(57)【要約】【課題】  本発明は、ヒト皮膚、特に真皮の３Ｄバイオプリンティングのための新規のバイオインクとしての、ナノセルロース及び／又はフィブリンが添加された及び添加されていないＲＧＤ接合アルギネートに基づくヒドロゲルの使用に関する。【解決手段】  ＲＧＤ接合アルギネートは、Ｉ型コラーゲンを生産する遺伝子の上方調節に寄与する細胞の接着及び延伸を引き起こすヒト線維芽細胞のための接着部位を提供する。本発明において、ＲＧＤ接合アルギネートは、３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインクの成分の１つとして使用される。ここに記載される別の革新は、アルギネート及びＲＧＤ改変アルギネートのバイオインクを用いて３Ｄバイオプリントする場合に同軸ニードルを使用することである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＤ改変アルギネート及びヒト線維芽細胞を含む３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項２】
フィブリンをさらに含む、請求項１に記載の３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項３】
ヒト線維芽細胞と共に、３Ｄバイオプリント用のＲＧＤ改変アルギネートで構成される３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項４】
ＲＧＤ改変アルギネート及びフィブリンを含む３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項５】
ヒト線維芽細胞と共に、３Ｄバイオプリント用のＲＧＤ改変アルギネート及びフィブリンで構成される３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項６】
前記ＲＧＤ改変アルギネートと共に、ＲＧＤ改変ナノセルロースが使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオインク。
【請求項７】
前記ＲＧＤ改変アルギネートと共に、ナノセルロースが使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオインク。
【請求項８】
ナノセルロース及びフィブリンを含む、ヒト細胞を含有する又は含有しない、３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項９】
ナノセルロース及びＲＧＤ改変アルギネートを含む、ヒト細胞を含有する又は含有しない、３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項１０】
ナノセルロース、ＲＧＤ改変アルギネート、及びフィブリンを含む、ヒト細胞を含有する又は含有しない、３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項１１】
ＲＧＤ改変アルギネート及びフィブリンを含む、ヒト細胞を含有する又は含有しない、３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項１２】
ヒト細胞と共に又はなしで、３Ｄバイオプリント用のＲＧＤ改変アルギネート、ナノセルロース、及びフィブリンで構成される３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項１３】
ヒト細胞と共に又はなしで、３Ｄバイオプリント用のナノセルロース及びフィブリンで構成される３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項１４】
ヒト細胞と共に又はなしで、３Ｄバイオプリント用のＲＧＤ改変アルギネート及びフィブリンで構成される３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項１５】
前記ＲＧＤ改変アルギネートの架橋を提供するために、少なくとも１つの同軸ニードルが使用される、請求項１〜７、９〜１２、及び１４のいずれか一項に記載のバイオインク。
【請求項１６】
細胞と共に又はなしで、バイオインクとして、ヒト線維芽細胞と共にＲＧＤ改変アルギネートを使用することを含む、３Ｄバイオプリンティングの方法。
【請求項１７】
細胞と共に又はなしで、バイオインクとして、請求項１〜７、９〜１２、及び１４のいずれか一項に記載の前記ＲＧＤ改変アルギネートを使用することを含む、３Ｄバイオプリンティングの方法。
【請求項１８】
細胞と共に又はなしで、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオインクを使用することを含む、３Ｄバイオプリンティングの方法。
【請求項１９】
真皮様構築物を生産する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記真皮様構築物が、創薬及び／若しくは化粧品の試験のために、並びに／又は疾患モデルとして使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＧＤ改変アルギネートと共に、ＲＧＤ改変ナノセルロースが使用される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＧＤ改変アルギネートと共に、ナノセルロースが使用される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＧＤ改変アルギネートの架橋を提供するために、少なくとも１つの同軸ニードルが使用される、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＧＤ改変アルギネートと共に、ナノセルロース又はＲＧＤ改変ナノセルロースが使用される、請求項１〜７、９〜１２、及び１４〜１５のいずれか一項に記載のバイオインク又は請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＧＤ改変アルギネートの架橋を提供するために、少なくとも１つの同軸ニードルが使用される、請求項１〜７、９〜１２、及び１４〜１５のいずれか一項に記載のバイオインク又は請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＧＤ改変アルギネート中に生きた線維芽細胞を含有する３Ｄバイオプリントされた生きた組織であって、バイオインクでプリントされたグリッド間のスペースが、栄養素、酸素、タンパク質、及び／又は成長因子の拡散を可能にする、組織。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオインクを使用して生産された３Ｄバイオプリントされた生きた組織であって、前記線維芽細胞が、前記３Ｄバイオプリントされた生きた真皮組織を生産するための成長培地にＴＧＦベータを添加することによって刺激される、組織。
【請求項２８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記バイオインクを使用して生産された３Ｄバイオプリントされた生きた組織であって、前記組織上でケラチノサイトが培養されて、表皮が構築され、皮膚様の組織が形成される、組織。
【請求項２９】
請求項２７若しくは２８に記載の前記組織の埋め込み、又は請求項１〜１５、２４若しくは２５のいずれか一項に記載の前記バイオインクを使用して生産された前記組織の埋め込み、又は請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法を使用して生産された前記組織の埋め込みによって、組織の欠陥を患う動物及び／又はヒトを処置する方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に従って生産された３Ｄバイオプリントされた組織の埋め込みによって、組織の欠損を患う動物及び／又はヒトを処置する方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に従って生産された３Ｄバイオプリントされた組織の埋め込みによって、これに限定されないが皮膚の欠陥などの組織を置き換えるために、動物及び／又はヒトを処置する方法。
【請求項３２】
３Ｄバイオプリンティングの方法であって、
線維芽細胞と共に又は線維芽細胞なしでＲＧＤ改変アルギネートバイオインクを使用すること、及び
真皮様構築物を形成すること
を含む、方法。
【請求項３３】
線維芽細胞なしでのＲＧＤ改変アルギネートバイオインクの使用であって、それによって線維芽細胞が、３Ｄバイオプリントされた足場上に植え付けられる、使用。
【請求項３４】
創薬及び／若しくは化粧品の試験のために、並びに／又は疾患モデルとして、前記真皮様構築物が使用される、請求項３２に記載の３Ｄバイオプリンティングの方法。
【請求項３５】
ヒト細胞と共に又はヒト細胞なしでの、３Ｄプリント用のバイオインクとしての、ＲＧＤ改変ナノセルロース及び／又はＲＧＤ改変アルギネートの使用であって、創薬及び／若しくは化粧品の試験のための、並びに／又は疾患モデルとして真皮様構築物を形成するための、使用。
【請求項３６】
ヒト細胞なしでの、３Ｄバイオプリント用のＲＧＤ改変アルギネートバイオインクの使用であって、創薬及び／若しくは化粧品の試験のための、並びに／又は疾患モデルとして組織を生産するための、使用。
【請求項３７】
創薬及び／若しくは化粧品の試験のための、並びに／又は疾患モデルとして組織を生産するための、３Ｄバイオプリント用の線維芽細胞を含有するＲＧＤ改変アルギネートバイオインクの使用。
【請求項３８】
再建術及び組織修復で使用される組織を生産するための、３Ｄバイオプリント用の線維芽細胞を含有するＲＧＤ改変アルギネートバイオインクの使用。
【請求項３９】
細胞と共に又はなしでの、３Ｄバイオプリントされた物体を構築するためＲＧＤ改変アルギネートバイオインクの使用であって、３Ｄバイオプリントされる物体は、足場、生きた組織、及び／又は臓器である、使用。
【請求項４０】
皮膚、軟骨、骨、大動脈、気管、半月板又は耳である、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の組織又は臓器。
【請求項４１】
創薬及び／又は化粧品の試験のための、及び／又は疾患モデルとしての、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の組織又は臓器の使用。
【請求項４２】
細胞と共に又はなしでの、真皮様構築物を３Ｄバイオプリントするための、ＲＧＤ改変アルギネート及びフィブリンバイオインクの使用。
【請求項４３】
創薬及び／又は化粧品の試験のための、及び／又は疾患モデルとしての、請求項４２に記載の前記真皮様構築物の使用。
【請求項４４】
ＲＧＤ改変アルギネートバイオインクの使用であって、ナノセルロース又はＲＧＤ改変ナノセルロースが、アルギネート及びフィブリンと共に使用される、使用。
【請求項４５】
ＲＧＤ改変アルギネートバイオインク、ＲＧＤ改変ナノセルロース、及びフィブリンを含む、３Ｄプリント可能なバイオインク。
【請求項４６】
ＲＧＤ改変アルギネート中に生きた線維芽細胞を含有する３Ｄバイオプリントされた生きた組織であって、バイオインクでプリントされたグリッド間のスペースが、栄養素、酸素、タンパク質及び成長因子の拡散を可能にする、組織。
【請求項４７】
ＲＧＤ改変アルギネート及びフィブリン中に生きた線維芽細胞を含有する３Ｄバイオプリントされた生きた組織であって、バイオインクでプリントされたグリッド間のスペースが、栄養素、酸素、タンパク質及び成長因子の拡散を可能にする、組織。
【請求項４８】
培地にＴＧＦベータを添加することによって、前記線維芽細胞が刺激される、請求項４６又は４７に記載の３Ｄバイオプリントされた生きた組織。
【請求項４９】
前記組織上でケラチノサイトが培養されて、表皮が構築され、皮膚様の組織が形成される、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の３Ｄバイオプリントされた生きた組織。
【請求項５０】
請求項１〜１５、４５、又は４６〜４９のいずれか一項で生産された組織の埋め込みによって、組織の欠陥を患う動物及び／又はヒトを処置する方法。
【請求項５１】
請求項１〜１５、４５、又は４６〜４９のいずれか一項で生産された組織の埋め込みによって、組織の欠損を患う動物及び／又はヒトを処置する方法。
【請求項５２】
Ｉ型コラーゲンの生産を上方調節するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の３Ｄプリント可能なバイオインクの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、３Ｄバイオプリンティング技術と共に使用される新規のバイオインクとして使用するための、フィブリンと組み合わせた、多糖類、例えばアルギネート及びナノセルロース、特にＲＧＤ接合アルギネート及びＲＧＤ接合ナノセルロースをベースとしたヒドロゲル、及びこれらの新規のバイオインクと同軸プリンティングニードルとの組合せに関する。これらの新規のバイオインクは、ヒト線維芽細胞の３Ｄ細胞培養及びヒト皮膚の成長に特に好適である。本発明において、ＲＧＤ接合アルギネートは、接合していないアルギネート含有の３Ｄバイオプリンティング用バイオインクの調合物に使用される。バイオインクの組成は、高い印刷忠実度を付与する最適なレオロジー特性が提供されるように設計される。ナノセルロースは、レオロジー特性を制御するために添加され、それに対してフィブリンは、線維芽細胞が増殖し、細胞外マトリックス、好ましくはＩ型コラーゲンを生産するのに好適な環境を提供するために添加される。本発明によって特許請求される重要な態様は、アルギネートに接合したＲＧＤペプチドの存在であり、これは、ヒト線維芽細胞の接着及び伸展に加えてフィブリンの存在に影響を与える。ヒト線維芽細胞の伸展は、細胞を活性化し、皮膚の主成分であるＩ型コラーゲン生産の上方調節を引き起こす。本明細書に記載されるバイオインクを同軸ニードル使用及び不使用でプリントしたところ、バイオプリンティング時の迅速な架橋と、高い細胞生存率を生じる最適な印刷忠実度の付与がもたらされた。本発明に記載されるバイオインクは、ヒト線維芽細胞と共に又はなしで、３Ｄバイオプリントできるが、細胞含有ヒドロゲルとして公知の様式でヒト線維芽細胞と混合されて３Ｄバイオプリントされることが好ましい。本発明の実施形態は、ヒト皮膚、特に皮膚の真皮層に関する。表皮は、皮膚の最上層であり、ケラチノサイト、メラニン細胞及びランゲルハンス細胞などの数々のタイプの細胞からなる。ケラチノサイトは、最も豊富な細胞型である。表皮は、真皮よりかなり薄く、典型的には、体の位置に応じて１〜４ｍｍの厚さである。本発明は、どのようにバイオインクを細胞と混合し、３Ｄバイオプリントし、培養して、化粧品、スキンケア製品の試験に使用でき、移植にも使用できる皮膚のモデルになるかを説明する。これはまた、ハイスループットの創薬、スクリーニング、及び毒性試験にも使用できる。代替として、これは、創傷中に直接埋め込むことができる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  皮膚は、人体の最も大きい器官である。皮膚は、２つの層で構成されており、そのうちの表皮は、最も外側の層であり、主としてケラチノサイトからなり、層化と呼ばれるプロセス中に、バリアとして作用するケラチンの高密度の層に変換される。第２の層である真皮は、主として細胞外マトリックスの生産に関与する皮膚線維芽細胞で構成される。真皮の細胞外マトリックスの主成分は、Ｉ型コラーゲンである。ヒトが老化する過程で、Ｉ型コラーゲンの生産は減少し、Ｉ型コラーゲンのネットワークと線維芽細胞との結合も減少する。これは、皮膚にダメージを与えるだけでなく、しわも生じさせる。化粧品及びスキンケア産業は、線維芽細胞の増殖を強化し、Ｉ型コラーゲンの生産を増加させることができる活性物質を含有する製品を開発することに取り組んできた。欧州では、２０１３年まで、新しい製品は、ほとんど動物試験により皮膚用製品を試験することによって評価された。２０１３年から欧州では化粧品の動物試験に対する禁止令が課されたことから、化粧品産業は、ヒト皮膚の他のモデルを開発するための研究を続けている。
【０００３】
[0003]  加えて、世界中で１１００万人の人が、医療介入を必要とする熱傷に苦しんでいる。毎年３００，０００人の人が熱傷により死亡する。２度、３度又は４度の火傷は、緊急処置を必要とする。現在のところ、これらの患者を助けるために皮膚移植が使用されている。自己皮膚移植が好ましいが、熱傷を負った患者は、移植可能なダメージを受けていない皮膚がないことが多い。患者自身の皮膚は、実験室で成長させることができ、何千人もの患者の命を救う助けになると予想される。
【０００４】
[0004]  ３Ｄバイオプリンティングは、組織や臓器のバイオファブリケーションを可能にする新興の技術である。この技術は、３Ｄバイオプリンターの動きを制御するためのＣＡＤファイルの青写真によって画定されたパターンで液状のバイオマテリアルと細胞を分配するロボットアームを含む３Ｄバイオプリンターの使用に基づく。３Ｄバイオプリンティング技術は、高分解能で異なる層を様々な細胞密度でプリントできるため、ヒト皮膚のバイオファブリケーションに使用できることが本明細書で教示される。３Ｄバイオプリンティングプロセスの結果は、使用されるバイオインクによって左右されることになる。バイオインクは、３Ｄバイオプリンティング中の好適なレオロジー特性、細胞生存を提供する役割を有し、さらに組織発達中の足場として作用する役割も有する。
【０００５】
[0005]  細胞外マトリックスを活発に生産するために、ヒト線維芽細胞を付着させる必要がある。自然の環境では、このような付着は、膜貫通型の細胞接着受容体であるインテグリンを介して細胞と相互作用するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（RGD）ドメインを含有するフィブロネクチンに結合することによって起こる。アルギネートは、長年にわたり、細胞のカプセル化のためのバイオマテリアルとして使用されてきており、多くの生物医学的な用途を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]  細胞は、純粋なアルギネートには結合しない。様々なペプチドの接合が、細胞の付着を容易にし、それを促進する。ペプチドがカップリングされたアルギネートは、Ｊ．Ａ．Ｒｏｗｌｅｙ，Ｇ．Ｍａｄｌａｍｂａｙａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｏｎｅｙ，Ａｌｇｉｎａｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ａｓ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０（１９９９），４５−５３によって記載されているような水性カルボジイミドの化学的性質を使用して調製することができる。この革新的技術に記載される材料の例は、ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、ＮｏｖａＭａｔｒｉｘ、Ｎｏｒｗａｙによって生産された、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  Ｇ／Ｍ  ＲＧＤ（GRGDSPがカップリングされた高G又は高Mのアルギネート）、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  Ｇ  ＶＡＰＧ（VAPGがカップリングされた高Gのアルギネート）、ＮＯＶＡＴＡＣＨ  Ｍ  ＲＥＤＶ（REDVがカップリングされた高Mのアルギネート）である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0007]  本発明では、新しいバイオインク、例えば、ＲＧＤ改変アルギネート；ナノセルロース又はＲＧＤ改変ナノセルロースが添加された又は添加されていないフィブリン；及びアルギネートが添加されたフィブリンで構成されるバイオインクの調製が記載される。本発明はまた、ヒト線維芽細胞と共に、このようなプリントのためにバイオインクを使用することも教示する。ＲＧＤ改変アルギネートは、線維芽細胞の表面におけるインテグリンのための付着部位を提供し、結果として細胞の延伸が起こる。細胞の延伸は、Ｉ型コラーゲンの生産を上方調節することが示されており、それによって、このような３Ｄバイオプリントされた構築物が、化粧品又はスキンケア製品中の活性物質を試験するための真皮モデルとして使用するために、又は皮膚移植のために好ましいものになる。本発明はまた、３Ｄバイオプリンティングプロセス中にアルギネートを架橋するために、同軸ニードルを使用することも記載する。真皮が発達したら、このような真皮層の上部にケラチノサイトを植え付けるか又は３Ｄバイオプリントすることができ、その間に完全な皮膚を発達させる。
【０００８】
[0008]  添付の図面は、本発明の実施形態の特定の態様を例示するものであり、本発明を限定又は定義するのに使用されないこととする。図面は、記載された説明と共に、本発明の特定の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[0009]真皮構築物をプリントするＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎからの３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥを示す図である。
【図２】[0010]好ましい印刷忠実度を有する線維芽細胞含有バイオインク構築物を示す図である。
【図３】[0011]ＲＧＤ−アルギネートを含むプリントされた構築物における細胞生存を例示する図である。
【図４】[0012]１４日の培養後のプリントされた構築物における細胞の形態を示す図である。ａ）改変されていないバイオインク、ｂ）ＲＧＤ改変アルギネート、ｃ）ＲＧＤ改変アルギネート及び培地へのＴＧＦベータの添加。
【図５】[0013]同軸ニードルを使用した３Ｄバイオプリンティング及び好ましいニードルの配置の実例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
[0014]  本発明は、様々な特徴を有する特定の実施形態を参照しながら説明されている。本発明の範囲又は本質から逸脱することなく本発明の実施において様々な改変及びバリエーションをなし得ることは、当業者には明らかであると予想される。当業者であれば、これらの特徴は、所与の適用又は設計の必要条件と詳細に基づき、単独で、又はあらゆる組合せで使用される可能性があることを認識していると予想される。様々な特徴を含む実施形態もまた、そのような様々な特徴からなっていてもよいし、又はそれらから本質的になっていてもよい。本発明の他の実施形態は、本発明の詳細と実施の考察から当業者には明らかであると予想される。提供される本発明の説明は実際に単なる例示であり、したがって、本発明の本質から逸脱しないバリエーションは、本発明の範囲内であること意図される。
【００１１】
[0015]  本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載の、又は図面で例示された構築の詳細及び要素の配置に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施又は実行することが可能である。また、本明細書において採用される表現及び用語は、説明の目的のためであり、限定とみなすべきではないことも理解されたい。
【００１２】
[0016]  本発明の実施形態は、記載された方法によって調製されたＲＧＤ改変アルギネートバイオインク製品を包含し、３Ｄバイオプリンティングのオペレーションで該製品を使用することを包含する。
【００１３】
[0017]  図１は、真皮構築物をプリントするＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎからの３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥを示す図である。これらの３Ｄプリントされた真皮構築物は、培養されて、化粧品、スキンケア製品の試験に使用でき、移植にも使用できる皮膚のモデルにすることができる。これらはまた、ハイスループットの創薬、スクリーニング、及び毒性試験にも使用できる。代替として、これらは、創傷中に直接埋め込むことができる。
【００１４】
[0018]  図２は、好ましい印刷忠実度を有する線維芽細胞含有バイオインク構築物を示す図である。これは、構築物内の細胞のために栄養素及び酸素を輸送するのに重要である。
【００１５】
[0019]  図３は、ＲＧＤ−アルギネートを含むプリントされた構築物における細胞生存を例示する図である。緑色のスポットは、生きている細胞を表し、一方で赤色のスポットは、死んだ細胞を示す。この図において、細胞生存率は、７０％より高い。
【００１６】
[0020]  図４は、１４日の培養後のプリントされた構築物における細胞の形態を示す図である。緑色のスポットは、細胞骨格を表し、青色のスポットは、細胞核を表す。
ａ）改変されていないバイオインク、ｂ）ＲＧＤ改変アルギネート、ｃ）ＲＧＤ改変アルギネート及び培地へのＴＧＦベータの添加。
【００１７】
[0021]  図５は、同軸ニードルを使用した３Ｄバイオプリンティング及び好ましいニードルの配置の実例を示す図である。同軸ニードルは、バイオプリンティング時のより速い架橋をもたらし、最適な印刷忠実度を与え、それにより好ましい実施形態において、高い細胞生存率がもたらされる。
【００１８】
[0022]  本発明のより優れた理解を容易にするために、以下の一部の実施形態の特定の態様の実施例を記載する。以下の実施例は、本発明の範囲を限定するか、又はそれを定義すると決して理解されないものとする。
【実施例】
【００１９】
[0023]  実施例１
[0024]  真皮様モデルの３Ｄバイオプリンティング
[0025]  ２つの異なるバイオインクを調製した。第１のバイオインクは、レオロジー特性を制御するためにナノセルロースが添加された純粋なアルギネートで構成した。第２のバイオインクは、ＲＧＤ改変アルギネートをナノセルロースと組み合わせて、レオロジー特性を制御することによって調製した。両方のバイオインクとも、優れた印刷特性を有していた。６００万個の初代ヒト線維芽細胞の継代番号３を融解し、２つの１５０ｃｍ２のＴ−フラスコに植え付けた。培養物がおよそ９０％の密集度に達したら、ＴｒｙｐＬＥを使用して細胞を回収し、フラスコを穏やかにタップして細胞を表面から取り外した。細胞をトリパンブルー染色で計数し（細胞１９０万個／ｍＬ）、細胞生存率を計算して、細胞が生きていることを確認した。次いで細胞を遠心分離し、培地に再懸濁し、次いでＴ１５０フラスコに細胞２，５００個／ｃｍ２で植え付けた。培地（DMEM、１％GlutaMAX、１０％FBS及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有、フェノールレッド含有）を１週間当たり３回交換した。細胞をバイオインクと共に混合して、最終濃度を細胞５２０万個／ｍｌにし、次いで慎重にプリンターカートリッジに移した。構築物を、ＣＥＬＬＩＮＫ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎからの３ＤバイオプリンターＩＮＫＲＥＤＩＢＬＥ（図１を参照）を使用して、６ｍｍ×６ｍｍ×１ｍｍの寸法を有する３層のグリッドパターンでプリントした（圧力：２４ｋＰａ、フィード速度：１０ｍｍ／秒）。プリンティング後、構築物を１００ｍＭのＣａＣｌ２で５分架橋した。その後、ＣａＣｌ２を除去し、構築物を培地で濯いだ。構築物を、インキュベーター中、３７℃で１４日間静置培養し、３日毎に培地を交換した。構築物の一部に、ＴＧＦベータを培地１ｍｌ当たり５ｎｇの濃度で添加した。１４日後、構築物を細胞生存率、形態及びコラーゲン生産について分析した。１日目、７日目、及び１４日目における静置培養物の各バイオインクからの３つの構築物に、ライブ／デッドセルイメージングキット（LIVE/DEAD Cell Imaging Kit）（R37601 Life Technologies）を使用して生死に関する染色を実行した。図３は、全てのプリントされた構築物についての優れた細胞生存率（７０％より高い）を示す。１４日目に、静置培養構築物を共焦点顕微鏡を使用して画像化した。ＦＩＴＣを使用して細胞骨格（緑色）を可視化し、ＤＡＰＩを使用して細胞の核（青色）を可視化した。画像を４×、１０×、及び２０×の倍率で撮り、細胞の形態を分析した。ＩｍａｇｅＪを使用して、細胞骨格及び核の画像を重ねた。図４ａ）は、ナノセルロースが添加されたアルギネートバイオインク中の線維芽細胞の形態を示す。細胞は丸みを帯びており、延伸されていない。図４ｂ）は、ナノセルロースが添加されたＲＧＤ改変アルギネートバイオインク中の線維芽細胞を示す。細胞はアルギネートと接合したＲＧＤペプチドに付着できたため、細胞は延伸された。図４ｃ）は、ＴＧＦベータを添加して培養された、ナノセルロースが添加されたＲＧＤ改変アルギネートバイオインク中の線維芽細胞を示す。作用は、細胞増殖の増加、及び延伸の継続として記録される。ＲＧＤで改変されなかったバイオインクでプリントされた細胞では、これらの作用は見られなかった。構築物をＰＣＲ��用いて分析したところ、ＲＧＤ改変アルギネートを有する構築物は、Ｉ型コラーゲンの生産に関する遺伝子の上方調節を示した。
【００２０】
[0026]  実施例２
[0027]  ナノセルロース、アルギネートＲＧＤ及びフィブリンバイオインクを用いた完全な皮膚の３Ｄバイオプリンティング
[0028]  Ｓｉｇｍａより購入したフィブリノーゲン粉末、並びにＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓから得たＧＲＧＤＳＰ−ペプチドであるＮｏｖａＭａｔｒｉｘと接合した３％ナノセルロース及び２．６％アルギネートのヒドロゲルから、無菌技術を使用して、バイオインクを調製した。成分を均一なヒドロゲルに混合することによってインクを作製した。フィブリノーゲンを含有するインクの場合、ナノセルロース及びアルギネートのヒドロゲルをまず混合し、フィブリノーゲンを、Ｆｉｓｈｅｒ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓから得た２００μＬ／１０ｍｇのフィブリノーゲントリス緩衝塩類溶液（TBS）で溶解させた。ＳｐｅｅｄＭｉｘｅｒ（商標）ＤＡＣ１５０．１ＦＶ−Ｋを使用することによって、フィブリノーゲンをヒドロゲル中に混合して、フィブリノーゲン、ナノセルロース及びアルギネートで構成された均一なヒドロゲルを得た。バイオインク１ｍｌ当たり１０ｍｇから５００ｍｇの範囲の様々な量のフィブリノーゲンを、ヒドロゲルバイオインクに添加した。２つの異なるタイプの細胞、すなわち、初代成人ヒト皮膚線維芽細胞（aHDF）及び初代ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）を使用した。これらは両方とも、ＬｉｆｅＬｉｎｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。これらを両方とも、供給元からのプロトコールに従って、細胞特異的な培養培地（それぞれFibroLife（登録商標）及びDermaLife（登録商標））中で培養し、その後、バイオインクと混合し、バイオプリントした。アルギネートを架橋して同時にフィブリノーゲンを重合できるように、１００ｍＭのＣａＣｌ２中１０ユニット／ｍｌのトロンビンを用いて、トロンビン溶液を調製した。選ばれた構築物モデルは、２層のグリッドパターンであった。ａＨＤＦを、細胞１０００万個／ｍｌの濃度でバイオインク中に混合した。それより低い細胞濃度及びそれより高い細胞濃度のどちらも使用することができる。使用されたプリンターは押出しバイオプリンター（INKREDIBLE（登録商標）、CELLINK（登録商標））であった。フィブリンベースのバイオインクの場合の印圧は、１２〜２３ｋＰａであった。プリンティング後、１００ｍＭのＣａＣｌ２中のトロンビン溶液を使用して構築物を５分間架橋及び重合し、その後、培養培地に入れた。次いで構築物をＦｉｂｒｏＬｉｆｅ（登録商標）培地中で２週間培養した。２週間後、ＨＥＫ細胞を植え付け（３０００万個／ｍｌ培地）、サンプルをさらに２週間インキュベートした。７日及び１４日及び２８日に分析用サンプルを採った。構築物をスライスして、プロコラーゲンをマッソントリクローム染色で染色した後、構築物中でのコラーゲン生産の可視化を達成した。細胞の形態及びＩ型コラーゲンの生産に対して、フィブリン添加のプラス効果がみられた。
【００２１】
[0029]  実施例３
[0030]  同軸ニードルを用いた構築物の３Ｄバイオプリンティング
[0031]  線維芽細胞含有ＲＧＤ−アルギネートで構成される構築物を、同軸ニードルを使用した３Ｄバイオプリンティングによって調製した（図５を参照）。ニードルの内部は、ＲＧＤ−アルギネートと混合された線維芽細胞でプリントするのに使用され、それに対してニードルの外部は、ＣａＣｌ２の１００ｍｍｏｌ溶液を射出するのに使用された。この方法を使用して、優れた印刷忠実度が達成された。別の実験において、線維芽細胞含有ＲＧＤ−アルギネートをフィブリノーゲンと組み合わせ、同軸ニードルを使用して３Ｄバイオプリントした。ニードルの内部は、ＲＧＤ−アルギネート及びフィブリノーゲンと混合された線維芽細胞をプリントするのに使用され、それに対してニードルの外部は、１００ｍｍｏｌのＣａＣｌ２溶液中に溶解させたトロンビン溶液を射出するのに使用された。この方法を使用して、優れた印刷忠実度が達成された。
【００２２】
[0032]  当業者は、開示された特徴は、所与の適用又は設計の必要条件と詳細に基づき、単独で、あらゆる組合せで使用されてもよいし、又は省略されてもよいことを認識していると予想される。実施形態が特定の特徴を「含む」と言及される場合、その実施形態は、代替として、それらの特徴のいずれか１つ又は複数「からなる」又は「から本質的になる」でもよいことを理解されたい。本発明の他の実施形態は、本発明の詳細と実施の考察から当業者には明らかであると予想される。
【００２３】
[0033]  特に、本明細書において値の範囲が示されているが、その範囲の上限と下限の間の各値も具体的に開示されることに留意されたい。これらのより狭い範囲の上限及び下限が、独立して、その範囲に包含される場合もあるし、又は同様に排除される場合もある。単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を包含する。詳細と実施例は、実際には例示とみなされ、本発明の本質から逸脱しないバリエーションは本発明の範囲内に含まれることが意図される。さらに、この開示で引用された参考文献の全ては、それぞれ個々に参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられ、そのようなものとして、本発明の実現可能な開示を補充する効率的な方法を提供することに加えて、当業界における通常の技術レベルを詳述する背景も提供することが意図される。
【００２４】
（要約）
本発明は、ヒト皮膚、特に真皮の３Ｄバイオプリンティングのための新規のバイオインクとしての、ナノセルロース及び／又はフィブリンが添加された及び添加されていないＲＧＤ接合アルギネートに基づくヒドロゲルの使用に関する。ＲＧＤ接合アルギネートは、Ｉ型コラーゲンを生産する遺伝子の上方調節に寄与する細胞の接着及び延伸を引き起こすヒト線維芽細胞のための接着部位を提供する。本発明において、ＲＧＤ接合アルギネートは、３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインクの成分の１つとして使用される。ここに記載される別の革新は、アルギネート及びＲＧＤ改変アルギネートのバイオインクを用いて３Ｄバイオプリントする場合に同軸ニードルを使用することである。同軸ニードルは、３Ｄバイオプリンティングのオペレーション時にバイオインクを架橋することを可能にし、したがって細胞外マトリックスの高い細胞生存率、増殖及び生産に必要な高い印刷忠実度の達成を可能にする。本発明において、新規のＲＧＤ改変アルギネートバイオインクは、ヒト線維芽細胞と共に３Ｄバイオプリントされ、得られた構築物は、線維芽細胞の高い細胞生存率、高い細胞増殖、高い程度の延伸及びＩ型コラーゲンの高い生産性を示す。本発明を用いてバイオファブリケーション化された細胞のバイオインク構築物は、化粧品及びスキンケア製品の活性成分、特に皮膚再生に使用されるものを試験するのに理想的である。また、ダメージを受けた又は熱傷を負った皮膚を有する患者の皮膚修復のための皮膚移植として使用されることも理想的である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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