(57)【要約】  本発明は、弱毒生インフルエンザワクチンに関連する組成物及び方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒生ウマインフルエンザウイルスを含む免疫学的組成物であって、前記ウイルスが、前記ウイルスのゲノムのセグメント１及びセグメント２のうちの１つ以上において１つ以上の突然変異を含む、前記免疫学的組成物。
【請求項２】
前記セグメント１が、配列番号１に記載される核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記セグメント２が、配列番号３に記載される核酸配列を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記ウイルスが、突然変異体ＰＢ２をコードするセグメント１において１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
変異体ＰＢ２が、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
突然変異体ＰＢ２が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項４〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ウイルスが、ＰＢ１をコードするセグメント２において１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
突然変異体ＰＢ１が、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
突然変異体ＰＢ１が、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む、請求項７〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
突然変異体ＰＢ１が、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ウイルスが、突然変異体ＰＢ２をコードするセグメント１における１つ以上の突然変異と、突然変異体ＰＢ１をコードするセグメント２における１つ以上の突然変異と、を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
突然変異体ＰＢ２が、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含み、突然変異体ＰＢ１が、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスが、Ａ型ウマインフルエンザウイルスのＨ３Ｎ８亜型に由来する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、対象におけるウマインフルエンザの治療のために使用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ウイルスが、異なるＥＩＶ株の突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ２、突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ１、及びＨＡならびにＮＡを発現するマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
対象におけるウマインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、弱毒生ウマインフルエンザウイルスを含む免疫学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記ウイルスが、前記ウイルスのゲノムのセグメント１及びセグメント２のうちの１つ以上において１つ以上の突然変異を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記セグメント１が、配列番号１に記載される核酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記セグメント２が、配列番号３に記載される核酸配列を含む、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルスが、突然変異体ＰＢ２をコードするセグメント１において１つ以上の突然変異を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
変異体ＰＢ２が、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
突然変異体ＰＢ２が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスが、ＰＢ１をコードするセグメント２において１つ以上の突然変異を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
突然変異体ＰＢ１が、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
突然変異体ＰＢ１が、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
突然変異体ＰＢ１が、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスが、突然変異体ＰＢ２をコードするセグメント１における１つ以上の突然変異と、突然変異体ＰＢ１をコードするセグメント２における１つ以上の突然変異と、を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
突然変異体ＰＢ２が、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含み、突然変異体ＰＢ１が、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルスが、Ａ型ウマインフルエンザウイルスのＨ３Ｎ８亜型に由来する、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が、ウマインフルエンザを有しておらず、前記方法が、ウマインフルエンザに対する免疫を誘導する、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、ウマインフルエンザに感染しており、前記方法が、治療的免疫応答を誘導する、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫学的組成物が、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下投与される、請求項１６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象がウマである、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ウイルスが、異なるＥＩＶ株の突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ２、突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ１、及びＨＡならびにＮＡを発現するマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）である、請求項１６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／３４５，２９３号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ）Ｈ３Ｎ８によって引き起こされるウマインフルエンザは、ウマの最も一般的かつ重要な呼吸器感染症である。ＥＩＶは非常に伝染性が高く、咳によって分散されたエアロゾル化された液滴で未処置の馬の群を通して急速に広がる可能性がある。ウマのＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８感染は、主要な馬術競技を混乱させ、重大な経済的損失を引き起こす原因となっている。ウマの個体群は高移動性であり、ウマは競技や繁殖の目的で道路や空路（他にもあるが）で長距離を移動する。感染したウマが感染しやすい個体群に導入されると、ＥＩＶの広がりは爆発的となる可能性がある。Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶの大規模な流行は、馬術競技でのウマの集合と関連することが多い。競技後のそれらの分散は、本ウイルスの広範な播種に繋がる可能性があり、世界各地で数多くの例がある。
【０００３】
ワクチン接種は、ウマのＨ３Ｎ８  ＥＩＶ感染を予防し、その影響を制限する最も効果的な手段の１つである。Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶの治療のための現在のワクチンは、これらが不活性化ウイルスを使用するので非効率的であるか、またはインフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）のように、これが２５年前に生成されて以来改良されていなかったので、効果が非常に限られているかのいずれかである。
【０００４】
したがって、ＥＩＶのための改善されたワクチンの必要性が当該分野において存在する。本発明は、この満たされていない要求を満たすものである。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、本発明は、ウマ弱毒生インフルエンザウイルスを含む免疫学的組成物を提供し、このウイルスは、ウイルスゲノムのセグメント１及びセグメント２のうちの１つ以上において１つ以上の突然変異を含む。一実施形態では、組成物は、対象におけるウマインフルエンザの治療のために使用される。
【０００６】
一実施形態では、組成物は、配列番号１に記載される核酸配列を含む突然変異したセグメント１を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号３に記載される核酸配列を含む突然変異したセグメント２を含む。
【０００７】
一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＰＢ２をコードするセグメント１における１つ以上の突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＰＢ１をコードする、セグメント２における１つ以上の突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
一実施形態では、ウイルスは、セグメント１に１つ以上の突然変異体を含み、
突然変異体ＰＢ２をコードし、そして、セグメント２の１つ以上の突然変異体を含み、突然変異体ＰＢ１をコードする。一実施形態では、突然変異体ＰＢ２はＮ２６５Ｓ点突然変異を含み、突然変異体ＰＢ１はＫ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む。
【００１０】
一実施形態では、ウイルスは、ウマインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ８サブタイプに由来する。一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ２、突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ１、及び異なるＥＩＶ株のＨＡならびにＮＡを発現するマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）である。
【００１１】
一態様では、本発明は、対象においてウマインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、対象におけるウマインフルエンザ感染を治療または予防するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ウマ弱毒生インフルエンザウイルスを含む免疫学的組成物を対象に投与することを含み、このウイルスは、ウイルスゲノムのセグメント１及びセグメント２のうちの１つ以上において１つ以上の突然変異を含む。
【００１２】
一実施形態では、組成物は、配列番号１に記載される核酸配列を含む突然変異したセグメント１を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号３に記載される核酸配列を含む突然変異したセグメント２を含む。
【００１３】
一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＰＢ２をコードする、セグメント１において１つ以上の突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＰＢ１をコードする、１つ以上の突然変異体をセグメント２に含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＰＢ２をコードするセグメント１における１つ以上の突然変異と、突然変異体ＰＢ１をコードする、セグメント２における１つ以上の突然変異とを含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含み、突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異を含む。
【００１６】
一実施形態では、ウイルスは、ウマインフルエンザＡ型ウイルスのＨ３Ｎ８サブタイプに由来する。一実施形態では、ウイルスは、突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ２、突然変異体ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ１、及び異なるＥＩＶ株のＨＡならびにＮＡを発現するマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）である。
【００１７】
一実施形態では、対象はウマインフルエンザを有しておらず、本方法はウマインフルエンザに対する免疫を誘導する。一実施形態では、対象はウマインフルエンザに感染しており、本方法は治療的免疫応答を誘導する。
【００１８】
一実施形態では、免疫学的組成物は、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下投与される。一実施形態では、対象はウマである。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読み取るときにより良好に理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、図面には現在のところ好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８野生型（ＷＴ）及び弱毒生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）のセグメント１（ＰＢ２）及び２（ＰＢ１）の概略図を描写する：ポリメラーゼＰＢ２サブユニットにおけるアミノ酸置換（Ｎ２６５Ｓ）及びＰＢ１サブユニットにおけるアミノ酸置換（Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、及びＡ６６１Ｔ）示されている。
【図２】Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８野生型（ＷＴ）及び弱毒生インフルエンザウイルス（ＬＡＩＶ）のポリメラーゼ活性に対する温度の影響を実証する実験例の結果を描写する：イヌＭＤＣＫ（１２ウェルプレートフォーマット、６．５×１０５細胞／ウェル、三通り）を、５００ｎｇのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｅ）（Ｇｌｕｃ）をコードするミニゲノム（ＭＧ）ウイルス（ｖ）ＲＮＡ様発現プラスミド、及び１００ｎｇのＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼプラスミドを構成的に発現するｐＣＡＧＧＳと共に、２００ｎｇのウイルスの複製及び転写（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ及びＮＰ）の最小要件をコードするアンビセンスｐＤＺ発現プラスミドを用いて同時形質移入した。６時間後、細胞を３３℃、３７℃または３９℃に置いた。形質移入後４８時間で、細胞を発光の評価のために溶解させた。ＦＦｌｕｃ活性はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性に対して標準化した。データは、三通りのアッセイについて測定された結果の平均値ＳＤを表す。標準化されたレポーター発現は、ＮＰの不在下でのＭＧ活性と関連付ける。データは、Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  ＷＴを１００％として見なした相対的な活性として表される。同じ結果がウマＥ−Ｄｅｒｍ細胞で得られた。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８野生型（ＷＴ）及び弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）のマルチサイクル増殖動態を実証する実験例の結果を描写する：イヌＭＤＣＫ細胞（１２ウェルプレートフォーマット、６．５×１０５細胞／ウェル、三通り）を、Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＷＴ及びＬＡＩＶにより低感染多重度（ＭＯＩ、０．００１）で感染させ、３３℃（図３Ａ）、３７℃（図３Ｂ）及び３９℃（図３Ｃ）でインキュベートした。内部対照として、ＭＤＣＫ細胞もまた、ＭｅｒｃｋからのウマＬＡＩＶであるＦｌｕ  Ａｖｅｒｔに感染させた。感染後１２、２４、４８及び９６時間目に組織培養上清を採集した。組織培養上清中のウイルス力価を、抗ＮＰモノクローナル抗体（ＨＢ−６５）を用いた免疫フォーカスアッセイ（フォーカス形成単位、ＦＦＵ／ｍｌ）により決定した。データは、三通りで測定した結果の平均値及びＳＤを表す。黒い点線は検出限界（２００ＦＦＵ／ｍｌ）を示す。
【図４】Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３野生型（ＷＴ）及び弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）のプラーク表現型に及ぼす温度の影響を実証する実験例の結果を描写する：イヌＭＤＣＫ細胞（６ウェルプレートフォーマット、１０６細胞／ウェル）をＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３ＷＴ及びＬＡＩＶで感染させ、寒天を含有する培地を重ねた。Ｆｌｕ  Ａｖｅｒｔで感染させたＭＤＣＫ細胞を内部対照として含めた。感染後３日目に、単層を抗ＮＰモノクローナル抗体（ＨＢ−６５）で免疫染色した。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＬＡＩＶの弱毒を実証する実験例の結果を描写する：６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝６）を、１×１０５ＦＦＵのＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＷＴまたはＬＡＩＶ、もしくは内部対照としてのＦｌｕ  Ａｖｅｒｔで鼻腔内に感染させた。感染マウスの肺（図５Ａ）及び鼻甲介（図５Ｂ）におけるウイルスの存在を、抗ＮＰモノクローナル抗体（ＨＢ−６５）を用いる免疫蛍光アッセイ（ＦＦＵ／ｍｌ）によって、感染後２日目（Ｎ＝３）及び４日目（Ｎ＝３）に評価した。データは平均値及びＳＤを表す。黒い点線は検出限界を表す（２００ＦＦＵ／ｍｌ）。
【図６】インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＬＡＩＶによる体液性応答の誘導を実証する実験例の結果を描写する：６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１×１０３ＦＦＵのＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＷＴまたはＬＡＩＶで免疫化した。マウスはまた、１×１０３ＦＦＵのＦｌｕ  Ａｖｅｒｔを陰性対照及び陽性対照としてそれぞれ模擬免疫付与または免疫付与した。感染後１４日目に、マウスから採血し、血清を採集して、Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３ＷＴウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞の細胞抽出物を用いて全インフルエンザウイルスタンパク質に対するＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡにより評価した。模擬感染細胞抽出物を用いて、抗体応答の特異性を評価した。ＯＤは光学濃度である。データは、６匹の個々のマウスについての結果の平均値＋／−ＳＤを表す。
【図７】インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＬＡＩＶの防御効力を実証する実験例の結果を描写する：６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝６）に１×１０３ＦＦＵのＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＷＴまたはＬＡＩＶをワクチン接種した。マウスはまた、１×１０３ＦＦＵのＦｌｕ  Ａｖｅｒｔを陰性対照及び陽性対照としてそれぞれ模擬ワクチン接種またはワクチン接種した。ワクチン接種後の２週間目に、マウスを１×１０５ＦＦＵのインフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８  ＷＴで曝露され、曝露後２日目（Ｎ＝３）及び４日目（Ｎ＝４）におけるウイルス力価を、抗ＮＰモノクローナル抗体（ＨＢ−６５）を用いた免疫フォーカスアッセイ（ＦＦＵ／ｍｌ）によって、肺ホモジネートから評価した。黒い点線は検出限界を表す（２００ＦＦＵ／ｍｌ）。データは、平均＋／−ＳＤを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ウマインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）及びＥＩＶ関連病理の治療及び予防のための組成物ならびに方法に関する。本発明は、突然変異体ＰＢ２及びＰＢ１タンパク質をこれらによりコードする、ＥＩＶゲノムのセグメント１及びセグメント２における様々な突然変異が、ウイルスを温度感応性にするという発見に一部は基づいている。例えば、本明細書では、このような突然変異は、野生型ＥＩＶと比較して、正常体温、及び高体温で低減されたウイルス複製を呈するＥＩＶをもたらすことが記載されている。しかしながら、温度感応性ＥＩＶは、ＥＩＶ特異的免疫応答を誘導することができる。したがって、本明細書に記載の温度感応性ＥＩＶは、本明細書ではＥＩＶ  ＬＡＩＶとして称されることがある弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）である。重要なことに、現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶは、市販のワクチンと比較して、ＥＩＶの治療においてより有効である。
【００２２】
本明細書では、ウマにおけるＨ３Ｎ８  ＥＩＶの予防及び制御のための有効かつ安全なＬＡＩＶの開発が記載される。逆遺伝学的アプローチをインフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３ＮウイルスのウイルスＰＢ２（Ｎ２６５Ｓ）及びＰＢ１（Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、及びＡ６６１Ｔ）ポリメラーゼサブユニットの改変と共に用いて、低温に適応した温度感応性ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＬＡＩＶを作製した。現行の不活性化ワクチンと比較して、現在記載の低温に適応した温度感応性ＬＡＩＶアプローチは、ＬＡＩＶが、呼吸器官の標的組織における、先天性及び適応性の体液性免疫応答と、Ｔ細胞免疫応答との両方の迅速かつ強力な産生を誘導するため、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶによって引き起こされる疾患に対してより良好かつ持続的な防御を提供する。また、ある特定の例では、ＬＡＩＶは、鼻スプレーを通して投与され、これが不活性化ワクチンの筋肉内感染に関連する腫れ及び筋肉痛を回避する。さらに、いくつかの実施形態では、低温適応された温度感応性ＬＡＩＶを用いた単回免疫付与は、現行の不活性化ワクチンで必要とされる複数回投与と比較して、より短期間でのＨ３Ｎ８  ＥＩＶに対する完全な防御を付与する。さらに、現在のＬＡＩＶ技術は、現行の不活性化ワクチンによって提供されるものとは抗原的に異なるＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８株に対する、より優れた交差防御効果を提供し、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶの流行の機会を減少させる。
【００２３】
唯一利用可能なＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＬＡＩＶと比較して、本技術はまた多くの利点を提供する。インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８のＰＢ２及びＰＢ１ポリメラーゼサブユニットに導入された突然変異は、現行のインフルエンザＡ／ウマ／ケンタッキー／１／９１  Ｈ３Ｎ８  ＬＡＩＶの低温適応によって生成された突然変異とは異なるが、同様の低温適応された温度感応性表現型をウイルスに付与することができる。さらに、最先端の逆遺伝学的技術の使用は、ヒトＬＡＩＶの場合と同様に、現在循環しているフロリダクレード１及び２サブタイプ、または新たに導入されたＨ３Ｎ８  ＥＩＶ株の治療のためのＬＡＩＶ候補の迅速かつ正確な開発を容易にする。これにより、現在のＬＡＩＶアプローチは、株適合のために、ウマにおけるＨ３Ｎ８  ＥＩＶ感染症を治療するために現在利用可能なＬＡＩＶよりも有効である。重要なことに、現行のＬＡＩＶとは対照的に、現在の低温適応された温度感応性インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８ウイルスは、ウマの個体群における現在循環しているかまたは潜在的に新しい抗原的に異なるＨ３Ｎ８ウマインフルエンザウイルスの予防及び制御を最終的な目的として、抗原的に異なる循環ＥＩＶ株からのＨＡ及びＮＡ糖タンパク質の導入によって毎年改良されるＬＡＩＶを産生するためのマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）として使用することができる。
【００２４】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な任意の方法及び材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が記載される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションにおいてそれに関連する意味を有する。
【００２６】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法的目的の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「ある要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００２７】
本明細書で量などの測定可能な値を指すときに使用される「約」は、このような変化が開示された方法を実施するために適切であるとき、特定の値から±２０％、±１０％、±５％、±１％または±０．１％の変化を包含することを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然の供給源または組換え供給源に由来する無処置の免疫グロブリンとすることができ、無処置の免疫グロブリンの免疫反応性部分とすることができる。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む、様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。
【００２９】
本明細書で使用される「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を引き起こす分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫担当細胞の活性化、またはその両方を伴うことができる。当業者であれば、実質的には全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が、抗原として働くことができることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えまたはゲノムＤＮＡから誘導することができる。当業者であれば、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、したがってこの用語が本明細書で使用されるような「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者であれば、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明が、限定されないが、２つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、及びこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者であれば、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が合成により生成することができるか、または生体試料から誘導することができることは容易に明らかである。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「自己」という用語は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指すことを意味する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「併用療法」は、第１の薬剤が別の薬剤と併せて投与されることを意味する。「と併せて」とは、別の治療モダリティーに加えて１つの治療モダリティーを施すことを指す。このように、「と併せて」とは、他の治療モダリティーを個体に送達する前、送達中または送達した後に１つの治療モダリティーを施すことを指す。このような組み合わせは、単一の治療レジメンまたはレジームの一部であると見なされる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「同時投与」という用語は、併用療法における第１の療法の施行と第２の療法の施行が互いに重なり合うことを意味する。
【００３３】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されないならば、そのときは動物の健康は悪化し続ける動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、動物の健康状態が、障害がない場合よりも好ましくない健康状態である。未処置のまま放置しても、障害は必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「有効量」は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。
【００３５】
本明細書使用される「発現」という用語は、そのプロモーターによって推進される特定のヌクレオチド配列の転写及び／または翻訳として定義される。
【００３６】
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給することができる。発現ベクターとしては、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、裸であるかまたはリポソーム中に封入される）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）などの、当技術分野において既知の全てのものが挙げられる。
【００３７】
「相同な」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められているとき、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められているならば、このときは分子がその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される一致するまたは相同な位置の数を、比較した位置の数で割って１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列における１０のうちの６つが一致または相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。一般に、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列されるときに比較が行われる。
【００３８】
本明細書で使用される「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能する部類のタンパク質として定義される。Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体として称されることもある。この部類のタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙液、母乳、胃腸分泌物及び呼吸器ならびに泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、大部分の対象における一次免疫応答において産生される主な免疫グロブリンである。これは、凝集、補体結合、及び他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防衛において重要である。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有さないが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露時にマスト細胞及び好塩基球から調整物質を放出させることにより、即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介免疫応答及び／またはＢ細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害活性、ならびにＢ細胞応答、例えば、抗体産生が挙げられる。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的に影響される免疫応答を含む。免疫応答に関与する免疫細胞としては、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）などのリンパ球；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞、及びケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、オリゴデンドロサイトなどの非プロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球などの骨髄細胞が挙げられる。
【００４０】
「単離された」は、自然状態から変更または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」が、その自然状態の共存する物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、または、例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在することができる。
【００４１】
免疫原性組成物の「非経口」投与としては、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射、もしくは注入技術が挙げられる。
【００４２】
「患者」、「対象」、「個体」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に記載の方法に従う、インビトロまたはインサイチュのいずれかの任意の動物またはその細胞を指す。
【００４３】
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、併用療法における第１の療法及び第２の療法が、約１５分以下、例えば、約１０分、５分または１分以下のいずれかの時間間隔で施されることを意味する。第１及び第２の療法が同時に施されるとき、第１及び第２の療法は、同じ組成物（例えば、第１及び第２の療法の両方を含む組成物）または別々の組成物（例えば、１つの組成物中に第１の療法に、及び第２の療法は別の組成物に含まれる）に含有され得る。
【００４４】
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つ以上の種からのその抗原にも結合することができる。しかし、このような異種間の反応性は、それ自体が特異的なものとして抗体の分類を変更しない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体はまた、抗原の異なる対立遺伝子型に結合し得る。しかしながら、そのような異種間の反応性は、それ自体が特異的なものとしての抗体の分類を変更しない。場合によっては、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、一般的なタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識し、かつ結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、エピトープ「Ａ」及び抗体を含有する反応におけるエピトープＡ（または遊離した非標識Ａ）を含有する分子の存在は、抗体に結合した標識付けされたＡの量を低減するであろう。
【００４５】
本明細書で使用される「正常温度」または「正常体温」という用語は、健康な対象の体温を指す。例えば、ある特定の例では、ヒト対象における「正常体温」は、約３６℃〜約３８℃の範囲である。ある特定の例では、ウマ対象において、「正常体温」は、約３７．５℃〜約３８．７℃の範囲である。
【００４６】
本明細書で使用される「高温度」または「高体温」という用語は、所与の生物体の対象の「正常体温」よりも高い対象の体温を指す。ある特定の例では、「高体温」は、発熱、感染、または他の疾病を示し得る。ある特定の例では、ヒト対象における高体温は、約３７℃を超える。ある特定の例では、ウマ対象における高体温は、約３８．９℃を超える。
【００４７】
本明細書で使用される「治療の」という用語は、治療及び／または予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【００４８】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師または他の臨床医が求める組織、系、または対象の生物学的または医学的応答を誘発すると思われる対象化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されると、治療される障害または疾患の徴候もしくは症状のうちの１つ以上の発症を予防するか、またはある程度緩和するために十分な化合物の量が含まれる。治療有効量は、化合物、疾患及びその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに依存して変化するであろう。
【００４９】
疾患を「治療する」という用語は、本用語は本明細書で使用される場合、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候もしくは症状の頻度または重症度を低減させることを意味する。
【００５０】
本明細書で使用される「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「形質移入された」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸で形質移入、形質転換または形質導入された細胞である。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【００５１】
範囲については、本開示の全体を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲の形式の記載は、単に便宜上及び簡潔性のためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、範囲内の全ての可能な部分範囲及び個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、範囲内の、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を、具体的に開示したものとみなされるべきである。これは範囲の幅に関係なく適用される。
【００５２】
説明
本発明は、ウマインフルエンザ及びウマインフルエンザ関連疾患ならびに障害の阻害、予防及び治療のために有用な免疫学的組成物ならびに方法を提供する。一実施形態では、免疫学的組成物は弱毒生ウイルス（ＬＡＶ）を含む。
【００５３】
一実施形態では、本発明は、ウマインフルエンザウイルスの温度感応性ＬＡＶを提供する。例えば、本明細書では、ＥＩＶゲノムのセグメント１及び／またはセグメント２における１つ以上の突然変異がウイルスを温度感応性にさせることが立証されている。本発明の温度感応性ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、野生型ＥＩＶと比較して、正常体温及び高温度または発熱温度の両方で低減されたウイルス複製を呈する。しかしながら、温度感応性ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、抗原特異的免疫応答及びＥＩＶに対する防御を提供する。一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、野生型ＥＩＶと比較して、少なくとも同じ抗原特異的免疫応答及びＥＩＶに対する防御を提供する。ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、不活性化ＥＩＶと比較して、より大きな抗原特異的免疫応答及びＥＩＶに対する防御を提供する。
【００５４】
一実施形態では、組成物は、ウイルスゲノムのセグメント１及び／またはセグメント２において１つ以上の突然変異体を有するＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む。例えば、一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、突然変異体ＰＢ２及び／または突然変異体ＰＢ１をコードする。ある特定の実施形態では、突然変異体ＰＢ２はＮ２６５Ｓ点突然変異を含む。ある特定の実施形態では、突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、またはＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの少なくとも１つを含む。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明は、ウイルスゲノムのセグメント１及び／またはセグメント２において１つ以上の突然変異を有するマスタードナーウイルス（ＭＤＶ）を含む組成物を提供する。一実施形態では、ＭＤＶは、本明細書に記載される突然変異体Ｈ３Ｎ８セグメント１及び／またはセグメント２を含む。ある特定の実施形態では、ＭＤＶは、他の病原体に対して防御的であるＬＡＩＶを生成するために使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、別のインフルエンザ株に対するＬＡＶは、他の株の１つ以上のウイルスタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）を発現するためにＭＤＶを用いることにより、生成することができる。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む組成物を投与することを含む、ＥＩＶ及びＥＩＶ関連病態を治療または予防するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、ＥＩＶ  ＬＡＩＶの鼻腔内送達を含む。
【００５７】
一般に、野生型インフルエンザウイルスは、以下の表１に記載されるような８つのセグメントを有するセグメント化されたゲノムを含有する。
【表１】
2019520338.tif 000003
【００５８】
ある特定の実施形態では、本発明は、セグメント１及び／またはセグメント２を含む免疫学的組成物を提供し、セグメント１及び／またはセグメント２は１つ以上の突然変異を含む。例えば、ある特定の実施形態では、免疫学的組成物は、セグメント１及び／またはセグメント２に１つ以上の突然変異を含むＬＡＩＶを含む。一実施形態では、免疫学的組成物は、セグメント１及び／またはセグメント２に１つ以上の突然変異を含む、ＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む。
【００５９】
本発明はまた、ＥＩＶ及びＥＩＶ関連疾患及び障害を予防、阻害ならびに治療する方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、ＥＩＶに向けられる免疫応答を生成することによってＥＩＶに対する免疫を誘導する。一実施形態では、本発明の方法は、ＥＩＶ特異的抗体の産生を誘導する。一実施形態では、本発明の方法は、ＥＩＶ関連病理を予防する。一実施形態では、本発明の方法は、ＬＡＶ（ＬＡＶは、セグメント１及び／またはセグメント２において１つ以上の突然変異を含む）を含む免疫学的組成物の投与を、投与を必要とする対象に施すことを含む。一実施形態では、方法は、免疫学的組成物の投与を、投与を必要とする対象に施し、それによりＥＩＶに対する免疫を誘導することを含む。
【００６０】
組成物
本発明は、投与を必要とする対象に施すとき、ウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ）に対する免疫応答を誘発する免疫学的組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリペプチド、ヌクレオチド、ベクター、またはワクチンを含む。さらに、組成物が対象に投与されるとき、これらは接種された対象をウマインフルエンザに対して防御するように働く免疫応答を誘発する。本明細書に例示されるように、組成物は、ワクチンとしての使用するために大量に得ることができる。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、例えば、免疫応答の刺激と、及びウマインフルエンザならびにウマインフルエンザ関連病態の予防において、免疫調節剤として有用である組成物を提供する。
【００６２】
弱毒生ウイルスは、ＥＩＶ特異的抗体の産生を誘導し、ウマインフルエンザ及びウマインフルエンザ関連病変から防御するための免疫刺激剤として使用することができる。したがって、一実施形態では、本発明の組成物は、弱毒生ＥＩＶ（ＥＩＶ  ＬＡＩＶ）を含み、このＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ウイルスゲノム中に１つ以上の突然変異を含み、ＥＩＶ  ＬＡＩＶを温度感応性にする。例えば、一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ウイルスゲノムのセグメント１において１つ以上の突然変異を含む。ウイルスゲノムのセグメント１における１つ以上の突然変異は、突然変異体ＰＢ２タンパク質をコードする。一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ウイルスゲノムのセグメント２において１つ以上の突然変異を含む。ウイルスゲノムのセグメント２における１つ以上の突然変異は、突然変異体ＰＢ１タンパク質をコードする。一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、セグメント１における１つ以上の突然変異と、セグメント２における１つ以上の突然変異とを含む。
【００６３】
一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８のゲノムに基づいている。インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８の各セグメントについての野生型核酸配列及びコードされたタンパク質の野生型アミノ酸配列を、以下の表２にまとめている。
【表２】
2019520338.tif 000004
【００６４】
一実施形態では、組成物は、ＰＢ２をコードするセグメント１、及び／またはＰＢ１をコードするセグメント２の核酸配列に１つ以上の突然変異を含む。したがって、ある特定の実施形態では、組成物は、突然変異体ＰＢ１及び／または突然変異体ＰＢ２をコードする。本明細書に記載されるように、１つ以上の突然変異は、ウイルスを温度感応性にさせて、正常温度または高温で低減されたウイルス複製を呈した。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明は、セグメント１において１つ以上の突然変異を含む組成物を提供する。例えば、一実施形態では、組成物は、アミノ酸残基２６５において点突然変異を有する突然変異体ＰＢ２の産生をもたらす１つ以上の突然変異を有するセグメント１を含む。例えば、一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、アミノ酸残基２６５において点突然変異を有することを除いては、配列番号６のアミノ酸配列を含む。例えば、一実施形態では、突然変異体ＰＢ２はＮ２６５Ｓ点突然変異を含み、ここでは突然変異体ＰＢ２は、アミノ酸残基２６５においてセリンを含む。
【００６６】
一実施形態では、組成物は、配列番号２のアミノ酸配列を有する突然変異体ＰＢ２をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号２と実質的に相同である突然変異体ＰＢ２をコードする核酸配列を含む。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号２と少なくとも５０％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％の相同、または少なくとも９９．５％の相同である突然変異体ＰＢ２をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号２と実質的に相同である突然変異体ＰＢ２をコードする核酸配列を含み、ここでは配列番号２に対して実質的に相同である突然変異ＰＢ２は、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含む。
【００６７】
一実施形態では、組成物は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む突然変異体セグメント１を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号１と実質的に相同であるヌクレオチド配列を含む。例えば、特定の実施形態では、組成物は、配列番号１と少なくとも５０％、少なくとも６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、または少なくとも９９．５％相同であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号１と実質的に相同であるヌクレオチド配列を含み、ここでは配列番号１と実質的に相同であるヌクレオチド配列によってコードされる突然変異体ＰＢ２は、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明は、セグメント２において１つ以上の突然変異を含む組成物を提供する。例えば、一実施形態では、組成物は、アミノ酸残基３９１、アミノ酸残基５８１、及びアミノ酸残基６６１のうちの１つ以上に点突然変異を有する突然変異体ＰＢ１の産生をもたらす１つ以上の突然変異を有するセグメント２を含む。例えば、一実施形態では、突然変異体ＰＢ２は、アミノ酸残基３９１、アミノ酸残基５８１、及びアミノ酸残基６６１のうちの１つ以上に点突然変異を有することを除いては、配列番号８のアミノ酸配列を含む。例えば、一実施形態では、突然変異体ＰＢ１はＫ３９１Ｅ点突然変異を含み、ここでは突然変異体ＰＢ１は、アミノ酸残基３９１においてグルタミン酸を含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１はＥ５８１Ｇ点突然変異を含み、ここでは突然変異体ＰＢ１は、アミノ酸残基５８１にグリシンを含む。一実施形態では、突然変異体ＰＢ１はＡ６６１Ｔ点突然変異を含み、ここでは突然変異体ＰＢ１は、アミノ酸残基６６１においてスレオニンを含む。
【００６９】
一実施形態では、組成物は、配列番号４のアミノ酸配列を有する突然変異体ＰＢ１をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号４と実質的に相同である突然変異体ＰＢ１をコードする核酸配列を含む。例えば、特定の実施形態では、組成物は、配列番号４と少なくとも５０％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、または少なくとも９９．５％相同である突然変異体ＰＢ１をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号４と実質的に相同である突然変異体ＰＢ１をコードする核酸配列を含み、ここでは配列番号４に実質的に相同である突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を含む。
【００７０】
一実施形態では、組成物は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む突然変異体セグメント２を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号３と実質的に相同であるヌクレオチド配列を含む。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号３に対して少なくとも５０％相同、少なくとも６０％相同、少なくとも７０％相同、少なくとも８０％相同、少なくとも９０％相同、少なくとも９５％相同、少なくとも９８％相同、少なくとも９９％相同、または少なくとも９９．５％相同であるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、組成物は、配列番号３と実質的に相同であるヌクレオチド配列を含み、ここでは配列番号３と実質的に相同であるヌクレオチド配列によってコードされる突然変異体ＰＢ１は、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を含む。
【００７１】
ある特定の実施形態では、組成物は、セグメント１における１つ以上の突然変異と、セグメント２における１つ以上の突然変異とを含む。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、Ｎ２６５Ｓ点突然変異を有するセグメント１と、Ｋ３９１Ｅ点突然変異、Ｅ５８１Ｇ点突然変異、及びＡ６６１Ｔ点突然変異のうちの１つ以上を有するセグメント２とを含む。
【００７２】
ある特定の実施形態では、組成物は、セグメント化されたゲノムの残り部分についての野生型核酸配列を含みながら、セグメント１及び／またはセグメント２の核酸配列に１つ以上の突然変異を含む。例えば、一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、セグメント１において１つ以上の突然変異を含み、野生型セグメント２、セグメント３、セグメント４、セグメント５、セグメント６、セグメント７、及びセグメント８を含む。一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、セグメント２において１つ以上の突然変異を含み、野生型セグメント１、セグメント３、セグメント４、セグメント５、セグメント６、セグメント７、及びセグメント８を含む。一実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、セグメント１及びセグメント２において１つ以上の突然変異を含み、野生型セグメント３、セグメント４、セグメント５、セグメント６、セグメント７及びセグメント８を含む。
【００７３】
ある特定の実施形態では、組成物は、ウイルスゲノムの１つ以上の他のセグメントにおける１つ以上の突然変異と組み合わせて、セグメント１及び／またはセグメント２における１つ以上の突然変異を含む。
【００７４】
ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、別の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と組み合わせて、突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含む。例えば、ある特定の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるように、別のウイルスまたは株のうち１つ以上の抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と組み合わせて、突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含む。例えば、ある特定の態様では、突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含む、本明細書に記載のＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、マスタードナーウイルス（ＭＤＶ）として使用することができる。例えば、本明細書に記載の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含むＨ３Ｎ８を含むＭＤＶは、別のインフルエンザ株からのＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、またはＮＥＰ／ＮＳ２のうち１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むように改変することができる。このように、本明細書に記載の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２またはこれらの組み合わせを含むＨ３Ｎ８を含む組成物は、組成物が異なる株の抗原を発現するとき、異なる株に対する防御を提供することができる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含むＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶの基本骨格を含む組成物は、別のインフルエンザ株からのＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、またはＮＥＰ／ＮＳ２のうち１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態では、本明細書に記載の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含むＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶの基本骨格を含む組成物は、異なるインフルエンザ株のＨＡまたはＮＡのうちの１つ以上をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。例えば、本明細書に記載のＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶの基本骨格を含む組成物は、新たに出現した株の１つ以上のウイルスタンパク質を発現するように改変されてもよく、それにより新たに出現する株に対する防御を提供する。
【００７５】
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載のＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶのセグメント１、セグメント２、セグメント３、セグメント５、セグメント７及びセグメント８を含み、セグメント１及びセグメント２のうちの１つ以上において１つ以上の点突然変異を含み、この組成物は、異なるＥＩＶ株のセグメント４及びセグメント６をさらに含む。
【００７６】
一実施形態では、組成物は、Ｈ３Ｎ８の突然変異セグメント１、Ｈ３Ｎ８の突然変異セグメント２、またはこれらの組み合わせを含み、異なるＥＩＶ株のセグメント４、セグメント６、またはこれらの組み合わせをさらに含む。ある特定の態様では、Ｈ３Ｎ８の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせは、ＥＩＶ  ＬＡＩＶの温度感応性弱毒化表現型を提供し、一方、異なるＥＩＶ株のセグメント４、セグメント６、またはこれらの組み合わせは、異なるＥＩＶ株のＨＡ、ＮＡまたはこれらの組み合わせをコードして、対象において異なるＥＩＶ株に対する特異的免疫応答を誘発する。
【００７７】
一実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数のＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む。例えば、一実施形態では、組成物は、Ｈ３Ｎ８の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含む第１のＥＩＶ  ＬＡＩＶを含み、ここでは、第１のＥＩＶ  ＬＡＩＶは、Ｈ３Ｎ８のセグメント４、セグメント６、またはこれらの組み合わせを含み、組成物は、Ｈ３Ｎ８の突然変異体セグメント１、突然変異体セグメント２、またはこれらの組み合わせを含む第２のＥＩＶ  ＬＡＩＶをさらに含み、ここでは、第２のＥＩＶ  ＬＡＩＶは、異なるＥＩＶ株のセグメント４、セグメント６、またはこれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、Ｈ３Ｎ８及び他のＥＩＶ株の両方に対する免疫応答を誘導する。
【００７８】
ある特定の実施形態では、組成物は、突然変異体ＰＢ２及び／または突然変異体ＰＢ１をコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡとすることができる。一実施形態では、組成物はＤＮＡワクチンを含む。
【００７９】
核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列及びポリペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。他の実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列から推測される。当技術分野において既知であるように、翻訳されたポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、冗長性コドンのためにいくつかの代替的なポリヌクレオチドが可能である。
【００８０】
さらに、本発明は、本明細書中に開示されるポリペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列と実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を有する単離された核酸を包含する。好ましくは、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列は「実質的に相同」であり、すなわち、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列と約６０％相同であり、より好ましくは約７０％相同であり、さらにより好ましくは約８０％相同であり、より好ましくは約９０％相同であり、さらにより好ましくは約９５％相同であり、そしてさらにより好ましくは約９９％相同である。
【００８１】
本発明の範囲は、これらの改変が元の分子の免疫学的活性を保存しなければならないという条件で、より短い及びより長いポリペプチド及びポリヌクレオチド、ならびに１つ以上のアミノ酸または核酸置換を有するポリペプチド及びポリヌクレオチド類似体、ならびに、当技術分野において既知であるようなアミノ酸または核酸誘導体、非天然アミノ酸または核酸及び合成アミノ酸または核酸を含む、相同体、類似体、変異体、断片、誘導体及び塩を包含することが明示的に理解されるべきである。具体的には、活性ポリペプチドの任意の活性断片、ならびに伸長、抱合体及び混合物が含まれ、本発明の原理に従って本明細書に開示される。
【００８２】
本発明は、本明細書中に記載かつ参照される核酸に相同であるありとあらゆる単離された核酸は、これらの相同な核酸が本明細書中に開示されるポリペプチドの生物学的活性を有するポリペプチドをコードすることを条件として含むと解釈されるべきである。
【００８３】
当業者であれば、本発明の核酸が、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列、及びＤＮＡまたはＲＮＡの化学的改変であって、それが無細胞であるとき、またはそれが細胞と会合しているとき、ヌクレオチド配列をより安定にさせるＤＮＡまたはＲＮＡの化学的改変を含む、それらの任意の改変形態を包含することを理解するであろう。ヌクレオチドの化学的改変もまた、ヌクレオチド配列が細胞によって取り込まれる効率、またはそれが細胞中で発現される効率を増強するために使用されてもよい。ヌクレオチド配列の改変のありとあらゆる組み合わせが、本発明において企図される。
【００８４】
さらに、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ方法論を使用して、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されているものなどの、本発明のタンパク質の突然変異体、誘導体または変異体の生成のために、いくつもの手順を使用することができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を変更することによって、アミノ酸変化を１つのポリペプチドまたは複数のポリペプチドに導入するための手順は、当技術分野において周知であり、これら及び他の論文にも記載されている。
【００８５】
さらに別の実施形態によれば、本発明の核酸配列または核酸配列の組み合わせを含む本発明の組成物は、ＥＩＶ特異的免疫応答を生成することが可能である。別の実施形態では、本発明の核酸配列または核酸配列の組み合わせを含む本発明の組成物は、ＥＩＶ特異的抗体を生成することが可能である。ある特定の実施形態では、組成物は、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶを含むＥＩＶに対して防御することができる。
【００８６】
一実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２及び配列番号４のうちのいずれか１つ以上の配列を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、相同体、変異体、誘導体または塩を含む。
【００８７】
本発明はまた、本明細書に開示されるポリペプチドと実質的相同性を有する任意の形態のポリペプチドを含むと解釈されるべきである。好ましくは、「実質的に相同」であるポリペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドのアミノ酸配列と約５０％相同であり、より好ましくは約７０％相同であり、さらにより好ましくは約８０％相同であり、より好ましくは約９０％相同であり、さらにより好ましくは約９５％相同であり、そしてさらにより好ましくは約９９％相同である。
【００８８】
さらに別の実施形態によれば、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせを含む本発明の組成物は、ＥＩＶ特異的免疫応答を生成することが可能である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはポリペプチドの組み合わせを含む本発明の組成物は、ＥＩＶ特異的抗体を生成することが可能である。ある特定の実施形態では、組成物は、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶを含むＥＩＶに対して防御することができる。
【００８９】
本発明はまた、本発明のポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」、「誘導体」、及び「変異体」を包含し、これらの突然変異体、誘導体及び変異体が、得られたポリペプチド（またはＤＮＡ）が本明細書に列挙される配列と同一ではないが、本明細書に開示されるポリペプチドと同じ生物学的特性を有するように、１つ以上のアミノ酸において変更された（または、それをコードするヌクレオチド配列を指すとき、１つ以上の塩基対において変更された）ポリペプチドであると解釈されるべきである。
【００９０】
弱毒生ウイルス（ＬＡＶ）
本発明は、一部には、ＥＩＶ特異的免疫応答を生成する弱毒生ウイルス（ＬＡＶ）の生成、選択及び同定、ならびにこのようなウイルスのワクチン及び医薬製剤における使用に関する。
【００９１】
本明細書に記載されるように、ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ウイルスを温度感応性にさせる、セグメント１における１つ以上の突然変異及び／またはセグメント２における１つ以上の突然変異を含む。例えば、一実施形態では、温度感応性ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、正常温度及び高温で低減されたウイルス複製を呈する。しかしながら、温度感応性ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ＥＩＶ特異的免疫応答及び抗体産生を誘導し、これにより、ＥＩＶ及びＥＩＶ関連病理に対して防御することができる。
【００９２】
少なくとも１つの突然変異を有する任意の突然変異体ウイルスまたは株を、本発明に従って選択して使用することができる。一実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されているように、セグメント１及び／またはセグメント２に少なくとも１つの突然変異を含む天然の突然変異体または変異体もしくは自発突然変異体を選択することができる。別の実施形態では、突然変異体ウイルスは、ウイルスを紫外線照射または化学的突然変異原などの突然変異原に曝露することによって、または非許容宿主中での複数の継代及び／または継代によって生成することができる。差次的増殖システムにおけるスクリーニングは、本明細書の他の箇所に記載されているように、セグメント１及び／またはセグメント２に少なくとも１つの突然変異を有する突然変異体を選択するために使用することができる。セグメント化されたゲノムを有するウイルスについて、弱毒化表現型は、遺伝子再集合（すなわち、弱毒化ウイルス及び所望の株の共感染、ならびに両方の表現型を示す遺伝子再集合体の選択）によって所望の抗原を有する別の株に移入することができる。
【００９３】
別の実施形態では、突然変異は、「逆遺伝学」アプローチを使用して、限定されるものではないがＨ３Ｎ８  ＥＩＶが含まれるインフルエンザウイルス中で操作することができる。このようにして、弱毒化表現型を付与する天然または他の突然変異をワクチン株で操作することができる。例えば、ＰＢ２をコードするセグメント１、及び／またはＰＢ１をコードするセグメント２のコード領域の欠失、挿入、または置換を操作することができる。セグメント１及び／またはセグメント２の非コード領域における欠失、置換または挿入もまた企図される。この目的のために、セグメント１及び／またはセグメント２の転写、複製、ポリアデニル化及び／またはパッケージングを担うシグナルにおける突然変異を操作することができる。
【００９４】
ある特定の例では、逆遺伝学技術は、ウイルスポリメラーゼによる認識に、かつ成熟ビリオンを生成するために必要なシグナルをパッケージングするために必須である、マイナス鎖ウイルスＲＮＡの非コード領域を含有する合成組換えウイルスＲＮＡの調製を伴う。組換えＲＮＡは、組換えＤＮＡ鋳型から合成され、精製されたウイルスポリメラーゼ複合体で、インビトロで再構成され、細胞に形質移入するために使用することができる組換えリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。場合によっては、インビトロまたはインビボのいずれかで合成ＲＮＡの転写中にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在する場合、より効率的な形質移入が達成される。合成組換えＲＮＰは、感染性ウイルス粒子中で開放され得る。前述の技術は、１９９２年１１月２４日に発行された米国特許第５，１６６，０５７号；１９９８年１２月２９日に発行された米国特許第５，８５４，０３７号；１９９６年２月２０日に公開された欧州特許公開第０７０２０８５Ａ１号；米国特許出願第０９／１５２，８４５号；１９９７年４月３日に公開されたＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９７／１２０３２号；１９９６年１１月７日に公開された同第ＷＯ９６／３４６２５号；欧州特許公開第ＥＰ−Ａ７８０４７５号；１９９９年１月２１日に公開された国際特許公開第９９／０２６５７号；１９９８年１１月２６日公開された同第ＷＯ９８／５３０７８号；１９９８年１月２２日公開された同第ＷＯ９８／０２５３０号；１９９９年４月１日公開された同第ＷＯ９９／１５６７２号；１９９８年４月２日公開された同第ＷＯ９８／１３５０１号；１９９７年２月２０日公開された同第ＷＯ９７／０６２７０号；及び１９９７年６月２５日公開された第ＥＰＯ  ７８０  ４７ＳＡ１号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９５】
逆遺伝学アプローチによって生成された弱毒化ウイルスは、本明細書に記載のワクチン及び医薬製剤に使用することができる。逆遺伝学技術はまた、ワクチン製造に重要な他のウイルス遺伝子に追加の突然変異を操作するために使用することができ、すなわち、有用なワクチン株変異体のエピトープを、弱毒化ウイルスに操作することができる。あるいは、他のウイルスまたは非ウイルス病原体に由来する抗原を含む、完全に外来のエピトープを、弱毒化株に操作することができる。
【００９６】
代替的な実施形態では、逆遺伝学技術と遺伝子再集合体技術との組み合わせを使用して、所望のエピトープを有する弱毒化ウイルスを操作することができる。例えば、弱毒化ウイルス（自然選択、突然変異誘発によって、または逆遺伝学技術によって生成される）及び所望のワクチンエピトープ（自然選択、突然変異誘発によって、または逆遺伝学技術によって生成される）を有する株は、セグメント化されたゲノムの遺伝子再集合を可能にする宿主に共感染させることができる。次いで、弱毒化表現型及び所望のエピトープの両方を表す遺伝子再集合体を選択することができる。
【００９７】
本発明の弱毒化ウイルスは、それ自体を、ワクチンまたは医薬製剤中の有効成分として使用することができる。ある特定の実施形態では、弱毒化ウイルスは、組換え生産ワクチンのベクターまたは「基本骨格」として使用することができる。この目的のために、「逆遺伝学」技術は突然変異を操作するか、または「親」株として働く弱毒化ウイルスに外来のエピトープを導入するために使用することができる。このようにして、ワクチンは、株変異体に対する免疫付与のために、または代替的に、完全に異なる感染因子または疾患抗原に対する免疫化のために設計することができる。
【００９８】
例えば、一実施形態では、本発明の免疫学的組成物は、ＥＩＶの１つ以上のエピトープまたは抗原を別の病原体のエピトープまたは抗原と共に発現するように操作された弱毒生ウイルスを含む。例えば、弱毒化ウイルスは、他の予め選択された株の中和エピトープを発現するように操作することができる。あるいは、他のウイルスのエピトープを弱毒化突然変異体ウイルスに組み込むことができる。あるいは、非ウイルス感染性病原体（例えば、寄生虫、細菌、真菌）のエピトープをウイルスに操作することができる。
【００９９】
一実施形態では、本発明において使用するために選択された弱毒化ウイルスは、宿主において強固な抗ＥＩＶ応答、すなわち、ワクチンとして使用される場合に強力な免疫応答の生成に寄与する特徴であり、そしてウイルスを他のウイルス感染症、または他の疾患の予防及び／または治療のための医薬品として有用にする他の生物学的結果を有する特徴を誘導することができる。
【０１００】
宿主においてＥＩＶ特異的免疫応答を誘導する弱毒化ウイルスもまた、他のインフルエンザ感染、またはインフルエンザ関連病理の予防もしくは治療のための医薬製剤に使用されてもよい。この点については、弱毒化ウイルスの親和性は、インビボまたはエクスビボで所望の標的臓器、組織または細胞にウイルスを向けるように変更することができる。このアプローチを使用して、ＥＩＶ特異的免疫応答を標的部位で局所的に誘導し、これにより、全身治療の副作用を回避または最小化することができる。このために、弱毒化ウイルスは、標的臓器、組織または細胞の受容体に特異的なリガンドを発現するように操作することができる。
【０１０１】
ワクチン
ある特定の態様では、免疫学的組成物はワクチンとして有用であり、この免疫学的組成物は、細胞、組織または哺乳動物における抗原に対する免疫応答を誘導する。好ましくは、ワクチンは哺乳動物において防御免疫応答を誘導する。本明細書で使用される場合、「免疫学的組成物」は、例として、弱毒生ウイルス（ＬＡＶ）、抗原（例えば、ポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば、抗原発現ベクター）、または抗原もしくは細胞構成成分を発現または提示する細胞を含み得る。特定の実施形態では、免疫学的組成物は、本明細書に記載の任意のポリペプチド抗原の全てまたは一部、もしくはその免疫学的機能的等価物を含むかまたはコードする。他の実施形態では、免疫学的組成物は、追加の免疫刺激剤またはこのような薬剤をコードする核酸を含む混合物中にある。免疫刺激剤には、追加の抗原、免疫調節剤、抗原提示細胞またはアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、追加の薬剤（複数可）のうちの１つ以上は、任意の組み合わせで、抗原または免疫刺激剤に共有結合される。ある特定の実施形態では、抗原性組成物は、ＨＬＡアンカーモチーフのアミノ酸に複合化されるか、またはこれを含む。
【０１０２】
本発明との関係においては、「ワクチン」という用語は、動物への接種時に抗ＥＩＶ免疫を誘導するか、またはＥＩＶを抑制する物質を指す。
【０１０３】
本発明は、弱毒化生ウイルス（ＬＡＶ）を含むワクチン製剤を包含し、このＬＡＶは弱毒生ウマインフルエンザウイルス（本明細書ではＥＩＶ  ＬＡＩＶと称される）である。例えば、ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、温度感応性であり、野生型ＥＩＶと比較して、正常温度及び高温で低減されたウイルス複製を呈する。一実施形態では、ワクチンは、セグメント１及び／またはセグメント２において１つ以上の突然変異を含むＥＩＶ  ＬＡＩＶと、好適な賦形剤とを含む。ワクチン製剤に使用されるウイルスは、天然突然変異体または変異体、突然変異誘発ウイルスまたは遺伝子操作されたウイルスから選択され得る。弱毒化されたＥＩＶ株は、遺伝子再集合技術を介して、または逆遺伝学的アプローチと遺伝子再集合技術との組み合わせを用いて生成することもできる。天然起源の変異体は、自然界から単離されたウイルスならびにウイルス増殖中に発生する自発的に生じる変異体を含む。弱毒化ウイルスは、それ自体を、ワクチン製剤中の有効成分として使用することができる。あるいは、弱毒化ウイルスは、組換え生産ワクチンのベクターまたは「基本骨格」として使用することができる。この目的のために、逆遺伝学（または、セグメント化ウイルスについては、逆遺伝学及び遺伝子再集合法の組み合わせ）などの組換え技術は、ワクチン製剤に使用される弱毒化ウイルスに対して突然変異を操作するか、または外来抗原を導入するために使用することができる。このようにして、ワクチンは、株変異体に対する免疫付与のために、または代替的に、完全に異なる感染因子または疾患抗原に対する免疫付与のために設計することができる。
【０１０４】
一実施形態では、ワクチン製剤は、複数の突然変異体ＥＩＶを含む。一実施形態では、ワクチン製剤は、本明細書に記載のＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む二価ワクチンを第２のＬＡＩＶと組み合わせて含み、第２のＬＡＩＶは、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶ基本骨格に基づくが、別の株のＨＡ及びＮＡウイルスタンパク質を発現するように操作される。
【０１０５】
一実施形態では、ワクチン製剤は、抗ＥＩＶ免疫応答を誘導する他の突然変異ＥＩＶと組み合わせて、本明細書に記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶのうちの１つ以上を含むことができる。一実施形態では、本発明は、宿主細胞を、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の突然変異を有するセグメント１及び／またはセグメント２の核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む、ＥＩＶ  ＬＡＩＶの生成方法を含む。
【０１０６】
培養物中のウイルスの増殖法は当業者に既知である。簡単に言えば、宿主細胞が一般に培養される培地組成物中でウイルスを増殖させる。ＥＩＶの複製に好適な宿主細胞には、例えば、ベロ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、及び２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞を含むＣＥＫ細胞が挙げられる。一般的に、上記の細胞株のうちの２つを含む共培養物、例えば、ＭＤＣＫ細胞及び２９３Ｔ細胞またはＣＯＳ細胞のいずれかを、複製効率を改善するために、例えば、１：１の比で使用する。典型的には、細胞は、中性緩衝化ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０〜７．２）を維持するために好適な制御された湿度及びＣＯ２濃度下で、血清（例えば、１０％ウシ胎児血清）を補充したダルベッコ変法イーグル培地などの標準的な市販の培養培地中で、または無血清培地中で培養する。任意に、培地は、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシンなどの細菌増殖を防止するための抗生物質、及び／またはＬ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸などの追加の栄養素、例えば、トリプシン、β−メルカプトエタノールなどの、好都合な増殖特性を促進するための追加の補助剤を含有する。
【０１０７】
培養物中の哺乳動物細胞を維持するための手順は、広範に報告されており、当業者に既知である。一般的なプロトコールは、例えば、Ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｒｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ，ｅ．ｇ．，ｉｎ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８３）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｐａｕｌ（１９７５）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ；Ａｄａｍｓ（１９８０）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ（ｅｄｓ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍに提供されている。インビトロでのインフルエンザウイルスの産生を特に関係する組織培養手順に関する追加の詳細としては、例えば、その全体が本明細書に組み込まれるＣｏｈｅｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｆｆｅｒｍａｎ（ｅｄｓ）Ｎｏｖｅｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶａｃｃｉｎｅｓにおけるＭｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎが挙げられる。加えて、本発明に適合されたこのような手順における変動は、慣習的な実験を通して容易に決定される。
【０１０８】
ウイルス産生のための細胞は、血清含有培地または無血清培地で培養することができる。いくつかの場合では、例えば、精製ウイルスの調製のために、無血清条件下で宿主細胞を増殖させることが望ましい。細胞は、小規模で、例えば、２５ｍｌ未満の培地、培養管またはフラスコ中で、または大型フラスコ中で攪拌しながら、回転ボトル中で、もしくはフラスコ、ボトルまたは培養反応器中のマイクロキャリアビーズ（例えば、Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ、Ｐｆｅｉｆｅｒ＆Ｌａｎｇｅｎ；ＳｕｐｅｒｂｅａｄなどのＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎマイクロビーズ；Ｓｕｐｅｒｂｅａｄ、Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｉｌｌｅｘ、ＳｏｌｏＨｉｌｌ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒなどのスチレンコポリマー−トリ−メチルアミンビーズ）上で培養することができる。マイクロキャリアビーズは、細胞培養物容積当たりの接着細胞増殖のための大きな表面積を提供する小さな球体（直径１００〜２００ミクロンの範囲）である。例えば、１リットルの培地は、８０００平方センチメートルを超える増殖表面を提供する２０００万個より多いマイクロキャリアビーズを含むことができる。例えば、ワクチン製造のための、ウイルスの商業的生産のためには、細胞をバイオリアクタまたは発酵槽中で培養することが望ましいことが多い。バイオリアクタは、１リットル未満から１００リットルを超える容積、例えば、Ｃｙｔｏ３バイオリアクタ（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，Ｍｉｎｎ．）；ＮＢＳバイオリアクタ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の実験室及び商業規模のバイオリアクタが利用できる。
【０１０９】
実際には、任意の異種遺伝子配列が、ワクチンで使用するために本発明のウイルスに構築されてもよい。好ましくは、様々な病原体のいずれかに対して防御免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、ウイルスの一部によって、またはウイルスの一部として発現されてもよい。例えば、ワクチンで使用するために本発明のウイルスに構築され得る異種遺伝子配列としては、ほんの数例を挙げれば、ｇｐ１２０などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、ｇＤ、ｇＥ）；ポリオウイルスのＶＰ１；細菌及び寄生虫などの非ウイルス病原体の抗原決定基が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、免疫グロブリン遺伝子の全てまたは一部が発現されてもよい。例えば、このようなエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリン遺伝子が、本発明のウイルスに構築されてもよい。さらに別の実施形態では、腫瘍関連抗体が発現されてもよい。
【０１１０】
組換えウイルス生ワクチンまたは不活性化組換えウイルスワクチンのいずれかを製剤化することができる。生ワクチンが好まれ得る。なぜなら宿主中の増殖が、自然感染で発生するものと同様な種類及び大きさの長期間の刺激をもたらし、それによって、実質的に長く持続する免疫を与えるためである。このような組換えウイルス生ワクチン製剤の製造は、細胞培養中またはニワトリ胚の尿膜中のウイルスの増殖に続く精製を伴う従来の方法を用いて達成することができる。
【０１１１】
多くの方法を用いて、上述のワクチン製剤を導入することができ、これらの方法としては、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下が挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンが設計される病原体の自然感染の経路を介して、または弱毒親ウイルスの自然感染の経路を介してウイルスワクチン製剤を導入することが望ましい場合がある。
【０１１２】
ＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む本発明のワクチンは、１回投与することができる。あるいは、ＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む本発明のワクチンは、投与間の好適な間隔で、２回または３回もしくはそれ以上の回数で投与することができる。あるいは、ＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む本発明のワクチンは、動物、好ましくは哺乳動物に必要な頻度で投与することができる。
【０１１３】
方法
本発明は、ウマインフルエンザ感染症またはＥＩＶ関連疾患もしくは障害を治療または予防するための方法を提供する。一実施形態では、本方法は、弱毒生ウイルス（ＬＡＶ）を含む免疫学的組成物を投与することを含み、ＬＡＶは、ＥＩＶ  ＬＡＩＶである。一実施形態では、本方法は、セグメント１及び／またはセグメント２において１つ以上の突然変異を含むＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む免疫学的組成物の投与を、投与を必要としている対象に施すことを含む。
【０１１４】
上述のように、ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、温度感応性であり、正常温度及び高温において、野生型ＥＩＶと比べてウイルス複製の減少を呈する。例えば、ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶのウイルス複製は、正常温度または高体温において野生型ＥＩＶよりも２倍少なく、３倍少なく、５倍少なく、１０倍少なく、１５倍少なく、２０倍少なく、５０倍少なく、１００倍少なく、５００倍少なく、または１０００倍少ない。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、不活性化ＥＩＶと比べて増強した免疫応答を誘導する。例えば、ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶの誘導された免疫応答は、不活性化ＥＩＶよりも２倍多く、３倍多く、５倍多く、１０倍多く、１５倍多く、２０倍多く、５０倍多く、１００倍多く、５００倍多く、または１０００倍多い。ＥＩＶ  ＬＡＩＶにより誘導される免疫応答は、標準アッセイによって測定することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶにより誘導される免疫応答は、ＥＩＶ  ＬＡＩＶの投与後に対象において生成されるＥＩＶ特異的抗体の量を検出することによって測定される。
【０１１６】
本発明の治療用組成物は、疾患または病態に冒されているか、あるいは疾患または病態の発症のリスクがあるか、もしくはその疑いがある対象に予防的または治療的に投与されてもよい。このような対象は、標準的な臨床方法を用いて特定することができる。本発明との関係においては、予防的投与は、明白な臨床症状の発現に先立って行われ、これにより、疾患または障害は予防されるか、あるいはその進行が遅延される。医学の分野との関係において、「予防する」という用語は、疾患からの死亡率または罹患率の負荷を低減する任意の活動を包含する。予防は、一次、二次及び三次予防レベルで行うことができる。一次予防は疾患の発症を回避するが、一方予防の二次及び三次レベルは、疾患の進行及び症状の発現を予防すること、ならびに機能を回復させ、かつ疾患に関連する合併症を低減することによって、すでに確立された疾患の悪影響を低減することを目的とする活動を包含する。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。例えば、対象としては、ヒト、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、または齧歯類を挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、対象はウマである。本方法は、任意の品種または種のウマにおいてＥＩＶまたはＥＩＶ関連病理を治療または予防するために使用されてもよい。ある特定の実施形態では、単回用量中の活性成分の相対量、または投与の頻度は、対象（例えば、ウマ）の年齢、性別、体重、または品種に応じて変化するであろう。
【０１１８】
本組成物は、アジュバントと組み合わせてもよい。アジュバントとは、免疫学的組成物と一緒に（または逐次的に）投与されると、免疫応答を増強させる化合物を指す。好適なアジュバントの例としては、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバンなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、医薬的に許容される担体と適切に組み合わせてもよい。このような担体の例は、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩緩衝液、培養液などである。さらに、ワクチンは、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有してもよい。ワクチンは、全身的にまたは局所的に投与される。ワクチン投与は、単回投与によって行われてもよく、または複数回投与によって追加免疫されてもよい。
【０１１９】
投与
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の免疫学的組成物の投与を、投与を必要とする対象に直接施すことを含む。組成物の投与は、例えば、鼻腔内、筋肉内、静脈内、腹腔、皮下、皮内、ならびに局所投与を含むことができる。
【０１２０】
さらに、実際の用量及びスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と併用して投与されるかどうか応じて、または薬物動態、薬物の体内動態、及び代謝における個体間差に応じて変化することができる。当業者であれば、特定の状況の緊急性に従っていずれかの必要な調整を容易に行うことができる。
【０１２１】
投薬レジメンは、有効量を構成することに影響を及ぼし得る。治療用製剤は、感染または疾患の診断前にまたは診断後のいずれかで大量に投与されてもよい。さらに、いくつかの分割投与量、ならびに数回に分けての投与量は、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または用量は、持続的に注入されてもよく、あるいはボーラス注入されてもよい。さらに、治療用製剤の投与量は、治療的または予防的状況の緊急性に適応して比例的に増加または減少されてもよい。
【０１２２】
本発明の組成物の対象への投与は、疾患を予防または治療するのに有効な投与量及び期間で、既知の手順を用いて行うことができる。治療効果を達成するのに必要な治療用化合物の有効量は、使用される特定の化合物の活性；投与の時間；化合物の排出率；治療の持続時間；本化合物と併用して使用される他の薬物、化合物または物質；疾患または障害の状態、年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態、治療される対象の以前の病歴などの要因、及び医学分野において周知である要因のようなものにより変化してもよい。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整されてもよい。例えば、いくつかの分割用量が毎日投与されてもよく、またはこの用量は、治療状況の緊急性に適応して比例的に減少されてもよい。本発明の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約１〜５，０００ｍｇである。当業者であれば、関連要因を検討して、過度の実験を行うことなく、治療用化合物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
【０１２３】
本化合物は、毎日数回ほどの頻度で対象に投与されてもよく、または本化合物は、1日１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回などの、それほど頻繁ではなく投与されてもよく、または数か月毎に１回もしくは１年に１回またはそれより少ないなど、さらに少ない頻度で投与されてもよい。
【０１２４】
医薬組成物
本発明は、本発明の治療用組成物の投与を、投与を必要とする哺乳類に施すことによる、哺乳動物におけるＥＩＶまたはＥＩＶ関連病理を治療または予防することを想定する。本発明による組成物の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか、または予防的であるか、及び当業者に既知の他の要因に応じて、連続的または断続的であってもよい。本発明の組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、または一連の間隔を空けた投与であってもよい。局所投与及び全身投与の両方が企図される。投与される量は、限定されるものではないが、選択される組成物、特定の疾患、哺乳動物の体重、体調、及び年齢、ならびに予防または治療のどちらが達成されるべきかが挙げられる様々な要因に応じて変化するであろう。このような要因は、動物モデルまたは他の試験システムを使用する臨床医によって容易に決定することができ、これらは当該技術分野において周知である。
【０１２５】
本発明は、抗ウイルス剤またはＥＩＶ関連疾患及び障害に対する薬剤として使用されるＥＩＶ  ＬＡＩＶを含む医薬組成物を包含する。本医薬組成物は、抗ウイルス予防薬としての有用性を有しており、感染するリスクがあるか、またはウイルスに曝されると予想される対象に投与することができる。例えば、ＥＩＶが流行している世界の地域に旅行する対象に、本発明の医薬組成物を投与することができる。ある特定の実施形態では、リスクを有する他の対象と接触することが予想される対象に、本発明の医薬組成物を投与することができる。
【０１２６】
本発明のＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ウイルスを特定の部位に向けることになるタンパク質またはペプチドを発現するために、本明細書に記載の方法を用いて操作することができる。一実施形態では、目標とされる部位が、増殖因子、例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、またはＰＤＧＦに対する受容体を発現する場合、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、適切な増殖因子またはその部分（複数可）を発現するように操作されてもよい。したがって、本発明によれば、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、抗ウイルス、抗菌、抗微生物、または抗がん活性に必要とされる部位にウイルスを向けるように機能すると思われる酵素、ホルモン、増殖因子、抗原または抗体などのペプチド、タンパク質が含まれる任意の標的遺伝子産物を発現するように操作されてもよい。
【０１２７】
導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、任意の従来の経路によって、例えば、注入または大量注入によって、上皮または皮膚粘膜被膜（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を通しての吸収によって投与されてもよく、他の生物活性剤と一緒に投与されてもよい。投与は、全身的または局所的とすることができる。加えて、好ましい実施形態では、任意の好適な経路によって、本発明の医薬組成物を肺に導入することが望ましい場合がある。肺投与はまた、例えば、吸入器または噴霧器の使用、及びエアロゾル化剤を伴う製剤の使用によって採用されてもよい。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、例えば、限定されるものではないが、手術中の局所注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と合わせて）、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、または移植片を用いて達成されてよく、該移植片は、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状物質、例えばシアラスト膜（ｓｉａｌａｓｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜、または繊維である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本医薬組成物は、限定されるものではないがウマ科の対象が挙げられる獣医学的対象に投与するのに好適な動物用医薬組成物である。例示的なウマ科の対象としては、ウマ、シマウマ、ロバ（ａｓｓｅｓ）、及び家畜用ロバ（ｄｏｎｋｅｙ）が挙げられるが、これらに限定されないウマ属の任意のメンバーを含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、動物用医薬組成物は、「口に合う」ものであり、これは、ウマを含むウマ科動物を何のなだめもなく、またはいくらかなだめて、ウマ科動物に容易に受け入れられる経口動物用組成物を意味する。
【０１３１】
さらに別の実施形態では、本医薬組成物は、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプが使用されてもよい（上記、Ｌａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ＆  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照し；またＬｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，  Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出系は、組成物の標的、すなわち肺の近傍に配置することができ、これにより、全身用量の一部分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，  ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８を参照されたい）。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによるレビュー（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）で論議されている。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、治療有効量の弱毒ウイルスと、医薬的に許容される担体とを含む。特定の実施形態では、「医薬的に許容される」という用語は、動物に使用するために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に列記されていることを意味する。「担体」という用語は、その医薬組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩水ならびにデキストローズ及びグリセロール水溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液として使用することができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレングリコール、水などが挙げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉剤、持続放出製剤などの形態を取ることができる。これらの組成物は坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準担体を含むことができる。好適な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、好適な量の担体と共に、治療有効量の治療薬を、好ましくは精製形態で含有するであろう。製剤は、投与のモードに適さねばならない。
【０１３３】
特定の疾患または障害の治療もしくは予防に有効となる本発明の医薬組成物の量は、疾患または障害の性質に依存するであろうし、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、インビトロアッセイは、任意に、最適な投与量範囲を特定する助けとなるように使用されてもよい。製剤で使用されるための正確な用量もまた、投与の経路、及び疾患または障害の重症度に依存するであろうし、開業医の判断及び患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験システムから誘導された用量反応曲線から推定することができる。
【０１３４】
ある実施形態では、本発明の方法を実行するために有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達させるように投与することができる。別の実施形態では、本発明の方法を実行するために有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を送達させるように投与されてもよい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物中の活性成分、医薬的に許容される担体、及び任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の独自性、サイズ、及び状態に応じて、及び組成物が投与されることになる経路にさらに応じて変化するであろう。例として、本組成物は、０．１％〜１００％（重量／重量）の活性成分を含むことができる。
【実施例】
【０１３６】
実験例
本発明は、以下の実験例を参照することによってさらに詳細に説明される。これらの実施例は、例示の目的のために提供されているに過ぎず、別段の定めがない限り、限定することを意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形形態も包含すると解釈されるべきである。
【０１３７】
さらなる説明がなくとも、当業者であれば、前述の説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明を行いかつ活用し、特許請求された方法を実践することができると考える。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘しており、本開示の残りの部分を多少なりとも限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３８】
実施例１：温度感応性Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶ
最先端のプラスミドベースの逆遺伝学アプローチを用いて、低温に適応した温度感応性組換えＨ３Ｎ８ウマインフルエンザウイルス（ＥＩＶ）の弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）を生成した。現在記載のＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶを生成するために、アミノ酸置換を、インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８（図１）のウイルスポリメラーゼＰＢ２（Ｎ２６５Ｓ）及びＰＢ１（Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、及びＡ６６１Ｔ）に導入した。ミニゲノム複製アッセイを用いて、これらのＰＢ２及びＰＢ１突然変異の導入は、高温（３７℃〜３９℃）におけるウイルスゲノム複製及び遺伝子転写の減少をもたらすが、低温（３３℃）ではもたらさないことが判明した（図２）。これらの結果は、インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８のＰＢ２及びＰＢ１ポリメラーゼサブユニットにおけるアミノ酸置換が、低温に適応した温度感応性表現型をもたらすことを立証している。次に、インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８ウイルスポリメラーゼＰＢ２及びＰＢ１サブユニットにおけるこれらの突然変異が、制限温度（３７℃〜３９℃）において増殖動態不全をもたらすが、許容温度（３３℃）ではもたらさないかを評価した。低温に適応した温度感応性ＬＡＩＶ及び野生型インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８ウイルスの複製動態を、低感染多重度（ＭＯＩ、０．００１）で感染させたイヌＭＤＣＫ細胞中で比較した。３３℃において、野生型及びＬＡＩＶ  Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８ウイルスの両方共に、同様に増殖し、感染のピーク（感染後約４８時間）において約１０８のフォーカス形成単位（ＦＦＵ／ｍｌ）のウイルス力価に達した。しかしながら、低温に適応した温度感応性ＥＩＶ  ＬＡＩＶの複製は、ＷＴ  ＥＩＶと比べて、３７℃及び３９℃のそれぞれで著しく減少したか、または損なわれた（図３Ａ〜図３Ｃ）。とりわけ、現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶの温度感応性は、市販のＥＩＶ  ＬＡＩＶ  Ｆｌｕ  Ａｖｅｒｔ（Ｍｅｒｃｋ）のものと同様であった。さらには、現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶの温度感応性は、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイによってさらに確認された（図４）。これらの結果は、インフルエンザＡ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８のＰＢ２及びＰＢ１ポリメラーゼサブユニットにおける突然変異が、ＬＡＩＶの製造にとって重要である許容温度（３３℃）において、ＷＴ  Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８ウイルスに匹敵するレベルまで複製することがさらに可能である低温に適応した温度感応性表現型をもたらしたことを立証している。現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶの安全性、免疫原性及び防御効率を評価するために、マウスでの実験も行った。これらのインビボ実験は、ＥＩＶ  ＬＡＩＶの存在が感染させた（１０５ＦＦＵ）マウスの肺において検出され得なかったために、現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶが、下気道においてＥＩＶ  ＷＴと比較して弱毒化されていることを示している（図５Ａ）。他方では、ＥＩＶ  ＬＡＩＶは、感染されたマウスの鼻粘膜において市販のＥＩＶ  ＬＡＩＶ  Ｆｌｕ  Ａｖｅｒｔよりも良好に複製している（図５Ｂ）。とりわ��、現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶは、ＥＩＶ  ＷＴによる感染により誘導されたものと同様で、かつ現行のＥＩＶ  ＬＡＩＶ  Ｆｌｕ  Ａｖｅｒｔのものよりも高い、中和抗体（表３）を含む体液性応答を誘導した（図６）。重要なことには、現在記載のＥＩＶ  ＬＡＩＶによる単回の鼻腔内免疫付与が、ＥＩＶ  ＷＴによる曝露に対して完全な防御を授与した（図７）。とりわけ、防御は、Ｆｌｕ  Ａｖｅｒｔで得られるものよりも良好であった。
【表３】
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【０１３９】
マウス試験に加えて、現在記載のＨ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶの安全性、免疫原性及び防御効率をウマにおいて評価した。ウマの試験からのデータは、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶ  ＬＡＩＶが安全であり、野生型Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶによる曝露に対する防御を授与することができることを立証している。観察された防御は、臨床症状の欠如ならびにワクチン接種したウマにおける感染後の様々な日における曝露野生型ウイルスのレベルの減少を含み、一方対照の模擬ワクチン接種されたウマは、曝露後２〜６日目にＥＩＶ感染の症状（咳及び発熱）及び鼻洗浄液中に高レベルのウイルス複製を発症した。模擬ワクチン接種及びワクチン接種されたウマの両方からの中和抗体を含む防御的免疫応答を評価するために、アッセイも行った。
【０１４０】
全体的に、これらの結果は、最先端のプラスミドベースの逆遺伝学アプローチを、Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８のウイルスＰＢ２（Ｎ２６５Ｓ）及びＰＢ１（Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、及びＡ６６１Ｔ）ポリメラーゼサブユニット中の突然変異の導入と組み合わせて、低温に適応した温度感応性ＬＡＩＶを生成することによる、Ｈ３Ｎ８  ＥＩＶの治療及び制御のための新しいＬＡＩＶ候補の開発の実現可能性を立証している。
【０１４１】
実施例２：Ａ／ウマ／オハイオ／１／２００３  Ｈ３Ｎ８に基づく温度感応性弱毒生ウマインフルエンザウイルス
突然変異セグメント１またはＰＢ２：
１．セグメント１（ＰＢ２）の突然変異ヌクレオチド配列：ＰＢ２タンパク質中のＮ２６５Ｓアミノ酸変化をもたらすヌクレオチド変化を太字で示している。改変されたＰＢ２セグメント中に導入されたＣｌａＩ制限部位に下線が付されている。
agcgaaagcaggtcaaatatattcaatatggagagaataaaagaactgagagatctgatgttacaatcccgcacccgcgagatactaacaaaaactactgtggaccacatggccataatcaagaaatacacatcaggaagacaagagaagaaccctgcacttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatacccaatcacggcagataagaggataatggagatgattcctgagagaaatgaacagggacaaaccctttggagcaaaacgaacgatgctggctcagaccgcgtaatggtatcacctctggcagtgacatggtggaataggaatggaccaacaacaagcacaattcattatccaaaagtctacaaaacttattttgaaaaggttgaaagattgaaacacggaacctttggccccgttcattttaggaatcaagtcaagataagacgaagagttgatgtaaaccctggtcacgcggacctcagtgccaaagaagcacaagatgtgatcatggaagttgttttcccaaatgaagtgggagccagaattctaacatcggaatcacaactaacaataaccaaagagaaaaaggaagaacttcaggactgcaaaattgctcccttgatggtagcatacatgctagaaagagagttggtccgaaaaacaaggttcctcccagtagcaggcggaacaagcagtgtatacattgaagtgttgcatctgactcagggaacatgctgggagcaaatgtacaccccaggaggagaagttagaaacgatgatattgatcaaagtttaattattgcagcacgatcgatagtgagaagagcaacagtatcagcagatccactagcatccctactggaaatgtgccacagtacacagattggtggaataaggatggtagacatccttaagcagaatccaacagaggaacaagctgtggatatatgcaaagcagcaatgggattgagaattagctcatcattcagctttggtggattcaccttcaaaagaacaagtggatcatcagtcaagagagaagaagaaatgcttacgggcaaccttcaaacattgaaaataagaatgcatgagggctatgaagaattcacaatggtcggaagaagagcaacagctattctcagaaaggcaaccagaagattgattcaattgatagtaagtgggagagatgaacaatcaattgctgaagcaataattgtagccatggtgttttcgcaagaagattgcatgataaaagcagttcgaggcgatttgaactttgttaatagagcaaatcagcgtttgaaccccatgcatcaactcttgaggcatttccaaaaagatgcaaaagtgcttttccaaaattggggaattgaacccatcgacaatgtaatggggatgattggaatattgcctgacatgaccccaagcaccgagatgtcattgagaggagtgagagtcagcaaaatgggagtggatgagtactccagcactgagagagtggtggtgagcattgaccgttttttaagagttcgggatcaaaggggaaacatactactgtcccctgaagaagtcagtgaaacacaaggaacggaaaagctgacaataatttattcgtcatcaatgatgtgggagattaatggtcccgaatcagtgttggtcaatacttatcaatggatcatcaggaactgggaaattgtaaaaattcagtggtcacaggaccccacaatgttatacaataagatagaatttgagccattccaatccctggtccctagggccaccagaagccaatacagcggtttcgtaagaaccctgtttcagcaaatgcgagatgtacttggaacatttgatactgctcaaataataaaactcctcccttttgccgctgctcctccggaacagagtaggatgcagttctcttctttgactgttaatgtaagaggttcgggaatgaggatacttgtaagaggcaattccccagtgttcaactacaataaagccactaaaaggctcacagtcctcggaaaggatgcaggtgcgcttactgaggacccagatgaaggtacggctggagtagaatctgctgttctaagagggtttctcattttaggtaaagaaaacaagagatatggcccagcactaagcatcaatgaactaagcaaacttgcaaaaggggagaaagccaatgtactaattgggcaaggggacgtagtgttggtaatgaaacggaaacgtgactctagcatacttactgacagccagacagcgaccaaaaggattcggatggccatcaattagtgttgaattgtttaaaaacgaccttgtttctact（配列番号１）
２．突然変異体ＥＩＶ  ＰＢ２タンパク質のアミノ酸配列：アミノ酸変化Ｎ２６５Ｓを太字で示している。
MERIKELRDLMLQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMKYPITADKRIMEMIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDRVMVSPLAVTWWNRNGPTTSTIHYPKVYKTYFEKVERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDVNPGHADLSAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKKEELQDCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQGTCWEQMYTPGGEVRNDDIDQSLIIAARSIVRRATVSADPLASLLEMCHSTQIGGIRMVDILKQNPTEEQAVDICKAAMGLRISSSFSFGGFTFKRTSGSSVKREEEMLTGNLQTLKIRMHEGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSQEDCMIKAVRGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNWGIEPIDNVMGMIGILPDMTPSTEMSLRGVRVSKMGVDEYSSTERVVVSIDRFLRVRDQRGNILLSPEEVSETQGTEKLTIIYSSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWEIVKIQWSQDPTMLYNKIEFEPFQSLVPRATRSQYSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTAQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNKATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTAGVESAVLRGFLILGKENKRYGPALSINELSKLAKGEKANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAIN（配列番号２）
【０１４２】
突然変異セグメント２またはＰＢ１：
１．セグメント２（ＰＢ１）の突然変異ヌクレオチド配列：ＰＢ２タンパク質中のＫ３１９Ｅ、Ｅ５８１Ｇ、及びＡ６６１Ｔをもたらすヌクレオチド変化を太字で示している、ＡａｔＩ制限部位（下線が付された）及びＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位（下線が付され＋斜字体）を改変されたＰＢ１セグメント中に導入した。ＢａｍＨＩ制限部位を除去するために元々のＰＢ１配列から突然変異されたヌクレオチドに下線が付され＋太字で示されている。
agcgaaagcaggcaaaccatttgaatggatgtcaatccgactctacttttcttaaaggtgccagcgcaaaatgctataagcacaacattcccttatactggagatcctccctacagtcatggaacagggacaggatacaccatggatactgtcaacagaacacaccaatattcagaaaaagggaaatggacaacaaacactgagattggagcaccacaacttaatccaatcgatggaccacttcctgaagacaatgaaccaagtgggtacgcccaaacagattgtgtattggaagcaatggctttccttgaagaatcccatcccggaatctttgaaaattcgtgtcttgaaacgatggaggtgattcagcagacaagagtggacaaactaacacaaggccgacaaacttatgattggaccttgaataggaatcaacctgccgcaacagcacttgctaatacgattgaagtattcagatcaaatggtctgacttccaatgaatcggggagattgatggacttcctcaaagatgtcatggagtccatgaacaaggaagaaatggaaataacaacacacttccaacggaagagaagagtaagagacaacatgacaaagagaatggtaacacagagaaccatagggaagaagaaacaacgattaaacagaaagagctatctaatcagaacattaaccctaaacacaatgaccaaggacgctgagagagggaaattgaaacgacgagcaatcgctaccccagggatgcagataagagggtttgtatattttgttgaaacactagcccgaagaatatgtgaaaagcttgaacaatcaggattgccagttggcggtaatgagaaaaaggccaaactggctaatgtcgtcagaaaaatgatgactaattcccaagacactgaactctccttcaccatcactggggacaataccaaatggaatgaaaatcagaacccacgcatattcctggcaatgatcacatacataactagaaaccagccagaatggttcagaaatgttctaagcattgcaccgattatgttctcaaataaaatggcaagactggggaaaggatatatgtttgaaagcaaaagtatgaaattgagaactcaaataccagcagaaatgctagcaagcattgacctgaaatatttcaatgattcaacaaaaaagaaaattgaagaaataaggcctcttctggttgacgggactgcttcactgagtcctggcatgatgatgggaatgttcaacatgttgagcactgtgctgggtgtatccatattaaacctgggccagaggaaatacacaaagaccacatactggtgggatggtctgcaatcatccgatgactttgctttgatagtgaatgcgcctaatcatgaaggaatacaagctggagtagacagattctatagaacttgcaaactggtcgggatcaacatgagcaaaaagaagtcctacataaatagaactggaacattcgaattcacaagctttttctaccggtatggttttgtagccaatttcagcatggaactacccagttttggggtttccggaataaatgaatctgcagacatgagcattggagtgacagtcatcaaaaacaacatgataaataatgatctcggtcctgccacggcacaaatggcactccaactcttcattaaggattatcggtacacataccggtgccatagaggtgatacccagatacaaaccagaagatcttttgagttgaagaagctttgggggcagactcgatcaaagactggtctactggtatcagatgggggtccaaacctatataacatcagaaacctacacatcccggaagtctgtttaaaatgggagctaatggatgaagattataaggggaggctatgcaatccattgaatcctttcgttagtcacaaagaaattgaatcagtcaacagtgcagtagtaatgtctgcgcatggccctgccaaaagcatggagtatgatgctgttactacaacacattcttggatacccaagaggaaccggtccatattgaacacaagccaaaggggaatactcgaagatgagcagatgtatcagaaatgctgcaacctgtttgaaaaattcttccccagcagctcatacagaagaccagtcggaatttctagtatggttgaggccatggtgtccagggcccgcattgatgcacgaattgacttcgaatctggacggataaagaaggatgagttcgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagctcagacggcaaaaatagtgaatttagcttgatcttcatgaaaaaatgccttgtttctact（配列番号３）
２．ＥＩＶ  ＰＢ１タンパク質のアミノ酸配列：アミノ酸変化Ｋ３９１Ｅ、Ｅ５８１Ｇ及びＡ６６１Ｔを太字で示している。
MDVNPTLLFLKVPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSEKGKWTTNTEIGAPQLNPIDGPLPEDNEPSGYAQTDCVLEAMAFLEESHPGIFENSCLETMEVIQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIEVFRSNGLTSNESGRLMDFLKDVMESMNKEEMEITTHFQRKRRVRDNMTKRMVTQRTIGKKKQRLNRKSYLIRTLTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRGFVYFVETLARRICEKLEQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFTITGDNTKWNENQNPRIFLAMITYITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLASIDLKYFNDSTKKKIEEIRPLLVDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQRKYTKTTYWWDGLQSSDDFALIVNAPNHEGIQAGVDRFYRTCKLVGINMSKKKSYINRTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINESADMSIGVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFELKKLWGQTRSKTGLLVSDGGPNLYNIRNLHIPEVCLKWELMDEDYKGRLCNPLNPFVSHKEIESVNSAVVMSAHGPAKSMEYDAVTTTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQKCCNLFEKFFPSSSYRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGRIKKDEFAEIMKICSTIEELRRQK（配列番号４）
【０１４３】
野生型セグメント１またはＰＢ２：
１．野生型ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８セグメント１（ＰＢ２）のヌクレオチド配列：
agcgaaagcaggtcaaatatattcaatatggagagaataaaagaactgagagatctgatgttacaatcccgcacccgcgagatactaacaaaaactactgtggaccacatggccataatcaagaaatacacatcaggaagacaagagaagaaccctgcacttaggatgaaatggatgatggcaatgaaatacccaatcacggcagataagaggataatggagatgattcctgagagaaatgaacagggacaaaccctttggagcaaaacgaacgatgctggctcagaccgcgtaatggtatcacctctggcagtgacatggtggaataggaatggaccaacaacaagcacaattcattatccaaaagtctacaaaacttattttgaaaaggttgaaagattgaaacacggaacctttggccccgttcattttaggaatcaagtcaagataagacgaagagttgatgtaaaccctggtcacgcggacctcagtgccaaagaagcacaagatgtgatcatggaagttgttttcccaaatgaagtgggagccagaattctaacatcggaatcacaactaacaataaccaaagagaaaaaggaagaacttcaggactgcaaaattgctcccttgatggtagcatacatgctagaaagagagttggtccgaaaaacaaggttcctcccagtagcaggcggaacaagcagtgtatacattgaagtgttgcatctgactcagggaacatgctgggagcaaatgtacaccccaggaggagaagttagaaacgatgatattgatcaaagtttaattattgcagcacggaacatagtgagaagagcaacagtatcagcagatccactagcatccctactggaaatgtgccacagtacacagattggtggaataaggatggtagacatccttaagcagaatccaacagaggaacaagctgtggatatatgcaaagcagcaatgggattgagaattagctcatcattcagctttggtggattcaccttcaaaagaacaagtggatcatcagtcaagagagaagaagaaatgcttacgggcaaccttcaaacattgaaaataagaatgcatgagggctatgaagaattcacaatggtcggaagaagagcaacagctattctcagaaaggcaaccagaagattgattcaattgatagtaagtgggagagatgaacaatcaattgctgaagcaataattgtagccatggtgttttcgcaagaagattgcatgataaaagcagttcgaggcgatttgaactttgttaatagagcaaatcagcgtttgaaccccatgcatcaactcttgaggcatttccaaaaagatgcaaaagtgcttttccaaaattggggaattgaacccatcgacaatgtaatggggatgattggaatattgcctgacatgaccccaagcaccgagatgtcattgagaggagtgagagtcagcaaaatgggagtggatgagtactccagcactgagagagtggtggtgagcattgaccgttttttaagagttcgggatcaaaggggaaacatactactgtcccctgaagaagtcagtgaaacacaaggaacggaaaagctgacaataatttattcgtcatcaatgatgtgggagattaatggtcccgaatcagtgttggtcaatacttatcaatggatcatcaggaactgggaaattgtaaaaattcagtggtcacaggaccccacaatgttatacaataagatagaatttgagccattccaatccctggtccctagggccaccagaagccaatacagcggtttcgtaagaaccctgtttcagcaaatgcgagatgtacttggaacatttgatactgctcaaataataaaactcctcccttttgccgctgctcctccggaacagagtaggatgcagttctcttctttgactgttaatgtaagaggttcgggaatgaggatacttgtaagaggcaattccccagtgttcaactacaataaagccactaaaaggctcacagtcctcggaaaggatgcaggtgcgcttactgaggacccagatgaaggtacggctggagtagaatctgctgttctaagagggtttctcattttaggtaaagaaaacaagagatatggcccagcactaagcatcaatgaactaagcaaacttgcaaaaggggagaaagccaatgtactaattgggcaaggggacgtagtgttggtaatgaaacggaaacgtgactctagcatacttactgacagccagacagcgaccaaaaggattcggatggccatcaattagtgttgaattgtttaaaaacgaccttgtttctact（配列番号５）
２．野生型ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ２タンパク質のアミノ酸配列：
MERIKELRDLMLQSRTREILTKTTVDHMAIIKKYTSGRQEKNPALRMKWMMAMKYPITADKRIMEMIPERNEQGQTLWSKTNDAGSDRVMVSPLAVTWWNRNGPTTSTIHYPKVYKTYFEKVERLKHGTFGPVHFRNQVKIRRRVDVNPGHADLSAKEAQDVIMEVVFPNEVGARILTSESQLTITKEKKEELQDCKIAPLMVAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQGTCWEQMYTPGGEVRNDDIDQSLIIAARNIVRRATVSADPLASLLEMCHSTQIGGIRMVDILKQNPTEEQAVDICKAAMGLRISSSFSFGGFTFKRTSGSSVKREEEMLTGNLQTLKIRMHEGYEEFTMVGRRATAILRKATRRLIQLIVSGRDEQSIAEAIIVAMVFSQEDCMIKAVRGDLNFVNRANQRLNPMHQLLRHFQKDAKVLFQNWGIEPIDNVMGMIGILPDMTPSTEMSLRGVRVSKMGVDEYSSTERVVVSIDRFLRVRDQRGNILLSPEEVSETQGTEKLTIIYSSSMMWEINGPESVLVNTYQWIIRNWEIVKIQWSQDPTMLYNKIEFEPFQSLVPRATRSQYSGFVRTLFQQMRDVLGTFDTAQIIKLLPFAAAPPEQSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNKATKRLTVLGKDAGALTEDPDEGTAGVESAVLRGFLILGKENKRYGPALSINELSKLAKGEKANVLIGQGDVVLVMKRKRDSSILTDSQTATKRIRMAIN（配列番号６）
【０１４４】
野生型セグメント２またはＰＢ１：
１．野生型ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８セグメント２（ＰＢ１）のヌクレオチド配列
agcgaaagcaggcaaaccatttgaatggatgtcaatccgactctacttttcttaaaggtgccagcgcaaaatgctataagcacaacattcccttatactggagatcctccctacagtcatggaacagggacaggatacaccatggatactgtcaacagaacacaccaatattcagaaaaagggaaatggacaacaaacactgagattggagcaccacaacttaatccaatcgatggaccacttcctgaagacaatgaaccaagtgggtacgcccaaacagattgtgtattggaagcaatggctttccttgaagaatcccatcccggaatctttgaaaattcgtgtcttgaaacgatggaggtgattcagcagacaagagtggacaaactaacacaaggccgacaaacttatgattggaccttgaataggaatcaacctgccgcaacagcacttgctaatacgattgaagtattcagatcaaatggtctgacttccaatgaatcggggagattgatggacttcctcaaagatgtcatggagtccatgaacaaggaagaaatggaaataacaacacacttccaacggaagagaagagtaagagacaacatgacaaagagaatggtaacacagagaaccatagggaagaagaaacaacgattaaacagaaagagctatctaatcagaacattaaccctaaacacaatgaccaaggacgctgagagagggaaattgaaacgacgagcaatcgctaccccagggatgcagataagagggtttgtatattttgttgaaacactagcccgaagaatatgtgaaaagcttgaacaatcaggattgccagttggcggtaatgagaaaaaggccaaactggctaatgtcgtcagaaaaatgatgactaattcccaagacactgaactctccttcaccatcactggggacaataccaaatggaatgaaaatcagaacccacgcatattcctggcaatgatcacatacataactagaaaccagccagaatggttcagaaatgttctaagcattgcaccgattatgttctcaaataaaatggcaagactggggaaaggatatatgtttgaaagcaaaagtatgaaattgagaactcaaataccagcagaaatgctagcaagcattgacctgaaatatttcaatgattcaacaaaaaagaaaattgaaaagatacgaccacttctggttgacgggactgcttcactgagtcctggcatgatgatgggaatgttcaacatgttgagcactgtgctgggtgtatccatattaaacctgggccagaggaaatacacaaagaccacatactggtgggatggtctgcaatcatccgatgactttgctttgatagtgaatgcgcctaatcatgaaggaatacaagctggagtagacagattctatagaacttgcaaactggtcgggatcaacatgagcaaaaagaagtcctacataaatagaactggaacattcgaattcacaagctttttctaccggtatggttttgtagccaatttcagcatggaactacccagttttggggtttccggaataaatgaatctgcagacatgagcattggagtgacagtcatcaaaaacaacatgataaataatgatctcggtcctgccacggcacaaatggcactccaactcttcattaaggattatcggtacacataccggtgccatagaggtgatacccagatacaaaccagaagatcttttgagttgaagaaactgtgggaacagactcgatcaaagactggtctactggtatcagatgggggtccaaacctatataacatcagaaacctacacatcccggaagtctgtttaaaatgggagctaatggatgaagattataaggggaggctatgcaatccattgaatcctttcgttagtcacaaagaaattgaatcagtcaacagtgcagtagtaatgtctgcgcatggccctgccaaaagcatggagtatgatgctgttgcaacaacacattcttggatccccaagaggaaccggtccatattgaacacaagccaaaggggaatactcgaagatgagcagatgtatcagaaatgctgcaacctgtttgaaaaattcttccccagcagctcatacagaagaccagtcggaatttctagtatggttgaggccatggtgtccagggcccgcattgatgcacgaattgacttcgaatctggacggataaagaaggatgagttcgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagctcagacggcaaaaatagtgaatttagcttgatcttcatgaaaaaatgccttgtttctact（配列番号７）
２．野生型ＥＩＶ  Ｈ３Ｎ８  ＰＢ１タンパク質のアミノ酸配列：
MDVNPTLLFLKVPAQNAISTTFPYTGDPPYSHGTGTGYTMDTVNRTHQYSEKGKWTTNTEIGAPQLNPIDGPLPEDNEPSGYAQTDCVLEAMAFLEESHPGIFENSCLETMEVIQQTRVDKLTQGRQTYDWTLNRNQPAATALANTIEVFRSNGLTSNESGRLMDFLKDVMESMNKEEMEITTHFQRKRRVRDNMTKRMVTQRTIGKKKQRLNRKSYLIRTLTLNTMTKDAERGKLKRRAIATPGMQIRGFVYFVETLARRICEKLEQSGLPVGGNEKKAKLANVVRKMMTNSQDTELSFTITGDNTKWNENQNPRIFLAMITYITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLASIDLKYFNDSTKKKIEKIRPLLVDGTASLSPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQRKYTKTTYWWDGLQSSDDFALIVNAPNHEGIQAGVDRFYRTCKLVGINMSKKKSYINRTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFGVSGINESADMSIGVTVIKNNMINNDLGPATAQMALQLFIKDYRYTYRCHRGDTQIQTRRSFELKKLWEQTRSKTGLLVSDGGPNLYNIRNLHIPEVCLKWELMDEDYKGRLCNPLNPFVSHKEIESVNSAVVMSAHGPAKSMEYDAVATTHSWIPKRNRSILNTSQRGILEDEQMYQKCCNLFEKFFPSSSYRRPVGISSMVEAMVSRARIDARIDFESGRIKKDEFAEIMKICSTIEELRRQK（配列番号８）
【０１４５】
本明細書で引用されたそれぞれ全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示は、それらの全体が本明細書に参照として組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照することによって開示されてきたが、本発明の他の実施形態及び変形形態が、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者によって考案されてもよいことは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのこのような実施形態及び等価な変形形態を含むと解釈されることを意図する。
【図１】
2019520338.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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