(57)【要約】  本明細書には、1つ以上のフラビウイルス抗原遺伝子を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンの組成物が開示される。かかるワクチンを構築及び製造するための方法、並びにこれらのワクチンを用いてフラビウイルスに対する免疫応答を生成する方法も記載される。本明細書中に記載される組成物は、アデノウイルスに対する既存免疫を有する対象におけるワクチン接種を可能とする。【選択図】  図１
2019521143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び
フラビウイルス標的抗原をコードする配列
を含む組成物。
【請求項２】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列を含む、請求項１の組成物。
【請求項３】
複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列が、それぞれが標的抗原に対応する複数の遺伝子インサートを含み、各遺伝子インサートは、自己切断2Aペプチドをコードする核酸配列により分離されている、請求項２の組成物。
【請求項４】
自己切断2Aペプチドが、豚テシオウイルス-1ウイルス又はトセア・アシグナウイルスに由来する、請求項３の組成物。
【請求項５】
複数のフラビウイルス標的抗原が、3つのフラビウイルス標的抗原又は4つのフラビウイルス標的抗原を含む、請求項２〜４のいずれか1項の組成物。
【請求項６】
複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか1項の組成物。
【請求項７】
複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルス5(Ad5)ベクターである、請求項１〜６のいずれか1項の組成物。
【請求項８】
複製欠損ウイルスベクターが、E1遺伝子領域、E3遺伝子領域、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか1項の組成物。
【請求項９】
E2b遺伝子領域における欠失が、E2b遺伝子領域における複数の欠失を含む、請求項１〜８のいずれか1項の組成物。
【請求項１０】
E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、それぞれ少なくとも1個の塩基対を含む、請求項１〜９のいずれか1項の組成物。
【請求項１１】
E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、2個以上の塩基対の転位から生じる、請求項１〜１０のいずれか1項の組成物。
【請求項１２】
E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、それぞれ少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、又は少なくとも150個の塩基対を含む、請求項１〜１１のいずれか1項の組成物。
【請求項１３】
E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、それぞれ150個超、160個超、170個超、180個超、190個超、200個超、250個超、又は300個超の塩基対を含む、請求項１〜１２のいずれか1項の組成物。
【請求項１４】
フラビウイルス標的抗原が、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルスの抗原を含む、請求項１〜１３のいずれか1項の組成物。
【請求項１５】
フラビウイルス標的抗原が、黄熱病ウイルス(YFV)、ジカウイルス(ZIKAV)、又はその両方からなる群から選択されるウイルスの抗原を含む、請求項１〜１４のいずれか1項の組成物。
【請求項１６】
フラビウイルス標的抗原がジカウイルス(ZIKAV)の抗原を含む、請求項１〜１５のいずれか1項の組成物。
【請求項１７】
フラビウイルス標的抗原が、C(カプシドタンパク質)、E(エンベロープタンパク質)、prM(前駆膜タンパク質)、M(膜タンパク質)、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む、請求項１〜１６のいずれか1項の組成物。
【請求項１８】
フラビウイルス標的抗原が、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む、請求項１〜１７のいずれか1項の組成物。
【請求項１９】
フラビウイルス標的抗原が、E、prM、M、及びNS3、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む、請求項１〜１８のいずれか1項の組成物。
【請求項２０】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、N末端GCCGCCACC配列を含む、請求項１〜１９のいずれか1項の組成物。
【請求項２１】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列が変異をコードする配列を含み、該変異が、イソロイシン(I)からアスパラギン酸(D)への変異、ロイシン(L)からアスパラギン酸(D)への変異、アスパラギン酸(D)からイソロイシン(I)への変異、アスパラギン酸(D)からロイシン(L)への変異、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜２０のいずれか1項の組成物。
【請求項２２】
変異が、I21D、L175D、L240D、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L、又はこれらの任意の組み合わせにおいて生じる、請求項２１の組成物。
【請求項２３】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号1１、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号2１、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号3１、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、請求項１〜２２のいずれか1項の組成物。
【請求項２４】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、配列番号15〜配列番号19からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、請求項１〜２３のいずれか1項の組成物。
【請求項２５】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列がアミノ酸配列であり、該アミノ酸配列が、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、及び配列番号36、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、請求項１〜２３のいずれか1項の組成物。
【請求項２６】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列がヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、配列番号27、配列番号29、配列番号3１、配列番号33、配列番号35、及び配列番号37、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、請求項１〜２３のいずれか1項の組成物。
【請求項２７】
複製欠損ウイルスベクターが、フラビウイルス標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか1項の組成物。
【請求項２８】
前記エレメントが、少なくとも1つのエレメント、少なくとも2つのエレメント、少なくとも3つのエレメント、少なくとも4つのエレメント、又は少なくとも5つのエレメントを含む、請求項２７の組成物。
【請求項２９】
エレメントが内部リボソーム結合部位を含む、請求項２７又は２８の組成物。
【請求項３０】
エレメントが構成的プロモーターを含む、請求項２７〜２９の組成物。
【請求項３１】
エレメントが誘導性プロモーターを含む、請求項２７〜３０の組成物。
【請求項３２】
エレメントが転写エンハンサーを含む、請求項２７〜３１の組成物。
【請求項３３】
転写エンハンサーがラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである、請求項３２の組成物。
【請求項３４】
エレメントがパリンドローム配列を含まない、請求項２７〜３３のいずれか1項の組成物。
【請求項３５】
複製欠損ウイルスベクターが、フラビウイルス標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか1項の組成物。
【請求項３６】
複製欠損ウイルスベクターが、guttedベクターではない、請求項１〜３５のいずれか1項の組成物。
【請求項３７】
組成物又は複製欠損ウイルスベクターが、共刺激分子又は免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜３６のいずれかの組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか1項の組成物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか1項の組成物又は請求項３８の医薬組成物を含む細胞。
【請求項４０】
細胞が宿主細胞である、請求項３９の細胞。
【請求項４１】
細胞が樹状細胞(DC)である、請求項３９〜４０のいずれか1項の細胞。
【請求項４２】
請求項３８に記載の医薬組成物を調製することを含む、ワクチンを調製する方法。
【請求項４３】
対象においてフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、請求項１〜３７のいずれかの組成物又は請求項３８の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
対象がフラビウイルスに感染していない、請求項４３の方法。
【請求項４５】
フラビウイルス標的抗原がフラビウイルス由来であり、該フラビウイルスが、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４３〜４４のいずれか1項の方法。
【請求項４６】
対象においてジカウイルス感染を予防する方法であって、該方法が、以下のものを含む組成物：
E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び
少なくとも1つのジカウイルス標的抗原をコードする配列
を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
対象が、アデノウイルス又はアデノウイルスベクターに対する既存免疫を有する、請求項４３〜４６の方法。
【請求項４８】
対象がヒト又は非ヒト動物である、請求項４３〜４７のいずれか1項の方法。
【請求項４９】
投与が、静脈内投与、皮下投与、リンパ内投与、腫瘍内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、経口投与、膀胱点滴を介した投与、又は乱刺を介した投与である、請求項４３〜４８のいずれか1項の方法。
【請求項５０】
対象への組成物の投与が、少なくとも1回であるか、少なくとも2回反復されるか、又は少なくとも3回反復される、請求項４３〜４９のいずれか1項の方法。
【請求項５１】
対象への組成物の投与が、1回用量当たり1x109〜5x1012ウイルス粒子を含む、請求項４３〜５０のいずれか1項の方法。
【請求項５２】
対象への組成物の投与が、1回用量当たり少なくとも109ウイルス粒子、少なくとも1010ウイルス粒子、又は少なくとも1011ウイルス粒子を含む、請求項４３〜５１のいずれか1項の方法。
【請求項５３】
複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項４３〜５２のいずれか1項の方法。
【請求項５４】
複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルス5(Ad5)ベクターである、請求項４３〜５３のいずれか1項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連発明の相互参照
本出願は、2016年7月15日に出願された米国仮特許出願第62/363,131号の利益を主張し、その開示内容は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。2017年7月5日に作成された前記ASCIIコピーは39891-724_601_SL.txtと命名され、サイズは430,874バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、免疫系が有害な物質及び疾患細胞を認識して破壊するのを訓練することにより、身体が疾患と闘うのを助ける。ワクチンは、予防ワクチンと治療ワクチンの2つのタイプに大きくグループ化することができる。予防ワクチンは特定の疾患の発症を予防するために健康な人々に投与されるが、免疫治療剤とも呼ばれる治療ワクチンは、疾患を有すると診断された人に、疾患が成長して広がるのを止めることを助けるため、又は予防的手段として投与される。
【０００４】
現在、感染性疾患及び癌と闘うのを助けるためにウイルスワクチンが開発されている。これらのウイルスワクチンは、宿主の細胞において疾患に関連する遺伝子の小断片の発現を誘導することにより機能し、この発現がその後、宿主の免疫系が疾患細胞を同定及び破壊する能力を高める。従って、ウイルスワクチンの臨床的応答は、高レベルの免疫原性を得て持続的に長期発現させる当該ワクチンの能力に依存し得る。
【０００５】
従って、複雑な疾患、特に新たに出現する疾患の脅威に対する治療的応答を高めるための、新規な組成物及び方法を見出す必要性が残されている。
【発明の概要】
【０００６】
様々な態様において、本開示は、E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及びフラビウイルス標的抗原をコードする配列を含む組成物を提供する。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列は、複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列を含む。さらなる態様において、複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列は、それぞれが標的抗原に対応する複数の遺伝子インサートを含み、ここで各遺伝子インサートは、自己切断2Aペプチドをコードする核酸配列により分離されている。一部の態様において、自己切断2Aペプチドは、豚テシオウイルス(Porcine teschovirus)-1ウイルス又はトセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルスに由来する。一部の態様において、複数のフラビウイルス標的抗原は、3つのフラビウイルス標的抗原又は4つのフラビウイルス標的抗原を含む。
【０００７】
一部の態様において、複製欠損ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。さらなる態様において、複製欠損ウイルスベクターは、アデノウイルス5(Ad5)ベクターである。なおさらなる態様において、複製欠損ウイルスベクターは、E1遺伝子領域、E3遺伝子領域、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む。一部の態様において、E2b遺伝子領域における欠失は、E2b遺伝子領域における複数の欠失を含む。
【０００８】
一部の態様において、E2b遺伝子領域おける欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせは、それぞれ少なくとも1個の塩基対を含む。
【０００９】
他の態様において、E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせは、2個以上の塩基対の転位から生じる。一部の態様において、E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせは、それぞれ少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、又は少なくとも150個の塩基対を含む。他の態様において、E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせは、それぞれ150個超、160個超、170個超、180個超、190個超、200個超、250個超、又は300個超の塩基対を含む。
【００１０】
一部の態様において、フラビウイルス標的抗原は、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルスの抗原を含む。さらなる態様において、フラビウイルス標的抗原は、黄熱病ウイルス(YFV)、ジカウイルス(ZIKAV、又はその両方からなる群から選択されるウイルスの抗原を含む。
【００１１】
なおさらなる態様において、フラビウイルス標的抗原は、ジカウイルス(ZIKAV)の抗原を含む。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原は、C(カプシドタンパク質)、E(エンベロープタンパク質)、prM(前駆膜タンパク質)、M(膜タンパク質)、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原は、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原は、E、prM、M、及びNS3、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む。
【００１２】
一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列は、N末端GCCGCCACC配列を含む。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列は、変異をコードする配列を含み、変異は、イソロイシン(I)からアスパラギン酸(D)への変異、ロイシン(L)からアスパラギン酸(D)への変異、アスパラギン酸(D)からイソロイシン(I)への変異、アスパラギン酸(D)からロイシン(L)への変異、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【００１３】
さらなる態様において、変異は、I21D、L175D、L240D、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L、又はこれらの任意の組み合わせにおいて生じる。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列は、配列番号１、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号1１、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号2１、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号3１、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む。
【００１４】
一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列は、配列番号15〜配列番号19からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む。一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列はアミノ酸配列であり、このアミノ酸配列は、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、及び配列番号36、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む。
【００１５】
一部の態様において、フラビウイルス標的抗原をコードする配列はヌクレオチド配列であり、このヌクレオチド配列は、配列番号27、配列番号29、配列番号3１、配列番号33、配列番号35、及び配列番号37、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む。
【００１６】
一部の態様において、複製欠損ウイルスベクターは、フラビウイルス標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む。さらなる態様において、このエレメントは、少なくとも1つのエレメント、少なくとも2つのエレメント、少なくとも3つのエレメント、少なくとも4つのエレメント、又は少なくとも5つのエレメントを含む。一部の態様において、エレメントは内部リボソーム結合部位を含む。
【００１７】
他の態様において、エレメントは構成的プロモーターを含む。一部の態様において、エレメントは誘導性プロモーターを含む。一部の態様において、エレメントは転写エンハンサーを含む。一部の態様において、転写エンハンサーは、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである。一部の態様において、エレメントはパリンドローム配列を含まない。
【００１８】
一部の態様において、複製欠損ウイルスベクターは、フラビウイルス標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様において、複製欠損ウイルスベクターは、guttedベクターではない。一部の態様において、組成物又は複製欠損ウイルスベクターは、共刺激分子又は免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む。
【００１９】
様々な態様において、本開示は、上記組成物及び製薬上許容可能な担体のいずれか1つを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
様々な態様において、本開示は、上記組成物のいずれか1つを含む細胞を提供する。一部の態様において、細胞は宿主細胞である。さらなる態様において、細胞は樹状細胞(DC)である。
【００２１】
様々な態様において、本開示は、上記の医薬組成物を調製することを含む、ワクチンを調製する方法を提供する。
【００２２】
様々な態様において、本開示は、対象においてフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、上記組成物又は上記の医薬組成物のいずれか1つを対象に投与することを含む、上記方法を提供する。一部の態様において、対象はフラビウイルスに感染していない。一部の態様において、標的フラビウイルス抗原はフラビウイルスに由来し、このフラビウイルスは、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【００２３】
様々な態様において、本開示は、対象においてジカウイルス感染を予防する方法であって、当該方法が、E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び少なくとも1つのジカウイルス標的抗原をコードする配列を含む組成物を対象に投与することを含む、上記方法を提供する。
【００２４】
一部の態様において、対象は、アデノウイルス又はアデノウイルスベクターに対する既存免疫を有する。一部の態様において、対象は、ヒト又は非ヒト動物である。一部の態様において、投与は、静脈内投与、皮下投与、リンパ内投与、腫瘍内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、経口投与、膀胱点滴を介した投与、又は乱刺（scarification）を介した投与である。一部の態様において、対象への組成物の投与は、少なくとも1回であるか、少なくとも2回反復されるか、又は少なくとも3回反復される。
【００２５】
一部の態様において、対象への組成物の投与は、1回用量当たり1x109〜5x1012ウイルス粒子を含む。さらなる態様において、対象への組成物の投与は、1回用量当たり少なくとも109ウイルス粒子、少なくとも1010ウイルス粒子、又は少なくとも1011ウイルス粒子を含む。一部の態様において、複製欠損ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。さらなる態様において、複製欠損ウイルスベクターは、アデノウイルス5(Ad5)ベクターである。
【００２６】
参照による組み込み
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれるように具体的に且つ個別に示されたかのような程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1は、生成された配列番号13及び配列番号14に由来するAd5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンを例示する。
【図２】図2は、本開示のフラビウイルスワクチン用の複数標的三重遺伝子インサートの模式図を示す。図2Aは、Ad5[E1-、E2b-]への挿入用に用いられるフラビウイルスのカプシドタンパク質(C)、膜タンパク質(M)及びエンベロープタンパク質(E)をコードする遺伝子を含む三重遺伝子構築物の模式図を示す。図2Bは、図2Aの化学量論的存在比の翻訳産物を示す。
【図３】図3は、本開示のフラビウイルスワクチン用の複数標的四重遺伝子インサートの模式図を示す。図3Aは、Ad5[E1-、E2b-]への挿入用に用いられるフラビウイルスのカプシドタンパク質(C)、膜タンパク質(M)、エンベロープタンパク質(E)、及びNSタンパク質をコードする遺伝子を含む四重遺伝子構築物の模式図を示す。図3Bは、図3Aの化学量論的存在比の翻訳産物を示す。
【図４】図4は、Zikaペプチドプールに対して曝露した後の、免疫化マウス由来の脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答及び抗体応答を示す。マウスにおいて、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンの免疫原性研究を行った。図4Aは、Ad5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)又はAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eを注射したマウスにおけるIFN-γ分泌細胞についてのELISpotのスポット形成細胞(SFC)により決定されるCMI応答を示す。CMI応答は、免疫化マウスにおいては誘導されたが(白色バー)、対照マウスにおいては誘導されなかった(斜線黒色バー)ことに留意されたい。特異性は、無関係な抗原のNefペプチドプールに対する反応性の欠如により確認された。Nefペプチドプール及びZikaペプチドプールについて、左側のバーは、空ベクター対照を注射したマウス由来のSFCを表し、右側のバーは、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eを注射したマウス由来のSFCを表すことに留意されたい。図4Bは、Ad5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)又はAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eを注射したマウスにおけるIL-2分泌細胞についてのELISpotのスポット形成細胞(SFC)により決定されるCMI応答を示す。CMI応答は、免疫化マウスにおいては誘導されたが(白色バー)、対照マウスにおいては誘導されなかった(黒色斜線バー)。特異性は、無関係な抗原のNefペプチドプールに対する反応性の欠如により確認された。Nefペプチドプール及びZikaペプチドプールについて、左側のバーは、空ベクター対照を注射したマウス由来のSFCを表し、右側のバーは、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eを注射したマウス由来のSFCを表すことに留意されたい。図4Cは、Ad5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)又はAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eを注射したマウスにおける定量的ELISAにより決定される抗ジカ-E IgG抗体応答を示す。抗体応答は、免疫化マウスにおいては誘導されたが(白色のバー、G4M1-5)、対照マウスにおいては誘導されなかった(黒色のバー、G1M1-5)。左側のG1M1、G1M2、G1M3、G1M4、及びG1M5は、空ベクター対照を注射したマウス由来の抗体応答を表し、右側のG1M1、G1M2、G1M3、G1M4、及びG1M5は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eを注射したマウス由来の抗体応答を表すことに留意されたい。
【図５】図5は、ブラジルにおいて2014年〜2015年に単離されたジカウイルス由来の非冗長エンベロープタンパク質(E)の、情報スペクトル法(ISM)ベースの系統樹を示す。
【図６】図6は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いて免疫したマウス由来の脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答及び細胞溶解性Tリンパ球(CTL)応答を示す。マウス(C57BL/6株)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。3種類のZikaワクチンを試験した。試験した第1のZikaワクチンは、配列番号34のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号35のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号34はヌクレオチド配列であり、配列番号35は配列番号34に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2015であった。配列番号35のZika mut 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2015抗原は、Zika wt 2015抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号26のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号27のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号26はヌクレオチド配列であり、配列番号27は配列番号26に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2014であった。配列番号２７に示されるZika wt 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第3のZikaワクチンは、配列番号28のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号29のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号28はヌクレオチド配列であり、配列番号29は配列番号28に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2014であった。配列番号29のZika mut 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2014抗原は、Zika wt 2014抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。各Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンの最終免疫化の一週間後、免疫化マウスから単離した脾細胞をジカwtウイルスペプチドプールに曝露し、その後ELISpotアッセイを用いて、CMI応答(IFN-γ及びIL-2分泌スポット形成細胞(SFC))及びCTL応答(グランザイム-B分泌SFC)を測定した。応答の特異性は、SIV-Nefペプチドプール(陰性対照)に対する脾細胞の反応性の欠如により示される。コンカナバリンA(Con A)に対する脾細胞の反応性を陽性対照として使用した。エラーバーは標準誤差(SEM)を示し、各群には5匹のマウスが含まれていた。図6Aは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、IFN-γ CMI応答を示す。図6Bは、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、IL-2 CMI応答を示す。図6Cは、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、グランザイムB CTL応答を示す。
【図７】図7は、フローサイトメトリーを用いて、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いて免疫したマウス由来の脾細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内発現により測定されるリンパ球活性化を示す。マウス(C57BL/6株)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。3種類のZikaワクチンを試験した。試験した第1のZikaワクチンは、配列番号34のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号35のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号34はヌクレオチド配列であり、配列番号35は配列番号34に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2015であった。配列番号35のZika mut 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2015抗原は、Zika wt 2015抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号26のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号27のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号26はヌクレオチド配列であり、配列番号27は配列番号26に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2014であった。配列番号27のZika wt 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第3のZikaワクチンは、配列番号28のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号29のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号28はヌクレオチド配列であり、配列番号29は配列番号28に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2014であった。配列番号29のZika mut 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2014抗原は、Zika wt 2014抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。最終免疫化の一週間後、免疫化マウスから単離した脾細胞をジカwtウイルスペプチドプールに曝露し、フローサイトメトリーを使用して、CD8＋細胞及びCD4＋細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内サイトカイン産生を測定した。応答の特異性は、SIV-Nefペプチドプール(陰性対照)に対する脾細胞の反応性の欠如により示される。PMA/イオノマイシンに対する脾細胞の反応性を陽性対照として使用した。データは、IFN-γ又はIFN-γ及びTNF-αを発現しているCD8＋又はCD4＋脾細胞のパーセントとして報告され、エラーバーはSEMを示す。各群は、5匹のマウスを有していた。図7Aは、フローサイトメトリーを用いて、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のCD8＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現により測定されるリンパ球活性化を示す。図7Bは、フローサイトメトリーを用いて、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対���マウス由来の脾細胞の曝露後のCD4＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現により測定されるリンパ球活性化を示す。図7Cは、フローサイトメトリーを用いて、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のCD8＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現により測定されるリンパ球活性化を示す。図7Dは、フローサイトメトリーを用いて、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のCD4＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現により測定されるリンパ球活性化を示す。
【図８】図8は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いて免疫したマウスの血清中の抗ジカIgG抗体応答を示す。頬袋から血液を引き出し、定量的ELISA又はIgG抗体を用いて、Gabitzsch et al.(Cancer Gene Ther. 2011 May；18(5)：326-335)に示される方法を用いて分析した。マウス(C57BL/6株、1群当たり5匹のマウス)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。3種類のZikaワクチンを試験した。試験した第1のZikaワクチンは、配列番号34のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号35のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号34はヌクレオチド配列であり、配列番号35は配列番号34に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2015であった。配列番号35のZika mut 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2015抗原は、Zika wt 2015抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号26のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号27のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号26はヌクレオチド配列であり、配列番号27は配列番号26に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2014であった。配列番号27のZika wt 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第3のZikaワクチンは、配列番号28のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号29のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号28はヌクレオチド配列であり、配列番号29は配列番号28に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2014であった。配列番号29のZika mut 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2014抗原は、Zika wt 2014抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。最終免疫化の一週間後、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、抗体応答の誘導についてマウス由来の血清を試験した。y軸は、血清中の抗ジカIgGのナノグラム(ng)を示す。x軸は、試験した各群及びマウスを示す(例えば、「G1M1」は、群1のマウス1を示す)。群1に属するマウスはAd5[E1-、E2b-]-Nullを用いて免疫し、群2に属するマウスはAd5[E1-、E2b-]-ジカMut 2015を用いて免疫し、群3に属するマウスはAd5[E1-、E2b-]-ジカMut 2014を用いて免疫し、群4に属するマウスはAd5[E1-、E2b-]-ジカWt 2014を用いて免疫したことに留意されたい。エラーバーはSEMを示す。
【図９】図9は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いたワクチン接種又は対照としてのAd5[E1-、E2b-]-null空ベクターを用いた注射後の、ジカウイルス感染のマウスモデル(Rossi et al. Am J Trop Med Hyg. 2016 Jun 1；94(6)：1362-9)における体重低下を示す。A129マウスの群(n=10/群)を、1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-E 2015wt又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(対照)を用いて1回免疫化した。免疫化の30日後、マウスを、ジカウイルスの病原性株に曝露した(5x105プラーク形成単位(PFU)のジカウイルス株FSS13025を腹腔内(IP)注射した)。体重変化についてマウスをモニターした。
【図１０】図10は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いたワクチン接種又は対照としてのAd5[E1-、E2b-]-null空ベクターを用いたワクチン接種後の、ジカウイルス感染のマウスモデル(Rossi et al. Am J Trop Med Hyg. 2016 Jun 1；94(6)：1362-9)における体温変化を示す。A129マウスの群(n=10/群)を、1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-E 2015wt又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(対照)を用いて1回免疫化した。免疫化の30日後、マウスを、ジカウイルスの病原性株に曝露した(5x105PFUのジカウイルス株FSS13025を腹腔内(IP)注射した)。体温変化についてマウスをモニターした。
【図１１】図11は、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンで免疫化したマウス由来の脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答及び細胞溶解性Tリンパ球(CTL)応答を示す。C57BL/6マウス(n=5/群)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。配列番号32のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号33のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号32はヌクレオチド配列であり、配列番号33は配列番号32に対応するアミノ酸配列である)を含むAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015を含め、2種類のZikaワクチンを試験した。配列番号33のZika wt 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号36のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号37のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号36はヌクレオチド配列であり、配列番号37は配列番号36に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)であった。Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)におけるZika抗原は、2つのC末端膜貫通アンカードメインと細胞外ループ、細胞膜への標的化を確実にするMタンパク質の一部と翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)とをコードするジカウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質の直上流の2つの膜貫通ドメイン、細胞外ループの直前の2つの膜貫通ドメイン、及び細胞外ループを包含する、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する全長エンベロープタンパク質を含む。膜貫通ドメインの包含は、mRNAを担持したリボソームの小胞体への移動、グリコシル化、及び最終的なタンパク質の細胞膜への移動及び結合を確実にするシグナル配列としての役割を果たすことが可能であり、これらは全て究極的には抗原性を高め、これにより免疫応答を生成し得る。Ad5[E1-、E2b-]-null(Viraquest社)及びAd5[E1-、E2b-]-null(E)(社内で製造したnull対照ベクター)を含む2つのAd5[E1-、E2b-]-nullを比較対照ベクターとして使用した。最終免疫化の7日後に脾細胞を単離し、Zika 2014ペプチドプール、SIV-Nefペプチドプール(陰性対照)、SIV-Gagペプチドプール(陰性対照)、及びコンカナバリンA(陽性対照)に曝露して、ELISPOTによりCMI応答(IFN-γ及びIL-2)及びCTL応答(グランザイムB)について評価した。データは、106個の脾細胞当たりのスポット形成細胞(SFC)の数として報告され、エラーバーはSEMを示す。図11Aは、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する曝露後の、免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞のIFN-γ CMI応答を示す。図11Bは、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する曝露後の、免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞のIL-2 CMI応答を示す。図11Cは、Zika 2014ペプチドプール又は対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞のグランザイムB CTL応答を示す。
【図１２】図12は、フローサイトメトリーを用いて、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンで免疫化したマウス由来の脾細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内発現により測定されるリンパ球活性化を示す。C57BL/6マウスを、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。配列番号32のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号33のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号32はヌクレオチド配列であり、配列番号33は配列番号32に対応するアミノ酸配列である)を含むAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015を含め、2種類のZikaワクチンを試験した。配列番号33のZika wt 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号36のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号37のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号36はヌクレオチド配列であり、配列番号37は配列番号36に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)であった。Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)におけるZika抗原は、2つのC末端膜貫通アンカードメインと細胞外ループ、細胞膜への標的化を確実にするMタンパク質の一部と翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)とをコードするジカウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質の直上流の2つの膜貫通ドメイン、細胞外ループの直前の2つの膜貫通ドメイン、及び細胞外ループを包含する、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する全長エンベロープタンパク質を含む。膜貫通ドメインの包含は、mRNAを担持したリボソームの小胞体への移動、グリコシル化、及び最終的なタンパク質の細胞膜への移動及び結合を確実にするシグナル配列としての役割を果たすことが可能であり、これが究極的には抗原性を高め、これにより免疫応答を生成し得る。Ad5[E1-、E2b-]-null(Viraquest社)及びAd5[E1-、E2b-]-null(E)(社内で製造したnull対照ベクター)を含む2つのAd5[E1-、E2b-]-nullを比較対照ベクターとして使用した。最終免疫化の7日後に、免疫化マウスから単離した脾細胞をジカウイルスペプチドプールに曝露し、フローサイトメトリーを用いて、CD8＋細胞及びCD4＋細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内サイトカイン産生を測定した。応答の特異性は、SIV-nefペプチドプール(陰性対照)及び培地(陰性対照)に対する脾細胞の反応性の欠如、並びにPMA/イオノマイシン(データ示されず)(陽性対照)に対する脾細胞の反応性により示される。データは、IFN-γ又はIFN-γ及びTNF-αを発現しているCD8＋又はCD4＋脾細胞のパーセントとして報告され、エラーバーはSEMを示す。図12Aは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD8＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。図12Bは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD4＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。図12Cは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露��の、CD8＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。図12Dは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD4＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。
【図１３】図13は、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンで免疫化したマウスの血清中の抗ジカIgG応答を示す。C57BL/6マウス(n=5/群)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015ワクチン又はAd5[E1-、E2b-]-Zika wt 2015全長(FL)ワクチンを用いて、2週間間隔で2回免疫化した。Ad5[E1-、E2b-]-null(Viraquest社)及びAd5[E1-、E2b-]-null(E)(社内で製造したnull対照ベクター)を含む2つのAd5[E1-、E2b-]-nullを、比較対照ベクターとして使用した。最終免疫化の7日後にマウスから血清を回収し、ジカウイルスエンベロープタンパク質-1に対する抗原特異的抗体について、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により評価した。y軸は、血清中の抗ジカIgGのナノグラム(ng)を示す。Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2015群では、5匹中3匹(3/5)が抗体陽性であった。Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2015 FL群では、5匹中5匹(5/5)が抗体陽性であった。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
以下の節は、本発明の様々な態様についてさらに詳細に記載している。各態様は、明らかに反対に指示されない限り、任意の他の態様(1つ又は複数)と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示されている任意の特徴は、好ましい又は有利であるとして示されている任意の他の特徴と組み合わせることができる。
【００２９】
別段に指示されない限り、本明細書中で使用される冠詞「a」は、別段に明確に規定されない限り1つ又はそれ以上を意味する。
【００３０】
別段に指示されない限り、本明細書中で使用される「含有する(contain)」、「含有している(containing)」、「包含する(include)」「包含している(including)」などの用語は、「含んでいる(comprising)」を意味する。
【００３１】
別段に指示されない限り、本明細書中で使用される「又は(or)」という用語は、接続語又は離接語であり得る。
【００３２】
別段に指示されない限り、本明細書中で使用される任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００３３】
別段に指示されない限り、本明細書中で用いられる本明細書中の発明の実施形態の一部は、数値範囲を想定する。本発明の様々な態様は、範囲形式で示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上及び簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲についての柔軟性のない限定として解釈すべきではないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲並びにその範囲内の個々の数値を、あたかも明確に記載されているかのように具体的に開示したものと考えられるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、例えば1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等のサブ範囲、並びにその範囲内の個々の数字(例えば、1、2、3、4、5、及び6)を具体的に開示したものと考えられるべきである。これは、範囲の幅に関わらず当てはまる。範囲が示される場合、この範囲は範囲の端点を包含する。
【００３４】
「アデノウイルス」又は「Ad」という用語は、アデノウイルス(Adenoviridae)科に属する未封入DNAウイルスの群を指し得る。ヒト宿主に加えて、これらのウイルスは、限定するものではないが、トリ、ウシ、ブタ及びイヌの種において見出され得る。本明細書中に記載されるE2b欠失ウイルスベクター又は他の欠失を含むベクターのベースとして、アデノウイルス科の4つの属(例えば、アビアデノウイルス(Aviadenovirus)、マストアデノウイルス(Mastadenovirus)、アタデノウイルス(Atadenovirus)及びシアデノウイルス(Siadenovirus))のいずれかに属する任意のアデノウイルスの使用が想定され得る。さらに、各種において幾つかの血清型が見出され得る。「Ad」は、これらのウイルス血清型のいずれかの遺伝子誘導体(例えば、限定するものではないが、遺伝子変異、同種又は異種のDNA配列の欠失又は転位など)にも関し得る。
【００３５】
「ヘルパーアデノウイルス」又は「ヘルパーウイルス」は、特定の宿主細胞は供給し得ないウイルス機能を供給することができるAdを指し得る(宿主は、E1タンパク質などのAd遺伝子産物を提供することができる)。このウイルスを利用して、逆に、第2のウイルス、すなわちヘルパー依存性ウイルス(例えば、guttedウイルス又はgutlessウイルス、すなわちE2b又は本明細書中に記載される他の領域などの特定の領域が欠失したウイルス)には欠如している機能(例えば、タンパク質)を与えることが可能であり；第一の複製不能ウイルスは、第2のヘルパー依存性ウイルスを「ヘルプ(助ける)」し、これにより細胞における第2ウイルスのゲノムの産生を可能にすると言うことができる。
【００３６】
本明細書中で使用される「アデノウイルス5 ヌル(Ad5null)」という用語は、発現用の任意の異種核酸配列を含み得ない非複製Adを指し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される「第一世代アデノウイルス」という用語は、初期領域1(E1)が欠失されているAdを指し得る。さらなる場合、非必須の初期領域3(E3)も欠失され得る。
【００３８】
本明細書中で使用される「gutted(内部欠失された)」又は「gutless(完全欠失された)」という用語は、全てのウイルスコーディング領域が欠失されているアデノウイルスベクターを指し得る。
【００３９】
本明細書中で用いられる「トランスフェクション」という用語は、真核細胞への外来核酸の導入を指し得る。トランスフェクションは、当技術分野で公知の様々な手段、例えばリン酸カルシウム-DNA共沈殿法、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、リポフェクション法、プロトプラスト融合法、レトロウイルス感染法、及び遺伝子銃法などにより達成することができる。
【００４０】
「安定なトランスフェクション」又は「安定的にトランスフェクトされた」という用語は、外来核酸、DNA又はRNAの、トランスフェクトされた細胞のゲノムへの導入及び組み込みを指し得る。「安定なトランスフェクタント」という用語は、外来DNAをゲノムDNAに安定的に組み込んだ細胞を指し得る。
【００４１】
「レポーター遺伝子」という用語は、レポーター分子(酵素を含む)をコードするヌクレオチド配列を示し得る。「レポーター分子」は、様々な検出系、例えば、限定するものではないが、酵素ベースの検出アッセイ(例えば、ELISA、並びに酵素ベースの組織化学的アッセイ)、蛍光系、放射線系、及び発光系などのいずれかにおいて検出することができる。
【００４２】
一実施形態において、大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子(Pharmacia Biotech(ピスカタウェイ、ニュージャージー州)から入手可能)、緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clontech(パロアルト、カリフォルニア州)から市販)、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子又は当技術分野で公知の他のレポーター遺伝子を利用することができる。
【００４３】
本明細書中で使用される、「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、及び「をコードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番又は配列を指し得る。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順番を決定し得る。核酸配列はこのようにしてアミノ酸配列をコードし得る。
【００４４】
本明細書中で使用される「異種核酸配列」という用語は、天然には結合していないか又は天然には異なる位置に結合している核酸配列に、結合しているか又は結合するように操作されているヌクレオチド配列を指し得る。異種核酸は、それが導入される細胞中で天然に見出されるヌクレオチド配列を含んでいてもよく、又は異種核酸は、天然配列に対する幾つかの改変を含んでいてもよい。
【００４５】
「導入遺伝子」という用語は、試験対象の細胞又はゲノム中に導入された、天然核酸配列若しくは異種核酸配列、又は融合した同種核酸配列若しくは異種核酸配列のいずれかの、任意の遺伝子コーディング領域を指し得る。本発明において、導入遺伝子は、導入遺伝子を対象の細胞に導入するために用いられる任意のウイルスベクター上で運ばれ得る。
【００４６】
本明細書中で使用される「第2世代アデノウイルス」という用語は、E1、E2、E3、また特定の実施形態においてはE4のDNA遺伝子配列の全て又は一部がウイルスから欠失されている(除去されている)Adを指し得る。
【００４７】
本明細書中で使用される「対象」という用語は、任意の動物、例えば哺乳動物又は有袋動物を指し得る。対象としては、例えば、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク)、マウス、豚、ウマ、ロバ、牛、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽などが挙げられる。
【００４８】
特定の態様において、フラビウイルスに対して広範に反応性の免疫応答を生成するための複数回ワクチン接種を可能とするアデノウイルスベクターを用いて、様々なフラビウイルスに対する免疫応答を生成するワクチンを製造するための方法が提供され得る。
【００４９】
一態様は、対象において幾つかのフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、a) E2b領域に欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、及びb) 複数のフラビウイルス標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを対象に投与し、さらに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記対象に再投与し、これによりフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成することを含む、上記方法を提供する。
【００５０】
別の態様は、アデノウイルスに対する既存免疫を有する対象において幾つかのフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、a) E2b領域に欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、及びb) 複数のフラビウイルス標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを個体に投与し、さらに上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与し、これによりフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成することを含む、上記方法を提供する。
【００５１】
I. フラビウイルス標的抗原
特定の実施形態において、フラビウイルス抗原、例えばC、prM、E、M、及び非構造タンパク質(例えばNS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5)を、例えば、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを含むワクチン組成物又は組成物において用いることができる。
【００５２】
例えば、E抗原及びM抗原を用いることができる。天然のフラビウイルス感染に対する防御の主な相関物は、血清及び粘膜中のEに特異的な抗体(Ab)のレベルであり得る。Eタンパク質に対する体液性応答は、防御のサロゲートとして用いられている中和力価として測定することができる。Mタンパク質は体液性応答の主な標的ではあり得ない；しかし、Mの発現はEの正常なフォールディング、従って正常な抗原提示を示し得る。
【００５３】
NS3もまた、特定の態様において用いることができる。研究は、NS3が、実験的ワクチン(例えばAd5ベクターを用いるワクチンなど)において使用される場合、より広範囲のフラビウイルス防御を提供することができる保存領域を含むことを示した(Papageorgiou, L et al.  Molecular BioSystems. 2016 DOI：10.1039/c5mb00706b；Duangchinda T et al. PNAS. 2010 107(39)：16922-16927)。
【００５４】
さらなる態様において、標的抗原は、様々なフラビウイルスタンパク質に由来する抗原を含み得る。特定の態様において、フラビウイルスタンパク質は、任意のフラビウイルス、例えば、限定するものではないが、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)に由来し得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、C、prM、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5からなる群から選択されるフラビウイルスタンパク質であり得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS1からなる群から選択されるタンパク質を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS2Aからなる群から選択されるタンパク質を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS2Bからなる群から選択されるタンパク質を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS3からなる群から選択されるタンパク質を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS4Aからなる群から選択されるタンパク質を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS4Bからなる群から選択されるタンパク質を含み得る。特定の実施形態において、少なくとも1つのフラビウイルスのウイルスタンパク質は、M、E、及びNS5からなる群から選択されるタンパク質を含み得る。一部の実施形態において、少なくとも1つの標的抗原は、C、prM、M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、又はNS5の抗原配列、又は本明細書中に記載される他の抗原配列のいずれか1つに対して、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも100％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、少なくとも1つの標的抗原は、フラビウイルスの構造及び/又は非構造抗原である。例えば、一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号1に示される配列によりコードされる黄熱病ウイルス(YFV)抗原(YFV JN628281.1)又はそのフラグメントである。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号2に示される配列によりコードされる日本脳炎ウイルス(JEV)抗原(JEV AY508812.1)又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号3に示される配列によりコードされるダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)-fe抗原(TBEV-fe KJ755186)又はそのフラグメントである。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号4に示される配列によりコードされるダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)-si抗原(TBEVi KP331441)又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号5に示される��列によりコードされるダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)-eu抗原(TBEV-eu TEU27495)又はそのフラグメントである。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号6に示される配列によりコードされるデングウイルス-1(DENV-1)抗原(DENV-1 KF887994.1)又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号7に示される配列によりコードされるデングウイルス-2(DENV-2)抗原(DENV-2 HQ026763)又はそのフラグメントである。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号8に示される配列によりコードされるデングウイルス-3(DENV-3)抗原(DENV-3 KP406805)又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号9に示される配列によりコードされるDENV-4抗原(DENV-4 KJ596658)又はそのフラグメントである。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号10に示される配列によりコードされるウエストナイルウイルス(WNV)抗原(WNV GQ903680)又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号11に示される配列によりコードされるジカウイルス(ZIKAV)抗原(ZIKAV KF383118)又はそのフラグメントである。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号12に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原(ZIKAV KF383121)又はそのフラグメントである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号13に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原(AMA12087-改変：変異D37I、D43L、D266I、D129L、D218Lを有するジカウイルス分離株AMA12087(Brazil-2015)由来のGP1)である。さらなる実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号13と同様に変異 D37I、D43L、D266I、D129L、D218Lを含むジカウイルス抗原である。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号14に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原(AHL43503-改変：変異I21D、L175D、L240Dを有するジカウイルス分離株AHL43503(Brazil-2014)由来のE)である。さらなる実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号14と同様に変異I21D、L175D、L240Dを含むジカウイルス抗原である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号15に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原(AHL43505(Brazil-2014))である。さらなる実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号15と同様に部分的ジカウイルスであるジカウイルス抗原である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号16〜配列番号21のいずれか1つに示される配列によりコードされるジカウイルス抗原である(配列番号16はAHL43503(Brazil-2014)であり、配列番号17はAHL43502(Brazil-2014)であり、配列番号18はAHL43501(Brazil-2014)であり、配列番号19はAMA12087(Brazil-2015)であり、配列番号20はジカウイルス分離株MEX/InDRE/14/2015ポリタンパク質遺伝子、部分的cd(GenBank： KU686218.1)であり、配列番号21はジカウ��ルス株 Haiti/1225/2014、全長ゲノム(GenBank：KU509998.3)である)。他の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号22(YFV 17Dワクチン株；GenBank ID：X03700.1)に示される配列によりコードされる黄熱病ウイルス(YFV)抗原である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号23に示される配列によりコードされる全長ジカウイルスポリタンパク質抗原(全長Zikaポリタンパク質配列-受託番号AHL43505)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号24〜配列番号25のいずれか1つに示される配列によりコードされるジカウイルス抗原である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号26に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは、配列番号23のアミノ酸409〜690に対応するZikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分を含み、さらに翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)も含むZika wt 2014抗原(AHL43503)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号27に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは配列番号26に示されるZika wt 2014抗原(AHL43503)のアミノ酸バージョンである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号28に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは、配列番号23のアミノ酸409〜690に対応するZikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分、翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)、及び配列番号29(N末端メチオニンは計数しない)においてアミノ酸変異I21D、L175D、L240Dを生じさせる点変異を含む、Zika mut 2014抗原(AHL43503)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号29に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは配列番号28に示されるZika mut 2014抗原(AHL43503)のアミノ酸バージョンである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号30に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは、2つのC末端膜貫通アンカードメインと細胞外ループ、細胞膜への標的化を確実にするMタンパク質の一部と翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)とをコードするジカウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質の直上流の2つの膜貫通ドメイン、細胞外ループの直前の2つの膜貫通ドメイン、及び細胞外ループを包含する、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する全長エンベロープタンパク質を含む、ジカ全長2014抗原(AHL43503)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号31に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは配列番号30に示されるジカ全長2014抗原(AHL43503)のアミノ酸バージョンである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号32に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは、配列番号23のアミノ酸409〜690に対応するZikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメ��ンの切断部分を含み、さらにまた翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)も含むZika wt 2015抗原(AHL12087)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号33に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは配列番号32に示されるZika wt 2015抗原(AHL12087)のアミノ酸バージョンである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号34に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは、配列番号23のアミノ酸409〜690に対応するZikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分、翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)、及び配列番号35(N末端メチオニンは計数しない)においてアミノ酸変異D37I、D43L、D266I、D129L、D218Lを生じさせる点変異を含む、Zika mut 2015抗原(AHL12087)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号35に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは配列番号34に示されるZika mut 2015抗原(AHL12087)のアミノ酸バージョンである。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原は、配列番号36に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは、2つのC末端膜貫通アンカードメインと細胞外ループ、細胞膜への標的化を確実にするMタンパク質の一部と翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)とをコードするジカウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質の直上流の2つの膜貫通ドメイン、細胞外ループの直前の2つの膜貫通ドメイン、及び細胞外ループを包含する、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する全長エンベロープタンパク質を含む、ジカ全長2015抗原(AHL12087)である。一部の実施形態において、本明細書中で用いられる少なくとも1つの標的抗原
は、配列番号37に示される配列によりコードされるジカウイルス抗原であり、これは配列番号36に示されるジカ全長2015抗原(AHL12087)のアミノ酸バージョンである。
【００５５】
特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号1又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号2又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号3又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号4又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号5又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号6又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号7又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号8又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号9又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号10又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号11又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号12又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65��、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号13又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号14又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号15又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号16又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号17又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号18又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号19又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号20又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号21又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号22又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号23又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又��値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号24又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号25又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号26又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のアミノ酸配列は、配列番号27又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号28又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のアミノ酸配列は、配列番号29又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号30又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のアミノ酸配列は、配列番号31又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号32又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のアミノ酸配列は、配列番号33又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号34又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のアミノ酸配列は、配列番号35又はそのフラグメントに対して少なくとも50％���60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のヌクレオチド配列は、配列番号36又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、抗原のアミノ酸配列は、配列番号37又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、又は100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。
【００５６】
特定の実施形態において、標的抗原は、ジカウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質(E)などのジカウイルスタンパク質である。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号13又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号14又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号15又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号16又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号17又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号18又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号19又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号11又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号12又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号20又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号21又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号23又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任���の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号24又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。特定の実施形態において、標的抗原は、配列番号25又はそのフラグメントに対して少なくとも50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、100％(又はこれらから導出される任意の範囲又は値)同一の領域を有する。
【００５７】
特定の態様において、標的抗原は、フラビウイルス科に属する任意の抗原を含む。フラビウイルス(Flaviviridae)科のフラビウイルス属は、公衆の健康及び/又は獣医学的に懸念される多数のウイルスを含む。フラビウイルスはベクター媒介性ウイルスであり、一部の群は蚊により伝染し、一部はダニにより伝染する。公衆の健康に関して特に興味深いフラビウイルスは、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、及びジカウイルス(ZIKAV)である。
【００５８】
黄熱病ウイルス(YFV)は、1年当たり200,000件の症例及び30,000件の死亡を引き起こすと推定されている。黄熱病ウイルスは、サハラ以南のアフリカ及び南米の風土病である。黄熱病ウイルス感染症は、大部分が無症候性であり得る。しかしながら、症例の約15％は、出血熱などのより重篤な形態の疾患へと発展し得る。幾つかの有効な生弱毒化ワクチンが入手可能である。しかしながら、これらのワクチンは、髄膜脳炎、ギラン・バレー症候群及び急性播種性脳脊髄炎などの重篤な有害事象を伴う可能性がある。
【００５９】
日本脳炎ウイルス(JEV)は、東アジア、東南アジア及び南アジアの風土病であり、さらに最近ではオーストラリアにおいて発見された。日本脳炎ウイルスの致死率は5〜40％であり、子供及び高齢の個体は重篤な疾患により感受性である。生存者の20〜50％に精神神経学的後遺症が生じ得る。日本脳炎ウイルスは、1年当たり70,000件の症例及び20,000件の死亡を引き起こすと推定されている。日本脳炎ウイルスの5つの異なる遺伝子型が存在するが、ワクチン株は全て遺伝子型IIIに属する。他の4つの遺伝子型に対するワクチンの有効性は十分に確立されていない。
【００６０】
ヒト疾患を引き起こすことが知られているダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)の3つのサブタイプが存在する。このサブタイプは、極東型(TBEV-fe)、シベリア型(TBEV-si)、及びヨーロッパ型(TBEV-eu)である。ダニ媒介性脳炎ウイルスは全て、ダニにより伝染する。症例の10〜30％は無症候性であり得ると考えられているが、ダニ媒介性脳炎ウイルスは、脊髄炎、髄膜炎、及び脳炎を引き起こす可能性がある。死亡率はサブタイプによって異なり、TBEV-feが最も高い死亡率(20％超)を有する。
【００６１】
デングウイルス(DENV)は、4つのサブタイプ、DENV-1、DENV-2、DENV-3、及びDENV-4を有する。これらのサブタイプを合わせると、推定で毎年5千万〜1億件の感染症を引き起こしており、認可ワクチンは存在しない。デングウイルスワクチンの製造を制限している問題の1つは、1つのワクチンで4つの血清型全てに対する免疫を提供する必要性である。デングウイルスによる初期感染は自己限定的であり得るが、その後異型のウイルスに感染すると、デングショック症候群(DSS)及びデング出血熱(DHF)につながる可能性がある。デングからは各年約20,000件の死亡が生じ、致死率の大部分は、デングショック症候群及びデング出血熱に関連していた。生弱毒化ウイルスを用いて4つの血清型全てに対するワクチンを作製する試みは、ワクチン株間の競合により失敗した。
【００６２】
ウエストナイルウイルス(WNV)は、アフリカ、ヨーロッパ、アジア、オーストラリア及びアメリカ中に広く分布している。大半の感染症は無症候性であり得るが、ウエストナイルウイルスは、ヒト、ウマ及びコンパニオン動物において神経性疾患を引き起こす可能性もある。
【００６３】
ジカウイルス(ZIKAV)は、最近南米に出現した。ジカウイルスは、1947年にアフリカで最初に分離され、その後赤道アフリカにおける黄疸の大流行の原因病原体であることが見出された。南米における最も最近の大流行は、ジカウイルスが、多くのフラビウイルスと同様に神経細胞疾患を引き起こし得ることを明らかにした。大部分のジカウイルス感染症は軽度又は無症候性であり得るが、感染は、致命的な脳損傷、小頭症及びギラン・バレー症候群などの重篤な神経学的症状につながり得る。妊娠第1三半期に生じる感染症は、胎児において脳損傷及び小頭症を引き起こす可能性があると考えられている。南北アメリカ大陸、特にブラジルにおける現在のフラビウイルス大流行の重大性は、危険性がある集団、特に医療に対する日常的なアクセスを有さない出産適齢期の女性を保護する長期持続フラビウイルスワクチンに対する医療上の必要性を明らかにした。
【００６４】
本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを用いて標的化することができるフラビウイルスの他の例としては、アブセタロフウイルス(Absettarov virus)、アポイウイルス(Apoi virus)、ハンサロバウイルス(Hansalova virus)、ハイパーウイルス(Hyper virus)、イレウスウイルス(Iheus virus)、イスラエル七面鳥髄膜脳炎(Israel turkey meningoencephalits)、ココベラウイルス(Kokobera virus)、コウタンゴウイルス(Koutango virus)、クンジンウイルス(Kunjin virus)、キャサヌル森林病ウイルス(Kyasanur Forest virus)、ランガトウイルス(Langat virus)、跳躍病ウイルス(Louping ill virus)、モドックウイルス(Modoc virus)、マレーバレー脳炎ウイルス(Murray Valley encephalitis virus)、ネギシウイルス(Negishi virus)、オムスク出血熱(Omsk hemorrhagic fever)、ポワッサンウイルス(Powassan virus)、リオブラボーウイルス(Rio Bravo virus)、ロシオウイルス(Rocio virus)、スポンドウェニウイスル(Spondweni virus)、セントルイス脳炎ウイルス(St. Louis encephalitis virus)、及びウェッセルスブロンウイルス(Wesselbron virus)などが挙げられる。
【００６５】
一部の実施形態において、本開示のAd5[E1-、E2b-]-ベースのベクターにおける抗原(例えば、任意のZika抗原)は、対象において抗ヒトC1q応答を生成するワクチンの能力を低下させ得る変異を含む。例えば、一部の実施形態において、点変異としては、Zika mut 2015抗原(Zika mut 2015抗原をコードするヌクレオチド配列は配列番号34であり、Zika mut 2015抗原をコードするアミノ酸配列は配列番号35である)におけるような、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)などが挙げられる。他の実施形態において、点変異としては、Zika mut 2014抗原(Zika mut 2014抗原をコードするヌクレオチド配列は配列番号28であり、Zika mut 2014抗原をコードするアミノ酸配列は配列番号29である)におけるような、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)などが挙げられる。
【００６６】
一部の実施形態において、本開示のAd5[E1-、E2b-]-ベースのベクターにおける抗原(例えば、任意のZika抗原)は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する配列を含む。例えば、かかる抗原の配列は、配列番号26〜配列番号29又は配列番号32〜配列番号35に示される。
【００６７】
一部の実施形態において、本開示のAd5[E1-、E2b-]-ベースのベクターにおける抗原(例えば、任意のZika抗原)は、2つの膜貫通ドメインと細胞外ループ、並びにエンベロープタンパク質の大部分を含み、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する。例えば、かかる抗原の配列は、配列番号30〜配列番号31又は配列番号36〜配列番号37に示される。膜貫通ドメインの包含は、mRNAを担持したリボソームの小胞体への移動、グリコシル化、及び最終的なタンパク質の細胞膜への移動及び結合を確実にするシグナル配列としての役割を果たすことが可能であり、これらは全て究極的には抗原性を高め、これにより免疫応答を生成し得る。
【００６８】
II. アデノウイルスベクター
特定の態様において、アデノウイルスベクターは、フラビウイルス抗原(特にジカウイルス抗原)の送達のための組成物及び方法において使用することができる。
【００６９】
組換えAd5[E1-、E2b-]ベクターワクチンプラットフォームは新しく、初期遺伝子2b(E2b)領域中にウイルスDNAポリメラーゼ(pol)及び/又は前末端タンパク質(pTP)遺伝子を除去し得る付加的な欠失を有し、E.C7ヒト細胞系において増殖することができる(Amalfitano A, Begy CR, Chanberlain JS, Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 93：3352-6；Amalfitano A, Chanberlain JS, Gene Ther. 1997 4:258-63；Amalfitano A et al. J Virol. 1998 72:926-33；Seregin SS and Amalfitano A Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1521-31)。このベクターは、現在のAd5[E1-]ベクターの7kbの容量と比較して複数遺伝子の包含を可能とするのに十分な12kbまで拡張された遺伝子運搬能/クローニング容量を有し得る(Amalfitano A et al. J Virol. 1998 72:926-33；Seregin SS and Amalfitano A Expert Opin Biol Ther. 2009 9:1521-31)。E2b領域の付加的な欠失は、Ad5ウイルスタンパク質に対する免疫応答を最小限に抑えながら特定の抗原に対して強力な免疫応答を誘発するなどの有利な免疫特性を付与し得る。
【００７０】
重要なことに、癌及び感染性疾患における前臨床的及び臨床的研究は、Ad5[E1-、E2b-]-ベースのベクターが、Ad５免疫の存在下であっても、ベクター化された抗原に対して強力なCMI及びAb応答を誘導し得ることを実証する(Osada T et al. Cancer Gene Ther. 2009 16:673-82；Gabitzsch ES et al. Vaccine. 2009 27:6394-8；Gabitzsch ES et al. Immunol Lett. 2009 122:44-51；Gabitzsch ES et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 59:1131-5；Gabitzsch ES et al. Cancer Gene Ther. 2011 18:326-35；Gabitzsch ES et al. Vaccine 2011 29:8101-7；Jones FR et al. Vaccine 2011 29:7020-6；Gabitzsch ES, Jones FR, J Clin Cell Immunol. 2011 S4:001. doi:10.4172/2155-9899. S4-001；Gabitzsch ES et al. Vaccine 2012 30:7265-70；Wieking BG et al. Cancer Gene Ther. 2012 19:667-74；Morse MA et al. Cancer Immunol Immunother. 2013 62:1293-1301；Balint et al. Cancer Immunol Immunother. 2015 64:977-87；Rice AE et al. Cancer Gene Ther. 2015 22:454-62；Gabitzsch ES et al. Oncotarget 2015 Sept 7)。
【００７１】
新型の組換えアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクタープラットフォームは、フラビウイルスに対する新規な、広く交差反応性のワクチンを開発する機会を与え得る。このベクターは、強力な免疫応答を誘導する抗原提示細胞(APC)に対する規定のフラビウイルス抗原の曝露のための皮下注射により、直接送達することができる。重要なことに、Ad5組換えベクターはエピソーム的に複製することができるが、そのゲノムを宿主細胞ゲノムに挿入することはできず、これにより、遺伝子組み込み及び生命維持に必要な細胞遺伝子機能の破壊が生じないことを確実にする(Imler JL Vaccine. 1995 13:1143-51；Ertl HC, Xiang Z J Immunol. 1996 156:3579-82；Amalfitano, A Curr Opin Mol Ther. 2003 5:362-6)。
【００７２】
残念ながら、現在のAd5-ベースのベクターが直面している主な課題は、Ad5に対する既存免疫の存在である。大部分の人々は、ヒト用ワクチンに最も広く用いられているサブタイプであるAd5に対する中和Abを示し、研究された人々の3分の2は、Ad5に対してリンパ増殖応答を有する(Chirmule N et al. Gene Ther. 1999 6:1574-83)。この免疫は、フラビウイルスワクチンのプラットフォームとしての現在の初期遺伝子1(E1)領域欠失Ad5ベクター(Ad5[E1-])の使用を妨げ得る。Ad5免疫は、組換えAd5ベクターを用いた免疫化、特に再免疫化を阻害し、ワクチン接種を受けた人の、第2の疾患抗原に対する免疫化も妨げ得る。既存のAd5ベクター免疫の問題を克服することは、集中的な研究の主題であった。しかしながら、他のAd血清型又はさらに非ヒト形態のAdの使用は、重要なケモカイン及びサイトカインの産生の変化、遺伝子調節異常に直接つながる可能性があり、また有意に異なる生体内分布及び組織毒性を有し得る(Appledorn DM et al. Gene Ther. 2008 15:885-901；Hartman ZC et al. Virus Res. 2008 132:1-14)。これらのアプローチが初期免疫化においては成功したとしても、後続のワクチン接種には、上記のAdサブタイプに対して誘導された免疫応答により問題が生じる可能性がある。現在のAd5[E1-]ベクターについてAd免疫化バリアの回避を補助し、また有害な症状を回避するため、改善されたAd5ベクタープラットフォームを上記のとおりに構築した。
【００７３】
さらに、Ad5[E1-、E2b-]ベクターは、注射後最初の24時間〜72時間中に、現在のAd5[E1-]ベクターと比較して炎症の低下を示し得る(Nazir SA, Metcalf JP J Investig Med. 2005 53:292-304；Schaack J Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 101:3124-9；Schaack J Viral Immunol. 2005 18:79-88)。Ad5[E1-、E2b-]後期遺伝子発現の欠如は、感染細胞の抗Ad5活性に対する影響の受けやすさを低下させ、感染細胞が導入遺伝子を長時間産生及び発現するのを可能にする(Gabitzsch ES, Jones FR J Clin Cell Immunol. 2011 S4:001. doi:10.4172/2155-9899. S4-001；Hodges BL J Gene Med. 2000 2:250-9)。Ad5[E1-、E2b-]ウイルスタンパク質に対する炎症性応答の低下及びその結果として得られる既存のAd5免疫の回避は、Ad5[E1-、E2b-]がAPC細胞に感染する能力を高めることが可能であり、被接種者(inoculee)のより高い免疫化をもたらす。さらに、他の細胞型の感染の増加は、強力なCD4＋及びCD8＋T細胞応答に必要とされる高レベルの抗原提示を提供し、メモリーT細胞の発達をもたらし得る。従って、E2b領域の欠失は、既存のAd5免疫の存在下でもAd5タンパク質に対する免疫応答を最小限に抑えながら、特定の抗原に対して強力な免疫特性を誘発することなどの有利な免疫特性を付与することができると考えられる。
【００７４】
結果は、組換えAd5[E1-、E2b-]プラットフォーム-ベースのワクチンの、既存免疫及び/又はAd5ベクター誘導性の免疫を克服し、顕著な防御免疫応答を誘導する能力を実証した。これらの研究は、新たなAd5[E1-、E2b-]ベクターベースのワクチンが、1) 現在のAd5[E1-]ベクターと比較して有意に高いCMI応答を誘導することが可能であり、2) 強力なCMI応答を誘導するために設計された複数回免疫化レジメンに利用することが可能であり、3) 既存のAd5免疫を有する動物において有意な抗原特異的CMI応答を誘導することが可能であり、4) 高レベルの既存のAd5免疫を有する動物において有意な抗腫瘍応答又は感染性疾患に対する防御を誘導することができることを確立した。
【００７５】
特定の態様は、フラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法及びアデノウイルスベクターに関する。特に、特定の態様は、2つ以上の抗原性標的実体に対する複数回ワクチン接種を達成し得るように改善されたAd-ベースのワクチンを提供し得る。重要なことに、ワクチン接種は、Adに対する既存免疫の存在下で実施することが可能であり、及び/又は本明細書中に記載されるアデノウイルスベクター又は他のアデノウイルスベクターを用いて以前に複数回免疫化した対象に投与することができる。アデノウイルスベクターを、対象に複数回投与して、様々なフラビウイルス抗原に対する免疫応答、例えば、限定するものではないが、多関節痛又は脳炎を引き起こすフラビウイルスに対する幅広い抗体の産生及び細胞媒介性免疫応答の生成などを誘導することができる。
【００７６】
特定の態様は、E2b欠失アデノウイルスベクター、例えば米国特許第6,063,622号；第6,451,596号；第6,057,158号：及び第6,083,750号(全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているE2b欠失アデノウイルスベクターなどの使用を提供する。‘622特許に記載されているとおり、ウイルスタンパク質発現をさらに無能にするため、また複製可能Ad(RCA)の生成の頻度を低下させるためにも、E2b領域に欠失を含むアデノウイルスベクターを特定の態様で提供することができる。これらのE2b欠失アデノウイルスベクターの増殖は、欠失E2b遺伝子産物を発現する細胞系を必要とする。
【００７７】
さらなる態様において、パッケージ細胞系；例えばHEK-203細胞系に由来するE.C7(正式にはC-7と呼ばれる)(Amalfitano A et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:3352-56；Amalfitano A et al. Gene Ther 1997 4:258-63)が提供され得る。
【００７８】
さらに、E2b遺伝子産物、DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質は、E.C7又は類似の細胞中で、E1遺伝子産物と共に構成的に発現され得る。Adゲノム由来の遺伝子セグメントの産生細胞系への移行は、即時の利益：(1) 組換えDNAポリメラーゼと前末端タンパク質が欠失されたアデノウイルスベクターの運搬能力の増加(理論上欠失され得るDNAポリメラーゼと前末端タンパク質の合わせたコーディング配列が4.6kb近いため)；(2) RCA生成の可能性の低下(RCAを生成するために2つ以上の独立した組換え事象が必要とされ得るため)、を有し得る。
【００７９】
従って、E1、Ad DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質発現細胞系は、ヘルパーウイルスの混入を必要とすることなく、13kb近い運搬能力を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能とし得る(Mitani et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995 92:3854；Hodges et al. J Gene Med 2000 2:250-259；Amalfitano and Parks Curr Gene Ther 2002 2:111-133)。
【００８０】
さらに、ウイルスの生活環には重要な遺伝子(例えば、E2b遺伝子)が欠失されている場合、Adが他のウイルス遺伝子タンパク質を複製又は発現することのさらなる無能化が起こり得る。このことは、ウイルスに感染した細胞の免疫認識を低下させる可能性があり、また外来導入遺伝子の発現期間の延長を可能とし得る。
【００８１】
しかしながら、E1、DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質欠失ベクターの重要な特性としては、それらがE1及びE2b領域に由来する各タンパク質を発現することができないこと、並びに大部分のウイルス構造タンパク質の発現の欠如が予測されることなどが挙げられる。例えば、Adの主要後期プロモーター(MLP)は、後期構造タンパク質L1〜L5の転写に関与している(Doerfler, In Adenovirus DNA, The Viral Genome and Its Expression (Martinus Nijhoff Publishing Boston, 1986)。MLPは、Adゲノム複製前は活性が最小であり得るが、ウイルスゲノム複製が起こった後に初めて、MLPから毒性の高いAd後期遺伝子が主として転写及び翻訳され得る(Thomas and Mathews Cell 1980 22:523)。この後期遺伝子転写のcis-依存性活性化はDNAウイルスの一般的な(例えばポリオーマ及びSV-40の増殖における)特徴であり得る。DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質は、(E4又はタンパク質IXタンパク質とは異なり)Ad複製に絶対的に必要とされ得るものであり、このためこれらの欠失は、APCなどの細胞におけるアデノウイルスベクターの後期遺伝子発現、及びその発現の毒性作用に極めて有害であり得る。
【００８２】
特定の実施形態において、使用のために想定されるアデノウイルスベクターとしては、例えば、AdゲノムのE2b領域及びE1領域に欠失を有するが、Adゲノムの任意の他の領域は欠失されていないE2b欠失アデノウイルスベクターなどが挙げられる。別の実施形態において、使用のために想定されるアデノウイルスベクターとしては、例えば、AdゲノムのE2b領域における欠失並びにE1領域及びE3領域における欠失を有するが、他の領域は欠失されていないE2b欠失アデノウイルスベクターなどが挙げられる。さらなる実施形態において、使用のために想定されるアデノウイルスベクターとしては、例えば、AdゲノムのE2b領域における欠失及びE1領域、E3領域における欠失並びにE4領域の部分的な又は完全な除去を有するが、他の欠失は有さないアデノウイルスベクターなどが挙げられる。
【００８３】
別の実施形態において、使用のために想定されるアデノウイルスベクターとしては、例えば、AdゲノムのE2b領域における欠失並びにE1領域及びE4領域における欠失を有するが、他の欠失は有さないアデノウイルスベクターなどが挙げられる。さらなる実施形態において、使用のために想定されるアデノウイルスベクターとしては、AdゲノムのE2a領域、E2b領域及びE4領域における欠失を有するが、他の欠失は有さないアデノウイルスベクターなどが挙げられる。
【００８４】
一実施形態において、本明細書における使用のためのアデノウイルスベクターは、E1、及びE2b領域のDNAポリメラーゼ機能は欠失されているが、他の欠失は有さないベクターを含む。さらなる実施形態において、本明細書における使用のためのアデノウイルスベクターは、E1、及びE2b領域の前末端タンパク質機能は欠失されているが、他の欠失は有さない。
【００８５】
別の実施形態において、本明細書における使用のためのアデノウイルスベクターは、E1、DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質機能は欠失されているが、他の欠失は有さない。一つの特定の実施形態において、本明細書における使用のために想定されるアデノウイルスベクターは、E2b領域及びE1領域の少なくとも一部が欠失されているが、「(内部を抜かれた)gutted」アデノウイルスベクターではない。これに関連して、ベクターは、DNAポリメラーゼ及びE2b領域の前末端タンパク質機能の両方が欠失され得る。
【００８６】
本明細書中で使用される「E2b欠失」という用語は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を妨げるような方法で変異されている特定のDNA配列を指し得る。従って、特定の実施形態において、「E2b欠失」とは、Adゲノムから欠失された(除去された)特定のDNA配列を指し得る。E2b欠失された、又は「E2b領域中に欠失を含む」は、AdゲノムのE2b領域中の少なくとも1個の塩基対の欠失を指し得る。従って、特定の実施形態においては、2個以上の塩基対が欠失され、さらなる実施形態においては、少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、又は150個の塩基対が欠失されている。別の実施形態において、欠失は、AdゲノムのE2b領域中の、150個超、160個超、170個超、180個超、190個超、200個超、250個超、又は300個超の塩基対の欠失である。E2b欠失は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を妨げる欠失であり得、従って、E2b特異的タンパク質のエクソンコーディング部分中の欠失並びにプロモーター配列及びリーダー配列中の欠失を包含する。特定の実施形態において、E2b欠失は、E2b領域のDNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質の1つ又は両方の発現及び/又は機能を妨げる欠失である。さらなる実施形態において、「E2b欠失」は、1つ以上のコードされるタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列中の1つ以上の点変異を指し得る。このような変異は、非機能的タンパク質を生じさせるアミノ酸配列中の変化をもたらす、異なる残基で置換されている残基を包含し得る。
【００８７】
本開示を読めば当業者には理解され得るとおり、Adゲノムの他の領域を欠失させることができる。従って、本明細書中で使用される、Adゲノムの特定の領域において「欠失された」とは、その領域によりコードされる少なくとも1つの遺伝子産物の発現及び/又は機能を妨げるような方法で変異された特定のDNA配列を指し得る。特定の実施形態において、特定の領域において「欠失される」とは、その領域によりコードされる発現及び/又は機能(例えば、DNAポリメラーゼのE2b機能又は前末端タンパク質機能)を妨げるような方法でAdゲノムから欠失された(除去された)特定のDNA配列を指し得る。特定の領域中で「欠失された」又は特定の領域中に「欠失を含む」とは、Adゲノムのその領域中の少なくとも1個の塩基対の欠失を指し得る。従って、特定の実施形態においては、特定の領域から2個以上の塩基対が欠失され、さらなる実施形態においては、少なくとも20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個、110個、120個、130個、140個、又は150個の塩基対が欠失される。別の実施形態において、欠失は、Adゲノムの特定の領域中の、150個超、160個超、170個超、180個超、190個超、200個超、250個超、又は300個超の塩基対である。一部の実施形態において、上記の欠失のいずれか1つは、2個以上の塩基対の転位の結果でもあり得る。
【００８８】
これらの欠失は、その領域によりコードされる遺伝子産物の発現及び/又は機能が妨げられ得るような欠失であり得る。従って、欠失は、タンパク質のエクソンコーディング部分中の欠失並びにプロモーター配列及びリーダー配列中の欠失を包含し得る。さらなる実施形態において、Adゲノムの特定の領域において「欠失された」とは、1つ以上のコードされるタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列中の1つ以上の点変異を指し得る。このような変異は、非機能的タンパク質を生じさせ得るアミノ酸配列中の変化をもたらす、異なる残基で置換されている残基を包含し得る。
【００８９】
1つ以上の欠失を含むアデノウイルスベクターは、当技術分野で公知の組換え技術を用いて生成することができる(例えば、Amalfitano et al. J. Virol. 1998 72:926-33；Hodges、Et al., J Gene Med 2000 2:250-59を参照)。当業者に認識され得るとおり、使用のためのアデノウイルスベクターは、E2b遺伝子産物及び、欠失され得る必要遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージ細胞系を用いて、首尾よく高力価に増殖させることができる。特定の実施形態において、E1及びDNAポリメラーゼタンパク質を構成的に発現するだけでなく、Ad-前末端タンパク質も発現するHEK-293-由来細胞を使用することができる。一実施形態において、アデノウイルスベクターの高力価ストックを首尾よく増殖させるためにE.C7細胞が使用される(例えば、Amalfitano et al. J. Virol. 1998 72:926-33；Hodges et al. J Gene Med 2000 2:250-59を参照)。
【００９０】
自己増殖アデノウイルスベクターから重要な遺伝子を欠失させるために、標的化遺伝子によりコードされるタンパク質を、最初にHEK-293細胞又は類似の細胞中でE1タンパク質と一緒に共発現させることができる。これにより、構成的に共発現させた場合に非毒性であるタンパク質(又は誘導的に発現される毒性タンパク質)のみを利用することができる。HEK-293細胞における(誘導性、非構成的プロモーターを利用した)E1遺伝子及びE4遺伝子の共発現が実証されている(Yeh et al. J. Virol. 1996 70:559；Wang et al. Gene Therapy 1995 2:775；及びGorziglia et al. J. Virol. 1996 70:4173)。E1遺伝子及びタンパク質IX遺伝子(ビリオン構造タンパク質)が共発現されており(Caravokyri及びLeppard, J. Virol. 1995 69：6627)、E1、E4、及びタンパク質IXの遺伝子の共発現も記載されている(Krougliak及びGraham Hum. Gene Ther. 1995 6:1575)。E1遺伝子及び100k遺伝子は、E1遺伝子及びプロテアーゼ遺伝子と同様に、トランス相補細胞系において首尾よく発現された(Oualikene et al. Hum Gene Ther 2000 11:1341-53；Hodges et al. J. Virol 2001 75:5913-20)。
【００９１】
高力価のE2b欠失Ad粒子の増殖において使用するための、E1遺伝子産物及びE2b遺伝子産物を共発現する細胞系は、米国特許第6,063,622号に記載されている。このE2b領域は、Adゲノム複製に絶対的に必要とされ得るウイルス複製タンパク質をコードする(Doerfler(上記参照)及びPronk et al. Chromosoma 1992 102:S39-S45)。有用な細胞系は、約140kDaのAd-DNAポリメラーゼ及び/又は約90kDaの前末端タンパク質を構成的に発現する。特に、高レベルのE1、DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質の構成的共発現を有する毒性のない細胞系(例えば、E.C7)が、複数回ワクチン接種における使用のためのAdの増殖における使用に望ましい場合がある。これらの細胞系は、E1、DNAポリメラーゼ及び前末端タンパク質が欠失されたアデノウイルスベクターの増殖を可能とし得る。
【００９２】
組換えAdは、当技術分野で公知の技術を用いて増殖させることができる。例えば、特定の実施形態において、E.C7細胞を含む組織培養プレートに、アデノウイルスベクターのウイルスストックを適切なMOI(例えば、5)で感染させ、37.0℃で40〜96時間インキュベートする。感染細胞を回収し、10mM トリス-CI(pH8.0)に再懸濁させ、超音波処理し、ウイルスを2ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離により精製する。特定の技術においては、ウイルス含有バンドをSephadex CL-6Bカラム(Pharmacia Biotech(ピスカタウェイ、ニュージャージー州))で脱塩し、スクロース又はグリセロールを添加し、複数アリコートを-80℃で保存する。一部の実施形態においては、ウイルスを、A195(Evans et al. J Pharm Sci 2004 93:2458-75)のような、ウイルスの安定性を高めるように設計された溶液中に入れる。このストックの力価は、(例えばSDS溶解後の1アリコートのウイルスの、260nmでの光学的密度の測定により)測定することができる。別の実施形態において、組換えE2b欠失アデノウイルスベクター全体を包含する直鎖又は環状のプラスミドDNAを、E.C7細胞、又は類似の細胞にトランスフェクトし、ウイルス産生の証拠が示されるまで37.0℃でインキュベートすることができる(例えば、細胞変性作用)。次いで、精製前に、これらの細胞から調製した培地を用いてさらなるE.C7又は類似の細胞を感染させ、産生されるウイルスの量を増加させるとができる。
【００９３】
精製は、2ラウンドの塩化セシウム密度遠心分離又は選択的濾過により達成することができる。特定の実施形態において、ウイルスは、市販製品(例えば、Puresyn, Inc.(マルバーン、ペンシルバニア州)製のAdenopure)又は特注のクロマトグラフィーカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００９４】
特定の実施形態において、組換えAdは、感染対象の細胞が一定数のウイルスと遭遇することを確実にするのに十分なウイルスを含み得る。従って、組換えAdのストック、特に組換えAdのRCA非含有ストックが提供され得る。Adストックの調製及び分析は、当技術分野で周知である。ウイルスストックは、主にウイルスの遺伝子型並びにそれらを調製するためのプロトコル及び細胞系に応じて、力価が相当変動し得る。ウイルスストックは、少なくとも約106、107、又は108ウイルス粒子(VP)/mLの力価を有し得、このようなストックの多くは、少なくとも約109、1010、1011、又は1012VP/mlなどのさらに高い力価を有し得る。
【００９５】
III. 異種核酸
アデノウイルスベクターは、それらに対して免疫応答を生成することが望ましい幾つかの目的の標的抗原、それらのフラグメント又は融合体をコードする異種核酸配列も含み得る。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターは、免疫応答を調節し得る幾つかのタンパク質、それらの融合体又はそれらのフラグメントをコードする異種核酸配列を含む。このようにして、特定の態様は、異種核酸配列を含む第2世代のE2b欠失アデノウイルスベクターを提供する。
【００９６】
従って、特定の態様は、本明細書中で「幾つかの目的のフラビウイルス標的抗原をコードするポリヌクレオチド」とも呼ばれ得る核酸配列を提供する。従って、特定の態様は、本明細書中でさらに記載される任意の源由来の標的抗原をコードするポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを含むベクター、及びかかる発現ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で本質的に互換的に用いられる。当業者にも認識されるとおり、ポリヌクレオチドは、一本鎖(コーディング鎖又はアンチセンス鎖)であっても二本鎖であってもよく、DNA分子(ゲノムDNA分子、cDNA分子又は合成DNA分子)であってもRNA分子であってもよい。RNA分子は、イントロンを含み1対1様式でDNA分子に対応するhnRNA分子、及びイントロンを含まないmRNA分子を含み得る。付加的なコーディング配列又は非コーディング配列は、必ずしもではないが、ポリヌクレオチド中に存在していてよく、ポリヌクレオチドは、必ずしもではないが、他の分子及び/又は支持物質に結合されていてもよい。本明細書中で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドが他のコーディング配列から実質的に離れていることを意味し得る。例えば、本明細書中で用いられる「単離されたDNA分子」は、大染色体フラグメント又は他の機能的遺伝子若しくはポリペプチドコーディング領域などの、無関係コーディングDNAの大部分を含まない。当然のことながら、この用語は、最初に単離されたDNA分子を指し得、実験室において後で組換え的にセグメントに付加された遺伝子又はコーディング領域を除外しない。
【００９７】
当業者に理解されるとおり、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列、ゲノム外配列及びプラスミドコード配列並びに本明細書中に記載される標的抗原、抗原のフラグメント、ペプチドなどを発現するか又は発現するように適応させ得るより小さな操作された遺伝子セグメントを包含し得る。かかるセグメントは、天然に単離されていてもよく、人手で合成的に改変されていてもよい。
【００９８】
ポリヌクレオチドは、天然配列(すなわち標的抗原ポリペプチド/タンパク質/エピトープ又はそれらの一部をコードする内在性配列)を含み得るか、又はかかる配列の変異体又は誘導体をコードする配列を含み得る。特定の実施形態において、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列は、本明細書中に記載される標的抗原タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、特定の細胞型(すなわち、ヒト細胞系)における発現のために最適化されており、天然のヌクレオチド配列又は変異体とは実質的に異なるが、類似のタンパク質抗原をコードし得る新規な遺伝子配列を表す。
【００９９】
他の関連実施形態において、本明細書中に記載されるタンパク質(例えば、目的の標的抗原)をコードする天然配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチド変異体、例えば、本明細書中に記載される方法(例えば、以下に記載される標準的なパラメータを用いるBLAST分析)を用いて本ポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも70％の配列同一性、特に少なくとも75％〜99％以上の配列同一性を含むポリヌクレオチド変異体が提供され得る。当業者であれば、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置などを考慮に入れることにより、これらの値を適切に調整して、2つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応同一性を決定し得ることを認識するであろう。
【０１００】
特定の態様において、ポリヌクレオチド変異体は、特に、変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性又は異種標的タンパク質の免疫原性が、天然ポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドに対して実質的に減少しないような1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含むであろう。本明細書中の他の箇所に記載されるとおり、ポリヌクレオチド変異体は、標的抗原の変異体、又はそのフラグメント(例えばエピトープ)をコードすることが可能であり、ここで変異体ポリペプチド又はそのフラグメント(例えばエピトープ)が抗原特異的抗血清及び/又はT細胞系若しくはクローンと反応する傾向は、天然ポリペプチドに対して実質的に減少しない。「変異体」という用語は、異種由来の相同遺伝子も包含し得る。
【０１０１】
特定の態様は、本明細書中に記載される標的タンパク質抗原並びにそれらの間の全ての中間長さを含むポリペプチドをコードする少なくとも約5個〜1000個以上の連続ヌクレオチドを含むか、又はこれらからなるポリヌクレオチドを提供し得る。この文脈において、「中間長さ」は、引用される値の間の任意の長さ、例えば16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53、等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；例えば200〜500；500〜1,000を通した全整数などを意味し得ることが容易に理解されるであろう。本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列は、エピトープ又は異種標的タンパク質などの、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする天然配列には見いだされない付加ヌクレオチドにより、一端又は両端で伸長することができる。この付加配列は、本開示配列のいずれかの末端又は本開示配列の両端の1個〜20個以上のヌクレオチドからなり得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド又はそれらのフラグメントは、コーディング配列自体の長さに関係なく、プロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコーディングセグメントなどの他のDNA配列と、それらの全長が相当変動し得るように組み合わせることができる。従って、ほぼあらゆる長さの核酸フラグメントを利用することが可能であり、全長は、意図される組換えDNAプロトコルにおける調製及び使用のしやすさにより制限され得ることが想定される。例えば、長さ約1000塩基対、2000塩基対、3000塩基対、4000塩基対、5000塩基対、6000塩基対、7000塩基対、8000塩基対、9000塩基対、10,000塩基対、約500塩基対、約200塩基対、約100塩基対、約50塩基対などの全長(全ての中間長さを含む)を有する例示的ポリヌクレオチドセグメントが、多くの実施において有用であると想定される。
【０１０３】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、以下に記載される最大対応について整列させたときに2つの配列中のヌクレオチドの配列が同一である場合、2つの配列は「同一である」と言うことができる。2つの配列間の比較は、配列類似性の局所領域を同定及び比較するための比較窓上で配列を比較することにより実施することができる。本明細書中で使用される「比較窓」は、少なくとも約20個、通常は30〜約75個、40〜約50個の連続位置のセグメントを参照することが可能であり、このセグメント中では、2つの配列を最適に整列させた後、1つの配列を同数の連続位置の参照配列に対して比較することができる。
【０１０４】
比較用の配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergene suite中のMegalignプログラム(DNASTAR, Inc.(マディソン、ウィスコンシン州))を使用し、デフォルトパラメータを用いて実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されている幾つかのアラインメントスキームを具体化する：Dayhoff MO(編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358中、Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships；Hein J Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 (1990)；Methods in Enzymology vol.183, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins DG and Sharp PM CABIOS 1989 5:151-53；Myers EW及びMuller W, CABIOS 1988 4:11-17；Robinson ED Comb. Theor 1971 11A 05；Saitou N, Nei M MoI. Biol. Evol. 1987 4:406-25；Sneath PHA and Sokal RR Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973)；Wilbur WJ及びLipman DJ, Proc. Natl. Acad., Sci. USA 1983 80:726-30。
【０１０５】
あるいは、Smith及びWaterman, Add. APL. Math 1981 2:482の局所同一性アルゴリズムにより、Needleman及びWunsch, J. MoI. Biol. 1970 48:443の同一性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85:2444の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ中のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTA(Genetics Computer Group(GCG)(サイエンスドクター575名)、マディソン、ウィスコンシン州))により、又は検査により、比較用の配列の最適なアラインメントを実行することができる。
【０１０６】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschul et al., Nucl. Acids Res. 1977 25:3389-3402、及びAltschul et al. J. MoI. Biol. 1990 215:403-10に記載されている。BLAST及びBLAST 2.0は、例えば、本明細書中に記載されるパラメータを用いて、ポリヌクレオチドについてのパーセント配列同一性を決定するために使用することができる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)を通して公的に入手可能である。1つの例示的な例において、ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータM(一対のマッチング残基についての報酬スコア；常に>0)及びパラメータN(ミスマッチング残基についてのペナルティスコア；常に<0)を用いて計算することができる。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ低下した場合；1つ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの蓄積により累積スコアがゼロ以下になった場合；又はいずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、ワード長(W)11、期待値(E)10、及びBLOSΜM62スコアリングマトリックス(Henikoff及びHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989 89:10915を参照)、アラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=-4及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【０１０７】
特定の態様において、「配列同一性のパーセント」は、2つの最適に整列された配列を、少なくとも20位置の比較窓上で比較することにより決定され、ここで2つの配列の最適なアラインメントのため、比較窓中のポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列(付加又は欠失を含まない)と比較して20パーセント以下、通常は5〜15パーセント、又は10〜12パーセントの付加又は欠失(すなわちギャップ)を含み得る。このパーセントは、両配列中で同一の核酸塩基が存在する位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を参照配列中の位置の総数(すなわち比較窓サイズ)で割り、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセントを得ることによって計算することができる。
【０１０８】
遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書中に記載される特定の目的の抗原又はそのフラグメントをコードする多くのヌクレオチド配列があり得ことは、当技術分野において通常の技能を有する者により認識されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有し得る。それにも関わらず、特定の態様において、コドン使用頻度の差により変動するポリヌクレオチドが具体的に想定される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルも同様に想定される。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加及び/又は置換などの1つ以上の変異の結果として変化し得る内在性遺伝子である。結果として得られたmRNA及びタンパク質は、必ずしもではないが、変化した構造又は機能を有し得る。アレルは、標準的な技術(例えばハイブリダイゼーション、増幅及び/又はデータベース配列比較)を用いて同定することができる。
【０１０９】
従って、別の実施形態において、本明細書中に記載される標的抗原配列又はそれらのフラグメントの変異体及び/若しくは誘導体の調製のため、部位特異的変異誘発などの変異誘発アプローチが用いられる。このアプローチにより、ポリペプチド配列中の特異的改変を、それらをコードする基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を通して行うことができる。これらの技術は、例えば、前述の考察の1つ以上を組み込んで、1つ以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することにより、配列変異体を調製及び試験するための直接的なアプローチを提供し得る。
【０１１０】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列、並びに十分なサイズのプライマー配列及び横断される欠失接合部の両側に安定な二本鎖を形成するための配列複雑性を提供する十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を通して、変異体の産生を可能とし得る。突然変異は、選択されたポリヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチド自体の特性を改善し、変更し、低下させ、改変し、あるいは変化させるため、及び/又はコードされるポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、又は一次配列を変更するために利用することができる。
【０１１１】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメント又はフラグメントは、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて一般的に実施されているとおり、化学的手段によりフラグメントを直接合成することによって容易に調製することができる。同様に、フラグメントは、米国特許第4,683,202号のPCR(商標)技術などの核酸再生産技術の応用により、組換え産生のため選択された配列を組換えベクターに導入することにより、また分子生物学の当業者に一般的に知られている他の組換えDNA技術(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NYを参照)によって得ることができる。
【０１１２】
本明細書中に記載される所望の標的抗原ポリペプチド若しくはそのフラグメント、又は上記のいずれかを含む融合タンパク質を発現するために、当技術分野で公知の組換え技術を用いて、上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は機能的等価物を、本明細書中の他の箇所に記載される適切なAdに挿入することができる。適切なアデノウイルスベクターは、挿入されるコーディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメント及び任意の所望のリンカーを含み得る。当業者に周知の方法を用いて、目的のポリペプチドをコードする配列並びに適切な転写及び翻訳制御エレメントを含むこれらのアデノウイルスベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換えなどが挙げられる。このような技術は、例えば、Amalfitano et al. J. Virol. 1998 72:926-33；Hodges et al. J Gene Med 2000 2:250-259；Sambrook J et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.、及びAusubel FM et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載されている。
【０１１３】
様々なベクター/宿主系を利用して、ポリヌクレオチド配列を含有及び産生させ得る。これらのベクター/宿主系としては、例えば、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドDNAベクターを用いて形質転換された細菌などの微生物；酵母ベクターを用いて形質転換された酵母；ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルスTMV)、又は細菌ベクター(例えば、Tiプラスミド又はpBR322プラスミド)を用いて形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系などが挙げられる。
【０１１４】
アデノウイルスベクター中に存在する「制御エレメント」又は「調節配列」は、宿主細胞のタンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行するベクターの非翻訳領域(エンハンサー、プロモーター、5’及び3’非翻訳領域)であり得る。このようなエレメントは、それらの強度及び特異性において異なり得る。利用されるベクター系及び宿主に応じて、任意の数の好適な転写エレメント及び翻訳エレメント、例えば構成的プロモーター及び誘導性プロモーターなどを用いることができる。例えば、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列からなるAd転写/翻訳複合体にライゲートすることができる。ウイルスゲノムの非必須E1又はE3領域における挿入を用いて、感染した宿主細胞中でポリペプチドを発現することができる生存可能ウイルスを得ることができる(Logan J及びShenk T (1984) Proc. Natl. Acad. Sci 1984 87:3655-59)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。転写エンハンサーは、1つのエレメント、少なくとも2つのエレメント、少なくとも3つのエレメント、少なくとも4つのエレメント、少なくとも5つのエレメント、又は少なくとも6つのエレメントを含み得る。
【０１１５】
特異的開始シグナルを用いて、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成することもできる。このようなシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を含む。ポリペプチド、その開始コドン、及び上流配列をコードする配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、付加的な転写制御シグナル又は翻訳制御シグナルは必要とされ得ない。しかしながら、コーディング配列又はその一部のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供することができる。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正しいリーディングフレーム中に存在し得る。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源由来の翻訳エレメント及び開始コドンであり得る。使用される特定の細胞系に適したエンハンサー(例えば文献(Scharf D. et al. Results Probl. Cell Differ. 1994 20:125-62)に記載されているもの)を含めることにより、発現の効率を増大させることができる。選択されたポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するため、転写又は翻訳のいずれかのための特異的終結配列も組み込むことができる。
【０１１６】
産物に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを用いて、ポリヌクレオチドにコードされる産物(例えば、目的の標的抗原)の発現を検出及び測定するための様々なプロトコルが、当技術分野において公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及び蛍光活性化細胞選別(FACS)などが挙げられる。所与のポリペプチド上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位、モノクローナルベースの免疫アッセイを幾つかの適用に使用することができるが、競合結合アッセイも利用することができる。これらの及び他のアッセイは、他の場所の中でもとりわけ、Hampton R et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.)及びMaddox DE et al. (J. Exp. Med. 1983 758:1211-16)に記載されている。アデノウイルスベクターは、幾つかの目的のフラビウイルス抗原をコードする核酸配列を含み得る。
【０１１７】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターの核酸配列中に、所望の標的抗原の発現を増加させるエレメントが組み込まれる。このようなエレメントは、内部リボソーム結合部位を含む(IRES；Wang及びSiddiqui, Curr. Top. Microbiol. Immunol 1995 203:99；Ehrenfeld及びSemler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995 203:65；Rees et al., Biotechniques 1996 20:102；Sugimoto et al. Biotechnology 1994 2:694)。IRESは翻訳効率を増加させることができる。さらに、他の配列は発現を高めることができる。一部の遺伝子については、特に5'末端の配列が転写及び/又は翻訳を妨げる可能性がある。これらの配列は、ヘアピン構造を形成することができるパリンドロームであり得る。送達される核酸中の任意のこのような配列は、欠失されていてもよいし、欠失されていなくてもよい。
【０１１８】
転写産物又は翻訳産物の発現レベルをアッセイして、どの配列が発現に影響を与えるのかを確認又は確定することができる。転写レベルは、例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、RNaseプローブ保護などの任意の公知の方法によりアッセイすることができる。タンパク質レベルは、ELISAなどの任意の公知の方法によりアッセイすることができる。当業者に認識され得るとおり、異種核酸配列を含むアデノウイルスベクターは、当技術分野で公知の組換え技術、例えば、Maione et al. Proc Natl Acad Sci USA 2001 98:5986-91；Maione et al. Hum Gene Ther 2000 1:859-68；Sandig et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2000 97:1002-07；Harui et al. Gene Therapy 2004 11:1617-26；Parks et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996 93:13565-570；Dello Russo et al. Proc Natl Acad Sci USA 2002 99:12979-984；Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, NY)に記載されている組換え技術を用いて生成することができる。
【０１１９】
上記のとおり、アデノウイルスベクターは、幾つかのフラビウイルス標的タンパク質又は目的の抗原をコードする核酸配列を含み得る。これに関して、ベクターは、1〜4つ又はそれ以上の異なる目的の標的抗原をコードする核酸を含み得る。標的抗原は全長タンパク質であってもよく、又はそのフラグメント(例えばエピトープ)であってもよい。アデノウイルスベクターは、1つの目的の標的タンパク質に由来する複数のフラグメント又はエピトープをコードする核酸配列を含んでいてもよく、又は多数の異なる目的の標的フラビウイルス抗原タンパク質に由来する1つ以上のフラグメント又はエピトープを含んでいてもよい。
【０１２０】
一部の態様において、核酸配列は複数のフラビウイルス標的抗原をコードする。複数のフラビウイルス標的抗原をコードする核酸配列は、それぞれが1つの標的抗原に対応する複数の遺伝子インサートを含んでいてよく、ここで各遺伝子インサートは、自己切断2Aペプチドをコードする核酸配列により分離されている。一部の態様において、自己切断2Aペプチド(すなわち切断可能リンカー)は、豚テシオウイルス-1若しくはトセア・アシグナウイルスなどに由来する。
【０１２１】
切断可能リンカーの例としては、2Aリンカー(例えば、T2A)、2A様リンカー又はそれらの機能的等価物及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。一部の実施形態において、リンカーとしては、例えば、ピコルナウイルス2A様リンカー、豚テシオウイルスのCHYSEL配列(P2A)、トセア・アシグナウイルス(T2A)又はそれらの組み合わせ、変異体及び機能的等価物などが挙げられる。
【０１２２】
特定の実施形態において、免疫原性フラグメントは、MHCクラスI又はクラスII分子に結合する。本明細書中で使用される免疫原性フラグメントは、結合が、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて検出可能な場合、MHCクラスI又はクラスII分子に「結合する」と言うことができる。例えば、ポリペプチドがMHCクラスIに結合する能力は、125I標識されたβ2-ミクログロブリン(β2m)のMHCクラスl/β2m/ペプチドヘテロ三量体複合体への組み込みを促進する能力をモニターすることにより、間接的に評価することができる(Parker et al., J. Immunol. 752:163, 1994を参照)。あるいは、当技術分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイを用いることができる。ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、一般的に、Paul, Fundamental Immunology, 第3版, 243-247 (Raven Press, 1993) 及びその中で引用されている参考文献にまとめられている技術などの、周知の技術を用いて同定することができる。免疫原性フラグメントを同定するための代表的な技術としては、例えば、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞系若しくはクローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることなどが挙げられる。特定の標的ポリペプチドの免疫原性フラグメントは、(例えば、ELISA及び/又はT細胞反応性アッセイにおいて)このような抗血清及び/又はT細胞と、全長標的ポリペプチドの反応性を実質的に下回らないレベルで反応するフラグメントであり得る。言い換えれば、免疫原性フラグメントは、このようなアッセイにおいて、全長ポリペプチドの反応性と同様の又はこれを上回るレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に当技術分野において通常の技能を有する者に周知の方法、例えば、Harlow及びLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されている方法を用いて実施することができる。
【０１２３】
標的抗原としては、例えば、限定するものではないが、フラビウイルスのいずれかに由来する抗原などが挙げられる。標的抗原としては、例えば、本明細書中に記載される感染性フラビウイルスのいずれかにより産生されるタンパク質、例えばC、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5などが挙げられる。本明細書中で使用される「感染因子」は、宿主に感染することができる任意の種であり得る。感染因子としては、例えば、フラビウイルス属内の任意のウイルスなどが挙げられる。
【０１２４】
アデノウイルスベクターは、標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列も含み得る。これに関して、このようなタンパク質を含有するアデノウイルスベクターを用いた免疫化の後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質に融合した目的の標的抗原を含む融合タンパク質であり得る。
【０１２５】
IV. 組み合わせ療法
特定の実施形態は、感染性疾患の治療及び予防のための組み合わせ免疫療法及びワクチン組成物を提供する。一部の実施形態は、複数標的ワクチン、免疫療法、及び感染性疾患などの複雑な疾患に対する治療応答を高める方法の組み合わせを提供する。組み合わせ療法の各成分は、ジカ感染又は任意のフラビウイルスによる感染の予防のためのワクチン組成物に独立して含めることができる。
【０１２６】
「治療」は、治療上有効用量の本開示のワクチンの対象への投与を指し得る。治療は、医薬組成物において対象に投与することができる。対象は治療時に健康且つ無病であってもよく、この場合、治療を予防的ワクチン接種と呼ぶことができる。対象は治療時に疾患症状に罹患していてもよく、この場合、治療を予防的ワクチン接種と呼ぶことができる。
【０１２７】
「対象」は、任意の動物、例えば、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク)、マウス、豚、ウマ、ロバ、牛、ヒツジ、ラット及び家禽などを指し得る。「対象」は、本明細書中で「個体」又は「患者」と互換的に用いることができる。
【０１２８】
一部の態様において、ベクターは少なくとも1つの抗原を含む。一部の態様において、ベクターは少なくとも2つの抗原を含む。一部の態様において、ワクチン製剤は、1：1の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：2の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：3の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：4の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：5の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：6の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：7の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：8の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：9の比のベクターと抗原を含む。一部の態様において、ワクチンは、1：10の比のベクターと抗原を含む。
【０１２９】
一部の態様において、ワクチンは組み合わせワクチンであり、ここでワクチンは、それぞれが少なくとも単一の抗原を含む少なくとも2つのベクターを含む。
【０１３０】
対象において、異なる抗原の混合物が同時に投与されるか、又は同一の若しくは異なるベクターから発現される場合、これらは互いに競合し得る。結果として、組み合わせ免疫療法又はワクチンにおける異なる濃度及び比の発現抗原を含む製剤を評価し、対象又は対象群に合わせて調整し、投与後に確実に有効且つ持続的な免疫応答が生じるようにすることができる。
【０１３１】
複数の抗原を含む組成物は、様々な比で存在し得る。例えば、2つ以上のベクターを有する製剤は、様々な比を有し得る。例えば、免疫療法又はワクチンは、2つの異なるベクターを、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：30、2：1、2：3、2：4、2：5、2：6、2：7、2：8、3：1、3：3、3：4、3：5、3：6、3：7、3：8、3：1、3：3、3：4、3：5、3：6、3：7、3：8、4：1、4：3、4：5、4：6、4：7、4：8、5：1、5：3、5：4、5：6、5：7、5：8、6：1、6：3、6：4、6：5、6：7、6：8、7：1、7：3、7：4、7：5、7：6、7：8、8：1、8：3、8：4、8：5、8：6、又は8：7の化学量論比で有し得る。
【０１３２】
一部の実施形態において、組換え核酸ベクターの少なくともの1つは、第一の同一性値を含む複製欠損アデノウイルス5ベクターを含む、複製欠損アデノウイルスベクターである。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスベクターは、E2b領域に欠失を含む。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域における欠失をさらに含む。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスベクターは、E1領域、及びE2b領域、E3領域、E4領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１３３】
本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]ワクチンと組み合わせて使用し得る具体的な治療法は、以下にさらに詳細に記載されている。
【０１３４】
A. 共刺激分子
【０１３５】
ジカウイルス抗原を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンの使用に加えて、免疫原性を増加させる共刺激分子を前記ワクチンに組み込むことができる。
【０１３６】
免疫応答の開始は、APCによるナイーブT細胞の活性化のための少なくとも2つのシグナルを必要とする(Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992)；Guinan, et al. Blood 84:3261-82 (1994)；Hellstrom, et al. Cancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996)；Hodge, et al. Cancer Res 39:5800-07 (1999))。抗原特異的第1シグナルは、ペプチド/主要組織適合複合体(MHC)を介してT細胞受容体(TCR)を通じて送達され、T細胞を細胞周期に入れる。第2の(すなわち共刺激性の)シグナルは、サイトカインの産生及び増殖のために送達され得る。
【０１３７】
通常はプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)の表面上に見られる少なくとも3つの別個の分子：B7-1(CD80)、ICAM-1(CD54)、及びLFA-3(ヒトCD58)は、T細胞活性化のために重要な第2のシグナルを提供することができると報告されている(Damle, et al. J Immunol 148:1985-92 (1992)；Guinan, et al. Blood 84: 3261-82 (1994)；Wingren, et al. Crit Rev Immunol 15: 235-53 (1995)；Parra, et al. Scand. J Immunol 38: 508-14 (1993)；Hellstrom, et al. Ann NY Acad Sci 690: 225-30 (1993)；Parra, et al. J Immunol 158: 637-42 (1997)；Sperling, et al. J Immunol 157: 3909-17 (1996)；Dubey, et al. J Immunol 155: 45-57 (1995); Cavallo, et al. Eur J Immunol 25: 1154-62 (1995))。
【０１３８】
例えば、これらの共刺激分子は、別個のT細胞リガンドであり得る。B7-1はCD28分子及びCTLA-4分子と相互作用し、ICAM-1はCD11a/CD18(LFA-1/ベータ-2インテグリン)複合体と相互作用し、LFA-3はCD2(LFA-2)分子と相互作用する。従って、特定の実施形態において、ジカウイルス抗原などの標的抗原をコードする1つ以上の核酸を含む組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンと組み合わせた場合に、特異的標的抗原に向けられた抗ジカ免疫応答をさらに増加/増強する、B7-1、ICAM-1、及びLFA-3をそれぞれ含む組換えアデノウイルスベクターを有することが望ましい場合があり得る。
【０１３９】
V. 免疫学的融合パートナー
本明細書中に記載されるウイルスベクター又は組成物は、ジカウイルス抗原などの標的抗原、又は本開示の任意の標的フラビウイルス抗原の免疫原性を増加させ得るタンパク質、すなわち「免疫学的融合パートナー」をコードする核酸配列をさらに含み得る。これに関して、かかるタンパク質を含むウイルスベクターを用いた免疫化の後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質に融合した目的の標的抗原を含む融合タンパク質であり得る。さらに、ジカウイルス抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、両治療的部分の組み合わせが、ジカウイルス抗原単独をコードするAd5[E1-、E2b-]ベクター、又は免疫学的融合パートナー単独をコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターのいずれか一方を上回る免疫応答を相乗的にブーストするように作用するような、免疫応答のブースティングをもたらし得る。例えば、ジカウイルス抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、抗原特異的エフェクターCD4＋及びCD8＋T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に向けられたNK細胞応答の刺激、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)機構又はこれらの任意の組み合わせを介した感染細胞の殺傷に向けられた好中球又は単球細胞応答の刺激、の相乗的増強をもたらし得る。この相乗的ブーストは、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を大きく改善し得る。特定の実施形態において、ジカウイルス抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む、免疫応答の生成をもたらし得る。別の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、ジカウイルス抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される標的抗原特異的細胞媒介性免疫活性の、約1.5〜20倍、又はそれ以上の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、適切な対照と比較して、本明細書中に記載されるジカウイルス抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを投与された対象における1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20、又はそれ以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０１４０】
さらなる例として、標的エピトープ抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、抗原特異的エフェクターCD4＋及びCD8＋T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に向けられたNK細胞応答の刺激、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)機構又はこれらの任意の組み合わせを介した感染細胞の殺傷に向けられた好中球又は単球細胞応答の刺激、の相乗的増強をもたらし得る。この相乗的ブーストは、それを必要とする対象への投与後に生存転帰を大きく改善し得る。特定の実施形態において、標的エピトープ抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む、免疫応答の生成をもたらし得る。別の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、標的エピトープ抗原及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される標的抗原特異的細胞媒介性免疫活性の、約1.5〜20倍又はそれ以上の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、適切な対照と比較して、本明細書中に記載されるアデノウイルスベクターを投与された対象における1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０１４１】
一実施形態において、このような免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリウム(Mycobacterium)種に由来する(例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)-由来のRa12フラグメント)。マイコバクテリウム種に由来する免疫学的融合パートナーは、配列番号38〜配列番号46及び配列番号109〜配列番号114に示される配列のいずれか1つであり得る。これらのマイコバクテリウム(Mycobacterium)種由来のRa12配列を構築するために使用し得るオリゴヌクレオチド、Met-Hisタグ、及びエンテロキナーゼ認識部位は、配列番号115〜配列番号122のいずれか1つに示されており、表2にも示されている。Ra12組成物、並びに異種ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列の発現及び/又は免疫原性の増強におけるそれらの使用方法は、米国特許第7,009,042号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。手短に言えば、Ra12は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)MTB32A核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域を指す。MTB32Aは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの病原性株及び非病原性株中の遺伝子によりコードされる32kDaのセリンプロテアーゼである。MTB32Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が報告されている(例えば、米国特許第7,009,042号；Skeiky et al., Infection and Immun. 67：3998-4007(1999)を参照、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる)。MTB32Aコーディング配列のC末端フラグメントは、高レベルで発現させることが可能であり、精製工程全体を通して可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ra12は、それが融合している異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強することができる。Ra12融合ポリペプチドは、MTB32Aのアミノ酸残基192〜323に対応する14kDaのC末端フラグメントを含み得る。他のRa12ポリヌクレオチドは、一般的に、Ra12ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約15個、30個、60個、100個、200個、300個又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。Ra12ポリヌクレオチドは、天然配列(すなわちRa12ポリペプチド又はそれらの一部をコードする内在性配列)を含んでいてもよく、又はかかる配列の変異体を含んでいてもよい。Ra12ポリヌクレオチド変異体は、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活性が天然Ra12ポリペプチドを含む融合ポリペプチドに対して実質的に減少しないような、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含み得る。変異体は、天然Ra12ポリペプチド又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約70％、80％、又は90％以上の同一性を有し得る。
【０１４２】
特定の態様において、免疫学的融合パートナーは、タンパク質D(グラム陰性細菌であるb型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae B)の表面タンパク質)に由来し得る。タンパク質Dに由来する免疫学的融合パートナーは、配列番号47に示される配列であり得る。一部の場合において、タンパク質D誘導体は、タンパク質の約3分の1(例えば、N末端の最初の100〜110アミノ酸)を含む。タンパク質D誘導体は、脂質付加されていてよい。特定の実施形態の範囲内で、リポタンパク質D融合パートナーの最初の109残基はN末端側に含まれて付加的な外因性T細胞エピトープを有するポリペプチドを提供し、これが大腸菌中で発現レベルを増加させ、発現エンハンサーとして機能し得る。この脂質尾は、抗原提示細胞に対する抗原の最適な提示を確実にし得る。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、NS1(ヘマグルチニン)などが挙げられる。典型的には、N末端の81アミノ酸が用いられるが、T-ヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントを使用することができる。
【０１４３】
特定の態様において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして知られるタンパク質、又はその一部(特にC末端部分)であり得る。LYTAに由来する免疫学的融合パートナーは、配列番号48に示される配列であり得る。LYTAは、アミダーゼLYTAとして知られるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼ(Lyt遺伝子によりコードされる)を合成する肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素(オートリシン)である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリンに対する、又はDEAEなどの一部のコリン類似体に対する親和性に関与している。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌C-LYTA発現プラスミドの開発に利用することができる。アミノ末端にC-LYTAフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製を利用することができる。別の実施形態の範囲内において、LYTAの反復部分を融合ポリペプチドに組み込むことができる。反復部分は、例えば、残基178において開始するC末端領域中に見出すことができる。1つの特定の反復部分は、残基188〜305を組み込む。
【０１４４】
一部の実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む免疫学的融合パートナー(本明細書中で「免疫原性成分」とも呼ばれる)に融合している。標的抗原融合物は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの1つ以上に対して実質的な同一性を有するタンパク質を産生し得る。標的抗原融合物は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの1つ以上に対して実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸をコードし得る。一部の実施形態において、標的抗原融合物は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む1つ以上の免疫学的融合パートナー(本明細書中で「免疫原性成分」とも呼ばれる)をさらに含む。IFN-γの配列は、限定されるものではないが、配列番号49に示される配列であり得る。TNFαの配列は、限定されるものではないが、配列番号50に示される配列であり得る。IL-2の配列は、限定されるものではないが、配列番号51に示される配列であり得る。IL-8の配列は、限定されるものではないが、配列番号52に示される配列であり得る。IL-12の配列は、限定されるものではないが、配列番号53に示される配列であり得る。IL-18の配列は、限定されるものではないが、配列番号54に示される配列であり得る。IL-7の配列は、限定されるものではないが、配列番号55に示される配列であり得る。IL-3の配列は、限定されるものではないが、配列番号56に示される配列であり得る。IL-4の配列は、限定されるものではないが、配列番号57に示される配列であり得る。IL-5の配列は、限定されるものではないが、配列番号58に示される配列であり得る。IL-6の配列は、限定されるものではないが、配列番号59に示される配列であり得る。IL-9の配列は、限定されるものではないが、配列番号60に示される配列であり得る。IL-10の配列は、限定されるものではないが、配列番号61に示される配列であり得る。IL-13の配列は、限定されるものではないが、配列番号62に示される配列であり得る。IL-15の配列は、限定されるものではないが、配列番号63に示される配列であり得る。IL-16の配列は、限定されるものではないが、配列番号90に示される配列であり得る。IL-17の配列は、限定されるものではないが、配列番号91に示される配列であり得る。IL-23の配列は、限定されるものではないが、配列番号92に示される配列であり得る。IL-32の配列は、限定されるものではないが、配列番号93に示される配列であり得る。
【０１４５】
一部の実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む免疫学的融合パートナー(本明細書中「免疫原性成分」とも呼ばれる)に融合又は結合している。一部の実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF(CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α,β,λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む免疫学的融合パートナー(本明細書中「免疫原性成分」とも呼ばれる)と、細胞中で共発現している。
【０１４６】
一部の実施形態において、標的抗原は、CpG ODN(例えば、クラスA、B、又はCのCpG ODN；非限定的な例となる配列は配列番号124〜配列番号135に示されており、ここでホスホジエステル塩基は大文字で、ホスホロチオエート塩基は小文字で、パリンドロームは下線付きで示され、コロンは反射点を示す)、コレラ毒素(非限定的な例となる配列は、配列番号65に示される)、細菌ADPリボシル化外毒素に由来する切断Aサブユニットコーディング領域(非限定的な例となる配列は、配列番号66に示される)、細菌ADPリボシル化外毒素に由来する切断Bサブユニットコーディング領域(非限定的な例となる配列は、配列番号67に示される)、Hp91(非限定的な例となる配列は、配列番号68に示される)、CCL20(非限定的な例となる配列は、配列番号69及び配列番号123に示される)、CCL3(非限定的な例となる配列は、配列番号70に示される)、GM-CSF(非限定的な例となる配列は、配列番号71に示される)、G-CSF(非限定的な例となる配列は、配列番号72に示される)、LPSペプチド模倣物(非限定的な例となる配列は、配列番号73〜配列番号84に示される)、志賀毒素(非限定的な例となる配列は、配列番号85に示される)、ジフテリア毒素(非限定的な例となる配列は、配列番号86に示される)、又はCRM197(非限定的な例となる配列は、配列番号89に示される)を含む、免疫学的融合パートナーに融合又は結合している。
【０１４７】
一部の実施形態において、標的抗原は、IL-15スーパーアゴニストを含む免疫学的融合パートナーに融合又は結合している。インターロイキン15(IL-15)は、ウイルス感染後に分泌される天然の炎症性サイトカインである。分泌されたIL-15は、エフェクター免疫細胞上のその同族受容体を介してシグナル伝達することによりその機能を実施することが可能であり、このようにして、エフェクター免疫細胞活性の全体的な増強をもたらし得る。
【０１４８】
細胞性免疫応答を刺激して維持するというIL-15の広範な能力に基づいて、IL-15は有望な免疫治療薬であると考えられている。しかし、IL-15の臨床開発における主な制限として、例えば、標準的な哺乳動物細胞発現系における低い生産収率及び短い血清半減期などが挙げられる。さらに、同一細胞により共発現されるタンパク質を含むIL-15：IL-15Rα複合体の方が、フリーのIL-15サイトカインよりもむしろ、L-15βγc受容体を有する免疫エフェクター細胞の刺激に関与し得る。
【０１４９】
これらの欠点に対応するため、IL-15Rβγcに結合する能力が増加し且つ生物学的活性が増強された、新規なIL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)が同定された。マウス又はヒトのいずれかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を、等モル濃度のIL-15N72Dへ添加すると、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、フリーのIL-15サイトカインより10倍超低いIL-15-依存性細胞増殖を支持する半有効濃度(EC50)を示すような、IL-15生物学的活性のさらなる増加を提供し得る。
【０１５０】
一部の実施形態において、IL-15スーパーアゴニストは、新規なIL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)であり得る。特定の実施形態において、マウス又はヒトのいずれかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)の、等モル濃度のIL-15N72Dへの添加は、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、フリーのIL-15サイトカインより10倍超低い場合があり得るIL-15-依存性細胞増殖を支持する半有効濃度(EC50)を示すような、IL-15生物学的活性のさらなる増加を提供し得る。
【０１５１】
従って、一部の実施形態において、本開示は、フリーのIL-15サイトカインのIL-15依存性細胞増殖を支持するEC50より、2倍超低い、3倍超低い、4倍超低い、5倍超低い、6倍超低い、7倍超低い、8倍超低い、9倍超低い、10倍超低い、15倍超低い、20倍超低い、25倍超低い、30倍超低い、35倍超低い、40倍超低い、45倍超低い、50倍超低い、55倍超低い、60倍超低い、65倍超低い、70倍超低い、75倍超低い、80倍超低い、85倍超低い、90倍超低い、95倍超低い、又は100倍超低い、IL-15依存性細胞増殖を支持するEC50を有するIL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体を提供する。
【０１５２】
一部の実施形態において、IL-15スーパーアゴニストは、2つのIL-15N72D分子と二量体の可溶性IL-15Rα/Fc融合タンパク質との生物学的に活性なタンパク質複合体であり、ALT-803としても知られている。ALT-803の組成物及びALT-803を製造及び使用する方法は、米国特許出願公開2015/0374790に記載されており、この文献は参照により本明細書中に組み込まれる。N末端にいわゆる「スシ」ドメイン(Su)を含む可溶性IL-15Rαフラグメントは、高親和性サイトカイン結合に関与する構造エレメントの大部分を有することが知られている。可溶性融合タンパク質は、ヒトIL-15RαSuドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を、Fcドメインを含むヒトIgG1 CH2-CH3領域 (232 アミノ酸)と結合させることにより生成することができる。このIL-15RαSu/IgG1 Fc融合タンパク質は、IgG1ドメインを介したジスルフィド結合による二量体形成及び標準的なタンパク質Aアフィニティークロマトグラフィー法を用いた精製の容易性という利点を有し得る。
【０１５３】
一部の実施形態において、ALT-803は、二量体のIL-15Rαスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質に対する高い親和性を伴うヒトIL-15変異体の2つのタンパク質サブユニットからなる可溶性複合体を有し得る。IL-15変異体は、へリックスCの72位にアスパラギン(Asn)からアスパラギン酸(Asp)への置換(N72D)を有する成熟ヒトIL-15サイトカイン配列を含む114アミノ酸のポリペプチドである。ヒトIL-15Rスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質は、Fcドメインを含むヒトIgG1 CH2-CH3領域(232アミノ酸)と結合したIL-15Rサブユニットのスシドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を含む。N72D置換を除いて、全てのタンパク質配列はヒト配列である。サブユニットのアミノ酸配列に基づくと、2つのIL-15N72Dポリペプチド(例となるIL-15N72D配列は、配列番号87に示される)及びジスルフィド結合したホモ二量体のIL-l5RαSu/IgG1 Fcタンパク質(例となるIL-15RαSu/Fcドメインは、配列番号88に示される)を含む複合体の計算分子量は92.4kDaである。一部の実施形態において、標的抗原及びALT-803をコードする組換えベクターは、標的抗原をコードするための本明細書中に記載される任意の配列を有し得、さらにALT-803をコードする配列番号87、配列番号87、配列番号88、及び配列番号88を任意の順序で有し得る。
【０１５４】
各IL-15N720ポリペプチドは約12.8kDaの計算分子量を有し得、IL-15RαSu/IgG 1 Fc融合タンパク質は、約33.4kDaの計算分子量を有し得る。IL-15N72D及びIL-15RαSu/IgG 1 Fcタンパク質はいずれもグリコシル化されていてよく、サイズ排除クロマトグラフィーにより、ALT-803の見かけの分子量約114kDaを生じる。ALT-803について決定された等電点(pI)は、約5.6〜6.5の範囲であり得る。従って融合タンパク質は、pH7では負に荷電し得る。
【０１５５】
ジカウイルス抗原及びALT-803をコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、両治療的部分の組み合わせが、いずれかの治療法単独を上回る免疫応答を相乗的にブーストするように作用するような、免疫応答のブースティングをもたらし得る。例えば、ジカウイルス抗原及びALT-803をコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、抗原特異的エフェクターCD4＋及びCD8＋T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に向けられたNK細胞応答の刺激、抗体依存性細胞媒介細胞毒性(ADCC)、又は抗体依存性細胞貪食(ADCP)機構を介した感染細胞の殺傷に向けられた好中球又は単球細胞応答の刺激、の相乗的増強をもたらし得る。ジカウイルス抗原及びALT-803をコードするAd5[E1-、E2b-]ベクターを用いた組み合わせ療法は、上記の応答のいずれか1つ、又は上記の応答の組み合わせを相乗的にブーストし、それを必要とする対象への投与後に、生存転帰を大きく改善することができる。
【０１５６】
本明細書中に記載される免疫原性増強剤のいずれかは、本明細書中に記載される任意の組換えベクターを用いて、免疫原性増強剤と標的抗原とを同じ組換えベクター中で発現させることにより、標的抗原に融合又は結合させることができる。
【０１５７】
かかる免疫原性増強剤をコードする核酸配列は、表1にまとめられている、配列番号38〜配列番号63、配列番号65〜配列番号93及び配列番号109〜配列番号135のいずれか1つをコードする核酸配列を含み得る。
【０１５８】
【表１】
2019521143.tif 000003
2019521143.tif 000004
2019521143.tif 000005
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【０１５９】
【表２】
2019521143.tif 000019
【０１６０】
一部の実施形態において、標的抗原及び免疫学的融合パートナーについての核酸配列は、任意の核酸により分離されていない。他の実施形態において、リンカーをコードする核酸配列を、本明細書中に記載される任意の標的抗原をコードする核酸配列と、本明細書中に記載される任意の免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列との間に挿入することができる。従って、特定の実施形態において、標的抗原、リンカー、及び免疫学的融合パートナーを含むウイルスベクターを用いた免疫化の後に産生されるタンパク質は、目的の標的抗原、その後に続くリンカーを含み、免疫学的融合パートナーで終了する融合タンパク質であり得、このようにして、標的抗原を、目的の標的抗原の免疫原性を増加させる免疫学的融合パートナーに、リンカーを介して結合させる。一部の実施形態において、リンカー核酸の配列は、長さ約1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長であり得る。一部の実施形態において、核酸配列は、1つ以上のアミノ酸残基をコードし得る。一部の実施形態において、リンカーのアミノ酸配列は、長さ約1〜約50アミノ酸残基、又は約5〜約25アミノ酸残基であり得る。一部の実施形態において、リンカーの配列は、10個未満のアミノ酸を含む。一部の実施形態において、リンカーは、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、又はアラニン及びグリシンの両方を有するリンカーであり得る。
【０１６１】
かかるリンカーをコードする核酸配列は、配列番号94〜配列番号108のいずれか1つであり得、表3にまとめられる。
【０１６２】
【表３】
2019521143.tif 000020
【０１６３】
VI.  使用方法
本アデノウイルスベクターは、本明細書中に記載される1つ以上の標的抗原に対する免疫応答を生成するための多数のワクチン設定において使用することができる。本アデノウイルスベクターは、Adに対する既存免疫を有する対象において免疫応答を生成するためにそれらを使用することが可能であり、またアデノウイルスベクターを用いる複数ラウンドの免疫化を含むワクチン接種レジメン(前世代のアデノウイルスベクターを用いて可能でなかったレジメン)において使用し得るという予想外の発見により、特に重要である。
【０１６４】
一般的に、免疫応答の生成は、体液性応答及び/又は細胞媒介性応答の誘導を含み得る。特定の実施形態において、目的の標的抗原に対する免疫応答を増加させることが望ましい。従って、「免疫応答を生成する」又は「免疫応答を誘導する」は、任意の統計的に有意な変化、例えば、1種以上の免疫細胞(T細胞、B細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球など)の数の増加、又は1種以上のこれらの免疫細胞の活性(CTL活性、HTL活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌のプロファイルの変化等)の増加を含み得る。
【０１６５】
当業者であれば、免疫応答の変化が生じたか否かを確立するための多くの方法が利用可能であることを容易に認識し得る。免疫応答における変化(例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性)を検出するための様々な方法が当技術分野において知られており、本発明の文脈において有用である。例示的な方法は、Current Protocols in Immunology, John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober(編) (2001 John Wiley & Sons, NY, NY) Ausubel et al. (2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)；Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)；Maniatis et al. (1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)及びその他の箇所に記載されている。この文脈において有用な例示的方法としては、細胞内サイトカイン染色法(ICS)、ELISpot法、増殖アッセイ法、クロミウム放出を含む細胞毒性T細胞アッセイ又は同等のアッセイ、及び任意の数のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はRT-PCRベースのアッセイを用いる遺伝子発現分析などが挙げられる。
【０１６６】
特定の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20倍以上、少なくとも、約、又は最大1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19(又はそれらから導出される任意の範囲又は数字)倍の、標的抗原特異的CTL活性の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、約1.5〜20倍、又はそれ以上の、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、グランザイム又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される標的抗原特異的細胞媒介性免疫活性の増加を含む。
【０１６７】
さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、適切な対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象における約1.5〜20倍、又はそれ以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０１６８】
従って、特定の態様は、目的のフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、a) E2b領域に欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、及びb) 標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを個体に投与すること、及び上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与し、これにより標的抗原に対する免疫応答を生成することを含む、上記方法を提供することができる。特定の実施形態において、投与されるベクターがguttedベクターではない方法が提供され得る。
【０１６９】
さらなる実施形態において、a) E2b領域に欠失を有する複製欠損アデノウイルスベクター、及びb) 標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを個体に投与し；上記アデノウイルスベクターを少なくとも1回上記個体に再投与し、これによりフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成することにより、Adに対する既存免疫を有する個体においてフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法を提供することができる。
【０１７０】
Adに対する既存免疫に関しては、Ad抗体の存在について試験するための抗体ベースのアッセイなどの当技術分野で公知の方法を用いてこれを決定することができる。さらに、特定の実施形態において、上記方法は、最初に個体がAdに対する既存免疫を有することを決定し、その後本明細書中に記載されるE2b欠失アデノウイルスベクターを投与することを含み得る。
【０１７１】
特定の態様において、本明細書中の他の箇所に記載されているような、フラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法が提供され得る。
【０１７２】
特定の態様において、本明細書中の他の箇所に記載されているような、フラビウイルスに対する免疫応答を生成する方法が提供され得る。
【０１７３】
本明細書中の他の箇所で述べられているとおり、アデノウイルスベクターは、それに対する免疫応答が生成される任意の1つ以上の感染因子に由来する1つ以上の目的の標的抗原をコードする核酸配列を含み得る。例えば、標的抗原としては、限定するものではないが、C、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5などのウイルス抗原タンパク質が挙げられる。
【０１７４】
投与のために、アデノウイルスベクターストックを、適切なバッファー、生理学的に許容可能な担体、賦形剤等と組み合わせることができる。特定の実施形態において、適切な数のアデノウイルスベクター粒子が、滅菌PBSなどの適切なバッファー中で投与される。
【０１７５】
特定の状況において、本明細書に開示されるアデノウイルスベクター組成物を、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、又はさらに腹腔内に送達することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中で調製することができる。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。他の実施形態において、E2b欠失アデノウイルスベクターは丸薬形態で、嚥下により又は坐剤により送達することができる。
【０１７６】
注射可能用途に適した例示的な医薬品形態としては、滅菌水溶液又は分散液及び、滅菌注射可能溶液又は分散液の即席調製のための滅菌粉末剤(例えば米国特許5,466,468号を参照)などが挙げられる。全ての場合において、上記の形態は無菌でなければならず、また注射針通過容易性が存在する程度に流動性でなければならない。医薬形態は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌、かび及び真菌などの微生物の夾雑作用に対抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、及び/又は植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には所要の粒径の維持により、及び/又は界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより容易に行うことができる。多くの場合、医薬品形態は、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含み得る。注射可能組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によりもたらされ得る。
【０１７７】
一実施形態において、水溶液中での非経口投与については、溶液は必要であれば適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張化されるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に特に好適であり得る。これに関連して、利用し得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知であろう。例えば、1回投与量を1mLの等張NaCl溶液に溶解させてから、1000mLの皮下注入液に添加するか又は点滴の提案部位に注射することができる(例えば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 第15版, 1035-1038頁及び1570-1580頁を参照)。投与量の幾らかの変動は、治療対象の対象の症状に応じて必然的に生じ得る。さらに、ヒト投与について、調製物は、生物学標準のFDA事務局によって要求される滅菌性、発熱性、及び一般的安全性及び純度標準を満たす必要性があり得る。
【０１７８】
担体は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。このような媒体及び薬剤の、医薬用活性物質への使用は当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と不適合である限りを除き、治療用組成物におけるその使用が想定される。補足的な活性成分も、組成物中に組み込むことができる。「製薬上許容可能な」という表現は、ヒトに投与された場合にアレルギー性又は類似の有害な反応を生じ得ない分子実体及び組成物を指し得る。
【０１７９】
本明細書中に記載される治療用組成物の投与の経路及び頻度、並びに投与量は、個体間及び疾患間で変動する可能性があり、標準的な技術を用いて容易に確立することができる。一般的に、医薬組成物及びワクチンは、注射により(例えば、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、又は皮下注射)、鼻腔内に(例えば吸引により)、丸薬形態で(例えば、嚥下、膣内送達又は直腸送達用の坐剤)投与することができる。特定の実施形態において、1〜3回用量を6週間の期間をかけて投与することが可能であり、その後定期的にさらなるブースターワクチン接種を与えることができる。
【０１８０】
様々な実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、このような免疫応答を生じさせるのに適した用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x108ウイルス粒子〜約5x1013ウイルス粒子の用量で投与される。一部の場合、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x109〜約5x1012ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x108ウイルス粒子〜約5x108ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約5x108ウイルス粒子〜約1x109ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x109ウイルス粒子〜約5x109ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約5x109ウイルス粒子〜約1x1010ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1010ウイルス粒子〜約5x1010ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約5x1010ウイルス粒子〜約1x1011ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1011ウイルス粒子〜約5x1011ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約5x1011ウイルス粒子〜約1x1012ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1012ウイルス粒子〜約5x1012ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約5x1012ウイルス粒子〜約1x1013ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1013ウイルス粒子〜約5x1013ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x108ウイルス粒子〜約5x1010ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1010ウイルス粒子〜約5x1012ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1011ウイルス粒子〜約5x1013ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x108ウイルス粒子〜約1x1010ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1010ウイルス粒子〜約1x1012ウイルス粒子の用量で投与される。一部の実施形態において、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり約1x1011ウイルス粒子〜約5x1013ウイルス粒子の用量で投与される。一部の場合、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012以上、又はそれを超えるウイルス粒子(VP)の用量で投与される。一部の場合、複製欠損アデノウイルスは、1回の免疫化当たり1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012以下、又はそれを超えるウイルス粒子の用量で投与される。様々な実施形態において、本明細書中に記載される所望の用量は、好適な体積(例えば約0.1〜10ml、0.2〜8mL、0.3〜7mL、0.4〜6ml、0.5〜5ml、0.6〜4ml、0.7〜3ml、0.8〜2ml、0.9〜1.5ml、0.95〜1.2ml、又は1.0〜1.1mLの体積)の製剤バッファー中で投与される。当業者は、この体積が、これらの値のいずれかにより境界づけられる任意の範囲内(例えば、約0.5mL〜約1.1mL)に入り得ることを認識する。
【０１８１】
好適な用量は、上記のように投与される場合、本明細書中の他の箇所に記載される標的抗原免疫応答を促進することができるアデノウイルスベクターの量であり得る。特定の実施形態において、免疫応答は、基底(すなわち未治療)レベルを少なくとも10〜50％上回る。このような応答は、患者における標的抗原抗体を測定することにより、又はin vitroでフラビウイルス感染細胞を殺傷することができる細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成により、あるいは免疫応答をモニターするための当技術分野で公知の他の方法によってモニターすることができる。
【０１８２】
一般的には、適切な投与量及び治療レジメンは、予防的利益を提供するのに十分な量でアデノウイルスベクターを提供することができる。防御免疫応答は、一般的に、免疫化(ワクチン接種)の前及び後に患者から得られるサンプルを用いて実施し得る標準的な増殖アッセイ、細胞毒性アッセイ又はサイトカインアッセイを用いて評価することができる。
【０１８３】
1つの利点は、特にAdに対する既存免疫を有する個体において、同じアデノウイルスベクターを用いる複数回ワクチン接種を投与する可能性であり得るが、アデノウイルスワクチンをプライムブーストレジメンの一部として投与することも可能である。混合様式のプライミング及びブースター接種スキームは、免疫応答の増強をもたらし得る。
【０１８４】
従って、一態様は、目的の標的抗原を含むプラスミドベクターなどのプラスミドワクチンを用いて、プラスミドワクチンを少なくとも1回投与することにより対象をプライミングし、所定の長さの時間を経過させ、その後アデノウイルスベクターを投与することによりブースティングする方法である。複数回のプライミング(例えば1〜3回)を用いることができるが、さらに多く用いてもよい。プライミングとブーストの間の時間の長さは約6ヶ月〜1年で変動し得るが、他の時間枠を用いてもよい。
【０１８５】
キット
本明細書中に記載される組成物、免疫療法、又はワクチンは、キットの形態で供給することができる。本開示のキットは、治療レジメン情報を含む投与量及び/又は投与に関する使用説明書をさらに含み得る。
【０１８６】
一部の実施形態において、キットは、記載される免疫療法又はワクチンを提供するための組成物および方法を含む。一部の実施形態において、キットは、キットの構成成分の投与に有用な成分、及び成分の調製法に関する使用説明書をさらに含み得る。一部の実施形態において、キットは、適切な実験室試験による治療の前及び後に患者のモニタリングを行うため、又は結果及び患者データについて医療スタッフと連絡をとるためのソフトウェアをさらに含み得る。
【０１８７】
キットの成分は、乾燥形態又は液体形態であり得る。キットは、これらが乾燥形態である場合、このキットは、乾燥材料を可溶化するための溶液を含み得る。キットは、液体形態又は乾燥形態のトランスファーファクターも含み得る。一部の実施形態において、トランスファーファクターが乾燥形態である場合、キットは、トランスファーファクターを可溶化するための溶液を含む。キットは、成分を混合及び調製するための容器も含み得る。キットは、投与を補助する器具、例えば、針、チューブ類、アプリケーター、吸入剤、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼ドロッパー、又は任意のこのような医療上認可された送達ビヒクルなども含み得る。本明細書中に記載されるキット又は薬物送達系は、本開示の組成物を市販及び流通のための閉鎖限局中に収容するための手段も含み得る。
【０１８８】
上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書中で言及される及び/又は出願データシートにリストされる全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許公開は、その全体が、それぞれ個々の公開、特許、又は特許出願が具体的且つ個別に示されて参照により組み込まれるかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。
【０１８９】
実施形態の態様は修正することが可能であり、必要であれば様々な特許、出願及び公開のコンセプトを利用してなおさらなる実施形態を提供することができる。
【０１９０】
上記の詳細な説明を考慮して、これらの及び他の変更を実施形態に加えることができる。一般的には、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲中に開示される具体的な実施形態に限定するものと解されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲に沿った全ての可能な実施形態を包含すると解されるべきである。従って、特許請求の範囲は本開示により限定されるものではない。
【実施例】
【０１９１】
以下の実施例は、本開示の一部の態様をさらに説明するために包含され、本開示の範囲を限定するために用いられるべきではない。
【０１９２】
実施例1
単一標的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンの製造
この実施例は、ジカウイルスE(「エンベロープ」又は「E」とも呼ばれる)抗原を含む単一標的Ad5[E1-、E2b-]ベクターの構築を示す。
【０１９３】
この実施例に従って用いられるAd5-ZIKAV-Eワクチンは、E1、E2b、E3遺伝子領域の除去又はこれらの任意の組み合わせ(例えば、Ad5[E1-、E2b-])、及び本明細書中で開示されている任意のジカウイルスE抗原(例えば、配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37のいずれか1つ)の挿入により改変されているアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。
【０１９４】
配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19に示されるアミノ酸配列を有するジカウイルスE抗原をコードするヌクレオチド配列を、複数のAd5[E1-、E2b-]-ベースのプラットフォームにクローン化し、それぞれが配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、及び配列番号19の1つを含む、個別の単一標的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンを製造する。別のジカウイルスEワクチンを、配列番号20のヌクレオチド969〜1274を有するヌクレオチド配列(すなわち、メキシコから得られたジカウイルス分離株のエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列)を用いて作製する。異なるジカウイルスEワクチンを、配列番号21のヌクレオチド977〜2491を有するヌクレオチド配列(すなわち、ハイチから得られたジカウイルス株のエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列)を用いて作製する。配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37のいずれか1つを、複数のAd5[E1-、E2b-]-ベースのプラットフォームにクローン化し、それぞれが配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37の1つを含む個別の単一標的Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンを製造する。
【０１９５】
マウスにおける前臨床的免疫原性研究のため、Ad5[E1-、E2b-ZIKAV-Eワクチンを、配列番号26に示されるジカウイルス野生型E遺伝子インサートを用いて構築した(Zika 2014 wt E遺伝子インサート核酸配列(開始コドンで開始し、停止コドンで終了する)。その後、図1に模式的に示されるとおり、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-EワクチンがE.C7細胞中で製造される。複製欠損ウイルスをE.C7パッケージ細胞系中で増殖させ、CsCl2精製又はイオン交換カラム精製し、力価測定する。ウイルス感染力価を、E.C7細胞単層上のプラーク形成単位(PFU)として決定する。ウイルス粒子(VP)濃度を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)破壊並びに260nm及び280nmにおける分光光度法により決定する。
【０１９６】
実施例2
複数のフラビウイルス抗原を含む複数標的Ad5[E1-、E2b-]構築物の調製
この実施例は、複数のフラビウイルス抗原、例えば本明細書中に開示されるジカウイルス抗原の任意の組み合わせ(例えば、配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37の任意の組み合わせ)を含む複数標的Ad5[E1-、E2b-]ベクターの調製を示す。
【０１９７】
この実施例に従って用いられるAd5-ZIKAV-Eワクチンは、E1、E2b、E3遺伝子領域の除去、又はこれらの任意の組み合わせ(例えば、Ad5[E1-、E2b-])、及びフラビウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列の挿入により改変されるアデノウイルス血清型5(Ad5)ベクターである。
【０１９８】
複数のフラビウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列を含むAd5[E1-、E2b-]ベクターが製造される。個々のフラビウイルス抗原遺伝子配列、例えば、カプシドタンパク質、膜タンパク質及びエンベロープタンパク質(E)をコードするフラビウイルス遺伝子配列を有する三重遺伝子インサート、並びにカプシドタンパク質、膜タンパク質及びエンベロープタンパク質(E)、及び非構造タンパク質(NS)をコードするフラビウイルス遺伝子配列を有する四重遺伝子インサートなどは、それぞれ豚テシオウイルス-1及びトセア・アシグナウイルスに由来する「自己切断」2Aペプチドにより分離されている(図2A及び図3A)(de Felipe P及びRyan M, Traffic 2004 5(8), 616-26；Holst J et al. Nature Immunol. 2008 9:658-66；Kim JH et al. PloS One, 2011 6(4), e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556)。2Aペプチドがリボソーム上で翻訳される際、2Aペプチドの最後の2つの残基間のペプチド結合は形成されず、これにより1回のリボソーム通過で別箇に発現されるタンパク質を生じさせる(図2B及び図3B)。3つの遺伝子を分離している2つの2Aペプチド配列の使用は、3つのタンパク質の近化学量論的発現をもたらす(図2B及び図3B)。
【０１９９】
実施例3
Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eの複数回注射は、ジカE抗原に対する免疫応答を生成する
この実施例は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンの注射が、ジカE抗原に対する免疫応答を誘導したことを示す。5匹のマウスの群を、1010VPのAd5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eの用量を用いて、それぞれ2週間間隔で2回皮下免疫化した(試験群マウスG4M1-5、白色のバー)。対照マウスに、1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター無配列対照)を注射した(対照群マウスG1M1-5、黒色の斜線バー)。2回目の免疫化の1週間後にマウスを屠殺し、ジカE抗原に対する誘導免疫応答決定のため、それらの脾臓及び血清を回収した。図4A〜4Cに示されるとおり、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eを用いた免疫化(ワクチン接種)により、細胞媒介性免疫(CMI)応答及び抗体(Ab)応答が生成された。
【０２００】
実施例4
マウスにおけるAd5[E1-、E2b-]-ZIKAV-Eワクチンの前臨床研究
この実施例は、細胞媒介性免疫(CMI)応答、細胞溶解性Tリンパ球(CTL)応答、細胞内サイトカイン発現、抗体分泌、及び体重/体温変化の評価を含む、マウスにおけるAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンの前臨床研究を示す。前臨床研究は、マウスにおける、幾つかの異なるZika抗原変異体を含むAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンの投与、対照との比較、及び免疫応答の評価を包含していた。
【０２０１】
Ad5[E1-、E2b-]-Zika変異体(mut)2015、Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2014、Ad5[E1-、E2b-]-Zika変異体(mut)2014ワクチンの前臨床評価
全てのAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、実施例1に記載されるZikaインサートを用いたワクチンの製造を含んでいた。
【０２０２】
CMI及びCTL応答。マウスにおけるCMI及びCTL応答を、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイにより評価した。図6は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いて免疫したマウス由来の脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答及び細胞溶解性Tリンパ球(CTL)応答を示す。マウス(C57BL/6株)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンの又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。3種類のZikaワクチンを試験した。試験した第1のZikaワクチンは、配列番号34のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号35のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号34はヌクレオチド配列であり、配列番号35は配列番号34に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2015であった。配列番号35のZika mut 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2015抗原は、Zika wt 2015抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号26のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号27のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号26はヌクレオチド配列であり、配列番号27は配列番号26に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2014であった。配列番号２７のZika wt 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第3のZikaワクチンは、配列番号28のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号29のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号28はヌクレオチド配列であり、配列番号29は配列番号28に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2014であった。配列番号29のZika mut 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2014抗原は、Zika wt 2014抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。最終免疫化の一週間後、各マウスから単離した脾細胞をジカwtウイルスペプチドプールに曝露し、ELISpotアッセイを用いて、CMI応答(IFN-γ及びIL-2分泌スポット形成細胞(SFC))及びCTL応答(グランザイム-B分泌SFC)を測定した。応答の特異性は、SIV-nefペプチドプール(陰性対照)に対する脾細胞の反応性の欠如及びコンカナバリンA(Con A)(陽性対照)に対する脾細胞の反応性により示された。エラーバーは標準誤差(SEM)を示し、各群には5匹のマウスが含まれていた。図6Aは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のIFN-γ CMI応答を示す。対照マウスと比較して、より多数のSFCが免疫化マウスにおいて誘導された。図6Bは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のIL-2 CMI応答を示す。対照マウスと比較して、より多数のSFCが免疫化マウスにおいて誘導された。図6Cは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のグランザイムB CTL応答を示す。対照マウスと比較して、より多数のSFCが免疫化マウスにおいて誘導された。
【０２０３】
細胞内サイトカイン発現。フローサイトメトリー分析は、細胞内サイトカイン発現を評価することにより測定されるリンパ球活性化のレベルを明らかにした。図7は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いて免疫したマウス由来の脾細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。マウス(C57BL/6株)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。3種類のZikaワクチンを試験した。試験した第1のZikaワクチンは、配列番号34のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号35のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号34はヌクレオチド配列であり、配列番号35は配列番号34に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2015であった。配列番号35のZika mut 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2015抗原は、Zika wt 2015抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号26のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号27のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号26はヌクレオチド配列であり、配列番号27は配列番号26に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2014であった。配列番号27のZika wt 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第3のZikaワクチンであり、ここに示されるのは、配列番号28のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号29のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号28はヌクレオチド配列であり、配列番号29は配列番号28に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2014である。配列番号29のZika mut 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2014抗原は、Zika wt 2014抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。最終免疫化の一週間後、免疫化マウスから単離した脾細胞をジカwtウイルスペプチドプールに曝露し、フローサイトメトリーを使用して、CD8＋細胞及びCD4＋細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内サイトカイン産生を測定した。応答の特異性は、SIV-nefペプチドプール(陰性対照)に対する脾細胞の反応性の欠如及びPMA/イオノマイシン(陽性対照)に対する脾細胞の反応性により示された。データは、IFN-γ又はIFN-γ及びTNF-αを発現しているCD8＋又はCD4＋脾細胞のパーセントとして報告され、エラーバーはSEMを示す。各群は、5匹のマウスを有していた。図7Aは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD8＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現のフローサイトメト���ー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。対照マウスと比較して、より高いパーセントの免疫化マウス由来の細胞が、ジカウイルスペプチドに応答してサイトカインを分泌した。図7Bは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD4＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。対照マウスと比較して、より高いパーセントの免疫化マウス由来の細胞が、ジカウイルスペプチドに応答してサイトカインを分泌した。図7Cは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD8＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。対照マウスと比較して、より高いパーセントの免疫化マウス由来の細胞が、ジカウイルスペプチドに応答してサイトカインを分泌した。図7Dは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD4＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。対照マウスと比較して、より高いパーセントの免疫化マウス由来の細胞が、ジカウイルスペプチドに応答してサイトカインを分泌した。
【０２０４】
抗原特異的抗体産生。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、免疫化マウスの血清中でジカ特異的IgG抗体を測定した。図8は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いて免疫したマウスの血清中の抗ジカIgG応答を示す。頬袋から血液を引き出し、Gabitzsch et al.(Cancer Gene Ther. 2011 May；18(5)：326-335)に示される方法を使用し、定量的ELISA又はIgG抗体を用いて分析した。マウス(C57BL/6株、1群当たり5匹のマウス)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。3種類のZikaワクチンを試験した。試験した第1のZikaワクチンは、配列番号34のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号35のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号34はヌクレオチド配列であり、配列番号35は配列番号34に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2015であった。配列番号35のZika mut 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2015抗原は、Zika wt 2015抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号26のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号27のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号26はヌクレオチド配列であり、配列番号27は配列番号26に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2014であった。配列番号27のZika wt 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第3のZikaワクチンは、配列番号28のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号29のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号28はヌクレオチド配列であり、配列番号29は配列番号28に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika mut 2014であった。配列番号29に示されるZika mut 2014抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。Zika mut 2014抗原は、Zika wt 2014抗原と比較して点変異を含む。これらの点変異としては、I21D、L175D、L240D(位置番号はN末端メチオニンをカウントしない)が挙げられ、これらの変異は、野生型と比較して低下した抗ヒトC1q応答をもたらし得る。最終免疫化の一週間後、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、抗体応答の誘導についてマウス由来の血清を試験した。y軸は、血清中の抗ジカIgGのナノグラム(ng)を示す。x軸は、試験した各群及びマウスを示す(例えば、「G1M1」は、群1のマウス1を示す)。抗体応答は、免疫化マウスにおいては誘導されたが、対照マウスにおいては誘導されなかった。エラーバーはSEMを示す。
【０２０５】
症状評価。体重及び体温の変化を含む、マウスにおけるジカ感染の症状を評価した。図9は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いたワクチン接種又は対照としてのAd5[E1-、E2b-]-null空ベクターを用いたワクチン接種後の、ジカウイルス感染のマウスモデル(Rossi et al. Am J Trop Med Hyg. 2016 Jun 1；94(6)：1362-9)における体重低下を示す。A129マウスの群(n=10/群)を、1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-E又は対照としての1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null空ベクターを用いて1回免疫化した。免疫化の30日後、マウスを、ジカウイルスの病原性株に曝露した(5x105プラーク形成単位(PFU)のジカウイルス株FSS13025を腹腔内(IP)注射した)。マウスを、体重変化についてモニターした。図10は、Ad5[E1-、E2b-]-ZIKA-Eワクチンを用いたワクチン接種又は対照としてのAd5[E1-、E2b-]-null空ベクターを用いたワクチン接種後の、ジカウイルス感染のマウスモデル(Rossi et al. Am J Trop Med Hyg. 2016 Jun 1;94(6):1362-9)における体温変化を示す。A129マウスの群(n=10/群)を、1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-ZIKA-E 2015wt又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(対照)を用いて1回免疫化した。免疫化の30日後、マウスを、ジカウイルスの病原性株に曝露した(5x105PFUのジカウイルス株FSS13025を腹腔内(IP)注射した)。体温変化についてマウスをモニターした。
【０２０６】
Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015及びAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)ワクチンの前臨床評価
全てのAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、実施例1に記載されるZikaインサートを用いたワクチンの製造を含んでいた。
【０２０７】
CMI及びCTL応答。マウスにおけるCMI及びCTL応答を、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイにより評価した。図11は、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンで免疫化したマウス由来の脾細胞における細胞媒介性免疫(CMI)応答及び細胞溶解性Tリンパ球(CTL)応答を示す。C57BL/6マウス(n=5/群)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。配列番号32のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号33のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号32はヌクレオチド配列であり、配列番号33は配列番号32に対応するアミノ酸配列である)を含むAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015を含め、2種類のZikaワクチンを試験した。配列番号33のZika wt 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号36のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号37のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号36はヌクレオチド配列であり、配列番号37は配列番号36に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)であった。Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)におけるZika抗原は、2つのC末端膜貫通アンカードメインと細胞外ループ、細胞膜への標的化を確実にするMタンパク質の一部と翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)とをコードするジカウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質の直上流の2つの膜貫通ドメイン、細胞外ループの直前の2つの膜貫通ドメイン、及び細胞外ループを包含する、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する全長エンベロープタンパク質を含む。膜貫通ドメインの包含は、mRNAを担持したリボソームの小胞体への移動、グリコシル化、及び最終的なタンパク質の細胞膜への移動及び結合を確実にするシグナル配列としての役割を果たすことが可能であり、これらは全て究極的には抗原性を高め、これにより免疫応答を生成し得る。Ad5[E1-、E2b-]-null(Viraquest社)及びAd5[E1-、E2b-]-null(E)(社内で製造したnull対照ベクター)を含む2つのAd5[E1-、E2b-]-nullを比較対照ベクターとして使用した。最終免疫化の7日後に脾細胞を単離し、Zika 2014ペプチドプール、SIV-Nefペプチドプール(陰性対照)、SIV-Gagペプチドプール(陰性対照)、及びコンカナバリンA(陽性対照)に曝露して、ELISPOTによりCMI応答(IFN-γ及びIL-2)及びCTL応答(グランザイムB)について評価した。データは、106個の脾細胞当たりのスポット形成細胞(SFC)の数として報告され、エラーバーはSEMを示す。図11Aは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のIFN-γ CMI応答を示す。図11Bは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後のIL-2 CMI応答を示す。図11Cは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、グランザイムB CTL応答を示す。
【０２０８】
細胞内サイトカイン発現。フローサイトメトリー分析は、細胞内サイトカイン発現を評価することにより測定されるリンパ球活性化のレベルを明らかにした。図12は、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンで免疫化したマウス由来の脾細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。C57BL/6マウスを、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン又は1x1010VPのAd5[E1-、E2b-]-null(空ベクター対照)を用いて、2週間間隔で2回免疫化した。配列番号32のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号33のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号32はヌクレオチド配列であり、配列番号33は配列番号32に対応するアミノ酸配列である)を含むAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015を含め、2種類のZikaワクチンを試験した。配列番号33のZika wt 2015抗原は、Zikaエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの切断部分である、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸409〜690に対応する。試験した第2のZikaワクチンは、配列番号36のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号37のアミノ酸配列によるZika抗原タンパク質(配列番号36はヌクレオチド配列であり、配列番号37は配列番号36に対応するアミノ酸配列である)を含む、Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)であった。Ad5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015全長(FL)におけるZika抗原は、2つのC末端膜貫通アンカードメインと細胞外ループ、細胞膜への標的化を確実にするMタンパク質の一部と翻訳の開始を確実にするN末端のKOZAK配列(GCCGCCACC)とをコードするジカウイルスゲノム中のエンベロープタンパク質の直上流の2つの膜貫通ドメイン、細胞外ループの直前の2つの膜貫通ドメイン、及び細胞外ループを包含する、3423-aaのZikaポリタンパク質(配列番号23)のアミノ酸271〜805に対応する全長エンベロープタンパク質を含む。膜貫通ドメインの包含は、mRNAを担持したリボソームの小胞体への移動、グリコシル化、及び最終的なタンパク質の細胞膜への移動及び結合を確実にするシグナル配列としての役割を果たすことが可能であり、これらは全て究極的には抗原性を高め、これにより免疫応答を生成し得る。Ad5[E1-、E2b-]-null(Viraquest社)及びAd5[E1-、E2b-]-null(E)(社内で製造したnull対照ベクター)を含む2つのAd5[E1-、E2b-]-nullを比較対照ベクターとして使用した。最終免疫化の7日後に、免疫化マウスから単離した脾細胞をジカウイルスペプチドプールに曝露し、フローサイトメトリーを用いて、CD8＋細胞及びCD4＋細胞におけるIFN-γ及びIFN-γ/TNF-αの細胞内サイトカイン産生を測定した。応答の特異性は、SIV-nefペプチドプール(陰性対照)及び培地(陰性対照)に対する脾細胞の反応性の欠如、並びにPMA/イオノマイシンに対する脾細胞の反応性(データ示されず)(陽性対照)により示された。データは、IFN-γ又はIFN-γ及びTNF-αを発現しているCD8＋又はCD4＋脾細胞のパーセントとして報告され、エラーバーはSEMを示す。図12Aは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD8＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。図12Bは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD4＋脾細胞におけるIFN-γの細胞内発現のフローサイトメト��ー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。図12Cは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD8＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。図12Dは、Zika 2014ペプチドプール及び対照に対する免疫化マウス及び対照マウス由来の脾細胞の曝露後の、CD4＋脾細胞におけるIFN-γ及びTNF-αの細胞内発現のフローサイトメトリー分析により測定されるリンパ球活性化を示す。
【０２０９】
抗原特異的抗体産生。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、免疫化マウスの血清中でジカ特異的IgG抗体を測定した。図13は、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンで免疫化したマウスの血清中の抗ジカIgG応答を示す。C57BL/6マウス(n=5/群)を、1x1010ウイルス粒子(VP)のAd5[E1-、E2b-]-Zika野生型(wt)2015ワクチン又はAd5[E1-、E2b-]-Zika wt 2015全長(FL)ワクチンを用いて、2週間間隔で2回免疫化した。Ad5[E1-、E2b-]-null(Viraquest社)及びAd5[E1-、E2b-]-null(E)(社内で製造したnull対照ベクター)を含む2つのAd5[E1-、E2b-]-nullを、比較対照ベクターとして使用した。最終免疫化の7日後にマウスから血清を回収し、ジカウイルスエンベロープタンパク質-1に対する抗原特異的抗体について、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により評価した。y軸は、血清中の抗ジカIgGのナノグラム(ng)を示す。Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2015群では、5匹中3匹(3/5)が抗体陽性であった。Ad5[E1-、E2b-]-Zika wt 2015 FL群では、5匹中5匹(5/5)が抗体陽性であった。
【０２１０】
実施例5
Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンを用いたジカ感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン(例えば、Zika抗原(例えば、配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を用いた予防による、ジカ感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、単一標的Zikaワクチンについては実施例1に記載されるとおりに構築され、又は複数標的Zikaワクチンについては実施例2に記載されるとおりに構築される。Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。ジカウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにジカウイルスによる感染からの防御は、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１１】
実施例6
Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン及び共刺激分子を用いた併用予防によるジカ感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン(例えば、Zika抗原(例えば、配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を本明細書中に記載される任意の共刺激分子と組み合わせて用いた予防によるジカ感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、単一標的Zikaワクチンについては実施例1に記載されるとおりに構築され、又は複数標的Zikaワクチンについては実施例2に記載されるとおりに構築される。Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、対象に対して皮下、皮内、又は筋肉内に、1回で、又は合計2回の免疫化については2週間毎に投与される。Adワクチンは、ワクチン製剤と混合された共刺激分子(例えばtoll様受容体(TLR)アゴニスト)と共に共投与される。ジカウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにジカウイルスによる感染からの防御は、共刺激分子と組み合わせたAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、共刺激分子と組み合わせたAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１２】
実施例7
Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン及び免疫学的融合パートナーを用いた予防によるジカ感染の予防
【０２１３】
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン(例えば、Zika抗原(例えば、配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)、並びに同様にアデノウイルスベクターによりコードされる本明細書中に記載される任意の免疫学的融合パートナーを用いた予防によるジカ感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、単一標的Zikaワクチンについては実施例1に記載されるとおりに構築され、又は複数標的Zikaワクチンについては実施例2に記載されるとおりに構築され、また上記Adベクターは、本明細書中に開示される任意の免疫学的融合パートナーをさらにコードする。Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。免疫学的融合パートナーを有するワクチンは、皮下に投与される。増強されたジカウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにジカウイルスによる感染からの防御が、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン-免疫学的融合パートナーを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-Zikaワクチン免疫学的融合パートナーを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１４】
実施例8
Ad5[E1-、E2b-]-黄熱病ウイルス(YFV)ワクチンを用いた黄熱病ウイルス感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-YFVワクチン(例えば、YFV抗原(例えば、配列番号1又は配列番号22)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を用いた予防による黄熱病ウイルス(YFV)感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-YFVワクチンは、単一標的YFVワクチンについては実施例1から適合するように構築され、又は複数標的YFVワクチンについては実施例２から適合するように構築される。Ad5[E1-、E2b-]-YFVワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。黄熱病ウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びに黄熱病ウイルスによる感染からの防御が、Ad5[E1-、E2b-]-YFVワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-YFVワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１５】
実施例9
Ad5[E1-、E2b-]-日本脳炎ウイルス(JEV)ワクチンを用いた日本脳炎ウイルス感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-JEVワクチン(例えば、JEV抗原(例えば、配列番号2)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を用いた予防による日本脳炎ウイルス(JEV)感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-JEVワクチンは、単一標的JEVワクチンについては実施例1から適合するように構築され、又は複数標的JEVワクチンについては実施例２から適合するように構築される。Ad5[E1-、E2b-]-JEVワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。日本脳炎ウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答及び日本脳炎ウイルスによる感染からの防御が、Ad5[E1-、E2b-]-JEVワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-JEVワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１６】
実施例10
Ad5[E1-、E2b-]-ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)ワクチンを用いたダニ媒介性脳炎ウイルス感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-TBEVワクチン(例えば、TBEV抗原(例えば配列番号3〜配列番号5)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を用いた予防によるダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-TBEVワクチンは、単一標的TBEVワクチンについては実施例1から適合するように構築され、又は複数標的TBEVワクチンについては実施例２から適合するように構築される。Ad5[E1-、E2b-]-TBEVワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。ダニ媒介性脳炎ウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにダニ媒介性脳炎ウイルスによる感染からの防御は、Ad5[E1-、E2b-]-TBEVワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-TBEVワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１７】
実施例11
Ad5[E1-、E2b-]-デングウイルス(DENV)ワクチンを用いたデングウイルス感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-DENVワクチン(例えば、DENV抗原(例えば、配列番号6〜配列番号9)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を用いた予防によるデングウイルス(DENV)感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-DENVワクチンは、単一標的DENVワクチンについては実施例1から適合するように構築され、又は複数標的DENVワクチンについては実施例２から適合するように構築される。Ad5[E1-、E2b-]-DENVワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。デングウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにデングウイルスによる感染からの防御は、Ad5[E1-、E2b-]-DENVワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-DENVワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１８】
実施例12
Ad5[E1-、E2b-]-ウエストナイルウイルス(WNV)ワクチンを用いたウエストナイルウイルス感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-WNVワクチン(例えば、WNV抗原(例えば、配列番号10)のいずれか1つ又は任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]など)を用いた予防によるウエストナイルウイルス(WNV)感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-WNVワクチンは、単一標的WNVワクチンについては実施例1から適合するように構築され、又は複数標的WNVワクチンについては実施例２から適合するように構築される。Ad5[E1-、E2b-]-WNVワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。ウエストナイルウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにウエストナイルウイルスによる感染からの防御が、Ad5[E1-、E2b-]-WNVワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-WNVワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２１９】
実施例13
Ad5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンを用いたフラビウイルス感染の予防
この実施例は、本開示の任意のAd5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンを用いた予防によるフラビウイルス感染の予防を示す。Ad5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンは、以下の任意の組み合わせを含む：実施例5に記載される単一標的又は複数標的Ad5[E1-、E2b-]-ジカベクター、実施例8に記載される単一標的又は複数標的Ad5[E1-、E2b-]-YFVベクター、実施例9に記載される単一標的又は複数標的Ad5[E1-、E2b-]-JEVベクター、実施例10に記載される単一標的又は複数標的Ad5[E1-、E2b-]-TBEVベクター、実施例11に記載される単一標的又は複数標的Ad5[E1-、E2b-]-DENVベクター、実施例12に記載される単一標的又は複数標的Ad5[E1-、E2b-]-WNVベクター。あるいは、Ad5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンは、異なるフラビウイルスに由来する少なくとも2つの抗原の任意の組み合わせがアデノウイルスベクターに挿入されているAd5[E1-、E2b-]を含む。例えば、上記の少なくとも2つの抗原は、Zika抗原(例えば、配列番号11〜配列番号21又は配列番号23〜配列番号37のいずれか1つ)、YFV抗原(例えば、配列番号1又は配列番号22)、JEV抗原(例えば、配列番号2)、TBEV抗原(例えば、配列番号3〜配列番号5)、DENV抗原(例えば、配列番号6〜配列番号9)、及び/又はWNV抗原(例えば、配列番号10)の任意の組み合わせを含む。
【０２２０】
Ad5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンは、合計2回の免疫化については2週間毎に対象に投与される。ワクチンは皮下に投与される。フラビウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答並びにフラビウイルスによる感染からの防御は、Ad5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンを用いた対象の免疫化後に誘導される。言い換えれば、Ad5[E1-、E2b-]-フラビウイルスワクチンを用いた予防免疫が対象に付与される。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、又は任意の他の非ヒト動物を含む任意の動物である。
【０２２１】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に示され且つ記載されているが、このような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。ここで本発明から逸脱することなく多数のバリエーション、変更及び置換が当業者に思い浮かぶであろう。本発明の実施において、本明細書中に記載される本発明の実施形態の様々な代替形態を利用し得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これによりこれらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が包含されることが意図される。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月1日(2019.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び
フラビウイルス標的抗原をコードする配列
を含む組成物。
【請求項２】
フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列を含む、請求項１の組成物。
【請求項３】
複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列が、それぞれが標的抗原に対応する複数の遺伝子インサートを含み、各遺伝子インサートは、自己切断2Aペプチドをコードする核酸配列により分離されている、請求項２の組成物。
【請求項４】
自己切断2Aペプチドが、豚テシオウイルス-1ウイルス又はトセア・アシグナウイルスに由来する、請求項３の組成物。
【請求項５】
複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルスベクターであり、場合によりアデノウイルス5(Ad5)ベクターである、請求項１〜５のいずれか1項の組成物。
【請求項６】
複製欠損ウイルスベクターが、E1遺伝子領域、E3遺伝子領域、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか1項の組成物。
【請求項７】
フラビウイルス標的抗原が、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルスの抗原を含む、請求項１〜６のいずれか1項の組成物。
【請求項８】
フラビウイルス標的抗原が、C(カプシドタンパク質)、E(エンベロープタンパク質)、prM(前駆膜タンパク質)、M(膜タンパク質)、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含み、場合によりフラビウイルス標的抗原をコードする配列が、N末端GCCGCCACC配列を含む、請求項１〜７のいずれか1項の組成物。
【請求項９】
複製欠損ウイルスベクターが、フラビウイルス標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、及び／又は組成物又は複製欠損ウイルスベクターが、共刺激分子又は免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか1項の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか1項に記載の組成物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか1項に記載の組成物又は請求項１０の医薬組成物を含む細胞であって場合により樹状細胞(DC)である、細胞。
【請求項１２】
対象においてフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法における使用のための、請求項１〜９のいずれか1項の組成物又は請求項１０の医薬組成物。
【請求項１３】
対象においてジカウイルス感染を予防する方法における使用のための組成物であって：
E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び
少なくとも1つのジカウイルス標的抗原をコードする配列
を含む、前記組成物。
【請求項１４】
対象が、アデノウイルス又はアデノウイルスベクターに対する既存免疫を有する、請求項１２又は１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
1回用量当たり1x109〜5x1012ウイルス粒子を含む、請求項１２〜１４のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
上記の詳細な説明を考慮して、これらの及び他の変更を実施形態に加えることができる。一般的には、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲中に開示される具体的な実施形態に限定するものと解されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利付与される均等物の全範囲に沿った全ての可能な実施形態を包含すると解されるべきである。従って、特許請求の範囲は本開示により限定されるものではない。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び
フラビウイルス標的抗原をコードする配列
を含む組成物。
２．フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列を含む、上記１の組成物。
３．複数のフラビウイルス標的抗原をコードする配列が、それぞれが標的抗原に対応する複数の遺伝子インサートを含み、各遺伝子インサートは、自己切断2Aペプチドをコードする核酸配列により分離されている、上記２の組成物。
４．自己切断2Aペプチドが、豚テシオウイルス-1ウイルス又はトセア・アシグナウイルスに由来する、上記３の組成物。
５．複数のフラビウイルス標的抗原が、3つのフラビウイルス標的抗原又は4つのフラビウイルス標的抗原を含む、上記２〜４のいずれかの組成物。
６．複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、上記１〜５のいずれかの組成物。
７．複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルス5(Ad5)ベクターである、上記１〜６のいずれかの組成物。
８．複製欠損ウイルスベクターが、E1遺伝子領域、E3遺伝子領域、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせを含む、上記１〜７のいずれかの組成物。
９．E2b遺伝子領域における欠失が、E2b遺伝子領域における複数の欠失を含む、上記１〜８のいずれかの組成物。
１０．E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、それぞれ少なくとも1個の塩基対を含む、上記１〜９のいずれかの組成物。
１１．E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、2個以上の塩基対の転位から生じる、上記１〜１０のいずれかの組成物。
１２．E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、それぞれ少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個、少なくとも100個、少なくとも110個、少なくとも120個、少なくとも130個、少なくとも140個、又は少なくとも150個の塩基対を含む、上記１〜１１のいずれかの組成物。
１３．E2b遺伝子領域における欠失、E1遺伝子領域における欠失、E3遺伝子領域における欠失、E4遺伝子領域における欠失、又はこれらの任意の組み合わせが、それぞれ150個超、160個超、170個超、180個超、190個超、200個超、250個超、又は300個超の塩基対を含む、上記１〜１２のいずれかの組成物。
１４．フラビウイルス標的抗原が、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるウイルスの抗原を含む、上記１〜１３のいずれかの組成物。
１５．フラビウイルス標的抗原が、黄熱病ウイルス(YFV)、ジカウイルス(ZIKAV)、又はその両方からなる群から選択されるウイルスの抗原を含む、上記１〜１４のいずれかの組成物。
１６．フラビウイルス標的抗原がジカウイルス(ZIKAV)の抗原を含む、上記１〜１５のいずれかの組成物。
１７．フラビウイルス標的抗原が、C(カプシドタンパク質)、E(エンベロープタンパク質)、prM(前駆膜タンパク質)、M(膜タンパク質)、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む、上記１〜１６のいずれかの組成物。
１８．フラビウイルス標的抗原が、E、prM、M、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、及びNS5、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む、上記１〜１７のいずれかの組成物。
１９．フラビウイルス標的抗原が、E、prM、M、及びNS3、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原を含む、上記１〜１８のいずれかの組成物。
２０．フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、N末端GCCGCCACC配列を含む、上記１〜１９のいずれかの組成物。
２１．フラビウイルス標的抗原をコードする配列が変異をコードする配列を含み、該変異が、イソロイシン(I)からアスパラギン酸(D)への変異、ロイシン(L)からアスパラギン酸(D)への変異、アスパラギン酸(D)からイソロイシン(I)への変異、アスパラギン酸(D)からロイシン(L)への変異、又はこれらの任意の組み合わせを含む、上記１〜２０のいずれかの組成物。
２２．変異が、I21D、L175D、L240D、D37I、D43L、D266I、D129L、D218L、又はこれらの任意の組み合わせにおいて生じる、上記２１の組成物。
２３．フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、配列番号１、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号1１、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号2１、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号3１、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、及び配列番号37、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、上記１〜２２のいずれかの組成物。
２４．フラビウイルス標的抗原をコードする配列が、配列番号15〜配列番号19からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、上記１〜２３のいずれかの組成物。
２５．フラビウイルス標的抗原をコードする配列がアミノ酸配列であり、該アミノ酸配列が、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、及び配列番号36、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、上記１〜２３のいずれかの組成物。
２６．フラビウイルス標的抗原をコードする配列がヌクレオチド配列であり、該ヌクレオチド配列が、配列番号27、配列番号29、配列番号3１、配列番号33、配列番号35、及び配列番号37、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列に対して、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、又は少なくとも99％の配列同一性を含む、上記１〜２３のいずれかの組成物。
２７．複製欠損ウイルスベクターが、フラビウイルス標的抗原の発現を増加させるエレメントをさらに含む、上記１〜２６のいずれかの組成物。
２８．前記エレメントが、少なくとも1つのエレメント、少なくとも2つのエレメント、少なくとも3つのエレメント、少なくとも4つのエレメント、又は少なくとも5つのエレメントを含む、上記２７の組成物。
２９．エレメントが内部リボソーム結合部位を含む、上記２７又は２８の組成物。
３０．エレメントが構成的プロモーターを含む、上記２７〜２９の組成物。
３１．エレメントが誘導性プロモーターを含む、上記２７〜３０の組成物。
３２．エレメントが転写エンハンサーを含む、上記２７〜３１の組成物。
３３．転写エンハンサーがラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーである、上記３２の組成物。
３４．エレメントがパリンドローム配列を含まない、上記２７〜３３のいずれかの組成物。
３５．複製欠損ウイルスベクターが、フラビウイルス標的抗原の免疫原性を増加させるタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、上記１〜３４のいずれかの組成物。
３６．複製欠損ウイルスベクターが、guttedベクターではない、上記１〜３５のいずれかの組成物。
３７．組成物又は複製欠損ウイルスベクターが、共刺激分子又は免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む、上記１〜３６のいずれかの組成物。
３８．上記１〜３７のいずれかの組成物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
３９．上記１〜３７のいずれかの組成物又は上記３８の医薬組成物を含む細胞。
４０．細胞が宿主細胞である、上記３９の細胞。
４１．細胞が樹状細胞(DC)である、上記３９〜４０のいずれかの細胞。
４２．上記３８に記載の医薬組成物を調製することを含む、ワクチンを調製する方法。
４３．対象においてフラビウイルス標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、上記１〜３７のいずれかの組成物又は上記３８の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
４４．対象がフラビウイルスに感染していない、上記４３の方法。
４５．フラビウイルス標的抗原がフラビウイルス由来であり、該フラビウイルスが、黄熱病ウイルス(YFV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介性脳炎ウイルス(TBEV)、デングウイルス(DENV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、ジカウイルス(ZIKAV)又はこれらの任意の組み合わせを含む、上記４３〜４４のいずれかの方法。
４６．対象においてジカウイルス感染を予防する方法であって、該方法が、以下のものを含む組成物：
E2b遺伝子領域に欠失を含む複製欠損ウイルスベクター；及び
少なくとも1つのジカウイルス標的抗原をコードする配列
を対象に投与することを含む、前記方法。
４７．対象が、アデノウイルス又はアデノウイルスベクターに対する既存免疫を有する、上記４３〜４６の方法。
４８．対象がヒト又は非ヒト動物である、上記４３〜４７のいずれかの方法。
４９．投与が、静脈内投与、皮下投与、リンパ内投与、腫瘍内投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、直腸内投与、膣内投与、鼻腔内投与、経口投与、膀胱点滴を介した投与、又は乱刺を介した投与である、上記４３〜４８のいずれかの方法。
５０．対象への組成物の投与が、少なくとも1回であるか、少なくとも2回反復されるか、又は少なくとも3回反復される、上記４３〜４９のいずれかの方法。
５１．対象への組成物の投与が、1回用量当たり1x109〜5x1012ウイルス粒子を含む、上記４３〜５０のいずれかの方法。
５２．対象への組成物の投与が、1回用量当たり少なくとも109ウイルス粒子、少なくとも1010ウイルス粒子、又は少なくとも1011ウイルス粒子を含む、上記４３〜５１のいずれかの方法。
５３．複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、上記４３〜５２のいずれかの方法。
５４．複製欠損ウイルスベクターがアデノウイルス5(Ad5)ベクターである、上記４３〜５３のいずれかの方法。
【国際調査報告】
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