(57)【要約】  バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカー、増幅プライマーおよびその応用を開示した。ＮＣＢＩから獲得したバナメイエビＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットのｍＲＮＡシークエンス（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ：ＫＦ７６５６７０．１）をベースとしてプライマーを設計し、それぞれ耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲの増幅を行い、それぞれ長さ５３３ｂｐのＰＣＲ産物を得た。シークエンシングの結果に対する照合解析を行い、当該セグメントシークエンスから１１個のＳＮＰを検出し、これらのテンプレートのすべてのＳＮＰにおける遺伝子型の関連分析を通じて、１つの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーを確定した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＮＰマーカーは配列番号２に示したシークエンスの５’から第３７９番目の塩基にあり、当該塩基はＣまたはＴであることを特徴とする、バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカー。
【請求項２】
以下のプライマー、
Ｌｖ−Ｆ：５’−ＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡ−３’、及び
Ｌｖ−Ｒ：５’−ＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧ−３’、
を含むことを特徴とする、バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーの増幅プライマー。
【請求項３】
請求項１に記載のバナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーのバナメイエビの分子マーカー補助育種における応用。
【請求項４】
測定しようとするバナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップａと、
請求項２に記載の増幅プライマーＬｖ−Ｆ及びＬｖ−Ｒを用いて前記測定しようとするバナメイエビの前記ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅を行うステップｂと、
増幅産物に対するシークエンシングを行い、請求項１に記載のＳＮＰマーカーの遺伝子型を確定し、ＴＴ遺伝子型の固体を選択して予備の母体として耐低塩性バナメイエビの品種育成を行うステップｃと、
を含むこと特徴とする、耐低塩性バナメイエビ品種の選択育成方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ増幅の反応系は２５μＬで、Ｍｇ２＋を含まない１０×ＰＣＲバッファーを２．５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２．０μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μＬ、５Ｕ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．２μＬ、１０μＭフォワードプライマーを０．５μＬ、１０μＭリバースプライマーを０．５μＬ、ＤＮＡテンプレートを１２．５ｎｇ含み、残りは滅菌水で２５μＬに補充されていることを特徴とする、請求項４に記載の選択育種方法。
【請求項６】
前記ＰＣＲ増幅の反応順序では、９５℃で３分間予備変性し、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長すること全体を３５サイクル行い、７２℃でさらに１０分間伸長することを特徴とする、請求項４または請求項５に記載の選択育種方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は水産生物技術領域に関し、特に、バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカー、増幅プライマーおよびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓ  ｖａｎｎａｍｅｉ）は世界的に生産量の最も多い養殖クルマエビである。ここ数年、バナメイエビの淡水養殖の発展が非常に速く、養殖産業の優良な耐低塩性バナメイエビ品種に対する需要が次第に増大している。そのため、多くの科学研究機関とクルマエビ会社がバナメイエビの耐低塩性優良品種の選択育成に着手し始めている。
【０００３】
国際的には、分子マーカーをベースとする分子マーカー補助選択育種技術が現代水産育種の肝心な技術になっている。一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）、即ち、ＳＮＰは、ゲノムのモノヌクレオチドの変異（塩基置換、トランスバージョン、単塩基の挿入あるいは欠失などを含む。）によって引き起こされたＤＮＡシークエンスの多態性を指し、最新の第３世代ＤＮＡ分子マーカーである。その数量が巨大で、分布が広範で、遺伝が安定で、測定が簡単かつ正確で、その他の技術で検出できない隠れた多型および遺伝子機能に関連する可能性のある多くの長所を表現することができるため、分子マーカー補助育種において広範に応用されている。
【０００４】
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子は甲殻類動物の重要な浸透圧調節遺伝子で、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ遺伝子はバナメイエビの塩ストレス耐性に関連する機能性遺伝子であることが研究によって明らかにされている。そのため、本発明はバナメイエビＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットの開発およびバナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーに対して、バナメイエビの耐低塩性優良品種の補助選択育成に用いることによって、バナメイエビの耐低塩性優良品種の選択育成が促進されることを期待している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的はバナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカー、増幅プライマーおよびその応用を提供することにある。バナメイエビの耐低塩性優良品種の補助選択育成に用いることによって、バナメイエビのストレス耐性優良品種の選択育成を加速させる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記発明目的を実現するために、本発明は、耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲ増幅とシークエンシングを通じてこれらテンプレートのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットのゲノムセグメントシークエンスに含まれているすべてのＳＮＰの遺伝子型を測定し、関連の分析方法を通じて耐低塩性に関連しているＳＮＰマーカーを確定し、そしてＳＮＰ増幅プライマーを提供して、バナメイエビの耐低塩性優良品種の分子マーカーの補助選択育成技術システムを創立し、バナメイエビの耐低塩性優良品種の選択育成を促進するための基礎を打ち立てる。
【０００７】
本発明の第１の目的は、バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーを提供することであり、このＳＮＰマーカーは配列番号２に示したシークエンスの５’から第３７９番目の塩基にあり、当該塩基はＣまたはＴである。配列番号２のシークエンスの３７９ｂｐにあるＹはＣまたはＴを表し、イタリックの部分はイントロンシークエンスを表している＊。（＊訳注：原文配列表中の文章装飾が施された箇所については、表４を参照。）
【０００８】
本発明の第２の目的は、Ｌｖ−Ｆ：５’−ＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡ−３’とＬｖ−Ｒ：５’−ＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧ−３’を含むバナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーの増幅プライマーを提供することである。
【０００９】
本発明の第３の目的は、前述のバナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーのバナメイエビ分子マーカーの補助育種への応用を提供することである。
【００１０】
本発明の第４の目的は、バナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップａと、前述の増幅プライマーＬｖ−ＦとＬｖ−Ｒを用いて測定しようとするバナメイエビのゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅を行うステップｂと、増幅産物に対するシークエンシングを行い、前述のＳＮＰマーカーの遺伝子型を確定し、ＴＴ遺伝子型の固体を選択して予備の母体として耐低塩性バナメイエビ品種の選択育成を行うステップｃとを含む、耐低塩性バナメイエビ品種の選択育成方法を提供することである。
【００１１】
前述のＰＣＲ増幅では、その反応系は、好ましくは、２５μＬであり、Ｍｇ２＋を含まない１０×ＰＣＲバッファーを２．５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２．０μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μＬ、５Ｕ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．２μＬ、１０μＭフォワードプライマーを０．５μＬ、１０μＭリバースプライマーを０．５μＬ、ＤＮＡテンプレートを１２．５ｎｇ含み、残りは滅菌水で２５μＬに補充されている。
【００１２】
前記ＰＣＲ増幅の反応順序では、好ましくは、９５℃で３分間予備変性し、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長すること全体を３５サイクル行い、７２℃でさらに１０分間伸長する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明はＮＣＢＩから獲得したバナメイエビＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットのｍＲＮＡシークエンス（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ：ＫＦ７６５６７０．１）をベースとしてプライマーを設計し、それぞれ耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲの増幅を行い、それぞれ長さ５３３ｂｐのＰＣＲ産物を得ており、その中には１つ長さ３５３ｂｐのイントロンを含む。シークエンシングの結果に対する照合解析を行い、当該シークエンスの中に１１個のＳＮＰを検出し、これらのテンプレートのすべてのＳＮＰにおける遺伝子型の関連分析を通じて、１つの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーを確定した。本発明はバナメイエビ耐低塩性優良品種の分子マーカー補助選択育成技術システムを創立し、バナメイエビ耐低塩性優良品種の選択育成を促進するための基礎を打ち立てた。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｌｖ―ＨＲ０８の遺伝子型ピークマップである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下は実施例に合わせて本発明に対する更なる説明を行うが、それらに限定するものではない。
【００１６】
下記実施例における実験方法は、特別な説明がない限り、何れも常套の方法または試薬箱の説明書に従って行ったものである。下記実施例に使用した材料、試薬などは、特別な説明がない限り、何れもビジネスルートを介して入手可能なものである。クローンシークエンシングとプライマーの合成作業が上海生物工程有限公司によって実施された。
【００１７】
１．    耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビサンプルの収集
１．１  淡水ストレス実験
体長２センチメートル前後のバナメイエビを淡水中に入れて、異なる時間におけるエビ幼生の死亡数量およびストレス実験開始１０時間後の生存数量を記録した。結果は表１に示す。
【００１８】
表１：淡水ストレス試験の結果
【表１】
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【００１９】
１．２  耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビサンプルの収集
ストレス実験開始１０時間後にまだ生きていたバナメイエビの幼生を耐低塩性サンプルとして、ストレス実験開始２時間後に死亡したエビの幼生を非耐低塩性サンプルとした。
【００２０】
２．    耐低塩性ＳＮＰマーカーの開発
２．１  耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビの幼生各４８尾を選び、それぞれの筋肉組織を採取し、海洋動物組織ゲノムＤＮＡ採取試薬キット（天根生化科技有限公司、北京）を用いてバナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出し、操作手順は厳格に説明書に従って行った。ゲノムＤＮＡの定量はＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）２０００分光光度計を用いて行い、質量分析は寒天電気泳動法で行った。
【００２１】
２．２  ＰＣＲプライマーの設計
ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）の中から獲得したバナメイエビＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットのｍＲＮＡシークエンス（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ：ＫＦ７６５６７０．１）をベースとして、プライマー増幅Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットのゲノムセグメントシークエンスを設計した。プライマー設計の要求としては、プライマーの長さ１８―２２ｂｐ、ＧＣ含量４０―６０％、Ｔｍ値５０―６２℃、上流・下流プライマーＴｍ値の差５以下、かつできるだけプライマーのダイマー、ヘアピン構造および誤対合を避ける。プライマーのシークエンスは次の通りである。
Ｌｖ−Ｆ（４６８−４８６）：５’−ＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡ−３’、
Ｌｖ−Ｒ（６４７−６３０）：５’−ＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧ−３’。
括弧の中の数字はプライマーのヌクレオチドのＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅαサブユニットｍＲＮＡシークエンスにおける位置を表す。
【００２２】
２．３  ＰＣＲ増幅とシークエンシング
ステップ２．１で抽出したバナメイエビゲノムＤＮＡの中から無作為に１組を選んでテンプレートとし、ステップ２．２で設計したプライマーＬｖ−Ｆ／Ｌｖ−Ｒを用いて当該ＤＮＡに対するＰＣＲ増幅を行い、反応系は２５μＬで、１０×ＰＣＲバッファー（Ｍｇ２＋不含）２．５μＬ、ＭｇＣｌ２（２５  ｍＭ）２．０μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）０．５μＬ、ＬＡＴａｑ酵素（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．５μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）０．５μＬ、ＤＮＡテンプレート（２５ｎｇ／μＬ）０．５μＬ、滅菌水１８．３μＬを含む。反応順序は、９５℃で３分間予備変性し、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で２分間伸長すること全体を３５サイクル行い、７２℃でさらに１０分間伸長した。ＰＣＲ増幅の産物を１％寒天電気泳動で測定した結果、当該プライマーが安定的に単一バンドを増幅することができることがわかった。増幅産物に対するクローンシークエンシングを行った結果、増幅産物の長さが５３３ｂｐで、目的のヌクレオチドシークエンスのほかに、また長さ３５３ｂｐのイントロンシークエンスを含んでおり、当該シークエンスのヌクレオチドシークエンスは配列番号１（ＳＥＱＩＤＰＧＬｖ―ＮＫと命名し、配列番号１が示したシークエンスのイタリックの部分＊はイントロンシークエンスを表す。）に示した通りである。（＊訳注：原文配列表中の文章装飾が施された箇所については、表３を参照。）
【００２３】
２．４  ＳＮＰのスクリーニングおよびＳＮＰの遺伝子型分析
ステップ２．１で抽出した耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ステップ２．２の前記プライマーＬｖ−Ｆ／Ｌｖ−Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行った。反応系と反応順序はステップ２．３とほぼ同じであるが、相違点としては、ＳＮＰをスクリーニングするＰＣＲシステムにおいてＬＡＴａｑ酵素の代わりにハイフィデリティＰＣＲ酵素（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用い、７２℃での伸長は２分間から１分間に短縮した。ＰＣＲ増幅産物をまず２％寒天電気泳動で測定し、それから３７３０ＸＬシークエネーターでシークエンシングを行った。すべての増幅産物のシークエンシングピークマップを照合解析してＳＮＰをスクリーニングし、全部で１１個のＳＮＰ（表２）を検出した。ＳＰＳＳ１６．０のノンパラメトリック検定（カイ二乗検定Ｘ２）を通じて耐低塩性と非耐低塩性のそれぞれのＳＮＰの遺伝子型頻度に対する有意差検定を行い、制限性の閾値Ｐ＝０．０５を設けた。その結果、前記ＳＥＱＩＤＰＧＬｖ−ＮＫシークエンスの３７９ｂｐに位置するＳＮＰの遺伝子型は耐低塩性と非耐低塩性バナメイエビにおける有意差が著しく（Ｐ＜０．０５）、当該ＳＮＰ（配列番号２に示したシークエンスの５’から第３７９番目の塩基に位置する。当該ＳＮＰマーカーはバナメイエビの耐低塩性マーカーである。イタリックの部分はイントロンシークエンスを表し、ＳＮＰの位置をボールドの混合塩基Ｙで示した＊。ＹはＴあるいはＣを表す。）はＣＣ、ＣＴ、およびＴＴ（ピークマップは図１を参照）の３種類の遺伝子型を有しており、その中でＴＴ遺伝子型は耐低塩性バナメイエビにしか検出されなかった（表２）ため、ＴＴ遺伝子型は耐低塩性優位の遺伝子型であり、バナメイエビの耐低塩性分子マーカーとして、バナメイエビの耐低塩性優良品種の補助選択育成に用いることができることを示唆している。（＊訳注：原文配列表中の文章装飾が施された箇所については、表４を参照。）
【００２４】
表２：ＳＥＱＩＤＰＧＬｖ−ＮＫシークエンスにおけるＳＮＰ、ＳＮＰの遺伝子型、頻度および有意差検定
【表２】
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注：第２列の数字はＳＮＰのＳＥＱＩＤＰＧＬｖ―ＮＫシークエンスにおける位置を表す
【００２５】
表３：配列番号１
【表３】
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【００２６】
表４：配列番号２
【表４】
2019518419.tif 000006
【００２７】
［付記］
［付記１］
ＳＮＰマーカーは配列番号２に示したシークエンスの５’から第３７９番目の塩基にあり、当該塩基はＣまたはＴであることを特徴とする、バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカー。
【００２８】
［付記２］
以下のプライマー、
Ｌｖ−Ｆ：５’−ＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＣＣＡ−３’、及び
Ｌｖ−Ｒ：５’−ＧＡＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧ−３’、
を含むことを特徴とする、バナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーの増幅プライマー。
【００２９】
［付記３］
付記１に記載のバナメイエビの耐低塩性に関連するＳＮＰマーカーのバナメイエビの分子マーカー補助育種における応用。
【００３０】
［付記４］
測定しようとするバナメイエビのゲノムＤＮＡを抽出するステップａと、
付記２に記載の増幅プライマーＬｖ−Ｆ及びＬｖ−Ｒを用いて前記測定しようとするバナメイエビの前記ゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ増幅を行うステップｂと、
増幅産物に対するシークエンシングを行い、付記１に記載のＳＮＰマーカーの遺伝子型を確定し、ＴＴ遺伝子型の固体を選択して予備の母体として耐低塩性バナメイエビの品種育成を行うステップｃと、
を含むこと特徴とする、耐低塩性バナメイエビ品種の選択育成方法。
【００３１】
［付記５］
前記ＰＣＲ増幅の反応系は２５μＬで、Ｍｇ２＋を含まない１０×ＰＣＲバッファーを２．５μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を２．０μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰを０．５μＬ、５Ｕ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．２μＬ、１０μＭフォワードプライマーを０．５μＬ、１０μＭリバースプライマーを０．５μＬ、ＤＮＡテンプレートを１２．５ｎｇ含み、残りは滅菌水で２５μＬに補充されていることを特徴とする、付記４に記載の選択育種方法。
【００３２】
［付記６］
前記ＰＣＲ増幅の反応順序では、９５℃で３分間予備変性し、９５℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニーリングし、７２℃で１分間伸長すること全体を３５サイクル行い、７２℃でさらに１０分間伸長することを特徴とする、付記４または付記５に記載の選択育種方法。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019518419.tif 000009
2019518419.tif 000010
2019518419.tif 000011
2019518419.tif 000012
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