(57)【要約】  本発明は、オジギソウの未分化細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物から得られる調製物、ならびにその調製方法、該調製物を含んでなる美容組成物または皮膚科学的組成物、および炎症性皮膚障害の処置のための、環境汚染により引き起こされる酸化ストレスの処置における抗酸化剤としての、また抗老化剤としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有するオジギソウ細胞抽出物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製のための方法であって、以下の工程：
ａ．オジギソウの無菌植物材料の準備工程、
ｂ．前記植物材料からの細胞の脱分化工程、
ｃ．未分化細胞を未分化状態で維持するための液体培地中での未分化細胞の懸濁培養工程、
ｄ．前記培養培地中での未分化細胞バイオマスの増殖培養工程、
ｅ．増殖の停止および５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する細胞抽出物の取得工程、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記オジギソウ植物材料が、葉、茎、葉柄、根、種子、花および蕾からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脱分化の工程ｂ）が、１以上の成長因子を含有する固体培地上で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記１以上の成長因子が、オーキシン、サイトカイン、ジベレリンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるホルモンを含むものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脱分化細胞のカルスを得るために、脱分化の工程ｂ）が繰り返される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）が、１以上の成長因子を含有する液体培地で行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１以上の成長因子が脱分化培地のものと同じものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増殖培養の工程ｄ）が、連続継代培養または液体培養培地での希釈により一定細胞密度が得られるまで行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
以下の付加的工程：
ｆ．液体／固体分離工程、
ｇ．５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する培養培地から分離されたバイオマスからなる細胞抽出物の回収工程、
を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下の付加的工程：
ｆ．液体／固体分離工程、
ｇ．５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する培養培地の液相からなる細胞抽出物の回収工程、
を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
抽出物を破砕し、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する破砕細胞材料を回収する付加的工程を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
得られた破砕材料の液体／固体分離が行われ、次いで、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する細胞抽出物としての液相の回収が行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
得られた破砕材料の液体／固体分離が行われ、次いで、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する細胞抽出物としての細胞残屑の固相の回収が行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程ｃ）および／または工程ｄ）の培養培地が、フェニルアンモニアリアーゼ基質を含有するものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記フェニルアンモニアリアーゼ基質が、フェニルアラニン、特にＬ−フェニルアラニン、桂皮酸、アスパラギン酸、グルタミン酸およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
得られた抽出物が、少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸を含有する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｎ−フェニルプロペノイルアミノ酸が、
Ｐ１：１−Ｏ−（４−クマロイル）−β−Ｄ−グルコース
Ｃ１５Ｈ１８Ｏ８
【化１】
2019518051.tif 000022
Ｐ２：Ｎ−ｐ−クマロイルアスパラギン酸またはアスパラギン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシシンナモイル）
Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ６
【化２】
2019518051.tif 000023
Ｐ３：Ｎ−シス−（ｐ−クマロイル）グルタミン酸またはグルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシ−Ｚ−シンナモイル）
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ６
【化３】
2019518051.tif 000024
Ｐ５：４−ヒドロキシシンナミド
Ｃ９Ｈ９ＮＯ２
【化４】
2019518051.tif 000025
Ｐ６：グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−シンナモイル
Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ５
【化５】
2019518051.tif 000026
およびそれらの混合物、
からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
乾燥重量５ｎｇ／ｇ未満のミモシン含量を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、オジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養抽出物。
【請求項１９】
ミモシン含量が５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満である、オジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養抽出物。
【請求項２０】
少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸を含有する、請求項１８または１９に記載の抽出物。
【請求項２１】
前記少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸が、
Ｐ１：１−Ｏ−（４−クマロイル）−β−Ｄ−グルコース
Ｃ１５Ｈ１８Ｏ８
【化６】
2019518051.tif 000027
Ｐ２：Ｎ−ｐ−クマロイルアスパラギン酸またはアスパラギン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシシンナモイル）
Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ６
【化７】
2019518051.tif 000028
Ｐ３：Ｎ−シス−（ｐ−クマロイル）グルタミン酸またはグルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシ−Ｚ−シンナモイル）
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ６
【化８】
2019518051.tif 000029
Ｐ５：４−ヒドロキシシンナミド
Ｃ９Ｈ９ＮＯ２
【化９】
2019518051.tif 000030
Ｐ６：グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−シンナモイル
Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ５
【化１０】
2019518051.tif 000031
およびそれらの混合物、
からなる群から選択される、請求項２０に記載の抽出物。
【請求項２２】
抽出物中の少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸の総含量が、１〜５０μｇ／ｇ乾燥バイオマスである、請求項２０または２１に記載の抽出物。
【請求項２３】
前記細胞が未分化細胞である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２４】
炎症性皮膚障害の処置において使用するための、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２５】
胸腺間質性リンパ球新生因子の阻害剤として使用するための、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２６】
前記炎症性皮膚障害が、アトピー性皮膚炎、掻痒症および掻痒症のためのかゆみ、湿疹ならびに乾癬から選択されるものである、請求項２４に記載の抽出物。
【請求項２７】
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物を含んでなる、胸腺間質性リンパ球新生因子の阻害剤として使用するための、組成物。
【請求項２８】
アトピー性皮膚炎、掻痒症および掻痒症のためのかゆみ、湿疹ならびに乾癬から選択される炎症性皮膚障害の処置のための、有効量の請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物と少なくとも１種類の皮膚科学的賦形剤とを含んでなる、皮膚科学的組成物。
【請求項２９】
皮膚老化の、および環境汚染による酸化ストレスを含む皮膚酸化ストレスに関連する皮膚障害の美容的処置のための、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物の使用。
【請求項３０】
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物と美容的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含んでなる、美容組成物。
【請求項３１】
請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の抽出物を皮膚科学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含んでなる、皮膚科学的組成物。
【請求項３２】
皮膚老化の、および環境汚染による酸化ストレスなどの皮膚酸化ストレスに関連する皮膚障害の美容的処置のための、請求項３０に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オジギソウの未分化細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物から得られる調製物およびその調製方法；該調製物を含んでなる美容組成物または皮膚科学的組成物；ならびに炎症性皮膚障害の処置のための、環境汚染による酸化ストレスの処置を含み酸化防止剤としての、また抗老化剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
オジギソウは、炎症を処置するためにアジアで数世紀にわたって使用されてきた薬用植物である。オジギソウ（Ｍｉｍｏｓａ  ｐｕｄｉｃａ  Ｌｉｎｎ．）（Ｆａｂａｃｅａｅ）は、その抗糖尿病性（Ｍａｒｌｅｓ  １９９５）、抗鬱性（Ｍｏｌｉｎａ  １９９９）、抗炎症性（Ｐａｔｅｌ  ２０１４）、抗酸性（Ｐａｔｒｏ  ２０１６）および抗菌性（Ｂｈａｋｕｎｉ  １９６９）に関して知られている。オジギソウはまた創傷治癒においても使用される（Ｐａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １（４）：２２３−２２７）。
【０００３】
オジギソウの葉のメタノール抽出物は、テルペン、フラボノイド、グリコシド、アルカロイド、キニーネ、フェノール、タンニン、サポニンおよびクマリンなどの活性分子を含有する（Ｇａｎｄｈｉｒａｊａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。含有されるフェノール分子は強い抗酸化活性を示す（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１．  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎ．  Ｍａｇ  ４：３５−３９）。しかしながら、この植物から単離された主要な分子は、その毒性：ミモシンに関しても注目度が高い。これは非タンパク質性アミノ酸（β−Ｎ（３−ヒドロキシ−４−ピリドン）−α−アミノプロピオン酸）である。ミモシンは動物で食欲減退、脱毛、生殖障害などの有害作用を誘導することが示されている（Ｋｕｌｐ  Ｋ．Ｓ．  １９９６．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  １３９：３５６−３６４）。ミモシンはまた、種子の発芽および培養細胞のＤＮＡ合成を阻害することも示されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．  Ａｌｌｅｌｏｐａｔｈｙ  Ｊ．  １９（２）：４２３−４３０；  Ｓｔｕｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）。ミモシンは、それを食した反芻動物からそれを防御するために植物により合成されると思われる：ミモシンは動物において消化問題を引き起こす。オジギソウの抽出物中のミモシンの存在は、この薬用植物の価格の安定化の限定要因である。一つのアプローチは、それを除去するための精製手段を見出すことにあろうが、このアプローチは方法を込み入らせ、より厳格な監視および従ってより高い製造コストを必要とする。
【０００４】
極性および非極性溶媒を用いた抽出物の調製に関する文献は多数存在する。文献ＫＲ  １０−１０６４８４８には、自己免疫疾患の処置のための、エタノールおよび酢酸エチルなどの有機溶媒を用いた植物からの抽出物が記載されている。
【０００５】
本発明に関して、本出願者は、別の経路、すなわち、未分化の全能性細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養による新規なオジギソウの価格の安定化策を示した。実際に、驚くことに、これらの細胞のバイオリアクター培養はミモシンが有意に除去された調製物の取得を可能とすることが示され、前記調製物は炎症性皮膚障害、酸化ストレス、および皮膚老化の処置に極めて魅力的な特性を有する。これらの特性は、より詳しくは、その方法の間に生物変換工程が行われる場合に驚くべきものであり、この工程はより詳しくは抗酸化活性を増強する新規な代謝産物を産生する。予期されないことに、本出願者は。これらの代謝産物がＮ−フェニルプロペノイル−Ｌアミノ酸（ＮＰＡ）の一部であることを見出した。ＮＰＡは、それ自体既知であり、それらの有利な薬理活性のために非常に珍重されている（Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．  ２００７；  ７３：１４２−１５０；  Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１；  ５９：５３４２−５３５０）。これまで、オジギソウ植物がＮＰＡなどの抗酸化剤を含有することは知られていなかった。
【０００６】
炎症性皮膚病において、皮のアトピー性皮膚炎を有する患者の皮膚病巣では、Ｔｈ２型細胞応答により媒介されるアレルギー性疾患の病因に重要な役割を果たすサイトカインＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子）の過剰発現が見られる（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２．  Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔ．  ６１：３−１７）。ＴＳＬＰは、アトピー性皮膚炎および乾癬にしばしば存在する掻痒の原因となることが記載されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、本発明による方法により得られるオジギソウの植物細胞培養（ＰＣＣ）抽出物が抗酸化活性および抗炎症活性を有し、特に、アトピー性皮膚炎のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでＴＳＬＰの極めて強力な阻害を示すことを初めて実証した。本発明者らは、本発明者らの抽出物においてミモシンの不在下で本発明によるオジギソウのＰＣＣ抽出物は抗炎症薬理活性を保持することも実証する。
【０００８】
本発明の目的である調製物を得るための方法は、オジギソウに由来する植物材料から細胞を脱分化させ、次いで、この植物の高純度、豊富、均質かつ無菌のバイオマスを迅速に得るために懸濁細胞を未分化状態で培養することからなる。細胞培養はこの植物の生合成経路を細胞レベルでより融通のきくものとする。
【０００９】
よって、本発明は、オジギソウの未分化細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に由来する調製物、前記調製を含んでなる美容組成物または皮膚科学的組成物、ならびに美容的および／または皮膚科学的な、より優先的には炎症性皮膚障害の処置のための、環境汚染煙草、化学物質またはアレルゲンによる屋内および屋外の大気汚染）による酸化ストレスの処置を含む抗酸化剤としての、また抗老化剤としてのその使用に関する。
【００１０】
よって、本発明は、下記の工程を含んでなる、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有するオジギソウ細胞抽出物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製のための方法に関する：
ａ．オジギソウの無菌植物材料の準備、
ｂ．前記植物材料からの細胞の脱分化、
ｃ．未分化細胞を未分化状態で維持するための液体培地中での未分化細胞の懸濁培養、
ｄ．前記培養培地中での未分化細胞バイオマスの増殖培養、
ｅ．増殖の停止および５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する細胞抽出物の取得。
【００１１】
特定の実施態様では、本発明による方法は、オジギソウ植物材料は葉、茎、葉柄、根、種子、花および蕾からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１２】
特定の実施態様では、本発明による方法は、脱分化の工程ｂ）が１以上の成長因子を含有する固体培地で行われることを特徴とする。
【００１３】
特定の実施態様では、本発明による方法は、１以上の成長因子がオーキシン、サイトカイン、ジベレリンおよびそれらの混合物からなる群から選択されるホルモンを含むことを特徴とする。
【００１４】
特定の実施態様では、本発明による方法は、脱分化細胞のカルスを得るために脱分化の工程ｂ）が繰り返されることを特徴とする。
【００１５】
特定の実施態様では、本発明による方法は、工程ｃ）が１以上の成長因子を含有する液体培地中で行われることを特徴とする。
【００１６】
特定の実施態様では、本発明による方法は、１以上の成長因子が脱分化培地のものと同じであることを特徴とする。
【００１７】
特定の実施態様では、本発明による方法は、増殖培養の工程ｄ）が連続継代培養または液体培養培地での希釈により一定細胞密度が得られるまで行われることを特徴とする。
【００１８】
特定の実施態様では、本発明による方法は、下記の付加的工程を含んでなることを特徴とする：
ｆ．液体／固体分離、
ｇ．５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する培養培地から分離されたバイオマスからなる細胞抽出物の回収。
【００１９】
別の特定の実施態様では、本発明による方法は、下記の付加的工程を含んでなることを特徴とする：
ｆ．液体／固体分離、
ｇ．５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する培養培地の液相からなる細胞抽出物の回収。
【００２０】
特定の実施態様では、本発明による方法は、抽出物を破砕し、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する破砕細胞材料を回収する付加的工程を含んでなることを特徴とする。
【００２１】
特定の実施態様では、本発明による方法は、得られた破砕材料に液体／固体分離、次いで、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する細胞抽出物としての液相の回収が行われることを特徴とする。
【００２２】
別の特定の実施態様では、本発明による方法、得られた破砕材料に液体／固体分離、次いで、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する細胞抽出物としての細胞残屑の固相の回収が行われることを特徴とする。
【００２３】
特定の実施態様では、本発明による方法は、工程ｃ）および／または工程ｄ）の培養培地がフェニルアンモニアリアーゼ基質を含有することを特徴とする。
【００２４】
特定の実施態様では、本発明による方法は、フェニルアンモニアリアーゼ基質がフェニルアラニン、特に、Ｌ−フェニルアラニン、桂皮酸、アスパラギン酸、グルタミン酸およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする。
【００２５】
特定の実施態様では、本発明による方法は、得られた抽出物が少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸を含有することを特徴とする。
【００２６】
特定の実施態様では、本発明による方法は、Ｎ−フェニルプロペノイルアミノ酸が以下からなる群から選択されることを特徴とする：
Ｐ１：１−Ｏ−（４−クマロイル）−β−Ｄ−グルコース
Ｃ１５Ｈ１８Ｏ８
【化１】
2019518051.tif 000002
【００２７】
Ｐ２：Ｎ−ｐ−クマロイルアスパラギン酸またはアスパラギン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシシンナモイル）
Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ６
【化２】
2019518051.tif 000003
【００２８】
Ｐ３：Ｎ−シス−（ｐ−クマロイル）グルタミン酸またはグルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシ−Ｚ−シンナモイル）
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ６
【化３】
2019518051.tif 000004
【００２９】
Ｐ５：４−ヒドロキシシンナミド
Ｃ９Ｈ９ＮＯ２
【化４】
2019518051.tif 000005
【００３０】
Ｐ６：グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−シンナモイル
Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ５
【化５】
2019518051.tif 000006
およびそれらの混合物。
【００３１】
本発明による方法により得ることができ、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有するオジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養抽出物を提供することも本発明の目的である。
【００３２】
本発明はまた、ミモシン含量が５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満であることを特徴とするオジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養抽出物に関する。
【００３３】
特定の実施態様では、本発明によるオジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養抽出物は、それが少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸を含有することを特徴とする。
【００３４】
特定の実施態様では、本発明による抽出物はまた、少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸が以下からなる群から選択されることを特徴とする：
Ｐ１：１−Ｏ−（４−クマロイル）−β−Ｄ−グルコース
Ｃ１５Ｈ１８Ｏ８
【化６】
2019518051.tif 000007
【００３５】
Ｐ２：Ｎ−ｐ−クマロイルアスパラギン酸またはアスパラギン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシシンナモイル）
Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ６
【化７】
2019518051.tif 000008
【００３６】
Ｐ３：Ｎ−シス−（ｐ−クマロイル）グルタミン酸またはグルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシ−Ｚ−シンナモイル）
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ６
【化８】
2019518051.tif 000009
【００３７】
Ｐ５：４−ヒドロキシシンナミド
Ｃ９Ｈ９ＮＯ２
【化９】
2019518051.tif 000010
【００３８】
Ｐ６：グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−シンナモイル
Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ５
【化１０】
2019518051.tif 000011
およびそれらの混合物。
【００３９】
特定の実施態様によれば、本発明による抽出物は、抽出物中の少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸の総含量(the total content of the extract in at least one N−phenylpropenoyl amino acid)が１〜５０μｇ／ｇ乾燥バイオマス、より優先的には１０および４０μｇ／ｇ乾燥バイオマスであることを特徴とする。
【００４０】
特定の実施態様によれば、本発明による抽出物は、細胞が未分化細胞であることを特徴とする。
【００４１】
本発明のもう一つの目的は、炎症性皮膚障害の処置において使用するための本明細書に記載されるような抽出物に関する。
【００４２】
本発明のもう一つの目的は、胸腺間質性リンパ球新生因子の阻害剤として使用するための本明細書に記載されるような抽出物に関する。
【００４３】
特定の実施態様では、炎症性皮膚障害は、アトピー性皮膚炎、掻痒症および乾癬から選択される。
【００４４】
本発明による抽出物を含んでなる胸腺間質性リンパ球新生因子の阻害剤として使用するための組成物もまた本発明の目的である。
【００４５】
有効量の本発明による抽出物と少なくとも１種類の皮膚科学的賦形剤とを含んでなる、アトピー性皮膚炎、掻痒症および乾癬から選択される炎症性皮膚障害の処置のための皮膚科学的組成物も本発明の目的である。
【００４６】
本発明はまた、皮膚老化の、および環境汚染による酸化ストレスを含む皮膚酸化ストレスに関連する皮膚障害の美容的処置のための、本発明による、および本明細書に記載されるような抽出物の使用に関する。
【００４７】
本発明はまた、本発明による抽出物を美容的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含んでなる美容組成物に関する。
【００４８】
本発明はまた、記載されるような本発明による抽出物を皮膚科学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて含んでなる皮膚科学的組成物に関する。
【００４９】
最後に、本発明はまた、皮膚老化の、および環境汚染による酸化ストレスなどの皮膚酸化ストレスに関連する皮膚障害の美容的処置のための、本発明による組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【発明の具体的説明】
【００５１】
定義
「脱分化」という表現は、細胞を成長点状態、すなわち、未分化細胞の状態、すなわち、それらの形態的特徴を失い、それらが一部であった元の組織の細胞とは生理学的に異なる細胞に戻すことに関する。
【００５２】
本発明の一つの実施態様では、抽出物は、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、より詳しくは４ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、いっそうより詳しくは３ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、なおより詳しくは２ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、またはいっそうより詳しくは１ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のミモシン含量を有する。
【００５３】
よって、オジギソウ細胞の未分化状態での本発明による培養が、事実上ミモシンを欠く抽出物の取得を可能とすることは特に注目に値する驚くべきことであり、この化合物の毒性のために、これが本発明の本質である。
【００５４】
本発明に関して、用語「抽出物」は、培養物の増殖が停止された場合の、液体培養培地に浸漬された未分化オジギソウ細胞から主として構成される培養培地に等しく関する。このような抽出物は１００〜５００ｇ乾燥重量／ｌ、特に１５０〜３５０ｇ／ｌを含有する。この材料は未分化細胞のバイオマスから主として構成される。
【００５５】
本発明による抽出物はまた、前記培養培地の固体画分、すなわち、培養培地から分離された未分化オジギソウ細胞からなるバイオマスに関する。
【００５６】
本発明による抽出物はまた、前記培養培地の液体画分、すなわち、未分化オジギソウ細胞を欠く培養培地に関する。
【００５７】
これらの固体および液体画分は、当業者に周知の液体／固体分離技術によって容易に得ることができ、これは例えば遠心分離、静置、濾過から選択してよい。
【００５８】
本発明による抽出物はまた、破砕された未分化オジギソウ細胞からなってもよい。このような破砕材料は、増殖を停止した後に培養培地を破砕することによって直接得ることができる。よって、このような破砕材料は膜および細胞壁残屑、細胞内容物ならびに培養培地および浮遊化合物および分子を含有する。
【００５９】
特定の実施態様による抽出物を構成するこのような破砕材料は、上記で得られるような未分化オジギソウ細胞、ならびに浮遊化合物および分子からなる培養培地の固体画分を破砕することによって得ることができる。
【００６０】
本発明による抽出物はまた、上記で定義されるような破砕材料の固体画分からなってもよい。このような抽出物は、細胞壁および膜断片ならびに特定の浮遊化合物および分子を含んでなる。
【００６１】
最後に、本発明による抽出物は、未分化オジギソウ細胞を含有する培養培地の固体画分の再懸濁および破砕後の破砕材料の液体画分によって代表されてもよい。
【００６２】
破砕は、例えば、Ｕｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ型ミキサーを用いて、または例えば場合により超音波により補助されるガラスビーズを用いた振盪によるなど、当業者に既知のいずれの手段により行うこともできる。
【００６３】
従って、本発明による抽出物はいくつかの形態を採り得ることが明らかとなる。
【００６４】
好ましくは、本発明による抽出物は、完全な未分化オジギソウ細胞または破砕された未分化オジギソウ細胞を含有する。この抽出物は、５ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、優先的には４ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、優先的には３ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、より詳しくは２ｎｇ／ｇ乾燥重量未満、いっそうより詳しくは１ｎｇ／ｇ乾燥重量未満のそのミモシン含量を特徴とする。
【００６５】
固体画分（完全な細胞または細胞断片）を欠く液体画分からなる本発明による抽出物に関して、ミモシンの量は、５ｎｇ／ｍｌ抽出物未満、優先的には４ｎｇ／ｍｌ抽出物未満、優先的には３ｎｇ／ｍｌ抽出物未満、より詳しくは２ｎｇ／ｍｌ抽出物未満、いっそうより詳しくは１ｎｇ／ｍｌ抽出物未満である。
【００６６】
より一般には、懸濁植物組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養は、それらの細胞の一次代謝または二次代謝に直接的に由来する活性有機化合物を生産するために使用できる。
【００６７】
懸濁植物細胞は、動物細胞培養に関する幹細胞の場合と同じ未分化状態で全能性が維持される。従って、これらの植物細胞は、理論上、完全な植物体に見られる代謝産物を総て産生することができる。脱分化は遺伝的またはエピジェネティック的性質の生合成経路の混乱を生じ、従って、その化学的プロフィールは完全な植物体と得られる細胞株との間で量的および質的に異なる。よって、理論的には、完全な植物体には見られない反応中間体が細胞懸濁液に見られることがあり、その逆もある。これは新たな資源を提供し、潜在的植物化学物質の生物多様性の利用を可能とする。
【００６８】
本発明の目的の一つは、未分化オジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養に由来する調製物に関する。
【００６９】
「未分化」または「脱分化」植物細胞は、いずれの特定の専門化した特徴を持たない、すなわち、自然状態の植物の成長点組織に近い生理状態にある植物細胞も意味する。これらの細胞は、それら自体で、他の細胞に依存せずに生きることができる。
【００７０】
オジギソウ細胞の最初の脱分化は、植物、または葉であれ、葉柄であれ、茎であれ、根であれ、種子であれ、花もしくはその器官であれまたは蕾であれ若い苗条から、より詳しくは種子または葉から採取された、生きている植物材料から得られる。
【００７１】
脱分化細胞を培養するための方法は、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．，  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  １９６２．  Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  １５：  ４７３−４９６  ／  Ｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ，  Ｖｏｌ−１  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｅ．  Ｆ．  Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｍ．  Ｐｕｔｔｏｃｋ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｊ．  Ｇｅｏｒｇｅ  （１９８７）  Ｅｘｅｇｅｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．  Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  Ｗｉｌｔｓ，  ＢＡ１３４ＱＧ  Ｅｎｇｌａｎｄを参照することにより、当業者に既知のいずれからの方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られる。
【００７２】
本発明による抽出物は以下の連続工程を行うことにより得ることができる：
ａ）細胞の脱分化、
ｂ）細胞を未分化生理状態で維持する培養培地を用いた細胞懸濁液の調製、
ｃ）培養培地を用いた増殖培養およびバイオマス生産、
ｄ）特定の実施態様では、培養物の細胞内コンパートメントにおける生物変換による目的代謝産物の富化、
ｅ）抽出物の取得。
【００７３】
調製は、目的が少量のバイオマスを生産することであればエルレンマイヤーフラスコで、または大量にはバイオリアクターで行うことができる。例えば、５００ｍｌの細胞懸濁液を含むエルレンマイヤーフラスコで収穫される平均量は、１７５ｇの乾燥バイオマス（または３５０ｇバイオマス／Ｌ細胞懸濁液）であるが、１０Ｌバイオリアクターで収穫される平均は３０００ｇの乾燥バイオマス（３００ｇ／Ｌバイオマス）である。
【００７４】
培養される種および培養ストレスに対するそれらの感受性に応じて、組織成長および二次代謝産物の生産を向上させるために異なるタイプのバイオリアクターを使用することができる。バイオリアクターで植物細胞を培養するためには３つの主要な様式が見られる：
１．不連続または回分培養、
２．再充填／収穫または流加培養および
３．連続培養。
【００７５】
植物材料滅菌工程：
オジギソウ外植体、より詳しくは種子を採取し、７０％エタノール溶液、次いで、次亜塩素酸ナトリウムもしくはカルシウム溶液または塩化水銀溶液で室温にて数分間清浄化する。これらの組織を無菌蒸留水ですすぎ、その後、清浄化の終了時に無菌蒸留水で少なくとも１回洗浄する。
【００７６】
細胞脱分化工程
種子を使用する場合には、それらを清浄化し、ショ糖および成長因子を添加したムラシゲ・スクーグ栄養寒天培地で発芽させる。後者は外植体の細胞機構を、細胞分裂を刺激し、脱分化細胞塊またはカルスを生産する（カロゲネシス）ようにしむける。得られたカルスを３〜４週間ごとに新鮮な脱分化栄養培地に移植する。実際に、この寒天培地の特定の成分はカルスにより代謝され得るか、または空気の作用によって分解され得る。
【００７７】
当業者はまた、例えば、未分化細胞を得るために、葉からの外植体などの分化組織を用いてもよい。
【００７８】
一般に、迅速な脱分化および液体培地への以降を促進する砕けやすいカルスの形態での旺盛な細胞倍加（カロゲネシス）を得るためには、オーキシン（ピクロラムまたは４−アミノ−３，５，６−トリクロロ−２−ピリジンカルボン酸）およびサイトカイニン（カイネチン）などの成長因子に基づくホルモン組成が試験で好結果を得ている。滅菌した種子を、８ｇ／Ｌ寒天、１．５ｍｇ／Ｌカイネチンおよび２ｍｇ／Ｌ  ４−アミノ−３，５，６−トリクロロ−２−ピリジンカルボン酸（ピクロラム）を添加した３０ｇ／Ｌショ糖の培地から構成され、ｐＨ６に調整した後に１２１℃で２０分間オートクレーブ処理（１バール）を行った寒天培地と接触させて置くことができる。種子を含むペトリ皿を暗所、２８℃でインキュベートする。最初のカルスは数日、特に、２週間に現れる。得られたカルスを３〜４週間ごとに、約２〜３ｃｍの大きさを維持するようにメスでカルスを分割することによって新鮮培地に移植する。砕けやすいカルスを得るために、これらの移植を約数週間、またはさらには数ヶ月、例えば、６〜８か月続ける。
【００７９】
培養培地中で細胞懸濁液を調製する工程
寒天培地でのカルスの連続移植による細胞の脱分化は、砕けやすいカルスの形成をもたらす。この細胞間の密着の低下は、植物によって２か月〜６か月で起こり得る脱分化の結果である。この状態は、誘発される機械的ストレスを最小にしつつ細胞懸濁液中でカルスの崩壊を保証するので、液体培地への移行に有利である。よって、砕けやすいカルスの集合物は、ゲル化剤を含まないこと以外は脱分化寒天培地と同じ配合を用いて調製された液体栄養培地に導入する（１０〜２０体積％）。
【００８０】
従って、砕けやすいカルスは、数日間振盪台の働きによって液体培地中で崩壊され、得られた細胞懸濁液は、崩壊を受けていないカルス部分が無くなり、このようにして均質な細胞懸濁液が生じる。この懸濁液を培養して十分に高密度の細胞集団を得る。この段階で、懸濁液を新鮮な栄養培地で（継代培養または）希釈し、同様に培養する。
【００８１】
最初の細胞懸濁液は、約２０〜４０ｇの砕けやすいカルスを、２００ｍｌの培地を含有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れることによって調製することができる。砕けやすいカルスは、暗所、２９℃、１１５ｒｐｍで２〜３日間、振盪台の働きで、液体培地中で崩壊される。次に、崩壊を受けていない残留カルス塊を残して、細胞懸濁液をピペットで採取する。従って、この細胞懸濁液は細胞の微小塊の均質な懸濁液を形成する。この懸濁液を培養して「十分に」高密度の細胞集団を得る。得られた細胞懸濁液を１４日間培養した後、新鮮培地で１／５希釈することによって同じ時間増殖させる。培養培地の組成（栄養素、成長因子など）は、バイオマスの生産性が最大となるように調整した。その結果は、液体細胞懸濁液のために最適化されたＳＥＮＳＭＳバイオマス増殖培地（表１参照）である。この培地は、カロゲネシス用のムラシゲ・スクーグ培地の改変版である。この培地をＫＯＨの添加によりｐＨ６に調整し、次いで、１２１℃で２０分間のオートクレーブ処理（ｐ＝１バール）または０．２μｍの除菌濾過を行う。
【００８２】
【表１】
2019518051.tif 000012
【００８３】
培養培地を用いた増殖培養およびバイオマス生産
数回のこのような継代培養の後、細胞懸濁液は、得られる細胞密度が期間内に一定である場合に安定化される。次に、バイオマスの生産性を最大にするために培養培地の組成（栄養素、成長因子など）を調整することができる。この最適化培地を、有効成分を抽出するためのバイオマス生産手段として使用する。
【００８４】
このようにして確立された「最適」条件下での細胞培養は、１４日ごとに細胞懸濁液の１／５希釈液を用いエルレンマイヤーフラスコで安定化および維持する（増殖培養）。これは、１４日の培養後におよそ３５０ｇ／Ｌの細胞懸濁液を生産するおよそ６０ｇ／Ｌの新鮮バイオマスを植え込む細胞培養に相当し、または必要に応じてバイオリアクターに植え込む。
【００８５】
新鮮バイオマスは、懸濁液１リットル当たり１００〜５００、より好ましくは懸濁液１リットル当たり２００および３５０ｇに相当する。
【００８６】
任意選択の工程：培養物の細胞内コンパートメントにおける生物変換による目的代謝産物の富化
構造が最終産物に十分に近い「前駆体」を含む細胞を、それらが細胞内に存在する酵素機構を用いて組み込まれる、修飾される、または変換されることを期待して提供することが不可欠である場合もある。
【００８７】
特定の実施態様では、本発明による方法は、工程ｃ）および／または工程ｄ）の培養培地がフェニルアンモニアリアーゼ基質を含有することを特徴とする。
【００８８】
特定の実施態様では、本発明による方法は、フェニルアンモニアリアーゼ基質がフェニルアラニン、特に、Ｌ−フェニルアラニン、桂皮酸、アスパラギン酸、グルタミン酸およびそれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする。
【００８９】
特定の実施態様では、本発明による方法は、得られた抽出物が少なくとも１種類のＮ−フェニルプロペノイルアミノ酸を含有することを特徴とする。
【００９０】
この細胞による前駆体の修飾の過程は生物変換と呼ばれる。培養培地への前駆体の添加は、目的二次代謝産物の生産を高めるための興味深いアプローチとなり得る。この概念は、目的代謝産物の生合成経路における反応中間体である化合物はいずれも最終産物の収量をおそらく向上させ得るという原理に基づく。
【００９１】
よって、ＮＰＡの構造（下図参照）に基づけば、特定の分子（アミノ酸）がこれらの反応中間体の前駆体であると思われる。例えば、アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンは、フェニルアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）酵素の活性に正の調節を行うのに有用な前駆体である。同様に、桂皮酸は、この同じ現象の起点であり得る。特にアスパラギン酸またはグルタミン酸など、多重の組合せも企図され得る。本発明者らは、これらの種々の前駆体（単独または組合せ）を用いて多くの実験を行ったところ、驚くことに、Ｌ−フェニルアラニンを用いた場合に、オジギソウ細胞では記載されたことのない、下記のものなどの有用なＮＰＡが得られる：
Ｐ１：１−Ｏ−（４−クマロイル）−β−Ｄ−グルコース
Ｃ１５Ｈ１８Ｏ８
【化１１】
2019518051.tif 000013
【００９２】
Ｐ２：Ｎ−ｐ−クマロイルアスパラギン酸またはアスパラギン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシシンナモイル）
Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ６
【化１２】
2019518051.tif 000014
【００９３】
Ｐ３：Ｎ−シス−（ｐ−クマロイル）グルタミン酸またはグルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシ−Ｚ−シンナモイル）
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ６
【化１３】
2019518051.tif 000015
【００９４】
Ｐ５：４−ヒドロキシシンナミド
Ｃ９Ｈ９ＮＯ２
【化１４】
2019518051.tif 000016
Ｐ６：グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−シンナモイル
Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ５
【化１５】
2019518051.tif 000017
およびそれらの混合物。
【００９５】
抽出物の取得
増殖を停止した後、得られた細胞懸濁液を濾過または遠心分離して培養培地からそれを分離し、細胞外培地（または培養上清）と収穫バイオマスの両方を得ることができる。次に、バイオマスを用途に応じて種々の方法で処理すればよい。それは凍結乾燥により乾燥させるか、または例えば、０．８％カラギーナンおよび１％クエン酸を含む６８．２％グリセリン中に３０％で再懸濁させる。また、細胞懸濁液に対して、例えば、音波処理またはフレンチプレスによる細胞分散をまず行うことにより溶媒抽出を行ってもよい。
【００９６】
処方物
本発明のもう一つの目的は、好ましくは局所適用に意図される、本発明による方法により得ることができるオジギソウ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養抽出物と１種類以上の美容的および／または皮膚科学的に許容可能な賦形剤とを含んでなる美容組成物または皮膚科学的組成物に関する。
【００９７】
美容的におよび／または皮膚科学的に許容可能な賦形剤は、当業者に既知のものの中のいずれの賦形剤であってもよい。本発明による組成物は、特に、クリーム、ローション、ゲル、軟膏、エマルション、マイクロエマルション、スプレーなどの形態の局所用組成物であろう。
【００９８】
本発明による美容組成物または皮膚科学的組成物は、特に、乳化剤、増粘剤、ゲル化剤、水固定剤、展着剤、安定剤、色素、香料および保存剤などの添加剤および配合助剤を含有してよい。
【００９９】
本発明によるもう一つの目的は、炎症性皮膚障害の処置における、環境汚染による酸化ストレスの処置を含め抗酸化としての、および抗老化剤としての本発明による抽出物の使用である。
【０１００】
「炎症性皮膚障害」は、アトピー性皮膚炎、掻痒症、および掻痒症のためのかゆみ（ＴＳＬＰ阻害）、湿疹および乾癬を意味する。
【０１０１】
好ましくは、前記皮膚科学的炎症性障害は、アトピー性皮膚炎、掻痒症、湿疹または乾癬からなる。別の実施態様によれば、本特許出願が関係する発明は、少なくとも有効成分として本発明による抽出物を含んでなる組成物に関する。
【０１０２】
よって、本発明は好ましくは、美容組成物または皮膚科学的組成物に関する。本発明による組成物は、皮膚科学的炎症性障害の処置を意図する。
【０１０３】
好ましくは、前記皮膚科学的炎症性障害は、アトピー性皮膚炎、掻痒症、掻痒症のためのかゆみ、湿疹または乾癬からなる。
【０１０４】
本発明による組成物は、油中水（Ｗ／Ｏ）型もしくは水中油（Ｏ／Ｗ）型エマルション、例えば水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルションもしくは油中水中油（Ｏ／Ｗ／Ｏ）型エマルションなどの多重エマルション、マイクロエマルションの形態で、または他には水性分散液(hydrodispersion)もしくは油性分散液(lipodispersion)、ゲルもしくはエアロゾルの形態で調製してよい。皮膚科学的または美容的に適合する賦形剤は、ミルク、クリーム、バーム、オイル、ローション、ゲル、発泡ゲル、軟膏、スプレーなどの形態で局所適用用の組成物を得る目的当業者に既知のもの中のいずれの賦形剤であってもよい。
【０１０５】
皮膚科学的組成物および美容組成物に加え、本発明はまた、医薬品として使用するための医薬組成物に関する。
【０１０６】
よって、本発明は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでなる医薬組成物に関する。本明細書において、薬学的に許容可能な担体は、副反応を引き起こさず、かつ、例えば、有効化合物の投与を容易にする、その保存寿命および／もしくは体内での有効性を高める、溶液中でのその溶解度を高める、またはその保存を改善する、医薬組成物中に含まれる化合物または化合物の組合せと定義される。これらの薬学的に許容可能な担体は周知であり、性質および投与様式に応じて当業者により適合される。
【実施例】
【０１０７】
実施例：ＷＡＶＥバイオリアクター（５Ｌ）での植物細胞培養
材料および方法：４ＬのＭＳ  ＳＥＮＳ培地（組成については上記の表を参照）を含有する有効容積５ＬのＷＡＶＥリアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に１Ｌのオジギソウ細胞培養懸濁液（細胞密度３００〜４００ｇ／Ｌ新鮮重（ＦＷ））を植え込んだ。
パラメーター：
・温度：２７℃
・空気体積：０．５Ｌ／分β（ｌｐｍ）
・圧力：５ｍＰａ〜１０ｍＰａ
・ロッキング角度：７°
・ｐＯ２は、ｒｐｍをＤ０（１９ｒｐｍ）〜Ｄ９（２７ｒｐｍ）に増すことにより７５％に維持
・ｐＯ２は、２５ｒｐｍにて、空気をＯ２でＤ９（５％Ｏ２）〜Ｄ１５（２０％Ｏ２）に富化することにより７５％で維持。
【０１０８】
成長速度論に従うと、糖消費（曲線の低下）と相関する、新鮮重（ＦＷ）または乾燥重量（ＤＷ）により評価されるバイオマスの増加は、生物変換培地が添加される培養１３日目、すなわちＤ１３まで見られる。
【０１０９】
生物変換および収穫
４Ｌ培養物の１３日（Ｄ１３）の回分培養後、細胞濃度は３００〜３５０ｇ／Ｌ（ＦＷ）であり、１２〜１４ｇ／Ｌ（ＤＷ）に相当する。この細胞濃度に到達したところで、除菌濾過により前駆体を注入することによって生物変換を行う：本発明者らは種々のアミノ酸（アスパラギン酸、桂皮酸、グルタミン酸またはＬ−フェニルアラニン）を選択し、本発明者らの培養条件下では、Ｌ−フェニルアラニンがＮＰＡ生物変換収量に関して最良の結果を示した。以下は下記の前駆体濃度の例である。
【０１１０】
【表２】
2019518051.tif 000018
【０１１１】
誘導体Ｎ−フェニルプロペノイルアミノ酸（ＮＰＡ）を含むヒドロキシ桂皮酸に有利な生物変換培地
化合物をＨ２Ｏで希釈し、この混合物を除菌濾過によりバイオリアクターに添加する。４８時間後、すなわち、Ｄ１５〜Ｄ１６に、例えば「２０μｍナイロンバッグ」を用いた直接濾過によりバイオマスを収穫する。バイオマスは、収穫されたバイオマスの容量に等しい容量の無菌脱塩水で一度洗浄する。Ｄ１３に評価された細胞濃度は、Ｄ１５まで等しくなければならない（＋／−１０％）。培養中、懸濁液容量の減少は主として採取されるサンプルによるものである。
【０１１２】
ある容量の培養物をＤ１３、Ｄ１４、Ｄ１５およびＤ１６に採取し、次に溶媒で抽出し、種々の抽出物を溶解した後、質量分析に連結したＨＰＬＣにより分析する。図は、Ｄ１３（前駆体Ｌ−フェニルアラニンが添加された日）に比べて、Ｄ１６で最大強度に達するまでＤ１４、Ｄ１５で新たなピークが段階的に出現することを示す。
【０１１３】
ピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６は、Ｄ１６で単離され、分子の構造を決定するために質量分析およびＮＭＲにより分析された。ピークＰ４は極めて少量であったので、本発明者らはその構造を決定することができなかった。初めて、驚くことに、本発明者らは、前駆体Ｌ−フェニルアラニンが生物変換のために最良のアミノ酸であったことを発見する。
【０１１４】
ＮＰＡ産物Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５およびＰ６は、質量分析およびＮＭＲにより同定した。
【０１１５】
ＮＰＡ名の一覧：
Ｐ１：１−Ｏ−（４−クマロイル）−β−Ｄ−グルコース
Ｃ１５Ｈ１８Ｏ８
Ｐ２：Ｎ−ｐ−クマロイルアスパラギン酸またはアスパラギン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシシンナモイル）
Ｃ１３Ｈ１３ＮＯ６
Ｐ３：Ｎ−シス−（ｐ−クマロイル）グルタミン酸または
グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−（４−ヒドロキシ−Ｚ−シンナモイル）
Ｃ１４Ｈ１５ＮＯ６
Ｐ５：４−ヒドロキシシンナミド
Ｃ９Ｈ９ＮＯ２
Ｐ６：
グルタミン酸；（Ｓ）型、Ｎ−シンナモイル
Ｃ１４Ｈ１４ＮＯ５
【０１１６】
実施例２：オジギソウ植物細胞と葉におけるミモシンのアッセイ
この目的は、抽出物中のミモシンを同定および定量するための分析条件を開発することである。オジギソウ細胞の懸濁培養（生物変換を伴う）由来のバイオマスをＥＴＯＨ８０またはＥＴＯＨ６０で抽出した。オジギソウの乾燥葉を乾燥させ、破砕し、同じ溶媒で抽出した。ＳｉｇｍａからのＬ−ミモシンを同定および定量の参照として用いる。サンプルをＨＰＬＣ／質量分析により分析した。
【０１１７】
材料および方法：分析条件
ＡＢＳｃｉｅｘ  ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ  ４６００質量分析計
方法（ＥＳ＋）：ＴＯＦ（１００ｍｓ）／ＭＲＭ（５０ｍｓ）
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＳＳ  Ｃ１８、１．８μｍ、２．１×１００ｍｍ、焼結０．５μｍ
溶出剤：Ａ（Ｈ２Ｏ−０．１％ＨＣＯ２Ｈ）／Ｂ（ＣＨ３ＣＮ−０．１％ＨＣＯ２Ｈ）
流速：５００μｌ／分
注入：１０μｌ
勾配：
【０１１８】
【表３】
2019518051.tif 000019
【０１１９】
定量アッセイにより、対照溶液で達した定量下限（ＬＬＯＱ）は５ｎｇ／ｍＬであることが確認された。このＬＬＯＱおよび本発明者らのヒドロ−エタノールサンプルの調製方法で、検出限界（１ｎｇのミモシン／ｇバイオマス）において発明者らの細胞培養サンプル中にミモシンが存在しないことが確認される：
・細胞のＥｔＯＨ８０およびＥｔＯＨ６０抽出物（２０％ｗ／ｗ）＜１ｎｇ／ｇの新鮮細胞
・凍結乾燥細胞のＥｔＯＨ６０抽出物（５％ｗ／ｗ）＜１ｎｇ／ｇの凍結乾燥細胞
・植物のＥｔＯＨ６０抽出物＝２１６０ｎｇ／ｇの乾燥植物
・植物のＥｔＯＨ８０抽出物＝７８０ｎｇ／ｇの乾燥植物
【０１２０】
これらの分析を生物変換無し（すなわち、ＮＰＡ前駆体の添加無し）のＰＣＣで同様に行ったところ、ミモシン含量がまた＜１ｎｇ／ｇの新鮮または凍結乾燥細胞であることを示した。
【０１２１】
結論として、本発明者らのオジギソウ植物細胞培養では、驚くことに、本発明者らはミモシンなどの望ましくない要素を検出しなかった。
【０１２２】
実施例２−抗炎症活性：植物抽出物とＰＣＣ抽出物の比較
この実施例では、本発明者らは、２つのオジギソウ抽出物（Ｅ１１とＥ１３）の抗炎症活性を比較する。抽出物Ｅ１１は、乾燥および破砕したオジギソウ葉の酢酸エチル抽出から得たものであり、抽出物Ｅ１３は、エルレンマイヤーフラスコで、生物変換を行わないオジギソウ植物細胞培養由来の破砕材料の、同じ溶媒での抽出から得たものである。これら２つの抽出物を溶媒蒸発乾固の後に秤量した。それらをＤＭＳＯに取る。これら２つの抽出物の同じ濃度での抗炎症活性を評価および比較するために、本発明者らは、表面に相応の細菌ＬＰＳによってＴＬＲ４受容体を発現するマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞を刺激することからなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理試験を有する（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ３０２：１３８−１４４）。いくつかのパラメーターを調べ、参照抗炎症薬デキサメタゾンと比較した：
・グリース技術による亜硝酸生産。亜硝酸レベルは、誘導型一酸化窒素合成酵素(inducible nitrite oxide synthase)（ｉＮＯＳ）により誘導されたＮＯ合成のレベルを反映する。
・サイトカイン分泌：ＥＬＩＳＡによるインターロイキン−６
・マルチプレックスアッセイによるＴＮＦ−α生産。
【０１２３】
細胞培養
ＲＡＷ２６４．７細胞は、マウスマクロファージ系譜である。これらの細胞は接着性があり、１２ウェルプレートにて、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ．グルタミンおよび５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中、１０００００細胞／ｃｍ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｃｅｐｔｅｒ  ｃｏｕｎｔ）で培養する。
【０１２４】
約７０％の集密度で、これらの細胞を、０．２μｇ／ｍＬ［大腸菌０５５：Ｂ５］ＬＰＳで活性化する１時間前に、同じ濃度（乾燥重量）のオジギソウ抽出物Ｅ１１（植物）またはＥ１３（ＰＣＣ）で、または参照抗炎症薬１μＭデキサメタゾン（Ｂｉｏｖｉｓｏｎ  １０４２−１）で処理する。これらの細胞を５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートする。２４時間後に、細胞上清を氷中に回収し、４℃にて３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、アリコートに分け、−８０℃で保存する。細胞試験は、２回重複を含め３回繰り返した。結果の平均値をグラフに示す。
【０１２５】
細胞生存率は、ＳＩＧＭＡ  ＣＧＤ１キット（ミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼ酵素の活性に基づくキット）を使用し、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いた代謝試験によってモニタリングする。この試験は、このモデルで試験する抽出物の用量を決定するために予め行った。
【０１２６】
亜硝酸アッセイ
ＮＯ合成のレベルは、新鮮または冷凍（−８０℃）細胞上清で、アッセイに影響を及ぼすことなく評価される。このアッセイの原理は、５４０ｎｍに吸収を有する桃色のアゾ化合物を生産するグリース（ジアゾ化）反応に基づく。
【０１２７】
ＩＬ６アッセイ
ＩＬ−６は、供給者のプロトコール（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、キットＭ６０００Ｂ）に従い、比色定量ＥＬＩＳＡにより、１／２００希釈した細胞上清でアッセイされる。
【０１２８】
ＴＮＦαアッセイ
細胞上清中のＴＮＦ−αの同時アッセイは、９６ウェルマイクロプレートでのフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡ原理に基づくＬｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）技術を用いて行った。基質として用いるマイクロビーズには、それらに識別カラーコード（異なる蛍光）を与える２つの蛍光色素を正確な比率で配合されている。サイトメーター（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  ２００）の光学系は、下記の２つのレーザーからなる：赤色レーザー（λ＝６３５ｎｍ）は、各マイクロビーズにおいてその定義色素混合物を励起し、従って、アッセイされるサイトカインを識別する。第２のレーザー緑色（λ＝５３２ｎｍ）は、サイトカインを定量するために特異的検出抗体に結合されたリポーター蛍光色素を励起する。この系は、データ取得および分析ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒバージョン４．１）を備えたコンピューターによって制御される。
【０１２９】
解凍後、上清をＭｉｌｌｉｐｌｅｘキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品番号ＭＣＹＴＯＭＡＧ−７０Ｋ−０４）を用い、培養培地で１／１０および１／４０に試験希釈した。このキットは、特異的ビーズ、検出抗体およびサイトカインをアッセイするための標品を含む。
【０１３０】
結果
濃度を平均として表す。阻害パーセンテージは、抽出物に関して引用する場合、０．２％ＤＭＳＯ対照と比較する。ＤＭＳＯは、細胞試験のための水性バッファーで希釈する前に、予め乾燥サンプルを溶解するために用いる。
【０１３１】
図の凡例：
図１：亜硝酸アッセイ
図２：ＩＬ６アッセイ
図３：ＴＮＦ−αアッセイ
【０１３２】
種々のサンプルをＸ軸に列挙する（左から右へ）：
・Ｏ：陰性対照−０．２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳにより活性化したＲＡＷ２４６．７細胞の培養物
・ＤＥＸＡ：陽性対照−０．２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳにより活性化する１時間前の、１μＭデキサメタゾン（Ｂｉｏｖｉｓｏｎ  １０４２−１）を用いた細胞のインキュベーション。
・ＤＭＳＯ：０．２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳにより活性化する１時間前の、可溶化に使用する溶媒対照を用いたインキュベーション（Ｅ１１およびＥ１２）。
・Ｅ１１：０．２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳにより活性化する１時間前の、オジギソウ葉（５０μｇ／ｍＬ）由来の抽出物を用いたインキュベーション。
・Ｅ１３：０．２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳにより活性化する１時間前の、植物細胞（５０μｇ／ｍＬ）由来の抽出物を用いた場合。
【０１３３】
亜硝酸アッセイ
ＮＯ生産は、もっぱら誘導性であり、デキサメタゾンにより有意に阻害可能である（％ｉ＝３５）。０．２％ＤＭＳＯは、アッセイに影響を及ぼさない。植物抽出物Ｅ１１は亜硝酸生産を弱く阻害する（％ｉ＝１６％）が、抽出物Ｅ１３は、同様の方法で、参照抗炎症性で見られた阻害（％ｉ＝３２％）に近く亜硝酸生産を阻害する。
【０１３４】
ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ
ＬＰＳで活性化された細胞（Ｏ）はＩＬ６を分泌する。デキサメタゾン（ＤＥＸＡ）は、ＩＬ−６分泌を阻害する（％ｉ＝３８％）。抽出物は、Ｅ１１（％ｉ＝２４％）およびＥ１３（％ｉ＝３１％）に関して、ＩＬ−６分泌を阻害する。
【０１３５】
ＴＮＦ−αのＬＵＭＩＮＥＸアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞は、基底状態でＴＮＦ−αを分泌する（平均０．２３ｎｇ／ｍＬ）。この生産は、０．２μｇ／ｍＬ  ＬＰＳによって１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−αまで活性化される。この活性化はデキサメタゾンにより弱く阻害可能である（％ｉ＝１６％）。ＰＣＣ抽出物Ｅ１３は、ＴＮＦ−α生産を低下させる（％ｉ＝４０％）。逆に、植物抽出物Ｅ１１はＴＮＦ−α生産を増加させ、ＬＰＳの活性を増強すると思われる（＋１１２％）。
【０１３６】
結論として、これらの結果は、以下のことを示す。
２つの抽出物Ｅ１１とＥ１３は同じ濃度で、このモデルにおいて亜硝酸ＮＯの阻害、対照ＤＥＸＡと同様に炎症誘発性サイトカインＩＬ６の阻害により表される炎症を強く阻害する。驚くことに、これらの実験条件下で、ＰＣＣ抽出物Ｅ１３はＤＥＸＡよりも良好にＴＮＦ−αを阻害するが、植物抽出物Ｅ１１はそれを増強する。
【０１３７】
実施例３：抗酸化活性−ＯＲＡＣ試験
抗酸化活性は、酸素ラジカル吸収能（ＯＲＡＣ）試験を用いて評価した（Ｄｅｖａｌｏｓ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；  Ｐｏｌｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｏｏｄおよびｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ；  ２００３；１２／５３：１３３−１３６）。このＯＲＡＣ値を、抽出物の抗酸化能を評価するために使用する。ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス−２−メチル−プロパンイミドアミド二塩酸塩）はペルオキシルフリーラジカルの供給源である。この試験では、それを、フリーラジカルによるフルオレセイン分解の動態を模倣するために使用する。これは抽出物または試験参照（ここでは、トロロックス）の経時的蛍光および濃度の低下をもたらす。トロロックス（ビタミンＥの類似体）は、強い抗酸化剤として知られている。トロロックス（標準溶液）または抽出物の添加は、フルオレセインを分解から保護する。トロロックス標準溶液に対して測定される抗酸化活性を評価することを可能とする。
【０１３８】
・生物変換工程（ＮＰＡ）を伴うオジギソウＰＣＣの抽出物。回分式ＷＯ２。Ｄ１３の生物変換日、Ｄ１４の午前１０時、Ｄ１４の午後４時、Ｄ１５、１６およびＤ１７に採取したサンプル。
・採取した抽出物の水での希釈。
【０１３９】
ＯＲＡＣ試験
使用溶液：総ての溶液をリン酸バッファー７５ｍＭｐＨ７．６中に調製する。１．１７μＭフルオレセイン（１１７ｍＭ保存溶液の使用、４℃で保存１週間）。即時調合される１２５ｍＭ  ＡＡＰＨ。１ｍＭトロロックス（保存−２０℃）。
【０１４０】
【表４】
2019518051.tif 000020
【０１４１】
反応容量：２００μｌ
下記のものを黒色９６ウェルプレート中に置く：２０μｌの抗酸化（トロロックス標準溶液または被験抽出物（破砕細胞培養培地））＋１６０μｌの１．１７μＭフルオレセイン。フィルムで覆ったプレートを３７℃で１５分間インキュベートする。２０μｌの１２５  ｍＭ  ＡＡＰＨ／ウェルを加える。すぐに分光蛍光計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）にて３７℃でインキュベートし、励起波長４８５ｎｍおよび発光波長５２０ｎｍで９０分間、毎分、読み取りを行う。各試験を３反復で行う。各試験（トロロックス標準溶液またはサンプル）について曲線下面積（ＡＵＣ）を計算する。正味のＡＵＣ＝ＡＵＣ標準溶液点またはサンプル−ブランクＡＵＣを求める。正味ＡＵＣの関数として検量線：トロロックス濃度（μＭ）をプロットする。
【０１４２】
線形方程式を用いて、アッセイした各サンプルについてトロロックス当量（μＭ）を求める。
μＭでのＥｑトロロックス＝ａ×（正味Ａｕｃ）２＋ｂ×（正味ＡＵＣ）
（式のａおよびｂは線形方程式によって求められる）。
ＯＲＡＣ値は、μｍトロロックス／１００ｇ抽出物に相当する。
ＯＲＡＣ値（ＴＥＡＣ）＝トロロックス当量μＭ×２０×（１００  ０００／［供試抽出物の］×２０）
【０１４３】
図４は、生物変換工程の前および後の、１／２００希釈した７５ｍｇ乾燥重量／ｍｌを含有する抽出物の抗酸化活性を示す。
【０１４４】
結果：ｘ軸に、培養（時間）のＸ日後、すなわち、Ｄ１３、Ｄ１４の午前１０時、Ｄ１４の午後４時、およびその後２４時間ごとＤ１５、Ｄ１６、Ｄ１７に採取したＰＣＣ抽出物ＷＯ２、最終サンプルの活性、４０％ＥＴＯＨブランク対照単独（抗酸化活性無し）。Ｄ１４、すなわち、１３日の培養および生物変換（ＡＡの添加）１日後に、Ｄ１６〜Ｄ１７まで安定化させるためにはＴＥＡＣ（μＭ当量のトロロックス）が５倍であったことが分かる。結論として、生物変換は、ＮＰＡの存在のために抗酸化活性を増強することを可能とする。
【０１４５】
実施例４：薬理活性：誘導アトピー性皮膚炎（ＡＤ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
アトピー性皮膚炎表現型を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるオジギソウの抗炎症活性のマルチパラメトリック評価。この薬理モデルは、Ｃａｓｔｅｘ−Ｒｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１４．  １７０  Ｓｕｐｐｌ  １：１２−８）により記載されている。
【０１４６】
４．１．抽出物および化合物
破砕、乾燥した標準オジギソウ培養培地Ｗ０１Ｄ１５（生物変換有り）から採取したＰＣＣ抽出物を。４０％ＥｔＯＨ中の溶液に初期濃度７５ｍｇ／ｍｌに溶解／希釈した。これらの化合物を生存率試験のために即時に、ならびに誘導アトピー性皮膚炎のモデルで薬理作用を測定するために適当な用量で可溶化した。
【０１４７】
４．２細胞種
Ｌｏｎｚａからの正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）。これらの細胞を標準培養培地で増殖させる。
【０１４８】
４．３  アトピー性皮膚炎表現型の誘導
ＮＨＥＫ細胞を播種し、ケラチノサイト−ＳＦＭ培養培地で培養する。次に、培養培地を、化合物と供試抽出物または対照として使用する溶媒（化合物処理の際に使用したものと同じ濃度のＥｔＯＨ４０％）を含有する培地に置き換える。１時間の「プレインキュベーション」の後、炎症誘発剤混合物（ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＩＬ４、ＩＬ１３）を加え、これらの細胞を２４時間培養する。
【０１４９】
誘発剤不含かつ化合物不含の対照も並行して行うと、この誘発モデルのバリデートが可能となる（ＮＨＥＫ対ＮＨＥＫ＋誘発物質）。
【０１５０】
ＮＨＥＫ細胞はまた、参照製品０．２９ｍＭデキサメタゾンでも処理し、有効性対照として用いる。
【０１５１】
誘発剤混合物との２４時間のインキュベーション後に細胞からＲＮＡを抽出する。
【０１５２】
４．５  ＲＴ−ｑＰＣＲによる差次的発現の分析
４．５．１．  全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成の抽出
抽出は、ＲＮＡＢｌｅ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）およびＱＩＡＧＥＮからのＲＮｅａｓｙミニキットを用いて行った。抽出した全ＲＮＡを分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＮＤ１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でアッセイし、それらの質をアガロースゲルで分析した。
【０１５３】
４．５．２．  定量的ＰＣＲ技術
・原理
リアルタイムＰＣＲは、遍在的に発現される参照遺伝子に対する標的遺伝子の発現率の相対的定量を可能とする正確、高感度かつ迅速な方法である。この技術は、メッセンジャーＲＮＡの定量を可能とする。この操作は、ＲＮＡの相補的ＤＮＡへの逆転写の後に、ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅される標的のいずれのかの側に位置する２つのプライマーの伸長によって行われる。指数関数的増幅のハイブリダイゼーション工程中に蛍光団（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）を組み込めば、新たに形成された増幅産物の量の定量およびリアルタイムのモニタリングが可能となる。定量値は、ＰＣＲ産物の対数増殖に関連するシグナル増強が製造者のマニュアルに従ってＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＥ分析プログラムを用いて検出され始める閾値サイクルの数（Ｃｔ：サイクル閾値）から得られる。従って、ゼロ時点の標的遺伝子のｃＤＮＡ量が多いほど、Ｃｔ数（閾値に達するまでのサイクル数）が少なくなる。
【０１５４】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を標準化するためには、同じ実験で「参照遺伝子」と呼ばれる少なくとも１つの内部対照を定量することが必要である。この「参照遺伝子」は、細胞の処理または非処理の条件に依存しない構成的発現を示さなければならない。選択された標的遺伝子の相対的発現は、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により提供されるＲＱ（相対的定量）ソフトウエアを用いるΔΔＣｔ法によって算出される。所与の化合物によって誘導された各遺伝子の発現値はまた、対照ＮＨＥＫ細胞（非処理細胞および化合物の担体として使用されるものと同じ％のＤＭＳＯで処理した細胞）が１に相当するように正規化する。従って、所与の遺伝子について各化合物で得られたＲＱ値は、発現が１である対照細胞と比較した、処理後のこの遺伝子の相対発現を表す。
【０１５５】
・プライマーの選択
プライマーは、Ｏｌｉｇｏ  ４（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、プリマス、ＭＮ）を含むコンピュータープログラムの補助で選択した。選択基準は、増幅される断片のサイズ（８０〜１２０ヌクレオチド）、プライマーのサイズ（２１〜２５ヌクレオチド）、プライマーのハイブリダイゼーション温度（約６５℃）およびプライマーの位置に関するものであり、プライマーは２つのプライマーのうち一方がイントロンおよびエキソンをまたぐように、または２つのプライマーが、それらを分断しているイントロンが２ｋｂｐより大きい場合には２つの異なるエキソンにあるように設計される。プライマーのかなり具体的な位置を選択することで、たとえ解離曲線（ＡＢＩ、７９００ＨＴ）に混入が見られなかったとしても、サンプル混入の場合にゲノムＤＮＡの増幅が避けられる。これらの予防措置は総て、ゲノムＤＮＡの混入が最小であることが、定量的ＲＴ−ＰＣＲのような感度によって得られる結果に極めて有意な影響を及ぼし得ることからくるものである。もう一つの重要な選択基準は、得られた特定のＰＣＲ産物に非特異的に干渉する、従って、結果を歪める（使用するＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ技術に内在する）二重鎖を形成しないことを保証することである。最後に、プライマーは、コンセンサス領域および／または多形を含まないように選択される。標的遺伝子のプライマーとして選択されるヌクレオチド配列の全体的な特異性は、全ヒトゲノムのコラージュ（ヌクレオチド−ヌクレオチドｂｌａｓｔ）を作製することによってテストされる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：４０３−４１０，  １９９０）。
【０１５６】
・標準増幅曲線
プライマーの有効性は、ＮＨＥＫ細胞から抽出したＲＮＡで、２反復で調製した５倍連続希釈液（４点）によって試験した。１００％に近い有効性を有するプライマー対のみ（３．３２に相当する傾き）を保持する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法により得られる定量的ＰＣＲ結果を歪める可能性のある二重鎖を形成しないことを保証するために、非鋳型対照（ＮＴＣ）増幅も行う。得られた増幅産物がユニークであることを保証するために、７９００ＨＴ装置で得られた解離曲線を使用する。プライマー有効性の低下を避けるために、標準増幅曲線の定期的確認を行う。
【０１５７】
・増幅
増幅は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲコア試薬キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行う。増幅は、各ストランドの指数関数的倍加を保証する、変性工程（９５℃で１０分）、次いで、４０サイクルのハイブリダイゼーション（９５℃で１５秒）の繰り返しおよび伸長（６５℃で１分）からなる。
【０１５８】
・定量された遺伝子
定量されたＡＤ表現型に特徴的な遺伝子を表２の左の列に列挙する。応答値は正規化後のものである。表の左から右へ、ＡＤと表示された列は、各遺伝子の誘導のレベル（有効薬剤の不在下）を示す。ＥＴＯＨ４０と表示された列は、溶媒による潜在的応答干渉を検出するために有効薬剤を含まない溶媒単独により生じた値に相当する。次のＷ０１と表示された２つの列は、誘導後の２種類の濃度、それぞれ１．５ｍｇ／ｍｌおよび０．７５ｍｇ／ｍｌの試験サンプルである。最後の列は、陽性対照０．２８ｍＭデキサメタゾンにより生じた値を示す。
【０１５９】
結果
【表５】
2019518051.tif 000021
【０１６０】
表に示された結果は炎症誘発性および炎症性遺伝子（インターロイキンおよびケモカイン）の阻害力、およびまた抗微生物性ペプチド（アトピー性皮膚炎では不足している）の誘導を示す。用量依存的にＷ０１により強く誘導される抗微生物性ペプチドは、ＥＦＢ１０３、ＲＮアーゼ７、および特にプソリアシン（Ｓ１００Ａ７）である。阻害されるインターロイキンは、ＩＦＮＢ１、ＩＬ１ＡおよびＩＬ１Ｂである。ＩＬ４ＲおよびＴＬＲ３受容体は抑制的であり、後者はケモカインＴＳＬＰのほぼ完全な阻害とよく相関している。これら２つの因子は、ＡＤ患者で、より詳しくは、掻痒が現れる場合に過剰発現される（Ｍｉｙａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５．  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ７８：８９−９４）。本発明者らがこのＡＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルで、オジギソウＰＣＣ抽出物によるこのような強い抗ＴＳＬＰ阻害を実証したのは初めてのことである。ケモカインＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ５、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１５および特にＩＬ８は、用量に関わらずに抽出物Ｗ０１により強く阻害された。要するに、この試験は、オジギソウＰＣＣ抽出物が、デキサメタゾン対照、特に、ＡＤ患者で掻痒を引き起こす因子ＴＳＬＰよりも良好とは言えないまでも同等に炎症誘発性および炎症性因子の大部分を阻害することを示す。
【図１】
2019518051.tif 000032
【図２】
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【図３】
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【図４】
2019518051.tif 000035
【国際調査報告】
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2019518051.tif 000037
2019518051.tif 000038
2019518051.tif 000039
2019518051.tif 000040
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