(57)【要約】  ＧＰＣ３を発現する固形腫瘍を呈する対象を処置するための方法であって、対象に抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞を投与することを含み、投与がリンパ球低減処置に対象を供した後にまたはそれと同時に行われる方法が提供される。方法において使用されるキットも提供される。
2019515913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリピカン−３（ＧＰＣ３）を発現する固形腫瘍を呈する対象を処置する方法であって、対象に抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞を投与することを含み、投与がリンパ球低減処置に対象を供した後にまたはそれと同時に行われる、方法。
【請求項２】
免疫応答細胞がＮＫ細胞（抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  ＮＫ細胞）またはＴ細胞（抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与することが、リンパ球低減処置に対象を供した後に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞少なくとも約５ｘ１０４個／ｋｇが対象に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞約５ｘ１０４個から約１ｘ１０１２個／ｋｇが対象に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
投与が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定して、少なくとも３０％腫瘍サイズを低減することに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
投与が、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定して、腫瘍病変の直径のベースライン測定値における１０％未満の変化として測定される、腫瘍サイズの安定化において有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与および対象をリンパ球低減処置に供することが、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を単独で投与することと比較して対象の中央生存期間を少なくとも約６ヵ月相乗的に増加させる、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
固形腫瘍が肝臓がん、胃がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、甲状腺がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、膵臓がん、脂肪肉腫、精巣非セミノーマ胚細胞がん、メラノーマ、副腎の腺腫、シュワン腫、悪性線維性組織球腫または食道がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体が、ＧＰＣ３のＣ末端への特異的結合を呈する抗原結合単位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗原結合単位が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に少なくとも９０％配列相同性を呈する配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲが、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０に少なくとも９０％配列同一性を呈する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲが、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０のいずれか１つに少なくとも９０％の配列同一性を呈する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が少なくとも２個の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が少なくとも３個の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０またはＩＣＯＳに由来するシグナル伝達ドメインから選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
リンパ球低減処置が、対象における制御性Ｔ細胞の量を低減することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
制御性Ｔ細胞の量を低減することが、対象における循環ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋細胞のフローサイトメトリー分析によって測定して、制御性Ｔ細胞の少なくとも約３０％の低減を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
リンパ球低減処置が、放射線または生物学的薬剤を対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
リンパ球低減処置が、化学療法を対象に投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法を対象に投与することが、シクロホスファミド、フルダラビン、エトポシド、シタラビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される化学療法剤を投与することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
化学療法剤が、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与に先行して対象に少なくとも１回投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
リンパ球低減処置が、全血球計算（ＣＢＣ）分析によって測定して、リンパ球の量を少なくとも約２０％低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の対象への２回目の投与をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
対象が難治性、持続性または進行性疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が対象に対して自己または同種異系である、請求項２に記載の方法。
【請求項２７】
抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞の投与と同時にまたはその後に少なくとも１つの免疫賦活剤を対象に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
免疫賦活剤が、アルデスロイキン（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＧＭ−ＣＳＦおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的薬剤が、リンパ球上に発現される抗原に対する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞の有効量；
（ｂ）対象に存在するリンパ球を低減するために有効な化学療法剤；および
（ｃ）化学療法剤の後にまたはそれと同時に対象に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための説明書
を含む、固形腫瘍を呈する対象に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するためのキット。
【請求項３１】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞（抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞）である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
化学療法剤が、シクロホスファミド、フルダラビン、エトポシド、シタラビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載のキット。
【請求項３３】
それを必要とする対象への投与のために製剤化された約６０ｍｇ／ｋｇから約８０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミドまたは約２５ｍｇ／ｍ２から約３５ｍｇ／ｍ２フルダラビンをさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３４】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞約１ｘ１０８個から約１ｘ１０１１個を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
説明書が、化学療法剤を投与した後に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための手順を提供する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３６】
説明書が、化学療法剤を投与した少なくとも１２時間後に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための手順を提供する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３７】
説明書が、化学療法剤を投与した少なくとも２４時間後に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための手順を提供する、請求項３１に記載のキット。
【請求項３８】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が静脈内注射のために製剤化されている、請求項３１に記載のキット。
【請求項３９】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が、固形腫瘍を含む対象の肝臓への動脈内注射のために製剤化されている、請求項３１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、ＣＮ特許出願第ＣＮ２０１６１０２５６５６８．９号、２０１６年４月２２日出願の利益を主張し、その内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんは、世界中で社会に強い影響を与えている。２０１６年には合衆国だけで推定１，６８５，２１０例のがんの新規症例が診断されており、５９５，６９０名が疾患のために死亡している。Journal of Oncology Practice (Erikson 2007)によると、２００５年における１１７０万名（２６名に１名）から、２０２０年までに、アメリカ人１８２０万名、およそ１９名に１名ががん患者または元がん患者となっているはずである。
【０００３】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、単一分子として、Ｔ細胞および他の免疫細胞の特異性および機能を再指定する、抗原に対する組換え受容体である。がん免疫療法におけるそれらを使用すると、活性免疫化の障害を回避して、腫瘍標的化Ｔ細胞を迅速に生成できるようになる。細胞で発現されるとＣＡＲ改変細胞は、対象において直ちに長期間効果を発揮できる。
【０００４】
がん患者のＴ細胞を彼らの腫瘍を認識するように編集するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞治療は、血液がんを処置するために有効であることが示されている。最近の臨床試験では、ＣＡＲ  Ｔ細胞治療は、進行した、他に処置不能な形態の白血病およびリンパ腫を有する血液がん患者の転帰を劇的に改善した。その反面、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、固形腫瘍においては特有の一連の課題に直面している。特に課題として、その発現が正常組織から腫瘍を明確に区別し、腫瘍内の腫瘍細胞の有効な殺滅およびそれによる腫瘍サイズの低減を確立する抗原の同定が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多種多様な固形腫瘍に対する代替的および有効な処置に対する緊急の必要性がある。本発明は、この必要性に対処し、関連する優位性も提供する。したがって本発明は、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を発現する場合がある固形腫瘍を呈する対象を処置する方法を開示する。一部の場合では方法は、抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞を対象に投与することを含む場合がある。一部の場合では投与は、対象をリンパ球低減処置に供した後またはそれと同時に行われてよい。一部の場合では免疫応答細胞は、ＮＫ細胞（抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  ＮＫ細胞）またはＴ細胞（抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞）であってよい。一部の場合では対象への抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与は、対象をリンパ球低減処置に供した後に行われてよい。一部の場合では抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞少なくとも約５ｘ１０４個／ｋｇが対象に投与されてよい。一部の場合では抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞約５ｘ１０４個から約１ｘ１０１２個／ｋｇが対象に投与される。投与は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定して、少なくとも３０％の腫瘍サイズの低減に有効であり得る。一部の場合では投与は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定して、腫瘍病変の直径のベースライン測定における１０％未満の変化として測定される、腫瘍サイズの安定化に有効であり得る。一部の場合では抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与および対象をリンパ球低減処置に供することは、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を単独で投与することと比較して対象の中央生存期間を少なくとも約６ヵ月相乗的に増加させことができる。一部の場合では固形腫瘍は、肝臓がん、胃がん、甲状腺がん（例えば、甲状腺癌）、肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、膵臓がん、脂肪肉腫、精巣非セミノーマ胚細胞がん、メラノーマ、副腎の腺腫、シュワン腫、悪性線維性組織球腫または食道がんである場合がある。一部の場合では抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体は、ＧＰＣ３のＣ末端への特異的結合を呈することができる抗原結合単位を含んでよい。一部の場合では抗原結合単位は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの配列相同性を呈する配列を含む場合がある。一部の場合では抗ＧＰＣ３−ＣＡＲは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０に少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの配列同一性を呈する配列を含む場合がある。抗ＧＰＣ３−ＣＡＲは、配列番号２８から３０のいずれか１つに少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８���％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの配列同一性を呈する配列を含む場合がある。一部の場合では抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、少なくとも２つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合がある。一部の場合では抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、少なくとも３つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む場合がある。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０またはＩＣＯＳに由来するシグナル伝達ドメインから選択されてよい。一部の場合ではリンパ球低減処置は、対象における制御性Ｔ細胞の量を低減することを含む場合がある。制御性Ｔ細胞の量を低減することは、対象における循環ＣＤ４＋およびＣＤ２５＋細胞のフローサイトメトリー分析によって測定して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い制御性Ｔ細胞の低減を含む場合がある。一部の場合ではリンパ球低減処置は、対象に放射線または生物学的薬剤を投与することを含む場合がある。リンパ球低減処置は、対象に化学療法を投与することを含む場合もある。対象への化学療法の投与は、シクロホスファミド、フルダラビン、エトポシド、シタラビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される化学療法剤を投与することを含む場合がある。一部の場合では化学療法剤は、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与に先行して対象に少なくとも１回投与されてよい。一部の場合ではリンパ球低減処置は、全血球計算（ＣＢＣ）分析によって測定して、リンパ球の量を少なくとも約２０％低減できる。
【０００６】
本明細書では、対象への抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の２回目の投与をさらに含む方法も開示される。一部の場合では対象は、難治性、持続性または進行性疾患を有する場合がある。抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、対象に対して自己または同種異系であってよい。
【０００７】
本明細書では、抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞の投与と同時またはその後に少なくとも１つの免疫賦活剤を対象に投与することをさらに含む方法も開示される。免疫賦活剤は、アルデスロイキン（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＧＭ−ＣＳＦおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてよい。生物学的薬剤は、リンパ球上に発現される抗原に対する抗体であってよい。
【０００８】
本明細書では、固形腫瘍を呈する対象に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するためのキットであって、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞の有効量；対象に存在するリンパ球を低減するために有効な化学療法剤；および、化学療法剤の後にまたはそれと同時に対象に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための説明書を含むキットが開示される。一部の場合では、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞（抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞）であってよい。化学療法剤は、シクロホスファミド、フルダラビン、エトポシド、シタラビン、メトトレキサート、ビンクリスチン、アドリアマイシンおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてよい。キットは、それを必要とする対象への投与のための製剤化された約６０ｍｇ／ｋｇから約８０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミドまたは約２５ｍｇ／ｍ２から約３５ｍｇ／ｍ２フルダラビンをさらに含んでよい。一部の場合ではキットは、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞約１ｘ１０４個から約１ｘ１０１２個を含んでよい。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した後に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための手順を提供できる。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも１２時間後に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための手順を提供できる。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも２４時間後に抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を投与するための手順を提供できる。抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、静脈内注射のために製剤化されてよい。抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、固形腫瘍を含む可能性がある対象の肝臓への動脈内注射のために製剤化されてよい。
【０００９】
参照による組込み
本明細書におけるすべての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許および特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるように同程度に参照により組み込まれる。本明細書における用語と組み込む参考文献における用語との間に矛盾がある場合、本明細書における用語が優先される。
【００１０】
図面の簡単な説明
本開示の新規特性は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載される。本開示の特性および優位性のより良い理解は、本開示の原理が利用され得る例示的実施形態を記載する次の詳細な記載およびその添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＧＰＣ３を標的化するキメラ抗原受容体をコードする第２世代ＣＡＲ−Ｔベクターを示す。
【図２】図２は、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを用いて処置された個体Ｈ０１、Ｈ０２またはＨ０３のリンパ球の対ベースラインレベル比を示す。
【図３】図３は、肝臓切片の処置前および後の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンを示す。
【図４】図４Ａは、３：１、１：１または１：３のエフェクター：標的比で、対照細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１と共培養された３３−２８ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺおよび４−２８ＢＢＺにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示し、図４Ｂは、第２の対照細胞株、ＣＨＯ−Ｋ１と共培養された３３−２８Ｚ、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺおよび９２−２８ＢＢＺにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。
【図５】図５Ａは、３：１、１：１または１：３のエフェクター：標的比で、ＧＰＣ３陽性肝臓がん細胞、Ｈｕｈ−７または、図５Ｂに示すとおりＧＰＣ３、ＣＨＯ−Ｋ１−ＧＰＣ３＋を発現するように形質導入した対照細胞と共培養された３３−２８ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺおよび４−２８ＢＢＺにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。
【図６】図６Ａは、ＨｅｐＧ２（ＨＣＣ）と共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。図６Ｂは、Ｈｅｐ３Ｂ（ＨＣＣ）と共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。図６Ｃは、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（肝細胞種）と（with or）共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。
【図７】図７Ａは、３：１、１：１または１：３のエフェクター：標的比で、Ｈｕｈ−７細胞と共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、３３−２８Ｚまたは３３−２８ＢＢＺにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。図７Ｂは、３：１、１：１または１：３のエフェクター：標的比で、胃癌細胞株ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞と共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、９２−２８Ｚまたは９２−２８ＢＢＺにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。
【図８】図８Ａは、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたマウスは、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置されたマウスと比較して腫瘍サイズが顕著に低減していたことを示す。図８Ｂは、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたＨｕｈ−７細胞を生着させたマウスは、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置されたマウスと比較して腫瘍サイズが顕著に低減していたことを示す腫瘍の画像を示す。図８Ｃは、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたマウスはまた、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置されたマウスと比較して腫瘍重量が顕著に低減していたことを示す。図８Ｄは、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたマウスはまた、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置されたマウスと比較して阻害が顕著に低減していたことを示す。
【図９】図９は、３：１または１：１のエフェクター：標的比で、Ｈｕｈ７（ＨＣＣ）細胞と共培養された種々の第２および第３世代抗ＧＰＣ３  ＣＡＲコンストラクト：４−２８Ｚ、４−２８ＢＢＺ、４−４−２８ＢＢＺ、４−１４−２８ＢＢＺ、４−２０−２８ＢＢＺ、４−３５−２８ＢＢＺ、４−４２−２８ＢＢＺのｃｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙの特異的溶解結果を示す。
【図１０】図１０Ａは、Ａ４３１（ＧＰＣ３ｎｅｇ）と共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、３３−２８Ｚ、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。図１０Ｂは、Ｈｕｈ−７（ＧＰＣ３ｐｏｓ）と共培養された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、３３−２８Ｚ、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックにおいて実施されたＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙを示す。ＣｙｔｏＴｏｘアッセイは、すべて３：１、１：１または１：３のエフェクター：標的比で実施された。
【図１１】図１１Ａは、異種移植マウスモデルの結果を示し、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたマウスは、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたはモックを用いて処置されたマウスと比較して腫瘍容量（ｍｍ３）が顕著に低減していた。図１１Ｂは、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたマウスは、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置されたマウスと比較して腫瘍重量が顕著に低減していたことを示す。図１１Ｃは、モック、９２−２８ＢＢＺまたは９２−２８Ｚ  ＣＡＲ−Ｔを用いて処置されたマウス由来の腫瘍の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
開示の詳細な記載
次の記載および実施例は、本開示の実施形態を詳細に例示する。本開示が本明細書に記載される具体的な実施形態に限定されず、したがって変化し得ることは理解される。当業者は、本開示の範囲内に包含される本開示の多数の変形形態および改変形態があることを認識する。他に示す場合を除いて任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わされてよい。
【００１３】
他に示す場合を除いて、本明細書において使用される、本明細書の一部の発明的実施形態は、数値範囲を検討する。本発明の種々の態様は範囲の形式で提示され得る。範囲の形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためだけであり、本発明の範囲への確固たる限定として解釈されるべきでないことは理解されるべきである。したがって範囲の記載は、具体的に開示されるすべての可能な部分的な範囲および範囲内の個々の数値を、明確に記載されたように含むと見なされるべきである。例えば１から６などの範囲の記載は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの具体的に開示される部分的な範囲、ならびに範囲内の個々の数、例えば１、２、３、４、５および６を含むと見なされるべきである。このことは範囲の幅に関わらず適用される。範囲が存在する場合、範囲は範囲の端点を含む。
【００１４】
定義
他に示す場合を除いて、本明細書において使用される冠詞「ａ」は、明確に他に規定される場合を除いて、１つまたは複数を意味する。
【００１５】
他に示す場合を除いて本明細書において使用される「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。
【００１６】
本明細書において使用される用語「活性化」およびその文法的同義語は、それにより細胞が静止状態から活性状態に移行するプロセスを指すことができる。このプロセスは、抗原への応答、遊走および／または、機能的に活性な状態への表現型的もしくは遺伝的変化を含む場合がある。例えば用語「活性化」は、Ｔ細胞活性化の段階的プロセスを指す場合がある。例えばＴ細胞は、完全に活性化するために少なくとも２つのシグナルを必要とし得る。第１のシグナルは抗原−ＭＨＣ複合体によるＴＣＲの会合後に生じる場合があり、第２のシグナルは共刺激分子の会合によって生じる場合がある（表３）。インビトロ（in vitro）で抗ＣＤ３は第１のシグナルを模倣でき、抗ＣＤ２８は第２のシグナルを模倣できる。例えば操作されたＴ細胞は、発現されたＣＡＲによって活性化される場合がある。本明細書において使用されるＴ細胞活性化」またはＴ細胞トリガーリングは、検出可能な細胞増殖（proliferation）、サイトカイン産生および／または検出可能なエフェクター機能を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す場合がある。
【００１７】
本明細書において使用される用語「抗原結合単位」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する（「免疫反応する」）抗原結合部位を含有する分子を指す。同様に用語「抗原結合単位」に包含されるのは、無脊椎動物および脊椎動物を含む種々の種由来の免疫グロブリン分子である。構造的に最も単純な天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって内部で繋がれている４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む。免疫グロブリンは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥなどの数種類の分子を含む分子の大きなファミリーを表す。用語「免疫グロブリン分子」として、例えばハイブリッド抗体または変更された抗体およびその断片が挙げられる。抗体の抗原結合機能が、天然に存在する抗体の断片によって実施され得ることは示されている。これらの断片は、集合的に「抗原結合単位」と称される。同様に用語「抗原結合単位」に包含されるのは、エピトープにフィットしそれを認識する特定の形状を有し、１つまたは複数の非共有結合相互作用が分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する、任意の、ポリペプチド鎖を含有する分子構造である。
【００１８】
ポリペプチドまたは他の物質を含む他の参照抗原にそれが結合するよりも大きな親和性または結合活性で結合する場合、抗原結合単位は、抗原に「特異的に結合する」または「免疫反応性である」。
【００１９】
本明細書において使用される「抗原」は、抗原結合単位が特異的に認識および結合する物質を意味する。抗原として、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖および脂質；これらの一部およびこれらの組合せが挙げられる。非限定的な例示的抗原として、ヒト、マウス由来のＧＰＣ３およびこれらの他のホモログが挙げられる。「抗原」は、免疫応答を誘発する分子も指す場合がある。この免疫応答は、抗体産生もしくは特定の免疫学的コンピテント細胞の活性化、または両方を含む場合がある。当業者は、実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の巨大分子が抗原として作用できることを理解する。
【００２０】
本明細書において使用される用語「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指すことができる。Ｂ細胞によって発現される抗体は、キメラ抗原受容体または抗原受容体と称される場合がある。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーはＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥであり、その内ＩｇＧは最も一般的な循環抗体である。それは、凝集、補体の固定および他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。例えば腫瘍細胞抗原は、ＣＡＲによって認識される場合がある。
【００２１】
用語「抗ＧＰＣ３抗体」は、細胞によって発現される他の抗原からＧＰＣ３を区別するために抗体が有用であるような十分な親和性でＧＰＣ３に結合できる抗体または抗体結合部位を指すことができる。一実施形態では無関係な、非ＧＰＣ３タンパク質への抗ＧＰＣ３抗体の結合の程度は、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって測定して、ＧＰＣ３への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態ではＧＰＣ３に結合する抗体は、＜１μΜ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜５ｎＭ、＜４ｎＭ、＜３ｎＭ、＜２ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭまたは＜０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する場合がある。ある特定の実施形態では抗ＧＰＣ３抗体は、さまざまな種由来のＧＰＣ３内で保存されているＧＰＣ３のエピトープに結合する。
【００２２】
本明細書において使用される用語「自己」およびその文法的同義語は、同じ存在から由来することを指すことができる。例えば試料（例えば細胞）は、除かれ、処理され、同じ対象（例えば患者）に後に戻されてよい。自己プロセスは、ドナーとレシピエントとが異なる対象である同種異系プロセスとは区別される。
【００２３】
本明細書において使用される「異種移植」およびその文法的同義語は、レシピエントへの移植、インプラントまたは細胞、組織もしくは器官の注入を含み、レシピエントとドナーとが異なる種である任意の手順を包含できる。本明細書に記載される細胞、器官および／または組織の移植は、ヒトへの異種移植のために使用されてよい。異種移植として、これだけに限らないが血管柄付き（vascularized）異種移植、部分血管柄付き（partially vascularized）異種移植、血管柄付きでない（unvascularized）異種移植、異種ドレッシング（xenodressing）、異種バンテージ（xenobandages）および異種構造（xenostructures）が挙げられる。
【００２４】
本明細書において使用される「同種移植」およびその文法的同義語（例えば同種異系移植）は、レシピエントへの移植、インプラントまたは細胞、組織もしくは器官の注入を含み、レシピエントとドナーとが同じ種だが異なる個体である任意の手順を包含できる。本明細書に記載される細胞、器官および／または組織の移植は、ヒトへの同種移植のために使用されてよい。同種移植として、これだけに限らないが血管柄付き同種移植、部分血管柄付き同種移植、血管柄付きでない同種移植、同種ドレッシング（allodressing）、同種バンテージ（allobandages）および同種構造（allostructures）が挙げられる。
【００２５】
本明細書において使用される「自家移植」およびその文法的同義語（例えば、自己移植）は、レシピエントへの移植、インプラントまたは細胞、組織もしくは器官の注入を含み、レシピエントとドナーとが同じ個体である任意の手順を包含できる。本明細書に記載される細胞、器官および／または組織の移植は、ヒトへの自家移植のために使用されてよい。自家移植として、これだけに限らないが血管柄付き自家移植、部分血管柄付き自家移植、血管柄付きでない自家移植、自家ドレッシング（autodressing）、自家バンテージ（autobandages）および自家構造（autostructures）が挙げられる。
【００２６】
本明細書において使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、これだけに限らないがＴ細胞が挙げられる免疫細胞によって発現され得る操作された分子を指す。Ｔ細胞において発現される場合ＣＡＲは、この人工受容体によって特異性が指定されるかたちで、標的細胞の殺滅を誘導するようにＴ細胞の対象を再指定することができる。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウス、ヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体に由来してよい。「抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ」は、ＧＰＣ３に結合できるＣＡＲである。
【００２７】
本明細書において使用される用語「エピトープ」およびその文法的同義語は、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞または操作された細胞によって認識され得る抗原の一部を指すことができる。例えばエピトープはＴＣＲによって認識されるがんエピトープであってよい。抗原内の複数のエピトープも認識され得る。エピトープは、突然変異される場合もある。
【００２８】
本明細書において使用される用語「操作された」およびその文法的同義語は、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸の１つまたは複数の変更を指すことができる。用語「操作された」は遺伝子の変更、付加および／または欠失を指すことができる。操作された細胞は、付加された、欠失されたおよび／または変更された遺伝子を有する細胞も指すことができる。
【００２９】
本明細書において使用される用語「細胞」または「操作された細胞」およびそれらの文法的同義語は、ヒトまたは非ヒト動物由来の細胞を指すことができる。操作された細胞は、ＣＡＲ発現細胞を指すこともできる。
【００３０】
本明細書において使用される用語「医薬品及び医薬部外品の製造管理および品質管理の基準」（ＧＭＰ）およびその文法的同義語は、ＦＤＡにより安全、有効または純粋である製品を指すことができる。ＧＭＰは、「ｃＧＭＰ」と称される場合もある。「ｃ」は「現在（ｃｕｒｒｅｎｔ）」を表している。製品の製造者は、ＧＭＰ製品の規制に適合するために最新の技術およびシステムを使用する場合がある。ＧＭＰ適合製品は、研究設定とは対照的な臨床設定において典型的には利用される。
【００３１】
本明細書において使用される用語「トランスフェクション」は、真核細胞への外来核酸の導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入法、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染および微粒子銃が挙げられる当技術分野において周知の種々の手段によって達成されてよい。
【００３２】
用語「安定トランスフェクション」または「安定にトランスフェクトされた」は、外来核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡの、トランスフェクトされる細胞のゲノムへの導入または組込みを指す。用語「安定トランスフェクタント」は、ゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた外来ＤＮＡを有する細胞を指す。
【００３３】
本明細書において使用される用語「コードする核酸分子」「コードするＤＮＡ配列」および「コードするＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。それにより核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００３４】
本明細書において使用される用語「対象」は、任意の動物、例えば哺乳動物または有袋類を指す。本発明の対象として、これだけに限らないがヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザルまたは他の種類のマカク）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラットおよび任意の種類の家禽が挙げられる。
【００３５】
本明細書において使用される用語「レシピエント」およびそれらの文法的同義語は、治療または処置を受けるヒトまたは非ヒト動物を指すことができる。
【００３６】
本明細書において使用される用語「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）およびその文法的同義語は、血液（例えば、末梢血）中を循環しているリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は器官に局在しないリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【００３７】
用語「免疫応答細胞」は、これだけに限らないがＴ細胞、Ｂ細胞およびＮＫＴ細胞、これらそれぞれの前駆体細胞およびこれらの後代が挙げられる、免疫応答を誘発できる細胞を指すことができる。免疫応答細胞は、リンパ性または骨髄性細胞系譜の細胞も指す場合がある。
【００３８】
本明細書において使用される用語「Ｔ細胞」およびその文法的同義語は、任意の由来のＴ細胞を指してよい。例えばＴ細胞は、初代Ｔ細胞、例えば自己Ｔ細胞、細胞株などであってよい。Ｔ細胞は、ヒトまたは非ヒトであってよい。
【００３９】
本明細書において使用される用語「Ｔ細胞活性化」または「Ｔ細胞トリガーリング」およびその文法的同義語は、検出可能な細胞増殖、サイトカイン産生および／または検出可能なエフェクター機能を誘導するように十分に刺激されたＴ細胞の状態を指すことができる。一部の場合では「完全Ｔ細胞活性化」は、Ｔ細胞傷害性をトリガーすることに類似する場合がある。Ｔ細胞活性化は、当技術分野において周知の種々のアッセイを使用して測定することができる。前記アッセイは、サイトカイン分泌を測定するためのＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン（ＣＤ１０７）発現を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、増殖を測定するためのフローサイトメトリーアッセイおよび標的細胞排除を判定するための細胞傷害性アッセイ（５１Ｃｒ放出アッセイ）であってよい。前記アッセイは、対照と比較した操作された細胞の相対的活性化を判定するために、操作された細胞（ＣＡＲ  Ｔ）を比較するための対照（非操作細胞）を典型的には使用する。追加的に前記アッセイは、標的抗原を発現しない標的細胞とインキュベートしたまたは接触させた操作された細胞を比較できる。例えば前記比較は、ＣＤ１９を発現しない標的細胞と共にインキュベートしたＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞であってよい。
【００４０】
用語「配列」およびその文法的同義語は、ヌクレオチド配列を指して使用される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含でき；１本鎖または２本鎖のいずれであってもよい。核酸配列は突然変異される場合がある。核酸配列は、任意の長さ、例えば２から１，０００，０００以上の間のヌクレオチド長（またはこれらの間もしくはこれを超える任意の整数値）、例えば約１００から約１０，０００ヌクレオチドの間または約２００から約５００ヌクレオチドの間であってよい。
【００４１】
使用方法
一態様では本明細書では、グリピカン−３（ＧＰＣ３）を発現する固形腫瘍を呈している対象を処置する方法が開示される。主題の方法は、抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞を対象に投与するステップであって、投与が対象をリンパ球低減処置に供した後またはそれと同時に行われるステップを典型的には含む。
【００４２】
本明細書において開示される方法によって処置される対象は、がんまたは固形腫瘍を呈する場合がある。しばしば、がん細胞または固形腫瘍細胞は、１つまたは複数の腫瘍抗原を発現する。典型的には腫瘍抗原は、グリピカン−３（ＧＰＣ３）である。ＧＰＣ−３を発現するがんまたは固形腫瘍を呈する対象は、ＧＰＣ３陽性がんを呈していると称される場合がある。
【００４３】
ＧＰＣ３を発現するがんとして、これだけに限らないが肝臓がん、胃がん、食道がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん、卵巣がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、膵臓がん、脂肪肉腫、精巣非セミノーマ（noneminomatous）胚細胞がん、メラノーマ、腺腫、副腎がん、シュワン腫、悪性、線維性組織球腫（fibrous histiochytoma）またはこれらの任意の組合せが挙げられる。主題の方法は扁平細胞癌または腺癌、胃腸管の神経内分泌癌、または"Glypican-3 expression in gastrointestinal and pancreatic epithelial neoplasms. (2013) 44, 542-550 Human Pathology."において開示の任意の他のがんを処置するために適用できる。追加的に本明細書で開示される抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ−Ｔなどの本明細書で開示される免疫応答細胞は、卵巣癌、胆管細胞癌、中皮腫、乳がん、ランチ（lunch）の扁平細胞癌、子宮頸部上皮内（intraethithelial）新生物、子宮頸部の扁平細胞癌、肝内および肝外がん、胆嚢癌、侵襲性腺管癌、明細胞癌、オンコサイトーマ、乳頭癌、腺癌、乳頭癌ならびに乳房の小葉および髄質癌を標的化するために利用することができる。抗ＧＰＣ３治療のための追加的標的として、"Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues. (2008) 129:899-906 Am J ClinPathol."に見出されるものが挙げられる。
【００４４】
一部の場合ではがんまたは腫瘍細胞は、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によってＧＰＣ３発現について評価される場合がある。がんまたは腫瘍細胞でのＧＰＣ３のレベルは、低、中または高に分類される。
【００４５】
一部の場合ではがんまたは腫瘍細胞は、細胞表面上にＧＰＣ３を発現できる。細胞表面上でのＧＰＣ３の発現は、免疫組織化学またはフローサイトメトリー分析などの方法において、例えばＧＰＣ３に対する抗体を使用して判定できる。代替的にＧＰＣ３  ｍＲＮＡ発現は、細胞表面上でのＧＰＣ３発現に相関すると考えられ、インサイツハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲから選択される方法によって判定することができる。
【００４６】
一部の場合ではＧＰＣ３は、表２中の参照遺伝子に少なくとも５０％配列同一性を呈する核酸配列を含む遺伝子によってコードされる。ＧＰＣ３は、表２中の参照遺伝子に少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの配列同一性を呈する核酸配列を含む遺伝子によってコードされてよい。
【００４７】
一部の実施形態では抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体免疫応答細胞は、ＧＰＣ３を発現する固形腫瘍を呈する対象に、対象をリンパ球低減処置に供した後またはそれと同時に投与される。
【００４８】
主題の抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合領域、膜貫通ドメインおよび免疫応答細胞活性化を調節する細胞内シグナル伝達領域を典型的には含む。一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲは、ヒンジまたはスペーサーをさらに含む。一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む。
【００４９】
キメラ抗原受容体は、細胞外抗原結合領域を典型的には含む。一実施形態では細胞外抗原結合領域は、完全にヒトであってよい。他の場合では細胞外抗原結合領域は、ヒト化されてよい。他の場合では細胞外抗原結合領域は、マウスまたは、細胞外抗原結合領域が少なくとも２種の異なる動物種に由来するアミノ酸配列からなるキメラであってよい。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、非ヒトであってよい。種々の抗原結合領域は、ＧＰＣ３を標的化するように設計されてよい。非限定的例として、抗体に由来する１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ’）、ライブラリーから選択される断片抗原結合領域（Ｆａｂ）、単一ドメイン断片またはそれらの同族受容体に会合する天然リガンドが挙げられる。細胞外抗原結合領域は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは天然リガンドおよびこれらの誘導体のいずれかを包含できる。細胞外抗原結合領域は、インタクト抗体の一部を含む場合があり、インタクト抗体が結合する抗原に結合できるインタクト抗体以外の分子を指す場合がある。抗体断片の例として、これだけに限らないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；直鎖状抗体；１本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。
【００５０】
細胞外抗原結合領域、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは天然リガンドは、抗原特異性を決定するＣＡＲの一部であってよい。細胞外抗原結合領域は、任意の相補性標的に結合できる。細胞外抗原結合領域は、可変領域の配列が周知である抗体に由来してよい。細胞外抗原結合領域は、入手可能なマウス融合細胞から得た抗体配列に由来してよい。代替的に細胞外抗原結合領域は、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）などの腫瘍細胞または初代細胞の全エクソーム配列決定から得ることができる。
【００５１】
一部の場合では細胞外抗原結合領域の結合特異性は、相補性決定領域または、軽鎖ＣＤＲもしくは重鎖ＣＤＲなどのＣＤＲによって決定され得る。多くの場合、結合特異性は、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲによって決定され得る。重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲとの所与の組合せは、他の参照抗原と比較してＧＰＣ３などの抗原に対してより大きな親和性および／または特異性を付与できる所与の結合ポケットを提供できる。例えばグリピカン−３に特異的なＣＤＲは、ＧＰＣ３を標的化するＣＡＲがＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞に免疫応答細胞を標的化できるように、ＣＡＲの細胞外結合領域において発現されてよい。
【００５２】
本明細書において開示される実施形態のいずれかの一部の態様では、ｓｃＦｖなどの細胞外抗原結合領域は、ＧＰＣ３に特異的な軽鎖ＣＤＲを含んでよい。軽鎖ＣＤＲは、ＣＡＲのｓｃＦｖなどの抗原結合単位の軽鎖の相補性決定領域であってよい。軽鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、またはフレームワーク領域などの非相補性決定領域によって分離され、かつ近接されてもよいアミノ酸残基の２つ以上の連続する配列を含んでよい。一部の場合では軽鎖ＣＤＲは、軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２などと称され得る２つ以上の軽鎖ＣＤＲを含んでよい。一部の場合では軽鎖ＣＤＲは、それぞれ軽鎖ＣＤＲ−１、軽鎖ＣＤＲ−２および軽鎖ＣＤＲ−３と称され得る３つの軽鎖ＣＤＲを含むことができる。一部の例では一般的軽鎖に存在するＣＤＲの群は、集合的に軽鎖ＣＤＲと称される場合がある。
【００５３】
本明細書において開示される実施形態のいずれかの一部の態様では、ｓｃＦｖなどの細胞外抗原結合領域は、ＧＰＣ３に特異的な重鎖ＣＤＲを含む場合がある。重鎖ＣＤＲは、ｓｃＦｖなどの抗原結合単位の重鎖の相補性決定領域であってよい。重鎖ＣＤＲは、アミノ酸残基の連続配列、またはフレームワーク領域などの非相補性決定領域によって分離され、かつ近接されてもよいアミノ酸残基の２つ以上の連続する配列を含んでよい。一部の場合では重鎖ＣＤＲは、重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２などと称され得る２つ以上の重鎖ＣＤＲを含んでよい。一部の場合では重鎖ＣＤＲは、それぞれ重鎖ＣＤＲ−１、重鎖ＣＤＲ−２および重鎖ＣＤＲ−３と称され得る３つの重鎖ＣＤＲを含んでよい。一部の例では一般的重鎖に存在するＣＤＲの群は、集合的に重鎖ＣＤＲと称される場合がある。
【００５４】
一部の場合では細胞外抗原結合領域標的化ＧＰＣ３は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞によって発現され得る。一部の場合ではＧＰＣ３抗原に結合するＣＤＲ、軽鎖および／または重鎖は、ＣＡＲ  Ｔ細胞などのＣＡＲ免疫応答細胞の細胞外抗原結合領域内に含まれてよい。一部の場合では改変抗ＧＰＣ３  ＣＤＲは、ＣＡＲ免疫応答細胞の細胞外抗原結合領域上に発現されてよく、元の抗ＧＰＣ３  ＣＤＲに約５０％相同性から約１００％相同性を有する。一部の場合では改変抗ＧＰＣ３  ＣＤＲは、未改変抗ＧＰＣ３  ＣＤＲに約５０％から５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの相同性を有する場合がある。
【００５５】
一部の場合ではｓｃＦｖ標的化ＧＰＣ３は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞によって発現される場合がある。一部の場合ではＧＰＣ３抗原に結合するＣＤＲ、軽鎖および／または重鎖は、ＣＡＲ  Ｔ細胞などのＣＡＲ免疫応答細胞のｓｃＦｖ上に発現されてよい。一部の場合では改変抗ＧＰＣ３  ＣＤＲは、ＣＡＲ  Ｔ細胞などのＣＡＲ免疫応答細胞のｓｃＦｖ上に発現されてよく、元の抗ＧＰＣ３  ＣＤＲに約５０％相同性から約１００％相同性を有する。一部の場合では改変抗ＧＰＣ３  ＣＤＲは、未改変抗ＧＰＣ３  ＣＤＲに約５０％から５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの相同性を有する場合がある。
【００５６】
表1:例示的抗GPC3細胞外抗原結合領域:
【表１】
2019515913.tif 000003
【００５７】
好ましい場合では細胞外抗原結合領域は、ＧＰＣ３を特異的に認識する。ＧＰＣ３は、表２の参照ＧＰＣ３遺伝子に少なくとも８０％同一性を呈する配列を含み得る。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、Ｎ末端、Ｃ末端またはＧＰＣ３のＮ末端からＣ末端の任意の部分を標的化できる。ＧＰＣ３のＣ末端は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して共有結合で細胞膜に付加され得る。Ｃ末端は、一部の場合では約１から約８００塩基を含んでよい。Ｃ末端は、Ｃ末端から約１、５０、１００、１５０、３００、５００、６００から約８００塩基までを含む場合がある。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、ＧＰＣ３のＧＰＩアンカーを標的化する場合がある。
【００５８】
表2: GPC3
【表２】
2019515913.tif 000004
【００５９】
遺伝子操作を使用することによって、細胞外抗原結合領域は種々の方法で改変できる。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、その標的へのより高い親和性について選択され得るように突然変異されてよい。一部の場合では、その標的に対する細胞外抗原結合領域の親和性は、正常組織では低レベルで発現される場合がある標的に対して最適化されてよい。この最適化は、潜在的毒性を最小化するために実施されてよい。他の場合では、標的の膜結合形態に対してより高い親和性を有する細胞外抗原結合領域のクローニングは、その可溶型対応物より好ましい場合がある。この改変は、一部の標的がさまざまなレベルで可溶型中にも検出される場合があり、それらの標的化が意図しない毒性を生じる場合があることから実施されてよい。
【００６０】
一部の場合では細胞外抗原結合領域は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８のいずれか１つに相同性で約５０％から約１００％類似であってよい。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの相同性を有する場合がある。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、マウス、ヒト化または完全ヒトであってよい。細胞外抗原結合領域は、約１％から約１００％ヒトであってよい。一部の場合では細胞外抗原結合領域は、約１０％から２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％までヒトであってよい。
【００６１】
一部の場合では細胞外抗原結合領域は、ヒンジまたはスペーサーを含む。用語ヒンジおよびスペーサーは、互換的に使用される場合がある。ヒンジは、細胞外抗原結合領域に可動性を提供するように使用されるＣＡＲの一部と見なすことができる。一部の場合ではヒンジは、特に細胞外抗原結合領域を検出するための抗体が機能性でないまたは入手できない場合に、細胞の細胞表面上のＣＡＲを検出するために使用できる。例えば免疫グロブリンに由来するヒンジの長さは、細胞外抗原結合領域が標的化する標的上のエピトープの位置に応じた最適化を必要とする場合がある。
【００６２】
一部の場合ではヒンジは、免疫グロブリンに属さないが代わりにＣＤ８アルファ分子の天然ヒンジなどの別の分子に属し得る。ＣＤ８アルファヒンジは、ＣＤ８共受容体とＭＨＣ分子との相互作用において役割を演じることが周知であるシステインおよびプロリン残基を含有できる。前記システインおよびプロリン残基は、前記ＣＡＲの性能に影響を与える場合がある。
【００６３】
ＣＡＲヒンジは、サイズ調節可能であってよく、ＣＡＲ免疫応答細胞と標的細胞との間の直行シナプス距離（orthogonal synapse distance）が正常化されるようにある程度補うことができる。免疫応答細胞と標的細胞との間の免疫学的シナプスのこのトポグラフィーは、短いヒンジのＣＡＲであってもシナプス距離をシグナル伝達のために接近させることができない、細胞表面標的分子上の膜から遠いエピトープのためにＣＡＲによって機能性に架橋されることができない距離も規定する。同様に、シグナル伝達出力が、長いヒンジのＣＡＲの場合だけ観察される、膜に近いＣＡＲ標的抗原エピトープが記載されている。ヒンジは、使用される細胞外抗原結合領域により調節されてよい。ヒンジは、任意の長さであってよい。
【００６４】
膜貫通ドメインは、ＣＡＲを細胞の原形質膜にアンカーできる。ＣＤ２８の天然膜貫通部分は、ＣＡＲにおいて使用されてよい。他の例ではＣＤ８アルファの天然膜貫通部分は、ＣＡＲにおいても使用されてよい。「ＣＤ８」によって、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００１７５９に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一性を有するタンパク質または、刺激性活性を有するその断片を意味することができる。「ＣＤ８核酸分子」によって、ＣＤ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意味されてよい。一部の場合では膜貫通領域は、ＣＤ２８の天然膜貫通部分であってよい。「ＣＤ２８」によって、ＮＣＢＩ参照番号：ＮＰ＿００６１３０に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一性を有するタンパク質または刺激性活性を有するその断片が意味されてよい。「ＣＤ２８核酸分子」によって、ＣＤ２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意味されてよい。一部の場合では膜貫通部分は、ＣＤ８α領域を含んでよい。
【００６５】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、ＣＡＲが存在する免疫応答細胞のエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与できる。ＣＡＲは、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であってよいＴ細胞のエフェクター機能を誘導できる。したがって用語細胞内シグナル伝達領域は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を特定の機能を実施するように導くタンパク質の一部を指す。通常細胞内シグナル伝達領域全体が使用され得るが、多くの場合、シグナル伝達ドメインの鎖全体を使用する必要はない。一部の場合では、細胞内シグナル伝達領域のトランケートされた一部が使用される。一部の場合では、したがって用語細胞内シグナル伝達領域は、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な細胞内シグナル伝達領域の任意のトランケートされた部分を含意することが意図される。
【００６６】
ＣＡＲにおける使用のためのシグナル伝達ドメインの好ましい例として、標的受容体会合に続いてシグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質性配列および共受容体、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および、同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられる。
【００６７】
一部の場合では前記細胞内シグナル伝達領域は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）としても周知であるシグナル伝達モチーフを含有する場合がある。細胞質性シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄ由来のものが挙げられる。しかし好ましい実施形態では細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖由来である。
【００６８】
１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフを含有するＴ細胞シグナル伝達ドメインの例は、ＣＤ３ゼータドメインであり、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖またはＣＤ２４７としても周知である。このドメインは、Ｔ細胞受容体ＣＤ３複合体の一部であり、抗原認識を、Ｔ細胞の主要なエフェクター活性化を伴ういくつかの細胞内シグナル伝達経路にカップリングすることにおいて重要な役割を演じている。本明細書において使用される、ＣＤ３ゼータとは、主に、ヒトＣＤ３ゼータ、および実質的に同一の配列を有するタンパク質を含め、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｐ２０９６３由来として周知のそのアイソフォームを指す。キメラ抗原受容体の一部として、完全Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖全体はやはり必要とされず、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含むその任意の誘導体は、その任意の機能性等価物を含めて、好適である。
【００６９】
細胞内シグナル伝達ドメインは、表３のドメインのいずれか１つから選択されてよい。一部の場合ではドメインは、参照ドメインのいずれか１つへの相同性が約５０％から約１００％であり得るように改変されてよい。表３のドメインのいずれか１つは、改変バージョンが約５０から６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または約１００％までの相同性を有することができるように改変されてよい。
【００７０】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達領域は、１つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む場合がある。細胞内シグナル伝達領域は、単一の共刺激ドメイン、例えばゼータ鎖（第１世代ＣＡＲ）、またはＣＤ２８もしくは４−１ＢＢ（第２世代ＣＡＲ）を含んでよい。他の例では細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８／ＯＸ４０またはＣＤ２８／４−１ＢＢ（第３世代）などの２つの共刺激ドメインを含んでよい。
【００７１】
ＣＤ８などの細胞内シグナル伝達ドメインと共に、これらの共刺激ドメインは、遺伝子転写および機能性細胞応答を支持するキナーゼ経路の下流活性化をもたらすことができる。ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＤ２８（ホスファチジルイノシトール−４、５−二リン酸３−キナーゼ）または４−１ＢＢ／ＯＸ４０（ＴＮＦ受容体関連因子アダプタータンパク質）経路のいずれかならびにＭＡＰＫおよびＡｋｔ活性化に関連する近傍のシグナル伝達タンパク質を活性化できる。
【００７２】
一部の場合では、ＣＡＲを通じて生成されたシグナルは、第２のまたは共刺激シグナルと組み合わされてよい。共刺激シグナル伝達ドメインに関しては、キメラ抗原受容体様複合体は、いくつかの潜在的な共刺激シグナル伝達ドメインを含むように設計されてよい。当技術分野において十分周知のとおり、ナイーブＴ細胞では、Ｔ細胞受容体の単なる会合はＴ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞への完全な活性化を誘導するためには不十分である。完全で生産性のＴ細胞活性化は、第２の共刺激シグナルを必要とする。Ｔ細胞活性化のための共刺激を提供することが報告されているいくつかの受容体として、これだけに限らないがＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢＬ、ＭｙＤ８８および４−１ＢＢが挙げられる。これらの共刺激分子によって利用されるシグナル伝達経路は、主要なＴ細胞受容体活性化シグナルと相乗的に作用する共通の特性を共有している。これらの共刺激シグナル伝達領域は、１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフ、例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに由来する主要なエフェクター活性化シグナルと相乗的であることができ、Ｔ細胞の活性化のための要件を満たすことができるシグナルを提供する。
【００７３】
一部の場合ではキメラ抗原受容体様複合体への共刺激ドメインの付加は、操作された細胞の有効性および持続性を増強できる。別の実施形態ではＴ細胞シグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインは、互いに融合され、それによりシグナル伝達領域を構成する。
【００７４】
表3.共刺激ドメイン
【表３】
2019515913.tif 000005
【００７５】
一部の場合では主題のＣＡＲは、配列番号９から配列番号１３のいずれか１つに約５０％から約１００％配列同一性を呈する配列またはその一部を含むことができる、表４。一部の場合では主題のＣＡＲは、配列番号９から配列番号１３のいずれか１つに約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの配列同一性を呈する配列を含むことができる。
【００７６】
表4:例示的ヒンジ、膜貫通、細胞内ドメインを包含するCAR-Tドメイン:
【表４】
2019515913.tif 000006
【００７７】
一部の場合では主題のＣＡＲは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０のいずれか１つに約５０％から約１００％配列同一性を呈する配列を含んでよい（表５）。一部の場合では主題のＣＡＲは、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５または配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９または配列番号３０のいずれか１つに約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％までの配列同一性を呈する配列を含んでよい。
【００７８】
表5:例示的抗GPC3 CAR
【表５】
2019515913.tif 000007
【００７９】
一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲは、次の特徴の少なくとも１つまたは複数を任意の組合せで有する場合がある：ａ）組換えヒトＧＰＣ３に結合する；ｂ）組換えカニクイザルＧＰＣ３に結合する；ｃ）ＨｅｐＧ２細胞の表面上の内在性ＧＰＣ３に結合する；ｄ）２９３細胞の表面上に発現されるカニクイザルＧＰＣ３に結合する；ｅ）がん細胞の表面上の内在性ＧＰＣ３に結合する；ｆ）肝細胞癌細胞の表面上の内在性ＧＰＣ３に結合する；ｇ）ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７およびＪＨＨ−７から選択される細胞株の細胞の表面上の内在性ＧＰＣ３に結合する；ｈ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸２５から１３７内のエピトープに結合する；ｉ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸Ｒ３５８／Ｓ３５９でのフューリン切断部位にわたるエピトープに結合する；ｊ）全長成熟ヒトＧＰＣ３に結合するが、ヒトＧＰＣ３のＮ末端断片またはヒトＧＰＣ３のＣ末端断片に結合しない  ｋ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４２０から４７０内のエピトープに結合する；ｌ）ヒトＧＰＣ３のアミノ酸４７０から５０９内のエピトープに結合する；ｍ）ヒトＧＰＣ３への結合について抗体７Ｈ１と競合する；ｎ）ヒトＧＰＣ３への結合について抗体４Ｇ７と競合する；ｏ）ヒトＧＰＣ３への結合について抗体１５Ｇ１と競合する；ヒトＧＰＣ３のＣ末端断片に結合する；および／またはｐ）ヒトＧＰＣ３への結合について抗体４Ａ１１と競合する。
【００８０】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲをコードする導入遺伝子は、細胞に組み込まれてよい。例えば導入遺伝子は、Ｔ細胞などの免疫応答細胞に組み込まれてよい。細胞に挿入される場合、導入遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のコピーである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）セグメント、またはゲノムＤＮＡ（イントロンを含むまたは含まない）の元の領域に存在する遺伝子それ自体のいずれかであってよい。
【００８１】
導入遺伝子配列をコードする核酸、例えばＤＮＡは、細胞の染色体に無作為に挿入されてよい。無作為な組込みは、核酸、例えばＤＮＡを細胞に導入する任意の方法によって生じてよい。例えば方法は、これだけに限らないが、電気穿孔法、ソノポレーション、遺伝子銃の使用、リポトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマーの使用、微量注入法ならびにアデノウイルス、ＡＡＶおよびレトロウイルスベクターが挙げられるウイルスベクターの使用ならびに／またはグループＩＩリボザイムであってよい。
【００８２】
導入遺伝子をコードするＤＮＡは、電気穿孔法を介して細胞に導入されてよい。ＤＮＡは、リポフェクション、感染または形質転換を介して細胞に導入されてもよい。電気穿孔法および／またはリポフェクションは、初代細胞をトランスフェクトするために使用できる。電気穿孔法および／またはリポフェクションは、初代造血細胞をトランスフェクトするために使用できる。ＤＮＡは、相同組換えの使用を伴わずに細胞ゲノムに導入されてもよい。一部の場合ではＤＮＡは、ゲノム中の標的化二重鎖切断領域に相補的である操作された部位によって近接されていてよい。一部の場合ではＤＮＡは、ポリ核酸から切り出されてよく、それにより相同組換えを伴わずに二重鎖切断領域に挿入されてよい。
【００８３】
挿入される導入遺伝子は、ポリ核酸から導入遺伝子を切り出すためにゲノム中の標的化二重鎖切断部位に類似する操作された部位に近接されていてよく、それにより二重鎖切断領域に挿入され得る。
【００８４】
導入遺伝子をコードするＤＮＡは、レポーター遺伝子を含むように設計されてもよく、それにより導入遺伝子またはその発現産物の存在はレポーター遺伝子の活性化を介して検出できる。上に開示されたものなどの任意のレポーター遺伝子を使用できる。レポーター遺伝子が活性化されたこれらの細胞を細胞培養中で選択することによって、導入遺伝子を含有する細胞を選択できる。
【００８５】
ＣＡＲの発現は、発現アッセイ、例えばｑＰＣＲまたはＲＮＡのレベルを測定することによって確認され得る。発現レベルは、コピー数の指標でもあり得る。例えば発現レベルが極めて高い場合、これは、ＣＡＲの１つより多いコピーがゲノムに組み込まれたことを示す可能性がある。代替的に高発現は、導入遺伝子が高度に転写される領域、例えば高発現プロモーター近くに組み込まれたことを示す可能性がある。発現は、ウエスタンブロッティングを通じてなど、タンパク質レベルを測定することによっても確認できる。
【００８６】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。１つまたは複数の導入遺伝子は、抗原上の少なくとも１つのエピトープ（例えば、ＧＰＣ３）を認識し、結合する、または抗原上の突然変異エピトープに結合するＣＡＲタンパク質を発現できる。ＣＡＲは、機能性ＣＡＲであってよい。主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、１つまたは複数のＣＡＲも含んでよく、または単一のＣＡＲおよび第２の操作された受容体を含んでよい。
【００８７】
導入遺伝子は、自殺遺伝子をコードできる。がん患者での多数の有効な処置において明らかなとおり、ＣＡＲ免疫応答細胞への応答における目的の腫瘍退縮は、毒性に付随して生じる場合がある。一部の場合ではＣＡＲ免疫応答細胞は、腫瘍と正常組織との間を、標的化抗原がそれらの間で共有されている場合に区別できない場合がある（「オン標的／オフ腫瘍」毒性）。他の場合では、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）としても周知の全身性の免疫系の撹乱が生じる場合がある。前記ＣＲＳは、ＣＡＲ免疫応答細胞の急速なインビボ（in vivo）増殖（expansion）の結果である可能性がある全身性の炎症性応答症候群またはサイトカインストームを含む場合がある。ＣＲＳは、発熱および、重度の場合多臓器不全をもたらす場合がある低血圧によって特徴付けられる状態である。多くの場合、前記毒性は、注入されたＣＡＲ免疫応答細胞のインビボ増殖と相関し、免疫系全体の撹乱を生じ、高レベルのＴＮＦアルファおよびＩＬ−６などのプロ炎症性サイトカインを放出し得る。
【００８８】
一部の場合では、正常組織と共有する抗原を標的化するＣＡＲ免疫応答細胞は、それらが一過性に、例えば受容体をコードするｍＲＮＡの電気穿孔法後にＣＡＲを発現するように生成されてよい。付加的に、重度のオン標的毒性の場合にＣＡＲ免疫応答細胞の劇的な排除を可能にする安全スイッチを含むことによって、ＣＡＲ免疫応答細胞をさらに操作するための相当な努力がなされている。ＣＡＲをコードするベクターは、誘導性カスパーゼ−９遺伝子（二量体化の化学的誘導因子によって活性化される）またはＥＧＦ受容体Ｒのトランケート型（モノクローナル抗体セツキシマブによって活性化される）またはＲＱＲ８などの安全スイッチと組み合わされてよい。
【００８９】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、自殺遺伝子導入遺伝子をコードしてよい。前記導入遺伝子は、ＣＡＲ受容体または別の類似する受容体も含んでよい。自殺遺伝子は、ＣＡＲ免疫応答細胞の排除を誘導できる。自殺遺伝子は、前記ＣＡＲ免疫応答細胞においてアポトーシスを誘導する任意の遺伝子であってよい。自殺遺伝子は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲと共にウイルスベクター内にコードされていてよい。
【００９０】
１つまたは複数の導入遺伝子は、さまざまな種由来であってよい。例えば１つまたは複数の導入遺伝子は、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、ラット遺伝子、ブタ遺伝子、ウシ遺伝子、イヌ遺伝子、ネコ遺伝子、サル遺伝子、チンパンジー遺伝子またはこれらの任意の組合せを含んでよい。例えば導入遺伝子は、ヒト由来で、ヒト遺伝子配列を有していてもよい。１つまたは複数の導入遺伝子は、ヒト遺伝子を含んでよい。一部の場合では１つまたは複数の導入遺伝子は、アデノウイルス遺伝子ではない。
【００９１】
導入遺伝子は、上に記載のとおり無作為または部位特異的なやり方で免疫応答細胞のゲノムに挿入されてよい。例えば導入遺伝子は、免疫応答細胞のゲノム中の無作為な遺伝子座に導入されてよい。これらの導入遺伝子は、機能性、例えばゲノム中のどこに挿入されても完全に機能性であり得る。例えば導入遺伝子は、それ自体のプロモーターをコードしていてよく、または内在性プロモーターの調節下にある位置に挿入されてよい。代替的に導入遺伝子は、遺伝子のイントロンもしくは遺伝子のエクソン、プロモーターまたは非コード領域などの遺伝子に挿入されてよい。導入遺伝子は、挿入が遺伝子、例えば内在性免疫チェックポイントを破壊するように挿入されてよい。
【００９２】
時に、導入遺伝子の１つより多いコピーは、ゲノム中の１つより多い無作為の遺伝子座に挿入されてよい。例えば複数のコピーは、ゲノム中の無作為の遺伝子座に挿入されてよい。これは導入遺伝子が無作為に１回挿入されるよりも全体での発現の増加をもたらすことができる。代替的に導入遺伝子のコピーは遺伝子に挿入されてよく、導入遺伝子の別のコピーは異なる遺伝子に挿入されてよい。導入遺伝子は、標的化されてよく、それにより免疫応答細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に挿入され得る。
【００９３】
一部の場合では、主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲをコードする配列を含むポリ核酸は、プラスミドベクターの形態を取ってよい。プラスミドベクターは、プロモーターを含んでよい。一部の場合ではプロモーターは、構成的であってよい。一部の場合ではプロモーターは誘導性であってよい。プロモーターは、ＣＭＶ、Ｕ６、ＭＮＤまたはＥＦ１ａであってよい、または由来であってよい。一部の場合ではプロモーターは、ＣＡＲ配列に隣接していてよい。一部の場合ではプラスミドベクターは、スプライシングアクセプターをさらに含む。一部の場合ではスプライシングアクセプターは、ＣＡＲ配列に隣接していてよい。プロモーター配列は、ＰＫＧまたはＭＮＤプロモーターであってよい。ＭＮＤプロモーターは、改変ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと共に含有する合成プロモーターであってよい。
【００９４】
一部の場合では主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲをコードするポリ核酸は、非ウイルス技術によって細胞にデリバリーされるように設計されてよい。一部の場合ではポリ核酸は、医薬品及び医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）適合試薬であってよい。
【００９５】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲをコードするポリ核酸の発現は、１つまたは複数のプロモーターによって調節されてよい。プロモーターは、偏在性、構成的（関連遺伝子の連続的な転写を可能にする未制御プロモーター）、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入される導入遺伝子の発現は、制御され得る。例えば導入遺伝子は、偏在性プロモーター近くにまたはその隣に挿入されてよい。いくつかの偏在性プロモーターは、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＲＯＳＡ２６プロモーターであってよい。
【００９６】
プロモーターは、内在性または外来性であってよい。例えば１つまたは複数の導入遺伝子は、内在性または外来性ＲＯＳＡ２６プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入されてよい。さらにプロモーターは、免疫応答細胞に対して特異的であってよい。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子はブタＲＯＳＡ２６プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入されてよい。
【００９７】
組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターは、発現の位置を調節するために使用できる。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入されてよい。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーターまたはＣｏｌ２Ａプロモーターであってよい。
【００９８】
組織特異的プロモーターまたは細胞特異的プロモーターは、発現の位置を調節するために使用できる。例えば、１つまたは複数の導入遺伝子は、組織特異的プロモーターに隣接してまたはその近くに挿入されてよい。組織特異的プロモーターは、ＦＡＢＰプロモーター、Ｌｃｋプロモーター、ＣａｍＫＩＩプロモーター、ＣＤ１９プロモーター、ケラチンプロモーター、アルブミンプロモーター、ａＰ２プロモーター、インスリンプロモーター、ＭＣＫプロモーター、ＭｙＨＣプロモーター、ＷＡＰプロモーター、Ｃｏｌ２Ａプロモーターであってよい。
【００９９】
誘導性プロモーターも使用することができる。これらの誘導性プロモーターは、適宜、誘導剤を添加または除くことによってオンオフすることができる。誘導性プロモーターが、これだけに限らないがＬａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ａｒａＢＡＤ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、ＶＨＢ、Ｍｘおよび／またはＴｒｅｘであってよいことは検討される。
【０１００】
さらに、発現のためには要求されないが、導入遺伝子配列は、転写または翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドおよび／またはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含んでもよい。
【０１０１】
いくつかの場合では導入遺伝子は、主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲをコードし、導入遺伝子は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲが発現されるようにセーフハーバーに挿入される。いくつかの場合では導入遺伝子は、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４遺伝子座に挿入される。他の場合では導入遺伝子は、無作為挿入のためのレンチウイルス中で細胞にデリバリーされる一方で、ＰＤ１−またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼはｍＲＮＡとして供給されてよい。いくつかの場合では導入遺伝子は、セーフハーバー（例えばＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、アルブミンまたはＨＰＲＴ）に特異的なヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと共にレトロウイルス、ＡＡＶまたはアデノウイルスなどのウイルスベクター系を介してデリバリーされる。細胞は、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを用いて処置されてもよい。一部の場合ではＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ＨＰＲＴ特異的ヌクレアーゼおよびＰＤ１−またはＣＴＬＡ−４特異的ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと共にウイルスデリバリー系を介して供給される。本明細書で開示される方法および組成物と共に使用され得るＣＡＲは、第１、第２および第３世代設計を含む、これらのすべての種類のキメラタンパク質を含むことができる。ＣＣＲ２またはｓｉＲＮＡなどの他の薬剤は、ＰＤ−１発現を低減するために適用することができる。
【０１０２】
一部の場合ではレトロウイルスベクター（ガンマ−レトロウイルスまたはレンチウイルスのいずれか）は、免疫応答細胞への導入遺伝子の導入のために使用することができる。例えばＣＡＲ（例えば抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ）もしくはＧＰＣ３抗原に結合する任意の受容体またはこれらの変異体もしくはその断片をコードする導入遺伝子は、レトロウイルスベクターにクローニングすることができ、発現は、その内在性プロモーターから、レトロウイルス末端反復配列から、または目的の標的細胞型に特異的なプロモーターから駆動され得る。非ウイルスベクターも使用され得る。非ウイルスベクターデリバリー系は、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロクサマーなどのデリバリー媒体と複合体化した核酸を含み得る。
【０１０３】
多数のウイルスベース系は、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発された。例えばレトロウイルスは、遺伝子デリバリー系のための好都合なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当技術分野において周知の技術を使用してベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされてよい。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組込みおよび娘細胞へのその伝播を可能にすることから、長期の遺伝子移入を達成するために好適なツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターを超える追加の優位性を有し、それらは非増殖性細胞を形質導入できる。それらは、低免疫原性の追加の優位性も有する。アデノウイルスベクターは、それらが標的細胞のゲノムに組み込まれず、それにより負の組込み関連事象を回避する優位性を有する。
【０１０４】
細胞は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子をトランスフェクトされてよい。導入遺伝子濃度は、約１００ピコグラムから約５０マイクログラムであってよい。一部の場合では、細胞に導入され得る核酸（例えばｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＲＮＡ）の量は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために変化してよい。例えば１マイクログラムのｄｓＤＮＡは、電気穿孔法のために各細胞試料に加えられてよい。一部の場合では最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率のために必要な核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、細胞型に特異的である。一部の場合では各試料に使用される核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）の量は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率に直接対応する場合がある。例えばトランスフェクションの濃度範囲。ベクターによってコードされる導入遺伝子は、細胞ゲノムに組み込まれてよい。一部の場合ではベクターによってコードされる導入遺伝子の組込みはフォワード方向になされる。他の場合ではベクターによってコードされる導入遺伝子の組込みはリバース方向になされる。
【０１０５】
一部の場合では、ＣＡＲのウイルスデリバリーなどの細胞改変のための開始細胞密度は、トランスフェクション効率および／または細胞生存率を最適化するために変化してよい。一部の場合では、ウイルスベクターを用いる細胞のトランスフェクションまたは形質導入のための開始細胞密度は、細胞約１ｘ１０５個未満であってよい。一部の場合では、ウイルスベクターを用いる細胞改変のための開始細胞密度は、細胞少なくとも約１ｘ１０５個から細胞少なくとも約５ｘ１０７個であってよい。一部の場合では最適なトランスフェクション効率および／または細胞生存率のための開始細胞密度は、細胞型に特異的であり得る。例えば細胞１．５ｘ１０６個の開始細胞密度は、マクロファージ細胞のために最適であり得る（例えば、最も高い生存率および／またはトランスフェクション効率を提供する）。別の例では細胞５ｘ１０６個の開始細胞密度は、ヒト細胞のために最適であり得る（例えば、最も高い生存率および／またはトランスフェクション効率を提供する）。一部の場合では開始細胞密度の範囲は、所与の細胞型のために最適である場合がある。例えば細胞５．６ｘ１０６個から５ｘ１０７個の間の開始細胞密度は、Ｔ細胞などのヒト細胞のために最適であり得る（例えば、最も高い生存率および／またはトランスフェクション効率を提供する）。
【０１０６】
例えばウイルス系を用いた、ＣＡＲをコードする核酸配列の細胞のゲノムへの組込み効率は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％もしくは９９．９％超である場合があるまたはおよそこれだけである場合がある。一部の場合では、フローサイトメトリーによって測定して、操作された細胞の細胞膜上でのＣＡＲの検出は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％もしくは９９．９％超である場合があるまたはおよそこれだけである場合がある。
【０１０７】
一部の場合では免疫応答細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋および／またはＩＬ−７Ｒα＋からなる幹細胞様メモリー（stem memory）ＴＳＣＭ細胞であってよく、前記幹細胞様メモリー細胞はＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３および／またはＬＦＡ−１も発現でき、前記幹細胞様メモリー細胞に特徴的な多数の機能的特質を示す。代替的に免疫応答細胞は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を含むセントラルメモリーＴＣＭ細胞であってもよく、セントラルメモリー細胞は、例えばＩＬ−２を分泌できるがＩＦＮγおよびＩＬ−４はできない。免疫応答細胞は、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクターメモリーＴＥＭ細胞であってもよく、例えばＩＦＮγおよびＩＬ−４などのエフェクターサイトカインを産生する。
【０１０８】
ベクターは、下に記載されるとおり個々の患者への投与によって、典型的には全身性投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、真皮下または頭蓋内注入）または局所適用によってインビボでデリバリーされてよい。代替的にベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えばリンパ球、Ｔ細胞、骨髄吸引液、組織生検）などの細胞に生体外で（ex vivo）デリバリーされてよく、通常ベクターを組み込まれた細胞の選択後の患者への細胞の再インプラントが続く。選択に先行して、または後に、細胞は増殖されてよい。
【０１０９】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲを発現するための好適な免疫応答細胞は、それを必要とする対象に対して自己または非自己である場合がある細胞であってよい。
【０１１０】
好適な免疫応答細胞の供給源は、対象から得られてよい。一部の場合ではＴ細胞は得ることができる。前記Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織および感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織ならびに腫瘍が挙げられる多数の供給源から得ることができる。ある特定の場合ではＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの当業者に周知の任意の数の技術を使用して対象から回収された血液の単位から得ることができる。一実施形態では個体の循環血由来の細胞は、アフェーレシスによって得られる。アフェーレシス産生物は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球および血小板を含むリンパ球を典型的には含有する。一実施形態ではアフェーレシスによって回収された細胞は、血漿画分を除き、続く処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地中に置くために洗浄されてよい。
【０１１１】
代替的に細胞は、健常ドナー由来、がんを有すると診断された患者由来、または感染を有すると診断された患者由来であってよい。別の実施形態では細胞は、さまざまな表現型特徴を提示する細胞の混合集団の一部であってよい。細胞株は、既に記載の方法により形質転換したＴ細胞からも得ることができる。細胞は、細胞治療バンクから得ることもできる。免疫抑制処置に抵抗性の改変細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかによって得ることができる。望ましい細胞集団は、改変に先行して選択されてもよい。操作された細胞集団は、改変後に選択されてもよい。操作された細胞は、自己移植に使用することができる。代替的に細胞は、同種移植に使用することができる。一部の場合では細胞は、がん関連標的配列を同定するために試料が使用された同じ患者に投与される。他の場合では細胞は、がん関連標的配列を同定するために試料が使用された患者とは異なる患者に投与される。
【０１１２】
一部の場合では免疫応答細胞は、初代Ｔ細胞、幹細胞または前駆細胞を含む初代細胞であってよい。前駆細胞は、造血性前駆細胞であってよい。本発明の細胞は、ヒト細胞であってよい。好適な細胞は、生体外で増殖され得る。好適な細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、ＩＬ−７Ｒα（＋）またはこれらの組合せであってもよい。
【０１１３】
一部の場合では好適な初代細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および、これだけに限らないがＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆体細胞、造血幹細胞または非多能性幹細胞などの他の血液細胞サブセットが挙げられる。一部の場合では細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞または任意の他の種類のＴ細胞などの腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）などの任意のＴ細胞を含む任意の免疫細胞であってよい。Ｔ細胞として、メモリーＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞も挙げられる。Ｔ細胞は、バルク集団から選択されてもよく、例えば全血からＴ細胞を選択する。Ｔ細胞は、バルク集団から増殖されてもよい。Ｔ細胞は、特定の集団および表現型へと偏らせてもよい。例えばＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を表現型で含むように偏らせてよい。ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ−７Ｒα（＋）を含むリストから選択される１つまたは複数の（one of more）マーカーを含む好適な細胞が選択されてよい。好適な細胞として、例として胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、ニューロン幹細胞および間葉系幹細胞などの幹細胞も挙げられる。好適な細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞および／またはマウス細胞などの任意の数の初代細胞を含んでよい。好適な細胞は、前駆細胞であってよい。好適な細胞は、処置される対象（例えば、患者）由来であってよい。好適な細胞は、ヒトドナー由来であってよい。好適な細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（−）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋およびＩＬ−７Ｒα＋からなる幹細胞様メモリーＴＳＣＭ細胞であってよく、前記幹細胞様メモリー細胞は、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３およびＬＦＡ−１も発現でき、前記幹細胞様メモリー細胞に特徴的な多数の機能的特質を示す。好適な細胞は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を含むセントラルメモリーＴＣＭ細胞であってよく、前記セントラルメモリー細胞は、例えばＩＬ−２を分泌できるが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４はできない。好適な細胞は、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を含むエフェクターメモリーＴＥＭ細胞であってもよく、ＩＦＮγおよびＩＬ−４などの例えばエフェクターサイトカインを産生する。
【０１１４】
一部の場合では方法は、細胞の急速増殖に先行して、培養したＴ細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮すること含む場合がある。ＩＬ−２中でのＴ細胞の培養に続いてＴ細胞は、例えばＣＤ８マイクロビーズ分離（例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳｐｌｕｓＣＤ８  ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する）を使用してＣＤ４＋細胞を枯渇させ、ＣＤ８＋細胞について濃縮されてよい。具体的な理論に束縛されることなく、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、抗腫瘍応答を妨害できると考えられ得る。したがって、Ｔ細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞について濃縮培養し、ＣＤ４＋細胞を低減または排除することは、養子移入された抗腫瘍ＣＤ８＋細胞の影響を改善でき、患者における応答率を改善でき、かつ／またはＣＤ４＋細胞によるサイトカインの産生によって観察される毒性を低減できると考えられ得る。追加的に濃縮されたＣＤ８＋「若い」Ｔ細胞は、臨床スケールの急速増殖においてバルクＴ細胞よりさらに確実および予測どおりに挙動すると考えられ得る。
【０１１５】
細胞は、医薬品及び医薬部外品の製造管理および品質管理の基準（ＧＭＰ）適合試薬であり得る。細胞は、それを必要とする対象においてがん、感染、自己免疫性障害または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を処置する併用療法の一部であり得る。一部の場合では本発明の細胞は、それを必要とする対象に、単剤療法として投与されてよい。
【０１１６】
一部の場合では主題のＣＡＲを発現する細胞は、不均一なＴ細胞集団を含む。一部の場合では使用される細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の不均一な集団から大部分がなってよい。前記ＣＤ４およびＣＤ８細胞は、循環エフェクターＴ細胞の表現型の特徴を有してよい。前記ＣＤ４およびＣＤ８細胞は、エフェクターメモリー細胞の表現型の特徴も有する。別の実施形態では細胞はセントラルメモリー細胞であってよい。
【０１１７】
ドナーから単離できる好適な細胞は、これだけに限らないが、胎性、新生児、若年および成体が挙げられる発達の任意の段階にあってよい。例えばドナー免疫応答細胞は、ヒト成体から単離されてよい。ドナーヒト免疫応答細胞は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１歳未満であってよい。例えば免疫応答細胞は、６歳未満のヒトから単離されてよい。免疫応答細胞は、３歳未満のヒトから単離されてもよい。ドナーは、１０歳を超えていてもよい。
【０１１８】
好適な細胞を獲得する方法は、所与のマーカーに基づいて選択することを含んでよい。例えばそのようなマーカーは、ＧＦＰ、抵抗性遺伝子、細胞表面マーカーまたは内在性タグを含んでよい。細胞は、任意の内在性マーカーを使用して選択され得る。適用可能な細胞選択技術として、フローサイトメトリーおよび／または磁気カラムが挙げられる。選択された細胞は、次に対象に注入されてよい。選択された細胞は、多量に増殖されてもよい。選択された細胞は、注入に先立って増殖されてよい。
【０１１９】
患者において治療有効であるために必要である細胞の量は、細胞の生存率および、遺伝的に改変された細胞を用いる効率（例えば、導入遺伝子が１つまたは複数の細胞に組み込まれる効率、または導入遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベル）に応じて変化する場合がある。一部の場合では、遺伝子改変後の細胞の生存率と、導入遺伝子の組込みの効率との積（例えば掛け算）は、対象への投与のために利用可能である細胞の治療アリコートに対応する場合がある。一部の場合では遺伝子改変後の細胞の生存率の増加は、患者において治療有効である投与のために必要である細胞の量における減少に対応する可能性がある。一部の場合では、導入遺伝子が１つまたは複数の細胞に組み込まれる効率の増加は、患者において治療有効である投与のために必要である細胞の量における減少に対応する可能性がある。一部の場合では、治療有効であるために必要である細胞の量を決定することは、経時的な細胞の生存率における変化に対応する関数を決定することを含み得る。一部の場合では、治療有効であるために必要である細胞の量を決定することは、時間依存性の変数に対する、導入遺伝子が１つまたは複数の細胞に組み込まれ得る効率における変化に対応する関数を決定することを含み得る（例えば、細胞培養時間、電気穿孔法時間、細胞刺激時間）。一部の場合では治療有効な細胞は、細胞表面上に約３０％から約１００％の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲの発現を有する細胞の集団であり得る。一部の場合では治療有効な細胞は、フローサイトメトリーによって測定して、細胞表面上に約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％から約９９．９％を超える抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現できる。
【０１２０】
種々の細胞を上に記載のとおり主題のＣＡＲを発現するために使用できる。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲは、真核細胞、例えば哺乳動物細胞の原形質膜に存在してよく、好適な哺乳動物細胞として、これだけに限らないが細胞傷害性細胞、Ｔリンパ球、幹細胞、幹細胞の後代、前駆細胞、前駆細胞の後代およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１２１】
真核細胞の原形質膜に存在する場合、ＣＡＲはその結合標的の存在下で活性であり得る。例えば抗ＧＰＣ３  ＣＡＲは、ＧＰＣ３の存在下で活性であり得る。ＧＰＣ３などの標的は、膜上に発現されてよい。標的は、可溶性であってもよい（例えば細胞に結合しない）。標的は、標的細胞などの細胞の表面に存在してよい。標的は、脂質二重層などの固体表面に存在してよい。標的は、可溶性抗原など可溶性であってよい。標的は、抗原であってよい。抗原は、標的細胞などの細胞の表面に存在してよい。抗原は、脂質二重層などの固体表面に存在してよい。一部の場合では標的は、抗原のエピトープであってよい。本明細書に開示される方法では抗原は、典型的にはＧＰＣ３であり、ＧＰＣ３発現標的細胞は、がんまたは腫瘍細胞である。
【０１２２】
いくつかの場合ではＣＡＲは、細胞の原形質膜上に存在する場合、およびその標的への結合によって活性化される場合、ＣＡＲの結合ドメインが結合する抗原をその細胞表面に発現する標的に対する、細胞による細胞傷害活性を生じる場合がある。例えば、一部の場合では細胞は、細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球）であってよく、本開示のＣＡＲは、細胞の原形質膜に存在する場合、およびその標的に結合することによって活性化される場合、ＣＡＲの結合ドメインが結合する抗原をその細胞表面上に発現する標的細胞に対する、細胞傷害性細胞の細胞傷害活性を増大させる場合がある。例えば、一部の場合では細胞は、ＮＫ細胞またはＴリンパ球であってよく、本開示のＣＡＲは、細胞の原形質膜に存在する場合、およびその標的に結合することによって活性化される場合、細胞の細胞傷害活性を、結合標的の非存在下での細胞の細胞傷害活性と比較して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍または１０倍を超えて増大させることができる。
【０１２３】
一部の場合ではその標的に結合することによって活性化される場合ＣＡＲは、増殖および増殖（細胞分裂の増大または抗アポトーシス応答のいずれかによる）などの他のＣＡＲ活性化関連事象を生じる場合がある。細胞の増殖は、顕微鏡下で見られる細胞凝集塊の観察によって視覚的に測定され得る。細胞増殖は、血球計数器測定によって測定され得る。一部の場合ではＣＡＲ−Ｔ細胞は、同等のＴ細胞、非ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較した場合細胞増殖および増殖が増大している。細胞増殖の増大は、同等の細胞のものの約１倍から約２０倍（hold）超であってよい。細胞増殖の増大は、同等の細胞のものと比べて約１倍から２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍まででよい。細胞増殖は、経時的に測定されてよい。例えば細胞増殖は、細胞取得（acquision）から対象への注入時まで生じてよい。他の場合では細胞増殖は、取得後約１日間から約３０日間まで生じてよい。細胞増殖は、取得後約１日から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間まで生じてよい。一部の場合では、急速増殖プロトコール（rapid expansion protocol）（ＲＥＰ）は、対象への注入に先立って細胞を増殖させるために利用されてよい。一部の場合ではＲＥＰは、約１４日間にわたって行われてよい。
【０１２４】
一部の場合では、その標的に結合することによって活性化される場合ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達モジュレーション、細胞分化または細胞死などの他のＣＡＲ活性化関連事象を生じる場合がある。一部の場合では細胞上でのＣＡＲの発現は、細胞の細胞内シグナル伝達を変更する場合がある。他の場合では、ＣＡＲの発現は細胞分化を変更する場合がある。
【０１２５】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、リンパ球低減処置と同時にまたはその後のいずれかで、ＧＰＣ３発現がんまたは腫瘍を呈する対象に投与されてよい。
【０１２６】
一部の態様では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、リンパ球低減処置後に投与される。処置は、処置された対象において循環リンパ球を低減できる、または循環リンパ球を実質的に枯渇させることができる（すなわち、リンパ球低減）。例えば抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、リンパ球低減処置の少なくとも１時間から少なくとも１週間後に投与されてよい。例えば抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、リンパ球低減処置の少なくとも１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間後またはさらに後に投与されてよい。一部の場合ではＣＡＲ−Ｔは、リンパ球低減処置約１、２、３、４、５、６週間後またはさらに後に投与されてよい。
【０１２７】
一部の場合では宿主リンパ球減少症は、ＣＡＲ  Ｔ細胞などの抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の増殖を促進する場合がある。一方でリンパ球減少症は、入ってくる養子移入された細胞のための「空間」を作ることができ、他方でそれは恒常的増殖を誘導できる。後者の効果は、ＣＡＲ  Ｔ細胞などのエフェクター細胞増殖を制限できる阻害性サイトカイン（例えばＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０）を通常分泌できる内在性制御性Ｔ細胞の化学療法的除去を通じて媒介されると考えられ得る。一部の場合ではリンパ球低減処置は、リンパ球低減処置を伴わない抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を用いた処置と比べてインビボでの抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の増殖を約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍または２０倍まで改善できる。
【０１２８】
追加的に、通常限定的な量で存在する場合があるＩＬ−７およびＩＬ−１５などのＴ細胞増殖恒常性サイトカインは、競合の低下およびリンパ球新生間質性細胞による産生の増大によって容易に利用可能になる可能性がある。したがって、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の注入に先立つリンパ球低減の誘導は、対象の処置における抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の有効性を増大させるために実施されてよい。一部の場合ではリンパ球低減処置は、リンパ球低減処置を伴わない処置と比べて、腫瘍低減として測定されるように、抗腫瘍有効性を約１０％から約１００％改善できる、または調節できる。例えばリンパ球低減処置は、リンパ球低減処置を伴わない処置と比べて、抗腫瘍有効性を約１０％から１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％まで改善できる。
【０１２９】
リンパ球低減は、種々の手段を使用して実施できる。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞投与前のリンパ球低減は、全身照射（ＴＢＩ）または細胞傷害性薬を使用して実施することができる。これらの手法は、レシピエントのリンパ系コンパートメントを枯渇させることを意図できるが、これらは、腫瘍細胞死および抗原放出をトリガーすることによって腫瘍抗原の提示も促進できる。次にこれらの抗原は、取り込まれ、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の活性化を増強するように抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される場合がある。
【０１３０】
照射および／または化学療法は、宿主細胞の活性化を導くことができ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−４などの炎症誘発性サイトカインの放出およびＣＤ８０などの共刺激分子の上方制御をもたらす。一部の場合ではリンパ球低減処置は、宿主細胞の活性化によって抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞治療を改善できる。一部の場合ではリンパ球低減処置は、共刺激分子の上方制御によって抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞治療を改善できる。ＡＰＣ機能および利用能の増強に加えてプレコンディショニングレジメンは、これらの器官を覆う細胞の放射線誘導アポトーシスを通じて粘膜バリアの完全性を損傷する場合がある。腸管に与えられた損傷は、ＬＰＳなどの細菌性産物の全身循環への移行を可能にする場合がある。ＬＰＳは、次にインビボで抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を活性化し、抗腫瘍性応答を増強する場合がある。したがって炎症誘発性サイトカインおよび微生物産生物は、ＤＣの活性化および成熟のための重大な「危険シグナル」を提供し、それにより抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞性腫瘍処置を増強する。
【０１３１】
一部の場合ではリンパ球低減処置は、ヒト化抗Ｔａｃ（抗ＣＤ２５）およびＯＮＴＡＫ（商標）（ジフテリア毒素にコンジュゲートされたＩＬ−２）を含むＣＤ２５−発現細胞をヒトにおいて選択的に枯渇させることができる。
【０１３２】
一部の場合では化学療法剤は、対象においてリンパ球低減をもたらすように投与されてよい。一部の場合では対象は、骨髄非破壊的リンパ球低減化学療法を受けてよい。骨髄非破壊的リンパ球低減化学療法は、任意の好適な治療であってよく任意の好適な経路によって投与されてよい。化学療法レジメンは、シクロホスファミドもしくはクロラムブシルなどの単一のアルキル化剤、またはＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰに加えてプロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰに加えてメトトレキサート、ブレオマイシンおよびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシドおよびロイコボリンに加えて標準ＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサートおよびロイコボリン）ならびにＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、一定用量のプレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）などの組合せ、の使用を含んでよい。
【０１３３】
骨髄非破壊的リンパ球低減化学療法は、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を、特にがんが転移性である可能性があるＧＰＣ３陽性である場合に含んでよい。シクロホスファミドおよびフルダラビンを投与する好ましい経路は、静脈内であってよい。同様に、シクロホスファミドおよびフルダラビンの任意の好適な用量が投与されてよい。好ましくは、６０ｍｇ／ｋｇ付近のシクロホスファミドが２日間投与されてよく、その後２５ｍｇ／ｍ２付近のフルダラビンは約５日間投与されてよい。
【０１３４】
一部の場合ではリンパ球低減は、免疫媒介抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞拒絶を最小化するために実施されてよい。例えば対象は、シクロホスファミド（Ｃｙ）に続いてフルダラビン（Ｆｌｕ）リンパ球低減処置によって処置されてよい。Ｃｙなどの化学療法剤の用量は、約１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇであってよい。Ｃｙの用量は、対象の１ｋｇあたり約１から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または約２００ｍｇまでであってよい。
【０１３５】
代替的にＣｙ処置のための例示的用量およびレジメンは、約０．５〜５ｇ／ｍ２／日、好ましくは０．６〜３ｇ／ｍ２／日、より好ましくは１〜２ｇ／ｍ２／日を１〜３日間、好ましくは１〜２日間であってよい。
【０１３６】
Ｆｌｕの用量は、対象の１ｍ２あたり約１から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または約２００ｍｇまでであってよい。
【０１３７】
代替的にフルダラビン処置のための例示的用量およびレジメンは、約２０〜８０ｍｇ／ｍ２／日、好ましくは２５〜７０ｍｇ／ｍ２／日または２５〜３０ｍｇ／ｍ２／日を２〜１０、３〜８または４、５、６または７日間であってよい。
【０１３８】
一部の場合では、ＣｙとＦｌｕとの併用は適用されてよい。例えば約１０〜６０ｍｇ／ｍ２／日または１５〜５０ｍｇ／ｍ２／日または２０〜３０ｍｇ／ｍ２／日を２〜８日間または３〜６日間の範囲のＦｌｕの開始用量に、約０．２〜１ｍｇ／ｍ２／日または０．３〜０．８ｍｇ／ｍ２／日または０．４〜０．６ｇ／ｍ２／日を１〜５または２〜３日間の量のＣｙが続く。
【０１３９】
一部の場合では対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞注入前にＣｙ  ６０ｍｇ／ｋｇｘ１回投与およびＦｌｕ  ２５ｍｇ／ｍ２ｘ３から５回投与でＣｙおよびＦｌｕを用いて処置され得る。対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞注入前にリンパ球枯渇剤（lymphodepletant）の約０から約２０回投与を受けてよい。対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞注入に先立って約０から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、約２０回までのＣｙまたはＦｌｕなどのリンパ球枯渇剤の投与を受けてよい。他の場合では対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞注入と同時にＣｙおよび／またはＦｌｕなどのリンパ球枯渇剤を同時投与されてよい。他の場合では対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞投与後にＣｙおよび／またはＦｌｕなどのリンパ球枯渇剤を投与されてよい。他の場合では対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞投与に先立って、同時におよび／または後にリンパ球枯渇剤を投与されてよい。対象は、一部の場合では（is some cases）リンパ球低減処置を受けない場合がある。一部の場合ではさまざまな用量のリンパ球枯渇剤がレジメンの経過の際に使用されてよい。例えば対象は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞に先立って６０ｍｇ／ｋｇのＣｙを受け、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞と同時の４０ｍｇ／ｋｇのＣｙの投薬が続いてよい。全血球計算（ＣＢＣ）は、リンパ球低減の程度および追加的な投与が必要であるかどうかを判定するために実施されてよい。一部の場合ではＣｙは単独で投与されてよい。他の場合ではＦｌｕは単独で投与されてよい。一部の場合ではＣｙおよびＦｌｕは、レジメンの際に交互であってよい。
【０１４０】
リンパ球低減は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞増殖を改善できる。リンパ球低減は、血液中の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞持続性を改善できる。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞増殖および持続性は、抗ＣＡＲ抗体を利用するフローサイトメトリー分析によって検出できる。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞持続性は、ｑＰＣＲによって抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞のコピー数を評価することによっても測定できる。
【０１４１】
一部の場合では対象は、リンパ球低減処置に供される場合、リンパ球低減処置を受けていない場合がある対象と比較して抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞用量が低減される場合がある。
【０１４２】
一部の場合ではリンパ球低減処置は、一定期間にわたって投与されてよい。例えばリンパ球低減処置は、１分間から約２４時間までの経過にわたって投与される場合がある。リンパ球低減処置は、１分間から１５分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間または約２４時間まで実施される場合がある。リンパ球低減剤は、希釈剤、神経保護剤（uroprotectant）、賦形剤またはこれらの組合せなどの追加的薬剤と共に投与されてよい。例えば、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（メスナ）は、リンパ球低減処置に含まれてよい。一部の場合では対象は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日を約２日間、ＩＶ、２５０ｍｌ  Ｄ５Ｗ中、と共にメスナ１５ｍｇ／ｋｇ／日を２日間、１時間かけて投与されてよい。メスナは、種々の用量のリンパ球枯渇剤と同時投与されてよい。例えばメスナは、約１ｍｇ／ｋｇ／日から約５０ｍｇ／ｋｇ／日までで投与されてよい。メスナは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または約５０ｍｇ／ｋｇ／日までで投与されてよい。一部の場合では肥満または小児の対象のために、薬物投与量は、実質体重を使用して算出されてよい。実質体重は、実際の体重と標準体重との平均であり得る。例えば標準体重は、男性＝５０ｋｇ＋２．３（６０インチで割ったインチ数）で算出できる。標準体重は、女性＝４５．５ｋｇ＋２．３（６０インチで割ったインチ数）で算出できる。一部の場合ではＦｌｕ投与は、２５ｍｇ／ｍ２／日、ＩＶＰＢ、毎日、３０分間かけて５日間であってよい。一部の場合ではＦｌｕ投与は、Ｃｙ投与の前に行われてよい。一部の場合ではＦｌｕ投与は、Ｃｙと同時に実施されてよい。一部の場合ではＦｌｕ投与は、Ｃｙ投与の後で実施されてよい。一部の場合では、フルダラビンは、Ｃｙおよびメスナのおよそ１から２時間後に開始されてよい。
【０１４３】
全身照射は、放射線療法の形態であってよい。名称が意味するとおりＴＢＩは、全身の照射を含み得るが、現在の実施では肺は、放射線誘発肺損傷の危険性を低下させるために部分的に遮蔽される場合がある。全身照射は、種々の線量で投与されてよい。例えば全身照射は、約１０から約１２Ｇｙで投与されてよい。一部の場合では全身照射は、全線量を一度でデリバリーするよりも、より少量の線量を数回のセッションで用いて分割されてよい。一部の場合では１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種までの異なる線量の照射が投与されてよい。
【０１４４】
造血幹細胞の報告されたＤ０値、つまり、特定の細胞型を全滅させるために必要な電離放射線の量は、約０．５から約１．４Ｇｙであり得、一方でヒト白血病細胞株のものは約０．８から約１．５Ｇｙであり得、両細胞が放射線感受性であることを示している。理想的な投薬スケジュールは、患者の年齢、疾患および意図する処置の種類に応じる場合がある。骨髄破壊的ＴＢＩは、１日約２から約３回処置で約４日間にわたって約８から約１２分割で与えられる約１２から約１５Ｇｙであってよい。一部の場合では骨髄破壊的ＴＢＩは、約５から約２０Ｇｙであってよい。骨髄破壊的ＴＢＩは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９から。約２０Ｇｙであってよい。一部の場合では骨髄破壊的ＴＢＩは、約５から約２０分割で与えられてよい。骨髄破壊的ＴＢＩは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９から約２０分割で与えられてよい。骨髄破壊的治療は、約１から約１０日間にわたって与えられてよい。骨髄破壊性（Myeloablatic）治療は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または約１０日間までにわたって投与されてよい。
【０１４５】
一部の場合では低線量ＴＢＩは、約１から約４分割で与えられる約２から約８Ｇｙの線量を含み得る。一部の場合では低線量ＴＢＩは、約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５または約８Ｇｙまでの線量を含んでよい。低線量ＴＢＩは、年齢または併存疾患のために骨髄破壊を許容できない対象に投与できる。
【０１４６】
ＴＢＩは、ＴＢＩのための約４から約１８ＭＶの高エネルギー光子線の平行対向対（parallel opposed pair）を使用して投与されてよい。一部の場合では光子線は、ＴＢＩのために約１から約２５ＭＶであってよい。光子線は、約１から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または約２５ＭＶまでであってよい。ＴＣＩは、Ｖａｒｉａｎ  Ｃｌｉｎａｃ  ｉＸまたはＳｉｅｍｅｎｓ  Ａｒｔｉｓｔｅなどの装置を使用して実施されてよい。
【０１４７】
一部の場合では、投与の速度は、約５ｃＧｙ／分から約１００ｃＧｙ／分であってよい。投与の速度は、約５から６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９５または１００ｃＧｙ／分までであってよい。
【０１４８】
一部の場合ではある特定の器官は、照射の際に遮蔽されてよい。例えば肝臓、肺、脳、心臓またはこれらの組合せは、全身照射の際に遮蔽されてよい。
【０１４９】
生物学的薬剤
一部の場合では抗体などの生物学的薬剤は、免疫細胞を枯渇させるために使用され得る。リンパ球について細胞溶解性であるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、リンパ球低減を得るための代替的手段であり得る。一部の場合では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞注入の前に投与され得るＴ細胞リンパ球低減のための抗体は、急速な注入および注入された抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞との再集団化を許容するために有効だがインビボで短命でなければならない。使用される抗体は、リンパ球などの細胞の表面に発現されるマーカーに対するものであってよい。一部の場合ではリンパ球低減抗体は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ５２およびこれらの任意の組合せであってよい。
【０１５０】
アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）、ブルテゾミブ、サイモグロブリン（ウサギＡＴＧ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）、ＡＴＧＡＭ（ウマＡＴＧ、Ｐｆｉｚｅｒ）およびアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）などの抗体は使用されてよい。リツキシマブ（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８）、ＧＡ１０１、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１、ＸｍＡｂ５５７４、ＣＤ１９に対するＦｃ操作された抗体、アレファセプト（ＬＦＡ３−Ｉｇ）、フィンゴリモド（ＦＴＹ７２０）、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体もリンパ球低減剤として使用できる。一部の場合ではクラドリビン［２−ＣｄＡ、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標）］、フルダラビンに類似するプリン類似体は使用できる。一部の場合では抗体リンパ球低減処置は、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）などの単一の抗体を含むことができる。他の場合では抗体ベースリンパ球低減処置は、アレムツズマブおよび抗ＣＤ４５などの少なくとも２つの抗体を含むことができる。一部の場合ではリンパ球低減処置は、抗体治療と組み合わせた放射線または放射線と組み合わせた化学療法などの複数のリンパ球低減手法を含んでよい。化学療法および抗体治療は、組合せで使用されてもよい。
【０１５１】
抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤は、リンパ球低減処置の際に対象に予防法として与えられてよい。例えば予防法は、アルトレックス（Altrex）５００ｍｇ毎日、バクトリウム（Bactrium）ＤＳ  １錠剤をｑＭＷＦでおよびフルコナゾール２００ｍｇを毎日が挙げられる。薬物療法の持続期間は、リンパ球絶対数（ＡＬＣ）および好中球絶対数（ＡＮＣ）が薬物療法前ベースラインに戻り得るまでである。生物学的薬剤は、アドリアマイシンであってもよい。
【０１５２】
１つまたは複数のサイトカインは、細胞に導入されてよい。サイトカインは、移入された細胞（養子移入された腫瘍特異的細胞を含む）を腫瘍微小環境内で増殖するようにブーストするために利用され得る。一部の場合ではＩＬ−２は、本明細書に記載される細胞の増殖を促進するために使用され得る。ＩＬ−１５などのサイトカインも使用されてよい。ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＬ−２１またはこれらの任意の組合せなどの免疫療法の分野における他の関連するサイトカインも利用されてよい。一部の場合では組換えサイトカインが使用される。
【０１５３】
一部の場合ではＴ細胞増殖因子は、投与されてよい。増殖因子は、任意の好適な経路によって投与されてよい。１つより多いＴ細胞増殖因子が投与される場合、それらは同時または逐次的に、任意の順で、同じ経路または異なる経路によって投与されてよい。アルデスロイキン（ＩＬ−２）などのＴ細胞増殖因子は、ボーラス注射として静脈内投与されてよい。ＩＬ−２などのＴ細胞増殖因子の投与量は、当業者によって高いと見なされるものである。好ましくは、ＩＬ−２の約７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量は、許容範囲まで１日３回投与されてよい。一部の場合（Is come cases）ＩＬ−２の約５から約１５用量が平均９用量付近で投与される。Ｔ細胞増殖因子の投与量は、約０から約２０であってよい。Ｔ細胞増殖因子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または約２０回まで投与されてよい。
【０１５４】
ＩＬ−２は、静脈内ボーラスとして７２０，０００ＩＵ／ｋｇの用量（全体重に基づいて）で投与されてよい。一部の場合ではＩＬ−２は、１５分間にわたって投与されてよい。一部の場合ではＩＬ−２は、２０分間にわたって投与されてよい。ＩＬ−２は、即時注射によって投与されてよい。一部の場合ではＩＬ−２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間までにわたって投与されてよい。
【０１５５】
一部の場合ではＩＬ−２は、細胞注入の２４時間以内に始め、約４日間まで（最大１２用量）継続して投与されてよい。一部の場合ではＩＬ−２は、投与開始から約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０日間まで投与されてよい。
【０１５６】
ＩＬ−２の用量は、８時間ごとに投与されてよい。一部の場合ではＩＬ−２は、投与開始から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間ごとに投与されてよい。一部の場合ではＩＬ−２投薬は、毒性が検出された場合に停止されてよい。一部の場合では投薬は、下痢、悪心、嘔吐、低血圧、皮膚の変化、食欲不振、粘膜炎、嚥下障害または全身症状および検査所見の変化などのアルデスロイキンに一般的な可逆性のグレード３毒性を除いて、患者がアルデスロイキンのためにグレード３または４毒性に達した場合に遅延または停止されてよい。一部の場合ではこれらの毒性が対症的手段によって２４時間以内に容易に戻り得る場合は、次に追加的な用量が与えられてよい。付加的に投薬は、処置医師の裁量により保持または停止されてよい。
【０１５７】
一部の場合では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現する免疫応答細胞は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを発現しない同等の免疫応答細胞と比較して、抗腫瘍有効性が増大している。
【０１５８】
一部の場合では抗腫瘍有効性は、細胞傷害活性を指す場合がある。他の場合では、抗腫瘍有効性は持続性を指す場合がある。抗腫瘍有効性は、腫瘍を標的化する細胞の能力を指す場合もある。抗腫瘍有効性は、種々のインビトロアッセイを使用して測定することができる。例えば細胞傷害能力は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の放出を測定するＥＬＩＳＡによって測定することができる。細胞傷害活性は、クロム−５１放出アッセイなどの殺滅アッセイまたは共培養アッセイによって測定することができる。一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、同等の細胞と比較した場合に抗腫瘍有効性および能力が増大している場合がある。
【０１５９】
抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ処置有効性は、複数の手法を使用して評価することができる。有効性は、ＧＰＣ３陽性腫瘍などの腫瘍が、調節、低減または排除される程度である抗腫瘍有効性を指す場合がある。処置有効性は、ＣＡＲ免疫応答細胞増殖、持続性、腫瘍標的化およびこれらの任意の組合せを指す場合もある。
【０１６０】
抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療などの抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞治療を投与され得る対象は、注入の際、注入の直後または注入の数年後まで評価されてよい。例えば処置された対象は、約１日から対象の生涯までの期間について評価のために診療所に再来してよい。処置された対象は、主題のＣＡＲ免疫応答細胞の初回投与後１から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０または９０年間まで評価されてよい。一部の場合では評価スケジュールは、毎日のモニタリング、毎週のモニタリング、毎月のモニタリングまたは毎年のモニタリングを含んでよい。一部の場合では対象は、臨床的に示されてさらに頻繁に診られてよい。評価として理学的検査、化学的評価、全血球計算、甲状腺パネル、毒性アセスメント、身体領域のコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、アフェーレシスおよびこれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１６１】
一部の場合ではアフェーレシスは、主題のＣＡＲ免疫応答細胞注入の投与に先行しておよび約１から約１０週間後に実施されてよい。他の時点では対象の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、Ｆｉｃｏｌｌ勾配上での遠心分離を使用する精製によって全血から得られてよい。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のアリコートは、細胞機能の免疫学的モニタリングのために凍結保存されてよい。一部の場合では種々の検査として、特異的溶解およびサイトカイン放出の評価、代謝および生体エネルギー研究（Ｓｅａｈｏｒｓｅを使用）が挙げられ、サイトカイン産生の細胞内ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ−スポットアッセイおよびリンパ球サブセット分析は、主題のＣＡＲ免疫応答細胞処置の免疫学的相関を評価するために使用できる。一般に、これらのアッセイにおける約２から約３倍の差異は、真の生物学的差異を示している可能性がある。一部の場合では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞治療後のインビトロアッセイでの約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、約５倍までの差異は、処置有効性を示している可能性がある。
【０１６２】
一部の場合では主題のＣＡＲ免疫応答細胞処置は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンまたはＭＲＩによって測定して、腫瘍サイズを少なくとも３０％低減できる。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞処置は、腫瘍サイズを少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約１００％まで低減できる。ＣＡＲ−Ｔ処置は、ＣＴスキャンによって測定して、腫瘍を排除できる。一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞処置は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンによって測定して、腫瘍病変の直径のベースライン測定値での１０％未満の変化として測定されるように腫瘍サイズを安定化できる。例えば腫瘍は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の投与後にサイズが拡張しない場合がある。一部の場合では安定化は、処置前測定と比較した腫瘍サイズにおける１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満の変化と見なされてよい。
【０１６３】
一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞有効性は、対象生存期間に関すると見なされてよい。例えば抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞などの抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を用いて処置される対象は、未処置対象または異なる治療を用いて処置された対象よりも長く生存できる。
【０１６４】
一部の場合では抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞有効性は、リンパ球低減処置などの第２の処置の追加によって改善され得る。第２の処置は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞治療と協同できる。一部の場合では第２の処置は、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞治療の相加効果を生じることができる。第２の処置は、リンパ球低減および細胞治療、抗体治療、化学療法、放射線療法、手術、抗血管新生治療およびこれらの任意の組合せの追加的な形態であってよい。
【０１６５】
処置応答は、改訂された固形がんの治療効果判定のための（ＲＥＣＩＳＴ）ガイドライン（バージョン１．１）によって提案された国際基準を使用して評価されてよい。腫瘍病変の最長径（一次元測定）および悪性リンパ節の場合は最短径における変化をＲＥＣＩＳＴ基準において使用できる。例えば測定可能な病変は、胸部Ｘ線による＞２０ｍｍ、ＣＴスキャンを用いる＞１０ｍｍまたは臨床検査によるキャリパーを用いて＞１０ｍｍのように、少なくとも１つの次元において正確に測定できるもの（記録される最大径）として定義されるものであってよい。病理学的に肥大し、測定可能であると見なすために、ＣＴスキャンによって評価する場合、リンパ節は短軸で＞１５ｍｍであってよい。小さな病変（最長径＜１０ｍｍまたは短軸≧１０から＜１５ｍｍを有する病理学的リンパ節）を含むすべての他の病変（または疾患部位）は、測定不能疾患と見なされる場合がある。骨病変、軟髄膜疾患、腹水、胸膜／心膜液貯留、皮膚／肺リンパ管炎（lymphangitis cutis/pulmonitis）、炎症性乳房疾患は、測定不能と見なされる場合がある。
【０１６６】
関連するすべての器官の代表の、器官あたり最大２つの病変および合計５つの病変までのすべての測定可能な病変が、標的病変として同定されてよく、ベースラインで記録および測定される。標的病変は、それらのサイズ（最長径を有する病変）に基づいて選択され、関連するすべての器官の代表とされてもよいが、加えてそれらは、再現性よく反復測定されるものでなければならない。時に、最大病変が再現性のよい測定にならない場合があり、そのような状況では、再現性よく測定され得る次に大きな病変が選択されるべきである。すべての標的病変についての直径（非結節病変について最長、結節病変について短軸）の合計は、算出され、ベースライン合計直径として報告されてよい。リンパ節が合計に含まれる場合には短軸だけが合計に加えられてよい。ベースライン合計直径は、疾患の測定可能な次元での任意の目的の腫瘍退縮をさらに特徴付けるための基準として使用される。
【０１６７】
一部の場合では臨床病変は表在性（例えば、皮膚結節および触知可能リンパ節）であり、カリパーを使用して直径約１０ｍｍ（例えば、皮膚結節）として評価され得る場合に測定可能であると見なされてよい。カリパーが病変を測定するために使用できない場合、ＣＴスキャンまたはＭＲＩも使用されてよい。一部の場合ではＣＴスキャンは、約５ｍｍ以下からの組織のスライスを得ることができる。一部の場合ではＣＴスキャンは、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍまたは０．５ｍｍのスキャンの厚さを有する場合がある。ＣＴスキャンが５ｍｍより厚いスライス厚を有する場合、測定可能な病変の最小サイズは、スライス厚の２倍である場合がある。一部の場合ではＭＲＩも、対象を評価するために実施されてよい。理想的には同じ種類のスキャナーが使用されるべきであり、処置有効性を判定する場合は、画像取得プロトコールは先行するスキャンに可能な限り厳密に従うべきである。身体スキャンは、可能であれば呼吸停止スキャン技術を用いて実施されるべきである。一部の場合では、フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）は、処置効率を測定するために使用されてよい。
【０１６８】
対象が評価されると、標的病変は安定疾患（ＳＤ）、進行性疾患（ＰＤ）、部分応答（ＰＲ）および／または完全応答（ＣＲ）に分類することができる。ＳＤは、直径の最小合計を基準として、ＰＲと認定するためには不十分な縮小およびＰＤと認定するためには不十分な増大と見なされ得る。ＰＤは、最小合計を基準として（これは、ベースライン合計をそれが最小であり得る場合は含んでよい）、標的病変の直径の合計における少なくとも２０％増大と見なされ得る。一部の場合では約２０％の相対的増大に加えて、合計は少なくとも約５ｍｍの絶対的増大も実証しなければならない。ＰＲは、直径のベースライン合計を基準として標的病変の直径の合計における、少なくとも約３０％減少であってよい。ＣＲは、標的病変の排除であってよい。
【０１６９】
一部の場合では、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞などの抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞の投与とリンパ球低減処置とは、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞を単独で投与することと比較して少なくとも約６ヵ月間対象の生存期間中央値を相乗的に増加させることができる、表６。一部の場合では、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞治療とリンパ球低減処置との組合せは、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ免疫応答細胞を単独で投与することと比較して対象の生存期間を少なくとも約１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１ヵ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間または約２５年間まで相乗的に増加させることができる。
【０１７０】
表6:コンストラクト比較
【表６】
2019515913.tif 000008
【０１７１】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、医薬品に製剤化され、それを必要とし、疾患、例えばがんを有すると診断されたヒトまたは哺乳動物を処置するために使用されてよい。これらの医薬品は、ヒトまたは哺乳動物に、１つまたは複数の化学療法剤または化学療法用化合物と併せて同時投与されてよい。
【０１７２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞などの主題のＣＡＲ免疫応答細胞の集団は、当業者に周知の技術を使用して対象への投与のために製剤化されてよい。ＣＡＲ免疫応答細胞の集団を含む製剤は、薬学的に許容される賦形剤（複数可）を含んでよい。製剤中に含まれる賦形剤は、例えば使用されるＴ細胞の亜集団および投与の様式に応じて異なる目的を有する。一般に使用される賦形剤の例として、非限定的に：生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、注射用水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝液および保存剤、等張化剤、増量剤ならびに滑剤が挙げられる。ＣＡＲ免疫応答細胞の集団を含む製剤は、典型的には動物血清などのいかなる非ヒト成分も含まずに調製および培養される。製剤は、１つのＣＡＲ免疫応答細胞の集団、または２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくはそれを超えるなどの１つより多いＣＡＲ免疫応答細胞の集団を含んでよい。例えば製剤は、１つのＣＡＲ  Ｔ細胞の集団、または２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくはそれを超えるなどの１つより多いＣＡＲ  Ｔ細胞の集団を含んでよい。
【０１７３】
抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の集団（複数可）を含む製剤は、当業者に周知の様式および技術を使用して対象に投与されてよい。例示的様式としてこれだけに限らないが、静脈内注射が挙げられる。他の様式として、非限定的に、腫瘍内、皮内、皮下（Ｓ．Ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（接合部）、滑膜内（滑液領域）、頭蓋内、脊髄内およびくも膜下腔内（脊髄液）が挙げられる。製剤注入の非経口注射のために有用な任意の周知のデバイスは、そのような投与を行うために使用できる。
【０１７４】
対象に投与されるＣＡＲ免疫応答細胞の集団（複数可）を含む製剤は、特定の適応症または疾患の処置および／または予防のために有効である多数のＣＡＲ免疫応答細胞を含む。したがってＣＡＲ免疫応答細胞の治療有効な集団は、対象に投与されてよい。一般に約１ｘ１０４個から約１ｘ１０１０個の間のＣＡＲ免疫応答細胞を含む製剤が投与される。多くの場合では製剤は、約１ｘ１０５個から約１ｘ１０９個の間のＣＡＲ免疫応答細胞、約５ｘ１０５個から約５ｘ１０８個のＣＡＲ免疫応答細胞または約１ｘ１０６個から約１ｘ１０７個のＣＡＲ免疫応答細胞を含む。しかし対象に投与されるＣＡＲ免疫応答細胞の数は、がんの位置、原因、同一性、程度および重症度、処置される個体の年齢および状態などに応じて広い範囲で変化する。医師は、使用される適切な投与量を最終的に決定する。
【０１７５】
腫瘍標的化分子は、ＣＡＲ免疫応答細胞の投与に先行してまたは同時にまたは後で対象に投与される。腫瘍標的化分子は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原への会合によって対象中の標的細胞に結合する。腫瘍標的化分子は、当業者に周知の技術を使用して対象への投与のために製剤化されてよい。腫瘍標的化分子の製剤は、薬学的に許容される賦形剤（複数可）を含んでよい。一般に使用される賦形剤の例として、非限定的に：生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、注射用水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合せ、安定化剤、可溶化剤および界面活性剤、緩衝液および保存剤、等張化剤、増量剤ならびに滑剤が挙げられる。
【０１７６】
腫瘍標的化分子は、当業者に周知の様式および技術を使用して対象に投与されてよい。例示的様式としてこれだけに限らないが、静脈内、腹腔内および腫瘍内注射が挙げられる。他の様式として、非限定的に、皮内、皮下（Ｓ．Ｃ．、ｓ．ｑ．、ｓｕｂ−Ｑ、Ｈｙｐｏ）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、動脈内、髄内、心臓内、関節内（接合部）、滑膜内（滑液領域）、頭蓋内、脊髄内およびくも膜下腔内（脊髄液）が挙げられる。一部の場合ではＣＡＲ−Ｔは、肝臓病変などの腫瘍病変に局所的に投与されてよい。製剤の非経口注射または注入のために有用な任意の周知のデバイスは、そのような投与を行うために使用できる。
【０１７７】
腫瘍標的化分子を含む製剤は、特定の適応症または疾患を処置するおよび／または予防のために有効である量で対象に投与される。一般に、体重１ｋｇあたり少なくとも約０．１ｍｇから約１００ｍｇの腫瘍標的化分子を含む製剤は処置を必要とする対象に投与される。多くの場合では投与量は、投与の経路、症状などを考慮して１日に体重１ｋｇあたり約１ｍｇから約１００ｍｇのタグ化タンパク質である。医師は、使用される適切な投与量を決定する。
【０１７８】
一実施形態ではキメラ抗原受容体は、免疫応答細胞性免疫応答を刺激するために使用される。例えばＴ細胞性免疫応答は、Ｔ細胞の活性化を含む免疫応答である。活性化抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞は、例えば腫瘍抗原を示すがん細胞など、それらの表面上に外来抗原のエピトープを示す標的細胞においてアポトーシスを誘導できる。別の実施形態ではキメラ抗原受容体は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供するために使用される。Ｔ細胞性免疫応答によって対象は、抗腫瘍免疫を発達させる。
【０１７９】
ある特定の場合では、がんを有する対象を処置する方法は、がん細胞に結合する腫瘍標的化分子の１つまたは複数の製剤を処置を必要とする対象に投与すること、および腫瘍標的化分子に結合でき、がん細胞死を誘導できる主題のＣＡＲ免疫応答細胞の治療有効な１つまたは複数の集団を投与することを含んでよい。別の実施形態は、がん細胞に結合し、それによりがん細胞死を誘導する主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞の治療有効な１つまたは複数の集団を処置を必要とする対象に投与することを含む、がんを有する対象を処置する方法に関する場合がある。
【０１８０】
抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞および抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を腫瘍標的化分子との組合せで含む両製剤の投与頻度は、処置される疾患、ＣＡＲ免疫応答細胞および腫瘍標的化分子を含む要素および投与の様式を含む要因に依存して変化する。各製剤は、１日４回、３回、２回または１回、１日おき、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、１週間に１回、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、２週間ごと、１ヵ月ごとおよび２ヵ月ごとに独立に投与されてよい。
【０１８１】
本明細書において使用される「化学療法剤」または「化学療法化合物」ならびにそれらの文法的同義語は、がんの処置において有用な化学的化合物であってよい。開示されるＣＡＲ免疫応答細胞との組合せで使用できるがん化学療法剤として、これだけに限らないが、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）が挙げられる。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびＮａｖｅｌｂｉｎｅ（商標）［ビノレルビン、５’−ノルアンヒドロブラスチン（noranhydroblastine）］を含む。さらに他の実施形態ではがん化学療法剤として、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼＩ阻害剤が挙げられる。本明細書において使用される「カンプトテシン化合物」として、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（商標）（イリノテカンＨＣＬ）、Ｈｙｃａｍｔｉｎ（商標）（トポテカンＨＣＬ）およびカンプトテシンに由来する他の化合物ならびにその類似体が挙げられる。本明細書で開示される方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤の別の分類は、エトポシド、テニポシドおよびミトポドジド（mitopodozide）などのポドフィロトキシン誘導体である。本開示は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤として周知の他のがん化学療法剤をさらに包含する。これらとして、非限定的にシスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン（chlomaphazin）およびダカルバジンが挙げられる。開示は、化学療法剤として代謝拮抗薬を包含する。この種類の薬剤の例として、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン（azathioprime）およびプロカルバジンが挙げられる。本明細書で開示される方法および組成物において使用され得るがん化学療法剤の追加的な分類として、抗生物質が挙げられる。例として、非限定的に、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシン（mytomycin）Ｃおよびダウノマイシンが挙げられる。これらの化合物について商業的に入手できる多数のリポソーム製剤がある。本開示は、非限定的に抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミドおよびミトキサントロンが挙げられる他のがん化学療法剤をさらに包含する。
【０１８２】
主題の抗ＧＰＣ  ＣＡＲ免疫応答細胞は、細胞傷害性／抗新生物剤および抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤との組合せで投与されてよい。細胞傷害性／抗新生物剤は、がん細胞を攻撃し、殺滅させる薬剤として定義され得る。一部の細胞傷害性／抗新生物剤は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤であってよい、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジンおよびダカルバジン。他の細胞傷害性／抗新生物剤は、腫瘍細胞に対する代謝拮抗薬であってよい、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン（mercaptopuirine）、アザチオプリンおよびプロカルバジン。他の細胞傷害性／抗新生物剤は、抗生物質であってよい、例えばドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣおよびダウノマイシン。これらの化合物について商業的に入手できる多数のリポソーム製剤がある。さらに他の細胞傷害性／抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）であってよい。これらとして、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびエトポシドが挙げられる。種々の細胞傷害性／抗新生物剤として、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロンおよびビンデシンが挙げられる。
【０１８３】
抗血管新生剤も使用されてよい。開示された方法および組成物での使用のための好適な抗血管新生剤として、ヒト化およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。血管新生の他の阻害剤として、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（αおよびβを含む）インターロイキン１２、レチノイン酸ならびにメタロプロテイナーゼ−１および−２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１および−２）が挙げられる。ラゾキサンなどのトポイソメラーゼ、抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が挙げられる小分子も使用されてよい。
【０１８４】
主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞との組合せで使用できる他の抗がん剤として、これだけに限らないが：アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アデルスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アバスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸エステル；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸エステル；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトギリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィ���ーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンレウロシン；ビノレルビン酒石酸塩；硫酸ビンロシジン；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩を含むがこれらに限定されない。他の抗がん薬は、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アデルスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生インヒビター；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アントラレリックス；ＡＤＭＰ（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１；前立腺癌用の抗アンドロゲン；抗エストロゲン；抗ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節剤；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦインヒビター；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキサミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来インヒビター；カルゼレシン；カゼインキナーゼインヒビター（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサ��ンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペントアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；サイトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン：ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；フォルフェニメックス；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼインヒビター；ゲムシタビン；グルタチオンインヒビター；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様成長因子１受容体インヒビター；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアノール；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリンＮトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害性因子；白血球アルファインターフェロン；ロイポロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリリシンインヒビター；マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦインヒビター；ミフェプリ��トン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシンである線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対するモノクローナル抗体；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子インヒビター；ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  １ベースの治療；マスタード系抗がん剤；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンザミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン：ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物による抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼインヒビター；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソームインヒビター；プロテインＡベースの免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣインヒビター；小型藻類のプロテインキナーゼＣインヒビター；プロテインチロシンホスファターゼインヒビター；プリンヌクレオシドホスホリラーゼインヒビター；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒ
ａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター；ｒａｓインヒビター；ｒａｓ−ＧＡＰインヒビター；脱メチル化レテリプチン；レニウム（Ｒｅ１８６）エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；老齢由来インヒビター１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達インヒビター；シグナル伝達モジュレーター；単鎖抗原結合性タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合性タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞インヒビター；幹細胞分裂インヒビター；スチピアミド；ストロメリシンインヒビター；スルフィノシン；過活動血管作動性腸管ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼインヒビター；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チロコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激性ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳インヒビター；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼインヒビター；チルホスチン；ＵＢＣインヒビター；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；赤血球遺伝子治療のためのベクター系；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。一実施形態では抗がん薬は、５−フルオロウラシル、タキソールまたはロイコボリンである。
【０１８５】
一部の場合では主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、注射、カテーテルなどによって導入されてよい。一部の場合では、これだけに限らないが、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびＩＬ−１１、ならびに他のインターロイキン、コロニー刺激因子、Ｇ−、Ｍ−およびＧＭ−ＣＳＦなど、インターフェロン、例えばガンマインターフェロンならびにエリスロポエチンが挙げられる免疫賦活剤も含まれてよい。一部の場合では対象は、ＣＡＲ−Ｔ、免疫枯渇剤（immunodepletant）および免疫賦活剤を用いて処置されてよい。対象は、ＣＡＲ−Ｔ細胞産生物（cellular product）の性能をブーストするようにＩＬ−２を用いて処置されてよい。一部の場合では免疫賦活剤は、組換えタンパク質であってよい。免疫賦活剤は、タンパク質の活性部分を含んでもよい。一部の場合では免疫賦活剤は、タンパク質の一部だけを含んでもよい。タンパク質の一部は、タンパク質の約５０％から６０％、７０％、８０％、９０％または約１００％までであってよい。
【０１８６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞などの主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を含む組成物は、選択されたｐＨに緩衝されてよい滅菌液体調製物、例えば等張水性溶液、懸濁物、乳剤、分散剤または粘稠組成物として好都合に提供されてよい。液体調製物は、ゲル、他の粘稠組成物および固形組成物より通常容易に調製される。追加的に液体組成物は、投与する、特に注射による、ためにある程度さらに好都合である。一方粘稠組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために適切な粘度範囲内になるように製剤化することができる。液体または粘稠組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい担体を含んでよい。滅菌の注射可能溶液は、適切な溶媒の必要量中に本発明の実施において利用される遺伝的に改変されたＣＡＲ免疫応答細胞を、適宜、種々の量の他の成分と共に組み込むことによって調製され得る。そのような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖などの好適な担体、希釈剤または賦形剤との混合であってよい。組成物は、凍結乾燥されてもよい。組成物は、望ましい投与の経路および調製物に応じて湿潤、分散または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘稠増強添加剤、保存剤、香味剤、着色料などの補助物質を含有する場合がある。参照により本明細書に組み込まれる"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985、などの標準的テキストは、過度の実験を行わずに好適な調製物を調製するために参考にされてよい。抗菌性保存剤、抗酸化物質、キレート剤および緩衝液が挙げられる組成物の安定性および滅菌性を増強できる種々の添加剤は、加えられてよい。微生物作用の予防は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの種々の抗菌剤および抗真菌剤によって確実にされる。注射可能な医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。しかし本発明により、使用される任意の媒体、希釈剤または添加剤は、遺伝的に改変されたＣＡＲ免疫応答細胞またはそれらの前駆体と適合性でなければならない。
【０１８７】
一部の場合では組成物は、等張であってよい、すなわちそれらは、血液および涙液と同じ浸透圧を有してよい。本発明の組成物の望ましい等張性は、塩化ナトリウムまたは、ブドウ糖、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質などの他の薬学的に許容される薬剤を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液のために特に好ましい。組成物の粘度は、適宜、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択されたレベルに維持されてよい。メチルセルロースは、容易におよび経済的に入手可能であり、扱いやすいことから好ましい。他の好適な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒロドキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘物質の好ましい濃度は、選択された薬剤に依存する。重要なポイントは、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、好適な担体および他の添加剤の選択は、実際の投与経路および具体的な投与形態、例えば液体投与形態の性質（例えば、組成物が溶液、懸濁剤、ゲルまたは、徐放性形態もしくは液体充填形態などの別の液体形態に製剤化されるかどうか）に依存する。
【０１８８】
一部の場合では、例えばがんを処置する組成物、製剤および方法において投与される組成物または製剤の単位投与量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ｍｇであってよい。一部の場合では投与される組成物または製剤の総量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｇであってよい。
【０１８９】
一部の場合ではＣＡＲ  Ｔ細胞などの主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を含む医薬組成物は、単独でまたは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と共に、任意の経路によって投与されてよく、そのような投与は単一および複数投与の両方で実行することができる。さらに具体的には医薬組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハンドキャンディー（hand candies）、粉剤、スプレー、水性懸濁剤、注射可能溶液、エリキシル剤、シロップなどの形態の種々の薬学的に許容される不活担体と組み合わされてよい。そのような担体として、固形希釈剤または充填剤、滅菌水性媒体および種々の無毒性有機溶媒などが挙げられる。さらにそのような経口医薬製剤は、そのような目的のために一般に使用される種類の種々の薬剤の手段によって好適に加糖および／または香味付けされてよい。
【０１９０】
例えば細胞は、これだけに限らないが抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン−２またはシタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても周知）などの薬剤を用いる処置が挙げられる任意の数の関連処置手法と併用して（例えば、前に、同時にもしくは続いて）患者に投与されてよい。一部の場合では操作された細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体または、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体治療などの他の免疫除去（immunoablative）剤、サイトキシン、フルダリビン（fludaribine）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインおよび照射との組合せで使用されてよい。操作された細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどのいずれかの化学療法剤を使用するＴ細胞除去治療、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドまたはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体と併用して（例えば前、同時または続いて）患者に投与されてもよい。一部の場合では操作された細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去治療に続いて投与されてよい。例えば対象は、高用量化学療法に続いて末梢血幹細胞移植を用いる標準的処置を受けてよい。ある特定の実施形態では移植に続いて対象は、操作された細胞、例えば増殖された操作された細胞の注入を受けてよい。追加的に、増殖された操作された細胞は、手術の前にまたは続いて投与されてよい。本明細書に記載される方法のいずれか１つによって得られた操作された細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を処置するために使用されてよい。したがって、不活性化ＴＣＲアルファおよび／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む操作された細胞の有効量を前記患者に投与することによって前記患者を処置することを含む、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を処置する方法は、検討されてよい。
【０１９１】
キット
本明細書では、組成物を含むキットが開示され得る。本明細書では、がん、病原体感染、免疫障害または同種移植の処置または予防のためのキットも開示され得る。一実施形態ではキットは、１つまたは複数の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを含む細胞の有効量を含有する治療用または予防用組成物を単位投与形態で含んでよい。一部の実施形態ではキットは、治療用または予防用ワクチンを含有できる滅菌容器を含み；そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスター包装または当技術分野において周知の他の好適な容器形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔または、医薬を保持するために好適な他の材料から作製されてよい。一部の場合ではＣＡＲ  Ｔ細胞などの主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、がん、病原体感染、免疫障害または同種移植を有するまたは発症する危険がある対象にＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための説明書と共に提供されてよい。説明書は、がん、病原体感染、免疫障害または同種移植の処置または予防のための組成物の使用に関する情報を全般に含む。一部の場合ではキットは、細胞約１ｘ１０４個から細胞約１ｘ１０１２個を含んでよい。一部の場合ではキットは、細胞少なくとも約１ｘ１０５個、細胞少なくとも約１ｘ１０６個、細胞少なくとも約１ｘ１０７個、細胞少なくとも約４ｘ１０７個、細胞少なくとも約５ｘ１０７個、細胞少なくとも約６ｘ１０７個、細胞少なくとも約６ｘ１０７個、細胞少なくとも約８ｘ１０７個、細胞少なくとも約９ｘ１０７個、細胞少なくとも約１ｘ１０８個、細胞少なくとも約２ｘ１０８個、細胞少なくとも約３ｘ１０８個、細胞少なくとも約４ｘ１０８個、細胞少なくとも約５ｘ１０８個、細胞少なくとも約６ｘ１０８個、細胞少なくとも約６ｘ１０８個、細胞少なくとも約８ｘ１０８個、細胞少なくとも約９ｘ１０８個、細胞少なくとも約１ｘ１０９個、細胞少なくとも約２ｘ１０９個、細胞少なくとも約３ｘ１０９個、細胞少なくとも約４ｘ１０９個、細胞少なくとも約５ｘ１０９個、細胞少なくとも約６ｘ１０９個、細胞少なくとも約６ｘ１０９個、細胞少なくとも約８ｘ１０９個、細胞少なくとも約９ｘ１０９個、細胞少なくとも約１ｘ１０１０個、細胞少なくとも約２ｘ１０１０個、細胞少なくとも約３ｘ１０１０個、細胞少なくとも約４ｘ１０１０個、細胞少なくとも約５ｘ１０１０個、細胞少なくとも約６ｘ１０１０個、細胞少なくとも約６ｘ１０１０個、細胞少なくとも約８ｘ１０１０個、細胞少なくとも約９ｘ１０１０個、細胞少なくとも約１ｘ１０１１個、細胞少なくとも約２ｘ１０１１個、細胞少なくとも約３ｘ１０１１個、細胞少なくとも約４ｘ１０１１個、細胞少なくとも約５ｘ１０１１個、細胞少なくとも約６ｘ１０１１個、細胞少なくとも約６ｘ１０１１個、細胞少なくとも約８ｘ１０１１個、細胞少なくとも約９ｘ１０１１個または細胞少なくとも約１ｘ１０１２個を含んでよい。例えば細胞約５ｘ１０１０個は、キットに含まれてよい。別の例ではキットは、細胞３ｘ１０６個を含んでよい；細胞は細胞約５ｘ１０１０個に増殖させて、対象に投与されてよい。
【０１９２】
一部の場合ではキットは、同種異系細胞を含んでよい。一部の場合ではキットは、ゲノム改変を含む可能性がある細胞を含んでよい。一部の場合ではキットは、「オフザシェルフ」細胞を含んでよい。一部の場合ではキットは、臨床使用のために増殖され得る細胞を含んでよい。一部の場合ではキットは、研究目的のための内容物を含有してよい。
【０１９３】
一部の場合では説明書は、次の少なくとも１つを含む：治療剤；新生物、病原菌感染、免疫障害または同種移植またはその症状の処置または予防のための投与スケジュールおよび投与；注意事項；警告；効能；禁忌（counter-indications）；過量投与情報；有害反応；動物薬理；臨床研究；の説明および／または参考文献。説明書は、容器（ある場合）に直接印刷されてよい、または容器に添付されるラベルとして、または別の印刷物、小冊子、カードまたは容器内にもしくはそれと共に供給される折りたたみ印刷物としてであってよい。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した後に抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞などの抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための手順を提供する。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与する前に抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための手順を提供する。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与することと同時に抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための手順を提供する。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも１２時間後に抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための手順を提供する。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または２日間まで、３日間、４日間、５日間、６日間もしくは７日間までの後に抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための手順を提供する。一部の場合では説明書は、化学療法剤を投与した少なくとも２４時間後に抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与するための手順を提供する。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、静脈内注射のために製剤化され得る。抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞は、固形腫瘍を含む可能性がある対象の肝臓への動脈内注射のために製剤化されてよい。
【０１９４】
一部の場合ではキットは、それを必要とする対象への投与のためにそれぞれ約６０ｍｇ／ｋｇから約８０ｍｇ／ｋｇおよび約２５ｍｇ／ｍ２から約３５ｍｇ／ｍ２に製剤化されたシクロホスファミドおよび／またはフルダラビンを含有してよい。一部の場合ではキットは、産生物を小児投与量で含有してよい。
【０１９５】
組換え方法は、当技術分野において十分周知である。本発明の実施は、他に示す場合を除いて、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用する。そのような技術は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait、ed., 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (Wei & Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller & Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994);および"Current Protocols in Immunology" (Coligan et al., eds., 1991)などの文献に十分説明されている。これらの技術は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、したがって、本発明を作製するおよび実施することにおいて考慮され得る。特に有用な技術は、続くセクションにおいて考察される。
【０１９６】
追加的な適用
有効な養子細胞移入ベース免疫療法（ＡＣＴ）は、がん（例えば、転移性がん）患者を処置するために有用である場合がある。例えば自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、がんまたは腫瘍細胞上でＧＰＣ３を認識する抗ＧＰＣ３キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように本明細書において開示される非ウイルス性またはウイルス性の方法を使用して改変されてよく、開示される方法およびキットにおいて使用することができる。本発明は、対象へのリンパ球低減処置に続いてまたはそれと同時にヒトまたはヒト化キメラ抗原受容体を使用する、これだけに限らないががんが挙げられる、免疫療法のための組成物および方法を対象とし得る。このキメラ抗原受容体は、対象へのリンパ球低減処置に続いてまたはそれと同時にヒトまたはヒト化キメラ抗原受容体コンストラクトを利用する。
【０１９７】
これらの組成物および方法は、多数の優位性を有するがん治療を提供できる。一部の場合では方法は、免疫応答細胞が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の存在または活性に実質的に非依存性になるように免疫応答細胞を改変することを含んでよい。一部の場合では本明細書に記載されるポリ核酸は、キメラ抗原受容体をコードできる。同様に、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲなどのキメラ抗原受容体を発現する免疫応答細胞の作製方法が開示される。がんまたは疾患を有する患者が抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与される場合がある処置方法も開示される。
【０１９８】
本明細書には、リンパ球低減処置に続いてまたはそれと同時にレシピエントに１つまたは複数の主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を移植することを含む、レシピエントにおいて疾患（例えば、がん）を処置する方法が記載される。
【０１９９】
自己リンパ球注入は、処置において使用されてよい。自己末梢血単球（ＰＢＭＣ）は処置を必要とする患者から回収されてよく、Ｔ細胞は本明細書に記載され、当技術分野において周知の方法を使用して活性化および増殖されてよく、次いで患者に注入で戻されてよい。他の場合では同種異系細胞は、患者を処置するために使用されてよい。主題のＣＡＲ免疫応答細胞の集団は、当業者に周知の技術を使用する対象への投与のために製剤化されてよい。次いで増殖された細胞は、未改変細胞のためのものと同様の条件下で増殖されてよく、それにより改変細胞（ceil）は増殖され、種々の目的のために使用されてよい。
【０２００】
本明細書で開示される方法は、移植することを含んでよい。移植は、細胞産生物の養子移植を指してよい。移植は、自家移植、同種移植、異種移植または任意の他の移植であってよい。例えば移植は、異種移植であってよい。移植は、同種移植であってもよい。
【０２０１】
一部の場合では、約５ｘ１０１０個の主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞が対象に投与される。一部の実施形態では細胞約５ｘ１０１０個は、対象に投与される細胞の量の中央値を表す。一部の実施形態では細胞約５ｘ１０１０個は、対象において治療応答を与えるために必要である。一部の実施形態では、細胞少なくとも約１ｘ１０７個、細胞少なくとも約２ｘ１０７個、細胞少なくとも約３ｘ１０７個、細胞少なくとも約４ｘ１０７個、細胞少なくとも約５ｘ１０７個、細胞少なくとも約６ｘ１０７個、細胞少なくとも約６ｘ１０７個、細胞少なくとも約８ｘ１０７個、細胞少なくとも約９ｘ１０７個、細胞少なくとも約１ｘ１０８個、細胞少なくとも約２ｘ１０８個、細胞少なくとも約３ｘ１０８個、細胞少なくとも約４ｘ１０８個、細胞少なくとも約５ｘ１０８個、細胞少なくとも約６ｘ１０８個、細胞少なくとも約６ｘ１０８個、細胞少なくとも約８ｘ１０８個、細胞少なくとも約９ｘ１０８個、細胞少なくとも約１ｘ１０９個、細胞少なくとも約２ｘ１０９個、細胞少なくとも約３ｘ１０９個、細胞少なくとも約４ｘ１０９個、細胞少なくとも約５ｘ１０９個、細胞少なくとも約６ｘ１０９個、細胞少なくとも約６ｘ１０９個、細胞少なくとも約８ｘ１０９個、細胞少なくとも約９ｘ１０９個、細胞少なくとも約１ｘ１０１０個、細胞少なくとも約２ｘ１０１０個、細胞少なくとも約３ｘ１０１０個、細胞少なくとも約４ｘ１０１０個、細胞少なくとも約５ｘ１０１０個、細胞少なくとも約６ｘ１０１０個、細胞少なくとも約６ｘ１０１０個、細胞少なくとも約８ｘ１０１０個、細胞少なくとも約９ｘ１０１０個、細胞少なくとも約１ｘ１０１１個、細胞少なくとも約２ｘ１０１１個、細胞少なくとも約３ｘ１０１１個、細胞少なくとも約４ｘ１０１１個、細胞少なくとも約５ｘ１０１１個、細胞少なくとも約６ｘ１０１１個、細胞少なくとも約６ｘ１０１１個、細胞少なくとも約８ｘ１０１１個、細胞少なくとも約９ｘ１０１１個または細胞少なくとも約１ｘ１０１２個。例えば細胞約５ｘ１０１０個は、対象に投与される場合がある。別の例では、細胞３ｘ１０６個を用いて開始して、細胞は細胞約５ｘ１０１０個に増殖され、対象に投与されてよい。一部の場合では細胞は、治療のために十分な数に増殖される。例えば細胞５ｘ１０７個は治療用使用のための十分な数を生成するために急速増殖を経る場合がある。一部の場合では治療用使用のための十分な数は、５ｘ１０１０個であってよい。任意の数の細胞が治療用使用のために注入されてよい。例えば対象は、１ｘ１０６から５ｘ１０１２個の間の数（これらの数を含む）の細胞を注入されてよい。患者は、彼らのために生成され得る、可能な限り多数の細胞を用いて注入されてよい。一部の場合では患者に注入される細胞は、すべて操作されているとは限らない。例えば患者に注入される細胞の少なくとも９０％は、操作されていてよい。他の場合では、患者に注入される細胞の少なくとも４０％は操作されていてよい。一部の実施形態では方法は、対象において治療応答を与えるために必要な、操作された細胞の量を算出することおよび／または対象に投与することを含み得る。一部の実施形態では、治療応答を与えるために必要な、操作された細胞���量を算出することは、細胞の生存率および／または抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ導入遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる効率を含む。一部の実施形態では、対象に治療応答を与えるために、対象に投与される細胞は生細胞であってよい。いくつかの実施形態では、対象に治療応答を及ぼすために、細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％は生細胞である。一部の実施形態では、対象に治療応答を与えるために、対象に投与される細胞は、細胞のゲノムに１つまたは複数の導入遺伝子が良好に組み込まれた細胞であってよい。一部の実施形態では、対象に治療応答を及ぼすために、細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％、少なくとも約１５％、少なくとも約１０％で、１つまたは複数のＣＡＲ導入遺伝子が細胞のゲノムに良好に組み込まれている。
【０２０２】
一部の場合では対象は、主題の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ免疫応答細胞を投与されてよく、投与され得るＣＡＲ免疫応答細胞は約１から約３５日齢であってよい。例えば投与される細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または約４０日齢までであってよい。ＣＡＲ免疫応答細胞の日齢は、刺激時からの日齢と考えてよい。ＣＡＲ免疫応答細胞の日齢は、アフェーレシス時からの日齢と考えてよい。ＣＡＲ免疫応答細胞の日齢は、形質導入時からの日齢と考えてよい。一部の実施形態では、対象に投与され得るＣＡＲ免疫応答細胞は、約１０から約１４または約２０日齢である。一部の場合ではＣＡＲ免疫応答細胞の「日齢」は、テロメアの長さによって決定してよい。例えば「若い」ＣＡＲ免疫応答細胞は、「疲弊した」または「古い」ＣＡＲ免疫応答細胞よりも長いテロメア長を有する場合がある。特定の理論に束縛されることなく、免疫応答細胞は１週間培養あたり約０．８ｋｂの推定テロメア長を失い、若いＣＡＲ免疫応答性細胞培養物は、約４４日齢である免疫応答細胞よりも約１．４ｋｂ長いテロメアを有し得ると考えられる。特定の理論に束縛されることなく、より長いテロメア長は、患者での陽性の客観的な臨床応答およびインビボでの細胞の持続性に関連する場合があると考えられる。
【０２０３】
一部の場合では細胞は、核酸（例えば遺伝子またはｃＤＮＡ）をトランスフェクトされた対象生物から単離され、対象生物（例えば患者）に再注入して戻される。
【０２０４】
移植前、後および／またはその際の細胞（例えば、操作された細胞または操作された初代Ｔ細胞）は、機能性であってよい。例えば移植される細胞は、移植後少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００日間機能性であり得る。移植される細胞は、移植後少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヵ月機能性であり得る。移植された細胞は、移植後少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５または３０年間機能性であり得る。一部の場合では移植された細胞は、レシピエントの寿命まで機能性であり得る。
【０２０５】
さらに、移植された細胞は、それらの通常意図される機能の１００％で機能できる。移植された細胞は、それらの通常意図される機能の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または約１００％まででも機能できる。
【０２０６】
移植される細胞は、それらの通常意図される機能の１００％を超えても機能できる。例えば移植される細胞は、それらの通常意図される機能の１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００または約５０００％まで機能できる。
【０２０７】
移植することは、任意の種類の移植によってでよい。部位として、これだけに限らないが、肝被膜下腔（subcapsular space）、脾臓被膜下腔、腎被膜下腔、網、胃もしくは腸の粘膜下、小腸の血管セグメント、静脈嚢（venous sac）、精巣、脳、脾臓または角膜が挙げられる。例えば移植は、被膜下移植であってよい。移植は、筋肉内移植であってもよい。移植は、門脈内移植であってよい。
【０２０８】
処置（例えば本明細書に開示される処置のいずれか）後、移植拒絶は、１つまたは複数の野生型細胞がレシピエントに移植される場合と比較して改善され得る。例えば移植拒絶は、超急性拒絶である場合がある。移植拒絶は、急性拒絶である場合がある。他の種類の拒絶として、慢性拒絶が挙げられる。移植拒絶は、細胞性拒絶またはＴ細胞性拒絶である場合もある。移植拒絶は、ナチュラルキラー細胞性拒絶である場合もある。
【０２０９】
移植を改善することは、超急性拒絶を減らすことを意味し、望ましくない影響または症状を減少させる、減らすまたは消失させることを包含できる。移植は、細胞産生物の養子移植を指す場合がある。
【０２１０】
良好な移植の別の指標は、レシピエントが免疫抑制療法を必要としない日数であってよい。例えば、本明細書で提供する処置（例えば移植）後、レシピエントは、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間またはこれを超えて免疫抑制療法を必要としない場合がある。これは、移植が良好であったことを示すことができる。これは、移植された細胞、組織および／または器官の拒絶がないことも示すことができる。
【０２１１】
一部の場合ではレシピエントは、少なくとも１日間免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも７日間免疫抑制療法を必要としない場合もある。レシピエントは、少なくとも１４日間免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも２１日間免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも２８日間免疫抑制療法を必要としない場合がある。レシピエントは、少なくとも６０日間免疫抑制療法を必要としない場合がある。さらにレシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間またはそれを超えて免疫抑制療法を必要としない場合がある。
【０２１２】
良好な移植の別の指標は、低減された免疫抑制療法をレシピエントが必要とする日数であってよい。例えば、本明細書で提供する前記処置後、レシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日間またはそれを超えて低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。これは、移植が良好であったことを示すことができる。これは、移植された細胞、組織および／または器官に拒絶がないまたは最小であることも示すことができる。
【０２１３】
例えば、レシピエントは、少なくとも１日間低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも７日間低減された免疫抑制療法を必要とする場合もある。レシピエントは、少なくとも１４日間低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも２１日間低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも２８日間低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。レシピエントは、少なくとも６０日間低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。さらにレシピエントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間またはそれを超えて低減された免疫抑制療法を必要とする場合がある。
【０２１４】
低減された免疫抑制療法は、１つまたは複数の野生型細胞がレシピエントに移植された場合に必要な免疫抑制療法と比較した低免疫抑制療法を指すことができる。
【０２１５】
免疫抑制療法は、免疫系を抑制する任意の処置を含むことができる。免疫抑制療法は、レシピエントにおいて移植拒絶を緩和、最小化または排除する助けとなり得る。例えば免疫抑制療法は、免疫抑制薬を含んでよい。移植前、その際および／またはその後に使用できる免疫抑制薬は、これだけに限らないがＭＭＦ［ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）］、ＡＴＧ（抗胸腺細胞グロブリン）、抗ＣＤ１５４（ＣＤ４ＯＬ）、抗ＣＤ４０（２Ｃ１０、ＡＳＫＰ１２４０、ＣＣＦＺ５３３Ｘ２２０１）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、抗ＣＤ２０（リツキシマブ）、抗ＩＬ−６Ｒ抗体（トシリズマブ、アクテムラ）、抗ＩＬ−６抗体［サリルマブ、オロキズマブ（olokizumab）］、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ（アバタセプト／オレンシア）、ベラタセプト（ＬＥＡ２９Ｙ）、シロリムス［ラピミューン（Rapimune）］、エベロリムス、タクロリムス（プログラフ）、ダクリズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（シムレクト）、インフリキシマブ（レミケード）、シクロスポリン、デオキシスパガリン、可溶性補体受容体１、コブラ毒因子、コンプスタチン、抗Ｃ５抗体（エクリズマブ／ソリリス）、メチルプレドニゾロン、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、抗ＩＬ−２Ｒ−Ａｂ、ラパマイシン、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＯＸ４０抗体および抗ＣＤ１２２抗体。さらに、１つまたは１つより多い免疫抑制剤／薬は、共にまたは逐次的に使用されてよい。１つまたは１つより多い免疫抑制剤／薬は、導入療法または維持療法のために使用されてよい。同じまたは異なる薬物が誘導および維持段階の際に使用されてよい。一部の場合ではダクリズマブ（ゼナパックス）は、導入療法のために使用されてよく、タクロリムス（プログラフ）およびシロリムス（ラピミューン）は、維持療法のために使用されてよい。ダクリズマブ（ゼナパックス）は、導入療法のためにも使用されてもよく、低用量タクロリムス（プログラフ）および低用量シロリムス（ラピミューン）は、維持療法のために使用されてよい。免疫抑制は、これだけに限らないが、全身照射、胸腺照射ならびに全および／または部分的脾臓摘出が挙げられる非薬物レジメンを使用して達成することもできる。これらの技術は、１つまたは複数の免疫抑制薬との組合せで使用されてもよい。
【実施例】
【０２１６】
本発明は、次の実験的実施例を参照することによって詳細にさらに記載される。これらの実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、他に規定のない限り限定を意図しない。したがって本発明は、次の実施例に限定されると全く見なされるべきでなく、むしろ本明細書で提供する教示の結果として明らかになる任意のおよびすべての変形形態を包含すると見なされるべきである。
【実施例１】
【０２１７】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲベクターの構築
例示的レンチウイルスプラスミドベクターを第３世代の自己不活性化レンチウイルスベクター系を使用して構築した。系は、Ｇａｇ／ＰｏｌをコードするパッキングプラスミドｐＭＤＬｇ  ＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ＲｅｖをコードするパッキングプラスミドｐＲＳＶ−ＲＥＶ（Ａｄｄｇｅｎｅ）、ＶＳＶ−ＧをコードするエンベローププラスミドｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）および空ベクターｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＰＧＫ−ＧＦＰ．ＷＰＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ）ベースの、ＣＡＲ遺伝子をコードする組換え発現ベクターを含有する。系は、複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ）粒子を形成する危険を有効に低下させることができる。
【０２１８】
空ベクターｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＰＧＫ−ＧＦＰ．ＷＰＲＥは、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）のプロモーターおよび、プロモーターとＣＤ８αｓｐシグナルペプチドとの間に挿入ＭｌｕＩ切断部位を含有する。詳細にはｐＷＰＴ−ＥＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）をＣｌａＩ／ＳａｌＩ（ＮＥＢ）を用いて二重消化して１．１ＫｂのＤＮＡ断片を回収し、次に、ＣｌａＩ／ＳａｌＩを用いて二重消化したｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＰＧＫ−ＧＦＰ．ＷＰＲＥにＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションした。次にライゲーション混合物を宿主細胞ＴＯＰ１０に形質転換した。陽性クローンをコロニーＰＣＲによって同定し、配列決定によって確認し、組換えプラスミドｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥを生成した。ＣＤ８αシグナルドメイン（別名断片１、４４２ｂｐ）のＥＦ−１αプロモーター（配列番号３３、Ｍｌｕ  Ｉ切断部位を含む）を上流プライマー５’−ｇｃａｇｇｇｇａａａｇａａｔａｇｔａｇａｃａ−３’（配列番号３１）、下流プライマー５’−ＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧ−３’（配列番号３２）および鋳型としてｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥを用いて増幅させた、増幅は次の条件下で実行した：初期変性９４℃、４分間；変性、９４℃、３０秒間、アニーリング、５３℃、３０秒間、および伸長６８℃、３０秒間；ならびに２５サイクル後、伸長６８℃、１０分間。増幅されたバンドが予測される断片サイズを有することをアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２１９】
ヒト化ＧＰＣ３タンパク質を特異的に認識できるヒト化抗体３５は、中国特許出願第ＣＮ２０１５１０４８１２３５．１号に記載されている。３５−ＣＡＲレンチウイルスプラスミドを構築するために、次のものを重鎖可変ドメイン断片を提供する増幅において使用した：鋳型として重鎖可変ドメイン３５（ＣＮ２０１５１０４８１２３５．１の配列番号８０）含有する断片、上流プライマー５’−ｃｔｃｃａｃｇｃｃｇｃｃａｇｇｃｃｇｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇ−３’（配列番号３４）、および下流プライマー５’−ＧＣＧＧＴＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧ−３’（配列番号３５）；次のものを軽鎖可変ドメイン断片を提供するために使用した：鋳型として３５の軽鎖可変ドメイン（配列番号７９  ＣＮ２０１５１０４８１２３５．１を含有する断片、上流プライマー５’−ＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＡＣ−３’（配列番号３６）、および下流プライマー５’−ＣＧＧＣＧＣＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧ−３’（配列番号３７）。上流ＣＤ８αシグナルペプチドおよび下流ヒンジ領域に反復性である配列を含む３５ｓｃＦｖ断片（配列番号３８、別名断片２、７６５ｂｐ）を提供するように重鎖および軽鎖可変ドメインプライマーを橋渡し（bridging）ＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲ増幅を次の条件下で実行した：初期変性９４℃、４分間；変性、９４℃、４０秒間、アニーリング、５８℃、４０秒間；伸長６８℃、４０秒間；および２５サイクル後、伸長６８℃、１０分間。増幅されたバンドが予測される断片サイズを有することをアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０２２０】
上流プライマー５’−ａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇ−３’（配列番号３９）および下流プライマー５’−ａａｔｃｃａｇａｇｇｔｔｇａｔｔｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃ−３’（配列番号４０）を、ｐＷＰＴ−ｅＧＦＰ−Ｆ２Ａ−ＧＰＣ３−２８Ｚを鋳型として用いて（中国特許出願第ＣＮ１０４１４０９７４  Ａ号を参照されたい）、ヒンジ−２８Ｚ（配列番号４１、断片３、７０３ｂｐ）（内部Ｓａｌ  Ｉ切断部位を有する）を増幅するために使用した。ＰＣＲ増幅を次の条件下で実行した：初期変性９４℃、４分間；変性、９４℃、３０秒間、アニーリング、６０℃、３０秒間、伸長６８℃、３０秒間；および２５サイクル後、最終伸長６８℃、１０分間。増幅されたバンドが予測される断片サイズを有することをアガロースゲル電気泳動によって確認した。等モル量（約５０ｎｇ）の断片１、断片２および断片３をオーバーラップＰＣＲによって次の条件下で増幅させた：初期変性９４℃、４分間；変性、９４℃、４０秒間、アニーリング、６０℃、４０秒間、伸長６８℃、１４０秒間；および５サイクル後、最終伸長６８℃、１０分間。次にＤＮＡポリメラーゼ、上流プライマー５’−ｇｃａｇｇｇｇａａａｇａａｔａｇｔａｇａｃａ−３’（配列番号３１）および下流プライマー５’−ａａｔｃｃａｇａｇｇｔｔｇａｔｔｇｔｃｇａｃｃｔａｇｃｇａｇｇｇｇｇｃａｇｇｇｃｃｔｇｃ−３’（配列番号４０）を混合物に補充し、次の条件下で２５サイクル増幅させた：初期変性９４℃、４分間；変性、９４℃、４０秒間、アニーリング、６０℃、４０秒間、伸長６８℃、１４０秒間；および最終伸長６８℃、１０分間。生じる３５−２８Ｚ（配列番号４１）の理論サイズは１８７４ｂｐであった。増幅産物はアガロースゲル電気泳動によって確認され、配列番号２３として示す予測断片サイズおよび配列を有した。
【０２２１】
ベクターｐＲＲＬＳＩＮ−ｃＰＰＴ．ＥＦ−１α−ＥＧＦＰ．ＷＰＲＥベクターおよび３５−２８ＺをＭｌｕＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、次いでＴ４リガーゼを用いてライゲーションし、ＴＯＰ１０に形質転換した。ｐＲＲＬ−ＥＦ−１α−３５−２８Ｚが得られたことを確認するために陽性クローンは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによってコロニーＰＣＲおよび配列決定を用いて同定された。
【実施例２】
【０２２２】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲレンチウイルスのパッケージング
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲレンチウイルスストック溶液（０．７５Ｌ）を胚性腎臓細胞２９３  Ｔ（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）を使用して調製した。詳細には２９３Ｔ細胞を１．１７×１０４／ｃｍ２で５層セルスタック（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。溶液Ａを１３３．２μｇのパッケージングプラスミドｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、１３３．２μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ、５１．５６μｇのｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇおよび１１１．７μｇのｐＲＲＬ−ＥＦ−１α−３５−２８Ｚを含むように、９６６μｇの全プラスミドを１７ｍｌ  ＤＭＥＭ基本培地に溶解し、穏やかに混合することによってトランスフェクションの当日に調製した。溶液Ｂを２．９ｍｇ  ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１７ｍｌ  ＤＭＥＭ基本培地に溶解することによって調製し、溶液を穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。次いで溶液Ａを溶液Ｂに加え、均一に混合し、室温に２０分間から２５分間置いた。次いで２９３  Ｔ培養液をセルスタックから１Ｌフラスコに移した。次にプラスミドおよびＰＥＩを含む合わせた溶液を培養液に加え、穏やかに混合した。次いで得られた溶液をセルスタックに移し、培地を１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充した新鮮増殖培地ＤＭＥＭに変更する前に５時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次に培養物を３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間インキュベートした。次にレンチウイルスストック溶液を回収し、０．４５μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを用いてろ過し、ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）ＩＩｉ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を用いて濃縮および精製し、ＡＩＭ−Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて洗浄し、保存した。ウイルスのタイトレーションをＣＮ１０４１４０９７４Ａに記載の方法により実行した。ウイルスタイターを約１×１０８／ｍｌと算出した。ウイルスを１×１０８／バイアルにパッケージングし、後の使用まで−８０℃で保存した。
【実施例３】
【０２２３】
抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製および肝臓がん細胞に対するインビトロ抗腫瘍アッセイ
ＣＡＲ  Ｔ細胞をｃＧＭＰ標準に従って免疫細胞調製ラボで調製した。詳細には、対象の末梢血またはＣＯＢＥスペクトル血液成分分離機を使用して得た白血球濃縮血液をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るために密度勾配遠心分離によって分離した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の両方でコートした磁気ビーズと、ＰＭＢＣ対磁気ビーズ１：３の比で混合し、組換えヒトＩＬ−２を最終濃度３００Ｕ／ｍＬ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｕａ  Ｘｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）で用いて刺激し、４８時間培養した。次に前述のレンチウイルスを活性化Ｔ細胞をおよそ５のＭＯＩで形質導入するためにＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ）によって形質導入効率を増強して使用した。形質導入２４時間および４８時間後に、遊離ウイルスを低速遠心分離（１００ｇｘ１０分間）を通じた培地交換によって除いた。形質導入７２時間後、磁気ビーズを除いた。前述の遠心分離を繰り返し、継代培養物を密度５ｘ１０５／ｍＬで得た。次に細胞を密度約３ｘ１０５／ｍＬで一日おきに継代培養した一方で、組換えヒトＩＬ−２をリンパ球培養培地に最終濃度３００Ｕ／ｍＬで加えた。
【０２２４】
形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞を１０から１２日間のインビトロ培養に続いてそれらのＣＡＲの発現についてフローサイトメトリーによってアッセイした。すなわちＣＡＲ  Ｔ細胞の陽性形質導入率をアッセイし、表７に示す。さらにインビトロ抗腫瘍アッセイを、高ＧＰＣ３発現肝臓がん細胞Ｈｕｈ−７、低ＧＰＣ３発現ＰＬＣ／ＰＲＦ／５およびＧＰＣ３陰性ＳＫ−ＨＥＰ−１とのエフェクター対標的比３：１、１：１および１：３での１８時間共インキュベーションによって実行した。詳細な手順についてＣＮ１０４１４０９７４Ａを参照されたい。エフェクター対標的比１：１でのインビトロ抗腫瘍活性結果を表８に提示する。
【０２２５】
結果は、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＡＲを約４０％から約８０％の範囲で発現したことを示している。さらに、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＰＣ３陽性Ｈｕｈ−３およびＰＬＣ／ＰＲＦ／５を特異的に殺滅させ、エフェクター対標的比に対する用量依存的効果を有していたが、一方、それらはＧＰＣ３陰性ＳＫ−ＨＥＰ−１に殺滅効果を有さず（表８）、本開示において対象から調製された抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が優れた標的化殺滅効果を有することを示している。
【０２２６】
表7:対象由来抗GPC3-CAR T細胞の陽性形質導入率および投与レジメンの概要
【表７】
2019515913.tif 000009
【０２２７】
表8:対象由来抗GPC3-CAR T細胞のインビトロ殺滅(エフェクター対標的比3:1、1:1および1:3、インビトロ、18時間)
【表８】
2019515913.tif 000010
【実施例４】
【０２２８】
リンパ球低減後のリンパ球の変化
処置対象由来の抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞調製の際に異常が生じなかったことを確認後、対象がインビボリンパ球低減に好適であるかどうかを判定するために対象を種々の健康状態の包括的評価に供した。主なリンパ球低減プロトコールは、好適な対象への投与のために設計された。
【０２２９】
次の２つのリンパ球低減プロトコールを設計した：プロトコール１：シクロホスファミド（ＣＴＸ）単剤リンパ球低減プロトコール、用量１ｇ／ｍ２／日ｘ１日。プロトコール２：併用フルダラビン（ＦＬＵ）＋シクロホスファミドリンパ球低減プロトコール、用量２０〜３０ｍｇフルダラビン／ｍ２／日ｘ４日間＋５００ｍｇシクロホスファミド／ｍ２／日ｘ２日間。
【０２３０】
プロトコールを次の条件を含むように調整して実施した：ヒト表面積の算出をスチーブンソンの式（Chinese Journal of Physiology, 12:327,1937）に従って実行した。すなわち表面積（ｍ２）＝０．００６１ｘ身長（ｃｍ）＋０．０１２８ｘ体重（ｋｇ）−０．１５２９。例えば身長１７０ｃｍおよび体重６０ｋｇの成人は、表面積１．６５２１ｍ２を有する。現在の健康状態または彼ら自身の意志によりリンパ球低減に好適でない対象は、第２列に割り当てた。異なるリンパ球低減処置を合計３名の対象（Ｈ０１、Ｈ０２およびＨ０３）で実施した。１名の対象（Ｈ０４）は健康状態およびその意志により除去に供されなかった。プロトコールを表９に提示する。
【０２３１】
表9:対象のためのリンパ球低減プロトコールの概要
【表９】
2019515913.tif 000011
【０２３２】
Ｈ０１１は、対象Ｈ０１への抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の初回投与を示している；Ｈ０１２は、対象Ｈ０１への抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の２回目の投与を示している；およびＤ０は抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞投与が実行された日と定義した。前述のリンパ球低減プロトコールの実施に続いて、対象においてリンパ球の絶対値に種々の変化が生じた。単剤としてのシクロホスファミドのリンパ球低減処置の結果として、リンパ球は約４０％から約７２％減少した。フルダラビンとシクロホスファミドとの併用リンパ球低減は、シクロホスファミド単剤投与と比較して約８２％から約９６．５％のリンパ球低減においてさらに顕著な差異をもたらした。詳細には図２は、リンパ球低減処置投与前および後の各モニタリング時点での、リンパ球の絶対数対ベースラインの比の変化を実証している。前述の結果は、フルダラビンとシクロホスファミドとの併用が、シクロホスファミド単剤低減プロトコールと比較して、より優れたリンパ球低減を生じることを実証している。
【実施例５】
【０２３３】
除去後の対象の臨床応答
リンパ球低減の実施の約２日後、対象に、静脈内投与によって抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置を投与した。投与された抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量を表７に提示する。処置後の対象の臨床応答を表１０に要約する。結果は、リンパ球低減を受けた３名の対象が抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置後から現在まで安定疾患（ＳＤ）または部分疾患（ＰＲ）を有することを実証している。対照的に、リンパ球低減処置を受けなかった対象Ｈ０４は、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置４週間後にＭＲＩによる進行性疾患を示す。
【０２３４】
ＡＦＰ結果に関して、対象Ｈ０２はＡＦＰ非感受性のために腫瘍マーカーから予後について評価できなかった。他の２名の対象について、表１０のとおり彼らのＡＦＰレベルはある程度減少した。対象Ｈ０３が、併用フルダラビンおよびシクロホスファミドを使用するリンパ球低減後に、処置前のベースラインと比較してＡＦＰの８７％低減を示したことは注目されるべきである。一方で画像法は、標的部位が部分的臨床応答を有することを示している。図３は、処置前対処置１０週間後での対象Ｈ０３由来ＭＲＩ結果を示している。
【０２３５】
表10:抗GPC3-CAR T細胞処置後の対象の臨床応答の概要
【表１０】
2019515913.tif 000012
【０２３６】
注：↓はＡＦＰレベルの減少を示す；↑はＡＦＰレベルの増大を示す；ＰＤは進行性疾患を示す；ＣＲは完全応答を示す；およびＰＲは部分応答を示す。安全データおよび臨床所見は、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いる処置後に、許容できない毒性または副作用を生じた対象がいなかったことを示した。すべての対象はある程度の発熱およびＧＲＰ増加があった。対象Ｈ０１およびＨ０４は、投与後に震えがあった。対象Ｈ０３は発熱によるアルブミンの減少があった。外因性栄養剤およびアルブミンの摂取により、対象は解熱後に正常アルブミンとなった（表１１）。
【０２３７】
表11:リンパ球低減療法に続く抗GPC3-CAR T細胞の投与後の対象での毒性または副作用の概要
【表１１】
2019515913.tif 000013
【０２３８】
さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用する血液がんの処置の際にしばしば生じるサイトカイン放出症候群は、本臨床研究では観察されず、抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞が安全であることを示している。
【０２３９】
総じて、ＧＰＣ３陽性肝細胞がんを処置するためにＣＡＲ−ＧＰＣ  Ｔ細胞を使用する臨床研究の結果は、有効なリンパ球低減を受けた対象は抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置によって確かな臨床的利益を与えられたが、一方でリンパ球低減治療を受けていない対象はいかなる臨床的利益も与えられなかったことを実証している。さらに、リンパ球低減を受けたまたは受けていない対象は両方とも、発熱およびＣＲＰの増加などのある特定の有害応答をいずれも有する許容できない毒性または副作用を呈さず、リンパ球低減が対象の有害応答を悪化させなかった可能性があることを示している。さらに、リンパ球低減治療の効果および対象への利益に関して、併用フルダラビンおよびシクロホスファミドリンパ球低減プロトコールは、シクロホスファミド単剤リンパ球低減プロトコールより優れている可能性がある。総じて有効なリンパ球低減の実施に続く抗ＧＰＣ３−ＣＡＲ  Ｔ細胞処置は、ＧＰＣ３陽性肝細胞癌の臨床処置に有効な治療解決法を提供できる。
【実施例６】
【０２４０】
表現型分析
細胞表面分子の発現を標準的方法を使用してフローサイトメトリーによって判定する。フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネートおよび／またはペリジニンクロロフィルタンパク質にコンジュゲートした次のモノクローナル抗体を使用する：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＣＲ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ５６、αβＴ細胞受容体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）。Ｔ細胞によるＣＡＲの発現を抗ＣＡＲ抗体を使用して検出する。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を使用して分析し、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって分析する。少なくとも１０，０００個の陽性事象を各試料について測定する。
【実施例７】
【０２４１】
細胞傷害性アッセイ：肝臓がん
第２世代および第３世代ＣＡＲ−Ｔ形質導入Ｔ細胞の潜在的細胞傷害効果を評価するために、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。簡潔には、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、３３−２８ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺおよび４−２８ＢＢＺを、対照細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１（図４Ａ）およびＣＨＯ−Ｋ１（図４Ｂ）と、エフェクター：標的比３：１、１：１または１：３で標的細胞１０，０００個／ウエルで共培養し、１８時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に標準的９６ウエルプレートリーダーを使用して可視波長吸光度データを回収した。
【０２４２】
抗腫瘍細胞傷害性を評価するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞、３３−２８ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺおよび４−２８ＢＢＺを、ＧＰＣ３陽性肝臓がん細胞、Ｈｕｈ−７または、ＧＰＣ３、ＣＨＯ−Ｋ１−ＧＰＣ３＋を発現するように形質導入された対照細胞と、エフェクター：標的比３：１、１：１または１：３で標的細胞１０，０００個／ウエルで共培養し、１８時間、３７℃でインキュベートした、それぞれ図５Ａおよび図５Ｂ。インキュベーション後に標準的９６ウエルプレートリーダーを使用して可視波長吸光度データを回収した。
【０２４３】
すべてのエフェクター：標的比について、細胞傷害性を５回反復ウエルの平均値として得た。
【０２４４】
結果
細胞傷害性データは、３：１、１：１および１：３で３３−２８ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺおよび４−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ−ＴコンストラクトがＧＰＣ３を発現する腫瘍細胞株に対する細胞傷害性を有する一方で、非ＧＰＣ３発現対照株には細胞傷害性を有さないことを示している。
【実施例８】
【０２４５】
細胞傷害性アッセイ：肝臓がんパネル
第２世代または第３世代ＣＡＲ−Ｔ形質導入Ｔ細胞の潜在的細胞傷害効果を評価するために、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。簡潔には、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックをＨｅｐＧ２（ＨＣＣ）（図６Ａ）、Ｈｅｐ３Ｂ（ＨＣＣ）（図６Ｂ）またはＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ｈｅｐａｔｏｍａ）（図６Ｃ）と、エフェクター：標的比３：１、１：１または１：３で標的細胞１０，０００個／ウエルで共培養し、１８時間、３７℃でインキュベートした。第２世代および第３世代ＣＡＲ−Ｔの細胞傷害効果を評価するために、同様にＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）アッセイを高ＧＰＣ３発現肝臓がん細胞、Ｈｕｈ−７と共培養した９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックを使用して実施した、図７Ａ。インキュベーション後に標準的９６ウエルプレートリーダーを使用して可視波長吸光度データを回収した。
【０２４６】
結果
細胞傷害性データは、第２および第３世代コンストラクトの両方が、ＨＣＣおよび肝細胞種腫瘍細胞株を含むすべての肝臓がんパネルにわたって３：１、１：１および１：３で同等の細胞傷害性を有することを示している。第２および第３世代コンストラクト（contruts）は、種々のレベルでのＧＰＣ３発現で腫瘍細胞を標的化でき、幅広い腫瘍標的化能力があることが明らかになった。
【実施例９】
【０２４７】
細胞傷害性アッセイ：胃癌
胃癌腫瘍設定における第２世代または第３世代ＣＡＲ−Ｔ形質導入Ｔ細胞の潜在的細胞傷害効果を評価するために、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。簡潔には、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、９２−２８Ｚ、９２−２８ＢＢＺまたはモックをＫＡＴＯ−ＩＩＩと、エフェクター対標的比３：１、１：１および１：３で１０，０００個／ウエルで共培養し、１８時間、３７℃でインキュベートした。
【０２４８】
結果
細胞傷害性データは、第２および第３世代コンストラクトの両方が、モック形質導入細胞が活性を有さずに、胃癌腫瘍株、ＫＡＴＯ−ＩＩＩに対して同等の細胞傷害性を有したことを示している、図７Ｂ。データは、ＣＡＲ−Ｔ細胞はそれらの腫瘍標的に特異的であり、ＧＰＣ３抗原を発現しない組織に反応性（reacticity）を示さないことを示唆している。
【実施例１０】
【０２４９】
ｓｃＦｖ３３対ｓｃＦｖ９２の比較
さまざまなｓｃＦｖを有するＣＡＲ−ＴをＧＰＣ３と比較するために、第２世代または第３世代ＣＡＲ−Ｔ形質導入Ｔ細胞をＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において使用した。簡潔には、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、３３−２８Ｚ、９２−２８Ｚ、９２−ＢＢＺ、９２−２８ＢＢＺまたはモックをＨｕｈ−７細胞または対照細胞、Ａ４３１（ＧＰＣ３  ｎｅｇ）と、エフェクター：標的比３：１、１：１または１：３で標的細胞１０，０００個／ウエルで共培養し、１８時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に標準的９６ウエルプレートリーダーを使用して可視波長吸光度データを回収した。
【０２５０】
結果
細胞傷害性データは、３：１、１：１および１：３のエフェクター対標的比でｓｃＦｖ３３を含むコンストラクトと比較して、ｓｃＦｖ９２を含むコンストラクトは、細胞傷害性が増大していたことを示している、図１０Ｂ。細胞傷害性は、ＧＰＣ３ｎｅｇ腫瘍細胞株Ａ４３１との共培養において細胞傷害性が検出されなかったことから抗原特異的であった、図１０Ａ。
【実施例１１】
【０２５１】
第２および第３世代ＣＡＲ−Ｔの比較
第２および第３世代ＣＡＲ−Ｔを比較するためにＣＡＲ−Ｔ形質導入Ｔ細胞をＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）において使用した。簡潔には、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞、４−２８Ｚ、４−２８ＢＢＺ、４−４−２８ＢＢＺ、４−１４−２８ＢＢＺ、４−２０−２８ＢＢＺ、４−３５−２８ＢＢＺ、４−４２−２８ＢＢＺまたは形質導入されたモックをＨｕｈ−７（ＨＣＣ）細胞と、エフェクター：標的比３：１または１：１で標的細胞１０，０００個／ウエルで共培養し、１８時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後に標準的９６ウエルプレートリーダーを使用して可視波長吸光度データを回収した。
【０２５２】
結果
細胞傷害性データは、４−２０−２８ＢＢＺ、４−３５−２８ＢＢＺおよび４−４２−２８ＢＢＺに細胞傷害性を有し、第２および第３世代コンストラクトの両方が溶解の増加として測定される、より高い細胞傷害性（cycotoxicity）を有していたことを示している、図９。
【実施例１２】
【０２５３】
増殖アッセイ
標的細胞（Ｈｕｈ−７、ＧＰＣ３＋）または対照細胞（ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＧＰＣ３−）への曝露後の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔの増殖をカルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル希釈アッセイによって判定した。
【０２５４】
形質導入１週間後、対照Ｔリンパ球および抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を１．５μｍｏｌ／Ｌカルボキシフルオレセインジアセテートサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標識し、照射された腫瘍標的（ＧＰＣ３陽性およびＧＰＣ３陰性株）と共に５：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で蒔いた。ＣＦＳＥ希釈は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でフローサイトメトリーによって共培養４日目に測定する。
【実施例１３】
【０２５５】
患者由来腫瘍移植片マウスモデルおよびリンパ球低減
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに２ｘ２ｘ２ｍｍ肺がん腫瘍をそれぞれインプラントした。インプラントのおよそ２７日後、または腫瘍サイズが２２０ｍｍ３に達した時に、マウスにシクロホスファミドを静脈内に、および１ｘ１０７モック、ｈｕ９２−２８Ｚまたはｈｕ９２−２８ＢＢＺ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかを腹腔内投与した。２回目の投与は３４日目に続いた。腫瘍容量をカリパー測定を使用して、およそ３〜７日ごとに腫瘍接種５２日目まで測定した。
【０２５６】
結果
腫瘍接種５１日後、９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置したマウスは、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置したマウスと比較して腫瘍サイズが顕著に低減していた、図８Ａおよび図８Ｂ。９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置したマウスは、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置したマウスと比較して腫瘍重量も顕著に低減していた、図８Ｃ。９２−２８Ｚ、第２世代ＣＡＲ−Ｔを用いて処置したマウスはまた、９２−２８ＢＢＺ、第３世代ＣＡＲ−Ｔまたは生理食塩水を用いて処置したマウスと比較して阻害が顕著に低減していた、図８Ｄ。
【実施例１４】
【０２５７】
異種移植ＨＣＣマウスモデル
８から１２週齢ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に０．５ｘ１０６Ｈｕｈ−７腫瘍細胞をそれらの左側腹部にインプラントした。腫瘍接種７日後、マウスを１ｘ１０７モック形質導入Ｔ細胞、ｈｕ９２−２８Ｚまたはｈｕ９２−２８ＢＢＺを用いて尾静脈注射によって処置した。処置に続いてマウスを腫瘍細胞接種後３５日間少なくとも１週間に１回、カリパー測定によってモニタリングした。
【０２５８】
結果
ｈｕ９２−２８Ｚおよびｈｕ９２−２８ＢＢＺを用いた処置は、モック形質導入Ｔ細胞を用いて処置したマウスと比較して顕著な抗腫瘍活性を有した。図１１Ａは、ｈｕ９２−２８Ｚまたはｈｕ９２−２８ＢＢＺを用いて処置したマウスは、腫瘍細胞接種後３５日目に腫瘍容量が顕著に低減していたことを示している。図１１Ｂは、ｈｕ９２−２８Ｚまたはｈｕ９２−２８ＢＢＺを用いて処置したマウスは、モック形質導入細胞を用いて処置したマウスと比較して、それらの重量測定値の低減によって証明されるとおり、腫瘍が顕著に小さくなっていたことを示している。図１１Ｃは、異種移植腫瘍の画像を示している。
【実施例１５】
【０２５９】
抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床用増殖
多数の形質導入Ｔ細胞を生成するために、細胞を急速増殖プロトコール（ＲＥＰ）を使用して増殖するように誘導する。ＲＥＰにおいて使用する前に、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＩＬ−２を含む培養を開始し、上に詳述のとおり培養開始の２日後に形質導入した。細胞を７５ｃｍ２フラスコ中、３７℃および５％ＣＯ２で培養する。細胞を、それらを培養物中に保持する残りの期間について計数し、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む新鮮Ｔ細胞培地に２日ごとに細胞０．５×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁する。
【実施例１６】
【０２６０】
臨床試験
評価可能な肝臓がんを有する患者は、末梢血単核細胞を単離するためにアフェーレシスを受ける。リンパ球を単離し、抗ＧＰＣ３  ＣＡＲを用いてウイルスで形質導入し、増殖させ、および免疫学的検査のためにアリコートで採取した。ＣＡＲ−Ｔ投与の７および６日前に、患者はシクロホスファミド、６０ｍｇ／ｋｇ／日ｘ２日間、１時間にわたるＩＶの準備レジメンを受ける。ＣＡＲ−Ｔ投与の７から３日前に、患者はフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日、毎日３０分間かけたＩＶＰＢの５日間の準備レジメンを受ける。準備レジメンの際に、患者は毎日全血球計算（ＣＢＣ）検査を受ける。
【０２６１】
第Ｉ相研究の第１のパートにおいて、用量漸増を患者１名あたり１０９個の抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔで開始して、１群あたり１名の患者を利用して開始する。個々の患者をハーフログ増加で処置する。したがって次の用量を利用する：１０９、細胞３ｘ１０９個、細胞１０１０個、細胞３ｘ１０１０個および細胞１ｘ１０１１個まで。自己抗ＧＰＣ３  ＣＡＲ−Ｔを２０から３０分間かけて非ろ過チューブを介して静脈内投与する。
【０２６２】
すべての患者は、ＣＡＲ−Ｔ細胞産生物の投与６週間後に評価のために診療所に再来する。
【０２６３】
表12:配列
【表１２−１】
2019515913.tif 000014
【表１２−２】
2019515913.tif 000015
【表１２−３】
2019515913.tif 000016
【表１２−４】
2019515913.tif 000017
【表１２−５】
2019515913.tif 000018
【表１２−６】
2019515913.tif 000019
【表１２−７】
2019515913.tif 000020
【表１２−８】
2019515913.tif 000021
【表１２−９】
2019515913.tif 000022
【図１】
2019515913.tif 000023
【図２】
2019515913.tif 000024
【図３】
2019515913.tif 000025
【図４】
2019515913.tif 000026
【図５】
2019515913.tif 000027
【図６−１】
2019515913.tif 000028
【図６−２】
2019515913.tif 000029
【図７】
2019515913.tif 000030
【図８−１】
2019515913.tif 000031
【図８−２】
2019515913.tif 000032
【図９】
2019515913.tif 000033
【図１０】
2019515913.tif 000034
【図１１−１】
2019515913.tif 000035
【図１１−２】
2019515913.tif 000036
【配列表】
2019515913000001.app
【国際調査報告】
2019515913.tif 000037
2019515913.tif 000038
2019515913.tif 000039
2019515913.tif 000040
2019515913.tif 000041