(57)【要約】  本発明は、商業規模の量のイヌ科動物機能的β細胞を調製する方法およびイヌ科動物未熟膵組織からの細胞株の樹立に関する。本発明はまた、イヌ科動物β細胞腫瘍またはそれに由来する細胞を用いた診断方法に関する。本方法は、増殖中のβ細胞内の移植物を富化して、イヌ科動物β細胞株を作製するためのサブ移植手順を含んでなる。このような株はグルコース刺激時にインスリンを発現、産生および分泌する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ科動物膵β細胞またはイヌ科動物β細胞腫瘍を調製する方法であって、
ａ）イヌ科動物未熟膵細胞に、ｉ）インスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するレンチウイルスベクター、またはｉｉ）インスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するレンチウイルスベクターおよびインスリンプロモーターの制御下でｈＴｅｒｔを発現するレンチウイルスベクター、またはｉｉｉ）インスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原とｈＴｅｒｔの両方を発現するレンチウイルスベクターを形質導入および同時形質導入する工程；
ｂ）ａ）で得られた形質導入未熟膵細胞を第１の重症複合免疫不全症（ｓｃｉｄ）非ヒト動物の腎被膜に導入する工程；
ｃ）形質導入未熟膵細胞にインスリノーマ様構造を発達させる工程、ここで、インスリノーマ様構造のイヌ科動物未熟膵細胞はインスリン産生膵β細胞に分化している；
ｄ）工程ｃ）で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させる工程；
ｅ）工程ｄ）で得られた細胞を第２のｓｃｉｄ非ヒト動物の腎被膜にサブ移植する工程；
ｆ）工程ｅ）のサブ移植細胞に新たに発達したインスリノーマ様構造を発達および再生させる工程、ここで、当該新たに発達したインスリノーマ様構造はインスリン産生膵β細胞内で富化される；
ｇ）工程ｆ）で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させ、回収する工程；
ｈ）場合により、工程ｇ）で得られた細胞を第３の非ヒトｓｃｉｄ動物の腎被膜にサブ移植し、インスリン産生膵β細胞のさらなる富化および増幅を可能とする工程；および
ｉ）場合により、適当な量のインスリン産生膵β細胞が得られるまで工程ｅ）、ｆ）およびｇ）を繰り返す工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記イヌ科動物未熟膵細胞が、イヌ未熟膵細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イヌ科動物未熟膵細胞が、膵臓の右葉（または頭部）の一部または膵臓の全右葉（または頭部）から得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記イヌ科動物未熟膵細胞が、最終の妊娠第三期、好ましくは受胎後４０〜６０日、さらに好ましくは受胎後４０〜５５日、さらに好ましくは受胎後４０〜４６日、特に受胎後４５日のイヌ科動物胎仔膵臓から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記レンチウイルスベクターの構築物が、可逆的または条件付き不死化を可能とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記レンチウイルスベクターが、少なくとも１つのＬｏｘＰ部位およびＳＶ４０ラージＴを含んでなり、かつ／または、ｈＴＥＲＴ遺伝子が、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記レンチウイルスベクターが、少なくとも１つのＦＲＴ部位を含んでなり、かつ、ＳＶ４０ラージＴおよび／またはｈＴＥＲＴ遺伝子が、ＦＬＰリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＳＶ４０ラージＴを発現する前記レンチウイルスベクターおよびｈＴＥＲＴを発現する前記レンチウイルスベクターが、ＬｏｘＰ部位またはＦＬＰ部位をさらに含んでなる（ただし、部位特異的組換え部位は前記ベクター間で異なる）、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
不死化遺伝子ＳＶ４０ラージＴおよび／またはｈＴＥＲＴが除去された細胞のみを選択するために、ＣｒｅまたはＦＬＰリコンビナーゼの作用後に負の選択工程が行われる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レンチウイルスベクターが、少なくとも１つの負の選択マーカー遺伝子を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記負のマーカー遺伝子が、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）遺伝子、およびシトシンデアミナーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｓｃｉｄ非ヒト動物が、ｓｃｉｄマウスである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｄ）の細胞に、インスリンプロモーターの制御下で抗生物質耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを形質導入することをさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗生物質耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｉ）で得られたイヌ科動物膵β細胞を回収して均質な細胞集団を形成し、場合により、前記集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養してイヌ科動物機能的β細胞株を樹立することをさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＳＶ４０ラージＴ、ｈＴＥＲＴおよび／または抗生物質耐性導入遺伝子を除去することを含む１以上の脱不死化工程をさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞。
【請求項１８】
前記腫瘍または細胞が、以下の特徴：
カルボキシペプチダーゼ−Ａ陰性
転写因子Ｐｄｘ１陽性
転写因子ＭａｆＡ陽性
プロコンベルターゼＰｃｓｋ１陽性
グルコース輸送体Ｇｌｕｔ２の発現
カリウムチャネルのサブユニットをコードするＫｃｎｊ１１およびＡｂｃｃ８の発現
亜鉛輸送体Ｚｎｔ８（Ｓｌｃ３０ａ８）の発現
イヌ科動物特異的インスリンの発現
のうち少なくとも１つを有する、請求項１７に記載のイヌβ細胞腫瘍またはイヌ膵β細胞。
【請求項１９】
前記腫瘍または細胞が、抗インスリン抗体、抗ＧＡＤ抗体および／または抗ＩＡ２抗体との反応に陽性である、請求項１７または１８のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、無血清培地およびマトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングウェルでの培養で維持および増殖される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のイヌ膵β細胞。
【請求項２１】
マトリゲルまたはフィブロネクチンを含んでなる無血清培地中に請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物膵β細胞を含んでなる細胞培養物。
【請求項２２】
イヌ科動物の糖尿病を治療するための候補医薬を試験およびスクリーニングするための方法であって、候補医薬を請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物膵細胞が移植されたｓｃｉｄ非ヒト動物に投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項２３】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍もしくはイヌ科動物膵β細胞、または前記細胞からのタンパク質抽出物を、固相支持体に結合または吸着させること、および、動物の血漿血清と反応させること、１型または他の型の糖尿病に特異的な異なる表面抗原、例えば、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（ＧＡＤＡ）から選択される膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、に対する自己抗体の有無を検出することを含んでなる、イヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項２４】
罹患動物および対照からの血清を請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞の組織切片に加えること、および、前記イヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞の組織切片を、標識された抗イヌ科動物ＩｇＧ、例えば、蛍光標識コンジュゲート抗イヌ科動物ＩｇＧとともにインキュベートして前記罹患動物の血清中の糖尿病関連自己抗体の有無を明らかにすることを含んでなり、自己抗体の存在が糖尿病の指標となる、請求項２３に記載のイヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項２５】
罹患動物の血清とともにインキュベートされた請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物のウエスタンブロットを含んでなり、前記罹患動物の血清中の糖尿病関連自己抗体の有無が標識された抗イヌ科動物ＩｇＧ、例えば、ＨＲＰコンジュゲート抗イヌ科動物ＩｇＧを用いて明らかにされ、自己抗体の存在下が糖尿病の指標となる、請求項２３に記載のイヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項２６】
ウェルプレートが請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物でコーティングされ、罹患動物血清および対照血清とインキュベートされるＥＬＩＳＡ試験を含んでなり、前記罹患動物の血清中の糖尿病関連自己抗体の有無が、標識された抗イヌ科動物ＩｇＧ、例えば、ＨＲＰコンジュゲート抗イヌ科動物ＩｇＧを用いて明らかにされ、自己抗体の存在がイヌ科動物の糖尿病の指標となる、請求項２３に記載のイヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法。
【請求項２７】
請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物を罹患動物の血漿血清と反応させること、異なる糖尿病関連表面抗原、すなわち、例えば、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（ＧＡＤＡ）などの膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、または他の特異的な糖尿病関連抗原を、前記抗原に対するイムノブロットまたはドットブロット自己抗体により検出することを含んでなる、イヌ科動物糖尿病関連自己抗体を同定する方法。
【請求項２８】
場合により固相支持体に結合または吸着された、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍もしくはイヌ科動物機能的膵β細胞、またはそれらからのタンパク質抽出物を含んでなる、イヌ科動物の糖尿病の診断キット。
【請求項２９】
請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法を実施するための試薬をさらに含んでなる、請求項２８に記載の診断キット。
【請求項３０】
イヌ科動物インスリン分泌を調節し得る化合物をスクリーニングするための方法であって、ａ）請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のイヌ科動物膵β細胞を試験化合物と接触させること、ならびにｂ）インスリン分泌を検出することおよびインスリン分泌のレベルを測定することを含んでなる、方法。
【請求項３１】
糖尿病の細胞療法のためのマスター細胞バンクの樹立方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によってイヌ科動物膵β細胞株を得る工程を含んでなり、細胞を脱不死化することをさらに含む、方法。
【請求項３２】
前記レンチウイルスベクターの構築物が、可逆的または条件付き不死化を可能とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記レンチウイルスベクターが、少なくとも１つのＬｏｘＰ部位およびＳＶ４０ラージＴを含んでなり、かつ／または、ｈＴＥＲＴ遺伝子が、Ｃｒｅリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記レンチウイルスベクターが、少なくとも１つのＦＲＴ部位およびＳＶ４０ラージＴを含んでなり、かつ／または、ｈＴＥＲＴ遺伝子が、ＦＬＰリコンビナーゼの作用によって除去される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＳＶ４０ラージＴを発現する前記レンチウイルスベクターおよびｈＴＥＲＴを発現する前記レンチウイルスベクターが、ＬｏｘＰ部位またはＦＬＰ部位をさらに含んでなる（ただし、部位特異的組換え部位は前記ベクター間で異なる）、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
不死化遺伝子ＳＶ４０ラージＴおよび／またはｈＴＥＲＴが除去された細胞のみを選択するために、ＣｒｅまたはＦＬＰリコンビナーゼの作用後に負の選択工程が行われる、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記レンチウイルスベクターが、少なくとも１つの負の選択マーカー遺伝子を含む、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が最初のβ細胞表現型に復帰する、請求項１〜１６または２９〜３５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるイヌ科動物機能的膵β細胞。
【請求項３９】
薬学上許容可能な担体と、有効量の請求項３８に記載のイヌ科動物機能的膵β細胞とを含んでなり、前記細胞が場合によりカプセル封入される、獣医学用組成物。
【請求項４０】
イヌ科動物膵障害の治療において使用するための請求項３９に記載のイヌ科動物機能的膵β細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵組織からイヌ科動物β細胞を調製するための方法に関する。本発明は特に、出生前の期間に得られた膵臓からインスリン分泌細胞を取得することに関する。本発明はまた、β細胞腫瘍またはそれに由来する細胞を用いたイヌ科動物の糖尿病の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
理想的な治療のない一般病態であるイヌ科動物の糖尿病
イヌ科動物の糖尿病、および一般的にはペット動物の糖尿病の有病率は、近年、特に疫学的レベルで初めて研究された。やはり動物の糖尿病の有病率もヒトと同様に増えている。獣医は、イヌ科動物の糖尿病の頻度は欧州およびＵＳＡでは３０年で３倍になったと見積もっている。しかしながら、イヌの糖尿病の原因は、詳細な特徴付けがなされて来なかった。結果として、イヌ科動物の糖尿病は、疾病経過において診断が遅れることが多い。
【０００３】
イヌの糖尿病の最も一般的な形態は、ヒトの１型糖尿病に似ているが、イヌでは他のタイプの糖尿病も記載されている(Nelson and Reusch, 2014; Rand et al., 2004; Bonnet et al., 2010; Catchpole et al., 2005; Shield et al, 2015; Ahlgren et al., 2014; Davison et al., 2008; Kennedy et al., 2006; Gale, 2005)。
【０００４】
毎日のインスリン注射からなる唯一の有効な治療は、イヌのあらゆるタイプの糖尿病に利用可能である。一般に、イヌは、１日１回、約１インスリン単位（ＩＵ）／ｋｇの用量を受容する(Davison et al., 2005)。このような治療は多大な財政負担となり、生活の質に大きな低下をもたらす(Niessen et al., 2012)。
【０００５】
これに関して、新規な、より有効かつ重くない治療の必要がある。この点で、細胞療法は、治療を受ける動物と適合性の高い可能性のある多能性細胞または成体細胞の無限に近い供給源を与え得るので、明らかに有利である。
【０００６】
細胞療法および獣医薬
細胞療法による飼育動物の慢性疾患または損傷の治療は、獣医学分野ですでに実施されている。
【０００７】
例えば、脂肪組織（脂肪）から単離され、治療を受ける飼育動物に集められる幹細胞を用いた治療が最近開発された（ＵＳ６７７７２３１Ｂ１、ＵＳ６４２９０１３Ｂ１）。これらの脂肪由来幹細胞は、治療を受ける飼育動物の罹患したまたは損傷を受けた軟骨、腱および関節に投与され、損傷組織を再生することが意図される（例えば、「Vet-Stem Biopharma」社により開発されたＶｅｔＳｔｅｍ再生細胞：ＶＳＲＣ（商標））。
【０００８】
しかしながら、これらの幹細胞に基づく療法は、糖尿病および他の内分泌障害には適用されない。
【０００９】
糖尿病の分野では、ペット動物、主としてイヌおよびネコのための「代替」療法において関心が高まっているにもかかわらず、細胞療法の進展はなお遅い。特に、ペット動物臓器採取ネットワークが開発され、臓器ライブラリーの創出に至っている。ランゲルハンス島は、提供動物の膵臓から採取し、適合する受容糖尿病動物に移植されるまで低温保存によって保存することができる（ＵＳ８７３５１５４Ｂ２）。このような低温保存のランゲルハンス島の移植は、移植を受けた適合糖尿病動物におけるインスリン注射に取って代わることを意図する（例えば、ＬＩＫＡＲＤＡ  ＬＬＣによりネコおよびイヌ向けに開発されたＫａｎｓｌｅｔ（商標））。
【００１０】
しかしながら、動物の糖尿病療法におけるこの重要な進展は、いくつかの目立った問題により制限されている。特に、回収および凍結されたランゲルハンス島は拡大培養できず、従って、利用できるランゲルハンス島の量は、各臓器で回収される量に厳密に依存している。
【００１１】
イヌ科動物の糖尿病の細胞療法の開発に向けた第一工程では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持および拡大培養可能なイヌ科動物β細胞株を保有することが極め有用であろう。
【００１２】
膵臓生理学および膵β細胞
哺乳動物成熟膵臓は、膵管を介して腸へ分泌される酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼ−Ａ）を産生する腺房細胞から構成される外分泌組織と、インスリン（β細胞）、グルカゴン（α細胞）、ソマトスタチン（δ細胞）および膵ポリペプチド（ＰＰ細胞）などのホルモンを産生する細胞から構成されるランゲルハンス島を含む、内分泌島としても知られる内分泌組織の２種類の組織を含む。
【００１３】
胎仔期の内分泌膵臓の個体発生および成体のランゲルハンス島の構造は、マウス、ラットおよびヒトでかなり集中的に研究されている(Steiner et al., 2010; Kim A et al., 2009; Pictet et al., 1972)。これに対し、イヌ科動物膵臓の発達は大方、無視されてきた。現時点で、胎仔または出生後の段階のイヌ科動物膵臓の発達は記載されていない。特に、ホルモン分泌膵組織（または内分泌組織）の成熟は記載されていないので、好結果が得られるβ細胞株の樹立および維持法の開発を阻んでいる。
【００１４】
さらに、イヌ科動物膵β細胞の大量生成は、このようなβ細胞は上記で説明したようにイヌ科動物の糖尿病の細胞療法に使用され得るので、重要な目的となる。加えて、このような膵β細胞は、イヌ科動物β細胞機能を調節することができ、イヌ科動物の糖尿病の治療に適合した新薬をスクリーニングするためにも有用であると思われる。
【００１５】
よって、イヌ科動物機能的β細胞株を開発するための信頼性および再現性がある方法の必要がなおある。
【発明の概要】
【００１６】
説明
本明細書でそうではないことが定義されない限り、本発明に関して使用される科学用語および技術用語は、当業者に共通に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈がそうではないことを必要としない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞・組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質・核酸化学ならびにハイブリダイゼーション、またそれらの技術に関して使用される名称は、当技術分野で周知かつ慣用されるものである。本発明の実施は、特に断りのない限り、分子生物学（組換え技術を含む）微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を使用し、それらは当業者の範囲内にある。このような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et ah, eds., 1987, and periodic updates); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al, ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al., 2001)などの文献で十分に説明されている。酵素反応および精製技術は、製造者の明細書に従って、当技術分野で一般に達成されているように、または本明細書に記載されているように実施される。
【００１７】
本発明者らは、細胞療法に基づくイヌ科動物β細胞の作製のための革新的なアプローチを開発した。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１：胎仔発生の第三四半期のイヌ膵臓の発達および内分泌細胞の分布。ｐｃ３０および３３日（Ｅ−３０、Ｅ−３３）のイヌ胚の解剖した中腸管またはＥ−３６〜Ｅ−４５の胚から解剖した膵臓の４μｍパラフィン切片に対する内分泌マーカーとしてのインスリン（薄いグレー）およびグルカゴン（白）の免疫染色。左のレーンは、免疫染色の大視野像を示す。各発達段階について、点線で示した挿入枠のより高倍率の像を右のレーンに示す。核はＤＡＰＩで染色した（濃いグレー）。大視野のスケールバー＝１００μｍ、挿入部のスケールバー＝２０μｍ。
【図２】図２：周生期および離乳前のイヌの膵臓発達および内分泌細胞の分布。ｐｃ５５日（Ｅ−５５）の胚、出生後１日（ＰＮＤ１）の新生仔および離乳前の８週目（ＰＮＷ８）の幼犬から得られたイヌ膵臓の５μｍパラフィン切片に対する内分泌マーカーとしてのインスリン（薄いグレー）およびグルカゴン（白）の免疫染色。インスリン染色およびグルカゴン染色の両方をそれぞれ左と中央のパネルに個別に示す。重畳免疫染色を右のパネルに示す。核はＤＡＰＩで染色した（濃いグレー）。矢印は、島様構造の形態を有する、インスリンおよびグルカゴン両方を含む細胞クラスターを指す。スケールバー＝２０μｍ。
【図３】図３：成犬膵臓の内分泌細胞は島としての構造をとる。イヌ膵臓左葉の５μｍパラフィン切片に対する内分泌マーカーとしてのインスリン（薄いグレー）およびグルカゴン（白）の免疫染色。上のパネルは、免疫染色の大視野像を示す。点線で示した４つの挿入枠（Ａ〜Ｄ）を拡大して下のレーンに示す。核はＤＡＰＩで染色した（濃いグレー）。大視野のスケールバー＝５００μｍ、挿入部のスケールバー＝２０μｍ。
【図４】図４：ｓｃｉｄマウスへのイヌ科動物未熟膵組織の移植は、内分泌組織および外分泌組織の両方を含む完全に成熟した膵臓臓器の発達をもたらす。Ａ）受胎後４２日の胎仔から得られた膵臓を、ｓｃｉｄマウスの腎被膜下に移植した。腫瘍が２か月後に発達した。Ｂ）内分泌マーカーとしてのインスリン（薄いグレー）およびグルカゴン（白）の免疫染色。Ｃ）内分泌マーカーとしてのインスリン（薄いグレー）および転写因子ＰＤＸ（白）の免疫染色。
【図５】図５：ｓｃｉｄマウスへのイヌ科動物未熟膵組織の形質導入および移植後に得られたインスリノーマ。受胎後４５日のイヌ胎仔膵臓を採取し、ラージＴ遺伝子（癌遺伝子ＳＶ４０）を形質導入した。Ａ）移植前後のマウス膵臓のヘキスト染色（濃いグレー）および内分泌マーカーインスリン（薄いグレー）の免疫染色。移植後、腫瘍（インスリノーマ）が生じた。Ｂ）移植２か月後の移植されたマウス膵臓。Ｃ）移植２か月後の移植されたマウス膵臓から取り出されたインスリノーマの内分泌マーカーインスリン（薄いグレー）およびラージＴ（白）の免疫染色。ラージＴの発現がインスリン分泌と共局在する。
【図６Ａ】図６Ａ：形質導入されたイヌ科動物膵細胞を移植したマウスは、調節を受けるイヌ特異的インスリンを分泌するインスリノーマを生成する。Ａ）摂食前と接触後の成犬における、また、非移植マウスとイヌβ細胞移植マウスにおける、比較イヌ特異的インスリン血漿アッセイ。イヌインスリノーマを移植したマウスにおけるイヌ特異的インスリンをアッセイすると腫瘍の存在が予測される。
【図６Ｂ】図６Ｂ：形質導入されたイヌ科動物膵細胞を移植したマウスは、調節を受けるイヌ特異的インスリンを分泌するインスリノーマを生成する。Ｂ）絶食（絶食）または通常食の移植マウスにおける比較イヌ特異的インスリンアッセイ。イヌ特異的インスリン分泌は、移植マウスでは血糖値によって調節される。
【図７】図７：イヌβ細胞株は機能的であり、イヌインスリンを産生する。イヌ特異的インスリンを分泌するインスリノーマから作出されたイヌβ細胞株の免疫染色。細胞を抗インスリン抗体で染色し（薄いグレー）、核はＤＡＰＩで染色した（濃いグレー）。細胞を共焦点顕微鏡により観察した。下のパネルは、これらの細胞の１つ（上のパネルに点線で示した挿入枠により示す）のクローズアップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の態様において、本発明は、イヌ科動物膵β細胞株またはイヌ科動物β細胞腫瘍を生産するための方法を提供する。特に、本発明は、イヌβ細胞株を生産するための方法を対象とする。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「β細胞」は、グルコースおよび他の分泌促進薬に応答してホルモンインスリンを分泌する膵臓のランゲルハンス島の細胞である。
【００２１】
「イヌ科動物膵β細胞（canine pancreatic beta cell）」または「イヌ科動物膵臓β細胞（canine pancreas beta cell）」または「イヌ科動物β細胞（canine beta cell）」（これらの用語は本願に関しては同義であり、よって、同じ意味を有すると解釈されるべきである）は、イヌ科動物起源のβ細胞である。同様に、本明細書で使用する場合、「イヌ膵β細胞（dog pancreatic beta cell）」または「イヌ膵臓β細胞（dog pancreas beta cell）」または「イヌβ細胞（dog beta cell）」は、イヌ起源のβ細胞である。
【００２２】
本発明者らは、イヌ科動物未熟膵組織材料からイヌ科動物β細胞株を作製するための新規かつ革新的な戦略を考案した。本発明者らは驚くことに、特定の発達段階のイヌ科動物未熟膵組織をｓｃｉｄマウスに移植すると、その結果、内分泌組織および外分泌組織の両方を含む完全に成熟した膵臓臓器が発達することを見出した。本発明者らはまた驚くことに、イヌ科動物未熟膵組織のサブ移植法を使用することにより、特定の条件下で膵細胞がインスリノーマ構造を形成し得ることを見出した。これらのインスリノーマ構造はイヌ科動物機能的β細胞を含み、そのサブ移植は、β細胞の特異的富化をもたらし、最終的には、臨床規模および商業規模にさらに増幅することができる均質、安定かつ機能的なイヌ科動物β細胞株の生産につながる。富化および増幅工程を繰り返すことにより、本発明者らは、イヌ科動物インスリンを安定に産生でき、かつ、検査、診断または治療用途に増幅することができるイヌ科動物機能的β細胞株を繰り返し得ることができた。
【００２３】
よって、本発明は、イヌ科動物膵組織からイヌ科動物β細胞を特異的に樹立および増幅するための方法に関する。
【００２４】
いくつかの独立したイヌ科動物β細胞株がこのように作製された。それらは総てインスリンを発現し、イヌ科動物インスリンを産生することができる。次に、イヌ科動物β細胞株はグルコース刺激に応答することができ、従って、十分に機能的である。
【００２５】
これはイヌ科動物の糖尿病の治療におけるβ細胞の獣医学的使用への展望を拓く。本発明の方法によるインスリン分泌細胞を得るための新規な方法は、イヌ科動物β細胞の豊富な供給源を提供する。有利には、当該新規な方法によって得られるイヌ科動物β細胞は、安定かつ機能的なイヌ科動物β細胞である。
【００２６】
本発明の方法を用いて得られるイヌ科動物β細胞株は、糖尿病イヌ科動物の血清中に見られる自己抗体の存在を検出するために有効に使用することができ、そにより、イヌ科動物の糖尿病の診断に大きな可能性を持つ。これらのβ細胞はまた、イヌ科動物細胞療法用のマスター細胞バッチを形成するイヌ科動物β細胞株を無限に作製および増幅するために使用される。
【００２７】
第１の実施形態において、本発明は、イヌ科動物膵β細胞またはイヌ科動物β細胞腫瘍を調製する方法であって、
ａ）イヌ科動物未熟膵細胞に、ｉ）インスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するレンチウイルスベクター、またはｉｉ）インスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原を発現するレンチウイルスベクターおよびインスリンプロモーターの制御下でｈＴｅｒｔを発現するレンチウイルスベクター、またはｉｉｉ）インスリンプロモーターの制御下でＳＶ４０ラージＴ抗原とｈＴｅｒｔの両方を発現するレンチウイルスベクターを形質導入および同時形質導入する工程；
ｂ）ａ）で得られた形質導入未熟膵細胞を第１の重症複合免疫不全症（ｓｃｉｄ）非ヒト動物の腎被膜に導入する工程；
ｃ）形質導入未熟膵細胞にインスリノーマ様構造を発達させる工程、ここで、インスリノーマ様構造のイヌ科動物未熟膵細胞はインスリン産生膵β細胞に分化している；
ｄ）工程ｃ）で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させる工程；
ｅ）工程ｄ）で得られた細胞を第２のｓｃｉｄ非ヒト動物の腎被膜にサブ移植する工程；
ｆ）工程ｅ）のサブ移植細胞に新たに発達したインスリノーマ様構造を発達および再生させる工程、ここで、当該新たに発達したインスリノーマ様構造はインスリン産生膵β細胞内で富化される；
ｇ）工程ｆ）で得られたインスリノーマ様構造を顕微解剖し、その細胞を解離させ、回収する工程；
ｈ）場合により、工程ｇ）で得られた細胞を第３の非ヒトｓｃｉｄ動物の腎被膜にサブ移植し、インスリン産生膵β細胞のさらなる富化および増幅を可能とする工程；および
ｉ）場合により、適当な量のインスリン産生膵β細胞が得られるまで工程ｅ）、ｆ）およびｇ）を繰り返す工程
を含んでなる方法を対象とする。
【００２８】
用語「膵組織」は、本明細書で使用する場合、膵臓から得られるまたは膵臓に由来する組織を指し、同様に、用語「膵細胞」は、本明細書では、膵臓から得られるまたは膵臓に由来する細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「未熟膵細胞」は、胎仔膵臓から得られる得る細胞、または内胚葉細胞において最初の分化を経た幹細胞を指す。
【００２９】
用語「イヌ科」または「イヌ科動物」は、本明細書で使用する場合、イヌ科のいずれの動物メンバーも指す。イヌ科としては、限定されるものではないが、オオカミ（Canis lupus）、イヌ（種：イエイヌ(Canis lupus familiaris)）、ディンゴ(Canis lupus)、コヨーテ(イヌ属)、リカオン（リカオン属）、キツネ（イヌ属、カニクイキツネ属、クルペオギツネ属、スジオイヌ属、オオミミギツネ属、ドロシオン属(Drocyon)、キツネ属）およびジャッカル（イヌ属）が挙げられる。
【００３０】
好ましくは、イヌ科動物は、イヌ（種：イエイヌ）である。
【００３１】
用語「イヌ科動物膵組織」は、本明細書で使用する場合、イヌ科のいずれのメンバーの膵臓から得られるまたは膵臓に由来する組織も指し、同様に、用語「イヌ科動物膵細胞（canine pancreatic cells）」または「イヌ科動物膵臓細胞（canine pancreas cells）」は、本明細書では、イヌ科のいずれのメンバーの膵臓から得られるまたは膵臓に由来する細胞も指す。用語「イヌ科動物未熟膵細胞（immature canine pancreatic cells）」または「イヌ科動物未熟膵臓細胞（immature canine pancreas cells）」は、本明細書で使用する場合、イヌ科のいずれのメンバーの胎仔膵臓から得られるもしくは胎仔膵臓に由来し得る細胞も、または内胚葉細胞において最初の分化を経たイヌ科のいずれのメンバーの幹細胞も指す。
【００３２】
好ましくは、イヌ科動物未熟膵細胞は、イヌ未熟膵細胞である。
【００３３】
現時点で、イヌ科動物膵臓の発達は記載されておらず、イヌ科動物膵細胞株の作製の成功を阻んでいる。本発明者らは、イヌ科動物内分泌膵臓の初期の形態学的発達を初めて研究した(Bricout-Neveu et al., 2017)。
【００３４】
特に、本発明者らは、イヌにおいて、膵臓の完全に成熟したインスリン産生構造が出生後初期にしか見られないことを初めて示した。実際に、本発明者らは、イヌ科動物インスリン陽性細胞が胎仔期の３０日前後の妊娠中期に出現し始めることを示した(Bricout-Neveu et al., 2017）。
【００３５】
よって、本発明の方法の一実施形態において、本発明による膵細胞は、最終の妊娠第三期の少なくとも１つのイヌ科動物胎仔膵臓から回収される。好ましくは、本発明による膵細胞は、受胎後４０〜６０日に取り出されたイヌ科動物胎仔膵臓から回収される。さらに好ましくは、本発明による膵細胞は、受胎後４０〜５５日に取り出されたイヌ科動物胎仔膵臓から回収される。有利には、本発明による膵細胞は、受胎後４０〜４６日に取り出されたイヌ科動物胎仔膵臓から回収される。好ましい実施形態において、本発明による膵細胞は、受胎後４５日に取り出されたイヌ科動物胎仔膵臓から回収される。実際に、本発明者らは、本発明の方法を用いて膵β細胞を得る収率は、受胎後４０〜６０日に取り出されたイヌ科動物胎仔膵臓を用いる場合に高く、受胎後４０〜４６日後に取り出されたイヌ科動物胎仔膵臓を用いる場合に特に優れていることを示した。
【００３６】
本発明による膵細胞は、少なくとも１つのイヌ科動物胎仔膵臓から手術により回収することができる。本発明による膵細胞は、イヌ科動物胎仔膵臓全体または該膵臓の一部のみから回収することができる。好ましくは、本発明による膵細胞は、イヌ科動物胎仔膵臓の右葉の一部または頭部の一部から回収することができる。さらに好ましくは、本発明による膵細胞は、イヌ科動物胎仔膵臓の右葉全体または頭部全体から回収することができる。実際に、本発明者らは、本発明の方法を用いた膵β細胞の収率は、イヌ科動物膵臓の右葉（頭部とも呼ばれる）またはその一部を使用する場合に特に高いことを示した。実際に、本発明者らは、β細胞がイヌ科動物膵臓の右葉または頭部でより代表的であることを初めて示した(Bricout-Neveu et al., 2017)。
【００３７】
よって、このような方法は、使用するためのイヌ科動物膵臓の部分および回収されたイヌ科動物胎仔の適当な発達段階が知られていなかったことから、これまで実施できなかった。
【００３８】
一実施形態において、膵組織は、採取後に凍結されている。別の実施形態において、本発明の方法で使用される膵組織は新鮮物である。よって、特定の実施形態によれば、本発明の方法は、工程ａ）の前に膵組織を採取する工程を含んでなる。
【００３９】
一実施形態において、本発明の方法は、イヌ科動物膵細胞を得るために工程ａ）の前にイヌ科動物未熟膵組織をコラゲナーゼで解離させるさらなる工程を含んでなる。
【００４０】
「コラゲナーゼ」とは、本明細書では、コラーゲン内のペプチド結合を切断することができるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーに属す酵素を指す。コラゲナーゼは、本発明によれば、細菌起源または動物起源のいずれかであり得る。細菌コラゲナーゼは、広い基質特異性を示すという点で脊椎動物コラゲナーゼとは異なる。動物コラゲナーゼとは異なり、細菌コラゲナーゼは、ほとんど総てのコラーゲンタイプに作用することができ、三重らせん領域内で複数の切断を行うことができる。好ましくは、本発明のコラゲナーゼは細菌酵素であり、より好ましくは、それは好気性細菌クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)により分泌される酵素である。好ましい実施形態において、本発明で使用されるコラゲナーゼは、コラゲナーゼタイプＩ−Ｓ、タイプＩＡ、タイプＩＡ−Ｓ、タイプＩＩ、タイプＩＩ−Ｓ、タイプＩＶ、タイプＩＶ−Ｓ、タイプＶ、タイプＶ−Ｓ、タイプＶＩＩＩ、タイプＸＩおよびタイプＸＩ−Ｓからなる群から選択される。最も好ましい実施形態において、本発明のコラゲナーゼは、コラゲナーゼＸＩである。
【００４１】
本発明の方法でイヌ科動物膵細胞を得るために使用されるコラゲナーゼの濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、より好ましくは４ｍｇ／ｍＬ以下、より一層好ましくは３ｍｇ／ｍＬ以下、さらにより好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下、なおより一層好ましくは１ｍｇ／ｍＬ以下である。最も好ましい実施形態において、当該コラゲナーゼは、１ｍｇ／ｍＬで使用される。本発明によれば、イヌ科動物未熟膵組織は、コラゲナーゼで少なくとも１０分、好ましくは少なくとも１５分、より好ましくは少なくとも２０分、より一層好ましくは少なくとも２５分、さらにより好ましくは少なくとも３０分、最も好ましくは３０分間約３７℃で解離される。解離が起こるためには、上記膵組織は好ましくは、ＰＢＳ＋２０％ＦＣＳを含んでなる適当な培地に懸濁させる。
【００４２】
「インスリンプロモーター」とは、本明細書では、インスリン遺伝子発現の調節に関与する調節核酸配列を含むゲノム領域を指す。好ましい実施形態において、本発明で使用されるインスリンプロモーターは、ネズミインスリンプロモーターである。好ましくは、本発明で使用されるインスリンプロモーターは、ラットインスリンプロモーターである。より一層好ましくは、当該ラットインスリンプロモーターは、Castaing et al., 2005に記載されているプロモーターである。
【００４３】
膵組織の解離から得られるイヌ科動物未熟膵細胞の、レンチウイルスベクターでの形質導入は、当業者に公知の方法に従って行われる（例えば、Russ et al., 2008およびKhalfallah et al., 2009、ならびにその中の参照文献参照）。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ１などのレンチウイルス由来のベクターである。それらのベクターは、非分裂細胞ならびに分裂細胞に形質導入を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脳、肝臓、筋肉、および造血幹細胞を含むいくつかの標的組織で異種核酸配列の発現を持続することができる。多数のレンチウイルスベクターが当業者にすでに知られており、本発明に関してはこれらのベクターのいずれのものも、インスリンプロモーターの制御下で少なくともＳＶ４０ラージＴ抗原および／またはｈＴＥＲＴを発現する限り使用可能である。当業者は、このようなレンチウイルスベクターの例が記載されているRuss et al., 2008およびKhalfallah et al., 2009を参照する。
【００４４】
本発明のイヌ科動物未熟β細胞をある特定の条件で脱不死化することが有利であり得る。例えば、患者への当該細胞の投与が企図される場合には、ベクターにより運ばれる癌遺伝子を除去することがより安全である。よって、レンチウイルスベクターは、可逆的または条件付きの不死化を可能とするために、少なくとも１つのＬｏｘ  Ｐ部位が導入され得るように構築することができる。より好ましくは、本発明によるベクターは、ＳＶ４０ラージＴおよび／またはｈＴＥＲＴ導入遺伝子が２つのＬｏｘ  Ｐ部位の間に位置するように構築される。当該導入遺伝子は、β細胞でＣｒｅリコンビナーゼを発現させることによって除去される。例えば、上記方法によって得ることができる細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するベクターまたはプラスミドにより形質導入され、復帰突然変異が起こる。当然のことながら、当業者は、当該導入遺伝子を除去するためにＦＲＴ／ＦＬＰ系の使用を選択してもよい。不死化された細胞を復帰させるための方法は、ＷＯ０１／３８５４８に記載されている。
【００４５】
特定の実施形態において、ＳＶ４０ラージＴを発現するレンチウイルスベクターおよびｈＴＥＲＴを発現するレンチウイルスベクターは、ＬｏｘＰまたはＦＲＴ部位をさらに含んでなる（ただし、部位特異的組換え部位は両ベクターで異なる）。
【００４６】
負の選択工程もまた、ＣｒｅまたはＦＬＰリコンビナーゼの作用後に行うことができる。このさらなる工程は、不死化遺伝子ＳＶ４０ラージＴおよびｈＴＥＲＴ、ならびに抗生物質耐性遺伝子が除去された細胞のみを選択することを可能とする。これらの細胞は、糖尿病イヌ科動物に移植されるまで、凍結、保存、および場合によりカプセル封入することができる。
【００４７】
負の選択マーカー遺伝子は、例えば、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子であり得、選択薬剤アシクロビル−ガンシクロビルであり得る。または負の選択マーカーは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子およびグアニン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）遺伝子であり、選択薬剤は、６−チオグアニンである。または負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ遺伝子であり、選択薬剤は、５−フルオロ−シトシンである。よって、好ましい実施形態において、当該負のマーカー遺伝子は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、グアニン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（Ｇｐｔ）遺伝子、およびシトシンデアミナーゼ遺伝子からなる群から選択される。負の選択マーカータンパク質の他の例は、ウイルスおよび細菌毒素、例えば、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）である。これらの負の選択遺伝子および薬剤ならびにそれらの使用は当業者に周知であり、ここでさらに詳説する必要はない。
【００４８】
次に、形質導入細胞は、重症複合免疫不全(severe compromised immunodeficiency)（ｓｃｉｄ）動物の少なくとも１つの腎被膜に導入される。ｓｃｉｄ動物は、ＴおよびＢリンパ球を欠き、体液性または細胞媒介性免疫を生成できない動物である。本明細書に言及されるｓｃｉｄ非ヒト動物は、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒトを除く霊長類、マウス、ラット、ハムスターなどの齧歯類の中から選択され得る。当該ｓｃｉｄ非ヒト動物は、免疫不全に至る少なくとも１つの他のタイプの突然変異を持ち得る。当該ｓｃｉｄ非ヒト動物は、非肥満型糖尿病／重症複合免疫不全症（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ）動物であり得る。ＮＯＤ／ｓｃｉｄ動物は、ＴおよびＢリンパ球を欠き、従って体液性免疫または細胞性免疫を生成できない動物である。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用されるＮＯＤ／ｓｃｉｄ動物はマウスである。ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスは文献において既知であり、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒまたはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの供給者から市販されている。好ましくは、本発明の方法で使用されるＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスは、任意の発達齢のものであり、好ましくは、腎被膜への移植が実施できる十分な齢である。好ましくは、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスは、約発達２〜１５週、より好ましくは、発達６〜８週である。
【００５０】
本発明者らは、イヌ科動物胎仔膵臓はｓｃｉｄマウスの腎被膜下に移植すると、通常に成長および成熟することを初めて示した。さらに、本発明者らは、イヌ科動物インスリノーマは、本発明の方法の工程ｃ）に従ってイヌ科動物未熟膵臓細胞を移植したマウスで得ることができることを初めて示した。
【００５１】
場合により、工程ａ）において上記細胞に、インスリンプロモーターの制御下で抗生物質耐性遺伝子を発現する別のレンチウイルスベクターをさらに形質導入する。抗生物質耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン−Ｓ−デアミナーゼ遺伝子からなる群において選択される。好ましい実施形態において、当該抗生物質耐性遺伝子は、ネオマイシン耐性遺伝子である。この場合、選択薬剤はＧ４１８である。
【００５２】
ヒト膵細胞を得るための方法は、Ravassard et al. (2011)およびＷＯ２００８／１０２０００に開示されている。しかしながら、この方法は、イヌ科動物インスリノーマおよびイヌ科動物膵β細胞を保有するマウスを取得および同定することができない。これらの刊行物に、イヌおよびイヌ科動物膵臓の発達に関する、特に、インスリン産生細胞の出現に関する情報は含まれていない。さらに、ヒトインスリンの発現はｓｃｉｄマウスにおいて低血糖を与えるが、イヌ科動物インスリンではそうではない。従って、血糖をアッセイすることによって、発達した機能的イヌ科動物インスリノーマを有するｓｃｉｄマウスをスクリーニングすることは不可能である。重要なこととして、本発明者らは、マウスにおいてイヌ科動物特異的インスリンをアッセイすることにより、移植マウスにおいてイヌ科動物インスリノーマが検出でき、移植に成功したマウスの選択が可能となることを初めて示した。よって、一実施形態において、インスリン産生膵細胞に分化した発達したインスリノーマ様構造を有する非ヒト動物は、非ヒト動物においてイヌ科動物特異的インスリンレベルを測定することによって選択される。
【００５３】
イヌ科動物特異的インスリンのレベルを測定および／または決定するための方法は、一般に当業者に公知であり、慣例的に、ヒトインスリンを測定するために開発された方法に頼っている。イヌ科動物インスリンのレベルを測定および／または決定するための方法としては、例えば、質量分析、例えば、従来の免疫検出試験（酵素結合免疫吸着アッセイもしくはＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）などの免疫試験、または例えば、スロットブロット（ドットブロットとも呼ばれる）またはウエスタンブロットなど、支持体上のタンパク質の移動を含む技術を用いる免疫試験を含む生化学的試験が含まれる。例えば、免疫組織化学と組み合わせたタンパク質マイクロアレイ、抗体マイクロアレイまたは組織マイクロアレイを使用することが可能である。使用可能な他の技術としては、ＢＲＥＴまたはＦＲＥＴ技術、特に、共焦点顕微鏡法および電子顕微鏡法を含む顕微鏡または組織化学法、１以上の励起波長の使用に基づく方法、および好適な光学的方法、例えば、電気化学的方法（ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー）、原子間力顕微鏡、および高周波法、例えば、多極共鳴分光法、共焦点および非共焦点、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率および複屈折の検出、または屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法などによる）、放射性同位元素または磁気共鳴画像法によるフローサイトメトリー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＨＰＬＣ−質量分析、液体クロマトグラフィー／質量分析／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）による分析である。これらの技術は総て当業者に周知であり、ここでそれらを詳説する必要はない。
【００５４】
よって、一実施形態において、本発明の方法は、インスリン産生膵細胞に分化した、発達してインスリノーマ様構造を有する非ヒト動物を選択するために、工程ｄ）の前にイヌ科動物特異的インスリンのレベルを測定する工程をさらに含んでなる。一実施形態において、イヌ科動物特異的インスリンのレベルは、イヌ科動物特異的インスリン抗体を用いて測定される。このような抗体は市販されている。有利には、イヌ科動物特異的インスリン抗体は、キットに含まれる。好ましくは、イヌ科動物特異的インスリンのレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定される。有利には、イヌ科動物特異的インスリンのレベルは、イヌ科動物特異的インスリン抗体を含んでなるイヌ科動物特異的ＥＬＩＳＡキットを用いてＥＬＩＳＡにより測定される。イヌ科動物特異的ＥＬＩＳＡキットは、抗体、キャリブレーター、バッファー、およびイヌ科動物インスリンに関して至適化された分析範囲をさらに含み得る。
【００５５】
上記で定義された方法は、均質な細胞集団を形成する工程ｇ）で得られたイヌ科動物機能的膵β細胞を回収することを含む。細胞集団は、イヌ科動物機能的β細胞株を樹立するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでさらに培養することができる。この段階で、成功したサブ移植に由来する細胞は、ＳＶ４０ラージＴおよび／またはｈＴＥＲＴと抗生物質耐性導入遺伝子を含んだ。よって、上記方法によって得ることができる細胞株は不死化され、エンドポイントに応じてそれらは復帰（脱不死化）されてもされなくてもよい。特に、脱不死化は、本発明の細胞の治療的使用が企図される場合に有用であり得る。
【００５６】
イヌ科動物機能的膵β細胞を調製するための上記方法は、マウスもしくはラットなどの非ヒト動物において移植後にｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、イヌ科動物の糖尿病を治療するための候補医薬を試験およびスクリーニングするのに特に有用である。
【００５７】
これに関して、また、特定の一実施形態において、上記方法は、試験およびスクリーニング目的で、ならびに１型糖尿病または他の型の糖尿病において糖尿病動物の分類を可能とするイヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断の目的で、多量の量のイヌ科動物機能的膵β細胞を調製するために実施することができる。ここで、当該細胞は、脱不死化されてもよい。対照的に、上記方法を用い、工程ｆ）、ｇ）およびｈ）は、多量のインスリノーマまたはその単離されたイヌ科動物β細胞を得るために必要な回数繰り返すことができ、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無限にさらに培養増幅してもよい。β細胞腫瘍の切片、それに由来する細胞またはこれらの細胞からのタンパク質抽出物を、固相支持体（例えば、ポリリジンコーティングプレート）に結合または吸着させ、イヌ科動物の血漿血清と反応させることができる。インキュベーション後、血清を洗い流し、糖尿病関連自己免疫に特異的な異なる表面抗原に対する自己抗体の有無を明らかにする（例えば、標識抗イヌ科動物Ｉｇの手段による）。
【００５８】
よって、第２の態様において、本発明は、上記方法により得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍またはインスリノーマ、またはイヌ科動物膵β細胞を目的とする。これらのイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞は、以下の特徴：
イヌ科動物特異的インスリンの発現、および
転写因子Ｐｄｘ陽性
のうち少なくとも１つを示す。
【００５９】
有利には、当該イヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞は、以下の特徴：
カルボキシペプチダーゼ−Ａ陰性
転写因子Ｐｄｘ１陽性
転写因子ＭａｆＡ陽性
プロコンベルターゼＰｃｓｋ１陽性
グルコース輸送体Ｇｌｕｔ２の発現
カリウムチャネルのサブユニットをコードするＫｃｎｊ１１およびＡｂｃｃ８の発現
亜鉛輸送体Ｚｎｔ８（Ｓｌｃ３０ａ８）の発現
イヌ科動物特異的インスリンの発現
のうち少なくとも１つをさらに示す。
【００６０】
上記で定義されたイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞はまた、抗インスリン、抗ＧＡＤおよび／または抗ＩＡ２抗体との反応に対しても陽性であり、無血清培地中およびマトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングウェル上での培養で維持および増殖させることができる。実際に、本発明者らは、このような培地増殖および維持したイヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物膵β細胞が安定、効率的かつ均質にイヌ科動物インスリンを産生できることを初めて示した。よって、本発明はまた、上記培養イヌ科動物膵β細胞を、マトリゲルまたはフィブロネクチンを含んでなる無血清培地中に含んでなる細胞培養物を企図する。この細胞培養物は、不死化イヌ科動物膵β細胞株の拡大培養および樹立を可能とする。
【００６１】
さらに、上記方法により得ることができる細胞株は、例えば、試験およびスクリーニング目的で、ならびに１型糖尿病または他の型の糖尿病において糖尿病動物の分類を可能とするイヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断の目的で使用できるように脱不死化してもよい。
【００６２】
「糖尿病」とは、本発明では、身体がインスリンを産生できないかまたは身体が産生するインスリンを適切に使用できない慢性の、しばしば衰弱性の、また、時には致死性の疾患を指す。本発明によるイヌ科動物１型糖尿病は、β細胞の自己免疫的破壊から起こる糖尿病である。本明細書で使用する場合、「イヌにおける他の型の糖尿病」または「他の型のイヌ科動物の糖尿病」は、１型でないイヌ科動物の糖尿病を指す。
【００６３】
イヌ科動物機能的膵β細胞を調製するための上記方法は、イヌ科動物の糖尿病を治療するための候補医薬を、マウスもしくはラットなどの非ヒト動物への移植後にｉｎ  ｖｉｖｏで、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験およびスクリーニングするのに特に有用である。具体的には、本発明は、イヌ科動物の糖尿病を治療するための候補医薬を試験およびスクリーニングするための方法であって、本発明のイヌ科動物膵細胞を移植した非ヒト動物に候補医薬を投与する工程を含んでなる方法に関する。より具体的な実施形態において、本方法は、上記方法に従って上記β細胞を取得し、当該細胞を上記非ヒト動物に移植する前工程を含んでなる。当該非ヒト動物は、好ましくは、上記のように、ｓｃｉｄ非ヒト動物である。
【００６４】
本発明はまた、イヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法に関する。β細胞腫瘍の切片、それに由来する細胞またはこれらの細胞からのタンパク質抽出物を固相支持体（例えば、ポリリジンコーティングプレート）に結合または吸着させ、動物の血漿血清と反応させる。インキュベーション後、血清を洗い流し、イヌ科動物糖尿病関連自己免疫に対して特異的な異なる表面抗原に対する自己抗体の有無を明らかにする（例えば、標識抗ヒトＩｇの手段による）。
【００６５】
よって、一実施形態において、本発明は、上記のようなイヌ科動物β細胞腫瘍もしくはイヌ科動物膵β細胞、または当該細胞由来のタンパク質抽出物を固相支持体に結合または吸着させること、および動物の血漿血清と反応させること、イヌ科動物１型糖尿病または他の型の糖尿病に特異的な異なる表面抗原に対する自己抗体、例えば、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（ＧＡＤＡ）から選択される膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、の有無を検出することを含んでなる、イヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法に関する。
【００６６】
好ましくは、糖尿病動物および対照動物由来の血清を、上記イヌ科動物β細胞腫瘍またはイヌ科動物β細胞の組織切片に加え、上記患者動物の血清中のイヌ科動物糖尿病関連自己抗体の有無を明らかにするために、蛍光標識コンジュゲート抗イヌ科動物ＩｇＧなどの標識抗イヌ科動物ＩｇＧとともにインキュベートする。この実施形態において、自己抗体の存在は、イヌ科動物の糖尿病の指標となる。
【００６７】
上記糖尿病動物の血清中のイヌ科動物糖尿病関連自己抗体の有無はまた、上記イヌ科動物β細胞腫瘍または上記イヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物のウエスタンブロットによって検出することもできる。この場合、上記糖尿病動物の血清中のイヌ科動物糖尿病関連自己抗体の有無は、標識抗イヌ科動物ＩｇＧ、例えば、ＨＲＰコンジュゲート抗イヌ科動物ＩｇＧで検出される。あるいは、上記糖尿病動物の血清中のイヌ科動物糖尿病関連自己抗体の有無は、ウェルプレートが上記イヌ科動物β細胞腫瘍または上記イヌ科動物膵β細胞のタンパク質抽出物でコーティングされているＥＬＩＳＡ試験によって検出される。この実施形態によれば、当該タンパク質抽出物を、糖尿病動物および対照動物由来の血清とともにインキュベートし、上記糖尿病動物の血清中のイヌ科動物糖尿病関連自己抗体の有無を、標識抗イヌ科動物ＩｇＧ、例えば、ＨＲＰコンジュゲート抗イヌ科動物ＩｇＧで検出する。
【００６８】
別の態様では、イヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法は、上記方法により得ることができβ細胞腫瘍の切片、それに由来する細胞またはこれらの細胞のタンパク質抽出物を動物の血漿血清と反応させること、イヌ科動物１型糖尿病もしくは他の型のイヌ科動物の糖尿病に特異的な異なる表面抗原に対する自己抗体、例えば、膵島細胞抗体（ＩＣＡ）、または最近同定されたインスリン自己抗体（ＩＡＡ）に対する抗体およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（ＧＡＤＡ）もしくはＩＡ−２抗体（ＩＡ２Ａ）、もしくは特異的な未知の抗体のようなより特異的な抗体の有無を検出することを含んでなる。既知のまたは新規な抗体の同定は、例えば、イムノブロットまたはドットブロットによって行うことができる。
【００６９】
本発明のこの態様は、イヌ科動物の糖尿病を診断するため、および糖尿病型の分類のために商業規模で調製することができるキットを初めて提供する。より詳しくは、このキットは、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体（ＧＡＤＡ）から選択される膵島細胞抗体（ＩＣＡ）などの特異的イヌ科動物自己抗体を検出するために使用することができる。実際に、これらの抗原は、上記方法に従って得ることができるβ細胞腫瘍またはそれに由来する細胞の表面で発現される。よって、本明細書にはイヌ科動物の糖尿病用の診断キットが包含され、当該キットは、場合により固相支持体に結合または吸着された、上記方法によって得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍もしくはイヌ科動物機能的膵β細胞、またはそれに由来するタンパク質抽出物を含んでなる。
【００７０】
別の実施形態において、上記のような細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養され、インスリン分泌を調節し得る化合物をスクリーニングするためにイヌ科動物膵β細胞株が樹立される。よって、本発明はまた、インスリン分泌を調節し得る化合物をスクリーニングするための方法であって、ａ）本発明のイヌ科動物膵β細胞を試験化合物と接触させる工程、およびｂ）インスリン分泌を検出し、インスリン分泌のレベルを測定する工程を含んでなる方法を提供する。インスリン分泌は、例えば以下の試験例、Ravassard et alおよびＷＯ２００８／１０２０００で詳説されるように、当業者に公知の手段のいずれかによって検出することができる。好ましい実施形態によれば、本発明のスクリーニング法は、工程ｂ）で得られた分泌インスリンのレベルを少なくとも１つの対照レベルと比較する工程を含んでなる。当該対照レベルは、インスリンを分泌することが分かっている細胞株によって産生されるインスリンのレベルに相当する。あるいは、当該対照レベルは、インスリンを産生しないことが分かっている細胞株によって産生されるインスリンのレベルに相当する。さらに好ましい実施形態において、工程ｂ）の分泌インスリンレベルは２つの対照レベルを比較し、一方は、インスリンを分泌することが分かっている細胞株によって産生されるインスリンのレベルに相当し、他方は、インスリンを産生しないことが分かっている細胞株によって産生されるインスリンのレベルに相当する。さらに別の好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング法は、上記イヌ科動物膵β細胞を調製するための方法に従ってイヌ科動物膵β細胞株を得る前工程を含んでなる。
【００７１】
さらに別の実施形態において、上記のようなイヌ科動物膵β細胞を調製するための方法は、イヌ科動物の糖尿病の細胞療法のためのマスター細胞バンクの樹立に向けられる。ここで、当該方法は、細胞を脱不死化することをさらに含む。当該細胞の脱不死化は、レンチウイルスベクターからＳＶ４０ラージＴおよびｈＴＥＲＴ導入遺伝子を除去する工程を含む。好ましくは、導入遺伝子は、上記のように、ＣｒｅまたはＦＬＰなどの部位特異的リコンビナーゼでの部位特異的組換えによって切断される。
【００７２】
さらに別の実施形態において、本発明は、上記のようにイヌ科動物膵β細胞を調製するための方法によって得ることができるイヌ科動物β細胞腫瘍およびその単離された細胞に関する。説明したように、本明細書には不死化および脱不死化の両方が含まれる。
【００７３】
本発明はまた、イヌ科動物の糖尿病の治療のために、上記で説明したイヌ科動物の糖尿病のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のために、および、イヌ科動物の糖尿病の細胞療法のために、候補医薬を試験またはスクリーニングするための上記細胞の使用に関する。
【００７４】
本発明はまた、イヌ科動物糖尿病に罹患している個々の動物においてイヌ科動物膵臓機能を再生する方法であって、有効量の上記で定義されたイヌ科動物機能的膵細胞（当該細胞は最初のβ細胞表現型に復帰している）を上記動物に投与する工程を含んでなる方法を提供する。好ましい実施形態において、当該細胞は、上記動物内に移植される。別の好ましい実施形態において、上記膵臓機能を再生する方法は、上記方法によって上記イヌ科動物膵β細胞を得る前工程を含んでなる。
【００７５】
本発明はまた、製薬上許容可能な担体と上記で定義された有効量のイヌ科動物機能的膵細胞を含んでなる医薬組成物に関し、当該細胞は場合によりカプセル封入されていてもよい。
【００７６】
「有効量」は、有益または所望の臨床結果を達成するのに十分な量である。有効量、例えば、１０５〜１０９細胞は１回以上の適用で投与することができるが、１回の投与で十分であることが望ましい。本発明の目的で、膵β細胞の幹細胞前駆体の有効量は、膵臓の機能のうち以上を回復させることができる分化した膵細胞を産生するのに十分な量である。回復は、比較的多数の、例えば、１０９細胞を超える膵細胞の導入によって速やかに起こり得ることが企図される。加えて、また、より少ない膵細胞が導入される場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏで１または複数の膵臓細胞が増殖可能である場合に機能は回復されるということも企図される。よって、「有効量」の膵細胞は、たった１個の膵臓細胞に膵臓全体または一部を再生するのに十分時間を与えることによって得ることができる。好ましくは、個体に投与される有効な量は、約１０１を超える膵細胞、好ましくは約１０２〜約１０１５の間の膵細胞、より一層好ましくは約１０３〜約１０１２の間の膵細胞である。治療に関して、膵細胞の「有効な量」は、糖尿病などの膵疾患を改善する、和らげる、安定にする、逆転させる、その進行を緩慢にする、または遅延させることができる量である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「薬学上許容可能な担体」は、生理学的に適合するいずれかおよびあらゆる溶媒、バッファー、塩溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。担体のタイプは、意図される投与経路に基づいて選択することができる。種々の実施形態において、担体は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮または経口投与に好適である。薬学上許容可能な担体としては、無菌水溶液または分散液および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が含まれる。薬学上活性な物質のための媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。静注のための典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンゲル液と１００ｍｇの組合せを含有するように構成することができる。非経口投与可能な化合物を調製するための実際の方法は当業者に既知または自明であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)ならびにその第18版および19版に詳細に記載されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００７８】
細胞をイヌ科動物に導入する方法は当業者に周知であり、限定されるものではないが、注射、静脈内または非経口投与が含まれる。単回、多回、連続または間欠的投与を行うことができる。よって、本発明のイヌ科動物β細胞は、限定されるものではないが、膵臓、腹腔、腎臓、肝臓、門脈または脾臓を含むいくつかの異なる部位のいずれかに投与することができる。好ましくは、当該β細胞は、動物の膵臓に挿入される。
【００７９】
本発明のイヌ科動物膵β細胞は、膵機能を再生するために有用であり得る。当該細胞はまた、膵障害に苦しむ動物に当該障害を治療するために投与することもできる。よって、本発明はまた、イヌ科動物膵障害を本発明の方法により得られるイヌ科動物膵β細胞で治療するための方法であって、当該イヌ科動物膵β細胞を、それを必要とする動物に投与することを含んでなる方法を企図する。好ましい実施形態によれば、本発明の治療方法は、イヌ科動物膵組織から上記イヌ科動物膵β細胞を得る前工程を含んでなる。さらに好ましい実施形態において、イヌ科動物膵組織は、治療を必要とする上記動物から得られる。
【００８０】
よって、本発明の別の態様は、薬剤としての本発明のイヌ科動物膵細胞を提供することである。より厳密には、本発明は、イヌ科動物膵障害を治療するための薬剤の調製を目的とした本発明のイヌ科動物膵β細胞の使用に関する。本発明のさらに別の態様は、イヌ科動物膵障害の治療に使用するための本発明のイヌ科動物膵β細胞に関する。
【００８１】
本発明によるイヌ科動物膵障害は、糖尿病、低血糖、または消化酵素の機能不全に関連する任意の病態である。好ましくは、イヌ科動物膵障害は、インスリン依存性糖尿病（Ｔ１Ｄ）である。
【実施例】
【００８２】
Ａ）材料および方法
Ａ．１．イヌ科動物膵組織の供給源および回収手順
表１に示されるように、イヌ胎仔膵臓の受胎後（ｐｃ）３０、３３、３６、４０、４５および５５日という６つの発達段階を選択した。本研究は、ｐｃ５５日に調べた胎仔膵臓を除き、単一系統のビーグル犬、すなわちＭａｉｓｏｎ−Ａｌｆｏｒｔ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｈｏｏｌの飼育施設で養育した系統に絞った。この５５ｐｃに得られた胎仔の母親は、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｓｃｈｏｏｌで養育したものではなく、５５ｐｃに得られたその胎仔の種類は不明であった。その母親の体長はビーグル犬に相当するものであった。
【００８３】
胎仔サンプルは総て、選択的帝王切開によって得た。胎仔齢は、血漿プロゲステロンサージにより確認される排卵によって決定した（５５日齢の胎仔を除く）。
【００８４】
さらに、収容中の出産後１日目の初期新生仔期または８週間目の離乳時に死亡した２個体のビーグル犬からも膵臓を得た。また、成犬１個体からの膵臓も調べた。このサンプルは進行性、重症無能性の神経筋障害のために安楽死させたラブラドールから得た。
【００８５】
ｐｃ４６日の胎仔段階および出生後１日に得られたビーグル犬膵臓の形態をそれぞれラブラドールおよびチャウチャウの膵臓と比較した。
【００８６】
動物を含む手順は総て、Ｅｔｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｍａｉｓｏｎ−Ａｌｆｏｒｔ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｈｏｏｌの倫理委員会によって承認された。
【００８７】
Ａ．２．イヌ科動物膵組織の調製
手術後すぐに、総ての膵臓を摘出し、３．７％ホルムアルデヒド中で固定した後、パラフィンに包理した。ｐｃ３０日および３３日の膵臓では、膵臓および胃を含む全中腸管を摘出したが、それ以降の段階では、膵臓のみを摘出した。新生仔（１日）および幼犬（８週間）の膵組織は、犬の死亡の１時間後に摘出し、ＰＢＳ−１０％ホルモール溶液で固定した後にパラフィン包理した。同じ手順を成犬から得られた膵断端にも適用した。この場合、膵断端は右葉から採取した。
【００８８】
Ａ．３．免疫組織化学
パラフィン包埋切片は、初期段階に対しては４μｍ、出生後および成犬段階には５μｍの厚さで切断した。切片をモルモット抗インスリン抗体（１／５００；Ａ０５６４、Ｄａｋｏ−Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）およびウサギ抗グルカゴン（１／１０００；２００７６−Ｉｍｍｕｎｏ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）で染色した。二次抗体はフルオレセインテキサスレッド抗モルモット抗体（１／２０００；７０６−０７６−１４８、Ｊａｃｋｓｏｎおよび抗ウサギ抗体（１／２００；７１１−０９６−１５２、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）であった。Ａｘｉｏ  Ｓｃａｎ  Ｚ１（Ｚｅｉｓｓ）を用いてデジタル画像をキャプチャーした。
【００８９】
各検体から得た切片の数および分析した切片の数を表１に記載する。
【００９０】
【表１】
2019515695.tif 000002
【００９１】
分析した切片は無作為に選択し、組織全体の代表的なものである。
【００９２】
Ａ．４．ＤＮＡ構築物および組換えレンチウイルスの生産
レンチウイルスベクターｐＴＲＩＰ  ΔＵ３．ＲＩＰ４０５−ＳＶ４０ＬＴ  ｌｏｘＰおよびｐＴＲＩＰ  ΔＵ３．ＲＩＰ４０５−ｈＴＥＲＴ  ｌｏｘＰは、従前に記載された(Ravassard et al, 2009)ｐＴｒｉｐ  ΔＵ３．ＲＩＰ４０５−ＳＶ４０ＬＴ／ｈＴＥＲＴの３’ＬＴＲ領域にｌｏｘＰ部位を付加することによって構築した。両ｐＴＲＩＰ  ΔＵ３ベクターをＫｐｎＩおよびＰａｃＩで消化して３’ＬＴＲ領域を除去した。ＳＩＮ−ＲＰ−ＬＴｃＤＮＡ−ＷＨＶ−Ｕ３ｌｏｘＰ（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｔｈｏｒｅｎｓにより提供）の３’ＬＴＲｌｏｘＰ領域をＰＣＲにより増幅し、次にＫｐｎＩおよびＰａｃＩで消化し、その後、２つの線状化したｐＴｒｉｐベクターに連結した。レンチウイルスベクター原株は、従前に記載されているように(Zufferey et al., 1997）、ｐ８．９プラスミド（ΔＶｐｒΔＶｉｆΔＶｐｕΔＮｅｆ）、ＶＳＶ糖タンパク質ＧをコードしたｐＨＣＭＶ−ＧおよびｐＴＲＩＰ  ΔＵ３組換えベクターのキャプシド形成による２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションによって生産した。上清をＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）で処理した後、超遠心分離を行い、得られたペレットをＰＢＳに再懸濁させ、アリコートに分け、その後、使用まで−８０℃で冷凍した。ｐ２４キャプシドタンパク質の量は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって定量した。総ての形質導入は、ｐ２４キャプシドタンパク質定量に対して正規化した。
【００９３】
Ａ．５．遺伝子導入
膵組織をウシ胎仔血清痛で１ｍｍ角の切片とし３７℃で３０分間、コラゲナーゼＸＩ（１ｍｇ／ｍｌ  ＲＰＭＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、次に、２０％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中で３回すすいだ。新生膵臓に、従前に記載されているように(Castaing et al., 2005; Scharfmann 2008)、ｐＴＲＩＰ  ΔＵ３．ＲＩＰ４０５−ＳＶ４０ＬＴ  ｌｏｘＰを形質導入した。簡単に述べれば、組織に、５．６ｍＭグルコース、２％ウシ血清アルブミン画分Ｖ（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭニコチンアミド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５．５μｇ／ｍｌトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、６．７ｎｇ／ｍｌセレナイト（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストランを含んだ２００μｌのＤＭＥＭ中、３７℃で２時間、２μｇのｐ２４キャプシドタンパク質に相当する合計量のレンチウイルスベクターを形質導入した。次に、組織を培養培地で２回洗浄し、ｓｃｉｄマウスに移植まで、一晩培養で維持した。
【００９４】
Ａ．６．動物およびｓｃｉｄマウスへの移植
雄ｓｃｉｄマウス（Ｈａｒｌａｎ）をアイソレーター内で管理した。解剖顕微鏡を用い、従前に記載されているように(Ravassard et al., 2011）、膵臓または膵島を腎被膜下に移植した。移植後の種々の時点で、マウスを犠牲にし、腎臓を摘出し、移植片を切開した。総ての動物試験およびプロトコールは、契約番号Ｂ７５−１３−０３の下、フランス立法に従ってＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｏｆｆｉｃｅにより承認されたものである。
【００９５】
Ａ．７．イヌ特異的インスリンレベルのアッセイ
ＭＥＲＣＯＤＩＡにより市販されているＥＬＩＳＡキットを製造者の説明書に従って用い、イヌ特異的インスリンのレベルをアッセイした。
【００９６】
Ｂ）イヌ科動物膵臓発達の研究
１−緒論
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持および拡大培養可能なイヌ科動物β細胞株の取得を可能とする。これはイヌ科動物の糖尿病の細胞療法の開発に向けた第一段階である。
【００９７】
従って、本発明の方法の膵臓を採取するのに最も適した胎仔段階を特定するために、イヌ科動物内分泌膵臓の初期の形態学的発達の研究を行った。本研究はまた、イヌ科動物胎仔発達におけるインスリンの役割の説明の第一段階ともなる。本研究における第一の目的は、始原膵臓がホルモン陰性細胞からホルモン陽性細胞へと進む膵発達期を決定することであった。このためにイヌ胎仔膵臓において、免疫組織化学を用い、インスリンおよびグルカゴンの発現を分析した。第二の目的は、ランゲルハンス島の高度に組織化された構造が形成される胎仔のまたは出生後初期発達の段階を決定することであった。最後に、成犬で内分泌膵臓の免疫組織学的構造を調べた。 
【００９８】
２−  結果
受胎後３０日（ｐｃ；Ｅ−３０）からｐｃ４５日（Ｅ−４５）までのイヌ胎仔膵臓の発達を図１に示す。左のレーンの上から下へ、胃の近くに局在した３０日および３３日目高密度の上皮芽から、３６日から４５日までの明瞭に分岐した上皮へと、膵上皮が顕著な拡大プロセスおよび分岐を受ける（図１、Ｅ−３０〜Ｅ−４５）。分岐した上皮では、幹部と頂部の両方が見て取れる（図１、Ｅ−３６およびＥ−４５、矢印）。
【００９９】
ｐｃ３０日および３３日では、希少なインスリン陽性β細胞が検出される（Ｅ−３０およびＥ−３３）。より若い膵臓では、β細胞は、調べた切片の２５％に見られるに過ぎなかった。従って、インスリン陽性細胞は、胎仔期３０日前後の妊娠中期に出現する。グルカゴン細胞ははるかに頻繁に見られる。両細胞は単独で、膵芽中に分散される。３６日目（Ｅ−３６）まで、β細胞およびα細胞の数は増えるが、グルカゴン細胞が優勢である。膵臓上皮は分岐し、内分泌細胞はほとんどが幹部内に局在する。β細胞またはα細胞の小クラスターも見て取れるが、大部分の内分泌細胞は単独である。ｐｃ４５日（Ｅ−４５）では、内分泌クラスターは大きくなり、希少なクラスターでは、α細胞とβ細胞の両方が見て取れる（図１、矢印）。同様の所見が様々な犬種に見られた。従って、妊娠第二期と最終の第三期（Ｅ−３６）の接点において、極めて少数のβ細胞が見て取れる。これは、他種、特に、妊娠第一期の終わって間もなく多数のβ細胞が見て取れることが明らかなヒトでの所見とは対照的である。従って、この膵臓発達パターンはイヌに特異的である。
【０１００】
妊娠終了（ｐｃ５５日）、ならびに１日齢の幼仔（ＰＮＤ−１）および８週齢の幼仔（ＰＮＷ−８）の膵臓の発達を図２に示す。周生期（Ｅ−５５およびＰＮＤ１）では、より早期の発達段階に比べてβ細胞の数が増えている。α細胞およびβ細胞はクラスターとして局在し、小島様構造が見られる（矢印）。離乳前の８週目（ＰＮＷ８）では、インスリン細胞がα細胞よりも優勢であり、内分泌細胞は島様クラスターとして組織化されている（図２）。
【０１０１】
成熟成犬膵臓の描写を図３に示す。単独のαまたはβ細胞も見て取れるが、ほとんどの細胞は、凝集塊またはより高頻度には島として組織化されている。これらの島の大きさは極めて多様であり、小さいものもあり（Ａ）、異なる形状を呈するものもある（パネルＢ、ＣおよびＤ）。グルカゴン細胞はこれらの島の周縁部に見られ、α細胞がβ細胞と混ざり合っている場合もある。重要なこととして、本結果は、イヌ科動物の膵島の大きさおよび細胞組成は、膵臓におけるそれらの場所によって異なることを示す。さらに、膵島はイヌ科動物膵臓の右葉の方に多い。
【０１０２】
３−考察
哺乳動物膵臓において、内分泌細胞は、外分泌組織に埋め込まれたランゲルハンス島に分類され、インスリン、グルカゴンおよびその他のポリペプチドホルモンを血流中へ分泌する。この構造は、成体哺乳動物でかなり集中に研究されており、種で保存されている(Steiner et al., 2010; Kim A. et al., 2010)。これに対して、胎仔および出生後の内分泌膵臓の発達は齧歯類(Pictet et al., 1972)およびヒト(Hawkins et al., 1987; Justice et al., 1997）で深く調べられているが、他の哺乳動物では、それは大方無視されている。本研究の目的は、初期胎仔から出生後までのイヌ科動物α細胞およびβ細胞の分化および成長を記述することであった。
【０１０３】
Pictet and Rutter (Pictet et al., 1972)の先駆的研究以来、膵臓の形態学的発達は主としてマウスで極めて詳細に研究され、３つの発達段階を経ることが知られている。
【０１０４】
第一期または第一移行期は、形態形成が起こる初期未分化段階である。前腸の予めパターン化された内胚葉上皮が分岐管および未分化上皮へと発達する。マウスでは、これはｅ８．５〜ｅ１２．５の間に起こる。第二移行期では、ｅ１４までに膵芽が内分泌細胞および外分泌細胞系譜へと分化し、膵上皮が増殖に、広範囲に拡大する。ｅ１５までに、マウスでは、背側膵と腹側膵が回転し、融合し、出生直前のｅ１９までにほぼ完全に発達した膵臓が形成する。この段階で、膵臓は、高密度化してランゲルハンス島となる単独クラスターへと組織化された内分泌細胞を含む（第三発達移行期）。最後に、内分泌細胞の成熟とそれらの完全な栄養応答性の獲得は出生後２〜３週間続く。
【０１０５】
ここで示される結果は、妊娠中期（胎仔齢３０および３３）に、上皮が稠密になり、希少なβ細胞が見て取れることを示す。ｐｃ３６日〜４５日に、膵臓は大きさを増し、上皮が拡大し、分岐し、幹部と頂部の両方が見て取れる。このイヌ膵臓発達の個体発生パターンは、ヒト膵臓発達の個体発生パターンとは異なる。ヒトでは、β細胞は妊娠第二期のはじめにしか見られない。
【０１０６】
免疫組織学的所見から極めて多くの情報が得られるが、イヌにおける膵臓発達を司る転写調節機構が齧歯類で記載されている転写調節経路に匹敵するかどうかを示すことはできない。イヌにおいてイヌ科動物膵臓発達を司る調節機構を特定するためにさらなる研究を追跡しなければならない。
【０１０７】
正常な成犬膵島におけるインスリン細胞およびグルカゴン細胞の分布の免疫組織化学的研究は、従前に記載されている(Hawkins et al., 1987; Justice et al., 1997)。今回の結果は、完全に形成された膵島に加えて少数の細胞の凝集塊およびまた単独のα細胞も見て取れること述べた解剖学的報告に従ったものである。ほとんどの報告は、α細胞（グルカゴン）は多くの場合これらの膵島の周縁部に局在していることを示している。本研究では、α細胞は、完全に形成された膵島内でβ細胞と混ざり合っていることが見出されている。これは報告されているもの(Hawkins et al., 1987; Justice et al., 1997)と矛盾する。さらに、膵臓の右葉と左葉には不均質性があることが知られている。また、本研究では、膵島はイヌ科動物膵臓の右葉の方が多いことが明らかである。重要なこととして、今回の結果は、イヌ科動物膵島の大きさおよび細胞組成は、膵臓におけるそれらの場所によって異なることを示す。
【０１０８】
本発明研究で総ての発達段階に同じ系統の犬を使用することを試みたが、これは実践的な理由で常に可能であるわけではなかった。従って、膵臓発達は、いくつかの犬種で比較した。胎仔齢ｐｃ４５日のビーグルの膵臓は、同じ胎仔齢のラブラドールと比較した。出生後１日ではビーグルとチャウチャウで同様の比較を行った。両齢とも、同様の内分泌クラスター分布が見られた。ｐｃ４５日では、グルカゴン細胞の優勢、ならびに凝集塊を形成するβ細胞とα細胞の存在が見られたが、真の島構造は見られなかった。出生後１日では、α細胞とβ細胞は、等しく表現され、クラスターとして組織化されている。両細胞とも凝集傾向にあり、膵島を形成したが、成熟した膵島の完全に典型的な構造は稀にしかみられない。これらの結果は、膵臓発達に関してイヌの一般系統間で大きな差はないことを示す。
【０１０９】
結論として、本研究は、イヌ胎仔のβ細胞は妊娠中期に見られること、および膵島は出生数日前に形成されることを示す。
【０１１０】
Ｃ）機能的インスリノーマの生産
受胎後４２日のイヌ胎仔から得られた膵臓を、ｓｃｉｄマウスの腎被膜下に移植した。腫瘍が２か月後に発達した（図４Ａ）。免疫組織化学的分析は、多量のインスリン分泌細胞およびグルカゴン分泌細胞の存在を明らかにする（図４Ｂ）。成体β細胞に通常見られるＰＤＸ転写因子の存在は、膵細胞が正常な発達をしていることを示す（図４Ｃ）。これらの結果は、ｓｃｉｄマウスに移植した場合、イヌ科動物胎仔膵臓は正常に成長および成熟し、インスリンとＰＤＸの両方を発現するβ細胞を有することを示す。
【０１１１】
ｐｃ４５日のイヌ胎仔から得られた膵臓から抽出された細胞に、ラットインスリンＩＩプロモーターの４０５ヌクレオチド長の断片の制御下でＳＶ４０ＬＴを発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。移植前の免疫組織化学的分析は、この段階の膵臓には極めて少数のインスリン分泌細胞しか存在しないことを示す（図５Ａ）。得られた形質導入膵組織をｓｃｉｄマウスの腎被膜下に移植して２か月後に、腫瘍が形成された（図５Ｂ）。免疫組織化学的分析は、インスリノーマ（インスリン分泌細胞、薄いグレー）の存在ならびにβ細胞によるインスリンおよびラージＴの発現を示す（白、図５Ｃ）。移植２か月後に通常食マウスの血清中にはイヌ特異的インスリンが検出され、インスリノーマがイヌ特異的インスリンを産生することが確認される。これに対して、予想されたように、イヌ特異的インスリンは移植前のマウスに見られず、インスリンレベルは、予想されたように食後の成犬血漿では増し、このことはイヌ特異的インスリンアッセイの特異性を示す（図６Ａ）。移植２か月後のマウスでは血糖はなお高いままである（平均０．５ｇ／Ｌ）。
【０１１２】
結論として、インスリノーマを有するｓｃｉｄマウスでのイヌ特異的インスリンのアッセイは、腫瘍の存在および腫瘍の発達段階を予測することを可能とする。
【０１１３】
形質導入膵組織（Ｅｃｄ３８およびＥｄｃ４９）を移植したマウスを、移植後１２か月後に１９時間絶食させた。絶食マウスの血清においてイヌ特異的インスリンレベルをアッセイした。図６Ｂは、絶食マウスの血清中ではイヌ特異的インスリンのレベルが極めて低いことを示す（絶食Ｅｃｄ３８およびＥｃｄ４９マウス）。１９時間の絶食期間の後に１か月間通常食を与えた場合、同じマウスは高レベルのイヌ特異的インスリンを発現する。従って、移植マウスにおけるイヌ特異的インスリンのレベルは、絶食期間中に著しく低下し、摂食時に大幅に増加する（図６Ｂ；絶食Ｅｃｄ３８およびＥｃｄ４９マウス）。非形質導入膵組織を移植した対照マウスの血清中では、絶食の場合でも非絶食の場合でも、イヌ特異的インスリンのレベルは極めて低い（図６Ｂ；Ｅｃｄ  ２８マウス）。これらの結果は、インスリノーマによるイヌ特異的インスリン分泌が移植マウスの血糖値によって調節されることを示す。
【０１１４】
Ｄ）機能的イヌ科動物β細胞株の作製
インスリノーマ様構造は、上記実施例Ｃ）に記載のとおりにｓｃｉｄマウスの腎被膜下にＳＶ４０ＬＴ形質導入イヌ胎仔膵細胞を移植した後に得られた。インスリノーマ様構造を顕微解剖し、細胞を解離させた。解離した細胞を新たなｓｃｉｄマウスの腎被膜にサブ移植し、新たに発達したインスリノーマ様構造を得た。マウスを犠牲にし、インスリノーマ様構造を顕微解剖した。インスリノーマ様構造の細胞を解離させ、膵β細胞を回収して均質な細胞集団を形成した。これらの均質な細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、マトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングプレート上、５．５ｍＭグルコース、ＢＳＡ、ニコチンアミド、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリンおよびナトリウムセレンを含有する無血清培地中で培養し、イヌβ細胞株を樹立した。イヌβ細胞株は、マトリゲルまたはフィブロネクチンコーティングウェル上、無血清培地中での培養で維持および成長させた。
【０１１５】
発達したイヌβ細胞株を免疫組織化学によって試験した。細胞を抗インスリン抗体で染色し（薄いグレー）、核はＤＡＰＩで染色した（濃いグレー；図７）。図７は、高レベルのインスリンがイヌβ細胞株の総ての細胞で検出されることを示す。インスリン染色は総ての細胞の細胞質コンパートメントに限定される。インスリン発現は、継代培養２０回を超えた後に検出される。これらの結果は、イヌβ細胞株が均質であること、およびこれらの細胞が安定してインスリンを生産していることを示す。これらのデータから、上記方法を使用することにより得られたイヌβ細胞株は完全に機能的かつ安定であることが確認される。
【０１１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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