(57)【要約】  本発明は、好ましくは、胃腸障害を予防または処置するために使用するための、少なくとも６または７の異なる、特定の細菌種に属する細菌の混合物に関する。好ましくは、前記細菌の混合物は、前記障害を予防または処置するために前記混合物を対象に投与する前に、発酵槽において一緒に増殖される。【選択図】図１２
2019511563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌から本質的になる組成物。
【請求項２】
胃腸障害に関連する症状を予防または処置するために使用するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記胃腸障害が、腸の障壁機能の破壊、下痢、便秘、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、嚢炎、粘膜炎、腸の感染症、腸微生物叢ディスバイオシス（dysbiosis）およびこれらの任意の組み合わせである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記胃腸障害が、ａ）腸管において１または限定されたメンバーの有益な細菌の増殖および／または活性を刺激すること、ｂ）腸管において１または限定されたメンバーの病原性細菌の増殖および／または活性を阻害すること、ｃ）胃腸表面の粘膜への非病原性細菌の付着を相対的に増加させること、ｄ）抗原、炎症促進物質、細菌または細菌生産物の腸による無制御の取り込みを減少させること、ｅ）腸表面における抗炎症活性を提供すること、ｆ）腸障壁機能を増加させること、ｇ）細菌代謝物を生産すること、またはｈ）ａ）〜ｇ）の任意の組合せを介して予防または処置される、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
Roseburia hominis種に属する細菌が、前記組成物から排除されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Escherichia coli種、Enterococcus faecium種、Lactobacillus mucosae種、Bifidobacterium adolescentis種、Bifidobacterium longum種、Bacteroides thetaiotaomicron種およびBacteroides vulgatus種に属する細菌が、前記組成物に添加されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
１以上のプレバイオティクスをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記胃腸障害を予防または処置するために、前記組成物を投与する前に、前記細菌が発酵槽において一緒に増殖される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記発酵槽が、胃腸管の動的シミュレーターである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細菌が、以下の株のリスト：Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362、Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677、Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360、Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109、Roseburia inulinivorans LMG P-29365、Roseburia inulinivorans DSMZ 16841、Roseburia hominis LMG P-29364、Roseburia hominis DSMZ 16839、Akkermansia muciniphila LMG P-29361、Akkermansia muciniphila DSMZ 22959、Lactobacillus plantarum LMG P-29366、Lactobacillus plantarum ZJ316、Anaerostipes caccae LMG P-29359、Anaerostipes caccae DSMZ 14662または少なくとも１つの前記株の１６ＳｒＲＮＡ配列と少なくとも９７％の配列同一性を示す株から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、直腸投与形態または経口摂取形態のいずれかとして製剤化されている医薬組成物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記経口摂取形態が、カプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、丸薬、懸濁液またはシロップである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
食品、飲料、食品サプリメントまたは栄養補助食品に組み込まれている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、１０５〜１０１１コロニー形成単位の細菌を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に定義される組成物を含む、反応槽。
【請求項１６】
１．５〜８のｐＨ範囲；炭素源の利用可能性；１０分〜２００時間の保持時間；０〜８ｇ／Ｌの酸素利用可能性；微量栄養素の利用可能性；抗生物質の存在／不存在；０〜２０ｍＭの間の胆汁酸塩の濃度；重金属の存在；免疫分子としての宿主因子の存在を含む、ＧＩ管を代表する標準化された条件下で操作する反応槽。
【請求項１７】
標準化された条件を特徴付けるパラメーターが、請求項１６に定義される、ｐＨ、特定の反応槽における保持時間、および胆汁酸塩の濃度を含む、請求項１６に記載の反応槽。
【請求項１８】
組成物の、５〜２０の別個の細菌メンバー、好ましくは５〜１５の別個の細菌メンバーが、機能的に安定なコラボローム（collaborom）を得るために、３〜１４日の時間存在する、請求項１６または１７に記載の反応槽。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、好ましくは、胃腸障害を予防または処置するために使用するための、少なくとも６または７の異なる、特定の細菌種に属する細菌の混合物に関する。より好ましくは、前記細菌の混合物は、前記障害を予防または処置するために前記混合物を対象に投与する前に、発酵槽において一緒に増殖される。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ヒトおよび動物の腸の生態系は、内容物の湿重量１グラム当たり１０１１を超える微生物、主に嫌気性菌を含むいわゆる微生物叢によって定着される、多様な異なる生息地および代謝性ニッチからなる（Macfarlane & Macfarlane, 1997）。今日、ヒトまたは動物の腸マイクロバイオームが、エネルギー収穫に寄与し、免疫系を調節し、日和見病原体に対する定着耐性を確立することによって、ヒトの健康（health）および健康（well-being）に重要な役割を果たすことはよく認識されている（Fuller & Gibson, 1997；Cummings & Macfarlane, 1997）。細菌およびそれらの代謝産物と粘膜層および／または腸壁との相互作用が重要であるという証拠が存在する（Barnett et al. 2012）。腸マイクロバイオームは、一般的に経時的に安定であるが、その組成は、食事の変化、抗生物質の使用、衛生およびストレスの増加などの外部摂動によって変化する。
【０００３】
これは、ディスバイオシス（dysbiosis）と呼ばれる胃腸管の不均衡状態を導く（Clemente et al. 2012）。ディスバイオシスは、正常な腸マイクロバイオーム組成における中程度または重度の破壊によって特徴付けられ、それによって、重要な微生物種の欠如、特定の微生物機能におけるギャップ、結果として腸壁活性の損なわれた調節を引き起こす。これは、下痢または壊死性腸炎を引き起こす、病原性微生物の定着を導く可能性がある（Sekirov et al., 2008）。このような発病の極端な形態の１つが、古典的な抗生物質療法が患者の治癒を次第に困難にするＣＤＡＤ（クロストリジウム・ディフィシル関連下痢症（Clostridium difficile associated diarrhea））である。
【０００４】
微生物ディスバイオシスの他の結果は、慢性炎症（Willing et al、2009）または食物アレルギーをもたらす易感染の免疫応答、または増加した腸の透過性、栄養素の吸収不良、さらには菌血症であり得る。微生物の機能性および腸壁の生理機能に対するディスバイオシスの悪影響は、このようにヒトの健康を損なう可能性がある。事実、便秘、ＩＢＳ、ＩＢＤ、嚢炎、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、心血管疾患、精神状態、認知機能障害、神経変性疾患、種々な種類の癌（例えば、結腸癌）、女性生殖器官の炎症、ＣＤＡＤ、リウマチまたは関節リウマチは全て、腸微生物叢の活性／組成の変化と関連している。したがって、ディスバイオシスは発生時に回避または治療すべきであることは明らかである。
【０００５】
ディスバイオシスが病原体の存在に関連する場合、健康に有害な微生物を取り除くための明らかな戦略は、抗生物質の適用である。しかしながら、過去数十年にわたる広範かつ不適切な、広いスペクトラムでの抗生物質の使用は、抗生物質耐性を劇的に増加させている（Brandl et al., 2008）。さらに、抗生物質は、その多くが、重要な機能を果たし健康上の利益をもたらす先住の腸微生物をも攻撃し、それゆえディスバイオシスの状態を悪化させる。結果として、過去２０年間で、機能性食品の研究、特にプレバイオティクスおよびプロバイオティクス製品の開発が大幅に増加した。プレバイオティクスの概念は、既に宿主に順応している先住の腸微生物の食事調節に関わるものであるので魅力的であるるものの（Van Loo et al, 1999）、主にそれは予防的方法において使用されている。
【０００６】
治療的適用のために、重度に破壊された腸マイクロバイオームは、罹患した個体においてあまり豊富でないかまたは存在さえしない、健康を促進する種に有益な基質を提供するよりもむしろ、重要な微生物種の導入によってより多くの利益を得る。可能性のある解決策は、プロバイオティクスと呼ばれる生存可能な、健康を促進する微生物の導入である（Iannitti and Palmieri, 2010）。プロバイオティクス製品は、大部分が、特定の機能性を有する、１〜いくつかの相互に連結されていない微生物株（大部分は乳酸産生細菌）からなる。しかしながら、上部消化管の過酷な条件下でのプロバイオティクス株の生存は困難であり、広大な先住マイクロバイオームとの競合はしばしば微々たるものである。しかし、易感染の腸生態系に新しい種を導入するという概念は、糞便微生物移植（fecal microbial transplants）（ＦＭＴ）の適用によって近年勢いを増している（Khoruts et al., 2010）。
【０００７】
これは健康なドナーから罹患したレシピエントへの糞便微生物スラリーの移動を伴う。この形態の細菌療法は、抗生物質耐性感染症の処置に主に適用され、９０％以上の治癒率を有する。ＦＭＴは現在、胃腸ディスバイオシス（クローン病、肥満、過敏性腸症候群）に起因する多くの他の病態を処置するために検討されている。ＦＭＴは、単一のプロバイオティクス株がしばしば失敗する場所で効率的に機能するようにみえる。しかしながら、特徴付けが不十分である糞便移植は、感染性疾患の伝染リスクがあり、急性でも致命的でもない病態における広範な適用可能性には、現在疑問を投げかけられている（De Vrieze 2013）。
【０００８】
２０１３年初めに、糞便微生物移植のための代替案が、ＣＤＡＤを治癒するための治療剤として、それらの培養可能性に基づいて個体から単離された微生物の人工的な混合物の使用に関する科学論文（Petrof et al., 2013）および特許出願（ＷＯ２０１３０３７０６８−胃腸系の障害の処置のための方法）により当該技術分野に提起された。そのような製品はまた、既知の微生物のセットから構成され、ＱＰＳ基準が尊重される場合、糞便移植からの疾患伝染の懸念を取り除くであろう。しかしながら、微生物を一緒に混合することは、それらが互いに相互作用し、微生物ネットワークを要求する機能的なニッチを占めることを保証するわけではない。それゆえ、製品の安定性、標準化および重要な機能の性能は保証されていない。
【０００９】
特許出願ＷＯ２０１４１４５９５８Ａ２（ネットワークを基にした微生物組成物及び方法）において、有効量の、治療用細菌組成物、複数の単離された細菌または精製された細菌調製物を、これを必要とする哺乳動物対象に投与することが提案されている。複数の単離された細菌または精製された細菌調製物は、いわゆるネットワーク生態を形成することができる。この調製物に属する細菌は、ゲノム情報に基づいて選択され、緩やかにアセンブリされた株のセットとして哺乳動物対象に提供される。
【００１０】
Becker et al. (2011)の刊行物において、８つの異なる株：Anaerostipes caccae、Bacteroides thetaiotaomicron、Bifidobacterium longum、Blautia producta、Clostridium butyricum、Clostridium ramosum、Escherichia coli、Lactobacillus plantarumからなるコミュニティーが記載されている。コミュニティーは、ＳＩＨＵＭＩｘ（拡張された単純化ヒト微生物叢（Simplified Human Microbiota extended））と呼ばれている。この人工的な微生物コミュニティーをラット研究において試験し、ＳＩＨＵＭＩｘ接種ラットと従来のヒト関連ラットおよび無菌ラットとを比較した。著者らは、そのコミュニティーが、組成および機能性の観点において、ヒト結腸関連微生物叢の代表であると主張している。微生物コミュニティーはラットの年齢に応じて発展したが、経時的に安定した組成に達した。
【００１１】
Van den Abbeele et al. (2013)は、適切で重要な種およびクロスフィーディング微生物の混合物を接種することができる従来のインビトロ発酵槽を使用することにより、グリカン分解コミュニティーを創出する可能性を提案した。接種および安定化後、特定の機能のためのこのような微生物ネットワークユニットは、大規模に達成および生産され得る。
【００１２】
最終的に、Newton et al. (1998)は、嫌気性ケモスタットを用いて、１４の異なる糖加水分解およびアミノ酸発酵種（すなわち、Bifidobacterium longum、Bif. adolescentis、Bif. pseudolongum、Bif. infantis、Bacteroides thetaiotaomicron、Bact. vulgatus、Lactobacillus acidophilus、Enterococcus faecalis、Ent. faecium、Escherichia coli、Clostridium perfringens、Cl. butyricum、Cl. innocuum、Cl. Bifermentans）を含む再現性のある定義された細菌コミュニティーを創出し、腸生物に対する硫酸還元細菌（sulphate-reducing bacterium）（ＳＲＢ）であるDesulfovibrio desulfuricansの効果を研究した。
【００１３】
しかしながら、胃腸障害を予防または処置するために効果的に使用することができる細菌種の代替および特定の混合物を設計する必要性は、依然として存在する。さらに、予め順応された混合物が、同じ細菌種の緩くアセンブリされ、かつ予め順応されていない混合物を投与することと比較した場合に、治療的により悪くまたはより良く機能するか否かは完全に不明である。
【発明の概要】
【００１４】
発明の概要
本発明は、第１の例において、好ましくは、胃腸障害に関連する症状を予防または処置するために使用するための、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌から本質的になる組成物に関する。
【００１５】
言い換えると、本発明は、それを必要する対象において、胃腸障害に関連する症状を予防または処置するための方法であって、治療的有効量の、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌から本質的になる組成物を投与することを含む、前記方法に関する。
【００１６】
本発明は、さらに、前記胃腸障害が、腸の障壁機能の破壊、下痢、便秘、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、嚢炎、粘膜炎、腸の感染症、腸微生物叢ディスバイオシスおよびこれらの任意の組み合わせである、上記の組成物に関する。
【００１７】
本発明はまた、前記胃腸障害が、ａ）腸管において１または限定されたメンバーの有益な細菌の増殖および／または活性を刺激すること、ｂ）腸管において１または限定されたメンバーの病原性細菌の増殖および／または活性を阻害すること、ｃ）胃腸表面の粘膜への非病原性細菌の付着を相対的に増加させること、ｄ）抗原、炎症促進物質、腸による細菌または細菌生産物の無制御の取り込みを減少させること、ｅ）腸表面における抗炎症活性を提供すること、ｆ）腸障壁機能を増加させること、ｇ）細菌代謝物を生産すること、またはｈ）ａ）〜ｇ）の任意の組合せを介して予防または処置される、上記の組成物に関する。
【００１８】
本発明はまた、Roseburia hominis種に属する細菌が、前記組成物から排除されている、上記の組成物に関する。
本発明はさらに、Escherichia coli種、Enterococcus faecium種、Lactobacillus mucosae種、Bifidobacterium adolescentis種、Bifidobacterium longum種、Bacteroides thetaiotaomicron種およびBacteroides vulgatus種に属する細菌が、前記組成物にさらに添加されている、上記の組成物に関する。
【００１９】
本発明はさらに、１以上のプレバイオティクスをさらに含む、上記の組成物に関する。
好ましい態様において、本発明は、前記胃腸障害を予防または処置するために、前記組成物を投与する前に、前記細菌が発酵槽において一緒に増殖されることにより、予め順応されている、上記の組成物に関する。
この点について、本発明はさらに、前記発酵槽が、胃腸管の動的シミュレーターである、上記の組成物に関する。
【００２０】
より具体的には、本発明は、前記細菌が、以下の株のリスト：Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362、Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677、Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360、Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109、Roseburia inulinivorans LMG P-29365、Roseburia inulinivorans DSMZ 16841、Roseburia hominis LMG P-29364、Roseburia hominis DSMZ 16839、Akkermansia muciniphila LMG P-29361、Akkermansia muciniphila DSMZ 22959、Lactobacillus plantarum LMG P-29366、Lactobacillus plantarum ZJ316、Anaerostipes caccae LMG P-29359、Anaerostipes caccae DSMZ 14662および／または少なくとも１つの前記株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と少なくとも９７％の配列同一性を示す株から選択される、上記の組成物に関する。
【００２１】
本発明はさらに、前記組成物が、直腸投与形態または経口摂取形態のいずれかとして製剤化されている医薬組成物である、上記の組成物に関する。
この点について、本発明はさらに、前記経口摂取形態が、カプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、丸薬、懸濁液またはシロップである、上記の組成物に関する。
本発明はさらに、食品、飲料、食品サプリメントまたは栄養補助食品に組み込まれている、上記の組成物に関する。
本発明は、より具体的には、前記組成物が、１０５〜１０１１コロニー形成単位の細菌を含む、上記の組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡単な説明
【図１】図１：胃、小腸および３つのそれぞれの結腸領域からなるＳＨＩＭＥ（登録商標）ユニットの概略図。液体ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地と膵液は、それぞれ胃と小腸を模擬した区画に入る。これらの滅菌区画内に規定された滞留時間後、懸濁液は３つの連続した結腸区画である、それぞれ異なるｐＨと滞留時間によって特徴付けられる上行、横行および下行結腸区画に進む。これらの区画に、ヒト糞便微生物叢が接種される。全てのベッセルは、ヘッドスペースにＮ２をフラッシュすることにより嫌気性に保たれ、連続的に攪拌され、３７℃に保たれる。
【００２３】
【図２】図２：２４時間のインキュベーションにおける２３の異なる組成物による酪酸生産（上パネル）、およびＴＨＰ１細胞の存在下で培養したＣａｃｏ−２細胞の経上皮電気抵抗（Trans-Epithelial Electrical Resistance）（ＴＥＥＲ）に対する効果（下パネル）。後者については、２４時間後の２３のインキュベーションから回収した試料を滅菌濾過し、半透性インサート上で１４日間増殖させたＣａｃｏ−２細胞の頂端区画に２４時間（１：５ｖ／ｖ）添加し、ＰＭＡ刺激ＴＨＰ１由来マクロファージの上に置いた（共培養）。増殖培地単独（ＤＭＥＭ）を対照として使用した。ＰＭＡの存在下で４８時間培養されたＴＨＰ１細胞は、ＤＭＥＭ対照におけるＴＥＥＲの減少によって測定されるように、Ｃａｃｏ−２細胞に損傷を誘発する。ＴＥＥＲ値は共培養前に測定された値（０時間）で正規化され、初期値からの百分率として表される。異なる組成物のコード化は以下のとおりであった：ＭＸ−Ｙ、式中、Ｘ＝組成物中に存在する単離体の数であり、Ｙ＝Ｘ単離体を含む、特有の組成物Ａ、Ｂ、Ｃ等である。
【００２４】
【図３】図３：７種の完全な組成物、またはその都度、元の７種のうちの１種が除かれている６種の組成物のいずれかにより、条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地中で２４時間および４８時間インキュベートした際の酪酸生産。結果は、全ての７種からなる組成物に対して、６種の組成物でのそれぞれのインキュベーションで検出された酪酸生産の百分率として提示される。組成物は、「全体」（全７種）または「全体−Ｘ」と呼ばれ、Ｘは全体の組成物から除かれた種である。＊：２４時間における「全体」と比較してｐ＜０．０５；＃：４８時間における「全体」と比較してｐ＜０．０５。
【００２５】
【図４】図４：条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地中での５日間の嫌気的インキュベーションにより組成物によって生産される酪酸、プロピオン酸および酢酸のレベル（ｍＭ）。組成物は、「アセンブリ」戦略（左パネル）または「コラボローム（collaborom）」戦略（右パネル）のいずれかによって生産された。
【００２６】
【図５】図５：「コラボローム」戦略による組成物の３つの独立した生産サイクルにおける１４日間にわたるプロピオン酸（左パネル）および酪酸（右パネル）のレベル（ｍＭ）の発展。適切な培養培地中での初期増殖において、組成物の株を混合し、接種し、ｐＨ６．１５〜６．４で単一の結腸領域からなるＳＨＩＭＥ（登録商標）装置で１４日間３重に培養した。
【００２７】
【図６】図６：代替「コラボローム」戦略による組成物の生産における、酢酸、プロピオン酸および酪酸のモル％として表される、ＳＣＦＡレベルの発展。適切な培養培地で初期増殖において、組成物の株を混合し、接種し、フェドバッチ方式で操作される単一の発酵槽で８日間３重に培養した。１６時間の特定の間隔で、増殖培地の４０％（ｖ：ｖ）を条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地で置き換えた。
【００２８】
【図７】図７：（ｉ）滅菌基本培地（上パネル）または（ｉｉ）ＳＨＩＭＥ結腸領域に由来する微生物叢（中央パネル）もしくは（ｉｉｉ）糞便微生物叢（下パネル）で補充された滅菌培地を用いた２４時間のインキュベーションにおける酢酸、プロピオン酸、酪酸および総短鎖脂肪酸（Short Chain Fatty Acid）（ＳＣＦＡ）の生産（ｍＭ）。「コラボローム」戦略により生産される組成物による異なる処置を、合計インキュベーション量の０％〜４％および２０％の範囲で適用した。
【００２９】
【図８】図８：Ｍ−ＳＨＩＭＥ（登録商標）における抗生物質回復実験における酢酸（上パネル）、プロピオン酸（中央パネル）および酪酸（下パネル）のレベル（ｍＭ）の発展。抗生物質のカクテル（それぞれ４０／４０／１０ｍｇ／Ｌのアモキシシリン／シプロフロキサシン／テトラサイクリン）の投与によるＳＨＩＭＥ（登録商標）由来の結腸微生物叢のディスバイオシス誘発において、ディスバイオシスされた微生物叢を「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略のいずれかにより生産された組成物で５日間処置した（１日目＝組成物の投与開始）。結果を抗生物質投与前の値に対する、各時点でのＳＨＩＭＥにおけるＳＣＦＡレベルのデルタで表す。
【００３０】
【図９】図９：Ｍ−ＳＨＩＭＥ（登録商標）におけるＩＢＤ関連ディスバイオシス回復実験における酢酸（上パネル）、プロピオン酸（中央パネル）および酪酸（下パネル）のレベル（ｍＭ）。３つの独立したＳＨＩＭＥ（登録商標）結腸ベッセルに、潰瘍性大腸炎患者からの糞便材料を接種した。同時に、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略のいずれかによって生産された組成物の単回用量を、それぞれのＳＨＩＭＥ結腸ベッセルに添加した。第３の実験は、組成物を投与しない対照実験として並行して行った。酢酸、プロピオン酸および酪酸の生産を、組成物の投与の１および２日続けた。
【００３１】
【図１０】図１０：Ｃ５７／ＢＬ６マウスの抗生物質回収実験における酢酸、プロピオン酸および酪酸のレベル（ｍｏｌ％）の発展。マウスに標準食餌を与えた対照期間の後、５日間、クリンダマイシン（２５０ｍｇ／Ｌ）を飲料水に添加することにより、腸微生物叢ディスバイオシスを誘発した。この後、マウス（ｎ＝１０／群）を、生理食塩水（細菌介在のない対照；左パネル）、「コラボローム」戦略により生産された組成物（中央パネル）、または「コラボローム」戦略により生産された拡張組成物（右パネル）のいずれかで、５日間、経口強制飼養した。同じ介在群から得られたマウス糞便試料をプールし、酢酸、プロピオン酸および酪酸のレベルを定量した。
【００３２】
【図１１】図１１：Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＴＮＢＳ誘発大腸炎実験における疾患活動性指数（Disease Activity Index）（ＤＡＩ）および体重変化の発展。マウスに標準食餌を与えた１週間の馴化期間の後、実験を開始した。各群（ｎ＝９／群）を経口強制飼養により５日間連続して処置した。全ての処置の予防的投与は、２ｍｇのＴＮＢＳ／５０％ＥｔＯＨの直腸投与の１日前に開始し、マウスを屠殺するまでＴＮＢＳ投与後４日間持続した。以下の処置：ＴＮＢＳ＋生理食塩水（ビヒクルＴＮＢＳ対照）；ＴＮＢＳ＋「アセンブリ」戦略により生産された組成物、およびＴＮＢＳ＋「コラボローム」戦略により生産された組成物を含んだ。従来の群（ＴＮＢＳ処置をしないが、生理食塩水で処置）を、ビヒクル対照として含んだ。
【００３３】
【図１２】図１２：Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＤＳＳ誘発慢性大腸炎実験における疾患活動性指数（ＤＡＩ）の発展。マウスに標準食餌を与えた１週間の馴化期間の後、実験を開始した。各群（ｎ＝１０／群）を、経口強制飼養により、８週間連続して週に３回処置した。全ての処置の予防的投与は、最初のＤＳＳサイクルの１週間前に開始した。最初のＤＳＳサイクルは２週目に開始し、１週間のＤＳＳ投与（飲料水中０．２５％）に続く２週間の回復を含む。この第１のサイクルの後に、同一の第２のＤＳＳサイクルが続いた。第３のＤＳＳサイクルは、１週間のＤＳＳ投与に続く１週間の回復からなり、その後、動物を屠殺した。以下の処置：ＤＳＳ＋生理食塩水溶液（ビヒクルＤＳＳ対照）；ＤＳＳ＋「コラボローム」戦略により生産された組成物を含んだ。従来の群（ＤＳＳ処置なし、生理食塩水で処置）を、ビヒクル対照として含んだ。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の説明
腸マイクロバイオームは、種々の対象内に共存し、お互いや宿主と相互作用する何百もの微生物種を含む。近頃では、腸微生物叢は、代謝機能および免疫恒常性を制御することによってヒトの健康および疾患において重要な役割を果たすと一般に考えられている（Cenit et al., 2014）。いくつかの研究は、全てのヒト個体が健康な腸マイクロバイオームの機能的能力を定義する必須の種または株の重要な数を共有していることを示唆する「コアマイクロバイオーム」を定義する試みにおいて、これらの複雑な腸微生物コミュニティー群集を調査している（Kinross et al., 2011）。この概念（すなわち、全てのヒトに「コアマイクロバイオーム」が生息している）、腸微生物叢（例えば、要となる種、粘膜管腔微生物叢（mucosal versus luminal microbiota）、近位遠位結腸細菌（proximal versus distal colon bacteria）など）の組成および機能に関する利用可能な広範な文献、ならびに機能的ゲノム解析に基づいて、複雑なヒト腸マイクロバイオームの主な機能を網羅する微生物の候補のリストを同定することができた。
【００３５】
本発明は、第１の例において、特別な驚くべき効果を有するヒト腸マイクロバイオームの細菌種のサブ群の特定の選択に関する。より具体的には、本発明は、好ましくは、胃腸障害に関連する症状を予防または処置するために使用するための、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌から本質的になる組成物に関する。用語「から本質的になる」は、それらが前記組成物の効果（すなわち、胃腸障害に関連する症状を予防または処置する）に悪影響を与えない限り、前記組成物が、他の細菌種および／または他の成分を含み得ることを指す。一つの態様において、本発明の組成物は、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌を含む。
【００３６】
別の態様において、本発明の組成物は、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌からなる。
【００３７】
細菌種Faecalibacterium prausnitzii（Duncan et al. 2002）、Butyricicoccus pullicaecorum（Eeckhaut et al. 2008）、Roseburia inulinivorans（Duncan et al. 2006）、Roseburia hominis（Duncan et al. 2006）、Ａkkermansia muciniphila（Derrien et al. 2004）、Lactobacillus plantarum（Walter 2008）およびAnaerostipes caccae（Schwiertz et al. 2002）は、当業者によく知られている細菌種である。用語「胃腸障害に関連する症状」は、ヒトおよび動物における健康問題を指す。本発明の組成物の使用は、より具体的には、細菌と腸表面との間の相互作用の正の調節をもたらす、ディスバイオシスからの予防／回復を導く。結果として、腸表面の改善された機能：例えば、障壁、ホルモン、免疫機能が得られる。腸表面に対する効果の開始は、「同じ株の緩くアセンブリされたセット」と比較して「予め順応されている組成物」が投与される場合に速い（さらに参照のこと）。本明細書で用いられるように、腸表面の障壁、ホルモンまたは免疫機能を調節または改善することは、腸表面の正常な恒常性に影響を及ぼす任意のパラメーター、特に病原体、抗原または他の有害物質による侵襲に対する第一線の防御におけるその役割、および宿主に全身的な影響を及ぼす物質（例えば、免疫分子、ホルモン）を生産するその役割を変化させることを含むことを意味する。
【００３８】
前記パラメーターは、これらに限定されるものではないが、
−  腸管において１または限定されたメンバーの有益な細菌（例えば、lactobacilli、bifidobacteria、酪酸またはプロピオン酸産生細菌、他のもの）の増殖および／または活性の刺激；
−  腸管において１または多数の病原性細菌の増殖および／または活性の阻害；
−  腸表面の粘膜への非病原性細菌の付着の相対的な増加；
−  腸からの、抗原、炎症促進性分子、細菌または細菌生産物の無制御の取り込みの減少、
−  腸管関連リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue）（ＧＡＬＴ）および宿主の全身性免疫系の調節；
−  特定の細菌代謝物（例えば、プロピオン酸、酪酸）の生産；および
−  代謝恒常性を直接的にまたは間接的に調節する特定の腸のシグナル伝達分子（例えば、プログルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、ＦＩＡＦ）の生産の調節；
を含む。
【００３９】
本発明は、したがって、前記胃腸障害が、ａ）腸管において１または限定されたメンバーの有益な細菌の増殖および／または活性を刺激すること、ｂ）腸管において１または限定されたメンバーの病原性細菌の増殖および／または活性を阻害すること、ｃ）胃腸表面の粘膜への非病原性細菌の付着を相対的に増加させること、ｄ）腸による、抗原、炎症促進物質、細菌または細菌生産物の無制御の取り込みを減少させること、ｅ）腸表面における抗炎症活性を提供すること、ｆ）腸障壁機能を増加させること、ｇ）細菌代謝物を生産すること、またはｈ）ａ）〜ｇ）の任意の組合せを介して予防または処置される、上記の組成物に関する。
【００４０】
一般的な胃腸障害に関連し得る健康状態は、これらに限定されないが、便秘、過敏性腸症候群（Irritable Bowel Syndrome）（ＩＢＳ）、炎症性腸疾患（Inflammatory Bowel Diseases）（ＩＢＤ）、腸微生物叢ディスバイオシス、粘膜炎、メタボリックシンドローム、肥満、糖尿病、心血管疾患、慢性疲労症候群、精神状態、認知機能障害、神経変性疾患、癌の形態、自己免疫状態、免疫機能障害、リウマチ、関節リウマチ、女性生殖器の炎症、病原体（細菌、ウイルスおよび真菌）の感染を含む。神経変性疾患の例としては、これらに限定されないが、ＡＬＳ、痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病を含む。癌の種類の例としては、これらに限定されないが、肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、および特に結腸直腸がんを含む。自己免疫疾患の例としては、これらに限定されないが、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎、セリアック病、乾癬および狼瘡を含む。
【００４１】
本発明の組成物が、胃腸上皮の粘膜層への非病原性細菌の相互作用および／または活性を増強するという観察に基づいて、前記調製物は、腸表面の障壁機能を改善するために、例えば、抗原、炎症誘発性分子、病原性細菌または細菌生産物の腸からの無制御の取り込みを予防または減少させるために、特に有用であると想定される。損なわれた粘膜障壁を有するそのような適応症の１つが、炎症性腸疾患である。炎症性腸疾患において、病変に対する解決策が損なわれた粘膜損傷がこれらの慢性的な適応症を導く重要な要素の１つであることが一般的に認められているので、本発明の組成物は前記適応症に有益な効果を有する。したがって、本発明の目的は、損なわれた障壁機能に関連し、抗原、炎症誘発性分子、病原性細菌または細菌生産物の腸からの無制御の取り込みにより特徴付けられる、状態の予防および処置において本発明の組成物の使用を提供することである。
【００４２】
本明細書で使用される、「慢性結腸疾患」とも呼ばれる「炎症性大腸疾患」は、胃腸管の様々なレベルでの持続性粘膜炎症により特徴付けられる任意の状態、例えば、炎症性腸症候群、粘膜炎、胃潰瘍、クローン病、潰瘍性大腸炎、結腸直腸がんおよび嚢炎などを含む。
【００４３】
粘膜炎は、典型的には、化学療法および放射線療法または幹細胞移植の有害事象として、口および胃腸管を覆う粘膜表面の炎症によって本質的に特徴付けられるものとして一般に認識されているので、本発明の組成物の適用は、前記適応症に有益な効果を有すると想定される。したがって、本発明の目的は、粘膜炎に関連する状態の予防および処置における本発明の組成物の使用を提供することである。粘膜炎は、胃腸管に沿ってどこでも生じ得る。口腔内に生じる場合、それは典型的には口腔粘膜炎と呼ばれる。
【００４４】
本発明の組成物の適用は、かかるアレルゲンが特定の食品物質、化学物質および他の分子を含み得る、アレルギー反応を引き起こす抗原による侵入に対する保護を提供することであると想定される。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、アレルギー反応を引き起こす抗原による侵入に関連する状態（例えば、食品アレルギー、喘息、湿疹）の予防および処置における組成物の使用を提供する。
【００４５】
さらに、組成物の適用は、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）および全身性免疫系の両方に影響を及ぼすことも想定される。他の効果の中でも、これは、炎症誘発性サイトカインの発現の減少および免疫調節因子の生産の増加およびリンパ球の活性の改善をもたらし得る。したがって、前記組成物は、宿主免疫系の発達および機能の改善に特に有用であると想定される。
【００４６】
本発明の別の側面において、本発明の組成物が上皮障壁を調節し、続いて慢性炎症を減少させるという観察に基づいて、前記組成物は、代謝恒常性の制御および改善に特に有用であると想定される。代謝恒常性に対する前記調製物の非限定的な効果には、食物摂取および脂肪およびグルコース代謝の制御、インスリン分泌および感受性の改善、ならびにコレステロール合成および代謝の制御を含む。したがって、本発明の目的は、食品取り込みの管理、満腹感の誘発、体重管理、損なわれた代謝恒常性に関連する状態、例えば肥満および２型糖尿病などの予防および処置における、本発明の組成物の使用を提供することである。
【００４７】
本発明の組成物が、心血管疾患（ＣＶＤ）のいくつかの確立された原因リスク因子を減少させるという観察に基づいて、本発明の別の側面において、前記組成物がＣＶＤの予防に特に有用であることが想定される。ＣＶＤは、技術的には、心血管系に影響を及ぼす任意の疾患を指すが、アテローム性動脈硬化症に関連する疾患を指すために通常使用される。後者は、動脈血管に影響を及ぼす症候群であり、大部分がマクロファージ白血球の蓄積に起因し、低密度リポタンパクによって促進される、動脈の壁における慢性炎症応答である。ＣＶＤの発生は複数のメカニズムに依存し、多くの明確な原因リスク因子が同定されている。これらの因子は、これらに限定されないが、ＬＤＬコレステロール上昇、血漿トリグリセリド、代謝疾患（肥満、糖尿病、．．．）、慢性炎症および酸化ストレスを含む。特に、後者の２つの因子が最も重要である。アテローム性動脈硬化症は、酸化ストレスの状況においてフリーラジカル、特に酸素フリーラジカルによって酸化されるＬＤＬ（ＬＤＬ−ｏｘ）から発症する。ＬＤＬ−ｏｘに引き起される損傷に対する、慢性炎症の場合における免疫系の過剰な応答は、疾患の拡大をさらに促進する。したがって、本発明の目的は、ＣＶＤの予防または処置における、本発明の組成物の使用を提供することである。
【００４８】
さらなる側面において、粘膜層への正常な微生物叢の付着に関する本発明の組成物の有益な効果を考慮すると、組成物の適用は、病原体による粘膜付着および侵入に対する保護を提供することが想定される。病原体の例は、これらに限定されないが、Bacillus anthracis；Bacillus cereus；Bordetella pertussis；Borrelia burgdorferi；Brucella abortus；Brucella canis；Brucella melitensis；Brucella suis；Campylobacter jejuni；Chlamydia pneumonia；Chlamydia trachomatis；Chlamydophila psittaci；Clostridium botulinum；Clostridium difficile；Clostridium perfringens；Clostridium tetani；Corynebacterium diphtheria；腸内毒素原性のEscherichia coli（ＥＴＥＣ）；腸病原性のE. coli；E. coli O157:H7；Francisella tularensis；Haemophilus influenza；Helicobacter pylori；Legionella pneumophila；Leptospira interrogans；Listeria monocytogenes；Mycobacterium leprae；Mycobacterium tuberculosis；Mycoplasma pneumonia；Neisseria gonorrhoeae；Neisseria meningitides；Pseudomonas aeruginosa；Rickettsia rickettsia；Salmonella typhi；Salmonella typhimurium；Shigella sonnei；Staphylococcus aureus；Staphylococcus epidermidis；Staphylococcus saprophyticus；Streptococcus agalactiae；Streptococcus pneumonia；Streptococcus pyogenes；Treponema pallidum；Vibrio cholera；Yersinia pestis；Candida spp.；Norovirus（Norwalk Virus）；Ａ型肝炎；天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラおよび風疹を誘発するウイルスを含む。したがって、さらなる態様において、本発明は、病原体による粘膜付着および侵入に関連する状態の予防および処置における；特に後天性下痢および旅行者の下痢の処置および予防における、本発明の組成物の使用を提供する。
【００４９】
本発明は、したがって、これを必要とする対象において胃腸障害に関連する症状を予防または処置するための方法であって、治療的有効量の、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌から本質的になる組成物を投与することを含む、前記方法に関する。
【００５０】
用語「必要とする対象」は、上記の胃腸障害を有するヒトまたは非ヒト動物を指す。
用語「治療的有効量」は、その予防的または治療的効果を発揮することができる７種の細菌種の組み合わされた合計量の最小値を指す。７つの細菌種は、以下に列挙される：Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphila、Lactobacillus plantarumおよびAnaerostipes caccae。
しかしながら、「治療的有効量」はまた、以下に列挙される６つの細菌種：Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Akkermansia muciniphila、Lactobacillus plantarumおよびAnaerostipes caccaeの組み合わされた合計量の最小値も指す。
【００５１】
最終の適用に応じて、前記組み合わされた合計量は、７つの細菌種のそれぞれの同量の結果でも、または７つの細菌種の同量でない量の結果であってもよく、７つの細菌種のそれぞれの単一の種が、組み合わされた合計量の０．０００１％の最小存在量、より好ましくは組み合わされた合計量の０．００１％の最小存在量、最も好ましくは組み合わされた合計量の０．０１％の最小存在量である。このように、例えば６種が、組み合わされた合計量の１０．００％の存在量を有する場合、７つ目の種は、組み合わされた合計量の４０．００％の存在量を有する。最終の適用に応じて、前記組み合わされた合計量は、１０２〜１０１４細菌細胞の１日用量の範囲、好ましくは１０３〜１０１３細菌細胞の１日用量の範囲、より好ましくは１０４〜１０１２細菌細胞の１日用量の範囲、および最も好ましくは１０５〜１０１１細菌細胞の１日用量の範囲である。
【００５２】
本発明はさらに、Roseburia hominis種に属する細菌が前記組成物から排除されている、上記の組成物に関する。用語「排除された」は、特に、７つ目の種としてRoseburia hominis種を添加または除去することなく、例の項でさらに示される６つの細菌種の組成物を作成することを指す。
本発明はさらに、Escherichia coli、Enterococcus faecium、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium longum、Bacteroides thetaiotaomicronおよびBacteroides vulgatusに属する細菌を前記組成物にさらに添加する、上記の組成物に関する。
【００５３】
細菌種Escherichia coli（Rath et al. 1999）、Enterococcus faecium（Schleifer et al. 1984）、Lactobacillus mucosae（Roos et al. 2000）、Bifidobacterium adolescentis（Scharek et al. 2000）、Bifidobacterium longum（Bahaka et al. 1993）、Bacteroides thetaiotaomicron（Scharek et al. 2000）およびBacteroides vulgatus（Rath et al. 1999）は、当業者によく知られている細菌種である。本発明はさらに、１以上のプレバイオティクスをさらに含む、上記の組成物に関する。
【００５４】
用語「プレバイオティクス」は、それらの宿主の健康に寄与する微生物（例えば、細菌）の増殖または活性を誘発する任意の化学物質を指す。したがって、プレバイオティクスは、腸マイクロバイオームの生物の組成に影響を与えたり、変化させたりすることができる。しかしながら、原則として、身体の他の領域をも言及することができる、より一般的な用語である。典型的な、しかし非限定的なプレバイオティクスは、胃腸管の上部を介して消化されていないものを少なくとも部分的に通過させ、それらの基質として作用することによって大腸に定着する有利な細菌の増殖または活性を刺激する、非消化性繊維化合物である。
【００５５】
好ましい態様において、本発明は、前記胃腸障害を予防または処置するために、前記組成物を投与する前に、前記細菌が発酵槽において一緒に増殖される、上記の組成物に関する。後者の組成物は、「コラボローム戦略」または「代替コラボローム戦略」とも呼ばれる（さらに参照のこと）。これに対して、前記細菌が投与前に発酵槽中で一緒に増殖されない組成物は、「アセンブリ戦略」と呼ばれる（さらに参照のこと）。
これに関して、本発明はさらに、前記発酵槽が胃腸管の動的シミュレーターである、上記の組成物に関する。この特定の場合において、後者の組成物は、「コラボローム戦略」とも呼ばれる（さらに参照のこと）。
【００５６】
ＳＨＩＭＥ（登録商標）（ヒト微生物生態系のシミュレーター（Simulator of the Human Microbial Ecosystem））は、全保持時間が７２時間である、胃、小腸、および３つの結腸領域（上行、横行および下行結腸）を模擬する、５つの二重ジャケット付きベッセルから構成されるヒト胃腸管の動的インビトロモデルである（図１）。１日３回、１４０ｍｌのＳＨＩＭＥ（登録商標）飼料および６０ｍｌの膵液をそれぞれ胃および小腸区画に添加した（Van den Abbeele et al., 2010）。微生物叢が課されたインビトロ条件に順応することを可能にする最初の２週間の安定化期間の後、単離手順が開始された。したがって、本発明の選択された微生物株を、ＧＩ管を代表する標準化された条件下で、単一段階（代替コラボローム戦略）または多段階反応槽もしくは胃腸管の動的シミュレーター（例えば、ＳＨＩＭＥ（登録商標）またはＭ−ＳＨＩＭＥ（登録商標）、コラボローム戦略）において接種することができる。
【００５７】
したがって、本発明は、本明細書で定義され、および以下にさらに挙げられる、６または７または１４までの種に属する細菌を含むか、それらからなる、またはそれらから本質的になる組成物を含む反応槽に関する：
−  Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌を含むか、それらからなる、またはそれらから本質的になる組成物を含む、または
−  Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種およびAnaerostipes caccae種に属する細菌を含むか、それらからなる、またはそれらから本質的になる組成物を含む、または
−  Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種、Lactobacillus plantarum種、Anaerostipes caccae種、Escherichia coli種、Enterococcus faecium種、Lactobacillus mucosae種、Bifidobacterium adolescentis種、Bifidobacterium longum種、Bacteroides thetaiotaomicron種およびBacteroides vulgatus種に属する細菌を含むか、それらからなる、またはそれらから本質的になる組成物を含む。
【００５８】
好ましい態様において、前記組成物を含むこの反応槽は、以下で定義されるＧＩ管を代表する標準化された条件下である。
標準化された条件を特徴付けるパラメーターは、これらに限定されないが、ｐＨ（１．５〜８の範囲）；炭素源（炭水化物またはタンパク質のいずれか、またはそれらの組み合わせ）の利用可能性；特定の反応槽における保持時間（１０分〜２００時間の範囲）；酸素利用可能性（０〜８ｇ／Ｌの範囲）；微量栄養素の利用可能性；抗生物質の存在／不存在；胆汁酸塩の濃度（０〜２０ｍＭの範囲）；重金属の存在；免疫分子としての宿主因子の存在を含む。好ましい態様において、標準化された条件を特徴付けるパラメーターは、ｐＨ、特定の反応槽における保持時間、および胆汁酸塩の濃度、本明細書の上記で定義される全てを含む。コラボロームの複雑さに応じて、１〜１５日の期間が機能的に安定したコラボロームを得るために必要とされる。平均して、７〜１４のメンバーから構成されるたコラボロームを開発するために、３〜１０日の時間が、機能的に安定したコラボロームを得るのに十分である（環境条件による）。本明細書で定義される組成物は、それゆえ、ｐＨ、特定の反応槽における保持時間および胆汁酸塩の濃度が本明細書で定義されるように設定される条件下で３〜１０日の時間に養成または培養された後に得ることができる。そのようなプロセスは、機能的に安定な組成物またはコラボロームの生産を可能にする。
本発明の文脈において、「機能的に安定なコラボローム」は、培養の少なくとも３または５または１０日後に初期の様々な数の種の細菌を依然として含む、本明細書で定義される組成物である。
【００５９】
さらなる側面において、１．５〜８のｐＨ範囲；炭素源の利用可能性；１０分〜２００時間の保持時間；０〜８ｇ／Ｌの酸素利用可能性；微量栄養素の利用可能性；抗生物質の存在／不存在；０〜２０ｍＭの間の胆汁酸塩の濃度；重金属の存在；免疫分子としての宿主因子の存在を含む、ＧＩ管を代表する標準化された条件下で操作する反応槽が提供される。一つの態様において、前記反応槽は、標準化された条件を特徴付けるパラメーターが、先の段落において定義される、ｐＨ、特定の反応槽中における保持時間、および胆汁酸塩の濃度を含むようなものである。一つの態様において、かかる反応槽は、５〜２０の別個の細菌メンバー、または６〜１４の別個の細菌メンバー、または５〜１５の別個の細菌メンバーの組成物を含む。好ましい態様において、かかる組成物は、機能的に安定なコラボロームを得るために、かかる反応槽において、３〜１４日、または３〜１０日の時間存在する。
【００６０】
本発明は、より具体的には、特定の機能的特徴を有し、ヒトおよび動物の健康問題を予防または処置するために一緒に機能するように予め順応されている、緩やかにアセンブリされた同じ株のセット（＝「アセンブリ戦略」）と比較して、より速いバイオ療法開始およびより高い有効性を得る、微生物株のセットの組成物および使用に関する。一緒に機能するように予め順応されているそのような微生物のセットは、「コラボローム戦略」または「代替コラボローム戦略」なる名称を用いる。
【００６１】
言い換えれば、本発明は、好ましくは、緩やかにアセンブリされた同じ微生物株のセットと比較して、バイオ療法開始の時間を有意に短縮するために、および／またはディスバイオシスの処置の効果を有意に増加させるために使用するための微生物株のセットの予め順応されている組成物に関する。
【００６２】
用語「バイオ療法開始の時間を有意に短縮する」とは、予め順応させることによって、微生物のセットが、緩やかにアセンブリされた同じ株のセットと比較して、少なくとも５％速く（時間的スケールで）、好ましくは少なくとも１０％速く、より好ましくは少なくとも２０％速く、最も好ましくは少なくとも３０％速く、それらの機能性を発揮することができることを意味する。５％未満の任意の値は、生理的に関連性がないとみなされる。
【００６３】
用語「処置の効果を有意に増加させる」とは、予め順応させることによって、微生物のセットが、少なくとも５％より有効的、好ましくは少なくとも１０％より有効的、より好ましくは少なくとも２０％、最も好ましくは少なくとも３０％より有効的に、それらの機能性を発揮することができることを意味する。有効性は、微生物のセットが設計されたエンドポイントに依存する。可能性のある機能性には、これらに限定されないが、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の生産；腸障壁透過性の改善；炎症促進性サイトカインの減少／増加；抗炎症性サイトカインの増加；病原体濃度の減少（少なくとも０．５ｌｏｇ）；ガス生産の減少；特定の腸壁受容体の刺激等を含む。５％未満の任意の値は、生理的に関連性がないとみなされる。
【００６４】
したがって、本発明は、より具体的には、それを必要とするヒトおよび動物のディスバイオシスを予防または処置するための方法であって、治療量の微生物株のセットの予め順応された組成物を前記ヒトまたは動物に投与することを含み、前記処置は、緩やかにアセンブリされた同じ微生物株のセットの投与と比較して、より速いバイオ療法の開始および／または増加した有効性をもたらす、前記方法に関する。
【００６５】
より具体的には、本発明は、前記細菌が、以下の株のリスト：Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362、Faecalibacterium prausnitzii DSMZ 17677、Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360、Butyricicoccus pullicaecorum LMG24109、Roseburia inulinivorans LMG P-29365、Roseburia inulinivorans DSMZ 16841、Roseburia hominis LMG P-29364、Roseburia hominis DSMZ 16839、Akkermansia muciniphila LMG P-29361、Akkermansia muciniphila DSMZ 22959、Lactobacillus plantarum LMG P-29366、Lactobacillus plantarum ZJ316、Anaerostipes caccae LMG P-29359、Anaerostipes caccae DSMZ 14662および／または前記株の少なくとも１つの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と少なくとも９７％の配列同一性を示す株から選択される、上記の組成物に関する。
【００６６】
受託番号LMG P-29362、LMG P-29360、LMG P-29365、LMG P-29364、LMG P-29361、LMG P-29366およびLMG P-29359を有する上で示される株は、BCCM/LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent), K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgiumで寄託された。
受託番号DSMZ 17677、LMG24109、DSMZ 16841、DSMZ 16839、DSMZ 22959、ZJ316およびDSMZ 14662を有する上で示される株は、公のコレクションに寄託され、集中的に記載されており、世界中の当業者はアクセス可能である。
【００６７】
前記対応する株のそれぞれの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列に対して少なくとも９７％（すなわち、９７、９８、９９％）の配列相同性を示す前記菌株のそれぞれの変異体もまた本発明の一部であることはさらに明らかであるべきである。そのような配列「相同性」を決定するための例は、例えば、Eeckhaut et al. (2008)に記載されている。本明細書中で用いられる用語「１６Ｓ ｒＲＮＡ」は、原核生物リボソーム小サブユニット（３０Ｓ）の構成要素である約１５４２ヌクレオチドの核酸配列を指す。１６Ｓ ｒＲＮＡは、リボソームタンパク質の位置を定める足場として作用することが知られている。１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、高度に保存された配列であることが知られているので、系統発生研究のために一般的に使用されている。何千もの生物からの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の比較分析は、オリゴヌクレオチドシグネチャー配列の存在を実証している。本明細書中で用いられる用語「相同性」は、核酸の配列類似性を指す。例えば、一般に、２つの核酸が同一の配列を有する場合、それらは１００％相同性を示す。核酸の１つのヌクレオチド配列の変化は、相同性の百分率を減少させる。一般に、相同性の百分率は、２つの核酸センテンス間の同一性の程度を定量化する。
【００６８】
配列同一性または配列相同性は、配列を比較することによって決定される、２以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として、本明細書において定義される。通常、配列同一性または類似性は、比較される配列の全長にわたって比較される。当該技術分野においては、「同一性」は、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」および「類似性」は、当業者に知られている様々な方法によって容易に計算することができる。好ましい態様において、配列同一性は、本明細書において同定される配列の全長を比較することによって決定される。
【００６９】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムにまとめられている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、例えば、ＮＣＢＩおよび他の供給源（BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894）から公的に入手可能なＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)）が含まれる。用いられる最も好ましいアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align）である。ＥＭＢＯＳＳを用いたアミノ酸配列比較のための好ましいパラメーターは、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスである。ＥＭＢＯＳＳを用いた核酸配列比較の好ましいパラメーターは、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００７０】
任意で、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者はまた、当業者には明らかな、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書中に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然のアミノ酸の各々についての好ましい保存的置換は以下のとおりである：ＡｌａからＳｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎ；Ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎからｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅ；およびＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕ。
【００７１】
１６Ｓ ｒＲＮＡ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)にオンラインで寄託することができ、それらを、例えば、Eeckhaut et al. (2008)によって記載されているように、配列相同性の評価における参照として１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を使用するために、それらの固有の受託番号に基づいて検索され得ることは、当業者によく知られている。組成物の７つの細菌種の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受託番号を以下に列挙する。これらの受託番号は、配列相同性の評価のために、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank／からそれぞれの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を検索するために用いることができる。
【００７２】
【表１】
2019511563.tif 000003
【００７３】
本発明はさらに、前記組成物が、直腸投与形態または経口摂取形態のいずれかとして製剤化されている医薬組成物である、上記の組成物に関する。
この点について、本発明はさらに、前記経口摂取形態が、カプセル、マイクロカプセル、錠剤、顆粒、粉末、トローチ、丸薬、懸濁液またはシロップである、上記の組成物に関する。
本発明はさらに、食品、飲料、食品サプリメントまたは栄養補助食品に組み込まれている、上記の組成物に関する。
【００７４】
したがって、本発明は、ヒト、非ヒト家畜または農場動物または水生動物のための、食品、食品サプリメントまたは医薬品として使用される、上記の組成物に関する。したがって、組成物は、食品、機能性食品、食品サプリメント、化粧品、栄養補助食品、プロバイオティック組成物または医薬品に組み込むことができる。食品は、典型的には、主要栄養素であるタンパク質、炭水化物および脂肪の１以上から主に構成される食用材料である。食品は、ビタミンまたはミネラルなどの１以上の微量栄養素も含有していてもよい。
【００７５】
本明細書で用いられる食品なる用語は、飲料も包含する。組成物が組み込まれ得る食品の例には、スナックバー、シリアル、パン、マフィン、ビスケット、ケーキ、ペーストリー、加工野菜、スイーツ、ヨーグルトを含むプロバイオティック配合物、飲料、植物油ベースの液体、動物脂肪ベースの液体、冷凍菓子およびチーズが含まれる。好ましい食品には、ヨーグルト、チーズおよび他の乳製品が含まれる。飲料の例には、ソフトドリンク、シロップ、スクワッシュ、乾燥飲料ミックスおよび栄養ドリンクが含まれる。栄養補助食品は、疾患の予防および処置を含む、医療または健康上の利益を提供すると考えられる食品成分、食品サプリメントまたは食物製品である。機能性食品は、消費者に純粋な栄養を供給することを上回る健康上の利益を提供するものとして典型的に販売される食品である。
【００７６】
本発明はまた、本明細書で議論される組成物を含むプロバイオティクスも提供する。プロバイオティクスは、典型的には、腸の微生物叢を増強することができる生きたサプリメントである。このようなプロバイオティクスは、特にヒトのみならず、農場および家畜動物、ならびに水生生物に与えられてもよい。プロバイオティクスは、ヒトまたは動物による摂取に適した、１以上の許容される賦形剤または香味料をさらに含んでいてもよい。
【００７７】
本発明の組成物は、医薬組成物の製造において使用されてもよい。したがって、本発明はさらに、本発明の組成物および薬学的に許容し得る賦形剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００７８】
本発明の化合物を含む組成物は、種々の形態、例えば、錠剤、カプセルまたは粉末の形態であってもよい。かかる組成物において存在していてもよい賦形剤の例は、希釈剤（例えば、でんぷん、セルロース誘導体または糖誘導体）、安定剤（例えば、吸湿性賦形剤、例えばシリカまたはマルトデキストリンなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤）、結合剤、コーティング剤、保存剤、または懸濁剤を含む。好適な賦形剤は、当業者によく知られている。
本発明は、より具体的には、前記組成物は、合計１０５〜１０１１コロニー形成単位の本発明の細菌を含む、上記の組成物に関する。
【００７９】
この文書およびその特許請求の範囲において、動詞「を含む（to comprise）」およびその活用形は、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味する非限定的な意味で使用される。加えて、動詞「からなる（to consist）」は、本明細書で定義される組成物が、具体的に同定されるものよりも多くの構成要素を含み得ることを意味する「から本質的になる（to consist essentially of）」と置き換えられてもよい。加えて、不定冠詞「a」または「an」による要素への参照は、その文脈が、要素のうちの１つのみが存在することを明確に要求しない限り、１を超える要素が存在する可能性を排除するものではない。不定冠詞「a」または「an」は、したがって、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００８０】
本明細書に引用される全ての特許および参考文献は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。以下の例は、説明の目的のためにのみ提供されており、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８１】
例
例１．本発明の組成物の確立
１．１  組成物のための細菌の単離
抗生物質療法に曝露されていない、若くて健康なドナーを選択し、ＳＨＩＭＥ（登録商標）モデルに接種した。ＳＨＩＭＥ（登録商標）モデル（図１、Van den Abbeele et al., 2010）のいくつかの操作パラメーターを制御することにより、食物繊維発酵、胆汁酸代謝、乳糖分解などに関与する微生物叢などのヒトの健康に有益な影響を及ぼす腸微生物叢のネットワークを豊かにし、そのネットワークを選択すことができる。ＳＨＩＭＥ（登録商標）装置は、様々な機能的特性を有する細菌株、例えば、繊維分解体（例えば、Bifido bacteria、Bacteroides）、発酵性（例えば、Escherichia coli）または乳酸産生体（例えば、Lactobacilli、PediococciおよびEnterococci）、酪酸産生体（例えば、Anaerostipes caccae、Butyricicoccus pullicaecorum、Faecalibacteruim prausnitzii、Roseburia hominis、Roseburia inulinivorans、Clostridium butyricum）およびプロピオン酸産生体（例えば、Bacteroides thetaiotaomicron、Bacteroides vulgatus、Roseburia inulinivorans、Akkermansia muciniphila）などの単離のために用いられた。この目的のために、選択培地は、ＬＡＭＶＡＢ（lactobacilli；Hartemink et al 1997）、ＲＢ（bifidobacteria；Hartemink et al. 1996）、Enterococcus培地（Enterococci；Possemiers et al. 2004）、ＴＢＸ（Escherichia coli；Le Bon et al. 2010）、ＢＢＥ（Bacteroides fragilis群；Livingston et al. 1978）、Mucin最小培地（Akkermansia;Derrien et al. 2004）、Ｍ２ＧＳＣ（酪酸産生体；Barcenilla et al. 2000）または乳酸含有最小ＳＨＩＭＥ培地（酪酸産生体）、コハク酸およびフコース含有最小ＳＨＩＭＥ培地（プロピオン酸産生体）、硫酸塩富化最小培地（硫酸産生体）、アラビノキシラン含有最小ＳＨＩＭＥ培地および血液アガープレート（Prevotella）などから選択した。ＳＨＩＭＥに加えて、同じ戦略を使用して、細菌は、健康なドナーからの新鮮な糞便試料からも直接単離した。
【００８２】
実際には、ＳＨＩＭＥの結腸区画または均質化された糞便試料から回収した試料の１０倍希釈物を作成し、上記の特定の培地組成を有するアガープレート上に広げた。異なる細菌群のそれぞれの増殖条件を考慮して、プレートを３７℃でインキュベートした。インキュベーションの際に、約３０のコロニーを細菌群ごとに採取し、適切な条件下で、それぞれ液体増殖培地中でインキュベートした。一晩培養物中の短鎖脂肪酸濃度を、Possemiers et al. (2004)に記載されるように、ガスクロマトグラフィーを用いて分析した。さらに、液体培養物の試料を系統発生分析に用いた。ＤＮＡを、Possemiers et al. 2004に記載されるように抽出し，ほぼ全長の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を、ユニバーサル真正細菌プライマーｆＤ１およびｒＤ１（Weisburg et al. 1991）を用いて各々の単離体について増幅した。精製の際に、ＤＮＡ試料を配列決定のために送り出した。得られた配列を、ＢＬＡＳＴツールボックス（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いる各々の単離体の同定のために、既存の配列と整列させた。
【００８３】
１．２  本発明の組成物の設計
様々な細菌株を実際に機能的な微生物ネットワークとして組み合わせるために、ＳＨＩＭＥ（登録商標）反応槽および糞便から単離した純粋な培養物（例１．１に記載）を使用した。加えて、純粋な培養物は、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ（http://bccm.belspo.be）およびＤＳＭＺ（www.dsmz.de）などの培養コレクションから供給された。
【００８４】
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は、腸微生物叢による食物繊維発酵の最終生産物であり、宿主の健康にいくつかの有益な効果を発揮することが知られている。生産される主なＳＣＦＡは、約６０：２０：２０のモル比の酢酸、酪酸およびプロピオン酸である。酢酸は腸から吸収され、宿主がエネルギー基質として使用することができる一方で、酪酸は腸上皮の主エネルギー源として作用し、炎症および結腸がんに対する保護効果が証明されている。プロピオン酸は、酪酸と比較して腸内で同様の局所活性を有するが、肝臓に輸送され、明確なコレステロール低下効果および血糖コントロールに対する効果を有することが示された。
【００８５】
ＳＣＦＡの重要かつ多様な生理学的役割を考慮すると、この腸微生物機能の破壊（例えば、胃腸障害）は、宿主の健康に重大な影響を及ぼす可能性がある。結果的に、この例において、スクリーニングを行い、合計ＳＣＦＡ生産および最も興味深い相対的ＳＣＦＡ生産比を誘発することができる組成物を設計した。後者について、酪酸は、生産される様々なＳＣＦＡの中で最も興味深いと考えられていた。さらに、腸障壁の完全な状態に関する異なる組成物の効果を、上皮細胞と免疫細胞との共培養によって評価した。
【００８６】
実際には、１．１に記載された単離および選択ラウンドから得られた、または培養コレクションから注文された、最も興味深い発酵プロファイルを有する合計２０の単離体（「単離体−Ｘ」と呼ぶ）を、それらのグリセロールストックから回収し、それらのそれぞれの最適な増殖条件下で増殖させ、細菌株の均質な懸濁液を得た。
【００８７】
【表２】
2019511563.tif 000004
【００８８】
単離体を９８の個別の最初のスクリーニング実験のセットにおいて２〜１０の範囲の数で組み合わせた。各実験について、ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４でｐＨ６．８に調整した滅菌ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地を含有する滅菌インキュベーションボトル中で発酵を開始し、窒素でフラッシュした。次に、滅菌培地に、等量の選択された種からなる１０％（ｖ／ｖ）の混合接種物を接種した。インキュベーションボトルに窒素をフラッシュして嫌気性条件を確保し、３７℃（９０ｒｐｍ）でインキュベートした。試料を、ＳＣＦＡ生産について２４時間後に分析した。最も高い酪酸産物を有する組成物をその後選択し、最後の実験において２３の異なる細菌のセットをさらに用いた（ＭＸ−Ｙと呼ぶ、式中、Ｘ＝組成物中に存在する単離体の数であり、Ｙ＝Ｘ単離体を含む、特有の組成物Ａ、Ｂ、Ｃ等である）。
【００８９】
【表３】
2019511563.tif 000005
【００９０】
これらの２３の組み合わせを、先に記載したように再度インキュベートした。２４時間後、試料を、ＳＣＦＡ分析およびPossemiers et al. (2013)に記載されている、Ｃａｃｏ−２およびＴＨＰ１細胞の共培養モデルとの組み合わせのために回収した。後者の実験のエンドポイントは、腸障壁機能に対する保護効果の尺度としての経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）であった。
【００９１】
図２は、２３の異なる組成物の２４時間のインキュベーションにより得られた酪酸レベルおよびＴＥＥＲ値に対するそれらの効果を記載する。酪酸レベルおよび腸内障壁機能に対する効果の両方において強い差異が観察され、最も高い酪酸レベルを有する組み合わせは、異なるランク付けにより示されるようにＴＥＥＲレベルに対する高い保護作用を必ずしも誘発しなかった。驚くべきことに、７つの異なる単離体の１つの組成物（図２においてＭ７−Ｂと呼ぶ）が、２４時間後の酪酸レベルと特に腸障壁機能に対する保護効果との両方で一番にランク付けされた。この組成物は、ＳＨＩＭＥからの６つの単離体とヒトの糞便試料から得られた１つの培養物を含有していた。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列決定およびＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴデータベースでの配列の比較は、Ｍ７−Ｂが、新規のＳＨＩＭＥ単離体である、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeならびに新規の糞便単離体である、Butyricicoccus pullicaecorumから構成されていたことを明らかにした。興味深いことに、新規の単離体は、図２に示される他の組成物の少なくとも１つに全て存在したが、他の組成物のいずれも、酪酸生産およびＴＥＥＲ値の保護に関して同じ有効性に達しなかった。これは、観察された効果が組成物中に存在する特定の種の１つには関連しないが、これらの７つの細菌の特定の組み合わせのみが驚くべき肯定的な結果を導くことを示す。
【００９２】
７つの新規の単離体は、以下の受託番号：Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362、Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360、Roseburia inulinivorans LMG P-29365、Roseburia hominis LMG P-29364、Akkermansia muciniphila LMG P-29361、Lactobacillus plantarum LMG P-29366およびAnaerostipes caccae LMG P-29359で、ＢＣＣＭ／ＬＭＧ細菌コレクション（Ghent Belgium）に寄託された。
【００９３】
７つの単離体とそれぞれの種の存在の必要性との間の驚くべき相乗作用のさらなる実験的証拠として、単離体の１つが毎回７つの単離体の元の組成物から除去（すなわち排除）された実験が設定された。実際には、ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４でｐＨ６．８に調整した滅菌ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地を含有する滅菌インキュベーションボトルで発酵を再び開始し、窒素をフラッシュした。次に、滅菌培地に、７つの単離体のうち６つの等量の１０％（ｖ／ｖ）の混合接種物を接種した。７つの単離体の完全な組成物を対照として作用させ、合計８つの並行インキュベーションを生じた。インキュベーションボトルに窒素をフラッシュして嫌気性条件を確保し、３７℃（９０ｒｐｍ）でインキュベートした。試料を、酪酸生産について２４時間および４８時間後に分析した。図３に示すように、元の組成物から１種のみを除去することは、６種の全ての組成物について２４時間後の酪酸生産レベルを、元の組成物の酪酸生産レベルの８０％未満まで有意に低下させた。４８時間のインキュベーション後も、酪酸レベルは、Roseburia hominisを含まない組成物を例外として、６種の全ての組成物について有意に低下した。これは、組成物の全ての単離体が、組成物の完全な可能性に到達するために必須であることを確認する。Roseburia hominisを含まない組成物のみが４８時間のインキュベーション後も依然として完全な組成物と同様の機能性をもたらしたので、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Akkermansia muciniphila、Lactobacillus plantarumおよびAnaerostipes caccaeから本質的になる６種の組成物の使用が、２番目に最適であると想定することができる。
【００９４】
１．３．本発明の組成物の生産
Lactobacillus plantarum種、Faecalibacterium prausnitzii種、Butyricicoccus pullicaecorum種、Roseburia inulinivorans種、Roseburia hominis種、Akkermansia muciniphila種およびAnaerostipes caccae種からなる組成物は、３つの異なる戦略を用いて生産される。これらの戦略は、１）組成物の種を別々に増殖させ、その後それらを一緒に混合すること、２）組成物の種を多段階発酵槽において一緒に増殖させること（すなわち、上記のインビトロＳＨＩＭＥ（登録商標）モデル）、および３）組成物の種を一段階発酵槽において一緒に増殖させること、の何れかを含む。
【００９５】
第１の戦略（＝「アセンブリ」戦略）では、選択された種を、それらのグリセロールストックから回収し、それぞれの最適増殖条件の下で増殖させ、細菌株の均質な懸濁液を得た。それらの機能的活性を評価するために、選択された種の等量からなる混合接種物を作成した。この接種物を、ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４でｐＨ６．８に調整した滅菌ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地を含有する滅菌インキュベーションボトルに１０％（ｖ／ｖ）で添加した。インキュベーションボトルに窒素をフラッシュして嫌気性条件を確保し、３７℃（９０ｒｐｍ）でインキュベートした。１６時間の特定の間隔において、増殖培地の４０％（ｖ：ｖ）を、条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地で置き換えた。条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地は、７００ｍＬの通常ＳＨＩＭＥ（登録商標）飼料（ｐＨ２）を３７℃で１時間インキュベートし、その後２５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２３．６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および４．７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４で補充された３００ｍＬの膵液（ｐＨ６．８）を添加することにより、調製した。試料をＳＣＦＡ生産について５日の期間にわたり分析した（図４）。酪酸レベルは、アセンブリの２４時間インキュベーションで７ｍＭに、５日後に最大１４ｍＭに達した。
【００９６】
第２の戦略（すなわち、「コラボローム」戦略、または「前記細菌が投与前に胃腸管の動的シミュレーターで一緒に増殖される」戦略）では、選択された種を、それらのグリセロールストックから回収し、それぞれの最適増殖条件の下で増殖させ、細菌株の均質な懸濁液を得た。次に、株を混合し、ｐＨ６．１５〜６．４で単一の結腸領域からなるＳＨＩＭＥ（登録商標）装置（Van den Abbeele et al., 2010）において３重に接種した。２週間の順応期間を実施し、機能的コラボーム組成物を作成した。そのような順応期間の必要性および関連性は、選択された種の組成物の培養の間のＳＣＦＡプロファイルの発展によって明らかに実証される（図５）。最初に、組成物は互いに順応し、供給された基質のＳＣＦＡへの変換において活性になるのに時間を要する。しかしながら、接種後４〜６日で、組成物によるＳＣＦＡの生産が安定化し始め、高レベルの酪酸が測定された。インキュベーションの最後の日（１４日目）に、３重のインキュベーションの各々は、酪酸レベルが１９ｍＭに達する、非常に類似した、安定した強力な活性な機能性組成物をもたらした。
【００９７】
安定化されたコラボロームをグリセロールストックとして−８０℃で凍結させ、その後、アセンブリ戦略と同じ方法で接種物として使用するために解凍した場合、酪酸レベルは、驚くほど速く上昇し、個別の種のアセンブリと同じインキュベーション条件下で、２５％高いレベルに達した（図４）。酪酸レベルは、アセンブリの２４時間のインキュベーションですでに１２ｍＭに達し、２日後にすでに最大１９ｍＭに達した。
【００９８】
第３の戦略では、前記組成物の生産は、フェドバッチ方式で操作される最適化された一段階発酵槽アプローチ（すなわち、代替「コラボローム」戦略または「前記細菌が投与前に１つの発酵槽で一緒に増殖される」戦略）を用いて行った。選択された種を、それらのグリセロールストックから回収し、それぞれの最適増殖条件の下で増殖させ、細菌株の均質な懸濁液を得た。発酵を、ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４でｐＨ６．８に調整した滅菌ＳＨＩＭＥ（登録商標）飼料を含有する滅菌インキュベーションボトル中で開始し、窒素をフラッシュした。次に、滅菌培地に、等量の選択した種からなる１０％（ｖ／ｖ）の混合接種物を接種した。インキュベーションボトルに窒素をフラッシュして嫌気性条件を確保し、３７℃（９０ｒｐｍ）でインキュベートした。１６時間の特定の間隔において、増殖培地の４０％（ｖ：ｖ）を、条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地で置き換えた。条件ＳＨＩＭＥ（登録商標）栄養培地は、７００ｍＬの通常ＳＨＩＭＥ（登録商標）飼料（ｐＨ２）を３７℃で１時間インキュベートし、その後２５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、２３．６ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および４．７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４で補充された３００ｍＬの膵液（ｐＨ６．８）を添加することにより、調製した。
【００９９】
図６に示すように、組成物によって生産された合計ＳＣＦＡ生産物およびＳＣＦＡの比は、６回の置き換えサイクル後に安定していた。前述の同じ戦略で再接種した場合、安定化されたコラボロームは、アセンブリ戦略における同じ種のセットと比較して、２日速い最大のＳＣＦＡ生産（酢酸／プロピオン酸／酪酸比は、約１４／１２／７４）、および２５％高い酪酸生産を導いた。
【０１００】
例２：インビトロ実験
２．１：複雑な微生物腸コミュニティーへの機能性組成物の添加の効果
この実験は、５００〜１０００の微生物種からなると推定されるこの複雑な腸コミュニティーのメンバーを有する結腸基質に対する強力な競合が存在する、混合微生物腸コミュニティーに接種した場合に、機能性組成物が活性であることを実証する。この問題に取り組むために、実験を、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有する組成物を用いた小さなインキュベーションボトル中で行い、例１．３のコラボローム戦略を通して生産した。
【０１０１】
増加する濃度の予め順応させた組成物（０、４および２０％）を、ＰＢＳで洗浄し、３つの異なる培地：
１）滅菌基本培地［２ｇ／Ｌペプトン、２ｇ／Ｌ酵母抽出物、２ｍＬ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ ８０、１０μＬ／ＬビタミンＫ１、５００ｍｇ／Ｌ Ｌ−システインＨＣｌ、１００ｍｇ／Ｌ ＮａＣｌ、４０ｍｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、４０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６，７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇ／Ｌレサズリン、５０ｍｇ／Ｌヘミン（５０ｍｇ／Ｌ）−ｐＨ５．５］＋デンプン６ｇ／Ｌ；
２）基本培地＋２０％糞便スラリー（De Boever et al., 2000に記載されているように調製）；
３）基本培地＋完全微生物叢を含む２０％ＳＨＩＭＥ（登録商標）結腸懸濁液
に添加した。
【０１０２】
０％〜４％および２０％の予め順応された酪酸生産コンソーシアム（consortium）の増加する濃度は、絶対酪酸レベルの比例的増加をもたらした（図７）。これは、滅菌培地においてのみ観察されるのではなく、糞便試料またはＳＨＩＭＥ（登録商標）結腸領域の両方に由来する混合微生物叢で補充された培地についても観察された。したがって、この実験は、組成物が非競合的な結腸環境に存在する場合にのみ活性であるだけでなく、多くの腸微生物が同じ栄養素に対して競合する混合された微生物叢に投与された場合に、高い酪酸レベルをもたらすことも実証する。さらに、酪酸の生産が増加したばかりでなく、プロピオン酸の生産もまた大幅に増加した。インキュベーションにおけるこれらの増加および酢酸の減少の組み合わせは、組成物が一般的な微生物発酵プロファイルをより健康に有益なプロファイルに調節することができることを示している。
【０１０３】
２．２：抗生物質に誘発されたディスバイオシスな腸微生物コミュニティーの代謝機能を回復するための機能性組成物の有効性
抗生物質の使用は、腸微生物叢コミュニティーの大きな破壊を引き起こすと考えられている。ディスバイオシスな微生物組成は、病原体による感染に対してより感受性であることが示されている。さらに、多くの胃腸疾患は、炎症性腸疾患などのディスバイオシスな微生物組成と相関しており、健康な腸マイクロバイオームの重要性が強調されている。分類学的組成の回復、特に長期の抗生物質摂取後の機能性は、通常、健康な腸内微生物コミュニティーである前処置状態に達するまでに３ヶ月かかる（Panda et al., 2014）。抗生物質療法に曝露後の回復時間の短縮は、したがって、重度の感染のリスクを低減させ、一般的に宿主の健康を促進することができる。この点において、選択された組成物の観察された機能的活性は、抗生物質誘発性ディスバイオシスにおける微生物コミュニティーの回復を促進し、感染リスクを低減する有望な戦略であり得る。
【０１０４】
この例において、抗生物質誘発性ディスバイオシスを、適切な抗生物質を投与することにより、インビトロＳＨＩＭＥ（登録商標）モデルにおいてモデル化した。この実験の目的は、機能性組成物の投与時の模擬腸結腸環境における典型的な「健康な」代謝産物プロファイルの回復を評価することであった。さらに、実験は、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略（例１．３を参照）のいずれかにより生産される場合、組成物の有効性を識別することを目的とした。実験を、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有する組成物で、再び実行した。腸マイクロバイオームの完全な機能的プロファイルをより上手く模倣するために、この特定の実験において、組成物を、Escherichia coli、Enterococcus faecium、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium longum、Bacteroides thetaiotaomicronおよびBacteroides vulgatusでさらに補充した。
【０１０５】
実際には、ＳＨＩＭＥ（登録商標）ベッセル（ｐＨ６．１５〜６．４０）に糞便材料を接種し、１４日間安定化させた（Ｍ−ＳＨＩＭＥ（登録商標）装置−Van den Abbeele et al., 2012）。２週間の制御期間後、ＳＨＩＭＥ（登録商標）由来の結腸微生物叢を、抗生物質のカクテル（それぞれ４０／４０／１０ｍｇ／Ｌのアモキシシリン／シプロフロキサシン／テトラサイクリン）で処置して、ディスバイオシスを誘発した。１日後、ディスバイオシスな微生物を、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略のいずれかによって生産された機能性組成物で５日間処置した。研究のエンドポイントは、模擬腸結腸環境における典型的な「健康な」ＳＣＦＡ代謝物プロファイルの回復を評価することであった。組成物を投与しない抗生物質暴露後の腸コミュニティーの代謝活性の自発的な回復を模擬するために対照ＳＨＩＭＥ（登録商標）ベッセルを含んだ。結果は、抗生物質投与前の値に対する各時点でのＳＨＩＭＥにおけるＳＣＦＡレベルのデルタとして表される（図８）。
【０１０６】
ＳＨＩＭＥ（登録商標）ベッセルの抗生物質処置の際に、酢酸、プロピオン酸および酪酸生産の有意な低下が観察された。この発見は、腸微生物コミュニティーの破壊を確認する。前処置状態への代謝物プロファイルの回復（ＳＣＦＡ生産に関して）は、５日間の酢酸、プロピオン酸および酪酸の発展として図８に示される。これは、機能の回復が、対照状況（組成物の投与なし）において遅く、完全な回復が、酢酸およびプロピオン酸について５日以内に観察されないことを示す。興味深いことに、組成物での処置は、３つの全てのＳＣＦＡの対照条件と比較してより速い回復をもたらした。さらに、アセンブリ戦略の組成物が、プロピオン酸および酪酸の完全な回復を、それぞれ５日後および３日後に誘発した一方で、コラボローム戦略の組成物は、それぞれ４日後および２．５日後のプロピオン酸および酪酸の完全な回復を伴う、アセンブリ戦略と比較してより速い回復を誘発した。最終的に、コラボローム戦略はまた、アセンブリ戦略と比較して、プロピオン酸および酪酸レベルの増加を伴う、最終的な活性の増加をもたらした。これらの結果は、抗生物質媒介微生物ディスバイオシスの回復のための組成物の可能性を強調している。さらに、この発見は、コラボローム戦略による予めの順応が、アセンブリ戦略と比較して抗生物質曝露後の微生物ＳＣＦＡ生産のより効率的な回復をもたらすことを明確に実証する。
【０１０７】
２．３：炎症性腸疾患におけるディスバイオシスな微生物腸コミュニティーの代謝機能を回復するための機能性組成物の有効性
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、損なわれた宿主−微生物相互作用に関連しており、少なくとも部分的には、腸微生物叢ディスバイオシスの状態に関連している。後者には、例えば、少ない存在量の、酪酸ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡトランスフェラーゼおよびプロピオン酸キナーゼを含み（Vermeiren et al., FEMS 2011）、これはひいてはバランスのとれたＳＣＦＡ生産能力の生産に悪影響を与える。正常な腸の発達および維持に対するＳＣＦＡの重要な影響を考慮すると、ＳＣＦＡ生産の観点からの微生物叢組成および機能の回復は、ＩＢＤ関連症状に肯定的な影響を及ぼし得る。この点において、選択された組成物の観察された機能的活性は、健康な腸障壁の回復および維持の基礎として、ＩＢＤのディスバイオシスにおける微生物コミュニティーの回復を増大させる有望な戦略であり得る。
【０１０８】
この例において、ＩＢＤ関連ディスバイオシスを、前述のインビトロＳＨＩＭＥ（登録商標）モデルにおいてモデル化した（Vigsnaes et al. 2013）。この実験の目的は、機能性組成物の投与時の模擬腸結腸環境におけるＳＣＦＡプロファイルの観点において、微生物叢の回復を評価することであった。さらに、実験は、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略（例１．３を参照）のいずれかにより生産される場合、組成物の有効性を識別することを目的とした。実験は、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有する組成物で再び行った。
【０１０９】
実際には、ＳＨＩＭＥ（登録商標）ベッセル（ｐＨ６．１５〜６．４０）に潰瘍性大腸炎患者からの糞便材料を接種した（Ｍ−ＳＨＩＭＥ（登録商標）装置−Van den Abbeele et al., 2012）。同時に、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略のいずれかによって生産された機能性組成物の単回用量を結腸領域に添加し、投与を模擬した。３番目の実験を、組成物の投与なしの対照実験として平行して行った。酢酸、プロピオン酸および酪酸の生産を組成物の投与後１および２日続けた。
【０１１０】
結果を図９に示す：アセンブリ戦略で生産された組成物の投与は、１日目にＳＣＦＡ生産（主に酢酸および酪酸）の増加をもたらしたが、この効果は２日目にはもはや見られなかった。これは、組成物が、ＩＢＤマイクロバイオーム環境において機能的に活性であることを示す。興味深いことに、プロピオン酸および酪酸生産に対する効果は、ＩＢＤ対照とは対照的に、コラボローム戦略の組成物の投与においてはるかに顕著であり、プロピオン酸および酪酸生産においてそれぞれ４倍および３倍の増加を伴った。アセンブリ戦略の組成物とは対照的に、効果は２日目に未だで顕著であり、低下した酢酸生産と一致した（クロスフィーディングの増加、それゆえネットワークの改善の兆候）。これらの結果は、ＩＢＤ関連微生物ディスバイオシスの回復のための組成物の可能性を強調する。さらに、この発見は、コラボローム戦略による予めの順応が、アセンブリ戦略と比較してＩＢＤ条件下での微生物ＳＣＦＡ生産のより効率的な回復をもたらすことを明確に実証する。
【０１１１】
２．４：インビトロシミュレーションアッセイにおける植物性Clostridium difficileの増殖を阻害するための機能性組成物の有効性
この例において、機能性組成物が腸条件下で機能的に活性であるだけでなく、感染から腸環境を保護することができるか否かを評価することを目的として、Clostridium difficileチャレンジ試験を行った。かかるチャレンジ試験において、組成物に植物性Clostridium difficile（Cdif）細胞をチャレンジし、模擬胃腸条件下でCdifの増殖を阻害するその能力を評価した。さらに、実験は、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略（例１．３を参照）のいずれかにより生産される場合、組成物の有効性を識別することを目的とした。実験は、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有する組成物で、再び実行した。
【０１１２】
実際には、Clostridium difficile（LMG 21717T）のグリセロールストックを解凍し、窒素をフラッシュして嫌気性条件を確保した補強クロストリジウム培地（Reinforced Clostridial Medium）（ＲＣＭ）ブロスを含有するボトルに接種した。ボトルを振盪インキュベーター（９０ｒｐｍ）で２４時間インキュベートし、増殖した培養物の１０％を再びＲＣＭブロスに接種した。２４時間の増殖後、均質化されたC. difficile培養物を、以下： 
１）基本培地（ブランク）；
２）アセンブリ戦略の組成物を含有する基本培地；
３）コラボローム戦略の組成物を含有する基本培地；
４）ＳＨＩＭＥ（登録商標）結腸懸濁液を含有する基本培地
を含有するボトルに（３重に）等分した（１０％ｖ：ｖ）。
【０１１３】
ボトルを３７℃で、振盪インキュベーター（９０ｒｐｍ）でインキュベートした。定期的な時点で、試料を回収し、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子の検出および定量に基づくｑＰＣＲアッセイによってC. difficileを定量する前に、直ちに−８０℃で凍結させた。この目的のために、ゲノムＤＮＡをBoon et al. (2003)にしたがって抽出した。増幅反応は、フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド：5'-TATGGACTATGTTGTAATAGGAC-3'（フォワード）および5'-CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3'（リバース）を含んだ。検量線を作成することにより、ＰＣＲ産物の絶対量を得た。
【０１１４】
この制御されたインビトロシミュレーションアッセイにおいて、C. difficileの増殖が４８時間のインキュベーション後に基本培地において観察され、インビトロシミュレーションアッセイにおけるブランクの有効性が確認された。ＳＨＩＭＥ（登録商標）結腸懸濁液（実際の糞便移植のシミュレーションとして）は、４８時間のインキュベーション後に最も高いC. difficile増殖阻害を示した（すなわち、５８％）。興味深いことに、同様の結果がコラボローム戦略の組成物について得られ、約５３％のC. difficile増殖阻害を示した。最も低い効果は、アセンブリ戦略の組成物が添加された場合に観察された（すなわち、２３％の増殖阻害）。この実験は、C. difficileが組成物によってその増殖が有意に阻害されたこと、およびこの阻害がコラボローム戦略による組成物を予め順応させた場合に最も顕著であることを明らかに実証している。
【０１１５】
２．５：腸障壁機能および腸免疫の宿主バイオマーカーに関する機能性組成物の効果
例２．１〜２．３は、組成物が、複雑な腸条件下で機能的に活性であり、コラボローム戦略による生産の場合に最も高い活性を有する腸代謝物プロファイルを回復することができることを示した。これは、腸上皮、およびそれによる腸障壁機能および局所免疫に有益な影響を与え得る。
【０１１６】
この可能性を評価するために、この例は、腸細胞（Ｃａｃｏ−２細胞）およびマクロファージ（ＴＨＰ１）の確立された共培養細胞モデル（Possemiers et al. 2013）に関する、先の実験から回収した試料の組み合わせを記載する。このモデルにおいて、ＬＰＳによるＴＨＰ１細胞の刺激は、炎症促進性サイトカインの増加した生産をもたらし、腸細胞層を破壊して、いわゆる「リーキーガット（leaky gut）」状態を作り出す傾向がある。「リーキーガット」への効果は、対照条件と比較した、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）［腸障壁有効性の測定］の効果および炎症性サイトカイン生産を評価することによって測定される。
実際には、例２．３のＭ−ＳＨＩＭＥ実験から１日目に回収した試料を、共培養リーキーガットモデルと組み合わせた。
【０１１７】
２．６：組成物の機能的活性に対する株同一性の変動の影響
組成物中の７つの単離体間の驚くべき相乗効果が株特異的であるか、または同じ種の他の株でも達成することができるか否かを評価するために、さらなる実験を行った。この例において、２つの異なる組成物は、「コラボローム」戦略（例１．３を参照）により生産される。
【０１１８】
組成物１が、例１．２に記載される特定の単離体を含有する一方で、組成物２は、培養コレクションから得られる同じ種の株から構成される：
組成物１：Faecalibacterium prausnitzii LMG P-29362、Butyricicoccus pullicaecorum LMG P-29360、Roseburia inulinivorans LMG P-29365、Roseburia hominis LMG P-29364、Akkermansia muciniphila LMG P-29361、Lactobacillus plantarum LMG P-29366およびAnaerostipes caccae LMG P-29359
組成物２：Lactobacillus plantarum ZJ316、Faecalibacterium prausnitzii (DSMZ 17677)、Butyricicoccus pullicaecorum (LMG 24109)、Roseburia inulinivorans (DSMZ 16841)、Roseburia hominis (DSMZ 16839)、Akkermansia muciniphila (DSMZ 22959)およびAnaerostipes caccae (DSMZ 14662)。
【０１１９】
実際には、選択された種を、それらのグリセロールストックから回収し、それぞれの最適増殖条件の下で増殖させ、細菌株の均質な懸濁液を得た。次に、株を組成物１および組成物２に混合し、６．１５〜６．４のｐＨで単一の結腸領域からなるＳＨＩＭＥ（登録商標）装置（Van den Abbeele et al., 2010）において３重に接種した。酪酸生産プロファイルは、１４日の期間続けた。
【０１２０】
驚くべきことに、酪酸生産における動力学は、両方の組成物において非常に類似しており、初期の強力な変動を伴い、その後、約６日後に酪酸レベルは安定化した。実験の最後（１４日目）において、組成物１についての酪酸レベルが１９．３ｍＭに達する一方で、組成物２についてのレベルは１８．８ｍＭであった。これは、例１．２からの組成物において観察される相乗効果は、同じ種から得られる異なる株を用いることにより置き換えることができたことを示す。
【０１２１】
例３：インビボ実験
３．１：抗生物質に誘発された胃腸微生物叢破壊のマウスモデル
この例における実験の目標は、機能性組成物がインビボ設定においても抗生物質誘発性ディスバイオシス後の腸マイクロバイオームの代謝能力を回復することができるか否かを評価することであった。
【０１２２】
この例において、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有する組成物が用いられ、例１．３の「コラボローム」戦略を介して生産された。さらに、腸マイクロバイオームの完全な機能性プロファイルをより完全に模倣する必要性を評価するために、さらなる実験を、Escherichia coli、Enterococcus faecium、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium longum、Bacteroides thetaiotaomicronおよびBacteroides vulgatusでさらに補充された組成物（「拡張組成物」と呼ぶ）において行った。
【０１２３】
実際には、「組成物」および「拡張組成物」を、コラボローム戦略にしたがって新鮮に調製し、（嫌気的条件を確保するために嫌気性チャンバー内で）ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬに濃縮し、経口強制飼養によってできる限り早くマウスに投与した。少なくとも５週齢のマウス（Ｃ５７／ＢＬ６）を購入し、病原体のない条件下で維持し、標準食餌を与えた。マウス実験は、ベルギーゲント大学動物実験倫理委員会（Ethics Committee of Animal Trials of Ghent University, Belgium）の承認を受けたプロトコールにしたがって行った。抗生物質誘発性ディスバイオシスを誘発するために、抗生物質クリンダマイシンを２５０ｍｇ／Ｌの濃度で飲料水に投与した。抗生物質処置の５日後、マウスの胃内容物をＮａＨＣＯ３で中和し、その後マウス（１群あたり１０匹のマウス）を５日間連続で、以下：
１）生理食塩水溶液中組成物；
２）生理食塩水溶液中拡張組成物および
３）生理食塩水溶液（対照）
を経口強制飼養した。
【０１２４】
従来の群（抗生物質処置をしないが、生理食塩水溶液で処置）を、強制飼養手順から生じる変動を排除するための対照として含んだ。実験中、糞便試料（約１００ｍｇ／マウス）を回収し、将来の分析のために−８０℃で保存した。
【０１２５】
同じ群に由来するプールされたマウスの糞便試料から得られたＳＣＦＡプロファイルは、５日間の抗生物質処置が酢酸のみが残存する程度まで、酪酸およびプロピオン酸生産を有意に減少させることを実証している（図１０）。図１０に示されるように、代謝機能の自発的な回復は遅く、最後の抗生物質処置の約５日後（１０日目）にのみ開始され、もっとも３つの主要なＳＣＦＡ（酢酸、プロピオン酸および酪酸）のモル比は未だ抗生物質前の状態に戻っていなかった。しかしながら、マウスがコラボローム戦略の組成物または拡張組成物のいずれかで処置された場合、酪酸代謝の回復は、抗生物質処置後、約３日後（８日目）にすでに開始した。さらに、両方の組成物で処置されたマウスの代謝活性は、抗生物質の最後の投与の５日後（１０日目）に、プロピオン酸および酪酸の両方の良好な生産を伴う、ほぼ完全な回復を示した。拡張組成物は、組成物と比較してより高い多様性の酢酸およびプロピオン酸産生体を含有し、これは、実験の１０日目でわずかに異なる発酵プロファイルによっても反映される。結論として、この例は、機能性組成物が、抗生物質誘発性ディスバイオシスにおける腸代謝プロファイルのより速くより強力な回復を得るのに有効であるこというインビボにおける確認を提供する。さらに、組成物中の正確な種の組み合わせにおける変化は、最終結果を特定の代謝プロファイルに合せることを可能にする。
【０１２６】
３．２：炎症についてのＴＮＢＳマウスモデル
ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）モデルは、体重喪失、血性下痢および腸壁肥厚を含む、クローン病（Scheiffele et al. 2001）の特徴のいくつかを模倣する大腸炎に一般に使用される。組織病理学において、ＴＮＢＳは、ＣＤに罹患した患者に見られる古典的な特徴である深い潰瘍の形成を伴って、腸の斑状の貫壁性炎症を引き起こす。これは、ＴＮＢＳモデルを、ＩＢＤにおける腸粘膜への損傷を予防および／または回復させるための、および健康な腸障壁の維持／発達を助けるための、機能性組成物の能力のインビボ評価のための優れた候補とする。
【０１２７】
この例において、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有する組成物を、ＴＮＢＳモデルにおける評価に関する有益な効果を評価するために用いた。さらに、実験は、「アセンブリ」戦略または「コラボローム」戦略（例１．３を参照）のいずれかにより生産される場合、組成物の有効性を識別することを目的とした。大腸炎を、エタノール中で希釈した粘膜増感剤であるＴＮＢＳの直腸滴下注入によって動物において引き起した。エタノールの投与は、結腸粘膜障壁を破壊してＴＮＢＳの基底膜への浸透を可能にするための前提条件である。ＴＮＢＳは、局在化した結腸および腸微生物タンパク質をハプテン化し、免疫原性にし、これにより、宿主の自然および適応免疫応答を誘発する。
【０１２８】
実際には、８〜１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを、１２：１２時間の明暗サイクルで２０℃の温度制御室に収容した。動物は水と市販の食物を自由に入手できた。ケージ効果を避けるために、マウスをケージ間でランダム化した。１週間の順化後、実験を開始した。各群（ｎ＝９／群）を経口強制飼養により５日間連続して処置した。全ての処置の予防的投与は、２ｍｇのＴＮＢＳ／５０％ＥｔＯＨの直腸投与の１日前に開始し、ＴＮＢＳ投与後４日間マウスを屠殺するまで続けた。以下の処置：
１）ＴＮＢＳ＋生理食塩水溶液中アセンブリ戦略の組成物；
２）ＴＮＢＳ＋生理食塩水溶液中コラボローム戦略の組成物および
３）ＴＮＢＳ＋生理食塩水溶液（対照）
を含む。
【０１２９】
従来の群（ＴＮＢＳ処置をしないが、生理食塩水溶液で処置）を、強制飼養手順から生じる変動を排除するための対照として含んだ。試験のエンドポイントとして、体重、糞便の血液喪失（ColoScreen）および一般的な外観を測定することにより、疾患活動性を毎日（毎日の処置の前に）監視した。
【０１３０】
この例の結果を図１１に表す。ＴＮＢＳを含まないビヒクル（生理食塩水）対照群について、体重および疾患活動性に関する効果が観察されなかった一方で、ＴＮＢＳを受けた対照群は、１日目における即時の８％の体重喪失および疾患活動性の強力な増加を示した。体重喪失と疾患活動性の両方は、研究の終わりまでに部分的に回復した。興味深いことに、組成物の強力な保護効果が体重喪失および疾患活動性の両方で観察されたが、この保護効果の程度は、組成物の生産戦略に依存していた。初期の軽度の保護が、低い体重喪失および疾患活動性に示されるように、アセンブリ戦略について一日目に観察された一方で、この保護効果は次の研究日にはもはや観察されなかった。対照的に、コラボローム戦略により生産された組成物の投与は、ＴＮＢＳ対照と比較して、一日目の体重喪失および疾患活動性に対する強力な予防効果、およびビヒクル対照のレベルまで疾患活動性が戻ることによって示されるような、研究の終わりまでの早くかつ完全な回復を導いた。結論として、この例は、機能性組成物が、ＴＮＢＳ誘発大腸炎誘導においての腸炎症および疾患活動性からのより速くより強力な回復を得るのに有効であるというインビボにおける確認を提供する。さらに、この発見は、コラボローム戦略による予めの順応が、アセンブリ戦略と比較してより効率的な活性をもたらすことを明らかに実証する。
【０１３１】
３．３：炎症についてのＤＳＳマウスモデル
慢性ＤＤＳモデルは、体重喪失および血性下痢を含む、クローン病の特徴のいくつかを模倣する大腸炎に一般に使用される。組織病理学において、慢性ＤＤＳ投与は、典型的な建築的（architectural）変化を伴う腸の炎症、例えば、腺窩の乱れ、炎症細胞の（サブ）粘膜炎症および線維症、ＣＤに罹患した患者に見られる特徴などを引き起す。これは、ＤＤＳモデルを、ＩＢＤにおける腸粘膜への損傷を予防および／または回復させるための、および健康な腸障壁の維持／発達を助けるための、機能性組成物の能力のインビボ評価のための優れた候補とする。
【０１３２】
この例において、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Roseburia hominis、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含有し、「コラボローム」戦略（例１．３を参照）により生産される組成物を、慢性ＤＳＳモデルにおける評価に関する有益な効果を評価するために用いる。大腸炎を、飲料水中ＤＳＳ（０．２５％チャレンジ）の繰り返し投与により動物において引き起こす。実験は、ＤＳＳ投与と回復の３サイクルで合計８週間にわたって行う。
【０１３３】
実際には、６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスを、１２：１２時間の明暗サイクルで２０℃の温度制御室に収容する。動物は水と市販の食物を自由に入手できる。ケージ効果を避けるために、ケージ間でマウスをランダム化する。１週間の順化後、実験を開始する。各群（ｎ＝１０／群）を経口強制飼養により、８週間連続して週に３回処置する。全ての処置の予防的投与は、第１のＤＳＳサイクルの１週間前に開始する。第１のＤＳＳサイクルは２週目に開始し、１週間のＤＳＳ投与（飲料水中０．２５％）、その後２週間の回復を含む。この第１のサイクルの後に、同一の第２のＤＳＳサイクルが続く。第３のＤＳＳサイクルは、１週間のＤＳＳ投与、その後の１週間の回復からなり、その後動物は屠殺される。以下の処置：
１）非ＤＳＳ対照
２）ＤＳＳ＋生理食塩水溶液中コラボローム戦略の組成物（３回／週）および
３）ＤＳＳ＋生理食塩水溶液（ＤＳＳ対照）
を含む。
【０１３４】
研究のエンドポイントとして、体重、糞便の血液喪失（ColoScreen）および一般的な外観を監視することにより、１週間に３回（毎日の処置前）、各ＤＳＳサイクルにおいて疾患活動性（ＤＡＩ）を監視した。図１２に示すように、ＤＳＳを受けていないビヒクル（生理食塩水）対照群についてＤＡＩに対する効果は観察されなかった一方で、ＤＳＳを受けた対照群は各投与サイクルにおいてＤＡＩの強い増加を示した。興味深いことに、組成物の強力な保護効果が疾患活動性に関して観察された（各サイクルにおいて約２５％低いＤＡＩ）。このことは、機能性組成物が、ＤＳＳ誘発性大腸炎誘導において腸炎症および疾患活動性からの強力な保護効果を得るのに有効であることをさらに実証する。
【０１３５】
例３．５：粘膜炎モデル
粘膜炎は、抗癌治療後の粘膜への損傷を説明するために使用される臨床用語である。これは、胃腸管（ＧＴ）（口を含む）および泌尿生殖管全体にわたって、および他の粘膜表面においてはより少ない程度で生じる。その重篤度および期間は、使用される薬物の用量および種類によって変化する。粘膜炎の重要性は、化学療法の用量を制限することである。ＧＩ管腺窩上皮は、化学療法毒性に対して特に脆弱であり、粘膜への細胞毒性の直接的な作用により、悪心および嘔吐、腹痛、膨張および下痢などを含む症状を伴う。５−フルオロウラシル（５ＦＵ）誘発性腸粘膜炎ラットモデルは、ＧＩ管への化学療法の効果を評価するために、Keefe et al.により確立されており、ラットにおける化学療法誘発性粘膜炎を調査するために現在最も広く使用されているモデルの１つである（Keefe 2004）。
【０１３６】
この例において、Lactobacillus plantarum、Faecalibacterium prausnitzii、Butyricicoccus pullicaecorum、Roseburia inulinivorans、Akkermansia muciniphilaおよびAnaerostipes caccaeを含む組成物を、実験のための基礎として用い、例１．３の「コラボローム」戦略により生産した。粘膜炎は、５ＦＵの単回腹腔内用量により誘発される。
【０１３７】
実際には、合計３０匹のラットを特定の時点で、対照群または実験群のいずれかにランダムに割り当てた。実験群の全てのラットは、５ＦＵ（１５０ｍｇ ５ＦＵ／ｋｇ ＢＷ）の単回腹腔内投与を受けた。対照群のラットは、溶媒ビヒクル（ジメチルスルホキシド）で処置を受けた。化学療法薬の投与に続いて、死亡率、下痢および一般的な臨床状態などの研究エンドポイントを２４時間ごとに４回評価した。ラットのサブ群は、薬物の投与の２４、４８、および７２時間後に、失血および頸椎脱臼によって屠殺した。関心のある主要なエンドポイントは、体重、下痢および一般的な健康状態（病気スコア）の発展であった。第２のエンドポイントは、腸試料および便および腸粘膜微生物叢分析の組織診を含んだ。
【０１３８】
評価された症状の予防または軽減に対する組成物の効果を評価するために、ラットの一部に経口強制飼養によって組成物を連続８日間投与した。予防的投与は、５ＦＵの投与の５日前に開始し、５ＦＵ投与後３日間、またはラットを屠殺するまで続けた。対照動物は組成物を受けなかった。
【０１３９】
参考文献
【表４】
2019511563.tif 000006
【０１４０】
【表５】
2019511563.tif 000007
【０１４１】
【表６】
2019511563.tif 000008
【図１】
2019511563.tif 000009
【図２】
2019511563.tif 000010
【図３】
2019511563.tif 000011
【図４】
2019511563.tif 000012
【図５】
2019511563.tif 000013
【図６】
2019511563.tif 000014
【図７】
2019511563.tif 000015
【図８】
2019511563.tif 000016
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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