(57)【要約】  本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能をアンタゴナイズする抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を治療する方法も提供される。
2019525772.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、単離された抗体。
【請求項２】
前記抗体が、対象における食後脂肪血症を阻害することができる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
前記抗体が、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
前記抗体が、ＶＬＤＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
前記抗体が、脂肪へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
前記抗体が、脂肪結合ＡｐｏＣ３に結合することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号２［ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項９】
前記エピトープが、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
前記エピトープが、配列番号２の４および９位のアミノ酸を含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
前記エピトープが、配列番号２の４、６、および９位のアミノ酸を含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
前記エピトープが、配列番号２の１、４、６、および９位のアミノ酸を含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
前記エピトープが、配列番号２の１、４、６、７、９、および１０位のアミノ酸を含む、請求項８に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、ＶＬＤＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
前記抗体が、脂肪へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号３［ＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項１７】
前記エピトープが、配列番号３の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
前記エピトープが、配列番号３の５および６位のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
前記エピトープが、配列番号３の２、５、６、および８位のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項２０】
前記エピトープが、配列番号３の１０位のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
前記エピトープが、配列番号３の６、８、および１０位のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
前記エピトープが、配列番号３の６および８位のアミノ酸を含む、請求項１６に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
前記抗体が、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
前記抗体が、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
前記抗体が、対象における食後脂肪血症を阻害することができる、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
前記抗体が、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２８】
相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含む、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３がそれぞれ、配列番号４、５、６、７３、７４、および７５；７、８、９、７６、７７、および７８；１０、１１、１２、７９、８０、および８１；１３、１４、１５、８２、８３、および８４；１６、１７、１８、８５、８６、および８７；１９、２０、２１、８８、８３、および８９；２２、２３、２４、９０、９１、および９２；２５、２６、２７、８２、９３、および９４；２８、２９、３０、９５、９６、および９７；１６、３１、３２、９８、９９、および１００；３３、３４、３５、１０１、９９、および１０２；２５、３６、３７、１０３、１０４、および１０５；３８、３９、４０、８２、１０６、および１０７；４１、４２、４３、１０８、１０９、および１１０；７、８、９、１１１、８３、および１１３；４７、４８、４９、８２、１１４、および１１５；５０、５１、５２、１１６、１１７、および１１８；５３、５４、５５、１１９、１２０、および１２１；５６、５７、５８、１２２、１２３、および１２４；５９、６０、６１、１２５、８３、および１２６；６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９；６５、６６、６７、８２、１１４、および１３０；６８、６９、７０、１３１、１３２、および１３３；または６８、７１、７２、１２４、１３５、および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体。
【請求項２９】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１３７〜１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗体。
【請求項３０】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、配列番号１６１〜１８３および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体。
【請求項３１】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体。
【請求項３２】
ＡｐｏＣ３への結合について請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の抗体と競合する、単離された抗体。
【請求項３３】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の抗体と同じＡｐｏＣ３のエピトープに結合する、単離された抗体。
【請求項３４】
前記抗体が、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、請求項８〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３５】
前記抗体が、対象における食後脂肪血症を阻害することができる、請求項８〜３４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３６】
前記抗体が、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる、請求項８〜３５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３７】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる、請求項８〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
前記抗体が、ＶＬＤＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、請求項８〜３７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
前記抗体が、脂肪へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する、請求項８〜３８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４０】
前記抗体が、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる、請求項８〜３８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４４】
請求項４３に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４５】
ＡｐｏＣ３に結合する抗体を産生するための方法であって、前記方法が、前記抗体の発現を可能にする条件下で、請求項４４に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４６】
対象の血液中のＡｐｏＣ３の活性を阻害するための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
対象の血液中のトリグリセリドレベルを低減させるための方法であって、前記方法が、有効量の
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４８】
対象における食後脂肪血症を阻害するための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４９】
対象における高トリグリセリド血症を治療するための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
対象におけるカイロミクロン血症を治療するための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５１】
高トリグリセリド血症を有する対象における心血管疾患のリスクを低減させるための方法であって、前記方法が、有効量の請求項１〜４１のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５２】
前記心血管疾患が、心筋梗塞である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記心血管疾患が、狭心症である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記心血管疾患が、脳卒中である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体が、前記対象の血液中のカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させる、請求項４６〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、追加の脂質低下薬を受けている、請求項４６〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記追加の脂質低下薬が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬が、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシンバスタチンである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記追加の脂質低下薬が、ＰＣＳＫ９阻害薬である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＰＣＳＫ９阻害薬が、アリロクマブ、エボロクマブ、またはボコシズマブである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記追加の脂質低下薬が、エゼチミブである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記追加の脂質低下薬が、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との組み合わせである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記追加の脂質低下薬が、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とＰＣＳＫ９阻害薬との組み合わせである、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年７月８日出願の米国仮特許出願第６２／３６０，０８４号および２０１７年４月２８日出願の同第６２／４９１，５９１号の利益を主張し、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体、およびそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
上昇した血中トリグリセリドレベル（高トリグリセリド血症）は、アテローム性動脈硬化症の要因であり、心血管死、狭心症、心筋梗塞、および脳卒中などの心血管事象のリスクを高める。
【０００４】
ＡｐｏＣ３は、非常に高い濃度（１０μΜ超）で血中を循環するタンパク質であり、そのほとんどが、高トリグリセリドリポタンパク質（ＴＲＬ）、ＴＲＬレムナント、および高密度リポタンパク質に結合している。ＡｐｏＣ３は、血中トリグリセリドレベルの重要な制御因子であると考えられる。例えば、ヒトにおけるＡｐｏＣ３レベルは、血中トリグリセリドレベルと正に相関し、上昇したＡｐｏＣ３レベルが高トリグリセリド血症と関連することが示されている。さらに、ＡｐｏＣ３は、リポタンパク質リパーゼ（ＴＲＬ中のトリグリセリドを加水分解する酵素）の活性を阻害し、またＴＲＬレムナントの肝摂取を阻害することが示されており、これらはいずれも血中トリグリセリドレベルの上昇を引き起こす。
【０００５】
治療高トリグリセリド血症のためのいくつかの認可された療法が存在する（例えば、フィブラート、ニコチン酸、およびω３脂肪酸）。しかしながら、これらの療法は、血漿トリグリセリドの低下について中程度にのみ効果的である。したがって、血漿トリグリセリドを低下させるための改善された療法が当該技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能を阻害する抗体（例えば、単離された抗体）を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を治療する方法も提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、肝細胞によるＴＲＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができる。したがって、開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、高トリグリセリド血症および関連する疾患（例えば、心血管疾患および膵炎）の治療および予防に有用である。
【０００７】
したがって、一態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合し、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の食後脂肪血症を阻害することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、ＶＬＤＬのリポタンパク質媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる。
【０００８】
いくつかの別個の種類の抗ＡｐｏＣ３抗体が本明細書に開示され、これらは各々、ＡｐｏＣ３の異なる新規のエピトープに結合し、異なる機能特性を有する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、配列番号３［ＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合し、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる。代替的には、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、配列番号２［ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合し、脂質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する。
【０００９】
したがって、別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号２［ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の４および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の４、６、および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＶＬＤＬのリポタンパク質媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する。
【００１０】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号３［ＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の５および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の６、８、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の６および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の食後脂肪血症を阻害することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる。
【００１１】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含む、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３がそれぞれ、配列番号４、５、６、７３、７４、および７５；７、８、９、７６、７７、および７８；１０、１１、１２、７９、８０、および８１；１３、１４、１５、８２、８３、および８４；１６、１７、１８、８５、８６、および８７；１９、２０、２１、８８、８３、および８９；２２、２３、２４、９０、９１、および９２；２５、２６、２７、８２、９３、および９４；２８、２９、３０、９５、９６、および９７；１６、３１、３２、９８、９９、および１００；３３、３４、３５、１０１、９９、および１０２；２５、３６、３７、１０３、１０４、および１０５；３８、３９、４０、８２、１０６、および１０７；４１、４２、４３、１０８、１０９、および１１０；７、８、９、１１１、８３、および１１３；４７、４８、４９、８２、１１４、および１１５；５０、５１、５２、１１６、１１７、および１１８；５３、５４、５５、１１９、１２０、および１２１；５６、５７、５８、１２２、１２３、および１２４；５９、６０、６１、１２５、８３、および１２６；６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９；６５、６６、６７、８２、１１４、および１３０；６８、６９、７０、１３１、１３２、および１３３；または６８、７１、７２、１２４、１３５、および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体を提供する。
【００１２】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１３７〜１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１６１〜１８３および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体を提供する。
【００１３】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３への結合について、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域とを含む抗体であって、当該ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３がそれぞれ、配列番号４、５、６、７３、７４、および７５；７、８、９、７６、７７、および７８；１０、１１、１２、７９、８０、および８１；１３、１４、１５、８２、８３、および８４；１６、１７、１８、８５、８６、および８７；１９、２０、２１、８８、８３、および８９；２２、２３、２４、９０、９１、および９２；２５、２６、２７、８２、９３、および９４；２８、２９、３０、９５、９６、および９７；１６、３１、３２、９８、９９、および１００；３３、３４、３５、１０１、９９、および１０２；２５、３６、３７、１０３、１０４、および１０５；３８、３９、４０、８２、１０６、および１０７；４１、４２、４３、１０８、１０９、および１１０；７、８、９、１１１、８３、および１１３；４７、４８、４９、８２、１１４、および１１５；５０、５１、５２、１１６、１１７、および１１８；５３、５４、５５、１１９、１２０、および１２１；５６、５７、５８、１２２、１２３、および１２４；５９、６０、６１、１２５、８３、および１２６；６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９；６５、６６、６７、８２、１１４、および１３０；６８、６９、７０、１３１、１３２、および１３３；または６８、７１、７２、１２４、１３５、および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む、抗体と競合する抗体を提供する。
【００１４】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３への結合について、配列番号１３７〜１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体と競合する抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３への結合について、配列番号１６１〜１８３および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３への結合について、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、当該重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含む、抗体と競合する抗体を提供する。
【００１５】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域とを含む抗体であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３がそれぞれ、４、５、６、７３、７４、および７５；７、８、９、７６、７７、および７８；１０、１１、１２、７９、８０、および８１；１３、１４、１５、８２、８３、および８４；１６、１７、１８、８５、８６、および８７；１９、２０、２１、８８、８３、および８９；２２、２３、２４、９０、９１、および９２；２５、２６、２７、８２、９３、および９４；２８、２９、３０、９５、９６、および９７；１６、３１、３２、９８、９９、および１００；３３、３４、３５、１０１、９９、および１０２；２５、３６、３７、１０３、１０４、および１０５；３８、３９、４０、８２、１０６、および１０７；４１、４２、４３、１０８、１０９、および１１０；７、８、９、１１１、８３、および１１３；４７、４８、４９、８２、１１４、および１１５；５０、５１、５２、１１６、１１７、および１１８；５３、５４、５５、１１９、１２０、および１２１；５６、５７、５８、１２２、１２３、および１２４；５９、６０、６１、１２５、８３、および１２６；６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９；６５、６６、６７、８２、１１４、および１３０；６８、６９、７０、１３１、１３２、および１３３；または６８、７１、７２、１２４、１３５、および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む、抗体と同じＡｐｏＣ３のエピトープに結合する抗体を提供する。
【００１６】
別の態様では、本開示は、配列番号１３７〜１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体と同じＡｐｏＣ３のエピトープに結合する抗体を提供する。別の態様では、本開示は、配列番号１６１〜１８３および１５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と同じＡｐｏＣ３のエピトープに結合する抗体を提供する。別の態様では、本開示は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であって、当該重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載されるアミノ酸配列を含む、抗体と同じＡｐｏＣ３のエピトープに結合する抗体を提供する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の食後脂肪血症を阻害することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、ＶＬＤＬのリポタンパク質媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる。
【００１８】
別の態様では、本出願は、本明細書に開示される抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
別の態様では、本出願は、本明細書に開示される抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）を提供する。別の態様では、本出願は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。別の態様では、本出願は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。別の態様では、本出願は、ＡｐｏＣ３に結合する抗体を産生するための方法を提供し、当該方法は、抗体の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【００２０】
別の態様では、本出願は、対象の血液中のＡｐｏＣ３の活性を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本出願は、対象の血液中のトリグリセリドレベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本出願は、対象における食後脂肪血症を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本出願は、対象における高トリグリセリド血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本出願は、対象におけるカイロミクロン血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００２１】
別の態様では、本出願は、高トリグリセリド血症を有する患者における心血管疾患のリスクを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、心筋梗塞である。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、狭心症である。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、脳梗塞である。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させる。
【００２３】
ある特定の実施形態では、対象は、追加の脂質低下薬を受けている。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬である。ある特定の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬は、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシンバスタチンである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、ＰＣＳＫ９阻害薬である。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害薬は、アリロクマブ、エボロクマブ、またはボコシズマブである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との組み合わせである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とＰＣＳＫ９阻害薬との組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）へのＡｐｏＣ３の結合に対する、ＡｐｏＣ３抗体の干渉を示すグラフである。ＥＬＩＳＡマイクロプレートをＤＭＰＣでコーティングし、試験抗ＡｐｏＣ３抗体と混合したＡｐｏＣ３と共にインキュベートした。プレートに結合したままであったＡｐｏＣ３の量を、ＥＬＩＳＡ比色アッセイの標準ステップに従い、ビオチン化抗ＡｐｏＣ３ポリクローナルヤギ抗体で測定した。
【００２５】
【図２】抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下での、ＶＬＤＬへのＡｐｏＣ３の結合を示すグラフのセットである。パートＡおよびＢでは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイのためにＶＬＤＬを表面上に固定化した。ＡｐｏＣ３単独（「ＡｐｏＣ３」）、１４Ｃ７単独（「１４Ｃ７」）、もしくはＡｐｏＣ３および１４Ｃ７（「１４Ｃ７＋」）（パートＡ）；またはＡｐｏＣ３単独（「ＡｐｏＣ３」）、５Ｅ５単独（「５Ｅ５」）、６Ａ６単独（「６Ａ６」）、ＡｐｏＣ３および５Ｅ５（「５Ｅ５＋」）、もしくはＡｐｏＣ３および６Ａ６（「６Ａ６＋」）（パートＢ）をｔ＝１８００ｓで注入し、緩衝液をｔ＝２１００ｓで注入して、未結合分子を除去した。パートＣでは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＬＩチップ上にリポソームを捕捉し、ＡｐｏＣ３をｔ＝１８００ｓで注入し、５Ｅ５および６Ａ６をｔ＝４４００ｓで注入した。ＳＰＲシグナルを測定した。
【００２６】
【図３】１４Ｃ７および１３Ｇ７が、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）活性を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させたことを示すグラフである。１４Ｃ７、１３Ｇ７、５Ｅ５、または６Ａ６抗体をイントラリピドおよび精製ＡｐｏＣ３タンパク質と共にインキュベートした。非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の産生を測定し、ＡｐｏＣ３の存在下であるが抗ＡｐｏＣ３抗体の不在下でのＮＥＦＡ産生と比較した産生されたＮＥＦＡの割合をプロットした。
【００２７】
【図４】ある特定の抗ＡｐｏＣ３抗体はＨｅｐＧ２細胞による超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させ（パートＡ）、ある特定の抗ＡｐｏＣ３抗体は減弱させなかった（パートＢ）ことを示すグラフのセットである。ＨｅｐＧ２細胞をＤｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共に、示されるように単独または抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下のいずれかでインキュベートした。「モタビズマブ」は、モタビズマブを含むが抗ＡｐｏＣ３抗体が添加されていない、陰性対照群を指す。ＨｅｐＧ２細胞によって取り込まれたＤｉｌ  ＶＬＤＬをＤｉｌ染料の蛍光分光法によって測定した。
【００２８】
【図５】ヒトＡｐｏＣ３（ｈｕＡｐｏＣ３）またはカニクイザルＡｐｏＣ３（ｃｙｎｏＡｐｏＣ３）への１４Ｃ７（パートＡ）、５Ａ７（パートＢ）、５Ｅ５（パートＣ）、および６Ａ６（パートＤ）の結合を示すグラフのセットである。
【００２９】
【図６】５Ｅ５（パートＡ）、６Ａ６（パートＢ）、および１４Ｃ７（パートＣ）のエピトープマッピングを示すグラフのセットである。７、１０、または１３個のアミノ酸を有する環状ＡｐｏＣ３ペプチドのアレイを合成した。示される抗ＡｐｏＣ３抗体とペプチドとの結合を測定し、結合親和性に従って強度プロットを生成した。抗体結合に寄与するアミノ酸を同定し、ハイライトした。
【００３０】
【図７】５Ｅ５（パートＡ）、６Ａ６（パートＢ）、および１４Ｃ７（パートＣ）のエピトープ置換スキャニングを示すグラフのセットである。パートＡおよびＢでは、他の１９個のＬアミノ酸で各アミノ酸を置き換える単一のアミノ酸変異を有する、１３個のアミノ酸ＤＫＦ  ＳＥＦ  ＷＤＬＤＰＥＶ（配列番号４４）を有するＡｐｏＣ３ペプチドのアレイを合成した。示される抗ＡｐｏＣ３抗体とペプチドとの結合を測定した。野生型および変異ＡｐｏＣ３ペプチドの相対的結合親和性を示す置換マトリックスを結合親和性データから生成した。パートＣでは、他の１９個のＬアミノ酸で各アミノ酸を置き換える単一のアミノ酸変異を有する、１３個のアミノ酸ＡＲＧＷ  ＶＴＤＧＦ  Ｓ  ＳＬＫ（配列番号４５）を有するＡｐｏＣ３ペプチドのアレイを合成した。１４Ｃ７抗ＡｐｏＣ３抗体とペプチドとの結合を測定した。野生型および変異ＡｐｏＣ３ペプチドの相対的結合親和性を示す置換マトリックスを結合親和性データから生成した。パートＡ、Ｂ、およびＣのそれぞれにおいて、１行目は、野生型ＡｐｏＣ３ペプチドの配列（配列１８５または１８６）を下から上に表す。１行目に示される各位置でのアミノ酸置換は、結合親和性の順により高いもの（左）からより低いもの（右）へと並べられている。各列について、左から右に、濃淡の強度が最下点まで減少し、その後、増加する。最下点の左では、濃淡の強度は結合親和性と正に相関し、最下点の右では、濃淡の強度は結合親和性と負に相関する。
【００３１】
【図８】ＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３マウスモデルにおける循環食後脂肪血症トリグリセリドに対するｈｕＡｐｏＣ３過剰発現の効果を実証するグラフのセットである。マウスをビヒクル（「未処置」）またはＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３の３ｘｌ０ｕウイルス粒子（「＋ＡＡＶＣ３  １４日目」）に感染させた。オリーブ油負荷後の血清トリグリセリドレベルは、ＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３マウスにおいてより高かった（パートＡ）。トリグリセリドレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）は、３８％増加し、独立Ｔ検定で０．００４７のｐ値を有した（パートＢ）。
【００３２】
【図９】は、５Ｅ５の食後脂肪血症トリグリセリド低下効果を示すグラフのセットである。３ｘｌ０ｕＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３ウイルス粒子を受けるマウスにビヒクルまたは５Ｅ５抗体を投与した。オリーブ油の経口用量を与え、時間経過と共にトリグリセリドレベルを測定した（パートＡ）。曲線下面積（「ＡＵＣ」）は、ビヒクル対照と比較して５Ｅ５投与で約２５％低減し、０．０３０のｐ値を有した（パートＢ）。血清ＡｐｏＣ３レベル（パートＣ）および５Ｅ５抗体レベル（パートＤ）も時間経過と共に測定した。パートＥでは、抗鶏卵リポソームヒトＩｇＧ１抗体（「ＨｙＨＥＬ５」）をアイソタイプ対照として使用した。
【００３３】
【図１０】ヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスへの５Ｅ５および６Ａ６抗体の皮下注射後の、血液からのＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢのクリアランスの加速を示す一連のグラフである。抗鶏卵リポソームヒトＩｇＧｌ抗体（ＨｙＨＥＬ５）を５Ｅ５のアイソタイプ対照として使用し、ＰＢＳを６Ａ６のビヒクル対照として使用した。パートＣは、血漿中のヒトＡｐｏｃ３の濃度を示す。パートＡ、Ｂは、陰性アイソタイプ対照からの差の百分率としてグラフ化され、Ｄは、抗体投与の直前に採取した血液試料から測定したそれぞれのベースラインレベルに対する増減率としてグラフ化されている。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能を阻害する抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を治療する方法も提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、肝細胞によるＴＲＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができる。したがって、開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、高トリグリセリド血症および関連する疾患（例えば、心血管疾患および膵炎）の治療および予防に有用である。
【００３５】
いくつかの別個の種類の抗ＡｐｏＣ３抗体が本明細書に開示され、これらは各々、ＡｐｏＣ３の異なる新規のエピトープに結合し、異なる機能特性を有する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、配列番号３［ＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合し、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる。代替的には、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、配列番号２［ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ］に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合し、脂質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する。
【００３６】
１．定義
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣ３」という用語は、アポリポタンパク質Ｃ３タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３は、ヒトＡｐｏＣ３である。例示的なヒトＡｐｏＣ３アミノ酸配列は、ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ００００３１．１に記載されている。Ｐ＿００００３１．１の成熟アミノ酸配列は以下の通りである：ＳＥＡＥＤＡＳＬＬＳＦＭＱＧＹＭＫＨＡＴＫＴＡＫＤＡＬＳＳＶＱＥＳＱＶＡＱＱＡＲＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫＤＹＷＳＴＶＫＤＫＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥＶＲＰＴＳＡＶＡＡ（配列番号１）。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語には、全長抗体、全長抗体の抗原結合断片、および抗体のＣＤＲ、ＶＨ領域、またはＶＬ領域を含む分子が含まれる。抗体の例としては、モノクローナル抗体、組換え産生された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖−抗体重鎖対、細胞内抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃｓ、ラクダ科抗体（例えば、ラマ抗体）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗−抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかの抗原結合断片が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、もしくはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリン分子であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧ抗体、またはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４）もしくはサブクラスである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、同定され、その天然環境の少なくとも１つの構成要素から分離および／または回収された抗体を指す。「単離された抗体」という用語には、組換え宿主細胞内での原位置の抗体が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接の抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載されており、これらは全て、参照によりそれらの全体が組み込まれており、互いに比較した場合、定義は、アミノ酸の重複またはサブセットを含む。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって定義される通りである。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、軽鎖ＣＤＲを示す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語には、可変領域の一部であるが、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を使用する）の一部ではないアミノ酸残基が含まれる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「可変領域」および「可変ドメイン」という用語は、交換可能に使用され、当該技術分野において一般的である。可変領域とは、典型的には、抗体の一部、一般に、軽鎖または重鎖の一部、典型的には、成熟重鎖における約アミノ末端１１０〜１２０アミノ酸または１１０〜１２５アミノ酸および成熟軽鎖における約９０〜１１５アミノ酸を指し、これらは、抗体ごとに配列が大きく異なり、それらの特定の抗原に対する特定の抗体の結合および特異性において使用される。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中している一方、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。特定の機構または理論に拘束されることは望まないが、軽鎖および重鎖のＣＤＲは、抗体の抗原との相互作用および特異性に主に関与している。ある特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲおよび霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【００４２】
「ＶＬ」および「ＶＬドメイン」という用途は、抗体の軽鎖可変領域を指すように、交換可能に使用される。
【００４３】
「ＶＨ」および「ＶＨドメイン」という用途は、抗体の重鎖可変領域を指すように、交換可能に使用される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「定常領域」および「定常ドメイン」という用語は、交換可能であり、当該技術分野において一般的である。定常領域は、抗体部分、例えば、抗原への抗体の結合に直接関与していないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示し得る、軽鎖または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比べて、より多くの保存されたアミノ酸配列を有する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「重鎖」という用語は、抗体に言及して使用される場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）を指し得、それらから抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭクラス（ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）がそれぞれ生じる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、抗体に言及して使用される場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）を指し得る。軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、軽鎖は、ヒト軽鎖である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「に特異的に結合する」という用語は、約１ｘ１０〜６Ｍ未満、１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、１ｘ１０−１２Ｍ、もしくはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）で抗原に結合するか、または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で抗原に結合する抗体の能力を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合することができる抗原の局所化領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの隣接したアミノ酸（線状もしくは隣接エピトープ）であり得るか、またはエピトープは、例えば、ポリペプチド（複数可）の２つ以上の非隣接領域（立体構造、非線状、不連続、または非隣接のエピトープ）から形成され得る。ある特定の実施形態では、抗体が結合するエピトープは、例えば、ＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析法と組み合わせた水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、ペプチドスキャニングアッセイ、または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって判定され得る。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、本明細書に記載される治療または予防手段を指す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害、または再発性疾患もしくは障害の１つ以上の症状を予防するか、治癒するか、遅延させるか、その重度を低減させるか、それを発症するリスクを低減させるか、または改善させるため、あるいはかかる治療の不在下で予想される対象の生存期間よりも長く延長させるために、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害にかかりやすい対象への抗ＡｐｏＣ３抗体の投与を用いる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、対象への療法剤の投与の文脈では、所望の予防または治療効果を達成する療法剤の量を指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、および／またはを意味する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、数値または数的範囲を修飾するために使用される場合、値または範囲を５％〜１０％上回る、および５％〜１０％下回る偏差が、引用された値または範囲の意図される意味の範囲内であることを示す。
【００５４】
２．抗ＡｐｏＣ３抗体
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能を阻害する抗体（例えば、単離された抗体）を提供する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、哺乳動物のＡｐｏＣ３タンパク質に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、ヒトＡｐｏＣ３に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＡｐｏＣ３に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、マウスＡｐｏＣ３に結合する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる（インビボまたはインビトロ）。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍減弱させる。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、食前、食中、または食後に投与された場合、対象における食後脂肪血症を阻害することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後脂肪血症を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％阻害することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後脂肪血症を少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍阻害することができる。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、食前、食中、または食後に投与された場合、対象におけるカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低減させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントを少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低減させることができる。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％増加させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍増加させることができる。ＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスを評価するための方法には、限定することなく、同位体トレーサー技術が含まれ、同位体は、放射性または安定のいずれであってもよい。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低減させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低減させることができる。ある特定の実施形態では、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルの低減は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４２、または４８時間維持される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、１、２、３、４、または５μＭの濃度で、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも５０％減弱させる。
【００６２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、脂質またはリポタンパク質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害する。ある特定の実施形態では、脂質は、脂肪酸鎖を含む。ある特定の実施形態では、脂質は、ホスファチジル基を含む。ある特定の実施形態では、脂質は、ホスファチジルコリン（例えば、ＤＭＰＣ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、またはホスファチジルグリセロールを含む。ある特定の実施形態では、脂質は、トリグリセリドである。ある特定の実施形態では、リポタンパク質は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントである。ある特定の実施形態では、開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、脂質およびリポタンパク質（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナント）へのＡｐｏＣ３の結合を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％阻害する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、脂質およびリポタンパク質（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナント）へのＡｐｏＣ３の結合を少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍減弱させる。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、本明細書（例えば、実施例３）に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価されるように、脂質結合ＡｐｏＣ３（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナントに結合したＡｐｏＣ３）に結合することができる。
【００６４】
本明細書に開示される抗体は、前述の実施形態に記載される特徴のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、またはその全てを有し得る。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減弱させ、かつ１、２、３、４、５μΜの濃度で、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも５０％減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減弱させ、かつ脂質結合ＡｐｏＣ３（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナントに結合したＡｐｏＣ３に結合することができる。
【００６５】
任意の好適なアッセイを使用して、本明細書に開示される抗体の前述の機能活性を測定することができる。例示的なアッセイには、本明細書の実施例に開示される機能アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
例示的な抗ＡｐｏＣ３抗体のアミノ酸配列は、本明細書の表１〜４に記載される。
【表１】
2019525772.tif 000003
【表２】
2019525772.tif 000004
【表３】
2019525772.tif 000005
2019525772.tif 000006
2019525772.tif 000007
【表４】
2019525772.tif 000008
2019525772.tif 000009
【００６７】
一態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、本明細書の表３に記載されるＶＨドメインのＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つ全てを含むＶＨドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのうちの１つのＣＤＲＨ１を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのうちの１つのＣＤＲＨ２を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのうちの１つのＣＤＲＨ３を含む。
【００６８】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、本明細書の表４に開示されるＶＬドメインのＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つ全てを含むＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載されるＶＬドメインのうちの１つのＣＤＲＨ１を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載されるＶＬドメインのうちの１つのＣＤＲＨ２を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載されるＶＬドメインのうちの１つのＣＤＲＨ３を含む。
【００６９】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）に従って判定することができる。ある特定の実施形態では、抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って判定され、抗体の重鎖ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って判定される。
【００７０】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、免疫グロブリン構造ループの位置を指すＣｈｏｔｈｉａ付番スキーム従って判定することができる（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ＆Ｌｅｓｋ  ＡＭ，（１９８７），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ１９６：９０１−９１７、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２７３：９２７−９４８、Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２２７：７９９−８１７、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２１５（１）：１７５−８２、および米国特許第７，７０９，２２６号を参照されたい）。典型的には、Ｋａｂａｔ付番の慣習を使用する場合、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ１ループは、重鎖アミノ酸２６〜３２、３３、または３４に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ２ループは、重鎖アミノ酸５２〜５６に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ３ループは、重鎖アミノ酸９５〜１０２に存在する一方、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＬ１ループは、軽鎖アミノ酸２４〜３４に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＬ２ループは、軽鎖アミノ酸５０〜５６に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＬ３ループは、軽鎖アミノ酸８９〜９７に存在する。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ１ループの末端は、Ｋａｂａｔ付番の慣例を使用して付番する場合、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームが、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終結し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終結し、３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終結する）。
【００７１】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ７：１３２−１３６およびＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２７：２０９−２１２に記載されるように、ＥＶＩＧＴ付番システムに従って判定することができる。ＥＶＩＧＴ付番スキームによると、ＣＤＲＨ１は、２６〜３５位にあり、ＣＤＲＨ２は、５１〜５７位にあり、ＣＤＲＨ３は、９３〜１０２位にあり、ＣＤＲＬ１は、２７〜３２位にあり、ＣＤＲＬ２は、５０〜５２位にあり、ＣＤＲＬ３は、８９〜９７位にある。
【００７２】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ超可変領域を指すＡｂＭ付番スキームに従って判定することができ、これは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の折衷案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）に使用されている。
【００７３】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２６２：７３２−７４５に従って判定することができる。また、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｉｉｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ３１，ｐｐ．４２２−４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）におけるＭａｒｔｉｎ  Ａ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」も参照されたい。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、表４に記載されるＶＬドメインのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、各ＣＤＲは独立して、本明細書に開示されるように、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＥＶＩＧＴ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、またはＡｂＭによるＣＤＲの定義に従って定義される。
【００７５】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体を提供し、当該抗体は、
（ａ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３３、３８、４１、４７、５０、５３、５６、６２、６５、もしくは６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、または
（ｂ）配列番号５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３１、３４、３６、３９、４２、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、もしくは７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、または
（ｃ）配列番号６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３２、３５、３７、４０、４３、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、もしくは７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、または
（ｄ）配列番号７３、７６、７９、８２、８５、８８、９０、９５、９８、１０１、１０３、１０８、１１１、１１６、１１９、１２２、１２５、１２７、１３１、もしくは１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、または
（ｅ）配列番号７４、７７、８０、８３、８６、９１、９３、９６、９９、１０４、１０６、１０９、１１４、１１７、１２０、１２３、１２８、１３２、もしくは１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、または
（ｆ）配列番号７５、７８、８１、８４、８７、８９、９２、９４、９７、１００、１０２、１０５、１０７、１１０、１１３、１１５、１１８、１２１、１２４、１２６、１２９、１３０、１３３、もしくは１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含む。
【００７６】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号４、５、および６；７、８、および９；１０、１１、および１２；１３、１４、および１５；１６、１７、および１８；１９、２０、および２１；２２、２３、および２４；２５、２６、および２７；２８、２９、および３０；１６、３１、および３２；３３、３４、および３５；２５、３６、および３７；３８、３９、および４０；４１、４２、および４３；４７、４８、および４９；５０、５１、および５２；５３、５４、および５５；５６、５７、および５８；５９、６０、および６１；６２、６３、および６４；６５、６６、および６７；６８、６９、および７０；または６８、７１、および７２に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号７、８、および９に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号１０、１１、および１２に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号６２、６３、および６４に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。
【００７７】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号７３、７４、および７５；７６、７７、および７８；７９、８０、および８１；８２、８３、および８４；８５、８６、および８７；８８、８３、および８９；９０、９１、および９２；８２、９３、および９４；９５、９６、および９７；９８、９９、および１００；１０１、９９、および１０２；１０３、１０４、および１０５；８２、１０６、および１０７；１０８、１０９、および１１０；１１１、８３、および１１３；８２、１１４、および１１５；１１６、１１７、および１１８；１１９、１２０、および１２１；１２２、１２３、および１２４；１２５、８３、および１２６；１２７、１２８、および１２９；８２、１１４、および１３０；１３１、１３２、および１３３；または１２４、１３５、および１３６に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号７６、７７、および７８に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号７９、８０、および８１に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号６２、６３、および６４に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【００７８】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、当該ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号４、５、６、７３、７４、および７５；７、８、９、７６、７７、および７８；１０、１１、１２、７９、８０、および８１；１３、１４、１５、８２、８３、および８４；１６、１７、１８、８５、８６、および８７；１９、２０、２１、８８、８３、および８９；２２、２３、２４、９０、９１、および９２；２５、２６、２７、８２、９３、および９４；２８、２９、３０、９５、９６、および９７；１６、３１、３２、９８、９９、および１００；３３、３４、３５、１０１、９９、および１０２；２５、３６、３７、１０３、１０４、および１０５；３８、３９、４０、８２、１０６、および１０７；４１、４２、４３、１０８、１０９、および１１０；７、８、９、１１１、８３、および１１３；４７、４８、４９、８２、１１４、および１１５；５０、５１、５２、１１６、１１７、および１１８；５３、５４、５５、１１９、１２０、および１２１；５６、５７、５８、１２２、１２３、および１２４；５９、６０、６１、１２５、８３、および１２６；６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９；６５、６６、６７、８２、１１４、および１３０；６８、６９、７０、１３１、１３２、および１３３；または６８、７１、７２、１２４、１３５、および１３６に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、当該ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号７、８、９、７６、７７、および７８に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、当該ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号１０、１１、１２、７９、８０、および８１に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、当該ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００７９】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３８に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３９に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５７に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【００８０】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、または１５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、または１５１に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１６２に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１６３に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１８１に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００８１】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、または１５１に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、または１６０に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、または１５１に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１３８および１６３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１３９および１６３に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１５７および１８１に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００８２】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される抗体、例えば、それぞれ配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と同じかまたは重複するＡｐｏＣ３のエピトープ（例えば、ヒトＡｐｏＣ３のエピトープ）に結合する単離された抗体を提供する。抗体のエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析法と組み合わせた水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）、ペプチドスキャニングアッセイ、または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって判定され得る。
【００８３】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への結合について、それぞれ配列番号１３７および１６１、１３８および１６２、１３９および１６３、１４０および１６４、１４１および１６５、１４２および１６６、１４３および１６７、１４４および１６８、１４５および１６９、１４６および１７０、１４７および１７１、１４８および１７２、１４９および１７３、１５０および１７４、１３８および１７５、１５２および１７６、１５３および１７７、１５４および１７８、１５５および１７９、１５６および１８０、１５７および１８１、１５８および１８２、１５９および１８３、または１６０および１５１に記載される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と競合する単離された抗体を提供する。競合結合は、試験用の免疫グロブリンがＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）などの共通の抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するアッセイにおいて判定され得る。数多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相直接または間接放射免疫測定法（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ９：２４２−２５３を参照されたい）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ＴＮ  ｅｔ  ａｌ，（１９８６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１３７：３６１４−９）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ＆Ｌａｎｅ  Ｄ，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）、１−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ＧＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２５（１）：７−１５を参照されたい）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：５４６−５２を参照されたい）、および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３２：７７−８２を参照されたい）が既知である。典型的には、かかるアッセイは、未標識の試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンのいずれかを保有する固体表面または細胞に結合した精製ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）の使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を判定することによって測定することができる。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在している。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは、共通の抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、またはそれ以上阻害することになる。競合結合アッセイは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して多数の異なる形式で構成され得る。このアッセイの一般的なバージョンでは、抗原は、９６ウェルプレート上に固定化されている。次いで、評者活性または酵素標識を使用して、抗原への標識抗体の結合をブロックする未標識抗体の能力が測定される。さらなる詳細については、例えば、Ｗａｇｅｎｅｒ  ���  ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１３０：２３０８−２３１５、Ｗａｇｅｎｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ６８：２６９−２７４、Ｋｕｒｏｋｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ５０：４８７２−４８７９、Ｋｕｒｏｋｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ２１：５２３−５３８、Ｋｕｒｏｋｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１１：３９１−４０７、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ＆Ｌａｎｅ  Ｄ（編集者上記），ｐｐ．３８６−３８９を参照されたい。
【００８４】
ある特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸配列ＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ（配列番号３）内のＡｐｏＣ３のエピトープに結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３内の少なくとも１つのアミノ酸を含み、任意で、配列番号３と隣接した配列番号１からの１つ以上のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも２つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも３つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも４つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の５および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の２、５、６、および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の６および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の８および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の６および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号３の６、８、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への結合について、それぞれ配列番号１３８および１６２、または１３９および１６３に記載される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と競合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号７、８、９、７６、７７、および７８、または１０、１１、１２、７９、８０、および８１に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１３８および１６２、または１３９および１６３に記載されるアミノ酸配列を含む。かかる抗体は、任意で、以下の特徴のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、またはその全てをさらに有する：（ａ）抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナントに結合したＡｐｏＣ３）に結合することができる；（ｂ）抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができない（例えば、抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０μΜの濃度で、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を５０％未満減弱させる）；（ｃ）抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減弱させる；（ｄ）抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後脂肪血症を阻害する（例えば、対象の血清中の食後トリグリセリドレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％阻害する）ことができる；（ｅ）抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることができる；（ｆ）抗体は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる；（ｇ）抗体は、対象の血中のＡｐｏＣ３レベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％低減させることができる；ならびに（ｈ）抗体は、対象の血中のＡｐｏＢレベルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％低減させることができる（これらの特徴は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価すぁれる）。
【００８５】
ある特定の実施形態では、本開示は、アミノ酸配列ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号２）内のＡｐｏＣ３のエピトープに結合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２内の少なくとも１つのアミノ酸を含み、任意で、配列番号２と隣接した配列番号１からの１つ以上のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも２つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも３つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも４つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも５つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の４および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の４、６、および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、９、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、および９位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１、４、６、７、９、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への結合について、それぞれ配列番号１５７および１８１に記載される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体と競合する単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号６２、６３、６４、１２７、１２８、および１２９に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１５７および１８１に記載されるアミノ酸配列を含む。かかる抗体は、任意で、以下の特徴のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、またはその全てをさらに有する：（ａ）抗体は、１、２、３、４、または５μΜの濃度で、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも５０％減弱させることができる；（ｂ）抗体は、脂質およびリポタンパク質（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナント）へのＡｐｏＣ３の結合を少なくとも７０％、８０％、９０��、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％阻害することができる；（ｃ）抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％減弱させることができる；（ｄ）抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後脂肪血症を阻害することができる；（ｅ）抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることができる；（ｆ）抗体は、対象の血中からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる；ならびに（ｇ）抗体は、対象の血中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢレベルを低減させることができる（これらの特徴は、本明細書に記載される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価される）。
【００８６】
任意のＩｇ定常領域を本明細書に開示される抗体に使用することができる。ある特定の実施形態では、Ｉｇ領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＹ免疫グロブリン分子、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリン分子である。
【００８７】
３．使用方法
ＡｐｏＣ３は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスを阻害し、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害し、それにより対象の血中のトリグリセリドレベルを増加させるように機能する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスを阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させるか、またはＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血液中のＡｐｏＣ３の活性を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３の活性は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスの阻害である。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３の活性は、ＴＲＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解の阻害である。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３の活性は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスの阻害、ならびにＴＲＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解の阻害である。
【００８８】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を増加させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を増加させる方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００８９】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の血中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを低減させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／ＡｐｏＢ１００）レベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低減させる。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低減させる。ある特定の実施形態では、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルの低減は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４２、または４８時間維持される。
【００９０】
開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の血中のトリグリセリドレベルを低減させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血中のトリグリセリドレベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００９１】
開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、高トリグリセリド血症の治療に有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における高トリグリセリド血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本出願は、対象におけるカイロミクロン血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるカイロミクロン血症症候群を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００９２】
開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象における食後脂肪血症の治療および予防に有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における食後脂肪血症を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。抗ＡｐｏＣ３抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与され得る。
【００９３】
理論に拘束されることを望むものではないが、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、食前、食中、または食後に投与された場合、対象におけるカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。抗ＡｐｏＣ３抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与され得る。
【００９４】
高トリグリセリド血症を有する患者の血中のトリグリセリドレベルの提言は、膵炎の発症のリスクを低減させ得る。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、高トリグリセリド血症を有する患者における膵炎のリスクを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００９５】
開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の心血管疾患のリスクを低減させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、高トリグリセリド血症を有する患者における心血管疾患のリスクを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。高トリグリセリド血症または過剰な食後脂肪血症に関連するかまたはそれらによって引き起こされる任意の心血管疾患を発症するリスクは、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物の投与によって低減され得る。リスクが低減され得る心血管疾患には、環状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、および脳梗塞が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物は、単独で、または追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、別の脂質低下薬である。任意の１つ以上の脂質滴下薬が、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物と組み合わせて使用され得る。好適な脂質低下薬には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシンバスタチン）、フィブラート、ニコチン酸、胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム）、食事性コレステロール吸収阻害剤（例えば、         エゼチミブ）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤（例えば、ロミタピド）、フィトステロール、膵リパーゼ阻害剤（例えば、オルリスタット）、コレステリルエステル転送タンパク質阻害剤、スクアレン合成酵素阻害薬（例えば、ＴＡＫ−４７５、ｚａｒａｇｏｚｉｃ  ａｃｉｄ、およびＲＰＲ１０７３９３）、ＡｐｏＡ−１Ｍｉｌａｎｏ、サクシノブコール（ＡＧＩ−１０６７）、アポタンパク質Ｂ阻害薬（例えば、ミポメルセン）、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）阻害薬（例えば、アリロクマブ、エボロクマブ、およびボコシズマブ）、ならびにこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との組み合わせである。ある特定の実施形態では、脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とＰＣＳＫ９阻害薬との組み合わせである。
【００９７】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物は、多様な経路で対象に送達され得る。これらには、非経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下経路が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体または医薬組成物は、皮下または静脈内に送達される。
【００９８】
状態の治療または予防に有効となる、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３または医薬組成物の量は、疾患の性質に依存することになり、標準的な臨床技術によって経験的に判定することができる。組成物に用いられる正確な用量はまた、投与経路、および感染症またはそれによって引き起こされる疾患の重度に依存することになり、医師の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効用量はまた、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態（年齢、体重、および健康状態を含む）、患者がヒトであるか動物であるか、投与された他の薬物、または治療が予防的であるか療法的であるかに応じて異なる場合がある。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療投薬量は、安全性および有効性を最適化するために、最適に滴定される。
【００９９】
本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体はまた、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、またはウェスタンブロッティングなどの免疫測定法を含む、当業者に既知である古典的な免疫組織学的方法を使用して生体試料中のＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質レベルをアッセイするために使用することもできる。好適な抗体アッセイ標識は当該技術分野で既知であり、これには、グルコース酸化酵素などの酵素標識、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクニチウム（９９Ｔｃ）などの放射性同位体、ルミノールなどの発光標識、ならびにフルオレセインおよびローダミン、およびビオチンなどの蛍光標識が含まれる。かかる標識は、本明細書に記載される抗体を標識されるために使用され得る。代替的には、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体を認識する第２の抗体が標識されてももよく、これを抗ＡｐｏＣ３抗体と組み合わせて使用してＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質レベルを検出する。
【０１００】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質の発現レベルについてアッセイすることは、直接的（例えば、絶対的タンパク質レベルを判定もしくは予測することによって）、または相対的に（例えば、第２の生体試料中の疾患関連タンパク質レベルと比較することによって）のいずれかで、第１の生体試料中のＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）レベルを定性的または定量的に測定または予測することを含むように意図される。第１の生体試料中のＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ポリペプチド発現レベルは、測定または予測され、標準ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質レベルと比較されてもよく、この標準は、障害を有しない個体から得られた第２の生体試料から取るか、または障害を有しない個体集団からのレベルを平均化することによって判定される。当該技術分野で理解されるように、「標準」ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ポリペプチドレベルがいったん知られると、これを比較のための標準として繰り返し使用することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を発現する可能性がある対象、細胞株、組織、または他の細胞源から得られた任意の生体試料を指す。組織生検および体液を動物（例えば、ヒト）から得る方法は、当該技術分野で周知である。生体試料には、末梢血単核細胞が含まれる。
【０１０２】
本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、予後診断、診断、監視、およびスクリーニング用途に使用することができ、これには、当業者に周知および標準的であり、かつ本明細書に基づくインビトロおよびインビボ用途が含まれる。免疫系状態または免疫応答のインビトロ評価および査定のための予後診断、診断、監視、およびスクリーニングアッセイおよびキットを利用して、予測、診断、および監視して、上昇したＡｐｏＣ３活性を有することが知られているか、またはそれを有することが疑われるものを含む、患者試料を査定することができる。一実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、生検試料の免疫組織化学的検査に使用され得る。別の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体を使用して、ある特定の疾患症状に繋がり得る、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）レベルを検出することができる。本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、検出可能な標識または機能標識を保有し得る。蛍光標識が使用される場合、現在利用可能な顕微鏡法および経口蛍光標識細胞分取分析（ＦＡＣＳ）、または当該技術分野で既知である両方の方法手順の組み合わせを利用して、特異的結合メンバーを同定および定量化することができる。本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、蛍光標識を保有し得る。例示的な蛍光標識としては、例えば、反応性およびコンジュゲートされたプローブ、例えば、アミノクマリン、フルオレセイン、およびテキサスレッド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料、Ｃｙ染料、およびＤｙＬｉｇｈｔ染料が挙げられる。抗ＡｐｏＣ３抗体は、同位体Ｈ、Ｃ、Ｐ、Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１ｌｎ、１１７Ｌｕ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、および１８６Ｒｅなどの放射性標識を保有し得る。放射性標識が使用される場合、当該技術分野で既知である現在利用可能な計数手順を利用して、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への抗ＡｐｏＣ３抗体の特異的結合を同定および定量化した。標識が酵素である場合には、検出は、当該技術分野で既知である現在利用されている比色分析、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法、または気体定量技術のいずれかによって達成され得る。これは、抗体とＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）との複合体の形成を可能にする条件下で、試料または対照試料を抗ＡｐｏＣ３抗体と接触させることによって達成することができる。抗体とＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）との間で形成される任意の複合体が試料および対照において検出され、比較される。また、本明細書に記載される抗体を使用して、免疫親和性精製を介してＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を精製することもできる。また、例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）の存在の程度の定量分析のための試験キットの形態で調製され得るアッセイシステムも本明細書に含まれる。システムまたは試験キットは、標識成分、例えば、標識ＡｐｏＣ３抗体と、１つ以上の追加の免疫化学的試薬とを含み得る。
【０１０３】
４．医薬組成物
薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤中で所望の純度を有する本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体を含む医薬組成物が本明細書に提供される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、これらには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどの親水性ポリマー；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１０４】
特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体と、任意で、１つ以上の追加の予防または治療剤とを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で、有効量の本明細書に記載される抗体と、任意で、１つ以上の追加の予防または治療剤とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。本明細書に記載される医薬組成物は、ＡｐｏＣ３活性の阻害、および癌または感染性疾患などの状態の治療に有用であり得る。
【０１０５】
非経口調製物に使用される薬学的に許容される担体には、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌薬、等張化剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が含まれる。水性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸加リンガー液が挙げられる。非水性経口ビヒクルには、植物由来の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、およびピーナッツ油が含まれる。複数用量容器にパッケージ化された経口調製物に、静菌的または静真菌的濃度の抗菌薬が添加されてもよく、これには、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。等張化剤には、塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝液には、リン酸およびクエン酸が含まれる。抗酸化剤には、重硫酸ナトリウムが含まれる。局所麻酔薬には、塩酸プロカインが含まれる。懸濁化剤および分散剤には、カルボキシメチルセルオースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｏｓｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤には、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が含まれる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤には、ＥＤＴＡが含まれる。また、薬学的担体には、水混和性のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も含まれる。
【０１０６】
医薬組成物は、対象への人の投与経路用に製剤化され得る。投与経路の具体的な例としては、鼻腔内、経口、肺、経皮、皮内、および非経口が挙げられる。皮下、筋肉内、または静脈内注射のいずれかを特徴とする非経口投与も本明細書において企図される。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液としての従来の形態で、注射前の液体中での溶解もしくは懸濁化に好適な固体形態で、または乳濁液として調製することができる。注射剤、溶液、および乳濁液は、１つ以上の賦形剤も含有する。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。さらに、所望の場合、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、可溶性増強剤、ならびに例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、およびシクロデキストリンなどの他のかかる薬剤も含有し得る。
【０１０７】
抗体の非経口投与のための調製物には、注射用の滅菌溶液、使用直前に溶媒と合わせるための凍結乾燥粉末などの乾燥した滅菌可溶性生成物（皮下錠剤を含む）、注射用の滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと合わせるための乾燥した滅菌不溶性生成物、および滅菌乳濁液が含まれる。溶液は、水性であっても非水性であってもよい。
【０１０８】
静脈内に投与される場合、好適な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤が含まれる。
【０１０９】
抗体を含む局所混合物は、局所および全身投与について記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液などであり得、クリーム、ゲル、軟膏、乳濁液、溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、泡状物質、エアロゾル、潅注剤、スプレー、坐薬、包帯、皮膚パッチ、または局所投与に好適な任意の他の製剤として製剤化され得る。
【０１１０】
本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、例えば吸入による局所投与のためにエアロゾルとして製剤化され得る（例えば、炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイドの送達のためのエアロゾルについて記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、同第４，４１４，２０９号、および同第４，３６４，９２３を参照されたい）。呼吸器への投与のためのこれらの製剤は、単独で、またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、ネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液の形態、または吹送のための微小粉末であり得る。かかる場合において、製剤の粒子は、一実施形態では５０ミクロン未満、一実施形態では１０ミクロン未満の直径を有することになる。
【０１１１】
本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体は、局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与用に、例えば、皮膚、および眼の中などの粘膜への局所適用のためにゲル、クリーム、およびローションの形態で、ならびに眼への適用または槽内もしくは脊髄内の適用のために、製剤化され得る。局所投与は、経皮送達について企図され、そして眼もしくは粘膜への投与、または吸入療法についても企図される。抗体単独の、または他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた鼻腔用溶液も投与され得る。
【０１１２】
イオン振とうデバイスおよび電気泳動デバイスを含む経皮パッチは、当該技術分野で周知であり、抗体を投与するために使用され得る。例えば、かかるパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、同第６，２６１，５９５号、同第６，２５６，５３３号、同第６，１６７，３０１号、同第６，０２４，９７５号、同第６，０１０７１５号、同第５，９８５，３１７号、同第５，９８３，１３４号、同第５，９４８，４３３号、および同第５，８６０，９５７号に開示されている。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるを含む医薬組成物は、溶液、乳濁液、および他の混合物として投与のために再構築され得る、凍結乾燥した粉末である。また、再構築し、固体またはゲルとして製剤化することもできる。凍結乾燥した粉末は、本明細書に記載される抗体またはその薬学的に許容される誘導体を好適な溶媒中に溶解することによって調製される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥した粉末は、滅菌である。溶媒は、安定性を改善させる賦形剤、または粉末もしくは粉末から調製された再構築された溶液の他の薬理成分を含有し得る。使用され得る賦形剤には、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の好適な薬剤が含まれるが、これらに限定されない。溶媒はまた、一実施形態では約中性ｐＨの、緩衝液、例えば、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはカリウム、または当業者に既知である他の緩衝液も含有し得る。当業者に既知である標準条件下でのその後の溶液の滅菌濾過に続く凍結乾燥によって、所望の製剤が提供される。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥用のバイアルに配分される。各バイアルは、単回投薬量または複数回投薬量の化合物を含有することになる。凍結乾燥した粉末は、約４℃〜室温などの適切な条件下で保管され得る。この凍結乾燥した粉末を注射用に水で再構築することにより、非経口投与における使用のための製剤を提供される。再構築のために、凍結乾燥した粉末は、滅菌水または他の好適な担体に添加される。正確な量は、選択される化合物によって異なる。かかる量は、経験的に判定され得る。
【０１１４】
本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体および本明細書に提供される他の組成物はまた、特定の組織、受容体、または治療される対象の身体の他の領域を標的化するように製剤化され得る。多くのかかる標的化の方法は、当業者には周知である。全てのかかる標的化の方法は、本組成物における使用のために本明細書において企図される。標的化の方法の非限定的な例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、および同第５，７０９，８７４号を参照されたい。
【０１１５】
インビボ投与に使用される組成物は、滅菌であり得る。これは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１１６】
５．ポリヌクレオチド、ベクター、および抗ＡｐｏＣ３抗体を産生する方法
別の態様では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞）における組換え発現のためのかかるポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に提供される。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然源において（例えば、マウスまたはヒトにおいて）存在する他の核酸分子から分離したものである。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞形質成分、もしくは組換え技術によって産生された場合には培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことがある。例えば、「実質的に含まない」という表現は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（特に、約１０％未満）の他の物質、例えば、細胞形質成分、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆体、または他の化学物質を有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体をコードする核酸分子（複数可）は、単離または精製されている。
【０１１８】
具体的な態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ペプチドに特異的に結合し、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む抗体、ならびにＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ポリペプチドへの結合についてかかる抗体と競合する（例えば、用量依存的な様式で）か、またはかかる抗体と同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
【０１１９】
ある特定の態様では、本明細書に記載される抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体のＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含み得る（例えば、本明細書の表１〜４を参照されたい）。
【０１２０】
また、例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種シグナル配列での置き換え、およびｍＲＮＡ不安定要素の排除によって最適化されている、抗ＡｐｏＣ３抗体をコードするポリヌクレオチドも本明細書に提供される。コドン変化を導入するか、またはｍＲＮＡにおける阻害領域を排除することによって、組換え発現のための抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン）をコードする最適化された核酸を生成する方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号、同第６，１７４，６６６号、同第６，２９１，６６４号、同第６，４１４，１３２号、および同第６，７９４，４９８号に記載される最適化方法を適宜適応させることによって実施することができる。例えば、ＲＮＡ内の潜在的なスプライス部位および不安定要素（例えば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕに富む要素）は、各配列によってコードされたアミノ酸配列を改変せずに変異されて、組換え発現のためのＲＮＡの安定性を増加させることができる。改変は、例えば、同一のアミノ酸の代替的なコドンを使用して、遺伝暗号の縮重を利用する。いくつかの実施形態では、１つ以上のコドンを改変して、保存的変異、例えば、元のアミノ酸と類似の化学構造および特性または機能を有する類似のアミノ酸をコードすることが望ましい場合がある。かかる方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによってコードされた抗ＡｐｏＣ３抗体の発現と比べて、抗ＡｐｏＣ３の発現を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍以上増加させることができる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、補体）ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体または断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体の最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８５４９号（例えば、段落７２〜７３）を参照されたい。
【０１２２】
当該技術分野で既知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を判定することができる。本明細書に記載される抗体、例えば、表１に記載される抗体、およびこれらの抗体の修飾バージョンをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知の方法を使用して、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸を生成するように集合させて、判定することができる。抗体をコードするかかるポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから集合させることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２−６に記載されるように）、これは簡潔には、抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびにその後の、ライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０１２３】
ｄａｉイ的には、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング法）を使用して、好適な供給源（例えば、ハイブリドーマ）由来の核酸から生成することができる。例えば、目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得たゲノムＤＮＡを使用して、既知の配列の３’および５’末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅を実施することができる。かかるＰＣＲ増幅法を使用して、抗体の軽鎖または重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。かかるＰＣＲ増幅法を使用して、抗体の可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅した核酸は、宿主細胞における発現のため、ならびに例えば、キメラおよびヒト化抗体を生成するためのさらなるクローニングのためにベクター内にクローニングすることができる。
【０１２４】
特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリ由来のｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または本明細書に記載される抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織または細胞から生成された抗体ｃＤＮＡライブラリ、もしくはそれから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から化学的に合成されるか、またはそれから得ることができる。ＰＣＲによって精製された増幅した核酸は、その後、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１２５】
本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源として機能し得る。いったん単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に置かれ、これは次いで、別様に免疫グロブリンタンパク質を産生しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＨＯ細胞）、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中の抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体の合成を得る。
【０１２６】
完全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護する隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンのＶＨまたはＶＬ配列を増幅させることができる。当業者に既知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅したＶＨドメインを、重鎖定常領域、例えば、ヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅したＶＬドメインを、軽鎖定常領域例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ある特定の実施形態では、ＶＨまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、文筆シグナル、可変領域のためのクローニング部位、定常領域、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされてもよい。次いで、当業者に既知である技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時にトランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定または一過性細胞株を生成する。
【０１２７】
ＤＮＡはまた、例えば、マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合させることによって修飾され得る。
【０１２８】
本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドに、高、中、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、高、中、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供されるＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【０１２９】
ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で記載されており、当業者には既知である。例えば、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約５０〜６５℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を伴いうる。高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、約４５℃の６ｘＳＳＣ中でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、続いて約６８℃の０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を伴い得る。他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者には既知であり、記載されており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの６．３．１〜６．３．６および２．１０．３頁を参照されたい。
【０１３０】
ある特定の態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する本明細書に記載される抗体を発現する（例えば、組換えで）細胞（例えば、宿主細胞）、ならびに関連するポリヌクレオチドおよび発現ベクターが本明細書に提供される。宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞における組換え発現のための抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が本明細書に提供される。また、本明細書に記載されるＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体（例えば、ヒトまたはヒト化抗体）を組換え発現するためのかかるベクターを含む宿主細胞も提供される。特定の態様では、宿主細胞由来のかかる抗体を発現させることを含む、本明細書に記載される抗体を産生するための方法が本明細書に提供される。
【０１３１】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する本明細書に記載される抗体（例えば、本明細書に記載される全長抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、または一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を伴う。本明細書に記載される抗体分子、抗体の重鎖または軽鎖（例えば、重鎖または軽鎖可変領域）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該技術分野で周知の技術を使用した組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に記載される。当業者に周知である方法を使用して、配列ならびに転写および翻訳制御シグナルをコードする抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが含まれる。また、プロモーターに操作可能に連結した、本明細書に記載される抗体分子、抗体の重鎖もしくは敬アｓ、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変領域、または重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。かかるベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７号および同第ＷＯ８９／０１０３６号、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）を含んでもよく、抗体の可変領域は、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖および軽鎖全体の両方の発現のためのかかるベクターにクローニングされてもよい。
【０１３２】
発現ベクターは、従来の技術によって細胞（例えば、宿主細胞）に転送され得、得られた細胞はその後、本明細書に記載される抗体を産生するために従来の技術によって培養され得る。したがって、宿主細胞におけるかかる配列の発現のためのプロモーターに操作可能に連結した、本明細書に記載される抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその断片、または本明細書に記載される一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、二本鎖抗体の発現の場合、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは個々に、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞中で共発現され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される抗体またはその断片の重鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載される抗体またはその断片の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、の２つの異なるベクターを含有する。他の実施形態では、第１の宿主細胞は、本明細書に記載される抗体またはその断片の重鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は、本明細書に記載される抗体の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。特定の実施形態では、第１の細胞によって発現された重鎖／重鎖可変領域は、第２の細胞の軽鎖／軽鎖可変領域と会合して、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体を形成した。ある特定の実施形態では、かかる第１の宿主細胞と、かかる第２の宿主細胞とを含む宿主細胞集団が本明細書に提供される。
【０１３３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体の軽鎖／軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体の重鎖／重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含むベクター集団が本明細書に提供される。
【０１３４】
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載される抗体分子を発現させることができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。かかる宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、その後精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に本明細書に記載される抗体分子をインサイツで発現することができる細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；抗体コード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉ  ｐｌａｓｍｉｄ）で形質転換された植物細胞系（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの緑藻類）；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１もしくはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７０３０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、およびＢＭＴ１０細胞）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体を発現させるための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体を発現させるための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、特に、全組換え抗体分子の発現の場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間体である初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せて、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ＭＫ＆Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ  Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ４５：１０１−５およびＣｏｃｋｅｔｔ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８（７）：６６２−７）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＨＯ細胞または��ＳＯ細胞によって産生される。特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する本明細書に記載される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成型プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって制御されている。
【０１３５】
細菌系において、発現される抗体分子について意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量のかかる抗体が産生される場合、抗体分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいことがある。かかるベクターには、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がｌａｃ  Ｚコード領域を有するフレーム中でベクター内に個々にライゲーションされ得る、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ  Ｕ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ  Ｂ（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ２：１７９１−１７９４）；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅＳ＆Ｉｎｏｕｙｅ  Ｍ（１９８５）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ１３：３１０１−３１０９、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  Ｇ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＳＭ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２４：５５０３−５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン５−転移酵素（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現させることができる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１３６】
昆虫系において、異種遺伝子を発現させるためのベクターとして例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（Ａｃ  ＰＶ）を使用することができる。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非本質的な領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内へ個々にクローニングされ、ＡｎＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。
【０１３７】
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３つに分かれた（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションされ得る。その後、インビトロまたはインビボ組換えによりこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非本質的な領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主において生存可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらすことになる（例えば、Ｌｏｇａｎ  Ｊ＆Ｓｈｅｎｋ  Ｔ（１９８４）ＰＮＡＳ８１（１２）：３６５５−９を参照されたい）。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。さらに、挿入全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のもの（天然および合成の両方）であり得る。発現の有効性は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含むことによって増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
【０１３８】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、糖鎖付加）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴および特定の機構を有する。発現された異種タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的で、一次転写産物の適切なプロセシング、糖鎖付加、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。かかる哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（一切の免疫グロブリン鎖を外因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７０３０、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、ならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞がふくまれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において産生される。
【０１３９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、低減されたフコース含量を有するか、またはフコース含量を有しない。かかる抗体は、当業者に既知である技術を使用して産生され得る。例えば、抗体は、フコシル化の能力を不足または欠損している細胞において発現され得る。特定の例では、１，６−フコシル転移酵素の両方のアレルのノックアウトを有する細胞株を使用して、低減したフコース含量を有する抗体を産生することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、低減したフコース含量を有する抗体を産生するために使用され得るシステムの一例である。
【０１４０】
組換えタンパク質の長期的な高収量の産生のために、安定的な発現細胞が生成され得る。例えば、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体を安定的に発現する細胞株は、操作され得る。特定の実施形態では、本明細書に提供される細胞は、本明細書に記載される抗体を形成するために会合する軽鎖／軽鎖可変領域および重鎖／重鎖可変領域を安定的に発現する。
【０１４１】
ある特定の態様では、ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を、富化された培地中で１〜２日間成長させ、その後、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗を付与し、細胞がそれらの染色体内にプラスミドを安定的に組み込み、成長して増殖巣を形成することを可能にし、これを細胞株へとクローニングおよび増殖させることができる。この方法を有利に使用して、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体を発現する細胞株を操作することができる。かかる操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価においてとりわけ有用であり得る。
【０１４２】
いくつかの選択システムを使用することができ、これには、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞中の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９７７）Ｃｅｌｌ１１（１）：２２３−３２）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＥＨ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  Ｗ（１９６２）ＰＮＡＳ４８（１２）：２０２６−２０３４）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９８０）Ｃｅｌｌ２２（３）：８１７−２３）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、以下の遺伝子の選択の基準として抗代謝抵抗を使用することもできる：メトトレキサートに対する抵抗を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９８０）ＰＮＡＳ７７（６）：３５６７−７０、Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）ＰＮＡＳ７８：１５２７−３１）；ミコフェノール酸に対する抵抗を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ＆Ｂｅｒｇ  Ｐ（１９８１）ＰＮＡＳ７８（４）：２０７２−６）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗を付与するｎｅｏ（Ｗｕ  ＧＹ＆Ｗｕ  ＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７−９５、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ｐ（１９９３）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ３２：５７３−５９６、Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２、およびＭｏｒｇａｎ  ＲＡ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９３）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ６２：１９１−２１７、Ｎａｂｅｌ  ＧＪ＆Ｆｅｉｇｎｅｒ  ＰＬ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１１（５）：２１１−５）；ならびにハイグロマイシンに対する抵抗を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ＲＦ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｇｅｎｅ３０（１−３）：１４７−５６）。組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で一般的に既知な方法が日常的に選択され得、かかる方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  Ｍ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉ  ＮＣ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌの第１２および１３章、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：１−１４に記載され、これの全体は参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４３】
抗体文ｓの発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説について、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ＣＲ＆Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ  ＣＣＧ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅された領域が抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅ  ＧＦ  ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ３：２５７−６６）。
【０１４４】
宿主細胞を、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターの、本明細書に記載される２つ以上の発現ベクターで同時にトランスフェクトすることができる。２つのベクターは同一の選択マーカーを含有し得、これは重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする。宿主細胞を、異なる量の２つ以上の発現ベクターで同時にトランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、または１：５０の第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターの比でトランスフェクトすることができる。
【０１４５】
代替的には、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつこれらを発現することができる単一のベクターを使用してもよい。かかる状況では、過剰な毒性を有しない重鎖を回避するために、重鎖の前に軽鎖が置かれるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ＮＪ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２２：５６２−５６５およびＫｏｈｌｅｒ  Ｇ（１９８０）ＰＮＡＳ７７：２１９７−２１９９）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。発現ベクターは、モノシストロン性であってもマルチシストロン性であってもよい。マルチシストロン性核酸構築物は、ヌクレオチド当たり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれ以上、または２〜５、５〜１０、もしくは１０〜２０個の遺伝子をコードすることができる。例えば、バイシストロン性核酸構築物は、以下の順序で、プロモーター、第１の遺伝子（例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖）、および第２の遺伝子および（例えば、本明細書に記載される抗体の軽鎖）を含み得る。かかる発現ベクターにおいて、両方の遺伝子の転写はプロモーターによって駆動され得る一方、第１の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性スキャニング機構によるものであり得、第２の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性機構、例えばＩＲＥＳによるものであり得る。
【０１４６】
いったん本明細書に記載される抗体分子が組換え発現によって産生されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａの後の特定の抗原に対する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解度、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術によって精製され得る。さらに、本明細書に記載される抗体を、本明細書に記載されるか、または他の様式で当該技術分野において既知である異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。
【０１４７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、単離または精製されている。一般に、単離された抗体は、単離された抗体とは異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体の調製物は、細胞形質成分または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞形質を実質的に含まない」という表現は、抗体が、それがそこから単離または組換え産生された細胞の細胞形質成分から分離されている抗体の調製物を含む。したがって、細胞形質成分を実質的に含まない抗体には、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（乾燥重量で）の異種タンパク質（本明細書において「混在タンパク質」とも呼ばれる）を有する抗体の調製物、または抗体のバリアント、例えば、抗体の異なる翻訳後修飾形態もしくは抗体の他の異なるバージョン（例えば、抗体断片）が含まれる。抗体が組換え産生された場合、これはまた培養培地も概して実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満に相当する。抗体が化学的合成によって産生された場合、これは化学的前駆体または他の化学物質を概して実質的に含まず、すなわち、これは、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、抗体のかかる調製物は、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体または目的の抗体以外の化合物を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、単離または精製されている。
【０１４８】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体は、抗体の合成のための当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、化学的合成によって、または組換え発現技術によって産生され得る。本明細書に記載される方法は、別途示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当該技術分野内の関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、例えば、本明細世に引用される参考文献に記載され、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｒｒｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１４９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、例えば合成、遺伝子操作を介したＤＮＡ配列の作製を伴う任意の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体（例えば、組換え抗体）である。ある特定の実施形態では、かかる抗体は、インビボで動物または哺乳動物（例えば、ヒト）の抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列（例えば、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列）を含む。
【０１５０】
一態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される細胞または宿主細胞を培養することを含む、方法が本明細書に提供される。ある特定の態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される細胞または宿主細胞（例えば、本明細書に記載される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を使用して抗体を発現させる（例えば、組換え発現させる）ことを含む、方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、細胞は、単離された細胞である。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドが細胞内に導入されている。特定の実施形態では、本方法は、細胞または宿主細胞から得た抗体を精製するステップをさらに含む。
【０１５１】
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【０１５２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で既知の幅広い技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ例えば、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ＆Ｌａｎｅ  Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３  ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を使用して産生され得る。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載される抗体、例えば、かかる抗体の軽鎖または重鎖を外因的に発現する宿主細胞から組換え産生され得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、単一の細胞（例えば、組換え抗体を産生するハイブリドーマまたは宿主細胞）によって産生され、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、または当該技術分野で既知であるか、もしくは本明細書に提供される実施例における他の抗原結合もしくは競合結合アッセイによって判定されるように、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、一価抗体または多価（例えば、二価）抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、単一特異性または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得る。本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５に記載されるようなハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または例えば、本明細書に記載される技術を使用してファージライブラリから単離されてもよい。クローン細胞株、およびそれにより発現されたモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，（上記）の第１１章を参照されたい）。
【０１５４】
ハイブリドーマ技術を使用して特定の抗体を産生およびスクリーニングするための方法は、慣例的であり、当該技術分野で周知である。例えば、ハイブリドーマ法において、マウス、またはヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、もしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物に免疫付与して、免疫付与に使用されるタンパク質（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））に特異的に結合することになる抗体を産生するか、またはそれを産生することができるリンパ球を誘発する。代替的には、リンパ球は、インビトロで免疫付与され得る。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞に融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。さらに、ＲＦＭＭＳ（繰り返し免疫複数部位）技術を使用して、動物に免疫付与することができる（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１６：３８１−９、参照によりその全体が組み込まれている）。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、マウス（またはラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、もしくはイヌなどの他の動物）に抗原（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））で免疫付与することができ、いったん免疫応答が検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中で検出される）と、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離した。次いで、周知の技術によって脾細胞を任意の好適な骨髄腫細胞、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０に融合させて、ハイブリドーマを形成する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。ある特定の実施形態では、免疫付与したマウスのリンパ節を採取し、ＮＳＯ骨髄腫細胞と融合させる。
【０１５６】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培養培地中で播種および増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むことになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【０１５７】
特定の実施形態は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感応性である骨髄腫細胞を用いる。これらの骨髄腫細胞株の中には、マウス骨髄腫細胞株、例えば、ＮＳＯ細胞株、またはＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手可能なＳＰ−２もしくはＸ６３−Ａｇ８．６５３細胞に由来するものがある。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ（１９８４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１３３：３００１−５、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１５８】
ハイブリドーマ細胞を増殖させている培養培地を、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、当該技術分野で既知の方法、例えば、免疫沈降法によって、または放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって判定される。
【０１５９】
所望の特異性、親和性、または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（上記））。この目的のために好適な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１６０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、好適には、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、または血清から分離される。
【０１６１】
本明細書に記載される抗体には、特異的ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を認識し、かつ当業者に既知である任意の技術によって生成され得る抗体断片が含まれる。例えば、本明細書に記載されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を使用して、免疫グロブリンのタンパク質切断によって産生され得る。Ｆａｂ断片は、抗体分子の２つの同一のアームのうちの一方に対応し、重鎖のＶＨおよびＣＨＩドメインと対になった完全な軽鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって結合した抗体分子の２つの抗原結合アームを含有する。
【０１６２】
さらに、本明細書に記載される抗体はまた、当該技術分野で既知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、患部組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリ）から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと共に組換え、ファージミドベクターにクローニングする。ベクターをＥ．ｃｏｌｉ中に電気穿孔し、Ｅ．ｃｏｌｉは、ヘルパーファージに感染させる。これらの方法に使用するファージは、典型的には、ｆｄおよびＭｌ３を含む繊維状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合されている。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、抗原により選択または同定され得る。本明細書に記載される抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ１８２：４１−５０、Ａｍｅｓ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ１８４：１７７−１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：９５２−９５８、Ｐｅｒｓｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｇｅｎｅ１８７：９−１８、Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ＆Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ（１９９４）Ａｄｖａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ５７：１９１−２８０、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４号、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、同第ＷＯ９１／１０７３７号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９３／１１２３６号、同第ＷＯ９５／１５９８２号、同第ＷＯ９５／２０４０１号、および同第ＷＯ９７／１３８４４号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号に開示されるものが挙げられる。
【０１６３】
上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、単離され、ヒト抗体を含む全抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために使用され、例えば、以下に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１２（６）：８６４−９、Ｓａｗａｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３４：２６−３４、およびＢｅｔｔｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３に開示されものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片を組換え産生する技術も用いられ得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、完全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護する隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、鋳型、例えばｓｃＦｖクローンからＶＨまたはＶＬ配列を増幅させることができる。当業者に既知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅したＶＨドメインを、ＶＨ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅したＶＬドメインを、ＶＬ定常領域例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされてもよい。次いで、当業者に既知である技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時にトランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定または一過性細胞株を生成する。
【０１６５】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合した、マウスまたはラットモノクローナル抗体の可変領域を含有し得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−７、Ｏｉ  ＶＴ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４−２２１、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２、ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、および同第６，３３１，４１５号を参照されたい。
【０１６６】
ヒト化抗体は、所定の抗原位結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウス免疫グロブリン）のアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲとを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含んでもよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む、任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、および米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面最古構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第ＥＰ５９２１０６号および同第ＥＰ５１９５９６号、Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５−８１４、およびＲｏｇｕｓｋａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）ＰＮＡＳ９１：９６９−９７３）、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３／１７１０５号、Ｔａｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１６９：１１１９−２５、Ｃａｌｄａｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３５３−６０、Ｍｏｒｅａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ２０（３）：２６７−７９、Ｂａｃａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７２（１６）：１０６７８−８４、Ｒｏｇｕｓｋａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ９（１０）：８９５  ９０４、Ｃｏｕｔｏ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ、Ｃｏｕｔｏ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ５５（８）：１７１７−２２、Ｓａｎｄｈｕ  ＪＳ（１９９４）Ｇｅｎｅ１５０（２）：４０９−１０、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３５（３）：９５９−７３に開示される技術を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知多様な技術を使用して産生され得る。参照によりその全体が組み込まれている米国出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４Ａ１号（２００５年２月２４日）も参照されたい。
【０１６７】
多重特異性（例えば、二重特異性抗体）を作製するための方法は記載されており、例えば、米国特許第７，９５１，９１７号、同第７，１８３，０７６号、同第８，２２７，５７７号、同第５，８３７，２４２号、同第５，９８９，８３０号、同第５，８６９，６２０号、同第６，１３２，９９２号、および同第８，５８６，７１３号を参照されたい。
【０１６８】
単一ドメイン抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体は、当該技術分野で周知の方法によって産生され得る。Ｓｅｅ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ＆Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ２３１：２５−３８、Ｎｕｔｔａｌｌ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１（３）：２５３−２６３、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ７４（４）：２７７−３０２、米国特許第６，００５，０７９号、および国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号、同第ＷＯ９４／２５５９１号、および同第ＷＯ０１／４４３０１号を参照されたい。
【０１６９】
さらに、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原に特異的に結合する抗体を利用して、当業者に周知の技術を使用して抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成することができる。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＮＳ＆Ｂｏｎａ  ＣＡ（１９８９）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ  Ａ（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【０１７０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＡｐｏＣ３抗体と同じＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）のエピトープに結合する本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体である。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のいずれか１つのＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への結合を競合的にブロックする本明細書に記載される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当業者に既知である任意の方法を使用して産生され得る。例えば、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによって、マウス胚幹細胞内に導入され得る。代替的には、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域がマウス胚幹細胞内に導入されてもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別に、または同時に非機能性となってもよい。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生を防止する。修飾された胚肝細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを産生する。その後、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。トランスジェニックマウスに通常の様式で、選択された抗原、例えば、抗原（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））の全てまたは一部で免疫付与する。従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫付与したトランスジェニックマウスから抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再構成し、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。このように、かかる技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ＆Ｈｕｓｚａｒ  Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ１３：６５−９３を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、および同第ＷＯ９６／３３７３５号、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。ヒト抗体を産生することができるマウスの例としては、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍ、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ  Ｃｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）、ならびにＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄ��ｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）が挙げられる。
【０１７１】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する上記のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で既知の多様な方法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、および同第５，８８５，７９３号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号も参照されたい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、マウス−ヒトハイブリドーマを使用してヒト抗体を産生することができる。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス−ヒトハイブリドーマを産生することができ、これらのマウス−ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを判定することができる。かかる方法は既知であり、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４６：１９−２３、Ｎａｇａｎａｗａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ１４：２７−３１を参照されたい）。
【０１７３】
６．キット
１つ以上の本明細書に記載される抗体またはその医薬組成物もしくはコンジュゲートを含むキットも提供される。特定の実施形態では、本明細書に提供される１つ以上の抗体などの、本明細書に記載される医薬組成物の１つ以上の成分で充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される医薬組成物と、本明細書に記載されるものなどの任意の予防剤または治療剤とを含有する。医薬製品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が、かかる容器（複数可）と任意で関連付けられ得、この通知は、ヒトへの投与についての当該機関による製造、使用、または販売の承認を示す。
【０１７４】
また、上記の方法に使用され得るキットも提供される。一実施形態では、キットは、本明細書に記載される抗体、好ましくは精製された抗体を１つ以上の容器に含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されるキットは、実質的に単離されたＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原を対照として含有する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載されるキットは、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）と反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の実施形態では、本明細書に記載されるキットは、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原への抗体の結合を検出するために１つ以上の要素を含有する（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、または発光化合物などの検出可能な基質にコンジュゲートされ得るか、第１の抗体を認識する第２の抗体は、検出可能な基質にコンジュゲートされ得る）。特定の実施形態では、本明細書に提供されるキットは、組換え産生されたか、または化学的に合成されたＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原を含んでもよい。キットに提供されるＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原はまた、固体支持体に結合していてもよい。より具体的な実施形態では、上記のキットの検出手段は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原が結合している固体支持体を含む。かかるキットはまた、非結合リポーター標識抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体を含んでもよい。この実施形態では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原への抗体の結合は、当該リポーター標識抗体の結合によって検出され得る。
【実施例】
【０１７５】
このセクション中の実施例は、本出願の利点および特徴をさらに明瞭にするために提供されるが、本出願の範囲を限定することは意図しない。実施例は、例示目的のみのためのものである。
【０１７６】
実施例１：免疫付与した動物からの抗ＡｐｏＣ３抗体ファージディスプレイライブラリの構築
この実施例は、抗ＡｐｏＣ３抗体ライブラリの最初の構築を説明する。ヒト血清から精製されたヒトＡｐｏＣ３（ｈｕＡｐｏＣ３）タンパク質をＡｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。このｈｕＡｐｏＣ３タンパク質を、本実施例および以下の実施例のいくつかに使用した。ＨｕＡｐｏＣ３をジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）リポソームと複合体化して、生理学的に適切な構造と近似させた。Ｋｌａｒｅｎｂｅｅｋおよび同僚ら（Ｋｌａｒｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ（２０１６）２９（４）：１２３−１３３）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）によって記載される手順に従い、筋肉内注射によってフロイント不完全アジュバントを含む６用量のｈｕＡｐｏＣ３で２匹のラマに免疫付与した。免疫付与スケジュールは、各１００μｇのｈｕＡｐｏＣ３の最初の２回の投与、各５０μｇのｈｕＡｐｏＣ３のさらに４回の投与、続いて各５０μｇのｈｕＡｐｏＣ３の２回のブースター投与での毎週の注射を含んだ。ブースト後に、免疫付与したラマの血液試料から末梢血リンパ球を単離した。全ＲＮＡを抽出し、ランダムプライマーで増幅したｃＤＮＡライブラリの調製のための鋳型として使用した。抗体レパートリーを増幅し、前述したようにｓｃＦｖファージディスプレイライブラリとしてのクローン（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｏｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｃＦｖ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＧＣＧＲ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｅｗ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｏｐｓ．（２０１６）ｍＡｂｓ，８（６）：１１２６−３５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれている））。
【０１７７】
バイオパニング手順においてコーティングされたｈｕＡｐｏＣ３上で、または代替的にはコーティングされたストレプトアビジン上に捕捉されたビオチン化ＡｐｏＣ３を用いて、ファージディスプレイライブラリを選択した。ファージをｐＨ５．５で溶出させて、酸性条件下でｈｕＡｐｏＣ３に対する親和性を失った抗体クローンを選択した。３ラウンドの選択の後、単一のコロニーを調製し、実施例２に記載される抗体スクリーニングに供した。
【０１７８】
実施例２：抗ＡｐｏＣ３モノクローナル抗体のスクリーニング
この実施例は、ＡｐｏＣ３に結合する抗体についての、実施例１で調製したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリのスクリーニングを記載する。プレート上に直接コーティングした精製されたＡｐｏＣ３を用いるもの、およびプレート上にコーティングしたストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン化ＡｐｏＣ３を用いるものの、２つのＥＬＩＳＡベースのスクリーニング法を採用した。各方法は、ＡｐｏＣ３に対する親和性を有するいくつかの抗体クローンを明らかにした。これらの２つのアッセイから同定されたクローン間で著しい重複があり、その差は、ＡｐｏＣ３タンパク質の構造の相違および２つの条件下でのエピトープの曝露を反映している可能性がある。
【０１７９】
２．１直接コーティングしたＡｐｏＣ３に対する親和性の分析
プレート上に直接コーティングした精製されたｈｕＡｐｏＣ３（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって、実施例１で構築したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリから選択した抗体クローンを分析した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中に希釈した１〜１０μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）の濃度のヒト天然ＡｐｏＣ３を、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  ｃａｔ＃４５６５３７または同様）中で、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含有する２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でコーティングしたプレートを３回洗浄して、過剰な未結合抗原を除去した。洗浄後、ＰＢＳ中で調製した２５０μｌの４％（ｍ／ｖ）乾燥脱脂乳溶液をブロッキングのために各コーティングしたウェルに添加し、プレートシェーカー（ＴｉｔｒａＭａｘ１０００またはＨｅｉｄｏｌｐｈ）上で、室温で１〜２時間インキュベートした。ブロッキング後、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄して、過剰なブロッキング溶液を除去した。粗製ペリプラズム抽出液（Ｐ．Ｅ．）（１００μｌの最終容積になるようにＰＢＳ中で１：５に希釈された）からの抗体断片（ｓｃＦｖ）を、プレートシェーカー上で室温で１時間、固定化した抗原に結合させた。２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄することによってＰ．Ｅ．中の未結合の可溶性ｓｃＦｖを除去した。検出のために、ウェルあたり１００μｌの、ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端に融合したｃ−ｍｙｃタグを認識する抗ｃ−ｍｙｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートモノクローナルＡｂ（Ｂｅｔｈｙｌ、ｃａｔ＃：Ａ１９０−１．０５Ｐまたは同様）を、１％（ｍ／ｖ）乾燥脱脂乳溶液中１：５０００希釈で使用した。室温で１時間のインキュベーション後、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回、および２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで３回、プレートを続けて洗浄した。分光光度検出を使用して、ＨＲＰ酵素コンジュゲートによって触媒された３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ＃：００−４２０１−５６）の酸化を監視した。ウェル当たり１００μｌの０．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ分光光度計を使用して最終生成物の吸光度を４５０ｎｍで測定した。盲検のＰ．Ｅ．を受けた対照ウェルと比較した吸光度値に基づいて、結合親和性を判定した。
【０１８０】
ｈｕＡｐｏＣ３に対する親和性を有するものとして３０個の抗体が同定された。最も強いシグナルをもたらしたクローンは、８Ｂ４、８Ａ４、８Ｈ４、１Ｄ５、１２Ｅ１２、６Ａ６、１０Ｂ６、４Ｈ１、５Ａ７、８Ｆ４、５Ｃ１１、７Ｄ９、５Ａ８、９Ａ４、４Ｃ２、５Ａ４、１２Ｃ３、および５Ｅ５である。これらのクローンのうちのいくつかのＶＨおよびＶＬの配列は、表１〜４に列挙される。
【０１８１】
２．２捕捉されたビオチン化ＡｐｏＣ３に対する親和性の分析
プレート上にコーティングしたストレプトアビジンによって捕捉されたビオチン化ＡｐｏＣ３を用いるＥＬＩＳＡアッセイによって、実施例１で構築したｓｃＦｖファージディスプレイライブラリから選択した抗体クローンを分析した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で希釈した２〜５μｇ／ｍｌの濃度のニュートラアビジン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＤＡｃａｔ＃：Ｗ９９９５Ｌ）（１００μｌ／ウェル）を、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  ｃａｔ＃４５６５３７または同様）中で、４℃で一晩インキュベートした。コーティングしたプレートを２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄して、過剰な未結合ニュートラアビジンを除去した。洗浄後、ＰＢＳ中で調製した２５０μｌの１％（ｍ／ｖ）カゼイン溶液をブロッキングのために各コーティングしたウェルに添加し、プレートシェーカー（ＴｉｔｒａＭａｘ１０００、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ、または同様）上で、室温で１〜２時間インキュベートした。ブロッキング後、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔでプレートを３回洗浄して、過剰なブロッキング溶液を除去した。ヒト天然ＡｐｏＣ３タンパク質（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のランダム部位にビオチン基を導入した。ＰＢＳ中０．１％（ｍ／ｖ）カゼイン中で１〜５ｎＭ（ウェル当たり１００μｌ）の濃度で希釈したビオチン化ＡｐｏＣ３を、コーティングおよびブロックしたプレート中で、ＡｐｏＣ３抗原の捕捉のために室温で１時間インキュベートした。２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄することによって、未結合の抗原を除去した。室温で１時間のインキュベーションの間に、粗製Ｐ．Ｅ．（１００μｌの最終容積になるようにＰＢＳ中で１：５に希釈された）からの抗体断片（ｓｃＦｖ）を捕捉された抗原に結合させた。２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔでプレートを５回洗浄することによって未結合の可溶性ｓｃＦｖ断片を除去した。検出のために、ウェルあたり１００μｌの、ｓｃＦｖ抗体断片のＣ末端に融合したｃ−ｍｙｃタグを認識する抗ｃ−ｍｙｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートモノクローナルＡｂ（Ｂｅｔｈｙｌ、ｃａｔ＃：Ａ１９０−１．０５Ｐまたは同様）を、１％（ｍ／ｖ）乾燥脱脂乳溶液中１：５０００希釈で使用した。室温で１時間のインキュベーション後、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳ−Ｔで３回、および２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで３回、プレートを続けて洗浄した。分光光度検出を使用して、ＨＲＰ酵素コンジュゲートによって触媒されたＴＭＢの酸化を監視した。ウェル当たり１００μｌの０．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止させた。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ分光光度計を使用して最終生成物の吸光度を４５０ｎｍで測定した。盲検のＰ．Ｅ．を受けた対照ウェルと比較した吸光度値に基づいて、結合親和性を判定した。
【０１８２】
ｈｕＡｐｏＣ３に対する親和性を有するものとして１７個の抗体が同定された。４５０ｎｍで最も強い吸光度をもたらしたクローンは、１２Ｅ１２、１２Ｃ３、１３Ｃ１０、１３Ｇ７、１２Ｇ８、１４Ｃ４、１３Ｆ２、１３Ｃ７、１４Ｇ４、１２Ｄ７、１４Ｃ７、１２Ａ３、および１２Ｅ３である。クローンのうちのいくつかのＶＨおよびＶＬの配列は、表１〜４に列挙される。
【０１８３】
２．３Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲアッセイ
この実施例は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００器具（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用するＳＰＲベースアッセイを使用した、中性条件下でのＡｐｏＣ３に対するそれらの親和性に関する抗ＡｐｏＣ３抗体の特性評価について記載する。天然ｈｕＡｐｏＣ３タンパク質をＣＭ５チップ上に固定化した。Ｂｉａｃｏｒｅによって提供される方法に従い、ＮＨＳ／ＥＤＣキット（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用して固定化を実施した。チップの活性化後、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中、６０μｇ／ｍｌのヒトＡｐｏＣ３を調製し、表面密度が約１０００ＲＵに達するまでこれを注入した。Ｂｉａｃｏｒｅによって提供される方法に従い、２０μｌの１０μｇ／ｍｌビオチン化ヒトＡｐｏＣ３の注入によって、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ（ＳＡ）上でのヒトＡｐｏＣ３の捕捉を実施し、それにより約５００ＲＵの表面密度に達した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ、ｃａｔ＃ＢＲ−１００８−２６、０．０１０Ｍ  ＨＥＰＥＳ、０．１５０Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中で希釈された１〜１００ｎＭの範囲の６０μＬの試験抗体を注入し、３０μｌ／分の流速でフローセルに通し、続いてｐＨ７．４またはｐＨ５．５で５分間オフ速度洗浄した。解離後、１０μｌの１０ｍＭ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０μｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を注入することによってフローセル表面を再生させた。ラングミュア１：１結合モデルを使用するＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを使用して、得られたセンサグラムを分析して、結合速度を得た。データをゼロ調節し、参照セルセンサグラムを減じた。
【０１８４】
このアッセイでは、いくつかのｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を検証した。これらの抗体の会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、分析物結合能力（Ｒｍａｘ）、平衡会合定数（ＫＡ）、および平衡解離定数（ＫＤ）は、表５に示される。
【表５】
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【０１８５】
実施例３：脂質競合アッセイ
この実施例は、ＡｐｏＣ３への結合について脂質と競合するかどうかに関する抗ＡｐｏＣ３抗体の特性評価について記載する。最初にＥＬＩＳＡベースアッセイを行って、脂質結合を抑止したかまたはしなかった抗体を同定した。結果をさらに確認するために、次に、ある特定のクローンで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースアッセイを行った。
【０１８６】
３．１ＥＬＩＳＡベースアッセイ
実施例２から同定された抗ＡｐｏＣ３抗体が、ｈｕＡｐｏＣ３タンパク質とＥＬＩＳＡプレート上に固定化された脂質との間の相互作用に干渉したかどうかを判定するために、ＥＬＩＳＡベース脂質競合アッセイを実施した。簡潔には、クロロホルム中の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ＤＭＰＣ、１４：０ＰＣ）をメタノール：クロロホルム：水（２．０：１．０：０．８）の混合物中で希釈した。５μｇのＤＭＰＣをＧｒｅｉｎｅｒ  Ｕ底高結合プレート（＃８５０３４５）の各ウェル内に分配し、クロロホルム、メタノール、および水溶媒を室温で最低３時間蒸発させた。ＰＢＳ中に溶解した無脂肪乳粉末（本明細書において「クリアミルクＰＢＳ」と呼ばれる）からなる２００μＬの緩衝液中でウェルを４℃で一晩ブロックした。各試験抗体を、ヒト血清（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から精製した天然ＡｐｏＣ３タンパク質と混合した。５０μＬの混合溶液をＤＭＰＣでコーティングしたマイクロタイタープレート内に分配し、プレートを室温で２時間、３００ｒｐｍで回転させた。２００μＬのＰＢＳでプレートを４回洗浄した。クリアミルクＰＢＳ中に溶解した５０μＬのビオチン化抗ａｐｏＣ３ポリクローナルヤギ抗体（Ａｂｅａｍ＃ａｂ２１０２４）を添加し、プレートを室温で１時間、３００ｒｐｍで回転させた。２００μｌのＰＢＳでプレートを１回洗浄し、５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液（Ａｂｅａｍ＃３４０２８、ＰＢＳ中で１００倍希釈）を添加した。プレートを室温で３０分間、３００ｒｐｍで回転させた。２００μＬのＰＢＳでウェルを４回洗浄した。８０μＬのＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ開発試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ＃３４０２８）を添加し、発色した後に５０ｕＬの０．５Ｎ  ＨＣＬにより発色反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、４パラメータロジスティック関数（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６）を使用してデータを分析した。
【０１８７】
図１に示されるように、クローン１２Ｃ１２、１２Ｄ７、１２Ｇ８、１３Ｇ７、１４Ｃ４、および１４Ｃ７は、ｈｕＡｐｏＣ３への脂肪の結合を阻害した一方、クローン１２Ａ３、１２Ｃ３、１２Ｄ１、１２Ｄ４、１２Ｅ１２、１３Ｃ７、１３Ｃ１０、１３Ｆ２、１４Ｆ２、および１４Ｇ４はそれを阻害しなかった。
【０１８８】
３．２ＳＰＲベースＶＬＤＬ結合アッセイ
選択された抗ＡｐｏＣ３抗体、すなわちｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマットの１４Ｃ７、５Ｅ５、および６Ａ６が、ＡｐｏＣ３結合について脂質と競合したかどうかを確認するために、ＳＰＲベース脂質競合アッセイを実施した。Ｍｅｎｄｏｚａ−Ｂａｒｂｅｒａおよび同僚ら（Ｍｅｎｄｏｚａ−Ｂａｒｂｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ２０１３）によって記載されたように、ＬＩセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上にＶＬＤＬリポソームを固定化した。図２のパートＡに示されるように、１０μｌ／分での１０μｇ／ｍｌのＡｐｏＣ３の注入は、ｔ＝１８００ｓで、緩衝液または１４Ｃ７ｍＡｂが注入された陰性対照と比較して増加した結合シグナルを生成し、これは、固定化されたＶＬＤＬリポソーム内にＡｐｏＣ３が組み込まれたことを示す。ｔ＝２１００ｓでの緩衝液の注入はシグナルの低減をもたらしたが、シグナルは、陰性対照と比較してベースラインを上回ったままであり、これは、ＶＬＤＬリポソーム内にＡｐｏＣ３が組み込まれたことを示す。比較すると、事前にインキュベートした１０μｇ／ｍｌのＡｐｏＣ３および１０μｇ／ｍｌの１４Ｃ７抗体の混合物がｔ＝１８００ｓで注入されたとき（「１４Ｃ７＋」として示される）、結合シグナルの初めの増加が認められたが、ｔ＝２１００ｓで緩衝液が注入されると、応答は陰性対照と同様にバックグラウンドレベルに戻り、これは、１４Ｃ７がＡｐｏＣ３と脂質との間の安定的な相互作用に干渉したことを示す。
【０１８９】
ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＡｐｏＣ３への結合について脂質と競合しなかった５Ｅ５および６Ａ６も、このＳＰＲベースアッセイ系で検証した。図２のパートＢに示されるように、５Ｅ５または６Ａ６の存在下でのＡｐｏＣ３の注入は結合シグナルの増加をもたらし、この結合シグナルは、ｔ＝２１００ｓでの緩衝液注入時にＡｐｏＣ３単独のシグナルよりも強いままに留まった。この結果は、ＡｐｏＣ３−５Ｅ５またはＡｐｏＣ３−６Ａ６複合体は、ＡｐｏＣ３−ＶＬＤＬとの相互作用を介してセンサーチップ上に保持されたことを示した。したがって、５Ｅ５および６Ａ６は、ＡｐｏＣ３結合について脂質と競合しなかった。ＡｐｏＣ３を含まない５Ｅ５または６Ａ６単独の対照試料は、試験表面に結合しなかった。
【０１９０】
３．３ＳＰＲベースリポソーム結合アッセイ
ＩｇＧ１フォーマットの１４Ｃ７、５Ｅ５、および６Ａ６抗体がＡｐｏＣ３結合について脂質と競合したかどうかを確認するために、第２のＳＰＲベース脂質競合アッセイを実施した。簡潔には、１００ｍｇ／ｍｌの濃度に達するようにガラスバイアル中で約５ｍｇのＤＭＰＣ（Ｓｉｇｍａ）をクロロホルム中に溶解することによってＤＭＰＣリポソームを調製した。ガラスバイアルを真空下に３時間置いてクロロホルムを除去し、それによりＤＭＰＣに脂質膜を形成させた。１ｍｌの再懸濁緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を脂質膜に添加し、膜が壁から外れるまで激しくボルテックスした。６回の凍結解凍サイクル（液体窒素中）の後、１００ｎｍポリカーボネート膜を通して懸濁液を３０回のストロークで押し出してリポソームを形成した。リポソームをＨＢＳ−Ｎ緩衝液中で１：１０に希釈した。１０μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＨを１０μｌ／分で、続いて３００μｌのＨＢＳ−Ｎ緩衝液を１５０μｌ／分で注入することによって、ＬＩセンサーチップを活性化させた。活性化したチップ表面上に固定化させるために、２０μｌのリポソームを２μｌ／分で注入した。その後、２０μｌの１００ｍＭ  ＮａＯＨ、続いて１０μｌの１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを注入した。ＨＢＳ−Ｎ緩衝液で表面を洗浄した後、天然ヒトＡｐｏＣ３タンパク質をｔ＝１８００ｓで注入して、リポソーム−ＡｐｏＣ３複合体を形成した。次いで、１４Ｃ７、５Ｅ５、および６Ａ６抗体をｔ＝４４００ｓで注入した。
【０１９１】
図２のパートＣに示されるように、５Ｅ５および６Ａ６抗体の注入時により大きい複合体が検出され、これは、これらの２つの抗体が脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができたことを示す。５Ｅ５および６Ａ６抗体は、ＡｐｏＣ３についてＡｐｏＡｌが置換された対照群においてシグナルを生成せず（データは示されない）、これは、それらがＡｐｏＡｌまたはＤＭＰＣリポソーム単独には結合しなかったことを示す。
【０１９２】
実施例４：ＡｐｏＣ３媒介性リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）阻害アッセイ
４．１ＬＰＬ活性の調節の分析
この実施例は、ＡｐｏＣ３媒介性ＬＰＬ阻害を減弱させるそれらの能力に関する抗ＡｐｏＣ３抗体の特性評価について記載する。１４Ｃ７、１３Ｇ７、５Ｅ５、および６Ａ６抗体を、ＩｇＧｌ形態に再フォーマット化し、インビトロＬＰＬ活性アッセイにおいて検証した。１４Ｃ７および１３Ｇ７は、ＬＰＬのＡｐｏＣ３媒介性阻害を減弱させ、用量依存性様式でＬＰＬ活性を著しく増加させた（図３）。１４Ｃ７および１３Ｇ７のＥＣ５０値は、それぞれ約２μΜおよび３μΜであった。かかる減弱は、５Ｅ５または６Ａ６抗体ではより弱く、それほど顕著ではなく、これらは５μΜ超のＥＣ５０値を有した。
【０１９３】
４．２材料および方法
２０％のイントラリピド乳濁液（ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ−２１５１８２）を、１０℃で１５分間、１５，０００ｘｇでの浮上分離により５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で３回洗浄して、過剰なリン脂質および他のより小さい脂質粒子を除去した。洗浄プロセスの終わりに、イントラリピドは１０％であると予測された。５０ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２％のＢＳＡ、１５ユニット／ｍＬのヘパリンからなるアッセイ緩衝液にイントラリピドを１００倍で希釈した。試験抗体を含有する２０μＬのイントラリピド、アッセイ緩衝液中のヒト血清（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から精製された２０μＬの天然ＡｐｏＣ３タンパク質、およびウシ乳から単離されたアッセイ緩衝液中の２０μＬのＬＰＬの添加によってアッセイをＶ底ポリプロピレンプレート（Ｆａｌｃｏｎ＃３５３２６３）に集めた。アッセイ緩衝液中のイントラリピド、ＡｐｏＣ３タンパク質、およびＬＰＬの最終濃度は、それぞれ０．１％、１．５μΜ、および３０ｎＭであった。アッセイを３０℃で３０分間進行させ、２０μΜのオルリステート（Ｏｒｌｉｓｔａｔｅ）を補充した１００μＬのＷａｋｏ  ＮＥＦＡ試薬Ａ（９９９−３４６９１、９９５−３４７９１）の添加によって終結させた。３０℃で２０分間の後、２００μΜのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を補充した５０μｌのＷａｋｏ  ＮＥＦＡ試薬Ｂ（９９１−３４８９１、９９３−３５１９１）を添加し、プレートを３０℃で２０分間インキュベートした。１２０μｌの一定分量を黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３９１５）に移し、ｅｘ５６０ｎｍ／ｅｍ５８５ｎｍで蛍光を読み取った。４パラメータロジスティック関数（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６）を使用してデータを分析した。
実施例５：肝細胞ＶＬＤＬ摂取アッセイ
５．１肝細胞ＶＬＤＬ摂取の分析
この実施例は、ＡｐｏＣ３による肝細胞ＶＬＤＬ摂取の阻害を逆転させるそれらに能力に関する抗ＡｐｏＣ３抗体の特性評価について記載する。図４に示されるように、クローン５Ａ４、５Ａ７、５Ａ１１、５Ｅ５、６Ａ６、７Ａ９、８Ａ４、８Ｂ４、８Ｂ７、８Ｆ４、８Ｈ４、１０Ｂ６、１２Ａ３、１２Ｃ３、１２Ｃ１２、１２Ｄ１、１２Ｄ４、１２Ｅ１２、１３Ｃ７、１３Ｇ７、１４Ｃ４、１４Ｃ７、および１４Ｇ４は、ＨｅｐＧ２細胞によるＶＬＤＬ摂取を増加させた。ＶＬＤＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力の減弱は、図４中の値から定量化することができる。「ＡｐｏＣ３」と標識された第１の棒は、肝細胞培養液に添加した精製されたＡｐｏＣ３によるＶＬＤＬ摂取のレベルを示す。「対照」と標識された第２の棒は、外因性ＡｐｏＣ３の不在化での肝細胞培養液中のＶＬＤＬ摂取のレベルを示す。第１の棒の値を阻害０％とし、第２の棒の値を阻害１００％として、５Ａ４、５Ａ７、５Ａ１１、５Ｅ５、６Ａ６、７Ａ９、８Ａ４、８Ｂ４、８Ｂ７、８Ｆ４、８Ｈ４、１０Ｂ６、１２Ａ３、１２Ｃ３、１２Ｃ１２、１２Ｄ１、１２Ｄ４、１２Ｅ１２、１３Ｃ７、１３Ｇ７、１４Ｃ４、１４Ｃ７、および１４Ｇ４によるＶＬＤＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力の減弱は、それぞれ約１００％、５０％、５５％、１００％、７５％、５０％、４０％、６０％、４０％、７５％、７０％、７０％、１００％、８５％、１００％、６０％、６０％、４０％、９５％、１００％、６０％、１００％、および１００％である（図４のパートＡ）。５Ａ７、７Ａ９、および８Ｂ７は、同じＶＨおよびＶＬ配列を有した。クローン１Ｄ５、１Ｄ８、１Ｇ４、４Ｃ２、４Ｈ１、５Ａ８、５Ｅ７、７Ｄ９、および１３Ｃ１０は、ＨｅｐＧ２細胞によるＶＬＤＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させなかった（図４のパートＢ）。
【０１９４】
５．２材料および方法
１０％ＦＣＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）を補充した１００μＬ完全ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でポリ−ｄ−リジンでコーティングした９６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ＃６５５９４０）上にＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  Ｈｂ−８０６５）を播種し、５％Ｃ０２を用いて３７℃で培養した。２４時間後、培地を除去し、０．０１２５％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ）を補充した２００μＬの完全ＭＥＭで細胞単層を１回洗浄した。０．０１２５％ウシ血清アルブミンを補充した完全ＭＥＭの１００μＬの新鮮な培地を添加した。さらに２４時間後、培地を除去し、０．０１２５％ＢＳＡを補充したＭＥＭ中の、３μΜのＡｐｏＣ３（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および１．５〜４μΜの試験抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃフォーマット）を含有する５０μＬの試験混合物で置き換えた。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、３０μｇ／ｍｌのＡｐｏＣ３枯渇Ｄｉｌ  ＶＬＤＬ（Ｋａｌｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＬＬＣ＃７７０１３０−９）を試験混合物に添加した。４時間のインキュベーション後、試験混合物を除去し、完全ＭＥＭ中で１００μＬの１％イントラリピドと共に細胞を２０分間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。培地を除去し、２００μｌ、３７℃のＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ１４１９０−１４４）で細胞を３回洗浄した。洗浄後、１００μｌのイソプロパノールを各ウェルに添加し、軽く振とうさせながら室温で１５分間プレートをインキュベートした。７５μｌの一定分量を黒色の９６ウェルプレート（ＶＷＲ８９０８９−５８２）に移し、蛍光を測定した（ｅｘ＝５２０ｎｍ、ｅｍ＝５８０）。イソプロパノールの単位容積当たりの細胞から抽出されたＤｉｌ−ＶＬＤＬの量は、Ｄｉｌ−ＶＬＤＬ標準曲線から判定される。残りのイソプロパノールを細胞プレートから除去し、１００μｌの溶解緩衝液（０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳ）を各ウェルに添加した。最低３０分間のインキュベーションの後、２５μＬの一定分量を使用してタンパク質を定量化した（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃２３２２５）。Ｄｉｌ−ＶＬＤＬ対タンパク質の量の比として細胞へのＶＬＤＬ摂取の量を計算した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用してグラフ化され、平均＋／−ＳＥＭとして報告される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用して複数の比較を伴う一元配置分散分析を計算した。
【０１９５】
実施例６：異種間反応性アッセイ
この実施例は、Ｂｉａｃｏｒｅベースアッセイを使用して、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＡｐｏＣ３（ｃｙｎｏＡｐｏＣ３）タンパク質と交差反応するそれらの能力に関する抗ＡｐｏＣ３抗体の特性評価について記載する。図５に示されるように、ＩｇＧ１フォーマットの１４Ｃ７（パートＡ）、５Ａ７（パートＢ）、５Ｅ５（パートＣ）、および６Ａ６（パートＤ）は全てｃｙｎｏＡｐｏＣ３に結合することができたが、ｃｙｎｏＡｐｏＣ３に対するそれらの親和性は、ｈｕＡｐｏＣ３に対するそれらの親和性よりも低かった。
【０１９６】
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００器具（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲ実験を行った。アミンカップリング化学を使用して、ＣＭ５センサーチップのフローセルを、生成された１４Ｃ７、５Ａ７、５Ｅ５、および６Ａ６のＩｇＧフォーマット化抗体（−２０００ＲＵ）と結合させた。ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１０μｇ／ｍｌの抗体溶液を使用して、コーティング密度として２０００ＲＵを目標とする適合固定化Ｂｉａｃｏｒｅプロトコルを使用してカップリングを実施した。全ての実験について、泳動および希釈緩衝液としてｐＨ７．４のＦ１ＢＳ−ＥＰ緩衝液を使用した。１０〜２００μｇ／ｍｌの濃度範囲の６０μｌのヒト天然ＡｐｏＣ３またはカニクイザル天然ＡｐｏＣ３タンパク質調製物をフローチャネル上に注入、続いてｐＨ７．４で５分間、オフ速度で洗浄した。２５℃で３０μｌ／分の一定速度で全ての注入を実施した。解離後、１０μｌの１０ｍＭ  ＮａＯＨ／１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０μｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を注入することによって、フローセル表面を再生した。ブランクチャネルを減算した後に得られたセンサグラムを使用して、異種間反応性を確認し、親和性を評価した。
【０１９７】
実施例７：抗ＡｐｏＣ３抗体５Ｅ５、６Ａ６、および１４Ｃ７のエピトープマッピング
７．１  ５Ｅ５、６Ａ６、および１４Ｃ７のエピトープスキャニング
この実施例は、５Ｅ５、６Ａ６、および１４Ｃ７抗体のエピトープスキャニングについて記載する。ラマ抗体５Ｅ５を、１μｇ／ｍｌの濃度のＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイと共にインキュベートし、マイクロアレイを二次および対照抗体で染色した。７／７（赤／緑）のスキャニング強度での読み出しは、非常に良好なシグナル対ノイズ比を表し、コンセンサスモチーフＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ（配列番号３）を有する隣接する１０ａａおよび１３ａａペプチドによって形成された２つのエピトープ様スポットパターンとの強く、明らかなモノクローナル応答を示した（図６、パートＡ）。
【０１９８】
ラマ抗体６Ａ６を、０．２μｇ／ｍｌの濃度のＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイと共にインキュベートし、マイクロアレイを二次および対照抗体で染色した。７／７（赤／緑）のスキャニング強度での読み出しは、非常に良好なシグナル対ノイズ比を表し、コンセンサスモチーフＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ（配列番号３）を有する隣接する１０ａａおよび１３ａａペプチドによって形成された２つのエピトープ様スポットパターンとの強く、明らかなモノクローナル応答を示した（図６、パートＢ）。
【０１９９】
ラマ抗体１４Ｃ７を、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの濃度のＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイと共にインキュベートし、マイクロアレイを二次および対照抗体で染色した。７／７（赤／緑）のスキャニング強度での読み出しは、良好なシグナル対ノイズ比を表し、コンセンサスモチーフＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号２）を有する隣接する１３ａａペプチドによって形成された単一のエピトープ様スポットパターンとの明らかなモノクローナル応答を示した（図５、パートＣ）。
【０２００】
７．２  ５Ｅ５、６Ａ６、および１４Ｃ７のエピトープ置換スキャニング
エピトープと５Ｅ５または６Ａ６抗体との間の相互作用にとって重要であるアミノ酸残基を同定するために、置換スキャニングによってコンセンサスモチーフＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ（配列番号３）をさらに分析した。１３ａａ環状拘束ペプチドのアレイを合成した。アレイの各列において、ペプチドＤＫＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥＶ（配列番号４４）中の単一のアミノ酸残基が置換され、置換する残基は、アレイの行によって示された。
【０２０１】
表６（親和性が野生型ＡｐｏＣ３ペプチド（配列番号４４）への結合のパーセンテージとして表される）置換マトリックス（図７のパートＡ）に示される置換アレイへの５Ｅ５の結合は、成熟ｈｕＡｐｏＣ３（配列番号１）のＷ６５およびＤ６６は、ｍＡｂ５Ｅ５の結合に不可欠であり、任意の他のアミノ酸による交換を許容しなかったことを示した。成熟ｈｕＡｐｏＣ３のＳ６２およびＤ６８も高度に保存されており、ＡまたはＶによるＳ６２の置換、およびＥまたはＰによるＤ６８の置換は、−６０％以上のスポット強度の減少を引き起こした。しかしながら、ＴによるＳ６２の保存的置換は、スポット強度の倍増をもたらした。アミノ酸Ｌ６７およびＰ６９は中程度に保存されており、ＴまたはＶによるＬ６７の置換、およびＴまたはＳによるＰ６９の置換は十分に許容された一方、他のアミノ酸による交換は、結合の約５０％の喪失をもたらした。アミノ酸Ｆ６１位およびＥ６３位は、より保存されなかったが、野生型およびいくつかの追加のアミノ酸（Ｆ６１位においてＥおよびＹ、Ｅ６３位においてＹ、Ｐ、およびＡ）に対して明らかな嗜好性を示し、他のアミノ酸による交換は、スポット強度のわずかな減少のみをもたらした。アミノ酸Ｆ６４は、完全に可変であった。可変アミノ酸Ｄ５９位およびＥ７０位も、野生型アミノ酸に対する嗜好性を明らかに示し、酸性アミノ酸ＤおよびＥについては一般的、かつより特異的でない嗜好性を示した。
【表６】
2019525772.tif 000011
１列目は、野生型ＡｐｏＣ３ペプチドにおけるアミノ酸位置を示す。１行目は、特定のアミノ酸置換を示す。
【０２０２】
表７（親和性が野生型ＡｐｏＣ３ペプチド（配列番号４４）への結合のパーセンテージとして表される）および置換マトリックス（図７のパートＢ）に示される置換アレイへの６Ａ６の結合は、成熟ｈｕＡｐｏＣ３（配列番号１）のＥ７０は、ｍＡｂ６Ａ６の結合に不可欠であり、任意の他のアミノ酸による交換を許容しなかったことを示した。成熟ｈｕＡｐｏＣ３のＤ６６およびＤ６８も高度に置換されていることを示し、Ｅによる保存的交換は、Ｄ６６位におけるスポット強度の８０％の減少、およびＤ６８における４４％の減少を引き起こし、他のアミノ酸による置き換えは、抗体結合の完全な抗体を伴わずには許容されなかった。Ｌ６７は十分に保存され、ＩまたはＴによる置換は抗体結合に影響を及ぼさなかったが、ＶまたはＭによる交換は、スポット強度の訳５０％の減少をもたらした。Ｅ６３は中程度に保存されたが、Ｄによる保存的交換に影響されやすく、Ｐによる置き換えはさらに−１．５倍高いスポット強度をもたらし、これは折り畳み効果に起因する可能性がある。Ｗ６５も中程度に保存されたが、Ｅ、Ｓ、Ｄ、およびＴによる交換はスポット強度の増加をもたらした。しかしながら、他のアミノ酸による置換は、抗体結合の少なくとも４５％の減少を引き起こした。Ｆ６１は、野生型アミノ酸に対する、またはＹによる保存的交換に対する明らかな嗜好性を示したが、一般的により保存的でなく、６Ａ６への結合を完全に喪失することなく全ての他のアミノ酸による交換に影響されやすかった。Ｓ６２およびＰ６９は野生型アミノ案に対してある特定の嗜好性を示したが、両方の位置の保存は乏しく、抗体結合への影響が一切ないいくつかの置換を許容した。Ｆ６４は、完全に可変的であった。全ての他の可変位置は、酸性アミノ酸ＤおよびＥに対する明らかな嗜好性を示し、これはイオン性効果に起因する可能性がある。
【表７】
2019525772.tif 000012
１列目は、野生型ＡｐｏＣ３ペプチドにおけるアミノ酸位置を示す。１行目は、特定のアミノ酸置換を示す。
【０２０３】
エピトープと１４Ｃ７抗体との間の相互作用にとって重要であるアミノ酸残基を同定するために、置換スキャニングによってコンセンサスモチーフＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号２）をさらに分析した。１３ａａ環状拘束ペプチドのアレイを合成した。アレイの各列において、ペプチドＡＲＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号４５）中の単一のアミノ酸残基が置換され、置換する残基は、アレイの行によって示された。
【０２０４】
表８（親和性が野生型ＡｐｏＣ３ペプチド（配列番号４５）への結合のパーセンテージとして表される）置換マトリックス（図７のパートＣ）に示される置換アレイへの１４Ｃ７の結合は、成熟ｈｕＡｐｏＣ３（配列番号１）のＴ４４およびＳ４９は、ｍＡｂ１４Ｃ７の結合に不可欠であり、結合の完全またはほぼ完全な喪失を伴わずに任意の他のアミノ酸による交換を許容しなかったことを示した。アミノ酸Ｇ４１およびＧ４６は高度に保存されており、Ｅ、Ｎ、またはＱによるＧ４１の置換は、−７０％以上のスポット強度の減少を引き起こした一方、ＮによるＧ４６の交換はほとんど許容されず、９０％低減されたスポット強度をもたらした。アミノ酸Ｆ４７位およびＬ５０位も高度な配列保存を示し、Ｙ（Ｆ４７）による、または他の疎水性アミノ酸ＦおよびＷ（Ｌ５０）による保存的交換のみを許容し、これはスポット強度の顕著な現象を伴った。アミノ酸Ｖ４３位、Ｄ４５位、およびＫ５１位も十分に保存され、野生型アミノ酸に対する明らかな嗜好性を伴い、かつ特に、Ｙ、Ｆ、およびＩ（Ｖ４３）、Ａ、Ｅ、およびＫ（Ｄ４５）、ならびにＲ（Ｋ５１）による保存的交換に対してある特定の許容度を有した。これらの交換はスポット強度の３０〜５５％の低減をもたらした一方、他のアミノ酸交換はより許容されなかった。しかしながら、ＹによるＶ４３の置き換えは、スポット強度を２倍に増加させた。アミノ酸Ｗ４２位および４８Ｓ位の保存は乏しく、またはさらには可変的であり、両方の位置は、いくつかのアミノ酸交換のみに影響されやすく、Ｆ、Ｓ、およびＴ（Ｗ４２）による、またはＥ（Ｓ４８）による交換はスポット強度の２〜３倍の増加さえ引き起こした。アミノ酸Ａ３９位およびＲ４０位は可変的であった。
【表８】
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１列目は、野生型ＡｐｏＣ３ペプチドにおけるアミノ酸位置を示す。１行目は、特定のアミノ酸置換を示す。
【０２０５】
７．３材料および方法
欠損ペプチドを回避するために、中性ＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号４６）リンカーによってＣ末端およびＮ末端でＡｐｏＣ３の配列を延長させた。延長した配列を、６、９、および１２アミノ酸のペプチド−ペプチド重複を含む７、１０、および１３アミノ酸ペプチドに変換した。Ｐｅｐｐｅｒｃｈｉｐ（登録商標）プラットホームを介したペプチド合成後、Ｃ末端システイン側鎖チオール基と、適切に修飾されたＮ末端との間のチオエーテル結合を介して全てのペプチドを環化させた。得られた環状ＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイは、複製（５０４ペプチドスポット）でプリントされた２５２個の異なる環状拘束ペプチドを含有し、追加のＨＡ制御ペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ（配列番号１１２）、８０スポット）によってフレームされていた。
【０２０６】
洗浄緩衝液中で１５分間、およびブロック緩衝液中で３０分間の前膨潤の後、ＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイコピーのうちの１つを初めに１：５０００希釈の二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０および１：２０００希釈の対照抗体マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００と共に室温で４５分間インキュベートして、抗原由来のペプチドとのバックグラウンド相互作用を分析した。７／７（赤／緑）のスキャニング強度で、二次抗体および対照抗体の両方とのＡｐｏＣ３ペプチドのバックグラウンド相互作用は、輝度およびコントラストの顕著な増加に際してさえも、一切認められなかった（調節されたスキャンを参照されたい）。マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００対照抗体は、ペプチドマイクロアレイをフレーミングする予想された十分に規定されたＨＡ対照スポットパターンをもたらし、全体的なペプチドマイクロアレイの完全性およびアッセイの品質を実証した。
【０２０７】
二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０（１：５０００）および対照抗体マウスモノクローナル抗ＨＡ（１２ＣＡ５）ＤｙＬｉｇｈｔ８００（１：２０００）を用いてＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイのうちの１つの予備染色を行って、二次抗体と、メインアッセイに干渉し得る抗原由来のペプチドとのバックグラウンド相互作用を調査した。他のＡｐｏＣ３ペプチドマイクロアレイの、抗体試料との後続のインキュベーションの後、二次抗体および対照抗体で染色し、７／７（赤／緑）のスキャニング強度で読み出した。ペプチドアレイをフレーミングする追加のＨＡペプチドを内部品質対照として染色して、アッセイの品質およびペプチドマイクロアレイの完全性を確認した。
【０２０８】
スポット強度の定量化およびペプチドアノテーションは、２４ビット色付きファイルよりも高いダイナミックレンジを示す、７／７のスキャニング強度での１６ビットグレースケールｔｉｆｆファイルに基づき、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてマイクロアレイ画像解析を行い、材料および方法に列挙されるエクセルファイル中に要約した。ソフトウェアアルゴリズムは、各スポットの蛍光強度を、未加工のフォアグラウンドおよびバックグラウンドシグナルに分解し、スポット複製の平均フォアグラウンド強度中央値およびスポット毎偏差偏差を計算する。平均フォアグラウンド強度中央値に基づき、強度マップを生成し、高いスポット強度については赤、および低いスポット強度については白を用いる強度の色コードでペプチドマップ中の相互作用をハイライトした。４０％の最大スポット毎偏差を許容し、そうでなければ対応する強度値はゼロとした。
【０２０９】
さらに、抗体試料でのアッセイの平均スポット強度を、Ｎ末端からＣ末端へのＡｐｏＣ３配列に対してプロットして、全体的なスポット強度およびシグナル対ノイズ比を可視化した。ペプチドおよび強度マップ、ならびにマイクロアレイスキャンの目視検査と強度プロットを相関させて、抗体試料によって認識されたエピトープを同定した。抗体結合に寄与するアミノ酸を同定し、ハイライトした。
【０２１０】
実施例８：抗ＡｐｏＣ３抗体５Ｅ５による食後トリグリセリドの低減
８．１ＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３マウスモデルの産生および特性評価
この実施例では、マウスモデル発現ヒトＡｐｏＣ３を最初に産生し、特性評価した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、ヒトＡｐｏＣ３遺伝子を保有する３×１０１１個のＡＡＶ８ベクターのウイルス粒子、またはビヒクル対照で感染させた。感染の１４日後、ＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３マウスの平均血清ｈｕＡｐｏＣ３レベルは、５．７μΜであった。４時間の絶食後の循環トリグリセリドレベルは、対照マウスにおける１０９ｍｇ／ｄＬ（ｐ＝０．００６５）と比較して、これらのマウスにおいて１６３ｍｇ／ｄＬであった。経口脂質負荷のクリアランスに対する増加したｈｕＡｐｏＣ３の影響を判定するために、ＡＡＶまたはビヒクル感染の１４日後にオリーブ油の経口用量（体重１ｍｇ当たり１０μＬ）をマウスに与えた。血清トリグリセリドレベルを時間経過と共に測定した。食後のトリグリセリドの増加は、実験の時間経過にわたりＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３マウスにおいてより高く（図８のパートＡ）、時間経過にわたるＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３マウスにおけるトリグリセリドレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）は、３８％高かった（独立Ｔ検定でｐ＝０．００４７）（図８のパートＢ）。まとめると、３×１０１１個のＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３ウイルス粒子の注入は、マウスにおけるトリグリセリドクリアランスを減じさせ、抗ＡｐｏＣ３抗体を特性評価するための動物モデルとして機能し得る。
８．２マウスモデルにおける食後脂肪血症に対する５Ｅ５の効果の特性評価
この実施例は、マウスモデルにおける食後トリグリセリドの低減に対するｍＡｂ５Ｅ５のインビボ有効性について記載する。＿３×１０１１個のＡＡＶ８−ｈｕＡｐｏＣ３ウイルス粒子を受けているマウスを使用して、食餌から吸収されカイロミクロン中に包含された食後トリグリセリドの低減において抗ＡｐｏＣ３抗体５Ｅ５を特性評価した。図９のパートＡに示されるように、５Ｅ５抗体の投与は、血清トリグリセリドの食後上昇の顕しい低減をもたらした。増加した食後トリグリセリドレベルは約ゼロに低減し、時間経過にわたるトリグリセリドレベルの曲線下面積は、約２５％低減し、０．０３０のｐ値を有した（図９のパートＢ）。ＡｐｏＣ３の血清レベルは、５Ｅ５の存在下で、オリーブ油負荷の２時間および３時間後に著しく低減した（図９のパートＣ）一方、５Ｅ５抗体自体の血清レベルは、最初の分配相の後に徐々に減退した（図９のパートＤ）。
【０２１１】
８．３材料および方法
この実施例で使用したヒトＡＡＶ８−ＡｐｏＣ３ウイルスベクターは、ＲｅｇｅｎＸｂｉｏ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍａｒｙｌａｎｄ）から得た。６０〜６３日齢の２４匹のＣ５７Ｂ１６雄マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を、水を自由に利用でき、かつ標準的な食物の食餌（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ；５００１）を適宜利用できる状態で、一定の１２時間明状態：１２時間暗状態のサイクルに維持した。マウス１匹当たり３×１０１１個のウイルス粒子の腹腔内投与の１２日後に、マウスの後眼窩洞から採血し、同等の平均ａｐｏＣ３レベルに従って群分けした。１４日目に、マウスを６時間絶食させ、後眼窩洞からの２５μｌの血液を採集して、トリグリセリドベースラインを確立した。２５ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ１フォーマットの５Ｅ５抗体を腹腔内に注入し、直後に２５０μｌのオリーブ油（Ｓｉｇｍａ＃０１５１４）の経口ボーラスを注入した。オリーブ油負荷の１５、３０、６０、１２０、および２４０分後に、後眼窩洞を介してマウスから採血して、血漿トリグリセリド、ＡｐｏＣ３、および試験抗体のレベルを判定した。測定された値を、時間の関数としてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して血漿グリセリドの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。全ての動物実験は、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにおける推奨に従って実施した。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｍａｂ，ＬＬＣによって承認された。
【０２１２】
５μＬのＥＤＴＡ−血漿を、黒色の９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３９１５）中で２００μＬのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を補充した１５０μＬのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ２２４２１）と共にインキュベートすることによってトリグリセリドを分析した。３０℃で１０分間の後、プレートを読み出し（ｅｘ５６０ｎｍ；ｅｍ５８５ｎｍ）、グリセロール標準曲線の４パラメータ適合（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から濃度を計算した。
【０２１３】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＡｐｏＣ３レベルを判定した。９６ウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ＃６５５０６１）を、ＰＢＳ中で希釈した５０μＬの一次ａｐｏＣ３抗体（Ａｂｅａｍウサギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０３２）で、４℃で一晩コーティングした。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、２００μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）を用いて３０℃で９０分間ブロックした。ブロック緩衝液を除去し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの試験試料を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で２時間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの二次抗体（ＡｂｅａｍヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０２４）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で１時間インキュベートさせた。ＴＢＳ−Ｔでプレートを１回洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した５０μＬのＳＡ−ＨＲＰ（Ａｂｅａｍ＃３４０２８）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で３０分間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、８０μＬのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ＃３４０２８）、続いて５０μＬの０．５Ｎ  ＨＣＬで開発した。吸光度を４５０ｎｍで読み出した。精製されたＡｐｏＣ３（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から試験ウェル中のＡｐｏＣ３の量を計算した。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて５Ｅ５抗体のレベルを判定した。９６ウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ＃６５５０６１）を、ＰＢＳ中で希釈した５０μＬの一次ＩｇＧ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ４１−ＸＧ５７ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル）で、４℃で一晩コーティングした。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ＰＢＳ中の、３％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  ＢＳＡ画分Ｖプロテアーゼ不含＃０３  １１７  ３３２  ００１）およびクリアミルク（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）からなる２００μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）を用いて３０℃で９０分間ブロックした。ブロック緩衝液を除去し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの試験試料を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で２時間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの二次抗体（Ａｂｅａｍヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ビオチン）ポリクローナル＃ａｂ９７２２３）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で１時間インキュベートさせた。ＴＢＳ−Ｔでプレートを１回洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した５０μＬのＳＡ−ＨＲＰ（Ａｂｅａｍ＃３４０２８）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で３０分間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、８０μＬのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ＃３４０２８）、続いて５０μＬの０．５Ｎ  ＨＣＬで開発した。吸光度を４５０ｎｍで読み出した。精製された試験抗体を使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から試験ウェル中のＩｇＧの量を計算した。
【０２１５】
実施例９：マウスモデルにおける５Ｅ５および６Ａ６抗体によるＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢの低減
ヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスを生成し、セクション８．１に記載されるように処置した。ＡＡＶ感染の１２日後に、後眼窩洞から血液試料を採集して、ベースライン（Ｔ＝０）ヒトＡｐｏＣ３およびマウスＡｐｏＢレベルを確立した。その後、全ての群がＴ０で同様の平均ＡｐｏＣ３レベルを有するようにマウスを群分けした。最初のＡＡＶ感染の１４５日後に、ＩｇＧ１フォーマットの、５Ｅ５抗体の２５ｍｇ／ｋｇの単一用量または６Ａ６抗体の２０ｍｇ／ｋｇの単一用量を、背部皮下腔内への注射により各マウスに投与した。試験抗体の投与の０、２、４、８、および２４時間後、ならびにその後３０日間にわたり２日ごとに血液試料を後眼窩洞から採集した。全ての動物実験は、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにおける推奨に従って実施した。
【０２１６】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒトＡｐｏＣ３およびマウスＡｐｏＢの血漿レベルを判定した。具体的には、９６ウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ＃６５５０６１）を、ＰＢＳで希釈した５０μＬの一次ＡｐｏＣ３抗体（Ａｂｅａｍウサギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０３２）または５０μＬの一次ＡｐｏＢ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓヤギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＢ＃Ｋ４５２５３Ｇ）で、４℃で一晩コーティングした。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、２００μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）を用いて３０℃で９０分間ブロックした。ブロック緩衝液を除去し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの試験試料を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で２時間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの二次抗体（ＡｂｅａｍヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０２４）または二次ＡｐｏＢ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＢ４８／１００＃３４００３Ｇ）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で１時間インキュベートさせた。ＴＢＳ−Ｔでプレートを１回洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した５０μＬのＳＡ−ＨＲＰ（Ａｂｅａｍ＃６４２６９）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で３０分間インキュベートさせた。次いで、２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、８０μＬのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ＃３４０２８）、続いて５０μＬの０．５Ｎ  ＨＣＬで開発した。吸光度を４５０ｎｍで読み出した。精製されたＡｐｏＣ３（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から試験ウェル中のＡｐｏＣ３の量を計算した。遠心分離によって単離したマウスＶＬＤＬを使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から、試験ウェル中のＡｐｏＢの量を計算した（ＡｐｏＢ含量は全タンパク質含量の２０％であると想定する）。
【０２１７】
図１０に示されるように、５Ｅ５抗体（パートＡおよびＢ）ならびに６Ａ６抗体（パートＣおよびＤ）は、陰性対照群における対応するレベルと比べて、ヒトＡｐｏＣ３およびマウスＡｐｏＢの血漿レベルを１〜２日間にわたり同様に低減させた。ＡｐｏＣ３の血漿レベルは、５Ｅ５および６Ａ６抗体の投与の４〜８時間後に５０％超低減した（パートＡおよびＣ）。ＡｐｏＢの血漿レベルは、５Ｅ５および６Ａ６抗体の投与の４〜８時間後に約４０〜５０％低減した（パートＢおよびＤ）。
【０２１８】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、記載されているものに加えた、本発明の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０２１９】
本明細書に引用される全ての参考文献（例えば、出版物または特許または特許出願）は、各個々の参考文献（例えば、出版物または特許または特許出願）が具体的かつ個々に全ての目的でその全体が参照により組み込まれていると示されているのと同程度に、全ての目的でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２２０】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2019525772.tif 000014
【図２−１】
2019525772.tif 000015
【図２−２】
2019525772.tif 000016
【図２−３】
2019525772.tif 000017
【図３】
2019525772.tif 000018
【図４−１】
2019525772.tif 000019
【図４−２】
2019525772.tif 000020
【図５−１】
2019525772.tif 000021
【図５−２】
2019525772.tif 000022
【図５−３】
2019525772.tif 000023
【図５−４】
2019525772.tif 000024
【図６−１】
2019525772.tif 000025
【図６−２】
2019525772.tif 000026
【図６−３】
2019525772.tif 000027
【図７−１】
2019525772.tif 000028
【図７−２】
2019525772.tif 000029
【図７−３】
2019525772.tif 000030
【図８−１】
2019525772.tif 000031
【図８−２】
2019525772.tif 000032
【図９−１】
2019525772.tif 000033
【図９−２】
2019525772.tif 000034
【図９−３】
2019525772.tif 000035
【図９−４】
2019525772.tif 000036
【図１０−１】
2019525772.tif 000037
【図１０−２】
2019525772.tif 000038
【図１０−３】
2019525772.tif 000039
【図１０−４】
2019525772.tif 000040
【配列表】
2019525772000001.app
【国際調査報告】
2019525772.tif 000041
2019525772.tif 000042
2019525772.tif 000043
2019525772.tif 000044