(57)【要約】  本発明は、β−グルカナーゼ変異体に関する。本発明はまた、変異体をコードするポリヌクレオチド；核酸構築物、ベクター、およびポリヌクレオチドを含む宿主細胞；および変異体を使用する方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親β−グルカナーゼの変異体であって、前記変異体が、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含み、ここで、前記変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、前記変異体が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの前記成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する変異体。
【請求項２】
前記親β−グルカナーゼが、以下：
ｉ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択される成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するポリペプチド、ならびに
ｉｉ）配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択される前記ポリペプチドの断片であって、β−グルカナーゼ活性を有する断片
からなる群から選択される、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記親β−グルカナーゼが、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択される前記ポリペプチドを含むか、またはそれから構成される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項４】
３３位に対応する位置に置換を含み、前記置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌのいずれかであり、好ましくは、前記置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌからなる群から選択され、さらに好ましくは、前記置換基アミノ酸が、以下：Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＣｙｓからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
１８８位に対応する位置に置換を含み、前記置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌのいずれかであり、好ましくは、前記置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒからなる群から選択され、さらに好ましくは、前記置換基アミノ酸が、以下：Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
以下：Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ａ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｆ３３Ｙ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ｎ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｅ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｗ＋Ｍ１８８Ｓ；Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ａ；Ｆ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｆ３３Ｑ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｃ；Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｑ；Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ａからなる群から選択される置換を含むか、またはそれから構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項７】
前記親に対して向上した特性を有し、前記向上した特性が、向上した酸化安定性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項８】
前記β−グルカナーゼ活性が、リケニナーゼＥＣ３．２．１．７３活性を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体を含む組成物。
【請求項１０】
ｉ）１または複数種の洗剤成分；および／またはｉｉ）１または複数種の別の酵素をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、クリーニングまたは洗剤組成物である、請求項９〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
１または複数種のアミラーゼをさらに含み、好ましくは、前記１または複数種のアミラーゼが、１または複数種のα−アミラーゼである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、液体組成物、固体組成物、例えば、粉末組成物、または液体、固体もしくはゲル形態であってよい単一用量組成物である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号２６の番号付けを用いて、親β−グルカナーゼ中に、配列番号２６の前記成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップであって、前記変異体が、β−グルカナーゼ活性を有するステップと；前記変異体を回収するステップを含む、β−グルカナーゼ変異体を取得する方法。
【請求項１５】
前記変異体が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの前記成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
洗濯、または食器洗浄を含む硬質表面クリーニングなどのクリーニング工程における、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体または請求項９〜１３のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは、本明細書おいて参照により援用される。
【０００２】
本発明は、β−グルカナーゼ変異体、変異体をコードするポリヌクレオチド、変異体を生成する方法、および変異体を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
β−グルカンは、β−グリコシド結合により連結されるグルコース単位から構成される多糖である。セルロースは、β−グルカンの１種であり、グルコース単位の全てが、β−１，４−グルコシド結合により連結される。この特徴によって、不溶性セルロースミクロフィブリルの形成が起こる。セルロースからグルコースへの酵素的加水分解には、エンドβ−グルカナーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．９１）およびβ−グルコシダーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．２１）の使用が必要である。
【０００４】
β−グルカンはまた、β−１，３−グルコシド結合（例えば、パン用イースト、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の細胞壁に見出されるものなど）、β−１，６−グルコシド結合ならびにβ−１，３−、β−１，４−、およびβ−１，６−グルコシド結合の組み合わせによっても連結することができる。β−１，３−およびβ−１，４−グルコシド結合の組み合わせは、例えば、オートムギおよびオオムギなどの穀物からの可溶性繊維に見出すことができる。リケニナーゼ（またはリケナーゼ）（ＥＣ３．２．１．７３）としても知られるβ−グルカナーゼの亜群を用いて、β−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒することにより、β−グルカンをもたらすことができる。リケニナーゼ（またはリケナーゼ）（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）は、（１，３）−および（１，４）−結合を含有するβ−Ｄ−グルカン中の（１，４）−β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解するため、リケニンおよび穀物β−Ｄ−グルカンには作用することができるが、１，３−または１，４−結合のみを含むβ−Ｄ−グルカンには作用しない。他のβ−グルカナーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．４）は、例えば、セルロース、リケニン、および穀物β−Ｄ−グルカン中の（１，４）−β−Ｄ−グルコシド結合の内部加水分解を実施し、さらに、１，３−結合を含むβ−Ｄ−グルカン中の１，４−結合も加水分解し得る。食器洗浄および洗濯においてオートムギおよびオオムギ含有汚れなどの穀物汚れの除去は、認識されている問題であり、そこに存在するβ−グルカンを分解することができる酵素を見出すことには相当の利点がある。例えば、Ｂ．アミロリケニファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などの様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、β−グルカナーゼを発現するが、これらの酵素は、一般に、アルカリ性用途（例えば、ｐＨ７．５以上）にはあまり好適ではなく、および／または粉末およびＡＤＷ洗剤中に存在する漂白剤に対して感受性である。
【０００５】
本発明は、β−グルカナーゼ活性（例えば、リケニナーゼ（ＥＣ３．２．１．７３）活性を含むか、もしくはそれから構成される）を有するグリコシドヒドロリアーゼファミリー１６（ＧＨ１６）のポリペプチドならびに前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、これらは、例えば、アルカリ性条件下（例えば、ｐＨ７．５以上）および／または漂白剤の存在下で、異なる種類のβ−グルカン（例えば、β−Ｄ−グルカン、β−１，３−１，４グルカン、混合結合β−グルカン、オオムギβ−グルカンおよびオートミールβ−グルカン）を分解する上で非常に活性であり、従って、前述の用途、例えば、硬質表面のクリーニング、食器洗浄および洗濯といったクリーニングもしくは洗剤用途および工程に使用することができる。β−グルカナーゼを含む既存の製品は、粉末およびＡＤＷ洗剤中に存在する漂白剤に対して感受性であり、ならびに／またはその主要な酵素基質がセルロースであるため、この種のβ−グルカンに対する作用は非常に低い。
【０００６】
本発明は、親と比較して向上した特性（例えば、漂白剤の存在下および／またはアルカリ性条件下で向上した安定性）を有するβ−グルカナーゼの変異体ならびにセルラーゼ活性のない（例えば、Ｄ−グルコース単位同士のβ−１，４結合に対するエンド−セルロース活性がない）β−グルカナーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）の変異体に関する。ランドリーの生地に対するセルラーゼおよびリケナーゼの使用で違うところは、リケナーゼが、生地の繊維を分解しない点である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、親β−グルカナーゼの変異体に関し、変異体は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位（例えば、Ｆ３３）および１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する１つまたは複数の位置に置換を含み、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、洗濯または食器洗浄をはじめとする硬質表面クリーニングなどのクリーニング工程における本発明のβ−グルカナーゼ変異体または本発明のβ−グルカナーゼ変異体を含む組成物の使用に関し；任意選択で、前記使用は、ｐＨ７．５（もしくはそれ以上）のアルカリ性条件下および／または漂白剤の存在下で実施される。また別の態様では、本発明は、さらに、本発明の変異体を含む組成物、ならびにβ−グルカン（例えば、β−Ｄ−グルカン、β−１，３−１，４グルカン、混合結合β−グルカン、オオムギβ−グルカン、オートミールβ−グルカン）の分解、流体（例えば、掘削流体）の粘性の制御、生地および／もしくは硬質表面の洗浄またはクリーニングのための／における本発明の変異体の使用；本発明の変異体を含む組成物をβ−グルカンに適用するステップを含む、β−グルカンの分解方法にも関する。別の態様では、本発明のβ−グルカナーゼ変異体は、リケナーゼ変異体である。また別の態様では、洗濯物の生地に対する、既知セルラーゼと本発明のリケナーゼ変異体の使用の違いは、リケナーゼ変異体が、生地の繊維を分解しない点である。本発明はまた、本発明の変異体または組成物（例えば、洗浄もしくは洗剤組成物）を用いた、布地もしくは生地の洗濯方法または自動食器洗浄（ＡＤＷ）および手洗い洗浄（ＨＤＷ）などの硬質表面のクリーニング法にも関する。本発明は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド；核酸構築物；組換え発現ベクター；前記ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞；ならびに本発明の変異体を生成する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】下記配列：配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８を有するβ−グルカンナーゼの複数のアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列表の概説
配列番号１は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ−６２４９９の株から単離されるβ−グルカナーゼのＤＮＡ配列である。
【００１１】
配列番号２は、配列番号１から自動的に推定されるβ−グルカナーゼのアミノ酸配列である。
【００１２】
配列番号３は、配列番号２に示され、且つ配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの最初のアミノ酸（２８位）が、Ｖａｌではなく、Ｍｅｔであるはずであることを考慮に入れて、配列番号１から推定されるβ−グルカナーゼのアミノ酸配列である。最初のコドンがｇｔｇであるとき、ｇｔｇは通常、Ｖをコードするが、Ｍｅｔが挿入される。
【００１３】
配列番号４は、バチルス・アキバイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｋｉｂａｉ）の株から単離されるβ−グルカナーゼのＤＮＡ配列である。
【００１４】
配列番号５は、配列番号４から推定されるβ−グルカナーゼのアミノ酸配列である。
【００１５】
配列番号６は、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）の株から単離されるβ−グルカナーゼのＤＮＡ配列である。
【００１６】
配列番号７は、配列番号６から推定されるβ−グルカナーゼのアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号８は、バチルス・モジャベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）の株から単離されるβ−グルカナーゼのＤＮＡ配列である。
【００１８】
配列番号９は、配列番号８から推定されるβ−グルカナーゼのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号１０は、ポリペプチド分泌シグナルバチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）である。
【００２０】
配列番号１１は、人工Ｎ末端ポリヒスチジンアフィニティ精製タグ配列である。
【００２１】
配列番号１２は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来のα−アミラーゼタンパク質配列（Ｓｔａｉｎｚｙｍｅの商品名でＮｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから市販されている）である。
【００２２】
配列番号１３は、国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応するポリペプチドである。
【００２３】
配列番号１４は、国際公開第０２／０１０３５５号パンフレットの配列番号６に対応するポリペプチドである。
【００２４】
配列番号１５は、国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６の残基１〜３３と国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４の残基３６〜４８３を含むハイブリッドポリペプチドに対応するポリペプチドである。
【００２５】
配列番号１６は、国際公開第０２／０１９４６７号パンフレットの配列番号６に対応するポリペプチドである。
【００２６】
配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９は、それぞれ、国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号２または配列番号７に対応するポリペプチドである。
【００２７】
配列番号２０は、国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２に対応するポリペプチドである。
【００２８】
配列番号２１は、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０に対応するポリペプチドである。
【００２９】
配列番号２２は、国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２に対応するポリペプチドである。
【００３０】
配列番号２３は、国際公開第２０１５／１４４８２４号パンフレットの配列番号３に対応するバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の株に由来するβ−グルカナーゼの成熟ポリペプチドである。
【００３１】
配列番号２４は、国際公開第２０１５／１４４８２４号パンフレットの配列番号４に対応する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株に由来するβ−グルカナーゼの成熟ポリペプチドである。
【００３２】
配列番号２５は、配列番号５の成熟ポリペプチドである（すなわち、配列番号５のアミノ酸１〜２４５に対応する）。
【００３３】
配列番号２６は、配列番号７の成熟ポリペプチドである（すなわち、配列番号７のアミノ酸１〜２２２に対応する）。
【００３４】
配列番号２７は、配列番号３および配列番号２の成熟ポリペプチドである（すなわち、配列番号３のアミノ酸１〜３５１、配列番号２のアミノ酸１〜３５１に対応する）。
【００３５】
配列番号２８は、配列番号９の成熟ポリペプチドである（すなわち、配列番号９のアミノ酸１〜２１４に対応する）。
【００３６】
配列番号２９は、成熟サイトファーガ（ｃｙｔｏｐｈａｇａ）α−アミラーゼのアミノ酸配列である。
【００３７】
定義
相乗効果：「相乗効果」という用語は、前記ポリペプチドを組み合わせた効果全体が、前記ポリペプチドの個別の酵素効果の和よりも大きくなるようなポリペプチドの協同作用を意味する。相乗効果の非限定的例としては、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチドと１種または複数種のα−アミラーゼのＲＥＭ相乗効果が挙げられる。
【００３８】
ＲＥＭ相乗効果：本明細書に記載のポリペプチドのＲＥＭ相乗効果は、任意の好適な洗浄性能方法（例えば、Ｗａｓｃａｔｏｒボトル洗浄法）を用いることにより実施される汚れ除去の分析に基づいて測定することができる。ＲＥＭ相乗効果を決定するために好ましい方法を実施例７に開示する。
【００３９】
β−グルカナーゼ：「β−グルカナーゼ」という用語は、本明細書で使用されるとき、β−グルカン中で２つのグルコシル残基をつなぐβ−１，４−結合の加水分解を触媒するエンドβ−１，４−グルカナーゼ活性（例えば、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ）を意味する。本明細書で定義されるβ−グルカナーゼの非限定的例としては、例えば、Ｄ−グルコース単位同士のβ−１，４結合に対してエンド−セルラーゼ活性を有するセルラーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．４、ならびに（１，３）−および（１，４）−結合を含むβ−Ｄ−グルカン中の（１，４）−β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解するリケニナーゼ（もしくはリケナーゼ）（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）を含む。β−グルカナーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．４）は、例えば、セルロース、リケニンおよび穀物β−Ｄ−グルカン中の（１，４）−β−Ｄ−グルコシド結合の内部加水分解を実施することができ、また、１，３−結合を含むβ−Ｄ−グルカン中の１，４−結合も加水分解し得る。本発明の目的のために、実施例に記載する手順に従って、β−グルカナーゼ活性を決定する。本発明の一態様では、本発明のポリペプチド（例えば、β−グルカナーゼ変異体）は、以下：配列番号７、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択される配列を有するポリペプチドのβ−グルカナーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。β−グルカナーゼ活性は、基質としてオオムギβ−グルカンを用いて、好適に測定することができる。β−グルカナーゼ活性を決定する上で好ましいアッセイを実施例１に開示する（ＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカンアッセイ）。本明細書で定義するβ−グルカナーゼのさらなる亜群（リケニナーゼ（もしくはリケナーゼ）としても知られる）（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）を用いて、β−１，４−グルコシド結合の加水分解を触媒して、β−グルカンを得ることもできる。リケニナーゼ（もしくはリケナーゼ）（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）は、（１，３）−および（１，４）−結合を含むβ−Ｄ−グルカン中の（１，４）−β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解するため、リケニンおよび穀物β−Ｄ−グルカンには作用することができるが、１，３−または１，４−結合のみを含むβ−Ｄ−グルカンには作用しない。本明細書で使用されるとき、「β−グルカナーゼ活性」という用語は、リケニナーゼ（もしくはリケナーゼ）（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）活性を含む。
【００４０】
β−グルカン：「β−グルカン」という用語は、構造成分としてグルコースのみを含む多糖を意味し、ここで、グルコース単位は、β−グルコシド結合によって連結されている。β−グルカンの非限定的例としては、β−Ｄ−グルカン、β−１，３−１，４グルカン、混合結合β−グルカン、オオムギβ−グルカン、オートミールβ−グルカンが挙げられる。
【００４１】
突然変異体：「突然変異体」という用語は、同一の染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを意味する。突然変異体は突然変異を介して自然に生じ、個体群において多型性をもたらし得る。遺伝子突然変異は、非表現性（コードされるポリペプチドに変化無し）であることが可能であり、または、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得る。ポリペプチドの突然変異体は、遺伝子の突然変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００４２】
バイオフィルム：「バイオフィルム」という用語は、細胞が、生地、食器類または硬質表面などの表面上に互いに付着している、いずれかの微生物群を意味する。こうした付着細胞は、多くの場合、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）の自己生成マトリックス内に包埋されている。バイオフィルムＥＰＳは、一般に、細胞外ＤＮＡ、タンパク質、および多糖から構成された高分子凝集塊である。バイオフィルムは、生存または非生存表面上に形成し得る。バイオフィルム内で増殖する微生物細胞は、同じ生物の浮遊細胞とは生理学的に異なり、浮遊細胞は、対照的に、液体媒体中に浮遊または泳動し得る単細胞である。
【００４３】
バイオフィルム内に生存する細菌は、フィルムの高密且つ保護された環境によって、これらの細菌が多様な方法で協同および相互作用することが可能になるため、同じ種の浮遊細菌とは極めて異なる特性を有する。このような環境の１つの効果は、高密度の細胞外マトリックスおよび細胞の外層が集団の内部を保護するために、洗剤および抗生物質に対する耐性が増大することである。
【００４４】
洗濯の際、細菌を産生するバイオフィルムは、以下の種から見出すことができる：アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、アエロミクロビウム属（Ａｅｒｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレバンジモナス属（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌｕｔｅｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、およびステノトロホモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）。
【００４５】
糖質結合モジュール：「糖質結合モジュール」という用語は、糖質結合活性をもたらす糖質活性酵素内の領域を意味する（Ｂｏｒａｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８３：７６９−７８１）。公知の糖質結合モジュール（ＣＢＭ）の大部分は、個別のフォールドを有する連続的アミノ酸配列である。糖質結合モジュール（ＣＢＭ）は、典型的に、酵素のＮ末端またはＣ末端のいずれかで見出される。一部のＣＢＭは、セルロースに対して特異性を有することが知られる。
【００４６】
触媒ドメイン：「触媒ドメイン」という用語は、酵素の触媒機構を含む酵素の領域を意味する。
【００４７】
ｃＤＮＡ：「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞または原核細胞から得られたスプライスされた成熟ｍＲＮＡ分子から逆転写によって調製可能であるＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。元の一次ＲＮＡ転写物は、スプライスされた成熟ｍＲＮＡとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるｍＲＮＡに対する前駆体である。
【００４８】
セルロース分解酵素またはセルラーゼ：「セルロース分解酵素」または「セルラーゼ」という用語は、セルロース系材料を加水分解する１種または複数種（例えば、数種）の酵素である。こうした酵素として、エンドグルカナーゼ（例えば、ＥＣ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。セルロース分解酵素活性を測定する２つの基本的なアプローチとして、以下：（１）総セルロース分解酵素活性を測定するもの、ならびに（２）Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２４：４５２−４８１に論評されているように、個別のセルロース分解酵素活性（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼ）を測定するものがある。総セルロース分解酵素活性は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙、微小結晶性セルロース、細菌セルロース、藻類セルロース、綿、前処理リグノセルロースなどをはじめとする、不溶性基質を用いて、測定することができる。最も一般的な総セルロース分解酵素活性アッセイは、基質としてＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙を使用する濾紙アッセイである。アッセイは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）（Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−６８）によって確立された。
【００４９】
セルロース分解酵素活性は、以下の条件下でセルロース分解酵素によるセルロース系材料の加水分解中の糖の生成／放出の増加を測定することによって決定することができる：セルロース分解酵素タンパク質を添加していない対照加水分解と比較して、前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）（または他の前処理セルロース系材料）中セルロース１ｇ当たり１〜５０ｍｇのセルロース分解酵素タンパク質を用い、４０℃〜８０℃、例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃などの好適な温度、および４〜９、例えば、５．０、５．５、６．０、６．５、または７．０などの好適なｐＨで３〜７日間。典型的な条件は、１ｍｌの反応物、洗浄もしくは非洗浄ＰＣＳ、５％不溶性固形分（乾燥重量）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５、１ｍＭ  ＭｎＳＯ４、５０℃、５５℃、もしくは６０℃、７２時間、ＡＭＩＮＥＸ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）による糖分析である。
【００５０】
セルロース系材料：「セルロース系材料」という用語は、セルロースを含有するあらゆる材料を意味する。バイオマスの一次細胞壁中で優勢な多糖は、セルロースであり、２番目に豊富なのがヘミセルロースであり、３番目がペクチンである。細胞が増殖を停止した後に生成される二次細胞壁も多糖を含有し、ヘミセルロースと共有結合したポリマーリグニンによって強化される。セルロースは、無水セロビオースのホモポリマー、従って直鎖状β−（１−４）−Ｄ−グルカンであるが、ヘミセルロースは、様々な置換基を有する複雑な分岐状構造中に、キシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、およびマンナンなどの多種の化合物を含む。一般に多形であるが、セルロースは、植物組織では、主に、平行なグルカン鎖の不溶性結晶性マトリックスとして見出される。ヘミセルロースは、通常、セルロース、ならびに他のヘミセルロースとも水素結合し、これは、細胞壁マトリックスを安定化する上で役立つ。
【００５１】
セルロースは、概して、例えば、植物の茎、葉、外皮、殻、および穂軸、または樹木の葉、枝、および木材に見出される。セルロース系材料は、農業廃棄物、草本材料（エネルギー作物を含む）、都市固形廃棄物、紙パルプ工場廃棄物、古紙、および木材（林地残材を含む）であってよいが、これらに限定されるわけではない（例えば、Ｗｉｓｅｌｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｅ．Ｗｙｍａｎ，ｅｄｉｔｏｒ），ｐｐ．１０５−１１８，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．；Ｗｙｍａｎ，１９９４，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３−１６；Ｌｙｎｄ，１９９０，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４／２５：６９５−７１９；Ｍｏｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃｓ，ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔ．Ｓｃｈｅｐｅｒ，ｍａｎａｇｉｎｇ  ｅｄｉｔｏｒ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６５，ｐｐ．２３−４０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。本明細書において、セルロースは、リグノセルロース、すなわち、混合マトリックス中にリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを含有する植物細胞壁材料の形態であってもよいことは理解される。一態様では、セルロース系材料は、任意のバイオマス材料である。別の態様では、セルロース系材料は、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンを含むリグノセルロースである。
【００５２】
一実施形態では、セルロース系材料は、農業廃棄物、草本材料（エネルギー作物を含む）、都市固形廃棄物、紙パルプ工場廃棄物、古紙、および木材（林地残材を含む）である。
【００５３】
別の実施形態では、セルロース系材料は、アシ（ａｒｕｎｄｏ）、バガス（ｂａｇａｓｓｅ）、タケ、トウモロコシ、穂軸、トウモロコシ繊維、トウモロコシ茎葉、ススキ（ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、イネ藁、スイッチグラス、または麦稈である。
【００５４】
別の実施形態では、セルロース系材料は、ヤマナラシ（ａｓｐｅｎ）、ユーカリ（ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、モミ（ｆｉｒ）、マツ（ｐｉｎｅ）、ポプラ（ｐｏｐｌａｒ）、トウヒ（ｓｐｒｕｃｅ）、またはヤナギ（ｗｉｌｌｏｗ）である。
【００５５】
別の実施形態では、セルロース系材料は、藻類セルロース、細菌セルロース、綿リンター、濾紙、微結晶性セルロース（例えば、ＡＶＩＣＥＬ（登録商標））、またはリン酸処理セルロースである。
【００５６】
別の実施形態では、セルロース系材料は、水生バイオマスである。本明細書で使用されるとき、「水生バイオマス」という用語は、光合成プロセスによって水生環境中に生成されるバイオマスを意味する。水生バイオマスは、藻類、抽水植物、浮葉植物、または沈水植物である。
【００５７】
セルロース系材料は、そのまま使用してもよいし、あるいは、本明細書に記載するように、当技術分野で公知の従来の方法を用いて前処理に付してもよい。好ましい態様では、セルロース系材料を前処理する。
【００５８】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームによって判定されるが、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧもしくはＴＴＧなどの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧもしくはＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組合せであってよい。
【００５９】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して自生（すなわち、同じ遺伝子由来）であっても外来性（すなわち、異なる遺伝子由来）であっても、相互に自生もしくは外来性であってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列、および、転写ターミネータが挙げられる。制御配列としては、プロモータ、ならびに、転写および翻訳停止シグナルが最低限挙げられる。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域との制御配列の連結反応を促進させる特定の制限部位を導入するために、リンカーと共に提供され得る。
【００６０】
洗剤成分：「洗剤成分」という用語は、本明細書では、洗剤組成物に使用することができる化学物質の種類を意味するために定義される。洗剤成分の例としては、界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルター、コビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系もしくは漂白剤成分、ポリマー、布地色相剤、布地コンディショナ、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光性白色化剤、香料、光学増白剤、殺菌剤、殺カビ剤、汚れ懸濁剤、汚れ遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素抑制剤もしくは安定剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、および溶解剤がある。洗剤組成物は、１つもしくは複数の任意の種類の洗剤成分を含み得る。
【００６１】
洗剤組成物：「洗剤組成物」という用語は、生地、食器、および硬質表面などの洗浄しようとする品目から不要な化合物を除去する上で有用な組成物を指す。洗剤組成物は、家庭用クリーニングおよび業務用クリーニングの両方の用途で、例えば、生地食器、および硬質表面をクリーニングするために用いることができる。この用語は、特定のタイプの所望のクリーニング組成物および製品の形態（例えば、液体、ゲル、粉末、顆粒、ペースト、またはスプレー組成物）に関して選択されるあらゆる材料／化合物を包含し、限定されないが、洗剤組成物（例えば、液体および／または固体洗濯洗剤ならびにデリケート布地用洗剤；ガラス、木材、プラスチック、セラミックおよび金属カウンター天板および窓などの硬質表面クリーニング製剤；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナ；布地柔軟剤；ならびに生地および洗濯プレスポッター、さらには食器洗浄用洗剤）を包含する。本発明の変異体（例えば、ＧＨ１６β−グルカナーゼ変異体）を含有する以外に、洗剤製剤は、１種または複数種の別の酵素（例えば、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キサンタナーゼ、キサンタンリアーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、アリールエステラーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラギナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、他のエンド−β−マンナナーゼ、エキソ−β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびこれらの組み合わせ、もしくはこれらの任意の混合物）、ならびに／または例えば、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白剤系もしくは漂白剤成分、ポリマー、布地コンディショナ、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、染料、香料、色あせ防止剤、光学増白剤、殺菌剤、殺カビ剤、汚れ懸濁剤、腐食防止剤、酵素抑制剤もしくは安定化剤、酵素活性化剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、青み付け剤および蛍光性染料、酸化防止剤、および溶解剤を含有してもよい。
【００６２】
食器洗浄：「食器洗浄」という用語は、例えば、手洗い食器洗浄（ＨＤＷ）、自動食器洗浄（ＡＤＷ）、硬質表面の専門的クリーニング、または食器洗浄機（ｗａｒｅｗａｓｈ）による、あらゆる形態の食器洗浄を指す。食器洗浄として限定されないが、例えば、プレート、カップ、グラス、ボールなどのあらゆる形態の瀬戸物、スプーン、ナイフ、フォークおよびキッチン用品などのあらゆる形態のカトラリー、ならびにセラミック製品、プラスチック製品、金属製品、磁器製品、ガラス製品およびアクリル製品のクリーニングが挙げられる。
【００６３】
食器洗浄組成物：「食器洗浄組成物」という用語は、硬質表面をクリーニングするためのあらゆる形態の組成物を指す。本発明は、いずれか特定の種類の食器洗浄組成物またはいずれか特定の洗剤に限定されない。
【００６４】
発現：「発現」という用語は、ポリペプチドの生成に関与するいずれかのステップを含み、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌が挙げられる。
【００６５】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、また、発現をもたらす制御ヌクレオチドに作動可能に結合している直線状または環状のＤＮＡ分子を意味する。
【００６６】
断片：「断片」という用語は、成熟ポリペプチドまたはドメインのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つまたは複数（数個）のアミノ酸を有するポリペプチドまたは触媒もしくは糖質結合モジュールを意味し；ここで、断片は、β−グルカナーゼまたは糖質結合活性を有する。一態様において、断片は、少なくとも３４０個のアミノ酸残基、または少なくとも２３０個のアミノ酸残基、または少なくとも２１０個のアミノ酸残基、または少なくとも２００個のアミノ酸残基、または少なくとも１８０個のアミノ酸残基を含み、ここで、断片は、β−グルカナーゼ活性を有する。
【００６７】
硬質表面クリーニング：「硬質表面クリーニング」という用語は、本明細書で、硬質表面のクリーニングとして定義され、ここで、硬質表面は、床、テーブル、壁、屋根など、ならびに自動車（自動車洗浄）および食器（食器洗浄）などの硬質物体の表面を含み得る。食器洗浄は、限定されないが、プレート、カップ、グラス、ボール、ならびにスプーン、ナイフ、フォーク、キッチン用品、セラミック製品、プラスチック製品、金属製品、磁器製品、ガラス製品およびアクリル製品などのカトラリーのクリーニングを含む。
【００６８】
ヘミセルロース分解酵素またはヘミセルラーゼ：「ヘミセルロース分解酵素」または「ヘミセルラーゼ」という用語は、ヘミセルロース系材料を加水分解する１種または複数種（例えば、数種）の酵素を意味する。例えば、Ｓｈａｌｌｏｍ  ａｎｄ  Ｓｈｏｈａｍ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６（３）：２１９−２２８）を参照されたい。ヘミセルラーゼは、植物バイオマスの分解における重要な成分である。ヘミセルラーゼの例として、限定されないが、アセチルマンナンエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、クマル酸エステラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、グルクロノイルエステラーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、キシラナーゼ、およびキシロシダーゼが挙げられる。これらの酵素の基質であるヘミセルロースは、水素結合を介して植物細胞壁中のセルロースミクロフィブリルと結合して、これらを頑健なネットワーク中に架橋させる分岐状および直鎖状多糖の異種群である。ヘミセルロースもまたリグニンに共有結合して、セルロースと一緒に、極めて複雑な構造を形成する。可変構造およびヘミセルロースの組織化には、その完全な分解のために多くの酵素の共同作用が必要である。ヘミセルラーゼの触媒モジュールは、グリコシド結合を加水分解するグリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）、または酢酸もしくはフェルラ酸側基のエステル結合を加水分解する炭水化物エステラーゼ（ＣＥ）のいずれかである。その一次配列の相同性に基づくこれらの触媒モジュールは、ＧＨおよびＣＥファミリーに割り当てることができる。全体として類似のフォールドを有するいくつかのファミリーは、アルファベットで表記されるクラン（例えば、ＧＨ−Ａ）に、さらに分類することができる。これらのおよび他の炭水化物活性酵素について最も情報量が多く、且つ更新された分類は、炭水化物活性酵素（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｎｚｙｍｅ）（ＣＡＺｙ）データベースで入手可能である。ヘミセルロース分解酵素活性は、４０℃〜８０℃、例えば、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃などの好適な温度、および４〜９、例えば、５．０、５．５、６．０、６．５、または７．０などの好適なｐＨで、Ｇｈｏｓｅ  ａｎｄ  Ｂｉｓａｒｉａ，１９８７，Ｐｕｒｅ  ＆  ＡｐｐＩ．Ｃｈｅｍ．５９：１７３９−１７５２に従って測定することができる。
【００６９】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入などに対して感受性を有するあらゆる細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異のために、親細胞と同じではない親細胞のあらゆる子孫、ならびに組換え宿主細胞、単離された宿主細胞（例えば、単離された組換え宿主細胞）、ヒト胚幹細胞ではない単離宿主細胞を包含する。
【００７０】
向上した特性：「向上した特性」という用語は、親と比較して向上した、変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性として、限定されないが、触媒効率、触媒速度、化学的安定性、酸化安定性、ｐＨ活性、ｐＨ安定性、特異的活性、貯蔵条件下での安定性、基質結合、基質切断、基質特異性、基質安定性、表面特性、熱活性、および熱安定性が挙げられる。好ましくは、本発明の変異体に関連する向上した特性は、親β−グルカナーゼと比較して向上した酸化安定性（例えば、漂白剤の存在下）である。
【００７１】
酸化安定性：「酸化安定性」という用語は、下記事項の１つもしくは複数に対する抵抗または抵抗の程度を意味する：ｉ）分子実体からの１個もしくは複数個の電子の完全な、最終的除去、ｉｉ）任意の基質内のいずれかの原子の酸化数の増加、ｉｉｉ）有機基質、例えば、ポリペプチドの酸素の獲得および／または水素の消失ならびにｉｖ）漂白剤を含有する環境での分解。
【００７２】
単離された：「単離された」という用語は、天然では存在しない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非制限的例として、（１）任意の非天然型物質、（２）これらに限定されないが、天然では関連している天然に存在する成分の１つまたは複数または全部から少なくとも部分的に取り出された任意の酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子；（３）天然に存在する物質に対して、人為的に修飾された任意の物質；または（４）天然では関連している他の成分と比較して物質の量を増加すること（例えば、宿主細胞における組換え生成；物質をコードする遺伝子の複数のコピー；および物質をコードする遺伝子と天然で関連するプロモータより強力なプロモータの使用）によって修飾された任意の物質が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞を培養することによって生成される発酵ブロスは、単離された形態で本発明のポリペプチドを含み得る。
【００７３】
洗濯する：「洗濯する」という用語は、家庭での洗濯および業務用洗濯の両方に関し、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物を含む溶液で生地を処理する工程を意味する。洗濯工程は、例えば、家庭用または業務用洗浄機を用いて実施することもできるし、または手で実施することもできる。
【００７４】
リケナーゼ活性：「リケナーゼ活性」という用語は、β−１，３−１，４−グルカン（例えば、ＥＣ３．２．１．７３）を加水分解する酵素を意味する。
【００７５】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾の後に、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。一態様において、成熟ポリペプチドは、以下：配列番号７（配列番号２６としても示される）のアミノ酸１〜２２２であり、配列番号２（配列番号２７としても示される）のアミノ酸１〜３５１、配列番号３（配列番号２７としても示される）のアミノ酸１〜３５１、配列番号５（配列番号２５としても示される）のアミノ酸１〜２４５、配列番号９（配列番号２８としても示される）のアミノ酸１〜２１４からなる群から選択される。配列番号２のアミノ酸−２８〜−１は、シグナルペプチドを予測する。配列番号３のアミノ酸−２８〜−１は、シグナルペプチドを予測する。配列番号５のアミノ酸−３１〜−１は、シグナルペプチドを予測する。配列番号７のアミノ酸−１５〜−１は、シグナルペプチドを予測する。配列番号９のアミノ酸−２９〜−１は、シグナルペプチドを予測する。成熟ポリペプチドの非限定的例として、さらに、以下：国際公開第２０１５／１４４８２４号パンフレットに記載の配列番号３に対応するバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の株に由来するβ−グルカナーゼの成熟ポリペプチドである配列番号２３、および国際公開第２０１５／１４４８２４号パンフレットに記載の配列番号４に対応する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株に由来するβ−グルカナーゼの成熟ポリペプチドである配列番号２４が挙げられる。
【００７６】
宿主細胞が、同じポリヌクレオチドによって発現される２種以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）の混合物を産生し得ることは当分野において公知である。さらに、異なる宿主細胞では、ポリペプチドのプロセシングが異なるため、あるポリヌクレオチドを発現する１宿主細胞は、同じポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞と比べて、異なる成熟ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端および／またはＮ末端アミノ酸を有する）を産生し得ることも当技術分野で知られている。
【００７７】
成熟ポリペプチドコード配列：「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、β−グルカナーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８５〜１１３７、配列番号４のヌクレオチド９４〜８２８、配列番号６のヌクレオチド４６〜７１１、配列番号８のヌクレオチド８８〜７２９からなる群から選択される。配列番号１のヌクレオチド１〜８４は、シグナルペプチドをコードする。配列番号４のヌクレオチド１〜９３は、シグナルペプチドをコードする。配列番号６のヌクレオチド１〜４５は、シグナルペプチドをコードする。配列番号８のヌクレオチド１〜８７は、シグナルペプチドをコードする。
【００７８】
悪臭：「悪臭」という用語は、清浄な品目に対して望ましくない臭いを意味する。洗浄された品目は、その品目に付着する悪臭がなく、新鮮且つ清浄な臭いがすべきである。悪臭の一例として、微生物によって発生され得る不快な臭いを有する化合物がある。別の例は、ヒトまたは動物と接触していた品目に付着した汗または体臭である。悪臭の別の例は、香辛料からの臭いである場合もあり、例えば、生地片などの品目に付着したカレーや、他の外来香辛料からの臭いがある。品目に悪臭が付着する程度を計測する一方法は、悪臭アッセイの使用によるものである。
【００７９】
核酸構築物：「核酸構築物」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖である核酸分子を意味し、これは、天然遺伝子から単離されるか、または、本来自然には存在し得ないような核酸のセグメント、もしくは、合成された核酸のセグメントを含有するよう修飾されており、１つまたは複数の制御配列を含む。
【００８０】
作動可能に結合：「作動可能に結合」という用語は、制御配列がコード配列の発現をもたらすよう、ポリヌクレオチドのコード配列と比して制御配列が適切な位置に位置されている構成を意味する。
【００８１】
親または親β−グルカナーゼ：「親」または「親β−グルカナーゼ」という用語は、本発明の酵素変異体を産生するような改変が実施されたβ−グルカナーゼを意味する。一態様では、親は、変異体と同一のアミノ酸配列を有するが、指定された位置の１つまたは複数に改変がないβ−グルカナーゼである。「同一のアミノ酸配列を有する」という表現は、１００％配列同一性に関することが理解されよう。親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチドまたはその変異体もしくは断片であってもよい。親β−グルカナーゼの非限定的例は、以下：配列番号７（配列番号２６としても示される）のアミノ酸１〜２２２であり、配列番号２（配列番号２７としても示される）のアミノ酸１〜３５１、配列番号３（配列番号２７としても示される）のアミノ酸１〜３５１、配列番号５（配列番号２５としても示される）のアミノ酸１〜２４５、配列番号９（配列番号２８としても示される）のアミノ酸１〜２１４からなる群から選択される成熟ポリペプチドを含む。
【００８２】
前処理トウモロコシ茎葉：「前処理トウモロコシ茎葉」という用語は、熱および希硫酸、アルカリ前処理、中性前処理、または当技術分野で公知のいずれかの前処理での処理によってトウモロコシ茎葉から得られたセルロース系材料を意味する。
【００８３】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳボージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００８４】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳ  ｐａｃｋａｇｅ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ）、好ましくはバージョン５．０．０以降のＮｅｅｄｌｅ  ｐｒｏｇｒａｍに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，ｓｕｐｒａ）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、および、ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００８５】
緊縮条件：様々な緊縮条件を以下の通り定義する。
【００８６】
「超低ストリンジェンシー条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブについて、５×ＳＳＰＥにおける４２℃、０．３％  ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片化および修飾サケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション、これに続く、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法を意味する。キャリア材料は、最終的に、１．６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００８７】
「低度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、２５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、０．８×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００８８】
「中度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、０．８×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００８９】
「中度−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、０．４×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００９０】
「高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００９１】
「極めて高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、７０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００９２】
サブ配列：「サブ配列」という用語は、成熟ポリペプチドコード配列の５’および／または３’末端から欠失された１つまたは複数（例えば、数個）のヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを意味し；ここで、サブ配列は、β−グルカナーゼ活性を有する断片をコードする。一態様において、サブ配列は、配列番号１の少なくとも２０８５個のヌクレオチドもしくはそのｃＤＮＡ配列、配列番号１の少なくとも２０７０個のヌクレオチドもしくはそのｃＤＮＡ配列、または配列番号１の２０５５個のヌクレオチドもしくはそのｃＤＮＡ配列を含む。
【００９３】
生地：「生地」という用語は、ヤーン、ヤーン中間物、繊維、不織布材料、天然材料、合成材料などのいずれかの生地材料、およびその他いずれかの生地材料、これらの材料から製造される布地、ならびに布地から製造される製品（例えば、衣服および他の物品）を意味する。生地または布地は、ニット、織物、デニム、不織布、フェルト、ヤーンおよびタオル地の形態であってよい。生地は、綿、亜麻／リンネル、ジュート、ラミー、サイザルもしくはコイアを含む天然セルロース系材料、または、ビスコース／レーヨン、ラミー、酢酸セルロース繊維（三細胞性）、リオセルもしくはこれらのブレンドを含む人工セルロース系材料（例えば、木材パルプ由来のもの）などのセルロース系材料であってよい。生地または布地はまた、ウール、ラクダ、カシミヤ、モヘア、ウサギおよび絹をはじめとする天然ポリアミド、またはナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレンおよびスパンデックス／エラスタンといった合成ポリマー、またはこれらのブレンドなどの非セルロース系材料、ならびに、セルロース系および非セルロース系繊維のブレンドであってもよい。ブレンドの例は、綿および／またはレーヨン／ビスコースと、ウール、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、およびセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻／リンネル、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）などの１種または複数種の随伴材料とのブレンドである。布地は、例えば、汚れた家庭ランドリーなどの従来の可洗ランドリーであってよい。布地または衣服という用語が用いられる場合、より広義の生地という用語も含むことが意図される。
【００９４】
変異体：「変異体」という用語は、１または複数（数個）の位置に改変（すなわち、置換、挿入および／または欠失）を含む、β−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し；欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し；また、挿入とは、ある位置のアミノ酸に隣接する１〜３個のアミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、以下：配列番号７、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号９からなる群から選択される配列のポリペプチド、または以下：配列番号７、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群から選択される配列の成熟ポリペプチドのβ−グルカナーゼ活性の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を有する。
【００９５】
野生型β−グルカナーゼ：「野生型β−グルカナーゼ」という用語は、細菌、古細菌、酵母、または天然に見出される糸状真菌などの天然に存在する微生物によって発現されるβ−グルカナーゼを意味する。
【００９６】
洗浄性能：「洗浄性能」という用語は、酵素または酵素のブレンドが、１種または複数種の酵素の存在なしでの洗浄性能と比較して、例えば、洗浄もしくは硬質表面クリーニング中に洗浄される物体上に存在する汚れを除去する能力として定義される。
【００９７】
変異体命名のための取り決め
β−グルカナーゼについて以下に記載する原則は、あらゆるタンパク質に使用することができる。本発明の目的のために、配列番号２６に開示される成熟ポリペプチドは、別のβ−グルカナーゼ（例えば、β−グルカナーゼ変異体）中の対応するアミノ酸残基の判定に用いられる。別のβ−グルカナーゼのアミノ酸配列を配列番号２６に開示される成熟ポリペプチドとアラインメントし、そのアラインメントに基づいて、配列番号２６に開示される成熟ポリペプチドにおける任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）で実行されているようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、好ましくはバージョン５．０．０以降を用いて決定する。用いるパラメータは、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【００９８】
他のβ−グルカナーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、ＭＵＳＣＬＥ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｙ  ｌｏｇ‐ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ；バージョン３．５以降；Ｅｄｇａｒ，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２：１７９２−１７９７）、ＭＡＦＦＴ（バージョン６．８５７以降；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｋｕｍａ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：３０５９−３０６６；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：５１１−５１８；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：３７２−３７４；Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５３７：３９−６４；Ｋａｔｏｈ  ａｎｄ  Ｔｏｈ，２０１０，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：１８９９−１９００）、および、ＣｌｕｓｔａｌＷを採用するＥＭＢＯＳＳ  ＥＭＭＡ（１．８３以降；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）を含むいくつかのコンピュータプログラムを、それぞれのデフォルトパラメータで用いることによる複数のポリペプチド配列のアライメントにより判定可能である。
【００９９】
配列番号２６の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合（Ｌｉｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９５：６１３−６１５）、他の対配列比較アルゴリズムを用いることが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリー（プロファイル）の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリーがタンパク質構造データベースにおいて１つまたは複数の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。ＧｅｎＴＨＲＥＡＤＥＲ（Ｊｏｎｅｓ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７９７−８１５；ＭｃＧｕｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：８７４−８８１）などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル）からの情報を利用する。同様に、Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３：９０３−９１９による方法が、未知の構造の配列とＳＣＯＰデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。
【０１００】
公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のＳＣＯＰスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。２〜６つのタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス（Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：８８−９６）または組み合わせ拡張法（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ａｎｄ  Ｂｏｕｒｎｅ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：７３９−７４７）などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体を発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である（例えば、Ｈｏｌｍ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ，２０００，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １６：５６６−５６７）。
【０１０１】
本発明の変異体の記載において、以下の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているＩＵＰＡＣの１文字または３文字のアミノ酸略記が利用されている。
【０１０２】
置換。アミノ酸置換に関しては以下の命名法が用いられている：元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、位置２２６でのスレオニンのアラニンでの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」または「Ｔ２２６Ａ」と示される。複数の突然変異は加算記号（「＋」）によって分けられており、例えば、「Ｇｌｙ２０５Ａｒｇ＋Ｓｅｒ４１１Ｐｈｅ」または「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」とされ、それぞれ、グリシン（Ｇ）のアルギニン（Ｒ）による、および、セリン（Ｓ）のフェニルアラニン（Ｆ）による位置２０５および４１１での置換が表されている。
【０１０３】
欠失。アミノ酸欠失に関しては、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、＊。従って、１９５位でのグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５＊」または「Ｇ１９５＊」と示される。複数の欠失は、例えば「Ｇｌｙ１９５＊＋Ｓｅｒ４１１＊」または「Ｇ１９５＊＋Ｓ４１１＊」のように、加算記号（「＋」）によって区切られる。
【０１０４】
挿入。アミノ酸挿入に関しては、以下の命名法が用いられる：元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、１９５位のグリシンの後のリシンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓ」または「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸＃１、挿入されたアミノ酸＃２；など］と示される。例えば、１９５位のグリシンの後のリシンおよびアラニンの挿入は、「Ｇｌｙ１９５ＧｌｙＬｙｓＡｌａ」または「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
【０１０５】
このような場合、挿入されたアミノ酸残基は、挿入されたアミノ酸残基の前に位置するアミノ酸残基の位置番号に小文字を付記することにより番号付けされる。従って、上の例の場合、配列は下記の通りである：
【０１０６】
【表１】
2019504625.tif 000002
【０１０７】
複数の改変。複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ＋Ｇｌｙ１９５Ｇｌｕ」または「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、１７０位および１９５位のアルギニンおよびグリシンのそれぞれチロシンおよびグルタミン酸による置換を表す。
【０１０８】
異なる改変。異なる改変を１つの位置に導入することが可能である場合、これらの異なる改変はコンマによって区切られ、例えば、「Ａｒｇ１７０Ｔｙｒ，Ｇｌｕ」は、１７０位のアルギニンのチロシンまたはグルタミン酸による置換を表す。ゆえに、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ，Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ，Ａｌａ」は以下の変異体を表す：
「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、「Ｔｙｒ１６７Ｇｌｙ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」、「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ｇｌｙ」、および「Ｔｙｒ１６７Ａｌａ＋Ａｒｇ１７０Ａｌａ」。
【０１０９】
発明の詳細な説明
本発明は、以下のものからなる群から選択される、β−グルカナーゼ変異体に関する：
ａ）配列番号２６の成熟ポリペプチドの位置Ｆ３３およびＭ１８８に対応する位置に１つまたは複数の置換を含む変異体であって、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する変異体、
ｂ）配列番号２７の成熟ポリペプチドの位置Ｆ３３およびＭ１８８に対応する位置に１つまたは複数の置換を含む変異体であって、変異体が、配列番号２７の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する変異体、
ｃ）配列番号２５の成熟ポリペプチドの位置Ｍ３２およびＭ１８８に対応する位置に１つまたは複数の置換を含む変異体であって、変異体が、配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する変異体、ならびに
ｄ）配列番号２８の成熟ポリペプチドの位置Ｍ２９およびＭ１８０に対応する位置に１つまたは複数の置換を含む変異体であって、変異体が、配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する変異体。
【０１１０】
別の態様では、本発明は、親β−グルカナーゼの変異体に関し、変異体は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの位置３３（例えば、Ｆ３３）および１８８（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置に１つまたは複数の置換を含み、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０１１１】
変異体
本発明は、β−グルカナーゼ変異体に関し、変異体は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの位置３３（例えば、Ｆ３３）および１８８（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置に１つまたは複数の改変を含み、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有する。
【０１１２】
一実施形態では、改変は、置換である。
【０１１３】
一実施形態では、変異体は、親β−グルカナーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０１１４】
別の実施形態では、変異体は、以下：配列番号７（配列番号２６としても示される）のアミノ酸１〜２２２、配列番号２（配列番号２７としても示される）のアミノ酸１〜３５１、配列番号３（配列番号２７としても示される）のアミノ酸１〜３５１、配列番号５（配列番号２５としても示される）のアミノ酸１〜２４５、配列番号９（配列番号２８としても示される）のアミノ酸１〜２１４からなる群から選択される成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０１１５】
一態様では、本発明の変異体の改変の数は、１〜２０、例えば、１〜１０および１〜５、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の改変である。
【０１１６】
別の態様では、変異体は、３２位（例えば、Ｍ３２）、３３位（例えば、Ｆ３３）、１８８位（例えば、Ｍ１８８）、２９位（例えば、Ｍ２９）および１８０位（例えば、Ｍ１８０）に対応する１つまたは複数の位置に改変を含む。
【０１１７】
別の態様では、変異体は、３２位（例えば、Ｍ３２）、３３位（例えば、Ｆ３３）、１８８位（例えば、Ｍ１８８）、２９位（例えば、Ｍ２９）および１８０位（例えば、Ｍ１８０）に対応する２つの位置に改変を含む。
【０１１８】
別の態様では、変異体は、３２位（例えば、Ｍ３２）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、３２位（例えば、Ｍ３２）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、さらに好ましくはＶａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＣｙｓで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２５の成熟ポリペプチドの置換Ｍ３２ＹもしくはＮを含むか、またはそれから構成される。
【０１１９】
別の態様では、変異体は、１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒで、さらに好ましくはＬｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２５の成熟ポリペプチドの置換Ｍ１８８Ｈを含むか、またはそれから構成される。
【０１２０】
別の態様では、変異体は、３３位（例えば、Ｆ３３）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、３３位（例えば、Ｆ３３）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、より好ましくはＶａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＣｙｓで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２６の成熟ポリペプチドの置換Ｆ３３ＹもしくはＮを含むか、またはそれから構成される。
【０１２１】
別の態様では、変異体は、１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒで、より好ましくはＬｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２６の成熟ポリペプチドの置換Ｍ１８８Ｈを含むか、またはそれから構成される。
【０１２２】
別の態様では、変異体は、３３位（例えば、Ｆ３３）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、３３位（例えば、Ｆ３３）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、さらに好ましくはＶａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＣｙｓで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２７の成熟ポリペプチドの置換Ｆ３３ＹもしくはＮを含むか、またはそれから構成される。
【０１２３】
別の態様では、変異体は、１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒで、より好ましくはＬｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２７の成熟ポリペプチドの置換Ｍ１８８Ｈを含むか、またはそれから構成される。
【０１２４】
別の態様では、変異体は、２９位（例えば、Ｍ２９）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、２９位（例えば、Ｍ２９）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、より好ましくはＶａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＣｙｓで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２８の成熟ポリペプチドの置換Ｍ２９ＹもしくはＮを含むか、またはそれから構成される。
【０１２５】
別の態様では、変異体は、１８０位（例えば、Ｍ１８０）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、１８０位（例えば、Ｍ１８０）に対応する位置のアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌで、好ましくはＡｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒで、より好ましくはＬｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇで置換されている。別の態様では、変異体は、配列番号２８の成熟ポリペプチドの置換Ｍ１８０Ｈを含むか、またはそれから構成される。
【０１２６】
別の態様では、変異体は、３２位（例えば、Ｍ３２）、３３位（例えば、Ｆ３３）、１８８位（例えば、Ｍ１８８）、２９位（例えば、Ｍ２９）および１８０位（例えば、Ｍ１８０）に対応する位置に置換を含むか、またはそれから構成される。
【０１２７】
別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＭ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｔに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、前述したものなどの位置Ｍ３２Ａ＋Ｍ１８８Ｆに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ、Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＭ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｃに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ、Ｍ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ａ、もしくはＭ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ｌに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｅ＋Ｍ１８８Ｌに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｗ＋Ｍ１８８Ｓに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ、もしくはＭ３２Ｎ＋Ｍ１８８Ｑに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｃ＋Ｍ１８８Ｅ、もしくはＭ３２Ｃ＋Ｍ１８８Ｐに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｑ＋Ｍ１８８Ｒに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ３２Ｌ＋Ｍ１８８Ｔに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。変異体は、さらに、１または複数（例えば、数個）の他の位置に１つまたは複数の別の改変を含んでもよい。
【０１２８】
別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＦ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｔに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、前述したものなどの位置Ｆ３３Ａ＋Ｍ１８８Ｆに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ、Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＦ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｃに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ、Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ａ、もしくはＦ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｌに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｅ＋Ｍ１８８Ｌに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｗ＋Ｍ１８８Ｓに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ、もしくはＦ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｑに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｅ、もしくはＦ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｐに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｑ＋Ｍ１８８Ｒに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ｔに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。変異体は、さらに、１または複数（例えば、数個）の他の位置に１つまたは複数の別の改変を含んでもよい。
【０１２９】
別の態様では、変異体は、位置Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｌ、Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｈ、もしくはＭ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｔに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、前述したものなどの位置Ｍ２９Ａ＋Ｍ１８０Ｆに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｌ、Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｒ、Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｈ、もしくはＭ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｃに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、位置Ｍ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ｙ、Ｍ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ａ、もしくはＭ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ｌに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、Ｍ２９Ｅ＋Ｍ１８０Ｌに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、Ｍ２９Ｗ＋Ｍ１８０Ｓに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、Ｍ２９Ｎ＋Ｍ１８０Ｆ、もしくはＭ２９Ｎ＋Ｍ１８０Ｑに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、Ｍ２９Ｃ＋Ｍ１８０Ｅ、もしくはＭ２９Ｃ＋Ｍ１８０Ｐに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、Ｍ２９Ｑ＋Ｍ１８０Ｒに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、Ｍ２９Ｌ＋Ｍ１８０Ｔに対応する位置に改変を含むか、またはそれから構成される。変異体は、さらに、１または複数（例えば、数個）の他の位置に１つまたは複数の別の改変を含んでもよい。
【０１３０】
別の態様では、変異体は、以下：Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ３２Ａ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｍ３２Ｙ；Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ３２Ｎ；Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｍ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ；Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｍ３２Ｅ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ１８８Ｈ；Ｍ３２Ｗ＋Ｍ１８８Ｓ；Ｍ３２Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｍ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ａ；Ｍ３２Ｃ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｍ３２Ｑ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｍ３２Ｌ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｃ；Ｍ３２Ｎ＋Ｍ１８８Ｑ；Ｍ３２Ｌ＋Ｍ１８８Ａ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ａ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｆ３３Ｙ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ｎ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｅ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｗ＋Ｍ１８８Ｓ；Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ａ；Ｆ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｆ３３Ｑ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｃ；Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｑ；Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ａ；Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｌ；Ｍ２９Ａ＋Ｍ１８０Ｆ；Ｍ２９Ｙ；Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｈ；Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｌ；Ｍ２９Ｎ；Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｒ；Ｍ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ｙ；Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｈ；Ｍ２９Ｅ＋Ｍ１８０Ｌ；Ｍ１８０Ｈ；Ｍ２９Ｗ＋Ｍ１８０Ｓ；Ｍ２９Ｎ＋Ｍ１８０Ｆ；Ｍ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ａ；Ｍ２９Ｃ＋Ｍ１８０Ｌ；Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｔ；Ｍ２９Ｑ＋Ｍ１８０Ｒ；Ｍ２９Ｌ＋Ｍ１８０Ｔ；Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｃ；Ｍ２９Ｎ＋Ｍ１８０Ｑ；およびＭ２９Ｌ＋Ｍ１８０Ａからなる群から選択される１つもしくは複数（例えば、数個）の置換を含むか、またはそれから構成される。
【０１３１】
別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｍ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＭ３２Ｖ＋Ｍ１８８Ｔを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ａ＋Ｍ１８８Ｆを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ、Ｍ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＭ３２Ｇ＋Ｍ１８８Ｃを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ、Ｍ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ａ、もしくはＭ３２Ｓ＋Ｍ１８８Ｌを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｅ＋Ｍ１８８Ｌを含むか、��たはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｗ＋Ｍ１８８Ｓを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ、もしくはＭ３２Ｎ＋Ｍ１８８Ｑを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｃ＋Ｍ１８８Ｅ、もしくはＭ３２Ｃ＋Ｍ１８８Ｐを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｑ＋Ｍ１８８Ｒを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２５、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２５の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ３２Ｌ＋Ｍ１８８Ｔを含むか、またはそれから構成される。変異体は、さらに、１つまたは複数（例えば、数個）の他の位置に１つまた���複数の別の改変を含んでもよい。
【０１３２】
別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＦ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｔを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ａ＋Ｍ１８８Ｆを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ、Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ、Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ、もしくはＦ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｃを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ、Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ａ、もしくはＦ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｌを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％��少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｅ＋Ｍ１８８Ｌを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｗ＋Ｍ１８８Ｓを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ、もしくはＦ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｑを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｅ、もしくはＦ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｐを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｑ＋Ｍ１８８Ｒを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２６および配列番号２７、ならびにβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２６もしくは２７の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少な���とも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ｔを含むか、またはそれから構成される。変異体は、さらに、１または複数（例えば、数個）の他の位置に１つまたは複数の別の改変を含んでもよい。
【０１３３】
別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｌ、Ｍ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｈ、もしくはＭ２９Ｖ＋Ｍ１８０Ｔを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ａ＋Ｍ１８０Ｆを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｌ、Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｒ、Ｍ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｈ、もしくはＭ２９Ｇ＋Ｍ１８０Ｃを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ｙ、Ｍ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ａ、もしくはＭ２９Ｓ＋Ｍ１８０Ｌを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｅ＋Ｍ１８０Ｌを含むか、��たはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｗ＋Ｍ１８０Ｓを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｎ＋Ｍ１８０Ｆ、もしくはＭ２９Ｎ＋Ｍ１８０Ｑを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｃ＋Ｍ１８０Ｅ、Ｐを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｑ＋Ｍ１８０Ｒを含むか、またはそれから構成される。別の態様では、変異体は、以下：配列番号２８、およびβ−グルカナーゼ活性を有する配列番号２８の成熟ポリペプチドに対して少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される成熟型ポリペプチドの置換Ｍ２９Ｌ＋Ｍ１８０Ｔを含むか、またはそれから構成される。変異体は、さらに、１または複数（例えば、数個）の他の位置に１つまたは複数の別の改変を含んでもよ���。
【０１３４】
アミノ酸の変更は軽微なものであり得、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／または活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換または挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の微小な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの微小なアミノ−またはカルボキシル−末端延伸；２０〜２５残基以下の小リンカーペプチド；または、正味の電荷または他の機能を変えることにより精製を容易とする、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープもしくは結合ドメインなどの微小な延伸であり得る。
【０１３５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、ならびに、低分子アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群に含まれるものによる。特異活性を概して改変しないアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、およびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【０１３６】
あるいは、アミノ酸変更は、ポリペプチドの物理化学的性質が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変更は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、最適ｐＨを変更するようなものなどであってよい。
【０１３７】
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの技術分野において公知である手法に準拠して同定することが可能である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中の全ての残基に導入され、得られるミュータント分子は、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにβ−グルカナーゼ活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用はまた、推定される接触部位アミノ酸の突然変異との組み合わせにより、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折、または、光親和性標識などの技術によって測定される構造の物理的分析によって判定可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸の同一性はまた、関連するポリペプチドとのアライメントから推定可能である。
【０１３８】
一実施形態では、変異体は、親酵素と比較して向上した酸化安定性を有する。
【０１３９】
一実施形態では、変異体は、親酵素と比較して向上した熱安定性を有する。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の変異体のβ−グルカナーゼ活性は、セルロースのＤ−グルコース単位同士のβ−１，４結合に対するエンド−セルラーゼ活性ではない。別の実施形態では、本発明の変異体のβ−グルカナーゼ活性は、リケニナーゼＥＣ．３．２．１．７３活性を含む。別の実施形態では、本発明の変異体のβ−グルカナーゼ活性は、リケニナーゼＥＣ．３．２．１．７３活性である。
【０１４１】
一実施形態では、本発明の変異体は、約７．５〜約１３．５の範囲で選択されるｐＨを有する水溶液中にβ−グルカナーゼ活性を有することができ、ここで、前記水溶液は、任意選択で、漂白剤を含み、好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲で選択され、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲から選択され、最も好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲で選択される。
【０１４２】
別の実施形態では、変異体は、約２０℃〜約７５℃の範囲で選択される温度の水溶液中でβ−グルカナーゼ活性を有することができ、前記水溶液は、任意選択で、漂白剤を含み、好ましくは、前記温度は、約４０℃〜約６０℃の範囲で選択される。
【０１４３】
別の実施形態では、変異体は、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも６０分間、さらに好ましくは少なくとも９０分間、最も好ましくは少なくとも１２０分間、β−グルカナーゼ活性を有することができる。
【０１４４】
親β−グルカナーゼ
親β−グルカナーゼは、下記の位置に対応する少なくとも１つの位置にメチオニンまたはフェニルアラニン残基を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）β−グルカナーゼであってよい：
例えば、配列番号２５のポリペプチドのように、３２位（例えば、Ｍ３２）および１８８位（例えば、Ｍ１８８）、
例えば、配列番号２６のポリペプチドのように、３３位（例えば、Ｆ３３）および１８８位（例えば、Ｍ１８８）、
例えば、配列番号２７のポリペプチドのように、３３位（例えば、Ｆ３３）およびＭ１８８位（例えば、Ｍ１８８）、
例えば、配列番号２８のポリペプチドのように、２９位（例えば、Ｍ２９）および１８０位（例えば、Ｍ１８０）。
【０１４５】
２つのメチオニンまたはフェニルアラニンとメチオニンの組み合わせは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）β−グルカナーゼの間で保存されており、また、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される成熟型ポリペプチドに対して低い配列同一性、例えば、約５０％まで同一であるか、またはそれより低い配列同一性を有するアルカリバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）β−グルカナーゼの間でもある程度保存されている（例えば、図１）。
【０１４６】
本発明の好ましい親β−グルカナーゼとしては、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９が挙げられる。本発明の他の好適な親β−グルカナーゼとしては、配列番号２３および配列番号２４を有するβ−グルカナーゼがある。
【０１４７】
図１は、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８を有する成熟β−グルカナーゼの複数の配列アラインメントを示し、アラインメントした配列が相同性であり、配列番号２５のポリペプチドのＭ３２およびＭ１８８、配列番号２６のポリペプチドのＦ３３およびＭ１８８、配列番号２７のポリペプチドのＦ３３およびＭ１８８、配列番号２８のポリペプチドのＭ２９およびＭ１８０からなる群から選択される位置に対応する位置にメチオニンまたはフェニルアラニン残基を含むことを明らかに証明する。
【０１４８】
親β−グルカナーゼは、（ａ）以下：配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、の配列同一性を有するポリペプチド；または（ｂ）低度の緊縮条件、好ましくは中度の緊縮条件、より好ましくは中高度の緊縮条件、さらに好ましくは高度の緊縮条件、非常に好ましくは高度の緊縮条件、最も好ましくは極めて高度の緊縮条件下で、（ｉ）以下：配列番号６、配列番号１、配列番号４、配列番号８からなる群から選択される配列の成熟ポリペプチドコード配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長補体であってよい。
【０１４９】
別の態様では、親は、β−グルカナーゼ活性を有する、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。一態様では、親のアミノ酸配列は、以下：配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される成熟ポリペプチドとは、最大１０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸異なる。
【０１５０】
別の態様では、親は、以下：配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれから構成される。別の態様では、親は、以下：配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドを含むか、またはそれから構成される。
【０１５１】
別の態様では、親は、以下：少なくとも１８０アミノ酸残基、例えば、少なくとも２００および少なくとも２１０アミノ酸残基を含有する配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドの断片である。
【０１５２】
別の実施形態では、親は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドの対立遺伝子変異体である。
【０１５３】
配列番号１、配列番号４、配列番号６、配列番号８またはその部分配列、ならびに配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドまたはその断片を用いて、当技術分野で公知の方法に従って様々な属または種の株から親を同定して、それをコードするＤＮＡをクローニングするための核酸プローブを設計することができる。特に、こうしたプローブは、標準に従って、目的の細胞のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用することができる。対応する遺伝子を同定して、単離するために、サザンブロッティング法を使用することができる。こうしたプローブは、配列全体よりかなり短くてもよいが、少なくとも１５、例えば、少なくとも２５、少なくとも３５、または少なくとも７０ヌクレオチド長であるべきである。好ましくは、核酸プローブは、少なくとも１００ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、少なくとも６００ヌクレオチド長、少なくとも７００ヌクレオチド長、少なくとも８００ヌクレオチド長、または少なくとも９００ヌクレオチド長である。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブのいずれをも使用することもできる。プローブは、一般に、対応する遺伝子を検出するために標識されている（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、またはアビジンで）。こうしたプローブは、本発明に包含される。
【０１５４】
こうした他の株から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、前述したプローブとハイブリダイズし、親をコードするＤＮＡについてスクリーニングしてもよい。こうした他の株に由来するゲノムＤＮＡまたはその他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または他の分離技術によって分離され得る。ライブラリー由来のＤＮＡまたは分離されたＤＮＡは、ニトロセルロースまたは他の好適な担体材料上に移して、固定化してもよい。以下：配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８またはその部分配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列とハイブリダイズするクローンまたはＤＮＡを同定するために、担体材料をサザンブロットに使用する。
【０１５５】
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、極めて高い緊縮条件下で、以下：（ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドコード配列；（ｉｉ）その完全長補体；または（ｉｉｉ）その部分配列に対応する標識核酸プローブとハイブリダイズすることを意味する。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは当技術分野で公知のいずれか他の検出手段を用いて、検出することができる。
【０１５６】
一態様では、核酸プローブは、以下：配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号７および配列番号９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドである。
【０１５７】
ポリペプチドは、あるポリペプチドの領域が他のポリペプチドの領域のＮ末端またはＣ末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【０１５８】
親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は技術分野において公知であり、フレーム中にあるよう、また、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータの制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を結合することが含まれる。融合ポリペプチドはまた、融合ポリペプチドが翻訳後に形成されるインテインテクノロジーを用いて構築され得る（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０１５９】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質を分泌すると、この部位が切断されて、２つのポリペプチドが放出される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８において開示されている部位が挙げられる。
【０１６０】
親は、全ての種類の微生物から得られてもよい。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされる親は、ソースによって生成されるか、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味すべきである。一態様において、親は、細胞外で分泌される。
【０１６１】
親は、細菌β−グルカナーゼであってよい。例えば、親は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、もしくはストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）β−グルカナーゼなどのグラム陽性菌ポリペプチド、またはカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸癌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボフラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、もしくはウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）β−グルカナーゼなどのグラム陰性菌ポリペプチドであってもよい。
【０１６２】
一態様では、親は、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）β−グルカナーゼである。
【０１６３】
別の態様では、親は、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、または腺疫菌ズーエピデミクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）β−グルカナーゼである。
【０１６４】
別の態様では、親は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）β−グルカナーゼである。
【０１６５】
上に挙げた種に関して、本発明が、完全および不完全な状態の両方を含み、また、それらが知られている種の名称にかかわらず、他の分類学上の均等物、例えば、アナモルフを包含することは理解されよう。当業者であれば、適切な均等物の同一性を容易に認識されよう。
【０１６６】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【０１６７】
親は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から単離された微生物、または、天然材料（例えば、汚染物、コンポスト、水等）から直接的に得られたＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）を利用することにより単離またはクローン化され得る。
【０１６８】
変異体の調製
本発明は、β−グルカナーゼ活性を有する変異体を取得する方法にも関し、これは、（ａ）親β−グルカナーゼ中に、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位（例えば、Ｆ３３）および１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップであって、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有するステップと；変異体を回収するステップを含む。
【０１６９】
本発明は、β−グルカナーゼ活性を有する変異体を取得する方法にも関し、これは、（ａ）親β−グルカナーゼ中に、配列番号２７の番号付けを用いて、配列番号２７の成熟ポリペプチドの３３位（例えば、Ｆ３３）および１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップであって、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有するステップと；変異体を回収するステップを含む。
【０１７０】
本発明は、β−グルカナーゼ活性を有する変異体を取得する方法にも関し、これは、（ａ）親β−グルカナーゼ中に、配列番号２５の番号付けを用いて、配列番号２５の成熟ポリペプチドの３２位（例えば、Ｍ３２）および１８８位（例えば、Ｍ１８８）に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップであって、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有するステップと；変異体を回収するステップを含む。
【０１７１】
本発明は、β−グルカナーゼ活性を有する変異体を取得する方法にも関し、これは、（ａ）親β−グルカナーゼ中に、配列番号２８の番号付けを用いて、配列番号２８の成熟ポリペプチドの２９位（例えば、Ｍ２９）および１８０位（例えば、Ｍ１８０）に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップであって、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有するステップと；変異体を回収するステップを含む。
【０１７２】
変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築、無作為突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。
【０１７３】
部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける１つまたは複数の規定の部位で１つまたは複数（例えば、いくつか）の突然変異を導入する技術である。
【０１７４】
部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーが使用されるＰＣＲによってインビトロで達成されることが可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドにおける部位が制限酵素により切断され、および、その後、ポリヌクレオチドに突然変異を含有するオリゴヌクレオチドが連結されるカセット式突然変異誘発によってインビトロで行われることが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と挿入断片とを互いに連結させる。例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；および、Ｂａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３４９−４９６６を参照のこと。
【０１７５】
部位特異的突然変異誘発はまた、技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；および、Ｃａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照のこと。
【０１７６】
いずれかの部位特異的突然変異誘発法が本発明において用いられることが可能である。変異体の調製に用いられることが可能である多くの市販のキットが入手可能である。
【０１７７】
合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子のインビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップにアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。
【０１７８】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１７９】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【０１８０】
半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および／または部位特異的突然変異誘発および／またはランダム突然変異誘発および／またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、ＰＣＲ技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンＰＣＲまたは非エラープローンＰＣＲ増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列がシャッフルされ得る。
【０１８１】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０１８２】
核酸構築物
本発明は、さらに、制御配列と適合可能な条件下で、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有し、ポリヌクレオチドは、制御配列と適合可能な条件下で、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。
【０１８３】
ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を可能にするために様々な方法で操作することができる。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入前にポリヌクレオチドを操作するのが望ましいか、または必要な場合がある。組換えＤＮＡ方法を用いてポリヌクレオチドを修飾する技術は、当技術分野で公知である。
【０１８４】
制御配列は、プロモータ、すなわち、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドである。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、変異型、切断型、およびハイブリッドプロモータをはじめとする、宿主細胞中で転写活性を示すいずれのポリヌクレオチドであってもよく、相同性または異種いずれかの細胞外もしくは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られるものでもよい。
【０１８５】
細菌性宿主細胞における本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３：９７−１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）および原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１）、ならびに、ｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、“Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ”，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４−９４；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａに記載されている。タンデムプロモータの例が国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに開示されている。
【０１８６】
糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例を以下に挙げる：アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸性安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）もしくはアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フサリウム・ベネナツム・ダリア（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｄａｒｉａ）  （国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フサリウム・ベネナツム・クイン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ  Ｑｕｉｎｎ）  （国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモータ（非翻訳リーダーが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置換されたアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子；非制限的例として、非翻訳リーダーが、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置換されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼがある）；ならびにこれらの変異体、切断型、およびハイブリットプロモータ。他のプロモータは、米国特許第６０１１１４７号に記載されている。
【０１８７】
酵母宿主において、有用なプロモータは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主のその他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８に記載されている。
【０１８８】
制御配列は転写ターミネータであってもよく、これは、宿主細胞によって転写の終止と認識される。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に結合する。宿主細胞において機能的である全てのターミネータが本発明において用いられ得る。
【０１８９】
細菌性宿主細胞について好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ａｍｙＬ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）に係る遺伝子から得られる。
【０１９０】
糸状真菌宿主細胞について好ましいターミネータは、以下に挙げるものの遺伝子から得られる：アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、およびトリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子。
【０１９１】
酵母宿主細胞の好ましいターミネータは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のその他の有用なターミネータは、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ．ａｌ．，１９９２（前掲）によって記載されている。
【０１９２】
制御配列はまた、プロモータの下流側であって、遺伝子の発現を高める遺伝子のコード配列の上流側のｍＲＮＡスタビライザ領域であり得る。
好適なｍＲＮＡスタビライザ領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５−３４７１）から入手される。
【０１９３】
制御配列はまた、リーダー、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に結合される。宿主細胞において機能性である任意のリーダーを用いてよい。
【０１９４】
糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼおよびアスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１９５】
酵母宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１９６】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列であってもよく、これは、ポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に結合し、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞に認識される配列である。宿主細胞において機能性である任意のポリアデニル化配列を用いてよい。
【０１９７】
糸状真菌宿主細胞の好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニレート・シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、およびフサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１９８】
酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列が、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【０１９９】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、ポリペプチドを細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’−末端は、ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の５’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、ポリペプチドの分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列が用いられてもよい。
【０２００】
細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ１１８３７マルトジェニックアミラーゼ、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）サブチリシン、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）および古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７：１０９−１３７に記載されている。
【０２０１】
糸状真菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、およびリゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０２０２】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼの遺伝子から得られる。その他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ．ａｌ．，１９９２（前掲）によって記載されている。
【０２０３】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られるポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド（または、いくつかの場合においてヂモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）天然プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−因子に係る遺伝子から得られ得る。
【０２０４】
シグナルペプチドとプロペプチド配列との両方が存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ末端の隣に位置され、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置される。
【０２０５】
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を加えることが望ましい場合もある。制御配列の例は、化学的刺激または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンオフさせるものであり、調節化合物の存在が含まれる。原核系中の調節系は、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系を含む。酵母では、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が有用であろう。糸状真菌では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモータ、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩプロモータ、およびトリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドラーゼＩＩプロモータを用いてよい。調節配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にする配列である。真核細胞系では、このような制御配列として、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。こうしたケースでは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、制御配列と作動可能に連結する。
【０２０６】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体をコードするポリヌクレオチド（ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する）、プロモータ、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含む、組換え発現ベクターに関する。
【０２０７】
種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【０２０８】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【０２０９】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体などの、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【０２１０】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカを含有することが好ましい。選択マーカは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。
【０２１１】
細菌性選択マーカの例は、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくは古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｄａｌ遺伝子、または、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカである。酵母宿主細胞の好適なマーカは、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状真菌宿主細胞で使用される選択マーカとしては、これらに限定されないが、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキサミド  シンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシルアミノイミダゾール  シンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルボモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニレート・シンターゼ）、ならびにこれらの均等物が挙げられる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞での使用に好適なのは、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞での使用に好ましいのは、ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ、およびｐｙｒＧ遺伝子である。
【０２１２】
選択マーカは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載の二重選択マーカ系であってもよい。一態様では、二重選択マーカは、ｈｐｈ−ｔｋ二重選択マーカ系である。
【０２１３】
ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製を許容する要素を含有することが好ましい。
【０２１４】
宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対および８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。
【０２１５】
自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。
【０２１６】
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７およびｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、ならびに、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０およびｐＡＭβ１の複製起点である。
【０２１７】
酵母宿主細胞で用いられる複製起点の例としては、２μ複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せがある。
【０２１８】
糸状真菌宿主細胞で有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１およびＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ  ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離および当該遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットに開示の方法に従って達成することができる。
【０２１９】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、ポリペプチドの生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカ遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカ遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。
【０２２０】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である（例えば、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照のこと）。
【０２２１】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞に関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有し、ポリヌクレオチドは、変異体をコードするポリペプチドの生成を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結している。
【０２２２】
ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、または、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【０２２３】
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物などの、本発明のポリペプチドの組換え生成において有用ないずれかの細胞であってよい。
【０２２４】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０２２５】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ−６２４４９、バチルス・アキバイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｋｉｂａｉ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・モジャベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞をはじめとする、いずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であってよい。
【０２２６】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０２２７】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセス・アウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０２２８】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５を参照のこと）、コンピテント細胞の形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３−８２９、または、Ｄｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９−２２１を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：５２７１−５２７８を参照のこと）により実施され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０を参照のこと）またはエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６１２７−６１４５を参照のこと）により実施され得る。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９−４０５を参照のこと）、接合（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３−３５８５を参照のこと）、または、形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６２８９−６２９４を参照のこと）により実施され得る。シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６４：３９１−３９７を参照のこと）、または、接合（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ  ａｎｄ  Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１−５７を参照のこと）により実施され得る。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、自然の受容能（例えば、Ｐｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５−１２９７を参照のこと）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ  ａｎｄ  Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ  ６８：１８９−２０７を参照のこと）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００−３８０４を参照のこと）または接合（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９−４３６を参照のこと）により実施され得る。しかしながら、ＤＮＡを宿主細胞に導入するための技術分野において公知であるいずれかの方法を用いることが可能である。
【０２２９】
宿主細胞はまた、哺乳動物、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核細胞であってもよい。
【０２３０】
宿主細胞は真菌細胞であってもよい。本明細書で用いる「真菌」には、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ならびに卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）ならびにあらゆる栄養胞子形成菌が含まれる（以下によって定義されている通り：Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
【０２３１】
真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。本明細書で用いる「酵母」には、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母、および不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（ブラストミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母が含まれる。酵母の分類は将来変わる可能性があるため、本発明の目的に関して、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおり定義する。
【０２３２】
酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、もしくはヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の細胞であってよい。
【０２３３】
真菌宿主細胞は、糸状真菌宿主細胞であってもよい。「糸状真菌」には、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）のあらゆる糸状形態が含まれる（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（前掲）により定義されているとおり）。糸状真菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖類から構成される菌糸壁を特徴とする。栄養成長は、菌糸伸長によって行われ、炭素異化作用は、必ず好気的である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養成長は、単細胞性葉状体の発芽によるものであり、また炭素異化作用は発酵性であり得る。
【０２３４】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤケイロタケ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコル属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフソラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチックス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞であってよい。
【０２３５】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ホエチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレジエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベッセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノンシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・サブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンズランジカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トプロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオラス・ハースタス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クロックウェレンズ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサ���ウム・サルクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコル・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオプソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアータ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシカラー（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）の細胞であってよい。
【０２３６】
真菌細胞は、それ自体知られている方法において、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む方法により形質転換することができる。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換のための好適な手順は、次の文献に記載されている：欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４、およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２。フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種を形質転換する好適な方法は、次の文献に記載されている：Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｇｅｎｅ  ７８  １４７−１５６、および国際公開第９６／００７８７号パンフレット。酵母は、次の文献に記載されている手順を用いて形質転換することができる：ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；ならびにＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０。
【０２３７】
生成方法
本発明はまた、以下：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養するステップ；および（ｂ）変異体を回収するステップを含む、変異体の生成方法（例えば、インビトロまたはエクスビボの生成方法）にも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの位置３３および１８８に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体を生成する方法に関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有し、この方法は、以下：（ａ）変異体の発現に好適な条件下で、変異体を発現する宿主細胞を培養するステップ；および（ｂ）変異体を回収するステップを含む。
【０２３８】
一態様では、細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞である。別の態様では、細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ−６２４４９、またはバチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、またはバチルス・アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、またはバチルス・モジャベンシス（Ｂ．ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）細胞である。
【０２３９】
宿主細胞は、技術分野において公知である方法を用いる変異体の生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中に、変異体の発現および／または単離が許容される条件下で行われる実験用または産業用発酵槽において、フラスコ振盪培養、または、小規模もしくは大規模発酵（連続、回分、流加または固相発酵を含む）により培養され得る。培養は、技術分野において公知である手法を用いて、炭素および窒素源、および、無機塩を含む好適な栄養培地において行われる。好適な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、または、公開されている組成物に従って調製され得る（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）。変異体が栄養培地に分泌される場合、変異体は培地から直接回収可能である。変異体が分泌されない場合、変異体は細胞可溶化物から回収可能である。
【０２４０】
変異体は、変異体に特異的である技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出法としては、これらに限定されないが、特定の抗体の使用、酵素生成物の形成、または、酵素基質の消失が挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いて変異体の活性を判定し得る。
【０２４１】
変異体は技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、変異体は、特にこれらに限定されないが、採取、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む従来の手法によって栄養培地から回収され得る。
【０２４２】
変異体は、特にこれらに限定されないが、実質的に純粋な変異体を得るための、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、吸収率較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム析出）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０２４３】
代替的な態様において、変異体は回収されず、変異体を発現する本発明の宿主細胞が変異体ソースとして用いられる。
【０２４４】
植物における生成
本発明はまた、回収可能な量で変異体を発現および生成するように、本発明のポリヌクレオチドを含む植物、例えば、トランスジェニック植物、植物部分、または植物細胞に関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む植物に関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有し、植物は、変異体を回収可能な量で発現および生成する。
【０２４５】
変異体は、植物または植物部分から回収することができる。あるいは、変異体を含む植物または植物部分は、食品または飼料の品質を改善する、例えば、栄養価、嗜好性および流体学的性質を高めるように、または非栄養因子を破壊するために用いられる。
【０２４６】
トランスジェニック植物は、双子葉（ｄｉｃｏｔ）または単子葉（ｍｏｎｏｃｏｔ）であってよい。単子葉植物の例としては、牧草（ブルーグラス、ポア（Ｐｏａ））などのイネ科牧草、フェツカ（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）などの飼料草、ヌカボ（Ａｒｇｏｓｔｉｓ）などの寒地型牧草、ならびに例えば、コムギ、オーツムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、およびトウモロコシ（コーン）が挙げられる。
【０２４７】
双子葉植物の例としては、タバコ、ルピナスなどのマメ科、ジャガイモ、テンサイ、エンドウマメ、インゲンマメおよびダイズ、ならびに例えば、カリフラワー、ナタネなどのアブラナ科植物（アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ））、およびごく近縁のモデル生物：シロイロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）がある。
【０２４８】
植物部分の例としては、茎、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎、ならびにこれらの部分を含む個々の組織、例えば、表皮、葉肉、柔組織、維管束組織、分裂組織が挙げられる。また、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソームおよび細胞質も植物部分であると考えられる。さらに、組織起源にかかわらず、あらゆる植物細胞が植物部分であると考えられる。同様に、本発明の使用を容易にするために単離された特定の組織および細胞などの植物部分も、植物部分と考えられ、例えば、胚、胚乳、アリューロンおよび種皮がある。
【０２４９】
さらに、このような植物、植物部分および植物細胞の子孫も本発明の範囲に含まれる。
【０２５０】
当分野では公知の方法により、変異体を発現するトランスジェニック植物または植物細胞を構築してもよい。手短には、変異体をコードする１つまたは複数の発現構築物を、植物宿主ゲノムまたは葉緑体ゲノムに組み込み、得られた修飾植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に繁殖させることによって、植物または植物細胞を構築する。
【０２５１】
発現構築物は、選択植物または植物部分のポリヌクレオチドの発現に必要な適切な調節配列と作動可能に結合した変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であるのが好都合である。さらに、発現構築物は、発現構築物が組み込まれた植物細胞を同定するのに有用な選択マーカと、この構築物を対象植物に導入するのに必要なＤＮＡ配列を含み得る（後者は、用いようとするＤＮＡ導入方法に応じて異なる）。
【０２５２】
プロモータおよびターミネータ配列ならびに任意選択でシグナルもしくは輸送配列などの調節配列の選択は、例えば、変異体をいつ、どこで、どのように発現したいのかに基づいて決定される。例えば、変異体をコードする遺伝子の発現は、構成性もしくは誘導性のいずれでもよく、または発生過程、ステージもしくは組織特異的であってもよく、種子もしくは葉などの特定の組織または植物部分に遺伝子構築物をターゲティングすることができる。調節配列は、例えば、Ｔａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ８６：５０６に記載されている。
【０２５３】
構成性発現の場合、３５Ｓ-ＣａＭＶ、トウモロコシユビキチン１、またはイネアクチン１プロモータを用いてよい（Ｆｒａｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２１：２８５−２９４；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ３：１１５５−１１６５）。器官特異的プロモータとしては、例えば、以下のものが挙げられる：種子、ジャガイモ塊茎、および果実などの貯蔵シンク組織由来のプロモータ（ＥｄｗａｒｄｓおよびＣｏｒｕｚｚｉ，１９９０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２７５−３０３）、または分裂組織などの代謝シンク組織由来のプロモータ（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：８６３−８７８）、グルテリン、プロラミン、グロブリンなどの種子特異的プロモータ、またはイネ由来のアルブミンプロモータ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：８８５−８８９）、レグミンＢ４由来のソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）プロモータおよびソラマメ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ）由来の未知の種子タンパク質遺伝子（Ｃｏｎｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：７０８−７１１）、種子オイルボディタンパク質由来のプロモータ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９：９３５−９４１）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）由来の貯蔵タンパク質ｎａｐＡプロモータ、または例えば国際公開第９１／１４７７２号パンフレットに記載されているような当分野では公知のいずれか他の種子特異的プロモータ。さらに、プロモータは、葉特異的プロモータであってもよく、例えば、イネもしくはタバコ由来のｒｂｃｓプロモータ（Ｋｙｏｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０２：９９１−１０００）、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモータ（ＭｉｔｒａおよびＨｉｇｇｉｎｓ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：８５−９３）、イネ由来のａｌｄＰ遺伝子プロモータ（Ｋａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４８：６６８−６７４）、またはジャガイモｐｉｎ２プロモータなどの創傷誘導性プロモータ（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３−５８８）がある。同様に、プロモータは、温度、乾燥もしくは塩分の変化などの非生物処理によって誘導しても、プロモータを活性化する外部適用の物質、例えば、エタノール、エストロゲン、エチレン、アブシジン酸、およびジベレリン酸のような植物ホルモン、ならびに重金属により誘導してもよい。
【０２５４】
さらに、植物における変異体のさらに高度の発現を達成するために、プロモータエンハンサーエレメントを用いてもよい。例えば、プロモータエンハンサーエレメントは、イントロンであってもよく、これは、プロモータと、変異体をコードするポリヌクレオチドとの間に配置される。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（前掲）は、発現を増大するためのイネアクチン１遺伝子の第１イントロンの使用を開示している。
【０２５５】
選択マーカ遺伝子および発現構築物の任意の他の部分は、当分野で入手可能なものから選択してよい。
【０２５６】
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、ウイルス媒介形質転換、マイクロインジェクション、パーティクルガン、微粒子銃形質転換、およびエレクトロポレーションなどの当分野では公知の従来の方法（Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２９３；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５３５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ｎａｔｕｒｅ  ３３８：２７４）により、核酸構築物を植物ゲノムに組み込む。
【０２５７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介遺伝子移入は、トランスジェニック双子葉植物を作製し（内容については、ＨｏｏｙｋａｓおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  １９：１５−３８を参照のこと）、また、単子葉植物を形質転換する方法であるが、他の形質転換方法をこれらの植物に用いてもよい。トランスジェニック単子葉植物を作製する方法は、胚形成能を有するカルスまたは発生過程の胚のパーティクルガン（形質転換ＤＮＡをコーティングした微細な金またはタングステン粒子）である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２：２７５−２８１；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：１５８−１６２；Ｖａｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：６６７−６７４）。単子葉植物を形質転換する別の方法は、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１５−４２８により記載されているように、原形質体形質転換に基づくものである。別の形質転換方法としては、米国特許第６，３９５，９６６号明細書および同第７，１５１，２０４号明細書（いずれも、参照として本明細書にその全文を組み込む）に記載されているものがある。
【０２５８】
形質転換の後、発現構築物が組み込まれた形質転換体を選択して、当分野では公知の方法により全植物に再生させる。多くの場合、形質転換手順は、例えば、２つの個別のＴ−ＤＮＡ構築物を用いた同時形質転換、または特定のリコンビナーゼにより選択遺伝子の部位特異的切除を用いることにより、再生中、または続く生成中のいずれかで、選択遺伝子の選択的排除を達成するように設計する。
【０２５９】
本発明の構築物による特定の植物遺伝子型の直接形質転換以外に、構築物を有する植物を、構築物が欠失した第２植物と交雑させることにより、トランスジェニック植物を作製してもよい。例えば、変異体をコードする構築物を、交雑により植物変種に導入することができ、この場合、対象の変種の植物を直接形質転換する必要は全くない。ゆえに、本発明は、本発明により形質転換された細胞から直接再生させた植物だけではなく、そのような植物の子孫も包含する。本明細書で用いる場合、子孫とは、本発明により作製した親植物のあらゆる世代の子孫を意味し得る。このような子孫は、本発明により作製したＤＮＡ構築物を含み得る。交雑は、ドナー植物系統で出発系統を他家受粉することにより、ある植物系統へのトランスジーンの導入を達成する。このようなステップの非制限的例が、米国特許第７，１５１，２０４号明細書に記載されている。
【０２６０】
植物は、戻し交雑変換法により作製することもできる。例えば、植物は、戻し交雑変換遺伝子型、系統、同系繁殖体、またはハイブリッドと呼ばれる植物を包含する。
【０２６１】
ある遺伝的背景から別の背景への本発明の１つまたは複数のトランスジーンの侵入を補助するために、遺伝子マーカを用いてもよい。マーカ補助による選択は、表現型変化によって起こったエラーを回避するのに用いることができるため、従来の育種と比較して利点をもたらす。さらに、遺伝子マーカは、特定の交雑の個々の子孫におけるエリート遺伝資源の相対度に関するデータを提供しうる。例えば、別の状況では非農業的に望ましい遺伝的背景を有する所望の特徴を備えた植物をエリート親と交雑する場合、遺伝子マーカを用いて、目的の特徴を有するだけではなく、所望の遺伝資源を比較的高い割合で備える子孫を選択することができる。このようにして、１つまたは複数の特徴を特定の遺伝的背景に侵入させるのに必要な世代数を最小限にする。
【０２６２】
本発明はまた、本発明の変異体を生成する方法にも関し、この方法は、（ａ）変異体の生成を可能にする条件下で、変異体をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物もしくは植物部分を培養するステップ；および（ｂ）変異体を回収するステップを含む。
【０２６３】
発酵ブロス配合物
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、本発明の変異体）を含む、発酵ブロス配合物にも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体をコードするポリペプチドを含む発酵ブロス配合物に関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０２６４】
発酵ブロス生成物はさらに、発酵工程で使用される追加成分、例えば、細胞（対象のポリペプチドを生成するのに用いられる、本発明のポリペプチド（例えば、本発明の変異体）をコードする遺伝子を含有する宿主細胞）、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および／または発酵産物も含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞および／または細胞残屑、ならびに培地を含有する細胞死滅発酵ブロスである。
【０２６５】
本明細書で使用される「発酵ブロス」という用語は、回収および／もしくは精製を全く経ないか、または最低限しか経ていない、細胞発酵により生成された調製物を指す。例えば、発酵ブロスは、微生物培養物を飽和まで増殖させ、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）および細胞培地中への分泌を可能にする炭素制限条件下でインキュベートする場合に生成される。発酵ブロスは、発酵終了時に得られる発酵材料の非分画または分画内容物を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは、非分画であり、例えば、遠心分離によって微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を除去した後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに生存可能および／または生存不能微生物細胞を含有する。
【０２６６】
一実施形態では、発酵ブロス配合物および細胞組成物は、少なくとも１つの炭素数１〜５の有機酸および／またはその塩を含む第１有機酸成分と、少なくとも１つの炭素数６以上の有機酸および／またはその塩を含む第２有機酸成分とを含む。具体的な実施形態では、第１有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、その塩、またはこれらの２種以上の混合物であり、第２有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチル吉草酸、フェニル酢酸、その塩、またはこれらの２種以上の混合物を含む。
【０２６７】
一態様では、組成物は、有機酸を含み、さらに任意選択で、死滅細胞および／または細胞残屑も含有する。一実施形態では、死滅細胞および／または細胞残屑を細胞死滅発酵ブロスから除去することにより、これらの成分を含まない組成物を取得する。
【０２６８】
発酵ブロス配合物または細胞組成物は、防腐剤および／または抗菌（例えば、静菌）剤をさらに含有してもよく、こうしたものとして限定されないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および当業者には周知の他のものが挙げられる。
【０２６９】
細胞死滅発酵ブロスまたは組成物は、発酵終了時に得られる発酵材料の非分画内容物を含有し得る。典型的には、細胞死滅発酵ブロスまたは組成物は、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を飽和まで増殖させ、タンパク質合成を可能にする炭素制限条件下でインキュベートした後に存在する使用済み培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、細胞死滅発酵ブロスまたは組成物は、使用済み細胞培地、細胞外酵素、ならびに死滅糸状真菌細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅発酵ブロスまたは組成物に存在する微生物細胞は、当分野で公知の方法を用いて、透過処理および／または溶解させることができる。
【０２７０】
本明細書に記載する発酵ブロスは、典型的に、液体であるが、不溶性成分、例えば、死滅細胞、細胞残屑、培地成分、および／または不溶性酵素を含有し得る。一部の実施形態では、不溶性成分を除去することにより、清澄にした液体組成物を取得してもよい。
【０２７１】
本発明の発酵ブロス配合物および細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレットまたは国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載されている方法によって生成することができる。
【０２７２】
酵素組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチド（例えば、本発明の変異体）を含む組成物にも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体を含む組成物に関し、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０２７３】
一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。好ましくは、組成物は、こうしたポリペプチドにおいて濃縮される。「濃縮される」という用語は、組成物のβ−グルカナーゼ活性が、例えば、少なくとも１．１の濃縮係数で、増加していることを示す。
【０２７４】
組成物は、主要酵素成分、例えば、単成分組成物として、本発明のポリペプチド（例えば、本発明の変異体）を含んでもよい。あるいは、組成物は、複数の酵素活性、例えば、以下：ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ、またはトランスフェラーゼ、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼからなる群から選択される１または複数種（例えば、数種）の酵素を含んでもよい。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２７５】
組成物は、当技術分野で公知の方法に従って調製してよく、液体または乾燥組成物の形態であってもよい。組成物は、当技術分野で公知の方法に従って安定化させてもよい。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２７６】
本発明の組成物の好ましい使用の例を以下に賦与する。組成物の用量および組成物が使用される他の条件は、当技術分野で公知の方法に基づいて決定され得る。
【０２７７】
使用
本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）または本発明の組成物は、β−グルカン（例えば、β−Ｄ−グルカン、β−１，３−１，４グルカン、混合結合β−グルカン、オオムギβ−グルカン、オートミールβ−グルカン）を分解する必要がある（例えば、アルカリ性条件下および／または酸化剤（例えば、漂白剤）の存在下で）用途に使用することができる。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体であって、変異体が、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する変異体の使用、または配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体を含む組成物であって、変異体が、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する組成物の使用に関し、上記の使用または使用される組成物は、β−グルカン、好ましくは、β−１，３−１，４グルカンなどのβ−Ｄ−グルカンを分解することを目的とし、任意選択で、７．５（もしくはそれ以上）のｐＨを有するアルカリ性条件下および／または酸化剤（例えば、漂白剤）の存在下で実施される使用である。
【０２７８】
一実施形態では、本発明の変異体または本発明の組成物は、β−グルカンを分解するために使用することができ、好ましくは、前記β−グルカンは、β−Ｄ−グルカンであり、さらに好ましくは、前記β−グルカンは、β−１，３−１，４グルカンであり、非常に好ましくは、前記β−グルカンは、混合結合β−グルカンであり、極めて好ましくは、前記β−グルカンは、オオムギβ−グルカンもしくはオートミールβ−グルカンであり；任意選択で、前記使用は、７．５（もしくはそれ以上）のｐＨを有するアルカリ性条件下および／または酸化剤（例えば、漂白剤）の存在下で実施される。
【０２７９】
一実施形態では、本発明の変異体または本発明の組成物は、自動食器洗浄（ＡＤＷ）を含む食器洗浄などの生地および／もしくは硬質表面の洗浄またはクリーニングに使用することができ；任意選択で、前記使用は、７．５（もしくはそれ以上）のｐＨを有するアルカリ性条件下および／または酸化剤（例えば、漂白剤）の存在下で実施される。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。β−グルカナーゼを使用することができる例として、洗剤用途、紙パルプ生産が挙げられる。一態様では、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）は、自動食器洗浄（ＡＤＷ）、手洗い洗浄（ＨＤＷ）を含む食器洗浄などの生地および／もしくは硬質表面の洗浄もしくはクリーニングのために、ならびに／または自動食器洗浄（ＡＤＷ）および業務用クリーニングを含む食器洗浄を含む洗濯もしくは硬質表面クリーニングなどのクリーニング工程において、ならびに／または自動食器洗浄（ＡＤＷ）をはじめとする食器洗浄を含む洗濯および／もしくは硬質表面クリーニングのために、ならびに／または以下：品目からのバイオフィルムおよび／もしくは悪臭の防止、抑制もしくは除去の少なくとも１つのために、ならびに／または再付着防止のために使用することができる。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２８０】
バイオフィルムは、微生物が品目上に存在し、品目上で一緒に付着する場合、生地上に発生し得る。ある微生物は、生地などの品目の表面に付着する傾向がある。ある微生物は、こうした表面に付着して、表面上にバイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、粘着性の場合があり、付着した微生物および／またはバイオフィルムは、除去するのが困難となり得る。さらに、バイオフィルムは、バイオフィルムの粘着性のために、汚れに付着する。市販されている商業洗濯洗剤は、このような付着した微生物もしくはバイオフィルムを除去しない。
【０２８１】
本発明は、品目からバイオフィルムを防止、抑制または除去するための、β−グルカナーゼ活性（例えば、本発明の変異体）を有するポリペプチドの使用に関し、ポリペプチドは、細菌ソースから得られ、品目は、生地である。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。本発明の一実施形態では、β−グルカナーゼ活性（例えば、本発明の変異体）を有するポリペプチドは、品目の粘着性を防止、抑制または除去するために使用される。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２８２】
組成物
本発明はまた、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明のポリペプチド、すなわち、本発明の変異体）を含む組成物にも関する。従って、本発明は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含む変異体を含む組成物に関し、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有する。
【０２８３】
本発明は、さらに、本発明のβ−グルカナーゼと１または複数種の別の酵素を含む組成物にも関する。本発明はまた、本発明のβ−グルカナーゼと１または複数種のアミラーゼを含む組成物にも関し、好ましくは、前記１または複数種のアミラーゼは、１または複数種のα−アミラーゼである。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２８４】
一実施形態では、本発明は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と好適な界面活性剤を含むクリーニング組成物および／または洗剤組成物に関する。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２８５】
一実施形態では、本発明は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と漂白剤を含む組成物、特にクリーニング組成物および／または洗剤組成物に関する。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２８６】
一実施形態では、洗剤組成物は、洗濯、特に、家庭ランドリー、食器洗浄または硬質表面クリーニングなどの特定の使用のために改変してもよい。
【０２８７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、クリーニングまたは洗剤組成物である。
【０２８８】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記変異体と前記１または複数種のアミラーゼは、相乗効果を有し；好ましくは、前記相乗効果は、ＲＥＭ相乗効果であり、より好ましくは、前記ＲＥＭ相乗効果は、約７．５のｐＨ、約４０℃で、約３０分間６．５を超え、さらに好ましくは、前記ＲＥＭ相乗効果は、約１０のｐＨ、約４０℃で、約３０分間６．１を超え、前記ＲＥＭ相乗効果は、約１０のｐＨ、約４０℃で、約３０分間６．２を超えるようにする。
【０２８９】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記変異体は、約７．５〜約１３．５のｐＨを有する水溶液中でβ−グルカナーゼ活性を有することができ、ここで、前記水溶液は、任意選択で漂白剤を含み、好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲にあり、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲にあり、極めて好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲にあるようにする。
【０２９０】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記変異体は、約２０℃〜約７５℃の範囲、および／または約４０℃〜約６０℃の範囲で選択される温度の水溶液中でβ−グルカナーゼ活性を示すことができ、ここで、前記水溶液は、任意選択で漂白剤を含むようにする。
【０２９１】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記変異体は、少なくとも１５分間、好ましくは、少なくとも３０分間、より好ましくは、少なくとも６０分間、さらに好ましくは、少なくとも９０分間、極めて好ましくは、少なくとも１２０分間、β−グルカナーゼ活性を有することができるようにする。
【０２９２】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、変異体のβ−グルカナーゼ活性は、アルカリβ−グルカナーゼ活性を含み、ここで、前記アルカリβ−グルカナーゼ活性は、ｐＨ７．５以上でβ−グルカナーゼ活性であるようにする。
【０２９３】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、変異体のβ−グルカナーゼ活性は、リケニナーゼＥＣ３．２．１．７３活性を含み、好ましくは、前記β−グルカナーゼ活性は、リケニナーゼＥＣ３．２．１．７３活性であるようにする。
【０２９４】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記アミラーゼは、α−アミラーゼであるようにする。
【０２９５】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、さらに、１または複数の洗剤成分を含む。
【０２９６】
一実施形態では、洗剤成分は、以下：界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルター、コビルダー、キレート剤、漂白剤成分、ポリマー、布地色相剤、布地コンディショナ、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光性白色化剤、香料、光学増白剤、殺菌剤、殺カビ剤、汚れ懸濁剤、汚れ遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素抑制剤、酵素安定剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、および溶解剤からなる群から選択される。
【０２９７】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、さらに、１または複数種の別の酵素を含む。
【０２９８】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、さらに、以下：ＤＮａｓｅ、ペルヒドロラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ヘミセルロース、キサンタナーゼ、キサンタンリアーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、アリールエステラーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラギナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、他のエンド−β−マンナナーゼ、エキソ−β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルカナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を含む。
【０２９９】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記組成物は、７．５以上のｐＨを有し、また、任意選択で、漂白剤を含み；好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１３．５の範囲で選択され、より好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲で選択され、極めて好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲で選択され、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲で選択されるようにする。
【０３００】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記α−アミラーゼは、以下のものからなる群から選択されるようにする：
（ａ）配列番号１３（国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３（国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および／または４４４の１つまたは複数に置換を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１４（国際公開第０２／０１０３５５号パンフレットの配列番号６に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド； 
（ｄ）配列番号１５（国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６の残基１〜３３と国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４の残基３６〜４８３を含む）のハイブリッドポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号１５（国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６の残基１〜３３と国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４の残基３６〜４８３を含む）のハイブリッドポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、ハイブリッドポリペプチドが、位置：４８、４９、１０７、１５６、１８１、１９０、１９７、２０１、２０９および／または２６４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号１６（国際公開第０２／０１９４６７号パンフレットの配列番号６に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号１６（国際公開第０２／０１９４６７号パンフレットの配列番号６に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２１２、２１６および／または２６９の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９（国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号２または配列番号７に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉ）配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９（国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号２または配列番号７に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１４０、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および／または４７６の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｊ）配列番号２０（国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｋ）配列番号２１（国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号２１（国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１７６、１７７、１７８、１７９、１９０、２０１、２０７、２１１および／または２６４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｍ）配列番号２２（国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２２（国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：８７、９８、１２５、１２８、１３１、１６５、１７８、１８０、１８１、１８２、１８３、２０１、２０２、２２５、２４３、２７２、２８２、３０５、３０９、３１９、３２０、３５９、４４４および／または４７５の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：２８、１１８、１７４；１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８９、１９５、２０２、２９８、２９９、３０２、３０３、３０６、３１０、３１４；３２０、３２４、３４５、３９６、４００、４３９、４４４、４４５、４４６、４４９、４５８、４７１および／または４８４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｐ）配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｒ）配列番号１２（国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および／または４４４の１つまたは複数に置換を含むポリペプチド；
（ｓ）配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；ならびに
（ｔ）配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１８７、２０３、４７６、４５８、４５９、４６０、１７８、１７９、１８０、１８１、７、２００、１２６、１３２、３０３、４７７、１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および／または４４４の１つまたは複数に置換を含むポリペプチド。
【０３０１】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記組成物は、アルカリ性条件下で、向上した安定性および／または性能を有し、好ましくは、前記アルカリ性条件は、ｐＨ７．５以上を有するようにする。
【０３０２】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記組成物は、以下：バー、均質タブレット、２つ以上の層を有するタブレット、１つまたは複数のコンパートメントを有するポーチ、通常または圧縮粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または通常、圧縮もしくは濃縮液体からなる群から選択される形態であるようにする。
【０３０３】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記クリーニングまたは洗剤組成物は、クリーニングまたは洗剤用途に酵素洗浄性利益を有するようにする。
【０３０４】
一実施形態では、本発明のクリーニングまたは洗剤組成物は、本発明の変異体と１または複数種のアミラーゼを含み、その際、前記クリーニングまたは洗剤組成物は、向上した安定性および／または性能を有し、好ましくは、前記の向上した安定性および／または性能が、ｐＨ７．５（もしくはそれ以上）を有するアルカリ性条件下、および／または酸化剤（例えば、漂白剤）の存在下で達成されるようにする。
【０３０５】
一実施形態では、本発明は、表面から汚れを除去する方法に関し、これは、表面を本発明の組成物と接触させるステップを含む。
【０３０６】
高いｐＨを有するアルカリ性液体洗剤は、洗濯および食器洗浄クリーニングなどのクリーニングに広く使用されている。高いｐＨを有する液体洗剤は、特に、北アメリカの消費者により一般的に使用されている。高ｐＨクリーニング組成物も、業務用クリーニング工程で使用されている。アルカリ性洗剤は、洗剤特性を有する液体を含む。こうした洗剤のｐＨは、通常、９〜１２．５の範囲のｐＨを有する。高ｐＨ洗剤は、典型的に、界面活性剤、ビルダーおよび漂白剤成分を含み、さらに、有意な量の水ならびにＮａＯＨ、ＴＳＰ（リン酸三ナトリウム）、アンモニア、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム（ＫＯＨ）などのアルカリも含有し、これらのアルカリは、通常、０．１〜３０重量％（ｗｔ）に対応する量で添加される。洗剤に酵素を添加することは、これらの酵素の特定の活性が、生地およびカトラリーなどの表面から特定の汚れを効果的に除去するため、極めて有利である。しかし、高ｐＨ液体洗剤中に許容可能な酵素安定性を維持するのが困難であるために、これらの洗剤への酵素の含有は長年にわたって禁止されている。別の実施形態では、本発明は、こうした組成物における使用に好適な本発明のアルカリ安定性β−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む高ｐＨ液体クリーニング組成物に関する。
【０３０７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、約７．５、少なくとも約８、少なくとも約９のｐＨ、好ましくはｐＨ１０以上をもたらすために、アルカリ性緩衝液系を含有するのが好ましい。好ましくは、ｐＨは、約９〜約１３である。高ｐＨを達成するためには、生成物について所望されるｐＨに応じて、通常、組成物の０．１〜約３０重量％（重量パーセント、略してｗｔ％）の量でアルカリ金属水酸化物、特に水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウム、ならびに好ましくは１．０〜２．５％、もしくはそれ以上の量の好適なアルカリ金属ケイ酸塩、例えば、金属ケイ酸塩を存在させることが必要である。
【０３０８】
別の実施形態では、本発明の組成物は、約７．５以上のｐＨを有し、任意選択で、漂白剤を含み；好ましくは、前記ｐＨは約７．５〜約１３．５の範囲で選択され、さらに好ましくは、前記ｐＨは約７．５〜約１２．５の範囲で選択され、非常に好ましくは、前記ｐＨは約８．５〜約１１．５の範囲で選択され、極めて好ましくは、前記ｐＨは約９．５〜約１０．５の範囲で選択される。
【０３０９】
本発明の洗剤組成物は、例えば、汚れた布地の前処理に好適なランドリー添加剤組成物およびリンス添加布地柔軟剤組成物をはじめとする、手洗いもしくは機械洗濯洗剤組成物として製剤化してもよいし、または一般的な家庭硬質表面クリーニング作業で使用するための洗剤組成物として製剤化してもよいし、または手洗いもしくは機械食器洗浄作業のために製剤化してもよい。本発明の洗剤組成物は、硬質表面クリーニング、自動食器洗浄用途、ならびに義歯、歯、毛髪および皮膚などの美容用途において有用となり得る。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１０】
本発明の洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、バー、タブレット、粉末、顆粒、ペーストまたは液体であってよい。液体洗剤は、典型的に、最大７０％の水と０〜３０％の有機溶媒を含有する水性であってもよいし、または非水性であってもよい。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１１】
別段注記されていない限り、本明細書に記載される全ての成分または組成物レベルは、その成分または組成物の活性レベルに準拠するものであり、市販のソースに存在し得る不純物、例えば、残留溶媒または副生成物は除外する。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１２】
本発明のβ−グルカナーゼは、通常、組成物の重量に基づき、０．０００００１％〜２％の酵素タンパク質、好ましくは、０．００００１％〜１％の酵素タンパク質、より好ましくは、０．０００１％〜０．７５％の酵素タンパク質、さらに好ましくは、０．００１％〜０．５％の酵素タンパク質のレベルで、洗剤組成物中に組み込まれる。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１３】
さらに、本発明のβ−グルカナーゼは、通常、洗浄水中のその濃度が、洗浄水中０．００００００１％〜１％の酵素タンパク質のレベル、好ましくは、０．０００００５％〜０．０１％の酵素タンパク質のレベル、より好ましくは、０．０００００１％〜０．００５％の酵素タンパク質のレベル、さらに好ましくは、０．００００１％〜０．００１％の酵素タンパク質のレベルとなるような量で、洗剤組成物の中に組み込まれる。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１４】
よく知られているように、酵素の量は、具体的な用途に応じて、および／または組成物に含まれる他の成分によっても変動し得る。
【０３１５】
例えば、自動食器洗浄（ＡＤＷ）に使用する組成物は、組成物の重量に基づき、０．００１％〜５０％、例えば０．０１％〜２５％、例えば０．０２％〜２０％、例えば０．１％〜１５％の酵素タンパク質を含有してもよい。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチドと１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１６】
例えば、洗濯用顆粒に使用する組成物は、組成物の重量に基づき、０．０００１％〜５０％、例えば０．００１％〜２０％、例えば０．０１％〜１５％、例えば０．０５％〜１０％の酵素タンパク質を含有してもよい。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１７】
例えば、洗濯用液体に使用する組成物は、組成物の重量に基づき、０．０００１％〜１０％、例えば０．００１％〜７％、例えば０．１％〜５％の酵素タンパク質を含有してもよい。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１８】
一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載される洗剤組成物は、典型的に、水洗浄作業中に、洗浄水が、約５．０〜約１３．５、または別の実施形態では、約６．０〜約１０．５、例えば、約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９、または約７〜約８のｐＨを有するように配合される。好ましくは、本明細書に記載される洗剤組成物は、典型的に、水洗浄作業中に、洗浄水が、約７．５〜約１３．５の範囲で選択されるｐＨを有し、より好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲で選択され、非常に好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲で選択され；極めて好ましくはｐＨ７．５以上を有するように配合される。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３１９】
一実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）は、既知のβ−グルカナーゼと比較して、高ｐＨ液体クリーニング組成物において向上した安定性、特に向上した貯蔵安定性を有する。好ましい実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼは、既知のβ−グルカナーゼと比較して、向上した安定性、特に向上した貯蔵安定性、ならびに同等または向上した洗浄性能を有する。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３２０】
一実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）は、親と比較して向上した特性を有し、向上した特性は、高い酸化安定性である。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３２１】
一部の好ましい実施形態では、顆粒または液体洗濯洗剤は、洗浄水が、約５．５〜約８のｐＨを有するように製剤化される。他の好ましい実施形態では、顆粒または液体洗濯洗剤は、洗浄水が、約７．５〜約１３．５の範囲で選択されるｐＨを有し、より好ましくは、前記ｐＨは約８．５〜約１１．５の範囲で選択され、非常に好ましくは、前記ｐＨは約９．５〜約１０．５の範囲で選択され、極めて好ましくは、前７．５以上のｐＨを有するように配合される。推奨される使用レベルにｐＨを制御する技術は、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用を含み、当業者には周知である。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３２２】
酵素成分の重量は、総タンパク質に基づく。パーセンテージおよび比は全て、別段記載のない限り、重量に基づき計算する。パーセンテージおよび比は全て、別段記載のない限り、総組成物に基づいて計算する。例示した洗剤組成物では、酵素レベルは、総組成物の重量に基づき、純粋な酵素により表され、別段記載のない限り、洗剤成分は、総組成物の重量に基づき表される。
【０３２３】
本発明の酵素は、洗剤添加剤にも有用である。本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む洗剤添加剤は、例えば、温度が、約４０℃以下のように低く、ｐＨが６〜８で、洗浄時間が、例えば３０分未満のように短い場合の洗浄工程に導入するのに適している。本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む洗剤添加剤は、例えば、ｐＨが約７．５〜約１３．５の範囲で選択され、温度が約２０℃〜約７５℃の範囲で選択され、且つ洗浄時間が、例えば、３０分未満、例えば、少なくとも１５分であるアルカリ性洗浄工程への導入に、さらに理想的に適している。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３２４】
洗剤添加剤は、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）と、好ましくは別の酵素であってよい。一実施形態では、添加剤は、洗浄工程への添加のための剤形にパッケージングする。単一剤形は、粉末および／もしくは液体を含む丸剤、タブレット、ジェルカプセルまたは他の単一剤形単位を含み得る。一部の実施形態では、充填材および／またはキャリア材料が含まれ、好適な充填材またはキャリア材料として、限定されないが、硫酸塩、炭酸塩およびケイ酸塩などの様々な塩ならびにタルク、粘土などが挙げられる。一部の実施形態では、液体組成物のための充填材および／またはキャリア材料は、水ならびに／またはポリオールおよびジオールをはじめとする、低分子第１級アルコールおよび第２級アルコールが挙げられる。こうしたアルコールの例として、限定されないが、メタノール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノールが挙げられる。
【０３２５】
特に好ましい一実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）は、顆粒組成物または液体に使用され、β−グルカナーゼは、カプセル化粒子の形態であってもよい。一実施形態では、カプセル化材料は、炭水化物、天然もしくは合成ガム、キチンおよびキトサン、セルロースおよびセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックスならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０３２６】
本発明の組成物は、典型的に、１または複数種の洗剤成分を含む。洗剤組成物という用語は、物品ならびにクリーニングおよびトリートメント組成物を含む。洗剤組成物という用語は、別段記載のない限り、タブレット、顆粒もしくは粉末状の汎用または「ヘビー・デューティ（ｈｅａｖｙ−ｄｕｔｙ）」洗浄剤、特に洗濯洗剤；液体、ゲルもしくはペースト状の汎用洗浄剤、特にいわゆるヘビー・デューティ液体タイプ；デリケート布地用液体洗剤；手洗い食器洗浄剤またはライト・デューティ（ｌｉｇｈｔ  ｄｕｔｙ）食器洗浄剤、特に高起泡タイプのもの；例えば、家庭および施設での使用のための多様なタブレット、顆粒、液体およびリンス補助タイプをはじめとする機械食器洗浄剤を含む。組成物は、単位用量パッケージの形態であってもよく、当技術分野で公知のもの、および水溶性、不水溶性および／または水透過性のものを含む。
【０３２７】
クリーニングおよび／または洗剤成分が、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）と適合性でない可能性がある実施形態では、好適な方法を用いて、２つの成分の組み合わせが適切になるまで、クリーニングおよび／または洗剤成分とβ−グルカナーゼを分離した（すなわち、互いに接触しない）状態に維持することができる。こうした分離方法としては、当技術分野で公知の任意の好適な方法（例えば、ジェルカプセル、カプセル化、タブレット、および例えば、１つまたは複数のコンパートメントを有する水溶性ポーチの使用による物理的分離）が挙げられる。
【０３２８】
記述するように、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）が、洗剤組成物（例えば、洗濯洗剤組成物、または食器洗浄洗剤組成物）の成分として使用される場合、これを、例えば、無粉塵性顆粒、安定化液体、または保護酵素の形態の洗剤組成物中に含有させてもよい。無粉塵性顆粒は、例えば、米国特許第４，１０６，９９１号明細書および同第４，６６１，４５２号明細書（いずれも、Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉ  Ａ／Ｓ）に開示されるように製造することができ、任意選択で、当技術分野で公知の方法によりコーティングしてもよい。ワキシーコーティング材料の例としては、平均分子量１０００〜２００００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）製剤；１６〜５０エチレンオキシド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが１２〜２０炭素原子を含み、且つ１５〜８０エチレンオキシド単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；ならびに脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリグリセリドがある。流動層技術による適用に好適な膜形成コーティング材料の例は、英国特許第１４８３５９１号明細書に記載されている。
【０３２９】
一部の実施形態では、本明細書で使用される酵素は、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）および／またはマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性ソースの存在により、最終的組成物中で安定化され、最終組成物は、こうしたイオン、ならびに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、およびオキソバナジウム（ＩＶ）を酵素に賦与する。本発明の洗剤組成物の酵素はまた、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖または糖アルコール、乳酸などの従来の安定剤を用いて安定化することもでき、組成物は、例えば、国際公開第９２／１９７０９号パンフレットおよび同第９２／１９７０８号パンフレットに記載されている通りに製剤化してもよい。本発明の酵素はまた、例えば、タンパク質タイプ（欧州特許第５４４７７７号明細書に記載の通り）またはボロン酸タイプの可逆性酵素阻害剤を添加することによっても安定化することができる。他の酵素安定剤は、ペプチドアルデヒドおよびタンパク質水和物のように当技術分野で公知であり、本発明のβ−グルカナーゼは、国際公開第２００５／１０５８２６号パンフレットおよび同第２００９／１１８３７５号パンフレットに記載されるようなペプチドアルデヒドまたはケトンを用いて安定化され得る。
【０３３０】
本発明の洗剤組成物に含有させる保護酵素は、前述したように、欧州特許第２３８２１６号明細書に開示される方法に従って調製することができる。
【０３３１】
組成物は、バイオフィルムの形成を防止または除去するための１または複数種の物質を増加してもよい。これらの物質は、限定されないが、分散剤、界面活性剤、洗剤、他の酵素、殺菌剤、殺生物剤を含み得る。
【０３３２】
本発明の組成物は、自動注入装置で使用される注入要素に適用してもよい。本発明の組成物を含む注入要素は、国際公開第２００７／０５２００４号パンフレットおよび同第２００７／０８３３１４１号パンフレットに記載される送達カートリッジ中に配置することができる。注入要素は、国際公開第２００７／０５１９８９号パンフレットの事例に記載されるように、細長い形状を有し、送達カートリッジを形成するアレイ中に設置することができ、このカートリッジは、自動注入装置の詰め替え容器である。送達カートリッジは、国際公開第２００８／０５３１９１号パンフレットに記載されるような自動注入装置に配置される。
【０３３３】
自動注入装置の好適な開示は、国際公開第２００７／０８３１３９号パンフレット、同第２００７／０５１９８９号パンフレット、同第２００７／０８３１４１号パンフレット、同第２００７／０８３１４２号パンフレット、および欧州特許第２３６１９６４号明細書に見出すことができる。
【０３３４】
他の酵素
一実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）は、１または複数種の酵素、例えば少なくとも２種の酵素、より好ましくは少なくとも３種の酵素、４または５種の酵素と組み合わせる。好ましくは、酵素は、異なる基質特異性、例えば、タンパク質分解活性、アミロース分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロース分解活性またはペクチン分解活性を有する。一実施形態は、本発明のβ−グルカナーゼポリペプチド（例えば、本発明の変異体）と１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物である。
【０３３５】
洗剤添加剤ならびに洗剤組成物は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼおよび／またはペロキシダーゼなどの１または複数種の酵素を含んでもよい。
【０３３６】
一般に、洗濯される酵素の特性は、選択される洗剤と適合性（すなわち、最適ｐＨ、他の酵素および非酵素成分などとの適合性）であるべきであり、酵素は、有効量で存在すべきである。
【０３３７】
セルラーゼ：好適なセルラーゼは、動物、植物または細菌由来のものを含む。特に好適なセルラーゼは、細菌または真菌由来のものを含む。化学的に修飾された変異体またはタンパク質改変変異体が含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）由来のセルラーゼ、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書、米国特許第５，６４８，２６３号明細書、米国特許第５，６９１，１７８号明細書、米国特許第５，７７６，７５７号明細書および国際公開第８９／０９２５９号パンフレットに開示されている、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から産生される真菌セルラーゼが挙げられる。
【０３３８】
特に好適なセルラーゼは、カラーケア利益を有するアルカリ性または中性セルラーゼである。このようなセルラーゼの例は、欧州特許第０  ４９５  ２５７号明細書、欧州特許第０  ５３１  ３７２号明細書、国際公開第９６／１１２６２号パンフレット、国際公開第９６／２９３９７号パンフレット、国際公開第９８／０８９４０号パンフレットに記載されているセルラーゼである。他の例は、国際公開第９４／０７９９８号パンフレット、欧州特許第０  ５３１  ３１５号明細書、米国特許第５，４５７，０４６号明細書、米国特許第５，６８６，５９３号明細書、米国特許第５，７６３，２５４号明細書、国際公開第９５／２４４７１号パンフレット、国際公開第９８／１２３０７号パンフレットおよび国際公開第１９９９／００１５４４号パンフレットに記載されているものなどのセルラーゼ変異体である。
【０３３９】
市販されているセルラーゼとしては、Ｃｅｌｌｕｚｙｍｅ（登録商標）、およびＣａｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）、Ｃｌａｚｉｎａｓｅ（登録商標）、およびＰｕｒａｄａｘ  ＨＡ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、ならびにＫＡＣ−５００（Ｂ）（登録商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【０３４０】
プロテアーゼ：好適なプロテアーゼは、細菌、真菌、植物、ウイルスもしくは動物由来、例えば、微生物または野菜由来のものを含む。微生物由来のものが好ましい。化学的に修飾された変異体またはタンパク質改変変異体が含まれる。これは、セリンプロテアーゼまたはメタロプロテアーゼなどのアルカリ性プロテーゼであってよい。セリンプロテアーゼは、例えば、Ｓ１ファミリー、例えば、トリプシン、またはスブチリシンなどのＳ８ファミリーのものであってよい。メタロプロテアーゼプロテアーゼは、例えば、ファミリーＭ４由来のサーモリシン、またはＭ５、Ｍ７もしくはＭ８ファミリーのものなどの他のメタロプロテアーゼであってよい。
【０３４１】
「スブチラーゼ」という用語は、Ｓｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｎｇ．４（１９９１）７１９−７３７およびＳｉｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６（１９９７）５０１−５２３による、セリンプロテアーゼの亜群を指す。セリンプロテアーゼは、活性部位にセリンを有することを特徴とするプロテアーゼの亜群であり、これは、基質と一緒に共有結合付加体を形成する。スブチラーゼは、６つの亜門、すなわち、スブチリシンファミリー、サーミターゼ（Ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ）ファミリー、プロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ）ファミリー、ランチビオチック（Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）ペプチダーゼファミリー、ケキシン（Ｋｅｘｉｎ）ファミリーおよびピロリシン（Ｐｙｒｏｌｙｓｉｎ）ファミリーにさらに分類することができる。
【０３４２】
スブチラーゼの例は、米国特許第７２６２０４２号明細書および国際公開第０９／０２１８６７号明細書に記載されている、例えば、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）およびバチルス・ギブソニ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるもの、ならびに国際公開第８９／０６２７９号パンフレットに記載されているスブチリシン・レンツス（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｌｅｎｔｕｓ）、スブチリシン・ノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｎｏｖｏ）、スブチリシン・カールスバーグ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、スブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）ＢＰＮ’、スブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）３０９、スブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）１４７およびスブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）１６８、ならびに（国際公開第９３／１８１４０号パンフレット）に記載されているプロテアーゼＰＤ１３８である。その他の有用なプロテアーゼは、国際公開第９２／１７５１７７号パンフレット、国際公開第０１／０１６２８５号パンフレット、国際公開第０２／０２６０２４号パンフレットおよび国際公開第０２／０１６５４７号パンフレットに記載されているものであり得る。トリプシン様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタまたはウシ由来）、ならびに国際公開第８９／０６２７０号パンフレット、国際公開第９４／２５５８３号パンフレットおよび国際公開第０５／０４０３７２号パンフレットに記載されているフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）プロテアーゼ、ならびに国際公開第０５／０５２１６１号パンフレットおよび国際公開第０５／０５２１４６号パンフレットに記載されているセルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）から得られるキモトリプシンプロテアーゼである。
【０３４３】
別の好ましいプロテアーゼは、例えば、国際公開第９５／２３２２１号パンフレットに記載されているバチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）ＤＳＭ５４８３からのアルカリプロテアーゼであり、ならびに国際公開第９２／２１７６０号パンフレット、国際公開第９５／２３２２１号パンフレット、欧州特許第１９２１１４７号明細書および欧州特許第１９２１１４８号明細書に記載されているその変異体である。
【０３４４】
メタロプロテアーゼの例は、国際公開第０７／０４４９９３号明細書（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔ．）に記載されている中性メタロプロテアーゼ、例えば、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られるものなどである。
【０３４５】
有用なプロテアーゼの例は、国際公開第９２／１９７２９号パンフレット、国際公開第９６／０３４９４６号パンフレット、国際公開第９８／２０１１５号パンフレット、国際公開第９８／２０１１６号パンフレット、国際公開第９９／０１１７６８号パンフレット、国際公開第０１／４４４５２号パンフレット、国際公開第０３／００６６０２号パンフレット、国際公開第０４／０３１８６号パンフレット、国際公開第０４／０４１９７９号パンフレット、国際公開第０７／００６３０５号パンフレット、国際公開第１１／０３６２６３号パンフレット、国際公開第１１／０３６２６４号パンフレットに記載されている変異体であって、特に、ＢＰＮ’番号付けを用いて、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：３、４、９、１５、２７、３６、５７、６８、７６、８７、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１１８、１２０、１２３、１２８、１２９、１３０、１６０、１６７、１７０、１９４、１９５、１９９、２０５、２０６、２１７、２１８、２２２、２２４、２３２、２３５、２３６、２４５、２４８、２５２および２７４。より好ましいスブチラーゼ変異体は、次の突然変異を有し得る：Ｓ３Ｔ、Ｖ４Ｉ、Ｓ９Ｒ、Ａ１５Ｔ、Ｋ２７Ｒ，＊３６Ｄ、Ｖ６８Ａ、Ｎ７６Ｄ、Ｎ８７Ｓ，Ｒ、＊９７Ｅ、Ａ９８Ｓ、Ｓ９９Ｇ，Ｄ，Ａ、Ｓ９９ＡＤ、Ｓ１０１Ｇ，Ｍ，Ｒ  Ｓ１０３Ａ、Ｖ１０４Ｉ，Ｙ，Ｎ、Ｓ１０６Ａ、Ｇ１１８Ｖ，Ｒ、Ｈ１２０Ｄ，Ｎ、Ｎ１２３Ｓ、Ｓ１２８Ｌ、Ｐ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ａ、Ｇ１６０Ｄ、Ｙ１６７Ａ、Ｒ１７０Ｓ、Ａ１９４Ｐ、Ｇ１９５Ｅ、Ｖ１９９Ｍ、Ｖ２０５Ｉ、Ｌ２１７Ｄ、Ｎ２１８Ｄ、Ｍ２２２Ｓ、Ａ２３２Ｖ、Ｋ２３５Ｌ、Ｑ２３６Ｈ、Ｑ２４５Ｒ、Ｎ２５２Ｋ、Ｔ２７４Ａ（ＢＰＮ’番号付けを用いて）。
【０３４６】
好適な市販されているプロテアーゼ酵素としては、次の商品名：Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｌａｓｅ（商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）、Ｒｅｌａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｃｏｒｏｎａｓｅ（登録商標）Ｕｌｔｒａ、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）およびＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）で販売されているもの、次の商品名：Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ（商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＭＡ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  Ｏｘ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ  ＯｘＰ（登録商標）、Ｐｕｒａｍａｘ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）、ＦＮ２（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、ＦＮ５（登録商標）、ＦＮ６（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）およびＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ）、Ａｘａｐｅｍ（商標）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｓｅｓ  Ｎ．Ｖ．）、ＢＬＡＰ（米国特許第５３５２６０４号明細書の図２９に示される配列）およびその変異体（Ｈｅｎｋｅｌ  ＡＧ）、ならびにＫＡＰ（バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）スブチリシン）（花王株式会社から）で販売されているものが挙げられる。
【０３４７】
リパーゼ：好適なリパーゼは、動物、植物または細菌由来のものを含む。特に好適なリパーゼは、細菌または真菌由来のものを含む。化学的に修飾された変異体またはタンパク質改変変異体が含まれる。有用なリパーゼの例としては、例えば、欧州特許第２５８  ０６８号明細書および欧州特許第３０５  ２１６号明細書に記載されているフミコラ・ラヌギノーサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）（Ｔ．ラヌギノスス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）または国際公開第９６／１３５８０号パンフレットに記載のＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）といったフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（テルモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）の同義語）由来のリパーゼ；例えば、Ｐ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）またはＰ．シュードアルカリアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（欧州特許第２１８  ２７２号明細書）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）（欧州特許第３３１  ３７６号明細書）、Ｐ．スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（英国特許第１，３７２，０３４号明細書）、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＳＤ７０５株（国際公開第９５／０６７２０号パンフレットおよび国際公開第９６／２７００２号パンフレット）、Ｐ．ウィスコンシネンシス（Ｐ．ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）（国際公開第９６／１２０１２号パンフレット）由来のシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）リパーゼ、例えば、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１１３１：  ２５３−３６０）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（日本国特許第６４／７４４９９２号明細書）またはＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）（国際公開第９１／１６４２２号パンフレット）由来のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リパーゼが挙げられる。
【０３４８】
他の例は、国際公開第９２／０５２４９号パンフレット、国際公開第９４／０１５４１号パンフレット、欧州特許第４０７  ２２５号明細書、欧州特許第２６０  １０５号明細書、国際公開第９５／３５３８１号パンフレット、国際公開第９６／００２９２号パンフレット、国際公開第９５／３０７４４号パンフレット、国際公開第９４／２５５７８号パンフレット、国際公開第９５／１４７８３号パンフレット、国際公開第９５／２２６１５号パンフレット、国際公開第９７／０４０７９号パンフレットおよび国際公開第９７／０７２０２号パンフレットに記載のものなどのリパーゼ変異体である。
【０３４９】
好ましい市販されているリパーゼ酵素としては、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｐｏｌａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（商標）、Ｌｉｐｅｘ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【０３５０】
アミラーゼ：本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）と一緒に用いることができる、好適なアミラーゼは、α−アミラーゼまたはグルコアミラーゼであってよく、細菌または真菌由来のいずれであってもよい。化学的に修飾された変異体またはタンパク質改変変異体が含まれる。アミラーゼとしては、例えば、英国特許第１，２９６，８３９号明細書に、より詳細に記載されているバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の特殊な系統といった、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得られるα−アミラーゼが挙げられる。好適なアミラーゼとしては、国際公開第９５／１０６０３号パンフレットに記載の配列番号３を有するアミラーゼ、またはその配列番号３に対して９０％の配列同一性を有する変異体が挙げられる。好ましい変異体は、国際公開第９４／０２５９７号パンフレット、国際公開第９４／１８３１４号パンフレット、国際公開第９７／４３４２４号パンフレット、ならびに国際公開第９９／０１９４６７号パンフレットの配列番号４に記載され、例えば、以下の１つまたは複数の位置に置換を伴う変異体である：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および４４４。別の好適なアミラーゼとして、国際公開第０２／０１０３５５号パンフレットに記載の配列番号６を有するアミラーゼ、または配列番号６に対して９０％の配列同一性を有する変異体が挙げられる。配列番号６の好ましい変異体は、１８１位および１８２位に欠失を有し、１９３位に置換を有するものである。好適な他のアミラーゼは、国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６に示されるＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られるα−アミラーゼの残基１〜３３と、国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４に示されるＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの残基３６〜４８３を含むハイブリッドα−アミラーゼまたはそれらに９０％の配列同一性を有する変異体である。このハイブリッドα−アミラーゼの好ましい変異体は、以下の１つまたは複数の位置に置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である：Ｇ４８、Ｔ４９、Ｇ１０７、Ｈ１５６、Ａ１８１、Ｎ１９０、Ｍ１９７、Ｉ２０１、Ａ２０９およびＱ２６４。国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットに記載の配列番号６に示されるＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られるα−アミラーゼの残基１〜３３と、配列番号４の残基３６〜４８３を含むハイブリッドα−アミラーゼの最も好ましい変異体は、以下の置換を有するものである：
Ｍ１９７Ｔ；
Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；または
Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｉ２０１Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ。
【０３５１】
好適なさらに別のアミラーゼは、国際公開第９９／０１９４６７号パンフレットに記載の配列番号６を有するアミラーゼまたは配列番号６に対して９０％の配列同一性を有する変異体である。配列番号６の好ましい変異体は、以下の位置：Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｈ１８３、Ｇ１８４、Ｎ１９５、Ｉ２０６、Ｅ２１２、Ｅ２１６およびＫ２６９の１つまたは複数の置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である。特に好ましいアミラーゼは、Ｒ１８１およびＧ１８２位、またはＨ１８３およびＧ１８４位に欠失を有するものである。用いることができる別のアミラーゼは、国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号３、配列番号２もしくは配列番号７を有するもの、または配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号７に対して９０％配列同一性を有する変異体である。配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号７の好ましい変異体は、以下の位置：１４０、１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２１２、２４３、２６０、２６９、３０４および４７６の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である。より好ましい変異体は、１８１位と１８２位、または１８３位と１８４位に欠失を有するものである。配列番号１、配列番号２もしくは配列番号７のより好ましいアミラーゼ変異体は、１８３位および１８４位における欠失と、次の位置：１４０、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および４７６の１つまたは複数に置換を有するものである。用いることができる他のアミラーゼは、国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０を有するアミラーゼ、または国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２に対して９０％の配列同一性を有する変異体もしくは国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０に対して９０％の配列同一性を有する変異体である。国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０の好ましい変異体は、以下の位置：１７６、１７７、１７８、１７９、１９０、２０１、２０７、２１１および２６４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である。さらに別の好適なアミラーゼは、国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２を有するアミラーゼまたはその配列番号２に対して９０％の配列同一性を有する変異体である。配列番号２の好ましい変異体は、Ｃ末端の切断および／または以下の位置：Ｑ８７、Ｑ９８、Ｓ１２５、Ｎ１２８、Ｔ１３１、Ｔ１６５、Ｋ１７８、Ｒ１８０、Ｓ１８１、Ｔ１８２、Ｇ１８３、Ｍ２０１、Ｆ２０２、Ｎ２２５、Ｓ２４３、Ｎ２７２、Ｎ２８２、Ｙ３０５、Ｒ３０９、Ｄ３１９、Ｑ３２０、Ｑ３５９、Ｋ４４４およびＧ４７５の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である。配列番号２のより好ましい変異体は、以下の位置：Ｑ８７Ｅ，Ｒ、Ｑ９８Ｒ、Ｓ１２５Ａ、Ｎ１２８Ｃ、Ｔ１３１Ｉ、Ｔ１６５Ｉ、Ｋ１７８Ｌ、Ｔ１８２Ｇ、Ｍ２０１Ｌ、Ｆ２０２Ｙ、Ｎ２２５Ｅ，Ｒ、Ｎ２７２Ｅ，Ｒ、Ｓ２４３Ｑ，Ａ，Ｅ，Ｄ、Ｙ３０５Ｒ、Ｒ３０９Ａ、Ｑ３２０Ｒ、Ｑ３５９Ｅ、Ｋ４４４ＥおよびＧ４７５Ｋの１つまたは複数における置換、ならびに／または以下の位置：Ｒ１８０および／もしくはＳ１８１またはＴ１８２および／もしくはＧ１８３における欠失を伴うものである。配列番号２の最も好ましいアミラーゼ変異体は、以下の置換：
Ｒ１８０＊＋Ｓ１８１＊＋Ｓ２４３Ｑ＋Ｇ４７５Ｋ
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ；
Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｆ２０２Ｙ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｄ３１９Ｔ＋Ｇ４７５Ｋ；
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ；または
Ｓ１２５Ａ＋Ｎ１２８Ｃ＋Ｔ１３１Ｉ＋Ｔ１６５Ｉ＋Ｋ１７８Ｌ＋Ｔ１８２Ｇ＋Ｙ３０５Ｒ＋Ｇ４７５Ｋ
を有するものであり、変異体は、Ｃ末端で切断されており、任意選択で、２４３位の置換ならびに／または１８０位および／もしくは１８１位の欠失をさらに含む。
【０３５２】
さらに別の好適なアミラーゼは、国際公開第１３１８４５７７号パンフレットの配列番号１を有するアミラーゼ、またはその配列番号１に対して９０％の配列同一性を有する変異体である。配列番号１の好ましい変異体は、以下の位置：Ｎ１２６、Ｅ１３２、Ｋ１７６、Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｉ２０３、Ｓ２４１、Ｙ３０３、Ｒ４５８、Ｔ４５９、Ｄ４６０、Ｇ４７６およびＧ４７７の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である。配列番号１のより好ましい変異体は、以下の位置：Ｎ１２６Ｙ、Ｅ１３２ＨＹ、Ｋ１７６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２ＦＹＨ、Ｍ１９９Ｌ、Ｉ２０３ＹＦ、Ｓ２４１ＱＡＤＮ、Ｙ３０３ＤＮ、Ｒ４５８Ｎ、Ｔ４５９Ｓ、Ｄ４６０Ｔ、Ｇ４７６ＫおよびＧ４７７Ｋの１つまたは複数における置換、ならびに／または以下の位置：Ｒ１７８および／もしくはＳ１７９またはＴ１８０および／もしくはＧ１８１における欠失を伴うものである。配列番号１の最も好ましいアミラーゼ変異体は、以下の置換：
Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｇ４７６Ｋ
Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｒ４５８Ｎ＋Ｔ４５９Ｓ＋Ｄ４６０Ｔ＋Ｇ４７６Ｋ
Ｎ１２６Ｙ＋Ｔ１８０Ｄ＋Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｙ３０３Ｄ＋Ｇ４７６Ｔ
Ｎ１２６Ｙ＋Ｅ１３２Ｈ＋Ｔ１８０Ｄ＋Ｅ１８７Ｐ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｙ３０３Ｄ＋Ｇ４７６Ｔ＋Ｇ４７７Ｅ
Ｎ１２６Ｙ＋Ｆ１５３Ｗ＋Ｔ１８０Ｈ＋Ｉ２０３Ｙ＋Ｓ２３９Ｑ
を有するものであり、変異体は、任意選択で、２４１位の置換ならびに／または１７８位および／もしくは１７９位または１８０位および／もしくは１８１位の欠失をさらに含む。
【０３５３】
他の好適なアミラーゼは、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットに記載の配列番号１２を有するα−アミラーゼまたは配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体である。好ましいアミラーゼ変異体は、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットに記載される配列番号１２の以下の位置：Ｒ２８、Ｒ１１８、Ｎ１７４；Ｒ１８１、Ｇ１８２、Ｄ１８３、Ｇ１８４、Ｇ１８６、Ｗ１８９、Ｎ１９５、Ｍ２０２、Ｙ２９８、Ｎ２９９、Ｋ３０２、Ｓ３０３、Ｎ３０６、Ｒ３１０、Ｎ３１４；Ｒ３２０、Ｈ３２４、Ｅ３４５、Ｙ３９６、Ｒ４００、Ｗ４３９、Ｒ４４４、Ｎ４４５、Ｋ４４６、Ｑ４４９、Ｒ４５８、Ｎ４７１、Ｎ４８４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を伴う変異体である。特に好ましいアミラーゼは、Ｄ１８３およびＧ１８４の欠失を有し、且つ、次の置換：Ｒ１１８Ｋ、Ｎ１９５Ｆ、Ｒ３２０ＫおよびＲ４５８Ｋを有する変異体、ならびに以下：Ｍ９、Ｇ１４９、Ｇ１８２、Ｇ１８６、Ｍ２０２、Ｔ２５７、Ｙ２９５、Ｎ２９９、Ｍ３２３、Ｅ３４５およびＡ３３９の群から選択される１つまたは複数の位置に置換をさらに有する変異体を含み、これらの全ての位置に置換をさらに有する変異体が最も好ましい。他の例は、国際公開第２０１１／０９８５３１号パンフレット、国際公開第２０１３／００１０７８号パンフレットおよび国際公開第２０１３／００１０８７号パンフレットに記載されているものなどのアミラーゼ変異体である。市販されているアミラーゼは、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（商標）、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ（商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ  Ｐｌｕｓ（商標）、Ｎａｔａｌａｓｅ（商標）、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ  ＸおよびＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから）、ならびにＲａｐｉｄａｓｅ（商標）、Ｐｕｒａｓｔａｒ（商標）／Ｅｆｆｅｃｔｅｎｚ（商標）、Ｐｏｗｅｒａｓｅ、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ  Ｓ１０００、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ  Ｓ１１０（Ｒ１７９＊，Ｇ１８０＊、Ｅ１８７Ｐ、Ｉ２０３Ｙ、Ｇ４７６Ｋ、Ｒ４５８Ｎ、Ｔ４５９Ｓ、Ｄ４６０Ｔ）、Ｐｒｅｆｅｒｅｎｚ  Ｓ１００（Ｒ１８０＊、Ｓ１８１＊、Ｓ２４３Ｑ、Ｇ４７５Ｋ）およびＥｘｃｅｌｌｅｎｚ  Ｓ２０００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔから）である。特に好適なのは、酸化安定性アミラーゼである。好ましいアミラーゼは、国際公開第０１／６６７１２号パンフレットに記載される配列番号１２のＭ２０２位に対応する位置にメチオニン以外のアミノ酸、例えば、Ｍ２０２Ｌ置換を有する。市販されている酸化安定性アミラーゼの例として、Ｄｕｒａｍｙｌ（商標）およびＳｔａｉｎｚｙｍｅ  Ｐｌｕｓ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから）ならびにＰｏｗｅｒａｓｅおよびＥｘｃｅｌｌｅｎｚ  Ｓ１０００（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．／ＤｕＰｏｎｔから）がある。
【０３５４】
他の好適なアミラーゼは、国際公開第２０１６／１８０７４８号パンフレットに開示される変異体である。特に、配列番号１３または１４に列記されているアミノ酸配列の変異体であり、変異体は、以下の位置：５４、５６、７２、１０９、１１３、１１６、１３４、１４０、１５９、１６７、１６９、１７２、１７３、１７４、１８１、１８２、１８３、１８４、１８９、１９４、１９５、２０６、２５５、２６０、２６２、２６５、２８４、２８９、３０４、３０５、３４７、３９１、３９５、４３９、４６９、４４４、４７３、４７６、または４７７に１つまたは複数の改変を含み、ここで、番号付けは、国際公開第２０１６／１８０７４８号パンフレットに開示される配列番号１に従い、且つ変異体は、国際公開第２０１６／１８０７４８号パンフレットの配列番号１３または配列番号１４に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【０３５５】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌または真菌由来のものを含む。化学的に修飾された変異体またはタンパク質改変変異体が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、例えば、ウシグソヒトヨタケ（Ｃ．ｃｉｎｅｒｅｕｓ）といったヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）由来のペルオキシダーゼ、ならびに国際公開第９３／２４６１８号パンフレット、国際公開第９５／１０６０２号パンフレット、および国際公開第９８／１５２５７号パンフレットに記載されているものなどのその変異体が挙げられる。
【０３５６】
市販のペルオキシダーゼには、Ｇｕａｒｄｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）がある。
【０３５７】
洗剤酵素は、１または複数種の酵素を含む個別の添加剤を添加することによって、またはこれらの酵素を全て含む複合添加剤を添加することによって、洗剤組成物中に含有させてもよい。本発明の洗剤添加剤、すなわち、個別の添加剤または複合添加剤は、例えば、顆粒、液体、スラリーなどとして製剤化することができる。好ましい洗剤添加剤製剤は顆粒、特に、前述したような無粉塵性顆粒、液体、特に安定化液体、またはスラリーである。
【０３５８】
界面活性剤
典型的に、洗剤組成物は、０％〜５０％、好ましくは２％〜４０％、より好ましくは５％〜３５％、さらに好ましくは７％〜３０％、非常に好ましくは１０％〜２５％、極めて好ましくは１５％〜２０％の範囲で１または複数種の界面活性剤を含む（組成物の重量に基づく）。好ましい実施形態では、洗剤は、４０重量％未満、好ましくは３０重量％未満、より好ましくは２５重量％未満、さらに好ましくは２０重量％未満の界面活性剤を含む液体または粉末洗剤である。組成物は、１％〜１５％、好ましくは２％〜１２％、３％〜１０％、非常に好ましくは４％〜８％、極めて好ましくは４％〜６％の１または複数種の界面活性剤を含む。好ましい界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、およびこれらの組み合わせである。好ましくは、界面活性剤の主要部分は、アニオン性である。好適なアニオン性界面活性剤は、当技術分野で公知であり、脂肪酸カルボキシレート（石鹸）、分岐鎖、直鎖およびランダム鎖硫酸アルキルまたは脂肪族アルコール硫酸塩もしくは第１級アルコール硫酸塩またはＬＡＳおよびＬＡＢなどのアルキルベンゼンスルホン酸塩またはフェニルアルカンスルホン酸塩またはアルケニルスルホン酸塩もしくはアルケニルベンゼンスルホン酸塩またはアルキルエトキシ硫酸塩または脂肪族アルコールエーテル硫酸塩またはα−オレフィンスルホン酸塩またはドデセニル／テトラデセニルコハク酸を含み得る。アニオン性界面活性剤は、アルコキシル化されていてもよい。洗剤組成物は、１重量％〜１０重量％のノニオン性界面活性剤、好ましくは２重量％〜８重量％、より好ましくは３重量％〜７重量％、さらに好ましくは５重量％未満のノニオン性界面活性剤を含んでよい。好適なノニオン性界面活性剤は当技術分野で公知であり、アルコールエトキシレート、および／またはアルキルエトキシレート、および／またはアルキルフェノールエトキシレート、および／または脂肪酸Ｎ−グルコシルＮ−メチルアミドなどのグルカミド、および／またはアルキルポリグルコシドおよび／またはモノ−もしくはジエタノールアミドまたは脂肪酸アミドを含み得る。洗剤組成物は、０重量％〜１０重量％のカチオン性界面活性剤、好ましくは０．１重量％〜８重量％、より好ましくは０．５重量％〜７重量％、さらに好ましくは５重量％未満のカチオン性界面活性剤を含んでよい。好適なカチオン性界面活性剤は当技術分野で公知であり、アルキル第４級アンモニウム化合物、および／またはアルキルピリジニウム化合物および／またはアルキル第４級ホスホニウム化合物および／またはアルキル第３級（ｔｅｒｎａｒｙ）スルホニウム化合物を含み得る。組成物は、洗濯工程中の洗浄液に１００ｐｐｍ〜５，０００ｐｐｍの界面活性剤をもたらす量で界面活性剤を含むのが好ましい。組成物は、水と接触すると、典型的に、０．５ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌの洗剤組成物を含む洗浄液を形成する。多数の好適な界面活性組成物が入手可能であり、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ＰｅｒｒｙおよびＢｅｒｃｈによる“Ｓｕｒｆａｃｅ−Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉおよび１１など��文献に詳しく記載されている。
【０３５９】
ビルダー
ビルダーの主要な役割は、二価金属イオン（例えば、カルシウムおよびマグネシウムイオン）を、そうでなければ界面活性剤系と有害に相互作用することになる洗浄液から隔離することである。ビルダーはまた、布地表面から金属イオンおよび無機汚れを除去し、粒子状汚れおよび飲料汚れの除去を向上させる上でも有効である。ビルダーは、アルカリ性のソースでもあり、洗浄水のｐＨを９．５〜１１のレベルに保つ。この緩衝能力は、アルカリ性の保存とも呼ばれ、好ましくは４を上回るべきである。
【０３６０】
本発明の洗剤組成物は、１または複数種のビルダーまたはビルダー系を含んでもよい。多種の好適なビルダー系が、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．などの文献に記載されている。ビルダーは、対象組成物の重量に基づき、０％〜６０％、好ましくは５％〜４５％、より好ましくは１０％〜４０％、非常に好ましくは１５％〜３５％、極めて好ましくは２０％〜３０％を占め得る。組成物は、対象組成物の重量に基づき、０％〜１５％、好ましくは１％〜１２％、２％〜１０％、非常に好ましくは３％〜８％、極めて好ましくは４％〜６％のビルダーを含み得る。
【０３６１】
ビルダーとして、限定されないが、アルカリ金属、ポリリン酸塩のアンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩（例えば、三リン酸塩ＳＴＰＰ）、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類およびアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩ビルダー（例えば、ゼオライト）およびポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレンもしくはビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、およびカルボキシメチルオキシコハク酸、多種のアルカリ金属、エチレンジアミン四酢酸およびニトリロ三酢酸などのポリ酢酸のアンモニウムおよび置換アンモニウム塩、ならびにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸およびこれらの可溶性塩などのポリカルボキシレートが挙げられる。エタノールアミン（ＭＥＡ、ＤＥＡおよびＴＥＡ）も、液体洗剤中の緩衝能力に寄与し得る。
【０３６２】
漂白剤
本発明の洗剤組成物は、１または複数種の漂白剤を含んでもよい。特に、粉末状洗剤は、１または複数種の漂白剤を含み得る。好適な漂白剤は、他の光漂白剤、事前に形成した過酸、過酸化水素のソース、漂白活性化剤、過酸化水素、漂白触媒およびこれらの混合物を含む。一般に、漂白剤を使用する場合、本発明の組成物は、対象クリーニング組成物の重量に基づき約０．１％〜約５０％、または約０．１％〜約２５％の漂白剤を含み得る。好適な漂白剤の例を以下に挙げる：
（１）他の光漂白剤、例えば、ビタミンＫ３；
（２）事前に形成した過酸：好適な事前に形成した過酸としては、限定されないが、過カルボン酸および塩、過炭酸および塩、過イミド酸および塩、ペルオキシ一硫酸および塩、例えば、Ｏｘｏｎｅ、ならびに、これらの混合物からなる群から選択される化合物が挙げられる。好適な過カルボン酸としては、Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−Ｏ−Ｍ（式中、Ｒは、過酸が疎水性であるとき、６〜１４個の炭素原子、または８〜１２個の炭素原子を有し、過酸が親水性であるとき、６個未満の炭素原子または４個未満の炭素原子を有する、任意選択で分岐状の、アルキル基であり；Ｍは、例えば、ナトリウム、カリウムもしくは水素などの対イオンである）を有する疎水性および親水性過酸が挙げられる；
（３）過酸化水素のソース、例えば、過ホウ酸塩（通常は一水和物または四水和物）、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩のナトリウム塩などのアルカリ金属塩を含む無機過水和塩。本発明の一態様では、無機過水和塩は、過ホウ酸塩、過炭酸塩、およびこれらの混合物のナトリウム塩からなる群から選択される。使用される場合、無機過水和塩は、典型的には、全組成物の０．０５〜４０重量％、または１〜３０重量％の量で存在し、典型的には、こうした組成物中に、コーティングされていてもよい結晶固形物として組み込まれる。好適なコーティングとしては、ケイ酸、炭酸若しくはホウ酸のアルカリ金属塩またはこれらの混合物などの無機塩、または水溶性若しくは分散性のポリマー、ワックス、油または脂肪石鹸などの有機物質が挙げられる。有用な漂白組成物は、米国特許第５，５７６，２８２号明細書、および同第６，３０６，８１２号明細書に記載されている；
（４）Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌ（式中、Ｒは、漂白活性化剤が疎水性であるとき、６〜１４個の炭素原子、または８〜１２個の炭素原子を有し、漂白活性化剤が親水性であるとき、６個未満の炭素原子または４個未満の炭素原子を有する、任意選択で分岐状の、アルキル基であり；Ｌは、脱離基である）を有する漂白活性化剤。好適な脱離基の例は、安息香酸およびその誘導体、特に、ベンゼンスルホネートである。好適な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸またはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）およびノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）が挙げられる。好適な漂白活性剤は、国際公開第９８／１７７６７号パンフレットにも開示されている。いずれの好適な漂白活性化剤を使用してもよいが、本発明の１つの態様では、対象クリーニング組成物は、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤまたはこれらの混合物を含んでもよい。
（５）過酸から酸素原子を受けて、酸素原子を酸化可能基質に輸送することができる漂白触媒は、国際公開第２００８／００７３１９号パンフレットに記載されている。好適な漂白触媒として、限定されないが、以下のものが挙げられる：イミニウムカチオンおよびポリイオン；イミニウム双性イオン、修飾アミン；修飾アミンオキシド；Ｎ−スルホニルイミン；Ｎ−ホスホニルイミン；Ｎ−アシルイミン；チアジアゾールジオキシド；ペルフルオロイミン；環状糖ケトンおよびこれらの混合物。漂白触媒は、典型的に、重量に基づき０．０００５％〜０．２％、０．００１％〜０．１％、または０．００５％〜０．０５％のレベルで洗剤組成物中に存在する。
【０３６３】
存在する場合、過酸および／または漂白活性化剤は、一般に、組成物を基準にして、約０．１〜約６０重量％、約０．５〜約４０重量％、または約０．６〜約１０重量％の量で、組成物中に存在する。１または複数種の疎水性過酸またはその前駆体を、１つ以上の親水性過酸またはその前駆体と組み合わせて使用してもよい。
【０３６４】
過酸化水素ソースおよび過酸または漂白活性化剤の量は、有効酸素（過酸化物ソースからの）と過酸のモル比が、１：１〜３５：１、または２：１〜１０：１となるように選択してよい。
【０３６５】
補助剤物質
分散剤−本発明の洗剤組成物は、分散剤も含有することができる。特に、粉末状洗剤は、分散剤を含み得る。好適な水溶性有機物質としては、ホモポリマーまたはコポリマーの酸またはこれらの塩が挙げられ、その場合、ポリカルボン酸は、互いに２個以下の炭素原子によって互いに隔てられている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【０３６６】
移染防止剤−本発明の洗浄組成物はまた、１または複数種の移染防止剤を含有してもよい。好適なポリマー移染防止剤としては、限定されないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドンおよびポリビニルイミダゾール、またはこれらの混合物が挙げられる。対象組成物中に存在する場合、移染防止剤は、組成物の重量に基づき、約０．０００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または約０．１％〜約３％のレベルで存在してよい。
【０３６７】
蛍光性白色化剤−本発明の洗浄組成物は、好ましくは、蛍光性白色化剤または光学増白剤のような、洗浄される物品に色合いを付け得る追加の成分を含有することもできる。洗濯洗剤組成物での使用に好適ないずれの蛍光性白色化剤を本発明の洗剤組成物に使用してもよい。最も一般的に使用される蛍光性白色化剤は、ジアミノスチルベン−スルホン酸誘導体、ジアリールピラゾリン誘導体およびビスフェニル−ジスチリル誘導体のクラスに属するものである。
【０３６８】
好ましい蛍光性白色化剤は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから市販されているＴｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳおよびＴｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳである。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＤＭＳは、４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベンジスルホネートの二ナトリウム塩である。Ｔｉｎｏｐａｌ  ＣＢＳは、２，２’−ビス−（フェニル−スチリル）ジスルホネートの二ナトリウム塩である。
【０３６９】
また、Ｐａｒａｍｏｕｎｔ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａにより供給される市販のＰａｒａｗｈｉｔｅ  ＫＸも、好ましい蛍光性白色化剤である。
【０３７０】
本発明での使用に好適な他の蛍光剤には、１，３−ジアリールピラゾリンおよび７−アルキルアミノクマリンがある。
【０３７１】
好適な蛍光性増白剤のレベルは、約０．０１重量％から、約０．０５重量％から、約０．１重量％から、または約０．２重量％からの低いレベルから、０．５重量％または０．７５重量％の高いレベルまでを含む。
【０３７２】
布地色相剤−本発明の洗浄組成物は、さらに、染料または顔料などの布地色相剤を含んでもよく、これらは、洗剤組成物に配合されると、布地が、前記洗剤組成物を含む洗浄液と接触したとき、布地に付着して、可視光の吸収により前記布地の色合いを改変することができる。蛍光性白色化剤は、少なくともある程度の可視光を発する。これに対し、布地色相剤は、可視スペクトルの少なくとも一部を吸収するため、表面の色合いを改変する。好適な布地色相剤は、染料および染料−粘土コンジュゲートを含み、また、顔料を含んでもよい。好適な染料は、小分子染料およびポリマー染料を含む。好適な小分子染料は、例えば、国際公開第２００５／０３２７４号パンフレット、同第２００５／０３２７５号パンフレット、同第２００５／０３２７６号パンフレットおよび欧州特許第１  ８７６  ２２６号明細書に記載されているように、ダイレクトブルー、ダイレクトレッド、ダイレクトバイオレット、アシッドブルー、アシッドレッド、アシッドバイオレット、ベーシックブルー、ベーシックバイオレットおよびベーシックレッド、またはこれらの混合物のカラー・インデックス（Ｃ．Ｉ．）分類に入る染料からなる群から選択される小分子染料を含む。洗剤組成物は、好ましくは、約０．００００３重量％〜約０．２重量％、約０．００００８重量％〜約０．０５重量％、または約０．０００１重量％〜約０．０４重量％の布地色相剤を含む。組成物は、０．０００１重量％〜約０．２重量％の布地色相剤を含んでよく、これは、組成物が単位用量ポーチの形態である場合、特に好ましいと考えられる。
【０３７３】
汚れ遊離ポリマー−本発明の洗剤組成物はまた、綿およびポリエステル基材の布地などの布地からの汚れの除去、特にポリエステル基材布地からの疎水性汚れの除去を助ける１または複数種の汚れ遊離ポリマーを含んでもよい。汚れ遊離ポリマーは、例えば、ノニオンまたはアニオン性テレフタレート系ポリマー、ポリビニルカプロラクタムおよび関連コポリマー、ビニルグラフトコポリマー、ポリエステルポリアミドであってよく、例えば、Ｐｏｗｄｅｒｅｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ７１，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．のＣｈａｐｔｅｒ  ７を参照されたい。別の種類の汚れ遊離ポリマーは、コア構造と、このコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む両親媒性アルコキシル化グリースクリーニングポリマーである。コア構造は、国際公開第２００９／０８７５２３号パンフレットに詳しく記載されているように、ポリアルキレンイミン構造またはポリアルカノールアミン構造を含み得る。さらに、ランダムグラフトコポリマーも好適な汚れ遊離ポリマーである。好適なグラフトコポリマーは、国際公開第２００７／１３８０５４、国際公開第２００６／１０８８５６号パンフレットおよび国際公開第２００６／１１３３１４号パンフレットにさらに詳しく記載されている。他の汚れ遊離ポリマーは、置換多糖構造、特に置換セルロース構造、例えば、欧州特許第１  ８６７  ８０８号明細書または国際公開第２００３／０４０２７９号パンフレットに記載されているような修飾セルロース誘導体である。好適なセルロースポリマーとしてはセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、セルロースアミドおよびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロースポリマーとしては、アニオン変性セルロース、ノニオン変性セルロース、カチオン変性セルロース、双イオン変性セルロース、およびこれらの混合物が挙げられる。好適なセルロースポリマーは、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エステルカルボキシメチルセルロース、およびこれらの混合物を含む。
【０３７４】
再付着防止剤−本発明の洗剤組成物はまた、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリオキシンエチレンおよび／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アクリル酸のホモポリマー、アクリル酸およびマレイン酸のコポリマー、ならびにエトキシル化ポリエチレンイミンなどの１つまたは複数の再付着防止剤を含んでもよい。汚れ遊離ポリマーの項目で上に記載したセルロース系ポリマーも、再付着防止剤として機能し得る。
【０３７５】
他の好適な補助剤物質として、限定されないが、収縮防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、結合剤、キャリア、染料、酵素安定化剤、布地軟化剤、充填材、起泡調節剤、ヒドロトロープ、香料、顔料、石鹸泡抑制剤、溶媒、液体洗剤用構造化剤および／または、構造弾性化剤が挙げられる。
【０３７６】
一態様では、洗剤組成物は、以下：
ａ）組成物の重量に基づき、少なくとも約１０％、好ましくは２０〜８０％の、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、石鹸およびこれらの混合物から選択される界面活性剤；ｂ）組成物の重量に基づき、約１％〜約３０％、好ましくは５〜３０％の水；ｃ）組成物の重量に基づき、約１％〜約１５％、好ましくは３〜１０％の非アミノ官能性溶媒；およびｄ）組成物の重量に基づき、約５％〜約２０％の、キレート剤、汚れ遊離ポリマー、酵素およびこれらの混合物から選択される性能添加剤を含む圧縮流体洗濯洗剤組成物であり；圧縮流体洗濯洗剤組成物は、以下：
（ｉ）界面活性剤は、約１．５：１〜約５：１のアニオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤の重量比を有し、界面活性剤は、組成物の重量に基づき、約１５％〜約４０％のアニオン性界面活性剤を含み、組成物の重量に基づき、約５％〜約４０％の石鹸を含み；（ｉｉ）組成物の重量に基づき、約０．１％〜約１０％の、起泡増進ポリマー、カチオン性界面活性剤、双イオン性界面活性剤、アミンオキシド界面活性剤、両性界面活性剤、およびこれらの混合物から選択される起泡増進剤を含み；ならびに（ｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方
の少なくとも１つを含む。全ての成分が、国際公開第２００７／１３０５６２号パンフレットに記載されている。洗剤製剤において有用な別のポリマーは、国際公開第２００７／１４９８０６号パンフレットに記載されている。
【０３７７】
別の態様では、洗剤は、以下を含む圧縮顆粒（粉末状）洗剤である：ａ）組成物の重量に基づき、少なくとも約１０％、好ましくは１５〜６０％の、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、石鹸およびこれらの混合物から選択される界面活性剤；ｂ）組成物の重量に基づき、約１０〜８０％、好ましくは２０％〜６０％のビルダー（ここで、ビルダーは、以下：ｉ）リン酸塩ビルダー、好ましくは全ビルダーの２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満が、リン酸塩ビルダーであり；ｉｉ）ゼオライトビルダー、好ましくは全ビルダーの２０％未満、より好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満が、ゼオライトビルダーであり；ｉｉｉ）クエン酸塩、好ましくは全ビルダーの０〜５％がクエン酸塩ビルダーであり；ｉｖ）ポリカルボン酸塩、好ましくは全ビルダーの０〜５％がポリカルボン酸塩ビルダーであり；ｖ）炭酸塩、好ましくは全ビルダーの０〜３０％が炭酸塩ビルダーであり；およびｖｉ）ケイ酸ナトリウム、好ましくは全ビルダーの０〜２０％がケイ酸ナトリウムビルダーである）；ｃ）組成物の重量に基づき、約０％〜２５％の硫酸塩などの充填材、好ましくは組成物の重量に基づき１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％、さらに好ましくは３％〜５％の充填材；ならびにｄ）組成物の重量に基づき、約０．１％〜２０％の酵素、好ましくは組成物の重量に基づき１％〜１５％、より好ましくは２％〜１０％の酵素。
【０３７８】
洗剤製剤にとって重要な汚れおよび染みは、多数の異なる物質から構成されるものであり、多種多様な酵素（全て、異なる基質特異性を有する）が、ランドリーおよび食器洗浄などの硬質表面クリーニングの両方に関する洗剤で使用するために開発されてきた。これらの酵素は、酵素を用いない同じ工程と比較して、それらが適用される洗浄工程において特に汚れ除去を向上させることから、酵素洗浄力利益をもたらすと考えられる。当技術分野で公知の汚れ除去酵素としては、カルボヒドラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ、およびペクチナーゼなどの酵素が挙げられる。
【０３７９】
本発明の好ましい態様では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を少なくとも２種の酵素と組み合わせてもよい。これらの別の酵素は、「他の酵素」のセクションで詳しく記載されているが、より好ましくは少なくとも３、４または５種の酵素である。好ましくは、酵素は、炭素分解活性、タンパク質分解活性、アミロース分解活性、脂肪分解活性、ヘミセルロース分解活性またはペクチン分解活性などの多様な基質特異性を有する。酵素組み合わせは、例えば、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）と別の汚れ除去酵素、例えば、本発明のβ−グルカナーゼとプロテアーゼ、本発明のβ−グルカナーゼとセリンプロテアーゼ、本発明のβ−グルカナーゼとアミラーゼ、本発明のβ−グルカナーゼとセルラーゼ、本発明のβ−グルカナーゼとリパーゼ、本発明のβ−グルカナーゼとクチナーゼ、本発明のβ−グルカナーゼとペクチナーゼまたは本発明のβ−グルカナーゼと再付着防止酵素であってよい。より好ましくは、本発明のβ−グルカナーゼは、少なくとも２種の他の汚れ除去酵素と組み合わせ、例えば、本発明のβ−グルカナーゼと、リパーゼおよびアミラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼおよびアミラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼおよびリパーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼおよびペクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼおよびセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼおよびヘミセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼおよびクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼおよびペクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼおよびクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼおよびセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼおよびヘミセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、リパーゼおよびペクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、リパーゼおよびクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、リパーゼおよびセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、リパーゼおよびヘミセルラーゼを組み合わせる。さらに好ましくは、本発明のβ−グルカナーゼは、少なくとも３種の他の汚れ除去酵素と組み合わせてもよく、例えば、本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、リパーゼおよびアミラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、アミラーゼおよびペクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、アミラーゼおよびクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、アミラーゼおよびヘミセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼ、リパーゼおよびペクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼ、リパーゼおよびクチナーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼ、リパーゼおよびセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、アミラーゼ、リパーゼおよびヘミセルラーゼ；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、リパーゼおよびペクチナーゼ���；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、リパーゼおよびクチナーゼ；；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、リパーゼおよびセルラーゼ；；または本発明のβ−グルカナーゼと、プロテアーゼ、リパーゼおよびヘミセルラーゼと組み合わせる。本発明のβ−グルカナーゼは、以下：アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、キサンタナーゼもしくはプルラナーゼなどのカルボヒドラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼまたはリパーゼを含む非包括的リストから選択される酵素のいずれと組み合わせてもよい。
【０３８０】
好ましい実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）をセリンプロテアーゼ、例えば、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）などのＳ８ファミリープロテアーゼと組み合わせる。
【０３８１】
本発明の別の実施形態では、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）をＮｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）またはＴｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎをはじめとするＭ４メタロプロテアーゼなどの１または複数種のメタロプロテアーゼと組み合わせてもよい。こうした組み合わせは、上に概説した他の洗剤酵素の組み合わせをさらに含んでもよい。
【０３８２】
クリーニング工程または生地のケア工程は、例えば、洗濯工程、食器洗浄工程、または浴室タイル、床、テーブル面、排水口、シンクおよび洗面台などの硬質表面クリーニングであってよい。洗濯工程は、例えば、家庭用洗濯であってよいが、業務用洗濯であってもよい。さらに、本発明は、布地および／または衣服の洗濯工程に関し、工程は、洗剤組成物と少なくとも１種の本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含有する洗浄溶液で布地を処理するステップを含む。クリーニング工程または生地のケア工程は、例えば、機械洗浄工程または手洗い工程で実施することができる。洗浄溶液は、例えば、洗剤組成物を含有する水性洗浄溶液であってよい。
【０３８３】
本発明の洗浄、クリーニングまたは生地のケア工程に付す布地および／または衣服は、通常の可洗ランドリー、例えば家庭ランドリーであってよい。好ましくは、ランドリーの大部分は、衣服および布地であり、ニット、織物、デニム、不織布、フェルト、ヤーン、およびタオル地を含む。布地は、綿、亜麻、リンネル、ジュート、ラミー、サイザルもしくはコイアを含む天然セルロース系材料、または、ビスコース／レーヨン、酢酸セルロース繊維（三細胞性）、リオセルもしくはこれらのブレンドを含む人工セルロース系材料（例えば、木材パルプ由来のもの）などのセルロース系材料であってよい。布地はまた、ウール、ラクダ、カシミヤ、モヘア、ウサギおよび絹を含む天然ポリアミドなどの非セルロース系材料、または、ナイロン、アラミド、ポリエステル、アクリル、ポリプロピレンおよびスパンデックス／エラスタンなどの合成ポリマー、またはこれらのブレンド、ならびに、セルロース系および非セルロース系繊維のブレンドであってよい。ブレンドの例は、綿および／またはレーヨン／ビスコースと、ウール、合成繊維（例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、およびセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、亜麻、リンネル、ジュート、酢酸セルロース繊維、リオセル）などの１または複数種の随伴材料とのブレンドである。
【０３８４】
この数年来、洗浄性能を損なうことなく、洗剤中の石油化学製品由来の成分を、酵素およびポリペプチドなどの再生可能な生物成分に換えることに関心が高まっている。洗剤組成物の成分を変える場合、プロテアーゼ、リパーゼおよびアミラーゼなどの通常使用される洗剤酵素に代わる、および／またはそれらより向上した特性を有する新規の酵素活性または新規の酵素は、伝統的な洗剤組成物と比較して同等もしくは向上した洗浄性能を達成することが求められる。
【０３８５】
典型的な洗剤組成物は、酵素以外に様々な成分を含み、これらの成分は、異なる作用を有し、界面活性剤のようなある成分は、洗剤の表面張力を低下させ、これによって、洗浄しようとする汚れを浮かせ、分散させた後、洗い流すことが可能となり、漂白系のような他の成分は、多くの場合、酸化により変色を除去し、また、多くの漂白剤は強力な殺菌性も有するため、消毒および滅菌のために使用される。ビルダーおよびキレート剤などのさらに別の成分は、例えば液体から金属イオンを除去することによって、洗浄水を軟化させる。
【０３８６】
特定の実施形態では、本発明は、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む組成物の使用に関し、前記酵素組成物は、洗濯または食器洗浄に、以下：界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白系もしくは漂白剤成分の少なくとも１つまたは複数をさらに含む。
【０３８７】
本発明の好ましい実施形態では、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白系および／もしくは漂白剤成分の量は、本発明のβ−グルカナーゼを添加せずに使用される界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白系および／もしくは漂白剤成分の量と比較して減少する。好ましくは、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白系および／もしくは漂白剤成分である少なくとも１つの成分は、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を添加していない系の成分の量、例えばこうした成分の従来の量よりも１％少ない、例えば２％少ない、例えば３％少ない、例えば４％少ない、例えば５％少ない、例えば６％少ない、例えば７％少ない、例えば８％少ない、例えば９％少ない、例えば１０％少ない、例えば１５％少ない、例えば２０％少ない、例えば２５％少ない、例えば３０％少ない、例えば３５％少ない、例えば４０％少ない、例えば４５％少ない、例えば５０％少ない量で存在する。一態様では、界面活性剤、ビルダー、キレート剤もしくはキレート化剤、漂白系もしくは漂白剤成分および／またはポリマーである少なくとも１つの成分を含有しない洗剤組成物に、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を使用する。
【０３８８】
洗浄方法
本発明の洗剤組成物は、洗濯用途での使用に理想的に適している。従って、本発明は、布地を洗濯する方法を含む。この方法は、洗濯しようとする布地を、本発明の洗剤組成物を含むクリーニング洗濯溶液と接触させるステップを含む。布地は、通常の消費者の使用条件で洗濯可能なあらゆる布地を含み得る。溶液は、好ましくは、約５．５〜約８のｐＨ、さらに好ましくは、約７．５〜約１３．５の範囲、もしくは約７．５〜約１２．５の範囲、もしくは約８．５〜約１１．５の範囲、もしくは約９．５〜約１０．５の範囲で選択されるｐＨ、またはｐＨ７．５以上のｐＨを有する。
【０３８９】
好ましい実施形態は、クリーニング方法に関し、この方法は、物体をクリーニングするのに好適な条件下で、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む高ｐＨクリーニング組成物（例えば、ｐＨ７．５以上）と物体を接触させるステップを含む。好ましい実施形態では、クリーニング組成物を洗濯または食器洗浄工程に使用する。
【０３９０】
また別の実施形態は、布地または食器類から汚れを除去する方法に関し、これは、物体をクリーニングするのに好適な条件下で、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む高ｐＨクリーニング組成物（例えば、ｐＨ７．５以上）と布地または食器類を接触させるステップを含む。
【０３９１】
さらに、本発明のクリーニング組成物を用いて布地を処理する（例えば、生地の糊抜きのために）組成物および方法も考慮される。高ｐＨクリーニング組成物は、当技術分野で公知の任意の布地処理方法に使用することができる。
【０３９２】
別の実施形態では、本発明の高ｐＨクリーニング組成物は、液体洗濯ならびに食器および自動車洗浄などの液体硬質表面用途での使用に適している。従って、本発明は、布地の洗濯および硬質表面の洗浄のための方法を含む。この方法は、クリーニングしようとする布地／食器類を、本発明の高ｐＨクリーニング組成物を含む溶液と接触させるステップを含む。繊維は、通常の消費者の使用条件で洗濯することが可能なあらゆる布地を含み得る。硬質表面は、陶器、カトラリー、セラミック、メラミンなどのプラスチック製品、金属製品、磁器製品、ガラス製品、アクリル製品などのあらゆる食器類、または自動車、床などの他の硬質表面を含み得る。溶液は、例えば、７．５以上、例えば、約９〜約１３．５のｐＨを有するのが好ましい。
【０３９３】
組成物は、溶液中約１００ｐｐｍ、好ましくは５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用してよい。水の温度は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲であり、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃および約９０℃を含む。水と繊維の比は、典型的に約１：１〜約３０：１である。
【０３９４】
特定の実施形態では、洗浄方法は、約５．０〜約１１．５のｐＨ、あるいは、別の実施形態では、約６〜約１０．５、例えば約５〜約１１、約５〜約１０、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５．５〜約１１、約５．５〜約１０、約５．５〜約９、約５．５〜約８、約５．５〜約７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７、約６．５〜約１１、約６．５〜約１０、約６．５〜約９、約６．５〜約８、約６．５〜約７、約７〜約１１、約７〜約１０、約７〜約９、約７〜約８、好ましくは約５．５〜約９、ならびにより好ましくは約６〜約８のｐＨで実施される。好ましい実施形態では、洗浄方法は、約７．５〜約１３．５の範囲、または約７．５〜約１２．５の範囲、または約８．５〜約１１．５の範囲、または約９．５〜約１０．５の範囲で選択されるｐＨ、またはｐＨ７．５以上で実施される。
【０３９５】
一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載される高ｐＨクリーニング組成物は、典型的に、水クリーニング作業での使用中に、洗浄水が、約９〜約１３．５、または別の実施形態では、約１０〜約１３．５、さらには約１１〜約１３．５のｐＨを有するように製剤化される。一部の好ましい実施形態では、液体洗濯洗剤は、約１２〜約１３．５のｐＨを有するように製剤化される。推奨される使用レベルにｐＨを制御する技術は、緩衝剤、酸、アルカリなどの使用を含み、当業者には周知である。本発明に関して、アルカリを用いて、ｐＨを約９〜約１３．５、好ましくは約１０〜約１３．５に調節する。
【０３９６】
特定の実施形態では、洗浄方法は、約０°ｄＨ〜約３０°ｄＨ、例えば約１°ｄＨ、約２°ｄＨ、約３°ｄＨ、約４°ｄＨ、約５°ｄＨ、約６°ｄＨ、約７°ｄＨ、約８°ｄＨ、約９°ｄＨ、約１０°ｄＨ、約１１°ｄＨ、約１２°ｄＨ、約１３°ｄＨ、約１４°ｄＨ、約１５°ｄＨ、約１６°ｄＨ、約１７°ｄＨ、約１８°ｄＨ、約１９°ｄＨ、約２０°ｄＨ、約２１°ｄＨ、約２２°ｄＨ、約２３°ｄＨ、約２４°ｄＨ、約２５°ｄＨ、約２６°ｄＨ、約２７°ｄＨ、約２８°ｄＨ、約２９°ｄＨ、約３０°ｄＨの硬度で実施される。典型的な欧州の洗浄条件下では、硬度は約１５°ｄＨであり、典型的な米国の洗浄条件下では、約６°ｄＨであり、典型的なアジアの洗浄条件下では、約３°ｄＨである。
【０３９７】
本発明は、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む洗剤組成物で、布地、食器類または硬質表面をクリーニングする方法に関する。
【０３９８】
好ましい実施形態は、クリーニング方法に関し、前記方法は、物体をクリーニングするのに好適な条件下で、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含むクリーニング組成物と前記物体を接触させるステップを含む。好ましい実施形態では、クリーニング組成物は、洗剤組成物であり、工程は、洗濯または食器洗浄工程である。
【０３９９】
また別の実施形態は、布地から汚れを除去する方法に関し、これは、前記物体をクリーニングするのに好適な条件下で、本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）を含む組成物と前記布地を接触させるステップを含む。
【０４００】
低温使用
本発明の一実施形態は、洗濯、食器洗浄または業務用クリーニングを実施する方法に関し、この方法は、洗浄しようとする表面を本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）と接触させるステップを含み、ここで、前記洗濯、食器洗浄、業務用または施設用クリーニングは、約４０℃以下の温度で実施される。本発明の一実施形態は、洗濯、食器洗浄またはクリーニング工程におけるβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）の使用に関し、ここで、洗濯、食器洗浄、業務用クリーニングの際の温度は、約４０℃以下である。
【０４０１】
別の実施形態では、本発明は、β−グルカン除去工程における本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）の使用に関し、ここで、β−グルカン除去工程での温度は、約４０℃以下である。
【０４０２】
上に明示した方法および使用の各々において、洗浄温度は、約４０℃以下、例えば約３９℃以下、例えば約３８℃以下、例えば約３７℃以下、例えば約３６℃以下、例えば約３５℃以下、例えば約３４℃以下、例えば約３３℃以下、例えば約３２℃以下、例えば約３１℃以下、例えば約３０℃以下、例えば約２９℃以下、例えば約２８℃以下、例えば約２７℃以下、例えば約２６℃以下、例えば約２５℃以下、例えば約２４℃以下、例えば約２３℃以下、例えば約２２℃以下、例えば約２１℃以下、例えば約２０℃以下、例えば約１９℃以下、例えば約１８℃以下、例えば約１７℃以下、例えば約１６℃以下、例えば約１５℃以下、例えば約１４℃以下、例えば約１３℃以下、例えば約１２℃以下、例えば約１１℃以下、例えば約１０℃以下、例えば約９℃以下、例えば約８℃以下、例えば約７℃以下、例えば約６℃以下、例えば約５℃以下、例えば約４℃以下、例えば約３℃以下、例えば約２℃以下、例えば約１℃以下である。
【０４０３】
別の好ましい実施形態では、洗浄温度は、約５〜４０℃、例えば約５〜３０℃、約５〜２０℃、約５〜１０℃、約１０〜４０℃、約１０〜３０℃、約１０〜２０℃、約１５〜４０℃、約１５〜３０℃、約１５〜２０℃、約２０〜４０℃、約２０〜３０℃、約２５〜４０℃、約２５〜３０℃、または約３０〜４０℃の範囲である。特に好ましい実施形態では、洗浄温度は、約２０℃、約３０℃、または約４０℃である。
【０４０４】
高温使用
本発明の一実施形態は、洗濯、食器洗浄または業務用クリーニングを実施する方法に関し、洗浄しようとする表面を本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）と接触させるステップを含み、ここで、前記洗濯、食器洗浄、業務用または施設用クリーニングは、約７５℃以下の温度で実施される。本発明の一実施形態は、洗濯、食器洗浄またはクリーニング工程におけるβ−グルカナーゼの使用に関し、ここで、洗濯、食器洗浄、業務用クリーニングにおける温度は、約７０℃以下である。
【０４０５】
別の実施形態では、本発明は、β−グルカン除去工程における本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、本発明の変異体）の使用に関し、ここで、β−グルカン除去工程における温度は、約６５℃以下である。
【０４０６】
上に明らかにした方法および使用の各々において、洗浄温度は、約６０℃以下、例えば約５９℃以下、例えば約５８℃以下、例えば約５７℃以下、例えば約５６℃以下、例えば約５５℃以下、例えば約５４℃以下、例えば約５３℃以下、例えば約５２℃以下、例えば約５１℃以下、例えば約５０℃以下、例えば約４９℃以下、例えば約４８℃以下、例えば約４７℃以下、例えば約４６℃以下、例えば約４５℃以下、例えば約４４℃以下、例えば約４３℃以下、例えば約４２℃以下、例えば約４１℃以下である。
【０４０７】
別の好ましい実施形態では、洗浄温度は、約４１〜９０℃、例えば約４１〜８０℃、約４１〜８５℃、約４１〜８０℃、約４１〜７５℃、約４１〜７０℃、約４１〜６５℃、約４１〜６０℃の範囲である。
【０４０８】
本発明を以下のパラグラフにさらに記載する：
１．親β−グルカナーゼの変異体であって、変異体は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位および１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含み、ここで、変異体は、β−グルカナーゼ活性を有し、変異体は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８のいずれかの成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、且つ１００％未満の配列同一性を有し、好ましくは、変異体は、配列番号２６の番号付けを用いて、配列番号２６の成熟ポリペプチドのＦ３３位およびＭ１８８位に対応する１つまたは複数の位置に置換を含み、さらに好ましくは、前記β−グルカナーゼ活性が、セルロースのＤ−グルコース単位同士のβ−１，４結合に対するエンド−セルラーゼ活性ではない、変異体。
２．以下：
ａ．配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８からなる群から選択される成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチド；
ｂ．低度の緊縮条件下で、好ましくは中度の緊縮条件下で、より好ましくは中度−高度の緊縮条件下で、非常に好ましくは高度の緊縮条件下で、極めて好ましくは極めて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号６、配列番号１、配列番号４、配列番号８からなる群から選択される配列の成熟ポリペプチドコード配列、または（ｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の完全長補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
ｃ．配列番号６、配列番号１、配列番号４、配列番号８からなる群から選択される配列の成熟ポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、ならびに
ｄ．配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択される成熟ポリペプチドの断片であって、前記断片が、β−グルカナーゼ活性を有する断片
からなる群から選択される親β−グルカナーゼの変異体である、パラグラフ１に記載の変異体。
３．親β−グルカナーゼが、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択されるポリペプチドを含むか、またはそれから構成される、パラグラフ１〜２のいずれかに記載の変異体。
４．改変の数が、１〜２０、例えば、１〜１０、および１〜５、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の改変である、パラグラフ１〜３のいずれかに記載の変異体。
５．３３位、例えば、Ｆ３３に対応する位置に置換を含み、置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌのいずれかであり、好ましくは、置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌからなる群から選択され、さらに好ましくは、置換基アミノ酸が、以下：Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＣｙｓからなる群から選択される、パラグラフ１〜４のいずれかに記載の変異体。
６．１８８位、例えば、Ｍ１８８に対応する位置に置換を含み、置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌのいずれかであり、好ましくは、置換基アミノ酸が、以下：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｙｒからなる群から選択され、さらに好ましくは、置換基アミノ酸が、以下：Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＡｒｇからなる群から選択される、パラグラフ１〜５のいずれかに記載の変異体。
７．以下：Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ａ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｆ３３Ｙ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ｎ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ｙ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｅ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｍ１８８Ｈ；Ｆ３３Ｗ＋Ｍ１８８Ｓ；Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｆ；Ｆ３３Ｓ＋Ｍ１８８Ａ；Ｆ３３Ｃ＋Ｍ１８８Ｌ；Ｆ３３Ｖ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｆ３３Ｑ＋Ｍ１８８Ｒ；Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ｔ；Ｆ３３Ｇ＋Ｍ１８８Ｃ；Ｆ３３Ｎ＋Ｍ１８８Ｑ；Ｆ３３Ｌ＋Ｍ１８８Ａからなる群から選択される置換を含むか、またはそれから構成される、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の変異体。
８．親に対して向上した特性を有し、向上した特性が、向上した酸化安定性である、パラグラフ１〜７のいずれかに記載の変異体。
９．変異体が、１８０〜２３０、例えば、１９０〜２２２、１９５〜２０５個のアミノ酸から構成される、パラグラフ１〜８のいずれかに記載の変異体。
１０．前記変異体が、約７．５〜約１３．５の範囲で選択されるｐＨを有する水溶液中にβ−グルカナーゼ活性を有することができ、ここで、前記水溶液は、任意選択で、漂白剤を含み、好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲で選択され、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲から選択され、非常に好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲で選択される、パラグラフ１〜９のいずれかに記載の変異体。
１１．前記変異体が、約２０℃〜約７５℃の範囲で選択される温度の水溶液中でβ−グルカナーゼ活性を有することができ、前記水溶液は、任意選択で、漂白剤を含み、好ましくは、前記温度は、約４０℃〜約６０℃の範囲で選択される、パラグラフ１〜１０のいずれかに記載の変異体。
１２．前記変異体が、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、さらに好ましくは少なくとも６０分間、非常に好ましくは少なくとも９０分間、極めて好ましくは少なくとも１２０分間、β−グルカナーゼ活性を有することができる、パラグラフ１〜１１のいずれかに記載の変異体。
１３．前記β−グルカナーゼ活性が、リケニナーゼＥＣ３．２．１．７３活性を含む、パラグラフ１〜１２のいずれかに記載の変異体。
１４．パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体を含む組成物。
１５．１または複数種の洗剤成分をさらに含む、パラグラフ１４に記載の組成物。
１６．洗剤成分が、以下：界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルター、コビルダー、キレート剤、漂白剤成分、ポリマー、布地色相剤、布地コンディショナ、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光性白色化剤、香料、光学増白剤、殺菌剤、殺カビ剤、汚れ懸濁剤、汚れ遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素抑制剤、酵素安定剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、および溶解剤からなる群から選択される、パラグラフ１５に記載の組成物。
１７．１または複数種の別の酵素をさらに含み、好ましくは前記１または複数種の別の酵素が、１または複数種のアミラーゼであり、さらに好ましくは、前記１または複数種のアミラーゼが、１または複数種のα−アミラーゼである、パラグラフ１４〜１６のいずれかに記載の組成物。
１８．さらに、以下：ＤＮａｓｅ、ペルヒドロラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キサンタナーゼ、キサンタンリアーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、アリールエステラーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラギナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、他のエンド−β−マンナナーゼ、エキソ−β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルカナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を含む、パラグラフ１４〜１７のいずれかに記載の組成物。
１９．前記組成物が、７．５以上のｐＨを有し、また、任意選択で、漂白剤を含み；好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１３．５の範囲で選択され、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲で選択され、非常に好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲で選択され、極めて好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲で選択される、パラグラフ１４〜１８のいずれかに記載の組成物。
２０．前記組成物が、アルカリ性条件下で、向上した安定性および／または性能を有し、好ましくは、前記アルカリ性条件は、ｐＨ７．５以上を有する、パラグラフ１４〜１９のいずれかに記載の組成物。
２１．前記組成物が、クリーニングまたは洗剤組成物である、パラグラフ１４〜２０のいずれかに記載の組成物。
２２．β−グルカンを分解するためのパラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体またはパラグラフ１４〜２１のいずれかに記載の組成物の使用であって、好ましくは、前記β−グルカンは、β−Ｄ−グルカンであり、さらに好ましくは、前記β−グルカンは、β−１，３−１，４グルカンであり、非常に好ましくは、前記β−グルカンは、混合結合β−グルカンであり、極めて好ましくは、前記β−グルカンは、オオムギβ−グルカンまたはオートミールβ−グルカンであり；任意選択で、前記使用は、ｐＨ７．５以上のアルカリ性条件下で実施される、使用。
２３．自動食器洗浄（ＡＤＷ）を含む食器洗浄などの生地および／もしくは硬質表面の洗浄またはクリーニングのためのパラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体またはパラグラフ１４〜２１のいずれかに記載の組成物の使用であって；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
２４．自動食器洗浄（ＡＤＷ）および業務用クリーニングをはじめとする食器洗浄を含む洗濯または硬質表面などのクリーニング工程におけるパラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体またはパラグラフ１４〜２１のいずれかに記載の組成物の使用であって；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
２５．自動食器洗浄（ＡＤＷ）をはじめとする食器洗浄を含む洗濯および／または硬質表面クリーニングのためのパラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体またはパラグラフ１４〜２１のいずれかに記載の組成物の使用であって、前記ポリペプチドまたは前記組成物は、酵素洗浄性利益を有し；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
２６．以下：品目からのバイオフィルムの防止、抑制または除去、好ましくは前記品目からの悪臭の抑制または除去の少なくとも１つのための、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体またはパラグラフ１４〜２１のいずれかに記載の組成物の使用であって；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
２７．パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体またはパラグラフ１４〜２１のいずれかに記載の組成物を適用するステップを含む、β−グルカンを分解するプロセスであって、好ましくは、前記β−グルカンは、β−Ｄ−グルカンであり、さらに好ましくは、前記β−グルカンは、β−１，３−１，４グルカンであり、非常に好ましくは、前記β−グルカンは、混合結合β−グルカンであり、極めて好ましくは、前記β−グルカンは、オオムギβ−グルカンまたはオートミールβ−グルカンであり；任意選択で、前記プロセスは、ｐＨ７．５以上のアルカリ性条件下で実施される、プロセス。
２８．前記β−グルカンが、食器洗浄のように、生地または硬質表面の表面に存在する、パラグラフ２７に記載のプロセス。
２９．パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体を含む、発酵ブロス配合物または細胞培養組成物。
３０．パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
３１．パラグラフ３０に記載のポリヌクレオチドを発現することができる核酸構築物または発現ベクターであって、好ましくは、パラグラフ３０に記載のポリヌクレオチドを含む前記核酸構築物または前記発現ベクターが、発現宿主におけるポリペプチドの産生を指令する１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結された、核酸構築物または発現ベクター。
３２．好ましくは、前記ポリヌクレオチドが、ポリペプチドの産生を指令する１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結されており、さらに好ましくは、前記組換え宿主細胞は、単離された組換え宿主細胞である、パラグラフ３０に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
３３．以下：ｉ）パラグラフ３０に記載のポリヌクレオチド；またはｉｉ）パラグラフ３１に記載の核酸構築物；またはｉｉｉ）パラグラフ３１に記載の発現ベクターの少なくとも１つを含む組成物。
３４．β−グルカナーゼを産生する方法であって、変異体の発現に好適な条件下で、パラグラフ３２に記載の組換え宿主細胞を培養するステップを含む方法。
３５．変異体を回収するステップをさらに含む、パラグラフ３４に記載の方法。
３６．パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体をコードするポリヌクレオチドで形質転換したトランスジェニック植物、植物部分または植物細胞。
３７．ポリペプチドの産生を助ける条件下で、パラグラフ３６に記載のトランスジェニック植物または植物細胞を培養するステップを含む、β−グルカナーゼ変異体を生成する方法。
３８．変異体を回収するステップをさらに含む、パラグラフ３７に記載の方法。
３９．配列番号２６の番号付けを用いて、親β−グルカナーゼ中に、配列番号２６の成熟ポリペプチドの３３位、例えばＦ３３、および１８８位、例えばＭ１８８に対応する１つまたは複数の位置の置換を導入するステップであって、変異体が、β−グルカナーゼ活性を有するステップと；変異体を回収するステップを含む、β−グルカナーゼ変異体を取得する方法。
４０．親が、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２５、および配列番号２８からなる群から選択される成熟ポリペプチドに対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％、または１００％の配列同一性を有する、パラグラフ３９に記載の方法。
４１．親β−グルカナーゼが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から取得されるか、または取得可能である、パラグラフ３４〜３５および３９〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の変異体と、１または複数種のアミラーゼを含むクリーニングまたは洗剤組成物であって、好ましくは、前記変異体および前記１または複数種のアミラーゼは、相乗効果を有し；より好ましくは、前記相乗効果が、ＲＥＭ相乗効果であり、さらに好ましくは、前記ＲＥＭ相乗効果は、約７．５のｐＨ、約４０℃で、約３０分間６．５を超え、さらにまた好ましくは、前記ＲＥＭ相乗効果は、約１０のｐＨ、約４０℃で、約３０分間６．１を超え、非常に好ましくは、前記ＲＥＭ相乗効果は、約１０のｐＨ、約４０℃で、約３０分間６．２を超え、極めて好ましくは、前記β−グルカナーゼ活性は、セルロースのＤ−グルコース単位同士のβ−１，４結合に対するエンド−セルラーゼ活性ではない、クリーニングまたは洗剤組成物。
４３．前記変異体が、約７．５〜約１３．５の範囲のｐＨを有する水溶液中でβ−グルカナーゼ活性を有することができ、ここで、前記水溶液は、任意選択で、漂白剤を含み、好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲であり、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲であり、非常に好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲である、パラグラフ４２に記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
４４．前記変異体が、約２０℃〜約７５℃の範囲、および／または約４０℃〜約６０℃の範囲で選択される温度の水溶液中でβ−グルカナーゼ活性を示すことができ、前記水溶液は、任意選択で、漂白剤を含む、パラグラフ４２〜４３のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
４５．前記変異体が、少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも３０分間、より好ましくは少なくとも６０分間、さらに好ましくは少なくとも９０分間、極めて好ましくは少なくとも１２０分間、β−グルカナーゼ活性を有することができる、パラグラフ４２〜４４のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
４６．前記β−グルカナーゼ活性が、アルカリβ−グルカナーゼ活性を含み、ここで、前記アルカリβ−グルカナーゼ活性は、ｐＨ７．５以上でβ−グルカナーゼ活性である、パラグラフ４２〜４５のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
４７．前記β−グルカナーゼ活性が、リケニナーゼＥＣ３．２．１．７３活性を含み、好ましくは、前記β−グルカナーゼ活性は、リケニナーゼＥＣ３．２．１．７３活性である、パラグラフ４２〜４６のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
４８．前記アミラーゼが、α−アミラーゼである、４２〜４７のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
４９．１または複数種の洗剤成分をさらに含む、４２〜４８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５０．洗剤成分が、以下：界面活性剤、ヒドロトロープ、ビルター、コビルダー、キレート剤、漂白剤成分、ポリマー、布地色相剤、布地コンディショナ、起泡増進剤、石鹸泡抑制剤、分散剤、移染防止剤、蛍光性白色化剤、香料、光学増白剤、殺菌剤、殺カビ剤、汚れ懸濁剤、汚れ遊離ポリマー、再付着防止剤、酵素抑制剤、酵素安定剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、および溶解剤からなる群から選択される、パラグラフ４９に記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５１．１または複数種の別の酵素をさらに含む、パラグラフ４２〜５０のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５２．さらに、以下：ＤＮａｓｅ、ペルヒドロラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ、β−グルカナーゼ、キシログルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キサンタナーゼ、キサンタンリアーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、アリールエステラーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、カラギナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、他のエンド−β−マンナナーゼ、エキソ−β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルカナーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される酵素を含む、パラグラフ４２〜５１のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５３．前記組成物が、約７．５以上のｐＨを有し、任意選択で、漂白剤を含み；好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１３．５の範囲で選択され、さらに好ましくは、前記ｐＨは、約７．５〜約１２．５の範囲で選択され、非常に好ましくは、前記ｐＨは、約８．５〜約１１．５の範囲から選択され、極めて好ましくは、前記ｐＨは、約９．５〜約１０．５の範囲で選択される、パラグラフ４２〜５２のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５４．前記α−アミラーゼが、以下：
（ａ）配列番号１３（国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１３（国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および／または４４４の１つまたは複数に置換を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１４（国際公開第０２／０１０３５５号パンフレットの配列番号６に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド； 
（ｄ）配列番号１５（国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６の残基１〜３３と国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４の残基３６〜４８３を含む）のハイブリッドポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｅ）配列番号１５（国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号６の残基１〜３３と国際公開第２００６／０６６５９４号パンフレットの配列番号４の残基３６〜４８３を含む）のハイブリッドポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：４８、４９、１０７、１５６、１８１、１９０、１９７、２０１、２０９および／または２６４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むハイブリッドポリペプチド；
（ｆ）配列番号１６（国際公開第０２／０１９４６７号パンフレットの配列番号６に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｇ）配列番号１６（国際公開第０２／０１９４６７号パンフレットの配列番号６に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１８１、１８２、１８３、１８４、１９５、２０６、２１２、２１６および／または２６９の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９（国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号２または配列番号７に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｉ）配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９（国際公開第９６／０２３８７３号パンフレットの配列番号１、配列番号２または配列番号７に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１４０、１８３、１８４、１９５、２０６、２４３、２６０、３０４および／または４７６の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｊ）配列番号２０（国際公開第０８／１５３８１５号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｋ）配列番号２１（国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｌ）配列番号２１（国際公開第０１／６６７１２号パンフレットの配列番号１０に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１７６、１７７、１７８、１７９、１９０、２０１、２０７、２１１および／または２６４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｍ）配列番号２２（国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｎ）配列番号２２（国際公開第０９／０６１３８０号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：８７、９８、１２５、１２８、１３１、１６５、１７８、１８０、１８１、１８２、１８３、２０１、２０２、２２５、２４３、２７２、２８２、３０５、３０９、３１９、３２０、３５９、４４４および／または４７５の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｏ）配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：２８、１１８、１７４；１８１、１８２、１８３、１８４、１８６、１８９、１９５、２０２、２９８、２９９、３０２、３０３、３０６、３１０、３１４；３２０、３２４、３４５、３９６、４００、４３９、４４４、４４５、４４６、４４９、４５８、４７１および／または４８４の１つまたは複数に置換、欠失もしくは挿入を含むポリペプチド；
（ｐ）配列番号１２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｒ）配列番号１２（国際公開第９５／１０６０３号パンフレットの配列番号２に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および／または４４４の１つまたは複数に置換を含むポリペプチド；
（ｓ）配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチド；ならびに
（ｔ）配列番号２９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドであって、位置：１８７、２０３、４７６、４５８、４５９、４６０、１７８、１７９、１８０、１８１、７、２００、１２６、１３２、３０３、４７７、１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１７８、１７９、１８１、１８８、１９０、１９７、２０１、２０２、２０７、２０８、２０９、２１１、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８、および／または４４４の１つまたは複数に置換を含むポリペプチド
からなる群から選択される、パラグラフ４２〜５３のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５５．前記組成物が、アルカリ性条件下で、向上した安定性および／または性能を有し、好ましくは、前記アルカリ性条件は、ｐＨ７．５以上を有する、パラグラフ４２〜５４のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５６．前記組成物が、バー、均質タブレット、２つ以上の層を有するタブレット、１つまたは複数のコンパートメントを有するポーチ、通常または圧縮粉末、顆粒、ペースト、ゲル、または通常、圧縮もしくは濃縮液体である、パラグラフ４２〜５５のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５７．クリーニングまたは洗剤用途において酵素洗浄性利益を有する、パラグラフ４２〜５６のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５８．向上した安定性および／または性能を有し、好ましくは、前記向上した安定性および／または性能が、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で達成される、パラグラフ４２〜５７のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物。
５９．表面をパラグラフ４２〜５８のいずれかに記載の組成物と接触させるステップを含む、表面から汚れを除去する方法。
６０．β−グルカンを分解するためのパラグラフ４２〜５８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物の使用であって、好ましくは、前記β−グルカンは、β−Ｄ−グルカンであり、さらに好ましくは、前記β−グルカンは、β−１，３−１，４グルカンであり、非常に好ましくは、前記β−グルカンは、混合結合β−グルカンであり、極めて好ましくは、前記β−グルカンは、オオムギβ−グルカンまたはオートミールβ−グルカンであり；任意選択で、前記使用は、ｐＨ７．５以上のアルカリ性条件下で実施される、使用。
６１．自動食器洗浄（ＡＤＷ）を含む食器洗浄などの生地および／もしくは硬質表面の洗浄またはクリーニングのためのパラグラフ４２〜５８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物の使用であって；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
６２．自動食器洗浄（ＡＤＷ）および業務用クリーニングをはじめとする、食器洗浄を含む洗濯または硬質表面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおけるパラグラフ４２〜５８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物の使用であって；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
６３．自動食器洗浄（ＡＤＷ）をはじめとする、食器洗浄などの洗濯および／または硬質表面クリーニングのためのパラグラフ４２〜５８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物の使用であって、前記組成物は、酵素洗浄性利益を有し；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
６４．以下：品目からのバイオフィルムの防止、抑制または除去、好ましくは前記品目からの悪臭の抑制または除去の少なくとも１つのための、パラグラフ４２〜５８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物の使用であって；任意選択で、前記使用は、７．５以上のｐＨを有するアルカリ性条件下で実施される、使用。
６５．パラグラフ４２〜５８のいずれかに記載のクリーニングまたは洗剤組成物を前記β−グルカンに適用するステップを含むβ−グルカンを分解するプロセスであって、好ましくは、前記β−グルカンは、β−Ｄ−グルカンであり、さらに好ましくは、前記β−グルカンは、β−１，３−１，４グルカンであり、非常に好ましくは、前記β−グルカンは、混合結合β−グルカンであり、極めて好ましくは、前記β−グルカンは、オオムギβ−グルカンまたはオートミールβ−グルカンであり；任意選択で、前記プロセスは、ｐＨ７．５以上のアルカリ性条件下で実施される、プロセス。
６６．前記β−グルカンが、食器洗浄など、生地または硬質表面の表面に存在する、パラグラフ６５に記載のプロセス。
【０４０９】
本発明を以下の実施例により詳しく説明するが、これらは、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０４１０】
本明細書に記載の実施例セクションで使用される洗剤組成物は、以下を含んだ。
【０４１１】
【表２】
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【０４１２】
【表３】
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【０４１３】
【表４】
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【０４１４】
【表５】
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【０４１５】
【表６】
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【０４１６】
実施例１：β−グルカナーゼ活性の決定：
エンド−グルカナーゼ活性の検知のために、ＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカン（アズリン染料と共有結合したβ−グルカン）アッセイを使用した。ＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカン（７５ｍｇ）を１５ｍＬの洗剤（漂白剤を含む、および含まないモデル洗剤Ａ、Ｘ、Ｚ、ならびにｐＨ調節されたＡＤＷモデル洗剤Ａ）中に懸濁させた。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ内の１ｍＬのこの溶液中に、１０μＬの酵素（０．３３ｍｇ酵素タンパク質／リットル）を添加し、予熱サーモミキサーにおいて１２５０ｒｐｍで振盪させながら４０℃で１５分間インキュベートし、１３２００ｒｐｍで２分間旋回させ、１０μＭのＣａＣｌ２を含む５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５倍希釈し、２５０μＬの溶液をマイクロタイタープレートに移し、５９０ｎｍでサンプル吸光度を測定した。
【０４１７】
実施例２：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）からのＧＨ１６エンド−β−１，３−１，４グルカナーゼのクローニング、発現および精製：
β−グルカナーゼは、表１に従い、Ｇｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から、または古典的な微生物技術により環境サンプルからの単離のいずれかで取得した細菌株から得た。
【０４１８】
【表７】
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【０４１９】
個別の菌株の純粋培養物からの染色体ＤＮＡを精製した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技法を用いて、全ゲノムシーケンシングに付した。アセンブルされたゲノム配列および１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子配列の後の分析から、菌株の同一性を確認した。
【０４２０】
β−１，３−１，４グルカナーゼをコードする個別の遺伝子をＰＣＲにより増幅し、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムへの組換えのために調節エレメントおよび相同性領域と融合させた。
【０４２１】
直鎖状の組み込み構築物は、強力なプロモータおよびクロラムフェニコール耐性マーカと、２つの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体領域の間の遺伝子との融合によって作製されたＳＯＥ−ＰＣＲ融合産物（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ  Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｇｅｎｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｇｅｎｅ  ７７：６１−６８）であった。ＳＯＥ  ＰＣＲ法は、特許出願：国際公開第２００３０９５６５８号パンフレットにも記載されている。
【０４２２】
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）由来のプロモータと、安定化配列を含むバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡプロモータとから構成される、トリプルプロモータ系（国際公開第９９／４３８３５号パンフレットに記載の通り）の制御下で、遺伝子を発現させた。
【０４２３】
ネイティブ分泌シグナルに代わりバチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）分泌シグナル（次のアミノ酸配列：ＭＫＫＰＬＧＫＩＶＡＳＴＡＬＬＩＳＶＡＦＳＳＳＩＡＳＡ（配列番号１０）をコードする）で、遺伝子を発現させた。さらに、発現構築物によって、発現された成熟タンパク質に対する、配列ＨＨＨＨＨＨＰＲ（配列番号１１）から構成されるＮ末端ポリヒスチジンアフィニティ精製タグの付加がもたらされた。
【０４２４】
ＳＯＥ−ＰＣＲ産物を枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換し、ペクチン酸リアーゼ遺伝子座への相同組換えによって染色体に組み込んだ。続いて、組み込まれた発現構築物を含む組換え枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）クローンを濃厚な液体培養物中で増殖させた。培養ブロスを遠心分離（２００００×ｇ、２０分）した後、沈殿物から上清を注意深くデカントし、酵素の精製のために使用した。
【０４２５】
ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによる組換え酵素の精製
清澄化した上清のｐＨをｐＨ８に調節し、０．２μＭフィルターでろ過した後、上清を５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ（商標）エクセルカラムに塗布した。ロードする前に、カラムは、５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８で平衡させておいた。非結合材料を除去するために、８ＣＶの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８でカラムを洗浄し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７＋１０ｍＭイミダゾールを用いて標的の溶出液を取得した。溶出したタンパク質は、３ＣＶの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７＋１００ｍＭ  ＮａＣｌを用いて平衡させたＨｉＰｒｅｐ（商標）２６／１０脱塩カラムで脱塩させた。この緩衝液は、標的の溶出にも使用し、流量は１０ｍｌ／分であった。関連画分を選択し、クロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいてプールした。
【０４２６】
実施例３：β−グルカナーゼ酵素を用いたＡＺＣＬ−アッセイ
この実施例では、様々な洗濯条件をモデル化する様々なｐＨ、温度および洗剤で、ＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカン基質に対する酵素活性を測定した。酵素活性の測定は、実施例１に記載と同様であるが、１０μＭ  ＣａＣｌ２を含む５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００による５倍希釈はなかった。モデル洗剤Ａ、モデル洗剤Ｘ、漂白剤を含むモデル洗剤Ｚ、漂白剤を含まないモデル洗剤Ｚ、ｐＨ調節した漂白剤を含むモデル洗剤Ｚ、ならびにｐＨ調節した漂白剤を含まないモデルＺ洗剤組成物中のバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のβ−グルカナーゼおよび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のβ−グルカナーゼを用いて比較を実施した。
【０４２７】
【表８】
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【０４２８】
実施例４：自動食器洗浄モデル洗剤におけるＡＺＣＬ−β−オオムギ基質に対する酵素活性のＡＺＣＬ−アッセイ
酵素活性の測定を実施例１に記載の通りに実施した。この実施例では、新規のβ−グルカナーゼの酵素活性を、自動食器洗浄モデルＡにおいてバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のβ−グルカナーゼの酵素活性と比較した。得られたデータを以下の表３に示す。
【０４２９】
【表９】
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【０４３０】
実施例５：ＴＳＡにより測定されるβ−グルカナーゼ安定性
この実施例では、新規のβ−グルカナーゼの安定性をバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のβ−グルカナーゼの安定性と比較した。熱シフトアッセイ（ＴＳＡ）は、ｐＨを５、７．５および１０にそれぞれ調節したアッセイ緩衝液：０．１Ｍコハク酸、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１Ｍ  ＣＨＥＳ、０．１Ｍ  ＣＡＰＳ、０．１５Ｍ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した酵素サンプルで実施した。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓ６６５０）はｍＱ水で１０１倍希釈した。１０μｌの希釈酵素サンプル＋１０μｌアッセイ緩衝液＋１０μｌ染料をＴＳＡアッセイプレート（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌプレート９６、ホワイト（Ｒｏｃｈｅ）のウェル内で混合し、光学シール（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｓｅａｌｉｎｇ  ｆｏｉｌ，Ｒｏｃｈｅ）で被覆した。Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ソフトウエア（公開１．５．０  ＳＰ４）を実行するＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩ装置により、２００℃／時で、２５〜９９℃にてタンパク質融解分析を実施した。サンプルは全て、２回反復して分析した。記録される読み出しは、タンパク質融解曲線の中点値として定義されるＴｍである。得られたデータを以下の表４に示す。
【０４３１】
【表１０】
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【０４３２】
実施例６：β−グルカナーゼ基質特異性
β−グルカナーゼの基質特異性をＭｅｇａｚｙｍｅからの様々なＡＺＣＬ−アッセイを用いてさらに試験した（ＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカン、ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース、ＡＺＣＬ−パキマンおよびＡＺＣＬ−カードラン（ｃｕｒｄｌａｎ）（アズリン染料と共有結合したβ−グルカン）。ＡＺＣＬ−基質（７５ｍｇ）を１５ｍＬのモデル洗剤Ｘに懸濁させた。エッペンドルフチューブ内の１ｍＬのこの溶液を１０μＬの酵素（０．３３ｍｇ酵素タンパク質／リットル）に添加し、予熱サーモミキサーにおいて１２５０ｒｐｍで振盪させながら４０℃で１５分間インキュベートし、１３２００ｒｐｍで２分間旋回させ、１０μＭのＣａＣｌ２を含む５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で５倍希釈し、２５０μＬの溶液をマイクロタイタープレートに移し、５９０ｎｍでサンプル吸光度を測定した。
【０４３３】
この実施例では、全６種のβ−グルカナーゼ（すなわち、バチルス・アキバイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｋｉｂａｉ）、バチルス・アガラドハエレンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、バチルス・モジャベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ｓｐ−６２４４９、バチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の）の基質特異性をＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカン、ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース、ＡＺＣＬ−パキマンおよびＡＺＣＬ−カードラン基質について試験した。得られた結果により、試験した全６種のβ−グルカナーゼが、ＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカン基質に対してのみ活性を有すること（すなわち、基質としてのＡＺＣＬ−オオムギβ−グルカンに対する陽性反応、および基質としてのＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース、ＡＺＣＬ−パキマンおよびＡＺＣＬ−カードランに対する陰性反応、以下の表５）をさらに確認した。データは、試験したβ−グルカナーゼが、β−１，３結合とβ−１，４結合の両方を含むβ−グルカンにだけ活性を示し、純粋なβ−１，４グルカンまたはβ−１，３グルカンのみまたはβ−１，３およびβ−１，６結合の混合物からなるβ−グルカンには示さないことを示す。前述の結果に基づき、本発明のβ−グルカナーゼは、本明細書で使用されるβ−グルカナーゼの定義において、エンド−セルラーゼからさらに区別することができ、前記エンド−セルラーゼは、セルロースのＤ−グルコース単位同士のβ−１，４結合を有する。以上のことから、本発明のβ−グルカナーゼは、リケニナーゼ（ＥＣ．３．２．１．７１）酵素活性を有することが結論付けられる。
【０４３４】
【表１１】
2019504625.tif 000012
【０４３５】
実施例７：α−アミラーゼと組み合わせた場合の本発明のβ−グルカナーゼ（例えば、リケナーゼ）の相乗効果
Ｉ．Ｗａｓｃａｔｏｒボトル洗浄法の説明：
酵素の性能を検知するために、Ｗａｓｃａｔｏｒボトル洗浄法を使用した。Ｗａｓｃａｔｏｒ洗濯機（ＦＯＭ  ７１  Ｌａｂ）に、酵素と４つの汚れ（Ｅｑｕｅｓｔ製の０３５ＫＣチョコレートポリッジオートムギ、直径２ｃｍ）を含む２５ｍＬ洗剤溶液の入ったボトル（６０ｍＬ、ＤＳＥ  ＰＰ  ７０Ｘ３５  Ａｓｅｐｔｉｓｋ，ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｎｏ．：２１６−２６２０，ＶＷＲ製）を添加した。洗濯機には２ｋｇのバラスト（ふきん、綿）を導入した。液体および粉末モデル洗濯洗剤（それぞれ、モデルＡ１およびモデルＸ１）ならびにＡＤＷモデル洗剤（ＡＤＷモデル洗剤Ａ１）を用いて、４０℃の２５Ｌ水で３０分間洗浄した。洗浄後、汚れを水道水（３Ｌ）で２回すすいでから、乾燥キャビネット（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｘ，Ｉｎｔｕｉｔｉｏｎ，ＥＤＤ２４００）内でｒｔ（室温）に設定し乾燥させた。分光光度計（Ｍａｃｈｂｅｔｈ  Ｃｏｌｏｒ−Ｅｙｅ  ７０００  Ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ）により４６０ｎｍで再光を測定した。
【０４３６】
ＩＩ．結果：
この実施例では、Ｗａｓｃａｔｏｒボトル洗浄法を用いて、様々なｐＨを有する多種の洗剤における２種の酵素同士の潜在的相乗効果を調べるために、個々のリケナーゼとα−アミラーゼ（Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ）（配列番号１２）の組み合わせの結果を検討した。４０℃で、リケナーゼのリットル当たり０．０１ｍｇの酵素タンパク質およびステインザイム（Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ）リットル当たり０．０５ｍｇの酵素タンパク質を用いて、モデル洗剤Ａ１、モデル洗剤Ｘ１およびＡＤＷモデル洗剤Ａ１でのバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のリケナーゼおよび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のリケナーゼについて比較を行った。この実施例で用いた詳細な条件は、表Ｆ〜Ｋに記載し、結果を以下の表６〜８に示す。
【０４３７】
【表１２】
2019504625.tif 000013
【０４３８】
【表１３】
2019504625.tif 000014
【０４３９】
【表１４】
2019504625.tif 000015
【０４４０】
【表１５】
2019504625.tif 000016
【０４４１】
【表１６】
2019504625.tif 000017
【０４４２】
【表１７】
2019504625.tif 000018
【０４４３】
本明細書で使用される略語：
ＲＥＭ＝測定値
ΔＲＥＭ＝ＲＥＭ−ブランク
ＲＥＭ組み合わせ＝測定値
ΔＲＥＭ組み合わせ＝ＲＥＭ組み合わせ−ブランク
ΔＲＥＭ理論値＝ΔＲＥＭ（アミラーゼ）＋ΔＲＥＭ（リケナーゼ）
ＲＥＭ相乗効果＝ΔＲＥＭ組み合わせ−ΔＲＥＭ理論値
【０４４４】
【表１８】
2019504625.tif 000019
【０４４５】
【表１９】
2019504625.tif 000020
【０４４６】
【表２０】
2019504625.tif 000021
【０４４７】
実施例８：最適ｐＨの決定
続いて、ＮａＯＨでｐＨ２〜１２に調節したブリトン・ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液（１００ｍＭリン酸、１００ｍＭ酢酸、１００ｍＭホウ酸、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２）中の０．４％ｗ／ｖＡＺＣＬ−グルカン（オオムギ）基質について、全６種のβ−グルカナーゼの最適ｐＨを決定した。調査対象である全てのｐＨ値について、最高水準のリニアアッセイレンジであると予想される酵素希釈液を選択した。最適ｐＨをｐＨ２〜１０の範囲で調べ、少数のサンプルについては、明確に最適を決定するために、それに前後するｐＨ値のいずれも包含した。結果を表９に示す。
【０４４８】
【表２１】
2019504625.tif 000022
【０４４９】
以上のことから、下記の通りいくつかの観察記録がなされた。
【０４５０】
バチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のβ−グルカナーゼは、６．０の最適ｐＨを有し、この活性に対して、ｐＨ１０．０では、１〜１１％の活性しかないことが判明した。新規の細菌β−グルカナーゼは、ｐＨ６〜９の範囲の最適ｐＨを有するが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の酵素と比べて、ｐＨ１０で２３〜９０％の範囲の有意に高い相対活性を有することが判明した。バチルス・アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）由来のＧＨ１６β−グルカナーゼは、非常に広範な最適ｐＨを有した。
【０４５１】
実施例９：変異体の同定、作製およびスクリーニング
多重配列アラインメント（ＭＵＳＣＬＥ）（例えば、図１）ならびに枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（３Ｏ５Ｓ）およびバチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（１ＧＢＧ）β−グルカナーゼの既知構造に基づく構造モデル化を使用することにより、２つの保存メチオニン（Ｍ２９、Ｍ１８０）を配列番号２３および配列番号２４を有するポリペプチドにおいて同定した。これらの部分的保存メチオニン（Ｍ２９、Ｍ１８０）は、それらの側鎖に付着するため、酸化不安定性硫黄原子が、活性側残基近傍の基質結合溝中に入り込む。これらのメチオニンの一方または両方の酸化は、基質結合に影響を与えて、活性および／または安定性の低下を招く。
【０４５２】
配列番号２３および配列番号２４を有するポリペプチド中のこれらのメチオニン（Ｍ２９、Ｍ１８０）を用いて、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８の成熟ポリペプチド中の対応するアミノ酸残基を同定した（例えば、図１）。従って、図１に示すように、以下の対応するアミノ酸残基が同定された：配列番号２５のポリペプチドのＭ３２およびＭ１８８；配列番号２６のポリペプチドのＦ３３およびＭ１８８；配列番号２７のポリペプチドのＦ３３およびＭ１８８；ならびに配列番号２８のポリペプチドのＭ２９およびＭ１８０。従って、例えば、小さなライブラリーにおいて、例えば、Ｍ３２Ｘ＋Ｍ１８８Ｘ、Ｆ３３Ｘ＋Ｍ１８８Ｘ、もしくはＭ２９Ｘ＋Ｍ１８０Ｘのように、単独でまたは組み合わせて、配列番号２５のポリペプチドのＭ３２およびＭ１８８；配列番号２６のポリペプチドのＦ３３およびＭ１８８；配列番号２７のポリペプチドのＦ３３およびＭ１８８；ならびに配列番号２８のポリペプチドのＭ２９およびＭ１８０からなる群から選択される位置に対応する１つまたは複数の位置のアミノ酸残基を置換することが提案され、次に、これらを漂白剤の存在下で安定性についてスクリーニングする。
【０４５３】
Ｍ３２ＸおよびＭ１８８Ｘ、Ｆ３３ＸおよびＭ１８８Ｘ、Ｍ２９ＸおよびＭ１８０Ｘに変化を有するこうしたライブラリーを作製することができ、ここで、Ｘは、２つの位置を広げるＰＣＲ断片を得ることができるように、メチオニン（またはフェニルアラニン）コドンのＮＮＳドーピングによる任意のアミノ酸であってよい。親グルカナーゼ遺伝子に特異的で、且つＭ３２Ｘ＋Ｍ１８８Ｘ、Ｆ３３Ｘ＋Ｍ１８８ＸおよびＭ２９Ｘ＋Ｍ１８０Ｘ断片とオーバーラップするプライマー、ならびにバチルス（ｂａｃｉｌｌｕｓ）ゲノムにおける特定の部位のためのプライマーを用いたＰＣＲにより、上方および下方組込み断片を調製することができる。グルカナーゼ遺伝子発現カセットは、上方および下方ペクチン酸リアーゼ遺伝子に特異的なプライマーを用いた三重ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）ＰＣＲ法により構築することができ、得られたＰＣＲ断片は、好適な枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主に形質転換することができ、そこで、ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌ）遺伝子座への相同組換えにより、発現構築物を枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体に組み込むことができる。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をマーカとして用いることができる（（Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｌａｓｍｉｄ  ３０：３１２−３１５に記載されている通り）。クロラムフェニコール耐性クローンをＤＮＡシーケンシングにより分析することができる。
【０４５４】
以下に記載するように、確立されたアッセイならびに基準活性および安定性（例えば、バチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の野生型β−グルカナーゼ）を用いて、変異体のライブラリーをβ−グルカナーゼ活性および安定性についてスクリーニングすることができる。変異体のβ−グルカナーゼ活性を測定する好ましいアッセイは、上の実施例１に開示されている。変異体のβ−グルカナーゼ活性の基質特異性を精密にするための好ましいアッセイは、上の実施例６に開示されている。
【０４５５】
あるいは、変異体のβ−グルカナーゼ活性は、タブレット形態のレマゾールブリリアントブルーＲ染料（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）で染色した高度精製低粘度オオムギ１，３−１，４−β−グルカンを用いたマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）フォーマットアッセイで測定することができる。
【０４５６】
アッセイは、Ｈ．Ｔ．Ｓ．Ｂｒｉｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍｎ．Ｓｏｃ．１９３１，１４５６−１４６２に従って調製される、１００ｍＭ  Ｂ＆ＲバッファーｐＨ７．５中で実施することができる。方法のステップは以下の通りである：
１．サンプルをＢ＆Ｒバッファーで希釈して、線形範囲の活性を達成する（すなわち、項目９で測定される吸光度が、０．１〜１．０の範囲内であるようにすべきである）；
２．基質：０．２４ｍＭ  ＣａＣｌ２、Ｂｒｉｊ  ｐＨ７．５を含有する５ｍｌのＢ＆Ｒバッファー中の１タブレットを調製する；
３．定速で攪拌しながら、１３０μｌの基質を９６ＰＣＲチューブに移す。これを低温に維持する；
４．２０μｌの希釈酵素を添加する。キャップをし、２〜３回反転させて混合する；
５．サーモサイクラー内で、４０℃で１０分間インキュベートする；
６．７５μｌのＮａＯＨ  １Ｍを添加し、チューブを密封し、２〜３回反転させて混合する；
７．２５００ｒｐｍで５分間遠心分離する；
８．１００μｌを新しいマイクロタイタープレートに移す；
９．５９０ｎｍで吸光度を測定する。
【０４５７】
上記に基づき、変異体および基準としてのバチルス・アミロリケニファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のβ−グルカナーゼならびにブラインドサンプルとしての緩衝液を含むＭＴＰプレートを、湿度制御装置付きシェーカ内で、３日間２２０ｒｐｍおよび３７℃にて、１２０μｌのＭｅｄ−Ｆ培地（例えば、以下の表１０に示す通り）中でインキュベートすることができる。
【０４５８】
上清を緩衝液（１００ｍＭ  ＢＲ、０．２４ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）で１００倍希釈し、２回目は洗剤／漂白剤溶液で１：１に希釈した。２つの同じサンプルを調製することができる。
【０４５９】
変異体の安定性を評価するために、１つのサンプルは、使用まで４℃に維持することができるが、他方のサンプルは、ＰＣＲ装置において４０℃で２０分間加熱することができる。これによって、活性および高い残留活性の両方を有する変異体を同定することができ、例えば、３２Ｘ＋Ｍ１８８Ｘ、Ｆ３３Ｘ＋Ｍ１８８Ｘ、またはＭ２９Ｘ＋Ｍ１８０Ｘにおける置換をシーケンシングにより確認することができる。
【０４６０】
【表２２】
2019504625.tif 000023
【０４６１】
漂白剤を含まないリン酸塩非含有洗剤、０．０８ｇ（１０％）過炭酸塩（ＤＣ０１５９６）（漂白剤）＋０．０３２ｇ（４％）ＴＡＥＤ（漂白剤活性化剤）から洗剤／漂白剤溶液：０．８ｇ／１００ｍｌ溶液を作製して、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて１００ｍｌまで希釈することができる。化学薬品は、ＤｉｆｃｏまたはＭｅｒｃｋから購入することができる。洗剤／漂白剤は、実験毎に新しく調製すべきである。
【０４６２】
本明細書に記載され、特許請求されている本発明は、本明細書に開示されている特定の態様によって範囲が限定されるべきではなく、これは、これらの態様は本発明の数々の態様の例示であることが意図されているためである。いずれかの同等の態様は本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本明細書に示され、記載されているものに追加した本発明の種々の改変形態が、前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。このような改変形態もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に属することが意図されている。競合する場合には、定義を含む本開示が優先されることとなる。
【図１】
2019504625.tif 000024
【配列表】
2019504625000001.app
【国際調査報告】
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2019504625.tif 000026
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