(57)【要約】血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ方法が記載されている。対象における一酸化炭素ヘモグロビン血症（一酸化炭素中毒）を処置する方法も記載されている。本方法は、その還元型である天然または人工酸素運搬体を投与するステップを含む。還元された酸素運搬体を産生する方法がさらに記載されている。酸素運搬体によりシアン化物中毒または硫化水素中毒を処置する方法も記載されている。
2019521966.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における一酸化炭素ヘモグロビン血症を処置する方法であって、
一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する対象を選択するステップと、
前記対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップと
を含み、前記酸素運搬体がその還元型である、方法。
【請求項２】
前記組成物が、薬学的に許容される還元剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元剤が、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸素運搬体が、グロビンタンパク質を含む天然酸素運搬体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記グロビンタンパク質が、ヘモグロビンまたはミオグロビンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、ヒトヘモグロビンまたはヒトミオグロビンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、非ヒト動物ヘモグロビンまたはミオグロビンである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記酸素運搬体が、ヘモシアニンを含む天然酸素運搬体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酸素運搬体が、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む人工酸素運搬体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸素運搬体が、リポソーム被包ヘモグロビン、リポソーム被包ミオグロビン、修飾ヘモグロビンまたは修飾ミオグロビンを含む人工酸素運搬体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去する方法であって、前記血液または動物組織を、天然または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップであって、前記酸素運搬体がその還元型である、ステップと、これにより前記血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するステップとを含む、方法。
【請求項１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であって、前記血液または動物組織を、天然または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップが、天然または人工酸素運搬体を含む前記組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物を前記対象に投与するステップの前に、一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する対象を選択するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、その血液中に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％カルボキシヘモグロビンを有する、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、還元剤をさらに含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記還元剤が、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記酸素運搬体が、グロビンタンパク質を含む天然酸素運搬体である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記グロビンタンパク質が、ヘモグロビンまたはミオグロビンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、ヒトヘモグロビンまたはヒトミオグロビンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、非ヒト動物ヘモグロビンまたはミオグロビンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記酸素運搬体が、ヘモシアニンを含む天然酸素運搬体である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記酸素運搬体が、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む人工酸素運搬体である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記酸素運搬体が、リポソーム被包ヘモグロビン、リポソーム被包ミオグロビン、修飾ヘモグロビンまたは修飾ミオグロビンを含む人工酸素運搬体である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
還元された酸素運搬体を調製する方法であって、
酸素運搬体−還元剤組成物を産生するために、酸素運搬体を第１の還元剤と接触させるステップと、
還元された酸素運搬体組成物を形成するために、前記酸素運搬体−還元剤組成物を脱塩カラムに通すステップと
を含み、前記還元された酸素運搬体の前記調製が、嫌気性環境で行われる、方法。
【請求項２６】
第２の還元剤を前記還元された酸素運搬体組成物に添加するステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の還元剤が、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下または約２．５ｍＭ以下の濃度で添加される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の還元剤、前記第２の還元剤またはその両方が、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、ヒドララジンおよびチトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼから選択される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
凍結された還元された酸素運搬体組成物を産生するために、前記還元された酸素運搬体組成物を凍結するステップをさらに含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記凍結された還元された酸素運搬体組成物を解凍するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記還元された酸素運搬体を、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、その血液中に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％カルボキシヘモグロビンを有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象におけるシアン化物中毒を処置する方法であって、
シアン化物中毒を有する対象を選択するステップと、
前記対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップと
を含み、前記酸素運搬体がその酸化型である、方法。
【請求項３５】
前記組成物が、薬学的に許容される酸化剤をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記酸化剤が、酸素含有ガス混合物、酸素含有液体混合物、フェリシアン化物塩またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記酸素運搬体が、グロビンタンパク質を含む天然酸素運搬体である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記グロビンタンパク質が、ヘモグロビンまたはミオグロビンを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、ヒトヘモグロビンまたはヒトミオグロビンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、非ヒト動物ヘモグロビンまたはミオグロビンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記酸素運搬体が、ヘモシアニンを含む天然酸素運搬体である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記酸素運搬体が、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む人工酸素運搬体である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記酸素運搬体が、リポソーム被包ヘモグロビン、リポソーム被包ミオグロビン、修飾ヘモグロビンまたは修飾ミオグロビンを含む人工酸素運搬体である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
対象における硫化水素（Ｈ２Ｓ）中毒を処置する方法であって、
Ｈ２Ｓ中毒を有する対象を選択するステップと、
前記対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップと
を含み、前記酸素運搬体がその還元型である、方法。
【請求項４５】
前記組成物が、薬学的に許容される還元剤をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記還元剤が、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記酸素運搬体が、グロビンタンパク質を含む天然酸素運搬体である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記グロビンタンパク質が、ヘモグロビンまたはミオグロビンを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、ヒトヘモグロビンまたはヒトミオグロビンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヘモグロビンまたはミオグロビンが、非ヒト動物ヘモグロビンまたはミオグロビンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記酸素運搬体が、ヘモシアニンを含む天然酸素運搬体である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記酸素運搬体が、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む人工酸素運搬体である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記酸素運搬体が、リポソーム被包ヘモグロビン、リポソーム被包ミオグロビン、修飾ヘモグロビンまたは修飾ミオグロビンを含む人工酸素運搬体である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年５月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／３３８，８７０号に基づく利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
本開示は、その還元型の天然または人工酸素運搬体を使用して、一酸化炭素ヘモグロビン血症を処置する方法に関する。本開示は、酸素運搬体としての使用のための還元グロビンタンパク質を産生するためのプロセスにさらに関する。酸素運搬体を使用して、シアン化物中毒および硫化水素中毒を処置する方法も記載されている。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＨＬ１２５８８６、ＨＬ１１０８４９、ＨＬ００７５６３およびＨＬ１０３４５５の下、政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
分野
一酸化炭素への吸入曝露は、環境的中毒の主原因を表す。個体は、住宅火災、屋内で使用される発電機もしくは屋外用バーベキューグリル、または閉鎖空間内での自殺企図の際等、種々の異なる状況下で、空気中の一酸化炭素に曝露され得る。一酸化炭素は、細胞におけるヘモグロビンおよび血液タンパク質（hemoprotein）、特に、呼吸伝達系の酵素に結合する。ヘモグロビンおよび他の血液タンパク質に結合した一酸化炭素の蓄積は、酸化的リン酸化のための酸素送達および酸素利用を損なう。これは最終的に、脳および心臓等の重要臓器に重度の低酸素および虚血性傷害をもたらす。その血液中に１０％を超える炭素カルボキシヘモグロビンを蓄積する個体は、脳傷害および神経認知機能障害のリスクがある。非常に高いカルボキシヘモグロビンレベルを有する患者は典型的に、不可逆的な脳傷害、呼吸不全および／または心血管虚脱を患う。
【０００５】
標準動脈および静脈血液ガス解析ならびにＣＯ−オキシメトリにより一酸化炭素中毒を迅速に診断する方法の利用可能性にもかかわらず、また、一酸化炭素中毒のリスク因子の認知にもかかわらず、現在、この有毒な曝露に利用できる解毒薬は存在しない。現在の治療法は、フェイスマスクによって１００％酸素を与えることであり、可能であれば、患者を高圧酸素に曝露することである。高圧酸素療法の背景にある機構は、酸素が、ヘモグロビンおよび組織からの一酸化炭素の放出速度を増加させ、天然の一酸化炭素クリアランスを加速させるということである。しかし、この治療法は、一酸化炭素クリアランス速度に僅かな効果しかなく、高圧酸素設備の複雑さに基づき、この治療法は、本分野では利用できず、多くの場合、著しい処置遅延および運送費を伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
一酸化炭素ヘモグロビン血症（一酸化炭素中毒としても公知）、シアン化物中毒および硫化水素中毒を処置するための、有効、迅速かつ容易に利用できる治療法の必要がある。
【０００７】
対象における一酸化炭素ヘモグロビン血症を処置する方法であって、一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する対象を選択するステップと、対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップとを含み、酸素運搬体はその還元型である、方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、組成物は、無毒な濃度で、弱い還元剤等の還元剤をさらに含む。
【０００８】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去する方法も提供される。本方法は、血液または動物組織を、天然または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップを含み、酸素運搬体はその還元型である。一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。他の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法である。
【０００９】
還元された酸素運搬体を調製する方法がさらに提供される。一部の実施形態では、本方法は、酸素運搬体−還元剤組成物を産生するために、酸素運搬体を第１の還元剤と接触させるステップと、還元された酸素運搬体組成物を形成するために、酸素運搬体−還元剤組成物を脱塩カラムに通すステップとを含む。還元された酸素運搬体の調製は、嫌気性環境で行われる。
【００１０】
シアン化物中毒を有する対象を選択すること、および対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与することにより、対象におけるシアン化物中毒を処置する方法であって、酸素運搬体がその酸化型である、方法も提供される。
【００１１】
Ｈ２Ｓ中毒を有する対象を選択すること、および対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与することにより、硫化水素（Ｈ２Ｓ）中毒を処置する方法であって、酸素運搬体はその還元型である、方法が、さらに提供される。
【００１２】
本発明の前述および他の目的、特色および利点は、添付の図面を参照しつつ進行する次の詳細な説明から、より明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、中等度ＣＯ中毒のマウスモデルにおける、組換えニューログロビンによるヘモグロビン由来のＣＯのｉｎ  ｖｉｖｏ結合を示すグラフである。
【００１４】
【図２】図２は、還元された酸素運搬体の調製のための本明細書に開示されている方法のステップの流れ図である。
【００１５】
【図３】図３は、一酸化炭素中毒を処置するために酸素運搬体および人工酸素運搬体を使用する方法の流れ図である。
【００１６】
【図４ＡＢ】図４Ａ〜４Ｃは、野生型ウマミオグロビンによるヘモグロビン由来のＣＯのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示すグラフである。５ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウムの存在下、３７℃で、カルボキシル化された赤血球細胞を含有する溶液に、ＰＢＳまたはミオグロビン（１００μＬ）を注入した。いくつかの時点において反応混合物から試料を採取し、遠心分離によって上清（Ｍｂを含有）からＲＢＣを分離した。各画分におけるＨｂＣＯ／ＭｂＣＯの量をＵＶ−ｖｉｓ分光法によって決定した。（図４Ａ）カルボキシル化ＲＢＣをＰＢＳと混合した。（図４Ｂおよび図４Ｃ）異なる量のカルボキシル化ＲＢＣがＭｂと混合された２種の試料の実験。黒色および赤色の点は、それぞれカルボキシル化ＨｂおよびＭｂの濃度を示す。
【図４Ｃ】同上。
【００１７】
【図５】図５は、重度のＣＯ中毒のマウスモデルにおける、野生型ウマミオグロビンによるヘモグロビン由来のＣＯのｉｎ  ｖｉｖｏ結合を示すグラフである。
【００１８】
【図６】図６は、心拍数（ＨＲ；上）および平均動脈圧（ＭＡＰ；下）に対する重度のＣＯ中毒の効果を示す一対のグラフであり、この効果は、ミオグロビンの添加により反転される。
【００１９】
【図７】図７は、血圧および心拍数に対する重度のＣＯ中毒の効果を示すグラフであり、この効果は、ミオグロビンの添加により反転される。２種の異なる用量のミオグロビンを示す。
【００２０】
【図８】図８は、血圧および心拍数に対する重度のＣＯ中毒の効果を示すグラフであり、この効果は、ヘモグロビンの添加により反転される。複数の異なる用量のヘモグロビンを示す。
【００２１】
【図９】図９は、本明細書に開示されているミトコンドリア呼吸試験の設定の流れ図である。
【００２２】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、ミトコンドリアおよび心臓組織呼吸に対するＣＯの効果を示す一対のグラフである。（図１０Ａ）ＣＯは、ＣＯ曝露前（空気）と比較して、３回の再酸素化（ＣＯ１、ＣＯ２、ＣＯ３）にわたり持続的に、単離された肝臓ミトコンドリアの呼吸を阻害する。（図１０Ｂ）ＣＯは、ＣＯ曝露前（空気）と比較して、３回の再酸素化（ＣＯ、ＣＯ２、ＣＯ３）にわたり心臓呼吸を阻害する。
【００２３】
【図１１】図１１は、ミトコンドリア呼吸が、ＣＯによって阻害され、この阻害が、デオキシヘモグロビンの添加により反転されることを示すグラフである。ＣＯは、ＣＯ曝露前（室内空気）と比較して、単離された肝臓ミトコンドリアの呼吸を６０．５％低下させた（ＣＯガス）。０．５モル濃度のデオキシヘモグロビンの添加は、ＣＯ阻害された量（ＣＯガス）から、呼吸を９５％増加させた（ヘモグロビン）（＊＝統計的に有意）。
【００２４】
【図１２】図１２は、心臓組織呼吸が、ＣＯによって阻害され、デオキシミオグロビンの添加により反転されることを示すグラフである。ＣＯは、ＣＯ曝露前（空気）と比較して、ＬＶホモジネートの呼吸を７５．６％低下させた（ＣＯガス）。０．５モル濃度のデオキシミオグロビンの添加は、ＣＯ阻害された量（ＣＯガス）から、呼吸を１９９％増加させた（処置）。処置なしでは、呼吸量は、再酸素化後であってもＣＯ曝露呼吸（ＣＯガス）と同等の低さを維持した（無処置）。
【００２５】
【図１３】図１３は、３０，０００ｐｐｍ（３％）ＣＯガスに曝露され、その後、ペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ）で処置されたマウスにおけるＨｂＣＯレベルの時間経過を示すグラフである。
【００２６】
【図１４】図１４は、３０，０００ｐｐｍ（３％）ＣＯガスに曝露され、その後、ＰＥＧ−Ｈｂで処置されたマウスの、経時的な平均動脈圧（ＭＡＰ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．略語
ＣＯ    一酸化炭素
ＣＯ−Ｈｂ    カルボキシヘモグロビン
Ｈ２Ｓ    硫化水素
Ｈｂ    ヘモグロビン
ＨｂＣＯ    カルボキシヘモグロビン
Ｈｇｂ    ヘモグロビン
ＩＶ    静脈内
ＬＤ５０    ５０％致死量
ＬＶ    左心室
Ｍｂ    ミオグロビン
Ｍｇｂ    ミオグロビン
Ｎｇｂ    ニューログロビン
ＰＥＧ−Ｈｂ    ペグ化ヘモグロビン
ＲＢＣ    赤血球細胞
ｒＮｇｂ    組換えニューログロビン
ＲＯＳ    活性酸素種
ＩＩ．用語および方法
【００２８】
特に断りのない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin  Lewin、Genes  V、Oxford  University  Pressから出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Kendrewら（編）、The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology、Blackwell  Science  Ltd.から出版、１９９４年（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびRobert  A.  Meyers（編）、Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference、VCH  Publishers,  Inc.から出版、１９９５年（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００２９】
本開示の様々な実施形態の総括を容易にするために、特定の用語に関する次の説明を示す：
【００３０】
投与：いずれか有効な経路によって治療剤（例えば、酸素運搬体）等の薬剤を対象に提供することまたは与えること。例示的な投与経路として、注射または注入（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、脳室内、線条体内、頭蓋内および脊髄中等）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、腟および吸入経路が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
解毒薬：毒の効果を中和または相殺する薬剤。
【００３２】
一酸化炭素（ＣＯ）：十分に高濃度で遭遇したときにヒトおよび動物にとって有毒な、無色、無臭および無味のガス。ＣＯは、正常な動物代謝においても低レベルで産生される。
【００３３】
カルボキシヘモグロビン（ＨｂＣＯまたはＣＯ−Ｈｂ）：ＣＯが吸入または正常代謝において産生されたときに赤血球細胞において形成する、一酸化炭素（ＣＯ）およびヘモグロビン（Ｈｂ）の安定複合体。
【００３４】
一酸化炭素ヘモグロビン血症または一酸化炭素中毒：血液中の過剰量の一酸化炭素の存在に起因する状態。典型的には、１００百万分率（ｐｐｍ）またはそれを超えるＣＯへの曝露は、一酸化炭素ヘモグロビン血症を引き起こすのに十分である。軽度急性ＣＯ中毒の症状は、意識朦朧、錯乱、頭痛、回転性めまいおよびインフルエンザ様効果を含む；より大規模な曝露は、中枢神経系および心臓の著しい毒性、さらには死亡をもたらし得る。急性中毒後に、長期続発症が起こることが多い。一酸化炭素は、妊婦の胎児に深刻な影響を及ぼす場合もある。低レベルの一酸化炭素への慢性曝露は、抑うつ状態、錯乱および記憶喪失をもたらし得る。一酸化炭素は主に、ヘモグロビンと結び付いて血液中にカルボキシヘモグロビン（ＨｂＣＯ）を形成することにより、ヒトにおける有害効果を引き起こす。これは、ヘモグロビンへの酸素結合を防止し、血液の酸素運搬能力を低下させ、低酸素症をもたらす。その上、ミオグロビンおよびミトコンドリアチトクロムｃオキシダーゼは、有害に影響されると考えられる。カルボキシヘモグロビンは、ヘモグロビンに復帰することができるが、ＨｂＣＯ複合体は相当に安定であるため、回復には時間がかかる。ＣＯ中毒の現在の処置方法は、１００％酸素の投与または高圧酸素療法の提供を含む。
【００３５】
接触：直接的に物理的会合した配置；固体および液体形態の両方を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ方法の文脈で使用される場合、「接触」は、投与も含む。
【００３６】
シアン化物中毒：シアン化水素ガスおよびシアン化物塩等、いくつかの形態のシアン化物への曝露に起因する中毒の１種。シアン化物中毒は、住宅火災による煙の吸入、金属研磨剤、特定の殺虫剤およびある特定の種子（リンゴ種子等）への曝露により起こり得る。シアン化物中毒の初期症状は、頭痛、眩暈、速い心拍数、息切れおよび嘔吐を含む。より後期の症状は、発作、遅い心拍数、低血圧、意識喪失および心停止を含む。
【００３７】
サイトグロビン：全ての組織において遍在性に発現されるグロビン分子。サイトグロビンは、組織を通した酸素の拡散を容易にし、亜硝酸塩を一酸化窒素に還元し、低酸素条件および酸化ストレス下で細胞保護的役割を果たすことが報告された６配位型のヘモグロビンである。
【００３８】
グロビン：酸素の結合および／または輸送に関与するヘム含有タンパク質。グロビンは、例えば、ヘモグロビン、ミオグロビン、ニューログロビンおよびサイトグロビンを含む。
【００３９】
ヘモシアニン：いくつかの無脊椎動物の全身に酸素を輸送するタンパク質の１種。ヘモシアニンは、単一の酸素分子に可逆的に結合する２個の銅原子を含有する金属タンパク質である。ヘモシアニンは、Ｍｏｌｌｕｓｃａ門およびＡｒｔｈｒｏｐｏｄａ門のみに見出される。
【００４０】
ヘモグロビン（Ｈｂ）：脊椎動物および他の動物における血液の赤血球細胞における鉄含有酸素輸送金属タンパク質。ヒトでは、ヘモグロビン分子は、４個の球状タンパク質サブユニットの集合体である。各サブユニットは、非タンパク質ヘム基と緊密に会合したタンパク質鎖で構成されている。各タンパク質鎖は、グロビンフォールド配置（この配置が、他のヘム／グロビンタンパク質において使用される同じフォールディングモチーフであることからそのように呼ばれる）で一体に接続されたアルファ−ヘリックス構造セグメントのセットへと配置する。このフォールディングパターンは、ヘム基に強く結合するポケットを含有する。
【００４１】
ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）：酸素運搬体として機能する、精製、組換えおよび／または修飾ヘモグロビンの輸液可能な流体。いくつかのＨＢＯＣが公知である、および／または臨床開発中である。ＨＢＯＣの例として、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化（pyridoxylated）Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）＋カタラーゼ＆ＳＯＤ（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１が挙げられるがこれらに限定されない（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【００４２】
異種：異種タンパク質またはポリペプチドは、異なる供給源または種に由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。
【００４３】
硫化水素中毒：硫化水素（Ｈ２Ｓ）への過剰曝露に起因する中毒の１種。Ｈ２Ｓは、ミトコンドリアチトクロム酵素における鉄に結合し、細胞呼吸を防止する。より低濃度のＨ２Ｓへの曝露は、眼刺激、咽頭炎、咳嗽、悪心、息切れ、肺水腫、疲労、食欲不振、頭痛、易刺激性、記憶力貧困および眩暈を引き起こし得る。より高レベルの曝露は、即時虚脱、呼吸不能および死亡を引き起こし得る。
【００４４】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸分子、タンパク質または細胞等）は、他の染色体および染色体外ＤＮＡならびにＲＮＡ、タンパク質および細胞等、該構成成分が天然に生じる生物の細胞、血液もしくは組織、または生物それ自体における他の生物学的構成成分から実質的に分離または精製されている。「単離」された核酸分子およびタンパク質は、標準精製方法によって精製されたこれらを含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質も包含する。
【００４５】
メトヘモグロビン：ヘム構成成分における鉄が二価鉄（＋２）から三価鉄（＋３）状態へと酸化された、酸化型のヘモグロビン。これは、ヘモグロビン分子を、組織へと酸素を有効に輸送および放出できなくする。通常、総ヘモグロビンの約１％が、メトヘモグロビン形態で存在する。
【００４６】
ミオグロビン（Ｍｂ）：タンパク質のグロビンファミリーのメンバー。ミオグロビンは、全ての脊椎動物およびほぼ全ての哺乳動物の筋肉組織に見出される鉄および酸素結合タンパク質である。ヒトでは、ミオグロビンは、筋肉傷害後の血流中にのみ見出される。ヘモグロビンとは異なり、ミオグロビンは、酸素に対する結合部位を１個のみ含有するが（タンパク質の１個のヘム基における）、酸素に対するその親和性は、酸素に対するヘモグロビンの親和性よりも大きい。
【００４７】
ニューログロビン（Ｎｇｂ）：タンパク質のグロビンファミリーのメンバー。ニューログロビンの生理的機能は、現在不明であるが、低酸素または虚血性条件下での保護を提供すると考えられる。ニューログロビンは、中枢および末梢神経系、脳脊髄液、網膜および内分泌組織において発現される。
【００４８】
酸化剤：別の物質から電子を受容する（物質を「酸化する」とも称される）ことができる物質。酸化剤は、化学反応において電子を獲得し、還元される。酸化剤は、「電子受容体」としても公知である。
【００４９】
酸素運搬体：身体内の酸素を結合、輸送および放出することができる分子または化合物。酸素運搬体は、ヘモグロビン、ミオグロビンおよびヘモシアニン等、天然タンパク質、ならびにヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）、リポソーム被包ヘモグロビンおよびポルフィリン金属錯体を含む人工酸素運搬体を含む。
【００５０】
ペプチドまたはポリペプチド：その単量体が、アミド結合により一体に連接されたアミノ酸残基である、ポリマー。アミノ酸がアルファ−アミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のどちらが使用されてもよいが、Ｌ−異性体が好ましい。本明細書において使用される用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、いずれかのアミノ酸配列を包含し、修飾されたグロビンタンパク質を含む修飾された配列を含むことが意図される。用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は、天然起源のタンパク質、および組換えまたは合成により産生されるものを網羅することが特に意図される。
【００５１】
保存的アミノ酸置換は、それが為されたときに、本来のタンパク質の特性への干渉が最小となる置換である、すなわち、斯かる置換によってタンパク質の構造、特に機能が保存され、有意に変化されない。保存的置換の例を下に示す。
【表Ａ】
2019521966.tif 000003
【００５２】
保存的置換は一般に、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス高次構造としての、置換の区域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積を維持する。
【００５３】
タンパク質特性に最大の変化を生じさせることが一般に予想される置換は、非保存的、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリンもしくはスレオニンが、疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンもしくはアラニンに代えて（またはそれにより）置換される；（ｂ）システインもしくはプロリンが、他のいずれかの残基に代えて（またはそれにより）置換される；（ｃ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リシン、アルギニンもしくはヒスチジンが、電気陰性残基、例えば、グルタミンもしくはアスパラギン酸に代えて（またはそれにより）置換される；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を持たない残基、例えば、グリシンに代えて（またはそれにより）置換される変化となる。
【００５４】
薬学的に許容される担体：実用的な薬学的に許容される担体が、慣例的である。Remington's  Pharmaceutical  Sciences、E.W.  Martin著、Mack  Publishing  Co.、Easton,  PA、第１５版、１９７５年は、本明細書に開示されている組成物の医薬送達に適した組成物および製剤について記載する。
【００５５】
一般に、担体の性質は、用いられている特定の投与機序に依存する。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料およびｐＨ緩衝剤その他、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンラウリン酸モノエステル等、微量の無毒補助的物質を含有することができる。
【００５６】
ポルフィリン：ヘモグロビン、クロロフィルおよびある特定の酵素における金属結合補助因子として機能する、４個のピロール環を含有する有機化合物。
【００５７】
組換え：組換え核酸またはタンパク質は、天然起源ではない配列を有する、または２個の天然状態では分離されている配列セグメントの人工的組合せによって作製された配列を有する核酸またはタンパク質である。この人工的組合せは、多くの場合、化学合成によって、または単離された核酸セグメントの人工操作、例えば、遺伝子工学技法によって達成される。組換えという用語は、天然核酸分子またはタンパク質の部分の付加、置換または欠失によって変更された核酸およびタンパク質を含む。
【００５８】
還元剤：レドックス化学反応において別の化学種へと電子を失う（または「供与する」）元素または化合物。還元剤は典型的に、そのより低い可能な酸化状態の１つにあり、電子供与体として公知である。レドックス反応において電子を失うため、還元剤は酸化される。例示的な還元剤として、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジン、土類金属、ギ酸および亜硫酸塩化合物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
配列同一性／類似性：２種もしくはそれよりも多い核酸配列または２種もしくはそれよりも多いアミノ酸配列の間の同一性は、配列間の同一性または類似性の観点から表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性の観点から測定することができる；パーセンテージが高いほど、配列はより同一である。配列類似性は、パーセンテージ類似性の観点から測定することができる（これは、保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）；パーセンテージが高いほど、配列はより類似する。核酸またはアミノ酸配列のホモログまたはオルソログは、標準方法を使用して整列された場合に、相対的に高い程度の配列同一性／類似性を保有する。オルソロガスタンパク質またはｃＤＮＡが、より遠縁の種と比較して（ヒトとＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列等）、より近縁の種に由来する場合に（ヒトとマウス配列等）、この相同性は、より有意である。
【００６０】
比較のための配列の整列方法は、本技術分野で周知である。様々なプログラムおよび整列アルゴリズムは、SmithおよびWaterman、Adv.  Appl.  Math.２巻：４８２頁、１９８１年；NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.４８巻：４４３頁、１９７０年；PearsonおよびLipman、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、Gene、７３巻：２３７〜４４頁、１９８８年；HigginsおよびSharp、CABIOS  ５巻：１５１〜３頁、１９８９年；Corpetら、Nuc.  Acids  Res.１６巻：１０８８１〜９０頁、１９８８年；Huangら、Computer  Appls.  in  the  Biosciences  ８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；およびPearsonら、Meth.  Mol.  Bio.２４巻：３０７〜３１頁、１９９４年に記載されている。Altschulら、J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年は、配列整列方法および相同性計算に関する詳細な考察を発表する。
【００６１】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Altschulら、J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜１０頁、１９９０年）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘに関連した使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネット上を含むいくつかの供給源から利用することができる。追加情報は、ＮＣＢＩウェブサイトに見出すことができる。
【００６２】
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、脊椎動物の生物を含む、生きている多細胞生物。
【００６３】
合成：研究室において人工的手段により産生されること、例えば、合成ポリペプチドは、研究室において化学合成することができる。
【００６４】
治療有効量：処置されている対象における所望の効果の達成に十分な、化合物または組成物、例えば、酸素運搬体の量。例えば、これは、血液もしくは組織における一酸化炭素の除去、血液におけるＨｂＣＯのレベルの低下、および／または一酸化炭素中毒に伴う１種もしくは複数の徴候もしくは症状の低下に必要な量であり得る。
【００６５】
他に説明がなければ、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、複数形の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、もしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および核酸またはポリペプチドに与えられる全ての分子量または分子質量の値が近似値であり、説明のために提示されていることをさらに理解されたい。本開示の実施または検査において、本明細書に記載されているものに類似のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、適した方法および材料を下に記載する。本明細書に言及されている全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。矛盾が生じる場合、用語の説明を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は、単なる説明であり、限定を意図しない。
ＩＩＩ．序文
【００６６】
酸素運搬体は、天然酸素運搬体および人工酸素運搬体の両方を含む。天然酸素運搬体の例として、ヒト、ウシまたは他の生体由来のヘモグロビン等、ヘモグロビン；ヒト、ウシまたは他の生体由来の濃縮赤血球細胞またはミオグロビン；および例えば、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａまたは他の生体に起源をもつヘモシアニンが挙げられる。人工酸素運搬体の例として、修飾ヘモグロビンおよびリポソーム被包ヘモグロビン等、天然酸素運搬体に由来する高度に機能的な酸素運搬体；アルブミン、アルブミン二量体およびアルブミンポリマーにポルフィリン金属錯体が取り込まれた化合物ならびにパーフルオロカーボン等、完全に合成された酸素運搬体；ならびに組換え／修飾ヘモグロビン等、組換え酸素運搬体が挙げられる。これらの酸素運搬体は、ヒトおよび他の動物の赤血球細胞に置き換わることができる。
【００６７】
これらの酸素運搬体は、臓器保存灌流液を提供するためまたは体外循環液として、大出血した患者等の患者への輸血のために、虚血性部位または腫瘍組織への酸素の供給に使用される（米国特許出願公開第２００４／０２５８７４５号および同第２００６／０００３９２３号）。ポルフィリン金属錯体の例は、２−［８−（２メチル−１−イミダゾリル）オクタノイルオキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス［α，α，α，α，−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイルアミノ）フェニル］ポルフィナト錯体である（米国特許出願公開第２００６／０００３９２３号）。
【００６８】
リポソーム被包ヘモグロビンは、脂質二重層から形成されるリポソームの内層に被包されたヘモグロビンを含み、その様々な調製方法および研究について記載されている（米国特許出願公開第２００４／０２５８７４５号）。
【００６９】
ミオグロビンおよびヘモグロビンは、ヘムに永続的に結合された１個のみのヒスチジンを有する５配位したヘムタンパク質である。ミオグロビンは、Ｏ２の６０倍のＣＯに対する親和性を有する（Nelsonら、「Carbon  Monoxide」、Goldfrank's  Toxicologic  Emergencies（第９版）、New  York：McGraw-Hill、１６５８〜１６７０頁、２０１１年）。ヘム基由来の鉄原子の反応は、次の通りに描写されている：
【数１】
2019521966.tif 000004
（式中、ｋｏｎおよびｋｏｆｆは、それぞれＣＯ結合および解離の速度である）。
【表１】
2019521966.tif 000005
【００７０】
ミオグロビンは、酸素よりもＣＯに対し６０倍高い親和性を有するため、組織におけるＣＯに優先的に結合する。ＣＯの存在下での還元Ｈｂは、ＣＯ結合のためのリザーバーとして作用するため、非ＣＯ結合Ｈｂは、ＣＯの追加的な標的として作用することができる。修飾ヘモグロビンまたはミオグロビン（人工酸素運搬体）は、天然起源の化合物と類似の様式で作用する。その上、これらの薬剤は、酸素と既に結合した状態で与えることができ、ＣＯに結合したままで、組織への酸素運搬を増加させる。
ＩＶ．一酸化炭素ヘモグロビン血症を処置する方法
【００７１】
対象における一酸化炭素ヘモグロビン血症を処置する方法が、本明細書に提供される。本方法は、一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する対象を選択するステップと、対象にその還元型の天然酸素運搬体または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップとを含む。
【００７２】
酸素運搬体が還元型であるとみなされるために、組成物に含まれる天然または人工酸素運搬体の１００％が還元される必要はない。一部の実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％等、酸素運搬体の少なくとも７０％が還元される。特定の実施形態では、酸素運搬体の７５〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％が還元される。
【００７３】
一部の実施形態では、組成物は、還元剤をさらに含む。還元剤は、ヒト対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの還元剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の例では、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の還元剤を還元された酸素運搬体組成物に添加するステップをさらに含む。大部分の事例では、第２の還元剤は、ヒトによる等、生理的に安全に耐容性を示す最低有効濃度（酸素運搬体をその還元型で維持するための）である濃度で、組成物に添加される。一部の例では、組成物における還元剤の濃度は、約５０μＭ〜約５０ｍＭ、約１００μＭ〜約２５ｍＭ、約２５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５００μＭ〜約５ｍＭまたは約７５０μＭ〜約１ｍＭ等、約１０μＭ〜約１００ｍＭである。特定の例では、組成物における還元剤の濃度は、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下または約２．５ｍＭ以下である。
【００７４】
一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、グロビンタンパク質を含む。一部の例では、グロビンタンパク質は、ヘモグロビンを含む。他の例では、グロビンタンパク質は、ミオグロビンを含む。さらに他の例では、グロビンタンパク質は、ニューログロビンまたはサイトグロビンを含む。特定の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ヒトヘモグロビン、ヒトミオグロビン、ヒトニューログロビンまたはヒトサイトグロビン等、ヒトグロビンタンパク質である。他の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ウシグロビンタンパク質またはウマグロビンタンパク質等、非ヒト動物由来である。
【００７５】
一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、軟体動物ヘモシアニンまたは節足動物ヘモシアニン等、ヘモシアニンを含む。
【００７６】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む。いくつかのＨＢＯＣが、本技術分野で公知である。適切なＨＢＯＣが、開示されている方法における使用のために選択および還元され得る。一部の例では、ＨＢＯＣは、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１である（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【００７７】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、リポソーム被包ヘモグロビンまたはリポソーム被包ミオグロビン等、リポソーム被包グロビンタンパク質を含む。他の実施形態では、人工酸素運搬体は、修飾ヘモグロビン、修飾ミオグロビン、修飾ニューログロビンまたは修飾サイトグロビン等、修飾グロビンタンパク質である。
【００７８】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ポルフィリン金属錯体を含む。例えば、人工酸素運搬体は、運搬体タンパク質（例えば、アルブミン、セルロプラスミン、ヘモペキシン）または有機化合物（例えば、パーフルオロカーボン）の添加によって可溶化されたポルフィリン金属錯体誘導体を含むことができる。
【００７９】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去する方法も本明細書に提供される。本方法は、血液または動物組織を、その還元型の天然酸素運搬体または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップを含む。
【００８０】
一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、血液または動物組織を、天然または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップは、治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。一部の例では、本方法は、天然または人工酸素運搬体を含む組成物を対象に投与することの前に、一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する対象を選択するステップをさらに含む。一部の例では、一酸化炭素ヘモグロビン血症を有する選択された対象は、その血液中に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％カルボキシヘモグロビンを有する。
【００８１】
他の実施形態では、血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。
【００８２】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するための方法の一部の実施形態では、組成物は、還元剤をさらに含む。還元剤は、ヒト対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの還元剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の例では、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
【００８３】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するための方法の一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、グロビンタンパク質を含む。一部の例では、グロビンタンパク質は、ヘモグロビンを含む。他の例では、グロビンタンパク質は、ミオグロビンを含む。さらに他の例では、グロビンタンパク質は、ニューログロビンまたはサイトグロビンを含む。特定の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ヒトヘモグロビン、ヒトミオグロビン、ヒトニューログロビンまたはヒトサイトグロビン等、ヒトグロビンタンパク質である。他の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ウシグロビンタンパク質またはウマグロビンタンパク質等、非ヒト動物由来である。
【００８４】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するための方法の一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、軟体動物ヘモシアニンまたは節足動物ヘモシアニン等、ヘモシアニンを含む。
【００８５】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するための方法の一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む。いくつかのＨＢＯＣが、本技術分野で公知である。適切なＨＢＯＣが、開示されている方法における使用のために選択および還元され得る。一部の例では、ＨＢＯＣは、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１である（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【００８６】
血液または動物組織におけるヘモグロビンから一酸化炭素を除去するための方法の一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、リポソーム被包ヘモグロビンまたはリポソーム被包ミオグロビン等、リポソーム被包グロビンタンパク質を含む。他の実施形態では、人工酸素運搬体は、修飾ヘモグロビン、修飾ミオグロビン、修飾ニューログロビンまたは修飾サイトグロビン等、修飾グロビンタンパク質である。
【００８７】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ポルフィリン金属錯体を含む。例えば、人工酸素運搬体は、運搬体タンパク質（例えば、アルブミン、セルロプラスミン、ヘモペキシン）または有機化合物（例えば、パーフルオロカーボン）の添加によって可溶化されたポルフィリン金属錯体誘導体を含むことができる。
Ｖ．シアン化物中毒を処置する方法
【００８８】
シアン化物は、チトクロムｃオキシダーゼにおけるヘムａ３中心に結合することにより、ミトコンドリア呼吸のＣＯ媒介性阻害と類似の様式で、ミトコンドリア呼吸を阻害することが公知である。これは、還元型に部分的に結合するが、シアン化物は、酸化状態のチトクロムｃオキシダーゼ（電子伝達系の複合体ＩＶ）に最も強く結合する（Leavesleyら、Toxicol  Sci  １０１巻（１号）：１０１〜１１１頁、２００８年）。還元状態でＣＯを除去する酸素運搬体の能力に類似して、酸化剤により媒介された酸化状態の酸素運搬体は、シアン化物を除去することができる。よって、赤血球細胞の内側に位置するシアノ−ヘモグロビンおよび身体内の他のヘム含有タンパク質（チトクロムｃオキシダーゼ等）からシアン化物を除去するための天然および人工酸素運搬体の使用が、本明細書に企図されている。
【００８９】
対象におけるシアン化物中毒を処置する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本方法は、シアン化物中毒を有する対象を選択するステップと、対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップとを含み、酸素運搬体は、その酸化型である。
【００９０】
酸素運搬体が酸化型であるとみなされるために、組成物に含まれる天然または人工酸素運搬体の１００％が酸化される必要はない。一部の実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％等、酸素運搬体の少なくとも７０％が酸化される。特定の実施形態では、酸素運搬体の７５〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％が酸化される。
【００９１】
一部の実施形態では、組成物は、酸化剤をさらに含む。酸化剤は、ヒト対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの酸化剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の例では、酸化剤は、酸素含有ガス混合物、酸素含有液体混合物、フェリシアン化物塩（フェリシアン化カリウム等）またはこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の酸化剤を酸化された酸素運搬体組成物に添加するステップをさらに含む。大部分の事例では、第２の酸化剤は、ヒトによる等、生理的に安全に耐容性を示す最低有効濃度（酸素運搬体をその酸化型で維持するための）である濃度で、組成物に添加される。一部の例では、組成物における酸化剤の濃度は、約５０μＭ〜約５０ｍＭ、約１００μＭ〜約２５ｍＭ、約２５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５００μＭ〜約５ｍＭまたは約７５０μＭ〜約１ｍＭ等、約１０μＭ〜約１００ｍＭである。特定の例では、組成物における酸化剤の濃度は、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下または約２．５ｍＭ以下である。
【００９２】
一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、グロビンタンパク質を含む。一部の例では、グロビンタンパク質は、ヘモグロビンを含む。他の例では、グロビンタンパク質は、ミオグロビンを含む。さらに他の例では、グロビンタンパク質は、ニューログロビンまたはサイトグロビンを含む。特定の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ヒトヘモグロビン、ヒトミオグロビン、ヒトニューログロビンまたはヒトサイトグロビン等、ヒトグロビンタンパク質である。他の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ウシグロビンタンパク質またはウマグロビンタンパク質等、非ヒト動物由来である。
【００９３】
一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、軟体動物ヘモシアニンまたは節足動物ヘモシアニン等、ヘモシアニンを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む。いくつかのＨＢＯＣが、本技術分野で公知である。適切なＨＢＯＣが、開示されている方法における使用のために選択および還元され得る。一部の例では、ＨＢＯＣは、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１である（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【００９５】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、リポソーム被包ヘモグロビンまたはリポソーム被包ミオグロビン等、リポソーム被包グロビンタンパク質を含む。他の実施形態では、人工酸素運搬体は、修飾ヘモグロビン、修飾ミオグロビン、修飾ニューログロビンまたは修飾サイトグロビン等、修飾グロビンタンパク質である。
【００９６】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ポルフィリン金属錯体を含む。例えば、人工酸素運搬体は、運搬体タンパク質（例えば、アルブミン、セルロプラスミン、ヘモペキシン）または有機化合物（例えば、パーフルオロカーボン）の添加によって可溶化されたポルフィリン金属錯体誘導体を含むことができる。
【００９７】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去する方法も本明細書に提供される。本方法は、血液または動物組織を、その酸化型の天然酸素運搬体または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ヘム含有タンパク質は、ヘモグロビンまたはチトクロムｃオキシダーゼである。
【００９８】
一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、血液または動物組織を、天然または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップは、治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。一部の例では、本方法は、天然または人工酸素運搬体を含む組成物を対象に投与する前に、シアン化物中毒を有する対象を選択するステップをさらに含む。
【００９９】
他の実施形態では、血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。
【０１００】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去するための方法の一部の実施形態では、組成物は、酸化剤をさらに含む。酸化剤は、ヒト対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの酸化剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の例では、酸化剤は、酸素含有ガス混合物、酸素含有液体混合物、フェリシアン化物塩（フェリシアン化カリウム等）またはこれらのいずれかの組合せを含む。
【０１０１】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去するための方法の一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、グロビンタンパク質を含む。一部の例では、グロビンタンパク質は、ヘモグロビンを含む。他の例では、グロビンタンパク質は、ミオグロビンを含む。さらに他の例では、グロビンタンパク質は、ニューログロビンまたはサイトグロビンを含む。特定の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ヒトヘモグロビン、ヒトミオグロビン、ヒトニューログロビンまたはヒトサイトグロビン等、ヒトグロビンタンパク質である。他の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ウシグロビンタンパク質またはウマグロビンタンパク質等、非ヒト動物由来である。
【０１０２】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去するための方法の一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、軟体動物ヘモシアニンまたは節足動物ヘモシアニン等、ヘモシアニンを含む。
【０１０３】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去するための方法の一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む。いくつかのＨＢＯＣが、本技術分野で公知である。適切なＨＢＯＣが、開示されている方法における使用のために選択および還元され得る。一部の例では、ＨＢＯＣは、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１である（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【０１０４】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からシアン化物を除去するための方法の一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、リポソーム被包ヘモグロビンまたはリポソーム被包ミオグロビン等、リポソーム被包グロビンタンパク質を含む。他の実施形態では、人工酸素運搬体は、修飾ヘモグロビン、修飾ミオグロビン、修飾ニューログロビンまたは修飾サイトグロビン等、修飾グロビンタンパク質である。
【０１０５】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ポルフィリン金属錯体を含む。例えば、人工酸素運搬体は、運搬体タンパク質（例えば、アルブミン、セルロプラスミン、ヘモペキシン）または有機化合物（例えば、パーフルオロカーボン）の添加によって可溶化されたポルフィリン金属錯体誘導体を含むことができる。
ＶＩ．硫化水素（Ｈ２Ｓ）中毒を処置する方法
【０１０６】
硫化水素は、ミトコンドリア呼吸のＣＯ媒介性阻害と類似の様式で、ミトコンドリア呼吸を阻害することが公知である。Ｈ２Ｓは、還元型のチトクロムｃオキシダーゼ（電子伝達系の複合体ＩＶ）に最も強く結合する（Nichollsら、Biochem  Soc  Trans  ４１巻（５号）：１３１２〜１３１６頁、２０１３年）。還元状態でＣＯを除去する酸素運搬体の能力と類似して、還元剤により媒介される還元状態の酸素運搬体は、Ｈ２Ｓを除去することができる。よって、赤血球細胞の内側に位置するヘモグロビンおよび身体内の他のヘム含有タンパク質（チトクロムｃオキシダーゼ等）からＨ２Ｓを除去するための天然および人工酸素運搬体の使用が、本明細書に企図されている。
【０１０７】
対象における硫化水素（Ｈ２Ｓ）中毒を処置する方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本方法は、Ｈ２Ｓ中毒を有する対象を選択するステップと、対象に天然または人工酸素運搬体を含む組成物の治療有効量を投与するステップとを含み、酸素運搬体はその還元型である。
【０１０８】
酸素運搬体が還元型であるとみなされるために、組成物に含まれる天然または人工酸素運搬体の１００％が還元される必要はない。一部の実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％等、酸素運搬体の少なくとも７０％が還元される。特定の実施形態では、酸素運搬体の７５〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％が還元される。
【０１０９】
一部の実施形態では、組成物は、還元剤をさらに含む。還元剤は、ヒト対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの還元剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の例では、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の還元剤を還元された酸素運搬体組成物に添加するステップをさらに含む。大部分の事例では、第２の還元剤は、ヒトによる等、生理的に安全に耐容性を示す最低有効濃度（酸素運搬体をその還元型で維持するための）である濃度で、組成物に添加される。一部の例では、組成物における還元剤の濃度は、約５０μＭ〜約５０ｍＭ、約１００μＭ〜約２５ｍＭ、約２５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５００μＭ〜約５ｍＭまたは約７５０μＭ〜約１ｍＭ等、約１０μＭ〜約１００ｍＭである。特定の例では、組成物における還元剤の濃度は、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下または約２．５ｍＭ以下である。
【０１１０】
一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、グロビンタンパク質を含む。一部の例では、グロビンタンパク質は、ヘモグロビンを含む。他の例では、グロビンタンパク質は、ミオグロビンを含む。さらに他の例では、グロビンタンパク質は、ニューログロビンまたはサイトグロビンを含む。特定の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ヒトヘモグロビン、ヒトミオグロビン、ヒトニューログロビンまたはヒトサイトグロビン等、ヒトグロビンタンパク質である。他の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ウシグロビンタンパク質またはウマグロビンタンパク質等、非ヒト動物由来である。
【０１１１】
一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、軟体動物ヘモシアニンまたは節足動物ヘモシアニン等、ヘモシアニンを含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む。いくつかのＨＢＯＣが、本技術分野で公知である。適切なＨＢＯＣが、開示されている方法における使用のために選択および還元され得る。一部の例では、ＨＢＯＣは、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１である（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【０１１３】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、リポソーム被包ヘモグロビンまたはリポソーム被包ミオグロビン等、リポソーム被包グロビンタンパク質を含む。他の実施形態では、人工酸素運搬体は、修飾ヘモグロビン、修飾ミオグロビン、修飾ニューログロビンまたは修飾サイトグロビン等、修飾グロビンタンパク質である。
【０１１４】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ポルフィリン金属錯体を含む。例えば、人工酸素運搬体は、運搬体タンパク質（例えば、アルブミン、セルロプラスミン、ヘモペキシン）または有機化合物（例えば、パーフルオロカーボン）の添加によって可溶化されたポルフィリン金属錯体誘導体を含むことができる。
【０１１５】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去する方法も本明細書に提供される。本方法は、血液または動物組織を、その還元型の天然酸素運搬体または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ヘム含有タンパク質は、ヘモグロビンまたはチトクロムｃオキシダーゼである。
【０１１６】
一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、血液または動物組織を、天然または人工酸素運搬体を含む組成物と接触させるステップは、治療有効量の組成物を対象に投与することを含む。一部の例では、本方法は、天然または人工酸素運搬体を含む組成物を対象に投与する前に、Ｈ２Ｓ中毒を有する対象を選択するステップをさらに含む。
【０１１７】
他の実施形態では、血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去する方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。
【０１１８】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去するための方法の一部の実施形態では、組成物は、還元剤をさらに含む。還元剤は、ヒト対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの還元剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の例では、還元剤は、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、チトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼ、ヒドララジンまたはこれらのいずれかの組合せを含む。
【０１１９】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去するための方法の一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、グロビンタンパク質を含む。一部の例では、グロビンタンパク質は、ヘモグロビンを含む。他の例では、グロビンタンパク質は、ミオグロビンを含む。さらに他の例では、グロビンタンパク質は、ニューログロビンまたはサイトグロビンを含む。特定の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ヒトヘモグロビン、ヒトミオグロビン、ヒトニューログロビンまたはヒトサイトグロビン等、ヒトグロビンタンパク質である。他の非限定的な例では、グロビンタンパク質は、ウシグロビンタンパク質またはウマグロビンタンパク質等、非ヒト動物由来である。
【０１２０】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去するための方法の一部の実施形態では、天然酸素運搬体は、軟体動物ヘモシアニンまたは節足動物ヘモシアニン等、ヘモシアニンを含む。
【０１２１】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去するための方法の一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ヘモグロビン系酸素運搬体（ＨＢＯＣ）を含む。いくつかのＨＢＯＣが、本技術分野で公知である。適切なＨＢＯＣが、開示されている方法における使用のために選択および還元され得る。一部の例では、ＨＢＯＣは、ＤＣＬＨｂ（ＨＥＭＡＳＳＩＳＴ（商標）；Ｂａｘｔｅｒ）、ＭＰ４（ＨＥＭＯＳＰＡＮ（商標）；Ｓａｎｇａｒｔ）、ピリドキシル化Ｈｂ  ＰＯＥ−コンジュゲート（ＰＨＰ）（Ａｐｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｏ−Ｒ−ＰｏｌｙＨｂＡ０（ＨＥＭＯＬＩＮＫ（商標）；Ｈｅｍｏｓｏｌ）、ＰｏｌｙＢｖＨｂ（ＨＥＭＯＰＵＲＥ（商標）；Ｂｉｏｐｕｒｅ）、ＰｏｌｙＨｂ（ＰＯＬＹＨＥＭＥ（商標）；Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ）、ｒＨｂ１．１（ＯＰＴＲＯ（商標）；Ｓｏｍａｔｏｇｅｎ）、ＰＥＧ−ヘモグロビン（Ｅｎｚｏｎ）、ＯＸＹＶＩＴＡ（商標）およびＨＢＯＣ−２０１である（GreenburgおよびKim、Crit  Care  ８巻（追補２号）：Ｓ６１〜Ｓ６４頁、２００４年；te  Lintel  Hekkertら、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２９８巻：Ｈ１１０３〜Ｈ１１１３頁、２０１０年；Eisenach、Anesthesiology  １１１巻：９４６〜９６３頁、２００９年）。
【０１２２】
血液または動物組織におけるヘム含有タンパク質からＨ２Ｓを除去するための方法の一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、リポソーム被包ヘモグロビンまたはリポソーム被包ミオグロビン等、リポソーム被包グロビンタンパク質を含む。他の実施形態では、人工酸素運搬体は、修飾ヘモグロビン、修飾ミオグロビン、修飾ニューログロビンまたは修飾サイトグロビン等、修飾グロビンタンパク質である。
【０１２３】
一部の実施形態では、人工酸素運搬体は、ポルフィリン金属錯体を含む。例えば、人工酸素運搬体は、運搬体タンパク質（例えば、アルブミン、セルロプラスミン、ヘモペキシン）または有機化合物（例えば、パーフルオロカーボン）の添加によって可溶化されたポルフィリン金属の錯体誘導体を含むことができる。
ＶＩＩ．還元された酸素運搬体を調製する方法
【０１２４】
還元された酸素運搬体を調製する方法が本明細書にさらに提供される。本方法は、酸素運搬体−還元剤組成物を産生するだめに、酸素運搬体を第１の還元剤と接触させるステップと、還元された酸素運搬体組成物を形成するために、酸素運搬体−還元剤組成物を脱塩カラムに通すステップとを含む。還元された酸素運搬体の調製は、嫌気性環境で行われる。
【０１２５】
一部の実施形態では、第１の還元剤を、１：１００〜５：１（還元剤対酸素運搬体）の比で酸素運搬体と接触させる。特定の実施形態では、還元剤対酸素運搬体の比は、１：５０〜４：１、１：２５〜３：１、１：１０〜２：１または１：５〜１：１である。一部の例では、還元剤対酸素運搬体の比は、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５、約１：１０、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０または約１：１００である。
【０１２６】
一部の実施形態では、本方法は、第２の還元剤を還元された酸素運搬体組成物に添加するステップをさらに含む。大部分の事例では、第２の還元剤は、ヒトによる等、生理的に安全に耐容性を示す最低有効濃度（酸素運搬体をその還元型で維持するための）である濃度で添加される。一部の例では、第２の還元剤は、約５０μＭ〜約５０ｍＭ、約１００μＭ〜約２５ｍＭ、約２５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５００μＭ〜約５ｍＭまたは約７５０μＭ〜約１ｍＭ等、約１０μＭ〜約１００ｍＭの濃度で添加される。特定の例では、第２の還元剤は、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下または約２．５ｍＭ以下の濃度で添加される。
【０１２７】
還元剤は、ヒトまたは他の哺乳動物対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの還元剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の実施形態では、第１の還元剤、第２の還元剤またはその両方は、亜ジチオン酸ナトリウム、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオン、ヒドララジンおよびチトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼまたはこれらのいずれかの組合せから選択される。
【０１２８】
一部の実施形態では、本方法は、還元された酸素運搬体組成物を凍結して、凍結された還元された酸素運搬体組成物を産生するステップをさらに含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、本方法は、凍結された還元された酸素運搬体組成物を解凍するステップをさらに含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、本方法は、還元された酸素運搬体を、一酸化炭素ヘモグロビン血症（一酸化炭素中毒）または硫化水素中毒を有する対象等、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。一部の例では、対象は、その血液中に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％カルボキシヘモグロビンを有する。
ＶＩＩＩ．酸化された酸素運搬体を調製する方法
【０１３１】
酸化された酸素運搬体を調製する方法が本明細書にさらに提供される。本方法は、酸素運搬体−酸化剤組成物を産生するために、酸素運搬体を第１の酸化剤と接触させるステップと、酸化された酸素運搬体組成物を形成するために、酸素運搬体−酸化剤組成物を脱塩カラムに通すステップとを含む。酸化された酸素運搬体の調製は、嫌気性環境で行われる。
【０１３２】
一部の実施形態では、第１の酸化剤を、１：１００〜５：１（酸化剤対酸素運搬体）の比で酸素運搬体と接触させる。特定の実施形態では、酸化剤対酸素運搬体の比は、１：５０〜４：１、１：２５〜３：１、１：１０〜２：１または１：５〜１：１である。一部の例では、酸化剤対酸素運搬体の比は、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１、約１：１、約１：２、約１：５、約１：１０、約１：２０、約１：３０、約１：４０、約１：５０、約１：６０、約１：７０、約１：８０、約１：９０または約１：１００である。
【０１３３】
一部の実施形態では、第１の酸化剤は、脱塩またはゲルクロマトグラフィー等の方法により酸素運搬体から物理的または化学的に除去される（例：フェリシアン化物）。
【０１３４】
一部の実施形態では、本方法は、第２の酸化剤を酸化された酸素運搬体組成物に添加するステップをさらに含む。大部分の事例では、第２の酸化剤は、ヒトによる等、生理的に安全に耐容性を示す最低有効濃度（酸素運搬体をその酸化型で維持するための）である濃度で添加される。一部の例では、第２の酸化剤は、約５０μＭ〜約５０ｍＭ、約１００μＭ〜約２５ｍＭ、約２５０μＭ〜約１０ｍＭ、約５００μＭ〜約５ｍＭまたは約７５０μＭ〜約１ｍＭ等、約１０μＭ〜約１００ｍＭの濃度で添加される。特定の例では、第２の酸化剤は、約１．０ｍＭ以下、約１．５ｍＭ以下、約２．０ｍＭ以下または約２．５ｍＭ以下の濃度で添加される。
【０１３５】
酸化剤は、ヒトまたは他の哺乳動物対象等の対象に安全に投与され得るいずれかの酸化剤（例えば、最小のおよび／または耐容できる毒性を有する薬剤）であり得る。一部の実施形態では、第１の酸化剤、第２の酸化剤またはその両方は、酸素含有ガス混合物、酸素含有液体混合物、フェリシアン化物塩（フェリシアン化カリウム等）またはこれらのいずれかの組合せから選択される。
【０１３６】
一部の実施形態では、本方法は、凍結された酸化された酸素運搬体組成物を産生するために、酸化された酸素運搬体組成物を凍結するステップをさらに含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、本方法は、凍結された酸化された酸素運搬体組成物を解凍するステップをさらに含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、本方法は、酸化された酸素運搬体を、シアン化物中毒を有する対象等、それを必要とする対象に投与するステップをさらに含む。
【０１３９】
次の実施例は、ある一定の特定の特色および／または実施形態を説明するために示されている。これらの実施例は、本開示を記載されている特定の特色または実施形態に限定するものと解釈するべきではない。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）
一酸化炭素（ＣＯ）除去は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＯ中毒マウスにおけるカルボキシヘモグロビン（ＨｂＣＯ）を迅速に取り除く
１５００ｐｐｍ  ＣＯガスを有する空気へのマウスの平均５０分間の曝露が、ＨｂＣＯレベルを６４％＋／−１％まで増加させたことが以前に示された（ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１５０４１３）。曝露に先立ち、マウスに、血圧モニタリング、血液サンプリング、および別の種類のＣＯ除去グロビンタンパク質である組換えニューログロビン（ｒＮｇｂ）または対照としてのＰＢＳのいずれかの注入のために、大腿動脈および静脈カテーテルの配置を外科的に装着した。Ｈａｒｖａｒｄ注入ポンプを使用して、マウスに、４分以内に２５０μＬの８〜１２ｍＭ  ｒＮｇｂまたはＰＢＳを注入した。注入直後および５分毎に、ＨｂＣＯの測定のため、５μＬの血液を収集した。図１に示す通り、ｒＮｇｂ注入は、ＰＢＳ対照と比較して、ＨｂＣＯレベルを迅速に低下させた。特に、正常空気に５分間戻した後に、ＨｂＣＯレベルは、ＰＢＳを受けた群における１３．３％に対して、ｒＮｇｂを受けた群において平均３２．８％降下した（図１）。６０分後に、マウスを屠殺し、膀胱は、ミリモル濃度のｒＮｇｂを含有することが判明した。本試験は、ｒＮｇｂが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＯキレート剤として作用し、ＨｂＣＯレベルを急速に低下させ、腎臓を通して濾過されることを実証した。
（実施例２）
材料と方法
【０１４１】
本実施例は、実施例３〜８に記載されている試験のための方法および実験手順について記載する。
ミオグロビンと混合されたカルボキシル化ＲＢＣの動態学
【０１４２】
５０〜１００μＬの血液をＰＢＳで５〜７回洗浄し、１０００×ｇで５〜１０分間遠心分離することにより、赤血球細胞を得た。洗浄したＲＢＣを１〜２ｍｌのＰＢＳに希釈した。次いで、最大１時間アルゴンガスの流れを通すことにより、ゆっくり撹拌しつつＲＢＣを氷上で脱酸素化した。嫌気性実験のため、アルゴンを短時間通し、Ｈｂに対し過剰な亜ジチオン酸ナトリウムを、ＲＢＣに添加した。少なくとも４：１の比で脱酸素化された赤血球細胞溶液を希釈することにより、カルボキシル化された赤血球被包Ｈｂを得た。ＲＢＣを脱気ＰＢＳ（嫌気性実験のために５〜１０ｍＭ亜ジチオン酸塩を含有）で２回洗浄し、脱気された隔壁キャップ付き１５ｍＬ遠心管において５分間１０００×ｇで遠心分離することにより、過剰ＣＯを除去した。洗浄後に、嫌気性実験のための過剰の亜ジチオン酸ナトリウムと共に、最終濃度１００〜２００μＭとなるようにＲＢＣを再懸濁した。
【０１４３】
純粋なＨｂによる実験について記載されているものと同じ手順に従って、酸素化または脱酸素化されたミオグロビン（Ｍｂ）を調製した。一部の実験では、反応開始後に、Ｍｂから赤血球を分離して、吸光度スペクトルを測定した。この場合、Ｉｓｏｔｅｍｐ撹拌ホットプレートおよびウォーターバスの組合せ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により反応温度を調節した。赤血球被包カルボキシヘモグロビン（ＨｂＣＯ）および酸素化または脱酸素化されたＭｂを、別々のガラスバイアルにおいて２５または３７℃に平衡化した。最終濃度４０μＭの両方のタンパク質のためＲＢＣ溶液にＭｂを注入することにより、反応を開始した。等容量のＰＢＳ（亜ジチオン酸塩含有または非含有）をカルボキシル化ＲＢＣの対照試料に注入した。定期的に、０．５ｍｌの反応および対照試料を採取し、１．５ｍＬ微量遠心管において３０〜６０秒間、５０００×ｇで遠心分離した。Ｍｂを含有する上清を取り出し（好気性実験において５ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウムを添加して、タンパク質の自動酸化を防止した）、氷上で貯蔵した。ＰＢＳ中の０．５％ＮＰ４０溶液（嫌気性実験のために５ｍＭ亜ジチオン酸ナトリウムを常に含有し、好気性のためには時には含有する）を赤血球ペレットに添加して、細胞を溶解した。１ｃｍ経路長キュベットにおいて、Ｃａｒｙ  ５０分光光度計により、溶解したＲＢＣ溶液におけるＨｂ吸光度を測定した。このサイクルを６回、各回１．５〜５分間で反復し、Ｈｂの６種の吸光度測定値を得た。対照および反応試料を連続的に撹拌した。反応においてヘモグロビンの吸光度を測定した時間を、遠心分離開始１５または３０秒後（それぞれ３０または６０秒間の遠心分離持続時間に対し）までの、Ｍｂの注入後に経過した時間であると仮定した。最後の（６番目の）時点を測定した後に、反応および対照混合物の貯蔵した上清試料の吸光度を記録した。
【０１４４】
一部の実験では、ＲＢＣをＭｂから分離しなかった。その代わりに、Ｃａｒｙ  １００分光光度計のＩｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｓｐｈｅｒｅアタッチメントにより、全体的混合物の吸光度を記録した。この装置は、ＲＢＣによって散乱された光を収集し、これにより、スペクトルデコンボリューションに十分に正確な吸光度スペクトルを提供する。これらの実験のための手順は、カルボキシル化赤血球の調製後に、Ｃａｒｙ  ５０においてＭｂを純粋ＨｂＣＯと混合するための手順と同じであった。
最小二乗デコンボリューション
【０１４５】
酸化型（ｍｅｔ）、脱酸素化型（デオキシ）、酸素化型（Ｏ２）およびカルボキシル化型（ＣＯ）のヘモグロビン（Ｈｂ）およびミオグロビン（Ｍｂ）の標準参照スペクトルを得た。タンパク質を氷上で解凍した後に、過剰のフェリシアン化カリウムと混合し、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧ脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に通すことにより、酸化型のスペクトルを得た。酸化型に過剰の亜ジチオン酸ナトリウムを添加した後に、脱酸素化種のスペクトルを記録した。好気性条件下で脱酸素化種を脱塩カラムに通した直後に、酸素化型のスペクトルを記録した。脱酸素化種をＣＯ飽和バッファーと１：４の比で混合した後に、カルボキシル化型のスペクトルを測定した。Ｃａｒｙ  ５０分光光度計において２０℃、２５℃および３７℃で全ての標準スペクトルを収集した。実験スペクトルのデコンボリューションを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌでの最小二乗法によるフィッティングルーチンにより行った。動態学実験の吸光度の変化は相対的に小さいため、デコンボリューションの精度を確認するために、ＨｂおよびＭｂ濃度が互いに等しくなる制約ありおよびなしで、４５０と７００ｎｍ、４９０と６５０ｎｍおよび５１０と６００ｎｍの間で、ＨｂおよびＭｂの両方で構成された全てのスペクトルは常に適合された。同じ目的で、一部の実例では、波長軸に沿って水平にスペクトルをシフトし得るパラメータも適合に含まれた。ＨｂおよびＭｂのカルボキシル化および脱酸素化標準を使用して、嫌気性実験由来の吸光度スペクトルをデコンボリューションした。酸化型、カルボキシル化型および酸素化型のＨｂおよびＭｂの標準を使用して、好気性実験由来の吸光度スペクトルをデコンボリューションした。ＭｂからＨｂが分離され、好気性実験ではＲＢＣにまたは嫌気性実験では上清に、亜ジチオン酸塩が後に添加されたＲＢＣ実験のため、酸素化型および酸化型の代わりにデコンボリューションにおいて脱酸素化標準を使用した。ストップトフロー分光計により、および時には、ＨＰ８４５３により収集されたスペクトルのデコンボリューションの前に、区分的キュービックエルミートの補間法を用いて、Ｍａｔｌａｂのｉｎｔｅｒｐ１機能を使用して、Ｃａｒｙ  ５０分光光度計によって使用されたものと同じ波長に、吸光度値を再度マッピングした。
酸素運搬体の還元
【０１４６】
酸素運搬体をＣＯに容易に結合させるために、酸素運搬体は、酸化したＦｅ３＋型ではなくＦｅ２＋型（還元型）でなければならない。酸化型は、ＣＯと相互作用せず、無効となる。酸素運搬体の還元状態を達成するために、強い還元剤を添加し、次いで投与に先立ち除去した。タンパク質を還元型で維持するために、ヒトにおいて安全かつ定期的に投与される、より弱い還元剤であるアスコルビン酸および／またはＮ−アセチルシステインを添加することができる。
【０１４７】
図２は、酸素運搬体調製プロセスの流れ図を示す。第１のステップは、亜ジチオン酸ナトリウム（一般的な工業用還元体）等、強い還元体により薬剤を還元することである。亜ジチオン酸塩それ自体は、ラットにおいて２５００ｍｇ／ｋｇ体重のＬＤ５０を有する。投与される量を最小化するために、Ｇ２５分離カラムに通して亜ジチオン酸ナトリウム塩を除去した。調製は、約９０％除去率（ＧＥ）を有する。これは、フード下にて嫌気性条件で嫌気性バッファー（ＰＢＳ）により調製された。
【０１４８】
このステップの後に、薬剤を脱酸素状態で還元した。次いで、少ない濃度の還元剤を添加して、薬剤をこの還元状態に維持した。使用した薬剤は、マウスにおける１．２５ｍＭ亜ジチオン酸塩等、少ない量においてヒト適用に安全である。予測されるヒトＬＤ５０は０．５ｇ／ｋｇであり、マウスはおよそ２５ｇの重さであるため、マウスにおけるＬＤ５０用量は約６２．５ｍｇである；本試験は、総計０．０６７ｍｇを使用した。亜ジチオン酸塩は、オキシモルフォン塩酸塩ＩＶの製剤（ＮＵＭＯＲＰＨＡＮ（商標））中に０．１０％で存在し、これは、溶液１００ｍＬ当たり約１００ｍｇと同等である。このプロセスのために働く他の薬剤は、例えば、アスコルビン酸、Ｎ−アセチルシステイン、メチレンブルー、グルタチオンおよびチトクロムｂ５／ｂ５−レダクターゼである。アスコルビン酸およびＮ−アセチルシステインは、ヒトにおいて治療目的で使用されており、非常に耐容性が良い。最大一日用量は、アスコルビン酸では６ｇ  ＩＶ、Ｎ−アセチルシステインでは３００ｍｇ／ｋｇ（または２５ｇ）である。メトヘモグロビン血症の処置のためのメチレンブルー推奨投薬は、１〜２ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｍ２の２回反復ＩＶである。
【０１４９】
次いで、薬剤を密封し、−８０℃で貯蔵した。解凍後に、薬剤は、＞９５％還元型を維持した。図３は、ＣＯ除去剤としての酸素運搬体の調製および投与のための流れ図を示す。
（実施例３）
ＣＯ中毒のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
【０１５０】
酸素運搬体は、ＣＯ中毒におけるＨｂＣＯ複合体からＣＯを除去する。この除去プロセスのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、嫌気性条件で溶液中に１００％ＨｂＣＯを入れた。ＰＢＳが添加された場合、分光法によって測定されるＨｂＣＯの濃度は、変化しなかった。１００％デオキシミオグロビンがこの溶液に１：１比で添加された場合、ＨｂＣＯの半分超が低下され、ＣＯがミオグロビンによって結合された。ＨｂＣＯに対し欠乏した状態で添加された場合（１１０．８μＭ  ＨｂＣＯ対８５．３μＭ  デオキシミオグロビン）、ＨｂＣＯ濃度は３分の１だけ低下した（図４）。
（実施例４）
酸素運搬体は、重度のＣＯ中毒マウスモデルにおいて血行動態虚脱を反転し、生存を改善する
【０１５１】
齧歯類においてＣＯ中毒のモデルが確立された。これらのモデルを使用して、ミオグロビンおよびヘモグロビンが、１）ｉｎ  ｖｉｖｏヘモグロビンからＣＯを除去することができ、２）ＣＯ中毒によって誘導される血行動態虚脱を反転することができ、３）ＣＯ毒性に起因するミトコンドリア呼吸阻害を反転することができる、解毒剤として作用することが実証された。
【０１５２】
心血管および死亡率エンドポイントのモデルを確立するために、気管挿管し、換気し、麻酔したマウスを、２１％酸素および１．５％イソフルランを有する３０，０００ｐｐｍ（３％）ＣＯガスに４．５分間曝露した。マウスに、頸静脈（薬物注入のため）および頸動脈（血圧および心拍数モニタリングのため）カテーテルの配置を外科的に装着した。本モデルにおいて、曝露後に３００μＬのＰＢＳを注入した群において８８．２％（１５／１７）の死亡率が見られた一方、１１ｍＭミオグロビンの注入を受けた全てのマウスは生存した（０％死亡率；ｎ＝５）。ミオグロビンを注入したマウスの生存は、ＣＯによって誘導された血行動態虚脱および徐脈における反転によるものであった（図５）。
【０１５３】
頸静脈カテーテルにより、分光法を使用してＨｂＣＯレベルをサンプリングした。４．５分間のＣＯ曝露の直後に、ＨｂＣＯレベルは、平均して８４〜８８％であった。ＰＢＳまたはウマミオグロビンの注入５分後に、ＨｂＣＯレベルは、それぞれ７２．５％および６５．０４％に低下した。処置１０分後に、ＨｂＣＯレベルは、それぞれ６４．２％および５２．８％にさらに低下した。ＣＯのマウス半減期は、ヒトよりもはるかに速い。ミオグロビンの注入が、流体よりも速くＨｂＣＯのレベルを有意に低下させ、曝露を停止したことが実証された。図６に示す通り、換気したマウスに対する４．５分間の３％ＣＯガス曝露後に、３００μＬのＰＢＳの注入は、８８．２％の死亡率をもたらした（青色で記録された死亡）。３００μＬの１１．５ｍＭ還元型ミオグロビンの注入は、０％死亡率をもたらした（赤色）。還元型ミオグロビンを注入したマウスにおける生存は、心拍数（上）および平均動脈圧（下）の回復に起因した。
【０１５４】
１１ｍＭ未満のミオグロビンの濃度は、ＰＢＳ（７．６９％、ｎ＝１３）および１１ｍＭを超えるミオグロビン濃度（１００％生存、ｎ＝１０）と比較して、同じ生存利益（０％生存、ｎ＝４）を付与しなかった（図７）。図７に示す通り、１１ｍＭを超えるミオグロビンが、重度のＣＯ中毒によって誘導された血行動態虚脱の反転に必要とされた。これは、還元された酸素運搬体によるＨｂＣＯ複合体からのＣＯの化学量論的結合によるものである。類似の様式で、ｍｅｔ（または酸化）型の酸素運搬体は、この除去に関与しないため、無効である。したがって、この治療法を有効にするためには、還元された酸素運搬体を調製することが必要である。
【０１５５】
ミオグロビンと同様に、重度のＣＯ中毒モデルにおいてマウスにヘモグロビンを注入した。これもまた、重度のＣＯ中毒によって誘導された血行動態虚脱を反転する著しい能力を示した（図８）。図８に示す通り、ヘモグロビン注入は、重度のＣＯ中毒によって誘導された血行動態虚脱を反転した。４ｍＭ未満の濃度は、ＣＯ除去プロセスの性質により、これらの効果を反転しなかった。重ねて、ＣＯは、化学量論的様式でＨｂＣＯから除去されるため、ヘモグロビンの濃度は、相当に濃度依存性であった。血行動態虚脱の反転に要求される濃度は、≧ｍＭの屈曲点に存在した  −  ＜４ｍＭを注入したマウスは死んだ一方、≧４ｍＭを注入したマウスは全て生存した。
（実施例５）
健康なマウスにおける酸素運搬体の安全性の測定
【０１５６】
健康なマウスにおけるヘモグロビンおよびミオグロビン注入は、耐容性が良かった。健康なマウスを、３％イソフルランガスにより麻酔し、後眼窩空間にミオグロビンおよびヘモグロビンを注射した。マウスを４８時間観察した。マウスは、麻酔後に僅かに低下した活動性およびその後に続く２４時間に体重減少を示したが、正常な活動性を再開し、その後に体重が増加した。４８時間目に、動物を屠殺し、その血清を血液化学に関して解析し、全血を全血球計算に関して検査した。血液学プロファイルは、血小板のごく僅かな減少を明らかにしたが、これは対照動物にも見られた。血液化学は、正常な腎臓および肝臓機能を示した。これは、ミオグロビンおよびヘモグロビンが、大量に（８〜１２ｍＭ）注射された場合であっても、マウスにおいて安全かつ耐容性が良いことを示唆する。
（実施例６）
ＣＯ誘導性ミトコンドリア阻害を反転するＣＯ除去剤の能力の測定
【０１５７】
Ｃｌａｒｋ型の酸素電極呼吸測定システムにおいて、ＣＯガス曝露の前後でミトコンドリア呼吸を測定した。還元型ヘモグロビンおよびミオグロビンの両方の注入の効果を評価した。正常なラットから新鮮な肝臓を収集し、分画遠心分離によりミトコンドリアを単離した。左心室（ＬＶ）組織のため、正常なラットから新鮮なＬＶを収集し、次いでホモジナイズした。その結果得られるミトコンドリアおよびＬＶ組織を、Ｃｌａｒｋ型電極気密反応チャンバーに置き、次いで基質（コハク酸塩（ミトコンドリア）またはリンゴ酸塩およびピルビン酸塩（ＬＶ）ならびにＡＤＰ）を添加した。ミトコンドリアは、０％酸素に対し呼吸し、次いで室内空気のピペッティング注入によりシステムを再酸素化した。ミトコンドリアは、再び所望のＯ２濃度に下げて呼吸した。この時点で、ガス形態または飽和ＰＢＳ溶液のいずれかでＣＯを添加した。次いで、システムを再酸素化し、０％へと下げて呼吸が起きた。これらの呼吸量をＣＯ曝露前と比較した。最初の再酸素化ステップの理由は、その機能を損傷し得る、ある程度の低酸素を経験したミトコンドリアの量をより等しく比較するためであった。これが完了した後に、ＣＯ除去剤を添加し、システムを再酸素化し、この最終呼吸量を、ＣＯ前およびＣＯ後呼吸の両方と比較した。
【０１５８】
図９に示す通り、ＡＤＰ／コハク酸塩の添加後に、ミトコンドリアは、所望のＯ２濃度に対し呼吸し、システムを再酸素化し、ミトコンドリアは、再度所望のレベルのＯ２に対し呼吸した。次いで、ＣＯを注入し、システムを再酸素化し、呼吸量を比較した。０％Ｏ２に対する呼吸後に、ミオグロビンを注入し、システムを再酸素化し、呼吸量を比較した。
（実施例７）
ミトコンドリアＣＯ毒性を反転するヘモグロビンおよびミオグロビンの能力
【０１５９】
ＣＯ中毒は、患者に長期効果を有し、一理論は、ミトコンドリアの中毒が、電子伝達系の複合体ＩＶの阻害により増加した活性酸素種（ＲＯＳ）の生成をもたらすということである。ＣＯ曝露によって産生される阻害の量を測定し、これを呼吸量により定量化するためのモデルが開発された。Ｃｌａｒｋ電極において、最大呼吸を測定するための基質コハク酸塩およびＡＤＰの添加により、ラット肝臓から単離されたミトコンドリアおよび左心室（ＬＶ）ホモジネートの酸素呼吸が測定された。ＣＯガスが、３回の再酸素化（呼吸測定システムに酸素を戻し注入し、ミトコンドリア呼吸を再度０％酸素にする）にわたり、単離されたミトコンドリア（図１０Ａ）およびＬＶ心臓組織（図１０Ｂ）においてミトコンドリア呼吸の持続性の減少を誘導したことが実証された。この効果は、より低酸素状態においてより強く、チトクロムｃオキシダーゼにおけるヘムにおける結合に対するＣＯおよびＯ２の間の公知の競合と一貫した（低酸素における６２％低下対、酸素正常状態におけるほぼ５０％）。これは、単離されたミトコンドリアおよび心臓組織において異なる酸素張力におけるＣＯの結合および阻害濃度をさらに検査するための、酸素正常状態および低酸素下のＣＯ中毒におけるミトコンドリア機能を測定する能力を実証した。
（実施例８）
組織呼吸におけるＣＯ毒性の効果を反転する還元型ヘモグロビンおよび還元型ミオグロビンの能力
【０１６０】
さらなる試験は、デオキシＨｂが、ミトコンドリアに対するＣＯ中毒の効果を反転したことを実証した。ＣＯガスは、最大呼吸からの６０．５％の減少を誘導した（ｐ＝２．３×１０−７）。０．５等モル溶液におけるデオキシＨｂの添加は、中毒になった呼吸量を９５％増加させた（ｐ＝０．０００３、独立ｔ検定）（図１１）。
【０１６１】
別の試験は、デオキシミオグロビンが、ＣＯへの曝露後にＬＶホモジネートの呼吸を増加させたことを実証した。図１２に示す通り、ＣＯガスは、最大呼吸からの７５．６％の減少を誘導した（ｐ＝０．０００４）。０．５等モルデオキシミオグロビンの添加は、呼吸量を１９９％増加させた（ｐ＝０．００９６、独立ｔ検定）。ＣＯ曝露後に処置なしでは、呼吸における回復はなかった。
（実施例９）
人工酸素運搬体は、重度のＣＯ中毒マウスモデルにおける血行動態虚脱を反転し、生存を改善する
【０１６２】
実施例４に記載されている通り、齧歯類においてＣＯ中毒のモデルが確立された。これらのモデルを使用して、人工酸素運搬体のペグ化ヘモグロビン（ＰＥＧ−Ｈｂ；ヒトヘモグロビンへのポリエチレングリコールの表面コンジュゲーション）が、１）ｉｎ  ｖｉｖｏヘモグロビンからＣＯを除去することができ、２）ＣＯ中毒によって誘導された血行動態虚脱を反転することができる、解毒剤として作用することが実証された。ＰＥＧ−Ｈｂは、ヒトにおいてヘモグロビン系酸素運搬体として検査された（Bjorkholmら、Haematologica  ９０巻（４号）：５０５〜５１５頁、２００５年；Olofssonら、Anesthesiology  １０５巻（６号）：１１５３〜１１６３頁、２００６年；Olofssonら、Transfus  Med  １８巻（１号）：２８〜３９頁、２００８年）が、ＣＯ中毒のモデルにおいては試験されていない。
【０１６３】
気管挿管し、換気し、麻酔したマウスを、２１％酸素および１．５％イソフルランを有する３０，０００ｐｐｍ（３％）ＣＯガスに４．５分間曝露した。マウスに、頸静脈（薬物注入のため）および頸動脈（血圧および心拍数モニタリングのため）カテーテルの配置を外科的に装着した。本モデルにおいて、ＰＥＧ−Ｈｂを受けた全てのマウス（ｎ＝３）が生存した。注入した濃度は、およそ２００〜２５０マイクロリットル容量における１０ｍＭであった。
【０１６４】
頸静脈カテーテルにより、分光法を使用してＨｂＣＯレベルをサンプリングした。４．５分間のＣＯ曝露の直後に、ＨｂＣＯレベルは、平均して８４〜８８％であった。図１３に示す通り、ＰＢＳ、アルブミンまたはＰＥＧ−Ｈｂの注入５分後に、ＨｂＣＯレベルは、それぞれ８２％、８０％および６６％に低下した。処置１０分後に、ＨｂＣＯレベルは、それぞれ７６％、７５％および６２％にさらに低下した。ＣＯのマウス半減期は、ヒトよりもはるかに速い。これらの結果は、ＰＥＧ−Ｈｂの注入が、流体よりも速く、ＨｂＣＯのレベルを有意に低下させ、曝露を停止したことを実証する。図１４に示す通り、換気したマウスへの４．５分間の３％ＣＯガス曝露後に、２００〜２５０μＬの１０ｍＭ還元型ＰＥＧ−Ｈｂの注入は、平均動脈圧（ＭＡＰ）を回復させた。ＰＥＧ−Ｈｂを投与した全てのマウスは、ＭＡＰにおける回復により生存した。
【０１６５】
開示されている発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を鑑みて、説明されている実施形態が、本発明の単なる好ましい実施例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではないことが認識されるべきである。それどころか、本発明の範囲は、次の特許請求の範囲によって定義される。したがって本出願人らは、本出願人らの発明として、これらの特許請求の範囲の範囲および精神内に収まる全てを主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ＡＢ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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