(57)【要約】  ウイルスを作製する、増殖させるおよび増やす方法、サンプル中のウイルスの存在を同定する方法、特にニホンウナギ細胞培養物を用いる方法。ウイルスを感染させてあってもよい、単離したニホンウナギ細胞培養物、本発明の方法によってもたらされるウイルスを含むワクチン、およびニホンウナギ細胞培養物を含むウイルス増殖のためのキットもまた提供される。ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）のような魚類ウイルスであってよい。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスを増殖させる方法であって、
好適な細胞培養物に前記ウイルスを感染させるステップと、
前記感染させた細胞培養物を培養するステップと、
前記ウイルスを収集するステップとを含み、
前記ウイルスを精製するステップを含んでもよく、
前記細胞培養物がニホンウナギ細胞培養物である、方法。
【請求項２】
前記細胞培養物が混合細胞株または単一の細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞培養物が上皮細胞および／または線維芽細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ニホンウナギ細胞培養物が、受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが魚類ウイルスである、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスが、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）からなる群から選択される１つである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスが組換えウイルスである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養物に、０．１〜１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ウイルスストックを感染させる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスが、約２×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ〜約２×１０11ＴＣＩＤ50／ｍｌの最終力価で収集される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスが、細胞変性効果（ＣＰＥ）が前記細胞内で観察されるときに収集される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスが上清および／または溶解細胞より収集される、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ウイルスの作製に好適な細胞培養物であって、ニホンウナギ細胞培養物である細胞培養物。
【請求項１３】
前記ニホンウナギ細胞培養物が、受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である、請求項１２に記載の細胞培養物。
【請求項１４】
ウイルスストックを増やすためのニホンウナギ細胞培養物の使用。
【請求項１５】
前記ニホンウナギ細胞培養物が、受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ウイルスを感染させた、単離したニホンウナギ細胞。
【請求項１７】
受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物に由来する、請求項１６に記載の単離したニホンウナギ細胞。
【請求項１８】
前記ウイルスが、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）からなる群から選択される１つである、請求項１６または１７に記載の単離したニホンウナギ細胞。
【請求項１９】
魚の疾患の予防または治療における使用のための、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法によって作製したウイルスを含むワクチン。
【請求項２０】
前記疾患が、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）からなる群から選択される１つである、請求項１９に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記ウイルスが不活性型である、請求項１９または２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ウイルスが、１×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい力価で存在する、請求項１９から２１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ウイルスが、１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、１×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、１×１０9ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、または１×１０10ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい力価で存在する、請求項１９から２２のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項２４】
ウイルス増殖のためのキットであって、ニホンウナギ細胞培養物および使用のための説明書を含むキット。
【請求項２５】
前記ニホンウナギ細胞培養物が、受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である、請求項２４に記載のキットオブパーツ。
【請求項２６】
ウイルスを作製する方法であって、
ウイルスストックを用いて好適な細胞培養物に形質導入するステップと、
前記形質導入した細胞を培養培地で培養するステップと、
前記ウイルスを回収するステップとを含み、
前記培養培地より前記ウイルスを精製するステップを含んでもよく、
前記細胞培養物がニホンウナギ細胞培養物である、方法。
【請求項２７】
前記ニホンウナギ細胞培養物が、受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
サンプル中のウイルスの存在を同定する方法であって、
ニホンウナギ細胞培養物を前記サンプルに曝すステップと、
感染させた細胞培養物を取得するステップとを含み、
前記感染させた細胞培養物をインキュベートするステップを含んでもよく、
ウイルスを単離するステップを含んでもよく、更に
前記ウイルスの存在を同定するステップを含む方法。
【請求項２９】
前記ニホンウナギ細胞培養物が、受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルスが、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）からなる群から選択される、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
受入番号ＥＣＡＣＣ  １６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる、単離した細胞培養物。
【請求項３２】
免疫原性組成物を作製する方法であって、
請求項３１に記載の単離した細胞培養物を提供するステップと、
前記細胞培養物にウイルスを感染させるステップと、
前記ウイルスを感染させた前記細胞培養物を培養するステップと、
前記細胞培養物より前記ウイルスを収集するステップとを含む方法。
【請求項３３】
前記ウイルスが、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、特に魚類ウイルスを作製するおよび増殖させる方法に関する。本発明はまた、ウイルスを作製するおよび増殖させる方法において使用するための細胞培養物、ならびにそれらの方法によって調製されるウイルスを含むワクチンにも関する。
【背景技術】
【０００２】
水産養殖による魚の産業的養殖は劇的に拡大している。病原体に起因する感染症は、産業的水生施設が克服すべき主な課題を構成する。魚類の病原体は、真菌、原生動物、細菌病原体またはウイルスであり得るが、ウイルス性疾患は大部分が制御不能であり、重大な経済的損失を引き起こす可能性があるため、養殖業者、孵化場管理者、および科学者に最も懸念されるのはウイルス性疾患である。
魚類は、様々なウイルス感染および疾患に感受性があるが、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ｐｉｌｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＰＣＮＶ）、ノダウイルスまたはウイルス性神経壊死（ＶＮＮ）、サケ膵疾患ウイルス（ｓａｌｍｏｎｉｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、ならびに、次の科：ビルナウイルス科、ラブドウイルス科、イリドウイルス科、レオウイルス科、オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）、アルテリウイルス科、およびピコルナウイルス科内の他のものを含む。
効果的なワクチンを開発することは、魚のウイルス感染により起こる高い死亡率および経済的損失を低減するための解決策である。しかしながら、不活化ワクチンの作製のコストは、それが、ウイルスを大量に培養し、続いて不活性化することを必要とするため、高い。
当該技術分野に公知のワクチン製造方法は、胚性卵（例えば鳥類の胚）の使用、細胞（組織）培養物（ＴＣ）、生動物の接種および／またはトランスジェニック動物の使用を含む。植物、昆虫細胞または細菌培養物を用いる研究方法もまた公知である。
それらの各々は、それらの利点および欠点を有する。例えば、細胞ベースのワクチンの生産時間は、卵ベースのワクチンと比較して大幅に低減されているが、細胞ベースのワクチンは、比較的高い生産コストおよび比較して低い収量を有する。
例えば、コイ科丘疹性上皮腫（ＥＰＣ）、ブルーギル稚魚尾幹（ＢＦ−２）、ハタ、チャイロマルハタ（ＧＦ−１）、プラーチョン稚魚（ＳＳＮ−１）、ヨーロッパヘダイ尾びれ（ＳＡＦ−１）、ニジマス生殖腺（ＲＴＧ−２）、マスノスケ胚（ＣＨＳＥ−２１４）、およびアジアハタ系統Ｋ（ＡＧＫ）の細胞のような、ウイルス増殖のためのいくつかの細胞培養物が公知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、従来技術における問題のいくつかを克服する、改善されたウイルスを作製するおよび増殖させる方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様は、ウイルスを増殖させる方法であって、
好適な細胞培養物にウイルスを感染させるステップと、
感染させた細胞培養物を培養するステップと、
ウイルスを収集するステップとを含み、
ウイルスを精製するステップを含んでもよく、
前記細胞培養物がニホンウナギ細胞培養物である、方法を提供する。
本発明の実施形態において、細胞培養物は、混合細胞株、すなわち２つ以上の細胞株の混合物、または単一の細胞株を含み得る。
ニホンウナギ細胞培養物は、単一の細胞型、または２つ以上の細胞型の混合物を含み得る。例えば、ニホンウナギ細胞培養物は、上皮細胞および／または線維芽細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物は上皮細胞および線維芽細胞を含む。
【０００５】
好ましくは、細胞培養物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として本出願人によって寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれるＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ由来の細胞培養物である。
用語「Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ」（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃａ）または「ニホンウナギ」は、ウナギ科のウナギの種を指す。これは日本、中国、台湾およびベトナムにおいて一般的にみられ、降河魚である、つまり、海で産卵するが、部分的に淡水に生息する。
用語「Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ」（ＡＪＫ）、または代替的に「Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｇｅｎｕｓ  Ｋ」は、本発明による新規の細胞株に与えられた名称である。
培養するステップの際、感染させた細胞培養物は、１０〜３０℃の温度で、より好ましくは１５〜２８℃の温度でインキュベートされ得る。最適なインキュベーション温度は、増殖すべきウイルスの型および株に依存するであろうことは理解されよう。例えば、ウイルスがＩＰＮＶである場合、培養温度は好ましくは約１５℃である。例えば、ウイルスがベータノダウイルスのようなノダウイルスである場合、培養温度は好ましくは約２８℃である。
【０００６】
本発明者らは、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａより収集した組織をインビトロで培養することができ、驚くほど高い収量でウイルスを作製するためおよび増殖させるための、生存可能な細胞培養物が予測外に形成されることを見出した。細胞培養物が、これらの予測外に高いウイルス収量を、当該技術分野で使用される他の細胞株または細胞培養物に通常観察されるものよりも低いインキュベーション温度で作製することおよび増殖させることができたことを観察したことも驚くべきことであった。本発明の目的のために、細胞培養物はＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれている。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。「魚類ウイルス」は、魚類において症状または疾患を引き起こすことができる任意のウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【０００７】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
【０００８】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
【０００９】
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス（Ａｐａｒａｖｉｒｕｓ）属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、および伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
【００１０】
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
用語「組換えウイルス」は、例えば組換えＤＮＡを使用してＤＮＡの断片を組換えることによって作製されるウイルスを指す。組換えはヒトの介入によって成し遂げられる。用語はまた、例えば核酸鎖の相同的な交叉またはゲノムセグメントの再集合による、１つ以上のウイルス株を感染された細胞内においてウイルスゲノム間に自然発生する組換えを指してもよい。
好ましくは、細胞培養物に、０．１〜１０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ウイルスストックを感染させる。本発明の文脈において、用語ＭＯＩは、感染標的（例えば細胞）の数に対する病原体（例えばファージ、またはより一般劇にウイルス、細菌）の比を指す。例えば、ウイルス粒子を接種された細胞集団に言及するとき、感染多重度またはＭＯＩは、規定された空間に存在する標的細胞の数に対するウイルス粒子の数の比である。好ましくは、病原体は魚類ウイルスであり、標的はＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、３０℃において１０％Ｌ−グルタミン、および１μＬ／ｍＬのゲンタマイシン、７．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって培養してもよい。培養条件、例えば培地は、増殖すべきウイルスに応じて変動し得ることは理解されよう。
他の実施形態において、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、２９℃において１０％Ｌ−グルタミン、１μＬ／ｍＬのゲンタマイシン、および７．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって培養してもよい。培養条件、例えば培地は、増殖すべきウイルスに応じて変動し得ることは理解されよう。
【００１２】
好ましい実施形態において、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、２８℃において１０％Ｌ−グルタミン、１μＬ／ｍＬのゲンタマイシン、および７．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって培養してもよい。培養条件、例えば培地は、増殖すべきウイルスに応じて変動し得ることは理解されよう。
さらに好ましい実施形態において、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、２７．５℃において１０％Ｌ−グルタミン、１μＬ／ｍＬのゲンタマイシン、および７．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって培養してもよい。培養条件、例えば培地は、増殖すべきウイルスに応じて変動し得ることは理解されよう。
【００１３】
好ましくは、ウイルスは約２×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ〜約２×１０11ＴＣＩＤ50／ｍｌの最終力価で収集される。いくつかの実施形態において、最終力価は、少なくとも約２×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌである。他の実施形態において、最終力価は少なくとも約２×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌ、少なくとも約２×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌ、少なくとも約２×１０9ＴＣＩＤ50／ｍｌ、または少なくとも約２×１０10ＴＣＩＤ50／ｍｌである。回収される最終力価は、ウイルスの型および株のような要素に依存するであろうことは理解されよう。
本発明の文脈において、用語「力価」は、ウイルスの有効濃度を意味することは理解されよう。力価は、ＴＣＩＤ50／ｍｌ（５０％組織培養感染価）、すなわち感染宿主の５０％を死滅するかまたは接種された組織培養細胞の５０％において細胞変性効果（ＣＰＥ）をもたらすのに必要とされるウイルスの量として一般的に測定される。
用語「最終力価」は、完全なＣＰＥの後に、例えば２５００×ｇ以上での懸濁液の遠心と後に続く上清の回収によって収集されたウイルスの濃度を指す。
好ましくは、全体的な細胞変性効果が細胞内で観察されるときに収集される。好ましくは、ウイルスは上清および／または溶解細胞より収集される。
【００１４】
細胞に関する用語「細胞変性効果」またはＣＰＥは、形態変化を引き起こす、ウイルス侵入によって引き起こされる細胞の破壊または損傷を意味すると理解されよう。例として、形態変化は、細胞内における新しいウイルス粒子の蓄積、または上清中の新しいウイルス粒子の放出を伴い得るウイルス複製の結果としてもたらされる。
本発明の第２の態様は、ウイルスの作製に好適な細胞培養物を提供し、細胞培養物はニホンウナギ細胞培養物である。
ニホンウナギ細胞培養物は、単一の細胞型、または２つ以上の細胞型の混合物を含み得る。例えば、ニホンウナギ細胞培養物は、上皮細胞および／または線維芽細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物は上皮細胞および線維芽細胞を含む。
【００１５】
好ましくは、ニホンウナギ細胞培養物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００１６】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
【００１７】
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
本発明の第３の態様は、ウイルスストックを増やすためのニホンウナギ細胞培養物の使用を提供する。
用語「ウイルスストック」は、当業者によって理解されるであろうが、前記ウイルスを含む溶液を一般的に指す。
ニホンウナギ細胞培養物は、単一の細胞型、または２つ以上の細胞型の混合物を含み得る。例えば、ニホンウナギ細胞培養物は、上皮細胞および／または線維芽細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物は上皮細胞および線維芽細胞を含む。
好ましくは、ニホンウナギ細胞培養物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
【００１８】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
【００１９】
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
【００２０】
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
本発明の第４の態様は、ウイルスを感染させた、単離したニホンウナギ細胞を提供する。ニホンウナギ細胞は、上皮細胞または線維芽細胞であってよい。
【００２１】
好ましくは、ニホンウナギ細胞は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物に由来する。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００２２】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
【００２３】
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、および伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
【００２４】
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
本発明の第５の態様は、魚の疾患の予防または治療における使用のための、本発明による方法によって作製されるウイルスを含むワクチンを提供する。
好ましくは、ウイルスは不活性型である。
好ましくは、ウイルスは、１×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、１×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、１×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、１×１０9ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい、または１×１０10ＴＣＩＤ50／ｍｌより大きい力価で存在する。
細胞ベースのワクチンは、卵ベースのワクチンに優るいくつかの利点を有し、それはより速い生産時間、ウイルスの簡単な単離、および卵ベースのアレルギー反応の回避を含む。さらに、細胞株および培養物は、動物血清に関連する危険性を最小限にする合成培地で増殖させ得る。しかしながら、細胞ベースの方法の欠点は、増大するコストおよび低減したウイルス収量を含む。本発明の細胞培養物は、既存の魚類ワクチンを作製するための細胞ベースの方法に改善をもたらす。
本発明の第６の態様は、ウイルス増殖のためのキットであって、ニホンウナギ細胞培養物および使用のための説明書を含むキットを提供する。
ニホンウナギ細胞培養物は、単一の細胞型、または２つ以上の細胞型の混合物を含み得る。例えば、ニホンウナギ細胞培養物は、上皮細胞および／または線維芽細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物は上皮細胞および線維芽細胞を含む。
【００２５】
好ましくは、細胞培養物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００２６】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
【００２７】
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、および伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
【００２８】
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
本発明の第７の態様は、ウイルスを作製する方法であって、
ウイルスストックを用いて好適な細胞培養物に形質導入するステップと、
形質導入した細胞を培養培地で培養するステップと、
ウイルスを回収するステップとを含み、
培養培地よりウイルスを精製するステップを含んでもよく、
細胞培養物がニホンウナギ細胞培養物である、方法を提供する。
ニホンウナギ細胞培養物は、単一の細胞型、または２つ以上の細胞型の混合物を含み得る。例えば、ニホンウナギ細胞培養物は、上皮細胞および／または線維芽細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物は上皮細胞および線維芽細胞を含む。
【００２９】
好ましくは、ニホンウナギ細胞培養物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００３０】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
【００３１】
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、および伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
【００３２】
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
好ましくは、細胞培養物は、０．０５〜１０、０．１〜１０、または０．１〜１の感染多重度（ＭＯＩ）で、ウイルスストックによって形質転換される。ＭＯＩは、ウイルスの型および株のような要素に依存するであろうことは理解されよう。
好ましくは、ウイルスは約２×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ〜約２×１０11ＴＣＩＤ50／ｍｌのウイルスの最終力価で回収される。いくつかの実施形態において、最終力価は、少なくとも約２×１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌである。他の実施形態において、最終力価は少なくとも約２×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌ、少なくとも約２×１０8ＴＣＩＤ50／ｍｌ、少なくとも約２×１０9ＴＣＩＤ50／ｍｌ、または少なくとも約２×１０10ＴＣＩＤ50／ｍｌである。回収される最終力価は、ウイルスの型および株のような要素に依存するであろうことは理解されよう。
好ましくは、ウイルスは、全体的な細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞内で観察されるときに収集される。好ましくは、ウイルスは上清より収集される。
【００３３】
発明者らが驚いたことに、本発明のＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物は、ＳＳＮ細胞またはＣＣＨ−１細胞のような他の公知の細胞株または培養物より高いウイルス収量をもたらすことができた。例えば、ＳＰＤＶについて、ＣＣＨ−１細胞によって２×１０7ＴＣＩＤ50／ｍｌの力価がもたらされたが、一方で、２桁以上大きい力価が、本発明の細胞によってもたらされた（例４を参照）。
Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞のより小さいサイズが、他の細胞と比べて単位用量当たりより多い数の細胞が存在するという観察をもたらすと考えられる。本発明のＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物はまた、サケ類の細胞培養物と比べたとき、より迅速に増殖させる。
これらの要素は、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物において観察される高いウイルス収量に寄与し得るが、収量における相違を部分的にしか説明できない。他の寄与する因子は、個々の細胞のウイルス担持能、例えば、遅延したタンパク質停止、アポトーシスの遅延／欠如を含む。
【００３４】
本発明の第８の態様は、サンプル中のウイルスの存在を同定する方法であって、
ニホンウナギ細胞培養物をサンプルに曝すステップと、
感染させた細胞培養物を取得するステップとを含み、
感染させた細胞培養物をインキュベートするステップを含んでもよく、
ウイルスを単離するステップを含んでもよく、
ウイルスの存在を同定するステップを含む方法を提供する。
【００３５】
用語「サンプル」は、動物と接触していた、または接触していなかった可能性がある動物培地のような、環境における任意の供給源、または組織培養物質のような人工供給源より取得できる、例えば、細菌、ウイルス細胞、魚類細胞、組織、または体液を指す。好ましくは、動物は魚である。
ニホンウナギ細胞培養物は、単一の細胞型、または２つ以上の細胞型の混合物を含み得る。例えば、ニホンウナギ細胞培養物は、上皮細胞および／または線維芽細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養物は上皮細胞および線維芽細胞を含む。
好ましくは、細胞培養物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる細胞培養物である。
【００３６】
サンプル中のウイルスの存在を同定する方法は、サンプル中のウイルスの存在を診断する方法であってよい。サンプルがウイルスを含む場合、方法は、ウイルスをニホンウナギ細胞培養物に感染させるステップと、ニホンウナギ細胞培養物中で増殖させるステップとをさらに含むであろう。
ウイルスに応じて、例えば、ウイルスが溶菌性であるか溶原性であるかに応じて、インキュベートするステップを含めてもよいことは理解されよう。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００３７】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
【００３８】
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、および伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、同定するステップは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウエスタンブロット解析、ノーザンブロット解析、サザンブロット解析、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）、および／またはＦＡＣＳ解析を含む群より選択される１つを含む。これらの技術、ならびに他の同様のウェットラボラトリーおよびコンピュータベースの、同定および予測の、ツールおよび技術は当業者に公知であろう。
本発明の第９の態様は、受入番号ＥＣＡＣＣ１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋと呼ばれる、単離した細胞株を提供する。
【００４０】
本発明の第１０の態様は、免疫原性組成物を作製する方法であって、
本発明の単離した細胞培養物を提供するステップと、
細胞培養物にウイルスを感染させるステップと、
ウイルスを感染させた細胞培養物を培養するステップと、
細胞培養物よりウイルスを収集するステップとを含む方法を提供する。
好ましくは、ウイルスは魚類ウイルスである。
ウイルスはＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスであってよい。
好ましくは、ウイルスはＲＮＡウイルスである。いくつかの実施形態において、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスである。代替的な実施形態において、ウイルスは、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、プラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。
【００４１】
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、ノダウイルス科；ビルナウイルス科；トガウイルス科；ラブドウイルス科；イリドウイルス科；レオウイルス科；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｏｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｉｘｏｖｉｒｕｓ）；アルテリウイルス科；ピコルナウイルス科；ニマウイルス科；ジシストロウイルス科；パルボウイルス科；およびオルトミクソウイルス科からなる群から選択される科のウイルスであってよい。
ウイルスは、アルファノダウイルス属；ベータノダウイルス属；アクアビルナウイルス属；トリビルナウイルス属；ブロスナウイルス属；エントモビルナウイルス属；アルファウイルス属；ルビウイルス属；ノビラブドウイルス属；ブレビデンソウイルス属；ウィスポウイルス属；アパラウイルス属；およびイサウイルス属からなる群から選択される属のウイルスであってよい。
【００４２】
ウイルスは、当業者に公知の任意の魚類ウイルスであってよく、そのうちのいくつかは、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、柱細胞壊死ウイルス（ＰＣＮＶ）、ノダウイルス、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）、伝染性皮下組織造血器壊死症ウイルス（ＩＨＨＮＶ）、クルマエビホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＶ）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、肝膵臓パルボウイルス（ＨＰＶ）、および伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）を含む。
【００４３】
好ましくは、ウイルスは、ノダウイルス、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、およびサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の群より選択される１つである。いくつかの実施形態において、ウイルスは組換えウイルスであってよい。好ましくは、魚類ウイルスは、本発明による細胞培養物中で増殖させることができる。
本発明は添付の図を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＥＣＡＣＣ受入番号１６０６２７０１として寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物のＰＣＲ解析の生成物のアガロースゲル電気泳動によるサイズ分離の結果を示す図である。
【図２】１のＭＯＩで感染させ、収集後５、６、７および８日目のウイルス力価に着目した、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物（ＥＣＡＣＣ受入番号１６０６２７０１）中の伝染性膵臓壊死症ウイルス単離体ＩＰＮ  ＮＶＩ  ０１５（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ３７９７４０およびＡＹ３７９７４１）の増殖曲線を示すグラフである。
【図３】０．５のＭＯＩで感染させ、収集後５、６、７、１２、および１４日目のウイルス力価に着目した、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物（ＥＣＡＣＣ受入番号１６０６２７０１）中のサケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）の増殖曲線を示すグラフである。
【図４】０．１、０．５および１のＭＯＩで感染させ、収集後４、５、６、７、９および１１日目のウイルス力価に着目した、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物（ＥＣＡＣＣ受入番号１６０６２７０１）中のノダウイルスの増殖曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
（例１）
Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物の種同定  −  分子試験
継代（ｐ）１１８で播種されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋのプレマスター細胞、およびｐ１２１で播種されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋのマスター細胞のアリコートを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびシークエンシングによって種同定について試験した。
【００４６】
材料および方法
Ｐ１２１播種のマスター細胞およびｐ１１８播種のプレマスター細胞のアリコートより、ＥＺ１  ＤＮＡ組織キットおよびＥＺ１  Ｂｉｏｒｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して二連でゲノムＤＮＡを抽出し、ミトコンドリアシトクロムオキシダーゼ１（ＣＯ１）および１６Ｓ遺伝子のためのプライマー（以下の表１）によるＰＣＲ増幅に供した。生成物はアガロースゲル電気泳動によるサイズ分離の後に可視化された（図１）。すべての生成物を切り出し、生成し、サイクルシークエンシング（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔおよびＡＢＩ  ３１３０ｘｌ  Ａｖａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））によって直接的にシークエンシングした。二連解析物からの共通配列を、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬで利用可能な公開された配列と、ＢｌａｓｔＮ解析によって比較した。
【表１】
2019511208.tif 000002
【００４７】
結果
図１は、ｐ１１８で播種されたプレマスターＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞（１および２ならびに７および８）、ならびにｐ１２１のマスター細胞（３および４ならびに９および１０）の、ＣＯ１遺伝子（左手側のセット、レーン１〜４）および１６Ｓ遺伝子（右手側のセット、レーン７〜１０）の増幅生成物を示す。レーン５、６、１１、および１２は陰性コントロールである。
【００４８】
ｐ１１８で播種されたプレマスター細胞およびｐ１２１で播種されたマスター細胞のアリコートのＣＯ１および１６Ｓ遺伝子のＰＣＲおよびシークエンシングは、すべて、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の対応する遺伝子に対する１００％同一性を示す。混合配列の証拠はなかった。
Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞はＡ．ｊａｐｏｎｉｃａ起源である。
（例２）
Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞の増殖
細胞増殖および細胞培養のための方法および実験的プロトコールは、当業者に公知であろう。本発明の方法のいくつかの例を以下に記載する。
細胞保存条件
細胞培養物を、２×１０6細胞／ｍｌの密度で、希釈していない最小必須培地（ＭＥＭ）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の１０％ＤＭＳＯの５０／５０容量中に保存した。
細胞培養条件
Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は概して、２８℃において１０％Ｌ−グルタミン、および１μＬ／ｍＬのゲンタマイシン、および７．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＬ−１５培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって維持した。
【００４９】
代替的に、Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、１５〜２８℃において、最小必須培地（ＭＥＭ）、７．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．５％重炭酸ナトリウム、および１％Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタメートジペプチド（Ｇｌｕｔａｍａｘ）中で維持した。
ＩＰＮを感染させたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、１５℃で維持した。ノバウイルスを感染させたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞は、２８℃で維持した。
継代
細胞は、１：６の播種比率、または１．６×１０4細胞／ｃｍ2の細胞播種率で継代した。
【００５０】
（例３）
Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物、ＥＣＡＣＣ受入番号１６０６２７０１
ＥＣＡＣＣに寄託されたＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞培養物は、継代（ｐ）１２４で播種されたプレマスター細胞のサンプルに関係する。解析は、細胞培養物が主に上皮性であり、線維芽細胞の存在を伴うことを示した。
【００５１】
（例４）
ウイルス収量の調査
６×１０4細胞／ｃｍ2の密度で２％ＦＢＳを含むＬ１５培地中で維持する約８０％コンフルエントのＡｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ−Ｋ細胞に、ウイルス（伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、サケ膵疾患ウイルス（ＳＰＤＶ）、またはノダウイルス）を接種し、１５℃でのインキュベーションが後に続いた。
細胞を、ＩＰＮおよびＳＰＤＶに対して１．０のＭＯＩで、ノダウイルスに対して０．１、０．５、および１．０のＭＯＩで接種した。
ウイルスの増殖極性を図２（伝染性膵臓壊死症ウイルス）、図３（サケ膵疾患ウイルス）、および図４（ノダウイルス）に示す。
【００５２】
細胞工場における３つのウイルス（ＩＰＮ、ＳＰＤＶ、およびノダウイルス）のより大きなスケールでの作製もまた調査し、最適な収集時間におけるウイルス力価を記録した。細胞を、ＩＰＮに対して１のＭＯＩで、ＳＰＤＶに対して０．５のＭＯＩで、ノダウイルスに対して０．１のＭＯＩで感染させた。
ウイルスは、完全なＣＰＥの後に２５００×ｇでの懸濁液の遠心と後に続く上清の回収によって収集した。ウイルスの平均力価を以下の表２に示す。
【表２】
2019511208.tif 000003
【図１】
2019511208.tif 000004
【図２】
2019511208.tif 000005
【図３】
2019511208.tif 000006
【図４】
2019511208.tif 000007
【国際調査報告】
2019511208.tif 000008
2019511208.tif 000009