(57)【要約】Ｔ細胞がエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するように条件付けるために、エキソビボまたはインビトロで脂肪酸異化作用プロモーターで前処理されたＴ細胞を対象に投与することを包含する、がんを処置する方法が開示される。さらに他の方法は、（ａ）腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物；及び（ｂ）腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞及び／または脂肪酸異化作用プロモーターでエキソビボで前処理されたＴ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬であって、Ｔ細胞が養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するように条件付ける化合物または試薬を、固形腫瘍によって特徴付けられるがんを有する対象に同時投与することを包含する。両方の方法ともまた、チェックポイント阻害剤の同時投与を使用してもよい。【選択図】図１
2019504071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前処理されたＴ細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて、エキソビボまたはインビトロで前処理または条件付けされるＴ細胞またはＴ細胞集団を、がんを有する対象に投与することを包含する、がんを処置する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、がんを有する対象に
（ａ）対象の腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物；ならびに
（ｂ）１つ以上の
ｉ．腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬；及び
ｉｉ．養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにＴ細胞を条件付けるために（ｉ）を用いてエキソビボで前処理したＴ細胞。
を、同時投与することをさらに包含する、方法。
【請求項３】
Ｔ細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてＴ細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含する、Ｔ細胞を改変する方法。
【請求項４】
キメラ抗原受容体−Ｔ細胞またはキメラ内分泌受容体−Ｔ細胞またはエキソビボで増殖した腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の生存を増強するための、請求項３に記載の方法であって、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入の前に、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボでＴ細胞を前処理することをさらに包含する、方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、がんの治療のための治療レジメンが：
（ａ）固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の１日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法用組成物の単回用量を投与すること；
（ｂ）腫瘍微小環境において腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を、前記対象に投与することであって、試薬の前記脂肪酸異化作用促進性化合物の前記第１の投与量が処置の０〜５日目に開始する投与；
（ｃ）（ｂ）の処置の開始日から処置の第７日〜第３０日の間に存在する日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性の化合物または試薬を投与すること、を包含する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに包含する、方法。
【請求項７】
前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体または低分子リガンドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する前記化合物または試薬が、フェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、ＡＭＰＫ活性化因子または５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記Ｔ細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られる、自己または異種の、天然に存在するＴ細胞、または組換えもしくは合成により修飾されたＴ細胞構築物、またはヒトＴ細胞もしくはナチュラルキ
ラー（ＮＫ）Ｔ細胞もしくはＴ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、あるいはヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られたＴ細胞、あるいは、前記前処理の前に、異種抗原受容体、またはキメラ抗原受容体もしくはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されたＴ細胞、あるいは内因性もしくは異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株、あるいはＣＤ８＋Ｔ細胞である方法。
【請求項１０】
前記免疫療法組成物が、がん抗原を発現する組換えウイルスまたはウイルス様粒子、がん抗原を発現するＤＮＡ構築物、がん抗原またはその断片を、ペプチド抗原またはタンパク質として、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片を含む組成物である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって：
（ａ）前記免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたＴ細胞が、実質的に同時に投与されるか；
（ｂ）前記脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬または前処理されたＴ細胞が、免疫療法用組成物の投与後少なくとも１日〜１４日に１回または繰り返し投与されるか；
（ｃ）前記免疫療法組成物が単回投与または１回以上の追加投与として投与されるか；
（ｄ）前記組成物（ａ）及び（ｂ）（ｉ）が独立して、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内またはリンパ節内投与によって全身的に投与されるか；または
（ｅ）組成物（ｂ）が経口投与される、方法。
【請求項１２】
前記前処理されたＴ細胞が１回もしくは反復投与されるか、または前記前処理されたＴ細胞が単回用量で、もしくは１回以上の量として投与されるか、または前記前処理されたＴ細胞が静脈内注射または注入により全身的に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法であって、
（ａ）前記対象を他の抗癌療法で処置すること；及び
（ｂ）前記前処置されたＴ細胞を投与する前に、化学療法で対象を処置すること、をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
前記抗癌療法が、前記前処置されたＴ細胞の投与前に前記リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応じて前記腫瘍を外科的に切除することを包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法によって標的化される前記がんまたは腫瘍が、低酸素、Ｔリンパ球による有意な浸潤、及び前記腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｔ細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いて、エキソビボまたはインビトロで前処理されたＴ細胞を含む組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物において、
（ａ）前記組成物が、哺乳動物対象への養子移入の方法における使用のためであり；
（ｂ）前記脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬が、フェノフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、ＡＭＰＫ活性化因子または５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシドであるか；または
（ｃ）前記Ｔ細胞が、自己もしくは異種の天然に存在するＴ細胞または組換えもしくは合
成で改変されたＴ細胞構築物、または対象からもしくは対象の骨髄移植適合から得られたヒトＴ細胞もしくはナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞またはＴ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヒト末梢血から、もしくは対象の腫瘍微小環境から得られたＴ細胞、または前記前処理の前に異種抗原受容体、もしくはキメラ抗原受容体もしくはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されたＴ細胞、または内因性もしくは異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株、またはＣＤ８＋Ｔ細胞である、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子形式で提出された資料の参照による組み込み
出願人は、これにより、本明細書と共に電子形態で提出された配列表資料を参照により組み込む。このファイルには、「ＷＳＴ１６１ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と表示され、２０１７年１月９日付である。
【背景技術】
【０００２】
がん免疫療法の最近の進歩にもかかわらず７、２９、１４の高度免疫原性腫瘍（例えば、黒色腫）でさえ、治癒は稀なままである。腫瘍の微小環境（ＴＭＥ）は、組織の乱れた血管新生、腫瘍及び間質細胞由来の有毒生成物の存在、ならびに栄養素及び酸素（Ｏ２）の欠如に起因して、ＴＩＬに有意な代謝上の課題を課す２。最近の２つの論文では、グルコースの欠乏が腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の効果的な機能を損なうことが示されている６、１４。腫瘍はグルコースだけでなく酸素も欠く。腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）の機能低下は、固形腫瘍に対する免疫療法の有効性を弱める。これは、持続的な抗原刺激によって引き起こされるそれらの消耗を部分的には反映すると考えられている。エキソビボで増殖されたＴＩＬの養子移入は、大きな黒色腫の退縮に影響を与える可能性がある３８。それにもかかわらず、このようなＴ細胞を誘導することを目的とした伝統的なワクチンは、ほとんど効果がなかった９。腫瘍抗原（ＴＡ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗１、３は、それらの同時阻害剤の発現増強、転写因子Ｔ−ｂｅｔのレベル低下、及び慢性腫瘍由来抗原刺激後のエフェクター機能の喪失３６によって特徴付けられる２２。Ｔ細胞の消耗は、固形腫瘍に対する能動免疫療法の失敗の原因となることが示唆されている。
【０００３】
ＴＩＬは、腫瘍細胞を排除するためにエネルギーを必要とする。活性化の際に、Ｔ細胞は解糖によりエネルギー産生を増強する３４。解糖は、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）よりも効率的ではないが、バイオマス形成及び細胞増殖の構成要素を提供する。腫瘍細胞はまた、ＴＭＥ内のグルコース（Ｇｌｕ）枯渇を引き起こし得る６、１４解糖をも使用する１３。Ｔ細胞はＧｌｕへのアクセスが制限されており、エネルギーを産生するためにＯＸＰＨＯＳに依存しなければならない。脂肪酸（ＦＡ）を含む多くの物質はＯＸＰＨＯＳにエネルギーを供給し得るが、これにはＯ２が必要であり、これは、血液供給不足のせいで腫瘍内で制限され得る１９。したがって、ＴＩＬは、機能的な消耗を生じ、それによってがん免疫療法の有効性を障害する、二重代謝の危険性に直面する。
【０００４】
従って、代謝は、Ｔ細胞エフェクター機能の調節において重要な役割を果たす。ＴＩＬがグルコース及び酸素欠乏を含むＴＭＥ内の代謝制約にどのように適応し、これらの制約が腫瘍進行と戦うＴＩＬの能力にどのように影響を及ぼすかは、依然として十分に理解されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
がんの処置及び予防療法を容易にするための新規かつ有効なツール及び方法の必要性が、当技術分野において依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、がんを治療するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬（「脂肪酸異化作用プロモーター」または「脂肪酸異化促進性化合物」と多様に呼ばれる）を投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体
または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
【０００７】
別の態様では、がんを処置するための方法は、がんを有する対象に、前処理されたＴ細胞によるエネルギー産生のためにグルコースよりも脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて、エキソビボまたはインビトロで前処理されるかまたは条件付けされているＴ細胞を投与することを包含する。
【０００８】
別の態様では、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物；及び腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を同時投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
【０００９】
別の態様では、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物；ならびに養子細胞移入の前またはその際にエネルギー産生のために、グルコースではなく脂肪酸を使用するようにＴ細胞を条件付ける腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理されるかまたは移入の際に処理される選択されたＴ細胞を同時投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
【００１０】
別の態様では、がんを処置するための方法は、本明細書において同定された免疫療法組成物、脂肪酸異化作用プロモーター及び選択されたＴ細胞を同時投与することを包含する。別の実施形態において、この方法は、抗体または低分子の形態でチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
【００１１】
別の態様では、がんを処置するための方法は、Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたＴ細胞を、がんを有する対象に投与することを包含する。脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬は、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにＴ細胞を条件付ける。この前処理及び条件付けは、Ｔ細胞（複数可）が一旦、対象に（すなわち養子療法によって）再投与されると、Ｔ細胞（複数可）の免疫機能を高める。別の実施形態では、この方法は、前処置され、条件付けられたＴ細胞の投与と組み合わせて、または連続して、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。別の態様では、Ｔ細胞を改変する方法は、Ｔ細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてＴ細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含する。
【００１２】
別の態様では、Ｔ細胞、例えば、自己Ｔ細胞、キメラ抗原受容体−Ｔ細胞、キメラ内分泌腺受容体−Ｔ細胞、またはエキソビボで増殖された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の生存を増強する方法であって、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入の前または養子細胞移入時に、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて、Ｔ細胞（複数可）をエキソビボで処置することを包含する。
【００１３】
さらに別の態様では、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の１日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回用量を投与することを包含する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を投与される。脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬の第１の用量
は、処置の０、１、２、３、４または５日目のいずれかで始まる。このレジメンにはまた、免疫療法組成物の処置の開始日から処置の７日目〜３０日目の間に存在する日まで毎日脂肪酸異化作用促進性の化合物または試薬を投与するステップも包含される。
【００１４】
さらに別の態様では、Ｔ細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたＴ細胞を含む哺乳動物対象への養子移入のための組成物が提供される。
【００１５】
これらの組成物及び方法の他の態様及び利点は、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明においてさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、腫瘍チャレンジ３日後（ｎ＝６〜１８／群）のＡｄＣ６８−ｇＤ（対照、Ｃｏ）またはＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙをＡｄＣ６８−ｇＤＥ７（ワクチン）と混合して投与されたマウスにおける腫瘍増殖を示すグラフである。ＣＤ８＋ＴＩＬは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で機能的に障害されるようになる。図１Ｂは、腫瘍チャレンジ後２週間に回収したものに対して１か月で回収した秘蔵及び腫瘍の産生因子由来の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞頻度の比を示す棒グラフ（左）；ならびに３または２の因子を産生する脾臓または腫瘍由来のチャレンジ１ヵ月後の特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対頻度を示す棒グラフ（右）である。ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ（ＧｒｚｍＢ）及びパーフォリンの産生を測定した。ｎ＝５〜７／群。図１Ｃは、脾臓由来の特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の中／上中のＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＫＬＲＧ１及びＥｏｍｅｓ（左から右）のＭＦＩ（平均ＳＥＭ）を示す４つのグラフである。ｎ＝５〜７／群。全ての図において、結果は、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を有する平均値として示される。（＊）は、群間の有意差を示す；＊ｐ≦０．０５〜０．０１、＊＊ｐ≦０．０１〜０．００１、＊＊＊ｐ≦０．００１〜０．０００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。図１Ｄは、本明細書の研究との比較のために、ＰＤ−１、ＰＰＡＲ−α及びＢｏｄｉｐｙ  Ｃ１６の発現に対する種々のがんにおけるヒトＴ細胞の特徴の３つの棒グラフを示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＣＤ８＋ＴＩＬがますますＴＭＥ内の代謝ストレスを経験することを示している。図２Ａは、チャレンジの２週間後または１ヶ月後に採取した脾臓及び腫瘍由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）及びミトコンドリア活性酸素種（ＭＲＯＳ）染色のＭＦＩ値（平均−ＳＥＭ）を示す（ｎ＝５マウス／群、３回の実験の代表）。ＭＭＰによって、ＯＸＰＨＯＳによるＡＴＰ合成に使用されるプロトン勾配の形成が可能になる。ＭＲＯＳは、ミトコンドリア電子伝達鎖の複合体Ｉ及びＩＩＩによって主に生成されるＯＸＰＨＯＳのスーパーオキシド高毒性副生成物である。図２Ｂは、１か月腫瘍またはＣＤ４４−Ｔ細胞を有するマウスからの高レベルまたは低レベルのＭＭＰ及びＭＲＯＳを伴うＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の象限ゲーティングの結果を報告する棒グラフを示す。グラフ中のバーの上に示す（−）非有意または（＊）有意は、第一バー〜第４バーがそれぞれＭＭＰｈｉＭＲＯＳｌｏ細胞、ＭＭＰｈｉＭＲＯＳｈｉ細胞、ＭＭＰｌｏＭＲＯＳｈｉ細胞及びＭＭＰｌｏＭＲＯＳｌｏ細胞の間の差を示すように配置されている。図２Ｃは、１か月腫瘍を有するマウスの脾臓及び腫瘍由来の特異的Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の中／上のＨＩＦ−１α及びＧｌｕｔ１発現のＭＦＩ（平均ＳＥＭ）を示す（ｎ＝５／群、それぞれ２つのアッセイ）。全ての棒グラフは平均ＳＥＭを示す。脾臓及び腫瘍由来の試料の代表的なヒストグラムを比較した（データ示さず）。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴に対する低酸素状態の影響を示す。ＨＩＦ−１αノックダウンは、ＬＡＧ−３発現を減少させ、黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を改善する。図３Ａは、対照（ｃｏＲＮＡ）またはＨＩＦ−１αｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ベクターで形質導入されたＴｒｐ−１特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの中／上のＨＩＦ−１α発現のＭＦＩ（平均−ＳＥＭ）値を左の棒グラフに示す。右の２つの棒グラフは、対照（ｃｏＲＮＡ）またはＨＩＦ−１αｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）ベクターで形質導入したＴｒｐ−１特異的ＣＤ８＋ＴＩＬによる同時阻害剤ＰＤ−１（左）及びＬＡＧ−３（右）発現のＭＦＩ（平均−ＳＥＭ）値を示す。対照またはＨＩＦ−１αのｓｈＲＮＡベクターで形質導入した試料の代表的なヒストグラムを比較した（データ示さず）。ＨＩＦ−１αはインビトロ及びインビボで同時阻害剤ＬＡＧ−３発現と相関する。図３Ｂは、個々の因子、ＧｚｍＢ、ＩＦＮ−γまたはパーフォリン（左から右まで）を産生するベクターを発現する対照（ｃｏＲＮＡ）またはＨＩＦ−１αｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターで形質導入したＭＡＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの％を示す。全ての棒グラフは平均ＳＥＭを示す。図３Ｃは、因子の３、２または１（各バーの上から下へ）を産生するレンチベクター形質導入細胞の％を示す棒グラフである（ｎ＝５〜７マウス／群）。カッコ内の＊は、左から右へ、応答の合計の有意差を示す（）の外の＊は、左から右へ：３、２、１機能の有意差。全ての棒グラフは平均ＳＥＭを示す。ＨＩＦ−１αノックダウンは、ＣＤ８＋ＴＩＬ機能を増大させる。
【図４】図４Ａ〜４Ｉは、Ｇｌｕ及び酸素へのアクセス制限が、ＣＤ８＋ＴＩＬを活性化してＦＡ異化作用を増強することを示す。後期段階の黒色腫では、グルコース及び酸素が制限されるようになる。図４Ａは、腫瘍（ｎ＝３／群）の血漿及び間質液中のＧｌｕ濃度を示す棒グラフである。データは平均ＳＥＭとして示す。図４Ｂは、上の２列（ｎ＝３〜４試料／群）の低酸素下でＧｌｕ培地中で培養したＣＤ８＋Ｔ細胞のものと比較して、ＧａｌまたはＧｌｕ＋２−ＤＧ培地で刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞における相対転写産物レベルを示す。。中央の２列では、２週齢の腫瘍（ｎ＝４〜５試料／群）由来の対応する抗原特異性のＣＤ８＋ＴＩＬと比較して、１−ｍｏ−ｏｌｄ（１か月齢）腫瘍由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬについて相対転写産物レベルを示す。下の２行は、ワクチン接種後３月対２週間に収穫したＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ脾臓細胞の相対転写産物レベルを示す。マップの右側に示された線のコードは、インビトロ及びインビボの試料間の転写レベルの変化を比較する。脂質代謝に関与する転写物は、インビトロ及びインビボで代謝的にストレスを受けたＴ細胞において増強される。図４Ｃは、２週齢の腫瘍由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬにおける解糖代謝物の強度と比較した１か月齢の腫瘍由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬの解凍代謝物の強度を示す棒グラフである。約３０匹のマウス／試料／実験から採取した２〜３個のプールした試料を用いて実験を２回行った。データは平均値として示す。図４Ｄは、チャレンジ後１か月で回収した同じマウスの脾臓（右）または２週の腫瘍（左）由来のものに正規化した１か月の腫瘍を保有するマウス由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬにおけるＴＣＡ回路代謝物への１３Ｃ６−Ｇｌｕの寄与を示す。実験は、約３０匹のマウス／試料／実験から採取した２〜３個のプールした試料を用いて２回行った。データは平均値として示す。図４Ｅは、１カ月齢の腫瘍由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬにおけるＦＡ代謝物の強度を、２週間の腫瘍由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬのものと比較して示す。約３０匹のマウス／試料／実験から採取した２〜３個のプールした試料を用いて実験を２回行った。データは平均値として示す。図４Ｆは、腫瘍チャレンジ後１か月対２週間で（右）、１か月対２週腫瘍（左）または１か月腫瘍対１か月脾臓（中）もしくは脾臓由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＣＡ回路代謝物への正規化した１３Ｃ１６−パルミチン酸の寄与を示す３つの棒グラフである。約３０匹のマウス／試料／実験から採取した２〜３個のプールした試料を用いて実験を２回行った。データは平均値として示す。図４Ｇは、２週腫瘍に対する１か月腫瘍から得られた結果の比として示す、腫瘍間質液中の遊離ＦＡ種の相対強度を示す棒グラフである（ｎ＝２〜３試料／群）。データは、平均ＳＥＭとして示す。図４Ｈは、エキソビボで直接試験した腫瘍チャレンジ後（ｎ＝５／群）２週間または１ヶ月後に回収した脾臓または腫瘍から新たに単離したＴｒｐ−１またはＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるホウ素−ジピロメテン蛍光色素（Ｂｏｄｉｐｙ）Ｃ１６の取り込みを示すグラフである。腫瘍チャレンジ１ヶ月後に回収した脾臓及び腫瘍由来の試料の代表的なヒストグラムを比較した（データ示さず）。バーの上に＊がある行は、有意差を示す。データは平均ＳＥＭとして示す。図４Ｉは、腫瘍チャレンジの２週間後または１ヶ月後に回収した脾臓または腫瘍由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｐｔ１ａのＭＦＩを表す棒グラフを示す。代表的なヒストグラムは示していない。ｎ＝５／群。バーの上に＊がある行は、有意差を示す。データは平均ＳＥＭとして示す。ＦＡ異化作用は、腫瘍の進行中にＣＤ８＋ＴＩＬにおいて増強される。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、ＣＤ８＋ＴＩＬの代謝及びエフェクター機能がＰＤ−１とは独立していることを示す。３日目にワクチン接種した腫瘍保有マウスを、ワクチン接種後１０日目に開始するアイソタイプまたは抗ＰＤ−１で処置した。ワクチン接種した腫瘍を有するマウスを、３日毎にアイソタイプ対照（Ｉｓｏ）または抗ＰＤ−１抗体（α−ＰＤ−１）で処置した。図５Ａは、腫瘍チャレンジ後１ヶ月における特定のＣＤ８＋ＴＩＬ中／上のＰＤ−１及びｐＡｋｔのＭＦＩを示す。ｎ＝５〜７マウス／群、データは平均−ＳＥＭとして示す。図５Ｂは、１か月腫瘍由来の特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの上／中のマーカー（ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７及びＥｏｍｅｓ、左から右へのパネル）のＭＦＩを示す。ｎ＝５〜７マウス／群。データは、平均ＳＥＭとして示す。図５Ｃは、ｉｓｏ処理された１か月腫瘍（薄灰色）に正規化されたα−ＰＤ−１処理（濃い灰色）からのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＣＡ回路代謝物への１３Ｃ１６−パルミチン酸塩寄与を示す。ｎ＝２〜３試料／群。各試料を２０〜３０匹のマウスからプールする。データは平均値として示す。図５Ｄは、ｉｓｏ処置した１か月腫瘍（薄灰色）と比較して、α−ＰＤ−１処置（濃い灰色）からのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるケトン体の強度を示す。ｎ＝２〜３試料／群。各試料を２０〜３０匹のマウスからプールする。データは平均値として示す。図５Ｅは、ｉｓｏ処理した１か月腫瘍（薄灰色）に正規化したα−ＰＤ−１処置（濃い灰色）由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＴＣＡ回路代謝物に対する１３Ｃ６−Ｇｌｕの寄与を示す。ｎ＝２〜３試料／群。各試料は、２０〜３０からプールされている。データは平均値として示す。これらの結果は、ＰＤ−１遮断が、ＣＤ８＋ＴＩＬの代謝に影響しないことを示している。図５Ｆは、３、２または１の因子（各バーの上から下まで）を産生するイソまたはα−ＰＤ−１で処置したマウスの１か月腫瘍由来の特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度を示す。ｎ＝１１〜１５マウス／群。データは平均ＳＥＭとして示す。
【図６】図６Ａ〜Ｊは、ＦＡ異化作用の促進がＰＤ−１発現を低下させることなくＣＤ８＋ＴＩＬ機能を改善することを示す。図６Ａは、ＦＡ異化作用の異なる経路を標的とする薬物を示すインビボ研究の実験装置の漫画である。図６Ｂは、移入前に希釈剤（Ｄｉｌ．）またはＦＦで処置したマウス由来のドナーＣＤ８＋Ｔ細胞の上／中のマーカー（ＰＤ−１、Ｔ−ｂｅｔ、ＣＤ６２Ｌ、Ｃｄ１２７、ＫＬＲＧ１及び全ＦｏｘＯ１、左から右へのパネル）のＭＦＩを示す棒グラフである。ｎ＝８〜１０／群。データは、平均ＳＥＭとして示す。図６Ｃは、３、２、及び１の因子（各バーの上から下へ）を産生する細胞の％として移入前にＤｉｌ．またはＦＦで処置したドナーマウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を示す棒グラフである。ｎ＝８〜１０／群。データは、平均ＳＥＭとして示す。図６Ｄは、Ｄｉｌ．またはＦＦを与えたドナーマウスの脾臓からのＣＤ８＋Ｔ細胞の基礎ＯＣＲを示す棒グラフである。いくつかの試料をＥｔｏｍｏｘｉｒ（Ｅｔｏ）（ｎ＝５−６マウス／群）とともにインキュベートした。データは、平均ＳＥＭとして示す。図６Ｅは、Ｄｉｌ．またはＦＦ処理ドナーＣＤ８＋ＴＩＬ（ｎ＝６／群）上のＰＤ−１のＭＦＩを示す棒グラフである。データは、平均ＳＥＭとして示す。図６Ｆは、３、２、または１の因子（各バーの上から下へ）を産生するＤｉｌ．またはＦＦ処理ドナー由来の特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ％を示す棒グラフである。各バーの上にある（−）または（＊）は、応答の合計の有意差を示す。＊下から上へ：１、２、または３の因子の産生の違い。データは、平均ＳＥＭとして示す。図６Ｇは、細胞移入２週間後の腫瘍重量（ｎ＝５／群）を示すグラフである。データは平均±ＳＥＭとして示す。図６Ｈは、ＦＦ−またはＤｉｌ．処理のＴ細胞の移入と組み合わせたＰＤ−１遮断の実験デザインの漫画である。図６Ｉは、ＦＦまたはＤｉｌ．処理のいずれかの細胞及び細胞移入後のアイソまたはα−ＰＤ−１処理のいずれかを受けたマウスにおける腫瘍容積として示す腫瘍進行を示すグラフである。ｎ＝６−７／群。データは平均±ＳＥＭとして示す。図６Ｊは、アイソまたはα−ＰＤ−１で処理されたレシピエントから回収された、ドナー由来のＦＦまたはＤｉｌ．で処理されたＣＤ８＋ＴＩＬに対するＰＤ−１発現を示す棒グラフのセットである。ｎ＝６−７／群。データは、平均ＳＥＭとして示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＦＡ異化作用の減少がＰＤ−１発現を減少させ、ＣＤ８＋ＴＩＬを損なうことを示す。図７Ａは、インビボ研究のための実験装置を示す漫画である。図７Ｂは、ｗｔ及びＰＰＡＲ−αＫＯドナーＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ上のＰＤ−１発現のＭＦＩである（ｎ＝６／群、２つのアッセイを代表する）。データは、平均ＳＥＭとして示す。ＦＡ異化作用の低下はＰＤ−１発現を減少させる。図７Ｃは、３、２、及び１の因子を産生するドナーマウスの２つの群（各バーの上から下まで）由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの％を示す。（）の外の＊は１−３の機能を生じる相違を示す（下から上へ）。（）内の＊は全体の頻度の相違を示す。各群由来のドナー由来Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの機能を示すフローブロットは示されていない。ｎ＝６／群。データは、平均ＳＥＭとして示す。ＦＡ異化作用の低下は、ＣＤ８＋ＴＩＬ機能を低下させる。
【図８】図８Ａ〜８Ｈは、低酸素状態がＣＤ８＋Ｔ細胞の代謝、分化及び機能に影響を及ぼすことを示す。図８Ａは、リンパ芽球形成を示す；正常酸素下で培養されたもの（Ｎ、濃い灰色）と比較して、低酸素（Ｈ、薄灰色）下での培養の４日目までに芽球を形成する活性化生ＣＤ８＋Ｔ細胞の％の正規化された変化。各バーの上の＊は、正常酸素状態でＧｌｕ培地で培養した試料から得られた値と比較して有意差を示す。（ｎ＝４〜５試料／群、３〜５回の実験を代表する）。データは、平均ＳＥＭとして示す。図８Ｂは、正常酸素、Ｎまたは低酸素、Ｈ（ｎ＝４〜５試料／群、３〜５回の実験の代表）下で培養された活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の中／上におけるＨＩＦ−１α及びＧｌｕｔ１発現（染色）のＭＦＩ値の正規化された変化を示す。各バーの上の＊は、正常酸素状態下でＧｌｕ培地で培養した試料から得られた値と比較した有意差を示す。データは、平均ＳＥＭとして示す。図８Ｃは、正常酸素（Ｎ）または低酸素（Ｈ）下で培養された４日目の活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の基礎ＯＣＲ（左）及びＥＣＡＲ（右）率を示すグラフである。（ｎ＝４〜５／条件、３〜５回の実験を代表する）。データは、平均ＳＥＭとして示す。図８Ｄは、活性化された細胞の内／上のＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＴ−ｂｅｔ（左から右へ）のＭＦＩの正規化された変化を示す（ｎ＝４〜５／条件、３〜５回の実験の代表）。データは、平均ＳＥＭとして示す。図８Ｅは、正常酸素（Ｎ）に正規化されたデータを用いて低酸素（Ｈ）下で培養された活性化細胞の個々の機能の生成を示す。ＩＦＮ−γ、ＧｚｍＢ及びパーフォリン因子を産生するＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の変化％として示すＣＤ８＋Ｔ細胞の機能（それらの代表的なフロープロットは示されていない）。（ｎ＝４〜５／条件、３〜５回の実験の代表）。データは、平均ＳＥＭとして示す。図８Ｆは、芽球形成を示す；生存ＩＬ−２の正規化％変化は、正常酸素（Ｈ、灰色）下で培養したものと比較して、低酸素（Ｈ、白）下で芽球を形成する休止中のＣＤ８＋Ｔ細胞を維持した（ｎ＝３〜４試料／群、２つの実験の代表）。データを平均−ＳＥＭとして示す。図８Ｇは、正常酸素下で培養した細胞（Ｎ、灰色）と比較した、低酸素（Ｈ、白色）に曝されたＩＬ−２維持休止細胞の中／上中のＰＤ−１、ＬＡＧ−３及びＴ−ｂｅｔの正規化発現変化を示す。ｎ＝６／条件、２回の実験の代表。バーの上の＊は、正常酸素状態に保たれた試料と低酸素状態に曝された試料との間の有意差を示す。データは、平均ＳＥＭとして示す。図８Ｈは、正常酸素（Ｎ、灰色）下で培養された細胞と比較して、低酸素（Ｈ、白色）下で培養されたＩＬ−２維持休止ＣＤ８＋Ｔ細胞による個々の機能の生成を示す。ＩＦＮ−γ、ＧｚｍＢ及びパーフォリンを産生するＩＬ−２維持休止ＣＤ８＋Ｔ細胞の％変化を定量した。データは、平均ＳＥＭとして示す。
【図９】図９Ａ〜９Ｅは、正常酸素（Ｎ）または短期低酸素（Ｈ）下でインビトロで活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の代謝、分化及びエフェクター機能に対するグルコース制限の影響を示す。示された（Ｙ軸のタイトルにおける）値は、１００で設定される、正常酸素状態に保たれたＧｌｕ培養物で得られた値に対して正規化される（点線の黒線）。点々で示されたラ薄灰色の線は、Ｇｌｕで培養され、Ｇｌｕでかつ正常酸素状態で培養された細胞の結果に正規化された低酸素状態に曝された細胞の結果を示す。ガラクトース／２−デオキシ−Ｄグルコース（２−ＤＧ）は、グルコースの欠如を模倣する。全てのデータを、平均ＳＥＭとして示す。図９Ａは、標準のＧｌｕ富化培地、２−ＤＧを含むＧｌｕ、またはＧｌｕの代わりにＧａｌを補充した培地中で４日間、刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞について、正規化された基礎ＯＣＲ変化（右のパネル）及び細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）変化（左パネル）を示す。（ｎ＝４試料／群、２０〜３０匹のマウスからプール／実験及び３回の実験の代表）。図９Ｂは、標準的なＧｌｕ富化培地、２−ＤＧを有するＧｌｕ、またはＧｌｕの代わりにＧａｌを補充した培地中で４日間刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞のベースラインでのＯＣＲ対ＥＣＡＲ比を示す。（ｎ＝４試料／群、２０〜３０匹のマウスからプール／実験及び３回の実験の代表）。グルコースの欠如は、ＯＣＲ／ＥＣＡＲ比を増大させる。図９Ｃは、正常酸素（Ｎ、濃い灰色）または低酸素（Ｈ、薄灰色）（ｎ＝４〜５／条件、５を超えるアッセイの代表）下で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＰＤ−１発現のＭＦＩ値の正規化された変化を示す。グルコースの欠如は、ＰＤ−１発現を増大させる。代表的なヒストグラムは示していない。図９Ｄは、Ｔ−ｂｅｔ（ｎ＝４〜５、３を超えるアッセイの代表）のＭＦＩ値の正規化された変化を示す。図９Ｅは、左では、異なる条件（Ｎ、正常酸素、Ｈ、低酸素）下で培養された全てのＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する３、２、及び１因子（各バーの上から下まで）を産生する細胞の％を示す。右は、対応するＯ２を供給したＧｌｕ培地中の細胞のものと比較した、Ｇｌｕ＋２−ＤＧまたはＧａｌ培地中の３、２及び１因子を産生する細胞の％（左の２つのバーについては下から上、及び右の２つのバーについて上から下へ）の相違を示す左と同じデータを示す。各バーの統計は、３、２、及び１の機能（下から上へ）を生成する細胞の％における相違を示す。ＩＦＮ−γ及びＧｚｍＢ産生の代表的なフロープロットは示されていない。グルコースの欠如は、正常酸素状態ではＣＤ８＋Ｔ細胞機能を低下させ、低酸素状態ではそれほど顕著ではない。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、インビトロで活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡ異化作用に対するグルコース及びＯ２制限の影響を示す。全てのデータを平均ＳＥＭとして示す。図１０Ａは、異なる条件下でインビトロで４日間刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞における脂肪酸異化作用関連代謝物の相対強度を示す。正常酸素（Ｎ、濃い灰色）；低酸素状態（Ｈ、薄灰色）；Ｇｌｕ、Ｎ（富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、２つのアッセイを代表して各実験について２０〜３０マウスからプールした）で培養した細胞のものと比較した。図１０Ｂは、正常酸素状態、Ｎ（１００と設定、破線で示す）下でＧｌｕ培地中で培養した細胞と比較した、異なる条件（正常酸素、Ｎ、濃い灰色、低酸素、Ｈ、薄灰色）下で異なる培地中で培養した細胞におけるＴＣＡ回路の代謝物質に対する１３Ｃ６−Ｇｌｕ／Ｇａｌ由来１３Ｃ炭素の正規化された寄与の変化を示す。データは、標識の相対平均％変化として示す（富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、各実験について２０〜３０のマウスからプールし、２アッセイの代表）。各々のバーの上の（＊）は、Ｇｌｕ、Ｎで培養した細胞と比較して有意差を示す。図１０Ｃは、Ｇｌｕ、Ｎ（１００として設定、点線で示す）の下で培養したものに比較して、異なる条件（正常酸素、Ｎ、濃い灰色；低酸素、Ｈ、薄灰色）の下で、異なる培地で培養した細胞におけるＴＣＡ回路の代謝物質に対する１３Ｃ６−パルミチン酸塩由来の１３Ｃ炭素の正規化された寄与の変化を示す。データは、標識の相対平均％変化として示す（富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、各実験について２０〜３０匹のマウスからプールし、２アッセイの代表）。各バーの上の（＊）は、Ｇｌｕ、Ｎ下で培養した細胞と比較して有意な差を示す。ＦＡ由来の炭素が多いほど、ＴＣＡ代謝及びアミノ酸に寄与し、このことは、低血糖及び低酸素下でのＡＴＰ及びバイオマス生産に関するＦＡの拡張使用を示している。図１０Ｄは、正常酸素（Ｎ）または低酸素（Ｈ）下でＧｌｕ（濃い灰色）またはＧａｌ（薄灰色）培地中で培養された細胞によるＢｏｄｉｐｙ  ＦＬ  Ｃ１６（蛍光なしのＦＡ）の取り込みを示す。低酸素状態に曝された代表的試料のヒストグラムは示していない。（ｎ＝５／群、２回の実験の代表）図１０Ｅは、ＧｌｕまたはＧａｌ培地でインビトロで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞（ｎ＝３試料、１５匹のマウス／群からプールされた）による外因性（濃い灰色のバー）及び内因性（薄灰色のバー）ＦＡの消費に起因するＦＡＯの基礎ＯＣＲを示す。ＦＡの代謝は、グルコースが制限されると増大する。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄによって、抗ＰＤ−１処置が腫瘍細胞代謝、すなわち、腫瘍間質液中のＧｌｕ濃度及び腫瘍細胞のＧｌｕ代謝を増大させることに影響を及ぼすことが示される。図１１Ａは、アイソタイプ対照（Ｉｓｏ、白色）または抗ＰＤ−１抗体（α−ＰＤ−１、灰色）を投与された、示されたマウスからの腫瘍間質液中のＧｌｕ濃度を示す棒グラフである。データは、平均ＳＥＭとして示す。図１１Ｂは、２つの１３Ｃ炭素をクエン酸及びＴＣＡ回路中間体、α−ケトグルタル酸に寄与させることによって異化経路を使用するか、または３つの１３Ｃ炭素をオキサロ酢酸塩及びクエン酸塩ならびにプリン合成経路中間体ＡＩＣＡＲに寄与させることによって、同化経路を使用する腫瘍細胞の１３Ｃ６グルコース代謝を示す模式図である。図１１Ｃは、ＮＳＧマウスの２０日目の腫瘍から単離された細胞の１３Ｃ６−Ｇｌｕトレースの結果を示す３つの棒グラフを示す。異化または同化の下流反応にＧｌｕを使用することを示す、２及び３個の炭素の取り込みが示されている。データは、平均ＳＥＭとして示す。図１１Ｄは、同定された腫瘍細胞上のＰＤ−１（灰色）及びＰＤ−Ｌ１（黒色）発現のＭＦＩを報告する棒グラフである。腫瘍細胞上のＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の連結は、アポトーシスまたはＴ細胞媒介性細胞溶解に対するそれらの耐性を増大させる。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄでは、インビトロでの活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡ代謝の操作が、それらの細胞の分化及び機能に影響を及ぼすことが示される。図１２Ａは、ＧｌｕまたはＧａｌでインビトロで刺激され、ＦＦ（ＦＦ、薄灰色）の添加により短期低酸素（Ｈ）に曝されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＢｏｄｉｐｙ  Ｃ１６取り込みを、同じ条件下で希釈剤を追加して培養された細胞の取り込み（Ｃｏ、濃い灰色）と比較して示す。バーの上の＊は、ＦＦ及び希釈剤で処理した細胞間の有意差を示す；代表試料のヒストグラムは示されていない。（ｎ＝５試料／条件、２回の実験を代表する）。データは、平均ＳＥＭとして示す。図１２Ｂは、同じ条件下で希釈剤と共に培養された細胞に対して正規化された正常酸素（Ｎ）または低酸素（Ｈ）下のＧｌｕまたはＧａｌ培地中でＥｔｏｍｏｘｉｒ（Ｅｔｏ）で培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞の相対的な基礎のＯＣＲ変化を示す（１００と設定、破線で示す）。各バーの上の＊は、Ｅｔｏ処理細胞と希釈剤処理細胞との間の有意差を示す。上に＊の付いたラインは、関連する試料の相違を示す。ｎ＝９試料／条件、２回の実験の代表。Ｅｔｏは脂質代謝を阻害する。図１２Ｃは、Ｇｌｕ（薄灰色のバー）またはＧａｌ（濃い灰色のバー）の培地で刺激され、低酸素状態に曝されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１発現変化に対するＦＦまたはＥｔｏの効果を示す棒グラフを示す（Ｈ、ｎ＝４〜６／群、３を超える実験を代表する）。データは、ＦＦまたはＥｔｏで処理した細胞のＰＤ−１染色の相対的ＭＦＩ変化として、同じ条件下で希釈剤で処理した細胞でのＰＤ−１染色のＭＦＩ変化に対して正規化して示す（１００でＮを設定、点線の黒い線）。バーの上の＊は、ＦＦまたはＥｔｏで処理した細胞と希釈剤で処理した細胞の間に有意差があることを示す。代表試料上のＰＤ−１発現のヒストグラムは示されていない。図１２Ｄは、３、２または１の因子を産生するＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の正規化された変化％（各バーの上から下へ）を示す棒グラフを示す。ＦＦまたはＥｔｏで処理した細胞の機能は、希釈液で処理した細胞の機能に対して正規化する（３００点、点線；ｎ＝５／群、３つのアッセイの代表／群）。（＊）：薬物または希釈剤で処理した細胞間の総応答の有意差。（）の外の＊：１、２、３因子の％の変化（下から上へ）の有意差。代表的なフロープロットは、因子のレベルを示す。全てのデータを平均ＳＥＭとして示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、インビトロでの代謝的にチャレンジングな条件下での活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡ異化作用の低下が、そのＰＤ−１発現及びエフェクター機能を低下させることを示す。図１３Ａは、ｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｎ＝４〜５／状態）のものと比較して異なる条件下で培養されたＰＰＡＲ−αＫＯ  ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１染色についてのＭＦＩ値の正規化された変化を示す。＊は、ｗｔとＰＰＡＲ−αＫＯ  ＣＤ８＋Ｔ細胞との間に有意差があることを示す。データを、同じ条件下で培養し、１００に設定したｗｔ細胞での結果に正規化する。正常酸素、Ｎ；低酸素、Ｈ。全てのデータを平均ＳＥＭとして示す。図１３Ｂは、ｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞での変化（ｎ＝５／状態）と比較して、３、２及び１の因子（各バーの上から下へ）を産生するＰＰＡＲ−αＫＯ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の％の正規化された変化を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＯＴ−１細胞（がんモデル）のインビトロ刺激の間のフェノフィブラート処理の効果ならびに細胞機能及び表現型に対する効果を示す。図１４Ａは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＴＣＲにトランスジェニックなＯＴ−１細胞を用いたマウスモデルＢ１４−ＳＩＩＮＦＥＫＬでの親のＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（平均ＳＥＭ）での％に基づく細胞機能の効果を示す。コントロール（Ｃｏ、各条件下の最初のバー）及びＦＦ処理された細胞（ＦＦ、各条件の下の２番目のバー）におけるＧｚｍＢ、ＩＦＮ−γ（γ）及びＴＮＦ−α（α）について個々に測定値をとった。図１４Ｂは、ＧｚｍＢ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの組み合わせについて同じ測定値を示すグラフである。コントロール、Ｃｏ、各条件の下の最初のバー；ＦＦ処理細胞、ＦＦ、各条件の下で２番目のバー。図１４Ｃは、抗原ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１及びＰＤ−１についてＭＦＩ（平均±ＳＥＭ）として測定された表現型に対する効果を示すグラフである。コントロール、Ｃｏ、各条件の下の最初のバー；ＦＦ処理細胞、ＦＦ、各条件の下で２番目のバー。これらのデータは、ＦＦ処置が、黒色腫以外のがんにおいて、かつＴ細胞増殖を誘導するために使用される特定のワクチンの投与なしで機能することを示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｆは、ＯＴ−１細胞のインビトロ刺激中のＦＦ処理を示す。図１５Ａは、種々の濃度のＦＦが増殖に及ぼす影響を示す棒グラフである。図１５Ｂは、ＰＤ１に対する種々の濃度のＦＦの効果を示す棒グラフである。図１５Ｃは、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｃ１６に対する種々の濃度のＦＦの効果を示す棒グラフである。図１５Ｄは、Ｃｐｔ−ａに対する種々の濃度のＦＦの効果を示す棒グラフである。図１５Ｅは、ＰＰＡＲαに対する種々の濃度のＦＦの効果を示す棒グラフである。図１５Ｆは、処置によって影響される様々な転写物及び機能を示すヒートマップを示す。
【図１６】図１６は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで刺激／活性化され、かつフェノフィブレートで前処理されたインビトロでのＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞がマウスモデルにおいて（ペプチドでトランスフェクトされた）黒色腫腫瘍細胞の増殖を阻害し得ることを示すグラフである。実施例８を参照のこと。グラフは、腫瘍容積（ｍｍ３）対時間（日）をプロットしている。ＦＦ処置され、ペプチド活性化されたＯＴ−１細胞（黒塗りの丸）の効果は、活性化された対照の処置されたＯＴ−１細胞（薄灰色の閉じた丸）及びナイーブな刺激されていない未処置のＯＴ−１細胞（白抜きの円）とは対照的である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に開示される方法及び組成物は、エネルギーを得るために、Ｔ細胞の代謝をグルコースの使用及び解糖から「がん」の直接または補助的処置のための脂肪酸異化作用の使用に「切り替える」能力に関する。
【００１８】
本発明者らは、本明細書中に提示されるデータを介して、養子免疫伝達またはワクチン誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞による脂肪酸異化を促進してがんの免疫療法の効力を改善する代謝介入、すなわち薬物、化合物または試薬の使用または補足的使用を決定し、支持した。具体的には、本発明は、ＴＭＥ内の代謝ストレスが腫瘍浸潤ＣＤ８＋ＴＩＬの機能を低下させるという決定に基づく。ＴＭＥ内のグルコース不足は、ＣＤ８＋ＴＩＬを脂肪酸異化に切り替えるように強制する。低Ｏ２およびグルコースに曝されたＣＤ８＋ＴＩＬは、ケトン体異化作用によってエネルギーを得る；ＦＡ異化作用を増強するように条件付けられたＣＤ８＋ＴＩＬは、改善された抗腫瘍活性を示す。
【００１９】
具体的には、以下の実施例に記載されるように、マウス黒色腫モデルを用いて、ＴＭＥ内の低酸素と組み合わせたグルコース（Ｇｌｕ）の欠乏に起因する代謝的チャレンジは、ワクチン誘導性ＣＤ８＋ＴＩＬ機能を損なうことが示された。同時に低血糖及び低酸素状態に曝された場合、ＣＤ８＋ＴＩＬは、エフェクター機能を部分的に保存するケトン体を含む脂肪酸（ＦＡ）の異化作用を増強する。ＰＤ−１発現が同時に増大するが、ＦＡ異化作用を増大させるためのＣＤ８＋ＴＩＬの前条件付けは、腫瘍進行を遅らせる能力をさら
に改善する。ＰＤ−１シグナル伝達の遮断はまた、ワクチンに誘導されるＣＤ８＋ＴＩＬ機能または代謝に影響を与えられないが、腫瘍の進行を減少または遅延させる。ＰＤ−１遮断（すなわち、抗ＰＤ−１処置）は、Ｔ細胞、特にＴＩＬの代謝の再プログラミングと相乗的に作用して、優れた抗腫瘍効果を達成する。したがって、本明細書で提供される方法及び組成物は、代謝介入を使用して、がん免疫療法の有効性を改善する。
【００２０】
本明細書で提供される方法及び組成物は、代謝ストレスによって引き起こされるＴＩＬ機能の喪失を遅延させる潜在的な治療的介入を提供する。まず第一に、本明細書において示される支持データによって、ワクチンに誘発されたＣＤ８＋ＴＩＬにおけるＴ細胞受容体のシグナル伝達の継続が、機能的な枯渇を引き起こす唯一の因子ではないことが示される、なぜなら、この結末はまた、ＴＭＥ内で発現していない抗原に向けられたＣＤ８＋ＴＩＬにも遭遇されるからである。さらなるデータによって、腫瘍進行中にますます重症になるグルコース及び酸素欠乏ＴＭＥ内のＴＩＬが代謝ストレスを経験することが示される。固形腫瘍内の低酸素状態によって、ＣＤ８＋ＴＩＬが、同時阻害剤リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ）−３発現を増強し、Ｔ細胞のエフェクター機能を低下させることによりＣＤ８＋Ｔ細胞の消耗を引き起こす、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αシグナル伝達を増大させるようにさせる。
【００２１】
実施例のデータはさらに、ＴＭＥ内のグルコース不足がＰＤ−１の発現を増強し、ＣＤ８＋ＴＩＬの機能を損なうことを示す。これによって、ＣＤ８＋ＴＩＬを、インビボで直接的に安定同位体トレース及び液体クロマトグラフィー−質量分光光度法によって実証された脂肪酸（ＦＡ）異化作用に切り替えさせる。ＰＰＡＲγアゴニストフェノフィブレートを通じたＣＤ８＋ＴＩＬのＦＡ異化作用の促進は、ＰＤ−１発現をわずかに増強するが、それにもかかわらずそれらのエフェクター機能を増強し、それにより腫瘍進行を遅延させることによって臨床利益を達成する。このデータは、低血糖及び低酸素状態が、ＣＤ８＋ＴＩＬの代謝の再プログラミング及び機能障害を駆動する上で重要な役割を果たすことを示している。さらに、Ｇｌｕ欠乏ＴＭＥ中のＣＤ８＋ＴＩＬによるＦＡ異化作用を増大させる代謝介入が、がん免疫療法の有効性を改善することが示されている。
【００２２】
したがって、がんを処置するための様々な方法は、がんを有する哺乳動物対象に、前処理されたＴ細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬でエキソビボもしくはインビトロで前処理もしくは条件付けされたＴ細胞を投与すること、及び／または腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物もしくは試薬（「脂肪酸異化作用プロモーター」または「脂肪酸異化作用促進化合物」と種々呼ばれる）を投与することを包含する。さらなる方法は、腫瘍特異的ワクチン組成物を、前処理したＴ細胞または脂肪酸異化作用促進性化合物と共に投与することを包含する。Ｔ細胞のエネルギー産生代謝の切り替えを利用するこれらの可能な方法の全ては、ＰＤ−１遮断のようなチェックポイント阻害と必要に応じて組み合わせてもよい。
【００２３】
これらの方法及び組成物の記載において使用される特定の成分及び定義は、以下に定義される。
【００２４】
本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、ヒト、獣医動物または畜産動物、家畜またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳類動物を意味する。より具体的には、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「Ｔ細胞（複数可）」または「Ｔ細胞集団」という用語は、任意のヒトまたは哺乳動物のＴ細胞（複数可）を意味する。１つの実施形態では、Ｔ細胞またはその細胞が活性化される。１つの実施形態において、Ｔ細胞は、自己または異
種の、天然に存在するＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は、組換えまたは合成によって修飾されたＴ細胞構築物である。いくつかの実施形態において、前処理されるＴ細胞は、原発性Ｔ細胞、ＣＤ８（細胞傷害性）Ｔ細胞、ＣＤ８（細胞傷害性）Ｔ細胞、Ｔ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＮＫ  Ｔ細胞または別のＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞は、末梢血、ＴＭＥまたは本明細書に記載の方法によって前処置または条件付けされたＴ細胞が投与される同じ哺乳動物対象の他の体液から得られる。別の実施形態では、前処理されるＴ細胞は、初代Ｔ細胞、ＣＤ８（細胞傷害性）Ｔ細胞、またはＮＫ  Ｔ細胞または対象の骨髄移植適合から得られる他のＴ細胞である。他の適切なＴ細胞としては、切除された腫瘍、ポリクローナルまたはモノクローナル腫瘍反応性Ｔ細胞から得られたＴ細胞が挙げられる。一実施形態では、Ｔ細胞はアフェレーシスによって得られる。さらに他の実施形態において、Ｔ細胞は、異種抗原受容体を発現するように、組換えまたは合成により改変される。一実施形態において、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはキメラ内分泌受容体（ＣＥＲ）を発現する。そのようなＣＡＲまたはＣＥＲは、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ，「Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ｄｅｓｉｇｎ」２０１３
Ａｐｒｉｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．３（４）：３８８−３９８；国際特許出願公開ＷＯ２０１３／０４４２５５号及びＷＯ２０１６／０５４１５３号、米国特許出願公開第２０１３／０２８７７４８号、ならびにそのようなキメラ構築物の使用に関する他の刊行物に記載される。これらの刊行物は、本明細書に記載の構築物のいくつかの設計に有用な種々の成分に関する情報を提供するために参照によって援用される。このようなＣＡＲまたはＣＥＲ  Ｔ細胞は、えり抜きの抗原を認識することを可能にするリガンドを発現する遺伝子改変リンパ球である。抗原認識の際に、これらの修飾Ｔ細胞は、これらのＴ細胞を強力な細胞殺傷因子に変換するシグナル伝達ドメインを介して活性化される。内因性Ｔ細胞を上回る利点は、それらがＭＨＣ制限されていないことであり、これにより、これらのＴ細胞は、ＭＨＣ発現を減少させることによって多くの腫瘍細胞で使用される免疫監視逃避法を克服することが可能になる。さらに他の実施形態では、前処置のためのＴ細胞は、内因性または異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株である。任意のＴ細胞は、本明細書で提供される方法及び組成物の目的のために、代謝機能を解糖からＦＡ異化作用に「切り替える」ために、選択された脂肪酸異化作用プロモーターでエキソビボで前処理に供されてもよい。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「がん」という用語は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを記述する。より具体的には、本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、固形腫瘍の存在を特徴とする任意のがんを意味する。本明細書に記載の方法による処置のための適切ながんとしては、限定するものではないが、黒色腫、乳癌、脳腫瘍、結腸癌／直腸癌、肺癌、卵巣癌、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、骨肉腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、膣癌、肺癌及び神経内分泌癌が挙げられる。
【００２７】
「腫瘍」という用語は、本明細書において使用される場合、悪性または良性のいずれかの全ての新生物細胞の成長及び増殖、ならびに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。一実施形態では、本方法によって標的化される腫瘍は、低酸素、Ｔリンパ球による有意な浸潤、及び腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる。
【００２８】
本明細書において使用される場合、腫瘍微環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬（「脂肪酸異化作用プロモーター」または「脂肪酸異化作用促進性化合物」と様々に呼ばれる）としては、限定されるものではないが、フェノフィブレート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラートまたはＡＭＰＫ活性化因子、例えば５−アミノイミダゾール−４−カ
ルボキサミドリボシドなどの化合物が挙げられる。これらの方法において有用な他の化合物、低分子化合物またはペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、当業者によって同定され得る。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「チェックポイント阻害剤」という用語は、様々なチェックポイントタンパク質に結合するか、またはそれを阻害する抗体もしくは低分子の形態の組成物を指す。このようなチェックポイントタンパク質としては、限定するものではないが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ及びＣＤ１６０が挙げられる。例として、公知のチェックポイント阻害剤としては、とりわけ、抗体イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、及びニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））が挙げられる。低分子または他のチェックポイント結合抗体または抗体断片として開発された他のチェックポイント阻害剤は、この定義に含まれる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ（抗体断片を含む）を含む、全てのタイプの免疫グロブリンを指す。抗体は、モノクローナルであっても、またはポリクローナルであってもよく、そして（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラクダもしくはヒトを含む任意の種の由来であってもよいし、またはキメラ抗体であってもよい。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４０３（１９８９）を参照のこと。抗体は、公知の方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４７４，８９３号または第４，８１６，５６７号を参照のこと）に従って産生された組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体はまた、公知の方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６７６，９８０号に従って化学的に構築されてもよい。また、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６１３，９２２号も参照のこと。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ドメイン抗体、二機能性、ダイアボディ；ワクチボディ（ｖａｃｃｉｂｏｄｙ）、線状抗体；一本鎖抗体分子（ｓｃＦＶ）；重鎖または軽鎖相補性決定領域、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む抗原結合断片である。このような抗原結合断片は、公知の技術によって生成され得る。
【００３１】
「治療試薬」または「レジメン」とは、化学療法医薬、生物学的反応修飾物質、放射線、食餌、ビタミン療法、ホルモン療法、遺伝子療法、外科的切除などを含むが、これに限定されない、固形腫瘍を伴うかまたは伴わないがんの処置において使用される任意のタイプの処置を意味する。
【００３２】
「腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物」とは、対象の免疫系を刺激するためにがん抗原を標的とするがんワクチンを含む任意の組成物を意味する。そのような免疫療法組成物は、体液性（例えば、抗体）または細胞性（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー）応答を誘発するように、または一実施形態では先天性免疫応答を誘発するように設計され、哺乳動物または動物対象への送達後の免疫原性組成物によって送達される標的遺伝子産物に装着される。一実施形態では、これらの方法において有用な免疫療法組成物は、ウイルスベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスなどを介して、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を介して対象の免疫系に抗原を提示することを包含する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される免疫療法組成物は、がん抗原を発現するＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される免疫療法組成物は、ペプチドまたはタンパク質としてのがん抗原またはその断片を含む組成物である。別の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される免疫療法組成物は、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片（複数可）である。この組成
物は、公知の組換え及び合成技術を用いて作製される組成物である。例えば、米国特許第９，４０２，８８８号及びその図７に詳細に記載されている例示的な黒色腫免疫療法組成物ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙに対する実施例の参照、ならびにその図７の参照を参照のこと。多くの免疫療法的がん「ワクチン」が公知であり、当該分野で記載されており、本明細書に記載の方法において使用され得る。
【００３３】
「腫瘍細胞上の抗原またはリガンド」とは、全長の野生型腫瘍特異的抗原または突然変異した腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原を意味する。腫瘍特異的抗原は、選択された特定のがんまたは腫瘍細胞上に見いだされるエピトープ及びタンパク質であり、すべてのがん細胞に見られるわけではない。がん関連抗原は、２つ以上のがんまたは腫瘍細胞型に関連し得る抗原である。例示的ながん特異的抗原としては、限定するものではないが、７０７−ＡＰ、アルファ（ａ）−フェトプロテイン、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ；ｂ−カテニン／ｍ、ｂ−カテニン／変異型Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ｍＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＭＡＧＥ−Ｂ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ  ＨＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ、ｉＣＥ、ＫＩＡＡ０２０５、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、Ｐ１５、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌが挙げられる。さらに他の適切な腫瘍またはがん遺伝子は、とりわけ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＵＣ−１、チモシンβ１、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−３、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｈｅｐａｒａｎａｓｅ１、Ｈｅｐａｒａｎａｓｅ２及びＣＥＡをコードする。さらに他の適切な抗原は、参考文献に挙げられており、参照により本明細書に組み入れられる抗原である。ＳｃｏｔｔａｎｄＲｅｎｎｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００１  Ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｌｔｄ．などの適切な抗原を同定するテキストも参照のこと。
【００３４】
「ベクター」とは、異種分子を治療目的またはワクチン目的のいずれかで細胞に送達する実体を意味する。本明細書において使用される場合、ベクターとは、限定するものではないが、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソーム、プラスミド、またはウイルスもしくは細菌を含む任意の遺伝的エレメントを包含し得る。ベクターは、実施例に記載される、本明細書で提供される技術及び配列を使用して、当業者に公知の技術と併せて生成される。このような技術としては、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ
Ｅｄｉｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２などのテキストに記載の技術のようなｃＤＮＡの従来のクローニング技術、サルモネラゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望のヌクレオチド配列を提供する任意の適切な方法が挙げられる。
【００３５】
「投与する」または「投与経路」とは、本明細書の方法で使用される免疫療法組成物、または脂肪酸異化作用プロモーター、またはチェックポイント阻害剤または前処置されたＴ細胞の対象への送達を意味する。以下に詳細に説明するように、これらの方法は、本方法の各構成要素に対して独立している場合がある。各投与方法は、医薬担体または賦形剤の有無にかかわらず、または別の化学療法剤の有無にかかわらず、対象のＴＭＥ中に行ってもよい。従来の及び薬学的に許容される投与経路としては、限定するものではないが、全身投与、例えば、腹腔内、静脈内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、気管内、皮下及び他の非経口投与の経路または腫瘍内もしくは結節内投与が挙げられる。一実施形態では、投与経路は経口である。別の実施形態において、投与経路は、腹腔内である。別の実施形態において、投与経路は血管内である。必要に応じて、投与経路を組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、投与は、以下に詳細に説明するように、定期的に繰り返される。
【００３６】
本明細書に記載の組成物及び方法の文脈において、列挙した組成物、化合物または試薬の「１つ以上」、「少なくとも５つ」などへの言及は、列挙したその組成物、試薬または化合物のいずれか１つまたは任意の及び全ての組み合わせを意味する。
【００３７】
「含む、包含する、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む、包含する、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる、包含している、備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきであり、すなわち他の特定されていない構成要素または工程段階を包含する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びその変形は、包括的ではなく、排他的に、すなわち、具体的に列挙されていない構成要素またはステップを除外すると解釈されるべきである。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、特記しない限り、与えられた参考文献からの１０％の変動性を意味する。
【００３９】
「１つの、ある（ａ）」または「１つの、ある（ａｎ）」という用語は、１つ以上の、例えば「１つのｍｉＲＮＡ（ａｎ  ｍｉ  ＲＮＡ）」を指し、１つ以上のｍｉＲＮＡを表すと理解されることに留意されたい。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では交換可能に使用される。
【００４０】
本明細書中で他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって、及び本出願で使用される多くの用語に対する一般的ガイドを当業者に提供する刊行されたテキストを参照して、一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４１】
本発明の１つの態様において、哺乳類対象への養子移入のための組成物は、Ｔ細胞によるエネルギー生産のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたＴ細胞またはＴ細胞集団を含む。一実施形態において、脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬は、フェノフィブラートである。別の実施形態において、脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬は、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、ＡＭＰＫ活性化因子、または５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシドである。さらに他の代謝性「切り替え」試薬も同じ方式で有用であると予想される。
【００４２】
これらの組成物は、そのような前処理のためのＴ細胞として、自己または異種の、天然に存在するＴ細胞または組換えもしくは合成により修飾されたＴ細胞構築物を使用してもよい。Ｔ細胞または集団は、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られた、ヒトＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞またはＴ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であってもよい。さらに他の実施形態では、Ｔ細胞または集団は、ヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる。さらに他の実施形態において、Ｔ細胞は、前記前処置の前に、異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）またはキメラ内分泌受容体（ＣＥＲ−Ｔ）を発現するように改変される。さらに他の実施形態では、前処置を予定されるＴ細胞または集団は、内因性または異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株である。さらに他の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＩＬまたはＣＤ８＋Ｔ細胞である。これらの組成物は、付随するチェックポイント阻害剤または腫瘍抗原特異的免疫学的組成物またはワクチンの有無にかかわらず、がんの処置のための養子移入のために調製される。
【００４３】
本明細書に記載される方法の一実施形態において、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免
疫療法組成物；及び腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を同時投与することを包含する。別の実施形態では、この方法はまた、選択されたチェックポイント阻害剤を抗体または低分子の形態で同時投与することも包含する。
【００４４】
本明細書に記載される方法の別の実施形態において、がんを処置するための方法は、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物；及びＴ細胞がエネルギー生産のためグルコースではなく脂肪酸を使用するように、Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理された選択されたＴ細胞、例えば、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞またはＣＡＲなどを投与することを包含する。これらの前処理されたＴ細胞は、養子細胞移入のために使用されてもよい。
【００４５】
本明細書中に記載される方法のさらに別の実施形態において、がんを処置する方法は、がんを有する対象に、エネルギー産生のためにグルコースを使用することから、エネルギー生産のために脂肪酸及びＦＡ異化作用を使用することへ細胞を促進または切り替える化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理されたＴ細胞を含む組成物を投与することを包含する。このような前処理のためのＴ細胞は、上記で同定されたＴ細胞のリストから選択される。
【００４６】
「選択された脂肪酸異化作用プロモーターによる前処理」とは、選択されたＴ細胞が、選択された脂肪酸異化作用プロモーター、例えばフェノフィブラートの存在下で約１〜約５００μＭの間で、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにＴ細胞を条件付けるＴ細胞増殖の時間の全体または一部で、培養及び増殖されることを意味する。一実施形態では、フェノフィブラート（または類似の脂肪酸異化作用プロモーター）の適切な濃度は、少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０から少なくとも約５００μＭである。列挙された任意の２つの数字の間の同様に介在する濃度は、「適切な濃度」という用語に包含される。一実施形態におけるＴ細胞増殖の時間は、数時間から少なくとも数日間に及び得る、インビトロ培養の全時間を意味する。別の実施形態では、Ｔ細胞増殖の時間は、最低限２４時間のインビトロ培養である。脂肪酸異化作用プロモーターによる前処理のための他の期間は、少なくとも１、５、１０、１５もしくは２０時間以上、または本明細書に記載された特定の時間数の間の任意の介在時間であってもよい。次いで、前処理されたＴ細胞は、周知の適応細胞移入技術によって対象に投与される。
【００４７】
一実施形態では、前治療したＴ細胞を投与して、がんを単一療法として処置する。別の実施形態において、この方法は、免疫治療組成物を前処置したＴ細胞と同時投与することを包含する。さらに他の実施形態では、この方法は、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を、前処理細胞及び／または免疫療法組成物と同時にまたは連続して投与することも包含してもよい。
【００４８】
がんを処置するための方法のさらに別の変形例において、同時投与は、免疫治療組成物、脂肪酸異化作用プロモーター（すなわち、化合物として投与される）及び本明細書で同定された選択された前処理されたＴ細胞を含む。別の実施形態において、この方法はまた、抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を同時投与することを包含する。
【００４９】
本明細書に記載の任意の方法において、免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたＴ細胞は、実質的に同時に投与される。別の実施形態では、免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたＴ細胞は、同じ投与経路または異なる投与経路によって連続的に投与される。選択される投与経路は、組成物の性質に依存する。例えば、脂肪酸異化作用プロモーターがフェノフィブラートまたは他の小さな化学分子である場合、そのような分子は、これらの薬物の他の医薬用途に知られ、かつ受け入れられた用量で経口投与され得る。一実施形態では、免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用プロモーターは、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内または結節内投与によって全身的に独立して投与される。別の実施形態では、組成物（ｂ）を経口投与する。
【００５０】
他の投与プロトコールでは、脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬または前処理されたＴ細胞は、少なくとも１日〜１４日まで１回または反復して投与される。いくつかのプロトコールでは、投与は免疫療法組成物の投与の１〜１４日後に行われる。特定の実施形態において、免疫療法組成物は、単回用量で投与される。他の実施形態では、免疫療法組成物は追加免疫用量として投与される。
【００５１】
これらの方法のさらに別の態様では、対象を、前処理されたＴ細胞を単独で使用して、または免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用プロモーターを使用して、または、免疫治療組成物及び前処理細胞の組み合わせを使用して前治療したＴ細胞を使用して処置の前、間、または後に他の抗がん療法を使用して処置してもよい。このような処置は、脂肪酸異化作用プロモーターと並行もしくは同時であっても、または改変Ｔ細胞養子移入及び／またはチェックポイント阻害剤との重複処置であってもよい。一実施形態では、本方法は、免疫療法組成物及び／または脂肪酸異化作用プロモーターを投与する前に、対象を化学療法で治療することを包含する。さらに別の実施形態では、この方法は、リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応じて、エネルギー生産のためにグルコースよりも脂肪酸を使用するようにＴ細胞を条件付けるために、脂肪酸異化作用プロモーターを用いてエキソビボで前処理した選択されたＴ細胞の養子移入の前に腫瘍を外科的に切除することを包含する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前処理された細胞は、単回用量で投与され、続いてチェックポイント阻害剤が任意に投与される。これらの投与は繰り返してもよい。本方法のさらに他の実施形態において、免疫療法組成物は、ブースターなしで単回投与し、続いて脂肪酸異化作用プロモーター、選択された前処置Ｔ細胞、及び／またはチェックポイント阻害剤の少なくとも１つが投与される。さらに別の実施形態では、免疫療法組成物は、脂肪酸異化作用プロモーター、選択された前処置されたＴ細胞、及び／またはチェックポイント阻害剤の投与後のブースター用量として再投与される。
【００５３】
任意のこれらの治療用組成物及び方法の構成要素は、好ましくは生物学的に適合する溶液または薬学的に許容される送達ビヒクル中に懸濁されて、患者に投与され得る。方法の種々の構成要素は、等張性生理食塩水のような薬学的または生理学的に許容される担体；等張性塩溶液またはこのような投与に熟練した者には明らかであろう他の製剤中に懸濁または溶解させることによって、投与のために調製される。適切な担体は、当業者に明らかであり、大部分は投与経路に依存するであろう。薬学的に許容される担体であり、当業者に周知であることが知られている他の水性及び非水性等張滅菌注射溶液及び水性及び非水性滅菌懸濁液をこの目的のために使用してもよい。
【００５４】
これらの治療用組成物の投与量は、主として、組成物のタイプ（すなわち、選択された前処置されたＴ細胞、ベクター、核酸構築物またはタンパク質）治療される状態、患者の年齢、体重及び健康状態などの要因に依存し、したがって、患者によって異なる場合があ
る。方法の構成要素の投与のための投薬量は、その成分を投与するのに有用であることが知られている従来の投薬量である。主治医は、以下のようなガイドラインを用いて適切な用量を選択し得る。
【００５５】
一実施形態では、前処置されたＴ細胞の有用な投与量は、単回注入最大耐量（ＭＴＤ）であり、これは動物モデルにおける用量漸増試験によって決定され得る。一実施形態では、Ｔ細胞の典型的な有効かつ非毒性の用量は、対象の体重１ｋｇあたり約２×１０４〜５×１０９細胞である。１０５または１０６または１０７または１０８のような他の用量も有用であり得る。例えば、ＷＯ２０１６／０５４１５３に記載されているような用量決定方法、及び当技術分野の他のＣＡＲ刊行物を参照のこと。
【００５６】
一実施形態では、免疫療法組成物の典型的な投与量は、組成物の性質に依存する。例えば、組成物がウイルスベクターで送達される場合、ウイルスベクターの治療的に有効な成体のヒトまたは獣医学的投与量は、一般に、約１×１０６〜約１×１０１５個の粒子、約１×１０１１〜１×１０１３個の粒子、または約１×１０９〜１×１０１２粒子のウイルスという濃度を含有する約１００μＬ〜約１００ｍＬの担体という範囲である。
【００５７】
組成物（例えば、免疫療法組成物、脂肪酸異化作用促進性化合物またはチェックポイント阻害剤）が抗体または他のタンパク質として投与される場合、投薬量は、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇタンパク質の単位投与量（これは約１２．５μｇ／ｋｇ体重と同等である）の範囲であり得る。チェックポイント阻害剤の投薬量は、使用される特定の抗体または低分子の既知の毒性に基づいて調整され得る。
【００５８】
本方法の任意の免疫療法組成物または他の成分が裸のＤＮＡとして投与される場合、投薬量は、滅菌溶液１ｍＬあたり約５０μｇ〜約１ｍｇのＤＮＡの範囲であってもよい。
【００５９】
同様に、脂肪酸異化作用促進性化合物の用量は、同様の化合物の他の用途のため、例えばコレステロール管理または高脂血症のために投与される用量と同様であってもよい。例えば、ＦＦは、成人に対して４０ｍｇ／日〜１２０ｍｇ／日の投与量で投与され得てもよい。さらに別の実施形態では、養子移入のための前処理されたＴ細胞の「標準的な」有効かつ非毒性の用量は、約１０７細胞である。別の例として、養子移入されたＴ細胞の数は、当業者によって最適化され得る。一実施形態では、そのような投薬量は、対象の体重１ｋｇあたり約１０５〜約１０１１細胞の範囲であり得る。他の投薬量は、本明細書に引用された参考文献に教示されており、処置レジメン、患者の体調、治療される腫瘍のタイプ及びステージ及び位置に依存して、ならびに患者を処置するために採用される他の補助的な化学療法を考慮に入れて、当業者によって容易に調整され得る。
【００６０】
さて、別の態様では、固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の１日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法成分の単回用量を投与することを包含する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、腫瘍の微小環境における腫瘍抗原特異的的なＴ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を投与される。試薬の脂肪酸異化作用促進性化合物の第１投与は、処置の０、１、２、３、４または５日目のいずれかで開始する。このレジメンには、免疫療法成分の処置の開始日から処置の第７日〜第３０日の間にある日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬を投与するステップも含まれる。チェックポイント阻害剤は、脂肪酸異化作用促進性化合物の投与と同時に投与されても、またはその後に投与されてもよい。
【００６１】
なお別の状態様では、固形腫を特徴とするがんを有する対象に、処置の１日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回投与を投与することを包含
する、がんの処置のための治療レジメンが提供される。このレジメンでは、その後、対象は、エネルギー生産のためにグルコースではなく脂肪酸を用いるようにＴ細胞を条件付ける腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボで前処理された選択されたＴ細胞を養子移入によって投与される。脂肪酸異化作用促進化合物で条件付けされた前処置されたＴ細胞の養子移入は、免疫療法組成物の投与後０日目〜１４日目のいずれで行ってもよい。したがって、特定の実施形態で、養子移入は、免疫療法組成物投与後の０日、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日または１４日または１４日よりさらに後に発生する。インビボで免疫療法組成物がどれくらい長く発現されるかに応じて、他の日付を選択してもよい。この発現は、ワクチンのタイプに依存し、従って、治療レジンでは同時投与のタイミングは、当業者によって調整され得る。チェックポイント阻害剤は、前治療されたＴ細胞の投与と同時にまたはその後に投与されてもよい。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明者らの発見はまた、記載されており４１、それぞれ参照により組み込まれる、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０７９０００及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５３１２８号に記載されている方法のような、キメラ抗原受容体−Ｔ細胞またはキメラ内分泌細胞受容体−Ｔ細胞またはエキソビボ増殖腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の生存を増強する方法も可能にする。一実施形態において、前処理されたＴ細胞は、末梢血から得られ、キメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾され、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬でエキソビボで前処理される。この前処理されたＴ細胞は、内因性または異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株である。この前処理されたＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。この方法では、Ｔ細胞（複数可）は、上記で考察される腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬でエキソビボで前処理され、次いで組み込まれた参考文献に記載されているように、養子細胞移入によって固形腫瘍を有する患者に投与される。
【００６３】
これらの方法の理論的根拠は、バイスタンダーＣＤ８＋ＴＩＬがエフェクター機能を失い、同時阻害剤の発現を増大させるというマウス黒色腫モデルにおける発明者の観察に基づいている。このデータは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の代謝ストレスが、マウス黒色腫モデルにおけるＣＤ８＋ＴＩＬの分化及びエフェクター機能に影響することを示している。ＨＩＦ−１αによる低酸素及びグルコース（Ｇｌｕ）不足は、同時阻害剤の発現を増強し、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を損なう。同時に低酸素及び低血糖に曝されると、ＣＤ８＋Ｔ細胞はケトン体を含む脂肪酸（ＦＡ）の異化作用を増強する。ＦＡ異化作用を増大するように条件付けられたＣＤ８＋ＴＩＬは、ＰＤ−１発現を増強させ、エフェクター分子の産生の改善を示す。
【００６４】
次善の新生血管新生または固形腫瘍内の灌流障害により引き起こされる低酸素状態によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞が低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１α及びリンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ）−３の発現を増大させ、機能を失わせるようになる。ワクチンに誘発されたＣＤ８＋ＴＩＬ及びインビトロで活性化されたポリクローナルＣＤ８＋Ｔ細胞で示されるように、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αによる低酸素状態は、同時阻害剤ＬＡＧ−３発現を増大させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞機能を損なう。限定されたＧｌｕ供給は、ＰＤ−１発現を増強し、エフェクター機能を低下させ、低酸素下でさらに増強されるＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡ異化作用を増大させる。本発明者らは、以下の実施例において、後期段階の腫瘍におけるＣＤ８＋ＴＩＬが、ＦＡ取り込み及びトリアシルグリセロール（ＴＧ）代謝回転によってあおられるＦＡ異化作用にますます依存し、ＰＤ−１発現を増大させるがいくつかのエフェクター機能を維持する、それらのエネルギー需要を満たすことを示した。ＣＤ８＋ＴＩＬのＦＡ異化作用を促進することにより、抗腫瘍効果が改善される。さらに、ＬＡＧ−３の過剰発現及び機能障害は、ＨＩＦ−１αの遺伝子ノックダウンによって逆転され得る。
【００６５】
グルコースの欠乏は、腫瘍細胞によるその消費に起因してＴＭＥ内で乏しくなり、ＣＤ８＋ＴＩＬの機能を損ない、ＰＤ−１の発現を増強し、液体クロマトグラフィー−質量分光光度計及び安定した同位体トレースによって示されるように細胞を脂肪酸異化作用に切り替えさせる。この代謝の嗜好は、低酸素状態でさらに強化される。グルコースではなく脂肪酸酸化によるエネルギー産生は、低酸素下で持続可能ではない可能性がある同等量のＡＴＰを生成するためにより多くのＯ２を必要とする。脂肪酸酸化の副産物であるケトン体は、必要なＯ２が少ない非常に効率的な燃料である。また、実施例のデータによって支持され、低酸素及び低血糖に曝された神経系の細胞について以前に示されているように、ＣＤ８＋ＴＩＬは、一旦腫瘍内の低酸素の領域に入れば、ケトン体異化作用を通じたエネルギー産生へ切り替える。
【００６６】
近年、免疫学的チェックポイントの遮断は、腫瘍抗原特異的免疫応答を増強する最も有望な治療の１つとして進化し、がん患者において耐久性のある臨床応答を達成している。免疫チェックポイント阻害剤を用いた処置は、ＴＩＬ機能を部分的に救済し、がん患者の有望な結果をもたらしている４。プログラムされた細胞死タンパク質（ＰＤ）−１のような免疫抑制剤によるシグナル伝達を阻害する抗体は、Ｔ細胞の機能を保持し、慢性の抗原刺激に起因して、消耗に向かって分化すると仮定した。本明細書に提供されるデータは、ワクチン誘導性ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）におけるＴ細胞受容体シグナル伝達の継続が、消耗及び機能不全を引き起こす唯一の因子ではないことを示す。なぜなら、ＴＭＥ内では発現されない抗原に向かうＣＤ８＋ＴＩＬもこの運命に遭遇するからである。インビトロで様々な培養条件下で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ワクチン誘導ＴＩＬで得られたさらなるデータは、ＴＩＬが、腫瘍進行中にますます重症になる、グルコース及び酸素不足ＴＭＥ内の代謝ストレスを経験することを示す。
【００６７】
全体として、実施例に示される全体的なこれらのデータによって、ＴＭＥ内で殺腫瘍機能を維持するために脂肪酸異化作用がＣＤ８＋ＴＩＬにとって必須であることが支持される。脂肪酸酸化を促進する薬物または脂質代謝に影響を及ぼす遺伝的変化を有するマウスを用いたさらなるデータによって、エネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するように活性化中に条件付けされた腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＴＭＥ内でより良好な機能保存を示し、腫瘍進行のより長い遅延を達成するが、より高いレベルのＰＤ−１を発現することがさらに示される。
【００６８】
発明の実施形態
本発明の様々な実施形態は、以下を包含する：
ａ）前処理されたＴ細胞によるエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いてエキソビボまたはインビトロで前処理または条件付けされたＴ細胞またはＴ細胞集団を、がんを有する対象に投与することを包含する、がんを処置するための方法；
ｂ）がんを有する対象に：対象の腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的する免疫療法組成物と、（ｉ）腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬；及び（ｉｉ）養子細胞移入のためのエネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸を使用するようにＴ細胞を条件付けるために（ｉ）を用いてエキソビボで前処理したＴ細胞のうちの１つ以上とを同時投与することを包含する、がんを処置するための方法；
ｃ）抗体または低分子の形態のチェックポイント阻害剤を投与することをさらに包含する、上記方法のいずれか；
ｄ）上記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ−１抗体または低分子リガンドである、本明細書に記載の任意の方法；
ｅ）がんが固形腫瘍の対象内に存在することを特徴とする、本明細書に記載の任意の方
法；
ｆ）がんが、黒色腫、乳癌、脳腫瘍、結腸癌／直腸癌、肺癌、卵巣癌、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、頭頸部癌、鼻咽頭癌、骨肉腫、口腔癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、唾液腺腫瘍、胃癌、癌、精巣癌、甲状腺癌、膣癌、神経内分泌癌である、本明細書における任意の方法；
ｇ）Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブレートである、本明細書における任意の方法；
ｈ）Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、ＡＭＰＫ活性化因子または５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシドである、本明細書における任意の方法；
ｉ）Ｔ細胞が自己または異種の、天然に存在するＴ細胞または組換えもしくは合成により修飾されたＴ細胞構築物である、本明細書における任意の方法；
ｊ）上記Ｔ細胞が、対象から、または対象の骨髄移植適合から得られたヒトＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞またはＴ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、本明細書における任意の方法；
ｋ）Ｔ細胞が、ヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる、本明細書における任意の方法；
ｌ）Ｔ細胞が、上記前処理の前に、異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾されている本明細書における任意の方法。
ｍ）Ｔ細胞が内因性または異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株である、本明細書における任意の方法；
ｎ）Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である本明細書における任意の方法；
ｏ）上記免疫療法組成物（ａ）が、がん抗原を発現する組換えウイルスまたはウイルス様粒子、がん抗原を発現するＤＮＡ構築物、がん抗原またはその断片をペプチドまたはタンパク質として含む組成物、がん抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または抗原結合断片である、本明細書における任意の方法；
ｐ）上記免疫療法組成物及び脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬、または免疫療法組成物及び前処理されたＴ細胞が実質的に同時に投与される、本明細書における任意の方法；
ｑ）脂肪酸異化作用促進性化合物もしくは試薬または前処理されたＴ細胞が、免疫療法用組成物の投与後少なくとも１日〜１４日に１回または反復投与される、本明細書における任意の方法；
ｒ）上記免疫療法組成物が単回用量または１回以上の追加用量として投与される、本明細書における任意の方法；
ｓ）各組成物が、筋肉内、腹腔内、静脈内、腫瘍内または結腸内投与によって独立して全身的に投与される、本明細書における任意の方法；
ｔ）腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が経口投与される、本明細書における任意の方法；
ｕ）前処理されたＴ細胞が１回または反復投与される、本明細書における任意の方法；
ｖ）前処置されたＴ細胞が単回用量または１回以上の用量として投与される、本明細書における任意の方法；
ｗ）前処置されたＴ細胞が、静脈内注射または注入によって全身的に投与される、本明細書における任意の方法；
ｘ）他の抗癌療法で対象を治療することをさらに包含する、本明細書における任意の方法；
ｙ）前処理されたＴ細胞、免疫原性組成物または脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物もしくは試薬を投与する前に、化学療法で対象を治療することをさらに包含する、本明細書における任意の方法；
ｚ）前処理されたＴ細胞の投与前に、リンパ球の対象を枯渇させること、及び必要に応
じて腫瘍を外科的に切除することをさらに包含する、本明細書における任意の方法；
ａａ）上記方法により標的とされる腫瘍が、低酸素、Ｔリンパ球による有意な浸潤、及び腫瘍微小環境における低グルコースによって特徴付けられる、本明細書における任意の方法；
ｂｂ）Ｔ細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬を用いてＴ細胞をエキソビボまたはインビトロで前処理することを包含するＴ細胞を改変する方法；
ｃｃ）キメラ抗原受容体−Ｔ細胞またはキメラ内分泌受容体−Ｔ細胞またはエキソビボで増殖された腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の生存を増強する方法であって、Ｔ細胞をエキソビボで、固形腫瘍を有する対象への養子細胞移入前の腫瘍微小環境における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞によるエネルギー産生のための脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を用いて前処理することを包含する、方法；
ｄｄ）脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブラートである２つの前述の任意の方法。
ｅｅ）脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、ＡＭＰＫ活性化因子、または５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシドである、本明細書における任意の３つの前述の方法；
ｆｆ）上記Ｔ細胞が、自己または異種の、天然に存在するＴ細胞または組換えもしくは合成により修飾されたＴ細胞構築物である、本明細書における任意の４つの前述の方法；
ｇｇ）上記Ｔ細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られたヒトＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞またはＴ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、本明細書における任意の５つの前述の方法。
ｈｈ）上記Ｔ細胞が、ヒト末梢血からまたは対象の腫瘍微小環境から得られる、本明細書における任意の６つの前述の方法。
ｉｉ）上記Ｔ細胞が、前記前処置の前に異種抗原受容体またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように改変されている、本明細書における任意の前述の方法；Ｔ細胞が内因性または異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株である、請求項２８または２９のいずれかに記載の方法。
ｊｊ）Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、本明細書における任意の前述の方法；
ｋｋ）がんの処置のための治療レジメンであって：
１．固形腫瘍を特徴とするがんを有する対象に、処置の１日目に腫瘍細胞上の抗原またはリガンドを標的とする免疫療法組成物の単回投与を投与すること；
２．腫瘍微小環境における腫瘍異種特異的Ｔ細胞による脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬を当該対象に投与することであって、脂肪酸異化作用促進性化合物の試薬の上記第一投与が処置の０〜５日目に開始する投与；
３．（２）の処置の開始日から処置の７日〜３０日目の間の日まで毎日、脂肪酸異化作用促進性化合物または試薬を投与すること；
を包含する治療レジメン；
ｌｌ）Ｔ細胞によるエネルギー産生のために脂肪酸異化作用を使用するように細胞を条件付ける化合物または試薬でエキソビボまたはインビトロで前処理されたＴ細胞を含む哺乳動物対象への養子移入のための組成物；
ｍｍ）脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬がフェノフィブラートである前記組成物；
ｎｎ）脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬が、クロフィブラート、ゲムフィブロジル、シプロフィブラート、ベザフィブラート、ＡＭＰＫ活性化因子または５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボシドである前述の組成物；
ｏｏ）Ｔ細胞が、自己または異種の、天然に存在するＴ細胞または組換えもしくは合成により修飾されたＴ細胞構築物である、任意の前述の組成物。
ｐｐ）Ｔ細胞が、対象からまたは対象の骨髄移植適合から得られた、ヒトＴ細胞または
ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞またはＴ浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、任意の前述の組成物；
ｑｑ）Ｔ細胞がヒト末梢血から、または対象の腫瘍微小環境から得られる、任意の前述の組成物；
ｒｒ）Ｔ細胞が、前記前処置の前に、異種抗原受容体、またはキメラ抗原受容体またはキメラ内分泌受容体を発現するように修飾される、任意の前述の組成物；
ｓｓ）Ｔ細胞が内因性または異種のヒトＴ細胞またはヒトＴ細胞株である、任意の前述の組成物；ならびに
ｔｔ）Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、任意の前述の組成物。
【００６９】
腫瘍微小環境内では、ワクチンに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、グルコース及びＯ２の不足に起因する代謝ストレスに遭遇し、その結果、同時阻害剤の発現が増大し、機能が失われる。ＣＤ８＋腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）は、ケトン体を含む脂肪酸の異化作用を増強することによって反応する。薬物によって誘発される脂肪酸酸化の増大は、ＣＤ８＋ＴＩＬ上の同時阻害剤ＰＤ−１の発現をさらに増大させるが、Ｔ細胞が腫瘍の進行を遅らせる能力を有意に改善する。
【００７０】
Ｇｌｕ及びＯ２の欠如が、ＣＤ８＋ＴＩＬの代謝再プログラミング及び機能的消耗を推進する上で重要な役割を果たすことを確認した。代謝介入ががん免疫療法の有効性を改善することもさらにを示されている。
【００７１】
以下の実施例は、例示のみを目的として提供され、本発明は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のかつ全ての変形を包含すると解釈されるべきである。要約すると、本明細書中に提示されるデータは、マウス黒色腫モデルを用いた能動的がん免疫療法の失敗の根本原因を明らかにする。黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）及び非関連腫瘍抗原（ＴＡ）、すなわちヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６のＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するワクチンの混合物を用いて黒色腫保有マウスを免疫した。ＭＡＡ及びバイスタンダーＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの両方とも、同時阻害剤の発現を増大させ、機能を失い、高く持続性の抗原刺激がＴＩＬ消耗５の単独の責任であるが、これは、それらの同族抗原に遭遇するＣＤ８＋Ｔ細胞のエネルギー需要を増大させることにより、寄与し得るという考えに異議を唱える。両方のＣＤ８＋ＴＩＬサブセットとも、腫瘍進行中の制限されたＯ２及びグルコース供給に起因する代謝ストレスをますます経験する。
【００７２】
実施例１：材料及び方法
細胞株及び組換えアデノウイルス及びレンチベクターの構築。
Ｂ１６細胞株及びワクチンは、以前に記載されている４０、１５。Ｂ１６ＢｒａｆＶ６００Ｅ細胞株（Ｄｒ．Ｍ  Ｈｅｒｌｙｎ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡから贈呈された）は、レンチベクターｐＬＵ−ＥＦ１ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ発現マウスＢｒａｆＶ６００Ｅを用いた形質導入によってＢ１６．Ｆ１０細胞から誘導された。ＨＥＫ  ２９３細胞を用いてワクチンベクターを増殖させた。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。
【００７３】
ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙ及びＡｄＣ６８−ｇＤＥ７ベクターの分子構築、レスキュー、精製及び滴定が記載されている４０。Ｍｅｌａｐｏｌｙ導入遺伝子配列（米国特許第９，４０２，８８８号の図７を参照のこと）は、ＥＲシグナル配列（ＥＲｓｓ）、続いてパンＤＲエピトープ（ＰＡＤＲＥ）、ヒト（ｈ）Ｔｒｐ−２由来の３つのＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、及びヒト（ｈ）またはマウス（ｍ）Ｔｒｐ−２、ｍＴｒｐ−１、ｈｇｐ１００及びｍＢｒａｆＶ６００Ｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質（ｇ
）Ｄに融合した）由来の８つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープから構成される。ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙベクターによって誘発された優勢なＣＤ８＋Ｔ応答は、Ｔｒｐ−１４５５エピトープ（ＭＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の約９０％）に対して向けられる。ＴＲＰ−１４５５−四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を表現型研究について分析し、一方、ＭＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、図全体を通じて細胞内サイトカイン染色によって機能アッセイについて評価した。
【００７４】
要するに、ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙまたはｇＤＥ７構築物を、Ｉ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩ部位を用いてＥ１欠損ＡｄＣ６８ウイルス分子クローンに挿入した。構築したプラスミドを用いて、リン酸カルシウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。プラーク形成の７〜１０日後に、アデノウイルスベクターを含む細胞を採取した。ウイルスをさらに連続感染によりＨＥＫ２９３細胞上で増殖させ、３サイクルの凍結融解により回収した。解凍の第３サイクルからの無細胞上清を、塩化セシウム密度超遠心によるウイルス精製に使用した。
【００７５】
レンチベクターの作製のために、ＨＩＦ−１αまたは対照ＲＮＡの異なる領域を標的とする短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を含む５つのｐＬＫＯ．１レンチベクターを、ＲＮＡｉコンソーシアムから得た。選択マーカーＴｈｙ１．１をｐＬＫＰＯ−Ｔｈｙ１．１レンチベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）から各ｓｈＲＮＡレンチベクターにクローニングした。標準的な手順を用いてレンチベクターを作製した。第２世代のレンチベクターパッケージシステム（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、パッケージングプラスミドＰｓＰＡＸ２、エンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇ、及びｓｈＲＮＡ−Ｔｈｙ１．１発現インサートプラスミドの各々を３：１：１の比で用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後に上清を回収した。レンチベクターは、２０，０００ｒｐｍ、４℃で２時間の超遠心分離によって濃縮した。ベクターペレットをＰＢＳで氷上で少なくとも２時間インキュベートした後、再懸濁した。トランスフェクトされた細胞におけるＨＩＦ−１α転写物の最も顕著な減少を示したレンチベクターをさらなる研究に使用した。
【００７６】
動物実験
雌性Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（Ｂ６ＣＤ４５．１＋）、Ｂ６．ＰＬ−Ｔｈｙ１ａ／ＣｙＪ（Ｂ６ＣＤ９０．１＋）及びＢ６；１２９Ｓ４−Ｐｐａｒａｔｍ１Ｇｏｎｚ／Ｊ（Ｂ６  ＰＰＡＲ−αＫＯ）マウス（６〜８週）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）またはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。手順は承認されたプロトコールに従って実施した。
【００７７】
ＰＢＳで希釈したＡｄＣ６８ベクター（ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙについては１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）；及びＡｄＣ６８−ｇＤＥ７については１０１１ｖｐ）を５〜８０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、筋肉内に（ｉ．ｍ．）ワクチン接種した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したＢ１６ＢｒａｆＶ６００Ｅ細胞（５×１０４細胞／マウス）を右脇腹に皮下（ｓ．ｃ．）接種した。腫瘍増殖は、腫瘍の垂直直径を２日ごとに測定することによってモニターした。サイズに依存して、初期の腫瘍はチャレンジの１０〜１４日後に回収し（２週間と呼ぶ）、一方で、後期の腫瘍は、チャレンジの４〜５週間後に回収した（１ヶ月と呼ぶ）。腫瘍が１〜１．５ｃｍの直径を超えたら、マウスを安楽死させた。
【００７８】
インビボ処置のために、フェノフィブラート（ＦＦ；１００ｍｇ／ｋｇ／日、Ｓｉｇｍａ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に最初に希釈し、次いでＰＢＳでさらに希釈
し、経口胃管投与法により３週間毎日与えた。対照マウスには同じ容積の希釈液を与えた。養子移入実験のために、薬物で処理され、１用量あたり５×１０４個のＴｒｐ−１４５５四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する、ワクチン接種マウス由来のレンチベクターまたは脾臓細胞を用いて形質転換した、１×１０７個のインビトロ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を、レシピエントマウスに静脈内注射した。ＦＦ／対照処置脾細胞または野生型／ＰＰＡＲ−αＫＯ脾細胞同時移入実験では、各群由来の１０５Ｔｒｐ−１４５５四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む脾細胞を混合し、ＣＤ９０．１＋レシピエントマウスに静脈内で移入した。
【００７９】
ＮＳＧまたはワクチン接種されていないＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＤ−１遮断実験では、抗ＰＤ−１抗体（クローン２９Ｆ．１Ａ１２）またはアイソタイプ対照抗体（クローン：ＬＴＦ−２、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ）を、腫瘍チャレンジ３日後に開始して与えた。ワクチン接種したＣ５７ＢＬ／６マウスでは、ワクチン接種の１０日後に抗ＰＤ−１またはアイソタイプ対照抗体処置を開始した。抗体は、３日毎に２００ｍｇ／マウスの用量で腹腔内注射によって与えた。
【００８０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞及び薬物処置のインビトロ刺激。
富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体でプレコートした６ウェルプレートで４日間活性化した。いくつかの試料では、細胞を最後の１６時間低酸素チャンバに移した。相対的に休止しているＣＤ８＋Ｔ細胞に対する低酸素の影響を研究するために、濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞を、正常酸素下で４８時間刺激した。次いで、細胞をプレートから取り出し、１００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含む新鮮な培地で９６時間再プレーティングした後、正常酸素または低酸素でＩＬ−２とともにさらに３６時間培養してから分析した。Ｇｌｕ（１０ｍＭ）またはＧａｌ（１０ｍＭ）、１０％透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタマックス、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＧｌｕなしのＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。低酸素実験は、Ｏ２交換用の窒素タンクを備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｎａｐｃｏシリーズ８０００ＷＪ  ＣＯ２インキュベーターで行った。Ｏ２レベルは、各アッセイで示された期間、ＣＤ８＋Ｔ細胞低酸素培養中、１％で保った。全てのアッセイにおいて、染色前に細胞生存率を評価した。低酸素下でＧｌｕ培地で培養した活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、正常酸素下で培養したもの（芽球の約７０〜８０％）と比較して、生存細胞の割合が安定していた。正常酸素下でＧａｌ培地で培養した活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生存率の低下を示した（芽球の約３０〜３５％）。細胞が低酸素及びＧａｌ培地の両方に曝された場合、生存細胞の頻度はわずかに増大した（芽球の約４６〜５０％）。薬物及び対応するビヒクル対照を、以下のとおり添加した：全培養期間にわたって、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ、２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）またはフェノフィブレート（ＦＦ、５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）；最後４８時間はエトモキシール（Ｅｔｏ、２００μＭ、Ｓｉｇｍａ）。ＤＭＳＯ濃度は、すべての培養条件について０．２％未満に維持した。
【００８１】
ナイーブＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（ＭＡＣＳ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたネガティブ選択によって精製した。富化したＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）及びＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体でプレコートした６ウェルプレートで４日間活性化した。いくつかの試料では、細胞を最後の１６時間低酸素チャンバに移した。安静時のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する低酸素の影響を研究するために、精製された富化ＣＤ８＋Ｔ細胞を正常酸素下で４８時間刺激した。次いで細胞をプレートから洗い流し、１００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含む新鮮な培地に９６時間再プレーティングした後、分析前に正常酸素または低酸素中でＩＬ−２とともにさらに３６時間培養した。Ｇｌｕ（１０ｍＭ
）またはＧａｌ（１０ｍＭ）、１０％透析ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＧｌｕなしのＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地（ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。低酸素実験は、Ｏ２交換用の窒素タンクを備えたＴｈｅｒｍｏ  Ｎａｐｃｏシリーズ８０００ＷＪ  ＣＯ２インキュベーターで行った。Ｏ２レベルは、各アッセイで示された期間、ＣＤ８＋Ｔ細胞低酸素培養中に１％で保った。薬物及び対応するビヒクル対照を、以下のとおり添加した：全培養期間にわたって２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ、２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）またはフェノフィブレート（ＦＦ、５０μＭ、Ｓｉｇｍａ）；Ｅｔｏｍｏｘｉｒ（Ｅｔｏ、２００μＭ、Ｓｉｇｍａ）、Ａｍｉｄｅｐｓｉｎｅ  Ａ（ＡｍＡ、２０μＭ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）またはＯｒｌｉｓｔａｔ（ＯＳ、１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）で４８時間。ＤＭＳＯ濃度は、すべての培養条件について０．２％未満に維持した。
【００８２】
メタボロミクス（代謝学）
インビトロでのグルコーストレースのために、細胞を、１０ｍＭの１３Ｃ６−グルコースまたは１３Ｃ６−ガラクトースを含む培地中で４日間、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激した。インビトロでのＦＡトレースのために、細胞を、通常のＧｌｕまたはＧａｌ培地で４日間刺激し、１０％脱脂ＦＢＳ及び４００μＭ１３Ｃ１６−パルミチン酸塩−ＢＳＡを含有する培地に培養の最後の４時間切り替えた。インビボでのトレースは、安楽死の３０分前に、２ｇ／ｋｇの［Ｕ−１３Ｃ］グルコースｉ．ｐ．注射によって、または０．５ｇ／ｋｇの２時間で１３Ｃ１６−パルミチン酸塩を供給し、イントラリピッドに溶解した１５０ｍｇ／ｋｇの１３Ｃ１６−パルミチン酸塩を、２０％ｉ．ｖ．で安楽死の１時間前に注射することによって行った。試料をＬＣ−ＭＳにより分析した。
【００８３】
細胞外フラックス分析及び脂肪酸異化作用アッセイ
種々の条件下で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＯＣＲ及びＥＣＡＲを、ＸＦ２４及びＸＦ９６細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて製造者の指示に従って測定した。
【００８４】
低酸素試料は、１％Ｏ２下で低酸素チャンバで調製した。ＭＡＣＳを用いた死滅細胞除去キットにより死細胞を除去し、生存細胞を１００μＭの塩化コバルトとともにプレインキュベートした後、低酸素チャンバから取り出し、Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析装置に入れた。ＯＣＲへの脂肪酸酸化（ＦＡＯ）の寄与を決定するための実験では、Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析の１５分前に２００μＭのＥＴＯを添加した。要するに、基礎の呼吸及び乳酸産生の測定を繰り返した後、１μＭのＯＭを添加してＯＣＲによるＡＴＰ漏出及びＥＣＡＲによる解糖能を測定した。次に、１．５μＭのＦＣＣＰを添加して、ＯＣＲにより最大呼吸を測定した後、１００ｎＭのＲｏｔｅｎｏｎｅ及び１μＭのＡｎｔｉｍｙｃｉｎ  Ａ（ＡｍＡ）を添加して、ＯＣＲによって予備呼吸容量を決定し、次いで１００ｍＭの２−ＤＧを添加してＥＣＡＲによって解糖貯蔵量を決定した。
【００８５】
外因性及び内因性ＦＡの異化作用（酸化）を測定するために、ＧｌｕまたはＧａｌ培地のいずれか中で３日間活性化された細胞を洗浄し、基質制限したＧｌｕまたはＧａｌ培地に一晩の刺激のために移した。基質制限培地は、０．５ｍＭのＧｌｕまたはＧａｌ、１ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ、０．５ｍＭのカルニチン（全てＳｉｇｍａ）及び１％の透析ＦＢＳを含有した。アッセイの１５分前に試料をＥＴＯまたは媒体対照のいずれかで処理した。パルミチン酸塩：ＢＳＡまたはＢＳＡをアッセイの直前に添加した。
【００８６】
脂肪酸異化作用ＦＡＯのＯＣＲへの寄与は、以下のように算出された：外因性ＦＡ異化作用／酸化による基礎呼吸＝（Ｂａｓａｌ  Ｐａｌｍ：ＢＳＡ−ＥＴＯ  ＯＣＲ速度−基
礎ＢＳＡ−ＥＴＯ  ＯＣＲ速度）−ＦＦＡによるアンカップリングに起因するＯＣＲ；ＦＦＡによるアンカップリング＝ＯＭ注入後、Ｐａｌｍ：ＢＳＡ−ＥＴＯ  ＯＣＲ速度−ＢＳＡ−ＥＴＯ速度。内因性ＦＡ消費に起因する基礎ＯＣＲ＝基礎ＢＳＡ−ＥＴＯ  ＯＣＲ速度−基礎ＢＳＡ＋ＥＴＯ  ＯＣＲ速度。
【００８７】
腫瘍間質液中の脂質及びグルコース濃度の測定
【００８８】
腫瘍の間質液を、記載されているように収集した（Ｗｉｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。遊離ＦＡ種濃度は、ＬＣ−ＭＳによって決定した。Ｇｌｕの絶対濃度は、内部標準として１３Ｃ６−Ｇｌｕを添加した際のＬＣ−ＭＳによって測定した。
【００８９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のレンチベクター形質導入
インビトロ実験のために、４×１０６個の富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、上記のように２４〜２８時間刺激した。新たに濃縮されたレンチベクターを、ポリブレン（６μｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を補充した活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に２０００ｒｐｍ、３２℃で２時間スピン−接種した。細胞を、形質導入の２０時間後に洗浄し、新しいＣＤ３抗体プレコートプレートに移し、正常酸素下で抗ＣＤ２８及びヒトＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を補充した培地中でさらに４０時間刺激するか、またはパートタイムの低酸素状態に切り替えた。レンチベクターを形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔｈｙ１．１の表面染色、続いてＢＤ  ＬＳＲＩＩを用いた分析によって同定された。
【００９０】
インビボ養子移入実験のために、細胞をレンチベクター形質導入の２０時間後に洗浄し、細胞移入前にヒトＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を補充した培地でさらに４８時間培養した。レンチベクター−形質導入のＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔｈｙ１．１の表面染色によって同定された。レシピエントＴｈｙ１．２＋マウスには、その時点で５日早く腫瘍細胞をチャレンジし、２日早くＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙをワクチン接種した。インビボ実験のために、ナイーブなＣ５７Ｂｌ／６マウスの脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズ（ＭＡＣＳ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたネガティブ選択によって精製した。富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いてスピン接種によるレンチベクターの形質導入の前に２４時間刺激した。
【００９１】
マウスからのリンパ球の単離
ＰＢＭＣ及び脾細胞を上記のとおり回収した４０。要するに、血液試料を、眼窩後穿刺により収集し、ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）勾配により単離した。脾臓を回収し、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ１５培地中でメッシュスクリーンで細かく刻み、７０μｍフィルター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を通過させることにより単一細胞懸濁液を生成させた。両方の試料について、赤血球を１×ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって溶解させた。腫瘍浸潤リンパ球を得るために、腫瘍を回収し、小さな断片に切断し、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩ（すべてＲｏｃｈｅ製）及び２％ＦＢＳ（組織培養生物学）をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、１Ｘ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で１時間攪拌して処理した。腫瘍断片をホモジナイズし、７０μｍのストレーナーで濾過し、リンパ球をＰｅｒｃｏｌｌ勾配遠心分離によって精製し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで洗浄した。この処理が試験されたマーカーのいずれにも影響しないことを保証するために、予備実験を行った。
【００９２】
抗体、染色及びフローサイトメトリー
ＴＡＰＤＮＬＧＹＭペプチドを有するＰＥ標識Ｔｒｐ−１特異的ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｄｂ）四量体及びＲＡＨＹＮＩＶＴＴＦペプチドを有するＡｌｅｘａ６４７標識ＨＰＶ−１６  Ｅ７特異的ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｄｂ）四量体（ＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅ
ｒ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た）を用いて細胞を染色した。リンパ球を、抗ＣＤ８−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５または−Ａｌｅｘａ７００、ＣＤ４−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５、ＣＤ４４−ＰａｃＢｌｕｅ、ＬＡＧ−３−ＡＰＣまたは−ＰｅｒｃｐＣｙ５．５、ＫＬＲＧＩ−ＦＩＴＣ、ＰＤ−１−ＰＥ−Ｃｙ７または−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）６０５（全てがＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、２Ｂ４−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＡｍｃｙａｎ蛍光反応性染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて染色した。
【００９３】
ミトコンドリア代謝マーカー分析のために、正常酸素または低酸素のいずれかの下で３７℃で３０分間、Ｍｉｔｏｓｏｘ  Ｒｅｄ（５μＭ、ＭＲＯＳ）及びＤｉｏＣ６（４０ｎＭ、ＭＭＰ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を染色した（低酸素下での染色の前に培養したインビトロサンプルについて）。脂肪酸取り込み実験のために、インビトロで異なる条件下で刺激された細胞、または２週齢もしくは１か月齢の腫瘍を有するマウスの脾臓及び腫瘍から単離された細胞を、直ちに１μＭのＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ
Ｃ１６（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。表面染色の前に、冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。Ｃｐｔ１ａ染色のために、細胞をまず表面マーカーについて染色し、続いて転写因子緩衝液セット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で透過性にした。細胞を、抗Ｃｐｔ１ａ抗体またはマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体（ａｂｃａｍ）を用いて１×ｐｒｗａｓｈ中で５μｇ／ｍｌで４５分間４℃で染色した。Ｔ−ｂｅｔの染色のために、細胞をまず表面マーカーについて染色し、次いでＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液で固定して透過性にし、Ｔ−ｂｅｔ−ＰＥ−Ｃｙ７  Ｅｏｍｅｓ−ＦＴＩＣ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）またはＦｏｘＯ１に対する一次抗体（Ｃ２９Ｈ４、Ｃｅｌｌ  Ｓｕｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて染色した。総ＦｏｘＯ１は、抗ウサギ二次抗体染色（ＣＳＴ）によってさらに決定された。リン酸化（ｐ）Ａｋｔ染色のために、細胞をＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ緩衝液セット及びＰｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（ＣＳＴ）抗体で染色した。
【００９４】
エキソビボリンパ球の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のために、１試料あたり約１０６個の細胞を、ペプチドプール（各ペプチドにつき５μｇ／ｍｌ）で６時間、２％ＦＢＳ及びＧｏｌｇｉｐｌｕｇ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１．５μｌ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ中で培養し、このペプチドプールには、ｇＤ−Ｍｅｌａｐｏｌｙによって発現される全てのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ｍＴｒｐ−１４５５−４６３：ＴＡＰＤＮＬＧＹＡ、ｍＴｒｐ−１４８１−４８９：ＩＡＶＶＡＡＬＬＬ、ｍＴｒｐ−２５２２−５２９：ＹＡＥＤＹＥＥＬ、ｈＴｐ−２１８０−１８８：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ、ｈＴｒｐ−２３４３−３５７：ＳＴＦＳＦＲＮＡＬ、ｍＴｒｐ−２３６３−３７１：ＳＱＶＭＮＬＨＮＬ、ｈｇｐ１００２５−３３：ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ、ｍＢｒａｆ５９４−６０２：ＦＧＬＡＮＥＫＳＩ）またはＥ７ペプチド：ＲＡＨＹＮＩＶＴＴＦ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）を含む。狂犬病ウイルス糖タンパク質ペプチドを陰性対照として使用した。
【００９５】
インビトロで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて実施したＩＣＳについて、約１０６個の細胞を元の培地中で９６ウェルプレートに移し、ＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（２０μｇ／ｍｌ）及びゴルジプラグを用いて４時間、正常酸素または低酸素のいずれかのもとで刺激した。染色は前記のとおり行った１４。ＩＦＮ−γ（ＡＰＣまたはＢＶ４２１）、グランザイムＢ（ＡＰＣ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びパーフォリン（ＰＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する抗体を用いて細胞を染色した。細胞を、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを分析した。
【００９６】
ＢＲＤＵ増殖アッセイ
マウスに１．５〜２ｍｇ／マウスのＢｒｄＵ溶液を腹腔内注射し、０．８ｍｇ／ｍｌの
濃度の水含有ＢｒｄＵをアッセイの前に２４時間与えた。それらを安楽死させ、リンパ球試料を、ＢｒｄＵの取り込みについて分析した。製造業者の指示（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って細胞をまず表面マーカーについて染色し、次いで細胞内ＢｒｄＵ（１：５０希釈）について染色した。
【００９７】
ＨＩＦ−１α及びＧｌｕｔ１染色
エキソビボアッセイのために、マウスを、安楽死させた直後にＰＢＳ及びヘパリン（１０単位／ｍｌ）で、次いで、ＰＢＳで希釈した１ｍＭ塩化コバルト（ＩＩ）（Ｃｏｃｌ２、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で灌流した。エキソビボ及びインビトロの実験の両方について、リンパ球の単離及び固定前の染色を、２００μＭのＣｏｃｌ２を含む培地中で行った。染色のために、リンパ球を最初に１０％正常ヤギ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で室温で３０分間ブロックし、次いで抗Ｇｌｕｔ１一次抗体またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて１μｇ／１０６細胞で６０分間室温で染色した。細胞を洗浄し、ＰａｃＢｌｕｅ標識ヤギ抗マウス二次抗体（１：２０００希釈）を用いて他の細胞表面マーカーに対する抗体とともに３０分間染色した。細胞を固定し、透過性にし、ＦｏｘＰ３緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて抗ＨＩＦ−１α−Ａｌｅｘａ７００抗体（Ｒ＆Ｄ）を用いてＨＩＦ−１αについて染色した。
【００９８】
腫瘍間質液中のグルコース濃度測定
２週または１か月齢の腫瘍を有するマウスを安楽死させた。腫瘍を除去し、記載のように間質液を採取した３７。ＧｌｕメーターでＧｌｕ濃度を決定した。
【００９９】
細胞培養及び同位体標識
インビトロでの１３Ｃ６−Ｇｌｕ／Ｇａｌトレースのために、細胞を、１０ｍＭのＧｌｕ／Ｇａｌ−１３Ｃ６（Ｓｉｇｍａ）を含むＧｌｕフリーＲＰＭＩ培地中でアッセイの開始から４日間培養した。インビトロでの１３Ｃ１６−パルミチン酸塩トレースのために、細胞をＧｌｕまたはＧａｌ培地中で３日間刺激した。３日目の夜に、一晩の培養のためにいくつかの試料を１％Ｏ２に移した。１３Ｃ１６−パルミチン酸塩（Ｓｉｇｍａ）を２００ｍＭの１００％エタノールに最初に溶解し、３７℃で３〜４時間、超音波処理によってボルテックスすることにより８ｍＭ−１３Ｃ１６−パルミチン酸塩−ＢＳＡの最終濃度まで５：１のモル比で脂肪酸を含まないＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）にコンジュゲートした。４日目に、試料をペレット化し、１０％脱脂ＦＢＳ（Ｃｏｃａｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｒｅａｍｓｔｏｗｎ、ＰＡ）及び４００μＭ１３Ｃ１６−パルミチン酸塩−ＢＳＡを含む新鮮な培地に再プレーティングした。低酸素試料を１％Ｏ２に戻した。すべての試料をさらに４時間培養した。死んだ細胞は、ＭＡＣＳによって除去した。試料を４０００ｒｐｍで５分間ペレット化した。全ての回収手順は４℃で行った。
【０１００】
各試料の細胞数を測定した。代謝を消失させ、１００万個の細胞あたり１ｍｌの−８０℃の８０：２０のメタノール：水を添加することにより代謝産物を抽出した。ドライアイスで２０分間インキュベートした後、試料を１００００ｇで５分間遠心分離した。ドライアイス上で１ｍｌの−８０℃の８０：２０のメタノール：水を用いて不溶性ペレットを再抽出した。２回の抽出からの上清を合わせ、Ｎ２下で乾燥させ、百万個の細胞あたり１ｍｌの水に再懸濁した。代謝産物を細胞数に対して正規化した。
【０１０１】
インビボでの１３Ｃ６−Ｇｌｕトレースのために、腫瘍保有マウスを、一晩、１６時間絶食させた。１３Ｃ６−ＧｌｕをＰＢＳで希釈し、マウスにｉ．ｐ．で２ｇ／ｋｇで投与した。注射の３０分後に脾臓及び腫瘍を採取した。Ｕ１３Ｃ１６−パルミチン酸塩トレースマウスを１６時間絶食させた後、ポリエチレングリコール３００（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ）に溶解した１３Ｃ１６−パルミチン酸塩を経口胃管投与により０．５ｇ／ｋｇで投与した。１時間後、イントラリピッドに溶解
した１３Ｃ１６−パルミチン酸塩、２０％（Ｓｉｇｍａ）を、ｉ．ｖ．で１５０ｍｇ／ｋｇ与えた。ｉ．ｖ．注射の１時間後にマウスを安楽死させ、脾臓及び腫瘍を収集した。組織を処理し、細胞をできるだけ迅速に氷上で単離した。プールされた脾臓及び腫瘍由来のＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞を染色し、４℃で選別し、細胞数を決定した。代謝産物を−８０℃の８０：２０メタノール：水で抽出し、Ｎ２下で乾燥し、１ｍｌの水に再懸濁した。代謝産物を細胞数に対して正規化した。ＴＣＡ回路代謝物への１３Ｃの寄与は、［（ｍ＋１）＊１＋．．．（ｍ＋ｎ）＊ｎ］／｛［（ｍ＋０）＋．．．＋（ｍ＋ｎ）］＊ｎ｝＊１００％として算出し、ここでｍ＋０は、１２Ｃ形の代謝産物の正規化されたシグナル強度であり、ｍ＋ｎは、１３Ｃ標識代謝産物の各形態の正規化されたシグナル強度を示し、ｎは代謝産物中の炭素原子の総数を示す。
【０１０２】
ＬＣ−ＭＳ計器及び方法開発。
解糖及びＴＣＡ代謝産物を、独立型オービトラップ（Ｔｈｅｒｍｏ）（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）でのネガティブモードエレクトロスプレーイオン化高分解能ＭＳと組み合わせた逆相イオン対形成クロマトグラフィーによって分析した。カルニチン種は、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）でのポジティブモードエレクトロスプレーイオン化と組み合わせた逆相イオン対形成クロマトグラフィーによって分析した；液体クロマトグラフィー分離は、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰカラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、２．７μｍ粒径、Ａｇｉｌｅｎｔ）で達成した。全実行時間は、０分から１２分までは５０μｌ／分、１２分から２５分までは２００μｌ／分の流速で２５分である。溶媒Ａは、９８：２の水：アセトニトリル（１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％の酢酸を含む）であり；溶媒Ｂはアセトニトリルである。勾配は１２分で０〜７０％Ｂである。全ての同位体標識パターンを、天然の１３Ｃ存在量に対して補正した。
【０１０３】
遺伝子発現解析
リンパ球は、異なる時点でマウスの脾臓及び腫瘍（腫瘍保有または正常）から単離し、生細胞、ＣＤ８＋、ＣＤ４４＋及びＴｒｐ−１及びＥ７四量体に対する色素及び抗体で染色した。同時養子移入実験のために、異なる起源のＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔドナー細胞を、３週間後に抗体染色及び選別によってレシピエントマウスの脾臓及び腫瘍から回収した。細胞を、氷上でＴｒｐ−１またはＥ７ｔｅｔ＋ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞にＲＮＡ保護細胞試薬（ＱＩＡＧＥＮ）中にソートした（Ｍｏｎｏ  Ａｓｔｒｉｏｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【０１０４】
インビトロで培養した試料について、手動細胞分離カラム及びＭｉｎｉ／Ｍｉｄｉ  ＭＡＣＳセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して約１０６個の細胞／試料を氷上で処理して死細胞を除去した。レンチベクター形質導入アッセイのために、形質導入細胞を、ＭＡＣＳを用いたＴｈｙ１．１発現に基づいてさらに精製した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを精製細胞から単離し、ＲＮＡ濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた逆転写により、ｃＤＮＡを得た。相対的定量的リアルタイムＰＣＲ分析は、７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。ｂ−２ミクログロブリンまたはＧＡＰＤＨを、内部対照として用いた。ＧＡＰＤＨまたはβ−２ミクログロブリンを、内部対照として使用した。表１は、実施例１に記載の遺伝子発現解析のための代謝経路、遺伝子名ならびにフォワード及びリバースプライマーを示す。プライマー設計にはベクターＮＴＩを用いた。
【表１−１】
2019504071.tif 000003
【表１−２】
2019504071.tif 000004
【０１０５】
転写産物発現レベルの相違は、ヒートマップで視覚化される。値を対数変換して相違の比を示した。カラースケールは−２（低発現、ディープブルー（藍色））から２（高発現、ディープレッド（深紅））に設定した。
【０１０６】
インビボでの同位体標識
腫瘍を有するマウスを１６時間絶食させた。ＰＢＳで希釈した１３Ｃ６−Ｇｌｕ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）をｉ．ｐ．でマウスに２ｇ／ｋｇで投与した。３０分後に脾臓及び腫瘍を収集した。１３Ｃ１６−パルミチン酸カリウムを、ＦＡフリーＢＳＡ（６：１のモル比）にコンジュゲートさせ、経口胃管投与により約０．３５ｇ／ｋｇでマウスに与えた。１時間後、１３Ｃ１６−パルミチン酸塩−ＢＳＡを、ｉ．ｖ．で１２５ｍｇ／ｋｇで与えた。脾臓及び腫瘍を、３０分後に収集し、細胞を氷上で単離した。腫瘍試料を秤量し、液体窒素中で急速凍結した。プールした試料由来のＣＤ８＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞を染色し、４℃で選別した。代謝産物を−８０℃の８０：２０メタノール：水で抽出し、Ｎ２下で乾燥させ、１００ｍｇ組織／ｍｌまたは１０６細胞／１００μｌで水に再懸濁した。
【０１０７】
統計分析
２つの集団間の差異の有意性は、スチューデントｔ検定によって計算した；複数の集団間の相違の有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いた一元または二元のＡＮＯＶＡによって計算した。生存の相違は、Ｌｏｇ−ｒａｎｋ  Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定によって算出した。有意性は、ｐ値が０．０５以下と設定した。タイプＩの誤差は、ホルムシダック法を用いて複数の比較について補正した。
【０１０８】
実施例２：ＣＤ８＋Ｔ細胞は、同族抗原の認識とは独立して、ＴＭＥ内で機能不全になる
ＣＤ８＋ＴＩＬの運命が継続的な抗原認識に依存するか否かを試験するために、本発明者らは、移植可能なマウス黒色腫モデルにおいて２種のワクチンを使用した。１つはＡｄＣ６８ｇＤ−Ｍｅｌａｐｏｌｙ４０と呼ばれ、主にＴｒｐ−１４５５−４６３エピトープにＭＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発するアデノウイルス（Ａｄ）ベースのポリエピトープワクチンであり；もう一方は、ＡｄＣ６８−ｇＤＥ７１５と呼ばれ、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＥ７に刺激する。
【０１０９】
本発明者らは、３日齢のＢ１６ＢｒａｆＶ６００Ｅ腫瘍を有するマウス及び正常マウスに、ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙをＡｄＣ６８−ｇＤＥ７と混合してワクチン接種
した。ワクチン接種は、腫瘍の進行を遅延させる（図１Ａ）。ワクチン接種の前に腫瘍細胞で３日間（ｄ）チャレンジしたかまたは曝露しなかったマウスの脾臓（Ｓｐｌ）及び腫瘍中の四量体（ｔｅｔ）＋Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞／１０６生存細胞の数を示す実験によって（ｎ＝７〜１０／群）、Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方とも、腫瘍内に蓄積し、腫瘍進行中の末梢よりＴＭＥにおいてより急速に収縮することが明らかになった（データは示さず）。
【０１１０】
ワクチン接種の３日前にＢ１６細胞をチャレンジしたマウスの脾臓及び腫瘍由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞へのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みの％を測定した（ｎ＝５／時点）。ワクチン接種後９日目、１９日目または２９日目にＢｒｄＵを２４時間、安楽死前日に投与した。測定は、１０日目、２０日目及び１か月に実施した（ｎ＝５、２回の実験の代表）。Ｔｒｐ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のみが腫瘍内で増殖する。Ｔｒｐ−１特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの数は、ワクチン接種後１０日〜１ヶ月で９０％を超えて減少したが、Ｅ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬは、約８０％未満の低下であった。Ｔｒｐ−１特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ数のこの顕著な減少は、腫瘍内で増殖しても観察された。それにもかかわらず、Ｔｒｐ−１抗原の存在が継続しているにもかかわらず、それらの増殖は経時的に減少する（図示せず）。
【０１１１】
ワクチン接種後２週間（ｗｋ）または１か月（ｍｏ）で脾臓及び腫瘍から特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１及びＬＡＧ−３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び代表的なヒストグラムを作製した。２週間及びより顕著な程度に１ヶ月の腫瘍からのＴｒｐ−１特異的及びバイスタンダーＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方とも、ＴＭＥ内の枯渇マーカーＰＤ−１及びＬＡＧ−３の発現を増大させる（データは示さず）。Ｔｒｐ−１特異的及びバイスタンダーＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＭＥ内で機能を失う。
【０１１２】
これによって、溶菌酵素またはインターフェロン（ＩＦＮ）−γのような、抗原特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ産生のエフェクター分子の頻度減少及び減少した多機能性と組み合わせて（図１Ｂ）、ワクチン誘導性のＴＩＬは、それらのエピトープ特異性にかかわらず、腫瘍の進行中に「消耗」に向かって分化することが示唆される。ワクチン接種に使用されるＡｄベクターは、低レベルで持続し、したがって完全に機能するエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を高頻度で維持する（Ｔａｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１１３】
別の実験において、Ｔｒｐ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４４−ナイーブＴ細胞についての代表的なヒストグラムを有する脾臓及び腫瘍由来の特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞中／上中のＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＫＬＲＧ１及びＥｏｍｅｓのＭＦＩを示すグラフを作成した（図１Ｃ）。脾臓及び腫瘍由来のワクチン誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞の上／中の分化マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＫＬＲＧ１及びＥｏｍｅｓのレベルは、匹敵したままであった。したがって、慢性抗原曝露以外の因子は、ＣＤ８＋ＴＩＬ枯渇に寄与する。
【０１１４】
代謝ストレスは、細胞の運命を決定し２６、１６、２３、抗原特異性とは無関係に潜在的にＣＤ８＋ＴＩＬの機能及び生存に影響を及ぼす。腫瘍進行中、Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬは、ＡＴＰ産生に必須であり、有毒なミトコンドリア活性酸素種（ＭＲＯＳ）のレベルを増大させるミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ）を徐々に失う（図２Ａ）。ＭＭＰｌｏＭＲＯＳｈｉＴｒｐ−１−及びそれほどではないが、Ｅ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬは、後期腫瘍において蔓延し（図２Ｂ）、一方で、脾臓由来の対応するＣＤ８＋Ｔ細胞は大部分がＭＭＰｈｉＭＲＯＳｌｏのままである。これらのデータによって、ＣＤ８＋ＴＩＬが成長する腫瘍内でますます代謝ストレスを経験することが示唆される。
【０１１５】
本明細書に示すとおり、継続的な刺激は障害を加速するようである。
【０１１６】
実施例３：ＨＩＦ−１Ａを通じた低酸素状態は、ＬＡＧ−３発現を増大させ、Ｔ細胞機能を低下させる
Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬは、低酸素下で安定化する転写因子であるＨＩＦ−１α及びその下流標的であるＧｌｕｔ１（Ｇｌｕ摂取を、ワクチン誘導ＣＤ８＋ＴＩＬ中／上で１ヶ月から促進する（図２Ｃ）。ただし、小さな２週間腫瘍では促進しない）の増強された発現によって示されるように、腫瘍進行中に次第に低酸素状態に曝される（データ示さず）。
【０１１７】
低酸素状態がＣＤ８＋Ｔ細胞にどのように影響を及ぼすかを決定するために、本発明者らは、正常酸素（２１％Ｏ２）下で９６時間、または低酸素（１％Ｏ２）下で最後の１６時間、インビトロで連続的に、富化された、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した。低酸素状態は、芽球形成を低減させ（図８Ａ）、ＨＩＦ−１α及びＧｌｕｔ１の発現を増大させる（図８Ｂ）。ＯＸＰＨＯＳの尺度であるＯ２消費速度（ＯＣＲ）は、低酸素下で減少するが、解糖の尺度である細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は増大する（図８Ｃ）。Ｔ細胞のＭＭＰは減少し、ＭＲＯＳは増大し、末期腫瘍におけるワクチン誘導性ＴＩＬの代謝プロフィールを想起させるＭＭＰｌｏＭＲＯＳｈｉＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が上昇する（データは示さず）。低酸素状態は、ＰＤ−１を減少させるが、ＬＡＧ−３発現を増強させ（図８Ｄ）、このことは、ＰＤ−１が低下し、ＬＡＧ−３が、ＨＩＦ−１αシグナリングによって駆動される解糖の増強の際に増大することを示唆する。低酸素下で培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ−ｂｅｔ発現を減少させ（図８Ｄ）、エフェクター分子の産生を減少させ、多機能性を失い（図８Ｅ）、これによって、低酸素状態がＣＤ８＋Ｔ細胞機能を損なうことが示される。
【０１１８】
休止中のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する低酸素状態の効果を試験する、以前に記載された別のプロトコール（Ｄｏｅｄｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を、Ｔ細胞を４８時間刺激することによって行った。活性化時のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３またはＣＤ２８刺激に対する抗体を有さないＩＬ−２含有培地に切り替えられ、低酸素状態の前にＩＬ−２中の比較的休止期で維持される。低酸素状態の影響は、ＩＬ−２で培養した細胞を、最後の３６時間、１％Ｏ２に曝すことによって評価した。図８Ｆは芽球形成を示す；生存ＩＬ−２の正規化された％は、このプロトコールを使用して正常酸素（濃い灰色）下で培養されたものと比較して低酸素（白）下で芽球を形成するＣＤ８＋Ｔ細胞を維持した。このプロトコールは、芽球形成（図８Ｆ）またはＰＤ−１に影響を及ぼさないが、ＬＡＧ−３は増大し（図８Ｇ）、Ｔ−ｂｅｔが減少する（図８Ｇ）。グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の産生は増大するが、他のエフェクター分子の産生及び多機能性は低下する（図８Ｈ）。ワクチンに誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＴＭＥの低酸素領域に浸潤する前に休止する可能性が低いため、その後の低酸素実験には連続ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化プロトコールを使用した。
【０１１９】
固形腫瘍は通常Ｏ２を欠く。このデータによって、ＴＭＥ内のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬが、低酸素下で安定化する転写因子であるＨＩＦ−１α及び下流標的Ｇｌｕｔ１（ワクチン誘導性ＣＤ８＋ＴＩＬの中／上で後期段階（図２Ｃ）から、Ｇｌｕ取り込みを容易にするが、ただし小さな２週目の腫瘍ではＧｌｕ取り込みを容易にしない（データ示さず））の増強された発現によって示されるように、腫瘍進行中に低酸素状態をますます経験することが示されている。
【０１２０】
低酸素状態の影響を試験するために、本発明者らは、正常酸素（２１％Ｏ２）下で通常のＧｌｕ豊富な培地で４日間ＣＤ８＋Ｔ細胞をインビトロで刺激するか、または培養の最後の１６時間に低酸素（１％Ｏ２）に曝した。低酸素状態は、芽球形成の減少によって証明されるように、Ｔ細胞刺激に影響を及ぼす（図８Ａ）。低酸素下で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＩＦ−１α及びＧｌｕｔ１の発現を増大させる（図８Ｂ）。それらは、ＭＭＰの減少及びＭＲＯＳの上昇によって証明されるように代謝的にストレスを受け、後期
腫瘍におけるワクチン誘導ＴＩＬのミトコンドリア代謝プロファイルを思い起こさせるＭＭＰｌｏＭＲＯＳｈｉＣＤ８＋Ｔ細胞（図８Ｃ）の割合の増大をもたらす。低酸素状態はＰＤ−１を減少させるが、ＬＡＧ−３発現を増大させ（図８Ｄ）、ＨＩＦ−１αシグナル伝達の強化などの解糖を促進する条件下でＰＤ−１が低下し、ＬＡＧ−３が増大することを示唆する。低酸素下で培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ−ｂｅｔ発現を低下させ（図８Ｄ）、エフェクター分子の産生を減少させ、多機能性を失う（図８Ｅ）。
【０１２１】
最初の活性化の際に、低酸素状態の前に、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＬ−２で休止されている、以前に記載された異なるプロトコール１０は、芽球形成（図８Ｆ）またはＰＤ−１レベルに影響を及ぼさないが、ＬＡＧ−３発現は増大し（図８Ｇ）、Ｔ−ｂｅｔレベルが減少する（図８Ｇ）。グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）の産生は増大するが、他のエフェクター分子の産生及び多機能性は低下する（図８Ｈ）。ワクチンによって誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、浸潤する腫瘍の前に休止する可能性が低いので、その後の低酸素状態実験のために連続ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化プロトコールを使用した。
【０１２２】
ＨＩＦ−１αは、低酸素状態に曝されたＴＩＬまたはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＬＡＧ−３の発現と相関する。ＨＩＦ−１αがＬＡＧ−３発現を直接的に促進するか否か、及びこれがＣＤ８＋Ｔ細胞機能に影響を及ぼすか否かを決定するために、本発明者らは、ＨＩＦ−１αをサイレンシングさせる短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡまたはコントロール配列を、Ｔｈｙ１．１選択マーカー（データ示さず）と一緒に発現するレンチベクターを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入することによって、ＨＩＦ−１α転写物をノックダウンした。ＨＩＦ−１αサイレンシング／ノックダウンは、低酸素下でインビトロで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＩＦ−１αの発現を減少させ（図３Ａ参照）、同時にＬＡＧ−３を減少させたが、ＰＤ−１は減少させず（図３Ａ参照）、ＧｚｍＢ及びＩＦＮ−γの産生を改善する（図３Ｂ参照）。ＨＩＦ−１αは、低酸素状態に曝されたＴＩＬまたはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＬＡＧ−３の発現と正の相関がある。
【０１２３】
ＨＩＦ−１αがＣＤ８＋ＴＩＬの同時阻害剤発現及び機能喪失に寄与するか否かを研究するために、本発明者らは、インビトロで富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化した。富化されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、対照またはＨＩＦ−１αを標的とするｓｈＲＮＡ及びＴｈｙ１．１を発現するレンチベクター（すなわち、レンチウイルスに基づくベクター）を用いて形質導入した。ウイルスを、５日早く腫瘍細胞をチャレンジし、２日早くＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙをワクチン接種したレシピエントマウス（すなわち、Ｔｈｙ１．２＋腫瘍保有、ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙワクチン接種マウス）にｉ．ｖ．で移入した。
【０１２４】
Ｔｒｐ−１特異的Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、移入から約２〜３週間後に腫瘍から回収された。同様のサイズの腫瘍を有するマウスからの試料を用いて、約２〜３週間後に、移入されたＴ細胞を分析した。腫瘍由来の細胞を、単核細胞、シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）、生存細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞上に最初にゲーティングした。それらは、Ｔｈｙ１．１＋細胞及びＴｒｐ−１−四量体＋ＣＤ４４＋細胞上でさらにゲーティングされた。
【０１２５】
ＨＩＦ−１αをノックダウンすると（図３Ａ）、ＰＤ−１に影響することなくＬＡＧ−３のＴｒｐ−１特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの発現が減少し（図３Ａ）、ＭＡＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度及びエフェクター機能が有意に改善される（図３Ｂ）。Ｔ細胞の頻度及び機能（図３Ｃ）。パーフォリンの産生は、インビボではＨＩＦ−１αサイレンシングの際に増大したがインビトロでは増大せず、これは活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する低酸素状態の影響に栄養素の供給の違いなどの他の条件が寄与していることを反映し得る。これらのデータは、増大したＨＩＦ−１αシグナル伝達による低酸素状態が、ＬＡＧ−３発現を直接
増強し、ＣＤ８＋ＴＩＬのエフェクター機能を減衰させることを支持する。
【０１２６】
集合的に、このデータは、ＨＩＦ−１αによる低酸素状態が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能障害をもたらすことを示す。低酸素誘導のＨＩＦ−１αは、同時阻害剤ＬＡＧ−３の発現を直接駆動し、インビトロで活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能を損なう。ＨＩＦ−１ａは、グルコース取り込み及び解糖の酵素を増大させる。これはピルビン酸デヒドロゲナーゼを不活性化するＰＤＫ１を活性化することにより、ＴＣＡ回路によるエネルギー産生を減少させる。グルコース不足の環境内で、ＨＩＦ−１ａシグナル伝達の増大は、ＴＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して逆効果である。このデータはさらに、解糖に対するＨＩＦ−１α駆動の代謝切り替えが、Ｏ２及びＧｌｕ欠乏ＴＭＥ内のＴ細胞機能に対して逆効果であることを示唆している。
【０１２７】
実施例４：ＧＬＵ及びＯ２エンハンサーＦＡ異化作用の両方を失う活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞
おそらく腫瘍細胞によるその消費のために、腫瘍進行中にＯ２だけでなくＧｌｕもＴＭＥ内で低下する。低血糖及び低酸素活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団効果を、解糖阻害剤である２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ）を用いたＧｌｕ培地中でインビトロで刺激することによって研究した。あるいは、Ｇｌｕを、ガラクトース（Ｇａｌ）で置換した。細胞を正常酸素状態または短期低酸素状態で培養した。解糖の尺度である細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）は、２−ＤＧまたはＧａｌと培養されたＴ細胞を減少させる。
【０１２８】
Ｏ２消費速度（ＯＣＲ）は、ＯＸＰＨＯＳの尺度であり、２−ＤＧと共に培養されたＴ細胞において減少するが、Ｇａｌの存在下で増大する（図９Ａ）。いずれの条件もＯＣＲ／ＥＣＡＲ比を増大させ、これによって、ＰＤ−１をより多く発現する、Ｇｌｕで増殖させたものと比較して、２−ＤＧまたはＧａｌと培養したＯＸＰＨＯＳ細胞を通じたエネルギー産生の増大が示唆されており、これはＯＸＰＨＯＳの使用が、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞での高いＰＤ−１発現とリンクされていることが示唆される（図９Ｂ〜９Ｃ）。Ｇｌｕと培養した細胞と比較して、正常酸素状態及び低酸素状態の両方でＧｌｕへのアクセス制限で増殖された細胞は、Ｔ−ｂｅｔ発現を減少させ（図９Ｄ）、機能を失う（図９Ｅ）。細胞が低酸素状態に曝された場合、ＧｌｕにアクセスすることがないＣＤ８＋Ｔ細胞の多機能は、より良好に保存される（図９Ｄ）。これらのデータによって、低酸素状態では、Ｇｌｕの供給が限られている細胞は、その機能をサポートするために代謝をより調整し得ることが示唆される。
【０１２９】
制限されたＧｌｕ及びＯ２供給を伴うＣＤ８＋Ｔ細胞によって使用される代謝経路を研究するために、本発明者らは定量的リアルタイム（ｑＲＴ）ＰＣＲによって、栄養素消費及びエネルギー産生に関与する因子の転写物を測定した（図１５Ｆ、図４Ｂ及び表２）。
【表２】
2019504071.tif 000005
【０１３０】
短期低酸素状態では、Ｇｌｕに富む培地で刺激された細胞と比較して、Ｇｌｕへのアクセスを制限して刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、解糖の酵素の転写物、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル、ＲＯＳ解毒、及び電子伝達鎖（ＥＴＣ）を低下するが、ＦＡ取り込みの受容体及び酵素の転写物、トリグリセリドＴＧ代謝回転、ペルオキシソーム及びミトコン
ドリアＦＡ異化作用を増大させる。
【０１３１】
このパターンは、小さい２週齢の腫瘍由来のものと比較して、１ヶ月の腫瘍由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬによって密接に反映され、このことは、代謝ストレスを受けたＣＤ８＋Ｔ細胞がますますＦＡ異化作用に依存することを示している。腫瘍進行中の転写産物の変化は、ＴＩＬをさらに休止期に分化させることによって駆動されない。なぜなら、それらの変化は、ワクチン接種後３か月と２週間で試験したワクチン誘導性脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞の相違とは異なるためである。
【０１３２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞代謝に対するＧｌｕ及びＯ２欠乏の影響を直接測定するために、脂質クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって代謝産物の強度を分析した。ＦＡミトコンドリア輸送及び異化作用に関与する代謝物、すなわちアセチルカルニチン、パルミトイルカルニチン及びケトン体３−ヒドロキシ酪酸は、Ｇａｌ培地中でインビトロで刺激された細胞において増大し、これは低酸素下でさらに増強される（図１０Ａ）。１３Ｃ６−Ｇｌｕ／Ｇａｌまたは１３Ｃ１６−パルミチン酸塩の同位体トレースは、Ｇｌｕ培地及び短期低酸素状態で活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞、または正常酸素下でＧｌｕ培地で活性化されたものと比較して正常酸素もしくは低酸素下でＧｌｕへのアクセスが制限された培地において活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、炭水化物由来のＴＣＡ回路代謝産物を減少させた（図１０Ｂ）。１３Ｃ１６−パルミチン酸塩由来の炭素は、アセチル−ＣｏＡ及びＴＣＡ回路代謝産物にますます取り込まれている（図１０Ｃ）。さらに、低酸素下で刺激された細胞は、正常酸素下で同じ培地で培養されたものよりも１３Ｃ１６−パルミチン酸塩由来アセチル−ＣｏＡの割合が高く、これによって、低酸素状態が脂肪酸異化作用をさらに増大させることが示唆される。これは、Ｇｌｕ及び／またはＯ２へのアクセスが限定された、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＦＡ取り込みの増大（図１０Ｄ）ならびに内因性及び外因性ＦＡの酸化の増強（図１０Ｅ）によっても支持される。これらのデータは、Ｇｌｕを剥奪された活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞がＦＡ異化作用にますます依存して、ＯＸＰＨＯＳを通じてエネルギーを生成することを示している。驚くべきことに、ＯＸＰＨＯＳはＯ２を必要とするが、低酸素状態はこの代謝切り替えを増大させる。
【０１３３】
本発明者らは次に、安定した同位体トレースによって、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の代謝をインビボで直接研究した。３日の腫瘍を有するマウスに、ＡｄＣ６８−ｇＤＭｅｌａｐｏｌｙ及びＡｄＣ６８−ｇＤＥ７をワクチン接種した。２週間または１ヶ月後、マウスに１３Ｃ６−Ｇｌｕをｉ．ｐ．で与えた。３０分後、ＴＩＬＳを単離し、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋細胞を単離し、それらの代謝産物を分析する。解糖代謝物のレベル及びＴＣＡ回路中間体への１３Ｃ取り込みを、脾臓及び腫瘍由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において分析した。ＴＩＬ中の解糖中間体グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）及び３−ホスホグリセリン酸（３ＰＧ）の強度は、腫瘍の進行中に低下し（図４Ｃ）、これは解糖の減少を示している。ＴＣＡ回路中間体へのＧｌｕ由来炭素の寄与は、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、後期腫瘍から早期腫瘍へ、または腫瘍から脾臓へ比較して低下し（図４Ｄ）、ＴＩＬがＧｌｕ異化作用を減少させることが確認された。
【０１３４】
本発明者らはさらに、２週間または１ヶ月の腫瘍を有するマウスにおいて１３Ｃ１６−パルミチン酸塩トレースを行った。マウスに、１３Ｃ１８−パルミチン酸塩−ＢＳＡを、ｏｓ／ｉ．ｖ．で投与した。供給後６０分及び注射後３０分で、ＴＩＬＳを単離し、ＣＤ８＋ＣＤ４４＋細胞を単離し、代謝産物を分析した。アシルカルニチン種、ケトン体３−ヒドロキシブチラート及びアセトアセテートの強度は、腫瘍進行中のＴＩＬにおいて増大する（図４Ｅ）。さらに、ＴＣＡ代謝物に対する１３Ｃ１６−パルミチン酸塩−由来１３Ｃの寄与は、２週間の腫瘍または１か月の脾臓由来の細胞と比較して１か月の腫瘍由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において高くなり（図４Ｆ）、これによって腫瘍の進行中のＴＩＬのＦＡ異化作用への依存の増強が支持される。ワクチン接種後の種々の時点で試験し
た脾臓ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＴＣＡ回路代謝産物への１３Ｃ１６−パルミチン酸塩由来炭素取り込みは、安定したままであるか、または経時的に減少する。ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ１２７の発現は、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬの２週間腫瘍のものと比較して、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬ上で顕著に低く（データ示さず）、これによって、後期段階のＣＤ８＋ＴＩＬによるＦＡ異化作用の増強は、記憶へ向かうそれらの分化を反映しないことが確認される。
【０１３５】
ＦＡ異化作用に対するＴＩＬの代謝切り替えは、後期腫瘍由来のワクチン誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞における、黒色腫間質液内の種々の遊離のＦＡ種の豊富さ（図４Ｇ）、ＦＡの取り込み増強（図４Ｈ）及びＦＡ酸化（ＦＡＯ）律速酵素Ｃｐｔ１ａの発現増大（図４Ｉ）により促進される。
【０１３６】
後期腫瘍由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＴＩＬは、早期腫瘍由来のＴＩＬまたは脾臓由来の対応するＴ細胞と比較して、ＦＡ取り込み（図４Ｈ）及び脂肪酸異化作用律速酵素Ｃｐｔ１ａの発現（図４Ｉ）を増大させ、このことは、それらの増大がＦＡ異化作用に依存していることを示唆している。ＦＡ取り込み及びＣｐｔ１ａレベルは両方とも低いままで、２週間または１ヶ月前にワクチン接種によって誘導されたＣＤ８＋Ｔ脾細胞で同等であり、これによって、ＴＩＬで観察された代謝変化は、より休息性「記憶」段階への分化によるものではないことが示唆される。ＦＡ代謝物の比較は、早期段階の腫瘍と比較して、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬにおけるアシルカルニチン種及びケトン体アセトアセテートのレベルが高いことを示す（図４Ｅ）。１３Ｃ１６−パルミチン酸塩からＴＣＡ代謝産物への１３Ｃの寄与は、腫瘍進行中のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬの増大をもたらし（図４Ｇ）、脂肪酸異化に対するそれらの増強された依存性をさらに支持する。ワクチン接種後の異なる時点で試験した脾臓ＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞では、１３Ｃ１６−パルミチン酸塩誘導のクエン酸塩またはリンゴ酸塩への１３Ｃ組み込みは安定したままであるか、または経時的に低下する（図４Ｆ）。
【０１３７】
このデータは、後期腫瘍におけるワクチン誘導性ＣＤ８＋ＴＩＬが、同時阻害剤ＰＤ−１及びＬＡＧ−３の発現を増強し、エフェクター機能及び多機能性を失い、代謝ストレスの増強を経験し、グルコース代謝を減少させ、ＦＡ異化作用にますます依拠することを示す。
【０１３８】
全体として、これらのデータは、Ｇｌｕを剥奪されたＣＤ４４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＦＡ異化作用に益々依拠して、ＯＸＰＨＯＳを通じてエネルギーを産生することを強く示している。驚くべきことに、これはさらに低酸素時に増大するが、ＯＸＰＨＯＳはＯ２を必要とする。
【０１３９】
実施例５：ＦＡ異化作用に対する依拠の向上は、ＰＤ−１発現を増大させ、そして、代謝的にストレス状態の下でＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を維持するために必須である
ＦＡ異化作用がＣＤ８＋Ｔ細胞分化に及ぼす影響をさらに評価するために、本発明者らは、ＦＡ異化作用を増強するＰＰＡＲαのアゴニストであるフェノフィブラート（ＦＦ）またはミトコンドリアの脂肪酸異化作用を低下させる、Ｃｐｔ１の不可逆阻害剤であるエトモキシール（Ｅｔｏ）の存在下で、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した（図６Ａ）。希釈処理した細胞と比較して、ＧｌｕまたはＧａｌ培地中で刺激したインビトロＦＦ処理細胞は、ＦＡ異化作用（データは示さず）及びＦＡ取り込み増大に関与する因子の転写産物の増強によって示されるように、脂肪酸異化を増大させる（図１２Ａ）。ＧｌｕまたはＧａｌ培地のいずれかで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｅｔｏの存在下でＯＣＲを減少させ（図１２Ｂ）、脂肪酸異化作用に対する薬物の阻害効果が確認された。ＯＣＲは、ＧａｌとＥｔｏと培養された細胞でより多く減少し、細胞が低酸素状態に曝されるとさらに減少し、ＧｌｕとＯ２が制限されているときに脂肪酸異化作用に対する細胞の依存が増大することが再
度確認された。低酸素状態の下では、ＰＤ−１は、ＦＦの添加と共に増大するが、Ｅｔｏの存在下で減少する（図１２Ｃ）。ＦＦは増大するが、Ｅｔｏは、Ｇｌｕ及びＯ２への限定されたアクセスで培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞の機能及び多機能性を減少させる。これらの結果、ＦＡ異化作用が、代謝的にストレスを受けたＣＤ８＋Ｔ細胞のＰＤ−１発現及びエフェクター機能を促進することが示される。
【０１４０】
図４Ｂに示すように、代謝ストレスを経験するＴ細胞は、ＴＧ代謝回転に関与する酵素の転写産物を増大させる。このような条件下でＣＤ８＋Ｔ細胞がＴＧを動員して脂肪酸異化作用及びＯＸＰＨＯＳに燃料供給するか否かを評価するために、脂肪分解酵素ｌｉｐａの阻害剤Ｏｒｒｉｄａｔ（ＯＳ）またはＴＧ合成酵素Ｄｇａｔ１及びＤｇａｔ２の阻害剤であるＡｍｉｄｅｐｓｉｎｅ  Ａ（ＡｍＡ）を、異なる条件で刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞に添加した（図６Ａ）。基礎のＯＣＲは、短期低酸素下でＧｌｕまたはＧａｌ培地中のいずれかの薬剤で培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞で減少し（データは示さず）、このことは、ＴＧ代謝回転がＯＸＰＨＯＳのための燃料供給することを示唆している。低酸素状態下では、ＰＤ−１は、他の培養条件及びＧａｌ培地へのＡｍＡの添加にかかわらず、ＯＳの添加とともに減少する（図１２Ｃ）。ＡｍＡ及びそれより低い程度でＯＳは、Ｇａｌ培地で培養し、低酸素状態に曝したＴ細胞の機能を低下させる。これらのデータは、低酸素下で活性化されたＴ細胞が、ＡｍＡまたはＯＳの存在下でＯＣＲが減少するにつれて、ＯＸＰＨＯＳのＴＧ代謝回転からの基質を使用することを示す。しかし、ＴＧは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が同時に低血糖にかからない限り、エフェクター機能にとって必須ではない。
【０１４１】
ＦＡ異化作用の増大がＣＤ８＋ＴＩＬ機能にどのように影響するかを評価するために、本発明者らは、ＣＤ９０．２を発現し、かつ及びＣＤ４５についてコンジェニックなマウスをワクチン接種し、ＦＦ（ＣＤ４５．１マウス）または希釈剤（ＣＤ４５．２マウス）で毎日３週間処置した。Ｔｒｐ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が等しい数で存在するように、これらの群からの脾細胞を混合した。この混合物を、腫瘍細胞をチャレンジし、３日後にワクチン接種したＣＤ９０．１＋レシピエントマウスに移した。ワクチン接種の２日後に細胞を移入した（図５Ｂ）。移入の直前に、ドナーマウス由来のＦＦ及び希釈剤で処理したＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１２７の同等の表面発現と同様の機能を有し、このことは、ＦＦが、Ｔ細胞活性化または記憶形成に影響しないことを示している。移入の前にＦＦ処理したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥｔｏによってブロックされたＯＣＲを増強し、このことは、ＦＦが、ワクチンによって誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、脂肪酸異化作用を増強するように条件づけることを示す。ドナー由来のワクチン誘導ＣＤ８＋ＴＩＬを、移入３週間後に分析した（データ示さず）。対照処置ドナーＴＩＬと比較して、ＦＦ処置ドナー由来ＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬは、脂質代謝に関与する因子の転写物のレベル向上及びＴｒｐ−１特異的細胞にとって有意になるＰＤ−１発現の増大を示す。さらに、ＦＦ処置ドナーに由来するＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度及び機能は、対照ドナーの頻度及び機能を上回る。ＦＦまたは希釈剤処置マウスの脾細胞を、腫瘍保有マウスの別個のコホートに移入すると、前者は腫瘍増殖を有意に遅延させる（図６Ｇ）。まとめると、これらのデータによって、増強されたＦＡ異化作用が、その機能を維持しながら、ＴＡ特異的ＴＩＬに対するＰＤ−１発現を増大させることが確認される。
【０１４２】
ＦＡ異化作用が代謝的にストレスを受けたＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を維持するか否かをさらに研究するために、ＰＰＡＲαＫＯマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞をインビトロで刺激し、野生型（ｗｔ）マウスのものと比較した。ＴＣＡ回路及び脂質代謝に関与するほとんどの因子の転写産物は、Ｇｌｕ培地及び低酸素下で刺激した場合のｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＰＰＡＲαＫＯにおいてより高い。このプロファイルは、Ｇａｌ培地及び低Ｏ２で培養した細胞では逆転し、このことは、ＰＰＡＲαの不活性化がＧｌｕなしで培養したＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡ異化作用を有意に減少させることを示唆している（データ示さず）。ｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較したＰＰＡＲαＫＯは、Ｏ２レベルにかかわらずＧａｌ培地
で培養した場合、低レベルのＰＤ−１を発現する（図１３Ａ）。それらの機能は、同じ条件下で培養されたｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能と比較して低く（図１３Ｂ）、ＦＡ異化作用は、Ｇｌｕへのアクセスが制限されているＣＤ８＋Ｔのエフェクター機能を維持するのに必要であることを支持している。
【０１４３】
ワクチン誘導ＴＩＬに対するＦＡ異化作用の効果をさらに調査するために、本発明者らは、ＰＰＡＲαＫＯ及びｗｔ  ＣＤ４５コンジェニックマウス由来の脾細胞をワクチン接種の３週間後に、腫瘍保有マウス及びワクチン接種したレシピエントマウスに同時移入する養子移入システムを使用した（図７Ａ）。移入直前の３、２及び１因子を産生する細胞の％としてのｗｔ及びＰＰＡＲ−αＫＯマウスの脾臓由来のＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能を決定した（データ示さず）。移入前に、Ｔｒｐ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能及び多機能性は２つの群間で類似しているが、ただしＰＰＡＲαＫＯマウスでは、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、量が少なく多機能性である。ＣＤ８＋ＴＩＬＳのＦＡ異化作用は、ＰＰＡＲ−αノックアウトによって減少する。これは、Ｅ７エピトープについてさらに低いＴｃＲシグナル伝達の強さが、活性化の後どの時点でどの程度まで細胞が脂肪酸異化作用に依存するかに影響を及ぼすかを反映し得る。ＣＤ１２７の発現は、２つのＴ細胞サブセット間で同等であり、これによって記憶形成に大きな差異がないことが示される（ヒストグラムは示さず）。移入３週後ＰＰＡＲ−αＫＯ及びｗｔドナーマウス由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬ（３〜４試料／群）のＴＣＡ回路及び脂質代謝酵素の異化酵素の転写産物を比較するヒートマップを再検討し（データ示さず）、移入３週間後にレシピエントマウスから採取したｗｔドナーと比較して、ＰＰＡＲαＫＯ由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬは、低酸素状態下でＧａｌ培地中でインビトロで培養したＣＤ８＋Ｔ細胞と類似の転写プロファイルを示す。これは、ＰＰＡＲαＫＯ由来ＣＤ８＋ＴＩＬによるＦＡ異化作用の減少を示す。それらは、多機能性を含む頻度及び機能の低下に付随するＰＤ−１発現のレベルの低下を示す（図７Ｂ、７Ｃ）。集合的に、これらのデータによって、ＦＡ異化作用がＰＤ−１発現を促進するが、代謝ストレスに際してＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能を維持することが確認される。
【０１４４】
実施例６：抗ＰＤ−１による処置は、ＣＤ８＋ＴＩＬＳの代謝または機能を変化させずに腫瘍進行を遅らせる。
臨床試験において、ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のようなチェックポイント阻害剤は、腫瘍の進行を遅延し得る（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。モデルのとおり、ＣＤ８＋ＴＩＬが、ＰＤ−１発現を経時的に増大するので、抗ＰＤ−１ｍＡｂでの処置が代謝または機能に影響を及ぼすか否かを試験した。
【０１４５】
マウスに腫瘍細胞をチャレンジし、３日後にワクチン接種し、ワクチン接種の１０日後に抗ＰＤ−１  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照で処置を開始した。１ヶ月の腫瘍内で、抗ＰＤ−１処置は、分化状態に影響を及ぼさずに（図５Ｂ）、ＰＤ−１の染色を減少させ、ワクチン誘導ＣＤ８＋ＴＩＬの中／上中のｐＡＫｔのレベルを増強する（図５Ａ）（Ｐａｔｓｏｕｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＰＤ−１遮断は、ＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬ（図５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅ）のＦＡまたはＧｌｕ異化作用に劇的に影響を及ぼさず、ワクチン誘導ＣＤ８＋ＴＩＬのエフェクター機能も改善しない（図５Ｆ）。
【０１４６】
ワクチン接種したＣ５７Ｂｌ／６マウス、対、ワクチン接種していないＣ５７Ｂｌ／６マウス、ならびにＴ、Ｂ及びナチュラルキラー細胞を欠くマウスである、免疫不全ＮＳＧマウスの腫瘍増殖のグラフ（図示せず）によって、ＰＤ−１遮断がＣＤ８＋ＴＩＬの機能に影響しないが、腫瘍進行を遅らせ、ただしＴ細胞とは独立していることが示される。これは、ワクチン接種されたマウス、及びワクチン接種されていないかまたはＮＳＧマウスでさえも腫瘍進行を効果的に遅延させ、このことは、ＰＤ−１チェックポイント遮断が、Ｔ細胞非依存的に腫瘍進行を遅延させることを示唆する。
【０１４７】
最近の研究は、抗ＰＤ−１処置が、ＰＤ−１＋黒色腫細胞におけるｍＴＯＲシグナル伝達を減少させることによって腫瘍進行を低減させることを示している（Ｋｌｅｆｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｍＴＯＲシグナル伝達が、Ｔ細胞のＧｌｕ代謝を増大させるので（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、抗ＰＤ−１  ｍＡｂが腫瘍細胞のＧｌｕ代謝を低下させ、それによりそれらの増殖を遅延させるか否かを試験した。３つのモデルすべてにおいて、抗ＰＤ−１処置は、腫瘍の間質液中のＧｌｕ含量を増大させる（図１１Ａ）。抗ＰＤ−１処置の際のＮＳＧマウスのＢ１６ＢｒａｆＶ６００Ｅ腫瘍由来の細胞は、ＴＣＡ回路またはプリン合成経路の代謝産物へのＧｌｕ由来炭素の取り込みを増大させ、このことは、ＰＤ−１遮断が、代謝反応及び同化反応の両方に対して実際にＧｌｕの使用を増大させることを示している（図１１Ｂ、１１Ｃ）。
【０１４８】
抗ＰＤ−１は、おそらくは逆方向シグナル伝達の遮断のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞の非存在下での腫瘍進行の遅延を引き起こす。腫瘍細胞上のＰＤ−１のＰＤＬ１への連結は、アポトーシスまたはＴ細胞媒介性細胞溶解に対するそれらの耐性を増大させる。（図１１Ｄ）。
【０１４９】
まとめると、ＰＤ−１遮断は、おそらくＴ細胞機能を救済することによってがん患者に臨床上の利益をもたらす。本発明者らのモデルでは、ＰＤ−１を低下させる状態、例えば低酸素状態は、Ｔ細胞機能を低下させる；しかし、フェノフィブレートは、ＰＤ−１発現を増大させるが、Ｔ細胞機能の改善をもたらす。ＰＤ−１は、解糖に対するＴ細胞の依存を減少させ、それによってその機能を維持することで、グルコース不足環境において有用であり得る。モデルでは、ＰＤ−１シグナル伝達は、ＣＤ８＋ＴＩＬの代謝にも機能にも大きな影響を及ぼさない。抗ＰＤ−１処置は、Ｔ細胞非依存的な様式で腫瘍の進行を減少し得る。
【０１５０】
代謝再プログラミングをＰＤ−１遮断と組み合わせることは、有用な処置法の一実施形態である。
【０１５１】
実施例７：ＦＡ異化作用に対する依拠の増強は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能維持に必須である
ＦＡ異化作用がＣＤ８＋Ｔ細胞機能に及ぼす影響をさらに評価するために、ＦＡ異化作用を増大するＰＰＡＲαのアゴニストであるフェノフィブラート（ＦＦ）またはミトコンドリアのＦＡＯを減少させる、Ｃｐｔ１の不可逆阻害剤であるエトモキシール（Ｅｔｏ）の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激した。希釈処理した細胞と比較してＧｌｕまたはＧａｌ培地で刺激したインビトロＦＦ処理細胞は、ＦＡ異化作用に関与する因子の転写産物の増強により示されるようにＦＡ異化作用を増大させる（ＰＰＡＲ−α、Ｅｈｈａｄｈ、Ａｃｏｘ１−Ｇｌｕ、Ｃｐｔ１ａ及びＢｄｈ１について強力に増大し、Ｇｌｕについても増大した；Ｅｈｈａｄｈ及びＣｐｔ１ａは強力に増大した−Ｇａｌ及びＰＰＡＲ−αについては増大し、Ａｃｏｘ１及びＢｄｈ−１についても増大した；データは示さず）、そしてＦＡ取り込みを増大した（図１２Ａ）。Ｅｔｏは、ＧｌｕまたはＧａｌ培地のいずれかで刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞によってＯＣＲを減少させる（図１２Ｂ）。ＯＣＲは、ＧａｌとＥｔｏと培養された細胞でより多く減少し、細胞が低酸素状態に曝されるときさらに減少し、ここでもＧｌｕ及びＯ２が制限されている場合に細胞のＦＡＯ依存性が高まることが確認される。低酸素状態下では、ＰＤ−１の発現はＦＦの添加により増大するが、Ｅｔｏの存在下では減少する（図１２Ｃ）。ＦＦは増大し、一方、Ｅｔｏは、Ｇｌｕ及びＯ２へのアクセスの限定下で培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞の機能及び多機能性を減少させる（図１２Ｄ）。これらの結果、増強されたＦＡ異化作用が、代謝的にストレスを受けたＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能を促進するが、ＰＤ−１発現を増大させることが示される。
【０１５２】
ＦＡ異化作用の増大がＣＤ８＋ＴＩＬ機能にどのように影響するかを評価するために、ＣＤ４５＋にコンジェニックなＣＤ９０．２＋マウスをワクチン接種し、ＦＦ（ＣＤ４５．１マウス）または希釈剤（ＣＤ４５．２マウス）で毎日３週間処置した。これらのマウス由来の脾細胞を、２人のドナー由来の１：１比のＴｒｐ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と混合し、腫瘍細胞をチャレンジし、３日後にワクチン接種したＣＤ９０．１＋レシピエントマウスに移入した。ワクチン接種の２日後に細胞を移入した（図６Ａ）。移入の直前に、ドナーマウス由来のＦＦ及び希釈処理されたＴｒｐ−１及びＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＫＬＲＧ１及びＦｏｘＯ１の同等の発現を示し、このことは、ＦＦが記憶形成に影響しないことを示した（図６Ｂ）。ＦＦ処理細胞は、ＰＤ−１及びＴ−ｂｅｔの発現の増大を示し、より高い活性化状態を示唆する。ＦＦ処置は、ワクチン誘導性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度または機能を有意に増強しない（図６Ｃ）。移入前にＦＦ処理された脾臓細胞は、ＯＣＲが増強され、これはＥｔｏによってブロックされており、これによって、ＦＦは、ワクチン誘導性のＣＤ８＋Ｔ細胞がＦＡＯを増強するように条件づけることが示されている（図６Ｄ）。
【０１５３】
ドナー由来のワクチン誘導ＣＤ８＋ＴＩＬを、移入３週間後に分析した（データ示さず）。ドナー由来の希釈剤処理ＴＩＬと比較して、ＦＦ処理ドナー由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬは、ＦＡ異化作用に関与する因子に対する転写産物のレベルの上昇を示す（データ示さず）。Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的なＦＦドナー由来のＣＤ８＋ＴＩＬは両方とも、ＰＤ−１発現の増大傾向を示す（図６Ｅ）。ＦＦ処理したワクチン誘導ＣＤ８＋ＴＩＬのドナー起源の頻度及び機能は、対照のものに比べて有意に高い（図６Ｆ）。ＦＦ−または希釈剤処理したマウス由来の脾細胞を腫瘍保有マウスの別々のコホートに移すと、ＦＦは腫瘍増殖を有意に遅延させる（図６Ｇ）。集合的にこれらのデータによって、増強されたＦＡ異化作用がＣＤ８＋ＴＩＬの抗腫瘍機能を改善することが確認される。
【０１５４】
ＦＦ誘導性ＰＤ−１増大がＦＦ処理ＣＤ８＋ＴＩＬ機能に影響するか否かを試験するために、ワクチン接種したドナーマウスにＦＦまたは希釈剤を３週間毎日与え、その後、別々の腫瘍保有マウスへの移入の際に、レシピエントを抗ＰＤ−１またはアイソタイプ対照抗体で処置した（図６Ｈ）。ドナーのＦＦ処置及びレシピエントの抗ＰＤ−１処置の両方とも、腫瘍進行を強力に遅延させる（図６Ｉ）。さらに、それらは相乗的に作用し、ワクチン接種したマウスの３０％超で腫瘍の成長を一緒になって完全に防止する（図６Ｉ及び図示せず）。抗ＰＤ−１処置は、ドナー細胞上のＰＤ−１染色を減少させ、これはＦＦによって影響されない（図６Ｊ）。これは、いずれかのセットのドナーマウスから誘導されたＭＡＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度及び機能に微妙な影響しか及ぼさない（データ示さず）。ＰＤ−１遮断は、ＦＦ処置ドナー由来の単機能性Ｅ７特異的ＣＤ８＋ＴＩＬの頻度を有意に増大させる。この効果は、ＭＡＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬのものよりもバイスタンダーＴ細胞機能をより容易に救済し得る、α−ＰＤ−１処置マウスのより小さな腫瘍サイズを部分的に反映し得る。
【０１５５】
ＦＡ異化作用がＣＤ８＋ＴＩＬの機能にどのように影響するかをさらに研究するために、ＰＰＡＲαＫＯマウスのＣＤ８＋Ｔ細胞をインビトロで刺激し、それらを野生型（ｗｔ）マウス由来の細胞と比較した。Ｇｌｕ培地中でかつ低酸素状態下で刺激した場合、ＴＣＡ回路及び脂質代謝に関与するほとんどの因子の転写物（例えば、ＩＤＨ３ａ、ＭＤＨ２、ｓｌｃ２７ａ２、ｓｌｃ２７ａ４、ＬＩＰＡ、Ａｃａａ１ａ、Ａｃｏｘ１、Ｃｐｔ１ａ及びＡｃａｄｖ１）は、ｗｔ  ＣＤ８＋に比較して、ＰＰＡＲαＫＯが高い；このプロファイルは、Ｇａｌ培地中及び低Ｏ２で培養された細胞において逆転し、これによってＰＰＡＲα不活性化がＧｌｕなしで培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞によるＦＡ異化作用を有意に減少させることが示唆される（データは示さず）。ｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較したＰＰＡＲαＫＯは、Ｏ２レベルにかかわらずＧａｌ培地で培養した場合、より低いレベルのＰＤ−１を発現する（図１３Ａ）。それらの機能及び多機能性は、Ｇａｌ培地中で培養された
ｗｔ  ＣＤ８＋Ｔ細胞のものと比較して有意に低く（図１３Ｂ）、このことは、ＦＡ異化作用が、Ｇｌｕへのアクセス限定下で活性化されるＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能を維持することが必要であることを示唆している。
【０１５６】
本発明者らは、ＰＰＡＲαＫＯ及びｗｔマウス由来の脾細胞をワクチン接種の３週間後に収集し、２つのドナー由来のＴｒｐ−１特異的ＣＤ８＋細胞の１：１比で混合し、腫瘍を保有しワクチン接種したレシピエントマウスに同時移入した養子移入システムにおいて、ワクチン誘導性ＴＩＬ機能に対するＰＰＡＲα不活性化の効果を調査した（図７Ａ）。移入する前に、ＭＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能及び多機能性は、２つの群間で類似していたが、ＰＰＡＲαＫＯマウスではＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞があまり豊富でなく多機能性であった（データは示さず）。この相違は、Ｅ７エピトープに対してより低いＴ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達の強度が、活性化後どの時点で細胞がＦＡ異化作用に切り替わるかに影響を及ぼすかを反映し得る。ＣＤ１２７の発現は、２つのＴ細胞サブセット間で匹敵するものであり、記憶形成に大きな差異がないことを示している（図７Ｃ）。ＰＰＡＲαＫＯ由来のＣＤ４４＋ＣＤ８＋ＴＩＬは、移入３週後にレシピエントマウスから収集したｗｔドナーと比較して、低酸素状態下でＧａｌ培地中でインビトロで培養されたＰＰＡＲαＫＯ  ＣＤ８＋Ｔ細胞と同様の転写プロファイルを示し、このことは、ＰＰＡＲαＫＯ  ＣＤ８＋ＴＩＬによるＦＡ異化作用の減少を示している（図は示さず；ただしＩＤＨ３ａ、ＭＤＨ２、ｓｌｃ２７ａ２、ｓｌｃ２７ａ４、ＬＩＰＡ、Ａｃａａ１ａ、Ａｃｏｘ１、Ｃｐｔ１ａ、Ａｃａｄｖ１の発現は、ＰＰＡＲ−αＫＯマウス由来のＴ細胞においては、野生型と比較して減少した）。Ｔｒｐ−１及びＥ７特異的ＰＰＡＲαＫＯ  ＣＤ８＋ＴＩＬの両方とも、ドナー由来のｗｔ  ＣＤ８＋ＴＩＬのものと比較して、頻度及び多機能性を含む機能の低下と同時に、ＰＤ−１発現のレベルの低下を示す（図７Ｂ及び図７Ｃ）。まとめると、これらのデータによって、ＦＡ異化作用が、ＰＤ−１発現レベルにかかわらず代謝的にチャレンジングな条件下でＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能を維持することが確認される。
【０１５７】
実施例８：がんの治療における前処理したＴ細胞の有用性
本発明者らは、ＯＴ−１細胞のインビトロ刺激中のフェノフィブラート処理が、Ｔ細胞代謝の代謝切り替えを引き起こすことを示した（図１５Ａ〜１７Ｅ）。ＯＴ−１マウス由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＶＡ由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ配列番号１を認識するＴＣＲを有する。例えば、Ｃｌａｒｋｅ、ＳＲ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＣＲ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅ  ＯＴ−Ｉ：ＭＨＣ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７８（２）：１１０−１１７を参照のこと。したがって、ＯＴ−１細胞は、腫瘍特異抗原ではなく、任意の抗原、この場合はＯＶＡ由来ペプチドで刺激することができるＴ細胞の良好なモデルである。
【０１５８】
インビボでの腫瘍増殖に対する、エネルギー産生のためにグルコースではなく脂肪酸異化作用の使用を促進する化合物または試薬、すなわち、フェノフィブラートを用いてインビトロで前処理されたＴ細胞またはＴ細胞集団の効果を評価するために、以下の実験を実施した。
【０１５９】
マウスに、卵白アルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）の免疫優性エピトープを発現するように形質導入された１０５Ｂ１６．Ｆ１０黒色腫細胞を注射した。５日後、マウスには、いかのいずれか、
（ａ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ナイーブＯＴ−１移入）のトランスジェニックＴ細胞受容体を発現する未処理のＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｉ．ｖ．）、
（ｂ）ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでインビトロで刺激／活性化され、希釈剤（Ｃｔｒｌ
処理ＯＴ−１）で前処理されたＯＴ−１細胞、または
（ｃ）ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでインビトロで刺激／活性化され、２５μＭのフェノフィブレート（ＦＦ）で前処理されたＯＴ−１細胞を与えた。
【０１６０】
マウスモデルにおける腫瘍増殖を最大２４日間モニターした。その結果を図１６のグラフに示しており、ここでは、ＦＦ−前処理された活性化Ｔ細胞で処置したマウスにおける腫瘍の増殖が、ナイーブな非活性化ＯＴ−１細胞または活性化された対照処置Ｔ細胞における応答と比較して阻害されたことが示される。
【０１６１】
したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞などのような前処理された活性化Ｔ細胞集団は、その代謝機能を切り替えることが可能で、腫瘍を有する対象に投与すると、腫瘍増殖を抑制するように働く。そのような効果は、前処置したＴ細胞のみを、すなわち腫瘍抗原特異的ワクチンのような他の抗癌免疫療法剤なしで投与することによって達成され得る。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、代謝機能を切り替えるために前処置されたＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた養子Ｔ細胞移入治療処置において有用であり、がん患者の処置の強化をもたらす。
【０１６２】
要約すると、本明細書中に提示されるデータは、代謝がＴ細胞分化及びエフェクター機能に深く影響を及ぼすことを実証する。ＴＭＥ  ＣＤ８＋Ｔ細胞内では、低酸素状態を経験し、腫瘍細胞が解糖を促進するために消費する栄養素、特にＧｌｕと競合しなければならない。細胞は、ＦＡのような代替栄養素を用いて、解糖からＯＸＰＨＯＳに切り替えることによってＧｌｕの欠如を補い得る。最近の研究では、ＴＭＥ内の低血糖がＣＤ８＋Ｔ細胞機能を損ない、能動免疫療法の有効性を低下させることが報告されている（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ここで示される結果により、ＴＭＥ内の代謝チャレンジが、バイスタンダーＴＩＬを含むＣＤ８＋ＴＩＬの性能を損なうが、ＴＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬはより影響を受ける傾向があることが示される。これは、ＴＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬが、それらの増殖によって証明されるように、ＴＭＥ内で刺激シグナルを受け取り続けることを反映する。さらに、栄養素やＯ２が特に制限されている腫瘍に深く浸透する可能性がある。
【０１６３】
固形腫瘍は、ＴＭＥの細胞内のＨＩＦ−１α経路を活性化する低酸素領域に発症する。ＨＩＦ−１α発現はまた、Ｔ細胞活性化の際に上昇する２０。この研究では、ＨＩＦ−１αはＭＡＡ特異的及びバイスタンダーＣＤ８＋ＴＩＬの両方で増大し、低酸素状態を根本原因として指摘している。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する低酸素状態の効果は、議論の余地がある。いくつかの研究では、Ｏ２がＴ細胞エフェクター機能に必要であることが示されている２８、３０。休止期にＣＤ８＋Ｔ細胞を低酸素状態に曝したプロトコールを使用している他の研究者らは、低酸素状態が機能を増大させると報告している１０、１１。このデータは、前者と一致している。なぜなら、前者では、減少したＨＩＦ−１αシグナル伝達がＣＤ８＋ＴＩＬの頻度及び機能を改善することを示しており、これによって、Ｇｌｕが限定的である場合、解糖を促進し、ＨＩＦ−１αにより、ＯＸＰＨＯＳを阻害することが、ＣＤ８＋ＴＩＬに有害となることが示されるからである。ＬＡＧ−３（このデータによれば、ＨＩＦ−１αによって調節される）は、Ｔ細胞の増殖及びエフェクター機能を阻害する（Ｇｒｏｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＬＡＧ−３遺伝子座は、低酸素状態下でのＬＡＧ−３発現に影響を及ぼす可能性のあるいくつかのＨＩＦ−１α応答エレメント（［Ａ／Ｇ］ＣＧＴＡ、（Ｐｅｓｃａｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を有する。低酸素状態がインビトロで活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター機能を弱め、ＣＤ８＋ＴＩＬの減少したＨＩＦ−１αシグナル伝達は、それらの頻度及び機能を改善することを示す。後者は、ＧｌｕがＴＭＥ内に限定される場合、ＨＩＦ−１αによる解糖の促進及びＯＸＰＨＯＳの阻害が有害になることを反映する可能性が高い。ＬＡＧ−３（データによればＨＩＦ−１αによって調節される）は、Ｔ細胞増殖及びエフェクター機能を阻害する１２。Ｌ
ＡＧ−３遺伝子座の配列の分析によって、ＬＡＧ−３発現に影響し得る、いくつかのＨＩＦ−１α応答エレメント（［Ａ／Ｇ］ＣＧＴＡ）が明らかになる２７。
【０１６４】
低酸素状態と低血糖は、反対の代謝シグナルを送る。低酸素状態は解糖を促進し、一方で、低血糖は細胞にＯＸＰＨＯＳを使用させ、ＯＸＰＨＯＳは様々な栄養素によって供給されるがＯ２を必要とする。がん細胞は、新生の脂肪生合成を増大させ２１、脂肪前駆細胞を補充する３９。したがって、このモデルでは、遊離ＦＡ種の量は、腫瘍進行中に増大する。このデータは、ＣＤ８＋ＴＩＬが、ＦＡ取り込み及びＦＡ異化作用を増強して、ＯＸＰＨＯＳを通じてエネルギーを獲得することによってＧｌｕ及びＯ２の欠如に対処することを示す。しかし、この代謝切り替えを用いても、ＣＤ８＋ＴＩＬは機能低下を示し、これは、ＦＦによる脂質代謝をさらに促進することによって改善され得る。
【０１６５】
ＰＤ−１の高発現は、ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇及びエフェクター機能の喪失をシグナル伝達すると考えられる。この結果によって、高ＰＤ−１発現が、障害されたＴ細胞機能と必ずしも関連しているとは限らないことが示唆される。活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞が低酸素状態に曝露されると、その減少したＰＤ−１発現は機能障害を伴う。対照的に、ＦＦ処理ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１発現の増大傾向を示すが、その機能はＰＤ−１シグナル伝達を改善し、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のＴＣＲ及びＣＤ２８媒介活性化を阻害し、これが次に解糖を低下し（Ｐａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、脂肪分解及びＦＡＯを促進する（Ｐａｔｓｏｕｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本発明者らは、ＣＤ８＋ＴＩＬにおける増強されたＰＤ−１シグナル伝達は、Ｇｌｕの乏しいＴＭＥ内で代謝切り替えを促進することによって有益であると推測している。このモデルでは、Ｔ細胞活性化の初期段階後のＰＤ−１の遮断は、腫瘍内の全体的なＧｌｕ濃度は増大するが、ＴＩＬの機能にも代謝にも影響を及ぼさない。これらの結果は、最初の活性化の間に抗ＰＤ−１で処置されたＣＤ８＋ＴＩＬによる解糖及びＩＦＮ−γ産生の改善を報告する、マウス肉腫モデルにおける最近の研究の結果とは異なる（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。これらの明らかに反対の結果は、ワクチン接種または腫瘍由来抗原による刺激によって誘導された腫瘍モデルまたはＴ細胞における本質的な差異を反映する。あるいは、処置のタイミングの違いが結果に影響を与える可能性がある。Ｔ細胞活性化の初期段階中のＰＤ−１遮断は、それらがＴＭＥ内のＧｌｕに対してよりよく競合することを可能にし得る；一旦、ＴＩＬがＦＡ異化作用に切り替わると、それらは、ＰＤ−１シグナル伝達にかかわらず、この経路に方向付けられたままとなる。
【０１６６】
抗ＰＤ−１処置は、モデルにおける腫瘍の進行を遅らせる。いくつかのデータによって、抗ＰＤ−１がＭＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を促進し得ることが示唆される（図示せず）。しかし、抗ＰＤ−１処置はまた、免疫不全マウスにおける腫瘍進行を遅延させるので、本発明者らは、抗ＰＤ−１処置が直接、ＴＭＥ内の腫瘍細胞、腫瘍間質細胞または免疫抑制細胞に作用すると仮定する。最近の研究では、抗ＰＤ−１が、ｍＴＯＲシグナル伝達を遮断することによりＰＤ−１＋腫瘍細胞の増殖を低減し得ることが示唆されている（Ｋｌｅｆｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＰＤ−１遮断のこの作用様式は、ＰＤ−１＋腫瘍細胞にのみ影響する。インビボで増殖した腫瘍から単離された黒色腫細胞は、非常に低いレベルのＰＤ−１を発現するので（データは示さず）；それらがＰＤ−１遮断によって直接的に影響されるとは考えにくい。免疫抑制性細胞は、高レベルのＰＤ−１（示さず）を発現し、ＰＤ−１遮断は腫瘍形成を促進する能力を損なう可能性がある（Ｍａｒｖｅｌ  ａｎｄ  Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、２０１５）。黒色腫細胞は、ＰＤ−Ｌ１（示さず）を発現し、このリガンドを通じたバックシグナル伝達は、ＦａｓまたはＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗性を増大させる（Ａｚｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。したがって、抗ＰＤ−１処置は、アポトーシスに対する感受性を増強することによって腫瘍細胞死を促進し得るか、または免疫適格性マウスにおいて、腫瘍細胞の溶菌酵素感受性を増大させることによって間接的にＴＩＬ機能を改善し得る
。いずれの機構も腫瘍増殖を遅延させ、それによって、ＴＭＥ内のＧｌｕレベルを高める可能性がある。追加のＧｌｕは、腫瘍細胞の増殖を促進することができるが、これはそれらの死亡率の増大により相殺され得る。
【０１６７】
解糖ではなくＦＡＯによるエネルギー生産は、相当な犠牲を払って行われる；同等の量のＡＴＰを生成するためにはより多くのＯ２が必要であり、ＲＯＳ産生が増大する。したがって、低酸素ＴＭＥ内でＦＡＯを通じてエネルギーを生成することは、ＣＤ８＋ＴＩＬがその機能を維持する唯一の方法ではない可能性がある。ケトン体は、Ｏ２が少なくても済む高効率燃料であり（Ｖｅｅｃｈ、２００４）、これまでの研究では、低酸素状態及び低血糖に曝された神経系細胞の好ましいエネルギー源として役立つことが示された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１６８】
ケトン体は、他の細胞（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｕｔｓｃｈｏｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）によって合成及び分泌される場合もあるし、またはケトン体代謝の重要な酵素であるＢｄｈ１の転写産物レベルの増大によって示唆されるように、ＴＩＬによって直接産生される場合もある。このデータによって、ＣＤ８＋ＴＩＬが、腫瘍進行の間、ケトン体アセトアセテート及び３−ヒドロキシブチラートの強度の顕著な増大を示すことが示される。さらに、Ｏ２レベルは腫瘍内で異なり、ＴＩＬは、ＴＭＥ内でランダムに移動する（Ｍｒａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＴＩＬは、エフェクター機能を維持し、それらの生存を拡大するために、周囲のＯ２レベルに応じてＦＡＯ及びケトン体を交互に使用し得る。
【０１６９】
この結果で示唆されるとおり、養子細胞移入の前にＦＡ異化作用を通じてエネルギー産生を増大するＣＤ８＋Ｔ細胞の代謝再プログラミングは、一部のタイプのがん、特に黒色腫のような低Ｇｌｕ含量を特徴とするがんを有する患者の細胞療法の全体的な有効性を高める。同調して、他の研究では、エネルギー産物のためにＦＡＯ及びＯＸＰＨＯＳを好む記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞が、エフェクター細胞よりも腫瘍進行を遅くする点で優れていることが示される（Ｃｒｏｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｓｕｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。対照的に、他の研究者らはＴＩＬの解糖系利用能を高めることで、それらの抗腫瘍効果が向上すると報告している（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。いずれの代謝操作が、ＴＩＬ媒介性の腫瘍の退縮を改善するために最も適切になるかは、その腫瘍の性質に依存する可能性が高い。十分なレベルのＧｌｕを含む腫瘍は、高解糖能を有するＣＤ８＋Ｔ細胞から恩恵を受ける可能性があるが、低血糖ＴＭＥを有する腫瘍は、ＦＡ異化作用を好むＣＤ８＋Ｔ細胞によって最もよく闘うことができる。
【０１７０】
本明細書の結果により、ＴＭＥ内の代謝障害が、ＣＤ８＋ＴＩＬに重大な影響を及ぼしていることが示される。これは、ケトン体（部分的にＣＤ８＋ＴＩＬの機能を維持し、それらの生存を改善し得る）の消費を含めて、ＦＡ異化作用を通じてＣＤ８＋ＴＩＬがますますエネルギーを獲得するよう強制する。ＰＤ−１シグナル伝達遮断と組合せてＣＤ８＋ＴＩＬがＦＡＯを使用する傾向を促進することにより、処置の転帰はさらに改善する。これらの結果、現在の治療戦略に代謝操作を加えることにより、がん免疫療法の転帰が改善できるか否かを評価するためのさらなる検討が招かれる。
【０１７１】
データによって、高ＰＤ−１発現が、障害されたＴ細胞機能に必然的に関連しているわけではないことが示唆されている。ＰＤ−１は、ｍＴＯＲ経路のＴ細胞受容体及びＣＤ２８媒介性の活性化を阻害し、それによって次には解糖が減少し２４、脂肪分解及び脂肪酸異化作用が促進される２５。ＰＤ−１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞をそれらの代謝に調節するように指向させる、環境的合図によって調節され得る。Ｇｌｕが利用可能な低酸素状態下では、解糖は、ＰＤ−１発現の減少を必要とするＯ２非依存性エネルギーの容易な供給源を提供する。Ｇｌｕ及びＯ２が制限的である場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１発現を増大さ
せ、これがＦＡ代謝を促進する。
【０１７２】
結果によって支持されるとおり、養子細胞移入の前にＦＡ異化作用を通じてエネルギー産生を増大させるＣＤ８＋Ｔ細胞の代謝再プログラミングは、一部のタイプのがん、特に黒色腫のような低Ｇｌｕ含量を特徴とするいくつかの種類のがんを有する患者の細胞療法の全体的な有効性を高める。同調して、他の研究では、エネルギー産生のために脂肪酸異化作用及びＯＸＰＨＯＳを好む記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞が、エフェクター細胞よりも腫瘍進行を遅くすることに優れていることが示されている３１、８。対照的に、他の研究者らは、ＴＩＬの解糖使用能力を増大することは抗腫瘍効果を改善すると報告してる６。いずれの代謝操作がＴＩＬ媒介性腫瘍退縮を改善するのために最も適しているかは、腫瘍の性質に依存する。十分なレベルのＧｌｕを有する腫瘍は、高解糖能を有するＣＤ８＋Ｔ細胞から恩恵を受ける場合があるが、低血糖ＴＭＥを有する腫瘍は、ＦＡ異化作用を好むＣＤ８＋Ｔ細胞によって最もよく闘うことができる。
【０１７３】
したがって、本発明者らは、ＴＭＥ内の代謝ストレスがＣＤ８＋ＴＩＬに大きな影響を有することを示した。これは、ケトン体（ＣＤ８＋ＴＩＬの機能を維持し、それらの生存を改善し得る）の消費を含めて、ＦＡ異化作用を通じてＣＤ８＋ＴＩＬがますますエネルギーを獲得するよう強制する。したがって、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡ代謝を増強することにより、黒色腫などのがんの能動免疫療法の有効性が増大する。免疫療法の転帰は、代謝操作によって改善され得る。
【０１７４】
本発明者らは、抗ＰＤ−１ｍＡｂでの処置が、ＣＤ８＋ＴＩＬの代謝または機能を変化させることなく腫瘍の進行を遅らせることを確認した。抗ＰＤ−１による処置は、Ｔ、Ｂ及びナチュラルキラー細胞を欠く、ワクチン接種された、及びワクチン接種されていない、または免疫不全のＮＳＧマウスでも腫瘍進行を効果的に遅延させ、これによって、ＰＤ−１チェックポイント遮断が、Ｔ細胞非依存性の方式で腫瘍進行を遅延することが示唆される。
【０１７５】
抗ＰＤ−１処置は、優れた抗腫瘍効果を達成するために、ＴＩＬの代謝再プログラミングと相乗的に作用する。ドナーのフェノフィブラート処置（ＦＡ異化作用を増大させるＰＰＡＲ−アルファのＦＦ−アゴニスト）及びレシピエントの抗ＰＤ−１処置は両方とも、腫瘍の進行を強力に遅延させ、一緒になって相乗的に作用して、ワクチン接種したマウスの３０％を超える腫瘍増殖を完全に防止する（図６Ｉ〜図６Ｊ）。
【０１７６】
ＦＡ異化作用は、複数の機構を通じてＴ細胞機能を改善する：エネルギー生産に寄与する。アミノ酸合成及びエフェクター分子の産生に寄与する。サイトゾル中のアセチル−ＣｏＡプールに寄与し、ＧＡＰＤＨをアセチル化し、ＩＦＮ−γ翻訳を増強する。このデータにより、ＴＭＥ内の代謝的制約に最適に対処するために腫瘍関連特異的Ｔ細胞を条件付ける代謝操作が、がん治療の全体的な有効性を有意に改善し得ることが実証される。
【０１７７】
表３
（配列リストフリーテキスト）
以下の情報が、数字の識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列に対して、提供される。
【表３−１】
2019504071.tif 000006
【表３−２】
2019504071.tif 000007
それぞれが、２０１６年１月１５日、２０１６年１１月９日、及び２０１６年１１月１０日に出願された、優先権のある米国仮特許出願第６２／２７９２５２号、第６２／４１９７７５号及び第６２／４２０２７１号を含む、各々のかつあらゆる特許、特許出願、ならびにその開示全体を通じて引用され、本明細書に列挙されたウェブサイトを含む、各々のかつあらゆる刊行物、ならびにこの出願に伴う配列表は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態及びバリエーションが当業者によって考案されることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態及び等価なバリエーションを包含する。
引用文献
１．Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ
ｔｕｍｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＰＤ−１  ａｎｄ  ａｒｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｉｍｐａｉｒｅｄ．Ｂｌｏｏｄ  １１４：１５３７−１５４４．
２．Ｂａｉｌｅｙ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ
ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒｓ．Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５，６３−１０７．
３．Ｂａｉｔｓｃｈ，Ｌ．（２０１１）．Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：２３５０−６０．
４．Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６，２４５５−２４６５．
５．Ｂｕｃｋｓ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｌｏｎｅ  ｉｓ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｄｒｉｖｅ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２，６６９７−６７０８．
６．Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｉｓ  
ａ  Ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．１６２，１２２９−４１．
７．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｒａｐｉｄ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｕｌｋｙ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｏｎｅ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２，２０７３−２０７４．
８．Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｏｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．７５，２９６−３０５．
９．Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，Ａ．Ｇ．（２０１１）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｗｈｙ  ｓｏ  ｆｅｗ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｒｅｆｌｅｃｔ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｏｐｔｉｍｉｓｍ  ｏｆ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２９：８５０１−８５０５．
１０．Ｄｏｅｄｅｎｓ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ＣＤ８（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１１７３−８２．
１１．Ｆｉｎｌａｙ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ＰＤＫ１  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ  １
ｉｎｔｅｇｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９，２４４１−２４５３．
１２．Ｇｒｏｓｓｏ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．ＬＡＧ−３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｅｌｆ−ａｎｄ  ｔｕｏｒ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７，３３８３−３３９２．１３．Ｈａｍａｎａｋａ，Ｒ．Ｂ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｄｅｌ，Ｎ．Ｓ．（２０１２）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０９，２１１−２１５．
１４．Ｈｏ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ  ｉｓ  ａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｃｅｌｌ．１６２；１２１７−２８．
１５．Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４，２０５−２１２．
１６．Ｌｏｃｈｎｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（２０１５）．Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４７２−４７８．
１７．Ｌｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｉａ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａ  ｓｔａｎｄ  ａｌｏｎｅ  ｏｒｂｉｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８２，３２１２−２１．
１８．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｏｕｔｓｃｈｏｏｒｎ，Ｕ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ（２０１２）．Ｋｅｔｏｎｅ  ｂｏｄｙ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．１１，３９６４−７１．
１９．Ｍａｚｚｏｎｅ，Ｍ．（２０１４）．Ｔｕｍｏｒ  ｓｔｒｏｍａ：ａ  ｃｏｍｐｌ
ｅｘｉｔｙ  ｄｉｃｔａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３３，１７４３−１７５４．
２０．ＭｃＮａｍｅｅ，Ｅ．Ｎ．（２０１３）．Ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．５５，５８−７０．
２１．Ｍｅｎｄｅｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｕｐｕ，Ｒ．（２００７）．Ｆａｔｔｙ
ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．７，７６３−７７７．
２２．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｎ．ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ，Ｒ．（２００９）．  Ｈｉｇｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６，８６２３−８６２８．
２３．Ｐａｌｍｅｒ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，１−６．
２４．Ｐａｒｒｙ，Ｒ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．ＣＴＬＡ−４  ａｎｄ  ＰＤ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９５４３−５３．
２５．Ｐａｔｓｏｕｋｉｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ＰＤ−１  ａｌｔｅｒｓ
Ｔ−ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ
ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，６６９２．
２６．Ｐｅａｒｃｅ，Ｅ．Ｌ．（２０１３）．Ｆｕｅｌｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４２；１２４２４５４．
２７．Ｐｅｓｃａｄｏｒ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｇｌ  ｎｉｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ３（ｅｇｌｎ３／ｐｈｄ３）ｇｅｎｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９０，１８９−１９７．
２８．Ｓｃｈｌｉｅ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｗｈｅｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｕｆｆｏｃａｔｅ：Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｕｎｄｅｒ  Ｌｏｗ  Ｏｘｙｇｅｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１１，４７０５９７−１３．
２９．Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（２０１５）．Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｏｗａｒｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｃｅｌｌ．１６１，２０５−２１４．
３０．Ｓｉｓｋａ，Ｐ．Ｊ．ａｎｄ  Ｒａｔｈｍｅｌｌ，Ｊ．Ｃ．（２０１５）Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｉｔｎｅｓｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，２５７−６４．
３１．Ｓｕｋｕｍａｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，４４７９−８８．
３２．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｓｔｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｈｙｐｏｘｉａ  ａｎｄ  ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ．ＡＳＮ．Ｎｅｕｒｏ．６，５．
３３．Ｖｅｅｃｈ，Ｒ．Ｌ．（２００４）．  Ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｋｅｔｏｎｅ  ｂｏｄｉｅｓ：ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｋｅｔｏｎｅ  ｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｋｅｔｏｓｉｓ，ｋｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｅｔ，ｒｅｄｏｘ  ｓｔａｔｅｓ，ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ．Ｌｅｕｋｏｔ．Ｅｓｓｅｎｔ．Ｆａｔｔｙ．Ａｃｉｄｓ．７０，３０９−１９
３４．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．（２０１２）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，９０７−９１５．
３５．Ｗａｒｂｕｒｇ，Ｏ．，Ｏｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．（１９５６）．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４，２６９−７０．
３６．Ｗｈｅｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．（２０１１）．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４９２−４９９．
３７．Ｗｉｉｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８４，Ｈ４１６−２４．
３８．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｃ．（２０１３）．Ｔｈｅ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃｓ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．３１，２０９−２１９．
３９．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｔｒｏｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ
ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｐｅｒｉｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｏｐｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２，５１９８−２０８．
４０．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２０１４）．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｏｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ−ｄｒｉｖｅｎ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３：１８３６−１８４６．
４１．Ｋａｌｏｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｈａｖｅ  ｐｏｔｅｎｔ    ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃａｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  Ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ
Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ．      Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，３（９５）：７３
４２．Ａｚｕｍａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｂ７−Ｈ１  ｉｓ  ａ  ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，３６３５−３６４３
４３．Ｋｌｅｆｆｅｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌ−Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ＰＤ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ．Ｃｅｌｌ  １６２，１２４２−１２５６．
４４．Ｌａｒｋｉｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１５．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ａｎｄ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｏｒ  Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｕｎｔ
ｒｅａｔｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３，２３−３４．
４５．Ｍａｒｖｅｌ，Ｄ．，Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，Ｄ．Ｉ．，２０１５．Ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ
ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２５，３３５６−３３６４．
４６．Ｍｒａｓｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６．Ｒａｎｄｏｍ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
ｐｒｅｃｅｄｅｓ  ｓｔａｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０３，２７４９−２７６１．
４７．Ｏｈｔａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ−ｐｏｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，２７．
４８．Ｐａｔｓｏｕｋｉｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ，２０１３．ＰＤ−１  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ＰＴＥＮ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｈｉｌｅ  ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ  ＰＴＥＮ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｃａｓｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３３，３０９１−３０９８．
４９．Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｅｒｓｉｓｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１０，１９１６−１９２３．
５０．Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，２０１２．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３，１６７
５１．Ｚｏｕ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１６．ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）ａｎｄ  ＰＤ−１  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ，ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ８，３２８ｒｖ４−３２８ｒｖ４．
５２．Ｃｌａｒｋｅ，ＳＲ  ｅｔ  ａｌ，２０００  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＣＲ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅ  ＯＴ−Ｉ：ＭＨＣ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，７８（２）：１１０−１１７
【図１−１】
2019504071.tif 000008
【図１−２】
2019504071.tif 000009
【図２−１】
2019504071.tif 000010
【図２−２】
2019504071.tif 000011
【図３−１】
2019504071.tif 000012
【図３−２】
2019504071.tif 000013
【図４−１】
2019504071.tif 000014
【図４−２】
2019504071.tif 000015
【図４−３】
2019504071.tif 000016
【図４−４】
2019504071.tif 000017
【図４−５】
2019504071.tif 000018
【図５−１】
2019504071.tif 000019
【図５−２】
2019504071.tif 000020
【図５−３】
2019504071.tif 000021
【図６−１】
2019504071.tif 000022
【図６−２】
2019504071.tif 000023
【図６−３】
2019504071.tif 000024
【図６−４】
2019504071.tif 000025
【図６−５】
2019504071.tif 000026
【図７−１】
2019504071.tif 000027
【図７−２】
2019504071.tif 000028
【図８−１】
2019504071.tif 000029
【図８−２】
2019504071.tif 000030
【図８−３】
2019504071.tif 000031
【図８−４】
2019504071.tif 000032
【図８−５】
2019504071.tif 000033
【図９−１】
2019504071.tif 000034
【図９−２】
2019504071.tif 000035
【図９−３】
2019504071.tif 000036
【図１０−１】
2019504071.tif 000037
【図１０−２】
2019504071.tif 000038
【図１０−３】
2019504071.tif 000039
【図１１−１】
2019504071.tif 000040
【図１１−２】
2019504071.tif 000041
【図１１−３】
2019504071.tif 000042
【図１１−４】
2019504071.tif 000043
【図１２−１】
2019504071.tif 000044
【図１２−２】
2019504071.tif 000045
【図１３】
2019504071.tif 000046
【図１４−１】
2019504071.tif 000047
【図１４−２】
2019504071.tif 000048
【図１５−１】
2019504071.tif 000049
【図１５−２】
2019504071.tif 000050
【図１５−３】
2019504071.tif 000051
【図１６】
2019504071.tif 000052
【配列表】
2019504071000001.app
【国際調査報告】
2019504071.tif 000053
2019504071.tif 000054
2019504071.tif 000055
2019504071.tif 000056