(57)【要約】  肝臓疾患を迅速に特定する。血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチド類の濃度やＡＳＴ、ＡＬＴの値を測定し、その測定値により、例えば多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）を行って、健常者（Ｃ）、薬剤性肝障害（ＤＩ）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、肝臓がん（ＨＣＣ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓疾患を特定する。
2011158590.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の組織中の酸化ストレスを検出するためのマーカーであって、
γ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドであることを特徴とする肝臓疾患マーカー。
【請求項２】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともグルコサミン、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、メチオニンスルホキシド、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎを含む組合せであることを特徴とする健常者識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項３】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とする薬剤性肝障害識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項４】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎを含む組合せであることを特徴とする無症状Ｂ型肝炎キャリア識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項５】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともγ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、メチオニンスルホキシド、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とする慢性Ｂ型肝炎識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項６】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともグルコサミン、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とするＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項７】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともグルコサミン、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓを含む組合せであることを特徴とする慢性Ｃ型肝炎識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項８】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともグルコサミン、メチオニンスルホキシド、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とするＣ型肝硬変識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項９】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とする肝臓がん識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項１０】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎを含む組合せであることを特徴とする単純脂肪肝識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項１１】
請求項１に記載の肝臓疾患マーカーであって、
少なくもグルコサミン、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎識別用の肝臓疾患マーカー。
【請求項１２】
肝臓疾患マーカーとして、サンプル中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドを測定することを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定方法。
【請求項１３】
サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、
試料中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドを、肝臓疾患マーカーとして測定するための分析手段と、
を備えたことを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定装置。
【請求項１４】
医薬品の投与前及び投与後に採取された血液において、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、
前記測定の結果を、前記医薬品の投与前の血液と投与後の血液とで比較する工程と、
を含むことを特徴とする医薬品の検定方法。
【請求項１５】
医薬品を投与された一以上の個体からなる第１の群から採取された血液、及び、前記医薬品を投与されていない一以上の個体からなる第２の群から採取された血液について、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、
第１の群と第２の群との間で、測定された前記肝臓疾患マーカーの濃度を比較する工程と、
を含むことを特徴とする医薬品の検定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び医薬品の検定方法に係り、特に、各種肝臓疾患の患者を健常者と識別してスクリーニング可能な肝臓疾患マーカー、その測定方法、装置及び該肝臓疾患マーカーを用いた医薬品の検定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓疾患は、薬剤性肝障害、Ｂ型、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多様であり、また無症状のＢ型、Ｃ型ウイルスのキャリアの人も存在する。特にＣ型肝炎ウイルス（hepatitis type C virus：ＨＣＶ）感染者の７割は、慢性的な肝臓の炎症（慢性肝炎）のため、徐々に正常な肝細胞が失われ、肝臓が線維化して、肝硬変に進行し、さらには肝臓がんまで発展する。Ｃ型慢性肝炎患者の１０−１５％、肝硬変患者の８０％に肝臓がんが発生することが報告されている。慢性肝炎の状態では生命に危険が生じることはないが、肝臓がんが発生したり、肝硬変が進行して肝不全を引き起こしたりすると生命の危険がせまる。従って、早期にＣ型肝炎を診断し、ウイルスを駆除することが必要である。【０００３】
Ｃ型肝炎は、肝硬変から肝臓がんへと症状も無く進行し、肝臓の機能が極度に低下して倦怠感や黄疸、意識障害など様々な障害がおこるが、この段階では現在有効な治療法はない。したがって、肝臓の機能が悪化する前に、なるべく早く症状の進行を検出し、インターフェロン投与などの治療などを施すことが必要である。しかし、各種の肝障害を正確かつ迅速に特定する方法は未だ確立されていないのが現状である。【０００４】
一般に肝臓疾患が疑われると、問診、視診、触診とともに、血中のアスパラギンアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬ−Ｐ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、ビリルビンなどの肝機能マーカーを測定する。これらの生化学検査値に異常があった場合は、Ｂ型やＣ型肝炎ウイルス検査、超音波検査、Ｘ線、ＣＴなどの画像検査が行われる。がんの判定には、血中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、異常プロトロンビン（ＰＩＶＫＡ−II）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）などのタンパク質の腫瘍マーカーを測定する。さらに、正確な判定が必要な場合は、腹腔鏡検査や肝生検（１週間程度の入院が必要）を行う（非特許文献１）。【０００５】
このように肝臓病を特定するには、多くの検査を受けなければならず、判定がつくまでに何日も費やす。また腹腔鏡検査や肝生検は、患者を危険に曝し、肉体的な苦痛を与える。腹腔鏡検査や肝生検は、患者の負担が大きいため、病態のチェックなどのために頻繁に行うことはできない。さらに従来法では、多くの検査や判定は専門家でなければ行うことができず、不足している医療関係者に負担を強いる。したがって、患者に負担がかからず、迅速で、正確かつ簡便な肝臓疾患の判定法が強く望まれている。【０００６】
肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、活性酸素の生成（酸化ストレス）と、それを除去する生体の防御システムの破たんによって惹起されることが知られている（非特許文献２）。活性酸素などの酸化ストレスに対する生体の防御の主要な一つに、グルタチオンシステムによるものがある。組織に最も高濃度に存在する抗酸化物質として還元型グルタチオン（ＧＳＨ：以下グルタチオン）があり、活性酸素や親電子物質にグルタチオンが抱合することによって、これらの物質は還元され、酸化ストレスは抑制される。【０００７】
しかし、グルタチオンが減少すると組織や細胞は酸化ストレスに曝され、様々な病態を惹起する（非特許文献３）。実際に肝障害でも、Ｂ型やＣ型の肝炎ウイルスの感染によって、酸化ストレスが亢進してグルタチオンが減少することや、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの患者やマウスでグルタチオンが減少することが報告されている（非特許文献２、４）。【０００８】
薬物の服用によって誘発される薬剤性肝障害も酸化ストレスによって惹起される。解熱鎮痛薬であるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）は肝臓で代謝され、毒性の高い親電子物質Ｎ−アセチルベンゾキノンイミン（ＮＡＱＰＩ）が生成される。このＮＡＱＰＩは、肝臓に高濃度に存在するグルタチオン（ＧＳＨ）が抱合することによって、解毒、排泄される。しかし、親電子物質が大量に存在する場合はグルタチオンが枯渇し、親電子物質が細胞内に蓄積し（酸化ストレス）、生体高分子と反応する。その結果、細胞の機能が撹乱され、薬剤性肝障害などの病態を惹起することが知られている。【０００９】
これまでに発明者らは、マウスにＡＰＡＰを大量に投与すると、ＡＰＡＰの代謝によって生成された親電子物質ＮＡＱＰＩを解毒するためにグルタチオンが減少し、反比例してオフタルミン酸が急増すること（図１（Ｂ）参照）、肝臓および血中のオフタルミン酸の増加は、親電子物質によって肝臓のグルタチオンが枯渇したことを示すことを見出した（特許文献１、非特許文献５）。【００１０】
その機序は以下の通りである。図１に示すように、グルタチオン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）とオフタルミン酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ−Ｇｌｙ）は、同じ二つの酵素γ−グルタミルシステイン合成酵素とグルタチオン合成酵素によって生合成されるトリペプチドであり、基質（出発物質）がシステイン（Ｃｙｓ）か２−アミノ酪酸（２ＡＢ）の違いである。図１（Ａ）に示す通常の還元状態では、肝臓内にグルタチオンが大量に存在し、最初の酵素γ-グルタミルシステイン合成酵素がフィードバック（ＦＢ）阻害されている。【００１１】
したがって、オフタルミン酸は、ほとんど生合成されない。しかし、図１（Ｂ）に示す酸化状態のように、親電子物質や活性酸素種が存在すると、解毒のためにグルタチオンが消費される。グルタチオンの減少によってフィードバック阻害が解除されて、γ-グルタミルシステイン合成酵素が活性化し、グルタチオンとオフタルミン酸が生合成される。オフタルミン酸は肝臓内に蓄積し、血中にも排泄される。このように親電子物質などによって酸化状態になると、肝臓や血液のオフタルミン酸が増加するため、オフタルミン酸は酸化ストレスのバイオマーカーとなる。【００１２】
又、肥満により内臓脂肪が増加すると問題になる非アルコール性脂肪肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease：ＮＡＦＬＤ）において、酸化ストレスマーカーの血清チオレドキシン（ＴＲＸ）が、肝硬変から肝臓がんに進行する非アルコール性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis：ＮＡＳＨ）と、良好な経過をたどる単純脂肪肝（simple steatosis：ＳＳ）の識別に有用であることも報告されている（非特許文献６）。【００１３】
他方、キャピラリー電気泳動−質量分析装置（ＣＥ−ＭＳ）による試料中の代謝物質測定法による細胞内の代謝物質の網羅的な測定方法（例えば、非特許文献７〜９参照）は、ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該ヒトまたは動物の身体由来の液体サンプルの低分子化合物（代謝物質）パターンおよび／またはペプチドパターンを、定性的かつ／または定量的に決定する方法であって、ここで、該液体サンプルの代謝物質およびペプチドは、キャピラリー電気泳動により分離され、次いで直接イオン化され、そしてオンラインでインターフェースを介して、接続された質量分析計で検出される。長期間にわたって該ヒトまたは動物の身体の状態をモニタリングするために、該状態を示す参照値およびサンプル値、ならびに該値から導かれた偏差および対応は、自動的にデータベースに記憶される。キャピラリー電気泳動と質量分析を組合せて陰イオン性化合物を分離分析する場合は、キャピラリーの内表面が予め陽イオン性にコーティングされたコーティングキャピラリーを用いて、電気浸透流を反転することを特徴とする陰イオン性化合物の分離分析方法（例えば、特許文献２参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００７−１９２７４６号公報
【特許文献２】特許第３３４１７６５号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Callewaert, N. et al. Nat. Med.10, 429-434, 2004.
【非特許文献２】Loguercio, Carmela et al. Free Radic. Biol. Med.34, 1-10, 2003.
【非特許文献３】Yadav, Dhiraj et al. Am. J. Gastroenterol. 97, 2634-2639, 2002.
【非特許文献４】Moriya, K. et al. Cancer Res. 61, 4365-4370, 2001.
【非特許文献５】Soga, T. et al. J. Biol. Chem. 281, 16768-16776, 2006.
【非特許文献６】谷川 久一編「酸化ストレスと肝疾患＜第５巻＞」メディカルトリビューン社, 3-37頁, 2009. 5. 7.
【非特許文献７】Soga, T. et al. J. Proteome Res.2. 488-494, 2003.
【非特許文献８】Soga, T. et al. J. Boil Chem.Vol.281, No.24, (June 16, 2006) 16768-16776
【非特許文献９】Hirayama, A. et al. Cancer. Res. 69 : (II). (June 1, 2009) 4918-4925
【非特許文献１０】Pignatelli, B. et al. Am. J. Gastroenterol. 96, 1758-1766, 2001.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、従来は、薬剤性肝障害（drug induced liver injury：ＤＩ）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（asymptomatic hepatitis B carrier：ＡＨＢ）、慢性Ｂ型肝炎（chronic hepatitis B：ＣＨＢ）、Ｃ型肝炎ウィルスキャリアでＡＬＴの値が正常なＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（hepatitis C with persistently normal ALT：ＣＮＡＬＴ）、慢性Ｃ型肝炎（chronic hepatitis C：ＣＨＣ）、Ｃ型肝硬変（cirrhosis type C：ＣＩＲ）、肝臓がん（hepatocellular carcinoma：ＨＣＣ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、単純脂肪肝（ＳＳ）等を一回の検査で識別して特定することは困難であった。【００１７】
本発明は、前記従来の問題点を解消するためになされたもので、血液中の低分子バイオマーカーを測定することによって、薬剤性肝障害（ＤＩ）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、肝臓がん（ＨＣＣ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、単純脂肪肝（ＳＳ）等の肝臓疾患を迅速に特定可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前述のように、肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、酸化ストレスと深い関係があるため、各肝障害でオフタルミン酸濃度が変動することが予想された。そこで、健常者（Ｃ）、薬剤性肝障害（ＤＩ）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、肝臓がん（ＨＣＣ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、単純脂肪肝（ＳＳ）の患者から血液を採取し、血清中のオフタルミン酸を測定した。しかし、マウスとは異なり、健常者（Ｃ）や薬剤性肝障害（ＤＩ）患者からは、オフタルミン酸は殆んど検出されなかった。（マウスの血清中のオフタルミン酸の濃度は約２μＭであったが、ヒトの血清中の濃度は、約１／２０程度であり、健常者（Ｃ）や薬剤性肝障害（ＤＩ）患者では殆んど検出されなかった。）【００１９】
しかし、発明者らは、各肝炎患者の血清中で著しく増加する物質を発見し、それらがγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸及びアミンを示す）であることを同定した。図２に、各種の肝障害患者でγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が生合成されるメカニズムを模式的に示す。さらに血清中の肝機能マーカーであるＡＳＴとＡＬＴの値とγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を用いて多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）モデルによる多変量解析を行うことにより、各種の肝炎患者を他と区別することに成功した。【００２０】
本発見によって、血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度やＡＳＴ、ＡＬＴの値を測定することによって、健常者（Ｃ）、薬剤性肝障害（ＤＩ）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、肝臓がん（ＨＣＣ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝臓疾患を迅速に特定することが可能になった。【００２１】
本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、哺乳動物の組織中の酸化ストレスを検出するためのマーカーであって、γ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドであるであることを特徴とする肝臓疾患マーカーである。ここで、複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドの組合せは、多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析により選ぶことができる。【００２２】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表２から明らかなように、少なくともＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎを含む組合せであることを特徴とする健常者（Ｃ）識別用の肝臓疾患マーカーである。【００２３】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表２から明らかなように、オッズ比が１に近いＡＳＴ、ＡＬＴ及びγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙを除いた、少なくともγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とする薬剤性肝障害（ＤＩ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙの少なくとも1つを加えて、精度を高めることができる。【００２４】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表２から明らかなように、オッズ比が１に近いＡＬＴを除いた、少なくともγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎを含む組合せであることを特徴とする無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、ＡＬＴを加えて、精度を高めることができる。【００２５】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表３から明らかなように、少なくともγ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とする慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）識別用の肝臓疾患マーカーである。【００２６】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表３から明らかなように、オッズ比が１に近いＡＬＴを除いた、少なくともＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とするＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、ＡＬＴを加えて、精度を高めることができる。【００２７】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表３から明らかなように、オッズ比が１に近いＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）とＡＬＴを除いた、少なくともＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓを含む組合せであることを特徴とする慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）及び／又はＡＬＴを加えて、精度を高めることができる。【００２８】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表４から明らかなように、オッズ比が１に近いＡＳＴとＡＬＴを除いた、少なくともＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とするＣ型肝硬変（ＣＩＲ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴを加えて、精度を高めることができる。【００２９】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表４から明らかなように、オッズ比が１に近いＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、ＡＳＴ及びＡＬＴを除いた、少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とする肝臓がん（ＨＣＣ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも1つを加えて、精度を高めることができる。【００３０】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表４から明らかなように、少なくともγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎを含む組合せであることを特徴とする単純脂肪肝（ＳＳ）識別用の肝臓疾患マーカーである。【００３１】
又、前記の肝臓疾患マーカーであって、後出表４から明らかなように、オッズ比が１に近いＡＳＴとＡＬＴを除いた、少なくもＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、ＡＳＴ及び／又はＡＬＴを加えて、精度を高めることができる。【００３２】
本発明は、又、肝臓疾患マーカーとして、サンプル中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドを測定することを特徴とする肝臓疾患マーカー測定方法である。【００３３】
又、サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、試料中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチドを、肝臓疾患マーカーとして測定するための分析手段と、を備えたことを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定装置である。【００３４】
又、医薬品の投与前及び投与後に採取された血液において、前記いずれかの肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、前記測定の結果を、前記医薬品の投与前の血液と投与後の血液とで比較する工程と、を含むことを特徴とする医薬品の検定方法である。【００３５】
又、医薬品を投与された一以上の個体からなる第１の群から採取された血液、及び、前記医薬品を投与されていない一以上の個体からなる第２の群から採取された血液について、前記いずれかの肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、第１の群と第２の群との間で、測定された前記肝臓疾患マーカーの濃度を比較する工程と、を含むことを特徴とする医薬品の検定方法である。【００３６】
又、本発明に係る、肝臓疾患の診断方法は、診断対象である一以上の個体から採血する工程と、上記いずれかの測定方法によって採血した血液における本発明に係るマーカーの濃度を測定する工程と、そのマーカーの濃度を、一以上の正常個体の血液におけるマーカー濃度と比較する工程と、を含むことを特徴とする。【００３７】
本発明に係る、医薬品の親電子性の毒性副作用（医薬品を投与した場合に生じる酸化ストレス）の診断方法は、医薬品投与前と医薬品投与後の個体から採血する工程と、上記いずれかの測定方法によって採血した血液における本発明に係るマーカーの濃度を測定する工程と、そのマーカーの濃度を、一以上の正常個体の血液におけるマーカー濃度と比較する工程と、を含むことを特徴とする。ここで、医薬品は如何なる種類でもよい。【００３８】
ここで、マーカーの濃度を測定する工程は、個体から採取した血液を個別に測定することも、複数の個体から採取した血液のプールを測定することも含む。また、測定されたマーカーの濃度を比較する工程は、各測定で得られた濃度を一つずつ比較することも、各測定で得られた濃度の積算値あるいは平均値を比較することも含む。【００３９】
組織中の酸化ストレスを検出するために、マーカーを用いることのできる哺乳動物は、組織における酸化ストレスに従い、血中で本発明に係るマーカーが測定できる哺乳類であれば制限はなく、ヒトであることが好ましい。【００４０】
この診断方法に用いられる血液を採取する哺乳動物は特に制限がないが、上記マーカーのうち少なくとも一つがその血液中に存在する哺乳動物であることが好ましく、マウスやラットなどのげっ歯類や、ヒト、サル、イヌであることが、より好ましい。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、血液中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度やＡＳＴ、ＡＬＴの値などを測定することによって、健常者（Ｃ）、薬剤性肝障害（ＤＩ）、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、肝臓がん（ＨＣＣ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、単純脂肪肝（ＳＳ）などの肝臓疾患を迅速に特定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】親電子物質と活性酸素（酸化ストレス）によってオフタルミン酸が生合成されるメカニズムを模式的に示す図
【図２】各種の肝障害患者でγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が生合成されるメカニズムを模式的に示す図
【図３】健常者（Ｃ）と肝臓がん（ＨＣＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸及びアミン）ペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図４】健常者（Ｃ）と無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図５】単純脂肪肝（ＳＳ）患者と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図６】健常者、各肝炎患者の血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の測定結果を比較して示す図
【図７】多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）モデルの開発と評価の一例の手順を示す流れ図
【図８】ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類による健常者のスクリーニング検査の精度を示す図
【図９】同じく薬剤性肝障害（ＤＩ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１０】同じく無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１１】同じく慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１２】同じくＣ型肝炎ウィルスキャリアでＡＬＴの値が正常なＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１３】同じく慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１４】同じくＣ型肝硬変（ＣＩＲ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１５】同じく肝臓がん（ＨＣＣ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１６】同じく単純脂肪肝（ＳＳ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１７】同じく非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１８】肝臓がん（ＨＣＣ）患者と胃がん（gastric cancer：ＧＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を比較して示す図
【図１９】肝臓がん（ＨＣＣ）患者を慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）患者やＣ型肝硬変（ＣＩＲ）患者から区別するためのＡＦＰとＭＬＲの箱ヒゲ図と受信者動作特性（receiver operating curve：ＲＯＣ）曲線を示す図
【図２０】ブチオニンスルホキシミン（buthionine sulfoximine：ＢＳＯ）、マレイン酸ジエチル（Diethylmaleate：ＤＥＭ）投与マウスの肝臓のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を示す図、
【図２１】同じくＡＰＡＰ投与マウスの肝臓のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を示す図
【図２２】同じくＡＰＡＰ投与マウスの血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を示す図
【図２３】健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの一部を示す図
【図２４】同じく健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの他の一部を示す図
【図２５】同じく健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの更に他の一部を示す図
【図２６】同じく健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの残りを示す図
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００４４】
前述のように、肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、酸化ストレスと深い関係があることが、知られている。そこで、健常者（Ｃ）５３名、薬剤性肝障害（ＤＩ）１０名、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）９名、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）７名、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）１０名、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）２４名、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）１０名、肝臓がん（ＨＣＣ）１９名、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）１１名、単純脂肪肝（ＳＳ）９名の血清を測定して、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法を用いて、オフタルミン酸濃度を測定した。しかし、別の物質が各肝炎患者で優位に増加していることを見出し、それらは、いずれもγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸及びアミンを示す）であることを特定した。
【００４５】
１．血清から代謝物質の抽出
健常者および各種肝炎患者から採取した血清（１００μｌ）を標準物質入りのメタノール９００μｌに入れ、酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。４００μｌの超純水、１０００μｌのクロロホルムを加えた後、４℃で５分間、４，６００ｇで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相７５０μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ−ＴＯＦＭＳおよびＬＣ−ＭＳ測定に供した。
【００４６】
２．キャピラリー電気泳動−質量分析装置（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）による血清中の代謝物測定
ＣＥ−ＴＯＦＭＳを用いて、健常者および肝炎患者の血清中の低分子代謝産物を一斉に測定した。
【００４７】
ＣＥ−ＴＯＦＭＳ分析条件
ａ．キャピラリー電気泳動（ＣＥ）の分析条件
キャピラリーには、フューズドシリカキャピラリー（内径５０μｍ、外径３５０μｍ、全長１００ｃｍ）を用いた。緩衝液には、１Ｍギ酸（ｐＨ約１．８）を用いた。印加電圧は、＋３０ｋＶ、キャピラリー温度は２０℃で測定した。試料は、加圧法を用いて５０ｍｂａｒで３秒間（約３ｎｌ）注入した。
【００４８】
ｂ．飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ）の分析条件
正イオンモードを用い、イオン化電圧は４ｋＶ、フラグメンター電圧は７５Ｖ、スキマー電圧は５０Ｖ、ＯｃｔＲＦＶ電圧は１２５Ｖに設定した。乾燥ガスには窒素を使用し、温度３００℃、圧力１０ｐｓｉｇに設定した。シース液は５０％メタノール溶液を用い、質量較正用にレゼルピン（ｍ／ｚ  ６０９．２８０７）を０．５μＭとなるよう混入し１０μｌ／ｍｉｎで送液した。レゼルピン（ｍ／ｚ  ６０９．２８０７）とメタノールのアダクトイオン（ｍ／ｚ  ８３．０７０３）の質量数を用いて得られた全てのデータを自動較正した。
【００４９】
３．液体クロマトグラフィー−質量分析装置（ＬＣ−ＭＳＭＳ）による血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類測定
高感度に測定するため、血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類はＬＣ−ＭＳＭＳを用いて測定した。
【００５０】
ａ．液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の分析条件
分離カラムには、野村化学（Nomura Chemical Co.）社製Develosil RPAQUEOUS-AR-3（内径２ｍｍ×長さ１００ｍｍ，３μｍ）を用い、カラムオーブンは３０℃に設定した。試料は１μｌ注入した。移動相Ａには０．５％ギ酸、Ｂにはアセトニトリルを用い、Ｂ液が０％（０ｍｉｎ）−１％（５ｍｉｎ）−１０％（１５ｍｉｎ）−９９％（１７ｍｉｎ）−９９％（１９ｍｉｎ）の流速０．２ｍｌ／ｍｉｎのグラジエント溶出法を用いてγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を分離した。
【００５１】
ｂ．三連四重極型質量分析計（ＱｑＱＭＳ）の分析条件
アプライドバイオシステム（Applied Biosystem）社製API3000三連四重極型質量分析計を用い、ポジティブイオンモードのＭＲＭモードで測定した。各質量分析計のパラメータを以下に示した。
【００５２】
イオンスプレー電圧：５．５ｋＶ
ネブライザガス圧力：１２ｐｓｉ
カーテンガス圧力：８ｐｓｉ
衝突ガス：８ｕｎｉｔ
窒素ガス温度：５５０℃
【００５３】
各γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類をＭＲＭ（Multiple Reaction Monitering）モードで測定するために最適化されたＭＲＭパラメータを表１に示す。
【００５４】
【表１】
2011158590.tif 000003
【００５５】
４．肝障害バイオマーカーの探索および評価
図３に健常者（Ｃ）と肝臓がん（ＨＣＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類をＬＣ−ＭＳを用いて測定した結果を示し、図４に健常者（Ｃ）と無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類をＬＣ−ＭＳを用いて測定した結果を示し、図５に単純脂肪肝（ＳＳ）患者と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類をＬＣ−ＭＳを用いて測定した結果を示す。図３、図４において、１はγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、２はγ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、３はγ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、４はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、５はγ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、６はγ−Ｇｌｕ−タウリン、７はγ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、８はγ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、９はγ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ、１０はγ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、１１はγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、１２はγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、１３はγ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、１４はγ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、１５はオフタルメート（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ−Ｇｌｙ）、１６はγ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、１７はグルタチオン酸化型（ＧＳＳＧ）、１８はγ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、１９はγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙである。多くのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が、健常者（Ｃ）に比べ肝臓がん（ＨＣＣ）患者や無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）患者で増加していること、及び、単純脂肪肝（ＳＳ）患者と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者で差があることが判明した。また他の肝障害でも、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は健常者に比べて有意に高かった。
【００５６】
図６に健常者（Ｃ）および各種の肝炎患者の血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値およびγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の測定結果を示す。図中、矢印は最大値、最小値を示し、ボックスの上が順位で２５％の値、ボックスの下が順位で７５％の値を示し、ボックス中の横線が中央値を示す。
【００５７】
従来の肝機能検査値であるＡＳＴ、ＡＬＴ値は、薬剤性肝障害（ＤＩ）、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）では上昇したが、他の肝炎では健常者の値と有意差はなかった。
【００５８】
しかし、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒなどのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類は、健常者（Ｃ）よりも薬剤性肝障害（ＤＩ）で高く、他の肝炎はさらに高値を示した。特に無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）や無症状Ｃ型肝炎キャリア（ＡＨＣ）や肝臓がん（ＨＣＣ）でも、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類は高値を示した。また詳細に見ると幾つかのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類で、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）より無症状Ｃ型肝炎キャリア（ＡＨＣ）が高かったり、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）より慢性Ｂ型肝炎（ＣＢＣ）が高かったり、同じＣ型肝炎でも無症状（ＡＨＣ）、慢性肝炎（ＣＨＣ）、肝臓がん（ＨＣＣ）と疾患が進行するにつれて、値が低くなる傾向が見られた。
【００５９】
このように、各疾患によって、ＡＳＴ、ＡＬＴと各γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の血中濃度が異なっているため、これらの成分の値を用いれば、各疾患を分けられるのではないかと考えた。そこで、各肝臓疾患を区別するためのバイオマーカーの選定を目的に多変量解析手法の多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析を行った。結果を表２〜表４に示す。
【００６０】
【表２】
2011158590.tif 000004
【表３】
2011158590.tif 000005
【表４】
2011158590.tif 000006
【００６１】
多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析では、目的変数である比率ｐに対して、ｋ個の説明変数ｘ1、ｘ2、ｘ3、…、ｘkを使って、
ｌｎ(ｐ／１−ｐ)＝ｂ0＋ｂ1ｘ1＋ｂ2ｘ2＋ｂ3ｘ3＋ … ＋ｂkｘk    ・・・（１）
というｐの回帰式を求めるが、表２〜表４中のパラメータの値が、（１）式のｂ0、ｂ1、…ｂkに入る具体的な値となる。（切片）は、定数項（ｂ0）の値を指す。
【００６２】
また、症例ごとに確率を計算するときは、例えば薬剤性肝障害（ＤＩ）のグループでは、表中の（切片）の値−４．１２をｂ0、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）の値２．３４をｂ1、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕの値−１７．９をｂ2、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕの値０．３２２をｂ3、ＡＳＴの値−０．０３４６をｂ4、ＡＬＴの値０．０５２１をｂ5、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙの値０．１１０をｂ6、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇの値３．５７をｂ7、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒの値１．２５をｂ8、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅの値７．９４をｂ9、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔの値１０．９をｂ10、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）の値−６．２１をｂ11、とし、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）の定量値をｘ1、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕの定量値をｘ2、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕの定量値をｘ3、ＡＳＴの定量値をｘ4、ＡＬＴの定量値をｘ5、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙの定量値をｘ6、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇの定量値をｘ7、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒの定量値をｘ8、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅの定量値をｘ9、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔの定量値をｘ10、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅの定量値をｘ11に代入して具体的な値を出す。推定したパラメータの標準誤差及び９５％信頼区間も表中に示す。
【００６３】
この解析結果から、健常者（Ｃ）も含めて多くの種類の肝炎患者を選択的に区別できるバイオマーカー候補が見つかった。例えば、健常者（Ｃ）を識別するバイオマーカーはＧｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎであり、これらの値によって、他の肝臓疾患と区別することが可能であることが判明した。この中でも、定量値ｘ1が１増加した場合に確率ｐがどれだけ変化するのかを表すオッズ比が１を超えて最も大きいγ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔの値が健常者（Ｃ）の判定に最も寄与している。一方、オッズ比が０であるγ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇ  ｌｕ−Ｐｈｅは、これらの物質の増加が、健常者以外（非Ｃ）と判定することに寄与している。又、図６から、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−シトルリン、メチオニンスルホキシドを用いることもできることがわかる。
【００６４】
また薬剤性肝障害（ＤＩ）のバイオマーカーは、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅであり、これらを組み合わせて、例えば多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析し、マン−ホイットニー試験のｐの値が所定値、例えば０．５より大きいことにより、他の肝臓疾患と区別することができる。この中でも、定量値ｘ1が１増加した場合に確率ｐがどれだけ変化するのかを表すオッズ比が１を超えて最も大きいγ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔの値が薬剤性肝障害（ＤＩ）の判定に最も寄与している。一方、オッズ比が０に近いγ−Ｇｌｕ−シトルリンは、その物質の増加が、健常者（Ｃ）と判定することに寄与している。ＡＳＴとＡＬＴはオッズ比がそれぞれ０．９６５９９、１．０５３４６と、変数に増加に伴うｐの変化がない１．０に近いため、寄与が小さく、省略できる可能性がある。
【００６５】
また、肝臓がん（ＨＣＣ）のバイオマーカーはγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）であり、これらを組み合わせて、例えば多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析し、ｐの値が所定値、例えば０．５より大きいことにより、他の肝臓疾患と区別することができる。この中でもオッズ比が１を超えて最も大きいγ−Ｇｌｕ−シトルリンの値が、肝臓がん（ＨＣＣ）の判定に最も寄与している。一方、オッズ比が０に近いγ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕは、この物質の増加に伴って肝臓がん以外（非ＨＣＣ）と判定することに寄与している。又、オッズ比が１に近いメチオニンスルホキシド、ＡＳＴ、ＡＬＴは、省略できる可能性がある。
【００６６】
同様に、他の疾患についても、表２〜表４に示したそれぞれのバイオマーカー候補が見つかった。
【００６７】
無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）は、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎであり、
慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）は、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）であり、
ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）は、Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）であり、
慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）は、Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓであり、
Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）は、Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）であり、
単純脂肪肝（ＳＳ）は、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎであり、
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（グルコサミン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）であった。
【００６８】
このうち、オッズ比が１に近いもの、例えば無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）を判別するときのＡＬＴ（１．０８３２５４）や、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）を判別するときのＡＬＴ（０．９５７３８８）、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）を判別するときのメチオニンスルホキシド（０．９８９４９３）、ＡＬＴ（０．９９３８０６）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）を判別するときのＡＳＴ（１．０１２４０２）、ＡＬＴ（０．９７３９２６）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を判別する時のＡＳＴ（０．９４９２３７）、ＡＬＴ（１．０３９５８３）などは省略できる可能性もある。
【００６９】
これらのバイオマーカーの寄与率は、症例データの追加によって、モデルを再学習させて、各判別に使うバイオマーカーの組み合わせと多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）モデルにおける係数の修正を行い、さらにＭＬＲモデルの精度を高めることもできる。
【００７０】
図７に、ＭＬＲモデルの開発と評価の一例の手順を示す。バイオマーカー発見段階において、２１７個の試料をクラスタリングし（ステップ１００）、大きな変化を示す要素（γ−グルタミルジペプチターゼ、メタボライト、トランスアミナーゼ）を選択した。選択した要素は、病気又は健常者の試料を他の全てのグループから区別するための重要性に従って、サポートベクトルマシン−要素選択（ＳＶＭ−ＦＳ）法により、その重要度をランク付けした（ステップ１０２）。
【００７１】
モデル開発段階において、ＭＬＲモデルを、重要度のランクが１位からＮ位以内の要素を用いて開発し、例えば１４２個のトレーニングデータを用いて式（１）の係数と定数項を決定した（ステップ１１０、１１２）。ＭＬＲの予測精度である受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の下面積（area under the receiver-operating curve：ＡＵＣ）が０．８より大きいか、Ｎが４になった場合（ステップ１１４の判定結果Ｙｅｓ）、そのモデルを最終予測変数として選択した。
【００７２】
次に、このＭＬＲモデルの予測精度を、例えば７５個の評価データを用いて評価した（ステップ１２０）。ＭＬＲモデルでトレーニングデータと評価データを予測したときの精度、すなわちＲＯＣ曲線とＡＵＣ値を図８〜図１７に示す。
【００７３】
図８〜図１７中に、ある疾患群と他のすべての疾患群を区別する多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）モデルの精度を示した。例えば、薬剤性肝障害（ＤＩ）の場合は、ＤＩとＤＩ以外全ての区別を行う。図８〜図１７で示したように、すべての疾患でＲＯＣ曲線下面積（area under the receiver-operating curve：ＡＵＣ）は、０．８５５から１．０００であり、これらのバイオマーカーによる各肝臓疾患スクリーニング検査は、高精度に各疾患を特定できることが確認された。特に、図８に示した健常者（Ｃ）、図１１に示した慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、図１２に示したＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）は、いずれもＡＵＣ＝１．０００で、本発明法により極めて高精度に特定されることがわかった。
【００７４】
５．他の疾患でのγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチドの評価
γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が他の疾患でも上昇するか確認した。図１８に肝臓がん（ＨＣＣ）患者と胃がん（ＧＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を示した。胃がん（ＧＣ）患者では、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は、健常者（Ｃ）と同等であり、肝臓がん（ＨＣＣ）患者のようなγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の増加は見られなかった。(注  ヘリコバクターピロリの感染が胃がんの原因であり、ヘリコバクターピロリの感染によって、酸化ストレスは抑制されるという報告がある（参考文献１０）。胃がんは酸化ストレスに曝されていないため、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は低いのではと推測される。)
【００７５】
図１９に、肝臓がん（ＨＣＣ）患者（個体数３２）を慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）患者（個体数３５）やＣ型肝硬変（ＣＩＲ）患者（個体数１８）と区別するためのα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）とＭＬＲの箱ヒゲ図とＲＯＣ曲線を示す。ＭＬＲモデルは、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−シトルリン、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ及びγ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅを用いている。マン−ホイットニー試験によるｐ値は、ＡＦＰ、ＭＬＲ共に０．０００１未満であった。ＡＦＰの箱ヒゲ図において、ＨＣＣグループの６プロットがプロット（＞５００ｎｇ／ｍｌ）の外であった。ＲＯＣ曲線中の値はＲＯＣ以下の面積及びその９５％信頼区間を示す。
【００７６】
また糖尿病患者でも血中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度は低く、血中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の増加は、肝臓疾患特異的に観察された。
【００７７】
６．γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の生合成機序の解明
マウスを用いて、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の生合成機序を解明した。図２（Ｂ）に示したように、活性酸素や親電子物質による酸化ストレス条件下では、これらの物質の除去のためにグルタチオンが枯渇し、それに伴い、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＣＳ）が活性化され、各種のアミノ酸が基質（出発物質）となって、γ−Ｇｌｕ−Ｘジペプチド類やγ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙトリペプチド類が生合成されることが判明した。以下に実験手順を示す。
【００７８】
ａ．ＧＣＳ阻害剤ＢＳＯおよび活性化剤ＤＥＭのマウスへの投与
一晩絶食させたオスのマウスにペントバルビタルナトリウム（体重１Ｋｇ当たり６０ｍｇ）を腹膜内注射して麻酔後、γ−グルタミルシステイン合成酵素（ＧＣＳ）阻害剤であるＢＳＯ、親電子物質（ＧＣＳ活性化剤）であるＤＥＭ、さらに健常として生理食塩水を体重１Ｋｇ当たりそれぞれ４ｍｍｏｌ／ｋｇ（ＢＳＯ８８８ｍｇ、ＤＥＭ６８８ｍｇ）を腹腔内に注射した。投与１時間後にマウスから肝臓（約３００ｍｇ）を採取した（各５回）。
【００７９】
ｂ．肝臓から代謝物質の抽出
マウスから摘出した肝臓（約３００ｍｇ）は直ちに内部標準物質入りのメタノール１ｍｌに入れ、ホモジナイズして酵素を失活させ、代謝の亢進を止めた。５００μｌの純水を加えた後、３００μｌの溶液を取り出し、２００μｌのクロロホルムを加え良く攪拌後、さらに４℃で１５分間、１５０００ｒｐｍで遠心した。静置後、分離した水−メタノール相３００μｌを分画分子量５ｋＤａの遠心限外ろ過フィルターを通過し、除タンパクした。ろ液を凍結乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水５０μｌを加え、それをＣＥ−ＴＯＦＭＳ測定に供した。
【００８０】
ｃ．酸化ストレスを示すγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類バイオマーカーの特定結果
生理食塩水（健常）、ＢＳＯ、ＤＥＭ投与後のマウスの肝臓および血清中のアミノ酸、γ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類の測定結果の一部を図１１に示す。左から、それぞれの試薬を投与したマウスの肝臓から検出されたアミノ酸（Ｘ）、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチドの定量結果、右に血清中のアミノ酸（Ｘ）、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチドの定量結果を示す。
【００８１】
例えば一番上は、Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）の結果である。肝臓中のグルタチオン量は健常に比較し、ＢＳＯ、ＤＥＭ投与マウスでは急激に減少した（ＢＳＯ投与ではγ−グルタミルシステイン合成酵素が阻害されるためグルタチオンは減少し、親電子物質ＤＥＭ投与マウスでは解毒のため消費されるからグルタチオンは減少する）。血清からグルタチオン関連物質は検出されなかった。
【００８２】
検出されたγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類が、グルタチオン生合成経路で合成されていることを以下の方法で確認した。図２に示したように、これらのペプチド類がグルタチオン生合成経路で合成されていれば、肝臓中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＧｌｙペプチドはＢＳＯ投与で（γ−グルタミルシステイン合成酵素が阻害されるため）健常より減少し、親電子物質ＤＥＭ投与で（γ−グルタミルシステイン合成酵素が活性化されるため）増加するはずである。
【００８３】
図２０に、ＢＳＯ，ＤＥＭ投与マウスの肝臓の測定結果、図２１に、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）投与マウスの肝臓の測定結果、図２２に、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）投与マウスの血清の測定結果を示す。図２０〜図２２のように、グルタチオン関連のγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、ＧＳＨ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ以外の肝臓中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類物質は、健常より、ＢＳＯ投与で減少し、ＤＥＭ投与で増加しており、確かにグルタチオン生合成経路によって生成されていることが確認された。
【００８４】
つまり、これらのγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類は、活性酸素や親電子物質などの酸化ストレスによって、グルタチオンが減少した際に肝臓内で生合成されることがわかった。
【００８５】
ｄ．スレオニン同位体による生合成経路追跡
さらにスレオニン（Ｔｈｒ）の13Ｃ、15Ｎの同位体を腹腔内投与し、親電子物質を生じて酸化ストレスを与えるＡＰＡＰを加えたところ、マウスの肝臓からＴｈｒの13Ｃ、15Ｎのγ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙが検出され、確かに、酸化ストレス条件下では、Ｔｈｒからγ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙが生合成されることが確認された。
【００８６】
一方、マウスの血清中の物質では、健常より、ＢＳＯ投与で減少し、電子物質ＤＥＭ投与で増加するγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類は、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢとオフタルミン酸（γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ−Ｇｌｙ）のみであった（図２２）。したがってマウスの場合は、親電子物質などの酸化ストレスによって、グルタチオンが減少した際に血中で増加するのは、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢとオフタルミン酸のみと考えられる。
【００８７】
しかし、各種の肝炎患者の血清測定では、γ−Ｇｌｕ−２ＡＢ、オフタルミン酸より、他のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度の方が高かった。この違いは、生物種間で、基質濃度、代謝酵素の基質特異性や活性、トランスポーターの種類、機能、発現量などが異なるからと推定される。
【００８８】
本発明による血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類測定による診断法は、肝硬変（cirrhosis）や非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの各種の肝障害の診断も可能である。
【００８９】
図２３〜図２６に、健常者（Ｃ）とＣ型肝硬変（ＣＩＲ）患者、単純脂肪肝（ＳＳ）患者、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータを示す、＊印で示すｐ値０．０５未満のＡＳＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅにより、単純脂肪肝（ＳＳ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を識別できることがわかる。
【００９０】
今回は、各種の肝障害のマーカー候補のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の組み合わせの例を記したが、それらに特定されるわけではなく、今後さらに多検体の精査を行うことで、バイオマーカー候補の種類組み合わせは変更される場合もある。
【００９１】
また今回は血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類測定には、ＬＣ−ＭＳ法を用いたが、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、チップＬＣや、チップＣＥ、それらに質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＣＥ−ＭＳ法、各種のＭＳ単独の測定法、ＮＭＲ法、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を蛍光物質やＵＶ吸収物質に誘導体化してから測定する方法、抗体を作成してＥＬＩＳＡ法などで測定するなど、測定法にこだわらず、あらゆる分析法で測定することが可能である。
【００９２】
本発明に係る医薬品の検定方法は、哺乳動物において、その医薬品が投与された哺乳動物から採取された血液と、投与されていない哺乳動物から採取された血液について、本発明のマーカーの濃度を測定する方法のことである。なお、この検定方法に用いられる血液を採取する哺乳動物は特に制限がないが、上記マーカーのうち少なくとも一つがその血液中に存在する哺乳動物であることが好ましく、マウスやラットなどのげっ歯類や、ヒト、サル、イヌであることが、より好ましい。
【００９３】
ここで、医薬品の親電子物質毒性と活性酸素（酸化ストレス）に対する治療薬としての有効性を検定する場合、医薬品の適用となる対象疾病は、酸化ストレスによって生じる疾病であれば限定されず、上述したような、マーカーの使用対象となる疾病と同様である。また、医薬品の投与によって生じる酸化ストレスの強さを検定する場合、医薬品の種類は全く限定されず、例えば、有害薬物も医薬品に含まれる。
【００９４】
なお、本発明に係る検定方法の目的は、酸化ストレスによって生じた疾病に対する治療薬として医薬品の有効性を検定すること、及び医薬品の投与によって生じる酸化ストレスの強さを検定することであるが、具体的には、様々な局面で用いられる。以下に、代表的な使用例を述べるが、本発明の検定方法は、これらの例に限定されない。
【００９５】
（１）治療薬としての有効性の検定
以下に、肝炎に対する使用例を述べるが、本発明の検定方法は、これらの例に限定されない。
【００９６】
（１−１）特定個体における薬効検定
例えば、本発明の検定方法を用い、ある肝炎治療薬が、特定の患者の肝炎を治療するのに有効であるかどうか、判定することができる。まず、肝炎に罹患した患者に肝炎治療薬を投与する前後で、その患者から血液を採取する。続いて、その血液において、肝炎診断マーカーの濃度を測定する。こうして得られた血液中のマーカー濃度を、肝炎治療薬の投与前後で比較する。この時、肝炎治療薬投与後の血液中マーカー濃度が、投与前と比較して有意に低下していれば、肝炎治療薬がその患者の肝炎を治療するのに有効であると判断できる。
【００９７】
（１−２）一般的な薬効検定
さらに、本発明の検定方法を複数のヒト個体に適用することにより、その医薬品の、肝炎治療薬としての一般的な有効性を検定することも可能である。
【００９８】
例えば、肝炎を患った複数のヒトにおいて、肝炎治療薬の投与前後で肝炎診断マーカーの濃度を比較することにより、その物質の治療薬としての普遍的効果を調べることができる。
【００９９】
あるいは、別態様として、２つの群の間で医薬品としての効果を比較してもよい。まず、肝炎に罹患している患者を２つの群に分ける。一方の群の患者には肝炎治療薬を投与し、もう一方の群の患者にはその治療薬を投与しないか、またはプラセボを投与する。これらの２つの群の患者から血液を採取する。続いて、その血液において、肝炎診断マーカーの濃度を測定する。さらに、この測定により得られた、血液中のマーカー濃度を、２つの群の間で比較する。
【０１００】
なお、「群」は一個体しか含まなくても、複数の個体を含んでもよく、２つの群の個体数が同じであっても、異なっていてもよい。測定は、同じ群の個体から採取した血液をプールし、その血液中のマーカー濃度を測定してもよいが、各個体の血液において別々にマーカー濃度を測定することが好ましい。
【０１０１】
医薬品の投与の前後や投与の有無といった、複数の血液を含むグループ間でのマーカー濃度の比較は、一血液ずつを対にして比較しても、同じグループに属する複数の血液におけるマーカー濃度の積算値や平均値をグループ間で比較してもよい。この比較は当業者に周知のいずれの統計学的方法を用いて行うことができる。このように比較した結果、治療薬の投与後において、投与前と比較して血液中マーカー濃度が有意に低下していたり、治療薬の投与群において、非投与群と比較して有意に低下していたりすれば、その治療薬が肝炎の治療に有効であると判断できる。また、低下の度合いによって、どの程度の有効性を有するかも判断できる。
【０１０２】
このように、肝炎治療薬としての一般的な有効性を検定することによって、肝炎治療薬のスクリーニングを行うことができる。また、複数の肝炎治療薬を用い、各肝炎治療薬の異なる濃度について治療効果を調べ、濃度に依存した薬効の違いを比較することにより、各肝炎治療薬の強さを調べることも可能である。
【０１０３】
（２）酸化ストレスの強さの検定
酸化ストレスが強いと副作用が強く現れるため、以下に、一例として、医薬品の副作用に対する使用例を述べるが、本発明の検定方法は、これらの例に限定されない。
【０１０４】
（２−１）特定個体における副作用の強さの検定
本発明の検定方法を用い、ある医薬品が、特定の哺乳動物個体に副作用をもたらすかどうかを判定することができる。まず、個体に治療用の医薬品を投与する前後にその個体から血液を採取する。続いて、その血液において、酸化ストレス検出マーカーの濃度を測定する。こうして得られた血液中のマーカー濃度を、医薬品の投与前後で比較する。この時、医薬品投与後の血液中マーカー濃度が、投与前と比較して有意に増加していれば、投与した医薬品がその個体で酸化ストレスを生じ、その個体に副作用をもたらしていると判断できる。
【０１０５】
（２−２）一般的な副作用の強さの検定
さらに、本発明の検定方法を複数の哺乳動物個体に適用することにより、ある医薬品の、一般的な副作用の強さを検定することも可能である。
【０１０６】
例えば、ある疾患を患った複数の個体において、当該疾患治療用医薬品の投与前後で酸化ストレス検出マーカーの濃度を比較することにより、その医薬品一般的な副作用の強さを調べることができる。
【０１０７】
あるいは、別態様として、２つの群の間で副作用の強さを比較してもよい。まず、ある疾患に罹患している哺乳動物を２つの群に分ける。一方の群の個体には当該疾患治療用医薬品を投与し、もう一方の群の個体にはその医薬品を投与しないか、またはプラセボを投与する。これらの２つの群の個体から血液を採取する。続いて、その血液において、酸化ストレス検出マーカーの濃度を測定する。さらに、この測定により得られた、血液中のマーカー濃度を、２つの群の間で比較する。なお、「群」は一個体しか含まなくても、複数の個体を含んでもよく、２つの群の個体数が同じであっても、異なっていてもよい。測定は、同じ群の個体から採取した血液をプールし、その血液中のマーカー濃度を測定してもよいが、各個体の血液において別々にマーカー濃度を測定することが好ましい。
【０１０８】
グループ間でのマーカー濃度の比較は、一血液ずつを対にして比較しても、同じグループに属する複数の血液におけるマーカー濃度の積算値や平均値をグループ間で比較してもよい。この比較は当業者に周知のいずれの統計学的方法を用いて行うことができる。このように比較した結果、医薬品の投与後において、投与前と比較して血液中マーカー濃度が有意に上昇していたり、医薬品の投与群において、非投与群と比較して有意に上昇したりすれば、その医薬品に副作用があると判断できる。
【０１０９】
このように、医薬品としての副作用の強さを検定することによって、副作用の弱い医薬品のスクリーニングを行うことができる。また、複数の医薬品を用い、各医薬品の異なる濃度について医薬品としての効果を調べるとともに、濃度に依存した副作用の違いを比較することにより、各医薬品の治療薬としての適性を比較することも可能である。
【０１１０】
上述したように、本発明の酸化ストレス検出マーカーは、肝臓疾患治療用医薬品の検定あるいは医薬品の副作用の強さの検定、及び疾病の診断などに用いることができる。その時、複数のマーカーを用いることによって、検定精度や診断精度を上げることができる。また、本発明のマーカー以外の検定方法や診断方法を組み合わせても構わない。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明で発見した生体で生じた酸化ストレスによってグルタチオンの枯渇を示すγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチドバイオマーカーは、各種の肝障害患者の迅速なスクリーニング法として有用であるばかりでなく、生体の酸化ストレスを把握するマーカーとして、幅広い生命科学分野で使用することが可能である。
【図２】
2011158590.tif 000007
【図３】
2011158590.tif 000008
【図４】
2011158590.tif 000009
【図５】
2011158590.tif 000010
【図６】
2011158590.tif 000011
【図７】
2011158590.tif 000012
【図８】
2011158590.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2011158590.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2011158590.tif 000019
【図１５】
2011158590.tif 000020
【図１６】
2011158590.tif 000021
【図１７】
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【図１８】
2011158590.tif 000023
【図１９】
2011158590.tif 000024
【図２０】
2011158590.tif 000025
【図２１】
2011158590.tif 000026
【図２２】
2011158590.tif 000027
【図２３】
2011158590.tif 000028
【図２４】
2011158590.tif 000029
【図２５】
2011158590.tif 000030
【図２６】
2011158590.tif 000031
【図１】
2011158590.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成24年11月22日(2012.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
しかし、発明者らは、各肝炎患者の血清中で著しく増加する物質を発見し、それらがγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸又はアミンを示す）であることを同定した。図２に、各種の肝障害患者でγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が生合成されるメカニズムを模式的に示す。さらに血清中の肝機能マーカーであるＡＳＴとＡＬＴの値とγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類を用いて多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）モデルによる多変量解析を行うことにより、各種の肝炎患者を他と区別することに成功した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明は、上記知見に基づいてなされたもので、哺乳動物の組織中の酸化ストレスを検出するためのマーカーであって、複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドと、グルコサミン、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも一つとの組合せであることを特徴とする肝臓疾患マーカーである。ここで、複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドの組合せは、多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析により選ぶことができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
又、後出表２から明らかなように、オッズ比が１に近いＡＳＴ及びＡＬＴを除いた、少なくともγ−Ｇｌｕ−Ｔａｕｒｉｎｅ（タウリン）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とする薬剤性肝障害（ＤＩ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも１つを加えて、精度を高めることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
又、後出表４から明らかなように、オッズ比が１に近いＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、ＡＳＴ及びＡＬＴを除いた、少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（シトルリン）を含む組合せであることを特徴とする肝臓がん（ＨＣＣ）識別用の肝臓疾患マーカーである。更に、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（メチオニンスルホキシド）、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも１つを加えて、精度を高めることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明は、又、肝臓疾患マーカーとして、サンプル中の複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドと、グルコサミン、メチオニンスルホキシド、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも一つとの組合せを測定することを特徴とする肝臓疾患マーカー測定方法である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
又、サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、試料中の複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドと、グルコサミン、メチオニンスルホキシド、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも一つとの組合せを、肝臓疾患マーカーとして測定するための分析手段と、を備えたことを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定装置である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１】親電子物質と活性酸素（酸化ストレス）によってオフタルミン酸が生合成されるメカニズムを模式的に示す図
【図２】各種の肝障害患者でγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類が生合成されるメカニズムを模式的に示す図
【図３】健常者（Ｃ）と肝臓がん（ＨＣＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図４】健常者（Ｃ）と無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図５】単純脂肪肝（ＳＳ）患者と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類のＬＣ−ＭＳ測定結果を比較して示す図
【図６】健常者、各肝炎患者の血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の測定結果を比較して示す図
【図７】多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）モデルの開発と評価の一例の手順を示す流れ図
【図８】ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類による健常者のスクリーニング検査の精度を示す図
【図９】同じく薬剤性肝障害（ＤＩ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１０】同じく無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１１】同じく慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１２】同じくＣ型肝炎ウィルスキャリアでＡＬＴの値が正常なＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１３】同じく慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１４】同じくＣ型肝硬変（ＣＩＲ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１５】同じく肝臓がん（ＨＣＣ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１６】同じく単純脂肪肝（ＳＳ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１７】同じく非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）のスクリーニング検査の精度を示す図
【図１８】肝臓がん（ＨＣＣ）患者と胃がん（gastric cancer：ＧＣ）患者の血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類の濃度を比較して示す図
【図１９】肝臓がん（ＨＣＣ）患者を慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）患者やＣ型肝硬変（ＣＩＲ）患者から区別するためのＡＦＰとＭＬＲの箱ヒゲ図と受信者動作特性（receiver operating curve：ＲＯＣ）曲線を示す図
【図２０】ブチオニンスルホキシミン（buthionine sulfoximine：ＢＳＯ）、マレイン酸ジエチル（Diethylmaleate：ＤＥＭ）投与マウスの肝臓のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を示す図
【図２１】同じくＡＰＡＰ投与マウスの肝臓のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を示す図
【図２２】同じくＡＰＡＰ投与マウスの血清中のγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙの定量結果を示す図
【図２３】健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの一部を示す図
【図２４】同じく健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの他の一部を示す図
【図２５】同じく健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの更に他の一部を示す図
【図２６】同じく健常者（Ｃ）、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）、単純脂肪肝（ＳＳ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のデータの残りを示す図
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
前述のように、肝炎、肝硬変、肝臓がんなど多くの肝障害は、酸化ストレスと深い関係があることが、知られている。そこで、健常者（Ｃ）５３名、薬剤性肝障害（ＤＩ）１０名、無症状Ｂ型肝炎キャリア（ＡＨＢ）９名、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）７名、ＨＣＶ陽性ＡＬＴ持続正常者（ＣＮＡＬＴ）１０名、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）２４名、Ｃ型肝硬変（ＣＩＲ）１０名、肝臓がん（ＨＣＣ）１９名、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）１１名、単純脂肪肝（ＳＳ）９名の血清を測定して、キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ−ＴＯＦＭＳ）法を用いて、オフタルミン酸濃度を測定した。しかし、別の物質が各肝炎患者で優位に増加していることを見出し、それらは、いずれもγ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド類（注：Ｘはアミノ酸又はアミンを示す）であることを特定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
ｃ．酸化ストレスを示すγ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類バイオマーカーの特定結果
生理食塩水（健常）、ＢＳＯ、ＤＥＭ投与後のマウスの肝臓および血清中のアミノ酸、γ−Ｇｌｕ−Ｘ、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチド類の測定結果の一部を図２０〜図２２に示す。図２０、２１は、それぞれの試薬を投与したマウスの肝臓から検出されたアミノ酸（Ｘ）、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチドの定量結果、図２２は血清中のアミノ酸（Ｘ）、γ−Ｇｌｕ−Ｘペプチド、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙペプチドの定量結果を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
哺乳動物の組織中の酸化ストレスを検出するためのマーカーであって、
複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドと、
グルコサミン、メチオニンスルホキシド、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも一つとの組合せであることを特徴とする肝臓疾患マーカー。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とする薬剤性肝障害識別用の肝臓疾患マーカー。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
少なくともγ−Ｇｌｕ−タウリン、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−シトルリンを含む組合せであることを特徴とする肝臓がん識別用の肝臓疾患マーカー。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
肝臓疾患マーカーとして、サンプル中の複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドと、グルコサミン、メチオニンスルホキシド、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも一つとの組合せを測定することを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定方法。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
サンプルから分析に適した試料を作成する手段と、
試料中の複数のγ−Ｇｌｕ−Ｘ（Ｘはアミノ酸又はアミン）ペプチドと、グルコサミン、メチオニンスルホキシド、ＡＳＴ、ＡＬＴの少なくとも一つとの組合せを、肝臓疾患マーカーとして測定するための分析手段と、
を備えたことを特徴とする肝臓疾患マーカーの測定装置。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
医薬品の投与前及び投与後に採取された血液において、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の肝臓疾患マーカーの濃度を測定する工程と、
前記測定の結果を、前記医薬品の投与前の血液と投与後の血液とで比較する工程と、
を含むことを特徴とする医薬品の検定方法。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2011158590.tif 000033
【国際調査報告】
2011158590.tif 000034
2011158590.tif 000035