な複合体は親化合物の抗菌活性よりもわずかに低いレベルではあるがその抗菌活性を保持することを示すこの分野の以前の文献とも一致している（Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００２，４５：２３３８−４１；  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００８，５１：  ６９５５−６９；  Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，‘Ｍａｇｉｃ  Ｂｕｌｌｅｔｓ’  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｇｅｎｔｓ）。重要なことに、骨髄炎の治療という状況では病原体は（これらの標準的なアッセイにおけるような）プランクトン型ではなくむしろバイオフィルムであり、且つ、基材としての骨に結合しており、前記ＢＰ−シプロフロキサシン複合体の強化された骨標的特性は（後述のバイオフィルム関連インビトロ及びインビボデータが裏付けるように）抗菌作用に適切な抗生物質の濃度よりも高い濃度を骨にもたらし、したがってより高い効力をもたらすはずである。
【０１５２】
インビトロ抗菌試験に使用される微生物用培地はタンパク質、炭水化物、酵素及び塩／金属を有しているので抗菌試験中のＢＰ−シプロフロキサシンの分解、変性、又はキレート化の可能性が存在する。この分解、変性、又はキレート化は抗生物質活性に悪影響を与えるが、化学的複合体化自体には無関係である可能性があった。我々のＡＳＴ及びＭＩＣの結果と前記複合体の明白な抗菌効果に基づくと、このことは少しもありそうにない。それにもかかわらず、我々は、ＢＰ−シプロフロキサシンをトリプチケースソイブロス微生物用培地に導入し、図４に示されるように定量的分光分析を実施することにより前記複合体の安定性を客観的に評価しようとした。結果として前記抗菌剤の良好な安定性が示され、２４時間後において微生物用培地中での分解又は変性の証拠は無かった。したがって、微生物用培地はおそらく複合体の活性及び効力に対して悪影響を全くかほとんど持たない。
【０１５３】
我々は、前記複合体の抗菌効果及び化学的安定性を確定した後で、次にＨＡ結合能を評価しようとした。ＨＡ球状体を我々の微生物用培地に添加し、そして我々の抗菌試験に使用した濃度と同様の様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシンを導入したところ、ＨＡによる前記複合体の顕著な吸着と保持が上清（ＨＡ球状体を含まない）の定量的分光分析によって確認された（図５）。これらの結果は類似する骨親和性を有するＢＰ部分を含有するこの分類の以前に報告された類似体と一致する（Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；１６：９２１７−２９；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１２；４７：６１５−８）。骨吸着も濃度依存的現象のようであった。
【０１５４】
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株が他の試験株と比較してシプロフロキサシンと前記複合体の両方に対して最小の感受性と最低のＭＩＣプロファイル（図３）を示したので、我々は次にこの菌株をさらに詳しい試験のために選択した。この株は他の試験株と比較してよく知られた強固なバイオフィルム形成性病原体でもある。そのため、我々にはバイオフィルムベースで臨床的に妥当なモデルでの抗菌活性の試験も促進しつつ、バイアス及び結果の過大評価を限定するために、我々の複合体を最も悪性の病原体に対して試験し、そして最適化する可能性があった。そこで、我々は酸性条件と塩基性条件の両方でＢＰ−シプロフロキサシンを用いてプランクトン型黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対してＡＳＴを実施して複合体活性に対するｐＨの効果を評価した。酸性条件下では抗菌活性が全体的に改善され、且つ、塩基性条件下でＭＩＣ５０に到達するために必要とされる前記複合体濃度の半分でＭＩＣ５０に到達する（図６）ことが、標準的な微量希釈法に由来する定量的な結果から示された。宿主の炎症及び破骨細胞形成と共にバイオフィルム病原体が酸性の局所的環境を作り出す骨髄炎への臨床応用にとって、このことは有用である可能性があった。しかしながら他の研究者は、感染性生物及び炎症により生じた局所酸性環境は骨における幾らかの薬物溶出と関連する可能性があるが、充分な濃度の前記抗菌剤を提供する点でそのような過程の効率はおぼつかなく、プロドラッグの設計と複合体化スキームがより大きな役割を果たすだろうと示唆している（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００８；  ５１：６９５５−６９）。最後に、シプロフロキサシン及び前記複合体のＭＩＣはそれぞれそれらの平均殺菌濃度（ＭＢＣ）に等しいこともＡＳＴデータから示された。
【０１５５】
次に前記複合体を用いて時間殺菌アッセイをＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協会）法に従って実施したところ、前記複合体はこれまでに確定されたＭＩＣでプランクトン型黄色ブドウ球菌のメチシリン感受性（ＡＴＣＣ−６５３８）単離株とメチシリン耐性（ＭＲ４−ＣＩＰＳ）単離株を１時間以内、最大で２４時間以内に殺菌し、増殖を１００％抑制することが結果より示された。対照と比較すると前記ＭＩＣの半分で１時間以内に殺菌作用が示され、増殖も最大で２４時間まで抑制される（５０％）ことがこれらのカイネティクス試験によって示された（図７）（ＣＬＳＩ．Ｍ１００−Ｓ２５  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ；  Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｆｔｈ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；  ２０１５）。カイネティクスの結果は試験細菌に対する前記複合体の時間依存的効力と２４時間にわたる持続的殺菌活性を示しており、試験細菌の存在下での切断活性を裏付けている。
【０１５６】
次に我々は、２種類の異なる基材（ポリスチレン及びＨＡディスク）上に予め形成された細菌バイオフィルムに対して前記複合体を試験して、バイオフィルムに対する抗菌効果をこの状況で初めて評価し、且つ、基材特異性が役割を担うかどうかも判定した。黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ−６５３８）のバイオフィルム及び追加として緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ−１５４４２）のバイオフィルムをＢＰ−シプロフロキサシンに曝露し、抗菌活性を評価した。緑膿菌は有病率の点で黄色ブドウ球菌の事例よりもずっと頻度が低いものの、２番目に最も一般的な骨髄炎の臨床病原体であるので、我々は緑膿菌も試験した。図８はバイオフィルム増殖のための基材としてのポリスチレンの結果を示しており、ＢＰ−シプロフロキサシンの最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ５０）は黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８については１５．６〜３１．２ｍｃｇ／ｍＬであり、それはプランクトン型培養物状態のこの株に対するＭＩＣに相当した。その試験濃度範囲では緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株についてＭＢＩＣ５０が認められなかった。
【０１５７】
しかしながら、ＨＡディスクがバイオフィルム基材として使用されると図９に示されるように殺菌活性の顕著な改善が認められ、全ての試験濃度の前記複合体によって統計学的に有意な殺菌活性が生じ、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の低下が起こった。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対して前記複合体のＭＢＩＣ５０は８ｍｃｇ／ｍＬであり、ＭＢＩＣ９０は５０ｍｃｇ／ｍＬであった。この病原体に対して親薬品であるシプロフロキサシンのＭＢＩＣ９０は８ｍｃｇ／ｍＬであった。しかしながら、緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株に対してシプロフロキサシンは全く抑制活性又は殺菌活性を持たず、一方で前記複合体は酸性条件及び塩基性条件下において５０ｍｃｇ／ｍＬの濃度で殺菌性であり、且つ、酸性条件で抗菌活性の改善が認められる黄色ブドウ球菌と対照的に塩基性条件で抗菌活性の改善を示した。まとめると、前記複合体は基材としてのポリスチレンよりも基材としてのＨＡの存在下でバイオフィルム病原体に対して効果的であり、試験される病原体の株及び細菌増殖モード（プランクトン型対バイオフィルム）のような因子に加えて基材特異性が抗菌活性に役割を担うことがこれらの結果から示唆される。このことは以前には実証されておらず、バイオフィルム病原体に対する臨床応用に関するこれらの化合物の抗菌能力に対する見通しがこれにより加えられる。
【０１５８】
最後に我々は、プランクトン型培養物とバイオフィルム培養物を用いる予防型の実験設定であって、骨髄炎向けの抗生物質による予防シナリオにおいて臨床的妥当性を有する可能性もある前記実験設定において前記複合体を使用する抗菌試験を実施した。ここではＨＡ球状体を様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシンに導入し、そして２４時間にわたって黄色ブドウ球菌と共にインキュベートし、そして定量的評価によって図１０に示されるように７．８ｍｃｇ／ｍＬという低い濃度から最大で２５０ｍｃｇ／ｍＬの前記複合体の濃度で細菌増殖が示されず、０．１２〜３．９ｍｃｇ／ｍＬの範囲の複合体濃度では強く抑制された最小の細菌増殖が示された。
【０１５９】
我々は次に黄色ブドウ球菌バイオフィルムを増殖させるための基材としてＨＡディスクを再び使用したが、今度はＢＰ−シプロフロキサシン又はシプロフロキサシンのどちらかとインキュベートした後であって、接種してバイオフィルムを増殖させる前の時点でそれらのディスクを培地で洗浄した。図１１は定量的バイオフィルム培養の結果と２４時間の増殖後のＣＦＵを示しており、１００ｍｃｇ／ｍＬの濃度でシプロフロキサシンは全てのバイオフィルム増殖を抑制し、一方で１０ｍｃｇ／ｍＬの濃度でＢＰ−シプロフロキサシンは全ての増殖を抑制した。シプロフロキサシンの分子質量は前記複合体の分子質量のおよそ半分であるので前記複合体はシプロフロキサシン単体と比較して完全殺菌作用の達成に関して活性が２０倍高かった。これらの発見はプロドラッグからの親薬品であるシプロフロキサシンの酵素切断と経時的分離についての効率的なメカニズムを裏付けている。ＨＡへの効率的な結合及び親抗生物質の切断又は再生は、親抗生物質単体に相当する、又はそれよりも高い実質的な抗菌効果を示すためのこの分類の複合体にとっての必要条件である（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  ２００８；  ５１：６９５５−６９（Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；  １６：９２１７−２９；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ）。
【０１６０】
インビボ安全性及び効力：
このＢＰ−シプロフロキサシン複合体は新しく、インビボでこれまでに試験されていないので、我々はインプラント周囲骨髄炎の動物モデルにおいて初めての安全性効力試験を実施した。このモデルは、バイオフィルム介在性疾患及び宿主応答をインビボで研究するために技術移転上の価値に適うように特異的に開発された、ユニークな自家製の顎骨インプラント周囲骨髄炎モデルである（Ｆｒｅｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１１；８２：７７８−８９）。簡単に説明すると、ラットの正常な細菌叢に常在性の細菌ではない顎骨骨髄炎病原体アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａａ；野生型Ｒ型株Ｄ７Ｓ−１；ａ血清型）のバイオフィルムを１０９ＣＦＵで小型チタン製インプラント上に予備培養した。我々の動物試験の前に、親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの感受性を確認するため、我々は以前に記載された長骨骨髄炎病原体について実施されたようにＡＳＴアッセイとＭＩＣアッセイを実施した。ディスク拡散阻止帯分析法によって４０ｍｍを超える直径が明らかになり、且つ、ＭＩＣ９０は２ｍｃｇ／ｍＬであり、親薬品であるシプロフロキサシンに対するこの微生物の強い感受性が示された。ＡａはｐＨ感受性ビオチン化シプロフロキサシンプロドラッグに対する感受性についても以前に試験されており、親抗生物質に対して感受性であることが分かった（Ｍａｎｒｉｑｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｒａｔ  ｏｒａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｂｙ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｄｏｓｉｎｇ．Ｍｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１３；  ２８：４０４−１４）。インビトロでバイオフィルムがインプラント上に定着した後に各ラットの顎骨にそれらのインプラントを外科的に移植する。動物に麻酔をかけ、頬を鉤で引っ張り、そして手作業で骨切除部にインプラントを挿入し、且つ、固定することができるように経粘膜骨切除術を実施する。２個のバイオフィルム接種インプラントを各ラットの口蓋骨の両側に設置する（ｎ＝１２ラット及び２４インプラント）。標準的、且つ、再現可能な量の生きた細菌がこのモデルによって各インプラント上によく定着したバイオフィルムとして形成されるが、我々はそのバイオフィルムがインプラント設置から数週間にわたってインビボで存続し、局所的に感染症、炎症、及び骨破壊の原因となることをこれまでに実証している（Ｆｒｅｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１１；８２：７７８−８９）。
【０１６１】
術後１週間でインプラント周囲感染症が確立されたところで、実験の項において明記された投与計画においてそれらの動物にＢＰ−シプロフロキサシン、陽性対照としてシプロフロキサシン単体、及び陰性対照として無菌エンドトキシン非含有生理食塩水を投与する。適切な投与濃度を決定するため、我々は類似のターゲット・リリース戦略を使用し、且つ、げっ歯類も使用する以前の試験及び薬物動態データに基づいて前記複合体のおおよその初回投与量を計算した（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５１：６９５５−６９；  Ｍｏｒｉｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１０；１８：１１４３−８）。我々はサンプルサイズの見積もり及びこの動物モデルに関するこれまでの経験に基づいて０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇと徐々に増加する用量に相当するモル当量のＢＰ−シプロフロキサシンにより群当たり２匹の実験動物において抗菌活性を決定することが可能になると予測した（Ｆｒｅｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１１；８２：７７８−８９）。動物は全身麻酔下で腹腔内注射により投与され、全ての化合物が適切なｐＨの無菌注射可能生理食塩水中に構成された。薬物療法から１週間後に全ての動物を殺処理し、インプラント周囲組織の摘出を実施し、そして微生物負荷量の定量的評価のために組織をすぐに均質化及び処理した。薬物療法の局所的又は全身的な悪影響について試験期間にわたって動物をモニターした。
【０１６２】
全ての動物が前記薬物療法をよく忍容し、皮膚の注射部位反応も炎症も無く、試験期間にわたって管理獣医師によって報告された全身性有害事象も無かった。治療効力は図１２に示されるように生きた細菌の量の対数（組織グラム当たりのＣＦＵの平均対数）に関して定量的に測定された。
【０１６３】
インビボでは一週間の期間にわたる複数回の投与（３回）において０．３ｍｇ／ｋｇの用量の前記複合体を投与された前記動物がＡａの回復を示さず、又は１００％の殺菌を示した。ＢＰ−シプロフロキサシンの１０ｍｇ／ｋｇの用量での単回投与によっても１０の２乗倍の減少又は９９％の殺菌、及び複数回の投与ではあるが同じ合計濃度のシプロフロキサシン単体よりも一桁より高い活性を伴う高い効力が示された。複数回投与処方の中のシプロフロキサシン単体により１０の１乗倍の減少又は９０％の殺菌が生じたが、このことは予期されたことであり、且つ、我々がこの化合物の公知の効力、その抗菌活性、及びこの化合物が前記複合体の親薬品であるという事実を考慮してシプロフロキサシンを陽性対照として選択した理由である。０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇという複合体濃度はほとんど効果を持たず、さらなる最適化がこの状況下で可能であることが示唆された。それにもかかわらず、前記プロドラッグの標的化と分離の能力を考慮すると、有効な用量が構成化合物の安全性プロファイルと経口投与能又は静脈内投与能を考慮した臨床背景で達成可能であることは当然である。前記複合体の複数回投与群では我々の培養物に酵母状の形態の証拠が示され、且つ、回復可能なＡａが示されなかったことが興味深い。汚染混入がこの現象についての１つの説明であり得たが、同様、且つ、同時に方法を実施しており、我々の研究室では酵母を培養しておらず、この同じ複数回投与群及び２匹の別個の動物の中にはＡａが回復されなかった動物試料しか存在しないので、この説明は全く非現実的である。したがって、Ａａの殺菌と消散がインビボで生じ、親薬品であるシプロフロキサシンに対して感受性が低い酵母などの別の生物が我々の培養物の中で増殖したというのが、より尤もらしい説明である。実際、口腔カンジダ症のよく確立されたモデルとしてラットが使用されており、通常のヒト口腔フローラの酵母に相当するラットの同等物はカンジダ・ピントロペッシ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｉｎｔｏｌｏｐｅｓｓｉ）であり、カンジダ・ピントロペッシは抗生物質で処理されたげっ歯類動物又は免疫不全のげっ歯類動物において予期せぬ疾患の原因となり得る（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ．Ｍｏｄｅｌｓ  ｈｏｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０１２；７１０：９５−１０５）。このこと、すなわち通常はインビボで酵母と競合する細菌叢の抑制による酵母の過剰増殖又はカンジダ症は抗生物質で処理されたヒト患者においてよく知られる現象でもある。
【０１６４】
陰性対照と比較して、及び陽性対照親薬品とも比較して前記複合体によってインビボで感染症が経時的に解決されることは前記複合体が効果的に骨に結合し、親抗菌剤を分離することをさらに裏付ける。このモデルで効力が無ければ前記プロドラッグが結合していないか、前記プロドラッグが親薬品を分離していないかどちらかを示唆することになる。インビボでの前記プロドラッグの薬物動態学を理解するための間接的な方法が少なくともこれにより提供される（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８；  ５１：６９５５−６９）。ラット脛骨骨髄炎モデルにおける研究であることを除いて類似の研究によってＢＰ−フルオロキノロン類の活性が試験され、骨の感染の１〜２日前に前記プロドラッグの単回静脈内注射が投与される予防的背景であることを除き、試験複合体の類似の効力及び大いに増強された抗菌活性の証拠が見出された（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８；  ５１：６９５５−６９）。このモデルにおける感染は外科的に露出された脛骨へのプランクトン型細菌のボーラス注射によって作出され、感染から２４時間後に動物が殺処理された。本試験はバイオフィルム介在性骨髄炎治療試験ではなかったが、ＢＰ−シプロフロキサシンの前処理によってバイオフィルム増殖が防止され得ることを示す本明細書において提示されるインビトロデータと一致する（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８；  ５１：６９５５−６９）。我々の実験により、親抗生物質単体の活性が既に消失しているときに定着したバイオフィルムに対する殺菌活性を維持するために充分な濃度のその親薬品を産出する安全、且つ、適切な単回用量のＢＰ−シプロフロキサシンプロドラッグの能力が確認されている。動物モデルにおいて長骨骨髄炎を治療する能力についてこの複合体をさらに評価し、包括的な薬物動態学的及び薬力学的研究もインビボで実施する。追ってこれらの試験の結果を提示する。
【０１６５】
考察
本実施例はターゲット・リリース戦略を利用したフェニルカルバメートＢＰ−シプロフロキサシン複合体の成功した設計と合成を示しており、本実施例によってこの化合物の各成分（並びに前記複合体全体）の機能性がインビトロ及びインビボで系統的に評価された。一般的な骨髄炎病原体に対して試験されたＢＰ−シプロフロキサシンのインビトロ抗菌性調査により強力な殺菌プロファイルが明らかになり、安全性と効力がプロテーゼ周囲骨髄炎の動物モデルにおいてインビボで示された。インビボでは一週間の期間にわたる複数回の投与において０．３ｍｇ／ｋｇの用量（合計で０．９ｍｇ／ｋｇ）の前記複合体を投与された前記動物が最高の効力を示し、回復可能な細菌を示さなかった。ｋｇ当たり１０ｍｇという用量の複合体（前記複合体の分子質量が前記親薬品の分子質量の二倍であることを考慮すると５ｍｇのシプロフロキサシン）の単回投与も強力な抗菌活性を示し、細菌の９９％を殺菌することになった。前記複合体の複数回投与及び前記複合体の最大単回用量は親抗生物質であるシプロフロキサシンの３０ｍｇ／ｋｇの用量での複数回投与に勝った。より低い単回投与濃度（０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇ）の前記複合体は有効ではなかった。
【０１６６】
これらの発見により、単回用量として提供されるときには最小用量が前記複合体のインビボ効力にとって必要であるが、定期的に投与されるときにはずっと低い濃度の前記複合体が最高の効力を提供することができ、親抗生物質の濃度の１０分の１未満で最高の効力を提供することができることが示されている。臨床への移行についてはこの標的化戦略が患者への投与濃度を低くし、且つ、治療指数を改善することによって、また全身曝露を限定することによっても有用であることが判明し得るだろう。複合体は独特の薬効評価パラメーターを有しているのでこれらのプロドラッグとそれらの親化合物との間の直接的比較はやや恣意的であることがこの分野の他の研究と共にこれらの結果によって示されていることが重要である。この分類の複合体のどんな将来的な薬物動態学的モデリングにも分布について骨格コンパートメントを数理的に含む必要が出てくるが、それは抗生物質の薬物動態学研究では一般的に行われていない。これにより新しい薬理学的データがもたらされるであろうし、これはインビボでの密接な関係も有する。
【０１６７】
ＢＰ−シプロフロキサシンはここで初めて臨床的に妥当なバイオフィルムに対しても試験され、インビトロとインビボの両方で基材としての骨にバイオフィルムが結合しているときに強力な抗菌活性を示した。前記複合体の抗菌活性は試験した病原体の種と株、その増殖モード（バイオフィルム対プランクトン型）、バイオフィルムがコロニー形成するための基材、ｐＨ、濃度、骨結合親和性、及び分離カイネティクスをはじめとする多数のパラメーターと関連するようである。ターゲット・リリース戦略による抗菌剤の（バイオフィルム病原体が常在する）骨への送達のための生化学的ベクターとしてのＢＰを使用するこの分類の複合体を最適化することが骨髄炎の治療にとって有利なアプローチであり、且つ、全身毒性を最小にしつつ改善された薬物動態を提供するはずである。
材料と方法
化学：
【０１６８】
【化１５】
2019518792.tif 000017
【０１６９】
１（ベンジルオキシ）−４（ブロモメチル）ベンゼン（１）
【０１７０】
４−ベンジルオキシベンジルアルコール（１．００ｇ、４．６７ｍｍｏｌ）を窒素下の炉内乾燥したフラスコ内の無水ジエチルエーテル（２５ｍｌ）中に溶解した。フラスコを氷浴中で冷却した。ブロモトリメチルシラン（ＢＴＭＳ、１．２６ｍｌ、９．５２ｍｍｏｌ）を注射器によって添加した。フラスコを室温までゆっくりと温めた。１７時間撹拌した後に反応混合物を水（５０ｍｌ）に投入し、有機相を分離した。水相をジエチルエーテル（２×２０ｍｌ）で洗浄し、混合した有機相を塩水（２×２０ｍｌ）で洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。エーテルの蒸発により白色の結晶質の固形物として生成物が生じた（１．２３ｇ、９５％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ７．４７  −  ７．２８（ｍ，７Ｈ），６．９８  −  ６．９０（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ）．
【０１７１】
【化１６】
2019518792.tif 000018
【０１７２】
テトライソプロピル（２（４（ベンジルオキシ）フェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（２）
【０１７３】
窒素保護下で無水ＴＨＦ（２ｍｌ）を鉱物油中の５７〜６３％の分散度の水素化ナトリウムに添加した。室温で撹拌しながらメチレンジホスホン酸テトライソプロピル（０．５７ｍｌ、１．８ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。ガスが放出され、灰色の懸濁固形物が消費されてほとんど透明な溶液を残した。混合物をさらに１０分間にわたって撹拌した。固形物１を窒素向流下で一度に添加した。溶液は１分間にわたって透明であり、その後に濁った。２時間にわたって撹拌し続け、次に反応をＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ；ＵＶ又はモリブデン酸アンモニウムセリウム（ＣＡＭ）染色により可視化）により確認し、２つの新規スポットがＲＦ＝０．３７及び０．５８に現れた。幾らか１（０．９超のＲＦ）が残り、３０分間にわたって５０℃まで反応を加熱したが、ＴＬＣでは進行がほとんど明らかにならなかった。反応混合物を５％クエン酸水溶液に投入し、エーテル（２×３０ｍｌ）で抽出し、塩水で洗浄し、そして蒸発処理した。ヘキサン中のＥｔＯＡｃ濃度が１０％から１００％ＥｔＯＡｃまで上昇するものを溶離液として使用して残留物を２３０〜４００メッシュのシリカを使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を無色の油として得た（０．５０８ｇ、５２％の収率）。
【０１７４】
【化１７】
2019518792.tif 000019
【０１７５】
テトライソプロピル（２（４−ヒドロキシフェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（３）
【０１７６】
化合物２（０．５０８ｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）を１３ｍｌのメタノール中に溶解し、７０ｍｇの１０％パラジウム炭素を添加した。フラスコを窒素でフラッシングし、その後に水素でフラッシングし、そして水素バルーンを取り付けて一晩にわたって撹拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ中の１０％ＭｅＯＨ、ＵＶ又はＣＡＭ染色により可視化）は出発物質（ＲＦ＝０．６３）の消失とＲＦ＝０．４９の新しいスポットの出現を示した。１００ｍｌのメタノールを使用してセライトで反応混合物を濾過した。濾液の蒸発により所望の化合物がさらに精製されずに使用される薄黄色の油として生じた（０．３６８ｇ、８８％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  d  ７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｔｄ，Ｊ＝１６．９，６．０  Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｔｔ，Ｊ＝２４．４，６．０  Ｈｚ，１Ｈ），１．３２  −  １．２１（ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２１．０６  ．
【０１７７】
【化１８】
2019518792.tif 000020
【０１７８】
４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）フェニル（４−ニトロフェニル）カーボネート（４）
【０１７９】
化合物３（０．１７１ｇ、０．３８０ｍｍｏｌ）を８ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、その後にトリエチルアミン（１５９μｌ、１．１４ｍｍｏｌ）を添加し、続いてｐ−ニトロフェニルクロロホルマート（０．０８６ｇ、０．４１８ｍｍｏｌ）を一度に添加した。その溶液は無色からすぐに黄色に変化した。２．５時間にわたって撹拌した後にＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ中の５％ＭｅＯＨ；ＵＶで可視化）によってわずかに微量の出発物質（ＲＦ＝０．３１）が示され、且つ、ＲＦ＝０．５９における高強度のスポットの出現が示された。溶離液として１：１の酢酸エチル：ヘキサン混液を使用するフラッシュクロマトグラフィーによりその化合物を精製して１つの不純物（ＲＦ＝０．８８）を除去した後に純粋な酢酸エチルで生成物を溶出した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ８．２９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４６  （ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．８４−４．５８（ｍ，４Ｈ），３．２２（ｔｄ，Ｊ＝１６．５，６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｔｔ，Ｊ＝２４．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３３−１．１４（ｍ，２４Ｈ）．
【０１８０】
【化１９】
2019518792.tif 000021
【０１８１】
７（４（（４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−１−シクロプロピル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（５）
【０１８２】
シプロフロキサシン（４６．５ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ）をプラスチック製バイアル瓶の中の１．４ｍｌの水の中に懸濁した。１５１μｌの１ＭのＨＣｌを添加し、そのバイアル瓶をボルテックスミキサーにかけてシプロフロキサシンを溶解して透明無色の溶液を得た。Ｎａ２ＣＯ３を添加してｐＨを８．５に調節し、濃白色の沈殿物が生じた。そのバイアル瓶を氷浴中に配置し、１．４ｍｌのＴＨＦ中に溶解された化合物４（７１．９ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）を約５分間にわたって滴下して添加した。その後でそのバイアル瓶をその氷浴から取り出し、遮光し、そして室温で一晩にわたって撹拌した。固形物が撹拌されるとその反応混合物は明黄色に変化した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ中の５％ＭｅＯＨ）によって出発物質４の消失、及び蛍光下で青色のスポット（ＲＦ＝０．５１）とｐ−ニトロフェノール副生成物に起因する可視光下で黄色のスポット（ＲＦ＝０．８１６）の出現が示された。その反応混合物を１０ｍｌの水で希釈し、そして目の細かいガラス製フリットに通して濾過した。残留固形物を黄色が残らなくなるまで水で洗浄した。その後、それらの固形物をＤＣＭで溶解してそのフリットから洗い流し、その溶液をフラッシュシリカカラムに負荷し、そしてＭｅＯＨ濃度が５％まで上昇するＤＣＭで溶出して明青色の蛍光を有するバンドを溶出した。画分を混合したものを蒸発させて白色の固形物として標記化合物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）  １Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）  δ８．７９（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．７０（ｄｐｄ，Ｊ＝７．４，６．２，１．３Ｈｚ，４Ｈ），３．９０（ｓ，５Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．３９（ｓ，４Ｈ），３．１８（ｔｄ，Ｊ＝１６．６，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６５（ｔｔ，Ｊ＝２４．３，６．３Ｈｚ，１Ｈ），１．４３−１．３４（ｍ，１Ｈ），１．３４−１．１９（ｍ，２４Ｈ），１．１８−１．１０（ｍ，２Ｈ）．
【０１８３】
【化２０】
2019518792.tif 000022
【０１８４】
本明細書において式２とも呼ばれる１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（６）
【０１８５】
化合物５（１０．０ｍｇ、０．０１２４ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌのバイアル瓶の中のＤＣＭ（０．２ｍｌ）中に溶解し、ブロモトリメチルシラン（ＢＴＭＳ）（０．２ｍｌ）を添加し、そしてすぐにそのバイアル瓶にキャップをし、３５℃の油浴の中に浸した。２４時間にわたって撹拌した後に溶媒及びＢＴＭＳを蒸発処理によって除去し、１ｍｌのＭｅＯＨを添加し、そしてそのバイアル瓶を一晩にわたって撹拌した。溶媒の蒸発によって６．８２ｍｇ（０．１０７ｍｍｏｌ）の緑色の蛍光を有する薄黄色の固形物が残った。ＨＰＬＣ分析のために約０．２ｍｇの試料を取り出した。水中に懸濁し、ｐＨが２．５に測定され、その後でそれを６．７に調節して青色の蛍光を有する薄黄色の溶液を得た。ＨＰＬＣ分析（Ｌｕｎａ  Ｃ１８；緩衝液系：０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液  ｐＨ７．１；Ａ：２０％アセトニトリル、Ｂ：７０％アセトニトリル。０〜７分：１００％Ａ、７〜２５分：０〜１００％Ｂの濃度勾配）はＲＴ＝１４．８分で主要ピークを示し、５．７６分（シプロフロキサシンに割り当てられる）及び１８．８分で小ピークを示した。シプロフロキサシン標準品（緩衝液Ａ中の飽和溶液を２倍希釈したもの；５μｌを注入）によって５．６８分のＲＴが生じた。
【０１８６】
微生物学：
実験株：
１２株のメチシリン感受性プロファイルを有する黄色ブドウ球菌臨床骨髄炎株及び１株の臨床メチシリン耐性株（ＭＲ−ＣＩＰＳ）を試験した。これらの病原体はポーランドのヴロツワフ医科大学薬学微生物学寄生虫学科の菌株コレクションの一部である。さらに、次のＡＴＣＣコレクション株、すなわち黄色ブドウ球菌６５３８株と緑膿菌１５４４２株を実験目的のために選択した。
【０１８７】
ＨＡディスク：
特注仕様のディスクの製造のために市販のＨＡ粉末を使用した。結合剤を使用せずに９．６ｍｍの直径の粉末ペレットをプレス加工した。焼結を９００℃で行った。静的引張試験、圧縮試験、及び曲げ試験用のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｓｔｒｏｎモデル３３８４；Ｉｎｓｔｒｏｎ社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用してそれらの錠剤を圧縮した。それぞれＬＥＸＴ  ＯＬＳ４０００顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、センターバレー、ペンシルバニア州）とＭｅｔｒｏｔｏｍ  １５００マイクロトモグラフ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）を使用する共焦点顕微鏡法とマイクロトモグラフィー（マイクロＣＴ）により、製造されたＨＡディスクの品質を検査した。
【０１８８】
試験株のシプロフロキサシンに対する感受性を評価するためのディスク拡散テスト：
ＥＵＣＡＳＴガイドラインに従ってこの方法を実施した。簡単に説明すると、０．５マクファーランド（ＭＦ）の細菌希釈物をミュラー・ヒントン（ＭＨ）寒天プレート上に広げた。５ｍｇのシプロフロキサシンを含有するディスクを差し込み、そのプレートを３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。次に定規を使用して阻止帯を記録した。得られた値（ｍｍ）をＥＵＣＡＳＴの表に由来する適切な阻止帯の値と比較した。
【０１８９】
分析されたプランクトン型の臨床スタフィロコッカス株に対する試験化合物のＭＩＣの評価：
微生物の増殖に対するＢＰ−シプロフロキサシン及びシプロフロキサシンの効果を評価するため、１×１０５ｃｆｕ／ｍｌの密度を有する１００μｌの微生物溶液を適切な濃度の試験化合物と共に９６ウェル検査プレートのウェルに入れた。その直後に分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＧＯ）を５８０ｎｍの波長で使用して溶液の吸光度を測定した。その後、細菌増殖に最適な条件を得るため、及び細菌のバイオフィルム形成を防止するためにプレートを撹拌機の中で２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベートした後に吸光度を再度測定した。次の対照試料を用意した：陰性対照試料１：微生物を含まない滅菌培地、陰性対照試料２：ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；シグマ・アルドリッチ社）を１％（体積／体積）の終濃度になるまで加えた微生物を含まない滅菌培地、陽性対照試料１：試験化合物を含まない培地＋微生物、陽性対照試料２：試験化合物を含まないがＤＭＳＯを１％（体積／体積）の終濃度になるまで加えた培地＋微生物。シプロフロキサシンはこの溶媒に効率的に溶解するが、ＤＭＳＯ濃度が１％を超えると微生物細胞にとって有害になり得ることが１％のＤＭＳＯを使用する論理的根拠であった。細胞の相対数を評価するために次の計算を行った。対照試料の吸光度の値（ＢＰ−シプロフロキサシンの場合では培地＋微生物、シプロフロキサシンについては培地＋微生物＋ＤＭＳＯ）を１００％と評価した。次に試験化合物と共にインキュベートされた細胞の相対数を以下のように計数した：対照試料吸光度の値／試験試料の値×１００％。
【０１９０】
安定性を検査するためのトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）微生物用培地中のＢＰ−シプロフロキサシン複合体の分光分析：
ＴＳＢ微生物培地中に０．２４〜２５０ｍｇ／Ｌの終濃度のＢＰ−シプロフロキサシンを９６ウェルプレートのウェルに入れた。直後に分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＧＯ）を２７５ｎｍの波長で使用して溶液の吸光度を測定した。次に溶液を撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。インキュベートした後に吸光度を再度測定した。複合体の分解を評価するために０時間及び２４時間で測定された吸光度の値を比較した。
【０１９１】
ＨＡ球状体を添加したトリプチケースソイブロス微生物用培地中のＢＰ−シプロフロキサシン複合体の分光分析：
ＴＳＢ微生物培地中に懸濁されたＨＡ粉末（球状体）に様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシンを導入した。ＢＰ−シプロフロキサシンとＨＡ球状体を含有する溶液を２４ウェルプレートのウェルに入れた。粉末の終濃度は１０ｍｇ／１ｍＬであり、一方で複合体の終濃度は０．２４〜２５０ｍｇ／Ｌであった。直後に分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＧＯ）を２７５ｎｍの波長で使用して溶液の吸光度を測定した。プレートは測定前に前記分光光度計の中で自動的に撹拌された。次にプレートを撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。２４時間後に吸光度を再度測定した。０時間及び２４時間の時点における前記複合体の相対濃度を評価するために実験の開始時と終了時に測定された吸光度の値を比較した。
【０１９２】
酸性ｐＨと塩基性ｐＨでの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株のプランクトン型培養物に対するＢＰ−シプロフロキサシンの抗菌物質感受性試験：
ＫＯＨ溶液又はＨＣｌ溶液を使用して微生物用培地をｐＨ７．４とｐＨ５に調節し、そして万能ｐＨ指示薬（Ｍｅｒｃｋ社、ポーランド）を使用してその微生物用培地を測定したことを除いてディスク拡散試験についてこれまでに記載されたようにしてこの実験設定を実施した。
【０１９３】
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株（ＭＳＳＡ）及び臨床ＭＲＳＡ  ＭＲ４−ＣＩＰＳ株に対するＢＰ−シプロフロキサシン複合体の時間殺菌アッセイ：
吸光度の測定（５８０ｎｍの波長）を０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間、及び２４時間の時点で行ったことを除いて「分析されたプランクトン型の臨床スタフィロコッカス株に対する試験化合物のＭＩＣの評価」の小見出しの下でこれまでに記載されたようにしてこの実験を実施した。
【０１９４】
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株及び緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株のバイオフィルムに対して実施されたＢＰ−シプロフロキサシンの抗菌物質感受性試験：
適切な寒天プレート（黄色ブドウ球菌についてはコロンビア寒天プレート；緑膿菌についてはマッコンキー寒天プレート）上で培養された株を液体微生物用培地へ移し、嫌気性条件下において２４時間にわたって３７℃で培養した。培養後に株を１ＭＦの密度まで希釈した。基材としてのＨＡディスクを含有する２４ウェルプレートのウェルにそれらの微生物希釈物を入れるか、又は底面がバイオフィルム形成用の基材として機能するポリスチレンウェルにそのままそれらの微生物希釈物を入れた。株を３７℃で４時間にわたって培養した。次にそれらのウェルから微生物含有溶液を取り除いた。それらの面、ＨＡディスク、及びポリスチレンプレートを静かに洗って接着した細胞を残すと共にプラクトン型又は緩く結合した微生物を除去した。０．２４〜１２５ｍｇ／ＬのＢＰ−シプロフロキサシン複合体を含む新しいＴＳＢ培地の中にこの様にして調製された面を浸した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後に生理食塩水溶液を使用してそれらの面を洗浄し、そして１ｍＬの０．５％サポニン（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）に移した。それらの面を１分間にわたってボルテックスミキサーで激しく撹拌して細胞を剥離させた。その後、全ての微生物懸濁液を１０〜１０９倍希釈した。各希釈物（１００ｍＬ）を適切な安定培地（緑膿菌と黄色ブドウ球菌についてそれぞれマッコンキーとコロンビア）上で培養し、２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。この後に微生物コロニーを計数し、バイオフィルムを形成する細胞の数を評価した。結果を平方ミリメートルの面当たりの平均ＣＦＵ数±平均の標準誤差として表した。ＨＡディスクの正確な表面積を推定するためにＸ線トモグラフィー分析を適用した。検査プレートの底面積を推定するために円の面積の数式であるπｒ２を適用した。
【０１９５】
ＨＡ球状体への黄色ブドウ球菌６５３８株の接着を抑制するＢＰ−シプロフロキサシン複合体の抑制能：
ＴＳＢ微生物培地中に懸濁されたＨＡ粉末（球状体）に様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシンを導入した。複合体とＨＡ球状体を含有する溶液を２４ウェルプレートのウェルに入れた。粉末の終濃度は１０ｍｇ／１ｍＬであり、一方で前記複合体の終濃度は０．１２〜２５０ｍｇ／Ｌであった。懸濁液を撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。２４時間後にそれらのウェルから懸濁液を取り除き、瞬間的に遠心分離してＨＡ粉末を沈殿させた。次に非常に静かに上清を捨て、１０５ｃｆｕ／ｍＬの密度を有する新しい１ｍＬの黄色ブドウ球菌を前記ＨＡ球状体に加えた。その後、この溶液を撹拌し、５８０ｎｍの波長を使用して吸光度を測定し、そして撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。インキュベーションの後に吸光度を再度測定し、０時間と２４時間の値を比較して対照試料１（球状体を含まない細菌懸濁液）及び対照試料２（複合体が添加されていない細菌懸濁液＋球状体）に対する細菌増殖の低下を評価した。さらに、溶液を瞬間的に遠心分離し、静かに上清を捨て、一方で前のように細菌含有ＨＡ球状体をプレート上に蒔いて培養し、定量的に評価した。
【０１９６】
複合体被覆ＨＡディスクが存在する中での２４時間のインキュベーション後の黄色ブドウ球菌の生存：
様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシン又はシプロフロキサシン単体を含有する２ｍＬの溶液の中にＨＡディスクを浸し、それらのディスクを２４時間にわたって３７℃で放置した。ＤＭＳＯ又はリン酸緩衝液の中でインキュベートされたＨＡディスクが対照試料として働いた。次にディスクを滅菌水で３回洗浄した。洗浄後にバイオフィルム形成用の基材としてのＨＡディスクを含有するウェルに２ｍＬの０．５ＭＦの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８株を入れ、前と同じようにバイオフィルムを形成した。
【０１９７】
動物試験：
全ての動物実験のプロトコルと方法は南カリフォルニア大学（ＵＳＣ）の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）及び米国獣医師会安楽死研究班の推奨に従って認可及び実施された。ＵＳＣは米国農務省（ＵＳＤＡ）に登録されており、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）に登録されている完全認可された認証状（第Ａ３５１８−０１号）を有しており、且つ、米国実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって認定されている。ＵＳＣの動物福祉保証番号はＡ３５１８−０１である。ＩＡＣＵＣによって認可された我々のプロトコルの標題は「バイオフィルム介在性骨溶解性感染症の治療用骨標的化抗菌剤」であり、そのプロトコル番号は２０４７４である。この研究のため、それぞれ約２００ｇの体重の１２匹の５か月齢未経産のメスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをこの研究に使用した。１２時間毎の明暗サイクル下、２２℃の小動物保存室においてケージ当たり２匹の動物を収容し、軟質食餌（Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ）を自由に摂取させた。ＵＳＣにおける動物の使用と管理についてのガイドラインと規制に従って全ての動物を扱った。動物は、毎日それらの動物を直接評価する１日２４時間待機している専任の獣医師の監督下にあった。全ての動物実験は、結果の質、信頼性、有効性、及び再現性を確保するために動物実験について報告するためのＡＲＲＩＶＥガイドラインを使用して記載されている（Ｋｉｌｋｅｎｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ：  ｔｈｅ  ＡＲＲＩＶＥ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ａｎｉｍａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｅｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１２；４１：２７−３１）。
【０１９８】
この動物モデルはバイオフィルム介在性疾患及び宿主応答をインビボで研究するために特異的に設計された自家製の顎骨インプラント周囲骨髄炎モデルである（Ｆｒｅｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１１；８２：７７８−８９）。顎骨骨髄炎病原体Ａａのバイオフィルムを１０９ＣＦＵで小型チタン製インプラント上に予め形成した。我々の動物試験の前に親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの感受性を確認するために我々は以前に記載された長骨骨髄炎病原体について実施されたようにＡＳＴアッセイとＭＩＣアッセイを実施した。インビトロでバイオフィルムがインプラント上に定着した後に各ラットの顎骨にそれらのインプラントを外科的に移植した。手術のため、最初に４％イソフルラン吸入剤を使用し、続いてケタミン（８０〜９０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により動物に麻酔をかけた。次に手術部位への０．２５％ブピバカインの浸潤注射により局所麻酔を加えた。次に先制鎮痛として持続放出性ブプレノルフィン（１．０〜１．２ｍｇ／ｋｇ）を最初の切開の前に皮下投与した。麻酔されたところで各ラットの頬粘膜を鉤で引っ張り、前口蓋の自然正中離開状態の歯槽堤にパイロットドリルを使用して経粘膜骨切除術を実施した。その後、プラットホームが粘膜の高さになるまで手作業で骨切除術部にインプラントを挿入し、骨に固定した。２個のバイオフィルム接種インプラントを各ラットの口蓋骨の両側に設置した。
【０１９９】
手術から１週間後に４％のイソフルランを再度投与してラットに軽く麻酔をかけ、インプラントの安定性を確認し、インプラント及び感染部位における臨床的発見を書き留めた。その後、腹腔内注射によりそれらの動物にＢＰ−シプロフロキサシン（単回投与として０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ、及び複数回投与群については０．３ｍｇ／ｋｇを週３回）又は陽性対照としてシプロフロキサシン単体（これも複数回投与群として１０ｍｇ／ｋｇを週３回）を投与し、陰性対照として無菌エンドトキシン非含有生理食塩水を投与した。ランダム化過程を介して動物の処置群と対照群への割り当てを行った。その週にわたってそれぞれの追加の注射の前に複数回投与群の動物を前に記載したように麻酔した。全ての化合物は薬理学グレードであり、適切なｐＨの無菌注射可能生理食塩水中に構成された。薬物療法から１週間後に全ての動物をＣＯ２室（６０〜７０％の濃度）の中に５分間にわたって入れ、その後で頸椎脱臼により安楽死させた。インプラント周囲組織（１ｃｍ２）の摘出を一括実施し、インプラントを取り出した。微生物負荷量の定量的評価のためにインプラント周囲組織をすぐに均質化及び処理した。処置群及び対照群に割り当てられたラットを匿名化し、その微生物データを分析する後の調査者から秘密にした。微生物分析のため、インプラント周囲軟組織及び骨を１ｍＬの０．５％サポニンの中に入れて処理し、１分間にわたってボルテックスミキサーで撹拌した後にそのまま寒天プレートに移し、そして培養した。Ａａを培養するための培地は改変ＴＳＢからなり、凍結ストックは２０％グリセロール、８０％改変ＴＳＢの中で−８０℃に維持された。全ての培養は５％ＣＯ２中において３７℃で実施された。ホモジェネートのＣＦＵ数（グラム当たりのＣＦＵ数）は段階希釈されたホモジェネートのアリコットをＴＳＡプレートに蒔くことにより決定された。処置の関数としてのグラム当たりのＣＦＵ数の１０を底とする平均対数の減少を記録した。
【０２００】
統計分析：
ＳｉｇｍａＳｔａｔパッケージバージョン２．０（ＳＰＳＳ社、シカゴ、イリノイ州）を使用して統計計算を行った。実験前にインビトロ試験及びインビボ試験のサンプルサイズの見積もりをするためにＧ  Ｐｏｗｅｒ  ３ソフトウェアを使用して検定力分析を実施した（Ｆａｕｌ  Ｆ，Ｅｒｄｆｅｌｄｅｒ  Ｅ，Ｂｕｃｈｎｅｒ  Ａ，Ｌａｎｇ  ＡＧ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐｏｗｅｒ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇ＊Ｐｏｗｅｒ  ３．１：  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｂｅｈａｖ  Ｒｅｓ  Ｍｅｔｈ  ２００９；４１：１１４９−６０）。クラスカル・ウォリス検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実験結果に由来する定量的データを分析し、処置群を対照群に比較するときにｐ＜０．０５で統計学的有意性を受け入れた。
【０２０１】
実施例２
【０２０２】
【化２１】
2019518792.tif 000023
【０２０３】
４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）安息香酸メチル（７）
【０２０４】
窒素雰囲気下において５０ｍＬの２首丸底フラスコの中で鉱物油中の６０％ＮａＨ分散物（０．１２２ｇ、３．０５ｍｍｏｌ）にＴＨＦ（３ｍＬ）を添加した。撹拌しながらその懸濁液を０℃まで冷却し、メチレンジホスホン酸テトライソプロピル（０．６９ｍＬ、２．１８ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。その反応を放置して外界温度にし、水素ガスがその反応混合物から泡立つことを止めたところでその溶液を再び０℃まで冷却した。４（ブロモメチル）安息香酸メチル（０．５ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、それを滴下しながら前記反応に添加した。それにより生じた溶液をゆっくりと外界温度に近づけながら一晩にわたって撹拌した。その後、反応混合物を０℃まで冷却し、Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）でクエンチした。クエン酸の５％水溶液（３０ｍＬ）を添加し、Ｅｔ２Ｏ（３×３０ｍＬ）で抽出し、混合した有機物を塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧したで濃縮し、そしてＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ濃度勾配（１０〜１００％）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製してかすかに黄色の油として７を得た（０．３２３ｇ、３０％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ７．９３（ｄ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．４，６．０  Ｈｚ，２Ｈ），４．７９−４．６８３（ｍ，４Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｔｄ，Ｊ＝１６．０，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．５０（ｔｔ，Ｊ＝２４．０，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３４−１．２４（ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２０．５７．
【０２０５】
【化２２】
2019518792.tif 000024
【０２０６】
４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）安息香酸（８）
【０２０７】
８ドラムのガラス製バイアル瓶の中のＭｅＯＨ（３ｍＬ）中の７（０．２７８ｇ、０．５８３ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．１２２ｇ、２．９１４ｍｍｏｌ）を添加し、それにより生じた溶液を一晩にわたって室温で撹拌した。その反応混合物を乾燥するまで蒸発処理し、残留物を水（３０ｍＬ）中に溶解し、そしてＨＣｌ（水溶液）（１Ｍ）を添加してゆっくりとｐＨ３まで到達させた。それにより生じた混合物をＣＨＣｌ３（３×３０ｍＬ）で抽出した。混合した有機物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮して濃厚で透明な油を得た。収率：定量的。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：  δ＝７．９６  （ｄ，Ｊ  ６．４，２Ｈ），７．３６  （ｄ，Ｊ  ６．４，２Ｈ），４．７８（ｓｅｘ，Ｊ  ５．０，４Ｈ），３．２７（ｔｄ，Ｊ  １４．０，４．８，２Ｈ），２．６０（ｔｔ，Ｊ  ２０．０，４．８，１Ｈ），１．４３−１．２６  （ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２０．５７．
【０２０８】
【化２３】
2019518792.tif 000025
【０２０９】
テトライソプロピル（２（４（クロロカルボニル）フェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（９）
【０２１０】
窒素雰囲気下において化合物８（０．１６２ｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍｌ）中に溶解し、そして触媒量のＤＭＦ（１．３μＬ、０．０１７ｍｍｏｌ）を添加した。塩化チオニル（４９．２μＬ、０．６７８ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、その反応を２時間にわたって室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去して透明な油を得た。さらに操作せずに生成物を次の工程にすぐに使用した。収率：定量的。
【０２１１】
【化２４】
2019518792.tif 000026
【０２１２】
７（４（４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）ベンゾイル）ピペラジン−１−イル）−１−シクロプロピル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（１０）
【０２１３】
シプロフロキサシン（０．１１２ｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍｌ）中に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３５４．３μＬ、２．０３４ｍｍｏｌ）を添加した。新しく作製された化合物９をクロロホルム（１ｍＬ）中に溶解し、徐々に前記シプロフロキサシン：ＤＩＰＥＡ懸濁液に添加した。反応混合物をホイルで覆い、室温で一晩にわたって撹拌した。翌日、溶媒を真空下で除去し、それにより生じた粗製物をＤＣＭ（５ｍＬ）中に溶解し、中程度のフリット漏斗に通して濾過し、そしてより多くのＤＣＭ（３×５ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮し、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ濃度勾配（０〜１０％）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりさらに精製して徐々に固形化する粘性の有る油として１０を得た（０．２２６ｇ、８４％の収率、１．８当量のＤＩＰＥＡ塩）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ＝８．７９（ｓ，１Ｈ），８．０６  （ｄ，Ｊ  １２．８，１Ｈ），７．３８（ｍ，５Ｈ），４．８０−４．７３（ｍ，４Ｈ），４．００（ｓ，ｂｒ，４Ｈ），３．５６−３．５３（ｍ，１Ｈ），３．３３−３．２０（ｍ，６Ｈ）  ２．５０（ｍ，１Ｈ），１．４５−１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３２−１．２５（ｍ，２４Ｈ），１．２３−１．１９（ｍ，２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２０．７７．
【０２１４】
【化２５】
2019518792.tif 000027
【０２１５】
１−シクロプロピル−７（４（４（２，２−ジホスホノエチル）ベンゾイル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１１）
【０２１６】
８ドラムのガラス製バイアル瓶の中で化合物１０（０．１０８ｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７００μＬ）中に溶解し、ＢＴＭＳ（６８６．０μＬ、５．２００ｍｍｏｌ）を添加した。そのバイアル瓶にキャップをし、ホイルで覆い、且つ、撹拌しながら３５℃で一晩にわたって加熱した。翌日、溶媒を真空下で除去し、粗製物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）でクエンチした。それにより生じた溶液を室温で３０分間にわたって撹拌した。溶媒を真空下で除去してオレンジ色の油を得た。数滴の水を添加して黄色の固形物を沈殿させた。より多くのＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加し、中程度のガラス製フリット漏斗を使用して、それにより生じた懸濁液を濾過した。それにより生じた固形物をＭｅＯＨでさらに洗浄して黄色の粉末を得た（０．０７０ｇ、８２％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐＨ  ７．５）：  δ＝８．５４（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．８９（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ  ８．０，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ  ８．０，２Ｈ），４．７９（ｍ，ｏｖｅｒｌａｐ  ｗｉｔｈ  Ｄ２Ｏ，４Ｈ），４．００（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．７９（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．４７（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．３４（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．２１（ｔｄ，Ｊ  １４．０，６．４，２Ｈ），２．３０（ｔｔ，Ｊ  ２２．０，６．６，１Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ１９．１２．ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ  （−）：  ６２２．２４  ［Ｍ−Ｈ］．
【０２１７】
実施例３
前記ＢＰ複合体に含めることが可能なキノロンの非限定的な例
フッ素化キノロン
【０２１８】
【化２６】
2019518792.tif 000028
【０２１９】
【化２７】
2019518792.tif 000029
【０２２０】
【化２８】
2019518792.tif 000030
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2019518792.tif 000032
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【０２２１】
【化２９】
2019518792.tif 000034
2019518792.tif 000035
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【０２２２】
【化３０】
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2019518792.tif 000040
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【０２２３】
【化３１】
2019518792.tif 000043
2019518792.tif 000044
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【０２２４】
次のものは非フッ素化キノロンの一例である。
【０２２５】
【化３２】
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【０２２６】
実施例４
次のものは本明細書に記載されるＢＰ−キノロン複合体の非限定的な例である。
【０２２７】
【化３３】
2019518792.tif 000047
2019518792.tif 000048
【０２２８】
【化３４】
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2019518792.tif 000050
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，
【０２２９】
【化３５】
2019518792.tif 000052
2019518792.tif 000053
【０２３０】
【化３６】
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【０２３１】
【化３７】
2019518792.tif 000057
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【０２３２】
【化３８】
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【０２３３】
【化３９】
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【０２３４】
【化４０】
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【０２３５】
実施例５
感染性骨疾患、すなわち骨髄炎はヒト医療１及び獣医医療２における世界的な大問題であり、四肢欠損に関わる後遺症３及び死亡４の可能性のために深刻な問題であり得る。骨髄炎を治療するための現行のアプローチは主に抗菌剤によるものであり、静脈内長期アプローチであることが多く、感染を管理するために多くの症例で外科的介入を伴う。長骨骨髄炎の症例の大半における原因病原体が黄色ブドウ球菌のバイオフィルムであり、これらの微生物はそれらのプランクトン型（浮遊型）の対応物と対照的に骨（図１）に結合する５。
【０２３６】
多くのバイオフィルム病原体が培養不可能であり、且つ、増殖速度及び抗菌剤耐性に関して変化した表現型を示すため、骨髄炎のバイオフィルム介在性は臨床上及び実験上の設定において重要である５、６。整形外科領域における感染症について高い成功率の抗菌剤治療が一般的に未だに実現していない理由は耐性バイオフィルム病原体の発生、骨内への抗菌剤の低い浸透度、及び全身毒性に関連付けられている有害事象３と共に従来の抗生物質によってバイオフィルムを根絶することが困難であるということによって部分的に説明される。
【０２３７】
骨髄炎治療に伴う多くの困難７を克服するため、全身曝露を最小限にしながら抗生物質の比較的に高い、又は比較的に持続的な局所的治療濃度を骨において達成するための骨標的複合体を使用する薬物送達アプローチに関心が高まっている８。骨吸着性ビスホスホネート（ＢＰ）へのフルオロキノロン抗生物質の複合体化（図１３）は各成分の安全性についての長期の実績及びそれらの有利な生化学的特性のために有望なアプローチである９、１０。シプロフロキサシン（図１３）はこの背景での目的再設定に対して幾つかの利点を有する。すなわち、１）シプロフロキサシンでは経口投与又は静脈内投与が可能であり、それらの投与は生物学的に見て比較的に同等であり、２）シプロフロキサシンは緑膿菌及び幾つかの他の病原体が原因の骨及び関節の感染症について既にＦＤＡにより認可されており、且つ、それらの感染症を適応症としており、３）シプロフロキサシンは最も一般的に出会う黄色ブドウ球菌（メチシリン感受性）のような骨髄炎病原体、長骨骨髄炎については緑膿菌１１、及び顎骨骨髄炎についてはアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス１２を含む広範囲の抗菌活性を有し、４）シプロフロキサシンは臨床的に達成可能な用量において殺菌活性を示し１３、５）シプロフロキサシンはフルオロキノロンファミリーの中で最も安価な薬品である。
【０２３８】
しかしながら、大半の抗生物質のようにフルオロキノロン類にはプランクトン型の同じ細菌と比較してバイオフィルムに対する活性が低下するという難点がある。この活性の低下は他の多くの細菌株及び抗生物質分類クラスに加えて黄色ブドウ球菌に対するシプロフロキサシンについて具体的に示されている１４〜１７。そのような研究により、バイオフィルムはそれらのプランクトン型の対応物と比較すると同じ抗菌剤に対して一桁〜数桁高い耐性を有し得ることがこれまでに示されている。このことは、抗生物質の比較的に高い局所的濃度を原因バイオフィルムに対して達成し、且つ、潜在的な耐性を克服するために骨標的化アプローチの重要性を骨髄炎治療に対して強調する。
【０２３９】
前記ＢＰファミリーの特異的な骨標的特性のためにこれらの薬品は骨髄炎薬物療法における骨への抗生物質の標的化にとって理想的なキャリアとなっている１８〜２０。ＢＰはリン酸カルシウム鉱物質と強力な二座配位結合及び三座配位結合を形成し、結果としてハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、特に感染及び炎症部位を含む代謝活性が高い骨格部位のハイドロキシアパタイトに濃縮される２１。ＢＰは化学的分解と生物学的分解の両方に対する例外的な安定性も示す２２。ＢＰ−フルオロキノロンの抗菌活性は複雑であり、試験した病原体の特定の株、抗生物質及び共有結合したＢＰ部分の選択、それらの２成分の間のテザー長、前記ＢＰの骨結合親和性、前記ＢＰの吸着脱離平衡、並びに複合体化に使用された結合部分の安定性／易変性及びカイネティクスに関連付けられる１８〜２０。したがって、複合体が循環中では安定であるが骨表面では不安定である場合により多くの最適化の機会と成功の機会がこの状況で「ターゲット・リリース」リンカー戦略（図１３）によって提供され得ることが蓄積されつつある証拠から示唆される。したがって、我々は代謝により加水分解可能なカルバメートリンカーを介したフェニルＢＰ部分へのシプロフロキサシンの複合体化によって骨髄炎薬物療法における抗生物質の投与に見られる問題が軽減されるはずであると仮説を立てた。その切断可能カルバメート結合が特定の組織における標的化と分離に適うように設計された多数の薬品における重要な機能であり２３、２４、酸性及び酵素環境（例えば炎症又は感染症）が存在する中で血清中の安定性及び感染骨表面での易変性などの薬物動態上の利点をもたらす２５。
【０２４０】
骨ターゲット・リリース戦略を利用した最近の一つの明確な成功事例がＭｏｒｉｏｋａら２６によって提示されており、彼らは比較的に安定なアミドペプチド結合の切断可能変異体（カルバメート）を使用してエストラジオール類似複合体を設計した。この結合の幾つかのバージョンが、薬理学的に活性を有する変異体（アリールカルバメート）が見つかる前に試みられた。重要なことに、彼らは単体で投与されたエストラジオールの骨に対する効果と同様の効果が（エストラジオール単体の合計の用量よりもほぼ５，６００倍低い）単回用量の同様に連結されたＢＰ−エストラジオール複合体によって生じることを実証した２６。エストラジオール単体と比較して全身及び子宮組織において効果が最小であったことから前記複合体はより高い治療指数も提供した。Ａｒｎｓらが完成させた薬物動態学的研究２７は比較的に不安定なリンカーを含むＢＰ−プロスタグランジンに基づく研究におけるこの劇的な効力増強と一致する。抗菌分野におけるこのアプローチの他の合成例がマクロライド系について報告されている２８。しかしながら、アルキルカルバメートが調べられただけであり、その他の成功例が存在しないことからターゲット・リリース戦略は生化学的標的に依存すると同時に（各構成成分の官能基の適合性を考慮すると）化学的分類に依存するようであり、そしてその戦略を使用するためにはいずれか特定の化学分類に適うような設計をする必要があることが示唆される。
【０２４１】
本実施例ではアリールカルバメートＢＰ−カルバメート−シプロフロキサシン複合体６（ＢＶ６０００２２）について説明し、一般的な骨髄炎病原体に対する抗菌活性、及びプロテーゼ周囲骨髄炎の動物モデルにおけるインビボ安全性と効力についてその複合体を評価する。比較的に高い臨床上又は技術移転上の妥当性を提供するために本実施例での研究はプランクトン型培養物に加えてバイオフィルムモデルとバイオフィルム方法論を活用している。
【０２４２】
本明細書では時にはこの化合物を「化合物６」、「複合体６」、又は単に「６」と呼ぶ場合がある。同様に他の化合物又は複合体も例えば「化合物１１」、例えば「複合体１１」と呼ぶ場合があり、又は単に化合物の場暗号（例えば１１）によって呼ぶ場合がある。
【０２４３】
結果
化学
比較的に薬理学的に不活性の４−ヒドロキシフェニルエチリデンＢＰ（３）から始まる６の全体的な合成スキームが図１６に示されている。図１６に提示されているスキームの試薬は次の通りであった。試薬及び条件：（ａ）ＢＴＭＳ（２当量）、Ｅｔ２Ｏ、０℃〜室温、１７時間、収率９５％。（ｂ）ｉ）テトライソプロピルメチレンビスホスホネート（１当量）、ＮａＨ（１当量）、ＴＨＦ、室温、１０分；ｉｉ）１（１当量）、室温、２時間、収率５２％。（ｃ）Ｐｄ／Ｃ（触媒）（０．０７当量）、Ｈ２、ＭｅＯＨ、室温、終夜、収率８８％。（ｄ）４−ニトロフェニルクロロホルマート（１．１当量）、Ｅｔ３Ｎ（３当量）、ＤＣＭ、室温、２．５時間、収率４４％。（ｅ）シプロフロキサシン（１．２当量）、水（ｐＨ８．５）、ＴＨＦ、０℃〜室温、終夜、収率５２％。（ｆ）ｉ）ＢＴＭＳ（過剰量）、ＤＣＭ、３５℃、２４時間、ｉｉ）ＭｅＯＨ、室温、終夜、収率８６％。
【０２４４】
このＢＰ設計の論理的根拠は、不必要な前記ＢＰ部分の骨吸収抑制活性を抑制しながらその骨探索能力を保持し、交絡因子を最小限にして親シプロフロキサシン化合物に起因する抗菌作用の評価に集中することであった。ＢＰリガンドは、解剖学的感染部位において抗菌作用に加えて骨組織保護という二重作用を提供することが必要である場合は（様々な効力の）骨吸収抑制機能性を有するようにも設計可能である。弱い結合親和性によって標的化効率が低下することがこれまでの研究１３、１４から実証されているため、骨結合親和性とテザー長を考慮してこのフェニルＢＰを選択した。アリールカルバメートをリンカーとして使用することによりこれまでに得られたＢＰ−フルオロキノロン複合体と比べて最適な血漿中安定性と骨上での適切な分離がこの生化学的標的に提供され得ると考えられた。
【０２４５】
さらに、カルバメート結合と対照的にアミド結合を有する類似のＢＰ−シプロフロキサシン複合体を対照複合体１１（ＢＶ６０００２６）として図３１に示されるスキームによって略述されるように合成した。図３１に提示されているスキームの試薬は次の通りであった。試薬及び条件：（ａ）ｉ）ＮａＨ（１．４当量）、ＴＨＦ、０℃〜室温、１時間；ｉｉ）メチル４（ブロモメチル）ベンゾエート（０．７当量）、ＴＨＦ、０℃〜室温、終夜、収率３７％。（ｂ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（５当量）、ＭｅＯＨ、室温、終夜、収率９１％。（ｃ）ＳＯＣｌ２（２当量）、ＤＭＦ（０．０５当量）、ＤＣＭ、室温、２時間、定量的収率。（ｄ）シプロフロキサシン（１当量）、ＤＩＰＥＡ（６当量）、ＣＨＣｌ３、室温、終夜、収率６５％。（ｅ）ｉ）ＢＴＭＳ（過剰量）、ＤＣＭ、３５℃、終夜、ｉｉ）ＭｅＯＨ、室温、３０分間、収率８２％。アミド複合体は親抗生物質を分離することができず、したがってこの例では１１について確認されることが求められたインビトロ及びインビボで有効性が低いことがこれまでの研究によって示されている。
【０２４６】
ＢＰ−シプロフロキサシン複合体の抗菌特性
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイ：
骨感染症に関連するメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む一団の黄色ブドウ球菌臨床株に対する複合体（６及び１１）及び親抗生物質であるシプロフロキサシンの両方の抗菌活性を標準的な実験室用プランクトン型培養システム中で評価した。ＥＵＣＡＳＴ（欧州薬剤感受性試験委員会）ガイドライン２９に従うと、ディスク拡散阻止帯分析法の結果は２５〜４０ｍｍの範囲（平均値：３１．５、ＳＤ：±５）の直径を示し、全ての株が親抗生物質であるシプロフロキサシンに対するＥＵＣＡＳＴ臨床ブレイクポイントに従う抗菌薬感受性を示した。微量希釈法を用いる８株の黄色ブドウ球菌に対する６及び１１の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の結果が図３２に示されている。基準とするために親化合物であるシプロフロキサシンのＭＩＣを同時に決定し（図３２参照）、それらのＭＩＣが確定済み臨床ブレイクポイント２９と矛盾しないことを見出した。
【０２４７】
ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）結合アッセイ：
６の抗菌効果を確定し、次にＨＡ結合能を評価しようとした。ＨＡ球状体を前記微生物用培地に添加し、前記抗菌試験に使用された濃度と同様の様々な濃度の６を導入した。ＨＡによる前記複合体の顕著な吸着と保持が上清（ＨＡ球状体を含まない）の定量的分光分析によって確認された（図１８及び図５）。
【０２４８】
抗菌物質感受性試験（ＡＳＴ）におけるプランクトン型黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対するｐＨの効果：
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株は他の試験株と比較してシプロフロキサシンと６の両方に対して最低のＭＩＣプロファイルを示した（図３２参照）のでこの株をさらに詳しい調査のために選択した。このＡＴＣＣ株はよく知られた強固なバイオフィルム形成性病原体でもある。そのため、バイオフィルムベースで臨床的に妥当なモデルでの抗菌活性の評価も促進しつつ、バイアス及び結果の過大評価を限定するために前記複合体を難しい病原体に対して試験した。酸性ｐＨと生理的ｐＨの両方で６を用いてプランクトン型黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対する抗菌物質感受性試験（ＡＳＴ）を実施して複合体活性に対するｐＨの効果を評価した。生理的条件下でＭＩＣ５０に到達するために必要とされる前記複合体濃度の半分でＭＩＣ５０に到達することから酸性条件（ｐＨ５）下では６の抗菌活性が全体的に改善されることが標準的な微量希釈法に由来する定量的な結果から示された（図６及び図４）。これらの結果及び本明細書中のどこかに提示される結果では、最小阻害濃度の表現であるＭＩＣ５０又はＭＩＣ９０はそれぞれ細菌量の５０％又は９０％の減少を指し、最小バイオフィルム阻止濃度についてのバイオフィルム関連の表現（ＭＢＩＣ５０又はＭＢＩＣ９０）はバイオフィルム細菌量の減少であることを除いて同様の減少（５０％又は９０％）を指す。
【０２４９】
化合物６の時間殺菌アッセイ：
次に６を用いてカイネティクスアッセイをＣＬＳＩ（米国臨床検査標準協会）法３０に従って実施した。この複合体はこれまでに確定されたＭＩＣでプランクトン型黄色ブドウ球菌のメチシリン感受性（ＡＴＣＣ−６５３８）単離株とメチシリン耐性（ＭＲ４−ＣＩＰＳ）単離株を１時間以内、最大で２４時間以内に殺菌し、細菌増殖を１００％抑制することが結果より示された。前記ＭＩＣ値の半分で細菌増殖の防止が２時間後に明確になり、増殖の抑制が２４時間後に対照の５０％の割合であることもこれらのカイネティクス試験によって示された（例えば図７）。
【０２５０】
バイオフィルムに対する６の抗菌効果の評価：
次に２種類の異なる基材（ポリスチレンディスク及びＨＡディスク）上に予め形成された細菌バイオフィルムに対して化合物６を試験してバイオフィルムに対する抗菌効果を評価し、且つ、観察された抗菌効果において基材結合特性が何らかの役割を担うかどうかも判定した。黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ−６５３８）のバイオフィルム及び追加として緑膿菌（ＡＴＣＣ−１５４４２）のバイオフィルムを基材としてのポリスチレン又はＨＡの上で増殖させ、抗菌活性の評価のためにそれらのバイオフィルムを様々な濃度の６に曝露した。緑膿菌はグラム陰性病原体であり、且つ、有病率の点でグラム陽性黄色ブドウ球菌よりも頻度が低いが２番目に最も一般的な骨髄炎の臨床病原体であるので緑膿菌をここで。例えば、図８はバイオフィルム増殖のための基材としてのポリスチレンの結果を示しており、６の最小バイオフィルム阻止濃度（ＭＢＩＣ５０）は黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８については１５．６〜３１．２μｇ／ｍＬであり、それはプランクトン型培養物状態のこの株に対するＭＩＣに相当した。その試験濃度範囲では緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株についてＭＢＩＣ５０が観察されず、ＭＢＩＣ９０はどちらの病原体についても観察されなかった。
【０２５１】
しかしながら、ＨＡディスクがバイオフィルム基材として使用されると顕著な殺菌活性が６について認められた。図３３に示されるように、全ての試験濃度のこの複合体によって統計学的に有意な（ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定）殺菌活性が生じ、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の低下が起こった。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対して６のＭＢＩＣ５０は１６μｇ／ｍＬであり、ＭＢＩＣ９０は１００μｇ／ｍＬであった。この病原体に対して親薬品であるシプロフロキサシンのＭＢＩＣ９０は８μｇ／ｍＬであった。しかしながら、緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株に対してシプロフロキサシンはこの設定では抑制活性又は殺菌活性を持たず、一方で前記複合体は酸性条件及び生理的条件下において５０μｇ／ｍＬの濃度で殺菌性であり、且つ、酸性条件で抗菌活性の改善が認められる黄色ブドウ球菌と対照的に生理的条件において殺菌活性の改善を示した。
【０２５２】
予防的抗菌アッセイ：
次に、プランクトン型培養物とバイオフィルム培養物を用いる予防型の実験設定であって、骨髄炎薬物療法向けの抗生物質による予防シナリオにおいて臨床的妥当性を有する可能性もある前記実験設定において６を使用する抗菌試験を実施した。ここではＨＡ球状体を様々な濃度の６に導入し、そして２４時間にわたって黄色ブドウ球菌と共にインキュベートし、そして定量的評価によって例えば図１０に示されるように１５．６μｇ／ｍＬという低い濃度から最大で２５０μｇ／ｍＬの６の濃度で細菌増殖が示されず、０．２４〜７．８μｇ／ｍＬの範囲の複合体濃度では強く抑制された最小の細菌増殖が示された。
【０２５３】
次に黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株バイオフィルムを治療する能力について前記カルバメート複合体６を試験するために使用した実験条件と類似の実験条件下で前記アミド複合体（１１）を試験した。ＨＡ上で増殖して定着した黄色ブドウ球菌バイオフィルム、及び予防実験設定においてバイオフィルム増殖の前に１１で前処理されたＨＡ上で増殖して定着した黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対して１１の活性を評価したところ、６を試験するために使用された用量よりも高い用量であっても１１の抗菌活性は図３４に示されるように両方の場合でわずかなものであった。
【０２５４】
前処理されたＨＡ上での黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８バイオフィルム形成を防止する能力について６を試験すると、前記複合体は親抗生物質と比較して、且つ、顕著な抗菌活性を示さなかった１１と対照的に、優れた抗菌活性を示した。図１１は定量的バイオフィルム培養の結果と２４時間の増殖後のＣＦＵ数を示しており、親薬品であるシプロフロキサシンは１００μｇ／ｍＬの濃度であらゆるバイオフィルム増殖を抑制し、一方で６は１０μｇ／ｍＬの濃度であらゆる増殖を抑制した。シプロフロキサシンの分子質量は６の分子質量のおよそ半分であるので６はシプロフロキサシン単体と比較して完全殺菌作用の達成に関して活性が２０倍高かった。
【０２５５】
インビボ安全性及び効力：
６が有望な活性をインビトロで示したので我々はプロテーゼ周囲骨髄炎の動物モデルにおいて薬品安全性と効力をインビボで評価しようとした。このモデルはバイオフィルム介在性疾患及び宿主応答をインビボで研究するために技術移転上の価値に適うように特異的に開発されたユニークな自家製の顎骨インプラント周囲骨髄炎モデルである３１。感染の結果として生じる骨溶解は骨のあらゆる高代謝部位のように高濃度のＢＰ複合体の誘引（標的化）にとって重要であり、後にこの疾患骨表面で前記複合体の活性シプロフロキサシン成分を分離するためにも重要であるため、全身治療レジメンが利用されることからこのアッセイはあらゆる感染した骨表面のモデル化にも役立つ。簡単に説明すると、ラットの正常な細菌叢に常在性の細菌ではなく、顎骨感染症に特異的な細菌である顎骨骨髄炎病原体アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａａ；野生型Ｒ型株Ｄ７Ｓ−１；ａ血清型）のバイオフィルムを１０９ＣＦＵで小型チタン製インプラント上に予備接種した。我々の動物試験の前に親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの感受性を確認するため、以前に記載された長骨骨髄炎病原体について実施されたようにＡＳＴアッセイとＭＩＣアッセイを実施した。ディスク拡散阻止帯分析法によって４０ｍｍを超える直径が明らかになり、且つ、ＭＩＣ９０は２μｇ／ｍＬであり、親薬品であるシプロフロキサシンに対するこの微生物の強い感受性が示された。ＡａはｐＨ感受性ビオチン化シプロフロキサシンプロドラッグに対する感受性についても以前に試験されており、親抗生物質に対して感受性であることが分かった３２。本研究におけるこれまでの病原体のように、６に対する感受性についてＨＡ上で増殖したＡａバイオフィルム病原体を試験し、我々の複合体が図３５に示されるような効果的な抗菌活性を示すことが分かった。
【０２５６】
インビトロでＡａバイオフィルムがインプラント上に定着した後に各ラットの顎骨にそれらのインプラントを外科的に移植する。動物に麻酔をかけ、頬を鉤で引っ張り、そして手作業で骨切除部にインプラントを挿入し、且つ、固定することができるように経粘膜骨切除術を実施する。２個のバイオフィルム接種インプラントを各ラットの口蓋骨の両側に設置する（ｎ＝１２ラット、合計２４インプラント）。標準的、且つ、再現可能な量の生きた細菌がこのモデルによって各インプラント上によく定着したバイオフィルムとして形成されるが、我々はそのバイオフィルムがインプラント設置から数週間にわたってインビボで存続し、局所的に感染症、炎症、及び骨破壊の原因となることをこれまでに実証している３１。
【０２５７】
術後１週間でインプラント周囲感染症が確立されたところで、実験の項において明記された投与計画においてそれらの動物に６、陽性対照としてシプロフロキサシン単体、及び陰性対照として無菌エンドトキシン非含有生理食塩水を投与した。適切な投与濃度を決定するため、げっ歯類においても類似のターゲット・リリース戦略を使用する以前の試験及び薬物動態データに基づいて前記複合体のおおよその初回投与量を計算した１３、２６。サンプルサイズの見積もり及びこの動物モデルに関するこれまでの経験に基づいて０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇと徐々に増加する用量に相当するモル当量の６により群当たり２匹の実験動物において抗菌活性を決定することが可能になり得る３２。動物は全身麻酔下で腹腔内注射により投与され、全ての化合物が適切なｐＨの無菌注射可能生理食塩水中に構成された。腹腔内注射は尾静脈注射のような他の非経口的方法と比べて小げっ歯類動物では投与が簡単であり、且つ、胃腸投与後のシプロフロキサシンの薬物動態が良好な生物学的利用率を示すことから腹腔内注射を活用した。そのような投与の後に達成される血清中薬品レベルは静脈内投与による血清中薬品レベルよりもわずかに低いが同等であり、初回通過代謝後に実質的な消失が無い３３。薬物療法から１週間後に全ての動物を殺処理し、インプラント周囲の硬組織と軟組織の一括摘出を実施し、微生物負荷量の定量的評価のためにそれらの組織を均質化した。
【０２５８】
全ての動物が前記薬物療法をよく忍容し、皮膚の注射部位反応も炎症も無かった。治療中に忍容性について大きな問題の兆候は無かった。治療効果を図３６に示されるように生きた細菌の減少量の対数（組織グラム当たりのＣＦＵの１０を底とする平均対数）として定量的に測定した。
【０２５９】
インビボでは６の１０ｍｇ／ｋｇの用量での単回投与によって細菌数の１０の２乗倍の減少（９９％の殺菌）、及び投与一回当たりの濃度（ｍｇ／ｋｇ）が同じであるが複数回にわたって投与されるシプロフロキサシン単体（合計３０ｍｇ／ｋｇの用量）よりもほぼ一桁高い活性を伴う最高の効力が示された。したがって、６のより大きな分子量（シプロフロキサシンの約２倍）を考慮すると１０ｍｇ／ｋｇという用量で投与された６の単回用量であれば完全分離を仮定するとおおまかに５ｍｇ／ｋｇの有効なシプロフロキサシンが送達可能であり、それは対照シプロフロキサシン群（合計３０ｍｇ／ｋｇ）のシプロフロキサシンのモル用量の６分の１である。複数回投与処方の中のシプロフロキサシン単体により細菌数の１０の１乗倍の減少（９０％の殺菌）が生じた。０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇという６の濃度はほとんど効果を持たず、臨床効果には最小用量が必要であること、及びさらなる化学最適化がこの状況下で可能であり得ることが示唆された。
【０２６０】
動物試験での発見を確認するため、及び統計分析に適したより強い統計力とより大きなサンプルサイズを提供するため、我々は投与計画の割り当てを除いて第１の動物試験とほぼ同一の第２の動物実験を実施した。上記の我々の第１の動物試験に由来する投与データと抗菌成績に基づき、我々は３処置群、すなわち陰性対照（ｎ＝５ラット）、１０ｍｇ／ｋｇという単回高用量の６（ｎ＝５ラット）、及び０．３ｍｇ／ｋｇを週３回という複数回低用量用法の６（ｎ＝２ラット）にこの第２の動物試験の焦点を合わせた。０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの投与群はこれまでに効力を示さなかったので除外され、我々の最初の動物試験でも確認されている強固な実績データがシプロフロキサシンの効力について存在することから親抗生物質単体も除外された。回復可能な細菌が存在しないことが治療効果に起因し得るのか、又は実験と標本の誤差に起因し得るのか確認するために複数回投与処方を再度活用した。他の全ての実験パラメーターは第１の動物実験と同一であり、前のようにそれぞれの動物に２個のインプラントが設置されており、それによって動物当たり２例の結果が可能になり、且つ、サンプルサイズの見積もりによって決定されるような統計分析に充分な統計力が提供された。
【０２６１】
全ての動物が再び治療及び薬物療法をよく忍容し、治療中に忍容性について大きな問題の兆候は無かった。臨床的には、対照群の動物の大多数が処置群の炎症を起こしていないインプラント周囲組織を有する動物の大多数と比較して局所的プロテーゼ周囲炎の証拠を示すことが麻酔時及び外科的摘出時に観察された。インプラント保持率は高い保持率である２４インプラント中２３インプラント（９６％）であり、後続の分析に強固な統計力を提供した。この第２の動物実験に由来する定量的抗菌成績が図３７に示されている。処置群間でＣＦＵを比較する一元配置ＡＮＯＶＡ検定（α＝０．０５）によって群間での有意性についてｐ値が０．００６になり、独立ｔ検定（ｐ＝０．０００５；ｄｆ＝２０）を活用するポストホック検定とダネットの多重比較検定（ｐ＜０．０５）によって対照と比較した６の単回高用量処置の有意性が示されたが、対照群又は単回高用量処置群と比較すると複数回低用量投与群の有意性は示されなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２６２】
考察
ＢＰ部分への（分離可能カルバメートリンカーを介した）複合体化による骨への抗生物質の標的化は、骨髄炎バイオフィルムの治療にとって有望なアプローチである。本明細書において提示されるＡＳＴ試験の結果とＭＩＣデータは、シプロフロキサシンと６がプランクトン型黄色ブドウ球菌に対して有効な殺菌活性を有しており、１１の比較的に弱い活性によって証明されているように複合体化のための連結が親薬品の抗菌活性に影響を与えていることを示している（図３２）。ＭＩＣに到達するために比較的に高濃度の６が必要とされた。複合体化は複合体から分離される前の抗生物質の生化学的相互作用を変更する可能性がある化学的改変であるため、このことは予期されたことである。結果として薬力学的効果を含む親薬品の特性がそのような改変によって変更される可能性がある。６についてのＭＩＣの結果は、この分類の複合体が親化合物の抗菌活性よりもわずかに低いレベルではあるがその抗菌活性を保持し得ることを示している以前の文献９、１０と一致した。
【０２６３】
試験した複数の黄色ブドウ球菌株に対して抗菌効果の相違をほとんど示さなかったシプロフロキサシン単体と比較して、同じ株に対する両複合体のＭＩＣ値が広く分布したことが興味深かった（図１７）。これらの結果には幾つかの説明が可能である。同種内の異なる細菌株が病毒性及び抗生物質に対する薬剤感受性／耐性に関して顕著な相違を示すことが知られている。株特異的な変動が抗生物質の輸送流出機構、細菌細胞壁密度、酵素活性レベル、耐性機構、及び環境のｐＨを変更する能力に関して存在することが充分に証明されている３４。シプロフロキサシンの殺菌活性はＤＮＡ複製に必要とされる酵素であるトポイソメラーゼＩＩ及びＩＶの細胞内での阻害により生じる３５。
【０２６４】
この分類の完全複合体は顕著な内在性抗菌活性を概ね失っており１８、１９、且つ、どのＢＰ関連抗菌作用も無視できる程度であることが証明されており、したがって少なくとも部分的な親薬品の分離が６について観察されるように顕著な抗菌活性の前提条件である。このことは、前記アッセイにおいて比較的に不安定なカルバメート連結複合体６の濃度の２〜６４倍になって同じ抗菌作用を達成した、比較的に安定なアミド結合の点で異なる１１の低い抗菌活性と一致している。
【０２６５】
６の抗菌効果を評価した後に、前記ＢＰ部分の骨結合機能性を評価しようとして、濃度依存的な前記複合体によるＨＡ球状体への効果的な吸着と保持を見出した。これらの結果は類似する骨親和性を有するＢＰ部分を含有するこの分類の以前に報告された類似体と一致する１３、１９。次に６の活性が異なるｐＨ条件で変化するか調査し、酸性条件でわずかに改善されたプロファイルが見出された。このことは前記リンカーがｐＨ７．４よりもｐＨ５で不安定であり、したがって比較的に低いｐＨでより多くのシプロフロキサシンが分離されるという事実によって少なくとも部分的に説明可能である。このことは、宿主の炎症及び破骨細胞形成と共にバイオフィルム病原体が酸性の局所的環境を作り出す骨髄炎への臨床応用にとって有用である可能性があった。しかしながら他の研究者は、感染性生物及び炎症により生じた酸性ｐＨは骨における幾らかの薬物溶出を引き起こす可能性があるが、顕著な濃度の前記抗菌剤を提供する点でそのような過程の有効性はおぼつかなく、プロドラッグの設計、複合体化スキーム、及び局所的酵素性加水分解に対する感受性がリンカーの切断性と効力に対してより大きな役割を果たすだろうと示唆している１３。本実施例のデータもそのような結論を裏付けている。
【０２６６】
６の時間殺菌カイネティクスの調査では２４時間にわたる持続的殺菌活性と共に試験細菌に対する効率的な殺菌活性率が示され、経時的な安定持続性分離プロファイルを有する親抗生物質の切断活性が裏付けられた。本明細書において観察されたその抗生物質分離カイネティクスは骨髄炎治療のために現在使用されている生物分解性と非生物分解性の送達系について観察されているカイネティクスとは異なる場合があり、後者のカイネティクスは一般的に投与部位において抗生物質の高い放出量を最初に示し、残りの抗生物質が長時間にわたってより少ないパーセンテージで消失する３６、３７。
【０２６７】
本実施例は骨髄炎治療向けにインビトロ及びインビボのバイオフィルム関連モデルにおける６などの複合体の抗菌効果の証拠を提示する。骨髄炎バイオフィルム（黄色ブドウ球菌及び緑膿菌）をインビトロでポリスチレン又はＨＡなどの異なる基材上に増殖させ、その後に６で処理すると、ポリスチレンよりもＨＡが存在する場合に、前記複合体はバイオフィルムに対して効果的であった。このことは、試験される病原体の株及び細菌増殖モード（プランクトン型対バイオフィルム）のような因子に加えて、基材結合特性が抗菌活性に役割を担うことを示している。６がＨＡ上の骨髄炎病原体に対しては効果的であったが、基材としてのポリスチレン上の同じ株に対しては効果的ではなかったという事実は、その基材（例えばＨＡ）に結合して直接的にバイオフィルムの下、又はバイオフィルム内に抗生物質を放出することの方が（親抗生物質単体、又は基材への結合が起こらず、定着した表面バイオフィルムに対する活性が見られなかったポリスチレン上の６の場合のように）バイオフィルム表面に沿って前記抗生物質を流すだけよりも骨髄炎バイオフィルムを効果的に治療するために必要であることを示している。基材としてポリスチレンを使用する設定と比較してＨＡディスクを使用する実験設定で見出された６の改善された活性は、前記複合体のＢＰ部分がＨＡ構造体に対して高い親和性を有しており、したがって前記ディスクへの６の局在化のために比較的に高濃度の親抗生物質に対してＨＡ付着性の細菌が曝露される可能性があったという事実に起因するようである。また、バイオフィルム細菌細胞の下にある骨での６の切断はこれまでに示されているように２２破骨細胞下でのカルバメート切断に類似している可能性があり、そのことは局所的環境がこの状況で役割を担っていることを示唆しており、且つ、これもまた骨溶解の原因となる細菌の下の環境が骨に存在する破骨細胞の下の環境との類似性を有していることをさらに示しているが、それはこれらの環境は両方ともおそらくはｐＨと酵素性加水分解の組合せによってアリールカルバメート結合を切断して活性シプロフロキサシンを分離することが可能であるように考えられるためである。ＢＰ（放射性標識）プロスタグランジン複合体を使用するＡｒｎｓらによる以前の研究２７は血流中の前記複合体の半減期が大半のＢＰ３８と同様に１５分未満であることを示唆している。したがって、前記複合体はその時間の内に骨に結合するか、又は排出されるかのどちらかである。この研究は我々のカルバメートに近い結合を有する骨表面上の前記ＢＰから前記活性薬品（この場合ではプロスタグランジン）が分離する半減期が５日と２８日との間であることも示している。本明細書において示される結合は、ここで報告される刺激的なインビボの結果を達成するためには５日の半減期の比較的近くで解離されなければならない。Ａｒｎｓら２７は骨細胞の下では切断機構は酵素性である可能性が最も高いと推測している。鉱物質表面上に細菌が存在する場合、切断機構は酵素ベースの切断である可能性もある。破骨細胞が存在しないインビトロ抗菌試験時についての原稿に既に記されているように、我々のカルバメート系複合体には活性が有るが、我々の切断不可能アミド系複合体には非常に低い活性しかない。
【０２６８】
黄色ブドウ球菌に対する骨髄炎予防実験においても前記複合体を試験し、完全殺菌作用の達成に関してシプロフロキサシン単体と比較して６は２０倍高い活性を有し（図１１）、一方で１１にはどんな抗菌活性も認められない（図３４）ことが分かった。これらの発見は１１と比較して効率的な６からの親抗生物質の経時的切断分離機構を裏付けている。効率的なＨＡへの結合及び親抗生物質の分離は実質的な抗菌効果を示すためのこの分類の複合体の前提条件である。
【０２６９】
最後に、モデル顎骨病原体Ａａを使用する顎骨インプラント周囲骨髄炎ラットモデルにおいて６のインビボ安全性と効力を試験しようとした。我々の動物試験の前に親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの感受性を確認するために我々は本研究において長骨骨髄炎病原体について実施されたようにインビトロＡＳＴアッセイとＭＩＣアッセイを実施した。Ａａは親薬品であるシプロフロキサシンに対して強い感受性を示した。６に対する感受性について（黄色ブドウ球菌及び緑膿菌と同様に）ＨＡ上で増殖したＡａバイオフィルムも試験し、我々の複合体が効果的な抗菌活性を示すことが分かった（図３５）。したがって、インプラント周囲顎骨骨髄炎モデルを利用して２つの連続的な動物実験を実施した。第１のインビボ試験では６の１０ｍｇ／ｋｇの用量での単回投与によってＣＦＵの１０の２乗倍の減少又は９９％の殺菌、及び投与一回当たりの濃度（ｍｇ／ｋｇ）が同じであるが複数回にわたって投与されるシプロフロキサシン単体よりもほぼ一桁高い活性（図３６）を伴う最高の効力であって、高用量の曝露であっても比較的に安定な１１では観察されず、比較的に不安定な６で観察されたような親抗生物質単体１８〜２０と同等以上の効力が示され、これによって切断が抗菌効果に寄与し、且つ、幾つかの例では切断が抗菌効果に必要であり得ることが確認された。この実験ではより低濃度の６は無効果であった。これらの結果を確認するために我々は対照と比較して有効な６の投与計画（１０ｍｇ／ｋｇ）と６の複数回投与処方に焦点を合わせているより大規模でより統計力が強い第２のインビボ実験を実施した。最大のＣＦＵ減少と効力が再び単回高用量（１０ｍｇ／ｋｇ）の複合体において観察された。
【０２７０】
インビボ実験により、親抗生物質単体の活性が既に消失しているときに定着したＡａバイオフィルムに対する殺菌活性のために感染したインプラント周囲骨を標的とし、且つ、充分な濃度の親抗生物質を産出する６の能力が安全、且つ、適切な単回用量で確認された。微生物の定量には一括摘除された組織のホモジェネートが関係するため（その方法論はプレート培養及び評価のための表面剥離を含まなかったので）表面病原体ばかりか三次元骨性構造体の細管内のバイオフィルム細菌でさえも分析に含まれる。このことはバイオフィルム細菌のＣＦＵのかなりの減少によって証明されるようなプロテーゼ周囲骨への有効なＢＰ吸収／吸着と抗生物質の分離を示唆している。
【０２７１】
複合体は独特の薬効評価パラメーターを有しており、且つ、前記ＢＰ部分のために主に骨に局在しているのでこれらの複合体とそれらの親化合物との間の直接的比較はやや恣意的であることもこの分野の他の研究と共にこれらの結果によって示されている。このことは、ヒトでは骨での取り込みよりも筋肉と腱での取り込みのほうがずっと高く３９、したがって感受性個体群におけるアキレス腱断裂などの有害事象と相関する親抗生物質（一般的にフルオロキノロンクラス）と対照的である。この分類の複合体のどんな将来的な薬物動態学的モデリング及び薬物動態学的試験にも分布について骨格コンパートメントを数理的に含む必要が出てくるが、それはシプロフロキサシン及び他のほとんどの抗生物質の薬物動態学研究では一般的に行われていない。ヒト集団におけるＢＰ薬品の骨薬物動態を正確に決定するためのそのようなアプローチの重要性が証明されている４０。そのようなアプローチはこの状況でより正確で必要な薬理学的データを提供し、臨床投与アプローチについての情報も与える。
【０２７２】
材料と方法
別途明言されない限り全ての操作は窒素雰囲気下で実施された。無水エチルエーテル、無水テトラヒドロフラン、無水クエン酸、クロロホルム、及び硫酸マグネシウムはＥＭＤ社から購入された。４−ベンジルオキシベンジルアルコール、ブロモトリメチルシラン、４−ニトロフェニルクロロホルマート、塩酸（３７％）、無水エタノール、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、及び塩化チオニルはシグマ・アルドリッチ社から購入された。硫酸ナトリウムはＡｍｒｅｓｃｏ社から購入された。水素化ナトリウム（５７〜６３％油性分散体）、メチレンジホスホン酸テトライソプロピル、１０％パラジウム活性炭素、４（ブロモメチル）ベンゾエート、水酸化リチウム一水和物、及びＮ−エチルジイソプロピルアミンはＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ社から購入された。酢酸エチル、ヘキサン、及びジクロロメタンはＶＷＲ社から購入された。無水メチルアルコール、トリメチルアミン、及び炭酸ナトリウムはＭａｃｒｏｎ社から購入された。水素ガスはＡｉｒｇａｓ社から購入された。シプロフロキサシンはＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入された。アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）はＳｐｅｃｔｒｕｍ社から購入された。別途明言されない限り全ての試薬は受け取られたまま使用された。３Åのモレキュラーシーブ（２０（質量／体積）％）４１を使用して全ての溶媒を乾燥した。シリカゲル（ＳｉｌｉｃａＦｌａｓｈ  Ｐ６０、４０〜６３Å、４０〜６３μｍ、２３０〜４００メッシュ）はＳｉｌｉｃｙｃｌｅ社から購入された。
【０２７３】
核磁気共鳴スペクトルを、９６スピナー試料交換機が装着されたＶａｒｉａｎ  ４００−ＭＲ  ２チャンネルＮＭＲスペクトル計上で記録し、ＴｏｐＳｐｉｎ及びＭｅｓｔＲｅＮｏｖａを使用して分析した。１Ｈの化学シフト（δ，ｐｐｍ）は残留溶媒ピークを基準とした。データ取得用にＴｕｎｅ  Ｐｌｕｓバージョン２．０ソフトウェアを使用し、且つ、データ処理用にＸｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）２．０．７を使用してポジティブモード及び／又はネガティブモード下にあるＥＳＩ源を装着されたＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａ  ＸＰ  Ｍａｘ質量分析計上で質量スペクトルを取得し、ｍ／ｚ形式で報告した。有機元素分析はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社によってＦｌａｓｈ  ２０００  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で実施された。
【０２７４】
最終化合物６及び１１並びに市販のシプロフロキサシンの純度は９５％以上であり、１Ｈと３１ＰのＮＭＲスペクトル測定、ＨＰＬＣ、及び元素分析計を使用して決定された。最終化合物の分析ＨＰＬＣはダイオードアレイ検出器が装着されたＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＨＰＬＣシステム上で実施された。ラボソリューション・ソフトウェアがデータの収集と分析の両方に使用された。ＨＰＬＣ方法Ａ：１．０ｍＬ／分の流速で運用されるＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５μ  Ｃ１８（２）  １００Å分析カラム（２５０×４．６ｍｍ）を使用した。次の溶媒濃度勾配を使用した：（緩衝液Ａ＝０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ７．５３）中の２０％ＡＣＮ、緩衝液Ｂ＝０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ７．１６）中の７０％ＣＡＮ）０〜７分：０％Ｂ、７〜２５分：１００％Ｂ、２５〜１００分：１００％Ｂ。
【０２７５】
１（ベンジルオキシ）−４（ブロモメチル）ベンゼン（１）の合成
４−ベンジルオキシベンジルアルコール（１．００ｇ、４．６７ｍｍｏｌ）を窒素下の炉内乾燥したフラスコ内の無水ジエチルエーテル（２５ｍＬ）中に溶解した。フラスコを氷浴中で冷却した。ブロモトリメチルシラン（ＢＴＭＳ）（１．２６ｍＬ、９．５２ｍｍｏｌ、２当量）を注射器によって添加した。フラスコを室温までゆっくりと温めた。１７時間撹拌した後に反応混合物を水（５０ｍＬ）に投入し、有機相を分離した。水相をジエチルエーテル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、混合した有機相を塩水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして硫酸ナトリウム上で乾燥した。その溶媒の蒸発によって白色の結晶質の固形物として化合物１を得た（１．２３ｇ、９５％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）δ７．４７  −  ７．２８（ｍ，７Ｈ），６．９８  −  ６．９０（ｍ，２Ｈ），５．０７（ｓ，２Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ）．
【０２７６】
テトライソプロピル（２（４（ベンジルオキシ）フェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（２）
窒素保護下で無水ＴＨＦ（２ｍＬ）を水素化ナトリウム（鉱物油中に５７〜６３％の分散度）（７５ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ、１当量）に添加した。室温で撹拌しながらメチレンジホスホン酸テトライソプロピル（５７０μＬ、１．８０ｍｍｏｌ、１当量）を滴下して添加した。ガスが放出され、灰色の懸濁固形物が消費されて透明な溶液を残した。混合物をさらに１０分間にわたって撹拌した。化合物１（５００ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ、１当量）を窒素向流下で一度に添加した。その溶液は１分間にわたって透明であり、その後に濁った。２時間にわたって撹拌し続け、反応の進行をＴＬＣ（１００％ＥｔＯＡｃ；ＵＶ及びモリブデン酸アンモニウムセリウム（ＣＡＭ）染色により可視化）によりモニターした。その反応混合物を５％クエン酸水溶液（３０ｍＬ）に投入し、エーテル（２×３０ｍＬ）で抽出し、塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、そして蒸発処理した。ＥｔＯＡｃ：ヘキサン濃度勾配（１０〜１００％）を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより残留物を精製して２を無色の油として得た（０．５０８ｇ、５２％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ７．４４−７．２７（ｍ，５Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．８６−４．６３（ｍ，４Ｈ），３．１５（ｔｄ，Ｊ＝１６．６，６．１Ｈｚ，２Ｈ），２．４４（ｔｔ，Ｊ＝２４．２，６．１Ｈｚ，１Ｈ），１．４８−１．０１（ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２１．１１．
【０２７７】
テトライソプロピル（２（４−ヒドロキシフェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（３）
化合物２（０．５０８ｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）を１３ｍＬのメタノール中に溶解し、１０％パラジウム活性炭素（７０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ、０．０７当量）を添加した。フラスコを窒素でフラッシングし、その後に水素でフラッシングし、そして水素バルーンを取り付けて一晩にわたって撹拌した。１００ｍＬのメタノールを使用してセライトで反応混合物を濾過した。濾液の蒸発により所望の化合物３がさらに精製されずに使用される薄黄色の油として生じた（０．３６８ｇ、８８％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．６９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），４．７１（ｍ，４Ｈ），３．１１（ｔｄ，Ｊ＝１６．９，６．０  Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｔｔ，Ｊ＝２４．４，６．０  Ｈｚ，１Ｈ），１．３２  −  １．２１（ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２１．０６．
【０２７８】
４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）フェニル（４−ニトロフェニル）カーボネート（４）
化合物３（７．９１ｇ、１５．９ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、その後にトリエチルアミン（６．７０ｍＬ、４７．９ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、続いてｐ−ニトロフェニルクロロホルマート（３．５４ｇ、１７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を一度に添加した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ中の５％ＭｅＯＨ；ＵＶで可視化）でモニターしながら反応混合物を２．５時間にわたって撹拌した。出発物質の消失後に反応を停止し、標的化合物をフラッシュクロマトグラフィー（１：１の酢酸エチル：ヘキサン混液）により精製して化合物４を得た（４．３３ｇ、４４％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ８．２９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４６  （ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．８４−４．５８（ｍ，４Ｈ），３．２２（ｔｄ，Ｊ＝１６．５，６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｔｔ，Ｊ＝２４．１，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３３−１．１４（ｍ，２４Ｈ）．
【０２７９】
７（４（（４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−１−シクロプロピル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（５）
シプロフロキサシン（２．７６ｇ、８．３４ｍｍｏｌ、１．２当量）をフラスコ中の７４．７ｍＬの水に懸濁した。その後、８．３０ｍＬの１ＭのＨＣｌを添加し、シプロフロキサシンを溶解するためにフラスコを撹拌し、透明無色の溶液が生じた。Ｎａ２ＣＯ３を添加してｐＨを８．５に調節し、濃白色の沈殿物が生じた。フラスコを氷浴中に配置し、そして８３ｍＬのＴＨＦ中に溶解された化合物４（４．２８ｇ、６．９５ｍｍｏｌ、１当量）を約５分間にわたってゆっくりと添加した。その後でフラスコをその氷浴から取り出し、遮光し、そして室温で一晩にわたって撹拌した。その反応混合物を真空下で元の体積の約半分まで濃縮し、そして目の細かいガラス製フリット漏斗に通して濾過した。残留固形物を黄色が残らなくなるまで水で洗浄した。その後、それらの固形物をＤＣＭで溶解してそのフリットから洗い流し、その溶液をフラッシュシリカカラムに負荷し、そしてＭｅＯＨ：ＤＣＭ濃度勾配（２〜５％）で溶出して化合物５を白色の固形物として得た（３．４７ｇ、５１．５％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）  δ８．７９（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．７０（ｄｐｄ，Ｊ＝７．４，６．２，１．３Ｈｚ，４Ｈ），３．９０（ｍ，４Ｈ），３．６５（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），３．３９（ｓ，ｂｒ，４Ｈ），３．１８（ｔｄ，Ｊ＝１６．６，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６５（ｔｔ，Ｊ＝２４．３，６．３Ｈｚ，１Ｈ），１．４３−１．３４（ｍ，２Ｈ），１．３４−１．１９（ｍ，２４Ｈ），１．１８−１．１０（ｍ，２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４）  δ２０．７１．ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ：  ８０８．２（Ｍ＋Ｈ），８３０．２（Ｍ＋Ｎａ）  ｃａｌｃ．ｆｏｒ  Ｃ３８Ｈ５３ＦＮ３Ｏ１１Ｐ２＋：  ８０８．３．
【０２８０】
１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（６）４２、４３
化合物５（１０．０ｍｇ、１．２４μｍｏｌ）を１．５ｍｌのガラス製バイアル瓶の中のＤＣＭ（２００μＬ）中に溶解し、ＢＴＭＳ（２００μＬ、１．５２ｍｍｏｌ、１２２当量）を添加し、そしてすぐにそのバイアル瓶にキャップをし、３５℃の油浴の中に浸した。２４時間にわたって撹拌した後に溶媒及びＢＴＭＳを真空下で除去し、１ｍＬのＭｅＯＨを添加し、そしてそのバイアル瓶を一晩にわたって撹拌した。溶媒を真空下で除去して緑色の蛍光を有する薄黄色の固形物として純粋な化合物６を得た（６．８２ｍｇ、８６．１％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｏｘｉｄｅ）  δ８．５１（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９８（ｓ，２Ｈ），３．７９（ｓ，２Ｈ），３．６７（ｓ，１Ｈ），３．４２（ｓ，４Ｈ），３．１６  （ｔｄ，Ｊ＝１５．５，６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．２１（ｔｔ，Ｊ＝６．９，２１．６Ｈｚ，１Ｈ），１．３７（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．１５（ｓ，２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｏｘｉｄｅ）  δ１９．１６  ＭＳ  （ＥＳＩ−）  ｍ／ｚ：  ６３８．０６  （Ｍ−Ｈ）  ｃａｌｃ．ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ２７ＦＮ３Ｏ１１Ｐ２−：  ６３８．１．ＨＰＬＣ  （Ｍｅｔｈｏｄ  Ａ，ＵＶ  １９０，２７４，３３０ｎｍ）：ｔｒ＝１１．６２  ｍｉｎ．
【０２８１】
メチル４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）ベンゾエート（７）４４
窒素雰囲気下において２５ｍＬの丸底フラスコの中で鉱物油中の５７〜６３％水素化ナトリウム分散物（０．１６３ｇ、４．０７ｍｍｏｌ、１．４当量）にＴＨＦ（５ｍＬ）を添加した。撹拌しながらその懸濁液を０℃まで冷却し、メチレンジホスホン酸テトライソプロピル（０．９２６ｍＬ、２．９０ｍｍｏｌ、１当量）を徐々に添加した。その反応を放置して外界温度にし、水素ガスがその反応混合物から泡立つことを止めたところでその溶液を再び０℃まで冷却した。メチル４（ブロモメチル）ベンゾエート（０．４６５ｇ、２．０３ｍｍｏｌ、０．７当量）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、それを滴下しながら前記反応に添加した。それにより生じた溶液をゆっくりと外界温度に近づけながら一晩にわたって撹拌した。その後、その反応混合物を０℃まで冷却し、ＥｔＯＨ（１ｍＬ）でクエンチした。クエン酸の５％水溶液（３０ｍＬ）を添加し、混合物をＥｔ２Ｏ（３×３０ｍＬ）で抽出し、混合した有機物を塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧したで濃縮し、そしてＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ濃度勾配（１０〜１００％）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製してかすかに黄色の油として７を得た（０．３７１ｇ、３７．０％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ７．９３（ｄ，Ｊ＝８．０  Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．４，２Ｈ），４．７９−４．６８（ｍ，４Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｔｄ，Ｊ＝１６．０，６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．５０（ｔｔ，Ｊ＝２４．０，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．３４−１．２４（ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２０．５７．
【０２８２】
４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）安息香酸（８）４４
８ドラムのガラス製バイアル瓶の中のＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）中の７（０．１３１ｇ、０．２７８ｍｍｏｌ）の溶液にＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０５８ｇ、１．３９ｍｍｏｌ、５当量）を添加し、それにより生じた溶液を一晩にわたって室温で撹拌した。その反応混合物を乾燥するまで蒸発処理し、残留物を水（３０ｍＬ）中に溶解し、そしてＨＣｌ（水溶液）（１Ｍ）を添加してゆっくりとｐＨ３まで到達させた。それにより生じた混合物をＣＨＣｌ３（３×３０ｍＬ）で抽出した。混合した有機物をＭｇＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮して８を濃厚な透明の油として得た（０．１１５ｇ、９０．６％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）：  δ＝７．９６  （ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），４．８２−４．７４（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｔｄ，Ｊ＝１６．６，６．１，２Ｈ），２．６０（ｔｔ，Ｊ＝２４．２，６．２，１Ｈ），１．３３−１．２６  （ｍ，２４Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２０．５７．
【０２８３】
テトライソプロピル（２（４（クロロカルボニル）フェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（９）
窒素雰囲気下において化合物８（０．１６２ｇ、０．３３９ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１ｍＬ）中に溶解し、触媒量のＤＭＦ（１．３０μＬ、０．０１７ｍｍｏｌ、０．０５当量）を添加した。塩化チオニル（４９．２μＬ、０．６７８ｍｍｏｌ、２当量）をゆっくりと添加し、その反応を２時間にわたって室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去して９を透明な油として得た。さらに操作せずに生成物を次の工程にすぐに使用した（定量的収率）。
【０２８４】
７（４（４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）ベンゾイル）ピペラジン−１−イル）−１−シクロプロピル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボキシレート（１０）
シプロフロキサシン（０．１１２ｇ、０．３３９ｍｍｏｌ、１当量）をクロロホルム（１ｍＬ）中に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（３５４μＬ、２．０３ｍｍｏｌ、６当量）を添加した。新しく作製された化合物９（１６８ｍｇ、０．３３８ｍｍｏｌ、１当量）をクロロホルム（１ｍＬ）中に溶解し、徐々に前記シプロフロキサシン：ＤＩＰＥＡ懸濁液に添加した。その反応混合物をホイルで覆い、一晩にわたって室温で撹拌した。翌日、溶媒を真空下で除去し、それにより生じた粗製物をＤＣＭ（５ｍＬ）中に溶解し、中程度のフリット漏斗に通して濾過し、そしてより多くのＤＣＭ（３×５ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮し、ＭｅＯＨ：ＤＣＭ濃度勾配（０〜１０％）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりさらに精製して徐々に固形化する粘性の有る油として１０を得た（０．２２６ｇ、６５．１％の収率、１．８当量のＤＩＰＥＡ塩）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ＝８．７９（ｓ，１Ｈ），８．０６  （ｄ，Ｊ＝１２．８，１Ｈ），７．３８（ｍ，５Ｈ），４．８０−４．７３（ｍ，４Ｈ），４．００（ｓ，ｂｒ，４Ｈ），３．５６−３．５３（ｍ，１Ｈ），３．３３−３．２０（ｍ，６Ｈ）  ２．５０（ｍ，１Ｈ），１．４５−１．３８（ｍ，２Ｈ），１．３２−１．２５（ｍ，２４Ｈ），１．２３−１．１９（ｍ，２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  δ２０．７７．
【０２８５】
１−シクロプロピル−７（４（４（２，２−ジホスホノエチル）ベンゾイル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１１）４２、４３
８ドラムのガラス製バイアル瓶の中で化合物１０（０．１０８ｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７００μＬ）中に溶解し、ＢＴＭＳ（６８６μＬ、５．２０ｍｍｏｌ、３８当量）を添加した。そのバイアル瓶にキャップをし、ホイルで覆い、且つ、撹拌しながら３５℃で一晩にわたって加熱した。翌日、溶媒を真空下で除去し、粗製物をＭｅＯＨ（２ｍＬ）でクエンチした。それにより生じた溶液を室温で３０分間にわたって撹拌した。溶媒を真空下で除去してオレンジ色の油を得た。数滴の水を添加して黄色の固形物を作製した。より多くのＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加し、中程度のガラス製フリット漏斗を使用して、それにより生じた懸濁液を濾過した。それにより生じた固形物をＭｅＯＨでさらに洗浄して１１を黄色の粉末として得た（０．０７０ｇ、８２．０％の収率）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｏｘｉｄｅ，ｐＨ  ７．５）：  δ＝８．５４（ｓ，ｂｒ，１Ｈ），７．９０−７．８７（ｍ，１Ｈ），７．６５−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），４．７９（ｍ，ｏｖｅｒｌａｐ  ｗｉｔｈ  Ｄ２Ｏ，４Ｈ），４．００（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．７９（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．４７（ｓ，ｂｒ，３Ｈ），３．３４（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），３．２１（ｔｄ，Ｊ＝１４．０，６．４，２Ｈ），２．３０（ｔｔ，Ｊ＝２２．０，６．６，１Ｈ），１．３８−１．３３（ｍ，２Ｈ），１．１５（ｓ，ｂｒ，２Ｈ）．３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ  Ｏｘｉｄｅ，ｐＨ  ７．５）  δ１９．１２．ＭＳ  （ＥＳＩ  −）  ｍ／ｚ：  ６２２．２４（Ｍ−Ｈ）  ｃａｌｃ．ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ２７ＦＮ３Ｏ１０Ｐ２−：  ６２２．１２．ＨＰＬＣ  （Ｍｅｔｈｏｄ  Ａ，ＵＶ  １９０，２７４，３３０ｎｍ）：ｔｒ＝４．４３  ｍｉｎ．
【０２８６】
ビスホスホネート−シプロフロキサシン複合体の抗菌特性
実験株：
７株のメチシリン感受性プロファイルを有する黄色ブドウ球菌臨床骨髄炎株及びメチシリン耐性プロファイルを有する１株を試験した。これらの病原体はポーランドのヴロツワフ医科大学薬学微生物学寄生虫学科の菌株コレクションの一部である。さらに、次の米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）株、すなわち黄色ブドウ球菌６５３８株と緑膿菌１５４４２株を実験目的のために選択した。
【０２８７】
ＨＡディスク：
特注仕様のディスクの製造のために市販のＨＡ粉末を使用した。結合剤を使用せずに９．６ｍｍの直径の粉末ペレットをプレス加工した。焼結を９００℃で行った。静的引張試験、圧縮試験、及び曲げ試験用のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｓｔｒｏｎモデル３３８４；Ｉｎｓｔｒｏｎ社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用してそれらの錠剤を圧縮した。それぞれＬＥＸＴ  ＯＬＳ４０００顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、センターバレー、ペンシルバニア州）とＭｅｔｒｏｔｏｍ  １５００マイクロトモグラフ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）を使用する共焦点顕微鏡法とマイクロトモグラフィー（マイクロＣＴ）により、製造されたＨＡディスクの品質を検査した。
【０２８８】
試験株のシプロフロキサシンに対する感受性を評価するためのディスク拡散テスト：
ＥＵＣＡＳＴ２９ガイドラインに従ってこの方法を実施した。簡単に説明すると、０．５マクファーランド（ＭＦ）の細菌希釈物をミュラー・ヒントン（ＭＨ）寒天プレート上に広げた。５ｍｇのシプロフロキサシンを含有するディスクを差し込み、そのプレートを３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。次に定規を使用して阻止帯を記録した。得られた値（ｍｍ）をＥＵＣＡＳＴの表２９に由来する適切な阻止帯の値と比較した。
【０２８９】
分析されたプランクトン型の臨床スタフィロコッカス株に対する試験化合物のＭＩＣの評価：
微生物の増殖に対する親抗生物質及び複合体の効果を評価するため、１×１０５ＣＦＵ／ｍｌの密度を有する１００μｌの微生物溶液を適切な濃度の試験化合物と共に９６ウェル検査プレートのウェルに入れた。その直後に分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＧＯ）を５８０ｎｍの波長で使用して溶液の吸光度を測定した。その後、細菌増殖に最適な条件を得るため、及び細菌のバイオフィルム形成を防止するためにプレートを撹拌機の中で２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。インキュベートした後に吸光度を再度測定した。次の対照試料を用意した：陰性対照試料１：微生物を含まない滅菌培地、陰性対照試料２：ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；シグマ・アルドリッチ社）を１％（体積／体積）の終濃度になるまで加えた微生物を含まない滅菌培地、陽性対照試料１：試験化合物を含まない培地＋微生物、陽性対照試料２：試験化合物を含まないがＤＭＳＯを１％（体積／体積）の終濃度になるまで加えた培地＋微生物。シプロフロキサシンはこの溶媒に効率的に溶解するが、ＤＭＳＯ濃度が１％を超えると微生物細胞にとって有害になり得ることが１％のＤＭＳＯを使用する論理的根拠であった。細胞の相対数を評価するために次の計算を行った。対照試料の吸光度の値（複合体については培地＋微生物、シプロフロキサシンについては培地＋微生物＋ＤＭＳＯ）を１００％と評価した。次に試験化合物と共にインキュベートされた細胞の相対数を以下のように計数した：対照試料吸光度の値／試験試料の値×１００％。
【０２９０】
分光光度法評価によって得られた結果を確認するため、処理された細菌溶液を１０ｍＬの新しい培地に移し、３７℃で４８時間にわたって放置した。培地の混濁形成の有無がそれぞれ病原体増殖の有無の証拠であった。さらに、適切な安定培地上で細菌溶液を培養した。液体培養物に由来する上記結果と共に細菌コロニーの増殖の有無が分光光度法によって得られた結果の確認として機能した。
【０２９１】
ＨＡ球状体を添加したトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）微生物用培地中の６及び１１の分光分析：
ＴＳＢ微生物培地中に懸濁されたＨＡ粉末（球状体）に様々な複合体濃度を導入した。ＢＰ−シプロフロキサシンとＨＡ球状体を含有する溶液を２４ウェルプレートのウェルに入れた。粉末の終濃度は１０ｍｇ／１ｍＬであり、一方で複合体の終濃度は０．２４〜２５０ｍｇ／Ｌであった。直後に分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｕｌｔｉｓｃａ  ＧＯ）を２７５ｎｍの波長で使用して溶液の吸光度を測定した。プレートは測定前に前記分光光度計の中で自動的に撹拌された。次にプレートを撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。２４時間後に吸光度を再度測定した。０時間及び２４時間の時点における前記複合体の相対濃度を評価するために実験の開始時と終了時に測定された吸光度の値を比較した。励起光側スリット、放射光側スリット、積分時間、及び増分を試料の濃度に基づいて最適化した。
【０２９２】
酸性ｐＨ及び生理的ｐＨにおける黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株のプランクトン型培養物に対する６の抗菌物質感受性試験：
ＫＯＨ溶液又はＨＣｌ溶液を使用して微生物用培地をｐＨ７．４とｐＨ５に調節し、そして万能ｐＨ指示薬（Ｍｅｒｃｋ社、ポーランド）を使用してその微生物用培地を測定したことを除いてディスク拡散試験についてこれまでに記載されたようにしてこの実験設定を実施した。
【０２９３】
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株（ＭＳＳＡ）及び臨床ＭＲＳＡ株（ＭＲ４−ＣＩＰＳ）に対する６の時間殺菌アッセイ：
吸光度の測定（５８０ｎｍの波長）を０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１６時間、及び２４時間の時点で行ったことを除いて「分析されたプランクトン型の臨床スタフィロコッカス株に対する試験化合物のＭＩＣの評価」の小見出しの下でこれまでに記載されたようにしてこの実験を実施した。
【０２９４】
黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株及び緑膿菌ＡＴＣＣ−１５４４２株のバイオフィルムに対して実施された６の抗菌物質感受性試験：
適切な寒天プレート（黄色ブドウ球菌についてはコロンビア寒天プレート；緑膿菌についてはマッコンキー寒天プレート）上で培養された株を液体微生物用培地へ移し、嫌気性条件下において２４時間にわたって３７℃で培養した。培養後に株を１ＭＦの密度まで希釈した。基材としてのＨＡディスクを含有する２４ウェルプレートのウェルにそれらの微生物希釈物を入れるか、又は底面がバイオフィルム形成用の基材として機能するポリスチレンウェルにそのままそれらの微生物希釈物を入れた。株を３７℃で４時間にわたって培養した。次にそれらのウェルから微生物含有溶液を取り除いた。それらの面、ＨＡディスク、及びポリスチレンプレートを静かに洗って接着した細胞を残すと共にプラクトン型又は緩く結合した微生物を除去した。０．２４〜１２５ｍｇ／Ｌの６と対照としてのシプロフロキサシンを含む新しいＴＳＢ培地の中にこの様にして調製された面を浸した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後に生理食塩水溶液を使用してそれらの面を洗浄し、そして１ｍＬの０．５％サポニン（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）に移した。それらの面を１分間にわたってボルテックスミキサーで激しく撹拌して細胞を剥離させた。その後、全ての微生物懸濁液を１０−１〜１０−９倍まで希釈した。各希釈物（１００ｍＬ）を適切な安定培地（緑膿菌と黄色ブドウ球菌についてそれぞれマッコンキーとコロンビア）上で培養し、２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。この後に微生物コロニーを計数し、バイオフィルムを形成する細胞の数を評価した。結果を平方ミリメートルの面当たりの平均ＣＦＵ数±平均の標準誤差として表した。ＨＡディスクの表面積を計算するためにＸ線トモグラフィー分析を適用した。検査プレートの底面積を推定するために円の面積の数式であるπｒ２を適用した。
【０２９５】
ＨＡへの黄色ブドウ球菌６５３８株の接着を抑制する６及び１１の抑制能：
ＴＳＢ微生物培地中に懸濁されたＨＡ粉末（球状体）に様々な濃度の６及び１１を導入した。６とＨＡ球状体を含有する溶液を２４ウェルプレートのウェルに入れた。粉末の終濃度は１０ｍｇ／１ｍＬであり、一方で前記複合体の終濃度は０．１２〜２５０ｍｇ／Ｌであった。懸濁液を撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。２４時間後にそれらのウェルから懸濁液を取り除き、瞬間的に遠心分離してＨＡ粉末を沈殿させた。次に非常に静かに上清を捨て、１０５ＣＦＵ／ｍＬの密度を有する新しい１ｍＬの黄色ブドウ球菌を前記ＨＡ球状体に加えた。その後、この溶液を撹拌し、５８０ｎｍの波長を使用して吸光度を測定し、そして撹拌しながら２４時間にわたって３７℃で放置した。インキュベーションの後に吸光度を再度測定し、０時間と２４時間の値を比較して対照試料１（球状体を含まない細菌懸濁液）及び対照試料２（複合体が添加されていない細菌懸濁液＋球状体）に対する細菌増殖の低下を評価した。さらに、溶液を瞬間的に遠心分離し、静かに上清を捨て、一方で前のように細菌含有ＨＡ球状体をプレート上に蒔いて培養し、定量的に評価した。１１の試験のためにＨＡ球状体と１〜４００μｇ／ｍＬまでを範囲とする比較的に高濃度の１１と０．５〜４００μｇ／ｍＬまでを範囲とする濃度のシプロフロキサシンを含有する溶液を調製し、バイオフィルム形成を抑制する能力について再び対照試料（ＨＡを含まない細菌懸濁液）とその溶液を比較した。前記カルバメート複合体と比較して弱いアミド複合体の活性が示されていたために比較的に高い濃度の１１を試験した。
【０２９６】
６で前処理されたＨＡ上での２４時間のインキュベーション後の黄色ブドウ球菌の生存：
様々な濃度のＢＰ−シプロフロキサシン又はシプロフロキサシン単体を含有する２ｍＬの溶液の中にＨＡディスクを浸し、それらのディスクを２４時間にわたって３７℃で放置した。ＤＭＳＯ又はリン酸緩衝液の中でインキュベートされたＨＡディスクが対照試料として働いた。次にディスクを滅菌水で３回洗浄した。洗浄後にバイオフィルム形成用の基材としてのＨＡディスクを含有するウェルに２ｍＬの０．５ＭＦの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８株を入れ、前と同じようにバイオフィルムを形成した。
【０２９７】
倫理声明：
全ての動物実験のプロトコルと方法は南カリフォルニア大学（ＵＳＣ）の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）及び米国獣医師会安楽死研究班の推奨に従って認可及び実施された。ＵＳＣは米国農務省（ＵＳＤＡ）に登録されており、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）に登録されている完全認可された認証状（第Ａ３５１８−０１号）を有しており、且つ、米国実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）によって認定されている。ＩＡＣＵＣによって認可された我々のプロトコルの標題は「バイオフィルム介在性骨溶解性感染症の治療用骨標的化抗菌剤」であり、そのプロトコル番号は２０４７４である。本明細書において提示される動物実験に関係する全ての動物実験プロトコル並びに研究者及び従事者はＵＳＤＡ動物福祉規制の中の実験動物の管理と使用に関する指針（ＣＦＲ１９８５）及び実験動物の人道的管理と使用に関する公衆衛生局方針（１９９６）を厳守した。
【０２９８】
インビボ動物試験：
本研究のため、それぞれ約２００ｇの体重の１２匹の５か月齢未経産のメスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをこの研究に使用した。１２時間毎の明暗サイクル下、２２℃の小動物保存室においてケージ当たり２〜３匹の動物を収容し、軟質食餌（Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｃｈｏｗ）を自由に摂取させた。ＵＳＣにおける動物の使用と管理についてのガイドラインと規制に従って全ての動物を扱った。動物は、毎日それらの動物を直接評価する１日２４時間待機している専任の獣医師の監督下にあった。全ての動物実験は、結果の質、信頼性、有効性、及び再現性を確保するために動物実験について報告するためのＡＲＲＩＶＥガイドライン４５を使用して記載されている。
【０２９９】
この動物モデルはバイオフィルム介在性疾患及び宿主応答をインビボで研究するために特異的に設計された自家製の顎骨インプラント周囲骨髄炎モデルである３１。顎骨骨髄炎病原体Ａａのバイオフィルムを１０９ＣＦＵで小型チタン製インプラント上に予め形成した。我々の動物試験の前に親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの感受性を確認するため、長骨骨髄炎病原体について記載されたようにバイオフィルムＨＡアッセイに加えてプランクトン型Ａａに対してＡＳＴアッセイとＭＩＣアッセイを実施した。インビトロでバイオフィルムがインプラント上に定着した後に各ラットの顎骨にそれらのインプラントを外科的に移植した。手術のため、最初に４％イソフルラン吸入剤を使用し、続いてケタミン（８０〜９０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５〜１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により動物に麻酔をかけた。次に手術部位への０．２５％ブピバカインの浸潤注射により局所麻酔を加えた。次に先制鎮痛として持続放出性ブプレノルフィン（１．０〜１．２ｍｇ／ｋｇ）を最初の切開の前に皮下投与した。麻酔されたところで各ラットの頬粘膜を鉤で引っ張り、前口蓋の自然正中離開状態の歯槽堤にパイロットドリルを使用して経粘膜骨切除術を実施した。その後、プラットホームが粘膜の高さになるまで手作業で骨切除術部にインプラントを挿入し、骨に固定した。２個のバイオフィルム接種インプラントを各ラット（ｎ＝１２ラット）の口蓋骨の両側に設置した。
【０３００】
手術から１週間後に４％のイソフルランを再度投与してラットに軽く麻酔をかけ、インプラントの安定性を確認し、インプラント及び感染部位における炎症の有無などの臨床的発見を書き留めた。その後、腹腔内注射によりそれらの動物にＢＰ−シプロフロキサシン（単回投与として０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ、及び複数回投与群については０．３ｍｇ／ｋｇを週３回の６）又は陽性対照としてシプロフロキサシン単体（これも複数回投与群として１０ｍｇ／ｋｇを週３回）を投与し、陰性対照として無菌エンドトキシン非含有生理食塩水を投与した。
【０３０１】
ランダム化過程を介して動物の処置群と対照群への割り当てを行った。その週にわたってそれぞれの追加の注射の前に複数回投与群の動物を前に記載したように麻酔した。全ての化合物は薬理学グレードであり、適切なｐＨの無菌注射可能生理食塩水中に構成された。薬物療法から１週間後に全ての動物をＣＯ２室（６０〜７０％の濃度）の中に５分間にわたって入れ、その後で頸椎脱臼により安楽死させた。インプラント周囲組織（１ｃｍ２）の摘出を一括実施し、インプラントを取り出した。プロテーゼ周囲炎の有無などの臨床パラメーターを手術及び摘出時に書き留めた。処置群及び対照群に割り当てられたラットを匿名化し、その微生物データを分析する後の調査者から秘密にした。
【０３０２】
微生物分析のため、摘除されたインプラント周囲軟組織及び骨を外科的摘出した直後に１ｍＬの０．５％サポニンの中に入れて均質化及び処理し、そして１分間にわたってボルテックスミキサーで撹拌した後に段階希釈した。１００〜１０−９までの範囲の希釈係数１０（例えば０．１ｍＬのサポニン溶液を０．９ｍＬの０．９％無菌等張生理食塩水溶液に移す）の段階希釈物を調製し、スプレッドプレート法を用いてそれらの希釈物の各々に由来する０．１ｍＬの溶液をプレート上に培養した。Ａａを培養するための培地は改変ＴＳＢからなり、凍結ストックは２０％グリセロール、８０％改変ＴＳＢの中で−８０℃に維持された。全ての培養は４８時間にわたって５％ＣＯ２中において３７℃で実施された。培養された生きているＡａ細菌の数（組織グラム当たりのＣＦＵ数）を手作業で計数し、処置の関数としてのグラム当たりのＣＦＵ数の１０を底とする平均対数の減少を記録した。Ａａ細菌の形態型を確認し、且つ、汚染混入も排除するため、ＣＦＵの計数が完了したところでプレートからコロニーをサンプリングすることによりグラム染色と組織学的評価を実施した。
【０３０３】
統計分析
ＳＰＳＳ  ２２．０（ＩＢＭ社、アーモンク、ニューヨーク州）及びＥｘｃｅｌ  ２０１６（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、レドモンド、ワシントン州）を使用して統計計算を行った。実験前にインビトロ試験及びインビボ試験のサンプルサイズの見積もりをするためにＧ  Ｐｏｗｅｒ  ３ソフトウェア４６を使用して検定力分析を実施した。データ（パラメトリック又は非パラメトリック）の分布を理解し、且つ、平均値、標準誤差、標準偏差、尖度と歪度、及び９５％信頼レベルを生成するために各群の実験結果に由来する定量的データをまず記述統計学によって分析した。その後、場合に応じてクラスカル・ウォリス検定又は一元配置ＡＮＯＶＡを用いてそのデータを分析し、処置群を対照群に比較するときにｐ＜０．０５で統計学的有意性を受け入れた。さらに、インビボ実験については独立ｔ検定を活用するポストホック検定とダネットの多重比較検定を実施した。
【０３０４】
使用した略語
Ａａ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス；ＡＡＡＬＡＣ、米国実験動物管理評価認証協会；ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＡＲＲＩＶＥ、動物研究インビボ実験報告規定；ＡＳＴ、抗生物質感受性試験；ＡＴＣＣ、米国培養細胞系統保存機関；ＢＰ、ビスホスホネート；ＢＴＭＳ、ブロモトリメチルシラン；ＣＦＵ、コロニー形成単位；ＣＬＳＩ、米国臨床検査標準協会；ＥＵＣＡＳＴ、欧州薬剤感受性試験委員会；ＨＡ、ハイドロキシアパタイト；ＩＡＣＵＣ、動物実験委員会；ＭＢＣ、平均殺菌濃度；ＭＢＩＣ５０、生物の５０％の増殖を抑制するために必要とされる最小バイオフィルム阻止濃度；ＭＦ、マクファーランド；ＭＨ、ミュラー・ヒントン；ＭＩＣ５０、生物の５０％の増殖を抑制するために必要とされる最小発育阻止濃度；ＭＳＳＡ、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌；Ｐｄ／Ｃ、パラジウム活性炭素；ＳＤ、標準偏差；ＢＴＭＳ、ブロモトリメチルシラン；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＳＯＣｌ２、塩化チオニル；ＳＥＭ、走査電子顕微鏡法。
【０３０５】
実施例５の参照先
１．Ｌｅｗ，Ｄ．Ｐ．；  Ｗａｌｄｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ａ．Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００４，３６４，３６９−３７９．
２．Ｄｅｓｒｏｃｈｅｒｓ，Ａ．；  Ｓｔ−Ｊｅａｎ，Ｇ．；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．Ｌｉｍｂ  ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ．Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍ．Ｆｏｏｄ  Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．２０１４，３０，１４３−１５５，ｖｉ．
３．Ｓｔｏｏｄｌｅｙ，Ｐ．；  Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．；  Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ，Ｐ．Ｐ．；  Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ，Ｌ．；  Ｂａｒａｔｚ，Ｍ．Ｅ．；  Ａｌｔｍａｎ，Ｄ．Ｔ．；  Ｓｏｔｅｒｅａｎｏｓ，Ｎ．Ｇ．；  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｗ．；  Ｄｅｍｅｏ，Ｐ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｐｒａｃｔ．２０１１，２２，５５８−５６３．
４．Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．；  Ｔｓａｉ，Ｋ．Ｔ．；  Ｗｅｎｇ，Ｓ．Ｆ．；  Ｌｉｎ，Ｈ．Ｊ．；  Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｓ．；  Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｊ．；  Ｇｕｏ，Ｈ．Ｒ．；
Ｈｓｕ，Ｃ．Ｃ．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｒｉｓｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｌｄｅｒｌｙ：  ａ  ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｈｏｒｔ  ｓｔｕｄｙ．ＢＭＣ  Ｇｅｒｉａｔｒ．２０１６，１６，７２．
５．Ｗｏｌｃｏｔｔ，Ｒ．Ｄ．；  Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｇ．Ｄ．Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．ＪＡＭＡ  ２００８，２９９，２６８２−
２６８４．
６．Ｊｕｎｋａ，Ａ．Ｆ．；  Ｓｚｙｍｃｚｙｋ，Ｐ．；  Ｓｍｕｔｎｉｃｋａ，Ｄ．；  Ｋｏｓ，Ｍ．；  Ｓｍｏｌｉｎａ，Ｉ．；  Ｂａｒｔｏｓｚｅｗｉｃｚ，Ｍ．；  Ｃｈｌｅｂｕｓ，Ｅ．；  Ｔｕｒｎｉａｋ，Ｍ．；  Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ，Ｐ．Ｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｒｅ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｄｅｓｔｒｏｙ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．２０１５，７３，４５１−４６４．
７．Ｐａｎａｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．；  Ｄｒｏｓｏｓ，Ｇ．；  Ｍａｌｔｅｚｏｓ，Ｅ．；  Ｐａｐａｎａｓ，Ｎ．Ｌｏｃａｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆｏｏｔ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ｏｎｅ  ｓｔｅｐ  ｂｅｙｏｎｄ？  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｌｏｗｅｒ  Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ  Ｗｏｕｎｄｓ  ２０１５，１４，８７−９１．
８．Ｐｕｇａ，Ａ．Ｍ．；  Ｒｅｙ−Ｒｉｃｏ，Ａ．；  Ｍａｇａｒｉｎｏｓ，Ｂ．；  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｃ．；  Ｃｏｎｃｈｅｉｒｏ，Ａ．Ｈｏｔ  ｍｅｌｔ  ｐｏｌｙ−ｅｐｓｉｌｏｎ−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ／ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ．Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０１２，８，１５０７−１５１８．
９．Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，Ｐ．；  Ｂｕｘｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，３ｒｄ；  Ｋｏｖａｃｓ−Ｋｕｌｙａｓｓａ，Ａ．；  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｐ．Ｄ．；  Ｓｚｔａｒｉｃｓｋａｉ，Ｆ．；  Ｓｔｒｏｅｂｅｌ，Ｇ．Ｇ．；  Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｋ．Ｍ．；  Ｆａｒｃａｓｉｕ，Ｄ．；  Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｊ．Ｆ．Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２，４５，２３３８−２３４１．
１０．Ｂｕｘｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．；  Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｓ．；  Ｈａｒｖｅｙ，Ｓ．Ｂ．；  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，３ｒｄ；  Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｊ．Ｆ．；  Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｋ．Ｍ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｓｋｅｌｉｔｅ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｏｃａｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｂｏｎｅ．Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．２００４，９１，１１９２−１１９６．
１１．Ｋｉｍ，Ｂ．Ｎ．；  Ｋｉｍ，Ｅ．Ｓ．；  Ｏｈ，Ｍ．Ｄ．Ｏｒａｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１４，６９，３０９−３２２．
１２．Ｒｅｅｖｅｓ，Ｂ．Ｄ．；  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．；  Ｇｒｉｅｃｏ，Ｐ．Ａ．；  Ｓｕｃｉ，Ｐ．Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｐｒｏｄｒｕｇ．Ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ  ２０１３，２９，１００５−１０１４．
１３．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｊ．；  Ｔａｎａｋａ，Ｋ．Ｓ．；  Ｋａｎｇ，Ｔ．；  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｅ．；  Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｙ．；  Ｄｅｌｏｒｍｅ，Ｄ．；  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｓ．；  Ｖｉｅｎｓ，Ｆ．；  Ａｒｈｉｎ，Ｆ．Ｆ．；  Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｉ．；  Ｌｅｈｏｕｘ，Ｄ．；  Ｆａｄｈｉｌ，Ｉ．；  Ｌａｑｕｅｒｒｅ，Ｋ．；  Ｌｉｕ，Ｊ．；  Ｏｓｔｉｇｕｙ，Ｖ．；  Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｈ．；  Ｍｏｅｃｋ，Ｇ．；  Ｐａｒｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｊｒ．；  Ｆａｒ，Ａ．Ｒ．Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｒｅｅ  ａｍｉｎｏ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１，６９５５−６９６９．
１４．Ｍｅｌｃｈｉｏｒ，Ｍ．Ｂ．；  Ｆｉｎｋ−Ｇｒｅｍｍｅｌｓ，Ｊ．；  Ｇａａｓｔｒａ，Ｗ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｓｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｖｅｒｓｕｓ  ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｖｅｔ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ２００６，５３，３２６−３３２．
１５．Ａｍｏｒｅｎａ，Ｂ．；  Ｇｒａｃｉａ，Ｅ．；  Ｍｏｎｚｏｎ，Ｍ．；  Ｌｅｉｖａ，Ｊ．；  Ｏｔｅｉｚａ，Ｃ．；  Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．；  Ａｌａｂａｒｔ，Ｊ．Ｌ．；  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｙａｇｏ，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９９，４４，４３−５５．
１６．Ｃｅｒｉ，Ｈ．；  Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．；  Ｓｔｒｅｍｉｃｋ，Ｃ．；  Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｒ．；  Ｍｏｒｃｋ，Ｄ．；  Ｂｕｒｅｔ，Ａ．Ｔｈｅ  Ｃａｌｇａｒｙ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｅｖｉｃｅ：  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９，３７，１７７１−１７７６．
１７．Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．；  Ｃｅｒｉ，Ｈ．；  Ｍｏｒｃｋ，Ｄ．Ｗ．；  Ｂｕｒｅｔ，Ａ．Ｇ．；  Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｒ．Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ：  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２００２，６６，８６−９２．
１８．Ｚｈａｎｇ，Ｓ．；  Ｇａｎｇａｌ，Ｇ．；  Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．’Ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔｓ’  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００７，３６，５０７−５３１．
１９．Ｔａｎａｋａ，Ｋ．Ｓ．；  Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｊ．；  Ｋａｎｇ，Ｔ．；  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｅ．；  Ｄｅｌｏｒｍｅ，Ｄ．；  Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｓ．Ｓ．；  Ｃａｒｏｎ，Ｌ．；  Ｖｉｅｎｓ，Ｆ．；  Ａｒｈｉｎ，Ｆ．Ｆ．；  Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｉ．；  Ｌｅｈｏｕｘ，Ｄ．；  Ｆａｄｈｉｌ，Ｉ．；  Ｌａｑｕｅｒｒｅ，Ｋ．；  Ｌｉｕ，Ｊ．；  Ｏｓｔｉｇｕｙ，Ｖ．；  Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｈ．；  Ｍｏｅｃｋ，Ｇ．；  Ｐａｒｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｊｒ．；  Ｒａｆａｉ  Ｆａｒ，Ａ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，１６，９２１７−９２２９．
２０．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，３ｒｄ；  Ｒｕｎｎｅｒ，Ｒ．；  Ｂｕｘｔｏｎ，Ｔ．Ｂ．；  Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｊ．Ｆ．；  Ｆａｒｃａｓｉｕ，Ｄ．；  Ｂｅｒｅｃｚｋｉ，Ｉ．；  Ｒｏｔｈ，Ｅ．；  Ｔｏｌｌａｓ，Ｓ．；  Ｏｓｔｏｒｈａｚｉ，Ｅ．；  Ｒｏｚｇｏｎｙｉ，Ｆ．；  Ｈｅｒｃｚｅｇｈ，Ｐ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，４７，６１５−６１８．
２１．Ｃｈｅｏｎｇ，Ｓ．；  Ｓｕｎ，Ｓ．；  Ｋａｎｇ，Ｂ．；  Ｂｅｚｏｕｇｌａｉａ，Ｏ．；  Ｅｌａｓｈｏｆｆ，Ｄ．；  ＭｃＫｅｎｎａ，Ｃ．Ｅ．；  Ａｇｈａｌｏｏ，Ｔ．Ｌ．；  Ｔｅｔｒａｄｉｓ，Ｓ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａｒｅａｓ  ｏｆ  ｔｏｏｔｈ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．２０１４，７２，２４６１−２４６８．
２２．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．；  Ｗａｔｔｓ，Ｎ．Ｂ．；  Ｅｂｅｔｉｎｏ，Ｆ．Ｈ．；  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．２００８，１９，７３３−７５９．
２３．Ｇｕｏ，Ｘ．；  Ｓｈｉ，Ｃ．；  Ｗａｎｇ，Ｊ．；  Ｄｉ，Ｓ．；  Ｚｈｏｕ，Ｓ．ｐＨ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａｃｔｉｖｅｌｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１３，３４，４５４４−４５５４．
２４．Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．；  Ｂｒｉｎｄｉｓｉ，Ｍ．Ｏｒｇａｎｉｃ  ｃａｒｂａｍａｔｅｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，２８９５−２９４０．
２５．Ｏｓｓｉｐｏｖ，Ｄ．Ａ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２０１５，１２，１４４３−１４５８．
２６．Ｍｏｒｉｏｋａ，Ｍ．；  Ｋａｍｉｚｏｎｏ，Ａ．；  Ｔａｋｉｋａｗａ，Ｈ．；  Ｍｏｒｉ，Ａ．；  Ｕｅｎｏ，Ｈ．；  Ｋａｄｏｗａｋｉ，Ｓ．；  Ｎａｋａｏ，Ｙ．；  Ｋａｔｏ，Ｋ．；  Ｕｍｅｚａｗａ，Ｋ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，１８，１１４３−１１４８．
２７．Ａｒｎｓ，Ｓ．；  Ｇｉｂｅ，Ｒ．；  Ｍｏｒｅａｕ，Ａ．；  Ｍｏｎｚｕｒ  Ｍｏｒｓｈｅｄ，Ｍ．；  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｎ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｏｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｕａｌ−ａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２０，２１３１−２１４０．
２８．Ｔａｎａｋａ，Ｋ．Ｓ．；  Ｄｉｅｔｒｉｃｈ，Ｅ．；  Ｃｉｂｌａｔ，Ｓ．；  Ｍｅｔａｙｅｒ，Ｃ．；  Ａｒｈｉｎ，Ｆ．Ｆ．；  Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｉ．；  Ｍｏｅｃｋ，Ｇ．；  Ｐａｒｒ，Ｔ．Ｒ．，Ｊｒ．；  Ｆａｒ，Ａ．Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１０，２０，１３５５−１３５９．
２９．ＥＵＣＡＳＴ：  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＣｓ  ａｎｄ  ｚｏｎｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒｓ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／ｓｒｃ／ｍｅｄｉａ／ＰＤＦｓ／ＥＵＣ  （ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｊａｎｕａｒｙ  １５，２０１７）．
３０．Ｍ１００−Ｓ２５  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ；  Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｆｔｈ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：  Ｗａｙｎｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ，２０１５．
３１．Ｆｒｅｉｒｅ，Ｍ．Ｏ．；  Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ，Ｐ．Ｐ．；  Ｓｃｈａｕｄｉｎｎ，Ｃ．；  Ｇｏｒｕｒ，Ａ．；  Ｄｏｗｎｅｙ，Ｊ．Ｓ．；  Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｈ．；  Ｃｈｅｎ，Ｗ．；  Ｋｏｏｋ，Ｊ．Ｋ．；  Ｃｈｅｎ，Ｃ．；  Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｓ．Ｄ．；  Ｚａｄｅｈ，Ｈ．Ｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２０１１，８２，７７８−７８９．
３２．Ｍａｎｒｉｑｕｅ，Ｐ．；  Ｆｒｅｉｒｅ，Ｍ．Ｏ．；  Ｃｈｅｎ，Ｃ．；  Ｚａｄｅｈ，Ｈ．Ｈ．；  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．；  Ｓｕｃｉ，Ｐ．Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｒａｔ  ｏｒａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｂｙ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｄｏｓｉｎｇ．Ｍｏｌ．Ｏｒａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３，２８，４０４−４１４．
３３．Ｏｌｉｐｈａｎｔ，Ｃ．Ｍ．；  Ｇｒｅｅｎ，Ｇ．Ｍ．Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ２００２，６５，４５５−４６４．
３４．Ｒｅｄｇｒａｖｅ，Ｌ．Ｓ．；  Ｓｕｔｔｏｎ，Ｓ．Ｂ．；  Ｗｅｂｂｅｒ，Ｍ．Ａ．；  Ｐｉｄｄｏｃｋ，Ｌ．Ｊ．Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｓｕｃｃｅｓｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４，２２，４３８−４４５．
３５．Ｍｕｓｔａｅｖ，Ａ．；  Ｍａｌｉｋ，Ｍ．；  Ｚｈａｏ，Ｘ．；  Ｋｕｒｅｐｉｎａ，Ｎ．；  Ｌｕａｎ，Ｇ．；  Ｏｐｐｅｇａｒｄ，Ｌ．Ｍ．；  Ｈｉａｓａ，Ｈ．；
Ｍａｒｋｓ，Ｋ．Ｒ．；  Ｋｅｒｎｓ，Ｒ．Ｊ．；  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．；  Ｄｒｌｉｃａ，Ｋ．Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ−ｇｙｒａｓｅ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：  ｔｗｏ  ｍｏｄｅｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，２８９，１２３００−１２３１２．
３６．Ａｙｒｅ，Ｗ．Ｎ．；  Ｂｉｒｃｈａｌｌ，Ｊ．Ｃ．；  Ｅｖａｎｓ，Ｓ．Ｌ．；  Ｄｅｎｙｅｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ
ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＰＭＭＡ  ｂｏｎｅ  ｃｅｍｅｎｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ｐａｒｔ  Ｂ  ２０１６，１０４，１５１０−１５２４．
３７．Ｎａｎｄｉ，Ｓ．Ｋ．；  Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ，Ｓ．；  Ｄａｓ，Ｐ．；  Ｓａｍａｎｔａ，Ｉ．；  Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｐ．；  Ｒｏｙ，Ｓ．；  Ｋｕｎｄｕ，Ｂ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌｏｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．２０１６，３４，１３０５−１３１７．
３８．Ｌｉｎ，Ｊ．Ｈ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｂｏｎｅ  １９９６，１８，７５−８５．
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４０．Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ，Ｐ．Ｐ．；  Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｃ．；  ＬａＶａｌｌｅｅ，Ｃ．；  Ｊｅｌｌｉｆｆｅ，Ｒ．Ｗ．；  Ｌｅ，Ａ．Ｄ．；  Ｌｅｅ，Ｐ．；  Ｋｉｓｓ，Ａ．；  Ｎｅｅｌｙ，Ｍ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｗ．Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｌ．２０１３，１１５，２２４−２３２．
４１．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｂ．；  Ｌａｗｔｏｎ，Ｍ．Ｄｒｙｉｎｇ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ：  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｄｅｓｉｃｃａｎｔｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，７５，８３５１−８３５４．
４２．ＭｃＫｅｎｎａ，Ｃ．Ｅ．；  Ｈｉｇａ，Ｍ．Ｔ．；  Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎ．Ｈ．；  ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．−Ｃ．Ｔｈｅ  ｆａｃｉｌｅ  ｄｅａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉａｌｋｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  ｂｒｏｍｏｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９７７，１８，１５５−１５８．
４３．ＭｃＫｅｎｎａ，Ｃ．Ｅ．；  Ｓｃｈｍｉｄｈｕｓｅｒ，Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｅｓｔｅｒ  ｄｅａｌｋｙｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏｍｏｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９７９，７３９−７３９．
４４．Ｄａｖｉｄ，Ｔ．；  Ｋｏｔｅｋ，Ｊ．；  Ｋｕｂｉｃｅｋ，Ｖ．；  Ｔｏｓｎｅｒ，Ｚ．；  Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｐ．；  Ｌｕｋｅｓ，Ｉ．Ｂｉｓ（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）−  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅｓ．Ｈｅｔｅｒｏａｔ．Ｃｈｅｍ．２０１３，２４，４１３−４２５．
４５．Ｋｉｌｋｅｎｎｙ，Ｃ．；  Ｂｒｏｗｎｅ，Ｗ．Ｊ．；  Ｃｕｔｈｉ，Ｉ．；  Ｅｍｅｒｓｏｎ，Ｍ．；  Ａｌｔｍａｎ，Ｄ．Ｇ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ：  ｔｈｅ  ＡＲＲＩＶＥ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ａｎｉｍａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２０１２，４１，２７−３１．
４６．Ｆａｕｌ，Ｆ．；  Ｅｒｄｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．；  Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ａ．；  Ｌａｎｇ，Ａ．Ｇ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐｏｗｅｒ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇ＊Ｐｏｗｅｒ  ３．１：  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｂｅｈａｖ．Ｒｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００９，４１，１１４９−１１６０．
【０３０６】
実施例６
カルバメート連結ビスホスホネート−シプロフロキサシンが特に感染性骨疾患の標的化治療向けの能力のある抗菌複合体であることを、本明細書において実証する（図１４）。
【０３０７】
ビスホスホネート（ＢＰ）はカルシウムと強力な二座配位相互作用及び三座配位相互作用を形成し、そうして（バイオフィルム病原体も常在している）骨表面又はハイドロキシアパタイト（ＨＡ）表面を標的とすることが可能である。ビスホスホネート−カルバメート−シプロフロキサシン（ＢＣＣ、化合物６）複合体を設計し、合成し、そして一般的な骨バイオフィルム病原体に対してインビトロ及びインビボで試験することに成功することで骨−バイオフィルム標的化抗菌アプローチの実現可能性を実証した。我々の結果はＢＣＣ（化合物６）が一般的な長骨及び顎骨骨髄炎生物に対してインビトロで、特に微生物の増殖と抗菌試験のためにバイオフィルムモデルを基材としてのＨＡと共に使用したときに強力な殺菌プロファイルを有することを示した。ＢＣＣ（化合物６）が予測可能な速度の持続的分離を示し、且つ、親薬品であるシプロフロキサシン単体と比較して完全殺菌作用の達成に関して２０倍高い活性を有する骨髄炎予防実験設定において前記複合体の化学吸着によってＨＡ上でのバイオフィルム増殖が抑制された。顎骨インプラント周囲炎の動物モデルにおいてインビボでアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスのバイオフィルムに対するＢＣＣ（化合物６）の効力と安全性を実証した。インビボでは１０ｍｇ／ｋｇ（１５．６μｍｏｌ／Ｋｇ）という単回腹腔内用量の前記複合体によって９９％のインプラント周囲殺菌効果が生じ、複数回の投与で投与された親抗生物質であるシプロフロキサシン単体（９０．６μｍｏｌ／Ｋｇ；合計で６倍高いシプロフロキサシンの全体的用量）よりも一桁高い活性が示された。この１０ｍｇ／ｋｇという単回用量ではより高い用量で複数回投与された親抗生物質であるシプロフロキサシンよりも高い効力と疾患の解決がＢＣＣ（化合物６）によって示され、バイオフィルム感染部位における骨標的化／骨生体分布の薬物動態学的利点と持続的抗生物質分離の薬力学的利点のために全身毒性又は副作用の可能性が存在しなかった。
【０３０８】
歯科インプラントは現代の歯科診療の重要な部分であり、最大で３５００万人のアメリカ人が一方又は両方の顎の歯の全てを失っていると推定されている。歯の置換と再構成のためのこれらのインプラントの市場全体が２０２２年までに４２億ドルに達すると期待されている。インプラントの大部分が成功する一方で、これらの補綴の中には、インプラント周囲炎のために失敗し、支持骨の破壊に至るものもある。インプラント周囲炎の発生は二峰性であり、初期（１２か月未満）障害と後期（５年超）障害を含む。これらの障害臨界点は両方とも主にインプラント上とインプラント周囲の細菌バイオフィルム感染の結果である。インプラント周囲炎はインプラントの失敗の一般的な理由である。歯科インプラントの失敗は生体機械上の理由、又は生物学／微生物学上の理由によって引き起こされることが一般的である。支持骨の破壊につながる最も重篤な形態の微生物関連インプラント疾患であるインプラント周囲炎の有病率は、現在の文献からは確認困難である。しかしながら、インプラント周囲炎が有病率の上昇と共に問題となりつつあることは最近の研究から示されている４。１５０人の患者を５〜１０年にわたって追跡した最近の研究からそれぞれ約１７％と約３０％というインプラント周囲炎の割合が示され、インプラント周囲炎が顕著な問題であることが示されている５。初期のインプラント失敗又は骨結合の欠如は個々の問題であり、インプラント処置した顎のざっと９％に起こる６。これは上顎ではもっとあり６、手術中の細菌感染又は近傍の部位からの細菌感染（例えば歯周炎）と関連し、同様に喫煙、糖尿病、過剰なセメント、及び不充分な口腔衛生状態などのよく認識されており、且つ、修復可能な他のリスク要因とも関連する２。
【０３０９】
バイオフィルム感染はインプラント周囲炎の疾患原因に含まれる可能性がある。バイオフィルム感染には治療について独自の問題が有り、診断困難であることが多く、標準的な抗生物質療法に対して耐性であり、宿主免疫応答に対する抵抗力を有し、そして持続的な難治性感染症を引き起こす７。細菌はマトリックス支持群落内に生存するという初期の説明８、９以来、バイオフィルム感染仮説が着実に発展してきている。今では慢性感染症の６５％超がバイオフィルム中に生存する細菌によって引き起こされると証明されている７。このことは米国のおよそ１２００万人の人々がこれらの感染症に罹り、毎年ほぼ５０万人の人々が米国内で死んでいることを意味する。インプラント周囲炎及び歯周炎は最も一般的なバイオフィルム感染の中に見受けられる。インプラント周囲炎は歯周炎感染症よりも多様ではない群落（及び主要病原体）１０の点で比較的に単純な感染症であることが分かっている。グラム陰性種が優位を占めることが典型的である１１。顎の感染症を含む他の整形外科領域における感染症又は骨感染症も細菌バイオフィルム群落によって引き起こされ１２、ここで開発された技術がこれらの疾患でも同様に使用できるようになる。
【０３１０】
現在のところインプラント周囲炎に対する治療アプローチには限界がある。インプラント周囲炎には幾つかの原因があるが、主な病因は細菌バイオフィルムである。インプラント周囲炎の治療には普遍的に受け入れられているガイドライン又はプロトコルが無く、細菌性インプラント周囲炎治療の臨床計画の多くが局所的抗生物質送達及び全身的抗生物質送達１３、並びに代替骨移植片を使用する再建移植を含む病変の外科的切除１４、１５を含む。しかしながら、深いインプラント周囲ポケットの底、及び感染した顎骨まで局所的抗生物質送達装置を進めること、又はバイオフィルム病原体を殺菌するために感染した顎骨に全身投与された抗生物質を適切に浸透させることすら１６難しいことが臨床上の経験から示されており、後者は抗生物質に本質的なその貧弱な骨（及びインプラント周囲）生体分布又は薬物動態１７に主に起因する。これまでの長期研究では感染したインプラントを消毒薬で局所的に清掃し、且つ、抗生物質の全身投与を行ったときでも進行したインプラント周囲炎病変の４０％超において支持骨の追加の喪失があった１５。
【０３１１】
さらに、長期全身抗生物質療法によって全身毒性又は副作用が生じる可能性があり、耐性が生じる可能性もあった。したがって局所送達系を使用して骨において比較的に高い治療抗菌濃度を達成することが臨床医の習慣になっている。例えば、歯科医は局所送達用の骨移植材料１８とミノサイクリン又はドキシサイクリンの粉末（例えばアレスチン（登録商標））又はクロルヘキシジン溶液（例えばペリオチップ（登録商標））の臨床時混合を用いる。そのようなアプローチは単にスラリーであり、ＢｉｏＶｉｎｃアプローチのような抗生物質と代替骨との間の強力な結合を意味せず、したがってこれまでに考察されたように比較的に早期の流失と効率性が低い薬物動態という難点がある。さらに、研究者は幾つかの生物分解性及び非生物分解性の局所的抗生物質送達系１９も使用してきた。しかしながら、これらのアプローチは幾つかの限界を有しており、例えば、非生物分解性アプローチ（例えばポリメチルメタクリレートセメント）は抗生物質負荷装置を除去するために２回目の手術を必要とし、ある特定の抗生物質と適合せず、そして非効率的な分離カイネティクスという難点を有し、幾つかの事例では送達された全抗生物質の１０％未満しか分離されない１７。ファイバー、ゲル、及びビーズを含む生物分解性材料に対する関心が増しているが、しかしながらインプラント周囲炎の治療に対するそれらの臨床効力はよく分かっていない３。局所的クロルヘキシジン送達などの効果的な抗菌薬／消毒薬を使用して顎のインプラント周囲炎を治療するときでも、有望な動物試験とヒト試験において実証されるような治療結果においてあまり影響がない１５、１７。まとめると、これまでに言及されたような骨における抗生物質の貧弱な薬物動態がこれらのデータによってさらに裏付けられており、骨結合性／骨標的化持続的抗生物質分離戦略の必要性が強調される。
【０３１２】
ＢＰ−複合体
現在の治療アプローチの限界を考慮すると、骨／バイオフィルム標的化抗菌剤を開発することは、本分野における顕著な進歩である。本明細書において提供される前記ＢＰ−抗生物質（ＢＰ−Ａｂ）複合体は骨内及び骨結合バイオフィルム内の貧弱な抗生物質薬物動態又は生物学的利用率に関連する多くの難点を克服することが可能である。これらの化合物は「ターゲット・リリースアプローチ」を介して感染を減少させることができ、そのアプローチは全身毒性及び／又は他の（例えば非感染）組織における薬品曝露に関する懸念を低減することができる。前記ＢＰ−Ａｂ複合体は代替骨移植片に組み込み可能である。前記ＢＰ−ＡｂはＢＰ−フルオロキノロン複合体であり得る。幾つかの例では、前記ＢＰ−Ａｂは図１５に示されるようにビスホスホネート−カルバメート−シプロフロキサシン（ＢＣＣ、化合物６）であり得る。図１５の例示構造体は本明細書においてＢＣＣ（化合物６）とも呼ばれる。骨移植片に組み込まれると前記ＢＰ−Ａｂ骨移植材料をＢＰ−Ａｂ−骨移植片と呼ぶことも可能である。例えば、その抗生物質がフルオロキノロンであるときにそれをＢＰ−ＦＱ−骨移植片と呼ぶことも可能である。これらの化合物は効果的にハイドロキシアパタイト（ＨＡ）／骨に吸着することが可能であり、且つ、経時的な持続的分離とバイオフィルム病原体に対する抗菌効果を達成することが可能である。本明細書において提供される前記化合物と前記化合物を組み込む移植材料をインプラント周囲炎の補助的治療又は予防のための抗感染性代替骨移植片として使用することが可能である。前記複合体は持続性分離カイネティクスで前記移植材料から局所的に放出され、我々が本明細書中の何処かで提供される他の結果の中でこれまでにインビトロ及びインビボで実証してきたように、細菌活性又は骨破壊活性が存在する中で切断されることになる。この様に前記移植片は現在の送達経路と比較して高い局所的濃度のＦＱ、例えばシプロフロキサシンを提供することができる。まとめると、本明細書において提供される前記化合物及び骨移植材料は、強力な多座配位静電相互作用を介して前記移植材料中のカルシウム／ＨＡに結合した安全な、又は薬理学的に不活性の（非骨吸収抑制性）ＢＰ部分に複合体化されている抗生物質を含有することが可能であり、その抗生物質は経時的に分離する。それはこの状況で幾つかの現在の臨床アプローチとして既存の骨移植材料と単純に混合されて泥状物になる局所抗生物質を単に表すだけではない。したがって、リン酸カルシウム鉱物質（ＨＡ）に結合したこの化学吸着薬品は本分野における大きな進歩であり、バイオフィルム病原体に対する効果的な殺菌活性のためのインプラント周囲骨への抗生物質送達における限界の多くを克服する。
【０３１３】
活性薬品分子をＢＰに連結することで骨を標的とするという全般的な考えが総説論文において考察されている３０。しかしながら、この時点でＦＤＡに認可された薬品は開発されておらず、初期の試みが、たいていファーマコフォア要件に抵触することによって複合体のどちらの構成要素も不活性化することが分かっている全身的に不安定なプロドラッグか切断不可能な複合体のどちらかになって終わった。キノロンの分野では安定なＢＰ連結同類物と複合体化されるとフルオロキノロンの抗菌特性が消失する顕著な例がＨｅｒｃｚｅｇｈによって述べられた３１〜３２。したがって、ターゲット・リリースリンカー戦略が必要である。
【０３１４】
近年、安定性が低い連結技術を活用する医薬化学戦略が出現し始めている。他の研究者によってカルボン酸基を介して幾つかの異なるＢＰ部分にフルオロキノロン類が連結された。彼らは抗生物質であるモキシフロキサシン及びガチフロキサシンのグリコールアミドエステルプロドラッグがラット骨髄炎モデルにおいて予防的に使用されると感染症を抑制することを見出した３３。この同じグループはアミン官能基を介して同じ抗生物質を単純なＢＰ系に係留するためにアシルオキシカルバメート系リンカー及びフェニルプロパノン系リンカーを使用した３４。彼らは同じ予防的ラットモデルを使用してこれらの複合体が感染症の確立の抑制の点でも親抗生物質よりも良好であることを示している。Ｔａｒｇａｎｔａチーム３３はこれらのプロドラッグ戦略のうちの幾つかをグリコペプチド抗生物質であるオリタバンシンについて使用している３５。この二重機能薬品は感染症の予防の点で幾らか効果的であるように見える。しかしながら、今日まで彼らは確立した感染症を治療することが可能であることを示す研究を公開しておらず、前記プロドラッグの薬物動態も公開していない。彼らの薬品候補選択は部分的に血漿不安定性に基づいているのでこの治療アプローチで完全に成功するにはこれらの類似体は血流中であまりに不安定であると考えられる。したがって、これらのグループによって開発されたこれらの化合物は前記抗生物質の効果的な局所的濃度を達成することができないと考えられる。
【０３１５】
ＢＣＣ化合物（図１５）はフェニルカルバメートリンカーのフェニル部分を前記分子のＢＰ部分に直接的に組み込むことができる。前記リンカーの傾向性を変更可能な電子吸引基又は供与基によるフェニル環の修飾を介して分離カイネティクスを変更又は調整することが可能である。さらに、前記ＢＰコアは骨吸収抑制剤としての有効性を欠いており、したがって比較的に強力な窒素含有ＢＰ薬（例えばゾレドロネート）のような顎の薬物治療関連骨壊死３９、４０のリスクを持たない。フェニルカルバメートリンカーを使用するこのターゲット・リリース戦略は骨環境中の細菌バイオフィルムに直接的に活性薬品を放出する可能性が高いことが本明細書及び本明細書中の他の実施例において証明されている。骨標的化は非常に効果的であるので前記化合物はプラスチック製容器中に増殖したプランクトン型培養物よりもＨＡ骨マトリックス代用物上に増殖したバイオフィルムに対してシプロフロキサシンよりもよく効く。前記カルバメートのフェノール性酸素を除外している切断不可能アミド結合を使用して作製された類似複合体（ビスホスホネート−アミド−シプロフロキサシン；ＢＡＣ；化合物１１）はどんな状況下でも細菌増殖に対してほとんど効果を持たないことが分かり、前記複合体の能動的な切断が抗菌活性に必要であることを示した。
【０３１６】
ＢＣＣ（化合物６）の合成スキームが図１６に示されている。前記化合物の特性が１Ｈ、１３Ｃ、及び３１ＰのＮＭＲ並びにマススペクトロメトリーによって解析された。抗菌活性が主に分離されたシプロフロキサシンによるものであるかどうかの究明に役立てるため、我々は前記複合体からシプロフロキサシンを分離しないように設計されているアミド連結複合体も同様に合成することにした。この化合物の合成は円滑に行き（図３１）、妥当な収率で対照化合物ＢＡＣ（化合物１１）を得た。
【０３１７】
一群の黄色ブドウ球菌（ＳＡ）株に対するＢＣＣ（化合物６）（「ＢＣＣ（６）」とも呼ぶ）、ＢＡＣ（化合物１１）（「ＢＡＣ（１１）」とも呼ぶ）、及び親薬品であるシプロフロキサシンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定するために一連のアッセイを実施した。欧州薬剤感受性試験委員会ガイドライン（参照番号４３）に従う希釈アッセイを用いてこれらの実験を実施した。それらの３種類の化合物の試験（図１７）より、ＢＣＣ（化合物６）複合体がこれらの病原体に対して顕著な殺菌活性を維持する一方でＢＡＣ（化合物１１）はその活性の大半を失っていることが示されている。これらの抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）データとＭＩＣデータは、シプロフロキサシンとＢＣＣ（化合物６）がプランクトン型及び臨床的に妥当なＳＡ病原体に対して強力な殺菌活性を有しており、ＢＡＣ（化合物１１）の弱い活性によって証明されているように複合体化のための連結が親薬品の抗菌活性に影響を与えている。これらの株に対する我々のシプロフロキサシンの試験は確定済み臨床ブレイクポイントと一致した。
【０３１８】
ＨＡは骨の主要無機成分であるので骨の代用物としての懸濁ＨＡビーズに対する吸着について前記化合物を試験した。ビーズの除去後の上清中の残留複合体の測定によって示されるように我々のＢＣＣ（化合物６）は実際にＨＡビーズによって吸収される（図１８）。ＢＣＣ（化合物６）について決定されたλｍａｘである２７５ｎｍの波長での吸光度を用いて分光光度法により０時間と２４時間の時点で上清中の複合体を測定した。これによりＢＣＣ（６）がこの骨代用物に結合していることが明確に示される。ＢＡＣ（化合物１１）の結合も同様に引き起こすことになるこのタイプのＢＰの結合とＢＣＣ（化合物６）のデータが一致しなかったので（参照番号３５、４４）我々はＢＡＣ（化合物１１）の結合を測定しなかった。
【０３１９】
次のインビトロ試験はＢＣＣ（６）の骨代用物標的化活性をＳＡ株に対するＭＩＣ活性によって示されるシプロフロキサシンの迅速な分離と組み合わせることであった。この実験のため、指定された濃度の前記複合体又はシプロフロキサシンの溶液でＨＡディスクを前処理し、続いてそれらのディスクを洗浄して前記化合物溶液を除去した。我々の公開された方法に従ってＳＡ（ＡＴＣＣ−６５３８株）のバイオフィルムを増殖させた。２４時間の増殖後にコロニー形成単位（ＣＦＵ）の定量的計数を実施した。ＤＭＳＯ及びＰＢＳで前処理されたディスクを対照として使用した。ＢＣＣ（６）が１０μｇ／ｍＬで全ての細菌増殖を抑制する（図１１）一方で純粋なシプロフロキサシンは１００μｇ／ｍＬで完全に抑制的になったことが結果より示された。前記複合体の分子量は純粋なシプロフロキサシンの分子量のおよそ半分であるのでこのことは細菌バイオフィルムの増殖の完全抑制の点でＢＣＣ（化合物６）が親薬品よりもざっと２０倍強力であることを示した。このことは骨マトリックス環境中で経時的に前記複合体から薬品が分離することを裏付けている。アミド複合体ＢＡＣ（１１）は非常に高い濃度でも代替骨上でバイオフィルムの増殖を抑制せず（データを示さず）、シプロフロキサシンの分離がこの活性にとって重要であり、これまでの文献及びプランクトン型培養物の試験（図１８）３０、３４、３５、４４と一致することを示した。
【０３２０】
我々のＢＣＣ（６）が殺菌活性を有していることを示す前述の結果について、我々は動物モデルのバイオフィルム感染に対してその活性を試験しようとした。簡単に説明すると、ラットの正常な細菌叢に常在性の細菌ではなく、顎骨感染症に特異的な細菌であるアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａａ；野生型Ｒ型株Ｄ７Ｓ−１；ａ血清型）を１０９ＣＦＵで小型チタン製インプラント上に予備培養した。我々の動物試験の前に親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの感受性を確認するために我々は以前に記載された長骨骨髄炎病原体について実施されたようにＡＳＴアッセイとＭＩＣアッセイをＡａについて実施した。ディスク拡散阻止帯分析法によって４０ｍｍを超える直径が明らかになり、且つ、ＭＩＣ９０は２ｍｇ／ｍＬであり、親薬品であるシプロフロキサシンに対するＡａの強い感受性が示された。Ａａバイオフィルムを担持する接種済みインプラントを１２匹のラットの中に設置した（動物当たり２個のインプラント）。このモデルは周囲の顎骨上に特徴がはっきりしたバイオフィルム感染を確実に発症し、炎症及び関連のインプラント周囲炎疾患を引き起こした（参照番号４５）。バイオフィルムを発生させた後に動物をランダム化して３処置群（ＢＣＣ（６）の１０ｍｇ／ｋｇ用量の単回投与を受ける５匹の動物、ＢＣＣ（６）の０．３ｍｇ／ｋｇ用量の週３回の投与を受ける２匹の動物、及び対照治療ｗｉｔｈ無菌生理食塩水による対照処理を受ける５匹の動物）に分けた。ＢＣＣ（６）の１０ｍｇ／ｋｇでの単回投与は週に３回１０ｍｇの計画で投与される合計３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたシプロフロキサシンとほぼ同様に効果的であることがパイロット実験（２動物／群）により示された（データを示さず）。したがって、我々は動物の利用を減らすためにより大規模な実験ではシプロフロキサシン対照を含めないことにした。全ての動物が処置及び薬物療法をよく忍容し、有害事象は無かった。臨床的には、我々は対照群の動物の大多数が処置群の炎症を起こしていないインプラント周囲組織を有する動物の大多数と比較して局所的プロテーゼ周囲炎の証拠を示すことを麻酔時及び外科的摘出時に観察し、インプラント保持率は全体で２４インプラント中２３インプラント（９６％）であり、強固な統計分析を提供した。
【０３２１】
安楽死後の摘除されたインプラント周囲組織（２４インプラント中２３インプラント）に由来するＡａのＣＦＵを定量的に決定し、この実験で１０ｍｇ／ｋｇの用量のＢＣＣ（６）の単回投与が約１０の６乗単位の殺菌を示し、低用量の複数回投与でさえ１０の２〜３乗単位（９９％〜９９．９％）の殺菌を示す結果が図１９に示されている。この実験について１０ｍｇ／ｋｇの用量のＢＣＣ（６）の単回投与が最高の効力を示し、対照群と比較すると非常に統計学的に有意であった（ｐ＝０．０００５）。
【０３２２】
フルオロキノロン類の投与について静脈内経路又は胃腸経路と相対的な生物学的同等性が存在するのでこれらの動物モデルの両方で腹腔内注射によりＢＣＣ（６）を送達してその化合物への曝露を確保した。分離可能ＢＰ−抗生物質（ＢＰ−Ａｂ）複合体がインプラント周囲疾患及び関連の骨髄炎の治療のための薬品として使用可能であることがこれらの結果によって示されていると我々は考えている。ここで我々はこれらの結果を利用して前記ＢＰ−Ａｂ複合体を局所的口腔送達と放出のための歯科代替骨移植片材料に組み込むことを提案する。
【０３２３】
実施例７
その他のＢＰ−Ａｂ複合体の設計と合成（図２０）
例えば、カルバメート系リンカー（例えばカルバメート、Ｓ−チオカルバメート、及びＯ−チオカルバメート）を介してＢＰ（例えば４−ヒドロキシフェニルエチリデンＢＰ（ＢＰ１、図２０）、そのヒドロキシ含有類似体（ＢＰ２、図２０；比較的に高い骨親和性を有する）、及びパミドロネート（ＢＰ３、図２０）に複合体化されているシプロフロキサシン及びモキシフロキサシンを使用して追加のＢＰ−Ａｂ複合体を設計することが可能である。図２１はＯ−チオカルバメートリンカーを含むＢＰ−Ａｂ複合体の合成についての例となる合成スキームを示している。ニューマン・クワート転位を介するＯ−チオカルバメート結合を有する複合体の異性体化によってＳ−チオカルバメート結合（易変性がわずかに高い）を有する複合体を得ることができる（参照番号４７、４８）。これらの標的の急速合成の実現可能性を実証するための予備的な化学が既に実施されている。したがって、骨親和性の付加はα−ＯＨ含有性ＢＰを使用してよく実証されている（４９）。付加された骨親和性によって骨表面における前記複合体の濃度が上昇し、比較的に高い薬品の局所的濃度が短期及び長期にわたって容易に達成される。α−ＯＨビスホスホネートエステルはホスホノホスフェートに再構成されやすいのでα−ＯＨ含有性ＢＰ（ＢＰ２及びパミドロネート、図２０）を有する複合体の合成のためにそのα−ＯＨはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基によって保護されてよい（スキーム２、図２２）（５０）。その後、α−Ｏ−ＴＢＳ  ＢＰ２エステルは４−ニトロフェニルクロロホルマートによって活性化され、そして図２１に示されているように同様にシプロフロキサシン又はモキシフロキサシンと反応する。α−Ｏ−ＴＢＳ  ＢＰ３エステルについては、フェノール基を有するリンカー（例えば、リンカー１（レゾルシノール）、リンカー２（ヒドロキノン）、リンカー３（４−ヒドロキシフェニル酢酸）、図２０）を使用してＢＰと抗菌剤を係留する。ここではリンカー３を使用する合成経路が例として示されている（スキーム３、図２３）。全てのＢＰ−Ａｂ複合体を識別するためにそれらの特性を１Ｈ、３１Ｐ、及び１３ＣのＮＭＲ、ＭＳ、ＨＰＬＣ、並びに元素分析によって分析する。
【０３２４】
前記ＢＰ−Ａｂ複合体の鉱物質結合親和性を決定する。簡単に説明すると、大粒径（一様に１〜２ｍｍ）の無機牛骨の重量を正確に量り（１．４〜１．６ｍｇ）、適切な量のアッセイ緩衝液（０．０５％（重量／体積）ツイーン２０、１０μＭ  ＥＤＴＡ、及び１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ＝７．４）を含有する４ｍＬの透明バイアル瓶の中で３時間にわたって懸濁することができる。その後、量を増やしていったＢＰ−Ａｂ（０、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、及び３００μＭ）と共にこの骨材料をインキュベートすることができる。前記アッセイ緩衝液の中で試料を３７℃で３時間にわたって穏やかに振盪することができる。平衡時間の後にそれらのバイアル瓶を１０，０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離して固形物と上清に分けることができる。その上清（０．３ｍＬ）を収集することができ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（２７５ｎｍの波長）を用いて平衡溶液の濃度を測定する。蛍光発光を用いて結合パラメーターを計算することも可能である。対照としてＨＡが存在しない状態で同様の方法を用いて非特異的結合を測定することが可能である。投入量と結合後に上清中に回収された量との間の差異からＨＡに結合した親薬品／ＢＰ−Ａｂ複合体の量を推測する。ＰＲＩＳＭプログラム（Ｇｒａｐｈｐａｄ社、米国）を使用して結合パラメーター（ＫｄとＢｍａｘはそれぞれ平衡解離定数と最大結合部位数を表す）を計算し、５回の独立した実験でそれらの結合パラメーターを測定することが可能である。２０μＭ（親ＢＰの約２倍のＫｄ）よりも低い平衡解離定数（Ｋｄ）を有する化合物が好まれ得る。２標本ｔ検定を用いて前記ＢＰ−Ａｂの結合パラメーターを評価することが可能である。各群におけるサンプルサイズ（ｎ＝５）を用いて８０％の統計力及び０．０５の片側第一種過誤において１．７２の効果量を検出することができる。
【０３２５】
前記ＢＰ−Ａｂ複合体の結合安定性を決定することができる。簡単に説明すると、異なるｐＨ（ｐＨ＝１、４、７．４、１０）とヒト又はイヌの血清を有するＰＢＳ緩衝液において各ＢＰ−Ａｂ複合体のリンカー安定性を検査することが可能である。４００μＬの上述のＰＢＳ、又は４００μＬの５０％（ＰＢＳ中の体積／体積）のヒト又はイヌの血清の中にＢＰ−Ａｂを懸濁することが可能である。その懸濁液／溶液を３７℃で２４時間にわたってインキュベートし、そして１３０００ｒｐｍで２分間にわたって遠心分離することが可能であり、その上清を回収することが可能である。メタノール（上清に対して５倍量）を各上清に添加することが可能であり、分離したフルオロキノロンを抽出するためにその混合物をボルテックスミキサーで１５分間にわたって撹拌することが可能である。その後、その混合物を１００００ｒｐｍで１５分間にわたって遠心分離して不溶性物質を沈殿させることが可能である。その抽出されたフルオロキノロンを含有する上清を回収し、乾燥するまで蒸発処理することが可能である。それらの乾燥沈殿物をＰＢＳ中に再懸濁することが可能であり、これまでに記載されたようにＵＶ−ＶＩＳ測定により分離したフルオロキノロンの量を決定することが可能である。その後、投入量と分離した薬品の測定量に基づいて分離したフルオロキノロン薬品のパーセンテージを計算することができる。分離した薬品が何であるかＬＣ−ＭＳ分析、及び／又は濃度が充分である場合にはＮＭＲにより確認することができる。
【０３２６】
ＨＡディスク上でのバイオフィルム増殖のインビトロ阻害を決定することができる。簡単に説明すると、特注仕様のディスクの製造のために市販のＨＡ粉末を使用することが可能である。結合剤を使用せずに９．６ｍｍの直径の粉末ペレットをプレス加工ことが可能である。焼結を９００℃で行うことが可能である。静的引張試験、圧縮試験、及び曲げ試験用のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｓｔｒｏｎモデル３３８４；Ｉｎｓｔｒｏｎ社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用してそれらの錠剤を圧縮することが可能である。それぞれＬＥＸＴ  ＯＬＳ４０００顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、センターバレー、ペンシルバニア州）とＭｅｔｒｏｔｏｍ  １５００マイクロトモグラフ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、オーバーコッヘン、ドイツ）を使用する共焦点顕微鏡法とマイクロトモグラフィー（マイクロＣＴ）により、製造されたＨＡディスクの品質を検査することが可能である。その後、次の濃度、すなわち８００ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、及び１ｍｇ／ｍＬの各ＢＰ−Ａｂ複合体及びシプロフロキサシン／モキシフロキサシンにＨＡディスクを投入し、２４時間にわたって３７℃で放置することが可能である。インキュベーション後にＨＡディスクを取り出し、１ｍＬのＰＢＳに投入し、軽揺動式撹拌機内で５分間にわたって放置することが可能である。後続の３回の洗浄をこの様に実施する。洗浄後に１ｍＬのＡａ懸濁液をディスクに投入し、２４時間にわたって３７℃で放置することが可能である。その後、ディスクを洗浄して結合しなかった細菌を除去し、それらのディスクをボルテックスミキサーで激しく撹拌することが可能である。その後、得られた懸濁液の段階希釈物を改変ＴＳＢ寒天プレート上に蒔くことができ、２４時間後にコロニーの増殖を数える。
【０３２７】
臨界サイズに対する前記ＢＰ−ＦＱ−骨移植片のオッセオインテグレーション効果は骨移植向けの上歯槽インプラント周囲欠損モデルにおいて評価可能である。簡単に説明すると、このスプリットマウスデザインにおいて６匹のビーグル犬（３匹のオス、３匹のメス）の下顎の両側のＰＭ２〜ＰＭ４を抜き取り、そして１２週間にわたって治癒させる。歯槽頂切開を行い、続いて粘膜骨膜弁の翻転を行う。骨切除術を実施して６ｍｍの上歯槽欠損を作製する。注水装置内臓型ドリルを使用して大量に注水しながら徐々に直径を増やす連続的切削により小臼歯部の各々にインプラント部位骨切除調製部位を作製する。作製された欠損に関して４ｍｍ歯槽頂上に向かって、且つ、頬側皮質骨板から同じ距離にインプラントが配置されるようにインプラント（Ａｓｔｒａ  Ｔｅｃｈ  Ｏｓｓｅｏｓｐｅｅｄ  Ｔｘ（登録商標）３×１１ｍｍ）を両側のＰＭ２〜ＰＭ４の位置に設置する。イヌを無作為に異なる３群（群当たり２匹のイヌ）に分ける。
【０３２８】
第１群：ＢＰ−フルオロキノロンを化学吸着させた無機牛骨（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径）を右側に使用し、コラーゲンプラグ（陰性対照）を左側に使用する。
【０３２９】
第２群：無機牛骨（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径；陽性対照）を右側に使用し、コラーゲンプラグ（陰性対照）を左側に使用する。
【０３３０】
第３群：ＢＰ−フルオロキノロンを化学吸着させたＢｉｏ−Ｏｓｓ（登録商標）（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径）を右側に使用し、Ｂｉｏ−Ｏｓｓ（登録商標）（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径、陽性対照）を左側に使用する。
【０３３１】
上記の実験の化学と抗菌アッセイの結果はここに記載される全てのインビボ実験に使用される移植材料への吸着向けの前記複合体の理想的な標準的な量の計算についての情報を伝えることができる。予備的な結果に基づいて予測された初期の計算は１ｇの移植材料に吸着された５ｍｇ以下の複合体によって試験病原体のＭＩＣの２〜３桁上の殺菌活性が提供されることを示している。我々のＢＰ−フルオロキノロン複合体は市販の骨移植材料、例えばＢｉｏ−Ｏｓｓ（登録商標）を含む広範囲の骨移植材料に適用可能であり、したがって我々は前記複合体の広範な適用の実証のための試験において自家製の無機牛骨とＢｉｏＯｓｓを陽性対照として選択する。標準的な量の生体材料で両側の各インプラントのプラットホームまで全ての欠損を（上記の群に応じて）充填し、安定性を改善するためにＢｉｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜を使用して移植片とインプラントをカバーする。骨膜減張切開、内側マットレス、そして最後に縁線単純結節用縫合糸（ＰＴＦＥ４，０、Ｃｙｔｏｐｌａｓｔ、米国）を使用して引張状態が無いように弁を閉じる。この時点でマイクロＣＴを取得し、炎症と有害事象について動物を臨床的にモニターする。さらに、後続の実験に記載されているようにこれらの動物は移植材料内の構成成分（例えば、完全な複合体、ＢＰ、抗生物質、又はリンカー）に対するあらゆる全身曝露の評価のためにＰＫ試験を受ける。１２週間後に動物を殺処理し、下顎を摘除し、且つ、マイクロＣＴで検査し、続いて組織学用の調製物を作製する。実験後のスキャンとの比較のために顎の基線マイクロＣＴを撮影する。定量的３Ｄ容量測定マイクロＣＴと組織形態計測分析を実施してインプラント周囲部位に存在する新しい骨の体積、並びに第１骨インプラント間接触部、総欠損領域、再生領域、総欠損領域内の再生領域、再生骨、残留代替骨材料、ミネラル化組織のパーセンテージ、軟組織のパーセンテージ、及び空隙のパーセンテージを調査する。最後に局所的口腔療法に由来する忍容性の問題についての肉眼的及び顕微鏡的兆候に関して内臓と系の死後検査するために剖検を実施する。
【０３３２】
イヌインプラント周囲炎モデルにおいて前記ＢＰ−ＦＱ−骨移植片の抗菌効果を評価することができる。簡単に説明すると、このスプリットマウスデザインにおいて外傷が最小限の方法を用いて８匹のビーグル犬の下顎の両側のＰＭ２〜ＰＭ４を抜き取る（４匹のオス、４匹のメス；合計４８個の歯）。３か月の治癒後に顎の両側において粘膜骨膜弁を持ち上げ、注水装置内臓型ドリルを使用して大量に注水しながら徐々に直径を増やす連続的切削により小臼歯部の各々に骨切除調製部位を作製する。非埋伏型手法を用いてインプラント（Ａｓｔｒａ  Ｔｅｃｈ  Ｏｓｓｅｏｓｐｅｅｄ  Ｔｘ（登録商標）３×１１ｍｍ）を各部位に設置する。インプラント設置の順序は両側で同一であるが、コンピューター生成されたランダム化スキームによってイヌとイヌとの間でランダム化される。吸収性縫合糸によって近接させた前記インプラントと弁にヒーリングアバットメントを接続する。その後、歯磨き剤を用いて歯を磨くことを含むプラークコントロール計画を週に４回発動する。インプラント設置から１２週間後のちょうど実験的インプラント周囲炎を始める前に無菌ペーパーポイント（Ｄｅｎｔｓｐｌｙ、サイズ３５；Ｍａｉｌｌｅｆｅｒ社、バレーグ、スイス）を使用して全てのインプラント周囲部位から微生物試料を獲得し、微生物分析のためにエッペンドルフチューブ（Ｓｔａｒｌａｂ社、アーレンスブルク、ドイツ）の中にすぐに入れる。我々が以前に詳細に説明したように（５５）ＤＮＡ抽出と１６Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅を介して微生物分析を実施する。Ｒｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸプラットホームを使用してＰＣＲアンプリコンの配列を解析し、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ（ＱＩＩＭＥ）ソフトウェアパッケージ（５６）によってデータ分析する。以前に記載された我々の第Ｉ相試験において決定したように試料からコロニー形成単位数（ＣＦＵ／ｍＬ）を決定する。この時点で実験的インプラント周囲炎を次のように開始する。ラット動物モデルにおける我々の以前の実験において実施され、また我々の以前の動物インプラント周囲炎試験においても実施されたように重要な歯周病原体であるがイヌの細菌叢内には存在しないアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａａ）のバイオフィルムをインビトロで前記ヒーリングアバットメント上に創始する。それらのバイオフィルム接種ヒーリングアバットメントを前記インプラント上に設置し、インプラント頸部の周囲の辺縁下の位置に綿結紮糸を設置する。１０週間の細菌感染の後に細菌の試料採取と分析を前回のように実施し、マイクロＣＴスキャンをインプラント周囲炎欠損の基線として撮影する。全層頬舌弁を持ち上げることで全てのインプラント部位を外科的に切除し、エアーアブレーション装置を使用してインプラント表面から既存のあらゆる歯石を取り除き、そして０．１２％グルコン酸クロルヘキシジン中に浸したガーゼでインプラント表面をぬぐうことによりこの実験的インプラント周囲炎モデルの治療を開始する。それらの動物を異化のような４群（群当たり２匹のイヌ）に分ける。
【０３３３】
第１群：ＢＰ−フルオロキノロンを化学吸着させた無機牛骨（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径）を右側に使用し、コラーゲンプラグ（陰性対照）を左側に使用する。
【０３３４】
第２群：無機牛骨（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径；陽性対照）を右側に使用し、コラーゲンプラグ（陰性対照）を左側に使用する。
【０３３５】
第３群：ＢＰ−フルオロキノロンを化学吸着させた無機牛骨（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径）を右側に使用し、抗菌剤放出器具（１００ｍｇ局所ミノサイクリン、陽性対照）を左側に使用する。
【０３３６】
第４群：ＢＰ−フルオロキノロン（陽性対照）を化学吸着させたＢｉｏ−Ｏｓｓ（登録商標）（１ｇで１〜２ｍｍの大粒径）を右側に使用し、抗菌剤放出器具（１００ｍｇ局所ミノサイクリン、陽性対照）を左側に使用する。
【０３３７】
処置群への割り当てはデータ分析を行う予定の研究者に対して隠される。標準的、且つ、同等の量の抗菌剤を処置群に使用する。治療後に弁の位置を戻し、縫合し（ＰＴＦＥ４，０、Ｃｙｔｏｐｌａｓｔ、米国）、縫合糸の除去から１週間後に口腔衛生手段を再開する。臨床検査及びマイクロＣＴスキャン検査を手術から３か月後の時点で再度実施し、上に記載したような分析のためにこの時点で微生物試料も取得する。インプラント周囲炎手術から６か月後に動物を安楽死させ、マイクロＣＴスキャンを実施し、そして「臨界サイズ歯槽上インプラント周囲欠損モデル」の項で詳細に説明したように組織学的パラメーターの評価のために顎を摘除する。臨床所見及びＸ線所見との相関について以前に詳細に説明されたように（参照番号５７）組織学切片から炎症スコアを決定する。
【０３３８】
統計分析：
ＳＰＳＳ  ２２．０（ＩＢＭ社、アーモンク、ニューヨーク州）及びＥｘｃｅｌ  ２０１６（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、レドモンド、ワシントン州）を使用して統計計算を行う。全ての動物試験についてサンプルサイズの見積もりをするためにＧ  Ｐｏｗｅｒ  ３ソフトウェア５８を使用して検定力分析を実施した。これらの動物試験からのデータ収集の後にデータ（パラメトリック又は非パラメトリック）の分布を理解し、且つ、平均値、標準誤差、標準偏差、尖度と歪度、及び９５％信頼レベルを生成するために定量結果をまず記述統計学によって分析する。場合に応じてクラスカル・ウォリス検定、ＡＮＯＶＡ、又は混合線形モデルを用いてそのデータを分析し、群と群とを比較するときにα＝０．０５のレベルで統計学的有意性を実施する。所見をさらに確認するために独立ｔ検定を活用するポストホック検定とダネットの多重比較検定も実施する。全ての動物実験は、結果の質、信頼性、有効性、及び再現性を確保するために動物実験について報告するためのＡＲＲＩＶＥガイドライン５９を使用して記載されている。
【０３３９】
前記薬品化合物と構成成分の安定性及びＢＣＣ（６）のインビトロＡＤＭＥを評価することができる。このデータはヒトの代謝と実験的動物との間で大きな差異が存在する可能性があるか確定するのに役立ち得る。ヒト、ラット、及びイヌの肝臓ミクロソーム及び肝細胞と６のインキュベーションとその後の代謝混合物のＬＣ／ＭＳ分析を実施する。シプロフロキサシンの代謝プロファイル６２、６３が知られているので我々は前記分子のＢＰ部分及び前記親のあらゆる代謝物（例えばシプロフロキサシンについて知られているようなピペラジン環切断）に焦点を当てる。代謝物がインビトロで決定されたところで上記の他のインビボ実験の血漿試料を使用してインビボのこれらの化合物を定常状態で決定する。
【０３４０】
ＢＣＣ（６）の毒物学をラット及びイヌで評価してＮＯＡＥＬを決定することができる。ラット及びイヌにおけるＮＯＡＥＬと最大忍容投与量（ＭＴＤ）を決定するために我々は用量範囲探索試験を最初に実施する。６匹のラット（３匹のオス、３匹のメス）からなる群に対して６を１０ｍｇ／ｋｇの用量で、又はその時点での我々の最良評価に基づいて単回静脈内投与する。急性毒性が認められる（ＭＴＤ）まで用量を倍増し、その後で効果が見られなくなるまでこの用量を２０％ずつ順次減少させていってこの用量がその化合物のＮＯＡＥＬになる。毒性を軽度、中程度、又は重度と評価し、２匹以上の動物における中程度の毒性又は１匹以上の動物における重度の毒性がＭＴＤと定義される６４。５日間にわたって体重と臨床観察について動物を追跡調査する。５日後に動物を安楽死させ、内臓重量と組織学を評価するために剖検を実施する（臨床ＢＰ毒性学に基づいて肝臓と腎臓を含めるために１５切片）。同様の用量範囲探索試験をイヌ（性別ごとに１匹；ラットの体重を２５０ｇ、イヌの体重を１０ｋｇと仮定して相対成長率から決定される４ｍｇ／ｋｇという等価の用量から開始する）において実施し、その試験はラットと同様に同じ終末試験に加えて血液学と臨床化学を含む。この実験は合計で４〜６コホートを用いることが可能である。
【０３４１】
トキシコキネティクス並びにＮＯＡＥＬ及びＭＴＤにおける回復試験を含む拡大急性毒性試験を動物群に実施することができる。各用量の毒性評価に性別ごとに１０匹ずつ、トキシコキネティクスのために性別ごとに９匹ずつ、そして回復試験のために性別ごとに５匹ずつのラットを含む４８匹のラット群を使用することができる。６タイムポイント（オス又はメスから無作為に各時点につき３匹のラットを選択する）においてトキシコキネティクスを実施し、続いて各用量を投与する。タイムポイントは投与後５分、３０分、６０分、１２０分、１２時間、及び２４時間である。動物の回復を１４日間にわたって観察し、その後で上記の試験のように内臓重量と組織学を評価する。トキシコキネティクス試験から非コンパートメント分析（ＮＣＡ）によってＣｍａｘ、ＡＵＣ、及び半減期を含むＰＫパラメーターを決定する。全部で１０匹の動物（投与のために性別ごとに３匹、回復試験のために性別ごとに２匹）を含むことを除いて同一の実験をイヌにおいて実施し、ラットと同じ時点で各動物から血液採取する。イヌのＮＯＡＥＬにおけるＡＵＣを使用して目的２において記載される骨移植／ＢＰ−フルオロキノロン複合体の最大許容曝露量を計算し、イヌにおけるＰＫ実験を用いてこのレベルの１／１００を超える全身曝露が存在するか決定する。
【０３４２】
母集団解析のために臨床的に確認されているＢＰ薬物動態のユニークな３コンパートメント（血液／尿／骨）数理モデル６５を現在のプロジェクトに適用する。イヌ試験から、我々はＢＰ及びフルオロキノロン濃度の決定のために安楽死時点の各動物において骨（顎と大腿部）、腱（腓腹筋）を試料採取する。我々はこれらのデータ及び我々のモデルを組み合わせてイヌにおけるタイムコースを説明する。このモデルから我々は交互投与又は反復投与されたＢＰとフルオロキノロンの両方に対する骨と軟骨の予期される曝露をシミュレートすることができる。これにより後続のヒト投与についての情報を伝えることができる。これまでに記載されたように６６〜６８、Ｒ向けのＰｍｅｔｒｉｃｓパッケージ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ロサンゼルス、カリフォルニア州）内に実装されている適応ガンマ付きノンパラメトリック適応型グリッド（ＮＰＡＧ）アルゴリズムを全てのＰＫモデルフィッティング法に使用する。測定された濃度の関数として誤差多項式を使用することの理由はアッセイ誤差（ＳＤ）であり、赤池の情報基準、予想濃度に対する観察濃度の回帰、ＰＫパラメーター共変数回帰の視覚的プロット、及び節約則を用いて性能比較評価を完了する。
【０３４３】
実施例８
前記ＢＰ−Ａｂ複合体を移植片及び移植器具に組み込むことができる。複数の実施形態において、ほんのわずかな例を挙げるとＢｉｏＯｓｓ（登録商標）（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ社、スイス）又はＭｉｎｅｒＯｓｓ（登録商標）（ＢｉｏＨｏｒｉｚｏｎｓ社、バーミングハム、アラバマ州）の牛骨材料など、既に認可されている骨移植製品に前記ＢＰ−Ａｂ複合体のうちの１又は複数を組み込むことができる。歯科代替骨移植片として使用される支持材料と前記ＢＰ−Ａｂ複合体を混合することが可能である。その製品は無機牛骨材料に吸着された前記複合体を含むことになる。この材料によって骨移植片移植領域への抗生物質の局所送達が行われて細菌感染率とインプラント周囲炎及び他の感染症などの関連の歯科病理が減少する。我々の製品の歯科応用にはインプラント周囲炎の治療ばかりか抜歯窩の維持、堤又は洞底の拳上術、歯周炎の予防又は治療、骨髄炎又は骨壊死の治療又は予防、又はそのような骨移植片が有益であり得る他の口腔歯周外科用途が含まれ得るだろう。前記ＢＰ−フルオロキノロン複合体材料は本質的に代替骨移植片に吸着されることになり、我々の予備的データは感染症の場合では骨破壊領域への持続的放出を示しており、それによって我々の製品は抗生物質を感染部位へより効果的に送達することができ、前記複合体化合物のどちらの成分に対する全身曝露も無視できる。
【０３４４】
前記移植材料は洞底移植術などの非歯科移植術にとっても有益であり得る。
【０３４５】
実施例６〜８の参照先
１．   ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａａｉｄ．ｃｏｍ／ａｂｏｕｔ／ｐｒｅｓｓ＿ｒｏｏｍ／ｄｅｎｔａｌ＿ｉｍｐｌａｎｔｓ＿ｆａｑ．ｈｔｍｌ
２．   Ｑｕｉｒｙｎｅｎ  Ｍ，Ｄｅ  Ｓｏｅｔｅ  Ｍ，ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｈｅ  Ｄ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｒｉｓｋｓ  ｆｏｒ  ｏｒａｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００２；１３（１）：１−１９．ｄｏｉ：  １０．１０３４／ｊ．１６００−０５０１．２００２．１３０１０１．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １２００５１３９．
３．   Ｎｏｒｏｗｓｋｉ  ＰＡ，Ｊｒ．，Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒ  ＪＤ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ：  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００９；８８（２）：５３０−４３．ｄｏｉ：  １０．１００２／ｊｂｍ．ｂ．３１１５２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８６９８６２６．
４．   Ｓａｌｖｉ  ＧＥ，Ｃｏｓｇａｒｅａ  Ｒ，Ｓｃｕｌｅａｎ  Ａ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．２０１６．ｄｏｉ：  １０．１１７７／００２２０３４５１６６６７４８４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７６８００２８．
５．   Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＪＡ，Ｒａｇｈｏｅｂａｒ  ＧＭ，ｄｅ  Ｗａａｌ  ＹＣＭ，Ｖｉｓｓｉｎｋ  Ａ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔ  ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｅｄｅｎｔｕｌｏｕｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｍｐｌａｎｔ−ｒｅｔａｉｎｅｄ  ｍａｎｄｉｂｕｌａｒ  ｏｖｅｒｄｅｎｔｕｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  １０−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｐｅｒｉｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２０１４；４１（１２）：１１７８−８３．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊｃｐｅ．１２３１１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５２２９３９７．
６．   Ｊｅｍｔ  Ｔ，Ｏｌｓｓｏｎ  Ｍ，Ｓｔｅｎｐｏｒｔ  ＶＦ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｉｒｓｔ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ：  Ａ  Ｒｅｔｒｏｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ２７  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｏｎｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ  Ｃｌｉｎｉｃ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１５；１７：Ｅ５０１−Ｅ１０．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｃｉｄ．１２２７７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５５３６２７３．
７．   Ｗｏｌｃｏｔｔ  ＲＤ，Ｅｈｒｌｉｃｈ  ＧＤ．Ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｊａｍａ−Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．２００８；２９９（２２）：２６８２−４．ｄｏｉ：  １０．１００１／ｊａｍａ．２９９．２２．２６８２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８５４４７２９．
８．   Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ＪＷ，Ｃｈｅｎｇ  ＫＪ，Ｇｅｅｓｅｙ  ＧＧ，Ｌａｄｄ  ＴＩ，Ｎｉｃｋｅｌ  ＪＣ，Ｄａｓｇｕｐｔａ  Ｍ，Ｍａｒｒｉｅ  ＴＪ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ｉｎ  ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｉｓｅｓａｅ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９８７；４１：４３５−６４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ３３１８６７６．
９．   Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ＪＷ，Ｇｅｅｓｅｙ  ＧＧ，Ｃｈｅｎｇ  ＫＪ．Ｈｏｗ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｔｉｃｋ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ．１９７８；２３８（１）：８６−９５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ６３５５２０．
１０． Ｋｕｍａｒ  ＰＳ，Ｍａｓｏｎ  ＭＲ，Ｂｒｏｏｋｅｒ  ＭＲ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｋ．Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｎｄ  ｆａｉｌｉｎｇ  ｄｅｎｔａｌ  ｉｍｐｌａｎｔｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０１２；３９（５）：４２５−３３．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊ．１６００−０５１Ｘ．２０１２．０１８５６．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２４１７２９４；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３３２３７４７．
１１． Ｓｈｉｂｌｉ  ＪＡ，Ｍｅｌｏ  Ｌ，Ｆｅｒｒａｒｉ  ＤＳ，Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ＬＣ，Ｆａｖｅｒｉ  Ｍ，Ｆｅｒｅｓ  Ｍ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｐｒａ  ａｎｄ  ｓｕｂｇｉｎｇｉｖａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｏｆ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ．２００８；１９（１０）：９７５−８２．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊ．１６００−０５０１．２００８．０１５６６．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８８２８８１２．
１２． Ｓｔｏｏｄｌｅｙ  Ｐ，Ｅｈｒｌｉｃｈ  ＧＤ，Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ，Ｈａｌｌ−Ｓｔｏｏｄｌｅｙ  Ｌ，Ｂａｒａｔｚ  ＭＥ，Ａｌｔｍａｎ  ＤＴ，Ｓｏｔｅｒｅａｎｏｓ  ＮＧ，Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ＪＷ，ＤｅＭｅｏ  Ｐ．Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｐｒａｃｔ．２０１１；２２（６）：５５８−６３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２３２３９２７；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３２７２６６９．
１３． Ｊａｖｅｄ  Ｆ，ＡｌＧｈａｍｄｉ  ＡＳＴ，Ａｈｍｅｄ  Ａ，Ｍｉｋａｍｉ  Ｔ，Ａｈｍｅｄ  ＨＢ，Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ  ＨＣ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１３；６３（４）：１６９−７６．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｉｄｊ．１２０３４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３８７９２５１．
１４． Ｓｍｅｅｔｓ  Ｒ，Ｈｅｎｎｉｎｇｓｅｎ  Ａ，Ｊｕｎｇ  Ｏ，Ｈｅｉｌａｎｄ  Ｍ，Ｈａｍｍａｃｈｅｒ  Ｃ，Ｓｔｅｉｎ  ＪＭ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｅｔｉｏｌｏｇｙ，ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ  −  ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｈｅａｄ  Ｆａｃｅ  Ｍｅｄ．２０１４；１０．ｄｏｉ：  １０．１１８６／１７４６−１６０ｘ−１０−３４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５１８５６７５；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ４１６４１２１．
１５． Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ  Ａ，Ｄａｈｌｅｎ  Ｇ，Ｒｅｎｖｅｒｔ  Ｓ．Ｆｉｖｅ−ｙｅａｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍａｎ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２００３；７４（１０）：１４１５−２２．ｄｏｉ：  １０．１９０２／ｊｏｐ．２００３．７４．１０．１４１５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １４６５３３８６．
１６． Ｍｏｍｂｅｌｌｉ  Ａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２０００．２００２；２８：１７７−８９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １２０１３３４１．
１７． Ｌｅｖｉｓｏｎ  ＭＥ，Ｌｅｖｉｓｏｎ  ＪＨ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２００９；２３（４）：７５−８９．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｉｄｃ．２００９．０６．００８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４４８４５７６；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ４０７９０３１  
１８． Ｋａｕｒ  Ｋ，Ｓｉｋｒｉ  Ｐ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｗｉｔｈ  ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｔｈｅ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ａｌｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆｒａｂｏｎｙ  ｄｅｆｅｃｔｓ：  Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  Ｊ  （Ｉｓｆａｈａｎ）．２０１３；１０（２）：２３８−４６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３９４６７４３；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３７３１９６７．
１９． Ｉｎｚａｎａ  ＪＡ，Ｓｃｈｗａｒｚ  ＥＭ，Ｋａｔｅｓ  ＳＬ，Ａｗａｄ  ＨＡ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｉｍｐｌａｎｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１６；８１：５８−７１．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１５．１２．０１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６７２４４５４．
２０． Ｓｃｈｍｉｔｔ  ＣＭ，Ｍｏｅｓｔ  Ｔ，Ｌｕｔｚ  Ｒ，Ｎｅｕｋａｍ  ＦＷ，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  ＫＡ．Ａｎｏｒｇａｎｉｃ  ｂｏｖｉｎｅ  ｂｏｎｅ  （ＡＢＢ）  ｖｓ．ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ  （ＡＢ）  ｐｌｕｓ  ＡＢＢ  ｉｎ  ｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｓｉｎｕｓ  ｇｒａｆｔｉｎｇ．Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ．２０１５；２６（９）：１０４３−５０．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｃｌｒ．１２３９６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４７３０６０２．
２１． Ｋｌｕｉｎ  ＯＳ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｉ  ＨＣ，Ｂｕｓｓｃｈｅｒ  ＨＪ，Ｎｅｕｔ  Ｄ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｖｓ  ｎｏｎ−ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１３；１０（３）：３４１−５１．ｄｏｉ：  １０．１５１７／１７４２５２４７．２０１３．７５１３７１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３２８９６４５．
２２． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２００９／０１９５３７ｓ０７３，０２０７８０ｓ０３０ｌｂｌ．ｐｄｆ
２３． Ｎａｎｃｏｌｌａｓ  ＧＨ，Ｔａｎｇ  Ｒ，Ｐｈｉｐｐｓ  ＲＪ，Ｈｅｎｎｅｍａｎ  Ｚ，Ｇｕｌｄｅ  Ｓ，Ｗｕ  Ｗ，Ｍａｎｇｏｏｄ  Ａ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＲＧＧ，Ｅｂｅｔｉｎｏ  ＦＨ．Ｎｏｖｅｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｏｎ  ｂｏｎｅ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ．Ｂｏｎｅ．２００６；３８（５）：６１７−２７．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｏｎｅ．２００５．０５．００３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １６０４６２０６．
２４． Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＲＧＧ，Ｗａｔｔｓ  ＮＢ，Ｅｂｅｔｉｎｏ  ＦＨ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＭＪ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ  ２００８；１９（６）：７３３−５９．ｄｏｉ：  １０．１００７／ｓ００１９８−００７−０５４０−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８２１４５６９．
２５． Ｋａｖａｎａｇｈ  ＫＬ，Ｇｕｏ  ＫＤ，Ｄｕｎｆｏｒｄ  ＪＥ，Ｗｕ  ＸＱ，Ｋｎａｐｐ  Ｓ，Ｅｂｅｔｉｎｏ  ＦＨ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＭＪ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＲＧＧ，Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ  Ｕ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ａｓ  ａｎｔｉ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｄｒｕｇｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００６；１０３（２０）：７８２９−３４．ｄｏｉ：  １０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０１６４３１０３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １６６８４８８１；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ１４７２５３０．
２６． Ｋａｓｈｅｍｉｒｏｖ  ＢＡ，Ｂａｌａ  ＪＬＦ，Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｅｂｅｔｉｎｏ  ＦＨ，Ｘｉａ  Ｚ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＲＧＧ，Ｃｏｘｏｎ  ＦＰ，Ｒｏｅｌｏｆｓ  ＡＪ，Ｒｏｇｅｒｓ  ＭＪ，ＭｃＫｅｎｎａ  ＣＥ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ  ｌａｂｅｌｅｄ  ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  ”ｍａｇｉｃ  ｌｉｎｋｅｒ”  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２００８；１９（１２）：２３０８−１０．ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｂｃ８００３６９ｃ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９０３２０８０．
２７． Ｊｕｎｋａ  ＡＦ，Ｓｚｙｍｃｚｙｋ  Ｐ，Ｓｍｕｔｎｉｃｋａ  Ｄ，Ｋｏｓ  Ｍ，Ｓｍｏｌｉｎａ  Ｉ，Ｂａｒｔｏｓｚｅｗｉｃｚ  Ｍ，Ｃｈｌｅｂｕｓ  Ｅ，Ｔｕｒｎｉａｋ  Ｍ，Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ａｒｅ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｄｅｓｔｒｏｙ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ．２０１５；７３（３）：４５１−６４．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｏｍｓ．２０１４．０９．０１９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５５４４３０３．
２８． Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ，Ｋｕｍａｒ  ＳＫＳ，Ｇｏｒｕｒ  Ａ，Ｓｃｈａｕｄｉｎｎ  Ｃ，Ｓｈｕｌｅｒ  ＣＦ，Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ＪＷ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｗｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００８；６６（４）：７６７−７５．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｏｍｓ．２００７．１１．０３５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８３５５６０３．
２９． Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ，Ｋｕｍａｒ  ＳＫＳ，Ｇｏｒｕｒ  Ａ，Ｓｃｈａｕｄｉｎｎ  Ｃ，Ｓｈｕｌｅｒ  ＣＦ，Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ＪＷ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｗ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｗ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｄｅｎｔ  Ａｓｓｏｃ．２００９；１４０（１０）：１２５９−６５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９７９７５５６．
３０． Ｚｈａｎｇ  ＳＦ，Ｇａｎｇａｌ  Ｇ，Ｕｌｕｄａｇ  Ｈ．’Ｍａｇｉｃ  ｂｕｌｌｅｔｓ’  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ  ２００７；３６（３）：５０７−３１．ｄｏｉ：  １０．１０３９／ｂ５１２３１０ｋ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １７３２５７８９．
３１． Ｈｅｒｃｚｅｇｈ  Ｐ，Ｂｕｘｔｏｎ  ＴＢ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＣ，Ｋｏｖａｃｓ−Ｋｕｌｙａｓｓａ  Ａ，Ｂｒｅｗｅｒ  ＰＤ，Ｓｚｔａｒｉｃｓｋａｉ  Ｆ，Ｓｔｒｏｅｂｅｌ  ＧＧ，Ｐｌｏｗｍａｎ  ＫＭ，Ｆａｒｃａｓｉｕ  Ｄ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ＪＦ．Ｏｓｔｅｏａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００２；４５（１１）：２３３８−４１．ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｊｍ０１０５３２６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １２０１４９７２．
３２． Ｂｕｘｔｏｎ  ＴＢ，Ｗａｌｓｈ  ＤＳ，Ｈａｒｖｅｙ  ＳＢ，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＣ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ＪＦ，Ｐｌｏｗｍａｎ  ＫＭ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｓｋｅｌｉｔｅ  （ＴＭ）  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｌｏｃａｌ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｂｏｎｅ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ．２００４；９１（９）：１１９２−６．ｄｏｉ：  １０．１００２／ｂｊｓ．４６４４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １５４４９２７３．
３３． Ｔａｎａｋａ  ＫＳＥ，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＴＪ，Ｋａｎｇ  Ｔ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｅ，Ｄｅｌｏｒｍｅ  Ｄ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＳＳ，Ｃａｒｏｎ  Ｌ，Ｖｉｅｎｓ  Ｆ，Ａｒｈｉｎ  ＦＦ，Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ  Ｉ，Ｌｅｈｏｕｘ  Ｄ，Ｆａｄｈｉｌ  Ｉ，Ｌａｑｕｅｒｒｅ  Ｋ，Ｌｉｕ  Ｊ，Ｏｓｔｉｇｕｙ  Ｖ，Ｐｏｉｒｉｅｒ  Ｈ，Ｍｏｅｃｋ  Ｇ，Ｐａｒｒ  ＴＲ，Ｆａｒ  ＡＲ．Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８；１６（２０）：９２１７−２９．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２００８．０９．０１０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８８１５０５１．
３４． Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ＴＪ，Ｔａｎａｋａ  ＫＳＥ，Ｋａｎｇ  Ｔ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｅ，Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｙ，Ｄｅｌｏｒｍｅ  Ｄ，Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＳＳ，Ｖｉｅｎｓ  Ｆ，Ａｒｈｉｎ  ＦＦ，Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ  Ｉ，Ｌｅｈｏｕｘ  Ｄ，Ｆａｄｈｉｌ  Ｉ，Ｌａｑｕｅｒｒｅ  Ｋ，Ｌｉｕ  Ｊ，Ｏｓｔｉｇｕｙ  Ｖ，Ｐｏｉｒｉｅｒ  Ｈ，Ｍｏｅｃｋ  Ｇ，Ｐａｒｒ  ＴＲ，Ｆａｒ  ＡＲ．Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｆｒｅｅ  Ａｍｉｎｏ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００８；５１（２１）：６９５５−６９．ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｊｍ８０１００７ｚ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８８３４１０６．
３５． Ｔａｎａｋａ  ＫＳＥ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｅ，Ｃｉｂｌａｔ  Ｓ，Ｍｅｔａｙｅｒ  Ｃ，Ａｒｈｉｎ  ＦＦ，Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ  Ｉ，Ｍｏｅｃｋ  Ｇ，Ｐａｒｒ  ＴＲ，Ｆａｒ  ＡＲ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２０１０；２０（４）：１３５５−９．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０１０．０１．００６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２００９７０６９．
３６． Ａｒｎｓ  Ｓ，Ｇｉｂｅ  Ｒ，Ｍｏｒｅａｕ  Ａ，Ｍｏｒｓｈｅｄ  ＭＭ，Ｙｏｕｎｇ  ＲＮ．Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｏｎｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｄｕａｌ−ａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２；２０（６）：２１３１−４０．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１２．０１．０２４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２３４１５７４．
３７． Ｌｉｕ  ＣＣ，Ｈｕ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｇ，Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  Ｊ，Ａｒｎｓ  Ｓ，Ｋｕｍａｒ  ＮＳ，Ｙｏｕｎｇ  ＲＮ，Ｇｒｙｎｐａｓ  ＭＤ．Ｎｏｖｅｌ  ＥＰ４  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｇｏｎｉｓｔ−Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｄｒｕｇ  （Ｃ１）  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｂｏｎｅ  Ｌｏｓｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５；３０（４）：６７０−８０．ｄｏｉ：  １０．１００２／ｊｂｍｒ．２３８２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５２８４３２５．
３８． Ｍｏｒｉｏｋａ  Ｍ，Ｋａｍｉｚｏｎｏ  Ａ，Ｔａｋｉｋａｗａ  Ｈ，Ｍｏｒｉ  Ａ，Ｕｅｎｏ  Ｈ，Ｋａｄｏｗａｋｉ  ＳＩ，Ｎａｋａｏ  Ｙ，Ｋａｔｏ  Ｋ，Ｕｍｅｚａｗａ  Ｋ．Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｂｏｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１０；１８（３）：１１４３−８．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２００９．１２．０４１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２００７１１８５  
３９． Ｋａｔｓａｒｅｌｉｓ  Ｈ，Ｓｈａｈ  ＮＰ，Ｄｈａｒｉｗａｌ  ＤＫ，Ｐａｚｉａｎａｓ  Ｍ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｗ．Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．２０１５；９４（４）：５３４−９．ｄｏｉ：  １０．１１７７／００２２０３４５１５５７２０２１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５７１０９５０．
４０． Ｌｅｅ  ＳＨ，Ｃｈａｎ  ＲＣ，Ｃｈａｎｇ  ＳＳ，Ｔａｎ  ＹＬ，Ｃｈａｎｇ  ＫＨ，Ｌｅｅ  ＭＣ，Ｃｈａｎｇ  ＨＥ，Ｌｅｅ  ＣＣ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｍｏｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｃａｒｅ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１４；２２（２）：５５３−６０．ｄｏｉ：  １０．１００７／ｓ００５２０−０１３−２０１７−ｙ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４２０３０８５．
４１． Ｍｏｕｒａ  ＬＡ，Ｒｉｂｅｉｒｏ  ＦＶ，Ａｉｅｌｌｏ  ＴＢ，Ｄｕｅｋ  ＥＡＤ，Ｓａｌｌｕｍ  ＥＡ，Ｎｏｃｉｔｉ  ＦＨ，Ｃａｓａｔｉ  ＭＺ，Ｓａｌｌｕｍ  ＡＷ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ  ｂｙ  ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ２０１５；２６（１０）：５７３−８４．ｄｏｉ：  １０．１０８０／０９２０５０６３．２０１５．１０４５２４９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５９１７５０１  
４２． ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｏｖｔｒａｃｋ．ｕｓ／ｃｏｎｇｒｅｓｓ／ｂｉｌｌｓ／１１４／ｈｒ３４／ｔｅｘｔ
４３． ＥＵＣＡＳＴ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＩＣｓ  ａｎｄ  ｚｏｎｅ  ｄｉａｍｅｔｅｒｓ．２０１５．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／
４４． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＪＣ，Ｒｕｎｎｅｒ  Ｒ，Ｂｕｘｔｏｎ  ＴＢ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  ＪＦ，Ｆａｒｃａｓｉｕ  Ｄ，Ｂｅｒｅｃｚｋｉ  Ｉ，Ｒｏｔｈ  Ｅ，Ｔｏｌｌａｓ  Ｓ，Ｏｓｔｏｒｈａｚｉ  Ｅ，Ｒｏｚｇｏｎｙｉ  Ｆ，Ｈｅｒｃｚｅｇｈ  Ｐ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１２；４７：６１５−８．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｅｊｍｅｃｈ．２０１１．１０．０４９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２０９３７６０．
４５． Ｆｒｅｉｒｅ  ＭＯ，Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ，Ｓｃｈａｕｄｉｎｎ  Ｃ，Ｇｏｒｕｒ  Ａ，Ｄｏｗｎｅｙ  ＪＳ，Ｃｈｏｉ  ＪＨ，Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｋｏｏｋ  ＪＫ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＳＤ，Ｚａｄｅｈ  ＨＨ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ  Ｂｉｏｆｉｌｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２０１１；８２（５）：７７８−８９．ｄｏｉ：  １０．１９０２／ｊｏｐ．２０１０．１００２６３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１２２２５４６．
４６． Ｖａｃｏｎｄｉｏ  Ｆ，Ｓｉｌｖａ  Ｃ，Ｌｏｄｏｌａ  Ａ，Ｆｉｏｎｉ  Ａ，Ｒｉｖａｒａ  Ｓ，Ｄｕｒａｎｔｉ  Ａ，Ｔｏｎｔｉｎｉ  Ａ，Ｓａｎｃｈｉｎｉ  Ｓ，Ｃｌａｐｐｅｒ  ＪＲ，Ｐｉｏｍｅｌｌｉ  Ｄ，Ｍｏｒ  Ｍ，Ｔａｒｚｉａ  Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃａｒｂａｍａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  （ＦＡＡＨ）  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ．２００９；４（９）：１４９５−５０４．ｄｏｉ：  １０．１００２／ｃｍｄｃ．２００９００１２０．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９５５４５９９；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ３５１７９７４．
４７． Ｌｌｏｙｄ−Ｊｏｎｅｓ  ＧＣ，Ｍｏｓｅｌｅｙ  ＪＤ，Ｒｅｎｎｙ  ＪＳ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｗａｒｔ  Ｏ  −＞  Ｓ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏ−ａｒｙｌ  ｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．２００８（５）：６６１−８９．ｄｏｉ：  １０．１０５５／ｓ−２００８−１０３２１７９．
４８． Ｍｏｓｅｌｅｙ  ＪＤ，Ｓａｎｋｅｙ  ＲＦ，Ｔａｎｇ  ＯＮ，Ｇｉｌｄａｙ  ＪＰ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｗａｒｔ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．２００６；６２（１９）：４６８５−９．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｔｅｔ．２００５．１２．０６３．
４９． Ｅｂｅｔｉｎｏ  ＦＨ，Ｈｏｇａｎ  ＡＭ，Ｓｕｎ  Ｓ，Ｔｓｏｕｍｐｒａ  ＭＫ，Ｄｕａｎ  Ｘ，Ｔｒｉｆｆｉｔｔ  ＪＴ，Ｋｗａａｓｉ  ＡＡ，Ｄｕｎｆｏｒｄ  ＪＥ，Ｂａｒｎｅｔｔ  ＢＬ，Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ  Ｕ，Ｌｕｎｄｙ  ＭＷ，Ｂｏｙｄｅ  Ａ，Ｋａｓｈｅｍｉｒｏｖ  ＢＡ，ＭｃＫｅｎｎａ  ＣＥ，Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＲＧ．Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ．Ｂｏｎｅ．２０１１；４９（１）：２０−３３．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｂｏｎｅ．２０１１．０３．７７４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１４９７６７７．
５０． Ｖａｃｈａｌ  Ｐ，Ｈａｌｅ  ＪＪ，Ｌｕ  Ｚ，Ｓｔｒｅｃｋｆｕｓｓ  ＥＣ，Ｍｉｌｌｓ  ＳＧ，ＭａｃＣｏｓｓ  Ｍ，Ｙｉｎ  ＤＨ，Ａｌｇａｙｅｒ  Ｋ，Ｍａｎｓｅｒ  Ｋ，Ｋｅｓｉｓｏｇｌｏｕ  Ｆ，Ｇｈｏｓｈ  Ｓ，Ａｌａｎｉ  ＬＬ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｗ  ｂｏｎｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；４９（１１）：３０６０−３．ｄｏｉ：  １０．１０２１／ｊｍ０６０３９８ｖ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １６７２２６２４．
５１． Ｌｏｐｅｚ−Ｐｉｒｉｚ  Ｒ，Ｓｏｌａ−Ｌｉｎａｒｅｓ  Ｅ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐｏｒｔｕｇａｌ  Ｍ，Ｍａｌｐｉｃａ  Ｂ，Ｄｉａｚ−Ｇｕｍｅｓ  Ｉ，Ｅｎｃｉｓｏ  Ｓ，Ｅｓｔｅｂａｎ−Ｔｅｊｅｄａ  Ｌ，Ｃａｂａｌ  Ｂ，Ｇｒａｎｉｚｏ  ＪＪ，Ｍｏｙａ  ＪＳ，Ｔｏｒｒｅｃｉｌｌａｓ  Ｒ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｄｏｇ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｅｅ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｌａｓｓｙ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ：  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｌｏｓｓ  ａｒｏｕｎｄ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ．２０１５；１０（１０）．ｄｏｉ：  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４０３７４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６４８９０８８；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ４６１９２００  
５２． Ｏｒｔｉ  Ｖ，Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  Ｐ，Ｔｒａｍｉｎｉ  Ｐ，Ｇａｉｔａｎ  Ｃ，Ｍｅｒｔｅｎｓ  Ｂ，Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ  Ｆ．Ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｆｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ：  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０１６；４６（５）：２９１−３０２．ｄｏｉ：  １０．５０５１／ｊｐｉｓ．２０１６．４６．５．２９１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７８００２１２；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ５０８３８１３．
５３． Ｒｅｉｚｎｅｒ  Ｗ，Ｈｕｎｔｅｒ  ＪＧ，Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ  ＮＴ，Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ  ＲＤ，Ｓｃｈｗａｒｚ  ＥＭ，Ｋａｔｅｓ  ＳＬ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１４；２７：１９６−２１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４６６８５９４；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ４３２２６７９．
５４． Ｗａｎｃｋｅｔ  ＬＭ．Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｏｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｕｓｅｓ．Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１５；５２（５）：８４２−５０．ｄｏｉ：  １０．１１７７／０３００９８５８１５５９３１２４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６１６３３０３．
５５． Ｓａｂｅｒ  ＭＨ，Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｒｇ  Ｋ，Ａｌｏｎａｉｚａｎ  ＦＡ，Ｋｅｌｌｅｙ  ＳＴ，Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ，Ｆｕｒｌａｎ  Ｍ，Ｌｅｖｙ  ＴＡ，Ｓｉｍｏｎ  ＪＨ，Ｓｌｏｔｓ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｆｌｏｒａ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｐｅｒｉｒａｄｉｃｕｌａｒ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  Ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ４５４−Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｅｎｄｏｄ．２０１２；３８（１１）：１４８４−８．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｊｏｅｎ．２０１２．０６．０３７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３０６３２２２．
５６． Ｃａｐｏｒａｓｏ  ＪＧ，Ｋｕｃｚｙｎｓｋｉ  Ｊ，Ｓｔｏｍｂａｕｇｈ  Ｊ，Ｂｉｔｔｉｎｇｅｒ  Ｋ，Ｂｕｓｈｍａｎ  ＦＤ，Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ＥＫ，Ｆｉｅｒｅｒ  Ｎ，Ｐｅｎａ  ＡＧ，Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  ＪＫ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＪＩ，Ｈｕｔｔｌｅｙ  ＧＡ，Ｋｅｌｌｅｙ  ＳＴ，Ｋｎｉｇｈｔｓ  Ｄ，Ｋｏｅｎｉｇ  ＪＥ，Ｌｅｙ  ＲＥ，Ｌｏｚｕｐｏｎｅ  ＣＡ，ＭｃＤｏｎａｌｄ  Ｄ，Ｍｕｅｇｇｅ  ＢＤ，Ｐｉｒｒｕｎｇ  Ｍ，Ｒｅｅｄｅｒ  Ｊ，Ｓｅｖｉｎｓｋｙ  ＪＲ，Ｔｕｍｂａｕｇｈ  ＰＪ，Ｗａｌｔｅｒｓ  ＷＡ，Ｗｉｄｍａｎｎ  Ｊ，Ｙａｔｓｕｎｅｎｋｏ  Ｔ，Ｚａｎｅｖｅｌｄ  Ｊ，Ｋｎｉｇｈｔ  Ｒ．ＱＩＩＭＥ  ａｌｌｏｗｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０；７（５）：３３５−６．ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．ｆ．３０３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２０３８３１３１．
５７． Ｂａｔｔｕｌａ  Ｓ，Ｌｅｅ  ＪＷ，Ｗｅｎ  ＨＢ，Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ  Ｓ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｍ，Ｒｏｍａｎｏｓ  ＧＥ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｌｉｇａｔｕｒｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ  Ｍｏｄｅｌ：  Ａ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  ＆  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ．２０１５；３０（３）：５３４−４５．ｄｏｉ：  １０．１１６０７／ｊｏｍｉ．３７３７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６００９９０４．
５８． Ｆａｕｌ  Ｆ，Ｅｒｄｆｅｌｄｅｒ  Ｅ，Ｂｕｃｈｎｅｒ  Ａ，Ｌａｎｇ  ＡＧ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐｏｗｅｒ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇ＊Ｐｏｗｅｒ  ３．１：  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｂｅｈａｖ  Ｒｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；４１（４）：１１４９−６０．ｄｏｉ：  １０．３７５８／ｂｒｍ．４１．４．１１４９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９８９７８２３．
５９． Ｋｉｌｋｅｎｎｙ  Ｃ，Ｂｒｏｗｎｅ  Ｗ，Ｃｕｔｈｉｌｌ  ＩＣ，Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｍ，Ａｌｔｍａｎ  ＤＧ．Ａｎｉｍａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ：  Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ：  Ｔｈｅ  ＡＲＲＩＶＥ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１０；１６０（７）：１５７７−９．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊ．１４７６−５３８１．２０１０．００８７２．ｘ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２０６４９５６１；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２９３６８３０．
６０． Ｓａｌｖｉ  ＧＥ，Ｌａｎｇ  ＮＰ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｅｒｉ−ｉｍｐｌａｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ．２００４；１９：１１６−２７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １５６３５９５２．
６１．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ＵＣＭ０７２１９３．ｐｄｆ
６２． Ｊａｅｈｄｅ  Ｕ，Ｚｕｒｃｈｅｒ  Ｊ，Ｓｏｒｇｅｌ  Ｆ，Ｎａｂｅｒ  Ｋ，Ｓｃｈｕｎａｃｋ  Ｗ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．１９８９；１１：Ｓ１１３５．
６３． Ｖａｎｃｅｂｒｙａｎ  Ｋ，Ｇｕａｙ  ＤＲＰ，Ｒｏｔｓｃｈａｆｅｒ  ＪＣ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  １９９０；１９（６）：４３４−６１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２９２１６８．
６４． Ｂａｕｍａｎｓ  Ｖ，Ｂｒａｉｎ  ＰＦ，Ｂｒｕｇｅｒｅ  Ｈ，Ｃｌａｕｓｉｎｇ  Ｐ，Ｊｅｎｅｓｋｏｇ  Ｔ，Ｐｅｒｒｅｔｔａ  Ｇ．Ｐａｉｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｌａｇｏｍｏｒｐｈｓ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  （ＦＥＬＡＳＡ）  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｐａｉｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ａｃｃｅｐｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＦＥＬＡＳＡ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９２．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ．１９９４；２８（２）：９７−１１２．ｄｏｉ：  １０．１２５８／００２３６７７９４７８０７４５３０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ８０３５５７２．
６５． Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ＰＰ，Ｊｏｎｅｓ  ＡＣ，ＬａＶａｌｌｅｅ  Ｃ，Ｊｅｌｌｉｆｆｅ  ＲＷ，Ｌｅ  ＡＤ，Ｌｅｅ  Ｐ，Ｋｉｓｓ  Ａ，Ｎｅｅｌｙ  Ｍ．Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｏｓｔｅｏｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｊａｗ．Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇ  Ｏｒａｌ  Ｍｅｄ  Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｌ  ２０１３；１１５（２）：２２４−３２．ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｏｏｏｏ．２０１２．０８．４５５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３２４６２２４；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３５４５０８７．
６６． Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ  ＪＮ，Ｇｕｌａｔｉ  Ａ，Ｌａｖｈａｌｅ  ＭＳ，Ｓｈａｒｍａ  ＳＳ，Ｐａｔｅｌ  ＡＪ，Ｒｈｏｄｅｓ  ＮＪ，Ｓｃｈｅｅｔｚ  ＭＨ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｈａｑｕｉｎ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１６；６８（１）：５６−６２．ｄｏｉ：  １０．１１１１／ｊｐｈｐ．１２４９８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２６７２５９１３．
６７． Ｎｅｅｌｙ  ＭＮ，ｖａｎ  Ｇｕｉｌｄｅｒ  ＭＧ，Ｙａｍａｄａ  ＷＭ，Ｓｃｈｕｍｉｔｚｋｙ  Ａ，Ｊｅｌｌｉｆｆｅ  ＲＷ．Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｕｔｌｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｍｅｔｒｉｃｓ，ａ  Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  Ｒ．Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｉｔ．２０１２；３４（４）：４６７−７６．ｄｏｉ：  １０．１０９７／ＦＴＤ．０ｂ０１３ｅ３１８２５ｃ４ｂａ６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２７２２７７６  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３３９４８８０  
６８． Ｔａｔａｒｉｎｏｖａ  Ｔ，Ｎｅｅｌｙ  Ｍ，Ｂａｒｔｒｏｆｆ  Ｊ，ｖａｎ  Ｇｕｉｌｄｅｒ  Ｍ，Ｙａｍａｄａ  Ｗ，Ｂａｙａｒｄ  Ｄ，Ｊｅｌｌｉｆｆｅ  Ｒ，Ｌｅａｒｙ  Ｒ，Ｃｈｕｂａｔｉｕｋ  Ａ，Ｓｃｈｕｍｉｔｚｋｙ  Ａ．Ｔｗｏ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ：  ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｇｒｉｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｂａｙｅｓｉａｎ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．２０１３；４０（２）：１８９−９９．ｄｏｉ：  １０．１００７／ｓ１０９２８−０１３−９３０２−８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３４０４３９３；  ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３６３０２６９．
６９． Ｗａｃｈａ  Ｈ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｄ，Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｖ，Ｋｎｏｔｈｅ  Ｈ．Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｌｄｅｒ  ｔｈａｎ  ７０  ｙｅａｒｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．１９９０；１８（３）：１７３−６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３６５４７０．
【０３４６】
実施例９
本実施例は様々なＢＰ複合体化合物及び合成スキームを示す。ＢＰ−カルバメート−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームが図１６及び関連の説明において示されている。ＢＰ−カルバメート−モキシフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームが図３８において示されている。図３９はＢＰ−カルバメート−ガチフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。図４０はＢＰ−ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。図４１はＢＰ−ＯＨ−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。図４２はＢＰ−Ｏ−チオカルバメート−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。図４３はＢＰ−Ｓ−チオカルバメート−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。図４４はＢＰ−レゾルシノール−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。図４５はＢＰ−ヒドロキノン−シプロフロキサシンＢＰ複合体及び合成スキームを示している。
【０３４７】
図４６はＷがＯ又はＳ又はＮであり得、ＸがＯ、Ｓ、Ｎ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２Ｎ、又はＣＨ２Ｓであり得、ＹがＨ、ＣＨ３、ＮＯ２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又はＣＯ２Ｈであり得、ＺがＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり得、且つ、ｎが１〜５であり得るＢＰ−フルオロキノロン複合体の構造の１実施形態を示している。図４７は様々なＢＰ−フルオロキノロン複合体を示している。
【０３４８】
図４８はＸがＨ、ＣＨ３、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり得、ＹがＰＯ３Ｈ２、又はＣＯ２Ｈであり得、ＺがＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、又はＮ３であり得、且つ、ｎが１又は２であり得るアリール基含有ホスホネート類の構造の１実施形態を示している。図４９はＸがＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり得、且つ、ｎが１又は２であり得る様々なＢＰを示している。
【０３４９】
図５０は末端一級アミンを有する様々なＢＰを示している。図５１は末端ヒドロキシル基とアミン官能基を含有するリンカーに結合した様々なＢＰであって、Ｒがリセドロネート、ゾレドロネート、ミノドロネート、パミドロネート、又はアレンドロネートであり得るものを示している。図５２は様々なＢＰ−パミドロネート−シプロフロキサシン複合体を示している。図５３は様々なＢＰ−アレンドロネート−シプロフロキサシン複合体を示している。
【０３５０】
実施例１０
チオカルバメートＢＰ複合体（１３）の抗菌特性を評価した。
【０３５１】
化合物１３（Ｏ−チオカルバメートＢＰ複合体）
【化４１】
2019518792.tif 000071
【０３５２】
化合物１３を１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸と呼ぶこともできる。化合物１３を次のように合成した。テトライソプロピル（２（４−ヒドロキシフェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（０．１０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら水の中で乳状にし、そして氷浴中で冷却した。１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、１時間にわたって撹拌した。次にその氷浴を取り外し、撹拌を室温でさらに１時間にわたって継続した。その後でシプロフロキサシン（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、遮光のためにホイルで覆って反応を室温で一晩にわたって撹拌した。翌日、フリット漏斗を使用して白色のペーストを濾過し、固形物を水で洗浄し、次にエーテルで洗浄した。それらの固形物を収集し、ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３濃度勾配を使用するシリカカラムクロマトグラフィーにより精製してわずかに灰色がかった白色の固形物を得た。その固形物をＤＣＭ中に溶解し、ブロモトリメチルシラン（ＢＴＭＳ）（４．００ｍｍｏｌ）を添加し、そして油浴中で一晩にわたって３５℃で加熱した。溶媒及びＢＴＭＳを蒸発処理によって除去し、そしてＭｅＯＨを添加し、室温で３０分間にわたって撹拌した。ロータリーエバポレーター上で溶媒を除去し、生成物を冷ＭｅＯＨ中に沈殿させた。フリット漏斗を使用してその懸濁液を濾過し、そして追加のＭｅＯＨで洗浄した。固形物を収集し、過剰な溶媒を蒸発させて標的化合物を得た。
【０３５３】
図２４はプランクトン型黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株に対するＯ−チオカルバメートＢＰ複合体のＭＩＣについての評価の結果を表すグラフと画像を示している。陰性対照＝培地＋複合体処理されていない微生物；陽性対照＝微生物を含まない滅菌培地。
【０３５４】
図２５は複合体基材としてのポリスチレン上に形成された黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８株のバイオフィルムに対する前記チオカルバメートの抗菌活性又は細菌量減少についての評価の結果を表すグラフを示している。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物；陽性対照＝微生物を含まない滅菌希釈物。
【０３５５】
図２６は基材としてのハイドロキシアパタイト上の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ−６５３８の形成済みバイオフィルムに対して試験されたＯ−チオカルバメートＢＰ複合体の抗菌活性の評価の結果を表すグラフを示している。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験；対照薬＝対照）。
【０３５６】
図２７は黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８のバイオフィルム形成を防止する能力を評価するＯ−チオカルバメートＢＰ複合体処理済みハイドロキシアパタイトディスクを使用する試験の結果を表すグラフを示している。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験；対照薬＝対照）。
【０３５７】
図２８は黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ６５３８のバイオフィルム形成を防止する能力を評価するＯ−チオカルバメートＢＰ複合体処理済みハイドロキシアパタイトパウダーを使用する試験の結果を表すグラフを示している。陰性対照＝複合体処理されていない細菌希釈物。（＊ｐ＜０．０５、クラスカル・ウォリス検定；三回の複製実験；対照薬＝対照）。
【０３５８】
実施例１１
追加の例となるＢＰ−複合体とそれらの合成を本実施例において説明する。
【０３５９】
【化４２】
2019518792.tif 000072
【０３６０】
１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（６）
【０３６１】
シプロフロキサシン（０．１２ｍｍｏｌ）を水の中に懸濁し、Ｎａ２ＣＯ３を使用してｐＨを８．５に調節した。その懸濁液を氷浴中で冷却し、ＴＨＦ中に溶解した４（２，２−ビス（ジイソプロポキシホスホリル）エチル）フェニル（４−ニトロフェニル）カーボネート（０．１０ｍｍｏｌ）を滴下して添加した。その後、反応混合物を氷浴から取り出し、遮光し、そして室温で一晩にわたって撹拌した。翌日、反応混合物を水で希釈し、そして目の細かいガラス製フリット漏斗に通して濾過した。残留固形物を黄色が残らなくなるまで水で洗浄した。その後、その固形物を溶解し、ＤＣＭを使用してフリット漏斗から洗い流した。回収された粗製物がＭｅＯＨ：ＤＣＭ濃度勾配を使用するシリカカラム上でさらに精製された。標記化合物が白色の固形物として産出され、それをＤＣＭ中に溶解し、ブロモトリメチルシラン（ＢＴＭＳ）（４．００ｍｍｏｌ）を添加し、そして油浴中で一晩にわたって３５℃で加熱した。溶媒及びＢＴＭＳを蒸発処理によって除去し、そしてＭｅＯＨを添加し、室温で３０分間にわたって撹拌した。ロータリーエバポレーター上で溶媒を除去し、生成物を冷ＭｅＯＨ中に沈殿させた。フリット漏斗を使用してその懸濁液を濾過し、そして追加のＭｅＯＨで洗浄した。固形物を収集し、過剰な溶媒を蒸発させて除去して標的化合物を得た。
【０３６２】
【化４３】
2019518792.tif 000073
【０３６３】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１２）
【０３６４】
（１−ヒドロキシ−２（４−ヒドロキシフェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）（０．１０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら水中に溶解し、そして氷浴中で冷却した。１，１’−カルボニルジイミダゾール（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、１時間にわたって撹拌した。次にその氷浴を取り外し、撹拌を室温でさらに１時間にわたって継続した。その後でシプロフロキサシン（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、遮光のためにホイルで覆って反応を室温で一晩にわたって撹拌した。翌日、溶媒を蒸発処理により除去し、ＭｅＯＨを添加して生成物を沈殿させた。フリット漏斗を使用してその懸濁液を濾過し、そして追加のＭｅＯＨで洗浄した。固形物を収集し、過剰な溶媒を蒸発させて標的化合物を得た。
【０３６５】
【化４４】
2019518792.tif 000074
【０３６６】
１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１３）
【０３６７】
テトライソプロピル（２（４−ヒドロキシフェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホネート）（０．１０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら水の中で乳状にし、そして氷浴中で冷却した。１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、１時間にわたって撹拌した。次にその氷浴を取り外し、撹拌を室温でさらに１時間にわたって継続した。その後でシプロフロキサシン（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、遮光のためにホイルで覆って反応を室温で一晩にわたって撹拌した。翌日、フリット漏斗を使用して白色のペーストを濾過し、固形物を水で洗浄し、次にエーテルで洗浄した。それらの固形物を収集し、ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３濃度勾配を使用するシリカカラムクロマトグラフィーにより精製してわずかに灰色がかった白色の固形物を得た。その固形物をＤＣＭ中に溶解し、ブロモトリメチルシラン（ＢＴＭＳ）（４．００ｍｍｏｌ）を添加し、そして油浴中で一晩にわたって３５℃で加熱した。溶媒及びＢＴＭＳを蒸発処理によって除去し、そしてＭｅＯＨを添加し、室温で３０分間にわたって撹拌した。ロータリーエバポレーター上で溶媒を除去し、生成物を冷ＭｅＯＨ中に沈殿させた。フリット漏斗を使用してその懸濁液を濾過し、そして追加のＭｅＯＨで洗浄した。固形物を収集し、過剰な溶媒を蒸発させて標的化合物を得た。
【０３６８】
【化４５】
2019518792.tif 000075
【０３６９】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１４）
【０３７０】
（１−ヒドロキシ−２（４−ヒドロキシフェニル）エタン−１，１−ジイル）ビス（ホスホン酸）（０．１０ｍｍｏｌ）を激しく撹拌しながら水中に溶解し、そして氷浴中で冷却した。１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、１時間にわたって撹拌した。次にその氷浴を取り外し、撹拌を室温でさらに１時間にわたって継続した。その後でシプロフロキサシン（０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、遮光のためにホイルで覆って反応を室温で一晩にわたって撹拌した。翌日、溶媒を蒸発処理により除去し、ＭｅＯＨを添加して生成物を沈殿させた。フリット漏斗を使用してその懸濁液を濾過し、そして追加のＭｅＯＨで洗浄した。固形物を収集し、過剰な溶媒を蒸発させて標的化合物を得た。
【０３７１】
【化４６】
2019518792.tif 000076
【０３７２】
１−シクロプロピル−７（４（（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１５）
【０３７３】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物１３をＮＭＰ中に懸濁し、マイクロ波反応器の中で２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０３７４】
【化４７】
2019518792.tif 000077
【０３７５】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１６）
【０３７６】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物１４をＮＭＰ中に懸濁し、マイクロ波反応器の中で２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０３７７】
【化４８】
2019518792.tif 000078
【０３７８】
１−シクロプロピル−７（（４ａＲ，７ａＲ）−１（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）オクタヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−６−フルオロ−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１７）
【０３７９】
シプロフロキサシンをモキシフロキサシンで置き換え、化合物６について記載された方法に従って化合物１７を合成した。
【０３８０】
【化４９】
2019518792.tif 000079
【０３８１】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（（４ａＲ，７ａＲ）−１（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）オクタヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１８）
【０３８２】
シプロフロキサシンをモキシフロキサシンで置き換え、化合物１２について記載された方法に従って化合物１８を合成した。
【０３８３】
【化５０】
2019518792.tif 000080
【０３８４】
１−シクロプロピル−７（（４ａＲ，７ａＲ）−１（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）オクタヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−６−フルオロ−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（１９）
【０３８５】
シプロフロキサシンをモキシフロキサシンで置き換え、化合物１３について記載された方法に従って化合物１９を合成した。
【０３８６】
【化５１】
2019518792.tif 000081
【０３８７】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（（４ａＲ，７ａＲ）−１（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）オクタヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２０）
【０３８８】
シプロフロキサシンをモキシフロキサシンで置き換え、化合物１４について記載された方法に従って化合物２０を合成した。
【０３８９】
【化５２】
2019518792.tif 000082
【０３９０】
１−シクロプロピル−７（（４ａＲ，７ａＲ）−１（（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）オクタヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−６−フルオロ−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２１）
【０３９１】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物１９をＮＭＰ中に懸濁し、２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０３９２】
【化５３】
2019518792.tif 000083
【０３９３】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（（４ａＲ，７ａＲ）−１（（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）オクタヒドロ−６Ｈ−ピロロ［３，４−ｂ］ピリジン−６−イル）−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２２）
【０３９４】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物２０をＮＭＰ中に懸濁し、２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０３９５】
【化５４】
2019518792.tif 000084
【０３９６】
１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）−３−メチルピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２３）
【０３９７】
シプロフロキサシンをガチフロキサシンで置き換え、化合物６について記載された方法に従って化合物２３を合成した。
【０３９８】
【化５５】
2019518792.tif 000085
【０３９９】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）−３−メチルピペラジン−１−イル）−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２４）
【０４００】
シプロフロキサシンをガチフロキサシンで置き換え、化合物１２について記載された方法に従って化合物２４を合成した。
【０４０１】
【化５６】
2019518792.tif 000086
【０４０２】
１−シクロプロピル−７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）−３−メチルピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２５）
【０４０３】
シプロフロキサシンをガチフロキサシンで置き換え、化合物１３について記載された方法に従って化合物２５を合成した。
【０４０４】
【化５７】
2019518792.tif 000087
【０４０５】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）−３−メチルピペラジン−１−イル）−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２６）
【０４０６】
シプロフロキサシンをガチフロキサシンで置き換え、化合物１４について記載された方法に従って化合物２６を合成した。
【０４０７】
【化５８】
2019518792.tif 000088
【０４０８】
１−シクロプロピル−７（４（（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）−３−メチルピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２７）
【０４０９】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物２５をＮＭＰ中に懸濁し、２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０４１０】
【化５９】
2019518792.tif 000089
【０４１１】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）−３−メチルピペラジン−１−イル）−８−メトキシ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２８）
【０４１２】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物２６をＮＭＰ中に懸濁し、２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０４１３】
【化６０】
2019518792.tif 000090
【０４１４】
７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−１−エチル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（２９）
【０４１５】
シプロフロキサシンをノルフロキサシンで置き換え、化合物６について記載された方法に従って化合物２９を合成した。
【０４１６】
【化６１】
2019518792.tif 000091
【０４１７】
１−エチル−６−フルオロ−７（４（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３０）
【０４１８】
シプロフロキサシンをノルフロキサシンで置き換え、化合物１２について記載された方法に従って化合物３０を合成した。
【０４１９】
【化６２】
2019518792.tif 000092
【０４２０】
７（４（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−１−エチル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３１）
【０４２１】
シプロフロキサシンをノルフロキサシンで置き換え、化合物１３について記載された方法に従って化合物３１を合成した。
【０４２２】
【化６３】
2019518792.tif 000093
【０４２３】
１−エチル−６−フルオロ−７（４（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェノキシ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３２）
【０４２４】
シプロフロキサシンをノルフロキサシンで置き換え、化合物１４について記載された方法に従って化合物３２を合成した。
【０４２５】
【化６４】
2019518792.tif 000094
【０４２６】
７（４（（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−１−エチル−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３３）
【０４２７】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物３１をＮＭＰ中に懸濁し、２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０４２８】
【化６５】
2019518792.tif 000095
【０４２９】
１−エチル−６−フルオロ−７（４（（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボニル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３４）
【０４３０】
電子レンジ用バイアル瓶の中で化合物３２をＮＭＰ中に懸濁し、２０分間にわたって２９０℃で加熱した。その懸濁液を濾過し、ＭｅＯＨで洗浄して標的化合物を得た。
【０４３１】
【化６６】
2019518792.tif 000096
【０４３２】
１−シクロプロピル−７（４（（（４（２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−６−フルオロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３５）
【０４３３】
【化６７】
2019518792.tif 000097
【０４３４】
１−シクロプロピル−６−フルオロ−７（４（（（４（２−ヒドロキシ−２，２−ジホスホノエチル）フェニル）チオ）カルボノチオイル）ピペラジン−１−イル）−４−オキソ−１，４−ジヒドロキノリン−３−カルボン酸（３６）
【図１】
2019518792.tif 000104
【図２Ａ】
2019518792.tif 000105
【図２Ｂ】
2019518792.tif 000106
【図３】
2019518792.tif 000107
【図４】
2019518792.tif 000108
【図５】
2019518792.tif 000109
【図６】
2019518792.tif 000110
【図７】
2019518792.tif 000111
【図８】
2019518792.tif 000112
【図９】
2019518792.tif 000113
【図１０】
2019518792.tif 000114
【図１１】
2019518792.tif 000115
【図１２】
2019518792.tif 000116
【図１３】
2019518792.tif 000117
【図１４】
2019518792.tif 000118
【図１５】
2019518792.tif 000119
【図１６】
2019518792.tif 000120
【図１７】
2019518792.tif 000121
【図１８】
2019518792.tif 000122
【図１９】
2019518792.tif 000123
【図２０】
2019518792.tif 000124
【図２１】
2019518792.tif 000125
【図２２】
2019518792.tif 000126
【図２３】
2019518792.tif 000127
【図２４】
2019518792.tif 000128
【図２５】
2019518792.tif 000129
【図２６】
2019518792.tif 000130
【図２７】
2019518792.tif 000131
【図２８】
2019518792.tif 000132
【図２９】
2019518792.tif 000133
【図３０】
2019518792.tif 000134
【図３１】
2019518792.tif 000135
【図３２】
2019518792.tif 000136
【図３３】
2019518792.tif 000137
【図３４】
2019518792.tif 000138
【図３５】
2019518792.tif 000139
【図３６】
2019518792.tif 000140
【図３７】
2019518792.tif 000141
【図３８】
2019518792.tif 000142
【図３９】
2019518792.tif 000143
【図４０】
2019518792.tif 000144
【図４１】
2019518792.tif 000145
【図４２】
2019518792.tif 000146
【図４３】
2019518792.tif 000147
【図４４】
2019518792.tif 000148
【図４５】
2019518792.tif 000149
【図４６】
2019518792.tif 000150
【図４７−１】
2019518792.tif 000151
【図４７−２】
2019518792.tif 000152
【図４７−３】
2019518792.tif 000153
【図４７−４】
2019518792.tif 000154
【図４７−５】
2019518792.tif 000155
【図４７−６】
2019518792.tif 000156
【図４７−７】
2019518792.tif 000157
【図４８】
2019518792.tif 000158
【図４９−１】
2019518792.tif 000159
【図４９−２】
2019518792.tif 000160
【図４９−３】
2019518792.tif 000161
【図５０】
2019518792.tif 000162
【図５１】
2019518792.tif 000163
【図５２−１】
2019518792.tif 000164
【図５２−２】
2019518792.tif 000165
【図５２−３】
2019518792.tif 000166
【図５３】
2019518792.tif 000167
【国際調査報告】
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2019518792.tif 000169