(57)【要約】遺伝子編集ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のインビボ送達用組成物を、潜伏感染ヒト細胞および動物疾患モデル由来である組込みレトロウイルスＤＮＡ配列を除去するために開発した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子編集剤と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードするウイルスベクターを含む組成物であって、当該ｇＲＮＡが、コードおよび／または非コードレトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列、レトロウイルス群に特異的な抗原の標的核酸配列、またはそれらの組合せを含む、レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、組成物。
【請求項２】
上記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、またはそれらの誘導体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
上記アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、ＤＪまたはＤＪ／８である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
上記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
上記遺伝子編集剤が、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはそのホモログである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはそのホモログである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
上記ｇＲＮＡが、上記レトロウイルス遺伝子配列の長い末端反復（ＬＴＲ）、群に特異的な抗原、またはそれらの組合せに相補的である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
上記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
上記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナウイルス、馬伝染性貧血ウイルスまたはヒトＴ細胞白血病ウイルスである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記標的配列が、上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）内の配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）内の配列が、Ｕ３、Ｒ、またはＵ５領域内の配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
上記群に特異的な抗原が、ヒト免疫不全ウイルスコードおよび／または非コード核酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
上記群に特異的な抗原が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、またはそれらの断片を含む少なくとも１つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする配列をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
上記トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列が、上記ガイドＲＮＡをコードする配列と融合する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
核局在シグナルをコードする配列をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
ｇＲＮＡが配列番号１〜７６のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ｇＲＮＡが配列番号１〜７６のいずれか１つを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
遺伝子編集剤と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードする単離核酸を含む発現ベクターであって、当該ｇＲＮＡが、コードおよび／または非コードレトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列、レトロウイルス群に特異的な抗原の標的核酸配列、またはそれらの組合せを含む、レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、発現ベクター。
【請求項２０】
上記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、またはそれらの誘導体である、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
上記アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、ＤＪまたはＤＪ／８である、請求項１９または２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
上記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）である、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
上記遺伝子編集剤が、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはその相同体である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
上記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはその相同体である、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
上記ｇＲＮＡが、上記レトロウイルス遺伝子配列の長い末端反復（ＬＴＲ）、群に特異的な抗原、またはそれらの組合せに相補的である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
上記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
上記レンチウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ビスナウイルス、馬伝染性貧血ウイルスまたはヒトＴ細胞白血病ウイルスである、請求項２６に記載の発現ベクター。
【請求項２８】
上記標的配列が、上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）内の配列を含む、請求項１９〜２７のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項２９】
上記ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）内の配列が、Ｕ３、Ｒ、またはＵ５領域内の配列を含む、請求項２８に記載の発現ベクター。
【請求項３０】
上記群に特異的な抗原が、ヒト免疫不全ウイルスコードおよび／または非コード核酸配列を含む、請求項１９〜２９のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３１】
上記群に特異的な抗原が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、またはそれらの断片を含む少なくとも１つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする配列をさらに含む、請求項１９〜３１のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３３】
上記トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列が、上記ガイドＲＮＡをコードする配列と融合する、請求項３２に記載の発現ベクター。
【請求項３４】
核局在シグナルをコードする配列をさらに含む、請求項１９〜３３のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３５】
ｇＲＮＡが配列番号１〜７６のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９〜３４のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３６】
ｇＲＮＡが配列番号１〜７６のいずれか１つを含む、請求項１９〜３５のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；プロウイルスＤＮＡの第１標的プロトスペーサー配列に相補的である第１スペーサー配列を有する第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；当該プロウイルスＤＮＡの第２標的プロトスペーサー配列に相補的である第２スペーサー配列を有する第２ｇＲＮＡを含む、単離核酸配列であって、当該第１標的プロトスペーサー配列および当該第２標的プロトスペーサー配列が当該プロウイルスＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）に位置する、単離核酸配列。
【請求項３８】
上記単離核酸配列が２つ以上の標的配列を標的とし、当該２つ以上の標的配列間の介在ウイルス配列を切除する、請求項３７に記載の単離核酸配列。
【請求項３９】
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；プロウイルスＤＮＡの第１標的プロトスペーサー配列に相補的である第１スペーサー配列を有する第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列；当該プロウイルスＤＮＡの第２標的プロトスペーサー配列に相補的である第２スペーサー配列を有する第２ｇＲＮＡをコードする単離核酸配列、を含む単離核酸配列をコードする発現ベクターであって、当該第１標的プロトスペーサー配列および当該第２標的プロトスペーサー配列が当該プロウイルスＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）に位置する、発現ベクター。
【請求項４０】
対象のレトロウイルスを不活性化する方法の方法であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログと、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする発現ベクターとを含む組成物を、上記対象に投与する工程を含み、当該ガイドＲＮＡが当該レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、方法。
【請求項４１】
ヒト免疫不全ウイルス感染を患う対象を治療する、またはヒト免疫不全ウイルス感染のリスクがある対象のヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを低減する方法であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログと、１つ以上のガイドＲＮＡとをコードする発現ベクター含む組成物を治療上有効な量、当該対象に投与する工程を含み、当該ガイドＲＮＡがレトロウイルスの標的核酸配列に相補的である、方法。
【請求項４２】
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；プロウイルスＤＮＡの第１標的核酸配列に相補的である核酸配列を有する第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；当該プロウイルスＤＮＡの第２標的核酸配列に相補的である第２核酸配列を有する第２ｇＲＮＡ；当該プロウイルスＤＮＡの第３標的核酸配列に相補的である第３核酸配列を有する第３ｇＲＮＡ；当該プロウイルスＤＮＡの第４標的核酸配列に相補的である第４核酸配列を有する第４ｇＲＮＡ、またはそれらの組合せを含む単離核酸配列を含む組成物であって、当該第１標的核酸配列および当該第２標的核酸配列が当該プロウイルスＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）に位置し、当該第３および第４標的核酸配列が構造タンパク質をコードする核酸配列に位置する、組成物。
【請求項４３】
上記単離核酸配列が２つ以上の標的配列を標的とし、当該２つ以上の標的配列間の介在ウイルス配列を切除する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
構造タンパク質をコードする上記核酸配列が、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、またはそれらの組合せを含む少なくとも１つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ｇＲＮＡが配列番号１〜７６のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
ｇＲＮＡが配列番号１〜７６のいずれか１つを含む、請求項４２〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
（連邦政府資金による研究開発の記載）
本発明は、国立保健研究所によってＰ３０ＭＨ０９２１７７およびＲ０１ＮＳ０８７９７１を基に連邦政府の一部支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本発明の実施形態は、レトロウイルスによる感染を予防または処置する、遺伝子編集複合体およびインビボ送達担体に関する。特に、遺伝子編集複合体は、組換えウイルスベクターによってコードされるClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼを含む。
〔背景技術〕
世界で４０００万人以上が感染し、毎年２００万人以上の新たな感染が続いているため、ＨＩＶ／ＡＩＤＳは主要な公衆衛生問題のままである（Adejumo OA, et al. J Int AIDS Soc 2015; 18:20049）。多剤併用療法（ｃＡＲＴ）によって、進行中のウイルス複製を効果的に制御し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の消失数を回復させることができる。しかしながら、この処置は潜伏感染細胞のウイルスを除去することができない（Kulpa DA, Chomont N. J Virus Erad 2015; 1:59-66）。増殖していないＣＤ４＋記憶Ｔ細胞のサブセットにおいて、組み込まれたプロウイルスＤＮＡは存続し、再活性化して複製可能なウイルスを産生することができる。これは、ｃＡＲＴを中止するとき、急速なウイルスの回復をもたらすという結果になり得る（Coffin JM. Science 1995; 267:483-489; Coffin JM. AIDS 1996; 10 (Suppl 3):S75-84）。したがって、感染した人々は、細胞保有体（cell reservoir）でのウイルス存続により、長期間の処置を維持しなければならない。
【０００３】
潜伏プロウイルスＤＮＡの除去については解明されていない。潜伏中、ＨＩＶ感染細胞はウイルスタンパク質をほとんどまたは全く産生しないので、宿主抗ウイルス免疫クリアランスまたは直接のウイルス細胞毒性を防止する。ウイルスの根絶は、疾患の「治療」を達成するために、そのクリアランス、ならびに、脾臓、リンパ節、脳、尿生殖路および消化管に存在する、他の感染リンパ球および単球マクロファージ中の潜伏感染細胞ＣＤ４＋Ｔエフェクター記憶細胞の再感染の予防を必要とする（Saleh S., et al. Blood 2007; 110:4161-4164; Swiggard WJ., et al., J Virol 2005; 79:141799-14188）（Lusic M, Giacca M. J Mol Biol 2015; 427:688-694）。
〔発明の概要〕
本発明の実施形態は、レトロウイルス核酸配列に特異的な、遺伝子編集複合体を含む組成物、および治療の必要がある対象へのこれらの遺伝子編集複合体の投与に関する。
【０００４】
一実施形態において、組成物は、遺伝子編集複合体と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードするウイルスベクターを含む組成物であって、当該ｇＲＮＡが、レトロウイルス配列の標的核酸配列、レトロウイルス群に特異的な抗原をコードする標的核酸配列、コード領域、非コード領域、またはそれらの組合せに相補的である。
【０００５】
他の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、またはそれらの誘導体を含む。好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、ＤＪまたはＤＪ／８を含む。一実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）を含む。
【０００６】
他の実施形態において、遺伝子編集剤は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはそのホモログ（homologue）もしくはオルソログ（ortholog）である。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはそのホモログもしくはオルソログである。
【０００７】
他の実施形態において、ｇＲＮＡは、レトロウイルス遺伝子配列の長い末端反復（ＬＴＲ）、群に特異的な抗原（group-specific antigen）、またはそれらの組合せに相補的である。本発明の一実施形態において、標的配列はヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）内の配列を含む。好ましくは、ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復内の配列は、Ｕ３、Ｒ、またはＵ５領域内の配列を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、群に特異的な抗原は、ヒト免疫不全ウイルスコードおよび／または非コード核酸配列を含む。一実施形態において、群に特異的な抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｔｅｖ、またはそれらの断片を含む少なくとも１つのヒト免疫不全ウイルス核酸配列を含む。
【０００９】
一実施形態において、組成物は、トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする配列をさらに含む。一実施形態において、トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列は、ガイドＲＮＡをコードする配列と融合する。他の実施形態において、組成物は、核局在シグナルをコードする配列を含む。
【００１０】
さらに別の実施形態は、遺伝子編集剤と、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードする単離核酸を含む発現ベクターであって、当該ｇＲＮＡが、レトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列、群に特異的な抗原の標的核酸配列、またはそれらの組合せに相補的である。
【００１１】
さらに別の実施形態において、単離核酸配列は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；プロウイルスＤＮＡの第１標的プロトスペーサー配列に相補的である第１スペーサー配列を有する第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；当該プロウイルスＤＮＡの第２標的プロトスペーサー配列に相補的である第２スペーサー配列を有する第２ｇＲＮＡを含み、当該第１標的プロトスペーサー配列および当該第２標的プロトスペーサー配列は当該プロウイルスＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）に位置する。いくつかの実施形態において、単離核酸配列は、複数の標的配列を標的とし、当該２つ以上の標的配列間の介在ウイルス配列を切除する。
【００１２】
さらに別の実施形態は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ；プロウイルスＤＮＡの第１標的プロトスペーサー配列に相補的である第１スペーサー配列を有する第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする単離核酸配列；当該プロウイルスＤＮＡの第２標的プロトスペーサー配列に相補的である第２スペーサー配列を有する第２ｇＲＮＡをコードする単離核酸配列を含む、単離核酸配列をコードする発現ベクターであって、当該第１標的プロトスペーサー配列および当該第２標的プロトスペーサー配列は当該プロウイルスＤＮＡの長い末端反復（ＬＴＲ）に位置する。
【００１３】
さらに別の実施形態は、対象のレトロウイルスを不活性化する方法であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログと、１つ以上のガイドＲＮＡとをコードする発現ベクターを含む組成物を、上記対象に投与する工程を含み、当該ガイドＲＮＡは当該レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である。
【００１４】
さらに別の実施形態は、ヒト免疫不全ウイルス感染を患う対象を処置する、またはヒト免疫不全ウイルス感染のリスクがある対象のヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを低減する方法であって、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログと、１つ以上のガイドＲＮＡとをコードする発現ベクターとを含む組成物を治療上有効な量、当該対象に投与する工程を含み、当該ガイドＲＮＡはレトロウイルスの標的核酸配列に相補的である。
【００１５】
本発明の他の態様は以下に示す。
〔図面の簡単な説明〕
図１Ａおよび１Ｂは、rAAV9:saCas9/gRNA Tg26 MEFによるＨＩＶ−１  ＤＮＡの切除を示す。図１Ａは、Ｔｇ２６動物を開発する導入遺伝子を作成するために除去された、ＧａｇおよびＰｏｌ遺伝子間（３１００ｂｐ）の位置を強調したＨＩＶ−１の模式図である。ｇＲＮＡ  ＬＴＲ１およびＧａｇＤの位置、ならびにそれらのヌクレオチドの組成を示す。赤字はＰＡＭ配列を示す。左上の図は、切除前後の予測される増幅産物と共に、ＰＣＲ（Ｐ１とＰ２）およびネステッドＰＣＲ（Ｐ１’とＰ２’）で使用したプライマーの位置を示す。図１Ｂは、Ｔｇ２６由来ＭＥＦの図と、rAAV9:Cas9/gRNAの量の増加に伴う、処置後のＨＩＶ−１  ＤＮＡのＰＣＲ増幅のゲル分析の結果を示す。全長（１３２３ｂｐ）および短縮型（truncated）（３４５ｂｐ）のＰＣＲ産生物の位置を示す。
【００１６】
図２Ａ〜２Ｄは、Ｔｇマウスの様々な組織における、rAAV9:saCas9/gRNAによるインビボにおけるＨＩＶ−１ＤＮＡの切除を示す。図２Ａは、rAAV9:Cas9/gRNAの接種に使用した手順、および分析に使用した臓器の模式図である。図２Ｂは、ｒＡＡＶ９を有するＴｇ２６マウス系統およびｒＡＡＶ９を有さないＴｇ２６マウス系統から得られたＤＮＡのＰＣＲの結果であり、ｒＡＡＶ９処置サンプル（左）において１３２３ｂｐおよび短縮型３４５ｂｐの位置を示す。３４５ｂｐのフラグメントを検出するためのプライマーＰ１／Ｐ２と、１６０ｂｐのフラグメントを検出するためのネステッドプライマーＰ１’／Ｐ２’を使用したＰＣＲ産生物のゲル解析を示す。全長ＰＣＲ産生物を矢印で示す（中央）。ＭＥＦ  ＤＮＡの二重プライマーＰＣＲ増幅の結果は、予測される２つの短縮型ＨＩＶ−１  ＤＮＡフラグメントを示す。全長増幅産物（矢印）および非特異的バンド（アスタリスク）の位置を示す。コントロール（Cont.）は、プライマー非存在下でのＰＣＲ反応物を示す（右）。図２Ｃは、パネルＢ（中央および右パネル）に示す１６０ｂｐのＤＮＡフラグメントのシークエンシングの結果を示す。プライマーならびにｇＲＮＡ  ＬＴＲ１およびＧａｇＤの位置を示す。図２Ｄは、さまざまな組織（レーン１および２）およびＭＥＦのＤＮＡのＰＣＲ増幅結果を示し、rAAV9:saCas9/gRNAを接種していない動物において、１６０ｂｐの短縮型ＤＮＡフラグメントは存在せず、rAAV9:saCas9/gRNAを与えた動物および細胞においてこのバンドが検出されたことを示した。
【００１７】
図３Ａ、３Ｂは、rAAV9:saCas9/gRNA接種後のラット血液細胞の組み込まれたＨＩＶ−１ＤＮＡのセグメントの除去、およびウイルスＲＮＡの発現を示す。（図３Ａ）コントロール（未処置）および実験（rAAV9:saCas9/gRNAで処置）ラットの循環リンパ球の全ＤＮＡを調製し、５’−ＬＴＲおよびＧａｇ遺伝子由来のプライマーセット（材料および方法を参照）を使用してＰＣＲ増幅に使用した。ゲル電気泳動後、〜１９８ｂｐの短いＤＮＡフラグメントが処置サンプルで検出されたが、未処置サンプルでは検出されず、該フラグメントを次に精製し、ＴＡベクターにクローニングした。いくつかのクローンをＤＮＡシークエンシング用に選択した。各動物から得られた４つの典型的なＤＮＡ配列（Ｃ１〜Ｃ４）を、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−１配列の参照ＬＴＲ−Ｇａｇ領域とアライメント（align）した。ＬＴＲ１およびＧａｇＤ標的配列の位置およびヌクレオチド組成を緑色、ＰＡＭを赤色、ならびにＰＣＲに使用したＬＴＲ特異的プライマーを青色で示す。（図３Ｂ）コントロール（未処置）およびrAAV9:saCas9/gRNAで１０日間処置した、トランスジェニックラットの循環リンパ球およびリンパ節から調製した全ＲＮＡを調製し、Ｇａｇ  ＲＮＡおよびＥｎｖ  ＲＮＡを検出するための定量ＲＴ−ＰＣＲに使用した。各アッセイにおけるβ−アクチンの発現量を測定し、その値をウイルスＲＮＡ発現における定量の参照として使用した。
【００１８】
図４Ａ〜４Ｅは、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノムを効率的に切除し、ＨＩＶ−１ルシフェラーゼレポーター発現を抑制することを示す。図４Ａ：ｓｇＲＮＡ標的部位（赤矢印）およびＰＣＲプライマー（黒矢印）の位置を示す。図４Ｂ、４Ｃ：ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターアッセイを使用した、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡシステムおよびｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡシステム間の効率の比較（図４Ｂ）と、ダイレクトＰＣＲジェノタイピング（direct PCR genotyping）（図４Ｃ）を示す。矢印は、ＬＴＲ１およびＬＴＲ３標的部位における典型的なフラグメントの欠失および追加の挿入を示しており、ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングで確認した（図４Ｃ）。図４Ｄおよび４Ｅ：ウイルス構造ｓｇＲＮＡと組み合わせた３つのＬＴＲ  ｓｇＲＮＡは、ONE-GLOルシフェラーゼアッセイによるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ活性を強力に阻害し（図４Ｄ）、図に示すプライマーでのダイレクトＰＣＲジェノタイピングによるフラグメントの欠失／挿入を誘導した（図４Ｅ）。赤枠の典型的なフラグメント欠失はサンガーシークエンシングによって確認した。９６ウェルプレートの６ウェル中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＮＬ４−３−ＥｃｏＨＩＶホタルルシフェラーゼレポーター（１０ｎｇ／ウェル）、ｐＣＭＶ−ウミシイタケルシフェラーゼレポーター（２ｎｇ／ウェル）および以下に示すＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ発現ベクターをコトランスフェクション：ｓｐＣａｓ９システム（図４Ｂ）についてはpLV-EF1a-spCas9-T2A-RFP（８０ｎｇ／ウェル）および図示する（indicated）ｓｇＲＮＡ発現ベクター（組合せｇＲＮＡに対して各６０ｎｇ／ウェル）；ＳａＣａｓ９システム（図４Ｂ、４Ｄ）についてはpX601-saCas9/LTR sgRNA発現ベクター（図示する対に対して各１００ｎｇ／ウェル）。４８時間後、細胞溶解物中のホタルルシフェラーゼ活性を、ONE-GLO（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムで測定した。また、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。データは、対応する空ｐＸ６０１ベクターと比較した、ウミシイタケルシフェラーゼ標準化後のホタルルシフェラーゼにおける、４つの独立したトランスフェクションでの割合変化の平均±ＳＤを示す。トランスフェクションした細胞の２ウェルはさらに、ダイレクトＰＣＲジェノタイピングに使用した（図４Ｃ、４Ｅ）。同様の実験を２〜３回繰り返した。
【００１９】
図５Ａ〜５Ｊは、オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。図５Ａ、５Ｂ：二重（duplex）ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ活性の強力な抑制（図５Ａ）、およびＨＩＶ−１ゲノムの切除（図５Ｂ）を示した。割合は、野生型バンドと比較した、フラグメント欠失バンドの濃度を示す（図５Ｂ）。図５Ｃ〜５Ｊ：四重（quadruplex）ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ活性の強力な抑制（図５Ｃ）、および５’−ＬＴＲ１／ＬＴＲ３とＧａｇＤ（図５Ｄ、５Ｅ）またはＧａｇＤ／ＰｏｌＢと３’−ＬＴＲ（図５Ｆ〜５Ｊ）の両方で、高い切除効率を示した。プライマーＴ３６１／Ｔ４５８（図５Ｄ）は、５’−ＬＴＲ１／ＬＴＲ３とＧａｇＤ（黒矢印）間のフラグメント欠失を検出し、さらなる挿入物が二重および四重の群（赤矢印）の両方で観察された。Ｔ７１０／Ｔ４５８は、５’−ＬＴＲ３およびＧａｇＤ間の欠失を検出した（図５Ｅ）。ＧａｇＤまたはＰｏｌＢと、３’−ＬＴＲ１／ＬＴＲ３との間の欠失は、プライマーＴ７５８／Ｔ３６３（図５Ｆ）およびＴ６８９／Ｔ３６３（図５Ｇ）によって、それぞれ検出された。プライマー対Ｔ６８９／Ｔ７１１は、ＰｏｌＢおよび３’−ＬＴＲ１間の欠失を検出した（図５Ｈ）。ゲノムＤＮＡをＳａＣａｓ９およびβ−アクチンで標準化した（図５Ｊ）。９６ウェルプレート中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターと、２つの独立した一重（monoplex）ｓｇＲＮＡを発現しているベクター（各１００ｎｇ）、１つの二重ｓｇＲＮＡが発現しているベクター（１００ｎｇ）およびｓｇＲＮＡコントロール群（２００ｎｇ、図５Ａ、５Ｂ）と等量にするための空ｐＸ６０１ベクター（１００ｎｇ）、または、１つの二重／四重ｓｇＲＮＡが発現しているベクターおよびｓｇＲＮＡコントロール（各１００ｎｇ、図５Ｃ〜５Ｊ）をコトランスフェクションした。４８時間後、ONE-Gloルシフェラーゼアッセイ（図５Ａ、５Ｃ）を図４Ａ〜４Ｅに示すように行い、ダイレクトＰＣＲジェノタイピングを図示するプライマー対を用いて行った（図５Ｂ、５Ｄ〜５Ｊ）。
【００２０】
図６Ａ〜６Ｇは、多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。１０の機能的ＭＯＩ（ｆＭＯＩ）による感染後２０日目のＮＳＣにおける、一重（図６Ａ）、二重（図６Ｂ）および四重（図６Ｃ）の類似の感染効率を示す。感染細胞を、抗ＨＡタグ抗体を用いた免疫蛍光細胞化学によって測定した。図６Ｄ〜６Ｆ：ダイレクトＰＣＲ分析によって、導入遺伝子ｓａＣａｓ９（図６Ｄ）およびＬＴＲ１／ＧａｇＤ（図６Ｅ）の用量依存的送達、および５’−ＬＴＲ／ＧａｇＤとＧａｇＤ／３’−ＬＴＲ（図６Ｆ）の感染後２日目の切除を確認した。（図６Ｇ）四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、１０ｆＭＯＩによる感染後２０日目において、二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９よりもより強い切除効率を示した。プライマーＴ３６１／Ｔ４５８は、５’−ＬＴＲ１／ＬＴＲ３およびＧａｇＤ間の欠失を検出し、プライマーＴ７５８／Ｔ６４５は、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１／ＬＴＲ３間の欠失を検出した（図６Ｆ、６Ｇ）。ＧＡＰＤＨはゲノムＤＮＡの標準化のために使用した。コントロールである８８２  ＡＡＶ−ＤＪウイルスは、非機能コントロールとして使用した。
【００２１】
図７Ａ〜７Ｇは、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ切除（図７Ａ〜７Ｃ）およびＨＩＶ−１  ＲＮＡ転写の強力な減少（ｄ−ｇ）を誘導したことを示す。図７Ａ、７Ｂ：Ｔｇ２６マウスに、尾静脈を通じて、精製ＡＡＶ−ＤＪ／８ウイルスを注入した（１．５３５×１０１２ＧＣ／マウス）。注入してから２週間後、マウスを犠牲にし、ゲノムＤＮＡ抽出およびＰＣＲジェノタイピングのために組織を回収した。ポジティブコントロールは、AAV-saCas9/sgRNA (LTR1+GagD)ベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターの切除を示した。ネガティブコントロールは、モックＡＡＶウイルスを注入したマウスを示した。図７Ｃ：最初の注入から２週目にＡＡＶ−ＤＪ／８をさらに注入し、２週間後に図示するプライマーによるＰＣＲジェノタイピングのために組織サンプルを回収した。典型的な欠失フラグメント（赤枠）を、ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングによって確認した（図１６Ａおよび１６Ｂを参照されたい）。図７Ｄ：ＨＩＶ転写物に対するＲＴ−ｑＰＣＲプライマー対の位置を示す模式図。図７Ｅ〜７Ｇ：モックＡＡＶウイルスを注入したコントロールマウスと比較した、ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９処置マウスにおけるＨＩＶ−１  ＲＮＡ転写物の量の強力な減少（ｐ＜０．００１）を示すＲＴ−ｑＰＣＲ分析。データは、ハウスキーピング遺伝子Ｐｐｉａによる標準化後の、３連の試験における平均±標準偏差を示す。
【００２２】
図８Ａ〜８Ｄは、インビボにおいて四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８がＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を誘導したことを示す、生物発光イメージング分析である。図８Ａ：ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ接種後すぐに、同じ注入部位に、各マウス（ｎ＝３）の右眼の血洞に眼窩後方注入によって、ＡＡＶ−ＤＪ／８を投与した。ＥｃｏＨＩＶ接種してから６、９、１２、および１９日目におけるマウスの典型的な生物発光イメージングを示した。すべてのイメージについて輝度（光子／秒／Ｓｒ２）を測定し、公正な比較による同じレインボースケールで疑似カラー化した。図８Ｂ：全光束の生物発光を、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃを接種してから各図示する日における、各群（１９日目（ｎ＝２）までｎ＝３／群）の全身から測定した。図８Ｃ：各マウスのＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ感染細胞からの生物発光出力を、比較のため右眼に定義した関心領域（ＲＯＩ）から測定した。データは、平均±標準偏差であり、各比較における「＊」は統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、スチューデント片側ｔ検定）。図８Ｄ：各マウス（１９日目（ｎ＝２）までｎ＝３／群）の首リンパ節からの生物発光出力を、ＨＩＶ切除における長期的なｓａＣａｓ９／ｇＲＮＡ処置の有効性との比較のために用いた（ｐ値は、線形混合効果モデルを使用した二面性（two-sided）である）。
【００２３】
図９Ａ〜９Ｉは、ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。図９Ａ〜９Ｃ：四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８（上パネル）または空コントロールＡＡＶ−Ｃｒｅ−ＤＪ／８（下パネル）による感染後１９日目について、図示する組織／臓器における、ｓａＣａｓ９（図９Ａ）、ＧａｇＤ（図９Ｂ）およびＬＴＲ−１（図９Ｃ）に関する遺伝子導入の様々な程度（various extent）。図９Ｄ〜９Ｆ：ネガティブコントロール（下パネル）と比較した、各図示する組織／臓器（上パネル）における、ＧａｇＤと３’−ＬＴＲ間のＥｃｏＨＩＶ  ＤＮＡ切除の様々な程度を示す従来のＰＣＲジェノタイピング。図９Ｇ〜９Ｉ：Ｂ１Ｍ１（図９Ｇ）、Ｂ１Ｍ２（図９Ｈ）およびＢ１Ｍ３（図９Ｉ）から選択された異なる組織／臓器における３つの図示するフラグメントの切除タイプの定量ＰＣＲ分析。データは３連における反応の平均±ＳＤを示し、同じ組織／臓器におけるＥｃｏＨＩＶ  ＤＮＡの内部未切断（非標的）領域と比較した相対量として示した。ＢｘＭｘは、枠およびマウスの番号を示す。
【００２４】
図１０Ａ〜１０Ｆは、ＡＡＶ処置後２週目（図１０Ａ〜１０Ｃ）、３週目（図１０Ｄ）および４週目（図１０Ｅ、１０Ｆ）において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。プライマー対Ｔ３６１／Ｔ４５８（５’−ＬＴＲ／Ｇａｇ増幅用）を使用した従来のＰＣＲ（３５サイクル）を、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡの存在を検出するために使用し、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ処置なしのＢ６Ｍ３ネガティブコントロールの肺組織において、弱い野生型バンド（１．４ｋｂ）を示した（図１０Ｃ）。１回目のＰＣＲ（プライマー対Ｔ３６１／Ｔ４５８による２２サイクル）からのテンプレートによる、プライマー対Ｔ３６１／Ｔ９４６（５’−ＬＴＲ／Ｇａｇ用）を使用したネステッドＰＣＲ（３５サイクル）は、すべてではないが、各ＢＬＴマウスの多くの臓器／組織においてＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの野生型ＤＮＡフラグメント（１．１３ｋｂ）を特定した（図１０Ａ〜１０Ｆ）。また、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡで処置したＨＩＶ感染ＢＬＴマウスの心臓、結腸および膣においてＨＩＶ−１切除に起因するフラグメント欠失のＰＣＲ産生物も特定した（図１０Ａ）。１回目のＰＣＲ（２５サイクル、Ｔ７５８／Ｔ４２５）からのテンプレートを使用した、プライマー対Ｔ７５８／Ｔ３６３（Ｇａｇ／３’−ＬＴＲ用）によるネステッドＰＣＲは、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ処置ＢＬＴマウスの臓器／組織においてフラグメント欠失バンドを特定したが（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｄ、１０Ｅ）、未処置ＢＬＴマウスでは特定されなかった（図１０Ｃ、１０Ｆ）。フラグメント欠失バンドは赤枠で示したｓａＣａｓ９編集に起因し、ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングで確認を行った（図２０Ａ、２０Ｂ、２１Ａおよび２１Ｂを参照されたい）。ＢｘＭｘは、枠およびマウスの番号を示す。ポジティブコントロールは、AAV-saCas9/sgRNA (LTR1+GagD)ベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターの切除を示した。
【００２５】
図１１Ａ〜１１Ｃは、ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシング分析を使用した、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃゲノムの予測されるフラグメント欠失の確認を示す。図１１Ａ：ｓｇＲＮＡ標的部位およびＰＣＲプライマー位置の模式図。図１１Ｂ：ＬＴＲ１およびＧａｇＤにおけるＰＡＭ（赤字）から３つ目のヌクレオチドにおける正確な切断後の９８４のヌクレオチド欠失の比較分析。図１１Ｃ：ＬＴＲ１およびＧａｇＤ間の編集／再ライゲーション部位を示す、典型的なサンガー配列トレーシング（tracing）。
【００２６】
図１２Ａおよび１２Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において多重ｓｇＲＮＡおよびｓａＣａｓ９を保有するＡＡＶ−ＤＪの機能的力価を示す。図１２Ａ：一重（プラスミド８２２）、二重（プラスミド９２４および９３８）および四重（プラスミド９６２）のｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪに対するゲノムおよび機能的力価のまとめである。図１２Ｂ：９６ウェルプレートに播いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞について、０．１μＬのＡＡＶ−ＤＪウイルス感染してから２日目における、抗ＨＡ抗体による免疫蛍光染色の典型的な画像。各３つのウェルの陽性細胞を数え、機能的力価は１ｍＬ当たりの導入ユニット（ＴＵ）として計算した。ゲノム力価は、標準サンプルのコピー数を使用した定量ＰＣＲ分析によって、１ｍＬのウイルスサンプル（ＧＣ／ｍＬ）中のウイルスゲノムコピー数によって決定した。
【００２７】
図１３Ａ〜１３Ｅは、二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪで感染させたＴｇ２６トランスジェニックマウスの異なる臓器／組織において、導入遺伝子発現およびＨＩＶ−１ゲノム切除について同様の効率を示す。図１３Ａ、１３Ｂ：感染してから１週間後の尾静脈からＡＡＶ−ＤＪウイルス（１００μＬのＰＢＳ中全量で４．１５〜４．２０×１０１２ＧＣ／マウス）を静脈内注入したＴｇ２６マウス（図１３Ａ）および最初の注入から１週間後にさらに注入したマウスの肝臓および脾臓における、ｓａＣａｓ９のＡＡＶ送達の高効率および典型的なｓｇＲＮＡ  ＬＴＲ−１発現カセット。組織サンプルは、最初の注入から１週間後（図１３Ａ）および２週間後（図１３Ｂ）に回収した。図１３Ｃ、図１３Ｄ：ネステッドＰＣＲ分析によって、肝臓、心臓、骨髄および脾臓においてフラグメント欠失を特定した。典型的な欠失フラグメント（赤枠）はＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングによって確認した（図１３Ｅ）。
【００２８】
図１４Ａ〜１４Ｃは、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、効率的な導入遺伝子の導入を誘導し（図１４Ａ、１４Ｂ）、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって、ＨＩＶ  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの様々な臓器／組織のＴａｔ転写を確認した。Ｔｇ２６マウスに、２週間に１回（図１４Ａ）または別々に２回（図１４Ｂ）、精製ＡＡＶ−ＤＪ／８ウイルス（１．５３５×１０１２ＧＣ／マウス）を尾静脈から注入した。最後の注入から２週間後に、マウスを犠牲にし、ゲノムＤＮＡ抽出、ならびに図示するｓｇＲＮＡおよびｓａＣａｓ９をコードするｃＤＮＡに対するＰＣＲジェノタイピングのために組織を回収した。図１４Ｃ：Ｔａｔ転写に対する、相対的なＣｔ値を示す典型的な増幅曲線である。
【００２９】
図１５Ａおよび１５Ｂは、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８を静脈内注入してから２週間後（図１５Ａ）および４週間後（図１５Ｂ）での、Ｔｇ２６マウスの臓器／組織におけるｓａＣａｓ９タンパク質の発現を示す。図示する臓器／組織の全ＲＮＡは、RNeasy Mini kitによって抽出し、残留するゲノムＤＮＡをRNase-Free DNase SetによるインカラムＤＮａｓｅ消化によって除去した。全ＲＮＡから逆転写（ＲＴ）させたｃＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析は、肝臓および肺に主に局在する、導入遺伝子であるｓａＣａｓ９の発現を測定するために使用した。Ｎｏ  ＲＴはゲノムＤＮＡコンタミネーションに対するネガティブコントロールとして使用した。テンプレートなしはＰＣＲコントロールとして使用した。組織凍結切片の典型的な顕微鏡写真は、ウサギ抗ＨＡタグ抗体（赤色）で免疫染色し、ファロイジン（緑色）で処理し、肝臓および肺においてｓａＣａｓ９タンパク質の発現を示す。ネガティブコントロールでは二次抗体のみ使用した。白矢印は、核においてｓａＣａｓ９様免疫反応の存在を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【００３０】
図１６Ａおよび１６Ｂは、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８を静脈内投与してから２週間後での、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの脳（図１６Ａ）および肝臓（図１６Ｂ）における、ＨＩＶ−１ゲノムのＧａｇＤから３’−ＬＴＲ１のフラグメント欠失の確認を示す。ＰＡＭ（赤字で強調されている）の３番目のヌクレオチドでの切断後の、予測される欠失である４９９２ｂｐのフラグメントは、ＴＡクローニングにおけるＰＣＲ産生物の多くの細菌クローンで観察され、いくつかのクローンにおいて小さな挿入または欠失があった。典型的なサンガー配列トレーシングは、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１間の切断／再ライゲーション部位（赤矢印）を示す。
【００３１】
図１７Ａ〜１７Ｆは、Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。ＬＴＲ１（図１７Ａ、１７Ｂ）、ＬＴＲ３（図１７Ｃ、１７Ｄ）およびＧａｇＤ（図１７Ｅ、１７Ｆ）で予測される、最も可能性があるオフターゲット部位の典型を、ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９処置してから４週間後における、Ｔｇ２６マウスの肝臓組織から抽出したゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産生物を使用した、Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイによって調査した。オンターゲットＰＣＲ産生物は、ポジティブコントロールとして使用した。矢印は、ＬＴＲ１に対するプライマー対Ｔ３６１／Ｔ３６３（図１７Ａ）、ＬＴＲ３に対するプライマー対Ｔ３６１／Ｔ４５８（図１７Ｃ）、およびＧａｇＤ（図１７Ｅ）よって生成されたポジティブコントロールＰＣＲ産生物に関する、ＩｎＤｅｌ変異パターンを示す。図１７Ｂ、１７Ｄ、１７Ｆ：マウスゲノムＤＮＡにおいて予測される、オフターゲットの可能性がある部位を包含する、ＰＣＲ産生物の典型的な配列。ＰＡＭ配列を赤字で強調し、ＰＣＲプライマーを緑字で強調する。
【００３２】
図１８Ａ〜１８Ｃは、ＮＣｒヌードマウスの心臓および肺組織における四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９によるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を示す。マウスの右眼に眼窩後方注入によってＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃを投与し、同じ注入経路で四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９を保有するＡＡＶ−ＤＪ８をさらに注入した。注入してから２週間後にマウスを犠牲にした。図１８Ａ：プライマーＴ７５８／Ｔ３６３によるＰＣＲジェノタイピングは、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１間に欠失を有する、予測されるフラグメントを増幅した。ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングのために、赤枠で示される、心臓および肺の欠失フラグメントをゲルから抽出した。図１８Ｂ、１８Ｃ：ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１間の予測される切断／再ライゲーション部位（赤矢印）を示す典型的なサンガー配列。欠失は、心臓（図１８Ｂ）および肺（図１８Ｃ）において、ＰＡＭ（赤字で強調されている）から３つ目のヌクレオチドで正確に起こった。
【００３３】
図１９は、ＨＩＶ切除効率を検出するｑＰＣＲ戦略を示す。表は、未切断（uncut）、切断（cut）および内在ＥｃｏＨＩＶ  ＤＮＡ量を示すためのすべてのｑＰＣＲプライマー対を示し、模式図はすべてのプライマーの位置を示す。
【００３４】
図２０Ａ、２０Ｂは、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡゲノム編集後のヒト化ＢＬＴマウスの臓器／組織における、５’−ＬＴＲ１およびＧａｇＤ部位間のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡのフラグメント欠失の確認を示す。図２０Ａ：予測される切断部位間に挿入されるジャンクション配列および予測されない配列の模式図。プライマーＴ３６１／Ｔ９４６（プライマーＴ３６１／Ｔ４５８による１回目のＰＣＲからのテンプレート）を使用したネステッドＰＣＲ産生物をＴＡクローニングのためにゲルから抽出し、各サンプルから２〜５のクローンをシークエンシングした。ＰＡＭから３番目のヌクレオチドにおける正確な切断部位（赤字で強調される）をはさみで示している。５’−ＬＴＲ１およびＧａｇＤ間の予測される欠失、および様々な追加の挿入（緑色）または欠失（黒点線）を特定した。青色およびピンク色の立体棒（solid bar）は、切断して残留する配列を示す。フラグメントの上の数は、ヌクレオチド部位の開始点および終点を示す。星印を有するＴＡクローンは、詳細な配列およびトレーシングを示すために選択する。図２０Ｂ：クローンＢ５Ｍ３−心臓−１の典型的なサンガー配列トレーシングは、５’−ＬＴＲ１およびＧａｇＤ間の、切断／再ライゲーション部位（矢印で示す）を示す。５’−ＬＴＲ１およびＧａｇＤ間の結合配列（conjunctive sequence）をそれぞれ、オレンジ色および緑色で示す。プライマーＴ３６１およびＴ９４６配列をそれぞれ、青色および黄色で示す。
【００３５】
図２１Ａおよび２１Ｂは、ゲノム編集後のヒト化ＢＬＴマウスの臓器／組織における、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１部位間のＨＩＶ−１ゲノムのフラグメント欠失の確認を示す。図２１Ａ：プライマーＴ７５８／Ｔ４５８による１回目のＰＣＲ増幅後、プライマーＴ７５８／Ｔ３６３を用いたネステッドＰＣＲ産生物。ＰＡＭ配列を赤字で強調する。はさみは、ＰＡＭから３番目のヌクレオチドにおける正確な切断部位を示す。ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１間の予測される欠失を、緑色で強調した、さらなる欠失または予測されない挿入物と共に示している。黒点線は、欠失部分を示す。青色およびピンク色の立体棒は、切断部位の位置を示す。フラグメントの上の数は、ヌクレオチド部位の開始点および終点を示す。星印を有するＴＡクローンは、詳細な配列を示すために選択する。図１０Ｂにおいて緑色の矢印で示すマウスＢ５Ｍ３の胸腺組織（hThymus）の短いフラグメントは、シークエンシングによって非特異的であると特定された一方、上側のバンドは切断して残留する配列であった。図２１Ｂ：矢印によって示される、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１間の、切断／再ライゲーション部位を示すクローンＢ５Ｍ３−胸腺−１の典型的なサンガー配列トレーシング。欠失後結合した、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１の切断配列を、それぞれ紫色および青色で強調している。プライマーＴ７５８およびＴ３６３配列をそれぞれ赤色および黄色で強調している。
【００３６】
図２２および２２Ｂは、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃおよびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの模式図である。図２２Ａ：病原に関する完全なＨＩＶ−１  Ｎｅｆの発現および早期ＨＩＶ感染を保持するために、Ｐ２Ａペプチド、上流および下流の遺伝子間を切断し得る自己切断ペプチド、および５’Ｎｅｆ部分を各レポーターの３’末端に枠内（in frame）でクローニングした。２Ａペプチドの切断部位は、正確でありかつよく定義されており、このような場合、ＮｅｆのＮ末端における１つの追加のアミノ酸でさえ予測された。図２２Ｂ：ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃにおいて、ＨＩＶ  ｇｐ１２０はエコトロピックマウス白血病ウイルスのｇｐ８０に置換し、ヒト細胞よりもマウス細胞のみに感染する。
〔発明を実施するための形態〕
遺伝子編集技術は、特にＨＩＶ−１ゲノムを標的とし、プロウイルスＤＮＡが組み込まれたコピーを切除するためのＲＮＡ−誘導Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９として知られている）に基づいて発展してきた。特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の作成の標的として機能し、単一または多重（multiplex）Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によってその標的配列を編集する、ＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）に属するＵ３領域を含むいくつかの特異配列が同定された。この戦略によって、潜在感染ＣＤ４＋Ｔ細胞および単核の食細胞（単核白血球、マクロファージ、ミクログリア、および樹枝状細胞）におけるウイルス複製の完全な切除が可能になる（Hu W, et al. Proc Natl Acad Sci USA 2014; 111:11461-11466; Khalili K, et al. J Neurovirol 2015; 21:310-321、当該文献は参照によって本明細書に援用される）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は遺伝毒性作用をもたない、または、ホストゲノムのオフターゲット編集を行わない。さらに、プロウイルスゲノムの組込みにおける、ＨＩＶ−１のＬＴＲの５’末端と３’末端との間の９７０９ｂｐのＤＮＡ断片を正確に切除するという、この技術能力を初めて示した。多重ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の存在もまた、後のＨＩＶ−１感染から保護し、ヒトの疾患における細胞モデルに首尾よく用いられた（Ebina H, et al. Sci Rep 2013; 3:2510; Liao HK, et al. Nat Commun 2015; 6:6413; Zhu W, et al. Retrovirology 2015; 12:22）。
【００３７】
しかし、重要な課題は、ウイルスＤＮＡを保有する（harbor）組織および細胞への機能的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をインビボ送達することに関する。近年、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）は、遺伝子損失または変異によるヒトの疾患を治療するための遺伝子送達システムのような、より多くの注意を捉えてきた（Mittermeyer G, et al. Hum Gene Ther 2012; 23:377-381）。ＡＡＶ送達の機構の利点には、その低い毒性、および１回の投与の後１２ヶ月に及ぶ持続的な遺伝子発現が含まれる（Boudreau RL, et al. Hum Mol Genet 2011; 20:R21-R27; Naldini L. Nature 2015; 526:351-360）。ＡＡＶ送達システムによって標的とされる最も一般的な疾患には、がん、心不全、神経樹状突起疾患、関節炎、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症およびキャナヴァン病に含まれるその他の疾患が含まれる（Bennett J, et al. Sci Transl Med. 2012; 4:120ra15; Janson C, et al. Hum Gene Ther 2002; 13:1391-1412）。
【００３８】
本発明は、インビボマウスモデルにおいて組込みＨＩＶゲノムの部分の切除を産出する組成物および方法を初めて提供する。特に、本発明は、ＡＡＶ系ＣＡｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集送達システムを含む。
【００３９】
よって、本発明の実施形態は、例えば、潜在感染ヒト細胞および動物疾患モデルによってヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のようなレトロウイルスＤＮＡが組み込まれた配列を切除するために開発された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムの効率の良いインビボ細胞内送達のための組成物に関する。組込みプロウイルスＤＮＡを編集するおよびウイルスを削除する方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの組成物の投与を含む。
【００４０】
本明細書に記載の全ての遺伝子、遺伝子の名称、および遺伝子産物は、本明細書に記載の組成物および方法が適用可能な任意の種に由来する相同体に対応することが、意図される。特定の種に由来する遺伝子または遺伝子産物が開示される場合、本開示はただの例示を意図しているに過ぎず、文脈から明示されていると取れる場合を除き、限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、例えば、本明細書に記載の遺伝子または遺伝子産物に関しては、他の種に由来する、相同および／またはオーソロガスな遺伝子および遺伝子産物を包含することを意図している。
【００４１】
以下の好ましい実施形態の説明は、事実上の例に過ぎず、発明、その用途および利用を限定することを意図するものではない。本発明の実施形態は、論理的に提示された側面を除き、実施可能である。さらに、理論的な側面は、出願人が、提示された理論を超えずに得た理解が提示されている。
【００４２】
数多くの特定の詳細、関係性および方法が、本発明の全体的な理解を提供するために述べられていることは理解されるべきである。しかし、関連性のある分野の当業者は、発明が、１つ以上の特有の詳細を伴わないか、他の方法を伴って実践できることを難なく認識するだろう。いくつかの作用が、その他の作用または事象を伴って、異なる順でおよび／または同時に発生し得るように、本発明は、作用または事象における順序の説明によって制限されない。さらに、全ての説明されたアクションまたは事象は、本発明の方法の実施が要求されない。
【００４３】
別の方法で定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語（専門および科学的用語を含む）は、この発明に属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。一般的に使用される辞書に定義されるようなこれらの用語は、関連する分野における文脈に整合する意味を持つとして解釈され、特に本明細書でそのように定義しない限り、理想化した、または過度に形式的な意味に解釈されないことは、さらに理解されることである。
【００４４】
（定義）
本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を説明するという目的でのみ使用され、本発明を限定する意図は無いということも理解されたい。
【００４５】
本明細書で用いられるように、単数形の"a"、"an"および"the"は、文脈において明確に別な方法で示していない限り、単数形と同様に複数形をも含むことを意図している。また、用語「含んでいる（including）」、「含む（includes）」、「有している（having）」、「有する（has）」、「共に（with）」、またはそれらの異形が、詳細な説明および／または請求項にて使用される範囲において、そのような用語は、「備えている（comprising）」という用語と同様に、包括的であることを意図している。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、用語「備えている（comprising）」または「備える（comprise）」または「備えられた（comprised）」およびそれらの変形は、関連する事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などの定義または記載された要素が、包括的またはオープンエンドであることを意味する。これらには追加の要素も認められるので、定義されたまたは記載された事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などは、その特定された要素（または、適宜、その同等物）を含み、他の要素が含まれてもよいことを示す。また、他の要素が含まれても、依然として、定義された事項、組成、装置、方法、プロセス、システム、などの範囲／定義にも該当することを示す。
【００４７】
用語「約（about）」または「およそ（approximately）」は、当業者などによって決定された特定の値が許容できる誤差範囲にあることを意味し、これは、どのように値を測定または決定したか、すなわち測定機器の限界など、によるものである。例えば、「約」は、その分野での習慣によって１または１より大きい標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、与えられた値または範囲における２０％に至るまで、１０％に至るまで、５％に至るまで、または１％に至るまでの範囲を意味し得る。または、特に生物学的システムまたはプロセスにおいて、当該用語は、５倍以内のオーダー、および２倍以内のオーダーの値も意味し得る。本願および請求項にて特定の値が記載されている場合、特に断りのない限り、用語「約」は、特定の値にとって許容できる誤差の範囲以内であることを意味するものとする。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「剤（agent）」は、疾患または医療の好ましくない健康状態を予防、改善、または治療することができる任意の分子、化学的単位、組成物、薬剤、治療剤、化学血清療法剤、または生物製剤を含むことを意味する。この用語は小分子化合物、アンチセンス試薬、ｓｉＲＮＡ試薬、抗体、酵素、ペプチド類有機化合物または無機化合物、天然または化合物等を含む。剤は、臨床試験中、プレトライアル試験中またはＦＤＡ認可後のいずれの段階においても本発明の方法に従って分析され得る。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「抗ウイルス剤」は、ウイルスの処置に用いられる任意の分子を指し、当該ウイルスと関連する任意の症状を緩和する剤、例えば、抗発熱剤、抗炎症剤、化学療法剤などを含む。抗ウイルス剤としては、抗体、アプタマー、アジュバント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ケモカイン、サイトカイン、免疫促進剤、免疫調節剤、Ｂ細胞調節剤、Ｔ細胞調節剤、ＮＫ細胞調節剤、抗原提示細胞調節剤、酵素、ｓｉＲＮＡ、リバビリン、リボザイム、プロテアーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プリンヌクレオシド、ケモカイン受容体拮抗薬、インターロイキン、またはそれらの組合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ヌクレオシドに関する「アナログ」は、改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980；Freier & Altmann, Nucl. Acid. Res., 1997, 25(22), 4429-4443,Toulme, J.J., Nature Biotechnology 19:17-18 (2001)；ManoharanM., Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139(1999)；FreierS. M., Nucleic Acid Research, 25:4429-4443 (1997)、Uhlman,E., Drug Discovery & Development, 3: 203-213 (2000)、Herdewin P.,
Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310(2000)によって概説的に記載されたもの；2'-O, 3'-C-linked [3.2.0]bicycloarabinonucleosides (例えば、N.K Christiensen., etal., J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463 (1998)を参照））を含んでいる。そのようなアナログには、結合特性が向上するよう設計された合成ヌクレオシド（例えば、２倍または３倍の安定性や特異性など）が含まれる。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、ウイルス（例えばＨＩＶウイルス）に結合し、免疫媒介による当該ウイルスの破壊および一掃を助ける１つ以上のウイルス特異的結合領域を含む。抗体またはその断片は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはそれらの組合わせを含む。
【００５２】
用語「決定する（determining）」、「測定する（measuring）」、「評価する（evaluating）」、「検出する（detecting）」、「評定する（assessing）」、「分析する（assaying）」は、明細書中、いずれの測定の形態をもいうために互換可能に使用され、要素が存在するかしないかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的な決定の両方を含む。評定することは、相対的または絶対的で有り得る。「存在を評定すること」は、そのものが存在するか欠けているかを決定することと同様、存在する量を決定することを含む。
【００５３】
本明細書に使用されるとき、「有効量、有効な量(effective amount)」は、治療的または予防的に利益を提供する量を意味する。本明細書で定義するように、「有効」量（すなわち効果的な服用量）の化合物または剤とは、望ましい結果（例えば臨床的に）を生み出すために十分な量を意味する。
【００５４】
「コードする（encoding）」とは、ポリヌクレオチド（遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど）におけるヌクレオチドの特異的配列に固有の性質を指す。上記性質とは、ヌクレオチドの定義された配列（つまり、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおいて、他の重合体および高分子の合成用テンプレートとして機能すること、ならびに、これに起因する生物学的性質、である。したがって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的システム中でタンパク質を産生する場合には、当該遺伝子はタンパク質をコードしていると言える。コーディング鎖（自身のヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通例配列表に記載されている）、および非コーディング鎖（遺伝子またはｃＤＮＡの転写用テンプレートとして用いられる）の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡの、タンパク質または他の産物をコードしている、と言うことができる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンの関係にあり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列を含む。「タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列」という語は、上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列のいくつかのバージョンがイントロンを含みうる程度に、イントロンを含んでもよい。
【００５５】
本明細書に使用されるとき、ウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の「根絶（eradication）」という用語は、当該ウイルスが複製できず、ゲノムが欠失し、断片化され、劣化し、遺伝子的に不活性化され、又は、当該ウイルスから遺伝性を失わせあるいは当該ウイルスが他の任意の細胞又は対象に感染するのを妨げる他の任意の物理的、生物学的、化学的、又は構造的発現が生じ、その結果、当該ウイルスがインビボで一掃されることを意味する。場合によっては、ウイルスゲノムの断片が検出されるかもしれないが、当該ウイルスは複製又は感染などができない。
【００５６】
用語「外来性（exogenous）」は、核酸またはポリペプチドが組換え核酸コンストラクトの一部であるか、もしくは組換え核酸コンストラクトにコードされていること、または、核酸またはポリペプチドがその自然環境にはないことを指す。例えば、外来性の核酸とは、ある種から別の種へ導入される配列（つまり、異種核酸）であり得る。典型的には、そのような外来性の核酸は、組換え核酸コンストラクトを介して別の種へと導入される。外来性の核酸は、ある生物に固有の配列であって、その生物の細胞に再導入された配列であってもよい。外来性の核酸と結合した非天然配列（例えば、組換え核酸コンストラクトにおいて、ネイティブ配列に隣接する非ネイティブ制御配列）の存在により、ネイティブ配列を含む外来性の核酸は、しばしば天然に存在する配列と区別されることがある。さらに、安定して形質転換された外来性の核酸は、一般的に、ネイティブ配列の位置とは別の位置に組み込まれる。
【００５７】
用語「発現（expression）」は、本明細書に使用されるとき、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳（そのプロモーターによって駆動される）、として定義される。
【００５８】
「発現ベクター」とは、組換えポリヌクレオチド（発現すべきヌクレオチド配列と操作的に結合している、発現調節配列を有する）を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用要素を含む。発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいし、または、インビトロ発現システム中に存在してもよい。発現ベクターは当該技術分野で知られているあらゆるものを含む。その例としては、組換えポリヌクレオチドが組み込まれた、コスミド、プラスミド（例えば、そのままの、またはリポソームに格納された）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などが挙げられる。
【００５９】
用語「免疫調製」、または「免疫細胞調節剤」は、免疫原性（すなわち、免疫応答を刺激または増加させる）または免疫抑制性（すなわち、免疫応答を減少させるまたは抑制する）化合物、組成物、または物質を意図する。「免疫システムの細胞」または「免疫細胞」は、免疫応答の増大を検出し得るか、あるいは、免疫反応の増大に関連し得る、免疫システムの任意の細胞を含むことを意図する。例として、Ｂリンパ球（Ｂ細胞とも呼ばれる）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞とも呼ばれる）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ）細胞、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単核白血球、マクロファージ、好中球、顆粒球、肥満細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核球細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、遺伝子改変免疫細胞（ハイブリドーマを含む）、薬剤改変免疫細胞、および、上記の細胞型の誘導体、前駆体、または原種が挙げられるが、これらに限定されない。抗原への機能または応答は、任意の種類の検定法（例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロッティングなど）にて測定できる。
【００６０】
用語「免疫応答を誘導するまたは高める」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が投与されていないコントロールサンプルに比べて、免疫応答を統計的に測定可能なほど誘導または増強することを意図する。その反対に、免疫応答の「抑制」は、例えば、自己免疫シナリオにおいて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が投与されたコントロールサンプルに比べて、免疫応答を測定可能なほど減少させることである。免疫応答の誘導または増強は、対象における予防反応または治療反応をもたらすことが好ましい。免疫応答の例としては、Ｉ型ＩＦＮの産生の増加、代わりの病原体によるウイルスまたは他の型の感染に対する抵抗力の増加が挙げられる。ウイルスに対する免疫応答（抗ウイルス応答）の増強、またはウイルス感染を防ぐもしくは現存のウイルスを除去するワクチンの開発。
【００６１】
「単離された（isolated）」とは、天然状態から変化したか、または取り去られたことを意味する。例えば、動物の生体中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共在物質から部分的または完全に分離した同じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離核酸または単離タンパク質は、実質的に純化された形態で存在してもよく、または、天然状態でない環境（例えば宿主細胞など）に存在してもよい。
【００６２】
「単離核酸」は、天然に存在する状態において隣接する配列から単離した、核酸セグメントまたは断片を指す。つまり、通常ならば上記断片が隣接している配列（つまり、上記断片が天然に存在するゲノムにおいて、当該断片に隣接している配列）から取り除かれた、ＤＮＡ断片である。当該用語は、通常は核酸を伴う他の成分（つまり、通常は細胞中において核酸を伴う、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、当該用語は、例えば、（i）ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ、（ii）自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに組み込まれた組換えＤＮＡ、または（iii）原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、または（iv）他の配列から独立した単離分子（つまり、ｃＤＮＡまたは、ＰＣＲもしくは制限酵素消化によって作製されたゲノム断片もしくはｃＤＮＡ断片）としての組換えＤＮＡ、を含む。また、追加のポリペプチド配列をコードしている、ハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡ；相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；天然および／または修飾されたモノマーまたはリンケージ（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換形態およびαアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアート、およびメチルホスホナートなども含む）の、直鎖状または環状のオリゴマーまたは重合体も含まれる。
【００６３】
用語「調節する（modulate）」に関していえば、活性に言及したいずれをも意味し、例えば、増加した、増強した、増加した、苦痛を与えた（agonized）（アゴニストについての作用）、促進した、減少した、抑制された、阻害された、拮抗した（アゴニストについての作用）を意味する。調節は、活性を基準値の１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、１００倍以上などに増加し得る。調節はまた、その活性を、基準値を下回って減少させ得る。調節はまた、活性を基準値へ標準化し得る。
【００６４】
本明細書で用いられるように、「核酸」、「単離核酸配列」または「核酸配列」または「ｃＤＮＡ」は、自然発生状態において隣接する配列から単離した、核酸セグメントまたはフラグメントを指す。つまり、通常ならば上記フラグメントが隣接している配列（つまり、上記フラグメントが自然発生するゲノムにおいて、当該フラグメントに隣接している配列）から取り除かれた、ＤＮＡフラグメントである。当該用語は、通常は核酸を伴う他の成分（つまり、通常は細胞中において核酸を伴う、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、当該用語は、例えば、（i）ベクターに組み込まれた組換えＤＮＡ、（ii）自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに組み込まれた組換えＤＮＡ、または（iii）原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡ、または（iv）他の配列から独立した単離分子（つまり、ｃＤＮＡまたは、ＰＣＲもしくは制限酵素消化によって作製されたゲノムフラグメントもしくはｃＤＮＡフラグメント）としての組換えＤＮＡ、を含む。また、追加のポリペプチド配列をコードしている、ハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。
【００６５】
本文中の用語「核酸塩基」は、非天然の核酸塩基と同様に天然に存在する核酸塩基も包含する。当業者にとってみれば、種々のすでに検討されていた「非天然」核酸塩基が、後に自然界において発見されることは明らかである。このように、「核酸塩基」は、既知のプリンおよびピリミジン複素環のみでなく、これらの複素環類似体および互変異性体も含む。核酸塩基の実例としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、偽異性シトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、およびBenner et al., 米国特許第5,432,272号に記載の「天然に存在しない」核酸塩基である。用語「核酸塩基」は、これらの類似体および互変異性体と同様、上述の例それぞれおよび全てを範囲に入れることを意図している。特に興味深い核酸塩基は、ヒトにおいて治療学的および診断上の用途に関係する天然に存在する核酸塩基として検討されてきたアデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシルである。
【００６６】
本明細書に使用されるとき、用語「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」および「遺伝子」は、明細書を通じて互換的に使用され、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；天然および／または修飾されたモノマーまたはリンケージ（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、その置換形態およびαアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアート、およびメチルホスホナートなども含む）の、直鎖状または環状のオリゴマーまたは重合体も含まれる。
【００６７】
核酸配列は「キメラ（chimeric）」であり得る。つまり、異なる領域から構成され得る。本発明の文脈において、「キメラ」化合物は、２つ以上の化学領域（例えば、ＤＮＡ領域、ＲＮＡ領域、ＰＮＡ領域など）を含む、オリゴヌクレオチドである。化学領域のそれぞれは、少なくとも１つのモノマーユニット（つまり、ヌクレオチド）から構成されている。これらの配列は、一般的に少なくとも１つの領域を含み、上記配列は、１つ以上の所望の性質を示すように修飾されている。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」は、Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed.（Freeman, San Francisco, 1992）に記載されているように、例えば２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシの形態を含む天然ヌクレオシドを含んでいる。
【００６９】
「付加的（optional）」または「付加的に（optionally）」とは、事象または事情がその後に発生し得るまたはし得えないことを表しており、本明細書は事象または事情が発生する場合の具体例、およびそれが発生しない場合の具体例を含む。
【００７０】
免疫原性組成物の「非経口的」投与は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内（intrasternal）への、注射または注入技術を含む。
【００７１】
「患者」または「個体」または「対象」という用語は、本明細書中において互換的に用いられ、治療される哺乳類の対象を意味し、ヒト患者であることが好ましい。場合によっては、本発明の方法は、実験動物、獣医学への応用、および疾患動物モデル（マウス、ラット、ハムスターを含む齧歯類、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されない）の開発に供される。
【００７２】
本明細書で用いられる、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、明細書を通じて互換的に使用され、別の方法によって示さない限り、様々な大きさのアミノ酸の高分子をいう。これらの用語は、アミノ酸の高分子の特定の長さを意味するものではない。このように、例えば、用語オリゴペプチド、タンパク質および酵素は、組換え技術、化学的なまたは酵素による合成によって生成されたものも、天然に存在するものも、ポリペプチドまたはペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などによって改変または誘導されたポリペプチドを含む。
【００７３】
用語「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの鎖を指し、「核酸」としても知られている。本明細書において使用する場合、ポリヌクレオチドは、本分野において利用可能な任意の手段によって得られる全ての核酸配列を含み、天然核酸および合成核酸の両方を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
ポリヌクレオチド配列の文脈で使用する場合、用語「バリアント」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義は、例えば、「対立遺伝子の」バリアント、「スプライス」バリアント、「種」バリアント、または「多形」バリアントも含み得る。スプライスバリアントは、参照元の分子との有意な同一性を持ち得るが、一般的には、より多いかまたはより少ない数のポリヌクレオチドを有する。これは、ｍＲＮＡプロセシング中に、異なるエクソンのスプライシングが行われるためである。対応するポリペプチドは、追加の機能ドメインを有するか、またはドメインの欠落を有し得る。種バリアントは、ある種と別の種との間で異なっている、ポリヌクレオチド配列である。野生型標的遺伝子産物のバリアントが、本発明において特に有用である。バリアントは、核酸配列中の少なくとも１つの変異に起因してよく、異なるｍＲＮＡまたはポリペプチドが生じる（これらの構造または機能は、変化していてもよいし、変化していなくてもよい）。任意の天然遺伝子または組換え遺伝子は、対立遺伝子の形態をまったく有さないか、または１つ以上の対立遺伝子の形態を有してもよい。バリアントを引き起こす一般的な変異は、一般的に、ヌクレオチドの自然的欠失、付加、または置換に起因している。これらの変化のそれぞれは、特定の配列中に、１回または複数回、単独または他との組合わせで、起こり得る。
【００７５】
得られたポリペプチドは一般的に、互いに関連する有意なアミノ酸同一性を有する。多形バリアントは、所定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異（variation）である。多形バリアントは、１つの塩基によってポリヌクレオチド配列が変化する、「一塩基多型（ＳＮＰ）」または一塩基変異をも包含する。ＳＮＰの存在は、例えば、疾患状態である、すなわち耐性に対して感受性がある、一定の集団を示し得る。
【００７６】
用語「標的核酸」は、レトロウイルスに由来する核酸配列を指し、オリゴヌクレオチドまたは例えばｇＲＮＡなどのガイド核酸配列が特異的にハイブリダイズされるようになっている。これは、検出対象である標的核酸の存在の有無、または定量対象の標的核酸の量のいずれかである。標的核酸は、標的に向けられている、対応するオリゴヌクレオチドの核酸配列に相補的な配列を有する。標的核酸という用語は、オリゴヌクレオチドが向けられている、より大きな核酸の特定の配列または配列全体（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ）を意味し得る。
【００７７】
本明細書において使用されるとき、ポリペプチドの「バリアント」は、１つ以上のアミノ酸残基によって変更されたアミノ酸配列を指す。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造的特性または化学的特性を有する「保存的な」変更（例えば、ロイシンをイソロイシンに置換すること）を有していてもよい。より珍しいものとして、バリアントは「非保存的な」変更（例えば、グリシンをトリプトファンに置換すること）を有していてもよい。アナログでマイナーなバリエーションは、アミノ酸の欠失もしくは挿入またはその両方も含み得る。生物学的活性を消滅させずにどのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失され得るかを決定する指針は、当該分野で公知のコンピュータプログラム（例えば、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR））を用いて見出せばよい。
【００７８】
「処置」は、病気の病状または症候の進行を妨げるまたは変える目的をもって行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置および予防的または防止的方策の両方を指す。「処置」は、緩和ケアとして特定されてもよい。処置が必要な者としては、既に病気を患っている者、および、病気を防ぎたい者が挙げられる。したがって、状態、病気または異常を「処置すること（treating）」またはその「処置（treatment）」は、（１）状態、病気もしくは異常に苦しむか、または、かかりやすくなっているが未だ当該状態、病気もしくは異常の臨床学的もしくは準臨床学的症候を経験もしくは顕示していないヒトまたは他の哺乳類において進行する当該状態、病気または異常の臨床学的症候の出現を防ぐことまたは遅らせること；（２）当該状態、病気または異常を阻害すること、すなわち、疾患の進行もしくはその再発（持続処置の場合）またはその少なくとも１つの臨床学的もしくは準臨床学的症候を抑えること、低減すること、または遅らせること；または（３）疾患を軽減すること、すなわち、当該状態、病気もしくは異常またはその臨床学的もしくは準臨床学的症候の少なくとも１つの退行を起こすこと、を含んでいる。処置される個体への利益は、統計学的に有意であるか、または、患者もしくは医師が少なくとも認知できる。
【００７９】
ここで定義されるように、化合物または剤の「治療上有効な」量（つまり、効果的な投与量）とは、所望の治療的（例えば臨床的）結果をもたらすのに、十分な量を意味する。組成物は、日に１回以上〜週に１回以上投与されてもよい（２日に１回の投与を含む）。当業者であれば、対象を効果的に処置するために必要な投与量およびタイミングが、ある種の要因に影響され得ることを理解するであろう。当該ある種の要因としては、疾患または障害の重篤度、過去の処置、対象の全身の健康状態および／または年齢、ならびに他に発症している疾患が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の化合物の治療上有効な量を用いる対象の処置としては、１回の処置または一連の複数回の処置が挙げられる。
【００８０】
本明細書に使用されるとき、用語「キット」は、物質を送達する任意の送達システムを意味する。「キット」という用語は、研究用および臨床用の、両方の用途のキットを含む。反応分析の文脈において、そのような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器に入れられた、オリゴヌクレオチド、酵素、など）および／または補助的な物質（例えば、緩衝液、分析を行うための説明書、など）を、ある場所から別の場所へ保管、移送、または配達することを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助的な物質を格納する、１つ以上の格納容器（例えば、ボックス）を備えている。本明細書に使用されるとき、「分裂キット(fragmented kit)」という用語は、２つ以上の分離容器を備えており、それぞれが全キット構成要素の一部を格納している送達システムを意味する。当該容器は、対象とする受取人へ、一緒にまたは別々に届けられてもよい。例えば、第１の容器が分析に使用される酵素を格納し、一方、第２の容器がオリゴヌクレオチドまたはリポソームを格納してもよい。「分裂キット」という用語は、米連邦食品・医薬品・化粧品法のセクション５２０（ｅ）において規制される検体特異的試薬（ＡＳＲ）を含むキットを包含することを意図しているが、これに限定されない。実際には、２つ以上の分離容器を備えており、それぞれが全キット構成要素の一部を格納している任意の送達システムは、「分裂キット」という用語に含まれる。対照的に、「結合キット(combined kit)」とは、１つの容器に反応分析用の全ての構成要素を格納している送達システム（例えば、所望の構成要素のそれぞれを格納する、１つのボックス）を意味する。「キット」という用語は、分裂キットおよび結合キットの両方を含む。
【００８１】
用語「パーセント配列同一性」、または、「配列同一性」を有する、は、任意のクエリ配列と対象配列との間の、同一性の程度を意味する。
【００８２】
「薬学的に許容できる」（または「薬理学的に許容できる」）という用語は、動物またはヒトに適宜投与されたときに、有害反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を起こさない、分子的実体および組成物を意味する。本明細書に使用されるとき、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容できる物質の媒体として使用され得る、溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤、等張性薬剤、および吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤、などの全てを含む。
【００８３】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な様態を、範囲の形式で示すことができる。範囲の型式による記載は、単に便宜および簡潔さのためのものであることを理解されたい。また、このような記載は、本発明の範囲における変更できない限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値だけでなく、具体的に開示された全ての取り得る部分範囲も含むと考えられるべきである。例えば、「１から６」という範囲の記載は、その範囲内の個々の数値（例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６）だけでなく、具体的に開示された部分範囲（１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６など）も含むと考えられるべきである。このことは、範囲の広さを問わず適用される。
【００８４】
任意のアミノ酸配列について、スイスプロットまたはＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号によって具体的に言及する場合、当該配列は参照によって本開示に援用される。シグナルペプチドの特定、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、プロモーター配列、および翻訳開始点などの寄託番号に関連する情報も、参照により全て本開示に援用される。
【００８５】
（一般的技術）
本発明のプラクティスにおいて有益な、一般的技術のさらなる詳細のために、当業者は一般的な本を参照し、細胞生物学、組織培養、発生学および生理学について見直すことができる。
【００８６】
分子および細胞生化学における一般的技術は以下のような本において参照することができる：A Laboratory Manual, 3rd Ed.（Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001）、Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. （Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999）、 Protein Methods （Bollag et al., John Wiley & Sons 1996）、Nonviral Vectors for Gene Therapy （Wagner et al. eds., Academic Press 1999）、 Viral Vectors （Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995）、 Immunology Methods Manual （I. Lefkovits ed., Academic Press 1997）、 and Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology （Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998）。本明細書において開示される遺伝子学的操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、次のような商業業者から入手することができる：BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, and ClonTech.
（組成物）
本発明の実施形態は、インビボおよびインビトロにおいて感染した細胞からレトロウイルスの核酸配列を切除および／または根絶するための組成物について開示する。感染の処置または予防の方法は、本明細書で開示される組成物を用いることを含む。
【００８７】
要するに、ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）および群特異的な抗体（Ｇａｇ）を認識するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共にＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、組換えアデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）によってＴｇ２６トランスジェニックマウスに送達される。マウス細胞は第８染色体に組み込まれた複数のＨＩＶ−１のコピーを保有した。Ｔｇ２６胎児マウスの繊維芽細胞の、ｓａＣａｓ９／ｇＲＮＡを発現するｒＡＡＶ９処置によって、組込みＨＩＶ−１  ＤＮＡのコピーを編集する能力および有効性を確認した。rAAV9:saCas9/gRNAは、結果として組込みＨＩＶ−１ＤＮＡを切断した。脾臓、肝臓、心臓、肺、腎臓、脳、および循環系リンパ球におけるＨＩＶ−１ＬＴＲとＧａｇ遺伝子との間にわたっている９４０塩基対のＤＮＡ断片の切除が検出された。これらの結果は、活性ＣＲＩＳＰＲ／ｓａＣａｓ９を、ウイルスを含む組織に効果的に送達するためのｒＡＡＶ９の能力を明らかにした。
【００８８】
よって、本発明の特徴である組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとＨＩＶウイルスにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む医薬製剤と同様に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとウイルス（例えばＨＩＶ）における標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む。また、本発明の特徴は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドとＨＩＶウイルスにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡとを含む医薬製剤と同様に、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドとＨＩＶにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡとを含む組成物である。
【００８９】
また、本発明の特徴は、レトロウイルス感染（例えばＨＩＶ感染）の処置のための組成物の投与の方法、ウイルス複製を除去する方法、およびＨＩＶ感染を予防する方法である。本明細書で開示される治療方法は、関連する他の抗レトロウイルス治療（例えばＨＡＡＲＴ）において実行できる。
【００９０】
本発明の方法は、宿主生物から、当該宿主の遺伝物質の完全性を妨げることなくウイルスまたは他の外来遺伝物質を除去することに使用され得る。ヌクレアーゼは、標的ウイルス核酸に対して使用され得る。それゆえ、ウイルス複製もしくは転写を妨げるか、または宿主ゲノムからウイルスの遺伝物質を削除さえもする。ヌクレアーゼは、ウイルス核酸が細胞内で粒子として存在する場合、または、ウイルス核酸が宿主ゲノム中に組み込まれている場合に、宿主物質に作用することなく、ウイルス核酸だけを除去するために特に標的とされ得る。ウイルス核酸を標的にすることは、配列特異的部分（ヌクレアーゼによる破壊のためにウイルスゲノム物質を標的とするが宿主細胞ゲノムを標的としないガイドＲＮＡ等）を用いて行われ得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（共にウイルスのゲノム物質を標的とし、選択的に編集または破壊する）が使用される。ＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats）は、細菌をファージ感染から保護する、バクテリア免疫システムの天然に存在する要素である。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体をウイルス標的配列に局在化させる。複合体の結合は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをウイルスゲノム標的配列に局在化させ、ウイルスゲノムにおける破壊を引き起こす。他のヌクレアーゼシステム（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベータ様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、または宿主の遺伝物質の通常の機能を妨げることなくウイルス核酸を分解または阻害するために使用することができる任意の他のシステムが挙げられる）が使用され得る。
【００９１】
組成物は、ウイルスの生活環における任意の形態において、または任意の段階において、ウイルス核酸を標的とするために使用され得る。標的とされるウイルス核酸は、独立した粒子として宿主細胞内に存在し得る。好ましい実施形態において、ウイルス感染は潜伏的であり、ウイルス核酸は宿主ゲノム中に組み込まれている。任意の適当なウイルス核酸が、裂開および消化の標的であり得る。
【００９２】
本実施形態において、本発明の組成物は、遺伝子編集剤と、レトロウイルスの標的配列に相補的な少なくとも一つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードする核酸を含む。本実施形態において、遺伝子編集剤は、以下を含む：Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬＥ転写活性剤、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、転写制御因子、ホモログ、オルソログ、またはそれらの組合せ。
【００９３】
一実施形態において、組成物は、遺伝子編集剤と、少なくとも一つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードするウイルスベクターを含む。ここで、ｇＲＮＡはレトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列に相補的である。当該標的核酸配列は以下を含んでいる：レトロウイルス遺伝子配列をコードしているおよび／またはコードしていない核酸標的配列、レトロウイルス群に特異的な抗体の標的核酸配列またはそれらの組合せ。ｇＲＮＡは、長い末端反復（ＬＴＲ）、レトロウイルスの群に特異的な抗体またはそれらの組合せと相補的である。本実施形態において、遺伝子編集剤は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼ、またはそのホモログである。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの一例は、Ｃａｓ９またはそのホモログまたはオルソログである。
【００９４】
他の実施形態において、発現ベクターは、遺伝子編集剤と、少なくとも一つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とをコードする単離核酸を含み、ここで、ｇＲＮＡは、レトロウイルス遺伝子配列の標的核酸配列、群に特異的な抗体の標的核酸配列またはその組合せに相補的である。実施形態において、遺伝子編集剤は、以下を含む：Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬＥ転写活性剤、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、転写制御因子、ホモログ、オルソログ、またはそれらの組合せ。別の実施形態において、遺伝子編集剤は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログまたはオルソログである。一実施形態において、ｇＲＮＡは、長い末端反復（ＬＴＲ）、レトロウイルス遺伝子配列の群に特異的な抗体またはそれらの組合せに相補的である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスであり、レンチウイルスは以下を含む：ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、またはヒトＴ細胞白血病ウイルス。よって、一実施形態においては、標的配列は、ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）に含まれる配列を含む。ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復に含まれる配列の一例としては、Ｕ３、ＲまたはＵ５領域に含まれる配列を含む。
【００９６】
実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）またはその誘導体を含む。ウイルスベクターは、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、ＤＪまたはＤＪ／８を含むアデノ随伴ウイルスベクターである。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）である。
【００９７】
いくつかの実施形態において、発現ベクターはトランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、ここで、トランス活性化小ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列は、ガイドＲＮＡをコードする配列と融合する。
【００９８】
他の実施形態において、発現ベクターはさらに、核局在シグナルをコードする配列をさらに含む。
【００９９】
（遺伝子編集剤）
本発明の組成物は少なくとも１つの遺伝子編集剤を含み、当該少なくとも１つの遺伝子編集剤にはＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９やＣｐｆ１  ｇＲＮＡ）、エンドヌクレアーゼのアルゴノートファミリー、clustered regularly interspaced short palindromic repeat（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、またはそれらの組合わせが含まれる。Schiffer, 2012, J Virol 88(17):8920-8936を参照されたい。当該文献は参照によって本明細書に援用される。
【０１００】
上記組成物は、Ｃ２ｃ２―ＲＮＡのみを標的とする最初の天然ＣＲＩＳＰＲシステムも含みうる。クラス２タイプＶＩ−Ａ  ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓエフェクター「Ｃ２ｃ２」は、ＲＮＡ誘導ＲＮａｓｅ機能を実証する。レプトトリキア・シャヒイ（Leptotrichia
shahii）細菌から得られたＣ２ｃ２は、ＲＮＡファージに対する干渉を提供する。インビトロの生化学的分析により、Ｃ２ｃ２は単一のｃｒＲＮＡによってガイドされ、相補的なプロトスペーサーを有するｓｓＲＮＡ標的を切断するようプログラムできることがわかる。細菌中で、Ｃ２ｃ２は特定のｍＲＮＡをノックダウンするようプログラムできる。切断は、２つのコンセンサスＨＥＰＮドメイン（触媒不活性ＲＮＡ結合タンパク質を生成する変異）中の触媒残留物によって媒介される。これらの結果は、Ｃ２ｃ２が新たなＲＮＡ標的ツールとなりうることを実証する。
【０１０１】
Ｃ２ｃ２は、細菌細胞中の特定のＲＮＡ配列を切断するようプログラムできる。ＲＮＡに集中したＣ２ｃ２の作用は、細胞の個性および機能に関するゲノムの青写真であるＤＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９システムを補う。ＲＮＡ（ゲノムの指示の実行を助ける）だけを標的とする能力は、高い処理能力でＲＮＡを特異的に操作し、遺伝子機能をより広範に操作する能力を提供する。
【０１０２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに類似したＤＮＡ編集技術であり、これは２０１５年にブロード研究所およびマサチューセッツ工科大学のFeng Zhangらによって特徴付けられている。Ｃｐｆ１は、クラスＩＩのＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。この後天性免疫メカニズムは、PrevotellaおよびFrancisella属の細菌において見られる。これはウイルスによる遺伝子損傷を防ぐ。Ｃｐｆ１遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲの遺伝子座と関連があり、ウイルスのＤＮＡを見つけて切除するためのガイドＲＮＡを用いるエンドヌクレアーゼをコードしている。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９よりも小さく、単純なエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのいくつかの制限を受けない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、遺伝子疾患および悪化しやすい好ましくない健康状態の処置を含む、複数の用途を持ち得る。上述したように、アルゴノートは、他の潜在的な遺伝子編集システムである。
【０１０３】
（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）
一実施形態において、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）またはそのホモログと、レトロウイルス（例えばＨＩＶ）の標的配列に相補的なガイドＲＮＡとを含む。
【０１０４】
ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）は、細菌で見つかり、ファージ感染から細菌を保護すると思われている。最近までは、真核性ＤＮＡにおいて遺伝子発現を変化させる手段として用いられてきたが、抗ウイルス治療として、またはより広くはゲノム物質を破壊させるための方法として提唱されていない。むしろ、標的とされた細胞または細胞集団のＤＮＡにおいて転写の増減を誘導する方法として挿入または欠失を誘導するために用いられてきた。例えば、以下を参照：Horvath et al., Science （2010） 327:167-170; Terns et al., Current Opinion in Microbiology （2011） 14:321-327; Bhaya et al., Annu Rev Genet （2011） 45:273-297; Wiedenheft et al., Nature （2012） 482:331-338; Jinek M et al., Science （2012） 337:816-821; Cong L et al., Science （2013） 339:819-823; Jinek M et al., （2013） eLife 2:e00471; Mali P et al. （2013） Science 339:823-826; Qi L S et al. （2013） Cell 152:1173-1183; Gilbert L A et al. （2013） Cell 154:442-451; Yang H et al. （2013） Cell 154:1370-1379; and Wang H et al. （2013） Cell 153:910-918。
【０１０５】
ＣＲＩＳＰＲ法はヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）を採用し、これらは配列に特異的な方法によって、いずれかの遺伝子的位置においてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流のＤＮＡを切断するために、ガイドとしての小型ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとして知られている、別々のガイドＲＮＡを使用し得る。これら２つの別々のＲＮＡは単一のＲＮＡに組み合わされ、短いガイドＲＮＡの設計によって、部位特異的な哺乳動物ゲノムの切断を可能にする。ＣａｓおよびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は公知の方法で合成することができる。Ｃａｓ／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、非特異的ＤＮＡ切断タンパク質であるＣａｓと、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを標的のためにハイブリダイズするために使用し、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体を回復する（recruit）。Chang et al., 2013, Cell Res. 23:465-472; Hwang et al., 2013, Nat. Biotechnol. 31:227-229; Xiao et al., 2013, Nucl. Acids Res. 1-11を参照。
【０１０６】
概して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つのＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインを含んでいる。ＲＮＡ認識および／またはＲＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡと相互作用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＤＮａｓｅドメインまたはＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、ＲＮａｓｅドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、および他のドメインを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導変異がプロウイルスを不活性化するメカニズムは異なりうる。例えば、上記変異はプロウイルス複製およびウイルスゲノム発現に影響しうる。上記変異は１つ以上の欠失を含みうる。上記欠失のサイズは、単一のヌクレオチドの塩基対から約１００００個の塩基対まで変わり得る。いくつかの実施形態では、上記欠失は、上記プロウイルス配列のすべてまたはほぼすべてを含みうる。いくつかの実施形態では、上記欠失は、上記プロウイルスを根絶し得る。上記変異は、１つ以上の挿入、すなわち、１つ以上のヌクレオチド塩基対を上記プロウイルス配列に加えることを含みうる。上記挿入された配列のサイズは、例えば、約１塩基対から約３００ヌクレオチド塩基対まで変わってよい。上記変異は、１つ以上の点変異、すなわち、１個のヌクレオチドの他のヌクレオチドとの交換を含みうる。使い得る点変異は、機能的な結果を有するもの、例えば、アミノ酸コドンを終止コドンに変換する結果となる変異、あるいは、非機能的なタンパク質を産生する結果となる変異である。
【０１０７】
実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、改変型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、または野生型もしくは改変型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、核酸結合アフィニティーおよび／もしくは特異性が増加する、酵素活性が変化する、ならびに／または当該タンパク質の別の特性が変化するよう改変され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ）ドメインは、改変、削除、または不活性化され得る。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、融合タンパク質の機能に不可欠ではないドメインを除去するために切り詰められ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、融合タンパク質のエフェクタードメインの活性を最適化するために切り詰められ得るか、または改変され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはその断片によって由来され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ様タンパク質は、改変型Ｃａｓタンパク質に由来され得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の１またはそれ以上の性質（例えば、ヌクレアーゼ活性、親和性、安定性）を変化させるために改変され得る。あるいは、ＲＮＡ誘導切断に携わらないＣａｓ９タンパク質のドメインは、タンパク質から除去され得るので、改変型Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９タンパク質よりも小さい。
【０１０９】
３つのタイプ（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが特定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー（以前に経験した可動因子に相補的な配列）を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写およびプロセシングを経て、成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）となる。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、タイプＩ、タイプＩＩ、またはタイプＩＩＩシステムであり得る。好適なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e（またはCasD）、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1（またはCasA）、Cse2（またはCasB）、Cse3（またはCasE）、Cse4（またはCasC）、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、およびCu1966が含まれている。
【０１１０】
一実施形態において、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ）は、タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに属し、切断標的のＤＮＡに対して強いエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、（i）成熟ｃｒＲＮＡ（約２０塩基対（ｂｐ）の固有の標的配列（スペーサーと呼ばれる）を有する）、および（ii）トランス活性型小型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（前駆体ｃｒＲＮＡの、リボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングのためのガイドとして機能する）によって誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、ｃｒＲＮＡのスペーサーと標的ＤＮＡの相補的な配列（プロトスペーサーと呼ばれる）との間の相補的な塩基対合を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡへ誘導する。Ｃａｓ９はトリヌクレオチド（ＮＧＧ）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、切断箇所（ＰＡＭからの３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別々に発現してもよい。または、合成ステムループ（ＡＧＡＡＡＵ）を介して人工的に融合された小型ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を合成して、天然ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖と同様に作用させてもよい。そのようなｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡのように、（i）合成してもよいし、（ii）ＲＮＡを直接トランスフェクションするために、インビトロで転写してもよいし、または、（iii）Ｕ６もしくはＨ１をプロモーターとするＲＮＡ発現ベクターによって発現させてもよい。しかしながら、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが別々に発現するシステムのものよりも低い。
【０１１１】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼであってもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型Streptococcus pyogenesの配列と、同一のヌクレオチド配列を有してもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種に由来する配列であってもよく、例えば、他のStreptococcus sp.（thermophilesなど）に由来してもよい。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、下記に挙げる他の種に由来するものであってもよいが、これらに限定されない：Nocardiopsis dassonvillei、Streptomycespristinaespiralis、Streptomyces viridochromogenes、Streptomyces roseum、Alicyclobacillusacidocaldarius、Bacillus pseudomycoides、Bacillus selenitireducens、Exiguobacteriumsibiricum、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus salivarius、Microscilla marina、Burkholderiales bacterium、Polaromonasnaphthalenivorans、Polaromonas sp.、Crocosphaera watsonii、Cyanothece sp.、Microcystis aeruginosa、Synechococcus sp.、Acetohalobium arabaticum、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatusdesulforudis、Clostridium botulinum、Clostridium difficle、Finegoldia magna、Natranaerobius thermophilus、Pelotomaculumthermopropionicum、Acidithiobacillus caldus、Acidithiobacillus ferrooxidans、Allochromatiumvinosum、Marinobacter sp.、Nitrosococcushalophilus、Nitrosococcus watsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacterracemifer、Methanohalobium evestigatum、Anabaena variabilis、Nodularia spumigena、Nostoc sp.、Arthrospira maxima、Arthrospira platensis、Arthrospirasp.、Lyngbya sp.、Microcoleus chthonoplastes、Oscillatoria sp.、Petrotoga mobilis、Thermosipho africanus、またはAcaryochlorismarina、Psuedomona aeruginosa、Escherichiacoli。または、配列が決定された他の細菌ゲノムおよび古細菌、または他の原核微生物も、本明細書に記載の実施形態において利用されるＣａｓ９配列の起源となり得る。
【０１１２】
野生型Streptococcus pyrogenes Ｃａｓ９配列は、改変され得る。核酸配列は哺乳類細胞における効率的な発現のために最適化されたコドンであり得る（すなわち「ヒト化」）。ヒト化Ｃａｓ９配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号KM099231.1 GI:669193757；KM099232. 1GI:669193761；またはKM099233.1 GI:669193765に挙げられている発現ベクターの何れかによってコードされているＣａｓ９ヌクレアーゼ配列であり得る。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、商業的に入手可能なベクター（Addgene社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）のPX330またはPX260）内に含まれている配列であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号KM099231.1 GI:669193757；KM099232.1GI:669193761；もしくはKM099233.1 GI:669193765のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列またはPX330もしくはPX260（Addgene社，マサチューセッツ州ケンブリッジ）のＣａｓ９アミノ酸配列の何れかのバリアントまたは断片であるアミノ酸配列を有し得る。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物学的に活性なバリアントをコードするよう改変され得、これらバリアントは、例えば、１つ以上の変異（例えば、付加、欠失、もしくは置換変異、またはそのような変異の組合わせ）を含むことによって野生型Ｃａｓ９とは異なるアミノ酸配列を有し得るか、または含み得る。１つ以上の置換変異は、置換（例えば、保存的アミノ酸置換）であり得る。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物学的に活性なバリアントは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して少なくともまたは約５０％の配列同一性（例えば、少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を備えるアミノ酸配列を有し得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群の範囲内の置換を含んでいる：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびスレオニン；リジン、ヒスチジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。Ｃａｓ９アミノ酸配列におけるアミノ酸残基は、天然に存在しないアミノ酸残基であり得る。天然に存在するアミノ酸残基としては、遺伝コードによって天然にコードされるもの、および標準的ではないアミノ酸（例えば、Ｌ−立体配置の代わりにＤ−立体配置を有するアミノ酸）が挙げられる。本ペプチドはまた、標準的な残基の改変バージョンであるアミノ酸残基（例えば、ピロリジンがリジンの代わりに使用され得、セレノシステインがシステインの代わりに使用され得る）を含み得る。天然に存在しないアミノ酸残基は、自然界に見出されたことはないが、アミノ酸の基本的な式で構成されており、ペプチド中に組み込むことができるものである。これらとしては、Ｄ−アロイソロイシン（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸およびＬ−シクロペンチルグリシン（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸が挙げられる。他の例については、教科書またはワールドワイドウェブ（カリフォルニア工科大学によって現在維持されているサイトが、機能的タンパク質に首尾よく組み込まれたことがある非天然アミノ酸の構造を掲げている）を参考にし得る。
【０１１３】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、変異配列であり得る。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、保存されたＨＮＨおよびＲｕｖＣドメイン（鎖特異的裂開に関与する）において変異され得る。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの変異（Ｄ１０Ａ）によって、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）がＤＮＡを裂開するのではなくニックを入れ、一本鎖の切断が生じ、続くＨＤＲを通じた選択的修復がオフターゲット二本鎖切断から望まないインデル変異の頻度を潜在的に減少させ得る。
【０１１４】
Ｃａｓ９はオルソログであり得る。６つのより小さいＣａｓ９のオルソログが用いられており、Staphylococcus aureus由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）は、ＳｐＣａｓ９よりも１０００塩基以上短いにもかかわらず、ＳｐＣａｓ９と同様の効率でゲノムを編集できるという報告が示されている。
【０１１５】
開示された野生型およびバリアントＣａｓ９エンドヌクレアーゼに加え、本発明の実施形態は、劇的にオフターゲット切断を低減させる、新たに開発した「特異性が増強された（enhanced-specificity）」S. pyogenes Ｃａｓ９バリアント（ｅＳｐＣａｓ９）を含むＣＲＩＳＰＲシステムをも包含する。これらのバリアントは、ＤＮＡの非標的鎖と相互作用する、溝の正電荷部位を中和するために、アラニンと置換するように改変されている。この改変の目的は、Ｃａｓ９と非標的鎖との相互作用を減少させることであり、これにより、標的鎖と非標的鎖との間で再度ハイブリダイゼーションすることを促す。この改変による効果は、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖との間のより強いワトソン−クリック対の要求であり、これはオフターゲット切断を制限する。（Slaymaker, I.M. et al. （2015） DOI:10.1126/science.aad5227）。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、最も切断効率が良く、オフターゲット効果が最も低いことが発見されている３つのバリアント：ＳｐＣａｓ９（K855A）、ＳｐＣａｓ９（K810A/K1003A/R1060A）（別名、eSpCas9 1.0）およびＳｐＣａｓ９（K848A/K1003A/R1060A）（別名、eSPCas9 1.1) が組成物中に用いられている。本発明は、３つのバリアントに限られた方法だけでなく、全てのＣａｓ９バリアントによるものをも包含する。
【０１１７】
本発明はまた、他のタイプの特異性が増強されたＣａｓ９バリアントである「高忠実度な」ｓｐＣａｓ９バリアント（ＨＦ−Ｃａｓ９）を含む（Kleinstiver, B. P. et al., 2016, Nature. DOI: 10.1038/nature16526）。
【０１１８】
本明細書で用いられる用語「Ｃａｓ」は、バリアント、変異体、オルソログ、高忠実度なバリアント等の全てのＣａｓ分子を含むことを意味している。
【０１１９】
（ガイド核酸配列）
本発明に係るガイドＲＮＡ配列は、センス配列またはアンチセンス配列であってもよい。ｇＲＮＡの具体的な配列は変わり得る。しかし有用なガイドＲＮＡ配列とは、配列に関係なく、オフターゲット効果を最小限にしつつ、高効率を達成し、ゲノム的に組み込まれたウイルスの除去を完遂する配列である。ガイドＲＮＡ配列は概して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでいる。ＰＡＭの配列は、使用されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異性要求に応じて変わり得る。S. pyogenesに由来するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、標的ＤＮＡは典型的には、５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前にある。それゆえ、S. pyogenesのＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列は、ＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧまたはＧＧＧであり得る。他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ特異性を有し得る。例えば、S. thermophilusに由来するＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１に対して５’−ＮＮＡＧＡＡが必要であり、ＣＲＩＳＰＲ３に対して５’−ＮＧＧＮＧが必要である。Neiseria meningitidisに由来するＣａｓ９は、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴが必要である。ガイドＲＮＡの具体的な配列は変わり得るが、配列に関係なく、有用なガイドＲＮＡ配列とは、オフターゲット効果を最小限にしつつ、高効率を達成し、ゲノム的に組み込まれているレトロウイルス（例えばＨＩＶウイルス）の除去を完遂する配列である。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０から約６０ヌクレオチド、またはそれ以上であり、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。
【０１２０】
ガイドＲＮＡ配列は単一の配列として構成されてもよく、または１つ以上の異なる配列の組合わせ（例えば、多重構造）として構成されてもよい。多重構造は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の異なるガイドＲＮＡの組合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態においては、組成物は複数の異なるｇＲＮＡ分子を含み、それぞれ異なる標的配列を標的とする。いくつかの実施形態においては、この多重戦略は高い効果を奏する。これら多重ｇＲＮＡは、異なるベクターにおいて別々に発現され得るか、一つの単一のベクターにおいて発現され得る。
【０１２１】
本発明の組成物は、レトロウイルスにおける標的配列に相補的なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列を含んでいる。レトロウイルスは、レンチウイルスで有り得、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスである。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり得る。標的配列には、任意のＨＩＶ由来配列も含まれ、例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２であり、これによる任意の組換え流行株が含まれる。ＨＩＶの遺伝的変異は、すでに記載した複数のグループおよびサブタイプにおいて反映される。ＨＩＶ配列のコレクションは、ロスアラモスＨＩＶデータベースおよび一覧表にまとめられている。本発明の方法および組成物は、上述の様々なグループ、サブタイプ、および組換え流行株のうち、任意のＨＩＶに適用可能である。これらには、例えば、ＨＩＶ−１メジャーグループ（グループＭとも称される）およびマイナーグループ（グループＮ、Ｏ、およびＰ）、さらに、以下の任意のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、および、Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。また、ＨＩＶのグループ（例えば、以下の任意のグループＮ、Ｏ、およびＰがあるが、これらに限定されない）も挙げられる。方法および組成物は、ＨＩＶ−２の任意の組換え流行株と同様にＨＩＶ−２および任意のクラスＡ、Ｂ、Ｃ、ＦまたはＧ（「サブタイプ」または「群」とも称される）に適用可能である。
【０１２２】
ガイドＲＮＡは、コーディングまたは非コーディング配列に相補的な配列であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、長い末端反復（ＬＴＲ）配列、タンパク質コーディング配列、または調節配列のようなＨＩＶ配列に相補的で有り得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＨＩＶの長い末端反復（ＬＴＲ）領域に相補的な配列を含む。ＨＩＶ−１  ＬＴＲは、およそ６４０塩基対の長さである。ＨＩＶ−１の長い末端反復（ＬＴＲ）は、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域に分かれる。ＬＴＲは遺伝子発現に必要なシグナルをすべて含んでおり、宿主細胞のゲノム内へのプロウイルスの組込みに関与している。例えば、基本プロモーターまたはコアプロモーター、コアエンハンサー、および調節領域がＵ３内にあり、転写促進反応因子がＲ内にある。ＨＩＶ−１において、Ｕ５領域はいくつかのサブ領域、例えば、転写活性化に関与するＴＡＲまたはトランス作用反応因子や、二量化およびゲノムパッケージングに関与するＰｏｌｙＡや、ＰＢＳまたはプライマー結合部位や、Ｐｓｉまたはパッケージングシグナルや、ＤＩＳまたは二量体開始部位を含む。
【０１２３】
有用なガイド配列はＬＴＲのＵ３、Ｒ、またはＵ５領域に相補的である。ガイドＲＮＡ配列は、例えば、配列またはコンセンサス配列の標的プロトスペーサー配列に相補的な配列を含む。しかし、本発明はこれに限らず、ガイドＲＮＡ配列は、任意の変異体またはバリアントＨＩＶ配列を標的として選択することができる。いくつかの実施形態において、一以上のガイドＲＮＡ配列が採用される。例えば第１ガイドＲＮＡ配列および第２ガイドＲＮＡ配列であり、第１および第２のガイドＲＮＡ配列は、上述した任意のレトロウイルス領域の標的配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、バリアント配列または類似種の配列を含む。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、処置を受けている対象によって保有されるウイルスゲノムにおける配列に対応する配列であり得る。このように、例えば、対象によって保有されているＨＩＶウイルスにおける特定のＵ３、Ｒ、またはＵ５領域の配列を入手することができ、患者の特定の配列に相補的なガイドＲＮＡを用いることができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、タンパク質コーディング配列、例えば、一つまたはそれ以上のウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｔａｔ）をコードする配列、に相補的な配列であり得る。このように、配列は次に示すタンパク質内の配列と相補的である：例えば、ＭＡ（マトリクスタンパク質ｐ１７）、ＣＡ（カプシドタンパク質ｐ２４）、ＳＰ１（スペーサーペプチド１、ｐ２）、ＮＣ（ヌクレオカプシドタンパク質ｐ７）、ＳＰ２（スペーサーペプチド２、ｐ１）およびＰ６タンパク質等のｇａｇポリタンパク質；例えば、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮアーゼＨ、インテグラーゼ（ＩＮ）およびＨＩＶプロターゼ（ＰＲ）等のｐｏｌ；例えば、ｇｐ１６０またはｇｐ１６０の切断生成物、例えばｇｐ１２０またはＳＵ、およびｇｐ４１等のｅｎｖ；例えば、７２アミノ酸１エクソンＴａｔまたは８６−１０１アミノ酸２エクソンＴａｔ等のｔａｔ。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、例えばｖｉｆ、ｎｅｆ（ネガティブ因子）ｖｐｕ（ウイルスタンパク質Ｕ）およびｔｅｖを含むアクセサリータンパク質をコードする配列に相補的な配列であり得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、配列は、構造的または調節要素に相補的な配列、例えば、ＬＴＲ、であり得る。ＬＴＲは、例えば、上述したように、以下のようなものがある；ＴＡＲ（Target sequence for viral transactivation）（Ｔａｔタンパク質および細胞タンパク質の結合部位であって、ヘアピンステムループ構造を形成するＨＩＶ−１（またはＨＩＶ−２における第一の１００ヌクレオチド）におけるウイルスｍＲＮＡの第一のおよそ４５ヌクレオチドからなる）；ＲＲＥ（Rev responsive element）（ＨＩＶ−１のｅｎｖ領域においてコードされているＲＮＡ要素であって、およそ２００ヌクレオチド（ｇｐ１２０からｇｐ４１にわたる、ＨＩＶ−１の転写開始点から７７１０〜８０６１番目）からなる）；ＰＥ（Psi element）（Ｇａｔ開始コドンの前かつ重複する４ステムループ構造のセット）；ＳＬＩＰ、ＴＴＴＴＴＴ「スリッペリーサイト（slippery site）」（ステムループ構造に続く）；ＣＲＳ（Cis-acting repressive sequences）；ＩＮＳ（Inhibitory/Instability RNA sequences）（例えば、ＨＩＶ−１のｇａｇ領域における４１４から６３１番目のヌクレオチドにて見られる）。
【０１２６】
ガイドＲＮＡ配列は、センス配列またはアンチセンス配列であってもよい。一般的に、ガイドＲＮＡ配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。ＰＡＭの配列は、使用されるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの特異的な要請に応じて、変わり得る。S. pyogenesに由来するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいては、標的ＤＮＡは、一般的に５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の直前に位置する。したがって、S. pyogenesＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列はＡＧＧ、ＴＧＧ、ＣＧＧ、またはＧＧＧであり得る。他のＣａｓ９オルソログは、異なるＰＡＭ特異性を有し得る。例えば、S. thermophilusに由来するＣａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ１に対して５’−ＮＮＡＧＡＡ、ＣＲＩＳＰＲ３に対して５’−ＮＧＧＮＧが必要である。Neiseria menigiditisに由来するＣａｓ９は、５’−ＮＮＮＮＧＡＴＴが必要である。ガイドＲＮＡの具体的な配列は変わり得る。しかし有用なガイドＲＮＡ配列とは、配列に関係なく、オフターゲット効果を最小限にしつつ、高効率を達成し、ゲノム的に組み込まれたＨＩＶプロウイルスの除去を完遂する配列である。ガイドＲＮＡ配列の長さは、約２０から約６０ヌクレオチド、またはそれ以上いずれかであり、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０ヌクレオチド、またはそれ以上である。外来ウイルスゲノムと宿主細胞ゲノム（内因性レトロウイルスＤＮＡを含む）との相同性が非常に低い領域を特定する有用な選別方法としては、１２ｂｐ＋ＮＧＧの標的選択規準を用いた生物情報的スクリーニングにより、オフターゲットのヒトトランスクリプトームまたは（稀ではあるが）非翻訳ゲノム部位を除外する方法；ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーター（宿主ゲノム中に潜在的に保存されている）内の、転写因子結合部位を避ける方法；（i）ＬＴＲ−Ａ−およびＬＴＲ−Ｂ−に特異的な、３０ｂｐのガイドＲＮＡおよび元来の細菌免疫システムを反映している前駆ｃｒＲＮＡシステムを選択して、２０ｂｐのガイドＲＮＡおよびキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃＲＮＡ系システムに対する特異性／効率を向上させる。（ii）ＷＧＳ、サンガーシーケンシング、およびＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって、潜在的なオフターゲット効果を特定し、除去する方法；が挙げられる。
【０１２７】
ガイドＲＮＡ配列は１つの配列として構成されてもよく、または１つ以上の異なる配列の組合わせ（例えば、多重構造）として構成されてもよい。多重構造は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の異なるガイドＲＮＡの組合わせを含んでもよい。例えば、Ｕ３、Ｒ、またはＵ５中の配列の組合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＬＴＲ  Ａ、ＬＴＲ  Ｂ、ＬＴＲ  ＣおよびＬＴＲ  Ｄを用いることができる。発現ベクターによって組成物を投与する場合、ガイドＲＮＡは１つのベクターによってコードされてもよい。または、複数のベクターを、それぞれが２つ以上の異なるガイドＲＮＡを含むように設計してもよい。有用な構成によって、切断箇所の間のウイルス性配列を切除することができる。その結果、ＨＩＶゲノムまたはＨＩＶタンパク質発現を、除去することができる。このように、２つ以上の異なるガイドＲＮＡを使用することによって、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって認識された切断箇所の間における、ウイルス性配列の切除が促進される。切除された領域の大きさは、１ヌクレオチドから数千ヌクレオチドまで、様々であり得る。切除された領域の典型例は、実施例に記載する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１〜７６の任意の１つと少なくとも６０％配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１から７６の任意の１つを含む。
【０１２９】
組成物が核酸として投与されるかまたは発現ベクター内に含まれる場合、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ配列と同じ核酸またはベクターによってコードされていてもよい。他の場合（または、これに加えて）、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ配列から物理的に分離した核酸においてコードされていてもよいし、または分離したベクター中にコードされていてもよい。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、１つ以上の修飾核酸塩基を含むように設計される。例えば、ＲＮＡ分子の公知の修飾としては、例えば、Genes VI, Chapter 9 ("Interpreting the Genetic Code")、Lewis, ed. (1997, Oxford University Press, New York)、およびModification and Editing of RNA, Grosjean and Benne, eds. (1998, ASM Press, Washington DC)に記載されている。修飾されたＲＮＡ成分としては、以下が挙げられる：２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４−２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；５−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−ホルミルシチジン；２’−Ｏ−メチル−５−ホルマイルシチジン；３−メチルシチジン；２−チオシチジン；リシジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；４−チオウリジン；リボシルチミン；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メトキシウリジン；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；５−カルボキシメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２’−チオウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；ジヒドロウリジン；ジヒドロリボシルチミン；２’−メチルアデノシン；２−メチルアデノシン；Ｎ６Ｎ−メチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６Ｎイソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）−アデノシン；Ｎ６−（グリシニルカルバモイル）アデノシン；Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（リン酸塩）；イノシン；２’Ｏ−メチルイノシン；１−メチルイノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；１−メチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（リン酸塩）；７−メチルグアノシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；ワイオシン；メチルワイオシン；修飾中ヒドロキシワイブトシン；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；ペルオキシワイブトシン；クエオシン；エポキシクエオシン；ガラクトシル−クエオシン；マンノシル−クエオシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アラカエオシン［７−ホルムアミド−７−デアザグアノシンとも呼ばれる］；および７−アミノメチル−７−デアザグアノシン。
【０１３１】
（改変核酸配列または変異核酸配列）
いくつかの実施形態において、核酸配列はいずれも、天然核酸配列から（例えば、変異、欠失、置換、核酸塩基、骨格の改変などによって）改変または誘導され得る。核酸配列は、ベクター、遺伝子編集剤、ｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡなどを含んでいる。本発明で想像されるいくつかの改変核酸配列の例は、改変骨格（例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖内結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖内結合）を含むものを含んでいる。いくつかの実施形態において、改変オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を備えるもの、およびヘテロ原子骨格、CH2--NH--O--CH2、CH、--N(CH3)--O--CH2 [メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2およびO--N(CH3)--CH2--CH2骨格（ここで、ネイティブなホスホジエステル骨格はO--P--O--CHと表される）を備えるものを含んでいる。De Mesmaekeret al. Acc. Chem. Res. 1995, 28:366-374によって開示されているアミド骨格も、本明細書において具体化される。いくつかの実施形態において、モルホリノ骨格構造を有する核酸配列（Summerton and Weller, U.S. Pat. No. 5, 034,506）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格に置き換えられており、核酸塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している）を有する核酸配列（Nielsen et al. Science 1991, 254, 1497）。核酸配列はまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。核酸配列はまた、ペントフラノシル基の代わりに、シクロブチル等の糖疑似体を有し得る。
【０１３２】
核酸配列はまた、追加的に、または代替的に、核酸塩基（しばしば当該分野において単に「塩基」と呼ばれる）の改変および置換を含み得る。本明細書において使用されるとき、「改変されていない」または「天然の」核酸塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含んでいる。改変核酸塩基は、天然の核酸において稀にまたは一過的にしか見出されない核酸塩基（例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン（特には５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも呼ばれ、しばしば当該分野において５−Ｍｅ−Ｃとも呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣ）、ならびに合成核酸塩基（例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニンおよび２，６−ジアミノプリン））を含んでいる。Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., SanFrancisco, 1980, pp75-77; Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res. 1987, 15:4513。当該分野で知られている「遍在的な」塩基（例えば、イノシン）も含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている（Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., AntisenseResearch and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。
【０１３３】
本発明の核酸配列の別の改変は、核酸配列と化学結合している、オリゴヌクレオチドの活性または細胞吸収を向上させる１つ以上の部分または共役を含んでいる。そのような部分としては、脂質部分（コレステロール部分、コレステリル部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553）、コール酸（Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1994, 4, 1053）等）、チオエステル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306；Manoharan et al.
Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al.,
Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533））、脂肪鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111；Kabanov et al. FEBS Lett. 1990, 259, 327；Svinarchuket al. Biochimie 1993, 75, 49））、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−rac−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート（Manoharanet al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651；Shea et al.Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3777））、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharanet al. Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
所定の核酸配列における全ての位置について均一に改変されている必要はなく、実際、２つ以上の前述の改変が１つの核酸配列中に組み込まれていてもよいし、核酸配列内の１つのヌクレオシド内において組み込まれていてもよい。
【０１３５】
（改変タンパク質またはペプチド）
ポリペプチドまたはその断片を含むハイブリッドタンパク質は、他のタイプのポリペプチドと結合し得る。これらの追加のポリペプチドは、精製、同定、タンパク質またはポリペプチドの全体的な投与量、および／またはペプチドの治療学的または予防学的な用途のために有用な任意のアミノ酸配列で有り得る。加えて、追加のポリペプチドは、シグナルペプチドまたは標的ペプチドなどであり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、上述した任意の核酸配列によってコードされたＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドを含み得る。本明細書では用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、たとえ、様々な大きさのペプチド配列であっても互換的に用いられる。本明細書では、本発明のアミノ酸系組成物は「ポリペプチド」と称することができ、この組成物はアミノ酸残基の線状ポリマーであることを伝え、全長のタンパク質から区別することを助ける。本発明のポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの断片を「構成する（constitute）」または「含む（include）」ものであって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性なバリアントを構成または含むポリペプチドを包含する。そのため、ポリペプチドはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの断片（またはその生物学的に活性なバリアント）だけでなく、追加の残基も同様に含み得ることが理解される。生物学的に活性なバリアントは、標的ＤＮＡを切断するための十分な活性を保持する。
【０１３７】
いくつかの場合において、付加、置換、または欠失を含み得るＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドは、ポリペプチドの安定性（タンパク質分解への耐性を含むがこれに限られない）を増加し得るか、ポリペプチドの、ポリペプチドに結合しているタンパク質への親和性を高め得る。いくつかの場合において、付加、置換または欠失は、ポリペプチドの溶解性を高め得る。いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞での発現に続いて、ポリペプチドの溶解性を高めるための目的で、非天然アミノ酸を取り込むための部位に加えて、天然にコードされるまたは非天然アミノ酸に置換する部位が選ばれる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、他の付加、置換または欠失を含み、関連するリガンド、結合タンパク質、および／またはレセプターへの親和性の調節、レセプターの二量体化の調節（増減を含むがこれに限らない）、レセプター二量体の安定化、循環系半減期の調節、放出または生物学的利用能の調節、精製の促進、または、特に投与経路の向上または改変をする。同様に、非天然アミノ酸は、化学または酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはｐｏｌｙ−Ｈｉｓを含むがこれに限らない）、または他の親和性ベース配列（ＦＬＡＧ、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含むがこれに限らない）または結合分子（ビオチンを含むがこれに限らない）を含み、検出（ＧＦＰを含むがこれに限らない）、精製、組織または細胞膜を通しての輸送、プロドラッグの放出または活性化、サイズの縮小、またはポリペプチドの他の特徴を向上させる。
【０１３８】
本明細書で開示される方法および組成物は、一またはそれ以上の非天然アミノ酸のポリペプチドへの取り込みを含む。一またはそれ以上の非天然アミノ酸は、一またはそれ以上のポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において取り込まれる。これは、「保存的な（conservative）」置換（疎水性アミノ酸の非天然または天然の疎水性アミノ酸による置換、バルキーなアミノ酸の非天然または天然のバルキーなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の非天然または天然の親水性アミノ酸による置換が含まれるがこれに限らない）および／または活性を要求しない位置における非天然アミノ酸の挿入によって達成される。
【０１３９】
生化学的および構造的アプローチの多様性は、ポリペプチドにおける非天然アミノ酸による置換に対する所望の位置を選択することによって得られ得る。任意のポリペプチド鎖の位置も非天然アミノ酸の取り込むための選択に適しており、選択は合理的なデザインに基づくものであるか、任意または特に望ましい意図のないランダムな選択によるものであり得る。所望の部位の選択は、任意の所望の特性または活性を有する非天然アミノ酸ポリペプチド（さらに改変されているか、改変されていないままのもの）（例えば、アゴニスト、スーパーアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、レセプター結合調節剤、レセプター活性調節剤、バインダーパートナーに結合する調節剤、バインダーパートナー活性調節剤、バインダーパートナー配置調節剤を含むが、これらに限定されない）の生成、二量体または多量体の形成、天然分子と比較した活性または特性の未変化、または溶解性、凝集または安定性などの任意の物理的または化学的性質の操作に基づき得る。例えば、ポリペプチドの生物学的活性のために必要とされるポリペプチドにおける位置は、点変異解析、アラニンスキャンニング、またはホモログスキャンニング法を含む方法（これに限らない）を用いることで特定できる。アラニンまたはホモログスキャンニング突然変異を含む方法（これに限らない）によって生物学的活性に欠かせないと特定された残基以外の残基は、ポリペプチドのために探索された所望の活性に依る、非天然アミノ酸によって置換するための良い候補となり得る。あるいは、生物学的活性に欠かせないと特定された部位をもまた、ポリペプチドのために探索された所望の活性に依る、非天然アミノ酸によって再度置換するための良い候補となり得る。他にも、ポリペプチド鎖の各位置を非天然アミノ酸で連続的に置換し、ポリペプチドの活性における効果を観察することで代替できる。任意のポリペプチドにおける非天然アミノ酸によって置換する位置を選択するいずれの手段、技術、または方法も、本明細書で開示されている方法、技術、および組成物に用いるのに適している。
【０１４０】
アミノ酸残基間の結合は、従来のペプチド結合またはその他の共有結合（エステル結合またはエーテル結合など）であり得、ポリペプチドは、アミド化、リン酸化、またはグリコシル化され得る。改変はポリペプチドの主鎖および／または側鎖に影響し得る。化学的改変は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳に続いてインビボで行われる天然の改変（例えば、細菌の宿主におけるグリコシル化）、またはインビトロで行われる合成的改変であり得る。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的活性バリアントは、天然の改変（すなわち、インビボにおいて天然で行われる）および合成的改変（すなわち、インビトロにおいて行われる天然由来または天然由来ではない改変）の任意の組合せに起因する１つ以上の構造的改変を含み得る。改変の例としては、以下の改変が挙げられるが、これらに限定されない：アミド化（例えば、Ｃ末端におけるアミノ基による、遊離カルボキシル基の置き換え）；ビオチン化（例えば、リジンまたはその他の反応性アミノ酸残基のビオチン分子によるアシル化）；グリコシル化（例えば、アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリンまたはトレオニン残基のいずれかへのグリコシル基の付加による糖タンパク質または糖ペプチドを生成）；アセチル化（例えば、アセチル基、一般的にはポリペプチドのＮ末端への付加）；アルキル化（例えば、アルキル基の付加）；イソプレニル化（例えば、イソプレノイド基の付加）；リポイル化（例えば、リポ酸部分の付着）；およびリン酸化（例えば、セリン、チロシン、トレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）
上述のように、生物学的活性バリアントにおける一またはそれ以上のアミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基であってもよい。天然アミノ酸残基は、遺伝子コードによって天然にコードされたものに加えて、標準的でないアミノ酸（例えば、Ｌ型ではなくＤ型のアミノ酸）も含む。本発明のペプチドは、標準的な残基の修飾バージョンであるアミノ酸残基も含んでもよい（例えば、ピロリジンをリジンの代わりに使用してもよく、セレノシステインをシステインの代わりに使用してもよい）。非天然アミノ酸残基は、天然に存在しないが、アミノ酸の基本式に合致するものであり、ペプチドに組み込まれることができる。これらには、Ｄ−アロイソロイシン（（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチル吉草酸）およびＬ−シクロペンチルグリシン（（Ｓ）−２−アミノ−２−シクロペンチル酢酸）が含まれる。他の例は、教科書またはワールドワイドウェブで調べることができる（現在カリフォルニア工科大学が運営しているサイトでは、機能タンパク質に正常に組み込まれた非天然アミノ酸の構造が公開されている）。
【０１４１】
あるいは、または、これに加えて、生物学的活性バリアントにおける一またはそれ以上のアミノ酸残基は、天然の残基で有り得、これは、野生型配列の対応する位置において見られる天然の残基とは異なる。言い換えれば、生物学的活性バリアントは、一またはそれ以上のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸残基の置換、付加、または欠失を、野生型配列の変異と呼ぶ。記載したように、置換は、天然のアミノ酸残基の、非天然アミノ酸残基または天然の残基とは異なるアミノ酸残基への置き換えで有り得る。さらに、置換は、保存的なまたは保存的でない置換を構成し得る。保存的なアミノ酸残基は、典型的には、以下の基における置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニン；リジン、ヒスチジン、およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【０１４２】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的活性バリアントであるポリペプチドは、その配列が対応する野生型ポリペプチドと類似または同一である程度の点で特徴付けることができる。例えば、生物学的活性バリアントの配列は、野生型ポリペプチドにおいて対応するアミノ残基が少なくとも約８０％の同一性を有し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的活性バリアントは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼまたはそのホモログまたはオルソログと、少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、少なくともまたは約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性）を有している。
【０１４３】
ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼのポリペプチドの生物学的活性バリアントは、本発明の方法において有用であるための、十分な生物学的活性を保持している。生物学的活性バリアントは、標的ＤＮＡ切断において十分に機能するための活性を保持している。生物学的活性は、当業者に知られた方法によって評価することができ、インビボ切断アッセイまたは機能的アッセイが含まれるが、これに限らない。
【０１４４】
（送達ビヒクル）
本明細書で使用される送達ビヒクルは、本明細書において具現化されている組成物の、インビトロ送達用またはインビボ送達用両方の、送達のためのあらゆる型の分子を含む。例としては、非限定的に、発現ベクター、ナノ粒子、コロイド組成物、脂質、リポソーム、ナノソーム、糖質、有機もしくは無機組成物などを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは発現ベクターであり、発現ベクターは、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離された核酸配列および少なくとも一つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ここで、ｇＲＮＡは、レトロウイルスゲノムにおける標的核酸配列に相補的なものである。
【０１４６】
本発明では、組換えコンストラクトも提供される。この組換えコンストラクトは、短縮型Ｔａｔ応答ＨＩＶ  ＬＴＲプロモーターの制御下においてＣａｓ９を発現させるための、細胞の形質転換に使用することができる。同様に、組換えコンストラクトは、ＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡを発現させるために利用されてもよい。組換え核酸コンストラクトは、本明細書に記載のように、Ｃａｓ９および／またはガイドＲＮＡ（ＨＩＶにおける標的配列に相補的な）をコードする核酸であって、Ｃａｓ９および／またはガイドＲＮＡ（ＨＩＶにおける標的配列に相補的な）を細胞中で発現させるのに適した調節領域と操作可能に結合している核酸を含む。多数の核酸により特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドがコードされ得ることが、理解されるであろう。遺伝コードの縮重が、当該技術分野でよく知られている。多くのアミノ酸では、１つより多いヌクレオチド・トリプレットが、アミノ酸のコドンとして機能している。例えば、特定の生物において最適な発現が得られるように、その生物にとって適切なコドンバイアス表を用いて、Ｃａｓ９をコードする配列中のコドンを変更してもよい。
【０１４７】
本明細書に記載されているような核酸を含むベクターもまた提供される。「ベクター」は、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンであり、その中に別のＤＮＡセグメントが挿入され得、挿入セグメントの複製を生じさせる。一般的に、適切な調節エレメントと関連付いている場合に、ベクターは複製可能となる。適したベクター骨格は、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、ＢＡＣ、ＹＡＣまたはＰＡＣなど、本技術分野において日常的に用いられているものである。用語「ベクター」は、クローニングベクターおよび発現ベクターの他に、ウイルスベクターおよび組込みベクターも含む。本明細書に記載されている核酸配列を発現させるために、幅広い種類の宿主／発現ベクターの組合わせが用いられ得る。適した発現ベクターは、非限定的に、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルスおよびレトロウイルスに由来する、プラスミドおよびウイルスベクターを含む。多くのベクターおよび発現システムが、例えば、Novagen （Madison, Wis.）、 Clontech （Palo Alto, Calif.）、Stratagene （La Jolla, Calif.）、およびInvitrogen/Life Technologies （Carlsbad, Calif.）などの会社から市販されている。
【０１４８】
ベクターはまた、例えば、複製開始点、足場付着領域（ＳＡＲ）、および／またはマーカーを含んでいてもよい。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選別が可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）に対する抵抗性などの、殺生物剤抵抗性を与えることができる。上述したように、発現ベクターは、発現するポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するように設計された、タグ配列を含んでもよい。タグ配列（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦｌａｇ（登録商標）タグ（Kodak, New Haven, Conn.）配列など）は、一般的に、コードされているポリペプチドと融合した状態で発現する。そのようなタグは、ポリペプチド中のどの場所に挿入されてもよい（カルボキシルまたはアミノ末端のいずれかをも含む）。
【０１４９】
一実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、またはそれらの誘導体である。アデノ随伴ベクターは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、ＤＪまたはＤＪ／８を含む。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）である。
【０１５０】
また、追加の発現ベクターは、例えば、染色体ＤＮＡ配列のセグメント、非染色体ＤＮＡ配列のセグメント、および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含んでもよい。好適なベクターとしては、ＳＶ４０および公知の細菌性プラスミドの誘導体（例えば、E. coliプラスミドであるｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４などのプラスミド）；ファージＤＮＡ（例えば、ファージ１の多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９）、および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３）、および線維状一本鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（２μプラスミドなど）またはその誘導体、真核細胞において有用なベクター（昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなど）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合わせから得られるベクター（ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミドなど）が挙げられる。
【０１５１】
酵母発現システムもまた使用できる。例えば、二つだけ例に挙げると、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、Ｋｐｎ１、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Invitrogen）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ，Ｂ，Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂を用いて精製し、エンテロキナーゼを用いて切断したＮ末端ペプチド；Invitrogen）を、本発明に従って使用し得る。イーストツーハイブリッド発現システムもまた、本発明に従って用意し得る。
【０１５２】
ベクターは、調節領域も含んでもよい。「調節領域」という用語は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写産物または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を意味する。調節領域としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答要素、タンパク質認識部位、誘導要素、タンパク質結合配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、およびイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
ここで用いられる「操作可能に結合している」という用語は、調節領域および転写される配列が、当該配列が配列の転写または翻訳に影響を及ぼすように、核酸中に位置していることを意味する。例えば、コーディング配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始点は、一般的に、プロモーターから１〜約５０ヌクレオチドに下流に位置する。しかしながら、プロモーターは翻訳開始点から約５，０００ヌクレオチドも上流に位置してもよく、または、転写開始点から約２，０００ヌクレオチドも上流に位置してもよい。プロモーターは、一般的に、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターは、少なくとも１つの制御要素（エンハンサー配列、上流要素、または上流活性化領域（ＵＡＲ）など）も含み得る。含まれるプロモーターは、いくつかの要因に合わせて選択される。当該要因としては、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、ならびに細胞または組織優先的な発現が挙げられるが、これらに限定されない。コーディング配列に関連するプロモーターおよび他の調節領域を、適宜選択および配置することによりコーディング配列の発現を調節することは、当業者にとっては通常の事項である。
【０１５４】
ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（アデノウイルスＡｄ、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびレトロウイルスなど）、リポソームおよび他の脂質含有複合体、ならびにポリヌクレオチドの宿主細胞への送達を仲介できる他の高分子複合体、が挙げられる。複製不全組換えアデノウイルスベクターを、公知の技術を用いて作製することができる（Quantin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584 （1992）; Stratford-Perricadet, et al., J. Clin. Invest., 90:626-630 （1992）; および Rosenfeld, et al., Cell, 68:143-155 （1992）を参照）。
【０１５５】
実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態においてウイルスベクターは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、ＤＪまたはＤＪ／８を含むアデノ随伴ウイルスベクターである。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）である。
【０１５６】
ベクターは、他の要素または機能性も備えてもよい。当該他の要素または機能性としては、（i）遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節するもの、または（ii）その他の有益な性質を標的細胞に与えるもの、が挙げられる。下記に詳細に記載・説明する通り、そのような他の要素としては、例えば、細胞に対する結合または標的化に影響を及ぼす要素（細胞型または組織特異的な結合を媒介する要素を含む）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす要素；取り込み後、細胞内におけるポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす要素（核局在化を仲介する薬剤など）；および、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす要素、が挙げられる。そのような要素としてはまた、マーカーも含まれ得る。このようなマーカーには、ベクターによって送達された核酸を取り込み発現している細胞の検知または選別に使用できる、検知可能および／または選別可能なマーカーが挙げられる。上記の要素はベクターに本来備わっている性質として得られてもよく（結合および取り込みを仲介する要素または機能性を有する、特定のウイルスベクターの使用など）、または、上記の機能性が得られるようにベクターを修飾してもよい。他のベクターとしては、Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)に記載のものが挙げられる。そのようなベクターは、様々な種類が当該技術分野で知られており、一般的に入手可能である。
【０１５７】
「組換えウイルスベクター」とは、１つ以上の異種遺伝子産物または配列を含んでいる、ウイルスベクターを意味する。多くのウイルスベクターは格納物に関して大きさの制約があるので、異種遺伝子産物または配列は、一般的に、ウイルスゲノムの１つ以上の部分を置換することによって導入される。そのようなウイルスは複製欠損性であることがあり、ウイルス複製およびカプシド形成に際して、欠失した機能をトランスに提供される必要がある（例えば、複製および／またはカプシド形成に必要な遺伝子産物を輸送する、ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を用いて）。送達されるポリヌクレオチドがウイルス粒子の外側に配置されている、改変ウイルスベクターも記載されている（例えば、Curiel, D T, et al. PNAS 88: 8850-8854, 1991を参照）。
【０１５８】
適した核酸送達システムは、組換えウイルスベクター、典型的には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、またはセンダイウイルス−リポソーム（ＨＶＪ）複合体の少なくとも一つに由来する配列を含む。いくつかの場合において、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに操作可能に結合している強力な真核生物性プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。組換えウイルスベクターは、その中のポリヌクレオチドの１以上、好ましくは約１のポリヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法に使用されるウイルスベクターは、約１０８から約５×１０１０ｐｆｕのｐｆｕ（plague forming units）を有する。非ウイルスベクターを用いてポリヌクレオチドが導入されることになっている実施形態において、約０．１ナノグラムから約４０００マイクログラムの使用が、多くの場合に実用的であり、例えば、約１ナノグラムから約１００マイクログラムである。
【０１５９】
さらなるベクターとしては、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学複合体が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、Moloneyマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶ系ウイルスが挙げられる。あるＨＩＶ系ウイルスベクターは、少なくとも２つのベクターを含み、ｇａｇ遺伝子およびｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノムから得られ、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルスから得られる。ＤＮＡウイルスベクターとしては、ポックスベクター（orthopoxベクターまたはavipoxベクターなど）、ヘルペスウイルスベクター（単純ヘルペスウイルスＩ（ＨＳＶ）ベクターなど）［Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64: 487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:90 7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149 (1990)］、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69: 2004 (1995)］、およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M.G., et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)］がある。
【０１６０】
ポックスウイルスベクターは、細胞の細胞質に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターは、短い期間のみの核酸発現に終わる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、本発明のいくつかの実施形態のための表示であり得る。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短い期間（例えば、約１ヶ月未満）の発現に終わるが、いくつかの実施形態においては、より長い発現をもたらし得る。選ばれる特定のベクターは、標的細胞および処置される条件に依存するだろう。適したプロモーターの選択は容易になされ得る。適したプロモーターの例は、７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。遺伝子発現に用いられる他の適したプロモーターは、非限定的に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）(Davis, et al., Hum Gene Ther 4:151 (1993))、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ＭＭＴ）遺伝子調節配列、β−ラクタマーゼプロモーター等の原核生物性発現ベクター、ｔａｃプロモーター、酵母菌または他の菌類からのプロモーター要素（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ・ホスファターゼ・プロモーター）、および動物の転写制御領域（組織特異性を示し、トランスジェニック動物で用いられてきた）が挙げられるが、これらに限定されない。上記動物の転写制御領域としては、膵臓の腺房細胞で活性化するエラスターゼＩ遺伝子制御領域、膵臓のベータ細胞で活性化するインシュリン遺伝子制御領域、リンパ細胞で活性化する免疫グロブリン遺伝子制御領域、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ細胞、および肥満細胞で活性化するマウス乳癌ウイルス制御領域、肝臓で活性化するアルブミン遺伝子制御領域、肝臓で活性化するアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓で活性化するアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域、骨髄性細胞で活性化するベータ−グロビン遺伝子制御領域、脳の希突起膠細胞で活性化するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域、骨格筋で活性化するミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域、および視床下部で活性化する性腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域が挙げられる。ある種のタンパク質は、自身のプロモーターを用いて発現し得る。ｔａｔ遺伝子およびｔａｒ要素などの、高発現レベルをもたらすエンハンサーまたはシステムなど、発現を増強し得る他の要素も含み得る。このカセットは、次いで、例えばＥ．ｃｏｌ複製起点を含むベクター、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２または他の公知のプラスミドベクターなどに挿入され得る。Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989)を参照。プラスミドベクターは、処置される生物の代謝にマーカーペプチドが悪影響を及ぼさないことを前提に、アンピシリン耐性のためのβラクタマーゼ遺伝子などの選択マーカーを含んでいてもよい。カセットは、例えばWO 95/22618に開示されているシステムなどの、合成送達システムにおける核酸結合部分に結合していてもよい。
【０１６１】
本発明において、ポリヌクレオチドは、マイクロ送達ビヒクル（カチオン性リポソームおよびアデノウイルスベクターなど）と共に使用されてもよい。リポソームの調製、標的化、および内容物の送達の手順としては、Mannino and Gould-Fogerite, BioTechniques, 6:682 (1988)を参照。また、Feigner and Holm, Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):21 (1989)およびMaurer, R.A., Bethesda Res. Lab. Focus, 11(2):25 (1989)も参照。
【０１６２】
別の送達方法では、細胞内で発現産物を産生されられる、一本鎖ＤＮＡ産生ベクターを用いる。例えば、Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)を参照（その全てが参照により本開示に援用される）。
【０１６３】
別の送達方法では、細胞内で発現産物を産生されられる、一本鎖ＤＮＡ産生ベクターを用いる。例えば、Chen et al, BioTechniques, 34: 167-171 (2003)を参照（その全てが参照により本開示に援用される）。
【０１６４】
本発明の核酸配列は、対象の適切な細胞へと送達され得る。これは、例えば、食細胞（マクロファージなど）による食作用に最適な大きさの、高分子送達媒体、生物分解性微粒子送達媒体、またはマイクロカプセル送達媒体を用いることで達成し得る。例えば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微粒子を、使用することができる。ポリヌクレオチドはこれらの微粒子内に格納され、マクロファージによって取り込まれて、細胞内で徐々に生分解される。これによって、ポリヌクレオチドが放出される。ポリヌクレオチドが放出されると、細胞内でＤＮＡが発現する。第２の種類の微粒子は細胞によって直接取り込まれず、主に核酸の徐放性保有体として機能する。上記核酸は、生分解を通じて微粒子から放出されたときのみ、細胞によって取り込まれる。したがって、これらの高分子粒子は、食作用を妨げるために、十分な大きさであるべきである（つまり、５μｍより大きく、好ましくは２０μｍより大きい）。核酸を能動的に取り込む別の方法では、リポソーム（標準的な方法で調製される）を使用する。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で組み込まれてもよく、組織特異的抗体と共に組み込まれてもよい。当該組織特異的抗体としては、例えば、ＨＩＶ感染症の一般的な潜伏感染保有体である、細胞型（例えば、脳マクロファージ、小膠細胞、星状膠細胞、および腸関連リンパ系細胞）を標的にする抗体が挙げられる。別の場合としては、電気的にまたは共有結合によってポリ−Ｌ−リジンに結合している、プラスミドまたは他のベクターから構成される分子複合体を調製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞の受容体に結合し得るリガンドに、結合する。インビボでの発現を実現する別の手段では、「そのままのＤＮＡ」（つまり、送達ビヒクルを含まない）を、筋肉内、皮膚内または皮下の部位へ送達する。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、上述したように、核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびレトロウイルスの標的配列に相補的なガイドＲＮＡをコードする配列を含む単離核酸配列をコードする。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ナノ粒子として製剤化されてもよい。当該ナノ粒子は、例えば、（i）ＤＮＡと複合体を形成している、高分子量の線状ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）からなるコアを有し、さらに（ii）ポリエチレングリコールによって修飾された（ＰＥＧ化された）低分子量のＬＰＥＩからなるシェルによって覆われている、ナノ粒子である。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＨＩＶの性感染を防止する局所ゲルとして製剤化されてもよい。局所ゲルは、性交に先立って、男性器または女性器の皮膚または粘膜に直接塗布することができる。他の場合（またはそれに加えて）、局所ゲルは、男性用または女性用のコンドームまたはペッサリーの表面に塗布されるか、またはそれらの中に収容されていてもよい。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載された組成物を封入したナノ粒子として調製され得る。
【０１６８】
組成物は、核酸であるかポリペプチドであるかに限らず、哺乳動物細胞による取り込みを促進するように製剤化される。有用なベクターシステムおよび製剤は、上述したとおりである。いくつかの実施形態において、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、物理的送達方法（エレクトロポーション法、マイクロインジェクション、弾道粒子、および「ジーン・ガン」システムなど）と同様に、他のＤＮＡ送達方法（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、およびペルフルオロ薬液を使用した化学的トランスフェクションなど）が予期される。
【０１６９】
他の実施形態において、組成物は、１つ以上のＣａｓ９／ｇＲＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクションされた、細胞を含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、エクスビボで適用することができる。つまり、対象の細胞を体から取り出し、培養中に組成物で処置して、例えばＨＩＶウイルス配列を切除し、処置された細胞を上記対象の体に戻してもよい。細胞は、対象の細胞であってもよく、または、ハプロタイプ適合細胞または細胞株であってもよい。複製を防止するために、細胞に放射線を照射してもよい。いくつかの実施形態において、細胞はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合細胞、自家移植細胞、細胞株、またはそれらの組合わせである。他の実施形態において、細胞は幹細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞または人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））が挙げられる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多数の動物種から確立されてきた。これらの種類の多能性幹細胞は、再生医療用の細胞の、最も有用な供給源と考えられる。なぜなら、これらの細胞は、その多能性を保有しつつ活発に分裂する能力を維持しながら、適切な分化誘導によって、ほとんど全ての器官へと分化可能であるからである。特にｉＰＳ細胞は、自己由来の体細胞から確立することができる。したがって、胚を破壊することによって作製されるＥＳ細胞と比較して、倫理的および社会的問題を引き起こす可能性が低い。さらに、ｉＰＳ細胞は自己由来の細胞であるので、再生医療または移植療法において最大の障害となる、拒絶反応を回避することが可能になる。さらに、ｉＰＳ細胞は自己由来の細胞であるので、再生医療または移植療法において最大の障害となる、拒絶反応を回避することが可能になる。
【０１７０】
単離された核酸は、当該分野で公知の方法（例えば、ｓｉＲＮＡを送達する方法）によって対象へ容易に送達され得る。いくつかの態様において、Ｃａｓは、当該Ｃａｓ分子の活性ドメインを含んでいるフラグメントであり得、それによって分子のサイズが削減されている。それゆえ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子は、現在の遺伝子治療に採用されているアプローチと同様に、臨床的に使用され得る。特に、細胞移植療法およびワクチン接種のためのＣａｓ９／多重ｇＲＮＡ安定発現幹細胞またはｉＰＳ細胞が、対象における使用のために開発され得る。
【０１７１】
形質導入された細胞が、確立された方法に従って再注入のために調製される。約２〜４週間の培養期間の後、細胞は１×１０６から１×１０１０の間の数になり得る。この点については、細胞の増殖特性は、患者間および細胞の種類間で変わる。形質導入された細胞の再注入前の約７２時間、表現型の分析および治療剤を発現している細胞のパーセンテージの分析のために一部が採取される。投与については、本発明の細胞は、細胞型のＬＤ５０ならびに患者の体重および全体的な健康に適用されるときの様々な濃度における細胞型の副作用によって決定される割合にて投与され得る。投与は１回投与または分割投与を介して達成され得る。成体幹細胞は、それらの産生を刺激し組織または空隙（骨髄または脂肪組織が挙げられるが、これらに限定されない）から出る、外因的に投与される因子を用いて集められてもよい。
【０１７２】
（併用療法）
いくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボにおいてレトロウイルスを根絶する組成物は、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼをコードする単離核酸配列；レトロウイルスゲノムの標的核酸配列と相補的である、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；抗ウイルス剤またはそれらの組合わせを、有効量含む。さらに、ウイルス感染と関連し得る他の任意の症状（例えば、発熱、さむけ、頭痛、二次感染）を緩和する１つ以上の剤を、上記薬学的組成物に合わせて、または上記薬学的組成物の一部として、または別々の時間に、投与してよい。これらの剤として、抗発熱剤、抗炎症剤、抗真菌剤、駆虫剤、化学療法剤、抗生物質、免疫調節剤、またはそれらの組合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、抗ウイルス剤は、抗体、アプタマー、アジュバント、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ケモカイン、サイトカイン、免疫促進剤、免疫調節剤、Ｂ細胞調節剤、Ｔ細胞調節剤、ＮＫ細胞調節剤、抗原提示細胞調節剤、酵素、ｓｉＲＮＡ、インターフェロン、リバビリン、リボザイム、プロテアーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、ヘリカーゼ阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プリンヌクレオシド、ケモカイン受容体拮抗薬、インターロイキン、ワクチンまたはそれらの組合わせを治療有効量含む。
【０１７４】
免疫促進剤は、サイトカイン、リンフォカイン、Ｔ細胞共刺激リガンドなどが挙げられるが、これらに限定されない。免疫促進分子は、液体および／または細胞免疫システムにポジティブまたはネガティブに影響を与える。特に、免疫促進分子は、その細胞および／または非細胞成分、その機能、および／または他の生理学的システムとの相互関係に影響を与える。免疫促進分子は、サイトカイン、ケモカイン、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ；とりわけ、Bernhagen (1998), Mol Med 76(3-4); 151-61 or Metz (1997), Adv Immunol 66, 197-223に記載のとおり）、Ｔ細胞受容体または可溶ＭＨＣ分子よりなる群から選択され得る。このような免疫促進エフェクター分子は当技術分野でよく知られている。とりわけ、Paul, “Fundamental immunology”, Raven Press, New York (1989)に記載されている。特に、既知のサイトカインおよびケモカインは、Meager, “The Molecular Biology of Cytokines” (1998), John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, West Sussex, England; (Bacon (1998). Cytokine Growth Factor Rev 9(2):167-73; Oppenheim (1997). Clin Cancer Res 12, 2682-6; Taub, (1994) Ther. Immunol. 1(4), 229-46 or Michiel, (1992). Semin Cancer Biol 3(1), 3-15)に記載されている。
【０１７５】
測定され得る免疫細胞活性には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない、（１）ＤＮＡ複製の測定による細胞増殖；（２）サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＴＮＦ−α）の特定の測定を含む、サイトカイン産生の増強；（３）細胞媒介標的殺滅または溶解；（４）細胞分化；（５）イムノグロブリン産生；（６）表現型の変化；（７）走化性因子の産生または走化性、すなわち、走化性によるケモタクチン（chemotactin）産生能力；（８）いくつかの他の免疫細胞種の活性阻害による、免疫抑制；および（９）アポトーシス。アポトーシスは、異常活性の徴候として、一定の状況下での活性免疫細胞の断片化を示す。
【０１７６】
また、細胞毒性Ｔリンパ球またはＬＡＫ細胞が標的に送達する溶解パッケージ（lytic package）に存在する酵素も対象である。孔形成タンパク質であるパーフォリンおよびＦａｓリガンドはこれらの細胞で主要な細胞溶解分子である（Brandau et al., Clin. Cancer Res. 6:3729, 2000; Cruz et al., Br. J. Cancer 81:881, 1999）。また、ＣＴＬは、グランザイムと呼ばれる少なくとも１１のセリンプロテアーゼファミリーを発現する。それらは、４つの主要な基質特異性を有する（Kam et al., Biochim. Biophys. Acta 1477:307, 2000）。ストレプトリジンＯおよびニューモリシンは、グランザイムＢ依存アポトーシスを促進する（Browne et al., Mol. Cell Biol. 19:8604, 1999）。
【０１７７】
他の好適なエフェクターはポリペプチドをコードする。該ポリペプチドの活性は、それ自体が細胞にとって毒性ではなく、細胞の代謝を変化させるまたは非毒性プロドラッグを致死性薬剤に変化させるかのいずれかによって、細胞を他の非毒性化合物に対する感受性を与える。例として、単純ヘルペスウイルスおよび触媒的に同等のバリアント由来である、チミジンキナーゼ（ｔｋ）が挙げられる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、抗ウイルス剤は、天然または組換えインターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターフェロンτ（ＩＦＮτ）、インターフェロンω（ＩＦＮω）、またはそれらの組合わせを含む。いくつかの実施形態において、インターフェロンはＩＦＮγである。任意のこれらのインターフェロンを安定化または改変して、耐性および生物学的安定性または他の生物学的特性を改善し得る。一般的な改変の一つはペグ化（pegylation）（ポリエチレングリコールによる改変）である。
【０１７９】
（薬学的組成物）
上述した通り、本発明の組成物は、当業者に公知の様々な方法によって調製することができる。その原材料またはそれを得る方法にかかわらず、本明細書に記載の組成物は、その用途に合わせて製剤化され得る。例えば、上述した核酸およびベクターは、組織培養の細胞に適用するための組成物、または、患者もしくは対象に投与するための組成物として、製剤化できる。本発明の薬学的組成物はいずれも、医薬品の調製への使用のために製剤化され得る。特定の用途は、治療（例えば、ＨＩＶ感染を患う対象またはＨＩＶ感染のリスクがある対象の治療）という文脈の中で後述されている。医薬として用いられる場合、任意の核酸およびベクターを、薬学的組成物の形態で投与してもよい。それらの組成物は、薬学の分野において周知の方法で調製することが可能である。また、局所的治療と全身治療のいずれが望まれるかに応じて、さらに治療される部位に応じて、様々な経路で投与することができる。投与としては、局所投与（点眼および粘膜（鼻腔、膣、および直腸を含む）への送達を含む）、肺内投与（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送（噴霧器によるものを含む）による；気管内、鼻腔内、表皮、および経皮）、点眼投与、経口投与、または非経口投与が挙げられる。目への送達方法としては、（i）局所投与（点眼）、（ii）結膜下、眼周囲もしくは硝子体内への注射、または（iii）バルーンカテーテルもしくは手術により結膜嚢に配置された眼内挿入物による導入、が挙げられる。非経口投与としては、（i）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは注入、または（ii）頭蓋内投与（例えば、クモ膜下投与またはは脳室内投与）が挙げられる。非経口投与は、単回のボーラス投与の形態で行われてもよい。または、例えば、連続潅流ポンプによって行われてもよい。局所投与用の薬学的組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴薬、座薬、スプレー、液体、粉末、などが挙げられる。従来の薬学的担体（水系、粉末系または油系の基剤、増粘剤など）が、必要であるかまたは望ましい場合がある。
【０１８０】
本発明はまた、薬学的組成物を含み、当該薬学的組成物は、本明細書に記載の核酸およびベクターを有効成分として含み、１つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含んでもよい。本明細書に使用されるとき、薬学的に許容される担体という用語は、薬学的に許容できる物質の媒体として使用され得る、溶媒、分散媒、被膜、抗菌剤、等張性薬剤、および吸収遅延剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、潤滑剤、ゲル、界面活性剤、などのいずれかおよび全てを含む。本発明の組成物を調製する際、当該有効成分は一般的に賦形剤と混合され、（i）賦形剤によって希釈されるか、または（ii）担体（例えば、カプセル、錠剤、小袋、紙包み、またはその他の容器の形態である）の中に封入される。賦形剤が希釈剤として機能する場合、当該賦形剤は、固体、半固体、または液体（例えば、生理食塩水）であってもよく、有効成分用のビヒクル、担体、または媒体としての役割を果たす。したがって、組成物は、錠剤、ピル、粉末、トローチ剤、小袋、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁液、エマルション、溶液、シロップ、エアロゾル（固体または液体媒体中の）、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、軟質および硬質ゼラチンカプセル、座薬、無菌注射液、ならびに無菌包装粉末の形態であり得る。当該技術分野で知られている通り、希釈剤の種類は、目的とする投与経路に合わせて変わり得る。得られる組成物は、追加の薬剤（防腐剤など）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、担体は、脂質系もしくは重合体系コロイドであるか、またはこれらを含んでもよい。いくつかの実施形態において、担体物質は、リポソーム、ヒドロゲル、微粒子、ナノ粒子、またはブロック共重合体ミセルとして製剤化された、コロイドであってもよい。上述の通り、担体物質はカプセルを形成してもよく、その材料は重合体系コロイドであってもよい。
【０１８１】
本発明の核酸配列は、対象の適切な細胞へと送達され得る。これは、例えば、食細胞（マクロファージなど）による食作用に最適な大きさの、重合体送達ビヒクル、生分解性微粒子送達ビヒクル、またはマイクロカプセル送達ビヒクルを用いることで達成され得る。例えば、直径約１〜１０μｍのＰＬＧＡ（ポリ−ラクト−コ−グリコリド）微粒子が使用され得る。ポリヌクレオチドはこれら微粒子内に格納され、マクロファージによって取り込まれて、細胞内で徐々に生分解される。これによって、ポリヌクレオチドが放出される。ポリヌクレオチドが放出されると、細胞内でＤＮＡが発現する。第２の種類の微粒子は細胞によって直接取り込まれず、主に核酸の徐放性保有体として機能する。上記核酸は、生分解を通じて微粒子から放出されたときのみ、細胞によって取り込まれる。したがって、これらの重合体粒子は、食作用を妨げるために、十分な大きさであるべきである（すなわち、５μｍより大きく、好ましくは２０μｍより大きい）。核酸を能動的に取り込む別の方法は、リポソーム（標準的な方法で調製される）を使用することである。核酸は、これらの送達ビヒクルに単独で組み込まれてもよいし、組織特異的抗体と共に組み込まれてもよい。当該組織特異的抗体としては、例えば、ＨＩＶ感染の一般的な潜伏感染保有体である細胞型（例えば、脳マクロファージ、小膠細胞、星状膠細胞、および腸関連リンパ系細胞）を標的にする抗体が挙げられる。あるいは、電気的にまたは共有結合によってポリ−Ｌ−リジンに結合している、プラスミドまたは他のベクターから構成される分子複合体を調製してもよい。ポリ−Ｌ−リジンは、標的細胞の受容体に結合し得るリガンドに結合する。インビボでの発現を実現する別の手段では、「そのままのＤＮＡ」（すなわち、送達媒体を含まない）を、筋肉内、皮膚内または皮下の部位へ送達する。関連するポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）において、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡをコードする配列を含む単離核酸配列をコードする核酸配列は、プロモーターまたはエンハンサーとプロモーターとの組合わせと操作可能に結合されている。プロモーターおよびエンハンサーは上記に記載されている。
【０１８２】
核酸およびベクターは、器具（例えば、カテーテル）の表面に適用されてもよく、またはポンプ、パッチ、または他の薬物送達装置内に含まれていてもよい。本発明の核酸およびベクターは単独で投与されてもよいし、薬学的に許容できる賦形剤または担体（例えば、生理的食塩水）の存在下において混合物として投与されてもよい。賦形剤または担体は、投与の方法および経路に基づいて選択される。好適な薬学的担体は、医薬製剤における使用のための医薬必需品と共に、当該分野においてよく知られた参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)、およびUSP/NF (United States Pharmacopeia and the National Formulary)に記載されている。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＨＩＶの性感染を防止する局所ゲルとして製剤化されてもよい。局所ゲルは、性交に先立って、男性器または女性器の皮膚または粘膜に直接塗布することができる。他の場合（またはそれに加えて）、局所ゲルは、男性用または女性用のコンドームまたはペッサリーの表面に塗布されるか、またはそれらの中に収容されていてもよい。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、組成物は、Ｃａｓ９またはバリアントＣａｓ９と、標
的ＨＩＶに相補的なｇＲＮＡ配列をコードする核酸、または、Ｃａｓ９と標的ＨＩＶと相補的なガイドＲＮＡ配列をコードする核酸を含むベクターを内包しているナノ粒子として製剤化され得る。あるいは、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９またはバリアントＣａｓ９）と、標的に相補的なガイドＲＮＡ配列を内包しているナノ粒子として製剤化され得る。
【０１８５】
本発明の製剤は、Ｃａｓ９と、標的ＨＩＶに相補的であるガイドＲＮＡ配列とをコードするベクターを包含し得る。ガイドＲＮＡ配列は、単一領域（例えば、ＬＴＲ  Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）と相補的な配列、またはＬＴＲ  Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤと相補的な配列の任意の組合わせを含んでいてもよい。あるいは、Ｃａｓ９をコードする配列と、ガイドＲＮＡをコードする配列を別々のベクターに存在させてもよい。
【０１８６】
（処置方法）
本明細書に記載の組成物は、概して、ＨＩＶ感染症等のレトロウイルス感染を患う対象の治療にとって、様々な形で有用である。当該方法は、任意のＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、およびそれらの組換え流行株を標的とするのに有用である。臨床的に有益な結果が得られる場合は常に、対象は効果的に処置されている。これは、例えば、疾患の症状の完全な解消、疾患の症状の重篤度の低減、または疾患の進行の減速を意味し得る。これらの方法はさらに、以下の工程を含んでもよい：ａ）ＨＩＶ感染症を患う対象を特定する工程（例えば患者、より具体的にはヒト患者）；およびｂ）Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、ＨＩＶ  ＬＴＲ等のＨＩＶ標的配列に相補的であるガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む組成物を対象に与える工程。対象は、標準的な臨床テストを用いて特定することができる。当該標準的な臨床テストとしては、例えば、対象の血清におけるＨＩＶ抗体またはＨＩＶポリペプチドｐ２４の存在を検出するイムノアッセイ、またはＨＩＶ核酸増幅アッセイが挙げられる。対象に与えられる組成物の量であって、感染症の症状の完全解消、感染症の症状の重篤度の低減、または感染症の進行の減速をもたらす量を、治療上有効な量とみなす。本発明の方法は、投与量および投与計画を最適化するための監視工程に加えて、結果を予測する工程も含んでもよい。本発明のいくつかの方法において、まず患者が潜伏期のＨＩＶ感染症であるか否かを判定し、その後、本明細書に記載の１つ以上の組成物を用いて患者を処置するか否かを決定してもよい。薬物耐性の発症を検出し、応答性患者を非応答性患者と迅速に区別するためにも、監視工程を利用することができる。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、患者が保有する特定のＨＩＶの核酸配列を決定する工程、および次いでそれらの特定の配列に相補的になるようにガイドＲＮＡを設計する工程を含んでいてもよい。例えば、対象のＬＴＲのＵ３領域、Ｒ領域もしくはＵ５領域を決定し、次いで患者の配列に正確に相補的になるように１つ以上のガイドＲＮＡを設計または選択し得る。
【０１８７】
組成物は、レトロウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）のリスクを有する対象の処置（例えば、予防的治療として）にも有用である。これらの方法は、以下の工程をさらに含んでもよい：ａ）ＨＩＶ感染のリスクを有する対象を特定する工程；ｂ）ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と、ＨＩＶ標的配列（例えば、ＨＩＶ  ＬＴＲ）に相補的であるガイドＲＮＡとをコードする核酸を含む組成物を対象に与える工程。ＨＩＶ感染のリスクを有する対象としては、例えば、無防備な性交（つまり、コンドームを使用しない性行為を行った）現在性交渉のある個体；別の性感染症を患う現在性交渉のある個体；静脈内薬の使用者；または割礼を受けていない男性、が挙げられる。ＨＩＶ感染のリスクを有する対象としては、例えば、職業上ＨＩＶ感染した人々と接触することになる個体（例えば、医療関係者または初期対応者）が挙げられる。ＨＩＶ感染のリスクを有する対象としては、例えば、矯正施設の収容者、またはセックスワーカー（つまり、収入を得る仕事のために、または貨幣以外のもの（食物、薬物、または宿など）のために、性交を行う個体）が挙げられる。
【０１８８】
組成物は、母からその子供へのＨＩＶの伝染の可能性を減少させるために、ＨＩＶ感染症を患う妊婦または授乳婦にも投与することができる。ＨＩＶに感染した妊婦は、子宮内で胎盤を通じて、産道を通る分娩の時、または分娩後に母乳を通じて、ウイルスをその子供に移すことがある。本明細書に記載の組成物は、ＨＩＶに感染した母に対して、（i）
出産前、周産期もしくは出産後の授乳期に投与してもよいし、または（ii）出産前投与、周産期投与および出産後投与の、任意の組合わせであってもよい。組成物は、標準的な抗レトロウイルス療法（後述）と共に、母に投与してもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、分娩後すぐの乳児に投与してもよい。また、いくつかの実施形態において、その後一定の期間ごとに投与してもよい。上記の乳児は、標準的な抗レトロウイルス療法も受けてもよい。
【０１８９】
本明細書の方法および組成物は、レトロウイルス感染の処置に有用である。当該レトロウイルスとしては、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等のヒト免疫不全ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；馬伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；およびヤギ関節炎／脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。場合によっては、本発明の方法は、実験動物、獣医学への応用、および疾患動物モデル（マウス、ラット、ハムスターを含む齧歯類、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されない）の開発に供される。
【０１９０】
本明細書に記載の組成物はいずれも、後に標的細胞へ送達されるように、宿主の身体の任意の場所に投与することができる。組成物は、哺乳類の、脳、髄液、関節、鼻粘膜、血液、肺、腸、筋組織、皮膚、または腹腔に送達され得るが、これらに限定されない。送達経路の観点から、組成物は、静脈内注射、頭蓋内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、筋肉内注射、直腸内注射、膣内注射、髄腔内注射、気管内注射、皮内注射、または経皮注射によって、経口投与または経鼻投与によって、または時間をかけた漸次的潅流(gradual perfusion)によって、投与されてもよい。さらなる例としては、組成物のエアロゾ
ル調製物を、吸入によって宿主に与えてもよい。
【０１９１】
必要な投与量は、投与経路、製剤の性質、患者の病気の性質、患者の大きさ、体重、表面積、年齢および性別、投与されている他の薬物、ならびに担当臨床医の判断、に基づいて決定される。様々な細胞標的、および様々な投与経路により異なる効率の観点から、広範囲にわたる必要投与量が予想される。これらの投与量レベルの変化幅は、当該分野においてよく理解される通り、標準的な経験的最適化ルーチンを用いて調節することができる。投与は、１倍または複数倍（例えば、２倍もしくは３倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、またはより大きい倍率）であってもよい。化合物を好適な送達ビヒクル（例えば、高分子微粒子または埋入器具）に封入することにより、送達効率を向上させることができる。
【０１９２】
本明細書に提供されている任意の組成物を用いた治療の期間は、１日という短い期間から宿主の生存期間（例えば、長年）という長い期間まで、任意の長さの期間であってもよい。例えば、化合物を週に１回（例えば、４週間から何カ月間または何年間にも渡って）；月に１回（例えば、３〜１２カ月間または何年間にも渡って）；または年に１回を５年間、１０年間、またはより長い期間、投与してもよい。なお、治療の頻度も変わり得る。例えば、本発明の化合物は、日に、週に、月に、または年に１回（または２回、３回、など）投与されてもよい。
【０１９３】
本明細書に提供されている任意の組成物の有効量を、処置が必要な個体に投与することができる。有効量は患者において所望の反応を誘導する一方、重大な毒性は誘導しない。当該量は、既知量の特定の組成物の投与後、患者の反応を評価することによって決定し得る。さらに、毒性（もしあれば）のレベルは、既知量の特定の組成物を投与する前後において、患者の臨床症状を評価することによって決定すればよい。なお、患者に投与される特定の組成物の有効量は、患者の反応および毒性のレベルだけではなく、所望の成果に合わせて調節してもよい。大きな毒性は、特定の患者それぞれによって異なり得るものであり、複数の要因に依存している。当該複数の要因としては、患者の疾患状態、年齢、および副作用に対する耐性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
当該分野において知られている任意の方法を、特定の反応が誘導されるか否かの判定に用いることができる。特定の疾患状態の程度を評価できる臨床的方法を、反応が誘導されるか否かの判定に用いることができる。反応を評価するために使用される特定の方法は、患者の障害の特質、患者の年齢および性別、投与されている他の薬物、ならびに担当臨床医の判断によって決定される。
【０１９５】
組成物は、他の治療剤（例えば、ＨＡＡＲＴに使用される抗レトロウイルス剤）と共に投与されてもよい。抗レトロウイルス薬としては、例えば、逆転写酵素阻害剤（例えば、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、ジドブジン、エムトリシチビン（emtricitibine）、ラミブジン、およびテノイフビル（tenoifvir）；ならびに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（エファバレンツ（efavarenz）、ネビラピン、リルピビリンなど）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、チピラビル（tipiravir）、ダルナビル、インジナビル）；侵入阻害剤（例えば、マラビロク）；融合阻害剤（例えば、エンフュビリタイド（enfuviritide））；またはインテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグリビル（raltegrivir）、ドルテグラビル）が挙げられる。抗レトロウイルス薬としては、多種を組み合わせた薬剤もある。多種を組み合わせた薬剤としては、例えば、エムトリシタビン、エファバレンツ、およびテノイフビルの組合わせ；エムトリシタビン、リルピビリン、およびテノイフビルの組合わせ；またはエルビテグラビル、コビシスタット、エムトリシタビンおよびテノイフビルの組合わせが挙げられる。
【０１９６】
２つ以上の治療剤を併せて投与する場合、それらの治療剤の治療的効果が発揮されている期間が重複する限り、それらの治療剤を同時に投与する必要、または同一経路で投与する必要はない。同時投与または逐次投与には、別々の日または別々の週に投与することが予期されている。治療剤は、規則的な投薬計画に基づき投与されてもよい（例えば、治療剤の継続的な少量投与）。
【０１９７】
そのような組成物の投与量、毒性、および治療的有効性は、培養細胞または実験用動物における、標準的な薬学的手順によって決定してもよい。例えば、ＬＤ５０（母集団の５０％が致死する投与量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に対して治療的効果のある投与量）を決定するための薬学的手順によって決定してもよい。毒性効果と治療的効果との間の用量比は、治療上の指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。
【０１９８】
培養細胞の分析および動物実験から得られたデータを、ヒトに使用される投与量の範囲を策定するために使用することができる。そのような組成物の投与量は、毒性が微小または皆無である状態で、かつ血中濃度の範囲にＥＤ５０が含まれることが好ましい。投与量は、この範囲内で、採用される投与形態および利用される投与経路に合わせて変わり得る。本発明の方法において使用される任意の組成物について、治療的効果のある投与量は、まず培養細胞の分析から推定されてもよい。投与量は、培養細胞において決定されたように、動物モデルにおいて策定されてもよい。この場合、血漿中濃度の範囲にＩＣ５０（つまり、症状を最大値の半分だけ抑制するような試験化合物の濃度）が含まれるように、投薬量が策定されてもよい。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定してもよい。
【０１９９】
記載したとおり、組成物の治療上有効な量（つまり、効果的な投与量）とは、所望の治療的（例えば臨床的）結果をもたらすのに、十分な量を意味する。組成物は、日に１回以上〜週に１回以上投与されてもよい（２日に１回の投与を含む）。当業者であれば、対象を効果的に治療するために必要な投与量およびタイミングが、ある種の要因に影響され得ることを理解するであろう。当該一定の要因としては、疾患または障害の重篤度、過去の治療、対象の全身の健康状態および／または年齢、ならびに他に発症している疾患が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の組成物の治療上有効な量を用いる対象の治療としては、１回の治療または一連の複数回の治療が挙げられる。
【０２００】
本明細書に記載の組成物は、上述した様々な薬物送達システムにおける使用に、好適である。さらに、投与される化合物のインビボ血清中における半減期を長期化させるため、組成物は、カプセル化されるか、リポソームの内腔に導入されるか、コロイドとして調製されてもよい。または、組成物の血中における半減期を延長する、他の従来技術を採用してもよい。リポソームの調製には様々な方法が利用可能であり、例えば、米国特許第４,２３５,８７１号（Szoka, et al.）、同第４,５０１,７２８号、および同第４,８３７,０２８号に記載の方法が利用可能である（それぞれが参照により、本開示に援用される）。さらに、薬物は標的薬物送達システムによって投与されてもよい。例えば、組織特異的抗体によってコーティングされたリポソームとして投与されてもよい。リポソームは、ある器官を標的にしており、その器官に選択的に取り込まれる。
【０２０１】
レトロウイルスを不活性化する方法も、提供される。当該レトロウイルスとしては、例えば、哺乳動物細胞中のレンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、またはウシ免疫不全ウイルスなど）が挙げられる。ヒト免疫不全ウイルスは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２であり得る。ヒト免疫不全ウイルスは、染色体に組み込まれているプロウイルスであり得る。哺乳動物細胞は、ＨＩＶに感染した任意の細胞型であってもよい。当該細胞型としては、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、線維芽細胞、単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞（ランゲルハンス細胞および濾胞樹状細胞など）、造血幹細胞、内皮細胞、脳小膠細胞、星状膠細胞、ならびに胃腸上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。そのような細胞型には、通常は初期感染において感染される細胞型が含まれる。当該細胞型としては、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、マクロファージ、単球またはランゲルハンス細胞に加えて、潜伏ＨＩＶ保有体を構成する細胞型（つまり、潜伏感染細胞）が挙げられる。
【０２０２】
本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、１つ以上のガイドＲＮＡとを含む遺伝子編集複合体をコードする発現ベクターを含む組成物を、上記対象に投与する工程を含むことができ、当該ガイドＲＮＡが当該レトロウイルスの標的核酸配列に相補的である。好ましい実施形態において、上述に記載のとおり、レトロウイルスにより潜在感染した宿主細胞のゲノムに組み込まれるプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法は、以下の工程を含む：ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼと、２つ以上の異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を対象に投与することによって宿主細胞を処置する工程であって、当該少なくとも２つのｇＲＮＡそれぞれがプロウイルスＤＮＡの異なる標的核酸配列と相補的である工程；プロウイルスＤＮＡを不活性化する工程。当該少なくとも２つのｇＲＮＡは、単一の配列として構成されてもよく、または１つ以上の異なる配列の組合わせ（例えば、多重構造）として構成されてもよい。多重構造は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の異なるｇＲＮＡの組合わせを含んでもよい。例えば、Ｕ３、Ｒ、またはＵ５中の配列の組合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＬＴＲ  Ａ、ＬＴＲ  Ｂ、ＬＴＲ  ＣおよびＬＴＲ  Ｄの組合わせを用いることができる。実施例に記載されている実験において、２つの異なるｇＲＮＡの使用により、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって認識される切断部位間のウイルス配列の切除を引き起こした。切除領域は、ＨＩＶ−１ゲノム全体を含み得る。処置工程はインビボで行ってもよく、すなわち、組成物はＨＩＶ感染を患う対象に直接投与し得る。しかしながら、本方法はこれに限定されず、処置工程はエクスビボで行ってもよい。例えば、１つの細胞もしくは複数の細胞、または組織外植片を、ＨＩＶ感染を患う対象から取り出して培養し、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとを含み、該ガイドＲＮＡがヒト免疫不全ウイルスの核酸配列に相補的である、組成物で処置し得る。上述のとおり、組成物は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとをコードし、該ガイドＲＮＡがヒト免疫不全ウイルスの核酸配列に相補的である、核酸であってもよく；該核酸配列を含む発現ベクターであってもよく；または、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとをコードする核酸を含み、該ガイドＲＮＡがヒト免疫不全ウイルスの核酸配列に相補的である、薬学的組成物であってもよく；または、該核酸配列を含む発現ベクターであってもよい。いくつかの実施形態において、遺伝子編集複合体はＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡとを含んでいてもよく、該ガイドＲＮＡがヒト免疫不全ウイルスの核酸配列に相補的である。
【０２０３】
組成物が核酸として投与されるかポリペプチドとして投与されるかに関わらず、組成物は、哺乳動物細胞による取り込みを促進するように製剤化される。有用なベクターシステムおよび製剤は、上述したとおりである。いくつかの実施形態において、ベクターは、組成物を特定の細胞型に送達することができる。しかしながら、本発明はこれに限定されず、物理的送達方法（エレクトロポーション法、マイクロインジェクション、弾道粒子、および「遺伝子銃」システムなど）と同様に、他のＤＮＡ送達方法（例えば、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、リポソーム、リポプレックス、界面活性剤、およびペルフルオロ薬液を使用した化学的トランスフェクションなど）が予期される。
【０２０４】
遺伝子編集複合体は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはそのホモログ）と、レトロウイルス標的配列（例えば、ＨＩＶ標的配列）と相補的なガイドＲＮＡと、を含む。遺伝子編集複合体は、プロウイルスＤＮＡ中に様々な変異を誘導し得る。このような変異がプロウイルスを不活性化するメカニズムは様々であり得る。例えば、変異は、プロウイルスの複製、ウイルス遺伝子の発現またはプロウイルスの切除に影響を与え得る。変異は、調節配列または構造遺伝子配列中に位置し、ＨＩＶの不完全な産生をもたらしてもよい。変異は欠失を含み得る。欠失のサイズは、１ヌクレオチド塩基対から約１０，０００塩基対まで変わり得る。いくつかの実施形態において、欠失は、レトロウイルス核酸配列の全てまたは実質的に全てを含み得る。変異は、挿入（すなわち、プロウイルス配列に対する１つ以上のヌクレオチド塩基対の付加）を含み得る。挿入される配列のサイズも変わり得る（例えば、約１塩基対から約３００ヌクレオチド塩基対）。変異は、点変異（すなわち、１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換される）を含み得る。有用な点変異は、機能的な結果（例えば、アミノ酸コドンを終止コドンに変化させる変異、または、非機能的なタンパク質の産生をもたらす変異）を有するものである。
【０２０５】
一実施形態は、宿主細胞のゲノムに組み込まれたプロウイルスＤＮＡを不活性化する方法である。この方法において、２つの異なるｇＲＮＡ配列を展開し（deploy）、各ｇＲＮＡ配列はプロウイルスＤＮＡの異なる部位を標的とする。すなわち、本発明は、単離核酸（たとえば、ＡＡＶ９発現ベクター）を含む組成物に、宿主細胞をさらす工程を含む。単離核酸は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ；プロウイルスＤＮＡの第１標的プロトスペーサー配列に相補的である第１スペーサー配列を有する第１ｇＲＮＡ；当該プロウイルスＤＮＡの第２標的プロトスペーサー配列に相補的である第２スペーサー配列を有する第２ｇＲＮＡを含む、単離核酸配列を含む。本方法はさらに、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ、第１ｇＲＮＡ、および第２ｇＲＮＡを宿主細胞内で発現させる工程；ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび第１ｇＲＮＡを含む第１遺伝子編集複合体と、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼおよび第２ｇＲＮＡを含む第２遺伝子編集複合体とを、宿主細胞内で集合させる工程；第１スペーサー配列と第１標的プロトスペーサー配列との間の相補的な塩基組合せによって、第１遺伝子編集複合体を第１標的プロトスペーサー配列の標的とする工程；第２スペーサー配列と第２標的プロトスペーサー配列との間の相補的な塩基組合せによって、第２遺伝子編集複合体を第２標的プロトスペーサー配列の標的とする工程；ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼで、第１標的プロトスペーサー配列のプロウイルスを切断する工程；プロウイルスＤＮＡに少なくとも１つの変異を誘導する工程を含む。同じ多重方法（multiplex method）は、ヒト免疫不全ウイルスを有する対象を処置する方法、およびヒト免疫不全ウイルス感染のリスクを低減する方法に容易に組み込まれる。用語「組成物」は、成分の混合物のみではなく、同時に投与される必要がない別個の成分も含み得ると理解される。非限定的な例として、本発明の組成物は、核酸配列（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、第１ｇＲＮＡと、第２ｇＲＮＡとをコードするＡＡＶ９発現ベクター）の別個の成分調製物を含み得る。宿主細胞を３つの成分すべてにさらす時間枠中、これらの各成分を注入により続けて投与する。
【０２０６】
他の実施形態において、組成物は、１つ以上のＣａｓ／ｇＲＮＡベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションした細胞を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、エクスビボで適用することができる。すなわち、対象の細胞を体から取り出し、培養中に組成物で処置して例えばＨＩＶウイルス配列を切除し、処置された細胞を上記対象の体に戻してもよい。細胞は、対象の細胞であってもよいし、ハプロタイプ適合細胞または細胞株であってもよい。細胞は、複製を防止するために放射線が照射されていてもよい。いくつかの実施形態において、細胞はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合細胞、自家移植細胞、細胞株、またはそれらの組合わせである。他の実施形態において、細胞は幹細胞であってもよい。例えば、胚性幹細胞または人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞））が挙げられる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工的な多能性幹細胞（人工多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞）は、ヒトを含む多数の動物種から確立されてきた。これらの種類の多能性幹細胞は、再生医療用の細胞の最も有用な供給源と考えられる。なぜなら、これらの細胞は、その多能性を保有しつつ活発に分裂する能力を維持しながら、適切な分化誘導によって、ほとんど全ての器官へと分化可能であるからである。特にｉＰＳ細胞は、自己由来の体細胞から確立することができる。したがって、胚を破壊することによって作製されるＥＳ細胞と比較して、倫理的および社会的問題を引き起こす可能性が低い。さらに、ｉＰＳ細胞は自己由来の細胞であるので、再生医療または移植療法において最大の障害となる拒絶反応を回避することが可能になる。
【０２０７】
ｇＲＮＡ発現カセットは、当該分野で公知の方法（例えば、ｓｉＲＮＡを送達する方法）によって対象へ容易に送達され得る。いくつかの局面において、Ｃａｓは、当該Ｃａｓ分子の活性ドメインを含んでいるフラグメントであり得、それによって分子のサイズが削減されている。それゆえ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ分子は、現在の遺伝子治療に採用されているアプローチと同様に、臨床的に使用され得る。特に、細胞移植療法およびワクチン接種のためのＣａｓ９／多重ｇＲＮＡ安定発現幹細胞またはｉＰＳ細胞が、対象における使用のために開発され得る。
【０２０８】
形質導入された細胞が、確立された方法に従って自家輸血のために調製される。約２〜４週間の培養期間の後、細胞は１×１０６から１×１０１０の間の数になり得る。この点については、細胞の増殖特性は、患者間および細胞の種類間で変わる。形質導入された細胞の自家輸血前の約７２時間、表現型の分析および治療剤を発現している細胞のパーセンテージのために一部が採取される。投与については、本発明の細胞は、細胞型のＬＤ５０ならびに患者の体重および全体的な健康に適用されるときの様々な濃度における細胞型の副作用によって決定される割合において投与され得る。投与は１回投与または分割投与を介して達成され得る。成体幹細胞は、それらの産生を刺激し組織または空隙（骨髄または脂肪組織が挙げられるが、これらに限定されない）から出る、外因的に投与される因子を用いて集められてもよい。
【０２０９】
（キット）
本明細書に記載の組成物は、例えば、「レトロウイルス感染症（例えばＨＩＶ感染症）を患う対象またはレトロウイルス感染症（例えばＨＩＶ感染症）に罹患している対象を治療するための療法用」とラベル付けした、適切な容器に入れられてもよい。容器は、上述したとおり、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードする、例えば、ＡＡＶ９発現ベクターの核酸配列を含む組成物を、収容していてもよい。配列はさらに、ＨＩＶ中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡ、またはその核酸をコードするベクター、および１つ以上の適切な安定剤、担体分子、および／または香料などを、適宜目的の用途に合わせてコードしていてもよい。したがって、パッケージ化された製品（例えば、本明細書に記載された組成物であって、保管、出荷、または販売のために、濃縮状態で、またはすぐに使用可能な濃度でパッケージ化されている組成物の１つ以上を含む滅菌容器）およびキット（本発明の少なくとも１つの組成物（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードする核酸配列と、ウイルス中の標的配列に相補的なガイドＲＮＡまたは上記核酸をコードするベクター）、および使用上の注意書きを含む）も、本発明の範囲に含まれる。製品は、本発明の１つ以上の組成物を含む容器（例えば、ビン、ジャー、ボトル、袋など）を含みうる。それに加えて、製品はさらに、例えば、パッケージ材料、使用上の注意書き、注射器、送達装置、緩衝剤、または予防または処置が求められる状態を処置または監視する調整試薬を含んでよい。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上の追加の抗レトロウイルス剤（例えば、逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、または侵入阻害剤）を含んでもよい。追加の薬剤（agent）は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）と、ヒト免疫不全ウイルスの標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列として、またはその核酸をコードするベクターとして、同じ容器に一緒に収容されてもよい。または、それらは別々に収容されてもよい。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）と、ヒト免疫不全ウイルスの標的配列に相補的なガイドＲＮＡとをコードする核酸配列、またはその核酸をコードするベクター、および追加の薬剤を、使用直前に混合させてもよい。また、それらを別々に投与してもよい。
【０２１１】
製品はまた、説明（例えば、印刷されたラベル、または挿入物、または当該製品の用途を説明する他の媒体（例えば、音声テープまたは映像テープ））も含んでよい。上記説明は容器に付随させる（例えば、容器に貼る）ことができ、当該製品内の組成物の投与の仕方（例えば、投与の頻度および経路）を説明でき、当該製品の各表示を説明でき、他の用途を説明できる。上記組成物は、すぐに投与できる状態であってよく（例えば、適切な服用量単位になっている）、１つ以上の薬学的に許容できる追加のアジュバント、担体、または他の希釈剤および／または追加の治療薬を含んでよい。あるいは、上記組成物は、希釈剤および希釈の指示を伴った濃縮形態で提供されてもよい。
【０２１２】
本発明のさまざまな実施形態を説明してきたが、それらは例示としてのみ提示されたものであり、限定として提示されたものではないことを理解されたい。開示された実施形態は、本明細書の開示に従い、本発明の精神または範囲から離れることなく、さまざまに変更することが可能である。したがって、本発明の範囲は、上述の実施形態のいずれによっても限定されるべきものではない。
【０２１３】
本明細書で言及したすべての文献は、参照により本明細書に援用される。本願で引用されたすべての刊行物および特許文献は、参照によって援用され、各刊行物または各特許文献が個別に示されたのと同じ効果を持つ。出願人は、本明細書でさまざまな文献を引用することにより、いかなる特定の文献も本発明に対する「従来技術」だと認めたわけではない。本発明の組成物および方法に関する実施形態を以下の実施例で説明する。
〔実施例〕
〔実施例１：遺伝子編集によるＨＩＶ−１  ＤＮＡの切除：インビボ研究〕
潜伏感染ヒト細胞および動物疾患モデルから組み込まれたＨＩＶ−１  ＤＮＡ配列を除去するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集戦略を開発した。ＨＩＶ−１  ＤＮＡの除去効率について、ウイルスゲノムを保有するマウス組織を調査した。
【０２１４】
＜材料および方法＞
（ＡＡＶ９送達ベクターの構築）
ＡＡＶ送達システムを作成するバックグラウンドプラスミド（background plasmid）は、px601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::Bsa1-sgRNAだった（「ｐｘ６０１」と略記する）（Ran FA, et al. Nature 2015; 520:186-191）。ＬＴＲおよびＧａｇ標的に対応するＤＮＡ配列を包含するオリゴヌクレオチドを、ｐｘ６０１におけるＢｓａｌ部位のＵ６プロモーターの前にクローニングした。ＬＴＲおよびＧａｇを標的とするｇＲＮＡを図１Ａに示し、さらに以下にも示し、ＰＡＭ配列を太字で示す。
【０２１５】
【化１】
2019504868.tif 000002
【０２１６】
【化２】
2019504868.tif 000003
【０２１７】
シークエンシングによる確認後、２０ｎｇのpX601 saCas9 gRNA HIV-1 LTR1/GagDプラスミドを、プラスミドＤＮＡ産生、ＤＮＡ構造／配列分析、ＡＡＶ血清型へのパッケージング、および高力価産生のために、Penn Vector Core, Gene Therapy Program（Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania）に提供した。
【０２１８】
（マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ））
ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、妊娠１７日目の胚から機械的および酵素的分離によって調製し、１０％ウシ胎児血清が補充されたＤＭＥＭに維持した。ＭＥＦ細胞を上述のように調製し（Behringer et al., Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014）、ＨＩＶ導入遺伝子に特異的なプライマーを使用したＰＣＲによって遺伝子型を決定した（genotyped）（Kopp JB, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:1577-1581; Dickie P, et al. Virology 1991; 185:109-119）。
【０２１９】
（Ｔｇ２６  ＭＥＦのインビトロ形質導入）
Ｔｇ２６  ＭＥＦ細胞に、ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をＭＯＩが１０５および１０６で形質導入させた。ウイルス接種材料はOpti-Memで調製し、最小量（６ウェルプレートにおいて、０．５ｍＬ／ウェル）で１時間ウイルスをインキュベーションし、１ｍＬの増殖培地を加え、一晩放置した。翌日、接種材料を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、新鮮な増殖培地を供給した。形質導入してから１週間後、ＤＮＡ分析のために細胞を回収した。
【０２２０】
（インビボrAAV9:saCas9/gRNA投与）
１００μＬのＡＡＶ９  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはコントロール動物へは１００μＬのＰＢＳをマウスの尾静脈を通じて０日目と５日目に注入した。５日目において、１対（ＡＡＶおよびＰＢＳ）の動物について、血液試料用に眼窩後方出血させ、安楽死させて組織を回収した。別の対の動物については、ＡＡＶ−Ｃａｓ９またはＰＢＳの２回目の尾静脈からの注入を行い、眼窩後方出血させてから７日目に組織の回収のために安楽死させた。組織として、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、およびリンパ球回収用末梢血を回収した。
【０２２１】
（ＤＮＡ分析）
製造業者のプロトコールにしたがって、NUCLEOSPIN Tissue kit（Macherey-Nagel）を使用して、細胞／組織からゲノムＤＮＡを単離した。２５ｎｇのゲノムＤＮＡについて、Terra PCR direct polymerase mix（Takara, Clontech）を用いて、次に示す条件でＰＣＲを行った：９８℃において３分間、３５サイクル（９８℃において１０秒、６８℃において１．３０分）、６８℃において５分間、そして１％アガロースゲルで分離させた。５μＬの最初のＰＣＲ反応物を使用して、同じ条件下で、ネステッドＰＣＲ（nested PCR）を行った。ＰＣＲ産生物を精製し、ＴＡベクター（Invitrogen）にクローニングして、Sanger sequencing（Genewiz, South Plainfield, NJ, USA）に送り、参照配列としてＨＩＶ−１  ＮＬ４−３配列を使用して、Clustal Omega（EMBL-EBI）ソフトウェア（Cambridgeshire, UK）でアライメントした（aligned）。
【０２２２】
（ＲＮＡ分析）
製造業者のプロトコールに従い、TRIzol試薬（Ambion, Foster City, CA, USA）を使用して組織から全ＲＮＡを調製し、次に、RNeasy Mini Prep Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を使用してDNAse I処理およびＲＮＡクリーンアップを行った。次に、１μｇのＲＮＡを使用して、M-MLV逆転写反応（Invitrogen）を行った。ｃＤＮＡを希釈し、細胞ラットβ−アクチン遺伝子を参照して、ＨＩＶ−１  ＧａｇおよびＥｎｖ遺伝子に特異的なTaqMan qPCRを使用して定量した（プライマーについては表１を参照されたい）。ｑＰＣＲ条件：９８℃で５分間、４５サイクル（９８℃で５分間、４５サイクル（９８℃で１５秒間、取得と共に（with acquition）６２℃で３０秒間、７２℃で１分間）。反応を行い、データは相対定量モードを使用して、LightCycler480（Roche, Basel, Switzerland）で分析した。
【０２２３】
＜結果＞
試験プラットフォームとして、ＧａｇのＣ末端およびＰｏｌ遺伝子のＮ末端に及ぶ３．１ｋｂの欠失（図１Ａ）を有するＨＩＶ−１ＮＬ４−３のゲノム由来の導入遺伝子を保有する、ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスを使用した。増殖性ＨＩＶ−１複製は報告されていない一方、低レベルのウイルス転写物の発現は、疾患発症前に様々な組織で検出されている（Curreli S, et al. Retrovirology 2013; 10:92; Kopp JB, et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89:1577-1581; Santoro TJ, et al., Virology,1994; 201:147-151）。ＨＩＶ−１関連腎症（ＨＩＶＡＮ）を含む、ＨＩＶ−１感染およびＡＩＤＳの選択的な臨床的特徴が観察されている（Barisoni L, et al. Kidney Int 2000; 58:173-181; Dickie P, et al. Virology 1991; 185:109-119）。マウスの早期致死性により、ＴｇマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｌバックグラウンドと交配し、二次疾患が制限され、１２月齢まで生存することができる動物を作成した。Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを発現する遺伝子の送達に関し、ＡＡＶ９ベクターを選択した。ＡＡＶベクターの使用に関連する主要な課題の１つは、そのゲノム受容能力に関する。この課題を軽減するために、より小さなＣａｓ９またはホモログであるｓａＣａｓ９（３．３ｋＤａ）を選択した。それは、Staphylococcus aureus由来であり、Streptococcus pyrogens由来の元のＣａｓ９（ｓｐＣａｓ９）の効率と同様の効率でゲノムを編集することができ、ｓｐＣａｓ９に比べて１ｋｂ以上短い（Ran FA, et al. Nature 2015; 520:186-191）。ＨＩＶ−１  ＬＴＲ（ｇＲＮＡ  ＬＴＲ  １）およびＧａｇ遺伝子（ｇＲＮＡ  Ｇａｇ  Ｄ）を標的とする２つのｇＲＮＡに対応するＤＮＡ配列と共に、ｓａＣａｓ９をコードする遺伝子をＡＡＶ９ベクターＤＮＡにクローニングした。図１Ａは、Ｔｇ２６マウスにおいて導入遺伝子を作成するために除去したウイルス遺伝子領域を強調したＨＩＶ−１ゲノムの構造組織と、ｇＲＮＡ  ＬＴＲ  １およびｇＲＮＡ  Ｇａｇ  Ｄの位置を示す。最初のステップとして、エクスビボ研究を行い、Ｔｇ２６動物由来のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の培養物を調製（develop）し、組込みＨＩＶ−１  ＤＮＡ部位の切除における、saCas9/gRNAを含む組換えＡＡＶ９（ｒＡＡＶ９）である、rAAV9:saCas9/gRNAの能力を評価するために使用した。図１Ｂは、ＬＴＲについて−４１３／−３９１およびＧａｇ遺伝子について＋８８８／＋９１０に及ぶプライマー対（Ｐ１およびＰ２）を利用したＰＣＲ遺伝子増幅の結果を示す（図１Ａ）。
【０２２４】
予測される全長増幅産物である１３２３塩基対（ｂｐ）に加えて、３４５ｂｐのより小さな断片がｒＡＡＶ９処置細胞で検出された。これらは、コントロールの未処置細胞では見られなかった。シークエンシングのデータの結果によって、２つのガイドＲＮＡ間にわたる９７８ｂｐのＤＮＡフラグメントの切除、および切除後の残存ウイルスＤＮＡの再結合を確認した（模式図を図１Ａに示す）。インビボ研究において、２匹のＴｇ２６動物および２匹の月齢が一致する（２月）コントロールマウスを選択し、１０１２の機能的な力価のrAAV9:saCas9/gRNAを尾静脈注入した。５日後、注入を繰り返し、５日後に動物を犠牲にし、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、脳および血液リンパ球を採取した（図２Ａ）。初回通過実験（first pass experiment）において、肝臓のＤＮＡを、Ｐ１およびＰ２プライマーを用いたＰＣＲ増幅により分析した。ＭＥＦ細胞培養物の結果と一致して、ＰＣＲ産生物のゲル分析の結果は、rAAV9:saCas9/gRNA処置マウスからの増幅後の、全長（１３２３ｂｐ）および短縮型（３４５ｂｐ）ＤＮＡフラグメントの存在を示したが、月齢が一致したコントロール動物においては見られなかった（図２Ｂ左）。ネステッドプライマー対である、Ｐ１’（−３７５／−３５４）およびＰ２’（＋７５５／＋７６３）（図１Ａに示す）の存在下でのＤＮＡ増幅の伸長により、１６０ｂｐのさらなる小さなＤＮＡフラグメントを得た（図２Ｂ、中央および右パネル）。１６０ｂｐＤＮＡのＤＮＡシークエンシングの結果、ｇＲＮＡ  ＬＴＲ１およびｇＲＮＡ  ＧａｇＤにおよぶ９７８ｂｐのＤＮＡ配列の切除を確認した（図２Ｃ）。他の組織におけるＨＩＶ−１  ＤＮＡに対するrAAV9:saCas9/gRNAの効果を評価した。図２Ｄに示すように、ＤＮＡシークエンシングによって確認されたように、ｇＲＮＡ  ＬＴＲ１およびｇＲＮＡ  ＧａｇＤによって、ＬＴＲおよびＧａｇ遺伝子間のＨＩＶ−１  ＤＮＡの切除を示す、特徴のある１６０ｂｐのＤＮＡフラグメントは、rAAV9:saCas9/gRNA処置動物のすべての組織で観察された（レーン２）。これらはコントロールである未処置動物では観察されなかった（レーン１）。
１６０ｂｐの増幅産物が、追加コントロールとして担う、ｒＡＡＶ９によるＭＥＦの処置において産生した（レーン３）。並行研究において、切除戦略効果を、別の小動物モデル、すなわち、ラットで評価した。ラットは、マウスモデルの構築で使用した同一の導入遺伝子を包含する。ここで、ｒＡＡＶ９の眼窩後方経路からの接種を利用した。標的特異的ＰＣＲによって生成した増幅産物のダイレクトシークエンシングによって確認したように、３０日齢のラットに５日間隔で、２．７３×１０１２のrAAV9:saCas9/gRNAを２回注入し、循環血球の５’−ＬＴＲおよびＧａｇ遺伝子におよぶＨＩＶ−１  ＤＮＡセグメントの切除を導いた。図３Ａ、３Ｂに示すように、切除されたフラグメントのいくつかのＰＣＲ産生物のシークエンシングデータの詳細な分析およびＨＩＶ−１  ＤＮＡを参照としたアラインメントによって、rAAV9:saCas9/gRNAで処置したマウスの組織において、ウイルスＤＮＡの切除にいくつか変異が見られることを確認した。ウイルス遺伝子発現量は、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＧａｇおよびＥｎｖ転写物量を測定することによって調べた。図３Ａ、３Ｂに示すように、ウイルスＲＮＡ量は、rAAV9:Cas9/gRNAで処置した動物から得られた循環血球において劇的に減少し、ウイルスゲノム切除は、ＨＩＶ−１  ＤＮＡの組込みコピーのウイルス遺伝子発現量に顕著な影響を与えることを示した。リンパ節におけるウイルスＲＮＡの結果はまた、処置ラットにおけるウイルスＲＮＡの抑制を示した。
【０２２５】
表１は、使用したＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を示す。
【０２２６】
【表１】
2019504868.tif 000004
【０２２７】
＜考察＞
本明細書において証明したように、ＡＡＶ９系ｓａＣａｓ９／ｇＲＮＡ遺伝子編集戦略システムは、ＨＩＶ−１  ＤＮＡ配列を保有するトランスジェニックマウスにおける、ＨＩＶ−１ゲノムの組込みコピーのセグメントを切除することができる。これらの結果は、ＨＩＶ−１感染ヒト化マウスのＨＩＶ−１  ＤＮＡを編集する、ｓａＣａｓ９／ｇＲＮＡの送達におけるｒＡＡＶ９の同様の能力を示す。さらに、これらの結果は、治療的ｒＡＡＶで処置した動物におけるウイルスＲＮＡ産生の抑制、および血液およびリンパ節におけるｓａＣａｓ９／ｇＲＮＡによるウイルスゲノムの特定セグメントの切除を証明する。
【０２２８】
本研究により、強力なＨＩＶ−１遺伝子除去戦略としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォーム技術の利用が一歩前進する。原則として、本技術は、感染動物、特にヒトにおいて、編集効率を向上し、それ自体は同様の良好な結果を導く、抗レトロウイルス療法と共に、改良および使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術に対するＡＡＶ送達の容易性およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の柔軟性は、ヌクレオチド変動が最小限である、ＨＩＶ−１のＤＮＡ配列を標的とする新規のｇＮＲＡの開発において、適切とみなされれば、治療戦略を個別化するこの治療的プラットフォームへの付加価値をもたらす。
【０２２９】
〔実施例２：前臨床動物モデルにおける、ＳａＣａｓ９および多重ｓｇＲＮＡによる、インビボでのＨＩＶプロウイルスの根絶〕
本研究において、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡシステムと、効率的にＨＩＶ−１ゲノムを根絶する、保存されたＨＩＶ−１調節および構造領域を標的とするｓｇＲＮＡとの組合せを最適化し、ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスおよびＥｃｏＨＩＶ増強ホタルルシフェラーゼ（ｅＬｕｃ）感染マウス（Rabinovich, B. A. et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105, 14342-14346; Potash, M. J. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 3760-3765, doi:10.1073/pnas.0500649102 (2005)）の両方において、インビボでのＨＩＶ−１プロウイルス切除に関し、二重（duplex）対四重（quadreplex）ｓｇＲＮＡとｓａＣａｓ９との実行可能性および有効性を試験した。さらに、オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターによって送達された多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９がインビボにおいて暴露前予防投与（ＰｒＥＰ）として使用し得ることを証明した。
【０２３０】
＜材料および方法＞
（高効率であるｇＲＮＡのバイオインフォマティクス設計）
ｓｐＣａｓ９システムに関する拡張スペーサー配列（NNNN[20nt]NGGNNN）を提供するので、高効率のｇＲＮＡ設計のために、Broad Institute gRNA designer tool（broadinstitute.org）を使用した。最適のオンターゲット切断に対するＳａＣａｓ９  ＰＡＭ配列は、NNGRRTである。NGG PAMを含み、確立されたｓｐＣａｓ９システムを用い得るので、NNGRRTのみを使用した。これを試験するために、ＨＩＶ−１  ＬＴＲプロモーター領域を標的とする３つのｓｇＲＮＡ、Ｇａｇを標的とする３つのｓｇＲＮＡ、およびＰｏｌを標的とする１つのｓｇＲＮＡを選択した。これらのｓｇＲＮＡ標的に対するオリゴヌクレオチドを表２に列挙した。
【０２３１】
（プラスミドおよび多重ｇＲＮＡ発現ＡＡＶベクターのクローニング）
pNL4-3-EcoHIV-eLuc レポーターウイルスを上述の通りに構築した（Yin, C. et al. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016); Zhang, Y. et al. Scientific reports 5, 16277, doi:10.1038/srep16277 (2015)）。5’-CACCおよび3’-AAACオーバーハングを有する、各標的部位に対するオリゴヌクレオチド対（表２）は、AlphaDNA（Montreal, Canada）から得た。標的シード配列を、ＢｓａＩ部位を介して、pX601- AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA;U6::BsaI-sgRNA（Addgene # 61591; Ran, F. A. et al. Nature 520, 186-191, doi:10.1038/nature14299 (2015)）にクローニングした。ｐＸ６０１  ＡＡＶをＢｓａＩで消化し、Antarctic Phosphataseで処理し、Quick nucleotide removal kit（Qiagen）で精製した。等量の相補的オリゴヌクレオチドをアニーリング用Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）バッファーに混合させた。これらのアニールしたシード対をＴ４  ＰＮＫでリン酸化し、Ｔ７ＤＮＡリガーゼを使用してＢｓａＩ消化ＡＡＶにライゲーションした。陽性クローンをＰＣＲスクリーニングによって特定し、サンガーシークエンシングによって確認した。多重ｓｇＲＮＡクローニングに関し、２つのアプローチを構築した：２種類の制限酵素による従来のクローニングおよびIn-FusionシームレスＰＣＲクローニングである。２種類の制限酵素による戦略において、まず標的ＡＡＶベクターをＫｐｎＩで消化および末端平滑化し、ＥｃｏＲＩで消化した。一方、予測されるｓｇＲＮＡ発現カセットを保有する伝達挿入物（transfer insert）をまず、ＮｏｔＩで消化および末端平滑化し、ＥｃｏＲＩで消化した。挿入物およびベクターをQIAquick Gel Extraction Kitによって精製後、標準のオーバーハング／平滑末端クローニングを行った。ポジティブクローンである、二重ｓｇＲＮＡを発現しているＡＡＶクローンを、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩによる２種類の制限酵素によって特定した。In-Fusion ＰＣＲクローニング戦略において、標的ＡＡＶベクターをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで線形化した。（新しいｓｇＲＮＡのさらなる追加のために）３’末端ＫｐｎＩ部位に変異を有するプライマー対Ｔ７９５／Ｔ７９６（表２）および伝達ｓｇＲＮＡ  ＡＡＶベクターをテンプレートとして使用したＰＣＲによって、挿入フラグメントを産生した。精製後、線形ベクターおよび挿入ＰＣＲ産生物を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech）を用いてライゲーションした。ポジティブクローンである、二重ｓｇＲＮＡを発現しているＡＡＶクローンを、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩによる２種類の制限酵素によって特定した。クローニング戦略の両方に対して同様の概念実証を用いて、二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９ベクターは、さらなる１−ｎのｓｇＲＮＡ発現カセットを挿入する標的ベクターとして機能し得る。選択ｓｇＲＮＡのシード配列において、消化部位（ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ）の非存在の確認が唯一１つの注意である。
【０２３２】
（細胞培養、トランスフェクション、およびホタルルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３７℃および５％ＣＯ２の加湿雰囲気下における、１０％ＦＢＳおよび抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）を含む高グルコースＤＭＥＭにおいて培養した。ルシフェラーゼレポーターアッセイについて、細胞を９６ウェルプレートで培養（３×１０４細胞／ウェル）し、標準のリン酸カルシウム沈殿プロトコールを使用して、図示する（indicated）プラスミドをトランスフェクションした。４８時間後、細胞を溶解し、2104 ENVISION（登録商標）Multilabel Reader（PerkinElmer）でONE-GLOルシフェラーゼアッセイシステムを用いて分析した。
【０２３３】
（ＴＥＲＲＡ（商標）ＰＣＲダイレクトジェノタイピングおよびネステッドＰＣＲ）
ＰＣＲを使用した高スループットジェノタイピング（genotyping）を行うために、細胞を９６ウェルプレートに播き、図示するベクターをトランスフェクションした。４８時間後、培地を除去し、１ウェル当たり４５μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨで細胞を処置し、９５℃で１０分間インキュベートした。５μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和後、０．５μＬのＤＮＡ抽出物を用いて、TERRA（商標）PCR Direct Polymerase Mix（Clontech）および図示するプライマーを使用した１０μＬのＰＣＲ反応に使用した。ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ接種マウスから単離した組織および臓器の切除されたＨＩＶプロウイルスＤＮＡのジェノタイピングに関し、二次汚染を避けるために別個のはさみにより各組織を粉々にし、５５℃の水浴において、１％ＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌから成る溶解バッファー中のプロテイナーゼＫで消化させた。そしてゲノムＤＮＡを、従来のフェノール／クロロホルム抽出法によって組織溶解物から抽出した。特定のＴｇ２６マウス組織からゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質を抽出するために、組織サンプルをすり鉢とすりこぎで機械的に破壊し、製造業者のプロトコールにしたがって、NUCLEOSPIN（登録商標）Tissue kitおよびNUCLEOSPIN（登録商標）RNA/Protein kit（CLONTECH）を用いて処理し、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を抽出した。ＰＣＲジェノタイピングを行うために、ＤＮＡサンプルを９８℃で３分間変性させてから、１分／ｋｂで６８℃において３５サイクルのアニーリング／伸長ステップを行う従来の２ステップＰＣＲを行った。ネステッドＰＣＲに対して、図示するプライマーを用いて２２〜２５サイクルの１回目の反応を行い、ネステッドＰＣＲプライマーを用いて３５サイクルの２回目のＰＣＲ反応を行った。
【０２３４】
（定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ））
図示する臓器／組織の全ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、RNeasy Mini kit（Qiagen）を使用して抽出した。残留する可能性があるゲノムＤＮＡを、RNase-Free DNase Set （Qiagen）を使用したオンカラムＤＮａｓｅ消化によって除去した。各サンプルにつき１μｇのＲＮＡについて、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Invitrogen, Grand Island, NY）を使用して、ランダムヘキサヌクレオチドプライマーを用いてｃＤＮＡに逆転写させた。ｃＤＮＡまたはＨＩＶゲノムＤＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を、SYBR（登録商標）Green PCR Master Mix Kit（Applied Biosystems）を使用して、LightCycler480（Roche）で行った。ｓａＣａｓ９、Ｇａｇ、Ｅｎｖ、Ｔａｔに対するプライマー対を表２に示すように設計した。ヒトβ２ミクログロブリンおよびマウスＰｐｉａハウスキーピング遺伝子に対するプライマーはRealTimePrimers（Elkins Park, PA）から得た。ＨＩＶ切除定量に対するプライマーは図１８Ａ〜１８Ｃに示すように設計した。各サンプルは３連で試験した。サイクル閾値（Ｃｔ）値は、標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子に関する図から得た。ハウスキーピング遺伝子および標的遺伝子間のＣｔ値の違いは、ΔＣｔ値として示した。ΔΔＣｔ値は、実験サンプルのΔＣｔ値から、コントロールサンプルのΔＣｔ値を引いて得られた。遺伝子発現またはＨＩＶ  ＤＮＡ切除における相対倍率または割合は２−ΔΔＣｔとして計算した。いくつかの場合において、増幅曲線および融解ピーク曲線を、比較分析に使用した。
【０２３５】
（ＡＡＶおよびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃパッケージングおよび精製）
ＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ／８の少量および大量の調製は、公開されているプロトコール（Zolotukhin, S. et al. Gene Ther 6, 973-985 (1999)）に従って、ViGene Biosciences Inc.（Rockville, MD）でのＡＡＶ産生サービスによって行った。簡潔に示すと、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３つのベクターをコトランスフェクションし、イオジキサノール勾配超遠心分離によってウイルス粒子を回収および精製した。ウイルスを濃縮し、リン酸緩衝食塩水で製剤化した。ウイルス力価は、線形ゲノムプラスミドを標準としたリアルタイムＰＣＲを使用して、１ｍＬのサンプル中のウイルスゲノムコピー数（ＧＣ／ｍＬ）によって決定した。
【０２３６】
パッケージング複製可能であるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃおよびＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃについて、ＢＬＩレポーターを有するＥｃｏＨＩＶまたはＨＩＶ−１（図２２Ａ、２２Ｂ）のいずれか一方の全長分子クローンをコードするプラスミドＤＮＡを、LIPOFECTAMINE 3000（Invitrogen）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Invitrogen）に導入した。トランスフェクションしてから２４時間後に、トランスフェクション試薬を含む培地およびＤＮＡを吸引し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。新鮮な培地を加えた。トランスフェクションしてから４８時間および６０時間後に、上清を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。製造業者の指示に従ったLenti-X Concentrator（Clontech, CA, USA）を使用するか、２０，０００×ｇでの２０％スクロース密度遠心分離を４℃下で４時間行うことにより、レンチウイルス上清を濃縮した。ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃについて、ｐ２４の定量は、製造業者のプロトコールにしたがって、ELISA（XpressBio, Frederick, MD）によって行った。蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）分析によって分析したＧＦＰ発現について、GHOST(3) X4/R5を基にＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃの力価を決定した。
【０２３７】
（ヒト化ＢＬＴマウスのウイルス接種）
すべての動物実験および手順は、ピッツバーグ大学またはテンプル大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。ヒト胎児肝臓、胸腺および同性の肝臓から単離されたＣＤ３４＋細胞が移植された、ＮＳＧ（登録商標）株を基にしたヒト化ＢＬＴマウスをJackson Lab（Bar Harbor, ME）から購入した。感染に関し、イソフルラン吸入を通じて（２Ｌ／分の酸素流量と共に、２〜２．５％）、マウスを麻酔した。中サイズのピペットチップを使用して、膣管に２０μＬのウイルス上清をゆっくりとピペッティングすることによって、膣内接種（マウス１匹当たり全量１×１０６ＴＣＩＵのＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃ）を行った。２９ゲージのニードルおよびインスリンシリンジを使用して、１００μＬの図示するウイルス力価を腹腔内に注入することによって、腹腔内接種（マウス１匹当たり全量１×１０５ＴＣＩＵのＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃ）を行った。ＢＬＴマウスにおけるＨＩＶ感染は、インビボＢＬＩを用いて可視化し、長期的なＨＩＶ伝播を示した。AAV-DJ/8/Cas9-sgRNA投与前の少なくとも７０日間以上、インビボで検出できるＨＩＶ−レポーター活性が存在しない可能性のある潜伏を示すために、選択したＨＩＶ感染ＢＬＴマウスを予め測定した。
【０２３８】
（インビボＡＡＶ注入）
Ｔｇ２６トランスジェニックマウスにおけるｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９遺伝子送達効率および機能アッセイについて、１００μＬの未精製ＡＡＶ−ＤＪ血清型、または、全量１００μＬである、血清を含まない１×ＤＭＥＭで希釈した５μＬの精製ＡＡＶ−ＤＪ／８血清型を、尾静脈を通じて動物に注入した。ＡＡＶ−ＤＪを注入したマウスについて、グループ１を犠牲にし、グループ２には最初の注入から１週間後にさらに注入した。グループ２は２回目の注入から１週間後に犠牲にした。コントロールマウスには、空ベクターを有するＡＡＶウイルスを注入した。ＡＡＶ−ＤＪ／８を注入したマウスについて、グループ１およびグループ２間の間隔は２週間だった。選択した臓器の組織サンプルを、すり鉢とすりこぎで機械的に破壊し、ユーザーマニュアルに従って、NUCLEOSPIN（登録商標）Tissue kitおよびNUCLEOSPIN（登録商標）RNA/Protein kit（CLONTECH）を用いて処理し、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を抽出した。
【０２３９】
ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃを接種したＮＣｒヌードマウスへのＡＡＶ−ＤＪ／８のインビボ注入において、全量１００μＬのＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの上清を眼窩後方注入後すぐに、同じ注入部位に、各マウスの右眼の血洞への眼窩後方注入のために、全量１０μＬの精製ＡＡＶ−ＤＪ／８をまず希釈した。当該上清は、ＥＬＩＺＡ（ZeptoMetrix）によって決定した全量２５０ｎｇのｐ２４を含んでいた。また、当該精製ＡＡＶ−ＤＪ／８は、９０μＬのＰＢＳに、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ（３．０７×１０１４  ＧＣ／ｍＬ）を含んでいた。
【０２４０】
ＢＬＴマウスにおける四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９／ＡＡＶ−ＤＪ／８送達を、膣内もしくは静脈内または両方の経路によって行った。上述のＨＩＶ接種と同様に、１匹のＢＬＴマウス当たり全部で６．１４×１０１２のＧＣのAAV-DJ/8/saCas9-sgRNAを含む、全量２０μＬのＰＢＳを膣内接種した。１匹のＢＬＴマウス当たり全部で６．１４×１０１２のＧＣのAAV-DJ/8/saCas9-sgRNAを含む、１００μＬのＰＢＳを、２９ゲージのニードルを有するインスリンシリンジを使用して、右眼の血洞を通じて（眼窩後方注入で）静脈内接種を行った。
【０２４１】
（生物発光イメージング（ＢＬＩ））
ウイルス接種してから図示する時点でイメージングを開始した。すべてのイメージング中、イソフルラン吸入を通じて（２Ｌ／分の酸素流量と共に、２〜２．５％）、マウスを麻酔した。Ｄ−ルシフェリンカリウム塩（Gold BioTechnology, Olivette, MO）を滅菌ＰＢＳに溶解し、１５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内注入した。生物発光イメージを、IVIS Lumina XR小動物光学イメージングシステム（Perkin Elmer, Hopkinton, MA）を用いて、２分間得た（光フィルター開、ビニング８×８、f/stop  １、視野１００ｍｍ）。
【０２４２】
（画像解析）
すべてのイメージ分析は、Living Image 4.3.1を用いて行った。関心領域（ＲＯＩ）は、測定領域のまわりまたは比較用に動物全体のまわりに設定し、平均輝度値（ユニット：ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｔｒ）をすべてのイメージ評価に用いた。画像に関し、イメージをウインドーに表示させ、マウスに隣接する背景レベル上の光出力すべてを見た。最大輝度値１１０，０００ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｔｒをイメージングスケールの最高位（high end）として選択し、背景カットオフを６，０００ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｔｒに設定し、これはウイルス接種前の２つの異なる時点においてイメージングした、マウスの平均光放出だった。
【０２４３】
（ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質抽出）
選択した臓器の組織サンプルを、すり鉢とすりこぎで機械的に破壊し、ユーザーマニュアルに従ったゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の抽出に続いて、NUCLEOSPIN（登録商標）Tissue kitおよびNUCLEOSPIN（登録商標）RNA/Protein kit（CLONTECH）を使って処理した。抽出した組織を、殺菌し、汚染物質が存在しないはさみを使って細かく刻み、プロテイナーゼＫおよび１％ＳＤＳを含む溶解バッファー（２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩基、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に加え、５５℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、得られた混合物を、一定量のフェノール：ＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１０分間反転（inversion）させて抽出を行った。混合物を１０分間１２，０００ＲＰＭで遠心分離させ、水相を除去し、再度一定量のＣＨＣｌ３：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出を行い、遠心分離で分離した。抽出したＤＮＡを沈殿させるために、一定量のイソプロパノールを除去した水相に加え、混合物を１５分間反転させた。ＤＮＡを１０分間１２，０００ＲＰＭで遠心分離させて、ペレット化した。次に、ＤＮＡペレットを、７５％エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。ほぼ乾燥させて、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）をペレットに加え、５５℃で一晩分離した（resolved）。
【０２４４】
（ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシング）
関心があるバンドをゲル精製し、ｐＣＲＩＩ  Ｔ−Ａベクター（Invitrogen）内にダイレクトクローニングし、個々のクローンの核酸配列をユニバーサルＴ７および／またはＳＰ６プライマーを使用して、Genewizにおけるシークエンシングによって決定した。
【０２４５】
（免疫細胞化学および免疫組織化学）
細胞を４％パラホルムアルデヒドで、続いてモノクローナル抗ＨＡ抗体（１：２００、Proteintech, Cat# 66006-1-Ig）による標準の免疫細胞化学で固定した。Hoechst陽性核と比較した、ｓａＣａｓ９−ＨＡ陽性細胞の割合を、３ウェルに対して、１ウェル当たり６つの無作為領域において定量した。免疫組織化学に関し、急速凍結した組織／臓器を１０μｍのクリオスタット切片にし、１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定した。洗浄後、０．５％のTriton X-100で透過させ、１０％正常ロバ血清でブロッキングし、０．１％のTriton X-100を含むＰＢＳ中のウサギ抗ＨＡポリクローナル抗体（１：１００、Proteintech, Cat# 51064-2-AP）で、切片を一晩４℃でインキュベートした。１０分間で３回洗浄後、切片を対応するALEXA FLOUR（登録商標）コンジュゲートロバ二次抗体（１：５００；Invitrogen, Grand Island, NY）およびファロイジン（１００ｎＭ；Cat. # PHDR1 cytoskeleton, Inc.）を用いて、室温で１時間インキュベーションした。核の対比染色にHoechst 33258を用いた。
【０２４６】
（統計解析）
定量データは２〜４の独立した試験からの平均±標準偏差（ＳＤ）を示し、スチューデントｔ検定によって評価した。＜０．０５または＜０．０１であるｐ値は、統計学的に有意に異なるとした。ＥｃｏＨＩＶ感染マウスモデルにおけるＢＬＩデータに関し、スチューデントｔ検定および線形混合効果モデルを、背側および腹側の両方それぞれからのＢＬＩによって測定された、ｓａＣａｓ９＋ＥｃｏＨＩＶおよびＥｃｏＨＩＶ間の経時の全光子流速変化の比較に使用した。
【０２４７】
＜結果＞
（ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡシステムは効率的にＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを切除する）
ｓａＣａｓ９システムの有効性を測定するために、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ（図４Ａ）を標的とする３つのｓｇＲＮＡを、最適のＰＡＭ  ＮＮＧＲＲＮを使用して選択した。ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターアッセイおよびダイレクトＰＣＲジェノタイピングを記載のとおり行った（Yin, C. et al. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016)）。機能的レポーターアッセイおよびＰＣＲジェノタイピングによるＨＩＶ−１の成功した切除をより確実に特定するために、ｓｇＲＮＡ組合せ法を採用した。図４Ｂに示すように、ｓａＣａｓ９の存在下、選択した３つのＬＴＲ  ｓｇＲＮＡ間のすべての組合せで、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ活性がほぼ完全になくなった（９５〜９９％まで）。これらの設計したｓｇＲＮＡに対するｓａＣａｓ９  ＰＡＭがｓｐＣａｓ９システムと同じＰＡＭ（ＮＧＧ）を利用しているので、これらのシード配列をレンチウイルス（ＬＶ）−ＷＧベクターにクローニングした（Yin, C. et al. Functional screening of guide RNA targeting the regulatory and structural HIV-1 viral genome for a cure of AIDS. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016)）。これは、ｓａＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列とは異なるcrRNA-loop-tracRNA（＝ｓｇＲＮＡ）配列を保有する（Ran, FA, et al. (2015). Nature 520: 186-191; Nishimasu, H, et al. (2015). Cell 162: 1113-1126）2, 21。そして、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡとｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡとのＨＩＶ−１切除効率を比較した。並列の（side-by-side）トランスフェクションおよびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーター研究は、これらの３つの組合せ法とのｓｐＣａｓ９は、ルシフェラーゼ活性の減少に対して大きく効果を示さなかった（図４Ｂ）。ｓｐＣａｓ９と比較したｓａＣａｓ９のすばらしい結果は、これまでの報告と一致する（Ran, F. A. et al. Nature 520, 186-191 (2015); Friedland, A. E. et al. Genome Biol 16, 257 (2015)）。ｓｐＣａｓ９と比較したｓａＣａｓ９の高効率は、次のいくつかの要因に起因し得る：（１）単一のベクターに存在することによる、同じ細胞におけるｓｇＲＮＡとｓａＣａｓ９の高い共発現；（２）小さなサイズであるｓａＣａｓ９により高い遺伝子送達効率が可能であり得る；（３）ｓａＣａｓ９の内在性ヌクレアーゼは、ＤＳＢ作製の点で活性が強い（Ran, F. A. et al. Nature 520, 186-191 (2015); Nishimasu, H. et al. Cell 162, 1113-1126 (2015)）。ｓａＣａｓ９およびｓｐＣａｓ９の両方におけるＬＴＲ  ｓｇＲＮＡの組合せによる効率的な根絶は、ＰＣＲジェノタイピングおよびサンガーシークエンシングによってさらに確認された（図４Ｃ）。
【０２４８】
（ＬＴＲ  ｓｇＲＮＡ、およびＧａｇまたはＰｏｌの併用は効果的な根絶を誘導した）
ｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡシステムを用いて、より容易なＰＣＲジェノタイピング、および、Ｇａｇ、Ｐｏｌ等のウイルス構造遺伝子（Yin, C. et al. AIDS, doi:10.1097/QAD.0000000000001079 (2016)）とのＬＴＲ  ｓｇＲＮＡ組合せによるより効率的なＨＩＶ−１根絶を立証した。これがさらにｓｐＣａｓ９／ｓｇＲＮＡシステムに応用可能か試験するために、ＧａｇまたはＰｏｌを標的とするｓｇＲＮＡを、３つのＬＴＲ  ｓｇＲＮＡのうちの１つと組み合わせた。ＧａｇまたはＰｏｌ  ｓｇＲＮＡと、ＬＴＲ−１または−３とのすべての組合せにおいて、細胞培養物中でＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ活性の強力な減少を誘導した（図４Ｄ）。ＬＴＲ−２およびＧａｇＤの組合せも強力な減少を誘導したが、ＧａｇＢ、ＧａｇＣおよびＰｏｌＢとの組合せは、レポーター活性の減少への効果は低かった（図４Ｄ）。５’−ＬＴＲまたは３’−ＬＴＲのプライマー対によるダイレクトＰＣＲジェノタイピングによって、すべてのｓｇＲＮＡ組合せの切断効率を確認した（図４Ｅ）。フラグメント欠失をさらに確認し、四重ｓｇＲＮＡ（以下を参照されたい）の合理性を提供するために、ＬＴＲ−１およびＧａｇＤとの組合せを、ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングの典型として選択した。結果は、２つの標的部位の切断後の、フラグメントの予測配列を示した（図１１Ａ〜１１Ｃ）。これらのデータは、ｓａＣａｓ９システムに対して選択されたすべてのｓｇＲＮＡが、予測される標的部位においてＤＳＢを作製するうえで効率が高かったことを示す。また、ＬＴＲ  ｓｇＲＮＡとウイルス構造領域を標的とするｓｇＲＮＡとの組合せが、機能的切除の様々な程度を誘導したことを示す。
【０２４９】
（オールインワンＡＡＶベクターにおける多重ｓｇＲＮＡはより効果的な根絶を誘導した）
上述に示した２つのｓｇＲＮＡの組合せについて、２つの個別のプラスミドは、コトランスフェクションの間、同じ細胞内に送達され得ない。ＨＩＶ−１根絶および抑制の最大効率を確実にするために、ＬＴＲ−１およびＧａｇＤの組合せを選択した。そして、レポーター低減の効率を、２つの単一ｓｇＲＮＡを発現しているベクターのコトランスフェクションと、二重ｓｇＲＮＡを発現しているベクターのトランスフェクション間で比較した。より小さなサイズのｓａＣａｓ９（３．１５９ｋｂ）は、効率的なＡＡＶパッケージングおよび遺伝子送達のために、単一のＡＡＶベクターが、２つのｓｇＲＮＡを発現するカセットおよびｓａＣａｓ９発現カセットを保有することを可能にする（Friedland, A. E. et al. Genome Biol 16, 257 (2015)）。図５Ａに示すように、二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９ベクターのトランスフェクションによってさらに、２つの独立した単一ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９ベクターのコトランスフェクションと比べて、ルシフェラーゼレポーター活性の減少を誘導した。レポーターＤＮＡの切断をＰＣＲジェノタイピングによって確認した。そして、野生型バンドと比較した切断されたフラグメントバンドの割合は、２つの独立したｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９ベクターよりも、二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９ベクターにおいて、より強い切断能力を示した（図５Ｂ）。二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９の際立った効果はおそらく、同じ細胞においてこれらの３つの組成の共発現に起因し得る。
【０２５０】
上述で証明したとおり、２つのＬＴＲ  ｓｇＲＮＡは、両方のＬＴＲのフラグメント欠失に加えて、全体のＨＩＶ−１ゲノムを切除することができた。そして、ＬＴＲ  ｓｇＲＮＡと構造遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡとの組合せは、高いプロウイルス切断効率およびより容易なＰＣＲジェノタイピングをもたらした。根絶効率の最適化のためにこれらの２つの特徴を組み合わせるために、ＬＴＲ−１、ＬＴＲ−３、ＧａｇＤおよびＰｏｌＢ  ｓｇＲＮＡの組合せを選択し、新規の互換性Infusionクローニング戦略を使用して、発現カセットをオールインワンｓａＣａｓ９  ＡＡＶベクターにクローニングした。同量の二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９が発現している単一プラスミドを一時的にトランスフェクションさせることによって、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９プラスミドが、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーター活性の減少においてより効果的であることを見出した（図５Ｃ）。このことは、ＰＣＲジェノタイピングによって確認し、５’−ＬＴＲおよびＧａｇにわたるＰＣＲプライマーによって生成される野生型バンドを強く減少させた（図５Ｄ、５Ｅ）。プライマーＴ３６１／Ｔ４５８（図４Ａ）は、二重および四重群の両方において、ＬＴＲ−１とＧａｇＤ間のフラグメント欠失、およびさらなる挿入を検出された一方、ＬＴＲ−３とＧａｇＤとの間の予測される別のフラグメント欠失は四重群で観察された（図５Ｄ）。プライマー対Ｔ７１０／Ｔ４５８は、５’−ＬＴＲ−３およびＧａｇＤ部位間のライゲーション後の予測されるフラグメントを検出した（図５Ｅ）。Ｇａｇ／Ｐｏｌおよび３’−ＬＴＲを包含するＰＣＲジェノタイピング分析は、ＨＩＶ−１ゲノム全体の切断への四重の強い可能性を示した。プライマーＴ７５８／Ｔ３６３は、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ−１または−３間の２つの欠失を検出した一方（図５Ｆ）、Ｔ６８９／Ｔ３６３は、ＰｏｌＢおよびＬＴＲ−１または−３間の２つの欠失を検出した（図５Ｇ）。プライマーＴ６８９／Ｔ７１１は、予測されたとおり１つの欠失を検出した（図５Ｈ）。フラグメント欠失に対するバンド強度の比較分析は、ＬＴＲ−１およびＧａｇＤがより効率的であった一方、ＬＴＲ−３が四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９システムにおいて効率が低かった（図５Ｄ、５Ｆ、５Ｇ）。これらの切断パターンは、四重カクテル戦略が、多重のフラグメント欠失および標的配列周辺の複数のＩｎＤｅｌ変異によって、より効果的であることを示す。
【０２５１】
（四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、より効率的な遺伝子編集のために、単一ＡＡＶ−ＤＪベクターにパッケージされ得る）
一重（monoplex）および二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶベクターのパッケージングの成功は近年報告されている（Friedland, A. E. et al. Genome Biol 16, 257 (2015)）。二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９が発現しているカセット（４．９６９ｋｂ）は、ＡＡＶウイルスのパッケージング限界に近い（（一般的に５〜５．２ｋｂ）Wu, Z., et al. Mol Ther 18, 80-86 (2010)）。しかしながら、５．２〜８．９ｋｂに及ぶゲノムサイズについて、いくつかの導入遺伝子において、インビトロおよびインビボの両方で効率的なＡＡＶパッケージングおよび遺伝子送達が報告されている（Allocca, M. et al. J Clin Invest 118, 1955-1964 (2008); Grieger, J. C. & Samulski, R. J. J Virol 79, 9933-9944 (2005); Wu, J. et al. Hum Gene Ther 18, 171-182 (2007)）。四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現カセット（５．７１６ｋｂ）がＡＡＶウイルス内に効率的にパッケージングされるか否かを試験した。次の理由でＡＡＶ−ＤＪ血清型を選択した：（１）８つの天然ＡＡＶ血清型（ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、トリＡＡＶ，ウシＡＡＶ、およびヤギＡＡＶ）の特徴を組み合わせ、よりよい形質導入効率を導き、標的細胞／組織の範囲を広げる（Grimm, D. et al. J Virol 82, 5887-5911 (2008)）；（２）抗体中和化を避けることができる（Bartel, M., et al. Front Microbiol 2, 204 (2011)）；（３）インビボにおけるＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ媒介ＨＩＶ−１根絶に対して、肝臓への最も高い形質導入効率を提供する。肝濃縮は、ＨＩＶ−１プロウイルスがインビボにおいて切除し得る概念実証を証明するのに不可欠である。二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９に対して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウイルス力価は予測されるとおり、ＰＣＲによって決定された４．１５〜４．３×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ（未精製粗溶解物）のゲノム力価、および、ＨＡタグｓａＣａｓ９タンパク質を検出する抗ＨＡ抗体を用いた免疫細胞化学による、４．４〜９．７×１０８導入ユニット（ＴＵ）／ｍＬの機能的力価だった。四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９に対して、同様のゲノム力価である４．２×１０１３ＧＣ／ｍＬが、二重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９と比較して、２．５×１０８ＴＵ／ｍＬの機能的力価の１．８〜３．９倍のみだった（図１１Ａ、１１Ｂ）。これらのデータは、生成した５．７ｋｂのゲノムである四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶが、ｓａＣａｓ９タンパク質の機能的発現を有して、哺乳動物細胞に効率的に感染し得るＡＡＶ−ＤＪウイルス内へのパッケージングが成功し得ることを示す。
【０２５２】
（多重ｓｇＲＮＡ/ｓａＣａｓ９のＡＡＶ媒介遺伝子送達は、ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞におけるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを効果的に根絶した）
ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスは、部分的なＧａｇおよびＰｏｌ遺伝子におよぶ３．１ｋｂの欠失を有する、ｐＮＬ４−３プロウイルスゲノムの１０を超えるコピー数が組み込まれた座を含むように以前構築され、ウイルス複製が不能の状態である（Dickie, P. et al. Virology 185, 109-119 (1991)）。Ｔｇ２６マウスは、よく特徴づけられた腎臓疾患（Kopp, J. B. et al. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1577-1581 (1992); Haque, S. et al. Am J Pathol 186, 347-358 (2016)）、発症の可能性がある特徴づけられていない神経および心血管欠陥（Cheung, J. Y. et al. Clin Transl Sci 8, 305-310 (2015)）、および他の疾患を発症する。インビボ研究の前に、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスから単離した神経幹／前駆細胞（ＮＳＣ／ＮＰＣ）を使用して、多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９のＨＩＶ−１切除効率を評価した。ＮＳＣ／ＮＰＣを使用する論理的証拠は、ＮＳＣ／ＮＰＣにおけるＨＩＶ感染／潜伏に対する累積証拠であり、ＨＩＶ関連神経認知障害に関連し得る。ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ注入後のマウスＮＳＣ／ＮＰＣにおける抗ＨＡ抗体による免疫細胞化学は、一重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪが、１０の機能的ＭＯＩ（ｆＭＯＩ）による接種後２０日目における測定によって９２．３％の細胞を感染させ、この数字は１．８×１０５ｇＭＯＩと等しく、ＮＳＣ／ＮＰＣの感染においてＡＡＶ−ＤＪウイルスが高効率であることを示した。二重（＝６．５×１０５ｇＭＯＩ）または四重（＝２．１×１０６ｇＭＯＩ）ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪの等量のｆＭＯＩ（図１２Ａ、１２Ｂ）は、それぞれ、約８７．６３％および９０．５２％の同様の感染効率であった（図６Ａ〜６Ｃ）。その後、培養ＮＳＣ／ＮＰＣでの組込みＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの切除における二重および四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９の両方の効率を測定した。ｓａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの用量依存的送達は、ＡＡＶ−ＤＪ感染してから２日目のＰＣＲ分析によって確認した（図６Ｄ、６Ｅ）。そして、ＨＩＶ−１切除効率をＰＣＲジェノタイピングによって評価した。二重および四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９の両方とも、ＡＡＶ感染から２日目において予測されるＤＮＡフラグメントが用量依存的に欠失したが、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、等量のｆＭＯＩを使用したときに切断効率が高かった（図６Ｆ）。ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡの持続的な発現および累積的なゲノム編集を導く、長期ＡＡＶ導入によって、感染後２０日目において切断効率が劇的に上昇した（図６Ｇ）。再び、四重は、類似の感染効率にもかかわらず、高効率のＨＩＶ−１を誘導した（図６Ｂ、６Ｃ）。これらのデータは、ＡＡＶ媒介多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９が、ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウス由来培養ＮＳＣ／ＮＰＣにおいて組込みＨＩＶ−１プロウイルスゲノムを効率的に切除でき、特大の四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪが高効率の遺伝子導入および機能的なゲノム編集を保有することが示す。
【０２５３】
（多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの様々な組織／臓器におけるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを効果的に根絶した）
Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡが、インビボにおける組込みＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを根絶することができるか否かを試験するために、肝臓において最も高い伝染力で組織の広範囲を感染させることができるＡＡＶ−ＤＪ血清型を選択した（Grimm, D. et al. J Virol 82, 5887-5911 (2008); Mao, Y. et al. BMC Biotechnol 16, 1 (2016)）。図１３Ａに示すように、尾静脈注入によるＡＡＶ−ＤＪウイルス（４．１５〜４．２０×１０１２ＧＣ）の単回投与は、ｓｇＲＮＡおよびｓａＣａｓ９が発現しているｃＤＮＡを１週間のみで肝臓および脾臓に効率的に送達できた。肝臓の組織病理学的および免疫組織学的調査によって、いかなるＡＡＶ関連組織毒性は特定されなかった。観察された高形質導入効率および最小組織毒性は、成熟マウスで同様の用量を使用した報告と一致している。しかしながら、最初の注入から１週間後のさらなる同じ用量の注入によって、遺伝子送達の一致したパターンは見られなかった（図１３Ｂ）。ｓａＣａｓ９と共に二重または四重ｓｇＲＮＡを保有するＡＡＶ−ＤＪは、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９の挿入物がＡＡＶパッケージング能力の限界を超えていると思われるにもかかわらず、多くの臓器において同様の遺伝子送達効率が得られた（図１３Ａ、１３Ｂ）。動物組織／臓器の組込みＨＩＶ−１ゲノムの切断におけるｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９の効率を測定するために、フラグメント欠失を増幅することができ、上述で証明した根絶事象を確認することができるプライマー対を用いてＰＣＲジェノタイピングを行った。５’−ＬＴＲ／Ｇａｇ欠失に関し、ネステッドＰＣＲ増幅を用いたときでさえ、感染から１週間後にフラグメント欠失は観察されず、これはインビボＡＡＶ送達してから１週間においてＣａｓ９の発現量が低かったことによる可能性がある。しかしながら、ネステッドＰＣＲ分析を行った後（図１３Ｃ）、様々な程度のフラグメント欠失の様々な程度が多くの臓器／組織、特に肝臓、骨髄、および脾臓において観察された（図１３Ｄ）。最初の感染から７日目におけるさらなるＡＡＶ感染によって、多くの臓器／組織において切断効率が上昇した（図１３Ｄ）。フラグメント欠失のサイズは組織／臓器で変動し、組織／臓器間におけるＤＮＡ修復事象が異なる可能性が暗示された。これらのフラグメント欠失を典型的なバンドのＴ−Ａクローニングおよびサンガーシークエンシングによって確認した（図１３Ｅ）。再び、二重および四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪの両方において、主に肝臓でフラグメント欠失の同様のパターンを誘導した一方、他の臓器ではフラグメント欠失のパターンが変動した（図１３Ｄ）。
【０２５４】
Ｔｇ２６トランスジェニックマウスにおける、ＨＩＶ−１根絶の組織範囲および可能性のある細胞種を広げるために、四重ｓｇＲＮＡ／ＳａＣａｓ９オールインワンベクターをＡＡＶ−ＤＪ／８ウイルスにパッケージングした。インビボにおける形質導入効率を最大化するために、大量の調製物を使用して、ＡＡＶ−ＤＪ／８ウイルスを精製および濃縮した（Holehonnur, R. et al. (2014). BMC Neurosci 15: 28）。特大の四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９のパッケージング効率は、３．０７×１０１４ＧＣ／ｍＬに達し、同時に調製される３ｋｂの挿入物を保有するコントロールＡＡＶ−Ｃｒｅ−ｒＬｕｃベクターに対する並列のパッケージングの力価（４．２１×１０１４ＧＣ／ｍＬ）に近かった。精製した四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８の単回尾ｉ．ｖ．注入（１．５×１０１２ＧＣ）は、回収した多くの臓器／組織においてｓａＣａｓ９遺伝子の効率的な導入を誘導した（図１４Ａ）。導入された臓器／組織におけるｓａＣａｓ９  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を、ｓａＣａｓ９を標的とするプライマーによるＲＴ−ｑＰＣＲ、および抗ＨＡ抗体による免疫組織化学によって確認した（図１５Ａ）。５’−ＬＴＲ／Ｇａｇプライマー対について、設計したサイズの明らかなフラグメント欠失を、従来のＰＣＲ条件を用いて観察された（図７Ａ）。Ｇａｇ／３’−ＬＴＲプライマー対を使用して、肝臓、肺、および脳組織におけるフラグメント欠失を従来のＰＣＲ条件下で観察した（図７Ｂ）。ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングによって、脳および肝臓の両方における設計サイズのフラグメントの欠失が確認された（図１６Ａ、１６Ｂ）。最初の注入から２週間後のさらなる感染（１．５×１０１２ＧＣ）によって、導入された組織／臓器の範囲が拡張し、最初の注入から４週間後にはｓａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの遺伝子形質導入効率が上昇した（図１４Ｂ、１５Ｂ）。Ｇａｇ／３’−ＬＴＲプライマー対によるフラグメント欠失によって示される切除効率は肝臓および肺でさらに上昇し、腎臓および脾臓等の他の臓器にも拡張した（図７Ｃ）。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、脳および腎臓における調節タンパク質Ｔａｔ（図７Ｇ、１４Ｃ）と同様に、脳、腎臓、肝臓および肺構造ウイルスタンパク質ＧａｇおよびＥｎｖのｍＲＮＡ発現の有意な減少を示した（図７Ｄ〜７Ｆ）。まとめると、二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９を保有するＡＡＶ−ＤＪおよびＡＡＶ−ＤＪ／８とも、インビボにおいて十分な遺伝子送達感染を誘導し、続いて、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの様々な臓器／組織において組込みＨＩＶ−１ゲノムの根絶を誘導した。
【０２５５】
全ゲノムシークエンシングおよびオフターゲット分析（Ebina, H. et al., (2013). Scientific reports 3: 2510; Kaminski, R, et al. (2016). Sci Rep 6: 22555; Yin, C, et al. (2016). AIDS 30: 1163-1174）は、培養一次細胞または細胞株において、多重のｓｇＲＮＡによるｓｐＣａｓ９のいかなる明らかなオフターゲット効果を検出しなかった。本研究において、インビボにおけるオフターゲット効果のいかなる可能性を調査するために、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９で処置したＴｇ２６マウスの組織／臓器のゲノムＤＮＡを用いて、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。バイオインフォマティクス分析によって予測される、可能性のあるオフターゲット部位を基に、最も高いスコアの特異性を有する各ｓｇＲＮＡ標的（ＬＴＲ−１、ＬＴＲ−３およびＧａｇＤ）に対する２〜３の予測部位を選択し、Ｔ７Ｅ１評価に対する５００〜８００ｂｐの産生物を生成する高忠実性ＰＣＲを行った。図１７Ａ〜１７Ｆに示すように、マウスゲノム中の７つの予測されるオフターゲット部位で変異は見つからなかったが、オンターゲットＰＣＲ産生物において明らかな変異が検出された。
【０２５６】
（インビボＨＩＶ−１切除を、無細胞ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターウイルスを接種した実験マウスモデルで可視化する）
Ｔｇ２６マウスについて上述に示すように、四重ｓｇＲＮＡカクテルはＡＡＶウイルスに効率的にパッケージングされ得、インビトロおよびインビボの両方において宿主ゲノムのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ全体を効率的に切除する。これらの結果は、ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９アプローチによる全身のＨＩＶ感染の実行可能性および有効性のさらなる試験を促進させた。しかしながら、これは、ＨＩＶ−１プロウイルスコピー／座、ランダム組込み、感染細胞種の稀有および高頻度の変異の点で、臨床ＨＩＶ感染／潜伏を繰り返していない。ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９アプローチによる全身のＨＩＶ感染後のＨＩＶ−１切除の実行可能性および有効性をさらに試験するために、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターウイルスを、ヌードマウスモデルである従来のＮＣｒ株に感染させるために使用した（Potash, M. J. et al. Proc Natl Acad Sci USA 102, 3760-3765 (2005); Kelschenbach, J. L. et al. J Neuroimmune Pharmacol 7, 380-387 (2012)）。右眼における眼窩後方注入によるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ接種（全量２５０ｎｇのＨＩＶ  ｐ２４／マウス、ｎ＝３）後すぐに、単回投与のＡＡＶ−ＤＪ／８（３．０７×１０１２ＧＣ／マウス）を、ＥｃｏＨＩＶ接種後すぐに同じ注入部位による各マウス（ｎ＝３）に注入した。別の３つのＮＣｒマウスには、ネガティブコントロール群として、同じ用量のＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃのみを注入した。生きている動物における長期的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）を、接種後６日目から開始し、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ接種後１９日間にわたって行った（図８Ａ〜８Ｄ）。ＡＡＶＤＪ／８感染なしのコントロール群（ｎ＝３）と比較して、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーター活性の有意な減少が、首リンパ節および注入を行った右眼の周囲組織で観察された（図８Ａ）。ｓａＣａｓ９処置マウスにおけるＥｃｏＨＩＶ感染細胞集団の減少は、マウス全体または右眼領域からのイメージングシグナルのインビボ測定によって、９日目と１９日目の両方において、統計学的に有意（ｐ＜０．０５）である（図８Ｂおよび８Ｃ）。統計学的な有意性に対する線形混合モデルを使用して、１９日間全体に対するＨＩＶ−１切除のｓａＣａｓ９／ｇＲＮＡの有効性を比較した。ネガティブコントロール群と比較して、ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９処置によるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ感染の減少は、実験全体コース間の、背側（ｐ＜０．０１１）および腹側（ｐ＜０．０１４）における首リンパ節からの生物発光出力によって測定されるように、統計学的に有意である（図８Ｄ）。
【０２５７】
インビボにおける根絶効率を確認するために、実験の最後に示した、確立したＰＣＲ条件を使用して、ＰＣＲジェノタイピングを行った（ＳａＣａｓ９／ｇＲＮＡのＡＡＶ導入後１９日目）。ＡＡＶＤＪ／８によるｓａＣａｓ９、ＧａｇＤおよびＬＴＲ１導入遺伝子の効率的な導入は、主に肝臓で確認されて、他の臓器および組織において少し異なった分布を確認した（図９Ａ〜９Ｃ）。従来のＰＣＲを使用して、予測された断片の効率的かつ強力な切除が多くの組織／臓器で確認され、注入した右眼領域、心臓、血液、肝臓、脾臓およびリンパ節で最も効果を示した。異なる動物の編集された組織の変動は、ｅｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ感染、ＡＡＶ媒介遺伝子送達およびＣａｓ９媒介切除の無作為の細胞／組織分布に起因し得る。再び、いくつかのフラグメント欠失をＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングによって確認した（図１８Ａ〜１８Ｃ）。インビボにおける四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９の切除効率を定量するために、３つの異なるプライマーの組合せ（図１９）を用いて切除フラグメントのｑＰＣＲ分析を行った。融解ピーク曲線分析は、設計したように次の３つのタイプのプロウイルスＤＮＡ切除を明らかに特定した：５’−ＬＴＲ１〜ＧａｇＤ、ＧａｇＤ〜３’−ＬＴＲ１または３’−ＬＴＲ３。内部標準として、未切断（非標的）領域（両方の標的部位に隣接する）を用いて、選択した組織／臓器で切除効率を評価したが（図９Ｇ〜Ｉ）、切除の様々な組合わせにより、個々の数字は効率を低く見積もり（underestimate）得る。結果は、切除効率（図９Ｇ〜９Ｉ）がＰＣＲジェノタイピング（図９Ｄ〜９Ｆ）と一致していることを示した。切除タイプおよび効率は異なる臓器／組織で変動した（図９Ｇ〜９Ｉ）。興味深いことに、すべての３つのタイプの切除について、Ｂ１Ｍ３マウスの肝臓において、ＧａｇＤ／３’−ＬＴＲに関し９６％の効率だった（図９Ｉ）。これらのデータは、四重ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、インビボにおける全身のＨＩＶ感染中の新たに感染した細胞においてさえも、ＨＩＶプロウイルスゲノムの切除において効率が高いことを示す。
【０２５８】
（潜在感染ヒト細胞のＨＩＶ−１プロウイルスのインビボ切除を、ヒト化ＢＬＴマウスで検出する）
より臨床的に関連がある動物モデルにおいてＨＩＶ−１プロウイルスを切除するｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡゲノム編集の実行可能性を実証するために、ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡを保有するＡＡＶ−ＤＪ／８を、Ｒ５−、Ｍ向性ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃレポーターウイルスを膣粘膜伝播（ｎ＝３、マウスＩＤ＝Ｂ５Ｍ２、Ｂ５Ｍ３およびＢ６Ｍ３）または腹腔内注入（ｎ＝３、マウスＩＤ＝Ｂ７Ｍ２、Ｂ７Ｍ４およびＢ１０Ｍ４）を介して接種したヒト化ＢＬＴマウスに投与した。これらのＢＬＴマウスにおけるＨＩＶ−１播種の時空間的動態を可視化し、ニッチにおける可視化した５つの単一細胞の感度を用いて、全身ＢＬＩから長期的に分析した（Song, J, et al. (2015). J Gen Virol 96: 3131-3142）。これらのＢＬＴマウスは、局所または全身のＨＩＶ伝播いずれかについて一定の度合いを示したが、感染は縮小し、最初の６０日後には完全になくなり、続く７０日以上において全身のＢＬＩ調査によって測定されたいかなる目で分かる感染はなかった。この現象はおそらく、Ｔ細胞枯渇、ＨＩＶ−１潜在またはＨＩＶ−１複製中の変異によるｅＬｕｃレポーターのサイレンシングの可能性に起因し得る。いくつかの組織においてネステッドＰＣＲによって検出されたＨＩＶ−１ゲノムがなかったので（図７Ａ〜７Ｆ）、サイレンスレポーター発現への変異の寄与は少ないと考えられる。四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８を、ＨＩＶ感染ＢＬＴマウスであるＢ５Ｍ２およびＢ５Ｍ３に、静脈内経路および膣内経路の両方によって投与した。ネガティブコントロールマウスであるＢ６Ｍ３と併せて、Ｂ５Ｍ２およびＢ５Ｍ３に膣粘膜を通じてＨＩＶ−１を接種し、ＨＩＶ感染ＢＬＴマウスであるＢ７Ｍ２およびＢ７Ｍ４マウスには、ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内注入のみ行った。ネガティブコントロールマウスであるＢ１０Ｍ４と併せて、Ｂ７Ｍ２およびＢ７Ｍ４に腹腔内注入によってＨＩＶ−１を接種した。ＡＡＶ送達してから２〜４週間後に、ＢＬＴマウスを犠牲にし、上述のとおり、ＰＣＲジェノタイピング用に、主要な臓器／組織からゲノムＤＮＡサンプルを抽出した。回収した臓器／組織におけるＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの存在を、５’−ＬＴＲ／Ｇａｇプライマー対（Ｔ３６１／Ｔ４５８およびＴ３６１/Ｔ９４６）を使用したネステッドＰＣＲによって確認した（図７Ａ〜７Ｆ）。重要なことは、膣、心臓、肺、右眼（ＡＡＶ注入部位）、結腸、および残った腎被膜下のヒト胸腺オルガノイドにおいて、５’−ＬＴＲ／Ｇａｇプライマー対Ｔ３６１／Ｔ９４６およびＧａｇ／３’−ＬＴＲプライマー対Ｔ７５８／Ｔ３６３の両方でフラグメント欠失が観察されたことである（図７Ａ、７Ｂ、７Ｄ、７Ｅ）。特に、完全なプロウイルスＤＮＡと比較して、フラグメント欠失を示すより高い強度のバンドが、Ｂ５Ｍ３マウスの心臓および膣管等の、同じ組織で観察された（図７Ｂ）。この結果は、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８の単回のｉ．ｖ．注入による、固体組織内の潜伏感染ヒト細胞における、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの効率的な切除を明らかに示す。これらのＰＣＲ産生物のＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシングによって、フラグメントの欠失が確認された：（図２０Ａおよび２０Ｂ）プライマー対Ｔ３６１／Ｔ９４６を使用した５’−ネステッドＰＣＲからのＰＣＲ産生物；（図２１Ａおよび２１Ｂ）プライマー対Ｔ７５８／Ｔ３６３を使用した３’−ネステッドＰＣＲからのＰＣＲ産生物。５’−ＬＴＲ／Ｇａｇ領域（図２０Ａ、２０Ｂ）およびＧａｇ／３’−ＬＴＲ領域の両方における切断して残留する配列内に、様々な長さの挿入物または欠失物が、標的ｓｇＲＮＡのＰＡＭから３番目のヌクレオチドにおける予測される切断部位間で観察された（図２０Ａ、２１Ａ）。前臨床データのこれらのセットは、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９がＡＡＶ−ＤＪ８によって、ヒト化マウスモデルの多くの組織／臓器に残留するＨＩＶ−１潜伏感染ヒト細胞内に送達されて、組込みＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡを切除し得るという概念実証を証明する。
【０２５９】
＜考察＞
本研究において際立った知見は、オールインワンＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ−ＤＪ／８ベクターにより送達されるｓａＣａｓ９および多重ｓｇＲＮＡを用いた、動物モデルにおける、宿主ゲノムのＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの効果的な根絶である。これらのウイルスは、ＨＩＶ−１  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスおよびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃ急性感染マウスにおいて、インビトロおよびインビボ両方において、効果的な遺伝子送達およびＨＩＶ−１プロウイルス根絶を誘導した。遺伝子治療におけるＡＡＶの臨床応用を基に、本研究は、ＨＩＶ−１／ＡＩＤＳ患者を処置する新規の治療方法を提供する。さらに、容易な多重ｓｇＲＮＡのクローニング、急速なレポータースクリーニング、確実なダイレクトＰＣＲジェノタイピング、および高効率であるＡＡＶウイルス産生は、個別化医療およびプレジションメディシン（precision medicine）におけるｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡゲノム編集の臨床応用を提供する。多重ｓｇＲＮＡを用いて同時に複数のＨＩＶプロウイルスＤＮＡを標的とすることは、同じＨＩＶプロウイルスゲノムにおいて２つの異なる標的配列の二重変異の可能性が比較的低いので、ＨＩＶ−１複製中高い割合の変異によるＨＩＶの逃避（escape）を防ぐのに有益である。最後に、２つのＬＴＲ標的部位（５’末端および３’末端の両方）と、２つの構造標的部位（ＧａｇおよびＰｏｌに保存されている）を組み合わせた、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９戦略は、ＨＩＶ−１感染の臨床患者において変異の割合が高いにもかかわらず、ＨＩＶ−１ゲノム全体中の複数のＩｎＤｅｌ変異およびフラグメント欠失の可能性を最大化するために、個別化医療においてＨＩＶ−１根絶のための有望な療法の候補である。この四重の戦略（quadruplex strategy）はさらに、次の利点を提供する：（ａ）ＨＩＶ−１逃避の可能性を大幅に減少させる、（ｂ）継続的なプロウイルス変異にかかわらず、臨床ＨＩＶ−１患者人口におけるＨＩＶ−１切除の高確率、（ｃ）標的遺伝子またはゲノムのかなりの部分の除去による、確実な機能喪失、および（ｄ）最適な切除効率である。
【０２６０】
インビボにおける遺伝子編集効率およびその臨床応用は、効率的な遺伝子送達に主に依存する。基礎研究に対して、標準のプラスミドのトランスフェクションおよび様々なウイルスベクター（特に、レンチウイルス、アデノウイルスおよびＡＡＶベクター）の導入は、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを別々にまたは組み合わせて送達するのに広く用いられている。多くの標的細胞における高い形質導入効率、および、長期間だが可逆／誘導性である遺伝子発現によって、レンチウイルス媒介Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ送達は、多くの研究室で好まれ、広く使用されている。しかしながら、レンチウイルスおよびアデノウイルスの安全性および免疫原性によって、臨床における実行可能性が制限されている。インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）はＺＦＮ送達で試験されている（Cecilia, A. P. et al. Current Gene Therapy 14, 365-376 (2014); Pelascini, L. P. et al. Human Gene Therapy Methods 24, 399-411 (2013); Lombardo, A. et al.  Nat Biotechnol 25, 1298-1306 (2007)）、そしてＣａｓ９およびＴＡＬＥＮ送達でのその応用は問題として残っている（Wang, X. et al. Nat Biotechnol 33, 175-178 (2015)）。突然変異がなく、毒性が低く、宿主免疫応答が低く、長期間有効であることより、ＡＡＶ媒介遺伝子治療は、臨床試験においてとても有望なアプローチになっている（Hastie, E. & Samulski, R. J. Hum Gene Ther 26, 257-265 (2015); Mingozzi, F. & High, K. A. Blood 122, 23-36 (2013)）。いくつかの研究において、インビトロおよびインビボの両方において、ＡＡＶ媒介Ｃａｓ９送達の実行可能性および有効性が試験されている。広く使用されているｓｐＣａｓ９（１３６８ａａ）は、４．１ｋｂのサイズであり、効率的にパッケージされ、細胞または組織を効率的に感染し得るＡＡＶベクターのクローニングに対して、とても小さな空間を有する。それにもかかわらず、最小のプロモーターおよびポリＡ配列を使用した４つの研究室において、培養細胞および動物モデルにおいてＡＡＶ−ｓｐＣａｓ９を応用することに成功したことを報告している（Swiech, L. et al. Nat Biotechnol 33, 102-106 (2015); Platt, R. J. et al. Cell 159, 440-455 (2014); Senis, E. et al. Biotechnol J 9, 1402-1412 (2014); Howes, R. & Schofield, C. Methods Mol Biol 1239, 75-103 (2015)）。ＡＡＶ送達効率を改善するために、機能的なＮ末端とＣ末端部に分けたｓｐＣａｓ９が最近報告され（Wright, A. V. et al. Proc Natl Acad Sci USA, doi:10.1073/pnas.1501698112 (2015); Zetsche, B., et al. Nat Biotechnol 33, 139-142 (2015)）、これにより、前臨床動物モデルにおいてｓｐＣａｓ９をより効率的に送達する新規方法を提供する。ＧｙｒＡインテインシステムを使用したＡＡＶ−分割ｓｐＣａｓｐニッカーゼベクターはまた、ゲノム編集の特異性を増強することが報告されている（Fine, E. J. et al. Scientific reports 5, 10777 (2015)）。いくつかの小さなＣａｓ９オルソログが近年同定されており、その中でｓａＣａｓ９はよく特徴づけられており、動物実験および臨床応用において有望性が高い。これらの小さなＣａｓ９は、オールインワンベクターシステムを使用した臨床試験においてＡＡＶ遺伝子治療を実行可能にするのみだけでなく、臨床試験について広く引きつける力（wide attraction）を保持もするＩＤＬＶシステムにおけるパッケージングおよび形質導入効率を上昇させる（Liu, K. C. et al. Current gene therapy 14, 352-364 (2014)）。いくつかの動物��験では、オールインワンＡＡＶベクターにおいてｓａＣａｓ９および１つまたは２つのｓｇＲＮＡが発現しているカセットを使用して、ＡＡＶパッケージングおよび遺伝子導入の高効率を証明している。本研究において、オールインワンＡＡＶ−ＤＪベクターにおける二重のＨＩＶ−ｓｇＲＮＡとｓａＣａｓ９がまた、培養細胞、特にＴｇ２６トランスジェニックマウスの様々な臓器／組織において、導入遺伝子の送達およびＨＩＶ−１ゲノムの根絶を可能にすることを証明した。さらに、初めて、四重ｓｇＲＮＡおよびｓａＣａｓ９をコードする特大のオールインワンＡＡＶベクターが同様に、培養ＨＩＶ組込みＮＳＣ／ＮＰＣ、ならびにＨＩＶ−１潜伏Ｔｇ２６トランスジェニックマウスおよび急性感染ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃマウスの様々な臓器／組織における、高力価のパッケージングおよびＨＩＶ−１ゲノムの効果的な根絶を誘導することができることを証明した。これらの新規かつ刺激的な知見は、前臨床および臨床環境において、ＨＩＶ−１根絶の最適な遺伝子治療に関し、ＨＩＶ−１  ＬＴＲおよび構造タンパク質領域を標的とする多重ｓｇＲＮＡのカクテルを開発するための新しい道を開く。
【０２６１】
オールインワンベクターに多重ｓｇＲＮＡが発現しているカセットを設置するいくつかのアプローチが報告されている。Ｃｓｙ４タンパク質またはリボソームのＲＮＡ加工特性を使用して、ＰｏｌＩＩプロモーター下の単一の転写物が複数のｓｇＲＮＡに加工され得る（Nissim, L., et al. Mol Cell 54, 698-710 (2014); Gao, Y. & Zhao, Y.  J Integr Plant Biol 56, 343-349 (2014)）。同じＵ６プロモーター下、７つまでのｓｇＲＮＡを有する多重ベクターについて、Golden Gateクローニング法を用いた構築に成功しており、その多重標的効果は、複数の遺伝子の多重ゲノム／エピゲノム編集、同時活性化／抑制化について試験されている（Sakuma, T., et al. Scientific reports 4, 5400 (2014)）。繰り返しＤＮＡ配列により組換えのリスクの可能性を減少させる、および各ｓｇＲＮＡの発現効率を最大化するために、４つの独立したＰｏｌＩＩＩプロモーター（ヒトＵ６プロモーター、マウスＵ６プロモーター、７ＳＫおよびＨ１）により駆動される（driven）多重ｓｇＲＮＡは、Golden Gate assembly法を用いて試験されている。当該方法は、単一のレンチウイルスベクター内に４つまでのｓｇＲＮＡを強力かつ急速にクローニングすることができる（Kabadi, A. M., et al. Nucleic Acids Res 42, e147 (2014)）。ここで、新規のIn-Fusionクローニング戦略が、２つの制限酵素の詮索やりとり（interrogated exchange）で開発され、単一のベクター内への任意の数の多重ｓｇＲＮＡを容易かつ迅速なクローニングを提供する。この概念実証は、任意のＰｏｌＩＩＩプロモーターおよび様々なウイルス遺伝子の送達システムの下、任意の多重ｓｇＲＮＡに応用可能である。４つの同一のＵ６プロモーターの下の４つのｓｇＲＮＡが、標的ＤＮＡ切断を誘導するのに十分な活性を示した一方、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９システムにおけるｓｇＲＮＡ  ＬＴＲ１、ＧａｇＤおよびＰｏｌＢがＨＩＶ−１プロウイルスの切断において最も良かったが、ＬＴＲ−３は二重ｓｇＲＮＡシステムにおいて高い切断能力を有するが、ＨＩＶ−１プロウイルスの切断においては弱かった。
【０２６２】
本研究は、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスおよびヒト化ＢＬＴマウスの両方における組込みＨＩＶ−１プロウイルス、ならびに、無細胞ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃレポーターウイルスを接種した従来のマウスにおける急性感染中のエピソームの可能性があるＨＩＶ−１  ＤＮＡの切除において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ遺伝子治療の使用の実行可能性を立証した。そして、ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９は、暴露前予防投与 （ＰｒＥＰ）として考慮され得る。ＡＡＶ−ＤＪまたはＡＡＶ−ＤＪ／８の静脈内投与によって、多くの組織／臓器、中でも肝臓、脾臓、およびリンパ節で最も高く、大量の遺伝子導入およびＨＩＶ−１根絶を達成した。本研究は、ＨＩＶ感染ヒト化ＢＬＴマウスにおいて、単回のＡＡＶ−ＤＪ／８投与によって、複数のマウス臓器／組織内の潜伏感染ヒト細胞のＧａｇ／３’−ＬＴＲおよび５’−ＬＴＲ／Ｇａｇの明らかな切除を証明する。この知見はまた、ＨＩＶ−１ウイルスを保有する、組織保有体（tissue reservoir）の範囲の広大さを実証する。ここで報告したこれらの知見は、ＨＩＶ−１疾患の予防および改善における、ＨＩＶ−１根絶のためのＣａｓ９／ｓｇＲＮＡアプローチのさらなる前臨床開発の正当化（justification）を提供する。
【０２６３】
結論として、小さなｓａＣａｓ９タンパク質サイズによって、二重または四重ものｓｇＲＮＡを発現するカセットが、細胞培養物および動物モデルにおいて、高力価パッケージングおよび強力な遺伝子誘導のために、オールインワンＡＡＶベクターで保有されることを可能にする。５’末端および３’末端ＬＴＲならびに構造ＧａｇおよびＰｏｌ領域を標的とする二重ｓｇＲＮＡとｓａＣａｓ９は、多様なパターンの小さなＩｎＤｅｌ変異および大きなフラグメント欠失を誘導する。したがってＨＩＶ−１ゲノム根絶の最適効率を提供する。ＡＡＶ遺伝子治療による動物におけるＨＩＶ−１根絶の実行可能性および有効性は、近い将来の前臨床研究および臨床試験を可能にする。
【０２６４】
【表２】
2019504868.tif 000005
【０２６５】
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【０２６６】
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【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１Ａ】rAAV9:saCas9/gRNA Tg26 MEFによるＨＩＶ−１  ＤＮＡの切除を示す。
【図１Ｂ】rAAV9:saCas9/gRNA Tg26 MEFによるＨＩＶ−１  ＤＮＡの切除を示す。
【図２Ａ】Ｔｇマウスの様々な組織における、rAAV9:saCas9/gRNAによるインビボにおけるＨＩＶ−１ＤＮＡの切除を示す。
【図２Ｂ】Ｔｇマウスの様々な組織における、rAAV9:saCas9/gRNAによるインビボにおけるＨＩＶ−１ＤＮＡの切除を示す。
【図２Ｃ】Ｔｇマウスの様々な組織における、rAAV9:saCas9/gRNAによるインビボにおけるＨＩＶ−１ＤＮＡの切除を示す。
【図２Ｄ】Ｔｇマウスの様々な組織における、rAAV9:saCas9/gRNAによるインビボにおけるＨＩＶ−１ＤＮＡの切除を示す。
【図３Ａ】rAAV9:saCas9/gRNA接種後のラット血液細胞の組み込まれたＨＩＶ−１ＤＮＡのセグメントの除去、およびウイルスＲＮＡの発現を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂは、rAAV9:saCas9/gRNA接種後のラット血液細胞の組み込まれたＨＩＶ−１ＤＮＡのセグメントの除去、およびウイルスＲＮＡの発現を示す。
【図４Ａ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノムを効率的に切除し、ＨＩＶ−１ルシフェラーゼレポーター発現を抑制することを示す。
【図４Ｂ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノムを効率的に切除し、ＨＩＶ−１ルシフェラーゼレポーター発現を抑制することを示す。
【図４Ｃ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノムを効率的に切除し、ＨＩＶ−１ルシフェラーゼレポーター発現を抑制することを示す。
【図４Ｄ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノムを効率的に切除し、ＨＩＶ−１ルシフェラーゼレポーター発現を抑制することを示す。
【図４Ｅ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡはＨＩＶ−１ゲノムを効率的に切除し、ＨＩＶ−１ルシフェラーゼレポーター発現を抑制することを示す。
【図５Ａ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｂ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｃ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｄ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｅ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｆ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｇ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｈ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｉ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図５Ｊ】オールインワン（all-in-one）ＡＡＶベクターにおける多重（multiplex）ｓｇＲＮＡの有効性を示す。
【図６Ａ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図６Ｂ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図６Ｃ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図６Ｄ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図６Ｅ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図６Ｆ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図６Ｇ】多重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９発現ベクターのＡＡＶ−ＤＪ媒介送達によって、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの神経幹細胞（ＮＳＣ）におけるＨＩＶ−１組込みゲノムを効率的に切除することを示す。
【図７Ａ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ切除を誘導したことを示す。
【図７Ｂ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ切除を誘導したことを示す。
【図７Ｃ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡ切除を誘導したことを示す。
【図７Ｄ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ転写の強力な減少を誘導したことを示す。
【図７Ｅ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ転写の強力な減少を誘導したことを示す。
【図７Ｆ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ転写の強力な減少を誘導したことを示す。
【図７Ｇ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの多くの器官／組織において、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ転写の強力な減少を誘導したことを示す。
【図８Ａ】インビボにおいて四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８がＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を誘導したことを示す、生物発光イメージング分析である。
【図８Ｂ】インビボにおいて四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８がＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を誘導したことを示す、生物発光イメージング分析である。
【図８Ｃ】インビボにおいて四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８がＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を誘導したことを示す、生物発光イメージング分析である。
【図８Ｄ】インビボにおいて四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８がＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を誘導したことを示す、生物発光イメージング分析である。
【図９Ａ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｂ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｃ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｄ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｅ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｆ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｇ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｈ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図９Ｉ】ＰＣＲジェノタイピングおよびｑＰＣＲ分析によって、マウスの様々な臓器／組織において、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８による、遺伝子導入およびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除効率を確認したことを示す。
【図１０Ａ】ＡＡＶ処置後２週目において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。
【図１０Ｂ】ＡＡＶ処置後２週目において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。
【図１０Ｃ】ＡＡＶ処置後２週目において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。
【図１０Ｄ】ＡＡＶ処置後３週目において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。
【図１０Ｅ】ＡＡＶ処置後４週目において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。
【図１０Ｆ】ＡＡＶ処置後４週目において、ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃを接種したヒト化ＢＬＴマウスにおける、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８によるＨＩＶプロウイルスＤＮＡの切除を示す。
【図１１Ａ】ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシング分析を使用した、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃゲノムの予測されるフラグメント欠失の確認を示す。
【図１１Ｂ】ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシング分析を使用した、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃゲノムの予測されるフラグメント欠失の確認を示す。
【図１１Ｃ】ＴＡクローニングおよびサンガーシークエンシング分析を使用した、ＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃゲノムの予測されるフラグメント欠失の確認を示す。
【図１２Ａ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において多重ｓｇＲＮＡおよびｓａＣａｓ９を保有するＡＡＶ−ＤＪの機能的力価を示す。
【図１２Ｂ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において多重ｓｇＲＮＡおよびｓａＣａｓ９を保有するＡＡＶ−ＤＪの機能的力価を示す。
【図１３Ａ】二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪで感染させたＴｇ２６トランスジェニックマウスの異なる臓器／組織において、導入遺伝子発現およびＨＩＶ−１ゲノム切除について同様の効率を示す。
【図１３Ｂ】二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪで感染させたＴｇ２６トランスジェニックマウスの異なる臓器／組織において、導入遺伝子発現およびＨＩＶ−１ゲノム切除について同様の効率を示す。
【図１３Ｃ】二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪで感染させたＴｇ２６トランスジェニックマウスの異なる臓器／組織において、導入遺伝子発現およびＨＩＶ−１ゲノム切除について同様の効率を示す。
【図１３Ｄ】二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪで感染させたＴｇ２６トランスジェニックマウスの異なる臓器／組織において、導入遺伝子発現およびＨＩＶ−１ゲノム切除について同様の効率を示す。
【図１３Ｅ】二重または四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪで感染させたＴｇ２６トランスジェニックマウスの異なる臓器／組織において、導入遺伝子発現およびＨＩＶ−１ゲノム切除について同様の効率を示す。
【図１４Ａ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、効率的な導入遺伝子の導入を誘導し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって、ＨＩＶ  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの様々な臓器／組織のＴａｔ転写を確認した。
【図１４Ｂ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、効率的な導入遺伝子の導入を誘導し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって、ＨＩＶ  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの様々な臓器／組織のＴａｔ転写を確認した。
【図１４Ｃ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８が、効率的な導入遺伝子の導入を誘導し、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析によって、ＨＩＶ  Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの様々な臓器／組織のＴａｔ転写を確認した。
【図１５Ａ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８を静脈内注入してから２週間後での、Ｔｇ２６マウスの臓器／組織におけるｓａＣａｓ９タンパク質の発現を示す。
【図１５Ｂ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ／８を静脈内注入してから４週間後での、Ｔｇ２６マウスの臓器／組織におけるｓａＣａｓ９タンパク質の発現を示す。
【図１６Ａ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８を静脈内投与してから２週間後での、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの脳における、ＨＩＶ−１ゲノムのＧａｇＤから３’−ＬＴＲ１のフラグメント欠失の確認を示す。
【図１６Ｂ】四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８を静脈内投与してから２週間後での、Ｔｇ２６トランスジェニックマウスの肝臓における、ＨＩＶ−１ゲノムのＧａｇＤから３’−ＬＴＲ１のフラグメント欠失の確認を示す。
【図１７Ａ】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。
【図１７Ｂ】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。
【図１７Ｃ】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。
【図１７Ｄ】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。
【図１７Ｅ】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。
【図１７Ｆ】Ｔ７Ｅ１ミスマッチ切断アッセイの結果を示し、四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９  ＡＡＶ−ＤＪ８の静脈内への単回注入を行ったＴｇ２６マウスの肝臓組織においてオフターゲット効果がなかったことを示す。
【図１８Ａ】ＮＣｒヌードマウスの心臓および肺組織における四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９によるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を示す。
【図１８Ｂ】ＮＣｒヌードマウスの心臓および肺組織における四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９によるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を示す。
【図１８Ｃ】ＮＣｒヌードマウスの心臓および肺組織における四重ｓｇＲＮＡ／ｓａＣａｓ９によるＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの切除を示す。
【図１９】図１９は、ＨＩＶ切除効率を検出するｑＰＣＲ戦略を示す。表は、未切断（uncut）、切断（cut）および内在ＥｃｏＨＩＶ  ＤＮＡ量を示すためのすべてのｑＰＣＲプライマー対を示し、模式図はすべてのプライマーの位置を示す。
【図２０Ａ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡゲノム編集後のヒト化ＢＬＴマウスの臓器／組織における、５’−ＬＴＲ１およびＧａｇＤ部位間のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡのフラグメント欠失の確認を示す。
【図２０Ｂ】ｓａＣａｓ９／ｓｇＲＮＡゲノム編集後のヒト化ＢＬＴマウスの臓器／組織における、５’−ＬＴＲ１およびＧａｇＤ部位間のＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡのフラグメント欠失の確認を示す。
【図２１Ａ】ゲノム編集後のヒト化ＢＬＴマウスの臓器／組織における、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１部位間のＨＩＶ−１ゲノムのフラグメント欠失の確認を示す。
【図２１Ｂ】ゲノム編集後のヒト化ＢＬＴマウスの臓器／組織における、ＧａｇＤおよび３’−ＬＴＲ１部位間のＨＩＶ−１ゲノムのフラグメント欠失の確認を示す。
【図２２Ａ】ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃおよびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの模式図である。
【図２２Ｂ】ＨＩＶＮＬ−ＢａＬ−ｅＬｕｃおよびＥｃｏＨＩＶ−ｅＬｕｃの模式図である。
【図１Ａ】
2019504868.tif 000008
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2019504868.tif 000010
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2019504868.tif 000013
【図３Ａ】
2019504868.tif 000014
【図３Ｂ】
2019504868.tif 000015
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2019504868.tif 000020
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2019504868.tif 000031
【図６Ｃ】
2019504868.tif 000032
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2019504868.tif 000034
【図６Ｆ】
2019504868.tif 000035
【図６Ｇ】
2019504868.tif 000036
【図７Ａ】
2019504868.tif 000037
【図７Ｂ】
2019504868.tif 000038
【図７Ｃ】
2019504868.tif 000039
【図７Ｄ】
2019504868.tif 000040
【図７Ｅ】
2019504868.tif 000041
【図７Ｆ】
2019504868.tif 000042
【図７Ｇ】
2019504868.tif 000043
【図８Ａ】
2019504868.tif 000044
【図８Ｂ】
2019504868.tif 000045
【図８Ｃ】
2019504868.tif 000046
【図８Ｄ】
2019504868.tif 000047
【図９Ａ】
2019504868.tif 000048
【図９Ｂ】
2019504868.tif 000049
【図９Ｃ】
2019504868.tif 000050
【図９Ｄ】
2019504868.tif 000051
【図９Ｅ】
2019504868.tif 000052
【図９Ｆ】
2019504868.tif 000053
【図９Ｇ】
2019504868.tif 000054
【図９Ｈ】
2019504868.tif 000055
【図９Ｉ】
2019504868.tif 000056
【図１０Ａ】
2019504868.tif 000057
【図１０Ｂ】
2019504868.tif 000058
【図１０Ｃ】
2019504868.tif 000059
【図１０Ｄ】
2019504868.tif 000060
【図１０Ｅ】
2019504868.tif 000061
【図１０Ｆ】
2019504868.tif 000062
【図１１Ａ】
2019504868.tif 000063
【図１１Ｂ】
2019504868.tif 000064
【図１１Ｃ】
2019504868.tif 000065
【図１２Ａ】
2019504868.tif 000066
【図１２Ｂ】
2019504868.tif 000067
【図１３Ａ】
2019504868.tif 000068
【図１３Ｂ】
2019504868.tif 000069
【図１３Ｃ】
2019504868.tif 000070
【図１３Ｄ】
2019504868.tif 000071
【図１３Ｅ】
2019504868.tif 000072
【図１４Ａ】
2019504868.tif 000073
【図１４Ｂ】
2019504868.tif 000074
【図１４Ｃ】
2019504868.tif 000075
【図１５Ａ】
2019504868.tif 000076
【図１５Ｂ】
2019504868.tif 000077
【図１６Ａ】
2019504868.tif 000078
【図１６Ｂ】
2019504868.tif 000079
【図１７Ａ】
2019504868.tif 000080
【図１７Ｂ】
2019504868.tif 000081
【図１７Ｃ】
2019504868.tif 000082
【図１７Ｄ】
2019504868.tif 000083
【図１７Ｅ】
2019504868.tif 000084
【図１７Ｆ】
2019504868.tif 000085
【図１８Ａ】
2019504868.tif 000086
【図１８Ｂ】
2019504868.tif 000087
【図１８Ｃ】
2019504868.tif 000088
【図１９】
2019504868.tif 000089
【図２０Ａ】
2019504868.tif 000090
【図２０Ｂ】
2019504868.tif 000091
【図２１Ａ】
2019504868.tif 000092
【図２１Ｂ】
2019504868.tif 000093
【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
2019504868.tif 000095
【配列表】
2019504868000001.app
【国際調査報告】
2019504868.tif 000096
2019504868.tif 000097
2019504868.tif 000098