(57)【要約】  生体適合性媒体中に分散された１ないしそれ以上の生体関連物質を含有する懸濁液を提供する工程を含む、球状体の製造方法が提供される。一定量の親水性物質が超疎水性表面の所定の領域上に堆積し、そして懸濁液の液滴が超疎水性上に配置された親水性物質上にバイオプリンティングされ、それによって球状体を生成する。
2019520824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１ないしそれ以上の生体関連物質を含む球状体の製造方法であって、
生体適合性媒体内に分散された１ないしそれ以上の生体関連物質を含有する懸濁液を提供し、そして
前記懸濁液の液滴を超疎水性表面上にバイオプリンティングする
ことから構成される球状体の製造方法。
【請求項２】
前記した１ないしそれ以上の生体関連物質が、磁気ビーズ、間質血管細胞群、幹細胞、１ないしそれ以上の関連細胞、またはそれらの組み合わせから構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体適合性媒体がヒドロゲルから構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロゲルが、アガロース、アルギン酸塩、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブリン、ラミニン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、シリコーン、多糖類、ポリエチレングリコール、およびポリウレタンからなる群から選択される物質から構成されるものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロゲルは、Ｉ型コラーゲンから構成されるものである請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記した１ないしそれ以上の生体関連物質が間質血管細胞群から構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記した１ないしそれ以上の生体関連物質が組織由来の微小血管フラグメンから構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記した１ないしそれ以上の生物学的関連物質が１ないしそれ以上の膵島細胞から構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記懸濁液の液滴を超疎水性表面上にバイオプリンティングする工程が懸濁液を直接書き込み印刷することで構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記懸濁液の液滴をバイオプリンティングするのに先立ち、超疎水性表面上に一定量の親水性物質を堆積させる工程をさらに有して構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記親水性物質が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーから構成されるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記懸濁液の液滴が前記親水性物質の上にバイオプリントされるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
超疎水性表面が約１５０°より大きい水接触角を有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記水接触角が約１５０°〜約１７０°である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記液滴をバイオプリンティングする工程が、約０．２ｍｍ〜約５ｍｍの直径を有する液滴をバイオプリントすることで構成されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記液滴をバイオプリンティングした後に、一定の期間、生理的温度で球状体をインキュベートする工程をさらに有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記液滴をバイオプリンティングした後に、球状体を細胞培養培地中で培養する工程をさらに有するものである請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
１ないしそれ以上の生体関連物質を含む球状体を形成する方法であって、
生体適合性媒体内に分散された１ないしそれ以上の生体関連物質を含有する懸濁液を提供し、
超疎水性表面上の所定の領域に一定量の親水性物質を堆積させ、
前記懸濁液の液滴を前記親水性物質上にバイオプリンティングする
ことから構成される球状体の製造方法。
【請求項１９】
超疎水性表面は、約１５０°〜約１７０°の水接触角を有するものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体適合性媒体がＩ型コラーゲンで構成されているものである請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
１ないしそれ以上の生体関連物質を含む球状体を形成する方法であって、
生体適合性媒体内に分散された間質血管細胞群を含有する懸濁液を提供し、
超疎水性表面上の所定の領域に一定量の親水性物質を堆積させ、
前記懸濁液の液滴を前記親水性物質上にバイオプリンティングする
ことから構成される球状体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年６月２７日に出願された米国仮出願第６２／３５４，９２９号および２０１６年１１月１６日に出願された米国仮出願第６２／４２２，６９４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
今回開示される主題は、概して、生体関連物質を含有する球状体および関係する方法に関するものである。特に、今回開示される主題のいくつかの実施形態は、生体関連物質を含む球状体、および、１ないしそれ以上の生体関連物質を含有する懸濁液を超疎水性表面上にバイオプリンティングするそのような球状体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養のための三次元環境の使用は、細胞挙動のイン・ビトロ[in vitro]（生体外）モデリングのための、およびその後の移植用の構築物の生成のための、より生理学的に関連のあるシステムを提供する。体内では、組織は複数の細胞型から構成され、そして細胞群は、臓器機能に特異的な幾何学形状に細胞群の配向を与える特定の空間的配列で組織化される。組織培養表面（例えば、ガラスおよびプラスチック）上で元々培養した細胞を利用した、イン・ビトロでの細胞機能の研究は、コラーゲンゲルにしばしば埋め込まれている細胞群の三次元（３Ｄ）培養に現在移行している。協調的に、研究者らは、二次元および三次元の細胞培養物が培養中に球状体を自発的に形成する能力を評価した。このようにして 、上皮および内皮のオルガノイド培養物が確立された。このような手法では、胚性幹細胞が懸滴として培養され、胚様体（ＥＢ）を形成させるものであった。球状体培養の戦略は、それ以来、血管系の細胞を代表する内皮、全ての複合組織の共通細胞成分を含むように、進められた。そして最近、実質細胞と血管細胞とを含む複合三次元組織の構築物が、実験モデルに移植されている。これらの研究のそれぞれは、機能的組織オルガノイドがイン・ビトロで構築されることができ、そして、移植された循環とレシピエントの循環との間での血管統合の証拠およびオルガノイドが組織機能の回復を提供し得るという証拠を持って組織に移植され得ることを示す。
【０００４】
三次元組織構築物の血管統合を援助するために、いくつかの研究が、脂肪由来間質血管細胞群（SVF）の使用を行った。脂肪由来ＳＶＦは、イン・ビボ[in vivo]（生体内）および臨床用途のための数多くの再生特性を有する不均一な細胞集団である。ＳＶＦ、ならびに他の多くの幹細胞および再生細胞集団のための現在の主要な配送様式は、溶液中に懸濁した細胞の直接注射である。しかしながら、ＳＶＦの直接注射の１つの大きな欠点は、移植部位における細胞の保持の欠如が観察されたことである。そのようなものとして、直接カプセル化または培地依存性自己凝集のいずれかによる、凝集体への細胞の集合が、注射時の細胞の保持を増加させるために提案されてきている。これに関して、ＳＶＦは、以前は骨格内に埋め込まれているか、またはイン・ビトロ用途のための様々なマトリックスヒドロゲル内にカプセル化されており、これらのカプセル化凝集体は、ＳＶＦの局在化および保持を増大させた。ＳＶＦ細胞凝集に関する以前の研究はまた、コラーゲンゲル中のＳＶＦの球状体およびその他の３次元培養物を形成するためのアルギン酸カプセル化の使用を含んでいるものであった。
【０００５】
現在、球状体の生成は、主に、細胞球状体、表面播種球状体およびカプセル化球状体の公称カテゴリーの下に収まっている。しかしながら、このような細胞球状体は、やはり、代表的には、懸滴法によって生成される、または、他の接着点の欠如による細胞自己凝集のメカニズムに依存して作り出される。細胞は、移動を支持する接着点を利用して、細胞の中心塊または凝集体へと、自発的に凝集することができる。この製造プロセスは、球状体を製造するのに数日かかり、そして細胞増殖速度によって大きく拡大される矛盾に悩まされるものである。表面播種球状体は、選択された生体高分子を用いて予め製造され、次いで選択された細胞と共にインキュベートされて細胞遊走誘導播種を可能にする。この製造戦略は、選択された生体物質が予め製造されることができる限り、非常に広範な用途を有する。予め製造された球状体の欠点は、細胞播種が遊走／接着に基づいているため、球状体の全体積ではなく、主に球状体表面に限定され、球状体負荷容量が制限されることである。カプセル化球状体の第三の戦略は、細胞を懸濁液中に混合し、次いでその懸濁液が選択された骨格／ハイドロゲルになることをもたらすというアイデアを考慮するものである。カプセル化を基本とする球状体は、細胞を運搬するために球状体の全容量を利用することができるという利点、および１日未満で生産することができるという利点を有する。しかしながら、この戦略は非常に生体物質に特異的であり、そしてコラーゲンの場合においては、機械的特性を変容するアルギン酸塩のような支持物質の使用を頻繁に必要とし、そして元の生体物質を非常に魅力的とする生物学的特性の一部を代用することとなってしまう。
【０００６】
要するに、三次元細胞および組織構築物の形成は未だ完全には実現されていない。従って、そのような複合された生物学的構造体の製造におけるいかなる改良も非常に望ましくかつ有益であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この文書で提供される情報の学習後には当業者に明らかになるであろうように、今回開示される主題は、上記に明らかにした要望の一部または全てを満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この要約は、今回開示される主題の幾つかの実施形態を説明し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び置換を挙げるものである。この概要は、多数の様々な実施形態の単なる例示である。与えられた実施形態の１ないしそれ以上の代表的な特徴の言及も、同様に例示的なものである。このような実施形態は、通常、言及された特徴を伴って、または伴わずに存在することができ、同様に、これらの特徴は、この要約に列挙されているか否かにかかわらず、ここ開示される主題の他の実施形態に適用することができる。過度の繰り返しを避けるために、この要約ではそのような特徴のすべての可能な組み合わせを挙げたり示唆したりはしない。
【０００９】
今回開示される主題のいくつかの実施では、生体関連物質を含む球状体を製造する方法が提供される。一実施では、懸濁液が最初に生成または提供される、１ないしはそれ以上の生体関連物質を含む球状体を製造する方法が提供され、ここで前記懸濁液は、生体適合性媒体内に分散した１ないしそれ以上の生体関連物質を含むものとされる。次いで、一定量の親水性物質を、所定の領域内および／または一定量で、適切な基材の超疎水性表面上に堆積させる。いくつかの実施では、超疎水性表面上に堆積された親水性物質は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーからなる。いくつかの実施では、今回開示される主題に従って利用される超疎水性表面は、約１５０°より大きい水接触角を有し、例えば、いくつかの実施では約１５０°―約１７０°の水接触角である。
【００１０】
今回開示される主題の例示的な方法で利用される特定の親水性物質および／または超疎水性表面の特定の水接触角に関係なく、懸濁液および基材が製造されると、懸濁液の液滴は次に、超疎水性表面上に配置された親水性物質の上に直接バイオプリントされ（例えば直接書き込み印刷され）、それによって生体関連物質を含有する球状体を製造する。懸濁液をバイオプリンティングしたことに続いて、得られた球状体は、それらの球状体形状を維持しながら生理的温度で一定期間インキュベートされることができる。いくつかの実施では、必要に応じて、球状体を次いで細胞培養培地中でさらに培養することができる。
【００１１】
今回開示される方法のいくつかの実施では、例示的な球状体に含有される１つまたはそれ以上の生体関連物質は、磁性ビーズ、間質血管細胞群、幹細胞、１ないしそれ以上の関連細胞、細胞または組織の集まり、またはこれらの任意の組合せからなる。例えば、いくつかの実施では、球状体は、間質性血管細胞群を、膵島細胞などのような、１ないしはそれ以上の関連細胞と組み合わせて含んで、生成されることができる。いくつかの実施では、１ないしそれ以上の生体関連物質は、従って、間質血管細胞群を含むことができる。いくつかの実施において、１ないしそれ以上の生体関連物質は、１ないしそれ以上の島細胞を含む。
【００１２】
今回開示される方法で利用される懸濁液を形成するために使用される生体適合性媒体に関して、いくつかの実施では、生体適合性媒体はヒドロゲルを含む。いくつかの実施では、ヒドロゲルは、アガロース、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、シリコーン、多糖類、ポリエチレングリコール、およびポリウレタンからなる群から選択される物質から構成される。いくつかの実施において、ヒドロゲルはI型コラーゲンからなる。
【００１３】
今回開示される主題のさらなる特徴および利点は、この文書の記載、図面、および非限定的な実施例を学習した後に、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】図１Ａ〜図１Ｄは、両親媒性表面上にバイオプリンティングした直後の間質血管細胞群（ＳＶＦ）積載Ｉ型コラーゲン球状体を示す画像（図１Ａ〜１Ｃ）、並びに、両親媒性表面およびＩ型コラーゲン球状体の断面（図１Ｄ）を示す概略図である。
【００１５】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】図２Ａ〜図２Ｈは：  位相差顕微鏡法によって視覚化された球状形態（図２Ａおよび図２Ｅ）；生細胞（図２Ｂおよび図２Ｆ）、死細胞（図２Ｃおよび図２Ｇ）に関して４倍の倍率で落射蛍光によって可視化されたカプセル化ＳＶＦ形態；カルセインＡＭ、エチジウムホモ二量体−１、およびヘキスト３３２５８[Hoechst 33258]ビス−ベンズイミドをそれぞれ使用して可視化した細胞分布（図２Ｄおよび図２Ｈ）を示す図である。球状体は、攪拌培養で２日間（図２Ａ〜図２Ｄ）および６日間（図２Ｅ〜図２Ｈ）培養した。図２Ｈに示される顕微鏡写真は、図２Ｅ〜図２Ｇに示されるものとは異なる球状体から得られた。
【００１６】
【図３】図３は、０、２、６、９、および１３日目の球状体内の細胞生存率を示すグラフである。
【００１７】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄは、攪拌培養の２日目（図４Ａ）、６日目（図４Ｂ）、９日目（図４Ｃ）、および１３日目（図４Ｄ）のＳＶＦ積載Ｉ型コラーゲン球状体の４倍拡大位相差顕微鏡写真を示す画像である。
【００１８】
【図５】図５は、ＳＶＦ積載コラーゲン球状体が、攪拌培養インキュベーション（ｎ＝１２）の６日から１３日に、有意な平均直径減少を受けることを示すグラフである。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１で測定された。
【００１９】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、攪拌培養で１４日後の、内皮特異的レクチン  グリフォニア・シンプリシフォリア[Griffonia simplicifolia]、ＧＳ−１（緑色）、アルファ平滑筋細胞アクチン、（α-ＳＭＡ）（赤色）、および核染色、ＲｅｄＤｏｔ（青色）で染色した、ＳＶＦ積載Ｉ型コラーゲン球状体の１０倍拡大共焦点顕微鏡写真を示す画像である。管状構造は、矢印で強調表示されている。図６Ｂは、図６Ａに示される上面図と比較して約２０°の透視シフトを示す。
【００２０】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｂは、三次元バイオプリンティングシステムおよび超疎水性表面を使用して、予備血管新生された膵島移植片を生成するための実現可能性を示す図である。図７Ａは、印刷および重合直後のＳＶＦ／島球状体を示す位相差画像である。図７Ｂは、７日目のＳＶＦ／島球状体を示す球状体の画像である。球状体は培養中に収縮する。スケールバーは５００μｍである。
【００２１】
【図８】図８は、膵島／ＳＶＦ球状体が、糖尿病動物モデルにおいて高血糖を矯正する能力を示すグラフである。
【００２２】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図９Ｇ】図９Ａ〜９Ｇは、ＳＶＦ球状体の位相差および共焦点顕微鏡画像である。図９Ａは、培養１１日後の球状体内でのＳＶＦ細胞分布を示す、位相差画像である。バーは１００μｍである。図９Ｂは、収縮の開始を示す、培養１２日後の位相差画像である。バーは１００μｍである。図９Ｃは、培養８日後の位相差画像である。バーは５０μｍである。図９Ｄは、培養１１日後の位相差画像であり、８日目の球状体と比較してより広範な分枝形成を示している。バーは５０μｍである。図９Ｅは、１４日後の、内皮特異的レクチン  グリフォニア・シンプリシフォリア、ＧＳ−１（緑色）、アルファ平滑筋細胞アクチン、（α−ＳＭＡ）（赤色）、および核染色、ＲｅｄＤｏｔ（青色）で染色した、ＳＶＦ積載Ｉ型コラーゲン球状体の共焦点顕微鏡画像である。バーは１００μｍである。図９Ｆおよび９Ｇは、ＧＳ−１およびα−ＳＭＡで共標識された図６Ｅの血管様構造の２倍高い倍率の透視図であり、分岐構造を矢印で区別して示している。バーは５０μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
今回開示される主題の１ないしそれ以上の実施形態の詳細は、本文書に記載されている。本文書に記載されたこの実施形態に対する変更は、および他の実施形態は、本文書に提供された情報を学習した後に当業者に明らかとなるであろう。本文書に提供される情報、特に、記載された例示的な実施形態の具体的な詳細は、主に理解を明確にするために提供されたものであり、それらから何ら不必要な限定が理解されるべきではない。矛盾がある場合は、定義を含めてこの文書の規定が統制するであろう。
【００２４】
本文書において使用される用語は、当業者によって十分理解されると思われるが、今回開示される主題の説明を容易にするために、いくつかの定義が定められる。
【００２５】
別途定義しない限り、本文書において使用される全ての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が属する技術分野における当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。
【００２６】
別途明記しない限り、本文書における全体の開示を通して参照される全ての特許、特許出願、公開された出願および刊行物、ジェンバンク[GenBank]配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公開された資料は、関連によりそれらの全体が本文書に取り込まれる。
【００２７】
ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し得、インターネット上の特定の情報は行き来し得るが、同等の情報はインターネットを検索することにより見出され得ることが理解される。それらへの言及は、そのような情報の利用可能性および公衆への普及を証明するものである。
【００２８】
本文書に記載されるものと同様ないし等価な任意の方法、装置、及び物質が、今回開示される主題の実施又は試験に用いることができるが、代表的な方法、装置、および物質は、本文書においてに記載されている。
【００２９】
本出願は、本発明の構成要素並びに本文書に記載されるその他の成分又は要素「から構成される[comprise]」（非限定的[open-ended])ことができ、または「から本質的になる[consist essentially of]」ことができる。本文書において使用される場合、「から構成される [comprising]」は、非限定なものであり、列挙された要素、または構造もしくは機能におけるそれらの等価物、および列挙されていない他の任意の要素ないし要素群を意味する。「有する[having]」および「含む[including]」という用語はまた、文脈がそうでないと示唆しない限り、非限定的として解釈されるべきである。
【００３０】
長年の特許法の慣例に従って、「１つ」[“a”,“an”, and“the”]という単数表記の用語は、請求の範囲を含めて、本出願において使用される場合、「１つまたは複数」を意味する。従って、例えば、（１つの）「細胞」[“a cell”]への言及は、複数のこのような細胞（細胞群）を包含する、といったようなものなどである。
【００３１】
別途明記しない限り、本明細書および請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などの特性などを表すすべての数字は、すべての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、そうでないと示さない限り、本明細書および特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、今回開示される主題によって得られることが要望される所望の特性に応じて変わり得る近似値である。
【００３２】
本文書において使用される場合、値、または質量、重量、時間、体積、濃度もしくは百分率の量を指すときの「約」という用語は、特定した量から、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、およびいくつかの実施形態では±０．１％の変動を、このような変動が開示される方法を実施する上で適当であるように、包含することを意味する。
【００３３】
本文書において使用される場合、範囲は、「約」ある特定の値から、および/または、「約」別のある特定の値まで、として表現されることができる。本文書において開示された多数の値があり、そして各値はまた、その値自体に加えて「約」その特定の値として、本文書において開示されるものであることもまた理解されるべきである。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。２つの特定の単位間の各単位もまた開示されていることも理解されるべきである。例えば、１０と１５が開示されている場合は、１１、１２、１３、および１４も開示されている。
【００３４】
本文書において使用される場合、「任意の」または「任意に」は、後に記載される事象または状況が起こるかまたは起こらないこと、およびその記載がその事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを含むことを意味する。例えば、任意に変異した部位は、その部位が変異型または非変異型であることを意味する。
【００３５】
今回開示される主題は、少なくとも部分的には、三次元（３Ｄ）バイオプリンティング技術を超疎水性表面を有する基材と組み合わせて利用して、Ｉ型コラーゲンゲル中の間質血管細胞群（ＳＶＦ）積載球状体を包含する、生体関連物質含有球状体の自動生成を支援することができるという発見に基づいている。塊状コラーゲンゲルの利用における制限要因は、移植前および移植中の取り扱いである。液体から架橋ヒドロゲルへのＩ型コラーゲンの重合は、典型的にはマルチウェルプレートのような形状保持器内で起こる。次いで、そのような重合した構築物は、典型的には除去され、そして滅菌された器具を用いて手動で取り扱われる。しかしながら、取り扱い、およびその後のいかなる潜在的なゲルの損傷も、調整するのが非常に難しい。さらに、コラーゲンゲルはある程度の弾力性を有するが、イン・ビボ用途は一般に不規則な形状を必要とし、それゆえに塊状ゲルを切片に切断するかまたは必要な形状に適合させるためにかなりの変形下に置くことを強いる必要がある。メカニズムのいかなる特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これらの問題はコラーゲンゲルを小さな球状体に利用することによって軽減できると考えられ、さらにこのようなコラーゲン球状体は流体懸濁液中での取扱いが簡便になるという利点があり、細胞懸濁液単独注射と比較してより優れた方法でイン・ビボ適用要件に適合するための正確な空間的および投薬量の制御を可能とすると考えられる。
【００３６】
今回開示される主題のいくつかの実施では、球状体の形成方法は、このように提供される。いくつかの実施では、親水性物質が、表面が超疎水性である基材の表面上の所定の領域上に最初に配置される、球状体の形成方法が提供される。次いで、１ないしそれ以上の生体関連物質を生体適合性媒体内に懸濁させて懸濁液を作り、その懸濁液の１つの液滴を親水性物質の上にバイオプリントする。例えば、今回開示される主題の球状体の形成方法の１つの例示的な実施において、バイオプリンティングの１つの形態としての直接書き込み印刷である、バイオアーキテクチャーツール[BioArchitecture Tool]（ＢＡＴ、例えば、米国特許第７，８５７，７５６号を参照のこと; スミスら、ティッシュ  エンジニアリング、２００４年、１０：１５６６-１５６７頁[Smith, et al., Tissue Eng.2004; 10:1566-1576]もまた参照のこと。これら両方はこの関連によりこの文書中に取り込まれる。）を使用する。
これは、独立したＸ軸方向およびＹ軸方向の平行移動を可能にするだけでなく、１ないしそれ以上の平行移動印刷ヘッド／分配システムのＺ軸方向の移動も可能にするコンピュータ制御されたステージを利用する。これに関して、バイオプリンティングパラメータは、最初に印刷命令としてスクリプト化され、次いで印刷装置（すなわち、前記ＢＡＴ）が懸濁液を含む正確な構造を製造するために使用されることができるように印刷装置にアップロードされることができる。いくつかの実施では、このような印刷装置を使用することによって、そのようなシステムによって印刷される液滴のサイズは、液滴を印刷するのに使用されるペンのサイズを制御することによって、および液滴が前記ペンより押し出される圧力を制御することによって調整できる。いくつかの実施形態では、約１５ゲージペンから約２５ゲージペン、および約２ｐｓｉから約７ｐｓｉの圧力を使用して、直径約０．２ｍｍから約５ｍｍのサイズを有する液滴、または以下に詳細に記載されるように得られる球状体を生成することができる。いくつかの実施においては、液滴、または得られる球状体は、約１ｍｍから約５ｍｍ、約２ｍｍから約４ｍｍ、または約３ｍｍから約４ｍｍの直径を有する。いくつかの実施では、液滴または球状体のサイズは、懸濁液の粘度、供給ペン先のサイズ、供給ペンから懸濁液を押し出すために使用される圧力、および供給ペン中の懸濁液に圧力がかかる時間の量からなる群から選択される１ないしそれ以上のパラメータを調整することによって制御される。そのようなパラメータは、所望のサイズを有する液滴または球状体を生成するために当業者によって容易に調整され得る。
【００３７】
１ないしそれ以上の生体関連物質を含む球状体を作製するための方法の１つの例示的な実施として、球状体は、最初に細胞懸濁液（例えば、Ｉ型コラーゲン中に混合されたヒト間質血管細胞群の個体群を有する細胞懸濁液）の形態の懸濁液を、中空針または管状構造から構成される供給ペン中に、配置することによって製造される。次に、供給ペンからの生物学的懸濁液の押出しは、供給ペン内の圧力を特定の値まで上昇させることによって制御され、それによって液滴を形成させる。次いで、供給ペンを所定の速度（例えば、５ｍｍ／秒）で基材の超疎水性表面上に配置された親水性物質に向かって下降させる。親水性物質と接触すると、懸濁液の液滴は続いて親水性物質に引き寄せられて、ペンから放出され、超疎水性表面上の親水性スポットの上に球状体を形成する。いくつかの実施では、懸濁液をバイオプリンティングした後に、得られた球状体は、次いで、利用されている生物学的媒体を重合させるのに十分な期間などのような、一定期間の間、生理的温度（例えば、３７℃）でインキュベートされることができる。いくつかの実施では、必要に応じて、次いで球状体は、細胞培養培地中でさらに培養されることができる。
【００３８】
「懸濁液」という用語は、本文書においては、生体適合性媒体内に分散されている、磁性粒子、細胞、組織、タンパク質などを含む生体関連物質を有する組成物を指すのに用いられる。今回開示される主題に従って使用するのに適した生体適合性媒体は、通常、室温（例えば２５℃）でゲル、半固体、または低粘度液体のような液体である任意の生体適合性物質から形成することができ、そして、および細胞、組織、タンパク質、およびその他の目的の生物学的物質のための三次元基材として使用することができる。今回開示される主題に従って生体適合性媒体を形成するために使用され得る例示的な物質としては、コラーゲン、フィブリン、キトサン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標名）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）、ポリエチレングリコール、化学架橋可能なあるいは光架橋可能なデキストランを包含するデキストランなどから構成される重合体およびヒドロゲル、ならびに静電紡糸された、合成の、または生合成の混合物などが含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施では、生体適合性媒体は、内皮化を支援する物質で構成される。例えば、米国特許第５，７４４，５１５号および第７，２２０，２７６号を参照のこと。これらのいずれも関連によりここの記載に組み込まれる。いくつかの実施において、生体適合性媒体はヒドロゲルから構成される。
【００３９】
「ヒドロゲル」という用語は、水が分散媒として作用しそしてポリマー鎖間の空間を埋める、ポリマー鎖の三次元ネットワークから構成される二成分または多成分ゲルを指すために使用される。今回開示される主題に従って使用されるヒドロゲルは、一般に、使用されるべき印刷パラメータ、並びに、選択されたヒドロゲルが、その構造中に配置される生物学的懸濁液中に取り込まれる生物学的物質（例えば、細胞）の挙動および活性において効果を有するであろうことを考慮して、その構造の意図される用途に基づいて特定の用途（たとえば特定の球状体）のために選択される。今回開示される主題の例示的なヒドロゲルは、アルギン酸塩、コラーゲン（Ｉ型およびＶＩ型コラーゲンを含む）、フィブリノーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、糖タンパク質、ポリラクチド、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリコライド［polycolide］、ポリジオキサノン、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリペプチド配列、タンパク質及びその誘導体、オリゴペプチド、ゼラチン、エラスチン、フィブリン、ラミニン、ポリメタクリレート、ポリアセテート、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリアミノ酸炭水化物、多糖類および変性多糖類、ならびにそれらの誘導体および共重合体などを含む重合性物質；ならびに生物活性ガラスなどのガラス、セラミック、シリカ、アルミナ、方解石、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウム、骨などのような無機物質、並びに上記のすべての組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。今回開示される主題のヒドロゲルを構成することができる物質に関する追加の情報については、例えば、米国特許第７,９１９,１１号、第６，９９１，６５２号および第６，９６９，４８０号を参照のこと。これらはいずれも、この関連によりこの文書に取り込まれる。
【００４０】
さらに、球状体を製造するために使用されるヒドロゲルに関して、いくつかの実施では、ヒドロゲルは、アガロース、アルギン酸塩、Ｉ型コラーゲン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７）[Pluronic&reg; F127]（ＢＡＳＦコーポレーション、ニュージャージー州マウントオリーブ））、シリコーン、多糖類、ポリエチレングリコール、およびポリウレタンからなる群から選択されてなる物質から構成される。いくつかの実施では、ヒドロゲルはアルギン酸塩から構成される。いくつかの実施では、ヒドロゲルはＩ型コラーゲンから構成される。
【００４１】
一方、例示的な懸濁液に含まれ、今回開示される主題に従って使用される生体関連物質に目を向けると、「生体関連物質」なる語句は、本文書で定義された「生体適合性媒体」中に含まれることができ、そして、その後生物学的システムと相互作用するおよび／またはそれに影響を与えることのできるような物質を述べるために用いられる。例えば、いくつかの実施では、生体関連物質は、ヒドロゲルと組み合わせることができ、そしてその後ヒドロゲルと共に球状体を製造するためにバイオプリントすることができる磁性ビーズ（すなわち、それ自体磁性であるビーズか、または鉄粒子のような磁界に応答する物質を含むビーズ）であり、当業者に公知の方法に従って器具類の較正において使用されることができるまたは細胞および組織の分離および精製のために使用することができる規定のサイズを有する球状体を製造する。別の例としては、他の実施において、細胞または組織を適切な生体適合性媒体と組み合わせると細胞または組織懸濁液が形成されるように、生体関連物質は１ないしそれ以上の細胞および組織を含む。いくつかの実施において、生体関連物質は、間質血管細胞群、幹細胞、1ないしそれ以上の関連細胞、またはそれらの組み合わせからなる。いくつかの実施では、生体関連物質は、間質血管細胞群から構成される。
【００４２】
今回開示される主題の方法に従って使用される間質血管細胞群に関して、当該間質血管細胞群は、典型的には、検体から得られるある量の脂肪組織を酵素的に消化することによって得られるものであり、脂肪組織の間質血管細胞群をペレット化するために次いで一定時間の遠心分離される。この点に関して、間質血管細胞群は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、前脂肪細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、内皮前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、および脂肪組織マクロファージ、並びに間質血管細胞群に見出される小血管や微小血管フラグメントを包含する多数の細胞型を含むものである。血管細胞群を生成するための脂肪組織の解離に関するさらなる説明および指針については、例えば、米国特許第４，８２０，６２６号を参照のこと。この文献の完全な内容は、この関連により本文書中に組み込まれる。いくつかの実施形態において、脂肪組織の不完全な消化もまた、脂肪微小血管フラグメントを産するために使用され得る。例えば、米国特許第７，０２９，８３８号を参照のこと。この文献の完全な内容は、この関連により本文書中に組み込まれる。
【００４３】
本発明の方法に従って利用することができる幹細胞に関しては、本文書で使用されるように、「幹細胞」なる用語は、伝統的な幹細胞、前駆細胞[progenitor cells,]、プレ前駆[preprogenitor]細胞、前駆細胞[precursor cells]、予備細胞[reserve cells]などを広く指す。例示的な幹細胞としては、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝臓幹細胞、筋肉幹細胞、筋肉前駆幹細胞、内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。幹細胞、リンパ系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞などが挙げられる。幹細胞を単離および培養するための方法を含む幹細胞の説明は、とりわけ、エンブリオニック  ステム  セルズ、メソッド  アンド  プロトコル、タークセン編、ヒューマナ  プレス、２００２年[Embryonic Stem Cells, Methods and Protocols, Turksen, ed., Humana Press, 2002]；ウェイズマンら、アニュアル  レビュー  オブ  セル  アンド  デベロップメンタル  バイオロジー、１７：３８７−４０３頁[Weisman et al., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.17:387-403]；ピッテインガーら、サイエンス、２８４：１４３−４７頁、１９９９年[Pittinger et al., Science, 284:143-47, 1999]；アニマル  セル  カルチャー、マスターズ編、オックスフォードユニバーシティ  プレス、２０００年[Animal Cell Culture, Masters, ed., Oxford University Press, 2000]；ジャクソンら、ＰＮＡＳ  ９６（２５）：１４４８２−８６頁、１９９９年[Jackson et al., PNAS 96(25):14482-86, 1999]；ズクら、ティッシュ  エンジニアリング、７：２１１−２２８頁、２００１年[Zuk et al., Tissue Engineering, 7:211-228, 2001]；並びに米国特許第５，５５９，０２２号、第５，６７２，３４６号および第５，８２７，７３５号において、見出すことができる。間質細胞を単離するための方法を含む間質細胞の説明は、とりわけ、プロコップ、サイエンス、２７６：７１−７４頁、１９９７年[Prockop, Science, 276:71-74, 1997]；セイースら、ヘパトロジー、３１：２３５−４０、２０００年[Theise et al., Hepatology, 31:235-40, 2000]；カレント  プロトコルズ  イン  セル  バイオロジー、ボニファシーノら編、ジョン  ウィリー  アンド  ソンズ、２０００年[Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino et al., eds., John Wiley & Sons, 2000] ；および米国特許第４，９６３，４８９号において、見出すことができる。当業者は、組織構築物中に含めるために選択される幹細胞および／または間質細胞が、典型的にはこのような細胞が特定の構築物の意図される用途に適切であるときに選択されることを理解するであろう。
【００４４】
最後に、本発明の方法に従って利用することができる関連細胞に関して、本文書で使用される「関連細胞」という用語は、今回開示される主体の球状体への組込みに、その球状体の意図された使用に基づいて適切な細胞を指す。いくつかの実施形態では、「関連細胞」という用語は、本文書に記載の関連細胞は、移植後に機能性組織を形成する能力を有するゆえに、「再生細胞」という用語と相互に交換可能に使用され得る。本明細書に記載の関連細胞としての「細胞」は、移植後に機能性組織を形成する能力を有する。例えば、特定の損傷を受けた組織または器官の修復、再構築、または再増殖に適した関連細胞は、典型的には、その組織または器官に一般的に見られる細胞または細胞群を含むであろう。その点に関して、今回開示される主題の球状体に組み込むことができる例示的な関連細胞は、ニューロン、心筋細胞、筋細胞、血管および／または胃腸平滑筋細胞、軟骨細胞、膵腺房細胞、ランゲルハンス島、膵島β細胞、骨細胞、肝細胞、クッパー細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、衛星細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前駆脂肪細胞、胆管上皮細胞などを包含する。これらの種類の細胞は、単離されて直ちに使用されるか、または当該分野で公知の従来の技術による培養に供され得る。例示的な技術は、とりわけ、フレッシュネイ、カルチャー  オブ  アニマル  セルズ、ア  マニュアル  オブ  ベーシック  テクニックス、第４編、ウィレイ  アンド  ソンズ、２０００年[Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 4th ed., Wiley Liss, John Wiley & Sons, 2000]；ベーシック  セル  カルチャー：ア  プラクティカル  アプローチ、ディビス編、オックスフォードユニバーシティ  プレス、２００２年[Basic Cell Culture: A Practical Approach, Davis, ed., Oxford University Press, 2002]；アニマル  セル  カルチャー：ア  プラクティカル  アプローチ、マスターズ編、２０００年[Animal Cell Culture: A Practical Approach, Masters, ed., 2000]；および米国特許第５，５１６，６８１号および第５，５５９，０２２号において見出すことができる。いくつかの実施において、生体関連細胞は、膵島細胞（例えばベータ細胞）または完全な無傷の膵島から構成される。 
【００４５】
今回開示される主題に従って生体適合性媒体と組み合わされる生体関連細胞の特定の種類が何であるかにかかわらず、上述のように、生体関連物質が生体適合性媒体と一旦組合わせられると、次いで、得られた懸濁液の液滴が、超疎水性表面上に配置された親水性物質上にバイオプリントされる。これに関して、懸濁液が室温に達すると、懸濁液は典型的にはゲル化し、そしてより安定した幾何学を有する球状体を形成する。しかしながら、押出し後であるが重合またはゲル化の前に液滴あるいは球状体の幾何学を維持するために、そして上記のように、今回開示の方法は、超疎水性表面を有する基材を利用する。
【００４６】
「超疎水性」なる用語は、水に最小の引力を示す基材を指すために、本文書において用いられる。超疎水性表面は、水滴が、例えばハス[lotus]またはタロイモの葉と接触したときに起こるような、ロータス[lotus]効果を典型的に示す。水滴の形成を支える超疎水性表面のその他の天然に存在する例としては、例えば、ナミブ砂漠に生息するフォグスタンドビートル[fogstand beetle]（ステノカラ  グラシリペス[Stenocara gracilipes]）という甲虫において見いだすことができる。これに関して、そのような超疎水性基材または表面は、典型的には、約１５０°を超える、水接触角、または液体を通して測定したときに液体または蒸気の界面が固体表面と出会う角度、を有するであろう。いくつかの実施では、本文書で使用される超疎水性表面は、１５０°を超える水接触角を有する。いくつかの実施では、例示的な超疎水性表面の水接触角は、約１５０°〜約１７０°である。そのような水接触角を有する多数の超疎水性表面は当業者に知られており、そして利用される特定の基材の結果として又は基材に適用されたコーティングの結果として存在することができる。例えば、いくつかの実施では、超疎水性表面は、例えば、ＮＥＶＥＲＷＥＴ（商標名）（ラスト  オレウム[Rust Oleum]、イリノイ州ベーノン  ヒルズ）のような、撥水性コーティングを適当な基材上にスプレーすることによって製造することができる。超疎水性表面コーティングのさらなる例としては、シリカ、酸化マンガンポリスチレン（ＭｎＯ２／ＰＳ）、酸化亜鉛ポリスチレン（ＺｎＯ２／ＰＳ）、沈降炭酸カルシウム、パーフルオロブタンスルホン酸、カーボンナノチューブ構造体、パラフィン、ポリテトラフルオロエチレン、ワックスなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
さらに上述したように、本文書に記載される方法のいくつかの実施では、ある量の親水性物質、すなわち、水に対する増大した親和性を有し、典型的には約９０°未満の水接触角を有する物質が、前記疎水性表面の定義された領域上に配置される。親水性物質の量および親水性物質が配置される領域は、当然ながら、製造しようとする球状体に応じて変わり得る。しかしながら、いくつかの実施では、球状体が印刷ペンに付着したままではなく超疎水性表面に付着することを確実にするために、約２μｌ〜約５μｌの親水性物質が疎水性表面上に配置される。いくつかの実施では、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７などの、両親媒性ブロック構造を有するブロックコポリマーが、このようなコポリマーは親水性でも疎水性でもあり、従って疎水性表面およびコラーゲンなどの水性生体適合性媒体の両方に接着することができるゆえに、利用できる。本発明に従って使用することができる他の親水性物質としては、Ｐ１８８などの他のコポリマー、ならびにウレタンおよびシランなどの他の物質が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの実施形態では、球状体の形成に有用な親水性物質は、球状体の除去を可能にするための可逆的な接着特性を提供する。そのような逆転は、とりわけ、球状体の水相中の親水性物質の温度変化または可溶化によって引き起こされる。
【００４８】
さらにまた、今回開示される主題のいくつかの実施形態において、本文書に記載の方法に従って製造される球状体が提供される。いかなる特定の理論または機構にも束縛されることを望むものではないが、そのような球状体は、薬剤をスクリーニングする血管新生および血管形成のイン・ビトロアッセイ；虚血組織に新たな血流を提供するために患者に移植することができるデバイス（球状体）；ならびに、脂肪由来幹細胞および再生細胞を使用して構築することができ、肝細胞、筋肉細胞、脂肪細胞、膵島を含む膵臓細胞、脳細胞、生殖細胞および腎臓細胞などを含む他の実質細胞を組み込むことができるデバイス（球状体）、として有利である。のような。さらに、今回開示された球状体および方法は、対象物質を組織培養に供する必要なしに、そして安定な球状体の形成を支持するためにその他の添加剤（例えば、アルギン酸塩）を利用する必要なしに、デバイスを直ちに形成および移植できるデバイスの製造を可能にすると考えられる。本文書に記載の球状体はイン・ビトロでの血管形成を支持するとも考えられる。
【００４９】
今回開示される主題の実践は、他に別段に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学における当業者に周知の技術を使用することができる。そのような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、モレキュラー  クローニング  ア  ラボラトリー  マニュアル（１９８９年）、第２版、サムブルック、フリッチュおよびマニアティス編、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー  プレス、第１６章および第１７章[Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapters 16 and 17]；米国特許第４，６８３，１９５号；ＤＮＡクローニング、第１巻および第２巻、グローバー  編、１９８５年[DNA Cloning, Volumes I and II, Glover, ed., 1985]、オリゴヌクレオチド  シンセシス、エム．ジェイ．ガイト編、１９８４年[Oligonucleotide Synthesis, M. J. Gait, ed., 1984]；ヌクリック  エシッド  ハイブリダイゼーション、ディー．ヘイムス  アンド  エス．ジェイ．ヒギングス編、１９８４年[Nucleic Acid Hybridization, D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984]；トランスクリプション  アンド  トランスレーション、ビー．ディ．ヘイムス  アンド  エス．ジェイ．ヒギングス編、１９８４年[Transcription and Translation, B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984]；カルチャー  オブ  アニマル  セルズ、アール．アイ．フレッシュネイ、アラン．アール．リス，インコーポレーテッド、１９８７年[Culture Of Animal Cells, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987]；イモビライズド  セルズ  アンド  エンザイムス、アイアールエル  プレス、１９８６年[Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, 1986]；パーバル（１９８４年）、ア  プラクティカル  ガイド  トゥ  モレキュラークローニング[Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning]を参照のこと。また、メソッズ  イン  エンザイモロジー（アカデミック  プレス，  インコーポレーテッド、ニューヨーク）[Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]；ジーン  トランスファー  ベクターズ  フォア  マンマリアン  セルズ、ジェイ．エッチ．ミラーおよびエム．ピー．キャロス編、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー、１９８７年[Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, J. H. Miller and M. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 1987]；メソッズ  イン  エンザイモロジー、１５４巻および１５５巻、ウゥら編、アカデミック  プレス，  インコーポレーテッド、ニューヨーク[Methods In Enzymology, Vols.154 and 155, Wu et al., eds., Academic Press Inc., N.Y.]；イムノケミカル  メソッズ  イン  セル  アンド  モレキュラー  バイオロジー（メイヤーおよびウォーカー編、アカデミック  プレス、ロンドン、１９８７年[Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987]；ハンドブック  オブ  エクスペリメンタル  イムノロジー、第Ｉ巻〜第ＩＶ巻、ディ．エム．ウェイアおよびシー．シー．ブラックウェル編、１９８６年[Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986]を参照のこと。
【実施例】
【００５０】
今回開示される主題は、以下の特定の、しかしながら非限定的な、実施例によってさらに説明される。以下の実施例には、本発明に関する開発の過程および実験の間のさまざまな時点で収集されたデータを代表するデータの併合が含まれる。
【００５１】
実施例１  ＜三次元バイオプリンターおよび超疎水性表面を用いた脂肪間質血管細胞群積載球状体の形成＞
【００５２】
材料および方法
【００５３】
超疎水性表面の作製
超疎水性表面は、ポリスチレン製４８穴マルチウェルプレート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）及び３５ｍｍペトリ皿上に、ＮＥＶＥＲＷＥＴ（商標名）（ラスト  オレウム、イリノイ州ベーノン  ヒルズ）の２段階エアロゾル適用を用いて形成した。第１段階はベースコートとしてバインダーを表面に適用することであり、これを室温で少なくとも１時間風乾した。続いて、ヘキサメチルジシラザンで変性されたポリジメチルシロキサンから構成されるトップシートを適用し、超疎水性層を形成した。超疎水性層の厚さは０．０７ｍｍであると測定された。続いてトップシートを室温でさらに１時間風乾した。ＮＥＶＥＲＷＥＴ（商標名）は１６５°の報告された接触角を有しており、１５０°の接触角を超える超疎水性であると考察された。水および溶液中の未重合化コラーゲンの両方の接触角が、側面写真およびそれに続くＩｍａｇｅＪでの接触角測定によって測定された。
【００５４】
親水性スポットの作成
超疎水性表面上の親水性スポットを、三次元バイオプリンター（バイオ−アッセンブリ  ツール（ＢＡＴ）  ３−Ｄプリンター、エヌスクリプト,インコーポレーテッド、フロリダ州オーランド[Bio-Assembly Tool (BAT) 3-D printer; nScrypt, Inc., Orlando, FL]）を 用いて作成し、プルロニック  Ｆ１２７[Pluronic F-127]（シグマ、ミズーリー州セントルイス）を押し出して形成した。各親水性スポットに関し、ＢＡＴは、１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３．８％（ｗｔ／ｗｔ）プルロニック  Ｆ１２７の標的体積２μＬを押出した。ＢＡＴ時間−圧力押出しシステムでは、これは、前記標的容積を分配するための適切な押出し力を生み出すために、２５Ｇ針を通して１００ｍｓの曝露時間で２．５ＰＳＩを必要とした。次いでこれらのスポットを使用前に３０分間風乾させた。
【００５５】
間質血管細胞群（ＳＶＦ）細胞
ＳＶＦ細胞は、以前に公表された酵素ベースの方法に従ってラット精巣上体脂肪パッドから単離された。全ての動物実験は、ケンタッキー州ルイビルのユニバーシティ  オブ  ルイビルからのＩＡＣＵＣ（インスティテューショナル  アニマル  ケア  アンド  ユース  コミッティ[Institutional Animal Care and Use Committee]）の承認の下に行われた。簡単に説明すると、滅菌外科的処置下でラット精巣上体脂肪パッドから脂肪試料を得、３分間手で細かく刻み、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで洗浄し、２ｍｇ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ（ウォーシングトン  バイオケミカル  カンパニー[Worthington Biochemical Company]、ニュージャージー州フリーホールド）中に懸濁させた。脂肪は、エンビロ−ゲイニー[enviro−genie]（サイエンティフィック  インダストリーズ、ニューヨーク州ボヘミア）を用いて、３７℃で３５分間消化された。ＳＶＦ細胞は、遠心分離（３５０×ｇで４分間）によって脂肪細胞から分離され、その後上清は廃棄された。得られたペレットをＰＢＳで２回洗浄し、２５０μｍフィルターを通して濾過し、そして球状体のバイオプリンティングに直ちに使用するために、内皮細胞培地に再懸濁した。
【００５６】
ＳＶＦ積載コラーゲン球状体の作製
新たに単離したＳＶＦを、最終ｐＨを７．４に滴定した１倍  ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマ、ミズーリー州セントルイス）と混合した未重合のラット尾Ｉ型コラーゲン中に懸濁し、１．６×１０５  ＳＶＦ細胞／最終溶液ｍＬを含む３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの混合物を調製した。この混合物を印刷するまで４℃に保ち、そしてバイオプリンター上の冷媒系を用いて印刷プロセスを通して同等の温度を維持してゲル重合を防止した。ＳＶＦ−コラーゲン溶液を３ｃｃの印刷シリンジ（ＥＦＤ、ノードソン[Nordson]、オハイオ州ウェストレイク）に移し、そして三次元バイオプリンター（エヌスクリプト,インコーポレーテッド、フロリダ州オーランド）に入れた。初期印刷条件は、連続シリンダー印刷について以前に公表されたデータに基づいた。球状体が印刷されたら、それらを組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）中で３７℃で１０分間インキュベートしてコラーゲンゲル重合を開始させた。
【００５７】
球状体培養法
製造後に、球状体は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ヘパリンを含む内皮成長サプリメント、ペニシリン（４５Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（４５μｇ／ｍＬ）から構成される内皮細胞成長媒体を含む細胞懸濁培地のための、スピナーフラスコ（１２５ｍＬ  マグナフレックス  マイクロキャリア  スピナー  フラスク[MagnaFlex Microcarrier Spinner Flask]、ウィートン  インダストリーズ[Wheaton Industries]、ニュージャージー州ミルビル］へと移された。球状体の連続的な懸濁液を提供するために、スピナーフラスコをマグネチックスターラープラットホーム（ＭＣＳ１０４−Ｌバイオロジカル  スターラー[MCS 104-L Biological Stirrer]、テックネ  インコーポレーテッド[Techne Inc.]、ニュージャージー州バーリントン）上に置き、そして、培養期間（１４日間）を通して磁気インペラー速度を４０ｒｐｍに設定した。分析に必要とされる球状体は、５０ｍＬの血清ピペットで除去した。球状体収縮研究のために、個々の球状体は、９６ウェル超低接着プレート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）の別々のウェルにプレート付けした。
【００５８】
球状体サイズの測定
球状体サイズ測定値は、９６ウェルプレート中で培養された球状体の光学顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス、日本国東京）によって得られた画像から計算された。これらの４倍画像の直径測定値は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて得られた。
【００５９】
生死アッセイ
ＳＶＦ生存率は、生／死蛍光染料（ライブ／デッド  バイアブリティ／トキシティ  キット[Live/Dead Viability/Toxicity Kit]、ライフ  テクノロジーズ  インコーポレーテッド[Life Technologies Inc.]、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて評価した。球状体を、ＰＢＳで洗浄し、１０μＭ  カルセインＡＭ[calcein AM]（生）および１０μＭ  エチジウムホモダイマー−１[ethidium homodimer-1]（死）と共に４５分間室温でインキュベートされ、そして落射蛍光顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス、日本国東京）で撮影された。画像は４倍の倍率で撮影した。製造された球状体中の細胞の生存率を定量するために、ＳＶＦ細胞が単離され、そして生存率をニュークリオカウンター[Nucleocounter]を用いて測定し、そして生および死の標準曲線を作成するために使用した。開発された標準曲線に基づいて、生存率を０、２、６、９、および１３日目に測定した。生／死キットを補足するために、細胞の分布を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）での透過処理の１５分後にヘキスト  ３３２５８  ビス−ベンズイミド核染色（アナスペック[Anaspec]、カリフォルニア州）で評価した。
【００６０】
共焦点顕微鏡法
イン・ビトロでの血管新生の分析のために、球状体試料が、１０倍の水浸対物レンズ（オリンパス、日本国東京）を用いたＭＰＥ ＦｌｕｏＶｉｅｗ１０００共焦点顕微鏡を用いて画像化された。共焦点画像スタックをＡＭＩＲＡ  ３Ｄ視覚化ソフトウェア（サーモ[Thermo] 、マサチューセッツ州ウォルサム）で再構築し、z軸投影として表示した。画像化の前に、球状体は４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定され、次に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で室温で１５分間透過処理された。透過処理後、球状体を、ＦＩＴＣ（ＧＳ−１）（ベクター  ラボラトリーズ[Vector Laboratories]、カリフォルニア州バーリンガム）に抱合されたグリフォニア・シンプリシフォリア−１  イソレクチン４[Griffonia Simplicifolia-1 Isolectin 4] で、１：５００の希釈率で染色した。同時に、マウスモノクローナルα−平滑筋アクチン一次抗体を１：２５０で添加した（α−ＳＭＡ）（サンタクルーズ  バイオテクノロジー[Santa Cruz Biotechnology]、テキサス州ダラス）。球状体は４℃で一晩インキュベートされた。翌日、球状体はＰＢＳで３回洗浄され、そしてＲｅｄＤｏｔ核染色剤[RedDot nuclear stain]（バイオチウム[Biotium]、カリフォルニア州フレモント）およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４二次抗体（サーモ  フィッシャー、マサチューセッツ州ウォルサム）と共に、それぞれ１：２００および１：１０００希釈で、室温で２時間インキュベートされた。試料はその後ＰＢＳで洗浄され、前述のようにして画像化された。内皮成分はＧＳ−１  ＦＩＴＣで緑色に染色された。血管周囲支持細胞ならびに線維芽細胞成分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に抱合させたα−ＳＭＡで赤色に染色され、そして核はＲｅｄＤｏｔで染色され、人工的に青色に着色された。
【００６１】
統計分析
ダンネットの多重比較事後検定[Dunnet’s multiple comparisons post-test]を用いた一元配置分散分析[One way ANOVA]が、２日目の平均球状体直径と他のすべての時点との間の統計的有意性を測定するために、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ７  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（グラフパッド  ソフトウェア  インコーポレーテッド[GraphPad Software Inc.]、カリフォルニア州ラ・ジョラ）を介して、用いられた。
【００６２】
結果
【００６３】
これらの研究に利用した三次元バイオプリンターは、押出ペン先の範囲を用いて種々の粘度での物質の時間および圧力調節された押出を行うことが可能であった。水と細胞、培地、およびコラーゲンの懸濁液との印刷された濃度での測定接触角は、それぞれ１５５°および１５６°で記録された。表Ｉは試験した印刷パラメータの範囲を示す。選択されたパラメータは、１０．３球状体／分の速度で均一サイズの球状体の一貫した押出を提供する条件を表す。シリンジ圧力、圧力持続時間、針ゲージがすべて組み合わさって押出し速度、従って、球状体サイズが決定される。より高い圧力およびより大きな針ゲージはより一貫した結果を可能にし、そしてそれらの理由のために選択された。球状体体積を維持するために圧力持続時間は低く保たれた。カートリッジサイズはバッチ容量に最もよく適合するように選択され、コラーゲン濃度は非印刷コラーゲンゲルと比較して球状体特性を維持するように選択された。細胞生存率を維持しながら細胞積載コラーゲンシリンダーを押し出すのに必要な以前に公表された条件を、今回の研究の出発点として使用した。
表Ｉ  球状体を生成するための三次元印刷条件
2019520824.tif 000003
ａ圧力効果は１００ｍｓ圧力持続時間を用いて評価された。
ｂ押圧の時間は一定の５ｐｓｉシリンジ圧を用いて評価された。
ｃｎＳｃｒｙｐｔ  バイオアッセイ  ツールは、正確流体分配システムにおいてＥＦＤカートリッジを利用する（ノードソン  コーポレーション[Nordson Corporation]、オハイオ州ウェストレーク）
ｄノードソンＥＦＤ押出しチップ
ｅラット尾由来コラーゲン
【００６４】
コラーゲンの押出後であるがコラーゲンの重合の前に球状の形態を維持するために、超疎水性コーティングが組織培養ポリスチレンプレート上で使用され、そして三次元球状体をそれらの表面上に直接バイオプリンティングした。図１Ａ〜１Ｂに示すように、球状体は印刷の期間中に、ステージの移動（Ｘ−Ｙ軸）の全体にわたって、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７によって超疎水性表面上に固定化され、そしてその後インキュベーターへと輸送された。超疎水性表面上のそのプルロニック（登録商標）Ｆ１２７ディスクを図１Ｄの図に示す。球状体は、水溶液中でインキュベートされるか、または表面を１０℃に冷却されることにより、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７から簡単に解放される。全プロセスを通して、球状体はそれらの超疎水性表面上ならびにそこより取除いた後においてその形状を維持した。
【００６５】
球状体のバッチ（回分）は、懸濁したＳＶＦ細胞を含有する２ｍＬの未重合Ｉ型コラーゲンを用いて調製され、そしてサイズに応じて１バッチ当たり１００〜１５０個の球状体の量で製造された。球状体は、平均直径が３．５４ｍｍ、標準偏差が０．１９５ｍｍであった。バッチ製造時間は、機器準備の２０分間と、押出しされた４８個の球状体当たり５分間を要した。押出し後、球状体を３７℃で１０分間インキュベートした結果、球状体使用前の総製造時間は３０〜３５分となった。
【００６６】
初期のコラーゲンのゲル化後における三次元印刷ＳＶＦ球状体の代表的形態を図２Ａ〜２Ｈに示す。位相差顕微鏡により可視化されたＳＶＦ積載球状体の形態は均一であり（図２Ａ）、そして移植細胞はカルセインＡＭ生染色によって示されるように、ほとんど生存していた（図２Ｂ）。図２Ｃに見られるように、エチジウムホモ二量体−１で標識された少数の非生存細胞が存在した。ビス−ベンズイミドによる核染色により評価した細胞の分布（図２Ｄ）は均質であり、コラーゲンのゲル化は、特定の位置内で細胞が沈降するといった証拠を何ら示すことなく、球状体全体にわたる細胞のカプセル化を維持することを示した。球状体内の細胞の分布および生存率を、攪拌培養で６日後に再度評価した。生細胞（カルセインＡＭ陽性）は図２Ｆにおいて示され、また死細胞（エチジウムホモ二量体−１陽性）が図２Ｇに示され、そして、核染色による全細胞分布（ビス−ベンズイミド陽性）が図２Ｈに示される。この培養時間時点で、カプセル化されたＳＶＦにおける形態学的変化が、三次元Ｉ型コラーゲン中におけるイン・ビトロでの血管新生の生起を示唆する、延長された新芽や複雑な幾何学形状を有する微小血管構造を含んで、記録された。
【００６７】
ＳＶＦ生存率は、図３に示すように、印刷直後の０日目ならびに２、６、９、および１３日目の培養期間を通して定量された。印刷０日目の生存率（６８．２４％±３．５９％）は、ピペット封入カプセル化の比較対照のそれよりも平均５．９６％低く、カプセル化前の細胞係数装置（Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ）をベースとした生存率よりも２７．８％低かった。
【００６８】
懸濁培養中の球状体の研究は、球状体が、直径の付随した減少を伴う収縮を受けることを示した。球状体の収縮は、図４Ａ〜４Ｄにおいて位相差顕微鏡によって示され、そして図５に示される結果をもって定量的に評価された。攪拌培養において、初期のコラーゲン収縮は、２〜３日目から０．００８３±０．０８７５ｍｍ／日の平均速度で起こり、収縮率は６〜７日目から０．３６７５±０．１３５９ｍｍ／日のピーク速度まで増加した。そのピークの後は、収縮速度は、攪拌培養における９〜１３日目から０．０４２±０．０４６３ｍｍ／日まで減少した。平均球状体直径は、培養において２日目とその後の全ての日数との間で有意に異なっていた（図５、ｐ＜０．０００１）。
【００６９】
ＳＶＦ球状体の一般的な形態学は、球状体が顕著な収縮を起こした時点である、攪拌培養１４日後に評価された。収縮した球状体中の細胞密度が高いため、落射蛍光法は細胞形態の鮮明な画像を得るには不十分であった。そのため、収縮した球状体における細胞の分布を正確に可視化し、血管細胞の表現型を特徴付けるために、１４日目の球状体を内皮（ＧＳ−１ＦＩＴＣ陽性）およびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４陽性）成分に関して染色し、そして共焦点顕微鏡により評価した。その後、Ａｍｉｒａソフトウェアを使用して、構成全体の３Ｄボリュームレンダリングを作成した。細胞は培養中の全時間にわたって生存性を保っているだけでなく、それらはまた、ＳＶＦを利用する三次元Ｉ型コラーゲン  イン・ビトロ  アッセイにおいて以前に観察されたような、血管様構造への表現型の変化を生起した。外膜的にα−ＳＭＡ陽性細胞によって反管腔側を囲繞された内皮細胞の存在によって、管状形成を示す細胞成分の例は、イン・ビトロでの血管新生の証拠を提供するものである。これは図６Ａ〜６Ｂにおいて矢印で強調表示されている。
【００７０】
検討
【００７１】
様々な疾患の治療のための間質血管細胞群を含む幹細胞および再生細胞の送達は、ヒトの臨床試験に到達している。しかしながら、移植部位における細胞の限られた保持は、観察された低い治療効果に関係しているとされてきた。保持を改善するための代替方法は、培養中の細胞の自己凝集および生体物質内への細胞のカプセル化を含んでいた。これらの研究は、移植部位における細胞保持の改善を確立した。間質血管細胞群は、アルギン酸塩を含む細胞保持を改善するために様々な物質にカプセル化されており、ＳＶＦ積載球状体を作り出している。アルギン酸塩中のＳＶＦの保持は細胞生存率を維持する。しかしながら、アルギン酸ゲルは、それらが生着細胞の遊走および増殖を支持しないことを意味する形態学的変化を全く示さず、従ってイン・ビトロ血管形成および細胞ベース治療のための潜在的イン  ビボ適用を制限する。このため、ＳＶＦ細胞集団はその細胞外マトリックス内でイン・ビトロ血管形成を示すことが示されているので、Ｉ型コラーゲンの使用が球状体産生のために探求された。ＳＶＦ積載コラーゲンゲルはシート状に作ることができ、操作が面倒である。さらに、従来のティッシュプレート上に印刷されたコラーゲン球状体は、ポリスチレンの親水性のために急速に平らになる。押出し後および重合後にＩ型コラーゲンを球状体形状に維持するために、超疎水性コーティングを組織培養ポリスチレンプレート上で利用し、そしてこれらの表面上に直接３Ｄバイオプリントした。
【００７２】
超疎水性表面上に印刷しようとする最初の試みは、球状体が超疎水性表面に付着することができず、ほとんどが印刷ペン先に付着したままであることによって、最初は失敗した。この付着力の欠如を克服するために、プルロニックＦ−１２７のディスクを超疎水性表面上に印刷した。プルロニックＦ−１２７は、親水性および疎水性を付与する両親媒性ブロック構造を有するトリブロックコポリマーである。これにより、プルロニックＦ−１２７は超疎水性表面に接着することも、コラーゲンなどの水性物質に接着することもできる。両親媒性表面が確立されたことで、コラーゲン球状体は、様々なサイズを提供する条件を用いて製造された。平均直径の調整は、１ｍｍから３．５ｍｍのサイズの範囲の球状体の製造を可能にする印加圧力の変化によってなされ得る。
【００７３】
自己組織化に基づく球状体生産方法と比較して、両親媒性球状体生産は、球状体のサイズおよび形状において同様の一貫性を有して、一桁速いものである。ＢＡＴのような自動化された時間−圧力押出しシステムを使用するときの球状体サイズの変動の主な原因は、分配される流体の粘度である。しかしながら、安定な中性ｐＨ、低温、およびＢＡＴ押出し前の未重合コラーゲン溶液の完全な混合を含む全てのパラメーターは、球状体バッチ内での変動を最小にするために対処された。
【００７４】
これらの研究は、球状体の完全性と細胞の分布は、１４日間の細胞培養期間を通して静的培養またはそれ以上の動的攪拌培養条件下のいずれでも維持されることを示している。コラーゲンへの封入以前に、ニュークリオカウンターによって測定された細胞の生存率は９６％であったので、コラーゲン包埋の過程で０日目の生存率は３０％弱低下した。しかしながら、ピペット操作したコラーゲン内の生存率は、印刷されたコラーゲンのそれよりもわずか５．９６％高いだけであり、これは、生存率の低下の原因はバイオプリンティングよりもむしろコラーゲンカプセル化であるとの結論を導く。この結論は、ピペットコラーゲンおよび印刷コラーゲンについて＞９０％の生存率を示す他者によって行われたピペットコラーゲン内の生存率に関する以前の研究と矛盾する。特に、この他者が、同じ濃度のコラーゲンにカプセル化された同じ起源の細胞を用いたそれらの生存率アッセイに同じマーカーを使用したことが与えられていた。生存率の差に最も寄与する可能性が最も高い２つの違いは、今回は新鮮な分離株の使用したのに対して他者は印刷前に細胞を培養したこと、および他者ではコラーゲン起源としてリスト化されていなかったラット尾部コラーゲンを今回使用ことである。この矛盾は、他者が、蛍光値でなく目視により、生存率について細胞計数をしたという事実に帰せられるかもしれない。目視により生存率について細胞を計数すると、より暗い対象物に対するユーザの偏りにデータが影響を受けやすいものとなる。相対蛍光単位（ＲＦＵ）に関して、生細胞は同数の死細胞よりも一桁明るいという事実によって、この問題は潜在的に誇張されており、画像ベースの生存率カウントに対する輝度補正はしばしば規制されていない。これは、計数されるべき細胞がどちらかの色で明るく染色されなければならないことを他者が明らかにしたことを考えると、特に可能性が高いように思われる。これは、ピペッティング細胞と印刷細胞との間の生存率の差は、両方の研究において類似しているという事実によってさらに支持された。蛍光光度計に基づく生存率に関する潜在的な問題は、非特異的染色でのゆがみの可能性である。しかしながら、ベースラインとして染色無細胞コラーゲン球状体を今回は使用したことで、無細胞シグナルを補償することを助けたはずであり、また標準曲線は細胞非特異的染色を補償したはずである。０日目以降、生存率は攪拌培養の期間を通して高いままであったが、９日目の後期球状体収縮と一致する生存率の低下があった。
【００７５】
球状体を形成するためにアルギン酸塩を使用した結果とは対照的に、細胞形態の顕著な変化があり、これは、特に限定されるものではないが、保持された微小血管フラグメントからの先端細胞形成および発芽を含む、血管形成の初期段階を細胞が示した可能性を示した。ＳＶＦ−コラーゲン球状体の収縮も、細胞培養後６日間後に観察された。線維芽細胞および内皮細胞の存在下でのコラーゲン収縮は十分に立証されており、そして細胞依存性収縮がこれらの埋め込まれた細胞の活性代謝、微小環境リモデリング、および細胞運動性の評価を提供することが示唆されている。収縮した球状体における細胞組成および表現型の共焦点顕微鏡分析は、α平滑筋アクチンと共に内皮細胞特異的レクチン  グリフォニア・シンプリシフォリア−１（ＧＳ−１）に関して陽性に染色される組織化され、延長化された、管構造の存在を示唆した。経時的なこの表現型の変化は、ＳＶＦが微小血管様構造に自己組織化する（血管発生[vasculogenesis]）か、または内皮細胞が既存の微小血管フラグメントから出芽している（血管新生[angelogenesis]）かのいずれかであるという証拠を提供した。イン・ビトロでのＳＶＦの血管発生および血管新生は、イン・ビボでの虚血状態の治療のために血管新生前のＩ型コラーゲン球状体を利用する治療的可能性を提供する。
【００７６】
直接描画コンピュータに支援された設計および製造による自動化は、両親媒性表面を利用して制御された、正確な、そして効率的な方法で球状体を製造する機会を提供した。そのようなシステムはまた、薬物伝達、細胞伝達、または免疫療法伝達を含む多数の目的のために、ハイスループット微小環境に基づくアッセイを設計する機会を提示した。球状体のいくつかのイン・ビトロ適用はまだ調査されていない。フィブリン、ヒアルロン酸、および他の未開発のヒドロゲルなどの生体物質からなる、多数の細胞外マトリックスをベースとする球状体を製造する能力は、様々な細胞ベースの治療法に適した微小環境の創出を可能とするであろう。実際に、表現型の変動および細胞機能は、使用されるＥＣＭに応じて異なり得る。周囲の宿主組織との機能的相互作用を含む、カプセル化された細胞の治療上の利点に対処しそして特徴づけるために、液体懸濁された細胞単独の直接注入と比較しての、イン・ビボ研究もまた必要である。
【００７７】
要約すると、前述の研究は、両親媒性表面を使用して、均一なサイズおよび形状の生存可能なＳＶＦ積載球状体を生成することができることが実証された。三次元バイオプリンターによる自動化の追加は、治療臨床設定の点において適合するハイスループットおよび十分に短い生産時間を可能にする。さらに、水溶性親水性スポットの使用およびプルロニックＦ−１２７の相転移特性は、球状体操作を必要とするであろう任意の用途において破壊的な球状体除去を最小限化することを可能にする。これらのＳＶＦ積載コラーゲン球状体は、細胞の局在化および保持を改善することによって再生目的での細胞注入の治療効果を高めるための戦略を提供することができる。
【００７８】
実施例２  膵島細胞積載球状体の製造
【００７９】
方法
【００８０】
超疎水性表面の作製、親水性スポットの形成、およびＳＶＦ細胞の単離。超疎水性表面と親水性スポットの形成は、実施例１で上述したと実質的に同様にして行われた。ＳＶＦ細胞は、上記実施例１においてまた説明したように以前に公開された酵素ベースの方法に従って再びラット精巣上体脂肪パッドから単離された。
【００８１】
膵島単離
膵島はバラマルガン［Balamarughan]の方法に従って単離された。
【００８２】
膵島／ＳＶＦ積載コラーゲン球状体の作製
新たに単離したＳＶＦおよび膵島を、最終ｐＨを７．４に滴定した１倍  ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（シグマ、ミズーリー州セントルイス）と混合した未重合のラット尾Ｉ型コラーゲン中に懸濁し、１．６×１０５  ＳＶＦ細胞／最終溶液ｍＬを含む３ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの混合物を調製した。この混合物を印刷するまで４℃に保ち、そしてバイオプリンター上の冷媒系を用いて印刷プロセスを通して同等の温度を維持してゲル重合を防止した。膵島／ＳＶＦ−コラーゲン溶液を３ｃｃの印刷シリンジ（ＥＦＤ、ノードソン[Nordson]、オハイオ州ウェストレイク）に移し、そして三次元バイオプリンター（エヌスクリプト,インコーポレーテッド、フロリダ州オーランド）に入れた。初期印刷条件は、連続シリンダー印刷について以前に公表されたデータに基づいた。球状体が印刷されたら、それらを組織培養インキュベーター（５％ＣＯ２）中で３７℃で１０分間インキュベートしてコラーゲンゲル重合を開始させた。
【００８３】
球状体培養法
製造後に、球状体は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ヘパリンを含む内皮成長サプリメント、ペニシリン（４５Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（４５μｇ／ｍＬ）から構成される内皮細胞成長媒体を含む細胞懸濁培地のための、スピナーフラスコ（１２５ｍＬ  マグナフレックス  マイクロキャリア  スピナー  フラスク[MagnaFlex Microcarrier Spinner Flask]、ウィートン  インダストリーズ[Wheaton Industries]、ニュージャージー州ミルビル］へと移された。球状体の連続的な懸濁液を提供するために、スピナーフラスコをマグネチックスターラープラットホーム（ＭＣＳ１０４−Ｌバイオロジカル  スターラー[MCS 104-L Biological Stirrer]、テックネ  インコーポレーテッド[Techne Inc.]、ニュージャージー州バーリントン）上に置き、そして、培養期間（１４日間）を通して磁気インペラー速度を４０ｒｐｍに設定した。分析に必要とされる球状体は、５０ｍＬの血清ピペットで除去した。球状体収縮研究のために、個々の球状体は、９６ウェル超低接着プレート（コーニング、ニューヨーク州コーニング）の別々のウェルにプレート付けした。
【００８４】
球状体サイズの測定
球状体サイズ測定値は、９６ウェルプレート中で培養された球状体の光学顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス、日本国東京）によって得られた画像から計算された。これらの４倍画像の直径測定値は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて得られた。
【００８５】
生死アッセイ
膵島およびＳＶＦ生存率は、生／死蛍光染料（ライブ／デッド  バイアブリティ／トキシティ  キット[Live/Dead Viability/Toxicity Kit]、ライフ  テクノロジーズ  インコーポレーテッド[Life Technologies Inc.]、カリフォルニア州カールスバッド）を用いて評価した。球状体を、ＰＢＳで洗浄し、１０μＭ  カルセインＡＭ[calcein AM]（生）および１０μＭ  エチジウムホモダイマー−１[ethidium homodimer-1]（死）と共に４５分間室温でインキュベートされ、そして落射蛍光顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス、日本国東京）で撮影された。画像は４倍の倍率で撮影した。製造された球状体中の細胞の生存率を定量するために、ＳＶＦ細胞が単離され、そして生存率をニュークリオカウンター[Nucleocounter]を用いて測定し、そして生および死の標準曲線を作成するために使用した。開発された標準曲線に基づいて、生存率を０、２、６、９、および１３日目に測定した。生／死キットを補足するために、細胞の分布を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）での透過処理の１５分後にヘキスト  ３３２５８  ビス−ベンズイミド核染色（アナスペック[Anaspec]、カリフォルニア州）で評価した。
【００８６】
インスリン放出
インスリン放出は、ＥＬＩＳＡを用いて定量した。
【００８７】
予備血管新生された膵島移植片の研究
ストレプトゾトシンの注入によって糖尿病とされた免疫無防備状態マウスに、予備血管新生された膵島が移植された。予備血管新生された膵島は皮下的に移植された。血糖値が、膵島移植後に測定された。
【００８８】
共焦点顕微鏡法
イン・ビトロでの血管新生の分析のために、球状体試料が、１０倍の水浸対物レンズ（オリンパス、日本国東京）を用いたＭＰＥ ＦｌｕｏＶｉｅｗ１０００共焦点顕微鏡を用いて画像化された。共焦点画像スタックをＡＭＩＲＡ  ３Ｄ視覚化ソフトウェア（サーモ[Thermo] 、マサチューセッツ州ウォルサム）で再構築し、z軸投影として表示した。画像化の前に、球状体は４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定され、次に０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で室温で１５分間透過処理された。透過処理後、球状体を、ＦＩＴＣ（ＧＳ−１）（ベクター  ラボラトリーズ[Vector Laboratories]、カリフォルニア州バーリンガム）に抱合されたグリフォニア・シンプリシフォリア−１  イソレクチン４[Griffonia Simplicifolia-1 Isolectin 4] で、１：５００の希釈率で染色した。同時に、マウスモノクローナルα−平滑筋アクチン一次抗体を１：２５０で添加した（α−ＳＭＡ）（サンタクルーズ  バイオテクノロジー[Santa Cruz Biotechnology]、テキサス州ダラス）。球状体は４℃で一晩インキュベートされた。翌日、球状体はＰＢＳで３回洗浄され、そしてＲｅｄＤｏｔ核染色剤[RedDot nuclear stain]（バイオチウム[Biotium]、カリフォルニア州フレモント）およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４二次抗体（サーモ  フィッシャー、マサチューセッツ州ウォルサム）と共に、それぞれ１：２００および１：１０００希釈で、室温で２時間インキュベートされた。試料はその後ＰＢＳで洗浄され、前述のようにして画像化された。内皮成分はＧＳ−１  ＦＩＴＣで緑色に染色された。血管周囲支持細胞ならびに線維芽細胞成分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４に抱合させたα−ＳＭＡで赤色に染色され、そして核はＲｅｄＤｏｔで染色され、人工的に青色に着色された。
【００８９】
統計分析
ダンネットの多重比較事後検定[Dunnet’s multiple comparisons post-test]を用いた一元配置分散分析[One way ANOVA]が、２日目の平均球状体直径と他のすべての時点との間の統計的有意性を測定するために、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ７  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（グラフパッド  ソフトウェア  インコーポレーテッド[GraphPad Software Inc.]、カリフォルニア州ラ・ジョラ）を介して、用いられた。
【００９０】
結果および考察
【００９１】
三次元バイオプリンティングは、移植のための組織構築物の開発への新規なアプローチを示す。本研究は、脂肪由来ＳＶＦ細胞および脂肪由来微小血管フラグメントを印刷すること、および続いてそれらの生存率および保持性を評価するためにこれらの構築物を移植することの実現可能性を示すためになされた。所定のサイズの細胞カプセル化球状体を作製するための技術を利用して、膵島構築物をバイオプリンティングするためのさらなる可能化技術が開発された。最初の研究はカプセル化生体物質としてアルギン酸塩を利用した。これらの研究は、脂肪ＳＶＦおよび膵島を共局在化する能力を確立し、そしてこれらの膵島は、培養中１４日間まで生存可能であり続けたが、球状体循環との宿主血管の統合の欠如が観察された。従って、Ｉ型コラーゲンをマトリックス分子として使用することに焦点を当てて、球状体を作製するための代替方法が探求された。上述のように、非疎水性溶液の球状体形状を維持するために超疎水性表面および親水性表面を使用する技術的解決法が見出された。これに関して、図１に示すものと同様に、バイオプリントシステムを使用して膵島と脂肪ＳＶＦを含む球状体をバイオプリントした。。図７は、そのような球状体の画像を示すものであり、そして膵島および脂肪由来の再生細胞を同時印刷する能力を証明するものである。図７は、これらの球状体における細胞分布、および攪拌培養において７日を超える期間にわたって膵島／ＳＶＦ球状体の構造的完全性を印刷および維持する能力を示す。さらに、図８および図９Ａ〜９Ｇに示されるように、糖尿病動物モデルにおいて高血糖を矯正する能力が確立されており、またＳＶＦ積載球状体における血管様構造の形成が示されている。
【００９２】
以下に示すリストにあるものを含めて、本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかもそれぞれの刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に示したものと同じ程度をもって、関連により本文書中に組み入れられる。
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【００９３】
なお、今回開示した主題の様々な詳細は、本文書に開示される主題の範囲から逸脱することなく変更できることが理解されるであろう。さらに、前述の記載は例示のみを目的とするものであり、限定を目的とするものではない。
【図１Ａ】
2019520824.tif 000004
【図１Ｂ】
2019520824.tif 000005
【図１Ｃ】
2019520824.tif 000006
【図１Ｄ】
2019520824.tif 000007
【図２Ａ】
2019520824.tif 000008
【図２Ｂ】
2019520824.tif 000009
【図２Ｃ】
2019520824.tif 000010
【図２Ｄ】
2019520824.tif 000011
【図２Ｅ】
2019520824.tif 000012
【図２Ｆ】
2019520824.tif 000013
【図２Ｇ】
2019520824.tif 000014
【図２Ｈ】
2019520824.tif 000015
【図３】
2019520824.tif 000016
【図４Ａ】
2019520824.tif 000017
【図４Ｂ】
2019520824.tif 000018
【図４Ｃ】
2019520824.tif 000019
【図４Ｄ】
2019520824.tif 000020
【図５】
2019520824.tif 000021
【図６Ａ】
2019520824.tif 000022
【図６Ｂ】
2019520824.tif 000023
【図７Ａ】
2019520824.tif 000024
【図７Ｂ】
2019520824.tif 000025
【図８】
2019520824.tif 000026
【図９Ａ】
2019520824.tif 000027
【図９Ｂ】
2019520824.tif 000028
【図９Ｃ】
2019520824.tif 000029
【図９Ｄ】
2019520824.tif 000030
【図９Ｅ】
2019520824.tif 000031
【図９Ｆ】
2019520824.tif 000032
【図９Ｇ】
2019520824.tif 000033
【国際調査報告】
2019520824.tif 000034