【手続補正書】
【提出日】令和3年12月6日(2021.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８  ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含むＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）を含む、組成物。
【請求項２】
血清を実質的に含まない凍結保存培地、５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び／またはデキストラン−４０をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記遺伝子改変が、ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の前記＋５８  ＤＨＳを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを送達することによって生成される、請求項１または２に記載の組成物であって、
任意選択で前記ｇＲＮＡが、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、および／または前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントであり、
さらに任意選択で前記ｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む、組成物。
。
【請求項４】
（ｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、０．１〜０．５のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す、及び／または前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す；および／または
（ｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、１５％〜５０％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す；および／または
（ｉｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す；および／または
（ｉｖ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの少なくとも７５％が、対象への前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する；および／または
（ｖ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、少なくとも４０％のオンターゲットインデル率を示す；および／または
（ｖｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す；および／または
（ｖｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、５％未満のオフターゲットインデル率を示す；および／または
（ｖｉｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、１％未満のオフターゲットインデル率を示す、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの単回用量を含み、
任意選択で前記単回用量が、少なくとも２×１０６改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣ／ｋｇを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣに、Ｎ末端ＳＶ４０核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントを送達することによって生成され、
任意選択で前記Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントが、Ｃ末端ＮＬＳ、任意選択でＣ末端ＳＶ４０  ＮＬＳをさらに含み、
さらに任意選択で配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含むｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、
さらに任意選択で前記ｇＲＮＡ：前記エンドヌクレアーゼの重量比が１：１である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ヘモグロビン異常症を有する対象を治療するための組成物であって、前記組成物が、ヒトＢ細胞リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８  ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含むＣＤ３４＋ヒト造血幹・前駆細胞（ｈＨＳＰＣ）を含み、前記ｈＨＳＰＣが、ベースラインとの対比で、前記対象に投与される輸血回数を低減するのに、及び／または前記対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルを少なくとも２０％まで増加させるのに有効な量で投与される、組成物。
【請求項８】
ヘモグロビン異常症を有する対象を治療するための改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの製造方法であって、
（ａ）ヘモグロビン異常症を有する対象から収集されたＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣを提供することであって、ここで前記対象は幹細胞が動員された対象であり；  
（ｂ）前記ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣから、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の赤血球系統特異的エンハンサー内の＋５８  ＤＮアーゼＩ高感受性部位（ＤＨＳ）内に遺伝子改変を含む改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣを生成することと、
を含み、
前記対象は、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの用量を、ベースラインとの対比で、前記対象に投与される輸血回数を低減するのに、及び／または前記対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）レベルを少なくとも２０％まで増加させるのに有効な量で投与される、方法。
【請求項９】
（ｉ）ステップ（ａ）の前記対象は、ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤が投与された対象であり、任意選択で、前記ＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の阻害剤がプレリキサホルであり、さらに任意選択でステップ（ａ）の前記対象は、顆粒球コロニー刺激因子が投与された対象であり、および／または
（ｉｉ）赤血球がさらに前記対象に投与されるものであり、任意選択で前記赤血球が、ステップ（ａ）の前及び／または後に投与されるものであり、および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１５×１０６  ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣ／ｋｇがステップ（ａ）で提供され、
（ｉｖ）ブスルファンがさらに前記対象に投与されるものであり、任意選択で前記ブスルファンが、ステップ（ｂ）の後に投与されるものであり、さらに任意選択でブスルファンの静脈内用量４ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇが１日１回４日間投与される、または静脈内用量０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇが６時間ごとに４日間投与される、あるいは、前記用量が、薬物動態レベルに基づき、曲線下面積（ＡＵＣ）４５００〜５５００μＭ／分、好ましくは５０００μＭ／分を達成するように調整される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子改変が、前記ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣに、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の前記＋５８  ＤＨＳを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを送達することによって生成され、任意選択で前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、任意選択で前記ｇＲＮＡが、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列を含み、および／または前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのバリアントであり、さらに任意選択で前記ｇＲＮＡが、３つの２’−Ｏ−メチル−ホスホロチオアート残基を、それぞれの５’及び３’末端に、またはその付近に含む、
請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
好中球の生着が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与後３５〜４５日以内に前記対象内で発生し、任意選択で好中球の生着が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与後４２日以内に前記対象内で発生する
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘモグロビン異常症がβ−サラセミアであり、かつ、
（ｉ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の２年の期間内、または前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の後の２年の期間内に、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の前の２年の期間との対比で、より少ない輸血回数を必要とする；および／または
（ｉｉ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する；および／または
（ｉｉｉ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも６ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する；および／または
（ｉｖ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも１２ヵ月間の輸血低減または輸血非依存を達成する；および／または
（ｖ）前記対象において、以下から選択されるアッセイ：疼痛スケール（１１点の数値評価スケール［ＮＲＳ］）、ＥｕｒｏＱｏｌクオリティーオブライフスケール（ＥＱ  ５Ｄ  ５Ｌ）、がん治療−骨髄移植の機能評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）、患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）−疲労、ＰＲＯＭＩＳ−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム（ＡＳＣＱ−Ｍｅ）のうちの少なくとも１つを用いて、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時的な変化が認められる；および／または
（ｖｉ）前記対象において、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または血清フェリチンレベルの変化による評価において、ベースラインとの対比で鉄過剰のパラメーターの減少が認められ、任意選択で前記鉄過剰のパラメーターの減少が、肝臓鉄濃度（ＬＩＣ）及び／または心臓鉄量（ＣＩＣ）の減少を含む；および／または
（ｖｉｉ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の２〜５年の期間内、または前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の後の２〜５年の期間内に、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の前の２〜５年の期間との対比で鉄キレート療法を必要としない、
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘモグロビン異常症が鎌状赤血球症であり、かつ、
（ｉ）前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の任意の時点または投与時期の後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である；および／または
（ｉｉ）前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与時期の任意の時点を起点に少なくとも６ヵ月間、少なくとも２０％である；および／または
（ｉｉｉ）前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の３ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である；および／または
（ｉｖ）前記対象の前記ＨｂＦレベルが、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも３ヵ月間、少なくとも２０％である；および／または
（ｖ）前記対象の前記ＨｂＦレベルが、二次薬物を用いた処置の不在下で少なくとも２０％であり、任意選択で前記二次薬物がヒドロキシウレア（ＨＵ）である；および／または
（ｖｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に、重症血管閉塞発作（ＶＯＣ）の年率におけるベースラインからの相対的変化が認められる；および／または
（ｖｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に、ＶＯＣの年率におけるベースラインからの少なくとも５０％の低減が認められる；および／または
（ｖｉｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも１２ヵ月間のＶＯＣの不在が認められる；および／または
（ｉｘ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与の６ヵ月後を起点に少なくとも２４ヵ月間のＶＯＣの不在が認められる；および／または
（ｘ）前記対象において、以下から選択されるアッセイ：疼痛スケール（１１点の数値評価スケール［ＮＲＳ］）、ＥｕｒｏＱｏｌクオリティーオブライフスケール（ＥＱ  ５Ｄ  ５Ｌ）、がん治療−骨髄移植の機能評価（ＦＡＣＴ−ＢＭＴ）、患者報告アウトカム測定情報システム（ＰＲＯＭＩＳ）−疲労、ＰＲＯＭＩＳ−認知機能、及び成人鎌状赤血球クオリティーオブライフ測定システム（ＡＳＣＱ−Ｍｅ）のうちの少なくとも１つを用いて、患者報告アウトカム（ＰＲＯ）の経時的な変化が認められる；および／または
（ｘｉ）前記対象において、以下の４つの溶血マーカー：網状赤血球数、アスパラギン酸トランスアミナーゼの血清中濃度、乳酸デヒドロゲナーゼ［ＬＤＨ］、及び総ビリルビンの主成分分析による測定において、溶血指数の経時的な変化が認められる；および／または
（ｘｉｉ）前記対象において、三尖弁逆流ジェット速度（ＴＲＶ）の経時的な変化が認められる、
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象に赤血球がさらに投与されるものであり、前記赤血球が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが投与される前に投与される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣを投与する前記ステップの前に赤血球（ＲＢＣ）輸血を受けている；および／または、
（ｉｉ）前記対象が、総Ｈｂの３０％未満のヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）レベルを有する；および／または
（ｉｉｉ）前記対象が、１１ｇ／ｄＬ以下の総Ｈｂ濃度を有する；および／または
（ｉｖ）前記対象において、ある期間にわたり、胎児ヘモグロビンを発現する循環赤血球（Ｆ細胞）の割合の増加が認められ、任意選択で少なくとも１０％の増加が認められ、任意選択で前記期間が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月又は少なくとも６か月である；および／または
（ｖ）前記対象において、ある期間にわたり、炎症及び内皮活性化マーカーの変化が認められ、任意選択で前記期間が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月又は少なくとも６か月である；および／または
（ｖｉ）前記対象において、ある期間にわたり、末梢血白血球中に存在する前記遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化が認められ、任意選択で前記期間が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月又は少なくとも６か月である；および／または
（ｖｉｉ）前記対象において、ある期間にわたり、骨髄細胞中に存在する前記遺伝子改変を伴うアレルの割合の変化が認められ、任意選択で前記期間が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から少なくとも３ヵ月又は少なくとも６か月である
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、０．１〜０．５のγ／（γ＋α）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す、及び／または前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、０．２〜０．６のγ／（γ＋β）−グロビンｍＲＮＡ比の増加を示す；および／または
（ｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、１５％〜５０％のＨｂＦ／（ＨｂＦ＋ＨｂＡ）タンパク質レベルのＨｂＦ平均パーセンテージを示す；および／または
（ｉｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、０．４以上の（γ＋β）／α−グロビンｍＲＮＡ比を示す；および／または
（ｉｖ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、７０％〜９０％の平均アレル編集頻度を示す；および／または
（ｖ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの少なくとも５０％が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与後少なくとも１６週間、多系統分化能を維持する；および／または
（ｖｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、少なくとも４０％のオンターゲットインデル率を示す；および／または
（ｖｉｉ）前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが、少なくとも８０％のオンターゲットインデル率を示す；および／または
（ｖｉｉｉ）前記対象が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣの投与から生じる新生物性及び／または骨髄増殖性病変を示さない、
請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記用量が、少なくとも２×１０６改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣ／ｋｇであり、任意選択で前記用量が、少なくとも３×１０６改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣ／ｋｇである、請求項８〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）の前記対象は、プレリキサホルがさらに投与された対象であり、赤血球が、前記改変ＣＤ３４＋  ｈＨＳＰＣが投与される前に投与されるものであり、任意選択でステップ（ａ）の前記対象は、顆粒球コロニー刺激因子がさらに投与された対象である、
請求項８〜１７のいずれか１項に記載の方法。