(57)【要約】  生物変換プロセスにより形成された（−）−アンブロックスの固体形態。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2019521952.tif 000007
で表される化合物の固体形態であって、以下の特徴：
それが、以下の回折角２θのピーク、約１５．６、１６．２、１６．７、１７．０、１７．４、１８．３＋／−０．２°の少なくとも１つを有するＸ線回折パターンを呈する；
それが、レーザー粒度測定法により測定すると少なくとも約１０〜約４００ミクロンの平均直径を有する細長い結晶を含む；
それが、１００ミクロンよりも大きいその最長寸法に沿った長さを有する細長い結晶を含む；および／または
それが、９０以上のＬ＊値；１未満であり−１よりも大きいａ＊値；および８未満であるｂ＊値を有する、ここでＬ＊、ａ＊およびｂ＊値はＣＩＥＬＡＢ  Ｌ＊ａ＊ｂ＊色度座標を表す；
の少なくとも１つによって特徴付けられる、前記固体形態。
【請求項２】
Ｘ線回折パターンが、以下の回折角２θのピーク、約１５．６、１６．２、１６．７、１７．０、１７．４および１８．３＋／−０．２°の全てを呈する、請求項１に記載の固体形態。
【請求項３】
実質的に図１に描画されたとおりのＸ線回折パターンによって特徴付けられる、請求項１または２に記載の固体形態。
【請求項４】
生物変換プロセスの生成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の固体形態。
【請求項５】
生物変換プロセスが、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｅおよび７Ｅ，３Ｚ幾何異性体の混合物を含むホモファルネソールの酵素触媒環化反応であり、反応が、生体触媒の存在下で行われる、請求項４に記載の固体形態。
【請求項６】
生体触媒が、酵素をコードする遺伝子を発現する組み換え微生物か、または単離された酵素か、または固定化された酵素である、請求項６に記載の固体形態。
【請求項７】
酵素が、野生型スクアレンホペン環化酵素または野生型スクアレンホペン環化酵素の変異型である、請求項６に記載の固体形態。
【請求項８】
生物変換プロセスによって形成される請求項１〜７のいずれか一項に定義されているとおりの（−）−アンブロックスの固体形態を調製する方法であって、以下のステップ：
Ｉ）生体触媒プロセスの手段によって生物変換培地中で結晶（−）−アンブロックスを形成すること；および
ＩＩ）生物変換培地から（−）−アンブロックスを分離すること
を含む、前記方法。
【請求項９】
分離のステップが、濾過のステップであるか、デカンテーションのステップであるか、または濾過のステップおよびデカンテーションのステップの両方の組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分離のステップに先立って、結晶（−）−アンブロックスを融解させるために生物変換培地が少なくとも８０℃の温度まで加熱され；およびその後、（−）−アンブロックスが生物変換培地から再結晶化されるように、ゆっくりと冷却される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
回収された（−）−アンブロックスの結晶が溶媒中で可溶化され、蒸発または再結晶化により溶媒を取り除かれることによって固体形態にされる前に、溶液がサブミクロンフィルターを通して濾過されることで、生物変換培地中に存在していたあらゆる残留粒子状物質を取り除かれる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法によって形成された、（−）−アンブロックスの固体形態。
【請求項１３】
９０以上のＬ＊値；１未満であり−１よりも大きいａ＊値；および８未満であるｂ＊値を有する、ここでＬ＊、ａ＊およびｂ＊値はＣＩＥＬＡＢ  Ｌ＊ａ＊ｂ＊色度座標を表す、請求項１２に記載の固体形態。
【請求項１４】
請求項１〜７、１２および１３のいずれか一項に記載の（−）−アンブロックスの固体形態の、香料成分としての使用。
【請求項１５】
組成物中に溶解または分散されている、請求項１〜７、１２および１３のいずれか一項に定義されているとおりの（−）−アンブロックスの固体形態を含む、香料組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の香料組成物を含む、家庭用ケア、パーソナルケア、ランドリーケアまたはエアケア組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、（−）−アンブロックス（Ambrox）の固体形態、ならびにそれを調製および精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
AMBROFIX（商標）は、一般式（Ｉ）
【化１】
2019521952.tif 000002
を有する（−）−アンブロックスの、その専売者であるジボダン（Givaudan）の商品名である。
【０００３】
AMBROFIX（商標）は、パフューマ―のパレット成分において非常に重要な分子である。これは、あらゆる香料製品における使用のための、極めて強力で、極めて実質的で、かつ極めて安定なアンバー様（ambery）ノートを出す。AMBROFIX（商標）は、ジボダンから入手可能であり、本格的なアンバーグリス（ambergris）匂いノートを得るのに最も好適な物質である。
【０００４】
現在、AMBROFIX（商標）は、他の大量生産向けの（−）−アンブロックスの形態と同様に、自然由来の出発物質から合成により生産されている。特定の出発物質の供給と質は、気候条件ならびに社会経済的要因に依存している。さらに、出発物質が天然資源から少量の産生量で抽出されることもあり得るため、ほぼ確実に、工業規模ではそれらの使用をますます不経済なものにしていくであろう価格で市販されている。したがって、AMBROFIX（商標）の大量生産的な工業的供給を、合理的費用で利用し続けていこうとするならば、工業化可能な、より費用対効果の高いプロセスが必要である。
【０００５】
（−）−アンブロックスへの工業的に拡張可能なバイオ技術的経路は、完全に合成化学的な手順よりも、潜在的により複雑でなく、より環境に優しく、より環境配慮型であることから、魅力的であろう。
【０００６】
（−）−アンブロックスを供給するための生物変換を試みるのに潜在的に使用可能な基質は、ホモファルネソールである。影響力のあるその論文において、Neumannら(Biol. Chem. Hoppe-Seyler Vol. 367 pp 723-726 (1986))は、酵素スクアレンホペン環化酵素（ＳＨＣ）を採用して、酵素的触媒下での、ホモファルネソールの（−）−アンブロックスへの転換の実現性について議論した。採用されたホモファルネソールは、この分子の４種の幾何異性体混合物であった。４種の異性体のうち、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体（通常の命名法を用いた）だけを環化することができるので、所望の（−）−アンブロックスの非常に低い収量が得られるに過ぎない。
【０００７】
JP 2009-60799(花王)は、それによりＳＨＣが（−）−アンブロックスを産生するためのホモファルネソール基質に作用する合成を開示している。基質は、４種の幾何異性体（３Ｚ，７Ｚ；３Ｅ，７Ｚ；３Ｚ，７Ｅ；および３Ｅ，７Ｅ）全ての混合物である。同文献は、ＳＨＣ遺伝子を発現する組み換え微生物から調製されたＳＨＣを含有する液体抽出物を使用したホモファルネソールからの（−）−アンブロックスの調製を開示するのみである。ホモファルネソール混合物は、（−）−アンブロックスとその９−エピ立体異性体に変換され、精製は、蒸留またはカラムクロマトグラフィーにより行うことができる。花王は、ＳＨＣを産生する実質的に全形（whole）のまたは無傷（intact）の微生物を用いてホモファルネソールを（−）−アンブロックスに変換するプロセスについては記載しておらず、さらに、（−）−アンブロックスを嗅覚的に純粋な形態で得ることができるそのようなプロセスにより得られる複雑な混合物の下流のプロセシングに関して、全く技術的な教示を提供していない。
【０００８】
出願人の知る限り、従来技術は、ホモファルネソールのＳＨＣ触媒生物変換を含む、（−）−アンブロックスを嗅覚的に純粋な形態で提供するための、実行可能で工業的に拡張可能なプロセスについて全く記載していない。
さらに、ホモファルネソールの生物変換が工業規模で実現されるようになっても、極めて純度の高い３Ｅ，７Ｅ−ホモファルネソールの費用効率の高いソースが入手可能でなければならない。しかしながら、ホモファルネソールの合成経路は文献（例えば、US 2013/0273619を参照）に記載されているが、出願人の知る限り、費用対効果の高い、現在入手可能な純粋な７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソールの工業規模のソースは存在しない。
【０００９】
価値あるフレグランス成分（−）−アンブロックスへの、経済的に実現可能でありかつ工業的に拡張可能な経路を提供する必要がある。
同時係属中の特許出願PCT/EP2014/072891（WO2015/059293として公開）およびPCT/EP2014/072882（WO2015/059290として公開）において、出願人は、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体が豊富な７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物を調製する効率的方法について記載している。７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物は、ベータ−ファルネセンから調製され、この出発物質に含有されている異性体情報は、７位のホモファルネソール二重結合がＥ−配置で固定されるというように、保存されている。しかしながら、この洗練された化学も、まだ３Ｅ／Ｚ異性体混合物をもたらす。純粋な７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソールは、合成的には難易度が高いままであり、異性体混合物の経済的に不利な精製という手段によってのみ達成され得る。
【００１０】
生体触媒によるホモファルネソールからの（−）−アンブロックスの生成に関する開発にもかかわらず、粒子状物質および他の物質、例えば細胞残屑ならびにあり得る副生成物、未反応基質、および生物変換プロセスに採用されるあらゆる溶媒または他の試薬、を含有する生物変換培地から、（−）−アンブロックスを分離および精製する効率的な手段を提供する必要が残っている。
【発明の概要】
【００１１】
従来技術の欠点に対処するにあたって、出願人は、驚くべきことに、（−）−アンブロックスの結晶形態が生体触媒プロセス中において形成され得るということを見出した。より具体的には、出願人は、（−）−アンブロックスの結晶が生物変換培地中において形成するということを見出した。
【００１２】
生物変換培地中において（−）−アンブロックスが結晶化される驚くべきであり予想外である様式、ならびに、形成された結晶の物理的特徴は、生物変換培地からの、本格的なアンバーグリス（ambergris）の匂いノートを呈する（−）−アンブロックスの本質的に無色かつ嗅覚的に純粋な形態の単離および精製の観点に特に関係する。生体触媒が微生物の生体触媒であるという場合では、そうすると、嗅覚的に純粋な質で（−）−アンブロックスが得られたという知見は、生物変換培地中に存在する微生物の生体触媒が、極めて不快な、攻撃的ですらあるオフノート（off-note）の特徴を有し得るという事実に鑑みれば、特に驚くべきことである。（−）−アンブロックスの結晶が生物変換培地中において微生物の触媒の外側に形成されるという驚くべき知見は、悪臭のする培地からの（−）−アンブロックスの特に効率的な分離を可能にする。
【００１３】
したがって、本発明は、第１の側面において、式（Ｉ）で表される化合物の固体形態、
【化２】
2019521952.tif 000003
ここで、前記固体形態は、以下の特徴の少なくとも１つによって特徴付けられる：
それが、以下の回折角２θのピーク、約１５．６、１６．２、１６．７、１７．０、１７．４、１８．３＋／−０．２°の少なくとも１つを有するＸ線回折パターンを呈する；
それが、レーザー粒度測定法により測定すると１０〜４００ミクロンの間の、より具体的には４０〜４００ミクロンの間の、およびより具体的にはさらに１００〜４００ミクロンの間の平均直径を有する細長い結晶を含む；
それが、レーザー粒度測定法により測定すると２０〜６００ミクロンの、より具体的には４０〜５００ミクロンの、およびより具体的にはさらに１００〜４００ミクロンの、好ましくは１００ミクロンよりも大きい、より具体的には２００ミクロンよりも大きい、およびより具体的にはさらに３００ミクロンよりも大きいその最長寸法に沿って測定した長さを有する細長い結晶を含む；および
それが、本明細書下記において用語が定義されているとおり、実質的に無色である。
【００１４】
より具体的な態様においては、式（Ｉ）で表される化合物の固体形態は、以下の回折角２θのピーク、約１５．６、１６．２、１６．７、１７．０、１７．４および１８．３＋／−０．２°を有するＸ線回折パターンを呈する粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる。
さらにより具体的な態様において、式（Ｉ）で表される化合物の固体形態は、実質的に以下の図１に描画されたとおりの粉末Ｘ線回折パターンによって特徴付けられる。
【００１５】
出願人の知る限り、生体触媒プロセスにより形成された（−）−アンブロックスの固体形態は、従来技術においてこれまでに記載も示唆もされていない。
したがって、本発明は、別のその側面において、式（Ｉ）に従う生物変換生成物の固体形態を提供する。
本発明の態様において、式（Ｉ）に従う生物変換生成物の固体形態は、本明細書における上記で言及した特徴の少なくとも１つを有する。
【００１６】
上で言及した粉末Ｘ線回折データは、当分野において周知である回折測定設備を使用して単純明快な様式で集めることができる。本明細書において言及される粉末Ｘ線回折パターンを測定するのに使用される方法論および器具類は、例においてより詳細に記載される。
【００１７】
結晶の形状は、当分野において周知の方法に従う顕微鏡法によって決定されており、ここではこれ以上の詳述を要しない。
本発明に従って得られた個々の結晶の特徴的なサイズおよび形状は、以下、図２に示される。
【００１８】
結晶の平均直径測定は、レーザー粒度測定法によって決定された。レーザー粒度測定法は、当分野において周知の技術である。平均粒子サイズは、かかる目的のために既知であるあらゆる粒子サイズ分析計、例えば、CILAS 1180 No. 516機器にて決定することができる。測定は、ＩＳＯ規格１３３２０−１（２００９年改訂）に従って、Fraunhoferを使用して、水をキャリア液として遮蔽指数(obscuration index)２４にて行うことができる。
【００１９】
上述のとおり、（−）−アンブロックスが生物変換培地中において結晶形態で現れるという事実、ならびに結晶の物理的特徴、すなわち、それらのサイズおよび密度は、（−）−アンブロックスの単離の効率性、および結局のところその透明性および嗅覚的純粋性の観点に特に関係する。
【００２０】
さらに具体的に言うと、サイズ分離のステップ、つまり、結晶のサイズ、形状および／または密度などの物理的特徴を活かした分離のステップ、さらに具体的に言うと濾過またはデカンテーションのステップという手段によって、粒子状物質、例えば細胞残屑、ならびにあらゆる副生成物、不純物などが含まれる生物変換培地から、結晶を効率的に分離することが可能であった。
【００２１】
さらに、粒子状物質およびその他の物質からのみならず、多成分で色の濃い生物変換培地からも、結晶の効率的な分離をすることは、形成され得るあらゆる副生成物、これは化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）として本明細書下記において言及される立体もしくは構造異性体などの、構造的な（構造）異性体および立体異性体を包含し得、これは（−）−アンブロックスと違って生物変換培地中において結晶化しない、を包含する不純物からの、（−）−アンブロックスの単離をも可能にする。
【００２２】
よって、（−）−アンブロックスが結晶化する様式、ならびにサイズ分離のステップの結果として、出願人には、本質的に無色かつ嗅覚的に純粋な生成物として（−）−アンブロックスを得ることが可能になる。
【００２３】
したがって、本発明は、別のその側面において、（−）−アンブロックスの固体形態を調製する方法であって、以下のステップ：
Ｉ）生体触媒プロセスの手段によって生物変換培地中で結晶（−）−アンブロックスを形成すること；および
ＩＩ）生物変換培地から（−）−アンブロックスを分離すること
を含む、前記方法を提供する。
【００２４】
本発明の手段によってそこから結晶（−）−アンブロックスを分離することができる生物変換培地は、不純物のありとあらゆる様式、例えば粒子状物質、副生成物などを含有し得る。特に、生物変換が、微生物の生体触媒を使用して行われるときには、結晶（−）−アンブロックスを、細胞および細胞残屑を含有する生物変換培地から、分離することができる。
【００２５】
本発明の具体的な態様においては、分離のステップは、液相（単数または複数）からの結晶物質の分離を可能にするのみならず、結晶の物理的特徴、例えばそれらのサイズ、形状および／または密度などのために、細胞または細胞残屑などのあらゆる粒子状物質からの結晶の分離をも可能とする、サイズ分離のステップである。
【００２６】
より具体的な態様においては、サイズ分離のステップは、濾過のステップであるか、デカンテーションのステップであるか、または濾過およびデカンテーションの組み合わせである。
（−）−アンブロックスはまた、濾過および／またはデカンテーションに代替して、またはこれに加えて、ペレット化されてもよい。好ましくは、（−）−アンブロックスの結晶は、濾過および／またはデカンテーションおよび／またはペレット化に先立って融解される。
【００２７】
本発明の具体的な態様においては、分離のステップに先立って、ｉｉ）生物変換培地は、（−）−アンブロックスを再結晶化させるための徐冷却の前に、（−）−アンブロックスの結晶を融解させるために加熱することができる。この目的のために、生物変換培地は、少なくとも５５℃の温度まで加熱され得る。約２０度以下の温度まで、例えば４℃まで、１時間あたり数度の速度で、より具体的には１時間あたり約５℃の速度で、ゆっくりと冷却される前に、加熱は、約１５分から約２時間までの範囲の時間にわたって徐々に行われ得る。この冷却の後で、生物変換培地は、８時間の間、４℃に維持され得る。
再結晶化のステップは、より大きくより均一な結晶を形成させることを可能にし、これは分離のステップの効率性をさらに改善することの助けになる。
【００２８】
驚くべきことに、再結晶化に先立つ生物変換培地への塩の添加は、結晶成長を支援し、これはさらに結晶のサイズを増大させ、および結晶サイズのより均一な分布を作り出したことが見出された。具体的な塩は、無機塩を、および特に塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムを包含する。
【００２９】
生物変換プロセスの間に形成されたより小さいかまたは壊れた結晶が排除されるので、結晶の増大したサイズおよび改善された均一性は、引き続くサイズ分離のステップを促進することができる。
【００３０】
サイズ分離のステップは、生物変換培地中に含有される粒子状物質、例えば、細胞および細胞残屑を、濾液とともに通過させるのに十分大きいが、（−）−アンブロックス結晶の全てまたは実質上全てを被保持物として捕捉するのに十分小さいメッシュサイズを有するフィルターを採用した濾過により、行うことができる。
（−）−アンブロックスの結晶は、１０〜１００ミクロンの間またはそれ以上のメッシュサイズ、好ましくは約５０ミクロン、６０ミクロン、７０ミクロン、８０ミクロン、９０ミクロンまたは１００ミクロンより大きい、を有する好適なフィルター床によって濾過されることができる。
【００３１】
濾過を行う手段に関しては、既知の濾過技術および設備のあらゆるものを採用することができる。しかしながら、工業的に規模拡大し得る技術が優先される。この観点で、遠心濾過は、特に好適である。
濾過遠心装置は、当分野において広く既知である（例えば、Frederick J. Dechow Novesによる“Separation and Purification Techniques in Biotechnology”の第１章；出版物ISBN No. 0-8155-1197-3を参照）。装置は、分離板遠心機、またはシリンダー型遠心機を包含する、そのあらゆる変型であってもよい。
【００３２】
濾過のステップを、Siebtechnic H250などの連続スクリーン遠心にて実行することが可能である。メッシュサイズは、本明細書上記において言及したあらゆるサイズ、および特に約１００ミクロン以上、とすることができる。濾過のプロセスの効率性に鑑みて、遠心は、５００ｇと２５００ｇとの間で、およびより具体的には、約２０００ｇで、さらにより具体的には２０２８ｇで、動作させてもよい。生物変換培地が遠心へと供給される速度は、可能な限り最も効率的な濾過を提供するために最適化されることができ、および、３００〜８００ｋｇ／時間、およびより具体的には約４００ｋｇ／時間、より具体的にはさらに約４３０ｋｇ／時間の速度を包含してもよい。
【００３３】
代替的に、サイズ分離のステップは、デカンテーションのステップの手段によって行われてもよい。
デカンテーションのプロセスにおいて、生物変換培地は、好適なデカンテーション装置中へと供給され、およびその中で重力加速を施される。ストークスの法則（Stoke's Law）に従って、生物変換培地中におけるより小さくて低密度である粒子状物質、例えば、細胞または細胞残屑は、生物変換プロセスの他の不純物を含有する上清中において懸濁されて保持され、一方、比較的大きくて高密度である（−）−アンブロックスの結晶は、それのために提供された台（ｂｅｄ）の上に沈殿物として沈む。分離は、静的に行うことができ、または、生物変換培地に、６０００ｇまでの、より具体的には約５００〜１５００ｇの、およびより具体的には約１０００ｇの、およびより具体的にはさらに１１７０ｇの、力を施すことによって、それを促進することができる。
【００３４】
上清は、取り去られて捨てられてもよく、または代替的に、上清中に残ったあらゆる結晶（−）−アンブロックスを分離および回収するためのさらなるデカンテーションのステップが施されてもよい。
デカンテーション装置は、当分野において一般的に既知である。本発明における使用のために好適である具体的な装置は、Guinard Decanter、例えば、モデルD1LC20HCである。生物変換培地は、効率的なスループットを提供するために最適化されたいずれかの望ましい速度で、例えば、５００ｋｇ／時間までで、および、より具体的には約３００〜４００ｋｇ／時間で、装置中へと供給され得る。
【００３５】
濾過およびデカンテーションは、粒子サイズ分離のプロセスにおけるステップとして個別に採用されてもよく、または、濾過およびデカンテーションのステップの組み合わせが使用されてもよい。サイズ分離のステップに従って反応培地から分離された（−）−アンブロックスの結晶は、あらゆる粒子状物質、例えば細胞または細胞残屑、ならびにあらゆる他の残留不純物、例えば副生成物、溶媒、未反応基質など、を取り除くために洗浄されてもよい。
【００３６】
Solvents useful 結晶を洗浄するのに有用な溶媒は、洗浄のステップが行われる温度で（−）−アンブロックスがこれに不溶性または極めて難溶性であるようなあらゆる溶媒を包含する。より具体的には、（−）−アンブロックスは、（−）−アンブロックスの溶解度が５℃において１０重量％以下である溶媒中において、不溶性または極めて難溶性であると見なされる。
【００３７】
洗浄は、水、水混和性溶媒、またはそれらの混合物を使用して行ってもよい。好適な水混和性溶媒は、エタノールなどの低級アルカノールを包含する。
より具体的には、結晶は、水、例えば１質量の結晶に対して３質量の水で洗浄される。複数回洗浄（multiple washings）が行われてもよい。
洗浄後、濾液を、または場合によっては上清を、捨てることができる。
【００３８】
（−）−アンブロックスの回収は、フィルターまたはデカンター装置またはベルトフィルター（例えば、変形（modifications）７、８、９および２０）からのその機械的除去（mechanical removal）により達成することができ、集められ、および乾燥させられる。（−）−アンブロックスは、この形態で、さらなる精製または仕上げ（polishing）なしに、香料用途において使用することができる。
しかしながら、より典型的には、（−）−アンブロックスには、香料用途に用いられる前に、溶媒中に溶解されて下記においてより詳細に記述されるとおりのさらなる精製ステップを施すことができる。
【００３９】
分離のステップから得られた（−）−アンブロックスは、好適な溶媒中に溶解させることができる。好適な溶媒は、トルエン、またはエタノール、例えば９６％エタノールなどの、低級アルカノールを包含する。
（−）−アンブロックスの溶液には、粒子サイズ分離のステップの間に取り除かれなかったかも知れない細胞または細胞残屑などのあらゆる残留粒子状物質を（−）−アンブロックスから取り除いて分離するのに好適なメッシュサイズを有するフィルター上での濾過のステップ、および引き続く洗浄が、施され得る。好適なメッシュサイズは、０．２２〜１ミクロンの間から始まり、および、１５０ミクロンまでであり得る。かかる目的のために好適であることが当分野において既知であるあらゆる濾過技術および装置が、本発明に従って採用されてもよい。
【００４０】
結晶を溶解させるために、エタノールを使用することができる。使用するエタノールの量は、好ましくは、約２５℃で（−）−アンブロックスを溶解させるのに十分なものとし、典型的には約１部の結晶に４部のエタノールとし、および、溶液が、１ｂａｒの圧力および大気温度で０．２２ミクロンフィルター（例えばKDS15）によって濾過される。加えて、それは最終的に、仕上げの濾過のステップとして０．２２ミクロンフィルターによって濾過されてもよい。
【００４１】
この段階での、細胞または細胞残屑などのあらゆる残りの粒子状物質を取り除くための濾過は、（−）−アンブロックスに対して脱臭効果を有することができる。これは、完成品の（−）−アンブロックス製品中に残留細胞または細胞残屑が残っているとすると、それが極めて不快なオフノートの原因になることがあるからである。（−）−アンブロックスの定着性がある特性のために、オフノートは特になかなか消えないものとなり得るので、その除去は嗅覚的に純粋な（−）−アンブロックスを得る目的のために特に重要である。
【００４２】
（−）−アンブロックスに、生物変換培地からの効率的な結晶の分離にもかかわらず存在するかもしれないあらゆる残留着色を取り除くための、任意の漂白のステップを施すことができる。フレグランス用途のためには、薄く色がついた（−）−アンブロックスでさえも原材料として望ましくないので、生成物をフレグランス用途、及び特にファインフレグランス用途、または香り付き化粧品用途のために価値あるものにしようとするならば、（−）−アンブロックスを可能な最大限まで透明にすることは、特に重要である。
【００４３】
この目的のために、可溶化された（−）−アンブロックス結晶の溶液を、活性モンモリロナイト粘土および／または活性炭などの漂白剤と接触させることができる。好適な漂白剤は、TONSIL FF、より具体的には、TONSIL 412FF、および／またはanimal blackまたはNoritを包含する。
任意に、（−）−アンブロックスの溶液に漂白剤を添加することの代替として、溶液を濃縮し、および固形残渣を減圧下で蒸留することもできる。
【００４４】
漂白剤は、（−）−アンブロックスの還流溶液（８０〜８５℃）に添加してもよい。この目的のために、漂白剤は、エタノールなどの好適な溶媒における懸濁液として添加してもよい。漂白剤と溶液との接触は、３０分間ほどの時間であってもよい。その後、漂白剤は、濾過によって、例えば、２５ミクロンフィルターを使用して、取り除かれる。
【００４５】
漂白剤は、色の濃い反応混合物の色を低減させること、ましてや香料用途のために必要とされるかまたは好適な程度までそうすることにおいては、効果的ではないかも知れない。しかしながら、本明細書に記載された生物変換培地からの（−）−アンブロックスの効率的な単離および精製のため、（−）−アンブロックスの溶液は既に実質的に無色であり、この溶液について所望の漂白効果を得ることはそれほど難しくない。結果として、生体触媒プロセスの生成物であるにもかかわらず、生成物を香料用途において採用しようとするならば期待される望ましい明度および色相を持った（−）−アンブロックスの形態を、得ることが可能である。
【００４６】
本発明の方法に従うと、脱臭および脱色された（−）−アンブロックス溶液は、溶媒の除去により、固体形態で提供され得る。溶媒除去は、再結晶化によってまたは蒸発によって影響されることがある。回収された（−）−アンブロックスは、溶媒除去が行われる様式に応じて、粉砕されてもよい、その再結晶化された形態でまたは固形残渣として得られ得る。
【００４７】
溶媒は蒸発により取り除かれ得、残留固形物は、例えば粉砕により回収され得、保存されて、香料用途において使用される。
代替的に、残留固形物は、好適な再結晶化溶媒中に溶解されてもよい。目的のために好適な溶媒は、エタノールなどの水混和性アルカノール、または前記アルカノールと水との混合物である。再結晶化溶媒は、約１０〜１５℃までの徐冷却の前に、約７５〜８０℃まで１５分間加熱することができる。結果物たる結晶は、濾過により回収し、および、任意に真空下で（例えば、０．５ｂａｒ）、乾燥させることができる。
【００４８】
本発明に従う方法の結果として、（−）−アンブロックスを実質的に無色かつ嗅覚的に純粋である固体形態で得ることができる。
【００４９】
したがって、本発明は、別のその側面において、実質的に無色の（−）−アンブロックスの固体形態であって、９０以上のＬ＊値；１未満であり−１よりも大きいａ＊値；および８未満であるｂ＊値を有する、ここでＬ＊、ａ＊およびｂ＊値はＣＩＥＬＡＢ  Ｌ＊ａ＊ｂ＊色度座標を表す、前記（−）−アンブロックスの固体形態を提供する。
本発明に従う（−）−アンブロックスの固体形態は、高い度合いの明度または明るさ（brightness）、および低い度合いの黄色度を呈する。これは香料用途のために、および特にファインフレグランスまたは化粧品における使用を意図した香料のために、視覚的な美観並びに匂いが重視されること、および香り付きの製品が香料成分の組み込みの結果として退色してはならないことから、重要である。
【００５０】
本発明に従う（−）−アンブロックスは、９０以上の、明度を示すＬ＊値、および８以下の、青−黄の色相を示すｂ＊値を有する。Ｌ＊値は、好ましくは９２以上であり、またはさらには９３以上である。ｂ＊値は、好ましくは５以下であり、またはさらには４以下である。
【００５１】
Ｌ＊値は、物の明度を規定する値であり、０と１００との間の値によって示される。１００のＬ＊値は、最も明るい状態（完全白）を示し、および、０のＬ＊値は、最も暗い状態（完全黒）を示す。
ｂ＊値は、物の青−黄の色相を規定する。ｂ＊値が大きければ大きいほど、黄色度の度合いが高くなる。ｂ＊値が小さければ小さいほど、青色度の度合いが高くなる。
【００５２】
Ｌ＊値およびｂ＊値は、色差表示方法に従うＬａｂ色度座標によって示され得る。Ｌ＊値およびｂ＊値は、いずれかの好適な市販の分光光度計、例えばMinolta CM3500dなどを使用して、測定され得る。
【００５３】
分光光度計は、測定を行う前に、少なくとも１時間電源を入れておくべきである。それのために提供されたガラス容器は、測定しようとする固形生成物で半分が満たされるようにし、容器の底が確実に生成物によって完全に覆われるように注意すべきである。その後、満たされた容器は、それのために提供された試料スタンド中に置くべきである。機器上の試料キーを押すべきであり、表示パネルからＬ＊ａ＊ｂ＊値を読み取る。
あらゆる読み取りを行う前に、それのために提供された黒および白の物体を機器の光学センサーの窓上に置くことによって、機器をゼロおよび１００％反射について校正すべきである。
【００５４】
本発明の態様において、（−）−アンブロックスの固体形態は、上で特徴付けられている結晶形態である。
本発明の態様において、（−）−アンブロックスの固体形態は、生物変換生成物である。
本発明の態様において、（−）−アンブロックスの固体形態は、本明細書に記載されているとおりの生物変換プロセスに従って形成された生物変換生成物である。
【００５５】
本発明のまた別の側面において、本明細書に記載されたとおりの生体触媒プロセスによって得られた（−）−アンブロックスの形態が提供される。
より具体的な態様においては、生体触媒プロセスは、微生物の生体触媒プロセスである。
本発明のまた別の側面において、本明細書に定義されたとおりの（−）−アンブロックスの形態の、フレグランスまたはフレーバー用途における使用が提供される。
【００５６】
本発明の原理、使用および実施は、付属の詳細な記載および図面を参照してさらに説明され、および理解され得る。発明の具体的な態様をより詳細に解説する前に、しかしながら、発明は、これ以降に記載される詳細に、その原理において限定されるものではないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な記載
本発明に従って、（−）−アンブロックスの結晶形態は、生物変換プロセスによって得られる。条件が、生体触媒が基質を変換させて、生物変換培地中において結晶化される形態で（−）−アンブロックスを生成することができるようなものであるならば、生物変換の正確な性質（例えば、使用する生体触媒、基質、基質の生物変換のための反応条件などの性質）は重大ではない。
【００５８】
本発明の態様において、７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソールの混合物からなる基質は、生物変換プロセスを受け、それによりホモファルネソール混合物が、酵素、特にホモファルネソールを（−）−アンブロックスに生物変換することができるスクアレンホペン環化酵素（ＳＨＣ）生物触媒、を発現する組み換え微生物の存在下で酵素的に環化されて、（−）−アンブロックスを驚くほど効率的な下流プロセシングにより実質的に無色かつ嗅覚的に純粋な形態で単離し得る反応混合物を産生する。
【００５９】
本発明の一つの側面において、（−）−アンブロックスを含む反応混合物を提供するための、ホモファルネソールの酵素触媒環化が提供され、ここで、ホモファルネソールは、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−幾何異性体の混合物を含み、反応は、酵素を産生する組み換え微生物、より具体的には酵素を産生する実質的に全形のまたは無傷の組み換え微生物の存在下で行われる。
【００６０】
環化反応は、ホモファルネソールを（−）−アンブロックスに生物変換することができるＳＨＣ生物触媒の存在下で行われる。
ＳＨＣ生物触媒は、野生型もしくは変異型酵素であるか、またはＳＨＣ酵素をコードする遺伝子を発現する微生物、好ましくは組み換え大腸菌微生物である。ＳＨＣ生物触媒は、これらに限定されないが、精製されたＳＨＣ酵素、ＳＨＣ酵素を含有する粗（crude）抽出物、または（例えば、担体上に）固定化されたＳＨＣ酵素などのあらゆる形態で用いることができ、あるいは、生物触媒は、ＳＨＣ酵素を含有する、無傷の組み換え全細胞および／または断片化細胞または膜分画などの、ＳＨＣを産生したもしくは産生する微生物であってもよい。
【００６１】
本発明の具体的態様においては、ホモファルネソール混合物は、７Ｅ，３Ｅ−幾何異性体が豊富である。
より具体的な態様においては、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で５５／４５である。
より具体的な態様においては、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で７０／３０である。
さらにより具体的な態様において、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で８０／２０である。
【００６２】
さらにより具体的な態様において、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で９０／１０である。
さらにより具体的な態様において、ホモファルネソール混合物は、少なくとも７Ｅ，３Ｅ／７Ｅ，３Ｚの重量で９５／５である。
本発明の具体的態様においては、ホモファルネソール混合物は、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−幾何異性体からなり、他の幾何異性体を含まない。
【００６３】
当業者は、ホモファルネソールに関連して用いられる用語７Ｅ、７Ｚ、３Ｅまたは３Ｚが、それぞれ、ホモファルネソールの７位および３位における二重結合の配向性について言及することを理解する。７Ｅ，３Ｅ−ホモファルネソール化合物はCAS No. 459-89-2を有するのに対し、７Ｅ，３Ｚ−ホモファルネソール化合物はCAS No. 138152-06-4を有する。用語７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソールの使用は、その化合物の混合物について言及する。
【００６４】
本発明の方法に従って、環化反応における基質として有用なホモファルネソール混合物を得る方法は、上で言及した同時係属中の出願PCT/EP2014/072891（WO2015/059293として公開）およびPCT/EP2014/072882（WO2015/059290として公開）において記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
一般論として、これらは、Ｎ−アルキル−Ｎ−ニトロソ尿素の有機溶液を用いて、ファルネセン、より具体的には、アルファ―ファルネセンおよび／またはベータ−ファルネセンを、それに対応するシクロプロパン化されたファルネセン誘導体に変換することによって進行するホモファルネソール混合物の合成について記載している。次いで、シクロプロパン化された誘導体は、７Ｅ，３Ｅ幾何異性体に選択的なホモファルネソール混合物を提供する、ブロンステッド酸の存在下での開環および転位反応を受ける。出発物質としてファルネセンを用いることは、ホモファルネソールの７位における二重結合のＥ−構造が固定されるのを確保するため、特に好ましい。
【００６６】
本発明の特定の態様を形成する特別な反応条件は、同時係属中の出願ならびに本明細書の下記における例に記載されており、ここではこれ以上の詳述を要しない。
【００６７】
（−）−アンブロックスを含有する反応混合物を提供するホモファルネソールの環化は、スクアレンホペン環化酵素（ＳＨＣ）により触媒され得る。ＳＨＣは、野生型酵素（例えば、配列番号１）またはその変異型（例えば、配列番号２または配列番号４）であってもよい。ＳＨＣは、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius（バシラス・アシドカルダリウス）（Bacillus acidocaldarius）））、ジモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、または（US2012/0135477A1の例３ｂに記載されているように）ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Bradyrhizobium japonicum）から得ることができる。
【００６８】
しかしながら、酵素はまた、当分野において一般的に既知である技術を用いて、組み換え手段により産生することもできる。
酵素に関して用いられる用語「組み換え」は、組み換えＤＮＡ技術によって産生される、すなわち所望の酵素をコードする外来性ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞から産生される、酵素を言うものとする。したがって、用語「組み換えＤＮＡ」は、ベクターに、自己複製プラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ（もしくは、天然の染色体上の部位以外の位置において、相同な細胞のゲノム）に組み込まれた組み換えＤＮＡを包含する。
【００６９】
核酸分子は、原核生物および／または真核生物宿主細胞における発現を可能にする発現制御配列に動作可能に連結される。本明細書において用いられる「動作可能に連結される」は、発現制御配列が、目的のコード配列の発現を有効に制御するように遺伝子コンストラクトに組み込まれていることを意味する。
【００７０】
上で言及した転写／翻訳制御エレメントは、誘導性および非誘導性、構成的、細胞周期により制御される、代謝により制御されるプロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサー、ならびに当業者に公知であり、遺伝子発現を駆動または別様に制御する他のエレメントを包含するが、これらに限定されない。かかる制御エレメントは、構成的発現に向かわせるかあるいは、例えばCUP-1プロモーター、例えばｔｅｔオンまたはｔｅｔオフシステムに採用されるｔｅｔリプレッサー、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム制御エレメントのように誘導性発現を可能にする、制御エレメントを包含するが、これらに限定されない。
【００７１】
例として、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）は１００μＭから１．０ｍＭの濃度範囲内においてタンパク質発現の効果的な誘導因子である。この化合物は、ｌａｃオペロンの転写を惹起するラクトース代謝物質であるアロラクトースの分子模倣体であり、それゆえに、遺伝子がｌａｃオペレーターの制御下にあるときにタンパク質発現を誘導するために用いられる。
【００７２】
同様に、核酸分子は、追加のポリペプチド配列、例えばマーカーまたはレポーターとして機能する配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成し得る。マーカーおよびレポーター遺伝子の例には、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、（ベータ−ガラクトシダーゼをコードする）ｌａｃＺ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。本開示の実施に関係する標準的手順の多くと同じく、当業者は追加の有用な試薬、例えばマーカーまたはレポーターの機能を果たし得る追加の配列を知っているであろう。
【００７３】
組み換えポリヌクレオチドは、野生型ＳＨＣまたはその変異型などのＳＨＣ酵素をコードすることができ、これは発現および任意の精製のためにベクター中に挿入され得る。ある種のベクターは、その中に追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされている環状二本鎖ＤＮＡループを代表するプラスミドである。
【００７４】
あるベクターは、それらが機能的に連結された遺伝子の発現を制御することができる。これらのベクターは「発現ベクター」と呼ばれる。通常は、ＤＮＡ組み換え技術に好適な発現ベクターはプラスミド型である。典型的には、発現ベクターは、野生型ＳＨＣまたはその変異型などの遺伝子を含む。プラスミドは最も多くの場合に用いられるベクター型であるので、本明細書において、用語「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。
【００７５】
かかるベクターは、宿主細胞中に天然には存在しないＤＮＡ配列、通常はＲＮＡに転写またはタンパク質に翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、および非組み換え宿主に導入したい他の遺伝子またはＤＮＡ配列を包含するが、これらに限定されないＤＮＡ配列を包含し得る。
【００７６】
典型的には、組み換え宿主のゲノムは、１種以上の組み換え遺伝子の安定な導入によって拡張されるということが理解されるであろう。しかしながら、自己または複製プラスミドもしくはベクターもまた、本開示の範囲内において用いられ得る。さらに、本開示は、低コピー数、例えば単一コピー、または高コピー数であるプラスミドまたはベクターを用いて実施され得る。
【００７７】
好ましい態様において、本開示のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工細菌および人工酵母染色体、ノックアウトまたはノックインコンストラクト、合成核酸配列、あるいはカセットを含み、一部は直鎖状ポリヌクレオチド、プラスミド、メガプラスミド、植物、細菌、哺乳類、もしくは酵母人工染色体などの合成または人工染色体の形態で産生され得る。
【００７８】
導入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、ベクターの導入時に細胞内で産生されることが好ましい。多様な遺伝子基質がプラスミド中に組み込まれ得る。プラスミドは多くの場合、標準的なクローニングベクター、例えば細菌マルチコピープラスミドである。基質同士は同じかまたは異なるプラスミド中に組み込まれ得る。多くの場合、異なる型の選択可能なマーカーを有するプラスミドの少なくとも２つの異なる型が用いられ、少なくとも２つの型のベクターを含有する細胞の選択を可能にする。
【００７９】
典型的には、細菌または酵母細胞が、当分野において周知であるように下記ヌクレオチド配列のいずれか１種以上によって形質転換され得る。インビボ組み換えのためには、ゲノムまたは他の遺伝子と組換えられるべき遺伝子が、標準的な形質転換技術を用いて宿主を形質転換するために用いられる。好適な態様においては、複製起点を提供するＤＮＡがコンストラクト中に含まれる。複製起点は当業者によって適切に選択され得る。遺伝子の性質に応じて、配列が、それら自体で複製起点として作動可能である遺伝子またはゲノムに既に存在する場合には、補足的な複製起点は必要とされないこともある。
【００８０】
細菌または酵母細胞は、かかるＤＮＡが細胞内に導入されたときに、外来性または異種ＤＮＡによって形質転換され得る。形質転換ＤＮＡは統合され（integrated）、すなわち細胞のゲノム中に共有結合的に連結されてもよく、もしくは統合されなくてもよい。原核生物および酵母において、例えば、形質転換ＤＮＡはプラスミドなどのエピソームエレメントとして維持され得る。
【００８１】
真核生物細胞に関しては、安定にトランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされたＤＮＡが、それが染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように染色体に統合されたものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団で構成される細胞株またはクローンを樹立する真核生物細胞の能力によって実証される。
【００８２】
一般的に、導入されるＤＮＡは、ＤＮＡの受容者である宿主に元々内在してはいないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離し、引き続いてそのＤＮＡの１つ以上の追加のコピーを同じ宿主に導入して、例えば遺伝子産物の産生を増強するかまたは遺伝子の発現パターンを変化させることは本開示の範囲内である。いくつかの場合には、導入されたＤＮＡは、内因性の遺伝子またはＤＮＡ配列を、例えば相同組み換えまたは部位特異的変異導入により、改変するかまたはさらには置換するであろう。好適な組み換え宿主には、微生物、植物細胞、および植物が含まれる。
【００８３】
本開示はまた、組み換え宿主をも特徴とする。用語「組み換え宿主」はまた、「遺伝子改変宿主細胞」または「トランスジェニック細胞」ともまた言われ、異種核酸を含むか、またはそのゲノムが少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列によって拡張された宿主細胞を指す。本開示の宿主細胞は、上で概説されているようにポリヌクレオチドまたはベクターによって遺伝子改変され得る。
【００８４】
本開示の目的のために用いられ得る宿主細胞には、例えば、本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、細菌人工染色体、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換され得る細菌（例えば大腸菌および枯草菌）などの原核生物細胞；例えば本開示のポリヌクレオチド分子を含有する組み換え酵母発現ベクターによって、形質転換され得る酵母（例えばサッカロミセス（Saccharomyces）およびピキア（Pichia））のような単純な真核生物細胞、が含まれるが、それに限定されない。
【００８５】
本開示のポリヌクレオチドを導入するために用いられる宿主細胞およびそれぞれのベクターに応じて、ポリヌクレオチドは例えば染色体もしくはミトコンドリアＤＮＡに統合し得るか、または例えばエピソームに、のように染色体外に、維持され得るか、または一過性にのみ細胞内に含まれ得る。
【００８６】
特に遺伝子工学、および１種以上の遺伝子または遺伝子の集合クラスターを細胞に導入することに言及して本明細書において用いられる用語「細胞」または産生細胞は、あらゆる原核生物または真核生物細胞を言うと理解される。原核生物および真核生物宿主細胞は両方とも、本開示に従った使用を企図され、大腸菌もしくはバシラス種のような細菌宿主細胞、Ｓ・セレビシエなどの酵母宿主細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptora frugiperda）などの昆虫宿主細胞、またはHeLaおよびJurkatなどのヒト宿主細胞を包含する。
【００８７】
具体的には、細胞は真核生物細胞、好ましくは真菌、哺乳類もしくは植物細胞、または原核生物細胞である。好適な真核細胞には、例えば限定なしに哺乳類細胞、酵母細胞、または（Sf9を包含する）昆虫細胞、（黒色素胞細胞を包含する）両生類細胞、または（カエノラブディティス・エレガンスを包含する）カエノラブディティスの細胞を包含する蠕虫細胞が含まれる。好適な哺乳類細胞には、例えば限定なしに（Cos-1およびCos-7を包含する）COS細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、HEK293 T-RexTM細胞、または他のトランスフェクション可能な真核細胞株が含まれる。好適な細菌細胞には、限定なしに大腸菌が含まれる。
【００８８】
好ましくは、大腸菌、バシラス、ストレプトミセス（Streptomyces）などの原核生物、またはHeLa細胞もしくはJurkat細胞のような哺乳類細胞、またはシロイヌナズナ（Arabidopsis）のような植物細胞が用いられ得る。
好ましくは、細胞はアスペルギルス種または真菌細胞であり、好ましくは、これは属サッカロミセス、カンジタ、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ハンゼヌラ（Hansenula）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、ヤロウィア（Yarrowia）、ピキア、およびアスペルギルスからなる群から選択され得る。
好ましくは、大腸菌宿主細胞は、産業界および規制当局によって認識されている大腸菌宿主細胞である（大腸菌 K12宿主細胞または例に実証されている大腸菌 BL21宿主細胞を包含するが、これらに限定されない）。
【００８９】
本開示で用いるための１種の好ましい宿主細胞は大腸菌であり、これは本明細書に記載されているように組み換え的に調製され得る。それゆえに、組み換え宿主は、組み換え大腸菌宿主細胞であり得る。大腸菌については、利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を増強するための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。サッカロミセスについて上で記載されているものと類似の方法が、組み換え大腸菌微生物を作るために用いられ得る。
【００９０】
１つの態様において、組み換え大腸菌微生物は、ＳＨＣ遺伝子をコードするヌクレオチド配列、またはそのバリアント、ホモログ、変異体、誘導体、または断片を包含するが、これらに限定されないその機能的同等物／相同物を含む。
【００９１】
本開示に使用するための別の好ましい宿主細胞はＳ・セレビシエであり、これは合成生物学においてシャシー生物として広く用いられている。それゆえに、組み換え宿主はＳ・セレビシエであり得る。Ｓ・セレビシエについては、利用可能な変異体、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデル、および他の情報のライブラリーがあり、生成物収率を増強するための種々のモジュールの合理的設計を可能にする。組み換えＳ・セレビシエ微生物を作るための方法は既知である。
【００９２】
細胞の培養は従来の様式で行われる。培養培地は炭素源、少なくとも１つの窒素源、および無機塩を含有し、ビタミンがそれに追加される。この培地の構成成分は、当該微生物種を培養するために従来用いられているものであり得る。
【００９３】
本方法にいて用いられる炭素源には、組み換え宿主細胞によって代謝されて増殖および／または（−）−アンブロックスの産生を促進し得るあらゆる分子が含まれる。好適な炭素源の例には、（例えばモラセス中に見いだされる）スクロース、フルクトース、キシロース、グリセロール、グルコース、セルロース、デンプン、セロビオース、または他のグルコース含有ポリマーを包含するが、これらに限定されない。
【００９４】
宿主として酵母を採用する態様においては、例えば、スクロース、フルクトース、キシロース、エタノール、グリセロール、およびグルコースなどの炭素源が好適である。炭素源は、培養期間に渡って宿主生物に提供することができ、また代替的には、生物を別のエネルギー源、例えばタンパク質の存在下においてある期間増殖させ、それから流加相（fed-batch phase）の間のみ炭素源を提供することができる。
【００９５】
本開示の方法において使用するための組み換え宿主細胞微生物の好適性は、周知の方法を用いる単純な試験手順によって決定され得る。例えば、試験されるべき微生物は、微生物の増殖のために一般的に用いられるｐＨ、温度、および通気条件において富栄養培地（例えば、ＬＢ培地、バクトトリプトン酵母エキストラクト培地、栄養培地等）で増殖させ得る。
【００９６】
一旦、所望の生物変換の生成物を産生する組み換え微生物（すなわち組み換え宿主細胞）が選択されれば、生成物は、典型的には産生宿主細胞株によって大スケールで、好適な発現システムおよび発酵によって、例えば細胞培養物中の微生物産生によって、産生される。
【００９７】
本開示の１つの態様においては、Ｍ９Ａなどの限定最少培地が細胞培養に用いられる。Ｍ９Ａ培地の構成成分は、ＫＨ２ＰＯ４ １４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １６ｇ／Ｌ、クエン酸Ｎａ３．２Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ７．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ ０．０１５ｇ／Ｌ、グルコース ５ｇ／Ｌ、および酵母エキストラクト １．２５ｇ／Ｌを含む）。
本開示の別の態様においては、ＬＢなどの富栄養培地が用いられた。ＬＢ（Luria-Bertani）培地の構成成分は１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母エキストラクト、５ｇ／ＬのＮａＣｌを含む。
ミネラル培地およびＭ９ミネラル培地の他の例は、例えばUS6,524,831B2およ
びUS2003/0092143A1に開示されている。
【００９８】
組み換え微生物は、バッチ（batch）、流加（fed batch）、もしくは連続プロセス、またはその組み合わせによって増殖させることができる。典型的には、組み換え微生物は、発酵槽（fermentor）内で定められた温度で好適な栄養源、例えば炭素源、の存在下において所望の期間増殖させ、ホモファルネソールを所望の量で（−）−アンブロックスに生物変換する。
【００９９】
組み換え宿主細胞はいずれかの好適な様式で、例えばバッチ培養または流加培養によって、培養され得る。本明細書において用いられる用語「バッチ培養」は、培養培地が培養の間に追加も取り出しもされない培養方法である。本明細書において用いられる用語「流加」は、培養培地が培養の間に追加されるが、培養培地は取り出されない培養方法を意味する。
【０１００】
本開示の１つの態様は、細胞系システムにおいて（−）−アンブロックスを産生する方法を提供し、前記方法は、野生型ＳＨＣまたはその変異型を好適な条件下において細胞系システムにおいて産生すること、ホモファルネソールを細胞系システムに供給する（feed）こと、細胞系システムを用いて産生された野生型ＳＨＣまたはその変異型を用いてホモファルネソールを（−）−アンブロックスに変換することと、細胞系システムからアンブロックスを回収すること、およびシステムから（−）−アンブロックスを単離することを含む。他のヌクレオチド配列の発現は、その方法を増強するために役立ち得る。生物変換方法は、細胞系システム中での追加の他のヌクレオチド配列の発現を包含し得る。他のヌクレオチド配列の発現は、（−）−アンブロックスを作るための生物変換経路を増強し得る。
【０１０１】
本開示のさらなる態様は、（−）−アンブロックスを作る生物変換方法であり、前記方法は、野生型ＳＨＣまたはその変異型遺伝子を含む宿主細胞を増殖させること、野生型ＳＨＣまたはその変異型酵素を宿主細胞において産生すること、ホモファルネソール（例えばＥＥＨ）を宿主細胞に供給すること、ホモファルネソールのアンブロックスへの変換を促進するために適切なｐＨ、温度、および可溶化剤の条件下において宿主細胞をインキュベートすること、ならびに（−）−アンブロックスを回収することを含む。宿主細胞における野生型ＳＨＣまたはその変異型酵素の産生は、ホモファルネソールが好適な反応条件下において宿主細胞に添加されたときに（−）−アンブロックスを作る方法を提供する。達成される変換は、より多くの生体触媒およびＳＤＳを反応混合物に添加することによって増強され得る。
【０１０２】
組み換え宿主細胞微生物は、引き続く生物変換ステップのための野生型ＳＨＣまたは変異型体酵素を発現する好適な量の細胞を提供するために、数多くのやり方で培養することができる。生物変換ステップのための適用可能な微生物は大幅に変わるので（例えば酵母、細菌、および真菌）、当然のことながら、培養条件はそれぞれの種の特定の要件に合わせて調整され、それらの条件は周知であり文書化されている。
【０１０３】
組み換え宿主細胞微生物の細胞を増殖させるための当分野において既知の方法はどれでも、本開示の引き続く生物変換ステップに利用可能な細胞を産生するために用いることができる。典型的には、細胞は、生物変換反応のための十分なバイオマスを産生するため（光学密度（ＯＤ）として測定可能であるように）特定の密度まで増殖させる。選ばれる培養条件は、得られる細胞（バイオマス）の量に影響を与えるのみならず、培養条件の質もまたどのようにバイオマスが生体触媒になるかに影響を与える。
【０１０４】
野生型ＳＨＣまたは変異型遺伝子を発現し野生型ＳＨＣまたは変異型酵素を産生する組み換え宿主細胞微生物は、生物変換反応における使用に好適である生体触媒と呼ばれる。いくつかの態様において、生体触媒は、野生型ＳＨＣまたは変異型を産生する組み換え全細胞であるか、またはそれは懸濁液もしくは固定されたフォーマットであり得る。
【０１０５】
１つの態様においては、生体触媒は、（十分なバイオマスを作り出すために）十分量で産生され、収穫され、生物変換ステップの前に洗浄される（かつ、任意に保存される（例えば凍結または凍結乾燥される））。
【０１０６】
さらなる態様においては、細胞は（十分な生体触媒を作り出すために）十分量で産生され、次いで、生物変換反応のために生体触媒を収穫および洗浄する必要なく、反応条件が調整される。このワンステップ（または「ワンポット」）方法は、それがコストを減じながらプロセスを単純化するので有利である。細胞を増殖させるために用いられる培養培地は、反応条件が生物変換反応を促進するように調整されている場合には、生物変換反応における使用にもまた好適である。
【０１０７】
本開示の生物変換方法は、ホモファルネソール原料ストックの（−）−アンブロックスへの変換をもたらすための時間、温度、ｐＨ、および可溶化剤の条件下において行われる。反応混合物のｐＨは、ＳＨＣ変異型酵素では４〜８、好ましくは５から６．５、より好ましくは４．８〜６．０の範囲内、野生型ＳＨＣ酵素では約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０の範囲内であってもよく、反応混合物への緩衝液の添加によって維持することができる。
【０１０８】
この目的のための例示的な緩衝液はクエン酸緩衝液である。代替的に、水道水または脱イオン水であって、０．５％または０．９％でのＮａＣｌを補ったものまたはこれを補っていないものを、５．０〜８．０のｐＨ範囲を包含するがそれに限定されない、最適な生体触媒の活性を提供するようなｐＨに調整した場合に、緩衝液の代用として使用することができる。
【０１０９】
したがって、本発明は、別のその側面において、本明細書に開示されている生物変換プロセスによって形成されたか、またはそれによって得ることができる、（−）−アンブロックスの固体形態を提供し、ここで生物変換反応は、緩衝液の代用としての水道水または脱イオン水を使用した培地中において、および、最適な生体触媒活性を確保するｐＨ範囲、好ましくはｐＨ範囲５．０〜８．０、において行われる。
【０１１０】
好ましい温度は約１５℃と約４５℃との間、好ましくは約２０℃と約４０℃との間であるが、これは好熱性生物では、特に好熱性微生物からの野生型酵素が用いられる場合にはより高く、５５℃までであり得る。温度は生物変換プロセスの間は一定に保たれてもよく、または変更されてもよい。
【０１１１】
可溶化剤（例えば界面活性剤、洗剤、可溶性増強剤、水混和性有機溶媒等）を生物変換反応中に包含させることが有用であり得る。界面活性剤の例には、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０、タウロデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および／またはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
出願人は、他のより有用でない可溶化剤の長いリストから、特に有用な可溶化剤としてＳＤＳを選択および同定した。特に、出願人は、ホモファルネソールの（−）−アンブロックスへの生物変換反応について反応速度および収率の観点から、例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００よりも顕著に優れた可溶化剤としてＳＤＳを同定した。
【０１１３】
理論によって拘束されることを望むものではないが、組み換え微生物宿主細胞へのＳＤＳの使用は、ＳＤＳがＳＨＣ酵素（これは膜結合酵素である）をホモファルネソール基質に対してよりアクセス可能にするために、宿主細胞膜と有利に相互作用し得るので有利であり得る。加えて、反応混合物中における好適なレベルでのＳＤＳの包含は、エマルジョン（水中のホモファルネソール）の特性を改善し、および／または宿主細胞内のＳＨＣ酵素へのホモファルネソール基質のアクセスを改善し得る一方で、同時に破壊（例えば、野生型ＳＨＣまたは変異型酵素の変性／不活性化）を防ぐ。
【０１１４】
生物変換反応に用いられる可溶化剤（例えばＳＤＳ）の濃度は、バイオマス量および基質（ＥＥＨ）濃度によって影響される。すなわち、可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度、バイオマス量、および基質（ＥＥＨ）濃度の間には、ある程度の相互依存性がある。
【０１１５】
例として、ホモファルネソール基質の濃度が増大すると、効率的な生物変換反応が起こるために十分量の生体触媒および可溶化剤（例えばＳＤＳ）が必要とされる。例えば可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度が低すぎる場合には、準至適な（suboptimal）ホモファルネソール変換が観察され得る。他方で、例えば可溶化剤（例えばＳＤＳ）濃度が高すぎる場合には、生体触媒が無傷の微生物細胞の破壊および／またはＳＨＣ／ＨＡＣ酵素の変性／不活性化のいずれかによって影響されるというリスクが存在し得る。
【０１１６】
バイオマス量および基質（ＥＥＨ）濃度との関連では、ＳＤＳの好適な濃度の選択は、当業者の知識の範囲内である。例として、好適なＳＤＳ、基質（ＥＥＨ）、およびバイオマス濃度を決定するための予測モデルが当業者に利用可能である。
【０１１７】
野生型ＳＨＣ酵素についての生物変換反応の温度は、約４５〜６０℃、好ましくは５５℃である。
野生型ＳＨＣ酵素についての生物変換反応のｐＨ範囲は、約５．０から７．０、より好ましくは約５．６から約６．２、さらにはより好ましくは約６．０である。
【０１１８】
ＳＨＣ変異型酵素についての生物変換反応の温度は、約３４℃から約５０℃、好ましくは約３５℃である。
ＳＨＣ変異型酵素についての生物変換反応のｐＨは、約４．８〜６．４、好ましくは約５．２〜６．０である。
【０１１９】
好ましくは、生物変換反応に用いられる可溶化剤は、ＳＤＳである。
［ＳＤＳ］／［細胞］比は、ＥＥＨホモファルネソールに対する生体触媒の比が約２：１であるときに、約１０：１〜２０：１の範囲内、好ましくは約１５：１〜１８：１、好ましくは約１６：１である。
【０１２０】
ＳＨＣ変異型酵素についての生物変換反応におけるＳＤＳ濃度は、ホモファルネソール濃度が約１２５ｇ／ｌのＥＥＨであり、生体触媒濃度が２５０ｇ／ｌである（約１７５のＯＤ（６５０ｎｍ）に対応する）ときに、約１〜２％の範囲内、好ましくは約１．４〜１．７％の範囲内、さらにはより好ましくは約１．５％である。
ＥＥＨホモファルネソール基質に対する生体触媒の比は約０．５：１〜２：１の範囲内、いくつかの態様においては２：１、好ましくは約１：１または０．５：１である。
【０１２１】
いくつかの態様において、（−）−アンブロックスは、ホモファルネソール基質が加えられる生体触媒を用いて産生される。既知の手段（例えばペリスタポンプ、注入シリンジ等）を用いて供給することによって基質を加えることが可能である。ホモファルネソールは油可溶性化合物であり、油フォーマットで提供される。生体触媒が水相に存在するということに鑑みて、生物変換反応は、ホモファルネソールが生物変換反応混合物に加えられるときには２相システムと見なすことができる。これは可溶化剤（例えばＳＤＳ）が存在するときでさえも当てはまる。
【０１２２】
好適な生物変換プロセス条件のさらなる詳細は、本明細書下記の例において開示される。
【０１２３】
生物変換プロセスは、所望の（−）−アンブロックス、およびまた多数の副生成物をも含有する生物変換培地を産生する。より具体的には、培地は、（−）−アンブロックスに加えて、式（ＩＩ）に記載の（−）−アンブロックスの新規構造異性体、ならびに式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に記載の（−）−アンブロックスの既知の立体異性体を含む、副生成物の複雑な混合物を含有する。
【化３】
2019521952.tif 000004
【０１２４】
出願人は、いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、式（ＩＩ）の化合物は、ホモファルネソールの７Ｅ，３Ｚ−幾何異性体の環化により形成されると考えている。これは、＞５００ｎｇ／ｌの検知閾値を有し、実際には無臭であると記載される。
【０１２５】
上述のとおり、出願人は、式（ＩＩ）の化合物は新規分子であると考えており、そのようにこの化合物は本発明のさらなる側面を形成する。
化合物（ＩＩ）からなるもしくはこれを含む香料成分および香料組成物、ならびにこれを含有する香り付き物品は、本発明の追加の側面を形成する。
【０１２６】
高級香水または、パーソナルケア、家庭用ケアおよび繊維ケア組成物などの機能性香料組成物といった香料用途における、式（ＩＩ）の化合物の香料成分としての使用は、本発明のさらなる追加の側面を形成する。
（−）−アンブロックスと嗅覚的に許容可能な量の化合物（ＩＩ）との混合物は、本発明のまた別の側面を形成する。
【０１２７】
式（ＩＩ）の化合物、または他の副生成物（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）のいずれか、または実際に本発明の方法に従って形成された（−）−アンブロックスにおける不純物として存在するあらゆる物質との関連において、本明細書において用いられる用語「嗅覚的に許容可能な量」は、化合物または物質が、その匂い検知閾値未満の量で、または（−）−アンブロックスの嗅覚的特徴に影響を及ぼすようにはその嗅覚的特性に寄与しない量で、（−）−アンブロックスとの混合物中に存在することを意味するものと理解される。
【０１２８】
嗅覚的に許容可能な量のあらゆるそのような化合物または物質を含有する（−）−アンブロックスは、ｅｘ−スクラレオールの合成的手順により得られ、Givaudanから入手できる、AMBROFIX（商標）などの、（−）−アンブロックスの市販グレードの匂い特性を有するものとして、熟練したパフューマ―に同定可能であろう。
【０１２９】
本発明の好ましい態様において、反応混合物は、未反応のホモファルネソールを全く含まないか、または実質的に含まない。
【０１３０】
出願人は、ホモファルネソールが、（−）−アンブロックスに対して、ならびに生物変換プロセスの上記副生成物に対して、強力な溶媒であることを発見した。そのように、相当な量のホモファルネソールの存在下では、（−）−アンブロックスおよび副生成物が、扱いにくい粗混合物中で一緒に溶解されたまま残り、そこから嗅覚的に純粋な形態で（−）−アンブロックスを分離して最終的に単離することは困難で、時間がかかる。（−）−アンブロックスと化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）との混合物中における未反応ホモファルネソールのレベルを減少させることにより、下流のプロセシングおよび（−）−アンブロックスの単離／精製がかなり容易になることが見出された。
【０１３１】
下流のプロセシングは、当業者により理解される通り、生物変換プロセスにより形成される有用な化合物の製造において重大な工程である。化合物合成の一部として、その化合物の物理的特徴に影響を与え得る。バイオテクノロジー的方法による香料成分の調製の場合においては、標的化合物の所望の匂い特徴が、発酵培地または生体触媒中に存在し得る不純物および副生成物の複雑な混合物の匂いの寄与によってゆがめられないように、標的化合物は、嗅覚的に純粋な形態で反応混合物から分離することができることが望ましい。
【０１３２】
したがって、本発明は、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む生物変換培地から、（−）−アンブロックスを単離および精製する方法を提供する。
本発明のさらに別の側面においては、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含有する生物変換培地から、（−）−アンブロックスを分離および精製するステップを含む、（−）−アンブロックスの匂いを改善または増強する方法が提供される。
【０１３３】
単離および精製された形態においては、（−）−アンブロックスは、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）のいずれも含有せず、または、前記化合物のいずれかを含有するとしても、それぞれは、嗅覚的に許容可能な量で存在すべきである。
【０１３４】
本明細書における上記の生物変換プロセスから得られる生物変換培地は、一般的に、粗（−）−アンブロックスならびに水およびあらゆる残留ホモファルネソールおよびあらゆる油性のまたは油溶性の不純物または副生成物を含有し得る油相からなる液相（単数または複数）を含む。副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上は、かかる油相中に存在し得る。
【０１３５】
固相は、液相（単数または複数）から、遠心濾過などの濾過、またはデカンテーションにより分離してもよい。さらに、また濾過による分離に関しては、適切なメッシュサイズを有するフィルターを選択することによって、生物変換培地中における粒子状物質、例えば細胞物質および／または残屑から、（−）−アンブロックスの固体形態を分離することも可能である。デカンテーションは、濾過と同様に、この粒子状物（particulate matter）と（−）−アンブロックスの固体形態との粒子サイズの違いを活かしてそれらの分離を可能にし、前者は上清中に懸濁されたまま残り、これは捨てることができ、一方後者は沈殿物として単離することができ、回収され、および任意にさらなる精製ステップを施される。
【０１３６】
一旦、粒子状物質、例えば細胞物質および／または残屑、ならびに液相（単数または複数）から、（−）−アンブロックスが分離されれば、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）などのあらゆる不純物から（−）−アンブロックスを単離するさらなるワークアップ手順を施される前に、それは洗浄されてもよい。
【０１３７】
本発明の具体的態様においては、（−）−アンブロックスを単離および精製する前記方法は、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の１種以上ならびに生物変換培地中で形成されたあらゆる他の不純物を含有し得る混合物から、（−）−アンブロックスを選択的に結晶化するステップを含む。
【０１３８】
用語「選択的に結晶化する」は、それによって（−）−アンブロックスには溶媒からの結晶化が生じる一方で、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）などの副生成物、またはあらゆる他の不純物は、単離された結晶物質が（−）−アンブロックスのみを含有するか、またはそれが化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれかを含有する場合には、それらが嗅覚的に許容可能な量でしか存在しない程度に結晶化溶媒中に溶解されたまま残る、プロセスステップを言う。
【０１３９】
選択的な結晶化は、（−）−アンブロックスが生物変換培地から結晶化し、一方で、生物変換培地中に存在し得る副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）などのあらゆる不純物が油相中に残るときに、起こり得る。かかる場合には、生物変換培地中に存在する化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のいずれも、（−）−アンブロックスが細胞および細胞残屑などのあらゆる粒子状物質から分離されるのと同じプロセスステップの間のデカンテーションおよび／または濾過ならびに洗浄によって、結晶（−）−アンブロックスから分離することができる。
【０１４０】
生物変換培地から結晶化された（−）−アンブロックスは、上で記載されている様式での濾過および／またはデカンテーションによって、分離することができる。その後、結晶を好適な溶媒中に溶解させ、および溶液をさらに処理することもまた、上で記載されている様式で行うことができる。特に、溶液は、細胞または細胞残屑などのあらゆる残留粒子状物質を取り除くために精密濾過し；それを好適な漂白剤に通すことによって脱色させ；および／または、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）などのあらゆる副生成物の残渣またはあらゆる他の残留不純物から結晶（−）−アンブロックスを分離するために溶媒から選択的に結晶化させることができる。
【０１４１】
結晶化は、好適な有機溶媒中において行われ得る。溶媒の選択は、室温および高温におけるまたは煮沸溶媒における溶解度の違いなどの考察；ならびに冷却溶媒における回収可能な結晶量の必要性についての考察に基づく。通常、分離されるべき化合物は、比較的極性である溶媒に溶解しており、次いで、比較的極性の弱い溶媒が添加されて溶解している化合物のその溶解性の限界をもたらすことができ、それにより結晶化が始まることになる。また、工業的プロセスにおいては、費用だけでなく取り扱いの安全性という問題にも関係する。好適な溶媒には、メタノール、アセトン、石油エーテル、ヘキサン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ＴＨＦおよび酢酸エチルが含まれるが、これらに限定されない。好ましい溶媒には、エチルアルコールが含まれる。２つの溶媒の組み合わせもまた、採用してよい。
【０１４２】
本発明の特に好ましい態様においては、選択的結晶化は、温かいメタノールに、（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含有する混合物を溶解して、水などの非溶媒を冷却エタノール溶媒にゆっくり加えることで（−）−アンブロックスを選択的に結晶化させることにより、行われる。
【０１４３】
（−）−アンブロックスと、それぞれが構造異性体および（−）−アンブロックスの２種の立体異性体である副生成化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）との密接な構造的関係を考慮すると、（−）−アンブロックスがそのような混合物から選択的に結晶化され、高収率で嗅覚的に純粋な形態での（−）−アンブロックスをもたらし得ることは注目すべきことであった。当業者は、１種以上の化合物が、（−）−アンブロックスと同じかまたは実質的に同様の条件下で結晶化し、下流のプロセシングが、実際に見出されるよりも、はるかにさらに複雑で、時間がかかり、かつ費用がかかるようになることを当然予期するはずである。
【０１４４】
（−）−アンブロックスが、結晶化により化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）を含有する混合物から分離される、驚くべき容易な方法は、本発明の際立った優位性を示している。
（−）−アンブロックスが結晶化により分離され得る容易性は、（−）−アンブロックスならびに副生成物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の沸点が非常に近いために精留などの他の精製技術によって、または溶媒抽出によって、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）を含有する混合物から、（−）−アンブロックスがかかる容易な方法およびかかる高い収率では回収され得ないという観察とは対照的であり得た。
【０１４５】
（−）−アンブロックスとの関連において用いられる、用語「嗅覚的に純粋な」は、（−）−アンブロックスが、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）もしくは（ＩＶ）、または反応混合物中において見出される他のあらゆる物質を含まないことを意味するか、あるいは、かかる化合物または物質が存在する場合には、本明細書においてその語が定義されている通り嗅覚的に許容可能な量でそれらが存在することを意味することが意図される。
【０１４６】
本発明の態様において、嗅覚的に純粋な形態での（−）−アンブロックスは、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のいずれかを５重量％未満含有する。
より具体的な態様においては、嗅覚的に純粋な形態の（−）−アンブロックスは、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の各々を、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．９重量％未満、０．８重量％未満、０．７重量％未満、０．６重量％未満、０．５重量％未満、０．４重量％未満、０．３重量％未満、０．２重量％未満、０．１重量％未満もしくは、０．０５重量％未満含有する。
【０１４７】
化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）を含有する混合物からの選択的結晶化による（−）−アンブロックスの分離の質は、それが分離される混合物の組成により影響され得る。より具体的には、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）の混合物からの結晶化による（−）−アンブロックスの分離の質は、（−）−アンブロックスの混合物中における他の化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および／または（ＩＶ）に対する重量比が、７０：３０、より具体的には８０：２０、より具体的には９０：１０、さらにより具体的には９５：５、およびさらにより具体的には９７：３より大きい場合に、改善された。
【０１４８】
さらに、結晶化による（−）−アンブロックスの分離の質は、それが分離される混合物中に存在する未反応ホモファルネソールの量に影響され得る。より具体的には、分離の質は、（−）−アンブロックスが結晶化されて分離される混合物の重量に基づき、未反応ホモファルネソールのレベルが、３０重量％未満、より具体的には２０重量％未満、より具体的には１０重量％未満、より具体的にはさらに５重量％未満、およびより具体的にはさらに３重量％未満、より具体的にはさらに２重量％未満、およびより具体的にはさらに１重量％未満である場合に、改善される。
【０１４９】
好ましくは、本発明の生物変換プロセスにおいて用いられる試薬および反応条件は、反応が、ホモファルネソールの１００％の変換を進めまたは実質的にそのように変換を進め、したがって、生物変換培地においては未反応ホモファルネソールは残らないようにするものである。しかしながら、未反応ホモファルネソールが存在する場合には、経済的に不利ではあるが、例えば、蒸留、または、（−）−アンブロックスの結晶を好適な溶媒で洗浄することによって、（−）−アンブロックスおよび他の副生成物からそれを分離することができる。
【０１５０】
したがって、本発明の具体的な態様においては、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含む混合物から（−）−アンブロックスを単離および精製する方法であって、この混合物がホモファルネソールを含まない、または実質的に含まない、前記方法が提供される。
より具体的な態様においては、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の１種以上を含み、ホモファルネソールを含まない、または実質的に含まない混合物からの（−）−アンブロックスの単離および精製は、（−）−アンブロックスの選択的結晶化により達成される。
【０１５１】
本発明の方法により得られる（−）−アンブロックスは、嗅覚的に純粋な形態で得られる。嗅覚的に純粋な（−）−アンブロックスは、本発明の別の側面を形成する。
結晶形態の（−）−アンブロックスは、本発明のさらに別の側面を形成する。
【０１５２】
本発明の方法にしたがって形成される（−）−アンブロックスは、１種以上の追加の香料成分と混合して、高級香水における使用ならびに、パーソナルケア、繊維ケアおよび家庭用ケア製品などの消費者製品における使用を含む、香料製品における使用を満たす香料組成物を形成してもよい。
【０１５３】
したがって、本発明は、別のその側面において、（−）−アンブロックスおよび少なくとも１種の他の香料成分を含む香料組成物を提供し、前記香料組成物は、嗅覚的に許容可能な量の、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の１種以上を含有する。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
本発明のより良い理解のために、付属の図面が参照され、このうち、
【図１】図１は、横座標のスケールが角度２θであり、および縦座標がカウント数での強度である、Ｘ線回折パターンを示す。
【図２】図２は、単結晶の顕微鏡画像を示し、結晶の細長い形状およびその長さ寸法に沿った３３０ミクロンを上回る長さ（３３８．２１ミクロン）を、明瞭に示す。
【０１５５】
【図３】図３は、生物変換培地；トルエン抽出物；結晶形態；および結晶回収後の濾液中における、（−）−アンブロックスおよびその異性体（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の相対量を比較する。
【図４】図４は、（−）−アンブロックスを産生するための下流プロセスの概略を示す。得られた（−）−アンブロックス抽出物には、本明細書下記においてより詳細に記載される、さらなる脱臭または脱色ステップを施すことができる。
【０１５６】
本発明は、下記例を参照してさらに説明されるであろう。
例１：
ホモファルネソールの調製
一般的な分析条件：
非極性ＧＣ／ＭＳ：５０℃／２分、２０℃／分２００℃、３５℃／分２７０℃。HP 7890AシリーズＧＣシステムを有するＧＣ／ＭＳアジレント5975C MSD。非極性カラム：SGEからのBPX5、５％フェニル９５％ジメチルポリシロキサン０．２２ｍｍ×０．２５ｍｍ×１２ｍ。キャリアガス：ヘリウム。インジェクター温度：２３０℃。スプリット１：５０。フロー：１．０ｍｌ／分。トランスファーライン：２５０℃。ＭＳ−四重極型：１０６℃。ＭＳソース：２３０℃。
【０１５７】
Ａ）ＴＨＦ中のＭＮＵの調製
水（４００ｍｌ）中の尿素（１７５ｇ、２．９ｍｏｌ）およびメチルアミン塩酸塩（１９８ｇ、２．９ｍｏｌ）の溶液を撹拌下において３．５時間、加熱還流（１０５℃）する。４０℃で、水（２００ｍｌ）中に溶解したＮａＮＯ２（１０１ｇ、１．４５ｍｏｌ）を加える。１５分後に、ＴＨＦ（１０００ｍｌ）を加え、これは透明な二相性混合物をもたらす。濃Ｈ２ＳＯ４（１１０ｇ、１．１ｍｏｌ）を０〜５℃で加え、１．５時間以内で撹拌する。０〜５℃でのさらなる０．５時間後に、２つの透明な相が２５℃で分離する。有機相（Ａ）（１０６５ｍｌ、理論上は１．３５Ｍ）は０〜５℃で数日間保存するか、または直ちにシクロプロパン化反応容器に進む。
【０１５８】
相分離の後に、水相をＴＨＦによって２回抽出する（２×１Ｌ）。これにより１１００ｍｌの相Ｂおよび１０７５の相Ｃが得られる。相Ａは、引き続くシクロプロパン化反応において末端アルケンのシクロプロパンへの５１％の変換を生じる一方で、相Ｂは＜０．５％のシクロプロパンを生じ、相Ｃは検出可能な変換を生じない。我々は、＞９９％のＭＮＵが最初の相分離の後に抽出されると結論づける。したがって、通常は、水相を、濃ＫＯＨ水溶液および酢酸による処理後の（有機相Ａからの）最初の相分離の後に捨てる。
【０１５９】
Ｂ）ＴＨＦ中のＭＮＵを用いるＥ−Δファルネセンの調製
【化４】
2019521952.tif 000005
ＴＨＦ（１３６ｍｌ、１８４ｍｍｏｌ）中のＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア１．３５Ｍを、０℃において、０〜５℃のＥ−ベータ−ファルネセン（ＣＡＳ１８７９４−８４−８）（２５ｇ、１２２ｍｍｏｌ）およびＫＯＨ水溶液（５０ｍｌ、４０％）の激しく撹拌した混合物に滴下添加する。４ｍｌのＭＮＵ溶液を添加後に、０．５ｍｌジクロロメタン中に予め溶解したＰｄ（ａｃａｃ）２（７．４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、０．０２％）を添加する。残りのＭＮＵ溶液を０〜５℃で４時間かけて添加する。この段階におけるＧＣは、２８％の未変換Ｅ−ベータ−ファルネセン、６５％の所望のモノシクロプロパン（上に示されている）、および３％のビスシクロプロパン化された化合物５を示した。
【０１６０】
２５℃での１６時間後に、酢酸（１００ｍｌ）を０〜５℃で添加し、次いでｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２５０ｍｌ）を添加する。相分離の後に、有機相を２ＭのＨＣｌ（２５０ｍｌ）によって洗浄し、水相をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（２５０ｍｌ）によって抽出する。組み合わせた有機層を水（２×１００ｍｌ）、１０％ＮａＯＨ水溶液（２×１００ｍｌ）、および水（２×１００ｍｌ）によって洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥して、濾過し、濃縮してやや黄色の液体２６．９ｇを得る。これは、９％のＥ−ベータ−ファルネセン、８２％の所望のモノシクロプロパン化合物、および６％のビスシクロプロパン化された副生成物を含有する。
【０１６１】
所望の化合物は、蒸留精製によってさらに単離され得る。
１ｇのＫ２ＣＯ３（１ｇ）の添加および４０〜６０ｍｂａｒでの３０ｃｍスチールコイルカラムによる蒸留により、１４７ｇのモノシクロプロパン化合物（６８％ｃｏｒｒ）を１３５〜１４５℃で得る。画分をプールして、純度１００％のモノシクロプロパン化合物９２ｇを得る。
【０１６２】
Ｅ−Δファルネセンの分析データ：
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 5.1 (2 m, 2 H), 4.6 (2 H), 2.2 (2 H), 2.1 (4 H), 2.0 (2 H), 1.7 (s, 3 H), 1.6 (2 s, 6 H), 1.3 (1 H), 0.6 (2 H), 0.45 (2 H) ppm. 13C-NMR (CDCl3, 400 MHz): 150.9 (s), 135.1 (s), 131.2 (s), 124.4 (d), 124.1 (d), 106.0 (t), 39.7 (t), 35.9 (t), 26.7 (t), 25.7 (q), 17.7 (q), 16.0 (d), 6.0 (t) ppm. GC/MS: 218 (2％, M+), 203 (5％, [M - 15]+), 175 (11％), 147 (31％), 134 (15％), 133 (20％), 121 (12％), 107 (55％), 95 (16％), 93 (30％), 91 (20％), 82 (11％), 81 (33％), 79 (42％), 69 (100％), 67 (22％), 55 (20％), 53 (21％), 41 (75％). IR (フィルム): 3081 (w), 2967 (m), 2915 (m), 2854 (m), 1642 (m), 1439 (m), 1377 (m), 1107 (w), 1047 (w), 1018 (m), 875 (s), 819 (m), 629 (w). C16H26の分析計算値: C, 88.00; H, 12.00.結果: C, 87.80; H, 12.01.
【０１６３】
Ｃ）（７Ｅ）−４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエン−１−オール（（７Ｅ）−ホモファルネソール）の調製
圧力管内における（Ｅ）−（６，１０−ジメチルウンデカ−１，５，９−トリエン−２−イル）シクロプロパン（Ｅ−Δファルネセン）（１ｇ、４．６ｍｍｏｌ）、ドデカン（０．２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、内部標準）、およびＬ−（＋）−酒石酸（１ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌下において１５０℃で加熱する。１８時間および（ＧＣによる）完全な変換の後に、混合物を水（５０ｍｌ）およびトルエン（５０ｍｌ）に注ぐ。
【０１６４】
相を分離し、水相をトルエン（５０ｍｌ）で抽出する。組み合わせた有機層を濃Ｎａ２ＣＯ３水溶液（５０ｍｌ）および濃ＮａＣｌ（２×５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４によって乾燥して、濾過し、減圧下で蒸発させることにより、茶色がかった樹脂（１．３５ｇ）を得る。これを３０％ＫＯＨ水溶液（４．３ｍｌ）と混合し、２５℃で２時間撹拌する。ＧＣ分析により、内部標準に従って９６％の（７Ｅ）−４，８，１２−トリメチルトリデカ−３，７，１１−トリエン−１−オールの形成が明らかになる。Ｅ／Ｚ比６８：２２。Ｅ異性体の分析データは文献からのものと一致している。例えばP. Kocienski, S. Wadman J. Org. Chem. 54, 1215 (1989)を参照。
【０１６５】
例２
ＳＨＣプラスミド調製および生体触媒産生
ＳＨＣプラスミド調製
アリシクロバチルス・アシドカルダリウス  スクアレン−ホペン環化酵素（AacSHC）（GenBank M73834, Swissprot P33247）をコードする遺伝子を、プラスミドｐＥＴ−２８ａ（＋）に挿入した。そこでは、それは大腸菌によるタンパク質産生のためのＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターの制御下にある。プラスミドを標準的なヒートショック形質転換プロトコールを用いて大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【０１６６】
エルレンマイヤーフラスコ培養
タンパク質産生のためには、富栄養培地（ＬＢ培地）または最少培地のいずれかを用いた。Ｍ９は最少培地の一例であり、これを用いて成功した。
【０１６７】
培地調製
デフォルトとして選んだ最少培地は、３５０ｍｌ培養のために下記のように調製した：３５ｍｌクエン酸／リン酸ストック（ＫＨ２ＰＯ４ １３３ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ４０ｇ／ｌ、クエン酸．Ｈ２Ｏ １７ｇ／ｇ、ｐＨは６．３に調整）にＨ２Ｏ ３０７ｍｌを加え、ｐＨは必要に応じて３２％ＮａＯＨで６．８に調整した。５０％ＭｇＳＯ４ ０．８５０ｍｌをオートクレーブした後に、微量元素溶液（次項の組成物）溶液 ０．０３５ｍｌ、チアミン溶液 ０．０３５ｍｌ、および２０％グルコース ７ｍｌを加えた。
【０１６８】
ＳＨＣ生体触媒産生（生体触媒産生）
小スケールの生体触媒産生（野生型ＳＨＣまたはＳＨＣ変異型）、３５０ｍｌ培養（培地に５０μｇ／ｍｌカナマイシンを補った）は、ＳＨＣ産生プラスミドを含有する大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の前培養から植菌した。細胞は、一定の撹拌（２５０ｒｐｍ）をしながら３７℃でおよそ０．５の光学密度（ＯＤ６５０ｎｍ）まで増殖させた。
【０１６９】
次いで、３００μＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによってタンパク質産生を誘導し、続いて一定の振盪をしながらさらなる５〜６時間のインキュベーションをした。得られたバイオマスは最終的に遠心によって集め、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５によって洗浄した。細胞はさらなる使用まで４℃または−２０℃でペレットとして保存した。一般的に、用いた培地とは関係なく、培養１リットルから、２．５から４グラムの細胞（湿重量）が得られた。
【０１７０】
発酵を調製し、７５０ｍｌのInforsHT反応容器内で実施した。発酵容器に脱イオン水１６８ｍｌを加えた。反応容器には全ての必要なプローブ（ｐＯ２、ｐＨ、サンプリング、消泡剤）、Ｃ＋Ｎフィード（feed）および水酸化ナトリウムのボトルを装備し、オートクレーブした。オートクレーブ後、反応容器に下記成分を加える：
２０ｍｌ  １０×リン酸／クエン酸緩衝液
１４ｍｌ  ５０％グルコース
０．５３ｍｌ  ＭｇＳＯ４溶液
２ｍｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４溶液
０．０２０ｍｌ  微量元素溶液
０．４００ｍｌ  チアミン溶液
０．２００ｍｌ  カナマイシンストック。
【０１７１】
反応条件は下記の通り設定する：ｐＨ＝６．９５、ｐＯ２＝４０％、Ｔ＝３０℃、３００ｒｐｍで撹拌。カスケード：３００でのｒｐｍセットポイント、最少３００、最大１０００、フローＬ／分セットポイント０．１、最少０、最大０．６。消泡剤コントロール：１：９。
【０１７２】
種培養から、０．４〜０．５のＯＤ６５０ｎｍになるよう発酵槽に植菌した。この種培養をＬＢ培地（＋カナマイシン）中で３７℃、２２０ｒｐｍで８時間増殖させた。発酵は最初にバッチモードで１１．５時間実施し、その後にフィード溶液（滅菌グルコース溶液（１４３ｍｌ Ｈ２Ｏ＋３５ｇグルコース）、これには、滅菌後、（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液１７．５ｍｌ、ＭｇＳＯ４溶液１．８ｍｌ、微量元素溶液０．０１８ｍｌ、チアミン溶液０．３６０ｍｌ、カナマイシンストック０．１８０ｍｌが添加されていた）によるＣ＋Ｎフィードを開始した。およそ４．２ｍｌ／時間の一定の流速でフィードを実施した。グルコースおよびＮＨ４＋測定が外部からなされ、培養物中のＣおよびＮ源の利用可能性を評価した。通常は、グルコースレベルは非常に低いままである。
【０１７３】
培養物は合計およそ２５時間増殖させ、そこでそれらは典型的には４０〜４５のＯＤ６５０ｎｍに達した。次いで、（ＩＰＴＧパルスとして、または注入シリンジを用いて３〜４時間かけて）発酵槽にＩＰＴＧをおよそ１ｍＭの最終濃度になるように添加し、温度を４０℃におよびｐＯ２を２０％に設定することによってＳＨＣ産生を開始した。ＳＨＣ産生の誘導は４０℃で１６時間続いた。誘導終了時、細胞は、遠心によって集め、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４で洗浄し、さらなる使用まで４℃または−２０℃でペレットとして保存した。
【０１７４】
結果１ａ
一般的に、産生された生体触媒の特異的活性は、全ての他の条件が不変である状態では、富栄養培地と比較して最少培地を用いたときにより高かった。誘導は３０または３７℃で成功した。誘導が４０〜４３℃でなされたときには、より高い特異的活性の生体触媒が得られるということが着目された。
【０１７５】
結果１ｂ
下記表１は、２つの例について、誘導開始および誘導終了の両方における培養体積、光学密度、および細胞の量と、集められたバイオマスの量（湿重量）とを示している。
【０１７６】
【表１】
2019521952.tif 000006
【０１７７】
野生型ＳＨＣアミノ酸配列（配列番号１） (GenBank M73834, Swissprot P33247)
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
【０１７８】
変異型Ｆ６０１Ｙ  ＳＨＣアミノ酸配列（配列番号２）−配列番号１に関しての変異型 
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGYPGDFYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
【０１７９】
変異型Ｆ６０５Ｗ  ＳＨＣヌクレオチド配列（配列番号３）
ATGGCTGAGCAGTTGGTGGAAGCGCCGGCCTACGCGCGGACGCTGGATCGCGCGGTGGAGTATCTCCTCTCCTGCCAAAAGGACGAAGGCTACTGGTGGGGGCCGCTTCTGAGCAACGTCACGATGGAAGCGGAGTACGTCCTCTTGTGCCACATTCTCGATCGCGTCGATCGGGATCGCATGGAGAAGATCCGGCGGTACCTGTTGCACGAGCAGCGCGAGGACGGCACGTGGGCCCTGTACCCGGGTGGGCCGCCGGACCTCGACACGACCATCGAGGCGTACGTCGCGCTCAAGTATATCGGCATGTCGCGCGACGAGGAGCCGATGCAGAAGGCGCTCCGGTTCATTCAGAGCCAGGGCGGGATCGAGTCGTCGCGCGTGTTCACGCGGATGTGGCTGGCGCTGGTGGGAGAATATCCGTGGGAGAAGGTGCCCATGGTCCCGCCGGAGATCATGTTCCTCGGCAAGCGCATGCCGCTCAACATCTACGAGTTTGGCTCGTGGGCTCGGGCGACCGTCGTGGCGCTCTCGATTGTGATGAGCCGCCAGCCGGTGTTCCCGCTGCCCGAGCGGGCGCGCGTGCCCGAGCTGTACGAGACCGACGTGCCTCCGCGCCGGCGCGGTGCCAAGGGAGGGGGTGGGTGGATCTTCGACGCGCTCGACCGGGCGCTGCACGGGTATCAGAAGCTGTCGGTGCACCCGTTCCGCCGCGCGGCCGAGATCCGCGCCTTGGACTGGTTGCTCGAGCGCCAGGCCGGAGACGGCAGCTGGGGCGGGATTCAGCCGCCTTGGTTTTACGCGCTCATCGCGCTCAAGATTCTCGACATGACGCAGCATCCGGCGTTCATCAAGGGCTGGGAAGGTCTAGAGCTGTACGGCGTGGAGCTGGATTACGGAGGATGGATGTTTCAGGCTTCCATCTCGCCGGTGTGGGACACGGGCCTCGCCGTGCTCGCGCTGCGCGCTGCGGGGCTTCCGGCCGATCACGACCGCTTGGTCAAGGCGGGCGAGTGGCTGTTGGACCGGCAGATCACGGTTCCGGGCGACTGGGCGGTGAAGCGCCCGAACCTCAAGCCGGGCGGGTTCGCGTTCCAGTTCGACAACGTGTACTACCCGGACGTGGACGACACGGCCGTCGTGGTGTGGGCGCTCAACACCCTGCGCTTGCCGGACGAGCGCCGCAGGCGGGACGCCATGACGAAGGGATTCCGCTGGATTGTCGGCATGCAGAGCTCGAACGGCGGTTGGGGCGCCTACGACGTCGACAACACGAGCGATCTCCCGAACCACATCCCGTTCTGCGACTTCGGCGAAGTGACCGATCCGCCGTCAGAGGACGTCACCGCCCACGTGCTCGAGTGTTTCGGCAGCTTCGGGTACGATGACGCCTGGAAGGTCATCCGGCGCGCGGTGGAATATCTCAAGCGGGAGCAGAAGCCGGACGGCAGCTGGTTCGGTCGTTGGGGCGTCAATTACCTCTACGGCACGGGCGCGGTGGTGTCGGCGCTGAAGGCGGTCGGGATCGACACGCGCGAGCCGTACATTCAAAAGGCGCTCGACTGGGTCGAGCAGCATCAGAACCCGGACGGCGGCTGGGGCGAGGACTGCCGCTCGTACGAGGATCCGGCGTACGCGGGTAAGGGCGCGAGCACCCCGTCGCAGACGGCCTGGGCGCTGATGGCGCTCATCGCGGGCGGCAGGGCGGAGTCCGAGGCCGCGCGCCGCGGCGTGCAATACCTCGTGGAGACGCAGCGCCCGGACGGCGGCTGGGATGAGCCGTACTACACCGGCACGGGCTTCCCAGGGGATTGGTACCTCGGCTACACCATGTACCGCCACGTGTTTCCGACGCTCGCGCTCGGCCGCTACAAGCAAGCCATCGAGCGCAGGTGA
【０１８０】
変異型Ｆ６０５Ｗ  ＳＨＣアミノ酸配列（配列番号４）−配列番号１に関しての変異型
MAEQLVEAPAYARTLDRAVEYLLSCQKDEGYWWGPLLSNVTMEAEYVLLCHILDRVDRDRMEKIRRYLLHEQREDGTWALYPGGPPDLDTTIEAYVALKYIGMSRDEEPMQKALRFIQSQGGIESSRVFTRMWLALVGEYPWEKVPMVPPEIMFLGKRMPLNIYEFGSWARATVVALSIVMSRQPVFPLPERARVPELYETDVPPRRRGAKGGGGWIFDALDRALHGYQKLSVHPFRRAAEIRALDWLLERQAGDGSWGGIQPPWFYALIALKILDMTQHPAFIKGWEGLELYGVELDYGGWMFQASISPVWDTGLAVLALRAAGLPADHDRLVKAGEWLLDRQITVPGDWAVKRPNLKPGGFAFQFDNVYYPDVDDTAVVVWALNTLRLPDERRRRDAMTKGFRWIVGMQSSNGGWGAYDVDNTSDLPNHIPFCDFGEVTDPPSEDVTAHVLECFGSFGYDDAWKVIRRAVEYLKREQKPDGSWFGRWGVNYLYGTGAVVSALKAVGIDTREPYIQKALDWVEQHQNPDGGWGEDCRSYEDPAYAGKGASTPSQTAWALMALIAGGRAESEAARRGVQYLVETQRPDGGWDEPYYTGTGFPGDWYLGYTMYRHVFPTLALGRYKQAIERR
【０１８１】
例３ａ
７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物の生物変換
下記反応条件を用いて生物変換を行った：
反応（合計体積１５０．１ｇ）は、合計ホモファルネソール１４６ｇ／ｌを含有するInforsHT７５０ｍｌ発酵槽において、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．４中で、８６：１４の７Ｅ，３Ｅ：７Ｅ，３Ｚの混合物であるホモファルネソール基質、細胞２５０ｇ／ｌ（例２の方法に従って形成された、発酵）、およびＳＤＳ１．５５％を用いて実施した。反応は３５℃で一定の撹拌（９００ｒｐｍ）をしながら実施し、ｐＨコントロールは水中の１０から４０％クエン酸を用いて行った。
【０１８２】
反応混合物は、下記の例４に記述される単離および精製ステップを施された。
【０１８３】
例３ｂ
７Ｅ，３Ｅ／Ｚ−ホモファルネソール混合物の生物変換
下記反応条件を用いて生物変換を行った：
反応（合計体積２．５ｍｌ）は、Heidolph Synthesis 1装置上の１１ｍｌガラス反応容器において０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液中で、５０℃およびｐＨ６．０で激しい振盪（８００ｒｐｍ）をしながら実施した。反応は、１ｇ／ｌのＥ，Ｅ−ホモファルネソール（８６：１４のＥＥ：ＥＺ比のホモファルネソールストックから）、例２に記載されている方法に従って野生型ＳＨＣを３０のＯＤ６５０ｎｍまで生成した細胞、および０．１２％ＳＤＳを含有した。反応開始の約４８時間後に、Ｅ，Ｅ−ホモファルネソールの変換は約６０％であった。
【０１８４】
反応を室温まで冷却したときには、反応混合物から取られた試料の顕微鏡分析の際にAmbrofix結晶が現れた。ＯＤ６５０ｎｍの１０の増加に相当する細胞のさらなる添加およびさらなる２４時間のインキュベーションは、完全なＥ，Ｅ−ホモファルネソールの変換を可能にした。反応混合物の試料の顕微鏡観察は、増加した数のAmbrofix結晶の存在を示唆した。
【０１８５】
反応をまた、０．１Ｍクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液中において、ｐＨ６．０で、合計体積１５０．１ｇにて、InforsHT７５０ｍｌ発酵槽中においても実行した。反応は、１ｇ／ｌのＥ，Ｅ−ホモファルネソール、０．１２％ＳＤＳ、および、野生型ＳＨＣを生成した細胞を１１８ｇ／ｌ湿重量で、含有し、および、激しい振盪（７００ｒｐｍ）をしながら５０℃でインキュベートした。反応開始のおよそ３０時間後に、Ｅ，Ｅ−ホモファルネソールの変換はおよそ８５％であった。反応混合物の試料の顕微鏡観察では、Ａｍｂｒｏｆｉｘ結晶の同定が可能であった。
【０１８６】
ホモファルネソールを再び１ｇ／ｌ相当量に添加し、および、反応をさらなるおよそ５０時間実施し；細胞もまた、３２ｇ／ｌ相当量（湿重量）に添加した。合計反応時間約６６時間で、Ｅ，Ｅ−ホモファルネソールの変換はおよそ８５％であった。反応混合物の試料の顕微鏡観察では、増加した数のＡｍｂｒｏｆｉｘ結晶の観察が可能であった。
【０１８７】
例４
一般的な下流プロセスは、参考として、以下、図４に記述される。
第１のステップにおいて、生物変換培地は、約１５分間の間、約８０〜８５℃の温度まで加熱され、（−）−アンブロックスの結晶を融解させる。この段階では液体である（−）−アンブロックスは、反応培地を１時間あたり約５℃の速度で、２０℃の温度まで冷却することによって、再結晶化される。
【０１８８】
第２のステップにおいて、（−）−アンブロックスが結晶化された後で、結晶は、生物変換培地から濾過によって分離される。濾過は、連続スクリーン遠心（Siebtechnic H250）において篩サイズ１００ミクロンで行われる。遠心は、２０２８Ｇの加速度および４３０ｋｇ／時間の供給速度で動作される。結晶と細胞残屑との間の顕著なサイズの違いのために、結晶の大部分は篩の上に保持されて、水で洗浄することができ、およびかかる目的のために提供されたナイフの手段によって機械的に集めることができる。
【０１８９】
第３のステップにおいて、第２のステップからの濾液は、ステップ２においてフィルターを通ったあらゆる結晶、これはデカンター装置中において沈殿物として沈む、から、上清中に保持された細胞残屑を分離するために、セットアップされた連続デカンター中へと供給される。デカンターは、１１７０Ｇの加速度および３７０ｋｇ／時間の供給速度で動作される。デカンター中において集められた結晶は、水で洗浄され、および、ステップ２において得られた結晶と組み合わせられる。組み合わせた結晶は、洗浄され、および、上清中のあらゆる残留細胞残屑を取り除くために静的にデカンテーションされ、および、洗浄された結晶はさらなるプロセシングに備えられる。
【０１９０】
第４のステップにおいて、洗浄された結晶は、１質量の結晶に対して４質量のエタノールの量にて、エタノール（９６％  技術グレード（technical grade））を用いて再可溶化される。溶液は、０．２２ミクロンフィルターを通して再び濾過される前に、大気温度および１ｂａｒの圧力でサブミクロンフィルター（０．６〜１．０ミクロン、KDS15）によって濾過される。
【０１９１】
このようにして形成された（−）−Ambrofix抽出物に、下記のとおりのさらなる脱臭および脱色のステップを施すことができる。
エタノール溶液を、真空下で、乾燥するまで濃縮した。濃縮物を、工業グレード（industrial grade）の変性エタノール中に再溶解させて、漂白剤（Tonsil 412FF）とそれに加えて珪藻土濾過剤（CELATOM FW 50）を、撹拌下において添加した。混合物を、５５〜６５℃まで冷却する前に、撹拌下において３０分間８０〜８５℃で還流した。固形物を取り除くために、混合物を２５ミクロンフィルターによって濾過した。
【０１９２】
余分な変性アルコールを、透明な脱色された溶液から大気圧蒸留によって排除した。水を、次に、熱い溶液に供給し、および、得られた混合物を、１５分間７５〜８０℃でかき混ぜた。この溶液を−１０〜−１５℃まで徐冷却することによって、（−）−アンブロックスを結晶化させた。結晶化された（−）−アンブロックスを、濾過で取り（filtered off）、および真空オーブン中で乾燥させた（５０〜６０℃；１〜５ｍｂａｒ）。
【０１９３】
例５ａ
下流プロセシング：（−）−アンブロックスを生物変換培地から選択的に分離する手段としての固−液分離とトルエン抽出との比較
２００ｍｌの不活性化された生物変換培地を、ＭＴＢＥで抽出し、およびガスクロマトグラフィーによって分析した。
【０１９４】
固−液分離
２００ｍｌの不活性化された生物変換培地を、液相から固形物を分離するために遠心した（Sorvall GS3、５０００ｒｐｍ、１０分、１０℃）。これは、およそ１２０ｍｌの液体上清から８０ｍｌの固形ペレットを分離させた。上清を取り除き、ＭＴＢＥで抽出し、およびガスクロマトグラフィーによって分析した。同様に、ペレットをＭＴＢＥで抽出し、およびＭＴＢＥ抽出物をガスクロマトグラフィーによって分析した。
【０１９５】
トルエン抽出
生物変換培地の２００ｍｌを、４５ｍｌトルエンによって６×抽出した。有機相を集め、および、あらゆる細胞残屑を取り除くために濾過した。トルエンを剥がし取り、および、ガスクロマトグラフィーによって分析する前に、残渣をＭＴＢＥ中に溶解させた。
【０１９６】
分析
ＧＣ分析結果は、以下、図３に描画される。結果から、遠心により集められた固相は、極めて高いレベルの（−）−アンブロックス、および極めて少ない量の副生成物ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶを含有したことが明らかである。他方で、トルエン抽出物は、未加工の生物変換培地と比較して（−）−アンブロックスを富化されていなかった。結果は、（−）−アンブロックスが生物変換培地から結晶化される一方で、構造的に関連する化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）が液相中に残ることを示唆する。固相の分析において見出された（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の残渣は、単に固相の徹底的な洗浄によって取り除くことができた残渣であった。
【０１９７】
この実験から、粒子サイズ分離のステップ（濾過および／またはデカンテーションなど）は、細胞残屑からの（−）−アンブロックスの固体形態の分離を可能にするのみならず、これはまた、固体（−）−アンブロックスを、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）などの構造的に関連する副生成物から完全にもしくは実質的に分離するために使用することもできると結論付けることができる。
【０１９８】
例５ｂ
官能分析
目的：粗物質中および結晶化された物質中において形成された（−）−アンブロックスならびに化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の官能分析を行うこと。
Ｅ，Ｅ−ホモファルネソールの生体内変換は、（−）−アンブロックスおよび化合物（ＩＶ）をもたらす。
Ｅ，Ｚ−ホモファルネソールの生体内変換は、マクロ環エーテル化合物（ＩＩ）およびエピ−アンブロックス化合物（ＩＩＩ）をもたらす。
（−）−アンブロックスの粗混合物は、それぞれ８７．１重量％、２．８重量％、２．５重量％、および７．６重量％の量で存在する、所望の（−）−アンブロックス、化合物（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を含む。
【０１９９】
粗混合物が選択的に結晶化された場合（実験室スケール）、結晶化された物質は、ガスクロマトグラフィーにより分析すると粗混合物と同じ構成成分を有するが、それぞれ９９．１重量％、０．１重量％、０．１重量％、および０．７重量％の量で存在する。（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）の残渣は、（−）−アンブロックスの結晶に付着した油性の残渣であると考えられる。
【０２００】
官能分析結果は下記の通りであった：
（−）−アンブロックス：匂い閾値  ０．２ｎｇ／ｌ。
化合物（ＩＶ）：弱い、ＩｓｏＥ、ウッディー、ＧＣ検出閾値  ５〜１０ｎｇ。
化合物（ＩＩ）：「無臭」（ＧＣ閾値  ＞５００ｎｇ）。
化合物（ＩＩＩ）：（−）−アンブロックスよりも約１０×高いＧＣ閾値（およそ２ｎｇ）。
【０２０１】
結論
３つの副生成物（化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）の官能分析は、（−）−アンブロックスからのものよりも弱い匂いを示す。
事実、エピ−アンブロックス（化合物ＩＩＩ）の匂いは、（−）−アンブロックスよりも約１０倍弱く、それが本質的に無臭であるということを示唆している。
【０２０２】
官能分析は、（−）−アンブロックスからの１つ以上の副生成物たる化合物の除去が、たとえ取り除かれた化合物が実際にはそれ自体無臭の化合物であっても、残った化合物（例えば、（  ）  アンブロックス）の匂いを改善し得るということを実証した。つまり、訓練されたパフューマーにより（許容可能な嗅覚的純粋性のための認識されているベンチマークを使用して）決定された、嗅覚的純粋性の観点でのアンブロックスの匂いの向上は、化合物ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶが存在しない場合に観察された。
【０２０３】
例６
微生物発酵プロセスにより形成された（−）−アンブロックスの固体形態のＸ線特徴付け
STOE STADI P Ｘ線回折計を使用して、粉末Ｘ線回折パターンを取得した。
【０２０４】
システムの記載：回折計は、位置敏感型検出器を使用することによって、トランスミッションモード（平板試料ホルダー、湾曲ゲルマニウム（ＩＩＩ）モノクロメーター、およびCuKa1放射1.54060オングストローム）にて使用した。発生器の電圧は４０ｋＶであり、電流は４０ｍＡであった。検出器：Mythen 1K。
実験パラメータ：パターン計測を、２θ＝約４°〜２６°の間で行った。決定した回折角の正確度は、およそ＋／−０．２°  ２θである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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