(57)【要約】本願発明は、変異原性を示す中間体を使うことなく、式（ＶＩ）の化合物を製造する方法を提供する（式中のそれぞれの記号は明細書中に記載）。該製造方法は、式（ＩＩ）の中間体化合物を立体選択的に単離するための光学分割を可能にする、式（Ｉ）の中間体化合物と酸との塩を形成を含んでなる。2019504038.tif 000070
2019504038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）で示される化合物またはその塩：
【化１】
2019504038.tif 000053
（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立してハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたはメチルオキシ；および
ｍは１または２の整数。）
を（Ｌ）―酒石酸または（Ｄ）―リンゴ酸を用いて光学分割する工程を包含する、式（ＩＩ）：
【化２】
2019504038.tif 000054
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩の製造方法。
【請求項２】
光学分割を、水ならびに、アセトニトリル、メタノール、２−プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトンおよびエチルメチルケトンからなる群から選択される１またはそれ以上の有機溶媒との混合溶媒中で行う、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
混合溶媒が水、２−プロパノールおよび酢酸エチルを含む、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2019504038.tif 000055
（式中、Ｘ１はハロゲン；および
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル、その他の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩を酸性条件化で処理し、その生成物を酢酸で再結晶する工程を含む、
式（ＩＶ）：
【化４】
2019504038.tif 000056
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物の酢酸塩の結晶の製造方法。
【請求項５】
式（ＩＩＩ）で示される化合物が、請求項１〜３のいずれかに記載の方法によって得られた式（ＩＩ）で示される化合物またはその塩を脱ハロゲン化水素反応に付すことにより得られた化合物である、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
請求項４または５記載の製造方法により得られた式（ＩＶ）：
【化５】
2019504038.tif 000057
（式中、Ｘ１はハロゲン；およびＲ１は置換されていてもよいアルキル。）
で示される化合物の酢酸塩またはフリー体と、式（ｇ）：
【化６】
2019504038.tif 000058
（式中、Ｈａｌはハロゲン。）
で示される化合物を反応させる工程を含む、式（ＶＩ）：
【化７】
2019504038.tif 000059
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩の製造方法。
【請求項７】
（１）式（ＩＩ）：
【化８】
2019504038.tif 000060
（式中、Ｘ１はハロゲン；
Ｘ２はハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）
で示される化合物またはその塩を脱水素化反応に付す工程、
（２）式（ＩＩＩ）：
【化９】
2019504038.tif 000061
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される生成物またはその塩を脱保護する工程、および
（３）式（ＩＶ）：
【化１０】
2019504038.tif 000062
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される生成物またはその塩と式（ｇ）：
【化１１】
2019504038.tif 000063
（式中、Ｈａｌはハロゲン。）
で示される化合物とを反応させる工程を含む、式（ＶＩ）：
【化１２】
2019504038.tif 000064
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩の製造方法。
【請求項８】
式（ＩＩ）で示される化合物またはその塩が、請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法によって得られたものである、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の製造方法によって得られた化合物（ＶＩ）を、ｐｋａが８以上の有機塩基で中和する工程を含む、式（ＶＩ）：
【化１３】
2019504038.tif 000065
（式中、Ｘ１はハロゲン；および
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル）
で示される化合物またはその塩の結晶の製造方法。
【請求項１０】
塩基がアルキルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、エチレンジアミンおよびそれらの混合物からなる群から選択される塩基である、請求項９記載の製造方法。
【請求項１１】
塩基がトリエチルアミンである、請求項９または１０記載の製造方法。
【請求項１２】
式（ＶＩＩ）：
【化１４】
2019504038.tif 000066
（式中、Ｘ１はハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）
で示される化合物またはその塩。
【請求項１３】
式（ＶＩＩＩ）：
【化１５】
2019504038.tif 000067
（式中、Ｘ１はハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）
で示される化合物またはその塩。
【請求項１４】
式（ＩＩ）：
【化１６】
2019504038.tif 000068
（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立してハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）
で示される化合物またはその塩。
【請求項１５】
酒石酸塩またはマロン酸塩である、請求項１４記載の塩。
【請求項１６】
式（ＩＶ）：
【化１７】
2019504038.tif 000069
（式中、Ｘ１はハロゲン；および
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル。）
で示される化合物の塩。
【請求項１７】
酢酸塩である、請求項１６記載の塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は式（ＶＩ）：
【化１】
2019504038.tif 000003
の化合物の製造方法に関する。
さらには本発明は式（ＶＩ）の化合物を製造するための中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
式（ＶＩ）の化合物はＢＡＣＥ１阻害活性を有するため、アルツハイマー病治療薬として有用である（特許文献１）。該化合物はチアジン環上の炭素原子にＳ−配置の不斉中心を有する。特許文献１には、キラルな中間体を用いた式（ＶＩ）の化合物の立体選択的な製造方法が開示されている。
【０００３】
式（ＶＩ）の化合物と類似した構造を有する置換アミノチアジン誘導体が開示されている（特許文献２）。また、置換アミノオキサジン誘導体が開示されている（特許文献３）。特許文献３には、周知な方法と一つとして光学異性体を得るためにジアステレオメリックな塩を形成する例示がある。しかしながら、開示されているように、これらの化合物はキラルな中間体化合物を環化する経、チアジンまたはオキサジン環を形成して製造されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／１５１０９８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／０７０７８１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１４／１３４３４１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、チアジン環を形成するために先行文献に記載されたようにキラルな中間体化合物を用いることなしに、式（ＶＩ）の化合物の製造方法を提供する。さらに本発明は、式（ＶＩ）で示される化合物を製造するための中間体化合物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によって提供される製造方法は以下の通りである。
（１）式（Ｉ）で示される化合物またはその塩：
【化２】
2019504038.tif 000004
（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立してハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたはメチルオキシ；および
ｍは１または２の整数。）
を（Ｌ）―酒石酸または（Ｄ）―リンゴ酸を用いて光学分割する工程を包含する、式（ＩＩ）：
【化３】
2019504038.tif 000005
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩の製造方法。
（２）光学分割を、水ならびに、アセトニトリル、メタノール、２−プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトンおよびエチルメチルケトンからなる群から選択される１またはそれ以上の有機溶媒との混合溶媒中で行う、上記（１）記載の製造方法。
（３）混合溶媒が水、２−プロパノールおよび酢酸エチルを含む、上記（２）記載の製造方法。
（４）式（ＩＩＩ）：
【化４】
2019504038.tif 000006
（式中、Ｘ１はハロゲン；および
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル、その他の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩を酸性条件化で処理し、その生成物を酢酸と再結晶する工程を含む、
式（ＩＶ）：
【化５】
2019504038.tif 000007
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物の酢酸塩の結晶の製造方法。
（５）式（ＩＩＩ）で示される化合物が、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法によって得られた式（ＩＩ）で示される化合物またはその塩を脱ハロゲン化水素反応に付すことにより得られた化合物である、上記（４）記載の製造方法。
（６）上記（４）または（５）記載の製造方法により得られた式（ＩＶ）：
【化６】
2019504038.tif 000008
（式中、Ｘ１はハロゲン；およびＲ１は置換されていてもよいアルキル。）
で示される化合物の酢酸塩またはフリー体と、式（ｇ）：
【化７】
2019504038.tif 000009
（式中、Ｈａｌはハロゲン。）
で示される化合物を反応させる工程を含む、式（ＶＩ）：
【化８】
2019504038.tif 000010
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩の製造方法。
（７）（１）式（ＩＩ）：
【化９】
2019504038.tif 000011
（式中、Ｘ１はハロゲン；
Ｘ２はハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）
で示される化合物またはその塩を脱水素化反応に付す工程、
（２）式（ＩＩＩ）：
【化１０】
2019504038.tif 000012
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される生成物またはその塩を脱保護する工程、および
（３）式（ＩＶ）：
【化１１】
2019504038.tif 000013
（式中の記号は上記と同意義。）の生成物またはその塩と化合物（ｇ）：
【化１２】
2019504038.tif 000014
（式中、Ｈａｌはハロゲン。）
で示される化合物と反応させる工程を含む、式（ＶＩ）：
【化１３】
2019504038.tif 000015
（式中の記号は上記と同意義。）
で示される化合物またはその塩の製造方法。
（８）式（ＩＩ）で示される化合物またはその塩が、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法によって得られたものである、上記（７）記載の製造方法。
（９）上記（６）〜（８）のいずれかに記載の製造方法によって得られた化合物（ＶＩ）をｐｋａが８以上の有機塩基で中和する工程を含む、式（ＶＩ）：
【化１４】
2019504038.tif 000016
（式中、Ｘ１はハロゲン；および
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル）
で示される化合物またはその塩の結晶の製造方法。
（１０）塩基がアルキルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、エチレンジアミンおよびそれらの混合物からなる群から選択される塩基である、上記（９）記載の製造方法。
（１１）塩基がトリエチルアミンである、上記（９）または（１０）記載の製造方法。
（１２）式（ＶＩＩ）：
【化１５】
2019504038.tif 000017
（式中、Ｘ１はハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）で示される化合物またはその塩。
（１３）式（ＶＩＩＩ）：
【化１６】
2019504038.tif 000018
（式中、Ｘ１はハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）で示される化合物またはその塩。
（１４）式（ＩＩ）：
【化１７】
2019504038.tif 000019
（式中、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立してハロゲン；
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル；
Ｒ２はそれぞれ独立してＮＯ２、メチル、ＣＦ３、ハロゲンまたメチルオキシ；および
ｍは１また２の整数。）で示される化合物またはその塩。
（１５）酒石酸塩またはマロン酸塩である、上記（１４）記載の塩。
（１６）式（ＩＶ）：
【化１８】
2019504038.tif 000020
（式中、Ｘ１はハロゲン；および
Ｒ１は置換されていてもよいアルキル。）
で示される化合物の塩。
（１７）酢酸塩である、上記（１６）記載の塩。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、化合物９の結晶の粉末Ｘ線回折のチャートを示す。Ｘ軸は２θ値、Ｙ軸は強度（Ｃｏｕｎｔ）を示す。
【図２】図２は、化合物９の結晶の熱重量-示差熱同時分析（ＴＧ／ＤＴＡ）の結果を示す。
【図３】図３は、化合物９の結晶の動的水蒸気吸脱着測定（ＤＶＳ）の結果を示す。
【図４】図４は、化合物１１の結晶の粉末Ｘ線回折のチャートを示す。
【図５】図５は、化合物１５のＩ型結晶の粉末Ｘ線回折のチャートを示す。
【図６】図６は、化合物１５のＩＩ型結晶の粉末Ｘ線回折のチャートを示す。
【図７】図７は、ＰＬＡＴＯＮ／ＯＲＴＥＰを使用して描いた分子Ｉの図をを示す。
【図８】図８は、ＰＬＡＴＯＮ／ＯＲＴＥＰを使用して描いた分子ＩＩの図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書中、各用語は単独で使用されている場合もまたは他の用語と一緒になって使用されている場合も、以下に示すように定義される。
【０００９】
「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を包含する。Ｘ１における「ハロゲン」はフッ素が好ましい。Ｘ２における「ハロゲン」は臭素が好ましい。
【００１０】
「アルキル」とは、炭素数１〜８、好ましくは１〜６、さらに好ましくは１〜３の直鎖または分枝状の炭化水素基を意味する。「アルキル」の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチルおよびｎ−オクチルが挙げられる。
【００１１】
「置換されていてもよいアルキル」の置換基の例としては、同一または異なる1以上の置換基が挙げられ、好ましくはフッ素のようなハロゲンから選択される１〜３の置換基が挙げられる。
「置換されていてもよいアルキル」の例としては、メチル、フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
【化１９】
2019504038.tif 000021
の例としては、
【化２０】
2019504038.tif 000022
が挙げられる。
好ましい例としては
【化２１】
2019504038.tif 000023
が挙げられ、さらに好ましい例としては、
【化２２】
2019504038.tif 000024
が挙げられる。
【００１３】
本願発明にかかる化合物の１またはそれ以上の水素、炭素および／または他の原子は、それぞれ水素、炭素および／または他の原子の同位体で置換され得る。そのような同位体の例としては、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、１２３Ｉおよび３６Ｃｌのように、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、ヨウ素および塩素が包含されるが、これらに限定されない。本願発明にかかる化合物は、そのような同位体で置換された化合物も包含する。上記同位体で置換された化合物は、医薬品としても有用であり、すべての放射性標識された化合物を包含する。また該「放射性標識体」を製造するための「放射性標識化方法」も本発明に包含され、代謝薬物動態研究、結合アッセイにおける研究および／または診断のツールとして有用である。
【００１４】
放射性標識された化合物は、当該技術分野で周知の方法で調製できる。例えば、トリチウム標識化合物は、例えば、トリチウムを用いた触媒的脱ハロゲン化反応によって、化合物にトリチウムを導入することで調製できる。この方法は、適切な触媒、例えばＰｄ／Ｃの存在下、塩基の存在下または非存在下で、化合物が適切にハロゲン置換された前駆体とトリチウムガスとを反応させることを包含する。他のトリチウム標識化合物を調製するための適切な方法としては、Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  （Ｐａｒｔ  Ａ），Ｃｈａｐｔｅｒ  ６  （１９８７年）を参照できる。１４Ｃ−標識化合物は、１４Ｃ炭素を有する原料を用いることによって調製できる。
【００１５】
本願発明にかかる化合物の塩としては、例えば、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、バリウム等）、マグネシウム、遷移金属（例えば、亜鉛、鉄等）、アンモニア、有機塩基（例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、エチレンジアミン、ピリジン、ピコリン、キノリン等）およびアミノ酸との塩、および無機酸（例えば、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、臭化水素酸、リン酸、ヨウ化水素酸等）、および有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、マンデル酸、グルタル酸、リンゴ酸、安息香酸、フタル酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等）との塩が挙げられる。特に塩酸、硫酸、リン酸、酒石酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸との塩等が挙げられる。これらの塩は、通常行われる方法によって形成させることができる。
【００１６】
本願発明に係る化合物またはその塩は、溶媒和物（例えば、水和物等）、共結晶および／または結晶多形を形成する場合があり、本発明はそのような各種の溶媒和物、共結晶および結晶多形も包含する。「溶媒和物」は、化合物に対し、任意の数の溶媒分子（例えば、水分子等）と配位していてもよい。化合物またはその塩を、大気中に放置することにより、水分を吸収し、吸着水が付着する場合や、水和物を形成する場合がある。また、化合物またはその塩を、再結晶することでそれらの結晶多形を形成する場合がある。「共結晶」とは、化合物またはその塩と対となる分子が同じ結晶対分子内で形成することをいう。
【００１７】
次のスキーム１に、化合物（ＶＩ）を製造するための発明の例示的な工程を示す。
スキーム１
【化２３】
2019504038.tif 000025
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２およびｍは上記と同意義である。）
【００１８】
本願発明の製造方法は、ノシル基のようなアリールスルホニル基を上記に示すような中間体である化合物（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のアミノ基の保護基として導入することに特徴を有する。また、該製造方法は、中間体化合物（ＩＩ）の塩を得るために（Ｌ）−酒石酸または（Ｄ）―マロン酸のような酸と塩を形成することを特徴とし、中間体化合物の光学分割を可能とする。
さらに該製造方法は、式（ＩＶ）で示される化合物の酢酸塩の結晶を製造することを特徴とする。
【００１９】
本発明の一態様として、スキーム１−Ａに示されるように中間体化合物（ＶＩＩＩ）を製造することができる。
スキーム１−Ａ
【化２４】
2019504038.tif 000026
（式中、Ｈａｌはハロゲンであり、Ｘ１、Ｒ１、Ｒ２およびｍは上記と同意義である。）
【００２０】
出発化合物（a）は商業的に入手可能であるか、商業的に入手可能な原料から当該分野で通常行われる方法により製造することが可能である。
【００２１】
（工程１）  化合物（a）のビニル化により化合物（b）を得ることが出来る。該工程は、例えばWO2008/133274に記載されたようなよく知られた方法に従って、塩化ビニルマグネシウム（VMC）のようなグリニヤ試薬を使用して実施することができる。
【００２２】
（工程２）  化合物（ｂ）を加水分解して化合物（ｃ）を得ることができる。該工程はＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３およびＬｉＯＨのような強塩基を使用して、適切な条件下、メタノール、エタノール、１−ブタノール、トルエン、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタン、水およびそれらの混合溶媒のような適切な溶媒中で実施することにより化合物（ｃ）を得ることができる。
【００２３】
（工程３）  化合物（ｃ）は、ノシル基のようなアリールスルホニル基でアミノ基を保護することにより、化合物（ＶＩＩ）を得ることが出来る。該工程は、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ-ジメチルアセタミド、ジクロロメタン、水およびそれらの混合溶媒のような適切な溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンのような塩基と、塩化２−ニトロベンゼンスルホニル、臭化２−ニトロベンゼンスルホニル、ヨウ化２−ニトロベンゼンスルホニル、塩化４−ニトロベンゼンスルホニル、塩化２、４−ジニトロベンゼンスルホニル、塩化３−ニトロベンゼンスルホニル、塩化４−メトキシシベンゼンスルホニル、塩化４−（トリフルオロメチル）ベンゼンスルホニル、塩化４−ブロモベンゼンスルホニルのようなハロゲン化アリールスルホニルを使用して実施することができる。反応温度は好ましくは０℃〜１００℃、より好ましくは３０℃〜７０℃、さらには好ましくは５０℃程度である。化合物（ｃ）がトリフルオロアセチル基（ＣＦ３ＣＯ−）で保護されている場合、該基は一般にアミノ基の保護基として使われるが、得られた保護された化合物（ＣＦ３ＣＯで保護された誘導体）は不安定で、分解されやすい。一方、本願発明の化合物（ＶＩＩ）は安定である。このように、化合物（ＶＩＩ）は、式（ＶＩ）で示される製薬に使用される化合物の製造に有用である。
【００２４】
（工程４）  化合物（ＶＩＩ）はハロゲン化して化合物（ｄ）を得ることが出来る。該工程は、ＷＯ２００８／１３３２７４に記載されるように当該技術分野でよく知られた方法に従って、適切な条件下、メタノール、エタノール、１-ブタノール、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタン、水およびそれらの溶媒和物のような適切な溶媒中で、塩酸を使用して実施することが出来る。反応温度は好ましくは０℃〜１００℃、より好ましくは０℃〜４０℃、さらに好ましくは室温付近である。
【００２５】
（工程５）  化合物（ｄ）はウレアと反応させて化合物（ＶＩＩＩ）を得ることが出来る。該工程は、ＷＯ２００８／１３３２７４に記載されるように当該技術分野でよく知られた方法に従って、適切な条件下、メタノール、エタノール、１-ブタノール、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタン、水およびそれらの溶媒和物のような適切な溶媒中で実施することが出来る。反応温度は好ましくは、０℃〜１００℃、より好ましくは３０℃〜７０℃、さらに好ましくは５０℃付近である。
工程４で塩酸を使用した場合、該工程で塩酸塩が形成する場合があり、析出した塩を単離することが出来る。このようにして得られた塩酸塩は、適切な条件下、メタノール、エタノール、１-ブタノール、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタン、水およびそれらの混合溶媒のような適切な溶媒中、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３、およびＬｉＯＨのような塩基で処理することで、化合物（ＶＩＩＩ）を得ることが出来る。該化合物は結晶化して単離することが出来る。該化合物の結晶化は当該分野でよく知られている。
【００２６】
本願発明の一態様としては、中間体化合物（ＩＩ）はスキーム１−Ｂに示すように合成することが出来る。
スキーム１−Ｂ
【化２５】
2019504038.tif 000027
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２およびｍは上記と同意義である。）
【００２７】
（工程６）  上記で得られた化合物（ＶＩＩＩ）は環化することで化合物（Ｉ）を得ることが出来る。該工程は、酢酸のような酸とＮ−ハロスクシンイミドを適切な条件下、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタンおよびそれらの混合物のような適切な溶媒中で実施することが出来る。
Ｎ−ハロスクシンイミドは好ましくはＮ−ブロモスクシンイミドである。反応温度は好ましくは−７０℃〜室温、より好ましくは−４０℃〜室温、さらに好ましくは−２０℃付近である。酢酸塩の形成は該工程で起こり、析出された塩は単離することができる。
【００２８】
（工程７）  化合物（Ｉ）は適切な酸と処理することで式（ＩＩ）の化合物の塩を生成することができる。式（ＩＩ）の化合物の塩（４Ｒ、５Ｒ−配置）は光学分割により立体選択的に得ることが出来る。式（ＩＩ）の化合物の塩は水和物のような溶媒和物として得ることが出来る。
本発明の具体的な態様としては、（Ｌ）−酒石酸または（Ｄ）−マレイン酸のような適切な酸をラセミ体である化合物（Ｉ）の溶液に加えることで、化合物（Ｉ）のジアステレオマー塩の結晶を形成することが出来、その後、分別結晶により分離することで式（ＩＩ）の化合物の酒石酸塩またはマレイン酸塩のような塩を得ることが出来る。
本発明の一態様としては、式（ＩＩ）の化合物のジアステレオーマー塩は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２-プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールのようなブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトン、エチルメチルケトン、イソブチルメチルケトン、メトキシメタン、２−エトキシエタノール、ジメチルアセトアミドおよび水のような適切な溶媒中で結晶化することが出来る。
本願発明の別の態様としては、式（ＩＩ）の化合物のジアステレオマー塩は水と少なくとも一つ以上の有機溶媒を含む混合溶媒中で結晶化することが出来る。
有機溶媒の例としては、アセトニトリル、メタノール、エタノール、２−プロパノール、１-ブタノール、２-ブタノールのようなブタノール、酢酸メチル、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトン、エチルメチルケトン、イソブチルメチルケトン、メトキシメタン、２-エトキシエタノールおよびジメチルアセトアミドからなる群から選択される１又はそれ以上の有機溶媒が挙げられるがこれらに限定されない。
さらに具体的には、有機溶媒の例としては、アセトニトリル、メタノール、２-プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトンおよびエチルメチルケトンからなる群から選択される１またはそれ以上の有機溶媒が挙げられる。
【００２９】
本発明の好ましい一態様としては、水ならびにアセトニトリル、メタノール、2-プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトンおよびエチルメチルケトンからなる群選択される有機溶媒との混合溶媒が挙げられる。
本発明の一態様としては、水：アセトニトリルの割合は、約１０：９０〜２５：７５、５０：５０または７５：２５である。
本発明の一態様としては、水：メタノールの割合は、８０：２０である。
本発明の一態様としては、水：２−プロパノールの割合は、約１０：９０〜４０：６０である。
本発明の一態様としては、水：ブタノールの割合は、約２５：７５〜７５：２５である。
本発明の一態様としては、水：酢酸エチルの割合は、約２０：８０である。
本発明の一態様としては、水：ギ酸エチルの割合は、約１０：９０〜７５：２５である。
本発明の一態様としては、水：アセトンの割合は、約８０：２０である。
本発明の一態様としては、水：エチルメチルケトンの割合は、約１０：９０〜２５：７５、５０：５０または７５：２５である。
【００３０】
さらに本発明の別の好ましい態様としては、該混合溶媒としては水、２−プロパノールおよび酢酸エチルが含まれる。
本発明の別の態様としては、該混合溶媒としては、水、２−プロパノールおよび酢酸エチルが含まれ、水：２-プロパノール：酢酸エチルの割合は、約２０〜４０：３０〜５０：２０〜５０（Ｖ／Ｖ）であり、例えば、約２０：４０：４０（ｖ／ｖ）または２０：３０：５０（ｖ／ｖ）である。
水：酢酸エチルの割合の例としては、約１：１．５〜２．５（Ｖ／Ｖ）、例えば、約１：１．５（Ｖ／Ｖ）、１：２（Ｖ／Ｖ）または１：２．５（Ｖ／Ｖ）である。
水：２−プロパノールの割合の例としては、約１：１．５〜２．５（Ｖ／Ｖ）、例えば、約１：１．５（Ｖ／Ｖ）、１：２（Ｖ／Ｖ）または１：２．５（Ｖ／Ｖ）である。
【００３１】
４Ｒ，５Ｒ−配置を持つ化合物（ＩＩ）の割合は、ＨＰＬＣのような当該分野でよく知られた分析技術によって決定することが出来る。また、結晶形および得られた結晶の構造は、粉末Ｘ線結晶構造解析、動的水蒸気収着重量（ＤＶＳ）分析、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）等のような当該技術分野でよく知られた分析技術を利用することで決定することが出来る。
【００３２】
本発明の一態様としては、中間体化合物（ＩＶ）はスキーム１−Ｃに示すように合成することが出来る。
スキーム１−Ｃ
【化２６】
2019504038.tif 000028
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、およびｍは上記と同意義である。）
【００３３】
（工程８）  式（ＩＩ）の化合物の塩または水和物のようなそれらの溶媒和物は、脱ハロゲン化水素反応に付すことにより、化合物（ＩＩＩ）を得ることが出来る。該工程は、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタンおよびそれらの混合溶媒中、適切な条件下で、ジアザビシクロウンデセン、ジアザビシクロノネン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ｔ−ブトキシナトリウム、ｔ−ブトキシカリウム、ｔ−ペントキシナトリウムおよびｔ−ペントキシカリウムのような塩基存在下で、−５０℃〜５０℃、好ましくは−２０℃〜室温、さらに好ましくは５℃付近で実施することが出来る。
【００３４】
（工程９）  化合物（ＩＩＩ）の保護基は、メタノール、エタノール、１−ブタノール、トルエン、酢酸エチル、ジオキサン、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタン、水およびそれらの溶媒中のような適切な溶媒中、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メチルモルホリンおよびピリジンのような塩基とチオールのような脱保護剤で除去することができる。反応温度は好ましくは０℃〜１００℃、より好ましくは２０℃〜６０℃、さらに好ましくは４０℃付近である。脱保護剤の例としては、４-クロロベンゾチオール、メタンチオール、エタンチオール、プロパンチオール、ドデカンチオール、およびベンゼンチオールが挙げられるが、これらに限定されない。得られた化合物（ＩＶ）は、直接、次の工程で利用することが可能であり、または酢酸に限られないが適切な酸で結晶化することにより、上記に示すようなそれらの塩結晶を得ることが出来る。結晶化の温度は好ましくは、０℃〜２０℃、さらに好ましくは５℃付近である。酢酸塩（ＩＶ）は、塩を結晶化するために、酢酸を適切な溶媒に加えることにより、効率的に再結晶をすることが出来る。式（ＩＶ）の化合物の塩を結晶化に使用するための溶媒の例としては、水、およびアセトニトリル、メタノール、２-プロパノール、ブタノール、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトンおよびエチルメチルケトンのような有機溶媒が挙げられるがこれらに限定されない。アセトニトリル、２−プロパノールおよび酢酸エチルは特に好ましい。得られた結晶の結晶構造は、粉末X線結晶構造解析、動的水蒸気収着重量（ＤＶＳ）分析、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）等のような当該技術分野でよく知られた分析技術のいずれかを利用することで決定することが出来る。
【００３５】
本発明の一態様として、中間体化合物（ＶＩ）はスキーム１−Ｄに示すように製造することができる。
スキーム１−Ｄ
【化２７】
2019504038.tif 000029
（式中、Ｈａｌはハロゲンであり、Ｘ１およびＲ１は上記と同意義である。）
【００３６】
（工程１０）  化合物（Ｖ）は商業的に入手可能であるか、商用的に入手可能な原料から通常の方法により製造することができる。
化合物（Ｖ）は、適切な溶媒中、ハロゲン化試薬を使用してハロゲン化することにより、化合物（ｇ）を得ることができる。溶媒としては、Ｎ−メチルピロリドン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、トルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、ジクロロメタンおよびそれらの混合溶媒が挙げられ、それらに限定されない。好ましいハロゲン化試薬としては、塩化チオニル、および塩化オキザリルが挙げられる。該工程は、０℃から室温で実施することが好ましく、５℃付近で実施することがさらに好ましい。
【００３７】
（工程１１）
上記で得られた式（ＩＶ）で示される化合物の塩を、適切な溶媒中にて塩基で処理することで、化合物（ＩＶ）のフリー体である化合物（ｆ）が得ることができる。溶媒の例としては、メタノール、エタノール、１−ブタノール、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジクロロメタン、水およびその混合溶媒を包含するが、これらに限定されるものではない。塩基の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ＮａＯＨ、およびＫＯＨを包含する。該工程の反応温度は０℃から４０℃が好ましく、より好ましくは室温付近である。
【００３８】
（工程１２）  化合物（ｆ）と化合物（ｇ）を反応させることにより、化合物（ＩＶ）を得ることができる。化合物（ＩＶ）の結晶は適切な塩基と中和した後で得ることができる。当該塩基の例としては、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンおよびそれらの混合物を包含するが、これらに限定されない。ｐＫａが８以上の有機塩基は化合物（ＩＶ）の結晶を効率的に得るために好ましい。当該塩基の例としては、モノアルキルアミン、ジアルキルアミンまたはトリアルキルアミンのようなアルキルアミン、ジシクロヘキシルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、メグルミン、エチレンジアアミンおよびそれらの混合物を包含するが、これらに限定されるものではない。好ましい例として、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリブチルアミン、ジイソプロピルアミンおよびそれらの混合物などのアルキルアミンを包含する。より好ましくはトリエチルアミンである。
本工程は、好ましくは適切な溶媒中が好ましく、例えばＮ−メチルピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、アセトニトリル、トルエン、ジクロロメタン、酢酸エチル、水およびそれらの混合溶媒が挙げられる。反応温度は−２０℃から室温であり、好ましくは３℃付近である。
【００３９】
本発明の別の一態様として、化合物（ＶＩ）は工程１２と同様の方法で、式（ＶＩ）で示す化合物の塩を化合物（ｇ）と直接反応させて得ることが出来る。
【００４０】
必要に応じて、得られた化合物（ＶＩ）は、当該技術分野で周知の方法に従って、再結晶および精製してもよい。
【００４１】
上記で得られた化合物結晶の結晶構造は、粉末Ｘ線回折測定、水分吸脱着等温線測定（ＤＶＳ）および示差走査熱量測定などの当該技術分野において周知の分析手法いずれかひとつを用いて決定することができる。分析の方法および条件は当業者に良く知られており、技術分野において理解されている。
【００４２】
図を参照にして以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４３】
本明細書中で用いる略語は以下の意味を表し、発明の理解を補助する。
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＭｅＯＨ：メタノール
ＰＴＥＥ：ポリテトラフルオロエチレン
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
【実施例】
【００４４】
実施例１−１
化合物7の製造
【化２８】
2019504038.tif 000030
テトラヒドロフラン（１６５ｍＬ）中の化合物1（３０．０ｇ、１２０．５ｍｍｏｌ）に１．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ビニルマグネシウムのテトラヒドロフラン溶液（２９７ｍＬ、４４５．９ｍｍｏｌ）を加えた。その混合液を−２０℃で1時間撹拌した。反応液をトルエン（１２０mL）、酢酸（２８．９ｇ、４１８．５ｍｍｏｌ）および水（１５０ｍＬ）の混合液に加え、分液操作を行った。有機層に１２％水酸化ナトリウム水溶液（１２０．１ｇ、３６２．４ｍｍｏｌ）を加え、その溶液を４５℃で２．５時間攪拌した。分液し、有機層を１１９ｇまで濃縮した。濃縮液にテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム（１５．２ｇ、１８１．２ｍｍｏｌ）および水（９０ｍＬ）を加え、混合溶液を５０℃まで加温した。２５％塩化ノシルのトルエン溶液（１１７．４ｇ、１３２．５ｍｍｏｌ）を加え、混合液を２．５時間攪拌した。分液後、有機層を９３．４ｇまで濃縮し、化合物４の濃縮液を得た。
化合物４の濃縮液（８４．０ｇ）に酢酸エチル（８１ｍＬ）および３５％塩酸（４５．２ｇ、４３３．６ｍｍｏｌ）を加え、混合液を２５℃で２．５時間攪拌した。トルエン（２７ｍＬ）および水（２７ｍＬ）を分液層に加えた。有機層をチオウレア（１０．７ｇ）の１−ブタノール（１６．１ｇ）懸濁液へ加え、５０℃で２．８時間攪拌した。混合液は２５℃へ冷却し、１時間撹拌し、濾過することで化合物６の結晶（湿潤結晶）４２．６ｇを得た。
化合物６（４１．０ｇ）の湿潤結晶にトルエン（３９ｍＬ）、酢酸エチル（１１７ｍＬ）、1-ブタノール（５２ｍＬ）および水（１３０ｍＬ）を加え、５℃へ冷却した。６％水酸化ナトリウム（８０．０ｇ）水溶液を加えた後、０．１％塩酸（３５．０ｇ）を加え、分液を行った。有機層を水（７８ｍＬ）で洗浄、分液後に、有機層に析出した析出物を濾過、乾燥することで化合物７（２８．９０ｇ、６５．２％）の結晶を得た。
化合物３
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 6.82 (1H, dd, J=7.09, 2.93 Hz), 6.71 (1H, dd, J=11.74, 8.56 Hz), 6.39 (1H, ddd, J=8.56, 3.79, 3.06 Hz), 6.12 (1H, ddd, J=17.18, 10.51, 1.77 Hz), 5.30 (1H, s), 5.15 (1H, dt, J=17.18, 1.77 Hz), 4.95 (1H, dd, J=10.51, 1.71 Hz), 4.82 (2H, bs), 1.50 (3H, d, J=1.10 Hz).
化合物４
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 10.55 (1H, s), 7.90-7.97 (2H, m), 7.77-7.86 (2H, m), 7.45 (1H, dd, J=7.21, 2.69 Hz), 6.96-7.04 (2H, m), 6.07 (1H, ddd, J=17.18, 10.51, 1.77 Hz), 5.49 (1H, s), 5.12 (1H, dt, J=17.21, 1.54 Hz), 4.97 (1H, dd, J=10.51, 1.47 Hz), 1.49 (3H, d, J=0.98 Hz).
化合物７
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.81-7.88 (1H, m), 7.55-7.67 (3H, m), 6.77-6.85 (1H, m), 6.67-6.74 (2H, m), 5.47-5.54 (1H, m), 3.90 (2H, d, J=7.70 Hz), 1.93-1.96 (3H, m).
【００４５】
実施例１−２
化合物９の製造
【化２９】
2019504038.tif 000031
化合物７（７５．０ｇ、１７６．７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２２５ｍＬ）および酢酸（５３．１ｇ、８８４．６ｍｍｏｌ）に溶解させた。溶液をＮ−ブロモスクシンイミド（３３．７ｇ、２１１．８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル１８８ｍＬの懸濁液へ加え、混合液を−２０℃で２時間攪拌した。トルエン（３００ｍＬ）を加え、２．２時間撹拌後、濾過することで化合物８の結晶（湿潤結晶）（１１８．９ｇ）を得た。
化合物８の湿潤結晶（５９．５ｇ）およびＬ−酒石酸（４６．４ｇ、３０９．２ｍｍｏｌ）を水（５３ｍＬ）、２−プロパノール（７９ｍＬ）および酢酸エチル（１３１ｍＬ）（水/2-プロパノール/酢酸エチル = ２０/３０/５０）溶液に溶解させ、２５℃で２時間撹拌し濾過、乾燥することで化合物９を２１．６７ｇ得た。（収率:３５．６％、 光学純度: ９７．９％）
化合物９
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.88-7.96 (2H, m), 7.77-7.85 (2H, m), 7.04-7.19 (3H, m), 5.07 (1H, dd, J=4.77, 3.18 Hz), 4.19 (2H, s), 3.23 (1H, dd, J=13.88, 4.95 Hz), 2.88 (1H, dd, J=13.82, 3.06 Hz), 1.59 (3H, s).
[α]D +7.3±0.9°(DMSO, 22℃, c=0.518)
【００４６】
実施例１−３
化合物１１の合成
【化３０】
2019504038.tif 000032
化合物９（２０．０ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）のＮ,Ｎ-ジメチルアセトアミド（３０ｍＬ３０ｍＬ）懸濁液を５℃に冷却した。１,８-ジアザビシクロ（５、４、０）−７−ウンデセン（３９．７ｇ、２６０．８ｍｍｏｌ）を加え、２２時間攪拌後、水（７０ｍＬ）を加え化合物１０の溶液を得た。
酢酸エチル（２００ｍＬ）、水（４０ｍ）および６２％ 硫酸（１２．７ｇ）の混合液に化合物１０の溶液を加え、その混合液を１０℃まで冷却した。１５％硫酸（３．７ｇ）を加え、混合液を２０℃へ加温後、分液した。有機層を５％塩酸ナトリウムの水溶液（９５ｇ）で洗浄した。分液した後、有機層を４２ｍＬまで減圧濃縮した。酢酸エチル（２０ｍＬ）および５０％炭酸カリウム水溶液（２０ｇ）を加え、混合液を４０℃まで加温した。４−クロロベンゼンチオール（６．２９ｇ、４３．５ｍｍｏｌ）および酢酸エチル（１１ｍＬ）を加え、混合液を1時間攪拌した。２０℃へ冷却後、酢酸エチル（１００ｍＬ）、水（６８ｍＬ）および１５％塩酸（４２．６ｇ）を加えた。その層を分液し、酢酸エチル（１４９ｍＬ）および２０％炭酸カルシウムの水溶液（４０．５ｇ）を水層に加えた。分液し、有機層を水（１００ｍＬ）で洗浄した。分液後、有機層を２０ｍＬに濃縮した。酢酸（１．７ｇ、２９．０ｍｍｏｌ）を加え、混合液を５℃に冷却し、９０分攪拌した。濾過、乾燥することで化合物１１の結晶７．１９ｇを得た。（収率: ８３．４％、S体の光学純度: １００％）
化合物１１
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 6.74 (1H, dd, J=11.86, 8.56 Hz), 6.62 (1H, dd, J=6.97, 2.93 Hz), 6.35-6.40 (2H, m), 6.11 (1H, dd, J=9.60, 4.71 Hz), 1.90 (3H, s), 1.49 (3H, s).
光学純度の決定方法を以下に示す。
（試料調製）
化合物１１を２５ｍｇ秤量し、溶媒に溶かし、５０ｍＬのサンプル溶液を調製した。
（方法）
液体クロマトグラフィーを使って、化合物１１のＲ体およびＳ体それぞれのピーク面積を液体クロマトグラフィーの自動積分法により決定した。
（条件）
検出器: 紫外吸光光度計（測定波長：２３０ｎｍ）
カラム: ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＤ−ＲＨ、 φ４．６×１５０mm、 ５μｍ、（ダイセル製）
カラム温度: ４０℃付近の一定温度
移動層: 水／液体クロマトグラフィー用アセトニトリル/液体クロマトグラフィー用メタノール/トリエチルアミン混液（１３２０：３４０：３４０：１）
流量: 毎分１．０ｍＬ（化合物１１の保持時間：Ｒ体が約８分、Ｓ体が約９分）
測定時間: 試料注入後から１５分間
インジェクション量：１０μＬ
試料冷却温度: ２５℃付近の一定温度
自己洗浄溶液：水/アセトニトリル混液（１：１）
【００４７】
実施例１−４
化合物１５の製造
【化３１】
2019504038.tif 000033
化合物１２（３．０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（１８ｍＬ）に溶かし、溶液を５℃に冷却した。塩化チオニル（３．１ｇ、２６．１ｍｍｏｌ）を加え、化合物１３の溶液を得た。
化合物１１（５．０ｇ、 １６．８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（５０ ｍＬ）の懸濁液に炭酸水素ナトリウム（３．５ｇ、 ４２．０ｍｍｏｌ）および水（５０ｍＬ）を加え、混合液を２０℃で５分間攪拌した。
反応液を分液し、有機層を１０ｇまで減圧濃縮した。Ｎ−メチルピロリドン（５ｍＬ）および３５％塩酸（０．９ｇ）を加え、混合液を３℃に冷却した。化合物１３の溶液およびＮ−メチルピロリドン（１．５ｍＬ）を加え、化合物１５の溶液を得た。
化合物１５の溶液を水（１５ｍＬ）および酢酸エチル（１０ｍＬ）の混合液に加え、１時間攪拌後、トリエチルアミン（１４．８ｇ、 １４．６ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルピロリドン（１．５ｍＬ）および水（４５ｍＬ）を加え、さらに１時間攪拌した。水（４５ｍＬ）を加え、混合液を1時間攪拌後、濾過、乾燥することで化合物１５の結晶（Ｉ型結晶、 ５．７１ｇ、９２．４％）を得た。
化合物１５
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.71 (3H, s), 4.06 (3H, s), 6.29 (2H, d, J = 2.4 Hz), 7.07 (1H, dd, J = 11.3, 8.8 Hz), 7.65 (2H, dd, J = 6.8, 2.8 Hz), 7.86 (1H, ddd, J = 8.8, 4.1, 2.8 Hz), 8.19 (1H, dd, J = 8.1, 2.0 Hz), 8.43 (1H, d, J = 8.1 Hz), 8.89 (1H, d, J = 2.0 Hz), 9.81 (1H, s).
[α]D -11.8±1.0°(DMSO, 23℃, c=0.518) 
【００４８】
実施例１−５
酢酸エチル（１８Ｌ）の化合物１１（１８３１ｇ、６．２ｍｏｌ）の懸濁液へ、炭酸水素ナトリウム（１２９３ ｇ、１５．４ｍｏｌ）および水（１８Ｌ）を加え、混合液を２０℃で５分攪拌した。その層を分液し、有機層を３．８ｋｇまで減圧濃縮し、化合物１４の濃縮液を得た。
化合物１２（９１２ｇ、６．２ｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（６４Ｌ）に溶解させ、溶液は４℃に冷却した。塩化チオニル（９５１ｇ、８．０ｍｏｌ）を加え、混合液を３０分間撹拌した。化合物１４の濃縮液を加えて化合物１５の溶液を得た。
化合物１５およびＮ−メチルピロリド（１．６Ｌ）の溶液を水（５kg）へ加えた後、混合液を２５℃で４０分間撹拌した。２４％水酸化ナトリウム水溶液（５kg）、炭酸水素ナトリウム（２５９ ｇ、３．１ｍｍｏｌ）および水（２．７Ｌ）をその混合液へ加えた。混合液を１時間撹拌し、濾過、乾燥することで化合物１５（１．９３ｋｇ、８５．４％）の結晶（準安定形であるＩＩ型結晶）を得た。
【００４９】
実施例１−６
反応液を水酸化ナトリウム（例えば、実施例１−５）などの無機塩基で中和した場合、析出物は中和反応中に得られた。得られた析出物は、準安定なＩＩ型結晶、もしくは安定なＩ型結晶と準安定なＩＩ型結晶の混ざりが得られた。得られた結晶の大きさは小さく、濾過速度は遅かった。
一方で、反応液を実施例１−４のようにトリエチルアミンまたはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンで中和した場合、析出物は中和反応中には得られなかった。析出物は、水の添加後に得られた。得られた析出物はＩ型結晶であった。得られた結晶の大きさは大きく、濾過速度は無機塩基を使用した場合よりも早かった。結果を以下に示す。
【表１】
2019504038.tif 000034
【００５０】
実施例２
ジアステレオマー塩の形成における酸の検討
１）方法
ａ.  以下に示す化合物（（４Ｒ、５Ｒ）体および（４Ｓ、５Ｓ）体の混合物）をＴＨＦ/ＤＭＦ（9/1）溶液に溶かした。その溶液を、９６穴の２ｍＬディープウェルプレートへ、1穴あたり１０ｍｇとなるように分注した。そして、以下に示す酸性溶液を化合物に対して１．０５当量ずつ、それぞれの穴へ添加した。
【化３２】
2019504038.tif 000035
ｂ.  溶媒を留去した後、直径３ｍｍのジルコニアボールおよび溶媒２００μＬを加え、密閉した。
ｃ.  プレート振とう器を用いて、１５℃、１０００ ｒｐｍにて１時間振とうし、３℃で一晩静置した。
ｄ.  沈殿が確認されなかったサンプルについては，酢酸エチル２００μＬを添加し，１５℃、１５００ ｒｐｍにてさらに１時間振とうした。
ｅ.  上澄みを２ｍＬの９６穴ディープウェルの濾過用プレートへ移し、遠心濾過を行った。
ｆ.  濾液を８０％アセトニトリル水溶液で希釈し、以下に示す条件でＨＰＬＣで分析を行った。
２）ＨＰＬＣ条件
機器:  島津製作所 Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＵＦＬＣ ２０Å シリーズ
カラム: ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＳ−ＲＨ、５μｍ、 ４．６ｍｍ Ｉ.Ｄ. × １５０ｍｍ、株式会社ダイセル製
移動相: １０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液/アセトニトリル ＝ ６０／４０（アイソクラティック溶出）
流量: 毎分１．０ｍＬ
波長: ２４０ｎｍ
注入量: ５μＬ
カラム温度: ２５℃
保持時間: ６．５分、７．４分
３）酸性溶液
Ｌ−（＋）−酒石酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの水溶液
Ｄ−（−）−酒石酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの水溶液
（−）−ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸： ０．５ ｍｏｌ／Ｌの９５％メタノール水溶液
（＋）−ジベンゾイル−Ｄ−酒石酸： ０．５ ｍｏｌ／Ｌの９５％メタノール水溶液
ジ-パラ-トルオイル-Ｌ-酒石酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの９５％メタノール水溶液
ジ-パラ-トルオイル-Ｄ-酒石酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌ の９５％メタノール水溶液
Ｌ−（−）−リンゴ酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの水溶液
Ｄ−（＋）−リンゴ酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの水溶液
（−）−１０−カンファースルホン酸： ０．５ ｍｏｌ／Ｌの水溶液
（＋）−１０−カンファースルホン酸： ０．５ ｍｏｌ／Ｌ水の溶液
Ｄ−（＋）−ショウノウ酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌ の５０％メタノール水溶液
Ｌ−ピログルタミン酸： ０．５ ｍｏｌ／Ｌ の５０％メタノール水溶液
Ｌ−（＋）−マンデル酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの５０％メタノール水溶液
Ｄ−（−）−マンデル酸: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの５０％メタノール水溶液
ナプロキセン: ０．５ ｍｏｌ／Ｌの９５％ＴＨＦ水溶液
Ｄ−（−）−キナ酸： ０．５ ｍｏｌ／Ｌの水溶液
４）結果
結果を以下に示す。目的のジアステレオマー（（４Ｒ、５Ｒ）体、 保持時間: ６．５分）は、Ｌ−酒石酸またはＤ−リンゴ酸を添加した試料では、濾液中には著く少なかった。したがって、目的の4Ｒ、５Ｒ−ジアステレオマー塩が析出物として得られたことを確認した。
【表２−１】
2019504038.tif 000036
【表２−２】
2019504038.tif 000037
【００５１】
実施例３−１
ジアステレオマー塩の形成における溶媒検討
１） 方法
ａ.  以下に示す化合物（酒石酸塩の二水和物）をバイアル瓶にそれぞれのバイアルに１０もしくは１００ｍｇずつ分注した。
【化３３】
2019504038.tif 000038
ｂ.  以下に示す各種溶媒５００μＬまたは１ｍＬをバイアル瓶に添加した。
ｃ.  バイアル瓶を回転型シェーカーで２５℃で１時間攪拌し、ＰＴＦＥフィルターでろ過した。
ｄ.  濾液を96穴のＨＰＬＣプレートへ入れ、５５％アセトニトリル水溶液で希釈した。
ｅ.  試料には気泡もしくは析出物がないことを確認し、プレートを密閉し、プレートミキサーで振とうした。
ｆ.  試料を以下条件でＨＰＬＣ分析をおこなった。
カラム: ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＺ−ＲＨ、５μｍ、４．６ｍｍ Ｉ.Ｄ.× １５０ｍｍ、ダイセル製
移動層: ２０ ｍＭ ギ酸含有水溶液／アセトニトリル（アイソクラティック溶出）
有機溶媒比率: ５５％
流量: 毎分１．０ ｍＬ
カラム温度: ２５℃
波長: ２５６ ｎｍ
注入量: ５ μＬ
保持時間:  ３．５２ 分、 ４．２７ 分
ｇ.  上澄み中の（４Ｒ、５Ｒ）体および（４Ｓ、５Ｓ）体の含量から、析出物の（４Ｒ、５Ｒ）体のジアステレオマー過剰率を求めた。
２） 結果
（４Ｒ、５Ｒ）体のジアステレオマー過剰率（ｄｅ％）を以下に示す。光学分割能は、有機溶媒（例えばアセトニトリル、メタノール、２−プロパノール、酢酸エチル、ギ酸エチル、アセトン、およびメチルエチルケトンなど）と水の混液を用いることで向上することが確認された。
【表３】
2019504038.tif 000039
【００５２】
実施例３−２
ジアステレオマー塩の形成を、水／２−プロパノール／酢酸エチルの混合溶媒を用いて評価した。
１） 方法
ａ.  以下に示す化合物の酒石酸塩二水和物を、バイアル瓶にそれぞれのバイアルに１０もしくは１００ｍｇずつ分注した。
【化３４】
2019504038.tif 000040
ｂ.  水／２−プロパノール／酢酸エチル（２０／４０／４０ （ｖ／ｖ））混液２５０ｍＬをバイアル瓶に添加した。
ｃ.  バイアル瓶を回転型シェーカーを用いて２５℃で1時間攪拌し、ＰＴＦＥフィルターでろ過した。
ｄ.   濾液を96穴のHPLCプレートへ入れ、５５％アセトニトリル水溶液で２００倍希釈した。
ｅ.  試料には気泡もしくは沈殿がないことを確認し、プレートを密閉し、プレートミキサーで振とうした。
ｆ.   試料は以下条件でＨＰＬＣ分析した。
カラム: ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ ＯＺ−ＲＨ、５ μｍ、４．６ｍｍＩ.Ｄ. × １５０ｍｍ、ダイセル製
移動層: ２０ ｍＭ ギ酸含有水溶液／アセトニトリル（アイソクラティック溶出）
有機溶媒比率: ５５％
流量: 毎分１．０ ｍＬ
カラム温度: ２５℃
波長: ２５６ ｎｍ
注入量: ５ μＬ
保持時間:  ３．５２ 分、 ４．２７ 分
３） 結果
ＨＰＬＣ測定の結果、濾液中の（４Ｒ、５Ｒ）体および（４Ｓ、５Ｓ）体−ジアステレオマーの濃度がそれぞれ１９ ｍｇ／ｍＬ、１４９ ｍｇ／ｍＬであり、目的の４Ｒ、５Ｒ−ジアステレオマー塩が選択的に得られた。得られた塩の４Ｒ、５Ｒ−ジアステレオマーのジアステレオマー過剰率（ｄｅ％）は７７％であった。
【００５３】
実施例４
化合物１４について、各種酸と溶媒を用いて結晶化検討を行った。
１） 方法
化合物１４  １０ ｍｇもしくは１００ ｍｇを各種溶媒に溶かし、酸（硫酸、塩酸、 臭化水素酸、酢酸、ギ酸もしくはリン酸）を加え、室温で1日間攪拌した。
【化３５】
2019504038.tif 000041
結晶化が確認された試料については、以下条件でＨＰＬＣ分析を行った。
カラム: Ｕｎｉｓｏｎ ＵＫ−Ｃ１８、３μｍ、４．６ｍｍ Ｉ.Ｄ.× １５０ｍｍ
流量: 毎分１．０ ｍＬ
波長: ２５４ｎｍ
移動相Ａ: ０．１％トリフルオロ酢酸／水
移動相Ｂ: ０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
移動相の流量: 表４に示した通り、移動相ＡとＢのグラジエントを行った。
【表４】
2019504038.tif 000042
カラム温度：３５℃
２） 結果
結果は表５に示す。１０ｍｇスケールでは、化合物１４は、水/硫酸の混液系では硫酸塩を形成し、２−プロパノール、アセトニトリルまたは酢酸エチルの系では酢酸塩を形成した。
１００ｍｇスケールでは、硫酸と酢酸について検討した。化合物１４の結晶化による収率は、水系での硫酸塩が収率７０％であったのに対し、酢酸エチルの系での酢酸塩が収率９１％であった（なお、収率は、０．５硫酸塩および１酢酸塩として計算した）
ＨＰＬＣ分析では、化合物１４の硫酸塩結晶は９７．８面積％、母液中の化合物１４は９９．５面積％であった。一方で、化合物１４の酢酸塩結晶は９８．７面積％であるのに対し、母液中の化合物１４は８０．８面積％であった。
化合物１４の精製効果は、酢酸塩の結晶化においてのみ確認され、硫酸塩の結晶化においては確認できなかった。
【表５−１】
2019504038.tif 000043
【表５−２】
2019504038.tif 000044
【００５４】
実施例５
粉末Ｘ線回折測定
日本薬局方に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、実施例１−２で得られた化合物９の結晶について、ブルカー社製のＤ８回折計（ＣｕＫα線、４０ｋＶ、４０ｍＡ、反射法、入射角３°および１２°）で粉末Ｘ線回折パターンを測定した。
粉末Ｘ線回折パターンは図1に示す。
【００５５】
実施例６
熱分析
化合物９の結晶３．６７ｍｇをアルミパンに量り、開放系にて測定を行った。結晶の熱挙動は、以下条件のもとＴＧ／ＤＴＡで測定した。
装置：ＴＧ／ＤＴＡ６３００（日立ハイテクサイエンス社製）
測定範囲：室温−３５０℃
昇温速度：１０℃／分
結果を図２に示す。図２は２００℃までの加温で５．１６％の重量減少を示し、測定結晶が二水和物の結晶であったことを示す。（二水和物の水分量論値＝５．２２％）
【００５６】
実施例７
水分吸脱着等温線測定（ＤＶＳ）
化合物９の結晶１５．２５ｍｇをサンプルパンに量り、測定を行った。結晶の水の吸着は、以下条件のもと水分吸脱着等温線測定によって行った。
装置：ＩＧＡ ＳＯＲＰ（Ｈｉｄｅｎ Ｉｓｏｃｈｅｍａ）
測定点：相対湿度５％ＲＨ（実測５．６％ＲＨ）から９５％ＲＨまでの５％間隔、および、その後の相対湿度９５％ＲＨから５％ＲＨ（実測７．９％ＲＨ）までの５％間隔
温度:２５℃
結果を図３に示す。図３は、室温下で５％強の値を示しており、測定結晶が二水和物であったと推定される。
【００５７】
実施例８
化合物１１の粉末Ｘ線回折測定
日本薬局方に記載された粉末Ｘ線回折測定法に従い、実施例１−３で得られた化合物１１の結晶の粉末Ｘ線回折パターンは、以下条件で、リガク社製のＲＩＮＴ−ＴＴＲＩＩＩでＣｕＫα線（平行ビーム）を用いて測定した。
管電流：３００ｍＡ
管電圧：５０ｋＶ
試料ホルダー：アルミニウム
走査範囲：４°−４０°
サンプリング幅：００２０°
走査速度：５°／分
発散スリット：１．００ ｍｍ
発散縦スリット: １０ ｍｍ
散乱スリット: １ ｍｍ
受光スリット: 開放
平行スリット：１００ ｍｍ
試料ホルダの回転速度：１２０回転/分
結果を図４および表６に示す。
【表６】
2019504038.tif 000045
粉末Ｘ線回折パターンにおいて、特徴的な回折角２θは、１１．９±０．２°、１２．３±０．２°、１５．０±０．２°、１７．２±０．２、１９．５±０．２°、２１．２±０．２°、２１．５±０．２°、２４．９±０．２°、２７．６±０．２°および３６．２±０．２°である。特徴的２θとして好ましくは、１１．９±０．２°、１２．３±０．２°、１９．５±０．２°、２１．２±０．２°および ２４．９±０．２°である。
【００５８】
実施例９
化合物１５の粉末Ｘ線回折分析
１）方法
化合物１５について、実施例１−４で得られた安定形であるＩ型結晶および実施例１−５で得られた準安定形であるＩＩ型結晶の粉末Ｘ線回折パターンを、実施例８記載と同様の方法で測定した。
２）結果
安定形であるＩ型結晶の粉末Ｘ線回折パターンを図５および表７、準安定形であるＩＩ型結晶の粉末Ｘ線回折パターンをを図６および表８に示す。なお、２θが３８°付近にあらわれるピークは、試料ホルダのアルミによる回折である。
【表７】
2019504038.tif 000046
図５（安定形Ｉ）の粉末Ｘ線回折パターンにおいて、特徴的な回折角２θは、７．６±０．２°、８．８±０．２°、１１．５±０．２°、１５．０±０．２°、 １７．２±０．２°、１８．１±０．２°、１９．２±０．２°、２４．７±０．２°、２６．２±０.２°および２７．１±０．２°である。特徴的２θとして好ましくは、７．６±０．２°、１５．０±０．２°、１８．１±０．２°、２４．７±０．２°および２７．１±０．２°である。
【表８】
2019504038.tif 000047
図６（準安定形ＩＩ）の粉末回折パターンにおいて、特徴的な回折角２θは、７．４±０．２°、９．４±０．２°、１３．６±０．２°、１５．０±０．２°、１７．２±０．２°、１７．７±０．２°、１８．８±０．２°、２１．６±０．２°、２４．１±０．２°および２７．４±０．２°である。特徴的２θとして好ましくは、７．４±０．２°、１５．０±０．２°、１７．２±０．２°、１７．７±０．２°および２７．４±０．２°である。
【００５９】
実施例９−２
単結晶構造解析
化合物１５  ０．１ｇにアセトニトリル１０ｍＬを加え６０℃へ加温し溶解して、２日間室温で静置し、化合物１５の単結晶を調製した。
化合物１５のＩ型結晶のＸ線回折実験はリガク社製  Ｒ−ＡＸＩＳ ＲＡＰＩＤ  イメージングプレート回折計を用いて、−１００℃下でグラファイトモノクロメータにより単色化したＣｕ Ｋα線（λ＝１．５４１８７Å）を照射し、データ収集を行った。データ測定および処理をリガク社製プログラムＲＡＰＩＤ  ＡＵＴＯ（ＲＡＰＩＤ−ＡＵＴＯ．  Ｒｉｇａｋｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、  ２００６）で実施した。データはローレンツ補正および吸収補正を行った。
結晶構造は、直説法プログラムＳＨＥＬＸＳ９７（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、 Ｇ. Ｍ. （２００８）、 Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ａ６４、 １１２-１２２）を用いて解き、精密化はＳＨＥＬＸＬ９７（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、 Ｇ. Ｍ. （２００８）、 Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ａ６４、 １１２-１２２）を用いてフルマトリックス最小二乗法を実施した。全ての非水素原子の温度因子は異方性で精密化を行った。水素原子はＳＨＥＬＸＬ９７のデフォルトパラメータを用いて計算により導入し、全て騎乗モデルとして取り扱った。Ｒ１  （Ｉ＞２．００  ｓ（Ｉ））は０．０６８０であり，最終の差フーリエから電子密度の欠如も誤置もないことを確認した。
非対称単位中に、化合物１５が2分子存在し、以下に"分子 I"および"分子 II"と示す。絶対構造決定はフラックパラメーター（Ｆｌａｃｋ、 Ｈ. Ｄ. （１９８３）、 Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ. Ａ３９、 ８７６−８８１）を用いて決定した。フラックパラメーター（χ）は０.０５（２）であり、"分子 I"および"分子 II"の絶対構造がいずれもＳ配置であることを確認した。
結晶構造解析の結晶学的データと収集パラメーターを表９、非水素原子の座標を表１０、水素原子の原子座標を表１１にそれぞれ示す。
【表９】
2019504038.tif 000048
【表１０−１】
2019504038.tif 000049
【表１０−２】
2019504038.tif 000050
【表１１】
2019504038.tif 000051
「分子Ｉ」および「分子ＩＩ」の熱振動楕円体の作図は、ＰＬＡＴＯＮ （Ｓｐｅｋ、 Ａ． Ｌ． （２００９）． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ． Ｄ６５、 １４８−１５５）／ＯＲＴＥＰ （Ｊｏｈｎｓｏｎ、 Ｃ. Ｋ. （１９７６）. ＯＲＴＥＰＩＩ. Ｒｅｐｏｒｔ ＯＲＮＬ−５１３８. Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｔｅｎｎｅｓｓｅe、 ＵＳＡ）を用い、３０％存在確率で、図７および８にそれぞれ示す。
【００６０】
実施例１０
Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ Ａｍｅｓ ｔｅｓｔ
凍結保存しているネズミチフス菌（ＴＡ９８株およびＴＡ１００株）それぞれ２０μＬを、１０ｍＬの液体栄養培地（２．５％  Ｏｘｏｉｄ  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ  Ｎｏ．２）に接種し、３７℃にて１０時間、振盪培養を行った。ＴＡ９８株培養液７．７０ｍＬを遠心（２０００×ｇ、１０分間）して培養液を除去した。そして、７．７０ｍＬのＭｉｃｒｏ  Ｆ緩衝液（Ｋ２ＨＰＯ４：３．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４：１ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４：１ｇ／Ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物：０．２５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０：０．１ｇ／Ｌ）に菌を懸濁し、懸濁液を１２０ｍＬのＥｘｐｏｓｕｒｅ培地（ビオチン：８μｇ／ｍＬ、ヒスチジン：０．２μｇ／ｍＬ、グルコース：８ｍｇ／ｍＬを含むＭｉｃｒｏＦ緩衝液）に添加した。ＴＡ１００株培養液３．４２ｍＬをＥｘｐｏｓｕｒｅ培地１３０ｍＬに添加し、試験菌液を調製した。試験化合物のＤＭＳＯ溶液（最高用量５０ｍｇ／ｍＬから２〜３倍公比で数段階希釈）、陰性対照としてＤＭＳＯ、非代謝活性化条件ではＴＡ９８株に対する陽性対照として５０μｇ／ｍＬの４−ニトロキノリン−１−オキシド  ＤＭＳＯ溶液、非代謝活性化条件ではＴＡ１００株に対する陽性対照として０．２５μｇ／ｍＬの２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド  ＤＭＳＯ溶液、代謝活性化条件でのＴＡ９８株に対する陽性対照として４０μｇ／ｍＬの２−アミノアントラセン  ＤＭＳＯ溶液、代謝活性化条件でのＴＡ１００株に対する陽性対照として２０μｇ／ｍＬの２−アミノアントラセン  ＤＭＳＯ溶液それぞれ１２μＬと試験菌液５８８μＬ（または代謝活性化条件では試験菌液４９８μＬとＳ９  ｍｉｘ  ９０μＬの混合液）を混和し、３７℃にて９０分間、振盪培養した。本試験化合物を暴露した菌液４６０μＬを、Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ培地（ビオチン：８μｇ／ｍＬ、ヒスチジン：０．２μｇ／ｍＬ、グルコース：８ｍｇ／ｍＬ、ブロモクレゾールパープル：３７．５μｇ／ｍＬを含むＭｉｃｒｏＦ緩衝液）２３００μＬに混和し、混合液を５０μＬずつマイクロプレート４８ウェル／用量に分注し、３７℃にて３日間、静置培養した。アミノ酸（ヒスチジン）合成酵素遺伝子の突然変異によって増殖能を獲得した菌を含むウェルは、ｐＨ変化により紫色から黄色に変色する。１用量あたり４８ウェル中の黄色に変色した菌増殖ウェルを計数し、陰性対照群と比較して変異原性を評価する。結果を表１２に示し、変異原性が陰性のものを（−）と示す。
【表１２】
2019504038.tif 000052
【００６１】
実施例１１
Ａｍｅｓ試験
Ａｍｅｓ試験は、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７および大腸菌ＷＰ２ｕｖｒＡを試験菌株として用い、化合物の遺伝変異原性を評価する。試験化合物のＤＭＳＯ溶液０．１ｍＬを、代謝活性化条件下でＳ９混合物０．５μＬまたは非代謝活性化条件下でリン酸緩衝液０．５μＬ、ならびに０．１ｍＬの試験菌の懸濁液と混合する。混合液は水浴中で３７℃にて20分間、プレインキュベートする。プレインキュベート後に、ヒスチジンならびにビオチンもしくはトリプトファンを含む軟寒天層２ｍＬとの混合物を、最小グルコース寒天培地に撒く。同時に、陰性対照物質のＤＭＳＯ、および陽性対照物質として２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド、アジ化ナトリウム、９−アミノアクリジンまたは２−アミノアントラセンも調製する。３７℃で４８時間インキュベーションした後、出現する復帰変異コロニーの数をカウントし、陰性対照グループと比較して判断する。復帰変異コロニーの数が濃度依存的に増えている場合、および陰性対照グループの2倍以上増えている場合を陽性と判断する。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本願発明にかかる製造方法および化合物は、式（ＶＩ）によって示される化合物の医薬製造に有用である。
【図１】
2019504038.tif 000071
【図２】
2019504038.tif 000072
【図３】
2019504038.tif 000073
【図４】
2019504038.tif 000074
【図５】
2019504038.tif 000075
【図６】
2019504038.tif 000076
【図７】
2019504038.tif 000077
【図８】
2019504038.tif 000078
【国際調査報告】
2019504038.tif 000079
2019504038.tif 000080
2019504038.tif 000081
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