(57)【要約】  本発明は、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含み、任意に光重合開始剤等の重合開始剤を更に含む溶液を含み、化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となる組成物に関する。本組成物は、３Ｄプリンティング、押出しシステム（付加製造技術）、スプレーシステム、キャスティング、マイクロ及びナノファイバー製造システム（電界紡糸、溶液ブロー紡糸）、又は微少流体素子に特に有用である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含み、光重合開始剤等の重合開始剤を更に含む溶液を含む組成物であって、前記アミノ酸鎖がメタクリロイル基又はアクリロイル基からなる群から選択される化学物質で化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となる、組成物。
【請求項２】
前記溶液が、５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で化学的に官能化されたアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アミノ酸鎖がメタクリロイル基で官能化される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記化学物質による前記ゼラチンポリマーの前記アミノ酸側鎖の官能化の程度が、リジン残基の３０％〜１００％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記化学物質による前記ゼラチンポリマーの前記アミノ酸側鎖の官能化の程度が、前記リジン残基の少なくとも８０％、好ましくは前記リジン残基の少なくとも８５％である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記重合開始剤が光重合開始剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記溶液が、フリーラジカルの存在下での重合又は架橋に反応性の基の共有結合架橋を誘導する前に、ゲル化（物理的架橋）を誘導する温度で予備処理される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ゼラチンポリマーがサルモ属又はオンコリンクス属に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含み、任意に光重合開始剤を更に含む溶液を含む組成物を製造する方法であって、前記アミノ酸鎖がメタクリロイル基又はアクリロイル基からなる群から選択される化学物質で化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となり、前記方法が、
ａ．低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを得て、それを溶媒、好ましくはＰＢＳ又は水に最終濃度１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）まで溶解する工程と、
ｂ．フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となり得る化学物質を添加することによって、工程ａ）の前記アミノ酸鎖ゼラチンポリマーの一次構造を化学的に修飾する工程と、
ｃ．工程ｂ）の前記溶液から全ての未反応の化学物質を除去する工程と、
ｄ．任意に、光重合開始剤等のラジカル発生重合開始剤及び／又は界面活性剤を添加する工程と、
を含む、方法。
【請求項１０】
１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含み、任意に光重合開始剤を更に含む溶液を含む組成物を製造する方法であって、前記アミノ酸鎖がメタクリロイル基又はアクリロイル基からなる群から選択される化学物質で化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となり、前記方法が、
ａ．低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを得て、それを溶媒、好ましくはＰＢＳ又は水に最終濃度１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）まで溶解する工程と、
ｂ．工程ａ）の前記溶液に無水メタクリル酸を添加することによって、工程ａ）の前記アミノ酸鎖ゼラチンポリマーの一次構造を化学的に修飾する工程と、
ｃ．工程ｂ）の前記溶液から全ての未反応の無水メタクリル酸を除去する工程と、
ｄ．任意に、光重合開始剤等のラジカル発生重合開始剤及び／又は界面活性剤を添加する工程と、
ｅ．任意に、適用可能であれば、工程ｃ）又は工程ｄ）から得られた組成物を濾過し、凍結乾燥する工程と、
を含む、方法。
【請求項１１】
前記低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーが、低温適応魚類、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の皮膚又は骨から得られた、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出方法が、ｐＨ３〜５．５、好ましくはｐＨ約５での調節を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化学的に修飾されたアミノ酸鎖及び光重合開始剤を含む前記溶液を、前記光重合開始剤の性質に応じて光、可視光、ＵＶ光又は赤外線に曝露して架橋された組成物を提供することを更に含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は入手可能な溶液を含む組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法によって得られる又は入手可能な架橋された組成物。
【請求項１６】
前記溶液が界面活性剤を更に含み、好ましくは前記界面活性剤が６個未満の炭素を有する分岐鎖フッ素系界面活性剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１４若しくは１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記界面活性剤が、０．００５％（重量／体積）〜０．１％（重量／体積）の濃度で６個未満の炭素を有する分岐鎖フッ素系界面活性剤である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が分岐鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物又は請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＰＥＧ誘導体が１％（重量／重量）〜５％（重量／重量）の濃度のマルチアームＰＥＧ誘導体である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
３Ｄプリンティング、押出しシステム（付加製造技術）、スプレーシステム、キャスティング、マイクロ及びナノファイバー製造システム（電界紡糸、溶液ブロー紡糸）又は微少流体素子における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
治療又は診断の目的に適したスキャフォルド、ビーズ、培養組織、又はデバイス及びマイクロデバイスの製造における、請求項１〜９のいずれか一項に記載の又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
食品コーティングにおける、請求項１〜９のいずれか一項に記載の又は請求項１４に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学的分野及び食物部門に関し、特に、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で、低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含有し、任意に光重合開始剤又は任意の他の種類のラジカル発生重合開始剤（radical-derived initiators）を更に含有する溶液を含み、化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に反応性となる組成物に関する。かかる組成物は、生物医学分野及び食物分野における使用に対する新たなバイオファブリケーション技術に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
生物医学分野では、新たなバイオファブリケーション技術により、治療又は診断の目的に対する、スキャフォルド、ビーズ、培養組織、装置及びマイクロデバイス等の生体材料の製造が可能となっている。これら（バイオファブリケーション又はバイオ製造）の技術の幾つかは、とりわけ３Ｄバイオプリンティング、押出しシステム（付加製造技術）、スプレーシステム、キャスティング、マイクロ及びナノファイバー製造システム（電界紡糸、溶液ブロー紡糸）、並びに微少流体素子等の技術の使用を含む。また、食品科学では、これらの技術の幾つかを特に押出しシステム及びスプレーシステムで使用する。
【０００３】
これらの技法又は技術の使用は、生体材料の凝集の状態、及び重合又は架橋の制御を必要とする。この意味で、生体材料は当初はその液体状態で扱われ、その後、重合／架橋の制御によって、より固い状態の最終生成物が得られる。この点に関して、任意の所与の特定の適用における最終生成物の機能が固体状態の生体材料の機械的、物理化学的及び生物学的な特性に依存することを考慮すると、これらの技術の高性能の機能は、液体状態の生体材料のレオロジー特性及びより固い状態への移行に対してシステムが持つ制御レベルに高度に依存する。言い換えれば、これらの高性能の技術は、重合／架橋の前の特定のレオロジー特性、重合／架橋及び重合又は架橋された生体材料の機械的特性の制御を必要とする。
【０００４】
実際、高精度のバイオ製造技術（インクジェットバイオプリンティング、スプレーコーティング及び微小流体派生システム等）は、非常に小さい液滴（ｐＬ）の形成を可能とするため、又は微小サイズのチャネル内での高い流れ抵抗を回避するため、特定のレオロジー特性を有する、生体材料の重合／架橋の状態の制御を可能とする組成物を必要とする。したがって、理想的な組成物は、架橋／重合に先立って特定のレオロジー特性を有し（例えば、３Ｄバイオプリンティングを実施する際に良好な噴射能力をもたらす）、一旦生体材料が固体状態となれば良好な機械的特性を有する。理想的な組成物は架橋／重合の工程に先立って、ニュートン流体挙動、２５ｃＰ〜１０ｃＰの粘度、及び種々のずり速度及び／又は温度での安定性を有する。または、理想的な組成物は低い表面張力（２５ｍＮ／ｍ〜３０ｍＮ／ｍ）を有することが好ましい。
【０００５】
バイオ医学分野は、治療又は診断の適用の結果に影響を及ぼす多くの物理化学的特性及び生物学的特性を要求する。これらの特性の幾つかは、細胞成分の微小環境、及び特定の生体応答において得られる細胞と生体材料との直接的な相互作用、及び細胞生物活性に応じた生体材料の活発なリモデリングの制御に関する。また、これらの特性は、生物学的に意味のある成分の制御送達、細胞適合性、生理活性及び生分解性として列挙される。一方、食物分野では、カプセル化ビタミン又は他の活性化合物の補給のため、スプレーシステム又はビーズ製造等の食品コーティングの成膜の特殊化されコスト効率の良い技術が必要とされている。
【０００６】
残念ながら、これらの分野はいずれも、最適以下のレオロジーの性質及びこれまで使用されている大多数の生体材料の重合／架橋の制御に起因して、実施が制限される。
【０００７】
近年、哺乳動物（例えば、ブタ及びウシ）のゼラチンに代わるゼラチン供給源を見出すことに対する関心が増え続けている。特に、魚類ゼラチンは代替品として提案されているが、克服されなければならない重要な課題は、その劣った流動学的特性である。この制限は、冷水魚のコラーゲン／ゼラチンのプロリンに富む領域の欠如に起因する（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００８】
改善された機械的特性を有する魚類ゼラチンポリマーを提供する目的で、分子内及び分子間の架橋の誘導が先に報告されている。非特許文献３は、ゼラチン含有組成物に対して架橋剤（すなわち、グルタルアルデヒド及び／又はゲニピン）を添加する、従来のゼラチン架橋法を記載している。この方法によって最適な架橋を得るのに要する時間は、数時間〜数日に及ぶ。
【０００９】
さらに、非特許文献４は、酵素トランスグルタミナーゼ（すなわち、ＭＴＧａｓｅ）を使用する、魚類ゼラチンの架橋を記載している。この文献は、酵素トランスグルタミナーゼによる架橋によって好適な粘度を有するゲルを得るのに要する時間は、数分の範囲であると教示している。
【００１０】
したがって、架橋に加えて、良好な機械的（圧縮及び／又は引張り）特性を有する組成物をもたらす、高精度のバイオ製造技術に適したレオロジー特性を有するゼラチン組成物を得ることが必要とされ、好ましくは架橋時間が数秒から数分の範囲、例えば最長で５分間まで減少される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Karim A A et al: Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576
【非特許文献２】Gomez-Guillen M C et al: Food Hydrocolloids 2011, 25(8) 1813-1827
【非特許文献３】Chiou B S et al: Polymer 2006, 47(18), 6379-6386
【非特許文献４】J. B. Yi et al: Journal of Food Science 2006, 71(9), E376-E383
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、これらの技術で使用される新たな生体材料が至急必要とされている。結果的に、生物医学及び食物における最適な適用に対して所望の幾何学的形状、生物学的特性及び物理学的特性を有する、構造上複雑なスキャフォルドを作り出すことができる、新規で非常に生物学的に活性な生体材料が現在も必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明では、本発明者らは、バイオ医学及び食品産業に特有の特性、すなわちその低温適応の性質に由来する特性を有する新たな光架橋性生体材料として、アミノ酸配列中にメタクリロイル基等の化学置換基が導入された、サケゼラチン等の低温適応海洋種の天然資源に由来するゼラチンポリマーの使用を提案する。サケ等の低温適応生物の特徴的な性質は、典型的には、それらのタンパク質が構造上より柔軟なことである。この意味で、１０％重量／体積の溶液中のサケゼラチンは、ウシゼラチンよりも４倍低い粘度を示した。この特性は、低粘度及び急速な重合を伴う生体材料を必要とする、高解像度の３Ｄプリンティング又は微小流体から派生する技法に対するマルチジェット又はポリジェット技術等の特殊化されたファブリケーション技術の使用を可能とする。本発明者らの初期の作業仮説は、レオロジーの利益以外に分子レベルのサケゼラチンのより高い柔軟性が、ＭＭＰ（メタロプロテイナーゼ）の触媒効率を増強し得ることであった。この新たな生体材料に基づいて光造形されたヒドロゲルの機械的な靭性の望ましくない減損にもかかわらず、上記の高い柔軟性は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の遊走／浸潤、血管形成及び組織統合を改善し得る。しかしながら、それに反して、本発明者らは、サケゼラチンのより高い柔軟性に起因するＭＭＰの触媒ターンオーバーの増加、さらには改質サケゼラチンに基づくヒドロゲルの分子柔軟性がウシよりも高いにもかかわらず、サケヒドロゲルの機械的特性は、ウシよりも高いヤング率を示したという予想外の事実を観察した。さらに、光架橋性サケゼラチンのヒドロゲルは、間葉系幹細胞であるＨＵＶＥＣと組み合わせ、マウスモデルにおいて皮下に埋め込んだ場合に、より高いレベルの血管新生及び組織統合を示す。さらに、新たな光架橋性生体材料として、アミノ酸配列中にメタクリロイル基等の化学置換基が導入された、サケゼラチン等の低温適応海洋種の天然資源に由来するゼラチンポリマーは、食品の加工及び保存に対して非常に素晴らしい組成物を構成する。
【００１４】
したがって、第１の態様では、本発明は、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含み、任意に光重合開始剤等の重合開始剤を更に含む溶液を含み、化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となる、組成物に関する。上記組成物は、５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）濃度でアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを含むことが好ましい。上記組成物は、界面活性剤を更に含むことがより好ましい。上記組成物のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーは、メタクリロイル基、アクリロイル基、又はポリマーの形成、若しくは表面若しくは他の分子との反応を媒介することができる任意の官能基若しくは部分からなる群から選択される化学物質によって官能化されることが更に好ましい。官能基として、本明細書で教示される様々なラジカル及び化学成分が挙げられ、アルケニル部分、例えばアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴアクリレート、オリゴメタクリレート、エタクリレート、イタコネート又はアクリルアミドが挙げられる。更なる官能基として、アルデヒドが挙げられる。他の官能基として、例えばアクリル酸又はメタクリル酸のアルキルエステル、例えばメチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ラウリルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ノニルアクリレート、ベンジルメタクリレート、同一の酸のヒドロキシアルキルエステル、例えば２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、及び２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、同一の酸のニトリル及びアミド、例えばアクリロニトリル、メタクリロニトリル、及びメタクリルアミド、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、塩化ビニリデン、塩化ビニル及びビニル芳香族化合物、例えばスチレン、ｔ−ブチルスチレン及びビニルトルエン、ジアルキルマレイン酸、ジアルキルイタコン酸、ジアルキルメチレン−マロン酸、イソプレン、及びブタジエンを含むエチレン性不飽和モノマーが挙げられ得る。カルボン酸基を含有する好適なエチレン性不飽和モノマーとして、アクリルモノマー、例えばアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチルイタコン酸、モノエチルイタコン酸、及びモノブチルイタコン酸を含むモノアルキルイタコン酸、モノメチルマレイン酸、モノエチルマレイン酸、及びモノブチルマレイン酸を含むモノアルキルマレイン酸、シトラコン酸、並びにスチレンカルボン酸が挙げられる。好適なポリエチレン性不飽和モノマーとして、ブタジエン、イソプレン、アリルメタクリレート、アルキルジオールのジアクリレート、例えばブタンジオールジアクリレート及びヘキサンジオールジアクリレート、ジビニルベンゼン等が挙げられる。アミノ酸鎖がメタクリロイル基で官能化されることが好ましい。
【００１５】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、フリーラジカルの存在下での重合又は架橋が可能な化学物質によるゼラチンポリマーの酸性側鎖の官能化の程度は、リジン残基の１０％〜１００％、好ましくは２０％〜１００％、より好ましくは３０％〜１００％、より好ましくは４０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％、より好ましくは６０％〜１００％、より好ましくは７０％〜１００％、より好ましくは８０％〜１００％、より好ましくは９０％〜１００％である。更に好ましい実施の形態では、官能化の程度は約９０％である。
【００１６】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態では、界面活性剤は、ＳＤＳ、ｔｗｅｅｎ２０、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（商標）Ｐ  １８８（Sigma-Aldrich）等からなる群から選択される。
【００１７】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態では、重合開始剤は、好ましくは約０．０１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の濃度のＩｒｇａｃｕｒｅ（商標）２９５９［Ciba specialty chemical、現BASF Resins）等の光重合開始剤である。本発明において、「重合開始剤」は、例えばフリーラジカルの発生によって、モノマー又はマクロマーの重合を開始することができる任意の物質を指す。重合開始剤は多くの場合酸化剤である。例示的な重合開始剤として、例えば、電磁放射又は熱への曝露によって活性化されるものが挙げられる。また、重合開始剤を使用することもでき、例えば、引用することにより全体が本明細書の一部をなす、米国特許出願公開第２０１０／０１３７２４１号に記載される。
【００１８】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態では、上記溶液を、架橋に先立って、１ミリ秒〜４時間、好ましくは１秒〜４時間、より好ましくは１分〜４時間、好ましくは１０分〜４時間、より好ましくは３０分〜４時間、より好ましくは４５分〜４時間、更に好ましくは約１時間〜約４時間、更に好ましくは約１時間〜約３時間の間隔で、−５℃〜１５℃の温度で予備処理する。
【００１９】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施の形態では、ゼラチンポリマーは、サルモ属又はオンコリンクス属に由来し、該ゼラチンポリマーはサケに由来することが好ましい。
【００２０】
本発明の第２の態様は、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含み、任意に光重合開始剤等の重合開始剤を更に含む溶液を含み、化学的に官能化されてフリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となる組成物を製造する方法であって、
ａ．低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを得て、それを溶媒に最終濃度１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）まで溶解する工程と、
ｂ．フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となり得る化学物質を工程ａ）の溶液に添加することによって、工程ａ）のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーの一次構造を化学的に修飾する工程と、
ｃ．工程ｂ）の溶液から全ての未反応の化学物質を除去する工程と、
ｄ．任意に、光重合開始剤等の重合開始剤及び／又は界面活性剤を上記溶液に添加する工程と、
を含む、方法に関する。
【００２１】
本発明の第２の態様の好ましい実施の形態では、上記アミノ酸鎖は、メタクリロイル基又はアクリロイル基からなる群から選択される化学物質によって官能化される。
【００２２】
本発明の第２の態様の別の好ましい実施の形態では、上記方法は、
ａ．低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを得て、それを溶媒に最終濃度１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）まで溶解する工程と、
ｂ．工程ａ）の溶液に無水メタクリル酸を添加することによって、工程ａ）のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーの一次構造を化学的に修飾する工程と、
ｃ．工程ｂ）の溶液から全ての未反応の無水メタクリル酸を除去する工程と、
ｄ．任意に、光重合開始剤等のラジカル発生重合開始剤及び／又は界面活性剤を添加する工程と、
ｅ．任意に、適用可能であれば、工程ｃ）又は工程ｄ）から得られた組成物を濾過し、凍結乾燥する工程と、
を含む。
【００２３】
本発明の第２の態様の別の好ましい実施の形態では、上記方法は、化学的に修飾されたアミノ酸鎖及び光重合開始剤を含む溶液を、光重合開始剤の性質に応じて、光、可視光、ＵＶ光又は赤外線に対して曝露して架橋された組成物を提供することを更に含む。
【００２４】
本発明の第３の態様は、本発明の第２の態様のいずれかの方法によって得られる又は得られうる溶液に関する。
【００２５】
本発明の第４の態様は、本発明の第２の態様で定義される化学的に修飾されたアミノ酸鎖を含む溶液を、重合開始剤の性質に応じて、光、可視光、ＵＶ光、赤外線に対する重合開始剤、より詳しくは光重合開始剤に曝露して架橋された組成物を提供することによって得られる、又は得られうる、架橋された組成物に関する。
【００２６】
本発明の第５の態様は、３Ｄプリンティング、押出しシステム（付加製造技術）、スプレーシステム、キャスティング、マイクロ及びナノファイバー製造システム（電界紡糸、溶液ブロー紡糸）、又は微少流体素子における、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で、低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含む、溶液の使用に関する。
【００２７】
本発明の第６の態様は、３Ｄプリンティング、押出しシステム（付加製造技術）、スプレーシステム、キャスティング、マイクロ及びナノファイバー製造システム（電界紡糸、溶液ブロー紡糸）、又は微少流体素子における、本発明の第１の態様に定義される、又は本発明の第３の態様に定義される組成物の使用に関する。
【００２８】
本発明の第７の態様は、治療又は診断の目的に適したスキャフォルド、ビーズ、培養組織、又はデバイス及びマイクロデバイスの製造における、本発明の第１の態様に定義される、又は本発明の第３若しくは第４の態様に定義される組成物の使用に関する。
【００２９】
本発明の第８の態様は、食品コーティングにおける、本発明の第１の態様に定義される、又は本発明の第３若しくは第４の態様に定義される組成物の使用に関する。
【００３０】
本発明の第９の態様は、食品コーティングにおける、又は治療若しくは診断の目的に適したスキャフォルド、ビーズ、培養組織若しくはデバイス及びマイクロデバイスの製造における、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）、好ましくは５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度で、低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含む溶液の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】１００ｓ−１ずり流れで測定した粘度の図である。２５℃において、濃度の増加は、サケメタクリル化ゼラチンと比較してウシメタクリル化ゼラチンの場合により一層の粘度の増加を与えた。０．０２Ｐａ・ｓは、２０センチポアズに等しい。全ての生体材料は、実施例で説明されるのと同じレベルの化学官能化を有した。
【図２】ゲル化温度の図である。Ｇ’として示されるずり弾性率又は剛性率は、生体材料のゲル化の間に増加する。非メタクリル化サケゼラチン（ＳＧ）と比較して、１５％（重量／体積）の濃度のメタクリル化サケゼラチン（ＳＧ８）はそのゲル化温度を減少させる。この図で示される他の曲線は、セルロースナノウイスカー（ＣＮＷ）等のフィラー分子を含む複合材料に対応し、同様のゲル化／温度の相関であるが、より高いずり弾性率を示す。
【図３】ずり流れの変化に応じた流体の粘度の変化の図である。ウシゼラチンは流体の非ニュートン挙動に典型的なずり減粘効果を示すのに対し、サケゼラチンについては、ニュートン挙動が観察される（ずり流れを増加させることの結果として粘度の変化がない）。
【図４】ずり流れの変化に応じた流体の粘度の変化の図である。ウシ又はサケに由来するメタクリレートゼラチンを比較すると、サケは種々のずり流れでより一層低い値を示した。メタクリル化サケゼラチンは、５％（体積／重量）の濃度を除いて、種々の濃度でニュートン挙動を示した。一方、試験した全ての濃度のメタクリレート化ウシゼラチンは非ニュートン挙動を示した。
【図５】１０％の濃度のリジンアミノ酸が８０％官能化されたメタクリレート化ウシゼラチンの光架橋（０．５％光重合開始剤）ヒドロゲルの圧縮弾性率（左端）、並びに同じ濃度であるが、（右から順に）官能化が２０％（赤色）、６０％（緑色）、７８％（橙色）及び８５％（紫色）のサケゼラチンに基づくヒドロゲルとの比較の図である。
【図６】１０％の濃度のリジンアミノ酸が８０％官能化されたメタクリル化ウシゼラチンの光架橋（０．５％光重合開始剤）ヒドロゲルの圧縮弾性率（左端）、並びに同じ濃度であるが、（右から順に）７８％官能化されたサケゼラチンに基づくヒドロゲル（紫色）、及び４℃で２時間冷却予備処理した７８％官能化（黄色）との比較の図である。
【図７】引張りヤング率の図である。種々の程度のリジン基の官能化（６０％、７８％及び８５％）を有する架橋メタクリル化ゼラチン（ＣＭＧ）ヒドロゲルの引張り試験をサケ起源とウシ起源で比較して試験した。サケゼラチンについてはわずかに高い値で同様の結果を観察した。
【図８】２４時間中のカプセル化された因子の送達速度の図である。１００ｎｇ／ｍｌの濃度のカプセル化された因子（ＶＥＧＦ）を有する１０％（体積／重量）の濃度の８０％官能化されたメタクリル化サケゼラチンのヒドロゲルを３７℃にて細胞培養培地中でインキュベートした。種々の濃度のＩＩ型コラゲナーゼ（Whortington）を使用し、ＶＥＧＦの上清への送達速度を評価した。移植片は、送達されたＶＥＧＦ及びサケゼラチンの可溶性ポリマーの濃度を示す。
【図９】製造業者の使用説明書に従ってＷＳＴ−１細胞増殖比色測定キット（Ｋ３０２、米国のBiovision）を使用して、架橋生体材料にカプセル化されたＨＵＶＥＣの細胞増殖評価を行った図である。簡潔には、このアッセイは、細胞ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによってホルマザンを生成するＷＳＴ−１の代謝性切断を定量する。ここで、１０％（体積／重量）の濃度の（リジン側鎖が）７８％官能化されたメタクリル化ウシゼラチンのヒドロゲルの比較を、１０％（体積／重量）の濃度の２０％官能化（Ｎａｔ−Ｂｉｏ  １）、６０％官能化（Ｎａｔ−Ｂｉｏ  ２）、７８％（Ｎａｔ−Ｂｉｏ  ３）及び８５％（Ｎａｔ−Ｂｉｏ  ４）のメタクリル化サケゼラチンと比較した。
【図１０】架橋ヒドロゲルの免疫原性、及びサケとウシとの間の比較の図である。２０％の官能化（ウシ０．５、サケ０．５）又は７８％の官能化（ウシ５、サケ５）を伴う、１０％（体積／重量）の濃度のサケ及びウシのゼラチンヒドロゲルを作製し、マウス（Ｃ５７ｂｌ／６）の皮下に埋め込んだ。１４日後、マウス腋窩リンパ節から白血球を単離し、活性化物質である静止Ｔリンパ球抗ＣＤ３（ａＣＤ３）の不在下又は存在下で、ウシ及びサケのゼラチン（Ｈｉｄｒｏ）を培養した。サケ及びウシのヒドロゲルの免疫応答性を定量するため、炎症因子としてＩＬ−６及びＩＦＮを測定した。これらの結果は、サケと比較して、ウシのより高い免疫応答性を示した。
【図１１】３週後のサケヒドロゲルの皮下埋め込みは、ヒドロゲル内の完全な血管新生、すなわち、周囲のマウス細胞からの細胞浸潤を示した。矢印は、埋め込まれたヒドロゲル内部の血管を示す。これらの結果は、ヒドロゲルの非常に良好な組織統合を示した。
【図１２】皮膚を清潔にし、予備処理と抽出のため溶液を作製する過程の画像、及び１０℃の予備処理の間のインキュベーションの画像である。
【図１３】改質され凍結乾燥されたサケゼラチンの外観の図である。バイオインクを作製するため、これはリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中、種々の濃度で作製される製剤の基本成分である。
【図１４】サケゼラチンの官能化及び改質サケゼラチンの架橋の模式図である。
【図１５】基本的なバイオインク（８５％官能化された、１０％（重量／体積）の濃度のＭＳＧ）に組み込まれる、実験室で作製されたセルロースナノウイスカーの原子間力顕微鏡検査（ＡＦＭ）によって得られた画像である。これらの細菌セルロースナノウイスカーは、チリ大学のFranck Quero教授の監督下で作製された。
【図１６】メタクリロイルによってリジンの８０％が官能化された改質サケゼラチンの架橋ヒドロゲルにカプセル化された細胞の顕微鏡画像である。
【図１７】リジン官能化２０％及び８０％（それぞれ、０．５及び５と称する）のレベルまで改質されたウシ及びサケのゼラチンに基づく７日間のヒドロゲルインプラントを有するＣ５７ＢＬ／６マウスの図である。７日後に外植されたヒドロゲルは、明らかな血管灌注が存在することがわかった。改質２０％サケヒドロゲルはより高いレベルの組織統合及びそのリモデリングを有し、この組織がマウス背部に明らかに存在することが観察されなかったことから、外植することができなかった。
【図１８】改質ゼラチン中の第一級アミンの定量の図である。化学的官能化反応に添加された無水メタクリル酸の量はパーセンテージで表され、ここで、１０％（重量／体積）の濃度でグラム単位の所定量の無水メタクリル酸をゼラチン（ウシ又はサケ）溶液１００ｍｌに添加する。各ゼラチンのリジン官能化のパーセンテージは、同じゼラチンであるが官能化されていないものに関して、ＯＰＡ法によって定量不可能なリジンのパーセンテージとして計算される。
【図１９】メタクリロイル基による種々のレベルのリジン官能化における改質されたサケ及びウシのゼラチンから形成されるヒドロゲルに対するヤング率及び圧縮弾性率の図である。全てのヒドロゲルを１０％（重量／体積）ゼラチン溶液から製造し、同じ線量（３６５ｎｍ、２分間に亘って８００ｍＷ／ｃｍ２）で照射した。０．５％＝２０％官能化；２％＝６０％官能化；５％＝８０％官能化；１０％＝９０％官能化。
【図２０】幾何学的形状の測定の図である。（ａ）ダブルギャップ、（ｂ）コーン−プレート、（ｃ）プレート−プレート。
【図２１】ダブルギャップジオメトリ（ａ、ｂ）及びコーン−プレートジオメトリ（ｃ、ｄ）で２５℃にて計算した、種々のずり速度での水（ａ、ｃ）及び１×ＰＢＳ（ｂ、ｄ）の粘度の図である。
【図２２】ダブルギャップジオメトリにより、サケゼラチンのニュートン挙動のより好適な説明、及び種々の測定間のより小さな変動を得ることが可能となることを示す図である。２５℃において、ダブルギャップジオメトリにより、ウシゼラチン試料とサケゼラチン試料との間の本質的な差を最も良好に観察することが可能となる。ウシゼラチンは、三重螺旋の形成がおよそ２５℃で観察されることから、ゲル状態にある。
【図２３】ダブルギャップジオメトリ（ａ、ｂ）及びコーンプレートジオメトリ（ｃ、ｄ）で算出された、２５℃でのずり速度によるサケゼラチン（ａ、ｃ）及びウシゼラチン（ｂ、ｄ）の粘度の図である。
【図２４】ダブルギャップジオメトリ（ａ）及びコーンプレートジオメトリ（ｂ）で算出された３７℃でのずり速度によるサケゼラチンの粘度の図である。
【図２５】官能化され、１００ｓ−１のずり速度で計算されたサケゼラチン（Ｎａｔ−Ｂｉｏ＝８５％のリジンが官能化されたサケゼラチン）及びウシゼラチンの粘度の図である。境界区域はポリジェット機器によって許容される粘度値に対応する。平均及びそれぞれの標準偏差を得るため、各実験を３回繰り返して行った。
【図２６】ＣＮＷで補足された基本的なバイオインク製剤に対する温度スキャンにおける貯蔵弾性率（貯蔵弾性率）、及びサケゼラチンのずり速度による粘度の図である。ＳＧ＝サケゼラチン；ＳＧ８＝メタクリロイル基により８５％のリジンが官能化された改質サケゼラチン；ＣＮＷ＝セルロースナノウイスカー。
【図２７】３７℃でのずり速度による３％重量／重量（ａ、ｃ）及び５％重量／重量のＣＮＷを含む、改質サケゼラチン化合物（ａ、ｂ）及び非改質ゼラチン（ｃ、ｄ）の粘度の図である。
【図２８】（ａ）１％の変形及び１Ｈｚの周波数の適用による、サケゼラチン（−●−）、８５％のレベルの官能化を有する改質サケゼラチン（−●−）、並びに３％（ＳＧ＿ＣＮＷ３−●−、ＳＧ８＿ＣＮＷ３−●−）及び５％（ＳＧ＿ＣＮＷ５−●−、ＳＧ８＿ＣＮＷ５−●−）のセルロースナノウイスカー（ＣＮＷ）でのサケゼラチン及び改質サケゼラチンに対する温度による貯蔵弾性率Ｇ’の図である。（ｂ）ａ）の曲線から外挿された種々のゼラチンに対する最大の貯蔵弾性率値の棒グラフである。
【図２９】メタクリロイル基の共有結合架橋を誘導する前に、ゲル化（物理的架橋）を誘導する温度での予備処理によって改善される機械的特性を示す図である。結果を、ゲル化を誘導しない温度による予備処理と比較し、同時にウシゼラチンをサケゼラチンと比較した。「ウシ０．５ＬＴ」の場合は複製物が１個のみであるのに対し、その他の試料についてはｎ＝３であることに留意されたい。０．５＝リジンの２０％官能化；１０％＝リジンの９０％官能化。
【図３０】「ＷＳＴ−１細胞増殖比色測定キット」（Ｋ３０２、米国のBiovision）によって評価したカプセル化された細胞の増殖の図である。３つのＷＳＴ−１代謝定量複製物によって１条件当たり３回の実験を行った。ヒドロゲルを１×ＰＢＳ中の１０％（重量／体積）の濃度の改質ゼラチンの溶液から製造した。さらに、比較のため、８０％のリジン官能化を有するウシゼラチンヒドロゲル中のカプセル化を含んだ。Ｎａｔ−Ｂｉｏ１＝２０％官能化；Ｎａｔ−Ｂｉｏ２＝６０％官能化；Ｎａｔ−Ｂｉｏ３＝８０％官能化；Ｎａｔ−Ｂｉｏ４＝９０％官能化。
【図３１】ゼラチンヒドロゲルを埋め込んだ区域を灌注するリンパ腺に存在するリンパ球系細胞の特性評価の図である。サケ及びウシのゼラチンヒドロゲル、並びに種々のレベルの官能化（０．５＝２０％官能化；５＝８０％官能化）を比較する。２０％官能化のサケゼラチンヒドロゲルを除いて、埋め込み後７日目に種々の条件の間に有意差はなかった。データが予備データ（ｎ＝２）であることを考慮すると、外科的処置自体によって生成された炎症によるものであって、ヒドロゲルの存在の結果としてではないリンパ球系細胞の増加を除外するため、以下の実験を対照の外科的処置の存在下で行わなければならない。
【図３２】改質されたサケ又はウシのゼラチンの存在による炎症性サイトカインの産生の図である。ヒドロゲルを埋め込んだマウスのリンパ節から単離した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、改質されたサケ又はウシゼラチンの存在によってメモリーの炎症性誘導に供した。サケゼラチンと比較して、ウシゼラチンで刺激した場合により大きな免疫反応が観察され、官能化の程度がより低いゼラチンの場合により大きくなる。ナイーブ＝埋め込みをされていないマウス；ｓｅ＝刺激なし；ａＣＤ３＝通常の（刺激）Ｔ細胞活性化因子；０．５＝２０％官能化ゼラチンヒドロゲルを埋め込んだマウスのリンパ節に由来するリンパ球；５＝８０％官能化ゼラチンヒドロゲルを埋め込んだマウスのリンパ節に由来するリンパ球；Ｈｙｄｒｏ＝ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物における改質されたゼラチンによるメモリー刺激、２０％又は８０％で刺激；ＩＬ−６＝インターロイキン６；ＩＦＮガンマ＝インターフェロンガンマ。炎症応答は、炎症因子（ＩＬ−６、ＩＦＮガンマ）の産生と関連する。
【図３３】種々のレベルのリジン官能化（メタクリロイル基による官能化）での改質されたウシ及びサケゼラチン系ヒドロゲルの外植片の組織学的画像である。２０％（０．５％）の官能化ゼラチン系ヒドロゲルの場合には、深い組織統合、細胞浸潤及び血管新生が観察されたのに対し、より高い官能化（８０％）については、細胞は、主にヒドロゲル周辺にとどまる。その２０％のリジンが官能化されたサケゼラチン系ヒドロゲルは、それらのリモデリングのレベルでは回収することができなかった。その区域に移動した細胞の活性による生体材料の十分な組織統合又は急速な分解が仮定される。
【図３４】改質ゼラチン系ヒドロゲルの浸潤アッセイの図である。これらの画像は、これらのアッセイの陰性対照（左）及び陽性対照（右）に対応する。特に、上部及び底部のチャンバーを分割する多孔質膜上で１ｍｍのヒドロゲルの層を形成することにより、これらのアッセイをトランスウェル装置で行う。２．４％濃度の溶液に由来する改質ゼラチンからヒドロゲルを形成する。アッセイ後、多孔質膜の底面に遊走した細胞は、青く染色される。陰性対照を、上部と底部の両方のチャンバーにおいて、遊走誘導物質の存在下で行う（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）。陽性対照を、底部チャンバーのみで遊走誘導物質の存在下で行う。
【図３５】官能化されていないサケゼラチン（Ｇ．Ｓ．）及び官能化されていないウシのゼラチン（Ｇ．Ｂ．）のゲル強度の図である。
【図３６】種々のずり速度での粘度測定の図である。ａ）２５℃で維持した１５％［ｐ／体積］濃度のサケゼラチン溶液。ｂ）２５℃で維持した１５％［重量／体積］濃度のウシゼラチン溶液。ｃ）３つの異なる濃度（５％、１０％、１５％［重量／体積］）で調製し、２５℃で維持した、メタクリロイル基で９０％のリジンが官能化されたサケゼラチンの溶液。ｄ）３つの異なる濃度（５％、１０％、１５％［重量／体積］）で調製し、２５℃で維持した、メタクリロイル基で９０％のリジンが官能化されたウシゼラチンの溶液。注：９０％メタクリル化サケゼラチンの場合、粘度が非常に低く、特に０．１ｓ−１〜１０ｓ−１の機器の検出限界のため、不正確な測定が生じた。エラーバー＝ＳＤ、ｎ＝３実験。
【図３７】９０％のリジンアミンにおけるメタクリロイル官能化の程度を有するサケ及びウシのゼラチンに対するずり流れにおける１００ｓ−１での粘度測定に対するサマリグラフである。エラーバー＝ＳＤ、ｎ＝３実験。
【図３８】ａ）サケ及びウシのゼラチンに由来するヒドロゲルの平均圧縮弾性率のグラフによる比較−ＤＭＡで試験を行った。ｂ）サケ及びウシのゼラチンに由来するヒドロゲルの引張り試験から得た平均ヤング率のグラフによる比較−機械試験装置を使用して試験を行った。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（マン−ホイットニー）、ｎ＝５〜６。
【図３９】２型コラゲナーゼによるヒドロゲル加水分解の反応進行曲線の図である。種々の供給源のゼラチンに由来し、官能化の程度が類似するヒドロゲル間の相対的な加水分解速度（ａ）〜（ｃ）。同じゼラチン供給源に由来するが、官能化の程度が異なるヒドロゲル間の相対的な加水分解速度（ｄ）及び（ｅ）。加水分解反応を３７℃にて３回繰り返して行った。Ｂ２Ｍ、Ｂ５Ｍ、Ｂ１０Ｍは、０．５、２及び１０のＭＡＡ［％体積／体積］の官能化反応に供されたゼラチンで製造されたヒドロゲルを表す。Ｂはウシを表し、Ｓはサケを表す。３回の加水分解反応をこの実験に対して行った。エラーバー＝Ｓ．Ｅ．
【図４０】ａ）ＯＰＡアッセイを使用する、サケゼラチン（ＳＧ）及びウシゼラチン（ＢＧ）中の遊離のアミンの相対的定量、並びにアミノ酸組成分析に基づくＳＧとＢＧとの間のリジンの相対的定量の図である。ｂ）ＳＧ及びＢＧのポリペプチドの分子量ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の図である。ウシの定量に対してパーセンテージを計算した。アミノ酸組成分析を２回繰り返して行い、ＯＰＡ分析を３回繰り返して行った。
【図４１】ＯＰＡ法を使用する、遊離アミンの測定に基づく、官能化リジンの定量の図である。０．５％（体積／体積）、２％（体積／体積）、５％（体積／体積）及び１０％（体積／体積）のＭＡＡで補足した１０％ゼラチン溶液を使用して、サケゼラチン（ＳＧ）及びウシゼラチン（ＢＧ）を無水メタクリル酸（ＭＡＡ）と反応させた。同じバッチの官能化ゼラチンを使用して、ＯＰＡアッセイを３回行った。エラーバー：Ｓ．Ｄ．
【図４２】種々の程度のメタクリロイル置換におけるウシ（ａ）及びサケ（ｂ）のゼラチンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの図である。０．５％（体積／体積）（すなわちＳ０．５Ｍ）、２％（体積／体積）、５％（体積／体積）及び１０％（体積／体積）のＭＡＡで補足した１０％ゼラチン溶液を使用して、サケゼラチン（ＳＧ）及びウシゼラチン（ＢＧ）を無水メタクリル酸（ＭＡＡ）と反応させた。「ａ」シグナルはフェニルアラニンに対応し、ピーク積分の正規化に使用した。「ｂ」シグナル（２．９ｐｐｍ）はリジンメチレンに対応し、その減少はリジン官能化と関連する。「ｃ」シグナル（１．８ｐｐｍ）はメタクリロイル基の存在と関連する。相対的な定量のため、スペクトルの正規化をフェニルアラニンシグナル（６．９ｐｐｍ〜７．５ｐｐｍ、スペクトル中の「ａ」ピーク）を使用して行った。
【図４３】各ゼラチン調製物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを使用する、リジンメチレンシグナルの減少の計算に基づく、官能化リジンの定量の図である。０．５％（体積／体積）、２％（体積／体積）、５％（体積／体積）及び１０％（体積／体積）のＭＡＡで補足した１０％ゼラチン溶液を使用して、サケゼラチン（ＳＧ）及びウシゼラチン（ＢＧ）を無水メタクリル酸（ＭＡＡ）と反応させた。研究全体で試験した同じバッチの官能化ゼラチンを使用して、特有のＮＭＲ実験及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルからメタクリル化の程度を得た。
【図４４】新たな製剤の機械試験及びレオロジー試験の図である。ａ）圧縮試験及びｂ）レオロジー試験を、１％及び５％［重量／重量］の８アーム−ＰＥＧ１０Ｋ−アクリレートトリペンタエリスリトールで補足した、架橋されたＳＧ８製剤（９０％官能化された１５％［重量／体積］サケゼラチン）に対して行った。
【図４５】架橋反応性及び吸湿性の手作業による定性的試験の図である。ａ）反応性及び吸湿性について手作業で試験した、１００μｍ厚のヒドロゲルの写真である。反応性を、プリンターヘッドからＵＶ光を２回及び４回透過させた後の架橋されていないヒドロゲルの存在によって評価した。機械的引っ掻きの後、液体溶液のみ＝架橋されていない。機械的引っ掻きの後、液体溶液及び塊状のヒドロゲル＝部分的に架橋。機械的引っ掻きの後、実質的なヒドロゲルのみ＝架橋。吸湿性を、機械的引っ掻きの後に転置された（displaced）溶液及びヒドロゲルの体積によって評価した。水和、低水和及び乾燥の３つのレベルがあり、それぞれ、おおまかには転置されたヒドロゲル容量５０μｌ、転置されたヒドロゲル容量２５μｌ、及び転置された容量がないことによって特徴づけられる。ｂ）引っ掻き又はヒドロゲル転置プロトコルのスキームである。
【図４６】種々のタイプ及び量の界面活性剤で補足した、マスター製剤（９０％で官能化されたサケゼラチンの１５％［重量／体積］溶液（ＳＧ８））の表面張力の図である。改質サケゼラチン及び界面活性剤の濃度は、重量／体積％及び体積／体積％としてそれぞれ表される。エラーバー＝ＳＤ、ｎ＝３実験。結果は、ａ）３００ｓの平衡後の静的表面張力、及びｂ）動的表面張力の導関数として示される。
【図４７】新たな製剤に基づくヒドロゲルにカプセル化された細胞に対する細胞生存率の図である。
【図４８】種々のｐＨ条件で抽出されたサケゼラチンに対する電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥの図である。
【図４９】種々のｐＨ条件で抽出されたサケゼラチンに対するゲル強度（ブルーム、ｇ）の図である。
【図５０】種々のｐＨ条件で抽出されたサケゼラチンに対する温度（フロー温度勾配によって試験した）の関数としての粘度の図である。
【図５１】種々のｐＨ条件で抽出されたサケゼラチンに対するラマンスペクトルの図である。
【図５２】Ａ）冷却予備処理及び光架橋に供した際のゼラチンポリマー及びその構造修飾のグラフィック描写の図である。温度減少及び続く光誘導性共有結合型の連結を経た構造固定による、三重螺旋形成を示す。Ｂ）予備冷却に供した場合の様々なメタクリル化の程度を有するサケゼラチンの１５％（重量／体積）溶液の圧縮弾性率試験の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
定義
本明細書で使用される「低温適応海洋種の天然資源」は、生物学的化合物、特に、海洋の寒冷環境に生息又は適応している生物種から抽出されるゼラチンとして理解される。そのため、これらの種類の化合物、特に低温適応ポリマーは、より低い温度で十分機能するための特殊な特性を獲得する。これらの特性のうちの幾つかは、哺乳動物に由来する化合物と比較して特定の濃度でのより低い粘度、より低いゲル化温度、より低い温度での液体状態安定性、溶液の場合のより低い表面張力、及びより高い分子の運動性又は柔軟性である。
【００３３】
本明細書で使用される「化学的に官能化された」は、化学基が化学反応又は生化学反応によってそれらの化学構造に付加されている、化合物、生体化合物、又はポリマーとして理解される。化学基が化学反応又は生化学反応の間に付加され得る位置は、元の化学構造に存在する化学基の反応性によって決定され得る。さらに、化合物又はポリマーを、官能化を構成する新たな化学基に対するアクセスを与えるため、それらの化学構造中に反応基を付加するように先に処理してもよい。
【００３４】
本明細書で使用される「アクリロイル基」は、Ｈ２Ｃ＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−の構造を有するエノンの形態であり、アクリル酸に由来するアシル基である。上記基に対する好ましいＩＵＰＡＣ名は、プロパ−２−エノイルであり、また（幾分正確性に欠けるが）アクリリル又は単にアクリルとして知られている。アクリロイル基を含む化合物は「アクリル酸化合物」と称される場合がある。アクリル酸化合物は、典型的にはα，β−不飽和カルボニル化合物であり、炭素−炭素単結合で分けられる、炭素−炭素二重結合及び炭素−酸素二重結合（カルボニル）を含むことから、両方の官能基に特徴的な特性:
Ｃ＝Ｃ結合において：酸及びハロゲンの求電子付加、水素化、ヒドロキシル化、並びに結合の切断、
Ｃ＝Ｏ結合において：求核置換（エステル等において）又は求核付加（ケトン等において）、
を持つ。
【００３５】
アクリル酸のカルボキシル基は、アンモニアと反応してアクリルアミドを形成し得る、又はアルコールと反応してアクリレートエステルを形成し得る。
【００３６】
本明細書で使用される「化学光重合開始剤」は、光の刺激又は適用の後に共有結合を破壊して、１個、２個又はそれよりも多いラジカルを形成してラジカル重合を支援する、化学物質又は分子として理解される。
【００３７】
本明細書で使用される「アミノ酸鎖ゼラチンポリマー」は、ペプチド結合によって共に接続された一連のアミノ酸モノマーとして理解される。しかしながら、特定の配列としてのこの結合されたアミノ酸の鎖は、Ｉ型コラーゲンの配列に対応するアミノ酸同一性を有し、抽出処理の後、これらのコラーゲンポリマーは、抽出条件に応じて幾つかのアミノ酸修飾及び一定の配列の短縮を受ける。このように、ゼラチンは部分的に加水分解され、変性されたコラーゲンとして理解される。
【００３８】
本明細書で使用される「アミノ酸側鎖の官能化の程度」は、ペプチド、ポリペプチド、或いは化学的修飾の結果、それらの元の化学構造に化学基が付加されている共有結合されたアミノ酸の配列を含むアミノ酸の総数からのアミノ酸の数として理解される。
【００３９】
本明細書で使用される「冷却予備処理」は、化合物又はポリマーが室温よりも低い温度、およそ２１℃未満でのインキュベーションに供される、方法の１工程として理解される。
【００４０】
本明細書で使用される「溶液」は、２以上の物質で構成される均質な混合物である。かかる混合物では、溶質は、溶媒として知られる別の物質に溶解された物質である。その溶液は、多かれ少なかれその相を含む溶媒の特徴を呈し、溶媒は一般的には混合物の主な画分である。溶液中の溶質の濃度は、塩のように、どれだけの溶媒が存在するのかに関して、その溶質が溶媒にどれだけ溶解されているのかの尺度である。
【００４１】
本明細書で使用される「３Ｄプリンティング」は、層の生成による積層の（layer）連続工程で通常作り出される、３次元構造の作製方法として理解される。カービングが元の固体から材料を取り除くことにより特徴を再現し、作りだされた構造物の全てが外部からアクセス可能であるのに対して、３Ｄプリンティングは構造物の周辺境界からアクセス可能である又はアクセス可能でない特定構造を作り出すことから、カービングとは区別される。
【００４２】
本明細書で使用される「押出しシステム（付加製造技術）」は、表面上に材料を堆積させるため、圧力を加えることでノズルに材料を通過させることができるシステムとして理解される。
【００４３】
本明細書で使用される「スプレーシステム」は、小さく広がった粒子又は液滴を作り出すため、圧力を加えることによって、特別に設計されたノズルに材料を押し通すことができるシステムとして理解される。
【００４４】
本明細書で使用される「キャスティング」は、硬化、重合又は架橋の後に充填材料から特定の形状を再現するため、予め作製されている型を充填する方法として理解される。
【００４５】
本明細書で使用される「マイクロ及びナノファイバー製造システム（電界紡糸）」は、より固い状態のポリマーのナノ及びマイクロファイバーの堆積物を生成する、押出しノズルと材料堆積の帯域との間に形成される強電場においてポリマー溶液を押出すシステムとして理解される。「電界紡糸」の用語は、当該技術分野で知られており、帯電したポリマージェットがアースされたコレクタに収集される方法であり、急速に回転するコレクタは、整列したナノファイバーをもたらすのに対し、静止しているコレクタは、ランダムに配向されたファイバーマットをもたらす。ポリマージェットは、印加された静電荷が溶液の表面張力を超える場合に形成される。臨界絡み合い濃度と称される、所与のポリマーに対する最小濃度が存在し、その濃度を下回ると、安定なジェットを達成することができず、ナノファイバーは形成しないが、ナノ粒子が達成され得る（エレクトロスプレー）。安定したジェットは２つのドメイン、すなわちストリーミングセグメント（streaming segment）及びホイッピングセグメント（whipping segment）を有する。ホイッピングジェット（whipping jet）は通常、肉眼では見えないが、ストリーミングセグメントは多くの場合適切な照明条件下で目に見える。長さ、厚み、流れの一貫性及び動きを観察することは、形成されているナノファイバーのアラインメント及び形態を予測するのに有用である。溶液の組成及び電界紡糸装置の配置を調整し、それにより製造されるファイバーのアラインメント及び形態を最適化することによって上記流れを最適化することができる。本明細書で使用されるポリマーを電解紡糸する任意の既知の方法を本発明の方法と共に使用して、本明細書に開示される多機能の生体材料を提供することができる。
【００４６】
本明細書で使用される「微少流体素子」は、マイクロメートルサイズのチャネルの回路で構成され、チャネル内で流体が灌流されて、概ね層流（並列ベクトルを有するフロー及び乱れのないフロー（non-turbulent flows））が形成される、デバイスとして理解される。
【００４７】
発明の詳細な説明
既に述べたように、バイオ医学分野では、治療又は診断の適用の結果に影響を及ぼす多くの物理化学的特性及び生物学的特性が要求される。これらの特性の幾つかは、細胞成分の微小環境の制御、及び生体材料と特定の生体応答において得られる細胞との直接的な相互作用、及び細胞生物活性に応じた生体材料の活発なリモデリングに関する。また、これらの特性は、生物学的に意味のある成分の制御送達、細胞適合性、生理活性及び生分解性としても列挙される。一方、食物分野では、カプセル化ビタミン又は他の活性化合物の補給のため、スプレーシステム又はビーズ製造等の食品コーティングの成膜の特殊化されコスト効率の良い技術が必要とされている。残念ながら、これらの分野はいずれも、最適以下のレオロジーの性質及びこれまで使用されている大多数の生体材料の重合／架橋の制御に起因して、実施が制限される。したがって、これらの技術で使用される新たな生体材料が至急必要とされている。結果的に、生物医学及び食物における最適な適用に対して所望の幾何学的形状、生物学的特性及び物理学的特性を有する、構造上複雑なスキャフォルドを作り出すことができる、新規で非常に生物学的に活性な生体材料が現在も必要とされている。
【００４８】
本発明は、低温適応海洋種、特にサルモ属及びオンコリンクス属の天然資源に由来し、フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となるように化学的に官能化されたアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを含む組成物（以下、「本発明の組成物」）を提供することによって上の課題を解決する。官能化の性質は多様となり得て、メタクリロイル基からアクリロイル基を含む（発明の概要を参照されたい）。生体材料のかかる化学的官能化は、かかる化学的に官能化されたヒドロゲルをフリーラジカルに供する場合の、より固い熱安定性のヒドロゲルへの重合又は架橋の素早い制御を提供する。さらに、驚いたことに、かかる官能化は、以下に説明されるように生体材料のレオロジー特性を改質する。
【００４９】
かかるレオロジー特性を説明するため、本発明者らは、約０．０１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の濃度の（特定の波長の強い光の存在下でフリーラジカルを生成する）化学光重合開始剤を添加した、約１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度のメタクリロイルサケゼラチンの溶液を含む、本発明の組成物の基本製剤を製造した。種々のアミノ酸側鎖、特にリジンにおける化学的官能化の程度は、１％〜１００％であってもよい。この溶液の重合又は架橋は、光による曝露によって誘導される。また、本発明者らは、約０．０１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の濃度の（特定の波長の強い光の存在下でフリーラジカルを生成する）化学光重合開始剤を添加した、約１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度のメタクリロイルウシゼラチンの溶液を含む更なる基本製剤を、比較例として製造した。また最後に、本発明者らは、約１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度の非メタクリロイルサケゼラチンの溶液も製造した。これらの溶液はいずれも、本明細書に詳述される実施例１〜実施例３に従って製造された。
【００５０】
図１に示されるように、２５℃において、メタクリロイルウシゼラチン溶液とメタクリロイルサケゼラチン溶液の両方のゼラチン溶液の濃度の増加があった。しかしながら、１００ｓ−１ずり流れで測定される粘度のかかる増加は、サケメタクリル化ゼラチンと比較して、ウシメタクリル化ゼラチンについてかなり高い増加を与えた。実際、約１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度のサケメタクリル化ゼラチンの溶液は、アミノ酸ポリマーを含む溶液に以下のレオロジー特性をもたらした。
２５℃での粘度：３センチポアズ〜２０センチポアズ。
３７℃での粘度：１．５センチポアズ〜８センチポアズ。
【００５１】
限定されないが、噴霧又は３Ｄプリンティング等のバイオファブリケーション技術の高性能の機能が、液体状態の生体材料のレオロジー特性に高度に依存することから、これらの粘度の値は、これらのバイオファブリケーション技術において特に有用である。
【００５２】
ゲル化温度について、図２に示されるように、１５％（重量／体積）の濃度のメタクリル化サケゼラチン（ＳＧ８）は、非メタクリル化サケゼラチン（ＳＧ）と比較して、そのゲル化温度を減少させることから、メタクリル化サケゼラチンをより広い範囲の温度においてより流動学的に安定させる。さらに、図２に説明される他の曲線は、セルロースナノウイスカー（ＣＮＷ）等のフィラー分子を含む複合材料に対応する。かかる複合材料は、同様のゲル化／温度の相関を示したが、より高いずり弾性率を示した。かかるより高いずり弾性率は、これらの組成物を、インクジェットバイオプリンティング法に対して更に好ましくないものとする。
【００５３】
さらに、ずり流れの変化に応じた流体の粘度の変化が図３に示されるように、ウシゼラチンは、流体の非ニュートン挙動に典型的なずり減粘効果を示し、一方、サケメタクリル化ゼラチンについては、ニュートン挙動が観察される（ずり流れを増加させることの結果として粘度が変化しない）。特に、５％〜２０％のメタクリロイルサケポリマーの濃度範囲において、上記溶液は、ニュートン溶液として作用した。
【００５４】
さらに、図４に示されるように、ウシ又はサケから得られたメタクリル化ゼラチンを比較すると、サケは、種々のずり流れにおいてより一層低い粘度の値を示した。さらに、メタクリル化サケゼラチンは、種々の濃度でニュートン挙動を示した。一方、試験した全ての濃度のメタクリル化ウシゼラチンは、非ニュートン挙動を示した。
【００５５】
さらに、表面張力はここまで行なわれた実験では算出されていないが、０．０１％から最大５％の濃度の界面活性剤を添加することは、メタクリル化サケゼラチンの粘度又はニュートン挙動を変化させないことに留意されたい。これは、生体材料溶液の表面張力が、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（商標）Ｐ  １８８（Sigma-Aldrich）等の界面活性剤を添加することによって制御され得ることを意味する。
【００５６】
高性能インクジェット（ポリジェット、ストラタシス）等の３ｄプリンティング技術では、２０センチポアズ超の粘度を有する生体材料のプリントは、３Ｄプリンティング性能の質を著しく低下させる。上に示されるように、メタクリル化サケゼラチン溶液は、幅広い温度範囲で２０センチポアズ未満の粘度を有し、３Ｄプリンティング技術、及び幅広い温度範囲でかかる低粘度を必要とする他の用途（すなわち、食品コーティング用途における噴霧）においてこの溶液又は組成物を特に有用なものとしている。同様に、非ニュートン挙動又は高い表面張力を有する生体材料もバイオファブリケーション技術の質を低下させる。この点に関しては、メタクリル化サケゼラチン溶液は、上に示されるように、広範囲の濃度及び温度でニュートン溶液として作用した。
【００５７】
さらに、液体状態の安定性及び素早い重合は、３Ｄプリンティング等のバイオファブリケーション技術における別の重要な側面である。この意味で、室温に近いゲル化温度を有する生体材料は、プリント処理の間の生体材料のゲル化に起因して、これらのシステムにおいて深刻な有害作用をもたらし、最終的にはプリンターヘッドにおいてフロー回路（flow circuits）の閉鎖をもたらす。それらの機能がナノリットル及びマイクロリットルの層流の正確な制御に基づく微小流体システムにも同じ課題があてはまり、ここでは粘度及びゲル化事象のあらゆる変化がシステムにおけるフローの制御を妨げる。同様に、高度に粘性で、又は更に悪い場合はゲル化している生体材料を使用して、スプレーシステムを実施することはできない。
【００５８】
上記の全ての理由のため、フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となるように化学的に官能化される、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度の低温適応海洋種、好ましくはサルモ属及びオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを含む溶液は、バイオ医学応用において用いられる、又は食物分野における応用のための、３Ｄプリンティング、微小流体システム及びスプレーシステム等のバイオファブリケーション技術に特に適したレオロジー特性を有する組成物を提供する。
【００５９】
したがって、第１の態様では、本発明は、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度の低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含む溶液を含み、任意に光重合開始剤等の重合開始剤を更に含み、フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となるように化学的に官能化される、組成物を指す。
【００６０】
上に言及されるように、ゼラチンは、骨、皮膚、及び結合組織の主な線維性タンパク質の構成要素であるコラーゲンの部分加水分解によって得られる。コラーゲンの供給源は、ゼラチンの特性に影響することが当該技術分野で知られている。
【００６１】
低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーとして、例えば、低温適応海洋魚類種に由来する（例えば、その皮膚、骨、鰭及び／又は鱗に由来する）アミノ酸鎖ゼラチンポリマーが挙げられる。低温適応海洋魚類種の一覧として、タラ（例えば、ガドゥス・モルフア（Gadus morhua）又はガドゥス・マクロケパルス（Gadus macrocephalus））又はスケトウダラ（ガドゥス・カルコグラムス（Gadus chalcogrammus））等のガドゥス属、タイセイヨウサケ（サルモ・サラ（Salmo salar））等のサルモ属、カラフトマス（オンコリンクス・ゴルブスカ（Oncorhynchus gorbuscha））、マスノスケ（オンコリンクス・シャウイッシャ（Oncorhynchus tshawytscha））、シロザケ（オンコリンクス・ケタ（Oncorhynchus keta））、ギンザケ（オンコリンクス・キスッチ（Oncorhynchus kisutch））、サクラマス（オンコリンクス・マソウ（Oncorhynchus masou））、及びベニマス（オンコリンクス・ネルカ（Oncorhynchus nerka））を含むオンコリンクス属（タイヘイヨウサケ）、タラとしてガディダ科に属するコダラ（メラノグランムス・アレグレフィヌス（Melanogrammus aeglefinus））；並びにメルルーサ属のメンバーが挙げられる。Gomez-Guillen M C et al (Food Hydrocolloids 2011, 25(8) 1813-1827)によって言及されるように、この一覧は特に限定されず、ゼラチン抽出に適した魚類又は海洋種の数は増え続けている。
【００６２】
近年、魚類ゼラチンを構造的に及び機能的に特性評価することを目的とする幾つかの研究が行われ、例えば、Leuenberger BH:Food Hydrocolloids 1991, 5(4) 353-61、Lim et al: Food Science 1999, 64(4), 616-22、Choi and Regenstein Food Science 2000, 65(2), 194-9、Gilsenan PM et al: Food Hydrocolloids 2000, 14(3), 191-5、Gomez-Guillen MC et al: Journal of Science and Food Agriculture 2001, 81(7), 665-73、Haug IJ et al: Food Hydrocolloids 2004, 18(2), 203-13、Cho SM et al: Food Hydrocolloids 2005, 19(2), 221-9、Gomez-Guillen M C et al: Food Hydrocolloids 2011, 25(8) 1813-1827、Karim A A et al: Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576、及びBoran G and Regenstein JM, Adv Food Nutr Res. 2010;60:119-43を参照されたい（これらは引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００６３】
ゼラチンのアミノ酸組成は、その親コラーゲンのものに非常に近く、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレット（式中、Ｘは大半がプロリンであり、Ｙは大半がヒドロキシプロリンである）の反復配列を特徴とする。魚類ゼラチン、特に低温適応種は、哺乳動物種から単離されたゼラチンよりも低いプロリン及びヒドロキシプロリンの含有量を有することを特徴とする（Karim A A et al: Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576）。
【００６４】
全体として、魚類ゼラチンは、哺乳動物のゼラチンと比較して、より低濃度のイミノ酸（プロリン及びヒドロキシプロリン）を有し、温水魚（メバチ及びティラピア等）のゼラチンは、冷水魚（タラ、メルルーサ及びオヒョウ等）のゼラチンよりも高いイミノ酸含有量を有する（Eastoe & Leach, chemical constitution of gelatin. In A. G. Ward, & A. Courts (Eds.), The science and technology of gelatin (pp. 73-107). New York: Academic Press）。プロリン及びヒドロキシプロリンの含有量は、哺乳動物のゼラチンについてはおよそ３０％、温水魚（ティラピア及びナイルパーチ）のゼラチンについては２２％〜２５％、及び冷水魚（タラ）のゼラチンについては１７％である（Muyonga et al., Food Hydrocolloids. 2004, 18. 581-592）。これを説明するため、Karim A A et al (Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576）は、表２において、ブタゼラチンと比較して幾つかの魚類ゼラチンのアミノ酸含有量を示す（残基の数／１０００個のアミノ酸残基）。
【００６５】
特定の実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、本発明の低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーは、２０％以下、好ましくは１９％、１８％、１７％、１６％、又は１５％以下のプロリン及びヒドロキシプロリンの含有量を示すことを特徴とする。さらに、または代替的には、このアミノ酸鎖ゼラチンポリマーは、全アミノ酸残基１０００残基当たり５０残基〜６０残基のヒドロキシプロリン、及び全アミノ酸残基１０００残基当たり９５残基〜１１５残基のプロリンを示すことを特徴とする。
【００６６】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、ゼラチンポリマーはサルモ属又はオンコリンクス属に由来し、ゼラチンポリマーはサケに由来することが好ましい。
【００６７】
上記組成物は、５％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）濃度でアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを含むことが好ましい。上記組成物は、界面活性剤を更に含むことがより好ましい。上記組成物のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーは、メタクリロイル基、アクリロイル基、又はポリマーの形成、若しくは表面若しくは他の分子との反応を媒介することができる任意の官能基若しくは部分からなる群から選択される化学物質によって官能化されることが更に好ましい。官能基として、本明細書で教示される様々なラジカル及び化学成分が挙げられ、アルケニル部分、例えばアクリレート、メタクリレート、ジメタクリレート、オリゴアクリレート、オリゴメタクリレート、エタクリレート、イタコネート又はアクリルアミドが挙げられる。更なる官能基として、アルデヒドが挙げられる。他の官能基として、例えばアクリル酸又はメタクリル酸のアルキルエステル、例えばメチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ブチルメタクリレート、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、ヘキシルアクリレート、ｎ−オクチルアクリレート、ラウリルメタクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ノニルアクリレート、ベンジルメタクリレート、同一の酸のヒドロキシアルキルエステル、例えば２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、及び２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、同一の酸のニトリル及びアミド、例えばアクリロニトリル、メタクリロニトリル、及びメタクリルアミド、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、塩化ビニリデン、塩化ビニル及びビニル芳香族化合物、例えばスチレン、ｔ−ブチルスチレン及びビニルトルエン、ジアルキルマレイン酸、ジアルキルイタコン酸、ジアルキルメチレン−マロン酸、イソプレン、及びブタジエンを含むエチレン性不飽和モノマーが挙げられ得る。カルボン酸基を含有する好適なエチレン性不飽和モノマーとして、アクリルモノマー、例えばアクリル酸、メタクリル酸、エタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチルイタコン酸、モノエチルイタコン酸、及びモノブチルイタコン酸を含むモノアルキルイタコン酸、モノメチルマレイン酸、モノエチルマレイン酸、及びモノブチルマレイン酸を含むモノアルキルマレイン酸、シトラコン酸、並びにスチレンカルボン酸が挙げられる。好適なポリエチレン性不飽和モノマーとして、ブタジエン、イソプレン、アリルメタクリレート、アルキルジオールのジアクリレート、例えばブタンジオールジアクリレート及びヘキサンジオールジアクリレート、ジビニルベンゼン等が挙げられる。アミノ酸鎖がメタクリロイル基で官能化されることが好ましい。
【００６８】
上記のように、かかる溶液又は組成物は、フリーラジカルに対して反応性の化学基で官能化されて、光重合開始剤と合わせて、光重合開始剤の性質に応じて、可視光、又はＵＶ光、又は赤外線に曝露した場合に、急速な重合／架橋を可能とする。好ましい化学基は、メタクリロイル基又はアクリロイル基である。本発明で有用な好適な光重合開始剤は、当該技術分野でよく知られている。
【００６９】
本発明の第１の態様の好ましい実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、重合開始剤は、好ましくは約０．０１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の濃度のＩｒｇａｃｕｒｅ（商標）２９５９［Ciba specialty chemical、現BASF Resins）等の光重合開始剤である。本発明において、「重合開始剤」は、例えばフリーラジカルの発生によって、モノマー又はマクロマーの重合を開始することができる任意の物質を指すことに留意されたい。重合開始剤は多くの場合酸化剤である。例示的な重合開始剤として、例えば、電磁放射又は熱への曝露によって活性化されるものが挙げられる。また、重合開始剤を使用することもでき、例えば、引用することにより全体が本明細書の一部をなす、米国特許出願公開第２０１０／０１３７２４１号に記載される。
【００７０】
さらに、１％〜２０％、好ましくは５％〜２０％の化学的に官能化されたポリマーの濃度範囲を有するかかる溶液又は組成物は、アミノ酸側鎖、特にリジンにおける５％〜１００％の変動し得る官能化の程度を含んでもよく、かかる溶液又は組成物は、アミノ酸側鎖、特にリジンにおける２０％〜１００％、３０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％又は９０％〜１００％、好ましくは約９０％の変動し得る官能化の程度を含むことが好ましい。
【００７１】
コラーゲンの可溶性ゼラチンへの変換は、化学的又は酵素的な加水分解によって達成され得る。この方法は、コラーゲンに存在する多数の分子内及び分子間の共有結合架橋の切断をもたらす。さらに、コラーゲン分子の鎖中の幾つかのアミド結合は加水分解を経る。抽出方法は、ポリペプチド鎖の長さ及びゼラチンの官能特性に影響を及ぼす可能性がある。
【００７２】
典型的には、化学加水分解は、酸又はアルカリのいずれかの中でコラーゲンを穏やかに加熱して架橋結合を破壊することを含む。一般に、ゼラチン抽出に先立って、穏やかな酸の予備処理を使用する。魚類ゼラチンは、数多くの種々の方法を使用して抽出されてきた。魚類皮膚コラーゲンでみられる架橋の酸不安定性のため、穏やかな酸処理は、一般的には、適切な膨潤をもたらして、非共有の分子内及び分子間の結合を崩壊させるのに十分である。低温適応海洋種のゼラチン抽出のｐＨは、典型的には３〜５．５であり、好ましくは４〜５であり、例えば約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５であり、より好ましくは抽出のｐＨは約５である。また、コラーゲン抽出の収率を高めるため、適切なプロテアーゼ阻害剤（例えばペプスタチンＡ）を抽出処理の間に使用することができる。Karim A.A.et al. Food Hydrocolloids 2009, 23(3), 563-576の表４は、本発明の低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーの抽出に使用され得る魚類ゼラチンの抽出について、先に記載される幾つかの方法を要約する。
【００７３】
特定の実施形態では、低温適応海洋種の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを抽出する方法は、弱酸性及び弱塩基性の予備処理を含む。上記ゼラチン抽出方法は、以下を含むことが好ましい：
ｐＨ約１３でのアルカリ加水分解（例えばｐＨ：１３．４でＮａＯＨ  ０．１Ｍを用いる）；
ｐＨ約４での酸加水分解（例えばｐＨ：３．８で酢酸０．０５Ｍを用いる）；及び、
５０℃〜７０℃（好ましくは約６０℃）の温度で、３〜５．５（好ましくはｐＨ約５）にｐＨ調整されたゼラチン抽出。インキュベーションの時間は特に限定されず、通常数分〜数時間、好ましくは２時〜４時間、より好ましくは３．５時間を要する。好ましい実施形態では、ゼラチン抽出はｐＨ約５にて６０℃で３．５時間に亘って行われる。
【００７４】
上記組成物は、０．００１％〜１０％、好ましくは０．０１％〜１％の濃度の界面活性剤を更に含み得る。特定の実施形態では、上記界面活性剤は、ＳＤＳ、ｔｗｅｅｎ  ２０、及びポロキサマー（例えば、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（商標）Ｐ  １８８（Sigma-Aldrich））等からなる群から選択される。
【００７５】
別の実施形態において、上記界面活性剤は生物的適合性の界面活性剤である。生物的適合性の界面活性剤は当技術分野において知られており、説明のための非限定的な例として、ペルフルオロペンタン（ＰＦＰ）、ポリエチレンオキシド−コ−ポリ乳酸（ＰＥＯ−ＰＬＡ）、ポリエチレンオキシド−コ−ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＥＯ−ＰＣＬ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐｉｃｏ−Ｓｕｒｆ（商標）１、Ｎｏｖｅｃ（商標）７５００、ＦＣ−４０、アミノ酸系界面活性剤（単一の鎖を有するアミノ酸系界面活性剤、システイン又はアルギニン双性界面活性剤、リジン類縁体、及びグリセロ脂質様構造を有する界面活性剤）が挙げられる。この生物学的適合性の界面活性剤は、フッ素系界面活性剤からなる群から選択されることが好ましい。フッ素系界面活性剤は、全フッ素置換されたアルキル尾部を示すことを特徴とする。これらの界面活性剤は、全フッ素置換されていない界面活性剤よりも表面張力の減少においてより効率的であることが示されている。しかしながら、これらの化合物は生体内蓄積されて毒性となることが知られている、関連する欠点が存在する。生体適合性フッ素系界面活性剤として、例えば、ペルフルオロヘキサン酸（ＰＦＨｘＡ）、ペルフルオロブタンスルホン酸、及びペルフルオロブタンスルホネート（ＰＦＢＳ）が挙げられる。６個未満の炭素のアルキル尾部を有する全フッ素置換界面活性剤は、生体内蓄積が減少されたことが示されている。したがって、好ましい実施形態では、上記生体適合性界面活性剤は、６個未満の炭素のアルキル尾部を有する全フッ素置換界面活性剤である。これは、限定されないが、Ｎｏｖｅｃ  ＦＣ−４４３０（3M（商標））、Ｚｏｎｙｌ  ＦＳＮ−１００（DuPont（商標））、及び（y）トリシロキサン界面活性剤（Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７）を含む。６個未満の炭素のアルキル尾部を有する全フッ素置換された特に好ましい界面活性剤は、例えば２個、３個、４個又は５個の炭素、好ましくは２個の炭素の分岐型の短いアルキル尾部を有するフッ素系界面活性剤である。より好ましい実施形態では、これらの界面活性剤は、幾つかのＣ２Ｆ５鎖を含む、分岐鎖フッ素系界面活性剤である。これは、Merckによって開発されたＴＩＶＩＤＡ（商標）界面活性剤、例えばＴＩＶＩＤＡ  ２３００及びＴＩＶＩＤＡ  ２５００を含む。
【００７６】
実施例９．２は、６個未満の炭素を有する分岐鎖フッ素系界面活性剤（すなわち、ＴＩＶＩＤＡ  ２３００及びＴＩＶＩＤＡ  ２５００）は、細胞毒性を減少させ（特に、細胞毒性であるとわかったＢＹＫ−３４５と比較して）、細胞の生存率を改善する（改質サケゼラチンに基づくヒドロゲル単独の対照よりも高かった）。おそらくは、このより良好な細胞生存率は、フッ素系界面活性剤（ＴＩＶＩＤＡ  ２３００、ＴＩＶＩＤＡ  ２５００）の存在に起因するヒドロゲル内での栄養素、代謝産物、及び気体のより高い拡散効率と相関する。
【００７７】
特定の実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、６個未満の炭素のアルキル尾部を有する上記フッ素系界面活性剤は、０．００５％（重量／体積）〜０．１％（重量／体積）、好ましくは０．０１％（重量／体積）〜０．０３％（重量／体積）、更に好ましくは約０．０２％（重量／体積）の濃度で存在する。
【００７８】
さらに、上記組成物は、マルチアームＰＥＧ誘導体等の分岐鎖ポリエチレングリコール誘導体を含み得る。上記分岐鎖の濃度は、０．１％（重量／重量）〜１０％（重量／重量）、好ましくは１％（重量／重量）〜５％（重量／重量）、より好ましくは約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、又は約５％であってもよい。好ましい分岐鎖ＰＥＧ誘導体は、トリペンタエリスリトール（８アーム型（ＴＰ）ＰＥＧ）（本明細書では８アーム−ＰＥＧ１０Ｋ−アクリレートとも称される）、トリペンタエリスリトールヘキサグリセロール（８アーム型ＰＥＧ）、ジペンタエリスリトール（６アーム型ＰＥＧ）、ペンタエリスリトール（４アーム型ＰＥＧ）、グリセロール（３アーム型ＰＥＧ）、３アーム型及び４アーム型のヘテロ官能性ＰＥＧ、並びに最後にヘテロ二官能性ＰＥＧからなる群から選択される。上記分岐鎖ＰＥＧ誘導体はいずれも変動し得るＰＥＧ長さを有し得る。
【００７９】
実施例９．１において、１％（重量／重量）及び５％（重量／重量）の濃度のマルチアームＰＥＧ誘導体等の分岐鎖ポリエチレングリコール誘導体を更に含む本発明の組成物のＵＶ光曝露に対する抵抗性を試験した。１％（重量／重量）の濃度は、脱水の兆候を伴わずに、温かいＵＶ光（warming UV light）に２回通した後の正しく架橋されたヒドロゲルを示した。さらに、上記製剤は、その粘度及びニュートン挙動を維持することを示した。一方、５％（重量／重量）の製剤は、４回通した後であっても脱水に抵抗性であることを示した。さらに、架橋反応性は更に改善されることを示した。
【００８０】
好ましい実施形態では、上記組成物は、本明細書に記載される６個未満の炭素を有する分岐鎖フッ素系界面活性剤及び分岐鎖ＰＥＧ誘導体を更に含む。本明細書に記載される実験結果によれば、かかる組成物は、以下の特性を有し得る：
ニュートン挙動
低粘度（５．５ｃｐ〜２０ｃＰ）
低い表面張力
高い架橋反応性及び構造完全性
良好な機械的特性（２５ｋＰａ〜１００ｋＰａの圧縮弾性率）
良好な吸湿性
細胞適合性
良好な栄養素、代謝産物、及びガスの拡散。
【００８１】
好ましい実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、上記組成物は、
そのリジン基の８０％超（好ましくは８５％超）が官能化された、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の低温適応海洋種（好ましくはサケ）メタクリロイルゼラチンと、
０．１％（重量／重量）〜１０％（重量／重量）の濃度、好ましくは１％（重量／重量）〜５％（重量／重量）の濃度の分岐鎖ＰＥＧ誘導体（好ましくは８アーム−ＰＥＧ１０Ｋ−アクリレートトリペンタエリスリトール）と、
０．００５％（重量／体積）〜０．１％（重量／体積）の濃度のフッ素系界面活性剤と、
０．０１％（重量／体積）〜５％（重量／体積）の濃度の光重合開始剤と、
を含む。
【００８２】
より一層好ましい実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、上記組成物は、
そのリジン基のおよそ９０％が官能化された、１５％（重量／体積）の低温適応海洋種（好ましくはサケ）メタクリロイルゼラチンと、
１％（重量／重量）〜５％（重量／重量）の濃度の分岐鎖ＰＥＧ誘導体（好ましくは８アーム−ＰＥＧ１０Ｋ−アクリレートトリペンタエリスリトール）と、
０．００５％（重量／体積）〜０．１％（重量／体積）の濃度の６個未満の炭素を有する（好ましくはＣ２Ｆ５鎖を有する）分岐鎖フッ素系界面活性剤と、
０．０５％（重量／体積）〜０．５％（重量／体積）、好ましくは約０．２％（重量／体積）の濃度の光重合開始剤と、
を含む。
【００８３】
本発明の第１の態様の別の好ましい実施形態では、上記溶液を、架橋に先立って、１ミリ秒〜４時間、好ましくは１秒〜４時間、より好ましくは１分〜４時間、好ましくは１０分〜４時間、より好ましくは３０分〜４時間、より好ましくは４５分〜４時間、更に好ましくは約１時間〜約４時間、更に好ましくは約１時間〜約３時間の間隔で、５℃〜１５℃の温度で予備処理する。
【００８４】
図６に説明されるように、変動可能な時間、好ましくは４時間未満の間、１℃〜１２℃の範囲に含まれる架橋前の予備処理の温度は、重合／架橋された生体材料の機械的特性（圧縮弾性率）を大きく増加させる。
【００８５】
かかる機械的特性は、５キロパスカル〜７００キロパスカルの範囲に含まれるように調整され得る。したがって、酸性側鎖、特にリジンにおける官能化の程度が５％〜１００％で変動し得るメタクリロイルゼラチンポリマーの濃度範囲、及び４時間未満の変動可能な時間の間、１℃〜１２℃の範囲に含まれる架橋前の予備処理の温度において、重合／架橋された生体材料の種々の物理化学的及び生物学的な特性が調整され得る。例えば、図８に示されるヒドロゲル周辺の微小環境を制御するためのカプセル化された可溶性因子の送達速度、又は図９に示されるカプセル化された細胞の増殖。重合／架橋された生体材料の他の調整され得る物理化学的及び生物学的な特性は、以下の通りである：
生体材料内の細胞浸潤性；
受動的分解時間；
細胞活性（酵素の分泌）による能動的分解時間；
リモデリング能力；
細胞接着；及び、
免疫原性。
ｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込んだ場合の材料内の新生血管形成の能力
埋め込んだ場合の組織統合の能力（血管形成能力と非常に関連する）
【００８６】
結果的に上に示されるように、低温適応海洋種、特にサルモ属及びオンコリンクス属の天然資源に由来し、フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に反応性となるように化学的に官能化された、約１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを含む溶液は、哺乳動物等の中温性の種に由来する他のアミノ酸ポリマー系生体材料と比較して、また驚いたことに非メタクリル化サケゼラチン（ＳＧ）と比較して、改善された特性を有する組成物を提供する。
【００８７】
したがって、更なる態様では、本発明は、
ｉ．フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となるように化学的に官能化された、１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の濃度のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを順に含む、溶液を含む組成物を、ゼラチンポリマーのゲル化点よりも低い温度に供して、物理的架橋を誘導する工程と、
ｉｉ．工程ｉ）では得られた、物理的に架橋され化学的に官能化されたポリマーの共有結合的架橋を誘導する工程と、
を含み、
上記ゼラチンポリマーが、天然資源、好ましくは本明細書に記載される低温適応海洋種に由来する、方法に関する。
【００８８】
当業者は、どのようにゲル化点を決定するかを理解し、例えば、冷却しながら示差走査熱量測定によって決定され得る。ゲル化点は、具体的な魚類の種に依存し得るが、典型的には冷水適応種は１０℃未満のゲル化点を有する。
【００８９】
重合開始剤は、工程ｉ）において溶液中に存在してもよく、工程ｉｉ）の実施に先立って添加されてもよい。工程ｉ）において上記溶液は、重合開始剤を更に含むことが好ましい。
【００９０】
特定の実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、重合開始剤は好ましくは０．５％の濃度で見られる光重合開始剤であり、ここで、工程ｉｉ）は、化学修飾されたアミノ酸鎖及び光重合開始剤を含む溶液を、光重合開始剤の性質に応じて光、可視光、ＵＶ光又は赤外線に対して曝露して、架橋された組成物を提供することを含む。
【００９１】
工程ｉ）では、組成物を、４時間未満、好ましくは２時間に亘って、ゼラチンポリマーのゲル化点よりも低い温度、典型的には１℃〜１２℃（好ましくは約４℃）に供する。
【００９２】
好ましい実施形態では、任意に上記又は下記の１以上の特徴と組み合わせて、以下の工程：
ａ．低温適応海洋種、好ましくはサルモ属又はオンコリンクス属の天然資源に由来するアミノ酸鎖ゼラチンポリマーを得て、それを１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）の最終濃度まで溶媒に溶解する工程と、
ｂ．フリーラジカルの存在下で重合又は架橋に対して反応性となり得る化学物質を添加することによって、工程ａ）のアミノ酸鎖ゼラチンポリマーの一次構造を化学的に修飾する工程と、
ｃ．工程ｂ）の溶液から全ての未反応の化学物質を除去する工程と、
ｄ．任意に、光重合開始剤等のラジカル発生重合開始剤及び／又は界面活性剤を添加する工程と、
ｅ．任意に、適用可能であれば、工程ｃ）又は工程ｄ）から得られた組成物を濾過し、凍結乾燥する工程と、
を含む方法によって、工程ｉ）の組成物を得る。
【００９３】
低温適応海洋種の皮膚に由来するゼラチン抽出のｐＨは、典型的には３〜５．５、好ましくは４〜５、例えば約４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５であり、より好ましくは約５である。
【００９４】
更なる態様では、本発明は、上の態様による方法によって得られる又は入手可能な、架橋／重合されたゼラチンポリマーを含む組成物を指す。上記ゼラチンポリマー及び組成物の他の特徴は、本発明の第１の態様のもと、本明細書に記載される。
【００９５】
以下の実施例を参照することにより、本発明はより容易に理解される。以下の実施例は、本発明を説明する役目を果たすに過ぎず、本発明を限定するものではないことに留意されたい。
【実施例】
【００９６】
実施例１．メタクリロイルサケゼラチン溶液の製造
サケゼラチンの抽出：
１．残った魚肉及び鱗をサケ皮膚から全て取り除く。
２．小さな立方体（３ｃｍ／辺〜５ｃｍ／辺）の皮膚を切り取る。
３．皮膚１グラム当たり６ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、１０℃で１時間、一定の撹拌（９０００ｒｐｍ）を維持する。→６ｍＬ／ｇ×５００ｇ＝３Ｌ（ｐＨ＝１３を測定）
４．溶液を除去して、濾過及び浸漬によりｄＨ２Ｏで皮膚を洗浄する。
５．皮膚１グラム当たり６ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、１０℃で１時間、一定の撹拌を維持する。→３Ｌ（ｐＨ＝１３を測定）
６．溶液を除去して、濾過によって皮膚をｄＨ２Ｏで洗浄し、ｄＨ２Ｏで濾過した皮膚をすすぎ、浸漬する。
注意：この工程の広範囲すぎる洗浄は工程７における酸性溶液のｐＨに影響を与える場合があり、この段階で回避されなければならないゼラチンの部分的な抽出を誘導するより高い酸性度をもたらす可能性がある。
７．次いで、皮膚１グラム当たり６ｍＬの０．０５Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨを添加し、１０℃で１時間、一定の撹拌を維持する（ｐＨ＝３．３を測定）。
８．最初にｄＨ２Ｏで皮膚を洗浄し、それらの皮膚を、皮膚１グラム当たり６ｍｌのｄＨ２Ｏに浸漬する。
９．ＣＨ３ＣＯＯＨを滴加することによってｐＨを４．０に設定する。
１０．一定の撹拌及び６０℃を維持しながら４時間インキュベートする。
１１．６０分毎にｐＨ及び温度を確認する。
１２．溶液から皮膚を取り出す。
１３．真空ポンプ及び濾紙２２μｍを使用して、溶液を濾過する。
１４．上記ゼラチン溶液を乾燥皿に入れることによって、６０℃で４８時間乾燥する。
１５．ゼラチンフィルムを挽いて粉末にする。
【００９７】
メタクリロイル基によるサケゼラチン官能化
先に以前に記載されるように（Nichol et al. 2010、Van Den Bulcke et al. 2000）無水メタクリル酸を混合し、ゼラチン溶液に由来するアミノ基、主にリジンと反応させることで、メタクリロイルサケゼラチンを合成した。簡潔には、粉に挽いたサケゼラチンを、６０℃のＰＢＳ  １×（ｐＨ７．４）中、最終濃度１０％（重量／体積）まで溶解した。完全に溶解した後、更に撹拌しながら、無水メタクリル酸（２７６６８５、米国のSigma）を最終濃度８％（体積／体積）まで徐々に添加した。異なるレベルのメタクリロイル官能化は、異なる濃度の無水メタクリル酸を必要とする。３時間の反応後、ＰＢＳ  １×にて５倍希釈を行い、反応させたゼラチンを４０℃で１週間に亘り脱イオン水に対して透析した。新たな脱イオン水で毎日置き換えて、透析の間の全ての未反応の無水メタクリル酸を除去した。最後に、透析した混合物を、８μｍ孔の濾紙を使用して濾過し、保管する前に凍結乾燥した。
【００９８】
実施例２．メタクリロイルウシゼラチン溶液の製造
実施例１と同様、先に記載されるように（Nichol et al. 2010、Van Den Bulcke et al. 2000）無水メタクリル酸を混合し、ゼラチン溶液に由来するアミノ基、主にリジンと反応させることで、メタクリロイルウシゼラチンを合成した。簡潔には、ウシゼラチン（ブルーム２２０、オランダ国のRousselot）を、６０℃のＰＢＳ  １×（ｐＨ７．４）中、最終濃度１０％（重量／体積）まで溶解した。完全に溶解した後、更に撹拌しながら、無水メタクリル酸（２７６６８５、米国のSigma）を最終濃度８％（体積／体積）まで徐々に添加した。異なるレベルのメタクリロイル官能化は、異なる濃度の無水メタクリル酸を必要とする。３時間の反応後、ＰＢＳ  １×にて５倍希釈を行い、反応させたゼラチンを４０℃で１週間に亘り脱イオン水に対して透析した。新たな脱イオン水で毎日置き換えて、透析の間の全ての未反応の無水メタクリル酸を除去した。最後に、透析した混合物を、８μｍ孔の濾紙を使用して濾過し、保管する前に凍結乾燥した。
【００９９】
実施例３．非メタクリロイルサケゼラチン溶液の製造
実施例１で説明されるようにサケゼラチンを抽出し、通常、６０℃のＰＢＳ  １×（ｐＨ７．４）中に１０％（重量／体積）ゼラチンの最終濃度まで得られたゼラチンを溶解させることによって、非メタクリロイルサケゼラチンを作製する。異なるゼラチン濃度の溶液は、ＰＢＳ  １×中に異なる量の粉に挽いたゼラチンを溶解させることを必要とする。
【０１００】
実施例４．本発明の組成物及び生物医学におけるその使用
４．１．材料及び方法
サケゼラチンの抽出
Los Fiordos Ltda.と呼ばれるサケ養殖場から８０ｋｇのサケ皮膚を受け取り、２０１６年１月１０日に−２０℃で冷凍保存した。管理された解凍工程の後、残った魚肉残渣及び鱗を手作業でクリーニングして取り除いた（cleaned off）。これまで、５回のクリーニングを行って、各回５ｋｇの皮膚を処理し、およそ１７％の収率で清潔な皮膚（８５０グラム）を得た。次いで、皮膚を４ｃｍ２の表面積を有する小片に切り分ける。１０℃での１時間の０．１Ｍ  ＮａＯＨによる２回の予備処理工程のそれぞれに続く蒸留水を使用する皮膚洗浄工程からなるJavier Enrione教授の研究室によって先に確立された抽出プロトコルを行った。０．０５Ｍ酢酸溶液中、１０℃で１時間に亘って第３の予備処理を行い、その後、皮膚を蒸留水で洗浄する。種々の量の酢酸を添加することによりｐＨを種々のレベルに調整した蒸留水中、６０℃で３．５時間皮膚をインキュベートする、酸抽出を最後に行う。試験したｐＨは３、４及び５であった。抽出されたゼラチンの収率、加水分解レベル及びゲル強度を評価した。
【０１０１】
サケゼラチンの化学的修飾
光を照射することによる重合を可能とするためのメタクリロイル基によるサケゼラチンの官能化は、無水メタクリル酸（Sigma）をゼラチン中のリジン側鎖の遊離アミノ基と反応させることによって行われる。１×ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を使用して、サケゼラチンを含む１０％溶液（重量／体積）をこの目的で作製した。この溶液を１時間に亘り６０℃に維持し、完全に可溶化させた。種々の容量の無水メタクリル酸を抽出用ドラフトの下で撹拌しながら滴加し（１０ｍｌ、５ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ又は０．５ｍｌを溶液１００ｍｌに添加する）、撹拌を制御しながら温度を６０℃に維持することを確実にして、３時間反応させた。その溶液のｐＨを７に維持し、そうしなければ酸性になって、改質ゼラチンの加水分解の程度が増加する可能性がある。
【０１０２】
サケゼラチンの官能化の後、反応混合物を３容量の１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４を添加することによって希釈し、次いで、４０℃で７日間、１日に２回水を交換して２０容量の蒸留水に対して透析した。未反応の無水メタクリル酸を除去する透析処理が終了したら、反応混合物を孔径８μｍのメンブレンを通して濾過し、次いで凍結乾燥し、それを−８０℃で保管した（図１３を参照されたい）。
【０１０３】
一旦サケゼラチンを化学的に修飾すると、以前に文献（Journal of Food Science 2001, 66(5), 642）に記載されるＯＰＡ法を使用して官能化された遊離アミン又はリジンのパーセンテージを定量した。反応前後に遊離アミンを定量することによって、合計のメタクリロイル基で官能化されたリジンの数を決定することができる（図１４を参照されたい）。
【０１０４】
ＵＶ光誘導性架橋後のサケゼラチンメタクリレートの機械的特性評価
光重合を誘導するため、改質サケゼラチンの溶液（１×ＰＢＳ又は蒸留水中５％、７％、１０％、１５％（重量／体積））に光重合開始剤である０．５％重量／体積の濃度のＩｒｇａｃｕｒｅ  ２９１９（Sigma）を含め、直径１０ｍｍ及び高さ３ｍｍの筒状金型においてＵＶ光（３６５ｎｍ、８００ｍＷ／ｃｍ２）を２分間照射した。改質サケゼラチン（ＭＳＧ）ヒドロゲル又は形成されたスキャフォルドは、メタクリル化反応に添加された無水メタクリル酸の量、したがって官能化のレベルに応じて、またヒドロゲルの生成に使用したＭＳＧ濃度に応じて、異なる機械的特性（ヤング率）を有した。機械試験を、ＤＭＡ（Dynamic Mechanical Analyser：動的機械アナライザー）及びテクスチャアナライザーの両方を使用して行った。圧縮モード及び引張りモードの両方で試験を行った。
【０１０５】
基本製剤（本明細書では「バイオインク」とも称される）のレオロジー特性評価
上の実施例４に記載されるプロトコルに従って、ゼラチンのリジン残基中の官能化の程度が８５％のＭＳＧを生成した。蒸留水中、種々の改質ゼラチン濃度（５％、１０％及び１５％（重量／体積））を有する溶液を作製して、レオロジー研究を実施した。Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ  ３０１レオメーター及び円筒ジオメトリを使用して、１００ｓ−１のずり速度での粘度データを記録した。これらの溶液の表面張力値を、制御された速度で灌流された毛細管の先端における液滴の体積の決定に基づいて、ドロップボリューム張力測定機（Ｌａｕｄａ  ＴＶＴ２、ドイツ国ラウダ・ケーニヒスホーフェンのDr. R.Wobser GmbH and Co.）を使用して更に定量した。液滴がその臨界体積に達した時、液滴は重力によって毛細管から落ちた。この臨界体積、溶液の密度及び毛細管の半径に基づいて表面張力を計算した（Food Hydrocolloids 25(5):958-967）。この方法論は、正確な密度の特定を必要とした。これをデジタル密度計（ＤＭＡ  ４５、オーストリア、グラーツのAnton Paar KG）によって行った。これらの実験は、Rommy Zuniga教授の監督のもと、テクノロヒカ・メトロポリタナ大学で行われた。
【０１０６】
基本バイオインクのレオロジーパラメーターに対する界面活性剤及び機械的補強成分（セルロースナノウイスカー）を組み込むことの効果の予備測定
リジン残基中８５％で官能化されたサケゼラチン１５％を含み、更にバクテリアセルロースナノウイスカー０％、３％及び５％（重量／体積）で補足された溶液の粘度及び粘弾性成分の測定を行った。円筒ジオメトリを使用して、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ  ３０１レオメーターで実験を行った（図１５を参照されたい）。
【０１０７】
架橋処理において改質されたゼラチンの架橋方法の開発
ゲル化点の温度よりも低い温度に供される場合の改質されていないゼラチンポリマーの天然活性の１つは、熱可逆的なヒドロゲルの形成をもたらすポリマーの三重螺旋の形成である。言いかえれば、一旦低温でヒドロゲルが形成されると、より高い温度に供される場合に、それらのヒドロゲルは液体状態に戻ることができる。架橋されたヒドロゲルの機械的特性を改善するための提案される方法の１つは、光媒介型架橋を引き起こす前に、低温によって誘導される三重螺旋の形成を可能とすることである。これにより、光誘導によって形成される共有結合の確立によって構造を固定する前に、より規則正しく機械的に強化された分子構造の形成が可能となる。この方法は、三重螺旋の形成を誘導しない架橋と比較して、重合後の機械的特性の２０倍の増加を得ることを可能にした。良好な生理活性にもかかわらず、材料としてのこれらのヒドロゲルの弱点のうちの１つが、それらの低い機械的特性であることを考慮すると、これらの機械的特性の増加は、以前にはどのような他の技術によっても見られず、患者及び市場へと移行することについて優れた将来性がある。テクスチャアナライザーを使用する圧縮試験によって、機械的特性を測定した。リジン残基中種々の程度の官能性を有する１０％（重量／体積）濃度の改質ゼラチン溶液を作製し（２２％及び９０％）、光媒介型架橋を誘導する前に４℃で２時間インキュベートした。予備冷却工程に供されたヒドロゲルの機械的特性を、そうしていないヒドロゲルと比較した。
【０１０８】
最適化された生体材料の生体適合性研究
種々の程度の官能化を伴う改質サケゼラチンで形成されたヒドロゲルにカプセル化されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖
上に記載されるように、それらのリジンが種々のレベル（２０％、５０％、６０％、８０％及び９０％）で官能化されるように改質されたサケゼラチンン系ヒドロゲルを、上記報告（１．ｃ）において上に記載される光重合開始剤と共に作製した。ヒドロゲルを光重合又は架橋する前に、最終濃度６×１０６細胞／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞とヒドロゲルを混合した。１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１×グルタミンで補足したＤＭＥＭ培養培地中でヒドロゲルをインキュベートした。培地を２日毎に交換し、３７℃及び５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに維持した。供給元の使用説明書に従い、ＷＳＴ−１細胞増殖比色測定キット（Ｋ３０２、米国のBiovision）を使用することによって、カプセル化された細胞の増殖を評価した。要するに、このアッセイは、細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによって媒介される、ホルマザンへのＷＳＴ−１の代謝的転換を定量する（図１６を参照されたい）。
【０１０９】
ネズミ科動物モデルの皮下に埋め込まれた改質サケゼラチンの免疫応答
種々のレベルのリジン官能化（２０％及び８０％）を有する改質サケヒドロゲルを作製した。筒状のヒドロゲルの寸法は直径１０ｍｍ及び高さ３ｍｍであった。これらをＣ５７ＢＬ／６マウスの背部皮下に埋め込んだ。免疫応答を分析するため、それらのヒドロゲルを７日後に摘除した。要するに、リンパ腺に存在する免疫細胞、及び遊走した又はヒドロゲルに組み込まれた細胞を分析し、このヒドロゲルの存在に反応して起こる炎症のレベルを評価した。同じレベルの官能化を有するウシゼラチンで製造されたヒドロゲルと比較されるように、全ての実験を行った（図１７を参照されたい）。
【０１１０】
種々のレベルに官能化されたサケゼラチンから形成されたヒドロゲルにおける細胞浸潤能
細胞性３Ｄ構造物を製造するためのバイオインクの設計において関連するポイントの１つは、カプセル化された細胞が遊走し、実際のヒドロゲルをリモデリングすることによって生物学的に応答して、３Ｄ構造物の移植領域に近い他の細胞を遊走させて、そのインプラントと、例えば血管系の形成によって相互作用させることができなければならないということである。予備レベルでこれを評価するため、種々のレベルに官能化することによって改質されたサケゼラチンヒドロゲルを通る細胞浸潤に対するアッセイを行った。また、これらの結果を、改質されたウシゼラチンを使用して得られる結果と比較した。基本的には、上記アッセイは、トランスウェル装置の使用を含んだ。該装置は、孔径８μｍのメンブレンによって結合された上部チャンバーと底部チャンバーの２つのチャンバーを備え、細胞は、底部チャンバーに存在する誘因刺激によって媒介されて、そのメンブレンを通って１つのチャンバーから別のチャンバーへと遊走する。ヒドロゲルを厚さ約１ｍｍのメンブレンに堆積させ、細胞をそのヒドロゲル上に蒔いた。使用した細胞は、組織工学で使用される細胞モデルとしての骨髄由来間葉系幹細胞である。底部チャンバーの底部チャンバー部分の上部からメンブレン上に見ることができた細胞は、ヒドロゲル及び多孔質メンブレンを通って遊走しなければならなかった。遊走した細胞数の定量は、細胞がヒドロゲル中で遊走する能力を証明する。
【０１１１】
４．２．結果
サケゼラチンの化学的修飾
ゼラチンリジン中のメタクリロイル基を用いる官能化によるサケゼラチンの化学的修飾を、以前に文献（Journal of Food Science 2001, 66(5), 642）に記載されたＯＰＡ法によって確認した。基本的には、この方法は、特異的な試薬によってゼラチンポリペプチド鎖中に存在する遊離アミノ基又は第一級アミンを定量する。ＯＰＡ法との反応に対して反応性の遊離アミノ基は、ほとんどがリジン側鎖に由来し、加水分解の程度に応じてわずかな割合（２％〜４％）が分子のポリペプチド鎖のＮ末端アミノに対応する。無水メタクリル酸との官能化の反応は、リジンの第一級アミンにメタクリロイル官能基を組み込んで、遊離アミノの数を定量する際にＯＰＡ試薬と無水メタクリル酸を反応させない（図１８を参照されたい）。
【０１１２】
ＵＶ光誘導性架橋後のメタクリル化サケゼラチンの機械的特性評価
上の項で言及されるように、ゼラチンリジン中のメタクリロイル基による官能化のレベルは、架橋を誘導することによって形成されたヒドロゲルの所定のレベルの機械的特性について概念的に決定されなければならない。メタクリロイル基の数が多いほど、架橋を誘導する際に形成される分子間及び分子内の共有結合の数が多くなる。このヒドロゲル中のより高い架橋のレベルは、構築物の機械的特性（ヤング率及び圧縮弾性率）の増加をもたらし得る。官能化のレベルが異なり、メタクリロイル基の光誘導性の架橋が同じである１０％（重量／体積）改質ゼラチン溶液から製造されたヒドロゲルに対する機械的特性の結果を図１９に示す。これらのパラメーターをサケ及びウシのゼラチンについて比較した（図１９を参照されたい）。
【０１１３】
十分興味深いことに、ヒドロゲルが種々のレベルの官能化を有する場合、圧縮弾性率の違い（圧縮試験によって測定された）は観察されなかったが、ヤング率（引張り試験によって測定された）は、官能化のレベルが大きくなると共に増加を示した。
【０１１４】
本発明の基本製剤のレオロジー特性評価
インクジェット（ポリジェット）印刷プロセスにおける液滴形成は、レオロジー特性に依存する。レオロジー研究の主な目的は、予め定義された多元的な実験計画に従って、新たな製剤の最初の最適化工程を行うため初期値を取得することであった。
【０１１５】
ゼラチンは、コラーゲンの部分的な分解に由来するタンパク質性生体材料であり、熱可逆的な物理的格子を形成することができる。ゼラチン鎖が冷却されると、非晶質から螺旋状（三重螺旋）へと構造遷移を経て、格子結合点（lattice bonding points）を形成する。その研究は、メタクリロイル基による官能化及びそれらのレオロジー挙動を通して、ゼラチン分子特性の効果に傾注した。
【０１１６】
レオロジーは、材料がどのように変形し流れるかに関する研究であり、弾性、可塑性及び粘度を含む。
【０１１７】
最も重要なレオロジー特性の幾つかは次の通りである：
見かけ粘度（ずり応力とずり速度の関係）
貯蔵弾性率及び損失弾性率（線形粘弾性挙動）
遷移温度。
【０１１８】
その研究では、全てのレオロジー測定を、Ａｎｔｏｎ−Ｐａａｒ  ＭＣＲ３０１応力制御レオメーター（オーストラリア、グラーツのAnton-For）により得た。
【０１１９】
サケゼラチンについて予想される低粘度値のため、種々のジオメトリを使用して、測定の精度及び感度に対するそれらの効果を分析した。
【０１２０】
測定ジオメトリ
ダブルギャップ（図２０ａ）の上部）。試料との接触面積が非常に大きいため低応力の場合により良好な測定感度を提供するジオメトリ。そうでない場合は、各測定に対してより多くの材料を必要とし（１０ｍＬ対コーン−プレートでは３００μＬ）、ジオメトリの表面の振幅により急速な温度調節は制限される。
【０１２１】
コーン−プレート（図２０ｂ））。コーンの角度の結果としてずり応力の均質な分布を提供する最適なジオメトリ。コーン−プレートは、ダブルギャップほど感度はよくないが、これもまた低粘度の材料による良好な測定を可能とする。粒子系には推薦されない。角度０．５度及び直径５０ｍｍのコーン−プレートを、これらの粘度測定に使用した。
【０１２２】
プレート−プレート（図２０ｃ））：これは、ギャップの振幅、迅速な温度変化及びずり速度の調節を可能とすることから、最も柔軟なジオメトリである。トッププレートの直径（その研究では５０ｍｍ）と共に測定感度は増加する。感度は前述のジオメトリよりも低いが、このジオメトリは迅速で均質な温度調節を可能とすることから、ゲル化研究で使用された。
【０１２３】
ダブルギャップジオメトリ及びコーン−プレートジオメトリの測定感度を最初に比較し、２５℃及び３７℃で１ｓ−１〜１０００ｓ−１のずり速度のフロースキャンによって、５％〜１５％（重量／体積）の種々の濃度のサケ及びウシのゼラチンについて見かけ粘度を測定した。１％の変形及び周波数０．１Ｈｚ〜１００Ｈｚによる周波数スキャン、及び周波数１Ｈｚの振幅スキャン、及び０．０１％〜１００％変形振幅を行って、線形部を決定した。貯蔵弾性率Ｇ’及び損失弾性率Ｇ’’と同様にゲル化Ｔｇ及び溶融温度Ｔｍを、１％の変形及び１Ｈｚの周波数を適用して、３７℃〜３℃及び３℃〜２０℃の温度に対する温度スキャン測定から外挿した。
【０１２４】
サケゼラチン（ＳＧ）をサケ皮膚から抽出した。ウシゼラチン（ＢＧ）は、アルカリ処理により、ウシの骨に由来した。
【０１２５】
無水メタクリル酸（２７６６８５、Sigma）との反応により、ゼラチンをメタクリロイル基で官能化した。要するに、サケ及びウシのゼラチンを、１０％（重量／体積）の濃度まで６０℃のＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。撹拌し続けながら、８％重量／重量の濃度まで無水メタクリル酸を徐々に添加した。３時間後、反応をＰＢＳで希釈することにより停止させ、その後、４０℃で１週間に亘って蒸留水中で透析した。８μｍ孔の濾過及び凍結乾燥によって最終生成物（ＳＧ８及びＢＧ８、それぞれサケ及びウシ）を得る。
【０１２６】
硫酸中のバクテリアセルロースの酸性加水分解によってセルロースナノウイスカー（ＣＮＷ）を得た。加水分解生成物を透析して反応副生成物を除去し、超音波処理して再懸濁し、最後にイオン交換樹脂によって精製して０．１％溶液（重量／体積）を得た。ゼラチン溶液中、３％及び５％重量／重量の溶液を得るため、ＣＮＷをロータリーエバポレーター（rotovapor）によって濃縮した。
【０１２７】
ゼラチン溶液
６０℃で１時間、撹拌し続けることによって、各サケゼラチン（ＳＧ）、ウシゼラチン（ＢＧ）及びリジンの８５％官能化を有するそれぞれの改質ゼラチン（ＳＧ８及びＢＧ８）について、１５％原液（重量／体積）を作製した。その後、１０％及び５％の溶液（重量／体積）を得るまでそれらの溶液を希釈した。測定するまで溶液を３７℃で一定に撹拌しながら維持した。
【０１２８】
ＣＮＷを含むゼラチン溶液
９ｍｇ及び１５ｍｇのＣＮＷをそれぞれ含む２ｍＬのＣＮＷ溶液にゼラチン０．３ｇを添加することによって、ＣＮＷで補足したサケゼラチン（ＳＧ）及び改質サケゼラチン（ＳＧ８）の１５％溶液（重量／体積）を作製し、ゼラチンに対して３％又は５％（重量／重量）の濃度のＣＮＷを含む溶液を得た。
【０１２９】
最初に、測定感度に対する測定ジオメトリの効果を分析した。３回繰り返して得られた測定は、最良のダブルギャップ感度を示し、ここでは２つの流体のニュートン挙動も低いずり速度で説明される。
【０１３０】
強調される重要ポイントの１つは、改質ウシのゼラチンとは異なって、ポリジェットプリンターでの使用に許容可能なバイオインクのゼラチン濃度の範囲が、サケの場合により広いことである。
【０１３１】
基本製剤のレオロジーパラメーターに対する界面活性剤及び機械的補強成分（セルロースナノウイスカー）を組み込むことの効果の予備測定
架橋後に機械的特性を改善するための基本製剤へのセルロースナノウイスカー（ＣＮＷ）の組み込みは、バイオインクの最終レオロジーに影響し得る。この理由で、溶液中のゼラチンのグラムに対して３％及び５％（重量／重量）の濃度のＣＮＷを製剤に含んだ実験を行った。結果は、補足されたバイオインクにおける貯蔵弾性率の増加を示し、これは、バイオインク製剤における種々のポリマーと粒子との間の相互作用力の増加として解釈される。これは機械的特性の増加へと変わり得るが、溶液粘度の増加は、バイオインクをポリジェット技術によって許容される範囲の外側とする。さらに、ナノウイスカーを添加することによって、ポリジェット機器には推奨されないニュートン挙動から非ニュートン挙動への変化（粘度は流体に適用されるずり速度に反比例する）を見ることができる（図２６、図２７及び図２８を参照されたい）。
【０１３２】
架橋処理で改質されるゼラチンの架橋方法の開発
ヒドロゲルを補強するための新たな方法を研究する主な理由の１つは、セルロースナノウイスカーの組み込みがバイオインクのレオロジー特性を変更し、それらをポリジェット技術に適さないものとしたという事実である。ゼラチンの温度による熱可逆的なゲル化の性質（natural）の理解に基づいて、ゼラチンモノマーの三重螺旋配置の形成が誘導される場合に、三重螺旋の形成（物理的な架橋）を最初に誘導し、続いてメタクリロイル基（化学的又は共有結合的な架橋）の光媒介型架橋を誘導する可能性を研究した。上に言及されるように、三重螺旋として既に整列されているゼラチンの化学的橋架は、三重螺旋構造を固定し、それを補強して、温度の上昇に対して不可逆なものとする。驚いたことに、この方法は機械的特性の２０倍の増加を可能とし、かかるレベルの補強は、研究された他の方法によって以前は見られなかった（図２９を参照されたい）。これは、達成された機械的特性が天然の軟組織と比較されることから、組織工学における適用に大いに関連し、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植を許容する。新たな図５２（ａ）は、ゲル化温度における三重螺旋の形成、及びｕｖ光に対する曝露による（不可逆的な）共有結合架橋を図示する。図５２（ｂ）は、架橋に先立って、４℃での予備冷却処理に供された、１５％でメタクリル化されたサケゼラチンヒドロゲルに対する圧縮弾性率の結果（ｋＰａ）を示す。試験したゼラチンは、様々なメタクリル化の程度を有する（０．５、２、５及び１０）。この図は、予備冷却処理が、ゼラチンヒドロゲルの構造特性の補強をもたらし、高いレベルの圧縮弾性率を達成することを示す。
【０１３３】
最適化された生体材料の生体適合性研究
種々の程度の官能化を有する改質サケゼラチンで形成されたヒドロゲルにカプセル化されたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖
ヒドロゲル又はスキャフォルドに細胞をカプセル化するこれらの処理に関する主な懸念の１つは、細胞が処理の後に到達する状態である。この理由で、上に説明されるように増殖アッセイを行った。この場合、架橋及び細胞カプセル化から１日後、４日後及び１４日後にＷＳＴ−１のミトコンドリア代謝を定量したところ、ヒドロゲル中の細胞増殖と相関した。メタクリロイル基でそのリジンの２０％を官能化することによる改質サケゼラチンに基づくヒドロゲルの場合のように、より低い機械的特性を有するヒドロゲルにおいてより高い増殖が観察された。しかしながら、６０％、８０％及び９０％の官能化のレベルは、有意差を示さなかった（図３０を参照）。
【０１３４】
ネズミ科動物モデルの皮下に埋め込まれた改質サケゼラチンの免疫応答
この報告の前の項で言及されるように、外来スキャフォルドが移植された場合のその存在に対する免疫応答は、組織病態の治療に対する培養組織の統合の成功に関する決定因子となり得る。免疫拒絶は、ヒドロゲル（カプセル化細胞の有無にかかわらず）の排除をもたらす、又は非常に広範囲の炎症反応に起因して患者を傷害する可能性がある。これを評価するため、低官能化（２０％）又は高官能化（８０％）によって改質されたサケ又はウシのゼラチンから製造されたヒドロゲルを用いて、マウスで皮下埋め込み予備実験を行った。結果は、概して、サケゼラチンと比較してウシゼラチンの存在と関連してより高い免疫原性を示し、さらに免疫応答は、ヒドロゲルがより高い程度に官能化される場合により低いようである（図３１及び図３２を参照されたい）。この概念に関して、この効果を、より官能化されているものよりも官能化の程度が低いヒドロゲルにおけるより高い細胞浸潤能力及び血管系の形成に関連付けることができ、これは免疫系に由来する細胞と官能化の程度がより低い場合のヒドロゲルとのより多くの接触を可能とし得る（図３３を参照されたい）。免疫応答は概して相当低いことが強調されるべきであり、概ねゼラチンについて記載される初期の知見を実証する。
【０１３５】
種々のレベルで官能化されたサケゼラチンから形成されたヒドロゲルにおける細胞浸潤の能力
このサブアクティビティに関して、種々の官能化の程度を有する改質されたウシ及びサケゼラチン系ヒドロゲルの浸潤能力をｉｎ  ｖｉｔｒｏで定量することが意図されるアッセイを組み立てることができ、その実験が現在行われている。図１２は、２．４％の濃度のゼラチン溶液から形成されたヒドロゲルを使用する、このアッセイの陰性及び陽性の対照を示す。陰性対照は、トランスウェルの両方のチャンバーにおいて誘導因子の存在下で行われるのに対し、陽性対照は、底部チャンバーでのみ行われ、ランダムな遊走ではなく、細胞走化性のみを定量する。
【０１３６】
実施例５．サケ及びウシのゼラチン溶液（官能化された及び官能化されていない）の溶融特性
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）を使用してサケ及びウシのゼラチン溶液（７重量／体積％）の溶融温度（Ｔｍ）及びエンタルピー（ΔＨｍ）を評価し、表１に示す。サケゼラチンのＴｍ（４．２±０．０２６℃）は、ウシのゼラチンのＴｍ（１２．２±０．００８℃）より著しく低い。これらのゼラチンを官能化した場合、溶融温度は有意に減少する（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。しかしながら、改質サケゼラチンのＴｍは、改質ウシゼラチンに対するＴｍよりもはるかに低い（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。サケ及びウシのゼラチンのＴｍ間のこの差を技術的な利点として使用することができ、バイオファブリケーション技術が、例えばゲル化が技術的な適用において適切に作用するように延長されるまで、経時的に粘度を変化せずにより幅広い温度範囲（より広い処理ウインドウ）内で安定な液体の凝集状態を必要とする、組織工学等のより広い適用ウィンドウを許容する。
【０１３７】
また、表１（ΔＴ）中の溶融遷移温度の範囲もまた、三重螺旋形成、したがってウシゼラチンと比較したサケゼラチンの粘弾特性のより良好な制御を可能としながら、遷移がより明確な温度で起こると証明することを強調することが重要である。
【０１３８】
【表１】
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【０１３９】
実施例６．官能化されていないサケ及びウシのゼラチンにおけるゲル強度
Wainewright (1977)によって報告される方法に従って、ゲル強度（ブルーム強度）を測定した。乾燥ゼラチンを２０分間に亘って６０℃の蒸留水に溶解し、４０℃で４０分間懸濁液を保持した後、サケ及びウシのゼラチンゲル（６．６７％重量／体積）をブルームジャー（１５０ｍＬ、英国のStable Micro Systems）中に作製した。作製した懸濁液を３℃で１６時間〜１８時間インキュベーターで保持した。５ｋｇのロードセル、クロスヘッド速度１ｍｍ／秒により、Ｒ１．２７ｃｍ径筒型プローブを装備したテクスチャアナライザーＴＡ．ＸＴｐｌｕｓ（英国のStable Micro Systems）でゲル強度を評価した。プローブがゼラチンゲルへ４ｍｍの距離で侵入する時の最大力（ｇ単位）を特定した。このアッセイの結果を図３５に示す。
【０１４０】
図３５は、サケゼラチン（ＳＧ）及びウシゼラチン（ＢＧ）において測定されたゲル強度を示す。種々の供給源（それぞれ、魚類及び哺乳動物）から得られたゼラチン間のゲル強度に関する有意差はかなり明らかであり、官能化されていないウシゼラチンのゲル強度は、官能化されていないサケゼラチンの約２．５倍高い。この挙動は、ゼラチンの分子量及びアミノ酸プロファイルにおける既存の相違と関連し得る。文献では、サケゼラチンの分子量はウシゼラチンよりも低いことが報告されている。一方、グリシン及びイミノ酸（プロリン及びヒドロキシプロリン）の含有量は、ウシゼラチンにおいてより高い。したがって、サケゼラチンにおけるより低い分子量及び特定のアミノ酸（グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリン）の含有量の減少は、ゼラチンゲル強度に直接影響を及ぼす螺旋構造を折りたたむ能力の減少を説明し得る。
【０１４１】
ウシのゼラチンに対して、架橋されず官能化されていないサケゼラチンのはるかに低い初期強度を考慮すると、メタクリル化魚類ゼラチンの架橋／重合が、ほとんど即時の重合をもたらし、メタクリル化架橋ウシゼラチン（本明細書において図１９及び図３８に示される）と同じ範囲の圧縮特性及び引張り特性を有するゲルを提供するという知見は、全く予想外であった。
【０１４２】
実施例７．メタクリル化されたサケ及びウシのゼラチン溶液の更なる特性評価
レオロジー特性評価
高精度システムでのそれらの有用性を予測するため、メタクリロイル基で置換された又は非置換のウシ及びサケのゼラチンの相対的なレオロジー研究を行った。
【０１４３】
上に記載されるように、種々のずり速度での粘度測定を行った。結果は、一方ではウシと比較して官能化されていない及び官能化されたサケゲルの溶液にてより低い粘度を示し、他方では、サケゼラチン溶液（官能化された及び官能化されていない）にてニュートン挙動を示したが、ウシゼラチン溶液では非ニュートン挙動を示した（図３６を参照されたい）。ずり速度が増加するにつれてウシ溶液にて粘度のずり減粘効果によって非ニュートン挙動が明らかとなるのに対し、サケ溶液では、粘度は種々のレベルのずり応力に伴って変化しなかった。ニュートン挙動は、ドロップオンデマンド式プリンティングシステム及び３Ｄプリンティングシステムにおいて、良好な噴射又は液滴形成の厳密な前提条件であり、バイオファブリケーション用途におけるサケゼラチンの別の利点となり得る。別の興味深い側面は、サケゼラチンが、２０％［重量／体積］の濃度であっても適切な粘度範囲内で作用し得ることであり、濃度、したがって架橋後の機械的特性に関して作業範囲がより広範であることを意味する（図３７を参照されたい）。
【０１４４】
機械的特性評価
動的機械分析（ＤＭＡ）によって測定されるサケ及びウシのゼラチンに由来するヒドロゲルの機械的特性は、圧縮弾性率が官能化の程度と共に増加して正の相関を表すことから、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）の第一級アミンの定量結果及び先の調査（Billiet T. et al., Biomaterials 2014, 35: 49-62）と一致する。サケ及びウシのゼラチンに基づく両方のヒドロゲルを、０．５ＭＡＡ［％体積／体積］の濃度を使用する反応において改質すると、１１ｋＰａの圧縮弾性率（それぞれ１０．６±０．７Ｓ．Ｄ．ｋＰａ及び１０．５±０．９Ｓ．Ｄ．ｋＰａ）を示した（図３８ａを参照されたい）。同じ官能化条件のもとで、ウシゼラチンに由来するヒドロゲルの２６．６±３．６ｋＰａと比較して、２ＭＡＡ［％体積／体積］のサケゼラチンヒドロゲルは３０．５±２．２ｋＰａの圧縮弾性率を示した。５ＭＡＡ［％体積／体積］の反応によって改質されたウシゼラチン由来ヒドロゲルは、サケゼラチンに由来するヒドロゲルと同様の圧縮弾性率、それぞれ３２±１．３ｋＰａ、３０．７±４ｋＰａを示した。さらに、サケでは平均３３ｋＰａを示したのに対し、１０ＭＡＡ［％体積／体積］のウシゼラチンに基づくヒドロゲルは圧縮弾性率２８．２±１．７ｋＰａを示したことから、１０ＭＡＡ［％体積／体積］で改質されたゼラチンに由来するヒドロゲルは、ほぼ有意の（ｐ＝０．０６、マン−ホイットニー）興味深い差を示し、ＯＰＡ及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）の結果が１０ＭＡＡ［％体積／体積］のより高い官能化の程度を示したにもかかわらず、５ＭＡＡ［％体積／体積］のウシのゼラチンに由来するヒドロゲルに対して得られた３２±１．３ｋＰａを考慮すると、減少を意味する。全体的に、サケ又はウシのゼラチンに由来するいずれのヒドロゲルも、圧縮の機械的特性に関して、他に勝ることはなかった。
【０１４５】
０．５ＭＡＡ［％体積／体積］での反応によって生成されたサケ又はウシに由来するゼラチンのいずれのヒドロゲルも、機械試験機を使用する引張り試験を可能とするための十分な完全性がなかった。しかしながら、２ＭＡＡ［％体積／体積］〜１０ＭＡＡ［％体積／体積］の反応条件で生成されたヒドロゲルから得られた結果（図３８ｂ））を参照されたい）は、官能化の程度とヤング率との間の正の相関を示すＤＭＡによって得られた結果を支持する。
【０１４６】
さらに、１０ＭＡＡ［％体積／体積］で反応させたサケゼラチンに由来するヒドロゲルは、２２．２±１．２Ｓ．Ｄ．ｋＰａのヤング率を示し（５ＭＡＡ［％体積／体積］のサケヒドロゲルから１ｋＰａ増加）、官能化の程度とヤング率との間の明らかな正の相関をもたらした。この結果は、１０ＭＡＡ［％体積／体積］での反応から得られたウシゼラチンについても見られ、ヒドロゲルは３ｋＰａの増加を示している。一般に、メタクリロイル置換の程度のわずかな変化は、良好な相関で機械試験に反映され、サケ及びウシに由来する光架橋改質ゼラチンの間に機械的挙動の差は観察されない。
【０１４７】
加水分解評価
先に見られたように、メタクリロイル官能化の程度は、光架橋されたヒドロゲルの機械的特性を増強することができ（図３８を参照されたい）、したがって、機械的な課題が予想される、組織工学の適用に好都合となり得る。しかしながら、付随する側鎖配列の中断を有するゼラチンのアミノ酸配列と共に大きな基（メタクリロイル）を含むことは、材料の包含及びＥＣＭ（細胞外マトリクス）リモデリング酵素の触媒側の加水分解に影響し得ることから、基質特異性及び触媒が損なわれる可能性がある。この生体材料の官能化の側面を判断するため、２つの異なる供給源に由来し、メタクリル化の程度が異なる、光架橋されたヒドロゲルを２型コラゲナーゼによる加水分解に供した。加水分解速度論（図３９を参照されたい）より、同程度の官能化を有するサケ及びウシのゼラチンを比較する場合、１０ＭＡＡ［％体積／体積］で官能化反応に供したゼラチンから作製されたヒドロゲルを除いて、顕著な差は観察されない。その場合、加水分解の初期速度及び加水分解の静止ピークまでの時間は、ウシと比較して、サケゼラチンがより速かった。メタクリル化の程度と関連して、メタクリロイル置換が増加する場合に、加水分解の初期速度及び静止ピークに到達するまでの時間が減少する。興味深いことに、機械的にはサケに由来するヒドロゲル及びウシヒドロゲルは同様の結果を示したが、サケゼラチンヒドロゲルは、特に高い官能化の程度において、より速い酵素加水分解を示し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで移植された場合により速い酵素由来組織統合（より速い血管形成、細胞の浸潤及び増殖）が期待される。
【０１４８】
実施例８．メタクリル化されたサケ及びウシのゼラチンの官能化の特性評価
反応性無水メタクリル酸は、穏やかな条件下でゼラチンと混合した場合、反応して、メタクリロイル基のほとんどをリジンの遊離アミン基に結合させることができる（Nichol JW, Biomaterials. 2010, 31(21): 5536-5544）。ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）アッセイ（P.M. Nielsen, Journal of Food Science 2001, 66(5): 642-646）による反応したメタクリロイルゼラチン中の残りの遊離アミン基の定量は、ゼラチンのメタクリル化又は官能化の程度を判断する信頼のおける方法論であろう。一方、サケ及びウシのゼラチンのＯＰＡアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、相対的な加水分解レベル及び分子量の近似値をそれぞれ定量することができる（図４０を参照されたい）。サケ及びウシのゼラチンのアミノ酸組成分析は、ウシゼラチンの場合にわずかに高い量のリジン（９％高いリジン数）を示し、９％高いＯＰＡアッセイを使用する遊離アミンの定量と同等であり、したがって、加水分解のレベルは両方の抽出されたゼラチン（ウシ及びサケ）について同等である。ゼラチン調製物における種々の程度の加水分解は、ペプチド結合の切断後に新たに露出されたアミンにより、相対的なリジン組成分析とは異なるＯＰＡの相対的な定量をもたらし得るため、これは差し引かれる。それらの定量は、本発明者らが、未反応のサケ及びウシのゼラチン中の遊離のアミン含有量に関する割合としてそれぞれ明示される（図４１を参照されたい）種々のゼラチン調製物におけるメタクリロイルアミンの調整量がサケ及びウシのゼラチン間で同程度であることを実証するのを支援した。
【０１４９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による精製されたサケ及びウシのゼラチンの分子量の分布を考慮すると、アミン基の定量及びリジン組成によって実証される同程度の加水分解、並びに官能化されたリジンの数、ゼラチンモノマー１個の当たりのメタクリロイル基の数は、様々な程度のメタクリロイル官能化の程度で作製されたウシゼラチンとサケゼラチンとの間で同等となり得る。これに関して、同等の試料を有することの重要性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイにおける相違がサケ及びウシのゼラチンの異なる性質（例えば、プロリン及びヒドロキシプロリンの含有量）によって説明され、分子量、加水分解度、又はポリペプチドのモノマー１個当たりのメタクリロイル基の数の相違によるものではないという事実にある。
【０１５０】
しかしながら、このアプローチは、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミン等の反応性がより低い他のアミノ酸におけるメタクリロイル置換が、反応の間に起こるかどうかの情報を提供しなかった。したがって、ＮＭＲ分析に基づく第２のより有益な定量法を行って、リジン以外のアミノ酸におけるメタクリロイル基の存在を排除した。図４２）は、種々のメタクリル化の程度のウシ及びサケのゼラチンから得られたスペクトルを示す。改質されていないゼラチン及び改質されたゼラチンを比較し、以前に報告された化学シフトの分析（J Mater Sci: Mater Med (2012) 23:2607-2617）に従って、ｄ＝５．４ｐｐｍ及びｄ＝５．６ｐｐｍで官能化ゼラチンのスペクトルに観察される新たなピークは、異なる程度のメタクリロイル置換を有するゼラチン調製物間で差次的に観察された。これらは、メタクルリロイル基中のアクリルプロトンの存在によって生成されるが、ｄ＝１．８ｐｐｍに位置するピーク（スペクトル中「ｃ」ピーク）は、同じ付加された基のメチル官能基（function）に起因する。一方、ｄ＝２．９ｐｐｍ（スペクトル中「ｂ」ピーク）に位置するリジンメチレンの存在と関連するシフトシグナルの減少は、リジンの官能化を実証する。おそらくはヒドロキシル基におけるメタクリロイルの遷移として先に報告される他のＮＭＲピーク（J Mater Sci: Mater Med (2012) 23:2607-2617）は、本発明者らのゼラチン調製物では観察されなかった。改質されていない及び改質されているゼラチンから得られた１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＯＰＡアッセイと比較して同様の結果を確認した（図４１及び図４３を参照されたい）。この前提の下で、種々の反応条件で得られたメタクリル化の程度は、ウシゼラチンとサケゼラチンとの間で類似する。
【０１５１】
実施例９．メタクリル化された冷水魚（cold-fish）のゼラチンを含む新たな製剤
実施例９．１  分岐鎖ポリエチレングリコール誘導体を更に含む製剤（例えば、マルチアームＰＥＧ誘導体）
改善された架橋反応性、より良好な吸湿性（脱水を回避する能力）、並びにより大きな圧縮弾性率及びヤング率を有する新たな複合材料を作る目的で、マスター製剤ＳＧ８（９０％官能化された１５％［重量／体積］サケゼラチン）を、種々の濃度の分岐鎖ポリ−リンカーＰＥＧ（８アーム−ＰＥＧ１０Ｋ−アクリレートトリペンタエリスリトール）で補足し、機械的特性、レオロジー挙動、脱水に対する反応性及び抵抗性について試験した。ＰＥＧの濃度の増加は、機械の後架橋の点からより強靭な製剤を生成したが、より高濃度のＰＥＧは、ニュートン製剤を比較的非ニュートンのより粘性の製剤へと変えた（図４４を参照されたい）。
【０１５２】
反応性試験について、通常の作業条件下、プリンターヘッド（Ｏｂｊｅｔ３０  ３Ｄプリンター、STRATASYS）からの２回及び４回ＵＶ光に通した後で架橋されたヒドロゲルの定性的観察を行った。ＳＧ８製剤のみに基づく１００μｍの高さのヒドロゲルは、２回通した後に部分的に架橋され脱水されて、４回通した後に完全に乾いたのに対し、１％［重量／重量］ＰＥＧによる補足は、２回通した後、脱水の兆候のない適正に架橋されたヒドロゲルを示したが、４回通した後、低い水和が観察された。５％［重量／重量］ＰＥＧで補足したＳＧ８製剤は、４回通した後であっても脱水に抵抗性であり、架橋反応性は更に改善された（図４５を参照されたい）。
【０１５３】
実施例９．２  界面活性剤を更に含む製剤
表面張力の測定
前に言及したように、溶液中の材料の良好な噴射能力は、好ましくはニュートン流体挙動、２５ｃＰ〜１０ｃＰの粘度及び低い表面張力（２５ｍＮ／ｍ〜３０ｍＮ／ｍ）を有する。ＳＧ８マスター製剤は、表面張力を除く全ての好ましいレオロジーパラメーターに適合する。本発明者らは、９０％官能化されたサケゼラチンの１５％［重量／体積］溶液（ＳＧ８）を作製し、該溶液は４３ｍＮ／ｍの静的表面張力を示した（図４６を参照されたい）。適切な範囲まで表面張力を低下させるため、水系に対して種々の界面活性剤、ＢＹＫ−３４５（米国のBYK）、Ｔｉｖｉｄａ  ＦＬ  ２３００及びＴｉｖｉｄａ  ＦＬ  ２５００（ドイツ国のMERCK）を使用した。わずかな量を添加することにより、全ての界面活性剤は、マスター製剤の静的表面張力を２５ｍＮ／ｍまで減少させることができた（図４６を参照されたい）。
【０１５４】
大半の液体は、通常、循環条件下で扱われることから、表面張力の時間変動成分を公表することは重要である（図４６を参照されたい）。この成分は、界面活性剤の濃度及び性質に応じて変化する。これに関して、平衡に対する時間がより短い界面活性剤は、ｐＬ液滴の形成中に表面張力を低下させることにおいてより効率的である。静的表面張力及び平衡に達するのに要する時間を考慮に入れると０．０２％［体積／体積］の濃度のＴｉｖｉｄａ  ＦＬ２３００及び０．０２％のＢＹＫ  ３４５は、インクジェット方式におけるｐＬ液滴形成に使用される最も有望な界面活性剤の条件のようである。
【０１５５】
細胞生存率及び細胞適合性の判定
新たな複合製剤の細胞生存率及び細胞適合性を検証するため、この製剤に基づくヒドロゲルを、カプセル化された細胞を用いて製造した。
【０１５６】
細胞がカプセル化される、すなわち細胞がヒドロゲル表面から１００μｍより遠くに離れているトランスグルタミナーゼ架橋ゼラチンゲルでは、細胞の増殖のプロファイルが大幅に減少されることが記載され（PLoS One. 2014 Aug 18;9(8):e105616）、既に知られている現象である。更に遠く離れた細胞に対する栄養素、酸素及び代謝産物の拡散及び交換の制限を減少することも、それらの細胞の生存率に重要な効果であると推定される。
【０１５７】
細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を高さ１．５ｍｍ及び直径８ｍｍのヒドロゲルにカプセル化した、本発明者らの新たな製剤を用いて同様の条件を試験した。種々の時間間隔（０日目、１日目、７日目、１４日目、２１日目）の後、カプセル化された細胞をヒドロゲルから回収し（図４７ａ）、計数し（図４７ｂ）、生存率を試験した（図４７ｃ）。予想通り、おそらくは、ヒドロゲル中深くのカプセル化細胞の細胞死に起因して回収される細胞数は７日まで減少した。７日後、おそらくはヒドロゲル表面に近いカプセル化細胞の細胞増殖に起因して細胞数は再び増加する。
【０１５８】
興味深いことに、予想外に、界面活性剤ＴＩＶＩＤＡ  ２３００及びＴＩＶＩＤＡ  ２５００の存在下で、ヒドロゲル製剤は７日目に観察される細胞死を減少するのに対し、界面活性剤ＢＹＫ−３４５は、細胞膜の完全性に影響するその特定の化学的性質により全ての細胞を死滅させた可能性が最も高い。ＴＩＶＩＤＡ  ２３００及びＴＩＶＩＤＡ  ２５００の場合、細胞生存率ははるかに高く、改質サケゼラチンのみに基づく対照のヒドロゲルよりも更に高かった。おそらくは、このより良好な細胞生存率は、フッ素系界面活性剤（ＴＩＶＩＤＡ  ２３００、ＴＩＶＩＤＡ  ２５００）の存在に起因する、ヒドロゲル内の栄養素、代謝産物及び気体のより高い拡散係数と相関する。
【０１５９】
実施例１０．種々のｐＨでのサケゼラチンの抽出
タイセイヨウサケ（サルモ・サラ）の皮膚から先に説明されるプロトコルに従ってサケゼラチンを抽出した。簡潔には、筋肉及び鱗の残渣を排除するためのクリーニング及び０．１Ｍ溶液のＮａＯＨ及び０．０５Ｍ酢酸溶液による一連の処理を含む予備処理の後、６０℃で３．５時間に亘り種々のｐＨ（３、４及び５）の下でサケゼラチン抽出を行った。上清液を真空濾過（２２ｍｍ）し、２４時間５５℃のオーブンで乾燥した。得られた乾燥ゼラチンを粉に挽き、更なる使用まで５℃で保管した。
【０１６０】
種々のｐＨ条件で得られたサケゼラチンを、それらの生化学的特性（一般組成、分子量及びアミノ酸プロファイル）、並びに物理学的特性、具体的にはゲル強度、熱及びレオロジー特性、並びにラマン分光法による分子立体構造に関して特性評価した。
【０１６１】
生化学的特性の特性評価
生化学特性に関して、AOAC(2015)によって記載され検証され、ゼラチンの特性評価に以前に使用された方法（Journal of the Science of Foods and Agriculture 91(2011):2558-2565、Food Hydrocolloids 71(2017):118-128）を使用して一般組成を試験した。分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって特定し、アミノ酸プロファイルをＨＰＬＣによって特定した（Journal of the Science of Foods and Agriculture 91(2011):2558-2565、Food Hydrocolloids 71(2017):118-128）。結果は、一般組成に関して、種々のｐＨ条件でのゼラチンの抽出は、主要栄養素の組成にそれほど影響を与えないことを示した（表２）。タンパク質含有量（試験した全てのゼラチンにおいておよそ９９％乾燥量基準）及び灰分（およそ０．６％乾燥量基準）における有意差は検出されなかったが、脂質含有量は使用した方法の検出限界を下回り、無窒素画分も検出されなかった。一方、アミノ酸組成は、ｐＨ抽出に起因する有意差を示さなかった。ゼラチン安定性に対して最も重要なアミノ酸（グリシン、プロリン及びヒドロキシプロリン）の含有量は、ｐＨ抽出によって影響を受けなかった（表２）。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって評価された分子量は、より高い加水分解条件がより低いｐＨで起こるため、抽出に使用されるｐＨが低いほど、電気泳動ゲル上の分子量分布が高くなることから、ｐＨ抽出がゼラチン鎖の分子量を特定するキー値であることを示した。したがって、ｐＨ５で抽出されたゼラチンは、最も可能性が高くはα−ヘリックスに対応するおよそ１２０ｋＤａに位置する分子量のバンド、及びより複雑なゼラチン鎖（例えば、β−ヘリックス）と関連するおよそ２５０ｋＤａの他のバンドを明確に示した（図４８）。しかしながら、ｐＨ３で抽出されたゼラチンは、３７ｋＤａ〜１００ｋＤａに分布する分子量のバンドを示し、より高い加水分解条件がより低いｐＨ値で促進したことを表す（図４８）。
【０１６２】
【表２】
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【０１６３】
物理特性の評価
物理特性の評価に関して、ｐＨ抽出は、ゲル強度に対する強い効果を示した（図４９）。したがって、試験した最も高いｐＨ抽出（ｐＨ５）は、より高いゲル強度を有し、試験した最も低いｐＨ（ｐＨ３）はより低いゲル強度を示し、それは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価されるｐＨ５で抽出されたゲルによって示されるより高い分子量と一致する。この挙動は、高分子量のゼラチンのより多い量の螺旋構造を形成するより高い能力と関連付けられた（Biomaterials 25(2004):5675-5680）。ゲル強度の結果によって説明される挙動は、種々のｐＨで抽出されたゼラチンの熱パラメーターと直接相関する。１０℃／分で７０℃〜−５℃の温度スキャンを適用して、ランダムなゼラチン鎖からの螺旋構造の形成（ゲル化点）と関連して発熱を伴う遷移が起こる温度を評価する、示差走査熱量測定法（ＤＣＳ）によって熱特性を調べた。ＤＳＣデータは、より高いエネルギー（エンタルピー）は、ｐＨ５で抽出されたゼラチンからのゲル形成に関与すること、またより少ないエネルギーがｐＨ３で得られたゼラチンによるゲル形成に関与することを示す（表３）。したがって、ｐＨ５で抽出されたサケゼラチンはより高い分子量を有し、より強いゼラチンのゲルを生じ、これはゼラチン折り畳みを促進するためより高いエネルギーを使用することを意味する。その他に、遷移温度も引用されたパラメーターと相関し、より高分子量のゼラチンでは、遷移は特定の温度で起こり、分子量が減少するにつれて、遷移温度はより低い値へとシフトしている（表３）。
【０１６４】
種々のｐＨで得られたサケゼラチンのレオロジーの特性評価に関して、得られた結果は、ここでも先に示された結果と直接相関する。図５０は、温度（フロー温度勾配）の関数として試験したサケゼラチン試料の粘度挙動を示す。ｐＨ５で抽出されたゼラチンが試験した全ての温度範囲でより高い粘度を示した場合、粘度挙動に対するゼラチン鎖の分子量の効果は非常に明らかであるのに対し、ｐＨ３で抽出されたゼラチンではその逆が観察された。また、これらの結果は、より高い分子量を有し、より多い量の螺旋構造（より高いゲル強度）を形成することができるゼラチン鎖は、より高いフラックス抵抗を促進し、より高い粘度を示すことを強調する。例えば、４℃において得られる粘度値は、ｐＨ３、ｐＨ４及びｐＨ５で抽出されたゼラチンに対して、それぞれ０．０３５Ｐａ・ｓ、１．４７７Ｐａ・ｓ及び１２．５０Ｐａ・ｓであった。また、レオロジー分析により、係数Ｇ’とＧ’’との間の交点を読み取ることによって、ゼラチンのゲル化点を評価することができる（データは示されていない）。したがって、興味深いことに、レオロジーによって記録されるゲル化点は、ＤＳＣによって先に記録されるそれらのゲル化点と一致する（表３）。
【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
最後に、ラマン分光法による分子立体構造の分析もまた、後の分析と密接に関連する結果を示す。ラマンスペクトルを図５１に示す。種々のｐＨで抽出されたゼラチンに対して得られたラマンスペクトルは、この種のタンパク質について予想されるスペクトルである。例えば、種々のアミドＩ、ＩＩ及びＩＩＩの基は、文献でこれらの基について報告されるラマンシフトで検出された（それぞれ、１６５０ｃｍ−１、１５５０ｃｍ−１及び１２４０ｃｍ−１）。抽出のｐＨが減少している場合にそのピークが強度の増加を示す、アミドＢ基によって示される挙動が興味深い。アミドＢ基は、タンパク質骨格の末端域に位置するヒドロキシル基と関連し、この場合、Ｎ末端にヒドロキシル基を有するより多くの分子の存在を示唆している。この挙動は、低ｐＨの加水分解効果に起因してｐＨ３で得られたより多くの加水分解されたゼラチン鎖と一致する。したがって、ラマンスペクトルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と適合し、ゲル強度、並びに熱及びレオロジーの特性と一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【国際調査報告】
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