(57)【要約】  本発明は、雌牛における受胎率を高めるのに有効な免疫調節のための組成物及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節剤組成物であって、
ａ．カチオン性リポソーム送達ビヒクル；及び
ｂ．雌牛における受胎率を高めるための免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子
を含む、免疫調節剤組成物。
【請求項２】
前記核酸分子が、少なくとも１つの免疫刺激性ＣｐＧモチーフ及び少なくとも１つの非免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含む、請求項１に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項３】
前記核酸分子が、配列番号１、配列番号２、又は配列番号３の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する、請求項１又は２に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項４】
前記リポソーム送達ビヒクルが、多層小胞脂質及び押出脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項５】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロール；並びにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロールからなる群から選択される一対の脂質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が配列番号１を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が配列番号２を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項８】
生物学的薬剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項９】
前記生物学的薬剤が、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗微生物剤、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項１０】
静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレーエアロゾル、経口、眼内、気管内、及び鼻腔内からなる群から選択される投与のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項１２】
雌牛における受胎率が、対照集団における受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫調節剤組成物。
【請求項１３】
有効量の免疫調節剤組成物を雌牛に投与することを含む、前記雌牛における受胎率を増加させる方法であって、前記免疫調節剤組成物が、
ａ．カチオン性リポソーム送達ビヒクル；及び
ｂ．免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子
を含む、方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が、少なくとも１つの免疫刺激性ＣｐＧモチーフ及び少なくとも１つの非免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子が、配列番号１又は配列番号２の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リポソーム送達ビヒクルが、多層小胞脂質及び押出脂質からなる群から選択される脂質を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポソーム送達ビヒクルが、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロール；並びにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロールからなる群から選択される一対の脂質を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子が配列番号１を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸分子が配列番号２を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的薬剤をさらに含む、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物学的薬剤が、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗微生物剤、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与が、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレーエアロゾル、経口、眼内、気管内、及び鼻腔内からなる群から選択される、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
雌牛における受胎率が、対照集団における受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、雌牛における免疫調節のための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、雌牛における初産受胎率を高めるのに有効な組成物及び方法を含む。
【背景技術】
【０００２】
乳牛の最も高い罹患率及び死亡率は、周産期に発生する。ミエロペルオキシダーゼアッセイ及び食作用アッセイを介して実証されるように、免疫機能は、分娩時に損なわれ、白血球数が減少し、白血球機能が低下することが示されている。分娩時に免疫機能を強化することができれば、免疫機能に敏感になる場合がある生殖転帰を改善することができる。
【０００３】
乳牛の繁殖力は、群れの大きさの増加、発情検出感度及び特異度の低下、分娩時の体調スコアの低下、並びに産後の体調スコア喪失率の上昇を含む複数の要因により国際規模で低下している。ＭｃＤｏｕｇａｌｌ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ５２，１８５−１９４（２００６）。最適な群れの健康及び生産性を維持するためには、高レベルの生殖性能が必要である。雌牛及び若雌牛の生殖能力を増大させることができる組成物及び方法が当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＭｃＤｏｕｇａｌｌ，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ５２，１８５−１９４（２００６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、雌牛及び若雌牛における受胎率を高めるための免疫調節剤組成物に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル、並びに雌牛及び若雌牛における受胎率を高めるための免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子を含み得る。
【０００６】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの免疫刺激性ＣｐＧモチーフ及び少なくとも１つの非免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含む。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１を含む。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号２を含む。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号３を含む。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号４を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、多層小胞脂質及び押出脂質からなる群から選択される脂質を含む。さらなる実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロール；並びにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロールからなる群から選択される一対の脂質を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、生物学的薬剤をさらに含む。さらなる実施形態では、生物学的薬剤は、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗微生物剤、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、免疫調節組成物は、投与用であり、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレーエアロゾル、経口、眼内、気管内、子宮内、膣内、及び鼻腔内からなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して増加する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、非周期的な雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して増加する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して増加する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、非周期的な雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して増加する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、雌牛における受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して、０．０５以下のｐ値によって測定されるように増加する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、非周期的な雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、非周期的な雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する。
【００１８】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、雌牛における受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない核酸分子を含み得る。
【００１９】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、雌牛における受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子を含み得る。
【００２０】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、非周期的な雌牛における受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない核酸分子を含み得る。
【００２１】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、非周期的な雌牛における受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子を含み得る。
【００２２】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、雌牛における初産受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない核酸分子を含み得る。
【００２３】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、雌牛における初産受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子を含み得る。
【００２４】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、非周期的な雌牛における初産受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない核酸分子を含み得る。
【００２５】
本発明はまた、雌牛に有効量の免疫調節剤組成物を投与することを含む、非周期的な雌牛における初産受胎率を増加させる方法に関する。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、少なくとも１つの免疫刺激性ＣｐＧモチーフ及び少なくとも１つの非免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含む。さらなる実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の配列と少なくとも８０％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１を含む。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号２を含む。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号３を含む。他の実施形態では、核酸分子は、配列番号４を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、多層小胞脂質及び押出脂質からなる群から選択される脂質を含む。さらなる実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロール；Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロール；１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロール；並びにジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロールからなる群から選択される一対の脂質を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、生物学的薬剤をさらに含む。さらなる実施形態では、生物学的薬剤は、免疫増強タンパク質、免疫原、ワクチン、抗微生物剤、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫調節剤組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、免疫調節組成物は、投与用であり、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレーエアロゾル、経口、眼内、気管内、及び鼻腔内からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ｐＭＢ７５．６プラスミド（配列番号１）のマップを示す図である。
【図２】ｐＧＣＭＢ７５．６プラスミド（配列番号２）のマップを示す図である。
【図３】ｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミド（配列番号３）のマップを示す図である。
【図４Ａ】最初の授精に対する受胎の確率（推定周辺平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ））のチャートを示す図である。
【図４Ｂ】治療群別の周期的及び非周期的な雌牛についての繁殖プログラムの計画的開始後３週間以内の妊娠の確率（推定周辺平均及びＳＥＭ）を示す図である。アスタリスクは、非周期的群内の治療間の違いを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明によれば、雌牛における受胎率を増加させるための免疫調節剤組成物及びその使用方法。免疫調節剤組成物は、カチオン性リポソーム送達ビヒクル及び免疫原をコードしない単離された細菌由来の核酸分子を含む。免疫調節剤組成物を使用する組成物及び方法は、以下により詳細に考察される。
【００３２】
Ｉ．組成物
本明細書に記載されているものなどの本発明に有用な組成物は、一般に、予防的療法、メタフィラキシー療法、又は感染症の治療療法として使用することができる。そのような組成物は、本明細書において免疫調節剤組成物と呼ばれる。免疫調節剤組成物は、雌牛における受胎率を増加させることができる、少なくとも免疫刺激性プラスミド又は免疫刺激性ＤＮＡ配列を含む。いくつかの態様では、免疫調節剤組成物は、リポソーム送達ビヒクルも含み得る。
【００３３】
Ａ．核酸
いくつかの態様では、本発明は、雌牛における受胎率を高めるのに有用な核酸分子に関する。本明細書に記載の核酸分子は、直鎖状二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡ、アミノ酸配列、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの組み合わせとして免疫刺激性プラスミドに含まれてもよい。いくつかの態様では、本発明は、免疫刺激性プラスミド又は免疫刺激性ＤＮＡ配列を含有する核酸分子、ベクター、及び宿主細胞（インビトロ、インビボ、又はエキソビボ）に関する。
【００３４】
本明細書に記載の核酸分子は、ＣｐＧモチーフに富んでいる。そのようなＣｐＧモチーフは、ＴＬＲ９及びＴＬＲ２１などの特定のＴｏｌｌ様受容体を介して免疫刺激性を誘導し得る。さらに、本明細書に記載の核酸分子は、非ＣｐＧ免疫刺激性モチーフも含有する。いくつかの態様では、核酸分子は、ランダム核酸配列において予想されるＣｐＧモチーフの頻度を超える約２〜２０％のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様では、核酸分子は、ランダム核酸配列において予想されるＣｐＧモチーフの頻度を超える約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０％、又はそれ以上のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様では、核酸分子は、ランダム核酸配列において予想されるＣｐＧモチーフの頻度を超える約１０％のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様では、脊椎動物ＤＮＡと比較して、１０倍を超えるＣｐＧモチーフの濃縮が観察される。いくつかの態様では、核酸分子は、脊椎動物ＤＮＡと比較して、約２〜５０倍又はそれ以上のＣｐＧモチーフを含有する。いくつかの態様では、核酸分子は、脊椎動物ＤＮＡと比較して、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５倍又はそれ以上のＣｐＧモチーフを含有する。
【００３５】
いくつかの態様では、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含む免疫刺激性プラスミド、又はＤＮＡ配列に関する。例えば、本明細書に記載のｐＭＢ７５．６プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子カナマイシンを含む。ｐＭＧ７５．６の配列は、表１に配列番号１として提供されている。
【００３６】
いくつかの態様では、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含まない免疫刺激性プラスミド、又はＤＮＡ配列に関する。プラスミドは、任意の選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子を欠いていてもよい。例えば、本明細書に記載のｐＧＣＭＢ７５．６プラスミドは、任意の全長又は機能的選択可能な若しくはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含まない。ｐＧＣＭＢ７５．６の配列は、表１に配列番号２として提供されている。
【００３７】
いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫刺激性プラスミドは、好ましくは全長又は機能的選択可能な若しくはスクリーニング可能なマーカーをコードする核酸配列を含まない。いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子を含まない。例えば、プラスミドは、カナマイシン耐性遺伝子を含まない。いくつかの態様では、本明細書に記載のプラスミドは、免疫原をコードしないことが好ましい。
【００３８】
いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子ではない選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子をコードする核酸配列を含み得る。例えば、本明細書に記載のｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドは、スクリーニング可能なマーカーとしてＬａｃＺ遺伝子を含む。ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のマップを図３に提供し、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６のヌクレオチド配列を表１に配列番号３として提供する。図３に示されるように、ｐＬａｃＺＭＢ７５．６は、ｐＧＣＭＢ７５．６と類似しているが、ＬａｃＺスクリーニング可能なマーカーを含有する。
【００３９】
ｐＭＢ７５．６、ｐＧＣＭＢ７５．６、又はｐＬａｃＺＭＢ７５．６プラスミドのヌクレオチド配列は、それらの免疫刺激性特性に著しく悪影響を及ぼすことなくある程度まで変え得ることが理解されよう。いくつかの態様では、本発明は、ｐＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫刺激性プラスミドに関する。免疫刺激性プラスミドは、好ましくはｐＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドは、より好ましくはｐＭＢ７５．６の配列（配列番号１）を含む。
【００４０】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号２）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を含む免疫刺激性プラスミドに関する。免疫刺激性プラスミドは、好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号２）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドは、より好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号２）を含む。
【００４１】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫刺激性プラスミドに関する。免疫刺激性プラスミドは、好ましくはｐＭＢ７５．６の配列（配列番号１）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドは、より好ましくはｐＭＢ７５．６の配列（配列番号１）からなる。
【００４２】
いくつかの態様では、本発明は、ｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号２）と少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列からなる免疫刺激性プラスミドに関する。免疫刺激性プラスミドは、好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号２）と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列からなる。いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドは、より好ましくはｐＧＣＭＢ７５．６の配列（配列番号２）からなる。
【００４３】
本発明の別の重要な態様は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号１又は配列番号２にハイブリダイズする核酸配列を含む、免疫応答を刺激することができる免疫刺激性ＤＮＡ配列又は免疫刺激性プラスミドを提供する。好適な核酸配列は、本発明の核酸と相同、実質的に類似、又は同一のものを含む。いくつかの態様では、相同核酸配列は、配列番号１に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列類似性、又はそれぞれの相補的配列を有する。他の態様では、相同核酸配列は、配列番号２に対して、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列類似性、又はそれぞれの相補的配列を有する。配列類似性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０に記載されている、ＢＬＡＳＴなどの当技術分野において既知の多数のアルゴリズムを使用して計算し得る。核酸は、遺伝コードの縮重のために上記の核酸と配列が異なり得る。一般に、参照配列は、１８個のヌクレオチド、より通常には３０個又はそれ以上のヌクレオチドであり、比較目的のために組成物の全核酸配列を含み得る。
【００４４】
配列番号１又は配列番号２にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列が本明細書において企図される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、５０℃以上及び０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム／１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションなどの条件が挙げられる。別の例は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡの溶液中で４２℃で一晩インキュベートして、続いて約６５℃で０．１×ＳＳＣ中で洗浄する。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上記の特定の条件と少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は９５％ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当技術分野で既知であり、本発明の核酸の相同体を同定するためにも用いられ得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ６，ｐｕｂ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９８９）。
【００４５】
突然変異体が核酸配列を含む限り、本明細書に記載のＤＮＡ分子の突然変異体ヌクレオチドを使用して、本明細書に記載のように雌牛における受胎率を増加させる能力を維持し得る。そのような突然変異のＤＮＡ配列は、通常、１若しくは複数のヌクレオチド又はアミノ酸が異なる。配列変化は、置換、挿入、欠失、又はそれらの組み合わせであり得る。クローン化遺伝子の突然変異誘発のための技術は、当技術分野で既知である。部位特異的突然変異誘発のための方法は、Ｇｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２，１９９３；Ｂａｒａｎｙ，Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３，１９８５；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：５３７−９，１９８５；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，ｐｐ．１５．３−１５．１０８に見ることができ、全て参照により本明細書に組み込まれる。要約すると、本発明は、対象において細胞質ゾルＤＮＡ監視分子を活性化することができる核酸配列及びその変異体又は突然変異体に関する。また、本発明は、記載された核酸配列によってコードされた中間ＲＮＡ、及びコードされた任意の得られたアミノ酸配列を包含する。
【００４６】
いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドのヌクレオチド配列が配列番号１及び２に提供される配列と異なる場合、プラスミド中のＣｐＧジヌクレオチドは、インタクトなままであることが好ましい。あるいは、プラスミドのヌクレオチド配列が、ＣｐＧジヌクレオチドが除去されるように改変される場合、プラスミド中のＣｐＧジヌクレオチドの総数が同じなままであるように、プラスミドの配列は別の場所で改変され得る。ヌクレオチド配列ｐＧＣＭＢ７５．６に既に存在するものに加えて、さらなるＣｐＧジヌクレオチドもプラスミドに導入され得る。したがって、例えば、本明細書に記載の免疫刺激性プラスミドは、好ましくは少なくとも約２００、少なくとも約２２０、少なくとも約２４０、少なくとも約２６０、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８３、少なくとも約２８５、又は少なくとも約２８８個のＣｐＧジヌクレオチドを含む。例えば、免疫刺激性プラスミドは、２８３個のＣｐＧジヌクレオチドを含み得る。
【００４７】
いくつかの態様では、免疫刺激性プラスミドのヌクレオチド配列が本明細書に提供される配列と異なる場合、プラスミド中のＣｐＧモチーフ型は、細胞質ゾルＤＮＡ監視分子の結果として生じる活性化を調節するために変えられる。例えば、免疫刺激性プラスミド／ＤＮＡの特定の閾値に応答して特定の細胞質ゾルＤＮＡ監視分子の活性化を増加させるために、免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数を増加させ得る。さらなる例として、非免疫刺激性ＣｐＧモチーフの数を増加させて、特定の細胞質ゾルＤＮＡ監視分子の活性化を減少させ得、かつ／又は他のＤＮＡ監視分子の活性化を増加させ得る。
【００４８】
特に、本発明は、本明細書に記載の免疫刺激性プラスミド又はＤＮＡ配列のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤に関する。
【００４９】
Ｂ．免疫調節剤
本明細書に記載の免疫刺激性プラスミドと共に使用するのに好適な免疫調節剤組成物は、米国特許出願公開第２０１２／００６４１５１Ａ１号及び第２０１３／０２９５１６７Ａ１号に記載されており、その両方の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
免疫調節剤組成物は、本明細書に記載のリポソーム送達ビヒクル及び少なくとも１つの免疫刺激性プラスミド、又はＤＮＡ配列を含む。
【００５１】
好適なリポソーム送達ビヒクルは、治療済みの対象の組織に核酸分子を送達することができる脂質組成物を含む。リポソーム送達ビヒクルは、核酸分子及び／又は生物学的薬剤を送達するのに十分な時間量の間対象において安定なままであり得ることが好ましい。例えば、リポソーム送達ビヒクルは、レシピエント対象において少なくとも約５分間、少なくとも約１時間、又は少なくとも約２４時間安定である。
【００５２】
本発明のリポソーム送達ビヒクルは、細胞中への核酸分子の送達を促進することができる脂質組成物を含む。核酸分子が１又は複数のタンパク質をコードする場合、核酸：リポソーム複合体は、好ましくは、送達される核酸１マイクログラム（μｇ）あたりの総組織タンパク質１ミリグラム（ｍｇ）あたりで発現される少なくとも約１ピコグラム（ｐｇ）のタンパク質のトランスフェクション効率を有する。例えば、核酸：リポソーム複合体のトランスフェクション効率は、送達される核酸１μｇあたりの総組織タンパク質１ｍｇあたりで発現される少なくとも約１０ｐｇのタンパク質；又は送達される核酸１μｇあたりの総組織タンパク質１ｍｇあたりで発現される少なくとも約５０ｐｇのタンパク質であり得る。複合体のトランスフェクション効率は、送達される核酸１μｇあたりの総組織タンパク質１ｍｇあたりで発現される１フェムトグラム（ｆｇ）ほど低いタンパク質であってもよく、上記の量がより好ましい。
【００５３】
本発明の好ましいリポソーム送達ビヒクルは、直径が約１００〜５００ナノメートル（ｎｍ）である。例えば、リポソーム送達ビヒクルは、直径が約１５０〜４５０ｎｍ、又は約２００〜４００ｎｍであり得る。
【００５４】
好適なリポソームは、例えば当業者に既知の遺伝子送達方法において一般的に使用されるものなどの任意のリポソームを含む。好ましいリポソーム送達ビヒクルは、多層小胞（ＭＬＶ）脂質及び押出脂質を含む。ＭＬＶの調製方法は、当技術分野において周知である。より好ましいリポソーム送達ビヒクルは、ポリカチオン性脂質組成物を有するリポソーム（すなわちカチオン性リポソーム）及び／又はポリエチレングリコールに共役したコレステロール骨格を有するリポソームを含む。例示的なカチオン性リポソーム組成物としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びコレステロール、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）及びコレステロール、１−［２−（オレオイルオキシ）エチル］−２−オレイル−３−（２−ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）及びコレステロール、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）及びコレステロール、並びにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。送達ビヒクルとして使用するための最も好ましいリポソーム組成物は、ＤＯＴＩＭ及びコレステロールを含む。
【００５５】
好適な核酸分子は、本明細書に記載の免疫刺激性プラスミドのいずれかを含む。コード核酸配列は、タンパク質又はペプチドの少なくとも一部をコードし、非コード配列は、タンパク質又はペプチドのいかなる部分もコードしない。本発明によれば、「非コード」核酸は、プロモーター領域などの転写単位の調節領域を含み得る。「空のベクター」という用語は、「非コード」という用語と互換的に使用することができ、特に、遺伝子挿入物を含まないプラスミドベクターなどのタンパク質コード部分の非存在下での核酸配列を指す。本明細書に記載のプラスミドによってコードされるタンパク質の発現は、細胞質ゾルＤＮＡ監視分子の活性化には必要とされず；したがって、プラスミドは、転写制御配列に機能的に連結されたいかなるコード配列も含有する必要はない。しかしながら、免疫原及び／又はサイトカインをコードする核酸配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を組成物中に含めることによって、さらなる利点が得られ得る（すなわち、抗原特異的及び高められた免疫性）。免疫原及び／又はサイトカインをコードするこのような核酸配列は、本明細書に記載の免疫刺激性プラスミドに含まれてもよく、又は組成物中の別個の核酸（例えば、別個のプラスミド）に含まれ得る。
【００５６】
本明細書に記載の免疫刺激性プラスミドとリポソームとの複合体形成は、当技術分野において標準的な方法を使用して、又はその内容全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，６９３，０８６号に記載の方法を使用して達成され得る。リポソームに添加するためのプラスミドの好適な濃度は、全身免疫応答が誘発されるように十分な量のプラスミドを対象に送達するのに有効な濃度を含む。例えば、約０．１μｇ〜約１０μｇのプラスミドを約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせることができ、約０．５μｇ〜約５μｇのプラスミドを約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせることができ、又は約１．０μｇのプラスミドを約８ｎｍｏｌのリポソームと組み合わせることができる。組成物中のプラスミド対脂質（μｇプラスミド：ｎｍｏｌ脂質）の比は、重量で少なくとも約１：１のプラスミド：脂質（例えば、１μｇプラスミド：１ｎｍｏｌ脂質）であり得る。例えば、プラスミド対脂質の比は、少なくとも約１：５、少なくとも約１：１０、又は少なくとも約１：２０であり得る。本明細書で表される比は、組成物中のカチオン性脂質の量に基づいており、組成物中の脂質の総量には基づいていない。本発明の組成物中のプラスミド対脂質の比は、好適には重量基準で約１：１〜約１：８０のプラスミドプラスミド：脂質；重量基準で約１：２〜約１：４０のプラスミドプラスミド：脂質；重量基準で１：３〜約１：３０のプラスミドプラスミド：脂質；又は重量基準で約１：６〜約１：１５のプラスミド：脂質である。
【００５７】
Ｃ．生物学的薬剤
本明細書に記載の免疫調節剤組成物のいずれも、リポソーム送達ビヒクル及び本明細書に記載のプラスミドの少なくとも１つに加えて、少なくとも１つの生物学的薬剤をさらに含むことができる。
【００５８】
好適な生物学的薬剤は、疾患を予防又は治療するのに有効な薬剤である。そのような生物学的薬剤としては、免疫エンハンサータンパク質、免疫原、ワクチン、抗菌剤、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。好適な免疫増強タンパク質は、免疫を増強することが既知のそれらのタンパク質である。非限定的な例として、タンパク質のファミリーを含むサイトカインは、既知の免疫増強タンパク質ファミリーである。好適な免疫原は、体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発するタンパク質であり、その結果、対象への免疫原の投与は、対象の組織内で遭遇する同じ又は類似のタンパク質に対する免疫原特異的免疫応答を引き起こす。免疫原は、細菌、ウイルス、寄生虫、又は真菌によって発現される病原性抗原を含み得る。好ましい抗原としては、対象において感染症を引き起こす生物由来の抗原が挙げられる。本発明によれば、免疫原は、体液性及び／又は細胞性の免疫応答を誘発する、天然に存在するか又は合成に由来するタンパク質の任意の部分であり得る。そのため、抗原又は免疫原のサイズは、間の任意のサイズを含む、約５〜１２個のアミノ酸程度の小ささであり、かつ全長のタンパク質と同じくらいの大きさであり得る。抗原は、多量体タンパク質又は融合タンパク質であり得る。抗原は、精製抗原であり得る。あるいは、免疫エンハンサータンパク質又は免疫原は、免疫刺激性プラスミドによって、又は免疫調節剤組成物中に含まれる別の核酸によってコードされ得る。免疫エンハンサータンパク質又は免疫原が免疫調節剤組成物中の核酸分子によってコードされている場合、免疫エンハンサータンパク質又は免疫原をコードする核酸配列は、転写制御配列に作動可能に連結されており、その結果、免疫原は対象の組織において発現され、それによって非特異的免疫応答に加えて、対象において免疫原特異的免疫応答を誘発する。病原体抗原免疫原性又はサイトカイン活性などの免疫原性についてスクリーニングするための技術は、当業者に既知であり、種々のインビトロ及びインビボアッセイを含む。
【００５９】
生物学的薬剤がワクチンである場合、ワクチンとしては、生ワクチン、感染性ワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチン、若しくは寄生虫ワクチン、又は死滅ワクチン、不活化ワクチン、ウイルスワクチン、細菌ワクチン、若しくは寄生虫ワクチンが挙げられ得る。１若しくは複数のワクチン、生ウイルスワクチン、又は死ウイルスワクチンを本発明の免疫調節剤組成物と組み合わせて使用してもよい。好適なワクチンとしては、鳥類又はウシ種について当技術分野において既知のものが挙げられる。
【００６０】
生物学的薬剤は、抗菌剤であり得る。好適な抗菌剤としては、キノロン、好ましくはフルオロキノロン、β−ラクタム、及びマクロライド−リンコサミドストレプトグラミン（ＭＬＳ）抗生物質が挙げられる。
【００６１】
好適なキノロンとしては、ベノフロキサシン、ビンフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ダノフロキサシン、ジフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、ゲミフロキサシン、イバフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マルボフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オルビフロキサシン、パズフロキサシン、プラドフロキサシン、ペルフロキサシン、サラフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、及びトスフロキサシンが挙げられる。好ましいフルオロキノロンとしては、シプロフロキサシン、ダノフロキサシン、エンロフロキサシン、モキシフロキサシン、及びプラドフロキサシンが挙げられる。好適なナフチリドンとしては、ナリジクス酸が挙げられる。好適なβ−ラクタムとしては、ペニシリン（例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ベンザチンペニシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、共アモキシクラブ［すなわちアモキシシリン／クラブラン酸］、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、フェノキシメチルペニシリン、ピペラシリン、プロカインペニシリン、テモシリン、及びチカルシリン）；セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファロニウム、セファマンドール、セファプリリン、セファゾリン、セフェピム、セフィキシム、セフォタキシム、セフォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフキノム、セフタジジム、セフチオフル、セフトリアキソン、セフロキシム、セファレキシン、セファロチン、及びデフォテタン）；カルバペネム及びペネム（例えば、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、及びメロペネム）；モノバクタム（例えば、アズトレオナム、ノカルジシンＡ、タブトキシン−β−ラクタム、及びチゲモナム）；並びにβ−ラクタマーゼ阻害剤（例えば、クラブラン酸、スルバクタム、及びタゾバクタム）が挙げられる。好ましいβ−ラクタムとしては、セファロスポリン、特にセファゾリンが挙げられる。
【００６２】
好適なＭＬＳ抗生物質としては、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピルリマイシン、及び任意のマクロライド系抗生物質が挙げられる。好ましいリンコサミド系抗生物質は、ピルリマイシンである。
【００６３】
他の抗菌剤としては、アミノグリコシド、クロピドール、ジメトリダゾール、エリスロマイシン、フラミセチン、フラゾリドン、ハロフジノン、２−ピリドン、ロベニジン、スルホンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、様々なプロイロムチリン（例えば、チアムリン及びバレムリン）、並びに様々なストレプトマイシン（例えば、モネンシン、ナラシン、及びサリノマイシン）が挙げられる。
【００６４】
ＩＩ．方法
Ａ．免疫刺激の方法
本発明の一実施形態では、ウシ種の雌成員に有効量の免疫調節剤組成物を投与することによって、ウシ種の雌成員において免疫応答が誘発される。有効量は、ウシ種の雌成員において免疫応答を誘発するのに十分な量である。免疫調節剤は、リポソーム送達ビヒクル及び核酸分子を含む。
【００６５】
一実施形態では、免疫調節剤の有効量は、動物１匹あたり約１マイクログラム〜約１０００マイクログラムである。別の実施形態では、免疫調節剤の有効量は、動物１匹あたり約５マイクログラム〜約５００マイクログラムである。さらに別の実施形態では、免疫調節剤の有効量は、動物１匹あたり約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムである。さらなる実施形態では、免疫調節剤の有効量は、動物１匹あたり約１０マイクログラム〜約５０マイクログラムである。
【００６６】
本発明の別の実施形態では、リポソーム送達ビヒクル、単離された核酸分子、及び生物学的薬剤を含む有効量の免疫調節剤を投与することによって、ウシ種の雌成員において免疫応答が誘発される。生物学的薬剤は、免疫調節剤と混合されてもよく、又は免疫調節剤と同時投与されてもよく、又はそれらと無関係に投与されてもよいと企図される。独立した投与は、免疫調節剤の投与の前又は後であり得る。また、免疫調節剤又は生物学的薬剤の複数回投与を使用して増強された免疫を拡張し得ることも企図される。さらに、２つ以上の生物学的薬剤を免疫調節剤と同時投与してもよく、免疫調節剤の前に投与してもよく、免疫調節剤の投与後に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。
【００６７】
Ｂ．受胎率
本発明の方法は、雌牛における受胎率を高めるのに有用である。いくつかの実施形態では、雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して増加する。いくつかの好ましい実施形態では、雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して、０．０５以下のｐ値によって測定されるように増加する。
【００６８】
本発明の方法は、雌牛における初産受胎率を高めるのに有用である。本明細書で使用される場合、初産受胎率は、最初の授精に受胎した人工授精に産まれる雌牛の割合を指す。好ましい実施形態では、雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して増加する。いくつかの好ましい実施形態では、雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する。
【００６９】
本発明の方法は、非周期的な雌牛における受胎率を高めるのに有用である。本明細書で使用される場合、「非周期的」は、観察によって、又は繁殖の計画的開始のおよそ３０日前にテールペイントの除去によって発情期に検出されない雌牛を指す。好ましい実施形態では、非周期的な雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して増加する。いくつかの好ましい実施形態では、非周期的な雌牛における受胎率は、対照集団における受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する。
【００７０】
本発明の方法は、非周期的な雌牛における初産受胎率を高めるのに有用である。好ましい実施形態では、非周期的な雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して増加する。いくつかの好ましい実施形態では、非周期的な雌牛における初産受胎率は、対照集団における初産受胎率に対して、０．０５以下のｐ値で測定されるように増加する。
【００７１】
Ｃ．管理
種々の投与経路が利用可能である。選択された特定の様式は、もちろん、選択された特定の生物学的薬剤、対象の年齢及び一般的健康状態、治療されている特定の状態、並びに治療効果に必要な投与量に依存する。本発明の方法は、臨床的に許容できない悪影響を引き起こさずに有効レベルの免疫応答を生じる任意の投与様式を使用して実施され得る。組成物は、簡便には単位剤形で提供されてもよく、当技術分野において周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。
【００７２】
ウシ種のワクチン接種は、任意の年齢で行うことができる。ワクチンは、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、スプレー／エアロゾル、経口、眼内、気管内、鼻腔内、又は当技術分野で既知の他の方法によって投与され得る。さらに、本発明の方法は、日常的なワクチン接種スケジュールに基づいて使用されてもよいと企図される。免疫調節剤はまた、静脈内、筋肉内、皮下、スプレー、経口、眼内、気管内、経鼻的、又は当技術分野で既知の他の方法によって投与され得る。一実施形態では、免疫調節剤は、皮下投与される。別の実施形態では、免疫調節剤は、筋肉内投与される。さらに別の実施形態では、免疫調節剤は、スプレーとして投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤は、経口投与される。
【００７３】
一実施形態では、免疫調節剤は、分娩前にそれ自体で動物に投与される。別の実施形態では、免疫調節剤は、分娩後にそれ自体で動物に投与される。さらに別の実施形態では、免疫調節剤は、分娩と同時にそれ自体で動物に投与される。さらに別の実施形態では、免疫調節剤は、分娩前及び分娩と同時にそれ自体で動物に投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、分娩前のワクチン接種と同時に同時投与される。なおさらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、分娩と同時にワクチン接種と同時に同時投与される。同時投与は、動物の同じ一般的な場所に互いに隣接する２つの異なる部位（すなわち、動物の首に互いに隣接して注射する）、動物の反対側の同じ一般的な場所（すなわち、首の両側に１つずつ）、又は同じ動物の異なる場所に、ワクチン及び免疫調節剤を投与することを含み得る。別の実施形態では、免疫調節剤組成物は、ワクチン接種及び分娩前に投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、ワクチン接種後であるが分娩前に投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、分娩前にワクチン接種された動物に分娩後に投与される。投与経路は、対象及び対象の健康状態又は状態に応じて変わり得ることを当業者は認識する。
【００７４】
一実施形態では、免疫調節剤は、繁殖前にそれ自体で動物に投与される。別の実施形態では、免疫調節剤は、繁殖後にそれ自体で動物に投与される。さらに別の実施形態では、免疫調節剤は、繁殖と同時にそれ自体で動物に投与される。さらに別の実施形態では、免疫調節剤は、繁殖前及び繁殖と同時にそれ自体で動物に投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、繁殖前のワクチン接種と同時に投与される。なおさらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、繁殖と同時にワクチン接種と同時に同時投与される。同時投与は、動物の同じ一般的な場所に互いに隣接する２つの異なる部位（すなわち、動物の首に互いに隣接して注射する）、動物の反対側の同じ一般的な場所（すなわち、首の両側に１つずつ）、又は同じ動物の異なる場所に、ワクチン及び免疫調節剤を投与することを含み得る。別の実施形態では、免疫調節剤組成物は、ワクチン接種及び繁殖前に投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、ワクチン接種後であるが繁殖前に投与される。さらなる実施形態では、免疫調節剤組成物は、繁殖前にワクチン接種されている動物に繁殖後に投与される。投与経路は、対象及び対象の健康状態又は状態に応じて変わり得ることを当業者は認識する。
【００７５】
一実施形態では、免疫調節剤は、攻撃誘発の約１〜約１４日前又は攻撃誘発の約１〜約１４日後に投与される。別の実施形態では、免疫調節剤は、攻撃誘発の約１〜約７日前又は攻撃誘発の約１〜約７日後に投与される。さらに別の実施形態では、免疫調節剤は、攻撃誘発の１、２、３、４、５、６、７日前又は攻撃誘発の１、２、３、４、５、６、７日後に投与される。好ましい実施形態では、免疫調節剤は、攻撃誘発の３日前又は攻撃誘発の３日後に投与される。
【００７６】
他の送達システムは、時間放出、遅延放出、又は持続放出送達システムを含み得る。そのようなシステムは、組成物の反復投与を回避することができ、それ故に利便性が増す。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に既知である。それらとしては、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、及びポリ無水物などのポリマー系システムが挙げられる。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。
【００７７】
送達システムはまた、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸などのステロール、又はモノ−ジグリセリド及びトリ−グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質である非ポリマーシステム；ヒドロゲル放出システム；シラスティックシステム；ペプチド系システム；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を使用した圧縮錠剤；部分的に融合したインプラント；などを含む。具体例としては、米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号、及び第５，７３６，１５２号に記載されているものなどの本発明の薬剤がマトリックス内の形態で含有されている浸食系、並びに米国特許第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号、及び第５，４０７，６８６号に記載されているような活性成分が、ポリマーから制御された速度で浸透する拡散系が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ポンプベースのハードウェア送達システムを使用することができ、それらのいくつかは、移植に適合している。
【００７８】
本発明の範囲から逸脱することなく上記の組成物、製品、及び方法に様々な変更を加えることができるので、上記の説明及び以下に示す実施例に含まれる全ての事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味ではないと解釈されるべきであることが意図されている。
【００７９】
定義
「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するために必要又は十分な量を指す。例えば、感染症を治療又は予防するための免疫調節剤の有効量は、微生物への曝露時に免疫応答の発生を引き起こすのに必要な量であり、したがって対象内の微生物の量の減少を引き起こし、好ましくは微生物の根絶を引き起こす。任意の特定の適用のための有効量は、治療される疾患若しくは状態、対象の大きさ、又は疾患若しくは状態の重症度などの要因に応じて変わり得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに免疫調節剤の有効量を経験的に決定することができる。
【００８０】
本明細書で使用される「雌牛」という用語は、雌のウシ、雌牛、及び若雌牛を含むがこれらに限定されない、子孫を産むことができるウシ種の任意の成員を指す。
【００８１】
「サイトカイン」という用語は、免疫増強タンパク質ファミリーを指す。サイトカインファミリーとしては、造血成長因子、インターロイキン、インターフェロン、免疫グロブリンスーパーファミリー分子、腫瘍壊死因子ファミリー分子、並びにケモカイン（すなわち、細胞、特に食細胞の遊走及び活性化を調節するタンパク質）が挙げられる。例示的なサイトカインとしては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターフェロン−α（ＩＦＮα）、及びインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
「誘発する」という用語は、活性化する、刺激する、生成する、又は上方制御するという用語と互換的に使用することができる。
【００８３】
対象における「免疫応答を誘発する」という用語は、免疫応答の活性を特異的に制御するか又はそれに影響を及ぼすことを指し、免疫応答の活性化、免疫応答の上方制御、免疫応答の増強、及び／又は免疫応答の変化を含み得る（例えば、あるタイプの免疫応答を引き出すことによって、それにより対象において普及しているタイプの免疫応答を有害な若しくは無効なものから有益若しくは保護的なものに変化させる）。
【００８４】
「作動可能に連結された」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた（すなわち、形質転換、形質導入、又はトランスフェクトされた）ときに分子が発現され得るように核酸分子を転写制御配列に連結することを指す。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及びリプレッサー配列などの転写開始を制御するものである。種々のそのような転写制御配列は、当業者に既知である。好ましい転写制御配列としては、鳥類、魚、哺乳動物、細菌、植物、及び昆虫細胞において機能するものが挙げられる。任意の転写制御配列が、本発明と共に使用され得るが、その配列は、免疫原又は免疫刺激性タンパク質をコードする配列と天然に関連する天然に存在する転写制御配列を含み得る。
【００８５】
「核酸分子」及び「核酸配列」という用語は、互換的に使用することができ、ＤＮＡを含む。ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡのいずれかの誘導体。この用語はまた、タンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子、並びに調節領域、イントロン、又は他の非コードＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む核酸分子の両方を含む、オリゴヌクレオチド及びより大きな配列も含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、約１〜約５００個のヌクレオチドの核酸配列を有し、より典型的には、少なくとも約５個のヌクレオチドの長さである。核酸分子は、哺乳動物、魚、細菌、昆虫、ウイルス、植物、又は合成の供給源を含む任意の供給源に由来し得る。核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、増幅、クローニング）又は化学合成などの当技術分野において一般的に既知の方法によって産生することができる。核酸分子は、天然の対立遺伝子変異体、及びそのような修飾が、本発明の方法において有用な免疫原又は免疫刺激タンパク質をコードする核酸分子の能力を実質的に妨害しないように、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、又は反転されている修飾核酸分子を含むが、これらに限定されない天然核酸分子及びそのホモログを含む。核酸ホモログは、当業者に既知のいくつかの方法を使用して産生され得（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと）、これは本明細書に参照として組み込まれる。病原体抗原免疫原性又はサイトカイン活性などの免疫原性についてスクリーニングするための技術は、当業者に既知であり、種々のインビトロ及びインビボアッセイを含む。
【００８６】
「選択マーカー」及び「選択マーカー遺伝子」という用語は、遺伝子が選択剤（例えば、抗生物質）から発現される生物を保護する産物、又はその生物を通常死滅させる若しくはその成長を抑制する状態をコードする遺伝子を指す。選択マーカー遺伝子は、最も一般的には抗生物質耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など）である。したがって、例えば、大腸菌細胞を、カナマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドを導入するための形質転換手順に供し、次いで、カナマイシンを含有する培地上又は培地中で増殖させると、プラスミドをうまく取り込んでカナマイシン耐性遺伝子を発現した大腸菌細胞だけが生存する。「選択マーカー」及び「選択マーカー遺伝子」という用語はまた、生物の増殖に必須の化合物の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を含む。必須化合物を合成することができない栄養要求性有機体に導入されると、そのような遺伝子は、有機体が必須化合物を補充されている培地中で増殖することを可能にする。例えば、リジン生合成に関与する酵素の変異の有無にかかわらず、アミノ酸リジンに対して栄養要求性である細菌細胞は、通常、リジンを補充していない培地上で増殖することができない。そのような細菌が、リジン生合成に関与する酵素をコードするプラスミドを導入するための形質転換手順に供される場合、プラスミドをうまく取り込んで酵素を発現した細菌は、リジンを補充していない培地上で増殖したとき生存する。「選択マーカー」及び「選択マーカー遺伝子」という用語は、毒物／解毒剤の選択を可能にする遺伝子をさらに含む。例えば、ｃｃｄＢ遺伝子は、細胞分裂に必須の酵素であるＤＮＡジャイレースに結合するタンパク質をコードしている。ＤＮＡジャイレースに結合すると、ｃｃｄＢ遺伝子産物は、遺伝子複製を損ない、細胞死を誘導する。したがって、ｃｃｄＢ遺伝子産物を発現する細菌は、生存することができない。ｃｃｄＡ遺伝子は、ｃｃｄＢ遺伝子産物の天然の阻害剤として作用するタンパク質（「解毒剤」）をコードする。したがって、それらの細菌ゲノム中にｃｃｄＢ遺伝子を有する細菌が、ｃｃｄＡ遺伝子産物をコードするプラスミドを導入するための形質転換手順に供される場合、プラスミドをうまく取り込んでｃｃｄＡ遺伝子を発現する細胞のみが生存する。
【００８７】
「スクリーニング可能なマーカー」及び「スクリーニング可能なマーカー遺伝子」という用語は、観察者がスクリーニング可能なマーカー遺伝子を発現する細胞とスクリーニング可能なマーカー遺伝子を発現していない細胞とを区別することを可能にする産物をコードする遺伝子を指す。スクリーニング可能なマーカー遺伝子システムは、当技術分野において周知であり、例えば、ｌａｃＺ遺伝子及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、又はシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などの蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【表１】
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【００８８】
［実施例］
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するものである。
【００８９】
［実施例１］
非周期的な雌牛における受胎率の増加における免疫調節剤組成物の有効性
この研究の目的は、治療済みの雌牛の生殖転帰に対する分娩時の免疫機能の調節の影響を評価することであった。
【００９０】
免疫調節剤
この研究で使用された免疫調節剤は、実施例１に上記された組成物であった。
【００９１】
動物を研究する
ニュージーランドのワイカト地方にある２つの商業用酪農場ファームＡ及びＢから、２歳以上のフリージアン、ジャージー、又は交雑種の雌牛８７５頭を入手した。雌牛は、新たに分娩され泌乳していることに基づいて選択された。雌牛は、分娩前３０日以内に抗生物質、非ステロイド系抗炎症剤、若しくはコルチコステロイドで治療した場合、又は分娩時に何らかの疾患の肉眼的証拠を示した場合は除外した。残りの動物は、年齢（若雌牛対雌牛）によってブロックし、あらかじめ用意された無作為化リストから治療群又はプラセボ群に提示された動物の連続したペア内に割り当てた。
【００９２】
治療
治療は、無作為化され、治療配分は、治療後のサンプリングシートのいずれにも含まれず、乳試料は、登録時に固有の番号を割り当て、その後の実験室分析中に使用した。分娩の日（０日目）及び身体検査及び登録の後、適切な治療薬を右臀筋へ筋肉内注射によって投与した。注射部位を、注射前に７０％のメチル化アルコールで湿らせた綿球で拭いた。右臀筋に注射しながら、治療を３日目の夕方又は４日目の朝に、及び産後７日目に再び繰り返した。
【００９３】
繁殖管理
繁殖プログラムの計画的開始のおよそ３０日前にテールペイント（熱検出助剤）を塗布した。発情時に観察又はテールペイントの除去によって検出されなかったそれらの雌牛は、プロゲステロン、ＧｎＲＨ、及びプロスタグランジンＦ２αの組み合わせで治療され、繁殖期人工授精のために交配された。農場Ａの現場での最初の３７日間及び農場Ｂの現場での４７日間、スタンディング発情で検出されたそれらの雌牛を人工授精によって繁殖させた。その後、インタクトな雄牛をその群れと共に行動させた。交配期間の長さの合計は、農場Ａ及び農場Ｂでそれぞれ７７日及び８０日であった。繁殖プログラムの開始後８３日及び１１３日（農場Ａ）並びに繁殖プログラムの開始後９０日及び１２０日（農場Ｂ）に、経直腸的超音波検査法によって雌牛を調べた。妊娠していると検出されたそれらの牛は、懐胎の段階が推定された。推定懐胎段階が記録された繁殖、人工授精又は自然交配の７日以内である場合、記録された日を受胎日として受け入れた。
【００９４】
結果
３週間の投入率（繁殖プログラムの開始時に３週間以内に検出され授精された雌牛の割合）、初産受胎率（最初の授精に受胎した人工授精に産まれた牛の割合）及び３週間から６週間の子牛率（繁殖プログラムの最初の３週間から６週間以内に妊娠が確認された雌牛の割合）、並びに最終妊娠率を計算した。
【００９５】
二項生殖転帰は、最初に二変量（カイ二乗）分析で分析した。次いで、治療の説明変数、群、年齢（２、３、及び３歳超）、繁殖プログラム開始時のミルクの日数（５０〜７１日及び７２日超に分類）、並びに品種（フリージアン対他の品種）を含む多変量ロジスティック回帰モデルを行った。さらに、受胎間隔に対する計画的交配開始を雌牛ごとに計算し、カプラン−マイヤー生存分析を使用して受胎までの日数の中央値を計算した。
【００９６】
表１に示すように、品種コード及び年齢について治療群を均衡させ、カイ二乗検定を使用してｐ値を計算した。
【表２】
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【００９７】
さらに、分娩から計画的交配開始までの平均及び中央時間は、表２に示すように、治療群と対照群との間で同じであった。治療群及び対照群について、分娩から計画的繁殖開始までの日数の中央値を比較するＰ値をマン−ホイットニー検定を使用して計算した。
【表３】
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【００９８】
表３に示すように、計画的交配開始（ＰＳＭ）後２１日での人工授精への投入確率（３週間以内に投入）、ＰＳＭ後の最初の授精に対する受胎（初産に対する受胎）の確率、ＰＳＭ後２１日及び４２日の妊娠（それぞれ３週間以内に妊娠及び６週間以内に妊娠）の確率、並びに二変量レベルでの全体的な妊娠について治療群と対照群との間に差はなかった。カイ二乗検定を使用してＰ値を計算した。
【表４】
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【００９９】
品種（ホルスタイン、ジャージー、及びクロスブレッド）、年齢（２、３、及び４歳以上）、群れ（１及び２）、卵巣周期活性（ＣＩＤＲ装置の挿入に基づく周期的及び非周期的）、並びに分娩からＰＳＭまでの時間（５０〜７１日及び７２日以上）を含む潜在的効果修飾子を制御した多変数回帰分析において、治療済みの群の非周期性雌牛は、対照群のそれらの対応物と比較して、初産に対する受胎及び３週間以内の妊娠の確率が高かった。図４Ａは、最初の授精に対する受胎の確率（推定周辺平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ））のチャートを示す図である。
【０１００】
図４Ｂは、治療群別の周期的及び非周期的な雌牛についての繁殖プログラムの計画的開始後３週間以内の妊娠の確率（推定周辺平均及びＳＥＭ）を示す図である。アスタリスクは、非周期的群内の治療間の違いを示している。ＰＳＭから妊娠までの時間の中央値は、治療済みの群及び対照群でそれぞれ１５日及び１６日であった（Ｐ＝０．２７）。
【０１０１】
初産に対して受胎した治療済みの雌牛の数（６９％対６５％）は、未治療の対照よりも３週間（６３％対６１％）及び６週間（８０％対７６％）までに妊娠していた。非周期的状態の相互作用による治療が存在したことにより、発情期に検出されないと診断され、この状態で治療されたこれらの雌牛の中で、治療済みの雌牛の方が初産受胎率が高く、繁殖プログラムに入る３週間までに妊娠した割合が高かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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