(57)【要約】  カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）脱分化幹細胞抽出物の製造方法であって、（ａ）カメリア・シネンシス脱分化幹細胞を含む細胞培養物を調製する工程と、（ｂ）抽出溶媒としてエタノールおよび／またはメタノールを用いて細胞培養物を抽出して、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を製造する工程と、を含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）脱分化幹細胞抽出物の製造方法であって、
（ａ）カメリア・シネンシス脱分化幹細胞を含む細胞培養物を調製する工程と、
（ｂ）抽出溶媒としてエタノールおよび／またはメタノールを用いて前記細胞培養物を抽出して、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を製造する工程と
を含む製造方法。
【請求項２】
前記細胞培養物が、カメリア・シネンシス植物カルス細胞を培養することによって製造される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記細胞培養培地が、ホルモンである２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項４】
前記細胞培養培地が５．６〜６．０のｐＨを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
没食子酸塩を実質的に含まないカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を含んだ組成物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を含む組成物。
【請求項７】
経口または局所用皮膚治療組成物である、請求項５または請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を少なくとも０．０１重量％含む、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｓｔｅｍ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）を少なくとも０．１重量％含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
乾燥および／またはＵＶ損傷から皮膚を保護するための、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物の使用。
【請求項１１】
炎症の危険性から皮膚を保護するための、カメリア・シネンシスの脱分化幹細胞抽出物の使用。
【請求項１２】
前記脱分化幹細胞抽出物が、細胞培養物からエタノールおよび／またはメタノールで抽出されている、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）脱分化幹細胞培養抽出物の製造方法、かかる抽出物を含んだ組成物、および、かかる抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、人々が健康な皮膚を好むことが望ましい。しかし、環境要因は皮膚／髪に損傷を引き起こし、皮膚／髪の健康を低下させ、ＵＶや乾燥などのストレスに対して弾力性を低下させる。
【０００３】
一般的に、消費者は、皮膚の外観または保護を改善するために、局所用組成物を皮膚に塗布し、特定の製品を消費することが好都合であることを見出している。
【０００４】
さらに、消費者は、特に組成物を消費する場合、一般に天然成分を好み、より合成的な組成物の使用には一般に気が進まない。
【０００５】
米国特許出願公開第２０１４／０１８６３１５号は、緑茶幹細胞抽出物を含む化粧品組成物を開示している。この組成物は、老化防止組成物であると述べられている。緑茶幹細胞は、細胞培養物中の全能性カルスを培養することによって作製される。活性成分は、細胞培養物から抽出されたと考えられる。ただし、抽出方法に関する詳細は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０１８６３１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、この領域におけるさらなる改善が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、カメリア・シネンシスの特定の細胞培養抽出物が皮膚の健康を改善するために使用できることを見出した。より具体的には、本発明者らは、カメリア・シネンシスの脱分化幹細胞培養抽出物が、皮膚細胞の環境的損傷に対して抵抗性をもたらすことを見出した。
【０００９】
したがって、第１の態様において、本発明は、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物の製造方法であって、
（ａ）脱分化したカメリア・シネンシス幹細胞を含む細胞培養物を調製する工程と、
（ｂ）抽出溶媒としてエタノールおよび／またはメタノールを用いて細胞培養物を抽出して、カメリア・シネンシス脱分化細胞培養抽出物を製造する工程と
を含む方製造法に関する。
【００１０】
脱分化幹細胞のそのような抽出物は、乾燥および紫外線によって引き起こされる細胞損傷に対する皮膚細胞の驚くべき保護を提供し、抗炎症効果を提供することが見出されている。
【００１１】
エタノールおよびメタノールは、フラバノン、ポリフェノールおよびテルペノイドのような、幹細胞抽出物内の特定の活性物質をより高い濃度で提供すると考えられている。他の溶媒は幹細胞抽出物の製造が著しく低いことが見出されている。
【００１２】
したがって、第２の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって得ることができるカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を含む組成物に関する。
【００１３】
このような脱分化幹細胞抽出物は、乾燥またはＵＶ照射に曝された場合に皮膚細胞に対して強力かつ明確な保護効果を有し、また炎症を減少させることがさらに見出されている。
【００１４】
したがって、第３の態様において、本発明は、皮膚を乾燥および／またはＵＶ損傷および／または炎症から保護するためのカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物の使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
茶は、カメリア／シネンシス変種シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）および／またはカメリア・シネンシス変種アッサミカ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．ａｓｓａｍｉｃａ）の科に属する１または複数の植物を指す。茶は世界で２番目に最も消費される飲み物である。これは、フラボノイドの単量体および重合体形態の豊富な供給源であり、フラボノイドを１０〜３０重量％まで含むことができる。
【００１６】
本発明において、抽出物は、脱分化茶幹細胞から調製される。脱分化茶幹細胞は、創傷への応答であるカルスから簡便に調製することができる。
【００１７】
植物カルスは、植物組織（外植片）に由来する組織化されていない柔細胞の塊である。植物生物学において、カルス細胞は、植物創傷を覆う細胞である。カルス形成は、表面滅菌およびインビトロ組織培養培地へのプレーティング後に植物組織から誘導される。オーキシン、サイトカイニン、およびジベレリンなどの植物成長調節因子を培地に補充して、カルス形成または体細胞胚発生を開始させる。
【００１８】
一般に、植物カルス細胞は、培養細胞を増殖させることによって得られる。植物カルス材料は、外植片から得られ、切断され、培養培地に移され得る。培養培地中に移したら、細胞は、十分な量が得られるまで、必要に応じて増殖させることができる。カルスを、寒天のような固体増殖培地上で増殖させ、次いで液体増殖培地に移して産生を増大させ、抽出によって活性成分を収穫することができる。
【００１９】
細胞培養方法は、当技術分野で公知の方法で行うことができる。
【００２０】
好ましくは、細胞培養培地は、ホルモンである２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含む。
【００２１】
好ましくは、細胞培養培地は、５．６〜６．０のｐＨを有する。
【００２２】
好ましくは、本発明の組成物は、０．０１重量％を超える濃度の幹細胞抽出物を含む。
【００２３】
本発明の組成物は、局所組成物である場合には化粧品として許容される基剤を含む。本発明による化粧品として許容される基剤は、クリーム、ローション、ゲルまたはエマルションである。化粧品として許容される基剤は、好ましくは、脂肪酸またはシリコーン化合物を含む。化粧品として許容される基剤が脂肪酸を含む場合、それは好ましくは組成物の１〜２５重量％で存在する。化粧品として許容される基剤が、クリーム、ローション、またはエマルションの形態の製品を有するようなものである場合、それは一般に脂肪酸を含む。これらの形態のうち、より好ましい形態はクリームまたはローションであり、さらに好ましくはクリームである。バニシングクリーム基剤は、３〜２５％、より好ましくは５〜２０％の脂肪酸を含むものであり、これは本発明の組成物の好ましい形態である。この場合、基剤は、好ましくは０．１〜１０％、より好ましくは０．１〜３％の石鹸を含む。Ｃ１２〜Ｃ２０脂肪酸は、バニシングクリーム基剤中で特に好ましく、さらにより好ましくはＣ１４〜Ｃ１８脂肪酸である。クリームにおいて、脂肪酸は、好ましくは、実質的にステアリン酸とパルミチン酸との混合物である。バニシングクリーム基剤中の石鹸としては、ナトリウム塩またはカリウム塩のような脂肪酸のアルカリ金属塩が挙げられる。石鹸は、好ましくは、脂肪酸混合物のカリウム塩である。バニシングクリーム基剤中の脂肪酸は、多くの場合、大部分は（一般に約９０〜９５％）、ステアリン酸とパルミチン酸との混合物（通常５５％のステアリン酸と４５％のパルミチン酸）であるヒストリック酸（ｈｙｓｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を用いて調製される。したがって、バニシングクリーム基剤を調製するためのヒストリック酸およびその石鹸の包含は、本発明の範囲内である。組成物が少なくとも６％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも１２％の脂肪酸を含むことが特に好ましい。化粧品として許容される基剤は、通常、組成物の１０〜９９．９重量％、好ましくは５０〜９９重量％である。別の好ましい基剤はローションである。ローションは、一般に１〜２０％の脂肪酸を含む。化粧品として許容される基剤は、好ましくは水を含む。水は、好ましくは組成物の３５〜９０重量％、より好ましくは５０〜８５重量％、さらに好ましくは５０〜８０重量％で含まれる。
【００２４】
特に好適な化粧品として許容される基剤は、シリコーン油を連続相として含む油中水型エマルションを含むものである。油中水型エマルションは、好ましくは架橋シリコーンエラストマーブレンドを含む。
【００２５】
油中水型エマルション中にシリコーンエラストマーブレンドを包含させることにより、本発明の組成物を調製するための化粧品として許容される基剤として使用することができる。シリコーン流体を用いることはできるが、架橋されたシリコーンエラストマーが特に好ましい。ジメチコンのような線状ポリマー間の架橋結合の生成は、線状ポリマーをシリコーンエラストマーに変換する。シリコーン流体ポリマーとは対照的に、エラストマーの物理的性質は、典型的には、分子量よりもむしろ架橋の数に依存する。膨潤するシリコーンエラストマーの能力は、それらを油相のための理想的な増粘剤にする。エラストマーは、皮膚または毛髪に塗布すると、非常に滑らかで柔らかい感触を有する。エラストマーは、化粧品組成物中の香料、ビタミンおよび他の添加剤の送達剤として使用することもできる。
【００２６】
市販されている、本発明の組成物に含めるのに適し、そして向上した安定性を提供することが見出されている適切なシリコーンエラストマーブレンドまたはゲルは以下のものである：Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＥＬ−８０５１  ＩＮ  シリコーン有機エラストマーブレンド［ＩＮＣＩ名：イソデシルネオペンタノエート（および）ジメチコン／ビスイソブチルＰＰＧ−２０  架橋ポリマー］；ＥＬ−８０５０［ＩＮＣＩ名：イソドデカン（および）ジメチコン／ビスイソブチルＰＰＧ  ２０架橋ポリマー］ＤＣ９０４０、ＤＣ９０４１、ＤＣ９０４５  （ジメチコン架橋ポリマー）；ＤＣ９５０６、９５０９（ジメチコンビニルジメチコン架橋ポリマー）；Ｓｈｉｎ−Ｅｔｓｕ  ＫＳＧ−１５、ＫＳＧ−１６、ＫＳＧ−１７（ジメチコンビニルジメチコン架橋ポリマー）。組成物は、組成物の５〜５０重量％のシリコーンエラストマーを含むことがさらに好ましい。
【００２７】
有用な日焼け防止剤、例えば、無機サンブロックを本発明に用いることが好ましいと思われる。これらには、例えば、酸化亜鉛、酸化鉄、ヒュームドシリカのようなシリカ、または二酸化チタンが含まれる。本発明による組成物に組み込まれる日焼け止めの総量は、組成物の０．１〜５重量％であることが好ましくい。
【００２８】
本発明の局所用組成物としては、皮膚美白剤をさらに挙げることができる。皮膚美白剤は、好ましくは、ビタミンＢ３化合物またはその誘導体、例えば、ナイアシン、ニコチン酸、ナイアシンアミド、または他の周知の皮膚美白剤、例えば、アロエ抽出物、乳酸アンモニウム、アゼライン酸、コウジ酸、クエン酸エステル、エラグ酸、グリコール酸、緑茶抽出物、ハイドロキノン、レモン抽出物、リノール酸、リン酸アスコルビルマグネシウム、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＡのようなビタミン類、ジカルボン酸、レゾルシノール誘導体、乳酸のようなヒドロキシカルボン酸およびそれらの塩、例えば、乳酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物から選択される。ビタミンＢ３化合物またはその誘導体、例えば、ナイアシン、ニコチン酸、ナイアシンアミドが本発明のより好ましい皮膚美白剤であり、最も好ましくはナイアシンアミドである。ナイアシンアミドは、使用する場合、好ましくは組成物の０．１〜１０重量％、より好ましくは０．２〜５重量％の範囲の量で存在する。
【００２９】
本発明による局所用組成物は、他の希釈剤を含むこともできる。希釈剤は、組成物中に存在する他の物質の分散剤または担体として作用し、組成物が皮膚に塗布されたときにそれらの分配を容易にする。水以外の希釈剤は、液体または固体の皮膚軟化剤、溶媒、湿潤剤、増粘剤および粉末を含み得る。
【００３０】
本発明の局所用組成物は、広範囲の他の任意選択の成分を含むことができる。ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、スキンケア産業において一般に使用される広範囲の非限定的な化粧品および医薬品成分を記載しており、これらは本発明の組成物への使用にも適している。例としては、酸化防止剤、結合剤、生物学的添加剤、緩衝剤、着色剤、増粘剤、ポリマー、収斂剤、芳香剤、湿潤剤、乳白剤、コンディショナー、皮膚剥脱剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、天然抽出物、精油、皮膚感覚剤（ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓａｔｅｓ）、皮膚鎮静剤（ｓｋｉｎ  ｓｏｏｔｈｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および皮膚治癒剤が挙げられる。
【００３１】
組成物が経口用組成物である場合、該組成物は、食品または飲料製品の形態をとり得る。一般に、このような経口製品は、飲料、バー、食事、またはサプリメントのような消費可能な製品の任意の適切な形態を取ることができる。
【００３２】
［実施例］
茶カルス細胞培養
・スリランカクローン２（カメリア・シネンシス・アッサミカ）の若葉を以下のように滅菌した。
【００３３】
○数滴のトウィーン２０を含む水に３０分間浸す
○流水下で１５分間洗う
○表面を過酸化水素で２分間滅菌する
○流水下で洗う
○７０％エタノール中で２分間表面を滅菌する
○流水下で洗う
○フローフードに移し、１０％の家庭用漂白剤で３０分間表面滅菌する
○蒸留水で洗う（フード内）
○葉を四角形（外植片）に切断し、ペトリ皿中の培地に移す
・固体培地組成：
○ＭＳ培地（塩類およびビタミン）
○３０ｇ／Ｌのスクロース
○０．８％の寒天
○ｐＨを０．２Ｍ  ＫＯＨで５．８に調整
○ホルモン０．２５ｍｇのＬ−１  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、０．２５ｍｇのＬ−１ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および１ｍｇのＬ−１  ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）。
【００３４】
・培地を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理して滅菌した。オートクレーブ処理した後、培地を６０℃に冷却し、その後９ｃｍのペトリ皿に注いだ（約１０ｍｌ／プレート）。寒天を４℃に冷却することによりセットした。
【００３５】
・５〜１０個の茶葉外植片を、植物成長キャビネット中で、１６時間の光および８時間の暗期のサイクルで、２５℃±２で各ペトリ皿中の固体培地で増殖させた
・外植片の創傷領域に発生するカルスの集塊を十分に増殖させた後、注意深く取り出し、固体培地の新鮮なペトリ皿上で継代培養した。
【００３６】
・カルス細胞の集塊を４週間ごとに新鮮な固体培地に継代培養した。継代培養はカルス培養物を新鮮な培地に移すだけである。これは、固体寒天ゲル培地が時間の経過とともに乾燥し（約３〜４週間）、増殖カルスを水和状態に保つ必要があるために必要である。
【００３７】
・１２週間後、カルスは、さらなる実験に十分な大きさ（直径約１〜２ｃｍ）となった。
【００３８】
・この段階でカルスを４８時間完全に凍結乾燥させ、必要になるまで−２０℃で保存した
茶カルス細胞抽出物の調製
・凍結乾燥カルス材料の２０％懸濁液を９６％エタノール中で調製した
・０．１ｇの凍結乾燥材料を０．９ｇの９６％エタノールと混合した。
【００３９】
注：これは、カルス材料の大部分が不溶性であり、懸濁状態のままであるので、１０／９０重量％カルス：エタノール溶液ではない。溶媒抽出後の不溶性物質の乾燥質量を秤量することにより、可溶性抽出物のおよその最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌであると計算した。したがって、細胞生存アッセイにおいて、１％＝０．１ｍｇ／ｍｌの可溶性抽出物である。
【００４０】
・懸濁液を１分間激しくボルテックス混合し、次いで超音波処理浴に入れ、０〜４℃で３０分間超音波処理した
・懸濁液を４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を保持した（幹細胞抽出物のストック溶液）
・幹細胞抽出物のストック溶液を、使用まで−２０℃で保存した
皮膚細胞乾燥保護アッセイ
・ヒト成人真皮線維芽細胞（カタログ番号Ｃ−０１３−５Ｃ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、低血清増殖補助剤（カタログ番号Ｓ−００３−１０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補添した０．５ｍｌのＭｅｄｉｕｍ  １０６（カタログ番号Ｍ−１０６−５００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む２４ウェルプレートにおいて、約９０％培養密度まで３７℃、５％ＣＯ２において培養した。
【００４１】
・幹細胞抽出物を、最終濃度が０．１％、０．５％または１％のいずれかの培地に加えた。
【００４２】
・１％エタノール（担体のみ）を含有する実験対照も調製した
・その後、細胞をさらに２４時間増殖させた
・ウェルから培地を完全に吸引し、室温で層流細胞培養フード中に１０分間放置することにより、細胞を乾燥させた。
【００４３】
・乾燥していない対照を各条件に含めた
・０．５ｍｌの新鮮培地を各ウェルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベートした
・１時間後、５０μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号ＤＡＬ１０２５）を各ウェルに添加した
・３７℃、５％ＣＯ２においてさらに４時間インキュベートした後、２００μｌの培地を各ウェルから取り出し、９６ウェルプレートに入れた。次いで、試料の蛍光強度を励起５５０ｎｍ／発光６１２ｎｍで読み取った。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅは、代謝的に活性な細胞における還元反応を介して、非蛍光色素（レサズリン）を高蛍光色素（レゾルフィン）に変換することにより、細胞生存度指標として働く。
【００４４】
皮膚細胞紫外線保護アッセイ
・ヒト成人真皮線維芽細胞（カタログ番号Ｃ−０１３−５Ｃ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１ｍＭのピルビン酸、２ｍＭのグルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清を補添加した１ｍｌのＤＭＥＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１０６３−０２９）を含む６ｃｍのペトリ皿において、約９０％集密まで３７℃、５％ＣＯ２において培養した。
【００４５】
・幹細胞抽出物を、最終濃度が０．１％、０．５％または１％のいずれかの培地に加えた。
【００４６】
・１％エタノール（担体のみ）を含有する実験対照も調製した
・その後、細胞をさらに２４時間増殖させた
・ペトリ皿から蓋を取り外し、細胞にＵｖａｃｕｂｅ４００紫外線チャンバー（Ｈｏｎｌｅ  ＵＶ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で３０分間照射した
・古い培地を取り除き、同じ種類の新鮮な培地を加えた。
【００４７】
・細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。
【００４８】
・１００μｌのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号ＤＡＬ１０２５）を、その後各ウェルに添加し、インキュベーションをさらに２４時間続けた。
【００４９】
・２００μｌの培地を各ウェルから取り出し、９６ウェルプレートに入れた。次いで、試料の蛍光強度を励起５５０ｎｍ／発光６１２ｎｍで読み取った。ＡｌａｍａｒＢｌｕｅは、代謝的に活性な細胞における還元反応を介して、非蛍光色素（レサズリン）を高蛍光色素（レゾルフィン）に変換することにより、細胞生存度指標として働く。
【００５０】
抗炎症アッセイ
・ヒト成人真皮線維芽細胞（カタログ番号Ｃ−０１３−５Ｃ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１％ウシ胎仔血清を補添した１ｍｌのＤＭＥＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０５６６０１６）を含む１２ウェルプレートにおいて、６０，０００細胞／ウェルの濃度まで３７℃、５％ＣＯ２において増殖させた。
【００５１】
・１ｍｌの培地を含む各ウェルに、最終濃度１％で茶カルス抽出物を添加した。同時に、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、カタログ番号Ｐ８１３９  Ｓｉｇｍａ）を最終濃度１００ｎｍで各ウェルに添加した。
【００５２】
・１％エタノール（担体のみ）および１００ｎｍのＰＭＡを含有する実験対照も調製した
・細胞を３７℃、５％ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした
・その後、細胞培養培地を除去し、１６，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。上清を回収し、必要になるまで−２０℃で保存した。
【００５３】
・細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１ウェルあたり１  ｍｌのＲＩＰＡ  Ｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号８９９０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を氷上で添加して３０分間溶解させた。
【００５４】
・細胞溶解物を回収し、１６，０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。溶解物上清を回収し、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全タンパク質含量についてアッセイした。
【００５５】
・細胞培地上清中のＩＬ−６含量を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｄ６０５０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。測定されたＩＬ−６濃度を正規化するために各ウェルの全タンパク質含量を使用した。これにより、各試料中のＩＬ−６レベルを直接比較することができた。
【００５６】
皮膚細胞乾燥アッセイ（茶抽出物）
表１：ヒト真皮線維芽細胞由来培地のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ蛍光測定値を、励起５５０ｎｍ／発光６１２ｎｍで読み取った。各条件について３回反復した（試料１〜３）。培地およびＡｌａｍａｒＢｌｕｅ単独の蛍光強度（バックグラウンド蛍光）を平均値から差し引いた。
【表１】
2019511227.tif 000002
2019511227.tif 000003
【００５７】
これらの結果は、茶幹細胞抽出物により処理した試料中の乾燥後の生存細胞数が、担体（エタノール）単独で処理した生存細胞数よりも多いことを示す。さらに、０．０１重量％を超えるレベルが、非常に重要な保護効果を提供することを示している。
【００５８】
カルスを生成しない茶葉由来の抽出物が生成される比較実施例も示している。これにはいくつかの保護効果があるが、カルス抽出物によってもたらされる保護効果ほど大きくはない。
【００５９】
異なる抽出溶媒を用いた皮膚細胞乾燥アッセイ（茶抽出物）
・粉砕し、凍結乾燥したカルス材料の２０％懸濁液を、以下の溶媒：エタノール、メタノール、クロロホルム、エーテル、アセトン、水中で調製した。
【００６０】
・懸濁液を１分間激しくボルテックス混合し、次いで超音波処理浴に入れ、４℃で３０分間超音波処理した
・懸濁液を４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を保持した
・上清を真空乾燥して溶媒を蒸発させた
・残留固体抽出物を１ｍｌのＤＭＳＯに溶解した（激しく１分間ボルテックス混合した）
・抽出物を、記載のように最終培地中１％の濃度で皮膚細胞乾燥アッセイに使用した
・１％ＤＭＳＯを含有する実験対照（担体のみ）も調製した
表２：ヒト真皮線維芽細胞由来培地のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ蛍光測定値を、励起５５０ｎｍ／発光６１２ｎｍで読み取った。各条件について３回反復した（試料１〜３）。培地およびＡｌａｍａｒＢｌｕｅ単独の蛍光強度（バックグラウンド蛍光）を平均値から差し引いた。
【表２】
2019511227.tif 000004
【００６１】
溶媒のエタノールおよびメタノールを用いて得られた細胞培養抽出物で処理した皮膚細胞は、他の溶媒で得られたものよりも著しく良好な結果をもたらすことが分かる。
【００６２】
皮膚細胞紫外線保護アッセイ（茶抽出物）
表３：ヒト真皮線維芽細胞由来培地のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ蛍光測定値を、励起５５０ｎｍ／発光６１２ｎｍで読み取った。各条件について３回反復した（試料１〜３）。培地およびＡｌａｍａｒＢｌｕｅ単独の蛍光強度（バックグラウンド蛍光）を平均値から差し引いた。
【表３】
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【００６３】
これらの結果は、茶カルス細胞抽出物により処理した試料中のＵＶ照射後の生存細胞数が、担体（エタノール）単独で処理した生存細胞数よりも多いことを示す。この効果は用量依存的であると思われる。
【００６４】
抗炎症アッセイ
表４：炎症経路アクチベーターＰＭＡと、１％茶カルス抽出物または１％エタノール（対照）のいずれかで処理したヒト成人真皮線維芽細胞によって産生されるインターロイキン−６の濃度（ＩＬ−６のｐｇ／全細胞タンパク質１μｇ）を示す。各処理について３回反復した（試料１〜３）。結果は、茶カルス抽出物が、抗炎症活性を示すＰＭＡ処理細胞で産生されるＩＬ−６の量を低下させることを示す。
【表４】
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【００６５】
茶カルス抽出物中の一般的なガレート型および非ガレート型カテキンの化学分析
試料：
・茶葉−２０１５年６月に収穫された葉
・茶カルス（旧）−２０１５年初めに培養された茶カルスの古いバッチ。
【００６６】
・茶カルス（新）−２０１５年末／２０１６年初めに培養された新しい茶カルスの新しいバッチ。
【００６７】
Ｘｅｖｏトリプル四重極質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ上のＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１００×２．１ｍｍ、１．７μｍ、Ｗａｔｅｒｓ）上に１０μｌのアリコートを注入した。移動相は、流速０．２ｍｌ／分およびカラム温度４０℃におけるメタノール（０．１％ｖ／ｖギ酸）／水（０．１％ｖ／ｖギ酸）勾配（１０分かけて１０：９０から６０：４０；１分かけて２：９８；２分保持；１分かけて１０：９０；１分間保持）からなる。データは、Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１ソフトウェアで提示された。各代謝産物の量は、ＭＲＭモードで特定の推移をモニタリングすることによって確立した（エピカテキン／カテキン：２８９＞２４５、エピガロカテキン：３０５＞１２５、没食子酸エピカテキン：４４１＞１６９、没食子酸エピガロカテキン：４５７＞１６９、没食子酸メチル：１８３．１＞１２４、没食子酸：１６９＞１２５）。
【００６８】
これは、茶葉試料がカルス試料よりも有意に多い没食子酸塩を有することを示す（例えば、ＥＧＣＧの場合には約１００倍）。
【００６９】
表５：様々な茶成分の測定レベル。このデータは、曲線下面積（ＡＵＣ）として相対的な用語で表される。
【表５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月17日(2018.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）脱分化幹細胞抽出物の製造方法であって、
（ａ）カメリア・シネンシス脱分化幹細胞を含む細胞培養物を調製する工程と、
（ｂ）抽出溶媒としてエタノールおよび／またはメタノールを用いて前記細胞培養物を抽出して、カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を製造する工程と
を含む製造方法。
【請求項２】
前記細胞培養物が、カメリア・シネンシス植物カルス細胞を培養することによって製造される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記細胞培養培地が、ホルモンである２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項４】
前記細胞培養培地が５．６〜６．０のｐＨを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるカメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を含む組成物。
【請求項６】
経口または局所用皮膚治療組成物である、請求項５または請求項６に記載の組成物。
【請求項７】
前記カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物を少なくとも０．０１重量％含む、請求項５から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記カメリア・シネンシス脱分化幹細胞抽出物（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  ｓｔｅｍ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ）を少なくとも０．１重量％含む、請求項８に記載の組成物。
【国際調査報告】
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