(57)【要約】【課題】増強ラマン散乱用金属ナノ粒子において特にその増強電場強度を粒子間距離のコントロールによって制御し、非常に強いラマン散乱特性を付与することにより、高感度なラマン散乱センシングを提供する。【解決手段】金属ナノ粒子を有機分子を介して連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合された金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなる、増強電場においてラマン活性分子からの増強されたラマン散乱光を発するものである分子センシング用金属ナノ粒子材料並びに該分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法及び該分子センシング用金属ナノ粒子材料を用いた分子センシング。【選択図】図１
2011158829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属ナノ粒子を有機分子を介して連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合された金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなる、増強電場においてラマン活性分子からの増強されたラマン散乱光を発するものである分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項２】
前記金属ナノ粒子が、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外光領域乃至赤外光領域に有する金属元素よりなる、請求項１に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項３】
前記金属ナノ粒子が、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均粒子径を有する粒子である、請求項１又は請求項２記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項４】
前記金属ナノ粒子集合体において、連結された金属ナノ粒子がその両隣の金属ナノ粒子との間で一直線上に結合されていない、請求項１乃至請求項３のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項５】
前記有機分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む、請求項１乃至請求項４のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項６】
前記有機分子が、３乃至４０の塩基数を有し、且つ、チオール基又はアミノ基を末端に有する核酸である、請求項５に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項６に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項８】
前記ラマン活性分子は前記有機分子に結合してなる、請求項１乃至請求項７のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項９】
前記金属ナノ粒子が、少なくとも１個以上の分子認識プローブ分子をその金属ナノ粒子表面に結合してなる、請求項１乃至請求項８のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項１０】
前記分子認識プローブ分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を介して分子認識プローブが結合された分子である、請求項１乃至請求項９のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料。
【請求項１１】
ａ）基体となる一本鎖核酸鎖（１）に、その核酸鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖核酸鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性核酸鎖を得る工程、
ｂ）前記変性核酸鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性核酸鎖を結合させた後、６０〜１００℃に加熱して変性核酸鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖核酸鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記核酸鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖核酸鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖核酸鎖（２）と一本鎖核酸鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
さらに、
前記ａ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
請求項１乃至請求項１０のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
【請求項１２】
ａ）基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）に、そのＤＮＡ鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性ＤＮＡ鎖を得る工程、
ｂ）前記変性ＤＮＡ鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性ＤＮＡ鎖を結合させた後、６０〜１００℃に加熱して変性ＤＮＡ鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖ＤＮＡ鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記ＤＮＡ鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖ＤＮＡ鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
さらに、
前記ａ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
請求項１乃至請求項１０のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
【請求項１３】
前記ｄ）工程において、該一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）の１当量に対して、該一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を２当量用いて金属ナノ粒子集合体を製造する、請求項１２に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
【請求項１４】
前記一本鎖ＤＮＡ鎖（２）は、互いに相補性を有する部位を持たないものである、請求項１２又は請求項１３に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
【請求項１５】
さらに、ａ）乃至ｄ）のうちいずれかの工程において、
ｅ）核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む分子鎖の一方の末端に分子認識プローブを有し、他方の末端にチオール基又はアミノ基を有する分子認識プローブ分子と、金属ナノ粒子とを反応させて、金属ナノ粒子表面に、チオール基又はアミノ基を介して末端に分子認識プローブ分子を結合させる工程
を含む、
請求項１２乃至請求項１４のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法。
【請求項１６】
請求項１乃至請求項１０のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料を、検体と接触させた後、検体のラマン散乱測定を行うことを特徴とする、分子センシング方法。
【請求項１７】
前記分子センシング用金属ナノ粒子材料が基板上に固定されてなる、請求項１６に記載の分子センシング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は表面プラズモン現象を応用した表面増強ラマン散乱法に用いる、分子センシング用金属ナノ粒子材料並びにその製造方法に関する。
詳細には、可視光領域において表面プラズモン吸収を有する金属ナノ粒子同士をＤＮＡなどの有機分子により所定距離を設けて連結した金属ナノ粒子集合体よりなる分子センシング用金属ナノ粒子材料である。
【背景技術】
【０００２】
金属表面に吸着した有機分子に対して特異的に見出される特性として、表面増強ラマン散乱（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＥＲＳ）がある。
ＳＥＲＳとは、具体的には、金属粒子同士が近接することにより、該粒子表面上で共鳴効果により、局在表面プラズモンを誘起し、さらに局在表面プラズモンが増強電場を誘起し、該増強電場中に金属粒子に吸着して存在してなるラマン活性分子（ローダミン６Ｇなどの色素有機分子）からのラマン散乱が増強された現象をいう。
このＳＥＲＳが注目される１つの理由には、単一分子や単一粒子からでも振動スペクトルを得ることができることにある。これにより生体分子認識など微量化学物質の検出が可能となるため、種々の研究が現在盛んに検討されている。（非特許文献１、２，３）【０００３】
そもそもラマン散乱は、その特性上、このような微量検出には全く不向きな物理現象である。その理由は次のように考えられる。
ラマン散乱は測定分子とレーザー光から放出される光子（フォトン）の衝突に起因している。たとえば、１秒間に波長４８８ｎｍアルゴンレーザーから放出されるフォトン数は１Ｗ出力でおよそ２．５×１０18個と見積もることができる。このうち分子と衝突できるフォトンは１０13〜１０15個程度で、大多数のフォトンは素通りする。このわずかに衝突するフォトンの衝突モードには、弾性衝突と非弾性衝突の２種類がある。前者は衝突の間に分子とフォトン間でのエネルギーの授受がないもので、この衝突モードで起こる散乱を「レイリー散乱」と呼んでいる。レイリー散乱ではフォトンと分子間のエネルギー授受が無いため散乱光の振動数はあくまでも入射光の波長に等しいことになる。上記のわずかに起こる分子とフォトンの衝突の大部分がこの弾性散乱であり、このため散乱光の大部分がレイリー散乱である。
一方、非弾性散乱は弾性散乱とは逆にフォトンは分子と衝突し、そのエネルギーを分子へと移動する。このため散乱光の振動数は、レイリー散乱とは対照的に入射光の振動数とは異なってくる。このような散乱をラマン散乱と呼んでいる。特にラマン散乱光が入射光の振動数よりも大きい場合（フォトンが分子からエネルギーを得る場合）をアンチストークスラマン散乱、逆にフォトンが分子にエネルギーを与える場合をストークスラマン散乱と呼ぶ。このような非弾性衝突を起こすフォトンは衝突フォトン全体のおよそ１／１０7程度である。このように入射フォトン数に対して非弾性衝突を起こしラマン散乱を引き起こすフォトン数は非常に少ない。このため検出感度が低く、今まで分析手段として用いられることが少なかった。
しかし、１９７０年代に入るとＷ．Ｈｏｌｚｅｒら（非特許文献４）による気体ハロゲン分子の共鳴ラマン散乱スペクトルの測定など多数の共鳴ラマンに関する研究が報告され始めた。この共鳴ラマン散乱による散乱強度の増大（通常共鳴ラマン効果による強度増強は１０3〜１０5倍程度）に伴いラマン散乱は脚光を浴びるようになった。共鳴ラマンとは、ある分子の吸収帯に重なる波長の励起光を用いてラマン散乱を測定したときに、吸収帯の原因となる発色団部分の振動に由来するラマンバンドの強度が著しく増大する効果で、数μＭ程度の濃度の色素のラマンスペクトル測定を可能にした。
その後１９７７年に更にＰ．Ｐ．Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅら（非特許文献５）とJ．Ａ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら（非特許文献６）のグループが独立に表面増強ラマン散乱を見出した。実際は、それより３年前にＦｌｅｉｓｃｈｍａｎｎらのグループがこの現象を観測していたが、彼らは散乱断面積が共鳴ラマン効果同様に増大していることに気がつかなかったようである。【０００４】
ＳＥＲＳは一般には金属電極、ゾル、結晶、蒸着膜、半導体の表面上に吸着したある種の分子のラマン散乱強度が、その分子が溶液中にあるときよりも著しく増強される現象をいうが、現在でもその現象のメカニズムに関しては不明な点が多い。金、銀、銅、白金、ニッケルなどでＳＥＲＳは確認されているが、現在分かっているＳＥＲＳの特徴は、特に、銀や金において増強効果が大きいことである。その代表的物性は次のような依存性を示す。
１）金属表面の粗さがＳＥＲＳ発現に何らかの関与をしている。
２）ＳＥＲＳスペクトルは一般に明確な波長依存性を示す。
３）ＳＥＲＳ強度は金属表面に吸着した分子の配向に依存する。また、金属表面からの距離に依存する。
ＳＥＲＳ発現のメカニズムは現在２つの考え方が提案されている。１つは表面プラズモンモデルである。このモデルは反射スペクトルを励起光が金属表面に当たることによって生じる表面プラズモンの吸収であるとみなし、吸着分子の分子振動とこの表面プラズモン励起とのカップリングによって発現するものと考えるものである。もう１つのモデルは、電荷移動モデルと呼ばれるもので、反射スペクトルを金属表面と分子が形成する錯体の吸収と考え、この吸収に起因する共鳴ラマン効果によりＳＥＲＳが発現するという考え方である。いずれにせよ、現在そのメカニズムはまだ解明されていないにしても、先に説明した共鳴ラマン条件とＳＥＲＳの条件が重なった表面増強ラマン散乱では散乱強度が１０11〜１０14倍程度にも増大することが明らかとなり、単一分子分光の可能性が大きく広がったのである。この感度の高さゆえ微量定性分析には既に応用され始めている。【０００５】
これまで提案されたＳＥＲＳを応用したナノ粒子としては、例えば低分子芳香環化合物を直接静電相互作用によりナノ粒子表面に吸着させる方法や、チオール末端を有するローダミン、ナフタレン、キノリンなどレポーター分子をナノ粒子表面に吸着させるものなどが（非特許文献７）、分子認識センサーやｐＨセンサーとして応用されている（非特許文献８）。
ＳＥＲＳ粒子の合成法としてはナノフレーク状金属複合体材料合成法（特許文献１参照）や、ナノ多孔質体表面にローダミン６Ｇなど色素（ラマン活性分子）を吸着させる方法（特許文献２参照）、また金ナノ粒子を応用した例では基板上に金ナノロッドを固定し、その表面分子の増強ラマン散乱を分析に用いるもの（特許文献３参照）などが知られている。
また、複数の会合した粒子の表面、および複数の金属粒子が最初に接触した複数の接合部に吸着した、複数のラマン活性有機化合物を含む金属クラスターを形成する、いくつかの融合または会合した複数の金属粒子を含む複数の合成有機無機ナノクラスター（特許文献４参照）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００９−０６１５８０号公報
【特許文献２】特開２００８−１８４６７１号公報
【特許文献３】特開２００５−２３３６３７号公報
【特許文献４】特表２００７−５１４１６９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ACS Nano 2(4) 612-616,(2008)
【非特許文献２】Anal Chem, 79,6927-6932,(2007)
【非特許文献３】Anal Chem, 77, 6134-6139, (2005)
【非特許文献４】J.Chem.Phys. 52,399 (1970)
【非特許文献５】J.Electroanal Chem.,84,1 (1977)
【非特許文献６】J.Am.Chem.Soc.,99,5215,(1977)
【非特許文献７】Langmuir 23,10539-10545(2007)
【非特許文献８】Nano Lett. Vol7, Nｏ9 2819-2823(2007)
【非特許文献９】J.Am.Chem.Soc. Vｏl131, 7518-7519 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
近年ＳＥＲＳは種々の応用が検討されているものの、使用できる基板や表面粗さに制限があるだけでなく、更にそのラマン強度はラマン活性分子の配向性に大きく依存することから、多くの場合測定箇所による大きなばらつきを生ずることとなり、定量性を求めた解析が非常に難しいなどの欠点がある。
更に従来提案されている色素などの低分子系ラマン活性分子を用いた場合、該ラマン活性分子のナノ粒子への吸着プロセス（静電的吸着過程）において、ナノ粒子の表面電荷が変化し、粒子間の表面電荷反発が弱まるために起こるとされるナノ粒子の凝集が起きる点が問題となる。ナノ粒子の凝集は、ラマン活性分子の脱離を引き起こすだけでなく、分子認識前にラマン活性分子の吸着したナノ粒子の凝集が起こると、分子認識前にも関わらずＳＥＲＳ信号が出てしまうため誤認識につながる。特に生体環境下でこれら粒子を用いる場合、高塩濃度下での分散安定性確保は必須であり、凝集問題に対する対策が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、金属ナノ粒子同士を有機分子を用いてあらかじめ一定間隔となるように連結させた金属ナノ粒子集合体を形成することにより、金属ナノ粒子の凝集や、金属ナノ粒子の濃度分布の偏りを抑制でき、金属ナノ粒子同士の近接界面に生成する増強電場から得られる表面増強ラマン散乱光を安定に検出できることを見出した。
また本発明者らは、金属ナノ粒子同士を連結する有機分子として特にＤＮＡを用いることにより、金属ナノ粒子間の距離を所望の距離に為すことが容易にできるだけでなく、金属ナノ粒子の集合体を容易に製造することができることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち本発明は、第１観点として金属ナノ粒子を有機分子を介して連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合された金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなる、増強電場においてラマン活性分子からの増強されたラマン散乱光を発するものである分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第２観点として、前記金属ナノ粒子が、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外光領域乃至赤外光領域に有する金属元素よりなる、第１観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第３観点として、前記金属ナノ粒子が、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均粒子径を有する粒子である、第１観点又は第２観点記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第４観点として、前記金属ナノ粒子集合体において、連結された金属ナノ粒子がその両隣の金属ナノ粒子との間で一直線上に結合されていない、第１観点乃至第３観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第５観点として、前記有機分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む、第１観点乃至第４観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第６観点として、前記有機分子が、３乃至４０の塩基数を有し、且つ、チオール基又はアミノ基を末端に有する核酸である、第５観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第７観点として、前記核酸がＤＮＡである、第６観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第８観点として、前記ラマン活性分子は前記有機分子に結合してなる、第１観点乃至第７観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第９観点として、前記金属ナノ粒子が、少なくとも１個以上の分子認識プローブ分子をその金属ナノ粒子表面に結合してなる、第１観点乃至第８観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第１０観点として、前記分子認識プローブ分子が、末端にチオール基又はアミノ基を有し、且つ、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を介して分子認識プローブが結合された分子である、第１観点乃至第９観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料に関する。
第１１観点として、ａ）基体となる一本鎖核酸鎖（１）に、その核酸鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖核酸鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性核酸鎖を得る工程、
ｂ）前記変性核酸鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性核酸鎖を結合させた後、６０〜１００℃に加熱して変性核酸鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖核酸鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記核酸鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖核酸鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖核酸鎖（２）と一本鎖核酸鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
さらに、
前記ａ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖核酸鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
第１観点乃至第１０観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
第１２観点として、ａ）基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）に、そのＤＮＡ鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性ＤＮＡ鎖を得る工程、
ｂ）前記変性ＤＮＡ鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性ＤＮＡ鎖を結合させた後、６０〜１００℃に加熱して変性ＤＮＡ鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖ＤＮＡ鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記ＤＮＡ鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖ＤＮＡ鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程、
さらに
前記ａ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（３）、又は、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む、
第１観点乃至第１０観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
第１３観点として、前記ｄ）工程において、該一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）の１当量に対して、該一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を２当量用いて金属ナノ粒子集合体を製造する、第１２観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
第１４観点として、前記一本鎖ＤＮＡ鎖（２）は、互いに相補性を有する部位を持たないものである、第１２観点又は第１３観点に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
第１５観点として、さらに、ａ）乃至ｄ）のうちいずれかの工程において、
ｅ）核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素を含む分子鎖の一方の末端に分子認識プローブを有し、他方の末端にチオール基又はアミノ基を有する分子認識プローブ分子と、金属ナノ粒子とを反応させて、金属ナノ粒子表面に、チオール基又はアミノ基を介して末端に分子認識プローブ分子を結合させる工程
を含む、
第１２観点乃至第１４観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法に関する。
第１６観点として、第１観点乃至第１０観点のうちいずれか一項に記載の分子センシング用金属ナノ粒子材料を、検体と接触させた後、検体のラマン散乱測定を行うことを特徴とする、分子センシング方法に関する。
第１７観点として、前記分子センシング用金属ナノ粒子材料が基板上に固定されてなる、第１６観点に記載の分子センシング方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、金属ナノ粒子が所定間隔で連結された金属ナノ粒子集合体からなるため、金属ナノ粒子の界面に形成される増強電場強度を一定にすることができ、従来技術で問題とされたＳＥＲＳ粒子の凝集や濃度部分布の偏りによる誤認検出を防止でき、また、表面状態によるＳＥＲＳ信号の変動を避けることができるため、表面増強ラマン散乱光の安定な検出につながる。
また、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、該金属ナノ粒子集合体の金属ナノ粒子の表面にビオチンなどの分子認識プローブを連結させることにより、目的検体を認識することができる。
そして、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料を用いることにより、通常のラマン散乱強度の１０の１１乗倍にも達する表面増強ラマン散乱の強度を安定に保つことが可能となるため、極めて濃度の薄い検体に対しても有効な検出が可能となる。【００１２】
さらに、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法によれば、表面増強ラマン散乱活性粒子である金、銀、銅、白金又はニッケルなどの金属ナノ粒子を、末端にチオール基又はアミノ基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖で修飾したものと、該ＤＮＡ鎖と相補鎖の関係にある末端にチオール基を有する別の一本鎖ＤＮＡで鎖修飾したものとを混ぜ合わせるだけで、容易に金属ナノ粒子間に結合が形成され、金属ナノ粒子集合体を製造できる。
また、金属ナノ粒子間の距離は、ＤＮＡの塩基数を調整することにより自由にコントロールできるため、最も強い増強電場を発生させる距離に金属ナノ粒子同士を連結させた金属ナノ粒子集合体を製造できる。
更に該金属ナノ粒子集合体中の金属ナノ粒子表面に、目的検体に対して強い相互作用を有する分子（分子認識プローブ分子）を連結させることにより、目的検体の認識が可能なＳＥＲＳ活性分子認識粒子が合成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造スキームを表す図である。
【図２】図２は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図３】図３は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図４】図４は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子と５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子状態の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図５】図５は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’を固定した金ナノ粒子の原子間力顕微鏡像を示す図である。
【図６】図６は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子と５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の原子間力顕微鏡像を示す図である。
【図７】図７は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’を固定した金ナノ粒子の近接場顕微鏡による形状及び電場測定を示す図である。
【図８】図８は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子と５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の近接場顕微鏡による形状及び電場測定を示す図である。
【図９】図９は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子と５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。
【図１０】図１０は、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子と５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子の混合後の粒子の温度変化によるラマン散乱強度変化の説明図を示す図である。
【図１１】図１１は、ビオチンをセンシングプローブとして表面に導入した５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’表面修飾金ナノ粒子と、５’−ＨＳ−Ｃ６−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’表面修飾金ナノ粒子によるストレプトアビジンの分子認識を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例１で得た特定間距離に連結した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図１３】図１３は、特定間距離に連結した金ナノ粒子を用いたストレプトアビジンの分子認識結果を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例２で得た特定間距離に連結した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図１５】図１５は、例８で得たチオール末端ＤＮＡ１１を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を示す図である。
【図１６】図１６は、例８で得たチオール末端ＤＮＡ１１又はチオール末端ＤＮＡ１２をさらに吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果（ＤＮＡ１１：符号１７、ＤＮＡ１２：符号１８）を示す図である。
【図１７】図１７は、例９で得たｓａｍｐｌｅ［１］溶液の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図１８】図１８は、例９で得たｓａｍｐｌｅ［２］溶液の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図１９】図１９は、例９で得た金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図２０】図２０は、例１０で得たチオール末端ＤＮＡ１３、チオール末端１４又はチオール末端１５を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果（ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）を示す図である。
【図２１】図２１は、例１０で得たｓａｍｐｌｅ［３］溶液（ＤＮＡ１３）、ｓａｍｐｌｅ［４］（ＤＮＡ１４）溶液又はｓａｍｐｌｅ［５］溶液（ＤＮＡ１５）の紫外・可視吸収スペクトル測定結果（ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）を示す図である。
【図２２】図２２は、例１０で得られたｓａｍｐｌｅ［６］とｓａｍｐｌｅ［７］の外観（写真）を示す図である。
【図２３】図２３は、ＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子粒子集合体の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。
【図２４】図２４は、ａ５４９がん細胞の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。
【図２５】図２５は、ＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子集合体を吸着させたａ５４９がん細胞の共鳴ラマン散乱測定結果を示す図である。
【図２６】図２６は、がん細胞由来ＤＮＡのリン酸由来のマッピングと、金粒子吸着部位のマッピングと、がん細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、有機分子を介して金属ナノ粒子同士が連結させることにより、３乃至１０個の金属ナノ粒子が各々隣の金属ナノ粒子との間で所定距離に結合した構造を有する金属ナノ粒子集合体を備え、該集合体はそれに加わる電場内にラマン活性分子を含みてなるものである。
【００１５】
本発明で用いる金属ナノ粒子としては特に限定されないが、表面プラズモン共鳴を生ずる共鳴波長を紫外線領域乃至赤外線領域に有する金属元素よりなり、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、アルミニウム等から選択される金属元素よりなる粒子を挙げることができる。中でも、金ナノ粒子を用いることが好ましい。
上記金属ナノ粒子は、１ｎｍ乃至５００ｎｍの、好ましくは１ｎｍ乃至１００ｎｍの、より好ましくは５ｎｍ乃至１００ｎｍの、特に好ましくは５ｎｍ乃至２０ｎｍの平均粒子径を有することが望ましい。
【００１６】
金属ナノ粒子同士の連結に用いる有機分子として、核酸、ポリエチレングリコール又は炭化水素等の有機化合物からなる分子鎖を用いることができ、これら有機分子は金属ナノ粒子（表面）に結合するための基として、チオール基又はアミノ基を末端に有してなる。
中でも核酸（特にＤＮＡ）は、塩基数を調整することで所望の分子鎖長を有する有機分子とすることができ、すなわち、金属ナノ粒子間の距離を所望の長さに調整することが容易であるために特に好ましい。この場合、核酸の塩基数の数値範囲は３塩基乃至４０塩基であることが好ましく、より好ましくは３乃至２０塩基であり、例えば１２塩基長のＤＮＡを用いることが好ましい。
【００１７】
また前記有機分子には、金属ナノ粒子間の距離を所定間隔に調整するために用いられる化合物（ＤＮＡなど）に加え、前記ラマン活性分子（ラマンプローブとも称する）を結合してなることが好ましい。ラマン活性分子は、例えばローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、クリスタルバイオレット（ＣＲＶ）、クマリンなど色素有機分子に加え、芳香環が幾つか連結した縮合環化合物などが挙げられる。これらラマン活性分子は有機分子のいずれかの末端に導入される。
【００１８】
前記有機分子によって連結される金属ナノ粒子の個数は、前述の通り、３乃至１０個であることが好ましい。これは、近接した２個の金属粒子間に誘起された増強電場は、２粒子の運動により方向が変化することから、常に最適な増強磁場を発する方向に向いているとは限らず、粒子が運動しても最適な増強電場を発生させるには、２粒子間に形成された有機分子による結合方向に対して、１８０°以下の角度を有する結合方向を持つ有機分子で更に粒子を結合させた３粒子以上の集合体の形態を為すことが望ましいためである。但し、これらの３粒子集合体に更に多くの有機分子と金属粒子からなる集合体を結合させても、検出場面でラベル化部分の濃度差が生じるために好ましくなく、金属粒子集合体は最大で１０粒子程度の金属粒子が有機分子で結合したものが好ましい。
そして、金属ナノ粒子集合体において、連結された金属ナノ粒子はその両隣の金属ナノ粒子との間で一直線に結合されていないこと、すなわち、３個の金属ナノ粒子間の２つの有機分子は、１８０°以下、例えば１０乃至１６０°の角度を有して真ん中の金属ナノ粒子の結合されていることが好ましい。
【００１９】
なお、前記金属ナノ粒子集合体における金属ナノ粒子（表面）は、目的検体を認識できる分子認識プローブ分子をさらに有していてもよい。これにより、検体を認識させた後にラマン散乱測定をすることにより、目的検体の検出が可能となる。
分子認識プローブ分子は、例えば上述の有機分子として用いた核酸（ＤＮＡ）とは別の塩基配列を有する核酸（ＤＮＡ）、ポリエチレングリコール、或いは炭化水素を含む分子鎖の一方の末端に分子認識プローブ（ビオチン等；検出部位ともいう）を導入し、他方の末端に金属ナノ粒子表面への結合能を有するチオール基、アミノ基などを導入した分子である。そして該チオール基等を介して、分子認識プローブ分子を金属ナノ粒子（表面）に結合させる。
【００２０】
本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法は以下のａ）乃至ｄ）工程を含みてなる。
ａ）基体となる一本鎖核酸鎖（１）に、その核酸鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖核酸鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性核酸鎖を得る工程、
ｂ）前記変性核酸鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性核酸鎖を結合させた後、６０〜１００℃に加熱して変性核酸鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖核酸鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記核酸鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖核酸鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖核酸鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖核酸鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖核酸鎖（２）と一本鎖核酸鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程。
【００２１】
本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法において、上記核酸はＤＮＡであることが望ましく、すなわち分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法は以下のａ）乃至ｄ）工程を含みてなる。
ａ）基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）に、そのＤＮＡ鎖（１）中の部分塩基構造に相補性を有し且つ片末端にチオール基を有する一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を少なくとも２つ会合させて２重らせんを形成させた変性ＤＮＡ鎖を得る工程、
ｂ）前記変性ＤＮＡ鎖のチオール基と金属ナノ粒子とを反応させ、該金属ナノ粒子の表面に変性ＤＮＡ鎖を結合させた後、６０〜１００℃に加熱して変性ＤＮＡ鎖の２重らせん構造を解離させることにより一本鎖ＤＮＡ鎖（１）を取り除き、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を得る工程、
ｃ）前記ＤＮＡ鎖（２）と相補性を有し、片末端にチオール基を有する塩基鎖長が等しい一本鎖ＤＮＡ鎖（３）と、金属ナノ粒子とを反応させ、チオール基を介して一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を得る工程、
ｄ）一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）が結合した金属ナノ粒子（２）を混合することにより、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させて金属ナノ粒子集合体を製造する工程。
【００２２】
そしてさらに、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料の製造方法において、前記ａ）乃至ｄ）工程に加え、前記ａ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）若しくは前記ｃ）工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（３）のいずれか一方、或いは、これら両者にラマン活性分子を結合する工程を含む。
【００２３】
上記工程で用いる一本鎖ＤＮＡ鎖（２）は、ＤＮＡ鎖（２）同士で互いに相補性を有することもできるが、好ましくはＤＮＡ鎖（２）同士が互いに相補性を有するものではないことが好ましい。これは金属ナノ粒子と反応させて一本鎖ＤＮＡ鎖（２）が結合した金属ナノ粒子（１）を形成する際、ＤＮＡ鎖（２）が互いに相補性を有するものであると、粒子（１）同士の会合体が形成される虞があり、凝集の発生を防ぐためである。
また、一本鎖ＤＮＡ鎖（２）と一本鎖ＤＮＡ鎖（３）の分子鎖長（すなわち塩基鎖長）は異なっていてもよいが、等しい長さであることが好ましい。
なお上記工程で用いる金属ナノ粒子（１）と金属ナノ粒子（２）に用いる金属は同一の金属種であっても異なる金属種であってもよいが、好ましくは同一の金属種を用いることが望ましい。
【００２４】
上記ａ）工程において、基体となる一本鎖ＤＮＡ鎖（１）と会合させた２つのＤＮＡ鎖（２）の２つのチオール基間の距離は、ｂ）工程で得られる金属ナノ粒子（１）上に形成されるＤＮＡ鎖（２）の結合位置に対応する。
ここで、金属ナノ粒子を挟んで互いに反対側の位置に２つのＤＮＡ鎖（２）が結合すると、３つの金属ナノ粒子、すなわち、金属ナノ粒子（１）と、その後のｄ）工程で該ＤＮＡ鎖（２）にＤＮＡ鎖（３）が会合して結合した２つの金属ナノ粒子（２）の３つの粒子が直線状に並ぶこととなる。すなわち、これら３つの金属ナノ粒子間に形成される２つの増強電場がなす角度が１８０°となり、前述した通り好ましくない。
このため、ＤＮＡ鎖の鎖長や、金属ナノ粒子の大きさ（平均粒径）を調整し、３つの金属ナノ粒子の配列（角度）を好ましい角度に調整することが重要である。
【００２５】
上記ｄ）工程、すなわち、金属ナノ粒子（１）と金属ナノ粒子（２）の混合による金属ナノ粒子集合体を製造する工程は、金属ナノ粒子（１）に対して過剰量の金属ナノ粒子（２）を添加することにより行われる。例えば金属ナノ粒子（１）と金属ナノ粒子（２）を１：２〜１０程度の当量比で混合することにより、ＤＮＡ鎖（２）とＤＮＡ鎖（３）を会合させて２重らせんを形成させ、２個の金属ナノ粒子間に有機分子（ＤＮＡなど）による結合を形成する。
例えば、２当量の一本鎖ＤＮＡ鎖（２）を有する１つの金属ナノ粒子（１）と、１当量の一本鎖ＤＮＡ鎖（３）を有する２つの金属ナノ粒子（２）を混合することによって得られる３つの金属ナノ粒子から構成される金属ナノ粒子集合体が好ましい。
【００２６】
このようにして得られた、金属ナノ粒子同士が等間隔に連結された金属ナノ粒子集合体は表面増強ラマン散乱を発することのできる分子センシング金属ナノ粒子材料として機能する。
【００２７】
以下に、本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料に用いる金属ナノ粒子集合体の製造方法について、図１の具体例を用いて説明する。本方法は非特許文献９に示される方法に倣って実施可能である。
図１中番号１、２、３に示す３種のＤＮＡ（以下、それぞれＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３と称する）を準備する。ＤＮＡ１とＤＮＡ２はそれぞれ相補鎖の関係にあるＤＮＡであり、ＤＮＡ３は中央部で２重鎖を組むがその両端はＤＮＡ１及びＤＮＡ２と相補鎖の関係にある塩基鎖である。またＤＮＡ１及びＤＮＡ２はその末端にチオール基を有する。
これらＤＮＡ１、ＤＮＡ２、及びＤＮＡ３を混合し、図１中番号４に示すような変性ＤＮＡを合成する。合成された変性ＤＮＡ４は金ナノ粒子５  コロイド溶液と混合し、金ナノ粒子表面にチオール基を介して結合させ図１中番号６に示すＤＮＡが結合した金ナノ粒子となる。次に、溶液を加温（塩基数によって適宜温度を設定する）して２重鎖を解離させ、図１中番号７に示すＤＮＡ１とＤＮＡ２が結合した金ナノ粒子を合成する。
これに対して、予め金ナノ粒子表面にチオール基を介して、ラマン活性分子を含むＤＮＡ１及びＤＮＡ２を結合させた金ナノ粒子８及び９を、図１中番号７に示す金ナノ粒子に加えることにより、ＤＮＡ同士で２重鎖を組ませ、図１中番号１０に示す金粒子接合が完成する。この場合、金粒子同士は完全に制御された位置に固定することが可能である。
【００２８】
上述の本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、検体と接触させたのち、検体のラマン散乱測定を行うことにより、分子センシングとして有用な方法となる。
このとき、前記分子センシング用金属ナノ粒子材料は、基板上に固定されていてもよい。
【００２９】
本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、前述したとおり、金属ナノ粒子を所定間隔で結合させた金属ナノ粒子集合体を用いることにより、金属ナノ粒子の界面に形成される増強電場をコントロールすることができ、すなわち、安定した増強電場を金属ナノ粒子表面に形成させることで一定のラマン鎖乱強度を安定化させることができる。したがって従来のようなラマン散乱の不安定さを改良する非常に有用な技術である。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明について、さらに具体的かつ詳細に実施例を用いて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以降の塩基配列における略号は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、チオール基（ＨＳ又はＳＨ）である。【００３１】
［例１  金ナノ粒子へのチオール末端ＤＮＡの固定］
先ず、相補鎖の関係にあるシングルストランドＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）をそれぞれ準備した。
（ａ）５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ6−ＴＡＭＲＡ−３’
塩基配列がＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣの１２塩基において、金表面に固定する部位としてチオール基を炭素原子数６のアルキル鎖を（Ｃ6）介して５’末端に結合させ、また、ラマン活性分子（ラマンプローブ）として色素であるローダミン（ＴＡＭＲＡ）を炭素原子数６のアルキル鎖（Ｃ6）を介して３’末端に結合させた。
（ｂ）５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’
塩基配列がＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣの１２塩基において、金表面に固定する部位としてチオール基を炭素原子数６のアルキル鎖を（Ｃ6）介して５’末端に結合させた。【００３２】
これらシングルストランドＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ独立に金ナノ粒子溶液（金コロイド溶液）に添加することにより、金ナノ粒子表面に結合されるが、これらＤＮＡの末端チオール基は不安定であり、周囲のチオール基同士が結合して容易にＳ−Ｓ結合を形成してしまうため、ＤＮＡを金表面に固定化する前に、形成したＳ−Ｓ結合を還元剤によりチオールに戻しておく必要がある。この還元方法については特に限定するものではないが、一例として、今回は次の手順により用いてＳ−Ｓ結合を還元した。
すなわち、１００ｐｍｏｌ／μＬの５’−チオール化ＤＮＡのＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液から５０μＬを１．５ｍＬのマイクロチューブに取り、２．５Ｍ  ＮａＣｌを２０μＬ、−２０℃に冷やしたエタノールを９５０μＬ添加し、−８０℃で２０分放置した。その後１２，０００回転、４℃で１０分間遠心し、上澄みを捨て、５０μＬのＴＥ溶液（トリス−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ〜８）で再溶解させ、精製チオール化ＤＮＡとした。【００３３】
金ナノ粒子へのＤＮＡの固定（結合）化操作としては特に限定されるものではないが、今回は次の方法を用いて行った。
すなわち、金ナノ粒子溶液１ｍＬに上述の方法にてＳ−Ｓ結合を還元した精製チオール化ＤＮＡ  ５ｎｍｏｌを添加した。このときチオール化ＤＮＡの最終濃度は５μＬであった。
添加後、容器をボルテックス・ミキサーを用いて５分間撹拌し、その後、５０℃恒温槽に４時間乃至２４時間放置し、金ナノ粒子表面へのＤＮＡの固定化を促進させた。このとき金ナノ粒子表面ではチオール基の結合だけでなく、ＤＮＡ塩基の吸着も起こるため、緻密な吸着状態にはなっていない。そこで、金ナノ粒子とチオール化ＤＮＡ溶液に、２．５Ｍ  ＮａＣｌを４０μＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液を２０μＬ添加して、ＮａＣｌ及びリン酸緩衝液（ｐＨ７）を最終濃度０．１Ｍ及び１０ｍＭになるようにし、更に５０℃で４０時間放置した。【００３４】
［例２  金ナノ粒子集合体の作製］
上記手法により相補鎖同士のＤＮＡをそれぞれ固定した２種の金ナノ粒子溶液を、０．５ｍＬずつマクロチューブに測り取り、１４，０００ｒｐｍで２５分間遠心にかけ、その後、上澄み液を取り除き、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）で再分散させた。このとき、擬似的に凝集することがあるが、その場合は５０℃でしばらく暖め、再分散させた。この操作をもう一度繰り返し、上澄みを取り除いた後、０．０１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。【００３５】
このようにして得られた、表面にＤＮＡが結合した、２種の金ナノ粒子分散溶液を混ぜ合わせ、ＤＮＡの相補鎖を会合させることにより、金ナノ粒子間の結合を形成させ、金属ナノ粒子集合体を製造した。
すなわち、先ずＰＣＲチューブに１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子５μＬ（相補関係にある修飾粒子をそれぞれ５μＬ）、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４μＬを加え室温で１０分間放置し、なお金ナノ粒子集合体の形成（凝集体のようにみえる）が見られない場合は氷冷して２０分以上放置した後、卓上遠心器で軽く遠心し、得られた集合体を沈殿させた。【００３６】
なお、金ナノ粒子集合体は、先ずＰＣＲチューブに１％  ｔｗｅｅｎ−２  １μＬ、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子５μＬ、前記修飾に用いたＤＮＡと相補鎖の関係にある１μＭ  ＤＮＡ  １０μＬ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４μＬを加え、室温で１０分間放置し（金ナノ粒子集合体の形成（凝集体のようにみえる）が見られない場合は氷冷して２０分以上放置した後）、卓上遠心器で軽く遠心し、得られた集合体を沈殿させることによっても得られた。【００３７】
［例３  金ナノ粒子集合体の解析（１）：集合体形成の解析］
得られた金属ナノ粒子集合体について、透過型電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡により解析した。
まず、前記シングルストランドＤＮＡ（ａ）［５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ6−ＴＡＭＲＡ−３’］が結合した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を図２に、シングルストランドＤＮＡ（ｂ）［５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’］が結合した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像を図３に、そしてこれら金ナノ粒子を混合し、得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を図４に、それぞれ示す。
また、前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）［５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’］が結合した金ナノ粒子の原子間力顕微鏡像を図５に、前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子とシングルストランドＤＮＡ（ａ）［５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ6−ＴＡＭＲＡ−３’］が結合した金ナノ粒子を混合
し、得られた金ナノ粒子集合体の原子間力顕微鏡像を図６に、それぞれ示す。
図４及び図６に示すように、単分散状態の２種の金ナノ粒子を混ぜ合わせることにより、集合体が形成できたことが、透過型電子顕微鏡像並びに原子間力顕微鏡像によって確認できた。【００３８】
［例４  金ナノ粒子集合体の解析（２）：増強電場の測定］
次に、隣接する金ナノ粒子の界面において形成される増強電場の計測と形状測定を近接場マイクロ顕微鏡を用いて同時に行った。
前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）［５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣ−３’］が結合した金ナノ粒子の近接場顕微鏡による像（位置情報、図７中  符号１１）とその表面近傍に形成される電場（図７中  符号１２）を図７に、前記シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子とシングルストランドＤＮＡ（ａ）［５’−ＨＳ−Ｃ6−ＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−Ｃ6−ＴＡＭＲＡ−３’］が結合した金ナノ粒子を混合し、得られた金ナノ粒子集合体の近接場顕微鏡による像（位置情報、図８中  符号１３）とその表面近傍に形成される電場（図８中  符号１４）を図８に、それぞれ示す。
図７及び図８に示すように、金ナノ粒子集合体が形成されている粒子からは非常に強い増強電場が得られていることが確認され、この増強電場中に含まれるラマン活性分子からは非常に強いラマン散乱が得られることが期待できる結果となった。【００３９】
［例５  金ナノ粒子集合体の解析（３）：ラマンスペクトル測定］
続いて、得られた金ナノ粒子集合体（溶液）を石英製のキャピラリー管に封入し、このキャピラリー管内の溶液のラマンスペクトルを測定した。なお、本試験で用いた１２塩基ＤＮＡは９０℃以上の温度でＤＮＡの会合が解離し、シングルストランドＤＮＡに戻ることから、９０℃の温度下でのラマンスペクトルの測定も併せて行った。生体温度に相当する温度（およそ３４〜３８℃）で測定したラマンスペクトル結果（金ナノ粒子集合体）を図９の符号１５に、９０℃の温度下でのラマンスペクトル結果（シングルストランドＤＮＡが結合した金ナノ粒子）を図９の符号１６に示す。
図９より明らかなように、集合体が形成された金ナノ粒子からは、強いラマン散乱が観察された。これは図１０に示すような金ナノ粒子同士の集合（結合）・解離状態が温度変化によって可逆的に変化するために起こったものといえる。【００４０】
［例６  分子認識プローブ含有金ナノ粒子集合体の作製及び分子認識］
このようにして得られた金ナノ粒子集合体の金属ナノ粒子表面を、更に特定分子認識可能な分子認識プローブで修飾した。その方法は特に限定するものではないが、先に示したＤＮＡを金ナノ粒子表面に固定するときに予め混合しておくことが一般的である。
すなわち、先ずＰＣＲチューブに１％ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子５μＬ、前記ＤＮＡ修飾金ナノ粒子の修飾に用いたＤＮＡと相補鎖の関係にある１μＭ  ＤＮＡ  １０μＬ中に１０質量％の割合で片末端にアルキルアミンをもう片末端にビオチンを有するヘテロ２官能ＰＥＧ（分子量５，０００）混合した溶液、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４μＬを加え室温で１０分間放置し（金ナノ粒子集合体の形成（凝集体のようにみえる）が見られない場合は氷冷して２０分以上放置した後）、卓上遠心器で軽く遠心し集合体を沈殿させた。【００４１】
このようにして得られた分子認識プローブ含有ラマンセンシング用金ナノ粒子集合体をストレプトアビジン・プレートに添加し、室温で数分間放置した後に、滅菌水で数回洗浄し、未固定の分子認識プローブ含有ラマンセンシング用金ナノ粒子集合体を、浄水から金のプラズモン吸収が消えるまで充分に洗浄した。このようにして処理したストレプトアビジン・プレートをレーザーラマン顕微鏡で観察したところ、図１１に示すようなラマン散乱スペクトルが得られ、分子認識プローブ含有ラマンセンシング用金ナノ粒子集合体による分子認識が出来たことが示された。【００４２】
［実験例１  金ナノ粒子集合体の製造及び分子認識］
＜ＤＮＡの調製＞
２種の一本鎖ＤＮＡを準備した。
先ず、塩基配列がＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡ  ＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧの３３塩基の５’末端に対して金表面に固定する部位としてチオール基を炭素数６のアルキル鎖を介して結合させたＤＮＡを合成した。
一方これとは別に塩基配列がＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧ  ＴＧＣの３３塩基の５’末端に対して金表面に固定する部位としてチオール基を炭素数６のアルキル鎖を介して結合させたＤＮＡを合成した。【００４３】
次に、上記一本鎖ＤＮＡの２つを金属ナノ粒子に固定するためのテンプレートとなる一本鎖ＤＮＡとして、上記一本鎖ＤＮＡに対して相補的な関係にある部位を有する塩基群と上記２つの一本鎖ＤＮＡの間隔をコントロールする塩基群からなる一本鎖ＤＮＡを準備した。
すなわち、先に示されたＤＮＡと結合させる相補的ＤＮＡとして、５’末端からＣＴＧＡＧＧＴＡＧ  ＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣの６５塩基のＤＮＡを合成した。
また後に示されたＤＮＡと結合させる相補的ＤＮＡとして、５’末端からＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣ  ＴＧＴＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣの６５塩基のＤＮＡを合成した。【００４４】
以上、合成したチオール末端３３塩基ＤＮＡと６５塩基ＤＮＡの構造は以下の通りである。
１：５’−ＨＳ−Ｃ6−ＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’
２：５’−ＨＳ−Ｃ6−ＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＧＣ−３’
３：５’−ＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡ  ＴＡＣＴＡＴＡＣＡＣＴＧＣＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣ−３’
４：５’−ＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧ  ＣＡＧＴＧＴＡＴＡＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣ−３’【００４５】
＜二重鎖ＤＮＡの製造＞
これら４種のＤＮＡをそれぞれ相補鎖の関係で二重鎖構造として結合させた。その手法は特に限定するのもではないが、今回は次の方法を用いて行った。
すなわち、前記１から４のＤＮＡをそれぞれ別々に濃度１０μＭになるように純水に溶解し、溶解後、ＤＮＡ１：ＤＮＡ３=９：１０、及びＤＮＡ２：ＤＮＡ４=９：１０の体積割合でそれぞれマイクロチューブに入れ混合した。これに３００ｍＭのＮａＣｌを含有する３０ｍＭ  トリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸（ｐＨ８）バッファーを添加して、最終濃度１００ｍＭ  ＮａＣｌになるように調整を行った。試料チューブを９０℃１０分間加熱放置した後、３０℃まで冷却速度−１℃／ｍｉｎで冷却し、会合したこれらＤＮＡを電気泳動法により分離精製した。【００４６】
＜金粒子へのＤＮＡの吸着（１）：ＤＮＡを１つ吸着させた金ナノ粒子＞
金ナノ粒子分散液（ブリティッシュ  バイオセル  インターナショナル製：粒子径：１５ｎｍ）１２０μＬに、予め調整した無水ビス（ｐ−スルホナトフェニル）フェニルフォスフィン２カリウム塩溶液（１０ｍｇ／ｍＬ水溶液、ＢＳＰＰと称する）１２μＬをマイクロチューブ内で混合し、ＢＳＰＰにより表面をコートされた金ナノ粒子を形成した。この混合溶液を４℃、１時間２１，６００Ｇで遠心分離し、上澄みを捨て、最終的に１０μＬとした。
この濃縮した金ナノ粒子分散液を２μＬのトリス−ボレート−ＥＤＴＡ（ＴＢＥと称する）バッファー（０．５×ＴＢＥ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ含有）と混合した。
この溶液４μＬに対して２μＬのチオール末端ＤＮＡ（２μＭ）（先に示したＤＮＡ１若しくはＤＮＡ２）を加え混合した。混合後、０．５×ＴＢＥ（１００ｍＭＮａＣｌ含有）で最終体積を８μＬに調整し、この混合溶液を室温で（２２℃）で２４時間放置した。放置後、ＢＳＰＰ（０．２５ｍg／ｍＬ溶液）２５０μＬを混合し、４℃、１時間、２１，６００Ｇで遠心沈降させ、上澄み液を捨て、未反応ＤＮＡを除去した。【００４７】
＜金粒子へのＤＮＡの吸着（２）：ＤＮＡを２つ吸着させた金ナノ粒子＞
上記（１）と同様の方法を用いてＢＳＰＰコート１５ｎｍ金ナノ粒子を調製した。前出の＜二重鎖ＤＮＡの製造＞で合成した二重鎖構造の精製ＤＮＡを、モル比（金ナノ粒子溶液）：（ＤＮＡ溶液）＝５：１にて、０．５×ＴＢＥバッファー（ＢＳＰＰ：１ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ  １６６ｍＭ）中で混合した。混合後室温で２４時間放置し、金粒子表面にＤＮＡを固定した。その後、ＢＳＰＰ溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ溶液）の希釈溶液中で４０℃に保つことにより、２重鎖を解裂させ、遠心精製（４℃、１時間、２１，６００Ｇ）により精製した。【００４８】
＜金ナノ粒子集合体の調製＞
金ナノ粒子へのＤＮＡの吸着（１）及び（２）で調製したＤＮＡ吸着金ナノ粒子分散液（ａ：ＤＮＡ１吸着金ナノ粒子、ｂ：ＤＮＡ２吸着金ナノ粒子、ｃ：ＤＮＡ１及びＤＮＡ２吸着金ナノ粒子）をａ：ｂ：ｃ＝１：１：１０の体積比で混合し、室温２４時間放置した。放置後遠心精製（−４℃、１０分、１０，０００Ｇ）し、未固定金ナノ粒子を除去した。得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を図１２に示す。
これによると、金ナノ粒子が３個結合していることが確認された。すなわち、ｃ粒子を過剰に加え、ａ粒子−ｃ粒子−ｂ粒子が非直線状に３個結合した集合体が得られた。このとき得られた金ナノ粒子の粒子界面に形成された電場は先の例４の試験で得られた結果と同等の強度でを有していた。【００４９】
＜分子認識プローブ含有金ナノ粒子集合体の製造及び分子認識＞
上述の得られた金ナノ粒子集合体溶液に対して１０質量％の割合にて、片末端にアルキルアミンをもう片末端にビオチンを有するヘテロ２官能ＰＥＧ（分子量５，０００、１００ｍＭ）を分子認識プローブ分子として混合し、室温で２時間放置した。その後、遠心精製により未吸着のセンシングプローブを除去した。
こうして得られた分子認識プローブ含有金ナノ粒子集合体をストレプトアビジン・プレートに添加し、室温で数分間放置した後に、滅菌水で数回洗浄し、未固定の分子認識プローブ含有金ナノ粒子を洗浄し、洗浄水から金のプラズモン吸収が消えるまで充分に洗浄を行った。このようにして処理したストレプトアビジン・プレートをレーザーラマン顕微鏡で観察したところ、図１３に示すようなラマン散乱スペクトルが得られ、分子認識プローブ含有金ナノ粒子による分子認識が出来たことが確認された。【００５０】
［実施例２］
以下に示す３種のＤＮＡ（ＤＮＡ５，６，７，８，９，１０）を準備した。
ＤＮＡ５；５’−ＨＳ−ＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＡＣＣＡＡＴＧＴＡＧＣＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴ−３’
ＤＮＡ６；５’−ＨＳ−ＴＴＴＣＧＡＴＣＴＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＡＴＡＣＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴ−３’
ＤＮＡ７；５’−ＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡＴＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＣ−３’
ＤＮＡ８；５’−ＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＣＣＡＴＧＣＡＡＴＣ−３’
ＤＮＡ９；５’−ＨＳ−ＴＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＴＴＧＧＴＡＧＧ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ−３’
ＤＮＡ１０；５’−ＨＳ−ＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡ−Ｃ６−ＴＡＭＲＡ-３’【００５１】
これを上記［実施例１］に示したものと同様の方法を用いてＤＮＡ７とＤＮＡ８を会合させて中央部分が二重鎖となったＤＮＡ鎖（図１中、中央部分が二重鎖となったＤＮＡ３に相当する）とし、さらにこのＤＮＡ鎖の両末端の一本鎖部分にＤＮＡ５及びＤＮＡ６を作用させ二重鎖を組ませた（図１中、変性ＤＮＡ４に相当する）。二重鎖を組ませる条件は全て実施例１に従って行った。
この二重鎖ＤＮＡ鎖の５ｎｍｏｌを金ナノ粒子溶液１ｍＬに添加した。添加後、容器をボルテックス・ミキサーを用いて５分間撹拌し、その後、５０℃恒温槽に４時間乃至２４時間放置し、金ナノ粒子表面へのチオール基を介した二重鎖ＤＮＡ鎖の固定化を促進させ、ＤＮＡが結合した金ナノ粒子（図１中、金ナノ粒子６に相当する）を形成した。次にこの金ナノ粒子含有溶液を９０℃で５時間に加熱し、２重鎖を解離させた（図１中、金ナノ粒子７に相当する）。
一方予め前記記載の方法でそれぞれ独立に準備しておいたＤＮＡ９及び１０が吸着した金ナノ粒子（図１中、金ナノ粒子８及び金ナノ粒子９に相当する）を上記金ナノ粒子含有溶液に添加し、金ナノ粒子集合体（図１中、金ナノ粒子集合体１０に相当する）を得た。
得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡像を図１４に示す。図１４に示すように、非直線状に粒子が３個結合した集合体が得られた。【００５２】
［例７  核酸（ＤＮＡ）の調製］
【表１】
2011158829.tif 000003
＜ＤＮＡの調製及び精製＞
まず、相補鎖の関係にあるシングルストランドＤＮＡ１１及びＤＮＡ１２を準備した（表１参照）。
続いて、これらＤＮＡ１１及びＤＮＡ１２において、金表面に固定する部位としてチオール基を炭素原子数６の直鎖アルキル基（Ｃ6）を介して５’末端に結合させた。
続いて、合成したチオール末端のＤＮＡ１１（又はＤＮＡ１２）に、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）をＤＮＡに対して２００倍量となるように加え、さらにＴＥ溶液（トリス−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ〜８）で溶解させた。ピペッティング、ボルテックスで溶液を攪拌後、常温で２時間反応させた。この操作により、ＳＨ化ＤＮＡの一部がＳ−Ｓ結合した部分を切断した。
その後、ＤＴＴ処理した上記ＤＮＡ溶液に、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液をＤＴＴ処理したＤＮＡ溶液に対して１／１０倍量となるように加えた。さらにあらかじめ４℃に冷やしておいた冷エタノールを、ＤＮＡ溶液に対して２．５倍量となるように加えた。その後、−２０℃フリーザーに６時間以上静置し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ；７，７４０Ｇ、３０分間）により回収した。これらエタノール沈殿−遠心分離による精製即ち、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を加えるところから沈殿精製させるところまでのサイクルをさらに２回行った。【００５３】
［例８  金ナノ粒子へのチオール末端ＤＮＡの固定］
金ナノ粒子分散液（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ビービーインターナショナル)製造：粒子径：１０ｎｍ）１ｍＬに、例７でＳ−Ｓ結合を還元（切断）、精製したチオール末端ＤＮＡ（ＤＮＡ１１若しくはＤＮＡ１２）を５ｎＭ添加し、ピペッティング、ボルテックスで１分間攪拌後、５０℃で１２時間静置し、金ナノ粒子表面へのＤＮＡの固定化を促進させた。
１２時間静置後、ＵＶ測定により金ナノ粒子の分散、凝集状態を確認した。図１５にチオール末端ＤＮＡ１１を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を示す。【００５４】
各金ナノ粒子分散液に２．５Ｍ  ＮａＣｌを４０μＬ、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を２０μＬ添加し、更に５０℃で４０時間静置した。この操作により、金表面のマイナス（−）電荷をＮａＣｌが奪い、溶液中に金ナノ粒子表面に未吸着の状態で残存しているチオール末端ＤＮＡをさらに金ナノ粒子表面に吸着させた。
４０時間静置後、ＵＶ測定により金ナノ粒子の分散、凝集状態を確認した。図１６にチオール末端ＤＮＡ１１（図１６中、符号１７）及びチオール末端ＤＮＡ１２（図１６中、符号１８）を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトルを示す。【００５５】
［例９  金ナノ粒子集合体の作製］
上記手法により相補鎖同士のＤＮＡ（ＤＮＡ１１、ＤＮＡ１２）をそれぞれ固定した２種の金ナノ粒子溶液を、１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ、金ナノ粒子を沈殿させ、上澄み液を取り除いた。ここに１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．５ｍＬを加えて沈殿物を再分散させた。再度１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ、上澄み液を取り除いた後、０．０１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。【００５６】
ＤＮＡ１１を用いて調製した金ナノ粒子分散液をｓａｍｐｌｅ［１］溶液、ＤＮＡ１２を用いて調製した金ナノ粒子分散液をｓａｍｐｌｅ［２］溶液と称する。それぞれのｓａｍｐｌｅ溶液を透過型電子顕微鏡で観察した結果をそれぞれ図１７及び図１８に示す。【００５７】
このようにして得られた、表面にＤＮＡが結合した、２種の金ナノ粒子分散溶液をまぜ合わせ、ＤＮＡの相補鎖を会合させることにより、金ナノ粒子間の結合を形成させ、金ナノ粒子集合体を製造した。
すなわち、先ず１．５ｍＬマイクロチューブに、１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、ｓａｍｐｌｅ［１］溶液  １０μＬ、ｓａｍｐｌｅ［２］溶液  １０μＬ、５Ｍ  ＮａＣl  ４μＬを加え、７５℃の高温槽中で１時間放置した後、室温で１０分間静置させた。
１０分間静置後、溶液の色が赤から紫へ変化したのを確認し、さらに２０分間静置後、軽く遠心分離を行い、得られた集合体を沈殿させた。
得られた金ナノ粒子集合体の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を図１９に示す。【００５８】
［例１０  塩基数の異なるＤＮＡによる金粒子表面の修飾］
＜ＤＮＡの調製＞
下記表２に示す３種のＤＮＡ（ＤＮＡ１３〜ＤＮＡ１５）のそれぞれについて、次の処理を行った。
チオール末端ＤＮＡ（ＤＮＡ１３〜ＤＮＡ１５）にＤＴＴ（ジチオトレイトール）をＤＮＡに対して２００倍量となるように加え、さらにＴＥ溶液（トリス−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ〜８）で溶解させた。ピペッティング、ボルテックスで溶液を攪拌後、常温で２時間反応させた。
その後、ＤＴＴ処理した上記ＤＮＡ溶液に、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液をＤＴＴ処理したＤＮＡ溶液に対して１／１０倍量となるように加えた。さらにあらかじめ４℃に冷やしておいた冷エタノールを、このＤＮＡ溶液のＤＮＡ溶液に対して２．５倍量となるように加えた。その後、−２０℃フリーザーに６時間以上静置し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ；７，７４０Ｇ、３０分間）により回収した。これらエタノール沈殿−遠心分離による精製即ち、３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液を加えるところから沈殿精製させるところまでのサイクルをさらに２回行った。【００５９】
【表２】
2011158829.tif 000004
【００６０】
＜金ナノ粒子へのチオール末端ＤＮＡの固定＞
金ナノ粒子分散液（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ビービーインターナショナル）製造：粒子径：１０ｎｍ）１ｍＬに前記工程で精製したチオール末端ＤＮＡ（ＤＮＡ１３乃至ＤＮＡ１５）を５ｎＭ添加し、ピペッティング、ボルテックスで１分間攪拌後、５０℃で２４時間静置し、金ナノ粒子表面へのＤＮＡの固定化を促進させた。
１２時間静置後、各金ナノ分散液に２．５Ｍ  ＮａＣｌを４０μＬ、２００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７）を５０μＬ添加し、さらに５０℃で４５時間静置した。静置後の各チオール末端ＤＮＡを吸着させた金ナノ粒子分散液（図中、ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を図２０に示す。【００６１】
上記３種のＤＮＡ（ＤＮＡ１３〜ＤＮＡ１５）をそれぞれ固定した３種の金ナノ粒子溶液を、その後、１４，０００ｒｐｍ（１８，７００Ｇ）で３０分間遠心にかけ、金ナノ粒子を沈殿させ、上澄み液を取り除いた。ここに１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．５ｍＬを加えて沈殿物を再分散させた。再度１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ、上澄み液を取り除いた後、０．０１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。【００６２】
ＤＮＡ１３を用いて調製した金ナノ粒子をｓａｍｐｌｅ［３］溶液、ＤＮＡ１４を用いて調製した金ナノ粒子をｓａｍｐｌｅ［４］溶液、ＤＮＡ１５で調製した金ナノ粒子をｓａｍｐｌｅ［５］溶液と称する。それぞれのｓａｍｐｌｅ溶液の紫外・可視吸収スペクトル測定結果を図２１（図中、ＤＮＡ１３：符号１９、ＤＮＡ１４：符号２０、ＤＮＡ１５：符号２１）に示す。【００６３】
＜金ナノ粒子集合体の作製（１）：ｓａｍｐｌｅ［３］溶液とｓａｍｐｌｅ［５］溶液＞
１．５ｍＬマイクロチューブに、１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、ｓａｍｐｌｅ［３］溶液（ＤＮＡ鎖長：４２ｍｅｒ）  １０μＬ、ｓａｍｐｌｅ［５］溶液（ＤＮＡ鎖長：１５ｍｅｒ）  １０μＬ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４μＬを加え、７５℃の高温槽中で１時間放置した後、室温で１０分間静置させた。
１０分間静置後、溶液の色が赤から紫へ変化したのを確認し、さらに２０分静置後、軽く遠心分離を行い、ＤＮＡ塩基の相補鎖を会合させることにより金ナノ粒子間の結合を形成させて得られた金ナノ粒子集合体を得た。得られた集合体をｓａｍｐｌｅ［６］と称する。【００６４】
＜金ナノ粒子集合体の作製（２）：ｓａｍｐｌｅ［４］溶液とｓａｍｐｌｅ［５］溶液＞
１．５ｍＬマイクロチューブに、１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、ｓａｍｐｌｅ［４］溶液（ＤＮＡ鎖長：２７ｍｅｒ）  １０μＬ、ｓａｍｐｌｅ［５］溶液（ＤＮＡ鎖長：１５ｍｅｒ）  １０μＬ、５Ｍ  ＮａＣｌ  ４μＬを加え、７５℃の高温槽中で１時間放置した後、室温で１０分間静置させた。
１０分間静置後、溶液の色が赤から紫へ変化したのを確認し、さらに２０分静置後、軽く遠心分離を行い、ＤＮＡ塩基の相補鎖を会合させることにより金ナノ粒子間の結合を形成させて得られた金ナノ粒子集合体を得た。得られた集合体をｓａｍｐｌｅ［７］と称する。
得られたｓａｍｐｌｅ［６］とｓａｍｐｌｅ［７］の外観（写真）を図２２に示す。【００６５】
［実施例３  核酸による分子認識］
肺がんに対する核酸製剤の１つであるアプタマーＡＳ１４１１の末端をチオール基で修飾した分子（つくばオリゴサービス株式会社より入手）を、例９で製造した金ナノ粒子集合体表面に吸着させ、これを肺がん細胞（ａ５４９）に作用させ、作用前後のラマン散乱スペクトルを比較した。
詳細には、例９に従って製造した金ナノ粒子集合体分散液（１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散）に５ｎＭのアプタマーＡＳ１４１１溶液を添加し、４０℃で２４時間攪拌した。その後１４，０００ｒｐｍ（１８，７００Ｇ）で３０分間遠心にかけ、粒子を沈殿させ、上澄み液を取り除いた。ここに１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．５ｍＬを加えて沈殿物を再分散させた。再度１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心にかけ上澄み液を取り除いた後、０．０１％  ｔｗｅｅｎ−２０  １μＬ、１０ｍＭリン酸緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＣｌ含有、ｐＨ７）０．２５ｍＬに再分散させた。
こうして得られたＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子集合体を予め培養シャーレで培養した肺がん細胞に２０ｕＬ添加し、４８時間放置しがん細胞へ吸着させた。その後ラマン分光装置によりがん細胞表面を測定し、吸着させる前のがん細胞表面と吸着後のがん細胞表面のラマン散乱スペクトルを比較した。ＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子粒子集合体のラマン散乱スペクトルを図２３に、ａ５４９がん細胞のラマン散乱スペクトルを図２４に、そしてＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子集合体を吸着させたａ５４９がん細胞のラマン散乱スペクトルを図２５に、それぞれ示す。
図２４〜図２５に示すように、ＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子集合体をがん細胞に作用させることでラマン散乱スペクトルが大きく変化しており、例９で製造した金ナノ粒子集合体を用いた分子認識が可能であることが確認された。【００６６】
［実施例４  核酸による分子認識］
肺がんに対する核酸製剤の１つであるアプタマーＡＳ１４１１の末端をチオール基で修飾した分子（つくばオリゴサービス株式会社より入手）を、実施例３に示す方法で製造した金ナノ粒子集合体表面に吸着させ、これを肺がん細胞（ａ５４９）に作用させ、吸着サイトのマッピングを試みた。
得られたＡＳ１４１１吸着−金ナノ粒子集合体を予め培養シャーレで培養した肺がん細胞に２０ｕＬ添加し、４８時間放置しがん細胞へ吸着させた。その後ラマン分光装置によりがん細胞表面を測定し、吸着に係わるラマンスペクトルに関して測定を行いがん細胞由来ＤＮＡのリン酸由来のマッピングと金粒子吸着部位のマッピング更に顕微鏡写真を重ね合わせ比較を行った結果、がん細胞が認識されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明の分子センシング用金属ナノ粒子材料は、高感度分子認識センサーとして有用であり、微量分子認識、即ち、生体関連物質のセンシングには好適な材料として使用できる。
【符号の説明】
【００６８】
１．チオール末端一本鎖ＤＮＡ１
２．ＤＮＡ１と相補鎖の関係にある一本鎖ＤＮＡ２
３．中央部が二本鎖ＤＮＡであり、その両端に１および２で示した一本鎖ＤＮＡを配したＤＮＡ３
４．ＤＮＡ３の両末端にＤＮＡ１及びＤＮＡ２が会合したＤＮＡ４
５．金ナノ粒子
６．表面にＤＮＡ４をチオール基を介して結合させた金ナノ粒子
７．加温により２重鎖を解離させて分離した後の金ナノ粒子
８．一本鎖ＤＮＡ１が吸着した金ナノ粒子
９．相補鎖ＤＮＡ２が吸着した金ナノ粒子
１０．金ナノ粒子集合体
１１．シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子の位置情報
１２．シングルストランドＤＮＡ（ｂ）が結合した金ナノ粒子から発せられる電場情報
１３．金ナノ粒子集合体における金ナノ粒子の位置情報
１４．金ナノ粒子集合体における金ナノ粒子から発せられる電場情報
１５．金ナノ粒子集合体における近接状態にある金ナノ粒子による増強ラマン散乱
１６．加温による金ナノ集合体が解消された金ナノ粒子による増強ラマン散乱
１７．チオール末端ＤＮＡ１１を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
１８．チオール末端ＤＮＡ１２を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
１９．チオール末端ＤＮＡ１３を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
２０．チオール末端ＤＮＡ１４を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
２１．チオール末端ＤＮＡ１５を吸着させた金ナノ粒子分散液の紫外・可視吸収スペクトル
【図１】
2011158829.tif 000005
【図７】
2011158829.tif 000006
【図８】
2011158829.tif 000007
【図９】
2011158829.tif 000008
【図１０】
2011158829.tif 000009
【図１１】
2011158829.tif 000010
【図１３】
2011158829.tif 000011
【図１５】
2011158829.tif 000012
【図１６】
2011158829.tif 000013
【図２０】
2011158829.tif 000014
【図２１】
2011158829.tif 000015
【図２３】
2011158829.tif 000016
【図２４】
2011158829.tif 000017
【図２５】
2011158829.tif 000018
【図２】
2011158829.tif 000019
【図３】
2011158829.tif 000020
【図４】
2011158829.tif 000021
【図５】
2011158829.tif 000022
【図６】
2011158829.tif 000023
【図１２】
2011158829.tif 000024
【図１４】
2011158829.tif 000025
【図１７】
2011158829.tif 000026
【図１８】
2011158829.tif 000027
【図１９】
2011158829.tif 000028
【図２２】
2011158829.tif 000029
【図２６】
2011158829.tif 000030
【国際調査報告】
2011158829.tif 000031
2011158829.tif 000032
2011158829.tif 000033
2011158829.tif 000034