(57)【要約】本開示の局面は、網膜色素変性を治療するための方法および組成物に関する。いくつかの局面において、本開示は、対象において内在性ｒｈｏ遺伝子の対立遺伝子（網膜色素変性に関連する変異ｒｈｏ対立遺伝子）の一方または両方の発現を減少させるために、干渉核酸（例えば干渉ＲＮＡ）を対象に送達するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態において、干渉核酸に耐性のある置換ｒｈｏ遺伝子もまた、対象に送達される。
2019511216.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵ（配列番号１）のセンス鎖および配列ＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号２）のアンチセンス鎖；
ｂ）配列ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号３）のセンス鎖および配列ＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号４）のアンチセンス鎖；
ｃ）配列ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵ（配列番号５）のセンス鎖および配列ＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号６）のアンチセンス鎖；または
ｄ）配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号７）のセンス鎖および配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号８）のアンチセンス鎖：
を含む、合成リボ核酸（ＲＮＡ）分子。
【請求項２】
ＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の合成ＲＮＡ分子。
【請求項３】
ＲＮＡが低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１に記載の合成ＲＮＡ分子。
【請求項４】
配列ＵＣＡＡＧＡＧ（配列番号９）のＲＮＡ、または配列ＵＧＵＧＣＵＵ（配列番号１０）のＲＮＡを含むループを有する、請求項３に記載のｓｈＲＮＡ。
【請求項５】
ＲＮＡが人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の合成ＲＮＡ分子。
【請求項６】
人工ｍｉＲＮＡが配列ＵＧＣＵＧＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＧＣＧＡ（Ｘ）ｎＵＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＵＡ（Ｙ）ｎＣＵＧＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＣＧＧＡ（配列番号１９）のＲＮＡを含み、
ａ）（Ｘ）ｎが配列番号１を含み、（Ｙ）ｎが配列番号２を含む；
ｂ）（Ｘ）ｎが配列番号３を含み、（Ｙ）ｎが配列番号４を含む；
ｃ）（Ｘ）ｎが配列番号５を含み、（Ｙ）ｎが配列番号６を含む；または
ｄ）（Ｘ）ｎが配列番号７を含み、（Ｙ）ｎが配列番号８を含む：
請求項５に記載の人工ｍｉＲＮＡ。
【請求項７】
さらに５’末端および／または３’末端に不対合突出配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡ。
【請求項８】
不対合突出配列が反復塩基配列を含む、請求項７に記載の合成ＲＮＡ。
【請求項９】
反復塩基配列が反復ウラシル（Ｕ）塩基を含む、請求項８に記載の合成ＲＮＡ。
【請求項１０】
不対合突出配列がＵＵである、請求項９に記載の合成ＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の合成ＲＮＡを含む組成物。
【請求項１２】
さらに１つ以上の生理学的に許容される担体および／または１つ以上の生理学的に許容されるアジュバントを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ａ）請求項３もしくは４に記載のｓｈＲＮＡ；または
ｂ）請求項５もしくは６に記載の人工ｍｉＲＮＡ
をコードするベクター。
【請求項１４】
ｓｈＲＮＡが配列番号１１〜１８のいずれか１つから選択される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
ベクターが発現プラスミドである、請求項１３または１４に記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターがウイルスベクターである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１７】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１６に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
対象におけるＲＨＯ発現を低減させる方法であって、請求項１１もしくは１２の組成物、または、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のベクターを対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
対象において網膜色素変性（ＲＰ）を治療する方法であって、
ａ）請求項１１もしくは１２の組成物、または、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のベクター；および
ｂ）ａ）の組成物またはベクターの干渉ＲＮＡが標的とする配列を含有しない、組換えｒｈｏ遺伝子：
の両方を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
組換えｒｈｏ遺伝子がｒＡＡＶを用いて送達される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
干渉ＲＮＡおよび組換えｒｈｏ遺伝子が同一のｒＡＡＶを用いて送達される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
干渉ＲＮＡおよび組換えｒｈｏ遺伝子が両方とも、単一のプロモーター配列の発現制御下にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
干渉ＲＮＡおよび組換えｒｈｏ遺伝子がそれぞれ、別のプロモーター配列の発現制御下にある、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
干渉ＲＮＡがｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの発現制御下にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
干渉ＲＮＡが人工ｍｉＲＮＡであり、人工ｍｉＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの発現制御下にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
組換えｒｈｏ遺伝子が構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの発現制御下にある、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
対象が哺乳動物である、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物がげっ歯類またはイヌである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／３０２，１２２号、および２０１６年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３９８，４５１号の利益を主張するものであり、これらのそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所によって付与された補助金番号Ｒ２４−ＥＹ０２２０１２による政府の支援によってなされた。
【背景技術】
【０００３】
背景
常染色体優性網膜色素変性（ａｄＲＰ）は、１２，０００人に１人に発症する失明に至る疾病である。これらの個体のうちかなりの割合が、網膜の光受容細胞の集光性色素タンパク質である、ロドプシンの遺伝子（ｒｈｏ）に変異を有する。この疾患は、いずれかの親からの変異した遺伝子の遺伝が網膜の変性と最終的な失明につながるため、優性である。ｒｈｏで特定された１００を超える異なる変異が、失明につながる。現在のところ、ａｄＲＰに対する承認された薬物療法または遺伝子療法の治療はない。従って、ａｄＲＰおよび関連する症状の、ありとあらゆる原因に関する、有効な治療選択肢が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本出願の局面は、対象における（例えば、ヒトにおける）網膜色素変性（例えば、優性網膜色素変性）を治療するための組成物および方法に関連する。いくつかの実施形態において、対象のロドプシン遺伝子（ｒｈｏ遺伝子）の対立遺伝子の一方または両方を、干渉ＲＮＡ分子を対象（例えば、網膜色素変性を有する対象であって、例としては優性網膜色素変性を有するヒト）に投与することによりサイレンシングする。いくつかの実施形態において、置換ｒｈｏ遺伝子もまた対象に投与して、対象に光受容細胞の機能を回復させる、機能性ＲＨＯタンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、置換ｒｈｏ遺伝子は、内在性遺伝子の対立遺伝子と比較して１つ以上のヌクレオチド置換を有しており、これが、該置換遺伝子を干渉ＲＮＡの効果に対して耐性にする。いくつかの実施形態において、置換ｒｈｏ遺伝子は、ｒｈｏ遺伝子を、干渉ＲＮＡ分子により仲介される分解に対して耐性にする（「硬化する（ｈａｒｄｅｎｅｄ）」とも呼ばれる）、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５つ以上の）置換を含む、ヒトｒｈｏ遺伝子（例えば、野生型ヒトｒｈｏ遺伝子）である。いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレオチド置換は、ｒｈｏ遺伝子のコード配列に存在する。いくつかの実施形態において、１つ以上のヌクレオチド置換はサイレントである（例えば、ＲＨＯタンパク質のアミノ酸配列を変化させない）。いくつかの実施形態において、１つ以上の置換はアミノ酸の変化を導入するが、結果として生じるＲＨＯタンパク質は、（少なくとも部分的な視力または正常な視力を回復または維持するのに）治療的に有効であるために十分に機能する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡおよび／または置換遺伝子は、任意の好適な技術を用いて対象に送達され得る。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは、干渉ＲＮＡをコードする遺伝子の形態で対象に提供される。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡをコードする遺伝子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で対象に提供される。いくつかの実施形態において、置換遺伝子は、ｒＡＡＶで対象に提供される。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡと置換遺伝子とをコードする遺伝子は、同一のｒＡＡＶで提供される（例としては、それらは両方とも、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する同一の組換えゲノム上にコードされている）。いくつかの実施形態において、両方の遺伝子は、同一のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、これらの遺伝子は、２つの異なるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡと置換遺伝子とをコードする遺伝子は、異なるｒＡＡＶで提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは：
ａ）配列ＣＵＧＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵ（配列番号１）のセンス鎖および配列ＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧＣＡＧ（配列番号２）のアンチセンス鎖；
ｂ）配列ＣＣＵＡＣＡＵＧＵＵＵＣＵＧＣＵＧＡＵ（配列番号３）のセンス鎖および配列ＡＵＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＵＧＵＡＧＧ（配列番号４）のアンチセンス鎖；
ｃ）配列ＧＣＡＵＧＧＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＵ（配列番号５）のセンス鎖および配列ＡＣＣＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＡＵＧＣ（配列番号６）のアンチセンス鎖；または
ｄ）配列ＧＵＧＧＣＡＵＵＣＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ（配列番号７）のセンス鎖および配列ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＧＡＡＵＧＣＣＡＣ（配列番号８）のアンチセンス鎖：
を含む、合成リボ核酸（ＲＮＡ）分子である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡ分子は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは配列ＵＣＡＡＧＡＧのＲＮＡ（配列番号９）、または、配列ＵＧＵＧＣＵＵのＲＮＡ（配列番号１０）を有するループを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、合成ＲＮＡ分子は、人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、人工ｍｉＲＮＡは、ＵＧＣＵＧＵＵＧＡＣＡＧＵＧＡＧＣＧＡ（Ｘ）ｎＵＡＧＵＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＵＧＵＡ（Ｙ）ｎＣＵＧＣＣＵＡＣＵＧＣＣＵＣＧＧＡ（配列番号１９）
のＲＮＡ配列を有し：
ａ）（Ｘ）ｎが配列番号１を含み、（Ｙ）ｎが配列番号２を含む；
ｂ）（Ｘ）ｎが配列番号３を含み、（Ｙ）ｎが配列番号４を含む；
ｃ）（Ｘ）ｎが配列番号５を含み、（Ｙ）ｎが配列番号６を含む；または
ｄ）（Ｘ）ｎが配列番号７を含み、（Ｙ）ｎが配列番号８を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、上記または本明細書の他の箇所に記載された合成ＲＮＡは、さらに、５’末端および／または３’末端に不対合突出配列を含む。いくつかの実施形態において、不対合突出配列は反復塩基配列を含む。いくかの実施形態において、反復塩基配列は反復ウラシル（Ｕ）塩基を含む。いくつかの実施形態において、不対合突出配列はＵＵである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、組成物（例えば、対象に投与するための組成物）は、上記または本明細書の他の箇所に記載された干渉ＲＮＡ（例えば、合成ＲＮＡ分子）の１つ以上（例えば、２、３、または４つ）を含む。いくつかの実施形態において、組成物（例えば、対象に投与するための組成物）は、上記または本明細書の他の箇所に記載された干渉ＲＮＡ(例えば、合成ＲＮＡ分子)の１つ以上（例えば、２、３、または４つ）をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、組成物はまた、１つ以上の生理学的に許容される担体、および／または１つ以上の生理学的に許容されるアジュバントを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ベクターは、１つ以上の（１、２、３、または４つ以上の）、（例えば、上記または本明細書の他の箇所に記載される）ｓｈＲＮＡおよび／または人工ｍｉＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡは、配列番号１１〜１８の１つ以上の配列を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ベクターは置換ｒｈｏ遺伝子をコードする。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ベクターは、置換ｒｈｏ遺伝子、並びに／または、１つ以上の、（例えば、上記または本明細書の他の箇所に記載される）ｓｈＲＮＡ、および／もしくは、人工ｍｉＲＮＡをコードする。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ベクターは発現プラスミドである。いくつかの実施形態において、ベクターは組換えウイルスゲノム（例えば、ｒＡＡＶゲノム）である。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはｒＡＡＶゲノムを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、対象におけるＲＨＯ発現を低減させる方法は、１つ以上の干渉ＲＮＡ、および／または、上記または本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の干渉ＲＮＡをそれぞれコードする（例えば、発現することができる）１つ以上のベクターを、対象に投与することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、対象において網膜色素変性（ＲＰ）を治療する方法は、干渉ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡを発現するベクターを含む組成物と、組換えｒｈｏ遺伝子を含む組成物（例としては、組換えｒｈｏ遺伝子をコードするベクター）とを、共に投与することを含み、ここで該ｒｈｏ遺伝子は該干渉ＲＮＡによる標的化に耐性がある。
【００１８】
いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子は、ｒＡＡＶを用いて送達される。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡおよび組換えｒｈｏ遺伝子は、同一のｒＡＡＶを用いて送達される。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡおよび組換えｒｈｏ遺伝子が両方とも、単一のプロモーター配列の発現制御下にある。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡおよび組換えｒｈｏ遺伝子がそれぞれ、別のプロモーター配列(例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれか)の発現制御下にある。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡおよび／または改変ｒｈｏ遺伝子は、ヒトプロモーターまたは異なる種のプロモーター（例えば、ウイルスプロモーター、原核生物プロモーター、または真核生物プロモーター、例としては、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、または他の種由来のプロモーター）の発現制御下にある（例えば、前記プロモーターに作動可能に連結されている）。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｈ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター)または、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、またはＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡはｓｈＲＮＡであり、ｓｈＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｈ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）の発現制御下にある。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡは人工ｍｉＲＮＡであり、人工ｍｉＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの発現制御下にある。いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、ヒトプロモーター、眼特異的プロモーター）の発現制御下にある。いくつかの実施形態において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターは、マウスプロモーター（例えば、マウスオプシン（ＭＯＰＳ）プロモーター）である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はげっ歯類またはイヌである。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒト（例えば、網膜色素変性、例としては優性網膜色素変性を有する、または有することが知られているヒト、例としては有すると診断されたヒト）である。これらの、および他の局面は、以下の図面、実施例、および特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
図面および以下の簡単な説明は、本明細書に記載される組成物および方法の局面の非限定的な例を提供する。
【００２１】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、ＦＡＣＳ（蛍光標識細胞分取）により測定される、ＧＦＰ標識したヒトロドプシンのノックダウンを示す。本実験は、２９３Ｔ細胞において、３回の生物学的反復試験（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）で行った。５００ｎｇのＧＦＰ標識したヒトＲＨＯｃＤＮＡを、異なるｓｉＲＮＡと同時トランスフェクトした。トランスフェクションは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬を用いて実施した。コントロールは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎより購入した非ターゲティングｓｉＲＮＡとした。サンプルを７２時間インキュベートし、その後フローサイトメトリーで解析し、最初に前方散乱および側方散乱についてゲーティングして生育不能な粒子を除外し、次に、自己蛍光を超えるＧＦＰ発現についてゲーティングした。コントロールｓｉＲＮＡで処理したＧＦＰ陽性細胞の数を１００％に設定した。
【図２】図２は、ｓｈＲＮＡによるＲＨＯのノックダウンを示す。本実験は、２９３Ｔ細胞において、３回の生物学的反復試験で行った。２００ｎｇのＧＦＰ標識したヒトロドプシンを、Ｈ１プロモーターにより駆動されるｓｈＲＮＡ１３１、７６５、または８２０のいずれかを含むｐＵＣ５７と同時トランスフェクトした。サンプルを７２時間インキュベートし、図１と同様に、ＲＨＯノックダウンをフローサイトメトリーで測定した。
【図３】図３は、ｓｈＲＮＡが、変異および野生型ＲＨＯ  ＲＮＡの両方を切断することを示す。本実験は、２９３Ｔ細胞において２回の生物学的反復試験で、および３回のｑＲＴ−ＰＣＲ反復試験でおこなった。２００ｎｇのＧＦＰ標識したヒトロドプシン（ＷＴ、Ｔ１７ＭまたはＰ２３Ｈ）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００を用いて、ｒＡＡＶ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡプラスミド（１３１（配列番号１１）、７６５（配列番号１５）、または８２０（配列番号１７））と同時トランスフェクトした。非ターゲティングｓｈＲＮＡは、無関係の光伝達タンパク質、桿体環状ＧＭＰ感受性イオンチャネルのサブユニットを分解するように、設計した。サンプルを４８時間インキュベートし、その後、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のために処理した。
【図４】図４は、ｍｉＲ３０（配列番号２８）の配列構成中の、ｓｉＲＮＡ１３１センス鎖（配列番号１）およびアンチセンス鎖（配列番号２）を示す。ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現させた後、ｓｉＲＮＡは前駆体から酵素Ｄｒｏｓｈａによって核内で切り出され、Ｄｉｃｅｒによって細胞質内で切り出される。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、イヌの網膜のブレブ（ｂｌｅｂ）および非ブレブ領域から取得した生検パンチにおける、ロドプシンの免疫ブロットを示す（図５Ａ）。図５Ｂは、ヒストンに標準化された、ロドプシンモノマー量の定量化を示す。図５Ｃは、標準化された量を示す表である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、イヌのＲＨＯ  ＲＮＡの絶対数を示す。図６Ａは、イヌのＲＨＯ  ＲＮＡの絶対数のプロットである。図６Ｂは、ＲＮＡの絶対数を示す表である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、イヌの網膜のブレブおよび非ブレブ領域から取得した生検パンチにおける、ロドプシンの免疫ブロットを示す（図７Ａ）。図７Ｂは、ヒストンに標準化された、ロドプシンモノマー量の定量化を示す。図７Ｃは、標準化された量を示す表である。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、イヌのＲＨＯ  ＲＮＡの絶対数を示す。図８Ａは、イヌのＲＨＯ  ＲＮＡの絶対数のプロットである。図８Ｂは、ＲＮＡの絶対数を示す表である。
【図９】図９は、ｓｈＲＮＡと、内在性ヒトＲＨＯｍＲＮＡまたは、硬化ＲＨＯｍＲＮＡの標的配列との間に生じる例示的な塩基対形成を表す。全てのｓｈＲＮＡは、イヌのＲＨＯｍＲＮＡの標的配列と、完全に塩基対を形成する。白四角：ｓｈＲＮＡと、内在性イヌＲＨＯｍＲＮＡ並びに硬化ＲＨＯｍＲＮＡとの間のミスマッチ。濃灰色四角：ＲＮＡのグアノシンとウラシルとの間に生じる弱いゆらぎ塩基対形成。薄灰色四角：ｓｈＲＮＡと硬化ＲＨＯｍＲＮＡとの間のみのミスマッチ。配列はそれぞれ、配列番号２９−３７に上から下に対応する。
【図１０】図１０は、ｓｈＲＮＡ１３４と、内在性ヒトＲＨＯ１３１ｍＲＮＡまたは、硬化ＲＨＯ１３１ｍＲＮＡの標的配列との間に生じる例示的な塩基対形成を表す。ｓｈＲＮＡ１３１および１３４の標的配列の近接（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）は、同じ硬化ＲＨＯ１３１を使用することを可能にする。濃灰色四角：ＲＮＡのグアノシンとウラシルとの間に生じる弱いゆらぎ塩基対形成。薄灰色四角：ｓｈＲＮＡと硬化ＲＨＯｍＲＮＡとの間のみのミスマッチ。配列はそれぞれ、配列番号３８−４０に上から下に対応する。
【図１１】図１１は、ＧＦＰ標識したヒトＲＨＯをコードするプラスミドの例示的なマップを表す。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ｓｉＲＮＡをコードするプラスミド（図１２Ａおよび図１２Ｂ）と、ヒトＲＨＯをコードするプラスミド（図１２Ｃ）のマップの非限定的な例を示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｅは、野生型ＲＨＯ＋／＋イヌにおける、網膜下に注射された異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による、ロドプシンノックダウンのＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。図１３Ａは、ウェスタンブロット解析およびＲＮＡ定量に使用された生検パンチの位置を示す網膜地図を示す。対になった、濃灰色、灰色、ドットの丸は、ウェスタンブロットの各複製のためのブレブ／処理および非ブレブ処理領域における、生検パンチの位置を示しており、一方で、黒丸は、ＲＮＡ定量のための生検パンチの位置を示す。図１３Ｂは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、処理領域内に残存するイヌのロドプシンＲＮＡを示す棒グラフを示す。図１３Ｃは、イヌの網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域から取得した生検パンチにおけるロドプシンの量を示す免疫ブロットを示す。ヒストンＨ３を標準化のために用いた。 棒グラフは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、残存するイヌのロドプシンタンパク質を示す。図１３Ｄは、ＲＮＡまたはタンパク質の残存率として報告された各実験の数値を示す表である。図１３Ｅは、ＲＮＡまたはタンパク質のノックダウン率として報告された各実験の数値を示す別の表である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄは、野生型イヌにおける、異なる力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０の網膜下注射後の、ＯＮＬおよびＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳ完全性の評価を示す。図１４Ａは、ＯＮＬの厚さの図を示す。；図１４Ｂは、ＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳの標準化強度の図を示す；図１４Ｃは、ＯＮＬの厚さの値を示す；および、図１４Ｄは、ＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳ層の標準化強度の値を示す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｅは、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおける、網膜下に注射された異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による、ロドプシンノックダウンのＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。図１５Ａは、ウェスタンブロット解析およびＲＮＡ定量に使用された生検パンチの位置を示す網膜地図を示す。対になった、濃灰色、灰色およびドットの丸は、ウェスタンブロットの各複製のためのブレブおよび非ブレブ領域における、生検パンチの位置を示しており、一方で、黒丸は、ＲＮＡ定量のための生検パンチの位置を示す。図１５Ｂは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、残存するイヌのロドプシンＲＮＡ量を示す棒グラフである。図１５Ｃは、イヌの網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域から取得した生検パンチにおけるイヌのロドプシンの量を示す免疫ブロットである。ヒストンＨ３を標準化のために用いた。棒グラフは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、残存するイヌのロドプシンタンパク質量を示す。図１５Ｄは、ＲＮＡまたはタンパク質の残存率として報告された各実験の数値を示す表である。図１５Ｅは、ＲＮＡまたはタンパク質のノックダウン率として報告された各実験の数値を示す別の表である。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおいて急性網膜変性を引き起こす短時間の光照射に暴露してから２週間後の、ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの、（異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による）処理網膜領域および非処理網膜領域を含むＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。（図１６Ａ）１ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。（図１６Ｂ）５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。（図１６Ｃ）２．５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。（図１６Ｄ）１ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。
【図１７】図１７Ａ−図１７Ｂは、光誘発性網膜変性からの防御を示す、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０で処理したＲＨＯＴ４Ｒ／＋由来の、ＯＮＬの厚さの組織分布図を示す。（図１７Ａ）非処理の野生型コントロールイヌのＯＮＬの厚さの図（左図）、および、５Ｅ＋１１ｖｇ／ｍｌでＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により処理したＥＭ４１１−ＯＳのＯＮＬの厚さの図であり、光誘発性ダメージ後数週間は、処理／ブレブ領域においてＯＮＬの厚さが保存されることを示す。白黒曲線は、網膜下注射直後に見られるブレブの境界を示す。下のパネルは、視覚化のために、ＯＮＬが濃灰色で色付けされた（中間のバンド）ＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。（図１７Ｂ）ブレブの外側および内側の部位を、ＯＮＬの厚さ測定のために選択した。
【図１８】図１８は、異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を網膜下注射した、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域における、組織学（ＨＥ染色）および免疫組織化学を示す（ロドプシンは緑に染色され、図１８の下図では薄い染色として現れている；ヒト錐体アレスチンは赤に染色され、図１８の下図では灰色の染色として現れている）。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｆは、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおける、５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価で網膜下に注射されたＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による、ロドプシンのノックダウンおよび置換のＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。図１９Ａは、ウェスタンブロット解析およびＲＮＡ定量に使用された生検パンチの位置を示す網膜地図を示す。対になった、濃灰色、灰色、ドットの丸は、ウェスタンブロットの各複製のための処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域における、生検パンチの位置を示しており、一方で、黒丸は、ＲＮＡ定量のための生検パンチの位置を示す。図１９Ｂは、イヌの網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域から取得した生検パンチにおける総ロドプシン量（イヌ＋ヒトＲＨＯ８２０）を示す免疫ブロットを示す。ヒストンＨ３を標準化のために用いた。棒グラフは、処理および非処理領域におけるイヌのロドプシンタンパク質の残存率を示す。ＥＭ４２４−ＯＤおよびＥＭ４２５−ＯＤの処理領域におけるより低い分子量のバンド（変異Ｔ４Ｒ  ＲＨＯタンパク質に対応する）の消失に留意されたい。図１９Ｃは、タンパク質定量のために用いられるパンチの各対に対する数値を示す表である。図１９Ｄは、非処理領域で測定されるイヌのＲＨＯ  ＲＮＡのパーセンテージとして、処理領域における残存するイヌのロドプシンＲＮＡを示す棒グラフである。図１９Ｅは、非処理領域で測定されるイヌのＲＨＯ  ＲＮＡのパーセンテージとして、処理領域におけるヒト  ＲＨＯ８２０を示す棒グラフである。図１９Ｆは、ＲＮＡ定量のために用いられるパンチの各対に対する数値を示す表である。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃは、５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により処理した、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋網膜の領域における、光誘発性網膜変性からの防御を示す、インビボ網膜イメージングを示す。図２０Ａは、光照射の２週間後の、変性から防御された網膜領域（白矢印によって区切られた境界）を示す、正面の（ｅｎ  ｆａｃｅ）ｃＳＬＯ合成画像を示す。薄灰色矢印は、図２０Ｂで示されたＯＣＴ  Ｂスキャンの処理領域の範囲内の位置を示し、濃灰色矢印は、図２０Ｃで示されたＯＣＴ  Ｂスキャンの非処理領域の範囲内の位置を示す。図２０Ｂは、注射前、注射の１１週間後、および注射の１３週間後／光照射の２週間後の、処理領域の範囲内のＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。ＯＮＬの厚さは、ウイルスベクター注射後の両方の時点における処理領域全体に渡って、保存されている。図２０Ｂおよび図３０Ｖは、注射前、注射の１１週間後、および注射の１３週間後／光照射の２週間後の、非処理領域の範囲内のＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。ＯＮＬは、注射の１１週間後まで保存されているが、光照射の２週間後には完全に失われている。
【図２１】図２１は、光誘発性網膜変性からの防御を示す、５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価でＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により処理した２つのＲＨＯＴ４Ｒ／＋由来の、ＯＮＬの厚さの組織分布図を示す。
【図２２】図２２は、５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を網膜下に注射した、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋網膜の処理、移行ゾーン、および非処理領域における、免疫組織化学を示す（ロドプシンは緑に染色され、図２２の図では薄い染色として現れている；ヒト錐体アレスチンは赤に染色され、図２２の図では灰色の染色として現れている）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本出願の局面は、対象において（例えば、優性網膜色素変性を有する対象において）、網膜色素変性を治療するために有用な方法および組成物を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、（例えば、変異のまたは正常な）内在性ロドプシンの発現を、ＲＮＡ干渉を用いて減少させるか、または、抑制して、失われたタンパク質を、ＲＮＡ阻害物質の標的部位を除去するように操作された正常タンパク質の遺伝子を送達することによって置換する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、単一のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＲＮＡ物質（例えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡまたは人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ）および組換えｒｈｏ遺伝子の両方を送達するために用いられる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ａ−ｍｉＲ）および／またはＲＮＡ酵素（リボザイム）は、マウス、ヒト、およびイヌに共通の配列を標的とすることによってロドプシンｍＲＮＡを分解するように設計することができる。これらの分子は、ヒト患者で機能し得る阻害物質を開発するために、細胞培養、マウス、および／またはイヌにおいて阻害を試験するのに有用であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ヒトおよびイヌの両方のロドプシンｍＲＮＡを標的とする低分子干渉核酸（例えば、ＲＮＡ）が提供される。いくつかの実施形態において、ヒトおよびイヌのロドプシン（ＲＨＯ）ｍＲＮＡを消化する４つの低分子干渉ＲＮＡが、ヒトおよび動物において内因的に生成されるロドプシンを枯渇させる目的で提供される。いくつかの実施形態において、これらの干渉ＲＮＡは、ＲＨＯの変異によって引き起こされる、網膜色素変性の優性遺伝型を有する対象において、ロドプシンの発現を標的とする。これらの変異のいくつかは、有毒な形態のタンパク質をもたらし、その合成は網膜の変性を防ぐためにサイレンシングされなければならない。
【００２７】
いくつかの実施形態において、干渉核酸（例えば、ＲＮＡ）は、変異ｒｈｏ遺伝子に特異的な配列を標的とするように設計される（例えば、干渉核酸は、変異ｒｈｏ遺伝子に存在し、野生型ｒｈｏ遺伝子に存在しない配列に相補的である）。しかし、いくつかの実施形態において、干渉核酸は、（例えば、干渉核酸により標的とされない他の位置に１つ以上の変異を有する）変異内在性ｒｈｏ遺伝子の野生型配列を標的とするように設計される。さらなる実施形態において、干渉核酸に耐性である機能的（例えば、野生型）ｒｈｏ遺伝子が、対象におけるＲＨＯ活性を回復させ、それによって、干渉核酸が標的とする変異内在性ｒｈｏ対立遺伝子に関連する疾患または障害の１つ以上の症状を治療するために、提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、１つ以上の干渉ＲＮＡは、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、または、他の好適な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーター）により駆動される低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、または、他の好適な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーター）により駆動される人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のいずれかとして、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて送達され得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、同じベクターが、正常なロドプシンをコードするが、ウイルスにより発現されたｓｉＲＮＡの作用に対して耐性がある、遺伝子（ｃＤＮＡ）を発現する。
【００３０】
干渉ＲＮＡの非限定的な例を、表１〜４に提示する。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【００３１】
いくつかの実施形態において、硬化された、正常な（例えば、野生型の）ロドプシン（ｒｈｏ）遺伝子は、ヒトｒｈｏ遺伝子に基づく配列を有し得（例えば、アクセッション番号ＮＧ＿００９１１５．１で示される配列；配列番号４１とも示される配列を有する）、または、ｍＲＮＡもしくはそのタンパク質コード部分（例えば、配列番号４１の９９７０−１１７０６に連結した８８９５−９１３４に連結した８６１３−８７７８に連結した７２３８−７４０６に連結したヌクレオチド５００１−５４５６によってコードされるｍＲＮＡ、またはそのタンパク質コード部分、例としては、配列番号４１の９９７０−１００８０に連結した８８９５−９１３４に連結した８６１３−８７７８に連結した７２３８−７４０６に連結したヌクレオチド５０９６−５４５６からなるコード配列）に基づく配列を有し得る。いくつかの実施形態において、正常なｒｈｏ遺伝子の配列は、治療される対象における変異内在性ｒｈｏ遺伝子の発現を減少させるために、ノックダウン物質として用いられる１つ以上の干渉ＲＮＡに対して、置換ｒｈｏ遺伝子を耐性にする１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の）変異を含むように、改変される。しかしながら、いくつかの実施形態において、改変されていない正常な（例えば、野生型の）配列を有する組換えｒｈｏ遺伝子が、治療される対象において標的とされる内在性ｒｈｏ遺伝子または対立遺伝子とは異なる配列を有する場合、および、用いられるノックダウン物質が、内在性ｒｈｏ遺伝子または対立遺伝子を標的とし提供される組換えｒｈｏ遺伝子を標的としないように設計されている場合に、改変されていない正常な（例えば、野生型の）配列を有する組換えｒｈｏ遺伝子が用いられ得る。いくつかの実施形態において、治療される対象とは異なる種由来のｒｈｏ遺伝子が用いられ得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、ｒｈｏ遺伝子（例えば、改変ｒｈｏ遺伝子）は、治療される対象と同じ種由来であり得る。いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子における１つ以上の改変は、コード配列の核酸配列を変化させるが、コードされるタンパク質は変化させない（例えば、それらはサイレント変異であり、例としては、コードされるアミノ酸を変化させることなく、２つ以上の異なるヌクレオチドのうちの１つを含み得る、コドンの第３の位置での変異である）。いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子は、野生型ｒｈｏ遺伝子のイントロン配列を含まない。いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子は、干渉ＲＮＡに対して耐性があるように改変されたｒｈｏ遺伝子のｍＲＮＡ（またはそのタンパク質コード部分）をコードする。いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子は、干渉ＲＮＡに対して耐性があるように改変された野生型コード配列を含む。いくつかの実施形態において、改変された野生型コード配列は、野生型ｒｈｏｍＲＮＡに由来しない上流および／または下流のｍＲＮＡ配列と共に、提供される。いくつかの実施形態において、組換え置換ｒｈｏ遺伝子は配列番号４２を含む。配列番号４２（以下に示す）は、８２０と呼ばれる干渉ＲＮＡの一例（本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ８２０またはｓｈＲＮＡ８２０）に、耐性がある。本明細書に記載される８２０干渉ＲＮＡ配列は、図９に示すように内在性ヒトｒｈｏｍＲＮＡの対応する配列を標的とするが、配列番号４２は、それを８２０干渉ＲＮＡによる標的化に耐性とする４つの置換（以下で下線および太字で示し、配列番号４１の、位置９０１４、９０１７、９０２０および９０２３に対応する）を含む。配列番号４２のコード配列は、配列番号４２の位置８８から開始する。いくつかの実施形態において、送達される組換えｒｈｏ遺伝子は、配列番号４２のコード配列を含み得る（例えば、配列番号４２の位置８８から開始する）が、異なる上流のｍＲＮＡ配列を伴うことができる。いくつかの実施形態において、組換えｒｈｏ遺伝子は１つ以上の他の配列の改変を（さらに、または、代替として）有して、さらなる、または、代替の干渉ＲＮＡ（例えば、本明細書において配列が提供されている他の干渉ＲＮＡ）に耐性となることができる。いくつかの実施形態において、対象における内在性ｒｈｏコード配列の異なる領域を標的とする１つ以上の干渉ＲＮＡが用いられ得る。
【００３２】
配列番号４２（改変「硬化」組換えヒトｒｈｏ遺伝子の非限定的な例）
【表５】
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【００３３】
従って、本明細書の組成物は、治療を必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、対象は、１つ以上の脳および／または眼の症状、疾患、または障害を有するか、有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に開示される症状、疾患、および障害の１つ以上を有するか、有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、（例えば、眼または網膜の疾患または障害に関連するか、それを引き起こす）１つ以上の内在性変異ｒｈｏ対立遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、対象は、（例えば、優性網膜色素変性を引き起こす）少なくとも１つの優性変異ｒｈｏ対立遺伝子を有する。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は非ヒト霊長類である。非ヒト霊長類の対象の非限定的な例には、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンが含まれる。他の例示的な対象には、イヌおよびネコなどの飼い慣らされた動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ  ａｎｉｍａｌ）；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギおよびニワトリなどの家畜；並びにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物が含まれる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞または対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６〜１０１４個の粒子／ｍＬもしくは１０３〜１０１５個の粒子／ｍＬの範囲のオーダーであってよく、または、いずれかの範囲の間の任意の値であってよく、例としては、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４個の粒子／ｍＬなどである。一実施形態において、１０１３個の粒子／ｍＬよりも多いｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの実施形態において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６〜１０１４ベクターゲノム（ｖｇｓ）／ｍＬもしくは１０３〜１０１５ｖｇｓ／ｍＬの範囲のオーダーであってよく、または、いずれかの範囲の間の任意の値であってよく、例としては、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇｓ／ｍＬなどである。一実施形態において、１０１３ｖｇｓ／ｍＬよりも多いｒＡＡＶ粒子が投与される。ｒＡＡＶ粒子は、治療される特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得るように、単回投与として投与され得るか、または２回以上の投与に分割され得る。いくつかの実施形態において、０．０００１ｍＬ〜１０ｍＬ（例えば、０．０００１ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．１ｍＬ、１ｍＬ、１０ｍＬ）が、１回の投与で対象に送達される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス力価は、１ｘ１０１０〜５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス力価は、１ｘ１０１０、２．５ｘ１０１０、５ｘ１０１０、１ｘ１０１１、２．５ｘ１０１１、５ｘ１０１１、１ｘ１０１２、２．５ｘ１０１２、５ｘ１０１２、１ｘ１０１３、２．５ｘ１０１３、または５ｘ１０１３ｖｇ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、ウイルス力価は、１ｘ１０１０ｖｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス力価は、１ｘ１０１５ｖｇ／ｍＬを超える。一実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、５ｘ１０１３ｖｇｓ／ｍＬを超える。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス力価は、本明細書にさらに記載される方法によって（例えば、網膜下に、または、硝子体内に）投与される。
【００３６】
ｒＡＡＶ粒子は、治療される特定の疾患または障害の治療を達成するために必要とされ得るように、単回投与として投与され得るか、または２回以上の投与に分割され得る。いくつかの実施形態において、本出願で記載される組成物の１〜５００マイクロリットルが、対象の片眼または両眼に投与される。例としては、いくつかの実施形態において、約１、約１０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、または約５００マイクロリットルが、各眼に投与され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、より少量またはより多量が投与され得ることが、理解されるべきである。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本開示は、単独で、または１つ以上の他の療法様式と組み合わせて、細胞または動物へ投与するための、特に、ヒト細胞、組織、およびヒトに発症する疾患を治療するための、薬学的に許容される溶液中の、本明細書に開示される１つ以上のｒＡＡＶベースの組成物の製剤を提供する。
【００３８】
必要であれば、ｒＡＡＶ粒子または核酸ベクターは、例えば、タンパク質、またはポリペプチド、または様々な薬学的に活性な物質などの、他の物質と組み合わせて投与することもでき、治療的ポリペプチド、生理活性フラグメント、またはそれらの変異体の１つ以上の全身または局所投与を含む。実際、追加の物質が標的細胞または宿主組織との接触において重大な有害作用を引き起こさないと考えると、含まれ得る他の成分には、実質的に制限はない。従って、ｒＡＡＶ粒子は、特定の場合に必要とされる様々な他の物質と共に、送達され得る。これらの組成物は、宿主細胞、または他の生物学的起源から精製され得るか、あるいは、本明細書に記載されるように化学的に合成され得る。
【００３９】
例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、関節内および筋肉内投与、並びに製剤化を含む、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに好適な投薬および治療レジメンの開発のように、薬学的に許容される賦形剤およびキャリア溶液の製剤化は、当業者に周知である。
【００４０】
通常、活性成分のパーセンテージはもちろん変化してもよいが、これらの組成物は、治療物質（例えば、ｒＡＡＶ粒子または宿主細胞）の少なくとも約０．１％以上を含有してもよく、好都合に、製剤全体の重量または用量の約１または２％〜約７０％または８０％以上であってもよい。当然のことながら、各治療的に有用な組成物中における治療物質（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の量は、化合物の所与の単位用量において好適な投与量が得られるように調製されてもよい。溶解性、生物学的利用率、生物学的半減期、投与のルート、産物有効期間などのような要因ならびに他の薬理学的考慮は、これらの医薬製剤を調製する当業者によって企図されるであろうし、また、そのため、様々な投薬量および治療レジメンは望ましくてもよい。
【００４１】
ある状況では、皮下に、眼内に、硝子体内に、非経口的に、皮下に、静脈内に、脳室内に、筋肉内に、髄腔内に、経口的に、腹腔内に、経口もしくは経鼻吸入により、または、１つ以上の細胞、組織、もしくは器官への直接注射により、本明細書に開示される好適に製剤化された薬学的組成物中のｒＡＡＶ粒子または宿主細胞を送達することが望ましい。
【００４２】
ｒＡＡＶ粒子または宿主細胞組成物の、注射用の使用のための好適な薬学的形態は、無菌水溶液または分散液を含む。いくつかの実施形態において、形態は無菌であり、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性である。いくつかの実施形態において、形態は、製造および保存の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物のコンタミネーション作用に対して守られる。キャリアは、例としては、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他同種のもの）、それらの好適な混合物、並びに／または、植物油を含有する、溶媒または分散媒であることができる。適切な流動度は、例としては、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されてもよい。
【００４３】
「キャリア」という用語は、ｒＡＡＶ粒子または宿主細胞と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水および油などの滅菌液であり得、油には、ミネラルオイルなどの石油、ピーナッツ油、大豆油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成による油が含まれる。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体キャリアとして使用することができる。
【００４４】
本開示の組成物は、治療される対象に、標準的なルートで投与され得、肺、鼻腔内、経口、吸入、非経口（例えば、静脈内、局所、経皮、皮内、経粘膜、腹腔内、筋肉内、関節内（ｉｎｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ）、眼窩内、硝子体内、心臓内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射）のルートを含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本開示の組成物は、様々なルートで眼に送達され得る。それらは、眼への局所的適用によって、または、眼内注射（例としては、硝子体（硝子体内注射）または網膜下（網膜下注射）の光受容細胞間隙（ｉｎｔｅｒ−ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｐａｃｅ）への眼内注射）によって、眼内へ送達され得る。いくつかの実施形態において、それらは桿体光受容細胞に送達される。あるいは、それらは、眼の周囲の組織に挿入または注射することによって局所的に送達されてもよい。それらは、経口ルートまたは皮下、静脈内もしくは筋肉内注射によって全身的に送達されてもよい。あるいは、それらは、カテーテルまたはインプラントによって送達されてもよく、当該インプラントは、シラスティックメンブレンもしくはファイバーなどの膜、生分解性ポリマー、またはタンパク質性材料を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン状材料から作製される。それらは、症状の発生に先立って、その発症を予防するために、例としては、眼の手術中、または病的状態の発生直後、または急性もしくは長期の症状の発症中に投与することができる。
【００４６】
注入可能な水溶液の投与のために、例としては、溶液は必要に応じて好適に緩衝されてよく、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされてよい。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下、および腹腔投与に好適である。これに関連して、使用することができる滅菌水性溶媒は、本開示に照らして当業者に知られている。例としては、一投与量を、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解して、１０００ｍｌの皮下点滴液に添加するか、または、提案された注入部位に注入する（例としては、“Remington's Pharmaceutical Sciences” 15th Editionの、1035-1038ページおよび1570-1580ページを参照されたい）。治療される対象の症状に応じて、投与量の多少の変動が必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与担当者は、個々の対象に対する適切な投与量を決定するだろう。さらに、ヒト投与のためには、製剤は無菌性、発熱原性、並びに、一般的な安全性および純度の基準を満たさなければならない（例えば、FDA Office of Biologicsの基準に従う）。
【００４７】
滅菌注射溶液は、ｒＡＡＶ粒子または宿主細胞を、必要に応じて上記に列挙したいくつかの他の成分と共に、適切な溶媒中に必要量加え、必要に応じてその後濾過滅菌することによって調製する。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、塩基性分散媒および上記に列挙したもの以外の他の必要成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製する。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分とを、予め滅菌濾過したその溶液から産生する、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００４８】
ｒＡＡＶ粒子、核酸ベクター、または宿主細胞組成物の量と、当該組成物の投与の時間は、本教示の利益を有する当業者の専門範囲内である。しかしながら、当該開示された組成物の治療的に有効な量の投与は、当該治療を受けている患者への単回投与によって、例としては治療上の利点を提供するのに十分な数の感染粒子の単回注射などによって、達成され得る。あるいは、いくつかの状況では、比較的短期間または比較的長期間にわたり、ｒＡＡＶ粒子または宿主細胞組成物の複数回または連続的投与を提供することが望ましい場合があり、これはこれらの組成物の投与を監督する医師によって決定され得ることである。
【００４９】
いくつかの実施形態において、桿体細胞は、細胞のロドプシン遺伝子発現のサイレンシングの際に、構造的に無傷のままであり、および／または、生存可能である。いくつかの実施形態において、細胞のロドプシン遺伝子発現がサイレンシングされた桿体細胞は、正常にロドプシンを含有する短縮された外節を有する。いくつかの実施形態において、外節の長さは、維持されるか、発現が本出願に記載される組成物を用いたサイレンシングに耐性である、外因的に加えられた（硬化）ロドプシン遺伝子を用いて、（例えば、部分的または完全に）回復され得る。
【００５０】
組成物は、ｒＡＡＶ粒子または宿主細胞を、単独で、または、天然のもしくは組換えの起源から得られ得るか、または、化学的に合成され得る、１つ以上のさらなる活性成分と組み合わせて、含むことができる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、同じ組成物で、または、同じ治療レジメンの一部として、ボルテゾミブまたはヒドロキシ尿素などのプロテアソーム阻害物質と組み合わせて、投与される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、疾患を「治療する」とは、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの徴候または症候の頻度または重症度を低減することを意味する。上記の組成物は、通常、有効量、すなわち、所望の結果を生み出すことができる量で、対象に投与される。所望の結果は、投与される活性物質に依存するであろう。例としては、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、異種核酸を、宿主の器官、組織、または細胞に移入することができる量であってよい。
【００５２】
本開示の方法において利用される組成物の毒性および有効性は、標準的な薬学的手順によって決定することができ、培養細胞または実験動物のいずれかを用いて、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）を決定する。毒性と有効性との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。有毒な副作用を示すものが使用されることがあるが、これらの副作用の潜在的な損傷を最小限にする送達システムを設計するように注意すべきである。本明細書に記載される組成物の投与量は、一般的に、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む範囲内にある。投与量は、用いられる投与形態および利用される投与ルートに応じて、この範囲内で変動し得る。
【００５３】
本開示の局面は、目的の遺伝子を含む１つ以上の核酸ベクターを様々な組織、器官および／または細胞に送達するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子に関する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、１つ以上のアミノ酸置換を含む、本明細書に記載されるｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、治療的ポリペプチドまたはタンパク質）をコードする。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、目的のＲＮＡ（例えば、治療的ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはリボザイム）をコードする。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は置換遺伝子（例えば、眼特異的遺伝子、機能性遺伝子、機能性ｒｈｏ遺伝子）である。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、目的のＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）および目的の置換遺伝子（例えば、眼特異的遺伝子、機能性遺伝子、機能性ｒｈｏ遺伝子）を、含むか、コードする。いくつかの実施形態において、機能性ｒｈｏ遺伝子は、目的のＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）によって分解されないようにさせる、サイレントヌクレオチド置換を含むｒｈｏ遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、目的のＲＮＡおよび目的の置換遺伝子は、同一のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、目的のＲＮＡおよび目的の置換遺伝子は、別のプロモーターの制御下にある。任意の好適なプロモーターを用いることができ、例としては、ウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶまたは他のウイルスプロモーター）、微生物（例えば、酵母または細菌）、または真核生物（例えば、哺乳動物）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子は、最低でも、（ａ）目的の遺伝子（例えば、目的のＲＮＡおよび／または目的の置換遺伝子）をコードする配列を含む１つ以上の異種核酸領域、および（ｂ）１つ以上の異種核酸領域に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、野生型ＩＴＲ配列、または操作されたＩＴＲ配列）を含む１つ以上の領域を含み得る。いくつかの実施形態において、核酸ベクターは、４ｋｂ〜５ｋｂの大きさ（例えば、４．２〜４．７ｋｂの大きさ）である。当該核酸ベクターは、本明細書に記載される修飾カプシドパク質を含み得るウイルスカプシド、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、またはＡＡＶ５カプシドによってカプシド形成され得る。いくつかの実施形態において、核酸ベクターは環状である。いくつかの実施形態において、核酸ベクターは一本鎖である。いくつかの実施形態において、核酸ベクターは二本鎖である。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸ベクターは、例としては、核酸ベクターの別の領域に相補的な核酸ベクターの領域を含有し、核酸ベクターの二本鎖の形成を開始させる、自己相補型ベクターであってよい。
【００５５】
ｒＡＡＶ粒子は、任意の誘導体またはシュードタイプを含む、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２／１、２／５、２／８、または２／９）であってよい。本明細書で用いられる場合、ｒＡＡＶウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の血清型は、組換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型を指す。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２ではない。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ２である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ６である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書に記載されるｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ６血清型である。誘導体およびシュードタイプの非限定的な例には、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５、ＡＡＶ−ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ−ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ−＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１、およびＡＡＶｒ３．４５が含まれる。これらのＡＡＶ血清型および誘導体／シュードタイプ、並びに、これらの誘導体／シュードタイプの生産方法は、当業界で知られている（例えば、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24.  The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads. Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ある血清型（例えば、ＡＡＶ２）由来のＩＴＲを含む核酸ベクター、および、（ｂ）別の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶ１０）由来のカプシドタンパク質からなるカプシドを含む、シュードタイプ化ｒＡＡＶ粒子である。シュードタイプ化ｒＡＡＶベクターの生産および使用方法は、当業界で知られている（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; および Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照されたい）。
【００５６】
ｒＡＡＶ粒子および核酸ベクターを生産する方法もまた、当業界で知られており、市販されている（例えば、Zolotukhin et al. 生産 and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167、米国特許出願公開第ＵＳ２００７００１５２３８号および第ＵＳ２０１２０３２２８６１号（これらは参照により本明細書に組み込まれる）、並びに、ＡＴＣＣおよびＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なプラスミドおよびキットを参照されたい）。例としては、当該核酸ベクターを含有するプラスミドは、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（例えば、本明細書に記載される改変ＶＰ３を含む、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする）を含有する、１つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせて、産生細胞株にトランスフェクトされてよく、それにより、ｒＡＡＶ粒子はパッケージされ、続いて精製できるようになる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、１つ以上のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子および（例えば、本明細書に記載されるｒＡＡＶカプシドタンパク質をコードする）ｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミドと、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドとを含む。いくつかの実施形態において、ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来するｒｅｐ遺伝子であり、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ２またはＡＡＶ６に由来し、本明細書に記載される改変カプシドタンパク質を生産するために、遺伝子への改変を含むことができる。ヘルパープラスミドと、これらのプラスミドの作製方法は、当業界で知られており、市販されている（例えば、PlasmidFactory, Bielefeld, Germany のｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド、Vector Biolabs, Philadelphia, PA; Cellbiolabs, San Diego, CA; Agilent Technologies, Santa Clara, Ca; および Addgene, Cambridge, MAから入手可能な他の製品およびサービス、ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998), Novel Tools for production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760; Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.; Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850; Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303;および Moullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照されたい)。
【００５８】
例示的で、非限定的な、ｒＡＡＶ粒子の生産方法を、次に記載する。ネイティブプロモーターの転写制御下に、所望のＡＡＶ血清型のｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦ、並びに、アデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）および、Ｅ４遺伝子を含む、１つ以上のヘルパープラスミドを生産するか、得る。ｃａｐＯＲＦはまた、本明細書に記載される改変カプシドタンパク質を生産するために１つ以上の改変を含む。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）に、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの脂質またはポリマー分子を介して、ヘルパープラスミドと、本明細書に記載される核酸ベクターを含有するプラスミドとを、トランスフェクトする。その後、ＨＥＫ細胞を、少なくとも６０時間培養して、ＡＡＶ粒子の生産を可能にする。または、別の例では、Ｓｆ９ベース安定産生細胞株を、核酸ベクターを含有する単一組換えバキュロウイルスに感染させる。さらに、別の例では、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株を、核酸ベクターを含有するＨＳＶ、並びに、場合により、ネイティブプロモーターの転写制御下に、本明細書に記載されるｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦと、アデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子とを含有する１つ以上のヘルパーＨＳＶに感染させる。その後、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞を、少なくとも６０時間培養して、ｒＡＡＶ粒子の生産を可能にする。その後、ｒＡＡＶ粒子は、当業界で知られるか、あるいは、本明細書に記載される任意の方法を用いて、例えば、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿により、精製することができる。
【００５９】
本開示はまた、開示されるｒＡＡＶ粒子または核酸ベクターの少なくとも１つを含む宿主細胞を企図している。これらの宿主細胞は、哺乳動物の宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞を含み、細胞培養または組織培養のいずれかで単離され得る。遺伝子組換え動物モデル（例えば、マウス）の場合、形質転換した宿主細胞は、非ヒト動物自体の体内に含まれ得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＣＤ３６＋赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）または赤芽球コロニー形成単位（ＣＦＵＥ−Ｅ）前駆細胞などの、赤血球系列の細胞である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、目的のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／または置換遺伝子）は、ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、目的のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／または置換遺伝子）は、脂質ナノ粒子に製剤化される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、目的のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／または置換遺伝子は、脂質−ポリカチオン複合体に製剤化され、カチオン性脂質ナノ粒子と呼ばれる。脂質ナノ粒子の形成は、当業界で知られる、および／または、米国特許出願公開第２０１２０１７８７０２号（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって、達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、カチオン性ペプチドまたはポリペプチド（限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチンおよび／またはポリアルギニンなど）、および、国際公開番号第ＷＯ２０１２０１３３２６号、または米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０１４２８１８号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるカチオン性ペプチドを含んでよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物（例えば、目的のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／または置換遺伝子）は、非カチオン性脂質（限定されないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など）を含む脂質ナノ粒子に製剤化される。
【実施例】
【００６１】
実施例１：ＲＨＯをノックダウンする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の特定
Ｋｈｖｏｒｏｖａらが記載した低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の設計原理４、５を使用して、１４個のｓｉＲＮＡを、イヌのｓｉＲＮＡを特異的に切断するように設計した。そのうち１２個は、ロドプシンのヒトｍＲＮＡも標的とする。先に進む前に、ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔユーティリティ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、ｓｉＲＮＡの２〜１９位をＮＣＢＩヒトＲｅｆＳｅｑデータベースに対してスクリーニングした。潜在的ｓｉＲＮＡのうち２つは、網膜で発現される可能性のある他の遺伝子とよく一致したため、除外した。１０種類のｓｉＲＮＡのＲＮＡバージョンを、コントロールとして使用する非ターゲティングｓｉＲＮＡと一緒に、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎに注文した。これらを、緑色蛍光蛋白質と融合したヒトＲＨＯ（ＧＦＰ、図１１に例示的なプラスミドマップを表す）を発現する細胞において試験し、緑色蛍光細胞の減少を、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）で測定した。その原理は、ＲＨＯ  ｍＲＮＡの切断がＧＦＰの生産を減少させることであった。全てのｓｉＲＮＡはｓｉＲＮＡの最新の設計原理に基づいて設計されたが、試験した１０個のうち３個のみが３０％以上の減少に至った（図１Ａ〜Ｃ）。
【００６２】
これらのｓｉＲＮＡがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから発現され、ＡＡＶによって送達される低分子ヘアピン型ＲＮＡとして有効であることを確認するために、ｓｈＲＮＡのＤＮＡ配列をクローニングして３つのｓｉＲＮＡを発現させた（図２）。興味深いことに、ｓｉＲＮＡ１３１（配列番号１）が最も有効なｓｉＲＮＡであったが、試験した当該ｓｈＲＮＡは最も効果が低かったため、ｓｉＲＮＡを用いたＲＨＯの相対的ノックダウンは、ｓｈＲＮＡを用いたＲＨＯの相対的抑制を正確に予測しなかった。ＲＮＡとしてのｓｉＲＮＡの単純なトランスフェクションは、転写およびプロセシングによって同じｓｉＲＮＡを生産するように設計されたｓｈＲＮＡの有効性を正確には予測できないであろう。
【００６３】
ｓｈＲＮＡが野生型（正常）および変異ＲＨＯの両方を切断するのに有効であることを確認するために、ＡＡＶベクターにクローニングした３個の同じｓｈＲＮＡを、野生型および２個の異なる変異ＲＨＯｍＲＮＡを消化する能力について、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をアッセイとして用いて、試験した（図３）。
【００６４】
表５は、センス鎖、ループ、アンチセンス鎖および突出を含む、ＲＨＯを切断することができると特定されたｓｈＲＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を示す。各配列には太字と下線で強調表示された２つの別のループ配列が表されており、イタリック体と下線で強調表示された突出が表されている。
【表６】
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【００６５】
ｓｉＲＮＡはまた、例えば図４の構造の人工ｍｉｃｒｏＲＮＡ７として送達され得る。図４の例示的なｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＨＯ１３１のセンス鎖（１００）およびアンチセンス（１０１）を含む（それぞれ、配列番号１および２）。この発現様式の利点は、ｓｉＲＮＡの生産が特定のプロモーター配列の使用によって細胞型特異的にされ得ることである。この場合、ヒトロドプシン遺伝子の近位プロモーターまたはヒトロドプシンキナーゼプロモーターは、光受容細胞への発現を制限するために使用されるであろう。
【００６６】
実施例２：ＲＨＯ＋／＋イヌにおけるＲＨＯノックダウン（ＫＤ）の解析
イヌ２１９０（ｒｃｄ１  キャリア）は、表６に示した濃度で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ１３の網膜下注射を受けた。イヌは注射後８週間で屠殺した。いくつかの３ｍｍの神経網膜生検パンチを、それぞれの眼から、ブレブ（ブレブ）および非ブレブ領域の両方から回収した。
【表７】
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【００６７】
本明細書に記載されるＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ  構築物の非限定的な例はまた、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＭＯＰ５００  ｒＧＦＰ−ｓｈＲＮＡ構築物とも呼ばれ得る。ＡＡＶ２／５は、該ｓｈＲＮＡをコードする核酸が、ＡＡＶ２  ＩＴＲに隣接しており、ＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子で提供されることを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の干渉ＲＮＡと、本明細書に記載される任意の組換えｒｈｏ遺伝子は、あるｒＡＡＶ粒子内（例えば、ＡＡＶ５  カプシドタンパク質を含む）の、同じＡＡＶ核酸上（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲに隣接する）で提供され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の干渉ＲＮＡと、本明細書に記載される任意の組換えｒｈｏ遺伝子は、異なるｒＡＡＶ粒子でカプシド形成された（例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むもの、または、異なるＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質を有するもの）、異なるＡＡＶ核酸上（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲに隣接するもの、または、異なるＡＡＶ血清型由来のＩＴＲに隣接するもの）で提供され得る。
【００６８】
ウェスタンブロット解析:
各眼の２つの生検パンチ（ブレブ領域または非ブレブ領域のいずれかを表す）を、５０μｌのＬｅｗｉｎ緩衝液Ａ（プロテアーゼ阻害物質を含む）中で、氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを４０％振幅、１５秒／１０秒オフ×８パルスで超音波処理した。次に、サンプルを遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。総タンパク質のうち１μｇをイムノブロットして、ロドプシンを可視化し（使用した抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３５６、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈）、抗ヒストン個抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１、１：３０００に希釈）をローディングコントロールとして用い（図５Ａ）、シグナルを標準化した（図５Ｂ）。ブレブ領域と非ブレブ領域との間のＲＨＯタンパク質量の比較は、実験デザインと一致しなかった（図５Ｃ）。
【００６９】
イヌの網膜におけるイヌのロドプシンＲＮＡの絶対定量：
リボザイム治療後の網膜に存在するロドプシンＲＮＡの絶対量を定量するために、Ｑ−ＰＣＲ標準曲線法を用いて、絶対定量を行った。イヌのＲＨＯｃＤＮＡの既知量の希釈系列を用いて、標準曲線を構築した。各サンプル中のイヌのＲＨＯ  ＲＮＡの総量を、この標準曲線に基づいて計算した（図６Ａ）。
【００７０】
イヌのＲＨＯの部分的ノックダウンは、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ１３１で見られる。使用した最高濃度では、タンパク質レベルは３７％低下し、ＲＮＡはほぼ５０％減少する（図６Ｂ）
【００７１】
実施例：ＲＨＯ＋／＋イヌにおけるＲＨＯノックダウンのさらなる解析
イヌ２１９４（ｒｃｄ１キャリア）は、表７に示した濃度で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ８１０の網膜下注射を受けた。イヌは注射後８週間で屠殺した。いくつかの３ｍｍの神経網膜生検パンチを、それぞれの眼から、ブレブ（ブレブ）および非ブレブ領域の両方から回収した。
【表８】
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【００７２】
ウェスタンブロット解析: 
各眼の２つの生検パンチ（ブレブ領域または非ブレブ領域のいずれかを表す）を、５０μｌのＬｅｗｉｎ緩衝液Ａ（プロテアーゼ阻害物質を含む）中で、氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを４０％振幅、１５秒／１０秒オフ×８パルスで超音波処理した。次に、サンプルを遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。総タンパク質のうち１μｇをイムノブロットして、ロドプシンを可視化し（使用した抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３５６、ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ブロッキングバッファーで１：１０００に希釈）、抗ヒストン個抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１、１：３０００に希釈）をローディングコントロールとして用い（図７Ａ）、シグナルを標準化した（図７Ｂ）。ブレブ領域と非ブレブ領域との間のＲＨＯタンパク質量の比較は、実験デザインと一致しなかった（図７Ｃ）。
【００７３】
イヌの網膜におけるイヌのロドプシンＲＮＡの絶対定量: 
リボザイム治療後の網膜に存在するロドプシンＲＮＡの絶対量を定量するために、Ｑ−ＰＣＲ標準曲線法を用いて、絶対定量を行った。イヌのＲＨＯｃＤＮＡの既知量の希釈系列を用いて、標準曲線を構築した。各サンプル中のイヌのＲＨＯ  ＲＮＡの総量を、この標準曲線に基づいて計算した（図８Ａ）。
【００７４】
イヌＲＨＯＲＮＡおよびタンパク質の完全なノックダウンが、１×１０１２ｖｇ／ｍｌというより低用量でも、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ８２０で見られる（図８Ｂ）。
【００７５】
実施例４：置換遺伝子の硬化ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態において、置換遺伝子（例えば、置換ＲＨＯ）のｍＲＮＡは、「硬化させる」（すなわち、ｓｉＲＮＡによる分解に耐性を持たせる）ために、１つ以上の位置で改変され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のサイレントヌクレオチド置換が、内在性遺伝子（例えば、ｒｈｏ遺伝子）をノックダウンするために提供されるｓｉＲＮＡに関連する置換遺伝子に含まれ得る。図９および図１０は、置換ＲＨＯｍＲＮＡに導入され得るヌクレオチド置換の非限定的な例を提供する。置換ｒｈｏ遺伝子は、これらの置換の１つ以上を含むことができることを理解されたい。
【００７６】
図９は、各ｓｈＲＮＡと、内在性ヒトＲＨＯｍＲＮＡまたは硬化ＲＨＯｍＲＮＡの標的配列との間で生じる塩基対形成の描写を示す。全てのｓｈＲＮＡは、イヌのＲＨＯｍＲＮＡの標的配列と、完全に塩基対を形成する。白四角：ｓｈＲＮＡと、内在性イヌＲＨＯｍＲＮＡ並びに硬化ＲＨＯｍＲＮＡとの間のミスマッチ。濃灰色四角：ＲＮＡのグアノシンとウラシルとの間に生じる弱いゆらぎ塩基対形成。薄灰色四角：ｓｈＲＮＡと硬化ＲＨＯｍＲＮＡとの間のみのミスマッチ。
【００７７】
図１０は、ｓｈＲＮＡ１３４と、内在性ヒトＲＨＯ１３１ｍＲＮＡまたは硬化ＲＨＯ１３１ｍＲＮＡの標的配列との間で生じる塩基対形成の描写を示す。ｓｈＲＮＡ１３１および１３４の標的配列の近接は、同じ硬化ＲＨＯ１３１を使用することを可能にする。濃灰色四角：ＲＮＡのグアノシンとウラシルとの間に生じる弱いゆらぎ塩基対形成。薄灰色四角：ｓｈＲＮＡと硬化ＲＨＯｍＲＮＡとの間のみのミスマッチ。
【００７８】
実施例５：ｓｉＲＮＡと置換遺伝子のコード
いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターにコードされたｓｉＲＮＡを提供することが望ましい場合がある。図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＤＮＡベクターにコードされたｓｉＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）の非限定的な例を表す。いくつかの実施形態において、図１２Ａおよび図１２Ｂに示す例示的なプラスミドマップにさらに表されているように、ＤＮＡベクターはさらに、ｓｉＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ）に隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列が隣接するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡベクターは、ｓｉＲＮＡを含む組換えＡＡＶ粒子の生産において用いられ得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターにコードされた置換ＲＨＯｍＲＮＡを提供することが望ましい。図１２Ｃは、ＤＮＡベクターにコードされた置換ＲＨＯｍＲＮＡの非限定的な例を表す。いくつかの実施形態において、図１２Ｃに示す例示的なプラスミドマップにさらに表されているように、ＤＮＡベクターはさらに、置換ＲＨＯ ｍＲＮＡ（例えば、ヒトＲＨＯ）に隣接するＩＴＲ配列をコードし得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列が隣接する置換ＲＨＯｍＲＮＡをコードするＤＮＡベクターは、ヒトｒｈｏを含む組換えＡＡＶ粒子の生産において用いられ得る。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列に隣接する、置換ｒｈｏ遺伝子と１つ以上の干渉ＲＮＡをコードする１つ以上の配列とを共に含む同様のＤＮＡベクターが、提供され得る。いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡおよび／または置換ｒｈｏ遺伝子は、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、またはＨ１ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、または本出願に記載される他のプロモーター）に作動可能に結合している。図１２Ａ〜図１２Ｃに表される干渉ＲＮＡおよび／または置換ｒｈｏ遺伝子は、Ｈ１ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下にある。図１２Ａ〜図１２Ｃの構築物はまた、ＭＯＰ５００−ｒＧＦＰ（ＧＦＰの逆配列（ｒＧＦＰ、それゆえ発現されない）の上流の、マウス桿体オプシンプロモーター（ＭＯＰ５００）の−３８５／＋８６部分）を含み、Ｈ１構築物またはＭＯＰ５００構築物とも呼ばれ得る。しかしながら、ＭＯＰ５００（例えば、ＭＯＰ５００−ｒＧＦＰ）部分は、必要ではない。従って、プラスミドまたはｒＡＡＶ核酸は、本明細書に記載される干渉ＲＮＡおよび／または改変ｒｈｏ遺伝子を、それぞれ、同じ、または異なるプロモーター（例えば、Ｈ１プロモーター）の制御下で、マウスオプシンプロモーターを有さずに、および／または、任意のＧＦＰコード配列を（いずれの向きでも）有さずに、コードすることができる。
【００８０】
実施例６：野生型ＲＨＯ＋／＋イヌにおける、ｓｈＲＮＡ８２０でのＲＨＯノックダウンの解析
実施例６は、野生型イヌにおいて網膜下注射後にロドプシン発現を効率的に抑制するｓｈＲＮＡ８２０ノックダウン試薬を保有するＡＡＶ２／５のウイルス力価の特定、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による網膜下注射後の、光受容細胞を含有する層（ＯＮＬ）は保存されるが、ロドプシンを含有する層が減少することの、野生型イヌにおけるインビボ網膜イメージングによる証明、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ、ＲＨＯ−ＡＤＲＰの自然発生モデルにおいて、網膜下注射後にロドプシン発現を効率的に抑制するｓｈＲＮＡ８２０ノックダウン試薬を保有するＡＡＶ２／５のウイルス力価の特定、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおいて、光受容細胞に、光誘発性網膜変性からの防御を付与するＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０のウイルス力価の特定、ロドプシン発現の効率的ノックダウンが桿体において外節の欠損を引き起こすという証明を含む。外節の保存は光伝達にとって重要であるため（桿体が光を電気信号に変換するメカニズム）、ＲＨＯ−ＡＤＲＰのための最適な治療は、天然のＲＨＯを減少させるが、外節構造は保存するべきである。これらの結果は、ノックダウン手法が十分ではないことを実証しており、ノックダウンおよび置換戦略の組み合わせの使用を主張している。
【００８１】
５匹の野生型ＲＨＯ＋／＋イヌは、以下の表８に示したように、１ｘ１０１１〜５ｘ１０１２の範囲のウイルス濃度で、両眼にＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ８２０の網膜下注射を受けた。
【表９】
2019511216.tif 000011
【００８２】
注射の６〜８週間後に、インビボ網膜イメージング（ｃＳＬＯ／ＯＣＴ）を行い、次いで、イヌを屠殺した。いくつかの３ｍｍ神経網膜生検パンチを、両眼から（イヌ２１９４）またはＯＳ眼のみから（他のイヌ）、ブレブ／処理および非ブレブ／非処理領域の両方において回収して、ウェスタンブロットによりイヌのロドプシンの発現レベルを、ｑＰＣＲ解析によりＲＨＯ  ＲＮＡの発現レベルを測定した。ＯＤ眼を固定し、最適な切断温度の培地に包埋し、組織学および免疫組織化学染色のために処理した。
【００８３】
ウェスタンブロット解析: 
最大で３組の生検パンチ（ブレブ領域または非ブレブ領域のいずれかを表す）を、５０μｌのＬｅｗｉｎ緩衝液Ａ（プロテアーゼ阻害物質を含有）中で、氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを４０％振幅、１５秒／１０秒オフ×８パルスで超音波処理した。次に、サンプルを遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。サンプルは、−２０℃で保管した。ロドプシンを可視化するために、総タンパク質のうち１μｇをゲルにロードした（使用した抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３５６、ＯＤＹＳＳＥＹブロッキングバッファーで１：１０００に希釈）。抗ヒストンＨ３抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１、１：３０００に希釈）を、ローディングコントロールとして用いて、シグナルを標準化した。
【００８４】
イヌの網膜におけるイヌのロドプシンＲＮＡの絶対定量: 
ｓｈＲＮＡ８２０治療後の網膜に存在するロドプシンＲＮＡの絶対量を決定するために、Ｑ−ＰＣＲ標準曲線法を用いて、絶対定量を行った。イヌのＲＨＯｃＤＮＡの既知量の希釈系列を用いて、標準曲線を構築した。総ｃＤＮＡのうち０．１ナノグラムを定量に使用した。各サンプル中のイヌのＲＨＯ  ＲＮＡの総量を、この標準曲線に基づいて計算した。
【００８５】
異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した野生型ＲＨＯ＋／＋イヌの目の網膜の完全性のインビボ網膜イメージングによる評価。
異なる力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０の網膜下注射後６〜８週間の、網膜のＯＮＬの完全性を評価するのに、ｃＳＬＯ／ＯＣＴによるインビボ網膜イメージングを用いた。ＯＮＬの厚さの組織分布図は、すべての力価でのこの層の保存を示した。外境界膜（ＥＬＭ）、内節（ＩＳ）および外節（ＯＳ）のセグメンテーションは、１ｘ１０１２および５ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌの力価を注射した眼のブレブ領域に対応する領域におけるシグナル強度の低下を明らかにした。これらの結果は、これらの結果は、ＲＨＯサイレングの結果としての光受容細胞ＯＳおよびＩＳの短縮を示唆し、インビボでのＲＨＯノックダウンの有効性を評価するために使用され得る。図１３Ａ〜図１３Ｅは、野生型ＲＨＯ＋／＋イヌにおける、網膜下に注射された異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による、ロドプシンノックダウンのＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。図１３Ａは、ウェスタンブロット解析およびＲＮＡ定量に使用された生検パンチの位置を示す網膜地図を示す。対になった、濃灰色、灰色、ドットの丸は、ウェスタンブロットの各複製のためのブレブ／処理および非ブレブ処理領域における、生検パンチの位置を示しており、一方で、黒丸は、ＲＮＡ定量のための生検パンチの位置を示す。図１３Ｂは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、処理領域内に残存するイヌのロドプシンＲＮＡを示す棒グラフを示す。図１３Ｃは、イヌの網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域から取得した生検パンチにおけるロドプシンの量を示す免疫ブロットを示す。ヒストンＨ３を標準化のために用いた。棒グラフは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、残存するイヌのロドプシンタンパク質を示す。図１３Ｄ〜図１３Ｅは、各実験の数値を示す表を示す（ＲＮＡまたはタンパク質の残存率、あるいはＲＮＡまたはタンパク質のノックダウン率として、それぞれ報告されている）。
【００８６】
図１４Ａ〜図１４Ｄは、野生型イヌにおける、異なる力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０の網膜下注射後の、ＯＮＬおよびＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳ完全性の評価を示す。図１４Ａは、ＯＮＬの厚さの図を示す；図１４Ｂは、ＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳの標準化強度の図を示す；図１４Ｃは、ＯＮＬの厚さの値を示す；および、図１４Ｄは、ＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳ層の標準化強度の値を示す。これらの結果は、ＲＨＯサイレングの結果としての光受容細胞ＯＳおよびＩＳの短縮を示唆し、インビボでのＲＨＯノックダウンの有効性を評価するために使用され得る。
【００８７】
イヌのＲＨＯＲＮＡおよびタンパク質の完全なノックダウンが、１ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌの低さのウイルス力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を網膜下に注射した野生型イヌで見られた。最も高いウイルス濃度であってもＯＮＬの厚さの減少は見られず、ロドプシンのノックダウンが光受容細胞死を誘導しないことを示唆した。ロドプシンの１００％ＫＤを誘導する高いウイルス力価で注射した眼の処理／ブレブ領域において、ＥＬＭ／ＩＳ／ＯＳ層のＯＣＴ反射率の減少が見られる。この知見は、これらの層の薄さに適合し、ノックダウン効率のインビボ結果測定として使用することができる。
【００８８】
実施例７：ＲＨＯＴ４Ｒ／＋変異イヌにおける、ｓｈＲＮＡ８２０によるＲＨＯノックダウンの解析
４匹のＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌは、以下の表９に示したウイルス濃度で、両眼にＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ８２０の網膜下注射を受けた。
【表１０】
2019511216.tif 000012
【００８９】
注射の８週間後に、ｃＳＬＯ／ＯＣＴを実施し、光誘発性網膜変性を誘発するために、全てのイヌでＯＳ眼に対して光照射（１ｍＷ／ｃｍ２で１分）を実施した。光照射の２週間後に全てのイヌについてｃＳＬＯ／ＯＣＴを再度実施し、治療によって与えられたレスキュー効果を評価した。イヌを屠殺し、いくつかの３ｍｍ神経網膜生検パンチを、ＯＤ眼から、ブレブ／処理および非ブレブ／非処理領域の両方から回収して、ウェスタンブロットによりイヌのロドプシンの発現レベルを、ｑＰＣＲ解析によりＲＨＯ  ＲＮＡの発現レベルを測定した。ＯＳ眼を固定して、最適な切断温度の培地に包埋し、組織学および免疫組織化学染色のために処理した。
【００９０】
ウェスタンブロット解析:
各ＯＳ眼由来の、３組の生検パンチ（ブレブ／処理または非ブレブ／非処理網膜領域のいずれかを表す）を、５０μｌのＬｅｗｉｎ緩衝液Ａ（プロテアーゼ阻害物質を含有）中で、氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを４０％振幅、１５秒／１０秒オフ×８パルスで超音波処理した。次に、サンプルを遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。サンプルは、−２０℃で保管した。ロドプシンを可視化するために、総タンパク質のうち１μｇをゲルにロードした(使用した抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３５６、ＯＤＹＳＳＥＹブロッキングバッファーで１：１０００に希釈)。抗ヒストンＨ３抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１、１：３０００に希釈）を、ローディングコントロールとして用いて、シグナルを標準化した。
【００９１】
イヌの網膜におけるイヌのロドプシンＲＮＡの絶対定量:
ＳｈＲＮＡ８２０治療後の網膜に存在するロドプシンＲＮＡの絶対量を決定するために、Ｑ−ＰＣＲ標準曲線法を用いて、絶対定量を行った。イヌのＲＨＯｃＤＮＡの既知量の希釈系列を用いて、標準曲線を構築した。総ｃＤＮＡのうち０．１ナノグラムを定量に使用した。各サンプル中のイヌのＲＨＯ  ＲＮＡの総量を、この標準曲線に基づいて計算した。
【００９２】
異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの眼における、光誘発性ダメージからの光受容細胞レスキューの、インビボ網膜イメージングによる評価。
１ｘ１０１２から１ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの範囲のウイルス力価で、網膜下に注射した変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ由来の眼を、注射の８週間後（光照射前）に、ｃＳＬＯ／ＯＣＴイメージングにより調べた。ブレブ／処理領域におけるＯＮＬの厚さは保存され、ｓｈＲＮＡ８２０がその期間に光受容細胞の損失を引き起こさなかったことを示唆した。ＲＨＯ  Ｔ４Ｒ突然変異体において急性の網膜変性を引き起こすが、野生型イヌでは引き起こさないことが以前に示された強度（１ｍＷ／ｃｍ２の角膜放射照度）での白色光の１分間の照射を、処理／ブレブ領域におけるＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０によって与えられる防御レベルを評価するために使用した。周囲の非ブレブ／非処理領域を、各眼に対する内部標準として使用した。光照射の２週間後、網膜を再度イメージングし、１ｘ１０１２および５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価で注射した眼のブレブ／処理領域において、ＯＮＬの厚さの良好な保存を示した。非常に緩やかなレスキューが２．５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価において見られ、１ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価では見られなかった。
【００９３】
図１５Ａ〜図１５Ｅは、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおける、網膜下に注射された異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による、ロドプシンノックダウンのＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。図１５Ａは、ウェスタンブロット解析およびＲＮＡ定量に使用された生検パンチの位置を示す網膜地図を示す。対になった、濃灰色、灰色およびドットの丸は、ウェスタンブロットの各複製のためのブレブおよび非ブレブ領域における、生検パンチの位置を示しており、一方で、黒丸は、ＲＮＡ定量のための生検パンチの位置を示す。図１５Ｂは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、残存するイヌのロドプシンＲＮＡ量を示す棒グラフである。図１５Ｃは、イヌの網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域から取得した生検パンチにおけるイヌのロドプシンの量を示す免疫ブロットである。ヒストンＨ３を標準化のために用いた。棒グラフは、同じ網膜の非処理領域で測定されたレベルのパーセンテージとして、残存するイヌのロドプシンタンパク質量を示す。図１５Ｄ〜図１５Ｅは、各実験の数値を示す表である(ＲＮＡまたはタンパク質の残存率、あるいはＲＮＡまたはタンパク質のノックダウン率として、それぞれ報告されている)。
【００９４】
図１６Ａ〜図１６Ｄは、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおいて急性網膜変性を引き起こす短時間の光照射に暴露してから２週間後の、ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの、（異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による）処理網膜領域および非処理網膜領域を含むＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。（図１６Ａ）１ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。（図１６Ｂ）５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。（図１６Ｃ）２．５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。（図１６Ｄ）１ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで処理したイヌのＯＣＴスキャン。図１７Ａ−図１７Ｂは、光誘発性網膜変性からの防御を示す、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ｓｈＲＮＡ８２０で処理したＲＨＯＴ４Ｒ／＋由来の、ＯＮＬの厚さの組織分布図を示す。（図１７Ａ）非処理の野生型コントロールイヌのＯＮＬの厚さの図（左図）、および、５Ｅ＋１１ｖｇ／ｍｌでＡＡＶ２／５−ｓｃ−ｓｈＲＮＡ８２０により処理したＥＭ４１１−ＯＳのＯＮＬの厚さの図であり、光誘発性ダメージ後数週間は、処理／ブレブ領域においてＯＮＬの厚さが保存されることを示す。白黒曲線は、網膜下注射直後に見られるブレブの境界を示す。下のパネルは、視覚化のために、ＯＮＬが濃灰色で色付けされた（中間のバンド）ＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。（図１７Ｂ）ブレブの外側および内側の部位を、ＯＮＬの厚さ測定のために選択した。
【００９５】
イヌのＲＨＯＲＮＡおよびタンパク質の完全なノックダウンが（ウェスタンブロットにより）、１ｘ１０１２および５ｘ１０１ｖｇ／ｍｌのウイルス力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ８２０により、見られた。光受容細胞の細胞体を含む外顆粒層（ＯＮＬ）の完全なレスキューは、１ｘ１０１２および５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌのウイルス力価でＡＡＶ２／５−ｓｈＲＮＡ−Ｒｈｏ８２０により達成された。
【００９６】
異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの眼における、光誘発性ダメージからの光受容細胞の防御の、組織学および免疫組織化学による評価。
１ｘ１０１２から１ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの範囲のウイルス力価で、網膜下に注射し、続いて、ある強度（１ｍＷ／ｃｍ２の角膜放射照度）で、白色光により１分間光照射した（注射の８週間後）、上表に示した同一の変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ由来の眼を調べた。この照射量は、ＲＨＯ  Ｔ４Ｒ変異体において急性の網膜変性を引き起こすが、野生型イヌでは引き起こさないことが以前に示されている。組織学および免疫組織学を用いて、処理／ブレブ領域におけるＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０によって与えられる防御レベルを評価した。周囲の非ブレブ／非処理領域を、各眼に対する内部標準として使用した。ロドプシン（ＲＨＯ）およびヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）に対する抗体を用いて、桿体外節および錐体の形態の完全性を評価した。図１８は、異なるウイルス力価のＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を網膜下に注射した、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域における、組織学（ＨＥ染色）および免疫組織化学を示す（ロドプシンは緑に染色され、図１８の下図ではより薄い染色として現れている；ヒト錐体アレスチンは赤に染色され、図１８の下図では灰色の染色として現れている）。光照射の２週間後、１ｘ１０１２および５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価で注射した眼のブレブ／処理領域において、ＯＮＬの厚さの良好な保存がみられたが、２．５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌではＯＮＬの厚さはわずかに減少し、１ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価では防御が見られなかった。１ｘ１０１２および５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌ力価でのロドプシン発現の非常に効率的なノックダウンと一致して、ロドプシン発現の減少と組み合わせて、桿体細胞ＯＳの長さの減少がＨＥ切片で見られた
【００９７】
イヌのＲＨＯＲＮＡおよびタンパク質の完全なノックダウンが（ウェスタンブロットにより）、１ｘ１０１２および５ｘ１０１ｖｇ／ｍｌのウイルス力価で、ＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により、見られた。光受容細胞の細胞体を含む外顆粒層（ＯＮＬ）の完全な防御は、１ｘ１０１２および５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌのウイルス力価でＡＡＶ２／５−ｓｃ−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により達成された。効率的なＲＨＯノックダウンの結果としての桿体の外節構造の損失は、処理された桿体が外節を保持し、機能性を維持できるように、ノックダウンと置換戦略の組み合わせの必要性を主張する。
【００９８】
実施例８
本実施例は、ＲＨＯ−ＡＤＲＰを用いた遺伝子療法をサポートするデータを提供する。ｓｈＲＮＡ８２０ノックダウン試薬と置換試薬ＲＨＯ８２０（＝硬化ヒトＲＨＯｍＲＮＡ）の両方を組み合わせたＡＡＶ２／５ベクター構築物（ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０）を、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌで試験すること、内在性のイヌのＲＨＯの効率的ノックダウン、および、置換硬化ヒトＲＨＯ（ＲＨＯ８２０）の効率的発現をもたらす、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０のウイルス力価を特定すること、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０が、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおける光受容細胞に光誘発性網膜変性からの防御を付与するという証明、およびＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０で処理した網膜領域において桿体外節の保存が達成されているという証明を含む。
【００９９】
ＲＨＯＴ４Ｒ／＋変異イヌにおける、ｓｈＲＮＡ８２０およびＲＨＯ８２０による、ＲＨＯノックダウンおよび置換の解析：
２匹のＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌは、以下の表（表１０）に示したウイルス濃度で、両眼にＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０の網膜下注射を受けた。
【表１１】
2019511216.tif 000013
【０１００】
注射の１１週間後に、インビボ網膜イメージング（ｃＳＬＯ／ＯＣＴ）を実施し、光誘発性網膜変性を誘発するために、両方のイヌでＯＳ眼に対して光照射（１ｍＷ／ｃｍ２で１分）を実施した。照射の２週間後に全てのイヌについてｃＳＬＯ／ＯＣＴを再度実施し、治療によって与えられたレスキュー効果を評価した。イヌを屠殺し、いくつかの３ｍｍ神経網膜生検パンチを、ＯＤ眼から、ブレブ／処理および非ブレブ／非処理領域の両方から回収して、ウェスタンブロットによりロドプシンの発現レベルを、ｑＰＣＲ解析によりイヌおよびヒトのＲＨＯ  ＲＮＡの発現レベルを測定した。ＯＳ眼を固定して、最適な切断温度の培地に包埋し、組織学および免疫組織化学染色のために処理した。
【０１０１】
ウェスタンブロット解析:
各ＯＤ眼由来の、３組の生検パンチ（ブレブ／処理または非ブレブ／非処理網膜領域のいずれかを表す）を、５０μｌのＬｅｗｉｎ緩衝液Ａ（プロテアーゼ阻害物質を含有）中で、氷上で１５分間インキュベートした。サンプルを４０％振幅、１５秒／１０秒オフ×８パルスで超音波処理した。次に、サンプルを遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。サンプルは、−２０℃で保管した。ロドプシンを可視化するために、総タンパク質のうち１μｇをゲルにロードした(使用した抗体：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ５３５６、ＯＤＹＳＳＥＹブロッキングバッファーで１：１０００に希釈)。該抗体は、イヌのＲＨＯおよびヒトのＲＨＯを共に検出することに留意されたい。Ａｓｎ２でのグリコシル化の喪失のために、変異Ｔ４Ｒロドプシンは、免疫ブロットで検出できるより低い分子量（ＭＷ）を有するので、野生型の（イヌまたはヒトの）ＲＨＯタンパク質と区別することができる。従って、ヘテロ接合変異体ＲＨＯＴ４Ｒ／＋からのＲＨＯ免疫ブロットは、野生型（高分子量）ＲＨＯタンパク質および変異Ｔ４Ｒ（低分子量）ＲＨＯタンパク質に対応する２つのバンドを示す。抗ヒストンＨ３抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ１７９１、１：３０００に希釈）を、ローディングコントロールとして用いて、シグナルを標準化した。
【０１０２】
イヌの網膜におけるイヌおよびヒトのロドプシンＲＮＡの絶対定量:
ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による治療後の網膜に存在する、内在性のイヌのロドプシンＲＮＡおよびヒトのＲＨＯ８２０ＲＮＡの絶対量を決定するために、Ｑ−ＰＣＲ標準曲線法を用いて、絶対定量を行った。イヌおよびヒトのＲＨＯｃＤＮＡの既知量の希釈系列を用いて、標準曲線を構築した。総ｃＤＮＡのうち０．１ナノグラムを定量に使用した。各サンプル中のイヌのＲＨＯおよびヒトＲＨＯ８２０のＲＮＡの総量を、この標準曲線に基づいて計算した。
【０１０３】
図１９Ａ〜図１９Ｆは、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌにおける、５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価で網膜下に注射されたＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０による、ロドプシンのノックダウンおよび置換のＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。対になった、濃灰色、灰色、ドットの丸は、ウェスタンブロットの各複製のための処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域における、生検パンチの位置を示しており、一方で、黒丸は、ＲＮＡ定量のための生検パンチの位置を示す。図１９Ｂは、イヌの網膜の処理（Ｔｘ）および非処理（ＵｎＴｘ）領域から取得した生検パンチにおける総ロドプシン量（イヌ＋ヒトＲＨＯ８２０）を示す免疫ブロットを示す。ヒストンＨ３を標準化のために用いた。棒グラフは、処理および非処理領域におけるイヌのロドプシンタンパク質の残存率を示す。ＥＭ４２４−ＯＤおよびＥＭ４２５−ＯＤの処理領域におけるより低い分子量のバンド（変異Ｔ４Ｒ  ＲＨＯタンパク質に対応する）の消失に留意されたい。図１９Ｃは、タンパク質定量のために用いられるパンチの各対に対する数値を示す表である。図１９Ｄは、非処理領域で測定されるイヌのＲＨＯ  ＲＮＡのパーセンテージとして、処理領域における残存するイヌのロドプシンＲＮＡを示す棒グラフである。図１９Ｅは、非処理領域で測定されるイヌのＲＨＯ  ＲＮＡのパーセンテージとして、処理領域におけるヒト  ＲＨＯ８２０を示す棒グラフである。図１９Ｆは、ＲＮＡ定量のために用いられるパンチの各対に対する数値を示す表である。
【０１０４】
５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌで、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を網膜下に注射した変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの眼における、光誘発性ダメージからの光受容細胞の防御の、インビボ網膜イメージングによる評価：
５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌのウイルス力価で、網膜下に注射した２匹の変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ由来の眼を、注射前、注射の１１週間後（光照射前）、および光ダメージの２週間後に、ｃＳＬＯ／ＯＣＴイメージングにより調べた。ＲＨＯ  Ｔ４Ｒ突然変異体において急性の網膜変性を引き起こすが、野生型イヌでは引き起こさないことが以前に示された強度（１ｍＷ／ｃｍ２の角膜放射照度）での白色光の１分間の照射を、処理／ブレブ領域におけるＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０ベクターによって与えられる防御レベルを評価するために使用した。ブレブ／処理領域におけるONLの厚さは、注射後の全ての時点で保存され、当該ベクター構築物が毒性がないこと、および、その期間に光受容細胞の損失がないことを示唆した。周囲の非ブレブ／非処理領域を、各眼に対する内部標準として使用した。光照射の２週間後、注射した両方の眼の、ブレブ／処理領域において、ＯＮＬの厚さが完全に保存されていた。
【０１０５】
図２０Ａ〜図２０Ｃは、５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により処理した、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋網膜の領域における、光誘発性網膜変性からの防御を示す、インビボ網膜イメージングを示す。図２０Ａは、光照射の２週間後の、変性から防御された網膜領域（白矢印によって区切られた境界）を示す、正面の（ｅｎ  ｆａｃｅ）ｃＳＬＯ合成画像を示す。薄灰色矢印は、図２０Ｂで示されたＯＣＴ  Ｂスキャンの処理領域の範囲内の位置を示し、濃灰色矢印は、図２０Ｃで示されたＯＣＴ  Ｂスキャンの非処理領域の範囲内の位置を示す。図２０Ｂは、注射前、注射の１１週間後、および注射の１３週間後／光照射の２週間後の、処理領域の範囲内のＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。ＯＮＬの厚さは、ウイルスベクター注射後の両方の時点における処理領域全体に渡って、保存されている。図２０Ｂおよび図３０Ｖは、注射前、注射の１１週間後、および注射の１３週間後／光照射の２週間後の、非処理領域の範囲内のＯＣＴ  Ｂスキャンを示す。ＯＮＬは、注射の１１週間後まで保存されているが、光照射の２週間後には完全に失われている。図２１は、光誘発性網膜変性からの防御を示す、５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価でＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により処理した２つのＲＨＯＴ４Ｒ／＋由来の、ＯＮＬの厚さの組織分布図を示す。
【０１０６】
５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を注射した変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌの眼における、光誘発性ダメージからの光受容細胞の防御の、組織学および免疫組織化学による評価：
５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価で、網膜下にＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を注射し、続いて、ある強度（１ｍＷ／ｃｍ２の角膜放射照度）で、白色光により１分間光照射した（注射の１１週間後）、上表に示した同一の変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋イヌ由来の眼を調べた。この照射量は、ＲＨＯ  Ｔ４Ｒ変異体において急性の網膜変性を引き起こすが、野生型イヌでは引き起こさないことが以前に示されている。
【０１０７】
免疫組織学を用いて、処理／ブレブ領域におけるＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０によって与えられる防御レベルを評価した。周囲の非ブレブ／非処理領域を、各眼に対する内部標準として使用した。 ロドプシン（ＲＨＯ）およびヒト錐体アレスチン（ｈＣＡ）に対する抗体を用いて、桿体外節および錐体の形態の完全性を評価した。光照射の２週間後、５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌの力価で注射した眼のブレブ／処理領域において、ＯＮＬの厚さの優れた保存が達成された。さらに、網膜をノックダウン試薬ｓｈＲＮＡ８２０で処理した場合とは対照的に、ＡＡＶ２  ／  ５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０構築物では桿体外節の保存が達成された。
【０１０８】
図２２は、５ｘ１０１１／ｖｇ／ｍｌの力価で、ＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０を網膜下に注射した、変異ＲＨＯＴ４Ｒ／＋網膜の処理（Ｔｘ）、移行ゾーン、および非処理（ＵｎＴｘ）領域における、免疫組織化学を示す（ロドプシンは緑に染色され、図２２の図ではより薄い染色として現れている；ヒト錐体アレスチンは赤に染色され、図２２の図では灰色の染色として現れている）。処理領域では、外顆粒層（ＯＮＬ）の厚さ、および桿体外節（ＯＳ）が完全に保存されているが、非処理領域では、全ての桿体が失われ、錐体細胞体は、一列に減少している。処理領域と非処理領域との間に、はっきりとした境界が、移行ゾーンで見られる。
【０１０９】
イヌのＲＨＯＲＮＡおよびタンパク質の完全なノックダウンが（ウェスタンブロットにより）、ウイルス力価５ｘ１０１１ｖｇ／ｍｌでのＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により、達成されている。イヌの網膜における正常なＲＨＯのレベルと比較した場合、硬化ＲＨＯ８２０による効率的な置換は、ｍＲＮＡ（１１８〜１３０％）およびタンパク質（３０〜３３％）のレベルの両方で達成される。光受容細胞の細胞体を含む外顆粒層（ＯＮＬ）の完全な防御は、ウイルス力価５×１０１１ｖｇ／ｍｌでのＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により達成される。ＲＨＯ８２０による効率的ＲＨＯ置換の結果としての、桿体外節の完全な保存は、ウイルス力価５×１０１１ｖｇ／ｍｌでのＡＡＶ２／５−ｓｃ−ＨＯＰ−ＲＨＯ８２０−Ｈ１−ｓｈＲＮＡ８２０により達成される。
【０１１０】
参考文献
1.Mao H, Gorbatyuk MS, Rossmiller B, Hauswirth WW, Lewin AS. Long-Term Rescue of Retinal Structure and Function by Rhodopsin RNA Replacement with a Single Adeno-Associated Viral Vector in P23H RHO Transgenic Mice. Hum Gene Ther. 2012;23:356-366.
2.Rossmiller B, Mao H, Lewin AS. Gene therapy in animal models of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Mol Vis. 2012;18:2479-2496.
3.Gorbatyuk M, Justilien V, Liu J, Hauswirth WW, Lewin AS. Suppression of mouse rhodopsin expression in vivo by AAV mediated siRNA delivery. Vision Res. 2007;47:1202-1208.
4.Khvorova A, Reynolds A, Jayasena SD. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 2003;115:209-216.
5. Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS, Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004;22:326-330.
6.Jensen SMR, Schmitz A, Pedersen FS, Kjems J+, Bramsen JB. Functional Selection of shRNA Loops from Randomized Retroviral Libraries. PLoS ONE. 2012;7:e43095.
7.Zhou H, Xia XG, Xu Z.  An RNA polymerase II construct synthesizes short-hairpin RNA with a quantitative indicator and mediates highly efficient RNAi. Nucleic Acids Res. 2005;33:e62-e70.
【０１１１】
均等物
本発明のいくつかの実施形態が本明細書で記載および例示される一方で、当業者は、本明細書に記載の機能を実行するための、および／または、結果および／または１つ以上の効果を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想到することができる。また、これらの変形および／または改変は、本明細書に記載される発明の実施形態の範囲内であると見なされる。さらに通常は、当業者は本明細書に記載される全てのパラメータ、寸法、材料及び形態が例示的であること、及び、実際のパラメータ、寸法、材料および／または形態は、本発明の教示が用いられる特定の適用に基づいていることを容易に認識しているであろう。当業者は、本明細書に記載される特定の発明の実施形態の多くの均等物を理解するであろうし、あるいは、通常の実験のみを用いて確認することが可能である。したがって、前述の実施形態は単なる例として提示されていることが理解されるべきであり、また添付の請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態は、明細書に記載され、請求の範囲に記載された以外の方法で実施することができることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個別の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法を対象とするものである。さらに、これらの特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲内に含まれ、それは、特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾したものでない場合に限る。
【０１１２】
本明細書中で定義され用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照することにより本明細書に組み込まれる文献中の定義、及び／又は定義された用語の普通の意味を制御すると理解されるべきである。
【０１１３】
本明細書中に開示された全ての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている対象事項に関して参照により組み込まれ、場合によっては、その全体を含んでもよい。
【０１１４】
本明細書および請求の範囲において用いられる不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、明示的に反する記載がない限り、「少なくとも１つ」という意味に理解されるべきである。
【０１１５】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる「および／または」という語句は、そのように結合された要素、すなわちある場合には結合的に（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅｌｙ）存在し、他の場合には非結合的（ｄｉｓｊｕｎｃｔｉｖｅｌｙ）に存在する要素の、「一方または両方」という意味に理解されるべきである。「および／または」と記載された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。具体的に特定された要素と関連するかどうかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に特定された要素以外の他の要素が、場合により存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」のような非制限的（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）言語と併せて使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみ（場合により、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（必要に応じて他の要素を含む）などを、指すことができる。
【０１１６】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、「または」は上記で定義した「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例として、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるべきであり、すなわち、いくつかの要素または要素のリストの少なくとも１つを含むが複数も含み、場合により追加のリストに示していない項目を含むと解釈されるべきである。明示的にこれと反する用語、例えば「１つだけ」もしくは「正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用される場合「〜からなる」の用語のみが、いくつかの要素または要素のリストの正確に１つの要素を含むことを指すであろう。一般的に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「１つ（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「１つだけ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または「正確に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」などの排他的な用語によって先行される場合にのみ、排他的な選択肢（すなわち、「どちらか一方であるが両方でない」）を示すと解釈されるであろう。特許請求の範囲において用いられる場合、「実質的に〜からなる」は、特許法の分野で用いられる通常の意味有するであろう。
【０１１７】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、１つ以上の要素のリストを参照して「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という語句は、要素のリスト内の１つ以上の任意の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであり、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙されたそれぞれの、および全ての要素の少なくとも１つを含む必要はなく、また、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つの」という語句が指し示す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が、その具体的に特定された要素と関連するかどうかにかかわらず、場合により存在することを可能にする。従って、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等であるが、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または、同等であるが、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、少なくとも１つの（場合により２つ以上を含む）Ａで、Ｂが存在しない（場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つの（場合により２つ以上を含む）Ｂで、Ａが存在しない（場合により、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つの（場合により２つ以上を含む）Ａ、および、少なくとも１つの（場合により２つ以上を含む）Ｂ（場合により他の要素を含む）などを指すことができる。
【０１１８】
明示的に反する記載がない限り、２つ以上のステップまたは作用を含む本明細書に記載される任意の方法において、本方法のステップまたは作用の順番は、本方法のステップまたは作用が列挙される順番に必ずしも限定されないこともまた、理解されるべきである。
【０１１９】
上記の明細書および請求の範囲において、全ての移行句は非制限的であると理解されるべきであり、移行句とは例えば、「含む」、「有する」、その他同種のものなどである。非制限的とはすなわち、それを含むがそれに限定されることはないということを意味する。「〜からなる」および「実質的に〜からなる」という移行句のみが、それぞれ制限的あるいは半制限的な移行句であり、特許審査手続の米国特許庁マニュアル第２１１１．０３項に記載されている。別の実施形態では、非制限的移行句（例えば、「含む」）を使用してこの文書に記載された実施形態もまた、非制限的移行句によって記載された特徴「〜からなる」および「実質的に〜からなる」と考えられることが認められるべきである。例としては、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、別の実施形態「ＡおよびＢからなる組成物」および「実質的にＡおよびＢからなる組成物」を企図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019511216.tif 000046
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