(57)【要約】本発明は、毒性バイオマーカーとしてのEGFRのレベルを場合によってはATPおよびKIM-1のような他のバイオマーカーと組み合わせて測定する細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、核酸分子、特にsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロ方法であって、
a. 適切な細胞培養培地中で、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階；
b. 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階；
c. 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階；および
d. その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAレベルの低下が、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、方法。
【請求項２】
EGFR mRNAレベルが、ビヒクル対照または非毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる参照値と比較され、ここで、非毒性の参照核酸分子はインビボで非毒性であると実証されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
非毒性の参照核酸分子が、CGTcagtatgcgAATc (SEQ ID NO: 1)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ビヒクル対照または非毒性参照の値に対して80％を下回るEGFR mRNAレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
EGFR mRNAレベルが、腎毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる第2の参照値とさらに比較され、ここで、腎毒性の参照核酸分子はインビボで腎毒性を引き起こすことが実証されている、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
毒性の参照核酸分子が、GCtgtgtgagcttGG (SEQ ID NO: 4)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
段階（d）が細胞外腎損傷分子-1 (KIM-1)タンパク質または細胞内mRNAレベルの測定をさらに含み、ここで、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生理食塩水または非毒性参照の値に対して200％を上回るKIM-1タンパク質のレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
生理食塩水または非毒性参照の値に対して1000％を上回るKIM-1 mRNAのレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
EGFR mRNAレベルが低下しない場合でも、KIM-1の増加が核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
段階（a）の培養培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含み、段階（d）が細胞内アデノシン三リン酸(ATP)レベルの測定をさらに含み、ここで、細胞内ATPレベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される原薬を示す、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
生理食塩水または非毒性参照の値に対して80％を下回る細胞内ATPレベルが、前記原薬の腎毒性の予測となる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
EGFRを発現する細胞が、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、および神経外胚葉細胞からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養物が、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞、および集合管上皮細胞、特に初代ヒトPTECまたはラットPTEC細胞からなる群より選択される初代腎上皮細胞培養物である、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
EGFRを発現する細胞が、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、CACO2、HK-2、NKi-2、またはヒトA549細胞株などの不死化細胞株から培養される、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子とのインキュベーションの期間が2〜6日間、例えば約3日間である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子が、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアプタマーから選択される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子が、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸分子が少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が、RNase Hを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子のライブラリーから、哺乳動物へのインビボ投与のための1種または複数種の核酸分子を選択する方法であって、
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階；
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、請求項13〜15のいずれか一項に記載のように、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階；
c.請求項16に記載のように、該細胞をある期間にわたってインビトロで培養する段階；
d. 請求項1〜12のいずれか一項に記載のように、各核酸分子について細胞内EGFR mRNAおよび任意で追加のバイオマーカーの量を測定する段階；および
e. 参照値に対するEGFRの減少率が80％を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む、方法。
【請求項２２】
毒性参照物質または親核酸分子と比較して、選択された核酸分子の治療指数が低下している、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子のライブラリーが、請求項17〜20のいずれか一項に記載の核酸分子のライブラリーである、請求項21または22に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子のライブラリーが親核酸分子の核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーであり、ここで、親核酸分子は毒性、例えば腎毒性であり、段階（d）は、親核酸分子よりも毒性の低い1種または複数種の核酸分子変異体を同定し、該核酸分子変異体は親核酸分子の核酸塩基配列を保持する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法によって得られた、核酸分子。
【請求項２６】
請求項25に記載の核酸分子と、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントとを含有する、薬学的組成物。
【請求項２７】
医薬における使用のための、請求項25に記載の核酸分子または請求項26に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、毒性バイオマーカーとしての上皮成長因子受容体(EGFR)のレベルを、場合によっては腎損傷分子-1 (KIM-1)およびアデノシン三リン酸(ATP)のような他のバイオマーカーと組み合わせて測定する細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、核酸分子、特にsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーなどの核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための方法に関する。本発明はさらに、核酸分子のライブラリー、特にRNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーなどの核酸分子のライブラリーから、インビボ投与のための1種または複数種の核酸分子を、前記方法を用いて選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
新規かつ最適化された薬物候補を同定する際の問題の一つは、用量制限毒性の事象である。インビボで評価したとき、典型的には、核酸分子化合物の一部は、薬物誘発性腎障害または腎毒性のような、毒性表現型を生じさせることがある。過去数年間に、核酸分子の腎毒性を予測するための数多くのモデルが、様々なバイオマーカーを用いて開発されてきた。
【０００３】
Sohn et al 2013 Toxicology letters Vol 217 pp235（非特許文献1）およびHuang et al 2015 Pharmacological Research & Perspectives Vol 3 pp e00148（非特許文献2）は、両方とも、腎損傷分子-1 (KIM-1)を含めた様々なバイオマーカーを用いて、小分子の腎毒性を予測するための細胞ベースのインビトロアッセイを開示している。
【０００４】
Ju et al 2015 Science translational medicine Vol 7, pp316ra193（非特許文献3）は、糸球体濾過量と相関する尿中のEGF転写物および分泌を測定することによる、慢性腎疾患の潜在的インビボバイオマーカーとしての上皮成長因子(EGF)を記載している。インビトロEGFRの減少または細胞外EGFの取り込みを測定することについての記載はない。
【０００５】
Wilmer et al 2016 Trends in Biotechnology Vol 34 pp 156（非特許文献4）は、インビボおよびインビトロの両方で薬物誘発性腎毒性をスクリーニングするためのさらなるバイオマーカーを報告している(表2参照)。
【０００６】
インビトロ腎毒性アッセイは、アムホテリシンB(抗真菌剤)、コリスチン(ポリペプチド抗生物質)、シクロスポリン(免疫抑制剤)、シスプラチン(化学療法剤)、ドキソルビシン(化学療法剤)、ゲンタマイシン(抗細菌剤)などの、いくつかの小分子またはポリペプチド原薬の既知の腎毒性を予測する能力が若干あることを示した。
【０００７】
しかしながら、これは、異なる種類の薬物、すなわちiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアプタマーなどの核酸ベースの薬物には当てはまらなかった。個々の核酸化合物の腎毒性はこれまでに発表されており、予測することはできないようである(例えば、Henry et al 1997 Toxicology Vol 120 pp 145; Monteith et al 1999 Toxicologic pathology Vol 27, pp. 307; Herrington et al 2011 American journal of kidney diseases: the official journal of the National Kidney Foundation Vol 57, pp300; Voit et al. 2014 The Lancet. Neurology Vol 13, pp987; van Poelgeest et al 2015 British journal of clinical pharmacology Vol 80, pp1350（非特許文献5〜9）を参照されたい)。
【０００８】
本発明者らの知る限りでは、核酸分子の腎毒性を予測するためのバイオマーカーとしてEGFRを用いた細胞ベースのインビトロアッセイは記載されていない。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドの腎毒性のインビトロ予測は、これまでに記載されたことがない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sohn et al 2013 Toxicology letters Vol 217 pp235
【非特許文献２】Huang et al 2015 Pharmacological Research & Perspectives Vol 3 pp e00148
【非特許文献３】Ju et al 2015 Science translational medicine Vol 7, pp316ra193
【非特許文献４】Wilmer et al 2016 Trends in Biotechnology Vol 34 pp 156
【非特許文献５】Henry et al 1997 Toxicology Vol 120 pp 145
【非特許文献６】Monteith et al 1999 Toxicologic pathology Vol 27, pp. 307
【非特許文献７】Herrington et al 2011 American journal of kidney diseases: the official journal of the National Kidney Foundation Vol 57, pp300
【非特許文献８】Voit et al. 2014 The Lancet. Neurology Vol 13, pp987
【非特許文献９】van Poelgeest et al 2015 British journal of clinical pharmacology Vol 80, pp1350
【発明の概要】
【００１０】
発明の目的
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための細胞ベースのインビトロアッセイにおいて信頼できるバイオマーカーとしてのEGFRを確立する。
【００１１】
腎毒性の信頼できるインビトロ予測は、薬物の臨床開発の成功を高めると考えられ、初期スクリーニングに動物を使用しない創薬は、核酸分子のライブラリーの毒性スクリーニングに必要な動物の数を大幅に減らして、より費用効果的であり、効率的かつ倫理的であるだろう。
【００１２】
発明の概要
本発明は、核酸分子、特にオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ腎毒性を予測することが見出された、インビトロ毒性アッセイを提供する。
【００１３】
本発明の一局面において、本発明者らは、腎毒性のバイオマーカーとして上皮成長因子受容体(EGFR)を同定した。このバイオマーカーは、腎損傷分子-1 (KIM-1)のような他のバイオマーカーと組み合わせることができる。
【００１４】
本発明は、インビボ毒性(またはインビボ毒性ポテンシャル)を予測するためのインビトロ方法(アッセイ)を提供し、該方法は、急性腎障害または薬物誘発性腎障害などの有害な腎毒性を示すことなくインビボ投与するのに適するかまたは適すると予測される核酸分子化合物を選択するために使用することができる。
【００１５】
本発明は、哺乳動物において、核酸分子、特に核酸ベースの分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ腎毒性を予測するための方法を提供し、該方法は、
a) 適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階；
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階；
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階；および
d) その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
【００１６】
本発明は、インビボ投与に適した1種または複数種の核酸分子を、核酸分子のライブラリーから選択するための方法を提供し、該方法は、
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階；
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階；
c. 該細胞をある期間にわたってインビトロで培養する段階；
d. 各核酸分子について細胞内EGFR mRNAの量を測定する段階；および
e. 対照サンプルに対してEGFRの減少が80％を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む。
【００１７】
任意で、前記方法は、選択された核酸分子を哺乳動物にインビボで投与する段階をさらに含むことができる。
【００１８】
適切には、本発明の方法では、少なくとも1つのバイオマーカーのレベルまたは量を、ビヒクルサンプルまたは非毒性の参照核酸分子(インビボで非毒性であると確認された)などの対照サンプルを投与したときに得られるレベルと比較して、該核酸分子の投与に起因する少なくとも1つのバイオマーカーの増加または低下(すなわち、腎毒性の少なくとも1つのバイオマーカーの変化)のレベルを決定することができる。さらに、少なくとも1つのバイオマーカーを、毒性の参照核酸分子(インビボで毒性であると確認された)を投与したときに得られるレベルと比較して、該少なくとも1つのバイオマーカーのアッセイウィンドウ(assay window)を決定することができる。
【００１９】
いくつかの実施態様では、EGFRを発現する細胞は、上皮細胞、間葉細胞および神経外胚葉細胞に由来する細胞培養物から選択される。特に、腎上皮細胞に由来する細胞培養物、例えばヒトPTECまたはヒトPTEC-TERT-1細胞培養物は、本発明の方法において有用である。
【００２０】
いくつかの実施態様では、予測される腎毒性は、細胞内のEGFRバイオマーカーの低下に関連する。さらなる実施態様では、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示すものである。腎毒性を予測するためのさらなるバイオマーカーは、細胞内ATPレベルの低下に関連し得る。
【００２１】
本発明は、核酸分子、特に核酸ベースの分子、例えばLNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの(例えば、潜在的な)腎毒性を判定するためのインビトロアッセイの使用を提供する。本発明は、本発明の腎毒性を予測するための方法によって、または核酸分子のライブラリーをスクリーニングするための方法によって得られた核酸分子を提供する。
【００２２】
本発明の腎毒性を予測するための方法または核酸分子のライブラリーをスクリーニングするための方法によって得られた核酸分子、ならびに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントを含有する薬学的組成物。
【００２３】
本発明の腎毒性を予測するための方法または核酸分子のライブラリーをスクリーニングするための方法によって得られた核酸分子、あるいは医薬に使用するためのそのような分子を含有する薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、100μMのオリゴヌクレオチドで7日間処理したPTEC-TERT1細胞の形態学的変化を示す。
【図２】図2は、EGFRおよびKIM-1バイオマーカーがインビボで観察される毒性とどのように相関するかを概略的に示す。白色は毒性なし(無毒)を示す；薄い灰色は軽度の毒性を示す；中間の灰色は中程度の毒性を示す；濃い灰色は高い毒性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
不死化細胞株
本発明との関係において用語「不死化細胞株」とは、細胞が正常な細胞老化を免れて、細胞の連続的な増殖または分裂を可能にするように改変された、多細胞生物の単一の細胞に由来する細胞の集団として理解されるべきである。不死化細胞は、インビトロで長期間増殖させることができる。不死化のために必要とされる突然変異は、自然発生的に起こってもよいし、例えば、ウイルスベクター、遺伝子の欠失、テロメラーゼなどの遺伝子もしくはタンパク質の誘導、または癌細胞などの不死細胞との融合を用いて、意図的に誘発してもよい。
【００２６】
初代細胞培養物
本発明との関係において用語「初代細胞培養物」とは、動物の特定の組織から分離された細胞の集団として理解されるべきである。初代細胞培養物は、事前の遺伝子操作またはクローン選択なしに培養されるが、それは、例えばFACSまたは選択的増殖条件を用いて、精製することができる。初代細胞培養物は、新鮮であってもよいし、凍結保存された組織から樹立されてもよい。
【００２７】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物タンパク質をコードする核酸とすることができ、例えば、遺伝子、RNA、mRNA、pre-mRNA、成熟mRNAまたはcDNA配列であり得る。標的核酸はまた、マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、核小体低分子RNAまたはトランスファーRNAであってもよい。
【００２８】
核酸分子
本明細書で使用する用語「核酸分子」または「治療用核酸分子」は、共有結合でつながれた2個以上のヌクレオシドを含む分子として当業者には一般的に理解されている。本発明の方法において言及される核酸分子は、一般に、50ヌクレオチド長以下の治療用オリゴヌクレオチドである。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであっても、それを含んでもよく、またはRNAi剤、アプタマー、リボザイムなどの別のオリゴマー核酸分子であってもよい。核酸分子は、一般に、固相化学合成とそれに続く精製によって研究室で作られる。核酸分子の配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基(nucleobase)部分もしくはその修飾体の配列または順序に言及する必要がある。本発明の核酸分子は人間が作り出したものであり、化学的に合成されて、典型的には精製または単離される。本発明の核酸分子は、1種または複数種の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。
【００２９】
いくつかの実施態様では、本発明の核酸分子は、長さ8〜40ヌクレオチド、例えば、長さ9〜35、10〜30、11〜22、12〜20、13〜18、または14〜16の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
【００３０】
いくつかの実施態様では、前記核酸分子またはその連続ヌクレオチド配列は、22以下のヌクレオチド、例えば、20以下のヌクレオチド、18以下のヌクレオチド、例えば14、15、16または17ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。本明細書に示される任意の範囲は、範囲の端点を含むことが理解されるべきである。したがって、核酸分子が10〜30ヌクレオチドを含むとされる場合、10ヌクレオチドと30ヌクレオチドの両方が含まれる。
【００３１】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、長さ8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30の連続ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。
【００３２】
前記核酸分子は、典型的には、哺乳動物における1種または複数種の標的核酸の発現を調節するためのものである。いくつかの実施態様では、核酸分子、例えばsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどは、典型的には、哺乳動物におけるRNA、例えばmRNAまたはマイクロRNAの発現を阻害するためのものである。したがって、該核酸分子は、哺乳動物における1種または複数種の標的核酸の発現を調節するのに有効であり得る。
【００３３】
本発明の一実施態様では、前記核酸分子は、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーから選択される。
【００３４】
いくつかの実施態様では、前記核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３５】
いくつかの実施態様では、前記核酸分子はホスホロチオエート核酸分子である。いくつかの実施態様では、前記核酸分子はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００３６】
いくつかの実施態様では、前記核酸分子は、非ヌクレオシド部分(コンジュゲート部分)にコンジュゲート化することができる。
【００３７】
いくつかの実施態様では、本発明の方法において使用または同定される核酸分子は、少なくとも1つの立体選択的(stereodefined)ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００３８】
核酸分子のライブラリーは、変異型核酸分子の集合体として理解されるべきである。核酸分子のライブラリーの目的は様々であり得る。いくつかの実施態様では、核酸分子のライブラリーは、異なる核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成され、例えば、それは、標的核酸(例えば、RNA配列)にわたって設計された核酸分子のライブラリー、例えば、核酸分子が標的核酸を効率的に調節する標的核酸上の領域を同定する目的で、mRNA遺伝子歩行(gene-walk)によって生成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAi剤のライブラリーであり得る。いくつかの実施態様では、核酸分子のライブラリーは、核酸分子のライブラリー内で最も効力のある配列を同定する目的で、標的核酸上の特定の領域を標的とする、重複する核酸塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから構成される。いくつかの実施態様では、核酸分子のライブラリーは、親または祖先核酸分子の核酸分子設計変異体(子核酸分子)のライブラリーであり、その場合、核酸分子設計変異体は親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する。いくつかの実施態様では、核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーは、1つまたは複数の設計パラメーターにおいて親核酸分子とは異なる。そのようなライブラリーの目的は親核酸分子を改善することであり、例えば、本出願との関係において、親核酸分子はインビボで腎毒性を誘発することが分かっている。
【００３９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができる核酸分子として定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、DNAまたはDNA様ヌクレオシドの1つまたは複数のストレッチ(stretch)を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００４０】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNase Hを動員することができ、例えば、フランク領域に1種または複数種の2'糖修飾ヌクレオシド、例えば2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシド、もしくはこれらの混合物(混合ウィングギャップマー(mixed wing gapmer))を含む、本明細書で定義されるギャップマー(gapmer)オリゴヌクレオチドであるか、またはギャップブレーカー(gap-breaker)オリゴヌクレオチドであり得る。
【００４１】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミックスマー(mixmer)である。ミックスマーオリゴヌクレオチドは、高親和性の2'糖修飾ヌクレオシド、例えば2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANAおよびLNAヌクレオシドと、1〜4または1〜3個のDNAヌクレオシドの短い領域との交互領域を含む。典型的には、ミックスマーはDNAの短いストレッチとの交互領域を含み、例えば、[LNA]1-5[DNA]1-3[LNA]1-4[DNA]1-3[LNA]1-4[DNA]1-3を含む。
【００４２】
様々なミックスマー設計は、例えばマイクロRNA (antimiR)、mRNA上のマイクロRNA結合部位(Blockmir)を標的とする場合に、またはスプライススイッチング(splice switching)オリゴマー(ASO)として、非常に有効である。例えば、WO2007/112754 (LNA-AntimiRsTM)、WO2008/131807 (LNAスプライススイッチングオリゴ)を参照されたい。
【００４３】
いくつかの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、7〜10ヌクレオチド長のTINY LNAオリゴヌクレオチドであり得る。そのようなTINY LNAは、参照により本明細書に組み入れられるWO2009/043353に開示されている。それらは、典型的には、マイクロRNAおよびマイクロRNAファミリーを阻害するために使用され、完全LNA修飾型であり得る(すなわち、各ヌクレオシドはLNAヌクレオシドである)。また、ギャップマーおよびミックスマーオリゴヌクレオチドと同様に、ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、かつ本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドと同様に、完全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００４４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、7〜30ヌクレオチド長、例えば、7〜10ヌクレオチド(例えば、TINY LNA)、10〜14ヌクレオチド(例えば、ショートマー(shortmer)または短いギャップマー)、または12〜20、10〜22もしくは10〜24ヌクレオチド長である。
【００４５】
iRNA
本明細書で使用するとき、本明細書で相互交換可能に使用される用語「RNAi」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」または「siRNA」は、RNAヌクレオシドを含み、かつRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を介してRNA転写物などの標的核酸の標的化された切断を媒介する、オリゴヌクレオチド分子を指す。iRNAは、RNA干渉(RNAi)として知られるプロセスを介してmRNAの配列特異的分解を指令する。iRNAは、細胞、例えば哺乳動物対象者などの対象者内の細胞における標的核酸の発現を調節する、例えば阻害する。
【００４６】
本発明の方法に供されるRNAi剤は、標的核酸の切断を指令するRISC経路を介して、標的RNA配列などの標的核酸配列と相互作用する、二本鎖RNA (dsRNA)または一本鎖RNA分子のいずれかであり得る。二本鎖RNAi剤は、一般に、20〜50ヌクレオチド長、例えば25〜35ヌクレオチド長であり、Dicerとして知られているエンドヌクレアーゼと相互作用する。Dicerは、dsRNAを、特徴的な2塩基の3'オーバーハングを有する19〜23塩基対の短い干渉RNAにプロセシングすると考えられ、干渉RNAはその後、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれる。二本鎖RNAi剤は、一緒になって二重鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖からなるsiRNA分子であり得る。あるいは、それは、二次ヘアピン構造を形成するオリゴヌクレオチドであってもよく、こうしたヘアピン構造は、ヘアピンの領域においてそれを本質的に二本鎖にする；そのような分子はshRNAとも呼ばれる。Dicer基質の有効な伸長形態は、参照により本明細書に組み入れられるUS 8,349,809およびUS 8,513,207に記載されている。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1種または複数種のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する。一本鎖RNAi剤は、RISCエンドヌクレアーゼArgonaute 2に結合し、その後標的mRNAを切断する。一本鎖iRNAは、一般に15〜30ヌクレオチド長であり、例えば修飾ヌクレオシド間結合とおそらく修飾ヌクレオシドをも含めて、化学的に修飾される。一本鎖siRNAの設計および試験は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,101,348号およびLima et al., (2012) Cell I 50: 883-894に記載される。dsRNAは、一本鎖RNAi剤と同様の方法で化学的に修飾され得る。
【００４７】
アプタマー
本明細書で使用するアプタマーという用語は、リガンド-タンパク質相互作用またはリガンド-DNAヘリックス相互作用などのリガンド-標的相互作用を介して、標的を調節することができる三次元構造を形成するオリゴヌクレオチドまたはペプチドを指す。オリゴヌクレオチドアプタマーは、DNA、RNAもしくは修飾ヌクレオシドまたはこれらの混合物から形成することができる。アプタマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAi剤のように標的ハイブリダイゼーションを介してではなく、その三次元構造を介して有効である。
【００４８】
修飾ヌクレオシド間結合
修飾ヌクレオシド間結合は、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエートおよびボラノホスフェートを含む群から選択され得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、本発明の方法において試験されるオリゴヌクレオチドのRNase H動員と適合するものであり、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエートまたはボラノホスフェートである。
【００４９】
いくつかの実施態様では、ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のような、硫黄(S)を含む。いくつかの実施態様では、本発明の方法で使用または同定されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００５０】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも50％がホスホロチオエートであり、例えば、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％がホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全てがホスホロチオエートである。
【００５１】
いくつかの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の中性ヌクレオシド間結合、特にホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタールまたはチオホルムアセタールから選択されるヌクレオシド間結合を含む。
【００５２】
さらなるヌクレオシド間結合は、WO2009/124238(参照により本明細書に組み入れられる)に開示される。一実施態様では、ヌクレオシド間結合は、WO2007/031091(参照により本明細書に組み入れられる)に開示されるリンカーから選択される。特に、ヌクレオシド間結合は、-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、0-PO(OCH3)-0-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-から選択することができ、かつ/またはヌクレオシド間リンカーは、-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-、-CH2-NCH3-O-CH2-(ここで、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される)からなる群より選択することができる。
【００５３】
ホスホロチオエート結合のようなヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸との二重鎖を形成する場合にヌクレアーゼを動員できるオリゴヌクレオチド領域、例えば、ギャップマーの領域G、またはヘッドマー(headmer)およびテイルマー(tailmer)の非修飾ヌクレオシド領域において、特に有用である。しかし、ホスホロチオエート結合はまた、非ヌクレアーゼ動員領域および/または親和性増強領域、例えば、ギャップマーの領域FおよびF'、またはヘッドマーおよびテイルマーの修飾ヌクレオシド領域においても、有用であり得る。
【００５４】
しかしながら、設計領域の各々は、ホスホロチオエート以外のヌクレオシド間結合、例えばホスホジエステル結合を、特にLNAなどの修飾ヌクレオシドが該結合をヌクレアーゼ分解から保護する領域において、含むことができる。ホスホジエステル結合を、例えば1つまたは2つの結合を、特に(典型的には非ヌクレアーゼ動員領域内の)修飾ヌクレオシド単位の間にまたはそれに隣接して、含めると、オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティおよび/または生体分布が改変され得る；参照により本明細書に組み入れられるWO2008/113832を参照されたい。
【００５５】
一実施態様では、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合および/またはボラノホスフェート結合である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【００５６】
立体選択的ヌクレオチド間結合
本発明との関係において、用語「立体選択的」とは、オリゴヌクレオチド中に存在する少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合が特定の立体化学、すなわちRpまたはSpのいずれか、を有する核酸分子、例えばアンチセンス、RNIおよびアプタマー分子などのオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施態様では、立体選択的オリゴヌクレオチド中のホスホロチオエートヌクレオシド間結合の全てが立体選択的であり得、すなわち、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、RpおよびSpホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる群より独立して選択される。
【００５７】
典型的には、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートは、RpおよびSpホスホロチオエート結合のランダム混合物(ラセミ混合物とも呼ばれる)として合成される。本発明では、ギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供され、その場合、ギャップ領域オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート結合の少なくとも1つは、立体選択的であり、すなわち、オリゴヌクレオチドサンプル中に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも75％、例えば、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または(本質的に)全部においてRpまたはSpのいずれかである。そのようなオリゴヌクレオチドは、立体選択的(stereodefined, stereoselective)、または立体特異的(stereospecified)であると呼ぶことができる：それらは、立体特異的である少なくとも1つのホスホロチオエート結合を含む。立体選択的および立体特異的という用語は、本明細書では相互交換可能に使用され得る。立体選択的および立体特異的という用語は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合(RpまたはSp)を記述するために使用されるか、またはこのようなホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述するために使用される。立体選択的オリゴヌクレオチドは、いずれか1つの位置での別の立体異性体を少量含み得ることが認識されており、例えば、Wanらは、NAR, November 2014に報告されたギャップマーについて98％の立体選択性を報告している。
【００５８】
発現の調節
本明細書で使用する用語「発現の調節」(modulation of expression)は、オリゴヌクレオチドの投与前の核酸標的の量と比較して、核酸標的の量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照して判定することができる。対照は、生理食塩水組成物で処置された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド(モック)で処置された個体もしくは標的細胞である、ことが一般に理解される。しかし、それはまた、標準治療で処置された個体であってもよい。
【００５９】
1つのタイプの調節は、例えばmRNAの分解または転写の妨害によって、核酸標的の発現を阻害、ダウンレギュレーション、低減、抑制、除去、停止、阻止、防止、軽減、低下、回避または終了させるオリゴヌクレオチドの能力である。別のタイプの調節は、例えばスプライス部位の修復もしくはスプライシングの防止、またはマイクロRNA抑制などの抑制機構の除去もしくは妨害によって、核酸標的の発現を回復、増加または増強させるオリゴヌクレオチドの能力である。
【００６０】
本発明のいくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドの標的がEGFR発現細胞に存在する場合、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドで処理した後にEGFR発現細胞の集団において標的調節(例えば、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害)のレベルを測定する段階をさらに含むことができる(例えば、これは、少なくとも1つのバイオマーカーの測定段階と並行して、またはその一部として行うことができる)。これに関連して、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドの比較効力または有効性および比較毒性を判定するために使用することができ、インビボで使用するための効力のある非毒性化合物の選択を可能にする。化合物の効力/有効性の判定は、別個のインビトロ実験で、例えばEGFR発現細胞、特に標的を発現している細胞で、行うことができることが理解されよう。
【００６１】
修飾オリゴヌクレオチド
非修飾DNAおよびRNA分子はインビボで急速に分解され、それ自体は治療的にほとんど役に立たない。したがって、典型的には、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは修飾される。1つの広く使用される修飾は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の使用であり、これは核酸分解からオリゴヌクレオチドを安定化するだけでなく、望ましい薬理学的特性を提供することが知られている。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【００６２】
別の望ましい修飾は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドのより高い親和性を付与するもの、いわゆる高親和性修飾ヌクレオチドであり、これには二環式「LNA」ヌクレオシドおよび多数の2'置換ヌクレオシドが含まれる。
【００６３】
高親和性修飾ヌクレオシド
いくつかの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、1種または複数種の高親和性修飾ヌクレオシドを含む。高親和性修飾ヌクレオシドは、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、オリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオシドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋0.5〜＋12℃、より好ましくは＋1.5〜＋10℃、最も好ましくは＋3〜＋8℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で公知であり、例えば、多くの2'置換ヌクレオシドなどの2'糖修飾ヌクレオシド、ならびにロックド核酸(LNA)が含まれる(例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照されたい)。
【００６４】
糖修飾
前記オリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、天然に存在するDNAおよびRNAヌクレオシドに見出されるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する1種または複数種のヌクレオシドを含むことができる。
【００６５】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドは、主にオリゴヌクレオチドのある種の特性、例えば親和性および/またはヌクレアーゼ耐性、を改善することを目的として、作製されている。そのような修飾には、リボース環構造が、例えばヘキソース環との置換(HNA)により、修飾されたものが含まれる。
【００６６】
糖修飾には、リボース環上の置換基を水素以外の基に変更するか、またはDNAおよびRNAヌクレオシド中に天然で存在する2'-OH基を変更することによって、行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば、リボース環の2'、3'、4'または5'位に導入され得る。修飾糖部分を有するヌクレオシドはまた、2'修飾ヌクレオシド、例えば2'置換ヌクレオシドも含む。多数の2'置換ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、ヌクレアーゼ耐性および親和性が高まるといった、有益な特性を有することが見出されている。一実施態様では、該核酸分子またはそのような分子のライブラリーは、1種または複数種の2'糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００６７】
2'置換に加えて、リボース環の2位の修飾を含む他の修飾もあり、例えば、典型的にはリボース環のC2炭素とC4炭素の間にビラジカル架橋を持つ二環式環(ロックド核酸またはLNAとしても知られる)、または典型的にはC2炭素とC3炭素の間の結合を欠く非連結リボース環(例えば、UNA)の導入などがある。その他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸(WO2011/017521)または三環式核酸(WO2013/154798)が含まれる。修飾ヌクレオシドにはまた、糖部分が非糖部分と置き換えられたヌクレオシドも含まれ、例えば、ペプチド核酸(PNA)またはモルホリノ核酸の場合である。
【００６８】
2'糖修飾ヌクレオシド
2'糖修飾ヌクレオシドは、2'位にHまたは-OH以外の置換基を持つヌクレオシド(2'置換ヌクレオシド)、または2'連結ビラジカルを含むヌクレオシドであり、2'置換ヌクレオシドおよびLNA (2'-4'ビラジカル架橋)ヌクレオシドが含まれる。例えば、2'修飾糖は、結合親和性の増強および/またはヌクレアーゼ耐性の増加をオリゴヌクレオチドに提供することができる。2'置換された修飾ヌクレオシドの例は、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-RNAおよび2'-F-ANAヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、ならびにDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照されたい。以下は、いくつかの2'置換された修飾ヌクレオシドの例である。
2019521675.tif 000002
【００６９】
ロックド核酸ヌクレオシド(LNA)
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドであり、すなわち、それらは少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。
【００７０】
LNAモノマー(二環式核酸、BNAとも呼ばれる)は、リボース環の2'位と4'位との間にビラジカル(biradical)が存在するヌクレオシドである。2'-4'ビラジカルは架橋(bridge)とも呼ばれる。LNAモノマーは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、相補的なDNAまたはRNA配列に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を高めることが知られており、これは、典型的には、オリゴヌクレオチド/標的二重鎖を融解するのに必要な温度(Tm)の上昇として測定または計算される。
【００７１】
LNAオリゴマーは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【００７２】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるLNAは、一般式Iの構造を持つことができる：
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式中、全てのキラル中心について、不斉基は、R配置またはS配置のいずれかで存在してもよく；
Xは、-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され、例えば、いくつかの実施態様では、-O-であり；
Bは、水素、置換されていてもよいC1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC1-4-アルキル、置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、天然に存在する核酸塩基および核酸塩基アナログを含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり；
Pは、隣接モノマーへのヌクレオチド間結合、または5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間結合または5'末端基は、任意で、置換基R5または等しく適用可能な置換基R5*を含み；
P*は、隣接モノマーへのヌクレオチド間結合、または3'末端基を示し；
R4*およびR2*は、一緒になって、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-および>C=Zから選択される1〜4個の基/原子からなる2価リンカー基を表し、ここで、Zは-O-、-S-および-N(Ra)-から選択され、RaおよびRbは、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル(geminal)置換基RaおよびRbは、一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表すことができ、全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在してもよく；かつ
存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*のそれぞれは、独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基は、一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを表すことができ、ここで、RNは、水素およびC1-4-アルキルから選択され、2個の隣接(非ジェミナル)置換基は二重結合を生じる追加の結合を表すことができ、そしてRN*は、存在しかつビラジカルに関与しない場合、水素およびC1-4-アルキルから選択される；ならびにそれらの塩基性塩および酸付加塩。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在してもよい。
【００７３】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-、およびC(RaRb)-C(RaRb)-O-からなる群より選択される基からなるビラジカルを表し、ここで、各RaおよびRbは、任意に独立して選択され得る。いくつかの実施態様では、RaおよびRbは、水素およびC1-6アルキルからなる群より任意に独立して選択することができ、例えばメチル、水素である。
【００７４】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル -O-CH(CH2OCH3)- (2'O-メトキシエチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem)を表し、RまたはSのいずれかの配置をとる。
【００７５】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル -O-CH(CH2CH3)- (2'O-エチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem)を表し、RまたはSのいずれかの配置をとる。
【００７６】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル -O-CH(CH3)-を表し、RまたはSのいずれかの配置をとる。いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル -O-CH2-O-CH2-を表す(Seth at al., 2010, J. Org. Chem)。
【００７７】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル -O-NR-CH3-を表す(Seth at al., 2010, J. Org. Chem)。
【００７８】
いくつかの実施態様では、LNA単位は、以下の群から選択される構造を有する。
2019521675.tif 000004
【００７９】
いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。
【００８０】
いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。
【００８１】
いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3は、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。
【００８２】
いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3は水素である。
【００８３】
いくつかの実施態様では、R5およびR5*は、それぞれ独立して、H、-CH3、-CH2-CH3,-CH2-O-CH3、および-CH=CH2からなる群より選択される。適切には、いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかが水素であり、他方の基(それぞれR5またはR5*)は、C1-5アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C1-6アルキル、置換C2-6アルケニル、置換C2-6アルキニルまたは置換アシル(-C(=O)-)からなる群より選択される；ここで、各置換された基は、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C2-6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2またはN(H)C(=X)N(H)J2 (XはOまたはS)から独立して選択される置換基でモノまたはポリ置換されており、各J1およびJ2は、独立して、H、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキル、置換C1-6アミノアルキル、または保護基である。いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかが置換C1-6アルキルである。いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかが置換メチレンであり、ここで、好ましい置換基はF、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2またはN(H)C(O)N(H)J2から独立して選択される1つまたは複数の基を含む。いくつかの実施態様では、各J1およびJ2は、独立して、HまたはC1-6アルキルである。いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかは、メチル、エチルまたはメトキシメチルである。いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかは、メチルである。さらなる実施態様では、R5またはR5*のいずれかは、エチレニルである。いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかは、置換アシルである。いくつかの実施態様では、R5またはR5*のいずれかは、C(=O)NJ1J2である。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。そのような5'修飾二環式ヌクレオチドは、WO 2007/134181に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００８４】
いくつかの実施態様では、Bは核酸塩基であり、例えば、核酸塩基アナログおよび天然に存在する核酸塩基、例えば、プリンもしくはピリミジン、または置換プリンもしくは置換ピリミジン、例えば本明細書で言及される核酸塩基を含む。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、および/または修飾もしくは置換された核酸塩基、例えば、5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2'チオ-チミン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、および2,6-ジアミノプリンからなる群より選択される。
【００８５】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、および-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-から選択されるビラジカルを表し、ここで、Ra、Rb、Rc、Rd、ReおよびRfは、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基RaおよびRbは、一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表すことができる。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。
【００８６】
さらなる実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、-CH(CH2-O-CH3)-O-、-CH2-CH2-、および-CH=CH-から選択されるビラジカル(2価の基)を表す。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。
【００８７】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカルC(RaRb)-N(Rc)-O-を表し、ここで、RaおよびRbは、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である；ここで、Rcは、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。
【００８８】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカルC(RaRb)-O-C(RcRd)-O-を表し、ここで、Ra、Rb、RcおよびRdは、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。
【００８９】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、ビラジカル-CH(Z)-O-を形成し、ここで、Zは、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C1-6アルキル、置換C2-6アルケニル、置換C2-6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオールからなる群より選択される；ここで、置換された基のそれぞれは、独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2およびCNから独立して選択される、保護されてもよい置換基でモノまたはポリ置換されており、ここで、各J1、J2およびJ3は、独立して、HまたはC1-6アルキルであり、XはO、SまたはNJ1である。いくつかの実施態様では、ZはC1-6アルキルまたは置換C1-6アルキルである。ある実施態様では、Zはメチルである。ある実施態様では、Zは置換C1-6アルキルである。ある実施態様では、前記置換基はC1-6アルコキシである。ある実施態様では、ZはCH3OCH2-である。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。そのような二環式ヌクレオチドは、米国特許第7,399,845号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3*は水素であり、かつR5、R5*の一方または両方は、上記およびWO 2007/134181に記載されるように、水素以外であり得る。
【００９０】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、架橋中に置換アミノ基を含むビラジカルを表し、例えば、ビラジカル-CH2-N(Rc)-からなるかまたはそれを含み、ここで、RcはC1-12アルキルオキシである。いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル-Cq3q4-NOR-を表し、ここで、q3およびq4は、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される；ここで、各置換された基は、独立して、ハロゲン、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2またはN(H)C(=X=N(H)J2(ここで、XはOまたはSである)から独立して選択される置換基でモノまたはポリ置換されており、J1およびJ2のそれぞれは、独立して、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキルまたは保護基である。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。そのような二環式ヌクレオチドは、WO2008/150729に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3は水素であり、かつR5、R5*の一方または両方は、上記およびWO 2007/134181に記載されるように、水素以外であり得る。いくつかの実施態様では、R4*およびR2*は、一緒になって、ビラジカル(2価の基) C(RaRb)-O-を表し、ここで、RaおよびRbは、それぞれ独立して、ハロゲン、C1-C12アルキル、置換C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換C2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシ、置換C1-C12アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2またはN(H)C(=S)NJ1J2である；またはRaおよびRbは、一緒になって、=C(q3)(q4)である；q3およびq4は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1-C12アルキルまたは置換C1-C12アルキルである；各置換された基は、独立して、ハロゲン、C1-C6アルキル、置換C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換C2-C6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2またはN(H)C(=S)NJ1J2から独立して選択される置換基でモノまたはポリ置換されている；J1およびJ2のそれぞれは、独立して、H、C1-C6アルキル、置換C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換C2-C6アルキニル、C1-C6アミノアルキル、置換C1-C6アミノアルキルまたは保護基である。そのような化合物はWO2009006478Aに開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９１】
いくつかの実施態様では、R4*およびR2*はビラジカル-Q-を形成し、ここで、QはC(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)=C(q3)、C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)またはC(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]である；q1、q2、q3、q4は、それぞれ独立して、H、ハロゲン、C1-12アルキル、置換C1-12アルキル、C2-12アルケニル、置換C1-12アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)-NJ1J2、C(=O)J1、-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2またはN(H)C(=S)NJ1J2である；J1およびJ2のそれぞれは、独立して、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキルまたは保護基である；任意で、QがC(q1)(q2)(q3)(q4)でありかつq3またはq4の一方がCH3である場合、q3またはq4の他方またはq1およびq2の一方の少なくとも1つはH以外である。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在し得る。そのような二環式ヌクレオチドは、WO2008/154401に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は、独立して、水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。いくつかの実施態様では、R1*、R2、R3は水素であり、かつR5、R5*の一方または両方は、上記およびWO 2007/134181またはWO2009/067647(α-L-二環式核酸アナログ)に記載されるように、水素以外であり得る。
【００９２】
さらなる二環式ヌクレオシド類似体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるそれらの使用は、WO2011/115818、WO2011/085102、WO2011/017521、WO09100320、WO10036698、WO09124295 & WO09006478に開示されている。そのようなヌクレオシド類似体は、いくつかの局面では、本発明の化合物において有用であり得る。
【００９３】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド化合物に使用されるLNAは、好ましくは、一般式IIの構造を有する：
2019521675.tif 000005
式中、Yは、-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)および/または-CH2-からなる群より選択される；ZおよびZ*は、ヌクレオチド間結合、RH、末端基または保護基の中から独立して選択される；Bは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分(核酸塩基)を構成し、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される；Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、任意に独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基RaおよびRbは、一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表すことができる；RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。いくつかの実施態様では、Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、任意に独立して、水素、およびメチルなどのC1-6アルキルからなる群より選択される。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在することができ、例えば、2つの例示的な立体化学異性体にはβ-Dおよびα-Lアイソフォームが含まれ、これらは次のように例示することができる。
2019521675.tif 000006
【００９４】
特定の例示的なLNA単位が以下に示される。
2019521675.tif 000007
【００９５】
用語「チオ-LNA」は、上記の一般式中のYがSまたは-CH2-S-から選択されるロックドヌクレオチド(locked nucleotide)を含む。チオ-LNAは、β-Dおよびα-Lの両立体配置をとり得る。
【００９６】
用語「アミノ-LNA」は、上記の一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-および-CH2-N(R)- (ここで、Rは水素およびC1-4-アルキルから選択される)から選択されるロックドヌクレオチドを含む。アミノ-LNAは、β-Dおよびα-Lの両立体配置をとり得る。
【００９７】
用語「オキシ-LNA」は、上記の一般式中のYが-O-を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ-LNAは、β-Dおよびα-Lの両立体配置をとり得る。
【００９８】
用語「ENA」は、上記の一般式中のYが-CH2-O-(-CH2-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'位に結合される)であるロックドヌクレオチドを含む。Reは水素またはメチルである。
【００９９】
いくつかの例示的な実施態様では、LNAは、β-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNAおよびβ-D-チオ-LNA、特にβ-D-オキシ-LNAから選択される。
【０１００】
LNAヌクレオシドの特定の例はスキーム1に示される。
スキーム1
2019521675.tif 000008
【０１０１】
実施例に示されるように、本発明のいくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド中のLNAヌクレオシドは、β-D-オキシ-LNAヌクレオシドである。
【０１０２】
ギャップマー
本明細書で使用する用語「ギャップマー」は、親和性を増強する1種または複数種の修飾ヌクレオシドを含む領域(フランクまたはウィング)が5'側および3'側に配置されたRNase H動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマー設計が本明細書に記載される。ヘッドマーおよびテイルマーは、フランク領域の一方が欠けている、すなわちオリゴヌクレオチドの末端の一方のみが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む、RNase Hを動員できるオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーでは、3'フランクが欠けており(すなわち、5'フランクが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む)、テイルマーでは、5'フランクが欠けている(すなわち、3'フランクが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む)。
【０１０３】
ギャップマー設計
ギャップマーオリゴヌクレオチドは、アンチセンス機構を介して、mRNAまたはウイルスRNAなどの細胞内の標的RNAを阻害するために、広く使用されている(それゆえに、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとも呼ばれる)。ギャップマー構造では、該オリゴヌクレオチドは、5'→3'方向に、少なくとも3つの異なる構造領域、5'-フランク、ギャップおよび3'-フランク、F-G-F'を含む。G領域またはギャップ領域は、RNase Hを動員することができる少なくとも5個連続したヌクレオチドの領域、例えば、6〜14 DNAヌクレオチドなどのDNAヌクレオチドの領域、またはRNase Hを動員することができる他のヌクレオシド、例えば、α-L-オキシ-LNA、2'-フルオロ-ANAおよびUNAを含む。ギャップ領域の5'側および3'側には、2'修飾ヌクレオチドなどの、親和性を増強する1種または複数種の修飾ヌクレオシドを含む領域(FおよびF'、フランキング領域またはウィング領域とも呼ばれる)が配置されている。いくつかの実施態様では、フランキング領域は1〜8ヌクレオチドの長さであり得る。
【０１０４】
さらなる実施態様では、領域F (5'フランクまたは5'ウィング)は領域Gの5'末端に結合され、領域F' (3'フランクまたは3'ウィング)は領域Gの3'末端に結合される。領域FおよびF'は、独立して、少なくとも1個の修飾ヌクレオシド、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個の修飾ヌクレオシドを含むか、またはそれからなる。一実施態様では、領域Fおよび/またはF'は、独立して、1〜7個の修飾ヌクレオシド、例えば、2〜6個の修飾ヌクレオシド、2〜5個の修飾ヌクレオシド、2〜4個の修飾ヌクレオシド、1〜3個の修飾ヌクレオシド、例えば1、2、3または4個の修飾ヌクレオシド含むか、またはそれからなる。F領域は、該領域の5'末端および3'末端に少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを有することによって定義される。F'領域は、該領域の5'末端および3'末端に少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを有することによって定義される。
【０１０５】
いくつかの実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の修飾ヌクレオシドは、3'エンド構造を有する。
【０１０６】
一実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の1種または複数種の修飾ヌクレオシドは、2'修飾ヌクレオシドである。一実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の全てのヌクレオシドは、2'修飾ヌクレオシドである。
【０１０７】
別の実施態様では、領域Fおよび/またはF'は、2'修飾ヌクレオシドに加えて、DNAおよび/またはRNAを含む。DNAおよび/またはRNAを含むフランクは、Fおよび/またはF'領域の5'末端および3'末端に2'修飾ヌクレオシドを持つことによって特徴づけられる。一実施態様では、領域Fおよび/またはF'は、DNAヌクレオシド、例えば、1〜3個連続したDNAヌクレオシド、1〜3個または1〜2個連続したDNAヌクレオシドを含む。フランク中のDNAヌクレオシドは、RNase Hを動員できない存在であることが好ましい。いくつかの実施態様では、Fおよび/またはF'領域中の2'修飾ヌクレオシドとDNAおよび/またはRNAヌクレオシドは、1〜3個の2'修飾ヌクレオシドと1〜3個のDNAおよび/またはRNAヌクレオシドとが交互に存在する。そのようなフランクは交互フランク(alternating flank)とも呼ばれる。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドの領域Fおよび/またはF'の長さは、独立して、4〜10ヌクレオシド、例えば、4〜8、4〜6ヌクレオシド、例えば4、5、6または7修飾ヌクレオシドであり得る。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドのF領域のみが交互である。ある実施態様では、オリゴヌクレオチドのF'領域のみが交互である。
【０１０８】
交互ヌクレオシドを有する領域Fおよび/またはF'の具体的な例は、
2'1-3-N'1-4-2'1-3
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
であり、ここで、2'は修飾ヌクレオシドを示し、N'はRNAまたはDNAである。いくつかの実施態様では、交互フランクの全ての修飾ヌクレオシドはLNAであり、N'はDNAである。さらなる実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の1種または複数種の2'修飾ヌクレオシドは、独立して、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-O-メチル-RNA、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、2'-アルコキシ-RNA、MOE単位、LNA単位、アラビノ核酸(ANA)単位、および2'-フルオロ-ANA単位から選択される。
【０１０９】
いくつかの実施態様では、Fおよび/またはF'領域は、LNAと、2'置換された修飾ヌクレオシドとの両方を含む。これらは、しばしば、混合ウィングまたは混合フランクオリゴヌクレオチドと呼ばれる。
【０１１０】
本発明の一実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の全ての修飾ヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。さらなる実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の全てのヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。さらなる実施態様では、領域Fおよび/またはF'中のLNAヌクレオシドは、独立して、β-Dもしくはα-Lのいずれかの立体配置またはそれらの組み合わせで、オキシ-LNA、チオ-LNA、アミノ-LNA、cETおよび/またはENAからなる群より選択される。好ましい実施態様では、領域Fおよび/またはF'は、連続した配列の5'末端に少なくとも1個のβ-D-オキシLNA単位を含む。
【０１１１】
さらなる実施態様では、領域G (ギャップ領域)は、好ましくは、上記ヌクレアーゼ、特にRNase Hを動員することができる、少なくとも4個連続したヌクレオシド、例えば、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、または少なくとも16個連続したヌクレオシドを含むか、包含するか、またはそれらからなる。さらなる実施態様では、領域Gは、上記ヌクレアーゼを動員することができる、5〜12個、6〜10個または7〜9個、例えば8個連続したヌクレオチド単位を含むか、包含するか、またはそれらからなる。
【０１１２】
ヌクレアーゼを動員することができる領域Gのヌクレオシド単位は、ある実施態様では、DNA、α-L-LNA、C4'アルキル化DNA (PCT/EP2009/050349およびVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300に記載されており、いずれも参照により本明細書に組み入れられる)、ANAおよび2'F-ANAのようなアラビノース由来ヌクレオシド(Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (アンロックド核酸)(Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載されており、参照により本明細書に組み入れられる)からなる群より選択される。UNAは、アンロックされた(unlocked)核酸であり、典型的には、リボースのC2とC3との間の結合が除去されて、ロック解除された「糖」残基を形成している。
【０１１３】
なおもさらなる実施態様では、領域Gの少なくとも1つのヌクレオシド単位は、DNAヌクレオシド単位であり、例えば1〜12個のDNA単位、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10または11個のDNA単位、好ましくは2〜12個のDNA単位、例えば4〜12個のDNA単位、より好ましくは5〜11個、または2〜10個、4〜10個、6〜10個のDNA単位、例えば7〜10個のDNA単位、最も好ましくは8、9または10個のDNA単位である。いくつかの実施態様では、領域Gは100％のDNA単位からなる。
【０１１４】
さらなる実施態様では、領域Gは、DNAと、RNase H切断を媒介することができる他のヌクレオシドとの混合物からなることができる。領域Gは、少なくとも50％のDNA、より好ましくは60％、70％または80％のDNA、さらにより好ましくは90％または95％のDNAからなり得る。
【０１１５】
さらなる実施態様では、領域Gの少なくとも1つのヌクレオシド単位は、α-L-LNAヌクレオシド単位であり、例えば少なくとも1個のα-L-LNA、例えば2、3、4、5、6、7、8または9個のα-L-LNAである。さらなる実施態様では、領域Gは、α-L-オキシ-LNAである少なくとも1つのα-L-LNAを含む。さらなる実施態様では、領域Gは、DNAとα-L-LNAヌクレオシド単位の組み合わせを含む。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、領域G中の連続した配列のサイズは、より長いものであり、例えば12、13、14、15、16、17、18、19または20個のヌクレオシド単位であり得る。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、領域G中のヌクレオシドは2'エンド構造を有する。
【０１１８】
本明細書に報告されるギャップマー設計では、ギャップ領域(Y')は、1種または複数種の立体選択的ホスホロチオエート結合を含むことができ、ギャップ領域の残りのヌクレオシド間結合は、例えば、非立体選択的ヌクレオシド間結合であってもよいし、立体選択的ホスホロチオエート結合であってもよい。
【０１１９】
LNAギャップマー
用語「LNAギャップマー」は、親和性を増強する修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドを指す。ある実施態様では、ギャップマーオリゴヌクレオチドの両方のフランク領域は、少なくとも1つのLNA単位を含み、ある実施態様では、フランク領域のヌクレオシドの全てがLNAヌクレオシドである。
【０１２０】
いくつかの実施態様では、3'フランクは、少なくとも1個のLNAヌクレオシド、好ましくは少なくとも2個のLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、5'フランクは、少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、5'および3'フランキング領域の両方がLNAヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、フランキング領域の全てのヌクレオシドがLNAヌクレオシドである。典型的には、LNAギャップマーのフランクのLNA負荷は、2'置換ヌクレオシドのそれよりも低く、LNAギャップマー設計の例として、[LNA]1-4-[DNA]5-15-[LNA]1-4が挙げられる。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、ギャップマーは、参照により本明細書に組み入れられるWO2008/113832に記載されるような、いわゆるショートマー(shortmer)である。
【０１２２】
さらなるギャップマー設計は、WO2004/046160およびWO2007/146511に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
混合ウィングギャップマー
用語「混合ウィングギャップマー」または「混合フランクギャップマー」は、フランク領域の少なくとも一方が少なくとも1個のLNAヌクレオシドと少なくとも1個の非LNA修飾ヌクレオシドを含む、LNAギャップマーを指す。少なくとも1個の非LNA修飾ヌクレオシドは、例えば、少なくとも1個のDNAヌクレオシドまたは少なくとも1個の2'置換された修飾ヌクレオシド、例えば2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA (MOE)、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-RNAおよび2'-F-ANAヌクレオシドなどである。いくつかの実施態様では、混合ウィングギャップマーは、一方のフランク(例えば、5'または3')がLNAヌクレオシドのみを含み、他方のフランク(対応して3'または5')が2'置換された修飾ヌクレオシドおよび任意でLNAヌクレオシドを含む。
【０１２４】
ギャップブレーカー
用語「ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド」(gapbreaker oligonucleotide)は、ギャップ領域が5個未満の連続したDNAヌクレオシドを含むように、ギャップ領域が非RNase H動員ヌクレオシド(ギャップブレーカーヌクレオシド、E)によって分断されているにもかかわらず、RNase H動員を維持することができるギャップマーに関して使用される。非RNase H動員ヌクレオシドは、例えば、3'エンド立体構造のヌクレオシド、例えばヌクレオシドのリボース糖環のC2'とC4'の間の架橋がβ立体配置にあるLNA、例えばβ-D-オキシLNAまたはScETヌクレオシドである。RNase Hを動員するギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの能力は、典型的には、配列特異的であり、または化合物特異的でさえある − Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照されたい；これは、標的RNAのより特異的な切断を場合によってはもたらすRNase Hを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。
【０１２５】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドはギャップブレーカーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、5'-フランク(F)、ギャップ(G)および3'-フランク(F')を含み、ここで、ギャップ領域は、該領域が少なくとも3または4個連続したDNAヌクレオシドを含むように、非RNase H動員ヌクレオシド(ギャップブレーカーヌクレオシド、E)によって分断されている。ギャップブレーカーの設計は、ギャップ領域(領域Y')がギャップブレーカーヌクレオシドを含むことを除いて、ギャップマーの設計、例えばここに開示されたもの(例えば、領域Fが上記ギャップマーのX'領域に対応し、領域F'が本明細書に記載のギャップマーの領域Z'に対応する)に基づいている。いくつかの実施態様では、ギャップブレーカーヌクレオシド(E)は、ヌクレオシドのリボース糖環のC2'とC4'の間の架橋がβ立体配置にあるLNAヌクレオシドであり、かつギャップブレーカーLNAヌクレオシドの5'側および3'側に少なくとも3個(5'側)と3個(3'側)、または少なくとも3個(5'側)と4個(3'側)、または少なくとも4個(5'側)と3個(3'側)のDNAヌクレオシドが配置されるように、ギャップ領域内に配置されており、その場合、該オリゴヌクレオチドはRNase Hを動員することができる。
【０１２６】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
F-G-E-G-F'、特にF1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
D'-F-G-F'、特にD'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
F-G-F'-D''、特にF1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D''1-3
D'-F-G-F'-D''、特にD'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D''1-3
式中、GはDNAヌクレオシドを表し、領域D'およびD''は任意であって、追加の5'および/または3'ヌクレオシド、例えばDNAヌクレオシドであり得る。
【０１２７】
いくつかの実施態様では、ギャップブレーカーヌクレオシド(E)は、LNA、β-D-オキシLNA、ScET、または別のLNAヌクレオシド、例えば本明細書に開示されるβ-D-ヌクレオシドである。
【０１２８】
立体選択的ギャップマー
いくつかの実施態様では、親ギャップマーオリゴヌクレオチドに由来する子オリゴヌクレオチドは、立体選択的であるギャップ領域のヌクレオシド間結合を少なくとも1つ有し、任意で、ギャップ領域はRpおよびSpヌクレオシド間結合の両方を含む。
【０１２９】
いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、ギャップ領域のヌクレオシド間結合の少なくとも1つは立体選択的であり、中央の領域はRpおよびSpヌクレオシド間結合の両方を含む。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、領域G内のヌクレオシド間結合は、全てが立体選択的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、領域FおよびF'内のヌクレオシド間結合は、立体選択的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、領域FとGとの間、および領域GとF'との間のヌクレオシド間結合は、立体選択的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、領域F-G-F'の連続したヌクレオシド内の全てのヌクレオシド間結合は、立体選択的なホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドのギャップ領域への少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエート結合の導入は、該オリゴヌクレオチドの生物学的プロファイルを変化させるために使用することができ、例えば、それは毒性プロファイルを変化させることができる。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)のギャップ領域のホスホロチオエート結合の2、3、4または5個は立体選択的である。いくつかの実施態様では、ギャップ領域の残りのヌクレオシド間結合は立体選択的でない：それらはオリゴヌクレオチド種の集団中にRpおよびSpのラセミ混合物として存在する。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、該オリゴヌクレオチドの残りのヌクレオシド間結合は立体選択的でない。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチド(および任意で親)において、ギャップ領域の全てのヌクレオシド間結合は立体選択的である。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、前記オリゴマーのギャップ領域中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14個の結合は、立体選択的ホスホロチオエート結合である。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、前記オリゴマー(例えば、ギャップマー)中の結合の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％、90％、または95％は、立体選択的ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施態様では、該オリゴマー中のホスホロチオエート結合の全ては、立体選択的ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施態様では、該オリゴマーの全てのヌクレオシド間結合は、立体選択的ホスホロチオエート結合である。
【０１３４】
RNase H活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性は、相補的RNA分子と二重鎖を形成した場合にRNase Hを動員するその能力を指す。WO01/23613は、RNase H活性を測定するためのインビトロ方法を提供しており、この方法を用いて、RNase Hを動員する能力を測定することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を提供された場合に、それが、pmol/l/minで測定される以下の初期速度、すなわち、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを用いて、WO01/23613(参照により本明細書に組み入れられる)の実施例91〜95に記載される方法により測定された初期速度の少なくとも5％、例えば少なくとも10％、または20％を超える初期速度を有するならば、RNase Hを動員することができるとみなされる。
【０１３５】
有効性および治療指数
本発明の方法によって同定された核酸分子は、それらがなおも有効な核酸分子であることを判定するために、本発明の方法の一環として、さらに毒性を試験することができる。特に、核酸ベースの核酸分子では、毒性が低下する場合、それは、一部には、該核酸分子の有効性の低下によるものであることが観察されている。本発明の一局面において、毒性グレードの低下は、有効性の有意な低下をもたらさない。いくつかの実施態様では、本発明の方法に従って選択された核酸分子の治療指数(therapeutic index：TI)は、毒性参照物質と比較して改善される。本発明において、TIは、対象者の50％に望ましい効力(標的のノックダウンまたは薬理学的効果)をもたらす用量(EC50)で割った、対象者の50％に腎臓の有害作用を引き起こす核酸分子の用量(TD50)を指す。いくつかの実施態様では、毒性の参照核酸分子、例えば、本明細書中の化合物4-1または毒性の親オリゴヌクレオチドまたは毒性の親核酸分子と比較した場合に、TIは少なくとも10％、例えば、少なくとも15、25、50、75、100、150、200、250または300％増加する。実験目的では、標的がマウスに存在すると仮定すると、TD50およびEC50は7日間のマウス研究において決定され得る。例えば核酸分子について、マウスにおけるその配列保存が望ましくない場合、他のモデル種、例えば、ラット、サル、イヌ、ブタまたはサル(例えば、カニクイザル)を使用することができる。いくつかの実施態様では、TIの増加は、TD50の増加およびEC50の減少の低さまたは減少なしに起因する。TIの増加はまた、両方のパラメーターの改善の結果でもある。本発明の方法に関して、TIの増加は、核酸分子の有効性を改善する(すなわち、EC50の減少)だけではもたらされない。
【０１３６】
したがって、本発明の方法は、(例えば、子)核酸分子のライブラリーを、それらの標的を調節する、例えば阻害する際のそれらの有効性についてスクリーニングする追加の段階を含むことができる。あるいは、本発明の方法は、核酸分子としての、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての、有効性を決定するために、選択された核酸分子(例えば、立体選択的オリゴヌクレオチド変異体)を毒性の低下について試験する追加の段階を含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、有効性は、RNase Hを動員するオリゴヌクレオチドの能力によって決定され得るか、またはいくつかの実施態様では、細胞における、インビトロでの、ある実施態様ではインビボでの、標的の発現を調節するオリゴヌクレオチドの能力であり得る。
【０１３７】
コンジュゲート部分
いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施態様では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-リン酸からなる群より選択される。
【０１３８】
いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、酵素、または抗体フラグメントを含むか、またはそれらの群から選択される。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、親油性部分であり、例えば、脂質、リン脂質、脂肪酸、およびステロールからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、小分子薬物、毒素、レポーター分子、および受容体リガンドからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールなどのポリマーである。
【０１３９】
いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とする部分であるか、またはそれを含み、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンを含むことができる。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、N-アセチルガラクトサミン3量体などの、ガラクトースクラスターを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、1価、2価、3価または4価のGalNAcなどのGalNAc (N-アセチルガラクトサミン)を含む。3価GalNAcコンジュゲートは、化合物を肝臓に標的化するために使用することができ(例えば、US 5,994517およびHangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701、WO2009/126933、WO2012/089352、WO2012/083046、WO2014/118267、WO2014/179620 & WO2014/179445を参照されたい)、図2の具体例を参照されたい。これらのGalNAc文献およびそこで使用される特定のコンジュゲートは、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１４０】
発明の詳細な説明
インビボ毒性の予測
本明細書に記載の方法は、哺乳動物における核酸分子のインビボ毒性を予測するために使用される。どの化合物の毒性も、典型的にはその用量に依存しているため、本発明の方法は、陰性対照、および/もしくは毒性プロファイルが知られている核酸分子と比較して、または核酸分子のライブラリー、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーなどの核酸分子の集団(またはライブラリー)と比較して、化合物の比較毒性プロファイルを評価するために使用することができる。これに関して、インビボ毒性の予測は、核酸分子が哺乳動物にインビボで投与される場合に、腎毒性などの毒性表現型にさらされる比較リスクの評価であり得る。
【０１４１】
核酸分子、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドの安全性を評価する場合、検査されるパラメーターの1つは、腎臓への該物質の影響、例えば、腎近位尿細管への蓄積、尿細管変性/再生変化(尿細管毒性)、尿中で検出可能なKIM-1などの急性腎障害のためのバイオマーカーである。腎臓関連毒性は一般に腎毒性として知られている。
【０１４２】
本発明の方法は、インビボ毒性(例えば、腎毒性)を予測するために使用することができ、あるいは、哺乳動物における核酸分子の潜在的なインビボ毒性プロファイル(例えば、腎毒性)を判定するために提示される。本発明の一実施態様では、インビボ腎毒性は、急性腎障害および/または尿細管障害(tubular degradation)である。本発明の方法は、核酸分子を、その標的を調節するのに有効な投与量で、または治療に有効な用量で使用した場合に、インビボで毒性ではない(例えば、腎毒性ではない)核酸分子を同定するために使用することができる。したがって、本発明の方法は、インビボで有効な投与量で使用したとき、用量制限毒性(例えば、腎毒性)を示さない核酸分子の選択を可能にする。インビボ使用または治療上の使用のための核酸分子を選択する場合、広い安全域を有することが有利であると認識されよう。そのため、本発明の方法は、有効な用量またはより高い用量で、例えば、有効用量の2倍、有効用量の3倍、有効用量の5倍、または有効用量の10倍の用量で投与した場合に、腎毒性などのインビボ毒性を誘発しない核酸分子を同定または選択するために使用され得る。したがって、本発明の方法は、有効用量よりも(例えば、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍)高い最大耐量を有する、インビボ使用のための核酸分子を同定するために使用することができる。これに関して、本発明の方法は、安全な治療的投与のための適切な治療指数(TI)または本明細書で定義される改善された治療指数を有する、核酸分子を選択するために使用され得る。
【０１４３】
本発明は、核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための細胞ベースのインビトロアッセイにおいて信頼できるバイオマーカーとしてのEGFRを確立する。
【０１４４】
本発明の一局面は、哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロ方法であり、該方法は、
a) 適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階；
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階；
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階；および
d) その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、該細胞内のEGFR mRNAの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
【０１４５】
細胞内EGFR mRNAレベルの低下は、未処理の細胞、ビヒクル(ビヒクル対照、すなわち、核酸分子が溶解される溶媒、例えば、生理食塩水、DMSOまたは他の適切な溶媒)で処理した細胞、またはインビボで非毒性であることが実証されている非毒性の参照核酸分子(インビボで実証済みの非毒性核酸分子)で処理した細胞から得られる参照値(対照)と比べて、評価され得る。特に、本発明のアッセイに供される核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸分子である場合、そのような非毒性核酸分子は、例えば、SEQ ID NO: 1を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物1-1であり得る。
【０１４６】
いくつかの実施態様では、EGFRバイオマーカーの変化は、参照値のパーセンテージとして決定される。実施例に示されるように、本発明者らは、細胞内のEGFR mRNA (細胞内EGFR)のレベルが参照値に対して80％以下、例えば、75％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下に低下することが、薬物化合物の腎毒性を予測するものであることを見出した。核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドである実施態様では、該オリゴヌクレオチドは、10マイクロモルを超える濃度、例えば、20〜150マイクロモル、30〜120マイクロモル、50〜100マイクロモルの濃度で、細胞に投与される。
【０１４７】
さらなる実施態様では、細胞内のEGFR mRNAのレベルは、インビボで腎毒性を引き起こすことが実証されている腎毒性の参照核酸分子(インビボで実証済みの腎毒性参照核酸分子)で処理した細胞から得られる第2の参照値とさらに比較される。いくつかの実施態様では、したがって、本発明の方法は、既知の毒性(例えば腎毒性)プロファイルを有する1種以上の核酸分子、例えばインビボ腎毒性を誘発することが知られている陽性対照の核酸分子および/またはインビボ腎毒性を誘発しないことが知られている陰性対照の核酸分子を投与する段階、ならびに核酸分子の投与から得られた細胞内EGFR mRNAレベルを、陽性および/または陰性対照から得られた該レベルと比較する段階をさらに含むことができる。陰性対照(ビヒクル対照またはインビボで実証済みの非毒性核酸分子)および陽性対照(インビボで実証済みの腎毒性核酸分子)からのデータの生成は、アッセイのバッチ間変動について正規化するために使用できるアッセイウィンドウの決定を可能にする。アッセイウィンドウ(assay window: AW)は、非毒性参照核酸分子と腎毒性参照核酸分子との間の差である。
【０１４８】
一実施態様では、EGFR mRNAレベルの低下は、「材料および方法」の項に記載されるオリゴヌクレオチド処理の条件を用いて確認され、その場合、オリゴヌクレオチドは1マイクロモル超、例えば、5マイクロモル超、10マイクロモル超の濃度、例えば、20〜150マイクロモル、30〜120マイクロモル、50〜100マイクロモルの濃度で細胞に投与される。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、インビボで実証済みの腎毒性参照核酸分子は、SEQ ID NO: 4を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物4-1である。
【０１５０】
追加的にまたは代替的に、対照データは、核酸分子のライブラリー、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi剤またはアプタマーなどの核酸分子のライブラリーを、本発明の方法を用いて、順次または並行して比較し、かつ核酸分子のライブラリーの各メンバーを投与した後にEGFR mRNAバイオマーカーのレベルを比較することによって決定され得る。こうした方法は、比較的低い毒性(例えば、腎毒性)の核酸分子の選択を可能にする。いくつかの実施態様では、対照データは、核酸分子またはビヒクル対照を投与されていない細胞培養サンプル(0日目対照)から得られる対照データであるか、またはそれを含むことができる。そのようなサンプルは、投与段階の直前に得ることができる。
【０１５１】
補足的バイオマーカー
実施例に示されるように、本発明者らは、細胞外の腎損傷分子-1 (KIM-1)タンパク質のレベルまたは細胞内KIM-1 mRNAのレベルが、本発明の方法の予測可能性をさらに強化する、EGFRバイオマーカーに対する補足的バイオマーカーとして役立ち得ることを見出した。
【０１５２】
いくつかの例では、EGFRバイオマーカー単独では、インビボ腎毒性が知られている化合物の腎毒性を予測するのに十分ではなかった。これらの例では、インビトロバイオマーカーとしてのKIM-1が、EGFRバイオマーカーを非常によく補足することを示した。図2に示されるように、本発明のアッセイにおけるEGFRおよびKIM-1バイオマーカーの組み合わせは、インビボ腎毒性を有することが知られている化合物の100％予測をもたらした。
【０１５３】
本発明の一実施態様は、哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための方法であり、該方法は、
a) 適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階；
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階；
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階；および
d) その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルおよび上清中のKIM-1タンパク質レベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAレベルの低下または上清中のKIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
【０１５４】
細胞外KIM-1タンパク質レベルに代わるか、またはそれを補足するものとして、KIM-1 mRNAの細胞内レベルを測定することもできる。
【０１５５】
いくつかの実施態様では、KIM-1タンパク質バイオマーカーの変化は、未処理の細胞、ビヒクル(ビヒクル対照、すなわち、核酸分子が溶解される溶媒、例えば、生理食塩水、DMSOまたは他の適切な溶媒)で処理した細胞、またはインビボで非毒性であることが実証されている非毒性の参照核酸分子(インビボで実証済みの非毒性核酸分子)で処理した細胞から得られる参照値(対照)のパーセンテージとして決定される。実施例に示されるように、本発明者らは、上清中のKIM-1 (細胞外KIM-1)のレベルが、参照値に対して175％超に、例えば、少なくとも200％、少なくとも250％、少なくとも300％、少なくとも350％、少なくとも400％に増加することが、薬物化合物の腎毒性を予測するものであることを見出した。いくつかの実施態様では、細胞内KIM-mRNAバイオマーカーの変化は、対照参照値のパーセンテージとして決定される。実施例に示されるように、本発明者らは、細胞内のKIM-1 mRNA (細胞内KIM-1)のレベルが、参照値に対して500％超に、例えば、少なくとも750％、少なくとも1000％、少なくとも1100％、少なくとも1300％、少なくとも1500％、少なくとも1700％、少なくとも2000％に増加することが、薬物化合物の腎毒性を予測するものであることを見出した。同じ化合物について、観測可能なEGFRレベルの低下が見られない場合でも、KIM-1レベルの増加は予測的である。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、インビトロでKIM-1バイオマーカーの増加を誘発するメカニズムは、細胞外EGFRレベルの増加を誘発するメカニズムとは異なると推察している。
【０１５６】
EGFRおよびKIM-1バイオマーカーに加えて、本発明者らは、細胞培養培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含む場合、EGFRバイオマーカーを補足できる追加のバイオマーカーを同定した。その追加のバイオマーカーは、細胞内アデノシン三リン酸(ATP)である。
【０１５７】
本発明のさらなる局面では、ATPは、核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための細胞ベースのインビトロアッセイにおいて、EGFRに対する補足的バイオマーカーとして使用することができる。
【０１５８】
本発明の別の実施態様は、哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための方法であり、該方法は、
a) 少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含有する適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階；
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階；
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階；および
d) その後、細胞内EGFR mRNAレベルおよび細胞内ATPレベルを測定する段階
を含み、細胞内EGFR mRNAレベルの低下および細胞内ATPタンパク質レベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
【０１５９】
対照と比較した細胞内ATPが参照値に対して少なくとも80％、例えば、少なくとも約70％、少なくとも約60％、少なくとも50％、少なくとも40％に低下することは、インビボで腎毒性を誘発する傾向が高いことを示している。ATPバイオマーカーは、EGFRバイオマーカーに関連して既に記載したような対照のセットと比較され、特に、未処理の細胞、ビヒクル(ビヒクル対照、すなわち、核酸分子が溶解される溶媒、例えば、生理食塩水、DMSOまたは他の適切な溶媒)で処理した細胞、またはインビボで非毒性であることが実証されている非毒性の参照核酸分子(インビボで実証済みの非毒性核酸分子)で処理した細胞から得られる陰性対照の参照値と比較される。特に、本発明のアッセイに供される核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸分子である場合、そのような非毒性核酸分子は、例えば、SEQ ID NO: 1を有する化合物1-1であり得る。細胞内ATPバイオマーカーは、インビボで腎毒性を引き起こすことが実証されている腎毒性の参照核酸分子(インビボで実証済みの腎毒性参照核酸分子)で処理した細胞から得られる第2の参照値とさらに比較される。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、細胞培養培地は、培養培地1mlあたり3〜20ngのEGF、例えば、5〜15ng/ml、6〜10ng/ml、例えば、少なくとも3ng/ml、少なくとも4ng/ml、少なくとも5ng/ml、少なくとも6ng/ml、少なくとも7ng/ml、少なくとも8ng/ml、少なくとも9ng/mlのEGFを含む。好ましい実施態様では、細胞培養培地は8〜15ng/mlを含む。さらに好ましい実施態様では、細胞培養培地は少なくとも10ng/ml(培養培地)のEGFを含む。これは、ATPが補足的バイオマーカーとして使用される場合に特に関係する。
【０１６１】
バイオマーカーの増加/低下の実際のレベルは、細胞培養物の特性、細胞培養物の密度、使用する核酸分子の濃度、および核酸分子のインキュベーション時間を含めて、多くの要因に依存することを認識すべきである。関連するパラメーターについては、以下の項で説明する。
【０１６２】
細胞培養物
本発明の実施例では、いくつかの細胞培養物が試験された。初代細胞培養物と不死化細胞培養物は、それらが上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する限り、いずれも本発明の方法において機能するようである。EGFRおよびKIM-1バイオマーカーの場合、EGFR受容体は必ずしも機能的である(すなわち、細胞による培地中のEGFの消費を促進する)必要はない。しかしながら、ATPのようなバイオマーカーを本アッセイで使用する予定であるならば、機能的EGF受容体が必要である。EGFRは内在性であり、このことは、EGFRが細胞によって発現されることを意味する。
【０１６３】
本発明の方法は、例えば、マウス、ラットもしくはウサギなどのげっ歯類の種、またはブタ(例えばミニブタ)もしくはイヌ、またはサル(例えばカニクイザル)などの霊長類のようなモデル種における核酸分子の潜在的なインビボ毒性を判定するために使用されるか、あるいは、ヒトにおける核酸分子の潜在的なインビボ毒性を判定するために使用され得る。本発明者らは、初代EGFR発現上皮細胞または初代肝細胞または不死化EGFR発現上皮細胞の使用が、げっ歯類研究ならびにヒト臨床試験においてインビボで見られる毒性プロファイルを予測することを見出した。特に、腎臓、胃腸管もしくは肺組織に由来するEGFR発現上皮細胞または初代肝細胞は本発明の方法に適している。一実施態様では、上皮細胞は眼由来ではなく、特に網膜色素上皮由来ではなく、特に細胞培養物はARPE19細胞培養物ではない。
【０１６４】
本発明の一実施態様では、前記細胞は、通常の条件下で(薬物またはビヒクル物質にさらされることなく)培養された場合に、該細胞が増殖培地中に存在するEGFを消費するという点で、機能的EGFRを発現する。EGF消費率は、好ましくは、薬物またはビヒクル物質にさらされることなく通常の条件下で細胞を増殖させる場合、72時間かけて培地からのEGFの少なくとも50％の消費である。いくつかの細胞培養物は、より高いEGF消費率を有し、例えば、60時間で培地中のEGFの少なくとも50％、48時間で培地中のEGFの少なくとも50％などを有し得る。細胞培養物中のEGF消費量を測定するためには、その培地がEGFを含むことが重要である。
【０１６５】
一実施態様では、EGFRを発現する細胞は、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、神経外胚葉細胞および肝細胞からなる群より選択することができる。特に、上皮細胞または肝細胞に由来する細胞培養物が本発明の方法において使用される。
【０１６６】
一実施態様では、上皮細胞は、哺乳類の初代細胞培養物の形態であり得、例えば、げっ歯類の初代上皮細胞、例えばマウスもしくはラット初代上皮細胞；ブタ(例：ミニブタ)上皮細胞、イヌ上皮細胞、非ヒト霊長類初代上皮細胞、例えばサル(例：カニクイザル)、またはヒト初代上皮細胞からなる群より選択される細胞培養物である。別の実施態様では、肝細胞は、哺乳類の初代細胞培養物の形態であり得、例えば、げっ歯類の初代肝細胞、例えばマウスもしくはラット初代肝細胞；ブタ(例：ミニブタ)肝細胞、イヌ肝細胞、非ヒト霊長類初代肝細胞、例えばサル(例：カニクイザル)、またはヒト初代肝細胞からなる群より選択される細胞培養物である。好ましい実施態様では、初代上皮細胞または肝細胞培養物は、ラットまたはヒトから得られる。様々な種から得られることに加えて、細胞培養物は様々な器官から得ることもでき、例えば、胃腸管、肺、生殖器官および尿路、腎臓、外分泌および内分泌腺からの上皮細胞であり得る。一実施態様では、上皮細胞培養物は、腎上皮細胞培養物、胃腸管上皮細胞培養物または肺上皮細胞培養物である。本発明は腎毒性を予測するために立案されているので、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞および集合管上皮細胞からなる群より選択される腎上皮細胞が特に関係する。初代細胞培養物の具体例は、ヒトPTECまたはラットPTECの細胞から作製されたものである。上皮細胞培養物に加えて、本発明の実施例はまた、EGFRを発現する他の細胞型、例えば初代肝細胞も使用できることを示している。
【０１６７】
別の実施態様では、EGFRを発現する細胞は不死化細胞株から培養される。不死化細胞株から得られる細胞培養物の具体例は、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、CACO2、HK-2、NKi-2、またはヒトA549細胞株である。EGFRを発現するが、EGFR消費を有しない不死化細胞株の例は、CACO2細胞である。
【０１６８】
核酸分子の投与
本発明の方法で評価される核酸分子は、当技術分野で公知の一般的な方法、例えば、受動拡散、エレクトロポレーション、超音波処理、細胞スクイージング(cell squeezing)、静水圧、ナノ粒子(例：リポソーム)、マグネトフェクション(magnetofection)、細胞透過性ペプチドなどによって細胞培養物に投与することができる。核酸分子は、一般に、トランスフェクションを用いて、またはジムノシス(gymnosis)(裸の送達(naked delivery)としても知られる；Stein et al., NAR 2010 38(1) e3またはSoifer et al., Methods Mol Biol 2012, 815: 333-46参照)として知られる方法を介して投与されるが、他の投与オプションも適用することができる。実施例では、EGFRバイオマーカーを用いたインビトロ腎毒性の予測は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞培養物にトランスフェクションによって、またはジムノシスによって投与されるかに無関係であることが分かる。投与方法は、細胞培養物の特性に適合させる必要がある。いくつかの細胞型は、PTEC型細胞株で実証されるように、オリゴヌクレオチドをジムノシスによって取り込む傾向があり、他の細胞株は、A549細胞株で見られるように、トランスフェクションに適している。したがって、投与方法は、特定の細胞培養物について最良の投与方法を検討するように、最適化を受けることになる。
【０１６９】
本発明の一実施態様では、特に核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは一本鎖RNAi剤などの一本鎖オリゴヌクレオチドである場合、その核酸分子はジムノシスによって投与される。5年以上前に発見されて以来、ジムノシス送達(gymnotic delivery)は、オリゴヌクレオチド研究に用いられる標準的なツールとなっており、当技術分野で使用される十分に確立された用語である。典型的には、オリゴヌクレオチドのジムノシス送達は、約1μM〜約1000μMの間、例えば、約5μM〜約100μM、約10μM〜約50μM、約20μM〜約40μM、例えば約25〜35μMのオリゴヌクレオチドの濃度を利用する。適切には、オリゴヌクレオチドは、最終濃度1〜100μM、例えば5〜50μM、例えば10または30μMを達成するように、例えばPBS中で、細胞培養物に投与され得る。ジムノシス送達の利点の一つは、オリゴヌクレオチドを細胞内に導入するために追加の化学物質を必要としないという点で、それがインビボで起こる送達に似ていることである。
【０１７０】
本発明の別の実施態様では、核酸分子はトランスフェクションによって投与され、このアプローチは一本鎖および二本鎖の両方のオリゴヌクレオチドに適している。トランスフェクションは、リポフェクション、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウムなどの当技術分野で公知の標準的な方法を用いて行うことができる。典型的には、トランスフェクションは、0.5ng〜50ngの核酸分子濃度、例えば、1ng〜25ng、2ng〜15ng、約3ng〜10ngを利用する。適切には、オリゴヌクレオチドは、上記の濃度に対応する最終濃度を達成するように、例えばPBS中で、細胞培養物に投与され得る。
【０１７１】
インキュベーション時間
核酸分子の投与と、関連するバイオマーカーの測定との間の時間は、インキュベーション時間または培養時間である。インビトロ毒性アッセイが可能な限り有効であるためには、読み出し(readout)が再現可能であり、かつ潜在的な毒性問題を有する化合物を一貫して予測する必要がある。別の関連するパラメーターは、アッセイを行うのに要する時間であり、それが迅速に行われるほど、スループットは高くなり得る；このことは、核酸分子の大きなライブラリーをスクリーニングするために本発明の方法を使用する場合に非常に重要である。インキュベーション時間は、細胞培養および投与方法に応じて、最適化を受けることになる。本発明の一実施態様では、核酸分子とのインキュベーション時間は、1〜9日、例えば、2〜8日、3〜7日、または4〜6日、特に2〜6日または3〜6日、例えば2、3、4、5、6、7、8または9日間である。本発明者らは、バイオマーカーEGFRおよびKim-1について、2〜6日のインキュベーション時間を用いて十分な再現性を達成することができ、特に、投与後3日目および6日目のバイオマーカー測定が良好な結果を示すことを見出した。本発明の一実施態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドを、50〜100μMの濃度でジムノシスを用いて細胞培養物に投与し、3〜6日間インキュベートして、これらの期間にEGFRおよび/またはKIM-1を測定する。
【０１７２】
細胞内バイオマーカーATPが測定される場合には、核酸分子とのインキュベーション時間は5〜10日、例えば6〜9日、例えば6、7、8または9日間である。
【０１７３】
トランスフェクションを用いて投与する実施態様では、核酸分子とのインキュベーション時間は1〜4日、例えば2〜3日、例えば1、2、3または4日間である。本発明の一実施態様では、核酸分子を1〜20ngの濃度でトランスフェクションを用いて細胞培養物に投与し、1〜3日間インキュベートして、これらの期間にEGFRおよび/またはKIM-1を測定する。
【０１７４】
哺乳動物細胞の細胞培養は、典型的には37℃または約37℃で実施され、外来性CO2をさらに含んでもよく、例えば、5％または約5％CO2の雰囲気に保持される。培養中の細胞は、一般に、定期的に、例えば2〜4日ごとに、新鮮な培地が必要である。インキュベーション時間が3〜4日を超える場合には、培地を3〜4日ごとに交換することができる。新鮮な培地は、インキュベーション期間中に核酸分子が継続して存在することを確保するために、好ましくは、0日目に与えられた濃度に対応する濃度の核酸分子を含有する。
【０１７５】
本発明の利点の一つは、インキュベーション時間の開始の比較的直後に、予測毒性バイオマーカーの早期読み出しが可能であり、使用されるバイオマーカーが信頼できるシグナルを提供することである。
【０１７６】
インビボで毒性プロファイルの減少が予測される子核酸分子を同定するための変異体ライブラリーのスクリーニング：
本発明は、哺乳動物へのインビボ投与に適した1種または複数種の核酸分子を、核酸分子のライブラリーから選択するための方法を提供し、該方法は、
a) 核酸分子のライブラリーを得る段階；
b) 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、例えば「細胞培養物」の項に記載されるような、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階；
c) 該細胞を、「インキュベーション時間」の項に記載されるような期間にわたってインビトロで培養する段階；
d) 「インビボ毒性の予測」および「補足的バイオマーカー」の項に記載されるような、少なくとも1つの腎毒性バイオマーカーの量を測定する段階；および
e) 参照値に対するEGFRの減少率が、参照値に対して80％以上、例えば、85％以上、90％以上、95％以上、例えば100％またはそれ以上である、1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む。
【０１７７】
本発明の一実施態様では、段階e)において選択された核酸分子の治療指数は、毒性参照物質または親核酸分子と比較して低下する。
【０１７８】
選択された核酸分子は、該化合物が腎毒性を誘発しないことを確認するために哺乳動物にインビボで任意に投与され得る。特に、ラットは、腎毒性核酸分子に対して非常に感受性であり、そのため本発明の方法を用いて得られた予測を確認するのに適した種である。当然ながら、本明細書で言及される他の哺乳動物種もまた適切であり得る。
【０１７９】
いくつかの実施態様では、核酸分子のライブラリーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーである。
【０１８０】
一実施態様では、核酸分子のライブラリーは、異なる核酸塩基配列を有し、例えば、それらは、標的配列(例えばmRNA)にわたって設計された核酸分子のライブラリー、例えばmRNA遺伝子歩行によって作製されたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAi剤のライブラリーであり得る。
【０１８１】
一実施態様では、核酸分子のライブラリーのメンバーは、該ライブラリー中の分子の少なくとも一部において、配列の連続したストレッチ(該連続したストレッチは該核酸分子よりも短い)中に同一の核酸塩基配列を有する。このような「ホットスポット」ライブラリーは、例えば、長さが50〜100核酸塩基の標的配列(例えば、標的RNA上のホットスポット)にわたって設計された核酸分子のライブラリーであってよく、該ライブラリーのメンバーは、この配列に沿って、少なくとも4〜14核酸塩基、例えば5〜12核酸塩基、6〜10核酸塩基で重複するであろう。該ライブラリーは、例えば、同定されたホットスポットを標的とする、最も高いTIを有するオリゴヌクレオチドを同定するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAi剤のライブラリーであり得る。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、核酸分子のライブラリーは、親核酸分子の核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーであり、その親核酸分子は毒性であり、例えば腎毒性である；前記段階d)は、親核酸分子よりも毒性が低い1種または複数種の核酸分子変異体を同定する；該核酸分子変異体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの親核酸分子のコア核酸塩基配列を保持する。
【０１８３】
いくつかの実施態様では、子核酸分子は、親核酸分子と同じ長さで、同じ核酸塩基配列を保持し得る。しかしながら、ある実施態様では、子核酸分子は、5'および/または3'末端ヌクレオチドの除去などにより、トランケートされてもよく、ある実施態様では、5'末端および/または3'末端に追加のヌクレオチドを有してもよい、と考えられる。1種または複数種の末端の高親和性ヌクレオシド、例えばLNAヌクレオシドの除去によって、RNA標的に対する核酸分子の親和性の維持が可能であり、また、ギャップ領域への1種または複数種のLNAヌクレオシドの挿入によって、RNA標的に対する親和性が増加するであろう。いくつかの実施態様では、子核酸分子のライブラリーは異なるフランク領域を有する変異体を含み得ると考えられ、トランケートされたもの、追加のヌクレオシドを有するもの、(RNA標的に対して測定して)1または2ヌクレオシドシフトされた配列を有するもの、フランク領域に追加の高親和性ヌクレオシドを有するものを含んでもよい；こうして、該ライブラリーは、不均一なホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する立体選択的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの複雑なライブラリーであり、それによって、親核酸分子と比較して毒性が低下した子核酸分子の同時選択が可能となる。
【０１８４】
親核酸分子と子核酸分子は、共通のコア核酸塩基配列を共有する。共通のコア核酸塩基配列(または連続した核酸塩基配列)は、典型的には、少なくとも10核酸塩基長、例えば少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、または少なくとも16核酸塩基長であり、いくつかの実施態様では、親核酸分子と同じ核酸塩基配列であり得る。いくつかの実施態様では、親核酸分子および(少なくとも一部の)子核酸分子は、その核酸分子の長さにわたって同じ核酸塩基配列を有する。しかし、いくつかの実施態様では、子核酸分子の一部は、追加の1、2または3個の5'または3'ヌクレオチドなどの、追加の5'または3'ヌクレオチドを含むことが想定される。それに加えて、またはその代わりに、いくつかの実施態様では、子核酸分子の一部は、親についてトランケートされていてもよく、例えば、5'または3'末端に1、2または3ntのトランケーションを含むことができる。いくつかの実施態様では、子核酸分子(の一部)の核酸塩基配列の追加の核酸塩基またはトランケーションは、単一の核酸塩基の付加またはトランケーションである。いくつかの実施態様では、子オリゴヌクレオチドまたはその一部は、標的配列にアライメントされた場合、親核酸分子と比較して、単一の核酸塩基だけ、または2もしくは3核酸塩基だけシフトされてもよい(実際には、一端がトランケートされ、他端が付加される)。追加のヌクレオチドは、標的核酸配列との相補性を保持する。
【０１８５】
いくつかの実施態様では、核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーは、1つまたは複数の設計パラメーターにおいて親核酸分子と相違する。設計パラメーターは、以下からなる群より選択することができる：i) 1つまたは複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在；ii)ギャップサイズの変化；iii)ギャップブレーカーの導入；iv)ウィングサイズの変化；v) 2'糖修飾ヌクレオシドの導入；およびvi)少なくとも2つの異なる2'修飾ヌクレオシド、例えばLNAヌクレオシドおよび2'置換ヌクレオシド、特にLNAおよびMOEをウィングに導入する、ウィング内の2'糖修飾ヌクレオシド組成の変化。ii)、iii)、iv)およびvi)の設計パラメーターは、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドのためである。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、核酸分子変異体はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、核酸分子変異体はRNAi剤である。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、核酸分子変異体は1つまたは複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在によって親核酸分子と異なる。化合物8-2および8-3ならびに化合物10-2〜10-5は、そのような立体選択的変異体分子の例であり、この場合の親分子はそれぞれ化合物8-1および10-1である。
【０１９０】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチド変異体はLNAオリゴヌクレオチドである。
【０１９１】
いくつかの実施態様では、子アンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーは、任意で、異なる混合ウィングギャップマー設計、ギャップブレーカー設計、ギャップ長さおよびフランク長さを含めて、異なるギャップマー設計を有する子オリゴヌクレオチドの集団であるか、またはそれを含む。
【０１９２】
本発明の方法は、インビボ毒性(例えば、腎毒性)が低下した立体選択的核酸分子、特に立体選択的アンチセンスオリゴヌクレオチドを同定するために使用され得る。
【０１９３】
したがって、本発明は、立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチド(親オリゴヌクレオチド)の毒性を低減させる特定の方法を提供し、該方法は、
a) 親オリゴヌクレオチドのコア核酸塩基配列を保持する、立体選択的オリゴヌクレオチド変異体(子オリゴヌクレオチド)のライブラリーを作製する段階；
b) 上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物において、段階a)で作製されたライブラリーをスクリーニングする段階；および
c) 親オリゴヌクレオチドと比較して、細胞培養物において低減した毒性を有する、該ライブラリー中に存在する1種または複数種の立体選択的変異体を同定する段階
を含む。
【０１９４】
任意で、前記方法は、例えば、該方法によって同定された1種または複数種の立体選択的変異体を次回のスクリーニング法で親オリゴヌクレオチドとして使用することにより、繰り返すことができる(反復スクリーニング)。
【０１９５】
本発明の方法において、段階b)で作製されたライブラリーの各メンバーは、親とは異なる少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
【０１９６】
本発明の方法は、本発明の方法の1つを用いて、低減した毒性を有する1種または複数種の選択された核酸分子変異体を製造する、追加の後続の段階をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、後続の製造は、1gを超える、例えば10gを超える、スケールである。いくつかの実施態様では、インビボまたはインビトロスクリーニング段階のためのオリゴヌクレオチドの合成は、1g未満、例えば0.5g未満、例えば0.1g未満のスケールで行われる。
【０１９７】
いくつかの実施態様では、前記方法は、核酸分子のライブラリーの、または段階c)もしくはe)で同定された該ライブラリー中の1種または複数種の選択された核酸分子の、インビトロまたはインビボ効力を判定する段階をさらに含む。
【０１９８】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチドの(例えば、潜在的な)インビボ腎毒性を予測するための方法を提供し、該方法は、
上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物であって、任意で該培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含有する該培養物に、該オリゴヌクレオチドを投与する段階；
該オリゴヌクレオチドの存在下で該細胞を2〜9日間、例えば2〜6日間、例えば3日間インキュベートする段階；
その後、例えば、該細胞内のEGFR mRNA、KIM-1 mRNAもしくはATPレベルの量、および/または培地中に放出されたKIM-1の量を測定することによって、本明細書に記載されるような、少なくとも1つの毒性バイオマーカーを測定する段階
を含む。適切には、細胞内EGFR mRNAレベルまたはATPレベルの低下は、腎毒性オリゴヌクレオチドを示しており、また、培地中のKIM-1の上昇は、腎毒性オリゴヌクレオチドを示している。一実施態様では、EGFRバイオマーカーは、任意でKIM-1および/またはATPバイオマーカーの測定と組み合わせて、測定される。
【０１９９】
本発明は、核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばLNAオリゴヌクレオチドの(例えば、潜在的な)腎毒性を判定するためのインビトロアッセイの使用を提供する。
【０２００】
いくつかの実施態様では、インビボ毒性(例えば、腎毒性)を予測する(または判定する)ための方法は、低減したインビトロまたはインビボ毒性を有する、親オリゴヌクレオチドの立体選択的変異体を同定するために使用され得ることが認識されるであろう。
【０２０１】
補足的毒性アッセイ
本出願に記載される原薬(drug substance)のインビボ腎毒性を予測する方法に加えて、該方法は、原薬、特に治療用オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発に関連する他の毒性を予測する方法とさらに組み合わせることができる。
【０２０２】
いくつかの実施態様では、本出願で開示または請求される腎毒性を予測する方法は、原薬、特にオリゴヌクレオチドの免疫毒性を予測する方法と組み合わせることができる。
【０２０３】
原薬、特にオリゴヌクレオチドの免疫毒性を予測するための1つの方法は、原薬にさらされた血液サンプル中の少なくとも1つの補体バイオマーカーおよび/または少なくとも1つの(例えば少なくとも2つの)サイトカインバイオマーカーを測定することを含む。特定の実施態様では、免疫毒性は、原薬、特にオリゴヌクレオチドにさらされた血液サンプル中の少なくとも1つの補体バイオマーカーおよび少なくとも2つのサイトカインバイオマーカーを測定することによって予測される。
【０２０４】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、免疫毒性を予測する方法をさらに含むか、または提供し、該方法は、
a)ヒト血液(身体から分離された血液)に原薬、特にオリゴヌクレオチドを投与する段階
b)該サンプルを30分〜8時間インキュベートする段階；
c)その反応を停止させる段階；および
d)次のバイオマーカー：（i)補体バイオマーカーのC3aおよびC5a、ならびに/または（ii)サイトカインバイオマーカーのインターロイキン6 (IL6)、インターロイキン8 (IL8)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、および単球走化性タンパク質-1 (MCP1)のうち少なくとも2つ、3つ、4つ、5つまたは全部を測定する段階
を含み、その場合に、対照と比較して、少なくとも2つのバイオマーカーの約2倍を超える平均増加は、オリゴヌクレオチドなどの原薬のインビボ免疫毒性を示している。段階a)の血液サンプルは、典型的には、少なくとも1人の健康なヒト対象者、例えば、少なくとも2人または少なくとも3人の健康なヒト対象者から得られる。一般的に、血液サンプルは混合されない。いくつかの実施態様では、補体バイオマーカーC3aおよびC5aの少なくとも1つは、インターロイキン6 (IL6)、インターロイキン8 (IL8)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、および単球走化性タンパク質-1 (MCP1)からなる群より選択される少なくとも2つのサイトカインバイオマーカーと組み合わせて測定される。いくつかの実施態様では、少なくともサイトカインバイオマーカーのインターロイキン8 (IL8)および単球走化性タンパク質-1 (MCP1)が測定される。
【０２０５】
いくつかの実施態様では、少なくとも3人のドナーに由来する血液サンプルが使用される。典型的には、血液は健康なドナーから得られる(すなわち、身体から分離される）。いくつかの実施態様では、3つの異なる血液サンプルからの測定値を平均して、免疫毒性の読み出しを得る。
【０２０６】
いくつかの実施態様では、本出願で開示または請求される方法は、原薬、特にオリゴヌクレオチドの肝毒性を予測する方法と組み合わせることができる。オリゴヌクレオチドのインビボ肝毒性を予測する方法は、参照により本明細書に組み入れられるWO2017/067970に記載されている。簡単に述べると、オリゴヌクレオチドのインビボ肝毒性を予測する1つの方法は、
a)細胞培養培地中のインビトロでの初代哺乳動物肝細胞の集団(またはiPS細胞に由来する肝細胞の集団)に該オリゴヌクレオチドを投与する段階；
b)細胞培養培地中のインビトロでの該細胞を、ある期間にわたり、例えば1〜14日間、特に2〜7日間培養する段階；および
c)その後、培地に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のレベルを測定し、かつ/または細胞ATPのレベルを測定する段階
を含み、その場合に、細胞培養培地中の乳酸デヒドロゲナーゼの増加、例えば対照と比較して20％の増加、または細胞ATPレベルの低下、例えば対照と比較して20％の低下は、哺乳動物においてインビボで肝毒性であるかまたは肝毒性であると予測されるオリゴヌクレオチドを示すものである。肝毒性の予測を補足することができるさらなるバイオマーカーは、培養培地中に放出されるマイクロRNA-122(この場合には、細胞培養培地中のマイクロRNA-122の増加が肝毒性を予測する)、および細胞内グルタチオン(GSH)レベル(この場合には、GHSレベルの低下が肝毒性を予測する)である。
【０２０７】
本発明のいくつかの実施態様では、インビボ腎毒性を予測するための方法は、上記の方法のような、インビボ免疫毒性を予測する方法およびインビボ肝毒性を予測する方法と組み合わされる。
【０２０８】
薬学的組成物
さらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって得られた核酸分子またはその塩を提供する。さらなる局面では、本発明の方法によって得られた核酸分子またはその塩は、上記のいずれかの核酸分子ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および/またはアジュバントを含有する薬学的組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される希釈剤中50〜300μMの濃度で使用される。
【０２０９】
本発明で使用するのに適した製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に見出される。薬物送達方法の概説については、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。WO 2007/031091は、薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントのさらなる適切かつ好ましい例を提供する(参照により本明細書に組み入れられる)。適切な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、WO 2007/031091に提供される。
【０２１０】
本発明の方法によって得られた核酸分子は、薬学的組成物または製剤の調製のための薬学的に許容される活性物質または不活性物質と混合され得る。薬学的組成物の製剤化のための組成物および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含むがこれらに限定されない、多くの基準に依存する。
【０２１１】
これらの組成物は、従来の滅菌技術で滅菌されるか、または滅菌ろ過され得る。得られた水溶液はそのまま使用するために包装されるか、または凍結乾燥され、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。製剤のpHは、典型的には3〜11、より好ましくは5〜9または6〜8、最も好ましくは7〜8、例えば7〜7.5である。得られた固体形態の組成物は、複数の単回投与単位に包装することができ、各単位は、例えば錠剤またはカプセルの密封包装中に、上記の薬剤の一定量を含有する。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏のために設計された絞り出し可能なチューブのような、自由選択な量のための容器に包装することもできる。
【０２１２】
本発明は、疾患を治療または予防するための方法を提供し、該方法は、治療上または予防上有効な量の、本発明の方法によって得られた核酸分子もしくはその塩、または本発明の薬学的組成物を、該疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい対象者に投与することを含む。
【０２１３】
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明の方法によって得られた核酸分子もしくはその塩、または本明細書に定義される薬学的組成物に関する。
【０２１４】
本発明の方法によって得られた核酸分子もしくはその塩、または本発明による薬学的組成物は、典型的には有効な量で投与される。
【０２１５】
本発明はまた、本明細書で言及される障害の治療用の医薬の製造のための、または本明細書で言及される障害の治療方法のための、本発明の方法によって得られた核酸分子またはその塩の使用を提供する。
【０２１６】
本発明の実施態様
本発明の以下の実施態様は、本明細書に記載の他の実施態様と組み合わせて使用することができる。
【０２１７】
1. 哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロ方法であって、
a. 適切な細胞培養培地中で、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階；
b. 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階；
c. 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階；および
d. その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階；
を含み、EGFR mRNAレベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、方法。
【０２１８】
2. EGFR mRNAレベルが、ビヒクル対照または非毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる参照値と比較され、ここで、非毒性の参照核酸分子はインビボで非毒性であると実証されている、実施態様1に記載の方法。
【０２１９】
3. 非毒性の参照核酸分子がCGTcagtatgcgAATc (SEQ ID NO: 1)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、実施態様2に記載の方法。
【０２２０】
4. ビヒクル対照または非毒性参照の値に対して80％を下回るEGFR mRNAレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、実施態様3に記載の方法。
【０２２１】
5. EGFR mRNAレベルが、腎毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる第2の参照値とさらに比較され、ここで、腎毒性の参照核酸分子はインビボで腎毒性を引き起こすことが実証されている、実施態様2〜4に記載の方法。
【０２２２】
6. 毒性の参照核酸分子がGCtgtgtgagcttGG (SEQ ID NO: 4)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、実施態様5に記載の方法。
【０２２３】
7. 段階d)が細胞外腎損傷分子-1 (KIM-1)タンパク質または細胞内mRNAレベルの測定をさらに含み、ここで、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【０２２４】
8. 生理食塩水または非毒性参照の値に対して200％を上回るKIM-1タンパク質のレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、実施態様7に記載の方法。
【０２２５】
9. 生理食塩水または非毒性参照の値に対して1000％を上回るKIM-1 mRNAのレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、実施態様7に記載の方法。
【０２２６】
10. EGFR mRNAレベルが低下しない場合でも、KIM-1の増加が核酸分子の腎毒性の予測となる、実施態様7〜9に記載の方法。
【０２２７】
11. 段階a)の培養培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含み、段階d)が細胞内アデノシン三リン酸(ATP)レベルの測定をさらに含み、ここで、細胞内ATPレベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される原薬を示す、実施態様1〜10のいずれか1つに記載の方法。
【０２２８】
12. 生理食塩水または非毒性参照の値に対して80％を下回る細胞内ATPレベルが、前記原薬の腎毒性の予測となる、実施態様11に記載の方法。
【０２２９】
13. EGFRを発現する細胞が、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、および神経外胚葉細胞からなる群より選択される、実施態様1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【０２３０】
14. EGFRを発現する細胞が上皮細胞培養物である、実施態様1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【０２３１】
15. 前記細胞が、げっ歯類初代細胞、例えばマウスまたはラット初代細胞；ブタ(例：ミニブタ)細胞、および霊長類初代細胞、例えばサル(例：カニクイザル)、ヒト初代細胞からなる群より選択される初代細胞培養物の形態である、実施態様13または14に記載の方法。
【０２３２】
16. 初代細胞培養物がラットまたはヒト上皮細胞から得られる、実施態様15に記載の方法。
【０２３３】
17. 上皮細胞培養物が、腎上皮細胞培養物、胃腸管上皮細胞培養物、または肺上皮細胞培養物である、実施態様14〜16のいずれか1つに記載の方法。
【０２３４】
18. 腎上皮細胞が、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞、および集合管上皮細胞からなる群より選択される、実施態様17に記載の方法。
【０２３５】
19. 細胞培養物がヒトPTECまたはラットPTECの細胞から作製される、請求項17または18に記載の方法。
【０２３６】
20. EGFRを発現する細胞が不死化細胞株から培養される、請求項1〜14、17または18のいずれか1つに記載の方法。
【０２３７】
21. 細胞培養物が、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、CACO2、HK-2、NKi-2、またはヒトA549細胞株からなる群より選択される、実施態様20に記載の方法。
【０２３８】
22. 細胞培養培地が、5〜15ng/ml、例えば8〜15ng/ml、例えば約10ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含有する、請求項1〜21のいずれか1つに記載の方法。
【０２３９】
23. 核酸分子とのインキュベーションの期間が2〜6日間、例えば約3日間である、請求項1〜21のいずれか1つに記載の方法。
【０２４０】
24. 核酸分子がRNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーから選択される、請求項1〜23のいずれか1つに記載の方法。
【０２４１】
25. 核酸分子がトランスフェクション剤の存在下で細胞培養物に投与される、請求項1〜24のいずれか1つに記載の方法。
【０２４２】
26. 核酸分子、特に一本鎖オリゴヌクレオチドが、トランスフェクション剤の非存在下で、すなわちジムノシス(gymnosis)と呼ばれる方法によって、細胞培養物に投与される、請求項1〜23のいずれか1つに記載の方法。
【０２４３】
27. 核酸分子が1種または複数種の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1〜26のいずれか1つに記載の方法。
【０２４４】
28. 1種または複数種の2'糖修飾ヌクレオシドが、独立して、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANAおよびLNAヌクレオシドからなる群より選択される、実施態様27に記載の方法。
【０２４５】
29. 1種または複数種の2'糖修飾ヌクレオシドがLNAヌクレオシドである、実施態様27または28に記載の方法。
【０２４６】
30. LNAヌクレオシドが、β-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNA、α-L-アミノ-LNA、β-D-チオ-LNA、α-L-チオ-LNA、(S)cET、(R)cET、β-D-ENAまたはα-L-ENAから選択される、実施態様28または29に記載の方法。
【０２４７】
31. 核酸分子が少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項1〜30のいずれか1つに記載の方法。
【０２４８】
32. 連続したヌクレオチド配列内のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、実施態様31に記載の方法。
【０２４９】
33. 核酸分子が、RNase Hを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1〜32のいずれか1つに記載の方法。
【０２５０】
34. アンチセンスオリゴヌクレオチドがギャップマーである、実施態様33に記載の方法。
【０２５１】
35. アンチセンスオリゴヌクレオチドが式5'-F-G-F'-3'のギャップマーであり、ここで、領域FおよびF'は独立して1〜7個の修飾ヌクレオシドを含み、GはRNase Hを動員することができる6〜16ヌクレオシドの領域である、実施態様33または34に記載の方法。
【０２５２】
36. インビボ腎毒性が急性腎障害および/または尿細管障害である、請求項1〜35のいずれか1つに記載の方法。
【０２５３】
37. 核酸分子のライブラリーから哺乳動物へのインビボ投与のための1種または複数種の核酸分子を選択する方法であって、
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階；
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、請求項13〜22のいずれか1つに記載のように、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階；
c. 該細胞を、実施態様に記載のように、ある期間にわたってインビトロで培養する段階；
d. 請求項1〜12のいずれか1つに記載のように、各核酸分子について細胞内EGFR mRNAの量を測定する段階；および
e. 参照値に対するEGFRの減少率が80％を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む方法。
【０２５４】
38. 選択された核酸分子の治療指数が、毒性参照物質または親核酸分子と比較して、低下している、実施態様37に記載の方法。
【０２５５】
39. 核酸分子のライブラリーが、請求項25〜35のいずれか1つに記載の核酸分子のライブラリーである、実施態様37または38に記載の方法。
【０２５６】
40. 核酸分子のライブラリーがアンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーである、請求項37〜39のいずれか1つに記載の方法。
【０２５７】
41. 核酸分子のライブラリーが親核酸分子の核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーであり、親核酸分子が毒性であり、例えば腎毒性であり、段階d)が、親核酸分子よりも毒性の低い1種または複数種の核酸分子変異体を同定し、該核酸分子変異体が親核酸分子の核酸塩基配列を保持する、請求項37〜40のいずれか1つに記載の方法。
【０２５８】
42. 核酸分子変異体のライブラリーが、設計によって親核酸分子と異なる子核酸分子の集団を含む、請求項37〜41のいずれか1つに記載の方法。
【０２５９】
43. 核酸分子変異体がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、かつ親アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、
i. 1つまたは複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在；
ii. ギャップサイズの変化；
iii. ギャップブレーカーの導入；
iv. ウィングサイズの変化；
v. ウィング内の2'糖修飾ヌクレオシドの変化；および
vi. ウィング内に少なくとも2つの異なる2'修飾ヌクレオシド、例えばLNAヌクレオシドと2'置換ヌクレオシド、特にMOEを有する、混合ウィングギャップマー
からなる群より選択される1つまたは複数の設計パラメーターにおいて異なる、実施態様37〜42に記載の方法。
【０２６０】
44. 哺乳動物へのインビボ投与のための1種または複数種の原薬の選択が、インビボ免疫毒性および/またはインビボ肝毒性を予測するのに適したインビトロ免疫毒性アッセイおよび/またはインビトロ肝毒性アッセイの結果にさらに基づいている、実施態様37〜43に記載の方法。
【０２６１】
45. 請求項37〜43のいずれか1つに記載の方法によって得られた核酸分子。
【０２６２】
46. 実施態様44の核酸分子ならびに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントを含有する薬学的組成物。
【０２６３】
47. 医薬における使用のための、実施態様44の核酸分子または実施態様46の薬学的組成物。
【実施例】
【０２６４】
方法および材料
化合物
（表１）実施例で使用するオリゴヌクレオチドのリスト
2019521675.tif 000009
n.d.＝未定
【０２６５】
上記化合物について、小文字はDNA単位を表し、大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表す。全てのLNA C単位は5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。Rp立体選択的ホスホロチオエート結合は下付き文字rで示される。Sp立体選択的ホスホロチオエート結合は下付き文字sで示される。太字のイタリック体小文字はMOE単位を表す。化合物20-1において、全てのC単位(DNAおよびMOE)は5'メチルCである。SEQ ID NOは化合物の核酸塩基配列を指す。
【０２６６】
インビボ腎毒性の測定
研究目的のために繁殖させたWistar Han Crl:WI(Han)雄ラットを7〜8週齢でCharles River Laboratoriesから入手し、体重に基づいて4グループ(表1、実験A)または8グループ(表1、実験B)に分けて、投薬前に少なくとも5日間順応させた。動物を標準的な環境条件(22±2℃、相対湿度50±20％、明/暗サイクル12h/12h、固形飼料と水を自由に与えた)下で飼育し、AAALAC公認施設で豊かな環境を提供して、定期的にかつ注意深く監視した。全ての手順は、それぞれの現地の規制に従って、また、動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により与えられた動物許可に従って行った。試験化合物を等張性滅菌生理食塩水中に調製し、滅菌濾過(0.22μm)して、1日目および8日目に40mg/kg (2.5mL/kg)で肩甲間部に投与した。対照群の動物にはビヒクル対照として生理食塩水を与えた。15日目に動物に水道水(10mL/kg)を経口投与し、代謝ケージにおいて尿を氷上に6時間集めた。尿タンパク質レベル(オーションマックス(Aution Max) AX-4280)および尿中腎損傷バイオマーカーを測定した(マルチプレックスMAPラット腎毒性磁気ビーズパネル2）。15日目に、ラットをペントバルビタールの腹腔内注射により犠牲にして、放血させた。腎皮質サンプルを採取し、10％中性緩衝化ホルマリンに浸漬して固定化し、パラフィンに包埋し、5μmの切片にして、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した。次いで、H&E切片を、Aperio ScanScope AT (Leica Biosystems社)スキャナーを用いて20倍の倍率でスキャンし、その後、スキャンした画像からImageScopeソフトウェアで画像を取り込んだ。次のパラメーターの1つまたは複数を評価した：腎臓の重量、血清クレアチニン、尿タンパク質、尿中のKIM-1タンパク質、KIM-1 mRNA、腎臓の変性/再生、および相対的な尿細管毒性(tubulotoxicity)グレード。
【０２６７】
細胞培養物
ヒト初代近位尿細管上皮細胞(PTEC)の細胞培養物
初代PTEC (Science Cell Research Labotoriesカタログ番号4100)を製造元の指示に従ってPTEC培地[1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ThermoFisher Scientific 15140122)、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific 15630056)、5μg/mlインスリンおよび5μg/mlトランスフェリンおよび8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム(全て100×濃縮原液から，ThermoFisher Scientific 41400045)、100nMヒドロコルチゾン(Sigma H6909)、3.5μg/mlアスコルビン酸(Sigma A4403)、25ng/mlプロスタグランジンE1 (Sigma P5516)、3.25pg/mlトリヨード-L-チロニン(Sigma T6397)、10ng/mlヒト組換え上皮成長因子(EGF, R&D Systems 236-EG-200)、および100μg/mlジェネティシン(G418硫酸塩, ThermoFisher Scientific 10131027)を含有する、フェノールレッド不含のDMEM/F12 (ThermoFisher Scientific 11039021)]で培養した。
【０２６８】
オリゴヌクレオチドで処理する前に、初代PTEC細胞をコラーゲンI被覆96ウェルプレート(Corning, 356407)にそれぞれ40,000および20,000細胞/ウェルの密度でPTEC培地に播種し、コンフルエンスまで増殖させた。
【０２６９】
ヒトPTEC-TERT1細胞培養物
PTEC-TERT1 (Evercyte GmbH, オーストリア)を製造元の指示に従ってPTEC培地[1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ThermoFisher Scientific 15140122)、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific 15630056)、5μg/mlインスリンおよび5μg/mlトランスフェリンおよび8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム(全て100x濃縮原液から，ThermoFisher Scientific 41400045)、100nMヒドロコルチゾン(Sigma H6909)、3.5μg/mlアスコルビン酸(Sigma A4403)、25ng/mlプロスタグランジンE1 (Sigma P5516)、3.25pg/mlトリヨード-L-チロニン(Sigma T6397)、10ng/mlヒト組換え上皮成長因子(EGF, R&D Systems 236-EG-200)、および100μg/mlジェネティシン(G418硫酸塩, ThermoFisher Scientific 10131027)を含有する、フェノールレッド不含のDMEM/F12 (ThermoFisher Scientific 11039021)]で培養した。
【０２７０】
オリゴヌクレオチドで処理する前に、PTEC-TERT1をコラーゲンI被覆96ウェルプレート(Corning, 356407)にそれぞれ40,000および20,000細胞/ウェルの密度でPTEC培地に播種し、コンフルエンスまで増殖させた。
【０２７１】
ラット初代近位尿細管上皮細胞(PTEC)の細胞培養物
近位尿細管上皮細胞を、Bruce et al, Methods Mol Biol 1001, 53-64 (2013)に記載される手法を簡便にした手法で調製した。1匹の麻酔した雄Wistarラット(10〜18週齢)から腎臓を摘出し、冷1×濃縮ハンクス平衡塩溶液(HBSS, ThermoFisher Scientific 14065049)で洗浄した。この臓器の被膜を剥離し、髄質を含まない腎皮質の外側ストリップを1〜2mm3片に切断した。組織片を、2mg/mlコラゲナーゼA (Roche 10103586001)および10μg/ml DNAse I (Roche 10104159001)を含有するHBSS 25ml中で連続的に穏やかに振とうしながら37℃で60分間消化した。2％ウシ血清アルブミン(BSA, フラクションV, Roche 10735086001)を含有する氷冷HBSS 25mlの添加により反応を停止させた。解離した組織を最初に200μmセルストレーナー(pluriSelect 43-50200)に通して、続いて100μmセルストレーナー(pluriSelect 43-50100)に通して連続的に濾過した；単細胞および尿細管断片を含むろ液を、MgCl2およびCaCl2を含まないHBSS溶液(HBSS-/-, ThermoFisher Scientific 14175053)中で3回洗浄して遠心分離(100g)した。沈降物を25mlのHBSS-/-中に再懸濁し、25mlの30％OptiPrep溶液［5倍容量の60％OptiPrep密度勾配媒体(Sigma D1556)と、4倍容量のH2O滅菌液と、1倍容量のMgCl2およびCaCl2を含まない10×濃縮リン酸緩衝生理食塩水(PBS-/- ThermoFisher Scientific 14200-067)との混合物］と混合して、15％OptiPrep中の細胞と尿細管断片の懸濁液を得る。その懸濁液を遠心分離した(800g、室温で20分間)。チューブの上部3分の1の細胞バンドを回収した；チューブの底にある沈降物中の細胞を捨てた。回収した細胞を、ラットPTEC培地［1倍容量のDMEM (ThermoFisher Scientific 11966025)、1倍容量のハムF-12栄養混合物(ThermoFisher Scientific 21765029)、2％ウシ胎仔血清(FBS, ThermoFisher Scientific 16000044)、1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ThermoFisher Scientific 15140122)、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific 15630056)、5μg/mlインスリンおよび5μg/mlトランスフェリンおよび8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム(全て100x濃縮原液から，ThermoFisher Scientific 41400045)、100nMヒドロコルチゾン(Sigma H6909)、3.5μg/mlアスコルビン酸(Sigma A4403)、25ng/mlプロスタグランジンE1 (Sigma P5516)、3.25pg/mlトリヨード-L-チロニン(Sigma T6397)、および10ng/mlラット組換え上皮成長因子(EGF, R&D Systems 3214-EG-100/CF)］中で3回洗浄して遠心分離した(400g、室温で5分間)。最終的な遠心分離工程の後、細胞調製物を50mlのラットPTEC培地中に再懸濁し、3本のコラーゲンI被覆150cm2細胞培養フラスコ(Corning 354486)に分配し、最初の2日間の後に培地を交換して4日間インキュベートした。
【０２７２】
オリゴヌクレオチドで処理する前に、増殖したラットPTEC細胞をトリプシン-EDTA溶液(ThermoFisher Scientific 25200056)で剥離させて培養フラスコから回収し、ラットPTEC培地で洗浄し、コンフルエンスまで増殖させるために、コラーゲンI被覆96ウェルプレート(Corning, 356407)に36,000細胞/ウェルの密度でラットPTEC培地に播種した。
【０２７３】
CACO2 (ヒト結腸直腸腺癌上皮細胞)
CACO2 (ATCC, HTB-37)を、製造元の指示に従って、CACO2培地［DMEM/F12-Glutamax、非必須アミノ酸(1％)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)(Gibco, 31331-028)(Gibco, 11140-035)(Gibco: 15140-122)、20％FBS (Gibco, 16000-044)］で2回継代して培養し、その後10％FBSを含有するCACO2培地に切り替えた。
【０２７４】
オリゴヌクレオチドで処理する前に、CACO2細胞を96ウェルプレートに10,000細胞/ウェルで播種し、コンフルエンスまで増殖させた。
【０２７５】
A549細胞(ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞)
A549細胞(ATCC CCL-185)を、製造元の指示に従って、A549培地［F-12K Nut Mix (Gibco, 21127-022)、1％ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco: 15140-122)、10％FBS (Gibco 16000-044)］で培養した。
【０２７６】
オリゴヌクレオチドで処理する前に、A549細胞を96ウェルプレートに3000細胞/ウェルでA549標準培地に播種し、60％コンフルエンスまで増殖させた。
【０２７７】
リポフェクションのために、細胞を、リポフェクタミン(Invitrogen, 11668-019)を製造元の指示に従って用いて、1ngまたは10ngのオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。24時間後、培地を、10ng/ml EGFおよび2％FCSを含むA549標準培地に交換した。72時間後、細胞を回収してEGFR mRNAを測定し、上清をKIM-1分析のために−20℃で保存した。
【０２７８】
ジムノシスのために、細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、下記のジムノシスプロトコルに供した。
【０２７９】
ジムノシスを用いたオリゴヌクレオチド処理
オリゴヌクレオチドをPBSに溶解し、所定の濃度、例えば10、30または100μMで細胞培養物に添加した。各ウェルの全容量は100μlであった。PBSをビヒクル対照として用いた。
【０２８０】
オリゴヌクレオチド処理後に細胞内ATPを分析する場合には、0日目と同じ濃度のオリゴヌクレオチドの添加を含めて、培地を3日ごとに交換した。
【０２８１】
オリゴヌクレオチド処理後にKIM-1のような細胞外マーカーを分析する場合には、培地を回収して、さらなる分析まで−20℃で保存した。最初のオリゴヌクレオチド処理の3日を超えて増殖させた細胞では、培地を回収し、新鮮なオリゴヌクレオチドを含めて、3日ごとに交換した。回収した培地を−20℃で保存した。
【０２８２】
ATPアッセイ
細胞内ATPレベルの測定のために、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay (G7571, Promega Corporation, Madison WI, 米国)を製造元の指示に従って使用した。各サンプルを3つ組で試験した。他の指示がない限り、細胞内ATPレベルは、オリゴヌクレオチド処理後9日目に測定した。ビヒクルに対して80％を下回るATPレベルの低下は、腎毒性を予測するものとみなされた。
【０２８３】
EGFRおよびPCSK9 mRNAアッセイ
培養培地を100μl/ウェルの1×RNA溶解混合物(QuantiGene(登録商標)サンプルプロセッシングキット, QS0101)で置き換えることによって、細胞を回収した。RNA溶解混合物を分析まで−80℃に保った。20μlの溶解物をmRNA捕捉磁気ビーズセット(ヒト細胞ではPanomics QuantiGene(登録商標)Plex Set＃12871、ラット細胞ではPanomics QuantiGene(登録商標)Plex Set＃31357)と混合し、一晩インキュベートし、分岐DNA増幅について処理し、製造元の指示(Panomics QuantiGene(登録商標)Plexアッセイキット, QP1015)に従って分析した。PPIBプローブを正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。3つの生物学的レプリケートの平均蛍光強度(FI)と標準偏差を計算し、ビヒクル対照に対して正規化した。ビヒクルに対して80％を下回る、好ましくは75％を下回るEGFR mRNAレベルの低下は、腎毒性を予測するものとみなされた。
【０２８４】
KIM-1アッセイ
ヒトおよびラットKIM-1の分析のために、細胞上清を氷上で解凍し、サンプル希釈緩衝液(BioRadカタログ番号M60-009RDPD)で1：2および1:10に希釈し、ヒトKIM-1ビーズ(Human Kidney Injury panel 4, Millipore HKI4MAG-99K-KIM1)またはラットKim-1ビーズ(Milliplex Rat Kidney toxicity RKTX1MAG-37K-Kim1)を用いたLuminexベースのELISAにより分析し、その後Bio-Plex(登録商標)200 Systems (BioRad社)を用いて製造元の指示に従って分析した。3つ組のウェルの平均濃度および標準偏差としてデータを記録する。ビヒクルに対して200％を上回るKIM-1タンパク質レベルの増加は、腎毒性を予測するものとみなされた。
【０２８５】
KIM-1 mRNAレベルは、EGFR mRNAレベルと同じ手順に従って測定した。ラットでは、Panomics QuantiGene(登録商標)Plex Set＃31357を使用し、この場合にはHAVCR1がKIM-1に対応する。ビヒクルに対して1000％を上回るKIM-1 mRNAレベルの増加は、腎毒性を予測するものとみなされた。
【０２８６】
実施例1：オリゴヌクレオチド処理後の細胞培養物の形態変化
本実施例は、オリゴヌクレオチド処理後の細胞培養物の形態への影響を評価する。
【０２８７】
PTEC-TERT1細胞は「材料および方法」の項に記載した培養物であった。循環している裸のオリゴヌクレオチドへの腎尿細管の生理学的曝露を模倣するために(すなわち、送達技術の助けなし；本明細書では、ジムノシスまたはジムノシス送達と呼ばれる)、コンフルエントなPTEC-TERT1細胞の単層を100μMのオリゴヌクレオチドの水溶液に曝露した。新鮮な培地中に100μMの新鮮オリゴヌクレオチドを含めて、培地を3日ごとに交換した。
【０２８８】
7日間の処理の後、処理された細胞培養物の形態学的変化を明視野顕微鏡下で調べた。図1は、オリゴヌクレオチド化合物1-1 (インビボで無毒)で処理したPTEC-TERT1細胞が、生理食塩水で処理した細胞と比較して、いかなる形態変化も示さなかったことを示す。オリゴヌクレオチド化合物3-1 (中程度のインビボ毒性)で処理した細胞は、不規則なドームおよび液胞を形成した一方で、オリゴヌクレオチド化合物4-1 (高いインビボ毒性)で処理したPTEC-TERT1細胞は、扁平で安定した外観を示した。両方の毒性化合物とも形態変化を示すものの、毒性の低い化合物3-1は、毒性の高い化合物4-1よりも顕著な形態変化をもたらす。
【０２８９】
結論として、毒性オリゴヌクレオチドは形態に影響を与えるが、形態変化を用いて毒性の重症度を予測することはできない。
【０２９０】
実施例2：PCSK9を標的とするオリゴヌクレオチドおよびPTEC-TERT1細胞におけるEGFR mRNA発現へのその影響
本実施例は、8時間から6日間までの時間経過でオリゴヌクレオチドに曝露した細胞におけるバイオマーカーEGFRへの影響を評価する。該化合物の有効性を示すために、標的核酸PCSK9への影響も分析した。
【０２９１】
不死化PTEC-TERT-1細胞株を「材料および方法」の項に記載した条件に従って培養した。コンフルエンスで、該細胞を、「材料および方法」の項に記載したように、100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０２９２】
該細胞におけるEGFR mRNAレベルおよびPCSK9 mRNAレベルを、「材料および方法」の項に記載したアッセイに従って測定した。
【０２９３】
結果は、以下の表2および表3に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０２９４】
（表２）表示した時間にわたりオリゴヌクレオチドで処理した後の、生理食塩水に対する％としてのEGFR mRNAの濃度
2019521675.tif 000010
【０２９５】
（表３）表示した時間にわたりオリゴヌクレオチドで処理した後の、生理食塩水に対する％としてのPCSK9 mRNAの濃度
2019521675.tif 000011
【０２９６】
このことから、すでに48時間後には、毒性の高いオリゴヌクレオチド(化合物4-1)がEGFRをダウンレギュレートし始めるのに対して、中程度の毒性の化合物(化合物3-1)は6日後にEGFRダウンレギュレーションへの影響を示すことが分かる。PCSK9を標的とする化合物(化合物2-1、3-1および4-1)は、いずれも24時間後にはPCSK9の効果的なノックダウンを示す。毒性の低い化合物2-1は、実際には、PCSK9をダウンレギュレートするのに最も効果的であるようであり、したがって、PCSK9のダウンレギュレーションはオリゴヌクレオチドの毒性に関係するようには見えない。
【０２９７】
EFGRをダウンレギュレートする化合物(化合物3-1および4-1)のさらなる研究は、これらのオリゴヌクレオチドがEGFR pre-mRNAに対する1つのミスマッチのみを含んでいたが、無毒の化合物はEGFR mRNAに対して有意なマッチ(相補性)を示さなかった、ことを明らかにした。したがって、EGFR mRNAのダウンレギュレーションは理論的にはオフターゲット効果に起因する可能性があるが、本発明者らは、以下の実施例3に見られる観察に基づいて、それが当てはまるとは考えていない。
【０２９８】
実施例3：PCSK9、MYD88、およびBcl11Aを標的とするオリゴヌクレオチドの細胞外への影響
本実施例では、他の標的に対するオリゴヌクレオチドのより大きなセットについて、実施例2における知見が再現可能であるかどうかを評価する。同じ研究において、バイオマーカーKIM-1、EGFおよびATPも同様に測定した。
【０２９９】
不死化PTEC-TERT-1細胞株を「材料および方法」の項に記載した条件に従って培養した。コンフルエンスで、該細胞を、「材料および方法」の項に記載したように、10、30または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３００】
EGFRおよびKIM-1については、6日目に測定を行った。EGFR mRNAおよびKIM-1タンパク質のレベルは、「材料および方法」の項に記載したアッセイに従って測定した。
【０３０１】
結果は、以下の表4に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３０２】
（表４）オリゴヌクレオチド処理後6日目の細胞内のEGFR mRNAレベルおよび培地中のKIM-1レベル、ならびにオリゴヌクレオチド処理後9日目に測定した細胞内ATPレベル
2019521675.tif 000012
2019521675.tif 000013
【０３０３】
表4から、EGFRバイオマーカーは、100μMオリゴヌクレオチドの用量で13種の毒性化合物のうちの10種を予測できることが分かる。これらのオリゴヌクレオチドのうち、化合物13-1および15-1は、ヒトEGFR pre-mRNAに対して2つのミスマッチを有する。化合物13-1はEGFR mRNAレベルに影響を与えないので、この化合物中の2つのミスマッチは、EGFR pre-mRNAの切断を生じさせるには低すぎる結合親和性をもたらす可能性が高い。化合物8-1、9-1、10-1、11-1および16-1は、どれもEGFR mRNAのレベルを低下させるが、これらの化合物のいずれも、それらが標的を切断すると予想されるレベルにまでヒトEGFR pre-mRNAに対して相補的ではない(それらはヒトEGFR pre-mRNAに対して3つより多いミスマッチを有する)。結果的に、これらの化合物によるEGFR mRNAのダウンレギュレーションは、オフターゲット効果によるものではなく、したがって、EGFR mRNAが、EGFR pre-mRNAに対するオリゴヌクレオチドの相補性のレベルとは無関係に、オリゴヌクレオチドの腎毒性を予測するのに適切なバイオマーカーであることを立証する。
【０３０４】
KIM-1は13種の毒性化合物のうちの2種を予測するにすぎない。しかし、これらは、EGFRバイオマーカーでは捕捉されなかった化合物であり、このことは、KIM-1がバイオマーカーとしてのEGFRによる予測を補足することができることを示している。
【０３０５】
バイオマーカーとしてのATPは、12種の毒性化合物のうちの5種を予測することができる。結果的に、ATPバイオマーカーは、EGFRバイオマーカーを補足するために使用され得る。
【０３０６】
これらの結果は、図2にも要約されている。
【０３０７】
実施例4：PCSK9およびBcl11Aを標的とするオリゴヌクレオチド、ならびにラット初代PTEC細胞におけるEGFRおよびKIM-1発現へのそれらの影響
本実施例では、実施例2および3の知見が、異なる種由来の細胞株において再現可能であるかどうかを評価する。
【０３０８】
初代ラットPTEC細胞の細胞培養物を作製し、「材料および方法」の項に記載した条件に従って培養した。コンフルエンスで、該細胞を、「材料および方法」の項に記載したように、1、10または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３０９】
EGFRおよびKIM-1については、3日目に測定を行った。EGFR mRNAおよびKIM-1タンパク質のレベルは、「材料および方法」の項に記載したアッセイに従って測定した。
【０３１０】
結果は、以下の表5に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３１１】
（表５）オリゴヌクレオチド処理後3日目のEGFRおよびKIM-1レベル
2019521675.tif 000014
【０３１２】
初代ラットPTEC細胞は、一般的にオリゴヌクレオチド処理に対して非常に感受性が高く、100μMオリゴヌクレオチドの用量は、アッセイが予測しにくくなる程度まで該細胞に影響を与えるようである。ラットPTEC細胞の感受性を説明するために、表5のデータを、化合物1-1として示された非毒性の毒性参照アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して正規化した。EGFRレベルの減少をバイオマーカーとして使用して、このアッセイは、1μM用量で8種の毒性化合物のうちの6種を予測することができる(化合物3-1、4-1、15-1、18-1、19-1および19-2)。これらの化合物のいずれも、ラットEGFR pre-mRNAに対するミスマッチが2未満ではないので、結果的に、その効果はオフターゲット効果であると予想されない。
【０３１３】
KIM-1レベルの増加は、mRNAレベルおよびタンパク質レベルで有意に異なっている。KIM-1 mRNAレベルについては、毒性の指標の閾値を、無毒な化合物1-1に対して10倍の増加に設定した。KIM-1タンパク質レベルを測定する際の毒性の指標の閾値は、無毒な化合物1-1に対して2倍の増加に設定した。これらの閾値を用いて、8種の毒性化合物のうちの3種が毒性であると予測された(化合物3-1、19-1および19-2)；このことは、KIM-1がいくつかの化合物のためのバイオマーカーとしてEGFRによる予測を補足することができることを示している。
【０３１４】
このことから、ラット初代PTEC細胞におけるEGFRバイオマーカーは、オリゴヌクレオチドのインビボ毒性を予測するために使用できることが分かる。しかしながら、該細胞はオリゴヌクレオチド処理に対してより感受性であるため、ヒトPTECおよびPTEC-TERT1細胞の場合よりも低いオリゴヌクレオチド濃度で、非毒性の毒性参照アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較させて評価を行うことが推奨される。
【０３１５】
実施例5：CACO2細胞におけるEGFRへのオリゴヌクレオチドの影響
以下の実施例では、活発なEGF消費を有しないがEGFRを発現する、腎臓由来ではない細胞株が、オリゴヌクレオチドの腎毒性を予測するために使用できるかどうかを調べた。
【０３１６】
不死CACO2細胞株を、培地にEGFを加えることなく、「材料および方法」の項に記載されるように培養した。コンフルエンスで、該細胞を、「材料および方法」の項に記載したジムノシスを用いて、1、10または100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３１７】
該細胞を6日目に回収し、EGFRおよびPCSK9 mRNAレベルを「材料および方法」の項に記載したアッセイに従って測定した。
【０３１８】
結果は、以下の表6に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３１９】
（表６）オリゴヌクレオチド処理後6日目のCACO2細胞におけるEGFRおよびPCSK9 mRNAレベル。9日間処理後のATPレベル。
2019521675.tif 000015
【０３２０】
このことから、10および100μMのオリゴヌクレオチドで、腎毒性化合物(化合物3-1および4-1)がCACO2細胞を用いて同定され得ることが分かる。しかしながら、この実施例の条件は、バイオマーカーとしてのATPの予測結果をもたらすことができない。
【０３２１】
実施例6：A549細胞におけるEGFRへのオリゴヌクレオチドの影響
この実施例では、活発なEGF消費を有しかつEGFRを発現する、腎臓由来ではない別の細胞株が、オリゴヌクレオチドの腎毒性を予測するために使用できるかどうかを試験した。
【０３２２】
A549を「材料および方法」の項に記載されるように培養した。コンフルエンスで、該細胞を、「材料および方法」の項に記載したジムノシスを用いて、100μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３２３】
該細胞を2日目に回収し、EGFRおよびPCSK9 mRNAレベルを「材料および方法」の項に記載したアッセイに従って測定した。
【０３２４】
結果は、以下の表7に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３２５】
（表７）オリゴヌクレオチドのジムノシス処理後2日目のA549細胞におけるEGFRおよびPCSK9 mRNAレベル。
2019521675.tif 000016
【０３２６】
このことから、100μMのオリゴヌクレオチドで、腎毒性の高い化合物(化合物4-1および8-1)がA549細胞およびオリゴヌクレオチドのジムノシス送達を用いて同定され得ることが分かる。中程度の腎毒性の化合物(化合物3-1)は、生理食塩水に対して80％に極めて近いEGFRの低下を有し、短いインキュベーション時間にしては、潜在的な毒性を示しているとみなすことができる。
【０３２７】
したがって、P549細胞は、おそらく2日を超えるインキュベーション時間で、EGFR mRNAをバイオマーカーとして使用しかつ送達のためにジムノシスを使用して、腎毒性化合物を同定するのに有用であると結論される。
【０３２８】
実施例7：トランスフェクションを用いたA549細胞におけるEGFRへのPCSK9標的化オリゴヌクレオチドの影響
この実施例では、トランスフェクションに適した細胞株が腎毒性を予測する方法に適用できるかどうかを試験した。
【０３２９】
A549を「材料および方法」の項に記載されるように培養した。50〜60％コンフルエンス後、25μlのOptiMEM (GIBCO 31985062)中の0.5μlのリポフェクタミン(Invitrogen, 11668-019)および同体積のOptiMEM中の1ngのオリゴヌクレオチドを用いて、該細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。その細胞を37℃で一晩インキュベートした。A459標準培地＋10ng/ml EGFを用いて培地を交換した。トランスフェクションの48時間後、細胞を回収し、EGFR mRNAレベル、PCSK9 mRNAレベルおよびATPレベルを測定した。
【０３３０】
結果は、以下の表8に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３３１】
（表８）オリゴヌクレオチドのトランスフェクションの48時間後のA549細胞からのEGFR、ATP、およびPCSK9 mRNAレベル
2019521675.tif 000017
【０３３２】
これらのデータは、EGFRが、トランスフェクトされた上皮細胞においても腎毒性のバイオマーカーとして使用できることを示している。腎毒性オリゴヌクレオチド(化合物3-1および4-1)は、ちょうど48時間のインキュベーション後にわずか1ngのオリゴヌクレオチドで腎毒性であると予測された。ATPバイオマーカーはこれらのデータをうまくサポートする。
【０３３３】
これらのデータはまた、PCSK9がPCSK9を標的とするオリゴヌクレオチド(化合物3-1および4-1)によってノックダウンされ、非標的化化合物1-1および8-1によってはノックダウンされないことを示している。
【０３３４】
実施例8：トランスフェクションを用いたA549細胞におけるEGFRへのPCSK9およびMYD88標的化オリゴヌクレオチドの影響
この実施例では、トランスフェクションに適した細胞株が腎毒性を予測する方法に適用できるかどうかを試験した。
【０３３５】
A549を「材料および方法」の項に記載されるように培養した。50〜60％コンフルエンス後、25μlのOptiMEM (GIBCO 31985062)中の0.5μlのリポフェクタミン(Invitrogen, 11668-019)および同体積のOptiMEM中の1ngのオリゴヌクレオチドを用いて、該細胞にオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。オリゴヌクレオチド化合物1-1および2-1は、10ngを用いてトランスフェクトした。その細胞を37℃で一晩インキュベートした。A459標準培地＋10ng/ml EGFを用いて培地を交換した。トランスフェクションの48時間後、細胞を回収し、EGFR mRNAレベルを測定した。
【０３３６】
結果は、以下の表9に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３３７】
（表９）オリゴヌクレオチドのトランスフェクションの48時間後のA549細胞からのEGFR mRNAレベル
2019521675.tif 000018
【０３３８】
この実施例で試験したオリゴヌクレオチドのうち、EGFRバイオマーカーは、7種の腎毒性化合物のうちの5種を同定した(化合物4-1、8-1、9-1、10-1および11-1)。実施例3と同様に、化合物12-1および13-1は、EGFRバイオマーカーまたはKIM-1バイオマーカーを用いて腎毒性として予測されなかった。
【０３３９】
EGFRバイオマーカーは、トランスフェクションに基づくアッセイでは、短いインキュベーション時間および少量のオリゴヌクレオチドが必要とされるという利点を有して、良好なバイオマーカーであるようである。
【０３４０】
実施例9：EGFRがブロックされた場合のバイオマーカーとしてのATPへの影響
実施例7では、CACO2細胞において、ATPはバイオマーカーとして予測可能でなかったことが示された。CACO2細胞の増殖および生存は、本明細書に記載されるような培養条件においてはEGFに依存しない。本実施例は、本発明の腎毒性アッセイに使用される細胞株上のEGFRのブロッキングがATPバイオマーカーに影響を及ぼすかどうかを確認するために設定された。
【０３４１】
本アッセイでは、EGFRキナーゼ活性の小分子阻害剤であるエルロチニブを5μMで使用した。コンフルエントなPTEC-TERT1において、エルロチニブを含むまたは含まない培地中で、10ng/mlのEGFと共に100μMのオリゴヌクレオチドに9日間曝露した後に細胞内ATPレベルを測定した。結果は、表10に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３４２】
（表１０）エルロチニブの存在下でのオリゴヌクレオチドの細胞内ATPへの影響
2019521675.tif 000019
【０３４３】
これらのデータは、エルロチニブを用いてEGFRが不活性化された細胞では、無毒オリゴヌクレオチドと毒性オリゴヌクレオチドのATPプロファイルが区別できなかったことを示している。このことは、細胞ベースのアッセイにおいてオリゴヌクレオチドの腎毒性プロファイルを評価する場合、EGFR発現が細胞内で機能的である必要があることを強く示している。
【０３４４】
実施例10：バイオマーカーとしてATPを使用した時の培地中のEGF濃度の検討
実施例9に示されるように、ATPをバイオマーカーとして使用する場合には、機能的EGF受容体が細胞上に必要とされる可能性が高い。本実施例では、細胞内ATPレベルならびにオリゴヌクレオチドによる標的ノックダウンへの培地中のEGF濃度の影響を評価する。
【０３４５】
細胞内ATPレベルは、コンフルエントなPTEC-TERT1において、培地中の0、1、3、10、30および100ng/mlのEGFと共に、100μMのオリゴヌクレオチドに9日間曝露した後で測定した。結果は、表11に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３４６】
（表１１）培地中のEGFの様々なレベルを用いた、生理食塩水に対する％としての細胞内ATP
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【０３４７】
これらの結果は、PTEC-TERT1細胞にオリゴヌクレオチドを適用する場合、細胞内ATPレベルへの影響が培地中のEGF濃度に依存するが、標的ノックダウンは培地中のEGFレベルに影響されないことを示している。培地中の10ng/mlのEGFでは、オリゴヌクレオチド化合物の毒性はうまく区別され得るが、3ng/ml以下では有意な差別化が観察されない。培地中のEGFの存在は、バイオマーカーEGFRの評価には必要でない(実施例7参照)。
【０３４８】
実施例11：PTEC-TERT1細胞におけるEGFR mRNAへのオリゴヌクレオチドの影響
化合物20-1は、ISIS, 388626としても知られており、ナトリウム-グルコース共輸送体2 (SGLT2)を標的とする、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この化合物は、13週間の試験で50mg、100mgまたは200mgを週1回投与した場合、ヒトにおいて可逆的なインビボ腎毒性を引き起こすことが示されている(Meer et al 2016 J Pharmacol Exp Ther Vol 359 pp 280-289)。
【０３４９】
本実施例では、化合物20-1をPTEC-TERT1細胞に投与した後でEGFR mRNAを測定することにより、この腎毒性を予測できるかどうかを調べた。
【０３５０】
初代不死化PTEC-TERT-1細胞株を「材料および方法」の項に記載した条件に従って培養した。コンフルエンスで、該細胞を、「材料および方法」の項に記載されるように、30、100、300、400または500μMの濃度のオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３５１】
EGFR mRNAを、「材料および方法」の項に記載したアッセイを用いて測定した。
【０３５２】
結果は、以下の表12に示されており、3つの同一の処理の平均を表す。
【０３５３】
（表１２）PTEC-TERT1細胞のオリゴヌクレオチド処理の9日後のEGFR mRNA
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【０３５４】
これらのデータから、MOEアンチセンスオリゴヌクレオチド(化合物20-1)のインビボ腎毒性は、PTEC-TERT1細胞を用いて、100μM以上のオリゴヌクレオチド濃度で、バイオマーカーとしてのEGFR mRNAにより予測できることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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