(57)【要約】本開示は、向上したゲノム編集組成物、およびＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集するための方法を提供する。本開示は、異常ヘモグロビン症の少なくとも１つの症状を予防、治療、または改善するためのゲノム編集した細胞をさらに提供する。
2019525759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＥバリアントが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、前記ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択される、ＬＨＥのバリアントである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択される、ＬＨＥのバリアントである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＨＥバリアントが、１個以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＨＥバリアントが、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＨＥバリアントが、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４４、４８、５０、５３、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８２、１３８、１４３、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置に含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｌ２６Ｒ、Ｌ２６Ｙ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ２８Ｇ、Ｒ３０Ｑ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３２Ｓ、Ｎ３２Ｋ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｉ、Ｔ４８Ｇ、Ｔ４８Ｖ、Ｈ５０Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｋ、Ｖ６８Ｒ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｅ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｑ、Ａ７０Ｌ、Ａ７０Ｓ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７２Ｔ、Ｓ７２Ｖ、Ｓ７２Ｍ、Ａ７６Ｌ、Ａ７６Ｈ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ａ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｋ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｔ４８Ｉ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｔ４８Ｉ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｇ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｈ５０Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２ＴＡ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｙ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｒ、Ａ７０Ｅ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｑ、Ｓ７２Ｍ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｓ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６〜１９のいずれか１項に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ＨＥバリアントが、配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＨＥバリアントが、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ＨＥバリアントが、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１３に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ＨＥバリアントが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される、請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１５．５のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のポリヌクレオチド配列と結合する、請求項４７または請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２６に示されるポリヌクレオチド配列と結合する、請求項４７〜４８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ペプチドリンカーおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ウイルス性自己切断型２Ａペプチドおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項５２または請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記末端プロセシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、前記ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子を、配列番号２５または配列番号２７に示されるポリヌクレオチド配列において切断する、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ｍＲＮＡ。
【請求項５９】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ。
【請求項６０】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項６１】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
【請求項６２】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項６３】
請求項６０に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項６４】
請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドによって導入される１個以上のゲノム修飾を含む、細胞。
【請求項６５】
前記細胞が造血細胞である、請求項６１〜６４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６６】
前記細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項６１〜６５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６７】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項６１〜６６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６８】
前記細胞がＣＤ１３３＋細胞である、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６９】
請求項６１〜６８のいずれか１項に従う細胞を含む、組成物。
【請求項７０】
請求項６１〜６８のいずれか１項に従う細胞および生理学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項７１】
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を細胞の集団中で編集する方法であって、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現により、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出される、方法。
【請求項７２】
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を細胞の集団中で編集する方法であって、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現により、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、前記破断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、方法。
【請求項７３】
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を細胞の集団中で編集する方法であって、請求項１〜５６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとドナー修復鋳型とを前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、前記ドナー修復鋳型が、前記二本鎖破断（ＤＳＢ）の部位における相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に組み込まれる、方法。
【請求項７４】
前記細胞が造血細胞である、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項７１〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞がＣＤ３４＋細胞である、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞がＣＤ１３３＋細胞である、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
５´−３´エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが前記細胞に導入される、請求項７１〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが前記細胞に導入される、請求項７１〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ドナー修復鋳型が、前記ＤＳＢのＢＣＬ１１Ａ遺伝子配列５´に相同である５´相同アームと、前記ＤＳＢのＢＣＬ１１Ａ遺伝子配列３´に相同である３´相同アームと、を含む、請求項７３〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記５´相同アームおよび３´相同アームの長さが、独立して、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記５´相同アームおよび３´相同アームの長さが、独立して、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される、請求項８１または請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記５´相同アームが約１５００ｂｐであり、前記３´相同アームが約１０００ｂｐである、請求項８１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記５´相同アームが約６００ｂｐであり、前記３´相同アームが約６００ｂｐである、請求項８１〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
ウイルスベクターを使用して、前記ドナー修復鋳型を前記細胞に導入する、請求項７３〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１個以上のＩＴＲを有する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項８７または請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２血清型またはＡＡＶ６血清型を有する、請求項８７〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記レンチウイルスがインテグラーゼ欠乏レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
異常ヘモグロビン症の少なくとも１つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法であって、対象に有効量の請求項６９または請求項７０に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９４】
前記対象が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記組成物の前記量が、前記対象の輸血を減少させるのに有効である、請求項９３または９４に記載の方法。
【請求項９６】
サラセミアの少なくとも１つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法であって、前記対象に有効量の請求項６９または請求項７０に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９７】
前記対象が、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記対象が、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
鎌状赤血球症の少なくとも１つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法であって、前記対象に有効量の請求項６９または請求項７０に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１０１】
前記対象が、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
対象におけるγ−グロビンの量を増加させる方法であって、前記対象に有効量の請求項６９または請求項７０の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１０３】
対象における胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の量を増加させる方法であって、前記対象に有効量の請求項６９または請求項７０の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１０４】
前記対象が異常ヘモグロビン症を有する、請求項１０２または請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記対象が、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記対象が、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記対象が、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象が、鎌状赤血球症、またはそれと関連付けられる状態を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記対象が、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する、請求項１０８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、２０１６年１０月２８日出願の米国仮出願第６２／４１４，２７３号、２０１６年８月１６日出願の米国仮出願第６２／３７５，８２９号、２０１６年７月２７日出願の米国仮出願第６２／３６７，４６５号、２０１６年７月２５日出願の米国仮出願第６２／３６６，５３０号の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する説明
本出願に付随する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０７１＿０４ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、１４１ＫＢであり、２０１７年７月２５日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
本開示は、向上したゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子を編集するための再プログラムされたヌクレアーゼ、組成物、およびその使用方法に関する。
【０００４】
関連技術の記載
異常ヘモグロビン症は、ヘモグロビンの構造および／または合成の変化に起因する単因子遺伝性血液障害の多様な群である。最も一般的な異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、α−サラセミア、およびβ−サラセミアである。世界人口の約５％がグロビン遺伝子変異を保持している。世界保健機構は、毎年３００，０００人を超える乳児が深刻なヘモグロビン障害を持って生まれている。異常ヘモグロビン症は、軽症の低色素性貧血から、中等症の血液疾患、重症で生涯にわたる多臓器関与型の輸血依存性貧血まで、大きなばらつきのある臨床症状を示す。
【０００５】
異常ヘモグロビン症に対する唯一の根治的である可能性のある治療は、同種造血幹細胞移植である。しかしながら、ＨＬＡ適合性ＨＳＣ移植は、罹患者の２０％未満にしか利用可能でないと推測されており、また長期毒性が重大である。加えて、ＨＳＣ移植は、ＳＣＤまたは重症のサラセミアを有する対象では高い死亡率および疾病率とも関連付けられている。高い死亡率および疾病率は、なかでも、ＨＳＣ移植前の輸血関連の鉄過剰、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および対象の移植前処置に必要な高用量の化学療法／放射線療法に一部起因する。
【０００６】
異常ヘモグロビン症のための支持療法は、鉄キレート、および場合によっては脾臓摘出術と組み合わせた、生涯にわたる定期的な輸血を含む。ＳＣＤのための追加の治療は、鎮痛剤、抗生物質、ＡＣＥ阻害剤、およびヒドロキシウレアを含む。しかしながら、ヒドロキシウレア治療と関連付けられる副作用は、血球減少、色素沈着過度、体重増加、日和見感染、無精子症、低マグネシウム血症、および癌を含む。
【０００７】
既存の方法で治療された患者は、推定寿命がよくても５０〜６０年である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、概して、ひとつには、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびｍｅｇａＴＡＬを含む組成物に関する。
【０００９】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、ヒトＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子中の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドを一部企図する。
【００１０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。
【００１１】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く。
【００１３】
さらなる実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く。
【００１４】
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く。
【００１５】
追加の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠く。
【００１６】
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠く。
【００１７】
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く。
【００１８】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩからなる群から選択される、ＬＨＥのバリアントである。
【００１９】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択される、ＬＨＥのバリアントである。
【００２０】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択される、ＬＨＥのバリアントである。
【００２１】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである。
【００２２】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおける１個以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
【００２３】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおける、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
【００２４】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４４、４８、５０、５３、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８２、１３８、１４３、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｌ２６Ｒ、Ｌ２６Ｙ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ２８Ｇ、Ｒ３０Ｑ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３２Ｓ、Ｎ３２Ｋ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｉ、Ｔ４８Ｇ、Ｔ４８Ｖ、Ｈ５０Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｋ、Ｖ６８Ｒ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｅ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｑ、Ａ７０Ｌ、Ａ７０Ｓ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７２Ｔ、Ｓ７２Ｖ、Ｓ７２Ｍ、Ａ７６Ｌ、Ａ７６Ｈ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ａ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００２７】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００２８】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｋ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｔ４８Ｉ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｔ４８Ｉ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３１】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｇ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｈ５０Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３２】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３３】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２ＴＡ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３４】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｙ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｒ、Ａ７０Ｅ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３５】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３６】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｑ、Ｓ７２Ｍ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３８】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００３９】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片に関して、以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｓ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【００４０】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４１】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４２】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４３】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４４】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４５】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４６】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４７】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４８】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４９】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５０】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５１】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５２】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５３】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５４】
一部の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００５５】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
【００５６】
さらなる実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される。
【００５７】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１１．５のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００５８】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１２．５のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００５９】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１３．５のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００６０】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ反復単位〜約１４．５のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００６１】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のポリヌクレオチド配列と結合する。
【００６２】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２６に示されるポリヌクレオチド配列と結合する。
【００６３】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２７に示されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【００６４】
ある特定の実施形態において、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む。
【００６５】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカーおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
【００６６】
一部の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス性自己切断型２Ａペプチドおよび末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片をさらに含む。
【００６７】
特定の実施形態において、末端プロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【００６８】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２０〜２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００６９】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７０】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７１】
ある特定の実施形態において、末端プロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７２】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２２〜２３のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７３】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７４】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２３に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００７５】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子を、配列番号２５または配列番号２７に示されるポリヌクレオチド配列において切断する。
【００７６】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。
【００７７】
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを企図する。
【００７８】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号３６〜３７のいずれか１つに示される配列を含む。
【００７９】
ある特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを企図する。
【００８０】
追加の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを企図する。
【００８１】
さらなる実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドを含む細胞を企図する。
【００８２】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を企図する。
【００８３】
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるベクターを含む細胞を企図する。
【００８４】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入される１つ以上のゲノム修飾を含む細胞を企図する。
【００８５】
ある特定の実施形態において、細胞は造血細胞である。
【００８６】
特定の実施形態において、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【００８７】
一部の実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【００８８】
特定の実施形態において、細胞はＣＤ１３３＋細胞である。
【００８９】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるゲノム編集した細胞を含む組成物を企図する。
【００９０】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、本明細書で企図されるゲノム編集した細胞と生理学的に許容される担体とを含む組成物を企図する。
【００９１】
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を細胞の集団中で編集する方法を企図し、本方法は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、このポリペプチドの発現により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出される。
【００９２】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を細胞の集団中で編集する方法を企図し、本方法は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、このポリペプチドの発現により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、この破断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される。
【００９３】
特定の実施形態において、本開示は、ひとつには、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を細胞の集団中で編集する方法を企図し、本方法は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとドナー修復鋳型とを細胞に導入することを含み、このポリペプチドの発現により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位において二本鎖破断が創出され、このドナー修復鋳型は、二本鎖破断（ＤＳＢ）の部位における相同組換え修復（ＨＤＲ）によって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に組み込まれる。
【００９４】
ある特定の実施形態において、細胞は造血細胞である。
【００９５】
さらなる実施形態において、細胞は造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【００９６】
一部の実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。
【００９７】
特定の実施形態において、細胞はＣＤ１３３＋細胞である。
【００９８】
さらなる実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
【００９９】
特定の実施形態において、５´−３´エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、細胞に導入される。
【０１００】
ある特定の実施形態において、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、細胞に導入される。
【０１０１】
追加の実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＳＢのＢＣＬ１１Ａ遺伝子配列５´に相同である５´相同アームと、ＤＳＢのＢＣＬ１１Ａ遺伝子配列３´に相同である３´相同アームとを含む。
【０１０２】
一部の実施形態において、５´相同アームおよび３´相同アームの長さは、独立して、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから選択される。
【０１０３】
追加の実施形態において、５´相同アームおよび３´相同アームの長さは、独立して、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される。
【０１０４】
一部の実施形態において、５´相同アームは約１５００ｂｐであり、３´相同アームが約１０００ｂｐである。
【０１０５】
さらなる実施形態において、５´相同アームは約６００ｂｐであり、３´相同アームは約６００ｂｐである。
【０１０６】
一部の実施形態において、ウイルスベクターを使用して、ドナー修復鋳型を細胞に導入する。
【０１０７】
追加の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。
【０１０８】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する。
【０１０９】
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。
【０１１０】
ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型またはＡＡＶ６血清型を有する。
【０１１１】
さらなる実施形態において、レトロウイルスはレンチウイルスである。
【０１１２】
一部の実施形態において、レンチウイルスはインテグラーゼ欠乏レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。
【０１１３】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、異常ヘモグロビン症の少なくとも１つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
【０１１４】
特定の実施形態において、対象は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
【０１１５】
ある特定の実施形態において、その量の組成物は、対象の輸血を減少させるのに有効である。
【０１１６】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、サラセミアの少なくとも１つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
【０１１７】
一部の実施形態において、対象は、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
【０１１８】
特定の実施形態において、対象は、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
【０１１９】
ある特定の実施形態において、対象は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
【０１２０】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、鎌状赤血球症の少なくとも１つの症状またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善する方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
【０１２１】
特定の実施形態において、対象は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
【０１２２】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、対象のγ−グロビンの量を増加させる方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
【０１２３】
様々な実施形態において、本開示は、ひとつには、対象の胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の量を増加させる方法を企図し、本方法は、対象に有効量の本明細書で企図される組成物を投与することを含む。
【０１２４】
特定の実施形態において、対象は、異常ヘモグロビン症を有する。
【０１２５】
一部の実施形態において、対象は、α−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
【０１２６】
さらなる実施形態において、対象は、β−サラセミア、またはそれと関連付けられる状態を有する。
【０１２７】
特定の実施形態において、対象は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
【０１２８】
ある特定の実施形態において、対象は、鎌状赤血球症、またはそれと関連付けられる状態を有する。
【０１２９】
特定の実施形態において、対象は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】選択的スプライシングアイソフォームを図示したヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子、およびＧＡＴＡ−１結合モチーフ（配列番号７７および７８）の位置、および転写開始部位の約５８ｋｂ下流に位置するＤＮａｓｅ超感受性部位（ＤＨＳ）内の再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位を示す。
【図２Ａ】天然のホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＳｍａＭＩが、セントラル４配列（ｃｅｎｔｒａｌ−４  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（配列番号３０）としてＴＴＡＴを含むＤＮＡ標的を切断することを示す。
【図２Ｂ】Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ再プログラム化標的であるＣＣＲ５遺伝子が、ＴＴＡＴセントラル４を、その天然のセントラル４切断特異性を保持したまま切断できることを示す。
【図３】３回の分類を行った後、再プログラムしたドメインを融合させて、標的部位を切断する完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼを単離することによる、キメラ「半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅｓ）」に対するＩ−ＯｎｕＩ  Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の再プログラムを示す。
【図４Ａ】染色体レポーターアッセイにおけるＩ−ＯｎｕＩ由来ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＢＣＬ１１Ａ標的部位に対する活性に関する初期スクリーニングを示す。
【図４Ｂ】より活性なバリアントであるＢＣＬ１１Ａ−Ｂ４Ａ３を得るための、最初に導出されたＩ−ＯｎｕＩ由来ホーミングエンドヌクレアーゼＢＣＬ１１Ａ．Ａ４の精製を示す。
【図４Ｃ】ＢＣＬ１１Ａ標的配列に対するＢＣＬ１１Ａ．Ａ４およびＢＣＬ１１Ａ−Ｂ４Ａ３の触媒活性の比較を示す。
【図５】同一でない位置をハイライトした、野生型Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ（配列番号７９）と比較したＢＣＬ１１Ａ．Ａ４（配列番号８０）およびＢＣＬ１１Ａ−Ｂ４Ａ３（配列番号８１）ホーミングエンドヌクレアーゼのアライメントを示す。
【図６Ａ】ＢＣＬ１１Ａ−Ｂ４Ａ３ホーミングエンドヌクレアーゼが、酵母表層提示に基づく基質滴定アッセイを使用して測定して、ナノモル未満の親和特性を有することを示す。
【図６Ｂ】標的配列の塩基を各位置で変化させることで、標的切断特異性がどのように影響を受けるのかを示す。
【図７】ＢＣＬ１１Ａ−Ｂ４Ａ３ホーミングエンドヌクレアーゼの総合的なセントラル４特異性プロファイルを示し、これにより、ＴＴＡＴを含む許容されたセントラル４配列のわずかに移動したスペクトルの中で、高度な全体的選択性を保持したことが実証される。
【図８Ａ】ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（配列番号８２および８３）を標的とするＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬの概略図を示す。
【図８ＢＣ】（図８Ｂ）初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的配列のＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ編集のＴＩＤＥ分析を示す。（図８Ｃ）編集型初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的配列のＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ編集のＰＣＲ系分析を示す。
【図８Ｄ】初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的配列（配列番号８４〜１０４）のＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ編集の単一コロニー配列決定分析を示す。
【図８Ｅ】初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞におけるＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的配列のＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ編集に関する追加実験からの結果を示す。
【図９】（図９Ａ）ＢＣＬ１１Ａ標的配列に隣接する相同アームと、２つの相同アームの間に埋め込まれた蛍光レポーターアッセイ遺伝子とを含むドナー修復鋳型の概略図を示す。（図９Ｂ）ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬのＣＤ３４＋細胞への導入、および２つの相同アームの間に埋め込まれた導入遺伝子カセットを担持するドナー修復鋳型を含むＡＡＶ６ゲノムによる細胞の形質導入により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位におけるカセットの高い標的化挿入率が生じることを示す。
【図１０】（図１０Ａ）ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬのＣＤ３４＋細胞への導入、およびドナー修復鋳型を含むＡＡＶ６ゲノムによる細胞の形質導入により、ヒトＣＤ３４＋細胞の赤血球分化誘導能力が大幅には改変されないことを示す。（図１０Ｂ）図１０Ａに示すデータを表にしたものを示す。
【図１１】（図１１Ａ）ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬで処理した初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞集団により、それらが赤血球系細胞に分化したときに、胎児ヘモグロビンが上方調節されることを示す、代表的なフローサイトメトリー分析である。（図１１Ｂ）ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬで処理した初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞集団により、それらが赤血球系細胞に分化したときに、胎児ヘモグロビンが上方調節されることを示す、代表的なＨＰＬＣ分析である。
【図１２】ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬで処理した初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞においてコロニー形成が影響を受けないことを示す。
【図１３】ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ、またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行ったヒトＣＤ３４＋細胞の編集率を示す。
【図１４】ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ、またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行ったヒトＣＤ３４＋細胞からのＨｂＦ産生レベルを示す。
【図１５】編集した細胞の減少が最小限である免疫不全マウスに安定に移植した、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬで処理した初代ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞集団を示す。
【図１６】ヒトＣＤ３４＋細胞移植片から、および移植片を移植したＮＳＧマウス由来の４カ月目の骨髄からのＨｂＦ産生レベルを示す。ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ、またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質をコードするｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行ったヒトＣＤ３４＋細胞。
【発明を実施するための形態】
【０１３１】
配列識別名の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列である。
配列番号３は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号４は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号５は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥのアミノ酸配列または生物学的に活性な断片である。
配列番号６〜１９は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するように再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ＧＡＴＡ−１モチーフをヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子のＤＮＡ超感受性部位５８に含むポリヌクレオチドである。
配列番号２５は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント標的部位である。
配列番号２６は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
配列番号２７は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
配列番号２８は、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
配列番号２９は、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＣ末端ドメイン標的部位である。
配列番号３０は、Ｉ−ＳｍａＭＩ  ＬＨＥ標的部位である。
配列番号３１は、ヒトＣＣＲ５遺伝子中のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント標的部位である。
配列番号３２は、ヒトＣＣＲ５遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのためのＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント表層提示型プラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号３３は、ヒトＣＣＲ５遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのための中央４アレイ（ｃｅｎｔｒａｌ  ４  ａｒｒａｙ）についてのポリヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのためのＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント表層提示型プラスミドのポリヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのための中央４アレイについてのポリヌクレオチド配列である。
配列番号３６は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子を切断するｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３７は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子を切断するｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合物をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３８は、マウスＴｒｅｘ２をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３９は、マウスＴｒｅｘ２をコードするアミノ酸配列である。
配列番号４０〜５０は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号５１〜７５は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
前述の配列中、Ｘは、存在する場合、任意のアミノ酸、またはアミノ酸の不在を指す。
【０１３３】
Ａ．概説
本開示は、概して、ひとつには、向上したゲノム編集組成物およびその使用方法に関する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、細胞中の胎児ヘモグロビンの量を増加させて、様々な異常ヘモグロビン症と関連付けられる症状を治療、予防、または改善するために使用される。このため、本明細書で企図される組成物は、根治的である可能性のある解決策を、異常ヘモグロビン症を有する対象に提供する。
【０１３４】
正常な成人のヘモグロビンは、２つのアルファ−（α）グロビンタンパク質と２つのベータ−（β−）グロビンタンパク質との四量体複合体を含む。発達過程において、胎児は、２つのβ−グロビンタンパク質の代わりに２つのガンマ−（γ）グロビンタンパク質を含む胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を産生する。周産期発生中のある時点で、赤血球が、γ−グロビン発現を下方調節し、β−グロビンを主に産生するように切り替わる、「グロビンスイッチング」が生じる。この切り替えは、主に、γ−グロビン遺伝子の転写の減少およびβ−グロビン遺伝子の転写の増加に起因する。ＧＡＴＡ結合タンパク質−１（ＧＡＴＡ−１）は、グロビンスイッチングに影響する転写因子である。ＧＡＴＡ−１は、β−グロビン遺伝子発現を直接的に転写活性化し、ＢＣＬ１１Ａ発現の転写活性化を通して、γ−グロビン遺伝子発現を間接的に抑圧または抑制する。スイッチングの薬理学的または遺伝子的な操作は、β−グロビン遺伝子中の突然変異に起因するβ−サラセミアまたは鎌状赤血球疾患に罹患した患者にとって魅力的な治療戦略を示す。
【０１３５】
様々な実施形態において、赤血球細胞中のＢＣＬ１１Ａ遺伝子機能および／または発現を撹乱するヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子修飾された細胞、ならびにそれらの使用方法が企図される。赤血球コンパートメント中のＢＣＬ１１Ａ発現は、コンセンサスＧＡＴＡ−１結合モチーフＷＧＡＴＡＡ（配列番号２４）をＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロンに含む赤血球エンハンサーに大きく依存する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、赤血球細胞中のＢＣＬ１１Ａ発現をＧＡＴＡ−１結合部位のゲノム編集によって低減または排除することで、γ−グロビン遺伝子発現の再活性化または抑圧解除、およびβ−グロビン遺伝子発現の減少が生じ、それによりＨｂＦ発現が増加して、異常ヘモグロビン症を有する対象と関連付けられる１つ以上の症状を効果的に治療および／または改善することが企図される。
【０１３６】
様々な実施形態において企図されるゲノム編集方法は、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ遺伝子（ＢＣＬ１１Ａ）中の転写因子結合部位に結合してそれを切断するように設計されたヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における２本鎖破断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチド鋳型、例えば、ドナー修復鋳型の非存在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはドナー修復鋳型の存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち相同組換えによって、修復され得る。ある特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復鋳型の存在下で細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを用いて修復され得る、１本鎖ＤＮＡ切断を生成する。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用の鋳型として相同ＤＮＡを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対する相同性を保持する配列が両側に隣接した、標的部位における所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作り出すことができる。
【０１３７】
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。
【０１３８】
ＤＮＡ破断がＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー中で生成される、種々の実施形態において、切断されたゲノム配列の両端のＮＨＥＪにより、ＢＣＬ１１Ａ発現が減少した細胞、および好ましくは、機能的ＢＣＬ１１Ａ発現が欠如したまたは実質的に欠如した、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制する能力が欠如し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化する能力が欠如した、赤血球細胞が生じ得る。
【０１３９】
切断されたＢＣＬ１１Ａゲノム配列の修復用のドナー鋳型が提供される、種々の他の実施形態において、ＤＳＢは、ＤＮＡ破断部位における相同組換えによって鋳型の配列を用いて修復される。好ましい実施形態において、修復鋳型は、標的とするゲノム配列とは異なるポリヌクレオチド配列を含む。
【０１４０】
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ＮＨＥＪまたはＨＤＲ効率を増大させるためにヌクレアーゼバリアントおよび１つ以上の末端プロセシング酵素を含む。
【０１４１】
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子および末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２を標的とする、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。
【０１４２】
様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞が企図される。ゲノム編集された細胞は、赤血球細胞系列中の内在性ＢＣＬ１１Ａ発現が減少している。ゲノム編集された赤血球細胞は、γ−グロビン発現が増加し、β−グロビン発現が減少している。
【０１４３】
したがって、本明細書で企図される方法および組成物は、異常ヘモグロビン症の治療のための既存の遺伝子編集戦略と比較して、飛躍的な向上を示す。
【０１４４】
特定の実施形態の実践は、特に別段の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で以下に記載される。かかる技法は、文献中で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
【０１４５】
Ｂ．定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の専門家によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示において、次の用語が下記で定義される。
【０１４６】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように本明細書で使用される。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【０１４７】
二者択一（例えば、「または」）の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
【０１４８】
「および／または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
【０１４９】
本明細書で使用されるとき、という用語「約」または「およそ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
【０１５０】
一実施形態において、範囲、例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
【０１５１】
本明細書で使用される、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％である、またはそれよりも高い数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである作用、例えば、生理学的作用を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【０１５２】
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程または要素の群は排除することを暗示するように理解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、何であれ「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。故に、「からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。故に、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
【０１５３】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書全体を通した種々の箇所での上述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様態で組み合わされてもよい。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の排除の根拠としての機能を果たすことも理解される。
【０１５４】
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然条件を最小限に変化させた生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的に数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８もしくは７２時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的に、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態においては、この用語は、エクスビボと交換可能に使用され得る。
【０１５５】
「インビボ」という用語は、生物の内部で起こる活性を指す。一実施形態において、細胞ゲノムは、インビボで操作、編集、または修飾される。
【０１５６】
「強化する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」または「増強する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより高い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、γ−グロビン発現の増加、ＨｂＦ発現の増加、および／または輸血非依存の増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって生み出される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。
【０１５７】
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより低い応答（すなわち、生理的応答）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答には、内在性β−グロビン、輸血依存、ＲＢＣ鎌状化などの減少が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、または対照によって生み出される応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である減少を含み得る。
【０１５８】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般に、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に同様のまたは同等の生理的応答（すなわち、下流作用）を生み出す、引き出す、または引き起こす、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。同等の応答は、参照応答と有意に異なるまたは測定可能な異なる（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）ことはないものである。
【０１５９】
本明細書で使用される「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での１つの分子の、別の分子への結合、例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインの、ＤＮＡへの結合を説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれを超えるＫａを有する結合ドメインを指す。
【０１６０】
代替的に、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ未満）の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義されてもよい。特定の実施形態で企図されるＤＮＡ標的部位に対する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技法、例えば、酵母細胞表層提示を使用して、または結合会合、もしくは標識されたリガンドを使用する置換アッセイによって、容易に決定することができる。
【０１６１】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍高い、バックグラウンド結合よりも約５倍高い、バックグラウンド結合よりも約１０倍高い、バックグラウンド結合よりも約２０倍高い、バックグラウンド結合よりも約５０倍高い、バックグラウンド結合よりも約１００倍高い、もしくはバックグラウンド結合よりも約１０００倍高い、またはそれを超える。
【０１６２】
「選択的に結合する」または「選択的に結合した」または「選択的結合性」または「選択的に標的とする」という用語は、および１つの分子が複数の目的標的外（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）分子の存在下で標的分子に優先的に結合することを説明する。特定の実施形態において、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬが目的標的外ＤＮＡ標的結合部位に結合する頻度の約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、または１０００倍の頻度で、目的標的ＤＮＡ結合部位に選択的に結合する。
【０１６３】
「目的標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）」は、標的部位配列を指す。
【０１６４】
「目的標的外（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」は、標的部位配列と類似しているが、同一ではない配列を指す。
【０１６５】
「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合するおよび／または切断する核酸の部分を規定する、染色体または染色体外核酸配列である。標的部位または標的配列の１本の鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列または配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合および／または切断される標的部位または標的配列は、二本鎖であり、参照配列およびその相補体を含むことが理解される。好ましい実施形態において、標的部位は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の配列である。
【０１６６】
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナーキャプチャを含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換プロセスを指す。本開示において、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞における２本鎖破断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を鋳型として使用して「標的」分子（すなわち、２本鎖破断を経験したもの）を修復し、それがドナーから標的への遺伝情報の伝播につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、かかる伝播は、破損した標的とドナーとの間でのヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存的単鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の変化をもたらす。
【０１６７】
「ＮＨＥＪ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復鋳型または相同配列の非存在下での二本鎖破断の解決を指す。ＮＨＥＪにより、破断部位に挿入および欠失が生じ得る。ＮＨＥＪは、いくつかの下位経路によって媒介され、これらの経路の各々は、個別の突然変異結果を有する。古典的ＮＨＥＪ経路（ｃＮＨＥＪ）は、ＫＵ／ＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体を必要とし、最低限の処理によって両端部をライゲーションして元に戻し、多くの場合に破断の正確な修復をもたらす。代替的ＮＨＥＪ経路（ａｌｔＮＨＥＪ）も、ｄｓＤＮＡ破断の解決に活性があるが、これらの経路は、変異原性がはるかに高く、多くの場合に挿入および欠失を特徴とする破断の不正確な修復をもたらす。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えば、Ｔｒｅｘ２など、末端プロセシング酵素によるｄｓＤＮＡ破断の修飾により、修復がａｌｔＮＨＥＪ経路に引き寄せされ得ることが企図される。
【０１６８】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって開始され得る。１本鎖切断および２本鎖切断の両方が可能である。２本鎖切断は、２つの別々の１本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または段違い末端のいずれかの生成をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬなどは、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれのＤＮＡ鎖にあってもよい。
【０１６９】
「外来性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞に導入される分子である。代表的な外来性分子には、有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外来性分子を細胞に導入するための方法は、当該技術分野で知られており、脂質媒介移入（すなわち、中性および陽イオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７０】
「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で細胞内に通常存在するものである。追加の内在性分子には、タンパク質、例えば、内在性グロビンが含まれ得る。
【０１７１】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに、調節配列がコードおよび／または転写配列に隣接するか否かに関わらず遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、複製起源、基質結合部位、および遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【０１７３】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子操作された」または「遺伝子修飾された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体または染色体外付加を指す。遺伝子修飾は、細胞のゲノム内の特定の部位に標的化されても標的化されなくてもよい。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的ではない。
【０１７４】
本明細書で使用されるとき、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復させる、補正する、撹乱する、かつ／または修飾する、細胞のゲノム内の標的部位における遺伝物質の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態で企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位においてまたは標的部位に近接してＤＮＡ損傷を生成するために、任意選択でドナー修復鋳型の存在下で、１つ以上のヌクレアーゼバリアントを細胞に導入することを含む。
【０１７５】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾する、または治療様ポリペプチドを発現させるための追加の遺伝子物質の細胞中の全遺伝子物質への導入を指す。特定の実施形態において、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾する、または治療用ポリペプチドを発現させるためのゲノム編集による遺伝子材料の細胞のゲノムへの導入は、遺伝子療法と見なされる。
【０１７６】
Ｃ．ヌクレアーゼバリアント
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位のゲノム編集に好適な、本明細書の特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）、ならびに任意選択で、本明細書で企図される１つ以上のリンカーを含む。「再プログラムされたヌクレアーゼ」、「操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は、交換可能に使用され、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、ヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）中で二本鎖ＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するように、親または自然発生ヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。ヌクレアーゼバリアントは、自然発生ヌクレアーゼまたは以前のヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
【０１７７】
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的配列に結合し、それを切断するヌクレアーゼバリアントの実例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント（メガヌクレアーゼバリアント）およびｍｅｇａＴＡＬが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位に、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位に、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）に、二本鎖破断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラムされる。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、交換可能に使用され、１２〜４５個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー、すなわちＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、自然発生ヌクレアーゼを指す。
【０１７９】
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたは自然界に見い出されるホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を増加させるように修飾されている野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
【０１８０】
「操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラムされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するように、親または自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生ホーミングエンドヌクレアーゼから、または別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから、設計および／または修飾されてもよい。特定の実施形態で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
【０１８１】
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、自然界に存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム突然変異誘発によって得ることができる。ＨＥバリアントは、自然発生ＨＥまたはＨＥバリアントにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を作製する、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異させる、置換する、付加する、または欠失させることによって、得られてもよい。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースに対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【０１８２】
特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素と共に、Ｔ細胞に導入される。ＨＥバリアントおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
【０１８３】
「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各ＨＥに関して、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖−側鎖間および側鎖−ＤＮＡ接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。故に、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の天然ＨＥまたはＨＥバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、天然ＨＥ（または以前に生成されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識インターフェースに局在する１つ以上のアミノ酸残基が変化している、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによってもたらされてもよい。ライブラリは、切断アッセイを用いて、各々予測されるＢＣＬ１１Ａ標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１−６８８０を参照されたい）。
【０１８４】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最も詳細に研究されているホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖１つあたり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または１本鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みを特徴とする、高度に保存されたコア構造が特定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ２００５）、このうちＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥによる高度に効率的かつ特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようＬＨＥを遺伝子操作することは、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大３分の２でのそのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変するためのＬＨＥの大規模な改変を必要とする。
【０１８５】
一実施形態において、再プログラムされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計される元となり得るＬＨＥとしては、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
再プログラムされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計される元となり得るＬＨＥの実例としては、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
一実施形態において、再プログラムされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＣｐａＭＩバリアント、Ｉ−ＨｊｅＭＩバリアント、Ｉ−ＯｎｕＩバリアント、Ｉ−ＰａｎＭＩバリアント、およびＩ−ＳｍａＭＩバリアントからなる群から選択される。
【０１８８】
一実施形態において、再プログラムされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントはＩ−ＯｎｕＩバリアントである。例えば、配列番号６〜１９を参照されたい。
【０１８９】
一実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、天然のＩ−ＯｎｕＩまたはその生物学的に活性な断片（配列番号１〜５）から生成された。好ましい実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子を標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ−ＯｎｕＩバリアントから生成された。一実施形態において、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号２５に示されるヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子標的部位に対して生成された。
【０１９０】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断する再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、１個以上のアミノ酸置換をＤＮＡ認識インターフェースに含む。特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）もしくは配列番号６〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントまたはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０１９１】
一実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）もしくは配列番号６〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントまたはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０１９２】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換または修飾を、配列番号１〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識インターフェースに含む。
【０１９３】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換または修飾を、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）、配列番号６〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェース、特に、２４位〜５０位、６８位〜８２位、１８０位〜２０３位、および２２３位〜２４０位に位置するサブドメインに含む。
【０１９４】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、ＤＮＡ認識インターフェースにおける１個以上のアミノ酸置換または修飾を、  Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩバリアントまたはそのさらなるバリアントの１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
【０１９５】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、もしくは４０個、またはそれ以上のアミノ酸置換または修飾を、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩバリアントまたはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェース、特に、２４位〜５０位、６８位〜８２位、１８０位〜２０３位、および２２３位〜２４０位に位置するサブドメインに含む。
【０１９６】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおける５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、もしくは４０個、またはそれ以上のアミノ酸置換または修飾を、Ｉ−ＯｎｕＩ配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩバリアントまたはそのさらなるバリアントの１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
【０１９７】
一実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、１個以上のアミノ酸置換または修飾を、Ｉ−ＯｎｕＩ配列全体のどこにでも位置する追加の位置に含む。置換されかつ／または修飾され得る残基としては、核酸標的に接触する、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。１つの非限定的な例において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断する本明細書で企図されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、１個以上の置換および／または修飾、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３０個、さらにより好ましくは少なくとも３５個、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個を、配列番号１〜１９のいずれか１つに関して、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４４、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８２、１３８、１４３、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０からなる位置群から選択される少なくとも１個の位置に含む。
【０１９８】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を、配列番号１〜１９に示されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片の２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、４０、４１、４２、４４、４８、５０、５３、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８２、１３８、１４３、１５９、１７８、１８０、１８４、１８６、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、２０１、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置で含む。
【０１９９】
さらなる実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｌ２６Ｒ、Ｌ２６Ｙ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ２８Ｇ、Ｒ３０Ｑ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３２Ｓ、Ｎ３２Ｋ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｉ、Ｔ４８Ｇ、Ｔ４８Ｖ、Ｈ５０Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｋ、Ｖ６８Ｒ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｅ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｑ、Ａ７０Ｌ、Ａ７０Ｓ、Ｓ７２Ａ、Ｓ７２Ｔ、Ｓ７２Ｖ、Ｓ７２Ｍ、Ａ７６Ｌ、Ａ７６Ｈ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅのうちの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも２５個、より好ましくは少なくとも３５個、もしくはさらにより好ましくは少なくとも４０個、またはそれ以上を含む。
【０２００】
ある特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ａ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０１】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０２】
一部の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０３】
ある特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｋ、Ｋ３４Ｎ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｔ、Ｔ４８Ｉ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０４】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｔ４８Ｉ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０５】
追加の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｇ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｒ、Ｇ４４Ｔ、Ｈ５０Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０６】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｈ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｒ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２ＴＡ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０８】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｙ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｒ、Ａ７０Ｅ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２０９】
一部の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｄ５３Ｅ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｓ７２Ｔ、Ａ７６Ｌ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２１０】
ある特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｖ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２１１】
ある特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｑ、Ｓ７２Ｍ、Ａ７６Ｒ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２１２】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｌ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２１３】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）もしくは配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるＩ−ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性な断片、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｖ、Ｒ２８Ｓ、Ｒ３０Ｑ、Ｎ３２Ｒ、Ｎ３３Ｓ、Ｋ３４Ｄ、Ｓ３５Ｙ、Ｓ３６Ａ、Ｖ３７Ｔ、Ｓ４０Ｒ、Ｔ４１Ｉ、Ｅ４２Ｈ、Ｇ４４Ｒ、Ｔ４８Ｖ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｓ、Ｓ７２Ｖ、Ａ７６Ｈ、Ｓ７８Ｑ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｙ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｎ１８４Ｒ、Ｉ１８６Ｒ、Ｋ１８９Ｎ、Ｓ１９０Ｖ、Ｋ１９１Ｎ、Ｌ１９２Ａ、Ｇ１９３Ｒ、Ｑ１９５Ｒ、Ｓ２０１Ｅ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｇ、Ｆ２３２Ｒ、Ｄ２３６Ｑ、Ｖ２３８Ｒ、およびＴ２４０Ｅを含む。
【０２１４】
特定の実施形態において、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子に結合しそれを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６〜１９のいずれか１つに示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２１６】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２１７】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２１８】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２１９】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２０】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２１】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２２】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２３】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２４】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２５】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２６】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２７】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２８】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２２９】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片を含む。
【０２３０】
２．ＭｅｇａＴＡＬ
様々な実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位に、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位に、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）に、二本鎖破断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラムされる。「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＢＣＬ１１Ａ遺伝子中でＤＮＡ標的配列に結合しそれを切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意選択で、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。
【０２３１】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、または鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素と共に、細胞に導入され得る。ｍｅｇａＴＡＬおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において、導入されてもよい。
【０２３２】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物のトランスクリプトームを操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬ−エフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、デノボで、または自然発生ＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３から、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から、遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導し、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、および同特許で引用される参考文献に開示され、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの、その対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的に３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的に反復の１２位および／または１３位に、反復可変Ｄｉ−残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉ−Ｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（標準的）コードは、１２位および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態においては、非標準的（非典型）ＲＶＤが企図される。
【０２３４】
特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適な非標準的ＲＶＤの例示的な例としては、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊［（＊）は、１３位のアミノ酸が不在であることを意味する］が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適なＲＶＤの追加の例示的な例としては、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものがさらに挙げられ、同特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３５】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５〜１５個の反復単位、より好ましくは７〜１５個の反復単位、より好ましくは９〜１５個の反復単位、およびより好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２３６】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、１組のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一の切頭型ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（本明細書の他の箇所で開示される（下記を参照）Ｃキャップのアミノ酸−２０〜−１）とを含む。故に、特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５〜３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５〜１５．５個の反復単位、より好ましくは７．５〜１５．５個の反復単位、より好ましくは９．５〜１５．５個の反復単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、または１５．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２３７】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドと、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むＴＡＬエフェクター構造を含む。一部の実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインは、同じ種に由来する。他の実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインのうちの１つ以上は、異なる種に由来する。
【０２３８】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも１２０個〜少なくとも１４０個またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１〜＋１２２から少なくとも約＋１〜＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１〜＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。
【０２３９】
本明細書で使用されるとき、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも２０〜少なくとも８５またはそれよりも多くのアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５アミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端側のハーフ反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復に対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。
【０２４０】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、標的配列に結合し、それを切断するように再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意選択で、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと任意選択で互いに接合されたＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドを含む。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、任意選択でＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含むｍｅｇａＴＡＬは、リンカーポリペプチドに融合され、これがホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されることが、企図される。故に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインが結合した標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内離れているＤＮＡ標的配列に結合する。このようにして、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
【０２４１】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、再プログラムされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約４、５、または６ヌクレオチド、好ましくは６ヌクレオチド上流の内にあるヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
【０２４２】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントによって結合および切断されるヌクレオチド配列（配列番号２５）の６ヌクレオチド上流である、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとを含む。好ましい実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は配列番号２７である。
【０２４３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択される、ＬＨＥから設計または再プログラムされたＬＨＥバリアントとを含む。
【０２４４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位と、ＣＴＤと、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントとを含む。
【０２４５】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、約９．５〜約１５．５のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントとを含む。
【０２４６】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２個のアミノ酸〜１３７個のアミノ酸のＮＴＤと、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、または約１５．５の結合反復単位と、約２０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸のＣＴＤと、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントとを含む。特定の実施形態において、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＴＤのうちのいずれか１つ、いずれか２つ、または全てを、同じ種または異なる種から好適な組み合わせで設計することができる。
【０２４７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号２０または２１のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【０２４８】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号２２または２３に示されるアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含み、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号２７に示されるヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【０２５０】
３．末端プロセシング酵素
特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよび末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一ポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、２Ａ配列によって、またはＩＲＥＳ配列によって分離される、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよび末端プロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、末端プロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。
【０２５１】
「末端プロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の露出した末端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの二本鎖ハイブリッド、ならびに合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ以外の塩基を含むもの）であってもよい。末端プロセシング酵素は、露出したポリヌクレオチド鎖末端を、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの除去、リン酸基の除去もしくは修飾、および／またはヒドロキシル基の除去もしくは修飾によって修飾してもよい。末端プロセシング酵素は、末端を、エンドヌクレアーゼ切断部位で、または剪断（例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリング、および噴霧）、電離放射、紫外線放射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤などの他の化学的もしくは機械的手段によって生成された末端で、修飾してもよい。
【０２５２】
特定の実施形態において、特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびＤＮＡ末端プロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。
【０２５３】
「ＤＮＡ末端プロセシング酵素」という用語は、ＤＮＡの露出した末端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、平滑末端または粘着末端（５´または３´突出を有する末端）を修飾してもよい。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを修飾してもよい。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、末端を、エンドヌクレアーゼ切断部位で、または剪断（例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリング、および噴霧）、電離放射、紫外線放射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤などの他の化学的もしくは機械的手段によって生成された末端で、修飾してもよい。ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、露出したＤＮＡ末端を、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの除去、リン酸基の除去もしくは修飾、および／またはヒドロキシル基の除去もしくは修飾によって修飾してもよい。
【０２５４】
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なＤＮＡ末端プロセシング酵素としては、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、および鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５５】
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なＤＮＡ末端プロセシング酵素のさらなる実例としては、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通ドメインを有しないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７−エキソヌクレアーゼ遺伝子６、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス統合タンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、アンタルチカ（Ａｎｔａｒｔｉｃ）ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、およびＵＬ−１２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５６】
特定の実施形態において、本明細書で企図される細胞を編集するためのゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬおよびエキソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エキソヌクレアーゼ」という用語は、３´末端または５´末端のいずれかでホスホジエステル結合を破断する加水分解反応によって、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。
【０２５７】
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なエキソヌクレアーゼの実例としては、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、およびラットＴＲＥＸ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５８】
特定の実施形態において、ＤＮＡ末端プロセシング酵素は、３´または５´エキソヌクレアーゼ、好ましくはＴｒｅｘ１またはＴｒｅｘ２、より好ましくはＴｒｅｘ２、さらにより好ましくはヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。
【０２５９】
Ｄ．標的部位
特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計することができ、自然発生ヌクレアーゼと比較して新規の結合特性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー要素等を含むがこれらに限定されない、遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節するかまたは減少させる。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復鋳型は、所望の標的配列を欠失させるように設計され得る。
【０２６０】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子中の標的配列に結合し、それを切断する。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子は、マウスＢｃｌ１１ａ／Ｅｖｉ９タンパク質に類似したＣ２Ｈ２型ジンクフィンガー転写因子をコードする。ＢＣＬ１１Ａは、グロビン遺伝子発現の調節に役割を果たす転写リプレッサーである。胎児発達において、ＢＣＬ１１Ａの全長形態は発現されず、赤血球細胞は、α−グロビンと複合体化して胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を形成するγ−グロビンを産生する。出生周辺期に、ＢＣＬ１１Ａ発現は、赤血球細胞中で増加し、γ−グロビンプロモーター中の転写要素に結合し、増加したβ−グロビン発現と関連付けられるγ−グロビン発現を抑制または抑圧する。γ−グロビンを犠牲にしたβ−グロビン発現の増加により、ＨｂＦからＨｂＡへの（２つのβ−グロビン／２つのα−グロビン）「グロビンスイッチング」が生じる。しかしながら、異常ヘモグロビン症をもたらすβ−グロビン遺伝子中の１つ以上の突然変異を有する対象において、変異したβ−グロビン遺伝子発現を犠牲にしてγ−グロビン遺伝子発現のスイッチをオンにすることで、異常ヘモグロビン症が治療される可能性がある。１つの解決策は、ＢＣＬ１１Ａ発現を減少させて、γ−グロビン遺伝子発現の抑圧解除を行い、変異したβ−グロビン遺伝子発現を減少させることである。
【０２６１】
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーに、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位に、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位に、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）に、二本鎖破断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、再プログラムされたヌクレアーゼまたはｍｅｇａＴＡＬは、コンセンサスＧＡＴＡ−１結合モチーフ（ＷＧＡＴＡＡ）に相補的な鎖上の「ＴＴＡＴ」配列を切断することによって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のＧＡＴＡ−１部位に二本鎖破断を導入する、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントを含む。
【０２６２】
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、二本鎖ＤＮＡを切断し、ＤＳＢを配列番号２５または２７に示されるポリヌクレオチド配列に導入する。
【０２６３】
好ましい実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子はヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子である。
【０２６４】
Ｅ．ドナー修復鋳型
核酸バリアントを使用して、ＤＳＢを標的配列に導入してもよい。ＤＳＢは、１つ以上のドナー修復鋳型の存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を通して修復され得る。特定の実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、配列をゲノムに挿入する。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、ゲノム中のゲノム配列を欠失させるかまたは修復する。
【０２６５】
様々な実施形態において、ドナー修復鋳型を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターを用いて、細胞を形質導入することによって、ドナー修復鋳型を、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中に導入する。
【０２６６】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位と隣接する１つ以上の相同アームを含む。
【０２６７】
本明細書で使用されるとき、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ破断と隣接するＤＮＡ配列と同一またはほぼ同一であるドナー修復鋳型中の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ破断部位のＤＮＡ配列５’と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む５’相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ破断部位のＤＮＡ配列３’と同一またはほぼ同一である核酸配列を含む３’相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型は、５’相同アームおよび３’相同アームを含む。ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位と直接隣接するゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位から任意の塩基対数内のゲノム配列に対する相同性を含んでもよい。一実施形態において、ドナー修復鋳型は、相同配列の任意の介在する長さを含む、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ、またはそれ以上、ゲノム配列と相同である核酸配列を含む。
【０２６８】
特定の実施形態で企図される相同アームの好適な長さの実例は、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ、またはそれより長い相同アームが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６９】
好適な相同アーム長さの追加の実例としては、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約１５００ｂｐが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７０】
特定の実施形態において、５’および３’相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される。一実施形態において、５’相同アームは約１５００ｂｐであり、３’相同アームは約１０００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約２００ｂｐ〜約６００ｂｐであり、３´相同アームは約２００ｂｐ〜約６００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約２００ｂｐであり、３´相同アームは約２００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約３００ｂｐであり、３´相同アームは約３００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約４００ｂｐであり、３´相同アームは約４００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約５００ｂｐであり、３´相同アームは約５００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約６００ｂｐであり、３´相同アームは約６００ｂｐである。
【０２７１】
Ｆ．ポリペプチド
様々なポリペプチドが本明細書で企図され、これらのポリペプチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および融合ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１〜２３および３９に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として交換可能に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な公知の組換えおよび／または合成技術のうちのいずれかを用いて調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生および非自然発生両方の当該技術分野で既知の他の修飾を含み得る。
【０２７２】
「単離タンパク質」、「単離ペプチド」、または「単離ポリペプチド」などは、本明細書で使用されるとき、細胞環境からの、および本細胞の他の構成要素との会合からの、ペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロの合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、これは、インビボ物質とは著しく関係していない。
【０２７３】
特定の実施形態で企図されるポリペプチドの実例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７４】
ポリペプチドは「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入において自然発生ポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、天然であってもよく、あるいは例えば上述のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、合成によって生成されてもよい。例えば、特定の実施形態において、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入をポリペプチドに導入することによって、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位に結合してそれを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、または同様のものの生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して、少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、ここでは、バリアントは参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【０２７５】
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の実例としては、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが挙げられる。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」という用語は、自然発生ポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および／または切断活性である。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、またはそれ以上のアミノ酸長であることが認識されよう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に示されるポリペプチドは、「Ｘ」と示されるアミノ酸を１個以上含んでもよい。「Ｘ」は、アミノ酸配列番号中に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。１個以上の「Ｘ」残基は、本明細書で企図される特定の配列番号に示されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端に存在し得る。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に示される残りのアミノ酸配列が、生物学的に活性な断片とみなされ得る。
【０２７６】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片、例えば、配列番号３〜１９、またはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号２０〜２１）を含む。生物学的に活性な断片は、Ｎ末端切断短縮および／またはＣ末端切断短縮を含んでもよい。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含み、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２個のＣ末端アミノ酸を欠くかまたはそれらの欠失を含む。特定の好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸および２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠くかまたはそれらの欠失を含む。
【０２７７】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、および／または以下の１、２、３、４、もしくは５個のＣ末端アミノ酸の欠失：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖを含む。
【０２７８】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失もしくは置換：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、および／または以下の１、２、３、４、もしくは５個のＣ末端アミノ酸の欠失もしくは置換：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖを含む。
【０２７９】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、および／または以下の１もしくは２個のＣ末端アミノ酸の欠失：Ｆ、Ｖを含む。
【０２８０】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の以下のＮ末端アミノ酸の欠失もしくは置換：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅ、および／または以下の１もしくは２個のＣ末端アミノ酸の欠失もしくは置換：Ｆ、Ｖを含む。
【０２８１】
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入を含む様々な方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、一般に当該技術分野で既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列改変は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそこに引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
【０２８２】
ある特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含有することになる。「保存的置換」は、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有し、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を含むポリペプチドを含む。同等のまたはさらに改良されたバリアントポリペプチドを作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが望ましいとき、当業者は、例えば、表１に従って、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させることができる。
【表１】
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【０２８３】
どのアミノ酸残基が、生物学的活性を無効にすることなく置換、挿入、または欠失され得るかを決定するための指針は、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したまたは荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。自然発生アミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸という４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときに芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく行われ得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
【０２８４】
一実施形態において、２個以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列を、本明細書の他の箇所で開示するＩＲＥＳ配列によって分離することができる。
【０２８５】
特定の実施形態で企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
【０２８６】
別の実施形態において、２個以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される、１個以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
【０２８７】
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、１個以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１個以上のヌクレアーゼ、ならびに１個以上のリンカーおよび／または自己切断型ポリペプチドを含む。
【０２８８】
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアント；リンカーまたは自己切断型ペプチド；ならびに５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリエキソヌクレアーゼ、および３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むがこれらに限定されない末端プロセシング酵素を含む。
【０２８９】
融合ポリペプチドは、１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、およびＨＡ）、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的に、Ｃ末端からＮ末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限りは、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも含むことができる。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、または２つの部分間の化学結合によって産生することができるか、または一般に、他の標準の技法を使用して調製することもできる。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
【０２９０】
融合ポリペプチドは、任意選択で、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用することができるリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確保するのに十分な距離により、任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために使用され得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野で標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子：（１）可撓性延長配座をとることができないこと、（２）第１のおよび第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造とることができないこと、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基を欠くこと、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の近い中性アミノ酸はまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用することができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含むときには、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的に、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長であり得、これはその間の全ての整数値を含む。
【０２９１】
例示的なリンカーとしては、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ＧＧＧ（配列番号４０）、ＤＧＧＧＳ（配列番号４１）、ＴＧＥＫＰ（配列番号４２）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号４３）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、上記を参照）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、４、または５である）（配列番号４４）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号４５）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４６）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号４８）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号４９）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号５０）が挙げられるが、これらに限定されない。代替として、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体との両方をモデリングすることが可能なコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって、合理的に設計することができる。
【０２９２】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインのそれぞれの間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。加えて、ポリペプチド切断部位を任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０２９３】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは、当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコｅｔｃｈウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコｅｔｃｈウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号５１）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号５２）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号５３）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳとの間に生じる）が好ましい。
【０２９４】
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０２９５】
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
【０２９６】
２Ａ部位の実例を表２に提供する。
【表２】
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【０２９７】
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、かつ組換え、合成、または単離されたもののいずれかであり得る。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型、ならびに全ての中間の長さの、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００またはそれ以上のヌクレオチド長のヌクレオチドの多量体型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、６、７、８、９などの、１０１、１０２、１０３などの、１５１、１５２、１５３などの、２０１、２０２、２０３などの引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０２９８】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されていてもよい。本明細書で使用されるとき、「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性、および／または活性を増加させるために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響する因子としては、（ｉ）２つ以上の生物、もしくは遺伝子、もしくは合成によって構築されたバイアステーブルの間のコドンバイアスの変化、（ｉｉ）生物、遺伝子、もしくは遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変化、（ｉｉｉ）コンテクストを含むコドンの体型的変化、（ｉｖ）コドンの解読ｔＲＮＡに従うコドンの変化、（ｖ）トリプレットの全体または１つの位置のいずれかにおけるＧＣ％に従うコドンの変化、（ｖｉ）参照配列、例えば、自然発生配列に対する類似性の程度の変化、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変化、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計の基になるＤＮＡ配列の機能についての予備知識、および／または（ｘ）各アミノ酸に対するコドンセットの体系的変化、および／または（ｘｉ）疑似翻訳開始部位の単離された除去のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」は、リン酸化された糖とのＮ−グリコシド連結における複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、および多種多様な当該技術分野で認識されている修飾された塩基を含むことが理解される。かかる塩基は、一般に、ヌクレオチド糖部分の１´位に位置する。ヌクレオチドは、一般に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）中、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基が欠如した糖である。例示的な天然窒素塩基としては、プリン、アデノシン（Ａ）、およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）、およびチミジン（Ｔ）（またはＲＮＡの背景ではウラシル（Ｕ））が挙げられる。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合される。ヌクレオチドは、通常、一リン酸塩、二リン酸塩、または三リン酸塩である。ヌクレオチドは、修飾されていなくてもよく、あるいは糖、リン酸、および／または塩基部分で修飾されていてもよい（交換可能に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、ＷＯ９２／０７０６５およびＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって概説されている。
【０３００】
ヌクレオチドは、エステル化が糖のＣ−５に付着したヒドロキシル基上で生じる、ヌクレオシドのリン酸エステルとも見なされ得る。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」は、糖とのＮ−グリコシド連結における複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、天然塩基を含むこと、および周知の修飾された塩基も含むことが当該技術分野では認識されている。かかる塩基は、一般に、ヌクレオシド糖部分の１´位に位置する。ヌクレオシドは、一般に、塩基、糖、および糖類を含む。ヌクレオシドは、修飾されていなくてもよく、あるいは糖および／または塩基部分で修飾されていてもよい（交換可能に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾されたヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、および非標準ヌクレオシドとも称される）。上にも記載したように、修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって概説されている。
【０３０１】
ポリヌクレオチドの実例としては、配列番号１〜１９および３９をコードするポリヌクレオチド、ならびに配列番号２０〜３８に示されるポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０２】
様々な例示的な実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、融合ポリペプチド、および発現ベクターをコードするポリヌクレオチド、ウイルスベクター、ならびに本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む移入プラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０３】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列でハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドで実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが、付加または欠失され、または修飾される、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、ある特定の改変が、参照ポリヌクレオチドに行われ得、それによって、改変されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野で十分に理解される。
【０３０４】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列について、熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が、平衡状態で占有されている。
【０３０５】
本明細書で使用される、「配列同一性」または例えば「〜と５０％同一である配列」を含むという記述は、比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。故に、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウ上の２つのの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを得ることができる。典型的に、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載の参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【０３０６】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５〜１８個、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るので、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドを比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、一般的には約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高い割合の相同性を生じること）によって行うことができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のユニット１９．３に見出すことができる。
【０３０７】
本明細書で使用される、「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、天然で存在せず、人間の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
【０３０８】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド、およびポリ（Ａ）尾部を含む。
【０３０９】
本明細書で使用されるとき、「５´キャップ」または「５´キャップ構造」または「５´キャップ部分」という用語は、ｍＲＮＡの５´末端に組み込まれている化学修飾を指す。５´キャップは、核外輸送、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳に関与する。
【０３１０】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５´−末端転写センスヌクレオチドとの間に５´−ｐｐｐ−５´−トリホスフェート連結を含む５´キャップを含む。この５´−グアニル酸キャップは、続いてメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。
【０３１１】
本明細書で企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態における使用に好適な５´キャップの実例としては、メチル化されていない５´キャップ類似体、例えば、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；メチル化された５´キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；ジメチル化された５´キャップ類似体、例えば、ｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；トリメチル化された５´キャップ類似体、例えば、ｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；ジメチル化された対称性５´キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ｇ、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ａ；ならびにアンチリバース（ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ）５´キャップ類似体、例えば、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａと称される、アンチリバースキャップ類似体（Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ））キャップ、ならびにそれらのテトラホスフェート誘導体）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）。
【０３１２】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、第１の転写ヌクレオチドの５´末端にトリホスフェート架橋を介して連結した７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）である５´を含み、その結果、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｎとなり、ここで、Ｎは任意のヌクレオシドである。
【０３１３】
一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、５´キャップを含み、このキャップは、キャップ０構造（キャップ０構造は塩基１および塩基２に付着したリボースの２´−Ｏ−メチル残基を欠く）、キャップ１構造（キャップ１構造は塩基２で２´−Ｏ−メチル残基を有する）、またはキャップ２構造（キャップ２構造は塩基２と塩基３との両方に付着した２´−Ｏ−メチル残基を有する）である。
【０３１４】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇキャップを含む。
【０３１５】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含む。
【０３１６】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０３１７】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０３１８】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、および４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０３１９】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、および４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０３２０】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０３２１】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０３２２】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジン、１つ以上の５−メチル−シトシン、および／または１つ以上の５−メチル−シチジンを含む。
【０３２３】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジンを含む。
【０３２４】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチル−シチジンを含む。
【０３２５】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチル−シトシンを含む。
【０３２６】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、ｍＲＮＡを安定させ、翻訳を促進するために、ポリ（Ａ）尾部を含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、３´ポリ（Ａ）尾部構造を含む。
【０３２７】
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは少なくとも約５００個、またはそれ以上のアデニンヌクレオチド、あるいは任意の介在数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、もしくは２７５個、またはそれ以上のアデニンヌクレオチドである。
【０３２８】
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、約１０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約３００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約２５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約２００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、もしくは約２５０〜約３００個のアデニンヌクレオチド、または任意の介在範囲のアデニンヌクレオチドである。
【０３２９】
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語には、５´（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３´（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５´から３´の方向または３´から５´の方向で注記され得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、５´から３´の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一（ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりのＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて）であるからである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３´から５´の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「逆方向」という用語は、３´から５´の方向で書かれた５´から３´の配列または５´から３´の方向で書かれた３´から５´の配列を指す。
【０３３０】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５´  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３´の相補的鎖は、３´  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５´である。後者の配列は、左に５´末端および右に３´末端を有する逆相補鎖、５´  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  ３´として書かれることが多い。その逆相補鎖に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
【０３３１】
本明細書で使用される、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後ポリペプチドを発現することができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれ以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要な適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画にトランスロケーションされ得るような位置および配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合させたその３´および５´末端を有し、例えば、カセットは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される治療遺伝子の配列を含有する。カセットを除去し、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入することができる。
【０３３２】
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用されるとき、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で企図される、阻害性ポリヌクレオチドの転写のための鋳型として機能するポリペプチドまたは融合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【０３３３】
さらに、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で企図されるポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなる天然遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性しか有しない。それにもかかわらず、コドン使用における相違により変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態において具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の突然変異の結果として改変される内在性ポリヌクレオチド配列である。
【０３３４】
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ドナー修復鋳型を含む。
【０３３５】
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０３３６】
一実施形態において、阻害性ＲＮＡを含むドナー修復鋳型は、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構成的なｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトもしくはマウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構成的なｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。
【０３３７】
コード配列それ自体の長さに関わらず、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるまたは当該技術分野で既知であるように、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、ならびに自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動し得る。したがって、ほぼ全ての長さのポリヌクレオチド断片を採用することができ、合計の長さは、好ましくは調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける使用によって制限されることが特定の実施形態で企図される。
【０３３８】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知であり利用可能である様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および／または送達することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入することができる。所望のポリペプチドは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞に送達することによっても発現させることができる。
【０３３９】
ベクターの実例としては、プラスミド、自律的に複製する配列、および転位性要素、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４０】
ベクターの追加の実例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４１】
ベクターとして有用なウイルスの実例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４２】
発現ベクターの実例としては、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションすることができる。
【０３４３】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソーム性ベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用されるとき、「エピソーム性」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなく、また宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外でまたはエピソームとして複製することも意味する。
【０３４４】
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、翻訳後調節要素、ポリアデニル化配列、５´および３´非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素を使用することができる。
【０３４５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない、ベクターを含む。ベクターは、１つ以上の外因性、内在性、または異種制御配列、例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。「内在性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作された細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。「合成」制御配列は、もう１つの内在性および／もしくは外因性配列、ならびに／または特定の療法のための最適なプロモーターおよび／またはエンハンサー活性を提供することがインビトロもしくはインシリコで決定された配列の要素を含んでもよい。
【０３４６】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞中で作動性であるプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域、および／または転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列であるＣＮＣＡＡＴ領域を含み、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであってよい。
【０３４７】
「エンハンサー」という用語は、転写の増強をもたらすことができる配列を含有し、いくつかの場合には別の制御配列に対するその方向とは独立して機能することができるＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０３４８】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、および／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現制御配列により、第２の配列に対応する核酸の転写が指向される機能的連結を指す。
【０３４９】
本明細書で使用されるとき、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよく、あるいは多様性が制限された細胞および組織型における発現をそれぞれ可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０３５０】
特定の実施形態での使用に好適な例示的な遍在発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−短）プロモーター、長伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−長）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、陰性制御領域の欠失した、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位が置換された（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５１】
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、または組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階で発現させるために）、細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
【０３５２】
本明細書で使用される、「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが挙げられるが、これらに限定されない、任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大もしくは減少を引き起こす処理もしくは条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
【０３５３】
誘導性プロモーター／系の実例としては、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５４】
条件発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的に、２つの）部位（複数可）を含む。本明細書で使用されるとき、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であってよい、１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）が関与する組換え反応に関与する切除的または統合的なタンパク質、酵素、補因子、もしくは関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはそれらの断片を含む融合タンパク質）、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態での使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５５】
ポリヌクレオチドは、多種多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組込みのために必要な任意の部位（複数可）とは別であることが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
【０３５６】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対コア配列と隣接した２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の代表的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓら、１９９６、ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、１９９７）、ｌｏｘ５１７１（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８）、ｌｏｘ２２７２（ＬｅｅおよびＳａｉｔｏ、１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒら、２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔら、１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５７】
ＦＬＰリコンビナーゼのための好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄら、１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（ＳｃｈｌａｋｅおよびＢｏｄｅ、１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆら、１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５８】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識される。φＣ３１  ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの付着部位に対して名づけられ、どちらも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性が高い不完全な逆方向反復を含有する（Ｇｒｏｔｈら、２０００）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）、それにより反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎら、２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉら、２００３）。故に、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義済みの遺伝子座に位置付け、次いでそれを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
【０３５９】
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復鋳型ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復鋳型ポリヌクレオチドは、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位に隣接する。
【０３６０】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離することができる。
【０３６１】
本明細書で使用されるとき、「内部リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＡＴＧなどの開始コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム進入を促進し、それにより、キャップに依存しない遺伝子の翻訳を導く要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販の脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）、およびＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。
【０３６２】
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０３６３】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、かつ所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号７６）であり、ここで、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０３６４】
異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素により、異種遺伝子の発現が増加する。転写終止シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される「ｐｏｌｙＡ部位」、「ｐｏｌｙＡ配列」、「ｐｏｌｙ（Ａ）部位」、または「ｐｏｌｙ（Ａ）配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリ（Ａ）尾部をコード配列の３’末端に付加することによってｍＲＮＡの安定性を促進し、その結果、転写効率の増加に寄与し得る。組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましく、これは、ポリ（Ａ）尾部を欠いている転写物が不安定であり、急速に分解されるためである。ベクターに使用され得るポリ（Ａ）シグナルの実例には、理想的なポリ（Ａ）配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知である別の好適な異種または内在性ポリ（Ａ）配列が挙げられる。
【０３６５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む細胞は、直接毒性および／または制御されていない増殖のリスクを低減するために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、特定の二量化の化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
【０３６６】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書で企図される遺伝子修飾細胞をインビボでの陰性選択に対して感受性にする、遺伝子セグメントを含む。「陰性選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として除去され得る注入された細胞を指す。陰性選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。陰性選択遺伝子は、当該技術分野で既知であり、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子、細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼを含むが、これらに限定されない。
【０３６７】
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾細胞は、インビトロで陰性選択可能な表現型の細胞の選択を可能にする陽性マーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。陽性選択可能なマーカーは、宿主細胞へ導入されたとき、その遺伝子を有する細胞の陽性選択を許容する優性表現型を発現する遺伝子であってもよい。この型の遺伝子は当該技術分野で既知であり、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【０３６８】
一実施形態において、陽性選択可能なマーカーおよび陰性選択可能な要素は、陰性選択可能な要素の消失が必ず陽性選択可能なマーカーの消失も伴うように連結される。特定の実施形態において、陽性および陰性選択可能なマーカーは、一方の消失が義務的に他方の消失をもたらすように、融合される。上記の所望の陽性選択特徴および陰性選択特徴の両方を付与するポリペプチドを発現産物として生じる融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの陽性選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの陰性選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドを生じる。優性の陽性選択可能なマーカーを陰性選択可能なマーカーと融合することから導出される二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用について記載する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公開も参照されたい。
【０３６９】
好ましい陽性選択可能なマーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい陰性選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態で企図される例示的な二機能性の選択可能な融合遺伝子としては、陽性選択可能なマーカーがｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、陰性選択可能なマーカーが、シトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択可能なマーカーに由来する遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７０】
特定の実施形態において、１つ以上のメホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、末端プロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、非ウイルス的方法およびウイルス的方法の両方によって、造血細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞に導入されてもよい。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復鋳型の送達は、同じ方法によってまたは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
【０３７１】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含んでもよいか、または宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＣＤ３４＋細胞に送達するために使用される。
【０３７２】
非ウイルスベクターの実例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７３】
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸共役体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７４】
特定の実施形態で企図される特定の実施形態における使用に好適なポリヌクレオチド送達系の実例としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体を標的とする、バクテリア由来の非生物ナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態で企図される。
【０３７５】
特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターを、細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など）にエクスビボで送達するか、または万能ドナー造血幹細胞に送達し、続いて、患者に細胞を再移植することができる。
【０３７６】
一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型を含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸のＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、分子を血液または組織細胞と最大に接触させるために通常用いられる任意の経路により、これらの経路としては、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない。かかる核酸を投与する好適な方法は、当該技術分野において利用可能でかつ当業者に周知であり、１つを超える経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもさらに即時的かつさらに有効な反応を提供し得る場合が多い。
【０３７７】
本明細書で企図される特定の実施形態における使用に好適なウイルスベクター系の実例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７８】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中に、その細胞を１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で形質導入することによって、導入される。
【０３７９】
ＡＡＶは、小さくて（約２６ｎｍ）複製欠損の主にエピソーム性の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最低限でも、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５´および３´ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されたＩＴＲおよびカプシド配列を含む。
【０３８０】
一部の実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列は１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つに由来するカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ２に由来するカプシド配列を含む。
【０３８１】
一部の実施形態において、遺伝子操作法および選択法をＡＡＶカプシドに適用して、それらが目的となる細胞を形質導入する可能性を高めることができる。
【０３８２】
ｒＡＡＶベクターの構築、その産生および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、および同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８３】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中に、その細胞を１つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスで形質導入することによって、導入される。一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型は、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中に、その細胞をインテグラーゼ欠乏レンチウイルスで形質導入することによって、導入される。
【０３８４】
本明細書で使用されるとき、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖２本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有的に一体化させるＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に好適な例示的なレトロウイルスとしては、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ））およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８５】
本明細書で使用されるとき、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が、好ましい。
【０３８６】
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で論じられるように、１つ以上のＬＴＲ、および以下の補助要素：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、輸出要素、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意選択で、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体要素、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
【０３８７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、組込みまたは非組込みまたは組込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用されるとき、「組込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組込み能力のないウイルスベクターは、特許出願ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８８】
インテグラーゼ活性を低減するのに好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例示的な突然変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８９】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠乏ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、またはＥ１５２Ａ突然変異、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、およびＥ１５２Ｇ突然変異、またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、およびＥ１５２Ａ突然変異を含む。
【０３９０】
一実施形態において、ＨＩＶ−１  インテグラーゼ欠乏ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ突然変異を含む。
【０３９１】
「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、これは、その天然の配列の状況では、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含有する。
【０３９２】
本明細書で使用されるとき、「ＦＬＡＰ要素」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリン区域および中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴおよび／またはＣＴＳ要素に１つ以上の突然変異を有するＦＬＡＰ要素を含有する。また別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ要素またはＣＴＳ要素のいずれかを含む。また別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴ要素もＣＴＳ要素も含まない。
【０３９３】
本明細書で使用されるとき、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー［Ψ］配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０３９４】
「輸送要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ輸送要素の例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９５】
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意選択で転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増大する。様々な転写後調節要素、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同様のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）が、タンパク質における異種核酸の発現を増大させることができる。
【０３９６】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの修飾の結果としていくつかの安全性の増強を含む。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、例えば、１回目のウイルス複製を超えてウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として知られる右側（３´）のＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が修飾されている（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の増強は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆動するために、５´ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
【０３９７】
本明細書で使用される、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を保有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングすることができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）は通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化させるため、ＨＩＶがより多様な細胞を感染させることが可能になる。
【０３９８】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０３９９】
本明細書で企図されるある種の特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる源を用いることができるか、またはある特定のレンチウイルス配列における組み合わせられた多数の置換および改変を、移入ベクターが本明細書に記載の機能を行う能力を損なうことなく適応させ得ることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知である。Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）、Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを生成するために採用され得る。
【０４００】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中に、その細胞を１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで形質導入することによって、導入される。
【０４０１】
アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要しない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に生成することができる。大部分のアデノウイルスベクターを、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように遺伝子操作し、その後、複製欠損性ベクターを、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増殖させる。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、高い輸送能力を有する。
【０４０２】
複製欠損性である現行のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する２９３と呼ばれる特有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから可欠であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ、１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞を利用して、Ｅ１領域、Ｄ３領域、またはそれらの両方の領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ、１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ、１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ、１９９２）に使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注入（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）が含まれる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０４０３】
様々な実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中に、その細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で形質導入することによって、導入される。
【０４０４】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖２本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する、エンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子が欠損している。一実施形態において、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、複製欠損性である。大部分の複製欠損性ＨＳＶベクターは、１つ以上の最初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去して複製を防止するために、欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子が欠損していてもよい。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏期に入る能力、および最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡ挿入を受け入れることができるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶベースのベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３に記載されており、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４０５】
Ｈ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、異常ヘモグロビン症の治療のための向上した細胞ベースの治療法を提供する。いずれの特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、胎児グロビンスイッチングを取り入れて、異常ヘモグロビン症を治療するために、またいくつかの実施形態において可能性としてそれを治癒するために使用され得るより頑丈なゲノム編集された細胞の組成物を提供すると考えられる。
【０４０６】
特定の実施形態で企図されるゲノム編集された細胞は、自家／自律（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自家（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であってもよい。本明細書で使用される「自家」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される「自律」は、比較される細胞とは遺伝子的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される「同系」は、比較される細胞と遺伝子的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される「異種」は、比較される細胞とは異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、任意選択で非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。
【０４０７】
「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外基質を実質的に含まない、非自然発生細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾された細胞、遺伝子操作された細胞等を指す。
【０４０８】
本明細書で企図される組成物および方法を使用してゲノムを編集することができる細胞型の実例としては、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０９】
「幹細胞」という用語は、（１）長期の自己複製、または元の細胞の少なくとも１つの同一コピーを生成する能力、（２）複数の、また一部の場合には１つのみの特殊化した細胞型への単一細胞レベルにおける分化、および（３）インビボでの組織の機能的再生を行うことができる未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、その発生能に従って、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、および寡能性／単能性として亜分類される。「自己複製」は、改変されていない娘細胞を産生する特有の能力、および特殊化した細胞型（効力）を生成する特有の能力を有する細胞を指す。自己複製は２つの方法で達成され得る。非対称性細胞分裂手順により、親細胞と同一である娘細胞が１つ、親細胞とは異なる、前駆細胞または分化細胞である娘細胞が１つ得られる。対称性細胞分裂手順により、同一の娘細胞が２つ得られる。細胞の「増殖」または「拡大」は、対称に分裂している細胞を指す。
【０４１０】
本明細書で使用されるとき、「前駆」または「前駆細胞」は、細胞が自己複製する能力およびより成熟した細胞に分化する能力を有することを指す。多くの前駆細胞は、単一の系列に従って分化するが、極めて広範な増殖能を有してもよい。
【０４１１】
特定の実施形態において、細胞は、初代細胞である。本明細書で使用される「初代細胞」という用語は、組織から単離されており、インビトロまたはエクスビボでの成長のために確立されている細胞を指すように当該技術分野で知られている。対応する細胞は、集団倍加を、あったとしてもごくわずかしか受けていないので、連続細胞株と比較して、それらが由来する組織の主な機能的構成要素をよりよく代表するものであり、故に、インビボ状態に対するより代表的なモデルを表す。様々な組織から試料を得る方法および初代細胞株を確立する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７を参照されたい）。本明細書で企図される方法において使用するための初代細胞は、臍帯血、胎盤血、動員された末梢血、および骨髄に由来する。一実施形態において、初代細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である。
【０４１２】
一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、胚性幹細胞である。
【０４１３】
一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、成体幹細胞または前駆細胞である。
【０４１４】
一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、初代細胞である。
【０４１５】
好ましい実施形態において、ゲノム編集された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、赤血球細胞、または造血細胞を含む細胞集団である。
【０４１６】
本明細書で使用されるとき、「細胞の集団」は、本明細書の他の箇所に記載されるように、任意の数および／または組み合わせの同質細胞型または異質細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞の形質導入のために、臍帯血、胎盤血、骨髄、または動員された末梢血から細胞の集団を単離または取得することができる。細胞の集団は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の編集される標的細胞型を含み得る。ある特定の実施形態において、造血幹細胞または造血前駆細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して異質細胞の集団から単離または精製されてもよい。
【０４１７】
造血細胞を得るための例示的なソースとしては、臍帯血、骨髄、または動員された末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１８】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物の寿命にわたって成熟血液細胞の全レパートリーを生成することができ、それに深く関与する造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生じる。「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、および当該技術分野で既知の他のもの（Ｆｅｉ，Ｒ．ら、米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅら、米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．ら、米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏら、米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、米国特許第５，７１６，８２７号）を含む生物の全ての血液細胞型を生じる、多能性幹細胞を指す。造血幹細胞および造血前駆細胞は、致死的な放射線を浴びた動物またはヒトに移植された場合、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、およびリンパ球造血細胞プールを再ポピュレートすることができる。
【０４１９】
本明細書で企図される方法および組成物と共に使用するのに好適な造血幹細胞または造血前駆細胞の追加の実例としては、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−である造血細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／−、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）である造血細胞、ならびにＣＤ１３３＋である造血細胞が挙げられる。
【０４２０】
好ましい実施形態において、ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋である造血細胞。
【０４２１】
好ましい実施形態において、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋である造血細胞。
【０４２２】
好ましい実施形態において、ＣＤ１３３＋ＣＤ９０＋ＣＤ３４＋である造血細胞。
【０４２３】
造血階層制の特性評価を行うために、様々な方法が存在する。１つの特性評価の方法は、ＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、遺伝子が染色体１（マウス）の単一遺伝子座に主に縦列で位置し、全て免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、もともとはＴ細胞刺激に関与すると考えられている１０個超の分子の群である。このファミリーには、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などが含まれ、ＣＤ１５０は、創始メンバーであるため、ｓｌａｍＦ１、すなわち、ＳＬＡＭファミリーメンバー１とも称される。造血階層制についての特徴的なＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）−ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−；多能性前駆細胞（ＭＰＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ２４４＋；系列制限された前駆細胞（ＬＲＰ）−ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＣＤ２４４＋；共通骨髄性前駆細胞（ＣＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｍｉｄ；顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４＋ＣＤ１６／３２ｈｉ；および巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）−ｌｉｎ−ＳＣＡ−１−ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ３４−ＣＤ１６／３２ｌｏｗである。
【０４２４】
本明細書で企図される組成物および方法を用いて編集される好ましい標的細胞型としては、造血細胞、好ましくはヒト造血細胞、より好ましくはヒト造血幹細胞および造血前駆細胞、ならびにさらにより好ましくはＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞が挙げられる。本明細書で使用される「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、ＣＤ３４タンパク質を細胞表面で発現している細胞を指す。本明細書で使用される「ＣＤ３４」は、細胞間接着因子として作用することが多い細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞と造血前駆細胞との両方の細胞表面マーカーである。
【０４２５】
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ２４４−細胞である。
【０４２６】
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞である。
【０４２７】
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１３３＋細胞である。
【０４２８】
一実施形態において、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
【０４２９】
特定の実施形態において、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞の集団は、編集されたＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含み、この編集は、ＮＨＥＪによるＤＳＢの修復である。編集は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位における編集であってもよい。
【０４３０】
特定の実施形態において、造血幹細胞および造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞の集団は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）における、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、またはそれ以上のヌクレオチドの挿入または欠失（ＩＮＤＥＬ）を含む、編集されたＢＣＬ１１Ａ遺伝子を含み、これにより、ＢＣＬ１１Ａ発現を減少させるか、低下させるか、または除去する。
【０４３１】
一実施形態において、編集は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサー、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）における、１個のヌクレオチドの挿入、または約１、２、３、もしくは４個のヌクレオチドの欠失であり、これにより、ＢＣＬ１１Ａ発現を減少させるか、低下させるか、または除去する。
【０４３２】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、赤血球細胞を含む。
【０４３３】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、β−グロビン遺伝子中の１つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、主題のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択される。
【０４３４】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、サラセミアを生じるβ−グロビン遺伝子中の１つ以上の１つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、サラセミアはα−サラセミアである。一実施形態において、サラセミアはβ−サラセミアである。一実施形態において、主題のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋からなる群から選択される。
【０４３５】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、鎌状赤血球症を生じるβ−グロビン遺伝子中の１つ以上の１つ以上の突然変異を含む。一実施形態において、主題のβ−グロビン対立遺伝子は、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択される。
【０４３６】
Ｉ．組成物および製剤
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、これらを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞の組成物を含んでもよい。特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団におけるヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物を使用して、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞中のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集する。
【０４３７】
様々な実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択で末端プロセシング酵素、例えば、３´−５´エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ヌクレアーゼバリアントは、上で開示したポリヌクレオチド送達方法、例えば、エレクトロポレーション、脂質ナノ粒子などを介して細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡと、任意選択で３´−５´エキソヌクレアーゼとを含む組成物は、上で開示したポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入される。本組成物は、ゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団をエラープローンＮＨＥＪによって生成するために使用され得る。
【０４３８】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、末端プロセシング酵素、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。ヌクレアーゼバリアントおよび／または末端プロセシング酵素は、上で開示したポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。
【０４３９】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、３´−５´エキソヌクレアーゼ、および任意選択でドナー修復鋳型を含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および／または３´−５´エキソヌクレアーゼは、上で開示したポリヌクレオチド送達方法を介して細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。
【０４４０】
特定の実施形態において、細胞の集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ１３３＋細胞、およびＣＤ３４＋細胞を含むがこれらに限定されない、遺伝子修飾された造血細胞を含む。
【０４４１】
組成物としては、薬学的組成物が挙げられるが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の１つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液中に製剤化される組成物を指す。必要に応じて、組成物は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤とも組み合わせて投与され得ることも理解されよう。組成物に含めることができる他の構成成分に対する限定は、追加の薬剤が組成物に悪影響を及ぼさないのであれば、実質的に存在しない。
【０４４２】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、炎症、アレルギー反応、または妥当な利益／リスク比に釣り合った他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に好適である、化合物、物質、組成物、および／または剤形を指すように本明細書で使用される。
【０４４３】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療用細胞が共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の実例は、滅菌液、例えば、細胞培地、水、および油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などといった、石油、動物、植物、または合成起源の油であり得る。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射用溶液のための液体担体として用いることができる。特定の実施形態において好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロール、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、ピロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。任意の従来の培地または薬剤が活性成分と互換性でない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０４４４】
一実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、心室内、髄腔内、またはくも膜下投与に好適である。薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液、細胞培地、または分散液を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる培地および薬剤の使用は当該技術分野で周知である。任意の従来の培地または薬剤が形質導入細胞と互換性でない場合を除き、薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【０４４５】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、遺伝子修飾された造血幹細胞および／または造血前駆細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む。本明細書で企図される細胞ベースの組成物を含む組成物は、所望の治療目標を達成するために、腸内もしくは非経口投与方法によって別々に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。
【０４４６】
薬学的に許容される担体は、本担体を治療されるヒト対象に投与するのに好適とするのために十分に純度が高く、かつ十分に毒性が低い必要がある。担体はさらに、組成物の安定性を維持するかまたは増大させるべきである。薬学的に許容される担体は、液体であっても固体であってもよく、計画されている投与様式を考慮して、組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望の嵩、密度などを提供するように選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、非限定的に、結合剤（例えば、事前ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得る。本明細書で企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体としては、水、食塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４７】
かかる担体溶液は、緩衝液、希釈液、および他の好適な添加剤も含有し得る。本明細書で使用される「緩衝液」という用語は、化学組成により、ｐＨの著しい変化を伴わずに酸または塩基が中和される、溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝液の例としては、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、水中５％のデキストロース（Ｄ５Ｗ）、通常の食塩水／生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４８】
薬学的に許容される担体は、組成物のｐＨを約７に維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、組成物は、ｐＨが、約６．８〜約７．４の範囲、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４である。また別の実施形態において、組成物は、ｐＨが約７．４である。
【０４４９】
本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容される培地を含んでもよい。組成物は懸濁液であってもよい。本明細書で使用される「懸濁液」という用語は、細胞が固体支持体に付着しない非接着性条件を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌されるかまたはかき混ぜられてもよく、培養皿などの支持体に接着しない。
【０４５０】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、ここでは、ゲノム編集された造血幹細胞および／または造血前駆細胞が、点滴（ＩＶ）袋または同様のものの中で、許容される液体培地または溶液、例えば、食塩水または無血清培地に分散される。許容される希釈剤としては、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム（食塩水）溶液、無血清細胞培地、および極低温貯蔵に好適な培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５１】
ある特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集された細胞、例えば、造血幹細胞および造血前駆細胞の集団を含む組成物の貯蔵に好適である。治療用組成物は、ヒト患者への投与が意図されるため、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
【０４５２】
一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培地で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培地は、無血清培地である。
【０４５３】
無血清培地は、血清含有培地と比較して、簡易化されより良好に定義された組成物、低減された度合いの汚染物質、可能性のある病原体源の排除、およびより低い費用を含むいくらかの利点を有する。様々な実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、任意選択でタンパク質を含まない場合がある。任意選択で、培地は、生物薬学的に許容される組換えタンパク質を含有てもよい。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質を置き換え、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
【０４５４】
特定の組成物中で使用される無血清培地の実例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ  １０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５５】
好ましい実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中で製剤化される。
【０４５６】
様々な実施形態において、造血幹細胞および／または造血前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地は、解凍後に、高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物中で使用される凍結保存培地の実例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５７】
一実施形態において、組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  ＡとＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０とを５０：５０で含む溶液中で製剤化される。
【０４５８】
特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、および微生物汚染を実質的に含まない。エンドトキシンについて「実質的に含まない」とは、細胞の用量あたりのエンドトキシンが、生物製剤についてＦＤＡによって許可されているものよりも少ないことを意味し、この許可されているエンドトキシンは、１日あたり体重１ｋｇあたり５ＥＵの合計エンドトキシンであり、平均的な７０ｋｇの人の場合、細胞の合計用量あたり３５０ＥＵとなる。特定の実施形態において、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入した造血幹細胞または造血前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、もしくは５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。
【０４５９】
ある特定の実施形態において、１つ以上の再プログラムされたヌクレアーゼをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、および任意選択で末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤が企図される。
【０４６０】
エクスビボ送達のための例示的な製剤は、当該技術分野で既知である様々なトランスフェクション剤、例えば、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショック、および様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）の使用も含み得る。以下でさらに詳述するリポソームは、少量の水性流体を封入する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外表面に自発的に会合し（その電荷を理由とする）、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用することになる。
【０４６１】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の製剤は、当業者に周知であり、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、心室内、脳内、頭蓋内、髄腔内、くも膜下、骨髄内の投与および製剤を含む、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載の特定の組成物を使用するために好適な投薬および治療レジメンの開発も同様である。本明細書で企図される特定の実施形態には、他の製剤、例えば、薬学分野で周知のもの、および例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ．２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載されているものが含まれ得ることが、当業者には理解される。
【０４６２】
Ｊ．ゲノム編集された細胞による療法
特定の実施形態で企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、異常ヘモグロビン症の予防、治療、および改善、または異常ヘモグロビン症、もしくはβ−グロビン遺伝子中の異常ヘモグロビン症性突然変異を有する対象と関連付けられる少なくとも１つの症状の予防、治療、もしくは改善に使用するための向上した薬物製品を提供する。本明細書で使用されるとき、「薬物製品」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して製造された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、この薬物製品は、遺伝子修飾された造血幹細胞または造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む。遺伝子修飾された造血幹細胞または造血前駆細胞により、γ−グロビン遺伝子発現が増加した成熟赤血球細胞が得られ、インビボでのγ−グロビン遺伝子の発現がほとんどまたは全くない対象の治療が可能となるため、ゲノム編集された細胞による療法を、これまではこの種の治療が実行可能な治療選択肢ではなかった対象に届ける機会が大幅に拡大される。
【０４６３】
特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーが非機能的であるかもしくは撹乱されているか、除去されているか、または欠失しているため、赤血球細胞中の機能的ＢＣＬ１１Ａ発現、例えば、不十分なＢＣＬ１１Ａ発現を低減または排除して、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化し、それにより赤血球細胞中のγ−グロビン遺伝子発現を増加させる。
【０４６４】
特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位、好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位、より好ましくはＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位、さらにより好ましくは配列番号２５に示される標的部位（その補体はコンセンサスＧＡＴＡ−１モチーフＷＧＡＴＡＲを含む）が非機能的であるかもしくは撹乱されているか、除去されているか、または欠失しているため、赤血球細胞中の機能的ＢＣＬ１１Ａ発現を低減または排除し、その結果、赤血球細胞中のγ−グロビン遺伝子発現を増加させる。
【０４６５】
特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞は、単一遺伝子疾患、障害、もしくは状態、または造血系の疾患、障害、もしくは状態、例えば、異常ヘモグロビン症を有すると診断されたかまたはそれが疑われる対象に、根治的、予防的、または緩和的療法を提供する。
【０４６６】
本明細書で使用されるとき、「造血」は、前駆細胞からの血液細胞の形成および発達、ならびに幹細胞からの前駆細胞の形成を指す。血液細胞としては、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）または赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ（ＲＢＣ））、網状赤血球、単球、好中球、巨核球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞、血小板、および白血球が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６７】
本明細書で使用されるとき、「異常ヘモグロビン症」または「異常ヘモグロビン症病態」という用語は、ヘモグロビンの構造および／または合成の変化に起因する異常なヘモグロビン分子の存在が関与する遺伝性血液障害の多様な群を指す。通常、ヘモグロビンは、β−グロビンの２つのサブユニットとα−グロビンの２つのサブユニットとの４つのタンパク質サブユニットからなる。これらのタンパク質サブユニットの各々は、ヘムと称される鉄含有分子に付着（結合）し、各ヘムは、中心に、１つの酸素分子に結合することができる鉄分子を含有する。赤血球内のヘモグロビンは、肺中で酸素原子に結合する。その後、これらの細胞は、血流に乗って移動し、酸素を身体全体の組織に送達する。
【０４６８】
ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）は、出生後に存在する正常なヘモグロビンの呼称である。ヘモグロビンＡは、２本のアルファ鎖および２本のベータ鎖（α２β２）を有する四量体である。ヘモグロビンＡ２は、出生後に赤血球に見い出されるヘモグロビンの微量成分であり、２本のアルファ鎖および２本のデルタ鎖（α２δ２）からなる。ヘモグロビンＡ２は、一般に、全赤血球ヘモグロビンの３％未満を構成する。ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）は、胎児発達中に主要なヘモグロビンである。この分子は、２本のアルファ鎖および２本のガンマ鎖（α２γ２）の四量体である。好ましい実施形態において、対象は、γ−グロビン遺伝子発現が増加し、かつ／または異常ヘモグロビン症性β−グロビン遺伝子発現が減少し、それにより対象のＨｂＦの量を増加させる赤血球細胞を生む、ゲノム編集された造血幹細胞または造血前駆細胞の投与を受ける。
【０４６９】
最も一般的な異常ヘモグロビン症としては、鎌状赤血球症、β−サラセミア、およびα−サラセミアが挙げられる。
【０４７０】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物および方法は、鎌状赤血球症を有する対象のためのゲノム編集された細胞による療法を提供する。「鎌状赤血球貧血」または「鎌状赤血球症」という用語は、赤血球細胞の鎌状化に起因する任意の症候性貧血状態を含むように、本明細書では定義される。鎌状赤血球症（ＳＣＤ）の一般的な形態である鎌状赤血球貧血βＳ／βＳは、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）によって生じる。ＨｂＳは、Ｇｌｕ６ＶａｌまたはＥ６Ｖと記される、β−グロビン中の６位でグルタミン酸（Ｅ）がバリン（Ｖ）で置き換えられることによって生成される。グルタミン酸がバリンで置き換えられることで、異常なＨｂＳサブユニットが互いに繋がりあうようになり、赤血球を鎌状（三日月状）の形状に曲げる長い剛性の分子を形成する。鎌状赤血球は未熟な段階で死滅し、これにより赤血球不足（貧血）が生じ得る。加えて、鎌状赤血球は、剛性であり、微小血管を閉塞させて、激しい痛みおよび臓器障害を引き起こし得る。
【０４７１】
β−グロビン遺伝子中のさらなる突然変異により、他の種類の鎌状赤血球症につながるβ−グロビン中の他の異常も生じ得る。これらのβ−グロビンの異常型は、アルファベットの文字またはときには名称で指定されることが多い。これらの鎌状赤血球症の他の種類において、一方のβ−グロビンサブユニットは、ＨｂＳで置き換えられ、他方のβ−グロビンサブユニットは、異なる異常なバリアント、例えば、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ；βＣと記されるβ−グロビン対立遺伝子）またはヘモグロビンＥ（ＨｂＥ；βＥと記されるβ−グロビン対立遺伝子）で置き換えられる。
【０４７２】
ヘモグロビンＳＣ（ＨｂＳＣ）疾患では、β−グロビンサブユニットは、ＨｂＳおよびＨｂＣで置き換えられる。ＨｂＣは、β−グロビン遺伝子中の突然変異から生じ、ＨｂＣ疾患（α２βＣ２）を有する人々において見い出される主要なヘモグロビンである。ＨｂＣは、アミノ酸のリジンがアミノ酸のグルタミン酸をβ−グロビン中の６位で置き換えるときに生じ、これは、Ｇｌｕ６ＬｙｓまたはＥ６Ｋと記される。ＨｂＣ疾患は、比較的良性であり、軽度の溶血性貧血および脾腫を生じさせる。ＨｂＳＣ疾患の重症度は様々であるが、鎌状赤血球貧血と同程度に重症となり得る。
【０４７３】
ＨｂＥは、アミノ酸のグルタミン酸がアミノ酸のリジンをβ−グロビン中の２６位で置き換えるときに生じ、これは、Ｇｌｕ２６ＬｙｓまたはＥ２６Ｋと記される。ＨｂＥ疾患を有する人々は、．軽度の溶血性貧血および軽度の脾腫を有する。ＨｂＥは、東南アジアで極めて一般的であり、一部の地域では頻度がヘモグロビンＡと同等である。一部の事例では、ＨｂＥ突然変異はＨｂＳで存在する。これらの場合、人は、疼痛、貧血、および脾臓機能異常の発生など、鎌状赤血球貧血と関連付けられるより重症の兆候および症状を有し得る。
【０４７４】
ヘモグロビン鎌状−β−サラセミア（ＨｂＳＢｅｔａＴｈａｌ）として知られる他の状態は、ヘモグロビンＳを産生する突然変異とβ−サラセミアを産生する突然変異とが共に発生するときに生じる。鎌状赤血球症をベータ−ゼロ（β０；β−グロビン産生を防ぐ遺伝子突然変異）サラセミアと組み合わせる突然変異が重症の疾患をもたらす一方、ベータ−プラス（β＋；β−グロビン産生）サラセミアと組み合わさった鎌状赤血球症はより軽症である。
【０４７５】
本明細書で使用されるとき、「サラセミア」は、ヘモグロビンの産生不全を特徴とする遺伝病を指す。サラセミアの例としては、α−サラセミアおよびβ−サラセミアが挙げられる。
【０４７６】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物および方法は、β−サラセミアを有する対象のためのゲノム編集された細胞による療法を提供する。β−サラセミアは、β−グロビン鎖における突然変異によって引き起こされ、重症型または軽症型で生じ得る。β−グロビン遺伝子中の４００個近い突然変異が、β−サラセミアを引き起こすものとして見い出されている。これらの突然変異の大部分は、β−グロビン遺伝子内またはその付近で単一ＤＮＡ構成単位（ヌクレオチド）の変化を伴う。他の突然変異は、β−グロビン遺伝子中の少数のヌクレオチドの挿入または欠失を行う。上述のように、β−グロビン産生を減少させるβ−グロビン遺伝子突然変異により、ベータ−プラス（β＋）サラセミアと称される種類の状態が生じる。細胞によるあらゆるベータ−グロビンの産生を防ぐ突然変異により、ベータ−ゼロ（β０）サラセミアが生じる。β−サラセミアの重症型では、小児は、出生時には正常であるが、生後１年の間に貧血を発症する。β−サラセミアの軽症型は、小さな赤血球を産生する。軽症型サラセミアは、片方の親のみから欠損遺伝子を受け継ぐ場合に生じる。この型の疾患を有する人々は、疾患のキャリアであり、通常は症状を有しない。
【０４７７】
ＨｂＥ／β−サラセミアは、ＨｂＥとβ−サラセミアとの組み合わせ（βＥ／β０、βＥ／β＋）から生じ、ＨｂＥの特徴またはβ−サラセミアの特徴のいずれかで見られる状態よりも重症の状態をもたらす。この障害は、中間型サラセミアの分類に入る中等症のサラセミアとして現れる。ＨｂＥ／β−サラセミアは、東南アジア出身の人々に最も一般的である。
【０４７８】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物および方法は、α−サラセミアを有する対象のためのゲノム編集された細胞による療法を提供する。α−サラセミアは、世界中でごく一般的な血液疾患である。Ｈｂ  Ｂａｒｔ症候群およびＨｂＨ疾患を有する乳児は、毎年何千人も出生しており、特に東南アジアで多い。α−サラセミアは、地中海諸国、北米、中東、インド、および中央アジアの人々においても頻繁に発生する。α−サラセミアは、典型的には、ＨＢＡ１遺伝子およびＨＢＡ２遺伝子が関与する欠失に起因する。これらの遺伝子の両方は、ヘモグロビンの構成要素（サブユニット）であるα−グロビンと称されるタンパク質を作製するための指示を与える。人間は、ＨＢＡ１遺伝子の２つのコピーとＨＢＡ２遺伝子の２つのコピーとを各細胞内に有する。異なる型のα−サラセミアは、ＨＢＡ１対立遺伝子およびＨＢＡ２対立遺伝子のいくつかまたは全ての喪失に起因する。
【０４７９】
α−サラセミアの最重症型であるＨｂ  Ｂａｒｔ症候群は、４つ全てのアルファ−グロビン対立遺伝子の喪失に起因する。ＨｂＨ疾患は、４つのα−グロビン対立遺伝子のうちの３つの喪失によって引き起こされる。これらの２つの状態では、α−グロビンの不足により、細胞による正常なヘモグロビンの作製が妨げられる。その代わりに、細胞は、ヘモグロビンＢａｒｔ（Ｈｂ  Ｂａｒｔ）またはヘモグロビンＨ（ＨｂＨ）と称される異常型のヘモグロビンを産生する。これらの異常ヘモグロビン分子は、酸素を身体の組織に効率的に運搬することができない。正常なヘモグロビンがＨｂ  ＢａｒｔまたはＨｂＨで置換されることで、貧血、およびα−サラセミアと関連付けられる他の深刻な健康問題が生じる。
【０４８０】
α−サラセミアの２つのさらなる変形は、α−グロビン量の低下に関係する。細胞は依然としていくらかの正常なヘモグロビンを産生するので、これらの変形は、ほとんどまたは全く健康問題を引き起こさない傾向にある。４つのα−グロビン対立遺伝子のうちの２つの喪失により、α−サラセミアの特徴が生じる。α−サラセミアの特徴を有する人々は、以上に小さく色の薄い赤血球および軽度の貧血を有し得る。１つのα−グロビン対立遺伝子の喪失が、α−サラセミア無症状キャリアにおいて見られる。これらの個体は、典型的には、サラセミアに関係する兆候または症状を有しない。
【０４８１】
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞による療法は、ヘモグロビンＣ疾患、ヘモグロビンＥ疾患、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、サラセミア、β−サラセミア、重症型サラセミア、中間型サラセミア、α−サラセミア、ヘモグロビンＢａｒｔ症候群、およびヘモグロビンＨ疾患からなる群から選択される異常ヘモグロビン症を治療、予防、または改善するために使用される。
【０４８２】
様々な実施形態において、ゲノム編集組成物は、インビボで、遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または臓器、例えば骨髄に直接注射することによって投与される。様々な他の実施形態において、細胞は、本明細書で企図される再プログラムされたヌクレアーゼによってインビトロまたはエクスビボで編集され、任意選択でエクスビボで増殖される。その後、ゲノム編集された細胞は、療法を必要とする対象に投与される。
【０４８３】
本明細書で企図されるゲノム編集方法において使用するのに好ましい細胞には、自家／自律（「自己」）細胞、好ましくは、造血細胞、より好ましくは造血幹細胞または造血前駆細胞、さらにより好ましくはＣＤ３４＋細胞が含まれる。
【０４８４】
本明細書で使用されるとき、「個体」および「対象」という用語は、交換可能に使用されることが多く、再プログラムされたヌクレアーゼ、ゲノム編集組成物、遺伝子療法用ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る異常ヘモグロビン症の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト対象が含まれる。典型的な対象には、異常ヘモグロビン症を有する、そうであると診断された、またはそれを有する危険性があるヒト患者が含まれる。
【０４８５】
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、再プログラムされたヌクレアーゼ、ゲノム編集組成物、遺伝子療法用ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法で治療され得る異常ヘモグロビン症と診断された対象を指す。
【０４８６】
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療すること」は、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の症状または病理に対する任意の有益なまたは望ましい効果を含み、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の症状の１つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療には、任意選択で、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の進行を遅延させることが関わり得る。「治療」は必ずしも、異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。
【０４８７】
本明細書で使用されるとき、「予防する」、および「予防」、「予防される」、「予防すること」などといった同様の語は、異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態の発生または再発の可能性を予防する、阻害する、または低減するための手法を指す。それはまた、異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の発症もしくは再発を遅延させること、または異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用されるとき、「予防」および同様の語は、異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の発症または再発前に異常ヘモグロビン症もしくは異常ヘモグロビン症病態の強度、影響、症状、および／または負荷を低減することも含む。
【０４８８】
本明細書で使用されるとき、「〜の少なくとも１つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療を受けている異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態、例えば、サラセミア、鎌状赤血球症などの１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療される異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態は、β−サラセミアであり、ここで、改善される１つ以上の症状としては、衰弱、疲労、血色不良、黄疸、顔面骨変形、成長遅延、腹部腫脹、暗色尿、鉄欠乏（輸血がない場合）、頻繁な輸血の必要が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、治療される異常ヘモグロビン症または異常ヘモグロビン症病態は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）であり、ここで、改善される１つ以上の症状としては、貧血；疼痛、例えば、腹部、胸部、骨、または関節の疼痛の原因不明の出現；手または足の腫脹；腹部腫脹；発熱；頻繁な感染；皮膚または爪床の血色不良；黄疸；成長遅延；視覚障害；脳卒中の兆候または症状；鉄欠乏（輸血がない場合）、頻繁な輸血の必要が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４８９】
本明細書で使用されるとき、「量」という用語は、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、臨床結果を含めて、有益なまたは所望の予防結果または治療結果を達成するための「有効量（ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
【０４９０】
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。必然的ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少ない。
【０４９１】
ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて異なり得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が、いずれの毒性効果または有害効果も上回るものでもある。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効である量を含む。治療的量が指示されるとき、特定の実施形態で企図される組成物の、投与されるべき精確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者（対象）の年齢、重量、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態における個体差を考慮して決定され得る。
【０４９２】
ゲノム編集された細胞は、骨髄切除療法を受けたまたは受けていない個体において骨髄または臍帯血移植の一部として投与されてもよい。一実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、化学的切除（ｃｈｅｍｏａｂｌａｔｉｖｅ）または放射線切除（ｒａｄｉｏａｂｌａｔｉｖｅ）骨髄療法を受けた個体に骨髄移植において投与される。
【０４９３】
一実施形態において、ある用量のゲノム編集された細胞が対象に静脈内送達される。好ましい実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞が対象に静脈内投与される。
【０４９４】
１つの例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、全ての介在する細胞の用量を含んで、少なくとも２×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６細胞／ｋｇ、もしくは少なくとも１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。
【０４９５】
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、全ての介在する細胞の用量を含んで、約２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。
【０４９６】
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、全ての介在する細胞の用量を含んで、約２×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、３×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、４×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約６×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約７×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇ、または６×１０６細胞／ｋｇ〜約８×１０６細胞／ｋｇである。
【０４９７】
いくらかの用量変動が治療される対象の状態に応じて生じるのは必然であろう。投与担当者は、いずれにしても、個々の対象に適した用量を決定することになる。
【０４９８】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、異常ヘモグロビン症またはそれと関連付けられる状態の治療、予防、または改善するために使用され、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＥ／βＥ、βＣ／β＋、βＥ／β＋、β０／β＋、β＋／β＋、βＣ／βＣ、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象に、治療有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、赤血球細胞における機能的ＢＣＬ１１Ａ発現を欠き、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化するのに十分なＢＣＬ１１Ａ発現に対する能力を欠く。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位に突然変異が導入されている。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位（配列番号２４）に突然変異が導入されている。
【０４９９】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞による療法は、サラセミアまたはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用される。本明細書で企図されるゲノム編集された細胞によって治療可能なサラセミアとしては、α−サラセミアおよびβ−サラセミアが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、β−サラセミアまたはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用され、βＥ／β０、βＣ／β０、β０／β０、βＣ／βＣ、βＥ／βＥ、βＥ／β＋、βＣ／βＥ、βＣ／β＋、β０／β＋、またはβ＋／β＋からなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象に、治療有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、赤血球細胞における機能的ＢＣＬ１１Ａ発現を欠き、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化するのに十分なＢＣＬ１１Ａ発現に対する能力を欠く。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位に突然変異が導入されている。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位（配列番号２４）に突然変異が導入されている。
【０５００】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞による療法は、鎌状赤血球症またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用される。特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、鎌状赤血球症またはそれと関連付けられる状態を治療、予防、または改善するために使用され、βＥ／βＳ、β０／βＳ、βＣ／βＳ、β＋／βＳ、またはβＳ／βＳからなる群から選択されるβ−グロビン遺伝子型を有する対象に、治療有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む。一実施形態において、ゲノム編集された細胞による療法は、赤血球細胞における機能的ＢＣＬ１１Ａ発現を欠き、例えば、γ−グロビン遺伝子転写を抑圧または抑制し、β−グロビン遺伝子転写を転写活性化するのに十分なＢＣＬ１１Ａ発現に対する能力を欠く。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１結合部位に突然変異が導入されている。一実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の第２のイントロン中のコンセンサスＧＡＴＡ−１結合部位（配列番号２４）に突然変異が導入されている。
【０５０１】
様々な実施形態において、対象は、対象におけるγ−グロビンの発現を増加させるのに有効な、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むある量のゲノム編集された細胞の投与を受ける。特定の実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むゲノム編集された細胞におけるγ−グロビン遺伝子発現の量は、ゲノム編集を受けていない細胞におけるγ−グロビン遺伝子発現と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、もしくは少なくとも約１０００倍、またはそれ以上増加する。
【０５０２】
様々な実施形態において、対象は、対象におけるＨｂＦのレベルを増加させるのに有効な、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むある量のゲノム編集された細胞の投与を受ける。特定の実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中の赤血球特異的エンハンサーへの突然変異を含むゲノム編集された細胞におけるＨｂＦの量は、ゲノム編集を受けていない細胞におけるＨｂＦの量と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、もしくは少なくとも約１０００倍、またはそれ以上増加する。
【０５０３】
当業者であれば、通常の方法を使用して、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を含む有効量の組成物の適切な投与経路および適正な投薬を決定することができる。また、ある特定の療法において、療法が効果をもたらすには、本明細書で企図される薬学的組成物の複数回投与が必要とされ得ることを認識することは、当業者であれば分かるはずである。
【０５０４】
ゲノム編集された造血幹細胞および造血前駆細胞による療法を用いた治療に適している対象を治療するために使用される主な方法のうちの１つは、輸血である。このため、本明細書で企図される組成物および方法の最大の目標のうちの１つは、輸血の回数を減少させるか、または輸血の必要を排除することである。
【０５０５】
特定の実施形態において、本薬物製品は１回投与される。
【０５０６】
ある特定の実施形態において、本薬物製品は、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上かけて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回、またはそれ以上投与される。
【０５０７】
本明細書において引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個々の刊行物、特許出願、または発行特許のそれぞれが参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５０８】
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および例示によりある程度詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変更および修正を行ってもよいことが、当業者には容易に明らかとなろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定するものではない。本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る種々の重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
【実施例】
【０５０９】
実施例１
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子における赤血球エンハンサー中の非標準的Ｉ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ標的部位の特定
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中に存在するコアＧＡＴＡ−１モチーフ（ＣＴＧｎｎｎｎｎｎｎＷＧＡＴＡＲ；配列番号２４参照；図１）は、標準的Ｉ−ＯｎｕＩ「セントラル４」切断性モチーフ：ＡＴＴＣ、ＴＴＴＣ、ＡＴＡＣ、ＡＴＡＴ、ＴＴＡＣ、およびＡＴＴＴを含まない。
【０５１０】
驚くべきことに、発明者らは、Ｉ−ＯｎｕＩが、ＧＡＴＡ−１モチーフを標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬの開発に好適な出発足場であることを見い出した。標的部位「ＴＴＡＴ」（配列番号２５参照）を選択し、これは、その逆相補体「ＡＴＡＡ」がＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のコアＧＡＴＡ−１モチーフ（配列番号２４参照）に存在するためである。標準的Ｉ−ＯｎｕＩ切断部位ではないものの、「ＴＴＡＴ」は、野生型Ｉ−ＳｍａＭＩ  ＬＨＥ（Ｉ−ＯｎｕＩと約４５％同一）のためのセントラル４配列（配列番号３０）である。図２Ａ。
【０５１１】
加えて、ＣＣＲ５遺伝子を標的とするＩ−ＯｎｕＩバリアントＨＥ（配列番号３１）のセントラル４特異性を、ハイスループット酵母表層提示インビトロエンドヌクレアーゼアッセイを使用してプロファイリングした（Ｊａｒｊｏｕｒ，Ｗｅｓｔ−Ｆｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＣＣＲ５を標的とするＨＥ（配列番号３２）をコードするプラスミドを、表層提示のためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換した後、「ＴＴＡＴ」を含む２５６個の可能性のあるセントラル４配列の各々を含有するＣＣＲ５標的部位ＤＮＡ配列（配列番号３３）を含む、ＰＣＲによって生成した二本鎖ＤＮＡ基質に対する切断活性について試験した。特異性プロファイルにより、再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩが、非標準的「ＴＴＡＴ」セントラル４配列を含む標的部位を切断できることが示された。図２Ｂ。
【０５１２】
Ｉ−ＯｎｕＩを、ＢＣＬ１１Ａ中のＧＡＴＡ−１モチーフを標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬの開発のための出発骨格として選択した。
【０５１３】
実施例２
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフを標的とさせるためのＩ−ＯｎｕＩの再プログラム
ＤＮＡ認識インターフェース中に可変のアミノ酸残基を含有するモジュールライブラリを構築することによって、Ｉ−ＯｎｕＩを、ＢＣＬＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフを標的とするように再プログラムした。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して、縮重コドンをＩ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ結合ドメインに組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ鋳型として使用して、酵母株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、Ｎ末端またはＣ末端いずれかのＩ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ認識ドメインにおよび、約１０７〜１０８個の固有の形質転換体を含有した。結果として得られた表層提示ライブラリを、対応するドメインの「半部位」を含む標的部位（配列番号２８〜２９）に対する切断活性について、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。．図３。
【０５１４】
Ｎ末端およびＣ末端ドメインを再プログラムしたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥを提示する酵母を生成し、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を行って、再プログラムされたドメインを増幅させ、これを続いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換し、再プログラムされたドメインの組合わせのライブラリを創出した。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフに存在する標的部位（配列番号２５）全体を認識する完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩバリアントをこのライブラリから特定し、精製した。
【０５１５】
実施例３
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフを効率的に標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼ
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフを標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥの活性を、染色体に組み込まれた蛍光レポーター系を使用して測定した（Ｃｅｒｔｏら、２０１１）。ＢＣＬ１１Ａ標的配列に結合してそれを切断する完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥを哺乳動物発現プラスミドにクローニングした後、個別にトランスフェクションを行って、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするアウトオブフレーム遺伝子の上流でＢＣＬ１１Ａ標的配列を含有するように再プログラムしたＨＥＫ  ２９３Ｔ線維芽細胞株にした。ＨＥによる埋め込まれた標的部位の切断、および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介したＤＮＡ修復によって生じる小さな挿入または欠失の後続の蓄積により、３つの修復された遺伝子座のうち約１つが蛍光レポーター遺伝子を「インフレーム」に戻す。このため、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、染色体に埋め込まれた標的配列でのエンドヌクレアーゼ活性の読出しである。ＢＣＬ１１Ａ標的部位に結合してそれを切断する完全に再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥは、遺伝子染色体の背景においてｍＣｈｅｒｒｙ発現の中等度の効率を示した。図４Ａ。
【０５１６】
第２のＩ−ＯｎｕＩバリアントライブラリを、最初のレポータースクリーニングで特定したＢＣＬ１１Ａ標的部位（ＢＣＬ１１．Ａ．Ｂ４、配列番号６）を標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥのうちの１つのランダム突然変異誘発を行うことによって生成した。加えて、触媒効率が向上したバリアントを単離する目的で、提示ベースのフローソーティングを、よりストリンジェントな切断条件下（ｐＨを７．２に調整）で行った。図４Ｂ。このプロセスにより、親Ｉ−ＯｎｕＩバリアントと比較してＤＮＡ認識インターフェースに２つのアミノ酸突然変異を含有し、親Ｉ−ＯｎｕＩバリアントよりも約３倍高い率のｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞を有するＩ−ＯｎｕＩバリアントであるＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３（配列番号７）が特定された。図４Ｃ。図５は、代表的なＩ−ＯｎｕＩの相対的アライメント、およびＤＮＡ認識インターフェースを含む残基の位置情報を示す。
【０５１７】
第３のＩ−ＯｎｕＩバリアントライブラリを、２次スクリーニングで特定したＢＣＬ１１Ａ標的部位（ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３、配列番号７）を標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥのうちの１つのランダム突然変異誘発を行うことによって生成した。加えて、結合特性が向上したバリアントを単離するために、提示ベースのフローソーティングを、よりストリンジェントな親和性条件下（５０ｐＭ）で行った。このプロセスにより、以下のＩ−ＯｎｕＩバリアントが特定された：ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｃ７（配列番号８）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｅ３（配列番号９）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｂ６（配列番号１０）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｈ４（配列番号１１）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｂ１２（配列番号１２）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ａ７（配列番号１３）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｃ２（配列番号１４）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｇ８（配列番号１５）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ａ１（配列番号１６）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ａ５（配列番号１７）、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｂ６．２（配列番号１８）、およびＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３．Ｂ７（配列番号１９）。
【０５１８】
実施例４
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフを効率的に標的とする再プログラムされたＩ−ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼの親和性および特異性
Ｉ−ＯｎｕＩバリアントＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３のＤＮＡ結合親和性および切断特異性を特性評価した。再プログラム中に特定されたＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３バリアントをコードするプラスミド（配列番号３４）を、表層提示のためにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに形質転換した。Ｉ−ＯｎｕＩバリアントＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３の親和性を平衡結合滴定によって決定し、平衡解離定数を、Ｉ−ＯｎｕＩサブファミリーにおけるいくつかの他の野生型ＨＥの範囲内である約５００ｐＭと推定した（図６Ａ）。
【０５１９】
連続置換分析を使用して、切断特異性を決定した。切断活性をＤＮＡ基質のパネルにわたって評定し、ここでは、各標的部位の位置（配列番号２５）を３つの交互塩基対の各々に突然変異させた。図６Ｂ。ＣＴＤは、ＮＴＤよりも高い程度の切断特異性を示した。
【０５２０】
ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３の標的特異性も評定し、これは、ＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３が、標的部位に非天然セントラル４配列を含有する配列を標的とするように再プログラムされた最初のホーミングエンドヌクレアーゼであるためである。ＢＣＬ１１Ａ標的部位内に２５６個全ての可能性のあるセントラル４配列を含むＤＮＡ基質を生成した（配列番号３５）。各基質を、酵母表層に提示されたＩ−ＯｎｕＩバリアントＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３に対してアッセイした（図７）。図２Ｂに提示したデータと同様に、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３は、ＴＴＡＴモチーフを含むが、天然のＩ−ＯｎｕＩセントラル４の特異性を保持したセントラル４プロファイルを示した。
【０５２１】
実施例５
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフの効率的な撹乱
Ｂｏｉｓｓｅｌら、２０１３に記載されている方法を使用して、ＢＣＬ１１Ａ標的部位（配列番号２６）の上流で１１塩基対ＴＡＬアレイ標的部位に対応するＮ末端１０．５  ＴＡＬアレイ（例えば、配列番号２１および３６）を付加することによって、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントＢＣＬ１１Ａ．Ｂ４．Ａ３をｍｅｇａＴＡＬとしてフォーマットした。図８Ａ。ｍｅｇａＴＡＬの別のバージョンは、Ｔｒｅｘ２（例えば、配列番号２３および３７）へのＣ末端融合を含む。
【０５２２】
ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ編集効率を初代ヒトＣＤ３４＋細胞中で評定した。これは、細胞を、サイトカインを補充した培地中で４８〜７２時間事前刺激した後、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号３６）および任意選択でＴｒｅｘ２融合タンパク質としてフォーマットしたｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号３７）をコードするインビトロで転写したｍＲＮＡを用いて、細胞をエレクトロポレーションすることによって行った。エレクトロポレーションの後、細胞を、サイトカインを補充した培地中で１〜４日間培養し、その間、アリコートをゲノムＤＮＡ単離のために取り出した後、ＢＣＬ１１Ａ標的部位にわたってＰＣＲ増幅を行った。
【０５２３】
小さな挿入／欠失（インデル）事象の頻度を、Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、２０１４参照）、インビトロ切断アッセイ、およびコロニー配列決定を使用して測定した。図８Ｂは、アンプリコンインデルの代表的なＴＩＤＥ分析を示し、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬの標的部位における＋１、−１、−２、−３、または−４のインデルの優位性を例示する。ＭｅｇａＴＡＬ編集率を、ＢＣＬ１１Ａ標的部位にわたるＰＣＲアンプリコンが組換えＢＣＬ１１Ａホーミングエンドヌクレアーゼによって再切断されることが可能であるのかを試験することによって確認した。ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬまたはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを用いた細胞の処理により、かなりの割合のアンプリコンが、組換えＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬによってもはや認識および切断されない程度にまで修飾された。図８Ｃ。インデルのスペクトルも、個々のコロニーのＰＣＲアンプリコンをクローニングし配列決定することによって特性評価した。ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ標的部位でのインデルのスペクトルを図８Ｄに示す。図８Ｅは、異なる初代ＣＤ３４＋ドナー細胞、様々な事前刺激ウィンドウ、細胞濃度、およびｍＲＮＡ産生バッチを用いた複数の実験にたわるインデル分析を要約する。
【０５２４】
ＤＮＡ配列決定試験により、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントが、処理した細胞のかなり部分でＧＡＴＡ−１コンセンサスモチーフを撹乱することが示される。ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬの編集効率は、Ｔｒｅｘ２との融合によって向上した。
【０５２５】
実施例６
ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１モチーフでの効率的なＨＤＲ
ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡを初代ヒトＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレーションして、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１標的配列におけるＡＡＶによって送達された導入遺伝子の相同組換え修復を評定した。ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ標的部位に隣接する５´領域および３´領域に対してＤＮＡ相同性の配列間に配置されたＢＦＰの発現を駆動する構成的プロモーターを含むＡＡＶ２／６ベクターを、標準的な方法を使用して調製した。図９Ａ。初代ヒトＣＤ３４＋細胞を、サイトカインを補充した培地中で事前刺激した後、洗浄し、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、配列番号３６）をコードするｍＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした。細胞を、エレクトロポレーション前にまたはエレクトロポレーション後の回復ステップ中にＡＡＶで形質導入した。細胞を、２〜１０日間、サイトカインを補充した培地中で培養し、その間、アリコートを、相同組換え修復を測定するためのＢＦＰ発現のフローサイトメトリー分析のために取り出した。
【０５２６】
ＢＦＰ＋細胞のかなりの頻度が、単剤対照試料と比較して、ｍｅｇａＴＡＬおよびＡＡＶの試料中で観察された。図９Ｂ。データにより、過渡的エピソーム性ＡＡＶゲノムからのＢＦＰ発現が、形質導入後、培養の２〜４日間にわたり消失するため、ＢＦＰ含有導入遺伝子によるＢＣＬ１１Ａ標的配列の相同組換え修復からの安定なＢＦＰ発現が示される。
【０５２７】
メチルセルロースアッセイを行って、ｍｅｇａＴＡＬベースのＮＨＥＪまたはＨＤＲによって初代ＣＤ３４＋細胞の系列特性が改変されたかどうかを決定した。初代ヒトＣＤ３４＋細胞を、エレクトロポレーション後の回復ステップの後に細胞を計数し、メチルセルロース培地に１４日間プレートしたことを除き、本実施例の前段落に記載したとおりに処理した。１４日間培養した後、コロニーを頻度および形態について採点した。ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬで処理した試料は、対照試料と同等の成熟コロニー表現型頻度を示し、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座のイントロン２中のＧＡＴＡ−１部位におけるゲノム編集と関連付けられる明白な系列の歪みの証拠を示さなかった。図１０Ａ。
【０５２８】
加えて、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬおよびＡＡＶで処理した試料は、２連の培養において３０％および２９．８％のＢＦＰ＋細胞を示した一方、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬに露出させたかまたはヌクレアーゼに露出させていない細胞は、１％未満のＢＦＰ＋細胞しかもたらさなかった。図１０Ｂ。これらの結果は、未分化造血幹細胞および造血前駆細胞中のＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬによって媒介される顕著な相同組換え修復と一致した。
【０５２９】
実施例７
ＢＣＬ１１Ａ標的化ＭｅｇａＴＡＬで編集されたＣＤ３４＋細胞によりＨｂＦレベルが上方調節される
初代ヒトＣＤ３４＋細胞中のＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１配列を効率的に撹乱するＭｅｇａＴＡＬにより、編集された細胞中のＨｂＦレベルが増加した。初代ヒトＣＤ３４＋細胞を、サイトカインを補充した培地中で事前刺激した後、洗浄し、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬとＴｒｅｘ２との融合物（例えば、配列番号３７）の存在下または非存在下でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を、培養されたＣＤ３４＋細胞のあいだで赤血球分化を促進する、血清、ｒｈＳＣＦ、ｒｈＩＬ−３、およびｒｈＥＰＯを含有するＩＭＤＭ系培地中で５〜７日間培養した。分化赤血球細胞中のＨｂＦレベルを、直接共役させた抗ＨｂＦ抗体を使用する染色およびフローサイトメトリーによって、またはグロブリン鎖のＨＰＬＣ分析によって分析した。
【０５３０】
フローサイトメトリーによるＨｂＦ＋細胞の頻度は、対照の培養細胞と比較して、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合物をコードするｍＲＮＡによってエレクトロポレーションした細胞中で増加した。図１１Ａ。ＨＰＬＣによるＨｂＦ＋細胞中の大幅な増加も、対照の培養細胞と比較して、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合物をコードするｍＲＮＡによってエレクトロポレーションした細胞中で観察された。図１１Ｂ。これらのデータにより、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子中のＧＡＴＡ−１部位を標的とするＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬがγ−グロビン遺伝子発現の抑圧を解除することで、β−グロビン発現遺伝子に対するγ−グロビンの割合が増加し、それにより、編集された赤血球細胞中のＨｂＦレベルが増加することが示される。
【０５３１】
実施例８
異種移植モデルにおけるヒト初代長期的ＮＳＧ再ポピュレーション細胞中の耐久性のあるゲノム編集
導入
ヒト初代ＣＤ３４＋細胞を、ｍｅｇａＴＡＬによってエレクトロポレーションし、ＮＳＧマウスに移植して、移植後の造血系の長期的再構成に寄与する、長期的再ポピュレーション造血幹細胞中のゲノム編集の耐久性を決定した。
【０５３２】
方法
新たなヒト動員末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４＋細胞を、標準的な加湿組織培養インキュベーター（５％のＣＯ２）においてサイトカイン含有培地（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３−Ｌ）中で４８時間事前刺激した。事前刺激の後、細胞を採取し、数え上げた。細胞を、２５×１０６細胞の６つの群に分け、４００μＬのエレクトロポレーション緩衝液に懸濁させた。ビヒクルを用いるか、またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、およびＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２をコードするｍＲＮＡを１００μｇ／ｍＬの濃度で用いて、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションデバイスおよびＯＣ４００キュベットを使用して、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞をフラスコに移し、サイトカイン含有培地（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３−Ｌ、ＩＬ−３）によって２×１０６細胞／ｍＬに希釈し、約２０時間３０℃でインキュベートした。エレクトロポレーションの翌日、細胞を移植の前に凍結保存した。
【０５３３】
細胞を解凍し、洗浄し、二等分に分け、２ｍＬのＳＣＧＭ＋サイトカインまたは赤血球分化培地に懸濁させ、標準的な１２ウェルの非接着性組織培養プレートに移した。ＳＣＧＭ＋サイトカイン中で培養した細胞を、最大でさらに６日間、標準的な加湿組織培養インキュベーター（５％のＣＯ２）中で維持し、細胞を、増殖曲線を確立する目的で培養にわたって数え上げた。加えて、５日間培養した後、以下で詳述するインデル頻度の分析のために細胞のサブセットを収集した。赤血球分化培地中で培養した細胞を、最大で３週間、または細胞の少なくとも３０％が赤血球分化のマーカーであるグリコホリンＡ＋およびＣＤ７１＋となるまで培養した。十分なレベルの赤血球分化が決定されたら、細胞を洗浄し、水中に再懸濁させ、ドライアイス上で瞬間冷凍した。その後、抽出したタンパク質を、イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）によってヘモグロビン含有量について分析した。
【０５３４】
洗浄した細胞を、２００μＬのＳＣＧＭに再懸濁させた後、サイトカインを補充したメチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｍ４４３４  Ｃｌａｓｓｉｃ）の３ｍＬのアリコートに移した。次に、１．１ｍＬを、先の丸い１６ゲージの針を使用して平行な３５ｍｍ組織培養皿に移した。皿を、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で１４〜１６日間維持し、コロニーを、サイズ、形態、および細胞構成について採点した。
【０５３５】
ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、ＰＣＲ増幅を行って、目的となる領域を増幅させた。ＰＣＲのクリーニング後、アンプリコンをＭｉｓｅｑ分析に取り入れ、標的化アンプリコン再配列決定によって挿入および欠失事象について分析した。
【０５３６】
遺伝子編集がヒト長期造血幹細胞に与える影響を評定するために、対照およびｍｅｇａＴＡＬで処理した細胞を、解凍し、洗浄した後、部分的に骨髄破壊した成体ＮＳＧマウスの尾静脈に移植した。マウスは、標準的ＩＡＣＵＣ動物愛護ガイドラインに従って無菌環境に収容した。末梢血（ＰＢ）および骨髄（ＢＭ）を、それぞれ移植後２カ月および４カ月で採取し、インデル頻度、抗ｈＣＤ４５抗体（ＢＤ＃５６１８６４）を用いた染色とその後のフローサイトメトリー分析によるヒト細胞の生着、および赤血球分化後のＨｂＦ誘導について分析した。
【０５３７】
ＴＡＬ処理によるＨｂＦ誘導の評定を目的として、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ小規模カラムを使用して、ＢＭをＣＤ３４＋富化した。次に、ＣＤ３４＋細胞を、最大で３週間、または細胞の少なくとも３０％がＣＤ７１＋およびＧＰＡ＋となるまで、赤血球分化培養に置いた。その後、細胞を、ＩＥ−ＨＰＬＣによってヘモグロビン含有量について分析した。
【０５３８】
結果
ｍｅｇａＴＡＬエレクトロポレーションはＣＦＣ形成に影響しない
凍結保存した対照およびｍｅｇａＴＡＬで処理した小規模薬物製品を解凍し、数え上げた。各処理群から５００個の細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（Ｈ４４３４）に移し、半固体培養を開始した。２週間培養した後、造血コロニーを、ＳＴＥＭＶｉｓｉｏｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して撮像し、数え上げた。ｍｅｇａＴＡＬ  ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした細胞は、コロニー形成、群あたりのコロニーの総数、または骨髄、赤血球、および幹細胞様表現型の歪みにおける差を示さなかった。図１２。
【０５３９】
ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は編集率を増加させる
凍結保存した対照およびｍｅｇａＴＡＬで処理した小規模薬物製品を解凍し、数え上げた。次に、細胞を５日間サイトカイン含有培地中で培養した後、インデル頻度分析を行った。ＣＣＲ５またはＢＣＬ１１Ａのいずれかに向けられたｈＣＤ３４＋細胞ｍｅｇａＴＡＬの処理により、約１０％のインデルが生成された。ＣＣＲ５またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質により、編集率は、約３０〜３５％のインデルへとそれぞれ２．９倍および４．１倍増加した。バックグラウンド編集率は１％未満であった。図１３。
【０５４０】
ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を誘導する
凍結保存した対照およびｍｅｇａＴＡＬで処理した小規模薬物を解凍し、数え上げ、赤血球分化培養に置いた。約３週間培養した後、赤血球分化のマーカー、細胞を採取し、洗浄し、水に，溶解させた。タンパク質を、ＩＥ−ＨＰＬＣによってヘモグロビン含有量について分析した。この細胞ロットにおけるＨｂＦのバックグラウンドレベルは約１８％であった。細胞に、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２  ｍｅｇａＴＡＬ融合タンパク質、またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行った。しかしながら、ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質を用いてエレクトロポレーションした細胞は、処理していない細胞と比較して、ＨｂＦを６４％増加させ、約２８％のＨｂＦを達成した。
【０５４１】
長期的再ポピュレーション細胞における編集頻度
編集率、またはインデルの頻度を、グラフト（前）、移植後２カ月のＰＢ分析（２カ月のＰＢＬ）、および４カ月のＢＭ編集分析（４カ月のＢＭ）の間で比較した。ＰＣＲ増幅をＴＡＬ標的部位にわたって行い、アンプリコンを、次世代配列決定を使用して配列決定した。ゲノム編集率は、ＢＣＬ１１Ａ−Ｔｒｅｘ２  ｍｅｇａＴＡＬを用いてエレクトロポレーションしたＣＤ３４＋細胞において４カ月の時点で２０％超のままであった。図１５。
【０５４２】
ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は長期的再ポピュレーション細胞中のＨｂＦを増加させる
ＮＳＧ  ＢＭから生じた赤血球分化ヒトＣＤ３４＋富化細胞をＩＥ−ＨＰＬＣによって分析した。結果として得られるＨｂＦレベルは、移植片のＨｂＦレベルを映す。これらの培養物におけるバックグラウンドＨｂＦレベルは約１１％であった。細胞に、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＣＲ５  ｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２  ｍｅｇａＴＡＬ融合タンパク質、またはＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いてまたは用いずにエレクトロポレーションを行った。しかしながら、ＢＣＬ１１Ａ−Ｔｒｅｘ２  ｍｅｇａＴＡＬを用いた治療により、ＨｂＦ産生は約１８％増加した。これは、対照細胞と比較して５０％を超える増加である。
【０５４３】
結論
ＢＣＬ１１Ａ  ｍｅｇａＴＡＬは、移植された細胞の編集されたＣＤ３４＋集団内の長期的な再ポピュレーション造血幹細胞集団の耐久性のあるゲノム編集と一致して、高いゲノム編集率を生成する。
【０５４４】
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が権利を有する等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８ＢＣ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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