(57)【要約】ＬＡＧ−３抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬的用途が提供される。さらに、ＬＡＧ−３抗体のＣＤＲを含むキメラ抗体、ヒト化抗体、ＬＡＧ−３抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、および、該医薬組成物の抗悪性腫瘍薬としての用途が提供される。特に、免疫細胞を含む、疾病の処置のための薬剤の調製における、ヒト化ＬＡＧ−３抗体の用途が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）、または以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される１つ以上のＣＤＲ領域配列を含む、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント：
（ｉ）配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１に示すＨＣＤＲ領域；および配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示すＬＣＤＲ領域；または
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示すＨＣＤＲ領域；および配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示すＬＣＤＲ領域。
【請求項２】
抗体の重鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、抗体の重鎖可変領域が、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、抗体の軽鎖可変領域が、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
マウス抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体の軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖ＦＲ領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖ＦＲ領域を含み；抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスＩｇＧ１またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含むか、マウスＩｇＧ２またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含むか、マウスＩｇＧ３またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含む、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
マウス抗体が、配列番号５に示す重鎖可変領域と、配列番号６に示す軽鎖可変領域とを含む、または、配列番号７に示す重鎖可変領域と、配列番号８に示す軽鎖可変領域とを含む、請求項４に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
抗体軽鎖が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含み；抗体重鎖が、さらに、マウスＩｇＧ１またはその変異体由来の重鎖定常領域を含むか、マウスＩｇＧ２またはその変異体由来の重鎖定常領域を含むか、マウスＩｇＧ３またはその変異体由来の重鎖定常領域を含む、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
キメラ抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域が、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ７−４−１＊０２およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し、好ましくは、ＩＧＨＶ７−４−１＊０２由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびｈｊｈ６．１由来のＦＲ４、または、その変異配列を含み；あるいは、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域が、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１−３＊０１およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し、好ましくは、ＩＧＨＶ１−３＊０１由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびｈｊｈ６．１由来のＦＲ４、または、その変異配列を含む、請求項９に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号２１または配列番号２９に示す配列であるか、これらのアミノ酸配列に少なくとも８５％の同一性を有し、好ましくは、重鎖可変領域に１〜１０個のアミノ酸変化を有する、請求項１０に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ヒト化抗体の重鎖ＦＲ配列が０〜１０個のアミノ酸逆突然変異を有し；好ましくは、逆突然変異が、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ７−４−１＊０２およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列の重鎖ＦＲ領域に存在し、かつ、Ｅ４６Ｋ、Ｒ３８Ｋ、Ｖ９３ＴおよびＹ９５Ｆからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸逆突然変異である；または、好ましくは、逆突然変異が、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１−３＊０１およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列の重鎖ＦＲ領域に存在し、かつ、Ｆ２９Ｌ、Ａ９７Ｔ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｉ７０Ｌ、Ｒ７２ＶおよびＴ７４Ｋからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸逆突然変異である、請求項１０に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である；または、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である、請求項１０に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ配列が、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびｈｊｋ４．１の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し；かつ、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＨＶ１−３９＊０１由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびｈｊｈ４．１由来のＦＲ４、または、その変異配列を含む、請求項９に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号２２または配列番号３０に示す配列であるか、これらのアミノ酸配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列であり、好ましくは、軽鎖可変領域に１〜１０個のアミノ酸変化を有する、請求項１４に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ヒト化抗体の軽鎖ＦＲ配列が、０〜１０個のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、Ｄ７０Ｑ、Ｆ７１Ｙ、Ｉ４８ＶおよびＡ４３Ｓからなる群から選択される１つ以上の逆突然変異を有し、または、好ましくは、Ｌ４６Ｒ、Ｇ６６Ｒ、Ｓ６０Ｋ、Ｐ４４Ｆ、Ｙ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｉ２１ＬおよびＴ８５Ｄからなる群から選択される１つ以上の逆突然変異を有する、請求項１４に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である；または、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である、請求項１４に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
ヒト化抗体が、
（ａ）重鎖可変領域配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である；
あるいは、重鎖可変領域配列が、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である、
重鎖可変領域、および／または
（ｂ）軽鎖可変領域配列が、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である；
あるいは、軽鎖可変領域配列が、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７の配列からなる群から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列である、
軽鎖可変領域
を含む、請求項９に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
抗体が、以下からなる群から選択される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、請求項９に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント：
１）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
２）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
３）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
４）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
５）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
６）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
７）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
８）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
９）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１０）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１１）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
１２）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
１３）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１４）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１５）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
１６）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
１７）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１８）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１９）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
２０）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
２１）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
２２）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
２３）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
２４）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
２５）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
２６）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
２７）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
２８）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
２９）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
３０）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
３１）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
３２）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
３３）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
３４）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
３５）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；および
３６）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域。
【請求項２０】
キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来する重鎖定常領域を含み、好ましくはヒトＩｇＧ４またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号３８に示す重鎖定常領域を含み；
キメラ抗体またはヒト化抗体の軽鎖が、さらに、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖、またはその変異体に由来する軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは配列番号３９に示す軽鎖定常領域を含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＬＡＧ−３との結合について競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
治療上有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントと、１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、ら選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞である、宿主細胞。
【請求項２６】
ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、請求項２５に記載の宿主細胞において抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させること、および、該宿主細胞から抗体またはその抗原結合フラグメントを単離することを含む、方法。
【請求項２７】
対象において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、治療上有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に投与し、または、請求項２２に記載の医薬組成物または請求項２３に記載の核酸を対象に投与し、それによって、対象における腫瘍の成長を阻害することを含む、方法。
【請求項２８】
病原性Ｔ細胞の関与に関連する疾病または症状の処置のための医薬の調製における、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＬＡＧ−３抗体または抗原結合フラグメント、または請求項２２に記載の医薬組成物、または請求項２３に記載の核酸の使用であって、該疾病または症状が、好ましくは癌であり、癌が、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、腸癌、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌、および血液系悪性腫瘍（骨髄腫、並びに、慢性および急性白血病を含む）を含むがこれらに限定されない、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、ＬＡＧ−３抗体、その抗原結合フラグメント、ＬＡＧ−３抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体またはヒト化抗体、並びに、ＬＡＧ−３抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、並びに、抗がん剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ＬＡＧ−３またはＣＤ２２３としても知られるリンパ球活性化遺伝子３は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、免疫細胞の様々な機能および生存サイクルを負に調節することができる。研究により、ＬＡＧ−３が、ウイルス感染、自己免疫疾患、および、腫瘍誘導性免疫系機能不全において重要な役割を果たすことが示されている。ＬＡＧ−３の機能に影響を及ぼすことにより、これらの疾病の発症中の免疫機能不全の状態を改善し、疾患の予後を改善することができる。
【０００３】
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーとして、ＬＡＧ−３は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの、３つの領域から構成される。成熟ＬＡＧ−３分子は、Triebel et al. in 1990 (J Exp Med, 1990, 171 (5): 1393-405)により最初に発見され、７０ｋＤａの相対分子量である４７０個のアミノ酸から成る。ＬＡＧ−３は、ＣＤＬＡ−４およびＰＤ−１と同様に、負の共刺激分子であり、その活性化により、リンパ球の機能を負に調節し得ることが見出されている。構造的に、ＬＡＧ−３は、ＣＤ４と密接に関連しているが、ＣＤ４とは逆の機能を有する。例えば、ＬＡＧ−３分子はＣＤ４分子と高い類似性を有し、共に、ＭＨＣ−ＩＩ（主要組織適合抗原）クラス分子に結合し得る。しかしながら、ＬＡＧ−３のＭＨＣ−ＩＩ分子に対する結合活性は、ＣＤ−４よりも高い。したがって、ＣＤ４＋Ｔリンパ球細胞によって誘導されるＴＣＲ活性化に介入し、Ｔリンパ球の活性化を阻害する(Curr Opin Immunol, 2009, 21(2):179-86; Eur  J  Immunol, 2003, 33 (4): 970-9)。インビトロの研究において、ＬＡＧ−３は、抗原によって誘導されるＴリンパ球の増殖を阻害し得ることが示されている。ＬＡＧ−３の遮断は、Ｔリンパ球の活性化および増殖を改善し、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）により分泌されるサイトカインを改善するであろう。Huang et al.は、活性化されたＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞上のＬＡＧ−３のレベルが有意に増加したこと、および、ＬＡＧ−３が、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇが最大の免疫抑制効果を発揮するのに必要な条件であることを示した（Immunity, 2004, 21 (4): 503-13）。さらに、抗ＬＡＧ−３抗体はまた、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔリンパ球の恒常性を維持し、ＬＡＧ−３の遮断は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球が腫瘍細胞を殺す能力を有意に増強するであろう(J Clin Invest, 2007, 117 (11): 3383-92)。疾病についてのいくつかの研究はまた、ＬＡＧ−３が疾病の発症および進行の調節において重要な役割を果たすことを示している。Gandhi et al．は、ヒトリンパ腫組織のＴリンパ球におけるＬＡＧ−３の発現レベルがＴリンパ球機能不全と関連しており、ＬＡＧ−３＋Ｔリンパ球の排除が、Ｔリンパ球による腫瘍細胞の除去能を有意に増強し得ることを立証した（Blood, 2006, 108(7):2280-9）。本結果は、ＬＡＧ−３が免疫細胞表面における重要な抑制分子であり、Ｔリンパ球に対して有意な負の調節効果を有することを示している。
【０００４】
ＬＡＧ−３は主に、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、およびＤＣ細胞上に発現している(Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (11): 5744-9. Eur J Immunol, 2005, 35 (7): 2081-8; J Immunol, 2009, 182 (4): 1885-91)。ＬＡＧ−３は、免疫抑制分子のクラスであり、ＴＣＲの共受容体を構成する構成成分の１つである。ＬＡＧ−３は、Ｔリンパ球により誘導されるＴＣＲ活性化に介入して、Ｔリンパ球の活性化において負の調節性の役割を果たす。いくつかの疾病において、ＬＡＧ−３の発現が増加し、それに付随する免疫抑制が観察された。Gandhi et al. は、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｇｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）を有する患者由来の血液および腫瘍組織のリンパ球が、ＬＡＧ−３を高発現すること；また、ＬＡＧ−３陽性Ｔ細胞を除去し、抗腫瘍機能を回復させ、サイトカイン分泌を増加させると、腫瘍組織において特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能が明らかに損なわれることを見出した。ＬＡＧ−３の発現は、特定のＴ細胞の免疫機能の負の調節と関連しており、ＬＡＧ−３分子の機能を阻害することにより、Ｔ細胞の抗腫瘍効果が増強することができ、よってＬＡＧ−３分子は、腫瘍免疫療法の潜在的標的であり得ることが推測された（Blood, 2006, 108 (7): 2280-9）。
【０００５】
現在、ＢＭＳやノバルティスなどのいくつかの多国籍製薬会社が、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することによって、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強し、腫瘍に対する患者自身の免疫応答を最大化し、続いて腫瘍細胞を殺す目的を達成する、ＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体の研究に従事している。現在関連する特許は、ＷＯ２０１００１９５７０、ＷＯ２０１４００８２１８、ＷＯ９５３０７５０、ＷＯ２００４０７８９２８、ＷＯ２００８１３２６０１、ＷＯ２０１４１４０１８０およびＷＯ２０１５１３８９２０などである。
【０００６】
本発明は、高い親和性、高い選択性、および高い生物学的活性を有する、ＬＡＧ−３抗体を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の概要
本発明は、以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）、または以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）に少なくとも８５％の同一性を有する配列から選択される１つ以上のＣＤＲ領域を含む、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する：
（ｉ）配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に示すＨＣＤＲ領域；並びに、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示すＬＣＤＲ領域；または
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示すＨＣＤＲ領域；並びに、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示すＬＣＤＲ領域。
【０００８】
本発明の別の好ましい実施形態において、重鎖可変領域が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列を含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【０００９】
本発明の別の好ましい実施形態において、重鎖可変領域が、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４にそれぞれ示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列を含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１０】
本発明の別の好ましい実施形態において、軽鎖可変領域が、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列を含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１１】
本発明の別の好ましい実施形態において軽鎖可変領域が、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０にそれぞれ示すＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含むか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列を含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１２】
本発明の別の好ましい実施形態において、マウス抗体またはそのフラグメントである、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１３】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体の軽鎖可変領域が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖ＦＲ領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖ＦＲ領域を含み、抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスＩｇＧ１またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含むか、マウスＩｇＧ２またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含むか、マウスＩｇＧ３またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施形態において、配列番号５に示す重鎖可変領域と、配列番号６に示す軽鎖可変領域とを含む、本発明のマウスＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１５】
本発明の別の好ましい実施形態において、配列番号７に示す重鎖可変領域と、配列番号８に示す軽鎖可変領域とを含む、本発明のマウスＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１６】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体軽鎖が、さらに、マウスκ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含むか、マウスλ鎖またはその変異体由来の軽鎖定常領域を含み；抗体の重鎖可変領域が、さらに、マウスＩｇＧ１またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含むか、マウスＩｇＧ２またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含むか、マウスＩｇＧ２３またはその変異体由来の重鎖ＦＲ領域を含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１７】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラ抗体またはそのフラグメントである、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体またはそのフラグメントである、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域が、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ７−４−１＊０２およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し；ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ７−４−１＊０２由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびｈｊｈ６．１由来のＦＲ４、または、その変異配列を含み；好ましくは、ヒト化抗体の重鎖ＦＲ配列が０〜１０個のアミノ酸逆突然変異を有し、より好ましくは、Ｅ４６Ｋ、Ｒ３８Ｋ、Ｖ９３ＴおよびＹ９５Ｆからなる群から選択される１つ以上の逆突然変異を有する、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号２１に示す配列であるか、当該配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列であり、好ましくは、重鎖可変領域に１〜１０個のアミノ酸変化が存在する、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５の配列を含むか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列である、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体重鎖可変領域の重鎖ＦＲ領域が、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１−３＊０１およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列、または、その変異配列に由来し；好ましくは、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ１−３＊０１由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびｈｊｈ６．１由来のＦＲ４、または、その変異配列を含み；ヒト化抗体の重鎖ＦＲ配列が０〜１０個のアミノ酸逆突然変異を有し、より好ましくは、Ｆ２９Ｌ、Ａ９７Ｔ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６８Ａ、Ｉ７０Ｌ、Ｒ７２ＶおよびＴ７４Ｋからなる群から選択される１つ以上の逆突然変異を有する、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号２９に示す配列であるか、または、上述の配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列であり；好ましくは、重鎖可変領域に１〜１０個のアミノ酸変化が存在する、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の重鎖可変領域配列が、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３の配列から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列である、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ配列が、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびｈｊｋ４．１の組み合わせ配列、並びに、その変異配列に由来し、かつ、ヒト生殖系列軽鎖ＩＧＨＶ１−３９＊０１由来のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびｈｊｈ４．１由来のＦＲ４、並びに、その変異配列を含む、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号２２に示す配列であるか、当該配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列であり；好ましくは、軽鎖可変領域に１〜１０個のアミノ酸変化が存在する、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖ＦＲ配列が０〜１０個のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、Ｄ７０Ｑ、Ｆ７１Ｙ、Ｉ４８ＶおよびＡ４３Ｓからなる群から選択される１つ以上の逆突然変異を有する、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の配列から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列である、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号３０に示す配列であるか、当該配列に少なくとも８５％の同一性を有する配列であり；好ましくは、軽鎖可変領域に０〜１０個のアミノ酸配列が存在する、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。これらのアミノ酸変化は、当業界における親和性成熟の技術に基づいて作製されてよい。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖ＦＲ配列が、０〜１０個のアミノ酸逆突然変異を有し、好ましくは、Ｌ４６Ｒ、Ｇ６６Ｒ、Ｓ６０Ｋ、Ｐ４４Ｆ、Ｙ３６Ｌ、Ｋ４２Ｇ、Ｉ２１ＬおよびＴ８５Ｄからなる群から選択される１つ以上の逆突然変異を有する、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３１】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体の軽鎖可変領域配列が、配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６または配列番号３７の配列から選択されるか、これらの配列に少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する配列である、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３２】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体が、
（ａ）配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択される配列に、少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列；および
（ｂ）配列番号２２、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８からなる群から選択される配列に、少なくとも８５％の同一性を有する、軽鎖可変領域配列
を含む、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３３】
本発明の別の好ましい実施形態において、ヒト化抗体が、
（ａ）配列番号２９、配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３からなる群から選択される配列に、少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する、重鎖可変領域配列；および
（ｂ）配列番号３０、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択される配列に、少なくとも８５％（好ましくは９５％）の同一性を有する、軽鎖可変領域配列
を含む、本発明のヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体が、以下からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：
１）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
２）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
３）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
４）配列番号２１の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
５）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
６）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
７）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
８）配列番号２３の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
９）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１０）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１１）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；
１２）配列番号２４の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域；
１３）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域；
１４）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２６の軽鎖可変領域；
１５）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２７の軽鎖可変領域；および
１６）配列番号２５の重鎖可変領域および配列番号２８の軽鎖可変領域。
【００３５】
本発明の別の好ましい実施形態において、抗体が、以下からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域の組み合わせを含む、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される：
１）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
２）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
３）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
４）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
５）配列番号２９の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
６）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
７）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
８）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
９）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
１０）配列番号３１の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
１１）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１２）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１３）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
１４）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；
１５）配列番号３２の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域；
１６）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３０の軽鎖可変領域；
１７）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３４の軽鎖可変領域；
１８）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３５の軽鎖可変領域；
１９）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３６の軽鎖可変領域；および
２０）配列番号３３の重鎖可変領域および配列番号３７の軽鎖可変領域。
【００３６】
本発明の別の好ましい実施形態において、キメラ抗体またはヒト化抗体の重鎖が、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ４またはその変異体に由来する重鎖定常領域を含み、最も好ましくは、配列番号３８に示す重鎖定常領域を含む、本明細書に記載されるキメラまたはヒト化ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００３７】
当該キメラ抗体または当該ヒト化抗体の軽鎖は、さらに、ヒトκ鎖、ヒトλ鎖またはその変異体に由来する軽鎖定常領域を含み、最も好ましくは、配列番号３９に示す軽鎖定常領域を含む。
【００３８】
本発明はさらに、治療上有効量の本明細書に記載されるＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントと、１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、上記に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＬＡＧ−３との結合について競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００４０】
本発明はさらに、上述のＬＡＧ−３抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【００４１】
本発明はさらに、上述の単離核酸を含む発現ベクターを提供する。
【００４２】
本発明はさらに、上記に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であって、宿主細胞が、原核細胞および真核細胞からなる群から選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞である、宿主細胞を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、上記に記載の宿主細胞において、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させること、および、該宿主細胞から抗体またはその抗原フラグメントを単離することを含む、方法を提供する。
【００４４】
本発明はさらに、対象において腫瘍細胞の成長を阻害するための方法であって、治療上有効量の本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、または、これを含む医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における腫瘍の成長を阻害することを含む、方法を提供する。
【００４５】
本発明はさらに、対象において腫瘍細胞の成長を阻害することにおける、上述のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、またはこれを含有する医薬組成物の使用を提供する。
【００４６】
本発明はさらに、対象において腫瘍細胞の成長を阻害するための医薬の調製における、当該ＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント、またはこれを含有する医薬組成物の使用を提供する。
【００４７】
本発明はさらに、免疫細胞の関与に関連する疾病または症状の処置のための医薬の調製における、本発明のＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供し、該疾病または症状が、好ましくは癌である。本明細書に記載される癌には、卵巣癌、メラノーマ（例えば、転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、腸癌（例えば、結腸および小腸癌）、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌（例えば、腎明細胞癌（ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌、および血液系悪性腫瘍（骨髄腫および慢性／急性白血病を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ヒト化抗ＬＡＧ−３抗体は、ＳＥＢにより活性化されたＴリンパ球からのＩＬ−２サイトカインの分泌を増強する。結果は、ヒト化ＬＡＧ−３抗体候補、Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５が、活性化したリンパ球からのサイトカインＩＬ−２の分泌を増強し得ること、および薬剤濃度の投与量効果により増強し得ることを示す。
【図２】Ｕ−８７ＭＧ腫瘍を有するマウスの腫瘍体積におけるヒト化抗ＬＡＧ−３抗体の効果。結果は、ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３  ６ｍｐｋおよびＨｕ３０３−００５  ６ｍｐｋはいずれも、ある種の抗腫瘍効果を有し、腫瘍抑制率は、それぞれ２７．２５％（ｐ＜０．０５）および３４．９４％（ｐ＜０．０１）であり、コントロールグループと比較して有意な違い（ｈＩＧｇに対して、ｐ＜０．００１）があったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の詳細な説明
１．用語
本発明をより容易に理解するために、特定の技術的および科学的用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、アミノ酸の一文字コードおよび三文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558で記載されるとおりである。
【００５１】
用語「ＬＡＧ−３」は、リンパ球活性化遺伝子３を指す。用語「ＬＡＧ−３」には、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ、およびパラログが含まれる。用語「ヒトＬＡＧ−３」は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７によるヒトＬＡＧ−３の完全なアミノ酸配列などの、ヒトＬＡＧ−３の配列を指す。ＬＡＧ−３はまた、当業界では、例えばＣＤ２２３として知られる。ヒトＬＡＧ−３配列は、例えば、保存された変異、または、非保存領域における変異を有するという点で、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７のヒトＬＡＧ−３とは異なり得、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７のヒトＬＡＧ−３と実質的に同一の生物学的機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ−３の生物学的機能は、本明細書中に開示される抗体が特異的に結合するＬＡＧ−３の細胞外ドメインにおけるエピトープであるか、またはヒトＬＡＧ−３の生物学的機能はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することである。
【００５２】
特定のヒトＬＡＧ−３配列は、一般的に、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７のヒトＬＡＧ−３とアミノ酸配列において少なくとも９０％の同一性を有するであろうし、他の種（例えば、マウス）由来のＬＡＧ−３アミノ酸配列と比較してヒトアミノ酸配列であると同定されるアミノ酸残基を含有する。いくつかの場合において、ヒトＬＡＧ−３は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７のＬＡＧ−３に対して、アミノ酸配列において、少なくとも８５％、または、さらには少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態において、ヒトＬＡＧ−３配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７のＬＡＧ−３配列と、１０個以下のアミノ酸の違いを提示するであろう。いくつかの実施形態において、ヒトＬＡＧ−３は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１８６２７のＬＡＧ−３配列と、５個以下、または、さらには４、３、２、または１個以下のアミノ酸の違いを提示することができる。同一性％は、本明細書に記載したとおりに決定することができる。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「配列同一性」は、適切な置換、挿入または欠失などの変異を有する場合に、最適にアライメントされて比較される際の、２つの核酸または２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。本発明に記載される配列と、対応する配列との間の配列同一性は、少なくとも８５％、９０％、または９５％であり、好ましくは少なくとも９５％である。代表的な例には、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
２つの配列の間の同一性％は、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要がある、ギャップの数、および、各ギャップの長さを考慮に入れた、２つの配列が共に有する同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列の間の、配列の比較および同一性％の決定は、米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のウェブサイトで利用できる、ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定を使用して、達成することができる。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、「抗体」は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖との間のジスルフィド結合によって共に連結された４つのペプチド鎖構造の免疫グロブリンを指す。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成および順番を示し、したがって異なる抗原性を示す。従って、免疫グロブリンは、免疫グロブリンアイソタイプと呼ばれる、５つのカテゴリー、すなわち、ＩｇＭ、IｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥに分類することができ、これらの重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖およびε鎖である。ヒンジ領域のアミノ酸組成と、重鎖ジスルフィド結合の位置によって、同じタイプのＩｇを、異なるサブカテゴリーに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、異なる定常領域を考慮して、κまたはλ鎖に分類することができる。５つのタイプのＩｇＧはそれぞれ、κまたはλ鎖を有し得る。
【００５６】
本発明において、本明細書で述べられる抗体軽鎖は、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖、またはその変異体を含む、軽鎖定常領域をさらに含む。
【００５７】
本発明において、本明細書で述べられる抗体重鎖は、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはその変異体を含む、重鎖定常領域をさらに含む。
【００５８】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端配列の近傍では、約１００個アミノ酸が大きく変化し、可変領域（Ｆｖ領域）として知られる；Ｃ末端の近傍の残りのアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域として知られる。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）と、４つの比較的保存された配列であるフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。３つの超可変領域が、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域から構成され、アミノ末端からカルボキシル末端への順番は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４である。３つの軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を指し、３つの重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指す。本明細書の抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域におけるＣＤＲ領域のアミノ酸残基の数および位置は、既知のＫａｂａｔ番号付け基準（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＥ２−３）に従うか、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付け基準（ＨＣＤＲ１）に従う。
【００５９】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体を含む。
【００６０】
本発明の用語「マウス抗体」は、当分野の知識やスキルに基づいて調製された抗ヒトＬＡＧ−３モノクローナル抗体を指す。調製の際に、試験対象にＬＡＧ−３抗原を注入し、所望の配列または機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離した。本発明の好ましい実施形態において、マウスＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントは、さらに、マウスκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域を含むか、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはその変異体の、重鎖定常領域を含む。
【００６１】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域と、ヒト抗体の定常領域を融合させることによって形成される抗体であり、該キメラ抗体は、マウス抗体が誘導する免疫応答を緩和させることができる。キメラ抗体を構築するには、まず、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを構築し、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングした後、ヒト抗体の定常領域遺伝子を所望に応じてクローニングし、マウス可変領域遺伝子を、ヒト定常領域遺伝子に連結させてヒトベクターに挿入することができるキメラ遺伝子を形成し、最後に、キメラ抗体分子を真核または原核系で発現させる。本発明の好ましい実施形態において、ＬＡＧ−３キメラ抗体の軽鎖は、さらに、ヒトκ鎖、λ鎖、またはその変異体の軽鎖定常領域を含む。ＬＡＧ−３キメラ抗体の重鎖は、さらに、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはその変異体の重鎖定常領域を含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含み、あるいは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、または、ＩｇＧ４、または、アミノ酸変異（例えば、ＹＴＥ変異）を有するその変異体の重鎖定常領域を含む。
【００６２】
用語「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ移植抗体としても知られ、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体の可変領域フレームワークに移植することによって作製される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列の間で生成される抗体を指し、ヒト化抗体は、大量のマウスタンパク質構成成分を有するキメラ抗体によって誘導される異種応答を克服している。これらのフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を網羅する公的なＤＮＡデータベース、または、公開された文献から、取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖系列配列データベース「ＶＢａｓｅ」（ウェブｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能）において、並びに、Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edにおいて、見つけることができる。免疫原性低下の間の活性の低下を回避するために、ヒト抗体の可変領域フレーム配列は最小限の逆突然変異を受けて活性を維持する。本発明のヒト化抗体はまた、ファージディスプレイによるＣＤＲ親和性成熟をさらに受けたヒト化抗体を含む。本発明の好ましい実施形態において、ヒト化ＬＡＧ−３抗体のマウスＣＤＲ配列は、配列番号９〜２０から選択される；ヒト抗体の可変領域フレームは、選択されるように設計されており、抗体の重鎖可変領域の重鎖ＦＲ配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびｈｊｋ４．１の組み合わせ配列に由来し、抗体の軽鎖可変領域の軽鎖ＦＲ配列は、ヒト生殖系列重鎖ＩＧＨＶ３−２３＊０４およびｈｊｈ６．１の組み合わせ配列に由来している。免疫原性の低下により引き起こされる活性の低下を回避するために、本明細書に記載されるヒト抗体の可変領域は、最小限の逆突然変異を受けて、抗体の活性を維持し得る。
【００６３】
ＣＤＲの移植は、抗原と接触するフレームワーク残基の変化に起因して、抗原に対するＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメントの親和性の低下をもたらし得る。これらの相互作用は、高度な体細胞変異の結果であり得る。従って、これらのドナーフレームワークアミノ酸を、ヒト化抗体のフレームワークに移植する必要があるかもしれない。非ヒトＬＡＧ−３抗体またはその抗原結合フラグメント由来の、抗原結合に関与するアミノ酸残基は、マウスモノクローナル抗体の可変領域配列および構造を調べることによって特定することができる。生殖系列とは異なるＣＤＲドナーフレームワークにおける残基はそれぞれ、関連性があると考えられる。最も近い近縁種を決定することができない場合、配列は、サブタイプのコンセンサス配列または高い類似性パーセントを有するマウス配列と比較することができる。希少なフレーム残基は、高度な体細胞変異の結果であると考えられており、結合において重要な役割を果たす。
【００６４】
用語、抗体の「抗原結合フラグメント」（または、略して「抗体フラグメント」）は、抗原（例えば、ＬＡＧ−３タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長の抗体フラグメントによって実施され得ることが示されている。用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域にてジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂフラグメントを含む、二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉＶ）抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなる、シングルドメインまたはｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature10 341:544-546)；および、（ｖｉ）分離したＣＤＲ、または（ｖｉｉ）場合により、合成リンカーにより連結された２つ以上の分離したＣＤＲの組み合わせが含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組み換え法を用いて合成リンカーにより連結され得、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖として作製され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426 および Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）。これらの一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合フラグメント」に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来技術を用いて得られ、インタクトな抗体と同じ方法で、有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、または、インタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分解によって、生成され得る。抗体は、異なるアイソフォームの抗体であってよく、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であってよい。
【００６５】
用語「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーで結合した抗体重鎖可変ドメイン（または、領域；ＶＨ）と、抗体軽鎖可変ドメイン（または、領域；ＶＬ）とを含む分子を指すことを意図している。これらのｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。先行技術における好適なリンカーは、反復性ＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはその変異体、例えば１〜４個の反復を有する変異体からなる（Holliger et al.(1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448）。本発明で用いられ得る他のリンカーは、Alfthan et al., Protein Eng.8:725-731、Choi et al (2001), Eur. J. Immuno l.31:94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res.56:3055-3061、Kipriyanov et al. (1999)、J.Mol.Biol.293:41-56 および Roovers et al (2001), Cancer Immunolにより記載されている。
【００６６】
用語「ＣＤＲ」は、抗原結合に主に寄与する抗体の可変ドメイン内の、６個の超可変領域の１個を指す。６個のＣＤＲに最も一般的に用いられる定義の１つが、Kabat E.A. et al, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242により提供された。本明細書で用いられる場合、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３（ＬＣＤＲｌ、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、またはＬｌ、Ｌ２、Ｌ３）、並びに、重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、またはＨ２、Ｈ３）のみに適用される
【００６７】
本明細書で用いられる、用語「抗体フレームワーク」は、ＶＬまたはＶＨのいずれかの可変ドメインの一部を指し、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場として働く。本質的には、ＣＤＲを有さない可変ドメインである。
【００６８】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えば、ＬＡＧ３分子上の特定の部位）を指す。エピトープには、通常、独特の空間的コンフォメーションで、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の、連続の、または、非連続のアミノ酸が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を、参照されたい。
【００６９】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの、抗体の結合を指す。通常、抗体は、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満、またはさらにそれ以下などの、およそ１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合している。
【００７０】
用語「競合的結合」は、ヒトＬＡＧ−３の細胞外領域上の、本発明のモノクローナル抗体と同一のエピトープ（抗原決定基とも呼ばれる）または同一のエピトープの一部を認識し、抗原に結合する抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する抗体は、本発明のモノクローナル抗体により認識されるヒトＬＡＧ−３のアミノ酸配列を認識して、それに結合する抗体を指す。
【００７１】
用語「Ｋｄ」または「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。通常、本発明の抗体は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて決定された、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満、またはさらにそれ以下などの、およそ１０−７Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）で、ＬＡＧ−３に結合している。
【００７２】
本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であってよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、「効果的に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に効果的に連結される。
【００７３】
用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ある実施形態において、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る、環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。本発明において、ベクターは、導入される宿主細胞において、自律複製可能であるか（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳類エピソーマルベクター）、または、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムと共に複製される（例えば、哺乳類非エピソーマルベクター）。
【００７４】
抗体および抗原結合フラグメントを生成および精製する方法は、当業界でよく知られており、例えば、Antibody Experimental Technology Guide of Cold Spring Harbor, Chapters 5-8 and 15に見出すことができる。例えば、マウスを、ヒトＬＡＧ−３またはそのフラグメントで免疫化し、得られた抗体を、当業界でよく知られる従来の方法を用いて、再生し、精製して、配列決定することができる。抗原結合フラグメントもまた、従来の方法により調製することができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を、非ヒト由来のＣＤＲに導入するように、遺伝子操作される。ヒトＦＲ生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）から、そのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒを経由して、または、The Immunoglobulin FactsBook,2001ISBN012441351から、入手することができる。
【００７５】
用語「宿主細胞」は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞は、細菌、微生物、植物または動物の細胞を含み得る。形質転換されやすい細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌株などの腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバーが含まれる。好適な微生物には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。好適な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣株）細胞およびＮＳＯ細胞が含まれる。
【００７６】
本発明の操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法を用いて調製および精製されてよい。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングして、ＧＳ発現ベクターに組換えてもよい。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、その後、安定してＣＨＯ細胞にトランスフェクトされ得る。当技術分野でよく知られるより推奨される方法として、哺乳動物発現系は、通常、ＦＣ領域の高度に保存されたＮ末端に、グリコシル化をもたらすであろう。安定なクローンは、ヒトＬＡＧ−３に特異的に結合する抗体の発現を通して得られる。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体生成のために、無血清培養培地で、増殖させることができる。抗体が分泌される培養培地は、従来技術により精製されてよい。例えば、該培地は、互換性のあるバファーで平衡化されたタンパク質ＡまたはＧセファロースＦＦカラムに、好都合にも適用され得る。該カラムは、非特異的結合構成成分を除去するために洗浄する。結合抗体をＰＨグラジエントにより溶出し、抗体フラグメントを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出して、その後保管する。抗体は、一般的な技術を用いて、濾過および濃縮され得る。可溶性混合物および凝集物は、サイズ排除またはイオン交換を含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。得られた生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結され得るか、あるいは、凍結乾燥され得る。
【００７７】
「投与」および「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または体液に適用される場合、外来性の医薬用、治療用、診断用の薬剤または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または体液と接触させることを指す。「投与」および「処置」は、例えば、治療的用、薬物動態学用、診断用、研究用、および実験用の方法を指すことができる。細胞の処置には、試薬を、細胞と接触させること、並びに、試薬を、細胞と接触している液体と接触さることが包含される。「投与」および「処置」はまた、例えば、細胞に対する、または、試薬、診断薬、結合化合物による、または別の細胞による、インビトロおよびエクスビボの処置を意味する。「処置」は、ヒト、家畜（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ）、または研究対象に適用される場合、研究および診断用途のための、治療処置、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）方法、または予防性（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）の方法を指す。
【００７８】
「処置する」とは、本発明の結合化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、「処置する」とは、本発明の結合性化合物のいずれかを含む組成物などの治療薬を、その治療薬が既知の治療活性を有する、１つ以上の疾病の症状を有する患者に対して、内的または外的に投与することを意味する。通常、これらの症状の臨床的に測定可能な程度に、退行を誘導することによるか、または進行を抑制することによるかにかかわらず、該治療薬は、処置された患者または集団において１つ以上の疾病の症状を緩和するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾病の症状を緩和するのに有効な治療薬の量（「治療上有効量」とも呼ばれる）は、患者の疾病のステージ、年齢、および体重、並びに、薬剤が患者において所望の応答を誘発する能力などのファクターに応じて変化し得る。疾病の症状が緩和されているかどうかは、医師または他の熟練した医療提供者がその症状の重症度または進行状況を評価するために通常使用する臨床測定によって評価することができる。本発明の実施形態（例えば、処置方法または製品）は全ての患者において目的の疾病の症状を緩和することに効果的でないかもしれないが、当業界で知られる任意の統計検定（例えば、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホイットニーのＵ検定、クラスカル・ワリス検定（Ｈ−ｔｅｓｔ）、ヨンクヒール・タプストラ検定（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ−Ｔｅｒｐｓｔｒａ−ｔｅｓｔ）およびウィルコクソン検定など）により決定される、統計的に有意な患者の数において、目的の標的とする疾病の症状を緩和するはずである。
【００７９】
「保存的修飾」または「保存的交換または置換」は、類似の特性（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、骨格のコンフォメーションおよび剛直性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）など）を有する他のアミノ酸による、タンパク質中のアミノ酸の置換を指し、これらの変更は、しばしば、タンパク質の生物学的活性を変えることなく行われ得る。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識している（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4.sup.th Ed.)を参照されたい）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸による置換は、生物学的活性を妨害する可能性はより低い。
【００８０】
「有効量」は、病状の症状または兆候を、寛解または予防するのに十分な量を包含する。有効量はまた、診断を可能にするか、促進するのに十分な量を意味する。特定の患者または獣医学的対象に対する有効量は、処置される症状、患者の一般的な健康状態、投与の経路および投与量、および副作用の重症度などの因子に応じて変化し得る。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大投与量または投薬プロトコールであり得る。
【００８１】
「外来性の」は、文脈に応じて、生物、細胞、または人体の外部で生成された物質を指す。「内在性の」は、文脈に応じて、細胞、生物、または人体の内部で生成された物質を指す。
【００８２】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列、または、２つのポリペプチド間の、配列類似性を指す。例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合など、比較されるべき２つの配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、該分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列が共有する、一致するか、または相同な位置の数を、比較された位置の数で割って、１００を掛けた値の関数である。例えば、二つの配列において、配列が最適にアライメントされた場合に、１０個のうち６個の位置が一致するか、相同であれば、２つの配列は６０％相同である。例えば、二つの配列において、配列が最適にアライメントされた場合に、１００個のうち９５個の位置が一致するか、相同であれば、２つの配列は９５％相同である。一般的に、２つの配列が最大の相同性％を与えるようにアライメントされる場合に、比較がなされる。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という言い回しは、互換的に用いられ、これらの表示には全て、子孫が含まれる。それゆえ、「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、継代（ｔｒａｎｓｆｅｒ）の数を考慮せずに、対象の一次細胞およびそれに由来する培養物を含む。意図的な、または偶発性の変異のために、すべての子孫がＤＮＡの内容において正確に同一でない可能性があることも理解される。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。異なるものを指すことが意図されている場合は、文脈から明らかであろう。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特異的部分を、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載される通りに、増幅させる手順または技術を指す。一般的に、目的の領域の末端からの、または、目的の領域を超えた配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーを設計できるように、利用可能である必要がある。これらのプライマーは、増幅されるべき鋳型に対応する鎖と、配列において同一または類似しているであろう。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅されるべき物質の末端に同一であることができる。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから転写されたｃＤＮＡを増幅するために使用され得る。一般的に、Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)を参照されたい。本明細書で用いられる場合、ＰＣＲは、核酸の特定部分を増幅または作製するための、プライマーとしての既知の核酸と、核酸ポリメラーゼとの使用を含む、核酸試験サンプルを増幅させるための核酸ポリメラーゼ反応方法の一例として考えられているが、唯一の例ではない。
【００８５】
「場合による」または「場合により」は、それに続く事象または状況が必ずしも起こらない場合があることを意味し、その表現は、事象または状況が起こる場合、または、起こらない場合を含む。例えば、「場合により、１〜３個の抗体重鎖可変領域を含む」は、特定の配列を有する抗体の重鎖可変領域が存在し得るが、必ずしも存在するわけではないことを意味する。
【００８６】
「医薬組成物」は、本発明の１つ以上の化合物、または、その生理学的／医薬的に許容される塩もしくはプロドラッグと、生理学的／医薬的に許容される担体および賦形剤などの他の化学的構成成分とを含有する混合物を指す。医用組成物は、生物への投薬を促進し、有効成分の吸収を推進し、それによって生物学的効果を発揮することを目的とする。
【実施例】
【００８７】
実施例および試験
以下、実施例により、本発明をさらに説明する。しかしながら、本発明の範囲は、これに限定されるものではない。特定の条件が記載されていない本発明の実施例において、実験は、一般的に、Antibody Technology Laboratory Manual and Molecular Cloning Manual of Cold Spring Harborに記載されている従来の条件下で、または、材料もしくは製品の製造業者によって提案された条件下で行われる。試薬の供給源が特に示されていない場合、試薬は、市販されている従来の試薬である。
【００８８】
実施例１．ＬＡＧ−３抗原および抗体の調製
１．タンパク質設計および発現
ＵｎｉＰｒｏｔのリンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ヒトＬＡＧ−３、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１８６２７）を、ＬＡＧ−３の鋳型として用いて、該抗原および検出に用いられるタンパク質のアミノ酸配列を設計し、場合により、異なるラベルをＬＡＧ−３タンパク質に融合させ、その後、ｐＨｒベクター（自社製造）またはｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ、カタログ番号１０２７６２）またはｐＴａｒｇｅＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１４１０）にクローニングした。本発明の抗原タンパク質および検出タンパク質を、２９３細胞において一過性に発現させ、または、ＣＨＯ−Ｓにおいて安定的に発現させ、精製して得た。
【００８９】
以下のＬＡＧ−３抗原は、特に記載されない場合、ヒトＬＡＧ−３を指す。
【００９０】
【化１】
2019518459.tif 000003
【００９１】
【化２】
2019518459.tif 000004
【００９２】
【化３】
2019518459.tif 000005
【００９３】
【化４】
2019518459.tif 000006
【００９４】
２．ＬＡＧ−３関連組換えタンパク質、並びに、ハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
１．ＦＬＡＧタグを有するＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ組換えタンパク質の精製ステップ
サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去し、適切な容量に濃縮した。その後、ＦＬＡＧ親和性カラムを０．５×ＰＢＳで平衡化して、２〜５カラム容量で洗浄した。不純物を除去した後に、上清サンプルを、カラムに負荷した。Ａ２８０の読み値がベースラインまで減少するまで、０．５×ＰＢＳでカラムを洗浄した。その後、カラムをＰＢＳで洗浄して、不純物タンパク質を洗い流し、回収した。標的タンパク質を１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で溶出して、インビトロでのさらなる活性化および精製のために、回収した。
【００９５】
２．ハイブリドーマ抗体、組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質の精製ステップ
細胞発現上清を高速で遠心分離して、不純物を除去し、ハイブリドーマ発現上清を、プロテインＧカラムにより精製し、組換え抗体およびＦｃ融合タンパク質を、プロテインＡカラムにより精製した。Ａ２８０の読み値がベースラインまで減少するまで、０．５×ＰＢＳでカラムを洗浄したその後、標的タンパク質を、１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）で溶出し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳで平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を用いてさらに精製し、ミスマッチピークを除き、正しいサンプルを分取して使用した。
【００９６】
実施例２．抗ヒトＬＡＧ−３モノクローナル抗体の調製
１．免疫化
抗ヒトＬＡＧ−３モノクローナル抗体を、マウスを免疫化することにより生成した。実験用ＳＪＬ白色マウス、雌、６週齢(Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., 動物生産ラインセンス番号（animal production license number）: SCXK (Beijing) 2012-0001)。飼育環境：ＳＰＦレベル。マウスを購入した後、１２／１２時間の明／暗サイクルで、２０〜２５℃の温度で、４０〜６０％の湿度で、マウスを実験室に１週間保管した。該環境に適応したマウスを、以下のスキームに従い免疫化した。免疫抗原は、ＦＬＡＧタグを有するＬＡＧ−３の細胞外ドメインであった（配列番号１）。
【００９７】
スキームＡ：ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（ｓｉｇｍａ  Ｌｏｔ  Ｎｕｍ：Ｔ２６８４）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍ（Ｔｈｒｅｍｏ  Ｌｏｔ  Ｎｕｍ：７７１６１）で、マウスを交差免疫化した。抗原とアジュバント（ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）の割合は１：１であり、かつ、抗原とアジュバント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍ）の割合は１：３であり、投与量は５０μｇ／マウス（初回免疫化）および２５μｇ／マウス（ブースター免疫化）であった。抗原を乳化させた後、マウスに、０、７、１４、２１、２８、３５、および４２日目に接種した。０日目に、マウスに対し、いくつかの部位で、皮下に（ｓ．ｃ．）乳化抗原を５０μｇ／マウスで注射した。７日目に、マウスに対し、腹腔内に（ｉ．ｐ．）２５μｇ／マウスで注射した。１４、２８、３５および４２日目に、背面または腹腔内のいずれかへの抗原注射を、背面の塊（ｌｕｍｐ）および腹部の腫脹状態に従って選択した。２１、３５、４９日目に、血液サンプルを回収し、マウス血清における抗体力価をＥＬＩＳＡにより決定した。７回の免疫化の後、より高い抗体力価を有するマウス、およびそれらの血清中でプラットホームになる力価を有するマウスを、脾細胞融合のために選択し、生理食塩水で製剤化した抗原溶液を、５０μｇ／マウスで、脾細胞融合の３日前に、腹腔内注射することにより、ブースター免疫化を実施した。
【００９８】
スキームＢ：マウスを、ＱｕｉｃｋＡｎｔｉｂｏｄｙ−Ｍｏｕｓｅ５Ｗ（ＫＸ０２１００４１）で免疫化した。抗原とアジュバントの割合は、１：１であり、２５μｇ／マウス（初回免疫化/ブースター免疫化）であった。抗原とアジュバントを迅速に混合して、接種に使用した。マウスに、０、２１、および３５日目に接種した。０日目に、マウスに、後腓腹筋（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｃａｌｆ  ｍｕｓｃｌｅ）を介して（筋肉内注射で）２５μｇ／マウスで抗原を注射し、２１および３５日目に、同じ方法の注射を、２５μｇ／マウスで繰り返した（三回目の免疫化を実施したかどうかは、抗体力価による）。２８日目および４２日目に、血液サンプルを回収した。マウス血清における抗体力価を、ＥＬＩＳＡにより決定した。より高い抗体力価を有するマウス、およびそれらの血清中でプラットホームになる力価を有するマウスを、脾細胞融合のために選択し、生理食塩水で製剤化した抗原溶液を、５０μｇ／マウスで、脾細胞融合の３日前に、腹腔内注射することにより、ブースター免疫化を実施した。
【００９９】
２．脾細胞融合
最適化されたＰＥＧ媒介融合手順を用いて、脾臓リンパ球を骨髄腫Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８２８７ＴＭ）と融合させることによって、ハイブリドーマ細胞を得た。得られたハイブリドーマ細胞を、０．５〜１×１０６／ｍｌの密度で、完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴおよび１×ＯＰＩを含有するＤＭＥＭ培地）に再懸濁し、１００μ／ウェルで、９６ウェル細胞培養物プレートにてインキュベートした。３７℃、５％ＣＯ２で３〜４日間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのＨＡＴ完全培地を補充し、培養を３〜４日間続けて針状クローンを形成した。上清を除去して、２００μｌ／ウェルのＨＴ完全培地（２０％ＦＢＳ、１×ＨＡＴ、１×ＯＰＩを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地）を添加して、５％ＣＯ２、３７°Ｃで３日間培養した後に、ＥＬＩＳＡアッセイで検出した。
【０１００】
３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマ培養上清を、ハイブリドーマ細胞の増殖密度に従い、結合ＥＬＩＳＡ（試験例１参照）によって、検出した。また、ＥＬＩＳＡの陽性ウェルを用いて、細胞遮断実験を行った（試験例３参照）。結合および遮断実験の両方について陽性であった細胞を増殖させ、適時に凍結保存し、細胞を単細胞クローンが得られるまで２〜３回サブクローニングした。
【０１０１】
各サブクローニング手順の後、細胞を、ＬＡＧ−３結合ＥＬＩＳＡおよび細胞遮断アッセイに供した（試験例１および試験例３を参照）。上記のスクリーニング実験によりハイブリドーマクローンを得、無血清細胞培養法でさらに抗体を調製し、抗体を試験例に用いられる精製例に従い精製した。
【０１０２】
４．陽性ハイブリドーマクローンのシーケンシング
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングするプロセスは、以下の通りであった：対数増殖期のハイブリドーマ細胞を回収し、キットの指示書に従いＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６−０１８）でＲＮＡを抽出し、その後ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号  ２６８０Ａ）で逆転写を実施した。逆転写により得られたｃＤＮＡを、マウスＩｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６  Ｒｅｖ．Ｂ  ０５０３）を用いてＰＣＲにより増幅し、シーケンシングを、シーケンシング会社で実施した。ハイブリドーマクローンｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３のＤＮＡ配列に対応する、重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、配列番号５、６および配列番号７、８にそれぞれ示す。
【０１０３】
【化５】
2019518459.tif 000007
【表１】
2019518459.tif 000008
【０１０４】
得られた陽性クローンを、ヒトＬＡＧ−３への結合のＥＬＩＳＡアッセイ（試験例１、タンパク質結合活性についてのＥＣ５０値の結果は表２に示す）、ヒトＬＡＧ−３過剰発現ＣＨＯ−ｓ細胞への結合のＥＬＩＳＡアッセイ（試験例２、細胞結合活性についてのＥＣ５０値の結果は表２に示す）、Ｄａｕｄｉ細胞へのＬＡＧ−３抗原の結合を遮断するアッセイ（試験例３、遮断活性についてのＥＣ５０値の結果は表２に示す）、および、ヒトＬＡＧ−３タンパク質との親和性についてのアッセイ（試験例４参照、結果は表３に示す）に供した。
【表２】
2019518459.tif 000009
【表３】
2019518459.tif 000010
【０１０５】
表２に示す結果は、ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３が共に、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に対して、優れた結合活性を示したこと、および、ヒトＬＡＧ−３タンパク質全長を過剰発現するＣＨＯ−Ｓ細胞に対しても、優れた結合活性を示したことを立証している。ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３は共に、ヒトＬＡＧ−３抗体の、Ｄａｕｄｉ細胞との結合を、有意に遮断した。
【０１０６】
表３に示す結果は、本発明のＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３が、ヒトＬＡＧ−３タンパク質により強い結合活性および親和性を示したことを立証している。
【０１０７】
実施例３．マウス抗ヒトＬＡＧ−３ハイブリドーマモノクローナル抗体ｍＡｂ２２９のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子データベースと、ＭＯＥソフトウェアとにおける比較を介して、ｍＡｂ２２９と高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、マウス抗体に由来するＣＤＲを、対応するヒト起源の鋳型に移植して、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で可変領域配列を形成した。ここで、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従い、特定および注釈付けした。
【０１０８】
１．ハイブリドーマクローンｍＡｂ２２９をヒト化するための、フレームワークの選択
マウス抗体ｍＡｂ２２９をヒト化するための軽鎖鋳型は、ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化するための重鎖鋳型は、ＩＧＨＶ７−４−１＊０１およびｈｊｈ６．１であり、ヒト化可変領域の配列は、以下の通りである。
【化６】
2019518459.tif 000011
【０１０９】
２．ハイブリドーマクローンｍＡｂ２２９のための鋳型選択および逆突然変異設計、以下の表４参照：
【表４】
2019518459.tif 000012
【表５】
2019518459.tif 000013
【化７】
2019518459.tif 000014
【０１１０】
実施例４．マウス抗ヒトＬＡＧ−３ハイブリドーマモノクローナル抗体ｍＡｂ３０３のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子データベースと、ＭＯＥソフトウェアとにおける比較を介して、ｍＡｂ３０３と高い相同性を有する重鎖および軽鎖可変領域生殖系列遺伝子を鋳型として選択し、マウス抗体に由来するＣＤＲを、対応するヒト起源の鋳型に移植して、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で可変領域配列を形成した。ここで、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従い、特定および注釈付けした。
【０１１１】
１．ハイブリドーマクローンｍＡｂ３０３をヒト化するためのフレームワークの選択
マウス抗体ｍＡｂ３０３をヒト化するための軽鎖鋳型は、ＩＧＫＶ１−３９＊０１およびｈｊｋ４．１であり、ヒト化するための重鎖鋳型は、ＩＧＨＶ１−３＊０１およびｈｊｈ６．１であり、ヒト化可変領域の配列は、以下のとおりである：
【化８】
2019518459.tif 000015
【０１１２】
２．ハイブリドーマクローンｍＡｂ３０３の鋳型選択および逆突然変異、以下の表６参照
【表６】
2019518459.tif 000016
【０１１３】
異なる変異の配列組み合わせは、以下の通りである：
【表７】
2019518459.tif 000017
【０１１４】
ヒト化抗体ｍＡｂ３０３の配列は以下の通りである：
【化９】
2019518459.tif 000018
【０１１５】
実施例５．組換えおよびヒト化抗体の調製
抗体を、ヒト重鎖ＩｇＧ４／軽鎖κ由来の定常領域を、各可変領域と組み合わせて構築し、ＩｇＧ４抗体の安定性を高めるために、ＦｃにおいてＳ２２８Ｐ変異を作製した。当業界で知られる他の変異もまた、抗体の性能を高めるために用いることができる。
【化１０】
2019518459.tif 000019
【０１１６】
１．組換え抗体の分子クローニング
可変領域コード配列を、ハイブリドーマスクリーニングから得られる陽性抗体分子をシーケンシングすることによって得た。得られた配列に従いプライマーを設計し、シーケンシング遺伝子を鋳型として用いて、様々な抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲで構築し、その後、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈｋａｐｐａ定常領域（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）で再構成して、全長組換え抗体についての発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを構築した。
【０１１７】
２．ヒト化抗体の分子クローニング
設計したヒト化抗体配列をコドン最適化に供して、ヒトコドン優先性を有するコード配列を作製した。プライマーを設計し、該抗体の様々なＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントをＰＣＲにより構築して、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ４／ｈｋａｐｐａ定常領域（ＣＨ１−ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）で再構成し、全長ヒト化抗体についての発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−ＦＣ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを構築した。
【０１１８】
３．組換えおよびヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖および重鎖を別々に発現するためのプラスミドを、１：１．２の割合で、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。６日後に発現上清を回収し、不純物を高速遠心分離で除去して、その後プロテインＡカラムで精製した。カラムを、Ａ２８０の読み値がベースラインまで減少するまで、ＰＢＳで洗浄した。標的タンパク質を、酸性溶出バッファー、ｐＨ３．０〜ｐＨ３．５で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０−９．０で中和した。溶出液を適切に濃縮し、ＰＢＳで平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）を用いてさらに精製した。ミスマッチピークを除き、溶出ピークを回収した。その後、正しいサンプルを分取して使用した。
【０１１９】
本発明の抗体の性能および利点は、以下の生化学的試験方法によって確認される。
【０１２０】
試験例１．ＬＡＧ−３抗体の、ヒトＬＡＧ−３タンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡアッセイ
抗ＬＡＧ−３抗体の、ヒトＬＡＧ−３タンパク質への結合能を、ＥＬＩＳＡアッセイで検出した。ＦｃまたはｍＦｃタグを有するＬＡＧ−３融合タンパク質を、マイクロタイター中の抗ＦｃまたはｍＦｃ抗体に結合させることにより、９６ウェルマイクロタイタープレートに固定化し、抗体の負荷後のシグナルの強さを用いて、抗体のＬＡＧ−３への結合活性を決定した。具体的な実験方法は以下の通りである。
【０１２１】
ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  カタログ番号１０９−００５−００８）またはヤギ抗マウスＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ３５３４−１ＭＬ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファーで、２μｇ／ｍｌの濃度に希釈して、５０μｌ／ウェルの容量で９６ウェルプレートに添加し、その後、プレートを３７℃で２時間、インキュベーターでインキュベートした。液体を捨てた後、プレートを、ＰＢＳ中の５％スキムミルク（Ｇｕａｎｇｍｉｎｇスキムミルク）を含有する２００μｌ／ウェルの遮断溶液で遮断し、３７℃で２．５時間、または、４℃で一晩（１６〜１８時間）、インキュベーターでインキュベートした。遮断した後、遮断溶液を捨て、プレートを、ＰＢＳＴバッファー（０．０５％のｔｗｅｅｅｎ−２０を含有する、ＰＨ７．４のＰＢＳ）で５回洗浄した。ＬＡＧ−３−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号３、自社製造）またはＬＡＧ−３−ｍＦｃ融合タンパク質（配列番号４、自社製造）を、サンプル希釈液（１％ＢＳＡを含有するＰＨ７．４のＰＢＳ）で１μｇ／ｍｌまで希釈して、各ウェルに５０μｌ／ウェルで添加した。その後、プレートを３７℃で１時間、または４℃で一晩、インキュベーターでインキュベートした。インキュベーション後、プレート中の反応液を捨て、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、その後、サンプル希釈液で希釈した様々な濃度の試験抗体（ハイブリドーマ精製抗体またはヒト化抗体）を５０μｌ添加して、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、１００μｌ／ウェルの、サンプル希釈液で希釈した、ＨＲＰで標識したヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０３５−００３）またはヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００３）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００３）を各ウェルに添加し、室温で５〜１５分間インキュベートし、各ウェルに、５０μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させた。４５０ｎｍの波長でのＯＤ値をＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーで読み取った後、ＬＡＧ−３抗体のヒトＬＡＧ−３への結合のＥＣ５０値を計算した。結果を表８に示す。本データは、本発明のスクリーニング方法で得られた全てのヒト化抗体が、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に優れた結合活性を示すことを示した。
【表８】
2019518459.tif 000020
【０１２２】
試験例２．ＬＡＧ−３抗体の、ヒトＬＡＧ−３を過剰発現するＣＨＯ−ｓ細胞との結合アッセイ
抗ＬＡＧ−３抗体の、ＬＡＧ−３タンパク質を過剰発現するＣＨＯ−Ｓ細胞への結合能を、結合アッセイにより検出した。全長ＬＡＧ−３プラスミド（自社製造、配列番号２）を、エレクトロポレーションでＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、ＬＡＧ−３の発現レベルを、電圧をかけた後の（ｐｏｓｔ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ）スクリーニングの２週間後に検出した。ＬＡＧ−３を過剰発現する細胞を、９６ウェルプレートの底に固定し、抗体の添加後のシグナルの強さを用いて、抗体のヒトＬＡＧ−３を過剰発現するＣＨＯ−ｓ細胞への結合能を決定した。具体的な実験方法は以下の通りである。
【０１２３】
１００μｌ／ウェルの細胞を、９６ウェルプレートに、４×１０５／ｍｌの密度で播種し、一晩インキュベートした。上清を捨て、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、４％ＰＦＡを１００μｌ／ウェルで添加して室温で３０分間固定し、その後プレートをＰＢＳで３回洗浄した。液体を捨てた後、プレートを、ＰＢＳで希釈した５％スキムミルク（Ｇｕａｎｇｍｉｎｇスキムミルク）を含有する２００μｌ／ウェルの遮断溶液で遮断し、３７℃で２．５時間インキュベートした。遮断した後、遮断溶液を捨て、プレートを、ＰＢＳＴバッファー（０．０５％のｔｗｅｅｅｎ−２０を含有する、ＰＨ７．４のＰＢＳ）で５回洗浄し、サンプル希釈液で希釈した異なる濃度の試験抗体（ハイブリドーマ精製抗体またはヒト化抗体）を５０μ／ウェルで添加し、その後３７℃で１時間、インキュベーターでインキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、１００μｌ／ウェルの、サンプル希釈液で希釈した、ＨＲＰで標識した、ヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０３５−００３）またはヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００３）を添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２−００−０３）を各ウェルに添加し、室温で５〜１５分間インキュベートし、各ウェルに５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させた。４５０ｎｍの波長でのＯＤ値をＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーで読み取った後、ＬＡＧ−３抗体のＬＡＧ−３を過剰発現するＣＨＯ細胞への結合のＥＣ５０値を計算した。
【０１２４】
試験例３．ＬＡＧ−３抗原のＤａｕｄｉ細胞への結合の遮断における、抗ＬＡＧ−３抗体についてのアッセイ
Ｄａｕｄｉ細胞（ヒト白血病細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ細胞バンクから購入）を９６ウェルプレートに３×１０５／ウェルの密度で播種した。１０００ｒｐｍでの遠心分離の後、上清を捨て、プレートに４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間固定した。固定溶液を捨てた後、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、プレートを、ＰＢＳで希釈した５％スキムミルク（Ｇｕａｎｇｍｉｎｇスキムミルク）を含有する２００μｌ／ウェルの遮断溶液で遮断し、３７℃で２．５時間インキュベートした。遮断後、遮断溶液を捨て、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．０５％のｔｗｅｅｅｎ−２０を含有する、ＰＨ７．４のＰＢＳ）で５回洗浄し、ビオチン標識ＬＡＧ−３−Ｆｃ融合タンパク質（自社製造、配列番号３）の混合物を５０μｌ／ウェルで添加し、最終濃度が０．４μｇ／ｍｌとなるように希釈液（１％ＢＳＡを含有するＰＨ７．４のＰＢＳ）で希釈し（ここで、ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ、  Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号ＬＫ０３）は予め１時間混合されている）、試験すべき抗体をグラジエント濃度で添加した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、反応液を捨て、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、サンプル希釈液で希釈されたＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ２４３８）を５０μｌ／ウェルで添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、カタログ番号５２−００−０３）を各ウェルに添加して、室温で５〜１５分間インキュベートし、各ウェルに５０μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。４５０ｎｍの波長でのＯＤ値をＮＯＶＯＳｔａｒマイクロプレートリーダーで読み取った後、抗原のＤａｕｄｉ細胞への結合の遮断におけるＬＡＧ−３抗体の活性を計算した。結果を表９に示す。本データは、本発明のスクリーニング方法により得られた全てのヒト化抗体が、ヒトＬＡＧ−３抗体のＤａｕｄｉ細胞への結合を有意に阻害したことを示すものである。
【表９】
2019518459.tif 000021
【０１２５】
試験例４．ＬＡＧ−３抗体の親和性についてのＢＩＡｃｏｒｅアッセイ
１．マウス抗捕捉抗体を、マウス抗捕捉キット（カタログ番号ＢＲ−１００８−３８、ＧＥ）に記載の方法に従って、ＣＭ５バイオチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−１２、ＧＥ）と共有結合させ、試験抗体が親和性を介して捕捉されるようにした。その後、ＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ抗原（自社製造、配列番号１）を、バイオチップ表面に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出して結合・解離曲線を得、親和性の値をフィッティングにより得た（上記の表２参照）。実験において各解離サイクルが終了した後に、バイオチップを洗浄して、マウス抗捕捉キットが提供する再生溶液で再生した。本結果は、ＬＡＧ−３抗体ｍＡｂ２２９およびｍＡｂ３０３が、ヒトＬＡＧ−３タンパク質への優れた結合活性および親和性を示したことを立証するものである。
【０１２６】
２．ヒト抗捕捉抗体を、ヒト抗捕捉キット（カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ＧＥ）に記載の方法に従って、ＣＭ５バイオチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−１２、ＧＥ）と共有結合させ、試験抗体が親和性を介して捕捉されるようにした。その後、ＬＡＧ−３−Ｆｌａｇ抗原（自社製造、配列番号１）を、バイオチップ表面に流し、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いてリアルタイムで反応シグナルを検出して結合・解離曲線を得、親和性の値をフィッティングにより得た（下記の表１０参照）。実験において各解離サイクルが終了した後に、バイオチップを洗浄して、ヒト抗捕捉キットが提供する再生溶液で再生した。本結果は、本発明のスクリーニング方法で得られた抗体が、ヒトＬＡＧ−３タンパク質に優れた結合活性および親和性を示したことを立証するものである。
【表１０】
2019518459.tif 000022
【０１２７】
試験例５．ＰＢＭＣ−Ｔリンパ球の活性化
Ｔリンパ球の活性化に対するＬＡＧ−３抗体の効果を研究するために、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を回収し、精製した。ＩＬ−２サイトカインの分泌レベルを、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のスーパー抗原により、インビトロで７２時間刺激した後に、測定した。実験プロセスを簡単に以下に記載する。
【０１２８】
新たに単離および精製されたＰＭＢＣを、９６ウェル細胞培養プレートに、約１×１０５／ウェルの細胞密度で播種し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢスーパー抗原刺激を加え、グラジエントに希釈した抗体サンプル（培地で希釈）またはブランクコントロールとしての培地を同時に添加した。その後、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、細胞培養物上清を回収した。培養上清中の分泌されたＩＬ−２のレベルを、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ、カタログ番号５５０６１１）で測定した。詳細な手順は、製造元のマニュアルに示されている。結果は図１に示した。ヒト化ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５はいずれも、活性化されたＴリンパ球によって分泌されるサイトカインＩＬ−２のレベルを異なる程度に高めることができ、薬物濃度についての投与量依存効果を有する。
【０１２９】
試験例６．皮下接種したＵ−８７ＭＧ腫瘍のＬＡＧ−３抗体による抑制
本研究では、Ｕ−８７ＭＧ腫瘍を有するマウスの腫瘍体積に対する、ヒト化抗ＬＡＧ−３抗体の効果を測定した。
【０１３０】
１００μｌのヒトグリオーマＵ８７  ＭＧ細胞（３．５×１０６細胞）を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｃａｖｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より購入）の右肋骨に皮下接種した。１０〜１４日後に、腫瘍が４０ｍｍ３まで成長した際に、マウスを、体重または腫瘍体積が大きすぎるものと、小さすぎるものを除いて、ランダムに３つのグループに分けた：アイソタイプが一致したｈＩｇＧのためのコントロールグループ、ＬＡＧ−３候補抗体Ｈｕ２２９−０１３のためのグループ、およびＬＡＧ−３候補抗体Ｈｕ３０３−００５のためのグループであり、腫瘍体積に従っており（グループ分けおよび投与量は表１参照）、各グループ８匹のマウス（Ｄ０）である。ＣＤ３抗体により刺激したＰＢＭＣを、５×１０５細胞／６０μｌで腫瘍組織に注射し、試験抗体の注射は、腹腔内注射により開始し、週に３回、計６回実施した。マウスは、週に２回、腫瘍体積を測定し、データを記録した。
腫瘍体積（Ｖ）は以下の通り計算した：
腫瘍体積（ＴＶ）＝１／２×ａ×ｂ２
ａおよびｂはそれぞれ、長さと幅を表す。
【０１３１】
各グループの腫瘍体積を、平均±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）として表し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアでプロットして、二元配置ＡＮＯＶＡ統計解析で解析し、腫瘍抑制率を以下の式に従い計算した：
腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）＝（Ｔ−Ｔ０／Ｃ−Ｃ０）×１００％
腫瘍抑制率％ＴＧＩ＝１−Ｔ／Ｃ％
【０１３２】
結果を表１１および図２に示しており、投与の１４日後に、ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３  ６ｍｐｋおよびＨｕ３０３−００５  ６ｍｐｋはいずれも一定の抗腫瘍効果を有し、腫瘍抑制率はそれぞれ、２７．２５％（ｐ＜０．０５）、３４．９４％（ｐ＜０．０１）であることを示した。コントロールグループと比較して有意な違いがあった（ｈＩＧｇに対してｐ＜０．００１）。
【表１１】
2019518459.tif 000023
【０１３３】
試験例７．マウスにおける、ヒト化抗ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５の薬物動態（ＰＫ）アッセイ
１８匹のＩＣＲマウス（体重１８〜２２ｇの雄）を、Ｗｅｓｔ  Ｐｏｏｌｅ−Ｂｉｋａｉ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．,Ｌｔｄから購入した。給餌期間中、マウスに水および食餌を自由に与え、実験室環境での適応期間は３日以上で、１２／１２時間の明／暗サイクル調節、１６〜２６℃の温度、４０〜７０％の相対湿度であった。実験開始３日前に、ＩＣＲマウスに番号付けを行い、別々のグループ（各グループ３匹）にランダムに分けた。実験当日に、２つのマウスのグループに、ヒト化候補抗体（Ｈｕ２２９−０１３）を、それぞれ３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、静脈内に注射した；他の２つのマウスのグループに、ヒト化候補抗体（Ｈｕ３０３−００５）を、それぞれ３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、静脈内に注射した。静脈内注射の容量は、２０ｍｌ／ｋｇである。
【０１３４】
血液サンプルを、投与後１５分、８時間、１日、２日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日および３５日の時点で回収した。毎回約０．１ｍｌの全血を、抗凝血剤を含まない遠心管に採取し、４℃で３０分間静置した後、１０００ｇで１５分間遠心分離した。その後、上清をＥＰその後、上清をピペットでＥＰチューブに入れ、−８０℃で保存した。
【０１３５】
血清中の薬剤の濃度をＥＬＩＳＡで測定して、Ｔ１／２および他の主なパラメーターをＷｉｎｎｏｌｉｎソフトウェアで計算した。主な薬物動態パラメーターは表１２に示す。
【表１２】
2019518459.tif 000024
【０１３６】
マウスにおけるヒト化ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５のＡＵＣは類似しており、３および１０ｍｇ／ｋｇの投与量におけるこれら２つの抗体のＡＵＣおよびピーク濃度は、投与量の増加と直線的に相関し、線形の薬物動態特性を示した。
【０１３７】
試験例８．抗体の物理的安定性
本試験例を用いて、ヒト化抗ＬＡＧ−３抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５の物理的安定性を検出した。
【０１３８】
異なる抗体の熱安定性をＤＳＣ(示差走査熱量測定)により検出して、異なる緩衝系および異なるｐＨ条件における抗体の安定性を比較した。異なるｐＨ値に対応する緩衝系は、例えば、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  Ｈｉｓ／１３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、１０ｍＭ酢酸／１３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．２）である。
【０１３９】
各サンプルを、対応するバッファーに溶解し、サンプルの濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調節し、ＭｉｃｒｏＣａｌ＊  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて検出した。試験の前に、各サンプルおよびブランクバッファーを、真空脱気装置で１〜２分脱気した。４００μｌのサンプルまたはブランクバッファーを、各ウェルに添加した（負荷量は３００μｌ）。最後に、ウェルの２つのペアに、１４％のＤｅｃｏｎ９０およびｄｄＨ２Ｏそれぞれ添加して、洗浄した。プレートにサンプルを負荷した後、プレートをプラスチックカバーでシールした。スキャンは、温度２５℃で開始して１００℃まで行い、スキャン速度は６０℃／ｈである。結果は表１３に示しており、抗体Ｈｕ２２９−０１３およびＨｕ３０３−００５の両方が、いくつかの試験系において優れた熱安定性を示したことを示している。
【表１３】
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【０１４０】
サンプルの純度を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣでモニターし、特定の条件下での周期的安定性を調べた。例示的な条件は、例えば、サンプルの濃度を約５０ｍｇ／ｍｌに調節し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）系にて、−８０℃で５回繰り返し凍結融解し、４℃および４０℃で１ヵ月間保管した、異なる抗体の安定性を比較することである。Ｘｂｒｉｄｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣ  ２００Ａ（Ｗａｔｅｒｓ）ＨＰＬＣカラムを用いて、検出した。結果を表１４に示しており、いずれの抗体もより高い安定性を示したことを示している。
【表１４】
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【０１４１】
試験例９．抗体の化学的安定性
脱アミドは、後の段階での安定性に影響を及ぼすことがある、抗体の一般的な化学的修飾であり、特に、ＣＤＲ領域でのアミノ酸残基の高レベルの脱アミド修飾を避けるか、または変異を減らそうとするのが一般的に望ましい。５００μｇの試験抗体を、５００μｌのｐＨ４．０のＰＢＳに溶解した後、４０℃のウォーターバスに置いた。酵素的アッセイのために、サンプルを０、３、６日目に採取した。異なる時点で採取した各サンプル１００μｇを、１００μｌの０．２Ｍ  Ｈｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ  Ｇμａ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ６．０に溶解し、０．１ｇ／ｍｌのＤＴＴ３μｌを添加した後に、サンプルを１時間、５０℃のウォーターバスに置いた。０．０２Ｍ  Ｈｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．０で２回限外濾過した後、３μｌの０．２５ｍｇ／ｍＬトリプシンを、３７℃で一晩、酵素分解するために添加した。脱アミド修飾をＬＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５３０  Ｑ−ＴＯＦ）を用いて調べ、その結果を表１５に示す。
【表１５】
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【０１４２】
マススペクトロメトリーの結果によると、検出した抗体では、明らかに高い、脱アミド修飾部位の割合は見られず、抗体の化学的安定性が後の段階において良好であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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