【手続補正書】
【提出日】令和3年11月22日(2021.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜色素上皮の細胞中の遺伝子の発現のための、単離核酸分子の使用であって、前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含み、前記遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合、前記網膜色素上皮の細胞中の遺伝子の発現を駆動するのに有効である、使用。
【請求項２】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記網膜色素上皮の細胞は、霊長類の細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記遺伝子が前記単離核酸分子に作動可能に結合している、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記単離核酸分子に作動可能に結合している前記遺伝子が、ハロロドプシン、チャネルロドシン、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、５ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオスタチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４、及び桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記単離核酸分子は、最小プロモーター配列を更に含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記最小プロモーター配列は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
網膜色素上皮の細胞中の遺伝子の発現のための発現カセットの使用であって、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む単離核酸分子、及び前記網膜色素上皮の細胞における発現のための遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記遺伝子をコードする前記核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している、使用。
【請求項１０】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記網膜色素上皮の細胞は、霊長類の細胞である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記単離核酸分子に作動可能に結合している前記遺伝子が、ハロロドプシン、チャネルロドシン、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、５ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオスタチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４、及び桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１４】
前記単離核酸分子は、最小プロモーター配列を更に含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１５】
前記最小プロモーター配列は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
網膜色素上皮の細胞中の遺伝子の発現のためのベクターの使用であって、前記ベクターは発現カセットを含み、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む単離核酸分子、及び前記網膜色素上皮の細胞における発現のための遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記遺伝子をコードする前記核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している、使用。
【請求項１７】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列を含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記網膜色素上皮の細胞は、霊長類の細胞である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記単離核酸分子に作動可能に結合している前記遺伝子が、ハロロドプシン、チャネルロドシン、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、５ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオスタチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４、及び桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項２１】
前記単離核酸分子は、最小プロモーター配列を更に含む、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
前記最小プロモーター配列は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１６に記載の使用。
【請求項２４】
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
単離細胞、細胞系又は細胞集団に発現カセットを形質移入することを含む、網膜色素上皮の細胞中で遺伝子を発現させる方法であって、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む単離核酸分子、及び前記網膜色素上皮の細胞における発現のための遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記遺伝子をコードする前記核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合しており、ここで、前記細胞が網膜色素上皮の細胞であり、又は前記細胞系若しくは細胞集団が網膜色素上皮の細胞を含む場合、前記遺伝子が前記単離細胞、前記細胞系又は前記細胞集団により発現される方法。
【請求項２６】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記単離核酸分子に作動可能に結合している前記遺伝子が、ハロロドプシン、チャネルロドシン、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、５ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオスタチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４、及び桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記単離核酸分子は、最小プロモーター配列を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記最小プロモーター配列は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
単離細胞、細胞系又は細胞集団にベクターを形質移入することを含む、網膜色素上皮の細胞中で遺伝子を発現させる方法であって、前記ベクターは発現カセットを含み、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む単離核酸分子、及び前記網膜色素上皮の細胞における発現のための遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記遺伝子をコードする前記核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している、方法。
【請求項３２】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１０００塩基対の核酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記単離核酸分子は、配列番号１の前記核酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記単離核酸分子に作動可能に結合している前記遺伝子が、ハロロドプシン、チャネルロドシン、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ６、ＭＴ−ＣＹＢ、ＭＴ−ＣＯ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ２、５ＭＴ−ＣＯＩ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ、ＯＰＡ１、ＯＰＡ３、ＯＰＡ７、ＡＣＯ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＢＤＮＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ｌ１、エンドスタチン、アンギオスタチン、ｓＦｌｔ、ＩＬ１０、ＩＬ１Ｒ１、ＴＧＦＢＩ、ＩＬ４、及び桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記単離核酸分子は、最小プロモーター配列を更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記最小プロモーター配列は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項３７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
ウイルス形質移入及び組織製剤
ＡＡＶ投与は、Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｃｈｉｎａにおいて眼科医及び外部委託先と連携して実施した。アカゲザルは、ケタミン及びフェノバルビタールナトリウムにより麻酔した。２本の穿刺トンネルは、それぞれ鼻腔及び側頭胸膜領域に配置された２５ゲージの穿刺針を使用して作成した。１本のトンネルを通して照明用ファイバーを硝子体腔内に注入し、５０μＬのＡＡＶは、第２トンネルを通してハミルトンシリンジ上に取り付けた３０ゲージ針を使用して網膜下に注射した。３カ月後、単離網膜を３０分間に渡りＰＢＳ中の４％のＰＦＡ中で固定し、次いでＰＢＳ中で４℃において洗浄ステップを行った。全網膜は、室温で１時間に渡り１０％の標準ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、ＰＢＳ中の０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により処理した。ＰＢＳ中３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中のモノクローナルラット抗ＧＦＰ  Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．；１：５００）による処理を室温で５日間実施した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．；１：２００）による処理を２時間に渡り実施した。切片を洗浄し、スライドガラス上にＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褪色防止用試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）と共に載せ、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．）を使用してイメージングした。
本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］
配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも１０００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、網膜色素上皮細胞の細胞中の遺伝子の特異的発現を、前記遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合にもたらす単離核酸分子。
［２］
最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターを更に含む、［１］に記載の単離核酸分子。
［３］
［１］又は［２］に記載の単離核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸分子。
［４］
規定の細胞中の遺伝子発現を促進するエレメントとして［１］又は［２］に記載の単離核酸を含む発現カセットであって、前記単離核酸が、少なくとも、網膜色素上皮細胞の細胞中で特異的に発現させるべき遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合している発現カセット。
［５］
［４］に記載の発現カセットを含むベクター。
［６］
ウイルスベクターである、［５］に記載のベクター。
［７］
網膜色素上皮細胞の細胞中の遺伝子の前記発現のための、［１］若しくは［２］に記載の核酸の、［４］に記載の発現カセットの、又は［５］に記載のベクターの使用。
［８］
単離細胞、細胞系又は細胞集団に［４］に記載の発現カセットを形質移入するステップを含む、網膜色素上皮細胞の細胞中で遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞が網膜色素上皮細胞の細胞であり、又は前記細胞が網膜色素上皮細胞の細胞を含む場合、発現させるべき前記遺伝子を前記単離細胞、前記細胞系又は前記細胞集団により特異的に発現させる方法。
［９］
［４］に記載の発現カセット又は［５］に記載のベクターを含む単離細胞。
［１０］
前記発現カセット又はベクターが、前記細胞のゲノム中に安定的に組み込まれている、［９］に記載の細胞。
［１１］
前記遺伝子の産物が、光感受性分子、例えば、ハロロドプシン又はチャネルロドプシンである、［１］若しくは［２］に記載の単離核酸分子、［４］に記載の発現カセット、［５］に記載のベクター、［７］に記載の使用、［８］に記載の方法又は［９］に記載の細胞。
［１２］
［１］又は［２］に記載の単離核酸分子を含む、網膜色素上皮細胞の細胞中で遺伝子を発現させるためのキット。