【手続補正書】
【提出日】令和3年12月6日(2021.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡは、
ａ）配列番号６７、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３又はその断片のいずれか１つ；
ｂ）配列番号６７、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４８、配列番号５１若しくはその断片のいずれか１つ；
ｃ）配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５４若しくはその断片のいずれか１つ
ｄ）配列番号６７；又は
ｅ）配列番号１〜配列番号７２若しくはその断片のいずれか１つ
を含む標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号１９５；
（ｂ）配列番号２３１；又は
（ｃ）１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）又は（ｂ）のいずれか
を含み、（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列は、前記標的化ドメインの３’側、任意選択で前記標的化ドメインの直ちに３’側に配置される、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
（ａ）配列番号１７４；
（ｂ）配列番号１７５；又は
（ｃ）配列番号１７６
の配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
（ａ）配列番号１７７を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含むｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７７を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含むｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７８を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含むｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７８を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含むｔｒａｃｒ
を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞に導入されると、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成され；かつ／又は
ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞に導入されると、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的な配列との間に形成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記インデルは、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まず、任意選択で、前記インデルは、非欠失ＨＰＦＨ又は転写因子結合部位のヌクレオチドを含まない、請求項５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の前記細胞の少なくとも約１５％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞に導入されると、
（ａ）胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞又はその子孫において増加し、任意選択で、胎児ヘモグロビンの前記発現は、前記ｇＲＮＡ分子が導入されていない細胞の集団又はその子孫の集団における胎児ヘモグロビンの発現のレベルと比較して、少なくとも約１５％増加し；
（ｂ）前記細胞又はその子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｃ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず；かつ／又は
（ｄ）オフターゲットインデルは、前記細胞の集団の細胞の約５％超において検出されない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症に罹患している患者から得られる、請求項５〜８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記細胞は、
ａ）ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであるか、又は
ｂ）前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、
請求項９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
ｂ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
ｃ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
ｄ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；又は
ｅ）上記ａ）〜ｄ）のいずれかのもの及び鋳型核酸；又は
ｆ）上記ａ）〜ｄ）のいずれかのもの及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物であって、前記Ｃａｓ９分子は、活性又は不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であり、任意選択で、前記Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５又はそれと少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含む、組成物。
【請求項１３】
前記Ｃａｓ９分子は、
（ａ）配列番号２３３；
（ｂ）配列番号２３４；
（ｃ）配列番号２３５；
（ｄ）配列番号２３６；
（ｅ）配列番号２３７；
（ｆ）配列番号２３８；
（ｇ）配列番号２３９；
（ｈ）配列番号２４０；
（ｉ）配列番号２４１；
（ｊ）配列番号２４２；
（ｋ）配列番号２４３；又は
（ｌ）配列番号２４４
を含む、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在し、かつ／または
ｂ）前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、例えば約１μＭ未満、例えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．１μＭ未満の濃度であり、任意選択で、前記ＲＮＰの前記濃度は、約２μＭであるか又は約１μＭであり、任意選択で、前記組成物は、細胞、例えばＨＳＰＣの集団をさらに含む、
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列を含むベクターであって、任意選択で、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド及びＲＮＡベクターからなる群から選択されるベクター。
【請求項１７】
細胞を前記細胞内の標的配列で又はその近傍で改変する方法であって、前記細胞を、
ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
ｂ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
ｃ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
ｄ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
ｅ）上記ａ）〜ｄ）のいずれか及び鋳型核酸；
ｆ）上記ａ）〜ｄ）のいずれか、及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
ｇ）請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物；又は
ｈ）請求項１６に記載のベクター
と接触させるステップを含む方法。
【請求項１８】
ａ）前記細胞は、動物細胞であり、任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症に罹患している患者から得られるものであり；
ｂ）前記細胞は、ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであり；
ｃ）前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置されるものであり；
ｄ）前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されるものであり、かつ／又は
ｅ）前記細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）細胞の集団の少なくとも約１５％が改変されている細胞の集団をもたらし；
（ｂ）前記改変は、赤血球系統の分化細胞への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンのレベルの増加を呈し；
（ｃ）前記改変は、分化細胞の集団への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、非改変細胞の集団と比較してＦ細胞の割合が増加しており；かつ／又は
（ｄ）前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞又は請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
【請求項２１】
表７−２に記載されるインデルを含む細胞であって、任意選択で、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子を含む細胞。
【請求項２３】
Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
幹細胞増殖剤と接触している、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール）との組み合わせ）
である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
ａ）動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる細胞であり；
ｂ）ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであり；
ｃ）骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離された細胞（例えば、細胞の集団）であり、かつ／または
ｄ）細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である細胞である、
請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞の集団であって、前記集団の前記細胞の少なくとも約５０％は、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の細胞である、細胞の集団。
【請求項２８】
分化細胞の集団への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、同じタイプの修飾されていない細胞の集団と比較してＦ細胞の割合が増加している、請求項２７に記載の細胞の集団。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団及び薬学的に許容可能な媒体を含む組成物。
【請求項３０】
細胞を調製する方法であって、
（ａ）細胞を提供するステップ；
（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中において前記細胞をエキソビボで培養するステップ；及び
（ｃ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１５に記載の核酸配列又は請求項１６に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
を含む方法。
【請求項３１】
ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞は、分化細胞への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、ステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞と比較して増加した胎児ヘモグロビンを産生する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）
である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含み、任意選択で、前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含み；任意選択で、前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）及び存在する場合にはヒトＩＬ−６をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、任意選択でそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度、任意選択で約１μＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭの濃度、例えば５００ｎＭの濃度又は約７５０ｎＭの濃度、例えば７５０ｎＭの濃度で含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ａ）で提供される前記細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化される、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
【請求項３７】
請求項３６に記載の細胞であって、
（ａ）前記細胞の集団の細胞の少なくとも約４０％は、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み；
（ｂ）前記細胞は、赤血球系統の分化細胞への分化能を有し、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンのレベルの増加を呈し；
（ｃ）前記細胞の集団は、分化細胞の集団への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、非改変細胞の集団と比較してＦ細胞の割合が増加しており；
（ｄ）前記細胞は、分化細胞への分化能を有し、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｅ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず；
（ｆ）オフターゲットインデルは、前記細胞の集団の細胞の約５％超において検出されず；かつ／又は
（ｇ）前記細胞又はその子孫は、移植後の１６週間超において、それを移植される患者で検出可能である、
細胞。
【請求項３８】
ａ）異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる細胞であり；
ｂ）ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであり；
ｃ）骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離された細胞（例えば、細胞の集団）であり；かつ／又は
ｄ）細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である細胞である、
請求項３６又は３７に記載の細胞。
【請求項３９】
医薬として使用するための、請求項２０〜２６もしくは３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７もしくは２８に記載の細胞の集団、又は請求項１１〜１４もしくは２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
患者における異常ヘモグロビン症、例えばβ−サラセミア又は鎌状赤血球病を治療するための医薬組成物であって、請求項２０〜２６もしくは３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７もしくは２８に記載の細胞の集団、又は請求項１１〜１４もしくは２９のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させるための医薬組成物であって、請求項２０〜２６もしくは３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞、請求項２７もしくは２８に記載の細胞の集団、又は請求項１１〜１４もしくは２９のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項４２】
ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、請求項２０〜２８又は３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、請求項２０〜２８又は３６〜３８のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞を含む、請求項４０又は４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記細胞若しくは細胞の集団又はその子孫は、任意選択で、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、前記患者、例えばヒト患者で検出可能であり、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択され；任意選択で、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超における参照細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）での前記インデルの検出のレベルは、投与の直前の前記細胞の集団における前記インデルの検出のレベルと比較して５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下で低下する、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。