(57)【要約】  本発明の課題は、より簡便な操作により誘導多能性幹細胞を製造する方法及びＮanog遺伝子発現細胞の製造方法を提供することにある。本発明によれば、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法及びＮanog遺伝子発現細胞の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記体細胞又は受精卵が、魚の体細胞又は受精卵である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記体細胞が、魚の鰭に由来する細胞である、請求項１又は２に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
５０ｋｖ／ｃｍ以下の電場の条件下で、前記パルスパワーの印加を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項５】
パルスパワーのパルス幅が１０００ｎｓ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
誘導多能性幹細胞がＮanog遺伝子発現細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項７】
少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成される装置を用いて、上記溶液中の体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法により得られる、誘導多能性幹細胞。
【請求項９】
体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、Ｎanog遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記体細胞又は受精卵が、魚の体細胞又は受精卵である、請求項９に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記体細胞が、魚の鰭に由来する細胞である、請求項９又は１０に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１２】
５０ｋｖ／ｃｍ以下の電場の条件下で、前記パルスパワーの印加を行う、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１３】
パルスパワーのパルス幅が１０００ｎｓ以下である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１４】
少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成される装置を用いて、上記溶液中の体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか１項に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法により得られる、Ｎanog遺伝子発現細胞。
【請求項１６】
（ａ）請求項１〜７及び９〜１４のいずれか１項に記載の方法により、誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を製造する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を分化させる工程、
を含むことを特徴とする、分化細胞を製造する方法。
【請求項１７】
分化細胞が生殖細胞である、請求項１６に記載の分化細胞を製造する方法。
【請求項１８】
少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成されるパルスパワー印加装置であって、請求項１〜７及び９〜１４のいずれか１項に記載の方法により誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を製造するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加することによる誘導多能性幹細胞を製造する方法、及び該方法により得られる誘導多能性幹細胞に関する。また、本発明は、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加することによるＮanog遺伝子発現細胞を製造する方法、及び該方法により得られるＮanog遺伝子発現細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell; iPS細胞）とは、胚性幹細胞のように多くの細胞に分化できる多能性と、多能性を維持したまま自己複製できる特徴とを有する細胞を言う（非特許文献１〜３参照）。誘導多能性幹細胞の作製は、京都大学の山中伸弥教授らのグループ、マサチューセッツ工科大学のルドルフ・ヤニッシュ(Rudolf Jaenisch)らのグループ、ウイスコンシン大学のジェームズ・トムソン（James Thomson）らのグループ、ハーバード大学のコンラッド・ホッケドリンガー（Konrad Hochedlinger）らのグループなどを含む複数のグループが成功している。誘導多能性幹細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として大きな期待を集めている。【０００３】
誘導多能性幹細胞は、健康人・患者を問わず、ヒトの皮膚線維芽細胞や血液細胞などの体細胞を材料として作製することが可能である。誘導多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）と同様に、あらゆる細胞に分化する潜在的能力を秘めた細胞であり、かつ、適切な条件の下で培養することにより無尽蔵に増殖させることが可能な細胞である。さらに、電気穿孔法などの方法を用いることにより、容易に遺伝子導入を施すことが可能な細胞である。一方で、誘導多能性幹細胞の作製には、ヒト胚を必要としないため、胚性幹細胞の使用に際して障害となる倫理的な問題を回避できる。今日、誘導多能性幹細胞を作製する新たな方法の開発が進んでおり、今後、より効率の良い、かつ、使用に際して危険性の低い人工多能性幹細胞の作製技術の開発が期待される。【０００４】
これまで報告されている一般的な誘導多能性幹細胞の作製においては、レトロウイルスベクター等を用いて、Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子等の初期化因子の遺伝子を体細胞へ導入して長期培養することで、その細胞でnanog遺伝子の発現を誘導し、誘導多能性幹細胞が作成されている（例えば、特許文献１〜５参照）。【０００５】
しかしながら、上記従来の方法では、作製された誘導多能性幹細胞のゲノム中に初期化因子の遺伝子がそのまま残存しており、初期化因子の中で、特にc-Mycは、過剰に発現した場合に細胞のがん化を引き起こす強力な作用を有していることが知られている。実際に、マウスの誘導多能性幹細胞に由来するキメラマウスにおいて、導入されたc-Myc遺伝子が再活性化して発現することにより、がんの発生が認められたことが報告されている。このように、誘導多能性幹細胞から発生した分化細胞においては、導入初期化遺伝子が再度発現し、細胞が癌化する可能性があり、再生医療への応用等を実現するためには、導入初期化遺伝子を有さず、がん化の可能性の低い人工多能性幹細胞の作製技術の開発が求められている。また、上記従来技の方法は、遺伝子導入ベクターの作成、遺伝子導入後の細胞の長期培養といった煩雑な工程を含むため、より簡便な誘導多能性幹細胞の製造技術の開発が求められている。さらに、上記従来技の方法では、哺乳類のみでしか誘導多能性幹細胞の作成に成功しておらず、より幅広い生物種において誘導多能性幹細胞の製造技術の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２８３９７２
【特許文献２】特開２００９−１６５４７８
【特許文献３】特開２００９−１６５４７９
【特許文献４】特開２００９−１６５４８０
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, 2006.
【非特許文献２】Kazutoshi Takahashi, Koji Tanabe, Mari Ohnuki, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Kiichiro Tomoda, and Shinya Yamanaka. Induction of pluripotent stem cells from Adult Human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872, 2007.
【非特許文献３】Keisuke Okita, Tomoko Ichisaka and Shinya Yamanaka. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 19, 313-318, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、より簡便な操作により誘導多能性幹細胞を製造する方法、及び該方法により得られる、より安全性の高い誘導多能性幹細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討した結果、分化の進んだ体細胞等にパルスパワーを印加することにより、誘導多能性幹細胞マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子の発現が上昇することを発見した。本発明は、かかる知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
（１）  体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
（２）  前記体細胞又は受精卵が、魚の体細胞又は受精卵である、（１）に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
（３）  前記体細胞が、魚の鰭に由来する細胞である、（１）又は（２）に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
（４）  ５０ｋｖ／ｃｍ以下の電場の条件下で、前記パルスパワーの印加を行う、（１）〜（３）のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
（５）  パルスパワーのパルス幅が１０００ｎｓ以下である、（１）〜（４）のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
（６）  誘導多能性幹細胞がＮanog遺伝子発現細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
（７）  少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成される装置を用いて、上記溶液中の体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する、（１）〜（６）のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
（８）  （１）〜（７）のいずれかに記載の誘導多能性幹細胞の製造方法により得られる、誘導多能性幹細胞。
（９）  体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、Ｎanog遺伝子発現細胞の製造方法。
（１０）  前記体細胞又は受精卵が、魚の体細胞又は受精卵である、（９）に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
（１１）  前記体細胞が、魚の鰭に由来する細胞である、（９）又は（１０）に記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
（１２）  ５０ｋｖ／ｃｍ以下の電場の条件下で、前記パルスパワーの印加を行う、（９）〜（１１）のいずれかに記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
（１３）  パルスパワーのパルス幅が１０００ｎｓ以下である、（９）〜（１２）のいずれかに記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
（１４）  少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成される装置を用いて、上記溶液中の体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する、（９）〜（１３）のいずれかに記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法。
（１５）  （９）〜（１４）のいずれかに記載のＮanog遺伝子発現細胞の製造方法により得られる、Ｎanog遺伝子発現細胞。
（１６）  （ａ）（１）〜（７）及び（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法により、誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を製造する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を分化させる工程、
を含むことを特徴とする、分化細胞を製造する方法。
（１７）  分化細胞が生殖細胞である、（１６）に記載の分化細胞を製造する方法。
（１８）  少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成されるパルスパワー印加装置であって、（１）〜（７）及び（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法により誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を製造するための装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法によれば、体細細胞又は受精卵へのパルスパワーの印加という簡便な操作により、誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞を製造することが可能であり、哺乳類のみならず、様々な生物種において誘導多能性幹細胞を製造することができる。本発明により提供される誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞は、生体を構成する任意の組織又は臓器に分化誘導することが可能であり、拒絶反応が無い移植用の組織や臓器を作製することが可能である。また、本発明では、ＥＳ細胞の場合のように初期胚を使用することもないため、倫理的問題に直面することなく再生医療に応用することが可能である。特に、本発明により製造される誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞は外部から導入された初期化遺伝子を有していないため、分化した細胞が癌化する可能性が非常に低いという利点を有しており、より安全性の高い誘導多能性幹細胞を提供することができる。また、本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞を分化させることにより得られる各種細胞（例えば心筋細胞、肝細胞など）は各種の薬剤や毒物などの薬効や毒性を評価するためのシステムとして使用することもできる。さらに、本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞は、生殖細胞に分化させ、人工授精を行うことにより、新たな固体の大量増殖に適用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１におけるパルスパワーを用いた誘導多能性幹細胞の製造方法の概要を示す図である。
【図２】実施例１において製造した誘導多能性幹細胞における、誘導多能性幹細胞マーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
【図３】実施例２において、パルスパワーを印加したメダカ受精卵（１日目胚）における分化マーカー遺伝子及び誘導多能性幹細胞マーカー遺伝子の発現解析の結果を示す図である。
【図４】実施例３における実験手順の概略を示す図である。
【図５】実施例で使用したパルスパワー発生装置のセットアップ図である。２は充電器（Battery charger）、３はコントローラー（Controller）、４はパルス発生器（pulse generator）、５はマイクロキュベット（電極が配置された容器でも可）、６は電極（electrode）（実験には電極間４mmのものを使用した）、７は溶液（PBSを使用）、８は組織もしくは体細胞または受精卵、９はcurrent monitor、１０はHigh voltage probe、１１はDigital scope(オシロスコープ)を示す。
【図６】実施例４における鰭細胞へのパルスパワー（5kV/cm）印加後の遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図７】実施例５におけるマウス胎児繊維芽細胞(MEF)へのパルスパワー印加とNanog遺伝子発現解析の結果を示す図である。
【図８】パルスパワー（３０ｋＶ／ｃｍ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の誘導多能性幹細胞の製造方法及びＮanog遺伝子発現細胞の製造方法は、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明で言う誘導多能性幹細胞とは、所定の培養条件下（例えば、ＥＳ細胞を培養する条件下）において長期にわたって自己複製能を有し、また所定の分化誘導条件下において多種の細胞への多分化能を有する幹細胞のことを言う。また、Ｎanog遺伝子は、誘導多能性幹細胞の主要なマーカー遺伝子の一つであり、当該遺伝子の発現は、現体細胞又は受精卵が誘導多能性幹細胞に変化したことを意味する。
【００１５】
本発明の製造方法において用いる体細胞又は受精卵の種類は特に限定されず、任意の体細胞又は受精卵を用いることができる。本発明で言う体細胞とは、生体を構成する細胞のうち生殖細胞以外の全ての細胞を包含し、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。本発明で用いられる体細胞又は受精卵の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類の何れでもよく特に限定されないが、好ましくは魚類であり、特に好ましくはメダカである。また、ヒトの体細胞を用いる場合、胎児、新生児又は成人の何れの体細胞を用いてもよい。本発明の方法で製造される誘導多能性幹細胞ないしＮanog遺伝子発現細胞を再生医療など疾患の治療に用いる場合には、該疾患を患う患者自身から分離した体細胞を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明の製造方法において体細胞を用いる場合、目的とする生物種から任意の組織または細胞を採取し、必要であれば、一定期間培養し、本発明の製造方法に供試することができる。体細胞を採取する組織の種類は特に限定されないが、例えば、体細胞が魚類に由来する場合、鰭に由来するものであることが好ましい。例えば、魚類の鰭に由来する細胞を使用する場合には、メダカ等の魚類の鰭を切断して水やPBSに浸し、その鰭をマイクロキュベットに移してパルスパワーを印加すればよい。また、受精卵を使用する場合には、例えば、２６℃のメダカ受精卵飼育水（ERM）で受精後６時間後まで飼育した後、パルスパワーを印加すればよい。
【００１７】
本発明において、パルスパワーとは、ごく短い時間ではあるが生成される巨大な電力を意味する。小さな電力で蓄えたエネルギーを蓄積時間よりも十分短い時間で放出すると、エネルギーは圧縮され、パルス状の大電力が得られる。また、本発明のパルスパワーには、大電力である、立ち上がり時間が短い、パルス幅が短い、狭い空間に供給できる大電力を含む。本発明では、このような電力を目的とする体細胞又は受精卵に印加することにより、誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞を得ることができる。
【００１８】
本発明の製造方法において、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程は、例えば、特開2006-135947や特開2005-153492等に開示のパルスパワー発生装置を用いることにより行うことができる。なお、以下の実施例で使用したパルスパワー発生装置のセットアップ図を図５に示す。実施例では、パルスジェネレータとして、高電圧パルスを発生することができるMPC（磁気パルス圧縮方式）を使用した。但し、パルスパワー発生装置はMPC以外の市販品を使用してもよく、MPC（磁気パルス圧縮）方式パルスパワー発生装置に限定されるものではない。
【００１９】
本発明の製造方法において、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程は、具体的には、前記電極に接続されたパルスパワー発生装置を用いて、所望の体細胞又は受精卵をPBS（水や細胞培地でも良い）に懸濁し、対向する一対の電極を配置した容器内の電極間に投入し、上述のパルスパワー発生装置を用いて、体細胞又は受精卵の懸濁溶液にパルスパワーを印加することで行うことができる。印加するパルスパワーの強度は、用いる体細胞又は受精卵の生物種や、体細胞が由来する組織の種類等に応じて最適な条件を選択すればよく、特に限定されるものではないが、例えば１００ｋｖ／ｃｍ以下が好ましく、具体的には０．０１〜１００ｋｖ／ｃｍ、より好ましくは０．１〜１００ｋｖ／ｃｍ、さらに好ましくは０．５〜１００ｋｖ／ｃｍ、さらに好ましくは０．５〜５０ｋｖ／ｃｍ、さらに好ましくは０．５〜４０ｋｖ／ｃｍである。
【００２０】
ここで、パルスパワーの強度に関する単位「ｋｖ／ｃｍ」とは、パルスパワー発生装置により、ある一定の空間にのみ電圧が生成されている電界の強度を意味する。例えば対向する電極にパルスパワー発生装置を接続することで、対向する一対の電極間に電界が発生するが、その電極間の距離により算出されるパルスパワーの電界強度である。
【００２１】
本発明の製造方法において、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程は、所定の時間、体細胞又は受精卵にパルスパワーを与えることにより行うことができる。例えば、１０００ｎｓ以下、好ましくは５００ｎｓ以下、より好ましくは３００ｎｓ以下、より好ましくは１００ｎｓ以下、より好ましくは６０ｎｓ以下で印加することができる。また、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する回数は、１回でも良いが、複数回に渡り断続的にパルスパワーを印加することもできる。
【００２２】
本発明の製造方法において、体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程は、所定の立ち上がり時間で体細胞又は受精卵にパルスパワーを与えることにより行うこともできる。例えば、100ns以下の立ち上がり時間で印加することができる。なお、立ち上がり時間とは、パルスの瞬時値が最初に規定した下限値に到達し、その後規定された上限値に到達するまでの時間間隔であり、下限及び上限値はピーク値の１０％及び９０％である。
【００２３】
本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞の用途は特に限定されず、各種の試験・研究や疾病の治療などに使用することができる。例えば、本発明の方法により得られた誘導多能性幹細胞をレチノイン酸、EGFなどの増殖因子、又はグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞、血球細胞など）を誘導することができ、そのようにして得られた分化細胞を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。
【００２４】
本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞を用いて治療を行うことができる中枢神経系の疾患としてはパーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳梗塞、脊髄損傷などが挙げられる。パーキンソン病の治療のためには、本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞をドーパミン作動性ニューロンへと分化しパーキンソン病患者の線条体に移植することができる。ドーパミン作動性ニューロンへの分化はマウスのストローマ細胞株であるPA6細胞と本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を無血清条件で共培養することで進めることができる。アルツイハイマー病、脳梗塞、脊髄損傷の治療においては本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を神経幹細胞に分化誘導した後に、傷害部位に移植することができる。
【００２５】
また、本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞は肝炎、肝硬変、肝不全などの肝疾患の治療に用いることができる。これら疾患を治療するには、本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を肝細胞あるいは肝幹細胞に分化し移植することができる。本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞をアクチビンＡ存在下で５日間培養し、その後肝細胞増殖因子（HGF）で1週間程度培養することで肝細胞あるいは肝幹細胞を取得することができる。
【００２６】
さらに本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞はＩ型糖尿病などのすい臓疾患の治療に用いることができる。Ｉ型糖尿病の場合には、本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を膵臓β細胞に分化させ、膵臓に移植することができる。本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を膵臓β細胞に分化させる方法は、ＥＳ細胞を膵臓β細胞に分化させる方法に準じて行うことができる。
【００２７】
さらに本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞は虚血性心疾患に伴う心不全の治療に用いることができる。心不全の治療には、本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞を心筋細胞に分化させた後に傷害部位に移植することが好ましい。本発明の誘導多能性幹細胞又はＮanog遺伝子発現細胞は胚様体を形成させる3日前よりノギンを添加し培地中に添加することで、胚様体形成後2週間程度で心筋細胞を得ることができる。
【００２８】
また、本発明の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞は、生殖細胞へ分化させることができ、その生殖細胞から新たな個体を生産することに用いることもできる。例えば、本発明を畜産動物、魚類等の養殖動物に適用し、それら動物の誘導多能性幹細胞及びＮanog遺伝子発現細胞を生殖細胞に分化させ、人工授精を行うことにより、それら生物種の大量増殖を可能とすることができる。また、本発明を絶滅が危惧される生物種に適用し、同様にして、それら生物種の大量増殖を可能とすることができる。
【００２９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］
メダカ成魚から採取した鰭細胞にパルスパワーを印加して、誘導多能性幹細胞の作製を行った。その作成方法の概要を図１に示し、以下、その手順について説明する。【００３１】
１．メダカからの鰭細胞の採取及び培養
メダカ成魚の鰭（尾鰭、腹鰭、背鰭や胸鰭）の組織を切断し、水またはPBS（-）に投入した。なお、必要に応じ、鰭組織のトリプシンもしくはコラゲナーゼ酵素処理を行い、鰭細胞の懸濁液を調製してもよい。【００３２】
２．鰭細胞へのパルスパワーの印加
上記の鰭組織もしくは鰭細胞の懸濁液をPBS（-）に浸し、これを対向する一対の電極を配置したマイクロキュベット内の電極間に投入し、前記電極に接続されたパルスパワー発生装置を用いて、鰭組織もしくは鰭細胞へ0.5〜30kv/cm、50〜100nsのパルスパワーを印加した。印加した鰭組織もしくは鰭細胞はPBSへ投入して１〜数時間インキュベートした。実施例で使用したパルスパワー発生装置のセットアップ図を図５に示す。なお、パルスジェネレータとして、高電圧パルスを発生することができるMPCを使用した。【００３３】
３．Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量の解析
上記パルスパワー未処理の細胞、各強度におけるパルスパワーを印加した細胞について、リアルタイム定量ＰＣＲにより、誘導多能性幹細胞の主要なマーカー遺伝子であるＮａｎｏｇ遺伝子の発現量について調べた。以下に、その手順を説明する。【００３４】
上記パルスパワーを印加して培養１時間後の組織もしくは細胞からRNAを抽出し、RNA PCR Kit(Applied Biosystems)を用いて、添付プロトコルに従いcDNAを合成した。定量的PCR解析に使用した機器はLightCycler 480 InstrumentII(Roche Applied Science)であり、LightCycler 480 SYBR Green I Masterを用いて、添付プロトコルに基づいて行った。また、使用したプライマーは以下の通りである。
nanog forward primer、5'-GTTCTTCAGACAGATCCTGT-3'（配列番号１）
nanog reverse primer、5'-CATCTGCCAGGTTCTTCATC-3' （配列番号２）
ef1 forward primer、5'-TGAGATGGGCAAGGGCTCCT-3' （配列番号３）
ef1 reverse primer、5'-GCTGGGTTGTAGCCGATCTT-3' （配列番号４）【００３５】
（結果）
上記リアルタイム定量ＰＣＲの結果を図２に示す。図２に示される通り、パルスパワーを印加した細胞では、パルスパワーを印加していない細胞と比較して、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現が有意に増加することが明らかとなった。Ｎａｎｏｇ遺伝子は誘導多能性幹細胞の主要なマーカー遺伝子であることから、この結果は、体細胞にパルスパワーを印加することにより、誘導多能性幹細胞を製造できることを示す。なお、特に、５ｋｖ／ｃｍの条件下でパルスパワーを印加する場合に、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量が顕著に増加した。【００３６】
［実施例２］
パルスパワーを印加したメダカ受精卵（１日目胚）における分化マーカー遺伝子（rx2、pax6、adh）及び誘導多能性幹細胞マーカー遺伝子（Nanog、Oct4）の発現量を解析した。その手順を以下に説明する。【００３７】
１．メダカ受精卵の調整
産卵直後の受精卵を採取したのち、受精卵の付着毛を丁寧に取り除き、水温26℃のメダカ生理食塩水(ERM)を投入した小型容器に移して６時間インキュベートした。なお、メダカ受精卵の発生は水温により制御でき、２６℃水温下では受精後６時間で後期桑実胚期を迎える。【００３８】
２．受精卵へのパルスパワーの印加
上記の受精卵１個をPBS(-)が入ったマイクロキュベットへ投入した後、このマイクロキュベットをパルスパワー発生装置にセットし、パルスパワー発生装置を用いて0.5〜30kv/cm、50〜100nsのパルスパワーを印加した。印加した受精卵はすぐにERMが入った小型シャーレに投入して、水温26℃でインキュベートした。【００３９】
３．各マーカー遺伝子の発現量の解析
上記のパルスパワー（30kv/cm）を印加した受精卵とパルスパワーを印加していない受精卵について、リアルタイム定量PCRにより、誘導多能性幹細胞の主要なマーカー遺伝子であるnanog遺伝子と分化マーカー遺伝子であるrx2、pax6及びadh遺伝子の発現量について調べた。以下に、その手順を説明する。【００４０】
パルスパワーを印加していないメダカ受精卵及びパルスパワーを印加したメダカ受精卵を用いて、眼胞形成期に各々受精卵１０個を１プールとしてRNAを抽出し、RNA PCR Kit(Applied Biosystems)を用いてcDNAを合成した。定量的PCR解析に使用した機器はLightCycler 480 Instrument II(Roche Applied Science)であり、LightCycler 480 SYBR Green I Masterを用いて、添付プロトコルに基づいて行った。また、使用したプライマー配列を表１に示す。【００４１】
【表１】
2011158845.tif 000002
【００４２】
（結果）
上記リアルタイム定量ＰＣＲによる各マーカー遺伝子の発現解析の結果を図３に示す。パルスパワーを印加した受精卵では、パルスパワーを印加していない受精卵と比較して、誘導多能性幹細胞マーカー遺伝子である、Ｎａｎｏｇ遺伝子及びＯｃｔ４遺伝子の発現量が顕著に増加した。また、パルスパワーを印加した受精卵では、パルスパワーを印加していない受精卵と比較して、分化マーカー遺伝子であるｒｘ２、ｐａｘ６及びａｄｈ遺伝子の発現量は減少した。
このように、本発明により、メダカ受精卵から誘導多能性幹細胞を製造可能であることが示された。【００４３】
［実施例３］
生殖細胞マーカー遺伝子であるolvas遺伝子を発現する生殖細胞をDsRed（赤色蛍光タンパク質）で可視化できるolvas-DsRedトランスジェニックメダカから、実施例１と同様にして、鰭組織もしくは鰭細胞を採取し、パルスパワーを印加して、誘導多能性幹細胞を製造する。このように得られた誘導多能性幹細胞を、olvas-DsRedトランスジェニックではないメダカ受精卵（ホスト）に移植する。その結果、移植したnanog発現細胞のうち全ての細胞もしくはいくつかの細胞が生殖細胞へ分化することができれば、そのホストにおいて、上記ドナー由来のDsRedポジティブ生殖細胞が出現する。すなわち、移植したnanog発現細胞が生殖細胞へ分化できる能力を持つことが確認される。その実験手順の概略を図４に示し、以下、その手順について説明する。【００４４】
１．メダカからの鰭細胞の採取及び培養
olvas-DsRedトランスジェニックメダカの鰭（尾鰭、腹鰭、背鰭もしくは胸鰭）を切断し、水またはPBSに投入する。また、必要であれば鰭組織のトリプシンもしくはコラゲナーゼ酵素処理を行い、鰭細胞の懸濁液を調整する。【００４５】
２．鰭細胞へのパルスパワーの印加
上記の鰭組織もしくは鰭細胞の懸濁液を、対向する一対の電極を配置した容器（マイクロキュベット）内の電極間に投入し、前記電極に接続されたパルスパワー発生装置を用いて、鰭組織もしくは鰭細胞へ0.5〜30kv/cm、50〜100nsのパルスパワーを印加する。【００４６】
３．パルスパワー印加細胞の移植
上記のパルスパワーを印加した鰭組織をトリプシンもしくはコラゲナーゼ処理した細胞懸濁液、もしくはパルスパワーを印加した鰭細胞の懸濁液を、移植針に細胞懸濁液を充填する。移植針をマイクロインジェクターにセットし、olvas-DsRedトランスジェニックではないメダカ受精卵（ホスト）に移植針を刺してパルスパワーを印加した鰭細胞を移植する。移植後の受精卵は、26℃のERM溶液で飼育し、蛍光実体顕微鏡下で赤色蛍光を発する生殖細胞が出現するかどうかを確認する。すなわち、ホストにおいて赤色蛍光を発する細胞が出現するならば、それはパルスパワーを印加して作製された多能性幹細胞から生殖細胞へ分化した細胞であり、上述の手順で多能性幹細胞から生殖細胞へ分化させることができるのではないかと考えられる。【００４７】
［実施例４］鰭細胞へのパルスパワー（5kV/cm）印加後の遺伝子発現解析
パルスパワー未処理の細胞とパルスパワーを印加した細胞を用いて、Nanog遺伝子、山中ファクター（oct4, sox2, klf4, myc）を、リアルタイム定量PCR法により調べた。以下に、その手順を説明する。【００４８】
上記パルスパワーを印加してから5時間後の組織もしくは細胞からRNAを抽出し、RNA PCR Kit(Applied Biosystems)を用いて、添付プロトコルに従いcDNAを合成した。定量的PCR解析に使用した機器はLightCycler 480 InstrumentII(Roche Applied Science)であり、LightCycler 480 SYBR Green I Masterを用いて、添付プロトコルに基づいて行った。また、使用したプライマーは以下の通りである。【００４９】
nanog forward primer、5'-GTTCTTCAGACAGATCCTGT-3'（配列番号１５）
nanog reverse primer、5'-CATCTGCCAGGTTCTTCATC-3' （配列番号１６）
ef1 forward primer、5'-TGAGATGGGCAAGGGCTCCT-3' （配列番号１７）
ef1 reverse primer、5'-GCTGGGTTGTAGCCGATCTT-3' （配列番号１８）
oct4 forward primer、5'- TTCGCGAAGGAGCTGAAACA -3' （配列番号１９）
oct4 reverse primer、5'- TCCGGTTGCAGAACCAAACA -3' （配列番号２０）
sox2 forward primer、5'- GCACCAACCAGAAAAACAGC -3' （配列番号２１）
sox2 reverse primer、5'- ACTGTCCATCCGCTGGTTAA -3' （配列番号２２）
klf4 forward primer、5'- CGCCAGTGAGCTCTTGTACA -3' （配列番号２３）
klf4 reverse primer、5'- TGATATCCCTGCGGAGGTAG -3' （配列番号２４）
myc forward primer、5'- CAGAAGACGAAGAGGAGGAA -3' （配列番号２５）
myc reverse primer、5'- TCTGTCGCCTTTCTCAGGAT -3' （配列番号２６）【００５０】
（結果）
上記リアルタイム定量PCRの結果を図６に示す。パルスパワーを印加した細胞では、パルスパワーを印加していない細胞と比較して、Nanog、oct4、sox2、klf4遺伝子の発現が有意に増加することが明らかとなった。一方で、癌遺伝子であるmyc遺伝子の発現には影響を及ぼさなかった。この結果は、体細胞にパルスパワーを印加するだけで、細胞の癌化を抑えた誘導多能性幹細胞を製造できることを示す。【００５１】
［実施例５］マウス胎児繊維芽細胞(MEF)へのパルスパワー印加とNanog遺伝子発現解析
マウス繊維芽細胞（mouse embryonic fibroblast : MEF）を、10%FBS（Fetal bovine serum）含有DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培地入りシャーレに播種し、コンフルエントになるまで37℃のCO2インキュベータで培養した。MEF細胞をTrypsin-EDTA処理、遠心分離し、10%FBS含有DMEMに懸濁してから細胞数を計数した。その後、MEF細胞を再度遠心分離して細胞をPBS（-）で懸濁し、これを対向する一対の電極を配置したマイクロキュベット内の電極間に投入した。前記電極に接続されたパルスパワー発生装置を用いて、0.5、1、5kV/cmでパルス幅が60nsのパルスパワーを印加した。印加したMEF細胞を遠心分離し、10%FBS含有DMEM培地に置換した後、1x103個のMEF細胞をシャーレに播いて、37℃のCO2インキュベータで24時間培養した。また、コントロールとして、PBS（-）で懸濁したMEF細胞をキュベット内に投入し、パルス印加を行わずに直ちにMEF細胞を遠心分離して、10%FBS含有DMEM培地で再懸濁した後に、1x103個のMEF細胞をシャーレに播いて細胞培養した。上記の操作について、各印加条件のパルス印加細胞の場合は3回測定を、コントロールの場合は６回測定を実施した。【００５２】
上記MEF細胞からRNAを抽出し、RNA PCR Kit(Applied Biosystems)を用いて、添付プロトコルに従いcDNAを合成した。定量的PCR解析に使用した機器はLightCycler 480 InstrumentII (Roche Applied Science)であり、LightCycler 480 SYBR Green I Masterを用いて、添付プロトコルに基づいて行った。また、使用したプライマーは以下の通りである。【００５３】
Nanog forward primer 5'-CAGCCCTGATTCTTCTACCA-3'（配列番号２７）
Nanog reverse primer 5'-TCTGCTTCTGAAACCTGTCC-3'（配列番号２８）
Activin-beta forward primer 5'-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3'（配列番号２９）
Activin-beta reverse primer 5'-ATCACAATGCCTGTGGTACG-3'（配列番号３０）【００５４】
（結果）
上記リアルタイム定量PCRの結果を図７に示す。パルスパワーを印加したMEF細胞では、未処理細胞と比較してNanog遺伝子の発現が増加する傾向が観察された。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成24年4月2日(2012.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
前記体細胞又は受精卵が、魚の体細胞又は受精卵である、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項３】
前記体細胞が、魚の鰭に由来する細胞である、請求項１又は２に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
５０ｋｖ／ｃｍ以下の電場の条件下で、前記パルスパワーの印加を行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項５】
パルスパワーのパルス幅が１０００ｎｓ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項６】
誘導多能性幹細胞がＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項７】
少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成される装置を用いて、上記溶液中の体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法により得られる、誘導多能性幹細胞。
【請求項９】
体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する工程を含むことを特徴とする、Ｎａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記体細胞又は受精卵が、魚の体細胞又は受精卵である、請求項９に記載のＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記体細胞が、魚の鰭に由来する細胞である、請求項９又は１０に記載のＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１２】
５０ｋｖ／ｃｍ以下の電場の条件下で、前記パルスパワーの印加を行う、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１３】
パルスパワーのパルス幅が１０００ｎｓ以下である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１４】
少なくともパルス発生器、並びに溶液を含み電極が設置された容器から構成される装置を用いて、上記溶液中の体細胞又は受精卵にパルスパワーを印加する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか１項に記載のＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞の製造方法により得られる、Ｎａｎｏｇ遺伝子発現細胞。
【請求項１６】
（ａ）請求項１〜７及び９〜１４のいずれか１項に記載の方法により、誘導多能性幹細胞又はＮａｎｏｇ遺伝子発現細胞を製造する工程；及び（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を分化させる工程、
を含むことを特徴とする、分化細胞を製造する方法。
【請求項１７】
分化細胞が生殖細胞である、請求項１６に記載の分化細胞を製造する方法。
【国際調査報告】
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