(57)【要約】ＭＥＮＡ及びＭＥＮＡアイソフォームのリン酸化及び脱リン酸化は、がん細胞の転移活性を制御する。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の投与は、樹立された腫瘍及び発生中の腫瘍におけるがん転移の発生の有意な減少をもたらす。チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせたＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の投与は、チロシンキナーゼ阻害剤療法の有効性を高める。抗微小管剤と組み合わせたＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の投与は、化学療法誘発性腫瘍細胞播種の有意な減少をもたらし、抗微小管療法の有効性を高める。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＮＡアイソフォーム基質上のセリン、スレオニン、及び／またはチロシン残基におけるリン酸の転移を阻害するためのＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を含む、治療を必要とするがん患者において、ＭＥＮＡアイソフォームの活性を低下させるための医薬。
【請求項２】
前記ＭＥＮＡアイソフォーム基質が、ＭＥＮＡタンパク質（配列番号１）である、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号１のＳｅｒ２、  Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４９、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｔｈｒ４６７、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｔｈｒ５１７、Ｓｅｒ５２０、Ｓｅｒ５２３、Ｔｙｒ５３４、Ｓｅｒ５５０、Ｓｅｒ５６５、Ｓｅｒ５６７、またはＴｈｒ５６９の群から選択される１つまたは複数のアミノ酸のリン酸化を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項４】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号１のＳｅｒ１２５へのリン酸の転移を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項５】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号１のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４９、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｔｈｒ４６７、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｔｈｒ５１７、Ｓｅｒ５２０、Ｓｅｒ５２３、Ｔｙｒ５３４、Ｓｅｒ５５０、Ｓｅｒ５６５、Ｓｅｒ５６７、またはＴｈｒ５６９の群から選択されるリン酸化アミノ酸の脱リン酸化を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項６】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号１のＳｅｒ１２５からのリン酸の転移を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項７】
前記ＭＥＮＡアイソフォーム基質が、ＭＥＮＡＩＮＶタンパク質（配列番号３）である、請求項１に記載の医薬。
【請求項８】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号３のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｓｅｒ１１９、Ｔｈｒ１２２、Ｔｈｒ１２４、Ｓｅｒ１２７、Ｔｈｒ１２８、Ｔｈｒ１３８、Ｓｅｒ１４４、Ｓｅｒ１５５、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ３０６、Ｔｈｒ２９４、Ｓｅｒ３０３、Ｓｅｒ３０４、Ｓｅｒ３０６、Ｓｅｒ１３４、Ｔｈｒ３１９、Ｓｅｒ３２１、Ｓｅｒ３４６、Ｓｅｒ３６３、Ｔｈｒ３６４、Ｓｅｒ３９４、Ｓｅｒ４００、Ｓｅｒ４０２、Ｓｅｒ４０９、Ｓｅｒ４２４、Ｔｈｒ４２９、Ｓｅｒ４３０、Ｓｅｒ４３３、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４５、Ｔｈｒ４４７、Ｔｈｒ４４９、Ｓｅｒ４６１、Ｓｅｒ４６８、Ｓｅｒ４８２、Ｔｈｒ４８３、Ｔｈｒ４８６、Ｓｅｒ４９６、Ｔｈｒ５００、Ｓｅｒ５０１、Ｓｅｒ５０４、Ｓｅｒ５０５、Ｔｈｒ５０６、Ｓｅｒ５０７、Ｔｈｒ５０８、Ｔｈｒ５１２、Ｔｈｒ５１９、Ｔｈｒ５２１、Ｓｅｒ５２５、Ｓｅｒ５２７、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３５、Ｔｈｒ５３６、Ｓｅｒ５３９、Ｓｅｒ５４２、Ｔｈｒ５４８、Ｔｙｒ５５３、Ｔｈｒ５６９、ｓｅｒ５８４、Ｓｅｒ５８６、またはＴｈｒ５８８の群から選択されるアミノ酸のリン酸化を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項９】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号３のＳｅｒ１４４へのリン酸の転移を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１０】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号３のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｓｅｒ１１９、Ｔｈｒ１２２、Ｔｈｒ１２４、Ｓｅｒ１２７、Ｔｈｒ１２８、Ｔｈｒ１３８、Ｓｅｒ１４４、Ｓｅｒ１５５、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ３０６，Ｔｈｒ２９４、Ｓｅｒ３０３、Ｓｅｒ３０４、Ｓｅｒ３０６、Ｓｅｒ１３４、Ｔｈｒ３１９、Ｓｅｒ３２１、Ｓｅｒ３４６、Ｓｅｒ３６３、Ｔｈｒ３６４、Ｓｅｒ３９４、Ｓｅｒ４００、Ｓｅｒ４０２、Ｓｅｒ４０９、Ｓｅｒ４２４、Ｔｈｒ４２９、Ｓｅｒ４３０、Ｓｅｒ４３３、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４５、Ｔｈｒ４４７、Ｔｈｒ４４９、Ｓｅｒ４６１、Ｓｅｒ４６８、Ｓｅｒ４８２、Ｔｈｒ４８３、Ｔｈｒ４８６、Ｓｅｒ４９６、Ｔｈｒ５００、Ｓｅｒ５０１、Ｓｅｒ５０４、Ｓｅｒ５０５、Ｔｈｒ５０６、Ｓｅｒ５０７、Ｔｈｒ５０８、Ｔｈｒ５１２、Ｔｈｒ５１９、Ｔｈｒ５２１、Ｓｅｒ５２５、Ｓｅｒ５２７、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３５、Ｔｈｒ５３６、Ｓｅｒ５３９、Ｓｅｒ５４２、Ｔｈｒ５４８、Ｔｙｒ５５３、Ｔｈｒ５６９、ｓｅｒ５８４、Ｓｅｒ５８６、またはＴｈｒ５８８の群から選択されるリン酸化アミノ酸の脱リン酸化を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１１】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号３のＳｅｒ１４４からのリン酸の転移を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１２】
前記ＭＥＮＡアイソフォーム基質が、ＭＥＮＡ１１ａ（配列番号５）である、請求項１に記載の医薬。
【請求項１３】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号５のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｓｅｒ５２８、Ｔｙｒ５２９、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３７、Ｔｈｒ５３８、Ｓｅｒ５４１、Ｓｅｒ５４４、Ｔｈｒ５５０、Ｔｙｒ５５５、Ｔｈｒ５７１、Ｓｅｒ５８６、Ｓｅｒ５８８、またはＴｈｒ５９０の群から選択される１つまたは複数のアミノ酸のリン酸化を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１４】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号５のＳｅｒ１２５へのリン酸の転移を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１５】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号５のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｓｅｒ５２８、Ｔｙｒ５２９、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３７、Ｔｈｒ５３８、Ｓｅｒ５４１、Ｓｅｒ５４４、Ｔｈｒ５５０、Ｔｙｒ５５５、Ｔｈｒ５７１、Ｓｅｒ５８６、Ｓｅｒ５８８、またはＴｈｒ５９０の群から選択されるリン酸化アミノ酸の脱リン酸化を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１６】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、配列番号５のＳｅｒ１２５からのリン酸の転移を阻害する、請求項１に記載の医薬。
【請求項１７】
前記ＭＥＮＡキナーゼが、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＭＡＰＫ−ＥＲＫ及び／またはＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路のメンバーである、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ。
【請求項１８】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤がＡＴＰ非競合阻害剤である、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項１９】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤がＡＴＰ競合阻害剤である、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２０】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が可逆的阻害剤である、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２１】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が共有結合阻害剤である、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２２】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤がＭＡＰＫキナーゼ（ＭＫ）阻害剤である、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２３】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２阻害剤、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤のうちの少なくとも１つである、請求項１７に記載のＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＭＡＰＫ−ＥＲＫ経路阻害剤。
【請求項２４】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、Ｐｉ３Ｋ阻害剤の少なくとも１つである、請求項１７に記載のＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路阻害剤。
【請求項２５】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が小分子である、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２６】
前記小分子が、アミノシアノピリジン、ピラゾロピリミジン、ピロロピリジン、カルボリン、ピロロピリミドン、及びＣＭＰＤ１からなる群から選択される、請求項２５に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２７】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤がペプチドである、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２８】
前記阻害剤が、配列番号６〜９のペプチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項２９】
前記阻害剤が、膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２７に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項３０】
前記膜貫通ドメインが、配列番号１０〜１３のペプチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載の膜貫通ドメイン。
【請求項３１】
前記阻害剤が、配列番号１４〜２９のペプチド配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項２７に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項３２】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤がタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、ＲＮＡアプタマー、リボザイム、またはｓｉＲＮＡである、請求項１に記載のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤。
【請求項３３】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を、経口的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、肺内に、腫瘍内に、鼻腔内に、髄腔内に、または皮下に投与する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３４】
前記ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を、他の薬物と併用投与する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３５】
前記他の薬物がチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）である、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３６】
他の薬物が抗微小管薬である、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３７】
ＭＥＮＡ媒介性疾患または障害を治療する方法であって、前記ＭＥＮＡ媒介性疾患または障害が、自己免疫疾患、慢性または急性の炎症性障害、自己炎症性障害、線維性障害、代謝性障害、腫瘍形成、または心血管障害もしくは脳血管障害である、前記方法。
【請求項３８】
前記線維性障害が、全身性硬化症／強皮症、ループス腎炎、結合組織病、創傷治癒、外科的瘢痕化、脊髄損傷、ＣＮＳ瘢痕化、急性肺損傷、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、薬剤性肺障害、糸球体腎炎、慢性腎臓病、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、消化管または胃腸管線維症、腎線維症、肝または胆道線維症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、脂肪性肝疾患による肝硬変、アルコール性脂肪性肝疾患による肝硬変、非アルコール性脂肪症／非アルコール性脂肪性肝疾患による肝硬変、放射線誘発線維症、頭頸部線維症、消化管線維症、肺線維症、原発性硬化性胆管炎、再狭窄、心臓線維症、心筋内線維症、心房性線維症、眼部瘢痕化、線維性硬化症、線維性癌、筋腫、線維腫、線維腺腫、線維肉腫、移植性動脈病変（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｍｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、ケロイド、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、及び腎性全身性線維症、からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍形成が、血管新生障害、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性及び慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前骨髄球性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、肥満細胞腫、ホジキン病、非ホジキン病、骨髄異形成症候群、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫、黒色腫、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、カポジ肉腫、黒色腫、奇形腫、横紋筋肉腫、転移性及び骨性疾患、骨、口／咽頭、食道、喉頭、胃、腸、結腸、直腸、肺、肝臓、膵臓、神経、脳、頭頸部、のど、卵巣、子宮、前立腺、精巣、膀胱、腎臓、乳房、胆嚢、頸部、甲状腺、前立腺、及び皮膚のがん、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、及び多形性膠芽腫からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記心血管障害または脳血管障害が、アテローム性動脈硬化症、アテローム性冠状動脈の再狭窄、急性冠症候群、心筋梗塞、心臓同種移植片血管症、脳卒中、炎症性またはアポトーシス性成分を伴う中枢神経系障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、神経性虚血及び末梢神経障害からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１に記載の医薬を、転移性がんを有する患者に治療的に投与することを含む、患者における転移を軽減するための方法。
【請求項４２】
前記医薬を、タキセル、ドセタキセル、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、及びカバジタキセルを含むがこれらに限定されない抗微小管薬の投与の前に、抗微小管薬の投与と組み合わせて、または抗微小管薬の投与後に投与する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記医薬を、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ＳＲＣ、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子１受容体、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、及びＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される、チロシンキナーゼ受容体の群に特異的なＴＫＩ治療薬の投与の前に、ＴＫＩ治療薬の投与と組み合わせて、またはＴＫＩ治療薬の投与後に投与する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記医薬を、ゲフィチニブの投与の前に、ゲフィチニブの投与と組み合わせて、またはゲフィチニブの投与後に投与する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の医薬を、それを必要とする患者に予防的に投与することを含む、患者における転移を予防するための方法。
【請求項４６】
前記医薬を、タキサン、ドセタキセル、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、及びカバジタキセルを含むがこれらに限定されない、抗微小管薬の投与の前に、抗微小管薬の投与と組み合わせて、または抗微小管薬の投与後に投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記医薬を、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ＳＲＣ、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦＲ−１）、線維芽細胞増殖因子受容体、血小板由来増殖因子受容体、及びＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される、チロシンキナーゼ受容体の群に特異的なＴＫＩ治療薬の投与の前に、ＴＫＩ治療薬の投与と組み合わせて、またはＴＫＩ治療薬の投与後に投与する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／３６０，１９０号、２０１７年３月９日出願の米国仮特許出願第６２／４６９，３７３号、２０１７年４月２１日出願の米国仮特許出願第６２／４８８，４６４号、及び２０１７年５月１９日出願の米国仮特許出願第６２／５０８，８９２号の利益を主張し、これらの各出願の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
配列表は、２０１７年７月７日に作成され、２４ＫＢのサイズを有する「０１０７３９−５００５−ＷＯ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして本明細書と共に提供する。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、ＭＥＮＡキナーゼの活性を調節することによってがん転移及び線維性疾患を阻害するための組成物を含む。
【背景技術】
【０００４】
がんは、最もわかりやすくは、異常細胞の無制御の増殖及び拡散を特徴とする複雑な疾患である。がんは依然として世界で最も深刻な健康問題の一つであり、米国では心臓病に次いで２番目によくある死因である。がんが早期に検出された場合、ほとんどの患者の予後は良好である。転移性病期へ進行した進行がん患者は、一般に予後不良であり、そのようながんはすべてのがん関連死亡の約９０％を占める。現在の腫瘍学的療法及び新しい治療法の開発は、原発腫瘍を標的とした抗増殖性細胞傷害性療法または標的療法によるがん細胞増殖の阻害に焦点を当てている。
【０００５】
転移進行を一般的に阻害することができる有効な抗転移療法の開発は、患者の転帰及び生存率を実質的に改善する可能性がある。悪性細胞の播種を促進するプロセスはがん間で共有されているので、転移カスケードを阻害する薬物は、複数のがん適応症にわたって広く有益であろう。現在利用可能な抗転移薬は、２つの一般的なカテゴリー、抗血管（血管新生）阻害剤及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤に分類される。これらの薬物の主な制限は、有効性の欠如及び無差別の分子阻害であった。
【０００６】
欠けているのは、腫瘍細胞の遊走、血管内侵入及び転移を標的とし、それによってその後の既存のアプローチで標的とされ得る原発腫瘍を不活性状態で停止させる効果的な治療法である。
【０００７】
ＭＥＮＡタンパク質及びそのアイソフォームは、転移の逐次的多段階プロセスに関与しており、腫瘍細胞の血管内侵入及び運動性に関与することが示されている。ＭＥＮＡは、Ｅｎａ／ＶＡＳＰタンパク質ファミリーのメンバーであり、アクチン重合において重要な調節的役割を果たしている。ＰｙＭＴマウス乳癌モデルにおけるＭＥＮＡ欠損は、血管内侵入を抑制し、死亡率及び罹患率を排除し、肺への転移性播種の頻度を大いに減少させる。異種移植マウス乳腺腫瘍におけるＭＥＮＡＩＮＶの発現は、同所性腫瘍からの自発的肺転移の形成増加を促進し、特に上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及びインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）に対する腫瘍細胞の感受性を変化させる。
【０００８】
患者において、高レベルのＭＥＮＡ発現は、転移リスクの増加と相関しており、高レベルのＭＥＮＡ発現は、その後がん転移を発症する早期疾患患者からの腫瘍試料において観察されている。高レベルのＭＥＮＡ発現は、早期乳癌、肺の扁平上皮癌、子宮頸癌、大腸癌及び膵臓癌を有する患者におけるがん転移のリスク増加と関連する。ＭＥＮＡは、選択的にスプライシングされて複数のタンパク質アイソフォームが腫瘍進行中に差次的に発現する。最も特徴付けられたアイソフォームのうちの２つは、もっぱら浸潤性腫瘍細胞において発現するＭＥＮＡＩＮＶ、及び原発性乳癌において発現し、かつ浸潤性腫瘍細胞においてダウンレギュレートされる上皮特異的アイソフォームであるＭＥＮＡ１１ａである。ＭＥＮＡＩＮＶ発現は、乳癌細胞において発現する場合に、上皮増殖因子（ＥＧＦ）に対する乳癌細胞の走化性応答を増強することによって強力な転移促進性表現型を付与し、それによってマクロファージによる乳癌細胞のパラクリンシグナル伝達の増加を介して効率的な流動運動を行う乳癌細胞の能力を高める。種及び異なる腫瘍型にわたる浸潤性腫瘍細胞におけるＭＥＮＡアップレギュレーションの保存は、それが転移進行において決定的な役割を果たすことを示唆する。
【０００９】
ＭＥＮＡは、局在化を促進するＥＶＨ１、ＬＥＲＥＲモチーフ、続いてプロフィリン結合に関与するプロリンリッチ配列、続いてＥＶＨ２ドメイン内の、オリゴマー化モチーフが後に続く一連のアクチン結合モチーフを含む、少なくとも４つの一般に認識されているドメインからなる。これらのドメインの配置を図１に示す。ＭＥＮＡＩＮＶアイソフォームは、タンパク質のＥＶＨ１ドメインの直後の１１６位に１９アミノ酸セグメントの挿入をもたらすＭＥＮＡ  ｍＲＮＡ転写物へのエクソンの選択的スプライシングによって形成される。ＭＥＮＡ１１ａアイソフォームは、ＭＥＮＡタンパク質のＥＶＨ２ドメイン内の５１３位に２１アミノ酸セグメントを挿入するＭＥＮＡ  ｍＲＮＡ転写産物へのエクソンの選択的スプライシングによって生成される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、攻撃的ながんを促進して原発腫瘍から遠隔の転移部位まで広げるＭＥＮＡ及びＭＥＮＡアイソフォームの活性を低下させて、線維性疾患に関連する過剰な線維形成を阻止する。本発明は、ＭＥＮＡＩＮＶアイソフォームの存在または活性を低下させ、ＭＥＮＡ１１ａアイソフォームの存在または活性を増大させることによって、及び／または、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ｍＴＯＲ  経路からのキナーゼ能力を阻害し、ＭＥＮＡまたはＭＥＮＡアイソフォーム活性を調節することによって、がん転移、腫瘍細胞薬剤耐性及び線維形成に関連するＭＥＮＡ依存性表現型を弱める。本発明はまた、ＭＥＮＡまたはＭＥＮＡＩＮＶアイソフォームの存在または活性を低下させ、ＭＥＮＡ１１ａアイソフォームの存在または活性を増大させる薬物と組み合わせて投与した場合、及び／または、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ｍＴＯＲ  経路からのキナーゼ能力を阻害し、ＭＥＮＡまたはＭＥＮＡアイソフォーム活性を調節する薬物と組み合わせて投与した場合、抗腫瘍チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）及び／または抗微小管薬物の有効性を高める。
【００１１】
ＭＥＮＡタンパク質は、腫瘍細胞の浸潤及び転移、アクチン重合、接着、ならびにＥＧＦ誘発運動性応答にとって重要である複数のプロセスを介して作用する。高度に遊走性及び浸潤性の腫瘍細胞亜集団は、ＭＥＮＡの選択的スプライシング形態を含むＭＥＮＡ  ｍＲＮＡを産生する。そのような選択的スプライシング形態の１つであるＭＥＮＡＩＮＶは、がん転移のリスクについての予後的なものであり、米国特許出願公開第２０１２／００２８２５２号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の選択的スプライシング形態であるＭＥＮＡ１１ａは、米国特許出願公開第２０１０／００４７２４０号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。種々のＭＥＮＡアイソフォームを同定し、一方を他方と区別するための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０１０／００３３２５８号に記載されており、これもまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１２】
ＭＥＮＡタンパク質は、腫瘍細胞の浸潤及び転移、アクチン重合、接着、ならびにＥＧＦ誘発運動性応答にとって重要である複数のプロセスを介して作用する。高度に遊走性及び浸潤性の腫瘍細胞亜集団は、ＭＥＮＡの選択的スプライシング形態を含むＭＥＮＡ  ｍＲＮＡを産生する。そのような選択的スプライシング形態の１つであるＭＥＮＡＩＮＶは、がん転移のリスクについての予後的なものであり、米国特許出願公開第２０１２／００２８２５２号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の選択的スプライシング形態であるＭＥＮＡ１１ａは、米国特許出願公開第２０１０／００４７２４０号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。種々のＭＥＮＡアイソフォームを同定し、一方を他方と区別するための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０１０／００３３２５８号に記載されており、これもまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１３】
ＭＥＮＡタンパク質は、腫瘍細胞の浸潤及び転移、アクチン重合、接着、ならびにＥＧＦ誘発運動性応答にとって重要である複数のプロセスを介して作用する。高度に遊走性及び浸潤性の腫瘍細胞亜集団は、ＭＥＮＡの選択的スプライシング形態を含むＭＥＮＡ  ｍＲＮＡを産生する。そのような選択的スプライシング形態の１つであるＭＥＮＡＩＮＶは、がん転移のリスクについての予後的なものであり、米国特許出願公開第２０１２／００２８２５２号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の選択的スプライシング形態であるＭＥＮＡ１１ａは、米国特許出願公開第２０１０／００４７２４０号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。種々のＭＥＮＡアイソフォームを同定し、一方を他方と区別するための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０１０／００３３２５８号に記載されており、これもまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本発明は、ＭＥＮＡが、ホスホチロシン受容体シグナル伝達制御において役割を果たすという観察から部分的に生じる。いくつかのがんは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む治療に対して全く反応しないか、または弱い反応しかしない。多くのがんは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を含む治療に対する耐性を発生させ、チロシンキナーゼ阻害剤を含む治療は、最初は腫瘍細胞の成長及び増殖を低下させるが、最終的には効力を失う。ＰＴＰ１Ｂなどの内因性脱リン酸化酵素がＴＫＩ標的受容体をその同族リガンドによる刺激に対して脱感作させる能力を制限することによって、ＭＥＮＡＩＮＶが少なくとも１つのＴＫＩ標的受容体タンパク質（ＥＧＦＲ）の脱リン酸化を阻止するという発見は、ＭＥＮＡＩＮＶアイソフォームが、浸潤性がんの表現型と非常に相関している理由のモデルを示唆している。このモデルでは、ＭＥＮＡＩＮＶは、デホスホリラーゼ複合体と標的受容体との会合を破壊することにより、脱リン酸化により誘導される受容体の通常のダウンレギュレーションを破壊して、腫瘍細胞を増殖因子刺激に対して感受性にする。対照的に、ＭＥＮＡ１１ａアイソフォームは、浸潤性腫瘍細胞においてダウンレギュレートされており、ＭＥＮＡ１１ａの発現は、凝集性腫瘍の形態と相関している。ＭＥＮＡまたはＭＥＮＡＩＮＶアイソフォームの存在または活性を低下させるか、あるいはＭＥＮＡ１１ａアイソフォームの存在または活性を増大させるための任意の治療は、転移性がん及び／または線維性疾患表現型の発症を制限または根絶するための方法を提供し得る。さらに、ＭＥＮＡまたはＭＥＮＡＩＮＶの存在または活性を低下させることにより、及び／またはＭＥＮＡ１１ａの存在または活性を増大させることにより、現在のＴＫＩに基づく療法の有効性を改善及び延長する可能性がある。ＭＥＮＡアイソフォーム活性を調節するための１つの可能性のある方法は、ＭＥＮＡキナーゼ活性を阻害することによってＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡアイソフォームのリン酸化及び脱リン酸化を制御することによる。
【００１５】
本発明はまた、ＭＥＮＡのセリン１２５（Ｓｅｒ１２５）リン酸化部位及びＭＥＮＡＩＮＶの相当するセリン１４４（Ｓｅｒ１４４）リン酸化部位に近いペプチド配列が、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼの強力な基質であるという発見にも部分的に基づく。ＭＥＮＡ中のＳｅｒ１２５及び／またはＭＥＮＡＩＮＶ中のＳｅｒ１４４をリン酸化不能なアミノ酸で置き換えると、ペプチド基質がＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼの有効なペプチド阻害剤に変わる。Ｈａｙｅｓｓ及びＢｅｎｎｄｏｒｆは、ペプチド配列ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）がＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２の強力な阻害剤であり、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２基質熱ショックタンパク質ＨＳＰ２５／２７のコンセンサス配列結合ドメインに基づいていることを発見した。ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２依存性リン酸化の質量分析ホスホプロテオミクス分析は、ＭＥＮＡ／ＭＥＮＡＩＮＶがＨＳＰ２７と比較してより強力なＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２基質であることを実証した。ドキソルビシン処理細胞では、ＭＥＮＡ  Ｓｅｒ１２５リン酸化部位はＨＳＰ２７  Ｓｅｒ８２リン酸化部位（約２．５倍増強）よりも強くリン酸化される（約８倍増強）。Ｓｅｒ１２５／Ｓｅｒ１４４セリン残基を、リン酸化不能グリシン残基と置き換えて、ＭＥＮＡ／ＭＥＮＡＩＮＶ基質ペプチドを、有効なＭＥＮＡキナーゼ阻害剤に転換した。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】個々のドメインの機能を同定したＭＥＮＡタンパク質アイソフォームのアラインメントを表す。ＭＥＮＡＩＮＶに特徴的な１９アミノ酸挿入の相対位置は
【化１】
2019521191.tif 000003
で示し、ＭＥＮＡ１１ａの２３アミノ酸挿入の相対位置は
【化２】
2019521191.tif 000004
で示す。
【図２】Ｓｅｒ１２５リン酸化ＭＥＮＡ（ｐＳｅｒ１２５  ＭＥＮＡ）、リン酸化Ｐ３８（ｐＰ３８）、リン酸化ＨＳＰ２７（ｐＨＳＰ２７）、及びチューブリンの存在に対する特異的な抗体でプローブした組換え細胞株ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶから回収したタンパク質のウエスタンブロットを示す。示しているように、実験サンプルをＴＮＦ−αで刺激し、阻害剤で処理した。
【図３】ＭＥＮＡのリン酸化Ｓｅｒ１２５（ｐＳｅｒ１２５  ＭＥＮＡ）及びチューブリンに対する抗体でプローブしたＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶの組換え細胞株から回収したタンパク質のウエスタンブロットを表す。示しているように、実験サンプルをＴＮＦ−αで刺激し、阻害剤で処理した。
【図４】ＭＥＮＡのリン酸化Ｓｅｒ１２５（ｐＳｅｒ１２５  ＭＥＮＡ）、チューブリン、及びリン酸化ＨＳＰ２７（ｐＨＳＰ２７）に対する抗体でプローブしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＭＥＮＡＩＮＶの組換え細胞株から回収したタンパク質のウエスタンブロットを表す図である。示しているように、実験サンプルをＴＮＦ−αで刺激し、阻害剤で処理した。
【図５】種々の阻害剤で処理した種々の組換えＭＶＤ７細胞株の細胞拡散アッセイの顕微鏡写真のコレクションである。パネル（ａ）ＭＥＮＡ欠損ＧＦＰ対照、パネル（ｂ）ＧＦＰ−ＭＥＮＡ（Ｓｅｒ１４４Ａ）、パネル（ｃ）非処理ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ、パネル（ｄ）Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ−Ｌｙ０２）１０ｕＭで処理したＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ、パネル（ｅ）ｐ３８ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤（ＬＹ２２２８８２０）１０ｕＭで処理したＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ、パネル（ｆ）ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２（ＰＦ−３６４４０２２）１０ｕＭで処理したＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ、パネル（ｇ）ＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）１ｕＭで処理したＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ、パネル（ｈ）ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド（１００ｕＭ）で処理したＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ。
【図６】図５の細胞拡散アッセイの結果のプロットであり、ＭＶＤ７−ＧＦＰはパネル（ａ）に対応し、ＭＶＤ−Ｓｅｒ１４４Ａはパネル（ｂ）に対応し、０はパネル（ｃ）に対応し、Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ−Ｌｙ０２）１０ｕＭはパネル（ｄ）に対応し、ｐ３８ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤（Ｐ３８−Ｌｙ８２０）１０ｕＭは、パネル（ｅ）に対応し、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２キナーゼ阻害剤（ＥＲＫ１／２−ＰＤ）１ｕＭは、パネル（ｆ）に対応し、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤Ｐｆｉｚｅｒ  ＰＦ−３６４４０２２  １０ｕＭ  は、パネル（ｇ）に対応し、Ｈ＆Ｂ−１００は１００ｕＭのＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド阻害剤を表し、パネル（ｈ）に対応する。Ｈ＆Ｂ−３００は、３００ｕＭのＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド阻害剤を表す（図５には示していない）。
【図７】種々の阻害剤で処理し、ＤＮＡ（ＤＡＰＩ）ならびにアクチンフィラメント（ファロイジン）及びフィブロネクチン沈着について染色した、組換えＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞株（パネル（ａ）及び（ｂ）に示すものを除く）のフィブロネクチン原線維形成アッセイの顕微鏡写真のコレクションである。それぞれ、パネル（ａ）ＭＶＤ７−ＧＦＰ、パネル（ｂ）ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ（Ｓｅｒ１４４Ａ）、パネル（ｃ）Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤（ＬＹ２９４００２）１０ｕＭ、パネル（ｄ）ｐ３８  ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤（ＬＹ２２２８８２０）  １０ｕＭ、パネル（ｅ）ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２（ＰＦ−３６４４０２２）  １０ｕＭ、パネル（ｆ）ＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）  １ｕＭ、及びパネル（ｇ）ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２  キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）ペプチド１００及び３００ｕＭ。
【図８】図７のフィブロネクチン原線維形成アッセイ（相対フィブロネクチン沈着）の結果のプロットであり、ＭＶＤ７−ＧＦＰはパネル（ａ）に対応し、ＭＶＤ７−Ｓｅｒ１４４Ａはパネル（ｂ）に対応し、０は非処理のＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞によって沈着したフィブロネクチンを表し、Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ−Ｌｙ０２）１０ｕＭはパネル（ｃ）に対応し、ｐ３８キナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（Ｐ３８−Ｌｙ８２０）１０ｕＭはパネル（ｄ）に対応し、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤ＰＤ０３２５９０１（ＥＲＫ１／２−ＰＤ）１ｕＭはパネル（ｅ）に対応し、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤（ＰＦ−３６４４０２２）１０ｕＭはパネル（ｆ）に対応し、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド（Ｈ＆Ｂ−１００）  １００ｕＭはパネル（ｇ）に対応し、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド（Ｈ＆Ｂ−３００）  ３００ｕＭはパネル（ｈ）に対応する。信頼水準は、Ｐ＝０．００２２の場合＊＊、Ｐ＝０．０００２の場合＊＊＊、Ｐ＜０．０００１の場合＊＊＊＊で示す。
【図９】種々の阻害剤で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＡＮＩＮＶ細胞の創傷アッセイにおける細胞遊走の顕微鏡写真のコレクションである。創傷閉鎖の推定割合は、各パネルの上に提示する。パネル（ａ）は処理前の細胞、パネル（ｂ）は阻害剤を含まない培地中の１８時間後の細胞、パネル（ｃ）はＰｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０ｕＭ）を補足した培地中の１８時間後の細胞、パネル（ｄ）はｐ３８キナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（１０ｕＭ）を補足した培地中の１８時間後の細胞、パネル（ｅ）はＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２  キナーゼ阻害剤ＰＦ−３６４４０２２（１０ｕＭ）を補足した培地中の１８時間後の細胞、パネル（ｆ）はＭＥＫ１／ＭＥＫ２キナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１ｕＭ）を補足した培地中の１８時間後の細胞、パネル（ｇ）はＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド（Ｈ＆Ｂ−１００）  １００ｕＭを補足した培地中の１８時間後の細胞、及び（ｈ）はＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド（Ｈ＆Ｂ−１００）  ３００ｕＭを補足した培地中の１８時間後の細胞、である。
【図１０】細胞浸潤及び走化性マトリゲルアッセイの結果のプロットである。Ｐｉ３ＫキナーゼＬＹ２９４００２  １０ｕＭ、ｐ３８キナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（Ｐ３８−Ｌｙ８２０）１０ｕＭ、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤（ＰＦ−３６４４０２２）１０ｕＭ、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２阻害剤ＰＤ０３２５９０１（ＥＲＫ１／２−ＰＤ）１ｕＭ、ならびにＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド阻害剤１００ｕＭ及び３００ｕＭを用いてインキュベーションを行った後、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ腫瘍細胞におけるＭＥＮＡ依存性浸潤及び走化性表現型を逆転させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ΔＭＥＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ  ｍｅｎａ−欠損細胞株は、ＥＧＦへ遊走する細胞はほとんど観察されず、有意な細胞浸潤及び走化性表現型を示さなかった。信頼水準は、Ｐ＜０．０４の場合＊で示す。
【図１１】ボイデンチャンバーアッセイにおける細胞遊走及び走化性の結果のプロットである。Ｐｉ３Ｋ  キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ−Ｌｙ０２）  １０ｕＭ、ｐ３８  ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤（ＬＹ２２２８８２０）  １０ｕＭ、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２（ＰＦ−３６４４０２２）  １０ｕＭ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤ＰＤ０３２５９０１（ＥＲＫ１／２−ＰＤ）  １ｕＭ及びＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド１００ｕＭ及び３００ｕＭを用いてインキュベーションを行った後、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ腫瘍細胞におけるＭＥＮＡ依存性遊走及び走化性表現型を逆転させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ΔＭＥＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ  ｍｅｎａ−欠損細胞株もリン酸化不能ＭＥＮＡ−Ｓｅｒ１４４Ａ細胞株も、ＥＧＦへ遊走する細胞はほとんど観察されず、有意な細胞浸潤及び走化性表現型を示さなかった。信頼水準は、Ｐ＜０．０４の場合＊＊、Ｐ＜０．０００４の場合＊＊＊で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
対象におけるＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡのアイソフォームであるＭＥＮＡＩＮＶの存在または活性を低下させることを含む、固形腫瘍を有する患者においてがんを治療するための方法を提供し、さらに、この方法は、対象におけるＭＥＮＡ１１ａアイソフォームの存在または活性を増大させることを含み得る。この方法は、ＭＥＮＡキナーゼによるＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡＩＮＶアイソフォーム基質中のセリン、スレオニン、及び／またはチロシン残基への、リン酸基の転移を阻害する薬物の投与によって、ＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡＩＮＶタンパク質アイソフォームのリン酸化または脱リン酸化を阻害することを伴う。同様に、この方法は、ＭＥＮＡ１１ａアイソフォーム基質のリン酸化または脱リン酸化の活性化を伴う。この方法は、本明細書に記載のＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡＩＮＶ及びＭＥＮＡ１１ａ特異的薬物の投与を含み、同時にＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡＩＮＶの存在または活性を低下させ、ＭＥＮＡ１１ａの存在または活性を増大させる。本明細書中で使用する場合、「ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤」という用語は、ＭＥＮＡ、ＭＥＮＡＩＮＶ、及びＭＥＮＡ１１ａを含むがこれらに限定されない、ＭＥＮＡアイソフォームのリン酸化または脱リン酸化を阻害する任意の組成物を指す。
【００１８】
本発明の一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、ＲＮＡアプタマー、リボザイム、またはｓｉＲＮＡである。
【００１９】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＡＴＰ競合阻害剤である。別の実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＡＴＰ非競合阻害剤である。
【００２０】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は可逆的阻害剤である。別の実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は非可逆的共有結合阻害剤である。
【００２１】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ及び／またはＰＩ３Ｋ−ＰＴＥＮ−ＡＴｋ−ｍＴＯＲ経路の阻害剤である。Ｒａｆ、ｐ３８  ＭＡＰ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫ、ＰＫＤ−１、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、及びｍＴＯＲ阻害剤、または当業者によく知られている同様のプロテインキナーゼ阻害剤を含むがこれらに限定されない。
【００２２】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫキナーゼ）の阻害剤である。本明細書中で使用する場合、「ＭＡＰＫキナーゼ」という用語は、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ２（ＭＡＰＫＡＰＫ２またはＭＫ２）阻害剤、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ３（ＭＡＰＫＡＰＫ３またはＭＫ３）阻害剤、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ５（ＭＡＰＫＡＰＫ５またはＭＫ５）阻害剤、または当業者によく知られている類似のＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ阻害剤を含むがこれらに限定されない、いくつかのＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼのそれぞれ及びすべてを指す。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＡＰＫＡＰＫ２（ＭＫ２）を特異的に阻害する。
【００２３】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ（配列番号１）のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４９、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｔｈｒ４６７、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｔｈｒ５１７、Ｓｅｒ５２０、Ｓｅｒ５２３、Ｔｙｒ５３４、Ｓｅｒ５５０、Ｓｅｒ５６５、Ｓｅｒ５６７、またはＴｈｒ５６９アミノ酸のうちの１つまたは複数のリン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡタンパク質のＳｅｒ１２５のリン酸化を排除する。
【００２４】
別の実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ（配列番号１）のリン酸化Ｓｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４９、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｔｈｒ４６７、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｔｈｒ５１７、Ｓｅｒ５２０、Ｓｅｒ５２３、Ｔｙｒ５３４、Ｓｅｒ５５０、Ｓｅｒ５６５、Ｓｅｒ５６７、またはＴｈｒ５６９アミノ酸のうちの１つまたは複数の脱リン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡタンパク質のリン酸化Ｓｅｒ１２５の脱リン酸化を排除する。
【００２５】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡＩＮＶエクソン（配列番号２）のＳｅｒ３、Ｔｈｒ６、Ｔｈｒ８、Ｓｅｒ１１、Ｔｈｒ１２のうちの１つまたは複数のリン酸化、またはＭＥＮＡＩＮＶタンパク質（配列番号３）の１１７〜１３５位のＭＥＮＡＩＮＶエクソン配列に隣接するアミノ酸のリン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡＩＮＶタンパク質アイソフォームのＳｅｒ１４４のリン酸化を排除する。
【００２６】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＡＮＩＮＶ（配列番号３）のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｓｅｒ１１９、Ｔｈｒ１２２、Ｔｈｒ１２４、Ｓｅｒ１２７、Ｔｈｒ１２８、Ｔｈｒ１３８、Ｓｅｒ１４４、Ｓｅｒ１５５、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ３０６，Ｔｈｒ２９４、Ｓｅｒ３０３、Ｓｅｒ３０４、Ｓｅｒ３０６、Ｓｅｒ１３４、Ｔｈｒ３１９、Ｓｅｒ３２１、Ｓｅｒ３４６、Ｓｅｒ３６３、Ｔｈｒ３６４、Ｓｅｒ３９４、Ｓｅｒ４００、Ｓｅｒ４０２、Ｓｅｒ４０９、Ｓｅｒ４２４、Ｔｈｒ４２９、Ｓｅｒ４３０、Ｓｅｒ４３３、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４５、Ｔｈｒ４４７、Ｔｈｒ４４９、Ｓｅｒ４６１、Ｓｅｒ４６８、Ｓｅｒ４８２、Ｔｈｒ４８３、Ｔｈｒ４８６、Ｓｅｒ４９６、Ｔｈｒ５００、Ｓｅｒ５０１、Ｓｅｒ５０４、Ｓｅｒ５０５、Ｔｈｒ５０６、Ｓｅｒ５０７、Ｔｈｒ５０８、Ｔｈｒ５１２、Ｔｈｒ５１９、Ｔｈｒ５２１、Ｓｅｒ５２５、Ｓｅｒ５２７、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３５、Ｔｈｒ５３６、Ｓｅｒ５３９、Ｓｅｒ５４２、Ｔｈｒ５４８、Ｔｙｒ５５３、Ｔｈｒ５６９、ｓｅｒ５８４、Ｓｅｒ５８６、またはＴｈｒ５８８アミノ酸のうちの１つまたは複数のリン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡＩＮＶタンパク質アイソフォームのＳｅｒ１４４のリン酸化を排除する。
【００２７】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡＩＮＶエクソン（配列番号２）のＳｅｒ３、Ｔｈｒ６、Ｔｈｒ８、Ｓｅｒ１１、Ｔｈｒ１２のうちの１つまたは複数の脱リン酸化、またはＭＥＮＡＩＮＶ（配列番号３）タンパク質の１１７〜１３５位のＭＥＮＡＩＮＶエクソン配列に隣接するアミノ酸の脱リン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡＩＮＶタンパク質アイソフォームのリン酸化Ｓｅｒ１４４の脱リン酸化を低減または排除する。
【００２８】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡＩＮＶ（配列番号３）のリン酸化Ｓｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｓｅｒ１１９、Ｔｈｒ１２２、Ｔｈｒ１２４、Ｓｅｒ１２７、Ｔｈｒ１２８、Ｔｈｒ１３８、Ｓｅｒ１４４、Ｓｅｒ１５５、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ３０６，Ｔｈｒ２９４、Ｓｅｒ３０３、Ｓｅｒ３０４、Ｓｅｒ３０６、Ｓｅｒ１３４、Ｔｈｒ３１９、Ｓｅｒ３２１、Ｓｅｒ３４６、Ｓｅｒ３６３、Ｔｈｒ３６４、Ｓｅｒ３９４、Ｓｅｒ４００、Ｓｅｒ４０２、Ｓｅｒ４０９、Ｓｅｒ４２４、Ｔｈｒ４２９、Ｓｅｒ４３０、Ｓｅｒ４３３、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４４５、Ｔｈｒ４４７、Ｔｈｒ４４９、Ｓｅｒ４６１、Ｓｅｒ４６８、Ｓｅｒ４８２、Ｔｈｒ４８３、Ｔｈｒ４８６、Ｓｅｒ４９６、Ｔｈｒ５００、Ｓｅｒ５０１、Ｓｅｒ５０４、Ｓｅｒ５０５、Ｔｈｒ５０６、Ｓｅｒ５０７、Ｔｈｒ５０８、Ｔｈｒ５１２、Ｔｈｒ５１９、Ｔｈｒ５２１、Ｓｅｒ５２５、Ｓｅｒ５２７、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３５、Ｔｈｒ５３６、Ｓｅｒ５３９、Ｓｅｒ５４２、Ｔｈｒ５４８、Ｔｙｒ５５３、Ｔｈｒ５６９、ｓｅｒ５８４、Ｓｅｒ５８６、またはＴｈｒ５８８アミノ酸のうちの１つまたは複数のリン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡＩＮＶタンパク質アイソフォームのリン酸化Ｓｅｒ１４４の脱リン酸化を排除する。
【００２９】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ１１ａエクソン（配列番号４）のＳｅｒ３、Ｓｅｒ１５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ１８のうちの１つまたは複数のリン酸化、またはＭＥＮＡ１１ａタンパク質の５１４〜５３４位のＭＥＮＡ１１ａエクソン配列（配列番号５）に隣接するアミノ酸のリン酸化、または配列番号５のリン酸化Ｓｅｒ１２５のリン酸化を低減または排除する。
【００３０】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ１１ａ（配列番号５）のＳｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｓｅｒ５２８、Ｔｙｒ５２９、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３７、Ｔｈｒ５３８、Ｓｅｒ５４１、Ｓｅｒ５４４、Ｔｈｒ５５０、Ｔｙｒ５５５、Ｔｈｒ５７１、Ｓｅｒ５８６、Ｓｅｒ５８８、またはＴｈｒ５９０アミノ酸のうちの１つまたは複数のリン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡ１１ａタンパク質アイソフォームのＳｅｒ１２５のリン酸化を排除する。
【００３１】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ１１ａエクソン（配列番号４）のリン酸化Ｓｅｒ３、Ｓｅｒ１５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ１８のうちの１つまたは複数の脱リン酸化、配列番号５の５１４〜５３４位のＭＥＮＡ１１ａエクソン配列に隣接するリン酸化アミノ酸の脱リン酸化、または配列番号５のＳｅｒ１２５の脱リン酸化を低減または排除する。
【００３２】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ１１ａ（配列番号５）のリン酸化Ｓｅｒ２、Ｓｅｒ５、Ｔｙｒ１６、Ｓｅｒ２９、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ３８、Ｔｈｒ４１、Ｔｈｒ４５、Ｔｙｒ７０、Ｔｈｒ７４、Ｔｈｒ７６、Ｔｙｒ８７、Ｓｅｒ９３、Ｓｅｒ１０２、Ｓｅｒ１１３、Ｔｈｒ１１６、Ｔｈｒ１１９、Ｓｅｒ１２５、Ｓｅｒ１３６、Ｓｅｒ２６５、Ｓｅｒ２６６、Ｓｅｒ２７２、Ｔｈｒ２７５、Ｓｅｒ２７９、Ｓｅｒ２８４、Ｓｅｒ２８５、Ｓｅｒ２８７、Ｓｅｒ２９５、Ｔｈｒ３００、Ｓｅｒ３０２、Ｓｅｒ３２７、Ｓｅｒ３４４、Ｔｈｒ３４５、Ｓｅｒ３７５、Ｓｅｒ３８１、Ｓｅｒ３８３、Ｔｈｒ３９０、Ｓｅｒ４０５、Ｔｈｒ４１０、Ｓｅｒ４１１、Ｓｅｒ４１４、Ｓｅｒ４２３、Ｓｅｒ４２５、Ｓｅｒ４２６、Ｔｈｒ４２８、Ｔｈｒ４３０、Ｓｅｒ４４２、Ｓｅｒ４４４、Ｓｅｒ４６３、Ｔｈｒ４６４、Ｓｅｒ４７７、Ｔｈｒ４８１、Ｓｅｒ４８２、Ｓｅｒ４８５、Ｓｅｒ４８６、Ｔｈｒ４８７、Ｓｅｒ４８８、Ｔｈｒ４８９、Ｔｈｒ４９３、Ｔｈｒ５００、Ｔｈｒ５０２、Ｓｅｒ５０６、Ｓｅｒ５０８、Ｓｅｒ５１２、Ｓｅｒ５１６、Ｓｅｒ５２８、Ｔｙｒ５２９、Ｓｅｒ５３１、Ｓｅｒ５３７、Ｔｈｒ５３８、Ｓｅｒ５４１、Ｓｅｒ５４４、Ｔｈｒ５５０、Ｔｙｒ５５５、Ｔｈｒ５７１、Ｓｅｒ５８６、Ｓｅｒ５８８、またはＴｈｒ５９０アミノ酸のうちの１つまたは複数の脱リン酸化を低減または排除する。好ましい実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はＭＥＮＡ１１ａタンパク質のリン酸化Ｓｅｒ１２５の脱リン酸化を排除する。
【００３３】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡまたはＭＥＮＡアイソフォームキナーゼのリン酸化または脱リン酸化を特異的に阻害する小分子阻害剤である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、小分子ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、アミノシアノピリジン、ピラゾロピリミジン、ピロロピリジン、カルボリン、ピロロピリミドン、及びＣＭＰＤ１などの足場に基づく。好ましい実施形態では、小分子阻害剤は、ＭＥＮＡキナーゼによるＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡアイソフォームのリン酸化または脱リン酸化を特異的に阻害する。
【００３５】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡキナーゼによるＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡアイソフォームのリン酸化または脱リン酸化を特異的に阻害するペプチド阻害剤である。
【００３６】
本発明の一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ペプチドＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号６）、ＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号７）、ＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号８）、及びＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号９）のうちの少なくとも１つを含む。
【００３７】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＨＩＶ  ＴＡＴペプチド配列が挙げられるが、これに限定されない細胞透過性ペプチド担体配列に連結されて、取り込み及び送達を促進する。ある種の実施形態では、ＨＩＶ  ＴＡＴペプチド配列に基づく細胞透過性担体配列は、ペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１０）、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１１）のうちの少なくとも１つを含む。他の細胞透過性担体形態が明確に企図されている。例えば、アンチトロンビンＩＩＩヘパリン結合ドメインに基づくＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（配列番号１２）及びＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲ（配列番号１３）。
【００３８】
ある種の実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号１４）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号１５）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号１６）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号１７）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号１８）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号１９）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２０）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２１）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２２）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２３）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２４）、ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２５）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２６）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２７）、ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＫＡＬＰＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２８）、及びＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＫＡＬＡＲＱＮＧＱＬＰ（配列番号２９）のうちの少なくとも１つを含む。
【００３９】
樹脂上でＦＭＯＣによりアミノ酸を保護して行う標準的な固相ペプチド化学を用いてペプチドを合成した。ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ及びＤＩＥＡを用いてアミノ酸活性化及びカップリングを実施した。ＦＭＯＣ基は、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて除去する。次いで、樹脂結合配列を、水、チオアニソール、エチルメチルスルフィド、及びエタンジチオール、及び／またはトリイソプロピルシランを含み得る種々の捕捉剤を含有する８０〜９０％ＴＦＡで切断及び脱保護した。ペプチドをエーテル中に沈殿させ、次いで遠心分離により単離した。乾燥ペプチドペレットを水とアセトニトリルの混合物中で再構成し、凍結乾燥した後、Ｃ１８カラムでの逆相ＨＰＬＣにより、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル−水緩衝液で溶出して精製を行った。各ペプチドを分析し、純粋画分をプールし、凍結乾燥する。分析用ＨＰＬＣデータを５ミクロンのＣ１８分析用カラムで、０．１％ＴＦＡを含有する水−アセトニトリル緩衝液で溶出して得た。分子量はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により確認した。
【００４０】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を含む医薬は、それを必要とする対象に予防的に投与して、転移性がんの発症または線維性疾患の進行を予防する。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を含む医薬はまた、既存の転移性がんの転移を低減させるために治療的に投与し得る。
【００４１】
他の実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−ＳＲＣ、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、線維芽細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体、血管内皮増殖因子受容体、及び当業者に既知の他のがん関連標的を標的とするチロシンキナーゼ受容体に特異的なＴＫＩ治療薬の投与の前に、ＴＫＩ治療薬の投与と同時に、またはＴＫＩ治療薬の投与後に投与して、ＴＫＩ治療薬の有効性を改善または延長することができる。さらに、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は他のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することができる。
【００４２】
一実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ媒介性疾患または障害を治療するために投与し、ＭＥＮＡ媒介性疾患または障害は自己免疫疾患、慢性または急性の炎症性障害、自己炎症性障害、線維性障害、代謝性障害、腫瘍形成、または心血管障害もしくは脳血管障害である。
【００４３】
さらなる実施態様では、線維性障害は、全身性硬化症／強皮症、ループス腎炎、結合組織病、創傷治癒、外科的瘢痕化、脊髄損傷、ＣＮＳ瘢痕化、急性肺損傷、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、急性肺損傷、薬剤性肺障害、糸球体腎炎、慢性腎臓病、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、消化管または胃腸管線維症、腎線維症、肝または胆道線維症、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、脂肪性肝疾患による肝硬変、アルコール性脂肪性肝疾患による肝硬変、非アルコール性脂肪症／非アルコール性脂肪性肝疾患による肝硬変、放射線誘発線維症、頭頸部線維症、消化管線維症、肺線維症、原発性硬化性胆管炎、再狭窄、心臓線維症、心筋内線維症、心房性線維症、眼部瘢痕化、線維性硬化症、線維性癌、筋腫、線維腫、線維腺腫、線維肉腫、移植性動脈病変（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｍｔｅｒｉｏｐａｔｈｙ）、ケロイド、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症、及び腎性全身性線維症からなる群から選択される。
【００４４】
さらなる実施形態では、腫瘍形成は、血管新生障害、多発性骨髄腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性及び慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、前骨髄球性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、肥満細胞腫、ホジキン病、非ホジキン病、骨髄異形成症候群、線維肉腫、横紋筋肉腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、神経鞘腫、黒色腫、セミノーマ、奇形癌腫、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞癌、カポジ肉腫、黒色腫、奇形腫、横紋筋肉腫、転移性及び骨性疾患、骨、口／咽頭、食道、喉頭、胃、腸、結腸、直腸、肺、肝臓、膵臓、神経、脳、頭頸部、のど、卵巣、子宮、前立腺、精巣、膀胱、腎臓、乳房、胆嚢、頸部、甲状腺、前立腺、及び皮膚のがん、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、及び多形性膠芽腫からなる群から選択される。
【００４５】
さらなる実施形態では、心血管障害または脳血管障害は、アテローム性動脈硬化症、アテローム性冠状動脈の再狭窄、急性冠症候群、心筋梗塞、心臓同種移植片血管症、脳卒中、炎症性またはアポトーシス性成分を伴う中枢神経系障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、神経性虚血及び末梢神経障害からなる群から選択される。
【００４６】
他の実施形態では、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、タキセル、ドセタキセル、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセルまたは当業者に既知の他の任意の抗微小管関連薬を含むがこれらに限定されるものではない、抗微小管薬の投与の前に、それと同時に、またはその後に投与し得る。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は本発明を説明する。実施例の特定の要素は説明の目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本発明の範囲内で同等の方法を開発し、それらの材料を利用することができるであろう。
【００４８】
実施例１
ＭＥＮＡアイソフォームリン酸化ならびに関連試薬及びアッセイ
ＭＥＮＡアイソフォームは差次的にリン酸化する。ＴＭＥＭ（腫瘍転移微小環境）に見られる腫瘍細胞中のＭＥＮＡＩＮＶの分析は、このタンパク質が活発にリン酸化されていることを示している。ＭＥＮＡＩＮＶとＭＥＮＡとの間のリン酸化の相違は、リン酸化アミノ酸が、ＭＥＮＡには存在しないＭＥＮＡＩＮＶに特徴的な１９アミノ酸と関連していることを示唆している。ＭＥＮＡ１１ａを発現する非転移性腫瘍細胞の分析からの同様の観察は、ＭＥＮＡのそのアイソフォームに特徴的な２１アミノ酸も、リン酸化のための標的を表し得ることを示している。重要なことに、（ＭＥＮＡに対する、）ＭＥＮＡアイソフォームの挿入それぞれのリン酸化への影響は、ＭＥＮＡＩＮＶ及びＭＥＮＡ１１ａ配列内のアミノ酸のリン酸化によるだけでなく、及びＭＥＮＡ１１ａ配列に近接している（空間的にまたは隣接する配列において）ＭＥＮＡアミノ酸のリン酸化に影響を及ぼし得る。
【００４９】
ＭＥＮＡＩＮＶ及びＭＥＮＡ１１ａ挿入に関連するか、またはそれに近接する、潜在的アミノ酸残基のうちのどれがリン酸化され得るかを判定するために、一連の組換えＭＥＮＡＩＮＶ及びＭＥＮＡ１１ａ構築物を作製して、修飾ＭＥＮＡアイソフォームバリアントを発現させ、候補残基をリン酸化できないアミノ酸に変化させる。一例では、アラニンは、類似のＲ基を有するが、ホスホリル転移に必要なヒドロキシル基を欠くアラニンで置換されている。他の例では、チロシンはフェニルアラニンで置換されてもよい。トレオニンは、リン酸化を阻止するためにアラニンまたはアスパラギンのいずれかで置換されてもよい。そのような変異体を生成するための材料及び方法は当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（商標）Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｒｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）、及び  ｔｈｅ  Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａ  ｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を参照のこと）。修飾ＭＥＮＡＩＮＶ及びＭＥＮＡ１１ａバリアントタンパク質をリン酸化する腫瘍細胞抽出物の能力を調べた。リン酸化レベルが有意に低下したバリアントは、腫瘍細胞キナーゼ（複数可）によりリン酸化される標的アミノ酸（複数可）を表す。そのような腫瘍細胞キナーゼは、ＭＥＮＡアイソフォームキナーゼと考えられ得る。
【００５０】
マウスＭＥＮＡ  Ｓｅｒ１２５リン酸化残基１１７〜１３３を含有し、ＫＬＨ（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｄｅｎｖｅｒ，  ＰＡ）にコンジュゲートしたペプチドを動物に注射して、ＭＥＮＡ／ＭＥＮＡＩＮＶにおけるＳｅｒ１２５／Ｓｅｒ１４４リン酸化部位に特異的な抗リン酸化ＭＥＮＡ抗体を産生させた。Ａｒｃｈｕｌｅｔａらのプロトコール（Ａｒｃｈｕｌｅｔａ，  Ｓｔｕｔｚｋｅ，  Ｎｉｘｏｎ，  及びＢｒｏｗｎｉｎｇ，  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｔｏ  ｍａｋｅ  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｗｏｒｋ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７１７：６９−８８，  ２０１１）に従って、ｐＳｅｒ１２５ＭＥＮＡ抗体の精製を行った。精製のために使用したペプチド（リン酸化ペプチド：Ａｃ−ＣＫＫＧＰＴＬＰＲＱＮ（ｐＳ）ＱＬＰＡＱＶＱＮ（配列番号３２）及び脱リン酸化：ＣＫＫＧＰＴＬＰＲＱＮＳＱＬＰＡＱＶＡＮ（配列番号３２））を、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）  及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ、からそれぞれ入手した。製造元の指示に従って、ペプチドをＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にカップリングさせた。血清を、脱リン酸化ペプチドを含むカラムに、次いでリン酸化ペプチドを含むカラムに順次通した。第二カラムに結合した抗体は、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて溶出した。
【００５１】
ＭＥＮＡ及び／またはＭＥＮＡアイソフォームのリン酸化は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＭＡＰＫ／ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路からのＭＥＮＡキナーゼ阻害剤によって阻害する。ＡＴＰ競合ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２阻害剤ＰＦ−３６４４０２２（（１０Ｒ）−９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−１０−メチル−３−（６−メチル−３−ピリジニル）−８Ｈ−［１，４］ジアゼピノ［５’，６’：４，５］チエノ［３，２−ｆ］キノリン−８−オン水和物）（ＴＯＣＲＩＳ，  Ｂｒｉｓｔｏｌ，  ＵＫ）、ＡＴＰ非競合ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２  Ｈａｙｅｓｓ及びＢｅｎｎｄｏｒｆ  ＨＳＰ２５ペプチドキナーゼ阻害剤（ＫＫＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０））（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）、ｐ３８ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（５−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］−３−（２，２−ジメチルプロピル）イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン；メタンスルホン酸）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）、ＡＴＰ非競合ＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）、及びＰｉ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（２−モルホリン−４−イル−８−フェニルクロメン−４−オン）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，  Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）をそれぞれ、ＭＥＮＡ及びＭＥＮＡＩＮＶのＳｅｒ１２５及びＳｅｒ１４４のＭＥＮＡキナーゼ依存性リン酸化を阻止する能力について、変異型ＭＶＤ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株それぞれにおいて、インビトロで評価した。ＭＥＮＡ／ＭＥＮＡＩＮＶのＳｅｒ１２５／Ｓｅｒ１４４におけるリン酸化に特異的なＭＥＮＡ抗体を用いた定量的免疫ブロットアッセイによって、リン酸化を測定した。ＭＥＮＡキナーゼを、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて処理し、活性化した。これらの条件下で、ＭＥＮＡはＳｅｒ１２５においてＭＥＮＡキナーゼ依存性リン酸化を受け、ＭＥＮＡＩＮＶはＳｅｒ１４４においてＭＥＮＡキナーゼ依存性リン酸化を受ける。市販のリン酸化特異的ＨＳＰ２７抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｌｉｎｇ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）を用いて、内部標準としてＨＳＰ２７のＭＥＮＡキナーゼ依存性リン酸化を監視した。
【００５２】
図２に示すように、ｐＳｅｒ１２５特異的抗体は、非リン酸化ＭＥＮＡ／ＭＥＮＡＩＮＶとリン酸化ＭＥＮＡ／ＭＥＮＡＩＮＶとを明確に区別する。「培地」と表示されたレーンと「砒酸ナトリウム」と表示されたレーンにおける抗体結合の程度の比較は、ＭＥＮＡＩＮＶを発現するように遺伝子操作した組換えマウス胚性線維芽細胞ＭＶＤ７細胞株（ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ）において、ｐＳｅｒ１２５  ＭＥＮＡ抗体は、ＭＥＮＡＩＮＶのリン酸化が最小の細胞（「培地」）由来のタンパク質においてシグナルをほとんど生成しないことを示している。この同じ細胞は、ＭＥＮＡＩＮＶのリン酸化可能部位を化学的に修飾するために砒酸ナトリウム（浸透圧ストレス誘導剤）で処理すると、ｐＳｅｒ１２５  ＭＥＮＡ抗体でプローブした場合に、異なるシグナルを生成する。ＭＥＮＡＩＮＶのＳｅｒ１４４部位は、ＭＥＮＡのＳｅｒ１２５に相当し、位置の違いは単にＭＥＮＡＩＮＶ中のＩＮＶエクソンの存在によるものである。ｐＳｅｒ１２５  ＭＥＮＡ抗体は、それがＭＥＮＡのＳｅｒ１２５位置に結合するのと同様に、ＭＥＮＡＩＮＶのＳｅｒ１４４位置に結合する。さらに、図２における非刺激及び非処理（培地）と刺激された非処理（０）サンプルとの比較は、ＴＮＦ−αによる細胞の刺激もまた、ＭＥＮＡＩＮＶのリン酸化を上昇させることを示す。図２に示すように、ｐ３８ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（１ｕＭ、レーン「Ｐ３８−Ｌｙ８２０  １ｕＭ」）、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＰＦ−３６４４０２２（１０ｕＭ、レーン「Ｐｆｉｚｅｒ１０ｕＭ」）、及びＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１ｕＭ、レーン「ＥＲＫ１／２−ＰＤ−１ｕＭ」）を用いて刺激細胞を処理すると、ＭＥＮＡＩＮＶリン酸化のレベルが有意に低下する。
【００５３】
図３はこの観察を確認し、図２の阻害剤のパネルを拡大して、Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（それぞれ１及び１０ｕＭ、レーン「Ｐ３８−Ｌｙ８２０  １ｕＭ」及び「Ｐ３８−Ｌｙ８２０  １ｕＭ」）、及び５０、１００、及び３００ｕＭのＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチド、所定阻害剤濃度で「Ｈ＆Ｂ」と表示されたレーン、を含むようにする。図４に示すように、ＭＥＮＡＩＮＶを発現するように操作したヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−１２３細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ）は、明らかにＳｅｒ１４４のリン酸化レベルが上昇したことを表し、これは上記の抗体を用いて検出でき、非刺激及び非処理の細胞由来のタンパク質を含有する（０）レーンに示す通りである。「Ｐｌ３Ｋ−Ｌｙ０２−１０ｕＭ」と表示されたレーンは、１０ｕＭのｐ３８  ＭＡＰＫキナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０で処理した刺激細胞由来のタンパク質である。「ＰＩ３Ｋ−Ｌｙ０２−１０ｕＭ」及び「ＰＩ３Ｋ−Ｌｙ０２−１ｕＭ」と表示されたレーンは、それぞれ１０ｕＭ及び１ｕＭのＰｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２で処理した刺激細胞由来のタンパク質を含む。「Ｐｆｉｚｅｒ  １０ｕＭ」と表示されたレーンは、１０ｕＭのＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＰＦ−３６４４０２２で処理した刺激細胞由来のタンパク質を含む。ＥＲＫ１／２−ＰＤ−１ｕＭと表示されたレーンは、１ｕＭのＭＥＫ１／ＭＥＫ２阻害剤ＰＤ０３２５９０１で処理した刺激細胞由来のタンパク質を含み、「Ｈ＆Ｂ」と表示されたレーンは、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤である所定濃度のペプチドＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）で処理した刺激細胞由来のタンパク質を含む。
【００５４】
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡアイソフォーム組換え細胞株の細胞拡散を制限する。ＭＥＮＡＩＮＶ組換え型ＭＶＤ７（ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ）細胞株の細胞拡散を制限する上記の種々のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の能力を、細胞拡散アッセイを用いて評価した。このアッセイは、図５に示す濃度のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を用いてまたは用いないで、１時間細胞株を前処理することを伴っていた。前処理後、ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞をフィブロネクチンに付着させて２０分間拡散させた。２０分後、細胞を固定し、透過処理し、ファロイジンで染色してアクチンフィラメントを可視化した。ｉｍａｇｅＪソフトウェアを使用して画像を取得し、分析した（ａｎｏｖａ、ｎ＝５）。図６に示すように、処理群を対照ＭＶＤ７−ＧＦＰ細胞と比較し、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を用いた平均としてプロットした。
【００５５】
図５パネル（ｃ）に示すＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞は、ＭＶＤ７−ＧＦＰ  ＭＥＮＡ欠損対照に対してもリン酸化不能ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ（Ｓｅｒ１４４Ａ）細胞（図５、パネル（ａ）及び（ｂ）それぞれ）に対しても観察されなかったＭＥＮＡ依存性の拡散及び接着表現型を示した。所定濃度でのＭＥＮＡキナーゼ阻害剤とのインキュベーション後に、ＭＥＮＡ依存性の拡散及び接着表現型の統計的に有意な減少が観察された（図６）。ＭＥＮＡ依存性の拡散及び接着表現型の統計的に有意な減少は、すべてのＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を用いて生じた（図６）。ＭＥＮＡ欠損とＭＥＮＡ  Ｓｅｒ１２５Ａリン酸化不能変異体陰性対照との間には、拡散及び接着について統計的に有意な差はなかった（図６）。
【００５６】
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ依存性原線維形成を逆転させた。ＭＥＮＡ依存性原線維形成を逆転させる上記の種々のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の能力を、ＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞株を用いたフィブロネクチン原線維形成アッセイにおいて評価した。細胞をＭＥＮＡキナーゼ阻害剤で図８に示す濃度で１時間前処理し、標識化フィブロネクチンを補足したフィブロネクチン枯渇血清を含有する培地中で培養した。４時間後、フィブロネクチンフィブリル形成を、定量的免疫染色により、ｉｍａｇｅＪソフトウェアを使用してフィブリルフィブロネクチンの存在量及び分布を測定して（ａｎｏｖａ、ｎ＝３）評価した。結果を、図８において、対照ＭＶＤ７−ＧＦＰ細胞に対してプロットした。
【００５７】
非処理のＭＶＤ７−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞は、かなりの量のフィブリルフィブロネクチンを集合させる（図７、パネル（ａ））。しかし、ＭＶＤ７−ＧＦＰ細胞及びリン酸化不能変異体ＭＥＮＡＩＮＶ（Ｓｅｒ１４４Ａ）（それぞれ図８及び図７パネル（ｂ））は、有意な量のフィブロネクチンを集合させることができない。ＭＥＮＡ依存性フィブロネクチン原線維形成表現型の用量依存的減少は、１００及び３００ｕＭの濃度のＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）ペプチドで、濃度が増加する場合に観察された（図７、パネル（ｇ）及び図８）。試験した全てのＭｅｎａキナーゼ阻害剤について、ＭＥＮＡ依存性フィブロネクチン原線維形成表現型の統計的に有意な減少が観察された。Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２キナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１、及びＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）は、ＭＥＮＡ欠損対照と比較して、ＭＥＮＡ依存性フィブロネクチン原線維形成表現型を有意に減少させた（図８）。ＭＥＮＡ欠損陰性対照とＭＥＮＡ  Ｓｅｒ１４４Ａリン酸化不能変異体との間には、フィブロネクチン沈着について統計的に有意な差はなかった。
【００５８】
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、創傷治癒アッセイにおいてＭＥＮＡ依存性細胞遊走を阻止する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞のＭＥＮＡ依存性細胞遊走を阻止する上記の種々のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の能力を、ＣｙＳｅｌｅｃｔ創傷治癒アッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いてアッセイした。製造元のプロトコールに従って、単層が創傷インサートの周囲に形成されるまで、細胞をフィブロネクチンコーティングウェル中で培養した。次いでインサートを除去し、細胞を、完全に補足された培地中で図９の所定濃度の阻害剤の存在下で培養した。１８時間後、細胞を固定し、染色し、インサートにより生じた創傷を閉じる能力を蛍光顕微鏡により評価した。
【００５９】
図９に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞は、完全に補足された培地中でＭＥＮＡ依存性浸潤表現型を示す（パネル（ｂ））。完全補足培地中で増殖させた細胞にＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を添加すると、創傷治癒アッセイにおいて乳癌細胞株が移動する能力が低下する（パネル（ｃ）  −  （ｈ））。パネル（ａ）は処理開始時の創傷サイズを表す。薬物を含まない完全補足培地中で一晩培養した細胞（パネル（ｂ））は創傷の５０％を閉じることができた。Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０ｕＭ）の添加は、わずか１５％の創傷閉鎖をもたらした（パネル（ｃ））。ｐ３８  ＭＡＲＫキナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（１０ｕＭ）は、わずか２０％の閉鎖をもたらした（パネル（ｄ））。ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＰＦ−３６４４０２２（１０ｕＭ）は、創傷閉鎖を１０％まで減少させた（パネル（ｅ））。ＭＥＫ１／ＭＥＫ２キナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１ｕＭ）は、創傷閉鎖を１５％まで減少させた（パネル（ｆ））。ＭＡＰＫＡＰＫ２  ／  ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）は、３００ｕＭで使用した場合、創傷閉鎖を創傷の１５％まで減少させた（パネル（ｈ））。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＥＮＡ依存性細胞浸潤及び走化性を阻害する。ＭＤＡ−ＭＢ−１２３−ＭＥＮＡＩＮＶ腫瘍細胞浸潤を阻害する上記の種々のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の能力を、ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤チャンバーアッセイ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，  ＭＡ）を用いて試験した。製造元のプロトコールに従って、ＭＤＡ−ＭＢ−１２３−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞を、図１０の所定濃度の阻害剤で１時間前処理した後、マトリゲルマトリックス膜インサートの層上に播種した。インサートを、基本培地（陰性対照）及び化学誘引物質ＥＧＦを含有するウェルに、各ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を添加してまたは添加せずに移した。１８時間後、膜の下部細胞表面に侵入した細胞を固定し、染色し、そしてｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いた定量的免疫染色により評価した。ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３）を用いてデータを分析し、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の非存在下における陰性対照ＥＧＦ刺激細胞（０）と比較して報告した。図１０に平均及び平均の標準誤差としてプロットした。
【００６０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞は、全ての内因性ＭＥＮＡ発現が、ＣＲＩＳＰＲに基づく手法を用いて細胞株から削除されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ΔＭＥＮＡ細胞株と比較して、ＥＧＦを含有する基本培地中で侵襲性及び走化性表現型を示す（図１０）。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を添加する場合、マトリゲルインサート膜を通ってＥＧＦ化学誘引物質に侵入するＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞の相対数が有意に減少する。Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０ｕＭ）（Ｐ＜０．０２８）、ｐ３８  ＭＡＲＫキナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（１０ｕＭ）（Ｐ＜０．０１９）、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＰＦ−３６４４０２２（１０ｕＭ）（Ｐ＜０．０４０）、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２  ＰＤ０３２５９０１（１ｕＭ）（Ｐ＜０．０４０）、及びＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）（１００及び３００ｕＭ）（それぞれＰ＜０．０１９及びＰ＜０．０２０）を用いたインキュベーションの効果を、図１０に示す。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞におけるＭＥＮＡ依存性浸潤表現型を、陰性対照である基本培地のみで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ（基本培地）と同様のレベルまで有意に逆転させた。
【００６１】
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、ボイデンチャンバーアッセイにおけるＭＥＮＡ依存性細胞遊走及び走化性を逆転させる。ＭＤＡ−ＭＢ−１２３−ＭＥＮＡＩＮＶ腫瘍細胞を、上記のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤で１時間前処理し、Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ。）のフィブロネクチンコーティング８ｕｍ孔ポリカーボネート膜インサートに充填した。次に、フィブロネクチンコーティングチャンバーを、基本培地（陰性対照）、ＥＧＦ、及び図１１の所定濃度のＭＥＮＡキナーゼ阻害剤を含むウェルに移した。基本陰性対照を除くすべての処理条件において、化学誘引物質としてＥＧＦを使用した。１８時間後、孔を通って化学誘引物質に向かって遊走した細胞を、上記のｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量的免疫染色によって評価した。ＡＮＯＶＡ（ｎ＝２）を用いてデータを分析し、図１１に平均の誤差を伴う平均として、阻害剤を全く含まないＥＧＦ刺激細胞陽性対照（０）と比較して報告した。
【００６２】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞は、ＥＧＦを含有する基本培地中で、遊走及び走化性ＭＥＮＡ依存性表現型を示す。この表現型は、同様の実験条件を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ΔＭＥＮＡ及びリン酸化不能ＭＥＮＡ−Ｓｅｒ１４４Ａ細胞株では観察されなかった（図１１）。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の添加により、フィブロネクチンコーティングインサート膜を通ってＥＧＦ化学誘引物質に向かって遊走したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞の相対数が、有意に減少した。Ｐｉ３Ｋキナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（１０ｕＭ）（Ｐ＜０．０２８）、ｐ３８  ＭＡＲＫキナーゼ阻害剤ＬＹ２２２８８２０（１０ｕＭ）（Ｐ＜０．００１８）、ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＰＦ−３６４４０２２（１０ｕＭ）（Ｐ＜０．００１８）、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２キナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１（１ｕＭ）（Ｐ＜０．００３１）及びＭＡＰＫＡＰＫ２／ＭＫ２キナーゼ阻害剤ＫＫＫＡＬＨＲＱＬＧＶＡＡ（配列番号３０）  １００及び３００ｕＭ（Ｐ＜０．０００４）、（Ｐ＜０．０００４）を用いたインキュベーションは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶ細胞におけるＭＥＮＡ依存性浸潤表現型を、陰性対照である基本培地のみで処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＭＥＮＡＩＮＶと同様のレベルまで有意に逆転させた。
【００６３】
実施例２
小分子ＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤の同定
小分子ＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤は、実施例１に記載したのと同じ（または同類の）インビトロアッセイのパネルを使用して同定する。ＭＥＮＡキナーゼの小分子阻害剤を同定するために、アミノシアノピリジン、ピラゾロピリミジン、ピロロピリジン、カルボリン、ピロロピリミドン、及びＣＭＰＤ１のなどの既知のプロテインキナーゼ阻害剤構造（足場）に基づく化合物の市販のコンビナトリアルケミカルライブラリーからの単一分子または分子プールを、上記のアッセイを使用して、それぞれのＭＥＮＡアイソフォーム基質のリン酸化を低下させるそれらの能力についてアッセイする。そのような方法は、当業者には周知である（ｏｎ  Ｏｈｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｏｍｅｒ，  ２００５，  Ｗａｎｇ及びＭａ，  ２０１５によって概説されている）。潜在的なキナーゼ阻害剤のライブラリーは市販されており（ＳＹＮｋｉｎａｓｅ，  Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａを参照のこと）、商業的サービス（例えば、Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１に記載されているＫｉＮａｔｉｖ（商標）サービス）の下でスクリーニングを行うことができる。アッセイにおいて同定された阻害剤は、当該技術分野において周知の方法により修飾して、それらの阻害特性を最適化し、薬効を改善することができる。最も有利な阻害剤プロファイルを示すものを、下記のさらなるインビボ試験のために選択する。
【００６４】
実施例３
ＭＥＮＡアイソフォームキナーゼペプチド阻害剤の同定
ペプチドＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤は、実施例１に記載したのと同じ（または類似の）インビトロアッセイのパネルを使用して同定する。配列番号１４〜２９を含むペプチドをアッセイし、本明細書中のさらなる実施例に記載されたさらなるインビボ試験のために最良の阻害剤プロファイルを有するものを選択する。
【００６５】
実施例４
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤はインビボＰｙＭＴマウスモデルにおいて転移性がんの発生率を低下させる
（Ｈａｒｎｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５によって詳細に記載されている、）ＰｙＭＴマウス乳癌モデルにおける転移を減少させるＭＥＮＡキナーゼ阻害剤の能力は、有効量の阻害剤を、以前に樹立された異種移植腫瘍を有するマウスに投与することによってアッセイする。阻害剤の適切な用量は、当該分野において周知の方法によって決定し得る。これらの実験では、循環腫瘍細胞の基準レベル及び腫瘍細胞播種を樹立し、次いでＭＥＮＡキナーゼ阻害剤をマウスに投与する。転移部位、循環腫瘍細胞数、及び肺転移のその後の変化を監視する。転移部位、循環腫瘍細胞数、及び肺転移のレベルの低下は、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が既存の転移性腫瘍におけるがん転移を減少させることを示している。
【００６６】
追加の実験を実施して、腫瘍転移を抑制するためのＭＥＮＡＩＮＶキナーゼ阻害剤の有効性を判定する。これらのさらなる実験には、異種移植腫瘍の導入前のＭＥＮＡＩＮＶキナーゼ阻害剤による対象マウスの処置、及び腫瘍発生の過程を通じての転移部位密度及び循環腫瘍細胞のレベルの判定が含まれる。対応する非処置対照マウスにおいて樹立された基準数に対する転移部位密度及び腫瘍細胞循環の減少は、ＭＥＮＡ１１ａキナーゼ阻害剤が転移表現型の樹立を効果的に阻害することを示している。
【００６７】
実施例５
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤は、マウスモデルにおいて転移性がんの発生率を低下させる
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、ヒトトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を移植したｎｏｄ／ｓｋｉｄマウスにおいて転移を減少させる能力（Ｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７により詳細に記載されている）を判定する。これらの実験は、転移性病変と血液の存在を考慮せず循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の数の増加について臓器を評価することを伴う。循環腫瘍細胞及び肺転移のレベルの低下は、ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤が、がん転移を減少させることを示している。
【００６８】
実施例６
ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤とパクリタキセルとの組合わせ治療は、パクリタキセル感受性を回復させパクリタキセル誘発腫瘍細胞播種を減少させる
タキサンの使用を含む細胞傷害性化学療法は、進行がん及びトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）などの侵攻性がんの治療のための標準的な治療法であり続けている。細胞傷害性化学療法に関連する利点にもかかわらず、奏効率は低い場合があり、例えばＴＮＢＣは治療の１年以内に耐性になる場合がある。パクリタキセルによる治療も腫瘍細胞の播種を誘発する場合がある。パクリタキセルなどのタキサンは、微小管を安定化させ、分裂中期の間の分解を阻害して有糸分裂停止及び細胞死を引き起こすことによって分裂期細胞死をもたらす。ＭＥＮＡＩＮＶ発現は、パクリタキセル処理した腫瘍細胞における動的及び安定微小管集団の比率を変化させる。ＭＥＮＡ発現はまた、パクリタキセル治療に応答してＭＡＰＫシグナル伝達を増加させる。ＭＥＮＡキナーゼ阻害剤との併用治療によるＭＥＮＡＩＮＶのリン酸化の減少によって、微小管安定化が促進されて、パクリタキセル感受性を回復することができる。
【００６９】
実施例７
ＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤とゲフィチニブとの組合わせ治療は、ゲフィチニブに対する自然発生的耐性を低下させる
ＥＧＦＲ特異的ＴＫＩ、ゲフィチニブは、多くのがん、特に非小細胞肺癌の初期治療に有効であるが、ＥＧＦＲ内または補助受容体経路内の互助的突然変異のためにしばしば効力を失う［Ｋｏｓａｋａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１に概説されている］。本発明の実施における好適な他の薬物としては、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（エルロチニブ）、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）、Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）（ラパチニブ）、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（登録商標）（カボザンチニブ）、Ｘａｌｋｏｒｉ（登録商標）（クリゾチニブ）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）、及びＧｉｏｒｅｉｆ（登録商標）（アファチニブ）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の実施における使用に適している現在開発中の薬物としては、チバンチニブ（ＡＲＱ１９７）、リロツムマブ（ＡＭＧ１０２）、ＡＭＧ４７９（ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤）、ＡＭＧ３３７（ｃ−ＭＥＴ阻害剤）、フィクラツズマブ（ＡＶ−２９９）、チバンチニブ（ＡＲＱ１９７）及びオナルツズマブ（ｃ−ＭＥＴ阻害剤）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＴＰ１ｂキナーゼ／デホスホリラーゼをＥＧＦＲに動員することにおけるＭＥＮＡの役割［Ｈｕｇｈｅｓ、ｅｔ  ａｌ．、２０１５を参照のこと］は、ＥＧＦＲのリン酸化を、ゲフィチニブにより直接的にかつＭＥＮＡを介して間接的に調節する組み合わせ効果により、ゲフィチニブに対する自然発生的耐性の発生率が低下し得ることを示唆する。ゲフィチニブに対する自然発生的耐性の発生率を低下させるためのＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤の能力を試験するために、ゲフィチニブ及びＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤を、上記のように異種移植腫瘍の樹立後に個々に及び組み合わせて、ＰｙＭＴマウス乳癌モデルマウスに投与する。転移部位密度及び循環腫瘍細胞のレベルは、腫瘍発生の過程を通して監視する。ゲフィチニブまたはＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤単独を投与したマウスと比較して、ゲフィチニブ及びＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤の両方を投与したマウスにおける全体的な転移部位密度及び循環腫瘍細胞の有意な減少は、組合わせ療法が有効であることを示す。転移部位発生の動態及び循環腫瘍細胞の観察されたレベルは、ゲフィチニブ耐性の発生を遅らせるためのＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤の能力に対する洞察を提供する。ゲフィチニブのみを投与したマウスと比較して、組合わせ療法を投与されたマウスにおける有意な転移部位発生レベル及び循環腫瘍細胞の増加の有意な遅延は、ＭＥＮＡアイソフォームキナーゼ阻害剤がゲフィチニブ耐性の発生を抑制することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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