(57)【要約】  複数の蛍光試薬を用いて複数の生体標本を自動化された手法で分析するためのシステムおよび方法について説明する。このシステムは、２つの光学システムすなわち蛍光イメージングシステムおよび光学消光システムを含むことができる。これら２つのシステムを、横方向で互いに隣り合うように、一般的には、標本を含むマイクロタイタプレートの複数のウェルのうち１つのウェルの真下に、配置することができる。その中に含まれる生体標本を、一連の蛍光試薬を用いて染色することができ、染色の合間に蛍光が消光される。イメージングシステムに対して標本を正確にポジショニングすることにより、複数の試薬を順次適用しながら標本をイメージングすることができる。
2019511913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの蛍光染料により染色された生体標本を分析するための自動化されたシステムであって、前記システムは、
前記蛍光染料から得られる蛍光シグナルのための励起ユニットおよび検出ユニットを有する蛍光システムと、
少なくとも１つの生体標本を前記蛍光染料と共に含む少なくとも１つのコンテナを保持するための開口部と、
前記蛍光シグナルを消光する消光ユニットと、
液体を前記コンテナに供給する、かつ／または、液体を前記コンテナから取り出す、液体処理システムと、
前記開口部、前記蛍光システム、前記消光ユニットおよび前記液体処理システムのうちの少なくとも１つを、１つの作業平面を規定する少なくとも２つの直交する次元において移動させるメカニズムと、
さらに前記蛍光染料の励起、前記蛍光シグナルの検出および収集ならびに前記蛍光シグナルの消光を含む１つのルーチンを、自動化された手法で実行する制御ユニットと、
を含む自動化されたシステム。
【請求項２】
前記液体処理システムは、蛍光染料、前記蛍光シグナルを消光する配合物、洗浄液および緩衝剤のうちの少なくとも１つを、前記生体標本へ供給する、
請求項１記載の自動化されたシステム。
【請求項３】
前記液体処理システムは、ステージ上に配置されたロボット制御型のピペットシステムを有し、前記ピペットシステムは、前記作業平面に対し直交するｚ軸に沿って移動可能である、
請求項１または２記載の自動化されたシステム。
【請求項４】
前記液体処理システムは、前記ピペットシステムの外側を洗浄して付着した液体を除去する手段を有する、
請求項１から３までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項５】
前記制御ユニットは、蛍光染料で染色された前記生体標本のイメージとして、前記蛍光シグナルを収集する、
請求項１から３までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項６】
前記自動化されたシステムはさらに、少なくとも１つの付加的な液体容器を有し、前記付加的な液体容器は、試薬、検出部分を有する抗原認識部分、蛍光染料を含む抗体、抗生物質、生体栄養素、毒素、染料および酸化剤のうちの少なくとも１つを含む、
請求項１から４までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項７】
前記コンテナは、各々別個の生体標本を含む複数の液体ウェルを有する、
請求項１から５までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項８】
前記コンテナは、タイタプレートである、
請求項６記載の自動化されたシステム。
【請求項９】
前記コンテナは、透明部分と不透明部分とを有し、前記透明部分に前記生体標本が配置され、前記不透明部分は、前記蛍光シグナルを反射するかまたは吸収する、
請求項１から７までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１０】
前記消光ユニットは、前記蛍光システムに横方向で隣り合って配置された光源を有し、前記光源は、消光放射を放出する、
請求項１から９までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１１】
前記消光ユニットは、それぞれ異なる波長の消光放射を放出する２つ以上の光源を有する、
請求項１から９までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１２】
前記消光ユニットはさらに、少なくとも１つのミラーを有し、前記ミラーは、前記生体標本または前記蛍光染料によっても吸収されない消光放射の一部分を反射して、前記生体標本に戻す、
請求項９記載の自動化されたシステム。
【請求項１３】
前記消光ユニットは、前記生体標本の表面領域あたりの放射および／または放射強度を均質化する手段を有する、
請求項１から９までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１４】
前記消光ユニットは、４００ｎｍよりも短くかつ９００ｎｍよりも長い波長の放射を前記消光放射から実質的に取り除くフィルタを有する、
請求項１から９までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１５】
前記消光ユニットは、さらに蛍光検出器を含み、前記蛍光検出器は、前記蛍光シグナルの減衰を消光データとして監視する、
請求項９記載の自動化されたシステム。
【請求項１６】
前記制御ユニットは、前記消光データに基づきフィードバックループにより前記消光ユニットを制御する、
請求項１から１２までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１７】
前記制御ユニットは、ｘ方向またはｙ方向において±約１〜２００μｍの精度を伴って、前記開口部を前記作業平面内で移動させる、
請求項１から１３までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１８】
前記自動化されたシステムは、さらに温度制御ユニットを有し、前記温度制御ユニットは、前記生体標本の温度を１０〜４０℃に制御する、
請求項１から１３までのいずれか１項記載の自動化されたシステム。
【請求項１９】
生体標本を分析するための自動化された方法であって、前記方法は、
少なくとも１つの生体標本を蛍光染料と共にステージ上の開口部におけるコンテナ内に保持するステップと、
蛍光システムによって、前記蛍光染料を励起し、前記蛍光染料から得られる蛍光シグナルを検出するステップと、
前記開口部、前記ステージ、前記蛍光システムおよび消光ユニットのうちの少なくとも１つを、１つの作業平面を規定する少なくとも２つの直交する次元において、前記生体標本が前記消光ユニットと隣り合うまで移動させるステップと、
さらに前記消光ユニットによって前記蛍光シグナルを消光するステップと、
を含む自動化された方法。
【請求項２０】
前記自動化された方法はさらに、
前記消光後に前記生体標本をイメージングするステップを含む、
請求項１９記載の自動化された方法。
【請求項２１】
前記自動化された方法はさらに、
液体処理システムにより一連の液体を、前記生体標本を保持する前記コンテナに搬送するステップと、
さらに前記蛍光染料の励起、前記蛍光シグナルの検出および収集ならびに前記蛍光シグナルの消光を含む１つのルーチンを、一連の液体を用いて自動化された手法で実行するステップと、
を含む、
請求項１９または２０記載の自動化された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料を分析するためのツールおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に免疫蛍光分析のために、１つまたは複数の抗体と共役された蛍光染料が使用される。標的細胞の特異的検出および隔離を行えるようにするため、抗体、蛍光染料、フローサイトメータ、フローソータおよび蛍光顕微鏡に関して、この２０年で膨大な数のバリエーションが開発されてきた。
【０００３】
組織の細胞構造を検出してイメージングするために、着目する抗原を標的とする蛍光色素共役体が使用される。このような技術において、蛍光シグナルの除去と再染色とをシーケンシャルに行うことによって、標識付けと検出とを同時に用いる標準の手順よりも、高い多重化能力が得られるようになる。たとえば米国特許第７７４１０４５号明細書（US 7741045 B2）、欧州特許第０８１０４２８号明細書（EP 0810 428 B1）または独国特許出願公開第１０１４３７５７号明細書（DE10143757）には、共役された蛍光部分の光化学的または化学的な破壊により、蛍光シグナルを除去することが開示されている。
【０００４】
上述の技術によれば、結果として生じた複数の蛍光シグナルが、１つのイメージとして収集される。蛍光シグナルの除去と種々の蛍光色素共役体による再染色とをシーケンシャルに行うことにより、それぞれ異なる抗原が検出され、その結果、試料のそれぞれ異なる部分（抗原）を表す同じ試料の複数のイメージが得られる。これらの技術によって収集される情報の品質は、イメージの分解能と、処理ステップの精度と、標本を操作するために各ステップの合間に必要とされる時間とに大きく左右される。公知の技術によって得ることができるのは、処理ステップが厄介であることに起因して、一連の染色を通して１つの特定の生体標本のごく限られた個数のイメージである。このため、提案された分析のために、生体試料の染色、イメージングおよび染色除去のサイクルについて、自動化された手順が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、生体標本のシーケンシャルな分析をコンピュータ制御のもと、その場で行うことができるシステムについて説明する。本発明による装置によれば、多数の蛍光試薬を同じ生体標本にシーケンシャルに適用することができ、イメージングメカニズムにより透明な支持部材を通して標本を観察することができる。イメージングメカニズムを蛍光イメージングシステムとすることができ、このシステムは、データ収集コンピュータと組み合わせられて、一連の様々な試薬により染色された生体標本の視覚的イメージを生成することができる。試薬各々の合間に、蛍光イメージングシステムと横方向で隣り合って配置された第２の光学システムにより、蛍光を消光することができ、この第２の光学システムは、蛍光部分を無効にするまたは破壊するのに十分な光で標本を照射する。
【０００６】
よって、本発明によるシステムは、複数の標本と複数の試薬とを含むことができ、これら各々は、マイクロタイタプレートの別個のウェルに含まれている。自動化された液体処理システムを含めることができ、この場合、ロボット制御型のピペットが所定量の特定の試薬を、複数の試薬容器のうちの１つから取り出し、特定の生体標本を含む特定の標本ウェルに、その所定量の試薬を沈積させる。
【０００７】
複数のマイクロタイタウェルを、プラスチック製のディスポーザブルマイクロタイタプレートとして、そこに形成された小さい液体ウェルと共に、用意することができる。それらのウェル各々は、試薬、検出部分を有する抗原認識部分、蛍光染料を含む抗体、抗生物質、生体栄養素、毒素、染料、酸化剤など、種々の配合物を含むことができる。別の選択肢として、ディスポーザブル品は、機能化されセグメント化された複数の領域を有することができ、そこに生物学的に活性の構造が付着される。
【０００８】
よって、本発明の対象は、少なくとも１つの蛍光染料により染色された生体標本を分析するための自動化されたシステムであって、このシステムは、
蛍光染料から得られる蛍光シグナルのための励起ユニットおよび検出ユニットを有する蛍光システムと、
少なくとも１つの生体標本を蛍光染料と共に含む少なくとも１つのコンテナを保持するための開口部と、
蛍光シグナルを消光する消光ユニットと、
液体をコンテナに供給する、かつ／または液体をコンテナから取り出す、液体処理システムと、
開口部、蛍光システム、消光ユニットおよび液体処理システムのうちの少なくとも１つを、１つの作業平面を規定する少なくとも２つの直交する次元で移動させるメカニズムと、
さらに蛍光染料の励起、蛍光シグナルの検出および収集ならびに蛍光シグナルの消光を含む１つのルーチンを、自動化された手法で実行する制御ユニットと、
を含む。
【０００９】
さらに本発明に対象は、生体標本を分析するための自動化された方法であって、この方法は、
少なくとも１つの生体標本を蛍光染料と共に、ステージ上の開口部におけるコンテナ内に保持すること、
蛍光システムによって、蛍光染料を励起し、蛍光染料から得られる蛍光シグナルを検出すること、
開口部、ステージ、蛍光システムおよび消光ユニットのうちの少なくとも１つを、１つの作業平面を規定する少なくとも２つの直交する次元において、生体標本が消光ユニットと隣り合うまで移動させること、
さらに消光ユニットによって蛍光シグナルを消光すること、
を含む。
【００１０】
本発明による自動化された方法は好ましくは、本明細書で説明する生体標本を分析するための自動化されたシステムにおいて実施される。
【００１１】
次に、以下の図面を参照しながら種々の実施例の詳細について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】自動化された分析ツールの平面簡略図である。
【図２】自動化された分析ツールを、そこに配置されたディスポーザブル標本ホルダと共に示す側面簡略図である。
【図３】自動化されたピペットシステムを示す自動化された分析ツールの側面簡略図である。
【図４】蛍光イメージングシステムの側面簡略図である。
【図５】フィードバック制御を備えた光学消光システムの側面簡略図である。
【図６】レーザ光源および共振器ミラーを備えた光学消光システムの側面簡略図である。
【図７】生体標本を通過する複数の経路を備えた光学消光システムの１つの実施形態の側面簡略図である。
【図８】生体標本を通過する複数の経路を備えた光学消光システムの別の実施形態の側面簡略図である。
【図９】生体標本を通過する複数の経路を備えた光学消光システムの別の実施形態の側面簡略図である。
【図１０】生体試料のための自動化されたツールを使用するための方法を示す簡略フローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
なお、これらの図面は必ずしも正確な縮尺で描かれているわけではなく、また、同じ特徴には同じ参照符号が付されている場合もあることを理解されたい。
【００１４】
本発明のシステムおよび方法は、複数の蛍光試薬を用いて複数の生体標本を、自動化された手法で分析するために設計されている。このシステムによれば、ロボット制御型のピペットシステムによって、各々がそれぞれ異なる試薬を保持する複数の液体容器のうちの１つから、所定量の蛍光試薬を取り出すことができる。次いでロボット制御型のピペットシステムは、標本を保持する複数の液体ウェルのうち特定の１つのウェルに、所定量の試薬を供給することができる。液体標本ウェルは、生体標本だけでなく緩衝液を含むこともできる。複数の試薬をマイクロタイタプレート９０の試薬容器に保管することができる一方、複数の標本をマイクロタイタプレート９２の標本ウェルに保管することができる。したがって本明細書で用いられる参照符号９０は、試薬を容器内に保管するディスポーザブルマイクロタイタプレートのことを指し、参照符号９２は、別個の生体標本をウェル内に保管するディスポーザブルマイクロタイタプレートのことを指す。
【００１５】
蛍光試薬
本発明において使用される蛍光試薬は、蛍光部分と抗原認識部分とを含んでおり、オプションとしてこれらはスペーサ分子により結合される。
【００１６】
適切な蛍光部分は、たとえばフローサイトメータまたは蛍光顕微鏡など免疫蛍光技術の分野から知られているものである。有用な蛍光部分は、フィコビリタンパク質などタンパク質ベースのもの、ポリフルオレンなどの高分子、キサンテンなどの有機小分子染料、たとえばフルオレセインまたはローダミン、シアニン、オキサジン、クマリン、アクリジン、オキサジアゾール、ピレン、ピロメテン、またはＲｕ，Ｅｕ，Ｐｔ錯体などの有機金属錯体とすることができる。単一分子単位のほか、蛍光タンパク質または有機小分子染料のクラスタ、同様にナノ粒子、たとえば量子ドット、アップコンバートナノ粒子、金ナノ粒子、染色されたポリマーナノ粒子も、蛍光部分として用いることができる。
【００１７】
本発明の別の変形実施形態によれば、蛍光試薬は、蛍光部分と抗原認識部分とを分離する酵素分解可能なスペーサを含んでいる。蛍光放出を除去するため消光ユニットによって、このスペーサを分解する適切な酵素を供給することができ、これによって蛍光部分が抗原認識部分すなわち生体標本から遊離される。遊離された染料を、洗浄により標本から取り除くことができる。適切な蛍光試薬および酵素は、欧州特許出願第１５２００３３８．０号明細書（EP15200338.0）に開示されており、たとえば酵素スペーサとして、ポリサッカライド、タンパク質、ペプチド、デプシペプチド、ポリエステル、ヌクレイン酸、デキストラン、プルラン、イヌリン、アミロース、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、グルコマンナン、ペクチン、キトサン、またはキチンを含み、さらに酵素として、ヒドロラーゼ、リアーゼ、またはレダクターゼを含む。
【００１８】
蛍光部分を、オプションのスペーサを介して、抗原認識部分と共有結合または非共有結合することができる。共有結合または非共有結合のための方法は、当業者に知られている。蛍光部分と、抗原認識部分またはオプションのスペーサとの間が共有結合されている場合には、蛍光部分、抗原認識部分またはスペーサのうちの１つにおける活性化群と、個々の他方の単一体における機能群との直接的な反応を用いることができる。
【００１９】
抗原認識部分
用語「抗原認識部分」とは、細胞標本の細胞において発現したマーカに対して向けられた、任意の種類の抗体、または断片化抗体、または断片化抗体派生物のことを指す。この用語は、完全に無損傷の抗体、断片化抗体または断片化抗体派生物に関連するものであり、たとえばＦａｂ，
【数１】
2019511913.tif 000003
，ｓｄＡｂ，ｓｃＦｖ，ｄｉ−ｓｃＦｖ，ナノボディなどである。かかる断片化抗体派生物を、これらの種類の分子を含有する共有結合および非共有結合を含む組み換え手順によって合成することができる。さらに抗原認識部分の例は、ＴＣＲ分子を標的とするペプチド／ＭＨＣ錯体、細胞接着受容体分子、副刺激分子の受容体、複数の分子を結合する人工改変抗体、たとえば細胞表面分子などを標的とするペプチドまたはアプタマーである。
【００２０】
本発明による方法において用いられる蛍光試薬は、１００個までの、好ましくは１〜２０個の抗原認識部分および／または抗原検出部分を有することができる。
【００２１】
好ましくは、本発明において用いられる蛍光試薬は、１つの蛍光部分と、ＩＬ２，ＦｏｘＰ３，ＣＤ１５４のような細胞内の、またはＣＤ３，ＣＤ１４，ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ２５，ＣＤ３４，ＣＤ５６およびＣＤ１３３のような細胞外の生体試料（標的細胞）により発現される抗原に対して向けられた１つの抗体と、を有する。
【００２２】
生体標本
生体標本は、蛍光試薬の抗原認識部分により検出／認識可能な標的部分を有する。生体標本は、動物全体、無脊椎動物（たとえばシノラブディス・エレガンス、キイロショウジョウバエ）、脊椎動物（たとえばゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル）、および哺乳動物（たとえばハツカネズミ、人類）の器官、組織切片、細胞集合体、または単一細胞のような任意の試料に由来するものとすることができる。生体標本は、組織切片、細胞集合体、懸濁細胞または粘着細胞の形態を有することができる。細胞を、生体または死体とすることができる。これらの試薬各々を別個の液体容器に収容することができ、この場合、液体容器各々が試薬、検出部分を有する抗原認識部分、蛍光染料を含む抗体、抗生物質、生体栄養素、毒素、染料および酸化剤のうちの少なくとも１つを含むようにする。
【００２３】
あとでさらに説明するように、試薬各々を液体処理システムによって取り出し、システムによってイメージングされる生体標本に適用することができる。
【００２４】
蛍光システム
Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）の励起のためには５２０〜５６０ｎｍの緑色光というように、蛍光試薬に対して調節された適切な波長の光の照射を介して、蛍光励起が実施される。したがって励起ユニットによって、特定の蛍光を吸収するスペクトル範囲内の電磁放射が供給される。次いで蛍光体は、赤色方向にシフトした波長（シフトは一般に約２０ｎｍ）の蛍光を放出し、励起放射からこれを別個に検出することができる。蛍光顕微鏡励起ユニットの一般的な具現化形態は、アークランプ、キセノンランプまたはメタルハライドランプなどのような白色光源と、励起に必要とされるスペクトル帯域を生成するための後続のフィルタとを含んでいる。レーザまたは発光ダイオードも使用される。
【００２５】
消光ユニット
用語「消光」および「退色」は、本明細書では入れ替え可能に用いられ、蛍光体または標識された生体標本への蛍光体の付着の化学的または放射による変質の結果として、標識された生体標本からの蛍光の減少を意味する、と理解されたい。したがって消光システムはさらに、試薬の蛍光性能または生体標本への試薬の付着を変質させる化学薬品または放射のうち少なくとも一方のソースを有することができる。
【００２６】
消光ユニットは、特定の蛍光体により吸収される波長の光を用いて、標本に高強度の照射をもたらすことができる。一般的に用いられる多数の染料のために要求を満たすのは、青色（４５０〜５００ｎｍ）、緑色（５２０〜５６０ｎｍ）および赤色（６３０〜６５０ｎｍ）を発光するＬＥＤの組み合わせである。放射強度を高めることによって、消光に必要とされる時間が短くなる。Ｐ−ＲＥのために約３００ｍＷ／ｃｍ２を用いると、おおよそ３０秒という蛍光シグナルの指数関数的な減衰の半減期時間が得られる。よって、当初のシグナルの１〜５％まで蛍光シグナルを低減するには、約３分が必要とされる。これを種々の蛍光体に対して同時に実施することができ、たとえばＦＩＴＣ（励起４７０ｎｍ、放出５２０ｎｍ）、Ｒ−ＰＥ（励起５３０ｎｍ、放出５８０ｎｍ）、ＡＰＣ（励起６３０ｎｍ、放出６６０ｎｍ）に対して同時に実施することができる。この実施形態によれば、消光ユニットを励起ユニットと同じ構成要素とすることもできる。
【００２７】
したがって消光ユニットに、それぞれ異なる波長の消光放射を放出する２つ以上の光源を設けることができる。たとえば消光ユニットに、３５０〜８５０ｎｍ好ましくは４５０〜６５０ｎｍの範囲内の合成放出スペクトルを有する２〜５個の光源を設けることができる。標本を同時にまたは順番に照射するために、複数の光源の放出を光学的に組み合わせることができる。たとえば消光ユニットに、４５０〜５００ｎｍ（青色）、５２０〜５６０ｎｍ（緑色）および６３０〜６５０ｎｍ（赤色）の範囲内で放出する３つの光源を設けることができる。別の実施形態によれば、３５０〜８５０ｎｍ好ましくは４５０〜６５０ｎｍの範囲内で光を放出するただ１つの光源が設けられる。複数の別個の光源を設けることの利点は、蛍光染料の消光（除去）に必要とされる放射のみに標本が晒され、それによって標本が他の波長の放射に不必要に晒されるのが回避される、ということである。複数の別個の光源の放射を、ミラーのような適切なデバイスまたは光ファイバのような光導波体によって結合することができる。
【００２８】
１つの好ましい実施形態によれば、消光ユニットは、蛍光シグナルの減衰を消光データとして監視する蛍光検出器を含むことができる。消光ユニットは、すべての光源のために１つの蛍光検出器を有することができ、または光源ごとに別個に蛍光検出器を有することができる。制御ユニットは、個々の消光データに基づき１つまたは複数のフィードバックループを用いて、消光ユニット内の各光源を制御することができる。便宜上、蛍光の除去を最大放出波長のところで測定することができるけれども、２つの波長間の放出スペクトルの積分を計算するのも適している。本発明のこの変形実施形態によれば、制御ユニットおよび／または消光ユニットは、蛍光放出が消光により予め規定された閾値を下回るように除去されない場合には、消光プロセスが繰り返される、というように構成されている。たとえば蛍光放出の消光は、当初の蛍光放出の５％よりも小さくなるまで、好ましくは１％よりも小さくなるまで、蛍光放出が低減されたときに、達成されたとみなされる。同時に２つ以上の蛍光試薬を供給するこの変形実施形態によれば、蛍光放出の低減は、測定される蛍光放出各々に基づく。
【００２９】
消光ユニットにはさらに、標本の表面領域ごとに放射および／または放射強度を均質化する手段を設けることができる。不均質な退色の結果、いくつかの領域が他の領域よりも僅かにしか照射されない、つまり僅かにしか退色されないことになる。他よりも僅かにしか退色されないかかる領域は、標本の最終イメージにおいて目立ってしまう／認識されてしまうか、または退色のために付加的な照射を必要とし、そのために時間を浪費し、かつ／またはすでに退色された標本領域の損傷を引き起こしかねない。第１の実施形態によれば、消光ユニットの光を散乱させるためのディフューザ手段が、消光ユニットに設けられている。光を散乱させることによって、不均質な退色を引き起こしかねない表面領域ごとの何らかの不均質な放射分布が排除される。ディフューザ材料として、すりガラス、テフロン、ホログラフィー製品、乳白ガラス、または灰色化ガラスを用いることができる。
【００３０】
放射および／または放射強度を均質化するための別の実施形態によれば、消光ユニットまたは標本ホルダまたは可動ステージ１０に振動手段を設けることができ、作業平面の１つまたは２つの次元において、たとえば最大で±１ｍｍの範囲内の僅かな前進後退運動が発生する状態にさせる。
【００３１】
消光ユニットが、標本サイズよりも小さい領域を照射する光源を有するケースではさらに、消光ユニットおよび／または可動ステージ１０を、ｘ−ｙ作業平面において標本ホルダの領域内または標本の表面領域内で移動させることができる。好ましくは、消光ユニットおよび／または可動ステージ１０は、線、円または格子状の態様で、ｘ−ｙ作業平面において標本領域内で動かされる。この動きは、好ましくはマイクロプロセッサの制御のもとで行われる。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態によれば、消光ユニットおよび／または光源に光学フィルタが設けられており、このフィルタは、消光には適さずしかも標本において熱を引き起こす波長を有する何らかの放射から標本を保護する。好ましくは光学フィルタは、４００ｎｍよりも短い、および／または９００ｎｍよりも長い波長を有する実質的にすべての波長を、消光のために使用される光から取り除く。この実施形態が有する利点は、蛍光染料の消光（除去）に必要とされる放射だけに標本が晒される一方、さもなければ不所望に標本温度を上昇させかねないＩＲ放射も同時に取り除かれる、ということである。
【００３３】
本発明のさらに別の変形実施形態によれば、消光ユニットは、たとえば酸化退色などにより蛍光染料を除去する化学薬品を供給する。退色に必要な化学薬品は、「マルチエピトープ・リガンド・カルトグラフィ」（"Multi Epitope Ligand Cartography"）、「チップベースのサイトメトリ」（"Chip-based Cytometry"）または「マルチオミックス」（"Multioymx"）の技術に関する上述の刊行物から知られている。
【００３４】
ディスポーザブル標本ホルダ
本発明による自動化されたシステムのコンテナは、各々が別個の生体標本を含む複数の液体ウェルを有することができる。好ましくは、このコンテナはタイタプレートである。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「タイタプレート」、「マルチウェルタイタプレート」および「マイクロタイタプレート」は入れ替え可能に使用され、どちらも以下の構造のことを意味すると理解されたい。すなわちこの構造は、複数の小さいウェルまたは凹部を含み、それら各々を、他のウェルまたは凹部とは別個に液体または試料を保持するために用いることができる。どちらも特に、ANSI SBS 1 -2004に準拠するデバイスのことを指す。
【００３６】
図２は、生体試料のための自動化された分析ツール１を、開口部２０および２２内に設置されたディスポーザブル標本ホルダ９０および９２と共に示す平面図である。既述のように以下の説明において、マイクロタイタプレート９０は試薬を含むことができ、マイクロタイタプレート９２は標本を含むことができる。ディスポーザブル標本ホルダ９０および９２を、既知の寸法のリジッドなプラスチック構造とすることができ、その中に複数の液体ウェルを形成することができる。実際には、ディスポーザブル品９０および９２を双方共に、標準フォームファクタを有するマルチウェルタイタプレートとすることができ、たとえばそこには９６個の小さい液体ウェルが形成されている。
【００３７】
別の選択肢として、ディスポーザブル品９０および９２をスライドガラスとすることができ、その上に生体試料が固定化される。別の実施形態によれば、ディスポーザブル品９０および９２は、プラスチックなどのような透明な支持部材上で異なる別個の領域に、機能化表面を含むことができる。この支持部材をスライドガラスとしてもよいし、または生体試料を保持可能な他の任意の透明な表面としてもよく、これを蛍光イメージングシステム３０および／または蛍光消光システム４０によってイメージングすることができる。ディスポーザブル品はさらに、透明部分と不透明部分とを有することができ、この場合、透明部分に生体標本が配置され、不透明部分は光を反射するかまたは吸収する。したがって生体標本を透明部分に配置することができ、不透明部分は蛍光シグナルを反射するかまたは吸収する。
【００３８】
ディスポーザブル品９０および９２の材料を、光の吸収を低減するように選定またはコーティングすることができる。不透明なまたは光学的に吸収性の材料を選定することができ、あるいはたとえば金属またはＴｉＯ２のＣＶＤ（化学気相成長）を用いて、反射性フィルムを透明材料にコーティングすることができる（吸収というよりも反射）。
【００３９】
自動化されたシステム
本発明によるシステムは、蛍光シグナルを測定する蛍光システムと、蛍光システムの上方で少なくとも１つの生体標本を含むディスポーザブル品を保持する開口部と、生体標本からの蛍光シグナルを消光するためにクエンチング光を供給する消光システムと、コンテナに液体を供給可能および／またはコンテナから液体を除去可能な液体処理システムと、開口部、蛍光システム、消光ユニットおよび液体処理システムのうちの少なくとも１つを、１つの作業平面を規定する少なくとも２つの直交する次元で移動させるメカニズムと、さらに蛍光染料の励起、蛍光シグナルの検出および収集ならびに蛍光シグナルの消光を含む１つのルーチンを、自動化された手法で実行する制御ユニットと、を含むことができる。
【００４０】
あとで開示するように制御ユニットは、蛍光染料で染色された生体標本のイメージとして蛍光シグナルを収集する。
【００４１】
液体処理システムを、液体レセプタクル間で液体を搬送可能なシステムとすることができる。液体処理システムは、液体を少なくとも１つのコンテナから取り出して別のコンテナに挿入できるように、複数の試薬を保持する複数の液体容器と、空気圧源または真空源とを含むことができる。
【００４２】
液体処理システムは、蛍光染料、蛍光シグナルを消光する配合物、洗浄液および緩衝剤のうちの少なくとも１つを、生体標本へ供給することができる。好ましくは液体処理システムは、ステージ上に配置されたロボットの制御型ピペットシステムを有しており、この場合、ピペットシステムは、作業平面に対し直交するｚ軸に沿って移動可能である。
【００４３】
ただしここで理解されたいのは、本発明の実施形態は、標本を光学システム３０および４０に対し相対的に移動させることができるシステムも含むことができるし、同様に光学システム３０および４０を標本に対し相対的に移動させることができる態様も含むことができる、ということである。説明をわかりやすくするため、可動ステージ１０上でイメージングシステム３０および消光システム４０に対し相対的に標本が動かされるようにした、図１〜図９に示した実施形態に関して本発明を説明する。たとえば、光学システムが生体標本に対し相対的に動かされるようにした、択一的な実施形態も考えられる、ということを理解されたい。したがってこの装置は、生体標本をイメージングするために少なくとも２つの直交する次元で、この装置と蛍光システムの少なくとも一方を移動させるためのメカニズムを含むことができる。
【００４４】
図１は、生体試料のための自動化された分析ツール１の１つの実施形態を示す平面図である。このツールには可動ステージ１０が含まれており、その中に２つの開口部２０および２２が形成されている。可動ステージ１０を、アルミニウムなど軽量で加工しやすい任意のリジッドな材料によって形成することができる。図１には示されていないが、たとえばステッピングモータなどのような複数のモータが設けられており、これらのモータは、図示された２つの直交する方向において、可動ステージ１０のポジショニングを調節する。図１ではＸ方向およびＹ方向が付されたこれら２つの直交する方向によって、自動化された分析ツール１のための可動のｘ−ｙ平面が規定される。本明細書では、この平面を作業平面と称する。可動ステージ１０を、マイクロプロセッサ、制御ユニットまたはコンピュータ１１０の制御のもと、ｘ−ｙ作業平面内で移動させることができる。コンピュータまたは制御ユニット１１０は、要求される速度および精度に応じて、ｘ方向またはｙ方向において±約１〜２００μｍの精度を伴って、開口部２０または２２を作業平面内で移動させることができる。
【００４５】
図１には、生体試料、緩衝剤のために、さらには可動ステージ１０の材料自体のためにも、冷蔵機能を提供する冷蔵ユニット５０も示されている。したがってこのシステムはさらに、生体標本を含め作業平面を冷却する冷却ユニットを有することができる。さらに図１には、隔離ボックスまたはテントのようなチルドエンクロージャ６０も示されており、これを２つの開口部２０および２２の上に、さらには冷蔵ユニット５０の上にも、配置することができる。チルドエンクロージャを、透明なマイラーなどのように、最小限に孔の開いたフレキシブルな任意の材料のテントとして形成することができる。このエンクロージャを開口部２０および２２の上に配置することができ、あとで述べるように、これによって生体標本周囲の環境において冷蔵状態が維持される。したがって自動化されたシステムはさらに、温度制御ユニットを有することができ、このユニットによって、生体標本の温度が約１０〜４０℃の間の設定値になるように制御される。
【００４６】
開口部２０，２２のすぐ真下に、２つの光学システム３０および４０を設けることができる。これら２つの光学システムをそれぞれ、蛍光イメージングシステム３０および蛍光退色システム４０とすることができる。これら２つの光学システムすなわち蛍光イメージングシステム３０および蛍光退色システム４０の詳細については、あとでさらに説明する。光学システム３０および４０は、一般に開口部２０または２２の少なくとも一方の真下に配置されている。説明の都合上、図１ではこれらの開口部は空の状態であるが、以下で述べるように、分析ツールが動作中のとき、開口部２０および２２は、（２２内に）生体試料の標本を、（２０内に）試薬の集合を保持することができ、またはその逆とすることができる。図１には示されていないが、光学イメージングシステム３０または蛍光退色システム４０のために、付加的な構造が必要とされる。これらの付加的な構造は、付加的なレンズ、ミラー、検出器、ソース、および他の光学素子を含むことができる。これらの付加的な構造については、さらにあとで説明する。
【００４７】
なお、蛍光イメージングシステム３０を、蛍光退色システム４０のすぐ隣りに配置することができる、という点に留意されたい。
【００４８】
図１には示されていないが、可動ステージ１０をｘ−ｙ平面において反復可能に正確に移動させるようにするために、ステッピングモータ、ギア、ベアリングおよび他の機械部品が用いられる。かかる部品は容易に入手可能であり、適切な寸法およびその他の機械的特性は、適用事例の詳細に依存することになる。やはり図示されていないが、スプリング、ダッシュポットおよびゴムバンパなど、様々なダンピングメカニズムが設けられている。かかる部品を用いて、自動化された分析ツール１を衝撃や振動など周囲を取り巻くファクタから隔離することができる。
【００４９】
ディスポーザブル品９０または９２の単一のウェルの正確なポジショニングを他の部品に対し相対的に調節するために、可動ステージ１０を移動することができる。たとえばディスポーザブル品９２を、標本操作中、蛍光イメージングシステム３０および／または蛍光消光システム４０のすぐ上に配置することができる。さらに別の時点において試薬の取り出し中に、ディスポーザブル品９０を、ピペット７０として示された液体処理システムのすぐ下に配置することができ、これについては図３を参照しながらあとで説明する。標本操作中、特定の標本ウェルを光学装置の上に、つまり蛍光イメージングシステム３０の上かまたは蛍光消光システム４０の上に配置するために、可動ステージを移動させることができる。実際には、マルチウェルタイタプレート９０または９２内の任意のウェルの内容の顕微鏡イメージを、正確にイメージングすることができるように、ディスポーザブル品９２をポジショニングすることができる。
【００５０】
図１と同じように冷蔵ユニット５０が、マルチウェルタイタプレート９０および９２を、さらにそれらの中に保持された液体も、冷却することができる。テント６０のように実質的に孔の開いていないエンクロージャによって、周囲環境への空気の移動を制限することができ、これはマルチウェルタイタプレート９０または９２内の生体試料を低温で維持するのに役立つ。
【００５１】
図３は、可動ステージ１０と、マルチウェルタイタプレート９０のすぐ上に保持された操作可能なピペット７０と、を示す側面図である。ピペット７０を、ポジションコントローラであるピペットステージ８０によって保持し制御することができ、マイクロプロセッサまたはコンピュータの指示のもとで移動させることができる。ピペットステージ８０は、マイクロタイタプレート９０内の複数のタイタウェルのうちのいずれかへ向かって、Ｚ方向でピペット７０を移動させることができる。複数のウェル各々は、それぞれ異なる配合物を含むことができ、試薬、検出部分を含む抗原認識部分、蛍光染料を含む抗体、抗生物質、生体栄養素、毒素、染料および酸化剤のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００５２】
したがってピペット７０を、ステージ上に配置されたロボット制御型のピペットシステムとすることができ、この場合、ピペットシステムは、作業平面に対し直交するｚ軸に沿って移動可能であり、生体標本に種々の配合物を適用するように構成されている。
【００５３】
本発明のさらに別の実施形態によればこの処理システムは、ピペットシステムの外側を洗浄し、付着した液体を除去する手段を有している。洗浄システムは、標本間の相互汚染を防止するため、ピペット（７０）に付着したすべての物質を除去しようというものであり、この目的で、液体または標本に接触した、かつ／または標本コンテナに挿入されたピペットの少なくとも一部分を洗浄するのが望ましい。この実施形態の第１の変形実施形態によれば、ピペット７０の外側表面を洗浄して付着した液体を除去することを、洗浄ポッドまたは洗浄液によって達成することができる。この目的でピペットステージ８０に、ピペット７０から物質を除去する少なくとも１つの洗浄ポッドを設けることができる。洗浄ポッドを、綿またはティッシュペーパーのように、液体を吸い取るのに適した任意の材料によって形成することができる。
【００５４】
この実施形態の第２の変形実施形態によれば、ピペット７０の洗浄は、洗浄液を用いてピペット７０の外側表面を洗浄することによって達成される。本発明のこの実施形態によれば、ピペットステージ８０に、ピペット７０のためのスリーブまたはガイド部材が設けられており、供給される洗浄液によってピペット７０を洗い流すことができ、この洗浄液は、スリーブの少なくとも１つのオリフィスを通して排出される。スリーブまたはガイド部材を通してピペット７０を案内することによって、ピペット７０は洗浄液の貯蔵器を通って、または洗浄液の蒸気中を通って動かされ、このようにすることによってピペット７０は、新しい汚染されていない洗浄液のみと接触することが保証される。スリーブが設けられたかかるピペットステージは、たとえば欧州特許出願第２９４４３７３号明細書（EP 2944373A1）に開示されている。
【００５５】
可動ステージ１０はＸ方向およびＹ方向に移動可能であるので、マルチウェルタイタプレート９０の任意の容器内に保持された任意の試薬を取り出す目的で、ピペット７０のためにはＺ方向の動きだけが必要とされる。特定の試薬の取り出しに応答して、マルチウェルタイタプレート９０内の所望のまたは適切なウェルが、ピペット７０の直下にポジショニングされるように、可動ステージ１０がずらされてポジショニングされる。次いでピペット７０が、マルチウェルタイタプレート９０の特定のウェル内に下げられ、マルチウェルタイタプレート９０の適切なウェル内に試薬が沈積される。
【００５６】
したがって特定の試料を特定の試薬によって染色する目的で、マルチウェルタイタプレート９０内の特定のウェルをピペット７０の真下にポジショニングするために、可動ステージ１０を移動させることができる。次いでコントローラ８０はピペット７０を、マルチウェルタイタプレート９０の指定されたウェル内に保持された液体試薬中に下げる。マイクロタイタプレート９０のウェル内に保持された特定の量の液体を抜き取る目的で、ピペットステージ８０は、ピペット７０のヘッドに適用すべき吸引力を生じさせることができる。その後、ピペット７０がウェルから引き抜かれる。
【００５７】
次いでマイクロプロセッサ１１０は、マルチウェルタイタプレート９２における特定のウェル内に含まれている所望のまたは適切な試料が、ピペット７０の真下に位置するポジションに、可動ステージ１０をずらすことができる。その後、コントローラ８０によって、ピペット７０がそのウェル内に下げられる。ピペット７０の内容を、生体試料を保持するマイクロタイタプレート９２の指定されたウェルに放出するために、ピペット７０のヘッドに圧力が適用される。次いで、いまや染色された試料を培養することができる。培養後、染色された生体試料を、以下のようにしてイメージングすることができる。
【００５８】
図４は、蛍光イメージングシステム３０を概念的に示す図である。蛍光イメージングシステム３０は、１つの波長帯域で放射を発生するＬＥＤ光源などのような光源３２を含むことができる。この放射をダイクロイックミラー３８に当射させることができ、ミラー３８は放射を対物レンズ３４に向けて反射する。対物レンズ３４は、光を成形、集束またはコリメートすることができる。その後、放射は、マイクロタイタプレート９２の特定のウェルに当射する。マルチウェルタイタプレート９２のウェルは、緩衝液１５０と生体試料１４０とを含むことができる。生体試料１４０の特性によっては、それがマルチウェルタイタプレート９２の底部に付着する可能性があり、または緩衝液１５０中に浮遊または懸濁する可能性がある。
【００５９】
生体試料１４０がたとえば細胞であれば、この細胞が染料または試薬と結合した状態にある可能性がある。染料または試薬を、抗体と共役された蛍光体とすることができる。抗体は、細胞膜上にある表面マーカまたは抗原と結合することができ、蛍光体は、適切な波長の光による照射に反応して、蛍光光子を放出することができる。したがって光源３２は、蛍光体励起のためにこの波長の光を放出することができ、これにより蛍光体は蛍光光子を放出することができる。ダイクロイックミラー３８は、光源からの放射を標識された生体試料１４０に向けて反射することができるが、図４に示されているようにダイクロイックミラー３８は、蛍光光子を検出器３６に向けて透過させることができる。
【００６０】
したがってダイクロイックミラー３８を、レーザまたは光源３２の波長の光を反射するが、生体標本１４０から放出された蛍光波長の放射を透過するように、構成することができる。光学検出器３６を、ＣＣＤカメラまたはマイクロチャネルプレートなどのように、ピクセルで構成された任意のディジタル検出器とすることができる。生体試料１４０における適切なスポットを検出器３６上に集束させるように、対物レンズ３４をｚ軸において移動可能または調整可能なものとすることができる。制御ユニットｘｘは、蛍光染料で染色された生体標本のイメージとして、蛍光シグナルを収集することができる。
【００６１】
図５は、蛍光消光システム４０を概念的に示す図である。蛍光消光システム４０には光源４２を含めることができ、この光源４２は対物レンズ４４によって、生体試料１４０上に集束される。既述のように生体試料を、マルチウェルタイタプレート９２におけるウェル内の緩衝液１５０中に沈積させることができる。
【００６２】
光源４２をＬＥＤまたはレーザとすることができるが、いずれのケースであれ、蛍光部分または生体試料１４０に付された標識の吸収帯域にオーバラップするように、放出される放射の波長が選定される。この放射の適用に反応して、標識が付された生体試料１４０は、放射により分解、分離または破壊される蛍光標識を有することができる。したがって消光システム４０は、光の照射により試薬の蛍光を破壊する光学消光システムを有することができ、さらにＬＥＤ光源および対物レンズを有する。
【００６３】
いずれにせよ、生体標本１４０に付された蛍光標識は、蛍光を全体的にまたは部分的に終わらせることができる。その結果、マルチウェルタイタプレート９２内の生体標本１４０から放出される蛍光は、減衰するようになる。このようにして低減された蛍光を、別の光学検出器４６によって検出することができ、この検出器の出力端はコンピュータ４８に接続されている。
【００６４】
コンピュータ４８は、放射源４２の振幅を制御する信号を発生することができる。光学検出器４６は、光学検出器３６と同じタイプのものであってもよいし、または異なるものであってもよい。したがって光学検出器４６を、ＣＣＤカメラまたはマイクロチャネルプレートなどのように、ピクセルで構成された任意のディジタル検出器とすることができる。
【００６５】
したがって消光システムは、光の照射による試薬の蛍光シグナルの減衰を消光データとして監視する蛍光検出器を含むことができる。制御ユニットは、消光データに基づきフィードバックループによって、消光システムを制御することができる。よって、制御ユニットは、予め定められた蛍光閾値に達するまで、消光放射を適用し続けるよう、消光システムを指示することができる。
【００６６】
生体試料１４０から連続的な蛍光が検出器４６により測定されて、検出されると、コンピュータ４８は、生体試料１４０に適用される放射量を増大または継続させるために、光源４２に適用される電流を増大または継続させるようにする。蛍光放射のすべてが、生体試料１４０からの放出を終わらせたときのみ、または予め規定された何らかの閾値を下回ったときのみ、コンピュータ４８は、光源４２への駆動信号を中止することができる。たとえば、蛍光の除去を最大放出波長のところで測定することができるけれども、放出スペクトルの積分を計算するのも適している。本発明のこの変形実施形態によれば、制御ユニットおよび／または消光ユニットは、蛍光放出が消光により予め規定された閾値を下回るように除去されない場合には、消光プロセスが繰り返される、というように構成されている。たとえば蛍光放出の消光は、当初の蛍光放出の５％よりも小さくなるまで、好ましくは１％よりも小さくなるまで、蛍光放出が低減されたときに、達成されたとみなされる。したがって一部の実施形態によれば、蛍光消光システム４０は、コンピュータ制御型フィードバックメカニズムを有することができ、このメカニズムは、生体標本１４０を照射する消光プロセスをいつ中止することができるのかを決定する。
【００６７】
蛍光消光システム４０内のその他の要素を、マイクロタイタプレート９２の上方に配置することのできる反射器４９とすることができる。反射器４９は、光源４２から放出された消光放射を、生体試料１４０を通して戻すように反射する。放射経路が付加的な時間を有するようにすれば、蛍光シグナルの消光をいっそう効果的または効率的なものとすることができる。よって、消光システムはさらに、少なくとも１つのミラーを有することができ、このミラーは、生体標本または蛍光染料によっても吸収されない消光放射の一部を反射して、生体標本に戻す。
【００６８】
既述のように本明細書で述べる実施例によれば、生体試料１４０の特定のスポットまたは特徴部分を、蛍光イメージングシステム３０のイメージング領域内にポジショニングするために、ステージ１０がｘ−ｙ作業平面内で動かされる。その後、同じようにして、可動ステージ１０をｘ−ｙ作業平面内で移動させることにより、スポットまたは特徴部分が蛍光消光システム４０の上方にポジショニングされる。ただしここで理解されたいのは、これは具体例にすぎず、別の選択肢として光学システム３０および４０を、生体試料１４０に対し相対的に移動させてもよい、ということである。換言すれば、蛍光イメージングシステム３０および蛍光消光システム４０に対してｘ−ｙ作業平面をポジショニングするのではなく、生体試料１４０に対して蛍光イメージングシステム３０および蛍光消光システム４０をポジショニングしてもよい。
【００６９】
図６は、蛍光消光システム５０の別の実施形態を概念的に示す図である。蛍光消光システム４０とは異なり、蛍光消光システム５０の場合には光源４２を、レーザ５２などのようなコヒーレントな光源とすることができる。レーザ５２は、特定の波長または狭帯域の波長で光を放出することができる。図５を参照しながらすでに説明したように、放射をダイクロイックミラー５８から対物レンズ５４を通して生体試料１４０へ向けて反射させることができる。次いでこの放射を、マルチウェルタイタプレート９２の上方に配置された付加的な反射器５９によって反射させることができる。その後、この光学反射器５９は、生体試料１４０を通過し第２の経路を辿って戻るように、レーザ放射を反射することができる。光学反射器４９を用いた場合のように、これによって蛍光シグナルの光学的な消光の効果を高めることができる。ただし図６のレーザの実施形態の場合には、ミラー５９とダイクロイックミラー５８とによって、共振キャビティを形成することができ、レーザ光源５２により放出されたレーザ放射を増幅することができる。既述のように共振キャビティによって、実質的に標本スポット上の標本に対し複数の放射経路が提供されることによって、放射源４２の効果を強めることができる。
【００７０】
図７は、光学消光システム６０の別の実施形態を概念的に示す側面図である。この光学消光システム６０の場合もやはり、放射源６２が対物レンズ６４を介してマルチウェルタイタプレート９０に向かって集束される。光源６２を、発光ダイオード（図４の場合のようにＬＥＤ３２）またはレーザ（図５の場合のようにレーザ光源４２）とすることができる。マルチウェルタイタプレート９２に入射すると、放射はマルチウェルタイタプレート９２の透明なガラスの底面支持部材１７０を通過する経路を辿ることができる。この透明な底面１７０は、生体試料１４０を支持することができる。生体試料１４０を、マルチウェルタイタプレート９２の特定のウェルの底部に、ただし緩衝液１５０などのような液体中に、沈めることができる。マルチウェルタイタプレート９２の特定のウェルの頂部に、カバーガラス１６０を設けることができる。このカバーガラス１６０を、液体およびマイクロタイタウェル９２の頂部に載置することができる。カバーガラス１６０を使用することによって、マルチウェルタイタプレート９２の特定のウェル内において液柱頂部に液体メニスカスが形成されるのを避けることができる。空気と液体との界面に形成されたメニスカスはドーム形状を有する可能性があり、これによってそこを通る光のダイレクトな伝達が妨げられるおそれがあり、ひいては生体試料１４０のイメージングが妨害されるおそれがある。
【００７１】
少なくとも１つの生体標本を蛍光染料と共に含むコンテナを、透明または半透明のカバープレートでカバーすることができる。透明または半透明のカバープレートをたとえば、透明なカバーガラスとすることができ、または蛍光シグナルに対しては透過性であるが消光放射に対しては反射性のコーティングが設けられたカバーガラスとすることができる。図７に示されているように、光源６２からの放射は、対物レンズ６４を通過し、緩衝液１５０中に沈められた生体試料１４０に向かう経路を辿ることができ、その際にこの放射は、２つの透明な表面１７０を通過し、試料を通過し、さらに光学カバーガラス１６０を通過して進むことができる。この時点で、放射は光学反射器６９に当射することができる。光学反射器６９を、マイクロタイタウェル９２の上方に配置することができ、かつ到来する放射に対し反射がそのまま逆平行にはならず、ただしその代わりに角度オフセットを有するようにして、第２の光学反射器６９’に当射するまで反射がいくらかの距離だけ横方向に進むように、配向することができる。この放射はさらにもう一度、光学反射器６９’から光学反射器６９へ戻るように反射させられる。この経路を辿るたびに、放射はやはりいくらかの距離だけ横方向に進む。このようにして、横方向の遮蔽物に遭遇する前に、あるいは放射が消滅させられるかまたは吸収される前に、試料を通過する複数の放射経路が達成される。上述のように二重の経路が得られることで、生体試料１４０に付された蛍光標識に対する消光動作の効果を、これらの複数の経路によって強めることができ、蛍光の完全な消光を達成することができる。
【００７２】
図８は、光学消光システム７０の別の実施形態を概念的に示す側面図である。光学消光システム６０の場合のように、放射源７２が対物レンズ７４を介して、マルチウェルタイタプレートまたはスライドガラスとすることのできるディスポーザブル品９２に向かって集束される。光源７２を、発光ダイオード（図４の場合のようにＬＥＤ３２）またはレーザ（図５の場合のようにレーザ光源４２）とすることができる。ディスポーザブル品９２に入射すると、この放射は、ディスポーザブル品９２の透明なガラスの底面支持部材１７０を通過する経路を辿ることができる。この透明な底面１７０は、生体試料１４０を支持することができる。生体試料１４０を、ディスポーザブル品９２の特定のウェルの底部において、ただし緩衝液１５０などのような液体中に、沈めることができる。図７の場合のように、ディスポーザブル品９２の特定のウェルの頂部に、カバーグラス１６０を設けることができる。このカバーガラス１６０を、液体およびディスポーザブル品９２の頂部に載置することができる。
【００７３】
既述の実施形態のように、光源７２からの放射は、対物レンズ７４を通過し、緩衝液１５０中に沈められた生体試料１４０に向かう経路を辿ることができる。よって、この放射は、２つの透明な表面１７０を通過し、試料を通過し、さらに光学カバーガラス１６０を通過して進むことができる。この時点で、放射は光学反射器６９に当射することができる。光学反射器６９を、マイクロタイタウェル９２の上方に配置することができ、表面１６０および１７０に対し角度を成すようにすることができる。このようにして、光源７２からの光を、いくからの距離をおいて横方向に反射させて、別の反射器６９に当射させることができる。この反射器は、逆の動作をするように配置されており、水平方向に進む放射が垂直方向に反射させられ、したがって透明な表面１６０および１７０を通過し、第２の経路を辿って、生体試料１４０を通過して戻されるようになる。第２の経路を辿った後、放射は２つの光学反射器６９’により反射させられ、これらの反射器６９’を、光学反射器６９と同じものとすることができるが、それよりも下方で光学反射器６９と横方向で隣り合うように、配置することができる。放射はもう一度、横向きに反射させられ、生体試料１４０を通過して戻される。この経路を辿るたびに、放射はやはりいくらかの距離だけ横方向に進む。このようにして、横方向の遮蔽物に遭遇する前に、あるいは放射が消滅させられるかまたは吸収される前に、試料を通過する複数の放射経路が達成される。上述のように二重の経路が得られることで、生体試料１４０に付された蛍光標識に対する消光動作の効果を、これらの複数の経路によって強めることができ、蛍光の完全な消光を達成することができる。したがって既述のように、ヘリオット型またはホワイト型の複数の反射セルまたは共振器などのように、試料を通過するクエンチング光の多数の経路を生成するシステムを形成するために、複数のミラーを用いることができる。
【００７４】
図８には４つの反射器（６９および６９’）が示されているけれども、本明細書で説明するコンセプトを任意の個数の反射器および経路に拡張することができる。
【００７５】
図９は、光学消光システム８０のさらに別の実施形態を概念的に示す側面図である。光学消光システム６０および７０のように、放射源８２が対物レンズ８４を介してマルチウェルタイタプレート９２に向かって集束される。光源８２を、発光ダイオード（図４の場合のようにＬＥＤ３２）またはレーザ（図５の場合のようにレーザ光源４２）とすることができる。マルチウェルタイタプレート９２に入射すると、この放射は、マルチウェルタイタプレート９２の透明なガラスの底面支持部材１７０を通過する経路を辿ることができる。この透明な底面１７０は、生体試料１４０を支持することができる。生体試料１４０を、マルチウェルタイタプレート９２の特定のウェルの底部に、ただし緩衝液１５０などのような液体中に、沈めることができる。マルチウェルタイタプレート９０の特定のウェルの頂部に、カバーガラス１６０を設けることができる。このカバーガラス１６０を、液体およびマイクロタイタウェル９２の頂部に載置することができる。
【００７６】
既述の実施形態のように、光源８２からの放射は、対物レンズ８４を通過し、さらに部分的に透過性の表面６９を通過して、緩衝液１５０中に沈められた生体試料１４０に向かう経路を辿ることができる。既述のようにこの放射はその後、透明な表面１７０を通過し、試料を通過し、さらに光学カバーガラス１６０を通過して進むことができる。この時点で放射は、部分的に透過性の第２の光学反射器６９’’に当射することができる。光学反射器６９’’を、マイクロタイタウェル９２の上方で、放射経路に直交しかつ光学反射器６９に平行に、配置することができる。光学反射器６９および６９’’の双方は、部分的に反射性かつ部分的に透過性であるので、これらの反射器は、レーザ８２などのようなコヒーレントな放射源と共に使用すれば、光学共振器を成すことができる。したがって、反射器６９に対する反射器６９’’の配置を微調整すれば、共振器内部の放射循環量に、ひいては蛍光消光システム８０の消光効果に、劇的な作用を及ぼすことができる。このようにして、光子が最後の反射器６９を通過して共振器から出る前に、あるいは光子が消滅させられるかまたは吸収される前に、試料を通過する複数の放射経路が達成される。上述のように二重の経路が得られることで、生体試料１４０に付された蛍光標識に対する消光動作の効果を、これらの複数の経路によって強めることができ、蛍光の完全な消光を達成することができる。
【００７７】
したがって光学消光システムはさらに、レーザ光源と、このレーザ光源の共振キャビティを規定する、ディスポーザブル品の上方と下方の２つのミラーと、を有することができる。
【００７８】
なお、これらの実施形態のあらゆるすべてのものを、図５に示した実施形態について説明した蛍光検出器およびコンピュータと結合することもできる、ということを理解されたい。よって、光源４２，５２，６２，７２および８２を、蛍光シグナルの完全な消光が達成されるまで、フィードバック制御のもとにおくことができる。
【００７９】
本発明による方法
これまで、例示的な蛍光イメージングシステム３０および例示的な蛍光消光システム４０の構成要素について説明してきたが、次にこの装置を用いる方法について説明する。なお、この方法によって、既述の実施形態における構成要素のあらゆるすべてのものを使用できる、ということを理解されたい。以下では、この方法全般について概略的に説明し、続いて図１０に示した固有のアルゴリズムについて述べる。
【００８０】
本発明によるシステムによって、蛍光試薬により認識された生体試料における抗原などのような標的部分の検出、位置特定およびイメージングが可能となる。本発明のシステムによれば、細胞を固定化することができ、次いで蛍光試薬と接触させることができる。生体試料（たとえば細胞表面）における個々の抗原によって抗体が認識され、結合されていない蛍光試薬が除去され、蛍光部分が励起された後、蛍光試薬の蛍光放出によって、抗原の位置が検出される。
【００８１】
蛍光放射の波長に対し十分な分解能と感度とを備えたディジタルイメージングデバイスによって、標的部分の位置特定が達成される。このディジタルイメージングデバイスを、たとえば蛍光顕微鏡などによる光学的拡大を伴って、または伴わずに、使用することができる。結果として得られたイメージが、ハードディスクドライブなどのような適切な記憶デバイスに、ＲＡＷ，ＴＩＦ，ＪＰＥＧまたはＨＤＦ５のフォーマットで格納される。
【００８２】
種々の抗原を検出する目的で、同じまたは異なる蛍光部分を有する種々の抗原認識部分を含む種々の蛍光試薬が供給される。それぞれ異なる波長を有する蛍光放出のパラレルな検出は制限を受けるので、蛍光試薬は順番に個々にまたは小グループ（２〜１０）で相前後して使用される。この変形実施形態の場合には、適切な個数の検出器を使用することができる。好ましくは、フィルタにより１つの蛍光放出を除きすべてをマスクすることによって、様々な蛍光試薬の蛍光放出を順次検出するために、ただ１つの検出器が用いられる。
【００８３】
本発明の１つの変形実施形態によれば、標本の生体試料が、特に細胞懸濁液が、マイクロキャビティにおけるトラップにより、または粘着により、固定化される。
【００８４】
一般に本発明による方法を、複数のバリエーションで実施することができる。たとえば、標的部分によっても認識されない共役体を、蛍光試薬により標識された標的部分が検出される前に、たとえば緩衝剤による洗浄によって除去することができる。
【００８５】
本発明の１つの変形実施形態によれば、少なくとも２つの蛍光試薬が、同時にまたは相次ぐ染色シーケンスで供給され、この場合、抗原認識部分各々がそれぞれ異なる抗原を認識する。
【００８６】
プロセス時間を最適化する目的で、蛍光放出の除去を監視することができる。本発明によれば、当初の蛍光放出の５％よりも小さくなるまで、好ましくは１％よりも小さくなるまで、蛍光放出が低減されたときに、蛍光放出の除去が達成される。便宜上、蛍光の除去を最大放出波長のところで測定することができるけれども、放出スペクトルの積分を計算するのも適している。同時に２つ以上の蛍光試薬を供給するこの変形実施形態によれば、蛍光放出の低減は、測定される蛍光放出各々に基づく。
【００８７】
本発明によるシステムおよび方法は、２つの光学システムすなわち蛍光イメージングシステム３０と光学消光システム４０とを含むこともできる。これら２つのシステムを、横方向で互いに隣り合うように、一般的には、標本を含むマイクロタイタプレート９２の複数のウェルのうち１つのウェルの真下に、配置することができる。換言すれば、消光ユニットの光源を、横方向で蛍光システムと隣り合うように配置することができる。別の選択肢として、消光ユニットを作業平面の上方に配置することができる。マイクロタイタプレート９０および９２を、可動ステージ１０の開口部内に配置することができ、可動ステージ１０は、液体処理システム７０に対し相対的に、または光学システム３０および４０に対し相対的に、ウェルを移動させる。
【００８８】
一般に、マイクロタイタプレート９２内に保持された複数の生体標本は、マイクロタイタプレート９０内に保持された複数の試薬のうちの１つによって染色される。マイクロタイタプレート９０の適切な液体ウェルをピペット７０の下にポジショニングすることにより、ピペット７０に吸引力を適用することで試薬を取り出すことができる。次いで、適切なウェルがピペット７０の下になるまで、ｘ−ｙステージを横方向にずらすことによって、試薬が適切な生体標本に供給される。試薬が生体標本に供給される。
【００８９】
培養後、可動のｘ−ｙステージを移動させて、標本を蛍光イメージングシステム３０の視野に入れることによって、蛍光イメージングシステム３０により標本をイメージングすることができる。次いで、蛍光消光システム４０の照射領域内に生体標本が配置されるように、ｘ−ｙ作業平面が横方向にずらされる。その後、光学的な放射、酸化または酵素分解および後続の洗浄によって、蛍光が消光される。適切な消光後にオプションとして、補正／制御の目的で標本がイメージングされ、次いで他の試薬が標本に適用されて、プロセスが繰り返される。複数のステップから成るこのシーケンスを、少なくとも１つの生体標本に対して多数の試薬の適用が完了するまで、繰り返すことができる。
【００９０】
なお、緩衝剤の追加、洗浄、液体の追加または取り出し、冷却および加熱といった付加的なステップを、必要に応じて加えることができる、という点を理解されたい。
【００９１】
図１０は、図１〜９を参照しながらこれまで説明してきた生体試料分析の自動化された分析ツールを使用するための固有の方法を示す簡略フローチャートである。この方法は、ステップＳ１０で始まり、ステップＳ２０に続く。ステップＳ２０において、少なくとも１つの蛍光試薬により試料が染色されて培養される。この実施形態によれば、ＤＡＰＩが適用され、これに続いてＦＩＴＣおよびＰＥといった２つの蛍光試薬が適用される。培養中、生体試料が試薬を吸収することができる。ステップＳ３０において、試薬が洗浄される。このステップにおいて、ピペットにより付加的な緩衝剤をウェルに加えることができる。その後、余分な液体がピペットにより取り出される。次いでステップＳ４０において、試料が蛍光イメージングシステムの上にポジショニングされ、ＤＡＰＩイメージが取得される。このイメージによって、核、ミトコンドリア等のような試料中の顕著な構造を識別することができる。イメージングステップと消光ステップとの合間にディスポーザブル品を再配置した後、イメージングシステムが標本を正確に同じ位置にポジショニングできるようにする目的で、これらの顕著な構造を目印として用いることができる。
【００９２】
次いでステップＳ５０において、ＦＩＴＣ蛍光およびＰＥ蛍光をイメージングするように、蛍光イメージングシステムを設定することができる。これらの条件のもとで取得されたイメージは、ＦＩＴＣ蛍光体またはＰＥ蛍光体に共役された抗体と試料との結合を表すことができる。後続のステップＳ６０において、すべてのマーカのイメージングが完了したのか否かの質問が問い合わせられる。完了したのであれば、このプロセスはステップＳ７０において終了する。付加的なマーカが残っているのであれば、ステップＳ８０において、試料の蛍光が退色または消光される。この退色ステップを、ディスポーザブル品を機械的に横方向にずらし、標本が消光システムの上にポジショニングされるようにすることによって達成できる。
【００９３】
したがってこのルーチンは、種々の配合物の適用の合間に消光システムによって蛍光シグナルを消光すること、を含むことができる。以前に識別された特徴または目印をコンピュータ制御のもとで位置特定することによって、標本をポジショニングし直すことができる。それぞれ異なる配合物が繰り返し適用されるときに同じ特徴が表示されるように、コンピュータは作業平面を移動させることができ、それによって適用されたそれぞれ異なる配合物による生体標本の比較ビューおよび相互作用が呈示される。
【００９４】
次いで、ステップＳ４０において取得されたイメージに関連させて標本を再配置するために、ＤＡＰＩが再びイメージングされ、ＦＩＴＣおよびＰＥの蛍光イメージが再び取得される。蛍光が消光または消滅させられたならば、この方法はステップＳ２０に戻り、このステップにおいて新たな染色が適用され、標本が培養される。
【００９５】
本発明の１つの変形実施形態によれば、標本の再配置を、標本のＤＡＰＩ染色によってではなく、標本を含むコンテナに蛍光マーカの粒子／スポットまたはドットを供給することによって、達成することができる。この変形実施形態は、標本がマイクロキャビティ内に隔離された細胞である場合に、特に有用である。
【００９６】
図１０のフローチャートには、蛍光の消光が完全には完了していない場合のループも示されており、その場合にはループが反復される。この方法は、フィードバック制御される蛍光消光システム４０を用いた図４に示した実施形態に最も密接に対応している。ステップＳ１１０において蛍光が測定され、蛍光が閾値レベルを下回ったか否かが判定される。既述のように、蛍光の除去を最大放出波長のところで測定することができるけれども、放出スペクトルの積分を計算するのも適している。本発明のこの変形実施形態によれば、制御ユニットおよび／または消光ユニットは、蛍光放出が消光により予め規定された閾値を下回るように除去されない場合には、消光プロセスが繰り返される、というように構成されている。たとえば蛍光放出の消光は、当初の蛍光放出の５％よりも小さくなるまで、好ましくは１％よりも小さくなるまで、蛍光放出が低減されたときに、達成されたとみなされる。達成されたのであれば、プロセスはステップＳ２０に戻る。達成されないのであれば、ステップＳ８０において消光プロセスが繰り返される。
【００９７】
もっと一般的にいえばこの自動化された方法は、少なくとも１つの生体標本を蛍光染料と共にステージ上の開口部におけるコンテナ内に保持すること、蛍光システムによって、蛍光染料を励起し、蛍光染料から得られた蛍光シグナルをイメージングすること、開口部、ステージ、蛍光システムおよび消光ユニットのうちの少なくとも１つを、１つの作業平面を規定する少なくとも２つの直交する次元において、生体標本が消光ユニットと隣り合うまで移動させること、消光ユニットによって蛍光シグナルを消光すること、さらに消光後、生体標本をイメージングすること、を含むことができる。自動化されたこの方法はさらに、液体処理システムにより一連の液体を、生体標本を保持するコンテナに搬送すること、さらに蛍光染料の励起、蛍光シグナルの検出および収集ならびに蛍光シグナルの消光を含む１つのルーチンを、一連の液体を用いて自動化された手法で実行すること、を含むことができる。
【００９８】
上述の記載において概略的に述べた例示的な具現化態様を参照しながら、種々の詳細な点について説明してきたけれども、公知の事項であれ、あるいは現時点では予見できないまたは予見できないであろう事項であれ、既述の開示内容を参酌すれば、種々の代替案、修正、変更、改善、および／または実質的な等価物が明らかになるであろう。さらに特定の方法に関する詳細、寸法、材料の使用、形状、製造技術等は、例示を意図して挙げたにすぎず、本発明はかかる実施形態に特定されるものではない。なお、システムおよび方法を任意の配向で実施できることは自明であるから、頂部、底部、左、右、前、後といった語句は、任意の事項である。以上のとおり、上述の例示的な具現化態様は、例示を意図したものであって、特定ではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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