(57)【要約】  本発明は、等温核酸自己増幅法を提供し、前記方法は、標的鋳型の両端に適切なパリンドローム相補配列を付加し、ステムループ構造を自発的に形成し、反応に必要な試薬及び条件を提供して自己増幅を行い、追加の増幅プライマーを加える必要はない。前記試薬は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。この方法によれば、外来プライマーに依存せずに、増幅を行うことができる。増幅温度を一定とし、複雑な温度制御装置を必要とせず、迅速に増幅する。増幅産物は、連続した相補配列としての長鎖の一本鎖ＤＮＡであり、特殊な場合に適用可能である。増幅にＧＣバイアスはない。【選択図】図１
2019518476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ、標的鋳型の両端に所望の配列を有するＤＮＡリンカーを付加するステップと、
ｃ、反応に必要な試薬及び条件を提供するステップと、を含み、
前記所望の配列を有するＤＮＡリンカーは、自発的に形成された自己ステムループ構造を有する線状核酸断片であり、  前記試薬は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ又は鎖置換活性を有するその他のポリメラーゼを含み、
追加の増幅プライマーを加える必要はないことを特徴とする等温核酸自己増幅法。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ又はその他のＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の等温核酸自己増幅法。
【請求項３】
前記標的鋳型の両端に付加されたＤＮＡリンカーは、パリンドローム相補配列を有する線状核酸断片であり、自己ステムループ構造を自発的に形成することにより、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長増幅をさせることができることを特徴とする請求項１に記載の等温核酸自己増幅法。
【請求項４】
前記ＤＮＡリンカーの配列は、適用例における塩基ＡＴの組み合わせの反復配列、又はＡＡＴＴの組み合わせの反復配列、又はＧＣの組み合わせの反復配列であってもよいが、これらに限定されなく、前記ＤＮＡリンカーは、塩基修飾が可能なリンカーであることを特徴とする請求項３に記載の等温核酸自己増幅法。
【請求項５】
前記増幅方法の産物は、縦列反復配列を有する折り畳まれた相補的一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の等温核酸自己増幅法。
【請求項６】
等温核酸自己増幅法の使用であって、
前記方法は、第二世代のシーケンシングライブラリーの構築に用いられ、前記ライブラリーの構築方法は、長鎖のゲノムＤＮＡを小さな断片に切断し、断片の両端に適切な配列を含有するリンカーを連結させて循環的な増幅を行うか、又は、リンカー断片をトランスポゾンやｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９システムなどにより選択的に挿入して選択的増幅を行うことによりなされ、前記増幅産物は、縦列反復配列であることを特徴とする等温核酸自己増幅法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等温核酸自己増幅法に関するものであり、核酸増幅技術領域に属する。
【背景技術】
【０００２】
最近の数十年間、核酸増幅技術は、分子生物学的研究と病原微生物の検出に画期的な貢献を与えている。
【０００３】
等温増幅技術（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける核酸増幅技術であり、反応中に温度が常に一定に維持され、異なる活性を有する酵素及びそれぞれの特異的プライマーを添加することにより、迅速な核酸増幅を達成するものである。一般的な等温増幅技術として、ループ介在等温増幅技術（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅技術（ＲＣＡ）、単一プライマー等温増幅技術（ＳＰＩＡ）、ヘリカーゼ依存性等温増幅技術（ＨＡＤ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）などが挙げられるが、従来の方法において、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより、プライマーの存在下で一般的に非特異的な増幅が起こりやすい。
【０００４】
等温増幅技術は、第二世代の核酸のシーケンシング技術に広く使用されているだけでなく、第三世代の核酸シーケンシング技術においても非常に重要な役割を果たしている。例えば、米国Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社が開発したシーケンシング技術において、ローリングサークル増幅技術ＲＣＡ（特許番号：ＵＳ９４０４１４６）を使用し、この技術により同じ断片のシーケンシングを繰り返し、その後ソフトウェアによる補正を行うことにより、シーケンシングデータの正確性を大幅に向上させた。同様に、英国Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社が開発した配列決定技術においても、類似した技術を使用すれば、シーケンシングデータの正確性を大幅に向上させることができる（ＩＮＣ−Ｓｅｑ：Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｒｅａｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．ＧｉｇａＳｃｉｅｎｃｅ（２０１６）５：３４）。しかしながら、英国Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ社のシーケンシングの原理は、非常に特殊であり、ローリングサークル増幅技術ＲＣＡを採用しているので、工程が煩雑になるだけでなく、増幅の均一性も不十分になり、シーケンシングの結果に影響を及ぼす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の課題を解決することを目的とし、等温核酸自己増幅法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、以下の技術案によって達成される。
等温核酸自己増幅法は、
ａ、標的鋳型の両端に所望の配列を有するＤＮＡリンカーを付加するステップと、
ｃ、反応に必要な試薬及び条件を提供するステップとを含む。
前記所望の配列を有するＤＮＡリンカーは、自発的に形成された自己ステムループ構造を有する線状核酸断片であり、前記自己増幅法において、追加の増幅プライマーを加える必要はない。
【０００７】
前記試薬は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ又は鎖置換活性を有するその他のポリメラーゼを含む。
【０００８】
好ましくは、前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ又はその他のＤＮＡポリメラーゼである。
【０００９】
好ましくは、前記標的鋳型の両端に付加されたＤＮＡリンカーは、パリンドローム相補配列を有する線状核酸断片であり、自己ステムループ構造を自発的に形成することにより、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長増幅をさせることができる。
【００１０】
好ましくは、前記ＤＮＡリンカーの配列は、適用例における塩基ＡＴの組み合わせの反復配列、又はＡＡＴＴの組み合わせの反復配列、又はＧＣの組み合わせの反復配列であってもよいが、これらに限定されない。前記ＤＮＡリンカーは、塩基修飾が可能なリンカーである。前記修飾は、チオ修飾などであってもよい。
【００１１】
好ましくは、前記増幅方法の産物は、縦列反復配列を有する折り畳まれた相補的一本鎖ＤＮＡである。
【００１２】
等温核酸自己増幅法の使用を提供し、前記方法は、第二世代のシーケンシングライブラリーの構築に用いられる。前記ライブラリーの構築方法は、長鎖のゲノムＤＮＡを小さな断片に切断し、断片の両端に適切な配列を含有するリンカーを連結させて循環的な増幅を行うか、又は、リンカー断片をトランスポゾンやｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９システムなどにより選択的に挿入して選択的増幅を行うことによりなされる。増幅産物は、縦列反復配列である。この方法により製造されたシーケンシングライブラリーは、ナノポアシーケンサーのようないくつかのシーケンシング装置を用いて目的配列がシーケンシングされる回数を増加させることにより、シーケンシングの精度を向上することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、主に以下のような有益効果を有する。
１、等温の場合、目的断片を迅速且つ効果的に増幅することができる。
２、ＤＮＡの末端に適切なパリンドローム相補配列を導入した後、プライマーに依存せずに、増幅を行うことができる。
３、増幅産物は、連続した相補配列としての長鎖の一本鎖ＤＮＡであり、特殊な場合に適用可能である。
４、増幅にＧＣバイアスはない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
以下、図面を併せて本発明の技術案をさらに説明する。
【図１】ＤＮＡ二本鎖の末端の呼吸作用及び立体配座転移の過程を示す模式図である。
【図２】ＤＮＡ二本鎖の末端（３’末端及び５’末端）のいずれも自己増幅に適した配列を持つ場合の自己増幅の過程を示す模式図である。
【図３】目的遺伝子の末端に適切な配列を付加する過程を示す模式図である。
【図４】非特異的増幅法により目的遺伝子の末端に適切な配列を付加する過程を示す模式図である。
【図５】第二世代のシーケンシングライブラリーの構築中の配列構造変化を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、等温核酸自己増幅法を提供し、その増幅産物は、折り畳まれた相補的一本鎖ＤＮＡである。
【００１６】
前記等温核酸自己増幅法は、
ａ、標的鋳型の両端に所望の配列を有するＤＮＡリンカーを付加するステップと
ｃ、反応に必要な試薬及び条件を提供するステップとを含む。
前記所望の配列を有するＤＮＡリンカーは、自発的に形成された自己ステムループ構造を有する線状核酸断片であり、前記自己増幅法において、追加の増幅プライマーを加える必要はない。
【００１７】
具体的には、前記標的鋳型の両端に付加されたＤＮＡリンカーは、パリンドローム相補配列を有する線状核酸断片であり、自己ステムループ構造を自発的に形成することにより、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長増幅をさせることができる。
【００１８】
前記標的鋳型は、ＰＣＲ、リガーゼ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ トランスポゾンシステムなどにより線状ＤＮＡの末端に適切なパリンドローム相補配列を付加することにより、自己ステムループ構造を形成することができる。  
【００１９】
本発明に記載の自己増幅法において、追加の増幅プライマーを加える必要はない。前記増幅法による産物は、折り畳まれた相補的一本鎖ＤＮＡである。
【００２０】
前記試薬は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ又はその他のポリメラーゼを含む。
【００２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼである。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼにより、増幅にＧＣバイアスがなくなり、増幅産物がより良好な均一性を持つようになる。
【００２２】
等温核酸自己増幅法の使用を提供し、前記方法は、第二世代のシーケンシングライブラリーの構築に用いられ、以下のステップを含む。ＤＮＡを断片化した後、リガーゼにより、ＤＮＡの両端に自己増幅に適した配列を付加するか、又は、断片をトランスポゾンやｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９システムなどにより選択的に挿入し、最後に、ＤＮＡ断片の末端に自己増幅に適した配列を連結させて等温自己増幅を行う。
【００２３】
以下、本発明に係る自己増幅法の原理について具体的に説明する。
ＤＮＡ呼吸作用によれば、二本鎖ＤＮＡの末端は、遊離した一本鎖への解離と二本鎖への相補的対合との動的平衡にあり、温度が上昇すると、呼吸作用が増加し、末端の二本鎖の解離がより顕著になる。この時、外来のマッチプライマーは、ＤＮＡの一方の鎖に結合するように直接侵入し、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの作用によって伸長増幅を行う（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  １４３２０-１４３２３｜ＰＮＡＳ｜Ａｕｇｕｓｔ  ２７、２０１３｜ｖｏｌ．１１０｜ｎｏ．３５）。
本発明によれば、まず、ＰＣＲ又はリンカーライゲーション、指向性ＤＮＡ組換えなどの技術により、目的遺伝子断片の末端に特殊なＤＮＡ配列を導入する。この配列は、パリンドローム配列であり、それ自体が塩基対合してステムループ構造を形成することができるので、外来プライマーを添加する必要がなく、ＤＮＡ呼吸作用を利用して、３’末端が鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの作用によってそのまま自体を鋳型として伸長増幅を行うことができる。１回目の増幅が完了してから、新たな３’末端配列と元の５’末端配列が相補的となり、同様にパリンドローム配列を形成し、それ自体が相補的に対合して次回の伸長増幅を行うことができる。新たな３’末端配列と元の５’末端配列が依然として相補的となり、循環的な増幅を行う。ＤＮＡ二本鎖のそれぞれの一本鎖は、類似した反応を同時に行い、最終産物が２つの、複数の反復配列を有する相補的一本鎖ＤＮＡである。  
【００２４】
ＤＮＡ二本鎖における相補的塩基は、水素結合で連結されており、Ａ（アデニン）とＴ（チミン）の間には２本、Ｇ（グアニン）とＣ（シトシン）の間には３本の水素結合が形成されているので、ＧＣ対は、ＡＴ対よりも解離が困難になる。ＤＮＡ呼吸現象において、３’末端にヘアピン構造の立体配座が形成される場合、ＤＮＡの完全に相補的な立体配座と比較して、末端の対合する塩基が少なくなるだけでなく、環状部分が空間構造によって対合できない場合もある。このため、３’末端にヘアピン構造がうまく形成される確率を高めるために、末端配列におけるＡＴ含量を向上し、遊離した一本鎖の長さを増加させるとともに、ＴＡの反復配列又はＴＡＡやＴＴＡＡなどのような短い反復配列を用いることにより、対合を容易にすることができる。
【００２５】
等温自己増幅の過程において、適切な配列を目的断片の末端に導入すると、プライマーを除去した後でも、依然として自己増幅を行うことができる。そして、増幅の過程において、増幅産物は、連続した相補配列であり、空間上の近距離効果によって、暴露された一本鎖ＤＮＡがほとんど露出せずに、迅速に対合して二本鎖構造を形成し、非特異的増幅を実質的に排除することを可能にする。単一細胞シーケンシングのようなハイスループットシーケンシングにおいて、自己等温増幅法は、ＰＣＲ法と比較して、ＧＣバイアスを排除するだけでなく、より良好な均一性を有することもできる。
【００２６】
等温自己増幅の最終産物は、連続した相補配列としての一本鎖ＤＮＡであり、酵素による切断などにより短い断片に変換する一方で、このような長い反復断片がシーケンシングのような特殊な場合に適用可能である。第二世代のシーケンシングライブラリーの構築を図５に示す。ゲノムＤＮＡは、長い配列であり、機械的せん断（例えば、磁気ビーズを添加して振動させるなど）又は酵素による切断などの技術により、長さ約数百ｂｐの小さな断片に切断し、次いでリガーゼの作用によって自己増幅に適した配列を含有するリンカー配列を末端に付加してから、等温自己増幅を行う。増幅の過程において、増幅プライマーを使用せず、また二本鎖を完全に解離させる工程もないので、ＰＣＲ法と比較して、産物がより良好な均一性を有し、且つＧＣバイアスもなくなる。
【００２７】
以下、図面を併せて本発明において自己増幅反応に適用するためのステムループ構造を異なる方法により形成することを具体的に説明する。
【００２８】
ＤＮＡ二本鎖の末端の呼吸作用及び立体配座転移を図１に示す。線状完全相補的ＤＮＡ二本鎖（Ｂ型）は、生理的条件下で、その末端の二本鎖が遊離状態（Ａ型）に解離し、この２つの状態が互いに変換して動的平衡となる。高温又はその他の条件下で、呼吸が強くなり、末端配列が自己相補的である場合、ステムループ構造（Ｃ型）を形成し、ＤＮＡポリメラーゼ結合部位が現れ、増幅反応が生じる。
【００２９】
ＤＮＡ二本鎖の末端（３’及び５’末端）のいずれも自己増幅に適した配列を持つ場合の自己増幅の過程を図２に示す。１、線状二本鎖ＤＮＡ；２、３’末端がヘアピン構造を呈し、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼに結合し、鎖置換反応が起こる；３、それ自体の増幅を完成し、アンチセンス鎖が置換され（アンチセンス鎖も同時に反応する）、コピー数が２倍になり、新たに生じた３’末端がいずれも５’末端を鋳型とし、依然としてヘアピン構造を呈することができる；４、Ｎ回サイクルの増幅を行う。５、Ｎ回サイクルの増幅後の産物は、コピー数が２のＮ乗の長い一本鎖ＤＮＡである。
【００３０】
ＰＣＲにより目的遺伝子の末端に適切な配列を付加する方法を図３に示す。１、プライマーＡの３’末端を目的遺伝子と相補的な配列とし、その５’末端を付加の配列とし、高温で解離してからプライマーを結合させ、ＰＣＲ増幅によりアンチセンス鎖を形成する；２、プライマーＢの３’末端を目的遺伝子と相補的な配列とし、その５’末端を付加の配列とし、高温で解離してからプライマーを結合させて、ＰＣＲ増幅を行う；３、高温解離後、増幅産物そのものが環化し、等温自己増幅が可能な出発物質になる。
非特異的増幅法により目的遺伝子の末端に適切な配列を付加する方法を図４に示す。１、高温で解離してからプライマーＡを結合させる；２、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅してアンチセンス鎖を形成する；３、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼのような一部の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの配列と鋳型が完全に一致しない場合にも、依然として結合して増幅することができる。これは、一般的に反応に不利な側面であるが、この特性によって、ＤＮＡが十分に長い場合、３’末端が湾曲してから自体に非特異的に結合して増幅することができ、これにより、５’末端と相補的な配列が得られる；４、等温自己増幅が可能な出発物質になる。
【００３１】
増幅効率の検出
過剰なプライマーや鋳型としての核酸などの干渉を排除し、ＤＮＡ等温自己増幅の効率をより良好に検証するために、Ｈｉｎｄ標準品１と命名され、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１であって、末端に等温自己増幅配列を有する一本鎖ＤＮＡを人工的に合成した（以下の全てのＤＮＡが上海サンゴンバイオテク社（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．）から合成された）。
ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
同時に、Ｈｉｎｄ標準品２と命名され、末端に等温自己増幅配列を有さない一本鎖ＤＮＡ（末端の相補配列を除去したもの）を人工的に合成した。
配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２
ＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
【００３２】
等温増幅反応系２５μｌ（ｄＮＴＰ ０．２ｍＭずつ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液１×、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、ウォームスタートＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ８Ｕ（ＮＥＢ社から購入）、Ｈｉｎｄ標準品約１００ｐＭ）を６０℃で１時間反応させた。
【００３３】
反応産物を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（ＮＥＢ社から購入）で切断した後、ｑＰＣＲにより検出した。
ｑＰＣＲ前のプライマー配列：ＣＧＣＧＣＧＴＡＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡ
ｑＰＣＲ後のプライマー配列：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ
ｑＰＣＲ反応系２０ｕｌ中に、終濃度２００ｎＭのプライマー、Ｆａｓｔ ｓｙｂｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ １×及び酵素切断産物３μｌが含まれた。反応手順は、９５℃で３０秒、そして６０℃で２０秒を４５サイクル、９５℃で５秒行った。
【００３４】
検出データを表１に示す
2019518476.tif 000003
【００３５】
この結果から、Ｈｉｎｄ標準品１が約１０００倍増幅され、Ｈｉｎｄ標準品２がほとんど増幅されず、特定の構造を有する核酸断片は、等温自己増幅が可能であることが示されている。
【００３６】
増幅効率と初期濃度との関係の検出
同様に、過剰なプライマーや鋳型としての核酸などの干渉を排除し、ＤＮＡ等温自己増幅をより良好に検証するために、人工的に合成した断片であるＨｉｎｄ標準品１を選択し、異なる初期濃度を採用した。
【００３７】
等温増幅及びｑＰＣＲ実験手順は、実施例１に説明したように、６０℃で２時間反応させた。
【００３８】
データを表２に示す。
2019518476.tif 000004
【００３９】
この結果から、溶液中の核酸断片が単一コピーに近い場合でも、依然として増幅を約１０００倍の効率で行うことができ、さらに、等温自己増幅が自発的に行われるものであり、増幅プライマーを添加する必要がないことが示されている。
【００４０】
増幅効率と末端配列との関係
同様に、過剰なプライマーや鋳型としての核酸などの干渉を排除し、ＤＮＡ等温自己増幅法をより良好に検証するために、人工的に合成した断片を選択し、異なる長さの末端配列を採用した。
【００４１】
Ｈｉｎｄ標準品１：
ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
Ｈｉｎｄ標準品２１：
ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
Ｈｉｎｄ標準品１５：
ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
Ｈｉｎｄ標準品９：
ＴＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
Ｈｉｎｄ標準品０：
ＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＧＴＡＡＡＴＡＧＧ
等温増幅及びｑＰＣＲ実験手順は、実施例１に説明したように、６０℃で２時間反応させた。
【００４２】
データを表３に示す。
2019518476.tif 000005
【００４３】
この結果から、末端ＴＡ反復配列の長さが３０、２１、１５である場合、増幅効率が約１０００倍であり、長さが９である場合、増幅効率が約１００倍であり、長さが０である場合、増幅がほとんどないことが示されている。等温自己増幅が末端ＴＡ反復配列依存的であることが示されている。
【００４４】
増幅倍数と時間との関係
過剰なプライマーや鋳型としての核酸などの干渉を排除し、ＤＮＡ等温自己増幅法をより良好に検証するために、Ｈｉｎｄ標準品１である、末端に等温自己増幅配列を有する一本鎖ＤＮＡを人工的に合成した。
【００４５】
等温増幅及びｑＰＣＲ実験手順は、実施例１に説明したように、６０℃で異なる時間反応させた。
【００４６】
データを表４に示す。
2019518476.tif 000006
【００４７】
この結果から、等温自己増幅の時間が長いほど、増幅倍数が高くなり、増幅効率が初期段階で若干高くなることが示されている。
【００４８】
本発明は、様々な具体的な実施形態を有し、同等の置換又は等価の変換により形成される技術案のすべては、本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
2019518476.tif 000007
【図２】
2019518476.tif 000008
【図３】
2019518476.tif 000009
【図４】
2019518476.tif 000010
【図５】
2019518476.tif 000011
【国際調査報告】
2019518476.tif 000012
2019518476.tif 000013
2019518476.tif 000014
2019518476.tif 000015
2019518476.tif 000016
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