(57)【要約】ここに提供されるのは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、任意に配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントである。さらに、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列、該核酸を含むベクター、該ベクターを含む宿主細胞、およびヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントの使用も提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントであって、重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列（ＥＶＱＬＸＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＸＡＳＧＦＴＦＳＮＦＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＸＸＬＹＬＱＭＮＳＬＸＴＥＤＴＸＶＹＹＣＴＳＹＤＹＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）を含み、ここで配列番号１の位置ｉ（ｉ＝５、２３、４９、７９、８０、８９、９４）におけるＸは、ＸＨｉと称され、ＸＨ５、ＸＨ２３、ＸＨ４９、ＸＨ７９、ＸＨ８０、ＸＨ８９、ＸＨ９４のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＸＨ５が、ＶまたはＬであり、ＸＨ２３が、ＡまたはＳであり、ＸＨ４９が、Ｓ、ＡまたはＧであり、ＸＨ７９が、ＮまたはＳであり、ＸＨ８０が、ＴまたはＩであり、ＸＨ８９が、ＫまたはＲであり、ＸＨ９４が、ＡまたはＴである、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）ＸＨ５が、Ｖであり、ＸＨ２３が、Ａであり；および／または
（ｂ）ＸＨ４９が、ＳまたはＡであり；および／または
（ｃ）ＸＨ７９が、Ｎであり、ＸＨ８０が、Ｔであり、ＸＨ８９が、ＫまたはＲであり、ＸＨ９４が、Ａである、
ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＶＨが、配列番号３、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ＶＨが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５に記載のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含み、ここでＶＬは、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に記載のＣＤＲを含む、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ＶＬが、配列番号２のアミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＸＸＬＳＸＳＶＧＤＲＶＴＸＸＣＫＡＳＥＮＶＧＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＸＸＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＸＲＦＴＧＸＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＸＸＤＸＡＴＹＹＣＧＱＳＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）を含み、ここで配列番号２の位置ｊ（ｊ＝９、１０、１３、２１、２２、４２、４３、６０、６５、８０、８１、８３）におけるＸは、ＸＬｊと称され、ＸＬ９、ＸＬ１０、ＸＬ１３、ＸＬ２１、ＸＬ２２、ＸＬ４２、ＸＬ４３、ＸＬ６０、ＸＬ６５、ＸＬ８０、ＸＬ８１、ＸＬ８３のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る、請求項６に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＸＬ９が、Ｓ、ＰまたはＡであり、ＸＬ１０が、ＴまたはＳであり、ＸＬ１３が、Ａ、ＬまたはＶであり、ＸＬ２１が、ＬまたはＩであり、ＸＬ２２が、ＳまたはＴであり、ＸＬ４２が、ＫまたはＱであり、ＸＬ４３が、Ａ、ＴまたはＳであり、ＸＬ６０が、ＳまたはＡであり、ＸＬ６５が、ＳまたはＴであり、ＸＬ８０が、ＰまたはＳであり、ＸＬ８１が、ＥまたはＤであり、ＸＬ８３が、ＦまたはＩである、請求項７に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
請求項７に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
（ａ）ＸＬ９が、ＳまたはＡであり、ＸＬ１０が、ＴまたはＳであり、ＸＬ１３が、Ａであり、ＸＬ２１が、ＬまたはＩであり、ＸＬ２２が、ＳまたはＴであり；および／または
（ｂ）ＸＬ４２が、ＫまたはＱであり、ＸＬ４３が、ＡまたはＴであり；および／または（ｃ）ＸＬ６０が、Ｓであり、ＸＬ６５が、ＳまたはＴであり、ＸＬ８０が、Ｐであり、ＸＬ８１が、ＥまたはＤであり、ＸＬ８３が、Ｆである、
ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ＶＬが、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ＶＬが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８に記載のＦＲを含む、請求項６に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
抗原結合フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、および単鎖結合ポリペプチドから選択される抗体フラグメントである、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
重鎖ポリペプチドが、ヒトＩｇＧ重鎖の定常領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒトＩｇＧが、ヒトＩｇＧ２である、請求項１０に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
軽鎖ポリペプチドが、ヒトκ鎖の定常領域を含む、請求項６に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
約１×１０−１１Ｍ〜約５×１０−１０ＭのＫＤでベイシジンに結合する、請求項１に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
５×１０−１１Ｍ〜約１．１×１０−１０ＭのＫＤでベイシジンに結合する、請求項１６に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントと、ベイシジンとの結合に関して競合することができる、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列。
【請求項２０】
配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１７、配列番号１９、または配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の単離された核酸配列。
【請求項２１】
ヒトＩｇＧ重鎖またはヒトカッパ鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１９に記載の単離された核酸配列。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
（ａ）請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント、および（ｂ）医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２６】
対象におけるベイシジンに関連する疾患を治療する方法であって、対象に有効量の請求項２５に記載の組成物を投与することを含む、上記方法。
【請求項２７】
ベイシジンに関連する疾患が、がんまたはマラリアである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
がんが、肺がん、肝臓がん、子宮頸がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、食道がんまたは胃がんである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象が、ヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
対象においてベイシジンに関連する疾患を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本発明の開示は、一般的に、ヒト化抗ベイシジン（BASIGIN）抗体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ベイシジン（また、ＥＭＭＰＲＩＮ、ニューロテリン（Neurothelin）およびＭ６抗原としても公知）は、５０から６０ｋＤの分子量を有する高度にグリコシル化された膜貫通糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーである。ヒトにおいて、ベイシジンは、２６９個のアミノ酸を有し、これは細胞外、膜貫通および細胞内領域に分けることができ、Ｎ末端の翻訳開始ポイントから最初の２１残基がシグナルペプチドを構成し、残基２２〜２０５が細胞外ドメインを構成し、残基２０６〜２２９が典型的なロイシンジッパー構造を有する膜貫通領域を構成し、Ｃ末端の残基２３０〜２６９が細胞内ドメインを構成する。
【０００３】
[0003]ベイシジンは、肺がん、肝臓がん、子宮頸がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、食道がんまたは胃がんなどの多くのタイプのヒト固形腫瘍で過剰発現されることが示されている。以前の研究によれば、ベイシジン分子は、腫瘍進行において重要な機能性膜タンパク質であることが示されており、例えば以下に示すような様々ながん関連の現象に関与する。
【０００４】
[0004]ｉ．ベイシジンは、腫瘍細胞の接着および転移を媒介する。腫瘍細胞の表面上で発現されたベイシジンは、ビンキュリンと相互作用して、腫瘍細胞の偽足形成、蔓延および接着を促進し；アネキシンＩＩと相互作用して、腫瘍細胞においてＭＭＰ−２の分泌を促進し；周囲のマトリックスの分解を促進し、腫瘍細胞と腫瘍細胞周辺の線維芽細胞を刺激して様々な細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１１、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＴ２−ＭＭＰなどを分泌することにより、腫瘍転移を促進する。
【０００５】
[0005]ｉｉ．ベイシジンは、腫瘍細胞の嫌気性代謝に関与する。ベイシジンは、モノカルボン酸トランスポーターＭＣＴ−１およびＭＣＴ−４の重要な分子シャペロンである。ベイシジンは、ＭＣＴ−１およびＭＣＴ−４と相互作用して、細胞膜上でのそれらの正しい位置決めを助け、それらの乳酸代謝生成物の輸送を調節し続けることができる。腫瘍細胞は主として嫌気性代謝に頼ってエネルギーを生産するため、ベイシジンは、エネルギー代謝と腫瘍細胞の機能を、ＭＣＴの発現を介して間接的に調節する。
【０００６】
[0006]ｉｉｉ．ベイシジンは腫瘍細胞の薬物耐性を促進する。ベイシジンは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子の転写に影響を与え、共発現調節メカニズムによりＰ−ｇの発現を促進し、結果として腫瘍のＭＤＲを誘導する。Ｋａｎｅｋｕｒａらは、ベイシジンはＰ−ｇを介してＭＤＲを引き起こすことを証明したが、これは、ベイシジンは、ＭＤＲを阻害するための将来性のある有効な標的であり得ることを示す。加えて、ベイシジンは、ｐ−ＴＦＩＩ−Ｉの核局在化を促進し、折りたたみ不全タンパク質応答（ＵＰＲ）における主要因子であるＢｉｐの発現を上方調節し、腫瘍細胞で小胞体ストレスとＵＰＲを引き起こすことによって、アポトーシスを阻害し、結果として薬物に対する不感受性を生じさせる。ベイシジンの阻害は、肝細胞癌細胞のアポトーシスを促進し、既存の抗腫瘍薬物に対する腫瘍細胞の感受性を強化することができる。
【０００７】
[0007]ｉｖ．ベイシジンは、ＶＥＧＦ発現を上方調節して、腫瘍の血管新生を促進する。それゆえに、ベイシジン発現の阻害は、ＶＥＧＦの分泌を有意に阻害し、それによって腫瘍の血管新生を阻害することができる。
【０００８】
[0008]ｖ．ベイシジンは複数の分子と相互作用する。ベイシジンタンパク質の膜貫通領域は、その様々な細胞膜タンパク質との相互作用に関する構造的な基礎である高度に保存された負電荷を有するグルタミン酸を有し、さらに、ベイシジンは、様々なタンパク質との相互作用を介して、細胞の様々な生理学的活性に影響を与える得ることも示唆されている。ベイシジンは、ＣＤ９８、インテグリン、カベオリン−１、シクロフィリン（ＣｙＰ）および他のタンパク質と相互作用して、例えばエネルギー代謝、細胞−マトリックス相互作用、シグナル伝達などの細胞機能を調整することにより、腫瘍細胞の成長および転移に影響を与える。
【０００９】
[0009]加えて、数々の過去の研究から、腫瘍組織におけるベイシジンの発現レベルとがん患者の予後とが密接に相関していることが示された。非小細胞肺がん患者において、ベイシジン発現レベルと患者の予後は密接に関連している。
【００１０】
[0010]それゆえに、ベイシジンは、腫瘍療法の新しい標的になりつつあり、抗体薬物「リカルチン（Licartin）」の開発成功により、ベイシジン標的薬の安全性および有効性が証明された。
【００１１】
[0011]加えて、赤血球上で発現されたベイシジンと熱帯熱マラリア原虫のロプトリータンパク質ＰｆＲｈ５との、リガンド−受容体の方式での相互作用は、熱帯熱マラリア原虫の侵入における重要な要素である熱帯熱マラリア原虫による赤血球の遠位認識を媒介する。ＰｆＲｈ５と赤血球上のベイシジンとの相互作用は、様々なマラリア株でみられることから、赤血球上のベイシジンは、抗マラリア薬の重要な標的であることが期待されることが示唆される。化学療法薬に対する耐性を克服するために、赤血球上のヒトベイシジンに対する新しい抗マラリア薬は、従来の抗マラリア薬と組み合わせて使用される。
【発明の概要】
【００１２】
[0012]モノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）は、疾患の診断および処置において広く使用されてきた。しかしながら、ヒトの体にマウスＭｃＡｂを複数回注射することは、患者においてヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を引き起こす可能性があり、全身性アレルギー反応は、抗体の有効性をブロックする可能性がある。それゆえに、抗体薬物調査およびそれらの可能性のある利点を調査するための開発において、ヒト抗体およびヒト化抗体が研究される。
【００１３】
発明の簡潔な要約
[0013]本発明の開示は、高い結合親和性を有するヒト化抗ベイシジン抗体を提供し、その生物活性は、実験を介して検証される。
【００１４】
[0014]本発明の開示は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
[0015]一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列（ＥＶＱＬＸＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＸＡＳＧＦＴＦＳＮＦＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＸＸＬＹＬＱＭＮＳＬＸＴＥＤＴＸＶＹＹＣＴＳＹＤＹＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）を有し、配列番号１の位置ｉにおけるＸ（ｉ＝５、２３、４９、７９、８０、８９、９４）は、ＸＨｉと称され、ＸＨ５、ＸＨ２３、ＸＨ４９、ＸＨ７９、ＸＨ８０、ＸＨ８９、ＸＨ９４のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。
【００１５】
[0016]一部の実施態様において、ＸＨ５は、ＶまたはＬである。一部の実施態様において、ＸＨ２３は、ＡまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＨ４９は、Ｓ、ＡまたはＧである。一部の実施態様において、ＸＨ７９は、ＮまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＨ８０は、ＴまたはＩである。一部の実施態様において、ＸＨ８９は、ＫまたはＲである。一部の実施態様において、ＸＨ９４は、ＡまたはＴである。
【００１６】
[0017]一部の実施態様において、（ａ）ＸＨ５は、Ｖであり、ＸＨ２３は、Ａであり；および／または（ｂ）ＸＨ４９は、ＳまたはＡであり；および／または（ｃ）ＸＨ７９は、Ｎであり、ＸＨ８０は、Ｔであり、ＸＨ８９は、ＫまたはＲであり、ＸＨ９４は、Ａである。
【００１７】
[0018]一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号９〜１１に記載の３つの重鎖ＣＤＲを含む。
[0019]一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５に記載のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【００１８】
[0020]一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号３、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有する。
[0021]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む。
【００１９】
[0022]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２のアミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＸＸＬＳＸＳＶＧＤＲＶＴＸＸＣＫＡＳＥＮＶＧＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＸＸＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＸＲＦＴＧＸＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＸＸＤＸＡＴＹＹＣＧＱＳＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）を有し、ここで配列番号２の位置ｊにおけるＸ（ｊ＝９、１０、１３、２１、２２、４２、４３、６０、６５、８０、８１、８３）は、ＸＬｊと称され、ＸＬ９、ＸＬ１０、ＸＬ１３、ＸＬ２１、ＸＬ２２、ＸＬ４２、ＸＬ４３、ＸＬ６０、ＸＬ６５、ＸＬ８０、ＸＬ８１、ＸＬ８３のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。
【００２０】
[0023]一部の実施態様において、ＸＬ９は、Ｓ、ＰまたはＡである。一部の実施態様において、ＸＬ１０は、ＴまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＬ１３は、Ａ、ＬまたはＶである。一部の実施態様において、ＸＬ２１は、ＬまたはＩである。一部の実施態様において、ＸＬ２２は、ＳまたはＴである。一部の実施態様において、ＸＬ４２は、ＫまたはＱである。一部の実施態様において、ＸＬ４３は、Ａ、ＴまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＬ６０は、ＳまたはＡである。一部の実施態様において、ＸＬ６５は、ＳまたはＴである。一部の実施態様において、ＸＬ８０は、ＰまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＬ８１は、ＥまたはＤである。一部の実施態様において、ＸＬ８３は、ＦまたはＩである。
【００２１】
[0024]一部の実施態様において、（ａ）ＸＬ９は、ＳまたはＡであり、ＸＬ１０は、ＴまたはＳであり、ＸＬ１３は、Ａであり、ＸＬ２１は、ＬまたはＩであり、ＸＬ２２は、ＳまたはＴであり；（ｂ）ＸＬ４２は、ＫまたはＱであり、ＸＬ４３は、ＡまたはＴであり；および／または（ｃ）ＸＬ６０は、Ｓであり、ＸＬ６５は、ＳまたはＴであり、ＸＬ８０は、Ｐであり、ＸＬ８１は、ＥまたはＤであり、ＸＬ８３は、Ｆである。
【００２２】
[0025]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２２〜２４に記載の３つの軽鎖ＣＤＲを含む。
[0026]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８に記載のＦＲを含む。
【００２３】
[0027]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を有する。
[0028]一部の実施態様において、抗原結合フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、および単鎖結合ポリペプチドから選択される抗体フラグメントである。
【００２４】
[0029]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ重鎖の定常領域を含む。一部の実施態様において、ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ２である。一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトκ鎖の定常領域を含む。
【００２５】
[0030]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０−１１Ｍ〜約５×１０−１０Ｍまたは約５×１０−１１Ｍ〜約１．１×１０−１０ＭのＫＤでベイシジンに結合する。
【００２６】
[0031]一形態において、本発明の開示はまた、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列も提供する。
[0032]一部の実施態様において、単離された核酸配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１７、配列番号１９、または配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
[0033]別の形態において、本発明の開示はまた、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターも提供する。
【００２８】
[0034]別の形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
[0035]さらに別の形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントおよび医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２９】
[0036]別の形態において、本発明の開示は、対象におけるベイシジンに関連する状態を処置する方法であって、対象に有効量の本明細書で提供される組成物を投与することを含む、上記方法を提供する。
【００３０】
[0037]一部の実施態様において、ベイシジンに関連する状態は、がんまたはマラリアである。一部の実施態様において、がんは、肺がん、肝臓がん、子宮頸がん、結腸がん、乳がん、卵巣がん、食道がんまたは胃がんである。一部の実施態様において、対象は、ヒトである。
【００３１】
[0038]別の形態において、本発明の開示は、対象におけるベイシジンに関連する状態を処置するための医薬品の製造における、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】[0039]図１は、ヒト化抗ベイシジン抗体の重鎖ＦＲにおける特異的なアミノ酸部位のある特定の例示的なバリエーションを示す図解である。
【図２】[0040]図２は、ヒト化抗ベイシジン抗体の軽鎖ＦＲにおける特異的なアミノ酸部位のある特定の例示的なバリエーションを示す図解である。
【図３】[0041]図３は、ＥＬＩＳＡ分析によって測定した場合の、ヒトベイシジンに対する、マウス６Ｈ８（塗りつぶしのひし形）、キメラ６Ｈ８（塗りつぶしの逆三角形）、ヒト化ＨＰ６Ｈ８−１（黒丸）、ヒト化ＨＰ６Ｈ８−２（塗りつぶしの三角形）、ヒト化ＨＰ６Ｈ８−３（塗りつぶしの正方形）などの抗ベイシジン抗体の用量依存性の結合を示す。
【図４】[0042]図４は、抗ベイシジン抗体の軽鎖遺伝子の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３−ＬＣ−Ｎ−２２９−２０５の概略的な構造であり、軽鎖可変領域をコードする配列は、ｐｃＤＮＡ３．３プラスミドのＸｂａＩ部位とＢｓｉＷＩ部位との間に挿入され、それに続いてヒトカッパ鎖の定常領域をコードする配列が挿入される。
【図５】[0043]図５は、抗ベイシジン抗体の重鎖遺伝子の発現ベクターｐＯｐｔｉｖｅｃ−ＨＣ−Ｄ−２２９−２０５の概略的な構造であり、重鎖可変領域をコードする配列は、ｐＯｐｔｉｖｅｃプラスミドのＸｂａＩ部位とＮｈｅＩ部位との間に挿入され、それに続いてヒトＩｇＧ２重鎖の定常領域をコードする配列が挿入される。
【図６】[0044]図６は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株におけるＨＰ６Ｈ８−１抗体の発現の結果を示す。
【図７】[0045]図７は、結腸、肝臓および肺がんの悪性組織におけるＨＰ６Ｈ８−１の免疫組織化学的染色の結果を示す。
【図８】[0046]図８は、ヒト化抗体ＨＰ６Ｈ８−１による赤血球の熱帯熱マラリア原虫侵入のインビトロにおける阻害結果を提示し、ここで結果のデータは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として示される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
[0047]以下の本発明の開示の説明は、単に様々な本発明の開示の実施態様を例示することが意図されている。そのようなものとして、論じられた具体的な改変は、本発明の開示の範囲に対する限定として解釈されないものとする。当業者であれば、本発明の開示の範囲から逸脱することなく様々な均等物、変更、および改変が可能であることが明らかであると予想され、このような等価な実施態様が本明細書に包含されることが理解される。本明細書において引用された全ての参考文献、例えば公報、特許および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００３４】
ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント
[0048]一形態において、本発明の開示は、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００３５】
[0049]本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、あらゆる免疫グロブリン、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、または二重特異性（２価）抗体を包含する。天然のインタクトな抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された２つの重鎖（Ｈ）および２つの軽鎖（Ｌ）を含む。抗体の各重鎖は、可変領域（ＶＨ）および第１、第２および第３の定常領域（それぞれＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなり、一方で抗体の各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）からなる。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。両方の鎖における可変領域は、一般的に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の３つの領域にさらに分割される（ここで、軽（Ｌ）鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を包含し、重（Ｈ）鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を包含する）。本明細書で開示される抗体および抗原結合フラグメントのＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉの慣例によって定義または同定することができる（Al-Lazikani, B.、Chothia, C.、Lesk, A.M.、J. Mol. Biol.、273（4）、927（1997）；Chothia, C.ら、J Mol Biol. Dec 5；186（3）：651〜63（1985）；Chothia, C.およびLesk, A.M.、J. Mol. Biol.、196、901（1987）；Chothia, C.ら、Nature. 12月21〜28日；31（6252）：877〜83（1989）；Kabat E.A.ら、National Institutes of Health、Bethesda、Md.（1991））。一部の実施態様において、抗体のＣＤＲの境界は、Ｋａｂａｔデータベースに従って決定される。３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ、ここで重（Ｈ）鎖ＦＲは、ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４を包含し、軽（Ｌ）鎖ＦＲは、ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４を包含する）として公知のフランキングストレッチの間に挿入され、このような領域は、ＣＤＲより高度に保存され、高度可変ループを支持する足場を形成する。それゆえに、各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを以下の順番：（アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端に）：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で含む。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。
【００３６】
[0050]哺乳類の重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμとして分類され、哺乳類の軽鎖は、λまたはκとして分類される。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、それぞれα、δ、ε、γ、およびμ重鎖の存在によって特徴付けられる５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに割り振られる。数種の主要な抗体クラスのサブクラスは、例えばＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、またはＩｇＡ２（α２重鎖）などである。
【００３７】
[0051]一部が１つの種由来の重鎖および／または軽鎖の一部であり、その残部が異なる種由来の重鎖および／または軽鎖である抗体または抗原結合フラグメントは、キメラと称される。説明に役立つ例において、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域および非ヒト種、例えばマウス由来の可変領域を含んでいてもよい。
【００３８】
[0052]ヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト（例えば、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ヤギ、ウマ、またはニワトリ）抗体由来のＣＤＲ、ならびに全体的または実質的にヒト免疫グロブリン由来の可変領域ＦＲおよび定常領域（存在する場合）を含む抗体または抗原結合フラグメントを指す。
【００３９】
[0053]「実質的に」は、本明細書で使用される場合、２つの比較される項目（例えば、配列、数値）間の類似性の程度が高いことを指し、当業者は、２つの項目間に有意差があるとみなさないであろうし、および／または２つの比較される項目が、それらの特性（例えば、物理的特性、または生物活性）に関してほとんど差がないと予期するであろう。
【００４０】
[0054]一部の実施態様において、ヒト化抗体または抗原結合フラグメントの配列を変更して（例えば、置換して、挿入して、または欠失させて）、例えば結合親和性、安定性、免疫原性、薬物動態学的な半減期、ｐＨ感受性、コンジュゲーションに対する適合性などの１つまたはそれより多くの特性において抗体を改善することができる。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの非ヒトＣＤＲおよび／またはヒトＦＲにおける１つまたはそれより多くのアミノ酸残基を変更して、１つまたはそれより多くの上述した抗体の特性を改善しつつ、抗体の結合親和性を維持または改善し、ここで変更されたアミノ酸残基は、特異的な結合にとって重要であるか、またはヒト化抗体のベイシジンへの結合が有意に影響を受けないように変更が保存的変化であるかのいずれかである。
【００４１】
[0055]一部の実施態様において、非ヒト抗体由来のＣＤＲは、元となる非ヒトＣＤＲと同じアミノ酸配列を含んでいてもよいし、または３つ以下、２つ以下、または１つ以下のアミノ酸変更を含んでいてもよい。一部の実施態様において、変更は、保存的置換である。
【００４２】
[0056]「保存的置換」は、アミノ酸配列に関して、類似の生理化学的な特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基でアミノ酸残基を置き換えること、またはポリペプチドの活性にとって重要ではないアミノ酸の置換を指す。例えば、保存的置換は、非極性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＰｈｅおよびＴｒｐ）の間、非荷電性の極性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＧｌｎ）の間、酸性側鎖を有する残基（例えば、ＡｓｐおよびＧｌｕ）の間、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の間、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ、ＶａｌおよびＩｌｅ）の間、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、ＣｙｓおよびＭｅｔ）の間、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＨｉｓおよびＰｈｅ）の間でなすことができる。一部の実施態様において、置換、欠失または付加はまた、このような置換、欠失、または付加がタンパク質の立体配座構造において有意な変化を引き起こさず、そのためタンパク質の生物活性を保持できる限りは「保存的置換」とみなすこともできる。保存的置換として挿入または欠失されるアミノ酸の数は、約１から３個の範囲であってもよい。
【００４３】
[0057]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号９〜１１に記載のＣＤＲを含む。一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２２〜２４に記載のＣＤＲを含む。
【００４４】
[0058]一部の実施態様において、コンピューターソフトウェアを使用して、抗体または抗原結合フラグメントのヒトベイシジンへの結合を実質的にシミュレートすることができ、したがって、結合にとって重要ではない抗体／フラグメント（例えば、ＦＲ）上のアミノ酸部位を同定することができる。シミュレーションにおいて、このような部位に関して様々なアミノ酸を試験して、抗体または抗原結合フラグメントの結合性部分の構造／コンフォメーションを変化させないアミノ酸、または任意選択で、例えば結合または結合親和性、安定性、免疫原性、薬物動態学的な半減期、ｐＨ感受性、コンジュゲーションに対する適合性などの抗体または抗原結合フラグメントの１つまたはそれより多くの特性を改善するアミノ酸を同定することができる。このようなコンピューターソフトウェアの例としては、これらに限定されないが、ＳＹＢＹＬ、ディスカバリースタジオ（Discovery Studio）、ＭＯＥ、ＡＭＢＥＲ、ＧＲＯＭＡＣＳ、ＮＡＭＤ、ＣＯＮＣＯＯＲＤ、ＤｙｎＤｏｍ、Ａｕｔｏｄｏｃｋ、ＭＯＤＥＬＥＲ、ＭｏｌＭｏｌなどが挙げられる。
【００４５】
[0059]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントのＦＲ領域は、例えば、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、または１個以下のアミノ酸部位にいくつかのアミノ酸バリエーションを含んでいてもよい。一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントのＦＲ領域は、非ヒトＦＲに相同である。
【００４６】
[0060]本明細書で使用される場合、「相同体」および「相同な」は、同義的に使用され、最適に並べた場合、別の配列に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列または核酸配列（またはその相補鎖）を指す。
【００４７】
[0061]アミノ酸配列（または核酸配列）に関する「配列同一性」のパーセント（％）は、最大の一致を達成するために配列を並べ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基に同一な候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸（または核酸）配列同一性のパーセントを決定する目的のアライメントは、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公共的に利用可能なツールを使用することによって達成することができる。
【００４８】
[0062]一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列（ＥＶＱＬＸＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＸＡＳＧＦＴＦＳＮＦＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＸＸＬＹＬＱＭＮＳＬＸＴＥＤＴＸＶＹＹＣＴＳＹＤＹＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）を有し、ここで配列番号１の位置ｉにおけるＸ（ｉ＝５、２３、４９、７９、８０、８９、９４）は、ＸＨｉと称され、ＸＨ５、ＸＨ２３、ＸＨ４９、ＸＨ７９、ＸＨ８０、ＸＨ８９、ＸＨ９４のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号１のアミノ酸配列（ＥＶＱＬＸＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＸＡＳＧＦＴＦＳＮＦＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸＥＩＲＬＫＳＮＮＹＡＴＨＹＡＥＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＸＸＬＹＬＱＭＮＳＬＸＴＥＤＴＸＶＹＹＣＴＳＹＤＹＥＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ）からなり、ここで配列番号１の位置ｉにおけるＸ（ｉ＝５、２３、４９、７９、８０、８９、９４）は、ＸＨｉと称され、ＸＨ５、ＸＨ２３、ＸＨ４９、ＸＨ７９、ＸＨ８０、ＸＨ８９、ＸＨ９４のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。
【００４９】
[0063]一部の実施態様において、ＸＨ５は、ＶまたはＬである。一部の実施態様において、ＸＨ２３は、ＡまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＨ４９は、Ｓ、ＡまたはＧである。一部の実施態様において、ＸＨ７９は、ＮまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＨ８０は、ＴまたはＩである。一部の実施態様において、ＸＨ８９は、ＫまたはＲである。一部の実施態様において、ＸＨ９４は、ＡまたはＴである。
【００５０】
[0064]一部の実施態様において、（ａ）ＸＨ５は、Ｖであり、ＸｖＨ２３は、Ａであり；および／または（ｂ）ＸｖＨ４９は、ＳまたはＡであり；および／または（ｃ）ＸｖＨ７９は、Ｎであり、ＸＨ８０は、Ｔであり、ＸｖＨ８９は、ＫまたはＲであり、ＸｖＨ９４は、Ａである。
【００５１】
[0065]一部の実施態様において、ＸＨ５は、Ｖであり、ＸｖＨ２３は、Ａである。一部の実施態様において、ＸＨ４９は、ＳまたはＡである。一部の実施態様において、ＸＨ４９は、Ｓである。一部の実施態様において、ＸＨ４９は、Ａである。一部の実施態様において、ＸＨ７９は、Ｎであり、ＸＨ８０は、Ｔであり、ＸＨ８９は、Ｋであり、ＸＨ９４は、Ａである。一部の実施態様において、ＸＨ７９は、Ｎであり、ＸＨ８０は、Ｔであり、ＸＨ８９は、Ｒであり、ＸＨ９４は、Ａである。
【００５２】
[0066]一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号１２〜１５から選択される１つまたはそれより多くの重鎖ＦＲを含む。一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号３、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様において、ＶＨは、配列番号３、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列からなる。
【００５３】
[0067]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域ＶＬを含む。一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に記載のＣＤＲを含む。
【００５４】
[0068]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２のアミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＸＸＬＳＸＳＶＧＤＲＶＴＸＸＣＫＡＳＥＮＶＧＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＸＸＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＸＲＦＴＧＸＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＸＸＤＸＡＴＹＹＣＧＱＳＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）を有し、ここで配列番号４３の位置ｊにおけるＸ（ｊ＝９、１０、１３、２１、２２、４２、４３、６０、６５、８０、８１、８３）は、ＸＬｊと称され、ＸＬ９、ＸＬ１０、ＸＬ１３、ＸＬ２１、ＸＬ２２、ＸＬ４２、ＸＬ４３、ＸＬ６０、ＸＬ６５、ＸＬ８０、ＸＬ８１、ＸＬ８３のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２のアミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＸＸＬＳＸＳＶＧＤＲＶＴＸＸＣＫＡＳＥＮＶＧＴＹＶＳＷＹＱＱＫＰＧＸＸＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＲＹＴＧＶＰＸＲＦＴＧＸＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＸＸＤＸＡＴＹＹＣＧＱＳＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ）からなり、ここで配列番号４３の位置ｊにおけるＸ（ｊ＝９、１０、１３、２１、２２、４２、４３、６０、６５、８０、８１、８３）は、ＸＬｊと称され、ＸＬ９、ＸＬ１０、ＸＬ１３、ＸＬ２１、ＸＬ２２、ＸＬ４２、ＸＬ４３、ＸＬ６０、ＸＬ６５、ＸＬ８０、ＸＬ８１、ＸＬ８３のそれぞれは、任意のアミノ酸であり得る。
【００５５】
[0069]一部の実施態様において、ＸＬ９は、Ｓ、ＰまたはＡである。一部の実施態様において、ＸＬ１０は、ＴまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＬ１３は、Ａ、ＬまたはＶである。一部の実施態様において、ＸＬ２１は、ＬまたはＩである。一部の実施態様において、ＸＬ２２は、ＳまたはＴである。一部の実施態様において、ＸＬ４２は、ＫまたはＱである。一部の実施態様において、ＸＬ４３は、Ａ、ＴまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＬ６０は、ＳまたはＡである。一部の実施態様において、ＸＬ６５は、ＳまたはＴである。一部の実施態様において、ＸＬ８０は、ＰまたはＳである。一部の実施態様において、ＸＬ８１は、ＥまたはＤである。一部の実施態様において、ＸＬ８３は、ＦまたはＩである。
【００５６】
[0070]一部の実施態様において、（ａ）ＸＬ９は、ＳまたはＡであり、ＸＬ１０は、ＴまたはＳであり、ＸＬ１３は、Ａであり、ＸＬ２１は、ＬまたはＩであり、ＸＬ２２は、ＳまたはＴであり；（ｂ）ＸＬ４２は、ＫまたはＱであり、ＸＬ４３は、ＡまたはＴであり；および／または（ｃ）ＸＬ６０は、Ｓであり、ＸＬ６５は、ＳまたはＴであり、ＸＬ８０は、Ｐであり、ＸＬ８１は、ＥまたはＤであり、ＸＬ８３は、Ｆである。
【００５７】
[0071]一部の実施態様において、ＸＬ９は、Ｓであり、ＸＬ１０は、Ｔであり、ＸＬ１３は、Ａであり、ＸＬ２１は、Ｌであり、ＸＬ２２は、Ｓである。一部の実施態様において、ＸＬ９は、Ａであり、ＸＬ１０は、Ｓであり、ＸｖＬ１３は、Ａであり、ＸＬ２１は、Ｉであり、ＸＬ２２は、Ｓである。一部の実施態様において、ＸＬ９は、Ｓであり、ＸＬ１０は、Ｓであり、ＸＬ１３は、Ａであり、ＸＬ２１は、Ｌであり、ＸＬ２２は、Ｔである。
【００５８】
[0072]一部の実施態様において、ＸＬ４２は、Ｋであり、ＸＬ４３は、Ａである。一部の実施態様において、ＸＬ４２は、Ｑであり、ＸＬ４３は、Ｔである。一部の実施態様において、ＸＬ４２は、Ｑであり、ＸＬ４３は、Ａである。
【００５９】
[0073]一部の実施態様において、ＸＬ６０は、Ｓであり、ＸＬ６５は、Ｓであり、ＸＬ８０は、Ｐであり、ＸＬ８１は、Ｅであり、ＸＬ８３は、Ｆである。一部の実施態様において、ＸＬ６０は、Ｓであり、ＸＬ６５は、Ｓであり、ＸＬ８０は、Ｐであり、ＸＬ８１は、Ｄであり、ＸＬ８３は、Ｆである。
【００６０】
[0074]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号２５〜２８から選択される１つまたはそれより多くのＦＲを含む。
[0075]一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。一部の実施態様において、ＶＬは、配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列からなる。
【００６１】
[0076]一部の実施態様において、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ重鎖の定常領域を含む重鎖を含む。一部の実施態様において、重鎖は、ヒトＩｇＧ重鎖の定常領域を含む。一部の実施態様において、ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一部の実施態様において、ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ２である。一部の実施態様において、ヒト化抗体またはそのフラグメントは、ヒトλまたはκ鎖の定常領域を含む軽鎖を含む。一部の実施態様において、軽鎖は、ヒトκ鎖の定常領域を含む。
【００６２】
[0077]一部の実施態様において、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体は、配列番号９〜１１に記載の３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号１２〜１５に記載のＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４の重鎖フレームワーク配列、配列番号２２〜２４に記載の軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号２５〜２８に記載のＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４の軽鎖フレームワーク配列を含み、ここで重鎖可変領域の配列は、式：ＨＦＲ１−ＨＣＤＲ１−ＨＦＲ２−ＨＣＤＲ２−ＨＦＲ３−ＨＣＤＲ３−ＨＦＲ４に従っており、軽鎖可変領域の配列は、式：ＬＦＲ１−ＬＣＤＲ１−ＬＦＲ２−ＬＣＤＲ２−ＬＦＲ３−ＬＣＤＲ３−ＬＦＲ４に従っている。
【００６３】
[0078]ヒト化抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト用の治療剤として有用である。一部の実施態様において、これはなぜなら、非ヒト種抗体と比較して、低い免疫原性を有するかまたはヒトにおいて免疫応答を誘発する可能性が低いためである。一部の実施態様において、非ヒト動物は、哺乳動物であり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ハムスター、または非ヒト霊長類（例えば、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）もしくは類人猿（例えば、チンパンジー、ゴリラ、サルまたは真猿亜目（affen））である。
【００６４】
[0079]用語「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、本明細書で使用される場合、２つの分子間の、例えば抗体と抗原との間の無作為ではない結合反応を指す。結合親和性は、ＫＤ値によって表すことができ、ＫＤ値は、抗原と抗体との結合が平衡に達したときの、会合速度（ｋｏｎ）に対する解離速度（ｋｏｆｆ）の比率、すなわち、ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。ＫＤ値は、当業界において公知の好適な方法、例えば、ビアコア（Biacore）などの機器を使用したプラズモン共鳴結合（ＳＰＲ）アッセイなどを使用して適切に決定することができる（例えば、Murphy, M.ら、Current protocols in protein science、第19章、ユニット19.14、2006年を参照）。
【００６５】
[0080]一部の実施態様において、本明細書で提供される抗ベイシジン抗体およびその抗原結合フラグメントは、プラズモン共鳴結合アッセイによって測定した場合、約１０−７Ｍまたはそれ未満（例えば、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）でのヒトベイシジンへの特異的な結合が可能である。一部の実施態様において、本明細書で提供される抗体または抗原結合フラグメントは、約１×１０−１１Ｍから約１×１０−７Ｍ、約１×１０−１１Ｍから約１×１０−８Ｍ、１×１０−１１Ｍから約５×１０−９Ｍ、約１×１０−１１Ｍから約１×１０−９Ｍ、１×１０−１１Ｍから約１×１０−９Ｍ、約５×１０−１１Ｍから約５×１０−１０Ｍまたは約５×１０−１１Ｍから約１．１×１０−１１Ｍの結合親和性（ＫＤ）でヒトおよび／または非ヒトベイシジンに特異的に結合する。一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、約１×１０−１１Ｍ〜約５×１０−１０Ｍ、または約５×１０−１１Ｍ〜約１．１×１０−１０ＭのＫＤでベイシジンに結合する。
【００６６】
[0081]一部の実施態様において、抗ベイシジン抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒトベイシジンに特異的に結合するが、マウスベイシジンに特異的に結合せず、例えばマウスベイシジンの結合親和性は、ヒトベイシジンの結合親和性の、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満である。
【００６７】
[0082]用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれより多くのＣＤＲを含む抗体のフラグメント、または抗原に結合するがインタクトな天然の抗体構造を含まない他のあらゆる抗体部分から形成された抗体フラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二重特異性ｄｓ−ダイアボディ（二重特異性ｄｓ−ｄＡｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体、単鎖結合ポリペプチド、単離されたＣＤＲおよび多重特異性抗体が挙げられる。抗原結合フラグメントは、親抗体が結合する抗原と同じ抗原に結合することが可能である。
【００６８】
[0083]「Ｆａｂ」は、ジスルフィド結合により単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域に結合した単一の軽鎖（可変および定常領域の両方）からなる抗体の１価抗原結合フラグメントを指す。
【００６９】
[0084]「Ｆａｂ’」は、ヒンジ領域の一部をさらに包含するＦａｂフラグメントに対応する１価抗原結合フラグメントを指す。
[0085]「Ｆ（ａｂ’）２」は、ジスルフィド結合により一緒に結合した２つのＦａｂ’フラグメントの二量体を指す。
【００７０】
[0086]「Ｆｖ」は、単一の重鎖の可変領域に結合した単一の軽鎖の可変領域からなる。
[0087]「ｄｓＦｖ」は、単一の軽鎖の可変領域と単一の重鎖の可変領域との間の連結がジスルフィド結合である、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントを指す。一部の実施態様において、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖、すなわち、ペプチドリンカーにより連結され、ジスルフィド架橋により２つのＶＬ部分に結合した２つのＶＨ部分を含む。一部の実施態様において、ｄｓＦｖは、二重特異性であり、重鎖と軽鎖とを対合させた各ジスルフィドは、異なる抗原特異性を有する。
【００７１】
[0088]「ダイアボディ」または「ｄＡｂ」は、２つの抗原結合部位を有する小さいフラグメントを指し、このフラグメントは、単一の鎖上の２つのドメイン間で対合するには短すぎるリンカーを使用することによって、単一のポリペプチド鎖中のＶＬドメインに接続されたＶＨドメイン（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）（例えば、Holliger P.ら、Proc Natl Acad Sci USA.；90（14）：6444〜8（1993）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照）を含み、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させられて、２つの抗原結合部位を作り出す。
【００７２】
[0089]一部の実施態様において、「二重特異性ｄｓダイアボディ」は、ＶＨ１とＶＬ１とのジスルフィド架橋を介してＶＬ１−ＶＨ２（これもペプチドリンカーにより連結されている）に結合したＶＨ１−ＶＬ２（ペプチドリンカーにより連結されている）を含む。
【００７３】
[0090]「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」または「単鎖抗体」は、抗体の単一のＶＨドメインおよび単一のＶＬドメインを含む操作された抗体フラグメントを指し、これらのドメインは、互いに直接的に、またはペプチドリンカー配列を介して接続されて、単一のポリペプチド鎖を形成する（Huston JS ら、Proc Natl Acad Sci USA、85：5879 （1988））。
【００７４】
[0091]「ｓｃＦｖ二量体」は、２つのｓｃＦｖの二量体を指す。
[0092]「単鎖結合ポリペプチド」は、抗原またはエピトープに結合することが可能なあらゆる単鎖ポリペプチドを指す。
【００７５】
[0093]用語「抗原」は、本明細書で使用される場合、抗体または抗原結合フラグメントと結合することが可能であり、加えて、その抗原に結合することが可能な抗体を生産させるために動物で使用することが可能な分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたはそれより多くのエピトープを有していてもよい。用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、原子の特定の基（例えば、糖側鎖、ホスホリル基、スルホニル基）、または抗体または抗原結合フラグメントと相互作用することが可能な抗原上のアミノ酸を指す。
【００７６】
[0094]一部の実施態様において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、および単鎖結合ポリペプチドから選択される抗体フラグメントである。
【００７７】
[0095]一部の実施態様において、本発明の開示は、例示的なマウスモノクローナル抗体ＨＡｂ１８ＧＣ２（６Ｈ８とも称される）、そのキメラ抗体（すなわち、ｃ６Ｈ８）、およびヒト化抗体ＨＰ６Ｈ８−１、ＨＰ６Ｈ８−２、ＨＰ６Ｈ８−３を提供する。
【００７８】
[0096]マウスモノクローナル抗体ＨＡｂ１８ＧＣ２は、配列番号３１の重鎖可変領域、配列番号２９の軽鎖可変領域を有する。キメラ抗体ｃ６Ｈ８は、上述したマウス可変領域に融合したＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域を含む。
【００７９】
[0097]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体は、ＨＰ６Ｈ８−１、ＨＰ６Ｈ８−２およびＨＰ６Ｈ８−３からなる群から選択され、これらは、配列番号３、５および７それぞれの重鎖可変領域（コード化ＤＮＡ配列である配列番号４、６および８それぞれに対応する）、ならびに配列番号１６、１８および２０それぞれの軽鎖可変領域（コード化ＤＮＡ配列である配列番号１７、１９および２１それぞれに対応する）を有する。
【００８０】
[0098]ヒト化抗体または抗原結合フラグメントを生産する方法
[0099]一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントは、組換え方法を使用して調製される。ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する組換えプロセスは、以下を含む：
[00100]  １）ヒトベイシジンタンパク質またはｈベイシジン生産細胞で好適な非ヒト動物を免疫化すること。動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、またはモルモットであってもよい。非ヒト動物からの脾臓またはリンパ節を使用して抗体を生産するハイブリドーマを生成するか、または免疫化された非ヒト動物のＢ細胞を集め、非ヒトモノクローナル抗ベイシジン抗体の力価を測定する。従来の手順を使用することによって（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離およびシーケンシングする。
【００８１】
[00101]  ２）生成したハイブリドーマまたは集められたＢ細胞クローンから、好適な力価を有する非ヒトモノクローナル抗ベイシジン抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングすること。そのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの配列を分析して、非ヒトモノクローナル抗体のＣＤＲの境界を同定する。
【００８２】
[00102]  ３）可変領域フレームワークおよび定常領域が存在する場合、それらが全体的にまたは実質的にヒト免疫グロブリン配列からのものになるように、非ヒト由来抗体のＣＤＲ遺伝子をヒト免疫グロブリン遺伝子にグラフト化することにより、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントの組換え遺伝子を得ること。
【００８３】
[00103]  ４）任意選択で（Optionally）、好適なベクターに組換え遺伝子を取り入れ、宿主細胞にベクターまたは組換え遺伝子を導入して、本明細書で提供されるヒト化抗体またはその抗原フラグメントを生産すること。
【００８４】
[00104]本明細書で提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、宿主細胞を培養すること、続いて宿主細胞または培養液（例えば、上清）を分離および精製することによって実質的に純粋で均一な形態で得ることができる。抗体またはその抗原結合フラグメントの分離および精製には、あらゆる従来のポリペプチド精製方法を採用することができる。
【００８５】
[00105]単離された核酸配列
[00106]一形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列を提供する。
【００８６】
[00107]「単離された」物質は、人工的にその天然状態から変更された物質であり、例えば、その元の環境から取り出された天然に存在する物質を、単離された物質と称することができる。「単離された」核酸は、実質的に他の核酸分子を含まず、天然状態で核酸に付随する天然に存在する要素を伴っていない核酸分子である。「単離された核酸配列」は、単離された核酸分子の配列を指す。
【００８７】
[00108]一部の実施態様において、単離された核酸配列は、本発明の開示で提供されるＣＤＲ配列をコードする１つまたはそれより多くのヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、単離された核酸配列は、配列番号４、配列番号６または配列番号８、またはそれらの相同配列のヌクレオチド配列を含む。一部の実施態様において、単離された核酸配列は、配列番号１７、配列番号１９または配列番号２１、またはそれらの相同配列のヌクレオチド配列を含む。
【００８８】
[00109]「相同体」および「相同な」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、別の配列に対して、最適に並べた場合、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する核酸配列（またはその相補鎖）またはアミノ酸配列を指す。
【００８９】
[00110]核酸配列（またはアミノ酸配列）に関するパーセント（％）「配列同一性」は、最大の一致を達成するために配列を並べ、必要に応じてギャップを導入した後の、参照配列中の核酸（またはアミノ酸）残基に同一な候補配列中の核酸（またはアミノ酸）残基のパーセンテージと定義される。核酸（またはアミノ酸）配列同一性のパーセントを決定する目的のアライメントは、例えば、公共的に入手可能なツール、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（米国の立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能であり、さらにAltschul S.F.ら、J. Mol. Biol.、215：403〜410（1990）；Stephen F.ら、Nucleic Acids Res.、25：3389〜3402（1997）も参照）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイトで入手可能であり、さらにHiggins D.G.ら、Methods in Enzymology、266：383〜402（1996）；Larkin M.A.ら、Bioinformatics（オックスフォード、英国）、23（21）：2947〜8（2007）も参照）、およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメーターを使用してもよいし、またはアライメントのために必要に応じて、例えば好適なアルゴリズムを選択することによってパラメーターをカスタマイズしてもよい。
【００９０】
[00111]ベクター
[00112]別の形態において、本発明の開示はまた、ヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸配列を含むベクターも提供する。
【００９１】
[00113]用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、細胞を形質転換またはトランスフェクトし、細胞中で遺伝子発現を可能にする核酸の運搬手段を指す。ベクターは、発現ベクターまたはクローニングベクターであり得る。本発明の開示は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする本明細書で提供される核酸配列、核酸配列に作動可能に連結した少なくとも１つのプロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）、および少なくとも１つの選択マーカーを含有するベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。本発明の開示の発現ベクターは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージおよびコスミドであり得る。例としては、これらに限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスなど）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）、ラムダファージ、およびＭ１３ファージ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．３、ｐＯｐｔｉｖｅｃ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＩＲＥＳ、ｐＱＤ−Ｈｙｇ−ＧＳｅｕ、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ１０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２、ｐＣＭＶ−ＳＣＲＩＰＴ（登録商標）、ｐＣＤＭ８、ｐＣＤＮＡ１．１／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ＰＣＲ２．１、ｐＥＦ−１、ｐＦＢ、ｐＳＧ５、ｐＸＴ１、ｐＣＤＥＦ３、ｐＳＶＳＰＯＲＴ、ｐＥＦ−Ｂｏｓなどが挙げられる。
【００９２】
[00114]宿主細胞
[00115]別の形態において、本発明の開示は、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００９３】
[00116]「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれより多くの外因性タンパク質を発現させるために外因性核酸および／またはベクターが導入された細胞を指す。用語「宿主細胞」は、特定の対象の細胞とその後代の両方を指すことを目的とする。宿主細胞は、原核生物、真核生物、植物細胞、動物細胞またはハイブリドーマであり得る。タンパク質および遺伝子生成物の翻訳後プロセシングおよび改変に関して、異なる宿主細胞は、異なる特徴およびメカニズムを有する可能性があるため、発現されたヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントが確実に正しく改変およびプロセシング（例えば一次転写、グリコシル化、およびリン酸化）されるように、宿主細胞として好適な細胞株を選ぶことができる。一部の実施態様において、宿主細胞は、哺乳類細胞である。
【００９４】
[00117]有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（例えば、ＣＯＳ−７）で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（例えば、懸濁培養中での増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＨＯ／−ＧＳ、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：116（1980））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather、Biol. Reprod. 23：243〜251（1980））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４１）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci. 383：44〜68（1982））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ＰＣ１２；マウス胚線維芽細胞株（３Ｔ３）；ＮＳＯ骨髄腫細胞（機能的な免疫グロブリン鎖を内因的にまったく生産しないマウス骨髄腫細胞株）である。一部の実施態様において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００９５】
[00118]上述されたベクターまたは組換え遺伝子で形質転換した宿主細胞は、従来の栄養培地、またはプロモーターを誘導する、形質転換株を選択する、もしくは望ましい配列をコードする遺伝子を増幅する必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養することができる。一部の実施態様において、宿主細胞は、抗体の異なるフラグメントをコードする第２のポリヌクレオチドと共に形質転換されてもよい。一部の実施態様において、宿主細胞は、外因性核酸を含有していてもよいが、調節物質が細胞に導入されたり、または外因性核酸が核酸と作動可能に連結するように調節配列が細胞に導入されたりしない限り、その外因性核酸によってコードされたタンパク質を望ましいレベルで発現しない。一部の実施態様において、形質転換したベクターを含有する宿主細胞は、抗ベイシジン抗体を一時的に発現することができる。
【００９６】
[00119]医薬組成物
[00120]一形態において、本発明の開示は、本明細書で提供される１つまたはそれより多くのヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【００９７】
[00121]本明細書で提供される医薬組成物は、これらに限定されないが、液状溶液、懸濁液、乳剤、丸剤、カプセル、錠剤、持続放出製剤または粉末などの当業界において公知のあらゆる従来の形態であってもよい。一部の実施態様において、医薬組成物は、注射用組成物に製剤化される。注射用組成物の例としては、すぐ注射可能な滅菌溶液；すぐ注射可能な滅菌懸濁液；すぐ注射可能な滅菌乳剤；滅菌乾燥させた可溶性製品、例えば使用直前に溶媒にすぐに再溶解可能な凍結乾燥粉末などが挙げられる。凍結乾燥粉末は、適切な条件下で、例えば約４℃から室温で貯蔵することができる。再溶解させるのに有用な溶液は、水性または非水性のいずれでもよい。一部の実施態様において、単位用量の注射用組成物は、アンプル、バイアルまたは針を有するシリンジ中に予めパッケージ化される。一部の実施態様において、複数用量の注射用組成物は、アンプルまたはバイアル中に予めパッケージ化される。
【００９８】
[00122]一部の実施態様において、医薬組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む。
[00123]用語「医薬的に許容される」は、本明細書で使用される場合、指定された担体が、一般的に、医薬組成物中に含まれる他の成分と化学的および／または物理的に適合性を有し、確実な医療的判断の範囲内であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなくレシピエント対象（例えば、ヒトおよび動物）におけるインビボでの使用に好適であり、適度なベネフィット／リスク比に見合っていることを意味する。
【００９９】
[00124]「医薬的に許容される担体」としては、例えば、医薬的に許容される水性、非水性または固体ビヒクル、抗微生物剤、等張剤、緩衝液、ｐＨ調節剤、懸濁／分散剤、封鎖剤またはキレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または非毒性の補助剤、貯蔵と対象への活性成分の投与を容易にすることができる当業界で公知の他の要素、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。本発明の開示で採用することができる医薬的に許容される担体としては、一般的に当業界で公知の担体、例えば、参照により本明細書に組み入れられる「Remington Pharmaceutical Sciences」Mack Pub. Co.、ニュージャージー州（1991）に記載される担体が挙げられる。
【０１００】
[00125]さらなる例示のために、医薬的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、塩化ナトリウム、デキストロース、ラクトース、フルクトース、グルコース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコール、クロロ−ブタノール、グリセロール、プロリン、ヒスチジン、アルギニン、塩酸、酢酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、アスコルビン酸、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸、クエン酸塩、リン酸塩、ソルビン酸塩（sorbitate）、リン酸スクロース、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、エタノール酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシケイ皮酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、シクロデキストリン、ＴＷＥＥＮ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、コーンシロップ、グリセリン、硫酸水素ナトリウム、塩酸プロカイン、ポロキサム（Poloxam）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたは他の好適な物質が挙げられる。
【０１０１】
[00126]一部の実施態様において、医薬組成物は、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメント、および１つまたはそれより多くの他の治療剤を含む。一部の実施態様において、他の治療剤は、放射線療法、化学療法、標的療法、遺伝子治療、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、緩和ケア、外科手術、抗マラリア薬またはそれらの組合せで使用される薬剤である。
【０１０２】
[00127]キット
[00128]本発明の開示は、本明細書で提供される抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。一部の実施態様において、キットは、生体サンプル中でベイシジンの存在またはレベルを検出するのに有用である。生体サンプルは、細胞または組織であり得る。
【０１０３】
[00129]一部の実施態様において、キットに含有される抗ベイシジン抗体またはそれらの抗原結合フラグメントは、検出可能な標識（例えば、蛍光、放射性または酵素標識）とコンジュゲートされている。いくつかの他の実施態様において、キットは、非標識の抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、非標識の抗ベイシジン抗体に結合することが可能な標識された二次抗体をさらに含む。キットはさらに、標識を検出する手段を包含していてもよい。キットは、特定の方法を実行するために使用される追加の試薬および緩衝液を含んでいてもよい。キットは、使用説明書、およびキット中の構成要素のそれぞれを分離するパッケージをさらに含んでいてもよい。一部の実施態様において、キットは、ベイシジン抗体を検出するためのイムノアッセイを含む。
【０１０４】
[00130]一部の実施態様において、キットは、ベイシジンタンパク質レベルを検出するために提供される。一部の実施態様において、キットは、ベイシジンに関連する状態を予測する、診断する、予防する、または処置するために使用される。
【０１０５】
[00131]処置方法（治療方法：Method of Treatment）
[00132]一形態において、本発明の開示は、対象におけるベイシジンに関連する状態を処置する方法であって、対象に、有効量の本明細書で提供される医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０６】
[00133]別の形態において、本発明の開示は、対象におけるベイシジンに関連する状態を処置するための医薬品の製造における、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【０１０７】
[00134]別の形態において、本発明の開示は、対象におけるベイシジンに関連する状態を処置するのに有用な、本発明の開示のヒト化抗ベイシジン抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１０８】
[00135]用語「対象」は、本明細書で使用される場合、動物を指す。動物は、典型的には哺乳動物であり、特定の例としては、霊長類（例えば、ヒト）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジが挙げられる。一部の実施態様において、対象は、ヒトである。
【０１０９】
[00136]「ベイシジンに関連する状態」は、本明細書で使用される場合、ベイシジン（例えば、ヒトベイシジン）の発現または活性の増加または減少によって引き起こされる、それによって悪化する、またはそれ以外の方式でそれに関連するあらゆる状態を指す。一部の実施態様において、ベイシジンに関連する状態は、がん、炎症性疾患または感染症である。
【０１１０】
[00137]「がん」は、本明細書で使用される場合、悪性細胞の増殖または新生物、異常な増殖、侵入または転移を特徴とするあらゆる病状を指し、固形腫瘍および非固形がん（血液系腫瘍）の両方を含み、例えば白血病を含む。「固形腫瘍」は、本明細書で使用される場合、新生物および／または悪性細胞の固体質量を指す。がんの例としては、これらに限定されないが、非小細胞肺がん（扁平上皮／非扁平上皮）、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、結腸がん、卵巣がん、乳がん（基底乳癌、腺管癌および乳房の小葉癌など）、膵臓がん、胃癌、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、膠芽腫、子宮頸がん、胸腺癌、黒色腫、骨髄腫、菌状息肉腫（mycoses fungoids）、メルケル細胞がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ性悪性腫瘍、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、クロム親和性細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、精上皮腫、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性（顆粒球）白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、真性多血症、肥満細胞由来の腫瘍、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ、ならびにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽細胞リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭癌、ＨＨＶ８関連原発性滲出液リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリーセル白血病および脊髄形成異常、中枢神経系原発リンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹グリオーマ、星細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、ならびに網膜芽細胞腫が挙げられる。一部の実施態様において、がんは、転移性のがんであり、特にベイシジンを発現する転移がんである。
【０１１１】
[00138]一部の実施態様において、ベイシジンに関連する状態は、炎症性疾患であり、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腸粘膜の炎症、大腸炎に関連する消耗性疾患、多発性硬化症、ウイルス感染、リウマチ様関節炎、変形性関節症、クローン病（Cohn’s disease）、および炎症性腸疾患、乾癬、全身性強皮症、自己免疫性糖尿病などである。
【０１１２】
[00139]一部の実施態様において、ベイシジンに関連する状態は、例えば真菌感染、寄生体／原生動物感染または慢性ウイルス感染、例えば、マラリア、コクシジオイデス・イミチス（coccidioiodmycosis immitis）、ヒストプラスマ症、爪真菌症、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ・アルビカンス（candidiasis albicans）、パラコクシジオイデス症（paracoccidioiomycosis）、微胞子虫症、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリスアスカリス症、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ属、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、横川吸虫症、ハエ蛆症、糸状虫症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ病、旋毛虫病、鞭虫症、トリパノソーマ症、蠕虫感染などの感染症、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、単純疱疹ウイルスＩ型、単純疱疹ウイルスＩＩ型、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型、カポジウェスト（Kaposi West）肉腫に関連するヘルペスウイルス流行、薄い環状のウイルス（トルクテノウイルス）、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ型、水痘帯状疱疹、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスの感染である。一部の実施態様において、状態は、マラリアである。
【０１１３】
[00140]状態を「処置（治療）すること」、状態の「処置」または「療法」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用することができ、治療的処置、予防もしくは防止的措置、例えば、状態を予防もしくは軽減すること、状態の発症もしくは状態が進行する速度の遅延、状態が進行するリスクの低減、状態に関連する症状の進行の予防もしくは遅延、状態に関連する症状の低減もしくは終止、状態の完全なもしくは部分的な寛解をもたらすこと、状態の治癒、またはそれらのいくつかの組合せを包含する。
【０１１４】
[00141]用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、ヒトベイシジンに関連する疾患または状態を処置するのに有効な薬物の投薬量または濃度を指す。例えば、がんを処置するための本明細書で開示されるヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントの使用に関して、治療有効量は、腫瘍体積を低減すること、がん細胞の成長または増殖を阻害すること、腫瘍増殖またはがん細胞の他の臓器への侵入を阻害するかまたは遅延させること、がん細胞の転移を阻害するかまたは遅延させること、がんに関連するあらゆる症状を緩和すること、がんの進行を予防または遅延させること、またはそれらのいくつかの組合せが可能な抗体または抗原結合フラグメントの投薬量または濃度である。または、マラリアを処置するための本明細書で開示されるヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントの使用に関して、治療有効量は、プラスモジウム属の感染または増殖を阻害すること、マラリアの状態に関連するあらゆる症状を緩和すること、マラリアの状態の進行を予防するかまたは遅延させること、またはそれらのいくつかの組合せが可能な抗体または抗原結合フラグメントの投薬量または濃度である。
【０１１５】
[00142]本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントの治療有効量（単独で、または化学療法剤などの他の薬剤と組み合わせて使用される場合）は、当業界において公知の様々な要因、例えば、処置しようとする疾患のタイプ、抗体のタイプ、体重、年齢、過去の病歴、現在の薬物療法、対象の健康状態、免疫の状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性および有害な副作用、加えて投与経路およびタイプ、疾患の重症度および進行度、ならびに主治医または獣医師の裁量によって決まると予想される。一部の実施態様において、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントは、１日当たり１回またはそれより多くの回数、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１日当たり１回またはそれより多くの回数、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療上有効な投薬量で投与されてもよい。一部の実施態様において、ヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントは、約５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満の投薬量で投与され、一部の実施態様において、投薬量は、２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、１０ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、３ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、０．３ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満、または０．１ｍｇ／ｋｇまたはそれ未満である。一部の実施態様において、投与量は、処置の経過にわたり変更することができる。例えば、一部の実施態様において、最初の投与量は、後続の投与量より多くてもよい。一部の実施態様において、投与量は、処置の経過にわたり対象の反応に応じて変更することができる。
【０１１６】
[00143]投薬レジメンは、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）がもたらされるように調整することができる。一部の実施態様において、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントは、１回で、または一連の処置にわたり、対象に投与される。一部の実施態様において、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体または抗原結合フラグメントは、疾患のタイプおよび重症度に応じて、１つまたはそれより多くの別個の投与により、または連続的な点滴により対象に投与される。指針は、例えば、米国特許第４，６５７，７６０号；５，２０６，３４４号；５，２２５，２１２号に見出すことができる。
【０１１７】
[00144]本明細書で開示されるヒト化抗ベイシジン抗体および抗原結合フラグメントは、当業界において公知のあらゆる経路、例えば、非経口（例えば、皮下、腹膜内、静脈内、例えば静脈内注入、筋肉内、または皮内注射など）または非経口（例えば、経口、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸、または局所）経路などによって投与することができる。
【０１１８】
[00145]一部の実施態様において、本明細書で開示されるヒト化抗ベイシジン抗体および抗原結合フラグメントは、制御放出の方式で投与することができる。制御放出用非経口製剤は、インプラント、油性注射液または微粒子系（例えば、マイクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子）として作製することができる（Banga, A.J.、Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc.、ペンシルベニア州ランカスター（1995）；Kreuter, J.、Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter編、Marcel Dekker, Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク、219〜31頁（1994）；TiceおよびTabibi、Treatise on Controlled Drug Delivery、A. Kydonieus編、Marcel Dekker, Inc. ニューヨーク州ニューヨーク、315〜339頁（1992）を参照）。一部の実施態様において、本明細書で提供されるヒト化抗ベイシジン抗体および抗原結合フラグメントは、分解性または非分解性ポリマーマトリックス中で投与することができる（Langer、Accounts Chem. Res. 26：537〜51、1993を参照）。
【０１１９】
[00146]別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。
[00147]単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、本明細書で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の形態も同様に含むことが意図される。用語「含む」、「含むこと」、「包含する」、「包含すること」、「有する」および／または「有すること」は、本明細書において使用される場合、述べられた特徴、工程、操作、エレメントおよび／または構成要素の存在を明記するものであるが、１つまたはそれより多くの他の特徴、工程、操作、エレメント、構成要素および／またはそれらの群の存在または追加を除外しないことがさらに理解されるものとする。用語「約」は、本明細書で使用されるように、特定の列挙された数値に関して使用される場合、その値が列挙された値から１０％以下で変動する可能性があることを意味する。
【０１２０】
[00148]本明細書において引用されたいずれの文書も、全ての相互参照されたまたは関連する特許または出願を含め、明示的に排除されたりまたはそれ以外の方法で限定されたりしない限り、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。全ての文書の引用は、それが、本明細書において開示または特許請求されたいずれかの発明に関する従来技術であること、または単独で、または他のいずれか１つまたは複数の参考文献とのあらゆる組合せで、このような発明のいずれかを教示している、示唆している、または開示していることの承認ではない。さらに、この文書中の用語のいずれかの意味または定義が、参照により組み入れられる文書中の同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する場合、この文書中でその用語に充てられた意味または定義が優先されるものとする。
【実施例】
【０１２１】
[00149]以下の実施例は、特許請求された発明をよりよく例示するために提供され、本発明の範囲を制限すると解釈されないこととする。後述される全ての具体的な組成物、材料、および方法は、その全体が、または部分的に、本発明の範囲内に含まれる。これらの具体的な組成物、材料、および方法は、発明を限定することを意図していないが、本発明の範囲内に含まれる具体的な実施態様を単に例示することを意図している。当業者は、発明の能力を行使することなく、さらに本発明の範囲から逸脱することなく、等価な組成物、材料、および方法を開発することが可能である。本明細書に記載の手順に、それでもなお本発明の範囲内に残るように多くのバリエーションをなすことができることが理解されると予想される。本発明者らの意図は、このようなバリエーションは本発明の範囲内に包含されることである。
【０１２２】
実施例１：ファージディスプレイベクターの構築
[00150]２００６年に、ハイブリドーマ細胞株ＨＡｂ１８ＧＣ２を生成し、中国典型培養物保存センター（China Center for Type Culture Collection）に受託番号ＣＣＴＣＣ−Ｃ２００６３６で寄託した。細胞株、細胞株によって生産される抗体および調製方法に関する詳細な情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる中国特許第ＺＬ２００７１０００７４５２．２号に記載されている。
【０１２３】
[00151]全ＲＮＡ抽出キット（オメガバイオテック（Omega bio-tek））をキットのマニュアルに従って使用することによって、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞ＨＡｂ１８ＧＣ２から抽出した。抽出された全ＲＮＡの完全性をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１２４】
[00152]逆転写キットＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ試薬キット（TaKaRa）のマニュアルに従って、μｇの全ＲＮＡをとり、ｃＤＮＡの第１の鎖を合成することによってｃＤＮＡを調製し、これをさらなる実験のために−２０℃で貯蔵した。
【０１２５】
[00153]ＶＨ遺伝子フラグメントおよびＶＬ遺伝子フラグメントを、ＰＣＲ反応でそれぞれＶＨおよびＶＬ遺伝子特異的プライマーセットを使用することによって、ｃＤＮＡテンプレートから増幅した。ＰＣＲにはＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用した。反応ミックスは、ＮＥＢのマニュアルに従って調製される。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りに設定される：９４℃、５分；（９４℃、１５秒、５４℃、３０秒、７２℃、１分）×３５サイクル；７２℃、１０分。増幅されたフラグメントのサイズを、１％アガロースゲル電気泳動で決定した。
【０１２６】
[00154]さらなるＰＣＲ反応で、リンカー配列およびその相補的なリバース配列を、それぞれＶＨ遺伝子フラグメントの３’末端およびＶＬ遺伝子フラグメントの５’末端に、プライマー（ＶＨリバースリンカー−Ｒ１：配列番号３４、ＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＡＣＡＡＡＡ；ＶＬリンカー−Ｆ１：配列番号３５、ＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧ）を介して、導入した。
【０１２７】
[00155]リンカー配列またはリンカー配列の相補的なリバース配列を有するＶＨ遺伝子フラグメントおよびＶＬ遺伝子フラグメントを、１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で混合し、オーバーラップ−ＰＣＲ方法を使用することによってｓｃＦｖ遺伝子を増幅させる。反応系を以下のようにして調製した：１ｐｍｏｌのＶＨ遺伝子フラグメント、１ｐｍｏｌのＶＬ遺伝子フラグメント、１００ｐｍｏｌのｐＦＬ−６Ｈ８−Ｆ１プライマー（配列番号３３、ＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴ）、１００ｐｍｏｌのｐＦＬ−６Ｈ８−Ｒ２プライマー（配列番号３６、ＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧ）、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液。ＰＣＲ反応条件を以下のように設定した：９５℃、５分；（９５℃、１５秒、５６℃、３０秒、７２℃、１分）×３５サイクル；７２℃、１０分。増幅されたフラグメントのサイズを、１％アガロースゲル電気泳動で決定した。
【０１２８】
[00156]期待されるサイズのバンドを切り出し、ＤＮＡフラグメント精製キット（オメガバイオテック）を使用することによって回収して、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩの制限部位を含有するｓｃＦｖ遺伝子フラグメントを得た。
【０１２９】
[00157]切断部位ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを含有するｓｃＦｖ遺伝子フラグメントおよびベクタープラスミドｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega）を紫外線分光光度計で測定し、次いで制限酵素消化に供した。
【０１３０】
[00158]反応を以下のように設定した：３μｇの回収されたｓｃＦｖ遺伝子フラグメントまたは３μｇのｐＧＥＭ−Ｔベクター、１μｌのＮｃｏＩ−ＨＦ、１μｌのＮｏｔＩ−ＨＦ制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）、５μｌの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液を混合し、水を添加して５０μｌにした。消化反応ミックスを３７℃で１時間インキュベートした。得られた生成物のサイズを、１％アガロースゲル電気泳動で決定し、期待されるサイズにおけるバンドを切り出し、ＤＮＡフラグメント精製キット（オメガバイオテック）を使用することによって回収して、消化されたｓｃＦｖ遺伝子フラグメントおよび消化されたｐＧＥＭ−Ｔベクターを得た。
【０１３１】
[00159]消化後、回収されたｓｃＦｖ遺伝子フラグメントおよびｐＧＥＭ−Ｔベクターをライゲートした。ライゲーション反応ミックスを以下のように設定した：０．７μｇの消化されたｓｃＦｖ遺伝子フラグメント、１．４μｇの消化されたｐＧＥＭ−Ｔベクター、４０ＵのＴ４リガーゼ、４０μｌの５×ライゲーション緩衝液。ライゲーション反応ミックスを１６℃で一晩インキュベートした。ＴＧ１コンピテント細胞をライゲーション生成物で形質転換し、次いでＬＢ寒天プレート上に塗り広げ、３７℃で一晩インキュベートした。別個のコロニーをピックアップし、ベクターにとって万能なプライマーを用いて陽性クローンに関してスクリーニングした。次いで陽性クローンを正しいインサートに関して配列決定し、正しいインサートを含有することが証明されたもの（組換えプラスミドｐＦＬ−６Ｈ８と命名）を、さらなる使用のために−４０℃で貯蔵した。組換えプラスミドｐＦＬ−６Ｈ８は、完全な重鎖および軽鎖可変領域配列を有するｓｃＦｖ遺伝子を含有する。
【０１３２】
実施例２：マウスモノクローナル抗体６Ｈ８のＣＤＲおよびＦＲの決定
[00160]マウスモノクローナル抗ｈベイシジン抗体６Ｈ８の軽鎖および重鎖可変領域中のＣＤＲ（ＨＡｂ１８ＧＣ２としても公知である。中国特許第ＺＬ２００７１０００７４５２．２号を参照）を、Ｋａｂａｔデータベースに従って決定した。３つの軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列表中、それぞれ配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４に示される。３つの重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列表中、それぞれ配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に示される。
【０１３３】
実施例３：適切なヒト免疫グロブリンフレームワーク配列の選択
[00161]抗体のヒト化のために、Ｋａｂａｔデータベースから得られたヒトＦＲ配列を上述のＣＤＲでグラフト化し、グラフト化した抗体の可変領域を相同性および構造に関してスクリーニングした。ディスカバリービジョン（Discovery Vision）（ＶＩＯＶＩＡ、バージョン３．５）という名称のコンピューターソフトウェアを使用して、分子モデリング、相同性モデリングおよび力学の最適化を介してヒト化の前および後の抗体の分子構造を分析し、置き換えられたＦＲがＶＨおよびＶＬの全体的な骨格構造を変化させずに、具体的には、マウスモノクローナル抗体のβ鎖の２次構造を破壊せずに、確実に元のマウス抗体の親和性を維持するかまたは改善するような、ヒトＦＲにおいて可能な変更を検証した。本発明の開示の図１および図２に、選択されたヒト重鎖／軽鎖可変ＦＲ配列を、特定の部位に起こり得るバリエーションと共に、マウスＦＲ配列と一致させて列挙した。
【０１３４】
実施例４：ファージディスプレイのヒト化抗ｈベイシジン抗体ライブラリーの構築およびスクリーニング
[00162]実施例２で決定されたＣＤＲおよび実施例３で検証されたＦＲ配列の配列に基づき、哺乳類細胞において一般的に使用されるコドンを使用することによって、ヒト化抗体のＳｃＦｖフラグメントをコードする対応するヌクレオチド配列を得た。オーバーラップ−ＰＣＲ方法によってコード化遺伝子を得て、次いでクローニングベクターにクローニングし、増幅し、陽性クローンをシーケンシング分析に供した。重鎖／軽鎖ＦＲのコード配列中の特異的なアミノ酸部位に、プライマーにより変更およびバリエーションを導入することによって、ＦＲのヒト化を実行した。詳細なプロトコールは後述される。
【０１３５】
[00163]材料
[00164]実施例１からのマウス由来のｓｃＦｖフラグメントを、テンプレートとして使用した。以下のプライマーを、ヒト化された重鎖可変領域（ｈＶＨ）およびヒト化された軽鎖可変領域（ｈＶＬ）の増幅のために使用した：
[00165]ｈＶＨフォワードプライマーとしては、以下が挙げられる：
[00166] １）６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ１：配列番号３７
[00167]ＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧ
[00168] ２）６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ２：配列番号３８（６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ２はプライマーの混合物を表し、式中Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｓ＝ＧまたはＣである）
[00169]ＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＴＲＳＣＧＡＡＡＴＴＡＧＡＴＴＧＡＡＡＴＣ
[00170] ３）６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ３：配列番号３９（６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ３はプライマーの混合物を表し、式中Ｒ＝ＧまたはＡである）
[00171]ＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＴＡＡＲＧＡＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧ
[00172]ｈＶＨリバースプライマーとしては、以下が挙げられる：
[00173] １）６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ１：配列番号４０（６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ１はプライマーの混合物を表し、式中Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｙ＝ＴまたはＣである）
[00174]ＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＣＧＧＭＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＹＴＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＧＧ
[00175] ２）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ２：配列番号４１
[00176]ＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧ
[00177] ３）６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ３：配列番号４２（６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ３はプライマーの混合物を表し、式中Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｋ＝ＧまたはＴである）
[00178]ＴＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＧＲＴＧＫＴＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴＧ
[00179] ４）６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ４：配列番号４３
[00180]ＧＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣ
[00181] ５）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ５：配列番号４４（６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ５はプライマーの混合物を表し、式中Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｓ＝ＧまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡである）
[00182]ＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡＣＴＧＡＧＲＳＧＧＡＣＡＧＧＧＷＧＧＶＧＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＴＣ
[00183]ｈＶＬフォワードプライマーとしては、以下が挙げられる：
[00184] １）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ４：配列番号４５（６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ４はプライマーの混合物を表し、式中Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴである）
[00185]ＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＭＴＣＷＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧ
[00186] ２）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ６：配列番号４６（６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ６はプライマーの混合物を表し、式中Ｙ＝ＴまたはＣ、Ｓ＝ＧまたはＣ、Ｗ＝ＡまたはＴである）
[00187]ＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＹＣＣＧＡＳＧＡＣＷＴＣＧＣＡＡＣＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＡＣ
[00188] ３）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ５：配列番号４７
[00189]ＣＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧ
[00190]ｈＶＬリバースプライマーとしては、以下が挙げられる：
[00191] １）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ６：配列番号４８（６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ６はプライマーの混合物を表し、式中Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴである）
[00192]ＧＴＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣＧＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＧＧＧＧＨＣＴＫＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧ
[00193] ２）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ８：配列番号４９
[00194]ＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣ
[00195] ３）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ７：配列番号５０（プライマー６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ７は、プライマーの混合物であり、式中Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣである）
[00196]ＡＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣＧＧＷＧＡＡＧＣＧＧＧＭＧＧＧＧＡＣＣＣＣＡＧＴＧＴＡＣＣＧＧＴＴＧＧＡＴＧＣＣＣＣ
[00197]方法および結果
[00198]標的フラグメントを、以下で設定した通りの以下の増幅スキームによって増幅した。
[00199]  第１の工程の増幅：５つのプライマーの対（６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ１＋６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ１、６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ２＋６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ３、６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ３＋６Ｈ８−Ｌ１−Ｒ４、６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ４＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ６、６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ６＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ８）を使用して、実施例１で得られたｐＦＬ−６Ｈ８ベクターから、５つの第１の工程のフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応条件を以下のように設定した：９５℃、３分；（９５℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、４０秒）×４０サイクル；７２℃、１０分。ＰＣＲの後、増幅されたフラグメントのサイズを、１％アガロースゲル電気泳動で決定し、次いでｐＭＤ１８−Ｔベクター（TaKaRa）にライゲートした。ライゲーション生成物をコンピテント細胞に形質転換し、クローンを選択し、正しい挿入に関してスクリーニングした。シーケンシング結果に基づき、正しい配列を有するフラグメントをそれぞれ６Ｈ８−Ｌ１−１、６Ｈ８−Ｌ１−２、６Ｈ８−Ｌ１−３、６Ｈ８−Ｌ１−４および６Ｈ８−Ｌ１−５と名付けた。
【０１３６】
[00200]  第２の工程の増幅：上記で得られた５つの第１の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−１、６Ｈ８−Ｌ１−２、６Ｈ８−Ｌ１−３、６Ｈ８−Ｌ１−４および６Ｈ８−Ｌ１−５）をテンプレートとして使用して、４つのプライマーの対（６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ１＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ２、６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ２＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ５、６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ４＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ７、６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ５＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ８）を使用して、第２の工程のフラグメントを増幅した。ＰＣＲ反応条件は、第１の工程の増幅における条件と同じであった。ＰＣＲの後、ＰＣＲ生成物を、１％アガロースゲル電気泳動を介して精製し、ｐＭＤ１８−Ｔベクター（TaKaRa）にライゲートし、コンピテント細胞に形質転換した。陽性クローンを選択し、正しい挿入に関してスクリーニングした。シーケンシング結果に基づき、正しい配列を有するフラグメントを、それぞれ６Ｈ８−Ｌ１−６、６Ｈ８−Ｌ１−９、６Ｈ８−Ｌ１−７および６Ｈ８−Ｌ１−８と名付けた。
【０１３７】
[00201]  第３の工程の増幅：第１の工程の増幅と同じ手順に従って、上記で得られた２つの第２の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−６および６Ｈ８−Ｌ１−９）をテンプレートとして使用して、プライマーの対（６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ１＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ５）を使用して、第３の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−１０）を得た。上記で得られた２つの第２の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−７および６Ｈ８−Ｌ１−８）をテンプレートとして使用して、プライマーの対（６Ｈ８−Ｌ１＿Ｆ４＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ８）を使用して、第３の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−１１）を得た。
【０１３８】
[00202]  第４の工程の増幅：第１の工程の増幅と同じ手順に従って、上記で得られた第３の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−１０および６Ｈ８−Ｌ１−１１）をテンプレートとして使用して、プライマーの対（６Ｈ８−Ｌ１−Ｆ１＋６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ８）を使用して、第４の工程のフラグメント（６Ｈ８−Ｌ１−１２）を得た。
【０１３９】
[00203]６Ｈ８−Ｌ１−１２フラグメントを制限酵素ＮｃｏＩ−ＨＦおよびＮｏｔＩ−ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、それに続いて１％アガロースゲル電気泳動を介して分離し、次いで消化されたフラグメントを、ゲル抽出キット（オメガバイオテック）によって精製した。精製され消化されたフラグメントを、ファージベクターｐＣｏｍｂ３Ｘｓｓ（ファージベクターの骨格に前もって加工されたｃ−ｍｙｃ融合タンパク質を包含する）を用いてライゲートしたこれは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（TaKaRa）により同じセットの制限酵素（すなわち、ＮｃｏＩ−ＨＦおよびＮｏｔＩ−ＨＦ）で消化される。ライゲーション生成物を脱イオン化し、次いでエレクトロポレーションを介してＴＧ１コンピテント細胞に形質転換した。形質転換したＴＧ１細胞を、クローンスクリーニングのためにＬＢプレート上に植え付けた。６Ｈ８−Ｌ１抗体ファージライブラリーの能力を記録し、さらなる使用のためにライブラリーを−８０℃で貯蔵した。
【０１４０】
[00204]６Ｈ８−Ｌ１抗体ファージライブラリーの抗原特異性のパニングを、以下の工程を用いた固相パニングによって行った。
[00205]６Ｈ８−Ｌ１抗体ファージライブラリーを６０ｍｌの２ＹＴ培地中で回復させ、振盪インキュベーター中、３７℃で、培養物のＯＤ６００が０．３〜０．４に達するまでインキュベートした。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（インビトロジェン（Invitrogen））を添加し、培養物を静止したインキュベーター中で３０分インキュベートし、振盪インキュベーター中、３７℃で６０分インキュベートした。培養物を、１５００ｒｐｍで１０分遠心分離し、上清を捨て、細胞を、６０ｍｌの５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２ＹＴ培地（グルコース非含有）で再懸濁した。再懸濁した培養物を、振盪インキュベーター中、３０℃で一晩インキュベートし、１２，０００ｒｐｍで１０分遠心分離して、ファージディスプレイライブラリーを含有する細菌を沈殿させた。上清を新しい遠心管に移し、３０ｍｌ／チューブのロットに等分し、７．５ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌを各遠心管に添加し、よく混合し、氷上に１時間置き、１２０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を捨て、ファージを、ＰＢＳ−５％ＢＳＡを含有する溶液２．２ｍｌで再懸濁した。再懸濁したファージを、１２０００ｒｐｍで再度５分遠心分離して、死細胞片を除去した。
【０１４１】
[00206]ヒトベイシジンでコーティングされたプレートを使用して、５ラウンドのパニング（結合−洗浄−増幅）で親和性パニングを実行した。ここでパニングのラウンドごとに、抗原のコーティング濃度を次第に減少させた（１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０００１μｇ／ｍｌ）。シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が１０．７６８未満になったときパニング実験を終わらせ、クローンを選択し、選択されたクローンを培養し、誘導して、ｓｃＦｖ抗体を発現させて、これをＥＬＩＳＡ分析に使用した。
【０１４２】
実施例５：ＥＬＩＳＡおよびシーケンシング分析
[00207]ヒトベイシジンを、コーティング緩衝液（２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．２）で１μｇ／ｍｌに希釈し、そのうち５０μｌを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。各ウェル中のコーティング溶液を捨て、プレートを、１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、１ウェル当たり２００μｌのブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ／１×ＰＢＳ緩衝液）で室温で１時間ブロックし、次いで１ウェル当たり２００μｌの１×ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。プレートの個々のウェルにＳｃＦｖ抗体および陰性対照を含有する細胞培養上清を添加し、室温で２時間インキュベートした。次いでプレートを２００μｌの１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。ブロッキング緩衝液で（１：２５００に）希釈された二次抗体としての抗ｃ−ＭｙｃＡｂ（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍカタログ番号ａｂ１９３１２、５０μｌ／ウェル）をプレートの個々のウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを２００μｌの１×ＰＢＳ緩衝液で６回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（５０μｌ／ウェル）を各ウェルに添加して、１０分反応させ、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、５０μｌ／ウェル）を添加して反応を終わらせた。４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで読んだ。ＥＬＩＳＡの結果に従って、シーケンシング分析のためにＡ４５０＞２．０の１２３個のクローンを選択した。
【０１４３】
[00208]シーケンシングからのＤＮＡ配列の結果を、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系データベースおよびウェブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/shab/を参照して、ヒト化の度合いに関して評価した。親和性ソーティングのために、最も高い程度にヒト化された２６個のｓｃＦＶ分子を選択した。
【０１４４】
実施例６：ＳＰＲによるｓｃＦｖ結合親和性の決定
[00209]抗体の親和性をＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６（バイオ−ラッド（Bio-Rad））を用いて測定した。ＧＬＣチップ（バイオ−ラッド、１７６５０１１）を、０．０４ＭのＥＤＣ＋０．０１Ｍのスルホ−ＮＨＳ（バイオ−ラッド）で活性化した。ヒトベイシジンを、１０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ４．５）を用いて１０ｍＭに希釈し、次いで３０μｌ／分の速度でチップ上に注入し、活性化されたチップに抗原をアミノ基を介してカップリングした。最終的に、チップを１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（バイオ−ラッド）で不活性化し、チップを９０度回転させ、それを、ベースラインが安定になるまで緩衝液（ＰＢＳ／０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。ｓｃＦｖ抗体および１つの陰性対照を含有する５つの細胞培養上清を、６つの水平のチャネル上に、それぞれ３０μｌ／分の供給速度で注入した。結合のための時間を６０秒と設定し、解離のための時間を９００秒と設定した。反応速度論−ラングミュアモデルを使用してデータを分析した。
【０１４５】
[00210]ヒトベイシジンのｓｃＦｖ抗体を含有するＴＧ１上清との結合をリアルタイムでモニターするために、ＳＰＲを使用した。全てのスクリーニングした抗体の会合速度定数（Ｋｏｎ）は同等であったため、抗体の結合親和性を決定するのにＫＤの代わりに解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を使用した。ヒトベイシジンのヒト化されたｓｃＦｖ抗体との結合親和性をＫｏｆｆに従って事前に評価した。表１に結果を示す。
【０１４６】
[00211]
【０１４７】
【表１】
2019521648.tif 000002
【０１４８】
[00212]他の特徴を考慮して、それぞれインタクトな抗体を構築するためにより相対的に低いＫｏｆｆ値を有するものから、５つのヒト化されたｓｃＦｖ（すなわち、１１１８８、１１２１４、１１２４２、１１２４５および１１３０５）を選択した。
【０１４９】
実施例７：インタクトなヒト化抗体の構築
[00213]以前の親和性ソーティングの結果に従って、選択されたｓｃＦｖを有する５つのクローンを一晩植え付けた。一晩の培養物のそれぞれからプラスミドを抽出し、それらの配列をシーケンシングによって確認した。
【０１５０】
[00214]以下のプライマーを、インタクトなヒト化抗体を生成するためのヒト化された重鎖可変領域（ＶＨ）およびヒト化された軽鎖可変領域（ＶＬ）の増幅のために使用した：
[00215]ＶＬフォワードプライマー：ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ１、配列番号５１
[00216]ＧＣＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣ
[00217]ＶＬリバースプライマー：ｐＣＩ−６Ｈ８＿Ｒ８、配列番号５２
[00218]ＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧ
[00219]ＶＨフォワードプライマーとしては、以下が挙げられる：
[00220]１）ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ２：配列番号５３
[00221]ＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣ
[00222]２）ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ３：配列番号５４
[00223]ＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＴＣ
[00224]３）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ２：配列番号５５
[00225]ＣＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＴＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧ
[00226]４）６Ｈ８−Ｌ１＿Ｒ５：配列番号５６
[00227]ＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡＣＴＧＡＧＲＳＧＧＡＣＡＧＧＧＷＧＧＶＧＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＴＣ
[00228]ＶＨリバースプライマー：ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｒ１、配列番号５７を参照。
[00229]ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣ
[00230]標的フラグメントを、以下で設定した通りの以下の増幅スキームによって増幅した：
[00231]１１１８８からのプラスミドをテンプレートとして使用し、プライマー対（ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ１＋ｐＣＩ−６Ｈ８＿Ｒ８およびＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ２＋ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｒ１）を使用して、インタクトなヒト化抗体ＷＢＰ２２９−２０１のためにＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。
【０１５１】
[00232]１１２１４からのプラスミドをテンプレートとして使用し、プライマー対（ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ１＋ｐＣＩ−６Ｈ８＿Ｒ８およびＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ２＋ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｒ１）を使用して、インタクトなヒト化抗体ＷＢＰ２２９−２０２のためにＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。
【０１５２】
[00233]１１２４２からのプラスミドをテンプレートとして使用し、プライマー対（ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ１＋ｐＣＩ−６Ｈ８＿Ｒ８およびＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ３＋ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｒ１）を使用して、インタクトなヒト化抗体ＷＢＰ２２９−２０３のためのＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。
【０１５３】
[00234]１１２４５からのプラスミドをテンプレートとして使用し、プライマー対（ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ１＋ｐＣＩ−６Ｈ８＿Ｒ８およびＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ２＋ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｒ１）を使用して、インタクトなヒト化抗体ＷＢＰ２２９−２０４のためのＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。
【０１５４】
[00235]１１３０５からのプラスミドをテンプレートとして使用し、プライマー対（ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ１＋ｐＣＩ−６Ｈ８＿Ｒ８およびＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｆ３＋ＰＣＩ−ｗｂｐ２２９＿Ｒ１）を使用して、インタクトなヒト化抗体ＷＢＰ２２９−２０５のためのＶＬおよびＶＨ領域を増幅した。
【０１５５】
[00236]ＰＣＲの後、増幅されたフラグメントを１％アガロースゲル電気泳動で分離し、期待されるサイズにおけるバンドを回収し、精製した。
[00237]精製されたＶＬ／ＶＨフラグメントをＮｇｏＭＩＶおよびＳｎａＢＩで消化し、消化されたフラグメントをＤＮＡ精製キットで精製し、次いで哺乳類発現ベクターである、（ｈＩｇＧ２重鎖定常領域またはヒトκ鎖定常領域）遺伝子を包含するｐＣＩ−ベクターにライゲートし、これを同じ酵素で消化した。ライゲーション生成物をＴＯＰ１０大腸菌（E. coli）細胞（インビトロジェン）に形質転換し、形質転換した細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に塗り広げた。次いで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液状培地中に陽性クローンをを植え付け、シーケンシングによってクローンを検証した後、Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅｐプラスミド抽出キット（キアゲン（QIAGEN））を使用することによってクローンプラスミドを抽出した。調製したプラスミドを、それぞれｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０１ＬおよびｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０１Ｈ、ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０２ＬおよびｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０２Ｈ、ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０３ＬおよびｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０３Ｈ、ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０４ＬおよびｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０４Ｈ、ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０５ＬおよびｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０５Ｈと名付け、これらのそれぞれは、インタクトなヒト化抗体を生産するために完全な軽鎖遺伝子または完全な重鎖遺伝子を含有する。
【０１５６】
実施例８：細胞の一過性トランスフェクションおよび抗体精製
[00238]ＨＥＫ２９３細胞（細胞１．０×１０６個／ｍｌ）を、インビトロジェンからのフリースタイルマックス試薬（Freestyle Max Reagent）トランスフェクション試薬を使用することによって、１つの軽鎖遺伝子および１つの対応する重鎖遺伝子を含有するプラスミドの対（例えば、ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０１Ｌ／Ｈ〜２０５Ｌ／Ｈ）と共にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、振盪インキュベーター中、３７℃、５％ＣＯ２で、さらに１２０ｒｐｍの回転速度で植え付けた。トランスフェクションから７日後に遠心分離によって培養上清を収集し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して、上清から標的抗体を単離および精製した。最も高いヒト化抗体を生産した以下の３つの培養物を選択した。
【０１５７】
[00239]１）配列番号３の重鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号１６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有するＨＰ６Ｈ８−１（ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０５Ｌ／Ｈに相当）。
【０１５８】
[00240]２）配列番号５の重鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号１８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有するＨＰ６Ｈ８−２（ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０４Ｌ／Ｈに相当）。
【０１５９】
[00241]３）配列番号７の重鎖可変領域のアミノ酸配列、および配列番号２０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有するＨＰ６Ｈ８−３（ｐＣＩ−ＷＢＰ２２９−２０３Ｌ／Ｈに相当）。
【０１６０】
実施例９：ヒト化抗ｈベイシジン抗体の結合親和性の決定
[00242]２００ｎｇのヒトベイシジン組換えタンパク質をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、４℃で一晩静置した。コーティングされたプレートを０．１％ＢＳＡで室温で１時間ブロックした。実施例８で得られた３種の抗体を、親マウスモノクローナル６Ｈ８およびキメラ抗体ｃ６Ｈ８と共に、それぞれ１０，１００、１，０００、１０，０００および１００，０００ｎｇ／ｍｌの勾配濃度を有する５種の溶液を用いて調製した。１００μｌの各溶液を個々のウェルに添加し、プレートを室温で１時間静置した。二次抗体として、１００μｌの１：４，０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒト軽鎖定常領域（ミリポア（Millipore））を添加し、室温で１時間静置した。次いでプレートを２００μｌの１×ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（５０μｌ／ウェル）を各ウェルに添加して、１０分反応させ、停止溶液（２ＭのＨＣｌ、５０μｌ／ウェル）を添加して反応を終わらせた。４５０ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで読んだ。
【０１６１】
[00243]結果に従って、３種のヒト化抗体およびキメラ抗体ｃ６Ｈ８は、親マウス抗体６Ｈ８と比較して、ヒトベイシジンに対して、より有意に高い親和性を示した（図３）。
[00244]３種のヒト化抗体、マウス抗体６Ｈ８およびキメラ抗体ｃ６Ｈ８の結合親和性もＳＰＲによって決定し（詳細な工程については実施例６の説明を参照されたい）、表２にデータを示した。
【０１６２】
[00245]
【０１６３】
【表２】
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【０１６４】
[00246]図３および表２で示されるように、ヒト化抗体の結合親和性は、親マウス抗体６Ｈ８の結合親和性より高かった。ヒトにおけるヒト化抗体の免疫原性は、親マウス抗体６Ｈ８の免疫原性より低く、ヒト化抗体の安定性は、親マウス抗体６Ｈ８の安定性より優れている。
【０１６５】
実施例１０：高度に効率的なヒト化抗ｈベイシジン抗体の発現ベクターの構築および安定な発現細胞株のスクリーニング
[00247]実施例９の結果に従って、ＨＰ６Ｈ８−１の遺伝子配列を、高度に効率的なヒト化抗体の発現ベクターの構築に使用した。
【０１６６】
[00248]１．軽鎖遺伝子の発現ベクターの構築
[00249]ＨＰ６Ｈ８−１のＶＬ領域をコードする遺伝子配列を合成し、ＸｂａＩおよびＢｓｉＷＩの制限酵素認識部位をそれぞれ配列の５’および３’末端に付加した。合成された分子および軽鎖定常遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．３−ＬＣ−１０４ｎｅｗ−Ｍプラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＢｓｉＷＩで消化した。消化された生成物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、期待されるサイズにおけるバンドを回収し、精製した。精製したフラグメント（合成分子由来の４１６ｂｐのフラグメントおよびｐｃＤＮＡ３．３−ＬＣ−１０４ｎｅｗ−Ｍプラスミド由来の５，７１２ｂｐのフラグメント）をＴ４リガーゼを使用することによってライゲートし、反応ミックスを１６℃で２０分維持した。２０μｌのライゲーション溶液のうち１０μｌを使用して、大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞（インビトロジェン）を形質転換した。ＰＣＲ分析、酵素消化分析およびシーケンシングによって形質転換したコロニーを確認した後、１つの正しいモノクローンを、２２０ｒｐｍの振盪インキュベーターにおいて２００ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で一晩植え付けた。プラスミドを抽出し、ｐｃＤＮＡ３．３−ＬＣ−Ｎ−２２９−２０５と名付けた（図４に示す）。
【０１６７】
[00250]２．重鎖遺伝子の発現ベクターの構築
[00251]同様に、ＨＰ６Ｈ８−１のＶＨ領域をコードする遺伝子配列を合成し、ＸｂａＩおよびＮｈｅＩの制限酵素認識部位をそれぞれ配列の５’および３’末端に付加した。合成された分子および重鎖定常遺伝子を有するｐＯｐｔｉｖｅｃ−ＨＣ−２０８−Ｍプラスミドを制限酵素ＸｂａＩおよびＮｈｅＩで消化した。消化された生成物を１％アガロースゲル電気泳動で分離し、期待されるサイズにおけるバンドを回収し、精製した。精製したフラグメント（合成分子由来の４３４ｂｐのフラグメントおよびｐＯｐｔｉｖｅｃ−ＨＣ−２０８−Ｍプラスミド由来の５，３６４ｂｐのフラグメント）をＴ４リガーゼを使用することによってライゲートし、反応ミックスを１６℃で２０分維持した。２０μｌのライゲーション溶液のうち１０μｌを使用して、大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞（インビトロジェン）を形質転換した。ＰＣＲ分析、酵素消化分析およびシーケンシングによって形質転換したコロニーを確認した後、１つの正しいモノクローンを、２２０ｒｐｍの振盪インキュベーターにおいて２００ｍｌのＬＢ培地中で３７℃で一晩植え付けた。プラスミドを抽出し、ｐＯｐｔｉｖｅｃ−ＨＣ−Ｄ−２２９−２０５と名付けた（図５に示す）。
【０１６８】
[00252]３．ＣＨＯ安定発現細胞株の構築およびスクリーニング
[00253]ヒト化抗体軽鎖の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３−ＬＣ−Ｎ−２２９−２０５およびヒト化抗体重鎖の発現ベクターｐＯｐｔｉｖｅｃ−ＨＣ−Ｄ−２２９−２０５を、フリースタイルマックス試薬（インビトロジェン）を使用することによってＣＨＯ／ＤＨＦＲ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を初代継代し、細胞の生存率が８５％を超えて回復するまで５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したＯｐｔｉＣＨＯ培地でスクリーニングした。２ラウンドのスクリーニングを、５００ｎＭのＭＴＸを含有するスクリーニング培地中で実行した。ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬを用いて単一のクローンを選択した。モノクローナル培養の７〜１０日の後、培養物上清中のＨＰ６Ｈ８−１の発現レベルは、ＨＴＲＦ方法で測定したところ２．２３±０．１８ｇ／Ｌであった（図６に示す）。
【０１６９】
実施例１１：ヒト化抗ｈベイシジン抗体の特異性の決定
[00254]免疫組織化学的方法を使用して、抗体ＨＰ６Ｈ８−１の腫瘍組織への特異的な結合を検出し、抗体の免疫組織化学的な交差反応性を調査した。内因性ペルオキシダーゼをブロックして不活性化するために３％Ｈ２Ｏ２を使用し、ブロックのために正常ヒツジ血清使用溶液を使用し、一次抗体としてＨＰ６Ｈ８−１を使用し、二次抗体としてビオチン標識ウサギ抗ヒトＦｃ抗体を使用し、標識試薬としてホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトマイシンアルブミン溶液を使用し、発色のためにＤＡＢを使用し、再染色のためにヘマトキシリンを使用した。サンプルを脱水した後、それを有するスライドを顕微鏡検査のためにマウントした。
【０１７０】
[00255]図７に結果を示した。抗体ＨＰ６Ｈ８−１の特異的な発色は、肺がん、肝臓がん、結腸がんおよび他の悪性腫瘍組織で観察されたが、正常な組織ではほとんど観察されなかった。様々な発色の程度を「＋＋」または「＋＋＋」で示した。
【０１７１】
[00256]上記の結果から、ＣＤＲグラフト化に基づき本発明の開示で生成されたヒト化抗体は、ヒトベイシジンを特異的に認識することができることが示される。
実施例１２：インビトロにおけるＨＰ６Ｈ８−１抗体を用いた抗マラリア性の試験
[00257]ヒト赤血球（Ｏ型）を、熱帯熱マラリア原虫株Ｄｄ２、３Ｄ７、ＦＣＣ１およびＮｆ５４それぞれで感染させた。感染率が≧１％であり、マラリアによる環状体が≧８０％の場合、抗マラリア性の試験を実行した。培養物をモノクローナル抗体で希釈して、寄生虫血症の初期レベルを０．５％に設定し、新鮮な赤血球を添加して、初期のヘマトクリットを２％に設定し、モノクローナル抗体ＨＰ６Ｈ８−１を、それぞれ１００、１０、１、０．１、０．０１μｇ／ｍｌの濃度で添加して、各濃度勾配を３連で試験した。３７℃で７２時間培養した後、薄い血液塗抹標本を調製し、１００倍の油浸顕微鏡下で観察して、寄生体の割合を数えた。実験を独立して３回繰り返し、結果を平均し、統計のためにＳＰＳＳで分析した。
【０１７２】
[00258]図８に、インビトロにおける熱帯熱マラリア原虫株Ｄｄ２、３Ｄ７、ＦＣＣ１およびＮｆ５４に対するヒト化ＨＰ６Ｈ８−１モノクローナル抗体の薬力学的結果を示した。抗体の投与から７２時間後、ヒト化モノクローナル抗体ＨＰ６Ｈ８−１は、全ての熱帯熱マラリア原虫株に対して有意な抗マラリア性作用を示し、ＩＣ５０は、それぞれ０．０４、０．０２、０．０４、および０．０５ｍｇ／ｍｌであった。
【図１】
2019521648.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2019521648000001.app
【国際調査報告】
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