(57)【要約】  ＯＤＳカラム（１５）とＵＶ検出器（１７）を用いたＬＣシステムにおいて、リン酸水溶液と含リン酸メタノールとのグラジエント溶離を利用してカンナビス由来の試料を分析する。制御部（３）は含リン酸メタノールの混合比率の上昇速度が分析期間の前半部よりも後半部で大きくなるように混合器（１２）で電磁バルブの開度を調整する。これにより、分析時間を３０分程度以内に抑えながら、カンナビスに含まれる１０個の有効成分（Total THC、Total CBD、CBNを含む）を良好に分離することができる。そうしてカラム（１５）で分離された各成分をＵＶ検出器（１７）で検出し、有効成分同定処理部（２２）はその検出信号から作成されるクロマトグラム上のピークの保持時間に基づいて１０個の有効成分を同定する。
2019525172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンナビスに含まれる複数の有効成分を液体クロマトグラフを用いて分析する分析方法であって、
a)カラムとしてＯＤＳカラムを用い、リン酸水溶液と含リン酸メタノールを移動相とするグラジエント溶離により、液体試料に含まれる複数の成分を分離する分離ステップと、
b)前記分離ステップにおいて分離された各成分を、紫外分光検出器又はフォトダイオードアレイ検出器である検出器により検出する検出ステップと、
c)前記検出ステップによる検出結果に基づいて作成されるクロマトグラムで観測されるピークの保持時間に基づいて、所定の複数の有効成分を同定する同定ステップと、
を有することを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載のカンナビス有効成分分析方法であって、
前記所定の複数の有効成分は、Tetrahydrocannabivarin (ＴＨＣＶ）、Cannabidiol（ＣＢＤ）、Cannabigerol（ＣＢＧ）、Cannabidiolic acid（ＣＢＤＡ）、Cannabigerolic acid（ＣＢＧＡ）、Cannabinol（ＣＢＮ）、Δ9-Tetrahydrocannabinol（ｄ９−ＴＨＣ）、Δ8-Tetrahydrocannabinol（ｄ８−ＴＨＣ）、Cannabichromene（ＣＢＣ）、Δ9-Tetrahydrocannabinolic acid A（ＴＨＣＡ−Ａ）の１０成分を含むことを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載のカンナビス有効成分分析方法であって、
前記分離ステップにおけるグラジエント溶離では、含リン酸メタノールの混合比率を第１の上昇速度で上昇させたあとに該第１の上昇速度よりも大きな速度の第２の上昇速度で上昇させるように変化させることを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項４】
請求項３に記載のカンナビス有効成分分析方法であって、
含リン酸メタノールの混合比率を第１の上昇速度で上昇させている期間中に、少なくともＴＨＣＶ及びＣＢＤの二つの成分を分離してカラムから順に溶出させ、含リン酸メタノールの混合比率を第２の上昇速度で上昇させている期間中に、ＣＢＤＡ、ＣＢＧＡ、ＣＢＮ、ｄ９−ＴＨＣ、ｄ８−ＴＨＣ、ＣＢＣ、ＴＨＣＡ−Ａの七つの成分を分離してカラムから順に溶出させることを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項５】
請求項３又は４に記載のカンナビス有効成分分析方法であって、
第２の上昇速度は第１の上昇速度の３〜４倍の速度であることを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項６】
請求項１に記載のカンナビス有効成分分析方法であって、
前記カラムは、充填剤の粒子径が２．２μm、その粒子の細孔径が８nmであるＯＤＳカラムであることを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項７】
請求項１に記載のカンナビス有効成分分析方法であって、
前記検出器の検出波長は２２０nmであることを特徴とするカンナビス有効成分分析方法。
【請求項８】
第１の移動相と第２の移動相との混合比率を調整する移動相混合部と、該移動相混合部により混合された移動相中に液体試料を注入するインジェクタと、その注入された液体試料に含まれる各成分を分離するカラムと、該カラムから溶出する溶出液中の成分を検出する検出器と、を含む液体クロマトグラフを用い、カンナビスに含まれる複数の有効成分を分析するために、該液体クロマトグラフの動作を制御する制御プログラムであって、
a)前記リン酸水溶液である第１の移動相と含リン酸メタノールである第２の移動相との混合比率を所定状態に維持するように前記移動相混合部を制御している状態で、その混合された移動相中に液体試料を注入するよう前記インジェクタを動作させる試料注入ステップと、
b)該試料注入ステップにおいて前記混合された移動相中に液体試料を注入したあと、第２の移動相の混合比率を第１の上昇速度で上昇させ、それから所定時間が経過した後に第２の移動相の混合比率を第１の上昇速度よりも大きな速度である第２の上昇速度で上昇させるように前記移動相混合部を制御するグラジエント溶離ステップと、
を実行することを特徴とする液体クロマトグラフ制御用プログラム。
【請求項９】
請求項８に記載の液体クロマトグラフ制御用プログラムであって、
前記第２の上昇速度は前記第１の上昇速度の３〜４倍の速度であることを特徴とする液体クロマトグラフ制御用プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カンナビスに含まれる有効成分を同定したり定量したりするための分析方法、及び、その分析のために液体クロマトグラフを制御するコンピュータプログラムに関する。なお、本明細書においてカンナビスは、麻（大麻草）の花冠や葉そのもの、それらを乾燥させたもの、それらの抽出物を樹脂化又は液体化したものなどを含むものとする。
【背景技術】
【０００２】
カンナビスは日本を始め多くの国で法的に禁止されている一方、オランダ、ブラジルなど、その使用が合法化されている国もある。また、米国では一部の州において医療用の使用に限って合法化されており、さらにごく一部の州では、医療用のみならず嗜好用のカンナビスの使用も合法化されている。カンナビスはその他の薬物と比較すれば中毒性や依存性がかなり低いとの報告もあり、また医療用としての効果も十分に認められることなどから、解禁に反対する意見も多いものの、米国では全体として合法化される流れになりつつある。
【０００３】
カンナビスにはカンナビノイドと総称される様々な化合物が、人体に対して薬理作用を有する有効成分として含まれることが知られている。カンナビスに含まれる有効成分の種類や量は大麻草の生産地や生産条件（例えば肥料の種類や量、季節等）等によって異なる。そのため、米国においてカンナビスが合法化されている州では、カンナビスに含まれる有効成分を精度良く同定したり定量したりすることが求められるようになっている。そうした検査や分析を請け負う受託分析機関は多く存在するものの、現在のところ、公定法が定められているわけではなく、その分析手法も確立されていない。そのため、受託分析機関等が個別に分析手法を試行錯誤的に決めているのが実状である。そのため、分析の信頼性は必ずしも高いとはいえず、また、異なる受託分析機関による分析結果を比較することも難しい。
【０００４】
従来一般に、カンナビスの有効成分の検査や分析には、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフ（ＬＣ）、液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）などの分析機器が利用されている。
【０００５】
ＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳは、合成カンナビノイド類などの違法薬物や毒物などの同定にしばしば用いられている（特許文献１など参照）。ＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳを用いた分析では、ＧＣやＬＣで複数の化合物が分離しきれなかった場合でも、つまりはＧＣやＬＣによる分離後の試料中で有効成分と夾雑物とが混じっていたり複数の有効成分が混じっていたりした場合でも、検出器である質量分析計において質量電荷比によってそれらを分離して検出することが可能である。そのため、多数の有効成分を確実に分離し、各成分を精度良く検出することができるという利点がある。
【０００６】
しかしながら、ＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳはＧＣやＬＣに比べてかなり高価である。一般に、受託分析機関では数多くの装置を効率良く運用することで利益を上げているが、装置が高価であると、装置の導入コストがかなりの負担になるという問題がある。また、ＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳはＧＣやＬＣに比べて装置の操作や取扱いも複雑であるため、分析作業に不慣れな作業者が操作するのは困難である。一方、ＧＣやＬＣはＧＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳに比べて装置はかなり廉価であり、操作や取り扱いも容易であるものの、複数の化合物の分離性能は劣る。そのため、カンナビスに含まれる多数の有効成分を一度に分析するのは難しく、多数の有効成分を同定したり定量したりするためには、通常、異なる分析条件の下で複数回の分析を行う必要がある。そのため、分析に時間が掛かり、分析効率が悪いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１５−５２５７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、比較的安価で取扱いや操作も簡便な装置を用いて、カンナビスの有効成分のうち特に重要である複数の成分を精度良く同定したり定量したりすることができるカンナビス有効成分分析方法、及びそのための制御プログラムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために成された本発明は、カンナビスに含まれる複数の有効成分を液体クロマトグラフを用いて分析する分析方法であって、
a)カラムとしてＯＤＳカラムを用い、リン酸水溶液と含リン酸メタノールを移動相とするグラジエント溶離により、液体試料に含まれる複数の成分を分離する分離ステップと、
b)前記分離ステップにおいて分離された各成分を、紫外分光検出器又はフォトダイオードアレイ検出器である検出器により検出する検出ステップと、
c)前記検出ステップによる検出結果に基づいて作成されるクロマトグラムで観測されるピークの保持時間に基づいて、所定の複数の有効成分を同定する同定ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１０】
本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、分離ステップにおいて、逆相液体クロマトグラフィにより液体試料中の複数の成分を分離し、検出ステップにおいて、分離された成分を紫外分光検出器又はフォトダイオードアレイ検出器である検出器により検出する。即ち、検出器ではカラムからの溶出液中の成分による特定波長の光の吸光度を測定することで、該成分の濃度に対応した検出信号を取得する。そして、同定ステップでは、検出器による検出結果に基づいてクロマトグラムを作成し、そのクロマトグラム上で観測されるピークの保持時間に基づいて、所定の複数の有効成分を同定する。
【００１１】
本発明に係るカンナビス有効成分分析方法において、同定対象である所定の複数の有効成分は、Tetrahydrocannabivarin（ＴＨＣＶ）、Cannabidiol（ＣＢＤ）、Cannabigerol（ＣＢＧ）、Cannabidiolic acid（ＣＢＤＡ）、Cannabigerolic acid（ＣＢＧＡ）、Cannabinol（ＣＢＮ）、Δ9-Tetrahydrocannabinol（ｄ９−ＴＨＣ）、Δ8-Tetrahydrocannabinol（ｄ８−ＴＨＣ）、Cannabichromene（ＣＢＣ）、Δ9-Tetrahydrocannabinolic acid A（ＴＨＣＡ−Ａ）、の１０成分を含むものとすることができる。
【００１２】
カンナビスの有効成分には上記１０成分以外に知られているものもあるが、特に分析の要望が高いのは、Total ＴＨＣ（ｄ９−ＴＨＣ、ｄ８−ＴＨＣ、ＴＨＣＡ−Ａ）、Total ＣＢＤ（ＣＢＤ、ＣＢＤＡ）、及びＣＢＮの定量である。上記１０成分の分析が可能であれば、これら要望の高い成分を全て含み、且つ、現在、米国の主要な受託分析機関のうちの三以上の機関で分析対象としている成分を網羅することができる。
【００１３】
カンナビスの有効成分の中には熱によって分解されてしまうものがある。具体的には、ＴＨＣＡ−Ａは熱分解によりｄ９−ＴＨＣに、ＣＢＤＡは熱分解によりＣＢＤに変化してしまう。ＧＣでは一般に、高温に加熱した試料気化室内で液体試料を揮発させてカラムに送り込むため、その過程で上記のような有効成分の少なくとも一部が分解して定量性を損なうおそれがある。これに対し、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、液体クロマトグラフを利用しているので、上述したような熱による試料中の有効成分の変性や変化を生じることがなく、熱分解し易い成分についても正確な同定や定量が行える。
【００１４】
上記１０成分はその化学構造がかなり類似しているものを含むため、保持時間が近いものがあり、通常、それらを完全に（つまりは１以上の分離度で以て）分離することは難しい。特に、化学構造がかなり近いｄ９−ＴＨＣとｄ８−ＴＨＣとを完全に分離して検出することは困難であった。これに対し本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、ＯＤＳカラムと、リン酸水溶液と含リン酸メタノールの二つを移動相とする適切なグラジエント溶離と、の組合せによって、上記１０成分を良好に分離することができる。即ち、１回の分析で以て上記１０成分を同定しその存在の有無を確認することができるとともに、例えばクロマトグラム上のピークの面積値に基づいて各成分の正確な定量を行うことができる。
【００１５】
本発明に係るカンナビス有効成分分析方法において、好ましくは、前記分離ステップにおけるグラジエント溶離では、含リン酸メタノールの混合比率を第１の上昇速度で上昇させたあとに該第１の上昇速度よりも大きな速度の第２の上昇速度で上昇させるように変化させるとよい。
【００１６】
より具体的には、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、含リン酸メタノールの混合比率を第１の上昇速度で上昇させている期間中に、少なくともＴＨＣＶ及びＣＢＤの二つの成分を分離してカラムから順に溶出させ、含リン酸メタノールの混合比率を第２の上昇速度で上昇させている期間中に、ＣＢＤＡ、ＣＢＧＡ、ＣＢＮ、ｄ９−ＴＨＣ、ｄ８−ＴＨＣ、ＣＢＣ、ＴＨＣＡ−Ａの七つの成分を分離してカラムから順に溶出させるようにすることができる。なお、ＣＢＧは、含リン酸メタノールの混合比率を第１の上昇速度で上昇させている期間中、その混合比率を第２の上昇速度で上昇させている期間中、又は、その両期間に跨ってカラムから溶出するようにすることができる。
【００１７】
このようにグラジエント溶離における移動相の混合比率を変化させる速度を二段階に切り替えることで、上記１０成分を良好に分離することができるとともに、各成分のカラムからの溶出を速やかに終了させることができる。それによって、分析時間を短縮することができる。後述するように、本発明者の実験によれば、多数の試料を連続的に分析する場合、１サイクル３０分程度以内の分析時間で以て上記１０成分を良好に分析することができる。
【００１８】
なお、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法において、グラジエント溶離の際にリン酸水溶液と含リン酸メタノールとの混合比率を変化させる第１の上昇速度、第２の上昇速度、それら速度の関係などは、各移動相のリン酸濃度、混合された移動相の流速、カラムのサイズなどの要因に依存する。３０分程度以内の分析時間で上記１０成分を良好に分離するには、上述したように第２の上昇速度を第１の上昇速度よりも大きい速度とすることが好ましいが、特に第２の上昇速度を第１の上昇速度の３〜４倍程度の速度とするとよい。
【００１９】
また、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、カラムとしてはＯＤＳカラムを用いるが、ＯＤＳカラムでは充填剤の粒子径やその粒子の細孔径などが理論段数などの分離能と分析時間とに影響を及ぼす。そこで、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、カラムとして、充填剤の粒子径が２．２μm、その粒子の細孔径が８nmであるＯＤＳカラムを用いるとよい。
【００２０】
このように汎用の標準的なＯＤＳカラム（粒子径：５μm、細孔径：１２nm）に比べて粒子径や細孔径が小さな充填剤を用いることで、カラムの長さを短くして分析時間の短縮を図りつつ、高い理論段数を実現し良好に各成分を分離することができる。
【００２１】
また、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法では、溶液中の成分をそのまま（液体状のまま）検出することが可能である紫外分光検出器又はＰＤＡ検出器が検出器として用いられるが、その検出波長は２２０nmとするとよい。
【００２２】
また、本発明に係る液体クロマトグラフ用制御プログラムは、第１の移動相と第２の移動相との混合比率を調整する移動相混合部と、該移動相混合部により混合された移動相中に液体試料を注入するインジェクタと、その注入された液体試料に含まれる各成分を分離するカラムと、該カラムから溶出する溶出液中の成分を検出する検出器と、を含む液体クロマトグラフを用い、カンナビスに含まれる複数の有効成分を分析するために、該液体クロマトグラフの動作を制御する制御プログラムであって、
a)前記リン酸水溶液である第１の移動相と含リン酸メタノールである第２の移動相との混合比率を所定状態に維持するように前記移動相混合部を制御している状態で、その混合された移動相中に液体試料を注入するよう前記インジェクタを動作させる試料注入ステップと、
b)該試料注入ステップにおいて前記混合された移動相中に液体試料を注入したあと、第２の移動相の混合比率を第１の上昇速度で上昇させ、それから所定時間が経過した後に第２の移動相の混合比率を第１の上昇速度よりも大きな速度である第２の上昇速度で上昇させるように前記移動相混合部を制御するグラジエント溶離ステップと、
を実行することを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る液体クロマトグラフ制御用プログラムは、液体クロマトグラフの移動相混合部、インジェクタ等の各部を制御するコンピュータ（制御用の汎用パーソナルコンピュータ又は装置に組み込まれた専用のコンピュータ）を動作させるプログラムである。このプログラムは、時間経過と移動相の混合比率又はその混合比率を実現するためのバルブの開度との関係を示すグラジエント溶離のタイムプログラムを含むものとする。こうしたプログラムは例えばＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭなどのパッケージとしてユーザに提供される、又はインターネットなどの通信回線を介してユーザに提供されるようにすることができる。
【００２４】
液体クロマトグラフに搭載された又は接続された制御用のコンピュータは、本発明に係る液体クロマトグラフ用制御プログラムに従って各部の動作を制御する。それにより、移動相混合部では例えば、第１及び第２の移動相をそれぞれ通過させる電磁バルブの開度が時間経過に伴って調整され、両移動相の混合比率が徐々に変化する、混合した移動相がカラムに送られる。こうしたグラジエント溶離とＯＤＳカラムとの組合せによって、カンナビスに含まれる主要な複数の成分、具体的には上記１０成分が良好に分離される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係るカンナビス有効成分分析方法及び液体クロマトグラフ用制御プログラムによれば、比較的廉価で操作や取り扱いも容易である液体クロマトグラフを用い、１回の分析によってカンナビスに含まれる複数の主要な有効成分を同定したり定量したりすることができる。それによって、低廉なコストで以てカンナビス有効成分分析用のシステムを構築することができる。また、そうしたシステムを導入したユーザは、自ら煩雑な分析条件決めなどの作業を行う必要がなく、システム導入後速やかに、面倒な訓練を要しない簡便な操作によって分析作業を遂行することができる。また、短い分析時間で主要な有効成分の正確な同定や定量を行うことができるので、信頼性の高い分析結果を高いスループットで得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明に係るカンナビス有効成分分析方法を実施するためのＬＣシステムの一実施例の概略構成図。
【図２】本実施例のＬＣシステムにおけるグラジエント溶離のタイムプログラムの一例を示す図。
【図３】本実施例のＬＣシステムを用いて、カンナビスに含まれる主要な１０成分を混合した標準試料（STD）と二つの実試料（SMP A、SMP B）を測定することで得られたクロマトグラムの実測例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に係るカンナビス有効成分分析方法の一形態について、添付図面を参照して説明する。図１は、本発明に係るカンナビス有効成分分析方法を実施するためのＬＣシステムの一実施例の概略構成図である。
【００２８】
図１に示すように、このＬＣシステムは、測定部１と、データ処理部２と、制御部３と、操作部４と、表示部５と、を含む。
測定部１は高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）であり、それぞれ異なる移動相（以下移動相Ａ、Ｂという）が収容された移動相容器１１Ａ、１１Ｂと、二つの移動相Ａ、Ｂを所定の混合比率で混合する複数の開度調整可能な電磁バルブを含む混合器１２と、混合器１２を介して移動相容器１１Ａ、１１Ｂからそれぞれ移動相Ａ、Ｂを吸引して送給する送液ポンプ１３と、送液ポンプ１３で送られて来る移動相に一定量の液体試料を注入するインジェクタ１４と、注入された液体試料中の成分（有効成分、夾雑物を含む）を時間方向に分離するカラム１５と、カラム１５を温調するカラムオーブン１６と、カラム１５の出口から溶出する溶出液中の成分を検出する紫外分光検出器（ＵＶ検出器）１７と、紫外分光検出器１７による検出信号を所定のサンプリング時間間隔でサンプリングしてデジタルデータに変換するアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）１８と、を含む。
【００２９】
データ処理部２は、機能ブロックとして、データ収集部２１と、有効成分同定処理部２２と、有効成分定量処理部２３と、を含み、紫外分光検出器１７で検出されＡＤＣ１８でデジタル化されたデータを処理することにより、液体試料中の有効成分を同定したり定量したりする。制御部３に内蔵された記憶部にはカンナビス分析用制御プログラム３１が格納されており、制御部３に含まれるＣＰＵ等がこのプログラムに従って測定部１の各部やデータ処理部２を適宜制御することで、後述するような分析動作が実行される。また、操作部４は作業者（ユーザ）が測定開始等の指示を制御部３に与えるものであり、表示部５は分析結果などを表示するものである。
【００３０】
本実施例のＬＣシステムにおいて、移動相容器１１Ａには移動相Ａとしてリン酸水溶液が、移動相容器１１Ｂには移動相Ｂとして含リン酸メタノールが収容されている。ここでは、リン酸水溶液の濃度は０．０８５％（v/v）、含リン酸メタノールの濃度も０．０８５％（v/v）である。
【００３１】
カラム１５は逆相ＬＣ用のＯＤＳカラムであり、ここでは、カラム長（L）は７５mm、カラム内径（I.D.）は３．０mm、充填剤の粒子径は２．２μm、粒子の細孔径は８nmである。具体的には、カラム１５として島津製作所製のShim-pack XR-ODS IIなどを用いることができる。
【００３２】
紫外分光検出器１７は溶出液を流通させる検出セルを備え、該検出セル中の溶出液に所定波長の光を照射し、それに対する透過光の強度を検出して、溶出液による吸光度を検出信号として取得する。この紫外分光検出器１７は紫外可視分光検出器でもよく、また紫外分光検出器１７に代えてフォトダイオードアレイ検出器を用いてもよい。いずれにしても、リン酸を含む溶液である移動相は一般に不揮発性であるため、溶出液を揮発させる工程が必要となる検出器は不適であり、溶液中の成分をそのまま検出可能な検出器が適している。
【００３３】
本実施例のＬＣシステムにおいて、カンナビス分析用制御プログラム３１に規定されているＬＣ分析条件は以下の通りである。
・移動相流速          ：１．０mL/min
・グラジエント溶離条件：移動相Ｂ混合比率  ６０％（０−５min）−７２％（１６min）−９５％（２２−２４min）−６０％（２５−３０min）
・液体試料注入量      ：５μL
・検出波長            ：２２０nm
・カラムオーブン温度  ：５０℃
・検出器セル温度      ：４０℃
【００３４】
図２は、グラジエント溶離条件のタイムプログラムをグラフ化したものである。図２に示すように、試料注入時点（時間０分）を起点として５分が経過した後から１６分が経過するまでの１１分間の間（期間ａ）、６０％から７２％まで約１．１％／minの速度で、移動相Ｂの混合比率は上昇する。そのあと、試料注入時点を起点として１６分が経過した後から２２分が経過するまでの６分間の間（期間ｂ）、７２％から９５％まで約３．８％／minの速度で、移動相Ｂの混合比率は上昇する。期間ｂ中の移動相Ｂの混合比率の上昇速度は、期間ａ中の移動相Ｂの混合比率の上昇速度に比べて約３．５倍である。このように、移動相Ｂの混合比率の上昇速度を後半の期間で大きくするように二段階に変えることにより、後述するように複数の有効成分の分離性能を確保しつつ分析時間を極力短縮している。
【００３５】
本実施例のＬＣシステムにおいて分析対象としているカンナビス有効成分は、Tetrahydrocannabivarin (ＴＨＣＶ）、Cannabidiol（ＣＢＤ）、Cannabigerol（ＣＢＧ）、Cannabidiolic acid（ＣＢＤＡ）、Cannabigerolic acid（ＣＢＧＡ）、Cannabinol（ＣＢＮ）、Δ9-Tetrahydrocannabinol（ｄ９−ＴＨＣ）、Δ8-Tetrahydrocannabinol（ｄ８−ＴＨＣ）、Cannabichromene（ＣＢＣ）、Δ9-Tetrahydrocannabinolic acid A（ＴＨＣＡ−Ａ）の１０成分である。既述のように米国ではカンナビス有効成分分析の公定法は定められていないが、既存の主要な受託分析機関で分析対象としている有効成分を調査し、３以上の機関において分析対象とされている有効成分が主要な有効成分であると判断し、上記１０成分を選定した。
【００３６】
次に、本実施例のＬＣシステムにおける試料の分析手順を説明する。
上述したように、分析中、制御部３はカンナビス分析用制御プログラム３１に従って測定部１及びデータ処理部２を制御する。例えば操作部４から測定開始が指示されると、これを受けて制御部３は移動相Ａと移動相Ｂとが所定の初期混合比率（ここでは移動相Ｂの混合比率が６０％）となるように混合器１２を制御し、混合された移動相の流速が上記流速（ここでは１．０mL/min）となるように送液ポンプ１３を動作させる。これにより、上記初期混合比率で混合された移動相がインジェクタ１４を介してカラム１５に一定流速で流される。
【００３７】
制御部３からの指示に応じてインジェクタ１４は、移動相中に所定のタイミングで上記注入量（５μL）の液体試料を注入する。一方、試料注入とほぼ同時に、データ処理部２のデータ収集部２１は、紫外分光検出器１７の検出信号をデジタル化したデータの収集を開始する。インジェクタ１４から注入された液体試料は移動相の流れに乗ってカラム１５に導入され、カラム１５を通過する過程で試料中の成分は時間方向に分離される。カラム１５において分離された成分は順番にカラム１５出口から溶出し、紫外分光検出器１７の検出セルを通過する。紫外分光検出器１７は、検出セルを通過する溶出液に所定波長（ここでは２２０nm）の光を照射し、その透過光の強度を検出して、溶出液による吸光度を検出信号として取得する。この検出信号がデジタル化されて、検出データとしてデータ収集部２１に格納される。
【００３８】
制御部３は試料注入時点からの時間経過に伴い、図２に示したタイムプログラムに従って混合器１２における電磁バルブの開度を調整する。具体的には、期間ａ中や期間ｂ中には移動相Ａ側の電磁バルブの開度を徐々に小さくする一方、移動相Ｂ側の電磁バルブの開度を徐々に大きくする。それによって、流速が一定に維持されたまま、移動相Ｂの混合比率が上昇する。移動相Ｂの比率が増加してゆくと溶出力が強くなる。ここでは、単に溶出力を徐々に強くしていくだけでなく分析期間の前半部より後半部で溶出力の変化を大きくすることで、分析期間の前半部で溶出する成分の分離度を確保しつつ、後半部で溶出する成分を十分に分離しながらその溶出を速めるようにしている。
【００３９】
なお、実際には、期間ｂ中に１０成分のうちの最後の成分は溶出し終えるが、そのあと、最終濃度（混合比率９５％）を初期濃度（混合比率６０％）に戻し、平衡化時間を十分に確保して一つの分析サイクルを終了する。
インジェクタ１４では予め用意した多数の試料を順次移動相中に注入することで連続分析を行うことができるが、連続分析の際には、上述した一つの分析サイクルが終了したならば引き続き次の分析を行えばよい。
【００４０】
図３は、本実施例のＬＣシステムを用い、上記１０成分を混合した標準試料（STD）と二つの実試料（SMP A、SMP B）を測定することで得られたクロマトグラムの実測例を示す図である。実試料SMP Aは、Total ＣＢＤが豊富に含まれるカンナビスの花冠を試料としたもの、実試料SMP Bは、Total ＴＨＣが豊富に含まれるカンナビスの花冠を試料としたものである。当然のことながら、標準試料は有効成分以外の夾雑物を含まないのに対し、実試料は様々な夾雑物や上記１０成分以外の有効成分（但し、これも夾雑物とみなし得る）を含む。そのため、上記１０成分が十分に分離できるのみならず、その１０成分とそれ以外の成分とが十分に分離できることも重要である。
【００４１】
図３中の標準試料におけるクロマトグラムを見れば分かるように、１０成分にそれぞれ対応するピークがそれぞれ隣接するピークと十分に分離されている。特に分離が難しいｄ９−ＴＨＣに対応するピーク（No.7）とｄ８−ＴＨＣに対応するピーク（No.8）も良好に分離されていることが分かる。
【００４２】
図３中の実試料SMP Aにおけるクロマトグラムでは、豊富に含まれるＣＢＤ、ＣＢＤＡに対応するピークが、標準試料におけるクロマトグラム上のＣＢＤ、ＣＢＤＡに対応するピークと同じ位置（保持時間）に大きな強度で観測されている。一方、図３中の実試料SMP Bにおけるクロマトグラムでは、豊富に含まれるＴＨＣＡ−Ａに対応するピークが、標準試料におけるクロマトグラム上のＴＨＣＡ−Ａに対応するピークと同じ位置（保持時間）に大きな強度で観測されている。また、実試料SMP A、SMP Bには上記１０成分に対応するピークとは異なる位置にピークが存在していることも確認できるが、それらピークも上記１０成分に対応するピークとは良好に分離できていることが分かる。
【００４３】
データ処理部２のデータ収集部２１には上述した分析によって得られたデータが格納されるから、分析終了後に又は分析途中に、有効成分同定処理部２２は得られたデータに基づいて図３に示したようなクロマトグラムを作成し、そのクロマトグラム上で所定のアルゴリズムに従ってピークを検出する。そして、そのピークの保持時間を予め登録されている上記１０個の各有効成分の保持時間と比較することで、各ピークに対応する成分を同定する。ここで、１０個の有効成分に該当しないピークについては未同定としてもよいし、或いは別のライブラリなどを参照して、可能な限り化合物同定を行うようにしてもよい。また、有効成分定量処理部２３は、上記１０成分のうち同定された（つまりは存在が確認された）成分についてピークの面積値を計算し、その計算値をカンナビス分析用制御プログラム３１に含まれる検量線に照らして定量値を算出する。そして、制御部３は、同定結果と定量結果とを表示部５に表示する。
【００４４】
図３で示したように、分析対象である１０個の有効成分は良好に分離され、さらにそれ以外の夾雑物もその１０個の有効成分とは良好に分離されるので、保持時間に基づいて各有効成分を正確に同定することができるとともに、同定された成分の定量値も精度良く求めることができる。
【００４５】
本発明者の実験によれば、上記実施例のＬＣシステムを用いることで、１０個の有効成分の分析を３０分以内の分析時間で以て達成できるほか、以下のような仕様の分析が達成されることが確認できた。
・定量下限値：全ての有効成分について０．７mg/L以下
・有効成分間の分離：分離度１．８以上
・実試料由来の夾雑物と有効成分との分離：分離度１．２以上
・検量線の直線性：直線性の寄与率（Ｒ2）が０．９９９以上
・キャリーオーバー：各有効成分のキャリーオーバーは０．１％未満
【００４６】
なお、上記実施例において、カラム１５のサイズやＬＣ分析条件等について挙げた各数値はあくまでも一例であり、適宜変更することができる。
また、上記実施例のＬＣシステムでは上述した１０個の有効成分を分析対象としたが、それらのうちの一部を分析対象から除外してもよいことは当然である。また逆に、１０個の有効成分以外に、それらと分離可能である別の有効成分や夾雑物を合わせて同定するようにしてもよいことは当然である。
【００４７】
さらにまた、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で、適宜変更や修正を行えることは明らかである。
【符号の説明】
【００４８】
１…測定部
１１Ａ、１１Ｂ…移動相容器
１２…混合器
１３…送液ポンプ
１４…インジェクタ
１５…カラム
１６…カラムオーブン
１７…紫外分光検出器（ＵＶ検出器）
１８…アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）
２…データ処理部
２１…データ収集部
２２…有効成分同定処理部
２３…有効成分定量処理部
３…制御部
３１…カンナビス分析用制御プログラム
４…操作部
５…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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