(57)【要約】  幹細胞の褐色脂肪細胞への分化を促進するためのキットの提供におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用、及び白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために用いられる薬剤の調製におけるＢＰの使用を含む、ＢＰの用途。【選択図】図５Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）基本培地及び幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分を含む条件培地と、
（２）ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、
を構成成分として含む、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進するためのキット。
【請求項２】
前記成分は、ロシグリタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進するために用いられる薬剤の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用。
【請求項４】
白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために用いられ、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも一方とともに投与される薬剤の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用。
【請求項５】
前記薬剤は、抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のために用いられる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記メタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記間葉幹細胞は、脂肪幹細胞である、請求項４から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤は、１日あたりＢＰとして３０ｍｇ／ｋｇ体重からＢＰとして２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤は、１日あたりＢＰとして３０ｍｇ／ｋｇ体重からＢＰとして２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される、請求項４から６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブチリデンフタリド（ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅｐｈｔｈａｌｉｄｅ、ＢＰ）の使用に関し、特には、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進することにおけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用及び白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減することにおけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用に関する。間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞と組み合わせてブチリデンフタリド（ＢＰ）を対象に投与することによって、対象において、より効率的に体重増加が抑制され、脂肪組織の蓄積が減り、そして白色脂肪の褐色脂肪への転換が促進される。
【背景技術】
【０００２】
脂肪は白色脂肪及び褐色脂肪の２種類に大きく分けられる。白色脂肪細胞からなる白色脂肪の外見は白色である一方、褐色脂肪細胞からなる褐色脂肪の外見は褐色である。Ｍｙｆ−５陰性筋線維芽細胞から分化した白色脂肪細胞は、形態学では１個の、かつ大きい脂肪滴を含むことで特徴付けられ、その主な機能はエネルギーを蓄えることである。Ｍｙｆ−５陽性筋線維芽細胞から分化した褐色脂肪細胞は、その中に分散した多数の小さな脂肪滴と多くのミトコンドリアとを含むことで特徴付けられる。また、褐色脂肪細胞は、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）を高度に発現でき、その主な機能はエネルギーを消費することである。
【０００３】
油、糖及び脂肪を多く含む西洋の食文化、概して運動を欠く生活様式、並びに遺伝等の因子によって、肥満が世界中で健康問題となっている。全身における白色脂肪の蓄積、並びに血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの過剰な含量等の特性が肥満である対象でよく見られることが研究で判明している。また、糖尿病、循環器疾患、脳血管疾患、高血圧症及び腎症等のメタボリック症候群の発生は、高トリグリセリド、高血糖及び高コレステロールに密接に関連している。体重を減少又は制御できると言われる市販の多くの薬があるが、これらの薬のほとんどが満腹感の増大、食欲の抑制及び脂肪の吸収の阻害等の機序によって、謳われている目的を達成する。その結果、これらの薬の投与は、頭痛、低血糖、便秘、不眠、及び脂肪便等の副作用を伴うことが多く、心臓病及び脳卒中になるリスクさえも増大させてしまう。したがって、本技術分野には副作用がより少なく、抗肥満及び肥満に関連するメタボリック症候群の予防に有効な方法又は薬剤を開発する必要性がいまだに残されている。
【０００４】
褐色脂肪は成人の体重の約０．１％であるが、それは１日の基礎代謝率の約１０〜２０％を燃焼し、トリグリセリドのクリアランスの促進、インスリンの過剰な活性の改善、及び抗肥満に有効であるということが研究で示されている。したがって、抗肥満の調査及び肥満に関連するメタボリック症候群の予防に係る研究は、全身の褐色脂肪の割合をいかにして増加させるかという点にますます注目している。
【０００５】
動物の体内の褐色脂肪の割合を増加させる２つの方法が知られており、一方は動物の体内で白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進すること（以下“脂肪褐色化”という）で、他方は褐色脂肪細胞又は褐色様脂肪細胞の細胞懸濁液を動物に注入すること（以下“褐色脂肪細胞の細胞注入”又は“褐色様脂肪細胞の細胞注入”という）である。褐色様脂肪細胞は、褐色脂肪細胞の形態を有し、その中に分散した多数の小さな脂肪滴を含み、多くのミトコンドリアを含み、高度に発現したＵＣＰ１タンパク質を有することで特徴付けられる細胞であるが、遺伝子発現において褐色脂肪細胞と異なる。褐色様脂肪細胞は幹細胞の分化又は白色脂肪細胞の転換の誘導及び促進によって得られることが知られている。細胞の形態上、褐色様脂肪細胞は褐色脂肪細胞に似ているため、それは脂肪分類における褐色脂肪に属するものと見なされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、今までのところ、全身の褐色脂肪の割合を増加させるための上記２つの方法に関して有効な技術的手段がない。運動又は寒い環境が動物の体内での脂肪褐色化の発生を刺激するのに有効であることが研究で示されているが、多くの人々は、通常は運動不足で寒い環境をすぐには利用できない。運動又は寒い環境に置かれることを介して動物の体内において効率的かつ安定して脂肪褐色化を促進することは実現困難である。さらに、褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞の細胞注入は、褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞の供給源がほとんどなく、細胞を取得するコストが高いため、費用効率が良くない。
【０００７】
上記課題を考慮して、動物の体内における脂肪褐色化を促進する、及び／又は褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞の取得が困難であるという問題を解決するための効果的な方法を開発することが切実に必要とされている。本発明の発明者は、基本培地と幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分を含む条件培地とが、ブチリデンフタリド（ＢＰ）が外部から加えられた場合に幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進し得ることを見出した。結果として、褐色様脂肪細胞を取得するためのコストが抑えられ、褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞の取得が困難であるという問題が解決される。
【０００８】
また、本発明の発明者は、動物へのブチリデンフタリド（ＢＰ）のみの投与、及び間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の投与がいずれも効果的に白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への変換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減することを見出した。このため、ブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用は、動物の体内での脂肪褐色化を促進することができ、抗肥満の効果をもたらし、肥満に関連するメタボリック症候群を防ぎ、さらに、満腹感の増大、食欲の抑制及び脂肪の吸収の阻害等の機序によって抗肥満効果をもたらす市販の抗肥満薬によって起こる副作用を回避することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進するためのキットを提供することであって、該キットは、（１）基本培地及び幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分を含む条件培地と、（２）ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、を構成要素として含む。好ましくは、該成分は、ロシグリタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びそれらの組み合わせである。
【００１０】
本発明の別の目的は、薬剤の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用を提供することであって、薬剤は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために用いられる。特に、薬剤は、抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のために用いられる。好ましくは、薬剤は、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも１つと組み合わせて投与される。より好ましくは、薬剤は、脂肪幹細胞と組み合わせて投与される。薬剤は、１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）約２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するための方法を提供することであって、該方法は、必要とする対象に有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）を投与することを含む。具体的には、方法は抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のためである。メタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである。好ましくは、必要とする対象には、有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）とともに間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも１つが投与される。より好ましくは、必要とする対象には、有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）と脂肪幹細胞とが投与される。ブチリデンフタリド（ＢＰ）の量は、１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）約２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はブチリデンフタリド（ＢＰ）で処理された幹細胞における脂肪滴産生の分化経過を示す。各顕微鏡写真は、左から右へ、異なる倍率（４０倍、１００倍及び２００倍）での脂肪幹細胞、脂肪幹細胞から分化した脂肪細胞及びブチリデンフタリド（ＢＰ）を外部から添加した条件培地での脂肪細胞の培養から得られた細胞の形態を個別に示す。
【図２Ａ】図２Ａは、異なる処理での細胞の脂肪滴の含量を示す。図２Ａは顕微鏡で観察された、オイルレッド染料で染色した脂肪細胞の写真である。図２Ａは脂肪幹細胞（条件培地で培養せず、未分化）、脂肪細胞（条件培地で培養、分化）及び２、１０、５０μｇ／ｍＬのブチリデンフタリド（ＢＰ）でそれぞれ処理された脂肪細胞（分化）の結果を含む。
【図２Ｂ】図２Ｂは、異なる処理での細胞の脂肪滴の含量を示す。図２Ｂは、脂肪滴の定量された吸光度を示すヒストグラムである。図２Ｂは脂肪幹細胞（条件培地で培養せず、未分化）、脂肪細胞（条件培地で培養、分化）及び２、１０、５０μｇ／ｍＬのブチリデンフタリド（ＢＰ）でそれぞれ処理された脂肪細胞（分化）の結果を含む。
【図３Ａ】図３Ａは、異なる濃度でのブチリデンフタリド（ＢＰ）の脂肪褐色化効果を示す。図３Ａは、脂肪細胞の酸素消費速度に対する異なる濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）の影響を示す曲線図である。図３Ａは未分化の脂肪幹細胞（“Ａ”で示される）、分化した脂肪細胞（“０”で示される）、外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を（２μｇ／ｍＬの終濃度まで）添加した条件培地で７日間培養された脂肪細胞（“２”で示される）、外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を（１０μｇ／ｍＬの終濃度まで）添加した条件培地で７日間培養された脂肪細胞（“１０”で示される）、及び外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を（５０μｇ／ｍＬの終濃度まで）添加した条件培地で７日間培養された脂肪細胞（“５０”で示される）の結果を含む。
【図３Ｂ】図３Ｂは、異なる濃度でのブチリデンフタリド（ＢＰ）の脂肪褐色化効果を示す。図３Ｂは、脂肪細胞の予備呼吸容量に対する異なる濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）の影響を示すヒストグラムである。図３Ｂは未分化の脂肪幹細胞（“Ａ”で示される）、分化した脂肪細胞（“０”で示される）、外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を（２μｇ／ｍＬの終濃度まで）添加した条件培地で７日間培養された脂肪細胞（“２”で示される）、外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を（１０μｇ／ｍＬの終濃度まで）添加した条件培地で７日間培養された脂肪細胞（“１０”で示される）、及び外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を（５０μｇ／ｍＬの終濃度まで）添加した条件培地で７日間培養された脂肪細胞（“５０”で示される）の結果を含む。
【図４Ａ】図４Ａは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で決定された脂肪細胞のＵＣＰ１遺伝子の発現の結果を示す。図４ＡはＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４（脂肪細胞の内部コントロール）及びアクチン（すべての細胞の内部コントロール）遺伝子の発現量を示す写真である。図４Ａは対照群（条件培地で１４日間培養、“対照群”で示される）、ブチリデンフタリド（ＢＰ）処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からＢＰを添加した条件培地でさらに７日間培養、“ＢＰ”で示される）、トファシチニブ処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からトファシチニブを添加した条件培地でさらに７日間培養、“トファシチニブ”で示される）、アデノシン処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からアデノシンを添加した条件培地でさらに７日間培養、“アデノシン”で示される）、及びプロアントシアニジン処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からプロアントシアニジンを添加した条件培地でさらに７日間培養、“プロアントシアニジン”で示される）の結果を含む。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ウエスタンブロットで決定された脂肪細胞のＵＣＰ１タンパク質の発現の結果を示す。図４Ｂは、ＵＣＰ１、ＦＡＢＰ４及びアクチンタンパク質の発現量を示す写真である。図４Ｂは対照群（条件培地で１４日間培養、“対照群”で示される）、ブチリデンフタリド（ＢＰ）処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からＢＰを添加した条件培地でさらに７日間培養、“ＢＰ”で示される）、トファシチニブ処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からトファシチニブを添加した条件培地でさらに７日間培養、“トファシチニブ”で示される）、アデノシン処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からアデノシンを添加した条件培地でさらに７日間培養、“アデノシン”で示される）、及びプロアントシアニジン処理群（条件培地で７日間培養に続いて外部からプロアントシアニジンを添加した条件培地でさらに７日間培養、“プロアントシアニジン”で示される）の結果を含む。
【図５Ａ】図５Ａは、マウスの脂肪の形態に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す。図５Ａはマウスの皮下脂肪切片のＩＨＣ染色の結果を示す写真である。“ＮＤ群”のマウスは、通常食で飼育されただけで、“ＨＦＤ群”のマウスは、高脂肪食で飼育されただけで、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつブチリデンフタリド（ＢＰ）を投与され、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつ脂肪幹細胞を投与され、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつブチリデンフタリド（ＢＰ）及び脂肪幹細胞を投与され、ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつ褐色様脂肪細胞を投与され、ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつブチリデンフタリド（ＢＰ）及び褐色様脂肪細胞を投与された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、マウスの脂肪の形態に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す。図５Ｂはマウスの内臓脂肪切片のＩＨＣ染色の結果を示す写真である。“ＮＤ群”のマウスは、通常食で飼育されただけで、“ＨＦＤ群”のマウスは、高脂肪食で飼育されただけで、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつブチリデンフタリド（ＢＰ）を投与され、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつ脂肪幹細胞を投与され、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつブチリデンフタリド（ＢＰ）及び脂肪幹細胞を投与され、ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつ褐色様脂肪細胞を投与され、ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”のマウスは、高脂肪食で飼育され、かつブチリデンフタリド（ＢＰ）及び褐色様脂肪細胞を投与された。
【図６Ａ】図６Ａは、マウス体脂肪の蓄積に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す。図６Ａは、心臓、肝臓、腎臓、皮下の脂肪組織及び内臓の脂肪組織の外観を示す写真である。図６Ａは“ＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【図６Ｂ】図６Ｂは、マウス体脂肪の蓄積に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す。図６Ｂはマウスの皮下の脂肪組織の重量を示すヒストグラムである。図６Ｂは“ＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【図６Ｃ】図６Ｃは、マウス体脂肪の蓄積に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す。図６Ｃはマウスの内臓の脂肪組織の重量を示すヒストグラムである。図６Ｃは“ＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【図７】図７は、９週齢から１８週齢の間のマウス重量の変化を表すことでマウス重量に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す曲線図であって、“ＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【図８Ａ】図８Ａは、マウス血清の生化学的検査値に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す図である。図８Ａは、血中のグルコースの含量を示すヒストグラムである。図８ＡはＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【図８Ｂ】図８Ｂは、マウス血清の生化学的検査値に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す図である。図８Ｂは、血中のトリグリセリドの含量を示すヒストグラムである。図８Ｂは“ＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【図８Ｃ】図８Ｃは、マウス血清の生化学的検査値に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）及び細胞注入の影響を示す図である。図８Ｃは、血中の総コレステロールの含量を示すヒストグラムである。図８Ｃは“ＮＤ群”、“ＨＦＤ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ群”、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ群”、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ群”及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ群”の結果を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下の段落は、本発明のいくつかの実施の形態を詳細に説明する。しかし、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は様々な実施の形態で具現化されてよく、本明細書及び特許請求の範囲に開示された実施の形態に限定されるべきではない。本明細書で特段の指示がなければ、本発明の明細書（特に特許請求の範囲）に記載された“ａ”、“ａｎ”、“ｔｈｅ”等は、単数形及び複数形の両方を含むことが意図される。
【００１４】
台湾の厚生省の健康増進管理の基準によれば、肥満の定義はＢＭＩ＞２４であって、メタボリック症候群の定義はＢＭＩ＞２４、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロール＜５０ｍｇ／ｄＬ、空腹時血糖＞１００ｍｇ／ｄＬかつトリグリセリド＞１５０ｍｇ／ｄＬである。世界保健機関（ＷＨＯ）の基準では、欧米人種の肥満の定義はＢＭＩ＞３０である。米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ａｄｕｌｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｐａｎｅｌ−ＩＩＩ（ＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩ）によれば、メタボリック症候群の定義は、血圧＞１３０／８５ｍｍＨｇ、トリグリセリド＞１５０ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬコレステロール＜４０ｍｇ／ｄＬ（男性）又は＜５０ｍｇ／ｄＬ（女性）、胴回り＞１０２ｃｍ（男性）又は＞８８ｃｍ（女性）、及び空腹時血糖＞１１０ｍｇ／ｄＬの少なくとも３つの指標を満たす対象である。したがって、本研究では、通常は高コレステロール、高血糖及び高トリグリセリドが肥満の指標として用いられる。
【００１５】
糖尿病、循環器疾患、脳血管疾患、高血圧症及び腎症等のメタボリック症候群の発症は、肥満に密接に関連することが知られている。このことは、“Ｃａｒｄｉａｃ  Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｙｏｕｔｈ  ｗｉｔｈ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ．２０１６  Ｊｕｌ；１６（７）：６２”，“Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｏｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｈｅａｌｔｈ．  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  ２０１３  Ａｐｒｉｌ；  ２７（２）：１４７−１５６”，  “Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２  Ｆｅｂ；１６５（３）：５９１−６０２”、及び“Ｏｂｅｓｉｔｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ．２０１５  Ｄｅｃ  １１；５（４）：７２０−７３２”に記載されており、参照することでそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【００１６】
上述のように、抗肥満の調査及び肥満に関連するメタボリック症候群の予防に係る研究は、全身の褐色脂肪の割合をいかにして増加させるかという点にますます注目している。ＰＥＴ／ＣＴ画像を用いて、褐色脂肪における熱発生が細胞でのミトコンドリアの呼吸鎖を脱共役させることで引き起こされることが研究によって確認され、成人の体内では脂肪組織の熱発生活性がＵＣＰ１の発現レベルに正の相関を示すことが発見された。特に、ＵＣＰ１を高度に発現している細胞（褐色脂肪細胞及び褐色様脂肪細胞を含む）は、ミトコンドリアの呼吸鎖の脱共役における電子伝達系を介して酸化を行うことができるが、細胞はリン酸化反応を行うことができないためＡＴＰが産生されない。このプロセスは栄養及び酸素の消費を促進し得るため、このプロセスは体重減少の目的を達成するために利用できる。これは、“Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  ｂｅｉｇｅ  ｆａｔ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｏｃｔ；１９（１０）：１２５２−１２６３に記載されており、参照することでその全体が本明細書に組み入れられる。
【００１７】
体の褐色脂肪の割合を増加させる方法には、動物の体内における脂肪褐色化の促進と、褐色脂肪細胞及び／又は褐色様脂肪細胞の注入とがあることが知られている。しかし、上述のように、動物の体内における脂肪褐色化を促進するための効率的な方法も褐色脂肪細胞及び褐色様脂肪細胞を取得することが困難であるという問題を解決するための有効な方法もない。トファシチニブ、アデノシン及びプロアントシアニジン等の薬が幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進するために使用できることを先行研究が示したが、それらの効果は限定的である。
【００１８】
本発明の発明者は、基本培地と幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分とを含む条件培地が、外部からブチリデンフタリド（ＢＰ）を加えられた場合に幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進し得ることを見出した。
【００１９】
したがって、本発明は、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進するためのキットに関し、該キットは、（１）基本培地及び幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分を含む条件培地と、（２）ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、を構成成分として含む。本発明に係るキットの使用によって、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進でき、安価な方法で大量の褐色様脂肪細胞を安定的に供給できる。得られた褐色様脂肪細胞は、褐色様脂肪細胞の細胞注入に用いられるのみならず、肥満又はエネルギー代謝に関連する研究に用いられる。褐色様脂肪細胞の適用範囲は広い。
【００２０】
本発明によって提供されるキットにおいて、幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる任意の適した成分がキットの構成成分（１）（すなわち、条件培地）において用いられる。例えば、成分はロシグリタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明によって提供されるキットの構成成分（１）（すなわち、条件培地）において、基本培地は、幹細胞の成長ための栄養及び条件（例えば、ｐＨ値及び湿度）を与えることができる必須成分を含み、それは概して培養される幹細胞の要求に応じて調整される。通常、採用可能な基本培地として、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ培地（最小必須培地）、α−ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地（イーグル基礎培地）、ＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、及びＲＰＭＩ培地（ロズウェルパーク記念研究所）が例示されるが、基本培地はこれらに限定されない。本発明のいくつかの実施の形態では、ＤＭＥＭ培地がキットで用いられた。
【００２２】
本発明に係るキットにおいて、構成成分（１）（すなわち、条件培地）及び構成成分（２）（すなわち、ブチリデンフタリド（ＢＰ））は、通常、独立して包装され、格納されており、個別に、若しくはセットで輸送又は販売されてもよい。任意に、構成成分（１）における副成分が独立して包装され、格納されてもよい。さらに、キットは、取扱説明書をさらに備えてもよく、取扱説明書は、細胞の培養、処理及び使用に関して現場での構成成分の混合について使用者に手順及び順番を示すものである。
【００２３】
例えば、構成成分（１）の副成分及び構成成分（２）が独立して包装され、格納され、個別に輸送又は販売される場合、幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分（例えば、ロシグリタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）及びデキサメタゾン）とブチリデンフタリド（ＢＰ）とは、４℃未満の温度で暗い環境に保存され、基本培地は−２０℃の温度の環境に保存される。また、本発明に係るキットにおける構成成分がセットで輸送され、販売される場合、ブチリデンフタリド（ＢＰ）及び幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分は、内部温度が４℃未満の容器内に保存され、基本培地は内部温度が−２０℃の容器内（例えば冷凍室）に保存される。構成成分がセットで輸送及び販売される際、構成成分の保管温度が相互に影響しないことが保証される所望の断熱機能を有する容器であれば、容器の形状及び大きさに特に限定はない。
【００２４】
本発明に係るキットを使用する際、各構成成分の処方及び混合の順番は特に限定されない。例えば、条件培地の副成分が個別に包装されている場合、条件培地は、処方された後、ブチリデンフタリド（ＢＰ）と混合されてもよい。また、ブチリデンフタリド（ＢＰ）が基本培地と混合された後、他の副成分と混合されてもよいし、あるいは条件培地の各副成分がブチリデンフタリド（ＢＰ）と同時に混合されてもよい。さらに、ブチリデンフタリド（ＢＰ）は条件培地又は基本培地に直接混合されてもよいし、あるいはブチリデンフタリド（ＢＰ）が溶媒に溶解されてブチリデンフタリド（ＢＰ）溶液を得てから、ブチリデンフタリド（ＢＰ）溶液が条件培地又は基本培地と混合されてもよい。ブチリデンフタリド（ＢＰ）を溶解させることができる溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオキシエチレンヒマシ油（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）  ＥＬ）、エタノール、植物油及び動物油等が例示されるが、溶媒はこれらに限定されない。
【００２５】
本発明に係るキットを用いる際、過度に低濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）では幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進できないが、過度に高濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）によって細胞傷害が起きることがわかった。したがって、用いられる濃度は、通常、条件培地の約１μｇから約１００μｇ／ｍＬまでの範囲であって、好ましくは、条件培地の約２μｇから約５０μｇ／ｍＬまでの範囲であって、さらに好ましくは、条件培地の約５μｇから約２０μｇ／ｍＬまでの範囲である。例えば、下記実施例に示されるように、ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、条件培地の約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進できる。
【００２６】
また、本発明の発明者は、動物へのブチリデンフタリド（ＢＰ）のみの投与、並びに間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の投与が双方ともに白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減する効果をもたらすことを発見した。
【００２７】
したがって、本発明は、薬剤の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用にも関連し、薬剤は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために用いられる。本発明によって提供される薬剤は、特に抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のために用いられる。肥満に関連するメタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである。任意に、薬剤は、間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞と組み合わせて投与される。
【００２８】
所望の目的に応じて、本発明の薬剤は、あらゆる適した形態で提供されてよく、特に限定されない。例えば、薬剤は、経口の又は非経口の（皮下注射、静脈注射、筋肉注射、腹膜注射、経皮、皮下移植又は間質内移植等）経路で必要とする対象に投与されてよいがこれらに限定されない。特に、経口投与によって、定時に患者自身が容易に服用できる。形態及び目的に応じて適した担体が選択され、当該担体がブチリデンフタリド（ＢＰ）の所望の効果に悪影響を及ぼさない限り、薬剤を供給するために用いられてもよい。担体の例は、賦形剤、希釈剤、助剤、安定化剤、吸収抑制剤、崩壊剤、屈水性剤、乳化剤、酸化防止剤、接着剤、結合剤、粘着付与剤、分散剤、懸濁化剤、潤滑剤、吸湿性剤等である。
【００２９】
経口投与に関する剤形に関して、適した担体の例は、限定されないが、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール又はその誘導体、セルロース、でんぷん、糖ベントナイト（ｓｕｇａｒ  ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、及びこれらの組み合わせ等である。薬剤は、任意の適した方法における経口投与のためにあらゆる適した形態で提供されてもよく、例えば錠剤、丸薬、カプセル、顆粒、散剤等の固形の形態、経口液体、シロップ、エキス、エリキシル剤、チンキ剤等の液体の形態であるが、これらに限定されない。
【００３０】
皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、又は腹膜投与のために適した注射又は点滴の形態に関して、本発明によって提供される薬剤は、１種以上の成分を含んでよく、該成分は、静脈内注入、乳化させた上での静脈内注入、注射のための粉末、注射のための懸濁液、又は注射のための粉末懸濁液等として薬剤を提供するため、例えば等張液、塩で緩衝化された生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水又はクエン酸緩衝生理食塩水）、屈水性剤、乳化剤、５％糖溶液、及び他の担体等である。また、薬剤は、注射前の固体として調製されてもよい。注射前の固体は、他の溶液若しくは懸濁液に可溶な形態、又は乳化可能な形態で提供されてもよい。必要とする対象に投与される前に注射前の固体を他の溶液若しくは懸濁液に溶解させるか、あるいは乳化させることで所望の注射が得られる。さらに、経皮投与のための外用剤形に関して、薬剤は、塗布薬（例えば、乳剤、クリーム、ゲル、分散ねり剤、軟膏）、スプレー、パッチ、又は溶液（例えば、洗浄剤、懸濁液）等の形態で提供されてもよい。
【００３１】
皮下移植又は間質内移植に適した剤形に関して、本発明によって提供される薬剤は、ウエハー、錠剤、丸薬、カプセル等の形態で薬剤を提供するために、１種以上の成分、例えば賦形剤、安定化剤、緩衝剤、他の担体等をさらに含んでもよい。このため、薬剤は、それに含まれるブチリデンフタリド（ＢＰ）を移植部位の周辺の組織にゆっくりかつ持続的に放出するように対象に移植されてよく、その結果、薬剤は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために、薬剤の局所で安定的な高い投与量を達成できる。例えば、本発明によって提供される薬剤は、混合物を提供するためにｐ（ＣＰＰ−ＳＡ）共重合体と混合されてよく、続いて混合物は二塩化メチレンに溶解され、乾燥されて粉末で提供されてもよく、その後、粉末は型に入れられ、軽度の圧力で圧縮されて、皮下移植又は間質内移植のためのウエハーとして提供されてもよいが、これに限定されない。
【００３２】
任意に、本発明によって提供される薬剤は、薬剤の味及び見た目を向上させるための香味剤、調色液又は着色剤、及び薬剤の安定性及び保存性を改善するための緩衝剤、保存剤、防腐剤、抗菌剤又は抗真菌剤等の適量の添加物をさらに含んでもよい。さらに、他の活性成分がブチリデンフタリド（ＢＰ）の所望の効果に悪影響を及ぼさない限り、薬剤は、βアドレナリン受容体アゴニスト（例えばＣＬ３１６２４３）、ＰＰＡＲ−γアゴニスト（例えば、ロシグリタゾン）、代謝促進関連因子（例えば、アディポネクチン）、免疫刺激剤等の１種以上の他の活性成分をさらに任意に含んでもよいし、薬剤の効果をさらに強化するために、又は上述の提供される製剤の適用柔軟性及び適応性を増加させるために、１種以上の他の活性成分を含む薬剤と組み合わせて用いられてもよい。
【００３３】
必要性、対象の年齢、体重及び健康状態に応じて、本発明によって提供される薬剤は、１日１回、１日複数回、又は数日ごとに１回等の様々な投与頻度で投薬される。例えば、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース、総コレステロールの含量を低減するために、本発明によって提供される薬剤が対象に経口で投与される場合、薬剤は、１日あたり（ＢＰとして）約３０ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）約２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは１日あたり（ＢＰとして）約１００ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、さらに好ましくは１日あたり（ＢＰとして）約２００ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）約５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。ここで、単位“ｍｇ／ｋｇ体重”は、対象のｋｇ体重あたりに要する量を意味する。本発明のいくつかの実施の形態では、本発明によって提供される薬剤は、抗肥満の（すなわち白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減する）ために使用され、薬剤は、１日あたり（ＢＰとして）約２５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。
【００３４】
本発明によって提供される薬剤の投与に加えて、追加の間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞が必要とする対象に任意に投与されてもよく、間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞は、同時に又は別に薬剤と組み合わせて投与されてもよい。必要性、対象の年齢、体重及び健康状態に応じて、間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞は、１日１回、１日複数回、数日ごとに１回、又は数週間ごとに１回等の様々な頻度で投与されてもよい。例えば、細胞注入で細胞が対象に投与される場合、細胞は、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の総量に基づいて、２週間ごとに約４×１０４個の細胞から約４×１０６個の細胞の範囲で投与される。本発明のいくつかの実施の形態では、本発明によって提供される薬剤を必要とする対象に投与するのに加え、対象は、細胞注入によって、２週間ごとに約４×１０５個の脂肪幹細胞又は約４×１０５個の褐色様脂肪細胞をさらに投与されてもよい。
【００３５】
また、本発明は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するための方法に関し、該方法は、必要とする対象に有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）を投与することを含む。この方法は、特に抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群を防ぐためのものである。組み合わせにおいて適用される経路、適用される型、適用される量、適用される形態及びブチリデンフタリド（ＢＰ）の関連する用途における使用は上記の説明と同じである。
【００３６】
本発明が以下の具体的な実施例で詳細にさらに説明される。しかし、以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ開示されるものである。本発明の範囲は、これらに限定されず、特許請求の範囲に示される。
【実施例】
【００３７】
［細胞実験］
Ａ１．条件培地の調製
ＤＭＥＭ培地（ブランド名：ＧＩＢＣＯ、製品番号：１１９６５０９２）が基本培地として用いられ、ロシグリタゾン（濃度：０．５μＭ、溶媒：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））、インスリン（濃度：１７０ｎＭ、溶媒：培養培地）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、濃度：０．５μＭ、溶媒：ＤＭＳＯ）及びデキサメタゾン（濃度：１μＭ、溶媒：ＤＭＳＯ）が外部からそこに添加され、条件培地とされた。
【００３８】
Ｂ１．細胞培養
Ｂ１−１．脂肪幹細胞の前培養
脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）が３７℃、５％ＣＯ２で５日間、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養された。上記前培養された細胞の形態が顕微鏡でいくつかの倍率（４０倍、１００倍及び２００倍を含む）で観察され、写真に撮影された。結果が図１に示されている（すなわち、脂肪幹細胞（未分化））。
【００３９】
Ｂ１−２．脂肪幹細胞の分化
脂肪細胞に分化させるために、実施例Ｂ１−１で得られた上記の前培養脂肪幹細胞が３７℃、５％ＣＯ２で７日間、実施例Ａ１で得られた条件培地で培養された。上記のように得られた細胞の形態が顕微鏡でいくつかの倍率（４０倍、１００倍及び２００倍を含む）で観察され、写真に撮影された。結果が図１に示されている（すなわち、脂肪幹細胞（分化））。
【００４０】
Ｂ１−３．脂肪細胞の転換
実施例Ｂ１−２で得られた脂肪細胞が７つの群に分けられ、独立して以下の処理を施された。
（１）対照群：Ａ１で得られた条件培地で細胞が７日間培養された。
（２）ＢＰ−２群：ブチリデンフタリド（ＢＰ）が外部から添加された（終濃度２μｇ／ｍＬ）条件培地で細胞が７日間培養された（ブチリデンフタリド（ＢＰ）はＥＣＨＯ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ社（台湾）から購入され、製品番号はＡ１０３５３である）。
（３）ＢＰ−１０群：ブチリデンフタリド（ＢＰ）が外部から添加された（終濃度１０μｇ／ｍＬ）条件培地で細胞が７日間培養された。
（４）ＢＰ−５０群：ブチリデンフタリド（ＢＰ）が外部から添加された（終濃度５０μｇ／ｍＬ）条件培地で細胞が７日間培養された。
（５）トファシチニブ群：トファシチニブが外部から添加された（終濃度２μＭ）条件培地で細胞が７日間培養された（トファシチニブはＵＮＩ−ＯＮＷＡＲＤ社（台湾）から購入され、製品番号はＰＺ００１７である）。
（６）アデノシン群：アデノシンが外部から添加された（終濃度１μＭ）条件培地で細胞が７日間培養された（アデノシンはＵＮＩ−ＯＮＷＡＲＤ社（台湾）から購入され、製品番号はＡ４０３６である）。そして、
（７）プロアントシアニジン群：プロアントシアニジンが外部から添加された（終濃度１０μＭ）条件培地で細胞が７日間培養された（アデノシンはＨｏｎｇ  Ｊｉｎｇ社（台湾）から購入され、製品番号はｓｃ−３４４９７６である）。
【００４１】
そして、各群の細胞の形態が顕微鏡でいくつかの倍率（４０倍、１００倍及び２００倍を含む）で観察され、写真に撮影された。“ＢＰ−１０群”の結果も図１に示されている。
【００４２】
実施例１：幹細胞の褐色様脂肪細胞での分化の促進に対するブチリデンフタリド（ＢＰ）の影響
上述のように、白色脂肪細胞との違い、褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞の形態は、（ｉ）多数の脂肪滴を含み、（ｉｉ）多くのミトコンドリアを含み、（ｉｉｉ）高度に発現した脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）を有することで特徴付けられる。多くのミトコンドリアを含むために、褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞は、白色脂肪細胞と比較して高い酸素消費速度及び予備呼吸容量を有する（予備呼吸容量は、最大酸素消費速度と基礎酸素消費速度との間の差を意味し、ＡＴＰの産生に用いられない酸素消費を表す）。このため、褐色様脂肪細胞／褐色脂肪細胞の個数及び割合は、細胞内の脂肪滴の個数、脂肪細胞の酸素消費速度並びにＵＣＰ１の遺伝子及びタンパク質の発現を調べることで評価できる。
【００４３】
（１−１）細胞における脂肪滴の産生効率の評価
まず、実施例Ｂ１−１、Ｂ１−２及びＢ１−３で撮影された写真における各群の細胞の形態を観察した。図１に示すように、実施例Ｂ１−１で得られた脂肪幹細胞（未分化）及び実施例Ｂ１−２で得られた脂肪細胞（分化）と比較して、実施例Ｂ１−３で得られた“ＢＰ−１０群”における脂肪細胞がより多くの脂肪滴を含んでいた。この結果は、ＢＰの使用によって脂肪幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化が効率的に促進されることを示す。
【００４４】
続いて、実施例Ｂ１−１で得られた脂肪幹細胞（未分化）、実施例Ｂ１−２で得られた脂肪細胞（分化）、実施例Ｂ１−３で得られた“ＢＰ−２群”、“ＢＰ−１０群”及び“ＢＰ−５０群”における脂肪細胞がオイルレッド染料で染色され、その形態が写真に撮影され、記録された。結果が図２Ａに示されている。そして、各群における脂肪細胞の脂肪滴の個数が計数された。結果が図２Ｂに示されている。図２Ａ及び２Ｂに示されたように、ブチリデンフタリド（ＢＰ）で処理されなかった脂肪細胞と比較して、“ＢＰ−２群”、“ＢＰ−１０群”及び“ＢＰ−５０群”においてブチリデンフタリド（ＢＰ）で処理された脂肪細胞は、より多くの脂肪滴を含んでおり、“ＢＰ−１０群”における脂肪細胞は、脂肪滴の含量が最大であった。この結果は、ＢＰの使用によって、脂肪幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化が効率的に促進されることを示す。
【００４５】
（１−２）酸素消費速度の向上効率の評価
実施例Ｂ１−１で得られた脂肪幹細胞（未分化）、実施例Ｂ１−２で得られた脂肪細胞（分化）、実施例Ｂ１−３で得られた“ＢＰ−２群”、“ＢＰ−１０群”及び“ＢＰ−５０群”における脂肪細胞が独立してＸＦ２４ウェル細胞培養プレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）に１．６５×１０４細胞／ウェルで播種され、３７℃で２４時間、緩衝成分（すなわち、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．８５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２５ｍＭグルコースを含む培地）を含まないＤＭＥＭ培地で培養された。培地が新たな培地に交換された後、細胞が続けて３７℃で１時間培養された。そして、各群の細胞のミトコンドリア生合成が、２５μＭオリゴマイシン、０．５μＭ  ＦＣＣＰ及び５μＭロテノン／アンチマイシンＡそれぞれで連続して阻害され、上述の阻害を行う前及び行っている間、ミトコンドリア生合成がＸＦ２４細胞外流動分析装置（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）によって継続的に検出された。酸素消費速度及び予備呼吸容量をさらに計算するために、培養培地の酸素圧及び酸性化の度合いが、調整されたプローブで検出された。酸素消費速度の結果が図３Ａに示されており、基礎酸素消費速度及び予備呼吸容量の結果が図３Ｂに示されている。
【００４６】
図３Ａ及び３Ｂに示されたように、ブチリデンフタリド（ＢＰ）で処理されなかった脂肪細胞（分化）と比較して、“ＢＰ−２群”、“ＢＰ−１０群”及び“ＢＰ−５０群”においてブチリデンフタリド（ＢＰ）で処理された細胞は、高い酸素消費速度（図３Ａ）及び予備呼吸容量（図３Ｂ）を有していた。この結果は、ＢＰの使用によって、脂肪幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化が効率的に促進されることを示す。
【００４７】
（１−３）ＵＣＰ１発現の解析
実施例Ｂ１−３で得られた各群の細胞が独立して回収され、細胞の総ＲＮＡ及びタンパク質が次の実験で個別に抽出された。
【００４８】
総ＲＮＡは、逆転写を受け、ｃＤＮＡをもたらし、そして各群の細胞のＵＣＰ１遺伝子の発現が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって解析された。その結果が図４Ａに示されており、ＦＡＢＰ４遺伝子が成熟した脂肪細胞のバイオマーカーであって、それは本実験における脂肪細胞の内部コントロールとして用いられた。アクチン遺伝子がすべての細胞の内部コントロールとして用いられた。さらに、各群における細胞のＵＣＰ１タンパク質の発現がウエスタンブロットで解析された。その結果が図４Ｂに示されており、ＦＡＢＰ４タンパク質が脂肪細胞の内部コントロールとして用いられた。アクチンがすべての細胞の内部コントロールとして用いられた。
【００４９】
図４Ａ及び４Ｂに示されたように、“ＢＰ−１０群”のＵＣＰ１遺伝子及びＵＣＰ１タンパク質の発現は、対照群のそれと比較していずれも顕著に増加し、ＵＣＰ１遺伝子及びＵＣＰ１タンパク質の増加量は、トファシチニブ群、アデノシン群及びプロアントシアニジン群のそれより大きかった。この結果は、ＢＰの使用によって、脂肪幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化が効率的に促進されることを示す。
【００５０】
上記実施例（１−１）から（１−３）までの結果で示されたように、ＢＰは、脂肪幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進し、その効果はトファシチニブ、アデノシン及びプロアントシアニジン等の脂肪幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進することができる既知の薬のそれよりも優れる。
【００５１】
［動物実験］
Ａ２．実験動物としてのマウスモデルの作製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（台湾のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから購入）が中国医科大学（台湾）の実験動物センターで４週齢になるまで飼育された（条件：ケージごとに３匹を飼育、飼育室の温度は２０℃から２４℃の範囲、相対湿度は５０％から７０％の範囲、照明サイクルが１２時間、毎日十分な水と通常食を与えた）。続いて、マウスが７つの群に無作為に分けられ（１群あたり６匹）、個別に次の処理及び実験を行った。
１．通常食群（すなわち“ＮＤ”群）：マウスは１８週齢になるまで通常食で継続的に飼育された。
２．高脂肪食群（すなわち、“ＨＦＤ”群）：マウスは１８週齢になるまで高脂肪食で継続的に飼育され、他の処理を受けていない。
３．ブチリデンフタリド（ＢＰ）の経口投与群（すなわち“ＨＦＤ＋ＢＰ”群）：マウスは１８週齢になるまで高脂肪食で継続的に飼育されるとともに、第９週の初めに経口でブチリデンフタリド（ＢＰ）が投与された（投与量：毎日、２５０ｍｇ／ｋｇ体重）。
４．脂肪幹細胞の細胞注入群（すなわち“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群）：マウスは１８週齢になるまで高脂肪食で継続的に飼育されるとともに、第１１週の初めに静脈注射で脂肪幹細胞が投与された（投与量：２週間ごと、１００〜１５０μＬの生理食塩水に懸濁された４×１０５細胞、合計で４回注射）。
５．脂肪幹細胞の細胞注入と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の経口投与群（すなわち“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群）：マウスは１８週齢になるまで高脂肪食で継続的に飼育されるとともに、第９週の初めに経口でブチリデンフタリド（ＢＰ）が投与され（投与量：毎日、２５０ｍｇ／ｋｇ体重）、かつさらに第１１週の初めに静脈注射で脂肪幹細胞が投与された（投与量：２週間ごと、１００〜１５０μＬの生理食塩水に懸濁された４×１０５細胞、合計で４回注射）。
６．褐色様脂肪細胞の細胞注入群（すなわち“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群）：マウスは１８週齢になるまで高脂肪食で継続的に飼育されるとともに、第１１週の初めに静脈注射によって実施例１で得られた褐色様脂肪細胞が投与された（投与量：２週間ごと、１００〜１５０μＬの生理食塩水に懸濁された４×１０５細胞、合計で４回注射）。
７．褐色様脂肪細胞の細胞注入と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の経口投与群（すなわち“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群）：マウスは１８週齢になるまで高脂肪食で継続的に飼育されるとともに、第９週の初めに経口でブチリデンフタリド（ＢＰ）が投与され（投与量：毎日、２５０ｍｇ／ｋｇ体重）、かつさらに第１１週の初めに静脈注射で実施例１で得られた褐色様脂肪細胞が投与された（投与量：２週間ごと、１００〜１５０μＬの生理食塩水に懸濁された４×１０５細胞、合計で４回注射）。
【００５２】
基準食（１３２６、Ａｌｔｒｏｍｉｎ、ラーゲ、ドイツ；購入仲介：ｅｊｏｙ２社）は、顆粒サイズが１３ｍｍの粒状餌であって、その中に１９％の粗タンパク質、４％の粗脂肪、６％の粗繊維、１３．５％の水、７％の灰白質及び５０．５％の無窒素化合物を含む。高脂肪食（ＴＤ．０６４１５、Ｈａｒｌａｎ、フレデリック、メリーランド州、米国；購入仲介：ｅｊｏｙ２社）は、ラード及び大豆油で混合された特別に調合された餌であって、その中に（重量として）２２．７％の脂肪及び（重量として）２２．８％のスクロースを含み、熱量が４．６ｋｃａｌ／ｇであって、カロリーの４５％が脂肪由来である。
【００５３】
Ｂ２．マウスモデルの評価、記録及び試料採取
Ｂ２−１．上記実施例Ａ２の作製方法において、マウスが１８週齢になるまでマウスの体重変化が毎週記録された。
【００５４】
Ｂ２−２．実施例Ｂ２−１が完了した後、マウスを１２時間絶食させ、続いてマウスの血液が心血採取によって血清チューブに採取された。採取した血液を３０分間静置し、４℃で１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた上清が採取され（すなわち血液試料）、以下の実験及び解析のために４℃で維持された。
【００５５】
Ｂ２−３．実施例Ｂ２−２が完了した後、マウスが犠牲にされ、肝臓、心臓、腎臓、皮下の脂肪組織及びその内臓の脂肪組織が写真を撮影するために摘出された。マウスの皮下の脂肪組織及びの内臓の脂肪組織の重量が測定され、記録され、採取された器官が以下の実験及び解析のために−８０℃で保存された。
【００５６】
実施例２：マウスの脂肪褐色化の状態の観察
褐色脂肪細胞には多数の小さい脂肪滴があることが知られている。ブチリデンフタリド（ＢＰ）が動物の体内で脂肪褐色化の発生の促進に有効であるか否かを明らかにするために、実施例Ｂ２−３で得られた皮下の脂肪組織及び内臓の脂肪組織がホルマリンで固定され、ワックスで加工され、薄い切片に切断された。当該切片がヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）によって染色され、各群のマウスの脂肪組織における細胞の形態が観察された。その結果が図５Ａ（皮下脂肪）及び５Ｂ（内臓脂肪）に示されている。
【００５７】
図５Ａ及び５Ｂに示されたように、“ＨＦＤ”群のマウスにおける皮下の脂肪組織及び内臓の脂肪組織は、両方とも１個の、かつ大きな白色脂肪細胞からなり、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群におけるそれらは、多数の小さな脂肪滴を有する褐色脂肪細胞を含んでいた。さらに、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群と比較して、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群のマウスは、多数の小さな脂肪滴を有する顕著に多くの褐色脂肪細胞を有していた。一方、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群と比較して、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスは、多数の小さな脂肪滴を有する顕著に多くの褐色脂肪細胞を有していた。
【００５８】
この結果は、ブチリデンフタリド（ＢＰ）のみの投与及び細胞注入と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の投与の両方が、高脂肪食によって誘導されるマウスの白色脂肪を、多数の小さな脂肪滴を有する褐色脂肪細胞へ効率よく転換することを示す。つまり、ブチリデンフタリド（ＢＰ）及びＢＰと細胞注入との組み合わせの両方が、動物の体内における脂肪褐色化の促進に有効であり、ＢＰと細胞注入との組み合わせの効果がより高い。
【００５９】
実施例３：マウスの心臓、肝臓、腎臓、皮下の脂肪組織及び内臓の脂肪組織の外観
ブチリデンフタリド（ＢＰ）が白色脂肪の蓄積を軽減するか否かを明らかにするために、実施例Ｂ２−３で記録された各群のマウスの肝臓、心臓、腎臓、皮下の脂肪組織及び内臓の脂肪組織の外観の写真が図６Ａに示されている。実施例Ｂ２−３で記録された各群のマウスの皮下の脂肪組織及び内臓の脂肪組織の重量がそれぞれ平均化された。その結果は、表１、図６Ｂ及び６Ｃに示されている。
【００６０】
【表１】
2019520055.tif 000003
【００６１】
図６Ａに示すように、“ＨＦＤ”群のマウスの内臓は、“ＮＤ”群のそれと比較して白色脂肪を大量に含んでおり、腎臓周囲の蓄積状態がもっとも重大であった。しかし、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの内臓における白色脂肪の蓄積状態は、“ＨＦＤ”群のそれと比較して有意に軽減されていた。一方、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群のマウスの状態は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群のそれと比較してより有意に軽減されていた。さらに、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの状態は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群のそれと比較してより有意に軽減されていた。
【００６２】
表１、図６Ｂ及び６Ｃに示されたように、“ＨＦＤ”群における皮下脂肪及び内臓脂肪の重量は、“ＮＤ”群のそれと比較していずれも有意に大きかった。しかし、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群における皮下脂肪及び内臓脂肪の重量は、“ＨＦＤ”群のそれと比較してすべて有意に小さかった。
【００６３】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）のみの投与及び細胞注入と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の投与の両方が高脂肪食によって誘導されるマウスの皮下の白色脂肪及び内臓の白色脂肪の蓄積を効率よく抑制し、ブチリデンフタリド（ＢＰ）と細胞注入との組み合わせの効果がより高いことを、この結果は示す。
【００６４】
実施例４：マウスの生理学パラメータの変化の評価
４−１．マウスの体重変化
ブチリデンフタリド（ＢＰ）が体重増加の抑制に有効であるか否かを明らかにするために、実施例Ｂ２−１の各群のマウスの記録された体重の平均値が毎週取得された。その結果は図７に示されている。図７に示されたように、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの体重の増加は、“ＨＦＤ”群のそれと比較して有意に抑えられた。一方、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群のマウスの体重の増加は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群のそれと比較して有意に抑えられた。さらに、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの体重の増加は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群のそれと比較して有意に抑えられた。
【００６５】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）のみの投与及び細胞注入と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の投与の両方が高脂肪食によって誘導されるマウスの体重増加を効率よく抑制し、体重増加の抑制に関して、ブチリデンフタリド（ＢＰ）と細胞注入との組み合わせの効果がより高いことを、この結果は示す。
【００６６】
４−２．血中のグルコース、トリグリセリド及び総コレステロールの含量
ブチリデンフタリド（ＢＰ）が血中のグルコース、トリグリセリド及び総コレステロールの含量の低減に有効であるか否かを明らかにするために、実施例Ｂ２−２で得られた各群のマウスの血液試料がＳＹＳＭＥＸ  Ｋ−１０００及びＴＯＳＨＩＢＡ  ＴＢＡ２００ＦＡ  自動血液分析装置で解析され、マウスの血中のグルコース、トリグリセリド及び総コレステロールの含量が解析された。各群の結果が平均化された。その結果は表２及び図８Ａ〜８Ｃに示されている“ＨＦＤ”群の結果に基づいて、各群のグルコース、トリグリセリド及び総コレステロールの相対的な含量が算出された。その結果も表２に示されている。
【００６７】
【表２】
2019520055.tif 000004
【００６８】
表２及び図８Ａに示されたように、“ＨＦＤ”群のマウスの血中のグルコース含量は、“ＮＤ”群のそれと比較して有意に高かった。しかし、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの血中のグルコース含量は、“ＨＦＤ”群のそれと比較してすべて有意に低かった。一方、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群のマウスの血中のグルコース含量は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群のそれと比較して有意に低かった。さらに、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの血中のグルコース含量は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群のそれと比較して低かった。
【００６９】
表２及び図８Ｂに示されたように、“ＨＦＤ”群のマウスの血中のトリグリセリド含量は、“ＮＤ”群のそれと比較して有意に高かった。しかし、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの血中のトリグリセリド含量は、“ＨＦＤ”群のそれと比較してすべて有意に低かった。一方、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群のマウスの血中のトリグリセリド含量は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群のそれと比較して低かった。
【００７０】
表２及び図８Ｃに示されたように、“ＨＦＤ”群のマウスの血中の総コレステロール含量は、“ＮＤ”群のそれと比較して有意に高かった。しかし、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群、“ＨＦＤ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群、“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群及び“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの血中のトリグリセリド含量は、“ＨＦＤ”群のそれと比較してすべて有意に低かった。一方、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＡＤＳＣ”群のマウスの血中のトリグリセリド含量は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群のそれと比較して低かった。さらに、“ＨＦＤ＋ＢＰ＋ＢＬＣ”群のマウスの血中のトリグリセリド含量は、“ＨＦＤ＋ＢＰ”群又は“ＨＦＤ＋ＢＬＣ”群のそれと比較して低かった。
【００７１】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）のみの投与及び細胞注入と組み合わせたブチリデンフタリド（ＢＰ）の投与の両方が高脂肪食によって誘導されるマウスの血中のグルコース、トリグリセリド及び総コレステロールの含量を効率よく低減し、ブチリデンフタリド（ＢＰ）と細胞注入との組み合わせの効果がより高いことを、この結果は示す。
【００７２】
細胞の及び動物の実験に係る上記結果によって示されたように、ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進し、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減することができ、抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群を予防するために動物に投与できる。特に、肥満に関連するメタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである。さらに、間葉系幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞とともにブチリデンフタリド（ＢＰ）を投与することで上記効果をさらに高めることができる。
【００７３】
上述の実施の形態は、本発明の原理及び作用を説明するためのみに用いられ、本発明の範囲はこれによって限定されない。本発明の原理と精神から逸脱することなく、当業者は上記実施の形態を変更及び交換することができる。本発明の範囲は、特許請求の範囲に示される。
【００７４】
（付記）
（付記１）
（１）基本培地及び幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分を含む条件培地と、
（２）ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、
を構成成分として含む、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進するためのキット。
【００７５】
（付記２）
前記成分は、ロシグリタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、付記１に記載のキット。
【００７６】
（付記３）
白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために用いられる薬剤の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用。
【００７７】
（付記４）
前記薬剤は、抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のために用いられる、付記３に記載の使用。
【００７８】
（付記５）
前記メタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである、付記４に記載の使用。
【００７９】
（付記６）
前記薬剤は、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも１つとともに投与される、付記３から５のいずれか一つに記載の使用。
【００８０】
（付記７）
前記間葉幹細胞は、脂肪幹細胞である、付記６に記載の使用。
【００８１】
（付記８）
前記薬剤は、１日あたりＢＰとして３０ｍｇ／ｋｇ体重からＢＰとして２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される、付記３から５のいずれか一つに記載の使用。
【００８２】
（付記９）
前記薬剤は、１日あたりＢＰとして３０ｍｇ／ｋｇ体重からＢＰとして２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される、付記６に記載の使用。
【図１】
2019520055.tif 000005
【図２Ａ】
2019520055.tif 000006
【図２Ｂ】
2019520055.tif 000007
【図３Ａ】
2019520055.tif 000008
【図３Ｂ】
2019520055.tif 000009
【図４Ａ】
2019520055.tif 000010
【図４Ｂ】
2019520055.tif 000011
【図５Ａ】
2019520055.tif 000012
【図５Ｂ】
2019520055.tif 000013
【図６Ａ】
2019520055.tif 000014
【図６Ｂ】
2019520055.tif 000015
【図６Ｃ】
2019520055.tif 000016
【図７】
2019520055.tif 000017
【図８Ａ】
2019520055.tif 000018
【図８Ｂ】
2019520055.tif 000019
【図８Ｃ】
2019520055.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月14日(2018.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）基本培地及び幹細胞の脂肪細胞への分化を誘導することができる成分を含む条件培地と、
（２）ブチリデンフタリド（ＢＰ）と、
を構成成分として含む、幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を促進するためのキット。
【請求項２】
前記成分は、ロシグリタゾン、インスリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）を含む、白色脂肪の蓄積を阻害し、及び／又は白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進するための医薬組成物。
【請求項４】
ブチリデンフタリド（ＢＰ）を含む、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するための医薬組成物であって、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも一方とともに投与される、医薬組成物。
【請求項５】
抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のために用いられる、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記メタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記間葉幹細胞は、脂肪幹細胞である、請求項４から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
１日あたりＢＰとして３０ｍｇ／ｋｇ体重からＢＰとして２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
１日あたりＢＰとして３０ｍｇ／ｋｇ体重からＢＰとして２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される、請求項４から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の別の目的は、薬剤の製造におけるブチリデンフタリド（ＢＰ）の使用を提供することであって、薬剤は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するために用いられる。特に、薬剤は、抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のために用いられる。好ましくは、薬剤は、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも１つと組み合わせて投与される。より好ましくは、薬剤は、脂肪幹細胞と組み合わせて投与される。薬剤は、１日あたり（ＢＰとして）３０ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の量で投与される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減するための方法を提供することであって、該方法は、必要とする対象に有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）を投与することを含む。具体的には、方法は抗肥満及び／又は肥満に関連するメタボリック症候群の予防のためである。メタボリック症候群は、糖尿病、脳血管疾患、循環器疾患、高血圧症及び腎症の少なくとも１つである。好ましくは、必要とする対象には、有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）とともに間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の少なくとも１つが投与される。より好ましくは、必要とする対象には、有効量のブチリデンフタリド（ＢＰ）と脂肪幹細胞とが投与される。ブチリデンフタリド（ＢＰ）の量は、１日あたり（ＢＰとして）３０ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）２０００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明に係るキットを用いる際、過度に低濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）では幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進できないが、過度に高濃度のブチリデンフタリド（ＢＰ）によって細胞傷害が起きることがわかった。したがって、用いられる濃度は、通常、条件培地の１μｇから１００μｇ／ｍＬまでの範囲であって、好ましくは、条件培地の２μｇから５０μｇ／ｍＬまでの範囲であって、さらに好ましくは、条件培地の５μｇから２０μｇ／ｍＬまでの範囲である。例えば、下記実施例に示されるように、ブチリデンフタリド（ＢＰ）は、条件培地の１０μｇ／ｍＬの濃度で幹細胞の褐色様脂肪細胞への分化を効率的に促進できる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
必要性、対象の年齢、体重及び健康状態に応じて、本発明によって提供される薬剤は、１日１回、１日複数回、又は数日ごとに１回等の様々な投与頻度で投薬される。例えば、白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース、総コレステロールの含量を低減するために、本発明によって提供される薬剤が対象に経口で投与される場合、薬剤は、１日あたり（ＢＰとして）３０ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）２０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは１日あたり（ＢＰとして）１００ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、さらに好ましくは１日あたり（ＢＰとして）２００ｍｇ／ｋｇ体重から（ＢＰとして）５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与される。ここで、単位“ｍｇ／ｋｇ体重”は、対象のｋｇ体重あたりに要する量を意味する。本発明のいくつかの実施の形態では、本発明によって提供される薬剤は、抗肥満の（すなわち白色脂肪の蓄積を阻害し、白色脂肪の褐色脂肪への転換を促進し、体重増加を抑制し、及び／又は血中のトリグリセリド、グルコース及び総コレステロールの含量を低減する）ために使用され、薬剤は、１日あたり（ＢＰとして）２５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明によって提供される薬剤の投与に加えて、追加の間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞が必要とする対象に任意に投与されてもよく、間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞は、同時に又は別に薬剤と組み合わせて投与されてもよい。必要性、対象の年齢、体重及び健康状態に応じて、間葉幹細胞及び／又は褐色様脂肪細胞は、１日１回、１日複数回、数日ごとに１回、又は数週間ごとに１回等の様々な頻度で投与されてもよい。例えば、細胞注入で細胞が対象に投与される場合、細胞は、間葉幹細胞及び褐色様脂肪細胞の総量に基づいて、２週間ごとに４×１０４個の細胞から４×１０６個の細胞の範囲で投与される。本発明のいくつかの実施の形態では、本発明によって提供される薬剤を必要とする対象に投与するのに加え、対象は、細胞注入によって、２週間ごとに４×１０５個の脂肪幹細胞又は４×１０５個の褐色様脂肪細胞をさらに投与されてもよい。
【国際調査報告】
2019520055.tif 000021
2019520055.tif 000022
2019520055.tif 000023
2019520055.tif 000024
2019520055.tif 000025
2019520055.tif 000026
2019520055.tif 000027
2019520055.tif 000028