(57)【要約】  本発明は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための方法であって、ａ）Ａ−ベータ種を緩衝液の中に入れるステップ、ｂ）アミロイドベータ凝集を定量するステップを含む方法において、ｃ）Ａ−ベータ種として、２単位のＡ−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する２単位のＡ−ベータモノマーを選択するステップを特徴とする方法に関する。そのためのリンカー、キット、ならびにその使用を開示する。
2019518196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための方法であって、
ａ）Ａ−ベータ種を溶液または緩衝液の中に入れるステップ、
ｂ）アミロイドベータ凝集を測定するステップ
を含む方法において、
ｃ）Ａ−ベータ種として、Ａ−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する２単位のＡ−ベータモノマーを選択するステップ
を特徴とする方法。
【請求項２】
アミロイド形成を検出するための蛍光色素を、溶液または緩衝液に添加し、アミロイドベータ凝集の検出として、蛍光シグナルの上昇を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アミロイドベータ凝集を光散乱によって検出することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ａ−ベータ種に、Ａ−ベータ（１−４２）および／もしくはＡ−ベータ（１−４０）からなるモノマー、ならびに／または別のＡ−ベータモノマーを選択することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
２つの同一単位のＡ−ベータモノマーまたは２つの同一ではない単位のＡ−ベータモノマーを選択することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
フレキシブルな立体配座を有するペプチドリンカーをリンカーとして選択することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
リンカーとして、極性、非荷電アミノ酸、例えば、セリンおよび／またはトレオニンに富み、小さいアミノ酸、例えば、グリシンおよび／またはアラニンおよび／またはプロリンに富むペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
Ａ−ベータ種間のリンカーとして、アミロイドベータ凝集の誘導期を少なくとも５０％、特に８０％、９０％、さらには１００％さえも低下させるペプチドを選択することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
リンクされるＡ−ベータモノマー中にあるアミノ酸数の５０％±５％に相当するアミノ酸数を有するリンカーを選択することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１０】
リンカーとして、配列（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）ｎ（ｘ＝１〜４、ｙ＝１およびｎ＝１〜１０）を有するペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
リンカーとして、配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４を有するペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アミノ酸グリシンがアミノ酸アラニンおよび／またはプロリンに交換されているリンカーを選択することを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸セリンがアミノ酸トレオニンおよび／またはアスパラギンおよび／またはグルタミンに交換されているリンカーを選択することを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
被検阻害剤を添加し、その阻害剤が、蛍光シグナルの高さを制限するか、または蛍光シグナルの時間的上昇を減速させた場合に肯定的に評価されることを特徴とする、請求項２〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーの凝集を検査するための方法であって、
−  タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーを溶液または緩衝液の中に入れるステップ、
−  モノマーの凝集を測定するステップ
を含む方法において、
−  モノマーとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の際に現れるモノマーの２単位であって、これらのモノマー単位間に配置されたリンカーを有する２単位を選択するステップ
を特徴とする検査方法。
【請求項１６】
グリシンおよび／またはセリンに富むことを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の方法を実施するためのペプチドリンカー。
【請求項１７】
配列番号１によるペプチドを特徴とする、請求項１６に記載のペプチドリンカー。
【請求項１８】
アミノ酸グリシンがアミノ酸アラニンおよび／またはプロリンに交換されており、アミノ酸セリンがアミノ酸トレオニンおよび／またはアスパラギンおよび／またはグルタミンに交換されていることを特徴とする、請求項１６または１７に記載のペプチドリンカー。
【請求項１９】
凝集、特に、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための、２単位のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー間、特にＡ−ベータモノマー間のリンカーとしての、請求項１６〜１８のいずれか一つに記載のペプチドリンカーの使用。
【請求項２０】
２つのモノマー、Ａ−ベータ（１−４２）および／またはＡ−ベータ（１−４０）を特徴とする、請求項１９に記載の、ペプチドリンカーの使用。
【請求項２１】
請求項１〜１５に記載の方法を実施するためのキットにおいて、
ａ）凍結乾燥された、タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー、特にＡ−ベータ種、
ｂ）緩衝液、
ｃ）任意選択で、凝集、特に、アミロイドベータ凝集を検出するための蛍光色素、
を含み、
モノマー、特に、Ａ−ベータ種が、２単位のモノマー間、特にＡ−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する２単位のモノマー、特にＡ−ベータモノマーからなる
ことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
今後数十年間における人口統計学上の展開に起因し、老人性疾患を患う者の数は上昇するであろう。ここでは、特に、いわゆるアルツハイマー病（ＡＤ、アルツハイマー型認知症、ラテン語：Ｍｏｒｂｕｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）を挙げたい。
【０００３】
これまでのところ、有効成分、またはＡＤの原因に対して効き目がある医薬品は存在しない。従来使用されている承認医薬品は、アルツハイマー型認知症において現れる症状のいくつかを和らげる。ただし、それらの医薬品は、病気の進行を遅延させること、または治癒をもたらすことはできない。動物実験において、ＡＤの予防には成果を示したものの処置に際しては（必ずしも）成果を示さなかった物質がいくつか存在する。
【０００４】
アルツハイマー病の特徴は、アミロイドベータペプチド（Ａベータペプチド、Ａ−ベータペプチド、Ａβ、またはＡβペプチド）の細胞外沈着である。Ａ−ベータペプチドの、プラークにおける沈着は、典型的には、死後のＡＤ患者の脳内に認められる。それゆえ、Ａ−ベータペプチドの様々な形態、例えば、原線維が疾患の発生および進行の原因とされている。さらに、数年来、自由拡散可能な小さいＡ−ベータオリゴマーが、ＡＤの発生および進行の主な原因と見なされている。
【０００５】
Ａ−ベータオリゴマーの構成成分であるＡ−ベータモノマーは、人体中で絶えず生じ、おそらくそれ自体は毒性ではない。しかも、モノマーが有利な機能を有するという可能性さえある。Ａ−ベータモノマーは、その濃度に依存して偶然に集合し得る。その濃度は、体内での形成速度および分解速度に依存する。年齢の増加と共に体内でのＡ−ベータモノマーの濃度が高まると、Ａ−ベータオリゴマーへのモノマーの自発的な集合がますます起こりやすくなる。そのように生じたＡ−ベータオリゴマーは、プリオンと類似に増加し、最終的にはアルツハイマー病につながるかもしれない。
【０００６】
従来技術から公知の物質は、きわめて様々なやり方で、Ａ−ベータモノマーおよび／またはＡ−ベータオリゴマーの濃度を低下させる。例えば、動物実験において予防に使用されたガンマセクレターゼ修飾薬が公知である。
【０００７】
動物実験において肯定的な結果を示した多数の物質の場合、人での臨床試験ではその効果を確かめることはできなかった。望ましいのは、最初のＡ−ベータオリゴマーの形成の阻止、つまり、一次核形成を妨げることであろう。その結果、毒性オリゴマーのいずれも形成されないかもしれない。
【０００８】
それゆえ、非常に特異的かつ高い親和性でＡ−ベータオリゴマーに結合してその増加を阻止するか、または直接にその形成を阻害する有効成分および阻害剤のような新規化合物への需要が存在する。
【０００９】
アミロイドベータ凝集の阻害剤は、原則的には、アミロイドベータペプチドに対する結合親和性をもつ分子を選択するというやり方で得られるかもしれない。例えば、免疫学的手法により抗体を、そしてディスプレイ選択法によりペプチドを選択してから、凝集に対する潜在的阻害効果に関してそれらを試験する。
【００１０】
凝集反応に対するその効果を介して直接に阻害剤を同定することが望ましい。それは、Ａｒｏｓｉｏ等から公知であるように、動力学的凝集アッセイを利用して可能である（Ａｒｏｓｉｏ  Ｐ．、Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，  Ｍ．、Ｄｏｂｓｏｎ，  Ｃ．Ｍ．、Ｋｎｏｗｌｅｓ，  Ｔ．Ｐ．Ｊ．（２０１５）．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｏｍｂａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ。Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  ３５：１２７〜１３５頁（非特許文献１））。
【００１１】
しかしながら、現在の動力学的凝集アッセイを利用した場合、Ｈａｂｃｈｉ等から公知であるように、一次核形成の阻害剤を特異的に同定することは、多くの時間と材料を費やさないと不可能であることが不利である（Ｈａｂｃｈｉ，  Ｊ．、Ａｒｏｓｉｏ，  Ｐ．、Ｐｅｒｎｉ，  Ｍ．、Ｃｏｓｔａ，  Ａ．Ｒ．、Ｙａｇｉ−Ｕｔｓｕｍｉ，  Ｍ．、Ｊｏｓｈｉ，  Ｐ．、Ｃｈｉａ，  Ｓ．、Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｉ．Ａ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｂ．Ｄ．、Ｌｉｎｓｅ，  Ｓ．、Ｎｏｌｌｅｎ，  Ｅ．Ａ．Ａ．、Ｄｏｂｓｏｎ，  Ｃ．Ｍ．、Ｋｎｏｗｌｅｓ，  Ｔ．Ｐ．Ｊ．、Ｖｅｎｓｄｒｕｓｃｏｌｏ，  Ｖ．（２０１６）．  Ａｎ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  Ａｂ４２  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．  ２、ｅ１５０１２４４：１〜１３頁（非特許文献２））。
【００１２】
それによると、個々の阻害剤候補に関して、一次核形成に対する阻害効果を検出するためには、複数のＡ−ベータ濃度ならびに阻害剤濃度において、通常は何時間にもわたって多数の凝集アッセイを実施してから、手間のかかる数学的なフィット法を行う必要があることが特に不利である。
【００１３】
この従来技術によって得られた阻害剤候補の場合、特に不利なことには、Ａ−ベータ凝集のどの反応ステップにおいて阻害剤がそもそも介入するのか不明なままである。
【００１４】
つまり、従来技術からは、アミロイド形成は妨害するものの、その代わりに、潜在的に毒性のＡ−ベータオリゴマーの形成を増加させる分子が頻繁に選択されることが公知である。したがって、一次核形成を特異的に阻害する分子は、労力と時間のかかるケースバイケースの検査によってしか同定できない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ａｒｏｓｉｏ  Ｐ．、Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，  Ｍ．、Ｄｏｂｓｏｎ，  Ｃ．Ｍ．、Ｋｎｏｗｌｅｓ，  Ｔ．Ｐ．Ｊ．（２０１５）．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｏｍｂａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ。Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．  ３５：１２７〜１３５頁
【非特許文献２】Ｈａｂｃｈｉ，  Ｊ．、Ａｒｏｓｉｏ，  Ｐ．、Ｐｅｒｎｉ，  Ｍ．、Ｃｏｓｔａ，  Ａ．Ｒ．、Ｙａｇｉ−Ｕｔｓｕｍｉ，  Ｍ．、Ｊｏｓｈｉ，  Ｐ．、Ｃｈｉａ，  Ｓ．、Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．Ｉ．Ａ．、Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｂ．Ｄ．、Ｌｉｎｓｅ，  Ｓ．、Ｎｏｌｌｅｎ，  Ｅ．Ａ．Ａ．、Ｄｏｂｓｏｎ，  Ｃ．Ｍ．、Ｋｎｏｗｌｅｓ，  Ｔ．Ｐ．Ｊ．、Ｖｅｎｓｄｒｕｓｃｏｌｏ，  Ｖ．（２０１６）．  Ａｎ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｘｉｃ  Ａｂ４２  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃｉ．  Ａｄｖ．  ２、ｅ１５０１２４４：１〜１３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
それゆえ、本発明の課題は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を明確に同定できる、より簡単かつ迅速で経済的な方法を提供することである。
【００１７】
さらに、本発明の課題は、この方法を実施するために適切な化合物を提供すること、またはその使用を提示することである。
【００１８】
本発明のもう１つの課題は、この方法を実施できるキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
この課題は、特許請求項１による方法、ならびに従属請求項による化合物およびキット、ならびにその使用によって解決される。これに関する有利な形態は、関連する請求項からもたらされる。
【００２０】
発明の説明
アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定する方法の最中、次の：
ａ）Ａ−ベータ種を溶液、特に緩衝液の中に入れるステップ、
ｂ）アミロイドベータ凝集を測定するステップ
を実施する。
【００２１】
この方法は、
ｃ）Ａ−ベータ種として、２単位のＡ−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する２単位のＡ−ベータモノマーを選択するステップ
を特徴とする。
【００２２】
前記のステップは、本方法の陰性対照の枠内で実施するステップである。
【００２３】
一次核形成と呼ばれるのは、あらゆるオリゴマーの生成である。
【００２４】
アミロイドベータ凝集、および潜在的阻害剤の影響は、従来技術による様々なやり方、例えば、マルチウェルプレート中で検出できる。
【００２５】
例えば、アミロイド形成を検出するための蛍光色素を、溶液または緩衝液に添加してもよい。次いで、アミロイドベータ凝集の検出として、蛍光シグナルの上昇を、例えば、いわゆるチオフラビンＴ試験によって測定する。
【００２６】
以下のさらなるアミロイドベータ凝集検出方法が、特に可能である：
ａ．アミロイドベータ凝集体に結合するとその蛍光特性（例えば、蛍光強度、蛍光偏光）が変化する色素分子を添加した後の蛍光分光法。一例は、アミロイドベータ凝集体への結合後に蛍光強度の明らかな上昇を示す色素チオフラビンＴである。
ｂ．アミロイドベータ凝集体に結合するとその蛍光特性（例えば、蛍光強度、蛍光偏光）が変化する色素で標識されたＡベータ・フレキシダイマー（Ｆｌｅｘｉｄｉｍｅｒ）分子を使用した蛍光分光法。
ｃ．（ナノ）粒子およびタンパク質凝集体を検出するための確立された方法である動的光散乱。
【００２７】
これらの測定は、時間に対して行う。
【００２８】
ｂ．の場合、特に、色素で標識されている、Ａ−ベータ種間のペプチドリンカーを選択してもよい。
【００２９】
リンカーは複数の利点を有する。リンカーは、対応する、リンクされていないモノマーの凝集における誘導期と比べて、アミロイドベータ凝集の誘導期を著しく短縮させ、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％さえも短縮させる。
【００３０】
したがって、本発明による方法では、有利には、リンクされたＡ−ベータモノマーを緩衝液に添加した直後にアミロイドベータ凝集が開始する。
【００３１】
本方法に関すると、このことは、リンクされていないモノマーを用いる、従来技術による方法において、蛍光シグナルの増大がおよそ１０ｈのインキュベーション時間後に起こる場合に、本発明による方法のステップｃ）により、この例に基づくと、誘導期がほぼ８０％短縮された遅くとも２ｈ後には、または誘導期がほぼ９０％短縮された遅くとも１ｈ後には、またはさらに短い時間の経過後に、誘導期の終了が確保されるということを意味する。
【００３２】
本発明による方法のステップｃ）により、有利には、２つのＡ−ベータモノマーのリンクにより、Ａ−ベータ種の局所濃度が上昇し、それゆえアミロイドベータ凝集が加速され得ることが分かった。
【００３３】
本発明による方法のステップｃ）により、絶対的に見たところ、同じく有利には、リンクされていないＡ−ベータモノマーを溶液中で使用するアッセイと比べて、リンクされたＡ−ベータモノマーを使用した場合、Ａ−ベータ種についてより少ない材料が必要であることが分かった。したがって、この方法は、より経済的である。
【００３４】
主な利点は、誘導期の明らかな短縮であり、この誘導期においては、従来技術での誘導期とは異なり、もはやいかなる二次プロセスも一次核形成に重ならない。したがって、本発明による方法によると、アミロイドベータ凝集における一次核形成に対する、物質の阻害効果の明確な検出を提供できる。
【００３５】
その際、ステップａ）〜ｃ）による、本発明による方法は、アミロイドベータ凝集を阻止するための、従来技術からすでに公知であるか、または仮定される、一次核形成の潜在的阻害剤の有効性を試験できる方法の陰性対照である。
【００３６】
Ａ−ベータ種またはＡ−ベータモノマーとして考慮の対象になるのは、それに限られるものではないが、特にＡ−ベータ（１−４２）のみならずＡ−ベータ（１−４０）、または任意の別のＡ−ベータ種、例えば、Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ａベータ（３−４０、３−４２）であり、アッセイアプローチに応じて選択可能である。本方法は、すべての公知のＡ−ベータモノマーに対して適用できる。
【００３７】
アルツハイマー型認知症のＡ−ベータモノマーおよびその凝集をこのやり方で試験するのみならず、別のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーをこのやり方で試験することも考えられる。その場合、それらの疾患において生じるタンパク質のモノマーを互いにリンクする。
【００３８】
ＡＤの場合、リンカーによってヘッドトゥーテール型または他のやり方でリンクされる２つの同一単位のＡ−ベータ種を選択できるが、そうでなくてもよい。つまり、様々なＡ−ベータ種のＡ−ベータモノマーを互いにリンクすることも可能であり、例えば、Ａ−ベータ（１−４０）とＡ−ベータ（１−４２）である。
【００３９】
ヘッドトゥーテール型（英語：ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）とは、リンカーが、好ましくは共有ペプチド結合によって、最初のＡ−ベータモノマー単位のＣ末端と２番目のＡ−ベータモノマー単位のＮ末端との間に配置されていることを意味する。
【００４０】
リンカーとしては、有利には、フレキシブルな立体配座（英語：ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（天然変性立体配座））を有するペプチドリンカーを選択できる。フレキシブルな立体配座を可能にするため、およびリンカーとＡ−ベータモノマー単位との相互作用を妨げるためには、リンカーが、極性、非荷電アミノ酸、例えば、セリン、トレオニン、および／またはアスパラギンおよび／またはグルタミンに富み、その上、小さいアミノ酸、例えば、グリシンおよび／またはアラニンおよび／またはプロリンに富んでいると有利である。特に、リンカーは、グリシンおよび／またはセリンに富むように選択可能であり、特に、もっぱらグリシンおよびセリンからなることも可能である。
【００４１】
リンカーが凝集状態の原線維（Ｆｉｂｒｉｌｌｅｎ）の形態には介入せず、および／またはＡ−ベータモノマーがダイマー中でその天然立体配座を維持することを示すために、本方法は、さらなるステップとしてＮＭＲ分光法を想定してもよい。
【００４２】
リンカーは、特に、溶液または緩衝液中において、Ａ−ベータ単位の本来的な不規則さ（英語：ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（天然変性立体配座））には影響を及ぼさない。リンカーは、特に、凝集状態のアミロイド原線維の形態も変化させない。
【００４３】
本方法、およびこのやり方でリンクされたＡ−ベータ単位の凝集の反応速度論は、本質的には、特に、緩衝液中のおよそ１〜５０μＭ、好ましくは１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ〜およそ５０μＭというＡ−ベータ種の濃度における一次核形成によって特徴づけられ、このことは、Ａ−ベータの局所濃度の上昇に起因する。その際、あらゆる中間値が可能である。
【００４４】
つまり、リンカーにより、ペプチドの天然特性は影響されない。特に、原線維および／または凝集体の立体配座の形成に対する本来の無秩序性の特性が、リンカーによって影響されない。
【００４５】
本方法は、リンクされたＡ−ベータ種の立体配座とリンクされていない単位の立体配座とを、例えば、ＮＭＲ測定によって比較するステップを有してもよい。
【００４６】
リンクされた単位が、有利には、リンクされていない単位に対するモデル物質として利用される。
【００４７】
本方法は、リンクされたＡ−ベータ種が、リンクされていないＡ−ベータ種と同じ形態の原線維を形成すること、またはリンクされたＡ−ベータ種が、リンクされていないＡ−ベータ種と同じ形態の原線維を形成するかどうかを検査するステップを有してもよい。そのためには、例えば、原子間力顕微鏡法を実施することができる。
【００４８】
本発明による方法は、例えば、マルチウェルマイクロタイタープレート中での、ハイスループットスクリーニングに適切である。
【００４９】
本方法は、特に、一次核形成の反応速度論を調べるために実施する。そのためには、マイクロタイターベースのアッセイを、アミロイドベータ凝集の阻害剤を使用して、および使用せずに実施することができる。
【００５０】
リンカーとしては、特に、配列（Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ）ｎ（ｘ＝１〜４、ｙ＝１およびｎ＝１〜１０）を有するペプチドリンカーが選択可能である。
【００５１】
セリンの代わりにトレオニンおよび／またはアスパラギンおよび／またはグルタミンを選択してもよい。これらのアミノ酸は、有利には安定性を維持する。
【００５２】
グリシンの代わりにアラニンおよび／またはプロリンを選択してもよい。
【００５３】
経験則としては、リンクされるＡ−ベータ種中にあるアミノ酸数のおよそ１０〜９０％がリンカー中にあることが望ましい。一般的には、タンパク質ミスフォールディング疾患の場合、リンカーが、凝集を引き起こすモノマー単位のアミノ酸数のおよそ１０〜９０％を含むことが望ましい。Ａ−ベータ（１−４０）の場合、リンカーがおよそ４〜３６個のアミノ酸を含む。特に、リンカーが、凝集を引き起こすモノマー単位のアミノ酸数の２０〜８０％、３０〜７０％または４０〜６０％を含む。
【００５４】
さらなる経験則としては、特に、リンクされたＡ−ベータ種中にあるアミノ酸数のおよそ５０％＋５％がリンカー中にあることが望ましい。一般的には、タンパク質ミスフォールディング疾患の場合、リンカーが、凝集を引き起こすモノマー単位のアミノ酸数のおよそ５０％±５％を含むことが望ましい。
【００５５】
特に、配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）４を有するペプチドリンカーが、リンカーとして実証され、ただし、別のアミノ酸での変換に関する上記の条件が当てはまり得る。
【００５６】
これらのリンカーが、有利には、リンクされるＡ−ベータ種として、それらに限られるものではないが、特にＡ−ベータ（１−４０）および／またはＡ−ベータ（１−４２）において、アルツハイマー型認知症のアミロイドベータ凝集の誘導期を特に著しく短縮させる。
【００５７】
リンクされたＡ−ベータ種を入れる濃度は、特に、およそ＞２μＭであることが望ましい。その場合、誘導期の短縮および一次核形成の優勢が特に顕著である。
【００５８】
前記の方法、およびそれに伴う、誘導期の短縮によって、アミロイドベータ凝集が直ちに開始して検出可能であることが確保される。その結果、一次核形成の反応速度論に及ぼす、潜在的な有効成分候補の影響が検出可能である。
【００５９】
Ａ−ベータ種間、または別のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー単位間にある、前記の、本発明によるリンカーは、（アミロイドベータ）凝集の誘導期を明らかに、好ましくは少なくとも８０％ほど低下させる。
【００６０】
被検物質、例えば、阻害剤を添加し、その阻害剤が、陰性対照のシグナルと比べて蛍光シグナルの高さを制限する、および／または蛍光シグナルの時間的上昇を減速させた場合に肯定的に評価される。
【００６１】
配列番号１によるペプチドである、アミノ酸配列ｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓｇｇｇｇｓを有するフレキシブルなリンカーが、例示的であり特に重要であるが、なぜなら、このリンカーは、有利には、必要な特性を有するからである。このリンカーは、特に、Ａ−ベータ（１−４０）および／もしくはＡ−ベータ（１−４２）からなる、ならびに／またはタンパク質ミスフォールディング疾患の別のモノマーからなるアミロイドベータ凝集の一次核形成に関する有効成分および阻害剤の同定において使用され、ただし、ここでも別のアミノ酸での変換性に関する上記の規則が当てはまることになる。
【００６２】
本発明による方法を実施するためのキットは、
ａ）凍結乾燥されたＡ−ベータ種、
ｂ）緩衝液または溶液、
ｃ）任意選択で、アミロイド形成または凝集を検出するための蛍光色素
を含み、ここで、Ａ−ベータ種は、２単位のＡ−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する２単位のＡ−ベータモノマーからなる。
【００６３】
キットの構成要素は、使用に先立ち緩衝液または溶液に溶解すると、直ちに使用できる。
【００６４】
リンカーは、有利には、アミロイドベータ凝集のシート構造には影響を及ぼさない。
【００６５】
すると、従来技術を介して、ここではチオフラビン試験により、蛍光シグナルの経時的上昇の測定によってマルチウェルプレート中のアミロイドベータ凝集が、および潜在的阻害剤の影響が検出可能である。
【００６６】
例えば、アミロイドベータ凝集を別のやり方で、例えば、上記のように、光散乱または別の方法によって検出する場合、蛍光色素を伴わないキットを提供することも可能である。
【００６７】
Ａ−ベータ凝集を妨害する物質、特に有効成分または阻害剤は、相応に、アルツハイマー病の治療に関して将来性のある有効成分候補であるが、なぜなら、本発明の方法によると、特に毒性のオリゴマーがまずまったく生じないからである。その意味で、本方法は、アミロイドベータ凝集の二次プロセスを時間的にスキップする。
【００６８】
特に、凝集反応の最初のステップ、いわゆる一次核形成の阻害剤は、その際、有効成分として同じく興味深い。そのような阻害剤は、アルツハイマー型認知症に関して特に毒性のＡ−ベータオリゴマーの形成を潜在的に妨げる。
【００６９】
本発明による方法を用いると、誘導期の相応する短縮により、特に簡単かつ手早いやり方で、アミロイドベータ凝集の確かな一次核形成阻害剤を同定すること、それゆえ毒性オリゴマーの形成に対する有効成分を経済的に見出すことに成功する。
【００７０】
その際、すでに従来技術で同定されている分子、例えば、癌処置用のペプチド、抗体、有効成分、例えば、ベキサロテンを、本発明による短縮されたアッセイにおいて使用することも当然可能であり、毒性オリゴマーの形成を妨げる際のその有効性を検査することができる。それらは、陽性対照として使用できる。
【００７１】
それに加えて、本発明の枠内では、アミロイドベータ凝集が、複数のステップからなる複雑な反応であり、その反応においては、後続の二次プロセスが、従来技術による一般的なアッセイの観察可能な反応推移を支配することが分かった。その上、それらの後続プロセスは、誘導期の最中に起こることが分かった。
【００７２】
それに応じて、本発明によると、誘導期の短縮によって、二次プロセスではなく一次核形成が優勢である反応速度論的凝集アッセイを開発した。
【００７３】
モノマーＡ−ベータの代わりに、本アッセイ、または本発明による方法、または本キットは、フレキシブルなペプチドリンカーによって２つのＡ−ベータモノマーが互いに結合している、「Ａベータ・フレキシダイマー」という仮称の、新規開発されたダイマー構築物を用いる。そのためには、例えば、最も頻繁なＡ−ベータ変種の２単位、Ａ−ベータ（１−４０）を使用できる。別のＡ−ベータ変種、例えば、Ａ−ベータ（１−４２）または修飾バージョン、さらには短縮バージョンのダイマー、およびそれらの混合物が興味深く、それゆえ、本発明の主題である。単に例示的に、モノマーＡ−ベータ（１−４０）を、モノマーＡ−ベータ（１−４２）とリンクすることが可能である。
【００７４】
比較的長いリンカーを選択することで、ダイマー構築物中のＡ−ベータ単位が、通常のアミロイド構造の形成において、融合された隣接物との相互作用によって邪魔されないようにし、そのことは、原子間力顕微鏡測定により確かめることができる。
【００７５】
Ａ−ベータモノマーと比べて、Ａベータ・フレキシダイマーは、有利には、反応速度論的凝集アッセイ、この場合、本発明による方法において、改善された挙動を示す。Ａベータ・フレキシダイマーは、有利には、誘導期をほぼ完全に除去することを特徴とする。これに関して、濃度は、緩衝液中において１μＭ〜およそ５０μＭ、好ましくはおよそ５μＭであり得る。その結果、有利には、試験方法を実施する際に明らかな時間の節約がもたらされる。その上、このやり方で、Ａ−ベータモノマー濃度の低下と同時に、後の時点で初めてさらなる凝集に介入するのではなく確かに一次核形成を阻害する有効成分として、添加された有効成分を同定できる。
【００７６】
これらの有利な効果は、リンカーに関する従来技術、例えば、Ｃｈｅｎ等（Ｃｈｅｎ，  Ｘ．、Ｚａｒｏ，  Ｊ．、Ｓｈｅｎ，  Ｗ．−Ｃ．（２０１３）。Ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ。Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６５（１０）：１３５７〜１３６９頁またはＣｈｉｃｈｉｌｌｉ等（Ｃｈｉｃｈｉｌｌｉ，  Ｖ．Ｐ．Ｒ．、Ｋｕｍａｒ，  Ｖ．、Ｓｉｖａｒａｍ  Ｊ．（２０１３年）。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：１５３〜１６７頁）からは予想できなかった。
【００７７】
このやり方で、毒性オリゴマーの形成を阻止し、相応するタンパク質ミスフォールディング疾患に対する有効成分として考慮の対象になる阻害剤を同定する。
【００７８】
本発明はそれに制限されるものではない。むしろ本発明は、タンパク質ミスフォールディング疾患全般のモノマーの凝集に関するさらなる方法に関し、詳細には特に、
タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーの凝集を検査するための方法であって、
ａ）タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーを溶液または緩衝液に入れるステップ、
ｂ）モノマーの凝集を測定するステップ
を含む方法において、
モノマーとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の際に現れるモノマーの２単位であり、これらのモノマー単位間に配置されたリンカーを有する２単位を選択するステップ
を特徴とする方法に関する。
【００７９】
そのリンカーは、記載されたような特徴を有する。
【００８０】
これに関しては、Ａ−ベータモノマー、例えば、前記のＡ−ベータ（１−４２）および／もしくはＡ−ベータ（１−４０）ならびに／またはアルツハイマー型認知症において現れる別のモノマーも、その凝集挙動を試験できるものと解釈される。その上、別のタンパク質ミスフォールディング疾患の別のあらゆるモノマーも、開示された方法による本発明のやり方で、試験することが可能であり、ならびにそのためのキットまたはペプチドリンカーが請求され得る。
【実施例】
【００８１】
以下では、本発明を、実施例および添付の図を手がかりに詳細に説明するが、それによって本発明をアミロイドベータ凝集に制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明によるダイマーを使用した本発明による方法の反応速度論を示す図である。Ａは、Ａ−ベータモノマー、ここではＡ−ベータ（１−４０）と対応するフレキシダイマーとの間の比較である。Ｂは、濃度に依存した、一次核形成と二次プロセスとの間の移行である。
【図２】Ａ−ベータ（１−４０）アミロイド形成とフレキシダイマーからなる原線維形成との間のモデル比較の図である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば２０μＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５０μＭＮａＣｌ中に溶かしたＡベータ・フレキシダイマーの２５μＭ溶液を入れる。アミロイド形成を検出するための色素、例えば、チオフラビンＴを添加する。
【００８４】
Ａ−ベータモノマー・フレキシダイマーが誘導期の短縮に及ぼす影響を図１に示す。
【００８５】
Ａでは、ｘ軸に時間（ｈ）をプロットし、ｙ軸には、凝集の尺度として蛍光強度をプロットしてある。Ａベータ・フレキシダイマーの凝集は、初期濃度＞１μＭにおいて、凝集アッセイの開始直後に、遅延時間なしに検出可能である（図１Ａ、白抜きひし形０．９μＭ、塗りつぶしひし形１．３μＭ、白抜き三角１．９μＭ、塗りつぶし三角２．７μＭ、白抜き丸３．９μＭ、塗りつぶし丸５．５μＭ、白抜き四角８μＭ、塗りつぶし四角１１μＭ）。
【００８６】
この挙動は、Ａベータ・フレキシダイマー濃度＞２μＭにおける、優勢な二次プロセスから優勢な一次核形成への移行と一致する（図１Ｂ）。図１Ｂには、フレキシダイマー濃度（μＭ）に対するｔ１／２（時間）の二重対数プロットを示す。およそ３μＭの濃度からは、Ａベータ・フレキシダイマーのアミロイドベータ凝集において、一次核形成が優勢なプロセスである。およそ−０．３の勾配が二次プロセスの優勢を示し、およそ−３の勾配が一次核形成の優勢を示す。
【００８７】
図２は、原子間力顕微鏡法により、フレキシダイマーが、Ａ−ベータモノマー、ここではＡ−ベータ（１−４０）の場合と同じ形態の原線維を形成することを示す。
【００８８】
阻害剤候補は、個々のウェルに添加する。マイクロタイタープレートを３７℃において蛍光レーザ中でインキュベートし、数分の間に、一定間隔で蛍光を測定する。
【００８９】
蛍光シグナルの時間的上昇を阻むか減速させるということにより、阻害剤を同定する（表示せず）。
【００９０】
さらなる実施例
１．マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば２０μＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５０μＭＮａＣｌ中に溶かしたＡベータ・フレキシダイマーの２５μＭ溶液を入れる。アミロイド形成を検出するための色素、例えば、チオフラビンＴを添加する。阻害剤の不在下および存在下において、蛍光レーザを使用して、蛍光強度を測定する。
【００９１】
２．蛍光偏光の上昇によりアミロイドベータ凝集を示す適切な色素分子で、Ａベータ・フレキシダイマーを標識する。マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば２０μＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５０μＭＮａＣｌ中に溶かした標識Ａベータ・フレキシダイマーの２５μＭ溶液を入れる。阻害剤の不在下および存在下において、蛍光レーザを使用して、蛍光偏光を測定する。
【００９２】
３．マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば２０μＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、５０μＭＮａＣｌ中に溶かしたＡベータ・フレキシダイマーの２５μＭ溶液を入れる。阻害剤の不在下および存在下において、光散乱検出器を使用して、光散乱を測定する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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