(57)【要約】本発明は、カロテノイド−酸素コポリマー、組成物、食品および関連する供給源中のカロテノイド−酸素コポリマーを同定および定量する方法、ならびにカロテノイド−酸素コポリマーを含む組成物を生成する方法に関する。一態様では、カロテノイド−酸素コポリマーを同定および定量する方法は、前記供給源中の低分子量マーカー化合物の分析を含む。別の態様では、本発明は、前記カロテノイド−酸素コポリマーを含む組成物を調製する方法、そして／または有益な免疫学的および健康上の効果も含めて動物およびヒトに有益な効果があるようにするために食品源中の前記コポリマーのレベルを十分なかつ実用上有用な濃度に高める方法を提供する。
2019515247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カロテノイド−酸素コポリマーの供給源を同定する方法であって、
（ａ）  カロテノイドを含有する食用植物源または微生物源を選択すること、
（ｂ）  酸化重合条件下で前記供給源を加工すること、および
（ｃ）  カロテノイド−酸素コポリマーの供給源であるか否かを決定するために、前記加工された供給源から前記カロテノイド−酸素コポリマーを直接単離するもしくは同定することによって、かつ／または前記加工された供給源から前記カロテノイド−酸素コポリマーの指示物質を単離するもしくは同定することによって、前記カロテノイド−酸素コポリマーの量を定量すること
を含む方法。
【請求項２】
前記供給源が、酸化によって、１〜１０００μｇ／ｇ湿重量または１０〜１０，０００μｇ／ｇ乾燥重量と同量のカロテノイド−酸素コポリマーを提供し得る、出発量のカロテノイドを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化重合条件が、空気または酸素への曝露、および、乾燥、粉末化、熱、光への曝露の増大、酸素の分圧（ｐｐＯ２）の上昇または酸化を促進させるその他の因子の１つまたは複数から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カロテノイド−酸素コポリマーの単離が、少なくとも１つの極性有機溶媒抽出／無極性溶媒沈殿サイクルを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒が、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）溶媒から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記極性有機溶媒が酢酸エチルであり、前記無極性溶媒がヘキサンである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記同定する方法が、元素分析、ＧＣ−ＭＳ、ＧＰＣ、およびＦＴＩＲの１つまたは複数から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記食用植物源が、植物もしくはその部分、種子、果実、または野菜である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記食用植物源が、ニンジン、トマト、アルファルファ、スピルリナ、バラの実、甘唐辛子、チリペッパー、パプリカ、サツマイモ、ケール、ホウレンソウ、海藻、ウィートグラス、マリーゴールド、ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ、および赤ヤシ油からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記カロテノイドがβ−イオノン環構造を有し、前記指示物質がゲロン酸である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記カロテノイドが、ルテイン、カプサンチン、またはゼアキサンチンであり、前記指示物質が、４−ヒドロキシゲロン酸またはそのラクトンである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記カロテノイドがルテインまたはゼアキサンチンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記カロテノイドがリコペンまたはγ−カロテンであり、前記指示物質がゲラン酸である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記カロテノイドがカンタキサンチンであり、前記指示物質が、２，２−ジメチルグルタル酸またはその無水物である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
植物、藻類、真菌、種子、または微生物からなる群から選択される天然源から入手可能なカロテノイド−酸素コポリマーの量を増強する方法であって、
（ａ）  カロテノイド生成を増強するために、前記天然源を遺伝子改変すること、および／または
（ｂ）  前記天然源を、酸化重合条件下で加工すること
を含む方法。
【請求項１６】
カロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物を調製する方法であって、
（ａ）  カロテノイドを含む食用植物源または微生物源を得ること、および
（ｂ）  前記供給源を、酸化重合条件下で加工すること
を含む方法。
【請求項１７】
前記酸化重合条件が、空気または酸素への曝露、および、乾燥、粉末化、熱、光への曝露の増大、酸素の分圧（ｐｐＯ２）、温度の上昇、または酸化を促進させるその他の因子の１つまたは複数から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法を使用して得られた前記生成物を、１つまたは複数の溶媒抽出／沈殿サイクルに供すること、そしてそこから前記カロテノイド−酸素コポリマー含有画分を回収することによって、前記カロテノイド−酸素コポリマー生成物を単離する方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの極性有機溶媒抽出／無極性溶媒沈殿サイクルにおいて、前記溶媒が、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）溶媒から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記極性有機溶媒が酢酸エチルであり、前記無極性溶媒が低分子量炭化水素である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記低分子量炭化水素がヘキサンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記食用植物源が、植物もしくはその部分、種子、果実、または野菜である、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記食用植物源が、ニンジン、トマト、アルファルファ、スピルリナ、バラの実、甘唐辛子、チリペッパー、パプリカ、サツマイモ、ケール、ホウレンソウ、海藻、ウィートグラス、マリーゴールド、ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ、および赤ヤシ油からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法を使用して調製される生成物。
【請求項２５】
抽出／沈殿サイクル後に回収された前記生成物が、カロテノイド分解生成物を含まない、請求項２４に記載の生成物。
【請求項２６】
請求項１５から２３のいずれか一項に従い調製されたカロテノイド−酸素ポリマーを含む生成物と、適切な賦形剤とを含む、組成物。
【請求項２７】
請求項１５から２３のいずれか一項に従い単離された前記カロテノイド−酸素コポリマー生成物と、適切な賦形剤とを含む、組成物。
【請求項２８】
請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法によって調製された前記カロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物を含む、動物飼料または動物飼料用栄養補助食品。
【請求項２９】
請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法によって調製されたカロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物を含む、栄養補給食品または栄養補助食品。
【請求項３０】
カロテノイドを含む食品または栄養補助食品中の、カロテノイド−酸素コポリマーを増強するための方法であって、前記食品または栄養補助食品に、請求項２４または２５に記載のカロテノイド−酸素コポリマー生成物を添加するステップを含む方法。
【請求項３１】
動物の免疫性を高めるための、請求項２４または２５に記載のカロテノイド−酸素コポリマー生成物の使用。
【請求項３２】
動物の健康を増進させるための、請求項２４または２５に記載の生成物を使用する単離されたカロテノイド−酸素コポリマーの有効量の使用。
【請求項３３】
前記動物の健康の増進が、先天性免疫を高め、抗炎症性を高め、免疫系の機能を高め、疾患に抵抗する動物の能力を高め、疾患から回復しもしくは克服し、または健康状態を維持することの、１つまたは複数から選択される、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記動物がヒトである、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法を使用して調製された、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の使用のために一貫した所望量のカロテノイド酸素コポリマーを有する生成物。
【請求項３６】
ノルイソプレノイド副生成物を含まない、自然を供給源とするＯｘＰＶＡ組成物。
【請求項３７】
ノルイソプレノイド副生成物を含まない、自然を供給源とするＯｘＣａｒ組成物。
【請求項３８】
酸化重合条件下でカロテノイドを含む天然源を加工すること、それを１つまたは複数の溶媒抽出／沈殿サイクルに供すること、それから前記カロテノイド−酸素コポリマー含有画分を回収することから誘導された、請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記天然源が、カロテノイド生成が増強されるように遺伝子改変されている、請求項３８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カロテノイド−酸素コポリマーの組成物、植物源または微生物源のような自然食品源などの天然源からカロテノイド−酸素コポリマーを同定および定量する方法、ならびに前記組成物を生成する方法に関する。本発明はまた、動物およびヒトの健康全般を維持し増進させ、または動物もしくはヒトの免疫応答もしくは免疫性を強化するなど、様々な使用のために、カロテノイド−酸素コポリマーの有効量を含む組成物も企図する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
様々な健康上の利益は、食餌カロテノイドに起因する１〜３。α−およびβ−カロテンとβ−クリプトキサンチンとを含む、いくつかのプロビタミンＡカロテノイドは、それらのビタミンＡ活性に関連した利益を提供する４。しかし、プロビタミンＡカロテノイドと、ビタミンＡに変換することができないその他のカロテノイドとの両方の、その他の非ビタミンＡの利益は、説明することが容易でない５〜７。
【０００３】
カロテノイドは、植物によって合成された、黄、橙、および赤色の色素である。純粋に炭化水素であるカロテンと、１個または数個の酸素原子で置換されたカロテンであるキサントフィルと呼ばれる２つのクラスで構成される、６００種を超える公知のカロテノイドがある。β−カロテンおよびリコペンは、一般的なカロテンの例であり、それに対してルテイン、ゼアキサンチン、およびカンタキサンチンは、キサントフィルの一般的な例である。北米における食餌で最も一般的なカロテノイドは、α−カロテン、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテイン、ゼアキサンチン、およびリコペンである。
【０００４】
全てのカロテノイドは、８個のイソプレン単位から形成され、各カロテノイド分子は、４０個の炭素原子を含有する。構造的に、カロテノイドは、環によって一端または両端が終結することもあるポリエン炭化水素鎖の形をとる。非置換β−イオノン環（β−カロテン、α−カロテン、β−クリプトキサンチン、およびγ−カロテンを含む）を含有するカロテノイドは、ビタミンＡ活性を有する（レチナールに変換できることを意味する）。対照的に、ルテイン、ゼアキサンチン、カプサンチン、カンタキサンチン、およびリコペンには、ビタミンＡ活性がない。
【０００５】
従来、非ビタミンＡ活性は、しばしば抗酸化剤としての、カロテノイド自体の作用に帰するとされている８〜１０。しかし最近の研究は、少なくとも発がんの阻害に関し、抗酸化剤の役割に対して疑いをかけており、その他のメカニズムの働きを指摘している１１、１２。
【０００６】
酸素の添加は、高度に不飽和である化合物の自発的酸化において本質的に好まれることが、長い間公知であったが１５、カロテノイドの酸化重合の主要な関与および有意性は、本発明者らの報告の前は驚くべきことに見逃されていた１３、１４（米国特許第５，４７５，００６号；米国特許第７，１３２，４５８号；米国特許第８，２１１，４６１号；米国特許出願公開第２０１１−０２１７２４４号；米国特許出願公開第２０１３−０１３１１８３号；および米国特許出願公開第２０１３−０１５６８１６号も参照）。さらに、β−カロテンと、溶媒中の酸素とのならびに類似して形成された完全酸化リコペンとの自発的反応によって得られる、完全に酸化されたβ−カロテン組成物（ＯｘＢＣと呼ばれ、Ａｖｉｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．のＯｘＣ−ｂｅｔａ（商標）ブランド製品における活性成分である）による研究は、ポリマー画分が、先天的免疫機能を刺激し強化し１４ならびに炎症プロセスを制限する１６能力を含む免疫活性の、原因であること１４を明らかにしてきた。β−カロテンおよびリコペン以外のカロテノイドは、このタイプの免疫学的に活性なポリマーの供給源として、これまで研究されていない。
さらに、β−カロテンを含むカロテノイド、特にβ−カロテンの遍在性と、それらの公知の食品加工中に失われ易い性質により１７、１８、酸化、特に共重合が食品中で自然に生ずるのか否かおよびどの程度まで生ずるのか、ならびにこの損失の原因となり得るのかが、不明瞭である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４７５，００６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１３２，４５８号明細書
【特許文献３】米国特許第８，２１１，４６１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１１−０２１７２４４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３−０１３１１８３号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３−０１５６８１６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要旨
カロテノイド酸化生成物自体が有益な性質を有するのか、例えば非ビタミンＡの健康上の利益を有するのか否か、かつ／または、それは、そのような利益を有する親カロテノイドおよびその抗酸化作用であるのか否かを決定することが求められている。さらに、動物の飼料、動物およびヒトの栄養補助食品、ならびに動物およびヒトの健康を増進することができる食品などの、製品を開発することが求められている。さらに、天然源（食品源、植物、または微生物など）から酸化カロテノイド生成物を開発するために、酸化カロテノイド生成物の供給源を同定することが求められている。さらに、そのような酸化カロテノイド生成物の経済的な供給源、およびそれを生成するための方法を、見出すことが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一部の実施形態では、本発明者らは驚くべきことに、食用植物源（例えば、植物またはその部分、果実、および野菜）および微生物などであってカロテノイド−酸素コポリマーの良好な供給源である、天然源を同定した。さらに、本発明者らは、一部の実施形態では、カロテノイド−酸素コポリマーの組成物と天然カロテノイド源からの生成物とを、驚くべきことに生成することができた。
【００１０】
一部の実施形態では、前記天然源は、非ビタミンＡカロテノイドに関連した健康上の利益のために使用することができる。一部の実施形態では、植物源および微生物は、加工中に好気性条件下で、カロテノイド−酸素コポリマーとの生成物をもたらすことができる、高レベルのカロテノイドを含む。一部の他の実施形態では、非加工植物源または微生物は、カロテノイド−酸素コポリマーを有していてもよく、直接使用することができ、またはカロテノイド−酸素コポリマー成分を単離する（またはカロテノイド−酸素コポリマーを含む成分を単離する）だけでなく一部の実施形態では得られる生成物のカロテノイド−酸素コポリマー含量を高められるようにも加工することができる。このように一部の実施形態では、本発明の方法は、単離されたまたは精製されたカロテノイドから開始することなく、むしろ天然源などのカロテノイドに富む出発生成物を得、ｉｎ  ｓｉｔｕでカロテノイドを酸化することによって、有益な効果を発揮するカロテノイド酸素コポリマーを含む生成物をもたらす。一部の実施形態では、出発生成物は既に、カロテノイド−酸素コポリマーに富む。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明者らは、天然源からの新しいカロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物と、それを生成する方法とを開発した。一部の他の実施形態では、本発明の方法は、所望の量のカロテノイド−酸素コポリマーを有する一貫した様式で、生成物の生成を可能にする。前記生成物には、動物およびヒトの健康を増進するなど、本明細書で述べる使用に関して利点がある。生成物を生成する能力には一貫して、規制上および消費製品の両方の観点からも利点がある。したがって本発明は、一部の実施形態において、一貫したレベルのカロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物を提供する。
【００１２】
一部の他の実施形態では、本発明者らは、前記天然源中のカロテノイド−酸素コポリマーのレベル／濃度を高め、組成物および生成物をもたらすための方法を開発した。本発明の一部の他の態様では、方法は、カロテノイド−酸素コポリマー生成の可能性が高まるようカロテノイドのレベルを増大させるのに、遺伝子改変された植物または微生物を使用することを含む。一部の他の態様では、本発明は、酸化重合の条件下で天然源を加工すること、そして極性溶媒抽出および無極性溶媒沈殿の１つまたは複数のサイクルを通してコポリマーを含む画分（単数または複数）を回収することにより、加工された天然源生成物中のカロテノイド−酸素コポリマーの、得られる濃度を高めるための方法を提供する。
【００１３】
さらに、従来技術のＯｘＢＣの組成物とは異なり、一部の他の実施形態では、本発明者らは、カロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物であってノルイソプレノイド分解生成物ではないものを単離および／または開発することができた。一部の実施形態では、本発明の組成物および生成物の活性成分は、カロテノイド−酸素コポリマーである。一部の他の実施形態では、前記組成物および生成物は、ノルイソプレノイド分解生成物を含まない。
【００１４】
一部の他の実施形態では、本発明の生成物は、カロテノイド−酸素コポリマーに加え、カロテノイドおよび不完全に酸化されたカロテノイドを含んでいてもよい。別の実施形態では、生成物は、他の酸化された非カロテノイド生成物を含んでいてもよく、前記組成物は、使用される天然源に依存する。一部の他の実施形態では、生成物が粉末である。
【００１５】
ある特定の態様では、本発明は、カロテノイド−酸素コポリマーの供給源を同定する方法であって、下記を含む方法を提供する：
（ａ）カロテノイドを含有する供給源を選択することであり、一実施形態では、前記供給源が、食用植物源、または細菌、酵母菌、および藻類を含むがこれらに限定されない微生物源であること。一実施例では、供給源は、カロテノイドのレベルが高まるように遺伝子改変され、例えばゴールデンライスおよびＭ３７Ｗ−Ｐｈ３コーン、ならびに遺伝子改変された微生物、例えば酵母、または「Plant  carotenoids:  genomics  meets  multi-gene  engineering」Current  Opinion  in  Plant  Biology  ２０１４年、１９巻：１１１〜１１７頁のG.  Guilianoにより記載されるものである５４；
（ｂ）酸素への曝露、酸素に曝露される表面積の増加、酸素の分圧（ｐｐＯ２）および／または温度の上昇、あるいは供給源中に存在するカロテノイド−酸素コポリマーのレベルを高める様式など、酸化重合条件下で供給源を加工すること；および
（ｃ）カロテノイド−酸素コポリマーの供給源であるか否かを決定するために、前記加工された供給源からカロテノイド−酸素コポリマーを直接単離するもしくは同定することによって、かつ／または前記加工された供給源からカロテノイド−酸素コポリマーの指示物質を単離するもしくは同定することによって、カロテノイド−酸素コポリマーの量を定量すること。一部の実施形態では、供給源は、酸化によって、１〜１０００μｇ／ｇ湿重量または１０〜１０，０００μｇ／ｇ乾燥重量と同量のカロテノイド−酸素コポリマーを提供し得る、出発量のカロテノイドを有する。一部の実施形態では、１０〜１０，０００μｇ／ｇ乾燥重量など、所望のカロテノイド−酸素コポリマーレベルをもたらす供給源が選択される。
【００１６】
さらに一部の他の実施形態では、植物源は、ニンジン、トマト、アルファルファ、スピルリナ、バラの実、甘唐辛子、チリペッパー、パプリカ、サツマイモ、ケール、ホウレンソウ、海藻、ウィートグラス、マリーゴールド４４〜４８、ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ４９〜５２、および赤ヤシ油からなる群から選択される。別の実施形態では、供給源は、粉末、例えばニンジン粉末、トマト粉末、スピルリナ粉末、バラの実粉末、パプリカ粉末、海藻粉末、およびウィートグラス粉末である、植物製品である。
【００１７】
一部の実施形態では、微生物源は、細菌、酵母、真菌、および藻類、例えばスピルリナ４４と、その遺伝子改変された形であってカロテノイド−酸素コポリマーの収率が高まるようにカロテノイドレベルを増大させたものからなる群から選択される。一部のさらなる実施形態では、微生物が、下記の種：藻類：スピルリナ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｕｒｉｅｌｏｐｓｉｓ。真菌：Ｂｌａｋｅｓｌｅａ  ｔｒｉｓｐｏｒａ。酵母：Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ。細菌：Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓからなる群から選択される。
【００１８】
一部の実施形態では、カロテノイドは、非置換β−イオノン環構造を有し、指示物質はゲロン酸である。別の実施形態では、非置換β−イオノン環構造を持つカロテノイドは：β−クリプトキサンチン；α−カロテン；γ−カロテン；およびβ−カロテンの１種または複数から選択され、あるいは別の実施形態ではβ−カロテンである。
【００１９】
一部の他の実施形態では、カロテノイドは、ビタミンＡを形成しない、またはビタミンＡ活性を持たないものから選択され、例えばカロテノイドは、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、カプサンチン、およびカンタキサンチンから選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、カロテノイド−酸素コポリマーの存在に関する指示物質は、下記の通りである：（ｉ）β−クリプトキサンチン；α−カロテン；β−カロテン、およびγ−カロテンのカロテノイド−酸素コポリマーに関しては、ゲロン酸；（ｉｉ）リコペンおよびγ−カロテンのカロテノイド−酸素コポリマーに関してはゲラン酸；（ｉｉｉ）ルテイン、ゼアキサンチン、およびカプサンチンのカロテノイド−酸素コポリマーに関しては、４−ヒドロキシゲロン酸および／またはそのラクトン；および（ｉｖ）カンタキサンチンのカロテノイド−酸素コポリマーに関しては２，２−ジメチルグルタル酸およびその無水物。一部の実施形態では、本発明は、そのそれぞれの指示物質を検出することによって（単離、標識、メチルエステル化、またはその他の手段を通して）、前述のカロテノイド−酸素コポリマーの存在を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、前記指示物質の量を定量し、前記量を、カロテノイド−酸素コポリマーの量に相関させることによって前記カロテノイド−酸素コポリマーの存在を定量するのに、前記指示物質を使用することができる。
【００２１】
一部の実施形態では、酸化重合条件は、空気または酸素への曝露、および、乾燥、粉末化、熱、光への曝露の増大、酸素の分圧（ｐｐＯ２）および／または温度の上昇、あるいは酸化を促進させるその他の因子の１つまたは複数から選択される。別の実施形態では、カロテノイド−酸素コポリマーの単離は、１つまたは複数の溶媒抽出／沈殿サイクルを含む。ある特定の実施形態では、抽出用の溶媒は、酢酸エチルまたは酢酸ブチルなどの極性有機溶媒である。本発明の他の態様では、沈殿は、ヘキサン、ペンタン、またはヘプタンなどの無極性溶媒を使用して、一部の実施形態ではヘキサンを使用して実行される。
【００２２】
一部の他の実施形態では、同定する方法は：元素分析、ＧＣ−ＭＳ、ＧＰＣ、およびＦＴＩＲの１つまたは複数から選択される。
【００２３】
一部の他の態様では、本発明は、下記を含む、カロテノイド−酸素コポリマーを含有する生成物を調製する方法を提供する：
（ａ）カロテノイドを含有する、または一部の実施形態ではカロテノイドに富む天然源、例えば微生物、または食用植物源、酵母、真菌、藻類、もしくは細菌を得ること。一部の実施形態では、天然源は、先に述べた植物および微生物から選択される；および
（ｂ）前記供給源を、酸化重合条件下で加工すること。一部の実施形態では、前記条件は、空気または酸素への曝露、および、乾燥、粉末化、熱、光への曝露の増大、酸素の分圧（ｐｐＯ２）および／または温度の上昇、あるいは酸化および／または存在するカロテノイド−酸素コポリマーのレベルを高める条件を促進させるその他の因子の１つまたは複数から選択される。
【００２４】
さらに一部の他の実施形態では、本発明は、上記（ｂ）から得られた生成物を、極性有機溶媒の１つまたは複数のサイクル、例えば酢酸エチル抽出／無極性溶媒沈殿、例えばヘキサン、ペンタン、またはヘプタン、あるいは一実施形態ではヘキサンに供すること、そしてそれからカロテノイド−酸素コポリマー含有画分を回収することによって、カロテノイド−酸素コポリマー生成物を単離するための方法を提供する。一実施形態では、プロセスで使用される溶媒は、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ものから選択され得る。抽出／沈殿サイクルは、酸化プロセス中に形成された可能性のあるカロテノイド分解生成物を含有しない、カロテノイド−酸素コポリマー生成物をもたらす。
【００２５】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法により単離されたカロテノイド−酸素コポリマーと、任意選択で適切な賦形剤とを含む組成物を含む。一部の他の実施形態では、本発明は、カロテノイド−酸素コポリマー、または本発明に準じて開発されたカロテノイド−酸素コポリマーを含有する生成物もしくは組成物を含む、動物の飼料または動物の飼料用の栄養補助食品を提供する。一部の実施形態では、生成物は、天然から供給される（例えば、果実もしくは野菜などの植物などの食品から、または藻類、真菌（酵母など）、もしくは細菌などの微生物から）。さらに一部の他の実施形態では、本発明は、カロテノイド−酸素コポリマーを含む栄養補給食品もしくは栄養補助食品もしくは食品、または、ヒトもしくは動物が使用するために本発明の方法に準じて開発されたカロテノイド−酸素コポリマーを含有する生成物もしくは組成物を提供する。
【００２６】
一部の他の実施形態では、本発明は、食品源または栄養補助食品（植物由来食品または栄養補助食品など）などの供給源中の、カロテノイド−酸素コポリマーを増強するための方法であって、カロテノイド−酸素コポリマーおよび／または画分を含むコポリマーの形成および／または単離が強化されるように、酸化条件下で前記食品源または栄養補助食品を加工するステップを含む方法を提供する。
【００２７】
一部の他の実施形態では、本発明は：先天性免疫を高め、炎症を制限しもしくは低減させ、免疫系の機能を高め、疾患に抵抗する動物の能力を高め、疾患から回復しもしくは克服し、または健康状態を維持することの１つまたは複数から選択されるものなど、動物およびヒトの健康、および／または動物の免疫性が増強されるような、カロテノイド−酸素コポリマーおよびそれを含む組成物の使用を提供する。一部の実施形態では、カロテノイドの供給源は、食品または植物またはその他の供給源である。ある特定の実施形態では、前記酸化カロテノイド生成物を含む、強化されたニンジン粉末またはトマト粉末は、家畜用の動物の飼料に直接使用することができ（例えば、飼料１トン中、合成由来の例えばＯｘＢＣ  ２ｐｐｍに一致させるのに、ニンジン粉末２〜４ｋｇ）、または前記天然源由来の「純粋な」単離された酸化カロテノイドポリマー生成物は、イヌまたはネコの咀嚼栄養補助食品に使用することができる。
【００２８】
さらに、一部の他の態様では、本発明は、先天性免疫機能を刺激し高めかつ慢性炎症を制限する生成物を提供する。さらに、食物由来コポリマーである本発明の酸化カロテノイドは、有機溶媒中ではなく食物そのものの環境内のカロテノイドのブレンドから形成される。次いで得られた混合コポリマーは、粉末の形で使用することができ、または食物用栄養補助食品および化粧品を含む使用のために溶媒抽出／沈殿によって多かれ少なかれ純粋な形で単離することができる。
【００２９】
本発明の追加の態様および利点は、以下に続く説明を考慮すれば明らかである。しかし、詳細な記述および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修正がこの詳細な記述から当業者に明らかにされることになるので、単なる例示として与えられることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、β−カロテンと有機溶媒中の分子状酸素との自発的反応が、主としてβ−カロテン−酸素コポリマーを、大部分馴染みのある短鎖ノルイソプレノイド化合物と一緒に発生させる、カロテノイドの酸化重合のモデルを示す。β−カロテンの完全酸化は、高度に再現性があり、分子状酸素をほぼ８モル当量消費し、それに付随して最終生成物、ＯｘＢＣの重量が約３０％増加する。リコペン、ルテイン、およびカンタキサンチンを含むカロテノイドの他の例は、酸化重合が、約６００の構成要素から構成されるカロテノイド族に共通した一般的現象であることを示す非常に類似した様式で振る舞う。このモデル反応は、植物由来食品中に存在するカロテノイドおよび関連物質が類似の反応を受けて類似の生成物を与えるか否かを決定するための、基礎として使用される。
【００３１】
【図２Ａ】図２Ａは、プロビタミンＡ（ＰＶＡ）カロテノイドの酸化重合が、炭素骨格の二重の酸化的開裂により、少量の生成物としてゲロン酸（ＧＡ）を発生させることを示す。２個の共役β−イオノン環を持つβ−カロテンは、分子当たり２つのＧＡをもたらすことができる。ＧＡは、β−カロテン、α−カロテン、γ−カロテン、およびβ−クリプトキサンチンから発生したノルイソプレノイド生成物で最も豊富にあり、１個のβ−イオノン環がそれぞれ、分子当たりただ１つのＧＡをもたらすことができる。
【００３２】
【図２ＢＣＤ】図２Ｂは、非プロビタミンＡカロテノイドリコペンの酸化重合が、炭素骨格の酸化的開裂により、少量の生成物としてゲラン酸を発生させることを示す。一部の実施形態では、リコペンは、分子当たり２つのゲラン酸をもたらし得るが、γ−カロテンは、１つのみ発生させることができる。ゲラン酸は、γ−カロテンの指示物質とすることもできることに、留意すべきである。図２Ｃは、非プロビタミンＡカロテノイドであるルテインの酸化重合が、４−ヒドロキシゲロン酸および／またはそのラクトンを発生させることを示す。これは、ゼアキサンチンおよびカプサンチンのカロテノイド−酸素コポリマーに関する指示物質でもある。図２Ｄは、非プロビタミンＡであるカンタキサンチンの酸化重合が、２，２−ジメチルグルタル酸およびその無水物を発生させることを示す。
【００３３】
【図２Ｅ】図２Ｅは、リコペン、γ−カロテン、ルテイン、ゼアキサンチン、カプサンチン、およびカンタキサンチンの化学構造を示す。
【００３４】
【図３】図３は、ＧＡとＧＡ−ｄ６メチルエステルとのＧＣ−ＭＳ強度比、Ｉ／Ｉ６を、２種の化合物の量の既知の比、ｍ／ｍ６に対してプロットした、典型的な較正曲線である。
【００３５】
【図４】図４は、ＳＩＭモードで記録されたニンジンジュース試料のゲロン酸分析の、ＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。シグナルは、ＧＡ−ｄ６（Ａ、ｍ／ｚ＝１６０）およびＧＡ（Ｂ、ｍ／ｚ＝１５４）の、メチルエステルのものである。
【００３６】
【図５】図５は、ＳＩＭモードで記録された生のトマトの試料の、ゲロン酸分析のＧＣ−ＭＳクロマトグラムである。ＧＡ−ｄ６（Ａ、ｍ／ｚ＝１６０）およびＧＡ（Ｂ、ｍ／ｚ＝１５４）の、メチルエステルのシグナルが示される。
【００３７】
【図６】図６は、走査モードで記録された、ニンジンジュース（上）および生のトマト（下）の試料のゲロン酸分析のＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。ＧＡ−ｄ６（Ａ）およびＧＡ（Ｂ）のメチルエステルに関する保持時間は、それぞれ７．４３および７．４６分である。
【００３８】
【図７】図７は、ニンジンおよびトマト粉末の抽出物の逐次溶媒沈殿によって単離された、ポリマー画分のＦＴＩＲスペクトルを示す。上から順に：ニンジン粉末＃１を、完全酸化β−カロテン（ＯｘＢＣ）と比較し、トマト粉末を、完全酸化リコペン（ＯｘＬｙｃ）と比較する。
【００３９】
【図８】図８は、ＯｘＢＣポリマー（実線）と比較した、抽出されたニンジン粉末＃１（点線）から得られた沈殿画分の、メタノール溶媒におけるＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。
【００４０】
【図９】図９は、ＯｘＢＣポリマー（実線）の場合と比較した、抽出されたニンジン粉末＃１（点線）から得られた３×沈殿画分のＧＰＣを示す。ＵＶ吸光度を２２０〜４００ｎｍでモニタした。注入された量は、両方の試料に関して２００μｇであった。７．７分でのＯｘＢＣポリマーに関するメジアンＭＷは、約７００〜８００Ｄａである（Burtonら１３）。
【００４１】
【図１０】図１０は、２５０℃のＧＣインジェクタポートで熱分解した後の、ＯｘＢＣポリマー（下）および抽出されたニンジン粉末＃２から得られた沈殿した画分（上）の、ＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。他に示さない限り、ＧＣ−ＭＳライブラリに対して５０％よりも大きい一致で同定された化合物は、１：β−シクロシトラール；２：β−ホモシクロシトラール（２−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサ−１−エニル）アセトアルデヒド）；３：４，８−ジメチルノナ−１，７−ジエン−４−オール（３８〜４７％一致）；４：５，６−エポキシ−β−イオノン；５：ジヒドロアクチニジオリド；６：４−オキソ−β−イオノンである。上部トレースのピーク７は、α−イオノンとして同定される（４０％一致）。
【００４２】
【図１１ＡＢ】図１１は、（Ａ）ニンジン粉末＃２、（Ｂ）トマト粉末、（Ｃ）トマトの搾りかす、（Ｄ）バラの実の粉末、（Ｅ）天日乾燥したアルファルファ、（Ｆ）ダルス海藻粉末、（Ｇ）ウィートグラス粉末、および（Ｈ）パプリカの、酢酸エチル抽出物から単離されたヘキサン沈殿固形分のポリマーの性質を例示する、ＧＰＣクロマトグラムを示す。
【図１１ＣＤ】図１１は、（Ａ）ニンジン粉末＃２、（Ｂ）トマト粉末、（Ｃ）トマトの搾りかす、（Ｄ）バラの実の粉末、（Ｅ）天日乾燥したアルファルファ、（Ｆ）ダルス海藻粉末、（Ｇ）ウィートグラス粉末、および（Ｈ）パプリカの、酢酸エチル抽出物から単離されたヘキサン沈殿固形分のポリマーの性質を例示する、ＧＰＣクロマトグラムを示す。
【図１１ＥＦ】図１１は、（Ａ）ニンジン粉末＃２、（Ｂ）トマト粉末、（Ｃ）トマトの搾りかす、（Ｄ）バラの実の粉末、（Ｅ）天日乾燥したアルファルファ、（Ｆ）ダルス海藻粉末、（Ｇ）ウィートグラス粉末、および（Ｈ）パプリカの、酢酸エチル抽出物から単離されたヘキサン沈殿固形分のポリマーの性質を例示する、ＧＰＣクロマトグラムを示す。
【図１１ＧＨ】図１１は、（Ａ）ニンジン粉末＃２、（Ｂ）トマト粉末、（Ｃ）トマトの搾りかす、（Ｄ）バラの実の粉末、（Ｅ）天日乾燥したアルファルファ、（Ｆ）ダルス海藻粉末、（Ｇ）ウィートグラス粉末、および（Ｈ）パプリカの、酢酸エチル抽出物から単離されたヘキサン沈殿固形分のポリマーの性質を例示する、ＧＰＣクロマトグラムを示す。
【００４３】
【図１２】図１２は、完全酸化（Ａ）リコペン（ＯｘＬｙｃ）、（Ｂ）ルテイン（ＯＰｘＬｕｔ）、および（Ｃ）カンタキサンチン（ＯｘＣａｎ）の、酢酸エチル溶液からヘキサン沈殿によって単離されたポリマー画分の、ＧＰＣを示す。
【００４４】
【図１３】図１３は、（上から順に）：ニンジン粉末＃２、トマトの搾りかす、バラの実の粉末、天日乾燥したアルファルファ、ウィートグラス粉末、ダルス海藻粉末、およびパプリカの、酢酸エチル抽出物から単離されたヘキサン沈殿ポリマー固形分の、ＦＴＩＲスペクトルを示す。
【００４５】
【図１４】図１４は、完全酸化カンタキサンチン（ＯｘＣａｎ）およびルテイン（ＯｘＬｕｔ）の、ＦＴＩＲスペクトルを示す。
【００４６】
【図１５ＡＢ】図１５Ａは、ゲラン酸メチル（化合物Ａ）を得るための、Ｍｅ３ＯＢＦ４によるゲラン酸のエステル化に関する反応スキームを示し；１５Ｂは、重水素で標識されたゲラン酸の、提案された合成を示し；１５Ｃは、Ｍｅ３ＯＢＦ４でエステル化した、トマト粉末抽出物およびＯｘＬｙｃ低ＭＷ画分のＧＣクロマトグラムであり、化合物Ａは、その質量スペクトルによって同定される。保持時間の差は、分析実行条件の少しの差の結果である。
【００４７】
【図１５Ｃ】図１５Ａは、ゲラン酸メチル（化合物Ａ）を得るための、Ｍｅ３ＯＢＦ４によるゲラン酸のエステル化に関する反応スキームを示し；１５Ｂは、重水素で標識されたゲラン酸の、提案された合成を示し；１５Ｃは、Ｍｅ３ＯＢＦ４でエステル化した、トマト粉末抽出物およびＯｘＬｙｃ低ＭＷ画分のＧＣクロマトグラムであり、化合物Ａは、その質量スペクトルによって同定される。保持時間の差は、分析実行条件の少しの差の結果である。
【００４８】
【図１６】図１６は、空気中に静置し光に曝露したときの、脱水したニンジン中のβ−カロテンに、付随する損失がある、ゲロン酸の形成を示すグラフである。時間０での測定は、新たに脱水したニンジンピューレを使用して、その後の時点では、トレイ上に薄く延ばしかつ空気および光に曝露した、乾燥ニンジン粉末で測定した。
【００４９】
【図１７】図１７は、ニンジンピューレ、１日目（Ａ）；脱水したニンジンピューレ、０日目（Ｂ）；ニンジン粉末、０日目（Ｃ）；およびニンジン粉末、２１日目（Ｄ）の、グレースケール写真（目視比較）である。カラーでは、（Ａ）および（Ｂ）で橙の様々な濃淡があり、これらは（Ｃ）よりも濃く、（Ｃ）が（Ｄ）よりも濃い。
【００５０】
【図１８】図１８は、ニンジン粉末試料の、空気への曝露を制限した効果の、グレースケール写真（目視比較）であり：（Ａ）試料は、脱水したニンジンチップをコーヒーブレードミルで粉砕し、次いでジャー内に４週間と６日間密封することによって調製し（色は、橙であった）；（Ｂ）試料は、乾燥ニンジンピューレを食品プロセッサブレードで粉末化し、コーヒーバーミルで粉砕し、次いで空気に１週間と６日間曝露することによって調製した（色は、褐色であった）。
【００５１】
【図１９ＡＢ】図１９は、ルテイン、ゼアキサンチン、およびカプサンチンの自動酸化の低分子量マーカーを示し：１９Ａは、その親ラクトンとＭｅ３ＯＢＦ４との反応による、ゲロン酸４，５−ジデヒドロメチル（化合物Ｂ）の形成を示し；１９Ｂは、重水素標識マーカー、４−ヒドロキシゲロン酸−ｄ６のラクトンの、１つの可能性ある合成を示し；１９Ｃは、ダルス粉末抽出物およびＯｘＬｕｔの低ＭＷ画分の、Ｍｅ３ＯＢＦ４でエステル化したもののＧＣクロマトグラムを示し、化合物Ｂの保持時間は７．３２分で示される。共通の質量スペクトルイオンは、ｍ／ｚ＝１８４（Ｍ＋）、１５２、１２５、１０９、８３、８１、６９、５５、４３を含む。
【００５２】
【図１９Ｃ】図１９は、ルテイン、ゼアキサンチン、およびカプサンチンの自動酸化の低分子量マーカーを示し：１９Ａは、その親ラクトンとＭｅ３ＯＢＦ４との反応による、ゲロン酸４，５−ジデヒドロメチル（化合物Ｂ）の形成を示し；１９Ｂは、重水素標識マーカー、４−ヒドロキシゲロン酸−ｄ６のラクトンの、１つの可能性ある合成を示し；１９Ｃは、ダルス粉末抽出物およびＯｘＬｕｔの低ＭＷ画分の、Ｍｅ３ＯＢＦ４でエステル化したもののＧＣクロマトグラムを示し、化合物Ｂの保持時間は７．３２分で示される。共通の質量スペクトルイオンは、ｍ／ｚ＝１８４（Ｍ＋）、１５２、１２５、１０９、８３、８１、６９、５５、４３を含む。
【００５３】
【図２０】図２０は、カンタキサンチンの自動酸化の低分子量マーカーを示し：２０（Ａ）は、２，２−ジメチルグルタル酸からその無水物およびそのジメチルエステル（化合物Ｃ）への変換を示し；２０（Ｂ）は、イソ酪酸−ｄ６出発材料からの、重水素標識マーカー、２，２−ジメチルグルタル酸の１つの可能性ある合成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
定義／略称
使用される略称：ＢＨＴ、ブチル化ヒドロキシトルエン（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）；ＧＡ、ゲロン酸；ＯｘＢＣ、完全酸化β−カロテン；ＯｘＬｙｃ、完全酸化リコペン；ＯｘＬｕｔ、完全酸化ルテイン；ＯｘＣａｎ、完全酸化カンタキサンチン；ＯｘＰＶＡ、酸化プロビタミンＡカロテノイド；ＰＶＡ、プロビタミンＡカロテノイド；ＳＰＥ、固相抽出。
【００５５】
「動物」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウシ、家禽、および魚を含むがこれらに限定されない、任意の動物を意味する。
【００５６】
「十分な量」または「有効量」は、健康を改善するのに必要とされる、例えば先天性免疫機能を刺激し炎症プロセスを制限することも含めて免疫系の機能を高め、疾患に抵抗する能力を高め、疾患から回復しもしくは克服し、健康状態を維持し、関節可動性を増大させ、活動レベルを上昇させ、または被覆品質を改善するのに必要とされる、酸化的に変換されたカロテノイドもしくはカロテノイド−酸素ポリマーまたはその分画成分の量を意味する。本発明の方法を実施するのに使用される本発明の組成物の有効量は、投与の様式、動物のタイプ、体重、および動物の健康全般に応じて様々である。最終的には、主治医または獣医師が、適切な量および投薬レジメンを決定することになる。そのような量を、「十分な量」または「有効量」と呼ぶ。
【００５７】
本明細書で使用される「カロテノイド」は、植物、藻類、細菌、およびある特定の動物、例えば鳥類および甲殻類に見出すことができる、テルペノイド群の天然に存在する色素を指す。カロテノイドには、炭化水素（即ち、酸素がない）であるカロテン、およびそれらの酸素化誘導体（即ち、キサントフィル）が含まれるが、これらに限定するものではない。カロテノイドの例には、リコペン；α−カロテン；γ−カロテン；β−カロテン；エキネノン；イソゼアキサンチン；カンタキサンチン；シトラナキサンチン；β−アポ−８’−カロテン酸エチルエステル；ヒドロキシカロテノイド、例えばアロキサンチン、アポカロテノール、アスタセン、アスタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、カロテンジオール、カロテントリオール、カロテノール、クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、デカプレノキサンチン、エピルテイン、フコキサンチン、ヒドロキシカロテノン、ヒドロキシエキネノン、ヒドロキシリコペン、ルテイン、リコキサンチン、ニューロスポリン、フィトエン、フィトフルオエン、ロドピン、スフェロイデン、トルレン、ビオラキサンチン、およびゼアキサンチンと；カルボン酸カロテノイド、例えばアポカロテン酸、β−アポ−８’−カロテン酸、アザフリン、ビキシン、カルボキシルカロテン、クロセチン、ジアポカロテン酸、ニューロスポラキサンチン、ノルビキシン、およびリコペン酸が含まれる。
【００５８】
本明細書で使用される「カロテノイド−酸素コポリマー」、「カロテノイドコポリマー」、および「ポリマー」は、分子状酸素との自発的反応によって、その反応性二重結合で完全に酸化された不飽和化合物であるカロテノイドであって、主生成物としてカロテノイドと酸素とのコポリマーをもたらし、かつ任意の付随するノルイソプレノイド副生成物を含まないか、またはこの副生成物から分離され、かつ単離される、カロテノイドを指す。
【００５９】
本明細書で使用される「含む（comprising）」は、「含む（including）」および「含有する」と同義であり、包括的で制約がなく、追加の列挙されていない要素または方法ステップを排除しない。
【００６０】
本明細書で使用される「からなる」は、制約があり、均等物の原理の支配下にあり、特許請求の範囲で指定されていないいかなる要素、ステップ、または成分も含まない。
【００６１】
「免疫系の機能を高め、疾患に抵抗する能力を高め、疾患から回復しもしくは克服し、または健康状態を維持する」ことは、疾患を引き起こす抗原、ウイルス、細菌、または様々なストレッサーに曝露した後に動物の健康を評価することを含むがこれらに限定されない多くの方法で評価することができ、曝露後に疾患に罹らずまたは疾患から回復する能力を、対照動物と比較する。
【００６２】
本明細書で使用される「完全酸化カロテノイド」は、分子状酸素との自発的反応によって、その反応性二重結合で完全に酸化されている不飽和化合物であるカロテノイドであって、カロテノイドと酸素とのコポリマーと、ノルイソプレノイド分解生成物との混合物をもたらすものを指す。
【００６３】
本明細書で使用される「ＧＡ」は、ゲロン酸を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「天然」または「天然源」は、植物源（植物もしくはその部分であって、その部分には、種子、葉、および幹を含めてもよいがこれらに限定するものではないもの、果実、または野菜が含まれる）または微生物を指す。「天然生成物」または「天然を供給源とする生成物」は、天然源を加工することから誘導された生成物を指す。
【００６５】
「プロビタミンＡカロテノイド」は、即ちα−、β−、およびγ−カロテン、ならびにβ−クリプトキサンチンを含むがこれらに限定することのない、酸化によってビタミンＡに変換することができるようなカロテノイドを指す。
【００６６】
「ＯｘＢＣ」は、約８５重量％のβ−カロテン−酸素コポリマーと約１５％のノルイソプレノイドと呼ばれる低分子量分解生成物とを含む、純粋なβ−カロテンの酸素との自発的反応の合成生成物である完全酸化カロテノイド組成物である。純粋なカロテノイドから誘導されたその他のカロテノイド酸素コポリマー組成物は、同様に示され、例えば完全酸化ルテインに関してはＯｘＬｕｔ、完全酸化リコペンに関してはＯｘＬｙｃ、または完全酸化カンタキサンチンに関してはＯｘＣａｎである。
【００６７】
「ＯｘＰＶＡ」は、他の残留生成物（即ち、カロテノイド−酸素コポリマーおよびその他の酸素化副生成物）を含み得る、１種または複数の完全酸化プロビタミンＡカロテノイド（「ＰＶＡ」）を含む、カロテノイド−酸素コポリマー組成物である。実施例２などの実施例を参照すると、それは、存在する、推定全プロビタミンＡカロテノイド−酸化コポリマーに言及している。「ＯｘＣａｒ」は、プロビタミンＡがその他の残留生成物（即ち、カロテノイド−酸素コポリマーおよびその他の酸素化副生成物）を含む可能性があってもなくても、１種または複数の完全酸化カロテノイドを含む、カロテノイド−酸素コポリマー組成物を指す。一部の実施形態では、ＯｘＰＶＡおよびＯＸＣａｒは、ノルイソプレノイドを含んでいてもよい。
【００６８】
説明
【００６９】
高度不飽和化合物は、酸化中に優先的に重合することが長く公知であるが、カロテノイド酸化における重合の支配および有意性は、本発明者らの研究以前は驚くべきことに見逃されてきた。重要なのは、β−カロテン−酸素コポリマーが、先天性免疫機能を刺激することおよび炎症プロセスを制限することを含む免疫学的活性を示すことである。予測される非ビタミンＡ免疫学的活性を持つ、本明細書に開示されるカロテノイド−酸素コポリマーを含有する食品（植物源など）の、本発明者らの発見には、ヒトおよび動物の栄養を含む重要な健康上の示唆がある。例えば、本明細書に記述される一実施例では、ニンジン粉末（元来β−カロテンに富む）から単離された化合物の化学的性質は、元素分析、ＧＰＣ、ＩＲ、ＧＣ−ＭＳ熱分解、およびＵＶデータをＯｘＢＣから得られたデータと比較することによって確認した。その他の乾燥食品から同じ様式で単離された化合物の元素分析、ＩＲ、およびＧＰＣデータは、それらの酸素−コポリマーの性質を裏付けた。
【００７０】
そのようなコポリマーの有意なレベルを見出すことは、抗酸化作用に対して、親カロテノイドの酸化生成物に関わるメカニズムが非ビタミンＡの健康上の利益に起因することを示す。その酸化的損失により親カロテノイド活性と言われるものの潜在的な減少ではなく、本発明者らは本明細書に、ポリマー化合物に変換されたカロテノイドが、以前は認識されなかった有益な免疫学的潜在性を有することを開示する。この主張は、百万分率（ｐｐｍ）の低いＯｘＢＣが補われた食餌を使用した家畜およびペットにおける研究で本発明者らが観察した、健康上の利益によって裏付けされる。本明細書では、カロテノイドの非ビタミンＡの利益に起因するようなコポリマーの、天然源の対応物に関する食品（乾燥食品など）において首尾良くなされた調査を、開示する。一実施形態では、カロテノイド−酸素コポリマー（単数または複数）を含む生成物は、単離されたまたは合成カロテノイドとは対照的に、ｉｎ  ｓｉｔｕでカロテノイドに富む生成物から作製される。
【００７１】
β−カロテン−酸素コポリマーは、新鮮な食品での低い十億分率（ｐｐｂ）から乾燥食品での百万分率（ｐｐｍ）まで、約千倍の範囲を包含するレベルで、ニンジン、トマト、サツマイモ、パプリカ、バラの実、海藻、アルファルファ、およびミルクを含む一般的な新鮮または乾燥した食品中で生じる。一部の乾燥食品から単離されたコポリマーは、千分率レベルに達し−これは当初のカロテノイドレベルに匹敵するものである。補われたβ−カロテン−酸素コポリマーのｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性は、百万分率レベルで既に文書化されており、ある特定の食品がそのような活性を有することを示唆している。
【００７２】
本発明者らは最近、純粋なβ−カロテンおよびその他のカロテノイドが酸化して免疫学的に活性な非ビタミンＡ生成物を形成するという、新規な発見を報告した１３、１４。この発見は、この非ビタミンＡ活性が、ビタミンＡ活性と全く同じように、カロテノイドの従来の酸化的変換を必要とすることを示唆する。重要なのは、自発的反応が、主としてカロテノイド−酸素コポリマー化合物が形成されるように、ならびに少量の通常のほとんど馴染みのあるノルイソプレノイド分解生成物が形成されるように、酸素を添加することによって特徴付けられることである（図１）１３。本発明者らは、カロテノイド−酸素コポリマーの天然源を同定する方法を開発するために、β−カロテン−酸素コポリマー（約８５％ｗ／ｗ）およびノルイソプレノイド化合物（約１５％）から構成される（図１）１３高度に再現性ある生成物（ＯｘＢＣ）をもたらす、溶液中のβ−カロテンのモデル酸化のこの詳細な理解を使用する。
【００７３】
食品マトリックス中のカロテノイド−酸素コポリマーは、任意の直接化学または生化学測定を容易に行うことができ難いので、本発明者らは、酸化およびポリマー形成の程度を決定するのに指示物質／マーカーを使用する新規な間接的手法を開発した。これらは図２に示されており、（ｉ）：ゲロン酸は、β−クリプトキサンチン；α−カロテン；β−カロテン、およびγ−カロテンのカロテノイド−酸素コポリマーに関するマーカーであり；（ｉｉ）ゲラン酸は、リコペンおよびγ−カロテンのカロテノイド−酸素コポリマーに関するマーカーであり；（ｉｉｉ）４−ヒドロキシゲロン酸および／またはそのラクトンは、ルテイン、ゼアキサンチン、およびカプサンチンのカロテノイド−酸素コポリマーに関するマーカーであり；（ｉｖ）２，２−ジメチルグルタル酸およびその無水物は、カンタキサンチンのカロテノイド−酸素コポリマーに関するマーカーである。
【００７４】
例としてゲロン酸を挙げると、カロテノイド−酸素コポリマーの存在を定量することができる。コポリマー生成物は、モデル酸化の過程の全体を通して優勢であり（≧８０％）、最終的な取込みはほぼ８モル当量の酸素に相当するが、ＧＡ、最も豊富なノルイソプレノイド生成物１３は、全反応生成物重量の１〜３％で連続的に形成される（参考文献１３の図８参照）。したがって、ＧＡに関する平均値が全生成物重量の約２％であるとすると、酸化生成物の量は、およそ５０倍高いと推定することができ、これがコポリマーの優勢度であるとすれば、約５０：１のポリマー：ＧＡの比になる。しかし実際の比は、その近似的な性質が与えられたとすれば、２５：１から１００：１の間であり得る。
【００７５】
カロテノイドが天然に存在する、即ちある特定の植物源、例えば果実および野菜、ならびにある特定の微生物（藻類、真菌、および細菌）という、さらにより複雑な環境内で、酸化および関連ある反応生成物を見出し得るという本発明者らの発見は、複雑な微小環境、ならびに生物材料中の多くのその他の潜在的に反応性のある化合物、即ち初期カロテノイド酸化反応を、種々の生成物の結果をもたらす無数の他の経路に逸らす化合物に鑑みて、明らかではなくまたは予測可能ではなかった。
【００７６】
そのような天然源から単離された本発明のカロテノイド−酸素コポリマー生成物（単数または複数）は、ＯｘＢＣ、またはその他の純粋なカロテノイドの完全酸化から得られた生成物（例えば、それぞれリコペン、ルテイン、およびカンタキサンチンからのＯｘＬｙｃ、ＯｘＬｕｔ、またはＯｘＣａｎ）と同じではなく、それは後者が低分子量化合物も含むからである（本明細書では、食品由来生成物からのポリマーの単離プロセスによって除去される）。一部の実施形態では、天然源生成物はしばしば、１種または複数の未反応のカロテノイドも依然として含む。例えば、天然源生成物は、純粋なカロテノイドから誘導されたＯｘＢＣと比較したニンジン粉末ＧＣＭＳ熱分解クロマトグラムを示す図１０に示されるように、重合反応中に組み込まれるようになったその他の化合物を含んでいてもよい。そのような一部の実施形態では、本発明は、天然源から誘導されたそれぞれのカロテノイド−酸素コポリマー成分を含む、ＯｘＰＶＡまたはＯｘＣＡＲ組成物を提供する。一部の実施形態では、前記組成物は、ノルイソプレノイド副生成物を含まない。
【００７７】
別の実施形態では、本発明は、カロテノイド−酸素コポリマーを含む天然源から生成物を調製する方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＧＲＡＳ溶媒を使用することを含む。別の実施形態では、方法は、酢酸エチル、ＧＲＡＳ溶媒で、乾燥食品源を抽出することを含み、このステップは、全てではなくともほとんどのβ−カロテン−酸素コポリマーを溶解することになり、次いでその他のより多くの可溶性化合物を含まないコポリマー化合物を、無極性溶媒を慎重に添加しながらゆっくり沈殿させる。一般に、本発明の抽出／沈殿プロセスは、ポリマーを溶解する最小量の溶媒を必要とし、次いで例えば無極性溶媒を１滴ずつ添加してポリマーを溶液から沈殿させ、次いでそれを濾過または遠心分離によって収集する。本発明の一態様では、乾燥植物由来食品からこのように単離されたカロテノイド−酸素コポリマー生成物は、その他の予想される低分子量カロテノイド分解生成物（例えば、β−カロテン酸化分解化合物を含有することが予測される生成物中のゲロン酸など、上述の指示物質を含む）を含有しない。このことは、後続の溶媒沈殿精製なしにそのような生成物を含む、純粋なカロテノイド源から誘導された完全酸化カロテノイド（ＯｘＢＣ、ＯｘＬｙｃ、ＯｘＬｕｔ、またはＯｘＣａｎなど）とは全く異なる。
カロテノイド−酸素コポリマーの存在を評価するための間接的方法。
概説
【００７８】
本発明は、プロビタミンＡカロテノイドなどのカロテノイドの酸化重合の、間接的な低分子量マーカーの使用を開示し、例えばβ−カロテンコポリマーの約２％のゲロン酸を使用して、その潜在的な供給源中のカロテノイド−酸素コポリマーの量を評価することができる。本発明は、その他の低分子量マーカーを、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、およびカンタキサンチンを含むその他の選択されたカロテノイドの酸化重合の指示物質として使用できることも開示する。
【００７９】
ＧＡは、生鮮食品、例えばニンジンジュースおよび生のトマトであって、酸化が最小限に抑えられることが期待されるものから、酸素の分圧（ｐｐＯ２）または温度の上昇、脱水、粉砕、粉末化、および光への曝露を含む偶然の酸化を引き起こし易いプロセスによって乾燥させた食品に及ぶ、様々な食品で測定された。ＧＡの決定は、同定されたＧＡに富む食品中の、カロテノイド−酸素コポリマー化合物を単離するための有用な指針であり、ゲロン酸レベルが高い食品源（乾燥）を、固体酸素コポリマー化合物の抽出および単離のための候補として選択した。即ち、カロテノイド酸化は、天然源中で生じていた。さらにゲロン酸のレベルは、乾燥を通した酸素への曝露を増大させおよび影響を受ける表面積を増大させる、プロセスに供される食品源中で非常に高いことがわかった。このことは、その他のカロテノイド−酸素コポリマーおよびそれらの指示物質と同様である。
方法
【００８０】
本明細書では、本発明者らは、ゲロン酸およびカロテノイド−酸素コポリマー生成物が、プロビタミンＡカロテノイドなどのカロテノイドを含有する植物ベースの食品中で、特に加工された食品中で、天然に存在することを示した。さらに本発明者らは、本明細書で、ＧＡが、これら食品中のβ−カロテンおよびその他のプロビタミンＡカロテノイドの酸化の特定の指示物質であることを示した。ＧＡが天然に存在することに関する以前の報告が多少ある２５、２６。ＧＡは、ある特定のノルイソプレノイド化合物、例えばβ−シクロシトラールの酸化によって実験室で作製することができるが、植物において、これらの化合物は、それ自体がカロテノイド酸化に由来する可能性がある。しかし動物由来の生成物では、ＧＡは、食餌を含むいくつかの供給源から、およびビタミンＡの酸化から得ることが可能である。同様に本発明者らは、その他のカロテノイド−酸素コポリマーの存在に関する低分子量指示物質の有用性に関する類似の発見をした。
【００８１】
モデルとしてβ−カロテンの酸化１３を使用することにより、本発明者らは本明細書で、食品中のＧＡをβ−カロテン−酸素コポリマー形成に相関させる方法を開発した。実質的な量のカロテノイド−酸素コポリマーを、試験をした全ての食品で最高濃度のＧＡを有するニンジン粉末から単離した。ニンジン粉末＃１は、ニンジン粉末＃２のＧＡの２倍を有しており、コポリマーの量のほぼ２倍をもたらした。ニンジン粉末抽出物から単離した化合物の化学的アイデンティティは、ＧＰＣ、元素分析、ＩＲ、およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法、およびＧＣ−ＭＳ熱分解を組み合せた証拠によって確立され、β−カロテン−酸素コポリマーが主として存在することを強く指摘している。
【００８２】
ＧＡは、α−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、およびβ−クリプトキサンチンを含む、その親カロテノイドがβ−イオノン環基を有するプロビタミンＡカロテノイド−酸素コポリマーの、間接的マーカーとして使用され得るが、その他の間接的マーカーが、ルテイン、ゼアキサンチン、カプサンチン、リコペン、γ−カロテン、またはカンタキサンチンなど、同じまたはその他のカロテノイドに使用することができる。例えば、一実施形態では、４−ヒドロキシゲロン酸またはそのラクトンを、ルテイン、ゼアキサンチン、またはカプサンチンの間接的マーカーとして使用することができる。別の実施形態では、ゲラン酸を、リコペンまたはγ−カロテンの間接的マーカーとして使用することができる。別の実施形態では、２，２−ジメチルグルタル酸またはその無水物を、カンタキサンチンの間接的マーカーとして使用することができる。他の実施形態では、これらのマーカーのエステル（メチルエステルなど）および／または標識形態（重水素標識など）を、化学分析を容易にするのに使用することができる。
【００８３】
したがって一部の実施形態では、本発明は、供給源中のカロテノイド−酸素コポリマーの存在を決定するための方法であって：
（ａ）供給源中に存在することが公知である純粋なカロテノイドを酸化すること、そして得られたカロテノイド−酸素コポリマー（付加生成物）と指示物質（反応の開裂生成物）との比を決定すること、そして時間、温度、圧力、供給源、出発材料の量、および酸素への曝露から選択される１つまたは複数の条件下で開裂生成物に対するカロテノイド−酸素コポリマーの較正曲線を作成すること；
（ｂ）酸化条件下で供給源を加工すること、そして得られる指示物質（反応の開裂生成物）の量を同定および／または定量すること；および
（ｃ）カロテノイド−酸素コポリマーのその存在または欠如を明らかにし、かつ／または源供給源中の、得られるカロテノイド−酸素コポリマーの量を決定するために、（ｂ）の結果と、（ａ）の下で開発された較正曲線とを使用すること
を含む方法を提供する。
【００８４】
一部の実施形態では、完全酸化によって類似のレベルのカロテノイド−酸素コポリマーに変換され得る、１〜１０００百万分率（ｐｐｍ）の湿重量または１０〜１０，０００ｐｐｍの乾燥重量のカロテノイドを含む供給源が、選択される。
【００８５】
一部の実施形態では、カロテノイドがβ−イオノン環を有する。別の実施形態では、カロテノイドは：α−カロテン、γ−カロテン、β−カロテン、およびβ−クリプトキサンチンからなる群から選択される。一部の実施形態では、カロテノイドがβ−イオノン環基を有する場合、指示物質がゲロン酸である。一部の実施形態では、カロテノイドは、ルテイン、ゼアキサンチン、カプサンチン、リコペン、γ−カロテン、およびカンタキサンチンからなる群から選択され、そのそれぞれの指示物質は、上述の通りである。
【００８６】
一部の他の実施形態では、供給源は、ニンジン、トマト、アルファルファ、スピルリナ、バラの実、甘唐辛子、チリペッパー、パプリカ、サツマイモ、ケール、ホウレンソウ、海藻、ウィートグラス、マリーゴールド４５〜４８、ｍｏｒｉｎｇａ  ｏｌｅｉｆｅｒａ４９〜５２、および赤ヤシ油からなる群から選択される。別の実施形態では、供給源は粉末形態である。別の実施形態では、供給源はトマトの搾りかすである。別の実施形態では、供給源は微生物である。
カロテノイド−酸素コポリマー生成物の単離
【００８７】
大量のカロテノイド−酸素コポリマーを、β−カロテン以外のカロテノイド（例えば、リコペン、ルテイン、およびカプサンチン）が豊富なその他の乾燥食品からも単離した。これらの食品には、トマト粉末、バラの実粉末、パプリカ、天日乾燥したアルファルファ、およびウィートグラス粉末が含まれる。
【００８８】
ポリマー化合物の構成は、それらが形成される環境によってある程度まで修正されることが予測される。酸化の偶発的性質、反応部位の複雑さおよび多様性、ならびにその他の反応性化合物の存在は、均質有機溶媒中での純粋な個々のカロテノイド（例えば、β−カロテン、リコペン、ルテイン、カンタキサンチン）の高度に再現性ある酸化の場合とは異なって、様々な生成物をもたらし得る。
【００８９】
食品から単離された生成物のＧＰＣからの分子量プロファイルは、確かに、個々の代表的なカロテノイドの酸化の場合と比べて複雑さを示す。食品化合物のほとんどの実験式は、個々のカロテノイドの酸化から得られたコポリマーの場合よりも多くの水素が存在することを示し、飽和炭化水素成分を含むいくらかの化合物が少量存在することを示唆している。また、少量の窒素含有成分も存在し、ニンジン抽出物の熱分解は、ＯｘＢＣポリマーでそうであるよりも多くの未知の分解生成物をもたらす。しかしＩＲスペクトルは、全ての化合物全体にわたって非常に目立つ程度の類似性を示す。
【００９０】
いくつかの乾燥食品では、コポリマーのレベルは、親カロテノイド、例えばニンジンおよびトマトの粉末における、当初のレベルに匹敵する。
【００９１】
したがって、一実施形態では、本発明は、追加の酸素化カロテノイド生成物を、カロテノイドを含む供給源から単離する方法を提供する。
【００９２】
一部の実施形態では、カロテノイド−酸素コポリマーの純度および量は、加工中の抽出／沈殿サイクルの数によって、所望のレベルに調節することができる。一実施形態では、本発明は、既知のレベルのカロテノイド−酸素コポリマーを持つ生成物が生成されるように、酸化を通して、既知のレベルのカロテノイドを持つ供給源を選択することができ、かつ／または既知の量のカロテノイド−酸素コポリマーもしくはその既知の量を含む組成物であって所望のその他の賦形剤もしくは食品を含んだもの、例えば既知の量のカロテノイド−酸素コポリマーを持つ栄養補助食品として、動物飼料の栄養補助食品に組み込んで、もしくは栄養補助食品として、またはヒトの食事もしくは栄養補助食品源に組み込んで、もしくはそのような食事もしくは栄養補助食品として、スパイス、パン、加工肉製品、スープ、およびその他の食品を含むがこれらに限定されないものを添加することによって、一貫した所望の量のカロテノイド−酸素コポリマーを持つ組成物を生成する方法を提供する。
カロテノイド−酸素コポリマーの使用
【００９３】
ＯｘＢＣ（β−カロテン−酸素コポリマー）化合物が、有益な非ビタミンＡ免疫活性を有する１４、１６という本発明者らの発見は、食品中のカロテノイド−酸素コポリマーの対応物が、有意な健康上の示唆を持つ生物活性を与えることになるという予測に繋がる。ＯｘＢＣは、ブタ２７、家禽、イヌ、および魚において、百万分率の食餌レベルで、実証された健康上の利益を有する。ヒトでは、カロテノイド−酸素コポリマーは、果実および野菜の消費に関連した有益な健康上の効果に寄与する可能性がある５。果実または野菜の消化中に解き放たれた、酸化プロセスから得られる食餌カロテノイドのｉｎ  ｓｉｔｕ酸化も、少なくとも部分的に、栄養補助食品からのβ−カロテンと比較して、食品中のβ−カロテンのビタミンＡ活性がばらつきがあり、数倍低いことの原因であり得る４、２８。β−カロテンの酸化分解および認識される活性の損失は、実際に、コポリマー形成を通した免疫学的活性の利益と考えられる。
【００９４】
リコペンは、β−カロテンよりも、活性コポリマー生成物の形成をさらになお受け易いことに気付くと１３、１４、リコペン−酸素コポリマー形成は、トマト加工中に生ずるリコペンの有意な損失を伴う可能性がある２９。前立腺発がんのラットモデルでは、リコペン単独ではなくトマト粉末が発がんを阻害した３０。筆者は、この発見が、「トマト生成物は、リコペンに加えて前立腺発がんを修正する化合物を含有する」ことを示唆すると結論付けた。リコペン−酸素コポリマーは、表および図で本明細書で文書化されるように（表３および４と図７および１１）、トマト粉末中に存在し、それらは他の加工トマト製品中に存在する可能性がある。
【００９５】
β−カロテン中に存在する線形共役二重結合の拡張系は、全てのカロテノイドに共通し、したがって他のカロテノイドは、分子状酸素とのそれらの自発的反応において同様に振る舞うことになると予測され、プロビタミンＡカロテノイド（α−、β−、およびγ−カロテンと、β−クリプトキサンチン）と、ビタミンＡに変換できないより多くのカロテノイドとの両方の、非ビタミンＡの作用を説明することができる。
【００９６】
一部の態様における本発明は、供給源中のカロテノイド−酸素コポリマーの量を増強し、かつ／または供給源に既知の一貫した量のカロテノイド−酸素コポリマーを持たせて、上述の健康全般および免疫性を増強するなどの所望の結果が実現されるように既知の有効量までの一貫した投与を容易にするのを可能にする。
【００９７】
さらに本発明は、一部の態様において、供給源として単離されたカロテノイドから出発することなくｉｎ  ｓｉｔｕで生成物を含むカロテノイド−酸素コポリマーを生成し、結果的に得られる動物およびヒトの健康上の利益を有する一貫したレベルのカロテノイド−酸素コポリマーを含む生成物を提供することを可能にする。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
材料および方法
材料
ＧＡ、ＧＡ−ｄ６、および完全に酸化されたβ−カロテン（ＯｘＢＣ）、リコペン（ＯｘＬｙｃ）、およびカンタキサンチン（ＯｘＣａｎ）の調製について、記述してきた１３。この研究では、完全に酸化されたルテイン（ＯｘＬｕｔ）を含む完全に酸化されたカロテノイドを、以下に述べるように６８〜７０℃で調製した。ＳＰＥカートリッジは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸ；５００ｍｇ収着剤、６ｍＬ容量）から得た。シリカゲル（４０〜６３μｍ）は、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  Ｉｎｃ．（Ｑｕｅｂｅｃ  Ｃｉｔｙ、ＱＣ  Ｃａｎａｄａ）から購入し、シリカゲルＴＬＣプレートは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
設備
【００９９】
ＧＣ−ＭＳを、５９７５Ｂ  ＶＬ質量選択検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ６８９０Ｎ  ＧＣで行った。ＧＣは、ＨＰ  ５カラム、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍを備えていた。測定条件：初期圧力１７ｐｓｉ、一定流１．０ｍＬ／分；注入温度２５０℃；初期炉内温度５０℃、１分間、温度上昇２０℃／分から２８０℃、保持時間２．５分。機器を、ＳＩＭモードで使用して、イオンｍ／ｚ＝１５４および１６０をモニタした。（注記：トマト粉末および赤ヤシ油の場合、２つの異なる温度プログラムを使用した。プログラム１（トマト粉末）：開始５０℃、上昇８℃／分で２１０℃まで、次いで上昇２０℃／分で２８０℃まで、および保持２．５分。プログラム２（赤ヤシ油）：開始５０℃、上昇１０℃／分で２１０℃まで、次いで上昇２０℃／分で２８０℃まで、および保持２．５分。）
【０１００】
ＯｘＢＣおよびＯｘＬｙｃに関するＦＴＩＲスペクトルを、ＫＢｒペレットまたはＮａＣｌディスクを使用するＶａｒｉａｎ  ６６０−ＩＲ分光計で得、被膜を、試料のクロロホルム溶液から流延する（１滴は約５０ｍｇ／ｍＬ）。その他全ての試料のＦＴＩＲスペクトルを、減衰した全反射率（ダイヤモンド表面）に関してＳｍａｒｔ  ｉＴＲ付属品を備えたＴｈｅｒｍｏ  ６７００  ＦＴＩＲ分光計を使用して得た。
【０１０１】
ＧＰＣクロマトグラムは、ダイオードアレイ検出器および７．８×３００ｍｍ  Ｊｏｒｄｉ  Ｆｌａｓｈ  Ｇｅｌ  ５００Ａ  ＧＰＣカラム（５μｍ粒度；Ｊｏｒｄｉ  Ｌａｂｓ  ＬＬＣ、Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ、ＭＡ  ０２０１９  ＵＳＡ）を備えたＨＰ  １０９０  ＨＰＬＣ装置を使用して得た。試料を溶解し、ＴＨＦで、１ｍＬ／分で１４分間溶出した。
【０１０２】
ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、１ｃｍの経路長の石英セルを使用したＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５２ダイオードアレイ分光光度計で、メタノール中で記録した。
【０１０３】
元素分析は、Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｌｔｄ．、Ｄｅｌｔａ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａにより行った。
食品試料
【０１０４】
他に述べない限り、全ての試料は、地元で購入した（Ｏｔｔａｗａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）。ニンジンジュース、乾燥デーツ、ホモゲナイズ牛乳（３．２５％乳脂肪）、全脂乳粉（３．２５％乳脂肪）、およびイエローコーンフラワーは、食料品店で買った。新鮮なレッドトマトは、農産物市場で購入した。天日乾燥したアルファルファはペットショップで買い、スピルリナ粉末は健康食料品店から購入した。ニンジン粉末＃１、パプリカ、およびｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａの根の粉末は、Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  Ｂａｙ  Ｓｐｉｃｅ  Ｃｏ．（Ｗａｔｓｏｎｖｉｌｌｅ、ＣＡ）から購入した。バラの実の粉末は、Ｃｏｅｓａｍ  Ｓ．Ａ．（Ｓａｎｔｉａｇｏ、Ｃｈｉｌｅ）から購入し、クランベリーの粉末はＡｔｏｋａ  Ｃｒａｎｂｅｒｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｎｓｅａｕ、Ｑｕｅｂｅｃ）から購入した。蜂蜜および蜂花粉は、Ｄｕｔｃｈｍａｎ’ｓ  Ｇｏｌｄ  Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｉｓｌｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）から購入した。ニンジン粉末＃２（空気乾燥）、トマト粉末（空気乾燥）、サツマイモ粉末＃１および＃２（それぞれ、空気乾燥およびドラム乾燥）は、Ｎｏｒｔｈ  Ｂａｙ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｂｒｕｌｅ、ＷＩ）から買った。トマトの搾りかすは、ＬａＢｕｄｄｅ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．（Ｇｒａｆｔｏｎ、ＷＩ）から得た。ダルス海藻粉末は、Ｚ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｆｏｏｄｓ（Ｗｅｓｔ  Ｐａｌｍ  Ｂｅａｃｈ、ＦＬ）から購入し、海苔フレークは、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍａｘｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．（Ａｎｔｅｌｏｐｅ、ＣＡ）から得た。赤ヤシ油は、Ｗｅｌｌ．ｃａ（Ｇｕｅｌｐｈ、Ｏｎｔａｒｉｏ）から購入した。全卵粉およびウィートグラス粉末は、Ｂｕｌｋｆｏｏｄｓ．ｃｏｍ（Ｔｏｌｅｄｏ、Ｏｈｉｏ）から買った。玄米粉は、Ｙｕｐｉｋ．ｃａ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ）から購入した。
６８〜７０℃での完全酸化カロテノイドの調製
【０１０５】
材料。β−カロテン、リコペン、ルテイン、およびカンタキサンチンを、Ａｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ（Ｔａｉｗａｎ）から得た。
【０１０６】
ＯｘＢＣの調製。β−カロテン（８０ｇ）を、撹拌棒、還流凝縮器、Ｏ２入口（ガラス管）と、必要に応じて温度をモニタし調節するよう加熱マントルに接続された温度プローブとを備えた、３つ口フラスコに入れた。酢酸エチル（２Ｌ）を添加し、Ｏ２を通気し、混合物を撹拌し、６８℃に加熱した。６６時間後、試料の吸光度は、約１０ｇ／Ｌで１ｍｍのキュベットを使用して、３８０ｎｍで０．３６と測定され、反応が終了したことが示される１３。反応を停止し、透明な薄橙色の液体を室温に冷却し、２個の１Ｌ丸底フラスコに分けた。溶媒を、圧力３０ｍｍＨｇに下げて４０℃でロータリーエバポレーターで除去し、得られたシロップを１０時間減圧乾燥することにより、ＯｘＢＣとして粘着性の橙色の固体（１０６．９ｇ）を得た。
【０１０７】
ＯｘＬｙｃの調製。リコペン（８１７ｍｇ）を、撹拌棒、還流凝縮器、およびＯ２入口（Ｐａｓｔｅｕｒピペット）を備えた、３つ口フラスコに入れた。酢酸エチル（２０．４ｍＬ）を添加し、Ｏ２を通気し、撹拌混合物を、６８℃で油浴内に下げた。２１時間後、反応を停止し、僅かに濁った黄色の液体を室温に冷却した。濾過した試料の吸光度は、約１．０ｇ／Ｌで、１ｃｍのキュベット中、３８０ｎｍで０．２７２と測定された。濁った黄色の液体を遠心分離にかけ、上澄みをデカントし、固体残留物を酢酸エチルで（２×３ｍＬ）濯ぎ／遠心分離にかけ、毎回上澄みをデカントした。固体残留物を４時間減圧乾燥することにより、淡黄色の薄片状の固体（３８ｍｇ）が得られた。合わせた上澄み液を、５０ｍＬの丸底フラスコに移し、溶媒を、圧力を３０ｍｍＨｇに下げて４０℃のロータリーエバポレーターで除去した。残留物を、減圧ポンプに移し、４時間乾燥することにより、ＯｘＬｙｃとして泡状の黄色い固体（１．０３６ｇ）が得られた。
【０１０８】
ＯｘＬｕｔの調製。ルテイン（１．００ｇ）を、撹拌棒、還流凝縮器、およびＯ２入口（Ｐａｓｔｅｕｒピペット）を備えた３つ口フラスコに入れた。酢酸エチル（２５ｍＬ）を添加し、Ｏ２を通気させ、撹拌混合物を７０℃の油浴内に下げた。１８時間４５分後、沈殿物が黄色の溶液中に観察され、反応を停止させ、室温に冷却した。冷却後、より多くの沈殿物が溶液から沈殿した。濾過した試料の吸光度は、約０．４ｇ／Ｌの１ｃｍキュベットで、３８０ｎｍで０．０７１２と測定された。混合物を遠心分離し、上澄みを、０．４５μｍのＴｅｆｌｏｎシリンジフィルタに通して濾過して、わずかな微細な薄片を除去した。固体画分を、酢酸エチルで濯ぎ（２×３ｍＬ）、遠心分離し、毎回液体をデカントした。固体を減圧乾燥することにより、薄褐色の粉末（１０５．８ｍｇ）が得られた。液体画分を合わせ、圧力を３０ｍｍＨｇに下げて溶媒を４０℃で蒸発させ、その後、減圧ポンプ上で３時間乾燥することにより、ＯｘＬｕｔとして黄色の泡状の固体（１．１４３ｇ）が得られた。
【０１０９】
ＯｘＣａｎの調製。カンタキサンチン（１．００２１ｇ）を、撹拌棒、還流凝縮器、Ｏ２入口（Ｐａｓｔｅｕｒピペット）を備えた３つ口フラスコに入れた。酢酸エチル（２５ｍＬ）を添加し、Ｏ２を通気し、撹拌混合物を６９℃の油浴内に下げた。７１時間後、反応を停止させ、室温に冷却した。透明な黄色の溶液の吸光度は、約０．５ｇ／Ｌの１ｃｍキュベットで、３８０ｎｍで０．６３０８と測定された。溶液を、５０ｍＬの丸底フラスコに移し、溶媒を、圧力を３０ｍｍＨｇに下げて４０℃のロータリーエバポレーターで除去し、ついで減圧ポンプ上で慎重に乾燥させ、固体材料を、フラスコを満たすのにちょうど十分になるよう膨張させた。減圧中で２時間４５分後、ＯｘＣａｎとして泡状の黄色の固体（１．２５０ｇ）が得られた。
純粋なカロテノイドから得られた完全酸化カロテノイド化合物からのカロテノイド−酸素コポリマーの単離
【０１１０】
ＯｘＢＣポリマー。ＯｘＢＣ（２．０５ｇ）を酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解し、撹拌しながらヘキサン（５０ｍＬ）を滴下した。液体を、沈殿した固体からデカントし、これを最少量の酢酸エチルに溶解した。溶媒を、圧力を２０ｍｍＨｇに下げ４０℃のロータリーエバポレーターで除去し、次いで液体濃縮物を、減圧ポンプ上で１時間乾燥することにより、固体が得られた。得られた固体を、上述のようにさらに２回沈殿させることにより、ＯｘＢＣポリマーが黄橙色の固体（１．０７６ｇ）として得られた。
【０１１１】
ＯｘＬｙｃポリマー。ＯｘＬｙｃ（８２６ｍｇ）を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。添加終了から１時間後、液体を沈殿固体からデカントし、次いでヘキサン（３×３ｍＬ）で濯いだ。残留物を減圧ポンプ上で１時間乾燥し、沈殿を、酢酸エチル／ヘキサンを使用してさらに２回繰り返した（１ｍＬ／２５ｍＬ、次いで１ｍＬ／１０ｍＬ）。固体材料を、最少量の酢酸エチルに溶解し、次いで減圧ポンプ上で３．５時間乾燥することにより、ＯｘＬｙｃポリマーが黄色の固体（７００ｍｇ）として得られた。
【０１１２】
ＯｘＬｕｔポリマー。ＯｘＬｕｔ（８３６ｍｇ）に、３：２の酢酸エチル：メタノール（５ｍＬ）を添加し、混合物をほぼ完全に溶解した（いくらかの微細な薄片が存在した）。ヘキサン（５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、数ｍＬを添加した後に、濁った混合物は透明になり、完全に溶解した。残りのヘキサンの添加は、いくらかの材料を沈殿させた。添加終了後、混合物を１５分間撹拌し、透明な黄色の液体が、濃い黄色がかった橙色のシロップの最上部に見えた。黄色の液体をデカントし、シロップを７×３ｍＬのヘキサンで濯いだ。シロップを酢酸エチル（３ｍＬ）に溶解し、溶媒を、４０℃で６０ｍｍＨｇになるようロータリーエバポレーターで除去し、残留物を減圧ポンプ上で１．５時間乾燥することにより、脆い黄色の固体（５８５ｍｇ）が得られた。固体を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（１０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、液体をデカントし、残留物をヘキサン（５×１．５ｍＬ）で濯いだ。残留物を酢酸エチル（４ｍＬ）に溶解し、次いで溶媒を、圧力を４５ｍｍＨｇに下げて３５℃のロータリーエバポレーターで除去し、残留物を減圧ポンプ上で４５分間乾燥させることにより、脆い黄色の固体（５６７ｍｇ）が得られた。沈殿を、酢酸エチル（１ｍＬ）およびヘキサン（１０ｍＬ）を使用してさらに１回繰り返し、ヘキサンで濯いだ（５×１．５ｍＬ）。残留物を減圧ポンプ上で２．５時間乾燥することにより、ＯｘＬｕｔポリマーが脆い黄色の固体（５６５ｍｇ）として得られた。
【０１１３】
ＯｘＣａｎポリマー。ＯｘＣａｎ（７９６ｍｇ）を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（１０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。添加終了から１時間後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。残留物を減圧ポンプ上で１時間乾燥し、沈殿を上述のようにさらに２回繰り返した。固体を最少量の酢酸エチルに溶解し、次いで減圧ポンプ上で２時間乾燥することにより、ＯｘＣａｎポリマーが黄色い固体（６４６ｍｇ）として得られた。
（実施例２）
食品試料中のゲロン酸の分析、およびプロビタミンＡカロテノイド−酸素コポリマー含量を推定するためのその使用
【０１１４】
一般的抽出手順。抽出中のカロテノイドの偶発的酸化を最小限に抑えるため、全ての有機溶媒は０．１％のＢＨＴを含有しており、または代替として、等量を抽出直前に試料に添加した。食品試料を、抽出直前に、未加工の食品に関してはクロロホルムと、または乾燥食品に関しては水性アセトニトリルとのいずれかとの水性有機溶媒混合物中で均質化した。抽出は、下記の通り実施した：１）ＧＡ−ｄ６標準を試料の水性懸濁液に添加し、クロロホルムで多数回抽出し、またはアセトニトリルと多数回ブレンドし、濾過し；２）抽出物を合わせ、濃縮し、濃縮物を、クロロホルムおよび硫酸マグネシウムまたは硫酸ナトリウムと混合し、濾過し、濾液を水性ＫＯＨで処理して、カルボン酸を抽出し（２×）；３）合わせた水性ＫＯＨ抽出物を、水性ＨＣｌで酸性にして、カルボン酸を単離し、クロロホルムまたはジクロロメタンに抽出し；４）分離したクロロホルムまたはジクロロメタン画分を乾燥および蒸発させ；５）下記の手順によりテトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウムで残留物をエステル化する。
【０１１５】
テトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウムによる抽出物のエステル化。窒素の流れの下または回転蒸発による溶媒の蒸発後、残留物をメタノール（４．５ｍＬ）に溶解した。水性重炭酸ナトリウム溶液（１Ｍ、１ｍＬ）を添加し、その後、テトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウム（約０．３ｇ）を少量ずつ、１〜５分にわたって添加した（ｐＨは、固体重炭酸ナトリウムを添加することによって弱塩基性に維持した）。得られた混合物を室温で１０分撹拌し、次いで水を添加し（４〜９ｍＬ）、生成物をジクロロメタンで抽出した（２×９ｍＬ）。合わせたジクロロメタン抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発させてメチルエステルを得、これをアセトニトリルに取り込み、濾過し、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。
【０１１６】
詳細な抽出手順。ニンジンジュース、ニンジン粉末、生のトマト、トマト粉末、トマトの搾りかす、デーツ、ミルク、粉ミルク、全卵粉、生のクランベリー、クランベリー粉末、バラの実の粉末、スピルリナ粉末、パプリカ粉末、サツマイモ粉末、ダルス粉末、海苔フレーク、天日乾燥アルファルファ、ウィートグラス粉末、および赤ヤシ油に関する詳細を、以下に提示する。
【０１１７】
ニンジンジュース。ＧＡの精製および濃縮は、クロロホルムを使用して実現した。クロロホルム抽出物は、カロテノイドおよびカルボン酸を含む、物質の複合混合物を含有していた。画分中に存在する酸は、塩基性水溶液（ｐＨ  １２〜１３；ＧＡは、ｐＨ  １２〜１３で水に可溶である）中に抽出し、抽出物の酸性化によって回収し、その後、クロロホルム中に再抽出した。陰イオン交換ＳＰＥカートリッジを使用する試みでは、ＧＡの濃縮および精製ができなかった。
【０１１８】
ＧＡ−ｄ６（０．５ｍＬメタノール中２．９μｇ）をニンジンジュース（約２００ｇ）に添加し、クロロホルム（２５０ｍＬ；０．１％ＢＨＴ）と混合した。激しく２．５時間撹拌した後、エマルジョンを分液漏斗に移し、クロロホルム層を分離した。水性画分をクロロホルム（２５０ｍＬ；０．１％ＢＨＴ）で再び抽出し、クロロホルム抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、セライトに通して濾過した。セライトおよびフィルタをクロロホルム（５０ｍＬ）で洗浄し、洗浄液を、合わせたクロロホルム溶液に添加した。合わせた抽出物および洗浄液は、回転蒸発により約１００ｍＬに濃縮された透明な溶液を与えた。抽出物中に存在するカルボン酸を、水性ＫＯＨ（０．０３２Ｍ；２×１００ｍＬ）と共に１５分間激しく撹拌し、合わせた水性抽出物（５％水性ＨＣｌ）をｐＨ２．５に酸性化し、酸をクロロホルム中に抽出することによって（２×１００ｍＬ）、抽出した。溶媒を、回転蒸発によって、合わせたクロロホルム抽出物から除去し、残留物をエステル化した（段落［００９６］に記述される手順に従いメチルエステルに変換した）。
【０１１９】
ニンジンジュース中のゲロン酸の存在に関する証拠の裏付けは、メチルエステルをその対応するセミカルバゾン誘導体に、ケト官能基を介して変換することにより得られた。ＧＡメチルエスエルを、単離したセミカルバゾン画分から再生し、ＧＣ−ＭＳにより分析した。
【０１２０】
上記得られたエステルの混合物を、３：１のメタノール：水（４．５ｍＬ）に溶解した。固体セミカルバジド塩酸塩（約０．１５ｇ）を添加し、その後、固体酢酸ナトリウム（約０．１５ｇ）を添加した。得られた懸濁液を短時間加熱還流し、室温に冷却し、ジクロロメタンで抽出し（２×９ｍＬ）、溶媒を蒸発させた。残留物をクロロホルムで抽出し（５×１．５ｍＬ）、合わせた抽出物を、シリカゲル（６ｍＬ）の短いパッドに通した。シリカをクロロホルム（２０ｍＬ）で溶出し、セミカルバゾンをメタノール（１５ｍＬ）で溶出した。メタノールを蒸発させ、残留物をクロロホルム（９ｍＬ）に溶解し、活性化ＭｎＯ２（０．３ｇ）を添加した。懸濁液を、室温で１時間激しく撹拌し、濾過し、濾過したＭｎＯ２をクロロホルムで洗浄した（２×１．５ｍＬ）。クロロホルム画分を合わせ、溶媒を回転蒸発により除去した。残留物をアセトニトリル（０．６ｍＬ）に溶解し、濾過し、溶液をＧＣ−ＭＳによって分析した。
【０１２１】
ニンジン粉末＃１および＃２。蒸留水（２５〜３０ｍＬ）、アセトニトリル（１２５〜１５０ｍＬ）、ＢＨＴ（約５〜９ｍｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中１５または３０μｇ）を、４００ｍＬビーカーに入っているニンジン粉末（約５．０ｇ）に添加した。混合物を、９，５００ｒｐｍで２０〜２５分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。濾液を取り分け、固体残留物を、アセトニトリル／水（１２５〜１５０ｍＬ／２５〜３０ｍＬ）で、記述したように再び均質化した。混合物を濾過し、両方の濾液を合わせた。溶媒を蒸発させ、油状残留物をクロロホルム（２０ｍＬ）に再度溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４；数分間にわたって橙色の液体が合体し、クロロホルムの上面に浮遊し、次いで乾燥剤上に吸着されるようになることに留意されたい）、綿に通して濾過した。フラスコおよびフィルタをクロロホルムで濯ぎ（４×５ｍＬ）、濯ぎ液を濾液と合わせた。クロロホルムを水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌し、次いで沈降させた。分液漏斗を使用して、クロロホルムの塊を除去し、残りを遠心分離によって除去した。水性層を取り分け、クロロホルム層を、水性ＫＯＨ（０．０３Ｍ；２５ｍＬ）で上述のように抽出した。水性層を合わせ、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ  １〜２に酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、綿に通して濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１２２】
生のトマト。ＧＡ−ｄ６（メタノール中２．８μｇ）、水性ＨＣｌ（１．５ｍＬ、３．６％ｖ／ｖ）およびクロロホルム（２５０ｍＬ；０．１％ＢＨＴ）を、小片に刻んだ新鮮なトマト（２００〜２５０ｇ）に添加した。混合物を均質化し、得られたペーストを、ガラス栓をしたフラスコに移し、クロロホルムで濯いで完全な移動を確実にした。暗所で一晩、２℃で静置後、懸濁液は２つの液体相を形成した。過剰なＭｇＳＯ４／ＮａＣｌ（１：１）を、分離した底部クロロホルム層に添加した。微細懸濁液が形成され、混合物をセライトに通して濾過した。セライトおよびフィルタをクロロホルムで洗浄し、合わせたクロロホルム溶液を約６０ｍＬに濃縮した。カルボン酸を、水性ＫＯＨ（０．１Ｍ；２×６５ｍＬ）と共に８分間、濃縮物を激しく撹拌することによって抽出した。黄色の懸濁液を含有する、合わせた水性抽出物を、ジクロロメタン／酢酸エチル（２：１、６０ｍＬ）で洗浄し、ｐＨ２．３に酸性化（５％ＨＣｌ水溶液）した。カルボン酸をジクロロメタンで抽出し（２×５０ｍＬ）、抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過した。溶媒を、回転蒸発により除去し、残留物をエステル化した。
【０１２３】
トマト粉末。約５．０ｇのトマト粉末に、ＢＨＴ（３〜４ｍｇ）、蒸留水（３０ｍＬ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）、およびゲロン酸−ｄ６（メタノール中６．２μｇ）を添加した。９５００ＲＰＭで２５分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル／水（１５０ｍＬ／３０ｍＬ）で上記のようにもう一度抽出し、濾液を合わせ、溶媒を蒸発させ、約２〜３ｍＬの油を残した。クロロホルム（１５ｍＬ）を添加し、混合物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、綿に通して濾過し、クロロホルムで濯いだ（４×４．５ｍＬ）。合わせた濾液を、水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌した。クロロホルムのほとんどを分液漏斗により除去し、残りを遠心分離によって分離した。水性層を収集し、クロロホルム層を、上述のように水性ＫＯＨでもう一度抽出した。水性層を合わせ、１Ｍ  ＨＣｌ（約３ｍＬ）で酸性化し、クロロホルム（２×２０ｍＬ）で抽出した。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、０．３〜０．５ｍＬに濃縮した。液体を、乾燥シリカゲルのカラム（直径２ｃｍ、長さ１３．５ｃｍ）に移し、Ｎ２を通した。シリカを乾燥した後、カラムを、メタノール：酢酸エチル：ヘキサン（５：１０：８５）およびＮ２圧力を使用して溶出し、約１．５分ごとに約１０ｍＬの画分を収集した。画分１８〜２５（黄色のバンド、およびゲロン酸による共スポットを含有する）を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１２４】
トマトの搾りかす。約２５ｇのトマトの搾りかすに、蒸留水（３０ｍＬ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）、ＢＨＴ（２〜４ｍｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中２．５μｇ）を添加した。９５００ｒｐｍで２０分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル／水（１５０／３０ｍＬ）でもう一度抽出し、濾液を合わせ、溶媒を蒸発させ、少量の油（約１〜２ｍＬ）を残した。油をクロロホルム（１５ｍＬ）に溶解し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、２５ｍＬのクロロホルムで濯いだ。水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ、２５ｍＬ）を添加し、５分間激しく撹拌した。層を遠心分離によって分離し、クロロホルム層を、上述のように再び水性ＫＯＨで抽出した。水性抽出物を合わせ、ＨＣｌ（１Ｍ、３ｍＬ）で酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させて０．３〜０．５ｍＬに減少させた。液体を、乾燥シリカゲルのカラム（直径２ｃｍ、長さ１３．５ｃｍ）の上部に移し、Ｎ２を通過させた。シリカを乾燥させた後、カラムを、メタノール：酢酸エチル：ヘキサン（５：１０：８５）およびＮ２圧力を使用して溶出し、約１０ｍＬの画分を収集した。画分１６〜２６（ゲロン酸による共スポット）を合わせ、溶媒を蒸発させた。残留物をエステル化し、エステルを、酢酸エチルの４％ヘキサン溶液に溶解し、綿に通して濾過した。溶媒を蒸発させ、残留物を、最小量の、酢酸エチルの４％ヘキサン溶液に溶解し、湿潤シリカゲルカラム（直径０．５ｃｍ、長さ３３ｃｍ）上に投入した。約５ｍＬの画分を収集し、最初に酢酸エチルの４％ヘキサン溶液で溶出し、画分７の後、酢酸エチルの１５％ヘキサン溶液に切り換えた。画分１１〜１７（ゲロン酸メチルによる共スポット）を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物をアセトニトリルに溶解した。
【０１２５】
乾燥デーツ。ＧＡ−ｄ６（メタノール中２．２μｇ）、アセトニトリル（２００ｍＬ；０．１％ＢＨＴ）、およびＮａＣｌ（１６ｇ）を、水（ＨＰＬＣ級、１２０ｍＬ）を入れたビーカーに入っている乾燥デーツ（５０〜１２０ｇ）に添加した。混合物を約８分間均質化し（２１，５００ｒｐｍ）、ペーストおよび淡黄色の溶液を得た。溶液をデカントし、ペーストを、アセトニトリルでさらに２回均質化し、上述のようにデカントした。合わせた溶液の回転蒸発により、黄色い油が得られた。油をクロロホルム（５０ｍＬ）で希釈し、ＭｇＳＯ４（２〜３ｇ）を激しく撹拌しながら添加した。得られた懸濁液を、ガラスウールに通して濾過し、その後、クロロホルム（５０ｍＬ）で濯いだ。合わせたクロロホルム画分を約１２ｍＬに濃縮し、水性ＫＯＨ（０．１Ｍ；１２ｍＬ）を添加し、カルボン酸を、８分間激しく撹拌することによって抽出した。エマルジョンを得、遠心分離で２層に分離した。分離したクロロホルム層を以前のようにＫＯＨ（０．１Ｍ；１２ｍＬ）で抽出した。水性抽出物を合わせ、ｐＨ２．３に酸性化し（５％ＨＣｌ水溶液）、カルボン酸をジクロロメタンで抽出した（２×２０ｍＬ）。ジクロロメタン抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ガラスウールに通して濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１２６】
ミルク。ＧＡ−ｄ６（メタノール中４．５μｇ）、ＮａＣｌ（７０ｇ）、およびアセトニトリル（３００ｍＬ）を、１Ｌビーカーに入れたミルク（約３３０ｇ）に添加し、混合物を８分間均質化した（２１，５００ｒｐｍ）。均質化白色スラリが形成された。冷蔵庫（２℃）内に一晩静置した後、２層が形成された。底部の透明層を取り分けた。最上部の白色層を、アセトニトリル（４００ｍＬ）で均質化した。層の分離は速く、上部の透明層を収集した。透明液体の画分を合わせ、回転蒸発により濃縮し、油状の白色懸濁液を残し、クロロホルムで抽出し（３×７ｍＬ）、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ガラスウールに通して濾過した。フィルタをクロロホルム（５ｍＬ）で濯ぎ、合わせた濾液をＫＯＨ水溶液（０．０６３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌した。エマルジョンが形成され、遠心分離で２層に分離した。分離したクロロホルム層を、水性ＫＯＨと共に再び撹拌し、上述のように分離した。水性層を合わせ、３Ｍ  ＨＣｌでｐＨ約２に酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２５ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１２７】
アルファルファ。天日乾燥したアルファルファを、電気式コーヒーグラインダを使用して粉末に粉砕した。試料（４０ｇ）を１Ｌビーカーに入れ、水（１２０ｍＬ）を添加し、混合物を１時間静置して、アルファルファによる吸水を生じさせた。次いでアセトニトリル（５５０ｍＬ）を添加し、その後、ＧＡ−ｄ６（メタノール中１４０μｇ）およびＢＨＴ（約０．０５ｇ）を添加した。混合物を８分間均質化し（２１，５００ｒｐｍ）、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル／水（５５０ｍＬ／１４０ｍＬ）で再び均質化し、上述のように濾過した。合わせた緑色濾液を回転蒸発によって濃縮し、暗緑色の油を得た。油をクロロホルム（２０ｍＬ）中に溶解し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ガラスウールに通して濾過し、クロロホルムでフラスコを濯ぎ（２×２０ｍＬ）、最後にフィルタをクロロホルム（５ｍＬ）で濯いだ。合わせたクロロホルム濾液および洗浄液を、約２５ｍＬに濃縮し、水性ＫＯＨ（０．０６３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌した。エマルジョンが形成され、遠心分離で２層に分離させた。分離したクロロホルム層を、ＫＯＨ水溶液と共に、記述したように再び抽出し、水性層を合わせ、３Ｍ  ＨＣｌでｐＨ約２に酸性化した。酸性溶液をクロロホルムで抽出し（２×２５ｍＬ）、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、１：１のヘキサン／酢酸エチル（４．５ｍＬ）に溶解し、シリカゲルカラム（２ｃｍ×１２ｃｍ）に通し、同じ溶媒混合物で溶出した。無色の画分および緑色画分を収集し、その後、黄色い画分を収集した。溶媒を、黄色い画分から蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１２８】
スピルリナ粉末。蒸留水（６０ｍＬ）、アセトニトリル（３５０ｍＬ）、ＢＨＴ（０．０６ｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中１４０μｇ）を、スピルリナ粉末（１３．７ｇ）に添加した。懸濁液を２１，５００ｒｐｍで８分間均質化し、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、固体残留物を、アセトニトリル／水（２５０ｍＬ／６０ｍＬ）で上述のように再び抽出した。濾液を合わせ、溶媒を回転蒸発により除去して、暗緑色の油を得た。油をクロロホルム（２０ｍＬ）に溶かした溶液を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、ガラスウールに通して濾過した。フラスコおよびフィルタを、クロロホルムで数回に分けて濯いだ。全ての濾液を合わせ、クロロホルムを蒸発させた。暗緑色の固体を得、１：１のヘキサン／酢酸エチル（４．５ｍＬ）に溶解し、シリカゲルのカラム（２．４ｃｍ×２１ｃｍ）上に投入した。カラムをヘキサン／酢酸エチル（１．０５：１）で溶出した。最初は無色の溶出液であり、その後、黄色バンド、次いで暗緑色バンドが続いた。暗緑色バンドの約３／４を、画分１として収集した。残りの暗緑色バンドおよび黄色バンドを、橙色バンドが溶出し始めるまで、画分２として収集した。画分２からの溶媒を、Ｎ２の流れの下で蒸発させ、残留物をクロロホルム（約２３ｍＬ）に溶解した。溶液を、水性ＫＯＨ（０．０６３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌し、得られたエマルジョンを遠心分離により分離した。水性層を取り分け、クロロホルム層を、上述のようにＫＯＨ水溶液（２５ｍＬ）で再び抽出した。両方の水性抽出物を合わせ、３Ｍ  ＨＣｌでｐＨ  １〜２に酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２５ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、溶媒を、Ｎ２の流れの下で蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１２９】
バラの実の粉末。蒸留水（３０ｍＬ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）、ＢＨＴ（約０．０３０ｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中５．７μｇ）を、４００ｍＬビーカーに入っているバラの実の粉末（約１０ｇ）に添加した。混合物を、９，５００ｒｐｍで２５分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。濾液を取り分け、固体残留物を、アセトニトリル／水（１５０ｍＬ／３０ｍＬ）で上述のように再び均質化した。混合物を濾過し、両方の濾液を合わせた。溶媒を蒸発させ、油状残留物をクロロホルム（２０ｍＬ）に再度溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ガラスウールに通して濾過した。フラスコおよびフィルタをクロロホルムで濯ぎ（３×１０ｍＬ）、濯ぎ液および濾液を合わせた。溶液を約２５ｍＬに濃縮し、ＫＯＨ（約０．０３Ｍ；２５ｍＬ）水溶液と共に５分間激しく撹拌した。懸濁液を、遠心分離によって層に分離し、水性層を取り分けた。水性ＫＯＨによるクロロホルム層の２回目の抽出を、上述のように実施し、水性層を遠心分離によって分離した。水性層を合わせ、３Ｍ  ＨＣｌでｐＨ  １〜２に酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ガラスウールに通して濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３０】
新鮮なクランベリー。新鮮な丸ごとのクランベリー（６０１．３３ｇ）を、アセトニトリル（０．０１ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴを含有する７００ｍＬ）およびＧＡ−ｄ６（メタノール中０．６４μｇ）が入っているビーカーに入れた。混合物を２１５００ＲＰＭで２０分間均質化し、ホモジナイザを周囲で慎重に移動させて、全てのベリーを潰した。得られたパルプをさらに２５分ブレンドし、次いで粗い焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル（７００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で２５分間均質化した。上述のように再び濾過し、溶媒を蒸発させて、赤紫色の油を得た。クロロホルム（１００ｍＬ）および水（１０ｍＬ）を添加し、混合物を４０℃で撹拌して溶解した。Ｎａ２ＳＯ４（約２５０ｇ）を添加し、混合し、混合物を、綿に通して濾過し、クロロホルム（５０ｍＬ）で濯いだ。濾液を水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍを５０ｍＬ）と共に激しく撹拌し、次いで分液漏斗に移した。クロロホルムのほとんどを分離し、残りの液体を遠心分離した。水性層を取り分け、クロロホルム層を上述のようにもう一度抽出した。水性層を合わせ、水性ＨＣｌ（１Ｍ、約６ｍＬ）で酸性化し、クロロホルムで抽出し（２×５０ｍＬ）、必要に応じて遠心分離して、層を分離した。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、約３ｍＬに濃縮し、乾燥シリカゲルのカラム（長さ１３．５ｃｍ×直径２ｃｍ）の最上部に移した。Ｎ２を強制的に通してシリカを乾燥し、カラムを、Ｎ２圧力および５：１０：８５のメタノール：酢酸エチル：ヘキサンの溶媒系を使用して溶出し、約１０ｍＬの画分を収集した。画分１９〜３５（ＧＡによる共スポット）を合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３１】
クランベリー粉末。蒸留水（３０ｍＬ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）、ＢＨＴ（約０．０１５ｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中０．７５μｇ）を、４００ｍＬビーカーに入っているクランベリー粉末（約４．８ｇ）に添加した。混合物を、９，５００ｒｐｍで２５分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。濾液を取り分け、固体残留物を、アセトニトリル／水（１５０ｍＬ／３０ｍＬ）で上述のように再び均質化した。混合物を濾過し、両方の濾液を合わせた。溶媒を蒸発させ、残留物をクロロホルム（２０ｍＬ）に再度溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ガラスウールに通して濾過した。フラスコおよびフィルタをクロロホルムで濯ぎ（４×５ｍＬ）、濯ぎ液および濾液を合わせた。溶液を約２５ｍＬに濃縮し、水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌した。層を遠心分離によって分離し、水性層を取り分けた。ＫＯＨ水溶液によるクロロホルム層の２回目の抽出を、上述のように実施し、水性層を遠心分離によって分離した。水性層を合わせ、３Ｍ  ＨＣｌでｐＨ約１に酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、綿に通して濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を約１ｍＬのメタノールに溶解し（注記：いくらかの微細な固体は溶解しないままである）、液体を、乾燥シリカゲルのカラム（２ｃｍ×１０ｃｍ）の最上部に可能な限り均一に移し、カラムの壁をメタノール（０．２ｍＬ）で濯いだ。Ｎ２を強制的にカラムに通してシリカを乾燥させ、次いでカラムを、８５／１０／５のヘキサン／酢酸エチル／メタノール溶液で、約５ｍＬ／分で溶出した。画分５ｍＬを収集し、ゲロン酸によるそれらの共スポットを合わせ、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３２】
パプリカ粉末。蒸留水（３０ｍＬ）、アセトニトリル（１５０ｍＬ）、ＢＨＴ（３〜５ｍｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中４．０μｇ）を、４００ｍＬビーカーに入っているパプリカ粉末（約５．０ｇ）に添加した。混合物を、９，５００ｒｐｍで２５分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。濾液を取り分け、固体残留物を、アセトニトリル／水（１５０ｍＬ／３０ｍＬ）で、記述したように再び均質化した。混合物を濾過し、両方の濾液を合わせた。溶媒を蒸発させ、油状の残留物をクロロホルム（１５ｍＬ）に再度溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、綿に通して濾過した。フラスコおよびフィルタをクロロホルムで濯ぎ（４×５ｍＬ）、濯ぎ液および濾液を合わせた。溶液を、水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ；２５ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌し、混合物を遠心分離によって２層に分離した。分離したクロロホルム層を、水性ＫＯＨ（２５ｍＬ）で上述のように抽出した。水性層を合わせ、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ  １〜２に酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２５ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、綿に通して濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３３】
サツマイモ粉末＃１および＃２。蒸留水（２５ｍＬ）、アセトニトリル（１２０ｍＬ）、ＢＨＴ（４〜６ｍｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中４．０μｇ）を、サツマイモ粉末（５〜８ｇ）に添加した。混合物を、１３，５００ｒｐｍで２５分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体を、アセトニトリル／水（１２０／２５ｍＬ）で、記述したように再び抽出し、濾液を合わせた。溶媒を、少量の油が残るまで（約１〜２ｍＬ）ロータリーエバポレーター上で除去した。クロロホルム（１２ｍＬ）を添加して油を溶解し、混合物をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。綿に通して濾過し、クロロホルム（２１ｍＬ）で濯いだ。水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ、２５ｍＬ）を、合わせた濾液に添加し、５分間激しく撹拌した。水性層を分離し、クロロホルムを、上述のように水性ＫＯＨで再び抽出した。合わせた水性抽出物を、水性ＨＣｌ（１Ｍ、約３ｍＬ）で酸性化し、次いでクロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３４】
海藻（ダルス粉末、海苔フレーク）。約５．０ｇの海藻に、蒸留水（２５ｍＬ）、アセトニトリル（１２０ｍＬ）、ＢＨＴ（２〜４ｍｇ）、およびＧＡ−ｄ６（メタノール中２１μｇ）を添加した。９５００ＲＰＭで２０分間均質化し、次いで焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル／水（１２０／２５ｍＬ）で上述のように再び抽出し、濾液を合わせ、ロータリーエバポレーター上で濃縮して、約１〜２ｍＬの油を残した。クロロホルム（１８ｍＬ）を添加して混合物を溶解し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、綿に通して濾過し、クロロホルム（約２２ｍＬ）で濯いだ。水性ＫＯＨ（約０．０３Ｍ、２５ｍＬ）で５分間激しく撹拌し、次いで遠心分離により分離した。水性層を収集し、クロロホルム層を上述のように再び水性ＫＯＨで抽出した。合わせた水性抽出物を酸性化し（１Ｍ  ＨＣｌ、約３ｍＬ）、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせたクロロホルム抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３５】
ウィートグラス粉末。約５．５ｇのウィートグラス粉末に、ＧＡ−ｄ６（メタノール中１０μｇ）、アセトニトリル（１２０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、およびＢＨＴ（約３ｍｇ）を添加した。混合物を１５分間、６，５００ｒｐｍで均質化し、次いで粗い焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル／水（１２０ｍＬ／３０ｍＬ）で上述のようにもう一度抽出し、濾液を合わせ、約１〜２ｍＬの緑色の油が残るまで溶媒を蒸発させた。クロロホルム（１５ｍＬ）を添加して油を溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、クロロホルム（２５ｍＬ）で濯いだ。合わせた濾液を水性ＫＯＨ（２５ｍＬ；約０．０３Ｍ）で５分間激しく撹拌し、混合物を分液漏斗に移した。クロロホルムのほとんどを分離し、残りの液体を遠心分離した。クロロホルム層を、上述のように水性ＫＯＨで再び抽出し、水性層を合わせ、水性ＨＣｌ（１Ｍ、約３ｍＬ）で酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物をエステル化した。
【０１３６】
赤ヤシ油。赤ヤシ油（約２８．０ｇ）に、ＢＨＴ（２〜３ｍｇ）、ヘキサン（２０ｍＬ）、およびゲロン酸−ｄ６（メタノール中２．０μｇ）を添加した。１０分間撹拌し、次いでアセトニトリル（２０ｍＬ）を添加し、激しく５分撹拌した。層を分離し、アセトニトリル層（最上部）を収集した。ヘキサン（２０ｍＬ）と共に５分間激しく撹拌し、次いでアセトニトリル層（底部）を収集し、溶媒を蒸発させた。水性ＮＨ３（５％、６ｍＬ）および蒸留水（３ｍＬ）を残留物に添加し、激しく撹拌して、濁った橙色の液体を得た。ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸ、６ｃｃ／５００ｍｇ）を、メタノール（６ｍＬ）、蒸留水（６ｍＬ）、および水性ＮＨ３（０．５％、４．５ｍＬ）に順次通すことによって準備した。橙色の液体をカートリッジに通し、水性ＮＨ３（０．５％、４．５ｍＬ）、メタノール（９ｍＬ）、および酸性メタノール（２％ＨＣｌ、４．５ｍＬ）で順次溶出した。酸性メタノール画分を収集し、固体ＮａＨＣＯ３を添加し、泡立ちが止むまで撹拌し、混合物をエステル化した。
【０１３７】
粉ミルク。約１０５ｇの全脂乳粉に、ＧＡ−ｄ６（メタノール中０．５μｇ）、酢酸エチル（２８０ｍＬ）、およびＢＨＴ（約３ｍｇ）を添加した。混合物を２０分間激しく撹拌し、次いで中間焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、上述のように酢酸エチル（２８０ｍＬ）でもう一度抽出し、合わせた濾液をロータリーエバポレーターで濃縮した。残留物をクロロホルム（１５ｍＬ）に溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、クロロホルム（３０ｍＬ）で濯いだ。合わせた濾液を、水性ＫＯＨ（２５ｍＬ；約０．０３Ｍ）と共に５分間激しく撹拌し、層を分離した。クロロホルム層を、上述のように水性ＫＯＨでもう一度抽出し、合わせた水性抽出物を水性ＨＣｌ（１Ｍ、約３ｍＬ）で酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２０ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させ、残留物をエステル化した。
【０１３８】
全卵粉。約２５ｇの全卵粉に、ＧＡ−ｄ６（メタノール中１〜２μｇ）、アセトニトリル（１２０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、およびＢＨＴ（約３ｍｇ）を添加した。混合物を１３，５００ＲＰＭで１０分間均質化し、次いで粗い焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過した。固体残留物を、アセトニトリル／水（１２０ｍＬ／３０ｍＬ）でもう一度抽出し、濾液を合わせ、溶媒を、Ｎ２の流れを一晩吹付けることによって蒸発させた（ロータリーエバポレーターの使用は、過剰な起泡によりできなかった）。クロロホルム（１５ｍＬ）を添加して残留物を溶解し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、クロロホルム（１３５ｍＬ）で濯いだ。合わせた濾液を水性ＫＯＨ（５０ｍＬ；約０．０３Ｍ）と共に５分間激しく撹拌し、次いでＮａＣｌ（５ｇ）を添加し、１分間撹拌し、混合物を分液漏斗に移した。クロロホルム層のほとんどを分離し、残りの液体を遠心分離した。クロロホルム層を、水性ＫＯＨで上述のようにもう一度抽出した。水性抽出物を合わせ、水性ＨＣｌ（１Ｍ、約６ｍＬ）で酸性化し、クロロホルムで抽出した（２×２５ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物をエステル化した。
ゲロン酸分析
【０１３９】
ＧＣ−ＭＳ分析。内部標準としてヘキサ重水素化ＧＡ、ＧＡ−ｄ６を使用する、ＧＣ−ＭＳをベースにしたアッセイを用いた１３。較正を、各食品試料の分析の前に実施した。予測される試料レベル（１．５〜３８μｇ／ｍＬ）に関連した強度でメタノール中に調製されたＧＡおよびＧＡ−ｄ６のストック溶液を、較正試料が得られるように比（１：４から４：１）の範囲で合わせた。溶液を、２０ｍＬのシンチレーションバイアル内で合わせた（全体積１．０〜１．５ｍＬ）後、以下に記述される手順に従って、それらをメタノールで４．５ｍＬに希釈し、テトラフルオロホウ酸トリメチルオキソニウムでエステル化した。窒素の流れの下でまたは回転蒸発によって溶媒を除去した後に得られたエステル化試料を、ＧＣ−ＭＳによる分析のためにアセトニトリルに溶解した。ＳＩＭモードでの、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６に関するそれぞれのイオンの存在量ｍ／ｚ＝１５４および１６０の比較を、ＧＡの較正および定量のために使用した。ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの保持時間は、参照標準により決定した。較正曲線は、ｍ／ｚ＝１５４および１６０イオン強度の比、Ｉ／Ｉ６を、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６標準の対応する質量比、ｍ／ｍ６に対してプロットすることにより作成した。データを、最小二乗解析によって方程式（１）に当て嵌め、ただしａは勾配であり、ｂはｙ切片である。
Ｉ／Ｉ６＝ａ（ｍ／ｍ６）＋ｂ    （１）
【０１４０】
食品試料中のＧＡの量、ｍは、方程式１を使用して、ＧＡ−ｄ６の既知の量、ｍ６を付加するために得られた試料のＩ／Ｉ６値と、較正曲線から得られたａおよびｂの値とから計算した。典型的な較正曲線の例を、図３に提示する。
【０１４１】
食品試料中の、内因性ＧＡおよび添加されたＧＡ−ｄ６メチルエステルのアイデンティティは、それらのＧＣ保持時間および質量スペクトルを、調製された標準と比較することによって確認された。ＧＡメチルエステルの質量スペクトルは、ＧＣ−ＭＳライブラリに対して９０〜９３％の一致をもたらした。ＧＡメチルエステルは、ｍ／ｚ＝１５４、１２９、および１０２で強度のイオンを示す。これらのイオンはそれぞれ、親イオンの［Ｍ＋−メタノール］、［Ｍ＋−ＭｅＣ（Ｏ）ＣＨ２］、［Ｍ＋−ＭｅＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨＣＨ２］フラグメントに対応する。親分子イオンの相対強度（ｍ／ｚ＝１８６；２％）は、分析するには低過ぎた。イオン１２９（４０％）および１０２（１００％）は高強度を有するが、それらは、抽出された食品試料中のその他の化合物から発生したイオンによって干渉を受けることがわかった。しかしイオン１５４（約２０％）は、そのような干渉をまれにしか受けないことがわかり、したがってＧＡメチルエステルの測定をモニタするために選択された。同様に、イオン１６０はＧＡ−ｄ６メチルエステルに使用された。
【０１４２】
１５４対１６０イオンの強度の比を、関連ある試料濃度の比に対してプロットすることにより、各食品試料ごとに作成されたＧＡ対ＧＡ−ｄ６のＧＣ−ＭＳ較正曲線は、図３に示されるように、優れた線形応答をもたらした。
【０１４３】
ニンジンジュース。ニンジンジュース分析物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムは、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの明らかに区別可能なシグナルを示す。エステルの保持時間は、純粋な標準化合物の保持時間と比較することによって確認され、ゲロン酸メチルエステルに対するライブラリの一致は９０％であった。ＳＩＭモードで記録された分析物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムは、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの、明瞭な、分離したシグナルを示した（図４）。シグナルを積分し、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの強度の比（Ｉ０／Ｉ６）を使用して、ニンジンジュース中のＧＡの濃度を、較正曲線（例えば、図３）から得た方程式（１）のパラメータに関する値を使用して計算した。添加したＧＡ−ｄ６の平均回収率は、個別に測定した標準溶液の強度と比較したクロマトグラムにおけるＧＡ−ｄ６シグナル強度に基づいて、８９％（７７〜１０２％の範囲）であった。
【０１４４】
生のトマト。ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルのシグナルは、生のトマトに関するＧＣ−ＭＳクロマトグラムで明らかに目に見えた。ＧＡメチルエステルに対するライブラリの一致は、９３％であった。ＳＩＭモードで記録された分析物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムは、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの、明瞭な、分離したシグナルを示した（図５）。ＧＡの平均濃度（１．５±０．９ｎｇ／ｇ；（表１Ｂ））は、ニンジンジュースの場合（１２．６±０．８ｎｇ／ｇ；表１Ａ）の約１０分の１であり、トマト中に存在するβ−カロテンのかなり低いレベルに一致していた（表３）。トマトに関するＧＡ値の、より広いばらつきは、低レベルのＧＡと、分析方法の感度限界に起因する。
結果
食品試料中のＧＡの分析
【０１４５】
図６は、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルに関して明瞭な、区別可能なシグナルを示す、ニンジンジュースおよび生のトマトの分析物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。エステルのアイデンティティは、それらの保持時間を、ゲロン酸メチルエステルに対する質量スペクトルライブラリの一致と一緒に、純粋な標準化合物の保持時間と比較することによって確認した１９。
【０１４６】
ニンジンジュースの例をとると、ＳＩＭモードで記録された分析物のＧＣ−ＭＳクロマトグラムは、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの明瞭な、区別可能なシグナルを示した（図４）。シグナルを積分し、ＧＡおよびＧＡ−ｄ６メチルエステルの強度の比（Ｉ０／Ｉ６）を使用して、ニンジンジュース中のＧＡの濃度を、較正曲線から得た方程式１のパラメータに関する値を使用して計算した。
【０１４７】
ＧＡの存在の、さらなる確認は、セミカルバゾン誘導体化を通して精製することにより、得られた。表１Ａは、セミカルバゾン精製によって、試料１および２の両方に関する直接的方法の場合に、密接に類似した値が得られたことを示す。
【０１４８】
表１Ａは、試料加工中の偶発的酸化を最小限に抑えるための、抗酸化保護の必要性も示す。添加される抗酸化剤がない場合、３２時間加工された試料１は、８時間加工された試料２の場合よりも高いＧＡ値を有していた。約０．１％のＢＨＴを抽出溶媒に添加した結果、著しくかつ一貫して低いＧＡ値が得られる（表１Ａ、試料３〜５）。また、ＢＨＴの存在下でセミカルバゾン誘導体化を介して得られたＧＡ値は（表１、試料６）、試料３〜５に関して直接得られた値に類似していた。
【０１４９】
様々な食品試料の分析は、広範にわたって変化するＧＡ値を示す（表２）。乾燥したプロビタミンＡに富む食品、特に粉末形態で分析されたもの（例えば、ニンジン、スピルリナ、海藻、アルファルファ、およびウィートグラス）に見られる、非常に高い値は、乾燥中にこれらの食品が空気、熱、および光に曝露されると、かなりのおよび様々な程度の偶発的β−カロテン酸化が引き起こされることを確認する。最高値は、ニンジンジュースに関する値の８４０倍で、ニンジン粉末＃１に関して観察され、これは乾燥重量ベースで比較した場合、ＧＡのほぼ１００倍の富化に相当する。注目すべきは、受け取ったままのこの粉末が淡褐色であり、非常に低レベルのβ−カロテンであることを示しており、このことは、β−カロテンが検出可能性の限界を下回ることを示すＵＶ測定によって確認された。明らかに、存在するβ−カロテンの全ては酸化されていた。
【０１５０】
第２の商用ニンジン粉末（＃２）は、橙色であり、約１２０μｇ／ｇのβ−カロテンを含有していた。したがってＧＡのレベルは実質的により低く、ニンジン粉末＃１に関する値のほぼ半分である。
【０１５１】
生のトマトの場合、ＧＡの濃度はニンジンジュースの場合の約１０分の１であり、これはトマト中のβ−カロテンの、かなり低いレベルに一致している。生のクランベリー中のレベルも低く、この果実中のプロビタミンＡカロテノイドの低レベルと矛盾しない。
【０１５２】
乾燥したスピルリナ、海藻、アルファルファ、およびウィートグラスは、高レベルのＧＡを示す。アルファルファは、動物飼料中のカロテノイドの重要な供給源であり、北米では牛乳の生成に使用される。したがって、ミルクおよび粉ミルク（それぞれ３．２５％の乳脂肪）の試料を分析し、少量のＧＡを含有することがわかった。全卵粉、別の動物由来生成物は、乳製品よりも多くのＧＡを含有していた。
【０１５３】
それにも関わらず、赤ヤシ油、即ちビタミンＥの存在によって酸化に対して自然に保護されるα−およびβ−カロテンが豊富な供給源は、適度な量のＧＡを含有する。
【０１５４】
そのいずれもβ−カロテンの公知の供給源ではないｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａの根の粉末、蜂蜜、または蜂花粉では、ＧＡが検出されなかった。イエローコーンフラワーまたは玄米粉に見出されたＧＡは、検出可能な量ではなかった。
プロビタミンＡカロテノイド−酸素コポリマー含量の推定。
【０１５５】
本発明者らの早期モデルβ−カロテン酸化研究における、ポリマー形成に対するＧＡ形成の程度を知ることにより、近似的推定は、主要なポリマーの全β−カロテン酸化生成物混合物のレベルで構成した。β−カロテンの酸化では、ＧＡが、全生成物、ＯｘＢＣのレベルのおよそ２％の割合で形成される１３。食品中の全酸化生成物レベルを推定する際の第１の近似では、全てのＧＡがβ−カロテンから得られると仮定した。しかし、ＧＡに変換することが可能なβ−イオノン環構造は、その他のプロビタミンＡカロテノイド中に存在する（図２）。２個の環を備えたβ−カロテンは、分子当たり２つのＧＡを形成することができ、それに対して１個の環を備えたα−カロテン、γ−カロテン、およびβ−クリプトキサンチンは、分子当たりただ１つのＧＡを形成することができる。プロビタミンＡカロテノイド（ＰＶＡ）は、この研究で分析される食品試料中では測定しなかった。代わりに、文献出典を使用して、酸化プロビタミンＡカロテノイドの全推定レベルと比較するための近似的公称値を得た（表２）。数個の試料において、少量のプロビタミンＡカロテノイド（例えば、ニンジン中のα−カロテン）の１種または２種からのいくらかの寄与があるとすれば、推定される全酸化生成物は、各カロテノイドからの寄与の合計を表す用語ＯｘＰＶＡによって指定される。任意の環構造を欠くリコペン、即ちトマト中の主要なカロテノイドは、酸化されたときにＧＡを形成しないことが確認されたことに、留意されたい。
【０１５６】
各食品ごとのＧＡ値から計算されたＯｘＰＶＡの値を、表２に示す。生の食品中に当初存在し必要に応じて含水量が調節される、全プロビタミンＡカロテノイド、ＰＶＡの、対応する推定レベルに対する、各食品ごとのＯｘＰＶＡ値の比較は、酸化によるカロテノイド損失のおよその推定を提示し、ＰＶＡのパーセンテージとして表され、即ちＯｘＰＶＡ／ＰＶＡである（表２、欄６）。
【０１５７】
ＯｘＰＶＡ／ＰＶＡデータは、ニンジンジュースおよび生のトマトが、約１％という低レベルの酸化β−カロテンを有することを示す。著しい対照として、乾燥食品は、中程度から高度のパーセンテージレベルの酸化生成物を示す。ＰＶＡからＯｘＰＶＡへの完全変換に関する上限値は、１３０％程度となり得る（ＯｘＢＣは、β−カロテンの約１．３倍重い）。ニンジン粉末＃１は、当初のカロテンの公称レベルの見掛けの５５％の変換に相当する最高値を示すが、既に述べたように、この生成物中のβ−カロテンの実際のレベルは検出できなかった。したがって、実際のＯｘＰＶＡ／ＰＶＡ値は、完全酸化変換に相当する１３０％に近くなるべきであり、このことは、想定されるＯｘＰＶＡ／ＧＡ比が５０よりも高いものであるべきことを示唆している。
【０１５８】
スピルリナ粉末、海苔海藻フレーク、ダルス海藻粉末、天日乾燥アルファルファ、ウィートグラス粉末、およびサツマイモ粉末も、酸化生成物の比較的有意な供給源である。それにも関わらず、非常に高いレベルの残留β−カロテンを含むスピルリナ粉末は、公称の当初β−カロテンレベルの僅かに見掛け上１％の酸化変換率であっても、ＯｘＰＶＡ源として顕著である。
【０１５９】
ほとんどの部分で、植物ベースの生成物に関するＯｘＰＶＡ／ＰＶＡ値は、１３０％の限度内にある。例外は、クランベリー粉末および乾燥デーツである。本発明者らは、おそらくはクランベリー中の低レベルのβ−カロテンにより配合される、生の果実におけるβ−カロテンの実際のレベルの不確実さは、これらの推定の精度に影響を及ぼす因子として、ＧＡ決定の精度にも影響を及ぼすと考える。
【０１６０】
ミルクおよび全卵粉中の推定ＯｘＰＶＡ／ＰＶＡ値も、１３０％を大幅に超える。ＧＡは、動物生成物中のＯｘＰＶＡを予測可能ではないと考えられ、食餌源、例えばアルファルファの影響を受ける可能性があり、おそらくは内因性ビタミンＡの酸化によって影響を受ける可能性がある。
（実施例３）
カロテノイド−酸素コポリマー化合物の直接単離
カロテノイド−酸素コポリマーを単離するための手順。
【０１６１】
一般に、ＢＨＴ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を含有する酢酸エチルを食品粉末と混合し、混合物を一晩静置させた。翌日、スラリを焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、ＢＨＴ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を含有する酢酸エチルで残留物を濯いだ。濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、再び濾過し、溶媒を蒸発させた。最小量の極性溶媒（酢酸エチルまたは酢酸エチル／メタノール）を使用して残留物を溶解し、その後、ヘキサンを慎重に添加することによって沈殿させた。上澄みをデカントし、残留物をヘキサンで濯ぎ、次いで酢酸エチルまたは酢酸エチル／メタノールに溶解した。溶液を必要に応じて濾過し、沈殿プロセスをさらに２回まで繰り返した。次いで最終生成物を減圧乾燥した。
【０１６２】
乾燥形態のニンジン、トマト、バラの実、パプリカ、ダルス海藻、アルファルファ、ウィートグラス、およびトマトの搾りかすに関する抽出の詳細な記述を、以下に提示する。
【０１６３】
ニンジン粉末＃１。粉末（８０ｇ）をフラスコに入れ、酢酸エチル（１２０ｍＬ）と混合し、７時間撹拌し、３日間静置させた。混合物を、焼結ガラスに通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（２×９０ｍＬ）。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、白色物質が沈殿する間、３０分間静置させた。液体を、０．２μｍのシリンジフィルタ（酢酸エチルで濯ぐ）に通して濾過し、溶媒を蒸発させて、カラメル色の油（８９８ｍｇ）を得た。油を酢酸エチル（１．２ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。添加終了後、３０分間撹拌し、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（２×３ｍＬ）。残留物を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、１時間減圧ポンプで乾燥して、７８ｍｇの褐色固体を得た。
【０１６４】
固体を、類似の様式で調製された別の試料と合わせて、合計２１８ｍｇにした。固形分を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、ヘキサン（５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。１時間後、液体をデカントし、沈殿物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。固体を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を２時間減圧ポンプで乾燥して、１９５ｍｇの褐色固体を得た。
【０１６５】
固体（１５５ｍｇ）を、酢酸エチル（０．５ｍＬ）およびヘキサン（５ｍＬ）から３回沈殿させ、ヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。減圧ポンプで３時間乾燥することにより、１３９ｍｇの褐色固体が得られた。
【０１６６】
ニンジン粉末＃２。粉末（５０２ｇ）を酢酸エチル（約４５０ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩（１７時間）静置させた。これを３回に分けて、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、それぞれ酢酸エチルで濯いだ（２×９０ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮し、約１４ｍＬの溶液を残した。０．２μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（３×３ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させて、４．７２９２ｇの暗赤色の油を得た。油を酢酸エチル（２ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（１００ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（３×３ｍＬ）。固体を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、生成物を減圧ポンプで乾燥して、２６９ｍｇの粘性の赤みがかった橙色の油を得た。
【０１６７】
油を酢酸エチル（０．５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（１０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。残留物を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒を蒸発させ、生成物を減圧ポンプで４５分間乾燥して、２１５ｍｇの固体を得た。
【０１６８】
固体を、酢酸エチル（０．５ｍＬ）およびヘキサン（５ｍＬ）からもう一度沈殿させ、残留物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。生成物を減圧ポンプで２時間乾燥させて、２０３ｍｇの橙色の固体を得た。
【０１６９】
トマト粉末。粉末（１５４ｇ）を酢酸エチル（３２０ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩（１７時間）静置させた。混合物を、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（２×１００ｍＬ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。濾液を合わせ、濃縮し、約１４ｍＬの溶液を残した。綿（３×３ｍＬの酢酸エチルで濯ぐ）に通して濾過し、約７ｍＬに濃縮し、０．２μｍのシリンジフィルタ（合計３ｍＬの酢酸エチルで少量ずつ濯いだ）に通して濾過した。溶媒の蒸発により、２．１５ｇの赤色の油が得られた。油を酢酸エチル（２．５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（１００ｍＬ）を撹拌しながら添加した。３０分後、液体をデカントし、固体沈殿物をヘキサンで濯いだ（３×３ｍＬ）。沈殿物を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解し、少量の不溶性白色物質を、濾紙（１０ｍＬの酢酸エチルで濯いだ）に通した吸引濾過によって除去した。ロータリーエバポレーターでの溶媒の蒸発の後、減圧ポンプで１時間乾燥することにより、赤色固体（４５３ｍｇ）が得られた。
【０１７０】
赤色固体を酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解した。少量の白色沈殿物は溶解できず、遠心分離によって除去した。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（１．３ｍＬ）に再度溶解した。ヘキサン（１３ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、３０分後に液体をデカントし、沈殿物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。沈殿物を酢酸エチルに溶解し（ゆっくりとしたプロセスであり、ロータリーエバポレーターの浴上で３５〜５０℃に温まるのに１時間を要する）、次いで溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、減圧ポンプで２．５時間乾燥して、赤色固体（４００ｍｇ）が得られた。
【０１７１】
トマトの搾りかす。トマトの搾りかす（５０５ｇ）を酢酸エチル（約１．５Ｌ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩静置させた。４回に分けて焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、それぞれ酢酸エチルで濯いだ（３×８０ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。合わせた溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残油をＮ２の流れの下で２時間乾燥して、６５．２８ｇの赤色油を得た。撹拌しながらヘキサン（５００ｍＬ）を油に滴下し、混合物を一晩撹拌させた。朝、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（５×４．５ｍＬ）。沈殿物を酢酸エチル（９ｍＬ）に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（４×３ｍＬ）。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を減圧ポンプで乾燥することにより、８３２ｍｇの濃厚な樹脂様赤色油が得られた。
【０１７２】
油を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）で沈殿させ、混合物を３０分間撹拌させた。液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯ぎ（４×１．５ｍＬ）、酢酸エチルに溶解した。溶媒を蒸発させ、残留物を減圧ポンプで乾燥させて、６９０ｍｇの赤色樹脂を得た。別の沈殿を、酢酸エチル（１．５ｍＬ）およびヘキサン（１５ｍＬ）を使用して実施し、ヘキサンで沈殿物を濯いだ（４×１．５ｍＬ）。溶媒の蒸発と、生成物を減圧ポンプで３時間乾燥させることにより、６３２ｍｇの赤色樹脂が得られた。
【０１７３】
樹脂を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、合計で１ｍＬの酢酸エチルの少量ずつで濯いだ。ヘキサン（２０ｍＬ）を、合わせた濾液に滴下して、沈殿物を得た。液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（４×１．５ｍＬ）。減圧ポンプの残留物を乾燥することにより、５０９ｍｇの赤色固体が得られた。
【０１７４】
アルファルファ。天日乾燥したアルファルファを、コーヒーグラインダで約２０秒間挽いて、粗く粉砕された材料（２６３ｇ）を得た。酢酸エチル（０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩静置させた。翌日、別々に４回に分けて焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、それぞれを酢酸エチルで濯いだ（２×１５０ｍＬ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮して約５５ｍＬにし、０．４５μｍシリンジフィルタに通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（３×３ｍＬ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。溶媒の蒸発により、濃厚な暗緑色のゲル（３．６８ｇ）が得られた。
【０１７５】
酢酸エチル（６．５ｍＬ）をゲルに添加したが、完全には溶解しなかった。０．４５μｍのシリンジフィルタに通して再び濾過し、酢酸エチルで濯いだ（４×１ｍＬ）。溶媒を蒸発させて、濃厚な暗緑色の油（３．３９ｇ）を得た。
【０１７６】
油を酢酸エチル（６ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。添加終了後、撹拌を止め、混合物を一晩静置させた。朝、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（４×３ｍＬ）。固体を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒をロータリーエバポレーターで除去して、３４５．４ｍｇの濃厚な暗緑色の油を得た。
【０１７７】
油を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（４×１．５ｍＬ）。固体を酢酸エチル（３ｍＬ）に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（４×０．７ｍＬ）。ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させた後、減圧ポンプで３０分間乾燥して、暗緑色の固体（２９２ｍｇ）を得た。
【０１７８】
固体を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（１０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、液体をデカントし、固体残留物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。残留物を酢酸エチル（２．５ｍＬ）に溶解し、０．２μｍのシリンジフィルタ（４×０．５ｍＬの酢酸エチルで濯いだ）に通して濾過した。合わせた溶媒を蒸発させ、残留物を減圧ポンプで３時間乾燥して、暗緑色の固体（２５７ｍｇ）を得た。
【０１７９】
バラの実の粉末。粉末（４０５ｇ）を酢酸エチル（４００ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩静置させた。朝、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に、２回に分けて通して濾過し、それぞれを酢酸エチルで濯いだ（２×１００ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、酢酸エチル（４０ｍＬ）を残留物に添加した。撹拌から１．５時間後、いくらかの白色沈殿物が観察された。遠心分離によって除去し、管を酢酸エチル（合計で約８ｍＬ）で濯いだ。液体画分を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮して約１５ｍＬにした。より多くの沈殿物が観察され、上述のように遠心分離によって除去した。液体画分を合わせ、溶媒を蒸発させて、橙色の固体（２．５３ｇ）を得た。酢酸エチル（１５ｍＬ）を添加し、混合物を一晩撹拌した。朝、いくらかの微細な白色沈殿物が見えた。ヘキサン（２００ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、３０分後、濁った混合物を、紙に通して吸引濾過し、ヘキサンで濯いだ（４×３ｍＬ）。残留物を、４０℃の酢酸エチル：メタノール（１：１、４ｍＬ）に溶解し、次いで溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を減圧ポンプで一晩乾燥して、５６０ｍｇの橙色の固体を得た。
【０１８０】
パプリカ。パプリカ（２３２ｇ）を酢酸エチル（約３００ｍＬ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩静置させた。混合物を、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（３×８０ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターで約３０ｍＬに濃縮した。０．４５μｍのシリンジフィルタ（３×３ｍＬの酢酸エチルで濯いだ）に通して濾過し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を、Ｎ２の流れの下で４．５時間乾燥して、暗赤色の油（２５．７８１１ｇ）を得た。酢酸エチル（１ｍＬ）を油に添加し、その後、撹拌しながらヘキサン（６５ｍＬ）を滴下した。１時間後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（４×３ｍＬ）。酢酸エチル（１０ｍＬ）を残留物に添加したが完全には溶解しなかった；メタノール（３ｍＬ）の添加により残留物を溶解させた。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を減圧ポンプで乾燥して、濃厚な赤色油（３０６ｍｇ）を得た。
【０１８１】
油を酢酸エチル：メタノール（２：１、０．５ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２５ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、濃厚な赤色油が、最上部の透明な橙色の液体層とは別に、フラスコの底面および側面を被覆した。橙色の液体をピペットにより除去し、赤色油をヘキサンで２回濯いだ（６ｍＬ＋３ｍＬ）。赤色油を酢酸エチル：メタノール（２：１）に溶解し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を減圧ポンプで乾燥した。溶媒が蒸発するにつれ、油はより濃厚になり、乾燥させるのがより難しくなった。さらなる乾燥は、樹脂の表面が乱れるようにＮ２の流れを使用し、次いで泡立ちが止むまで約５分間穏やかに加熱しながら減圧ポンプ上に置くことによって、実現した。Ｎ２の流れと減圧ポンピングとが交互になされる数サイクル後、樹脂を４５〜５０℃の油浴に入れ、１時間減圧乾燥して、粘性の暗赤色の油（２５０ｍｇ）を得た。
【０１８２】
ダルス海藻粉末。粉末（３５１ｇ）を酢酸エチル（約４００ｍＬ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）で覆い、一晩静置させた。朝、混合物を、２回に分けて、焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、それぞれを酢酸エチルで濯いだ（２×１００ｍＬ；０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴ）。濾液を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮して約９ｍＬに減少させた。１時間静置させた後、液体を、０．４５μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、酢酸エチルで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。濾液を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残留物を、Ｎ２の流れの下で２０分間乾燥させて、濃厚な暗緑色の油（１．７９ｇ）を得た。
【０１８３】
油を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（５０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。１時間後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（４×１．５ｍＬ）。残留物を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒を蒸発させ、残留物を減圧ポンプで４５分間乾燥させて、暗緑色の粘性の油（３３９ｍｇ）を得た。
【０１８４】
油を酢酸エチル（１ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２５ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。３０分後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。残留物を酢酸エチルに溶解し、次いで溶媒を蒸発させ、生成物を減圧ポンプで１時間４５分乾燥させて、暗緑色の固体（２６４ｍｇ）を得た。
【０１８５】
３回目の沈殿を、酢酸エチル（１ｍＬ）およびヘキサン（１０ｍＬ）を使用して以前のように実施し、ヘキサンで濯いだ（３×１．５ｍＬ）。固体を酢酸エチルに溶解し、０．２μｍのシリンジフィルタに通して濾過した。溶媒を、Ｎ２の流れの下で蒸発させ、残留物を減圧ポンプで１時間４０分乾燥させて、暗緑色の固体（２２２ｍｇ）を得た。
【０１８６】
ウィートグラス粉末。ウィートグラス粉末（４０１．０９ｇ）を、１Ｌビーカーに入っている酢酸エチル（７００ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴを含有）と混合し、アルミ箔で覆い、３日間静置させた。スラリを、２回に分けて、粗い焼結ガラスＢｕｃｈｎｅｒ漏斗に通して濾過し、それぞれの分量を酢酸エチルで濯いだ（３×７０ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ  ＢＨＴを含有）。濾液を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーターで除去して、暗緑色の高粘度の液体を得た。これを酢酸エチル（１０ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（５００ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。添加終了から１時間後、液体を紙に通して吸引濾過し、ヘキサンで濯いだ（４×３ｍＬ）。残留物を酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶解し、０．４５μｍのシリンジフィルタに通して濾過し、酢酸エチル（３ｍＬ）で濯いだ。溶媒を蒸発させて、暗緑色の固体（５９９ｍｇ）を得た。酢酸エチル（８ｍＬ）を緑色固体に添加したが溶解せず、したがってメタノール（１ｍＬ）を添加し、混合物を溶解した。ヘキサン（９０ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、添加終了から１時間後、液体をデカントした。固体沈殿物をヘキサンで濯ぎ（４×３ｍＬ）、減圧ポンプで１時間乾燥させて、暗緑色の固体（４０９ｍｇ）を得た。固体を８：１の酢酸エチル：メタノール（２ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２０ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。添加終了から１時間後、液体をデカントし、残留物をヘキサンで濯いだ（４×３ｍＬ）。残留物を減圧ポンプで３時間乾燥させて、暗緑色の固体（３７１ｍｇ）を得た。
結果
ニンジン粉末からのカロテノイド−酸素コポリマー化合物の直接単離。
【０１８７】
ニンジン粉末中に存在するＧＡから推定された高レベルのＯｘＰＶＡが与えられ（ニンジン粉末＃１中、約０．５ｍｇ／ｇ）、またβ−カロテンからのＯｘＢＣポリマーが極性であり、無極性溶媒に不溶であることがわかっているので、溶媒沈殿によるカロテノイド−酸素コポリマー生成物の直接単離を試みた。事実、ニンジン粉末＃１の酢酸エチル抽出物へのヘキサンの添加は、褐色沈殿物をもたらした。回収された固体を酢酸エチルに再溶解し、ヘキサンで再び沈殿させ、手順を繰り返すことにより、褐色の固体が得られ、この固体は約０．７ｍｇ／ｇで、推定されるＯｘＰＶＡレベルの約１．４倍であり、ＧＡベースの推定に関して予想される範囲内に十分含まれる（表２の単離されたポリマーおよびポリマー／ＯｘＰＶＡの欄を参照）。類似の比（１．６）がニンジン粉末＃２に関して見出され、これに関するコポリマーの収量は、ニンジン粉末＃１の場合の約半分であり、ＧＡのそれぞれの相対量と一致した。単離された固体の大部分がカロテノイド−酸素コポリマー生成物から構成されることの確認は、元素組成、ＩＲ、ＵＶ−Ｖｉｓ、ＧＰＣ、およびＧＣ−ＭＳ熱分解データの、ＯｘＢＣポリマーに関する対応データとの比較によって提供された。
【０１８８】
ニンジン粉末＃１および＃２の抽出物から単離された生成物の、炭素、水素、酸素、および窒素に関する元素分析は、それらが炭素、水素、および酸素のほぼ全体から構成されかつ微量の窒素を含むことを確認し、高レベルの酸素を特徴とした（約２４％、表５）。β−カロテン（Ｃ４０Ｈ５６）に関する分子式に対して計算された元素Ｃ、Ｈ、およびＯの実験式を、表４に示す。ニンジン粉末＃１および＃２に関する結果、即ちそれぞれＣ４０Ｈ６４Ｏ１１およびＣ４０Ｈ６８Ｏ１１は、各カロテン分子に対する、平均して約５〜６個のＯ２分子の付加と一致している。この数は、ＯｘＢＣポリマーまたは空気中の固体β−カロテンの酸化に関する、約７個のＯ２よりもいくらか少ない（表４）。これは反応条件における可能性ある相違であり、共役二重結合が１つ少ないα−カロテンの存在は、より少ない酸素分子との反応をもたらす。興味深いことに、ニンジン粉末の実験式は、Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍから単離されたスポロポレニンの実験式と非常に類似している（表４）。スポロポレニンバイオポリマー、即ち花粉および胞子の保護外被の一体化成分は、カロテノイド−酸素共重合によって形成されることが提示されてきた２０。
【０１８９】
ニンジン粉末抽出物のＩＲスペクトルは、ＯｘＢＣの場合に対して高度な類似性を示す（図７）。既に本発明者らは、ＯｘＢＣおよびＬｙｃｏｐｏｄｉｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍスポロポレニンのＩＲスペクトルも、顕著に類似することを示した１３。
【０１９０】
図８に示されるニンジン粉末抽出物のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、ＯｘＢＣポリマーの場合と非常に類似している。両方のスペクトルは、約２０５ｎｍでのピーク、ならびに約２３５および２８０ｎｍでの２つのブロードなショルダーによって特徴付けられる。これらの吸収は、コポリマー中のカルボキシル（２０５ｎｍ）、α，β−不飽和カルボニル２１、２２（２３５ｎｍ）、および共役ジエノン２３（２８０ｎｍ）基の存在と一致している。これらの吸収の相対強度は、関連ある官能基の相対的存在度に応じて様々になり、図８に見られるような、ＯｘＢＣとニンジン粉末＃１との吸収プロファイルの小さい差を説明することができる。
【０１９１】
主要なポリマーＯｘＢＣのＧＰＣ分子量プロファイルについては、既に記述してきた１３。ニンジン粉末抽出物のポリマーの性質は、図９に示されるＧＰＣトレースに示される。ＯｘＢＣポリマーに関する、上に重ねられたトレースの単一のブロードな対称ピークとの比較は、ニンジン粉末生成物がより複雑であることを示す。単一ＯｘＢＣポリマーピークと広範に一致する２つのピークに加え、早期の溶出ブロードピークがあり、より大きい分子量のポリマー成分が存在することを示している。溶出時間に対する、ニンジン粉末ＧＰＣクロマトグラムのＵＶ−Ｖｉｓ断面分析は、ピークを横切る一貫した均一性の程度が、本質的にはカロテノイド−酸素コポリマーで構成されることを示す。上述の、同じ全般的なＵＶ−Ｖｉｓスペクトルプロファイルは、全体を通して明らかであり、表示される強度の変化は、ほとんどが２３５ｎｍの吸収領域にあった（データは図示せず）。
【０１９２】
ニンジン粉末コポリマーの、より大きい分子量の拡がりは、酸化が生ずるニンジンマトリックス環境の不均質な性質に起因した。ＯｘＢＣを形成するためのβ−カロテンの酸化は、溶媒中にβ−カロテンおよび酸素のみ含むのに対し、ニンジンマトリックス中での酸化は、追加の分子種（α−カロテンを含む）の存在下で生じ、エマルジョン、ミセル、および膜を含むことができる不均質環境内で引き起こされるようである。エマルジョン中のラジカル自動酸化反応は、ラジカル−ラジカル終結が生ずる前に、より長い鎖長で進行することができ、その結果、より大きい分子量のポリマーが得られる。
【０１９３】
ニンジン粉末抽出物の、同定可能な低分子量生成物への熱分解も、化合物のカロテノイド−酸素コポリマーの性質を裏付ける。比較のため、ＯｘＢＣポリマー画分（即ち、低ＭＷノルイソプレノイドを差し引く）の、ＧＣ−ＭＳ機器の加熱インジェクタポートへの注入は、数多くの低ＭＷ化合物への迅速な熱分解をもたらし、そのいくつかは、保持時間、ならびに質量スペクトルと参照データベース情報との比較によって同定することができる。ＭＳデータベース１９に対して５０％よりも良好な一致が見られる６種の化合物は、分解生成物において容易に同定された。これらには、周知のノルイソプレノイド、β−シクロシトラール、ジヒドロアクチニジオリド、４−オキソ−β−イオノン、および５，６−エポキシ−β−イオノンが含まれる（図１０）。これらの生成物中の不飽和カルボニル基の存在は、それらおよび関連ある基が当初の前駆体コポリマー中に存在することを反映している。同じ６種の化合物は、ニンジン粉末＃２のＧＣ−ＭＳにも存在する（図１０）。α−イオノンと同定された第７の生成物は、α−カロテンコポリマーに由来するようである。
その他の食品からのカロテノイド−酸素コポリマー化合物の単離
【０１９４】
かなりの量のポリマー材料を含有する固形分を、トマト粉末、トマトの搾りかす、バラの実の粉末、パプリカ、ダルス海藻粉末、天日乾燥アルファルファ、およびウィートグラス粉末の、酢酸エチル抽出物のヘキサン沈殿によって容易に単離した（表２の最後の２つの欄を参照）。元素分析は、化合物が、本質的に炭素、水素、および酸素から構成され、かつ少量の窒素（１〜２％）を含み、高い含量の酸素（２１〜３９％）を特徴とすることを確認した（表４および表５）。ＧＰＣ分析は、化合物のポリマーの性質を確認し（図１１）、酢酸エチル中の単一の純粋な候補のカロテノイドの酸化から得られたコポリマーと比較して、より複雑な性質を示す（図９および１２）。対応するＦＴＩＲスペクトル（図７および１３）は、互いに対してかつ完全酸化βカロテンおよびリコペン（図７）ならびに完全酸化ルテインおよびカンタキサンチン（図１４）のスペクトルに対して、高度な類似性を示す。
【０１９５】
単離したポリマーの収量と、対応する推定されたＯｘＰＶＡレベルとの比較であって、表２でポリマー／ＯｘＰＶＡ比として計算された値は、ニンジン粉末に関する約１の値よりも何倍も大きい値を示す。このことは、千分率レベルで生成物が得られるように酸化重合にも関与する、リコペン、ルテイン、およびカプサンチンを含むその他のカロテノイドの豊富さを反映する（例えば、トマト、バラの実粉末、およびパプリカ）。
【０１９６】
トマト粉末の実施例では、リコペンが主要なカロテノイドである。既に報告されたように１３、リコペンは、β−カロテンよりもさらに迅速に酸素と反応し、より大きい分子量のコポリマーを、明らかにさらに多量に形成する。ＯｘＬｙｃに関する表４の実験式は、リコペン当たり平均して７〜８個のＯ２が付加されることを示す。トマト粉末抽出物に対応するデータは、ニンジン粉末に比べて酸素（７〜８個のＯ２）の高い取込みを示し、Ｃ、Ｈ、Ｏの実験式（Ｃ４０Ｈ６２Ｏ１５）はＬｉｌｉｕｍ  ｈｅｎｒｙｉｉスポロポレニン（表４）の場合に類似している。
【０１９７】
表２は、トマト粉末から単離されたポリマー生成物が、推定されるＯｘＰＶＡレベルを１００倍よりも大きく超えることを示す。その他の汚染化合物が存在する可能性があるが、リコペンは、加工されたトマト生成物におけるそのような範囲でβ−カロテンを超えることができることが、公知である２４。ＯｘＬｙｃ、ＯｘＢＣ、およびニンジン粉末コポリマーのスペクトルに対するＩＲスペクトルの高度な類似性（図７）は、汚染化合物のレベルが有意ではないことを示唆する。
（実施例４）
リコペンおよびγ−カロテンの自動酸化のマーカーとしてのゲラン酸
【０１９８】
この実施例は、ゲラン酸（Ｉ）を、リコペンおよびγ−カロテンの自動酸化のマーカーとすることができることを示す。
【化１】
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【０１９９】
このマーカー化合物は、完全自動酸化リコペン（ＯｘＬｙｃ）において同定されており、完全自動酸化γ−カロテン中に存在することも予測される。本発明者らは、この化合物を、溶媒沈殿によってポリマー画分を除去した後のＯｘＬｙｃの低ＭＷ画分中で同定した。同定はＧＣ−ＭＳによって行い、質量スペクトルライブラリで３９％の一致が見出された。水性Ｎａ２ＣＯ３での抽出によるＯｘＬｙｃの酸画分の単離、およびその後の、水性ＨＣｌによる酸性化、次いでジエチルエーテルによる抽出と、ＧＣ−ＭＳへの注入は、８０％のＧＣ−ＭＳライブラリの一致をゲラン酸にもたらした。参照標準はＡｌｄｒｉｃｈから購入して、ＧＣ−ＭＳにより構造を比較し確認した（８７％のライブラリの一致）。Ｍｅ３ＯＢＦ４による酸のエステル化は、ゲラン酸メチルをもたらし（図１５Ａ参照；８３％のＧＣ−ＭＳライブラリの一致）；ＯｘＬｙｃの低ＭＷ画分をそのエステル化条件に供することによってもゲラン酸メチルが得られた（７６％のＧＣ−ＭＳライブラリの一致）。
【０２００】
図１５Ａは、Ｍｅ３ＯＢＦ４によるゲラン酸のエステル化によってゲラン酸メチル（化合物Ａ）が得られることを示す。重水素標識されたゲラン酸の、提案された合成を、図１５Ｂに提示する。この化合物は、食品中のゲラン酸の量を測定するための内部標準として使用することができ、したがって、酸化リコペンと、間接的にはその関連あるコポリマーとの量の推定を提示することができる。リコペンの１当量は、ゲラン酸の２当量を発生させることができるのに対し、γ−カロテンの１当量は、ゲラン酸の１当量のみを発生させるはずである。
【０２０１】
Ｍｅ３ＯＢＦ４でエステル化された、トマト粉末およびトマトの搾りかすの抽出物の試料は、ゲラン酸メチルの存在を示した（それぞれ、４５％および６５％のライブラリの一致）。図１５Ｃは、エステル化トマト粉末抽出物（上）と、ＯｘＬｙｃ低ＭＷ画分（下）とのＧＣクロマトグラムを示し、ゲラン酸メチルは化合物Ａとして示される。保持時間の相違は、分析条件におけるいくつかの小さな相違の結果であり、例えば、ＧＣカラムが試料間で整えられたことに起因し、その結果、ＯｘＬｙｃ低ＭＷの実験操作では、より短い保持時間が得られる。エステル化されたバラの実の抽出物のＧＣ−ＭＳ分析も、ゲラン酸メチルの存在を明らかにした（７５％のライブラリの一致）。
（実施例５）
食品中のカロテン−酸素コポリマーの増強
【０２０２】
この研究は、酸化を増大させることがわかっている因子が、食品中のカロテノイド−酸素コポリマーのレベルを上昇させ得ることを示すように、設計した。ゲロン酸は、カロテノイド−酸素コポリマー含量の指示物質として働くことが、既に公知である（Burtonら５３）。この研究は、酸化を増大させることが予測される条件に曝露されたニンジン中のゲロン酸の増加を測定することによって、そのような事実を利用する。それらの条件には、増大した表面積（ピューレ形成、粉末化）、脱水、熱、および光が含まれる。
実験設計
【０２０３】
上部および底部を切り取った、新鮮な、皮を剥いたニンジンを水で濯ぎ、ペーパータオルで軽く叩くように水気を取り、フードプロセッサで細かく細断した。ニンジンの細片を、ゲロン酸に関して分析して、新鮮なニンジン中の含量を決定した（詳細な手順に関しては下記のアッセイ方法を参照）。また細片を、フードプロセッサを使用してピューレ状にし、約１／４インチの厚さでパーチメント紙上に塗り拡げ、食品乾燥機（Ｅｘｃａｌｉｂｕｒ  ３９２６ＴＢ）内で１０時間、約５２〜５３℃で脱水し、次いで約８時間で室温に冷ました。乾燥ピューレを、ゲロン酸およびβ−カロテン含量に関して分析した（詳細な手順に関しては下記のアッセイ方法を参照）。残りの乾燥ピューレを、フードプロセッサのブレードを使用して粉末化し、次いで台所用濾し器に通して篩い分けることにより、大きい粒子を除去した。ニンジン粉末を、アルミ箔で裏打ちされたトレイ（４６ｃｍ×３６ｃｍ）上に薄く塗り拡げ、オープンスペースに置いた。トレイの上方約１．１メートルの蛍光灯による照明を使用して、周囲光条件への曝露をほぼシミュレートした。ニンジン粉末の試料は、ゲロン酸およびβ−カロテン含量の分析のため、５〜９日離した間隔で得た（詳細な手順に関しては下記のアッセイ方法を参照）。粉末の試料を得る前に、トレイを穏やかに振盪させて、上部の粉末とその下にある粉末とを混合した。
アッセイ方法
新鮮なニンジンのゲロン酸アッセイ
上部および底部を切り取った、新鮮な、皮を剥いたニンジンを濯ぎ、ペーパータオルで叩くように水気を取り、次いでフードプロセッサを使用して細かく細断した。ニンジン細片２３０〜４００ｇを１Ｌビーカーに入れ、その後、ゲロン酸−ｄ６溶液０．４ｍＬ（メタノール中、０．００１６０４ｍｇ／ｍＬ）、ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン；４〜５ｍｇ）、およびクロロホルム（ＣＨＣｌ３）（４００〜５００ｍＬ）を入れた。混合物を２０分間、１３，５００ｒｐｍで均質化し、次いでホモジナイザを止め、液体をビーカーに排出させ、ホモジナイザの内部および外部をＣＨＣｌ３で濯いだ（合計で４×１．５ｍＬ）。全ての材料を２Ｌ分液漏斗に移し、橙色のＣＨＣｌ３層を橙色のパルプから分離し、パルプをビーカーに戻した。ＣＨＣｌ３（３００〜４００ｍＬ、２〜４ｍｇのＢＨＴを含有）をパルプに添加し、５分間均質化した。ＣＨＣｌ３層を以前のように分離し、ＣＨＣｌ３抽出物を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。ＣＨＣｌ３を添加して（１５ｍＬ）、残留物を溶解し、混合物を乾燥し（ＭｇＳＯ４）、綿に通して濾過し、ＣＨＣｌ３（合計で１５ｍＬ）で濯いだ。水性ＫＯＨ（２５ｍＬ；約９０ｍｇのＫＯＨを５０ｍＬの水に溶解することによって調製された）をＣＨＣｌ３溶液に添加し、５分間激しく撹拌した。混合物を分液漏斗に移し、ＣＨＣｌ３のほとんどを除去し、残りの液体を５分間遠心分離した。水性層を分離し、酸性化し（１Ｍ  ＨＣｌを約３ｍＬ）、ＣＨＣｌ３で抽出した（２×１５ｍＬ）。合わせた抽出物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物をメタノール（９ｍＬ）に溶解し、固体ＮａＨＣＯ３（約０．１ｇ）を添加し、混合物を撹拌した。水性ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ、１Ｍ）を添加し、その後、Ｍｅ３ＯＢＦ４（約０．３ｇ）を添加した。１５分撹拌した後、９ｍＬの水（Ｈ２Ｏ）を添加し、撹拌し、混合物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で抽出した（２×７．５ｍＬ）。合わせたＣＨ２Ｃｌ２抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、綿に通して濾過し、溶媒を、ロータリーエバポレーターで、室温で慎重に蒸発させた。残留物を０．２ｍＬのアセトニトリルに溶解し、１μＬをＧＣ−ＭＳに注入した（スプリットレス注入、ＳＩＭモードモニタリングイオン１５４．１および１６０．１）。
乾燥したニンジンピューレまたは粉末のゲロン酸アッセイ
【０２０４】
この手順で使用される全ての酢酸エチルは、０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＨＴを含有していた。乾燥したニンジンピューレまたは粉末約３．５ｇを、５０ｍＬの試験管に計量した（ニンジンピューレは、管の底に適合するようにスパチュラで潰した）。管に、１５ｍＬの酢酸エチルおよびゲロン酸−ｄ６（メタノール中０．６４〜１３μｇ）を添加した。混合物を１０分間、１３，５００ｒｐｍで均質化し、次いで６，５００ｒｐｍで１０分間均質化した。ホモジナイザを止め、液体を管に排出させ、ホモジナイザの内部および外部を酢酸エチルで濯いだ（合計で４×１．５ｍＬ）。全ての材料を、２×１５ｍＬの遠心分離試験管に移し、遠心分離した（約５分）。上澄みを５０ｍＬの丸底フラスコに移し、溶媒を蒸発させた。この時点で、フラスコをアルゴン下で封止し、翌朝までフリーザ内で一晩保存した。次いで５％のＮＨ３水溶液６ｍＬ、およびＨ２Ｏ  ３ｍＬを添加し、２０分間激しく撹拌した。その間、ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸ、５００ｍｇ／６ｍＬ）を、下記の溶液に順に通すことによって準備した：メタノール（６ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（６ｍＬ）、０．５％のＮＨ３水溶液（４．５ｍＬ）。次いで分析物の塩基性溶液を、重力によってカートリッジに通した（ピペットバルブによる圧力は、流動が非常に遅い場合は許容される）。次いでカートリッジを０．５％のＮＨ３水溶液（４．５ｍＬ）で洗浄し、その後メタノール（９ｍＬ）で洗浄した。次いでカルボン酸を、メタノールに２％のＨＣｌを溶かした溶液（４．５ｍＬ）に通してカートリッジから溶出し、２０ｍＬのシンチレーションバイアルに収集した。固体ＮａＨＣＯ３を添加し、泡立ちが止むまで（約３０秒）撹拌した。次いで１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（１ｍＬ）を添加し、濁った溶液を得た。溶液を、Ｍｅ３ＯＢＦ４が添加される間（約０．３ｇ）、穏やかに撹拌した。混合物を１５分間激しく撹拌し、バイアル中の少量の固体ＮａＨＣＯ３の存在を確実にすることによって（目視検査−必要に応じてさらに添加する）僅かに塩基性に維持した。１５分後、６ｍＬのＨ２Ｏを添加し、撹拌し、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（２×６ｍＬ）。合わせたＣＨ２Ｃｌ２抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、綿に通して濾過し、溶媒を室温で、ロータリーエバポレーターで慎重に蒸発させた。残留物を０．２ｍＬのアセトニトリルに溶解し、必要に応じて０．２μｍのＴｅｆｌｏｎシリンジフィルタに通して濾過し、１μＬをＧＣ−ＭＳに注入した（スプリットレス注入、ＳＩＭモードモニタリングイオン１５４．１および１６０．１）。
乾燥したニンジンピューレまたは粉末のβ−カロテンアッセイ
【０２０５】
この手順で使用した全ての酢酸エチルは、０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＨＴを含有した。乾燥したニンジンピューレまたは粉末約１．０ｇを、５０ｍＬの試験管に計量した。管に、２０ｍＬの酢酸エチルを添加した。１０分間、１３，５００ｒｐｍで均質化し、次いでホモジナイザを止め、液体を管に排出させ、ホモジナイザの内部および外部を酢酸エチルで濯いだ（５×１．５ｍＬ）。全ての材料を、２×１５ｍＬ遠心分離試験管に移し、約５分間遠心分離し、上澄みを１００ｍＬのメスフラスコに移した。残留物を、５０ｍＬ試験管に移し戻し、必要に応じて遠心分離管を酢酸エチルで濯いで、完全な移送を確実にした。合計で２０ｍＬの酢酸エチルを残留物に添加し、３分間、６，５００ｒｐｍで均質化した。混合物を遠心分離し、以前のように分離し、残留物をもう一度抽出した（３分、６，５００ｒｐｍ）。３回の全ての抽出からの液体を、１００ｍＬのメスフラスコ内で合わせ、酢酸エチルで体積まで希釈し、３０回反転させて混合した。この濁った橙色の溶液１ｍＬを、０．２μｍのＴｅｆｌｏｎシリンジフィルタに通して、１ｍＬの容量バイアル内に濾過した。溶液をピペットで１０ｍＬのメスフラスコに移し、数回に分けた酢酸エチルで慎重に濯いで、完全な移送を確実にした。溶液は、酢酸エチルで１０ｍＬのマークまで構成され、３０回反転させて混合し、溶液の吸光度を４５４ｎｍで測定した。先に決定されたβ−カロテン消光係数２３７．６７ｍＬ・ｍｇ−１・ｃｍ−１を使用して、溶液中のβ−カロテンの量を計算した。
結果および考察
【０２０６】
新鮮な、細断したニンジンは、４．９ｎｇ／ｇのゲロン酸を含有することがわかった（表６）。ニンジンピューレの脱水は、８９．５％の質量減少をもたらした。表６に見られるように、０日目の、加工されたニンジン中のゲロン酸の量は、ピューレ形成および脱水後に約２０倍に増加した。ゲロン酸の上昇レベルは、脱水中の質量の１０分の１の減少と、いくらかの酸化との両方の結果である。乾燥したピューレを粉末化し、それを薄くトレイ上に塗り拡げて空気および光に曝露することによるさらなる加工は、５日後にゲロン酸の約９倍の増加を引き起こし、それに付随してβ−カロテンが減少した（表６）。２１日後、ゲロン酸は、４１５５ｎｇ／ｇに実質的に増加し、β−カロテンは、出発時の量の半分未満に減少した。
【０２０７】
図１６は、β−カロテンの減少に対するゲロン酸の上昇の、逆の関係をグラフで示す。ゲロン酸の変化を、各時点でのβ−カロテンの変化によって割ることで、およそ一定の比が得られ（表６）、ゲロン酸の生成はβ−カロテンの酸化的損失に密接に関連することが示される。
【０２０８】
表６は、ニンジン中のゲロン酸およびβ−カロテンのレベルに対する加工の影響を示す。
【０２０９】
脱水の様々な段階を経て進行するときの、加工済みニンジンの画像を、図１７に示す。当初のニンジンピューレは、１日後の脱水したピューレおよび粉末でそうであるように、明るい橙色であるが、２１日後に撮影されたニンジン粉末の写真で見られるように、時間と共に橙色は褪せる。色抜けは、β−カロテンの酸化と、関連あるゲロン酸および間接的にカロテノイド−酸素コポリマーの形成を示す。
【０２１０】
酸化を高める際のニンジンの空気曝露および物理的状態の重要性の視覚的例示を、図１８に示すが、これらはニンジン粉末の２つのバイアルを対照させている。左側の橙色の粉末のバイアルは、ニンジンチップ（新鮮なニンジンから約１／４インチの厚さにカットした）を脱水し、それらをコーヒーブレードミルで粉砕し、次いで封止したバイアル内で４週と６日間静置させることにより、調製した。
【０２１１】
右側の、バイアル内のより微細な薄褐色の粉末は、ニンジンピューレを脱水し、フードプロセッサで粉末化し、次いで粉末を、Ｂａｒａｔｚａ  Ｖｉｒｔｕｏｓｏ  Ｃｏｆｆｅｅ  Ｂｕｒｒ  Ｍｉｌｌで一定のサイズに粉砕することにより調製した。粉末を、最も粗い設定４０で、次いで再び３０で、最後に２０で粉砕した。粉末を、アルミ箔で裏打ちされたトレイ上に置き、空気に１週と６日間曝露したが、光を排除しようとはしなかった。
【０２１２】
左側の、バイアル内に封止されたニンジン粉末は、４週と６日後に明るい橙色のままであるが、ちょうど１週と６日間空気に曝露された右側のバイアルの粉末は薄褐色であり、β−カロテンが、より大幅に失われたことを示す。
【０２１３】
この実験は、β−カロテン酸化の程度を高めるための、細かく分割されたニンジン粉末と空気への容易な接触との重要性を示す。
（実施例６）
ルテイン、ゼアキサンチン、およびカプサンチンの自動酸化の、４−ヒドロキシゲロン酸およびそのラクトンマーカー。
【０２１４】
４−ヒドロキシゲロン酸およびそのラクトンは、完全酸化ルテインまたはゼアキサンチン、および原則としてカプサンチンのマーカーである。ラクトンを、ルテインのオゾン分解から単離し、ＮＭＲ（１Ｈ，１３Ｃ）、エレクトロスプレーＭＳおよびＧＣ−ＭＳにより同定した。溶媒沈殿によるポリマー画分の除去後に得られたＯｘＬｕｔの低ＭＷ液体画分は、ＧＣ−ＭＳによって確認されるようにラクトンを含有した。水性Ｎａ２ＣＯ３でＯｘＬｕｔの低ＭＷ液体画分を抽出し、その後、水性ＨＣｌで酸性化し、ジエチルエーテルで抽出することにより、ＧＣ−ＭＳ分析でラクトンが得られた。Ｍｅ３ＯＢＦ４によるエステル化に供したとき、ラクトンは開裂し、脱水して、ゲロン酸４，５−ジデヒドロメチル（化合物Ｂ、図１９Ａ）が得られる。化合物Ｂは、１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳ分析によって確認された。
【０２１５】
図１９Ａは、その親ラクトンとＭｅ３ＯＢＦ４との反応による、ゲロン酸４，５−ジデヒドロメチル（化合物Ｂ）の形成を示す。化合物Ｂは、Ｍｅ３ＯＢＦ４でのエステル化により、ＯｘＬｕｔ低ＭＷ液体画分中に形成される。それは、ＧＣ保持時間および質量スペクトルの比較によって、ダルス粉末、海苔フレーク、およびＧｒｅｅｎｓ＋粉末（食餌用栄養補助食品）の、同様にエステル化された抽出物中にも同様に存在する。図１９Ｃは、ダルス粉末およびＯｘＬｕｔ低ＭＷ画分の、エステル化抽出物のＧＣクロマトグラムを示す。しかしパプリカ抽出物、カプサンチンの供給源のエステル化は、化合物Ｂの存在を明らかにしなかった。
【０２１６】
重水素標識ラクトンの、提案された合成を、図１９Ｂに提示する。この化合物は、食品中のラクトンの量を測定するための内部標準として使用することができ、したがって、酸化ルテインまたはゼアキサンチン、および間接的に関連あるコポリマーの、量の推定を提供することができる。イソ酪酸−ｄ６出発材料の調製は、Can.  J.  Chem.、９２巻、３０５〜３１６頁（２０１４年）のBurtonら１３に記載されている。
【０２１７】
図１９Ｃは、ダルス粉末抽出物、およびＯｘＬｕｔの低ＭＷ画分であって、Ｍｅ３ＯＢＦ４でエステル化されたものの、ＧＣクロマトグラムである。化合物Ｂは、ゲロン酸４，５−ジデヒドロメチルであり、その保持時間は７．３２分である。共通の質量スペクトルイオンは、ｍ／ｚ＝１８４（Ｍ＋）、１５２、１２５、１０９、８３、８１、６９、５５、４３を含む。
（実施例７）
カンタキサンチンの自動酸化の２，２−ジメチルグルタル酸およびその無水物マーカー
【０２１８】
２，２，−ジメチルグルタル酸およびその無水物は、完全酸化カンタキサンチンの潜在的なマーカーである。それらを、カンタキサンチンのオゾン分解から単離し、１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳによって同定した。溶媒沈殿によるポリマー画分の除去後に得られた、ＯｘＣａｎの低ＭＷ液体画分は、ＧＣ−ＭＳにより確認されるように（６９％の質量スペクトルのライブラリの一致）、無水物を含有した。カンタキサンチンのオゾン分解の反応生成物を、Ｍｅ３ＯＢＦ４によるエステル化に供し、２−２−ジメチルグルタル酸ジメチル（化合物Ｃ、図２０Ａ）を得た。化合物Ｃを単離し、その構造を１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＣ−ＭＳによって確認した。Ｍｅ３ＯＢＦ４によるＯｘＣａｎの低ＭＷ液体画分のエステル化も、化合物Ｃ（９１％のライブラリの一致）をもたらした。図２０Ａは、２，２−ジメチルグルタル酸からその無水物およびそのジメチルエステル、化合物Ｃへの変換を示す。
【０２１９】
重水素標識２，２−ジメチルグルタル酸の、提案された合成を、図２０Ｂに示す。この化合物は、食品中の２，２−ジメチルグルタル酸の量を測定するための内部標準として使用することができ、したがって、酸化カンタキサンチン、および間接的にその関連あるコポリマーの、量の推定を提示することができた。図２０Ｂのイソ酪酸−ｄ６出発材料の調製は、Burtonら１３、Can.  J.  Chem.、９２巻、３０５〜３１６頁（２０１４年）に記載されている。
表
【表１Ａ】
2019515247.tif 000004
a添加されたGA-d6内部標準の量、m6、=2.9μg。b方程式1を使用して、測定された強度比、I/I6から計算された。cセミカルバゾン誘導体を介して得られた角括弧内の値。dBHTを添加せず、試料の調製時間は32時間。eBHTを添加せず、試料の調製時間は8時間。f較正:I/I6  =  1.121  m/m6  -  0.029;  R2  =  0.996。g較正:I/I6  =  1.025  m/m6  -  0.031;  R2  =  0.999。
【表１Ｂ】
2019515247.tif 000005
a添加されたGA-d6内部標準の量、m6、=2.8μg。b方程式1を使用して、測定された強度比、I/I0から計算された。較正:I/I6  =  1.080  m/m6  +  0.044;  R2  =  0.999。
【表２】
2019515247.tif 000006
aGAの生成は、溶液中のモデルβ-カロテン酸化についてのそれと並行すると仮定して、プロビタミンAカロテノイド酸化生成物、OxPVAの推定された近似的総量=50×GAである。OxPVAは暗に、2つのその他のプロビタミンAカロテノイド、α-カロテンおよびクリプトキサンチン(表3)から、任意の、ほとんど少量の寄与を含み、これは原則として、β-カロテンからの2つに比べ、それぞれがカロテノイド分子当たりGA  1分子を寄与することができる。bプロビタミンAカロテノイドレベルの合計、PVA=α-+β-カロテン+クリプトキサンチンであり、生の食品に関しては文献の値を使用し、水の損失を調節した後の脱水形態に関する公称の当初の量として表される(表3)。γ-カロテンは、非常に少量のGAをOxPVA計算に寄与することもできる。c角括弧内の値は、親の生の形態に関する。d推定された全プロビタミンAカロテノイド-酸化生成物、OxPVAであって、文献をベースにした初期プロビタミンAカロテノイドレベル、PVAの合計のパーセンテージとしたもの。eヘキサンによる酢酸エチル抽出物から逐次沈殿により単離された脱水食品のグラム当たりの、カロテノイド-酸素コポリマー画分の重量(μg)。f  OxPVAに対する、単離されたポリマー画分の比。g薄褐色粉末。h橙色粉末。i生の甘唐辛子との比較。jドラム乾燥。k空気乾燥。
【表３】
2019515247.tif 000007
【表４】
2019515247.tif 000008
a乾燥食品抽出物からのコポリマー、OxLyc、OxLut、およびOxCanに関する元素分析データを、表5に提示する。bShaw31、314〜315頁のスポロポレニンに関するデータから計算される。
【表５】
2019515247.tif 000009
【表６】
2019515247.tif 000010
*β-カロテンの測定値は近似値である。アッセイは、丸ごとのニンジンの抽出物の吸光度を454nmで、即ちβ-カロテンの最大吸収波長で測定する。しかし、この波長での吸光度に適度に寄与し得る、α-カロテンならびに部分的に酸化されたβ-およびα-カロテンなどの、より少量のその他の化合物が存在する。
**  n.d.  -決定されず
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(32)  USDA  National  Nutrient  Database  for  Standard  Reference,  Release  26.  http://ndb.nal.usda.gov/.  a)  Entry  11655,  Carrot  juice,  canned.  b)  Entry  11124,  Carrots,  raw.  c)  Entry  11683,  Carrot,  dehydrated.  d)  Entry  11529,  Tomatoes,  red,  ripe,  raw,  year  round  average.  e)  Entry  09078,  Cranberries,  raw.  f)  Entry  35203,  Rose  hips,  wild  (Northern  Plains  Indians).  g)  Entry  11821,  Peppers,  sweet,  red,  raw.  h)  Entry  02028,  Spices,  paprika.  i)  Entry  11666,  Seaweed,  spirulina,  raw.  j)  Entry  11667,  Seaweed,  spirulina,  dried.  k)  Entry  11507,  Sweet  potato,  raw,  unprepared.  l)  Entry  01211,  Milk,  whole,  3.25%  milkfat,  without  added  vitamin  A  and  vitamin  D.  m)  Entry  01212,  Milk,  dry,  whole,  without  added  vitamin  D.  n)  Entry  01123,  Egg,  whole,  raw,  fresh.  o)  Entry  01133,  Egg,  whole,  dried.
(33)  Canadian  Nutrient  File  (Health  Canada).  http://webprod3.hc-sc.gc.ca/cnf-fce/index-eng.jsp.  a)  Food  Code  2205  -  Tomato  powder.  b)  Food  Code:  2205  -  Seaweed,  dulse  (laver,  nori),  raw.  c)  Food  code:  2499  -  Seaweed,  dulse  (laver,  nori),  dried.
(34)  製造業者の製品データシートより。
(35)  Danish  Food  Composition  Databank.  http://www.foodcomp.dk/v7/fcdb_default.asp.  FCDB  no.  0095,  Rosehip,  dried,  powder.
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(43)  類似の製品についての製造業者の栄養情報シートから引用(Cranberry  whole  fruit  powder,  Milne  Fruit  Products,  Prosser  WA.  http://milnefruit.com/images/specsheets/nutritional/Milne_CranberryWFruitPowderNutr.pdf  .
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【図１】
2019515247.tif 000011
【図２Ａ】
2019515247.tif 000012
【図２ＢＣＤ】
2019515247.tif 000013
【図２Ｅ】
2019515247.tif 000014
【図３】
2019515247.tif 000015
【図４】
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【図５】
2019515247.tif 000017
【図６】
2019515247.tif 000018
【図７】
2019515247.tif 000019
【図８】
2019515247.tif 000020
【図９】
2019515247.tif 000021
【図１０】
2019515247.tif 000022
【図１１ＡＢ】
2019515247.tif 000023
【図１１ＣＤ】
2019515247.tif 000024
【図１１ＥＦ】
2019515247.tif 000025
【図１１ＧＨ】
2019515247.tif 000026
【図１２】
2019515247.tif 000027
【図１３】
2019515247.tif 000028
【図１４】
2019515247.tif 000029
【図１５ＡＢ】
2019515247.tif 000030
【図１５Ｃ】
2019515247.tif 000031
【図１６】
2019515247.tif 000032
【図１７】
2019515247.tif 000033
【図１８】
2019515247.tif 000034
【図１９ＡＢ】
2019515247.tif 000035
【図１９Ｃ】
2019515247.tif 000036
【図２０】
2019515247.tif 000037
【国際調査報告】
2019515247.tif 000038
2019515247.tif 000039