(57)【要約】  本発明は、癌の処置において用いられるＤＮＡ修復及び核酸編集機構の調節に関する。本発明は、癌の処置において用いられるＤＮＡ修復及び機構の不活性化に関する。本発明はまた、新しい抗癌剤のスクリーニングに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための方法であって、
ａ）ｉ）癌細胞を有する対象、及びｉｉ）ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーを提供するステップと、
ｂ）前記対象を前記モディファイヤーで処置するステップとを含み、前記処置が前記対象における癌細胞の数を低減する、方法。
【請求項２】
ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物の前記モディファイヤーが、活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、損傷乗り越え合成に関与するタンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、ＤＮＡ−ｐｏｌ  η、τ又はκである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸編集遺伝子が、ＲＮＡ又はＤＮＡ編集に関与するタンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸編集酵素が、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、ＡＤＡＲＢ２−ＡＳ１、ＡＩＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ１、Ａ１ＣＦ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ４、ＡＰＯＢＥＣ３ＡＰ１又はＡＰＯＢＥＣ３Ｂ−ＡＳ１である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子の前記モディファイヤーが、失活剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ修復遺伝子がＭＭＲ遺伝子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＭＭＲ遺伝子がＭｕｔＬホモログである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭｕｔＬホモログが、ＭＬＨ１、ＭｕｔＬα、ＭｕｔＬβ、ＭｕｔＬγ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２又はＭＬＨ３である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸編集酵素が、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、ＡＤＡＲＢ２−ＡＳ１、ＡＩＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ１、Ａ１ＣＦ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ４、ＡＰＯＢＥＣ３ＡＰ１又はＡＰＯＢＥＣ３Ｂ−ＡＳ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記モディファイヤーが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド又は小分子化合物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
失活剤が、ゲノム編集を介して不活性化を提供する分子である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌がＭＭＲ＋ｖｅ癌である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ修復酵素の前記モディファイヤーが、異なる癌処置と組み合わせて提供される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の癌の処置方法。
【請求項１６】
前記異なる癌処置が、ＭＭＲ遺伝子を不活性化する処置である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記異なる癌処置が、テモゾロミド又はＭＮＵ又はそれらの誘導体による処置である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記異なる癌処置が免疫療法である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤、又は免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤＬ−１抗体又はそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ミスマッチ修復遺伝子の前記失活剤／阻害剤が、テモゾロミド、ＭＮＵ又はそれらの誘導体である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の処置方法。
【請求項２２】
抗癌化合物のスクリーニングのための方法であって、
ａ）ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子を発現している細胞を提供するステップと、
ｂ）前記細胞を試験化合物の存在下でインキュベートするステップと、
ｃ）試験化合物の存在下でのＤＮＡ又はＲＮＡ突然変異率を測定するステップとを含み、
ｄ）試験化合物の非存在下での細胞において測定されたものと比較した、試験化合物の存在下での細胞におけるＤＮＡ又はＲＮＡ突然変異率の増大は、試験化合物が抗癌化合物であることを示す、方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ修復遺伝子を発現している細胞がヒト腫瘍細胞株である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ修復遺伝子が、ＭＬＨ１、ＭｕｔＬα、ＭｕｔＬβ、ＭｕｔＬγ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２又はＭＬＨ３である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸編集酵素が、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、ＡＤＡＲＢ２−ＡＳ１、ＡＩＣＤＡ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ１、Ａ１ＣＦ、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ４、ＡＰＯＢＥＣ３ＡＰ１又はＡＰＯＢＥＣ３Ｂ−ＡＳ１である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
免疫療法による処置に好適な腫瘍を有する患者の特定方法であって、
ａ）前記腫瘍のサンプルを取得するステップと、
ｂ）前記サンプルを分析して、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子の配列を決定するステップと、
ｃ）腫瘍サンプルにおける前記ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子の前記配列を、非腫瘍サンプルにおける配列と比較するステップとを含み、
非腫瘍サンプルにおける前記遺伝子の前記配列と比較した、前記腫瘍サンプルにおける前記ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子の前記配列における欠損は、前記患者が免疫療法による処置に好適な腫瘍を有することを示す、方法。
【請求項２７】
ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーのスクリーニングのための方法であって、
ａ）レポーターコード配列がフレームの外側にあるように、前記レポーターコード配列の上流にクローニングされた単純なヌクレオチド配列を含むコンストラクトを提供するステップと、
ｂ）ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子を含むコンストラクトと組み合わせた、ａ）の前記コンストラクトで細胞をトランスフェクトするステップと、
ｃ）前記細胞を試験化合物の存在下でインキュベートするステップと、
ｄ）前記レポーターコンストラクトからのシグナルを測定するステップとを含み、
ｅ）前記試験化合物の非存在下での前記シグナルと比較した、前記試験化合物の存在下での前記レポーターコンストラクトからのシグナルの増大は、前記試験化合物が前記ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーであることを示す、方法。
【請求項２８】
前記単純なヌクレオチド配列が、ＣＡジヌクレオチド反復配列、好ましくはＣＡ（２０）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｂ）の前記ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子が、ＭＬＨ１である、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲコンストラクトを含む、ＭＬＨ−１の失活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の処置において用いられるＤＮＡ修復及び核酸編集機構の調節に関する。本発明は、癌の処置において用いられるＤＮＡ修復及び機構の不活性化に関する。本発明はまた、新しい抗癌剤のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
既に利用できる様々な癌処置が存在するにも関わらず、癌処置の成功率が向上した、新しい抗癌剤の新しい標的及び機構を特定する必要性が依然として存在している。
【０００３】
加えて、転移性癌が抗癌標的薬で攻撃された場合、薬物に非感受性の細胞のサブセットがほとんど常に出現する。その結果、ほとんどの場合、標的療法は、患者に一過性にのみ有効である。従って、耐性を防止又は克服する戦略は、次世代の臨床試験を設計する上で必須である。標的薬による処置後のほぼ確実な疾病再発を克服することは、依然として、癌処置の主要課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、新たに診断された癌患者を処置する第一選択のための新しい抗癌標的薬に加えて、薬物耐性の出現を制限し、長期間有効な治療反応をもたらす、新たな標的及び機構を特定する必要性が尚存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、マウスモデル腫瘍細胞株におけるＤＮＡ修復遺伝子（本明細書でＭＭＲ遺伝子ＭＬＨ１により例示される）の不活性化により、これらの細胞株が免疫コンピテント同系マウスに注入された際、細胞株の腫瘍の形成が不可能となることを見出した。任意の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、宿主ＣＤ−８  Ｔ細胞が同時に抑制された際、腫瘍形成能が回復されることを確証し、これは、腫瘍成長抑制における宿主免疫系に関する役割を示す。本発明者らは、ＭＭＲ遺伝子により例示される不活性化ＤＮＡ修復遺伝子を有する細胞において、ＤＮＡ突然変異（及び、従って、対応するネオ抗原）プロファイルが経時的に動的に発達することを見出した。このことは、宿主免疫系の進行性の及び反復する関与をもたらすであろう。このことは、第一選択腫瘍療法の新規な戦略をもたらす。加えて、現行の抗癌剤に対する耐性の発生の可能性は、従って、Ｔ細胞の新たなプールが関与する新たな抗原の動的出現により均衡される。
【０００６】
ＤＮＡ修復遺伝子により例示されるが、本発明は、その不活性化又は調節が、突然変異率又は荷重の増大、例えば動的突然変異荷重の増大をもたらす、又はネオ抗原形成の増大をもたらす、任意の遺伝子又はタンパク質産物にも関する。例えば、いくつかの核酸編集酵素の機能は、免疫系に提示される抗原の量及び種類に影響し、これらの酵素の調節により、宿主免疫系が腫瘍に対する抗応答を仲介する傾向が有利に増大し得る。
【０００７】
従って、第一の態様において、癌を処置するための方法が提供され、この方法は、
ａ）ｉ）癌細胞を有する対象、及びｉｉ）遺伝子又はそのタンパク質産物のモディファイヤーを提供するステップであって、前記遺伝子は、その調節が、Ｔ細胞による腫瘍組織の抗原ベースの認識の治療的に有利な増大をもたらすものである、提供するステップと、
ｂ）前記対象を前記モディファイヤーで処置するステップと
を含み、前記処置が前記対象における癌細胞の数を低減する。
【０００８】
好適には、上記の（ａ）部で定義された遺伝子は、例えば核酸編集、修復又は改変等の酵素機構に関与する任意の遺伝子（又はそのタンパク質産物）であり得る。好適な編集酵素としては、ＲＮＡ編集に関与するＡＤＡＲファミリー酵素、及びＤＮＡを編集するＡＰＯＢＥＣ又はＡＩＣＤＡファミリー酵素が挙げられる。
【０００９】
従って、別の態様では、癌を処置するための方法が提供され、この方法は、
ａ）ｉ）癌細胞を有する対象、及びｉｉ）ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物のモディファイヤーを提供するステップと、
ｂ）前記対象を前記モディファイヤーで処置するこステップと
を含み、前記処置が前記対象における癌細胞の数を低減する。
【００１０】
別の態様では、癌を処置するための方法が提供され、この方法は、
ａ）ｉ）癌細胞を有する対象、及びｉｉ）ＤＮＡ修復遺伝子又はそのタンパク質産物のモディファイヤーを提供するステップと、
ｂ）前記対象を前記モディファイヤーで処置するステップと
を含み、前記処置が前記対象における癌細胞の数を低減する。
【００１１】
好適には、対象における癌細胞の数の低減は、腫瘍質量又はサイズの低減を検出することによって決定され得る。癌細胞の数の低減はまた、癌療法の成功、例えば腫瘍再燃若しくは再発の非存在、又は、前記処置の非存在下での同様の個人に観察される平均生存率と比較した、生存率の増大を示す、任意の臨床エンドポイントにより決定され得る。
【００１２】
一実施形態において、癌細胞を有する対象は、ＤＮＡ修復又は核酸編集プロフィシェント腫瘍、即ちＤＮＡ修復又は核酸編集の欠陥が既に特定されている腫瘍ではない腫瘍を有する対象である。腫瘍サンプルにおけるＤＮＡ修復又は核酸編集の欠陥を特定する方法は、当業者に周知であろう。従って、特定の実施形態において、癌細胞を有する対象は、例えば、ＭＬＨ−１欠損を有さない腫瘍を有する対象である。
【００１３】
一実施形態において、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーは、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物の活性化因子である。この実施形態では、ＤＮＡ修復遺伝子は、例えば、ＤＮＡ  ｐｏｌ  η、τ及びκ等の損傷乗り越え合成に関与するものを含むＤＮＡポリメラーゼから選択され得る。核酸編集遺伝子は、突然変異体遺伝子産物の存在又は発現の増大をもたらすやり方でＤＮＡ又はＲＮＡを編集し又は変化させる酵素から選択され得る。そのような核酸編集遺伝子は、ＲＮＡ編集酵素であり得る。本明細書で好適な遺伝子としては、例えば、ＡＤＡＲ（アデノシンデアミナーゼ、ＲＮＡ特異的）酵素及びＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＩＣＤＡ等のＡＰＯＢＥＣ酵素が挙げられる。
【００１４】
別の実施形態では、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物のモジュレーターは、遺伝子又はそのタンパク質産物の失活剤である。
【００１５】
ＤＮＡ修復遺伝子の例は、本明細書に提供されている。一実施形態において、ＤＮＡ修復遺伝子は、例えば、ＭｕｔＬホモログ等のＭＭＲ遺伝子である。好適なＭｕｔＬホモログとしては、例えば、ＭＬＨ１、ＭｕｔＬα、ＭｕｔＬβ、ＭｕｔＬγ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２又はＭＬＨ３が挙げられる。一実施形態において、ＤＮＡ修復遺伝子は、ＭＬＨ１である。別の実施形態では、ＤＮＡ修復遺伝子は、例えば、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＤ若しくはＰＯＬＱ等のプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ、又はＢＲＣＡ１若しくはＢＲＣＡ２等の相同組換え酵素であり得る。
【００１６】
核酸編集遺伝子の例は、本明細書に提供されている。
【００１７】
好適には、本発明の任意の態様又は実施形態における使用のための「モディファイヤー」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド又は小分子化合物である。
【００１８】
本発明の任意の態様の一実施形態において、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子のモディファイヤーは、その遺伝暗号を変更することにより、遺伝子の発現を改変するレベルでの遺伝子の変更を介して調節を提供する分子であり得る。遺伝子発現を改変する好適な方法は、当業者に既知であり、ゲノム編集方法の使用を含む。例えば、遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集アプローチを使用してノックアウト又は調節され得る。ゲノム編集のための好適な方法は、本明細書に記載されている。一実施形態において、本明細書に記載される、特定のゲノム編集コンストラクトは、本発明による方法に使用され得る。特定の遺伝子からの遺伝子発現をノックアウト又改変するための他の方法には、干渉ＲＮＡアプローチが挙げられる。
【００１９】
本発明の任意の態様の一実施形態において、ＤＮＡ修復遺伝子の失活剤は、遺伝子の発現のサイレンシング又はノックアウトのレベルでの遺伝子の不活性化を介して不活性化を提供する分子であり得る。遺伝子発現をノックアウトするための好適な方法は、当業者に既知であり、ゲノム編集方法の使用を含む。例えば、遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集アプローチを使用してノックアウトされ得る。ゲノム編集のための好適な方法は、本明細書に記載されている。一実施形態において、本明細書に記載される、特定のゲノム編集コンストラクトは、本発明による方法に使用され得る。特定の遺伝子からの遺伝子発現をノックアウト又は低減する他の方法には、干渉ＲＮＡアプローチが挙げられる。
【００２０】
一実施形態において、本発明により処置される癌は、ＭＭＲ＋ｖｅ癌である。
【００２１】
一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物のモディファイヤーが、他の異なる又は第二の癌処置との組み合わせにおいて、処置の一部として提供される、癌を処置するための方法を提供する。従って、癌の処置を必要とする対象における癌の処置方法が提供され、この方法は、前記対象に治療的有効量のａ）ＤＮＡ修復遺伝子若しくはそのタンパク質産物のモディファイヤー、及びｂ）異なる（即ち、更なる又は第二の）癌処置を投与することを含む。異なる／他の（即ち、更なる／第二の）癌処置は、別々に、同時に、又は連続して提供され得る。好適には、異なる癌処置は、例えばＭＭＲ遺伝子を不活性化することにより、他のＤＮＡ修復機構を不活性化するものである。ＭＭＲ遺伝子を不活性化する化合物は、当業者に周知であり、例えば、テモゾロミド（ＴＭＺ）又はＭＮＵ又はそれらの誘導体が挙げられる。テモゾロミド及び他の同様の化合物の場合、これらがＤＮＡ修復を直接不活性化するのではなく、ＴＭＺ暴露に対する獲得耐性が、ＤＮＡ修復の不活性化をもたらすことが認識され得る。
【００２２】
別の実施形態では、異なる癌処置は、免疫療法、即ち癌の処置に免疫系を使用する療法であり得る。様々な免疫療法アプローチが当業者に既知であろう。特に、免疫チェックポイントとして作用する、即ち免疫系機能に影響を与える化合物（例えばペプチド、抗体、小分子等）を、本発明による処置方法と組み合わせて使用することができる。例えば、免疫チェックポイント療法は、阻害チェックポイントを遮断して、免疫系機能を回復させ得る。免疫チェックポイントとして作用する化合物の好適な標的としては、例えば、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤＣＤ１、ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても既知）及びそのリガンド、ＰＤ−１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞活性に重要な調節的役割を果たし、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１の癌媒介上方調節が、阻害されない場合に癌細胞を攻撃するＴ細胞を阻害することが観察されている。ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１のいずれかに結合して、この阻害作用を遮断することにより、Ｔ細胞による腫瘍の攻撃を可能にする治療抗体が開発されている。従って、本発明による処置方法と組み合わせて使用されるのに好適な化合物としては、抗ＰＤ１抗体（例えばニボルマブ、ペンブロリズマブ）及び抗ＰＤＬ−１抗体等の、ＰＤ−１経路を阻害する治療抗体が挙げられる。他の抗体としては、ＣＴＬＡ−４を標的とするもの、例えば抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。同様の免疫チェックポイント標的に対する他の免疫チェックポイント療法が開発され得る。一実施形態において、ＤＮＡ修復のモディファイヤーとの組み合わせにおける使用のための免疫療法は、免疫系を標的とする分子の組み合わせ、例えば抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤＬ−１等と組み合わせた抗ＰＤ１であり得る。
【００２３】
本発明の一実施形態において、ミスマッチ修復遺伝子の失活剤は、テモゾロミド、ＭＮＵ又はそれらの誘導体である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、抗癌化合物のスクリーニングのための方法を提供し、この方法は
ａ）ＤＮＡ修復遺伝子を発現している細胞を提供するステップと、
ｂ）前記細胞を試験化合物の存在下でインキュベートするステップと、
ｃ）試験化合物の存在下でのＤＮＡ突然変異率を測定するステップとを含み、
ｄ）試験化合物の非存在下での細胞において測定されたものと比較した、試験化合物の存在下での細胞におけるＤＮＡ突然変異率の増大が、試験化合物が抗癌化合物であることを示す。
【００２５】
本発明はまた、抗癌化合物のスクリーニングのための方法を提供し、この方法は
ａ）ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子を発現している細胞を提供するステップと、
ｂ）前記細胞を試験化合物の存在下でインキュベートするステップと、
ｃ）試験化合物の存在下でのＤＮＡ突然変異率を測定するステップとを含み、
ｄ）試験化合物の非存在下での細胞において測定されたものと比較した、試験化合物の存在下での細胞におけるＤＮＡ突然変異率の増大は、試験化合物が抗癌化合物であることを示す。
【００２６】
好適には、これらの態様による方法において、ステップａ）に示したＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子を発現している細胞は、コンストラクト内においてフレームの外側に配置された、単純なヌクレオチド配列の下流のレポーターコンストラクトを更に含み得る。
【００２７】
一実施形態において、突然変異率の増大は、試験化合物の非存在下での読み取り値（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）と比較した、試験化合物の存在下でのレポーターコンストラクトからの読み取り値の増大として特定される。
【００２８】
従って、別の態様では、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物のモディファイヤーのスクリーニングのための方法が提供され、この方法は：
ａ）レポーターコード配列がフレームの外側にあるように、レポーターコード配列の上流にクローニングされた単純なヌクレオチド配列を含むコンストラクトを提供するステップと、
ｂ）ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子を含むコンストラクトと組み合わせたａ）のコンストラクトを細胞にトランスフェクトするステップと、
ｃ）前記細胞を試験化合物の存在下でインキュベートするステップと、
ｄ）レポーターコンストラクトからのシグナルを測定するステップとを含み、
ｅ）試験化合物の非存在下でのシグナルと比較した、試験化合物の存在下でのレポーターコンストラクトからのシグナルの増大は、試験化合物が前記ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーであることを示す。
【００２９】
好適には、「単純なヌクレオチド配列」は、複製エラーに関する部位として知られる、例えば、ＤＮＡ複製中にミスマッチを蓄積することが既知のものである任意のゲノム反復配列であり得る。好適なゲノム反復配列としては、マイクロサテライト領域として特定される配列、例えばマイクロサテライト反復配列又は複製修復欠損に関連した若しくは複製修復欠損を示す配列が挙げられる。好適なそのような配列としては、ポリＡ配列、例えばＡ（１７）が挙げられる。別の実施形態では、ＣＡ又はＧＴ、特にＣＡ（ｎ）（ｎは、任意の数であり得る）等のジヌクレオチド反復配列が使用され得る。一実施形態において、ジヌクレオチド反復配列は、ＣＡ（ｎ）反復「繰り返し」配列とも称されるＣＡ（１４）又はＣＡ（２０）である。トリヌクレオチド反復配列等の他の反復配列も予想される。
【００３０】
好適には、レポーターコード配列は、レポーター部分をコードする核酸配列である。好適なレポーター部分は、当業者に周知であり、選択マーカーを含む。レポーター部分の例としては、β−ガラクトシダーゼ、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）等が挙げられる。有利には、レポーター部分は、発現されているフレーム内レポーター部分の数における僅かな変化が、ポジティブシグナルをもたらすように、広い及び線形動的範囲を有し、かくして高感度アッセイを可能にする部分である。好適な選択マーカーは、当業者に周知であり、抗生物質耐性遺伝子及び薬物選択マーカーを含み、そのような遺伝子は、例えば、ピューロマイシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ゼオシン又はネオマイシン等の抗生物質に対する耐性をコードする。有利には、選択マーカーの使用により、生存シグナルを検出することができ、即ち、試験化合物がＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーとして作用する細胞のみが、抗生物質の存在下で成長した際に生存する。
【００３１】
好適には、本発明によるスクリーニング方法における使用のための細胞は、哺乳動物細胞株である。好適な哺乳動物細胞株としては、ＨＥＫ２９３Ａ等のＨＥＫ２９３細胞、ＦＴ又はＴ細胞が挙げられるが、他の細胞株も予想される。
【００３２】
本発明によるスクリーニング方法における使用のための好適なＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子は、本明細書に記載され、例えば、複製後ＤＮＡ修復に関与するＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子、例えば、例えばＭＬＨ−１を含むＭＭＲ酵素をコードする遺伝子を含む。
【００３３】
これらの態様において、試験化合物は候補抗癌化合物であり得、それは、この化合物が、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子の発現を低減若しくは改変し、又はＤＮＡ修復遺伝子のタンパク質産物の阻害剤若しくはモディファイヤーとして作用して、ＤＮＡ修復活性を阻害若しくは変更し、又はさもなければ細胞突然変異負荷の増大を動的に生成するのに有効であるためである。好適なスクリーニング方法の例は、実施例セクションでのＤＮＡ突然変異率を測定する好適な方法の例と共に、本明細書に記載される。ＤＮＡ突然変異は、ＤＮＡの突然変異数／メガベース（Ｍｂ）として測定され得る。例えば、ＤＮＡミスマッチ修復又は核酸編集酵素の機能的不活性化は、反復ＤＮＡ要素又はｃＤＮＡの配列決定によって決定され得る。未処理細胞と比較した、試験化合物で処理された細胞のエクソーム配列決定は、突然変異荷重を測定するのに使用され得る。例えば、異なる時点で長期間に収集された細胞からのエクソーム配列決定を行うことができる。重要なことには、ＤＮＡ突然変異又はｃＤＮＡエピ突然変異の率の増大は、突然変異及び抗原の数の増大をもたらすだけでなく、ＤＮＡ修復不活性化若しくは改変又は核酸編集改変の結果として、経時的に新たな突然変異を獲得する。これは動的高頻度突然変異状態をもたらす。従って、突然変異（及び、従って、対応するネオ抗原）プロファイルは、ゲノム景観がネオ抗原の連続出現を伴って急速かつ動的に発達するように、好ましくは動的に発達する。
【００３４】
一実施形態において、高い突然変異荷重は、処理された細胞にて観察される場合があり、従って試験化合物が候補抗癌剤であることを示す。好適には、高い突然変異荷重は、増大したＤＮＡ突然変異率が、ＤＮＡの１０〜１００突然変異／メガベースの領域内にある突然変異率として表され得る。別の実施形態では、突然変異負荷の増大は、ＤＮＡの１００突然変異／メガベースを超える領域内にあり得る。
【００３５】
突然変異率を決定するための方法は、例えば図４Ａを参照して記載されている。ＲＮＡｓｅｑ解析を用いて、転写され、従ってネオ抗原として作用し得る突然変異型遺伝子の割合を特定することもできる。マイクロサテライト不安定性アッセイも使用することができる。
【００３６】
本発明によるスクリーニング方法の一実施形態では、ＤＮＡ修復遺伝子を発現している細胞は、ヒト腫瘍細胞株、例えば結腸直腸、乳癌細胞であり得る。
【００３７】
好適には、ＤＮＡ修復遺伝子は、ＭＬＨ１である。この実施形態では、例えば候補抗癌化合物による処置の結果としての遺伝子発現又はタンパク質活性の阻害を介して、ＭＬＨ１発現又はＭＬＨ１活性を喪失した細胞は、図５Ａに示すように、阻害剤に対して非感受性である。従って、ＭＭＲ欠損細胞は、例えば表２に列挙したもの等の多数の抗癌剤の影響を受けず又はこれらの抗癌剤に対してより耐性である。
【００３８】
一実施形態において、ＤＮＡ突然変異率は、増大した動的突然変異荷重率である。好適には、そのような増大した率は、ネオ抗原の発現に転換される。
【００３９】
別の態様では、免疫療法による処置に好適な腫瘍を有する患者の特定方法が提供され、この方法は：
ａ）前記腫瘍のサンプルを取得するステップと、
ｂ）前記サンプルを分析して、ＤＮＡ修復遺伝子の配列を決定するステップと、
ｃ）腫瘍サンプルにおける前記ＤＮＡ修復遺伝子の配列を、非腫瘍サンプルにおける配列と比較するステップとを含み、
非腫瘍サンプルにおける前記遺伝子の配列と比較した、腫瘍サンプルにおける前記ＤＮＡ修復遺伝子の配列における欠損は、前記患者が免疫療法による処置に好適な腫瘍を有することを示す。
【００４０】
一実施形態において、ＤＮＡ修復遺伝子における突然変異が検出される。そのような「突然変異」は、ＤＮＡ修復遺伝子を不活性にするＤＮＡ修復遺伝子の全欠失若しくは部分欠失、又は点突然変異であり得る。
【００４１】
別の態様では、免疫療法による処置に好適な腫瘍を有する患者の特定方法は、高い突然変異率を測定することにより、機能不全ＤＮＡ修復を検出することを含む。特に、患者のサンプルから、突然変異状態の動的変化が存在するか否かに関して決定することができる方法が提供される。
【００４２】
更なる態様において、本発明は、個人における癌の処置方法を提供し、この方法は、高い突然変異率の測定値に基づいて個人における癌サブタイプを診断するステップと、免疫療法組成物を用いて個人を処置するステップとを含む。
【００４３】
別の態様では、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子の失活剤が提供され、前記失活剤は、前記ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子の発現を妨げるコンストラクトを含む。好適な失活剤は、本明細書に記載されるＭＬＨ−１の失活剤であるＣＲＩＳＰＲコンストラクト等のＣＲＩＳＰＲコンストラクトを含む。更なる好適な失活剤としては、ｓｉＲＮＡｓ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするベクターが挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
癌遺伝子は、一般に、２つの主なグループに分類される：癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子。大部分の癌遺伝子は、シグナル伝達経路の主要ノードを制御し、それらのタンパク質対応物を恒常的に活性化して細胞増殖の増大をもたらす点突然変異によって変更されている。１腫瘍抑制遺伝子は、一般に、欠失又は機能喪失突然変異等のそれらの機能を不活性化する分子変化を有する。２多数の腫瘍抑制遺伝子が、細胞分割の間に生じるＤＮＡ複製エラーを修正することに関与している。４ＤＮＡ修復遺伝子における変化は、細胞増殖を直接促進しないが、突然変異率を増大させ、それにより癌発達を加速することによって腫瘍形成を刺激すると考えられている。５ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）を制御する遺伝子における生殖系列突然変異は、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）等の癌症候群に関与している。ＨＮＰＣＣに罹患した個人は、若年齢で腫瘍を発生し、結腸直腸、子宮内膜、尿路、卵巣及び膵臓腫瘍の生涯リスクが高い。６ＭＭＲ遺伝子はまた、体細胞性突然変異型の場合、腫瘍進行を促進する。３、６、７およそ２０％の孤発性結腸直腸癌、２９％の卵巣及び２８％の子宮内膜癌が、ＭＭＲ遺伝子における体細胞変化を保有する。８、９
【００４５】
ヒト細胞では、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６及びＰＭＳ２を含むタンパク質複合体によって複製後ＤＮＡミスマッチ修復が行われる。１０ＭＭＲ機構に欠陥がある場合、細胞は、増大した速度で突然変異を蓄積し、特徴的なマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す。ＭＭＲ欠損結腸直腸腫瘍は、早発性及び急速な進行を含むが好ましい予後を有するという独特の臨床的特徴を有する。１１これらの明らかに矛盾する臨床的特徴の分子的基盤は、以前ほとんど理解されていなかった。
【００４６】
癌患者では、標的化化学療法薬に対する応答は、多くの場合、著しいが短命であり、患者の大部分が数週間又は数カ月で再燃し、これは化学療法薬に対する部分耐性により特徴付けることができる。標的化薬剤を用いた化学療法とは対照的に、免疫療法の最も注目すべき特徴は、多くの場合数年間続く応答の長さである。従って、免疫療法は、疾病再発及び罹患の可能性を低減し、一次疾病診断の時点での大規模手術を動機付ける。従って、患者の免疫系を動員して腫瘍細胞を攻撃する抗癌療法の戦略は、標的化化学療法薬の改善である。しかしながら、腫瘍細胞が免疫調節薬に対する耐性を生じ得ることは依然として可能である。このことは、患者の免疫応答に継続的に再関与して腫瘍細胞を攻撃する、新たなＴ細胞プールにより関与される新たな腫瘍抗原の継続的な出現を促進する戦略によって回避することができる。
【００４７】
従って、免疫監視の中心となる動的高頻度突然変異状態をもたらすＤＮＡ修復若しくは核酸編集機構の不活性化若しくは調節、又は免疫監視に感受性の突然変異誘発物表現型の誘導は、抗癌療法の新規な戦略である。
【００４８】
モディファイヤー
用語モディファイヤーは、化合物の非存在下の活性と比較して、化合物の存在下でＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物の活性を変化させる試験化合物を指す。好適には「モディファイヤー」は、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物の活性化因子又は失活剤であり得る。例えば活性化因子は、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はそのタンパク質産物の活性を向上させるものであり得るが、失活剤は、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子によりコードされるタンパク質の酵素活性の阻害により、又は修復が行われ得ないように共有結合性の酵素−ＤＮＡ複合体を安定化させることにより、ＤＮＡ修復又は核酸編集活性を低減するものであり得る。
【００４９】
上記に定義したモディファイヤーは、遺伝子、ＲＮＡ又はタンパク質レベルに作用することにより、構成成分を改変するように働く化合物である。特に、本明細書に記載されるＤＮＡ修復又は核酸編集「遺伝子」等の腫瘍抑制「遺伝子」に対する参照は、遺伝子自体、及び、この遺伝子によりコードされるタンパク質（即ち、そのタンパク質産物）に対する参照である。
【００５０】
化合物がＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子／タンパク質のモディファイヤーであるか否かを決定する方法としては、関心対象の特定のＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子に対する結合を検出する方法、特定のＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子／タンパク質に関する当業者に周知の機能的アッセイ、及び、突然変異の増大を測定することによる、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子／タンパク質の欠損を検出する方法が挙げられる。突然変異の増大を測定する好適な方法は、本明細書に記載されており、経時的なマイクロサテライトシフトを測定する方法を含む。
【００５１】
本発明の別の態様又は実施形態では、治療法における使用のためのＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子のモディファイヤーが提供される。別の態様又は実施形態では、本発明は、癌の処置における使用のためのモディファイヤーを提供する。別の態様又は実施形態では、本発明は、癌の処置における使用のための医薬の製造におけるＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子のモディファイヤーの使用を提供する。いくつかの実施形態では、モディファイヤーは、併用療法に使用され得る。
【００５２】
ＤＮＡ修復機構
本発明の任意の態様の一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ修復に関与するもの等の腫瘍抑制遺伝子の改変を提供する。好適には、本発明は、その不活性化が突然変異率又は突然変異荷重の増大、例えば動的突然変異荷重の増大をもたらす任意の遺伝子に関し得る。
【００５３】
細胞内で、ＤＮＡは、突然変異をもたらし得る多数の化学的変化を受けやすく、ＤＮＡ修復機構に関与して、突然変異が蓄積されないように損傷した又は不適切な塩基を修正する遺伝子及びそのタンパク質産物のネットワークが存在する。「ＤＮＡ修復遺伝子」は、ＤＮＡ修復機構に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。本明細書で使用するとき、用語ＤＮＡ修復遺伝子は、遺伝子と、この遺伝子がコードするタンパク質を指す。
【００５４】
ＤＮＡ修復機構は、１）損傷の直接的な化学的取り消し、及び２）切除修復を含む。切除修復では、損傷塩基が除去された後、ＤＮＡ合成の局在化範囲内で置換／修正される。切除修復は、塩基切除修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）及びミスマッチ修復（ＭＭＲ）を含み、それらの各々は、特定の酵素セットを使用する。
【００５５】
非常に多数の遺伝子が、ＤＮＡ修復機構に関与するとして報告されている。それらは機能に従って、例えば、ＸＲＣＣ４、ＬＩＧ４、ＤＮＡ−ＰＫを含む非相同末端結合（ＮＨＥＪ）遺伝子；ＭＲＥＩＩ、ＸＲＣＣ１、ＬＩＧ３を含むマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）遺伝子；ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＲＡＤ５１、ＬＩＧ１を含む相同組換え（ＨＲ）遺伝子；ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＰＭＳ２を含むミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子；ウラシルＤＮＡ−グリコシラーゼ、ＡＰ−エンドヌクレアーゼを含む塩基切除修復（ＢＥＲ）遺伝子；ＸＰＣ、ＸＰＤ、ＸＰＡを含むヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）遺伝子；ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣを含むＤＮＡ架橋修復遺伝子；ＡＴＭ、ＡＴＲ及びｐ５３を含むＤＮＡ−修復チェックポイント遺伝子に広く分類することができる。
【００５６】
他の遺伝子には、ＤＮＡポリメラーゼをコードするものが挙げられる。ＤＮＡ修復に関与し得る２つのクラスのポリメラーゼが存在し、それらは１）エラーを読み過ごし、それらを残留させるもの、及び２）プルーフリードするものである。
【００５７】
プルーフリードするものには、ＤＮＡ−ｐｏｌ  η、τ及びκを含む、損傷乗り越え合成に関与するポリメラーゼがある。ＤＮＡ修復遺伝子が損傷乗り越え合成に関与するポリメラーゼである本発明の実施形態では、そのＤＮＡ修復遺伝子及び／又はそれらがコードするタンパク質の活性化因子が提供される。
【００５８】
例えばＰＯＬＥ、ＰＯＬＤ及びＰＯＬＱを含むプルーフリードするポリメラーゼの場合、本発明は、これらの遺伝子及び／又はそれらがコードするタンパク質の失活剤を提供する。
【００５９】
ＤＮＡ修復機構に関与し得る遺伝子を、以下の表１に列挙する：
【００６０】
【表１】
2019515951.tif 000002
【００６１】
【表２】
2019515951.tif 000003
【００６２】
本発明の一実施形態において、ＤＮＡ修復遺伝子は、ＭＭＲ遺伝子、即ちそのタンパク質産物がミスマッチ修復（ＭＭＲ）に関与する遺伝子である。好適な遺伝子としては、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２及びＰＭＳ２が挙げられる。
【００６３】
一実施形態において、ＤＮＡ修復遺伝子は、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＡＴＲ、ＲＡＤ５０、ＰＯＬＥ、ＰＯＬＤ、ＦＡＮＣＭ、ＡＴＭ、ＰＲＫＤＣ、ＰＯＬＱ又はＤＮＭＴ１であり得る。
【００６４】
好適には、ＤＮＡ修復遺伝子／タンパク質を改変してそれらを不活性化することは、経時的に動的に発達するＤＮＡ突然変異（及び、従って、対応するネオ抗原）プロファイルをもたらす。一実施形態において、改変は、ネオ抗原（腫瘍抗原）の生成をもたらす。一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ修復遺伝子／タンパク質の不活性化によって達成され得る、「動的」な突然変異荷重の増大に関する。
【００６５】
ＤＮＡ修復遺伝子の改変は、異なるレベルの数で測定することができる。一実施形態において、例えば、試験化合物がＤＮＡ修復遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する能力、及び／又は、試験化合物がその遺伝子の機能を阻害する能力を分析する機能的アッセイが行われ得る。ＤＮＡ修復に関与する特定のタイプのタンパク質に関する好適なアッセイは、当業者に周知であろう。例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、相同組換え（ＨＲ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、塩基切除修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド切除修復（ＮＥＲ）、ＤＮＡ架橋修復、ＤＮＡ−修復チェックポイント及びＤＮＡポリメラーゼに関するアッセイが利用可能である。
【００６６】
別の実施形態では、ＤＮＡ修復遺伝子の改変は、ＤＮＡ突然変異を測定することにより、特に突然変異率を測定することにより決定され得る。突然変異又は突然変異率の蓄積を決定する好適な方法は、本明細書に記載されている。一実施形態において、突然変異率の増大は、ネオ抗原の数を測定することにより決定され得る。
【００６７】
好適には、本発明による処置において、ＤＮＡ修復遺伝子又はタンパク質のモディファイヤーが治療的有効量で提供される。用語「治療的有効量」は、処置されている疾患の疾病の１つ以上の症状をある程度緩和するであろう、投与される化合物の量を指す。一実施形態において、処置は、比較的長期間、例えば数カ月間に亘る場合がある。
【００６８】
本明細書において、用語「処置すること」は、疾病若しくは疾患の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅延させる若しくは逆行させること、疾病若しくは疾患の臨床症状を実質的に寛解させること、又は疾病若しくは疾患の臨床症状の出現を予防することを含む。
【００６９】
本発明による処置の一部としてのモディファイヤーの投与の前に、患者は、患者が患う又は患い得る癌が、ＤＮＡ修復遺伝子又は酵素の活性形態の存在により特徴付けられるものであるか否かを決定するためにスクリーニングされ得る。例えば、癌は、ＭＭＲ＋ｖｅ癌、即ちＭＭＲに関与する遺伝子が活性であり及び／若しくは存在し、又は腫瘍発達の一部として損失されていない癌として特定され得る。ＤＮＡ修復プロセスに関与する遺伝子、例えばＭＭＲの存在は、例えばＰＣＲ方法を含む、当業者に周知の方法を用いて検出することができる。
【００７０】
「医薬の製造」という表現は、更なる活性薬剤のためのスクリーニングプログラムでの使用、又はそのような医薬の製造の任意の段階における使用に加えて、医薬としての直接の上述した化合物を含む。
【００７１】
核酸編集機構
本発明の任意の態様の一実施形態において、本発明は、核酸編集に関与するもの等の遺伝子の改変を提供する。好適には、本発明は、その調節がＤＮＡ突然変異、又はＲＮＡのレベルでのエピ突然変異の率又は荷重の増大をもたらす任意の遺伝子に関し得る。
【００７２】
生殖系列コード遺伝子の突然変異体をコードする改変されたタンパク質産物の発現を誘導する放射線又は化学的突然変異源等の外因に加えて、コードするタンパク質補体を可逆的又は不可逆的に変更する多様な内因性機構が存在する。核酸編集の内因性プロセスでは、特定のヌクレオチド塩基が酵素活性後に変換を受けて、塩基を交代させる。核酸編集機構に関与し得る遺伝子を、以下の表２に列挙する。
【００７３】
【表３】
2019515951.tif 000004
【００７４】
本発明の一実施形態において、核酸編集遺伝子は、活性化誘導シチジンデアミナーゼ遺伝子（ＡＩＤ又はＡＩＣＤＡ）であり、これは免疫系の体細胞により用いられて、Ｉｇｇ体細胞高頻度突然変異及びクラススイッチ組換えを誘導することによりコーディング組成物及び免疫グロブリン遺伝子の多様性を不可逆的に改変する。内因性ＡＩＣＤＡ遺伝子及びそのホモログが、健康な体細胞の遺伝的多様性の拡大に用いられる一方、この遺伝子の活性はまた、新規な抗原を提示するように思われるものを含む、Ｂ細胞悪性腫瘍に発癌性体細胞突然変異を導入し得る。
【００７５】
様々な更なる核酸編集酵素が、天然及び発癌性ＤＮＡ変化の両方に影響を与えるように思われる。本発明の別の実施形態では、核酸編集遺伝子は、アポリポタンパク質−Ｂ編集シチジンデアミナーゼ（ＡＰＯＢＥＣ）遺伝子ファミリーのメンバーであり；これらの遺伝子は、正常な細胞により用いられて、メッセンジャーＲＮＡｓのシチジン塩基をウラシルに編集及び変換し、これは天然遺伝子の新規な転写後アイソフォームを誘導する。加えて、ＡＰＯＢＥＣファミリーの酵素活性は、ヒトウイルス及び内因性レトロウイルスの両方の活性をサイレンシング及び制限する先祖伝来の役割を果たすと思われる。ＡＩＣＤＡ遺伝子と同様、ＡＰＯＢＥＣ酵素活性は、発癌性ＤＮＡ突然変異に同様に影響するように思われ：ヒト癌の主要なサブセットは、上昇した及び疑似ＡＰＯＢＥＣ活性と一致する突然変異パターンを示す。ここで、ＡＰＯＢＥＣ酵素は、ＤＮＡ複製及びＤＮＡ損傷の間に断続的に存在する一本鎖ＤＮＡ末端の塩基を改変する可能性がある。従って、様々なヒト癌及びヒト癌抗原は、過剰なＡＰＯＢＥＣ酵素活性により生じる可能性がある。
【００７６】
本発明の別の実施形態では、核酸編集酵素は、ＲＮＡ−編集アデノシンデアミナーゼ酵素ファミリー（ＡＤＡＲｓ）遺伝子の１つであり、これもタンパク質発現における正常及び発癌性転写後変化の両方に役割を果たすように思われる。ここで再び、ｄｓＲＮＡウイルス応答におけるＡＤＡＲ遺伝子の天然機能は、内因性ｍＲＮＡｓのコーディングポテンシャルを変化させる、酵素活性がアデノシンからイノシンへの塩基変更を導入するいくつかの場合において、破壊されているように思われる。変化したＡＤＡＲ酵素活性及びその結果としてのｍＲＮＡ内容物の、その生殖系列ＤＮＡコーディング配置を超える変化が、癌細胞様肝細胞癌腫、及び自己免疫性疾患の両方において観察することができる。
【００７７】
核酸を編集し得る他の分子としては、スプライシング因子が挙げられる。ｔＲＮＡ改変のためのＡＤＡＴｓも予想され得る。
【００７８】
好適には、核酸編集機構の改変は、経時的に動的に発達するＤＮＡ突然変異又はＲＮＡエピ突然変異プロファイルをもたらし、従ってそれに対応してネオ抗原の発現及び免疫系への提示の改変をもたらすであろう。一実施形態において、改変は、ネオ抗原（腫瘍抗原）の生成をもたらす。一実施形態において、本発明は、ＤＮＡ修復遺伝子／タンパク質の不活性化により達成され得る「動的」な突然変異荷重の増大に関する。
【００７９】
別の実施形態では、核酸編集遺伝子の改変は、ＤＮＡ又はＲＮＡ突然変異を測定することにより、特に突然変異率を測定することにより決定することができる。そのような突然変異には、点突然変異、フレームシフト突然変異、及び相同組換えの結果としての突然変異が挙げられ得る。突然変異の蓄積又は突然変異率を決定する好適な方法は、本明細書に記載されている。一実施形態において、突然変異率の増大は、ネオ抗原の数の測定により決定することができる。
【００８０】
好適には、本発明による処置において、核酸編集遺伝子又はタンパク質のモディファイヤーは、治療的有効量で提供される。用語「治療的有効量」は、処置されている疾患の疾病の症状の１つ以上をある程度緩和するであろう、投与される化合物の量を指す。一実施形態において、処置は、比較的長期間、例えば数カ月間に亘る場合がある。
【００８１】
本明細書で、用語「処置すること」は、疾病若しくは疾患の進行を抑止する、実質的に阻害する、遅延させる若しくは逆転させること、疾病若しくは疾患の臨床症状を実質的に寛解させること、又は、疾病若しくは疾患の臨床症状の出現を実質的に予防することを含む。
【００８２】
本発明による処置の一部としてのモディファイヤーの投与の前に、患者は、患者が患う又は患い得る癌が、核酸編集遺伝子又は酵素の変化形態の存在により特徴付けられるものであるか否かを決定するためにスクリーニングされ得る。例えば、癌は、ＡＩＣＤＡ−ＡＰＯＢＥＣ依存性又は「カタエギス」ＤＮＡ高頻度突然変異を有する癌、即ち、核酸酵素ＡＩＣＤＡ又はＡＰＯＢＥＣに関与する遺伝子が、腫瘍発達の一部として変更されている癌として特定され得る。核酸編集プロセスに関与する遺伝子の存在は、例えばＰＣＲ方法を含む、当業者に周知の方法を用いて検出することができる。
【００８３】
「医薬の製造」という表現は、更なる活性薬剤のためのスクリーニングプログラムでの使用、又はそのような医薬の製造の任意の段階における使用に加えて、医薬としての直接の上述した化合物を含む。
【００８４】
試験化合物
本発明の任意の実施形態の任意の態様によるアッセイにおける使用のための試験化合物は、タンパク質又はポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド又は小分子化合物であり得る。一実施形態において、アッセイは、試験化合物のライブラリー、例えばタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド又は小分子化合物のライブラリーのスクリーニングを包含し得る。試験化合物は、ＣＲＩＳＰＲコンストラクト、ｓｉＲＮＡ分子、アンチセンス核酸分子等の核酸コンストラクトも含み得る。好適なハイスループットスクリーニング方法は、当業者に既知であろう。
【００８５】
本発明の任意の態様又は実施形態によるＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はタンパク質のモディファイヤーとして使用され得る好適な試験化合物を特定するための他の方法としては、化合物の合理的設計が挙げられる。このアプローチでは、スクリーニングのための化合物ライブラリーは、関心対象のＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子に対して構造的類似性又は相同性を有する分子に結合し及び／又は分子を阻害／不活性化し又は増強／活性化することが既知の化合物から出発することに基づき得る。
【００８６】
例えば、ＭＬＨ１の構造解析は、ＭＬＨ１が細菌酵素、ＤＮＡギラーゼと構造的類似性を共有することを示唆する。従って、合理的な薬物設計アプローチは、本発明によるスクリーニング方法で試験する化合物ライブラリーを導き出すための基礎としての、ＤＮＡギラーゼの既知の阻害剤から出発し得る。この方法の好適な出発点は、例えばＣｏｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１１）９２：４７９−４９７により記載されている。
【００８７】
組み合わせ
本発明の任意の態様の一実施形態において、ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子又はタンパク質を改変する、例えば活性化又は不活性化するように作用する化合物を使用する処置は、単独の治療法、例えば単剤療法として提供され得る。別の実施形態では、ＤＮＡ又は核酸編集修復遺伝子を改変するように作用する化合物を、他の異なる癌療法と組み合わせて使用し得る。従って、癌を有する個人は、化学療法等の初期処置を付与され、ここでＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子を改変するように作用する化合物が投与されて、処置後の急速な耐性派生時期に有効であり得る。特に、本発明は、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子のモディファイヤーと、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせを含む。
【００８８】
本明細書に記載したように、ＭＭＲ遺伝子が不活性化されるであろう、癌細胞の選択に有効であり得る化学療法薬又は天然産物、例えばＭＮＮＧ、６ＴＧ、テモゾロミド。
【００８９】
癌のタイプ
処置され得る癌（及びそれらの良性対応物）の例としては、非限定的に、上皮起源の腫瘍（腺癌、扁平上皮癌、移行細胞癌腫及び他の癌腫を含む様々なタイプの腺腫及び癌腫）、例えば膀胱及び尿路、乳房、胃腸管（食道、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））、小腸、結腸、直腸及び肛門を含む）、肝臓（肝細胞癌腫）、胆嚢及び胆道系、外分泌膵臓、腎臓、肺（例えば腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、気管支肺胞上皮癌腫及び中皮腫）、頭部及び頸部（例えば舌、頬側口腔、喉頭、咽頭、上咽頭、扁桃腺、唾液腺、鼻腔及び副鼻腔の癌）、卵巣、ファロピウス管、腹膜、腟、外陰、陰茎、子宮頸部、子宮筋、子宮内膜、甲状腺（例えば甲状腺濾胞腺癌）、副腎、前立腺、皮膚及び付属器（例えば黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、角化棘細胞腫、異形成母斑）の癌腫；血液学的悪性腫瘍及びリンパ系系列の関連する状態を含む、血液学的悪性腫瘍（即ち白血病、リンパ腫）及び前悪性血液学的疾患及び境界悪性腫瘍の疾患（例えば急性リンパ性白血病［ＡＬＬ］、慢性リンパ性白血病［ＣＬＬ］、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫［ＤＬＢＣＬ］等のＢ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫及び白血病、ナチュラルキラー［ＮＫ］細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、不確かな有意性の単クローン性γグロブリン血症、形質細胞腫、多発性骨髄腫、及び移植後リンパ増殖性疾患）、並びに骨髄性系列の血液学的悪性腫瘍及び関連する状態（例えば急性骨髄性白血病［ＡＭＬ］、慢性骨髄性白血病［ＣＭＬ］、慢性骨髄単球性白血病［ＣＭＭＬ］、過好酸性症候群、骨髄増殖性疾患、例えば真性多血症、本態性血小板血症及び原発性骨髄線維症、骨髄増殖性症候群、骨髄異形成症候群、及び前骨髄球性白血病）；間葉系起源の腫瘍、例えば軟組織、硬骨又は軟骨の肉腫、例えば骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、類上皮肉腫、胃腸間質腫瘍、良性及び悪性組織球腫、並びに隆起性皮膚線維肉腫；中枢又は末梢神経系の腫瘍（例えば星状細胞腫、グリア細胞腫及び神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、松果体腫瘍、並びにシュワン腫）；内分泌腫瘍（例えば下垂体腫瘍、副腎腫瘍、膵島細胞腫瘍、副甲状腺腫瘍、カルチノイド腫瘍、及び甲状腺の髄様癌）；眼球及び付属器腫瘍（例えば網膜芽細胞腫）；生殖細胞胞及び絨毛性腫瘍（例えばテラトーマ、セミノーマ、未分化胚細胞腫、胞状奇胎及び絨毛癌）；並びに小児科及び胚性腫瘍（例えば髄芽腫、神経芽腫、ウィルムス腫瘍、及び原始神経外胚葉性腫瘍）；又は症候群が挙げられ、これらは、患者を悪性腫瘍（例えば色素性乾皮症）に罹り安い状態のままとする先天性のもの又はそれ以外である。
【００９０】
一実施形態において、本発明により処置される腫瘍は、ＤＮＡ修復又は核酸編集遺伝子に突然変異を有する腫瘍であり得る。
【００９１】
例えば、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）は、ＭＭＲを制御する遺伝子に生殖系列突然変異を含む遺伝性癌症候群である。従って、ＨＮＰＣＣは、本発明により、又は、本発明によるスクリーニング方法を用いて特性される化合物を使用して、処置され得る１つの癌症候群である。ＤＮＡ修復遺伝子に突然変異を有する他の好適な癌は、当業者に周知であろう。
【００９２】
ＭＭＲ遺伝子に変化を有する他の癌は、例えばＸｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）及びＯｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）に記載されており、孤発性結腸直腸癌、卵巣及び子宮内膜癌を含む。
【００９３】
一態様において、本発明は、ＤＮＡ修復又は核酸編集機構に欠陥を有する患者を特定することによって、免疫療法アプローチに応答する可能性が最も高い個人を選択する方法も提供する。従って、患者は、患者が患う又は患い得る癌が、高いレベルのＤＮＡ突然変異により特徴付けられるものであり、従って免疫チェックポイント阻害剤等の免疫調節アプローチを有する化合物を用いた処置に感受性であるか否かを決定するためにスクリーニングされ得る。
【００９４】
例えば、診断試験を行うことができる。好適には、患者から採取した生体サンプルを分析して、患者が患う又は患い得る癌が、突然変異率の増大をもたらす遺伝子異常又は異常なタンパク質発現により特徴付けられるものであるか否かを決定し得る。突然変異率の増大は、例えば、本明細書に記載されるマイクロサテライト分析を使用して、経時的に突然変異数を測定することにより決定され得る。
【００９５】
診断試験は、典型的には、腫瘍生検サンプル、血液サンプル（脱落腫瘍細胞の単離及び濃縮）、便生検、痰、染色体分析、胸水及び腹水から選択される生体サンプルに対して行われる。
【００９６】
本発明の別の態様及び実施形態を、以下の条項に示す：
１．癌を処置するための方法であって：
ａ）ｉ）癌細胞を有する対象、及びｉｉ）ＤＮＡ修復若しくは核酸編集遺伝子、又はそのタンパク質産物のモディファイヤーを提供するステップと、
ｂ）前記対象を前記モディファイヤーで処置するステップとを含み、前記処置が前記対象における癌細胞の数を低減する、方法。
２．ＤＮＡ修復遺伝子又はそのタンパク質産物のモディファイヤーが、活性化因子である、条項１による方法。
３．ＤＮＡ修復遺伝子が、損傷乗り越え合成に関与するタンパク質をコードする、条項２による方法。
４．ＤＮＡ修復遺伝子が、ＤＮＡ−ｐｏｌ  η、τ又はκである、条項３による方法。
５．ＤＮＡ修復遺伝子のモディファイヤーが失活剤である、条項１による方法。
６．ＤＮＡ修復遺伝子がＭＭＲ遺伝子である、条項７による方法。
７．ＭＭＲ遺伝子がＭｕｔＬホモログである、条項８による方法。
８．ＭｕｔＬホモログが、ＭＬＨ１、ＭｕｔＬα、ＭｕｔＬβ、ＭｕｔＬγ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２又はＭＬＨ３である、条項９による方法。
９．モディファイヤーが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド又は小分子化合物である、条項１〜８のいずれかによる方法。
１０．失活剤が、ゲノム編集を介して不活性化を提供する分子である、条項１〜９のいずれかによる方法。
１１．癌がＭＭＲ＋ｖｅ癌である、条項１〜１０のいずれかによる方法。
１２．ＤＮＡ修復酵素のモディファイヤーが、異なる癌処置と組み合わせて提供される、条項１〜１１のいずれかによる癌の処置方法。
１３．異なる癌処置が、ＭＭＲ遺伝子を不活性化する処置である、条項１２による方法。
１４．異なる癌処置が、テモゾロミド又はＭＮＵ又はそれらの誘導体による処置である、条項１３による方法。
１５．異なる癌処置が免疫療法である、条項１５による方法。
１６．免疫療法が、免疫チェックポイント阻害剤、又は免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせである、条項１８による方法。
１７．免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤＬ−１抗体又はそれらの組み合わせである、条項１９による方法。
１８．ミスマッチ修復遺伝子の失活剤／阻害剤が、テモゾロミド、ＭＮＵ又はそれらの誘導体である、条項１〜１７のいずれかによる処置方法。
１９．抗癌化合物のスクリーニングのための方法であって、
ａ）ＤＮＡ修復遺伝子を発現している細胞を提供するステップと、
ｂ）前記細胞を試験化合物の存在下でインキュベートするステップと、
ｃ）試験化合物の存在下でのＤＮＡ突然変異率を測定するステップとを含み、
ｄ）試験化合物の非存在下での細胞において測定されたものと比較した、試験化合物の存在下での細胞におけるＤＮＡ突然変異の増大は、試験化合物が抗癌化合物であることを示す、方法。
２０．ＤＮＡ修復遺伝子を発現している細胞がヒト腫瘍細胞株である、条項２２による方法。
２１．ＤＮＡ修復遺伝子が、ＭＬＨ１、ＭｕｔＬα、ＭｕｔＬβ、ＭｕｔＬγ、ＰＭＳ１、ＰＭＳ２又はＭＬＨ３である、条項２２又は条項２３による方法。
２２．免疫療法による処置に好適な腫瘍を有する患者の特定方法であって：
ａ）腫瘍のサンプルを取得するステップと、
ｂ）サンプルを分析して、ＤＮＡ修復遺伝子の配列を決定するステップと、
ｃ）腫瘍サンプルにおけるＤＮＡ修復遺伝子の配列を、非腫瘍サンプルにおける配列と比較するステップとを含み、
非腫瘍サンプルにおける遺伝子の配列と比較した、腫瘍サンプルにおけるＤＮＡ修復遺伝子の配列における欠損は、患者が免疫療法による処置に好適な腫瘍を有することを示す、方法。
【００９７】
以下に、以下の図面及び実施例を参照して、本発明の特定の態様及び実施形態を例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】［ＣＴ２６、結腸直腸癌及びＴＳ／Ａ乳癌細胞株におけるインビボでのＭＬＨ−１−不活性化の結果］    ＭＬＨ−１のＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９仲介ノックアウトをＣＴ２６結腸直腸細胞株内で得た（Ａ）。ＣＴ２６を感染させ、ピューロマイシン選択後、単一細胞クローニングを行った。ＣＴＲＬは、ガイドを有さないＣＲＩＰＲ／ＣＡＳ９ベクターで感染させたＣＴ２６クローンを表す。Ｍ２及びＭ３は、各々、ガイド数２及び３を用いて得た２つの異なるクローンであった。２つのガイドを選択して、任意のオフ標的効果を回避した。ＣＴ２６クローンをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注入し（マウス当たり５×１０５細胞）、犠牲の日まで成長を監視した。（Ｂ）ＣＴ２６クローンをＢａｌｂＣ免疫コンピテントマウスに注入した。Ｍ２及びＭ３クローンの大部分は拒絶され（各々、１４のうち１１、及び１４のうち１０）、免疫欠損マウス内で成長した同じ細胞は、免疫コンピテント系内に入った後、拒絶されることを示した。（Ｃ）対照（実線）、Ｍ２（黒い点線）及びＭ３（黒い小点線）を有する、（Ｂ）で注入されたＢａｌｂＣマウスの生存曲線。ＭＬＨ−１  ＫＯは、大部分の注入したマウスの生存を３か月を超えて保証した（Ｄ）ＭＬＨ−１欠損細胞をＴＳ／Ａ乳癌細胞株からも得た。ＴＳ／Ａの場合、本発明者らは、２つのＭＬＨ−１  ＫＯクローンを選択した。Ｍ３及びＭ６は、各々ガイド数３及び６からの２つのクローンを表す。ウェスタンブロットは、インビトロでの３か月の培養後のＭＬＨ−１レベルを示した。ＭＬＨ−１  ＫＯ及びＷＴクローンを免疫欠損マウスに注入した。（Ｅ）ＭＬＨ−１プロフィシェント及び欠損細胞をＢａｌｂＣマウスに皮下注入した（マウス当たり５×１０５細胞）。ＭＬＨ−１  ＫＯクローンを有する大部分のマウスは拒絶した（７匹のマウスのうち６匹）が、ＣＴＲＬは成長した。統計分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。（Ｆ）（Ｅ）の実験のマウスからＴＳ／Ａの生存曲線を得た。
【図２】［膵臓癌細胞株におけるＭＬＨ−１不活性化は、免疫原性拒絶を与える］      （Ａ）図１で従ったものと同じアプローチを、ＰＤＡＣ細胞株において従った。２つの対照クローンと、ガイド２及び６で感染させたＭＬＨ−１  ＫＯクローンとにおいてＭＬＨ−１を４カ月間監視した。（Ｂ）ＭＬＨ−１プロフィシェント及び欠損クローンをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注入し、プロフィシェント免疫系を有さないマウス内で生着の固有の能力を示した。（Ｃ）ＰＤＡＣ細胞を同所的にＦＶＢマウスに注入した（マウス当たり１０３細胞）。３週間後、マウスを犠牲にし、腫瘍負荷を測定した。膵臓腫瘍の腫瘍体積は、ＭＬＨ−１サイレンシングが腫瘍成長を妨げることを示した。（Ｄ）膵臓腫瘍塊を分離し、ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞の百分率を分析した。統計分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。
【図３】［ＭＬＨ−１不活性化は、ＢａｌｂＣマウスにおいてＣＴ２６を抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４療法に応答性とした］    （Ａ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内で成長した腫瘍を側部２ｍｍの小片に切断し、左脚の位置で皮下移植した。１８日後、抗ＰＤ１（マウス当たり２５０μｇ）及び抗ＣＴＬＡ４（マウス当たり２００μｇ）を３日毎に３回ｉ．ｐ．投与した。その後、抗ＰＤ−１を用いて治療法を３日毎に継続した。ＭＬＨ１  ＫＯマウス内の腫瘍は抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４療法に応答したが、プロフィシェントＭＬＨ１を有する腫瘍は、成長の遅延のみを示した。（Ｂ）ＣＤ８  Ｔ細胞の百分率は、対照と比較してＭＬＨ欠損腫瘍において高かった。ＭＬＨ−１プロフィシェント腫瘍においては、療法は腫瘍内のＣＤ８  Ｔ細胞の百分率を増大させた。統計分析：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。（Ｃ）ＣＤ８浸潤は、ＭＬＨ−１  ＫＯクローン内のネオ抗原のレベルの増大のために、ＭＬＨ−１プロフィシェント腫瘍と比較してＭＬＨ１  ＫＯで明らかにより高かった。（Ｄ）ＣＴ２６を注入し（マウス当たり５×１０５細胞）、同日にマウスを抗ＣＤ８枯渇抗体（０日目にマウス当たり４００μｇ、１日目にマウス当たり１００μｇ、及び２日目に１００μｇ）で処理した。ＭＬＨ−１  ＫＯ腫瘍におけるＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇は腫瘍成長を保証し、それらの細胞がＭＬＨ１欠損腫瘍内で腫瘍エスケープを制御したことが確認された。
【図４】［ＣＴ２６に関する経時的な突然変異荷重、及びネオ抗原予測］    （Ａ）ＣＴ２６クローンを経時的に比較して、好適なネオ抗原の発達を追跡した。アノテーションファイルに報告された突然変異体を、突然変異型ペプチド配列の計算に使用し、ＮｅｔＭＨＣ  ４．０ソフトウエアにロードし、予測されるネオ抗原を得た。（Ｂ）同じことをＭＣ３８細胞株についても行った。（Ｃ）ＣＴ２６クローンの初期のプールから出発して、各クローンに関して各時点で突然変異負荷を計算した。単一ヌクレオチドコーディング突然変異体（生殖系列のものを除外）の総数を、少なくとも１％アレル頻度を支持した場合、コーディングエクソームに対して正規化し、突然変異率（１００万当たりの塩基）として報告した。
【図５】［ＭＬＨ−１プロフィシェント及び欠損腫瘍におけるアルキル化剤の薬物スクリーニングは、テモゾロミドを有望な治療的アプローチとして特定した］    （Ａ）ＭＬＨ−１を有する又は有さない細胞株に関するアルキル化剤の薬物スクリーニング。細胞の差次感受性を、クリスタルバイオレット染色全体において測定した。ある量のクリスタルバイオレットを溶解し、分光光度計によって定量化した。図Ａは、ＭＬＨ−１  ＫＯ及びｗｔの間のＬｏｇ２比のＩＣ５０であり、どの薬物が親と比較してＭＬＨ−１  ＫＯの生存に対してより低い効果を有するかを特定した。（Ｂ）テモゾロミド処理後のＣＴ２６及びＭＣ３８の突然変異荷重。細胞を、１００μＭから開始して５００μＭまでのテモゾロミドで４カ月間処理した。（Ｃ）ＣＴ２６及びＭＣ３８を皮下注入した（マウス当たり５×１０４細胞）。腫瘍体積を週に２回測定した。（Ｄ）テモゾロミド処理後のＣＴ２６及びＭＣ３８におけるＭＬＨ−１発現。ＭＬＨ−１レベルはＭＣ３８において強く低下したが、ＣＴ２６では差異は認められなかった。
【図６】［ＣＴ２６クローンにおけるＭＬＨ−１配列アラインメント］    ＭＬＨ−１領域をガイド数２及び３に従って特定した。ガイド２を有するクローンは、２２コドンのフレームシフトを誘導する８ｂｐｓの欠失を示した。ガイド３は、二重欠失により、９コドンのフレームシフトを生じた。第一のラインは、マウス参照アセンブリーｍｍ１０である。
【図７】［インビトロでのＣＴ２６、ＭＣ３８、ＴＳ／Ａ及びＰＤＡＣ細胞株の成長］    結腸直腸癌細胞株を１０００細胞／ウェルで蒔いた。ＴＳ／Ａ及びＰＤＡＣを５０００細胞／ウェルで蒔いた。ＭＬＨ−１  ＫＯの全クローンをインビトロで成長に関して試験した。それらの代謝活性をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて２４時間毎に定量化した。
【図８】［犠牲の日のＰＤＡＣ腫瘍を有するマウス］    犠牲の日のＰＤＡＣ腫瘍を有するマウス。写真は、分析した全クローンにおける腫瘍のサイズを示した。
【図９】［インビボでのＣＴ２６クローンに対する免疫制御の効果］    （Ａ）免疫欠損マウスに注入されたＣＴ２６クローンを外植した。腫瘍の重量は、ＭＬＨ−１  ＫＯクローンの場合、増大したサイズを示したが、統計的有意性に達しなかった。（Ｂ）ＣＴ２６を移植されたマウスの生存曲線は、ＭＬＨ−１の非存在が腫瘍を免疫チェックポイント阻害剤に対してより応答性とすることを示した（Ｂ上部パネル）。アイソタイプ対照マウス及びＭＬＨ−１  ＫＯ腫瘍を倫理的理由のため同じ日に犠牲にした。（Ｃ）ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＭＬＨ−１  ＫＯ  ＣＴ２６において腫瘍拒絶に関与していた。ＣＤ８  Ｔ細胞の非存在は、ＭＬＨ−１プロフィシェント腫瘍においても腫瘍成長を向上させた。ＣＤ８仲介対照の非存在は、ＣＴ２６対照細胞の成長速度を増大させた。
【図１０】［ＣＴ２６、ＰＤＡＣ及びＴＳ／Ａハツカネズミ細胞株におけるＭＨＣＩの発現］    細胞株を抗Ｈ−２ｋｂ／Ｈ−２Ｄｂ及びＨ−２ｋｄ／Ｈ−２Ｄｄ  ＰＥ標識抗体で染色した。細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％  ＦＢＳ）中で一回洗浄した後、抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。分析により、使用した全クローンは、ＭＨＣＩプロフィシェントであることが明らかとなった。
【図１１】［ＣＡ（２０）ＮａｎｏＬｕｃアッセイ］    プロフィシェント複製後ＭＭＲの存在下、レポーター遺伝子は、フレーム外に留まる。阻害された又は遺伝的に欠損したＭＭＲは、フレームシフト突然変異及びフレーム内レポーターをもたらし、これは市販のＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイシステムを使用して検出される。
【図１２】細胞をＣＡ（２０）−ＮａｎｏＬｕｃプラスミド及び対照空ベクター（ＥＶ）又は野生型（ＷＴ）ＭＬＨ１を発現しているプラスミドのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、条件当たり８反復で、９６ウェルプレート内に１０，０００細胞／ウェルで再び蒔いた。次いで、細胞を７２時間培養し、次いでＮａｎｏＧｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、４つのウェルからＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター活性を検出した。発光をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー上で測定した。細胞数をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）の使用のために正規化し、残りの４ウェルからもＣｌａｒｉｏｓｔａｒ上で読み取った。データを、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅデータに対して正規化した、正規化ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性として示す。
【図１３】細胞を、ＣＡ（２０）−ＮａｎｏＬｕｃプラスミド及び対照空ベクター（ＥＶ）、野生型（ＷＴ）ＭＬＨ１、又はＭＬＨ１  Ｇ６７Ｒクローン＃１、２又は３を発現しているプラスミドのいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、条件当たり８反復で、９６ウェルプレート内に１０，０００細胞／ウェルで再び蒔いた。次いで、細胞を７２時間培養し、次いでＮａｎｏＧｌｏアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、４つのウェルからＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター活性を検出した。発光をＢＭＧ  Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒプレートリーダー上で測定した。細胞数をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）の使用のために正規化し、残りの４ウェルからもＣｌａｒｉｏｓｔａｒ上で読み取った。データを、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｒｅ  Ｂｌｕｅデータに対して正規化した、正規化ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性として示す。
【実施例】
【００９９】
実施例１
概要
ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）に関与する腫瘍抑制遺伝子における分子変化は、癌開始を促進し、腫瘍進行を助長する。ＭＭＲ欠損癌は、好ましい予後を示し、緩慢進行を示すことが多い。ＭＭＲ腫瘍を有する患者の臨床成績の機能的基礎は対処された。マウス結腸直腸、乳房及び膵臓癌細胞におけるＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）は、遺伝的に不活性化された。ＭＭＲ欠損細胞は、インビトロで及び免疫不全マウスに移植された際、それらのプロフィシェント対応物と同じ又は高い速度で成長した。しかしながら、際立ったことに、ＭＭＲ欠損結腸直腸及び乳癌細胞は、同系マウスモデルに皮下注入された際、大部分が腫瘍を形成することができなかった。同所的に移植された場合、ＭＭＲプロフィシェント膵臓癌細胞は致命的疾病を急速にもたらした一方、それらのＭＭＲ欠損対応物は成長せず、又はり小さい腫瘍を形成した。ＭＭＲ欠損腫瘍は、高いレベルの浸潤Ｔ細胞及びＴリンパ球の抑制を示し、同系マウスにおけるＭＭＲ欠損腫瘍を指数関数的に成長させた。免疫欠損マウスにおいて当初樹立されたＭＭＲ欠損腫瘍は、同系動物に移植された際に指数関数的に成長したが、免疫チェックポイント阻害剤が投与された際に完全に退行した。ＭＭＲプロフィシェント細胞の配列決定は、経時的に安定な高い突然変異荷重（５０〜１００突然変異／Ｍｂ）及びネオ抗原プロファイルを明らかにした。ＭＭＲ不活性化は、突然変異負荷を更に増大させ、ネオ抗原の持続的な再生をもたらした。薬理学的スクリーニングにより、突然変異レベル増大それ自体は、免疫監視の誘発に十分ではないことが見出された。対照的に、薬物誘導によるＤＮＡ修復の持続性の不活性化は、免疫監視の中心となる動的高頻度突然変異状態をもたらす。これらの結果は、革新的な抗癌療法を開発するための理論的根拠を提供する。
【０１００】
結果
腫瘍形成におけるミスマッチ修復の役割、及び療法に対する応答を機能的に規定するために、ＭＭＲプロフィシェント結腸直腸（ＣＴ２６、ＭＣ３８）、乳房（ＴＳＡ）及び膵臓（ＰＤＡＣ）マウス癌細胞を試験した。ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムを用いたゲノム編集を使用して、これらの細胞モデルの各々におけるＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）を不活性化した。区別されるＭＬＨ１エクソン領域に指向される非依存性ＲＮＡガイドを使用し、多数のクローンを単離した。特異的ＲＮＡガイドを有さずに処理された細胞から誘導されたクローンは、対照（ＣＴＲクローン）としての役割を果たした。ＭＬＨ１の不活性化は、ゲノムレベル（図６）、及びタンパク質レベル（図１Ａ、図１Ｄ、図２Ａ）で確認された。ＤＮＡミスマッチ修復の機能的不活性化は、反復マウスＤＮＡ要素の配列決定により確立され、このＤＮＡ要素は、ヒトゲノムの等価領域に対する相同性に基づいて選択された（図６）。
【０１０１】
インビトロで、ＭＭＲ欠損細胞の増殖速度は、それらの親誘導体及びＣＴＲクローンの増殖速度と同等であった（図７）。結腸直腸及び乳房ＭＭＲ欠損細胞は、免疫不全マウスに皮下注入された際に急速に腫瘍を発生し、数週間のうちに、この動物は倫理指針に従って犠牲にする必要があった（図１Ａ及び１Ｄ）。ＭＭＲ欠損細胞は対照よりも速く成長したが、実験終点において、差異は統計的有意性に達しなかった（図９Ａ）。
【０１０２】
ＣＴ２６細胞が対応する同系マウスモデル（ＢａｌｂＣ）に注入された際、それらは急速に成長し、３０日後に動物を犠牲にする必要があった。対照的に、ＭＭＲ欠損細胞（Ｍ２及びＭ３クローン）は生着せず、又は、数日後に退行した小さい腫瘍塊を形成した（図１Ｂ）。全コホートは３カ月間に亘り監視され、その間、腫瘍再燃の証拠は存在せず、マウスは治癒されたことが示唆された（図１Ｃ）。
【０１０３】
同じタイプの実験を乳癌細胞を用いて行い、ここでＭＬＨ１は同系マウスにおいて不活性化されていた（図１Ｅ）。この場合でも、ＭＭＲ欠損細胞は腫瘍を形成せず、又は小さい病変を形成し、これはその後退行した。対照的に、ＭＭＲプロフィシェント乳癌細胞は急速に成長し、１か月未満での動物の犠牲をもたらした（図１Ｅ）。ＭＭＲ欠損腫瘍を有するマウスの生存は、対照よりも長かった（図１Ｆ）。
【０１０４】
癌細胞が皮下注入された際、腫瘍間質構成成分及び微小環境の構造及び性質は、適切に再構成されないことが既知である。１５第３のモデルとして、膵臓腺管癌（ＰＤＡＣ）細胞を、同系マウスの膵臓内に同所的に注入した。１６この癌モデルは、ヒトＰＤＡＣｓの分子特徴を高く再現する。それらのヒト対応物と同様、マウスＰＤＡＣ細胞は、極めて悪性度が高く、急速に致命的な腫瘍をもたらす。注目すべきことに、この場合でも、本発明者らは、ＭＭＲプロフィシェント及びＭＭＲ欠損細胞の間の著しい相違を認めた（図２Ｂ及び図８）。移植から３週間後、ＣＴＲ細胞を注入したマウスは、大きい腫瘍を発生し、対照的にＭＬＨ１ノックアウト細胞は、腫瘍を形成せず、又は非常に小さい病変を発生した（図２Ｂ）。免疫欠損マウスに注入されたＰＤＡＣ細胞は、同じ速度の生着を示し、免疫プロフィシェントマウスで見られた効果が、障害されたクローン成長に関連しないことを確認した（図２Ｃ）。ＣＤ８  Ｔ細胞の百分率は、ＭＬＨ−１  ＫＯクローンにおいて明らかにより高く、ＭＬＨ−１編集後のネオ抗原が、潜在的な細胞傷害性Ｔ細胞のリクルートメントに関与することを確認した（図２Ｄ）。
【０１０５】
既に樹立された腫瘍に対するミスマッチ修復の不活性化の影響を調べた。同系免疫コンピテントマウスにおいてＭＬＨ１ノックアウト細胞は成長しないため、又は成長が不十分であるため、それらは最初に、腫瘍が２０００ｍｍ３のサイズに達するまで、免疫欠損マウス内で増大させ、その時点で病変（側部２ｍｍ）を同系ＢａｌｂＣレシピエントに移植した。これらの条件下で、ＭＬＨ１ノックアウト結腸直腸癌細胞は、レシピエント動物内で成長を続けた（図３Ａ）。この状態は、結腸直腸癌患者が一般に免疫療法を受容する、即ち腫瘍が完全に樹立された場合の臨床状況を再現し得ると判断された。１７従って、ＭＭＲプロフィシェント及びＭＭＲ欠損腫瘍を有するマウスは、抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせで処理された。結果は著しく、対照腫瘍は成長を続けた一方、それらのＭＭＲ欠損対応物は退行した（図３Ａ）。大部分の場合、療法は、病変が消失し、マウスが再発なしで３か月を超えて生存したため、治癒的であった（図９Ｂ）。実験の終了時に、動物のサブセットを犠牲にし、組織学的分析は完全病理学的応答（ＣＰＲ）を示した。
【０１０６】
これらの知見に関与する分子機構の洞察を収集するために、細胞モデルにおけるＭＨＣＩ発現を検証した。ＭＨＣＩの発現は、ＭＭＲ可能及び欠損細胞の間で同等であった（図１０）。アイソタイプ特異的対照抗体を受容した同系マウスにおいて樹立されたＭＭＲプロフィシェント及びＭＭＲ欠損腫瘍に関する次の組織学的及びＦＡＣＳ分析を行った。注目すべきことに、ＭＬＨ１ノックアウト腫瘍は、対照と比較して高いレベルの免疫浸潤を示した（図３Ｂ）。詳細には、ＣＤ８  Ｔ細胞の増大したレベルは、アイソタイプ対照抗体を受容した、ＭＭＲ欠損腫瘍において見出されたが、ＭＭＲプロフィシェント腫瘍には見出されなかった。この実験は、ＭＭＲ欠損及びＭＭＲプロフィシェント腫瘍のサンプルが抗ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４組み合わせ処理後の早い時点で収集されるように反復された。ＣＤ８  Ｔ細胞は、対照と比較して、ＭＬＨ１ノックアウトクローンにおいて選択的に増大することが見出された（図３Ｂ）。腫瘍サンプルにおけるＣＤ８細胞の免疫蛍光染色後に同じことが得られた（図３Ｃ）。観察された腫瘍形成表現型にＴ細胞が関与し得るという仮説を試験するために、抗ＣＤ８抗体の存在下でＭＭＲ欠損細胞の注入を反復し、アイソタイプ一致抗体が対照として機能した。結果は明白であり、ＭＭＲ欠損細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞が同時に抑制された場合のみ、同系マウスにおいて腫瘍を容易に形成した（図３Ｄ）。ＭＬＨ−１プロフィシェント腫瘍を有するマウスにおけるＣＤ８の枯渇は、腫瘍成長を増大させた（図９Ｃ）。
【０１０７】
いくつかの報告は、高い突然変異負荷を有する腫瘍（黒色腫及び肺癌等）が、免疫療法に選択的に応答することを示す。１３、１８−２１しかしながら、注目すべきことに、高頻度突然変異型腫瘍の大部分は、好ましくない予後を有し、免疫モジュレーターに応答しない。１４、１７
【０１０８】
親細胞及び一致した正常（生殖系列）ＤＮＡのエクソーム配列決定により、ＣＴ２６及びＭＣ３８は、高い突然変異荷重、各々１５０及び１２９突然変異／メガベースのＤＮＡを示すことが明らかとなった（図４Ａ）。ＲＮＡ  ｓｅｑ分析は、突然変異型遺伝子の大部分が転写され、従ってネオ抗原として作用し得ることを示した。これらの結果は、以前の報告と一致し、突然変異原性であるとして知られる発癌物質で処理されたマウスから得られたＣＴ２６及びＭＣ３８細胞の起源を同様に反映する。２２ヒト癌で測定された突然変異荷重レベルに基づいて分類された際、ＣＴ２６腫瘍は高頻度突然変異されていると見なされるであろう。高いレベルのネオ抗原が免疫系による癌−細胞関与を生じる場合に、ＣＴ２６腫瘍が何故これらの細胞に決して暴露されていない同系マウス内で成長するのかという疑問に対処するために、ＭＭＲ欠損細胞の突然変異荷重を測定した。ＭＬＨ１の不活性化が、ＣＴ２６（１５０から２４７〜３５２突然変異／Ｍｂ）及びＭＣ３８（１２９から１９０〜２５０突然変異／Ｍｂ）の突然変異負荷を更に増大させることが見出された。この増大は免疫応答を開始するのに十分である可能性があるが、他の可能性も考えられた。ＭＳＩ腫瘍が無効なＤＮＡ修復に起因して高い突然変異数を有するだけでなく、それらの突然変異的景観が結果として連続的に変動すると仮定された。これを公式に試験するために、区別される時点で長期的に収集した細胞から公式にエクソーム配列決定を行った。図４に示すように、ＭＭＲ細胞において、突然変異（及び、従って、対応するネオ抗原）プロファイルは、経時的に動的に発達する。従って、ＭＭＲ欠損癌を同様に免疫療法に応答するように変える重要な特徴は、それらのゲノム景観が急速に及び動的に発達することであると提案される。これは新規な突然変異の連続的な出現をもたらし、これは徐々にかつ反復して免疫系により関与される。この可能性は、ＭＭＲ欠損腫瘍の臨床所見が、何故一般により好ましい予後を有し、より長期間、免疫系による制御下に留まる傾向があるのかを説明するであろう。
【０１０９】
本発明者らは、ＭＭＲ腫瘍における免疫監視の回避が、新しいＴ細胞プールにより関与される新しい抗原の動的出現により均衡されると提案する。以前に論じたように、ＤＮＡ修復に関与する腫瘍抑制遺伝子の不活性化は、癌細胞の突然変異率を増大させ、これが癌進行を刺激する。突然変異原性剤は、発癌を促進することが知られている。従って、ヒト細胞における突然変異数の増大は、腫瘍促進事象であると見なされる。２３癌細胞における突然変異数の強制的な増大は、治療目的のために（逆説的に）有益であり得ると判断される。しかしながら、突然変異の増加は、静的ではなく動的である必要があると仮定される。この可能性を試験するために、ＤＮＡ修復機構の持続的な不活性化をもたらし得る又は得ない突然変異原性剤で癌細胞を処理した。本発明者ら及びその他は、突然変異原性剤に対する耐性が、ＭＬＨ１及びＭＳＨ２等のＭＭＲ遺伝子の不活性化に関連し得ることを以前に報告した。２４薬理学的スクリーニングを設計して、それらのＭＳＩ対応物と比較してＭＭＲプロフィシェント細胞に選択的に影響を与える抗癌剤を特定した。スクリーニングのために、ＤＮＡをアルキル化し、及び／又はＤＮＡ複製を障害することが知られているＦＤＡ承認抗癌薬物を選択した（表２）。機能的アッセイは、ＭＭＲ欠損細胞が、試験した抗癌剤の影響を受けないか、又は抗癌剤に対してより耐性であるかを示した（図５Ａ）。しかしながら、結腸直腸及び乳房ＭＭＲプロフィシェント細胞は、それらのＭＳＩ対応物と比較して、テモゾロミド（ＴＭＺ）に対する選択的な感受性を示した。テモゾロミドは、いくつかの腫瘍タイプの処置に使用され、ＤＮＡ損傷を引き起こす周知の化学療法薬である。２５、２６ＴＭＺ暴露はＤＮＡ修復に影響を与え、ＴＭＺによる処置は、ＭＭＲ不活性化をもたらし得ることが以前に示されている。２７ＣＴ２６及びＭＣ３８  ＭＭＲプロフィシェント細胞を、耐性集団が出現するまでテモゾロミドで処理した。エクソーム分析は、ＴＭＺへの暴露が、ＭＭＲの不活性化により達成されたものと同等のレベルに、突然変異荷重を増大させることを明らかにした（図５Ｂ）。次いで、ＣＴ２６及びＭＣ３８細胞を、対応する同系マウスに注入した。ＴＭＺ耐性ＣＴ２６細胞は、腫瘍を容易に形成し、それらの親対応物と同等の速度で成長した（図５Ｃ）。しかしながら、テモゾロミドに耐性のＭＣ３８は、腫瘍を形成しなかった。それ故、ＴＭＺ耐性ＣＴ２６及びＭＣ３８細胞のＭＭＲ状態を評価した。最も注目すべきことに、マイクロサテライト不安定性アッセイにより測定して、ＭＣ３８細胞はＭＭＲ欠損を示したがＣＴ２６細胞は示さなかった。ＭＬＨ１発現はＭＣ３８細胞内で劇的に低下する（がＣＴ２６細胞ではしない）ことが更に見出された（図５Ｄ）。これらの結果は、アルキル化剤への暴露が、癌細胞の突然変異荷重を増大させることを示すが、このこと自体は、インビボで腫瘍拒絶を駆動するのに十分ではない。
【０１１０】
【表４】
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【０１１１】
纏めて考慮した場合、これらの知見はいくつかの意義を有する。第一に、腫瘍抑制因子タンパク質の機能を回復することができる薬物の開発において、それらが抗癌剤として機能し得るという希望の下に、多大な努力が為された。しかしながら、本発明者らのデータは、腫瘍抑制遺伝子又は遺伝子産物の持続的な不活性化（再活性化ではなく）が、代わりに治療的目的のために探求され得ることを示している。この非慣習的なアプローチの理論的根拠は、癌細胞における突然変異数の、静的ではなく動的な増大が、細胞ベースの免疫応答をもたらし得るという概念に基づいている。
【０１１２】
第二に、ＰＤ−１及びＰＤＬ−１阻害剤等の免疫モジュレーターは、癌患者のサブセットにおいてのみ有効である。本明細書に提示する結果に基づいて、免疫療法から長期間利益を得る患者は、動的高頻度突然変異状態をもたらすＤＮＡ修復欠損を有することが可能である。結腸直腸癌では、これらの集団は、主に、ＭＭＲ及びポリメラーゼ遺伝子に欠損を保有する個人と重複している。これらの遺伝子は、黒色腫及び肺癌では頻繁に変化しないが、これらの患者のサブセットは、免疫遮断に長期の応答を有する（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６，２４４３−２４５４，（２０１２））。免疫モジュレーターから顕著な及び持続性の利益を得る黒色腫及び肺癌患者の幾人かも、動的高頻度突然変異状態をもたらす分子変化を保有すると考えられる。
【０１１３】
これらの結果の別の意義は、ネオ抗原の連続的再生をもたらす動的突然変異荷重の増大が、薬理学的に誘導され得、これが有効な免疫監視をもたらし得ることである。この点において、テモゾロミド（通常使用されている化学療法薬）を用いて本発明者らが得た結果は、ＤＮＡ修復機能の不活性化をもたらす薬物が、全身的に耐容可能であり得ることを示唆する。本明細書に示すデータの焦点は、ミスマッチ修復に関与するＭＬＨ１に関するものであるが、動的突然変異荷重を促進することを目標として、他の（腫瘍抑制因子）遺伝子も標的となり得る。例えば、ＰＯＬＥ及びＰＯＬＤ等のＤＮＡポリメラーゼの薬物誘導不活性化を想像することができる。ミスマッチ修復システム及びＤＮＡポリメラーゼの構成成分に触媒活性（各々、ＡＴＰアーゼ及びエンドヌクレアーゼ活性）を与え、それにより薬理学的阻害を受ける筈である。
【０１１４】
結論として、本発明者らにより示されるデータは、ＤＮＡミスマッチ修復の不活性化が、持続性免疫監視を引き起こす動的高頻度突然変異状態をもたらすことを示唆する。これらの結果は、ＤＮＡ修復酵素の不活性化に基づく革新的な抗癌療法の開発の理論的根拠を提供する。
【０１１５】
方法
マウスモデル
全動物手順はトリノ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｕｒｉｎ）の倫理委員会及びイタリア健康省（Ｉｔａｌｉａｎ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により承認され、それらは機関指針（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ガイドｌｉｎｅｓ）（４Ｄ．Ｌ．Ｎ．１１６，Ｇ．Ｕ．，ｓｕｐｐｌ．４０，１８−２−１９９２）、並びに国際法及び政策（ＥＥＣ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９，ＯＪ  Ｌ  ３５８，１，１２−１２−１９８７；ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，１９９６）に従って行われた。４〜６週齢のＣ５７／ＢＬ／６Ｊ、ＢａｌｂＣ及びＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｌｃｏ、Ｃｏｍｏ、Ｉｔａｌｙ）から得た。マウス実験において、細胞を皮下接種した（５×１０５細胞／マウス）。腫瘍成長及びマウスの健康を、犠牲にするまで監視した腫瘍サイズを５日毎に測定し、式：Ｖ＝（（ｄ／２）２×（Ｄ／２））／２（ｄ＝腫瘍短軸；Ｄ＝腫瘍長軸）を使用して計算し、腫瘍塊体積として報告した（ｍｍ３、個々の腫瘍体積の平均±ＳＥＭ）。
【０１１６】
膵臓腺管癌のマウスモデルを、以前記載したように単離したＫｒａｓＬＳＬ＿Ｇ１２Ｄ、ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｆｌｏｘ／＋細胞を、ＦＶＢ／ｎ同系マウスのコホートに同所的に注入（１ｘ１０３細胞／マウス）することにより得た。免疫コンピテントＦＶＢ／ｎマウスの膵臓に注入した際、これらの株は、３〜４週間の潜時により、自発的腫瘍微小環境の多数の特徴を再現する腫瘍を形成することができた。ノギスを用いて、個別に切除した巨視的腫瘍（＞１ｍｍ３）の体積を測定し、以前に記載した式を用いることにより総腫瘍負荷を定量化した。
【０１１７】
細胞モデル
ＣＴ２６及びＭＣ３８結腸直腸癌細胞株を、Ｍａｒｉａ  Ｒｅｓｃｉｇｎｏ，ＰｈＤ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）研究室から提供して頂いた。ＴＳ／Ａ乳癌細胞株は、ＢＡＬＢ／ｃマウス内で自発的に生じた、中程度に分化した乳房腺癌の第一のインビボ移植片から樹立された高悪性度細胞株である。Ｆｅｄｅｒｉｃａ  Ｃａｖａｌｌｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、トリノ大学、イタリア）によりＴＳ／Ａ細胞を提供して頂いた。Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞株をＡＴＣＣから購入した。ｍＰＤＡＣ細胞を、腫瘍を有するＰＤＡＣマウスから単離した。膵臓癌ＧＥＭＭモデルは、ＦＶＢ／ｎバックグラウンド由来であった。組み合わされたｐ５３点突然変異体及びＩＮＫ４ａ／Ａｒｆフロックスドマウス、ＫＩＡＰｐ４８Ｃｒｅは、以下の遺伝子構造を有した：ｐ４８ｃｒｅ、ＫｒａｓＬＳＬ＿Ｇ１２Ｄ、ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆｆｌｏｘ／＋。対応する腫瘍抑制遺伝子の野生型アレルは、腫瘍形成の過程で喪失することに留意されたい。ＣＴ２６及びＭＣ３８細胞株をＲＰＭＩ１６４０  １０％  ＦＢＳ＋グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン中、インビトロで増やした（ｅｘｐａｎｄ）。ＴＳ／Ａ  ＬＬＣ及びＰＤＡＣをＤＭＥＭ  １０％  ＦＢＳ＋グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン中で培養した。
【０１１８】
ＭＬＨ１のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９仲介ノックアウト
Ｍｌｈ１遺伝子をノックアウトするために、ゲノム編集システムを使用した（ｈＳｐＣａｓ９を誘導可能に送達する別個のレンチウイルスコンストラクトを有する、オールイン１及び２ベクター、Ｊｏｎｋｅｒｓ研究室の贈与）。最小限のオフ標的効果を有する特異的ＲＮＡガイド特定のために、Ｚｈａｎｇ  ｌａｂウェブサイトにより提供されるソフトウェアツールを使用した（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ）。ハツカネズミＭｌｈ１を標的とするアニールされたｓｇＲＮＡオリゴヌクレオチドを、前述されたように、ＢｓｍｂＩ（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）制限レンチＣＲＩＳＰＲ−ｖ２プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６１から）ベクター及びレンチＧｕｉｄｅ−Ｐｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃５２９６３から）内にクローン化した。２９連結プラスミドをコンピテントＳｔｂｌ３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。各コンストラクトのために、３〜５つの個々のコロニーを精選し、ＬＢアンピシリン培地中で一晩成長させた。次いで、各コロニーからのプラスミドを、ＤＮＡミニ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ｈＵ６−フォワードプライマーを使用して配列決定して、正確な組み込み配向を検証した。
【０１１９】
レンチウイルス生成及び感染
レンチウイルス粒子をウイルスベクター及びパッケージングプラスミドｐＶＳＶｇ（ＡｄｄＧｅｎｅ＃８４５４）、ｐｓＰＡＸ２（ＡｄｄＧｅｎｅ＃１２２６０）によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共トランスフェクションによりパッケージングした（Ｓａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ２０１４）。トランスフェクションはＣａＣｌ２を使用して達成され、その後、細胞を４８時間インキュベートした。次いで、各ウェルからの上清を回収し、０．２２μｍフィルターを通して細胞デブリを除去し、１ｍＬアリコートとして−８０℃で凍結した。細胞をおよそ６０％コンフルエンスで、８μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下、レンチウイルスで感染させた。形質導入された細胞を選択するために、本発明者らは、ピューロマイシン（Ｐ９６２０  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）処理、及び誘導可能なベクターの場合、ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ＣＡＳ９の誘導は、インビトロでの４ＯＨ−タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）処理（１μｇ／ｍｌ）に継続した。
【０１２０】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９におけるオフ標的効果
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現がオフ標的カッティングをもたらすか否かを調べるために、各ｓｇＲＮＡの上位２０オフ標的部位及び少なくとも３つのエクソンオフ標的を分析した。アンプリコンベースのＮＧＳデータの分析により、これらの予測されたオフ標的部位における専ら野生型の配列が明らかとなった。従って、望ましくないオフ標的効果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現２９の実験設定では無視できると結論付けられる。
【０１２１】
処理
抗マウスＰＤ−１（クローンＲＭＰ１−１４）及び抗マウスＣＴＬＡ−４（クローン９Ｈ１０）抗体をＢｉｏＸｅｌｌ（ＵＳＡ）から購入した。マウスを２５０μｇ／マウスの抗ＰＤ−１及び２００μｇ／マウスの抗ＣＴＬＡ−４でｉ．ｐ．処理した。処理は注入後、３、６及び９日目に投与した。抗ＰＤ−１を３日毎に連続的に付与した。アイソタイプ対照（ＰＤ−１にはラットＩｇＧ２ａ、及びＣＴＬＡ−４にはポリクローナルＳｙｒｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ  ＩｇＧ）を同じスケジュールに従って注入した。抗マウスＣＤ８ａ（クローンＹＴＳ  １６９．４）及びアイソタイプラットＩｇＧ２ｂを、免疫コンピテントマウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞の枯渇に使用した。抗マウスＣＤ８ａ抗体（２００μｇ／マウス）を腫瘍接種と同じ日にｉ．ｐ．注入した。腫瘍注入の２及び３日後に、マウスを１００μｇ／マウスの枯渇抗体で処理した。ＦＡＣＳ分析を行って、腫瘍を有さないマウス血流中のＣＤ８ａ  Ｔ細胞のレベルに関して制御した。インビボで誘導可能なＭＬＨ１ノックアウトを、タモキシフェンでｉ．ｐ．処理することにより得た。１０ｍｇ／ｍｌのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈのＴ５６４８）を１：１０のエタノール及び９：１０のピーナッツ油に溶解した。各マウスに１００μｌの薬物を５日間、毎日注入した。
【０１２２】
ウェスタンブロット
生化学的分析のために、全細胞を１０％  ＦＢＳで補充した培地中で成長させた。細胞を沸騰ＳＤＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１％  ＳＤＳ）中で可溶化することにより、総細胞タンパク質を抽出した。サンプルを１０分間沸騰させ、３０秒間遠心分離にかけた。抽出物を遠心分離により澄まし、ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により標準化した。増強化学発光システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びペルオキシダーゼ結合２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてウェスタンブロット検出を行った。以下の１次抗体をウェスタンブロットに使用した：抗ｍＭＬＨ−１、１：５０００（ＡｂＣａｍのｅｐｒ３８９４）、抗アクチン（Ｉ−１９）１：２０００（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから）。
【０１２３】
免疫表現型分析
麻酔したマウスの尾静脈から血液細胞を収集した。マウス腫瘍を細かく切り、コラゲナーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）及びＤＮＡｓｅ（１００μｇ／ｍｌ）で脱凝集し、濾過器で濾過した。細胞（１０６）を特異的抗体及びＺｏｍｂｉｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙキット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて染色した。ＦＡＣＳ  Ｄａｋｏ機器及びＦｌｏｗＪｏソフトウエアによりフローサイトメトリーを行った。以下の抗体を用いて表現型分析を行った。ＰｅｒＣｐ−ラットＣＤ４５（３０Ｆ１１）、ラットＡＰＣ  ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ラットＰＥ／Ｃｙ７  ＣＤ３（１７Ａ２）、ＦＩＴＣラットＣＤ４（ＲＭ４−５）及びＰＥラットＣＤ８（ＹＴＳ１５６．７．７）。
【０１２４】
エクソーム及び生物情報学分析
ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ｇＤＮＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡサンプルの捕捉及び濃縮を、ＩｎｔｅｇｒａＧｅｎによりＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎキットを使用して行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ４０００を使用してライブラリーを配列決定した。ＩｎｔｅｇｒａＧｅｎにより提供された未加工データの配列決定に関して、ＦＰＯ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｒｉｃｏｖｅｒｏ  ｅ  Ｃｕｒａ  ａ  Ｃａｒａｔｔｅｒｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ（ＩＲＣＣＳ−ＦＰＯ）にて生物情報学分析を行った。Ｆａｓｔｑフォーマットの未加工データを、ＣＡＳＡＶＡ  １．８ソフトウエアを使用して、ペアエンド７５−ｂｐ読み取りとして分離（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）した。平均で、７０ｘのメジアン深度が認められ、９７％を超える標的化領域が少なくとも１つの読み取りによりカバーされた。更なる分析の前に、ＢＷＡ−ｍｅｍアルゴリズムを使用してペアエンド読み取りをマウス参照、アセンブリーｍｍ１０にアラインした（Ｌｉ，Ｈ．＆Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，５８９−５９５（２０１０））。次いで、「ｒｍｄｕｐ」ｓａｍｔｏｏｌｓコマンドを使用して、ＰＣＲ重複をアラインメントファイルから除去した。３０特別注文のＮＧＳパイプラインを使用して、ＢａｌｂＣ及びＣ５７ｂｌ６に見出された生殖系列バリエーションを減算して、体細胞バリエーションを要求した。３１最小深度５ｘを示し、かつ少なくとも１％アレル頻度により支持された位置のみを考慮した。アレル頻度の有意性を計算するために、本発明者らは、各突然変異体に関するＦｉｓｃｈｅｒ試験を行った。標的化領域上に正規化したコーディング突然変異体のみを考慮して、突然変異負荷を計算した。バリエーションのアノテーションファイルから出発してネオ抗原を計算した。報告されたアミノ酸変化を使用して、コドン変化の範囲内でペプチド配列を再構成した。突然変異型ペプチド配列を適切にトリミングした後、ＮｅｔＭＨＣ  ４．０ソフトウエアに供給して、ネオ抗原を予測した。３２各バリエーションに関して、最高ランクを有する予測されたネオ抗原のみを、好適なペプチドアウトプットの生成のために考慮した。
【０１２５】
統計解析
Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの全データを、各々３つの実験反復を有する少なくとも３つの依存性実験の平均±ｓ．ｄ．として示す。グループ当たり少なくとも４匹のマウスを用いて、マウス実験を行った。Ｐ値をスチューデントｔ−検定により計算した。
【０１２６】
実施例２−モジュレーターに関する細胞ベースのアッセイ
哺乳動物細胞におけるミスマッチ修復（ＭＭＲ）を読み出すために、ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ）レポーター酵素の活性に基づくアッセイを開発した（「ＣＡ（２０）−ＮａｎｏＬｕｃアッセイ」）。ＣＡジヌクレオチド反復配列の２０コピー（「ＣＡ（２０）」と称される）をＮａｎｏＬｕｃコーディング配列の上流にクローン化して、ＮａｎｏＬｕｃ活性をＭＭＲ経路の制御下に置いた。このＣＡ（２０）繰り返しは、ＮａｎｏＬｕｃコーディング配列をフレーム外とし、従って、酵素発現及び活性は従って存在しない。しかしながら、ＣＡ（２０）繰り返しは、高頻度のＤＮＡ複製エラーを課される配列であり、従って任意の複製後ＤＮＡミスマッチを修復するＭＭＲ経路に依存している。ＭＭＲコンピテント細胞においては、任意のエラーは効率的に修復され、ＮａｎｏＬｕｃコーディング配列はフレーム外に留まり、従ってレポーター活性は低い。しかしながら、ＭＭＲが小分子により又は任意のＭＭＲ機構の遺伝的損失により阻害された場合、複製後エラーは未修復のままであり、フレームシフト突然変異が生じ得、それにより集団内のいくつかの細胞は、目下、機能的ＮａｎｏＬｕｃタンパク質を発現することになる。これは図１１に示す模式図に示される。
【０１２７】
従って、ＭＭＲ阻害は、ＣＡ（２０）ＮａｎｏＬｕｃコンストラクトを含むプラスミドが細胞にトランスフェクトされた際、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）活性の増大として報告され得る。ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）は、広い及び線形動的範囲を有する非常にプロセッシブな酵素であるため、ポジティブシグナルを生成するのに少数のＭＭＲエラーのみを必要とし、シグナル対ノイズ比を有する高感度アッセイに役立つことが予測される。
【０１２８】
このアッセイフォーマットを、ＨＥＫ２９３Ａ、ＦＴ及びＴ細胞を使用して試験した。これらの細胞において、ＭＬＨ１プロモーターは、様々な程度で過剰メチル化されており、従ってＭＬＨ１発現は低い。図１２に示すように、これらの細胞がＣＡ（２０）−ＮａｎｏＬｕｃコンストラクト及び野生型ヒトＭＬＨ１を発現しているプラスミドで共感染された場合、ＮａｎｏＬｕｃシグナルはほぼ完全に抑制される。これは、ＣＡ（２０）−ＮａｎｏＬｕｃプラスミドがＭＬＨ１活性について報告し、ＭＬＨ１活性がこのアッセイシステムを用いて測定できることを示す。
【０１２９】
これらの知見を拡張するために、グリシン６７をアルギニン（Ｇ６７Ｒ）に突然変異させることにより、ヒトＭＬＨ１のＡＴＰアーゼデッド突然変異体を生成した。これはヒトＬｙｎｃｈ症候群突然変異であり、以前に生化学的アッセイにおいてＡＴＰアーゼデッドとして報告されている。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において、ＷＴ  ＭＬＨ１を用いて以前と同じ明らかなＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性の阻害が観察されたが、３つの異なるＭＬＨ１  Ｇ６７Ｒプラスミドは、図１３に示すように、レポーター活性を阻害しなかった。
【０１３０】
化合物に関するアッセイは、以下のように行った：
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＷＴ  ＭＬＨ１及びＣＡ（２０）−ＮａｎｏＬｕｃプラスミドで共感染させ、細胞を９６ウェルプレート内に再び蒔いた後、ある用量範囲の潜在的阻害剤で処理した。活性化合物は、阻害ではなく、レポーターシグナルの増大を報告するであろう。これは、シグナル喪失により報告されるアッセイフォーマットにおいて、細胞毒性を起こし得る未成熟ヒット化合物に対処する際の明らかな利点であり、このアッセイフォーマットでは、シグナル低下は、多くの場合、細胞死に起因し、化合物は誤ってヒットと呼ばれることになる。
【０１３１】
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４  Ｒａｙｎｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐａｎｏｐｌｙ  ｏｆ  ｅｒｒｏｒｓ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １６，７１−８１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ．２０１５．１２（２０１６）．
５  Ｂｒｏｎｎｅｒ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅＨｏｍｏｌｏｇｕｅＨＭＬＨ１  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈＨｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，２５８−２６１，ｄｏｉ：１０．１０３８／３６８２５８ａ０（１９９４）．
６  Ｋｏｏｒｎｓｔｒａ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｏｌｏｎｉｃ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｙｎｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １０，４００−４０８，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ１４７０−２０４５（０９）７００４１−５（２００９）．
７  Ｌａｘ，Ｓ．Ｆ．，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｂ．，Ｔａｓｈｉｒｏ，Ｈ．，Ｓｌｅｂｏｓ，Ｒ．Ｊ．＆Ｈｅｄｒｉｃｋ，Ｌ．Ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐ５３，Ｋ−ｒａｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｄｉｆｆｅｒｓ  ｉｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ８８，８１４−８２４（２０００）．
８  Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｗ．＆  Ｇｏｕｒｌｅｙ，Ｃ．Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  −−  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １３２，５０６−５１２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｇｙｎｏ．２０１３．１２．００３（２０１４）．
９  Ｏｋｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｉｎｔ  ２０１０，９８４０１３，ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１０／９８４０１３（２０１０）．
１０  Ｐｏｎｔｉ，Ｇ．，Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ，Ｅ．，Ｒｕｉｎｉ，Ｃ．，Ｐｅｒｃｅｓｅｐｅ，Ａ．＆  Ｔｏｍａｓｉ，Ａ．Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｕｎｄｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｌｙｎｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ８７，５０７−５１６，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｇｅ．１２５２９（２０１５）．
１１  Ｖｉｌａｒ，Ｅ．＆  Ｇｒｕｂｅｒ，Ｓ．Ｂ．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ−ｔｈｅ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ７，１５３−１６２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２００９．２３７（２０１０）．
１２  Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ＰＤ−１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，１２４−１２８，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ１３４８（２０１５）．
１３  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．＆  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，６９−７４，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａａ４９７１（２０１５）．
１４  ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎａｌ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｅｌｉｃｉｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ１４９０（２０１６）．
１５  Ｓｐｅｒｏｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｉｔｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｌａｎｋ  ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８，３７５−３７９（２００９）．
１６  Ｂａｒｄｅｅｓｙ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｔｈ  ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐ１９（Ａｒｆ）−ｐ５３  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，５９４７−５９５２，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０６０１２７３１０３（２００６）．
１７  Ｌｅ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ＰＤ−１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ−Ｒｅｐａｉｒ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７２，２５０９−２５２０，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１５００５９６（２０１５）．
１８  Ｘｉａｏ，Ｙ．＆  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｌｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｇｏｏｄ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５，１６−１８，ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１４−１３９７（２０１５）．
１９  Ｌｌｏｓａ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｖｉｇｏｒｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｌｅ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ５，４３−５１，ｄｏｉ：１０．１１５８／２１５９−８２９０．ＣＤ−１４−０８６３（２０１５）．
２０  Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６，２４４３−２４５４，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１２００６９０（２０１２）．
２１  Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６，２４５５−２４６５，ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１２００６９４（２０１２）．
２２  Ｌｅｒｎｅｒ，Ｗ．Ａ．，Ｐｅａｒｌｓｔｅｉｎ，Ｅ．，Ａｍｂｒｏｇｉｏ，Ｃ．＆  Ｋａｒｐａｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｓｈａｒｅｄ  ｂｙ  ｏｔｈｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏｗａｒｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３１，４６３−４６９（１９８３）．
２３  Ｃａｓｔｒｏ−Ｇｉｎｅｒ，Ｆ．，Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．＆  Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ｔｈｅ  ｍｉｎｉ−ｄｒｉｖｅｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｇｅｎｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １５，６８０−６８５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｃ３９９９（２０１５）．
２４  Ｂａｒｄｅｌｌｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，５７７０−５７７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１０８２８９８（２００１）．
２５  Ｃｈｉａｐｐｉｎｅｌｌｉ，Ｋ．Ｂ．，Ｚａｈｎｏｗ，Ｃ．Ａ．，Ａｈｕｊａ，Ｎ．＆  Ｂａｙｌｉｎ，Ｓ．Ｂ．Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  Ｃｏｍｂａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１５−２１２５（２０１６）．
２６  Ｆｉｎｋ，Ｄ．，Ａｅｂｉ，Ｓ．＆Ｈｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｂ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４，１−６（１９９８）．
２７  ＭｃＦａｌｉｎｅ−Ｆｉｇｕｅｒｏａ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎｏｒ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＳＨ２  Ｅｘｅｒｔ  ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｎ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５，３１２７−３１３８，ｄｏｉ：１０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１４−３６１６（２０１５）．
２８  Ｋｉｌｐｉｖａａｒａ，Ｏ．＆  Ａａｌｔｏｎｅｎ，Ｌ．Ａ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，１５５９−１５６２，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３３８９９（２０１３）．
２９  Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．＆  Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，７８３−７８４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３０４７（２０１４）．
３０  Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／Ｍａｐ  ｆｏｒｍａｔ  ａｎｄ  ＳＡＭｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，２０７８−２０７９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ３５２（２００９）．
３１  Ｓｉｒａｖｅｇｎａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＥＧＦＲ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３８７０（２０１５）．
３２  Ａｎｄｒｅａｔｔａ，Ｍ．＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｇａｐｐｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｕｓｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３２，５１１−５１７，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｖ６３９（２０１６）．
【図１】
2019515951.tif 000006
【図２】
2019515951.tif 000007
【図３】
2019515951.tif 000008
【図４】
2019515951.tif 000009
【図５】
2019515951.tif 000010
【図６】
2019515951.tif 000011
【図７】
2019515951.tif 000012
【図８】
2019515951.tif 000013
【図９】
2019515951.tif 000014
【図１０】
2019515951.tif 000015
【図１１】
2019515951.tif 000016
【図１２】
2019515951.tif 000017
【図１３】
2019515951.tif 000018
【国際調査報告】
2019515951.tif 000019
2019515951.tif 000020
2019515951.tif 000021
2019515951.tif 000022
2019515951.tif 000023
2019515951.tif 000024
2019515951.tif 000025