(57)【要約】  本発明は、顕微鏡分析に適した膨張生物標本を調製するための方法を提供する。生体試料を膨張させることは、重要な生体分子をポリマーネットワークに結合させ、例えば係留し、ポリマーネットワークを膨潤させるかまたは膨張させ、それにより、以下でさらに記載するように生体分子を引き離すことによって達成され得る。生体分子がポリマーネットワークに係留される場合、ポリマーネットワークの等方性膨張が生体分子の空間的配向を保持し、その結果、膨張または拡大生物標本が得られる。
2019511914.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膨張性生物標本を調製するための方法であって、
（ａ）試料を、前記試料内の生体分子に結合する巨大分子と接触させ；
（ｂ）二官能性架橋剤で前記標本を処理し；
（ｃ）膨潤性ポリマーの前駆体を前記標本に浸透させ；
（ｄ）前記前駆体を重合させて前記標本内で膨潤性ポリマーを形成させ；
（ｅ）前記生体分子を前記膨潤性ポリマーに係留し；
（ｆ）約５０℃〜約７０℃で約０．５〜約３時間、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに前記試料を温置する段階
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、前記膨潤性ポリマーを膨潤させることによって、前記膨張性標本を膨潤させる、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記標本が、予め保存された臨床試料である、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）またはヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織試料または新鮮凍結試料であり、接触段階（ａ）の前に、
（ｉ）前記試料が載置されている場合、前記試料からカバースリップを取り外し；
（ｉｉ）前記試料が載置されている場合、前記試料に対して封入剤除去を行い；
（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）が実施される場合、前記試料に対して再水和を行い；
（ｉｖ）前記試料に対して抗原回復を行う段階
を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記プロテアーゼが、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、ペプシン、サーモリシンおよびエラスターゼから選択される、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記緩衝液が、Ｔｒｉｓ、クエン酸、リン酸、重炭酸、ＭＯＰＳ、ホウ酸、ＴＡＰＳ、ビシン、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＭＥＳから選択される、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＨＡ、ＥＤＤＳ、ＢＡＰＴＡおよびＤＯＴＡから選択される、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ソルビタン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＥＧ、デシルグルコシド、デシルポリグルコースおよびコカミドＤＥＡから選択される、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記塩がＮａ＋、Ｋ＋、アンモニウムおよびＣｓ＋から選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、８Ｕ／ｍＬプロテイナーゼＫ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液中で前記試料を温置する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記二官能性架橋剤が、６−（（アクリロイル）アミノ）ヘキサン酸のスクシンイミジルエステル（ＡｃＸ）である、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、接触段階（ａ）の前に、前記試料に対して抗原回復を行う、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記試料を約１００℃にて２０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液中で加熱する、方法。
【請求項１４】
膨張性生物標本を調製するための方法であって、
（ａ）前記標本を二官能性架橋剤で処理し；
（ｂ）膨潤性ポリマーの前駆体を前記標本に浸透させ；
（ｃ）前記前駆体を重合させて前記標本内で膨潤性ポリマーを形成させ；
（ｄ）約０．５〜約３時間、約５０℃〜約７０℃で、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに前記標本を温置する段階
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、前記膨潤性ポリマーを膨潤させることによって、前記膨張性標本を膨張させる、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、８Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液中で前記試料を温置する、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、処理段階（ａ）の前に、前記試料に対して抗原回復を行う、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記二官能性架橋剤が、６−（（アクリロイル）アミノ）ヘキサン酸のスクシンイミジルエステル（ＡｃＸ）である、方法。
【請求項１９】
膨潤性材料埋め込み生物標本を膨張させるための方法であって、
（ａ）約５０℃〜約７０℃で約０．５〜約３時間、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに前記標本を温置し；
（ｂ）膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、前記膨潤性ポリマーを膨潤させること
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、８Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液中で前記標本を温置する、方法。
【請求項２１】
膨張性生物標本を調製する方法であって、
（ａ）試料を、前記試料内の生体分子に結合する巨大分子と接触させ；
（ｂ）二官能性架橋剤で前記標本を処理し；
（ｃ）膨潤性ポリマーの前駆体を前記標本に浸透させ；
（ｄ）前記前駆体を重合させて前記標本内で膨潤性ポリマーを形成させ；
（ｅ）前記生体分子を前記膨潤性ポリマーに係留し；
（ｆ）金属イオンキレート剤、非イオン性界面活性剤および一価塩を含む緩衝液中で非特異的プロテアーゼとともに前記試料を温置する段階
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれる、２０１６年２月２５日提出の米国仮特許出願第６２／２９９，７５４号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
病理学において、回折限界顕微鏡を用いた細胞構造および分子組成の検査は、長い間、様々な疾患前状態および疾患状態の診断の鍵となってきた。しかし、生体分子自体は、ナノスケールの寸法であり、細胞および組織全体にわたってナノスケールの精度で構成される。基礎科学では、先駆的な超解像顕微鏡法ならびに電子顕微鏡法を用いてこれを探索し始めているが、このような戦略は複雑なハードウェアを必要とし、急激な学習曲線を提示し得、ヒト組織などの大寸法の試料に適用することは困難である。したがって、超解像度イメージングおよびナノスコピーは、病理学の診療において日常的な実用性をもたらしていない。
【０００３】
したがって、現在の回折限界顕微鏡とともに機能し得、ナノスケールの精度で、組織切片または腫瘍などの試料を光学的に拡大し得る、より高解像度の顕微鏡が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、膨張生物標本を調製するための方法を提供する。膨張生物標本は、顕微鏡分析に適している。「顕微鏡分析」とは、肉眼では見ることができない、すなわち通常の眼の解像度範囲内にない標本の態様の可視化を提供する任意の技術を用いた標本の分析を意味する。「膨張生物標本を調製する」とは、一般に、生物標本が、本明細書中に記載の方法に曝露される前の標本と比較して、物理的に膨張または拡大されることを意味する。生体試料を膨張させることは、重要な生体分子をポリマーネットワークに結合させ、例えば係留し、ポリマーネットワークを膨潤させるかまたは膨張させ、それにより、以下でさらに記載するように生体分子を引き離すことによって達成され得る。生体分子がポリマーネットワークに係留される場合、ポリマーネットワークの等方性膨張が生体分子の空間的配向を保持し、その結果、膨張または拡大生物標本が得られる。
【０００５】
一実施形態において、膨張性生物標本を調製するための方法は、試料を、試料内の生体分子に結合する巨大分子と接触させ；二官能性架橋剤で標本を処理し；膨潤性ポリマーの前駆体を標本に浸透させ；この前駆体を重合させて標本内で膨潤性ポリマーを形成させ；生体分子を膨潤性ポリマーに係留し；約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で１〜１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに試料を温置する段階を含む。膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、膨潤性ポリマーを膨潤させることによって、膨張性生物標本を膨張させ得る。一実施形態において、処理段階（ａ）の前に、試料を熱処理する。「熱処理された」とは、一般に、当業者にとって公知であり、以下にさらに記載されるような、任意の適切な抗原回復工程を意味する。
【０００６】
一実施形態において、膨張性生物標本を調製するための方法は、標本を二官能性架橋剤で処理し；膨潤性ポリマーの前駆体を標本に浸透させ；この前駆体を重合させて標本内に膨潤性ポリマーを形成させ；約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤；および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに、約０．５〜約３時間、約５０℃〜約７０℃で標本を温置する段階を含む。一実施形態において、本方法は、試料を、試料内の生体分子に結合する巨大分子と接触させる段階をさらに含み得る。一実施形態において、本方法は、生体分子を膨潤性ポリマーに係留する段階をさらに含み得る。膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、膨潤性ポリマーを膨潤させることによって、膨張性標本を膨張させ得る。一実施形態において、処理段階（ａ）の前に、試料を熱処理する。
【０００７】
一実施形態において、以下にさらに記載するように、膨潤性材料埋め込み生物標本を膨張させるための方法は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに、約０．５〜約３時間、約５０℃〜約７０℃で標本を温置し；膨潤性ポリマーを膨潤させるために膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ−１Ｍ】図１Ａ〜図１Ｍは、膨張病理学法（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）（ＥｘＰａｔｈ）の設計および検証を示す。（Ａ）ＥｘＰａｔｈワークフローの概略図。（Ｂ）広視野落射蛍光顕微鏡で取得し、ＤＡＰＩならびに複数の抗体で染色した正常ヒト乳房組織の１．５ｍｍコアの膨張前画像。青、ＤＡＰＩ；緑、ビメンチン；赤、電圧依存性陰イオンチャネル（ＶＤＡＣ）。（Ｃ）同じ範囲におけるＢの試料のＥｘＰａｔｈ画像。（ＤおよびＥ）膨張前対膨張後画像に対する測定長さの関数としての平均二乗（ＲＭＳ）長さ測定誤差（青実線、ＤＡＰＩチャネルの平均；緑実線、ビメンチンチャネルの平均；影付きの領域、平均の標準誤差；ｎ＝３名の異なる患者。平均膨張係数：４．３（ＳＤ：０．３））。（Ｆ）ＤＡＰＩおよび複数の抗体で染色された正常ヒト乳房組織の超解像構造化照明顕微鏡（ＳＲ−ＳＩＭ）画像。青、ＤＡＰＩ；緑、ビメンチン；赤、ケラチン−１９（ＫＲＴ１９）。（Ｇ）スピニングディスク型共焦点顕微鏡で得られたＦの試料のＥｘＰａｔｈ画像。（ＨおよびＩ）ヒト乳房組織のＥｘＰａｔｈ対ＳＩＭ画像に対する測定長さの関数としてのＲＭＳ長さ測定誤差（青実線、ＤＡＰＩチャネルの平均；赤実線、ＫＲＴ１９チャネルの平均；影付きの領域、平均の標準誤差；ｎ＝４名の異なる患者からの試料からの５視野。平均膨張係数：４．０（ＳＤ：０．２））。（Ｊ）非定型乳管過形成（ＡＤＨ）がある、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色ヒト乳房試料。挿入図（左上）は、点線で囲まれた領域の拡大図である。（Ｋ）Ｈｓｐ６０（赤）ビメンチン（緑）およびＤＡＰＩ（青）に対する抗体で染色されたＪの試料のＥｘＰａｔｈ広視野蛍光画像。（Ｌ）ＨＥＲ２増幅を伴わないヒト乳房試料のＥｘＰａｔｈ広視野蛍光画像。青、抗ＨＥＲ２（不可視）；灰色、ＤＡＰＩ；緑、１７番染色体セントロソームに対するＤＮＡ  ＦＩＳＨ；赤、ＨＥＲ２に対するＤＮＡ  ＦＩＳＨ。（Ｍ）Ｌのように染色した、ＨＥＲ２増幅を伴うヒト乳癌試料のＥｘＰａｔｈ広視野蛍光画像。スケールバー：（Ｂ）２００μｍ、（Ｃ）２２０μｍ（膨張後の物理的サイズ、９００μｍ、膨張係数４．１）、（Ｆ）１０μｍ、（Ｇ）１０μｍ（膨張後の物理的サイズ、４３μｍ、膨張係数４．３）。（Ｊ）５μｍ；挿入図１μｍ（Ｋ）５μｍ；挿入図１μｍ（膨張後の物理的サイズ、２３μｍ；挿入図、４．６μｍ；膨張係数４．６）。（Ｌ）および（Ｍ）、膨張後の物理的サイズは２０μｍである。
【図２】図２は、広範囲のヒト組織試料のＥｘＰａｔｈイメージングを示す。ヒト患者由来の正常（左画像）および癌（右画像）組織の両方に対する様々な組織型の画像。上から下へ、異なる行は、標識されるとおり、異なる組織型（例えば、前立腺、肺、乳房など）を示す。所与の組織ｘ疾患タイプに対する画像の各ブロック内に、５つの画像を示す。５つの画像の左端は、組織マイクロアレイ（スケールバー、２００μｍ）からのコアを示す。５つの画像内の中央の列は、２つの画像を示し、その上部は小さな視野（スケールバー、１０μｍ）であり、その下部は、上部の画像において白いボックスで示された領域にズームする（スケールバー、２．５μｍ）。５つの画像内の右列は、中央列と同じ視野を示すが、膨張後である（黄色のスケールバー、上１０〜１２．５μｍ、下２．５〜３．１μｍ：膨張後の物理的サイズ、上５０μｍ、下１２．５μｍ；膨張係数４．０〜５．０ｘ、詳細については表２を参照）。試料をＤＡＰＩおよび複数の抗体で染色した。青、ＤＡＰＩ；緑、ビメンチン；赤、ＫＲＴ１９。
【図３Ａｉ−３Ｌ】図３Ａ〜図３Ｌは、ヒト組織の膨張成功に影響を及ぼす条件を示す。（Ａ）ＤＡＰＩ（灰色）およびビメンチン（緑色）およびＡＣＴＡ４（赤色）に対する抗体で染色されたヒト皮膚試料の画像。試料を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含有する８単位／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液で、６０℃にて０．５時間（ｉ−ｉｉｉ）または２時間（ｉｖ−ｖｉ）消化した。（ｉおよびｉｖ）０．５時間（ｉ）または２時間（ｉｖ）の消化後の、ＰＢＳ緩衝液中のヒト皮膚−ヒドロゲルハイブリッド試料の写真；（ｉｉ）（ｉ）の試料からの膨張前広視野蛍光画像。（ｉｉｉ）（ｉ）の試料からの膨張後広視野蛍光画像であり、破線のオレンジ色のボックスは、膨張後の、ＤＡＰＩチャネルにおける自己蛍光および歪んだビメンチンネットワークを伴う領域を強調する。（ｖ）（ｉｖ）の試料については、（ｉｉ）と同じ。（ｖｉ）（ｉｖ）の試料について（ｉｉｉ）と同じであり、破線のオレンジ色のボックスは、ＤＡＰＩチャネルにおいて自己蛍光がある領域を強調する。（Ｂ）２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含有する８単位／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液で、６０℃にて０．５時間（ｉ−ｉｉｉ）および２時間（ｉｖ−ｖｉ）、試料を消化したことを除き、（Ａ）と同様。（Ｃ）１ｍＭ  ＥＤＴＡに基づくプロトコールで消化したヒト肝臓試料の写真（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含有する８単位／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液、６０℃にて０．５時間および２時間）。（Ｄ）２５ｍＭ  ＥＤＴＡに基づくプロトコールで消化したヒト肝臓試料の写真（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４Ｍ  ＮａＣｌを含有する８単位／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液、６０℃にて０．５時間および２時間）。（Ｅ）ＤＡＰＩ（灰色）およびＡＣＴＡ４に対する抗体（赤）で染色したヒト肝臓試料の膨張前広視野蛍光画像。同じものを１ｍＭ  ＥＤＴＡに基づくプロトコールで１時間消化した。（Ｆ）Ｅと同じ試料の膨張後広視野蛍光画像。白い破線は、歪みによって生じる焦点外領域を示す。（Ｇ）ＤＡＰＩ（灰色）およびＡＣＴＡ４に対する抗体（赤）で染色したヒト肝臓試料の膨張前広視野蛍光画像。試料を２５ｍＭ  ＥＤＴＡに基づくプロトコールで０．５時間消化した。（Ｈ）Ｇと同じ試料の膨張後広視野蛍光画像。（Ｉ）ＤＡＰＩ（青）およびビメンチンに対する抗体（緑）で染色し、１ｍＭ  ＥＤＴＡに基づくプロトコールで３時間処理した、浸潤乳癌があるヒトリンパ節組織の膨張後共焦点画像。（Ｊ）２５ｍＭ  ＥＤＴＡに基づくプロトコールで処理した、Ｉと同じ組織の膨張後共焦点画像。（Ｋ）インシトゥ重合の前に、アセトンで固定し、コラーゲンＩＶに対する抗体で染色し、０．１ｍｇ／ｍＬのアクリロイル−Ｘで処理した正常ヒト腎臓組織の膨張後共焦点画像。亀裂を白い矢印で示す。（Ｌ）インシトゥ重合の前に０．０３ｍｇ／ｍＬのアクリロイル−Ｘで処理した、Ｋと同じ試料��膨張後共焦点画像。スケールバー：Ａｉｉおよびｉｉｉ、９．２μｍ（物理的サイズ：４０μｍ、膨張係数：４．３３）。Ａｖおよびｖｉ、９．４μｍ（物理的サイズ：４０μｍ、膨張係数：４．２８）。Ｂｉｉおよびｉｉｉ、９μｍ（物理的サイズ：４０μｍ、膨張係数：４．４１）。Ｂｖおよびｖｉ、８．９μｍ（物理的サイズ：４０μｍ、膨張係数：４．５１）。ＥおよびＦ、１１９μｍ（物理的サイズ：５００μｍ、膨張係数：４．２２）；ＧおよびＨ、１０９μｍ（物理的サイズ：５００μｍ、膨張係数：４．５８）。（Ｉ〜Ｌ）４０μｍ、物理的サイズ。
【図４】膨張処理の前後の良性乳房病変ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドの代表的画像。膨張後の画像について、青：ＤＡＰＩ、緑：ビメンチン、赤：Ｈｓｐ６０（ミトコンドリア）。スケールバー：左上、１５μｍ；右上、６５μｍ；左下、２．５μｍ；右下、１２μｍ。
【図５Ａ−５Ｇ】臨床的に意義のあるナノスケール変化のＥｘＰａｔｈ分析：腎臓ポドサイトの足突起消失。（Ａ）スピニングディスク共焦点顕微鏡で取得し、ＤＡＰＩならびに複数の抗体で染色した、糸球体の一部を示す正常ヒト腎臓試料の膨張前共焦点画像。青、ビメンチン；緑、アクチニン−４；赤、コラーゲンＩＶ；灰色、ＤＡＰＩ。オレンジ色の破線は、Ｃでラインカット（ｌｉｎｅ  ｃｕｔ）が分析される場所を示す。（Ｂ）同じ顕微鏡での同じ試料のＥｘＰａｔｈ画像。赤の破線は、Ｃでラインカット（ｌｉｎｅ  ｃｕｔ）が分析される場所を示す。（Ｃ）（Ａ）および（Ｂ）のオレンジおよび赤の破線に沿ったアクチニン−４強度のプロファイル。（Ｄ）正常ヒト腎臓由来の臨床生検試料の電子顕微鏡写真。挿入図、黒色のボックス（破線）により囲まれた領域へのズームイン；挿入図内の破線は、以下でラインカット（ｌｉｎｅ  ｃｕｔ）が分析される場所を示す。以下、挿入図のラインカット（ｌｉｎｅ  ｃｕｔ）に沿った電子顕微鏡写真フィーチャ強度（ｆｅａｔｕｒｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）。（Ｅ）（Ｄ）で分析し、（Ａ）のように染色した同じ患者からの臨床腎生検試料のＥｘＰａｔｈ画像。青、ビメンチン；緑、アクチニン−４；赤、コラーゲンＩＶ；灰色、ＤＡＰＩ。挿入図、白色ボックス（破線）により囲まれた領域へのズームイン；挿入図内の破線は、以下でラインカット（ｌｉｎｅ  ｃｕｔ）が分析される場所を示す。以下、挿入図のラインカット（ｌｉｎｅ  ｃｕｔ）に沿ったアクチニン−４の強度。（Ｆ）Ｄと同様であるが、ＭＣＤの患者の場合。（Ｇ）Ｅと同じであるが、Ｆと同じ患者に対するもの。スケールバー：（Ａ）５μｍ、（Ｂ）５μｍ（膨張後の物理的サイズ、２３．５μｍ；膨張係数：４．７）、（Ｄ）１μｍ；挿入図、２００ｎｍ、（Ｅ）１μｍ（膨張後の物理的サイズ、４．３μｍ；膨張係数：４．３）；挿入図、２００ｎｍ、（Ｆ）１μｍ、挿入図、２００ｎｍ、（Ｇ）１μｍ（膨張後の物理的サイズ、４．２μｍ；膨張係数：４．２）；挿入図、２００ｎｍ。
【図６Ａ．６Ｂ】図６Ａおよび図６Ｂは、熱処理によりヒト腎臓試料においてアクチニン−４の免疫染色が改善されることを示す。（Ａ）クエン酸緩衝液中での熱処理ありまたはなしでの、ヒト腎臓切片の広視野蛍光画像。（Ｂ）左パネルの破線の黄色長方形により示される領域に対応するズームイン領域。スケールバー：１ｍｍ（Ａ）、２００μｍ（Ｂ）。
【図７Ａ−７Ｈ】図７Ａ〜図７Ｈは、抗アクチニン−４が三次ポドサイト足突起を特異的に染色することを示す。（Ａ〜Ｄ）ＤＡＰＩおよび抗体で染色したヒト腎臓切片の膨張後広視野画像。青、ビメンチン；緑、アクチニン−４；赤、シナプトポジン；灰色、ＤＡＰＩ。（Ｅ）（Ａ〜Ｄ）の合成画像。（ＦおよびＧ）ＢおよびＣにおける白い破線の四角から取ったものと同じ試料からの、アクチニン−４（Ｆ）およびシナプトポジン（Ｇ）チャネルにおける拡大領域。（Ｈ）ＦおよびＧの白色破線カットに沿って取った、蛍光強度のプロファイル。緑、アクチニン−４赤、シナプトポジン。スケールバー：１μｍ（４．５μｍ物理的サイズ、膨張係数４．５）。
【図８Ａ−８Ｈ】腎臓ＦＦＰＥ試料の免疫染色画像。（Ａ）クエン酸抗原回復法（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で処理した正常ヒト腎臓ＦＦＰＥ試料の膨張後広視野画像。（Ｂ）ズームインした拡大領域（囲み線）。（Ｃ）Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ抗原回復法（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．０）で処理した正常ヒト腎臓ＦＦＰＥ試料の膨張後広視野画像。（Ｄ）ズームインした拡大領域（囲み線）。（Ｅ）クエン酸抗原回復法で処理した正常ヒト腎臓ＦＦＰＥ試料の膨張後共焦点画像。（Ｆ）ズームインした拡大領域（囲み線）。（Ｇ）クエン酸抗原回復法で処理したヒト腎臓微小変化型疾患ＦＦＰＥ試料の膨張後共焦点画像。（Ｈ）ズームインした拡大領域（囲み線）。全試料をＤＡＰＩ（灰色）およびビメンチン（青）、アクチニン−４（緑）およびＩＶ型コラーゲン（赤）に対する抗体で染色した。スケールバー：（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）および（Ｇ）、４０μｍ。（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）および（Ｈ）、８μｍ。
【図９Ａ−９Ｃ】ＥｘＰａｔｈは、初期乳房病変におけるコンピュータ診断を大幅に改善する。（Ａ）自動セグメンテーションフレームワーク：画像前処理および核セグメンテーションパイプラインの段階：ローリングボール補正を用いたノイズ除去→ヒストグラム平坦化によるコントラスト強調→最小誤差しきい値処理による核セグメンテーション→マルチスケールラプラシアンガウシアン（Ｌａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎ）（ＬｏＧ）フィルターによる種子検出→マーカーコントロール付きウォーターシェッドによる核分割。（Ｂ）核のコンピュータ検出およびセグメンテーションは、膨張前試料と比較した場合、膨張試料において有意により正確である：非定型乳管過形成（ＡＤＨ）の例；緑、真の陽性；赤、偽陰性；青、偽陽性）。（Ｃ）分類モデルは、Ｌ１正規化ロジスティック回帰（ＧＬＭＮＥＴ分類器）を用いて構築した。分類精度は、相互検証における分類モデルによって達成される受信者動作曲線下面積（ＡＵＣ）として測定した。ＥｘＰａｔｈは、初期の乳房新生物病変の自動診断を改善する：発明者らは、正常、良性および侵襲前悪性乳房疾患のコンピュータ鑑別のための、膨張前Ｈ＆Ｅおよび膨張画像の両方において、この画像分類フレームワークを適用した。両データセットは、３６枚の正常乳房組織画像、３１枚の良性乳房組織画像（１５枚のＵＤＨおよび１６枚のＡＤＨ）および３８枚の非侵襲性乳癌組織画像（ＤＣＩＳ）を含有する１０５枚の画像からなる。平均膨張係数：４．８（ＳＤ：０．３）。＊Ｐ＜０．０５、ブートストラップ対応のあるｔ検定。各バイナリ比較のためのＰ値：正常対ＵＤＨ（０．１７）；正常対ＡＤＨ（０．３４）；正常対ＤＣＩＳ（０．２４）；ＵＤＨ対ＡＤＨ（０．０２）；ＵＤＨ対ＤＣＩＳ（０．０１）；ＡＤＨ対ＤＣＩＳ（０．２４）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
光学的にではなく物理的に拡大することによって、細胞および組織試料を画像化するための方法および組成が提供される。参照により本明細書中に組み込まれる２０１５年２月２０日に提出された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／１６７８８号は、「膨張顕微鏡法（ＥｘＭ）」と呼ばれる工程である、物理的に標本を膨張させることによって、従来の光学顕微鏡の解像度を４〜５倍向上させ得ることを教示する。簡潔に述べると、生物標本を膨潤性ヒドロゲル材料に埋め込み、生得の生物学的ネットワークを破壊するための処理に供し、次いで膨張させる。ＥｘＭの利点としては、組織透明化、解像度向上およびｚ軸における標本膨張によるセクショニングエラー（ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ  ｅｒｒｏｒ）に対するより高い許容度が挙げられる。しかし、ＥｘＭ工程は、物理的膨張の倍単位の増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｆｏｌｄ）に制限され、その点で、ある試料から次への膨張度は一致しなかった。
【００１０】
本発明は、ナノスケールの精度および分子同一性を有する臨床生検試料の光学的照合のための単純で多目的な方法である膨張病理学法（ＥｘＰａｔｈ）を提供する。ＥｘＰａｔｈは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および／または新鮮凍結組織標本を含む病理学において現在使用される臨床試料の大部分を処理可能であり、したがって従来の実験室で見られるものを超えるハードウェアは必要なく、ナノスケールのイメージングが可能となる。ＥｘＰａｔｈは、多岐にわたる組織型でよく機能し、ナノスケール病理を示すことが知られている疾患の診断においてすぐに臨床応用される。
【００１１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「１つ以上」を意味すると定義され、文脈により別段の明確な指示がない限り、複数を含む。任意の要素がある場合にそれを排除するよう、特許請求の範囲が立案され得ることにさらに留意されたい。そのようなものとして、この記述は、特許請求の範囲の要素と関連して「専ら」、「単なる」のような排他的な用語の使用または「ネガティブな」制限の使用に対する前提となるものとする。本開示を読めば当業者にとって明らかとなるであろうように、本明細書中に記載され、示される個々の実施形態のそれぞれは、本教示の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の何れかの特性から容易に分離され得るかまたはそれらと組み合わせられ得る個別の要素および特性を有する。引用される何れの方法も、引用される事象の順序で、または論理的に可能である任意の他の順序で実施され得る。
【００１２】
本開示を読めば当業者にとって明らかとなるであろうように、本明細書中に記載され、示される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の何れかの特性から容易に分離され得るかまたはそれらと組み合わせられ得る個別の要素および特性を有する。引用される何れの方法も、引用される事象の順序で、または論理的に可能である任意の他の順序で実施され得る。
【００１３】
本発明は、膨張生物標本を調製するための方法を提供する。膨張生物標本は、顕微鏡分析に適している。「顕微鏡分析」とは、肉眼では見ることができない、すなわち通常の眼の解像度範囲内にない標本の態様の可視化を提供する任意の技術を用いた標本の分析を意味する。「膨張生物標本を調製する」とは、一般に、生物標本が、本明細書中に記載の方法に曝露される前の標本と比較して、物理的に膨張または拡大されることを意味する。生体試料を膨張させることは、重要な生体分子をポリマーネットワークに結合させ、例えば係留し、ポリマーネットワークを膨潤させるかまたは膨張させ、それにより、以下でさらに記載するように生体分子を引き離すことによって達成され得る。生体分子がポリマーネットワークに係留される場合、ポリマーネットワークの等方性膨張が生体分子の空間的配向を保持し、その結果、膨張または拡大生物標本が得られる。
【００１４】
一実施形態において、膨張性生物標本を調製するための方法は、試料を、試料内の生体分子に結合する巨大分子と接触させ；二官能性架橋剤で標本を処理し；膨潤性ポリマーの前駆体を標本に浸透させ；この前駆体を重合させて標本内で膨潤性ポリマーを形成させ；生体分子を膨潤性ポリマーに係留し；金属イオンキレート剤、非イオン性界面活性剤および一価塩を含む緩衝液中で非特異的プロテアーゼとともに試料を温置する段階を含む。膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、膨潤性ポリマーを膨潤させることによって、膨張性生物標本を膨張させ得る。一実施形態において、接触段階前に、当業者にとって公知であり、以下にさらに記載されるような任意の適切な抗原回復工程に試料を供する。一実施形態において、本方法は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに標本を温置することを含む。一実施形態において、試料を約５０℃〜約７０℃で約０．５〜約３時間温置する。
【００１５】
一実施形態において、膨張性生物標本を調製するための方法は、二官能性架橋剤で標本を処理し；膨潤性ポリマーの前駆体を標本に浸透させ；この前駆体を重合させて標本内で膨潤性ポリマーを形成させ；金属イオンキレート剤、非イオン性界面活性剤および一価塩を含む緩衝液中で非特異的プロテアーゼとともに標本を温置する段階を含む。一実施形態において、本方法は、試料を、試料内の生体分子に結合する巨大分子と接触させる段階をさらに含み得る。一実施形態において、本方法は、生体分子を膨潤性ポリマーに係留する段階をさらに含み得る。膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させて、膨潤性ポリマーを膨潤させることによって、膨張性標本を膨張させ得る。一実施形態において、処理段階前に、当業者にとって公知であり、以下にさらに記載されるような任意の適切な抗原回復工程に試料を供する。一実施形態において、本方法は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤；約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤；および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに標本を温置することを含む。一実施形態において、試料を約５０℃〜約７０℃で約０．５〜約３時間温置する。
【００１６】
一実施形態において、膨潤性材料中に埋め込まれた生物標本を膨張させるための方法。一実施形態において、標本は、本明細書中でさらに記載のように、膨潤性材料埋め込み生物標本である。本方法は、金属イオンキレート化剤、非イオン性界面活性剤および一価塩を含む緩衝液中で非特異的プロテアーゼとともに標本を温置し；溶媒または液体と膨潤性ポリマーを接触させて、膨潤性ポリマーを膨潤させることを含む。一実施形態において、本方法は、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤；約０．１％〜約１．０％非イオン性界面活性剤；および約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中で約１〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼとともに標本を温置することを含む。一実施形態において、試料を約５０℃〜約７０℃で約０．５〜約３時間温置する。
【００１７】
「生物標本」または「生体試料」という用語は、本明細書中では広義に使用され、核酸を含有し、固定され得る供給源を含むことが意図される。代表的な生体試料としては、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腸、胸腺、結腸、扁桃腺、精巣、皮膚、脳、心臓、筋肉および膵臓組織が含まれるが限定されない組織が挙げられるが限定されない。他の代表的な生体試料としては、生検、骨髄試料、臓器試料、皮膚断片および生物が挙げられるが、限定されない。臨床または法医学の状況から得られた材料もまた、生体試料という用語の意図された意味の範囲内である。一実施形態において、試料は、ヒト、動物または植物由来である。一実施形態において、生体試料は組織試料、好ましくは臓器組織試料である。一実施形態において、試料はヒトである。試料は、例えば、剖検、生検から、または外科手術から得られ得る。これは、例えば、実質組織、結合組織または脂肪組織、心臓または骨格筋、平滑筋、皮膚、脳、神経、腎臓、肝臓、脾臓、乳房、癌腫（例えば、腸、上咽頭、乳房、肺、胃など）、軟骨、リンパ腫、髄膜腫、胎盤、前立腺、胸腺、扁桃腺、臍帯または子宮などの個体組織であり得る。組織は、腫瘍（良性または悪性）、癌性または前癌性組織であり得る。試料は、疾患または他の病態に罹患しているか、またはそれが疑われるか（正常または病的）、または正常もしくは健康とみなされる、動物またはヒト対象から得られ得る。本明細書中で使用される場合、「固定された生体試料」という用語は、細胞不含試料、例えば細胞抽出物を明白に除外し、ここでは細胞からの細胞質および／または核成分が単離される。
【００１８】
本明細書中に記載の方法およびシステムとともに使用するのに適した組織標本としては、一般に、生きているかまたは死んだ対象から回収した任意のタイプの組織標本、例えば生検標本および剖検標本が挙げられる。組織標本は、本明細書中に記載の方法およびシステムを用いて回収および処理され得、処理直後に顕微鏡解析に供され得るか、または保存され、将来、例えば長期間保存後に顕微鏡解析に供され得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の方法を使用して、将来の解析のために、安定でアクセス可能で完全に無傷の形態で組織標本を保存し得る。例えば、ヒト脳組織標本などの組織標本は、上記のように処理され、例えば脂質などの複数の細胞成分を除去するために透徹され、次いで将来の解析のために保存され得る。
【００１９】
保存または固定されている組織は、生物医学的手順におけるタンパク質の検出可能性を低下させ得る様々な化学修飾を含有する。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の方法およびシステムを使用して、既に保存されているかまたは保存された組織標本を解析し得る。以前に保存された組織標本としては、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および／または新鮮凍結組織標本を含む病理学で使用される臨床試料が挙げられる。以前に保存された試料にカバースリップがある場合、カバースリップを除去するべきである。封入剤を除去するために試料を処理する。このような、封入剤を除去するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、試料をキシレンで処理して、パラフィンまたは他の疎水性封入剤を除去する。あるいは、試料が水ベースの封入剤中で載置される場合、試料を水で処理する。次いで、試料を再水和させ、抗原回復に供する。「抗原回復」という用語は、エピトープ遮蔽状態から元に戻し、エピトープ−抗体結合を回復させる任意の技術を指し、これは例えば、酵素誘導エピトープ回復、熱誘導エピトープ回復（ＨＩＥＲ）またはタンパク質分解誘導エピトープ回復（ＰＩＥＲ）などであるが限定されない。例えば、抗原回復処理は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ならびに市販の標的回復溶液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）などの中で行い得る。
【００２０】
「生体分子」とは、一般に、組織または細胞内のタンパク質、脂質、ステロイド、核酸および細胞内構造を意味するが、限定されない。
【００２１】
「巨大分子」とは、標本内の生体分子を標的とするタンパク質、核酸または小分子を意味する。これらの巨大分子は、標本内の生体分子を検出するため、および／または生体分子を膨潤性ポリマーに係留するために使用される。例えば、特定の細胞生体分子、例えばタンパク質、脂質、ステロイド、核酸などおよび細胞内構造の可視化を促進する巨大分子が提供され得る。いくつかの実施形態において、巨大分子は診断用である。いくつかの実施形態において、巨大分子は予後判定用である。いくつかの実施形態において、巨大分子は、治療に対する応答性を予測する。いくつかの実施形態において、巨大分子は、スクリーニング、例えば疾患の診断および／または予後判定、疾患の処置などにおいて支援する薬剤に対するスクリーニングなどにおける候補薬物である。
【００２２】
一例として、標本は、顔料または免疫蛍光による直接または間接的の何れかの標識のための、特定の細胞生体分子に特異的であり、それと結合する、１つ以上のポリペプチド巨大分子、例えば抗体、標識されるペプチドなどと接触させ得る。免疫蛍光法とは、細胞内の特異的タンパク質または他の分子を標識するために、抗体の、その抗原または結合パートナーへの非常に特異的な結合を使用する技術を意味する。関心のある生体分子に特異的な一次抗体で試料を処理する。フルオロフォアは、一次抗体またはペプチドに直接複合化され得る。あるいは、一次抗体に特異的に結合する検出部分またはフルオロフォアに複合化される二次抗体を使用し得る。標的細胞生体分子に特異的であり、フルオロフォアまたは他の検出部分と複合化されるペプチドも使用し得る。
【００２３】
巨大分子として提供され得る薬剤のクラスの別の例は、核酸である。例えば、関心のある遺伝子の転写産物に相補的であり、それと特異的にハイブリッド形成するアンチセンスＲＮＡと標本を接触させて、例えば標本の細胞中の遺伝子発現を試験し得る。別の例として、例えば遺伝子突然変異、例えばヘテロ接合性の喪失、遺伝子重複、染色体逆位などを研究するために、関心のあるゲノム材料に相補的であり、それと特異的にハイブリッド形成するＤＮＡと標本を接触させ得る。ハイブリッド形成するＲＮＡまたはＤＮＡは、検出部分、すなわち直接的または間接的の何れかで顕微鏡で可視化され得る薬剤と複合化される。インシトゥハイブリッド形成技術の例は、例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ．インシトゥハイブリッド形成：発生生物学および医学への応用（Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０；および蛍光インシトゥハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）応用ガイド（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ）．Ｌｉｅｈｒ，Ｔ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  １９９０で見ることができる。
【００２４】
一実施形態において、生体試料を検出可能な標識で標識またはタグ付加し得る。一般的には、標識またはタグは、試料の生体分子またはその成分に化学的に結合する（例えば、共有結合、水素結合またはイオン結合）。検出可能な標識は、抗体または他の標的特異的結合剤で達成され得るように、特異的な標的（例えばバイオマーカーまたは分子のクラス）に対して選択的であり得る。検出可能な標識は、色素または蛍光分子に典型的であるように、可視成分を含み得るが；しかし、標識によって使用される任意のシグナル伝達手段も企図される。例えば蛍光標識された生体試料は、顕微鏡解析を支援するために、免疫蛍光、免疫組織化学または免疫細胞化学染色などであるが限定されない技術を通じて標識される生体試料である。一実施形態において、検出可能な標識は、生体試料またはその標的成分に化学的に結合される。一実施形態において、検出可能な標識は、抗体および／または蛍光色素であり、この抗体および／または蛍光色素は、標本を膨潤性ポリマー、例えば膨潤性ヒドロゲルに連結または架橋する物理的、生物学的または化学的アンカーまたは部分をさらに含む。標識された試料は、さらに、複数の標識を含み得る。例えば、各標識は、特定のまたは識別可能な蛍光特性、例えば識別可能な励起および発光波長を有し得る。さらに、各標識は、試料中の特異的で識別可能な標的または試料の成分に対して選択的である異なる標的特異的結合剤を有し得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、二官能性架橋剤は、試料内の生体分子上の官能基に対する反応基（例えば一級アミンまたはスルフヒドリル）を含む。二官能性架橋剤は、膨潤性ポリマー官能基で生体分子のアミン基を化学的に修飾するために使用され、これにより、試料内の抗体および他の内在性生体分子を膨潤性ポリマーに直接係留するかまたはこれに組み込むことが可能になる。一実施形態において、二官能性架橋剤はヘテロ二官能性架橋剤である。ヘテロ二官能性架橋剤は、スペーサーアームの何れかの末端に異なる反応基を保持し、すなわち原子、スペーサーまたはリンカーがこれらの反応基を分離する。これらの試薬は、それぞれの標的官能基を有する分子の１段階複合化を可能にするだけでなく、望ましくない重合または自己複合化を最小限にする連続的（２段階）複合化も可能にする。
【００２６】
一実施形態において、二官能性架橋剤は、タンパク質反応性化学部分およびゲル反応性化学部分（すなわち、膨潤性ポリマー反応性化学部分）を含む。タンパク質反応性化学基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、チオール、アミン、マレイミド、イミドエステル、ピリジルジチオール、ヒドラジド、フタルイミド、ジアジリン、アリールアジド、イソシアナートまたはカルボン酸が挙げられるが限定されず、これらは例えば、タンパク質またはペプチド上のアミノまたはカルボン酸基と反応させ得る。一実施形態において、タンパク質反応性基としては、Ｎ−スクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、カルボン酸またはチオールが挙げられるが限定されない。ゲル反応基としては、ビニルまたはビニルモノマー、例えばスチレンおよびその誘導体（例えばジビニルベンゼン）、アクリルアミドおよびその誘導体、ブタジエン、アクリロニトリル、酢酸ビニルまたはアクリラートおよびアクリル酸誘導体などが挙げられるが限定されない。
【００２７】
一実施形態において、任意の膨潤性ポリマーにタンパク質を直接係留するための化学物質は、６−（（アクリロイル）アミノ）ヘキサン酸のスクシンイミジルエステル（アクリロイル−Ｘ、ＳＥ；略語「ＡｃＸ」；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。ＡｃＸでの処理によって、アクリルアミド官能基を有するタンパク質上のアミンが修飾される。アクリルアミド官能基によって、タンパク質がインシトゥで合成されるときに膨潤性ポリマーに係留されるようになる。
【００２８】
一実施形態において、関心のある試料のタンパク質は、クリック化学を使用して、個別の段階でタンパク質反応基およびゲル反応基により修飾され得る。タグ付加とも呼ばれるクリック化学は、選択基質を特異的な生体分子と連結することを第一に目的とする生体適合性反応のクラスである。この方法において、クリック基を含むタンパク質反応基で関心のある試料のタンパク質を処理し、次いで相補的クリック基を含むゲル反応基で処理する。相補的な基としては、アジド基および末端アルキンが挙げられるが限定されない（例えば、参照により本明細書中で組み込まれる、Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ；Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ；Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（２００１）．”クリック化学：数個の良好な反応からの多様な化学的機能（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｄｉｖｅｒｓｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｆｅｗ  Ｇｏｏｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）”．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．４０（１１）：２００４−２０２１を参照）。
【００２９】
生物標本は、膨潤性ポリマー中に埋め込まれる。「膨潤性ポリマー」とは、水または他の溶媒などの液体と接触したときに膨張する３次元（３Ｄ）ポリマーネットワークを形成するために、架橋または「重合」され得る親水性モノマー、プレポリマーまたはポリマーを意味する。例えば、重合可能なエチレン的に不飽和である基を含有する水溶性基からなる群から選択されるモノマーなど、１つ以上の重合性材料、モノマーまたはオリゴマーを使用し得る。モノマーまたはオリゴマーは、そのジビニル架橋剤（例えば、Ｎ，Ｎ−アルキレンビスアクリルアミド）を含め、１つ以上の置換または非置換メタクリラート、アクリラート、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルアルコール、ビニルアミン、アリルアミン、アリルアルコールを含み得る。前駆体は、重合開始剤および架橋剤も含み得る。
【００３０】
一実施形態において、膨潤性材料は３次元で均一に膨張する。追加的または代替的に、材料は、膨張時に光が試料を通過し得るように透明である。一実施形態において、膨潤性ポリマーは膨潤性ヒドロゲルである。一実施形態において、膨潤性材料は、その前駆体からインシトゥで形成される。
【００３１】
「膨潤性ポリマーの前駆体」、「ヒドロゲルサブユニット」または「ヒドロゲル前駆体」とは、３次元（３Ｄ）ヒドロゲルネットワークを形成するために架橋または「重合」され得る親水性モノマー、プレポリマーまたはポリマーを意味する。一実施形態において、膨潤性ポリマーは多価電解質である。一実施形態において、膨潤性ポリマーは、ポリアクリラートまたはポリアクリルアミドおよびそれらのコポリマーまたは架橋コポリマーである。
【００３２】
科学的な理論に縛られるものではないが、ヒドロゲルサブユニットの存在下での生物標本のこの固定は、標本の生体分子をヒドロゲルサブユニットに架橋させ、それにより、組織構造および細胞形態を保存して、分子成分を適所に固定すると考えられる。
【００３３】
膨潤性ポリマーの前駆体は、膨潤性材料の前駆体を試料に浸透させるか、灌流するか、注入するか、浸漬させるか、試料に添加するかまたは他の方法で混合することを含むが限定されない、任意の都合のよい方法によって、生物標本に送達させ得る。このようにして、生物標本は、標本全体で生体分子と生体分子との間およびその周囲を流動する膨潤性物質の前駆体で飽和される。
【００３４】
標本に浸透させた後、膨潤性ポリマー前駆体を重合させ、すなわち、共有結合によるかまたは物理的に架橋させて、ポリマーネットワークを形成させる。ポリマーネットワークは、標本内および標本全体にわたり形成される。このようにして、生物標本は、標本全体で生体分子と生体分子との間およびその周囲を流動する膨潤性物質で飽和される。
【００３５】
重合は、熱架橋、化学的架橋、物理的架橋、イオン架橋、光架橋、照射架橋（例えば、Ｘ線、電子ビーム）などを含むが限定されない任意の方法によるものであり得、使用されるヒドロゲルタイプおよび当技術分野での知識に基づいて選択され得る。一実施形態において、ポリマーはヒドロゲルである。重合されると、ポリマー埋め込み生物標本が形成される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載のような試料全体にわたり灌流された膨潤性ポリマーに係留されるネイティブタンパク質は、ＥｘＭの非特異的タンパク質分解を改変型のゲル化後均質化処理で置き換える場合、エピトープ官能性を保持し、膨張後に標識化され得る。このようなアプローチは、ネイティブ組織の濃密な環境において抗体を送達することに伴う制限を克服し得る。
【００３７】
標本の超微細構造を物理的に支持する膨潤性ポリマーに試料を埋め込むことによって、この技術は、ポリマーネットワークにより固定されたその３次元分布で生体分子（例えば、標本中のタンパク質、小ペプチド、小分子および核酸）を保つ。標本の破壊的切片化を回避することにより、細胞内構造を分析し得る。さらに、標本は反復的に染色され、脱色され、包括的な分析のために他の試薬で再染色され得る。
【００３８】
生体試料を膨潤性ポリマーに係留した後、標本に対して内在性生体分子（または生体試料の物理的構造）の破壊を行うが、標的生体分子の情報を保つ巨大分子、例えば標識またはタグはインタクトであり、膨潤性ポリマーに係留されたままである。このようにして、標本−膨潤性ポリマー複合体の機械的特性がより空間的に均一になり、より大きくより一貫した等方性膨潤が可能になる。
【００３９】
標本または生物標本の内在性の生体分子の内在性物理的構造の破壊は、一般的に、膨張に抵抗しないような、試料の機械的、物理的、化学的、生化学的または酵素による消化、破壊または分解を指す。一実施形態において、非特異的プロテアーゼを用いて、試料−膨潤性ポリマー複合体を均質化する。
【００４０】
一実施形態において、非特異的プロテアーゼは、約４〜約１２のｐＨを有する緩衝液中にある。Ｔｒｉｓ、クエン酸、リン酸、重炭酸、ＭＯＰＳ、ホウ酸、ＴＡＰＳ、ビシン、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳおよびＭＥＳを含むが限定されない任意の適切な緩衝剤を使用し得る。一実施形態において、緩衝液は、非特異的プロテアーゼ、金属イオンキレート剤、非イオン性界面活性剤および一価塩を含む。一実施形態において、緩衝液は、約１Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤、約０．１％〜約１．０％の非イオン性界面活性剤および約０．０５Ｍ〜約１Ｍの一価塩を含む。一実施形態において、試料を緩衝液中で約５０℃〜約７０℃にて約０．５〜約３時間温置する。一実施形態において、試料が完全に消化されるまで、試料を緩衝液中で温置する。
【００４１】
非特異的プロテアーゼは、当業者にとって周知である。非特異的プロテアーゼとしては、プロテイナーゼＫ、サブチリシン、ペプシン、サーモリシンおよびエラスターゼが挙げられるが限定されない。一実施形態において、緩衝液は、約１Ｕ／ｍＬ〜約１００Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼを含む。一実施形態において、緩衝液は、約１Ｕ／ｍＬ〜約５０Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼを含む。一実施形態において、緩衝液は、約１Ｕ／ｍＬ〜約２５Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼを含む。一実施形態において、緩衝液は、約１Ｕ／ｍＬ〜約１０Ｕ／ｍＬの非特異的プロテアーゼを含む。
【００４２】
キレート剤は、当業者にとって周知である。キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＤＨＡ、ＥＤＤＳ、ＢＡＰＴＡおよびＤＯＴＡが挙げられるが限定されない。一実施形態において、緩衝液は約５ｍＭ〜約１００ｍＭの金属イオンキレート剤を含む。一実施形態において、緩衝液は約５ｍＭ〜約７５ｍＭの金属イオンキレート剤を含む。一実施形態において、緩衝液は約５ｍＭ〜約５０ｍＭの金属イオンキレート剤を含む。
【００４３】
非イオン性界面活性剤は、当業者にとって周知である。非イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ソルビタン、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ＰＥＧ、デシルグルコシド、デシルポリグルコースおよびコカミドＤＥＡが挙げられるが限定されない。一実施形態において、緩衝液は約０．１％〜約１．０％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．１％〜約０．７５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．１％〜約０．５％の非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．１％〜約０．３％の非イオン性界面活性剤を含む。
【００４４】
一価カチオン塩は、当業者にとって周知である。一価カチオン塩は、Ｎａ＋、Ｋ＋、アンモニウムおよびＣｓ＋を含むが限定されない陽イオンを含有する。一実施形態において、緩衝液は約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．７５Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの一価塩を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．１Ｍ〜約０．７Ｍの一価塩を含む。一実施形態において、緩衝液は約０．０５Ｍ〜約０．８Ｍの一価塩を含む。
【００４５】
破壊は膨潤性ポリマーの構造に影響を与えないが、標本の構造を破壊することが好ましい。したがって、標本破壊は、膨潤性ポリマーに対して実質的に不活性であるべきである。消化の程度は、標本の機械的構造の完全性を損なうのに十分であり得るか、または標本−膨潤性ポリマー複合体が実質的に試料不含となる程度まで完全であり得る。
【００４６】
次いで、例えば、膨潤性ポリマーを溶媒または液体と接触させ、次いで膨潤性ポリマーによってそれが吸収され、膨潤を引き起こすことによって、標本−膨潤性ポリマー複合体を膨張させる。膨潤性ポリマーが水膨潤性である場合、水溶液を使用し得る。膨潤性ポリマーの膨潤の結果、標本自体が膨張する（例えばより大きくなる）。これは、ポリマーが標本全体に埋め込まれているからであり、したがって、ポリマーが膨潤（拡大）するにつれてそれが膨張し、係留された生体分子がそれぞれから引き離される（すなわち遠ざかる）からである。一実施形態において、膨潤性ポリマーは等方的に膨張（膨潤）し；したがって係留された生体分子は、標本内の相対的な空間的配向を保持する。
【００４７】
膨潤生物標本−ポリマー複合体は、任意の光学顕微鏡で画像化し得、古典的な回折限界以下で有効なイメージング性をもたらす。得られた標本は透明であり得るので、体積が大きく広い視野が可能なカスタム顕微鏡、３Ｄ走査もまた、膨張試料と一緒に使用され得る。この方法はまた、検出可能な標識の増幅を含む任意の段階も提供する。
【００４８】
記載の方法、試薬、キット、システムおよび装置を使用して、当業者は、顕微鏡解析のための任意の生物標本を調製可能である。トランスジェニック動物、例えば脊椎動物または無脊椎動物、例えば昆虫、蠕虫、ツメガエル、ゼブラフィッシュ、哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、げっ歯類、非ヒト霊長類またはヒトを含むが限定されない任意の植物または動物から標本を調製するために、方法、試薬、キット、システムおよび装置を使用し得る。組織標本は、生きている対象（例えば生検試料）から回収され得るか、または死亡した対象（例えば、剖検または剖検試料）から回収され得る。標本は、あらゆる組織型であり得、例えば造血性、神経（中枢または末梢）、グリア、間葉系、皮膚、粘膜、間質性、筋肉（骨格、心臓または平滑筋）、脾臓、網内系、上皮、内皮、肝臓、腎臓、膵臓、消化器、肺、線維芽および他の細胞型である。いくつかの例において、標本は生物全体であり、例えば蠕虫、昆虫、ゼブラフィッシュである。他の例において、標本は臓器全体、例えばげっ歯類の全脳である。他の例において、標本は臓器の一部、すなわち生検、例えば移植組織の生検である。標本は、新鮮単離され得るかまたは保存、例えば瞬間凍結され得る。いくつかの実施形態において、標本は、例えば組織バンクからの保存標本、例えば、組織採取プログラムから得られるヒト脳の保存標本など、予め保存された標本であり得る。いくつかの例において、標本は、特定の疾患または状態に罹患していることが知られる対象由来、例えば、自閉症のヒトからの脳組織の試料であり得る。他の例において、試料は、特定の疾患または状態に罹患していない「正常な」対象由来であり得る。いくつかの例において、試料は、例えばトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック対象由来であり得る。
【００４９】
標本の細胞および／または生体分子は、標本の超微細構造を物理的に支持する膨潤性ポリマーに係留されているため、細胞および組織の３次元構造を保持しながら、通常は構造的支持を提供するが、細胞内タンパク質および分子の可視化を妨げる細胞成分（例えば脂質）を除去し得る。この除去により、生物標本の内部が光および／または巨大分子に対して実質的に透過性になり、標本の内部、例えば細胞および細胞内構造が、時間の浪費および組織の破壊的な切片化なく、顕微鏡下で可視化できるようになる。さらに、標本は反復的に染色され、脱色され、包括的な分析のために他の試薬で再染色され得る。
【００５０】
本方法には多くの用途がある。例えば、本方法は、中枢神経系の接続性の研究のための標本を調製するために適用し得る。本明細書中で使用される場合、「接続性」とは、一般に、ニューロン間の接続を意味し、単一細胞レベルでの接続、例えばシナプス、軸索末端、樹状突起棘など、ならびに主要な軸索路としてのニューロン群とＣＮＳ領域との間の連結、例えば脳梁（ＣＣ）、前交連（ＡＣ）、海馬交連（ＨＣ）、錐体交叉、錐体路、外包、内包（ＩＣ）、大脳脚（ＣＰ）などを含む。全脳および／または脊髄標本またはその領域（例えば大脳（すなわち大脳皮質）、小脳（すなわち小脳皮質）、前脳の腹側領域（例えば、線条体、尾状核、被殻、淡蒼球、側坐核；中隔核、視床下核）；視床および視床下部の領域および核；深部小脳の領域および核（例えば歯状核、球状核、柱状核、室頂核）および脳幹（例えば、黒質、赤核、脳橋、オリーブ核、脳神経核）；および脊椎の領域（例えば、前角、側角、後角））は、本方法によって死後調製され得、その中のニューロンの連結性は、例えば、死後に、脳、例えばヒト脳の完全な接続性を提供するために、顕微鏡により分析され、例えば得られ、保管され、レンダリングされ、使用され、作動される。このような研究は、脳が、健康な状態で、および疾患中にどのように発達し、機能するかということ、および認知および人格の土台を理解することに大きく寄与する。
【００５１】
別の例として、本方法は、疾患を評価、診断または監視するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「診断」は、一般に、疾患または障害に対する対象の感受性の予測、対象が疾患または障害に現在罹患しているか否かに関する判定、疾患または障害に罹患した対象の予後判定（例えば、癌状態、癌のステージ、癌が原因で患者が死亡する可能性の特定）、疾患または障害に対する処置に対する対象の反応性（例えば、例えば同系異種造血幹細胞移植、化学療法、放射線療法、抗体療法、小分子化合物療法に対して陽性反応、陰性反応、全く反応なし）の予測およびセラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）の使用（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するための対象の状態の監視）を含む。例えば、癌組織から生検を調製し、顕微鏡で分析し、癌のタイプ、癌の進行度、癌が治療介入に反応するか否かなどを判定し得る。
【００５２】
別の例として、組織の状態、疾患進行の程度、処置が奏効する可能性などを判定するために、生検を病変組織、例えば腎臓、膵臓、胃などから調製し得る。「処置」、「処置する」などの用語は、本明細書中で一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり得、および／または、疾患および／または疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書中で使用される場合、「処置」は、哺乳動物における疾患の任意の処置を包含し、以下を含む：（ａ）疾患に罹患し易い可能性があるが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患発症を予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること；または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち疾患退行を引き起こすこと。治療剤は、疾患または損傷の発症前、発症中または発症後に投与し得る。処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減する、進行中の疾患の処置は特に興味深い。このような処置は、罹患組織における機能の完全な消失前に行われることが望ましい。本治療は、望ましくは、疾患の症候ステージの間に、場合によっては疾患の症候ステージの後に投与される。「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」という用語は、本明細書中では交換可能に使用され、診断、処置または治療が所望されるあらゆる哺乳動物対象、特にヒトを指す。本方法およびシステムを用いた評価、分析、診断、予後診断および／または処置に適している疾患の例としては、癌、免疫系障害、神経精神医学的疾患、内分泌／生殖疾患、心臓血管／肺疾患、筋骨格疾患、消化器疾患などが挙げられるが限定されない。
【００５３】
本方法は、正常組織、臓器および細胞を評価するために、例えば、正常組織標本、例えば特定の疾患または状態に罹患していることが知られていない対象から採取した組織標本の細胞と組織との間の関係を評価するためにも使用され得る。本方法は、例えば、胎児発生中の、例えば神経系の発達および成熟中などにおける細胞と組織との間の関係を調べるために、ならびに発達が完了した後の細胞と組織との間の関係、例えば、完全に発達した成体標本の神経系の細胞と組織との間の関係を調べるために使用され得る。
【００５４】
本方法はまた、候補治療剤を組織または疾患に対するそれらの効果についてスクリーニングするための有用なシステムも提供する。例えば、対象、例えば、マウス、ラット、イヌ、霊長類、ヒトなどを候補薬剤と接触させ得、その臓器または生検を本方法によって調製し得、調製した標本を１つ以上の細胞または組織パラメータについて顕微鏡下で分析する。パラメータは、細胞または組織の定量化可能な成分、特に、高スループット系で望ましくは正確に測定され得る成分である。
【００５５】
本方法は、例えば染色体異常（逆位、重複、転座など）、遺伝子ヘテロ接合性の喪失、疾患または良好な健康に対する素因を示す遺伝子アレルの存在、治療に対する反応性の可能性、遺伝的系統など、細胞レベルの解像度で、組織全体における遺伝子コードマーカーの分布を可視化するためにも使用され得る。このような検出は、例えば、上記のような疾患の診断および監視において、オーダーメイド医療において、および父系性の研究において使用され得る。
【００５６】
本明細書中で使用される場合、「診断」という語句は、病的状態の存在または性質を同定することを意味する。診断方法は、その感度および特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、陽性（「真陽性」のパーセント）を試験する罹患個体のパーセンテージである。アッセイによって検出されない疾患個体は「偽陰性」である。罹患しておらず、アッセイにおいて試験で陰性とされる対象を「真陰性」と呼ぶ。診断アッセイの「特異性」は、１から偽陽性率を差し引いたものであり、「偽陽性」率は、試験で陽性とされる、疾患のない者の割合として定義される。特定の診断方法は、状態の確定的な診断を提供しないかもしれないが、本方法が診断に役立つ肯定的な指標を提供すれば十分である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、「診断する」という語句は、疾患または症状を分類すること、疾患の重症度を判定すること、疾患進行を監視すること、疾患の転帰および／または回復の見込みを予測することを指す。「検出する」という用語は、上記の何れかも場合によっては包含し得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、拡大試料は、非膨潤性ポリマー中に再び埋め込まれ得る。「再び埋め込まれる」とは、非膨潤性ポリマーを、好ましくはその前駆体を添加することによって、試料に浸透させること（例えば、灌流、注入、浸漬、添加または他の混合）を含む。代替的にまたは追加的に、非膨潤性ポリマーに試料を埋め込むことは、試料全体に１つ以上のモノマーまたは他の前駆体を浸透させ、モノマーまたは前駆体を重合させ、および／または架橋して非膨潤性ポリマーまたはポリマーを形成させることを含む。このようにして、第１の拡大試料が、例えば、非膨潤性ポリマーに埋め込まれる。非膨潤性ポリマー中に膨張試料を埋め込むことによって、塩濃度変動にもかかわらず、シークエンシング中の立体構造変化が防止される。非膨潤性ポリマーは、電荷中性ヒドロゲルであり得る。例えば、アクリルアミドモノマー、ビスアクリルアミド架橋剤、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）開始剤およびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）促進剤から構成されるポリアクリルアミドヒドロゲルであり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、固定された生体試料は不動態化される。本明細書中で使用される場合、「不動態化」という用語は、中の電荷を中和するために固定剤を化学試薬で官能化することによるなど、固定剤内に含有される成分との、試料の反応性を低くするための方法を指す。例えば、膨潤性ゲル中で使用され得るアクリラートのカルボキシル基は、下流の酵素反応を阻害し得る。アクリラートから構成される膨潤性ゲルを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で処理することによって、１級アミンが、カルボキシル基に共有結合して電荷中性アミドを形成し、膨潤性ゲルを不動態化するようになる。
【００６０】
技術革新により、臨床組織標本の固有の物理的および化学的特性に基づいて一般的な臨床組織標本の物理的膨張が可能になる。臨床組織標本は通常、高度に固定され、スーパーフロストガラススライド上にしっかりと取り付けられ、長期保管のためにパラフィンに包埋される（または染色され、封入剤中で載置される。）。いくつかの臨床組織標本は、蛍光イメージングと相容れないヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）などの色素で染色される。ＥｘＭを臨床試料に適用するために、脱パラフィン、抗原回復および激しいプロテアーゼ消化を包括的なワークフローに統合して、様々な種類の一般的な臨床標本を取り扱う。脱パラフィンおよび抗原回復は、保管臨床試料の回収に対処するが、その一方で、ヒト組織の殆どは試料の均質な膨張を妨げるコラーゲンおよびフィブロネクチンなどの大量の難消化構造タンパク質を含有するので、試料膨張の成功のために激しいプロテアーゼ消化が不可欠である。まとめると、本発明は、膨大な量の保管臨床試料へのＥｘＭの適用を可能にし、従来の光学顕微鏡による広範な疾患の機序の超解像度光学照合を可能にする。
【００６１】
本発明は、超解像度分子イメージングのための一般的なタイプの臨床試料の膨張を促進するための包括的なワークフローを提供する。本明細書中に記載の方法によって、適切な免疫染色、組織の十分な消化、高品質のポリマー合成および膨張中の関心のあるタンパク質の維持など、最適な結果が得られる。
【００６２】
本発明はまた、ナノスケールレベルでのさらなる生体分子照合のための古典的Ｈ＆Ｅ染色スライドの再利用も記載する。一般的に、Ｈ＆Ｅ染色スライドは、染色および封入剤の除去が困難であるため、さらなる下流処理には適していないと考えられる。したがって、本発明は、この障壁を克服し、使用されるＨ＆Ｅスライドからのより多くの情報の抽出を可能にするための、ユニークで費用効果の高いアプローチを記載する。一実施形態において、さらなる利用のためにＨ＆Ｅ染色スライドを膨張させる方法は、キシレン−エタノール−水での連続的な洗浄、タンパク質係留およびインシトゥポリマー合成を組み合わせる。
【００６３】
例
ヒト試料
この研究で使用した乳房病理標本は、べス・イスラエル・ディーコネス・メディカルセンター（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の病理アーカイブからのものであり、ＡＨＢに対するＢＩＤＭＣ  ＩＲＢプロトコール＃２０１３ｐ０００４１０のもと使用した。凍結腎臓の病理試料は、ＢＷＨ  ＩＲＢプロトコール＃２０１１Ｐ００２６９２のもと、ブリガム・アンド・ウィメンズ（Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍａｎ’ｓ）のアーカイブによってＡＷに提供された。他のヒト組織試料および組織マイクロアレイは、市販品を購入した（表１参照）。
【表１】
2019511914.tif 000003
【００６４】
不明の保管標本の使用は、対象からのインフォームドコンセントを必要としない。
【００６５】
抗原回復前の試料調製
パラフィン包埋された臨床試料の場合
一実施形態において、ワークフローを図１にまとめる。臨床組織試料がパラフィン中に包埋される実施形態において、脱パラフィン化が必要である。コプリン染色槽中にスライドを入れ、次の溶液：（ａ）２ｘキシレン、（ｂ）１：１キシレン：１００％エタノール、（ｃ）２ｘ１００％エタノール、（ｄ）９５％エタノール、（ｅ）７０％エタノール、（ｆ）５０％エタノール、最後に（ｇ）冷水道水を使用して臨床組織試料を連続的に洗浄することによって、脱パラフィンを行う。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を各溶液中で３分間洗浄する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を室温で洗浄する。パラフィン包埋された臨床組織試料がガラススライド上にある実施形態において、本明細書中に記載のような溶液中で連続的にスライドを洗浄する。いくつかの実施形態において、パラフィン包埋された臨床試料は組織マイクロアレイの一部である。いくつかの実施形態において、パラフィン包埋された臨床試料は組織マイクロアレイである。いくつかの実施形態において、脱パラフィン溶液（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてパラフィン包埋された臨床試料を脱パラフィンする。
【００６６】
いくつかの実施形態において、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）臨床試料について、試料を一連の溶液に各段階に対して３分間、２ｘキシレン、２ｘ１００％エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、最後に二重脱イオン水に連続的に入れた。全ての段階を室温（ＲＴ）で行った。
【００６７】
染色され、載置された永久スライドの場合
臨床組織試料が永久スライド上で染色され、載置される実施形態において、スライドのカバースリップを最初に慎重に取り外す。例えばカミソリ刃などの任意の適切な道具でカバースリップを取り外し得、カバースリップを取り外すことが困難な場合は、キシレン溶液での前処理によってカバースリップを緩め易くなる。次いで、上記のキシレンベースの脱パラフィン溶液でスライドを連続的に洗浄する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料をＨ＆Ｅで染色する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、スライドを上記のＦＦＰＥ試料として処理した。
【００６９】
臨床組織試料がエオシンなどの水溶性染色剤で染色される実施形態において、染色剤を水で洗い流し得る。臨床組織試料が、不溶性の染色剤で染色され、ヘマトキシリンなど、不溶性染色剤でさらに染色される実施形態において、上記のキシレンベースの脱パラフィン溶液で臨床組織試料を洗浄することによって不溶性の染色剤を除去し得、またはこのような不溶性の染色剤は試料中に残存し得るが、インシトゥでのポリマー合成、消化および膨張段階後に酸化し、除去し得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、不溶性染色剤が完全に除去されるまで臨床組織試料を含むスライドを０．１Ｍ  ＨＣｌ溶液中に入れることによって、不溶性染色剤を除去し得る。いくつかの実施形態において、不溶性染色剤はヘマトキシリンである。０．１Ｍ  ＨＣＬ溶液中で不溶性染色剤を除去することの欠点は、組織が後の段階でガラススライドから剥離し得ることである。
【００７１】
臨床組織試料をガラススライド上で固定し、凍結する実施形態において、臨床組織試料を室温に放置して、凍結切削媒体（ｆｒｅｅｚｅ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）を融解させる。臨床組織試料がパラフィン中に包埋される場合、試料を上記のように脱パラフィン化する。
【００７２】
一実施形態において、最初に、３ｘＰＢＳ洗浄の前に、−２０℃の氷冷アセトン中で５〜１０分間、最適切削温度（ＯＣＴ）溶液（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中の未固定凍結組織スライドを固定した。既に固定され、凍結された臨床組織切片については、スライドをＲＴで２分間放置して、ＯＣＴ溶液を融解させ、ＰＢＳ溶液で３回洗浄した。
【００７３】
臨床組織試料を脱パラフィン化したら、または臨床組織試料がパラフィンに包埋されていないが、パラホルムアルデヒドまたは同様のアルデヒドベースの化学物質で固定されている場合、臨床組織試料を抗原回復段階に進める。
【００７４】
抗原回復
ホルマリンまたは同様のアルデヒドベースの化学物質によって固定される臨床試料の実施形態において、臨床組織試料は免疫染色段階の前に抗原回復手順で処理しなければならない。臨床組織試料がパラフィン包埋されていないか、または脱パラフィン化されていて、ホルマリンまたは同様のアルデヒドベースの化学物質によって固定されていない場合、臨床組織試料を免疫染色段階に進め得る。
【００７５】
臨床組織試料を抗原回復手順で処理しなければならない実施形態において、当業者にとって公知の任意の熱誘導エピトープ回復法または酵素誘導エピトープ回復法または任意の種のそれらの組み合わせを抗原回復のために使用し得る。例えば、いくつかの実施形態において、臨床組織試料を１０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．５）中にＲＴで５分間置き、次に８０〜１００℃で３０分間、１０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．５）に移し得る。
【００７６】
一実施形態において、組織スライドを１００℃前後の２０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．５）に入れ、６０℃の温置チャンバー中で３０分間冷却した。
【００７７】
免疫組織化学
臨床組織試料を脱パラフィン化し、必要に応じて抗原回復に供したら、当業者にとって公知の任意の方法によって臨床組織試料を免疫染色する。いくつかの実施形態において、試料を３７℃で１時間、ＭＡＸｂｌｏｃｋ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）で最初にブロッキング処理し、その後、１０μｇ／ｍＬの濃度のＭＡＸｓｔａｉｎ（商標）Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）中で、組織の厚さおよび抗体に依存して約０℃〜約４０℃で約１分〜約数日にわたり、一次抗体とともに温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに６〜２４時間温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに室温前後〜３７℃で温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに室温前後で温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに約３７℃で温置する。次いで、臨床組織試料をＭＡＸｗａｓｈ（商標）Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）で４回、それぞれ５〜３０分間洗浄し、洗浄と洗浄の間に溶液を交換する。次いで、臨床組織試料を、ＭＡＸｓｔａｉｎ（商標）Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ中の３００ｎＭのＤＡＰＩと一緒に、およそ１０μｇ／ｍＬの濃度の適切な二次抗体とともに、組織の厚さおよび抗体に依存して約０℃〜約４０℃で約１分〜約数日間温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに６〜２４時間温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに室温前後〜３７℃で温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに室温前後で温置する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料を一次抗体とともに約３７℃で温置する。次いで、臨床組織試料をＭＡＸｗａｓｈ（商標）Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍで数回洗浄する。
【００７８】
タンパク質保存のための化学処理
臨床組織試料を脱パラフィン化し、必要に応じて抗原回復を行い、臨床組織試料を免疫染色したら、参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２０１７／０２７３６８号パンフレットにより記載のように、試料をタンパク質保存のために処理し得る。いくつかの実施形態において、臨床組織試料は、０．０３〜０．２ｍｇ／ｍＬのアクリロイルＸアクリロイル−Ｘ、ＳＥ（６−（（アクリロイル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル、ここではＡｃＸと略記（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；を含有するＰＢＳ緩衝液中での２〜１２時間にわたる温置によって処理する。
【００７９】
一実施形態において、ＡｃＸを１０ｍｇ／ｍＬの濃度の無水ＤＭＳＯ中で溶解させ、分注し、乾燥環境で凍結保存した。ＲＴにて６時間超、ＰＢＳ緩衝液中で希釈した０．０３〜０．１ｍｇ／ｍＬ  ＡｃＸ（非アルデヒド固定液で固定した試料に対しては０．０３ｍｇ／ｍＬ、アルデヒド固定液で固定した試料に対しては０．１ｍｇ／ｍＬ）とともに組織スライドを温置した。
【００８０】
インシトゥポリマー合成
臨床組織試料を脱パラフィン化し、必要に応じて抗原回復を行い、臨床組織試料を免疫染色し、場合によってはタンパク質保存のために処理したら、臨床組織試料をインシトゥポリマー合成に供する。簡潔には、インシトゥポリマー合成の前に、１ｘＰＢＳ、２Ｍ  ＮａＣｌ、８．６２５％（ｗ／ｗ）アクリル酸ナトリウム、２．５％（ｗ／ｗ）アクリルアミド、０．１０％（ｗ／ｗ）Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（全てＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈより）を含むモノマー溶液を調製し、分注した。モノマー溶液を完全に拡散させ、早すぎるゲル化を防止するために、組織スライドをモノマー溶液とともに４℃で約１時間温置した。４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を阻害剤として、テトラメチルエチレンジアミンを促進剤として、過硫酸アンモニウムを開始剤として、それぞれ０．２％（ｗ／ｗ）まで、モノマー溶液に連続的に添加した。最後に、試料を加湿雰囲気で３７℃にて１．５〜２時間温置してゲル化を完了させた。
【００８１】
いくつかの実施形態において、インシトゥポリマー合成の前に、アクリル酸ナトリウム、アクリルアミドおよびビスアクリルアミド、塩および緩衝液を含むモノマー溶液を調製する。モノマー溶液は、早すぎるゲル化を防ぐために４℃で冷却し得る。開始剤としての過硫酸アンモニウム、促進剤としてのテトラメチルエチレンジアミンおよび阻害剤としての４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシルをそれぞれモノマー溶液に０．２％（ｗ／ｗ）まで添加する。組織スライドを（厚さに応じて変動する時間にわたり）４℃でモノマー溶液とともに温置してモノマー溶液を拡散させ、次いでゲル化させるために加湿雰囲気で３７℃にて１〜２時間温置する。
【００８２】
重合完了後、カミソリの刃または適切な道具を用いて関心のある領域を切り出す（スライド試料については、組織はスライドに付着したままである。）。いくつかの実施形態において、試料からの関心領域は、試料を膨張させた後に切り出され得る。いくつかの実施形態において、試料からの関心領域は、膨張前に切り出される。
【００８３】
試料消化および膨張
臨床組織試料をインシトゥポリマー合成に供したら、臨床組織試料を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５〜１００ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４ＭグアニジンＨＣｌを含む改変消化緩衝液中の４〜３２Ｕ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中で温置する。いくつかの実施形態において、消化完了まで、臨床組織試料を５０℃で少なくとも８時間温置する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、プロテイナーゼＫ消化のための通常の緩衝液が臨床組織試料とはうまく機能しないので、臨床組織試料は消化困難であり、それにより試料の信頼に足る消化を確証することが困難になる。したがって、本発明はまた、この問題を克服するための「膨張中の消化」方法も記載する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料およびプロテイナーゼＫを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．４ＭグアニジンＨＣｌを含む改変消化緩衝液中で温置する。塩濃度は、消化中の組織試料の適度の膨張を促進し、組織内側での消化酵素のより良好な浸透を可能にする低イオン強度で維持される。消化をさらに助けるために、高濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の二ナトリウム塩を用いて、コラーゲンおよびフィブロネクチンなどの組織中の構造タンパク質の構造完全性を維持する残留二価陽イオンをキレートする。温置温度は、酵素活性を向上させるように設定する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．４ＭグアニジンＨＣｌ（または０．４Ｍ  ＮａＣｌ）を含有する改変消化緩衝液中の８Ｕ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中で試料を温置し、組織を６０℃で０．５〜３時間、または消化完了まで温置した。消化した試料を１ｘＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の３００ｎＭ  ＤＡＰＩで１時間染色し、次いで各洗浄で少なくとも２０分間、１ｘＰＢＳで少なくとも２回洗浄した。最後に、膨張させるために、ゲルを二重脱イオン水中に１０分間入れた。新鮮な水または０．００２％〜０．０１％アジ化ナトリウム溶液（細菌増殖を防ぐため）中で、膨張試料の大きさが変化しなくなるまで、この段階を３〜５回繰り返した。
【００８６】
いくつかの実施形態において、臨床組織試料の消化完了の結果、スライド上の組織が緩く剥離する。いくつかの実施形態において、臨床組織試料をスライドから分離し得る。いくつかの実施形態において、臨床組織試料は、ＤＡＰＩまたは他の化学核染色剤で染色し得る。一実施形態において、消化後に、臨床組織試料を１ｘＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の３００ｎＭ  ＤＡＰＩで１時間染色し、次いで各洗浄で少なくとも２０分間、１ｘＰＢＳで少なくとも２回洗浄する。インシトゥポリマー合成の前に、試料をＤＡＰＩまたは他の化学的核染色剤で染色する場合、染色剤は消化緩衝液中に拡散する。核染色を回復させるために、消化後に、試料を１ｘＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、ＰＢＳ緩衝液中の３００ｎＭ  ＤＡＰＩで１時間染色し、次いで各洗浄で少なくとも２０分間、１ｘＰＢＳで少なくとも２回洗浄する。最後に、ＭｉｌｌｉＱ水で繰り返し洗浄することにより試料を膨張させる。
【００８７】
ＤＮＡ  ＦＩＳＨ
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ  ＦＩＳＨのためにさらに処理される膨張試料について、消化ゲル試料を１ｘＰＢＳ、１５％炭酸エチレン、２０％硫酸デキストラン、６００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２ｍｇ／ｍＬ１本鎖サケ精子ＤＮＡを含有するハイブリッド形成緩衝液中で８５℃にて３０分間温置し、次に８５℃で１０分間予め加熱したＳｕｒｅＦＩＳＨプローブ（Ａｇｉｌｅｎｔ／Ｄａｋｏ）を含有する３０μＬのハイブリッド形成緩衝液と混合した。次いで、混合物を４５℃で一晩温置した。翌日、１ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）および２０％炭酸エチレンを含有するストリンジェンシー洗浄緩衝液で４５℃にて１５分間、試料を洗浄し、その後、４５℃にて２ｘＳＳＣで３回、各１０分間洗浄した。最後に、膨張が完了するまで、ゲル試料を０．０２ｘＳＳＣで複数回（各５分間）洗浄した。
【００８８】
イメージング
いくつかの実施形態において、膨張臨床組織試料のイメージングを従来の蛍光、共焦点顕微鏡または他の所望の観察機器で行い得る。ガラス底６ウェルプレート（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に膨張前および膨張後の臨床組織試料を置くことによって、臨床組織試料の膨張前および膨張後の画像をＡｎｄｏｒ  Ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎスピニングディスク共焦点（Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｄｉｓｋ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ）上で取得し、１％アガロースとともに載置することによって適所に保持した。１ｘまたは１．５ｘズームの４０ｘ１．１０ＮＡ（Ｎｉｋｏｎ）水対物レンズで画像を撮影し、パラフィン包埋組織マイクロアレイの膨張を図２で示し、Ｈ＆Ｅ染色スライドの再使用および膨張を図４で示す。
【００８９】
膨張後の蛍光顕微鏡
ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲソフトウェアによって制御される、ＳＰＥＣＴＲＡ  Ｘライトエンジン（Ｌｕｍｅｎｃｏｒ）および５．５Ｚｙｌａ  ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ）を取り付けたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ落射蛍光顕微鏡上で、４ｘ０．１３ＮＡ空気対物レンズまたは１０ｘ０．２ＮＡ空気対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を用いて、標本の低倍率画像を画像化した。いくつかの画像については、４０ｘ１．１５ＮＡ水浸対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を用いて同じ顕微鏡上で画像を取得した。以下のフィルターキューブ（Ｓｅｍｒｏｃｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用した：ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−１１ＬＰ−Ａ−０００；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＧＦＰ−１８２８Ａ−ＮＴＥ−ＺＥＲＯ；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、ＦＩＴＣ／ＴＸＲＥＤ−２Ｘ−Ｂ−ＮＴＥ；Ａｔｔｏ  ６４７ＮまたはＣＦ６３３、Ｃｙ５−４０４０Ｃ−０００。
【００９０】
そうでなければ、４０ｘ１．１５のＮＡ水浸対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  ＴＩ−Ｅ顕微鏡本体上のＡｎｄｏｒスピニングディスク（ＣＳＵ−Ｘ１  Ｙｏｋｏｇａｗａ）共焦点システムを用いて、他の全ての提示された蛍光画像を画像化した。ＤＡＰＩは、４５０／５０発光フィルターを備えた４０５ｎｍレーザーで励起した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８は、５２５／４０発光フィルターを備えた４８８ｎｍレーザーで励起した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６は、６０７／３６発光フィルターを備えた５６１ｎｍレーザーで励起した。Ａｔｔｏ  ６４７ＮおよびＣＦ６３３は、６８５／４０発光フィルターを備えた６４０ｎｍレーザーで励起した。
【００９１】
明視野顕微鏡
低倍率画像は、４ｘ０．１３ＮＡ空気対物レンズまたは１０ｘ０．２ＮＡ空気対物レンズとともに、ＤＳ−Ｒｉ２  ｓＣＭＯＳ  １６ｍｐカラーカメラ（Ｎｉｋｏｎ）および白色ＬＥＤ光を備えたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡上で取得した。４０ｘ０．９５ＮＡ空気対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、Ｐａｎｎｏｒａｍｉｃ  Ｓｃａｎ  ＩＩ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ）上で、Ｈ＆Ｅスライドの高倍率画像を取得した。
【００９２】
自己蛍光分析
分析前に、空白領域からの平均ピクセル値を差し引くことによって、組織に関係のないバックグラウンドを全ての画像から除去した。各蛍光チャネルについて、最も明るい蛍光シグナルを含有する１０カ所の関心領域および病理学者の目視検査によって判定された自己蛍光シグナルを含有する１カ所の領域を選択し、シグナルとバックグラウンドとの比を計算するために使用した。
【００９３】
測定誤差の定量化
膨張前後に、異なるｚ面における同じ視野を最初に画像化した。膨張前後のｚ面を一致させるために、膨張前後のｚ面（またはｚプロジェクション）の対の可能な組み合わせ全てについて、スケール不変特徴変換（ＳＩＦＴ）キーポイントを作成した。ＶＬＦｅａｔオープンソースライブラリを使用してＳＩＦＴキーポイントを作成し、回転、変換およびスケーリングに限定された幾何学モデルでのランダムサンプルコンセンサス（ＲＡＮＳＡＣ）によってフィルタリングした。回転、変換および均一スケーリングならびに膨張係数およびベクトル変形場の計算による画像登録のために、ＳＩＦＴキーポイントが最大である膨張前後の画像の対を使用した。任意の２点の得られたベクトルを差し引くことによって、２点間の測位誤差の見込まれる測定値の集団全体をサンプリングし、このような測定値に対する平均二乗誤差を測定長さの関数としてプロットした。
【００９４】
計算核非定型性分析（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｔｙｐｉａ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
以下は、膨張乳房組織画像を、異なるカテゴリー：正常乳房、良性乳房病変（ＵＤＨおよびＡＤＨ）および非侵襲性乳癌に分類するためのフレームワーク案である。この画像分類フレームワークは、４つの構成成分：画像前処理、核セグメンテーション、特徴抽出および画像分類からなる。画像前処理および核セグメンテーションパイプラインを図９Ａで示す。
【００９５】
画像の前処理
組織膨張およびＤＡＰＩを用いた核のバイオマーカー染色の後、４０倍の倍率で共焦点顕微鏡を用いて画像取得を行った。複数の非重複タイルの取得および単一画像を作成するためのステッチングゆえに、これらのタイルはローリングボール背景ノイズを示した。画像前処理中に、不均一なバックグラウンドノイズを除去するために、平均核サイズとしてボールサイズを用いたローリングボールバックグラウンド補正アルゴリズムを適用した。バックグラウンドノイズ除去後、適応性のヒストグラム平坦化により、核とバックグラウンドとのコントラストを強調した。これらの強調画像は、半径１０の中央値フィルターによって平坦化した。
【００９６】
核セグメンテーション
核セグメンテーション手順は３段階からなる。第１に、ポアソン分布に基づく最小誤差しきい値処理法を用いて核のセグメンテーションを行った。核およびバックグウランド領域における高い変動性のために、標準およびグローバルしきい値処理法は、最小誤差しきい値処理法として効率的ではない。この問題に対処するために、この局所適応型しきい値処理アルゴリズムは、画像ヒストグラムを用いて２つのポアソンモデルの混合をモデル化することによってしきい値を選択した。しきい値は、画像ヒストグラムとポアソン混合モデルとの間の相対エントロピーを最小化することによって算出された。次いで、ホールフィリングおよび、穴を埋め、核の小断片を組み合わせて１つの単一の核を形成するためのモルフォロジー・クロージングおよび、小さな非核領域（例えば血管、断片化した核の一部および人為産物）を除去するためのモルフォロジー・オープニングを含む、一連のモルフォロジー操作によって、核の初期セグメンテーションを改善した。このセグメンテーション法は、互いに接触しているクラスタ化された核をアンダーセグメント（ｕｎｄｅｒ−ｓｅｇｍｅｎｔ）し得る。第２に、接触し、重複する核を分離するために、発明者らはスケール適応多重スケールラプラシアン・ガウシアン（ＭＳＬｏＧ）フィルターを使用して、局所的な最大値を作成し、核の種子点を選択した。局所的最大点を選択する場合、初期乳房腫瘍病変において核サイズがかなり変動するので、不変スケールは不正確な核種子点を生じさせる。この問題に対処するために、スケール適応型ＭＳＬｏＧフィルターを所定の数のスケールに適用し、スケール空間応答の局所的最大点を種子点として選択した。最後に、接触し、重複する核を分離するために、これらの種子点を、マーカー制御されたウォーターシェッドアルゴリズムのためのマーカーとして使用した。
【００９７】
特徴抽出
核セグメンテーションの後、形態学的、一次統計的および二次統計的特徴を各核に対して抽出した。形態学的特徴としては、核の表現型情報を反映する形状および幾何学的特徴が挙げられる。算出形態学的特徴は、面積、凸面面積、周囲長、等価周囲長、偏心、配向、堅牢性、規模、稠密性、長軸長、短軸長、楕円の短径および長径である。一次統計的特徴は、核領域内のグレーレベル値の分布を決定した。算出一次統計的特徴は、平均、中央値、平均絶対偏差、標準偏差、四分位範囲、歪度および尖度である。二次統計的特徴は核テクスチャ内の変動を決定した。
【００９８】
グレーレベルＨａｒａｌｉｃｋ同時生起およびランレングス行列を使用して、２種類の二次統計的特徴を算出した。同時生起行列ＧＬＣＭ（ｉ、ｊ；ｄ、θ）は、次元Ｎｇで正方形であり、Ｎｇは画像中のグレーレベルの総数である。行列のｉ番目とｊ番目の列の値は、値ｉのピクセルが距離ｄと角度θの値ｊのピクセルに隣接している場合の総数を数えることによって生成させた。次に、生成させたこのような比較の総数により行列全体を分けた。あるいは、ＧＬＣＭ行列の各要素は、グレーレベルｊのピクセルが、距離ｄおよび角度θのグレーレベルｉのピクセルで存在する確率と考えられる。隣接性は、１つの変位ベクトルにより４つの方向（垂直、水平、左右の対角線）で定義し、これは４つのＧＬＣＭ行列を生成した。テクスチャ情報は回転不変である。したがって、４方向全てにおける平均を取り、１つのＧＬＣＭ行列を作成した。その後、より密にテクスチャを識別するために、Ｈａｒａｌｉｃｋによって提案された１４の特徴をＧＬＣＭから算出した。これらの１４の特徴は、自己相関、相関、コントラスト、クラスタシェード（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｓｈａｄｅ）、クラスタプロミネンス（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）、エネルギー、エントロピー、均質性、逆差分正規化、逆差分モーメント正規化、異質性、最大確率、情報測度相関１および情報測度相関２である。
【００９９】
同じグレーレベルを有し、所定の方向で同一直線上にある一連の連続ピクセルは、グレーレベルランレングス行列ＧＬＲＬＭ（ｉ，ｊ；θ）を構成する。ＧＬＲＬＭの次元はＮｇｘＲであり、Ｎｇはグレーレベルの数であり、Ｒは最大ランレングスである。ＧＬＣＭと同様に、ＧＬＲＬＭを４方向について算出し、後で平均を算出した。ＧＬＲＬＭから派生した１１のランレングス特徴は、ショートラン強調（ＳＲＥ）、ロングラン強調（ＬＲＥ）、グレーレベル不均一性（ＧＬＮ）、ランレングス不均一性（ＲＬＮ）、レシオパーセンテージ（ｒａｔｉｏ−ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）（ＲＰ）、低グレーレベルラン強調（ＬＧＬＲＥ）、高グレーレベルラン強調（ＨＧＬＲＥ）、ショートラン低グレーレベル強調（ＳＲＬＧＬＥ）、ショートラン高グレーレベル強調（ＳＲＨＧＬＥ）、ロングラン低グレーレベル強調（ＬＲＬＧＬＥ）およびロングラン高レベル強調（ＬＲＨＧＬＥ）である。合計で、各核について４５個の特徴が算出された。最後に、画像ごとに各特徴の平均、中央値、平均絶対偏差、標準偏差、四分位範囲、歪度および尖度を含む一次統計量を算出し、画像あたり３１５のサマリーフィーチャ（ｓｕｍｍａｒｙ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）を作成することによって、画像レベルでこれらの特徴をまとめた。
【０１００】
画像分類
フレームワークの最後の部分の間に、Ｌａｓｓｏ正則化を用いてロジスティック回帰分析を行い、正常、良性および侵襲前悪性組織画像を分類するための多変量画像特徴に基づくモデルを構築した。ｇｌｍｎｅｔパッケージを使用して、分析をＲで実行した。標準的ロジスティック回帰分析から得られるものよりも過剰適合する傾向が小さい単純なモデルを作成するために、Ｌａｓｓｏ正則化を使用した。Ｌａｓｓｏ手順は、最小予測特徴の回帰重みを０に縮小する効果を有する、Ｌ１正則化ペナルティを用いてロジスティック回帰分析を実行することからなる。ペナルティの量（およびモデルにおける非ゼロ特徴の数）は、正則化パラメータλによって決定される。この方法は、共直線性の設定において良好に機能することが示されており、橋渡し的な癌研究における高次元データから予測モデルを構築するために広く使用されている。ｇｌｍｎｅｔにおける選択設定を使用して、モデル構築前に、トレーニングおよび検証データセットにおいて特徴を個別に標準化した。６倍交差検証（６Ｆ−ＣＶ）によるモデル性能を評価した。検証のために、交差検証で最大曲線下面積（ＡＵＣ）を達成したλの値をトレーニング分割データセットで選択し、この固定モデルを検証分割データセットに適用した。真陽性対偽陽性の受信者動作曲線下の面積（ＡＵＣ）を算出することによってモデル性能を評価し、ここで、完璧な分類器は１のＡＵＣを達成し、一方でランダム分類器は０．５のＡＵＣを達成する。
【０１０１】
フレームワークの評価はまた、生物医学研究において一般的に使用される２つの他の機械学習分類器も用いて実施した。ランダムフォレスト分類器は、データセットの様々なサブ試料において多数の決定木をフィットさせ、平均化を使用して、予測精度を向上させ、過剰適合を制御する。ランダム選択で使用しようとする木の数（ｎｕｍＴｒｅｅｓ）、木の最大深度（ｍａｘＤｅｐｔｈ）および特徴の数（ｎｕｍＦｅａｔｕｒｅｓ）は、ランダムなフォレストの性能に影響する３つのパラメータである。実験において、ｎｕｍＴｒｅｅｓ＝１００、ｍａｘＤｅｐｔｈ＝３０およびｎｕｍＦｅａｔｕｒｅｓ＝２０を使用した。最後の分類器はＮａｉｖｅ  Ｂａｙｅｓであり、これは、特徴間の強い独立仮定とともにＢａｙｅｓの定理を適用することに基づく確率的分類器である。予測値がクラスラベルである（例えば、発明者らは、分類問題を追求している。）ので、独立仮定は、回帰と比較した場合、分類についてあまり限定的ではない。
【０１０２】
画像分類の結果
膨張前画像と膨張画像の両方において画像分類フレームワークを適用した。両データセットは、３６枚の正常乳房組織画像、３１枚の非侵襲性病変乳房組織画像（１５枚のＵＤＨおよび１６枚のＡＤＨ）および３８枚の侵襲前乳房組織画像（ＤＣＩＳ）を含有する１０５枚の画像からなる。したがって、これらの１０５枚の画像は、４つの異なるクラス（正常、ＵＤＨ、ＡＤＨ、ＤＣＩＳ）に属する。症例の総数は１３１であり；１０５例を分析し、ボーダーライン診断例と判定されたために２６例を除外した。正常乳房組織を各非侵襲性および侵襲前乳房組織型と識別するために、全てのクラスについてバイナリ分類を行い、結果を図９Ｃで示す。正常な乳房組織をＵＤＨ、ＡＤＨおよびＤＣＩＳ組織と識別するために、ＧＬＭＮＥＴ分類器は、それぞれ、膨張前データでのＡＵＣ０．８６、０．８２および０．７５と比較した場合、膨張データに対してＡＵＣ０．９５，０．９６および０．９４を報告した。非定型ではない乳房組織（ＵＤＨ）を非定型乳房組織（ＡＤＨおよびＤＣＩＳ）と鑑別するため、ＧＬＭＮＥＴ分類器は、それぞれ、膨張前データでのＡＵＣ０．７１および０．８２と比較した場合、膨張データにおいてＡＵＣ０．９３および０．８９を報告した。侵襲前乳癌組織（ＤＣＩＳ）と非定型良性乳房組織（ＡＤＨ）を識別するために、ＧＬＭＮＥＴ分類器は、膨張前データでのＡＵＣ０．８４と比較して、膨張データではＡＵＣ０．９５を報告した。
【０１０３】
臨床試料および病理学的に最適化された膨張顕微鏡
全て組織が薄切され、ガラススライド上にあると仮定して、異なる臨床試料がＥｘＭ処理（図１Ａ）：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、Ｈ＆Ｅ染色組織切片および新鮮凍結組織に対して最適化された状態に全て到達するように一連の段階を考案する際に、臨床および病理組織試料に対する３種類の出発状態を考慮した。他の３つのカテゴリーに必要な段階の全てが、ＦＦＰＥ組織処理に必要とされる段階のサブセットまたは順列の何れかであると仮定したので、最初にＦＦＰＥ試料を試験した。パラフィンを除去するためのキシレン処理、続く再水和およびごく標準的な抗原回復段階（例えば、１００℃でｐＨ８の２０ｍＭクエン酸ナトリウム中に試料を入れ、次いですぐに６０℃のチャンバーに３０分間移す。）によって、試料を処理することが可能になり得るかどうかを評価した。高度にホルマリン固定されたヒト組織は、消化が行われない限り、パラフィン除去後でさえ、プロトコール下で均一に膨張しなかったことが分かった。アセトン固定ならびにＦＦＰＥ試料を含む、皮膚、肝臓、乳房および肺を含むヒト試料の消化における１ｍＭ対２５ｍＭ濃度のＥＤＴＡの影響（図３；表２）を調べた。
【表２】
2019511914.tif 000004
【０１０４】
別個の細胞外マトリクス成分を含有し、ホルマリン固定細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質による青色および緑色蛍光発光チャネルにおいて強い自己蛍光を呈する、ヒト皮膚および肝臓ＦＦＰＥ試料に対する両条件下での消化時間の影響を調べた。
【表３】
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【０１０５】
ヒト皮膚および肝臓試料の両方が、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ支援プロテイナーゼＫ消化で０．５時間以内に完全に消化され、完全に膨張したことが分かった。一方で、ＥＣＭは、残留自己蛍光によって示されるように、何れのタイプの組織でも、１ｍＭのＥＤＴＡでは完全には消化されなかった（図３Ａｉｉｉ、Ａｖｉ）。不完全消化は、マイクロスケールおよびマクロスケールの両方で歪みを引き起こし得る。他のタイプの組織に関しては、両方法は十分である。
【０１０６】
キシレン処理およびＥＤＴＡ増加を伴うこのＦＦＰＥパイプラインは、本明細書中に記載の方法のための試料を調製し得、これは、ＦＦＰＥ保存で調製された正常ヒト乳房組織上のパイプライン全体を評価することによって実証された。広視野（図１Ｂ）またはＳＲ−ＳＩＭ（図１Ｆ）顕微鏡の何れかを用いた膨張前イメージングに続いて、それぞれ広視野（図１Ｃ）または共焦点（図１Ｇ）顕微鏡での膨張後イメージングを行い、数パーセントの低い歪みレベルが生じた（図１Ｄ、１Ｅ、１Ｈおよび１Ｉ）。このように、この膨張病理学法（ＥｘＰａｔｈ）プロトコールは、パラフィン包埋され、高度にアルデヒド固定された試料を膨張可能であった。
【０１０７】
基本的なＥｘＰａｔｈパイプラインを確立したので、Ｈ＆Ｅ染色試料も調製することが望ましかった。載置された試料については、カバースリップおよび封入剤（ポリスチレン製の硬質物質）を除去しなければならず；膨張顕微鏡検査のための前処理としてキシレン処理が許容可能であったので、キシレン前処理段階を追加して、封入剤を溶解除去し、カバースリップを除去した。
【０１０８】
Ｈ＆Ｅ染色組織は高いバックグラウンド蛍光を示し、このことから、エオシンおよびヘマトキシリンの除去が後の蛍光抗体染色に重要であることが示唆される。ＥｘＰａｔｈプロトコールを用いて、エオシンおよびヘマトキシリンは、両方とも処理の時間経過にわたって自然に除去された。このように、非定型乳管過形成（ＡＤＨ）を伴うヒト乳房組織のＨ＆Ｅスライドを用いて、核ＤＮＡを可視化し（消化後にＤＡＰＩで染色）、ミトコンドリアタンパク質Ｈｓｐ６０およびビメンチンに対する抗体染色を適用することによって、載置されたＨ＆Ｅ試料を調製し得ることが明らかになった（図１Ｊ、１Ｋ）。
【０１０９】
最後に、アセトン固定で保存された新鮮凍結切片については、おそらくアルデヒドで処理されていない組織で利用可能な遊離アミンの数がより多いために、ＡｃＸの濃度を０．１ｍｇ／ｍＬから０．０３ｍｇ／ｍＬに低下させることにより、より良好な処理が可能になることが分かった（図３Ｋ、３Ｌ）。
【０１１０】
基本的なＥｘＰａｔｈプロトコールを確立したので、プロトコールを実験的背景に拡大した。例えば、ＤＮＡ蛍光インシトゥハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）は、一般に、乳癌におけるＨＥＲ２遺伝子増幅を評価するために使用される。ＤＡＰＩは、膨張試料中のＤＮＡのゲル保持と一致して、膨張後にＤＮＡを染色することが可能であるので；膨張後のＤＮＡ  ＦＩＳＨが可能か否かを調べた。従来の２本鎖細菌人工染色体（ＢＡＣ）に基づくＦＩＳＨプローブ（例えば、ＨＥＲ２を標的とするＢＡＣに基づくＦＩＳＨプローブの長さはおよそ２２０ｋｂである。）の大型サイズは、膨張試料の染色を妨げるので、ＨＥＲ２および（対照として）１７番染色体のセントロソームを標的とする、平均サイズが約１５０塩基である１本鎖オリゴヌクレオチドのライブラリである市販のＳｕｒｅＦＩＳＨプローブを選択した。ＨＥＲ２増幅がない乳癌の市販の標本（図１Ｌ）の場合、およびＨＥＲ２増幅がある癌（図１Ｍ）の場合、ＳｕｒｅＦＩＳＨプローブが乳房ＥｘＰａｔｈ試料に拡散し、染色体ＤＮＡとハイブリッド形成し、より多くのＤＮＡハイブリッド形成がＨＥＲ２増幅例で明らかとなることが観察された。ＤＮＡ  ＦＩＳＨは工程の最終段階として行われるので、プロトコールの初期に行われる免疫染色を妨害しない。乳房試料をＨＥＲ２タンパク質に対する抗体で同時染色し、ＨＥＲ２タンパク質発現とＨＥＲ２遺伝子増幅との相関を確認した（図１Ｌ、１Ｍ）。
【０１１１】
ＥｘＰａｔｈは、分子をばらばらにし、また不要な分子も排除するので、従来の免疫染色を超えるいくつかの利点がある。例えば、組織自己蛍光は、既存の自己蛍光低減方法にもかかわらず、病理学分析における免疫蛍光および蛍光インシトゥハイブリッド形成の臨床適用に対しては依然として困難な点がある。ＥｘＰａｔｈで処理した標本は＞９９％水であり、したがって透明であり、水と屈折率が一致する。したがって、自己蛍光に寄与する係留を外された生体分子（タンパク質ならびに小分子の両方を含む可能性がある。）を排除する、ＥｘＰａｔｈの分子透明化は、非常に実用的な結果をもたらし：すなわち、シグナルと比較して、いくつかのスペクトルチャネルにおいて自己蛍光が一桁低下する。
【０１１２】
平均膨張係数４．７（標準偏差（ＳＤ）０．２）で約４−５ｘの膨張を得た全ての例において、８種類の様々な臓器−乳房、前立腺、肺、結腸、膵臓、腎臓、肝臓および卵巣由来の、癌含有対正常組織を調べて、様々な臓器からの数十の試料を含有する市販の組織マイクロアレイにＥｘＰａｔｈを適用した。膨張の変動性は１０％よりも小さく、異なるタイプのヒト組織間での一貫した膨張性能を示す。ＥｘＰａｔｈは、上皮間葉移行、癌進行および転移開始において重要である中間フィラメントケラチンおよびビメンチンのサブ回折限界構造を明らかにした（図２）。ビメンチンが間質組織の標準マーカーであり、ケラチンが上皮組織の標準マーカーであるとすれば、ＥｘＰａｔｈは、多岐にわたるヒト臓器からの臨床生検試料において、核酸のみならずタンパク質バイオマーカーのサブ回折形態を観察するための単純で便利な方法を提供する。
【０１１３】
ＥｘＰａｔｈは、ヒトポドサイトの三次足突起の可視化を可能にする
ナノスケールイメージングが病理学において広く普及していないと仮定すると、本明細書中に記載のＥｘＰａｔｈ法は、正常な試料と異常な試料との探索、その後の、新規病理学的機序の特定ならびに、疾患分類および精密な診断の両方のための、重要な特徴の従来型または自動化検査で使用され得る。例えば、微小変化型疾患（ＭＣＤ）および局所分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）（およびネフローゼ症候群に関連する他の病変）などの腎疾患は、一般的には、電子顕微鏡によって診断または確認される。ＭＣＤにおいて、一般的には、指上嵌入のような糸球体毛細血管ループの表面を被覆する腎三次ポドサイト足突起は、代わりに、その特徴的形態を失い、電子顕微鏡下で連続的に見えるが−これは足突起消失（ＦＰＥ）と呼ばれる現象である。個々の足突起の幅は２００ｎｍ前後であり、これは従来の光学顕微鏡を用いた解像度の限界を超えている。ＥｘＰａｔｈがポドサイト足突起の可視化に役立ち得るか否かを判定した。最初に、三次ポドサイト足突起において特異的かつ豊富なタンパク質標的を同定し、報告されるポドサイト足突起マーカーの選択の免疫蛍光を調べた。可能性のあるタンパク質のうち、特異的かつ強力なポドサイト足突起染色を示すための標的は、免疫染色前に熱処理されたアセトン固定凍結腎臓試料に対するＥｘＰａｔｈの状況では（図６および７）、アクチニン−４であった。ＥｘＰａｔｈイメージングに適した抗シナプトポジン２３抗体も同定された（図７）。抗アクチニン−４の免疫染色の質は、クエン酸またはＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ抗原回復法（図８）の何れかで処理した腎臓ＦＦＰＥ試料では、アセトン固定凍結腎臓試料のものと比較して、僅かに低下した。免疫染色の質の低下は、ホルマリン誘導性架橋によって引き起こされる抗原性劣化によるものであり得る。抗アクチニン−４ならびにビメンチン（糸球体マーカー）およびコラーゲンＩＶ（毛細血管の基底膜のマーカー）に対する抗体でヒト腎臓試料を同時染色すると、正常ヒト腎臓試料（図５Ｃ）において、糸球体の微細構造の観察が可能になり（図５ＡとＢ）、ＥｘＰａｔｈから、従来の共焦点イメージング（図５Ａ）と対比して、三次ポドサイト足突起の超微細構造（図５Ｂ）が明らかになった。したがって、正常腎臓の患者ならびにＭＣＤまたはＦＳＧＳの患者からの新鮮凍結腎臓切片を染色し、膨張させた。ＥｘＰａｔｈ画像を取得し、対応する症例の電子顕微鏡画像と比較した。非臨床ヒト腎臓試料の結果と同様に、正常な症例からの腎臓における三次足突起の超微細構造が観察されたが（図５Ｅ）、ＭＣＤ症例では足突起消失が観察され（図５Ｇ）、同じ試料からの対応するＥＭ画像で見られる足突起形態と一致した（図５Ｄおよび５Ｆ）。したがって、ネフローゼ疾患のヒト臨床試料間のナノスケールの差異が、試料膨張後の従来の回折限界光学顕微鏡で可視化され得る。
【０１１４】
ＥｘＰａｔｈによってＭＣＤとＦＳＧＳの両方の症例からの足突起消失の正確な同定が可能になり得るか否かを盲検試験で調べるために、５名の病理学者および２名の非病理学者を含む７名の観察者が、最初に、膨張前および膨張後状態の両方において腎臓糸球体の免疫蛍光画像の試料セットを試験し、次いで、正常対象からの３個の標本、ＭＣＤ患者からの２個の標本およびＦＳＧＳ患者からの１個の標本の腎臓糸球体の、１０枚の異なる膨張前および１０枚の膨張後免疫蛍光画像を調べた。非膨張試料について、分類精度は僅か６５．７％（標準偏差（ＳＤ）１７％）であったが、膨張後画像を代わりに使用した場合、９０％（ＳＤ８％）まで有意に上昇した（ｐ＝０．００８８、両側ｔ検定）。観察者間の合意を評価するため、両方のデータセットにおいて、観察者のカテゴリー評定のためにＦｌｅｉｓｓのκ値を計算した。膨張後データの観察者の評定において強い一貫性が見られ、カッパ値は９５％信頼水準で０．６８±０．１４であり、一方で膨張前データにおける観察者間の合意（０．３５±０．１３、９５％信頼水準）は乏しく、臨床において受容可能なしきい値が０．４０と仮定すると、実際にカッパ値はボーダーラインであった。ＥｘＰａｔｈは、１つの膨張後画像から、画像が、正常状態の試料由来であるか、または異常状態の試料由来であるかについて、観察者間で正確で一貫性のある評価を可能にした（臨床業務において、言うまでもなく腎臓病理学者は一般的に、正確な診断のために複数の選択ＥＭ画像を検査する。）。この結果から、ＥｘＰａｔｈを用いた大規模な盲検試験が、ネフローゼ腎疾患および潜在的には既知のナノスケールの病理を含む他の疾患の診断または確認を簡素化し、ならびに変化が通常の顕微鏡で解像するには小さすぎる場合に、より早い疾患検出を促進することに非常に適したものであり得ることが示唆される。
【０１１５】
ＥｘＰａｔｈは、初期乳房病変におけるコンピュータ診断を大幅に改善する
乳房病変における最も困難な問題領域の１つは、初期乳房病変の分類である。例えば、一研究において、熟練した専門病理学者と地域で診療を行っている病理学者との間の一致率は、乳房の非侵襲性病変の分類においてかなり変動し得、非定型乳房病変については合意が僅か約５０％である１１ことが示されている。これらの病変の病理学的分類は、過剰および過小処置を防止し、臨床管理を導くために非常に重要な診断情報を提供する。
【０１１６】
現在の分類スキームでの問題は、２つの論点によるものであると仮定した：第１に、診断基準は主に定性的で主観的であり；第２に、画像に含有される情報は、従来の光学顕微鏡の光学回折限界によって制限される。第１の論点に取り組み始めるために、悪性の乳管内増殖性乳房病変と良性を識別し得るコンピュータ病理モデルが開発された。しかし、これらのモデルの有効性は、回折限界画像から抽出可能な情報によって制限される。したがって、膨張試料から得られる追加情報は、抽出される特徴の高品質性につながり得、結果として、侵襲前の乳房病変の再現性のある分類の改善をもたらすので、初期乳房病変の病理学的分類を調べるために、ＥｘＰａｔｈを用いた。
【０１１７】
膨張前Ｈ＆Ｅ染色画像ならびに膨張後ＤＡＰＩ染色画像に対して最適化された核検出およびセグメンテーションアルゴリズムで更新された画像分類フレームワークにおいて、自動セグメンテーションフレームワークを適用した（図９Ａ）。膨張後ＤＡＰＩ染色画像に対する画像分類フレームワークには、前景検出、核種子検出および核セグメンテーションが含まれる（図９Ａ）。このフレームワークの適用後、３種類の特徴：核の形態学的特徴、核の強度の特徴および核のテクスチャの特徴が、膨張前および膨張後画像の両方からの各セグメンテーション核から抽出された。
【０１１８】
２つのデータセット（膨張前および膨張後）のそれぞれは、１０５枚の画像：３６枚の正常乳房組織画像、３１枚の増殖性病変（良性）画像（１５枚の通常の乳管過形成（ＵＤＨ）、１６枚の非定型乳管過形成（ＡＤＨ））および３８枚の上皮内の乳管癌（ＤＣＩＳ）からなる。全ての試料が、４．８の平均膨張係数で約４〜５ｘ膨張した（ＳＤ：０．３）。膨張前および膨張データセットの両方からの３１枚の画像のサブセットに対する核検出およびセグメンテーションアルゴリズムの性能に対するＥｘＰａｔｈの影響を評価した（６枚の正常、９枚のＵＤＨ、９枚のＡＤＨおよび７枚のＤＣＩＳ；図９Ｂ）。核のコンピュータ検出は、膨張試料（図９Ｂ）において有意により正確であり、非膨張試料よりも、真の陽性率が１１％上昇し、陽性予測値が２２％上昇し、ｆ−スコアが１６％上昇し、セグメンテーションも有意に改善され、ｆスコアが１４％上昇し、カッパが７７％上昇し、グローバル・コンシステンシー・エラー（ｇｌｏｂａｌ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ  ｅｒｒｏｒ）（ＧＣＥ）が６６％低下した。核検出およびセグメンテーションの精度のこの向上は、コンピュータ病理分析の改善を支援するのに役立つ。この目的のために、膨張前のデータ（図９Ｃ）と比較した場合、膨張後データでモデルを実行した場合、分類性能が向上した。特に、真の陽性対偽陽性の受信者動作曲線下面積（ＡＵＣ）を調べるとき、完全な分類器が１のＡＵＣを達成し、一方でランダム分類器が０．５のＡＵＣを達成すると、パイプラインはＵＤＨなどの病変をＡＤＨなどの非定型病変と区別し得、膨張試料でＡＵＣは０．９３であり、それに対して膨張前組織では僅か０．７１であった。
【０１１９】
これらの知見から、膨張後画像上で達成された核セグメンテーションの改善の結果、より有益な特徴が得られ、結果としてより高性能の分類モデルが得られることが示唆される。したがって、ＥｘＰａｔｈは、増殖性乳房病変のコンピュータ病理鑑別を促進し得、過剰診断および過小診断を防止し、臨床管理の指針となる可能性があり得る診断情報を提供する。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態を参照して本発明を具体的に示し、記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更がなされ得ることが当業者により理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図２】
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【図３Ａｉ】
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【図３Ａｉｉ】
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【図３Ａｉｉｉ】
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【図３Ａｉｖ】
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【図３Ａｖ】
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【図３Ａｖｉ】
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【図３Ｂｉ】
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【図３Ｂｉｉ】
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【図３Ｂｉｖ】
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【図３Ｂｖ】
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【図３Ｂｖｉ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図５Ｆ−Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【国際調査報告】
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