(57)【要約】  本発明は、質量比が１：４−３２．５である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が３７．５−９５．３ｗｔ％のアルブミンと４．７−６２．５ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：１−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製される、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤に関する。前記ナノ製剤の調製方法は、ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製と、担体溶液の調製と、薬物溶液の調製と、ナノ製剤の調製とを含む。前記ナノ製剤は、粒子径の分布が比較的均一であり、分散性に優れており、安定で凝集することなく、凍結乾燥・再溶解後の粒子径が基本的に変わらず、ミリポアフィルターによるろ過（０．２２μｍ）後の収率が高く、薬効が良好である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量比が１：４−３２．５である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が３７．５−９５．３ｗｔ％のアルブミンと４．７−６２．５ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：１−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製されることを特徴とする、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【請求項２】
質量比が１：４．８−１９である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が５０．０ｗｔ％−９５．０ｗｔ％のアルブミンと５．０−５０．０ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：２−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製されることを特徴とする、請求項１に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【請求項３】
前記ヒアルロン酸の分子量が２−６０ｋＤａであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【請求項４】
前記アルブミンがヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、オボアルブミン及び遺伝子組換えヒト血清アルブミンから選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【請求項５】
前記疎水性抗腫瘍薬物がパクリタキセル、ドセタキセル、アジタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、サイクロスポリン、ラパマイシン、バンコマイシン、チオテパ又はそれらの誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【請求項６】
ナノ粒子安定剤をさらに含み、前記ナノ粒子安定剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック重合体、ｄ−αトコフェロールコハク酸ポリエチレングリコールエステル、ポリビニルピロリドンから選択され、前記ナノ粒子安定剤が疎水性抗腫瘍薬物の質量の１．０−１０．０％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【請求項７】
以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸とアルブミンとを水性媒体に加えて溶解させ、溶液のｐＨを５．０−６．０に調節した後、それに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを添加して１５−６０ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．０−７．５に調節し、室温で３−２４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得る。或いは、
ヒアルロン酸を水性媒体に溶かし、溶液のｐＨを５．０−６．０に調節した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを添加し、室温で１５−６０ｍｉｎ撹拌反応させることにより、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られた。さらに、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルをアルブミンの水性媒体溶液に滴下し、或いはアルブミンの水性媒体溶液をヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルに滴下し、溶液のｐＨを７．０−７．５に調節し、室温で３−２４ｈ撹拌反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得る。
（２）担体溶液の調製
アルブミンと工程（１）で調製されたヒアルロン酸−アルブミン共役物を水性媒体に溶かし、担体溶液が得られる。
（３）薬物溶液の調製
疎水性抗腫瘍がん薬物又は疎水性抗腫瘍がん薬物とナノ粒子安定剤を有機溶剤に溶かし、薬物溶液が得られる。
（４）ナノ製剤の調製
均質条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに、高圧均質下で二次エマルジョンが得られ、その後有機溶剤を除去し、ろ過し、凍結乾燥することにより、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤が得られる。
【請求項８】
工程（２）に記載の担体溶液における担体の濃度が４．０−５０．０ｍｇ／ｍＬであり、工程（３）に記載の薬物溶液における疎水性抗腫瘍薬物の濃度が１６．０−３４５．０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項７に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
【請求項９】
工程（１）に記載の水性媒体が２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、リン酸塩緩衝液又は無菌水であり、工程（２）に記載の水性媒体が無菌水、リン酸塩緩衝液、生理食塩水、５．０ｗｔ％グルコース水溶液又は５．０ｗｔ％マンニトール水溶液であり、工程（３）に記載の有機溶剤がジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロメタンとエタノールの混合物、又はクロロホルムとエタノールの混合物であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
【請求項１０】
工程（４）に記載の高圧均質の圧力が１００００−４００００ｐｓｉであり、高圧均質でのスループットが１０．０−２５．０Ｌ／ｈであり、高圧均質での循環回数が７−２０回であり、前記有機溶剤の除去方法が１５．０−４５．０℃の条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発して除去することを特徴とする、請求項７又は８に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に属し、具体的には、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大部分の腫瘍は内部の血管の成長が速くて不規則であり、内部リンパ系のクリアが遅く、腫瘍透過の向上因子が存在することで、高分子やナノ粒子が腫瘍の内部に滞留しやすく、それは「血管透過性・滞留性亢進効果」（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ、ＥＰＲ）と呼ばれる。ナノ投薬系はＥＰＲ効果で受動的に腫瘍を標的にでき、腫瘍標的治療への応用過程で重視されてきている。リポソーム、ナノ粒子といった通常のナノ剤型は、血漿において、ヒト細網内皮系により認識されることで、ナノ製剤の血漿クリアが加速するため、その治療効果が低下する。そのため、表面が修飾されたナノ製剤は広く検討され、注目されている。
【０００３】
アルブミンは血漿に大量存在するタンパク質である。薬物担体の研究で常用されるアルブミンはヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、オボアルブミンを含む。アルブミンは分子内に多種類の薬物結合部位があり、異種の薬物に対して効果的に負荷できるとともに、水溶性が高いこと、安定性が良好であること、分解可能であることなどの特徴を有し、その生物的適合性が高いため、人体への使用は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認められるので、アルブミンは薬物輸送の理想的な担体である。そして、アルブミンに存在するアミノ基、メルカプトなどは、標的性を向上させるように主動標的基をさらに修飾することができる。既存の注射用パクリタキセル（アルブミン結合型）注射剤（Ａｂｒａｘａｎｅ）は販売されて広く注目される。
【０００４】
特許文献１（中国特許出願第２０１２１０１４２９９１号）では、ヒアルロン酸とヒト血清アルブミンとの共役物を担体として調製し、高速均質、高圧均質又は超音波処理の条件下で植物類抗がん薬物及びナノ粒子安定剤とから植物類抗がん標的ナノ製剤を作製することが開示されている。当該ナノ製剤は腫瘍細胞表面の受容体、例えばＣＤ４４に対する生体標的作用を有し、体内に静脈注射されると、腫瘍のＥＰＲ効果及びＨＡのＣＤ４４高度結合性により、薬物を腫瘍部位に蓄積させ、かつナノ薬剤担送システムの体内での循環時間を延ばすことができる。
【０００５】
生体医学への応用において、ナノ粒子薬物の粒子径が重要であり、粒子径が異なると代謝経路も異なり、粒子径が小さいものは腎臓代謝であるが、粒子径が大きいものは肝臓代謝である。そのうち、２０−２００ｎｍの粒子は腫瘍に対して受動標的作用を持ち、この粒子径の範囲内にあるナノ粒子薬物は薬物自身のサイズによる若干の生体医学効果を削除でき、それにより医療効果を向上できる。
【０００６】
また、注射剤は無菌製剤の一つであり、その無菌は良好に制御される検証された滅菌／除菌プロセスにより、生産過程で医薬品の製造管理及び品質管理基準（ＧＭＰ、ＧｏｏｄＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＰｒａｃｔｉｃｅｆｏｒｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ）に厳しく従うことで実現される。高温でタンパク質が変性してしまうため、大量のタンパク質（例えば、アルブミン）を含有する製剤はいずれも通常の方法（例えば、高温）で滅菌されることが禁止される。ろ過滅菌法は、監督管理機関に認められる不安定性があるので、高温滅菌を含む滅菌法を採用してはいけない状況で採用する最終の滅菌方法である。そのため、０．２２μｍフィルターによりろ過除菌する方法は、注射型ナノ製剤を調製するために好適である。
【０００７】
しかしながら、特許文献１（中国特許出願第２０１２１０１４２９９１号）におけるナノ製剤粒子は、粒子径の分布係数が大きく、粒子径の分布が広く、且つ凍結乾燥して再溶解された後、ヒト血清アルブミンを修飾するヒアルロン酸の分子鎖が絡んでしまうことで、粒子間が凝集し、付着して、凍結乾燥品が再溶解された後に粒子径が増大する。そのため、ミリポアフィルター（０．２２μｍ）によるろ過に際しては、フィルターの膜孔が塞がれやすく、ろ液中の粒子濃度が低下し、それにより、ろ液における薬物の含有量が低下し、薬効が影響されて製品の収率が低下してしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０２６８８２００号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
それに基づき、本発明の目的の一つは、粒子径の分布が比較的均一であり、分散性に優れており、安定で凝集することなく、凍結乾燥・再溶解後の粒子径が基本的に変わらず、ミリポアフィルター（０．２２μｍ）によるろ過後のろ液中の薬物濃度が基本的に変わらない、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤を提供することである。
【００１０】
上述した目的を達成するための具体的な技術方案は以下の通りである。
【００１１】
質量比が１：４−３２．５である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が３７．５−９５．３ｗｔ％のアルブミンと４．７−６２．５ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：１−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製される、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤である。
【００１２】
いくつかの実施例においては、前記標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤は、質量比が１：４．８−１９である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が５０．０−９５．０ｗｔ％のアルブミンと５．０−５０．０ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：２−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製される。
【００１３】
いくつかの実施例においては、前記ヒアルロン酸の分子量が２−６０ｋＤａである。
【００１４】
いくつかの実施例においては、前記アルブミンがヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、オボアルブミン及び遺伝子組換えヒト血清アルブミンである。
【００１５】
いくつかの実施例においては、前記疎水性抗腫瘍薬物がパクリタキセル、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、アジタキセル（ａｚｉｄｉｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、サイクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）又はそれらの誘導体から選択される。
【００１６】
いくつかの実施例においては、前記標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤がナノ粒子安定剤をさらに含み、前記ナノ粒子安定剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック重合体、ｄ−αトコフェロールコハク酸ポリエチレングリコールエステル、ポリビニルピロリドンから選択され、前記ナノ粒子安定剤が疎水性抗腫瘍薬物の質量の１．０−１０．０％である。
【００１７】
本発明の目的のもう一つは、前記標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法を提供することである。
【００１８】
具体的な技術方案は以下の通りである。
【００１９】
以下の工程を含む前記標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法である。
【００２０】
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸とアルブミンとを水性媒体に加えて溶解させ、溶液のｐＨを５．０−６．０に調節した後、それに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを添加して１５−６０ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．０−７．５に調節し、室温で３−２４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後、ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得る。或いは、
ヒアルロン酸を水性媒体に溶かし、溶液のｐＨを５．０−６．０に調節した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを添加し、室温で１５−６０ｍｉｎ撹拌反応させることにより、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られる。さらに、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルをアルブミンの水性媒体溶液に滴下し、或いはアルブミンの水性媒体溶液をヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルに滴下し、溶液のｐＨを７．０−７．５に調節し、室温で３−２４ｈ撹拌反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得る。
【００２１】
（２）担体溶液の調製
アルブミンと工程（１）で調製されたヒアルロン酸−アルブミン共役物を水性媒体に溶かし、担体溶液が得られる。
【００２２】
（３）薬物溶液の調製
疎水性抗腫瘍がん薬物又は疎水性抗腫瘍がん薬物とナノ粒子安定剤を有機溶剤に溶かし、薬物溶液が得られる。
【００２３】
（４）ナノ製剤の調製
均質条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに、高圧均質下で二次エマルジョンが得られ、その後有機溶剤を除去し、ろ過し、凍結乾燥することにより、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤が得られる。
【００２４】
いくつかの実施例においては、工程（２）に記載の担体溶液における担体の濃度が４．０−５０．０ｍｇ／ｍＬであり、工程（３）に記載の薬物溶液における疎水性抗腫瘍薬物の濃度が１６．０−３４５．０ｍｇ／ｍＬである。
【００２５】
いくつかの実施例においては、工程（１）に記載の水性媒体が２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、リン酸塩緩衝液又は無菌水である。工程（２）に記載の水性媒体が無菌水、リン酸塩緩衝液、生理食塩水、５．０ｗｔ％グルコース水溶液又は５．０ｗｔ％マンニトール水溶液である。工程（３）に記載の有機溶剤がジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロメタンとエタノールの混合物、又はクロロホルムとエタノールの混合物である。
【００２６】
いくつかの実施例においては、工程（４）に記載の高圧均質の圧力が１００００−４００００ｐｓｉであり、高圧均質でのスループットが１０．０−２５．０Ｌ／ｈであり、高圧均質での循環回数が７−２０回である。前記有機溶剤の除去方法は１５．０−４５．０℃の条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発して除去する。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の発明者は、長期間の経験で実験過程では、ヒアルロン酸−アルブミン共役物に未変性のアルブミンを添加することにより、本発明に係る標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の粒子の粒子径を低下し、粒子径の分布がより均一になり、ナノ粒子間の凝集や付着を回避又は減少することができることを見出した。そのため、本発明に係る標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤は、以下の利点がある。
【００２８】
１、本発明に係るナノ製剤は粒子径の分布が比較的均一で大部分が２２０ｎｍより小さく、かつ再溶解後の粒子径が増大しておらず、ミリポアフィルター（０．２２μｍ）によるろ過の後に高い収率を有し、粒子径の過大で捕捉されることによるロスが大幅低減され、薬効が向上し、腫瘍に対する抑制作用を高めることができる。
【００２９】
２、本発明に係るナノ製剤は粒子径の大部分が２２０ｎｍより小さく、かつ再溶解後の粒子径が増大しておらず、それにより体内循環システム中でのナノ粒子の長期間循環に寄与し、単核マクロファージに呑み込まれることも肝臓中の細網系に阻止されることもなく、主動標的性を有するため、標的部位での十分な血中濃度を確保し、薬効を高め、非腫瘍部位に対する毒性を低下させることに寄与できる。
【００３０】
３、本発明に係るナノ製剤は、再溶解した後、溶液での安定性に優れ、体内環境で安定し、担体や薬物が稼働中で安定した複合体に保持できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例３の標的ナノ製剤粒子のろ過前の粒子径分布図。
【図２】比較例１の標的ナノ製剤粒子のろ過前の粒子径分布図。
【図３】実施例１及び２、実施例５及び６と比較例１及び２の標的ナノ製剤の腫瘍に対する抑制作用の比較模式図。
【図４】実施例１、実施例６と比較例１及び２の標的ナノ製剤の生体標的性の比較模式図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。
【００３３】
ＥＤＣＩ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩  （Ｎ−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ′−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液
ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯブロック重合体：ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック重合体
ＴＰＧＳ：ｄ−αトコフェロールコハク酸ポリエチレングリコール
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン
【００３４】
（実施例１）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量２ｋＤａ）２．７０４２ｇとヒト血清アルブミン４．４９５８ｇ（モル数がヒアルロン酸の１／２０倍）とを、無菌水２７．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．５に調節した後、それにＥＤＣＩ１２．９６００ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ２９．３５８４ｇとを添加して１５ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．４に調節し、室温で５ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００３５】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン０．９７２０ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物０．１０８０ｇとを無菌水２１６．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００３６】
（３）薬物溶液の調製
パクリタキセル０．１２００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）２．７ｍＬに溶かし、薬物溶液を得た。
【００３７】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：２００００ｐｓｉ、スループット：１０．０Ｌ／ｈ）で７回循環させて二次エマルジョンを得た後、３０．０−４５．０℃の条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてパクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００３８】
（実施例２）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量３ｋＤａ）２．４５７５ｇとヒト血清アルブミン８．１７１１ｇ（モル数がヒアルロン酸の３／２０倍）とを、０．０１ＭＭＥＳ溶液２７．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．５に調節した後、それにＥＤＣＩ６．２８１３ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ１４．２２９１ｇとを添加して１５ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．４に調節し、室温で４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００３９】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン１．２７５４ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物０．３１８９ｇとを無菌水２１３．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００４０】
（３）薬物溶液の調製
パクリタキセル０．１２００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）７．１ｍＬに溶かし、薬物溶液を得た。
【００４１】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：１４０００ｐｓｉ、スループット：１２．０Ｌ／ｈ）で１０回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてパクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００４２】
（実施例３）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量５ｋＤａ）１．４３１９ｇとヒト血清アルブミン３．１７４１ｇ（モル数がヒアルロン酸の１／６倍）とを、０．０１ＭＰＢＳ１８．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．４に調節した後、それにＥＤＣＩ１．６４７０ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ３．３５７９ｇとを添加して１５ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．５に調節し、室温で４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００４３】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン１．０５９４ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物０．４６０６ｇとを無菌水１５０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００４４】
（３）薬物溶液の調製
パクリタキセル０．０８００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）の約４．３ｍＬに溶かし、薬物溶液を得た。
【００４５】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：１７０００ｐｓｉ、スループット：１５．０Ｌ／ｈ）で１２回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてパクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００４６】
（実施例４）
アジタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量８ｋＤａ）１．６８８４ｇとヒト血清アルブミン２．６３１６ｇ（モル数がヒアルロン酸の３／１６倍）とを、０．０１ＭＭＥＳ２４．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．６に調節した後、それにＥＤＣＩ１．０１１５ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ２．０６２２ｇとを添加して１５ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．４に調節し、室温で４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００４７】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン２．１６ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物１．４４ｇとを無菌水２９０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００４８】
（３）薬物溶液の調製
アジタキセル０．４０００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）７．２ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００４９】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：２００００ｐｓｉ、スループット：１５．０Ｌ／ｈ）で１４回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてパクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００５０】
（実施例５）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量１０ｋＤａ）１．８１４４ｇとヒト血清アルブミン２．５８５６ｇ（モル数がヒアルロン酸の３／１４倍）とを、０．０１ＭＰＢＳ３０．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．３に調節した後、それにＥＤＣＩ０．８６９６ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ１．４７７４ｇとを添加して１５ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．４に調節し、室温で６ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００５１】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン４．１８００ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物０．２２００ｇとを無菌水３００．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００５２】
（３）薬物溶液の調製
パクリタキセル０．６０００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）７．３ｍＬに溶かし、薬物溶液を得た。
【００５３】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：２５０００ｐｓｉ、スループット：１５．０Ｌ／ｈ）で１０回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてパクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００５４】
（実施例６）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量１５ｋＤａ）１．６２８９ｇとヒト血清アルブミン１．８０５４ｇ（モル数がヒアルロン酸の１／４倍）とを、０．０１ＭＭＥＳ３３．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．５に調節した後、それにＥＤＣＩ０．４１６４ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ０．７０７４ｇとを添加して２０ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．３に調節し、室温で３ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００５５】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン３．８４６５ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物０．６８６９ｇとを無菌水２３０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００５６】
（３）薬物溶液の調製
パクリタキセル０．８０００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）５．０ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００５７】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：３００００ｐｓｉ、スループット：１８．０Ｌ／ｈ）で１２回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてアジタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００５８】
（実施例７）
ドセタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量２０ｋＤａ）１．２２２１ｇとヒト血清アルブミン１．２１９１ｇ（モル数がヒアルロン酸の３／１０倍）とを、０．０１ＭＰＢＳ３１．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．０に調節した後、それにＥＤＣＩ０．２３４３ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ０．３１８４ｇとを添加して２０ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．０に調節し、室温で８ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００５９】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン３．７６６４ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物２．０９２４ｇとを無菌水２３５．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００６０】
（３）薬物溶液の調製
ドセタキセル１．２０００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（９：１）４．７ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００６１】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：２５０００ｐｓｉ、スループット：２０．０Ｌ／ｈ）で１４回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてドセタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００６２】
（実施例８）
カンプトテシン標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量２５ｋＤａ）２．４４７５ｇを０．０１ＭＭＥＳ８２．０ｍＬに完全に溶解させ、溶液のｐＨを６．０に調節した後、それにＥＤＣＩ０．３００３ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ０．３４０１ｇとを加え、室温で６０ｍｉｎ撹拌して反応させ、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られた。さらにヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルをヒト血清アルブミン（モル数がヒアルロン酸の３／８倍）のＭＥＳ溶液（２．４４１４ｇ／４９．０ｍＬ）に滴下し、溶液のｐＨを７．５に調節し、室温で１０ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００６３】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン３．５５５６ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物４．４４４４ｇとを無菌水２７０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００６４】
（３）薬物溶液の調製
カンプトテシン２．００００ｇをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（１１：１）１３．３ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００６５】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：３００００ｐｓｉ、スループット：２３．０Ｌ／ｈ）で１５回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてカンプトテシン標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００６６】
（実施例９）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量３０ｋＤａ）１．３５１８ｇを０．０１ＭＰＢＳ６８．０ｍＬに完全に溶解させ、溶液のｐＨを５．９に調節した後、それにＥＤＣＩ０．１０３７ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ０．１１７４ｇとを加え、室温で３０ｍｉｎ撹拌して反応させ、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られた。さらにヒト血清アルブミン（モル数がヒアルロン酸の１／２倍）のＰＢＳ溶液（１．４９８２ｇ／２５．０ｍＬ）をヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルに滴下し、溶液のｐＨを７．５に調節し、室温で１２ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００６７】
（２）担体溶液の調製
ヒト血清アルブミン５．７０００ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物１．９０００ｇとを０．０１ＭＰＢＳ２２０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００６８】
（３）薬物溶液の調製
パクリタキセル０．４０００ｇとＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯブロック重合体０．００４０ｇとをクロロホルム３．３ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００６９】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：２５０００ｐｓｉ、スループット：２５．０Ｌ／ｈ）で１６回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてパクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００７０】
（実施例１０）
チオテパ標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量４０ｋＤａ）６．６０７０１ｇを０．０１ＭＭＥＳ３００．０ｍＬに完全に溶解させ、溶液のｐＨを５．１に調節した後、それにＥＤＣＩ０．２３２７ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ０．１８４５ｇとを加え、室温で４５ｍｉｎ撹拌して反応させ、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られた。さらにヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルを遺伝子組換えヒト血清アルブミン（モル数がヒアルロン酸の３／５倍）のＭＥＳ溶液（６．０５４９ｇ／８６．０ｍＬ）に滴下し、溶液のｐＨを７．２に調節し、室温で１５ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００７１】
（２）担体溶液の調製
遺伝子組換えヒト血清アルブミン４．８５００ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物８．０８３３ｇとを生理食塩水３２０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００７２】
（３）薬物溶液の調製
チオテパ０．４０００ｇとＴＰＧＳ０．０１２０ｇとをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（７：１）５．９ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００７３】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：１００００ｐｓｉ、スループット：２０．０Ｌ／ｈ）で１８回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．４５μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてチオテパ標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００７４】
（実施例１１）
バンコマイシン標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量５０ｋＤａ）５．４０５４ｇを０．０１ＭＰＢＳ５４０．０ｍＬに完全に溶解させ、溶液のｐＨを５．６に調節した後、それにＥＤＣＩ０．０８２９ｇとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ０．０２８２ｇとを加え、室温で４０ｍｉｎ撹拌して反応させ、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られた。さらにオボアルブミン（モル数がヒアルロン酸の３／６倍）のＰＢＳ溶液（３．５９４６ｇ／４５．０ｍＬ）をヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルに滴下し、溶液のｐＨを７．４に調節し、室温で１８ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００７５】
（２）担体溶液の調製
オボアルブミン５．４０００ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物５．４０００ｇとを５．０ｗｔ％グルコース水溶液２４０．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００７６】
（３）薬物溶液の調製
バンコマイシン１．２０００ｇとＴＰＧＳ０．０８４０ｇとをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（１５：１）４．０ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００７７】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：３５０００ｐｓｉ、スループット：１８．０Ｌ／ｈ）で１９回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．２２μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてバンコマイシン標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００７８】
（実施例１２）
ドキソルビシン標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸（分子量６０ｋＤａ）０．３３１３ｇと牛血清アルブミン０．３６７１ｇ（モル数がヒアルロン酸の１倍）とを０．０１ＭＭＥＳ３３．０ｍＬに溶解させ、溶液のｐＨを５．４に調節した後、それにヒアルロン酸と同じモル比であるＥＤＣＩとＳｕｌｆｏ−ＮＨＳとを添加して１５ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．３に調節し、室温で２４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応のＥＤＣＩ、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得た。
【００７９】
（２）担体溶液の調製
牛血清アルブミン１３．９６８３ｇとヒアルロン酸−アルブミン共役物０．６９８４ｇとを５．０ｗｔ％マンニトール水溶液３００．０ｍＬに溶かし、担体溶液を得た。
【００８０】
（３）薬物溶液の調製
ドキソルビシン２．００００ｇとＰＶＰ０．２０００ｇとをクロロホルムとエタノールとの混合溶剤（５：１）５．８ｍＬに溶解させ、薬物溶液を得た。
【００８１】
（４）ナノ製剤の調製
高速均質の条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに高圧均質（圧力：４００００ｐｓｉ、スループット：１５．０Ｌ／ｈ）で２０回循環させて二次エマルジョンを得た後、１５．０−２５．０℃、−０．１ＭＰａの条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発除去し、０．４５μｍフィルターでろ過し、ろ液を凍結乾燥させてドキソルビシン標的抗腫瘍ナノ製剤を得た。
【００８２】
（比較例１）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
特許文献１（中国特許出願第２０１２１０１４２９９１号）における実施例３に従って実施する。
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
まず、ヒアルロン酸活性エステルを調製した。具体的には、ヒアルロン酸（分子量５ｋＤａ）４００ミリグラムを０．１ＭＭＥＳ緩衝液１０．０ｍＬに溶解させ、ヒアルロン酸のモル数の１．２倍のＥＤＣＩと、ヒアルロン酸のモル数の１．２倍のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドとを加えた。室温で３０分間撹拌して反応させて、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルを作製した。次に、ヒト血清アルブミンの凍結乾燥粉５００．０ｍｇを無菌水１０．０ｍＬに溶解させ、上記で得られたヒアルロン酸のスクシンイミド活性エステルの溶液に添加した。ｐＨを７．０−７．２に調整し、室温で６０分間撹拌して反応させた。反応が完成した後、分子量を１００００までカットオフした透析袋に入れ、未反応の試薬及び反応副生成物を透析で除去した。透析後のヒアルロン酸−アルブミン溶液を凍結乾燥させ、凍結乾燥されたヒアルロン酸−アルブミンをｐＨ５．５のリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ緩衝液）に溶かし、アルブミン／ヒアルロン酸溶液を得た。
【００８３】
（２）パクリタキセル溶液の調製
パクリタキセルを５０．０ｍｇ、ＴＰＧＳを５０．０ｍｇ量り取り、クロロホルム１．０ｍＬに溶かし、パクリタキセル溶液を得た。
【００８４】
（３）パクリタキセル／ＴＰＧＳ／ヒアルロン酸−アルブミンナノ製剤の調製
撹拌の条件でパクリタキセル溶液をアルブミン／ヒアルロン酸溶液に加え、一次エマルジョンを形成した。一次エマルジョンを高圧ホモジナイザー（９０００−４００００ｐｓｉ）で処理してナノエマルジョンを得、ナノエマルジョンをロータリーエバポレーターに移し、３０．０−４５．０℃で減圧して有機溶剤を迅速に蒸発して除去し、そして無菌条件で凍結乾燥させ、凍結乾燥粉末を得た。
【００８５】
（比較例２）
パクリタキセル標的抗腫瘍ナノ製剤の調製
特許文献１（中国特許出願第２０１２１０１４２９９１号）における実施例１４に従って実施する。
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
まず、ヒアルロン酸活性エステルを調製した。具体的には、ヒアルロン酸（分子量５ｋＤａ）４００．０ｍｇを０．１ＭＭＥＳ緩衝液１０．０ｍＬに溶解させ、ヒアルロン酸のモル数の１．２倍のＥＤＣＩと、ヒアルロン酸のモル数の１．２倍のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドとを加えた。室温で３０分間撹拌して反応させて、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルを作製した。次に、ヒト血清アルブミンの凍結乾燥粉５００．０ｍｇを無菌水１０．０ｍＬに溶解させ、上記で得られたヒアルロン酸のスクシンイミド活性エステルの溶液に添加した。ｐＨを７．０−７．２に調整し、室温で６０分間撹拌して反応させた。反応が完成した後、分子量を１００００までカットオフした透析袋に入れ、未反応の試薬及び反応副生成物を透析で除去した。透析後のヒアルロン酸−アルブミン溶液を凍結乾燥させ、凍結乾燥されたヒアルロン酸−アルブミンをｐＨ５．５のリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ緩衝液）に溶かし、アルブミン／ヒアルロン酸溶液を得た。
【００８６】
（２）パクリタキセル溶液の調製
パクリタキセルを５０．０ｍｇ、ＴＰＧＳを５０．０ｍｇ量り取り、クロロホルムとエタノールとの混合物（９：１）１．０ｍＬに溶かし、パクリタキセル溶液を得た。
【００８７】
（３）パクリタキセル／ＴＰＧＳ／ヒアルロン酸−アルブミンナノ製剤の調製
撹拌の条件でパクリタキセル溶液をアルブミン／ヒアルロン酸溶液に加え、一次エマルジョンを形成した。一次エマルジョンを高圧ホモジナイザー（９０００−４００００ｐｓｉ）で処理してナノエマルジョンを得、ナノエマルジョンをロータリーエバポレーターに移し、３０．０−４５．０℃で減圧して有機溶剤を迅速に蒸発して除去し、そして無菌条件で凍結乾燥させ、凍結乾燥粉末を得た。
【００８８】
（実施例１３）
標的ナノ製剤薬物の含有量の比較
実施例１−１２及び比較例１−２で得られたナノ製剤の凍結乾燥物の各１０．０ｍｇを、それぞれ無菌ろ過された生理食塩水に加えて再溶解させ、均一に振とうした後、そのうちの２．０ｍＬを０．２２μｍフィルターでろ過した。それぞれナノ製剤溶液にクロロホルム−エタノール溶液（９：１）２．０ｍｌを加え、ボルテックスシェーカーで十分に振とうさせて製剤中の薬物を抽出し、高速液相クロマトグラフィーでろ過前後の液体中の薬物濃度を測定し、そして各実施例及び比較例における、有機溶剤の除去された（すなわち、凍結乾燥前の）二次エマルジョンの薬物含有率及び薬物収率を比較した。そのうち、薬物含有率（％）＝薬物濃度＊体積／（薬物と担体の質量）＊１００％、薬物収率（％）＝薬物含有率／理論的薬物含有率＊１００％である。結果を表１に示した。
【００８９】
ナノ製剤の凍結乾燥前、凍結乾燥・再溶解後及び再溶解・ろ過後の薬物含有率と薬物収率
【表１】
2019504874.tif 000003
【００９０】
表１の結果から分かるように、本発明の標的ナノ製剤は、凍結乾燥・再溶解及び再溶解、０．２２μｍフィルターによるろ過後、依然として非常に高い薬物含有率と薬物収率を有した。また、比較例１及び比較例２における標的ナノ製剤は、凍結乾燥前後の薬物収率が特に大きい差異がないが、０．２２μｍフィルターによるろ過後の薬物収率が急激に低下し、ろ過前の３９．８６％と５６．９９％でしかなかった。それは、ろ過工程で多量の薬剤担送粒子がろ過膜により捕捉されたことを証明し、これらの粒子は粒子径が０．２２μｍフィルターのろ過膜の細孔径より大きいと推測される。それに対して、本発明の標的ナノ製剤においては、凍結乾燥・再溶解後に粒子径が０．２２μｍより大きい粒子が極めて少なく存在した。また、本発明の標的ナノ製剤の粒子は分散性により優れ、より安定し、凝集することもないため、ろ過された後でも高い薬物収率を有することも証明された。
【００９１】
（実施例１４）
標的ナノ製剤の粒子径の比較
実施例１−１２及び比較例１−２で得られたナノ製剤の凍結乾燥物の各１０．０ｍｇを、それぞれ無菌ろ過された生理食塩水に加えて再溶解させ、均一に振とうした後、そのうちの２．０ｍＬを０．２２μｍフィルターでろ過した。米国ブルックヘブンのレーザー散乱粒度測定装置（ＺｅｔａＰＡＬＳ）でろ過前後のナノ製剤の粒子径を測定し、各実施例における有機溶剤の除去された（すなわち、凍結乾燥前の）二次エマルジョンの粒子径を比較した。実施例３の標的ナノ製剤粒子のろ過前の粒子径分布図を図１に示し、比較例１の標的ナノ製剤粒子のろ過前の粒子径分布図を図２に示し、すべての結果を表２に示した。
【００９２】
ナノ製剤の凍結乾燥前、凍結乾燥・再溶解後及び再溶解・ろ過後の平均粒子径及び粒子径の範囲
【表２】
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【００９３】
表２の結果から分かるように、すべての実施例の標的ナノ製剤の粒子は、凍結乾燥前と凍結乾燥・再溶解後の粒子径が異なり、本発明の標的ナノ製剤は比較例の標的ナノ製剤より、凍結乾燥・再溶解後の粒子の粒子径の増大程度が遥かに小さかった。また、本発明の標的ナノ製剤の粒子は、再溶解後の粒子径が２５０ｎｍ以下であったことに対して、比較例の標的ナノ製剤の粒子は粒子径が最大３５０ｎｍに近づいた。そして、再溶解前後の平均粒子径と粒子径の範囲の変化から、すべての実施例及び比較例の標的ナノ製剤の粒子の平均粒子径がいずれも２２０ｎｍより小さかったが、比較例の粒子径の分布範囲がより広く、粒子径が２２０ｎｍより大きい粒子が多く存在したことを見出した。この結果は、再溶解して０．２２μｍフィルターでろ過された比較例の標的ナノ製剤の薬物収率が低かった結果と一致している。
【００９４】
（実施例１５）
標的ナノ製剤安定性の比較
（１）再溶解安定時間の比較
実施例１−１２及び比較例１−２で得られたナノ製剤の凍結乾燥物の各１０．０ｍｇを、無菌ろ過された生理食塩水４．０ｍＬで再溶解させ、室温で混合懸濁液の状態、沈殿の有無及び沈殿発生の時間を観察した。結果を表３に示した。
【００９５】
（２）アルブミンと結合した疎水性薬物の安定性比較
実施例１−１２及び比較例１−２で得られたナノ製剤の凍結乾燥物５０．０ｍｇを分子量を５０００までカットオフした透析袋に入れ、３７．０℃のｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝溶液５００．０ｍＬ（０．０１Ｍ、０．５ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ８０含有）に置き、定期的に定量のＰＢＳ緩衝溶液を取り出し、０．２２μｍのろ過膜でろ過した後、高速液相クロマトグラフィーで測定した。結果を表３に示した。
【００９６】
ナノ製剤の再溶解安定性及び２４ｈ放出率
【表３】
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【００９７】
表３の結果から分かるように、本発明の標的ナノ製剤は、ＰＢＳ緩衝溶液での２４ｈで５．００％未満の薬物のみが放出され、比較例よりはるかに低いため、薬物と担体との間の結合力が強く、投薬後の薬物の体内循環及びターゲットに達した前の稼働過程中の担体からの漏出を回避又は減少することにより有利である。それにより、薬物毒性を低下し、薬物利用率を高めることができ、投薬量の低下に有利である。また、再溶解分散安定時間から、本発明の標的ナノ製剤粒子は分散性に優れ、凝集傾向が弱かったことが分かり、この結果は、再溶解前後の粒子径が著しく増大しなかった結果と一致している。
【００９８】
（実施例１６）
動物実験
（１）腫瘍抑制実験
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを用いてヒトＭＸ−１乳腺がん細胞担癌マウスモデルを作製し、腫瘍が１５０−３００ｍｍ３に成長した後、マウスを６匹ずつで生理食塩水陰性グループ、実施例１−２、実施例５−６及び比較例１−２の薬物グループに分けた。薬物を用量１０．０ｍｇ／ｋｇで５日間ごとに連続５回尾静脈注射した。試験中で５日間ごとに腫瘍の体積を測定し、その体積の計算方法が、Ｖ＝ｄ２Ｄ／２であり、そのうちｄが短方向の長さで、Ｄが長方向の長さである。結果を図３に示した。
【００９９】
図３から分かるように、本発明の標的ナノ製剤は、同じ濃度で腫瘍に対する抑制作用がより著しく、本発明の標的ナノ製剤の薬物利用率がより高いことを証明した。
【０１００】
（２）マウス体内での薬物の分布比較
体内でのパクリタキセル標的ナノ製剤の分布測定は、１４Ｃ標記パクリタキセルにより行われた。実施例１、実施例６、比較例１−２におけるパクリタキセル標的ナノ製剤を用量５．０ｍｇ／ｍＬで、Ｈ２２腫瘍細胞を接種してから７日間を経たマウス体内に尾静脈注射した。注射後のマウスを２４時間後に殺死し、内臓と腫瘍をそれぞれ摘出し、その放射強度を測定し、各組織におけるパクリタキセルの濃度を計算した。結果を図４に示した。
【０１０１】
図４から分かるように、本発明の標的ナノ製剤は、静脈注射された後に体内の各種の組織に分布しているが、比較例と比較すると、本発明の薬剤担送粒子は腫瘍での蓄積が有意に向上したが、その他の組織での蓄積が相対的に低下し、上述した腫瘍抑制効果と一致している。それにより、本発明の標的ナノ製剤は比較例より毒性が低く、副作用を低下させて患者コンプライアンスを向上させることに有利であることを証明した。
【０１０２】
上述した実施例の各技術的特徴は任意に組み合わせることができ、説明を簡潔にするために、前記実施例の各技術的特徴のあらゆる可能な組合せを説明しないが、これらの技術的特徴の組合せが矛盾しなければ、いずれも本明細書の範囲に含まれる。
【０１０３】
上述した実施例は、単に本発明の幾つかの実施形態のみを示し、それらについての説明が具体的で詳細であるが、そのために本発明の特許請求の範囲を制限すると理解することはできない。なお、当業者にとっては、本発明の思想を逸脱しない範囲で、さまざまな変化や改進が実施でき、これらはいずれも本発明の特許請求の範囲に含まれる。そのため、本発明の特許請求の範囲は、付随する請求項によって規定されている。
【０１０４】
（付記）
（付記１）
質量比が１：４−３２．５である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が３７．５−９５．３ｗｔ％のアルブミンと４．７−６２．５ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：１−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製されることを特徴とする、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【０１０５】
（付記２）
質量比が１：４．８−１９である疎水性抗腫瘍薬物と担体とを含み、前記担体が５０．０ｗｔ％−９５．０ｗｔ％のアルブミンと５．０−５０．０ｗｔ％のヒアルロン酸−アルブミン共役物からなり、前記ヒアルロン酸−アルブミン共役物がモル比１：２−２０のアルブミンとヒアルロン酸から調製されることを特徴とする、付記１に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【０１０６】
（付記３）
前記ヒアルロン酸の分子量が２−６０ｋＤａであることを特徴とする、付記１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【０１０７】
（付記４）
前記アルブミンがヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、オボアルブミン及び遺伝子組換えヒト血清アルブミンから選択されることを特徴とする、付記１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【０１０８】
（付記５）
前記疎水性抗腫瘍薬物がパクリタキセル、ドセタキセル、アジタキセル、ドキソルビシン、カンプトテシン、サイクロスポリン、ラパマイシン、バンコマイシン、チオテパ又はそれらの誘導体から選択されることを特徴とする、付記１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【０１０９】
（付記６）
ナノ粒子安定剤をさらに含み、前記ナノ粒子安定剤がポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック重合体、ｄ−αトコフェロールコハク酸ポリエチレングリコールエステル、ポリビニルピロリドンから選択され、前記ナノ粒子安定剤が疎水性抗腫瘍薬物の質量の１．０−１０．０％であることを特徴とする、付記１又は２に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤。
【０１１０】
（付記７）
以下の工程を含むことを特徴とする、付記１〜６のいずれか１つに記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
（１）ヒアルロン酸−アルブミン共役物の調製
ヒアルロン酸とアルブミンとを水性媒体に加えて溶解させ、溶液のｐＨを５．０−６．０に調節した後、それに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを添加して１５−６０ｍｉｎ反応させ、溶液のｐＨを７．０−７．５に調節し、室温で３−２４ｈ撹拌して反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得る。或いは、
ヒアルロン酸を水性媒体に溶かし、溶液のｐＨを５．０−６．０に調節した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウムを添加し、室温で１５−６０ｍｉｎ撹拌反応させることにより、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルが得られた。さらに、ヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルをアルブミンの水性媒体溶液に滴下し、或いはアルブミンの水性媒体溶液をヒアルロン酸スクシンイミド活性エステルに滴下し、溶液のｐＨを７．０−７．５に調節し、室温で３−２４ｈ撹拌反応させ、反応が終了した後、結合されないヒアルロン酸、未反応の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム及びその他の副生成物を透析で除去し、凍結乾燥した後ヒアルロン酸−アルブミン共役物を得る。
（２）担体溶液の調製
アルブミンと工程（１）で調製されたヒアルロン酸−アルブミン共役物を水性媒体に溶かし、担体溶液が得られる。
（３）薬物溶液の調製
疎水性抗腫瘍がん薬物又は疎水性抗腫瘍がん薬物とナノ粒子安定剤を有機溶剤に溶かし、薬物溶液が得られる。
（４）ナノ製剤の調製
均質条件で、前記工程（３）で調製された薬物溶液を工程（２）で調製された担体溶液に加えて一次エマルジョンが得られ、さらに、高圧均質下で二次エマルジョンが得られ、その後有機溶剤を除去し、ろ過し、凍結乾燥することにより、標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤が得られる。
【０１１１】
（付記８）
工程（２）に記載の担体溶液における担体の濃度が４．０−５０．０ｍｇ／ｍＬであり、工程（３）に記載の薬物溶液における疎水性抗腫瘍薬物の濃度が１６．０−３４５．０ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、付記７に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
【０１１２】
（付記９）
工程（１）に記載の水性媒体が２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、リン酸塩緩衝液又は無菌水であり、工程（２）に記載の水性媒体が無菌水、リン酸塩緩衝液、生理食塩水、５．０ｗｔ％グルコース水溶液又は５．０ｗｔ％マンニトール水溶液であり、工程（３）に記載の有機溶剤がジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロメタンとエタノールの混合物、又はクロロホルムとエタノールの混合物であることを特徴とする、付記７又は８に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
【０１１３】
（付記１０）
工程（４）に記載の高圧均質の圧力が１００００−４００００ｐｓｉであり、高圧均質でのスループットが１０．０−２５．０Ｌ／ｈであり、高圧均質での循環回数が７−２０回であり、前記有機溶剤の除去方法が１５．０−４５．０℃の条件で減圧して回転させて有機溶剤を蒸発して除去することを特徴とする、付記７又は８に記載の標的疎水性抗腫瘍薬物ナノ製剤の調製方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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