(57)【要約】本発明は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物及びその製造方法に関するもので、本発明の新規化合物は造骨細胞分化に係わる遺伝子であるＡＬＰの発現を増加させ、脂肪細胞分化に関与する遺伝子であるＰＰＡＲγ、ａＰ２及びＣＤ３６の発現を調節し、卵巣切除骨粗鬆症動物モデルの骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増加させ、骨髄内の脂肪細胞を減少させることにより、骨代謝疾患又は肥満に有用な医薬品又は健康機能食品の有効成分に用いられることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１の化合物、その異性体又はこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分とする骨代謝疾患予防又は治療用組成物：
【化１】
2019521091.tif 000014
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか１であり、
前記Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に水素又はフェニル基であり、前記Ｒ７及びＲ９が水素であればＲ８及びＲ１０はフェニルであり、前記Ｒ７及びＲ９がフェニルであればＲ８及びＲ１０は水素であり、前記フェニルは非置換のものであるかあるいはヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか一つの置換基に置換されたものである。
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、炭素数１〜６のアルキル及び炭素数１〜６のアルコキシからなる群から選択されるいずれか１であり、前記Ｒ２及びＲ５の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか１であることを特徴とする、請求項１に記載の骨代謝疾患予防又は治療用組成物。
【請求項３】
前記化学式１の化合物は、下記化学式７、化学式８又は化学式９の化合物であることを特徴とする、請求項２に記載の骨代謝疾患予防又は治療用組成物：
【化７】
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【化８】
2019521091.tif 000016
【化９】
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【請求項４】
造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の骨代謝疾患予防又は治療用組成物。
【請求項５】
肥満及び骨代謝疾患を同時に予防又は治療することを特徴とする、請求項４に記載の骨代謝疾患予防又は治療用組成物。
【請求項６】
下記化学式１の化合物、その異性体又はこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分とする、骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品：
【化１】
2019521091.tif 000018
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか１であり、前記Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に水素又はフェニル基であり、前記Ｒ７及びＲ９が水素であればＲ８及びＲ１０はフェニルであり、前記Ｒ７及びＲ９がフェニルであればＲ８及びＲ１０は水素であり、前記フェニルは非置換のものであるかあるいはヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか一つの置換基に置換されたものである。
【請求項７】
前記Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、炭素数１〜６のアルキル及び炭素数１〜６のアルコキシからなる群から選択されるいずれか１であり、前記Ｒ２及びＲ５の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか１であることを特徴とする、請求項６に記載の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品。
【請求項８】
前記化学式１の化合物は、下記化学式７、化学式８又は化学式９の化合物であることを特徴とする、請求項７に記載の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品：
【化７】
2019521091.tif 000019
【化８】
2019521091.tif 000020
【化９】
2019521091.tif 000021
【請求項９】
造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制することを特徴とする、請求項６に記載の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品。
【請求項１０】
肥満及び骨代謝疾患を同時に予防又は治療することを特徴とする、請求項９に記載の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品。
【請求項１１】
下記化学式１の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物：
【化１】
2019521091.tif 000022
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか１であり、前記Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に水素又はフェニル基であり、前記Ｒ７及びＲ９が水素であればＲ８及びＲ１０はフェニルであり、前記Ｒ７及びＲ９がフェニルであればＲ８及びＲ１０は水素であり、前記フェニルは非置換のものであるかあるいはヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか一つの置換基に置換されたものである。
【請求項１２】
前記Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に炭素数１〜６のアルキル及び炭素数１〜６のアルコキシからなる群から選択されるいずれか１であり、前記Ｒ２及びＲ５の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に水素、ヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか１であることを特徴とする、請求項１１に記載の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物。
【請求項１３】
前記化学式１の化合物は、下記化学式７、化学式８又は化学式９の化合物であることを特徴とする、請求項１２に記載の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物：
【化７】
2019521091.tif 000023
【化８】
2019521091.tif 000024
【化９】
2019521091.tif 000025
【請求項１４】
下記化学式４の化合物と化学式５の化合物を反応させて化学式６の化合物を製造する段階；及び前記化学式６の化合物からＭＯＭ保護基を除去する段階；を含む、化学式７の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物の製造方法：
【化４】
2019521091.tif 000026
【化５】
2019521091.tif 000027
【化６】
2019521091.tif 000028
【化７】
2019521091.tif 000029
【請求項１５】
下記化学式２の化合物とクロロメチルメチルエーテルを反応させて化学式３の化合物を製造する段階、及び前記化学式３の化合物と水素化ジイソブチルアルミニウムを反応させて前記化学式４の化合物を製造する段階、をさらに含むことを特徴とする、請求項１４に記載の化学式７の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物の製造方法：
【化２】
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【化３】
2019521091.tif 000031
【請求項１６】
前記化学式２の化合物は４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ桂皮酸から合成されることを特徴とする、請求項１５に記載の化学式７の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する新規化合物、その製造方法に関するもので、本発明の新規化合物は骨代謝疾患又は肥満に係わる健康機能食品又は医薬品の製造に用いられることができる。
【背景技術】
【０００２】
骨は筋肉又は臓器を構造的に支えるだけでなく、人体の軟組織と体重を支え、内部器官を取り囲んで内部臓器を外部の衝撃から保護し、体内のカルシウム又は他の必須無基質、つまりリン又はマグネシウムのような物質を保存する人体の重要な部分の一つである。
【０００３】
骨は造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、及び破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）からなっている。そのうち、造骨細胞は軟骨細胞（ｃｏｎｔｒａｃｔ）、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）への分化が可能な間充織幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）から由来するもので、増殖期、骨基質形成期、石灰化期を経て骨組職を形成する役割を果たす。また、破骨細胞は骨を吸収（resorption）する役割を果たす。
【０００４】
大人の古い骨は、破骨細胞によって除去され、造骨細胞によって新しい骨に取り替えられる骨の吸収及び生成が持続的に繰り返されることによって骨再形成過程がなされる。例えば、造骨細胞は、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）及びその誘導収容体であるＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）のような物質の分泌によって骨吸収を担当する破骨細胞の分化を調節することによって体内の骨代謝の恒常性が維持される。
【０００５】
前記骨代謝の恒常性が特定の原因によって崩れれば、骨粗鬆症、骨形成障害又は骨折などの骨代謝疾患が発生する。
【０００６】
代表的な骨代謝疾患である骨粗鬆症は、骨量及び骨質が減少して骨ミネラル密度（Ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が２．５以下に減少した場合、又はＴ−ｓｃｏｒｅ（一般的な大人の平均骨質量からの標準偏差）が−２．５以下に減少した場合に、骨が弱くなって骨折しやすい状態を言う。骨粗鬆症は閉経期以後の女性で頻繁に発生し、年を取るほど骨基質が減少し、その空間に脂肪細胞が形成され、形成された脂肪細胞は骨を形成する造骨細胞の機能及び分化を低下させ、塩症性サイトカインを分泌して骨の吸収を担当する破骨細胞の機能及び分化を促進することが知られている。骨ミネラル密度があまりにも減少すれば、小さな衝撃によっても骨折しやすくなる。骨粗鬆症はその症状そのものよりは、骨の弱化によって来される各種の骨折、特に大腿骨の骨折又は脊椎の骨折などによって長期間活動を制限するため元気な生活を営むことができなく、結果的に老人層の死亡原因の１５％となることが知られている。
【０００７】
また、骨形成異常症（ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）とは骨異栄養症とも言い、晩成腎不全などによって発生する骨の疾患である。先天的に異常な腎臓機能によって発生し、腎臓が弱くなるとき透析しなければ死亡する。このような骨疾患は腎性骨異栄養症（ｒｅｎａｌ  ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）と呼ばれる。骨異栄養症に係わる骨疾患としては、骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、線維性骨塩（ｏｓｔｅｉｔｉｓｆｉｂｒｏｓａ）などがある。
【０００８】
前記骨代謝疾患の治療又は予防のためにカルシウム補強剤が推薦され、閉経期の女性にはビタミンＤ、又はエストロゲンやカルシトニンのようなホルモン剤が推薦されている。また、フォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ、成分名：ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）とアクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ、成分名：ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）のようなビスフォスフォネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）系のように、破骨細胞を抑制し、死滅を誘導する骨吸収抑制剤が主に使われている。
【０００９】
しかし、カルシウム補強剤は副甲状線ホルモンの分泌を抑制し、骨吸収による骨量減少を防止するが、骨量維持の個人差がひどいものであると知られており、ホルモン剤は骨ミネラル密度を増加させるが、乳房癌、心筋梗塞、静脈血栓症などの副作用が報告されたことがある（Ｎｅｌｓｏｎ， Ｈ． Ｄｅｔａｌ．， ＪＡＭＡ， ２８８：８７２−８８１， ２００２；Ｌｅｍａｙ， Ａ．， Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． Ｂｙｎａｅｃｏｌ． Ｃａｎ．， ２４：７１１−７１５２−３）。また、ビスフォスフォネート製剤の場合、顎骨の怪死、重症心房細動、骨又は関節の無力化又は筋骨格の痛症が発生する事例が報告されている（Ｃｏｌｅｍａｎ  ＲＥ．， Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， ９８：１７３６−１７４０（２００８）。
【００１０】
また、前記従来の骨代謝疾患の治療又は予防用製剤は更なる骨損失を防ぐ薬理作用は有するが、減少した骨量を元の状態に回復させることができる効果はなかった。
【００１１】
したがって、本発明者は新たに合成した新規化合物が造骨細胞と脂肪細胞分化調節によって骨代謝疾患又は肥満を治療して予防することができることを確認して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は新規化合物を有効成分とする骨代謝疾患予防又は治療用組成物を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は新規化合物を有効成分とする骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する新規化合物を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する新規化合物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の骨代謝疾患予防又は治療用組成物は、下記化学式１の化合物、その異性体又はこれらの薬学的に許容可能な（pharmaceutically acceptable）塩を有効成分とする。
【００１７】
また、本発明の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品は、下記化学式１の化合物、その異性体又はこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分とする。
【００１８】
また、本発明の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物は下記化学式１の化合物である。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、炭素数１〜６のアルキル、炭素数１〜６のアルコキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか一つであり、
前記Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９及びＲ１０の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素又はフェニル基であり、前記Ｒ７及びＲ９が水素であればＲ８及びＲ１０はフェニルであり、前記Ｒ７及びＲ９がフェニルであればＲ８及びＲ１０は水素であり、前記フェニルは非置換のものであるかあるいはヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか一つの置換基に置換されたものである。
【００２１】
好ましくは、前記Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、炭素数１〜６のアルキル及び炭素数１〜６のアルコキシからなる群から選択されるいずれか一つであり、
前記Ｒ２及びＲ５の各々は互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ独立的に、水素、ヒドロキシ、ハロゲン及びトリフルオロメチルからなる群から選択されるいずれか一つである。
【００２２】
より好ましくは、前記化学式１の化合物は、下記化学式７、化学式８又は化学式９の化合物である。
【００２３】
【化７】
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【００２４】
【化８】
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【００２５】
【化９】
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【００２６】
前記化学式７の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物は、下記化学式４の化合物と化学式５の化合物を反応させて化学式６の化合物を製造する段階；及び前記化学式６の化合物からＭＯＭ保護基を除去する段階；を含む製造方法によって製造されることができる。
【００２７】
【化４】
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【００２８】
【化５】
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【００２９】
【化６】
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【００３０】
前記化学式７の造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物は、下記化学式２の化合物とクロロメチルメチルエーテルを反応させて化学式３の化合物を製造する段階；及び前記化学式３の化合物と水素化ジイソブチルアルミニウムを反応させて前記化学式４の化合物を製造する段階；をさらに含む製造方法によって製造されることができる。
【００３１】
【化２】
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【００３２】
【化３】
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【００３３】
前記化学式２の化合物は４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ桂皮酸から合成されることができる。
【００３４】
前記化学式３〜６の‘ＭＯＭＯ−’はヒドロキシ基にヒドロキシル保護基（ｈｙｄｒｏｘｙｌ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）の一つであるメトキシメチルがエステル結合されたものを例示的に示したもので、ヒドロキシル保護基は分子内で所望の化学反応が完了した後に除去が容易であり、化学反応に対してヒドロキシ基の保護に適した作用基に係わる。一般に、このような作用基は前述した非置換又は置換のアリール、アラルキル（ａｒａｌｋｙｌ）又はアシル基、追加的にアルキル基である。前記ヒドロキシル保護基の特性及び大きさは所望の化学反応又は反応シーケンス（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）以後にこれらが除去されるので重要ではない：好ましくは炭素数１−２０、特に１−１０を有する作用基であり得る。ヒドロキシル保護基は、例えばベンジル、メトキシメチル、４−メトキシベンジル、ｐ−ニトロ−ベンゾイル、ｐ−トルエンスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチル及びアセチル（ａｃｅｔｙｌ）であり、ベンジル及びメトキシメチルが特に好ましい。
【００３５】
本発明で使われる用語、‘薬学的に許容可能な塩（pharmaceutically acceptable salt）’は化合物が投与される有機体に深刻な刺激を引き起こさなくて化合物の生物学的活性及び物性を損傷させない化合物の塩を意味する。前記薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容される陰イオンを含む無毒性酸付加塩を形成する酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無機酸、酒石酸、ギ酸、クエン酸、酢酸、卜リクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、安息香酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、サリチル酸などの有機カルボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸などによって形成された酸付加塩が含まれる。例えば、薬学的に許容されるカルボン酸塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどによって形成された金属塩又はアルカリ土類金属塩、リシン、アルギニン、グアニジンなどのアミノ酸塩、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジエタノールアミン、コリン及びトリエチルアミンなどの有機塩などが含まれる。
【００３６】
本発明で使う用語‘有効成分とする’とは前記化学式１の化合物の効能又は活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。
【００３７】
前記骨代謝疾患は骨粗鬆症、骨形成異常症又は骨折などを含む。
【００３８】
前記‘骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）’は骨ミネラル密度（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ、ＢＭＤ）測定による臨床的分類形態、すなわち骨減少症（ｏｓｔｅｏｐｅｎｉａ）、骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）及び深刻な骨粗鬆症（ｓｅｖｅｒｅ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）の全てを含む。また、原発性骨粗鬆症である第１型骨粗鬆症（ｔｙｐｅ１．  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、第２型骨粗鬆症（ｔｙｐｅ２．  ｓｅｎｉｌｅ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）及び続発性骨粗鬆症の全てを含む。
【００３９】
前記‘骨形成異常症（ｏｓｔｅｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）’は骨軟化症（ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ）、線維性骨塩（ｏｓｔｅｉｔｉｓ  ｆｉｂｒｏｓａ）などを含む。
【００４０】
前記‘骨折（ｆｒａｃｔｕｒｅ）’は骨又は軟骨の連続性が完全又は不完全に消失されるとか線上の変形を引き起こした状態を言う。前記骨折は、解剖学的位置、骨折の程度、骨折面の方向、開放創同伴有無、骨折片の数、安全性、骨折片の転位有無、特殊骨折である、骨粗鬆症と腫瘍骨髄炎などによって発生する病的骨折と、負荷が繰り返し加わることによって発生する疲労骨折などに分類されることができる。
【００４１】
本発明の骨代謝疾患予防又は治療用組成物は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する。したがって、肥満及び骨代謝疾患を同時に予防又は治療することができる。
【００４２】
本発明の骨代謝疾患予防又は治療用組成物は、前記化学式１の化合物とともに骨代謝疾患の予防又は治療活性を有する薬物、ビタミン、天然物、又はその抽出物を含むことができる。例えば、前記化学式１の化合物とともにカルシウム補強剤、ビタミンＤ、エストロゲン又はカルシトニンのようなホルモン剤、フォサマックス（Ｆｏｓａｍａｘ、成分名：ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、アクトネル（Ａｃｔｏｎｅｌ、成分名：ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）のようなビスフォスフォネート（ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）系の骨吸収抑制剤が一つ以上含まれることができる。
【００４３】
本発明の骨代謝疾患予防又は治療用組成物は、前記記載した有効成分に加えて薬学的に許容可能な担体を一つ以上含んで製造することができる。薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１成分以上を混合して使うことができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。また、当該分野の適正な方法で又はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて各疾患によって又は成分によって好ましく製剤化することができる。
【００４４】
本発明の骨代謝疾患予防又は治療用組成物は、目的によって経口投与又は非経口投与（例えば静脈内、腹腔内、皮下又は局所に適用）することができ、投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。本発明において、化学式Ｉの化合物の投与量は１日に０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇで投与することが良い。投与は１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【００４５】
本発明の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する。したがって、肥満及び骨代謝疾患を同時に改善又は予防することができる。
【００４６】
本発明の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品は、前記化学式１の化合物とともに骨代謝疾患の改善又は予防活性を有するビタミン、天然物、又はその抽出物を含むことができる。例えば、前記化学式１の化合物とともにカルシウム補強剤、ビタミンＤなどを一つ以上含むことができる。
【００４７】
本発明の骨代謝疾患改善又は予防用健康機能食品は、前記記載した有効成分に加えて食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含むことができる。
【００４８】
本発明の健康機能食品は、各種の食品類、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態として使うことができる。
【００４９】
前記化学式１の化合物が骨代謝疾患改善又は予防の目的で食品又は飲料に添加されるとき、食品中の前記化合物の量は一般的に総食品重量の０．００１〜５重量％で加えることができ、飲料中の前記化合物の量は飲料１００ｍｌを基準として０．００２〜５ｇ、好ましくは０．０３〜１ｇの比率で加えることができる。
【００５０】
前記飲料は有効成分として前記化学式１の化合物を含むことを除き、液体成分には特別な制限はなく、通常の飲料のようにさまざまな香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカリド、例えば葡萄糖、果糖などのジサッカリド、例えばマルトース、スクロースなどのポリサッカリド、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどの通常的な糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えばレバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使うことができる。前記天然炭水化物の比率は、一般的に飲料１００ｍｌ当たり約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００５１】
前記の他に、本発明の健康機能食品は、さまざまな営養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを含むことができる。その他に、本発明の健康機能食品は天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は独立して又は組合せで使うことができる。このような添加剤の比率はそれほど重要ではないが、本発明の健康機能食品１００重量部当たり０．１〜約２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【発明の効果】
【００５２】
本発明は造骨細胞分化を促進するとともに脂肪細胞分化を抑制する活性を有する化合物及びその製造方法に関するもので、本発明の新規化合物は造骨細胞分化に係わる遺伝子であるＡＬＰの発現（expression）を増加させ、脂肪細胞分化に関与する遺伝子であるＰＰＡＲγ、ａＰ２及びＣＤ３６の発現を調節し、卵巣切除の骨粗鬆症動物モデルで骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を増加させ、骨髄内の脂肪細胞を減少させることから、骨代謝疾患又は肥満に有用な医薬品又は健康機能食品の有効成分として用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＮＫ１１化合物の１ＨＮＭＲスペクトルである。
【図２】ＮＫ１１化合物の１３ＣＮＭＲスペクトルである。
【図３】実験例１で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の造骨細胞分化時、ＮＫ１１化合物処理によるＡＬＰの生成量の変化を比較するためのＡＬＰ染色写真であり、前記ＡＬＰ生成量の変化を−ｂ  ｖａｌｕｅ（−ｂ値）で測定したグラフである。
【図４】実験例１で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の脂肪細胞分化時、ＮＫ１１化合物処理による脂肪生成量の変化を示すためにオイルレッドオー（Oil Red O）染色を行った結果であり、前記染色結果をオイルレッドオー吸光度で示したグラフである。
【図５】実験例１で、ＮＫ１１化合物処理によるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株内のｍＲＮＡであるＰＰＡＲγ、ａＰ２、ＣＤ３６、ＡＬＰの発現量の変化を表示したグラフである。
【図６】実験例２で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の造骨細胞分化時、ＮＫ１１化合物と化学式８の化合物処理によるＡＬＰ生成量の変化を比較するためのＡＬＰ染色写真であり、前記ＡＬＰ生成量の変化を−ｂ  ｖａｌｕｅで測定したグラフである。
【図７】実験例２で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の造骨細胞分化時、ＮＫ１１化合物と化学式８の化合物処理による脂肪生成量の変化を示すためにオイルレッドオー染色を行った結果であり、前記染色結果をオイルレッドオー吸光度で示したグラフである。
【図８】実験例２で、化学式８の化合物処理によるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株内のｍＲＮＡであるＰＰＡＲγ、ａＰ２、ＣＤ３６、ＡＬＰの発現量の変化を表示したグラフである。
【図９】実験例３で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の造骨細胞分化時、化学式４、化学式２、化学式１０、化学式１１及び化学式９の化合物を処理してＡＬＰ生成量の変化をＮＫ１１化合物と比較するためのＡＬＰ染色写真であり、前記ＡＬＰ生成量の変化を−ｂ  ｖａｌｕｅで測定したグラフである。
【図１０】実験例３で、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株の脂肪細胞分化時、化学式４、化学式２、化学式１０、化学式１１及び化学式９の化合物を処理して脂肪生成量の変化をＮＫ１１化合物と比較するためにオイルレッドオー染色を行った結果であり、前記染色結果をオイルレッドオー吸光度で示したグラフである。
【図１１】実験例３で、化学式４、化学式２、化学式１０、化学式１１及び化学式９の化合物処理によるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株内のｍＲＮＡであるＰＰＡＲγ、ａＰ２、ＣＤ３６、ＡＬＰの発現量の変化をＮＫ１１化合物と比較したグラフである。
【図１２】実験例４で、ＮＫ１１化合物を８週間経口投与した卵巣切除白ねずみの体重比較グラフである。
【図１３】実験例４で、ＮＫ１１化合物を投与した卵巣切除白ねずみの血漿内の中性脂肪、コレステロール、ＡＬＰ濃度を測定したグラフである。
【図１４】実験例４で、ＮＫ１１化合物を投与した卵巣切除白ねずみの大腿骨のＢＭＤを測定したグラフである。
【図１５】実験例４で、ＮＫ１１化合物を投与した卵巣切除白ねずみの大腿骨内骨細胞のｍＲＮＡ発現量を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下、本発明を実施例及び実験例に基づいて詳細に説明する。ただ下記の実施例及び実験例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容がこれらに限定されるものではない。
【００５５】
製造例１：化学式３の化合物（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）の合成
４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ桂皮酸から公知の合成方法で化学式２の化合物を製造した。
【００５６】
前記化学式２のフラン化合物（４０１ｍｇ、０．８１２ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの丸底フラスコに入れ、窒素気体雰囲気でジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２、３ｍＬ）、ジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、４９５μＬ、２．８４ｍｍｏｌ）とクロロメチルメチルエーテル（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ、２１６μＬ、２．８４３ｍｍｏｌ）を入れた。常温で１２時間撹拌させた後、反応溶液に塩化アンモニウム水溶液（５ｍＬ）を加えて反応をクエンチ（quench）した。５ｍＬのジクロロメタンで３回抽出して得た有機層溶液に無水硫酸マグネシウムを入れて水を除去した後、濾過して濃縮させた。濃縮された反応生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅｓ：ＥｔＯＡｃ、２：１）で分離して黄色液体の化学式３の化合物であるｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（４７６ｍｇ、０．８１９ｍｍｏｌ、９９％収率）を合成した。
【００５７】
IR (neat): 2983 (w), 1735 (s), 1365 (m), 1240 (s), 1045 (s), 920 (m), 732 (s) cm-1;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 6.68 (s, 4H), 5.38 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 5.13 (s, 4H), 3.87 (s, 12H), 3.74 (s, 6H), 3.61 (s, 6H), 3.60 (d, J = 2.4 Hz, 2H);
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 171.5, 153.3, 135.9, 133.9, 102.5, 97.9, 82.9, 56.8, 56.2, 55.8, 52.3;
HRMS (ESI-TOF) m/z: [M + Na]+ Calcd for C28H36NaO13 603.2054; Found 603.2059.
【００５８】
製造例２：化学式４の化合物（２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ）の合成
１０ｍＬの丸底フラスコにＭＯＭ保護基が導入されたメチルエステル、化学式３の化合物（５０．０ｍｇ、０．０８６１ｍｍｏｌ）を入れ、窒素気体雰囲気でトルエン（１．９ｍＬ）を入れ、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）（４２０μＬ、０．４１９ｍｍｏｌ）を入れた。常温で１時間撹拌させた後、製造された反応溶液に酒石酸カリウムナトリウム水溶液３ｍＬを徐々に入れて、残っているアルミニウム水素化物をクエンチ（quench）した後、酢酸エチルで３回洗った（３ｍＬ×３）。有機層溶液を集め、無水硫酸マグネシウムで水を除去し、濾過後に濃縮させた。濃縮された反応結果物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ、４：１）で分離して無色液体であるアルコール、化学式４の化合物である２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｄｉｍｅｔｈａｎｏｌ（４３．０ｍｇ、０．０８２７ｍｍｏｌ、９６％収率）を合成した。
【００５９】
IR (neat): 3392 (br s), 2940 (w), 1591 (m), 1227 (m), 1114 (s), 957 (s), 838 (w) cm-1;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 6.61 (s, 4H), 5.12 (s, 4H), 4.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.87 (s, 12H), 3.86-3.82 (m, 2H), 3.71-3.63 (m, 2H), 3.60 (s, 6H), 3.40 (br s, 2H), 2.35-2.26 (m, 2H);
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 153.6, 137.8, 134.3, 103.3, 98.2, 83.4, 63.0, 57.1, 56.7, 56.2;
HRMS (ESI-TOF) m/z: [M + Na]+ Calcd for C26H36NaO11 547.2155; Found 547.2158.
【００６０】
製造例３：化学式６の化合物（（２Ｅ，２’Ｅ）−２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｂｉｓ（３−（４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ））の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに二つのアルコール基が置換された化学式４の化合物（５８０ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）、化学式５のトランスクマリン酸誘導体化合物（５７５ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、４０５ｍｇ、３．３２ｍｍｏｌ）とＥＤＣ（Ｎ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、５２９ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）を入れ、窒素気体雰囲気で０℃に反応温度を低めた後、６１ｍＬのジクロロメタンを入れた。０℃で１時間撹拌した後、常温に温度を上げた後、さらに２時間撹拌した。反応混合物溶液に塩化アンモニウム水溶液（６０ｍＬ）を入れ、ジクロロメタン６０ｍＬで３回洗浄した。有機層溶液を集め、無水硫酸マグネシウムで水を除去し、濾過した後に濃縮した。濃縮された生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｈｅｘａｎｅｓ：Ｅｔ２Ｏ：ＣＨ２Ｃｌ２、１：１：１）で分離して白色固体の化学式６のエステル化合物である（２Ｅ，２’Ｅ）−２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｂｉｓ（３−（４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ）（７２４ｍｇ、０．８００ｍｍｏｌ、７２％収率）を合成した。
【００６１】
IR (neat): 2990 (w), 1760 (m), 1597 (m), 1509 (m), 1240 (s), 1146 (s), 970 (s), 832 (m), 757 (w) cm-1;
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.61 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.70 (s, 4H), 6.28 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 5.21 (s, 4H), 5.13 (s, 4H), 5.04-5.03 (m, 2H), 4.44-4.43 (m, 4H), 3.86 (s, 12H), 3.61 (s, 6H), 3.49 (s, 6H), 2.65-2.60 (m, 2H);
13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 167.0, 159.2, 153.5, 145.2, 137.5, 133.8, 129.8, 127.8, 116.4, 115.1, 102.7, 98.1, 94.0, 83.0, 63.5, 57.1, 56.1, 56.0, 50.4;
HRMS (ESI-TOF) m/z: [M + Na]+ Calcd for C48H56NaO17 927.3415; Found 927.3416.
【００６２】
製造例４：化学式７の化合物（２Ｅ，２’Ｅ）−（−２，５−ｂｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｂｉｓ（３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ）の合成
２５ｍＬの丸底フラスコにＭＯＭ保護基が導入された化学式６の化合物（２１２ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を入れ、メタノール（７ｍＬ）と１２Ｎ  ＨＣｌ（０．８ｍＬ）を入れ、５０℃で５分間撹拌した。反応後、溶媒を濃縮した後に残った反応生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＣＨ２Ｃｌ２、１：１）で分離して黄色固体の最終生成物、化学式７の化合物（（２Ｅ，２’Ｅ）−（−２，５−ｂｉｓ（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）ｂｉｓ（３−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｔｅ）（１１９ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、７０％収率）を合成した。前記化学式７の化合物を本発明者らは‘ＮＫ１１’又は‘ｏｒｉｚａｔｉｖｏｌ  Ａ’と名付けた。
【００６３】
IR (neat): 3385 (br s), 2990 (w), 2363 (w), 1710 (m), 1597 (m), 1503 (m), 1233 (s), 1146 (s), 970 (s), 832 (m), 751 (w) cm-1;
1H NMR (CD3OD, 400 MHz): δ 7.39 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.80-6.74 (m, 8H), 6.21 (d, J = 15.9 Hz, 2H), 5.04 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.45-4.37 (m, 4H), 3.82 (s, 12H), 2.70-2.63 (m, 2H);
13C NMR (CD3OD, 100 MHz): δ 169.1, 161.6, 149.6, 147.2, 136.7, 133.8, 131.5, 127.2, 117.1, 115.0, 105.2, 85.8, 64.8, 57.0, 51.8;
HRMS (ESI-TOF) m/z: [M + Na]+ Calcd for C40H40NaO13 751.2367; Found 751.2362.
【００６４】
製造例５：化学式８の化合物の合成
製造例３及び４の方法を応用して化学式５のトランスクマリン酸誘導体化合物（４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄのヒドロキシ基にＭＯＭ保護基が結合された誘導体）及びその異性体であるシスクマリン酸誘導体（ｃｉｓ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄのヒドロキシ基にＭＯＭ保護基が結合された誘導体）をテトラヒドロキシフラン環に結合させて化学式８の化合物を合成した。前記化学式８の化合物を本発明者らは‘ｏｒｉｚａｔｉｖｏｌ  Ｂ’と名付けた。
【００６５】
製造例６：化学式９の化合物の合成
製造例３及び４の方法を応用して化学式５のトランスクマリン酸誘導体化合物（４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄのヒドロキシ基にＭＯＭ保護基が結合された誘導体）の代わりに桂皮酸（ｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）を添加して化学式９の化合物を合成した。
【００６６】
製造例７：化学式１０の化合物の合成
製造例３及び４の方法を応用してテトラヒドロフラン環にアセトキシメチル基を結合させて化学式１０の化合物を合成した。
【００６７】
【化１０】
2019521091.tif 000012
【００６８】
製造例８：化学式１１の化合物（２，５−ｂｉｓ（３，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４−（ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ−３，４−ｄｉｙｌ）ｄｉａｃｅｔａｔｅ）の合成
製造例３及び４の方法を応用してテトラヒドロフラン環にヒドロキシメチル基を結合させて化学式１１の化合物を合成した。
【００６９】
【化１１】
2019521091.tif 000013
【００７０】
実験例１：ＮＫ１１化合物の造骨細胞分化活性及び脂肪細胞分化阻害活性の測定
（１）ＮＫ１１化合物のＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）生成促進活性の測定
マウスの胚芽纎維母細胞から由来したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は一般的に造骨細胞を含む多様な細胞血統に分化することができる多能性幹細胞株である。造骨細胞の特徴の一つはＡＬＰ活性を示すことであるので、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株のＡＬＰ活性によって造骨細胞分化効果を測定した。
【００７１】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は１０％ＦＢＳ、１％ペニシリンとストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地によって３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養された。前記Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、６ウェルプレートに２．５×１０４／ｍｌの濃度で骨細胞分化のための１０ｍＭ  β−グリセルリン酸塩と５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む培地とともに培養し、ＮＫ１１化合物を０．１、０．５、１及び５μＭでそれぞれ添加し、３日ごとに培地を交換しながら９日間分化させた。
【００７２】
多能性幹細胞株であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリンとストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地によって３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。細胞は、６ウェルプレートに２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で骨細胞分化のための１０ｍＭ  β−グリセルリン酸塩と５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を含む培地とともに培養し、３日ごとに培地を交換し、ＮＫ１１化合物０．１、０．５、１及び５μＭをそれぞれ添加し、９日間分化させた後、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いてＡＬＰ染色を実施した。その結果を図３に示している。
【００７３】
その後、ＡＬＰ染色を行ったウェルプレートのイメージファイルを用いてＬａｂ色空間を測定した結果、ＮＫ１１化合物は、ＤＭＳＯ処理した陰性対照群（DMSO-treated negative control group）（Ｂｌａｎｋ）に比べ、処理濃度が増加するに伴ってＡＬＰ生成が増加することが分かる（図３参照）。
【００７４】
（２）ＮＫ１１化合物の脂肪細胞分化阻害活性の測定
前記実験例１と同様な方法で、６ウェルプレートに細胞を分株した後、脂肪細胞分化のために１μＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍＬインシュリン及び１μＭトログリタゾンを含む培地とＮＫ１１化合物０．１、０．５、１及び５μＭをそれぞれ添加し、９日間培養した。分化終了後、培地を除去し、１０％中性緩衝ホルマリンで細胞を固定させ、０．５％オイルレッドオー溶液で染色し、その結果を図４に示した。
【００７５】
その後、オイルレッドオー溶液で染色を行ったウェルプレートのイメージファイルを用いてＬａｂ色空間を測定した結果、ＮＫ１１化合物は、ＤＭＳＯ処理した陰性対照群（DMSO-treated negative control group）（Ｂｌａｎｋ）に比べ、濃度依存的に脂肪細胞の脂肪生成を阻害する効果を確認した（図４参照）。
【００７６】
（３）ＮＫ１１化合物の造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）分化因子及び脂肪細胞分化因子発現量の測定
ＮＫ１１化合物を処理したとき、細胞内の造骨細胞分化因子及び脂肪細胞分化因子のｍＲＮＡ発現量を調べた。その結果を図６に示した。
【００７７】
まず、実験例１と同様に、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株を造骨細胞に分化させながら造骨細胞分化因子であるＡＬＰの発現量を確認した。また、実験例２と同様に、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株を脂肪細胞に分化させながら脂肪細胞分化因子であるＰＰＡＲγ、ａＰ２及びＣＤ３６の発現量を調べた。
【００７８】
総ＲＮＡ抽出はＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。分離したＲＮＡ  １μｇはランダムプライマ（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ）、ｄＮＴＰ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を添加してｃＤＮＡに合成した。合成したｃＤＮＡはプライマーをＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）とともに用いて実時間ＰＣＲを遂行した。
【００７９】
脂肪細胞関連遺伝子であるＣＤ３６とａＰ２、ＰＰＡＲγの発現量を濃度依存的に減少させ、骨生成関連の重要指標であるＡＬＰの発現量が５μＭで高く発現された（図５参照）。
【００８０】
実験例２：ＮＫ１１化合物及び化学式８の化合物の造骨細胞分化活性及び脂肪細胞分化阻害活性の比較
ＮＫ１１化合物はテトラヒドロフラン環の３番及び４番位置の炭素に２個のトランスクマリン酸誘導体化合物が結合されたものであり、化学式８の化合物は前記ＮＫ１１のテトラヒドロフラン環のトランスクマリン酸誘導体の一つがシスクマリン酸誘導体に置換されたＮＫ１１化合物の異性体である。
【００８１】
ＮＫ１１化合物の異性体である化学式８の化合物の造骨細胞分化活性及び脂肪細胞分化阻害活性を前記実験例１の方法と同様に実施して比較した。
【００８２】
（１）ＮＫ１１化合物と化学式８の化合物のＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）生成促進活性の比較
図６のＡＬＰ染色写真及びグラフに示したように、化学式８の化合物はＮＫ１１化合物と同様に濃度依存的にＡＬＰ生成が増加することが分かる。
【００８３】
（２）ＮＫ１１化合物と化学式８の化合物の脂肪細胞分化阻害活性の比較
図７の写真及びグラフに示したように、化学式８の化合物はＮＫ１１化合物と同様に濃度依存的に脂肪細胞の脂肪生成を阻害する効果を示し、その濃度別効果もＮＫ１１化合物とほとんど違いがなかった。
【００８４】
（３）ＮＫ１１化合物と化学式８の化合物の造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）分化因子及び脂肪細胞分化因子発現量の比較
図８のグラフに示したように、化学式８の化合物は、図５のＮＫ１１化合物の結果と同様に、脂肪細胞関連遺伝子であるＣＤ３６とａＰ２、ＰＰＡＲγの発現量を濃度依存的に減少させ、骨生成関連重要指標であるＡＬＰの発現量が５μＭで高く発現された。
【００８５】
実験例３：ＮＫ１１化合物及び化学式４、化学式２、化学式１０、化学式１１及び化学式９の化合物の造骨細胞分化活性及び脂肪細胞分化阻害活性の比較
化学式４及び化学式１１の化合物はテトラヒドロフラン環の３番及び４番位置の炭素に２個のヒドロキシメチル基が結合されたものであるが、ただ化学式４の化合物はテトラヒドロフラン環の２番及び５番位置の炭素に結合されたフェニル基の４番位置の炭素のヒドロキシにメトキシメチル保護基が結合されたものであり、化学式１１の化合物はそのヒドロキシ基がそのまま露出されたものである。
【００８６】
また、化学式２の化合物はテトラヒドロフラン環の３番及び４番位置の炭素に２個のメチルカルボキシ基が結合されたものであり、化学式１０の化合物はテトラヒドロフラン環の３番及び４番位置の炭素に２個のアセトキシメチル基が結合された化合物である。
【００８７】
また、化学式９の化合物はテトラヒドロフラン環の３番及び４番位置の炭素に結合される２個のトランスクマリン酸誘導体の代わりに桂皮酸が結合された化合物である。
【００８８】
実験例３では、ＮＫ１１化合物の合成過程の中間体及びＮＫ１１化合物の類似構造化合物の造骨細胞分化活性及び脂肪細胞分化阻害活性を実験例１と同様な方法でＮＫ１１化合物と比較した。ただ、ＮＫ１１化合物は１μＭで処理し、残りの化合物は５μＭ濃度で処理した。
【００８９】
（１）ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）生成促進活性の比較
ＮＫ１１化合物の合成過程の中間体及びその類似構造化合物である化学式４、化学式２、化学式１０及び化学式１１の化合物はＡＬＰ生成量で陰性対照群（ＤＭＳＯ）と違いがなく、化学式９の化合物でのみＮＫ１１化合物の約２倍ほどのＡＬＰ生成量を確認することができた（図９参照）。各実験に用いられたＮＫ１１化合物と化学式９の化合物の濃度を考慮したとき、化学式９の化合物はＮＫ１１より僅かに低いが大きなＡＬＰ生成促進効果を有することが分かった。
【００９０】
（２）脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）分化阻害活性の比較
化学式４、化学式２、化学式１０及び化学式１１の化合物は脂肪細胞分化阻害効果において陰性対照群（ＤＭＳＯ）と差がなく、化学式９の化合物でのみＮＫ１１化合物とともに脂肪細胞分化阻害効果を確認することができた（図１０参照）。
【００９１】
（２）造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）分化因子及び脂肪細胞分化因子発現量の比較
化学式４、化学式２、化学式１０及び化学式１１の化合物は脂肪細胞関連遺伝子であるＣＤ３６とａＰ２、ＰＰＡＲγの発現量又は骨生成関連重要指標であるＡＬＰの発現量に影響を与えることができなかった（図１１参照）。
【００９２】
しかし、化学式９の化合物はＮＫ１１化合物の結果と同様に脂肪細胞関連遺伝子であるＣＤ３６とａＰ２、ＰＰＡＲγの発現量を減少させ、骨生成関連重要指標であるＡＬＰの発現量が高かった。ただ、化学式９の化合物処理群はその添加濃度がＮＫ１１化合物の５倍高く添加されたにもかかわらずＮＫ１１化合物処理群で脂肪細胞分化因子の発現阻害効果及び造骨細胞分化因子の発現促進効果がもっと高く現れた。
【００９３】
実験例４：卵巣切除（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ）骨代謝疾患動物モデルを用いた動物試験
ＮＫ１１化合物が骨代謝疾患の治療及び予防にどの影響を及ぼすかを調べるために、卵巣切除白ねずみに抽出物を投与した後、骨ミネラル密度を測定し、組職学的分析を実施した。
【００９４】
（１）動物飼育及び卵巣切除述（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ）
８週齢の雌ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを購入して１週間の純化期間を有した。９週齢になったとき、卵巣切除述を施行し、１週間の回復期を有した。８週間にかけて試料を毎日１回経口投与し、実験期間中の実験動物は一匹ずつ１ケージで飼育し、環境条件は室内温図２５±５℃、相対湿度５０±１０％、照明／消灯時間を１２時間／１２時間サイクルに調節した。飼料（ＡＩＮ−９３ｇ）と水は自由に取れるようにした。
【００９５】
実験群は卵巣を切除せずに開腹した群（Ｓｈａｍ）、卵巣切除施行後に蒸溜水を投与した群（ＯＶＸ）、卵巣切除施行後に各０．５、１ｍｇ／ｋｇの濃度でＮＫ１１を投与した群（ＮＫ１１０．５、ＮＫ１１１）と陽性対照群としてエストラジオール（ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ）５０μｇ／ｋｇとアグリコン大豆イソフラボン（ＩＳＯＦＬＡＶＯＮＥ）５０ｍｇ／ｋｇを投与した群に分けて試験した。
【００９６】
８週間の試料処理後、ジエチルエーテルで痲酔して心臓穿刺によって採血した血液を３０分間静置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得た血清を生化学分析に使った。分析項目としては、中性脂肪、総コレステロール、ＡＬＰ濃度及びＧＯＴ／ＧＴＰ比率を測定した。
【００９７】
実験終了後、犠牲にされた卵巣切除白ねずみの体重を測定し、大腿骨を摘出し、二重エネルギーＸ線骨ミネラル密度測定器（Ｎｏｒｌａｎｄ  ｐＤＥＸＡ）を使ってＢＭＤを測定した。
【００９８】
卵巣切除白ねずみから摘出した大腿骨を液体窒素で急速冷凍してから粉砕して試験に使った。総ＲＮＡの抽出にはＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。分離したＲＮＡ  １μｇはｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ、ｄＮＴＰ、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を添加してｃＤＮＡに合成した。合成したｃＤＮＡはプライマーを用いてＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）と一緒に実時間ＰＣＲを行うことにより、造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）形成に係わる分化因子であるＡＬＰのｍＲＮＡ発現量を確認した。
【００９９】
（２）体重の測定
卵巣を切除せずに開腹した群（Ｓｈａｍ）に比べ、卵巣切除した全ての実験群で体重が増加する傾向は現したが、有意な違いは現れなかった（図１２参照）。
【０１００】
（３）生化学的指標の測定
全ての実験群で、中性脂肪、総コレステロール、ＡＬＰ濃度及びＧＯＴ／ＧＴＰ比率に有意な違いは確認することができなかった（図１３参照）。
【０１０１】
（４）骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の測定
卵巣切除した実験群（ＯＶＸ）の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）が卵巣切除をしなかった実験群（Ｓｈａｍ）に比べて有意に減少することを現し、陽性対照群であるエストラジオール（ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ）とアグリコン大豆イソフラボン（ＩＳＯＦＬＡＶＯＮＥ）に比べてＮＫ１１化合物は濃度依存的に有意に骨ミネラル密度を増加させることを確認することができた（図１４参照）。
【０１０２】
（５）造骨細胞分化因子発現量の測定
大腿骨から抽出した造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）形成に係わる分化因子であるＡＬＰは卵巣切除した実験群（ＯＶＸ）で卵巣切除しなかった実験群（Ｓｈａｍ）に比べて有意に減少し、ＮＫ１１化合物の投与はこれを再び有意に上昇させた。ＮＫ１１化合物は濃度依存的にＡＬＰの発現量を増加させる傾向を現し、１ｍｇ／ｋｇの投与時、陽性対照群と類似した発現量を現した（図１５参照）。
【０１０３】
下記で本発明の抽出物を含む組成物の製剤例を説明するが、本発明はこれを限定しようとするものではなく具体的に説明しようとするものである。
【０１０４】
製剤例１．酸剤の製造
ＮＫ１１化合物  ２０ｍｇ
乳糖  １００ｍｇ
タルク  １０ｍｇ
上記成分を混合し、気密布に充填して酸剤を製造する。
【０１０５】
製剤例２．錠剤の製造
ＮＫ１１化合物  １０ｍｇ
トウモロコシ澱粉  １００ｍｇ
乳糖  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
上記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造する。
【０１０６】
製剤例３．カプセル剤の製造
ＮＫ１１化合物  １０ｍｇ
結晶性セルロース  ３ｍｇ
ラクトース  １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって前記成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
【０１０７】
製剤例４．注射剤の製造
ＮＫ１１化合物  １０ｍｇ
マンニトール  １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水  ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当たり（２ｍｌ）前記成分含量で製造する。
【０１０８】
製剤例５．液剤の製造
ＮＫ１１化合物  ２０ｍｇ
異性化糖  １０ｇ
マンニトール  ５ｇ
精製水  適量
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、前記成分を混合した後、精製水を加えて全体を１００ｍｌに調節した後、茶色瓶に充填して滅菌させることによって液剤を製造する。
【０１０９】
製剤例６．健康機能食品の製造
ＮＫ１１化合物  １，０００ｍｇ
ビタミン混合物  適量
ビタミンＡアセテート  ７０μｇ
ビタミンＥ  １．０ｍｇ
ビタミンＢ１  ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２  ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６  ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２  ０．２μｇ
ビタミンＣ  １０ｍｇ
ビオチン  １０μｇ
ニコチン酸アミド  １．７ｍｇ
葉酸  ５０μｇ
パントテン酸カルシウム  ０．５ｍｇ
無機混合物  適量
硫酸第１鉄  １．７５ｍｇ
酸化亜鉛  ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム  ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム  １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム  ５５ｍｇ
枸椽酸カリウム  ９０ｍｇ
炭酸カルシウム  １００ｍｇ
塩化マグネシウム  ２４．８ｍｇ
上記ビタミン及びミネラル混合物の組成比は比較的健康食品に適した成分を好適な実施例として混合して造成したが、その配合比を任意に変形して実施しても構わなく、通常の健康食品製造方法によって前記成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康機能食品の製造に使うことができる。
【０１１０】
製剤例７．健康機能食品飲料の製造
ＮＫ１１化合物  １，０００ｍｇ
枸椽酸  １，０００ｍｇ
オリゴ糖  １００ｇ
梅濃縮液  ２ｇ
タウリン  １ｇ
精製水を加えて全体９００ｍｌ
通常の健康機能食品飲料製造方法によって前記成分を混合した後、約１時間の間に８５℃で撹拌しながら加熱した後、用意された溶液を濾過し、滅菌された２容器に取得して密封滅菌し、冷蔵保管した後、本発明の健康機能食品飲料組成物の製造に使用する。
【０１１１】
上記組成比は比較的嗜好飲料に適した成分を好適な実施例として混合して造成したが、需要階層、需要国家、使用用途など、地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変えて実施しても構わない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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