(57)【要約】  シーケンシングリードを、血液サンプルから調製されたセルフリーＤＮＡにおいて組織タイプまたは疾患タイプの存在を検出および定量化するために利用する方法およびシステムが、ここに開示される。
2019521673.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に由来するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルを特性評価する方法であって、
前記被験者に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて複数のシーケンシングリードを受け取ることであって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含むことと、
前記複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいてメチル化パターンを計算することであって、前記メチル化パターンが前記連続核酸配列に対応するゲノム領域および前記ゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含むことと、
前記メチル化パターンを１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して１つ以上の尤度スコアを計算することであって、前記１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含むことと、
前記１つ以上の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、前記シーケンシングリードを、前記生物学的組成を含むとして特性評価することと
を含む方法。
【請求項２】
前記複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて、前記計算、比較、および特性評価の工程を反復すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
既存のメチル化シーケンシングデータに基づいて、前記１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーを構築すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のシーケンシングリードにおける前記生物学的組成を含むシーケンシングリードの数に基づいて、前記ｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成のレベルを判定すること
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記既存のメチル化シーケンシングデータが、組織特異的シーケンシングデータ、疾患特異的シーケンシングデータ、個々のシーケンシングデータ、集団のシーケンシングデータ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ｃｆＤＮＡサンプルが、前記被験者に由来する血漿または血液サンプルから調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的組成が、疾患組織、がん組織、特定の器官に由来する組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、結腸組織、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、小腸組織、膵臓組織、副腎組織、食道組織、脂肪組織、心臓組織、脳組織、胎盤組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記がん組織が、肝臓がん組織、肺がん組織、腎臓がん組織、結腸がん組織、膵臓がん組織、脳がん組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記メチル化ステータスおよび所定のメチル化ステータスがビンレベルで判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記メチル化ステータスおよび所定のメチル化ステータスがＣｐＧ部位レベルで判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上のモチーフがＣｐＧ部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験者の前記ｃｆＤＮＡ中の前記生物学的組成の前記レベルを既知のがん患者における前記生物学的組成のレベルと比較すること
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験者の前記ｃｆＤＮＡ中の前記生物学的組成の前記レベルを正常な被験者における前記生物学的組成のレベルと比較すること
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記正常な被験者における前記生物学的組成の前記レベルをに以下に従って判定すること：
前記正常な被験者に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて複数のシーケンシングリードを受け取ることであって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含むこと、
前記複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいてメチル化パターンを計算することであって、前記メチル化パターンが前記連続核酸配列に対応するゲノム領域および前記ゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含むこと、
前記メチル化パターンを１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して１つ以上の尤度スコアを計算することであって、前記１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含むこと、
前記１つ以上の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、前記シーケンシングリードを、前記生物学的組成を含むとして特性評価すること、
前記複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて前記計算、比較、および特性評価の工程を反復すること、ならびに
前記複数のシーケンシングリードにおける前記生物学的組成を含むシーケンシングリードの数に基づいて、前記正常な被験者に由来する前記ｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成のレベルを判定すること
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
未知の被験者に由来するセルフリー（ｃｆＤＮＡ）サンプル中の生物学的組成のレベルを正常な被験者または既知のがん患者における同じ生物学的組成のレベルと比較する方法であって、
前記未知の被験者に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて第１の複数のシーケンシングリードを受け取ることであって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含むことと、
ｉ）前記第１の複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいてメチル化パターンを計算することであって、前記メチル化パターンが前記連続核酸配列に対応するゲノム領域および前記ゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含むことと、
ｉｉ）前記メチル化パターンを１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して１つ以上の尤度スコアを計算することであって、前記１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含むことと、
ｉｉｉ）前記１つ以上の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、前記シーケンシングリードを、前記生物学的組成を含むとして特性評価することと、
ｉｖ）前記第１の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて前記計算、比較、および特性評価の工程を反復することと、
ｖ）前記第１の複数のシーケンシングリードにおける前記生物学的組成を含むシーケンシングリードの数に基づいて、前記未知の被験者に由来する前記ｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成の第１のレベルを判定することと、
前記正常な被験者または既知のがん患者に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて第２の複数のシーケンシングリードを受け取ることであって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含むことと、
前記正常な被験者または既知のがん患者に由来する前記ｃｆＤＮＡサンプルに工程ｉ）からｖ）を実行することによって、前記患者に由来する前記ｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成の第２のレベルを判定することと、
前記生物学的組成の前記第１のレベルと前記第２のレベルを比較することと
を含む方法。
【請求項１６】
患者に由来するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルの組成の変化を検出する方法であって、
第１の時点において、前記患者に由来する第１のｃｆＤＮＡサンプルについて第１の複数のシーケンシングリードを受け取ることであって、前記第１の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の第１の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含むことと、
ｉ）前記第１の複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいて第１のメチル化パターンを計算することであって、前記第１のメチル化パターンが前記第１の連続核酸配列に対応する第１のゲノム領域および前記第１のゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含むことと、
ｉｉ）前記第１のメチル化パターンを１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して１つ以上の第１の尤度スコアを計算することであって、前記１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含むことと、
ｉｉｉ）前記１つ以上の第１の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、前記シーケンシングリードを、前記生物学的組成を含むとして特性評価することと、
ｉｖ）前記第１の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて工程ｉ）からｉｉｉ）を反復して前記第１の時点における前記ｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成の存在を判定することと、
ｖ）前記第１の複数のシーケンシングリードにおける前記生物学的組成を含むシーケンシングリードの数に基づいて、前記第１のｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成の第１のレベルを判定することと、
第２の時点において、同じ患者に由来する第２のｃｆＤＮＡサンプルについて第２の複数のシーケンシングリードを受け取ることであって、前記第２の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の第２の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含むことと、
前記第２の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて工程ｉ）からｖ）を反復して前記第２の時点における前記第２のｃｆＤＮＡサンプル中の前記生物学的組成の第２のレベルを判定することと、
前記第１の時点と第２の時点との間で前記生物学的組成の変化を検出することと
を含む方法。
【請求項１７】
前記生物学的組成が、疾患組織、がん組織、特定の器官に由来する組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、結腸組織、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、小腸組織、膵臓組織、副腎組織、食道組織、脂肪組織、心臓組織、脳組織、胎盤組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の方法を実行するように構成されるコンピュータプログラム論理が記録されたコンピュータ可読媒体を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項１９】
がんの検出および起源組織の特定のために構成される命令を有する不揮発性コンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、コンピューティングシステムのプロセッサによって実行されると、前記プロセッサに以下の工程：
前記不揮発性コンピュータ可読媒体に記憶された患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのデータにアクセスする命令を受信する工程と、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する工程であって、前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数である工程と、
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定する工程であって、０≦θ≦１である工程と、
可能性のあるがんタイプｔを判定する工程と、
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する工程であって、ｋ＝１，２，…Ｋである工程と、
θ、ｔ、およびｘｋを使用して予測スコアλを計算する工程と、
λが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定する工程と、
λが前記所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が非がん性であると判定する工程と
を行わせる、コンピュータプログラム製品。
【請求項２０】
Ｋが１４０００〜１５０００である、請求項１９に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２１】
複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する前記工程が、以下の工程：
第１の非がん性メチル化プロファイルにおいてＣｐＧクラスターの第１のメチル化レベルを判定する工程と、
第２のがん性メチル化プロファイルにおいて前記ＣｐＧクラスターの第２のメチル化レベルを判定する工程と、
前記第１のメチル化レベルと前記第２のメチル化レベルとの間の差異を使用してメチル化範囲係数ＭＲを判定する工程と、
ＭＲが所定の閾値よりも高い場合に、前記ＣｐＧクラスターをＣｐＧクラスター特徴として特定する工程と
をさらに含む、請求項１９〜２０の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２２】
前記ＣｐＧクラスターがシーケンシングプロセスにおいて特定されるＣｐＧ部位の上流および下流の１００塩基対である、請求項１９〜２１の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２３】
ＭＲの前記所定の閾値が０．２またはその前後〜０．３またはその前後である、請求項１９〜２２の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２４】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
特定のＣｐＧクラスターのメチル化レベルｘｋを前記特定のＣｐＧクラスター内のメチル化されたシトシンの数ｍｋおよびシトシンの総数ｎｋを使用して推定する工程
をさらに含む、請求項１９〜２３の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２５】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
正常なメチル化プロファイルの第１のベータ分布関数およびがん性メチル化プロファイルの第２のベータ分布関数をコンボリューションすることによって前記メチル化レベルｘｋを表す確率密度関数を誘導する工程
をさらに含む、請求項１９〜２４の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２６】
前記ｃｔＤＮＡ負荷係数θが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項１９〜２５の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２７】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のθ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項１９〜２６の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項２８】
前記既定のθ値が下記式として表現され、
【数１】
2019521673.tif 000028
式中Ｊは正の整数である、請求項１９〜２７の何れか１項に記載のコンピュータ製品。
【請求項２９】
前記可能性のあるがんタイプｔが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項１９〜２８の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３０】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のｔ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項１９〜２９の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３１】
前記既定のｔ値が０、１、２、３、４、５、または６である、請求項２９〜３０の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３２】
前記予測スコアλが最大尤度推定プロセスを使用して判定され、前記最大尤度推定プロセスがθ、ｔ、およびｘｋを変数として含む、請求項１９〜３１の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３３】
前記予測スコアλが以下の等式を使用して計算される：
【数２】
2019521673.tif 000029
式中Ｋは前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数であり、Ｌは最大尤度関数であり、θ＾は最適化されたθであり、ｔ＾は最適化されたｔであり、Ｍはｘｋの関数であり、Ｎはｘｋの関数である、請求項１９〜３２の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項３４】
がんの検出および起源組織の特定のために構成される装置であって、
不揮発性メモリと、
前記不揮発性メモリに連結されたプロセッサであって、
前記不揮発性メモリに記憶された患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのデータにアクセスする工程と、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する工程であって、前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数である工程と、
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定する工程であって、０≦θ≦１である工程と、
可能性のあるがんタイプｔを判定する工程と、
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する工程であって、ｋ＝１，２，…Ｋである工程と、
θ、ｔ、およびｘｋを使用して予測スコアλを計算する工程と、
λが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定する工程と、
λが前記所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が非がん性であると判定する工程と
を実行するように構成されるプロセッサと
を含む装置。
【請求項３５】
Ｋが１４０００〜１５０００である、請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する前記工程が、以下の工程：
第１の非がん性メチル化プロファイルにおいてＣｐＧクラスターの第１のメチル化レベルを判定する工程と、
第２のがん性メチル化プロファイルにおいて前記ＣｐＧクラスターの第２のメチル化レベルを判定する工程と、
前記第１のメチル化レベルと前記第２のメチル化レベルとの間の差異を使用してメチル化範囲係数ＭＲを判定する工程と、
ＭＲが所定の閾値よりも高い場合に、前記ＣｐＧクラスターをＣｐＧクラスター特徴として特定する工程と
をさらに含む、請求項３４〜３５の何れか１項に記載の装置。
【請求項３７】
前記ＣｐＧクラスターがシーケンシングプロセスにおいて特定されるＣｐＧ部位の上流および下流の１００塩基対である、請求項３４〜３６の何れか１項に記載の装置。
【請求項３８】
ＭＲの前記所定の閾値が０．２またはその前後〜０．３またはその前後である、請求項３４〜３７の何れか１項に記載の装置。
【請求項３９】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
特定のＣｐＧクラスターのメチル化レベルｘｋを前記特定のＣｐＧクラスター内のメチル化されたシトシンの数ｍｋおよびシトシンの総数ｎｋを使用して推定する工程
をさらに含む、請求項３４〜３８の何れか１項に記載の装置。
【請求項４０】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
正常なメチル化プロファイルの第１のベータ分布関数およびがん性メチル化プロファイルの第２のベータ分布関数をコンボリューションすることによって前記メチル化レベルｘｋを表す確率密度関数を誘導する工程
をさらに含む、請求項３４〜３９の何れか１項に記載の装置。
【請求項４１】
前記ｃｔＤＮＡ負荷係数θが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項３４〜４０の何れか１項に記載の装置。
【請求項４２】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のθ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項３４〜４１の何れか１項に記載の装置。
【請求項４３】
前記既定のθ値が下記式として表現され、
【数３】
2019521673.tif 000030
式中Ｊは正の整数である、請求項３４〜４２の何れか１項に記載の装置。
【請求項４４】
前記可能性のあるがんタイプｔが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項３４〜４３の何れか１項に記載の装置。
【請求項４５】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のｔ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項３４〜４４の何れか１項に記載の装置。
【請求項４６】
前記既定のｔ値が０、１、２、３、４、５、または６である、請求項３４〜４５の何れか１項に記載の装置。
【請求項４７】
前記予測スコアλが最大尤度推定プロセスを使用して判定され、前記最大尤度推定プロセスがθ、ｔ、およびｘｋを変数として含む、請求項３４〜４６の何れか１項に記載の装置。
【請求項４８】
前記予測スコアλが以下の等式を使用して計算される：
【数４】
2019521673.tif 000031
式中Ｋは前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数であり、Ｌは最大尤度関数であり、θ＾は最適化されたθであり、ｔ＾は最適化されたｔであり、Ｍはｘｋの関数であり、Ｎはｘｋの関数である、請求項３４〜４７の何れか１項に記載の装置。
【請求項４９】
コンピュータシステムによって実行される、がんの検出および起源組織の特定のための方法であって、
前記コンピュータシステムのプロセッサによって、前記プロセッサと通信状態にある不揮発性コンピュータ可読媒体に記憶された患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのデータにアクセスする命令を受信することと、
前記プロセッサによって、前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定することであって、前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数であることと、
前記プロセッサによって、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定することであって、０≦θ≦１であることと、
前記プロセッサによって、可能性のあるがんタイプｔを判定することと、
前記プロセッサによって、前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定することであって、ｋ＝１，２，…Ｋであることと、
前記プロセッサによって、θ、ｔ、およびｘｋを使用して予測スコアλを計算することと、
前記プロセッサによって、λが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定することと、
前記プロセッサによって、λが前記所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が非がん性であると判定することと
を含む方法。
【請求項５０】
Ｋが１４０００〜１５０００である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する前記工程が、以下の工程：
第１の非がん性メチル化プロファイルにおいてＣｐＧクラスターの第１のメチル化レベルを判定する工程と、
第２のがん性メチル化プロファイルにおいて前記ＣｐＧクラスターの第２のメチル化レベルを判定する工程と、
前記第１のメチル化レベルと前記第２のメチル化レベルとの間の差異を使用してメチル化範囲係数ＭＲを判定する工程と、
ＭＲが所定の閾値よりも高い場合に、前記ＣｐＧクラスターをＣｐＧクラスター特徴として特定する工程と
をさらに含む、請求項４９〜５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＣｐＧクラスターがシーケンシングプロセスにおいて特定されるＣｐＧ部位の上流および下流の１００塩基対である、請求項４９〜５１の何れか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ＭＲの前記所定の閾値が０．２またはその前後〜０．３またはその前後である、請求項４９〜５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
特定のＣｐＧクラスターのメチル化レベルｘｋを前記特定のＣｐＧクラスター内のメチル化されたシトシンの数ｍｋおよびシトシンの総数ｎｋを使用して推定する工程
をさらに含む、請求項４９〜５３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
正常なメチル化プロファイルの第１のベータ分布関数およびがん性メチル化プロファイルの第２のベータ分布関数をコンボリューションすることによって前記メチル化レベルｘｋを表す確率密度関数を誘導する工程
をさらに含む、請求項４９〜５４の何れか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｃｔＤＮＡ負荷係数θが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項４９〜５５の何れか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のθ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項４９〜５６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記既定のθ値が下記式として表現され、
【数５】
2019521673.tif 000032
式中Ｊは正の整数である、請求項４９〜５７の何れか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記可能性のあるがんタイプｔが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項４９〜５８の何れか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のｔ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項４９〜５９の何れか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記既定のｔ値が０、１、２、３、４、５、または６である、請求項４９〜６０の何れか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記予測スコアλが最大尤度推定プロセスを使用して判定され、前記最大尤度推定プロセスがθ、ｔ、およびｘｋを変数として含む、請求項４９〜６１の何れか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記予測スコアλが以下の等式を使用して計算される：
【数６】
2019521673.tif 000033
式中Ｋは前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数であり、Ｌは最大尤度関数であり、θ＾は最適化されたθであり、ｔ＾は最適化されたｔであり、Ｍはｘｋの関数であり、Ｎはｘｋの関数である、請求項４９〜６２の何れか１項に記載の方法。
【請求項６４】
患者から得られたｃｆＤＮＡのバイサルファイトシーケンシングを行ってメチル化プロファイルを得ることと、
前記メチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定することであって前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数であることと、
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定することであって、０≦θ≦１であることと、
可能性のあるがんタイプｔを判定することと、
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定することであって、ｋ＝１，２，…Ｋであることと、
θ、ｔ、およびｘｋを使用して、予測スコアλを計算することと
を含む方法。
【請求項６５】
Ｋが１４０００〜１５０００である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する前記工程が、以下の工程：
第１の非がん性メチル化プロファイルにおいてＣｐＧクラスターの第１のメチル化レベルを判定する工程と、
第２のがん性メチル化プロファイルにおいて前記ＣｐＧクラスターの第２のメチル化レベルを判定する工程と、
前記第１のメチル化レベルと前記第２のメチル化レベルとの間の差異を使用してメチル化範囲係数ＭＲを判定する工程と、
ＭＲが所定の閾値よりも高い場合に、前記ＣｐＧクラスターをＣｐＧクラスター特徴として特定する工程と
をさらに含む、請求項６４〜６５の何れか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＣｐＧクラスターがシーケンシングプロセスにおいて特定されるＣｐＧ部位の上流および下流の１００塩基対である、請求項６４〜６６の何れか１項に記載の方法。
【請求項６８】
ＭＲの前記所定の閾値が０．１またはその前後〜０．５またはその前後である、請求項６４〜６７の何れか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
特定のＣｐＧクラスターのメチル化レベルｘｋを前記特定のＣｐＧクラスター内のメチル化されたシトシンの数ｍｋおよびシトシンの総数ｎｋを使用して推定する工程
をさらに含む、請求項６４〜６８の何れか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
正常なメチル化プロファイルの第１のベータ分布関数およびがん性メチル化プロファイルの第２のベータ分布関数をコンボリューションすることによって前記メチル化レベルｘｋを表す確率密度関数を誘導する工程
をさらに含む、請求項６４〜６９の何れか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｃｔＤＮＡ負荷係数θが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項６４〜７０の何れか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のθ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項６４〜７１の何れか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記既定のθ値が下記式として表現され、
【数７】
2019521673.tif 000034
式中Ｊは正の整数である、請求項６４〜７２の何れか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記可能性のあるがんタイプｔが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項６４〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のｔ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項６４〜７４の何れか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記既定のｔ値が０、１、２、３、４、５、または６である、請求項６４〜７５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記予測スコアλが最大尤度推定プロセスを使用して判定され、前記最大尤度推定プロセスがθ、ｔ、およびｘｋを変数として含む、請求項６４〜７６の何れか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記予測スコアλが以下の等式を使用して計算される：
【数８】
2019521673.tif 000035
式中Ｋは前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数であり、Ｌは最大尤度関数であり、θ＾は最適化されたθであり、ｔ＾は最適化されたｔであり、Ｍはｘｋの関数であり、Ｎはｘｋの関数である、請求項６４〜７７の何れか１項に記載の方法。
【請求項７９】
λが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定すること
をさらに含む、請求項６４〜７８の何れか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記プロセッサによって、λが前記所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が非がん性であると判定すること
をさらに含む、請求項６４〜７９の何れか１項に記載の方法。
【請求項８１】
がん患者におけるがんを処置するための方法であって、
前記患者から得られたｃｆＤＮＡのバイサルファイトシーケンシングを行って、メチル化プロファイルを得ることと、
前記メチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定することであって、前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数であることと、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定することであって、０≦θ≦１であることと、可能性のあるがんタイプｔを判定することと、前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定することであって、ｋ＝１，２，…Ｋであることと、θ、ｔ、およびｘｋを使用して予測スコアλを計算することであって、前記予測スコアλが所定の閾値よりも高いこととを含む方法に基づいて、前記患者ががんを有すると判定された後に、前記患者に有効量の化学療法、放射線、または免疫療法を施すこと
を含む方法。
【請求項８２】
前記がんの起源点が判定され、前記患者がその判定に基づいて処置される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
処置の前に前記患者が生検を受ける、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
Ｋが１４０００〜１５０００である、請求項８１〜８３の何れか１項に記載の方法。
【請求項８５】
複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する前記工程が、以下の工程：
第１の非がん性メチル化プロファイルにおいてＣｐＧクラスターの第１のメチル化レベルを判定する工程と、
第２のがん性メチル化プロファイルにおいて前記ＣｐＧクラスターの第２のメチル化レベルを判定する工程と、
前記第１のメチル化レベルと前記第２のメチル化レベルとの間の差異を使用してメチル化範囲係数ＭＲを判定する工程と、
ＭＲが所定の閾値よりも高い場合に、前記ＣｐＧクラスターをＣｐＧクラスター特徴として特定する工程と
をさらに含む、請求項８１〜８４の何れか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＣｐＧクラスターがシーケンシングプロセスにおいて特定されるＣｐＧ部位の上流および下流の１００塩基対である、請求項８１〜８５の何れか１項に記載の方法。
【請求項８７】
ＭＲの前記所定の閾値が０．２またはその前後〜０．３またはその前後である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
特定のＣｐＧクラスターのメチル化レベルｘｋを前記特定のＣｐＧクラスター内のメチル化されたシトシンの数ｍｋおよびシトシンの総数ｎｋを使用して推定する工程
をさらに含む、請求項８１〜８７の何れか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについてメチル化レベルｘｋを推定する前記工程が、
正常なメチル化プロファイルの第１のベータ分布関数およびがん性メチル化プロファイルの第２のベータ分布関数をコンボリューションすることによって前記メチル化レベルｘｋを表す確率密度関数を誘導する工程
をさらに含む、請求項８１〜８８の何れか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ｃｔＤＮＡ負荷係数θが大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項８１〜８９の何れか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のθ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記既定のθ値が、下記式として表現され、
【数９】
2019521673.tif 000036
式中Ｊは正の整数である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記可能性のあるがんタイプｔが、大域的最適化推定プロセスを使用して判定される、請求項８１〜９２の何れか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記大域的最適化推定プロセスが様々な既定のｔ値を試すことによって誤差関数に従って最小化された誤差値を計算することを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記既定のｔ値が０、１、２、３、４、５、または６である、請求項８１〜９４の何れか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記予測スコアλが最大尤度推定プロセスを使用して判定され、前記最大尤度推定プロセスがθ、ｔ、およびｘｋを変数として含む、請求項８１〜９５の何れか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記予測スコアλが以下の等式を使用して計算される：
【数１０】
2019521673.tif 000037
式中Ｋは前記複数のＣｐＧクラスター特徴の総数であり、Ｌは最大尤度関数であり、θ＾は最適化されたθであり、ｔ＾は、適化されたｔであり、Ｍはｘｋの関数であり、Ｎはｘｋの関数である、請求項８１〜９６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９８】
患者におけるあるタイプのがんを単一のリードの分解能で検出するように構成される命令を有する不揮発性コンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、コンピューティングシステムのプロセッサによって実行されると、前記プロセッサに以下の工程：
前記患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出すことであって、Ｎが正の整数であることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定することであって、Ｊが正の整数であることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＬ個のＣｐＧ部位を特定することであって、Ｌが正の整数であることと、
前記タイプのがんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出すことであって、Ｋが正の整数であることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて前記Ｋ個のマーカー領域を判定することであって、前記マーカー領域が前記タイプのがんの前記ＤＮＡメチル化マーカーに対応する前記ＣｐＧクラスターであることと、
ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｔクラスのメチル化パターンが前記タイプのがんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、
ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて負荷θを計算することと
を行わせる、コンピュータプログラム製品。
【請求項９９】
０≦θ≦１である、請求項９８に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１００】
θが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有すると判定することと、θが所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有さないと判定することとをさらに含む、請求項９８〜９９の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０１】
ＣｐＧクラスターがＣｐＧ部位の上流および下流のＸ個の塩基対を含み、Ｘが２５〜３００であり、２つのＣｐＧクラスターが互いにオーバーラップする場合、前記２つのＣｐＧクラスターが１つのＣｐＧクラスターに統合される、請求項９８〜１００の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０２】
リードにおける合同メチル化ステータスを判定することをさらに含み、前記リードの前記合同メチル化ステータスがｒ＝（ｒ１，ｒ２，…，ｒｊ，…，ｒＬ）として表され、ｊ＝１，２，…Ｌであり、ｒｊが２進数であり、ｒｊ＝１が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていることを表し、ｒｊ＝０が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていないことを表し、ｒｊ＝ＮＡが部位ｊのＣｐＧがリードによってカバーされていないことを表す、請求項９８〜１０１の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０３】
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの前記Ｎ個のリードのうちの１つにおけるｒｊがｒｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｐ）として表されるベルヌーイ分布に従い、ｐが部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項９８〜１０２の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０４】
メチル化パターンｍを踏まえて、前記リードｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）における前記合同メチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ│ｍ）を下記式として計算することをさらに含み、
【数１１】
2019521673.tif 000038
式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項９８〜１０３の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０５】
Ｐ（ｒ│ｍ）が下記式として計算され、
【数１２】
2019521673.tif 000039
式中、Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項９８〜１０４の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０６】
Ｔクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＴｋ）を計算することと、
Ｎクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＮｋ）を計算することと
をさらに含む、請求項９８〜１０５の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０７】
前記負荷θが最大尤度推定Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）を使用して計算され、式中
ＲはＲ＝｛ｒ（１），…，ｒ（Ｎ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの前記Ｎ個のリードを表し、
ＭはＭ＝｛（ｍＴ１，ｍＮ１），…，（ｍＴｋ，ｍＮｋ），…，（ｍＴＫ，ｍＮＫ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおける前記Ｋ個のマーカー領域のメチル化パターンを表す、請求項９８〜１０６の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０８】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）である、請求項９８〜１０７の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１０９】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１θＰ（ｒ（ｉ）｜ｍＴｋ）＋（１−θ）Ｐ（ｒ（ｉ）｜ｍＮｋ）である、請求項９８〜１０８の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１１０】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）の前記負荷θの最良の解がグリッドサーチを通じて見出される、請求項９８〜１０９の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１１１】
前記グリッドサーチがＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を０％、０．１％、…、０．９９％、および／または１００％の値の前記負荷θを用いて計算することである、請求項９８〜１１０の何れか１項に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項１１２】
患者におけるあるタイプのがんを検出するように構成される装置であって、
（１）不揮発性メモリと、
（２）前記不揮発性メモリに連結されたプロセッサであって、
（３）前記患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出す工程であって、Ｎが正の整数である工程と、
（４）前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定する工程であって、Ｊが正の整数である工程と、
（５）前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＬ個のＣｐＧ部位を特定する工程であって、Ｌが正の整数である工程と、
（６）前記タイプのがんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出す工程であって、Ｋが正の整数である工程と、
（７）前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて前記Ｋ個のマーカー領域を判定することであって、前記マーカー領域が前記タイプのがんの前記ＤＮＡメチル化マーカーに対応する前記ＣｐＧクラスターである工程と、
（８）ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出す工程であって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｔクラスのメチル化パターンが前記タイプのがんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンである工程と、
（９）ｍＮｋとして表される、それぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出す工程であって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンである工程と、
（１０）前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて負荷θを計算する工程と
を実行するように構成されるプロセッサと
を含む装置。
【請求項１１３】
０≦θ≦１である、請求項１１２に記載の装置。
【請求項１１４】
θが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有すると判定することと、θが所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有さないと判定することとをさらに含む、請求項１１２〜１１３の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１５】
ＣｐＧクラスターがＣｐＧ部位の上流および下流のＸ個の塩基対を含み、Ｘが２５〜３００であり、２つのＣｐＧクラスターが互いにオーバーラップする場合、前記２つのＣｐＧクラスターが１つのＣｐＧクラスターに統合される、請求項１１２〜１１４の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１６】
リードにおける合同メチル化ステータスを判定することをさらに含み、前記リードの前記合同メチル化ステータスがｒ＝（ｒ１，ｒ２，…，ｒｊ，…，ｒＬ）として表され、ｊ＝１，２，…Ｌであり、ｒｊが２進数であり、ｒｊ＝１が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていることを表し、ｒｊ＝０が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていないことを表し、ｒｊ＝ＮＡが部位ｊのＣｐＧがリードによってカバーされていないことを表す、請求項１１２〜１１５の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１７】
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの前記Ｎ個のリードにおけるｒｊがｒｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｐ）として表されるベルヌーイ分布に従い、ｐが部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１１２〜１１６の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１８】
メチル化パターンｍを踏まえて、前記リードｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）における前記合同メチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ│ｍ）を下記式として計算することをさらに含み、
【数１３】
2019521673.tif 000040
式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１１２〜１１７の何れか１項に記載の装置。
【請求項１１９】
Ｐ（ｒ│ｍ）が
【数１４】
2019521673.tif 000041
として計算され、式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１１２〜１１８の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２０】
Ｔクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＴｋ）を計算することと、
Ｎクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＮｋ）を計算することと
をさらに含む、請求項１１２〜１１９の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２１】
前記負荷θが最大尤度推定Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）を使用して計算され、
ＲがＲ＝｛ｒ（１），…，ｒ（Ｎ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリードを表し、
ＭがＭ＝｛（ｍＴ１，ｍＮ１），…，（ｍＴｋ，ｍＮｋ），…，（ｍＴＫ，ｍＮＫ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおけるＫ個のマーカー領域のメチル化パターンを表す、請求項１１２〜１２０の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２２】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）である、請求項１１２〜１２１の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２３】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１θＰ（ｒ（ｉ）｜ｍＴｋ）＋（１−θ）Ｐ（ｒ（ｉ）｜ｍＮｋ）である、請求項１１２〜１２２の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２４】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）の前記負荷θの最良の解がグリッドサーチを通じて見出される、請求項１１２〜１２３の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２５】
前記グリッドサーチがＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を０％、０．１％、…、０．９９％、および／または１００％の値の前記負荷θを用いて計算することである、請求項１１２〜１２４の何れか１項に記載の装置。
【請求項１２６】
あるタイプのがんを有する患者におけるがんを処置するための方法であって、
前記患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出すことであって、Ｎが正の整数であることと、前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定することであって、Ｊが正の整数であることと、前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＬ個のＣｐＧ部位を特定することであって、Ｌが正の整数であることと、前記タイプのがんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出すことであって、Ｋが正の整数であることと、前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて前記Ｋ個のマーカー領域を判定することであって、前記マーカー領域が前記タイプのがんの前記ＤＮＡメチル化マーカーに対応する前記ＣｐＧクラスターであることと、
ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｔクラスのメチル化パターンが前記タイプのがんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、
ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの前記Ｎ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて負荷θを計算することとを含む方法に基づいて前記患者が前記タイプのがんを有することが判定された後に、前記患者に有効量の化学療法、放射線、または免疫療法を施すことを含む方法。
【請求項１２７】
０≦θ≦１である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
θが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有すると判定することと、θが所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有さないと判定することとをさらに含む、請求項１２６〜１２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
ＣｐＧクラスターがＣｐＧ部位の上流および下流のＸ個の塩基対を含み、Ｘが２５〜３００であり、２つのＣｐＧクラスターが互いにオーバーラップする場合、前記２つのＣｐＧクラスターが１つのＣｐＧクラスターに統合される、請求項１２６〜１２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３０】
リードにおける合同メチル化ステータスを判定することをさらに含み、前記リードの前記合同メチル化ステータスがｒ＝（ｒ１，ｒ２，…，ｒｊ，…，ｒＬ）として表され、ｊ＝１，２，…Ｌであり、ｒｊが２進数であり、ｒｊ＝１が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていること表し、ｒｊ＝０が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていないことを表し、ｒｊ＝ＮＡが部位ｊのＣｐＧがリードによってカバーされていないことを表す、請求項１２６〜１２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの前記Ｎ個のリードにおけるｒｊがｒｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｐ）として表されるベルヌーイ分布に従い、ｐが部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１２６〜１３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３２】
メチル化パターンｍを踏まえて、前記リードｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）における前記合同メチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ│ｍ）を下記式として計算することをさらに含み、
【数１５】
2019521673.tif 000042
式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１２６〜１３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３３】
Ｐ（ｒ│ｍ）が下記式として計算され、
【数１６】
2019521673.tif 000043
式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１２６〜１３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３４】
Ｔクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＴｋ）を計算することと、
Ｎクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＮｋ）を計算することと
をさらに含む、請求項１２６〜１３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記負荷θが最大尤度推定Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）を使用して計算され、
ＲがＲ＝｛ｒ（１），…，ｒ（Ｎ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリードを表し、
ＭがＭ＝｛（ｍＴ１，ｍＮ１），…，（ｍＴｋ，ｍＮｋ），…，（ｍＴＫ，ｍＮＫ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおけるＫ個のマーカー領域のメチル化パターンを表す、請求項１２６〜１３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）である、請求項１２６〜１３５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１θＰ（ｒ（ｉ）｜ｍＴｋ）＋（１−θ）Ｐ（ｒ（ｉ）｜ｍＮｋ）である、請求項１２６〜１３６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３８】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）の前記負荷θの最良の解がグリッドサーチを通じて見出される請求項１２６〜１３７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記グリッドサーチがＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を０％、０．１％、…、０．９９％、および／または１００％の値の前記負荷θを用いて計算することである、請求項１２６〜１３８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
患者におけるがんのタイプを検出するための方法であって、
前記患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出すことであって、Ｎが正の整数であることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定することであって、Ｊが正の整数であることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＬ個のＣｐＧ部位を特定することであって、Ｌが正の整数であることと、
前記がんのタイプのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出すことであって、Ｋが正の整数であることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて前記Ｋ個のマーカー領域を判定することであって、前記マーカー領域が前記がんのタイプの前記ＤＮＡメチル化マーカーに対応する前記ＣｐＧクラスターであることと、
ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｔクラスのメチル化パターンが前記がんのタイプの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、
ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、前記Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて負荷θを計算することと
を含む方法。
【請求項１４１】
０≦θ≦１である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
θが所定の閾値よりも高い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有すると判定することと、θが所定の閾値よりも低い場合に、前記患者が前記タイプのがんを有さないと判定することとをさらに含む、請求項１４０〜１４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
ＣｐＧクラスターがＣｐＧ部位の上流および下流のＸ個の塩基対を含み、Ｘが２５〜３００であり、２つのＣｐＧクラスターが互いにオーバーラップする場合、前記２つのＣｐＧクラスターが１つのＣｐＧクラスターに統合される、請求項１４０〜１４２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
リードにおける合同メチル化ステータスを判定することをさらに含み、前記リードの前記合同メチル化ステータスがｒ＝（ｒ１，ｒ２，…，ｒｊ，…，ｒＬ）として表され、ｊ＝１，２，…Ｌであり、ｒｊが２進数であり、ｒｊ＝１が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていること表し、ｒｊ＝０が部位ｊのＣｐＧがメチル化されていないことを表し、ｒｊ＝ＮＡが部位ｊのＣｐＧがリードによってカバーされていないことを表す、請求項１４０〜１４３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルの前記Ｎ個のリードにおけるｒｊがｒｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｐ）として表されるベルヌーイ分布に従い、ｐが部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１４０〜１４４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４６】
メチル化パターンｍを踏まえて、前記リードｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）における前記合同メチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ│ｍ）を下記式として計算することをさらに含み、
【数１７】
2019521673.tif 000044
式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１４０〜１４５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４７】
Ｐ（ｒ│ｍ）が下記式として計算され、
【数１８】
2019521673.tif 000045
式中Ｂｅｔａ（η，ρ）はベータ関数であり、ｐは部位ｊの前記ＣｐＧの平均メチル化率である、請求項１４０〜１４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
Ｔクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＴｋ）を計算することと、
Ｎクラスに特異的なマーカー領域のメチル化ステータスの尤度Ｐ（ｒ｜ｍＮｋ）を計算することと
をさらに含む、請求項１４０〜１４７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記負荷θが最大尤度推定Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）を使用して計算され、
ＲがＲ＝｛ｒ（１），…，ｒ（Ｎ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリードを表し、
ＭがＭ＝｛（ｍＴ１，ｍＮ１），…，（ｍＴｋ，ｍＮｋ），…，（ｍＴＫ，ｍＮＫ）｝として表される前記ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおけるＫ個のマーカー領域のメチル化パターンを表す、請求項１４０〜１４８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）である、請求項１４０〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１θＰ（ｒ（ｉ）｜ｍＴｋ）＋（１−θ）Ｐ（ｒ（ｉ）｜ｍＮｋ）である、請求項１４０〜１５０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）の前記負荷θの最良の解がグリッドサーチを通じて見出される、請求項１４０〜１５１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記グリッドサーチがＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を０％、０．１％、…、０．９９％、および／または１００％の値の前記負荷θで計算することである、請求項１４０〜１５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記グリッドサーチがＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を０％、０．０１％、…、０．９９％、および／または１００％の値の前記負荷θで計算することである、請求項１４０〜１５２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記グリッドサーチがＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を０％、０．００１％、…、０．９９％、および／または１００％の値の前記負荷θで計算することである、請求項１４０〜１５２の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による支援を受けた研究に関する記述
[0001]本発明はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  （ＮＩＨ）において、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＨＬＢＩ）によって与えられた付与番号ＭＡＰＧＥＮ  Ｕ０１ＨＬ１０８６３４のもとに、政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
優先権
[0002]本出願は、２０１６年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／３４７，０１０号、２０１７年３月２０日出願された米国仮特許出願第６２／４７３，８２９号、および２０１７年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４９１，５６０号に対する優先権を主張し、これらのすべては参照によりその全体がここに組み込まれる。
【０００３】
[0003]ここに開示される本発明は、概して、核酸サンプル（たとえばセルフリーＤＮＡサンプル）のシーケンシングデータを分析するための方法に関する。本発明はまた、がんの特定、起源、および位置を含む、がんの診断および予後の方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]侵襲的な外科手術を伴う従来の生検とは異なり、液体生検は最小限の侵襲性で得られた血液サンプルのみを利用する。血液はヒト循環系を通じてヒト器官のほぼすべて（腫瘍および炎症性組織を含む）との接触を有する唯一の生物学的材料である。したがって、血液は多数の器官の状態に関する貴重な情報および疾患の兆候を大量に有している。たとえば血漿において多数の器官においてアポトーシスまたは壊死した細胞から放出される分解されたＤＮＡフラグメントであるセルフリー循環ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡと略される）は、多数の正常な組織細胞および疾患細胞（たとえば、がん性腫瘍細胞）の混合物と考えられる。したがって、それらは血液に基づくがん診断の最も良いソースの１つであり、近年では血液に基づくがん診断の主要な関心対象となっている。
【０００５】
[0005]しかしながら、疾患細胞に由来するＤＮＡフラグメントは、特に疾患の初期段階では、ｃｆＤＮＡサンプルのごく一部分を構成するにすぎないことが多い。そのため、疾患ＤＮＡを表すシーケンシング情報は、正常なＤＮＡを表すシーケンシング情報によって打ち消されることが多い。疾患ＤＮＡに関連するシーケンシング情報を選択的かつ高感度で解読するための方法および／またはシステムが必要とされている。
【０００６】
[0006]がんの早期検出および特定は高く所望されている。従来的に、がんの特定は侵襲的な組織生検手順を伴う。がんが初期段階である場合には、非侵襲的な方法でがんの起源組織の正確なスクリーニングおよび特定を提供する方法も装置も存在しない。
【０００７】
[0007]がんに転移する機会を与える前でがんを早期検出することが、がんからの生存率を増加させるための最も良い戦略である。近年、血液に由来するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用したがんの検出は、その非侵襲的な性質に起因して、著しい関心を引いている。しかしながら、腫瘍ｃｆＤＮＡレベルは、ほとんどの初期段階および多くの進行段階のがん患者では非常に低い（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４、Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。したがって、ｃｆＤＮＡに基づく初期のがん診断における主な課題は、血液中の総ｃｆＤＮＡの中からごくわずかな量の腫瘍ｃｆＤＮＡをどのようにして特定するかである。この課題に対処するためのアプローチの主流は、変異に基づくもの、すなわち標的化されたディープシーケンシング（５，０００×を上回るカバレッジ）を、誤差抑制技法と組み合わせて使用して、小さな遺伝子パネルにおいてｃｆＤＮＡ変異を呼び出すことである（Ｂｅｔｔｅｇｏｗｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４、Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４、Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。このアプローチは変異が公知である場合にはがんの再発をモニタリングする高感度の手法を提供するが、同じタイプのがんであっても変異が広範囲に及び、非常に不均一であり得るため、小さな遺伝子パネルでは診断目的を果たすことができない（Ｂｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３、Ｔｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，，  ２０１２、Ｇｒｅｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７、Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。しかしながら、シーケンシング深度を維持しながら遺伝子パネルを拡大することは非常に費用がかかる。したがって、異なるアプローチを使用して、すなわちｃｆＤＮＡメチル化パターンを使用して、微量の腫瘍ｃｆＤＮＡを検出するという課題が残っている。
【０００８】
[0008]本開示は、がんが初期段階にあるときに、患者から採取された血液サンプルを使用してがんをスクリーニングし、がん細胞の起源組織を特定するための機械、装置、コンピュータ製品、および方法の様々な態様を開示する。
【発明の概要】
【０００９】
[0009]一側面において、対象に由来するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルを特性評価する方法がここに提供される。一部の態様において、本方法は、対象に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて、複数のシーケンシングリードを受け取る工程であって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含む工程と、複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいてメチル化パターンを計算する工程であって、メチル化パターンが連続核酸配列に対応するゲノム領域およびゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含む工程と、メチル化パターンを１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して、１つ以上の尤度スコアを計算する工程であって、１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含む工程と、１つ以上の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、シーケンシングリードを生物学的組成を含むとして特性評価する工程とを含む。
【００１０】
[0010]一部の態様において、本方法は、複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて、比較および特性評価の工程を反復する工程をさらに含む。
【００１１】
[0011]一部の態様において、本方法は、既存のメチル化シーケンシングデータ（たとえばアレイに基づくものおよびシーケンシングデータの両方）に基づいて、１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーを構築する工程をさらに含む。
【００１２】
[0012]一部の態様において、本方法は、複数のシーケンシングリードにおける生物学的組成を含むシーケンシングリードの数に基づいて、ｃｆＤＮＡサンプル中の生物学的組成のレベルを判定する工程をさらに含む。
【００１３】
[0013]一部の態様において、既存のメチル化シーケンシングデータは、組織特異的シーケンシングデータ、疾患特異的シーケンシングデータ、個々のシーケンシングデータ、集団のシーケンシングデータ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１４】
[0014]一部の態様において、ｃｆＤＮＡサンプルは対象に由来する血漿または血液サンプルから調製される。生物学的サンプルは、任意の生物学的液体、たとえば唾液、羊水、嚢胞液、髄液もしくは脳液、尿、汗、または涙液であり得る。これは、混入量の細胞、たとえば液体１マイクロリットル（またはその中で誘導可能な任意の範囲）当たり約１、１０、１００、１０００、または１００００個以下のインタクトな細胞（平均で）の量の細胞を含有し得る。
【００１５】
[0015]一部の態様において、生物学的組成は、疾患組織、がん組織、特定の器官に由来する組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、結腸組織、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、小腸組織、膵臓組織、副腎組織、食道組織、脂肪組織、心臓組織、脳組織、胎盤組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ここに記載される方法、コンピュータプログラム、および装置は、罹患した個体と罹患していない個体、あるいは異なる段階の疾患もしくは状態にあるかまたは異なる予後を有する個体に由来するセルフリーＤＮＡのメチル化パターンに差異が存在する、任意の疾患または状態に適用することができる。たとえば乏突起膠細胞に由来するセルフリーＤＮＡの異常なメチル化パターンを特定して多発性硬化症の診断を行うこと、膵臓のβ細胞に由来するものによってＩ型糖尿病の診断を行うこと、および膵臓細胞に由来するものによって膵炎の診断を行うことが、これらの疾患のメチル化シグネチャーを誘導するデータに基づいて可能である。したがって、一部の態様において、疾患を有する生物学的サンプルからセルフリーＤＮＡのメチル化プロファイルを得ることまたは生成することが含まれる。他の態様において、疾患を有さないかまたは疾患がないと考えられる生物学的サンプルから、セルフリーＤＮＡのメチル化プロファイルを得ることまたは生成することが含まれる。
【００１６】
[0016]一部の態様において、がん組織は、肝臓がん組織、肺がん組織、腎臓がん組織、結腸がん組織、脳がん組織、膵臓がん組織、脳がん組織、胃腸がん組織、頭頸部がん組織、骨がん組織、舌がん組織、歯肉がん組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される。他の態様において、組織は、肝臓組織、脳組織、肺組織、腎臓組織、結腸組織、膵臓組織、脳組織、胃腸組織、頭頸部組織、骨、舌組織、歯肉組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００１７】
[0017]一部の態様において、メチル化ステータスおよび所定のメチル化ステータスはビンレベルで判定される。
【００１８】
[0018]一部の態様において、メチル化ステータスおよび所定のメチル化ステータスはＣｐＧ部位レベルで判定される。
【００１９】
[0019]一部の態様において、１つ以上のモチーフはＣｐＧ部位である。
【００２０】
[0020]一部の態様において、本方法は、対象のｃｆＤＮＡ中の生物学的組成のレベルを、正常な対象もしくは既知のがん患者、または特定の疾患もしくは状態を患うかもしくはそれに悩まされている患者における生物学的組成のレベルと比較することをさらに含む。
【００２１】
[0021]一部の態様において、正常な対象または既知のがんもしくは他の疾患の患者における生物学的組成のレベルは、同じ方法または異なる方法を使用して、事前に判定されている。
【００２２】
[0022]一側面において、正常な対象からの生物学的組成のレベルを、可能性のある患者からの同じ生物学的組成のレベルと比較するための方法がここに提供される。ここで、ここに開示される方法は、正常な対象と可能性のある患者の両方に由来するｃｆＤＮＡサンプルを使用して、生物学的組成のレベルを判定するために使用することができる。
【００２３】
[0023]一側面において、既知のがん患者からの生物学的組成のレベルを、可能性のある患者からの同じ生物学的組成のレベルと比較するための方法がここに提供される。別の側面において、既知の疾患または状態を有する患者からの生物学的組成のレベルを、可能性のある患者からの同じ生物学的組成のレベルと比較するための方法がここに提供される。ここで、ここに開示される方法は、正常な対象と可能性のある患者の両方に由来するｃｆＤＮＡサンプルを使用して、生物学的組成のレベルを判定するために使用することができる。
【００２４】
[0024]任意の疾患の既知の患者に由来するｃｆＤＮＡを、疾患診断の標準として使用することができることが理解されるであろう。がんに関してここに考察される任意の態様は、正常または非疾患個体と疾患個体の間で、なぜｃｆＤＮＡにおけるメチル化プロファイルが異なるかについて、任意の他の疾患または状態に対して実装され得ることが企図される。
【００２５】
[0025]一側面において、未知の対象に由来するセルフリー（ｃｆＤＮＡ）サンプル中の生物学的組成のレベルを、正常な対象または既知のがん患者における同じ生物学的組成のレベルと比較する方法がここに提供される。本方法は、未知の対象に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて、第１の複数のシーケンシングリードを受け取る工程であって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含む工程と、ｉ）第１の複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいてメチル化パターンを計算する工程であって、メチル化パターンが連続核酸配列に対応するゲノム領域およびゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含む工程と、ｉｉ）メチル化パターンを、１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して、１つ以上の尤度スコアを計算する工程であって、１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含む工程と、ｉｉｉ）１つ以上の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、シーケンシングリードを生物学的組成を含むとして特性評価する工程と、ｉｖ）第１の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて、計算、比較、および特性評価の工程を反復する工程と、ｖ）第１の複数のシーケンシングリードにおける生物学的組成を含むシーケンシングリードの数に基づいて、未知の対象に由来するｃｆＤＮＡサンプル中の生物学的組成の第１のレベルを判定する工程と、正常な対象または既知のがん患者に由来するｃｆＤＮＡサンプルについて、第２の複数のシーケンシングリードを受け取る工程であって、それぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含む工程と、正常な対象または既知のがん患者に由来するｃｆＤＮＡサンプルに、工程ｉ）からｖ）を実行することによって、患者に由来するｃｆＤＮＡサンプル中の生物学的組成の第２のレベルを判定する工程と、生物学的組成の第１のレベルと第２のレベルを比較する工程とを含む。
【００２６】
[0026]一側面において、患者に由来するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）サンプルの組成の変化を検出する方法がここに提供される。本方法は、第１の時点において、患者に由来する第１のｃｆＤＮＡサンプルについて、第１の複数のシーケンシングリードを受け取る工程であって、第１の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の第１の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含む工程と、ｉ）第１の複数のシーケンシングリードにおける１つのシーケンシングリードに基づいて第１のメチル化パターンを計算する工程であって、第１のメチル化パターンが第１の連続核酸配列に対応する第１のゲノム領域および第１のゲノム領域内の１つ以上のモチーフのメチル化ステータスを含む工程と、ｉｉ）第１のメチル化パターンを、１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれと比較して、１つ以上の第１の尤度スコアを計算する工程であって、１つ以上の事前構築されたメチル化シグネチャーのそれぞれが生物学的組成と相関し、それぞれの事前構築されたメチル化シグネチャーが少なくとも１つの所定のシグネチャー領域およびそれと関連する所定のメチル化率を含む工程と、ｉｉｉ）１つ以上の第１の尤度スコアのうちの少なくとも１つが閾値を上回る場合に、ｃｆＤＮＡを生物学的組成を含むとして特性評価する工程と、ｉｖ）第１の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて、工程ｉ）からｉｉｉ）を反復して、第１の時点におけるｃｆＤＮＡサンプル中の生物学的組成の存在を定量化する工程と、第２の時点において、同じ患者に由来する第２のｃｆＤＮＡサンプルについて、第２の複数のシーケンシングリードを受け取る工程であって、第２の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードが５０個以上の核酸の第２の連続核酸配列から得られるメチル化シーケンシングデータを含む工程と、第２の複数のシーケンシングリードにおけるそれぞれのシーケンシングリードについて、工程ｉ）からｉｖ）を反復して、第２の時点におけるｃｆＤＮＡサンプル中の生物学的組成の存在を定量化する工程と、第１の時点と第２の時点との間で生物学的組成の変化を検出する工程とを含む。
【００２７】
[0027]一部の態様において、生物学的組成は、疾患組織、がん組織、特定の器官に由来する組織、肝臓組織、肺組織、腎臓組織、結腸組織、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、小腸組織、膵臓組織、副腎組織、食道組織、脂肪組織、心臓組織、脳組織、胎盤組織、およびこれらの組合せからなる群から選択される。一部の態様において、患者は、疾患もしくは状態を有すると判定され得るか、または疾患もしくは状態を有さないと具体的に判定され得る。
【００２８】
[0028]特に、がん細胞はしばしば、異常なＤＮＡメチル化パターン、たとえば腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーター領域の高メチル化および遺伝子間領域の広汎性低メチル化を呈し得る。したがって、患者のＤＮＡメチル化プロファイルは、臨床の実施において、がん評価の標的となり得る。高／低メチル化された腫瘍ＤＮＡフラグメントは細胞のアポトーシスまたは壊死を通じて血流中に放出され得、そこでこれらの循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は血漿中の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の一部となる。ｃｆＤＮＡメチル化プロファイリングの非侵襲的な性質は全般的ながんのスクリーニングにとって有効な戦略であり得る。
【００２９】
[0029]非侵襲的ながんのスクリーニングおよび腫瘍起源組織の特定のための態様を開発する際、血漿中のセルフリーＤＮＡの検出および特性評価は有効な方法であり得る。液体生検たとえば採血は、従来の組織生検とは異なり、様々な異なる悪性腫瘍を診断する能力を有する。
【００３０】
[0030]本開示はここで、一部の態様において、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を使用して、がんおよびまたは腫瘍の位置の特定を含め、がんに関して患者を評価する確率論的方法を提供する。この態様は、全ゲノムＤＮＡメチル化データを使用して、血液サンプル中の腫瘍由来のセルフリーＤＮＡの割合および起源組織を同時に特定する。本開示は、シミュレーションおよび実データを用いた態様を包括的に開示し、これらの態様の性能を比較する。本開示は、予測された腫瘍負荷が真の値と高度に一致することを示す。注目すべきことに、ここに開示される態様は、患者の血漿サンプルから得られるＤＮＡメチル化データのシーケンシングカバレッジが非常に低いという事実にもかかわらず、これらのサンプルで正確な結果を達成する。腫瘍の存在、ならびに位置を正確に特定するそのような能力はがん療法において高度に望ましい。
【００３１】
[0031]一態様によると、コンピュータプログラム製品は、がんの検出および起源組織の特定のために構成される命令を有する不揮発性コンピュータ可読媒体を含み、コンピューティングシステムのプロセッサによって実行されると、プロセッサに不揮発性コンピュータ可読媒体に記憶された患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのデータにアクセスする命令を受信する工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する工程であって、複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数である工程と、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定する工程であって、０≦θ≦１である工程と、可能性のあるがんタイプｔを判定する工程と、ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについて、メチル化レベルｘｋを推定する工程であって、ｋ＝１，２，…Ｋである工程と、θ、ｔ、およびｘｋを使用して、予測スコアλを計算する工程と、λが所定の閾値よりも高い場合に、患者が可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定する工程と、λが所定の閾値よりも低い場合に、患者が非がん性であると判定する工程とを行わせる。
【００３２】
[0032]別の態様によると、がんの検出および起源組織の特定のために構成される装置は、不揮発性メモリと、不揮発性メモリに連結されたプロセッサであって、不揮発性メモリに記憶された患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのデータにアクセスする工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定する工程であって、複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数である工程と、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定する工程であって、０≦θ≦１である工程と、可能性のあるがんタイプｔを判定する工程と、ＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについて、メチル化レベルｘｋを推定する工程であって、ｋ＝１，２，…Ｋである工程と、θ、ｔ、およびｘｋを使用して予測スコアλを計算する工程と、λが所定の閾値よりも高い場合に、患者が可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定する工程と、λが所定の閾値よりも低い場合に、患者が非がん性であると判定する工程とを実行するように構成される、プロセッサとを含む。上記に考察されるように、ここで考察されるこの態様および他の態様はがん以外の疾患に適用することができる。
【００３３】
[0033]さらに別の態様によると、コンピュータシステムによって実行されるがんの検出および起源組織の特定のための方法は、コンピュータシステムのプロセッサによって、プロセッサと通信状態にある不揮発性コンピュータ可読媒体に記憶された患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのデータにアクセスする命令を受信することと、プロセッサによってｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて複数のＣｐＧクラスター特徴を特定することであって、複数のＣｐＧクラスター特徴の総数がＫであり、Ｋが正の整数であることと、プロセッサによって循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）負荷係数θを判定することであって、０≦θ≦１であることと、プロセッサによって可能性のあるがんタイプｔを判定することと、プロセッサによってＣｐＧクラスター特徴のそれぞれについて、メチル化レベルｘｋを推定することであって、ｋ＝１，２，…Ｋであることと、プロセッサによって、θ、ｔ、およびｘｋを使用して、予測スコアλを計算することと、プロセッサによって、λが所定の閾値よりも高い場合に、患者が可能性のあるがんタイプｔを有するがん性であると判定することと、プロセッサによって、λが所定の閾値よりも低い場合に、患者が非がん性であると判定することとを含む。
【００３４】
[0034]一部の態様において、Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）の負荷θの最良の解はグリッドサーチを通じて見出される。一部の態様において、グリッドサーチはまた、より高い分解能の工程（０．０１％）、たとえば０．０１０％、０．０２０％、０．０２５％、０．０３０％、０．０４０％、０．０５０％、０．０６０％、０．０７０％、０．０８０％、０．０９０％、０．１００％、０．１２５％、０．１５０％、０．１７５％、０．２００％、０．２２５％、０．２５０％、０．２７５％、０．３００％、０．３２５％、０．３５０％、０．３７５％、０．４００％、０．４２５％、０．４５０％、０．４７５％、０．５００％、０．５２５％、０．０５５％、０．５７５％、０．６００％、０．６２５％、０．６５０％、０．６７５％、０．７００％、０．７２５％、０．７５０％、０．７７５％、０．８００％、０．８２５％、０．８５０％、０．８７５％、０．９００％、０．９２５％、０．９５０％、０．９７５％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５．０％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６．０％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、８．０％、８．１％、８．２％、８．３％、８．４％、８．５％、８．６％、８．７％、８．８％、８．９％、９．０％、９．１％、９．２％、９．３％、９．４％、９．５％、９．６％、９．７％、９．８％、９．９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９９％、および／または１００％、またはその中で誘導可能な任意の範囲を使用して行われてもよい。一部の態様において、グリッドサーチはより高い分解能の工程（０．００１％）、たとえば０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１０％、０．０２０％、０．０２５％、０．０３０％、０．０４０％、０．０５０％、０．０６０％、０．０７０％、０．０８０％、０．０９０％、０．１００％、０．１２５％、０．１５０％、０．１７５％、０．２００％、０．２２５％、０．２５０％、０．２７５％、０．３００％、０．３２５％、０．３５０％、０．３７５％、０．４００％、０．４２５％、０．４５０％、０．４７５％、０．５００％、０．５２５％、０．０５５％、０．５７５％、０．６００％、０．６��５％、０．６５０％、０．６７５％、０．７００％、０．７２５％、０．７５０％、０．７７５％、０．８００％、０．８２５％、０．８５０％、０．８７５％、０．９００％、０．９２５％、０．９５０％、０．９７５％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５．０％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６．０％、６．１％、６．２％、６．３％、６．４％、６．５％、６．６％、６．７％、６．８％、６．９％、７．０％、７．１％、７．２％、７．３％、７．４％、７．５％、７．６％、７．７％、７．８％、７．９％、８．０％、８．１％、８．２％、８．３％、８．４％、８．５％、８．６％、８．７％、８．８％、８．９％、９．０％、９．１％、９．２％、９．３％、９．４％、９．５％、９．６％、９．７％、９．８％、９．９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９９％、および／または１００％、またはその中で誘導可能な任意の範囲を使用して行われてもよい。
【００３５】
[0035]態様は、がんの症状を有するか、がんの症状がないか、がんの家族歴もしくは患者歴を有するか、がんの危険性にあるか、またはがんと診断されている患者に関係する。患者は哺乳動物患者であってもよいが、ほとんどの態様において、患者はヒトである。がんは、悪性、良性、転移性、または前がん状態であってもよい。がんは、ステージＩ、ＩＩからＩＩＩ、またはＩＶであってもよい。がんは再発性および／または化学療法もしくは放射線耐性であってもよい。なおもさらなる態様において、がんは、黒色腫、非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝細胞癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、頸部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、子宮頸、胃腸、リンパ腫、脳、結腸、肉腫、または膀胱のものである。がんには腫瘍細胞から構成される腫瘍が含まれてもよい。態様は、特定の疾患もしくは状態の症状を有するか、特定の疾患もしくは状態の症状がないか、疾患もしくは状態の家族歴もしくは患者歴を有するか、疾患もしくは状態の危険性にあるか、または疾患もしくは状態と診断されている患者に関係する。
【００３６】
[0036]一部の態様において、がん患者におけるがんの処置のための方法であって、ここに開示される方法に基づいて、患者ががんを有すると判定された後に、患者に、有効量の化学療法、放射線療法、または免疫療法（またはこれらの組合せ）を施すことを含む方法が存在する。がんの起源点が判定されてもよく、その場合、処置はその起源のがんに合わせて調整される。一部の態様において、腫瘍切除は、処置として行われるか、または他の処置のうちの１つによる処置の一部であってもよい。化学療薬の例としては、以下のものが含まれるがこれらに限定されない：アルキル化剤、たとえば二官能性アルキル化剤（たとえばシクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン）または単一官能性アルキル化剤（たとえばダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ニトロソ尿素、テモゾロミド（経口ダカルバジン））；アントラサイクリン（たとえばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン；細胞骨格を破壊するタキサン（たとえばパクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、タキソテール）；エポチロン；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（たとえばボリノスタット、ロミデプシン）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（たとえばイリノテカン、トポテカン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（たとえばエトポシド、テニポシド、タフルポシド（tafluposide））；キナーゼ阻害剤（たとえばボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ）；ヌクレオチド類似体およびヌクレオチド前駆体類似体（たとえばアザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン（tioguanine）（以前のチオグアニン（thioguanine））；ペプチド抗生物質（たとえばブレオマイシン、アクチノマイシン）；白金系抗悪性腫瘍剤（たとえばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）；レチノイド（たとえばレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン）；ならびにビンカアルカロイド（たとえばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）。免疫療法としては、細胞療法たとえば樹状細胞療法（たとえばキメラ抗原受容体に関する）；抗体療法（たとえばアレムツズマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、またはこれらの抗体のうちの１つと同じ標的を有する他の抗体たとえばＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、または他のチェックポイント阻害剤）；ならびにサイトカイン療法（たとえばインターフェロンまたはインターロイキン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
[0037]ある特定の態様において、患者ががんまたは別の疾患もしくは状態を示すメチル化プロファイルを有するかどうかを判定することに基づいて、患者を診断する方法が存在する。一部の態様において、方法は、患者ががんまたは別の疾患もしくは状態を有するかどうか、有する場合にはどの器官に由来するかを示す、メチル化プロファイルを生成することを伴う。ある特定の態様において、これは、セルフリーＤＮＡを含む、患者に由来する生物学的サンプルを使用して行われる。
【００３８】
[0038]方法は、患者のメチル化プロファイルを判定した後に、生検を行うこと、ＣＡＴスキャンを行うこと、マンモグラムを行うこと、超音波を行うこと、またはそれ以外の方法でがん性であることが疑われる組織を評価することをさらに含んでもよい。一部の態様において、見出されたがんはがん分類において分類される。
【００３９】
[0039]血漿中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、がんを検出するための良好な標的であるが、これはがんの検出に限定されない。血漿ｃｆＤＮＡは健常な細胞と腫瘍細胞の両方に由来するＤＮＡを含む。一般に、血漿ｃｆＤＮＡにおいて、腫瘍細胞に由来するｃｆＤＮＡの部分は健常な細胞よりも大幅に少ない。したがって、血漿ｃｆＤＮＡを使用してがんを検出することに関する課題は、腫瘍細胞に由来する非常に少ない量のｃｆＤＮＡをどのようにして正確に検出するかである。
【００４０】
[0040]従来のＤＮＡメチル化分析は、細胞集団における個々のＣｐＧ部位のメチル化率に焦点を当てている。β値と称されることも多いが、この率はＣｐＧ部位がメチル化されている細胞の割合である。しかしながら、そのような集団平均の尺度では、腫瘍細胞に由来する少量のｃｆＤＮＡによる異常なメチル化シグナルを捕捉するには感度が十分ではない。図１はこの点を例示する血漿ｃｆＤＮＡの例１００である。
【００４１】
[0041]例１００は、βｎｏｒｍａｌ＝１である正常な血漿ｃｆＤＮＡを含む。例１００はβｔｕｍｏｒ＝０である肝臓腫瘍由来のｃｆＤＮＡを含む。例１００は、９９％の正常な血漿ｃｆＤＮＡと、１％の肝臓腫瘍由来のｃｆＤＮＡの混合物である血漿ｃｆＤＮＡを含む。したがって、血漿ｃｆＤＮＡはβｍｉｘｅｄ＝０．９９を有する。現在の技術では、βｍｉｘｅｄ＝０．９９とβｎｏｒｍａｌ＝１とを高い信頼性で区別することができない。
【００４２】
[0042]以下の装置および方法の態様は、少量の腫瘍由来のｃｆＤＮＡたとえば図１の例１００を、高い信頼性で検出するための解決策を提供することを目的とする。
【００４３】
[0043]一態様において、患者におけるがんを単一のリードの分解能で検出するように構成される命令を有する不揮発性コンピュータ可読媒体を含む、コンピュータプログラム製品であって、コンピューティングシステムのプロセッサによって実行されると、プロセッサに患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出すことであって、Ｎが正の整数であることと、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定することであって、Ｊが正の整数であることと、がんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出すことであって、Ｋが正の整数であることと、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＫ個のマーカー領域を判定することであって、マーカー領域ががんのＤＮＡメチル化マーカーに対応するＣｐＧクラスターであることと、ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｔクラスのメチル化パターンががんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて負荷θを計算することとを含む工程を行わせる、コンピュータプログラム製品。
【００４４】
[0044]別の態様において、患者におけるがんを検出するように構成される装置であって、不揮発性メモリと、不揮発性メモリに連結されたプロセッサであって、患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出す工程であって、Ｎが正の整数である工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定する工程であって、Ｊが正の整数である工程と、がんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出す工程であって、Ｋが正の整数である工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＫ個のマーカー領域を判定する工程であって、マーカー領域ががんのＤＮＡメチル化マーカーに対応するＣｐＧクラスターである工程と、ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出す工程であって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｔクラスのメチル化パターンががんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンである工程と、ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出す工程であって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンである工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて、負荷θを計算する工程とを実行するように構成される、プロセッサとを含む装置が存在する。一部の態様において、装置はポルタである。
【００４５】
[0045]別の態様において、患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出すことであって、Ｎが正の整数であることと、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定することであって、Ｊが正の整数であることと、がんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出すことであって、Ｋが正の整数であることと、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＫ個のマーカー領域を判定することであって、マーカー領域ががんのＤＮＡメチル化マーカーに対応するＣｐＧクラスターであることと、ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｔクラスのメチル化パターンががんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出すことであって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンであることと、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて、負荷θを計算することとを含む方法に基づいて、患者ががんを有すると判定された後に、患者に、有効量の化学療法、放射線、または免疫療法を施すこと。
【００４６】
[0046]別の態様において、患者に由来する生物学的サンプルに基づいて、患者におけるがんを検出するための方法。一部の態様において、方法は、以下の工程のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上を実装する、コンピュータプログラム製品を使用することを含む：患者のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）メチル化プロファイルのＮ個のリードを取り出す工程であって、Ｎが正の整数である工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＪ個のＣｐＧクラスターを特定する工程であって、Ｊが正の整数である工程と、がんのＫ個のＤＮＡメチル化マーカーを取り出す工程であって、Ｋが正の整数である工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいてＫ個のマーカー領域を判定する工程であって、マーカー領域ががんのＤＮＡメチル化マーカーに対応するＣｐＧクラスターである工程と、ｍＴｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＴクラスのメチル化パターンを取り出す工程であって、ｍがマーカー領域を表し、ＴがＴクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｔクラスのメチル化パターンががんの腫瘍細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンである工程と、ｍＮｋとして表されるそれぞれのマーカー領域のＮクラスのメチル化パターンを取り出す工程であって、ｍがマーカー領域を表し、ＮがＮクラスを表し、ｋ＝１，２，…Ｋであり、Ｎクラスのメチル化パターンが正常な細胞のｃｆＤＮＡに由来するメチル化パターンである工程と、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルのＮ個のリード、Ｋ個のｍＴｋおよびＫ個のｍＮｋに基づいて負荷θを計算する工程。
【００４７】
[0047]上記は、以下の本発明の詳細な説明がより良好に理解され得るように、本発明の特徴および技術的利点をどちらかといえば広義に概説している。本発明のさらなる特徴および利点は以下に記載され、これらは本発明の特許請求の範囲の主題をなす。当業者であれば、開示される概念および特定の態様が、本発明の同じ目的を実現するために他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用され得ることを理解すべきである。また、当業者であれば、そのような均等な構築物が添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の趣旨および範囲から逸脱しないことを理解すべきである。構成および操作方法の両方に関して、本発明の特徴であると考えられる新規な特性は、さらなる目的および利点とともに添付の図面と関連付けて考慮される場合、以下の説明によってより良好に理解されるであろう。しかしながら、図面のそれぞれは例示および説明の目的で提供されるものにすぎず、本発明を限定するものの定義として解釈されるものではない。
【００４８】
[0048]なおもさらなる態様において、がんは、黒色腫、または非小細胞肺、小細胞肺、肺、肝細胞癌、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、頸部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、子宮頸、胃腸、リンパ腫、脳、結腸、肉腫、もしくは膀胱のがん性細胞もしくはそれらに由来するがん性細胞である。がんには腫瘍細胞から構成される腫瘍が含まれてもよい。
【００４９】
[0049]一部の態様において、がん患者におけるがんの処置のための方法であって、ここに開示される方法に基づいて、患者ががんを有すると判定された後に、患者に、有効量の化学療法、放射線療法、または免疫療法（またはこれらの組合せ）を施すことを含む方法が存在する。がんの起源点が判定されてもよく、その場合、処置はその起源のがんに合わせて調整される。一部の態様において、腫瘍切除は、処置として行われるか、または他の処置のうちの１つによる処置の一部であってもよい。
【００５０】
[0050]ある特定の態様において、患者ががんを示すメチル化プロファイルを有するかどうかを判定することに基づいて患者を診断する方法が存在する。一部の態様において、方法は、患者ががんを有するかどうか、有する場合にはどの器官に由来するかを示す、メチル化プロファイルを生成することを伴う。ある特定の態様において、これは、セルフリーＤＮＡを含む、患者に由来する生物学的サンプルを使用して行われる。
【００５１】
[0051]方法は、患者のメチル化プロファイルを判定した後に生検を行うこと、ＣＡＴスキャンを行うこと、マンモグラムを行うこと、超音波を行うこと、またはそれ以外の方法でがん性であることが疑われる組織を評価することをさらに含んでもよい。一部の態様において、見出されたがんはがん分類において分類される。がんの分類は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのいずれかとして分類してもよい。
【００５２】
[0052]一部の態様において、方法はまた、測定した値を関連する非がん性組織または関連するがん性組織を示す対照と比較することを含んでもよい。ある特定の態様において、測定された値は所定の閾値と比較される。一部の態様において、ある特定のレベルまたは所定の閾値は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセンタイル、またはその中で誘導可能な任意の範囲であるか、それ未満であるか、またはそれを上回る。さらに、値または対照は、少なくともまたは多くとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００人以上の患者（またはその中で誘導可能な任意の範囲）に基づくものであってもよい。
【００５３】
[0053]一側面において、ここに開示される態様の方法を実行するように構成される、コンピュータプログラム論理が記録されたコンピュータ可読媒体を含む、コンピュータプログラム製品がここに提供される。
【００５４】
[0054]本明細書において考察されるいずれの態様も、本発明の任意の方法、システム、キット、コンピュータ可読媒体、または装置に対して実装することができ、その逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の装置は本発明の方法を達成するために使用することができる。さらに、ここに考察される任意の態様が具体的に除外されてもよいことが具体的に企図される。
【００５５】
[0055]当業者であれば、ここに開示される態様を任意の組合せで組み合わせることができることを理解するであろう。
【００５６】
[0056]当業者であれば、以下に説明される図面が例示目的のものにすぎないことを理解するであろう。図面は決して本発明の教示の範囲を制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】[0057]図１は、（Ａ）「フェージングされた」メチル化パターンに基づく分析が、腫瘍由来のｃｆＤＮＡの検出に関して、個々のＣｐＧ部位の平均メチル化率に基づく分析よりも感度が高い根拠、および（Ｂ）「フェージングされた」メチル化分析を、どのように本質的にｃｆＤＮＡ組成を推測するために使用することができるかの根拠を図示する例示的な態様を示す。黒塗りの丸はメチル化されている部位を示し、白抜きの丸はメチル化されていない部位を示す。
【図２】[0058]図２は、ｃｆＤＮＡシーケンシングリードの起源組織の特定の尤度および血漿ｃｆＤＮＡの正常な組織組成を推測するためのそれらの使用を図示する例示的な態様を示す。
【図３】[0059]図３は、「フェージングされた」ｃｆＤＮＡメチル化の統合分析を図示する例示的な態様を示す。黒色の方形に白色の文字で方法の構成要素を示し、灰色の方形はデータである。
【図４】[0060]図４は、どのようにしてメチル化シグネチャーを組織サンプルの集団にわたる平均値に基づいて構築することができるかを図示する例示的な態様を示す。２つのモデルが異なる分解能：ビン（モデル１）およびＣｐＧ部位（モデル２）でメチル化シグネチャーを特性評価するために使用される。
【図５】[0061]図５は、血漿ｃｆＤＮＡメチル化シーケンシングデータを得るためのプロセスを図示する例示的な態様を示す。
【図６】[0062]図６は、ＥＭアルゴリズムのフローチャートを図示する例示的な態様を示す。新しい未知の組織について、その推定されるメチル化シグネチャーはｍｎｅｗｊ＝ｆ（ｑ，Ｒ）であり、式中ｆ（ｑ，Ｒ）はどちらのメチル化シグネチャーモデルが使用されるかに応じて等式（９）または等式（１０）のいずれかである。
【図７】[0063]図７は、患者の血漿ｃｆＤＮＡのがん組成および組織組成が、どのようにしてがんの診断に使用されるかを図示する例示的な態様を示す。（Ａ）Ｚスコアを計算して、クラスｔの分率が正常な血漿サンプルからどれほど離れているかを評価する、（Ｂ）それぞれのクラスの分率のＺスコアを統合して予測スコアにする。
【図８】[0064]図８は、血漿ｃｆＤＮＡにおける異なる腫瘍負荷を用いたシミュレーションデータの健常かがんかの予測性能（曲線下面積：ＡＵＣ）を図示する例示的な態様を示す。
【図９】[0065]図９は、（ｉ）新しい患者が健常であるかがんを有するかの、２値分類、ならびに（ｉｉ）新しい患者が、正常、肝臓がん、または肺がんに分類される、多クラス分類という２つのタイプの分類タスクに関して、単一次元を使用することおよび両方の次元を使用することの予測性能を図示する例示的な態様を示す。異なるランダムな試験セットにわたって平均した予測性能を報告する（すなわちＡＵＣおよび混合行列）。混合行列において、真のクラス（ｔ）および予測されたクラスｐのそれぞれのエントリー値は下記の分率として計算される：
【数１】
2019521673.tif 000003
【図１０−１】[0066]図１０−１は、外科手術による切除の前および後の複数の時点における、２人の肝臓がん患者の分析を図示する例示的な態様を示す。２人のがん患者に関してそれぞれの時点の円グラフは１４個の組織の組成である：Ａは患者１であり、Ｂは患者２である。Ｃは患者１および患者２のＺスコアの値を挙げる。
【図１０−２】[0066]図１０−２は、外科手術による切除の前および後の複数の時点における、２人の肝臓がん患者の分析を図示する例示的な態様を示す。２人のがん患者に関してそれぞれの時点の円グラフは１４個の組織の組成である：Ａは患者１であり、Ｂは患者２である。Ｃは患者１および患者２のＺスコアの値を挙げる。
【図１１】[0067]図１１は、組織サンプルの個々の値に基づいてＤＮＡメチル化パターンを特性評価するための３つのモデルを図示する例示的な態様を示す。３つのモデルは、異なる分解能（高いものから低いもの）：（モデル１）エピアレル、（モデル２）ＣｐＧ部位、および（モデル３）ビンで、メチル化シグネチャーを特性評価するために使用することができる。
【図１２】[0068]図12は、一態様による、がんをスクリーニングし、腫瘍の起源組織を特定するための方法のフローチャートである。
【図１３】[0069]図１３は、一態様による、腫瘍タイプｔに由来する異なるｃｔＤＮＡ負荷での患者の血漿ｃｆＤＮＡにおけるメチル化レベル（ｘ）の混合モデルである。
【図１４Ａ】[0070]図１４Ａは、一態様による、正常なサンプルの予測されたｃｔＤＮＡ負荷のヒストグラムである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、一態様による、がんサンプルの予測されたｃｔＤＮＡ負荷および真のｃｔＤＮＡ負荷の比較である。
【図１５】[0071]図１５は、本開示の態様の予測性能を示す棒グラフである。
【図１６】[0072]図１６は、本開示の一態様による実データのそれぞれの血漿のｃｔＤＮＡ負荷と腫瘍組織予測との間の関係性である。
【図１７】[0073]図１７は、本開示の一態様による、特徴の区別を学習させるため、シミュレーション実験と実データ実験の両方のための、データパーティションを例示する。
【図１８】[0074]図１８は、本開示の一態様による、がんを検出し、起源組織を特定するために、データベースファイルへのアクセスを取得するためのコンピュータシステムを図示する。
【図１９】[0075]図１９は、本開示の一態様による、がんの検出および起源組織の特定のために構成されるコンピュータシステムを図示する。
【図２０】[0076]図２０は、シーケンシングリードにおけるすべてのＣｐＧ部位にわたって平均化されたメチル化値（α値）がなぜ、腫瘍由来ｃｆＤＮＡの検出において、すべてのリードにわたって平均化されたＣｐＧ部位の従来のメチル化レベル（β値）よりも感度が高いかについて図示する。それぞれの線はシーケンシングリードを表し、それぞれの点はＣｐＧ部位を表す。
【図２１】[0077]図２１は、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ法を概説する。ｃｆＤＮＡシーケンシングリードの色はそれらの起源を表す：赤色（緑色）のリードは腫瘍（正常な血漿）のｃｆＤＮＡフラグメントに由来する。
【図２２】[0078]図２２は、正常なクラスおよび腫瘍クラスのメチル化パターンを踏まえて、マーカーにおけるｃｆＤＮＡシーケンシングリードの尤度を計算することの図である。
【図２３】[0079]図２３は、実際の健常なｃｆＤＮＡサンプル（Ｎ１ＬまたはＮ２Ｌ）および固形肝臓腫瘍サンプル（ＨＣＣ１またはＨＣＣ２）からシーケンシングリードをサブサンプリングおよび混合することによって、８つの異なる負荷：０、０．１％、０．３％、０．５％、０．８％、１％、３％、５％、ならびに３つの異なるシーケンシングカバレッジ（２×、５×、および１０×）でシミュレーションした、肝臓がんｃｆＤＮＡサンプルの予測された血中腫瘍負荷（１０回の実行にわたる平均）である。それぞれの両対数プロットにおいて、青色の点はシミュレーションしたサンプルをエラーバー（予測された腫瘍負荷の標準偏差）とともに示し、ｘ軸はその真の腫瘍負荷であり、ｙ軸はその予測された腫瘍負荷である。予測された腫瘍負荷が範囲外（５％を上回る）であった場合は、枠の上に点を描いた。
【図２４】[0080]図２４は、１０回すべての実行における実データの予測された血中腫瘍負荷である：（Ａ）ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒの標準偏差バーありの平均ＲＯＣ曲線、（Ｂ）以前の方法であるＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒの標準偏差バーありの平均ＲＯＣ曲線、ならびに（Ｃ）ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒによって予測された腫瘍サイズと平均血中腫瘍負荷との関係性。
【図２５】[0081]図２５は、１０回すべての実行における、腫瘍切除の前および後の２人の肝臓がん患者の縦断的データの平均の予測された血中腫瘍負荷である。第２の患者は外科手術後に亡くなった。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
定義
[0082]別途示されない限り、用語は関連する分野の当業者による従来の使用法に従って理解されるものとする。
【００５９】
[0083]一側面において、血液サンプルからのシーケンシングデータ（たとえば核酸）に基づく疾患の診断のための方法がここに開示される。ここに開示されるように、シーケンシングデータは、ｃｆＤＮＡ、セルフリーマイクロＲＮＡ、および免疫レパートリーシーケンシングに関する情報を含む。ｃｆＤＮＡが主要な例として本出願全体を通じて使用されるが、これは決して本発明の範囲を制限するものではない。
【００６０】
[0084]一側面において、既存のシーケンシングメチル化データ（たとえばアレイに基づくものと従来の非アレイに基づくもの両方のシーケンシングデータ）に基づいて、シーケンシングシグネチャー（たとえばメチル化シグネチャー）のライブラリーを構築するための方法およびシステムがここに開示される。たとえば、ｃｆＤＮＡ、セルフリーマイクロＲＮＡ、および免疫レパートリーシーケンシングデータを含む、すべての好適な既存のシーケンシングメチル化データをここで使用することができる。一部の態様において、シーケンシングデータは疾患特異的（たとえばがん特異的）および／または組織特異的であり得る。
【００６１】
[0085]一側面において、提供される方法はまた、組織タイプを特定し、がんの予後および患者の生存率を予測するために使用することができる。ここで、ｃｆＤＮＡは最小限に侵襲的な手順によって血液サンプルから得られる。一部の態様において、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンシングデータは、それぞれが核酸の連続配列を含むシーケンシングリードを含む。一部の態様において、ｃｆＤＮＡサンプルからのシーケンシングデータは連続配列内の選択された配列のメチル化ステータスをさらに含む。ここに開示されるように、メチル化ステータスは核酸部位におけるメチル化修飾の存在と不在の両方を含む。
【００６２】
[0086]一側面において、ここに開示される方法はまた、ドライバークローン、ドライバー遺伝子、およびドライバー制御経路を特定するためのがん処置をモニタリングするために使用することができる。
【００６３】
[0087]一側面において、提供される方法はまた、血漿ｃｆＤＮＡにおける組織タイプの組成を特定し、がんの診断および予後を予測し、患者が有する可能性の高い腫瘍タイプを特定するために使用することができる。
【００６４】
[0088]すべての血漿ｃｆＤＮＡに基づくがん診断方法の中でも、ｃｆＤＮＡメチル化の変化は、（ｉ）メチル化変化が、文献において初期の発がん機序であると仮説が立てられており、したがって初期がんの指標となる可能性があるため、ならびに（ｉｉ）多くの異常な全ゲノムＤＮＡメチル化パターンが、近年の研究において血漿ｃｆＤＮＡにおいて観察されているため、多くの研究上の関心を引いている。ほぼすべての既存のｃｆＤＮＡに基づくメチル化分析方法は個々のＣｐＧ部位またはゲノム領域にわたる平均メチル化率の測定に基づく。ＣｐＧ部位またはＣＧ部位は、線形塩基配列において、その５’から３’の方向に沿って、シトシンヌクレオチドにグアニンヌクレオチドが続いているＤＮＡの領域である。ＣｐＧは５’−Ｃ−リン酸−Ｇ−３’の簡略表記である、すなわちシトシンおよびグアニンが１つのリン酸のみによって離間している。リン酸はＤＮＡにおいて任意の２つのヌクレオチドを連結させる。しかしながら、図１Ａの簡単な例に示されるように（肝臓腫瘍を例とする）、平均メチル化率はｃｆＤＮＡの混合的性質を見逃し、それによって真のがんシグナル（腫瘍由来のｃｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ）が正常な血漿ｃｆＤＮＡに埋もれてしまう。したがって、ｃｔＤＮＡの分率がわずかである初期のがん段階では、混合したｃｆＤＮＡにおける個々のＣｐＧ部位の平均メチル化率、たとえば図１Ａにおけるｍｍｉｘｅｄ＝０．９９は正常な血漿ｃｆＤＮＡのｍｎｏｒｍａｌ＝１とは無視できる程度の相違しか有さない。測定の誤差およびバイアスを考慮すると、この事実により、既存の方法は初期のがん患者について腫瘍シグナルを高感度で検出することができないものとなることが多い。しかしながら、それぞれの個々のｃｆＤＮＡフラグメント（メチル化シーケンシングリードによって捕捉することができる）を調べた場合には、腫瘍由来のｃｆＤＮＡフラグメントは正常な血漿ｃｆＤＮＡフラグメントと容易に区別することができるが、血漿中のｃｔＤＮＡ分率は１％しかない。この原理は図１Ａおよび１Ｂに示されている。
【００６５】
[0089]個々のｃｆＤＮＡフラグメント上の複数の隣接するＣｐＧ部位のメチル化ステータスの偶発性は、実際には個々のｃｆＤＮＡフラグメントのいわゆる「フェージングされた」メチル化パターンまたは文献中の「エピアレル」である。本研究において、本発明者らは、個々のｃｆＤＮＡフラグメント上の「フェージングされた」メチル化パターンは個々のＣｐＧ部位またはゲノムビンの平均メチル化率よりも感度が高いという仮説を立てた。近年、クローン進化ならびに腫瘍内系統発生および精製に関して、固形腫瘍サンプルにおける「フェージングされた」メチル化パターンの感度を実現した複数の研究が存在している。現在のところ、「フェージングされた」メチル化パターンをｃｆＤＮＡに基づくがん診断に適用した研究はない。したがって、本発明者らが、がん診断のための「フェージングされた」ｃｆＤＮＡメチル化分析を初めて提案した。ｃｆＤＮＡの全ゲノムメチル化シーケンシングたとえば全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）または表示低減型（reduced representation）バイサルファイトシーケンシング（ＲＲＢＳ）により、本発明者らの「フェージングされた」分析方法に役立つ「フェージングされた」メチル化データが豊富に得られる。すなわち、少なくとも３つのＣｐＧ部位をカバーするＷＧＢＳまたはＲＲＢＳのシーケンシングリードが「フェージングされた」メチル化データである。図１Ａは実際に直感的な「フェージングされた」メチル化分析方法を表す。それぞれのｃｆＤＮＡリードに、どちらのソース（正常な血漿または肝臓腫瘍）に由来する可能性が高いかをラベル付けし、次いですべてのｃｆＤＮＡリードの中で肝臓腫瘍に由来する可能性が最も高いリードの分率を推測することができる。これは実際に図１Ｂに正式に図示されているようにｃｆＤＮＡリードのカテゴリー分類であり、２クラスの組成推論プロセスである。結果として、肝臓腫瘍由来のｃｆＤＮＡリードの分率の上昇は患者が肝臓がんを有する危険性を示唆し得る。このプロセスを他のがんタイプに関して反復すると、患者ががんを有するかどうかを判定することができるだけでなく、患者がどのがんタイプを有し得るかを予測することもできる。後者の予測は血漿ｃｆＤＮＡにおいて最も異常に上昇した分率を有するがんタイプを選択することによって行うことができる。
【００６６】
[0090]ｃｆＤＮＡを２つのクラス（正常な血漿および特定の腫瘍タイプ）にデコンボリューションする以外に、血漿ｃｆＤＮＡが様々な器官の正常な組織から放出されたＤＮＡの混合物であるという事実により、ｃｆＤＮＡを複数の正常な組織タイプの組成にデコンボリューションするというもう１つの異なるプロセスが想起された。これは起源組織特定および組織組成推測のプロセスである。メチル化データは、これまでの研究により、メチル化パターンが豊富な組織特異的バイオマーカーを有するという十分な根拠が提供されているため、このプロセスに理想的である４。図２に示されるように、上記と同じ手順に従って、まず、それぞれのｃｆＤＮＡリードの起源組織尤度を特定し、次いで血漿ｃｆＤＮＡの組織組成を推測する。Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）は、血漿ｃｆＤＮＡの最も異常に上昇した組織の分率を、がんタイプの予測の根拠として使用することができることを実証しているが４、その方法は、「フェージングされた」メチル化データではなく、ゲノム領域の平均メチル化率に基づく。
【００６７】
[0091]上述の２つの異なる「フェージングされた」メチル化パターンに基づくｃｆＤＮＡ分析方法は、様々な生物学的側面から、かつ様々なゲノム領域に基づいて、大量の腫瘍とは無関係なｃｆＤＮＡに埋もれている限られた腫瘍シグナルを探求する。本発明者らの結果は、がん特異的なメチル化パターンのゲノム領域と組織特異的なメチル化パターンのゲノム領域との間には、非常に少ないオーバーラップ（８％）しか存在しないことを示した。したがって、この観察により、がん診断の決定を一緒に行うためにこれら２つのオーバーラップしない分析を統合することとなった。本研究において、本発明者らは、非侵襲的ながんの診断のために、「フェージングされた」ｃｆＤＮＡメチル化の統合分析を行うことを提案する。
【００６８】
全体的なプロセス
[0092]「フェージングされた」ｃｆＤＮＡメチル化の統合分析の例示的な概要を図３に示す。この方法には３つの構成要素が存在する：（ｉ）公的なメチル化データからメチル化シグネチャーを構築すること、（ｉｉ）ｃｆＤＮＡ組成を推測する確率論的フレームワーク、ならびに（ｉｉｉ）がん診断の統合方法。ｃｆＤＮＡサンプルにおける組織組成および腫瘍組成を判定するためのプロセスを構築することができる。
【００６９】
[0093]第１の構成要素において、可能な限り多くのメチル化データを、公的データたとえばＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）レポジトリ、Ｒｏａｄｍａｐエピゲノミクス、および科学文献における他の論説から収集する。がん特異的または正常組織特異的メチル化シグネチャーは、メチル化シグネチャーのライブラリーを構築するために、既存のメチル化データに基づいて構築され、ここでそれぞれのシグネチャーはがんタイプまたは組織タイプに対応する。
【００７０】
[0094]第２の構成要素において、患者の血漿ｃｆＤＮＡをシーケンシングし、彼／彼女の「フェージングされた」メチル化データを、たとえばＩｌｌｕｍｉｎａからの全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）方法または表示低減型バイサルファイトシーケンシング（ＲＲＢＳ）方法を使用して得る。次いで、「フェージングされた」メチル化に基づく確率論的方法を適用して、血漿ｃｆＤＮＡ組成を２つのクラスに関して推測する。
【００７１】
[0095]がん患者のシーケンシングデータを使用して、がん特異的メチル化シグネチャーを構築することができる。がん特異的メチル化シグネチャーを使用して、特定のがんタイプの存在の検出、ならびに特定のｃｆＤＮＡサンプル内の正常な血漿および特定のがんタイプの相対的な組成の判定を行うことができる。
【００７２】
[0096]正常または非がん患者のシーケンシングデータを使用して、組織特異的なメチル化シグネチャーを構築することができる。組織特異的メチル化シグネチャーを使用して、特定の組織タイプの存在の検出、ならびに特定のｃｆＤＮＡサンプル内の異なる組織タイプの相対的な組成の判定を行うことができる。
【００７３】
[0097]第３の構成要素において、前の工程で推測された異なる血漿ｃｆＤＮＡ組成を統合して２つの質問に回答する：（ｉ）この患者は健常であるかまたはがんであるか？（ｉｉ）彼／彼女ががんを有する場合、腫瘍はどこにあるか？
[0098]それぞれの構成要素のさらなる説明および例示的な態様は下記および実施例に含まれる。
【００７４】
メチル化シグネチャー
[0099]ＷＧＢＳ、ＲＲＢＳ、およびアレイに基づくデータを含め、多くの公的に入手可能なメチル化データを利用して、がん特異的および組織特異的メチル化シグネチャーを構築することができる。メチル化シグネチャーは少なくとも２つの種類の情報を含む：ゲノム領域を示すものおよびゲノム領域のメチル化ステータスを表すもの。一部の態様において、メチル化シグネチャーはまた、組織（図２）または腫瘍タイプ（図１Ｂ）の集団におけるメチル化レベルの個体間のばらつきも示す。
【００７５】
[00100]たとえば、２工程の手順を採用して、メチル化シグネチャーを構築する：
工程１：がんタイプ（または正常な組織タイプ）を区別することができるゲノム領域、いわゆる「がん特異的」メチル化領域（または「組織特異的」メチル化領域）が特定される。一部の態様において、ゲノム領域は、特定の染色体上のセグメントとして、たとえば第１１染色体のヌクレオチド２，０００からヌクレオチド３，０００として表すことができる。既存の「差次的メチル化領域」（ＤＭＲ）検出方法を使用するか、またはＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）によるものなど、それぞれの領域の区別力を示す単純なスコア付け関数を設計するかのいずれかを行うことができる。
【００７６】
[00101]工程２：工程１において特定されたそれぞれの領域において、メチル化シグネチャーを、異なるゲノム分解能（ＣｐＧ部位またはゲノムビン）で、それぞれのクラス（すなわちがんタイプ、組織タイプ、または正常な血漿）に関して、このクラスのサンプルの集団を使用して特性評価する。メチル化シグネチャーのゲノム分解能の選択は公的なメチル化データにより提供され得る情報に依存する。
【００７７】
[00102]上述のように、メチル化シグネチャーは、ゲノム領域または位置、およびゲノム領域または位置内のメチル化ステータスという少なくとも２種類の情報を含む。メチル化シグネチャーは複数の様式で表すことができる。メチル化シグネチャーは集団と個体の両方のレベルで構築することができる。たとえば、集団レベルでは、特定のゲノム領域について、１セットの個体のベータ分布モデリングメチル化率はビンレベル（モデル１）または個々のＣｐＧ部位レベル（モデル２）のいずれかで判定することができる。図４を参照されたい。個体レベルでは、メチル化率は、未加工のバイサルファイトシーケンシングデータ（モデル１）、個々の部位レベル（モデル２）、およびビンレベル（モデル３）から判定することができる。図１１を参照されたい。
【００７８】
[00103]特定の疾患は、複数のメチル化シグネチャーに対応し得ることが理解されるであろう。一部の態様において、疾患は、２つのメチル化シグネチャー、５つ以下のメチル化シグネチャー、１０個以下のメチル化シグネチャー、１５個以下のメチル化シグネチャー、２０個以下のメチル化シグネチャー、５０個以下のメチル化シグネチャー、１００個以下のメチル化シグネチャー、１５０個以下のメチル化シグネチャー、２００個以下のメチル化シグネチャー、２５０個以下のメチル化シグネチャー、５００個以下のメチル化シグネチャー、７５０個以下のメチル化シグネチャー、１，０００個以下のメチル化シグネチャー、１，５００個以下のメチル化シグネチャー、２，０００個以下のメチル化シグネチャー、３，０００個以下のメチル化シグネチャー、４，０００個以下のメチル化シグネチャー、５，０００個以下のメチル化シグネチャー、７，５００個以下のメチル化シグネチャー、１０，０００個以下のメチル化シグネチャー、１５，０００個以下のメチル化シグネチャー、または２０，０００個以下のメチル化シグネチャーに対応する。一部の態様において、疾患は２０，０００個以上のメチル化シグネチャーに対応する。
【００７９】
[00104]一部の態様において、メチル化シグネチャーは疾患特異的である。一部の態様において、メチル化シグネチャーは疾患特異的ではない。しかしながら、メチル化シグネチャーは疾患間で有意に変動するため、結果として、そのばらつきを使用して特定の疾患タイプの存在を検出することができる。
【００８０】
[00105]一部の態様において、メチル化データはビンレベルで構築することができる。たとえば図１１のモデル３を参照されたい。ビンのサイズは核酸配列の所定の長さである。たとえばビンは、１０，０００ヌクレオチド以下、５，０００ヌクレオチド以下、２，５００ヌクレオチド以下、１，５００ヌクレオチド以下、１，０００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下を含み得る。一部の態様では、ビンは１０，０００ヌクレオチド以上を含み得る。
【００８１】
[00106]たとえば、サンプルのクラスｔについて、それぞれのサンプルはメチル化率ｍｔを同じビンの範囲［０，１］に有する。これは通常、ベータ分布ｍｔ〜Ｂｅｔａ（αｔ，βｔ）によってモデリングされる。
【００８２】
[00107]一部の態様において、メチル化データは個々のＣｐＧ部位レベルで構築することができる。たとえば図１１のモデル２を参照されたい。クラスｔのＣｐＧ部位ｊについて、それぞれのサンプルはメチル化率ｍｔｊを有し、これは通常、ベータ分布ｍｔｊ〜Ｂｅｔａ（αｔｊ，βｍｔｊ）によってモデリングされる。これらの態様において、メチル化ステータスが核酸配列の所与のセグメントのそれぞれのＣｐＧ部位について提供される。
【００８３】
[00108]ここに開示されるように、記号Ωｔを使用して、クラスｔのすべてのメチル化シグネチャーを示す。ここで、それぞれのクラスは疾患タイプ、がんタイプ、組織タイプなどであり得る。
【００８４】
[00109]あるいは、ＤＮＡメチル化パターンは未加工のバイサルファイトシーケンシングデータおよび頻度ヒストグラムに基づいて定義され得る。たとえば図１１のモデル１を参照されたい。
【００８５】
[00110]類似の方法およびシステムを使用して、組織タイプおよび疾患タイプが未知であるサンプルのメチル化パターンを計算することができる。たとえば血液サンプルを患者から採取することができ、その血液サンプルに由来するｃｆＤＮＡサンプルについてシーケンシングデータを得ることができる。ここで、未知のサンプルから得られたメチル化パターンはまた、核酸配列およびそれと関連するメチル化ステータスという２種類の情報を含む。
【００８６】
[00111]しかしながら、ここに開示されるように、シーケンシングデータはシーケンシングリードを含む。シーケンシングリードは核酸の連続セグメントに由来する未加工の配列である。そのため、任意のシーケンシングリードのメチル化ステータスは「フェージングされている」、すなわちこれは二倍体染色体ＤＮＡからのアレルのうちの一方のみのメチル化ステータスを表す。メチル化ステータスを複数のリードにわたって平均化すると、それはアレル非特異的となり、「フェージングされていない」とも呼び得る。
【００８７】
[00112]ここに開示されるように、シーケンシングリードは、１，０００ヌクレオチド以下、８００ヌクレオチド以下、６００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、または１０ヌクレオチド以下を含んでもよい。一部の態様において、シーケンシングリードは１，０００ヌクレオチド以上（またはその中の導出できる任意の範囲）を含んでもよい。
【００８８】
分析フレームワーク
[00113]ここで上述のように、メチル化シグネチャーは特定の組織タイプまたは疾患タイプ（たとえばがんタイプ）からの既存のシーケンシングデータに基づいて構築され、メチル化シグネチャーのライブラリーを形成する。それぞれのライブラリーは特定の組織タイプまたは疾患タイプ（たとえば特定のがんタイプ）と関連する。これらのライブラリーは後続の分析の標準として使用することができる。
【００８９】
[00114]たとえば、シーケンシングリードのメチル化パターンを１つ以上の構築されたライブラリーのメチル化シグネチャーと比較することができる。構築されたメチル化シグネチャーに類似のメチル化パターンは、ｃｆＤＮＡサンプルが特定の組織タイプに由来する核酸フラグメントを含むことを示唆し、したがって血漿ｃｆＤＮＡの組成が判定される。加えて、構築されたメチル化シグネチャーに類似のメチル化パターンはまた、ｃｆＤＮＡサンプルが特定の疾患、たとえば肝臓がんまたは肺がんに関連する核酸フラグメントを含むことも示唆し得る。
【００９０】
[00115]一部の態様において、複数の血液サンプルがある期間にわたって同じ患者から採取され得る。これらの血液サンプルに由来するメチル化パターンを使用して、危険性の高い集団の疾患発症をモニタリングすることができる。あるいは、これらの血液サンプルに由来するメチル化パターンを使用して、疾患の進行たとえばがんの予後をモニタリングすることができる。
【００９１】
[00116]一部の態様において、確率論的フレームワークを使用して未知のサンプルのメチル化パターンと確立されたメチル化シグネチャーとの間の関係を判定することができる。フレームワーク内で、可能性のあるすべての解の悉皆的探索（グリッドサーチアルゴリズムと称される）または期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムのいずれかが適用される。ＥＭアルゴリズムは、統計学的モデルにおいてパラメーターの最大尤度または最大事後確率（ＭＡＰ）推定を見出すための反復的方法であり、ここでモデルは観察されていない潜在変数に依存する。
【００９２】
[00117]確率論的分析の例示的な態様は実施例２に提示される。この確率論的フレームワークおよびＥＭアルゴリズムは柔軟性があるが、これは、（ｉ）新しい未知の組織タイプの追加または除去のいずれかを行うことができ、（ｉｉ）公的なデータベースからどの分解能のメチル化データを収集することができるかに依存する組織特異的メチル化シグネチャーの様々なモデルを考慮することができるためである。
【００９３】
[00118]一部の態様において、血漿ｃｆＤＮＡの個別化されたデコンボリューションは同じ患者のバフィーコートサンプルを使用して達成することができる。本発明者らは、患者のバフィーコートサンプルの白血球がＤＮＡを血漿中に放出すると仮定する。したがって、正常な組織組成の推測工程において、他の人の白血球のメチル化シグネチャーを使用するのではなく、患者自身の白血球のメチル化シグネチャーを使用することができる。これにより、一部の個体間のばらつきまたは生殖系列のばらつきが除去され得ると予測される。
【００９４】
[00119]一部の態様において、ここに開示される方法はｃｆＤＮＡの組成および組織の起源を分析するために適用することができる。一部の態様において、そのような組成における変化を使用して、個体の健康状態をモニタリングすることができる。たとえば、がん性核酸材料の検出は明らかな警戒標識であり、これはさらなる試験および検査の根拠である。たとえば、健常な個体のｃｆＤＮＡ中の肝臓ＤＮＡ成分はある特定の範囲内であり得る。ｃｆＤＮＡサンプル中の肝臓ＤＮＡ成分の急激な上昇は健康状態の変化を示し得る。同様に、個体のｃｆＤＮＡサンプル中の特定のＤＮＡ成分の急激な減少もまた、健康状態の変化を示唆し得る。
【００９５】
[00120]一部の態様において、ここに開示される方法は、血液細胞たとえば白血球の組成を分析するために適用することができる。近年の研究により、患者のバフィーコートサンプルにおける様々な白血球タイプの異常な組成もまた、疾患の指標であることが報告された。特に、末梢血免疫細胞のメチル化プロファイルは非造血系のがんと関連していることが報告されている。したがって、本発明者らの方法をこの問題に適用し、それをがん診断の第３の次元として統合することができる。
【００９６】
ｃｆＤＮＡの組成ならびに疾患の診断および予後
[00121]ｃｆＤＮＡの組成および組織の起源を判定した後、情報を疾患の診断および予後のために統合することができる。たとえば、血漿ｃｆＤＮＡのがん組成および組織組成をがんの診断のために統合することができる。これら２種類の組成を任意の患者の２つの特徴として使用することができる。理想的には、多数の健常な人々およびＴ個のがんタイプを有する患者から採取された血漿ｃｆＤＮＡサンプルを有するとして、ナイーブベイズ分類器を使用し、新しく来た患者ががんを有するかどうか、およびどのがんタイプを有するかを診断するように、これらの２特徴のデータによって訓練することができる。
【００９７】
[00122]しかしながら、血漿サンプルの数は限られているため、実データでの予測のためにナイーブベイズ法を訓練することは不可能である。したがって、本発明者らは小さなサンプルサイズのためのＺスコアに基づく単純な診断方法を設計した。新しい患者のクラスｔの分率が正常な人々のものに由来するものから上昇しているほど、この患者ががんを有する可能性が高く、そのがんタイプは最も上昇した分率を有するクラスｔであることが直感的である。図７に示されるように、本発明者らは、正常な血漿サンプルの集団におけるそれぞれの組織の（または腫瘍の）分率がどのようになっているかの経験的な分布を得ていると仮定する。したがって、新しい患者については、まず工程２を行って彼／彼女の組織（または腫瘍）ｔの分率（ｘとして表される）を得た後、ＺスコアＺｔ（またはＺ'ｔ）を計算してｘが正常な血漿集団からどれほど離れているかを評価することができる：
【数２】
2019521673.tif 000004
式中
【数３】
2019521673.tif 000005
（σｎｏｒｍａｌ）は正常な血漿集団における組織（または腫瘍）ｔの分率の平均（標準偏差）である。そうすると、予測スコアはすべての組織ｔ＝１，…，ＴにわたるＺｔ＋Ｚ'ｔの最大値である。このスコアは直感的であるが、これは彼／彼女の血漿ｃｆＤＮＡにおける組織および腫瘍ｔの２つの分率が正常な人々の集団から最も離れている患者ががんタイプｔを有する可能性が最も高いためである。ｍａｘｔ（Ｚｔ＋Ｚ'ｔ）が正常な範囲内であれば、この患者は健常である可能性が高い。
【００９８】
コンピュータシステムおよびプログラム製品
[00123]ここに開示される方法は、コンピュータ可読ストレージ媒体に埋め込まれたコンピュータプログラム機序を含むコンピュータシステムおよび／またはコンピュータプログラム製品として実装することができる。さらに、本発明の方法のいずれも１つ以上のコンピュータまたはコンピュータシステムにおいて実装することができる。なおもさらに、本発明の方法のいずれも１つ以上のコンピュータプログラム製品において実装することができる。本発明の一部の態様は、ここに開示されるありとあらゆる方法を実行するための命令をコードするかまたは命令を有するコンピュータシステムまたはコンピュータプログラム製品を提供する。そのような方法／命令は、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、または任意の他のコンピュータ可読データもしくはプログラムストレージ製品に記憶され得る。そのような方法はまた、恒久的ストレージたとえばＲＯＭ、１つ以上のプログラム可能なチップ、または１つ以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に埋め込まれ得る。そのような恒久的ストレージは、サーバ、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリッジ／ステーション、リピータ、ルータ、携帯電話、または他の電子デバイスに局在化され得る。コンピュータプログラム製品においてコードされるそのような方法はまた、インターネットを介してまたはそれ以外の方法でデジタルまたは搬送波のいずれかでのコンピュータデータシグナル（ここにソフトウェアモジュールが埋め込まれる）の伝送によって電子的に分配されてもよい。
【００９９】
[00124]本発明の一部の態様は、ここに開示されるありとあらゆるプログラムモジュールを含むコンピュータシステムまたはコンピュータプログラム製品を提供する。これらのプログラムモジュールは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスクストレージ製品、または任意の他のコンピュータ可読データもしくはプログラムストレージ製品に記憶され得る。プログラムモジュールはまた、恒久的ストレージたとえばＲＯＭ、１つ以上のプログラム可能なチップ、または１つ以上の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）に埋め込まれ得る。そのような恒久的ストレージは、サーバ、８０２．１１アクセスポイント、８０２．１１無線ブリッジ／ステーション、リピータ、ルータ、携帯電話、または他の電子デバイスに局在化され得る。コンピュータプログラム製品におけるソフトウェアモジュールはまた、インターネットを介してまたはそれ以外の方法で、デジタルもしくは搬送波のいずれかでのコンピュータデータシグナル（ここにソフトウェアモジュールが埋め込まれる）の伝送によって電子的に分配されてもよい。
【０１００】
[00125]一部の態様において、ここに開示される方法は、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、ｉＰｏｄ（登録商標）、タブレット、ネットワークデバイスを搭載した携帯デバイス、スマートフォン、ポケットベル、テレビ、メディアプレーヤー、デジタルビデオレコーダー（ＤＶＲ）、および任意の他のネットワークデバイスからなる群から選択されるネットワークデバイスにおいて実装され得る。
【０１０１】
ＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒに関するさらなる態様
[00126]がん細胞はしばしば、異常なＤＮＡメチル化パターンたとえば腫瘍サプレッサー遺伝子のプロモーター領域の高メチル化および遺伝子間領域の広汎性低メチル化を呈し得る。したがって、ＤＮＡメチル化は臨床の実施においてがん診断の標的となり得る。高／低メチル化された腫瘍ＤＮＡフラグメントは細胞のアポトーシスまたは壊死を通じて血流中に放出され、そこで血漿中の循環セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の一部となる。ｃｆＤＮＡメチル化プロファイリングの非侵襲的な性質は全般的ながんスクリーニングにとって有効な戦略であり得る。
【０１０２】
[00127]一部の態様は様々な特定のがんに対する血漿メチル化のバイオマーカーを含んでもよい。差次的にメチル化されたマーカー遺伝子は、ある特定のがんタイプを有する患者から得られたメチル化プロファイルデータを健常な対照と比較することによって、特定することができる。異なるがんに特異的な様々なメチル化プロファイルを特定することで、ここに開示される態様により単純で非侵襲的な液体生検に基づいて、多数のタイプのがんを検出し、さらなる特定の臨床上の調査のための腫瘍の位置情報を得ることができる。
【０１０３】
[00128]図１２は、一態様による、がんをスクリーニングし、腫瘍の起源組織を特定するための方法１００のフローチャートである。
【０１０４】
[00129]図１２に示されるように、方法１００は大規模ながんゲノム（ＴＣＧＡ）ＤＮＡメチル化データ１１０から様々ながんタイプの情報的特徴を学習する。この方法は次に、がん患者の血漿ｃｆＤＮＡ１２５を正常なｃｆＤＮＡ１３０およびｃｔＤＮＡ１２０の混合物としてモデリングする。最終的に、未知の患者のｃｆＤＮＡサンプル１３０に由来する全ゲノムメチル化プロファイルを踏まえて、ここに開示される態様は、情報的特徴１１５を使用して、血漿１２５中のｃｔＤＮＡの分率、ならびに検出されたｃｔＤＮＡがそれぞれの腫瘍タイプ１３５に由来する尤度を推定する。それらの尤度に基づいて、ここに開示される態様は、患者が腫瘍を有するかどうか、および有する場合には原発性腫瘍の位置に関して最終決定１３５を行う。
【０１０５】
[00130]方法１００の第１の工程は、正常な血漿１０５および大規模なＴＣＧＡデータベース１１０からの複数の腫瘍タイプの情報的特徴を特定することである。方法１００は、一般的に高レベルの血液循環を有するとみなされている５つの器官たとえば乳房、結腸、腎臓、肝臓、および肺からの７つのがんタイプに焦点を当てている。第２の工程では、患者の血漿ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルを踏まえて、方法１００はそれらの情報的特徴を使用してがんの検出およびその起源組織の位置判定を同時に行う。
【０１０６】
[00131]第１の工程において、本方法は、ＣｐＧクラスターのメチル化範囲（ＭＲ）が十分に大きい場合に、ＣｐＧクラスターを特徴として選択する１１５。「ＣｐＧ」部位は、線形塩基配列において、その５’から３’の方向に沿って、シトシンヌクレオチドにグアニンヌクレオチドが続いているＤＮＡの領域である。ＣｐＧ部位はＣｐＧクラスターに分類される。ＭＲは健常な血漿および様々な固形腫瘍組織において観察される平均メチル化レベルの範囲として定義される。
【０１０７】
[00132]ここに開示される態様は、よりマッピング性の高いリードを使用するために、個々のＣｐＧ部位をＣｐＧクラスターに分類する。シーケンシングプロセスにおいてプローブによってカバーされるＣｐＧ部位については、本態様は、１００ｂｐ（塩基対）上流および下流の領域をその隣接領域として定義し、この領域内に位置するすべてのＣｐＧ部位がプローブによってカバーされるＣｐＧ部位と同じ平均メチル化レベルを有すると仮定してもよい。２つの隣接するＣｐＧ部位は、それらの隣接領域がオーバーラップする場合、１つのＣｐＧクラスターに分類される。最後に、マイクロアレイプローブによってカバーされるＣｐＧ部位を少なくとも３つ含むＣｐＧクラスターのみが本態様において使用される。
【０１０８】
[00133]他の事例において、ここに開示される態様は概して、隣接領域のサイズおよびクラスター内のＣｐＧの数を３つの基準に従って選択する：（ｉ）固形腫瘍サンプルにおけるメチル化値の堅強な測定値を得るために少なくとも３つのＣｐＧ部位（マイクロアレイデータに）が含まれており、（ｉｉ）低いカバレッジのシーケンシングデータが使用される場合であっても、メチル化値を計算するのに十分なＣｐＧ部位が存在するように、クラスターが妥当なサイズであり、（ｉｉｉ）あるタイプのゲノム領域（ＣｐＧアイランドまたはショアのいずれか）内に及ぶクラスターを可能な限り多く保有する。
【０１０９】
[00134]一部の態様において、この手順により４２，３７４個のＣｐＧクラスターが得られ、これらにはＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイデータ上のすべてのＣｐＧ部位の約半分が一緒に含まれている。これらのクラスターの大半について、それぞれのクラスターは１つの遺伝子のみと関連している。これらのＣｐＧクラスターは後続の特徴選択に使用される。他の態様において、この手順により４０，０００個またはその前後〜５０，０００個またはその前後のＣｐＧクラスターを得てもよい。他の態様において、この手順により３０，０００個またはその前後〜６０，０００個またはその前後のＣｐＧクラスターを得てもよい。他の態様において、この手順により２０，０００個またはその前後〜７０，０００個またはその前後のＣｐＧクラスターを得てもよい。他の態様において、この手順により１０，０００個またはその前後〜９０，０００個またはその前後のＣｐＧクラスターを得てもよい。他の態様において、この手順により５，０００個またはその前後〜１００，０００個またはその前後のＣｐＧクラスターを得てもよい。
【０１１０】
[00135]方法１００により平均で総数Ｋ＝１４４２９個のＣｐＧクラスター（特徴）が選択され、そのＭＲは０．２５の閾値以上である。
【０１１１】
[00136]他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが１４０００〜１５０００個である。他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが１３０００〜１６０００個である。他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが１２０００〜１７０００個である。他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが１００００〜１８０００個である。他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが８０００〜２００００個である。他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが６０００〜２２０００個である。他の態様において、特性評価されるＣｐＧクラスターは総数Ｋが５０００〜３００００個である。
【０１１２】
[00137]他の態様において、ＭＲの閾値は０．２またはその前後〜０．３またはその前後であり得る。他の態様において、ＭＲの閾値は０．１またはその前後〜０．５またはその前後であり得る。他の態様において、ＭＲの閾値は０．０５またはその前後〜０．７またはその前後であり得る。他の態様において、ＭＲの閾値は０．０１またはその前後〜０．９またはその前後であり得る。さらなる態様において、ＭＲの閾値は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはその中で誘導可能な任意の範囲であるか、または少なくともこれらの数であるか、またはこれらの数以下である。
【０１１３】
[00138]それぞれのＣｐＧクラスターについて、本方法は、１２０に示されるように、同じ腫瘍タイプ（または正常な血漿）のメチル化レベルの分布をベータ分布Ｂｅｔａ（αｔ，βｔ）としてモデリングすることによって個体間の変動性を考慮する。インデックスｔ＝０は正常な血漿を表し、一方でｔ＝１，…，Ｔは腫瘍タイプを表す。
【０１１４】
[00139]第２の工程において、方法１００は、１３５において、選択された特徴（選択されたＣｐＧクラスター）およびそれらのベータ分布を使用して、患者の血漿ｃｆＤＮＡのメチル化プロファイル１３０を正常な血漿ｃｆＤＮＡの分布、および該当する場合には固形腫瘍分布にデコンボリューションする。方法１００はｃｔＤＮＡの負荷および起源組織を同時に推測することができる確率論的方法を含んでもよい。１３５において、任意の腫瘍タイプの存在の尤度が正常なバックグラウンドにおいて観察される分布の尤度よりも実質的に高くない場合、患者は非がん性と予測される。そうではなく、任意の腫瘍タイプの存在の尤度が正常なバックグラウンドよりも実質的に高い場合、患者は最も高い尤度と関連する腫瘍タイプを有すると予測される。
【０１１５】
[00140]一態様において、患者のｃｆＤＮＡのメチル化プロファイルＸを踏まえてｃｔＤＮＡ負荷θおよび腫瘍タイプｔを判定するという問題は最大尤度推定関数Ｌ（θ，ｔ｜Ｘ）として定式化することができ、ここで尤度関数はＫ個の選択されたＣｐＧクラスターのすべてが互いに独立していると仮定し、それぞれの選択されたＣｐＧクラスターの尤度の積として表される。これはＬ（θ，ｔ｜Ｘ）＝ΠＫｋ＝１Ｌ（θ，ｔ｜ｘｋ）として表され、式中ｘｋはがん患者のｃｆＤＮＡのメチル化プロファイルＸにおける選択されたＣｐＧクラスターｋのメチル化レベルを表す。原則的には、ｘｋは正常な血漿のＤＮＡメチル化レベルと分率θを有する固形腫瘍タイプｔのＤＮＡメチル化レベルの線形結合であり得る。メチル化の正常な成分および腫瘍成分は、図１３に示されるように、ｖｋおよびｕｋによって示される。すなわち、ｘ＝（１−θ）ｖ＋θｕ（単純化のために、これらの表記のｋの下付きは省略する）。前述のように、ｖおよびｕはそれぞれベータ分布Ｂｅｔａ（α０，β０）およびＢｅｔａ（αｔ，βｔ）に従うため、ここでｔは腫瘍タイプを表し、ｔ＝０はがんのないプロファイルを表す。したがって、ｘは分布ψ（θ，ｔ）に従い、これは２つのベータ分布Ｂｅｔａ（α０，β０）およびＢｅｔａ（αｔ，βｔ）のコンボリューションとして計算される。
【０１１６】
[00141]一部の態様において、患者の血漿から得られるｃｆＤＮＡは少数であり得るため、患者の血漿のメチル化プロファイルは通常、シーケンシングに基づく方法によって測定される。したがって、ＣｐＧクラスターｋのメチル化レベルｘｋはｎｋおよびｍｋの２つの数から導出することができ、ここでｎｋはＣｐＧクラスターｋにおいて利用可能なシトシンの総数を表し、ｍｋはＣｐＧクラスターｋにおいてメチル化されているシトシンの数を表す。本態様は、ｍｋおよびｎｋを二項分布ｍｋ〜Ｂｉｎｏｍｉａｌ（ｎｋ，ｘｋ）として一緒にモデリングすることができ、尤度関数はＬ（θ，ｔ｜Ｍ，Ｎ）＝ΠＫｋ＝１Ｌ（θ，ｔ｜ｍｋ，ｎｋ）として記述しなおすことができる。この方法の詳細な説明は以下の項において展開される。
【０１１７】
[00142]一部の態様において、血漿ｃｆＤＮＡのメチル化レベルの混合モデルを使用することができる。たとえば、がん患者の血漿中のｃｆＤＮＡは正常なバックグラウンドのＤＮＡと腫瘍により放出されたＤＮＡとの混合物とみなすことができる。正式には、それぞれのＣｐＧクラスターｋ∈｛１，２，…，Ｋ｝について、所与の患者に由来する血漿ｃｆＤＮＡのメチル化レベルｘｋはｖｋとｕｋとの混合物に近似し得、ここでｖｋは正常な血漿サンプルのメチル化レベルを表し、ｕｋは固形腫瘍組織のメチル化レベルを表す。θ∈（０，１）とし、θは血漿ｃｆＤＮＡ中の腫瘍由来のＤＮＡの割合を表すとする。ｘｋはｖｋおよびｕｋの加重和すなわちｘｋ＝（１−θ）ｖｋ＋θｕｋとして表すことができる。
【０１１８】
[00143]本態様は、個体が、Ｔ個の可能性のある腫瘍タイプのうち１個以下のタイプの腫瘍を有すると仮定してもよい。ｔ∈｛０，１，２，…，Ｔ｝を正常な血漿（ｔ＝０）または腫瘍タイプ（１≦ｔ≦Ｔ）のいずれかを表す変数とする。それぞれのＣｐＧクラスターｋについて、本態様はタイプｔのサンプル中のそのメチル化レベルをベータ分布としてモデリングすることができる：正常な血漿サンプル（ｔ＝０）についてはｖｋ〜Ｂｅｔａ（αｋ０，βｋ０）およびタイプｔ∈｛１，…，Ｔ｝の固形腫瘍サンプルについてはｕｋ〜Ｂｅｔａ（αｋｔ，βｋｔ）であり、ここでαｋ０およびβｋ０（またはαｋｔおよびβｋｔ）は正常な血漿（固形腫瘍）サンプル中のＣｐＧクラスターｋのメチル化レベルのベータモデルのパラメーターである。図１２の工程１に図示されるように、これらのベータ分布のパラメーターは多数の公的な腫瘍データおよび正常な血漿データを使用してモーメント法によって推定される。
【０１１９】
[00144]一部の態様において、２つのベータ分布（ｖｋおよびｕｋ）を統合することによって、図１３に示されるように、ｘｋを所与のｃｔＤＮＡ負荷θおよびソース腫瘍タイプｔを用いて導出される分布によってモデリングすることができる。このモデルは確率密度関数ψ（ｘｋ｜θ，ｔ）として表され、これはＢｅｔａ（αｋ０，βｋ０）およびＢｅｔａ（αｋｔ，βｋｔ）のコンボリューションによって計算される。これは公式的に下記式で表現される：
【数４】
2019521673.tif 000006
ここでｆＢｅｔａはベータ分布の確率質量関数である。
【０１２０】
[00145]一部の態様は、血漿ｃｆＤＮＡシーケンシングデータのメチル化されたシトシンの計数をモデリングする。これらの態様においては、血漿中におけるその存在度が低いことに起因して、ｃｆＤＮＡのメチル化プロファイルは通常、シーケンシングに基づく方法によって測定され、ＣｐＧクラスターｋのメチル化レベル（ｘｋ）はリード上のメチル化されたシトシンおよびメチル化されていないシトシンの数によって特性評価することができる。Ｍ＝（ｍ１，ｍ２，…，ｍＫ）をメチル化されたシトシンの数とし、Ｎ＝（ｎ１，ｎ２，…，ｎＫ）をすべてのＣｐＧ部位にマッピングされたシトシンの総数とし、添え字はＫ個すべてのＣｐＧクラスターにわたる通し番号であるとする。それぞれのＣｐＧクラスターｋについて、ｍｋは二項分布：ｍｋ〜Ｂｉｎｏｍｉａｌ（ｎｋ，ｘｋ）によってモデリングすることができる。等式（１）におけるｘｋの混合モデルを統合することによって、本態様は、それぞれのＣｐＧクラスターｋについて、モデルパラメーター（θ、ｔ、αｋ０およびβｋ０、αｋｔおよびβｋｔ）ならびに血漿サンプルの配列測定値（ｍｋ、ｎｋ）からの入力を有する下記の尤度関数を有する：
【数５】
2019521673.tif 000007
ここでｆＢｉｎｏｍｉａｌは二項分布の確率密度関数である。
【０１２１】
[00146]一部の態様は、最大尤度Ｌを利用して血中腫瘍負荷およびタイプを推定する、たとえば図１２に示される工程１３５および１４０。これらの態様において、これまでに開示されているようにベクトルＭおよびＮから誘導することができる患者の血漿ｃｆＤＮＡサンプルのメチル化シーケンシングプロファイルを踏まえて、本態様は下記の２つのモデルパラメーターを見出すことを目的とする：（１）この特定のサンプルのｃｆＤＮＡ腫瘍負荷θおよび（２）そのソース腫瘍タイプｔの最大尤度推定。複数のマーカーの混合モデルを統合して定式化するために、本態様はすべての特徴またはマーカーが互いに独立しているという仮定を採用した。この仮定は多くの細胞タイプデコンボリューション研究において広く使用されている。この仮定のもとに対数尤度は下記式として記述することができる：
【数６】
2019521673.tif 000008
【０１２２】
[00147]等式（１）−（２）の統合は容易に解析的に解くことができないため、本態様はシンプソンの公式を使用して対数尤度ｌｏｇ（Ｌ（θ，ｔ｜Ｍ，Ｎ）を計算する。すなわちＪ個の既定のθ値のセット
【数７】
2019521673.tif 000009
を使用して最良推定（すなわち大域的最適化の解）のためのグリッドサーチを行う。分解能（Ｊ）が高いほど推定の精度が高い。等式（３）が最大となる解（すなわち最適化されたθ＾および最適化されたｔ＾）を得た後、ここに開示される態様は、推定されたパラメーターを使用して、「患者ががんを有するか？」および「患者ががんを有する場合、それはどの腫瘍タイプであるか？」という２つの質問に答える、単純であるが有効な予測スコアを計算する。この予測スコアは以下に定義される。
【数８】
2019521673.tif 000010
ここで、異なる数の特徴を使用する場合にλが比較可能となるように、分母Ｋを使用して対数尤度を正規化する。θ＝０は正常な血漿サンプルを示すため、変数ｔはＬ（θ＝０｜Ｍ，Ｎ）には含まれない。予測スコアλが大きいほど患者がタイプｔ＾のがん腫瘍を有する可能性が高い。具体的には、λが閾値よりも高い場合、患者はｃｔＤＮＡ負荷θ＾および腫瘍タイプｔ＾のがんを有すると予測され、そうでなければ彼／彼女は非がん性として分類される。
【０１２３】
[00148]一部の態様において、予測モデルを構築する際、シミュレーションされる血漿ｃｆＤＮＡサンプルのメチル化データは、正常な血漿ｃｆＤＮＡサンプルの全メチル化プロファイルと、固形腫瘍サンプル（たとえば乳房、結腸、腎臓、肝臓、または肺の腫瘍）のものを、様々なｃｔＤＮＡ負荷（θ値）でコンピュータによって混合することによって生成される。この戦略により、シミュレーションされるメチル化データは実データにおいてＣｐＧクラスター間でのメチル化値の相関の可能性を反映するものとなり得る。一部の態様において、予測モデルを構築する際、腫瘍のコピー数異常（ＣＮＡ）事象が既定の確率（すべてのＣｐＧクラスターにわたって１０％、３０％、および５０％）で付加される。
【０１２４】
[00149]一部の態様において、予測モデルは既知のｃｔＤＮＡ分率を用いたシミュレーションデータで評価される。結果は、予測モデルがｃｔＤＮＡの予測された割合と真の割合との間で０．９７５のピアソン相関係数（ＰＣＣ）、ならびに非がんおよび腫瘍タイプの分類については０．０７４の誤り率を達成することができることを示す。さらに、予測モデルはｃｆＤＮＡ事例における腫瘍由来のＤＮＡの割合が５０％よりも低い場合に良好に機能し、これは実際には典型的に低いＣＮＡを表す。本開示の態様により、初期段階のがん患者から採取されたがんサンプルを含め、患者の血漿サンプルにおいて有望な予測結果が達成された。
【０１２５】
[00150]図１４Ａに示されるように、正常なサンプルについて推定されたｃｔＤＮＡ負荷の大半（８７．９％）は０．０２以下であり、いずれも０．０５以下であった。サンプルががん患者に由来するかどうかは、予測されるｃｔＤＮＡ負荷ではなく、予測モデルにおいて計算される最適尤度によって判定されるものであることに留意されたい。シミュレーションしたがん患者の血漿サンプルの予測結果を図１４Ｂに示す。
【０１２６】
[00151]図１４Ａおよび３Ｂに示されるように、結果は予測されたｃｔＤＮＡ負荷（θ）のばらつきが真のθとともに増加することを示し、負荷の推定は患者が中期または後期のがん段階にある場合には精度が低くなることを示す。この結果は、後期段階の腫瘍サンプルにおいては高い腫瘍不均一性が存在し得、これによりｃｔＤＮＡ負荷予測の複雑さがもたらされるという事実によって部分的に説明され得る。しかしながら、予測されるθは正常なバックグラウンドよりも依然として高いため、このばらつきの増加によりがん検出の性能が低減されるわけではない。実際に、図１４Ｂに示されるように、ｃｔＤＮＡ予測におけるばらつきの増加にもかかわらず、ｃｔＤＮＡのがんの起源組織の予測は高いｃｔＤＮＡ負荷によってさらに区別できるようになる。図１４Ｂにおいて、シアンおよび赤色の円は正しい予測および正しくない予測を表すことに留意されたい。
【０１２７】
[00152]図１５において、予測モデルの態様をさらに評価する。系統的な比較のために、本態様はシミュレーションデータを異なるがん段階の１０個のサブセットにわけ、サブセットのそれぞれは２００個の正常な血漿サンプルおよびそれぞれの腫瘍タイプの２００個のがん血漿サンプルを含む。異なるがん段階（初期から、中期、後期の段階）は、ｘ軸として、θ＝０、１０％、２０％、１５  ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％で、ｃｔＤＮＡ負荷範囲のセット（θ，＋１０％］によって表される。６クラス（ｔ＝０、２、…５）のがん分類の問題（正常、乳房、結腸、腎臓、肝臓、および肺）について、図１５の態様は分類性能を評価するために誤り率の尺度を採用する。図１５に示されるように、範囲θ∈（０，１０％］のｃｔＤＮＡ負荷を有する初期段階のがん患者については、予測モデルは０．２４０の誤り率を有する。２番目に低いｃｔＤＮＡ負荷θ∈（１０％，２０％］については、予測モデルは誤り率０．０６７の非常に高い予測性能に達する。これらの結果は、予測モデルの態様が少数のｃｔＤＮＡ分率で十分に機能するため顕著であり、初期段階のがんのスクリーニングにおける本態様の有用性が強調される。
【０１２８】
[00153]図１７に示されるように、本態様は固形腫瘍サンプルのうちの７５％  ６０５および健常な血漿ｃｆＤＮＡサンプルのうちの７５％  ６１５を訓練セットにランダムに選択してモデルパラメーターを構築する。健常な血漿サンプルの残り２５％  ６２０および腫瘍ｃｔＤＮＡサンプルの残り２５％  ６１０によりシミュレーションデータセットを形成する。健常な血漿サンプルの残り２５％  ６２０およびがん患者から採取したすべての腫瘍ｃｔＤＮＡサンプル６２５により試験セットを形成する。
【０１２９】
[00154]表１は図１７に示されるモデル予測結果を示す。この手順（ランダムデータパーティションおよび予測を含む）を１０回行った後、本態様の予測を表１に示されるように混合行列にまとめる。新しい患者の血漿サンプル６２５について、予測モデルはがんタイプに関する事前の情報がないと仮定する。したがって、表１における実際の血漿データが結腸または腎臓の腫瘍を含まないにもかかわらず、モデルは結腸および腎臓の腫瘍を可能性のある結果と考える。表１の結果はモデルが良好に機能したことを示す。具体的には、乳がん、肝臓がん、および肺がんのサンプルの大半はがん検出モデルによって正確に予測される。がん検出モデルは、６クラスの予測問題について０．２６５という低い誤り率を得る。表１の結果は、図１４Ａおよび１４Ｂに示される５０％未満のｃｔＤＮＡ負荷のシミュレーション実験と一致する。
【０１３０】
[00155]推定されるｃｔＤＮＡ負荷と実データにおける腫瘍タイプとの間の関係性をさらに探求するために、本発明者らは、１０回すべての実行におけるそれぞれの血漿サンプルの予測をまとめることによって図１６にそれらの関係性をプロットした：それぞれのサンプルについて、１０回の実行の平均予測ｃｔＤＮＡ負荷（ｙ軸の値）および最も高頻度で予測された腫瘍タイプ。推定されるｃｔＤＮＡ負荷が高いほど、腫瘍タイプの予測の精度が高いことを観察することができる。これは図１４Ａおよび１４Ｂに示されるシミュレーションデータの結果と高度に一致する。図１６に示されるように、乳がんサンプルについては、５つのサンプルのうち３つが２．２％以下のｃｔＤＮＡ負荷を有し、がんではないと予測された。２つの正しく予測されたサンプルの予測ｃｔＤＮＡ負荷はそれぞれ５．０％および１８．０％であり、後者は転移性サンプルである。肝臓がんサンプルについては、すべてのサンプルのうち少なくとも２５個が初期段階（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ、ステージＡ）の患者に由来する。それらの大半（８０％）が予測モデルによって肝臓がんと正しく分類され、それらのすべてはがんサンプルとして検出された。乳がんサンプルと比較すると、肝臓サンプルの大半は肝臓が一般的に強力な血液循環を有することを考慮すると、初期段階であっても中等度から高度な腫瘍負荷（平均予測腫瘍負荷は１４．９％であり、最も高いものは５９．０％に達する）を有し得るが、本発明者らは２．０％の予測ｃｔＤＮＡ負荷しか有さないものも肝臓がんとして正しく分類した。１２個の肺がんサンプルの中で（２つのサンプルはがんの段階の情報を有さない）、そのうちの少なくとも５つが初期段階の患者から採取されたものである。これらの初期段階のサンプルは２．０％〜４．０％の範囲の予測ｃｔＤＮＡ負荷を有する。これらの５つの初期段階の肺がんサンプルの中で、４つは肺がんとして正しく予測されたが、一方で残りの１つはがんではないと予測される。
【０１３１】
[00156]モデルは８つの慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）サンプルのうち７つをがんではないサンプルと正しく予測した。加えて、本発明者らの方法は、良性の肺腫瘍を有する単一のサンプルを、１０回の実行すべてにおいて予測ｃｔＤＮＡ負荷０．０％でがんではないと予測することに成功した。これらの結果は、ここに開示されるがん検出モデルが、健常なサンプルとがんのサンプルとを区別するだけでなく、より洗練されたシナリオたとえばＢ型肝炎ウイルス保因者または良性腫瘍の患者とがん患者との区別に対処することができることを示す。
【０１３２】
[00157]非侵襲性であることに加えて、血液に基づくがんの診断は従来の組織生検に基づく診断とは異なり、多数の器官に由来する腫瘍を診断する能力を有する。ここに開示される予測モデルは、腫瘍の存在を診断するだけでなく起源組織を検出することによってもｃｆＤＮＡのこの能力を利用することを目的としている。ここに開示される態様は、ｃｆＤＮＡに基づくがんタイプの推測のための体系的な予測方法を展開し、シミュレーションデータと実データの両方においてその性能を包括的に評価する。開示される態様は、腫瘍由来のＤＮＡが５０％未満の場合に、特に初期段階のがんにおいて正確かつ有用な予測を示す。加えて、本態様は、予測がＣＮＡ事象に対して堅強であることを示すが、これは全ゲノム特徴が局所的な異常よりも重大であり得るためである。
【０１３３】
[00158]一部の態様において、公的ドメインにおける全ゲノムバイサルファイトシーケンシングデータの欠如に起因して、固形腫瘍組織のＤＮＡメチル化マイクロアレイを使用してモデルを訓練するためのデータを得た。ＤＮＡメチル化マイクロアレイデータは、プロモーター領域上のメチル化に焦点を当てるため妥当である。したがって、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングデータの量を増やすことで、ここに開示される態様の能力が有意に増すことが予測されるが、これはより分解能の高いデータが得られる可能性があるためである。
【０１３４】
[00159]一部の態様において、メチル化データは以下の様式で収集され処理される。本態様は、固形腫瘍の公的なメチル化データならびに健常な人々およびがん患者から採取された血漿ｃｆＤＮＡサンプルの大規模なセットを収集する。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）における腫瘍メチル化プロファイルの大半は、ＤＮＡマイクロアレイたとえばＩｎｆｉｎｉｕｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイを使用してアッセイされたものであった。本態様は、５つの異なる器官に由来する１００個を上回るサンプルを用いて固形腫瘍のデータを収集する：６８１個の乳房サンプル（ＢＲＣＡ）、２９０個の結腸サンプル（ＣＯＡＤ）、５２２個の腎臓サンプル（３００／１５６個のＫＩＲＣ／ＫＩＲＰサンプルを含む）、１６９個の肝臓サンプル（ＬＩＨＣ）、および８０９個の肺サンプル（４５０／３５９個のＬＵＡＤ／ＬＵＳＣサンプルを含む）。この段落において、略語は次の意味を有する。ＢＲＣＡ：乳房の浸潤癌、ＣＯＡＤ：結腸腺癌、ＫＩＲＣ：腎臓の腎明細胞癌、ＫＩＲＰ：乳頭状腎細胞癌、ＬＩＨＣ：肝臓の肝細胞癌、ＬＵＡＤ：肺腺癌、ＬＵＳＣ：肺扁平上皮細胞癌。
【０１３５】
[00160]一部の態様において、血漿サンプルの全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）データの２つのデータセットを、３２人の正常な人々、８人のＨＢＶに感染した患者、２９人の肝臓がん患者、４人の肺がん患者、５人の乳がん患者、および大量の血流を有さない器官に腫瘍を有する多数の患者から得る。本態様により、８人のがん患者（５人の初期肺がん患者、１人の後期肺がん患者、２人の段階の情報が未知の肺がん患者）、ならびに１人の良性肺腫瘍を有する患者から採取した血漿サンプルのＷＧＢＳデータも生成した。本態様は、正常、ＨＢＶ、および乳がん／肝臓がん／肺がん患者のみを研究に使用し、血漿サンプルの総数は８７であった。これらの公的なＷＧＢＳデータは非常に低いシーケンシングカバレッジ（平均約４×）を有するが、９個のサンプルすべてに関して本発明者らが新しく生成したデータのカバレッジはおよそ１０×であることに留意されたい。
【０１３６】
[00161]一部の態様において、ヒト対象の血液サンプルを使用した。本態様には、８人の肺がん患者および１人の良性肺腫瘍患者の血液サンプルが含まれる。
【０１３７】
[00162]セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の単離および全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）がここに開示される態様に含まれる。一部の態様において、ｃｆＤＮＡ単離およびＷＧＢＳは以下の様式で処理される：血液サンプルをまず１，６００×ｇで１０分間遠心分離した後、血漿を新しいマイクロチューブに移し１６，０００×ｇでさらに１０分間遠心分離した。血漿を採取し−８０℃で保管した。ｃｆＤＮＡを、試薬キットたとえばＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｋｉｔを使用して５ｍｌの血漿から抽出し、蛍光光度計たとえばＱｕｂｉｔ  ３．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって定量化した。ｃｆＤＮＡのバイサルファイト変換を、試薬キットたとえばＥＺ−ＤＮＡ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ＧＯＬＤキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用することによって行った。その後に、別の試薬キットたとえばＡｃｃｅｌ−ＮＧＳ  Ｍｅｔｈｙ−Ｓｅｑ  ＤＮＡライブラリーキット（Ｓｗｉｆｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してシーケンシングライブラリーを調製した。ＤＮＡライブラリーを次いで１５０ｂｐの対合末端リードでシーケンシングした。
【０１３８】
[00163]本態様により、認識できる選択されたＣｐＧ特徴すなわちＣｐＧクラスターが構築される。一部の態様において、ＣｐＧ特徴は以下の様式で構築される。約４５０，０００個のＣｐＧについて、固形腫瘍サンプルを測定する適切なマイクロアレイデータたとえばＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイデータをＴＣＧＡから収集した。本態様の試験サンプルは、シーケンシングカバレッジが非常に低いＷＧＢＳデータであり得るため、本態様はよりマッピング性の高いリードを使用するためにＣｐＧ部位をＣｐＧクラスターに分類する。マイクロアレイにおいてプローブによってカバーされるＣｐＧ部位については、本態様は１００ｂｐ（塩基対）上流および下流の領域をその隣接領域として定義し、この領域内に位置するすべてのＣｐＧ部位がプローブによってカバーされるＣｐＧ部位と同じ平均メチル化レベルを有すると仮定してもよい。２つの隣接するＣｐＧ部位はそれらの隣接領域がオーバーラップする場合、１つのＣｐＧクラスターに分類される。最後に、マイクロアレイプローブによってカバーされるＣｐＧ部位を少なくとも３つ含むＣｐＧクラスターのみが本態様において使用される。本態様は隣接領域のサイズおよびクラスター内のＣｐＧの数を３つの基準に従って選択する：（ｉ）固形腫瘍サンプルにおけるメチル化値の堅強な測定値を得るために、少なくとも３つのＣｐＧ部位（マイクロアレイデータに）が含まれており、（ｉｉ）低いカバレッジのシーケンシングデータが使用される場合であってもメチル化値を計算するのに十分なＣｐＧ部位が存在するように、クラスターが妥当なサイズであり、（ｉｉｉ）あるタイプのゲノム領域（ＣｐＧアイランドまたはショアのいずれか）内に及ぶクラスターを可能な限り多く保有する。一部の態様において、この手順により４２，３７４個のＣｐＧクラスターが得られ、これらにはＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイデータ上のすべてのＣｐＧ部位の約半分が一緒に含まれている。これらのクラスターの大半についてそれぞれは１つの遺伝子のみと関連している。これらのＣｐＧクラスターは後続の特徴選択に使用される。
【０１３９】
[00164]一部の態様において、メチル化マイクロアレイデータが処理される。メチル化マイクロアレイデータは、以下の様式で処理されてもよい。マイクロアレイデータ（ＴＣＧＡデータベースにおいてレベル３）により、個々のＣｐＧ部位のメチル化レベルが得られる。本態様は、クラスター内のすべてのＣｐＧ部位の平均メチル化レベルとしてＣｐＧクラスターのメチル化レベルを定義する。クラスターのメチル化レベルは、そのＣｐＧ部位の半数よりも多くがメチル化の測定値を有さない場合には、該当なし（ＮＡ）として表記される。
【０１４０】
[00165]一部の態様において、ＷＧＢＳデータが処理される。ＷＧＢＳデータは以下の様式で処理されてもよい。ＤＮＡ配列アライメントツールたとえばＢｉｓｍａｒｋを利用して参照ゲノムＨＧ１９に対してリードをアライメントし、メチル化されたシトシンと呼ぶ。ＰＣＲ重複を除去した後、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンの数をそれぞれのＣｐＧ部位について計数する。特定のＣｐＧクラスター（ｋ）のメチル化レベル（ｘｋ）を、クラスター内のメチル化されたシトシンの数（ｍｋ）とシトシンの総数（ｎｋ）との比として計算する。しかしながら、ＣｐＧクラスターにアライメントしたリードにおけるシトシンの総数（ｎｋ）が３０未満の場合、このクラスターのメチル化レベルは「ＮＡ」として扱われる。
【０１４１】
[00166]一部の態様において、ＣｐＧクラスターはさらにフィルタリングされる。特徴のフィルタリングは以下の様式で行うことができる。それぞれのＣｐＧクラスターについて、本態様はメチル化範囲（ＭＲ）を使用してクラス間での特徴の区別力を示すことができる。本態様は、まずそれぞれのクラス（すなわち健常な血漿またはそれぞれの腫瘍タイプ）のすべてのサンプルの平均メチル化レベルを得、次いでＭＲをこの平均値セットの範囲（すなわち最も大きな平均値と最も小さな平均値との差）として定義した。クラスターのＭＲが高いほど高い区別力を有する。最後に、ＭＲが閾値以上であるＣｐＧクラスターを選択した。
【０１４２】
[00167]一部の態様により、シミュレーションデータたとえば図１７に示される６１０と６２０との組合せを生成する。シミュレーションデータは予測モデルＬの精度を検証するために正常な血漿および腫瘍の血漿からコンピュータにより生成される。本態様は、前述の確率論的モデル：（ｉ）ｃｆＤＮＡを正常な血漿ｃｆＤＮＡと原発性腫瘍部位から放出されたＤＮＡの混合物として扱う混合モデル、および（ｉｉ）血漿ｃｆＤＮＡシーケンシングデータのメチル化されたシトシン計数の二項モデルを使用して、患者の血漿ｃｆＤＮＡのメチル化シーケンシングデータをシミュレーションする。加えて、シミュレーションデータをより現実的なものにするために、本態様はコピー数異常および読み深度バイアスを組み込む。シミュレーション血漿ｃｆＤＮＡメチル化シーケンシングデータを生成するための手順を以下に詳述する。
【０１４３】
[00168]シミュレーションデータの生成は以下の入力を必要としてもよい：（ｉ）Ｋ個すべてのＣｐＧクラスターのゲノム領域、（ｉｉ）任意のＣｐＧクラスターにアライメントされるシーケンシングリード上のシトシンの総数（Ｚ）、（ｉｉｉ）θの範囲：（θＬ，θＵ）、（ｉｖ）正常な血漿サンプル（ＰＯＯＬｎｏｒｍａｌとして表される）および固形腫瘍サンプル（ＰＯＯＬｔｕｍｏｒとして表される）の集合、ならびに（ｖ）ΣＫｋ＝１ｂｋ＝１を満たすｂｋ、ＣｐＧクラスターｋにアライメントされるＣｐＧジヌクレオチドのバックグラウンド確率。最後の入力は、シーケンシングプロセスおよびリードアライメント中に導入される読み深度バイアス、ならびにクラスター内のＣｐＧ部位の密度を反映する。
【０１４４】
[00169]シミュレーションによる血漿サンプルのメチル化シーケンシングプロファイルが生成され、整数のベクトルＭ＝（ｍ１，ｍ２，…，ｍＫ）およびＮ＝（ｎ１，ｎ２，…，ｎＫ）によって表される。成分ｍｋおよびｎｋはそれぞれＣｐＧクラスターｋにマッピングされたリードにおけるメチル化されたシトシンの数およびシトシンの総数である。
【０１４５】
[00170]一態様において、シミュレーションによる血漿サンプルのメチル化シーケンシングプロファイルは以下の手順で生成される。手順は６つの工程を含む。工程１：分布θ〜Ｕｎｉｆｏｒｍ（θＬ，θＵ）からランダムなｃｔＤＮＡ分率θを生成する。
【０１４６】
[00171]工程２：ランダムな整数のコピー数ｃｋを、それぞれのＣｐＧクラスターｋについて、カテゴリー分布ｃｋ〜Ｃａｔ（６，ｐ０，ｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ４，ｐ５）から生成し、ここでＣａｔはカテゴリー分布を指す。ここでｐｃはシーケンシングデータにおいてコピー数ｃ∈｛０，１，２，３，４，５｝を観察する確率を表す。確率ｐｃは３つの基準を満たす：（ｉ）合計が１に等しくΣ５ｃ＝０ｐｃ＝１であり、（ｉｉ）平均コピー数が２に等しくΣ５ｃ＝０ｃ＊ｐｃ＝２であり、（ｉｉｉ）極端なコピー数の変化が生じる可能性が低い。一部の事例において、本態様は、ｐ０＝０．００５、ｐ１＝０．１６、ｐ２＝０．７、ｐ３＝０．１０５、ｐ４＝０．０２５、ｐ５＝０．００５を既定してもよい。ｐ２（この事例においては３０％）を除きすべてのこれらの確率の合計がＣＮＡ事象を有する任意の所与のＣｐＧクラスターの確率であることに留意されたい。本態様は、より多い（５０％）または少ない（１０％）ＣＮＡ事象でのシミュレーションについて、他の確率構成を有してもよく、類似の結果が得られた。正常な血漿サンプルをシミュレーションする場合には、ＣＮＡ事象は考慮しない（すなわちｃｋは２に固定される）。
【０１４７】
[00172]工程３：メチル化プロファイルが（ｖ１，２，…，ｖＫ）によって表されるＰＯＯＬｎｏｒｍａｌから正常な血漿サンプルをランダムに選択し、メチル化レベルプロファイルが（ｕ１，ｕ２，…，ｕＫ）によって表されるＰＯＯＬｔｕｍｏｒから固形腫瘍をランダムに選択する。一部の態様はまた、新しい正常な血漿サンプルをシミュレーションするために、ＰＯＯＬｎｏｒｍａｌから２つの正常な血漿サンプルをランダムに選択してもよいことに留意されたい。
【０１４８】
[00173]工程４：ＣｐＧクラスターｋにおける血漿ｃｆＤＮＡのメチル化レベルｘｋを計算する。これは、工程２において生成されたコピー数ｃｋを組み込んだ後のｖｋおよびｕｋの調整された線形結合である。すなわちｘｋ＝（１−θ’ｋ）ｖｋ＋θ’ｋｕｋであり、式中θ’ｋは
【数９】
2019521673.tif 000011
によって得られるθの調整された値であり、θ’ｋはｃｔＤＮＡのコピー数ｃｋを考慮した後の実際のｃｔＤＮＡ分率を示す。
【０１４９】
[00174]工程５：ポワソン分布ｎｋ〜Ｐｏｉｓｓｏｎ（ＺＢｋ）からＣｐＧクラスターｋ内のシトシンの総数を表す乱数ｎｋを生成する。Ｂｋは調整されたＣｐＧジヌクレオチドバイアスｂｋであり、
【数１０】
2019521673.tif 000012
によって、工程２において生成されたコピー数ｃｋを拡張した後に得られる。
【０１５０】
[00175]工程６：二項分布ｍｋ〜Ｂｉｎｏｍｉａｌ（ｎｋ，ｘｋ）から乱数ｍｋを生成する。
【０１５１】
[00176]一部の態様はまた、２つの正常な血漿サンプルを異なる混合比で混合することによって新しい正常な血漿サンプルをシミュレーションした。この手順は正常な血漿サンプル中にはＣＮＡ事象が存在しないため、すべてのコピー数を２として固定したことによって工程２を無視したことを除き上記と同じである。
【０１５２】
[00177]一部の態様は、シグネチャー特徴の学習、シミュレーション、および実データでの実験のためのデータパーティションのために以下の方法を有する。すべてのＴＣＧＡ固形腫瘍組織および血漿サンプルを、（ｉ）特徴を区別することを学習すること、（ｉｉ）シミュレーション実験、および（ｉｉｉ）実データでの試験の３つのタスクのためのオーバーラップしないセットに分割する。具体的には、図１７に示されるように、本態様は、それぞれの組織タイプのＴＣＧＡ固形腫瘍をシグネチャー特徴を学習するための７５％  ６０５およびシミュレーションデータを生成するための２５％  ６１０という２つのパーティションに分割する。本態様はまた、すべての正常な血漿サンプルも、シグネチャー特徴を学習するための７５％  ６１５、およびシミュレーションデータを生成するためまたは実データでの実験のための２５％  ６２０という２つのパーティションに分割する。がん患者のすべての血漿サンプル６２５を使用して、実データでの実験における試験セットを形成する。これらの血漿サンプルではなく、公的なメチル化データベースから収集した固形腫瘍サンプルおよび試験に使用しなかった正常な血漿サンプルのサブセットのみを特徴を学習するために使用したことに留意されたい。すべてのデータを上述の割合に従ってランダムにパーティションし、１つのそのようなパーティションに対して方法を適用することを「１回の実行」とみなす。堅強な結果を作製するために、本態様は、実験を１０回の実行で反復し、１０回の実行で得られたすべての予測を最終結果として単一の混合行列に集約する。本態様は、試験のための実際のがん血漿サンプルの数が限られているため（乳がん、肺がん、および肝臓がんの患者からそれぞれ５個、１２個、および２９個のｃｆＤＮＡサンプルのみ）、方法のハイパーパラメーター推定のための典型的な交差検証は可能ではない。
【０１５３】
[00178]ここに開示されるがんの検出および起源組織の特定のための様々な方法、工程、パラメーターの計算は図１８に示されるコンピュータシステム７００および／または図１９に示されるコンピュータシステム８００において実装することができる。たとえば図１２に示される方法１００のフローチャートはコンピュータシステム７００および／またはコンピュータシステム８００において実装することができる。別の例において、図１３に示されるように、等式ψ（ｘｋ｜θ，ｔ）および関連するパラメーターｘ、θ、ｕ、ｖ、ｋ、およびｔはコンピュータ可読命令として、コンピュータシステム７００および／またはコンピュータシステム８００において実装することができる。別の例において、図１４Ａ〜１６に示されるがん検出の結果はコンピュータシステム７００および／またはコンピュータシステム８００によって実行することができる。さらに別の例において、シグネチャー特徴の学習、シミュレーション実験、および実データでの実験のためのデータパーティションはコンピュータシステム７００および／またはコンピュータシステム８００によって実行することができる。さらに別の例において、表１に示される混合行列はコンピュータシステム７００および／またはコンピュータシステム８００によって実行することができる。
【０１５４】
[00179]図１８は、本開示の一態様に従ってがんを検出し起源組織を特定するために、データベースファイルへのアクセスを取得するためのコンピュータシステム７００を図示する。コンピュータシステム７００は、サーバ７０２、データストレージデバイス７０６、ネットワーク７０８、およびユーザインターフェイスデバイス７１０を含んでもよい。サーバ７０２はまた、サーバ構成情報を有するモジュールとともにオペレーティングシステムをホストする１つ以上のゲストパーティションを実行するハイパーバイザに基づくシステムであってもよい。さらなる態様において、システム７００は、データストレージデバイス７０６と、サーバ６０２またはネットワーク７０８と通信状態にある他の構成要素との間のデータ通信を管理するように構成される、ストレージコントローラ７０４またはストレージサーバを含んでもよい。代替的な態様において、ストレージコントローラ６０４はネットワーク７０８に連結されてもよい。
【０１５５】
[00180]一態様において、ユーザインターフェイスデバイス７１０は、広義に言及され好適なプロセッサに基づくデバイスたとえばデスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、携帯情報端末（ＰＤＡ）もしくはタブレットコンピュータ、スマートフォン、またはネットワーク７０８へのアクセスを有する他の携帯通信デバイスを包含することが意図される。さらなる態様において、ユーザインターフェイスデバイス７１０は、インターネットまたは他の広域ネットワークもしくはローカルエリアネットワークにアクセスしてサーバ７０２によってホストされるウェブアプリケーションまたはウェブサービスにアクセスしてもよく、ユーザが情報を入力または受信するのを可能にするためのユーザインターフェイスを提供してもよい。
【０１５６】
[00181]ネットワーク７０８は、サーバ７０２とユーザインターフェイスデバイス７１０との間のデータの通信を促進し得る。ネットワーク７０８は、直接的なＰＣとＰＣとの接続、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、モデムとモデムとの接続、インターネット、上記の組合せ、または２つ以上のコンピュータが通信するのを可能にするネットワーキング分野内の現在公知であるかもしくは今後開発される任意の他の通信ネットワークを含むがこれらに限定されない任意のタイプの通信ネットワークを含んでもよい。
【０１５７】
[00182]図１９は、本開示の一態様によるがんの検出および起源組織の特定のために構成されるコンピュータシステム８００を図示する。図１９はまた、サーバ７０２および／またはユーザインターフェイスデバイス７１０のある特定の態様に従って適合されるコンピュータシステム８００を図示する。中央処理装置（「ＣＰＵ」）８０２はシステムバス８０４に連結される。ＣＰＵ８０２は汎用ＣＰＵもしくはマイクロプロセッサ、グラフィック処理装置（「ＧＰＵ」）、および／またはマイクロコントローラであってもよい。本発明の態様は、ＣＰＵ８０２が直接的か間接的かに関係なく、ここに記載される操作に役立つ限りＣＰＵ８０２の構造によって制限を受けるものではない。ＣＰＵ８０２は本発明に態様に従って様々な論理命令を実行してもよい。
【０１５８】
[00183]コンピュータシステム８００はまた、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）８０８を含んでもよく、ＲＡＭは同期ＲＡＭ（ＳＲＡＭ）、動的ＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、同期動的ＲＡＭ（ＳＤＲＡＭ）などであってもよい。コンピュータシステム８００は、ＲＡＭ８０８を利用して、ソフトウェアアプリケーションによって使用される様々なデータ構造を記憶してもよい。コンピュータシステム８００はまた、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）８０６を含んでもよく、ＲＯＭはＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ（登録商標）、光学ストレージなどであってもよい。ＲＯＭはコンピュータシステム８００を起動するための構成情報を記憶してもよい。ＲＡＭ８０８およびＲＯＭ８０６はユーザおよびシステムのデータを有し、ＲＡＭ８０８とＲＯＭ８０６の両方がランダムにアクセスされてもよい。
【０１５９】
[00184]コンピュータシステム８００はまた、Ｉ／Ｏアダプタ８１０、通信アダプタ８１４、ユーザインターフェイスアダプタ８１６、およびディスプレイアダプタ８２２を含んでもよい。Ｉ／Ｏアダプタ８１０および／またはユーザインターフェイスアダプタ８１６は、ある特定の態様においてユーザがコンピュータシステム８００と相互作用するのを可能にしてもよい。さらなる態様において、ディスプレイアダプタ８２２はソフトウェアまたはウェブに基づくアプリケーションと関連するグラフィックユーザインターフェイス（ＧＵＩ）をディスプレイデバイス８２４たとえばモニターまたはタッチスクリーンに表示してもよい。
【０１６０】
[00185]Ｉ／Ｏアダプタ８１０は、１つ以上のストレージデバイス８１２たとえばハードドライブ、ソリッドステートストレージデバイス、フラッシュドライブ、コンパクトディスク（ＣＤ）ドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、またはテープドライブのうちの１つ以上をコンピュータシステム８００に連結してもよい。一態様によると、データストレージ８１２はＩ／Ｏアダプタ８１０へのネットワーク接続を通じてコンピュータシステム８００に連結された別個のサーバであってもよい。通信アダプタ８１４はコンピュータシステム８００をネットワーク７０８に連結するように適合され得、ネットワークはＬＡＮ、ＷＡＮ、および／またはインターネットのうちの１つ以上であってもよい。ユーザインターフェイスアダプタ８１６はユーザ入力デバイスたとえばキーボード８２０、ポインティングデバイス８１８、および／またはタッチスクリーン（示されない）をコンピュータシステム８００に連結する。ディスプレイアダプタ８２２はディスプレイデバイス８２４への表示を制御するように、ＣＰＵ８０２によって駆動されてもよい。デバイス８０２〜８２２のいずれも物理的および／または論理的であってもよい。
【０１６１】
[00186]本開示のがん検出モデルはコンピュータシステム８００の構造に限定されるものではない。むしろ、コンピュータシステム８００はサーバ７０２および／またはユーザインターフェイスデバイス７１０の機能を行うように適合され得る１つのタイプのコンピューティングデバイスの例として提供される。たとえば、限定されないが、携帯情報端末（ＰＤＡ）、タブレットコンピュータ、スマートフォン、コンピュータゲームコンソール、ならびにここに開示されるがん検出モデルの様々な態様および／または工程を実装するためのマルチプロセッササーバを含む任意の好適なプロセッサに基づくデバイスが利用されてもよい。さらに、本開示のがん検出方法の様々な態様は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、超大規模集積（ＶＬＳＩ）回路、または他の回路で実装されてもよい。実際には、当業者であれば、記載される態様に従って論理操作を実行することが可能な任意の数の好適な構造を利用することができる。たとえばコンピュータシステム７００および８００は複数のユーザおよび／またはアプリケーションによるアクセスのために仮想化されてもよい。
【０１６２】
[00187]ファームウェアおよび／またはソフトウェアにおいて実装される場合のここに開示される様々な方法、工程、パラメーターの計算、上述の様々な機能は、１つ以上の命令またはコードとして、コンピュータ可読媒体に記憶されてもよい。例としては、データ構造でコードされる不揮発性コンピュータ可読媒体およびコンピュータプログラムでコードされるコンピュータ可読媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体は物理的コンピュータストレージ媒体を含む。ストレージ媒体はコンピュータによってアクセスすることができる任意の利用可能な媒体であってもよい。例として、かつ限定されるものではなく、そのようなコンピュータ可読媒体は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ（登録商標）、ＣＤ−ＲＯＭ、もしくは他の光学ディスクストレージ、磁気ディスクストレージもしくは他の磁気ストレージデバイス、または命令もしくはデータ構造の形態で所望されるプログラムコードを記憶するために使用することができコンピュータによってアクセスすることができる任意の他の媒体を含み得る。ディスク（disk）およびディスク（disc）には、コンパクトディスク（ＣＤ）、レーザーディスク（登録商標）、光学ディスク、デジタル多目的ディスク（ＤＶＤ）、フロッピー（登録商標）ディスク、およびブルーレイディスクが含まれる。一般に、ディスク（disk）はデータを磁気的に再生し、ディスク（disc）はデータを光学的に再生する。上述の組合せもまた、コンピュータ可読媒体の範囲内に含まれるものとする。
【０１６３】
[00188]コンピュータ可読媒体上のストレージに加えて、命令および／またはデータは通信装置に含まれる伝送媒体上のシグナルとして提供されてもよい。たとえば、通信装置は命令およびデータを示すシグナルを有するトランシーバを含んでもよい。命令およびデータは１つ以上のプロセッサに特許請求の範囲に概説される機能を実装させるように構成される。
【０１６４】
ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒに関するさらなる態様
[00189]メチル化に基づく腫瘍ｃｆＤＮＡ検出を動機付ける理由がいくつかある：（ｉ）ＤＮＡメチル化パターンが広汎性であること、すなわち同じメチル化パターン（メチル化されているかまたはメチル化されていない）がゲノム領域全体に広がる傾向にあること。この特徴は、１つのグループによってがん診断のための大規模なゲノム領域にわたってＤＮＡの低メチル化を評価するために利用されている（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））。ここに開示されるように、この特徴は、単一のシーケンシングリードの分解能においてではあるが、異常なｃｆＤＮＡシグナルを増幅するために使用され、したがって低いシーケンシングカバレッジであってもわずかな量の腫瘍ｃｆＤＮＡの超高感度な検出をもたらす。（ｉｉ）異常なＤＮＡメチル化パターンはがんの発病の初期に生じ（Ｂａｙｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１））、したがって初期のがん検出が容易となる。実際に、ＤＮＡメチル化異常はがんの顕著な特徴のうちの１つであり、腫瘍の開始からがんの進行および転移までがんのすべての側面と関連し（Ｃｈｅｉｓｈｖｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）、Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、Ｐｌａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））、がんのエピジェネティクス療法の魅力的な標的となっている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、Ｓｉｇａｌｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））。
【０１６５】
[00190]重要な側面は、シグナル増幅にＤＮＡメチル化の広汎性を利用するために、個々のｃｆＤＮＡシーケンシングリード上の複数の隣接するＣｐＧ部位の合同メチル化パターンに焦点を当てることを含む。従来のＤＮＡメチル化分析は細胞集団における個々のＣｐＧ部位のメチル化率に焦点を当てている。β値と称されることも多いが、この率はＣｐＧ部位がメチル化されている細胞の割合である（図１の例を参照されたい）。しかしながら、そのような集団平均の尺度では、ｃｆＤＮＡのごくわずかな割合にのみ影響を及ぼしている異常なメチル化シグナルを捕捉するには感度が十分ではない。図２０は、この点について図示している。個々のＣｐＧ部位の平均メチル化率は、正常な血漿ｃｆＤＮＡについてはβｎｏｒｍａｌ＝１であり、腫瘍ｃｆＤＮＡについてはβｔｕｍｏｒ＝０である。腫瘍ｃｆＤＮＡの存在が１％であると仮定すると、従来の尺度ではβｍｉｘｅｄ＝０．９９となり、これをβｎｏｒｍａｌ＝１と区別することは困難である。しかしながら、ＤＮＡメチル化の広汎性に基づいて、疾患特異的なｃｆＤＮＡリードを正常なｃｆＤＮＡリードと区別する新しい手段を調査した。所与のリードにおけるすべてのＣｐＧ部位のメチル化値（α値と表される）を平均する場合、異常にメチル化されたｃｆＤＮＡと正常なｃｆＤＮＡとの間（αｔｕｍｏｒ＝０％およびαｎｏｒｍａｌ＝１００％）には、顕著な差異（０および１）が存在する。換言すると、ＤＮＡメチル化の広汎性を踏まえて、複数の隣接するＣｐＧ部位の合同メチル化パターンにより、がん特異的ｃｆＤＮＡリードと正常なｃｆＤＮＡリードとを容易に区別することができる。α値から着想すると、広汎性メチル化を利用する鍵は、リードにおけるすべてのＣｐＧ部位の合同確率が疾患のＤＮＡメチル化シグネチャーに従うかどうかを推測することであることが認識された。このリードに基づく確率論的アプローチは「ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ」と称され、これは血漿中のすべてのｃｆＤＮＡの中から微量の腫瘍ｃｆＤＮＡを高感度で特定することができる。
【０１６６】
[00191]一部のＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒの態様を、正常な血漿のｃｆＤＮＡサンプルと固形腫瘍サンプルのシーケンシングリードを既知の混合率（または腫瘍負荷）で部分サンプリングし組み合わせる、シミュレーションによる血漿サンプルにおいて評価した。結果は、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒが、中等度のシーケンシングカバレッジ（１０×）において、腫瘍ｃｆＤＮＡの予測された割合と真の割合との間で０．９９７４のピアソン相関係数（ＰＣＣ）を達成し得る（Ｐ値、９．８Ｅ−８）ことを示した。また、予測性能はシーケンシングカバレッジとともに増加し、シーケンシングカバレッジが高いほど予測腫瘍負荷が真の値に近くなる。さらに、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒは、予測性能と堅強さの両方の点で、本発明者らの以前のｃｆＤＮＡ腫瘍負荷予測方法すなわち「ＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ」（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７））よりも性能が優れていた。次いで、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒを実際の血漿ｃｆＤＮＡサンプルで試験し、１０回の実験的実行にわたってその高い性能すなわち初期段階のがん患者について９４．４％±３．７％の特異度（特異度を１００％とした場合）が示されたが、一方でＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒは７４．４％±１０．０％の特異度（特異度を１００％とした場合）を有した。加えて、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒによって予測される腫瘍負荷は、縦断的なサンプルにおいて、臨床情報たとえば腫瘍サイズおよび生存結果と高い一貫性を示した。本発明者らが、これらの結果を、低いシーケンシングカバレッジ（すべてのゲノム位置にわたって、平均で１×〜３×）を有する実際のサンプルに基づいて達成したことに留意されたい。
【０１６７】
[00192]図２１は、一態様によるがんを検出するための方法２００である。方法２００はＤＮＡメチル化マーカーを特定する工程１１０を含む。方法２００は患者のｃｆＤＮＡメチル化プロファイルをシーケンシングする工程１２０を含む。方法はリードに基づく確率論的モデルを使用してｃｆＤＮＡの組成を推測する工程１３０を含む。
【０１６８】
[00193]工程１１０において、ＤＮＡメチル化マーカーたとえばマーカー−１  １１２、マーカー−２  １１４、マーカー−３  １１６、…およびマーカー−Ｋ  １１８が特定される。メチル化マーカー１１２、１１４、１１６、１１８は、ある特定のタイプのがん、たとえば肝臓がんに特異的なメチル化パターンである。
【０１６９】
[00194]ＤＮＡメチル化マーカーを特定するために、Ｊ個のＣｐＧクラスターをｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおいて特定する。肝臓がんを例として使用すると、Ｊ個すべてのＣｐＧクラスターの中でそのメチル化レベルによってほとんどの肝臓腫瘍を正常な肝臓細胞と正常な血漿の両方と区別することができるＣｐＧクラスターのセットをマーカーに選択する。このタスクにはさらに２つの工程が含まれ得る：（１）対応する肝臓腫瘍と正常な肝臓組織の間で対応するペアの半数よりも多くにメチル化に差がある（カットオフを上回る）「高頻度で差次的なメチル化領域（ＦＤＭＲ）」を選択する工程。この工程により、健常な肝臓組織に特異的なマーカーは除去し、肝臓がんに特異的なマーカーは保持することができる。（２）腫瘍サンプルと正常な血漿サンプルとを区別することができるＦＤＭＲを選択する工程。これは、正常なクラス（Ｎクラス）と腫瘍クラス（Ｔクラス）との間でそのメチル化パターンの中央値の差が所定の閾値よりも高いＦＤＭＲを選択することによって行うことができる。この工程により、確実に腫瘍のメチル化シグナルを血液中で特定することができるようになる。ｃｆＤＮＡのシーケンシングカバレッジが固定であることを踏まえると、より多くのマーカーを使用するとこれらのマーカーの品質は下がり得るが、より多くの腫瘍由来のｃｆＤＮＡリードを特定することができる。したがって、マーカーの品質と使用することができる腫瘍ｃｆＤＮＡシグナルの量との間にはトレードオフがある。
【０１７０】
[00195]一態様において、前の段落で言及された２つの工程の前述の所定の閾値は０．１〜０．９たとえば０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、および０．９であり得る。一態様において、所定の閾値は０．１〜０．３であり得る。さらに別の態様において、閾値は０．２である。
【０１７１】
[00196]それぞれのマーカー１１２、１１４、１１６、１１８は、患者のｃｆＤＮＡメチル化プロファイルにおけるマーカー領域１２２、１２４、１２６、および１２８に対応する。それぞれのマーカー領域１２２、１２４、１２６、および１２８は、２つのメチル化パターンを有する：１つが正常なクラス（Ｎクラス）のパターンであり、１つが腫瘍クラス（Ｔクラス）のパターンである。任意のクラスのメチル化パターンはベータ関数Ｂｅｔａ（η，ρ）としてモデリングされる。具体的には、マーカーｋは２つのメチル化パターン、すなわちクラスＴについてはＢｅｔａ（ηＴｋ，ρＴｋ）、クラスＮについてはＢｅｔａ（ηＮｋ，ρＮｋ）と関連している。
【０１７２】
ηｃｋ，およびρｃｋはベータ分布の形状パラメーター（通常αおよびβと表される）であるが、ここでは本発明者らは導入の節において定義されたα値およびβ値との混乱を避けるために記号ηおよびρを使用したことに留意されたい。ベータ分布のパラメーターは、モーメント法または最大尤度のいずれかを使用して、クラスのサンプル集団から容易に学習することができる。表記を単純にするために、マーカーｋのメチル化パターンを、クラスＴについてはｍＴｋ≡Ｂｅｔａ（ηＴｋ，ρＴｋ）と表し、クラスＮについてはｍＮｋ≡Ｂｅｔａ（ηＮｋ，ρＮｋ）と表す。
【０１７３】
[00197]方法２００はそれぞれのｃｆＤＮＡシーケンシングリードのクラス特異的尤度を計算することをさらに含む１４２。目標は、それぞれのｃｆＤＮＡリードをリード上の複数のＣｐＧ部位の合同メチル化ステータスに基づいて、クラスＴまたはＮとして分類することであった。ｃｆＤＮＡリード１３２における合同メチル化ステータス１３４はｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）と表され、ここで２値ｒｊ＝１または０はリードｒにおけるＣｐＧ部位ｊに関してメチル化されているかまたはメチル化されていないかのステータスを表す。この２値ベクトルｒをベータ−ベルヌーイ分布によってモデリングした。
【０１７４】
[00198]図２２に示されるように、具体的にはリードｒが含まれるマーカーのメチル化パターンｍ≡Ｂｅｔａ（η，ρ）を踏まえると、リードにおけるそれぞれのＣｐＧ部位ｊのメチル化ステータスｒｊはｒｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｐ）として分布され、ここでｐはマーカー内のＣｐＧ部位の平均メチル化率の事前分布であり、ベータ事前分布ｐ〜Ｂｅｔａ（η，ρ）に従う。この統計学的モデルを使用して、リードにおける合同メチル化ステータスｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）３３０の尤度は、メチル化パターンｍ３１０または３２０を踏まえて、以下のように計算することができる。
【数１１】
2019521673.tif 000013
ここでＢ（ｘ，ｙ）はベータ関数である。したがって、クラスＴのメチル化パターンｍＴｋおよびクラスＮのメチル化パターンｍＮｋを有するマーカーｋについて、リードｒのクラス特異的尤度Ｐ（ｒ｜ｍＴｋ）３２２およびＰ（ｒ｜ｍＴｋ）３１２を計算するために、上述の式を使用することができる。この尤度計算は個々のリードに関してα値の確率論的バージョンを実装することに留意されたい。
【０１７５】
[00199]方法２００は腫瘍由来のｃｆＤＮＡ負荷を予測する工程１３０を含む。図２０に図示されるように、確率論的フレームワークを展開して、ｃｆＤＮＡリードを２つのクラス（腫瘍由来のＤＮＡについてはクラスＴ、および正常な血漿ｃｆＤＮＡについてはクラスＮ）に２つのクラスのメチル化パターンと関連するマーカーのセットに基づいて分類することによって、０≦θ＜１として表される腫瘍由来のｃｆＤＮＡ分率（すなわち腫瘍負荷）を推測した。Ｋ個すべてのマーカーのメチル化パターンはＭ＝｛（ｍＴ１，ｍＮ１），…，（ｍＴｋ，ｍＮｋ），…，（ｍＴＫ，ｍＮＫ）｝と表す。また、患者のｃｆＤＮＡのメチル化シーケンシングデータは合計でＭ個のＣｐＧ部位をカバーするＮ個のリードのセットＲ＝｛ｒ（１），…，ｒ（Ｎ）｝として表される。マーカーｋの領域にアライメントされるリードについては、クラス特異的尤度Ｐ（ｒ｜ｍｃｋ）を有する２つのクラスのうちの１つに由来し得ると仮定し、式中ｍｃｋはクラスｃのメチル化パターンである。θが腫瘍由来のｃｆＤＮＡ負荷であるとすると、正常なｃｆＤＮＡの分率は１−θとなる。θを対数尤度ｌｏｇＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を最大化することによって推定することが望ましい。これは最大尤度推定問題である。それぞれのリードの独立性、Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）を仮定した。リードｒ（ｉ）の尤度Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）は以下のように展開される：
Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）＝θＰ（ｒ（ｉ）｜ｍＴｋ）＋（１−θ）Ｐ（ｒ（ｉ）｜ｍＮｋ）。
【０１７６】
[00200]Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）は、推定しようとするパラメーターθが１つのみであるため、グリッドサーチを適用して０％〜１００％に均一に分布している１０００個すべての分率値すなわち０％、０．１％、…、０．９９％、および１００％を徹底的に列挙することができる。この方法は０．１％の精度で大域的最適化を得ることができ、これはわずかな量の腫瘍由来のｃｆＤＮＡを捕捉するのに十分であると考える。グリッドサーチは計算が速いため、より高い分解能でθを決定する工程を容易に精査することができる。
【０１７７】
[00201]本発明を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲に定められている本発明の範囲を逸脱することなく、修正形、変化形、および均等な態様が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示におけるすべての例は非限定的な例として提供されていることを理解されたい。
【０１７８】
［実施例］
[00202]以下の非限定的な例は、ここに開示される本発明の態様をさらに例示するために提供される。当業者には、以下の例において開示されている技法が、本発明の実施において十分に機能することが見出されているアプローチを表すものであり、したがってその実施のための様式の例を構成すると考えられ得ることが理解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示を踏まえて、開示されている特定の態様において、多数の変更を加え、依然として本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
【０１７９】
例１
メチル化シグネチャー
[00203]ＧＥＯおよびＴＣＧＡのほとんどの公的なメチル化データはマイクロアレイデータであるため、ビンレベルで最も良好にモデリングすることができる要約データのタイプである。したがって、この研究において、ビンレベルのメチル化データすなわち図４のモデル１を使用して、それぞれの「がん特異的」または「組織特異的」領域のメチル化シグネチャーを特性評価する。
【０１８０】
[00204]本方法は柔軟性があり、２つの異なるレベルのメチル化データを本方法において使用するのを可能にすることに留意されたい。
【０１８１】
例２
「フェージングされた」メチル化データにより血漿ｃｆＤＮＡ組成を推測する確率論的フレームワーク
[00205]第２の工程はＴ≧２個のクラスの血漿ｃｆＤＮＡ組成を推測することである。図３に示されるように、「がん組成」についてはＴ＝２個のクラスは正常な血漿ｃｆＤＮＡおよび特定の腫瘍タイプを指すが、「組織組成」についてはＴ＞２個のクラスはＴ個の正常な組織タイプを指す。
【０１８２】
[00206]血漿中のｃｆＤＮＡの存在度が低く、図２に示されるような「フェージングされた」データの利点を利用するため、常に患者の血漿ｃｆＤＮＡにメチル化シーケンシングを行う。結果として、本方法の構成要素１において特定されるすべてのメチル化シグネチャーにおけるＭ個のＣｐＧ部位をカバーするＮ個のｃｆＤＮＡシーケンシングリードの集合を有する。図５に示されるように、フラグメントのこれらのメチル化データは三元行列Ｒ＝（ｒｉｊ）×Ｍによって表すことができ、ここでそれぞれの行（または列）はフラグメント（またはＣｐＧ部位）およびそれぞれのエントリーｒｉｊ∈｛０，１，−｝に対応する。ｒｉｊ＝０（または１）はｊ番目のＣｐＧ部位がｉ番目のフラグメントによってカバーされておりメチル化されていない（またはメチル化されている）ことを示し、一方でｒｉｊ＝−は部位ｊがフラグメントｉによってカバーされていないことを示す。
【０１８３】
[00207]患者の血漿ｃｆＤＮＡは、実データではすべてのｃｆＤＮＡがＴ個の既知の組織から放出されるとは限らないというのが真であるため、本方法の構成要素１において学習されたメチル化シグネチャーΩｔ（１≦ｔ≦Ｔ）を有するＴ個の既知のクラス、およびいずれの既知のクラスにも属さない可能性の高いすべてのｃｆＤＮＡからなる新しい未知の組織タイプ（理解を容易にするために、この節でこれ以降、「クラス」の代わりに「組織」を使用する）によって構成されると仮定する。そうすると、メチル化シグネチャーのセットはΩ＝｛Ω１，Ω２…，ΩＴ，ΩＴ＋１｝として定義され、ここでΩｔ（１≦ｔ≦Ｔ）は既知であり、ΩＴ＋１は未知であり、これから本発明者らの方法によって推定される。患者の血漿ｃｆＤＮＡのメチル化シーケンシングデータから導出された入力行列Ｒを踏まえ、本発明者らは２つの仮定を有する。
【０１８４】
[00208]仮定１：それぞれのｃｆＤＮＡフラグメントが組織細胞の部分集団から放出され、血漿ｃｆＤＮＡに寄与するＴ個の組織の組成は組成ベクトルΘ＝（θ１，θ２，…，θＴ，θＴ＋１）として表され、ここでθｔ（１≦ｔ≦Ｔ＋１）は血漿ｃｆＤＮＡ中の組織ｔのｃｆＤＮＡの割合であり、ΣＴ＋１ｔ＝１θｔ＝１である。
【０１８５】
[00209]仮定２：入力行列Ｒにおける組織ｔに由来するｃｆＤＮＡフラグメントの割合により、血漿中の組織ｔのｃｆＤＮＡ分率θｔが明らかとなり得る。
【０１８６】
[00210]これらの仮定、入力フラグメント行列Ｒ、および組織特異的シグネチャーΩに基づいて、本発明者らは、血漿ｃｆＤＮＡ中の組織組成Θを推定するために尤度（Ｒ｜Θ，Ω）を最大化することを目指す。これを公式的に以下のように表現する：
【数１２】
2019521673.tif 000014
ここでΘおよびΩＴ＋１（Ωにおける）は推定しようとするパラメーターである。これは典型的な最大尤度推定（ＭＬＥ）問題である。対数尤度を下記のようにそれぞれのｃｆＤＮＡシーケンシングリードの対数尤度の総和に展開することができる：
【数１３】
2019521673.tif 000015
【０１８７】
[00211]等式（１）を期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムによって最適化し、潜在確率変数ｚｉをそれぞれのｃｆＤＮＡシーケンシングリードＲｉ（行列Ｒのｉ番目の列）に導入して、このリードがどの組織ｔから放出されたかを示す、すなわちｚｉ＝ｔであり、ｔ＝１，２，…，Ｔ，Ｔ＋１である。カテゴリー分布：ｚｉ〜Ｃａ（Ｔ，Θ）に従ってｚｉをモデリングし、したがってＰ（ｚｉ＝ｔ｜Θ）＝θｔとなる。次いで、等式（２）のｃｆＤＮＡフラグメントＲｉの尤度を下記のように記述しなおす：
【数１４】
2019521673.tif 000016
ここでＰ（Ｒｉ｜Ωｔ）は組織ｔのｃｆＤＮＡリードＲｉの起源組織の尤度である。ｑ（ｔ）がｚｉ＝ｔの事後確率であるとする。その場合、以下のイエンセンの不等式を有し、等式（１）の対数尤度関数は以下に定義される新しい関数Ｆ（ｑ，Θ）による下限値となり得る。
【数１５】
2019521673.tif 000017
ここでΩＴ＋１はパラメーターであることを強調するためΩｎｅｗと表し、ｑはすべてのｉ＝１，…，Ｎにわたるすべてのｑｉ（ｔ）、およびすべてのｔ＝１，…，Ｔ，Ｔ＋１にわたるすべてのｔのセットである。ＥＭアルゴリズムによると、座標上昇法によって（ｑ，Θ）を最適化するために以下の代替的な工程を有する。
【数１６】
2019521673.tif 000018
【０１８８】
[00212]ΩｎｅｗはビンレベルまたはＣｐＧ部位レベルでのメチル化率であり得、ビンｊ（またはＣｐＧ部位ｊ）についてｍnewjと表すことができる。Ｅ工程において、ｑのそれぞれのｑｉ（ｔ）は所与のＲｉ、Ωｔ、および既定のパラメーター設定Θ（ｋ）を踏まえて、ｚｉの事後確率によって推定することができ、すなわち下記のとおりである。
【数１７】
2019521673.tif 000019
【０１８９】
[00213]Ｍ工程において下記を得る。
【数１８】
2019521673.tif 000020
メチル化シグネチャーがそれぞれのＣｐＧ部位ｊによってモデリングされる場合、下記のとおりである（モデル２）：
【数１９】
2019521673.tif 000021
メチル化シグネチャーがそれぞれのビンｊによってモデリングされる場合、下記のとおりである（モデル１）：
【数２０】
2019521673.tif 000022
それぞれｔ＝１，…，Ｔ＋１である。したがって、等式（７）、（８）、（９）、または（１０）はそれぞれＥ工程およびＭ工程の解である。ＥＭアルゴリズムによると、ランダムなΘ（０）およびΩｎｅｗ（０）で開始した後、等式（７）、（８）、（９）、または（１０）を反復的に実行することにより対数尤度関数の極大に収束することができる。したがって、ＥＭアルゴリズムを異なる初期値で何度も実行し、最大の対数尤度を有する解を選択する必要がある。この手順の例示を図６に示す。
【０１９０】
[00214]等式（７）の上述のＥＭアルゴリズムのＥ工程において、鍵となる計算はＰ（Ｒｉ｜Ωｔ），であり、これは組織ｔのｃｆＤＮＡリードＲｉの起源組織の尤度である。メチル化シグネチャーΩｔの異なるモデルによると（図４に列挙されている）、以下のＰ（Ｒｉ│Ωｔ）の計算方法を有する。
【０１９１】
[00215]Ωｔの個体間でのばらつきを考慮しないエピアレルモデル：単純にＰ（Ｒｉ│Ωｔ）としてメチル化ステータスの頻度ヒストグラムにおける相対頻度を使用することができる。これを図１１のモデル１に例示する。
【０１９２】
[00216]Ωｔの個体間でのばらつきを考慮しないＣｐＧ部位のモデル：ｍｔ＝（ｍｔ１，ｍｔ２，…，ｍｔＭ）が、組織ｔについてそれぞれの組織特異的ＣｐＧ部位ｊ（１≦ｊ≦Ｍ）の平均メチル化率（ｍtj）を表すとする。ｊ番目のＣｐＧ部位におけるｃｆＤＮＡリードＲｉのメチル化ステータス（ｒｉｊ＝０または１と表す）をベルヌーイ分布ｒｉｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｍtj）に従ってモデリングすると、図１１のモデル２に示されるように、Ｐ（Ｒｉ│Ωｔ）は下記のように計算することができる。
【数２１】
2019521673.tif 000023
ここでｒｉｊは行ベクトルＲｉのｊ番目の要素である。
【０１９３】
[00217]Ωｔの個体間でのばらつきを有するＣｐＧ部位モデル：ｊ番目のＣｐＧ部位の組織特異的メチル化率の個体間でのばらつきを考慮する場合、ベータ事前分布ｍｔｊ∝Ｂｅｔａ（αｔｊ，βｔｊ）を用いてベルヌーイの確率変数ｒｉｊをモデリングすることができ、ここでそれぞれのｍｔｊの個体間でのばらつきはパラメーターαｔｊおよびβｔｊを用いたベータ分布によって特性評価される。そうすると、Ｐ（Ｒｉ│Ωｔ）は（図４のモデル２に示されるように）下記のように計算することができる。
【数２２】
2019521673.tif 000024
【０１９４】
[00218]Ωｔの個体間でのばらつきを考慮しないビンモデル：メチル化率ｍｔはビンにおけるΩｔを表す。Ｐ（Ｒｉ│Ωｔ）は等式（１１）の単純なバージョンであり、（図１１のモデル３に示されるように）下記のように計算することができる。
【数２３】
2019521673.tif 000025
【０１９５】
[00219]Ωｔの個体間でのばらつきを有するビンモデル：それぞれのビンの組織特異的メチル化率ｍｔの個体間でのばらつきを考慮する場合、ベータ事前分布ｍｔ〜Ｂｅｔａ（αｔ，βｔ）を用いてベルヌーイの確率変数ｒｉｊをモデリングすることができ、ここでそれぞれのｍｔの個体間でのばらつきはパラメーターαｔおよびβｔのベータ分布によって特性評価される。すると、Ｐ（Ｒｉ│Ωｔ）は（図４のモデル１に示されるように）下記のように計算することができる。
【数２４】
2019521673.tif 000026
【０１９６】
例３
サンプルの収集および分析
[00220]メチル化シグネチャーを特性評価するために、公的な腫瘍組織サンプルからＤＮＡメチル化データを収集する：固形腫瘍ならびに正常な人々およびがん患者の血漿ｃｆＤＮＡサンプルの両方のすべての公的に利用可能なメチル化データを収集する。ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）データベースの腫瘍メチル化プロファイルの大半はＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイによってアッセイされたものであるため、固形腫瘍について２つの組織タイプ：肝臓（ＬＩＨＣ）および肺（がんタイプにはＬＵＡＤおよびＬＵＳＣが含まれる）をカバーするメチル化マイクロアレイデータのみを収集する。２０１３年１２月の時点で１６９個のＬＩＨＣ腫瘍および４５０／３５９個のＬＵＡＤ／ＬＵＳＣ腫瘍を収集した。ＲｏａｄＭａｐプロジェクトからの正常な組織サンプルのみを使用したことに留意されたい。今後はＧＥＯおよびＴＣＧＡからの固形正常組織サンプルのマイクロアレイメチル化データを使用するであろう。
【０１９７】
[00221]ここでＬＩＨＣは肝臓の肝細胞癌を表し、ＬＵＡＤは肺腺癌を表し、ＬＵＳＣは肺の扁平上皮細胞癌を表す。
【０１９８】
[00222]ＣｐＧクラスター（特徴）の構築：ほとんどの公的なメチル化データ（ＴＣＧＡおよびＧＥＯ）はＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイデータである。この研究において、本発明者らは、ＣｐＧ部位のクラスター（プローブによってカバーされる）すなわち可変サイズのゲノム領域を特徴として使用した。これは患者の血漿ｃｆＤＮＡデータのシーケンシングカバレッジが低いためであり（平均で約４×）、これは唯一のソースであるＣｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）からのものである。ＣｐＧクラスターはより多くのシーケンシングリードをカバーすることができ、したがって個々のＣｐＧ部位を使用するよりも、より信頼性の高いメチル化の測定値を生成することができる。詳細には、それぞれのＣｐＧクラスターはすべての個々の隣接するＣｐＧプローブ（部位）をこのビン内に分類することによってゲノムビンとなり、これは、（ｉ）クラスター内の２つの隣接するＣｐＧプローブ間のゲノム距離が７００ｂｐ未満であり、（ｉｉ）それぞれのクラスターが少なくとも１０個のＣｐＧプローブを有する、という２つの基準を満たす必要がある。２つの数はＷＧＢＳリードの十分なカバレッジのために、可能な限り多くのＣｐＧプローブ（マイクロアレイデータの）をクラスター化し、同時にクラスターのゲノムサイズは可能な限り小さく抑えるように注意深く選択される。プローブの注釈によると、ほとんどのクラスターは１つのみの遺伝子と関連していることが観察される。これにより１１，５７２個のＣｐＧクラスターが得られ、これにはＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイのすべてのＣｐＧプローブのうちの約１／３が含まれる。これらのＣｐＧクラスターを図１２に示される方法の構成要素１においてシグネチャー特徴の選択に使用する。
【０１９９】
[00223]公的な血漿ｃｆＤＮＡサンプルのＤＮＡメチル化データの収集：血漿ｃｆＤＮＡサンプルのメチル化データに関して見出すことができる唯一の主要な公的なデータソースは血漿ｃｆＤＮＡメチル化分析の近年の研究からのものである３。この研究において、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は、３２人の正常な人々、８人の慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者、２６人の肝臓がん患者、および４人の肺がん患者を含む血漿サンプルのセットの全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）データを寄託しており、これは合計で７０個の血漿サンプルである。これらのＷＧＢＳデータはシーケンシングカバレッジが低いことに留意されたい（平均で約４×）。Ｂｉｓｍａｒｋを利用して、参照ゲノムＨＧ１９に対してリードをアライメントし、メチル化されたシトシンと呼ぶ４。ＰＣＲ重複を除去した後、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンの数をそれぞれのＣｐＧ部位について計数する。次いで、ＣｐＧクラスターのメチル化レベルをクラスター内のメチル化されたシトシンの総数とすべてのシトシンの総数との比として計算する。
【０２００】
[00224]メチル化がん特異的および組織特異的シグネチャー：本発明者らは、１６人の正常な人々の血漿ｃｆＤＮＡのＷＧＢＳデータ（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）のデータから）と固形腫瘍（ＴＣＧＡのデータから）の両方を使用して１，４５２個のがん特異的メチル化シグネチャーを得たが、これは可変サイズのビンによってモデリングされる（上記および図４のモデル１に定義されるＣｐＧクラスター）。組織特異的メチル化シグネチャーについては、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）によるＲｏａｄＭａｐデータから学習した５，８２０個のバイオマーカーを使用したが、これは１４個の組織を含み、５００ｂｐのビンによってモデリングされている。これらのバイオマーカーは集団ではなく、ＲｏａｄＭａｐデータ内の１人の個体のみから学習されている。
【０２０１】
[00225]この予備的な結果には、新たな未知の組織タイプを工程３におけるｃｆＤＮＡ組成推測アルゴリズムに含めなかったことに留意されたい。今後の研究については、これらを使用するであろう。
【０２０２】
例４
予測の性能
ｃｆＤＮＡがん患者のシミュレーションされたメチル化データの結果
[00226]健常な血漿サンプルのＷＧＢＳデータおよび固形腫瘍サンプルのＷＧＢＳデータからのアライメントしたリードを混合することによって、既定のシーケンシングカバレッジ約２×で８個の異なる腫瘍ＤＮＡ負荷：０．５％、０．８％、１％、３％、５％、１０％、１５％、および２０％において、患者の血漿ｃｆＤＮＡサンプルのＷＧＢＳデータをシミュレーションした。４個の正常な血漿サンプル（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）から）、１個の固形肺腫瘍サンプル（ＴＣＧＡから）、および１個の固形肝臓腫瘍サンプル（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）から）を使用した。合計すると、シミュレーションしたがん患者の血漿サンプルは４×（１＋１）×８＝６４個である。
【０２０３】
[00227]残り１２個の正常な血漿サンプル（すなわち３２個のサンプルのうち１６個のサンプルをシグネチャーの学習に使用し、４個のサンプルをシミュレーションデータの生成に使用した）を含むことにより本発明者らの方法を行って、それぞれのシミュレーションしたサンプルまたは１２個の正常な血漿サンプルのそれぞれに対して予測スコアを得る。次いで、受信者動作特性（ＲＯＣ）の曲線下面積（ＡＵＣ）によって健常かがんかの予測の性能を評価する。図８において、異なる腫瘍ＤＮＡ分率でのシミュレーションデータのＡＵＣをプロットした。表示を簡略化するために、がんの組成は「がん次元」と称し、一方で正常な組織組成を「組織次元」と称する。両方の次元（灰色の線）を使用することは、すべての腫瘍負荷においてがん次元（青色の線）または組織次元（オレンジ色の線）のいずれかを使用するよりも性能が優れていることを観察することができる。加えて、２つの次元を用いた本発明者らの方法は血漿ｃｆＤＮＡの腫瘍負荷５％でおよそ７５％のＡＵＣを達成することができる。
【０２０４】
実際のｃｆＤＮＡがん患者の結果
[00228]前述のように、１６個の正常な血漿サンプル（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）のデータにおける３２個すべての正常なサンプルのうち）をがん特異的メチル化シグネチャーの誘導に使用した。したがって、この実験においてＺスコアに基づく統合方法において使用される正常な血漿集団の組織および腫瘍組成の経験的分布を構築するために、残り１６個の正常な血漿サンプルのうちの８個をランダムに選択した。次いで、最後の８個の正常なサンプルを試験セットにおいて使用した。試験セットはまた、慢性Ｂ型肝炎ウイルスに感染している８個の血漿サンプル（これらはがんではないかまたは正常なサンプルとみなす）、２６人の肝臓がん患者および４人の肺がん患者を含む。正常な血漿サンプルはランダムパーティションであるため、試験セットはランダムパーティションごとで異なる。そのため、異なる試験セットにおいて方法を評価し、平均の性能スコア（ＡＵＣまたは混合行列）を最終結果として使用する。
【０２０５】
[00229]２つの予測タスクを評価する：（ｉ）２値分類−新しい患者が健常であるかがんを有するか、および（ｉｉ）多クラス分類−新しい患者が正常、肝臓がん、または肺がんに分類される。結果を図９に示す。本発明者らは以下の結論を観察する。
【０２０６】
[00230]組織次元は腫瘍次元よりも多クラス分類タスクでは良好に機能するが、２値分類タスクでは劣る。これは、（ｉ）発がん機序が多数のがんタイプで共通しており、そのためがん性メチル化シグネチャーはがんタイプ間でそれほど異ならないが、対照的に（ｉｉ）文献から明らかなように、多くのメチル化パターンは組織特異的であり、起源組織の予測に寄与し得るため驚くべきことではない。
【０２０７】
[00231]両方の次元を統合することにより、多分類の分類タスクをさらに増やすことができる。この観察結果により、血漿ｃｆＤＮＡにおいて可能な限り多くの腫瘍関連の兆候を統合することの重要性が強調される。
【０２０８】
例５
がん患者のモニタリング
[00232]がんの診断に加えて、本発明者らの方法は予測スコアによって患者のがんの進行をモニタリングすることにも有効である。予測スコアは患者の血漿ｃｆＤＮＡの腫瘍および組織組成が正常な人々からどの程度離れているかを直感的に表す。したがって、予測スコアが大きいほど、患者はがんの段階がより後期にある（またはより重度である）。
【０２０９】
[00233]縦断的な血漿ｃｆＤＮＡ  ＷＧＢＳデータ（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）のデータから）を有する２人の肝臓患者を使用した。腫瘍切除の前に、患者１（サンプル識別子：ＴＢＲ３６）は正常な人々の平均スコア（すなわちゼロ）よりもはるかに高い予測スコア３４．２を有する。外科手術の３日後、３／６／１２ヶ月後に、予測スコアは即座に正常な範囲（ゼロの付近）へと戻る。図１０に示されるように、これはこの患者の血漿ｃｆＤＮＡサンプル中の１４個の組織の組成でも観察可能である。しかしながら、患者２（サンプル識別子：ＴＢＲ３４）は、手術の３日後および２ヶ月後に依然としてそれぞれ１０．８および１２．９の高い予測スコアを有する。この患者は後日死亡した。
【０２１０】
例６
例７〜９の材料および方法
概要
[00234]このアプローチの目標は、それぞれのリード（メチル化マーカー領域における）を腫瘍由来のｃｆＤＮＡのクラス（クラスＴと略される）または正常な血漿由来のｃｆＤＮＡのクラス（クラスＮと略される）のいずれかに分類することである。ここではがんの１つのタイプである肝臓がんに焦点を当てるが、本方法は任意のがんタイプに汎用化することができる。このアプローチは３つの主要な工程を含む：（ｉ）肝臓がんのＤＮＡメチル化シグネチャーを特定する工程。肝臓がんのメチル化マーカーは肝臓腫瘍およびそれらの対応する正常な組織ならびに正常な血漿ｃｆＤＮＡサンプルのＤＮＡメチル化データに基づいて導出された。大量のメチル化データを公的なデータベースＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））および近年の文献Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）から収集した。（ｉｉ）リードがメチル化シグネチャーを有する尤度を計算する工程。メチル化シーケンシングを新たな患者の血漿ｃｆＤＮＡサンプルに行った。選択されたマーカーのゲノム領域内に含まれるｃｆＤＮＡフラグメントのシーケンシングリードを得た。データの不確実性およびマーカーにおける個体間のメチル化のばらつきを考慮するために、それぞれのリードがそれぞれのクラスに由来する尤度を計算した。（ｉｉｉ）ｃｆＤＮＡ組成を推測する工程。それぞれのリードがそれぞれのクラスに由来する尤度を使用して、ｃｆＤＮＡにおける腫瘍負荷を導出することができる。図２１は本発明者らのアプローチの概略図を示し、個々の工程を以下の節に詳述する。
【０２１１】
肝臓がんに特異的なメチル化マーカーの特定および特性評価
[00235]メチル化マーカーは２種類の情報を含む：固形腫瘍サンプル（クラスＴ）と正常な血漿ｃｆＤＮＡサンプル（クラスＮ）の両方におけるそのゲノム領域およびメチル化パターン。主としてマイクロアレイプラットフォームによって生成されているＴＣＧＡからの大量の公的なメチル化データを利用するために、以下の２工程の手順を開発して肝臓がん特異的メチル化マーカーを得た。
【０２１２】
肝臓がんのメチル化マーカーの特定
[00236]十分なマイクロアレイプローブによってカバーされているゲノム領域のみが潜在的に有望なマーカーの資格を有する。したがって、本発明者らの近年の研究（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）、参照によりここに組み込まれる）におけるＣｐＧクラスターの定義を使用して、すべての可能性のあるゲノム領域を特定する。詳細については以下の例を参照されたい。すべての可能性のある領域の中で、メチル化レベルによって、ほとんどの肝臓腫瘍サンプルを対応する正常な肝臓組織だけでなく正常な血漿サンプルとも区別することができる領域を選択した。このタスクには本質的に２つの工程が含まれる：（ｉ）対応する腫瘍と正常な組織の間で対応するペアの半数よりも多くにメチル化に差がある（カットオフを上回る）、「高頻度で差次的なメチル化領域（ＦＤＭＲ）」を選択する工程。この工程により、肝臓組織に特異的なマーカーは除去するが、肝臓がんに特異的なマーカーは保持することができる。（ｉｉ）腫瘍サンプルを正常な血漿サンプルと区別することができる、すなわち２つのクラスにおけるそのメチル化レベルの中央値の間の差がカットオフよりも高いＦＤＭＲを選択する工程。この工程により、確実に腫瘍のメチル化シグナルを血液中で特定することができるようになる。ｃｆＤＮＡのシーケンシングカバレッジが固定であることを踏まえると、より多くのマーカーを使用すると（すなわちパネルサイズがより大きいと）、これらのマーカーの品質は下がり得るが、特定することができる腫瘍由来のｃｆＤＮＡリードはより多い。したがって、マーカーの品質と使用することができる腫瘍ｃｆＤＮＡシグナルの量との間にはトレードオフがある。この研究において、すべての公的な血漿ｃｆＤＮＡサンプルはシーケンシングカバレッジが低いため（１×〜３×）、両方の工程におけるメチル化差異のカットオフは比較的良好なマーカーの品質を保ち、この低いシーケンシングカバレッジで十分な腫瘍ｃｆＤＮＡを捕捉するのに十分に大きいメチル化マーカーパネルのサイズを維持するために０．２を選択した。
【０２１３】
メチル化パターンの特性評価
[00237]工程１において特定されたそれぞれのマーカー領域において、それぞれのクラス（ＴおよびＮ）におけるメチル化レベルの個体間でのばらつきを考慮する。領域を踏まえて、メチル化データ分析において広範に使用されているベータ分布Ｂｅｔａ（η，ρ）に従うようにクラス内のすべてのサンプルのメチル化レベルをモデリングした。具体的には、マーカーｋは２つのメチル化パターン、すなわちクラスＴについてはＢｅｔａ（ηＴｋ，ρＴｋ）、クラスＮについてはＢｅｔａ（ηＮｋ，ρＮｋ）と関連している。ηｃｋおよびρｃｋはベータ分布の形状パラメーター（通常αおよびβと表される）であるが、ここでは本発明者らは導入の節において定義されたα値およびβ値との混乱を避けるために記号ηおよびρを使用したことに留意されたい。β分布のパラメーターは、モーメント法または最大尤度のいずれかを使用して、クラスのサンプル集団から容易に学習することができる（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）。表記を単純にするために、マーカーｋのメチル化パターンを、クラスＴについてはｍＴｋ≡Ｂｅｔａ（ηＴｋ，ρＴｋ）と表し、クラスＮについてはｍＮｋ≡Ｂｅｔａ（ηＮｋ，ρＮｋ）と表した。
【０２１４】
それぞれのｃｆＤＮＡシーケンシングリードのクラス特異的尤度の計算
[00238]目標は、それぞれのｃｆＤＮＡリードを、リード上の複数のＣｐＧ部位の合同メチル化ステータスに基づいて、クラスＴまたはＮとして分類することであった。ｃｆＤＮＡリードにおける合同メチル化ステータスはｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）と表され、ここで２値ｒｊ＝１または０はリードｒにおけるＣｐＧ部位ｊについてメチル化されているかメチル化されていないかのステータスを表す。この２値ベクトルｒをベータ−ベルヌーイ分布によってモデリングした（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５））。具体的には、リードｒが含まれるマーカーのメチル化パターンｍ≡Ｂｅｔａ（η，ρ）を踏まえると、リードにおけるそれぞれのＣｐＧ部位ｊのメチル化ステータスｒｊはｒｊ〜Ｂｅｒｎｏｕｌｌｉ（ｐ）として分布され、ここでｐはマーカー内のＣｐＧ部位の平均メチル化率の事前分布であり、ベータ事前分布ｐ〜Ｂｅｔａ（η，ρ）に従う。この統計学的モデルを使用して、リードにおける合同メチル化ステータスの尤度ｒ＝（ｒ１，ｒ２，…）は、メチル化パターンｍを踏まえて、以下のように計算することができる：
【数２５】
2019521673.tif 000027
【０２１５】
[00239]ここでＢ（ｘ，ｙ）はベータ関数である。したがって、クラスＴのメチル化パターンｍＴｋおよびクラスＮのメチル化パターンｍＮｋを有するマーカーｋについて、上述の式を使用して、リードｒのクラス特異的尤度すなわちＰ（ｒ｜ｍＴｋ）およびＰ（ｒ｜ｍＮｋ）を計算することができる。この尤度計算は個々のリードに関してα値の確率論的バージョンを実装することに留意されたい。例を図２２に図示する。
【０２１６】
腫瘍由来のｃｆＤＮＡ負荷の予測
[00240]図２１に図示されるように、確率論的フレームワークを展開して、ｃｆＤＮＡリードを２つのクラス（腫瘍由来のＤＮＡについてはクラスＴ、および正常な血漿ｃｆＤＮＡについてはクラスＮ）に２つのクラスのメチル化パターンと関連するマーカーのセットに基づいて分類することによって０≦θ＜１として表される、腫瘍由来のｃｆＤＮＡ分率（すなわち腫瘍負荷）を推測した。Ｋ個すべてのマーカーのメチル化パターンはＭ＝｛（ｍＴ１，ｍＮ１），…，（ｍＴｋ，ｍＮｋ），…，（ｍＴＫ，ｍＮＫ）｝と表す。また、患者のｃｆＤＮＡのメチル化シーケンシングデータを合計でＭ個のＣｐＧ部位をカバーするＮ個のリードのセットＲ＝｛ｒ（１），…，ｒ（Ｎ）｝として表す。マーカーｋの領域にアライメントされるリードについては、クラス特異的尤度Ｐ（ｒ｜ｍｃｋ）を有する２つのクラスのうちの１つに由来し得ると仮定し、式中ｍｃｋはクラスｃのメチル化パターンである。θが腫瘍由来のｃｆＤＮＡ負荷であるとすると、正常なｃｆＤＮＡの分率は１−θとなる。θを対数尤度ｌｏｇＰ（Ｒ｜θ，Ｍ）を最大化することによって推定することが望ましい。これは最大尤度推定問題である。それぞれのリードの独立性、Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）＝ΠＮｉ＝１Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）を仮定した（文献（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）、Ｌａｎｄａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）において広く採用されている）。リードｒ（ｉ）の尤度Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）は以下のように展開される：
Ｐ（ｒ（ｉ）｜θ，Ｍ）＝θＰ（ｒ（ｉ）｜ｍＴｋ）＋（１−θ）Ｐ（ｒ（ｉ）｜ｍＮｋ）。
【０２１７】
[00241]Ｐ（Ｒ｜θ，Ｍ）は、推定しようとするパラメーターθが１つのみであるため、グリッドサーチを適用して０％〜１００％に均一に分布している１０００個すべての分率値すなわち０％、０．１％、…、０．９９％、および１００％を徹底的に列挙することができる。この方法は０．１％の精度で大域的最適化を得ることができ、これはわずかな量の腫瘍由来のｃｆＤＮＡを捕捉するのに十分であると考える。グリッドサーチは計算が速いため、より高い分解能でθを決定する工程を容易に精査することができる。
【０２１８】
[00242]「生殖細胞系」マーカーの除去：さらに、すべてのがん特異的マーカーにわたって全体的な腫瘍負荷（θ）を推定した。腫瘍負荷（θ）はまた、単一のマーカーについてのみ推定してもよい。理想的には、初期段階のがん患者については、推定されたθはすべてのマーカー全体または個々のマーカーのいずれかで小さい数（たとえば２０％未満）となるはずである。しかしながら、実際のがん患者のデータにおいて、本発明者らは全体的な腫瘍負荷よりもはるかに高い個々の推定された腫瘍負荷を有するいくつかのマーカーを観察した。したがって、これらの「外れ値」マーカーにおいて異常なメチル化を有するｃｆＤＮＡフラグメントはがん細胞に由来するのではなく、個体間でのばらつき（たとえば年齢、環境への曝露、またはその人物が有し得る他の疾患）に起因して、正常な細胞（たとえば白血球）に由来する可能性が高いことが明らかである。そのようなメチル化異常は概念的に「生殖細胞系」変異と類似している。結果として、これらの「生殖細胞系」マーカーを含めることにより腫瘍負荷の推定の精度が損なわれる。「生殖細胞系」マーカーを特定し除去した後に、全体的な腫瘍負荷を調節するように反復的アルゴリズムを設計した。すべてのマーカーを使用して得られた全体的な負荷θとは区別するために、θｋをマーカーｋにおける腫瘍負荷として表す。このアルゴリズムの手順を以下に提示する。
【０２１９】
[00243]初期化−Ｍはθの推定のために使用するマーカーのセットを表すとする。最初に、すべてのマーカーをＭに入れる。
【０２２０】
[00244]「生殖細胞系」マーカーを除去する−Ｍにおけるそれぞれのマーカーｋのθｋを推定し、すべてのθｋの標準偏差を計算し、ｓｔｄ（θｋ）と表す。Ｍからθｋ＞θ＋λｓｔｄ（θｋ）のマーカーを除去し、ここでλは入力固定パラメーターである。
【０２２１】
[00245]θをアップデートする−工程１においてアップデートしたＭのすべてのマーカーを使用して全体的な負荷θを推定する。  
工程１および２をθが収束するまで反復する。
【０２２２】
[00246]「生殖細胞系」マーカーを除去した後、出力θは調整された全体的な腫瘍負荷である。このアルゴリズムのパラメーターλはそれらの「生殖細胞系」マーカーのθｋが平均θからどの程度偏差するかを制御する。このパラメーターは正常な血漿ｃｆＤＮＡサンプルを使用して推定することができるが、これは最適なλが正常なサンプルの全体的なθをゼロに近くなるように調整することが可能であるべきだと予測されるためである。
【０２２３】
メチル化データの収集、生成、および処理
[00247]データ収集：４９個の固形肝臓腫瘍サンプルおよびそれらの対応する隣接する固形肝臓組織サンプルのメチル化プロファイルをＴＣＧＡデータベースから収集した。これらのサンプルのすべてにＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイを使用してアッセイを行った。血漿ｃｆＤＮＡサンプルについては、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）およびＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）からのメチル化シーケンシングデータを使用した。それらには、３２人の健常な人々、８人の慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者、および２９人の肝臓がん患者から採取した血漿サンプルの全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）データが含まれる。
【０２２４】
[00248]データの生成：血漿ｃｆＤＮＡサンプルの公的なＷＧＢＳデータはシーケンシングカバレッジが非常に低いため（１×〜３×）、血漿ｃｆＤＮＡサンプルのＷＧＢＳデータを２人の健常な人々から高いカバレッジ（平均で約１０×）で生成し、がん患者からより高いカバレッジのｃｆＤＮＡ  ＷＧＢＳデータをシミュレーションするために２人のがん患者由来の固形腫瘍サンプルのＷＧＢＳデータを生成した。血液サンプルを１６００×ｇで１０分間遠心分離した後、血漿を新しいマイクロチューブに移し、１６，０００×ｇでさらに１０分間遠心分離した。血漿を採取し−８０℃で保管した。ｃｆＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｋｉｔを使用して５ｍｌの血漿から抽出し、Ｑｕｂｉｔ  ３．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。ｃｆＤＮＡのバイサルファイト変換をＥＺ−ＤＮＡ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ＧＯＬＤキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行った。その後に、Ａｃｃｅｌ−ＮＧＳ  Ｍｅｔｈｙ−Ｓｅｑ  ＤＮＡライブラリーキット（Ｓｗｉｆｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してシーケンシングライブラリーを調製した。ＤＮＡライブラリーを次いで、１５０ｂｐの対合末端リードでシーケンシングした。固形腫瘍サンプルについては、バイサルファイト変換をＥＺ−ＤＮＡ−Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ＧＯＬＤキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて行い、シーケンシングライブラリーをＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して調製した。ＤＮＡライブラリーを次いで、ＨｉＳｅｑ  Ｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して１５０ｂｐの対合末端リードでシーケンシングした。
【０２２５】
[00249]メチル化マイクロアレイデータの処理：マイクロアレイデータ（ＴＣＧＡデータベースにおいてレベル３）により、個々のＣｐＧ部位のメチル化レベルが得られる。ＣｐＧクラスターのメチル化レベルをクラスター内のすべてのＣｐＧ部位の平均メチル化レベルとして定義する。クラスターのメチル化レベルは、そのＣｐＧ部位の半数よりも多くがメチル化の測定値を有さない場合には、「該当なし」（ＮＡ）として表記される。
【０２２６】
[00250]ＷＧＢＳデータの処理：Ｂｉｓｍａｒｋ（Ｋｒｕｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１））を使用して、リードを参照ゲノムｈｇ１９とアライメントし、メチル化されたシトシンと呼ぶ。ＰＣＲ重複を除去した後、メチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンの数をそれぞれのＣｐＧ部位について計数した。ＣｐＧクラスターのメチル化レベルをクラスター内のメチル化されたシトシンの数とシトシンの総数との比として計算する。しかしながら、ＣｐＧクラスターにアライメントしたリードにおけるシトシンの総数が３０未満の場合、このクラスターのメチル化レベルはＮＡ（該当なし）として扱われる。このＷＧＢＳデータ処理手順を、メチル化マーカーを特定するために使用される正常な血漿サンプルにおけるＣｐＧクラスターの平均メチル化レベルの計算に使用する。血漿ｃｆＤＮＡサンプルを試験データとして使用する場合、Ｂｉｓｍａｒｋの出力からのマーカーパネルの領域にアライメントする個々のシーケンシングリードのすべてのＣｐＧ部位の合同メチル化ステータスを抽出し、次いでこの情報をＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒにその入力データとして供給した。実データのシーケンシングカバレッジが低いため、この研究においては、本発明者らは少なくとも１つのＣｐＧ部位をカバーするすべてのリードを使用した。高いカバレッジのｃｆＤＮＡメチル化データについては、カバーするＣｐＧ部位が３つ未満であるリードをフィルタリングして入力データの品質を向上させることができる。
【０２２７】
例７
肝臓がんに特異的なメチル化マーカーの特定
[00251]メチル化マーカーの機能を果たすのに適したすべてのゲノム領域の定義：訓練データは、約４５０，０００個のＣｐＧを有するＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイによって測定したＴＣＧＡ固形組織からのものである。しかしながら、試験データ（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５））はシーケンシングカバレッジが非常に低いＷＧＢＳデータである。したがって、試験データからマッピング性の高いリードを使用するために、ＣｐＧ部位をＣｐＧクラスターに分類した。マイクロアレイにおいてプローブによってカバーされるＣｐＧ部位については、１００ｂｐ上流および下流の領域をその隣接領域として定義し、この領域内に位置するすべてのＣｐＧ部位がプローブによってカバーされるＣｐＧ部位と同じ平均メチル化レベルを有すると仮定する。２つの隣接するＣｐＧ部位はそれらの隣接領域がオーバーラップする場合、１つのＣｐＧクラスターに分類される。最終的に、メチル化レベルの堅強な測定を達成するために、マイクロアレイプローブによってカバーされるＣｐＧを少なくとも３つ含有するＣｐＧクラスターのみを使用する。この手順により４２，３７４個のＣｐＧクラスターが得られ、これらにはＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０マイクロアレイ上のすべてのＣｐＧ部位の約半分が一緒に含まれている。これらのクラスターの大半はそれぞれが１つの遺伝子のみと関連している。これらのＣｐＧクラスターは後続の特徴選択に使用される。
【０２２８】
[00252]肝臓がん特異的マーカーの選択ならびに正常および腫瘍のクラスにおけるそれらのパターンの特性評価：４２，３７４個のＣｐＧクラスターを踏まえて、がん特異的マーカーを、訓練データにおいて例６に記載される方法を使用することによって選択した：（ｉ）固形肝臓腫瘍およびそれらの対応する正常な肝臓組織の４９個のペアならびに（ｉｉ）３２人すべての健常な血漿サンプルのうちの７５％。健常な血漿サンプルの残り２５％は試験データとして使用すること、および健常な血漿サンプルを訓練／試験データとしてそれぞれ７５／２５の比でランダムに１０回パーティションを行ったことに留意されたい。これは、１０個の異なる訓練／試験データのセットが存在し、それぞれのセットが異なる選択されたマーカーおよび腫瘍負荷の推定をもたらし得ることを示す。それぞれの訓練／試験データのセットならびにその結果は実験実行と称される。１０回の実行のそれぞれにおいて、平均で３，２１４個の肝臓がん特異的マーカー（ＣｐＧクラスター）が特定され、これらのマーカーの大半がすべての実行で共通していた。正常なクラスおよび腫瘍のクラスにおけるそれぞれのマーカーのメチル化パターンを、クラス内のメチル化レベルの個体間でのばらつきを捕捉することができる学習された形状パラメーターを用いて、２つのベータ分布として分類した。
【０２２９】
例８
シミュレーション実験による腫瘍ｃｆＤＮＡの検出におけるＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒの超高感度の実証
[00253]血漿ｃｆＤＮＡサンプルのメチル化データを、２つの実サンプル、正常な血漿ｃｆＤＮＡサンプル、および固形腫瘍サンプルをサンプリングし、メチル化シーケンシングリードを混合することによって、様々な腫瘍負荷（θ）および様々なシーケンシングカバレッジ（ｃ）でシミュレーションした。この戦略により、本発明者らは実データを模倣し、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ法の検出力および要件たとえば腫瘍由来のｃｆＤＮＡがどの腫瘍負荷およびシーケンシングカバレッジで検出され得るかを試験するために、混合サンプルにおける腫瘍負荷およびシーケンシングカバレッジを正確に制御することが可能となり得る。ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒを、本発明者らが近年開発したｃｆＤＮＡメチル化データからがんのシグナルをデコンボリューションすることを目的とした現時点で唯一の方法である別の確率論的ｃｆＤＮＡデコンボリューション方法である「ＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ」（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７））およびＵＳＮ６２／４７３，８２９、参照によりここに組み込まれる）と比較した。ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒはリードに基づく方法であるが、ＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒはｃｆＤＮＡにおけるマーカーのβ値を２つのクラス（腫瘍または正常なｃｆＤＮＡ）のβ値の線形結合としてデコンボリューションすることによる従来のβ値に基づく。
【０２３０】
[00254]ごくわずかな腫瘍ｃｆＤＮＡ（すなわちθ≦５％）の特定におけるこれら２つの方法の感度を比較するために、８つの異なる腫瘍負荷（θ＝０、０．１％、０．３％、０．５％、０．８％、１％、３％、および５％）ならびに３つの異なるシーケンシングカバレッジ（ｃ＝２、５、１０）で、血漿ｃｆＤＮＡサンプルをシミュレーションした。シミュレーション手順において使用される実サンプルは２つの正常な血漿サンプル（Ｎ１ＬおよびＮ２Ｌ）ならびに２つの固形肝臓腫瘍サンプル（ＨＣＣ１およびＨＣＣ２）のＷＧＢＳデータである。この実験環境により、８×３×２×２＝９６個の混合サンプルが得られる。図２３は、腫瘍ｃｆＤＮＡの検出における２つの方法の感度を実証し、ここに３つの所与のシーケンシングカバレッジ（２×、５×、および１０×）で８つの所与の腫瘍負荷においてシミュレーションしたサンプルの１０回の実験実行にわたって平均した予測腫瘍負荷の散布図が示される。図２３に明確に示されているように、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ４１０によって予測された血中腫瘍負荷は真の値と高度に一貫性があり、予測のばらつきは非常に低い。たとえば、最も高いシーケンシングカバレッジ１０×を使用した場合、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ４１０は１０回の実行の平均で０．９９７４±０．００１２（Ｐ値＝７．２Ｅ−８±９．８Ｅ−８）のピアソンの相関係数（ＰＣＣ）を達成した。一貫性はシーケンシングカバレッジとともに増加した、すなわちそれぞれ２×、５×、１０×のシーケンシングカバレッジで平均ＰＣＣ＝０．９８１１、０．９９５９、０．９９７４であり、それらの関連するＰ値が２．５Ｅ−５、６．０Ｅ−６、９．８Ｅ−８となった。より重要なことに、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ４１０は、（ｉ）低いシーケンシングカバレッジ（２×）、低い腫瘍負荷（θ＝１％）で腫瘍ｃｆＤＮＡを検出することができ、（ｉｉ）シーケンシングカバレッジを増加させる場合（５×および１０×）、検出限度を１％から０．３％に改善することができる。一方で、β値に基づく方法であるＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ４２０は腫瘍負荷θが５％未満でシーケンシングカバレッジが２×であるかθが３％未満でカバレッジが５×である場合には、いずれの腫瘍ＤＮＡも検出することができない。１０×シーケンシングカバレッジであってもその予測は安定しておらず（予測に高いばらつきがある）、真の腫瘍負荷とは大幅に偏差する。要約すると、この結果は、リードに基づくＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ４１０方法は、低いシーケンシングカバレッジであっても少量の腫瘍ｃｆＤＮＡを高感度で検出することができ、予測の精度および安定性はシーケンシングカバレッジが高いほど増加する。
【０２３１】
例９
実データでの試験により、腫瘍ｃｆＤＮＡのデコンボリューションにおけるＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒの高い感度が確認された
[00255]公的な血漿サンプルの集合（３２人の健常な人々、８人のＨＢＶ保因者、および２９人の肝臓がん患者）をＣｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）およびＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）から収集した。これらのデータはシーケンシングカバレッジが低い（１×〜３×）。３２人の健常な血漿サンプルを、訓練セット（７５％）および試験セット（２５％）に１０回（実行）ランダムに分割した。それぞれの実行において、組み合わせた訓練セットならびに固形肝臓腫瘍および対応する正常な組織のＴＣＧＡマイクロアレイデータを使用して肝臓がん特異的なメチル化マーカーを特定し、次いで試験セット：８人のＨＢＶ保因者、２９人の肝臓がん患者、および健常対象の残り２５％からの血漿サンプルにおいて腫瘍負荷を予測した。腫瘍負荷を予測する性能は受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって測定することができ、ここでがんおよび非がんサンプルを分離する感度および特異度を計算し、異なる腫瘍負荷カットオフを使用することによってプロットする。図２４Ａおよび２４Ｂに示されるように、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ５１０の平均ＲＯＣ曲線は、予測性能および堅強性の両方の点でＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ５２０のものよりも性能が優れている（すなわち標準偏差がはるかに低い）。たとえば腫瘍負荷の閾値を決定するためにＲＯＣ曲線の左上の隅の点を選択した場合、１００％の特異度で、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ５１０は１０回の実行にわたって標準偏差３．２％で９５．２％の平均感度を達成することができるが、β値に基づくＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ５２０方法は、１００％の特異度で、標準偏差１０．７％で７４．１％の平均感度を達成した。２９人の肝臓がん患者の中に少なくとも２５人の初期段階（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ、ステージＡ）の患者が存在することに留意されたい。２５人の初期段階のがん患者および健常／ＨＢＶサンプルのみに試験した場合、１００％の特異度で、本発明者らの方法はまた、標準偏差３．７％で９４．４％の平均感度を達成することができるが、一方でＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ５２０では、標準偏差１０．０％で７４．４％の感度が得られた。曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して性能の比較をまとめると、本発明者らの方法は、すべての実サンプルについて、１０回の実行にわたる平均で標準偏差０．００４で０．９８８のＡＵＣを達成し、初期段階のがん患者については標準偏差０．００５で０．９８７の平均ＡＵＣを達成することができるが、一方でＣａｎｃｅｒＬｏｃａｔｏｒ５２０では、実サンプルについては標準偏差０．０１４で０．９７５の低い平均ＡＵＣが得られ、初期段階のがん患者については標準偏差０．０１４３で０．９７５の平均ＡＵＣが得られた。ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ５１０は、８つすべての慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）サンプルのｃｆＤＮＡ腫瘍負荷を正常なサンプルと同じ範囲（すなわちゼロに近い）であると正しく予測し、がんサンプルと良好に区別された。これらの結果は、ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ５１０が健常なサンプルとがんのサンプルとを区別するだけでなく、より洗練されたシナリオたとえばＨＢＶの保因者とがん患者との区別に対処することができることを示した。したがって、実際の血漿サンプルを使用して、本発明者らはまた、リードに基づくＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒ法が腫瘍ｃｆＤＮＡをより高感度に検出することができることを実証した。
【０２３２】
[00256]一般に、予測された腫瘍負荷は腫瘍のサイズと良く相関する。図２４Ｃに示されるように、腫瘍サイズの情報がある２６人の肝臓がん患者の中で、予測された腫瘍負荷と腫瘍サイズとの間のＰＣＣは０．８７である（Ｐ値＝７．３７ｅ−０９）。最も大きな腫瘍（サイズが６ｃｍを上回る）を有する３人の患者を除外した後でさえも、依然として０．４２という比較的良好なＰＣＣが得られる（Ｐ値＝４．６１ｅ−０２）。
【０２３３】
[00257]ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｏｒはまた、がんの進行および処置をモニタリングするためにも使用することができる。血漿サンプルが外科手術による腫瘍の切除前および外科手術後の複数の時点で得られているＣｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）からの２人の肝臓がん患者を使用した。第１の患者は１２ヶ月を上回って生存したが、第２の患者は手術後に転移性疾患によって死亡した（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３））。図２５に示されるように、予測された血中腫瘍負荷は処置効果と一貫性がある：第１の患者の腫瘍負荷は迅速に正常な範囲となるが、一方で第２の患者は外科手術後も比較的高い値を維持する。
【０２３４】
[00258]初期のがんの検出の成功は、（ｉ）高品質ながん特異的メチル化マーカー、および（ｉｉ）わずかな量の腫瘍ｃｆＤＮＡ（通常５％未満または初期段階のがん患者においてはさらには０．５％未満）の超高感度な検出のためのコンピュータによる方法に依存するところが大きい。一部の態様において、個々のリードの分解能で総ｃｆＤＮＡから腫瘍ｃｆＤＮＡをデコンボリューションするための方法がある。従来のがん検出方法と比較して、本発明者らの方法は、わずかな腫瘍シグナルを特定するにあたり、２つの利点を有する：（ｉ）ＤＮＡメチル化の広汎性を利用して、異常なｃｆＤＮＡシグナルを有意に増幅させる。図１および図２０、ならびに実験の結果において示されるように、リードにおける複数のＣｐＧ部位の合同メチル化ステータス（α値）は個々のＣｐＧ部位の平均メチル化率（β値）よりも高感度な腫瘍シグナルを有する。α値に基づく本発明者らの確率論的方法は、腫瘍負荷およびシーケンシングカバレッジが低い場合に特に有利である。（ｉｉ）すべてのマーカーにわたって腫瘍負荷を合同でデコンボリューションする。既存の方法はすべてのマーカーからのシグナルを集約するのではなく、単一の腫瘍マーカーにおいて腫瘍シグナルを検出することに焦点を当てていることが多い（Ｓｈａｒｍａ（２００９）、Ｓｔｕｒｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９））。あるいは、本発明者らの方法はわずかな腫瘍シグナルがゲノムの複数の場所で生じるはずだという考えを有する。本発明者らの方法はリードレベルで腫瘍ｃｆＤＮＡを検出することができるが、すべての可能性のあるシグナルを組み合わせて腫瘍負荷の堅強かつ高感度な推定を得た。示されるように、（ｉ）および（ｉｉ）の鍵となる考察により、本発明者らの方法が、低いかまたは中等度のシーケンシングカバレッジ（５×および１０×）において極めて低い腫瘍負荷（１％未満）について良好に機能し得ることが見込まれた。したがって、本アプローチはがん検出の費用を大幅に低減させる可能性を有する。
【０２３５】
[00259]さらに、当業者であれば異なる態様からの様々な特徴の適用性を認識するであろう。同様に、上記で考察された様々な要素、特徴、および工程ならびにそれぞれのそのような要素、特徴、または工程の他の公知の均等物を当業者が組み合わせて個々に記載される原理による方法を実行することができる。様々な要素、特徴、および工程のうち、多様な態様において、一部が具体的に含まれ、その他が具体的に除外される。
【０２３６】
[00260]本発明はある特定の態様および例の文脈で開示されているが、当業者であれば本発明の態様が具体的に開示されている態様を越えて他の代替的な態様および／または使用ならびにそれらの修正形および均等物に拡張されることを理解するであろう。
【０２３７】
[00261]多数の変化形および代替的な要素が本発明の態様において開示されている。なおもさらなる変化形および代替的な要素が当業者には明らかであろう。
【０２３８】
[00262]一部の態様において、本発明のある特定の態様について説明し、特許請求するために使用される成分の量、特性たとえば分子量、反応条件などを表す数は一部の事例において「約」という用語によって修飾されているとして理解されるものである。したがって、一部の態様において記載される説明および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメーターは近似値であり、特定の態様によって得ようとする所望される特性に応じて多様であり得る。一部の態様において、数値パラメーターは報告された有効桁の数を考慮し、通常の端数処理技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の一部の態様の広範な範囲について記載する数値範囲およびパラメーターは近似値ではあるが、特定の例において記載される数値は予測可能な限り正確なものとして報告されている。本発明の一部の態様において提示される数値はそれらのそれぞれの試験測定において見出された標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を含み得る。
【０２３９】
[00263]一部の態様において、本発明の特定の態様について説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲のうちのある特定のものの文脈において）使用される「１つの（a）」および「１つの（an）」および「その（the）」という用語ならびに類似の参照物は単数形と複数形の両方を含むと解釈することができる。本明細書における値の範囲の列挙は単にその範囲内に含まれるそれぞれの別個の値に個別に言及する簡略的な方法の機能を果たすことが意図される。本明細書において別途示されない限り、それぞれの個別の値は、それが本明細書において個別に引用されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において別途示されるかまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行することができる。ここである特定の態様に関して提供されるありとあらゆる例または例示的な語法（たとえば「たとえば」）の使用は単に本発明を良好に示すことを意図するものであり、特許請求される本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書におけるいずれの語法も本発明の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すとして解釈されるべきではない。
【０２４０】
[00264]ここに開示される本発明の代替的な要素または態様の群は制限として解釈されるものではない。それぞれの群のメンバーは個別または群の他のメンバーもしくはここに見出される他の要素との任意の組合せで参照され特許請求され得る。群の１つまたは複数のメンバーは便宜上および／または特許性の理由である群に含まれ得るかまたはそこから削除され得る。任意のそのような包含または削除が生じる場合、本明細書は添付の特許請求の範囲に使用されるすべてのマーカッシュ群の書面による説明を満たすように修飾された群を包含することがここに想定される。
【０２４１】
[00265]さらに、多数の参照が本明細書全体を通じて特許および刊行物に対してなされている。上記で引用された参考文献および刊行物のそれぞれは参照によりその全体が個別にここに組み込まれる。
【０２４２】
[00266]最後に、ここに開示される本発明の態様は本発明の原理の例示であることを理解されたい。利用することができる他の修正形は本発明の範囲内に含まれ得る。したがって、例としてであり、制限するものではなく、本発明の代替的な構成をここの教示に従って利用することができる。したがって、本発明の態様は正確に示され記載されているものに限定されない。
【０２４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2019521673.tif 000069
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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