(57)【要約】  本開示は、神経炎症及び神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を管理するための方法及び組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、炎症の抑制又は調節を前記対象においてもたらすことができる少なくとも１つの化合物を、前記神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために投与することを含む方法。
【請求項２】
神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる少なくとも１つの化合物を含み、必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む、組成物。
【請求項３】
ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発される神経変性を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を、前記神経変性を抑制するために、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる少なくとも１つの化合物により処置する工程を含む方法。
【請求項４】
化合物が、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症性分子、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤、又はそれらのあらゆる組合せを含む群から選択される、請求項１もしくは３に記載の方法、又は請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
化合物がチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１もしくは３に記載の方法、又は請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
化合物がサーチュイン−２阻害剤である、請求項１もしくは３に記載の方法、又は請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
チロシンキナーゼ阻害剤がチロシンキナーゼ阻害剤ファミリーからの分子又は化合物であり、かつ、サーチュイン−２阻害剤がサーチュイン−２阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である、請求項４、５又は６に記載の方法。
【請求項８】
非ステロイド性抗炎症薬が、セレコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク及びトルメチンを含む群から選択され、
抗炎症性分子がＮＡＣであり、
チロシンキナーゼ阻害剤が、ＰＤ１８０９７０、アキシチニブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ及びビスモデギブを含む群から選択され、かつ、
サーチュイン−２阻害剤が、ＡＧＫ−２及びＡＫ−７から選択されるか、又はそれらの任意の組合せである、
請求項４〜７に記載の方法又は組成物。
【請求項９】
ニューロン周囲細胞における神経炎症を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を、前記神経炎症を抑制するために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せにより処置する工程を含む方法。
【請求項１０】
神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１１】
神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物。
【請求項１２】
チロシンキナーゼ阻害剤がチロシンキナーゼ阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である、請求項９もしくは１０に記載の方法、又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
チロシンキナーゼ阻害剤が、ＰＤ１８０９７０、アキシチニブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、それらの立体異性体、医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物、水和物、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１２に記載の方法又は組成物。
【請求項１４】
サーチュイン−２阻害剤がサーチュイン−２阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である、請求項９もしくは１０に記載の方法、又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
サーチュイン−２阻害剤が、ＡＧＫ−２、ＡＫ−７、それらの立体異性体、医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物、水和物、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項１４に記載の方法又は組成物。
【請求項１６】
化合物が、医薬的に許容される賦形剤とともに投与される、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１７】
阻害剤が、医薬的に許容される賦形剤とともに投与される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１８】
医薬的に許容される賦形剤が、造粒剤、結合剤、滑剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、付着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、酸化防止剤、ガム、被覆剤、着色剤、風味剤、添加物、溶媒、増粘剤、可塑剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤、植物セルロース系材料、球形化剤及びそれらの組合せを含む群から選択される、請求項１６もしくは１７に記載の方法、又は請求項２もしくは１１に記載の組成物。
【請求項１９】
対象が哺乳類であり、好ましくはヒトである、請求項１もしくは１０に記載の方法、又は請求項２もしくは１１に記載の組成物。
【請求項２０】
神経変性疾患又は神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される、請求項１もしくは１０に記載の方法、又は請求項２もしくは１１に記載の組成物。
【請求項２１】
阻害剤により、ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死が停止させられる、請求項９もしくは１０に記載の方法、又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
ニューロン周囲細胞が、グリア細胞、星状膠細胞及び免疫細胞、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項３、９又は２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物工学、医学及び細胞生物学の分野に関する。具体的には、本開示は、神経炎症及び神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を管理するための方法及び組成物に関する。
【０００２】
神経変性は、総称用語としてである場合、脳の様々な領域におけるニューロンの死を含めて、ニューロンの構造又は機能の進行性喪失を伴う。パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）及び多発性硬化症（ＭＳ）を含む様々な神経変性疾患が、高齢者に対する深刻な課題として現れている。神経変性又はニューロン細胞死における顕著な特徴は、酸化ストレス、ニューロンにおける増大したタンパク質（α−シヌクレイン／アミロイド）凝集体、及び中枢神経系（ＣＮＳ）における低レベルの慢性炎症である。
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、硬直、制御不能な振戦、姿勢の不安定性及び運動の緩慢さを含めて、様々な重度の運動症状を特徴とする神経変性疾患である。ＰＤの主要な際立った病理学的特徴には、ドパミン作動性ニューロンの喪失をもたらす黒質緻密部における神経変性、線条体における低下したドパミンレベル、同様にまた、アルファ−シヌクレインの凝集が伴う。ＰＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に一般的な神経変性疾患である。この疾患の原因となる作用因には、酸化ストレス、遺伝子変異、ミトコンドリアの機能不全、及びタンパク質の誤った折り畳みが含まれる場合がある。Ｌ−ＤＯＰＡが、この疾患のための現在の標準的な対症療法であり、しかし、Ｌ−ＤＯＰＡはドパミンレベルを特定の程度まで補うだけである。さらに進行すると、実質的な治療利益をもたらす処置が存在しない。この処置もまた、さらなる神経変性を停止させない。他の処置がこの３０年で開発されてきたにもかかわらず、ほとんどの患者が、ＰＤ症状を制御することにおけるその優れた効力を考慮してＬ−ＤＯＰＡを使用する。残念なことに、Ｌ−ＤＯＰＡには、長期の運動合併症（運動変動及びジスキネジー）が伴う。これらの望ましくない影響の主な原因が、治療域が疾患の自然進行とともに狭くなること、薬物の短い半減期に起因する脈動的なドパミン作動性刺激、及び一定しない吸収である。
【０００４】
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳及び脊髄における神経細胞の絶縁被覆が損傷を受ける脱髄性疾患である。この損傷は、神経系の様々な部分が情報を伝達し得ることを妨げ、その結果、身体的、精神的及び時には精神医学的な問題を含めて、様々な徴候及び症状を生じさせる。
【０００５】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチントン舞踏病としてもまた知られているものであり、脳細胞の死をもたらす遺伝性障害である。最も初期の症状は多くの場合、気分又は知的能力に関する微妙な問題である。ヒトは２コピーのハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）を有しており、この遺伝子により、タンパク質のハンチンチン（ＨＴＴ）がコードされる。この遺伝子はＨＤとも呼ばれ、また、「興味深い転写物１５」を意味するＩＴ１５とも呼ばれる。この遺伝子の一部が、トリヌクレオチド反復と呼ばれる反復部分であり、この部分は長さが個体間で異なっており、また、長さが世代間で変化する場合がある。この反復が、正常な遺伝子に存在するならば、動的突然変異により、反復の数が増大し、欠陥遺伝子が生じる場合がある。この反復部分の長さが、ある一定の閾値に達すると、それにより、変化した形態のタンパク質（これは変異型ハンチンチンタンパク質（ｍＨＴＴ）と呼ばれる）が生じる。これらのタンパク質の異なる機能が、疾患の諸症状を結果的には引き起こす様々な病理学的変化の原因である。
【０００６】
現在の治療剤は、症状を軽減するためにだけ役立っており、治療法は依然として得られていない。したがって、そのような神経変性疾患において示される状態を標的とし、かつ、改善し得る治療剤を探すことが、早急に求められている。
【０００７】
様々な研究により、炎症が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病などのような神経変性疾患において関係づけられる。脳は血液脳関門（ＢＢＢ）の存在のために免疫特権部位であるという従来から信じられている考えとは対照的に、最近の研究では、脳は免疫応答を完全に呼び起こすことができることが立証されている。脳における炎症には、末梢免疫系が関与せず、また、抗体又はＴ細胞が関与しない。脳における免疫反応は、グリア細胞による、とりわけ、常在性食細胞（これは脳の場合にはミクログリアである）による炎症成分の合成に依存する。
【０００８】
脳内において、グリア細胞は、ニューロンの生存を促進するホメオスタシスの微小環境を維持する上で非常に重要な役割を果たしている。ミクログリアは、サイトカイン、ケモカイン、プロスタグランジン、反応性の酸素種及び窒素種、並びに増殖因子を含む無数の因子を分泌することによって、侵入病原体に対する自然免疫応答を媒介する。したがって、炎症促進性応答及び抗炎症性応答は、炎症により誘発された長期に及ぶ酸化ストレスの、脆弱なニューロン集団に対する潜在的な有害影響を防止するために厳密に調節されなければならない。
【０００９】
正常な成人の脳において、ミクログリア細胞は通常、静止状態にある。活性化されたとき、これらの細胞は、周囲のニューロンにおける損傷及び細胞死を引き起こす様々なタイプの炎症促進性分子（例えば、一酸化窒素（ＮＯ）及びサイトカインなど）を放出することが知られている。例えば、パーキンソン病では、核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）経路の活性化と同様に、活性化されたミクログリア、サイトカインの蓄積の証拠が、ＰＤの進行に寄与することが見出されている。
【００１０】
現在、神経炎症及び神経変性疾患又は神経変性障害を処置するための選択肢は限られている。したがって、本開示は、先行技術において存在する制限に対処する方法及び組成物を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
本開示は、神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、炎症の抑制又は調節を対象においてもたらすことができる少なくとも１つの化合物を、神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために投与することを含む方法；神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる少なくとも１つの化合物を必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物；ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発される神経変性を抑制する方法であって、ニューロン周囲細胞を、神経変性を抑制するために、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる少なくとも１つの化合物により処置する工程を含む方法；ニューロン周囲細胞における神経炎症を抑制する方法であって、ニューロン周囲細胞を、神経炎症を抑制するために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せにより処置する工程を含む方法；神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを対象に投与することを含む方法；及び、神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００１２】
本開示が容易に理解され、実際に実施され得るために、添付された図面を参照して例示されるような例示的な実施形態が次に参照されるであろう。図面は下記の詳細な説明と一緒になって、本明細書に組み込まれ、その一部を形成しており、本開示に従って、実施形態をさらに例示するために、また、様々な原理及び利点を説明するために役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＢＶ２細胞株におけるＬＰＳ誘発の亜硝酸放出に対する化合物ＰＤ１８０９７０及び化合物ＡＧＫ２の抗炎症性応答を示す。
【図２（Ａ）】ニューロン−ミクログリア共培養アッセイにおける化合物ＣＣＮＤ−０１（チロシンキナーゼ阻害剤）、化合物ＣＣＮＤ−０２（Ｓｉｒｔ−２阻害剤）及び化合物ＮＡＣの神経保護効果を示しており、本発明の実施形態に従って、ＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２及びＮＡＣは、グリア細胞により分泌される炎症性因子によって誘発されるニューロン細胞死を阻害することを示す。
【図２（Ｂ）】ニューロン−ミクログリア共培養アッセイにおける化合物ＣＣＮＤ−０１（チロシンキナーゼ阻害剤）、化合物ＣＣＮＤ−０２（Ｓｉｒｔ−２阻害剤）及び化合物ＮＡＣの神経保護効果を示しており、本発明の実施形態に従って、ＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２及びＮＡＣは、亜硝酸放出を阻害することを示す。
【図３】ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞からの馴化培地によって誘発される毒性における、ＮＡＣ、ＣＣＮＤ−０１及びＣＣＮＤ−０２の神経保護効果を示す。
【図４】Ｎ２７−ＢＶ２共培養におけるＬＰＳ誘発のニューロン死に対する化合物の神経保護効果を示す。
【図５】Ｎ２７−ＢＶ２共培養におけるＬＰＳ誘発の亜硝酸放出に対する化合物の抗炎症性応答を示す。
【図６】Ｎ２７−ＢＶ２共培養におけるＢＶ２によるＬＰＳ誘発のＩＬ−６分泌に対する化合物の抗炎症性応答を示す。
【図７】Ｎ２７−ＢＶ２共培養におけるＢＶ２によるＬＰＳ誘発のＭＣＰ−１分泌に対する化合物の抗炎症性応答を示す。
【図８】ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞によって誘発される毒性における、ＮＡＣ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ＴＫ阻害剤（ＣＣＮＤ−０１、イマチニブ及びニロチニブ）及びサーチュイン−２阻害剤（ＡＧＫ−２）の神経保護効果を示す。
【図９】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞株におけるｎＦ−κＢ誘発のＳＥＡＰ活性に対するＣＣＮＤ−０１の抗炎症性応答を示す。
【図１０】ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞株におけるｎＦ−κＢ誘発のＳＥＡＰ活性に対するＡＧＫ２の抗炎症性応答を示す。
【図１１】Ｎ２７細胞における過酸化水素誘発の神経毒性に対する化合物の効果を示す。
【図１２】Ｎ２７細胞におけるＭＰＰ＋誘発の神経毒性に対する化合物の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、炎症の抑制又は調節を対象においてもたらすことができる少なくとも１つの化合物を、神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本開示はまた、神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる少なくとも１つの化合物を必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００１６】
本開示はまた、ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発される神経変性を抑制する方法であって、ニューロン周囲細胞を、神経変性を抑制するために、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる少なくとも１つの化合物により処置する工程を含む方法に関する。
【００１７】
１つの実施形態において、化合物は、非ステロイド性抗炎症薬、抗炎症性分子、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００１８】
別の実施形態において、化合物はチロシンキナーゼ阻害剤である。
【００１９】
１つの実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である。
【００２０】
さらに別の実施形態において、化合物はサーチュイン−２阻害剤である。
【００２１】
１つの実施形態において、この場合、サーチュイン−２阻害剤はサーチュイン−２阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である。
【００２２】
また別の実施形態において、
非ステロイド性抗炎症薬は、セレコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク及びトルメチンを含む群から選択される；
抗炎症性分子はＮＡＣである；
チロシンキナーゼ阻害剤は、ＰＤ１８０９７０、アキシチニブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ及びビスモデギブを含む群から選択される；
サーチュイン−２阻害剤は、ＡＧＫ−２及びＡＫ−７から選択される；又はそれらの任意の組合せ、である。
【００２３】
本開示は、ニューロン周囲細胞における神経炎症を抑制する方法であって、ニューロン周囲細胞を、神経炎症を抑制するために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せにより処置する工程を含む方法に関する。
【００２４】
本開示はまた、神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを対象に投与することを含む方法に関する。
【００２５】
本開示はまた、神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００２６】
１つの実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である。
【００２７】
別の実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＰＤ１８０９７０、アキシチニブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、それらの立体異性体、医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物、水和物、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００２８】
さらに別の実施形態において、サーチュイン−２阻害剤はサーチュイン−２阻害剤ファミリーからの分子又は化合物である。
【００２９】
さらなる別の実施形態において、サーチュイン−２阻害剤は、ＡＧＫ−２、ＡＫ−７、それらの立体異性体、医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物、水和物、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００３０】
さらなる別の実施形態において、化合物は、医薬的に許容される賦形剤と一緒に投与される。
【００３１】
さらなる別の実施形態において、阻害剤は、医薬的に許容される賦形剤と一緒に投与される。
【００３２】
さらなる別の実施形態において、医薬的に許容される賦形剤は、造粒剤、結合剤、滑剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、付着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、酸化防止剤、ガム、被覆剤、着色剤、風味剤、添加物、溶媒、増粘剤、可塑剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤、植物セルロース系材料、球形化剤及びそれらの組合せを含む群から選択される。
【００３３】
さらなる別の実施形態において、対象は哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００３４】
さらなる別の実施形態において、神経変性疾患又は神経変性障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される。
【００３５】
さらなる別の実施形態において、阻害剤は、ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死を停止させる。
【００３６】
さらなる別の実施形態において、ニューロン周囲細胞は、グリア細胞、星状膠細胞及び免疫細胞、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００３７】
本明細書中で別途定義される場合を除き、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途要求される場合を除き、単数形で示された用語は、文脈及び／又は適用に対して適切であるとみなされるように複数であることを包含するものとし、また、複数形で示された用語は、文脈及び／又は適用に対して適切であるとみなされるように単数であることを包含するものとする。様々な単数形／複数形の入れ替えが、明瞭化のために本明細書中において明示的に示される場合がある。一般に、本明細書中に記載される生物工学、医学及び細胞生物学の技術に関連して使用される命名法、並びに本明細書中に記載される生物工学、医学及び細胞生物学の様々な技術は、当該技術分野において広く知られているものであり、また、一般に使用されるものである。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先するものとする。材料、方法、図及び例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「管理する」又は用語「管理」には、疾患状態又は障害或いは悪影響又は副作用を処置すること、又は治すことが含まれる。この用語はまた、最適な状態を維持すること、及び疾患状態又は障害或いは悪影響又は副作用におけるさらなる進展を防止することを包含する。さらに、「管理」又は「管理する」は、疾患又は障害に起因する死亡の危険性を低下させること、疾患又は障害の発症を遅らせること、疾患又は障害の進行を抑制すること、疾患若しくは障害及び／又は前記疾患若しくは障害に起因し得る有害作用の部分的又は完全な治癒、所望の薬理学的効果及び／又は生理学的効果を得ること（当該効果は、障害若しくは疾患若しくは状態又はそれらの症状を完全に、又は部分的に防止するという点で予防的である場合があり、並びに／或いは、疾患若しくは障害及び／又は前記疾患若しくは障害に起因し得る有害作用についての部分的又は完全な治癒の点で治療的である場合がある）、或いは、疾患又は障害を緩和すること（すなわち、疾患又は障害の退行を引き起こすこと）を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「神経炎症」には、神経組織又はニューロン周囲細胞の炎症が含まれる。神経炎症が、感染、外傷性脳傷害、毒性代謝産物、自己免疫などを含めて様々なきっかけに応答して開始される場合がある。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「神経変性」には、ニューロンの死を含めて、ニューロンの構造又は機能の進行性喪失が含まれる。本開示の神経変性疾患又は神経変性障害には、神経変性プロセスの結果として生じる筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病及びハンチントン病が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「ニューロン周囲細胞」には、ニューロン（１つ又は複数）を取り囲む任意の細胞が含まれる。本開示のニューロン周囲細胞には、グリア細胞、星状膠細胞、免疫細胞などが含まれるが、これらに限定されない。本開示の全体にわたって、用語「グリア細胞」及び用語「ミクログリア」は交換可能に使用され、同じ意味及び範囲を有する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「化合物」及び用語「抗炎症性化合物」は交換可能に使用され、これらの用語には、以前から知られている抗炎症性化合物（これらに限定されない）を含めて、炎症の抑制又は調節をもたらすことができる任意の化合物が含まれる。そのような化合物には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗炎症性分子、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「チロシンキナーゼ阻害剤」（ＴＫＩ）には、酵素チロシンキナーゼを阻害する任意の化合物が含まれる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「サーチュイン−２阻害剤」には、酵素サーチュイン−２（ＳＩＲＴ２）を阻害する任意の化合物が含まれる。
【００４５】
本開示の全体にわたって、用語「ＣＣＮＤ−０１」、用語「ＮＤ１」及び用語「ＰＤ１８０７９０」は交換可能に使用され、同じ意味及び範囲を有する。
【００４６】
本開示の全体にわたって、用語「ＣＣＮＤ−０２」、用語「ＮＤ２」、用語「ＡＧＫ２」及び用語「ＡＧＫ−２」は交換可能に使用され、同じ意味及び範囲を有する。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「凍結保存溶液」は、細胞をより長い存続期間／貯蔵寿命にわたって保存するために使用される組成物／溶液を意味する。本開示の１つの実施形態において、５００ｍＬあたりの凍結保護溶液は、１５０ｍＬのグリセロール、１５０ｍＬのエチレングリコール、及び２００ｍＬの１ＸＰＢＳ（これは、７．４へのｐＨに調節される）を含む。必要時に、凍結保存細胞が解凍され、要求に従って使用される。
【００４８】
本開示は、神経変性疾患又は神経変性障害の管理のための、神経炎症を管理することができる化合物の使用に関する。
【００４９】
具体的には、本開示は、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の処置又は防止のための、神経炎症を管理することができる化合物の使用に関する。
【００５０】
１つの実施形態において、神経炎症を管理することができる化合物は、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤、抗炎症性分子、ＮＳＡＩＤ、又はそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択される。
【００５１】
本開示は、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を管理するための、ＮＡＣの単独での使用、又は任意の他の抗炎症性化合物との併用での使用に関する。
【００５２】
本開示は、神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を管理するためのチロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤の使用に関する。
【００５３】
１つの実施形態において、本開示は、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を抑制するための、処置するための、又は防止するための抗炎症性化合物の使用に関する。
【００５４】
１つの実施形態において、本開示は、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を抑制するための、処置するための、又は防止するためのＮＡＣの使用に関する。
【００５５】
１つの実施形態において、本開示は、神経炎症或いは神経炎症媒介性の神経変性疾患又は神経変性障害を抑制するための、処置するための、又は防止するためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用に関する。
【００５６】
１つの実施形態において、本開示は、神経炎症或いは神経炎症媒介性の神経変性疾患又は神経変性障害を抑制するための、処置するための、又は防止するためのサーチュイン−２阻害剤の使用に関する。
【００５７】
１つの実施形態において、本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤、抗炎症性分子、ＮＳＡＩＤ又はそれらの組合せを含む群から選択される化合物の、炎症又は神経炎症を抑制することができる１つ又は複数の化合物と一緒での使用であって、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を抑制するための、処置するための、又は防止するための使用に関する。
【００５８】
本開示は、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物の一群に含まれるいずれかの化合物の予防的使用又は治療的使用であって、神経炎症及び神経炎症により誘発される神経変性の防止又は処置をその必要性のある対象において行うための予防的使用又は治療的使用に関する。
【００５９】
本開示はまた、神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、効果的な量の少なくとも１つの抗炎症性化合物、又は前記抗炎症性化合物を含む組成物を、前記神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために前記対象に投与するという行為を含む方法に関する。１つの実施形態において、抗炎症性化合物は、炎症の処置、抑制、防止又は軽減をもたらすことができる任意の化合物を含む。
【００６０】
１つの実施形態において、本開示はまた、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、効果的な量の少なくとも１つの抗炎症性化合物、又は前記抗炎症性化合物を含む組成物を、前記神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために前記対象に投与するという行為を含む方法に関する。
【００６１】
本開示はまた、神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤、又はチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の組合せから選択される、効果的な量の少なくとも１つの化合物、又は前記化合物を含む組成物を、前記神経変性疾患又は神経変性障害を改善するために前記対象に投与するという行為を含む方法に関する。
【００６２】
１つの実施形態において、本開示は、ニューロン周囲細胞の神経炎症を含めて神経炎症の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤、及び／又はサーチュイン−２阻害剤或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を前記対象に投与することを含む方法に関する。
【００６３】
別の実施形態において、本開示は、神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、少なくとも１つの抗炎症性化合物又はその立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を、前記神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために前記対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００６４】
別の実施形態において、本開示は、神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行う方法であって、抗炎症性分子、ＮＳＡＩＤ、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物から選択される少なくとも１つの化合物を前記対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００６５】
１つの実施形態において、神経炎症媒介の神経変性の処置を本開示に従ってその必要性のある対象において行う方法は、効果的な量の抗炎症活性を有する少なくとも１つの化合物又はその立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を含む医薬組成物／治療用組成物を、前記神経変性を改善するために前記対象に投与する工程を含む。
【００６６】
１つの実施形態において、神経炎症媒介の神経変性の処置を本開示に従ってその必要性のある対象において行う方法は、効果的な量の少なくとも１つの抗炎症性分子、ＮＳＡＩＤ、チロシンキナーゼ阻害剤化合物及び／又はサーチュイン−２阻害剤化合物或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を含む医薬組成物／治療用組成物を、前記神経変性を改善するために前記対象に投与する工程を含む。
【００６７】
１つの実施形態において、神経炎症媒介の神経変性の防止を本開示に従ってその必要性のある対象において行う方法は、予防効果的な量の少なくとも１つの抗炎症性化合物又はその立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物、或いは前記化合物を必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物を、神経変性の高リスク対象に投与するという行為を含む。
【００６８】
１つの実施形態において、神経炎症媒介の神経変性の防止を本開示に従ってその必要性のある対象において行う方法は、抗炎症性分子、ＮＳＡＩＤ、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物の一群に含まれる予防効果的な量の少なくとも１つの化合物、或いは前記化合物を必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物を、神経変性の高リスク対象に投与するという行為を含む。
【００６９】
神経変性の抑制、処置又は防止を、神経変性が神経炎症（ニューロン周囲細胞の炎症を含む）によって誘発される対象において行う方法、前記方法は、効果的な量の１つ又は複数の抗炎症性化合物、或いは、１つ若しくは複数の抗炎症性化合物又はそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を含む組成物を投与するという行為を含む。
【００７０】
神経変性の抑制、処置又は防止を、神経変性が神経炎症（ニューロン周囲細胞の炎症を含む）によって誘発される対象において行う方法、前記方法は、抗炎症性分子、ＮＳＡＩＤ、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を含む群から選択される効果的な量の化合物、或いは前記化合物を含む組成物を投与するという行為を含む。
【００７１】
本開示の限定されない実施形態において、神経炎症及び神経炎症媒介の神経変性を管理するためのチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の併用効果は、それらの単独効果の和よりも大きい。
【００７２】
本開示の実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤ファミリー又はサーチュイン−２阻害剤ファミリーからの化合物は必要な場合には、異なるファミリーからの１つ又は複数の抗炎症性化合物と組み合わされる。
【００７３】
本開示の実施形態において、神経変性疾患又は神経変性障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される。
【００７４】
本開示の１つの実施形態において、神経炎症には、ニューロン周囲細胞（例えば、グリア細胞、星状膠細胞、免疫細胞など）の炎症が含まれる。
【００７５】
本開示の実施形態において、神経変性疾患又は神経変性障害は、正常な状態と比較して、ニューロンを取り囲む炎症及び炎症マーカーの慢性レベル又は急性レベルによって引き起こされる任意の疾患又は障害を包含し、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症及び筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される。
【００７６】
１つの実施形態において、本開示の方法及び組成物は、多数の神経学的障害又は神経変性障害を管理することを提供する。
【００７７】
本開示はまた、ニューロン周囲細胞における神経炎症を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を、前記神経炎症を抑制するために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せにより処置する工程を含む方法に関する。
【００７８】
１つの実施形態において、本開示は、ニューロン周囲細胞（例えば、限定されないが、グリア細胞など）における神経炎症を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を、前記神経炎症を抑制するために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤により処置する工程を含む方法に関する。
【００７９】
本開示はまた、ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発される神経変性を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を少なくとも１つの抗炎症性化合物により処置する工程を含む方法に関する。
【００８０】
本開示はまた、ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発される神経変性を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を、前記神経変性を抑制するために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２により処置する工程を含む方法に関する。
【００８１】
１つの実施形態において、本開示は、ニューロン周囲細胞（例えば、限定されないが、グリア細胞など）における炎症によって誘発される神経変性を抑制する方法であって、前記ニューロン周囲細胞を、前記ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死を停止させるために少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤及び／又はサーチュイン−２阻害剤により処置する工程を含む方法に関する。
【００８２】
本開示の実施形態において、本開示の化合物（１つ又は複数）は、ＮＳＡＩＤ（例えば、ＣＯＸ−２選択的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、非選択的ＮＳＡＩＤなど）、抗炎症性分子、チロシンキナーゼ阻害剤、サーチュイン−２阻害剤、又はそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択される。
【００８３】
本開示の例示的な実施形態において、ＣＯＸ−２  ＮＳＡＩＤは、セレコキシブ、バルデコキシブ及びロフェコキシブ、又はそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択される。
【００８４】
本開示の例示的な実施形態において、非選択的ＮＳＡＩＤは、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、スリンダク及びトルメチン、又はそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択される。
【００８５】
例示的な実施形態において、抗炎症性分子はＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）であり、しかし、これに限定されない。ＮＡＣは強力な抗酸化剤であり、ヒドロキシルラジカルの捕捉剤である。ＮＡＣはチオール含有アミノ酸であり、グルタチオン（ＧＳＨ）合成のための前駆体である。ＮＡＣは、ＲＯＳとのその直接的な相互作用のためにフリーラジカルの捕捉剤として作用する。１つの実施形態において、本開示は、神経炎症媒介の神経変性を管理するための、Ｎ−アセチルシステイン又はＮ−アセチルシステインを含む組成物の使用に関する。
【００８６】
チロシンキナーゼ阻害剤化合物は、グリア細胞、星状膠細胞及び免疫細胞（これらに限定されない）を含むニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死を、チロシンキナーゼを阻害することによって停止させる。
【００８７】
本開示のすべての実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤には、チロシンキナーゼ阻害剤ファミリーに属する任意の分子又は化合物が含まれる。
【００８８】
本開示の例示的な実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＰＤ１８０７９０、アキシチニブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パルボシクリブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、それらの立体異性体、医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物、水和物、又はそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択される。
【００８９】
サーチュインはタンパク質デアセチラーゼであり、遺伝子サイレンシングに関与する新しいクラスのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を表す。ＳＩＲＴ調節因子は、ガン、糖尿病、筋分化、心不全、神経変性及び老化のための潜在的な治療剤である。サーチュイン−２阻害剤化合物は、グリア細胞、星状膠細胞及び免疫細胞、又はそれらの任意の組合せ（これらに限定されない）を含むニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死を、サーチュイン−２を阻害することによって停止させる。
【００９０】
本開示のすべての実施形態において、サーチュイン−２阻害剤には、サーチュイン−２阻害剤ファミリーに属する任意の分子又は化合物が含まれる。
【００９１】
本開示の例示的な実施形態において、サーチュイン−２阻害剤は、ＡＫ−７、ＡＧＫ−２、それらの立体異性体、医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物、水和物、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００９２】
本開示はまた、神経炎症の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００９３】
本開示はまた、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、少なくとも１つの抗炎症性化合物を必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００９４】
本開示はまた、神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害の管理をその必要性のある対象において行うための組成物であって、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤若しくはサーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せを必要な場合には医薬的に許容される賦形剤とともに含む組成物に関する。
【００９５】
本開示のすべての実施形態において、対象は哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００９６】
上記の有効成分に加えて、本開示の組成物は、活性な化合物を、医薬的に使用され得る調製物に加工することを容易にする好適な医薬的に許容される賦形剤を含有する場合がある。用語「賦形剤」には、有効成分のためのビヒクル／キャリア及び／又は希釈剤として使用される不活性物質が含まれる。用語「賦形剤」にはまた、有効成分の加工又は凍結保護の利益を提供するために配合物／組成物に添加される物質が含まれ、賦形剤は、不活性成分として最終生成物に存在することが意図される。配合及び投与のための様々な技術に関するさらなる詳細が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に見出され得る。
【００９７】
本開示の例示的な実施形態において、医薬的に許容される賦形剤は、造粒剤、結合剤、滑剤、崩壊剤、甘味剤、流動促進剤、付着防止剤、帯電防止剤、界面活性剤、酸化防止剤、ガム、被覆剤、着色剤、風味剤、添加物、溶媒、増粘剤、可塑剤、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤、植物セルロース系材料、球形化剤及びそれらの組合せ（これらに限定されない）を含む群から選択される。
【００９８】
本開示の別の例示的な実施形態において、組成物は、固体の経口用配合物、液体配合物及び非経口用配合物、或いはそれらの任意の組合せを含む群から選択される投薬形態物に配合される。制御放出型、同様にまた、持続放出型の配合物が意図される。
【００９９】
本開示のなおも別の例示的な実施形態において、固体の経口用配合物は、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、口内錠、分散性粉末剤、分散性顆粒剤、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される；液体配合物は、水性又は油性の懸濁物、乳化物、液滴、硬ゲルカプセル又は軟ゲルカプセルにおける乳化物、シロップ剤、エリキシル剤、或いはそれらの任意の組合せを含む群から選択される；非経口用配合物は、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、筋肉内デポー剤、皮下注射剤、経皮注射剤、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【０１００】
１つの実施形態において、本開示の組成物は、腹腔内投与、経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、関節内投与、皮内投与、又は任意の他の適切な部位における注射、或いはそれらの任意の組合せを含む群から選択される様式により投与される。
【０１０１】
投与経路に依存して、異なる賦形剤／キャリアが本発明の組成物のために使用される。当業者は、神経炎症或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を管理するための本開示の組成物の好適な配合物及び投与量を選ぶことを理解しているであろう。
【０１０２】
本明細書中で使用される場合、用語「効果的な量」には、神経炎症、神経炎症に起因して生じる任意の状態、疾患又は障害、或いは神経炎症媒介の神経変性疾患又は神経変性障害を管理するために要求される有効成分（すなわち、ＴＫＩ、サーチュイン−２阻害剤又はそれらの組合せ）の量が含まれる。
【０１０３】
本開示の１つの実施形態において、神経炎症又は神経炎症媒介の神経変性を抑制するための化合物（１つ又は複数）の濃度は約１ｐＭから１００ｍＭにまで及んでおり、好ましくは約１ｐＭから１０μＭにまで及んでおり、より好ましくは約１ｎＭから１０μＭにまで及んでいる。
【０１０４】
本開示の１つの実施形態において、神経炎症又は神経炎症媒介の神経変性を管理するための化合物（１つ又は複数）の投与量は約１０ｍｇから１０００ｍｇにまで及んでいる。
【０１０５】
本開示の１つの実施形態において、安全かつ有効な薬物用量が前臨床試験によって見積もられる。
【０１０６】
中枢神経系（ＣＮＳ）は種々の細胞タイプを有しており、その大部分が、ニューロン、グリア細胞及び星状膠細胞である。近くに存在するニューロン及び細胞の間における複雑な相互作用が、ニューロン変性／死の進行又は軽減における大きな役割を果たしている。慢性炎症をＣＮＳにおいて誘発する際のグリア細胞の役割もまた、ＰＤ、ＡＤ及びＭＳを含むいくつかの神経変性疾患に関係している。脳における免疫反応は、周囲のニューロンにおける損傷及び細胞死を引き起こす、グリア細胞による炎症促進性分子（例えば、一酸化窒素（ＮＯ）及びサイトカインなど）の合成に依存する。したがって、ＣＮＳの生理学を模倣し、ＣＮＳの全体的な生理学に対する様々な化合物の影響を研究するために、本開示では、神経炎症媒介のニューロン毒性を示し、神経炎症媒介のニューロン毒性の緩和における試験化合物の活性をもたらすニューロン−ミクログリア共培養モデルが用いられる。
【０１０７】
ニューロン−ミクログリア共培養：
マウス脳の皮質ニューロン、海馬ニューロン、線条体ニューロン及び７ＰＡ２（これらに限定されない）を含む群から選択されるニューロン細胞が、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいてグリア細胞と共培養される（ニューロン細胞をプレートの下部ウエルにおいて、グリア細胞をウエルの上部に挿入される多孔性の透過性支持体において）。ニューロン細胞が、様々な化合物（例えば、限定されないが、ＮＡＣ、チロシンキナーゼ阻害剤又はＳｉｒｔ−２阻害剤など）の存在下及び非存在下においてＬＰＳ（約１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ）により処理され、約１２時間〜７２時間の間インキュベーションされる。その後、神経細胞の生存が、ＭＴＳアッセイを使用して測定される。約３０時間後、処理培地がすべての条件から集められ、Ｇｒｉｅｓｓアッセイを使用して一酸化窒素の濃度について、同様にまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重化アッセイを使用してサイトカインプロフィルについて調べられる。
【０１０８】
本発明は、神経炎症時の神経変性に関しての共培養モデルにおいて神経変性からの保護についての抗炎症性化合物（例えば、限定されないが、ＮＡＣ、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤など）の役割を開示する。炎症、すなわち、炎症性分子の放出が、ニューロン毒性の原因となっていた。前記化合物がこのアッセイに導入されたとき、これらの化合物は神経炎症を防止／軽減し、したがって、神経炎症媒介の神経変性からの救済をもたらし、それにより、神経変性疾患及び関連疾患における神経保護に寄与している。１つの実施形態において、抗炎症性化合物による処理はニューロン周囲細胞（例えば、グリア細胞など）の活性化及び炎症性応答における有意な低下を引き起こす。本開示の例示的な実施形態において、抗炎症性化合物（例えば、ＮＡＣ、ＰＤ１８０７９０及びＡＧＫ−２など）による処理はニューロン周囲細胞の活性化及び炎症性応答における有意な低下を引き起こし、ニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死を停止させ、抑制し、又は防止する。
【０１０９】
本発明は、神経炎症時の神経変性に関しての共培養モデルにおいて神経変性からの保護についてのチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の役割を開示する。炎症、すなわち、炎症性分子の放出が、ニューロン毒性の原因となっていた。前記化合物がこのアッセイに導入されたとき、これらの２つの化合物は神経炎症を防止／軽減し、したがって、神経炎症媒介の神経変性からの救済をもたらし、それにより、神経変性疾患及び関連疾患における神経保護に寄与している。
【０１１０】
チロシンキナーゼ及び／又はサーチュイン−２の阻害剤による処理はグリア細胞の活性化及び炎症性応答における有意な低下を引き起こす。チロシンキナーゼ阻害剤はｐ２１０のＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼを阻害し、サーチュイン−２阻害剤はＳＩＲＴ２を阻害するが、本開示では、神経炎症の調節因子として同じものがミクログリア細胞株モデルにおいて用いられる。
【０１１１】
本開示の１つの実施形態において、ＰＤ１８０７９０及びＡＧＫ−２による処理はＢＶ２細胞の活性化及び炎症性応答における有意な低下をＬＰＳ神経炎症モデルにおいて引き起こす。ＰＤ１８０９７０と、ＡＧＫ２とは、ｐ２１０のＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼと、ＳＩＲＴ２とのそれぞれ十分に特徴づけられた強力な阻害剤であるが、本開示では、神経炎症の調節因子としてのそれらの効力がミクログリア細胞株モデルにおいて詳しく調べられる。
【０１１２】
１つの実施形態において、本開示では、ニューロン細胞（例えば、限定されないが、Ｎ２７など）及びグリア細胞（例えば、限定されないが、ＢＶ２など）を含む群から選択される細胞株が用いられる。
【０１１３】
Ｎ２７ニューロン細胞が、ＰＤにおける神経変性機構を研究するための細胞モデルとして使用される。Ｎ２７は、腹側中脳（ＰＤにおいて直接に影響を受ける脳の領域）から構築される不死化されたラット中脳のドパミン作動性ニューロン細胞株である。Ｎ２７細胞は、ドパミン合成及び細胞のシグナル伝達経路を含む機能的特徴を有するチロシンヒドロキシラーゼ陽性（ＴＨ＋）ニューロンの均質な集団を表す。
【０１１４】
ＢＶ−２細胞は、マウスの初代ミクログリア細胞に由来するレトロウイルス不死化ミクログリアである。ミクログリア細胞は、単球系譜である脳の優勢な免疫細胞であり、全身免疫系のマクロファージと同様に機能する。ミクログリアの活性が、神経活動、神経変性及び感染と密接に関連している。ＢＶ−２細胞は、マクロファージの形態学的マーカー、表現型マーカー及び機能的マーカーを有する。ミクログリアはこれまでいくつかの神経学的疾患及び精神的疾患（例えば、統合失調症、物質乱用、うつ病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病など）に関係づけられており、また、ミクログリアは非常に様々な多数の神経伝達物質受容体を発現する。そのため、ミクログリアは、脳に対する精神活性化合物の影響を詳しく調べるための関連のあるモデルになっている。
【０１１５】
本開示の１つの実施形態において、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤は、神経保護効果を酸化ストレス誘発剤（例えば、過酸化水素及びＭＰＰ＋など）に起因して誘発されるニューロン変性に対して何ら有しておらず、しかし、神経炎症媒介の神経変性においては有意な神経保護効果を有することが見出される。
【０１１６】
正常な生理学的状態において、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）がミトコンドリアの呼吸の副産物として生じる。その限定された毒性影響が、一酸化窒素と反応して、非常に細胞毒性であるペルオキシニトリトアニオンを形成し得るか、又は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）への不均化（スーパーオキシドジスムターゼによって促進される反応）をもたらし得るかのどちらかである。Ｈ２Ｏ２は結果的には、その毒性影響を主に高反応性のヒドロキシルラジカル（ＯＨ−）の第一鉄イオン依存的形成を介して発揮する。Ｈ２Ｏ２モデルにおいて、Ｎ２７細胞の過酸化水素による処理はＯＨ−イオンの産生を増大させ、これは、脂質、タンパク質及びＤＮＡの変化を引き起こし、その結果として、細胞死を生じさせる。ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）は、違法麻薬において一般に見出される混入物である。これは血液脳関門（ＢＢＢ）を越えることができ、グリア細胞においてモノアミンオキシダーゼＢによって高毒性のＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリジニウム）に代謝される。ＭＰＰ＋はドパミントランスポーター（ＤＡＴ）によってドパミン作動性ニューロンに輸送され、ミトコンドリアに蓄積し、その結果、複合体Ｉ活性を阻害することによるＡＴＰ枯渇、ニューロンにおける不安定鉄の蓄積を引き起こすミトコンドリアアコニターゼの不活性化、ミトコンドリア膜電位の変化、活性酸素種（ＲＯＳ）の増大、及び最終的にはアポトーシス細胞死を生じさせる。
【０１１７】
１つの実施形態において、本開示では、リポ多糖類（ＬＰＳ）誘発の神経変性モデルが、ミクログリアの活性化をインビトロ状態において調べるために用いられる。ＬＰＳはグラム陰性細菌の外側細胞壁の主成分であり、ミクログリアの立証された活性化因子である。ミクログリア表面に発現されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−４によって認識されたとき、ＬＰＳは、核転写因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）及び様々なマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（例えば、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）及びｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）など）を含めて一連の酵素及び転写因子の活性化を誘発する。このことは多数の炎症促進性媒介因子（例えば、ＮＯ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６など）の放出をもたらし、これにより、炎症性の微小環境がもたらされ、ニューロン細胞死が生じる。ＬＰＳ刺激されたミクログリアは、一般に使用されているモデルとなっている。
【０１１８】
本開示の１つの実施形態において、ＳＩＲＴ２阻害剤により、炎症性応答が、ｐ６５の脱アセチル化及びＮＦ−κＢ活性の阻害を介してマウスにおいて抑制される。ＳＩＲＴ２は、ペントースリン酸経路を刺激して、酸化的損傷を打ち消し、マウス赤血球を保護するために細胞質ゾルＮＡＤＰＨを供給するＧ６ＰＤの脱アセチル化及び活性化に関わっている。
【０１１９】
ＩＬ−６は、ミクログリアのような免疫細胞から放出される炎症促進性サイトカインであり、ＩＬ−６は結果的には、神経変性に加えて、憎悪した細胞ストレス及び細胞死を引き起こす。ＩＬ−６の低下により、ニューロンの生存が改善される。
【０１２０】
チロシンキナーゼ阻害剤、ＮＡＣ及びサーチュイン−２阻害剤は、神経炎症状態（例えば、増大した亜硝酸放出、ＩＬ−６分泌、ＭＣＰ−１分泌及びｎＦ−κＢ活性など）によって誘発されるニューロンの死又は変性を抑制／処置／防止する神経保護効果を示す。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本開示はまた、下記の態様に関する：
Ｉ．対象を処置するための方法であって、ａ．神経変性疾患を有する対象を提供する工程と、ｂ．神経変性に罹患した対象に、少なくとも１つのチロシンキナーゼ阻害剤化合物、又はサーチュイン２阻害剤化合物、或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物を含む治療用組成物を、前記神経変性疾患が改善されるようにそのような状態のもとで投与する工程とを含む方法。
ＩＩ．神経変性の防止をその必要性のある対象において行うための方法であって、チロシンキナーゼ阻害剤又はサーチュイン−２阻害剤化合物或いはそれらの立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物の一群に含まれる化合物の適切な用量を、神経変性の高リスク対象に投与することを含む方法。
ＩＩＩ．神経変性の処置又は防止を、神経変性が神経炎症によって誘発される対象において行う方法であって、チロシンキナーゼ阻害剤化合物又はその立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物の群から選択される化合物の予防効果的な量を対象に投与することを含む方法。
ＩＶ．前記阻害剤化合物が、グリア細胞（これに限定されない）を含むニューロン周囲細胞における炎症により誘発されるニューロン死を、チロシンキナーゼ又はサーチュイン２を阻害することによって停止させる、態様ＩＩＩの方法。
Ｖ．正常な状態と比較して、ニューロンを取り囲む炎症及び炎症マーカーの慢性レベル又は急性レベルを有する前記神経変性が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及び筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、態様Ｉ及び態様ＩＩＩの方法。
ＶＩ．チロシンキナーゼ阻害剤又はサーチュイン−２阻害剤のどちらか、或いはその立体異性体、それらの医薬的に許容される塩、多形体、溶媒和物及び水和物の一群に含まれる化合物の、神経炎症により誘発される神経変性の防止及び／又は処置をその必要性のある対象において行うための予防的使用又は治療的使用であって、予防効果的な量を神経変性の高リスク対象に投与することを含む予防的使用又は治療的使用。
【０１２２】
より完全な理解を、例示目的のためだけに提供され、かつ、本開示の範囲を限定するためには意図されない下記の具体な例を参照することによって得ることができる。
【０１２３】
例
本開示により、本発明の様々な態様が下記の例として示される。例１は、ＬＰＳ（リポ多糖類）により処理されるマウスグリア細胞（ＢＶ２）細胞に対するチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の影響に関する。（Ｎ２７細胞及びＢＶ２細胞の）ニューロン−ミクログリア共培養に対するＮＡＣ、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン（Ｓｉｔｕｉｎ）−２阻害剤の影響が例２において示され、この場合、前記化合物の影響が、ニューロン細胞死及び亜硝酸放出に基づいて明らかにされる。（Ｎ２７細胞及びＢＶ２細胞の）ニューロン−ミクログリア共培養に対するチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤の影響が例３〜５において示され、この場合、前記阻害剤／化合物の影響が、グリア細胞により分泌される炎症性因子によって誘発されるニューロン細胞死、亜硝酸放出、ＩＬ−６分泌及びＭＣＰ−１分泌に基づいて明らかにされる。例６では、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４／ＴＬＲ２細胞株におけるＬＰＳ誘発のｎＦ−κＢ活性におけるチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の影響が示される。例７は、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤は神経保護効果を酸化ストレスモデル（すなわち、過酸化水素及びＭＰＰ＋により誘発されるＮ２７細胞における神経毒性）において有しないことを示す。インビトロ研究のために、実験が、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって行われ、ＬＰＳが滅菌水に溶解される。ＬＰＳ誘発マウスの脳に対するチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の影響を評価するためのプロトコルが例８において示される。インビボ研究のために、ＬＰＳがＰＢＳに溶解され、ＮＤ１及びＮＤ２のためのビヒクルが、ＰＢＳにおける約５％のＤＭＳＯである。
【０１２４】
材料及び方法
試薬：すべての化学物質、リポ多糖Ｏ１１１：Ｂ４をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ポリＩ：Ｃ及びＨＥＫ−Ｂｌｕｅ検出培地をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。
【０１２５】
細胞培養：ラット中脳の不死化されたドパミン作動性細胞（Ｎ２７細胞）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕのペニシリン及び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた［２２］。マウスのミクログリア細胞（ＢＶ２細胞）を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＨＩ−ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地で成長させた。細胞を、６０％〜７０％のコンフルエンスに達するまで３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気において維持した。
【０１２６】
処理の基本的枠組み：６０％〜７０％のコンフルエンシーでの細胞を集め、８×１０３細胞／ウエルの播種密度で９６ウエルプレートに播種した。
【０１２７】
ニューロン−ミクログリア共培養：Ｎ２７細胞及びＢＶ２細胞（これらをアイオワ州立科学技術大学（米国）から得た）を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて共培養した（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）。ＢＶ２細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１２時間〜７２時間（好ましくは３０時間）、チロシンキナーゼ及びサーチュイン−２の指定された阻害剤の存在下及び非存在下においてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により処理した。その後、Ｎ２７細胞の生存を、ＭＴＳアッセイを使用して測定した。培地をすべての条件から集め、Ｇｒｉｅｓｓアッセイを使用して一酸化窒素の濃度について、同様にまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重化アッセイを使用してサイトカインプロフィルについて調べた。Ｇｒｉｅｓｓアッセイ及びＬｕｍｉｎｅｘ多重化アッセイは、製造者によって与えられるプロトコルに従って実施される。
【０１２８】
培地移入アッセイ：ＢＶ２細胞を１×１０４細胞／ウエルの播種で９６ウエルプレートにおいて培養し、化合物の存在下及び非存在下においてＬＰＳ（１ｇ／ｍｌ）により４８時間処理した。その後、培地を、８×１０３細胞／ウエルの播種で９６ウエルプレートにおいて２４時間培養されるＮ２７細胞に移した。その後、Ｎ２７細胞の生存を、製造者によって与えられるプロトコルに従って行われるＭＴＳアッセイを使用して測定した。
【０１２９】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２／３／４アッセイ：Ｈｅｋ−Ｂｌｕｅ  ＴＬＲ−２細胞、ＴＬＲ−３細胞及びＴＬＲ−４細胞をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得た。培養処理及びアッセイを製造者の推奨プロトコルに従って行った。細胞を処理し、１２時間インキュベーションし、その後、６２０ｎｍにおけるＯＤ値を集めた。
【０１３０】
酸化ストレスモデル（過酸化水素）：細胞を８時間、化合物の存在下及び非存在下において７５μＭのＨ２Ｏ２により共処理した。処理を、２％のＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ培地において行った。細胞の生存を、製造者によって与えられるプロトコルに従って行われるＭＴＳアッセイを使用して測定した。
【０１３１】
神経毒モデル（ＭＰＰ＋）：細胞を２４時間、化合物の存在下及び非存在下において３００μＭのＭＰＰ＋により共処理した。処理を、２％のＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ培地において行った。細胞の生存を、製造者によって与えられるプロトコルに従って行われるＭＴＳアッセイを使用して測定した。
【０１３２】
統計学的分析：すべてのデータを、一標本ｔ検定を使用するＰｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して分析した。
【０１３３】
例１：チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤の抗神経炎症効果
ＢＶ２（マウスグリア細胞）細胞を、０．１ｎＭから１０μＭにまで及ぶ濃度での試験化合物（ＰＤ１８０９７０又はＡＧＫ−２）の存在下又は非存在下において１μｇ／ｍｌの濃度でのＬＰＳにより処理し、５％ＣＯ２において３７℃で４８時間インキュベーションした。化合物の抗炎症能を調べるために、Ｇｒｉｅｓｓアッセイを使用して、放出された亜硝酸を測定した。未処理のＢＶ２細胞をブランクとして使用し、培地における０．１％のＤＭＳＯをビヒクルとして使用した。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を亜硝酸放出についてのコントロールとして使用した。図１は、ＢＶ２細胞に対する化合物のＬＰＳとの４８時間の共処理の影響を示す。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃（Ｐ＜０．０１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊（Ｐ＜０．０１）；＊＊＊（Ｐ＜０．００１）；＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）は、ＬＰＳ処理細胞と比較して有意に異なることを示している。
【０１３４】
ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、ＢＶ２細胞におけるＬＰＳ誘発の炎症に対する抗炎症効果を有することが認められた。ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、グリア細胞におけるＬＰＳ単独と比較して、亜硝酸のレベル（炎症の尺度）における有意な低下を引き起こした。したがって、ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は有意な抗神経炎症効果を示す。
【０１３５】
例２：
例２．１：ニューロン−ミクログリア共培養に対するＮＡＣ、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤の神経保護効果
Ｎ２７細胞（ラットのドパミン作動性細胞）及びＢＶ２細胞（マウスのグリア細胞）を、１０％のＨＩ−ＦＢＳが補充されるＲＰＭＩ完全培地において３７℃、５％ＣＯ２で２４時間、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて共培養した（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）。ＢＶ２細胞を、１０μＭのＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２、ＣＣＮＤ−０３及びＣＣＮＤ−０４、並びに１０ｍＭのＮＡＣの存在下及び非存在下において１μｇ／ｍｌのＬＰＳにより、３７℃、５％ＣＯ２で３０時間処理した。その後、Ｎ２７細胞の生存を、ＭＴＳアッセイを行い、４９０ｎｍでの読み取りを３０分間のインキュベーションの後で行うことによって測定した。培地をすべての条件から集め、Ｇｒｉｅｓｓアッセイを使用して一酸化窒素の濃度について、同様にまた、Ｌｕｍｉｎｅｘ多重化アッセイを使用してサイトカインプロフィルについて調べた。
【０１３６】
ＣＣＮＤ−０３及びＣＣＮＤ−０４が陰性コントロールとして使用される。ＣＣＮＤ−０３は６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）であり、強力な可逆的かつＡＴＰ競合的なＧＳＫ−３α／β阻害剤であり、ヒト及びマウスの胚性幹細胞において自己再生を維持することが示された最初の薬理学的薬剤である。ＣＣＮＤ−０４はＸＣＴ７９０であり、ＥＲＲαの強力かつ特異的なインバースアゴニストである。ＣＣＮＤ−０４は選択的であり、関連した核内受容体（例えば、ＥＲＲγ又はＥＲαなど）に対する有意なアンタゴニスト活性を１０μＭ未満の濃度において示さない。
【０１３７】
図２（Ａ）は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞によって誘発される毒性におけるＣＣＮＤ−１、ＣＣＮＤ−２及びＮＡＣの神経保護効果を示す。すべてのデータを、一標本ｔ検定を使用するＰｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して分析した。ＬＰＳ処理のＢＶ２細胞はＮ２７細胞における約５０％の細胞死を３０時間で引き起こした。ＣＣＮＤ−１、ＣＣＮＤ−２及びＮＡＣは炎症を軽減し、グリア細胞によって分泌される炎症性因子により誘発されるニューロン細胞死を抑制する。したがって、ＣＣＮＤ−１及びＣＣＮＤ−２の両方がＮ２７細胞における有意な神経保護効果を有した。
【０１３８】
例２．２：ＬＰＳ誘発の亜硝酸放出における低下
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）共培養されるＮ２７及びＢＶ２を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の存在下において３０時間、１μＭのＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２、ＣＣＮＤ−０３及びＣＣＮＤ−０４、並びに１０ｍＭのＮＡＣにより処理し、亜硝酸放出についてアッセイした。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理のＢＶ２細胞を亜硝酸放出についてのコントロールとして使用した。Ｇｒｉｅｓｓアッセイを、ＢＶ２によって放出される亜硝酸の濃度を求めるために行った。図２（Ｂ）は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞におけるＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２及びＮＡＣの亜硝酸防止効果を示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を、Ｎ２７におけるほぼ５０％の死を引き起こす炎症誘発剤として使用した。ＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２及びＮＡＣは、ＬＰＳ誘発のＢＶ２細胞によって放出される亜硝酸のレベルにおける有意な低下を引き起こした。したがって、ＣＣＮＤ−０１、ＣＣＮＤ−０２及びＮＡＣのＬＰＳとの共処理は、ＬＰＳ単独と比較した場合、ニューロン生存における有意な増大を引き起こした。
【０１３９】
例３：ニューロン−ミクログリア共培養に対するＮＡＣ、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤の影響
Ｎ２７細胞及びＢＶ２細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）共培養した。ＢＶ２細胞を、１０μＭのＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２の存在下及び非存在下において、又は１ｍＭのＮＡＣの存在下において１μｇ／ｍｌのＬＰＳにより処理し、３０時間インキュベーションした。Ｎ２７細胞の生存を、ＭＴＳアッセイを行い、４９０ｎｍでの読み取りを３０分間のインキュベーションの後で行うことによって測定した。結果が図３に示される。図３では、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞によって誘発される毒性におけるＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２の神経保護効果が例示される。新鮮培地は、細胞に触れていないＲＰＭＩ培地を示す。非誘発培地は、ＬＰＳ／処理が何ら行われないＢＶ２細胞に加えられ、４８時間インキュベーションされたＲＰＭＩを示す。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理のＢＶ２細胞をコントロールとして使用した。ＬＰＳ処理のＢＶ２細胞はＮ２７細胞における約５０％の細胞死を３０時間で引き起こした。ＮＡＣ、ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、Ｎ２７細胞における有意な神経保護効果を有した。
【０１４０】
例４：ニューロン−ミクログリア共培養に対するＮＡＣ、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤の神経保護効果
例４．１：細胞生存度に対する影響
Ｎ２７細胞及びＢＶ２細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて共培養し（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下において１μＭの化合物ＰＤ１８０９７０及び化合物ＡＧＫ−２、並びに１０μＭの化合物ＮＡＣにより処理し、３０時間でのＮ２７細胞の生存についてアッセイした。細胞を試験化合物単独（ＬＰＳ非存在）で処理することにより、化合物が単独で毒性又は炎症性であるか否かが示される。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理のＢＶ２細胞を亜硝酸放出についてのコントロールとして使用した。ＭＴＳアッセイを、Ｎ２７生存率を求めるために行った。図４は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞によって誘発される毒性におけるＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２の神経保護効果を示す。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃＃＃（ｐ＜０．００１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊＊＊（ｐ＜０．００１）は、ＬＰＳ処理細胞と比較して有意に異なることを示している。
【０１４１】
ＬＰＳ処理のＢＶ２細胞はＮ２７細胞における約５０％の細胞死を３０時間で引き起こした。単独でのＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ２による細胞の処理は影響が何らなく、このことは、ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ２は、細胞、その生存、亜硝酸放出又は形態学に対する影響を何ら有していないことを示していた。ＰＤ１８０９７０／ＡＧＫ−２のＬＰＳとの共処理は、ＬＰＳ単独と比較した場合、亜硝酸レベルにおける有意な低下を引き起こした。ＮＡＣ、ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、Ｎ２７細胞における有意な保護効果を有した。
【０１４２】
例４．２：ニューロン−ミクログリア共培養におけるＢＶ２細胞によるＬＰＳ誘発の亜硝酸放出における低下
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）共培養されるＮ２７及びＢＶ２を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下において３０時間、１μＭの化合物（ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２）により処理し、亜硝酸放出についてアッセイした。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理のＢＶ２細胞を亜硝酸放出についてのコントロールとして使用した。Ｇｒｉｅｓｓアッセイを、ＢＶ２によって放出される亜硝酸の濃度を求めるために行った。図５は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞におけるＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２の亜硝酸防止効果を示す。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃＃＃（ｐ＜０．００１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊＊＊（ｐ＜０．００１）は、ＬＰＳ処理細胞と比較して有意に異なることを示している。
【０１４３】
ＰＤ１８０９７０又はＡＧＫ２は単独では、細胞、生存、亜硝酸放出又は形態学に対する影響そのものを何ら有していなかった。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を、Ｎ２７におけるほぼ５０％の死を引き起こす炎症誘発剤として使用した。ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２の両方が１μＭでは、ＬＰＳ誘発のＢＶ２細胞によって放出される亜硝酸のレベルにおける有意な低下を引き起こした。ＰＤ１８０９７０／ＡＧＫ−２のＬＰＳとの共処理は、ＬＰＳ単独と比較した場合、ニューロン生存における有意な増大を引き起こした。
【０１４４】
例４．３：ニューロン−ミクログリア共培養におけるＢＶ２細胞によるＩＬ−６及びＭＣＰ−１のＬＰＳ誘発放出における低下
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）共培養されるＮ２７及びＢＶ２を、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下において３０時間、１μＭの化合物（ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２）により処理した。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理のＢＶ２細胞をコントロールとして使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘ多重化アッセイを、放出されたＩＬ−６及びＭＣＰ−１の濃度を求めるために行った。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を、ＩＬ−６放出又はＭＣＰ−１放出についてのコントロールとして使用した。
【０１４５】
ＰＤ１８０９７０又はＡＧＫ２は単独では、細胞、生存、亜硝酸放出又は形態学に対する影響そのものを何ら有していなかった。ＬＰＳ処理のＢＶ２細胞は、ＢＶ２細胞によって分泌されるＩＬ−６及びＭＣＰ−１のレベルにおけるかなりの増大を３０時間において引き起こした。ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２の両方が１μＭでは、ＬＰＳ誘発のＢＶ２細胞によって放出されるＩＬ−６のレベルにおける有意な低下を引き起こした。ＩＬ−６の低下により、ニューロンの生存が改善される。図６は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞におけるＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２に起因するＩＬ−６のレベルにおける低下を示す。図７は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞におけるＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２に起因するＭＣＰ−１のレベルにおける低下を示す。ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、ＬＰＳ単独と比較した場合、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１のレベルにおける有意な低下を引き起こした。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃（ｐ＜０．０１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊（ｐ＜０．０１）；＊＊＊（ｐ＜０．００１）は、ＬＰＳ処理細胞と比較して有意に異なることを示している。
【０１４６】
例５：ニューロン−ミクログリア共培養に対するＮＡＣ、様々なチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン２阻害剤の影響
Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳトランスウエルプレートにおいて（Ｎ２７を２４ウエルプレートの下部ウエルにおいて、ＢＶ２を２４ウエルの上部に挿入される０．４μｍの多孔性の透過性支持体において）共培養されるＮ２７及びＢＶ２を、１０μＭのチロシンキナーゼ阻害剤（ＰＤ１８０９７０、イマチニブ（ＩＭＡＢ）又はニロチニブ（ＮＩＬＯ））、又は１０μＭのサーチュイン−２阻害剤（ＡＧＫ−２）の存在下においてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）により処理し、１０μＭのＮＡＣがＢＶ２細胞に関して処理され、３０時間インキュベーションした。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）処理のＢＶ２細胞を亜硝酸放出についてのコントロールとして使用した。ＭＴＳアッセイを、Ｎ２７生存率を求めるために行った。図８は、ＬＰＳ活性化ＢＶ２細胞によって誘発される毒性におけるＢｃｒ−Ａｂｌ  ＴＫ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤の神経保護効果を示す。ＬＰＳ処理のＢＶ２細胞はＮ２７細胞における約５０％の細胞死を３０時間で引き起こした。ＮＡＣが神経保護的役割を示していた。Ｂｃｒ−ＡｂｌチロシンキナーゼのＰＤ１８０９７０、イマチニブ及びニロチニブ、並びにサーチュイン−２阻害剤のＡＧＫ−２は１０μＭでは、Ｎ２７細胞における有意な保護効果を有した。これらのチロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤により処理される（ＬＰＳ存在下での）細胞の生存（この場合、細胞生存が７５％超である）が、これらの化合物により処理されないＬＰＳ細胞（この場合、細胞生存が約５０％にすぎない）と比較して有意に増大し、このことは前者の神経保護的役割を暗示していた。
【０１４７】
例６：ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞株におけるＬＰＳ誘発のｎＦ−κＢ活性における低下
１ｎＭ〜１００μＭの範囲での化合物（ＰＤ１８０９７０又はＡＧＫ−２）の存在下又は非存在下において１２時間、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞を１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのＬＰＳにより処理し、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２を１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのＰａｍ３ＣＳＫ４により処理し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした。ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）をＳＥＡＰ活性についてのコントロールとして使用した。ｎＦ−κＢ誘発のＳＥＡＰ活性を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）検出を６２０ｎｍで使用して定量した。図９は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞に対するＰＤ１８０９７０のＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）との１２時間の共処理の影響を示す。図１０は、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞に対するＡＧＫ−２のＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）との１２時間の共処理の影響を示す。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃（Ｐ＜０．０１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊（Ｐ＜０．００１）；＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）は、ＬＰＳ処理細胞と比較して有意に異なることを示している。
【０１４８】
ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に共処理されるＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、ＬＰＳ単独と比較した場合、ｎＦ−κＢ誘発ＳＥＡＰのレベルにおける有意な低下を引き起こした。ＰＤ１８０９７０及びＡＧＫ−２は、ｎＦ−κＢ誘発ＳＥＡＰ活性に対する有意な阻害効果を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ２細胞においてではなく、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＬＲ４細胞において有することが認められ、このことは、これらの化合物はＴＬＲ４経路を介して働き、ＴＬＲ２経路を介しては働かないことを示唆した。
【０１４９】
例７：
例７．１：チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤はＨ２Ｏ２誘発のドパミン作動性細胞死（酸化ストレスモデル）に対する神経保護効果を示さない
Ｎ２７細胞を９６ウエルプレートにおいて８時間、０．１ｎＭ〜１０μＭの濃度範囲での化合物（ＰＤ１８０９７０又はＡＧＫ２）の存在下及び非存在下において７５μＭの過酸化水素により処理した。ＭＴＳアッセイを、化合物の神経保護能を調べるために使用して、細胞生存度を調べた。未処理培地による細胞をブランクとして使用し、０．１％のＤＭＳＯ（化合物のためのビヒクル又は溶媒）を含有する培地による細胞をビヒクルとして使用した。過酸化水素（７５μＭ）処理のＮ２７細胞をコントロールとして使用した。図１１は、Ｎ２７細胞での８時間にわたる過酸化水素誘発の神経毒性に対する化合物のスクリーニング効果を示す。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃＃＃（Ｐ＜０．００１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊＊＊（Ｐ＜０．００１）は、Ｈ２Ｏ２処理の細胞と比較して有意に異なることを示している。これらの化合物は、Ｎ２７細胞におけるＨ２Ｏ２誘発の毒性に対する有意な神経保護効果を有しないことが認められたので、これらの化合物のどちらもがニューロンを変性から救済することができなかった。
【０１５０】
例７．２：チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤はＭＰＰ＋誘発のドパミン作動性細胞死（酸化ストレスモデル）に対する神経保護効果を示さない
Ｎ２７細胞を０．１ｎＭ〜１０μＭの濃度範囲での化合物（ＰＤ１８０９７０又はＡＧＫ−２）の存在下及び非存在下において３００μＭのＭＰＰ＋により処理し、２４時間インキュベーションした。ＭＰＰ＋（３００μＭ）処理のＮ２７細胞をコントロールとして使用した。ＭＴＳアッセイを、化合物の神経保護能を調べるために使用して、細胞生存度を調べた。これらの化合物のどれもが、ＭＰＰ＋処理のドパミン作動性Ｎ２７細胞を救済することができなかった。図１２は、Ｎ２７細胞での２４時間にわたるＭＰＰ＋誘発の神経毒性に対する４つの化合物のスクリーニング効果を示す。データは群平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４／条件）。実験を３回繰り返した。＃＃＃（Ｐ＜０．００１）は、ブランクコントロール細胞と比較して有意に異なることを示している。＊＊＊（Ｐ＜０．００１）は、ＭＰＰ＋処理細胞と比較して有意に異なることを示している。これらの化合物のどれもが、ニューロンの救出を示さず、したがって、Ｎ２７細胞におけるＭＰＰ＋誘発の毒性に対する有意な神経保護効果を有しないことが認められなかった。
【０１５１】
したがって、上記の結果から、チロシンキナーゼ阻害剤及びサーチュイン−２阻害剤は、酸化ストレス又は毒性に起因して引き起こされるニューロン変性を抑制することができないことが認められる。しかしながら、これらの化合物は、グリア細胞（これに限定されない）を含むニューロン周囲細胞における炎症によって誘発されるニューロン死を、チロシンキナーゼ又はサーチュイン−２を阻害することにより停止させることによって、例１〜例５において例示されるように、ニューロンに対する抗神経変性効果を有する。
【０１５２】
例８：マウスにおける試験化合物の抗神経炎症効果及び神経保護効果
ＬＰＳ誘発マウス［Ｃ５７ＢＬ／６、オス、約１０週〜１２週、約２８ｇ〜３０ｇ］における脳（ＳＮＰｃ）に対する試験化合物の影響が評価される。すべての動物を実験前に約５日間にわたって順応させ、体重に応じてランダム化して約８つの群にする。動物を、表１における実験設計で指定されるように試験化合物及びＬＰＳにより処理する。行動試験、強制水泳試験（ＦＳＴ）及びロータロッド（Ｒｏｔａｒｏｄ）試験を、実験期間を通して２日に１回、すべての群について行う。各グループからの約１０匹の動物が約６日目及び１９日目に屠殺される。
【０１５３】
【表１】
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【０１５４】
配合物調製：
ＬＰＳのためのビヒクルはＰＢＳである。ＮＤ１及びＮＤ２のためのビヒクルはＰＢＳにおける約５％のＤＭＳＯである。
【０１５５】
約５ｍｇ／ｋｇの用量のために必要となる最終濃度は、約５％ＤＭＳＯ＋約９５％ＰＢＳにおける約１ｍｇ／ｍｌである。与えられる服用体積は約５ｍｌ／ｋｇである。
【０１５６】
強制水泳試験（ＦＳＴ）：
強制水泳試験がマウスに対して個々に行われる。マウスを、約１５ｃｍの水を約２５±１℃で含有する開放型円筒容器（直径：約１０ｃｍ、高さ：約２５ｃｍ）において泳がせ、約６分の試験期間中における全不動期間をスコア化する。それぞれのマウスが、水中でのもがきをやめ、水に浮いて動かないままであり、これにより、そのような動きのみが、頭を水面上に保つために必要となっているときには不動であると判断される。不動期間が記録される。
【０１５７】
ロータロッド試験：
訓練手順：
すべての動物が、注射日の前に５日間連続して、約５匹からなる群において訓練される。
【０１５８】
５匹の動物を、回転していないロータロッドに同時に載せ、ロッドの上でバランスを取らせる。下記の訓練計画（表２）は、以下に従う。
１．ロータロッドを（訓練計画に従って）適切な速度で始動させ、速度を、５秒あたり約１ｒｐｍの割合で加速することによって、上記で指定される訓練計画に基づくある一定のより大きいｒｐｍにまで上げる（訓練の４日目及び５日目については、約２０の固定されたｒｐｍが使用される）。速度がこのより大きいｒｐｍに達するまでは、すべての動物は、落下するならば、回転するロータロッドに戻される。
２．ロータロッドの速度がこのより大きいｒｐｍに達すると、動物には、約５秒の期間が、自身を維持するために与えられる。すべての動物は、約５秒のこの期間中に落下したときには、回転するロータロッドに戻される。
３．５秒の期間の後、このより大きいｒｐｍを約１分間にわたって維持し、この時間内に落下する動物が除かれ、そのそれぞれのケージに戻される。
４．上記手順を、約５分の試験間の間隔を与えることによってそれぞれの個々の群のすべての動物について繰り返す。
【０１５９】
【表２】
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【０１６０】
実験手順：
１．一度に、約５匹の動物を、ロッドの上でバランスを取ることができるまで、回転していないロータロッドに載せる。
２．ロータロッドを約２０ｒｐｍで直接に始動させる。動物には、約５秒の期間が、約２０ｒｐｍで自身を維持するために与えられる。すべての動物は、約５秒のこの期間中に落下したときには、回転するロータロッドに戻される。
３．約５秒の期間の後、２０ｒｐｍの速度を約１分間にわたって維持し、この時間内に落下する動物が除かれ、そのそれぞれのケージに戻される。
４．工程２から工程３までの上記手順を、約５分の試験間の間隔を与えることによってそれぞれの個々の動物群について３回繰り返す。
５．落下するまでの平均時間を、３回すべての試験の平均をそれぞれの個々の動物について取ることによって計算する。
【０１６１】
ｍＲＮＡレベルを調べるための脳採取：
１．組織サンプルを切除する前に、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔにおいて安定化されることになるサンプルの体積（又は重量）を見積もる。
２．組織を保存するための適量のＲＮＡ  ｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを、適切な採取容器、又は適切なサイズのＲＮＡｌａｔｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｔｕｂｅにピペット分注する。少なくとも１０体積の試薬（又は概算では１ｍｇの組織あたり約１０μｌの試薬）が必要である。
３．脳組織の概算重量：５００ｍｇ
５００ｍｇの場合；５００×１０ｕｌ＝５ｍｌ
１６０個の組織の場合；８０×５ｍｌ＝４００ｍｌ
４．動物からの組織サンプルを切除し、必要に応じて、厚さが約０．５ｃｍ未満である薄片に切断する。この工程を可能な限り迅速に行う。
５．組織片を直ちに、ＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを含有する工程２からの採取容器において完全に浸ける。
【０１６２】
組織病理学：
服用後及び指定された時点［６日目及び１９日目］において、動物をＣＯ２窒息によって屠殺する。
【０１６３】
固定化プロトコル：
１．マウスを、最初に１％の冷ＰＢＳにより約３分間、次いで約４％のパラホルムアルデヒド溶液により約８分間、蠕動ポンプを使用して約１０ｍｌ・ｍｉｎ−１の流速で経心灌流する。
２．脳を素早く取り出し、脳自体の体積の少なくとも１０倍の約４％のパラホルムアルデヒドに約４℃で一晩にわたって浸ける。
３．固定処理された脳を、固定液を捨て、凍結保護溶液で置き換えることによって凍結保護する。脳が容器反転後に容器の底に迅速に沈むまで凍結保護することが重要である。
凍結保護溶液の組成（約５００ｍＬについて）：
グリセロール−約１５０ｍＬ
エチレングリコール−約１５０ｍＬ
１ＸＰＢＳ−約２００ｍＬ
ｐＨを７．４に調節する。
４．脳を、凍結ウルトラミクロトーム又はビブラトームを使用して切片化する。
切片化のための凍結ウルトラミクロトーム：脳を、粉末化ドライアイスで冷却されるイソペンタン（２−メチルブタン）に浸けることによって凍結する。最良の結果を得るために、温度計をイソペンタンの中に入れて、その温度を測定する。約−４０℃では、マウスの脳を凍結するためにおよそ約３５秒を要する。凍結脳を、サンプル識別をホイルの外側に有するアルミニウムホイルで包み、凍結脳が処理されるまで約−８０℃で貯蔵する。切片化のために、切片を、固定処理された凍結脳全体を組織凍結媒体（例えば、ＯＣＴ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）とともに金属物体ホルダーにしっかりと接着することによって免疫染色のために準備し、クライオスタット又は凍結滑走式ミクロトームで切断する。
切片化のためのビブラトーム：脳をガラスバイアル／マルチウォールプレートにおいて凍結保護溶液に浸け、脳が処理されるまで約−２０℃で貯蔵する。切片化のために、切片を、固定処理された脳全体を組織付着媒体（例えば、ｆｅｖｉ−ｑｕｉｃｋ）とともにビブラトームの金属物体ホルダーに接着することによって免疫染色のために準備し、約３０μｍ切片厚さのためにビブラトームで切断する。
脳組織の採取された切片（約３０μｍの厚さ）、特に、ドパミン作動性細胞及びミクログリアに富む黒質緻密部領域（ＳＮＰｃ）に由来する切片が、免疫組織化学のために使用される。切片は、好ましくは２４ウエルプレートで、凍結保護溶液において約−２０℃で貯蔵されなければならない（約１ｍＬの凍結保護溶液においてウエルあたり約２０個の切片）。
【０１６４】
本開示及び例示は明瞭化及び理解のための例示及び例として提供されているにもかかわらず、様々な変更及び改変が、本開示の精神又は範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には明らかである。したがって、上記の説明及び例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【０１６５】
本開示における実施形態の説明により、現在の知識を適用することによる様々な適用のための改変及び／又は適合化のために容易に適し得る実施形態の一般的性質が明らかにされる。包括的概念から逸脱していない本開示のそのような具体的な実施形態、したがって、そのような様々な適合化及び改変は、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲の範囲内で理解されなければならず、かつ、開示された実施形態の均等物の意味及び範囲の範囲内であるとみなされなければならず、また、そのように理解されること、かつ、そのようにみなされることが意図されている。
【０１６６】
本明細書中で用いられる語句又は用語は説明のためであり、限定とすることは何ら意図していないこともまた理解されたい。本開示の全体にわたって、語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”（含む）又は変化形（例えば、“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”又は“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”など）は、使用されるときは常に、述べられた要素、整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）又は工程、或いは要素、整数又は工程の群を含み、しかし、任意の他の要素、整数又は工程、或いは要素、整数又は工程の群が除外されないことを含意するように理解されたい。
【０１６７】
数値による限定又は数値範囲が本明細書中で述べられる場合、端点は包含される。また、数値による限定又は数値範囲に含まれる様々な値及び部分範囲は、明示的に記載されているものとして具体的に包含される。
【０１６８】
本開示における任意の複数形の用語及び／又は単数形の用語の使用に関して、当業者は、文脈及び／又は適用に対して適切であるとみなされるように複数形から単数形に、及び／又は単数形から複数形に翻訳して理解することができる。様々な単数形／複数形の入れ替えが、明瞭化のために本明細書中において明示的に示されている場合はある。
【０１６９】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス及び物品などの議論はいずれも単に、本開示のための状況を提供するという目的のためだけである。そのような議論は、本出願の優先日の前にはどこにでも存在していたので、これらの事項のいずれか又はすべてが先行技術の基礎の一部を形成すること、又は本開示に関連のある分野における共通する一般的知識であることを認めるものとして解釈してはならない。
【０１７０】
本出願を通して引用されるすべての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容が、すべての目的のために参照によって本明細書中に組み込まれる。
【図１】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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