(57)【要約】レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。レンチウイルスベクター系は、治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。レンチウイルスベクター系は、パーキンソン病を患う被験体のニューロン細胞におけるＰＡＲＰの発現を阻害するためのレンチウイルス粒子を産生し得る。一局面では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が提供され、これは：ａ．ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含む治療用ベクター、ｂ．このｓｈＲＮＡをニューロンに標的化するためのニューロン特異的配列を含む、エンベローププラスミド、ならびにｃ．ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を含む、少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。
2019520841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系であって、
ａ．ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含む治療用ベクター、
ｂ．前記ｓｈＲＮＡをニューロンに標的化するためのニューロン特異的配列を含む、エンベローププラスミド、ならびに
ｃ．ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を含む、少なくとも１つのヘルパープラスミド
を含み、
前記治療用ベクター、前記エンベローププラスミド、および前記少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、ＰＡＲＰの発現を阻害できるニューロン特異的レンチウイルス粒子が、前記パッケージング細胞株によって産生される、レンチウイルスベクター系。
【請求項２】
前記ｓｈＲＮＡが、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項３】
前記ｓｈＲＮＡが、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項４】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項５】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項６】
前記ニューロン特異的配列が、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＵＧ−Ｃ、もしくはｇｐ６４、またはそれらのバリアントをコードする、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項７】
前記ニューロン特異的配列が、ＶＳＶ−Ｇまたはそのバリアントをコードする、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項８】
前記ニューロン特異的配列が、ニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードする、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項９】
前記ニューロン特異的配列が、ＴＨ＋ニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードする、請求項１に記載のレンチウイルスベクター系。
【請求項１０】
パッケージング細胞によって産生され、細胞への感染が可能なレンチウイルス粒子であって、
ａ．前記細胞への感染が可能なエンベロープタンパク質、および
ｂ．ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡ
を含む、レンチウイルス粒子。
【請求項１１】
前記細胞が、ニューロンを含む、請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１２】
前記細胞が、ＴＨ＋ニューロンを含む、請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１３】
前記ｓｈＲＮＡが、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む、請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１４】
前記ｓｈＲＮＡが、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む、請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１５】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１６】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む、請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１７】
パーキンソン病に罹患している被験体を処置する方法であって、前記被験体に、レンチウイルス粒子を投与することを含み、前記レンチウイルス粒子が、
ａ．前記被験体の細胞への感染が可能なエンベロープタンパク質、および
ｂ．ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡ
を含む、方法。
【請求項１８】
前記細胞が、ニューロンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、ＴＨ＋ニューロンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｓｈＲＮＡが、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｓｈＲＮＡが、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｓｈＲＮＡが、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
第２の治療レジメンをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
第２の治療レジメンをさらに含み、前記第２の治療レジメンが、外科的介入による切除、神経刺激、Ｌ−ＤＯＰＡの投与、またはドーパミンアゴニストの投与を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「ＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＴＲＥＡＴＩＮＧ  ＰＡＲＫＩＮＳＯＮ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ」の表題で２０１６年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６５，３１６号の優先権を主張し、その開示は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明の態様は、パーキンソン病を処置するためにベクターを使用することに関する。より具体的には、本発明の態様は、パーキンソン病を処置するために、ＰＡＲＰを含有するレンチウイルスベクターを含む、レンチウイルスベクターを使用することに関する。
【背景技術】
【０００３】
パーキンソン病（「ＰＤ」）は、米国で２番目に一般的な神経変性障害である。およそ１００万人のアメリカ人が、ＰＤを患っており、毎年６０，０００を上回る新しい症例が診断される。例えば、Ｆａｈｎ，Ｓ．、９９１巻  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１〜１４頁（２００３年）を参照されたい。発生数は、２０３０年までに２倍となることが予測される。例えば、Ｄｏｒｓｅｙ，Ｅ．Ｒ．ら、６８巻（５号）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３８４〜６頁（２００７年）を参照されたい。ＰＤは、一般的には晩年に見られる慢性進行性状態である。ＰＤは、脳幹神経節の黒質領域におけるドーパミン産生ニューロンの変性および死滅によって引き起こされる。劣化したニューロンおよび低減されたドーパミンにより、異常な神経活動および運動機能制御の慢性進行性劣化がもたらされる。ＰＤを有する患者は、運動緩徐、硬直、振戦、および不安定な姿勢を含む症状に起因して、重大な生活の質の問題に苦しむ。ＰＤに起因する追加の併発症としては、非運動性の症状、例えば、嚥下障害、および精神神経系の作用が挙げられる。例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｄ．ら、１４巻（２補遺）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｍａｎａｇ．  Ｃａｒｅ、Ｓ４０〜８頁（２００８年）を参照されたい。
【０００４】
ＰＤは、Ｌ−ＤＯＰＡまたはドーパミンアゴニストを用いて処置することができるが、重大な副作用があり、継続的なニューロン死は、Ｌ−ＤＯＰＡまたはドーパミンアゴニストの要件の増加をもたらす。遺伝子療法は、黒質におけるニューロンの挙動を修飾する可能性を有する。結果として、遺伝子療法は、ＰＤを有効に処置する見込みがあると考えられている。
【０００５】
ＰＤ遺伝子療法に関する初期の臨床研究では、ドーパミン合成酵素、特に、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）のレベルを上昇させることによって、黒質におけるドーパミン産生を増加させることが試みられた。ＡＡＤＣに対する相補的ＤＮＡ配列を保持するアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が、ＰＤを患う患者の黒質に注射された。一研究では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用したＡＡＤＣの送達は、良好な耐容性を示したが、臨床転帰は、ほんの軽度の改善である傾向があった。例えば、Ｅｂｅｒｌｉｎｇら、７０巻（２１号）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９８９〜９３頁（２００８年）を参照されたい。長期（例えば、４年間）の追跡の後には、臨床上の影響は、大部分が失われ、投薬が、持続的な臨床上の改善には不十分であったと結論付けられた。
【０００６】
ＰＤを処置するために、遺伝子療法を使用して黒質における神経栄養増殖因子であるニュールツリンの発現を増加させる代替的なアプローチが探求された。ＰＤを患う患者の脳へのニュールツリン遺伝子のＡＡＶ送達により得られた結果では、偽対照にまさる改善は見られなかった。例えば、Ｍａｒｋｓ  Ｊｒ．ら、９巻（１２号）、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．、１１６４〜７２頁（２０１０年）を参照されたい。
【０００７】
ドーパミン産生を増加させるか、または神経栄養増殖因子を提供するように設計された遺伝子療法治験では、ＰＤを有する患者において、有意で持続的な客観的臨床応答は得られなかった。例えば、Ｅｂｅｒｌｉｎｇら（上記）を参照されたい。疾患の進行が、ドーパミン作動性ニューロンの死滅の加速に起因し、これにより、最終的に、ドーパミンが生存可能に満たないレベルまで低減されることが、ＰＤの処置が複雑かつ困難である原因の一部である。
【０００８】
したがって、ＰＤの症状の現在の処置としては、薬物、外科的介入による切除、および神経刺激が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｅｂｅｒｌｉｎｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（２００８年）７０巻（２１号）１９８９〜９３頁
【非特許文献２】Ｍａｒｋｓ  Ｊｒ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．（２０１０年）、９巻（１２号）１１６４〜７２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が、提供される。この系は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（「ＰＡＲＰ」）の発現を阻害するためのショートヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）をコードする治療用ベクターを含む。この系はまた、ｓｈＲＮＡをニューロンに標的化するためのニューロン特異的配列を含むエンベローププラスミド、ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、ＰＡＲＰの発現を阻害するように最適化されたニューロン特異的レンチウイルス粒子が、パッケージング細胞株によって産生される。
【００１１】
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも８５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む。
【００１２】
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも８５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つを含む。実施形態では、ニューロン特異的配列は、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＵＧ−Ｃ、もしくはｇｐ６４、またはそれらのバリアントをコードする。任意選択で、ニューロン特異的配列は、ＶＳＶ−Ｇまたはそのバリアントのみをコードする。ニューロン特異的配列は、ニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードし得る。ニューロン特異的配列は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ＋）を発現するニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードし得る。
【００１３】
別の態様では、パーキンソン病に罹患している被験体を処置する方法が開示される。本方法は、被験体に、ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含む治療用ベクター、ｓｈＲＮＡをニューロンに標的化するためのニューロン特異的配列を含むエンベローププラスミド、ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを投与することを含む。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドが、少なくとも１つのパッケージング細胞にトランスフェクトされると、ＰＡＲＰの発現を阻害するように最適化されたニューロン特異的レンチウイルス粒子が、パッケージング細胞によって産生され、レンチウイルス粒子が、それを必要とする被験体に投与される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、ＰＡＲＰ  ｓｈＲＮＡを送達するために宿主細胞に形質導入される。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも８５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも８５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも９０％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに少なくとも９５％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つを含む。ニューロン特異的配列は、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＵＧ−Ｃ、もしくはｇｐ６４、またはそれらのバリアントをコードし得る。ニューロン特異的配列は、ＶＳＶ−Ｇまたはそのバリアントのみをコードし得る。ニューロン特異的配列は、被験体のニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードし得る。ニューロン特異的配列は、被験体のチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｇ）ヒドロキシラーゼ（ＴＨ＋）を発現するニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードし得る。
【００１４】
別の態様では、パーキンソン病に罹患している被験体を処置する方法が開示される。本方法は、被験体に、本明細書において記載されるレンチウイルスベクター系によって発現される、治療有効量のレンチウイルス粒子を投与することを含む。本方法はまた、第２の治療レジメンも含み得る。第２の治療レジメンには、外科的介入による切除、神経刺激、Ｌ−ＤＯＰＡの投与、またはドーパミンアゴニストの投与が含まれ得る。
【００１５】
別の態様では、パーキンソン病に罹患している被験体を処置するための、治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドの使用が開示される。治療用ベクターは、ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含む。エンベローププラスミドは、ｓｈＲＮＡをニューロンに標的化するためのニューロン特異的配列を含む。１つまたは複数のヘルパープラスミドは、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つまたは複数を含む。
【００１６】
ＰＡＲＰレベルを抑制することによって、本明細書において開示されるレンチウイルスベクター系は、ニューロン死の速度を低減させ、正常なドーパミン産生能力を保存し、かつパーキンソン病の発症を遅延または予防する。本明細書において開示されるレンチウイルスベクター系は、ＡＡＶとは異なり、休止細胞に形質導入するための高い能力を有し、ニューロンに効率的に形質導入するように最適化することができ、導入遺伝子を細胞ＤＮＡに挿入することによって恒久的な修飾をもたらすことができる。加えて、本明細書において開示されるレンチウイルスベクター系は、ＡＡＶよりも炎症性が低く、そのため、より高い用量漸増が可能であり、別のエンベロープ糖タンパク質、ベクター組成、用量、および関連する送達方法を試験する場合、ベクター設計におけるより高い柔軟性が可能となる。
【００１７】
本明細書において記載される本発明の他の態様および利点は、本発明の態様を例として図示する添付の図面と併せて、以下の詳細な説明から明らかとなろう。
【００１８】
特許出願または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。該当する場合、カラー図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、必要に応じて、かつ必要な費用の支払いに応じて、当局により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、実験用治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドから構成される、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターは、ＧＦＰを含有する。図１Ｂは、ＰＤを患う患者の黒質ニューロンにおけるＰＡＲＰ１の発現を低減するように設計された例示的な治療用ベクターを示す。図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターは、ＧＦＰを含有しない。図１Ｃは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｄは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｅは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｆは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
【図１Ｂ】図１Ａは、実験用治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドから構成される、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターは、ＧＦＰを含有する。図１Ｂは、ＰＤを患う患者の黒質ニューロンにおけるＰＡＲＰ１の発現を低減するように設計された例示的な治療用ベクターを示す。図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターは、ＧＦＰを含有しない。図１Ｃは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｄは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｅは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｆは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
【図１Ｃ】図１Ａは、実験用治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドから構成される、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターは、ＧＦＰを含有する。図１Ｂは、ＰＤを患う患者の黒質ニューロンにおけるＰＡＲＰ１の発現を低減するように設計された例示的な治療用ベクターを示す。図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターは、ＧＦＰを含有しない。図１Ｃは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｄは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｅは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｆは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
【図１Ｄ】図１Ａは、実験用治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドから構成される、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターは、ＧＦＰを含有する。図１Ｂは、ＰＤを患う患者の黒質ニューロンにおけるＰＡＲＰ１の発現を低減するように設計された例示的な治療用ベクターを示す。図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターは、ＧＦＰを含有しない。図１Ｃは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｄは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｅは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｆは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
【図１Ｅ】図１Ａは、実験用治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドから構成される、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターは、ＧＦＰを含有する。図１Ｂは、ＰＤを患う患者の黒質ニューロンにおけるＰＡＲＰ１の発現を低減するように設計された例示的な治療用ベクターを示す。図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターは、ＧＦＰを含有しない。図１Ｃは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｄは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｅは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｆは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
【図１Ｆ】図１Ａは、実験用治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドから構成される、例示的なレンチウイルスベクター系を示す。図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターは、ＧＦＰを含有する。図１Ｂは、ＰＤを患う患者の黒質ニューロンにおけるＰＡＲＰ１の発現を低減するように設計された例示的な治療用ベクターを示す。図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターは、ＧＦＰを含有しない。図１Ｃは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｄは、図１Ａに詳細に示される実験用治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｅは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な３ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。図１Ｆは、図１Ｂに詳細に示される治療用ベクターを含む、環状の例示的な４ベクターのレンチウイルスベクター系を示す。
【００２０】
【図２】図２は、ヒト細胞におけるＰＡＲＰ１に関するノックダウン実験により得られた結果を示す。
【００２１】
【図３】図３は、マウス細胞におけるＰＡＲＰ１に関するノックダウン実験により得られた結果を示す。
【００２２】
【図４】図４は、例示的なレンチウイルスベクターを形質導入したニューロンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示の概要
本発明の態様は、ＰＤを処置するためのレンチウイルスベクター系の開発について記載する。レンチウイルスベクター系は、ＰＡＲＰの発現を低減させるための阻害性ＲＮＡ構築物を含む治療用ベクターを含む。ＰＡＲＰ１タンパク質は、ＰＤにおけるその役割が関係付けられている。
【００２４】
定義および解釈
本明細書において別途定義されない限り、本開示と関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書において記載される細胞および組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、ならびにタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションと関連して使用される命名法ならびにこれらの技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。本開示の方法および技法は、一般に、別途示されない限り、当該技術分野において周知であり、また様々な一般文書ならびに本明細書を通じて引用および考察されるより具体的な参考文献に記載されている、従来的な方法に従って行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（２０００年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００２年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９９８年）；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．（２００３年）を参照されたい。いずれの酵素反応および精製技法も、製造業者の仕様書に従って、当該技術分野において一般に行われているようにまたは本明細書において記載されるように、行われる。本明細書において記載される解析化学、合成有機化学、ならびに薬化学および医薬化学と関連して使用される命名法ならびにこれらの実験室手順および技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。
【００２５】
「含む」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されることなく含むことを意味する。
【００２６】
「レンチウイルスベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、「治療用ベクター」という用語と同義である。「実験用治療用ベクター」という用語は、ＧＦＰなどの実験上の特徴を含む治療用ベクターを意味する。
【００２７】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、マイクロＲＮＡを意味する。
【００２８】
「パッケージング細胞株」という用語は、本明細書で使用される場合、レンチウイルス粒子を発現させるために使用することができる任意の細胞株を指す。
【００２９】
本明細書において「ＰＤ」とも称される「パーキンソン病」という用語は、本明細書で使用される場合、公知の神経変性疾患、ならびにそれに関連するすべての症状を指す。「パーキンソン病」の処置は、したがって、パーキンソン病と関連する症状のすべてまたは一部の処置と関連し得る。
【００３０】
「ＰＡＲＰ」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼを表し、すべてのＰＡＲＰファミリーのメンバーを含み、特定のＰＡＲＰファミリーのメンバーであるＰＡＲＰ１（受託番号ＮＭ＿００１６１８．３）およびそのバリアントを含む。
【００３１】
本明細書において「配列同一性」とも称される「同一性パーセント」という用語は、２つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列の文脈において、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、または目視検査によって測定したときに、最大の一致に関して比較およびアラインメントした場合に、指定された百分率の同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つまたはそれよりも多い配列または部分配列を指す。適用に応じて、「同一性パーセント」は、比較されている配列の領域、例えば、機能的ドメインに存在してもよく、または代替として、比較しようとする２つの配列の全長にわたって存在してもよい。配列の比較に関して、典型的に１つの配列が参照配列としての機能を果たし、それに対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列を、コンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【００３２】
比較に最適な配列のアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁（１９８１年）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（概して、Ａｕｓｕｂｅｌら（上述）を参照されたい）によって、行うことができる。
【００３３】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに好適であるアルゴリズムの１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
【００３４】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスおよび４０、５０、６０、７０または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．  ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８９年））を使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用して決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかおよび１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ加重および１、２、３、４、５または６の長さ加重を使用して決定することができる。
【００３５】
本開示の核酸および／タンパク質配列は、さらに、例えば、関連配列を特定するための公的データベースに対する検索を実行するための「クエリー配列」として使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。本開示において提供される核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実行することができる。本開示のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００３６】
「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語と同義である。
【００３７】
「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」という用語は、本明細書で使用される場合、「配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ  Ｎｏ）」という用語と同義である。
【００３８】
「ｓｈＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、ショートヘアピンＲＮＡを指す。
【００３９】
「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト患者を含むが、他の哺乳動物もまた含む。
【００４０】
「ＴＨ」という用語は、本明細書で使用される場合、チロシンヒドロキシラーゼを指す。
【００４１】
本開示の態様の説明
本開示の態様では、本開示は、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系を提供する。この系は、ＰＡＲＰファミリーメンバーの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含む、治療用ベクターを含む。多数のＰＡＲＰファミリーメンバーが存在し、本開示は、いずれか１つの特定のＰＡＲＰファミリーメンバーに限定されない。しかしながら、実施形態では、レンチウイルスベクター系は、ＰＡＲＰ１を特異的に阻害する。
【００４２】
系は、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子のそれぞれは、個々のプラスミドに提供されてもよく、または１つもしくは複数の遺伝子が、同じプラスミドに一緒に提供されてもよい。実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミドに提供される（例えば、図１Ｃ）。実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が、第１のプラスミドに提供され、ｒｅｖ遺伝子が、第２のプラスミドに提供される（例えば、図１Ｄ）。さらなる実施形態では、３ベクターおよび４ベクターの系が、本明細書において提供される。
【００４３】
本明細書において詳述されるように、治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子が、産生される。本明細書において記載される実験条件下において、レンチウイルスベクター系によって産生されるレンチウイルス粒子は、ＰＡＲＰの発現を阻害するように最適化されたニューロン特異的レンチウイルス粒子であり得る。
【００４４】
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む。
【００４５】
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つを含む。実施形態では、前述のｓｈＲＮＡのいずれも、好適なｍｉＲＮＡで置き換えられ得る。実施形態では、ニューロン特異的配列は、ニューロン細胞に指向的な特異性を付与する、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＵＧ−Ｃ、もしくはｇｐ６４または任意の他の配列をコードする。任意選択で、ニューロン特異的配列は、ＶＳＶ−Ｇのみをコードする。実施形態では、ニューロン特異的配列は、ニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードする。実施形態では、ニューロン特異的配列は、ＴＨ＋ニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードする。
【００４６】
本開示の別の態様では、ＰＤに罹患している被験体を処置する方法が開示される。実施形態では、被験体は、軽度、中等度、または重度のＰＤを患っているヒトである。実施形態では、被験体は、ＰＤに一般的にまたは稀に付随する任意の症状を患っているヒトである。
【００４７】
本方法は、被験体に、ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含むレンチウイルス治療用ベクターを投与することを含む。実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＰＡＲＰ  ｓｈＲＮＡを送達するために宿主細胞に形質導入される、レンチウイルス粒子としてパッケージングされる。
【００４８】
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、ＰＡＲＰ１特異的ｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つに、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号６〜１０のうちのいずれか１つを含む。
【００４９】
実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも８０％、または少なくとも８１％、または少なくとも８２％、または少なくとも８３％、または少なくとも８４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも８５％、または少なくとも８６％、または少なくとも８７％、または少なくとも８８％、または少なくとも８９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つに、少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１６〜２０のうちのいずれか１つを含む。実施形態では、前述のｓｈＲＮＡのいずれも、好適なｍｉＲＮＡで置き換えられ得る。実施形態では、ニューロン特異的配列は、ニューロン細胞に指向的な特異性を付与する、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＵＧ−Ｃ、もしくはｇｐ６４または任意の他の配列をコードする。任意選択で、ニューロン特異的配列は、ＶＳＶ−Ｇのみをコードする。実施形態では、ニューロン特異的配列は、被験体のニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードする。実施形態では、ニューロン特異的配列は、被験体のＴＨ＋ニューロンへの形質導入を改善するタンパク質をコードする。
【００５０】
別の態様では、ＰＤに罹患している被験体を処置する方法が開示される。本方法は、被験体に、本明細書において記載されるレンチウイルスベクター系によって発現される、治療有効量のレンチウイルス粒子を投与することを含む。実施形態では、本方法は、第２の治療レジメンを含む。実施形態では、第２の治療レジメンには、外科的介入による切除、神経刺激、Ｌ−ＤＯＰＡの投与、ドーパミンアゴニストの投与、または任意の他の公知のパーキンソン病処置が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、本明細書において開示される系は、ＰＤを処置し、同時に、Ｌ−ＤＯＰＡの用量を増加させる必要性を排除するために、使用することができる。
【００５１】
レンチウイルスベクター系
レンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）を産生するために必要なウイルスタンパク質をコードするベクター系によって発現される。プロモーターに作動可能に連結した、逆転写および組込みに必要なレンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含有する少なくとも１つのベクターが存在する。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。
【００５２】
別の態様では、ＰＤに罹患している被験体を処置するための、治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドの使用が開示される。治療用ベクターは、ＰＡＲＰの発現を阻害するためのｓｈＲＮＡを含む。実施形態では、エンベローププラスミドは、ｓｈＲＮＡをニューロンに標的化するためのニューロン特異的配列、ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を含む、少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。
【００５３】
ＰＡＲＰレベルを抑制することによって、本明細書において開示されるレンチウイルスベクター系は、ニューロン死の速度を低減させ、正常なドーパミン産生能を保存し、かつＰＤの発症を遅延および／または予防するであろう。本明細書において開示されるレンチウイルスベクター系は、当該技術分野において公知のＡＡＶ系とは異なり、休止細胞に形質導入するための高い能力を有し、ニューロンに効率的に形質導入するように最適化することができ、導入遺伝子を細胞ＤＮＡに挿入することによって恒久的な修飾をもたらすことができる。加えて、本明細書において開示されるレンチウイルスベクター系は、ＡＡＶ系よりも炎症性が低く、そのため、より高い用量漸増が可能であり、別のエンベロープ糖タンパク質、ベクター組成、用量、および関連する送達方法を試験する場合、ベクター設計におけるより高い柔軟性が可能となる。
【００５４】
開示されるレンチウイルスベクター系は、ＰＤを患う被験体におけるＰＡＲＰ発現の短期、中期、または長期の抑制のために最適化され得る。したがって、投薬レジメンは、ＰＤまたは関連するＰＤ症状の重症度に基づいて変動し得る。本明細書において開示されるレンチウイルス粒子は、それを必要とする被験体に、様々な用量で投与され得る。被験体には、１０６以上の形質導入単位のレンチウイルス粒子懸濁物（標的細胞１個に形質導入を行うために、平均で１用量が必要である場合）が投与され得る。被験体には、１０６以上、１０７以上、１０８以上、１０９以上、または１０１０以上の形質導入単位が投与され得る。投薬の上限は、当業者によって理解される様々な要因によって決定されるであろう。
【００５５】
レンチウイルス粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノムに由来する核酸配列を含有しない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結したエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含有する別個のベクターが、使用される。このｅｎｖベクターもまた、レンチウイルスパッケージング配列を含有しない。一実施形態では、ｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。
【００５６】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルス由来ではなく、異なるウイルスに由来する。結果として得られる粒子は、偽型粒子と称される。エンベロープの適切な選択によって、事実上あらゆる細胞に「感染する」ことができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎または麻疹）、ピコルナウイルス（メンゴ、ポリオ、およびコクサッキー）、ならびにオルソミクソウイルス（インフルエンザウイルス）のものなど、エンドサイトーシスコンパートメントを標的化するエンベロープタンパク質をコードする、ｅｎｖ遺伝子を使用することができる。好ましく使用することができる他のエンベロープは、モロニー白血病ウイルス、例えば、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、およびＧＡＬＶに由来するものが挙げられる。これらの後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合に特に好ましい。他のエンベロープタンパク質は、所望される宿主細胞に応じて選択することができる。例えば、特定の受容体、例えば、ドーパミン受容体を標的化することが、脳への送達のために使用され得る。別の標的は、血管内皮であり得る。これらの細胞は、フィロウイルスエンベロープを使用して、標的化され得る。例えば、エボラのＧＰ（転写後修飾によりＧＰとなる）およびＧＰ２糖タンパク質。別の実施形態では、偽型エンベロープを有する様々なレンチウイルスキャプシドを使用することができる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶ偽型ベクターは、動物モデル、例えば、サルにおいて、容易に使用することができる。
【００５７】
本明細書に詳述されるように、レンチウイルスベクター系は、典型的に、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子のそれぞれは、個々のプラスミドに提供されてもよく、または１つもしくは複数の遺伝子が、同じプラスミドに一緒に提供されてもよい。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミドに提供される（例えば、図１Ｃ）。別の実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子が、第１のプラスミドに提供され、ｒｅｖ遺伝子が、第２のプラスミドに提供される（例えば、図１Ｄ）。したがって、３ベクターおよび４ベクターの系の両方を使用して、実施例の節および本明細書の他の箇所に記載されるように、レンチウイルスを産生することができる。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。治療用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子が、産生される。
【００５８】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現させるためのレンチウイルスベクター系が開示される。この系は、本明細書において記載されるレンチウイルスベクター、細胞に感染するように最適化されたエンベロープタンパク質を発現させるためのエンベローププラスミド、ならびにｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現させるための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、ここで、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドがパッケージング細胞株にトランスフェクトされると、レンチウイルス粒子が、パッケージング細胞株によって産生され、このレンチウイルス粒子は、ＰＡＲＰ１の産生を阻害できる。
【００５９】
別の態様では、図１Ｃに詳細に示されるように、本明細書において治療用ベクターとも称されるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含む：ハイブリッド５’末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号２１〜２２）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２３）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号２４）、Ｅｎｖエレメント（配列番号２５）、ｃＰＰＴ（配列番号２６）、Ｈ１プロモーター（配列番号２７）、ＰＡＲＰ１を標的化するｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＡＲＰ１）（配列番号６〜１０）、ＥＦ１プロモーター（配列番号２８）、ＧＦＰエレメント（配列番号２９）、ウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３０）、および３’ＬＴＲデルタＵ３（配列番号３１）。別の態様では、配列の変化、例として、置換、欠失、付加、または変異を使用して、本明細書における参照配列を修飾することができる。
【００６０】
別の態様では、本明細書において、例えば、図１Ｃに詳細に示されるように、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＭＶエンハンサー（配列番号３２）、ニワトリベータアクチンプロモーター（配列番号３３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号３４）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２３）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号３５）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号３６）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２４）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号３７）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現させるための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現させるための第２かつ別個のプラスミドを含むように修飾され得る。別の態様では、配列の変化、例として、置換、欠失、付加、または変異を使用して、本明細書における参照配列を修飾することができる。
【００６１】
別の態様では、本明細書において、例えば、図１Ｃに詳細に示されるように、エンベローププラスミドは、左から右の方向に、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＭＶプロモーター（配列番号３９）、ベータグロビンイントロン（配列番号４０）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）。別の態様では、配列の変化、例として、置換、欠失、付加、または変異を使用して、本明細書における参照配列を修飾することができる。
【００６２】
別の態様では、レンチウイルスのパッケージングに使用されるプラスミドは、類似のエレメントで修飾することができ、イントロン配列は、ベクター機能を損なうことなく、潜在的に除去されていてもよい。例えば、以下のエレメントは、パッケージング系を構成するプラスミドにおいて類似のエレメントと置き換えてもよい：伸長因子−１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターと置き換えてもよい。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡは、ウサギベータグロビンポリＡと置き換えてもよい。ヘルパープラスミドにおけるＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築され得る。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ａ型インフルエンザトリペストウイルス（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）に由来する膜糖タンパク質と置換され得る。
【００６３】
注目すべきことには、レンチウイルスパッケージング系は、市販で入手することができ（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤからのＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキット）、また、本明細書において記載されるように設計することもできる。さらに、レンチウイルス粒子の産生効率を含め、任意の数の関連する因子を改善するように、レンチウイルスパッケージング系の態様を置換または修飾することは、当業者の技能の範囲内である。
【００６４】
用量および剤形
投薬は、１日１回であってもよく、または１日数回であってもよい。投薬は、投薬間に間隔をあけて行ってもよい。例えば、被験体は、初日に処置を受け、次いで、１日おきに、または２日に１回、または３日に１回、または４日に１回、または５日に１回、または６日に１回、または７日に１回、または２週間に１回、または１カ月に１回など、処置を受けてもよい。しかしながら、投薬は、１年に１回、２回、または数回であってもよく、そのような投薬スケジュールが、年基準で繰り返されてもよい。レンチウイルス粒子は、ＰＤと関連する症状を処置するのに好適な任意の方法によって送達することができる。例えば、投薬は、ガイドされたニードルを使用した、脳幹への直接的な注射によって行われてもよい。これは、脳深部刺激と併せて行われる可能性が高いであろう。
【００６５】
別の態様では、本明細書において記載されるレンチウイルス粒子を含む医薬組成物は、固形剤形で製剤化され得る。固形剤形は、当業者に公知の賦形剤を含み得る。本明細書において記載されるレンチウイルス粒子は、ゲル形態、泡沫体形態、生体分解性カプセル形態、ナノ粒子形態で製剤化されてもよく、またはリポソームもしくは当業者に公知の他の構造体で製剤化されてもよい。固形剤形は、即時放出または調節放出（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）のために製剤化され得る。調節放出剤形には、制御放出形態または長期放出形態が含まれる。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で提供されるものであり、決して本発明を制限することを意味するものではない。本実施例は、本明細書において記載される方法とともに、現在、好ましい実施形態を表すものであり、例示であり、本発明の範囲に対する制限として意図されるものではない。そこになされる変更、および特許請求の範囲によって定められる本発明の趣旨に包含されるその他の使用が、当業者には想起されるであろう。
【実施例】
【００６７】
（実施例１  レンチウイルスベクター系の開発）
レンチウイルスベクター系を、概して図１に要約されるように、開発した。レンチウイルス粒子は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入）において、治療用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミドのトランスフェクションの後に、産生させた。機能的ウイルス粒子を産生した２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞のトランスフェクションには、プラスミドＤＮＡの取込み効率を増加させるために、試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を利用した。プラスミドおよびＤＮＡは、まず、３：１の比（ＰＥＩ対ＤＮＡの質量比）で、血清不含の培養培地に、別個に添加した。２〜３日後に、細胞培地を採取し、レンチウイルス粒子を、高速遠心分離および／または濾過、続いて、アニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）の単位で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ  ｐ２４のレベルを測定し（ｐ２４タンパク質は、レンチウイルス粒子に組み込まれる）、定量的ＰＣＲ、または細胞に感染して光を使用すること（ベクターがルシフェラーゼもしくは蛍光タンパク質マーカーをコードする場合）により、細胞１個当たりのウイルスＤＮＡコピー数を測定することによって達成した。
【００６８】
３ベクターの系（すなわち、２ベクターのレンチウイルスパッケージング系）を、レンチウイルス粒子の産生のために設計した。３ベクターの系の概要は、図１Ａ、１Ｃ、および１Ｅに示されている。簡単に述べると、また図１Ｃおよび１Ｅを参照すると、一番上のベクターは、ヘルパープラスミドであり、この事例では、Ｒｅｖを含む。図１Ｃおよび１Ｅの中央に示されているベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、本明細書において記載される治療用ベクターである。
【００６９】
図１Ｃおよび１Ｅを参照すると、ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドは、ＣＭＶエンハンサー（配列番号３２）、ニワトリベータアクチンプロモーター（配列番号３３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号３４）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２３）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号３５）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号３６）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２４）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号３７）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）を含む。ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドはまた、図１Ａにおいて線形形態でも示されている。
【００７０】
図１Ｃおよび１Ｅを参照すると、エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号３９）、ベータグロビンイントロン（配列番号４０）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）を含む。エンベローププラスミドはまた、図１Ａにおいて線形形態でも示されている。
【００７１】
ヘルパー（＋Ｒｅｖ）およびエンベローププラスミドを含む、２ベクターのレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：ヘルパープラスミドを、まずは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含有するｐＮＬ４−３  ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  Ａｉｄｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）に由来するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅によって、構築した。プライマーは、ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において同じ部位に挿入するために使用することができる、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するように設計した。フォワードプライマーは、（５’−ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣ  ＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号４１）であり、リバースプライマーは、（５’−ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号４２）であった。
【００７２】
Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片の配列は、以下の通りであった。
【化１】
2019520841.tif 000003
【化２】
2019520841.tif 000004
【００７３】
次いで、隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いてＲｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。ＤＮＡ断片を、次いで、プラスミドのＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は、以下の通りであった。
【化３】
2019520841.tif 000005
【００７４】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターを、ＣＡＧエンハンサー／プロモーターに加えてニワトリベータアクチンイントロン配列と置き換えた。隣接するＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含有するＤＮＡ断片を、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。ＤＮＡ断片を、次いで、プラスミドのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は、以下の通りであった。
【化４】
2019520841.tif 000006
【００７５】
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
水疱性口内炎Ｉｎｄｉａｎａウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列を、隣接するＥｃｏＲＩ制限部位を用いて、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。次いで、ＤＮＡ断片を、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入し、正しい配向を、ＣＭＶ特異的プライマーを使用したシーケンシングによって決定した。ＤＮＡ配列は、以下の通りであった。
【化５】
2019520841.tif 000007
【００７６】
４ベクターの系（すなわち、３ベクターのレンチウイルスパッケージング系）もまた設計し、本明細書において記載される方法および材料を使用して、産生させた。４ベクターの系の概要は、図１Ｄおよび１Ｆに示されている。簡単に述べると、図１Ｄおよび１Ｆを参照すると、一番上のベクターは、ヘルパープラスミドであり、この事例では、Ｒｅｖを含まない。頁の左側にある上から２番目のベクターは、別個のＲｅｖプラスミドである。頁の右側にある下から２番目のベクターは、エンベローププラスミドである。一番下のベクターは、実験用治療用ベクターである。
【００７７】
図１Ｄおよび１Ｆを参照すると、ヘルパープラスミドは、ＣＭＶエンハンサー（配列番号３２）、ニワトリベータアクチンプロモーター（配列番号３３）、ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号３４）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２３）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号３５）、ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号３６）、ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号２４）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）を含む。
【００７８】
図１Ｄおよび１Ｆを参照すると、Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号４７）、ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号３７）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）を含む。
【００７９】
図１Ｄおよび１Ｆを参照すると、エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号３９）、ベータグロビンイントロン（配列番号４０）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号２５）、およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）を含む。エンベローププラスミドはまた、図１Ａにおいて線形形態でも示されている。
【００８０】
ヘルパー、Ｒｅｖ、およびエンベローププラスミドを含む、３ベクターのレンチウイルスパッケージング系の合成
材料および方法：
Ｒｅｖを有さないヘルパープラスミドの構築：
Ｒｅｖを有さないヘルパープラスミドを、ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含有するＤＮＡ断片を挿入することによって、構築した。この配列は、隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を用いて、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。ＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列を、次いで、ヘルパープラスミドのＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は、次の通りである。
【化６】
2019520841.tif 000008
【００８１】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列を、隣接するＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって、単一のＤＮＡ断片として合成した。ＤＮＡ断片を、次いで、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターと置き換えられているｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は、以下の通りであった。
【化７】
2019520841.tif 000009
【００８２】
３ベクターおよび４ベクターのパッケージング系のプラスミドは、類似のエレメントを有するように修飾することができ、イントロン配列は、ベクター機能を損なうことなく、潜在的に除去されていてもよい。例えば、以下のエレメントは、３ベクターおよび４ベクターのパッケージング系において、類似のエレメントと置き換えることができる。
【００８３】
プロモーター：伸長因子−１（ＥＦ−１）（配列番号２８）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号４９）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号５０）は、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーター（配列番号３９）と置き換えてもよい。これらの配列はまた、付加、置換、欠失、または変異によって、さらに変更され得る。
【００８４】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号５１）およびｂＧＨポリＡ（配列番号５２）は、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号３８）と置き換えてもよい。これらの配列はまた、付加、置換、欠失、または変異によって、さらに変更され得る。
【００８５】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミドにおけるＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築してもよい。例えば、Ｂａｌ株に由来するＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号２３）、ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号３５）、およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号３６）は、本明細書において概説されるヘルパー／ヘルパー＋Ｒｅｖプラスミドに含まれるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と互換可能である。これらの配列はまた、付加、置換、欠失、または変異によって、さらに変更され得る。
【００８６】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号５３）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号５４）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号５５）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号５６）、Ａ型インフルエンザトリペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号５７）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号５８）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号５９）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号６０）に由来する膜糖タンパク質と置換され得る。これらのエンベロープの配列は、本明細書の配列の部分において特定される。さらに、これらの配列はまた、付加、置換、欠失、または変異によって、さらに変更され得る。
【００８７】
要約すると、３ベクター系  対  ４ベクター系を、比較して、部分的には、次のように対比させることができる。３ベクターのレンチウイルスベクター系は、次のものを含む：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇエンベロープ；ならびに３．治療用ベクター：ＲＳＶ／５’ＬＴＲ、ＨＩＶ  Ｇａｇ、ＲＲＥ、Ｅｎｖ、ｃＰＰＴ、Ｈ１、ｓｈＰＡＲＰ１、ＥＦ１、ＧＦＰ、ＷＰＲＥ、および３’ＬＴＲΔＵ３。４ベクターのレンチウイルス系は、次のものを含む：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇエンベロープ；ならびに４．治療用ベクター：ＲＳＶ／５’ＬＴＲ、ＨＩＶ  Ｇａｇ、ＲＲＥ、Ｅｎｖ、ｃＰＰＴ、Ｈ１エレメント、ｓｈＰＡＲＰ１、ＥＦ１、ＧＦＰ、ＷＰＲＥ、および３’ΔＬＴＲ。上述のエレメントに対応する配列は、本明細書の配列表の部分において特定される。
【００８８】
（実施例２  レンチウイルスベクター系のレンチウイルスベクターにおいて使用するためのＰＡＲＰ１阻害性ＲＮＡの開発）
この実施例の目的は、ＰＡＲＰ１阻害剤ＲＮＡレンチウイルスベクターを開発することであった。
【００８９】
阻害性ＲＮＡの設計。Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ１）ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００１６１８）またはＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｐａｒｐ１  ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００７４１５）の配列を使用して、ヒトまたはマウスの細胞においてＰＡＲＰ１レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探求した。可能性のあるＲＮＡ干渉配列を、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラム、例えば、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＭＩＴ）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＧＰＰ）Ｗｅｂ  ＰｏｒｔａｌからのものまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒによって、選択した候補から選択した。可能性のあるＲＮＡ干渉配列を、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラム、例えば、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって主催されるＧＰＰ  Ｗｅｂ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）からのものまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）によって選択した候補から選択した。
【００９０】
ベクターの構築。ＰＡＲＰ１  ｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含有するオリゴヌクレオチド配列を、ＭＷＧ  ｏｐｅｒｏｎによって合成した。オリゴヌクレオチド配列を、摂氏７０度でインキュベートし、室温に冷却することによって、アニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチドを、摂氏３７度で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化させた後、酵素を、摂氏７０度で２０分間、熱不活化した。並行して、レンチウイルスベクターを、摂氏３７度で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化させた。消化させたレンチウイルスベクターを、アガロースゲル電気泳動によって精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＤＮＡゲル抽出キットを使用して、ゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍの吸光波長で、分光光度法によって決定した。ベクターおよびオリゴヌクレオチド配列を、３：１の比（インサート対ベクター）で、ライゲートした。ライゲーション反応は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、室温で３０分間行った。２．５マイクロリットルのライゲーション混合物を、２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。形質転換を、摂氏４２度での熱ショックによって行った。細菌細胞を、アンピシリンを含有する寒天プレートに画線し、次いで、コロニーを、ＬＢブロスで増殖させた。オリゴ配列の挿入の確認のために、プラスミドＤＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いて、採取した細菌培養物から抽出した。レンチウイルスベクターへのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡ発現を制御するために使用されるいずれかのプロモーターに特異的なプライマーを使用して、ＤＮＡシーケンシングによって検証した。次いで、正しいＰＡＲＰ１配列を含有するレンチウイルスベクターを使用して、レンチウイルス粒子をパッケージングして、ＰＡＲＰ１をノックダウンするそれらの能力について試験した。哺乳動物細胞に、ポリブレンの存在下または非存在下のいずれかにおいて、レンチウイルス粒子を形質導入した。細胞を、２〜４日後に採取し、タンパク質を、ＰＡＲＰ１の発現に関して、ウエスタンブロットによって分析した。
【００９１】
表１に要約されるＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＲＰ１標的配列が、これらの実験に関連して特定され、ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列に関しては、本明細書の表２に概説される。
【表１】
2019520841.tif 000010
【００９２】
表２に要約される以下のＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＲＰ１  ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を、これらの実験に使用した。
【表２】
2019520841.tif 000011
【００９３】
表３に要約されるＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＰＡＲＰ１標的配列が、これらの実験に関連して特定され、ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列に関しては、本明細書の表４に概説される。
【表３】
2019520841.tif 000012
【００９４】
表４に要約される以下のＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＰＡＲＰ１  ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を、これらの実験に使用した。
【表４】
2019520841.tif 000013
【００９５】
この実施例に概説されるＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓＰＡＲＰ１  ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を、本明細書において考察されるレンチウイルスベクター系と併せて使用した。
【００９６】
実験用治療用ベクターを、図１Ａ（線形形態）、ならびに図１Ｃおよび１Ｄ（環状形態）に示されるように、設計した。図１Ｃおよび１Ｄに示される環状ベクターマップを参照すると、実験用治療用ベクターは、以下のものを含む：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号２１〜２２）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２３）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号２４）、Ｅｎｖエレメント（配列番号２５）、ｃＰＰＴ（配列番号２６）、Ｈ１プロモーター（配列番号２７）、ＰＡＲＰ１標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＡＲＰ１）（配列番号６〜１０）、ＥＦ１プロモーター（配列番号２８）、ＧＦＰエレメント（配列番号２９）、ウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３０）、および３’ＬＴＲデルタＵ３（配列番号３１）。ＧＦＰの存在は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏのモデル系において、形質導入を示すことにおけるその有用性のため、実験目的のものである。
【００９７】
さらに、図１Ｅおよび１Ｆに示される環状ベクターマップを参照すると、以下のものを含む治療用またはレンチウイルスベクターを、設計した：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号２１〜２２）、ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号２３）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号２４）、Ｅｎｖエレメント（配列番号２５）、ｃＰＰＴ（配列番号２６）、Ｈ１プロモーター（配列番号２７）、ＰＡＲＰ１標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＡＲＰ１）（配列番号６〜１０）、ウッドチャック転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３０）、および３’ＬＴＲデルタＵ３（配列番号３１）。図１Ｅおよび１Ｆに詳細に示される治療用またはレンチウイルスベクターは、ＧＦＰを含有しない。
【００９８】
（実施例３  ＰＡＲＰ１タンパク質発現のｓｈＲＮＡ媒介性減少）
Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＰＡＲＰ１に対して設計されたｓｈＲＮＡを、ＰＡＲＰ１遺伝子の発現を下方制御するそれらの能力に関して試験した。ヒトＰＡＲＰ１  ｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスベクターを、レンチウイルス粒子としてパッケージングした。１〜１０のＭＯＩのレンチウイルス粒子を、ヒトＵ２５１膠芽腫細胞に添加した。４８時間後に、細胞を溶解させ、ＰＡＲＰ１の発現を、ＰＡＲＰ１特異的抗体を用いた免疫ブロット分析によって、測定した。
【００９９】
以下の表５に示されるように、ＰＡＲＰ１に対して設計したｓｈＲＮＡのうちの５つが、ＰＡＲＰ１タンパク質の発現を下方制御する能力を示した。対照ｓｈＲＮＡ配列の１００％と比較すると、配列６（配列番号６）は、５７．１％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列７（配列番号７）は、４５．８％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列８（配列番号８）は、４７．２％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列９（配列番号９）は、４８．８％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列１０（配列番号１０）は、２７．１％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらした。
【表５】
2019520841.tif 000014
【０１００】
Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  ＰＡＲＰ１に対して設計されたｓｈＲＮＡを、ＰＡＲＰ１遺伝子の発現を下方制御するそれらの能力に関して試験した。マウスＰＡＲＰ１  ｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスベクターを、レンチウイルス粒子としてパッケージングした。１〜１０のＭＯＩのレンチウイルス粒子を、マウスＨｅｐａ１−６肝細胞がん細胞に添加した。４８時間後に、細胞を溶解させ、ＰＡＲＰ１の発現を、ＰＡＲＰ１特異的抗体を用いた免疫ブロット分析によって、測定した。以下の表６に示されるように、ＰＡＲＰ１に対して設計したｓｈＲＮＡのうちの５つが、ＰＡＲＰ１タンパク質の発現を下方制御する能力を示した。対照ｓｈＲＮＡ配列の１００％と比較すると、配列１６（配列番号１６）は、２２．８％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列１７（配列番号１７）は、４７．７％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列１８（配列番号１８）は、２％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列１９（配列番号１９）は、０．２％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらし、配列２０（配列番号２０）は、２％のＰＡＲＰ１タンパク質発現をもたらした。
【表６】
2019520841.tif 000015
【０１０１】
ＰＡＲＰ１タンパク質の発現は、ｓｈＲＮＡの投与の後に、ヒトおよびマウス細胞において、低減されることが見出された。まず、図２を参照すると、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターでの処置の後に、Ｕ２５１ヒト膠芽腫細胞株におけるＰＡＲＰ１タンパク質の低減が、示される。細胞株Ｕ２５１は、ｓｈＣｏｎ（すなわち、ＰＡＲＰ１タンパク質の発現に影響を及ぼさない無関係のｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクター）として特定されるレーンに示されるように、細胞溶解物中に、測定可能なＰＡＲＰ１タンパク質を含有している。個々のｓｈＲＮＡ配列６〜１０（本明細書の表２において参照される）を、レンチウイルスベクターにクローニングし、感染性ウイルス粒子として発現させ、これを使用してＵ２５１細胞に形質導入した。形質導入の４８時間後に、細胞を溶解させ、タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離させ、抗ＰＡＲＰ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する免疫ブロットアッセイによって検出した。
【０１０２】
なおも図２を参照すると、配列６は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−１に対応し、配列７は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−２に対応し、配列８は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−３に対応し、配列９は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−４に対応し、配列１０は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−５に対応する。ハウスキーピングタンパク質であるアクチンを、抗アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出し、類似の量のタンパク質が、ゲルのそれぞれのレーンにおいて分析されたことを確認した。配列１０を、ヒトＵ２５１細胞において、ＰＡＲＰ１を低減するのに最も有効であるとして特定した。
【０１０３】
マウス細胞での実験に移り、図３を参照すると、ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターの投与後に、Ｈｅｐａ１−６マウス肝細胞がん細胞におけるＰＡＲＰ１タンパク質レベルの低減が、観察された。細胞株Ｈｅｐａ１−６は、感染なし（レンチウイルスを使用していない）またはｓｈＣｏｎ（ＰＡＲＰ１タンパク質の発現に影響を及ぼさない無関係のｓｈＲＮＡ配列を含有するレンチウイルスベクター）として特定されるレーンに示されるように、細胞溶解物中に、測定可能なＰＡＲＰ１タンパク質を含有している。個々のｓｈＲＮＡ構築物１６〜２０（本明細書の表４において参照される）を、レンチウイルスベクターにクローニングし、感染性ウイルス粒子として発現させ、これを使用してＨｅｐａ１−６細胞に形質導入した。形質導入の４８時間後に、細胞を溶解させ、タンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離させ、抗ＰＡＲＰ１抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用する免疫ブロットアッセイによって検出した。なおも図３を参照すると、配列１６は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−１に対応し、配列１７は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−２に対応し、配列１８は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−３に対応し、配列１９は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−４に対応し、配列２０は、レーンｓｈＰＡＲＰ１−５に対応する。ハウスキーピングタンパク質であるアクチンまたはチューブリンを、ゲルのそれぞれのレーンにロードされたタンパク質の量に関して、対照として、抗体試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。ｓｈＲＮＡ  １６、１７、および１８は、ＰＡＲＰ１タンパク質の発現を阻害することに関して、強力であった。配列１９を、マウスＨｅｐａ１−６において、ＰＡＲＰ１を低減するのに最も有効であるとして特定した。
【０１０４】
（実施例４  マウスニューロンにおけるレンチウイルスベクターの形質導入）
本明細書において概説されるレンチウイルスベクター系は、マウスニューロンにおける形質導入が可能であることが見出されている。図４を参照すると、野生型マウスに、マウスの脳の黒質領域に挿入したスチール製のニードルを介して、顕微鏡写真の左列では模擬（レンチウイルスなし）を注射し、顕微鏡写真の右列では緑色蛍光タンパク質も発現するＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ１を注射した。ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ１−ＧＦＰは、およそ１×１０８形質導入単位を含有する０．１ｍｌで投薬した。１４日後に、マウスを殺処分し、黒質領域を脳から切除し、ホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンに包埋した。薄切片を、スライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡で可視化した。ＴＨ＋ニューロン（高いレベルのチロシンヒドロキシラーゼを発現する）は、概して黒質領域を特定し、図４において赤色（またはグレースケール写真では白色）に見える。中央のパネルは、模擬（左列）またはＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ１−ＧＦＰ（右列における緑色［またはグレースケール写真では白色］の染色を参照されたい）を形質導入した細胞を示す。効率的な形質導入および導入遺伝子の発現を示すＧＦＰによって放出される高い強度の光のため、陽性に形質導入されたニューロンはこの図では黒色に見え、予測した通り、偽対照（左列）には存在していなかった。下のパネルは、レンチウイルス形質導入に由来するＴＨ＋ニューロンの染色およびＧＦＰ＋ニューロンの染色の合体であり、ＴＨ＋ニューロン内を含め、黒質内の形質導入された細胞の存在を示す。
【０１０５】
（実施例５  レンチウイルスベクター系を使用したニューロン死の治療的処置）
化学的な神経毒素１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、マウスにおいて重度かつ不可逆的な運動異常を引き起こし、ヒトＰＤをモデリングするために広く使用されている。例えば、ＫｏｐｉｎおよびＭａｒｋｅｙ、１１巻、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、８１〜９６頁（１９８８年）を参照されたい。ＭＰＴＰでマウスを処置することにより、線条体ドーパミンおよびその代謝産物のレベルが低下するが、これは、薬物の神経毒性により、黒質におけるドーパミン産生細胞の数が低減するためである。このモデルは、ＭＰＴＰ曝露後のニューロン死を予防する、一酸化窒素を含む化合物の保護効果を試験するために使用されている。例えば、Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉら、９３巻、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、４４５６５〜４５７１頁（１９９６年）を参照されたい。このモデルを使用して、ＰＡＲＰのニューロン細胞での発現を低減させるであろうショートヘアピンＲＮＡ配列（ｓｈ）を発現するように設計された、レンチウイルスベクター（ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ）で、マウスを事前処置することによって、ドーパミン作動性ニューロンの死滅を予防する能力を測定することができる。このベクターは、形質導入された細胞を特定する緑色蛍光タンパク質マーカーを発現するように、さらに修飾されてもよく（ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰ）、ｓｈＰＡＲＰを発現しないベクター（ＬＶ−ＧＦＰ）と比較される。
【０１０６】
ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰまたはＬＶ−ＧＦＰの懸濁物を、健常な成体マウスの黒質に注射する。用量は、重度の運動障害またはマウスの死亡をもたらす毒性レベルに到達するまで、漸増させる。最大耐容量を使用して、マウスを、ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰまたは対照ベクターで処置する。２週間後に、それぞれの群から歩哨動物を殺処分して、黒質におけるニューロンの形質導入を確認する。残りの動物（１０匹の群）を、生理食塩水中２０ｍｇ／ｋｇの用量のＭＰＴＰ−ＨＣｌで、２時間間隔で４回、腹腔内注射により、処置した。２〜７日後に、マウスの群を殺処分し、脳を摘出し、固定し、そして切片作製のためにパラフィンに包埋した。黒質領域を、チロシンヒドロキシラーゼを発現するニューロン（ＴＨ＋）の染色によって特定し、形質導入されたニューロンを、ＧＦＰの発現によって特定する。ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰの治療的影響は、ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰまたは対照ベクターで処置したマウスに由来する黒質におけるＴＨ＋またはＧＦＰ＋ニューロンの数を計数することによって、決定する。ＭＰＴＰは、黒質ＴＨ＋細胞の多くを破壊することが予測され、ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰは、これらの細胞を保護し、黒質の正常な外見を保存することが予測される。ＬＶベクターおよびＭＰＴＰの両方で同様に処置したマウスのさらなる群では、脳を、ＭＰＴＰ投薬の７日後に摘出し、黒質領域を、切開によって単離し、組織を、摂氏−８０度で凍結させる。続いて、組織標本を解凍し、ドーパミンを、公開されている方法に従って抽出する（Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉら（上述）を参照されたい）。ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰは、ＭＰＴＰ処置後に、正常なレベルのドーパミン産生を保存すると予測され、ドーパミンレベルは、ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ−ＧＦＰで処置したマウスでは、対照ベクターで処置したマウスよりも有意に高くなる。
【０１０７】
（実施例６  エンベロープ糖タンパク質のバリアントを使用した、レンチウイルスのニューロンへの標的化）
個々のエンベロープ糖タンパク質の特性は、組織の指向性および疾患の部位への治療用遺伝子の送達の効率に影響を及ぼす。ＰＤを処置するために、遺伝子療法の標的は、黒質のＴＨ＋細胞である。ＴＨ＋細胞への標的化を最適化するために、様々なエンベロープ糖タンパク質を、マウス黒質のＴＨ＋細胞への形質導入効率を改善するそれらの役割に関して、比較する。実施例１において上述のように、水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を含有するエンベローププラスミドを設計し、産生させた。このエンベローププラスミドを、ＶＳＶ−Ｇの代わりに、ＦＵＧ−Ｃ（狂犬病ウイルス糖タンパク質のＮ末端領域）、バキュロウイルスに由来するｇｐ６４エンベロープ糖タンパク質、ヒヒ内在性ウイルスに由来するエンベロープ糖タンパク質、またはレンチウイルス粒子をパッケージングするのに好適な他の代替物を含む、設計された他のエンベローププラスミドと比較することができる。それぞれの事例において、エンベローププラスミドのバリアントを使用して、レンチウイルスベクターストックを産生させ、マウスの脳に注射し、マウス黒質のＴＨ＋細胞への形質導入の効率性を、試験する。
【０１０８】
（実施例７  ＰＤの治療効果に関するＰＡＲＰ遺伝子の試験）
本明細書において記載される研究には、ＰＡＲＰ１、およびその調節をどのようにしてＰＤを治療的に処置するために使用することができるかに焦点を当てたものが含まれる。しかしながら、ＰＡＲＰ１は、同様の機能を有するおよそ１６個の緊密に関連するＰＡＲＰ遺伝子のうちの１つに過ぎない。本明細書において記載される、標的の特定、ｓｈＲＮＡの産生およびレンチウイルスにより送達されるｍｉＲＮＡへの変換のための技法を使用して、他のＰＡＲＰ遺伝子を、ＰＤを処置することに有効な治療用ベクターとなり得るそれらの能力に関して、試験することができる。簡単に述べると、他のＰＡＲＰ遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを、マウスに注射して、本明細書において記載される方法、技法、および材料を使用して、ＰＤの補正に関して試験することができる。
【０１０９】
（実施例８  レンチウイルスベクター系への挿入のための合成ｍｉＲＮＡを設計する方法）
１９〜２２ヌクレオチドの長さである、標的ショートヘアピン配列を、ｓｈＲＮＡ設計プログラム、例えば、例として、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢｌｏｃｋ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  ｄｅｓｉｇｎｅｒまたはＢｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＲＮＡｉ設計プログラム（ＭＩＴ）から選択する。数個の配列を、特定の遺伝子、例えば、例として、ＰＡＲＰの効率的なノックダウンに関して試験する。標的遺伝子の発現を少なくとも８０％減少させるｓｈＲＮＡ配列を、次いで、規定のマイクロＲＮＡヘアピン骨格内に挿入する。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ヘアピン構造はｍｉＲＢａｓｅ．ｏｒｇのウェブサイトから入手することができる。
【０１１０】
選択したｓｈＲＮＡ配列を、次いで、ヘアピン構造内に挿入するが、ループ配列は、変更せずに残す。アンチセンスｓｈＲＮＡ配列を、ｍｉＲＮＡヘアピンの５−プライム配列内に挿入して、遺伝子標的化のためのシード配列にする。センスｓｈＲＮＡ配列を、選択された特定のｍｉＲＮＡヘアピン構造に応じて修飾する。例として、センス鎖のヌクレオチド９および１０を、ｍｉＲ３０ヘアピン構造については除去する。標的配列、例えば、ＰＡＲＰを含有するｍｉＲ配列および骨格配列を、ＭＷＧ  ＯｐｅｒｏｎまたはＩＤＴのいずれかによって、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いて合成する。この配列を、ｍｉＲアクセプターレンチウイルスベクターのＢｓｒＧ１およびＮｏｔＩ部位に挿入する。
【０１１１】
（実施例９  ＰＤを有するヒト患者の処置）
ＰＤの初期診断から少なくとも５年後に、年齢が３５〜７５歳の１２人の患者に、用量漸増研究において、本明細書において記載される（ｃＧＭＰグレード）ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ組成物（例えば、図１Ｂに示されるレンチウイルス構築物に基づく）を、両側定位的被殻内（ｉｎｔｒａｐｕｔａｍｉｎａｌ）注射で受容させた。可能性の高い用量範囲は、５ｍｌの滅菌生理食塩水中、１０８形質導入単位のＬＶ−ｓｈＰＡＲＰである［１形質導入単位が、平均で、単一の標的細胞の染色体に１コピーの導入遺伝子が組み込まれるのを達成するのに必要なＬＶ−ｓｈＰＡＲＰの量である］。範囲の上限は、およそ１０１０形質導入単位のＬＶ−ｓｈＰＡＲＰであることが予測される。処置した患者を、少なくとも１年間から最長５年間、自発運動状態の変化に関して追跡する。
【０１１２】
臨床状態の変化は、統一パーキンソン病評定スケールを使用して決定し、ＰＤを有する対応する患者の群について、ＬＶで処置したものを、薬物処置なしの状態と比較して、決定する。患者はまた、困難な運動障害がない時間に関する臨床状態を記録することも求められ、また、手先の器用さに関するパーデューペグボード試験および日常生活の活動スコアでの試験を受ける場合がある。例えば、Ｍａｒｋｓ  Ｊｒ．ら、９巻（１２号）、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．、１１６４〜７２頁（２０１０年）を参照されたい。ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ療法の後の患者の転帰を、これまでのＬ−ＤＯＰＡ産生を増加させるためのグルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子もしくは芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼのアデノ随伴ウイルス送達を試験する遺伝子療法治験、または神経栄養増殖因子ニュールツリンのアデノ随伴ウイルス送達を使用した研究と、比較する。例えば、Ｋａｐｌｉｔｔら、３６９巻（９５７９号）、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２０９７〜１０５頁（２００７年）を参照されたく、またＣｈｒｉｓｔｉｎｅら、７３巻（２０号）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１６６２〜９頁（２００９年）も参照されたい。ＬＶ−ｓｈＰＡＲＰ組成物を受容した被験体は、ＰＤおよびＰＤ関連症状の改善を示すことが、論理的に予測される。
【０１１３】
上述の実施例の実施形態の開示は、以下の特許請求の範囲において記載される本発明の範囲およびそれらの均等物の例証であることが意図されるものであり、制限を意図するものではない。本発明の例示的な実施形態が、理解の明確さの目的でいくらか詳細に記載されているが、ある特定の変更および修正が、以下の特許請求の範囲内で実施され得ることは、明らかであろう。以下の特許請求の範囲、要素、および／またはステップは、特許請求の範囲において明示的に言及されるかまたは本開示によって暗に必要とされない限り、任意の特定の実行順序を暗示するものではない。
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【表７−１５】
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【表７−１６】
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【表７−１７】
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【表７−１８】
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【表７−１９】
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【表７−２０】
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【表７−２１】
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【表７−２２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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