(57)【要約】  本明細書中で開示されるのは、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種由来のマンナナーゼ、当該マンナナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該マンナナーゼを含有する組成物、及びそれらの使用方法である。マンナナーゼを含有する組成物は、洗剤としての使用に、布地及び硬い表面の洗浄に、そして種々の他の産業用途において、適している。【選択図】図４Ａ
2019504616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）１０、１９、３８、５９、６０、６２、６３、６６、６７、６８、７０、７１、７４、７５、７８、７９、８０、９７、１２９、１３１、１３５、１３６、１４３、１６７、１６８、１８４、２１３、２１４、２２５、２２８、２３５、２４２、２４４、２５８、２５９、２６１、及び２８３；
（ｉｉ）１９、３８、６３、６７、７１、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１；
（ｉｉｉ）１９、３８、６７、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１；
（ｉｖ）１９、３８、６７、１２９、１６８、１８４、２２５、２４４、２５８、及び２６１；
（ｖ）１９、３８、６７、９７、１２９、１６８、１８４、２４４、２５８、及び２６１；
（ｖｉ）８５、１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１；又は
（ｖｉｉ）１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１；
から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片であって：
前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項２】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は：
（ｉ）Ｘ１０Ｑ／Ｔ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｘ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｘ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｘ７０Ｒ／Ｖ、Ｘ７１Ｄ／Ｈ、Ｘ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｘ７５Ｉ、Ｘ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｘ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｘ８０Ｑ／Ｔ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１３１Ｐ、Ｘ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ｘ１３６Ｅ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２１３Ｅ、Ｘ２１４Ｃ／Ｑ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４２Ｓ／Ｅ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｘ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＸ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔ；
（ｉｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ７１Ｄ／Ｈ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｉｉｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｉｖ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖｉｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒ；又は
（ｖｉｉｉ）Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒ；
から選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含み：
Ｘは、あらゆるアミノ酸である、請求項１に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項３】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は：
（ｉ）Ｎ／Ｔ１０Ｑ／Ｔ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｇ／Ｓ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ／Ｑ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｅ／Ｔ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｉ／Ｌ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ／Ｔ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｋ／Ｒ７０Ｒ／Ｖ、Ｅ／Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｅ／Ｎ／Ｓ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｌ／Ｖ７５Ｉ、Ｄ／Ｑ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｎ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｈ／Ｋ８０Ｑ／Ｔ、Ａ／Ｎ／Ｓ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｓ／Ｔ１３１Ｐ、Ｄ／Ｓ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ａ１３６Ｅ、Ｄ／Ｋ／Ｑ１４３Ｑ／Ｒ、Ｆ／Ｙ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｄ／Ｎ２１３Ｅ、Ｋ／Ｑ２１４Ｃ／Ｑ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ／Ｄ／Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｅ／Ｑ２４２Ｓ／Ｅ、Ｋ／Ｒ／Ｙ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｅ／Ｇ／Ｓ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＤ／Ｇ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔ；
（ｉｉ）Ｎ１０Ｑ／Ｔ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｓ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｔ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｌ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｋ７０Ｒ／Ｖ、Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｎ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｖ７５Ｉ、Ｑ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｎ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｋ８０Ｑ／Ｔ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｔ１３１Ｐ、Ｓ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ａ１３６Ｅ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｆ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｎ２１３Ｅ、Ｋ２１４Ｃ／Ｑ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｑ２４２Ｓ／Ｅ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｇ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＤ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔ；
（ｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｉｖ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ／Ｎ／Ｓ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｄ／Ｋ／Ｑ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ／Ｄ／Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＤ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＤ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｖｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｉｘ）Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ／Ｖ８５Ｌ−Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｘ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ；
（ｘｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｎ／Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｓ／Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｎ／Ｅ２６１Ｒ；
（ｘｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒ；又は
（ｘｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒ
から選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含む、請求項１又は２に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項４】
配列番号２又は配列番号１６のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％又は少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含むが、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＡＥＸ６０７６２、そしてＷＰ＿０４６２１４４６２でなく、且つ場合によってはＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含むが、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＰｐａＭａｎ２、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＰａｐＭａｎ９、ＡＥＸ６０７６２、ＷＰ＿０４６２１４４６２、そしてＥＰ２２６０１０５−０４１８でないことを条件とする、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項７】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに：
（ｉ）位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆ又はＹであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）；（ｉｉ）位置２６３〜２７４にてＬＤＸＸＸＧＰＸＧＸＬＴ（配列番号１２）のモチーフ（式中、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）；（ｉｉｉ）位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍ又はＬであり、Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）；及び（ｉｖ）位置２６３〜２７４にてＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフから選択される１つ又は複数のモチーフを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項８】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに：
（ｉ）位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆ又はＹであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）；（ｉｉ）位置２６３〜２７４にてＬＤＸＸＸＧＰＸＧＸＬＴ（配列番号１２）のモチーフ（式中、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）；（ｉｉｉ）位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍ又はＬであり、Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）；及び（ｉｖ）位置２６３〜２７４にてＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフから選択される１つ又は複数のモチーフを含み、
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３１、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＰｓｐＭａｎ９、ＡＥＸ６０７６２、ＷＰ＿０４６２１４４６２、ＹＰ＿００３８６８９８９、ＹＰ＿００３９４４８８４、ＷＰ＿０１７４２７９８１、ＡＡＸ８７００２、ＷＰ＿００９５９３７６９、ＹＰ＿００６１９０５９９、そしてＷＰ＿０１９９１２４８１でなく、且つ場合によってはＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、そしてＰｐａＭａｎ２でないことを条件とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項９】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフを含み、式中、Ｘａは、Ｆであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸であり、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３１、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、そしてＡＥＸ６０７６２でなく、且つ場合によってはＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする、請求項８に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１０】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）又はＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフを含み、式中、Ｘ１は、Ｍであり；Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮであり、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、そしてＷＰ＿０４６２１４４６２でなく、且つ場合によってはＰａｍＭａｎ２でないことを条件とする、請求項８に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１１】
前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、（ｉ）位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）、及び（ｉｉ）位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）又はＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍであり；Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）を含み、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、そしてＷＰ＿０１７６８８７４５でなく、且つ場合によってはＰａｍＭａｎ２でないことを条件とする、請求項８に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１２】
前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、基準ポリペプチドに由来し、前記基準ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１３】
前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、前記基準ポリペプチドのアミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性が、少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である、請求項１２に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１４】
前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、基準ポリペプチドに由来し、前記基準ポリペプチドは、ＧＨ５マンナナーゼであり、前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、場合によっては、ＧＨ５マンナナーゼ又はエンド−β−マンナナーゼである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１５】
前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、マンナナーゼ活性を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１６】
マンナナーゼ活性は、界面活性剤及び／又はプロテアーゼの存在下で示される、請求項１５に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１７】
前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、基準ポリペプチドに対して１つ又は複数の特性が向上している、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１８】
向上する前記特性は、熱的安定性、洗剤安定性、マンナン基質に対する特異的活性、及び洗浄性能から選択される、請求項１７に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項１９】
前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、炭水化物−結合モジュールを含まない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含む洗浄組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つの界面活性剤；カルシウム及び亜鉛から選択される少なくとも１つのイオン；少なくとも１つの補助剤成分；少なくとも１つの安定化剤；約０．００１重量％〜約１．０重量％の、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片；少なくとも１つの漂白剤；並びに／あるいはアシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エキソ−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、及びそれら組合せから選択される少なくとも１つの酵素又は酵素誘導体：をさらに含む、請求項２０のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項２２】
前記洗浄組成物は、洗濯洗剤、布地柔軟仕上げ洗剤、食器洗い洗剤、及び硬質表面洗浄洗剤から選択される洗剤組成物である、請求項２０又は２１に記載の洗浄組成物。
【請求項２３】
前記洗浄組成物は、液体、粉末、顆粒状の固体、タブレット、シート、及び単位用量から選択される形態である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項２４】
前記組成物は、ホスフェートを含有し、若しくはホスフェートを含有せず、且つ／又はホウ素を含有し、若しくはホウ素を含有しない、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の洗浄組成物。
【請求項２５】
マンナンを含む汚れ又は染みを含む表面又はアイテムを、（ｉ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片、あるいは（ｉｉ）請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の洗浄組成物と接触させることを含み、前記汚れ又は前記染みに含有される前記マンナンは加水分解される、洗浄方法
【請求項２６】
前記アイテムは、皿類又は布地である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を生産する方法であって：
（ａ）請求項２８に記載の発現ベクターで請求項２９に記載の宿主細胞を安定して形質転換することと；
（ｂ）形質転換された前記宿主細胞を、前記宿主細胞が前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を産生するのに適した条件下で培養することと；
（ｃ）前記マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を回収することと
を含む方法。
【請求項３１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含む食品組成物若しくは飼料組成物及び／又は食品添加物。
【請求項３２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の、食品組成物若しくは飼料組成物、並びに／又は食品添加物若しくは飼料添加物、並びに／又は食品若しくは飼料及び／若しくはペットフードの調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月５日出願の米国仮特許出願第６２／２５１５１６号明細書、及び２０１６年１月１３日出願の米国仮特許出願第６２／２７８３８３号明細書の優先権の利益に関し、且つこれを主張する。これらの出願は双方とも、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書中で開示されるのは、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種由来のマンナナーゼ、当該マンナナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該マンナナーゼを含有する組成物、及びそれらの使用方法である。マンナナーゼを含有する組成物は、洗剤としての使用に、布地及び硬い表面の洗浄に、そして種々の他の産業用途において、適している。
【０００３】
電子的に提出される配列表への参照
ＡＳＣＩＩテキストファイル（名前：ＮＢ４０８３１ＷＯＰＣＴ＿ＳＴ２５；サイズ：５９．３ＫＢ；作成日：２０１６年１１月２日）として本出願と共に電子的に提出された配列表の内容は、本出願の一部を形成し、そしてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
エンド−β−マンナナーゼが挙げられるマンナナーゼ酵素は、マンナンを加水分解することによってガムの染みを除去する洗剤洗浄組成物に使用されてきた。種々のマンナンが自然界に見出され、例えば、直鎖マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、及びグルコガラクトマンナンがある。そのような各マンナンは、グルコース残基で最大３３％置換されていてよいマンノース残基のβ−１，４−結合骨格を含有する多糖で構成される（Ｙｅｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，７０：１，２０１０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。ガラクトマンナン又はグルコガラクトマンナンにおいて、ガラクトース残基が、アルファ−１，６−結合でマンナン骨格に結合している（Ｍｏｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｆｉｌｈｏ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７９：１６５，２００８）。したがって、マンナンの、その構成糖への加水分解には、エンド−１，４−β−マンナナーゼが必要とされ、これは、骨格結合を加水分解して、短鎖のマンノオリゴサッカライドを生じさせる。マンノオリゴサッカライドはさらに、１，４−β−マンノシダーゼによって単糖に分解される。マンナナーゼ、例えばエンド−β−マンナナーゼが、工業用酵素の技術において知られているが、特定の条件及び用途に適した更なるマンナナーゼが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書中で開示される変異体、組成物、及び方法は、組換えグリコシルヒドロラーゼファミリー５（ＧＨ５）マンナナーゼ、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関する。例えば、２０１５年７月１０日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／４００５７号明細書（後に国際公開第２０１６／００７９２９号パンフレットとして公開）においてより完全に記載されている野生型マンナナーゼである、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＰｓｐＭａｎ４マンナナーゼ（配列番号２）は、ＧＨ５マンナナーゼであり、これは、マンナナーゼについて予想される活性を有し、且つ、三次元構造が比較された場合に、他のＧＨ５メンバーとの高い構造的類似性を示す。以下の２つの多様に置換されているＰｓｐＭａｎ４変異体：ＰｓｐＭａｎ１１８（配列番号６）及びＰｓｐＭａｎ１４８（配列番号７）の三次元構造は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＪＡＭＢ−６０２（ＰＤＢエントリ１ＷＫＹ＿Ａ）（配列番号１０）及びＢ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）（ＰＤＢエントリ２ＷＨＬ＿Ａ）（Ｑ５ＹＥＸ６の残基３０〜３３０）（配列番号９）のＧＨ５マンナナーゼ構造に相同である。ＧＨ５マンナナーゼ：ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、ＵＳ６５６６１１４−００２の残基３２〜３３０（配列番号１５）、及びＵＳ６５６６１１４−００２の残基３２〜３４０（配列番号１７）は全て、１ＷＫＹ＿Ａのアミノ酸配列（配列番号１０）に対するアミノ酸配列同一性が９０％を超え、そして結果として、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体において探究された多くの部位は、例えば、２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号９）、１ＷＫＹ＿Ａ（配列番号１０）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）、並びに他のＮＤＬ−クレードマンナナーゼ、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３３０）（配列番号１５）、及びＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）のアミノ酸配列における、構造的に対応する各位置にて、同じアミノ酸を有する。したがって、これらの、そして２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号９）、１ＷＫＹ＿Ａ（配列番号１０）、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）、又は他のＮＤＬ−クレードマンナナーゼ、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３３０）（配列番号１５）、及びＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）のマンナナーゼに構造的に類似する他のＧＨ５マンナナーゼにおける置換は、基準ポリペプチドＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、及びＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）について、本明細書中に記載される置換と同じ性能及び安定性の向上を付与すると予想される。
【０００６】
一実施形態は、１０、１９、３８、５９、６０、６２、６３、６６、６７、６８、７０、７１、７４、７５、７８、７９、８０、９７、１２９、１３１、１３５、１３６、１４３、１６７、１６８、１８４、２１３、２１４、２２５、２２８、２３５、２４２、２４４、２５８、２５９、２６１、及び２８３から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｘ１０Ｑ／Ｔ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｘ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｘ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｘ７０Ｒ／Ｖ、Ｘ７１Ｄ／Ｈ、Ｘ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｘ７５Ｉ、Ｘ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｘ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｘ８０Ｑ／Ｔ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１３１Ｐ、Ｘ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ｘ１３６Ｅ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２１３Ｅ、Ｘ２１４Ｃ／Ｑ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４２Ｓ／Ｅ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｘ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＸ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｎ／Ｔ１０Ｑ／Ｔ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｇ／Ｓ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ／Ｑ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｅ／Ｔ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｉ／Ｌ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ／Ｔ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｋ／Ｒ７０Ｒ／Ｖ、Ｅ／Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｅ／Ｎ／Ｓ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｌ／Ｖ７５Ｉ、Ｄ／Ｑ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｎ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｈ／Ｋ８０Ｑ／Ｔ、Ａ／Ｎ／Ｓ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｓ／Ｔ１３１Ｐ、Ｄ／Ｓ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ａ１３６Ｅ、Ｄ／Ｋ／Ｑ１４３Ｑ／Ｒ、Ｆ／Ｙ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｄ／Ｎ２１３Ｅ、Ｋ／Ｑ２１４Ｃ／Ｑ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ／Ｄ／Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｅ／Ｑ２４２Ｓ／Ｅ、Ｋ／Ｒ／Ｙ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｅ／Ｇ／Ｓ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＤ／Ｇ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔ、又は（ｉｉ）Ｎ１０Ｑ／Ｔ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｓ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｔ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｌ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｋ７０Ｒ／Ｖ、Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｎ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｖ７５Ｉ、Ｑ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｎ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｋ８０Ｑ／Ｔ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｔ１３１Ｐ、Ｓ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ａ１３６Ｅ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｆ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｎ２１３Ｅ、Ｋ２１４Ｃ／Ｑ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｑ２４２Ｓ／Ｅ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｇ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＤ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【０００７】
さらに別の実施形態は、（ｉ）１９、３８、６３、６７、７１、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１、又は（ｉｉ）１９、３８、６７、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ７１Ｄ／Ｈ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ／Ｎ／Ｓ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｄ／Ｋ／Ｑ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ／Ｄ／Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＤ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【０００８】
別の実施形態は、（ｉ）１９、３８、６７、１２９、１６８、１８４、２２５、２４４、２５８、及び２６１、又は（ｉｉ）１９、３８、６７、９７、１２９、１６８、１８４、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＤ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【０００９】
更なる実施形態は、（ｉ）８５、１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１、又は（ｉｉ）１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。別の実施形態は、（ｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒ、又は（ｉｉｉ）Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。さらに別の実施形態は、（ｉ）Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ／Ｖ８５Ｌ−Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｎ／Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｓ／Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｎ／Ｅ２６１Ｒ、（ｉｖ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒ、又は（ｖ）Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００１０】
更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、配列番号２又は配列番号１６のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％又は少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、基準ポリペプチドとして、マンナナーゼ（エンド−１，４−β−マンノシダーゼ、ＥＣ  ３．２．１．７８）のＧＨ５＿８サブファミリー内の、天然に存在するマンナナーゼ及び組換えマンナナーゼが挙げられる。マンナナーゼのＧＨ５＿８サブファミリーは、Ａｓｐｅｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ５（ＧＨ５）」、ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：１８６においてより完全に記載されている。さらに別の実施形態において、基準ポリペプチドは、ＧＨ５マンナナーゼである。さらに別の実施形態において、基準ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７から選択される。更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、基準ポリペプチドのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＧＨ５マンナナーゼである。更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、基準ポリペプチドに対して１つ又は複数の特性が向上している。更なる実施形態において、基準ポリペプチドに対して向上している１つ又は複数の特性は、熱安定性、洗剤安定性、マンナン基質に対する特異的活性、並びに洗濯用途及び食器洗い用途に関連した基質に対する洗浄性能から選択される。更なる実施形態において、基準ポリペプチドに対して向上している１つ又は複数の特性は、熱安定性、マンナン基質に対する特異的活性、並びに洗濯用途及び食器洗い用途に関連した基質に対する洗浄性能から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、１ＷＫＹ＿Ａマンナナーゼの、ＰｓｐＭａｎ１１８マンナナーゼ変異体との構造比較を示しており、１ＷＫＹ＿Ａマンナナーゼの主鎖を灰色で示し、ＰｓｐＭａｎ１１８マンナナーゼの主鎖を黒色で示す。
【図２】図２は、ＰｓｐＭａｎ１１８のＮＤＬモチーフ及び欠失モチーフの領域における、ＰｓｐＭａｎ１１８構造及び１ＷＫＹ＿Ａ構造の構造比較を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰｓｐＭａｎ１４８（黒色）マンナナーゼ及び２ＷＨＬ＿Ａ（淡い灰色）マンナナーゼの主鎖折畳みの比較を示しており、２ＷＨＬ＿Ａに結合するマンノトリオシル部分は、（基質結合部位の相対的位置を示すために）灰色のスティックとして示し、ＰｓｐＭａｎ１４８に存在する１８個のアミノ酸置換の側鎖を、黒色のスティック図として示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰｓｐＭａｎ１４８（黒色）マンナナーゼ及び２ＷＨＬ＿Ａ（淡い灰色）マンナナーゼの主鎖折畳みの比較を示しており、２ＷＨＬ＿Ａに結合するマンノトリオシル部分は、（基質結合部位の相対的位置を示すために）灰色のスティックとして示し、基質結合部位の周りの、且つ近くの、ＰｓｐＭａｎ１４８における７個の置換（Ｓ３０Ｔ、Ｓ５９Ｖ、Ｌ６０Ｑ、Ｋ６３Ｒ、Ｔ２２８Ｖ、Ｓ２５８Ｄ、及びＮ２６１Ｒ）の位置を、黒色の球として示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＰｓｐＭａｎ１４８（黒色）マンナナーゼ及び２ＷＨＬ＿Ａ（淡い灰色）マンナナーゼの主鎖折畳みの比較を示しており、２ＷＨＬ＿Ａに結合するマンノトリオシル部分は、（基質結合部位の相対的位置を示すために）灰色のスティックとして示し、ＰｓｐＭａｎ１４８における１１個の表面置換を、黒色の球として示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＭＵＳＣＬＥソフトウェアを用いた、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）、ＰｓｐＭａｎ１４８（配列番号７）、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３３０）（配列番号１５）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、及び２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号９）のマンナナーゼ触媒ドメインの複数の配列アラインメントを示し、ＰｓｐＭａｎ４中の生産的位置を、下線を引いた太字のフォントで示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＭＵＳＣＬＥソフトウェアを用いた、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）、ＰｓｐＭａｎ１４８（配列番号７）、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３３０）（配列番号１５）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、及び２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号９）のマンナナーゼ触媒ドメインの複数の配列アラインメントを示し、ＰｓｐＭａｎ４中の生産的位置を、下線を引いた太字のフォントで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書中で記載されるのは、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種由来のエンド−β−マンナナーゼ、そのようなエンド−β−マンナナーゼをコードするポリヌクレオチド、そのようなマンナナーゼを含有する洗浄組成物、及びそれらの使用方法である。一実施形態において、本明細書中で記載されるパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種エンド−β−マンナナーゼは、グリコシルヒドロラーゼ活性を有し、且つ／又は洗浄組成物及び／若しくはプロテアーゼの存在下で安定している。本明細書中に記載されるエンド−β−マンナナーゼの特徴は、種々の洗浄用途及び他の工業用途での使用によく適しており、例えばそこで、当該酵素は、洗剤組成物中に見出される界面活性剤、プロテアーゼ、及び／又は他の成分の存在下でマンナンを加水分解することができる。
【００１３】
明確にするために以下の用語が定義される。定義されない用語及び略語は、当該技術分野において用いられている通常の意味が与えられるべきである。例えば、本明細書中で定義されない技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ  １９９４；及びＨａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ  １９９１参照）。
【００１４】
単数の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の言及を含む。
【００１５】
用語「マンナンエンド−１，４−β−マンノシダーゼ」、「エンド−１，４−β−マンナナーゼ」、「エンド−β−１，４−マンナーゼ」、「β−マンナナーゼＢ」、「β−１，４−マンナン４−マンナノヒドロラーゼ」、「エンド−β−マンナナーゼ」、「β−Ｄ−マンナナーゼ」、「１，４−β−Ｄ−マンナンマンナノヒドロラーゼ」、又は「エンド−β−マンナナーゼ」（ＥＣ  ３．２．１．７８）は、マンナン、ガラクトマンナン、及びグルコマンナン中の１，４−β−Ｄマンノシド結合のランダムな加水分解が可能な酵素を指す。エンド−１，４−β−マンナナーゼは、グリコシルヒドロラーゼのいくつかのファミリーのメンバーであり、ＧＨ２６及びＧＨ５が挙げられる。特に、エンド−β−マンナナーゼは、マンナンを分解させる一群のポリサッカラーゼを構成し、そして、マンノース単位を含有するポリオース鎖を切断することができる（すなわち、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、及びガラクトグルコマンナン中のグリコシド結合を切断することができる）酵素を意味する。本明細書中で記載される「エンド−β−マンナナーゼ」は、追加的な酵素活性（例えば、エンド−１，４−β−グルカナーゼ、１，４−β−マンノシダーゼ、及びセロデキストリナーゼ活性）を有し得る。
【００１６】
用語「マンナナーゼ」、「マンノシド酵素」、「マンノース分解酵素」、「マンナナーゼ酵素」、「マンナナーゼポリペプチド」、又は「マンナナーゼタンパク質」は、マンナンを分解させることができる酵素、ポリペプチド、又はタンパク質を指す。マンナナーゼ酵素は、例えば、エンド−β−マンナナーゼ、エキソ−β−マンナナーゼ、又はグリコシルヒドロラーゼであってよい。本明細書中で用いられるマンナナーゼ活性は、当該技術分野において知られているあらゆる手順に従って判定されてよい（例えば、Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２７３，１９７２；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｅｌｌ，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，（１９６８），２２：１９２４；米国特許第６，６０２，８４２号明細書；及び国際公開第９５３５３６２Ａ１号パンフレット参照）。
【００１７】
本明細書中で用いられる「マンナン」は、β−１，４結合したマンノースで構成される骨格を有する多糖である；「グルコマンナン」は、多かれ少なかれ規則正しく交互になっている、β−１，４結合したマンノース及びグルコースの骨格を有する多糖である；「ガラクトマンナン」及び「ガラクトグルコマンナン」は、アルファ−１，６結合したガラクトース側枝を有するマンナン及びグルコマンナンである。これらの化合物はアセチル化されていてもよい。ガラクトマンナン及びガラクトグルコマンナンの分解は、ガラクトース側枝の完全な、又は部分的な除去によって促進される。さらに、アセチル化マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、及びガラクトグルコマンナンの分解は、完全な、又は部分的な脱アセチル化によって促進される。アセチル基は、アルカリによって、又はマンナンアセチルエステラーゼによって除去され得る。マンナナーゼから、又はマンナナーゼとアルファガラクトシダーゼ及び／若しくはマンナンアセチルエステラーゼとの組合せによって放出されるオリゴマーは、β−マンノシダーゼ及び／又はβ−グルコシダーゼによってさらに分解して、遊離マルトースを放出し得る。
【００１８】
用語「改変」は、アミノ酸配列におけるあらゆる変化又は変更を指し、注目するアミノ酸配列の同定された位置でのアミノ酸の、出発アミノ酸とは異なるアミノ酸による置換、注目するアミノ酸配列の同定された位置でのアミノ酸の欠失、注目するアミノ酸配列の同定された位置でのアミノ酸の挿入、注目するアミノ酸配列中のアミノ酸側鎖の置換、及び／又は注目するアミノ酸配列の化学的改変が挙げられる。
【００１９】
用語「触媒活性」又は「活性」は、定義された反応条件下での所定の基質の変換を量的に説明する。用語「残留活性」は、ある条件セット下での酵素の触媒活性の、異なる条件セット下での触媒活性に対する比率と定義される。用語「比活性」は、定義された反応条件下での酵素量あたりの触媒活性を量的に説明する。
【００２０】
用語「ｐＨ安定性」は、安定性が最適であるｐＨから大きく（例えば、最適ｐＨを１ｐＨ単位超える、又は下回るよりも）外れているｐＨ値への限られた曝露に、その活性が測定可能である条件下でその活性を失うことなく耐えるタンパク質の能力を説明する。
【００２１】
用語「洗剤安定性」は、洗剤組成物混合物中での指定された洗剤組成物成分（例えば加水分解酵素）の安定性を指す。
【００２２】
用語「ペルヒドロラーゼ」は、洗浄、漂白、及び消毒等の用途に適した過酸の形成をもたらす反応を触媒することができる酵素を指す。
【００２３】
フレーズ「水性組成物」及び「水性環境」に用いられる用語「水性」は、少なくとも５０％水で構成される組成物を指す。水性組成物は、水を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％含有し得る。
【００２４】
用語「界面活性剤」は、表面活性品質を有すると当該技術分野において一般に認識されているあらゆる化合物を指す。界面活性剤として一般に、陰イオン性化合物、陽イオン性化合物、非イオン性化合物、及び双性イオン性化合物が挙げられ、これらは本明細書中でさらに説明される。
【００２５】
用語「表面特性」は、タンパク質の表面によって示される静電荷、並びに疎水性及び親水性等の特性に関して用いられる。
【００２６】
用語「キレーター安定性」は、本開示のエンド−β−マンナナーゼが、例えばキレート剤に曝され、又はこれと接触しながら、本明細書中で開示されるマンノシル化プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス、又は他のプロセスの間の支配的な条件下で所定の期間にわたって、指定された量の酵素活性を保持することを指す。一部の実施形態において、マンナナーゼは、例えば、少なくとも約１０分、約２０分、約４０分、約６０分、約１００分その他の所定の期間にわたるキレート剤との接触後、マンナナーゼ活性を少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％保持する。
【００２７】
用語「熱安定性」及び「熱安定の」は、マンナナーゼが、例えば、高温に曝されながら、マンノシル化プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス、又は他のプロセスの間の支配的な条件下で所定の期間にわたって高温に曝された後に、指定された量の酵素活性を保持することを指す。一部の実施形態において、マンナナーゼは、例えば、少なくとも約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分その他の所定の期間にわたって、高温、例えば、少なくとも約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、又は約７０℃に曝された後に、マンナナーゼ活性を少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％保持する。
【００２８】
用語「洗浄活性」は、本明細書中で開示されるマンノシル化プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス、又は他のプロセスの間の支配的な条件下で、エンド−β−マンナナーゼによって達成される洗浄性能を指す。一部の実施形態において、洗浄性能は、食品、家庭用剤、又はパーソナルケア製品から生じた酵素感受性の染みに関する種々の洗浄アッセイの利用によって判定される。これらの染みの一部として、例えば、標準的な洗い条件に染みを曝した後の種々のクロマトグラフィ、分光測光法、又は他の定量的方法論によって判定される、アイスクリーム、ケチャップ、ＢＢＱソース、マヨネーズ、スープ、チョコレートミルク、チョコレートプリン、冷凍デザート、シャンプー、ボディローション、サンプロテクション製品、練り歯みがき、ローカストビーンガム、又はグアーガムが挙げられる。例示的なアッセイとして、以下に限定されないが、国際公開第９９／３４０１１号パンフレット、米国特許第６６０５４５８号明細書、及び米国特許第６５６６１１４号明細書に記載されるもの、並びに実施例に記載される方法が挙げられる。
【００２９】
用語「クリーンな表面」及び「クリーンな織物」は、染み除去パーセントが、汚された表面又は織物の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、又は４０％である表面又は織物をそれぞれ指す。
【００３０】
マンナナーゼ変異体又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と併せて用いられる場合の用語「有効量」は、指定された洗浄組成物中で所望されるレベルの酵素活性を達成するのに必要とされるマンナナーゼ変異体又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の量を指す。そのような有効量は、当業者によって容易に確認され、そして多くの因子、例えば、用いられる特定のマンナナーゼ変異体又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片、洗浄用途、洗浄組成物の特定の組成に、そして液体組成物又は乾燥組成物（例えば、顆粒、バー、粉末、固体、液体、タブレット、ゲル、ペースト、泡、シート、又は単位用量）が必要とされるかに基づく。
【００３１】
洗浄組成物と併せて用いられる場合の用語「補助剤成分」は、所望される洗浄組成物の特定のタイプ、及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、タブレット、ゲル、単位用量、シート、又は泡の組成物）について選択されるあらゆる液体、固体、又は気体の材料を意味し、当該材料もまた好ましくは、組成物に用いられるマンナナーゼ変異体又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と適合する。一部の実施形態において、顆粒状組成物は、「コンパクトな」形態であり、他の実施形態において、液体組成物は、「濃縮した」形態である。
【００３２】
用語「洗浄組成物」及び「洗浄製剤」は、洗浄されることになるアイテム又は表面、例えば布地、皿、コンタクトレンズ、固体表面、毛髪、皮膚、及び歯からの不所望の化合物（例えば、汚れ又は染み）の除去に用いられる化学成分の混合物を指す。洗浄されることになる表面又はアイテム、及び組成物又は製剤の所望される形態に応じて、組成物又は製剤は、液体、ゲル、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、タブレット、ゲル、単位用量、シート、又は泡の形態であってよい。
【００３３】
用語「洗剤組成物」及び「洗剤製剤」は、汚された物体の洗浄用の洗い媒体に用いることが意図される化学成分の混合物を指す。洗剤組成物／製剤は一般に、少なくとも１つの界面活性剤を含み、そして場合によっては、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤、蛍光色素、固化阻害剤、マスキング剤、酵素活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤を含んでよい。
【００３４】
用語「食器洗い組成物」は、皿類及びカトラリーを洗浄するための、例えば、顆粒、単位用量、及び液体の形態が挙げられる組成物の全ての形態を指す。一部の実施形態において、食器洗い組成物は、自動食器洗い機に用いられる「自動食器洗い」組成物である。用語「皿類」は、セラミックス、プラスチック、金属、磁器、ガラス、及びアクリルが挙げられるがこれらに限定されないあらゆる材料の皿（例えば、プレート、カップ、ガラス、ボウル、及びコンテナ）及びカトラリー（例えば、スプーン、ナイフ、及びフォークが挙げられるがこれらに限定されない器具）を指す。
【００３５】
用語「漂白する」は、十分な時間、そして適切なｐＨ及び温度の条件下での材料（例えば、布地、洗濯物、パルプその他）又は表面の、材料のブライトニング（すなわちホワイトニング）及び／又は洗浄をもたらすための処理を指す。漂白に適した化学物質の例として、以下に限定されないが、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、及びＮＯ２が挙げられる。
【００３６】
マンナナーゼ変異体又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の用語「洗い性能」は、洗剤組成物に追加的な洗浄性能を付与する、変異体又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の、洗いへの寄与を指す。洗い性能は、関連する洗い条件下で比較される。用語「関連する洗い条件」は、本明細書中で、皿又は洗濯洗剤の市場区分における、家庭で実際に用いられる条件、特に洗い温度、時間、洗い機構、泡濃度、洗剤のタイプ、及び水硬度を示すのに用いられる。
【００３７】
本明細書中で用いられる用語「殺菌」は、表面からの汚染物質の除去、並びにアイテムの表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。
【００３８】
本明細書中の洗浄組成物の「コンパクトな」形態は、密度によって、そして組成に関しては無機フィラー塩の量によって、最も良く反映される。無機フィラー塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物において、フィラー塩は、かなりの量で、典型的には総組成物の約１７〜約３５重量％の量で存在する。それに対して、コンパクトな組成物において、フィラー塩は、総組成物の約１５％以下の量で存在する。一部の実施形態において、フィラー塩は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５重量％以下の量で存在する。一部の実施形態において、無機フィラー塩は、アルカリ金属及びアルカリ土類金属の硫酸塩及び塩化物塩から選択される。一部の実施形態において、好ましいフィラー塩は、硫酸ナトリウムである。
【００３９】
用語「布地」は、例えば、布、ニット、及び不織材料、そして例えば、糸及び布、ニット、並びに不織布に変換され得るステープルファイバー及びフィラメントを指す。当該用語は、天然繊維、及び合成（例えば人造）繊維から製造される材料を包含する。
【００４０】
核酸又はポリヌクレオチドが「単離される」とは、以下に限定されないが、例えば、他のタンパク質、核酸、及び細胞が挙げられる他の成分から少なくとも部分的に、又は完全に分離されている場合である。同様に、ポリペプチド、タンパク質、又はペプチドが「単離される」とは、以下に限定されないが、例えば、他のタンパク質、核酸、及び細胞が挙げられる他の成分から少なくとも部分的に、又は完全に分離されている場合である。モルベースで、単離された種は、組成物中の他の種よりも豊富である。例えば、単離された種は、存在する全ての高分子種の少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（モルベース）を構成し得る。好ましくは、注目する種は、必要な均一性となるように精製される（すなわち、汚染物質種が、従来の検出方法によって組成物中に検出され得ない）。純度及び均一性は、当該技術分野において周知のいくつかの技術、例えば、核酸サンプル又はタンパク質サンプルのそれぞれアガロース電気泳動又はポリアクリルアミドゲル電気泳動に続く、染色直後の視覚化を用いて、判定され得る。所望される場合、高分解能の技術、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）又は類似の手段が、物質の精製に利用されてよい。
【００４１】
核酸又はポリペプチドに用いられる用語「精製された」は、一般に、当該技術分野において周知の分析技術によって判定されて、他の成分が本質的にない核酸又はポリペプチドを意味する（例えば、精製されたポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィ溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離に曝された媒体において、不連続なバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲル中に本質的に１つのバンドが生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されている」。精製された核酸又はポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、又は９９．８％以上純粋である（例えば、モルベースでの重量パーセント）。これに関連して、精製技術又は富化技術の利用後に分子の濃度が実質的に増大している場合、組成物は分子について富化されている。用語「富化される」は、出発組成物におけるよりも高い相対濃度又は絶対濃度にて組成物中に存在する化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは成分を指す。
【００４２】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合する複数のアミノ酸を含む分子を指す。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、互換的に用いられる。タンパク質は、場合によっては、官能性を付加するように改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、そしてスルホン化）されてよい。そのようなアミノ酸配列は、活性を示す場合、「酵素」と呼ばれ得る。アミノ酸残基についての従来の１文字コード又は３文字コードが用いられ、アミノ酸配列は、標準的なアミノ末端からカルボキシ末端の向き（すなわち、Ｎ→Ｃ）に示される。
【００４３】
用語「ポリヌクレオチド」は、ポリペプチドをコードすることができるＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ二本鎖、及び合成分子を包含する。核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよいし、化学改変を有してもよい。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられる。遺伝コードが縮重するので、複数のコドンが、特定のアミノ酸をコードするのに用いられ得、そして本組成物及び本方法は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を包含する。特に明記されない限り、核酸配列は、５’から３’の向きに示される。
【００４４】
ポリペプチドに関して、用語「野生型」及び「親の」は、１つ又は複数のアミノ酸位置にて人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関して、用語「野生型」及び「親の」は、１つ又は複数のヌクレオシドにて人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかしながら、野生型又は親のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型又は親のポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含することを強調する。
【００４５】
本明細書中で用いられる用語「天然に存在する」は、自然界に見出されるあらゆるもの（例えば、ポリペプチド配列又は核酸配列）を指す。逆に、用語「天然に存在しない」は、自然界に見出されないあらゆるもの（例えば、ラボ、又は野生型配列の改変で生産された組換え核酸及びポリペプチド配列）を指す。
【００４６】
ポリペプチドに関して、用語「基準」は、１つ又は複数のアミノ酸位置にて人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチド、及び１つ又は複数のアミノ酸位置にて１つ又は複数の人工的な置換、挿入、又は欠失を含む天然に存在する又は合成のポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関して、用語「基準」は、１つ又は複数のヌクレオシドの人工的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリヌクレオチド、及び１つ又は複数のヌクレオシドにて１つ又は複数の人工的な置換、挿入、又は欠失を含む天然に存在する又は合成のポリヌクレオチドを指す。例えば、野生型又は親のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型又は親のポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含することを強調する。
【００４７】
フレーズ「配列番号２に対する１つ又は複数の変異」に用いられる場合の用語「変異」は、配列番号２における対応する位置に存在するアミノ酸と異なる各アミノ酸を包含する。例えば、注目する変異体の配列は、図４Ａ〜図４Ｂに示されるアラインメントに従って、配列番号２とアラインされて、変異体における各位置が、配列番号２と比較されて、配列番号２における対応する位置に存在するアミノ酸と異なる各位置のアミノ酸が同定されて、配列番号２における対応するアミノ酸と異なる各アミノ酸が、変異である。
【００４８】
１文字コード「Ｚ」は、親又は基準のアミノ酸配列において、挿入又は欠失を同定する。親又は基準の配列に対する挿入について、１文字コード「Ｚ」は、位置番号の左側にあり、そしてさらに、その中に挿入される各アミノ酸の前に、挿入の順位を示す数字（例えば、．０１）を含む。例えば、位置２９８での一アミノ酸、グルタミン（Ｑ）の挿入は、「Ｚ２９８．０１Ｑ」と表されることとなる；位置２９８での一アミノ酸Ｘ（Ｘはあらゆるアミノ酸であってよい）の挿入は、「Ｚ２９８．０１Ｘ」と表されることとなる；そして、位置８７と８８の間への３つのアミノ酸、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、及びチロシン（Ｙ）の挿入は、「Ｚ８７．０１Ａ／Ｚ８７．０２Ｓ／Ｚ８７．０３Ｙ」と表されることとなる。欠失について、１文字コード「Ｚ」は、位置番号の右側にある。例えば、位置１００からのアラニン（Ａ）の欠失は、Ａ１００Ｚと表されることとなる。先の挿入及び欠失のいくつかの組合せが、以下のように表されることとなる：「Ｇ８７Ｓ／Ｚ８７．０１Ａ／Ｚ８７．０２Ｓ／Ｚ８７．０３Ｙ／Ａ１００Ｚ」。
【００４９】
本明細書中に記載されるアミノ酸置換は、以下の名称の１つ又は複数を用いる：位置又は出発アミノ酸：位置：置換されたアミノ酸。位置のみの言及は、その位置の基準ポリペプチド、親又はベンチマーク分子に存在し得るあらゆる出発アミノ酸、及びそのような出発アミノ酸が置換され得るあらゆるアミノ酸（すなわち、置換されたアミノ酸は必然的に、そのような基準ポリペプチド、親又はベンチマーク分子の出発アミノ酸を除外する）を包含する。置換されたアミノ酸の言及はさらに、普通のフラッシュ（ｆｏｒｅｓｌａｓｈ）（「／」）によって分けられた、いくつかの置換されたアミノ酸として表され得る。例えば、Ｘ１３０Ａ／Ｎ−２０９−２１３は、３つのアミノ酸置換の組合せを示しており、式中、Ｘは、アラニン（Ａ）又はアスパラギン（Ｎ）で置換され得る位置１３０のあらゆる出発アミノ酸であり；２０９は、あらゆる出発アミノ酸が、出発アミノ酸でないアミノ酸で置換されていてよい位置を示し；そして２１３は、あらゆる出発アミノ酸が、出発アミノ酸でないアミノ酸で置換され得る位置を示す。更なる例として、Ｓ１０１Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｔ／Ｖは、位置１０１での５つの考えられる置換を示しており、出発アミノ酸セリン（Ｓ）は、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、又はバリン（Ｖ）で置換されていてよい。
【００５０】
用語「マンナナーゼ変異体」は、１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加、又は欠失によって、典型的には組換えＤＮＡ技術によって基準ポリペプチドから得られるポリペプチドを指す。マンナナーゼ変異体は、少数のアミノ酸残基が基準ポリペプチドと異なってよく、そして、触媒ドメインの全長にわたる、基準ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義されてよい。例えば、マンナナーゼ変異体は、基準ポリペプチドとのアミノ酸配列同一性が、少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。基準ポリペプチドとして、マンナナーゼ（エンド−１，４−β−マンノシダーゼ、ＥＣ  ３．２．１．７８）のＧＨ５＿８サブファミリー内の天然に存在するマンナナーゼ及び組換えマンナナーゼが挙げられる。このＧＨ５＿８サブファミリーは、Ａｓｐｅｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１２），「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ５（ＧＨ５）」，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２：１８６においてより完全に記載されている。例示的なＧＨ５＿８細菌のマンナナーゼとして、例えば、ＮＤＬ−Ｃｌａｄｅマンナナーゼ、例えば、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）；並びに他のマンナナーゼ、例えば、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）及びその変異体、バチルス属種（Ｂａｃ．ｓｐ．）１ＷＫＹ＿Ａ（ＢＡＤ９９５２７．１）（配列番号１０）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）２ＷＨＬ＿Ａ（Ｑ５ＹＥＸ６の残基３０〜３３０）（配列番号９）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、ＵＳ６５６６１１４−００２の残基３２〜３３０（配列番号１５）、及びＵＳ６５６６１１４−００２の残基３２〜３４０（配列番号１７）が挙げられる。マンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅは、２０１５年７月１０日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１５／４００５７号明細書（後に国際公開第２０１６／００７９２９号パンフレットとして公開）においてより完全に記載されている。
【００５１】
用語「変異ポリヌクレオチド」は、マンナナーゼ変異体をコードし、親ポリヌクレオチドとの指定された程度の相同性／同一性を有し、又は親ポリヌクレオチド若しくはその相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。例えば、変異ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドとのヌクレオチド配列同一性が、少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
【００５２】
標準的なパラメータを用いる既知のプログラム、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬを用いて、配列同一性が判定されてよい（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．［１９９０］Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．［１９８９］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．［１９９３］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３；及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．［１９８８］Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアが、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）により公開されている。また、ＦＡＳＴＡを用いて、データベースが検索されてもよい（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［１９８８］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８）。２つのポリペプチドが実質的に同一であるという１つの指示は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。典型的には、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが、１つの保存的な置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。複数のタンパク質配列の比較に有用な別のアルゴリズムとして、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ．）のＭＵＳＣＬＥプログラムがある（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｅｄｇａｒ．ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００４）３２（５）：１７９２−１７９７）。
【００５３】
用語「に由来する」は、用語「に起源する」、「から得られる」、「から入手できる」、「から単離される」、及び「から生じる」を包含し、一般に、指定されたある材料が、指定された別の材料にその起源があるのを見出すことを、又は指定された別の材料に関して記載され得る特徴を有することを示す。
【００５４】
用語「ハイブリダイゼーション」は、当該技術分野において知られているように、核酸の鎖が、塩基対形成により相補鎖と結合するプロセスを指す。
【００５５】
用語「ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション反応が行われる条件を指す。当該条件は典型的に、ハイブリダイゼーションが評価される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸に結合する複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいてよい。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、典型的に、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍを５℃下回る）くらいで；「高ストリンジェンシー」は、Ｔｍを約５〜１０℃下回って；「中程度のストリンジェンシー」は、プローブのＴｍを約１０〜２０℃下回って；そして「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍを約２０〜２５℃下回って、起こる。代わりに、又は加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの塩若しくはイオンの強度条件、並びに／又は１つ若しくは複数のストリンジェンシー洗い、例えば６×ＳＳＣ＝非常に低いストリンジェンシー；３×ＳＳＣ＝低〜中程度のストリンジェンシー；１×ＳＳＣ＝中程度のストリンジェンシー；及び０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーに基づいてよい。機能的に、最大ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を同定するのに用いられ得る；一方、高ストリンジェンシー条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を同定するのに用いられる。高い選択性を必要とする用途については、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を用いる（例えば、比較的低い塩及び／又は高い温度条件が用いられる）ことが典型的に所望される。
【００５６】
少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における用語「実質的に類似した」及び「実質的に同一の」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、親配列若しくは基準配列との同一性が少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％である配列、又は、官能性を付加することなく本記載を回避するためだけになされたアミノ酸の置換、挿入、欠失、若しくは改変を含む配列のいずれかを含むことを意味する。
【００５７】
用語「発現ベクター」は、指定されたポリペプチドをコードして、適切な宿主においてポリペプチドの発現をもたらすことができる適切な制御配列に作動可能に結合されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列は、転写をもたらすプロモーター、そのような転写を制御する任意選択のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミドであってもファージ粒子であってもよいし、単純に、潜在的なゲノム挿入物であってもよい。一旦適切な宿主に形質転換されれば、ベクターは、宿主ゲノムと独立して複製且つ機能してもよいし、場合によっては、それ自体ゲノム中に組み込んでもよい。
【００５８】
用語「組換え体」は、例えば、変更されたポリペプチドを生産するようにコード配列を突然変異させることによって、コード配列を別の遺伝子のコード配列に融合させることによって、異なるプロモーターの制御下に遺伝子を置くことによって、異種起源の生物中で遺伝子を発現させることによって、低いレベル又は高いレベルにて遺伝子を発現させることによって、条件的に、又は構成的に、その生来の発現プロフィールと異なるように遺伝子を発現させることによって、配列特性又は発現特性を変えるように改変された遺伝的材料（すなわち、核酸、これがコードするポリペプチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）を指す。通常、組換え核酸、ポリペプチド、それらに基づく細胞は、人によって、自然界に見出される関連する核酸、ポリペプチド、及び細胞と同一でないように操作されてきた。
【００５９】
用語「シグナル配列」は、ポリペプチドのＮ末端部分に結合した一連のアミノ酸の配列を指し、これにより、成熟形態のタンパク質の、細胞からの分泌が促進される。成熟形態の細胞外タンパク質は、分泌プロセスの間にシグナル配列が切断されて、これを欠く。
【００６０】
用語「選択マーカー」又は「選択可能なマーカー」は、導入された核酸又はベクターを含有する宿主の選択を容易にし得る、宿主細胞中での発現が可能な遺伝子を指す。選択可能マーカーの例として、以下に限定されないが、代謝の利点、例えば栄養的な利点を宿主細胞に付与する抗菌物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は遺伝子が挙げられる。用語「選択可能な遺伝子産物」は、選択可能なマーカーが発現される細胞に、抗生物質又は薬物に対する耐性を付与する酵素活性をコードする遺伝子を指す。
【００６１】
本明細書中で用いられる用語「調節要素」は、核酸配列の発現の一部の態様を制御する遺伝的要素を指す。例えば、プロモーターは、作動可能に結合されたコード領域の転写の開始を促進する調節要素である。追加的な調節要素として、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルが挙げられる。
【００６２】
用語「宿主細胞」は一般に、当該技術分野において知られている組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換又は形質移入される原核生物宿主又は真核生物宿主を指す。形質転換された宿主細胞は、タンパク質変異体をコードするベクターを複製することができ、又は所望されるタンパク質変異体を発現することができる。タンパク質変異体のプレフォーム又はプロフォームをコードするベクターの場合、そのような変異体は典型的に、発現された場合、宿主細胞から宿主細胞培地中に分泌される。
【００６３】
核酸配列を細胞中に挿入する文脈における用語「導入される」は、形質転換、形質導入、又は形質移入を意味する。形質転換の手段として、当該技術分野において知られているプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔法、裸ＤＮＡ等が挙げられる（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ［１９７９］Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１−１１５；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．［１９８６］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．によるレビュー論文（Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．５７−７２，１９８９）参照）。
【００６４】
数値と併せて用いられる場合の用語「約」は、数値の−１０％〜＋１０％の範囲を指す。例えば、フレーズ「約６のｐＨ値」は、５．４から６．６のｐＨ値を指す。
【００６５】
本明細書中で用いられるあらゆる見出しは、便宜上記載されるものであり、限定として解釈されるべきでない。一見出しの下に含まれる記載は、全体として本明細書に適用され得る。
【００６６】
本明細書中で開示される変異体、組成物、及び方法は、１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含む組換えマンナナーゼ、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、そのような変異体は、従来の分子生物学技術により生じる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【００６７】
一実施形態は、１０、１９、３８、５９、６０、６２、６３、６６、６７、６８、７１、７４、７５、７８、７９、８０、９７、１２９、１３１、１３５、１３６、１４３、１６７、１６８、１８４、２１３、２１４、２２５、２２８、２３５、２４２、２４４、２５８、２５９、２６１、及び２８３から選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｘ１０Ｔ、Ｘ１０Ｑ、Ｘ１９Ｖ、Ｘ１９Ｅ、Ｘ３８Ｉ、Ｘ３８Ｑ、Ｘ３８Ｒ、Ｘ３８Ｖ、Ｘ３８Ｅ、Ｘ３８Ｍ、Ｘ３８Ｌ、Ｘ５９Ｎ、Ｘ５９Ｇ、Ｘ５９Ｄ、Ｘ５９Ｋ、Ｘ５９Ｔ、Ｘ５９Ｑ、Ｘ６０Ｆ、Ｘ６０Ｍ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ６２Ｖ、Ｘ６２Ｉ、Ｘ６２Ｑ、Ｘ６２Ｅ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６６Ｔ、Ｘ６６Ｖ、Ｘ６６Ｃ、Ｘ６７Ｑ、Ｘ６７Ｐ、Ｘ６７Ｇ、Ｘ６７Ａ、Ｘ６７Ｖ、Ｘ６７Ｄ、Ｘ６７Ｅ、Ｘ６７Ｓ、Ｘ６８Ｗ、Ｘ６８Ｒ、Ｘ６８Ｌ、Ｘ６８Ｍ、Ｘ６８Ｓ、Ｘ７０Ｖ、Ｘ７０Ｒ、Ｘ７１Ｈ、Ｘ７１Ｄ、Ｘ７４Ｑ、Ｘ７４Ｖ、Ｘ７４Ｃ、Ｘ７４Ｅ、Ｘ７５Ｉ、Ｘ７８Ｌ、Ｘ７８Ｄ、Ｘ７８Ｍ、Ｘ７８Ａ、Ｘ７９Ｅ、Ｘ７９Ｗ、Ｘ７９Ｆ、Ｘ８０Ｑ、Ｘ８０Ｔ、Ｘ９７Ｅ、Ｘ９７Ｑ、Ｘ９７Ｌ、Ｘ９７Ｐ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１３１Ｐ、Ｘ１３５Ａ、Ｘ１３５Ｑ、Ｘ１３５Ｃ、Ｘ１３６Ｅ、Ｘ１４３Ｑ、Ｘ１４３Ｒ、Ｘ１６７Ｓ、Ｘ１６７Ｙ、Ｘ１６７Ｗ、Ｘ１６７Ｌ、Ｘ１６８Ｅ、Ｘ１６８Ｌ、Ｘ１６８Ｍ、Ｘ１６８Ｇ、Ｘ１６８Ｓ、Ｘ１６８Ｔ、Ｘ１６８Ａ、Ｘ１８４Ｌ、Ｘ１８４Ｍ、Ｘ１８４Ｆ、Ｘ１８４Ｈ、Ｘ１８４Ｄ、Ｘ１８４Ｐ、Ｘ２１３Ｅ、Ｘ２１４Ｃ、Ｘ２１４Ｑ、Ｘ２２５Ｐ、Ｘ２２５Ｗ、Ｘ２２５Ｃ、Ｘ２２５Ａ、Ｘ２２８Ｇ、Ｘ２２８Ｋ、Ｘ２２８Ａ、Ｘ２２８Ｖ、Ｘ２２８Ｓ、Ｘ２２８Ｉ、Ｘ２２８Ｙ、Ｘ２２８Ｈ、Ｘ２３５Ｓ、Ｘ２３５Ｇ、Ｘ２３５Ｖ、Ｘ２３５Ｑ、Ｘ２３５Ｉ、Ｘ２３５Ｌ、Ｘ２４２Ｓ、Ｘ２４２Ｅ、Ｘ２４４Ｓ、Ｘ２４４Ａ、Ｘ２４４Ｇ、Ｘ２４４Ｌ、Ｘ２４４Ｃ、Ｘ２４４Ｍ、Ｘ２４４Ｐ、Ｘ２５８Ｔ、Ｘ２５８Ｇ、Ｘ２５８Ｎ、Ｘ２５８Ａ、Ｘ２５８Ｅ、Ｘ２５８Ｍ、Ｘ２５８Ｄ、Ｘ２５８Ｐ、Ｘ２５９Ａ、Ｘ２５９Ｗ、Ｘ２５９Ｒ、Ｘ２５９Ｅ、Ｘ２５９Ｓ、Ｘ２６１Ｍ、Ｘ２６１Ｗ、Ｘ２６１Ｐ、Ｘ２６１Ｔ、Ｘ２６１Ｖ、Ｘ２６１Ｉ、Ｘ２６１Ｙ、Ｘ２６１Ｑ、Ｘ２６１Ｒ、Ｘ２６１Ｓ、Ｘ２８３Ｈ、Ｘ２８３Ｔ、及びＸ２８３Ｇから選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、Ｘは、あらゆるアミノ酸であり；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｎ１０Ｔ、Ｎ１０Ｑ、Ｐ１９Ｖ、Ｐ１９Ｅ、Ｔ３８Ｉ、Ｔ３８Ｑ、Ｔ３８Ｒ、Ｔ３８Ｖ、Ｔ３８Ｅ、Ｔ３８Ｍ、Ｔ３８Ｌ、Ｓ５９Ｎ、Ｓ５９Ｇ、Ｓ５９Ｄ、Ｓ５９Ｋ、Ｓ５９Ｔ、Ｓ５９Ｑ、Ｌ６０Ｆ、Ｌ６０Ｍ、Ｌ６０Ｖ、Ｔ６２Ｖ、Ｔ６２Ｉ、Ｔ６２Ｑ、Ｔ６２Ｅ、Ｋ６３Ｌ、Ｌ６６Ｔ、Ｌ６６Ｖ、Ｌ６６Ｃ、Ｎ６７Ｑ、Ｎ６７Ｐ、Ｎ６７Ｇ、Ｎ６７Ａ、Ｎ６７Ｖ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｅ、Ｎ６７Ｓ、Ａ６８Ｗ、Ａ６８Ｒ、Ａ６８Ｌ、Ａ６８Ｍ、Ａ６８Ｓ、Ｋ７０Ｖ、Ｋ７０Ｒ、Ｎ７１Ｈ、Ｎ７１Ｄ、Ｎ７４Ｑ、Ｎ７４Ｖ、Ｎ７４Ｃ、Ｎ７４Ｅ、Ｖ７５Ｉ、Ｑ７８Ｌ、Ｑ７８Ｄ、Ｑ７８Ｍ、Ｑ７８Ａ、Ｎ７９Ｅ、Ｎ７９Ｗ、Ｎ７９Ｆ、Ｋ８０Ｑ、Ｋ８０Ｔ、Ｎ９７Ｅ、Ｎ９７Ｑ、Ｎ９７Ｌ、Ｎ９７Ｐ、Ｙ１２９Ｍ、Ｔ１３１Ｐ、Ｓ１３５Ａ、Ｓ１３５Ｑ、Ｓ１３５Ｃ、Ａ１３６Ｅ、Ｋ１４３Ｑ、Ｋ１４３Ｒ、Ｆ１６７Ｓ、Ｆ１６７Ｙ、Ｆ１６７Ｗ、Ｆ１６７Ｌ、Ｐ１６８Ｅ、Ｐ１６８Ｌ、Ｐ１６８Ｍ、Ｐ１６８Ｇ、Ｐ１６８Ｓ、Ｐ１６８Ｔ、Ｐ１６８Ａ、Ｑ１８４Ｌ、Ｑ１８４Ｍ、Ｑ１８４Ｆ、Ｑ１８４Ｈ、Ｑ１８４Ｄ、Ｑ１８４Ｐ、Ｎ２１３Ｅ、Ｋ２１４Ｃ、Ｋ２１４Ｑ、Ｇ２２５Ｐ、Ｇ２２５Ｗ、Ｇ２２５Ｃ、Ｇ２２５Ａ、Ｔ２２８Ｇ、Ｔ２２８Ｋ、Ｔ２２８Ａ、Ｔ２２８Ｖ、Ｔ２２８Ｓ、Ｔ２２８Ｉ、Ｔ２２８Ｙ、Ｔ２２８Ｈ、Ｙ２３５Ｓ、Ｙ２３５Ｇ、Ｙ２３５Ｖ、Ｙ２３５Ｑ、Ｙ２３５Ｉ、Ｙ２３５Ｌ、Ｑ２４２Ｓ、Ｑ２４２Ｅ、Ｋ２４４Ｓ、Ｋ２４４Ａ、Ｋ２４４Ｇ、Ｋ２４４Ｌ、Ｋ２４４Ｃ、Ｋ２４４Ｍ、Ｋ２４４Ｐ、Ｓ２５８Ｔ、Ｓ２５８Ｇ、Ｓ２５８Ｎ、Ｓ２５８Ａ、Ｓ２５８Ｅ、Ｓ２５８Ｍ、Ｓ２５８Ｄ、Ｓ２５８Ｐ、Ｇ２５９Ａ、Ｇ２５９Ｗ、Ｇ２５９Ｒ、Ｇ２５９Ｅ、Ｇ２５９Ｓ、Ｎ２６１Ｍ、Ｎ２６１Ｗ、Ｎ２６１Ｐ、Ｎ２６１Ｔ、Ｎ２６１Ｖ、Ｎ２６１Ｉ、Ｎ２６１Ｙ、Ｎ２６１Ｑ、Ｎ２６１Ｒ、Ｎ２６１Ｓ、Ｄ２８３Ｈ、Ｄ２８３Ｔ、及びＤ２８３Ｇから選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００６８】
さらに別の実施形態は、１９、３８、６３、６７、７１、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｘ１９Ｅ、Ｘ１９Ｖ、Ｘ３８Ｅ、Ｘ３８Ｉ、Ｘ３８Ｌ、Ｘ３８Ｍ、Ｘ３８Ｑ、Ｘ３８Ｒ、Ｘ３８Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６７Ａ、Ｘ６７Ｄ、Ｘ６７Ｅ、Ｘ６７Ｇ、Ｘ６７Ｐ、Ｘ６７Ｑ、Ｘ６７Ｓ、Ｘ６７Ｖ、Ｘ７１Ｄ、Ｘ７１Ｈ、Ｘ９７Ｅ、Ｘ９７Ｌ、Ｘ９７Ｐ、Ｘ９７Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ、Ｘ１４３Ｒ、Ｘ１６８Ａ、Ｘ１６８Ｅ、Ｘ１６８Ｇ、Ｘ１６８Ｌ、Ｘ１６８Ｍ、Ｘ１６８Ｓ、Ｘ１６８Ｔ、Ｘ１８４Ｄ、Ｘ１８４Ｆ、Ｘ１８４Ｈ、Ｘ１８４Ｌ、Ｘ１８４Ｍ、Ｘ１８４Ｐ、Ｘ２２５Ａ、Ｘ２２５Ｃ、Ｘ２２５Ｐ、Ｘ２２５Ｗ、Ｘ２２８Ａ、Ｘ２２８Ｇ、Ｘ２２８Ｈ、Ｘ２２８Ｉ、Ｘ２２８Ｋ、Ｘ２２８Ｓ、Ｘ２２８Ｖ、Ｘ２２８Ｙ、Ｘ２３５Ｇ、Ｘ２３５Ｉ、Ｘ２３５Ｌ、Ｘ２３５Ｑ、Ｘ２３５Ｓ、Ｘ２３５Ｖ、Ｘ２４４Ａ、Ｘ２４４Ｃ、Ｘ２４４Ｇ、Ｘ２４４Ｌ、Ｘ２４４Ｍ、Ｘ２４４Ｐ、Ｘ２４４Ｓ、Ｘ２５８Ａ、Ｘ２５８Ｄ、Ｘ２５８Ｅ、Ｘ２５８Ｇ、Ｘ２５８Ｍ、Ｘ２５８Ｎ、Ｘ２５８Ｐ、Ｘ２５８Ｔ、Ｘ２６１Ｉ、Ｘ２６１Ｍ、Ｘ２６１Ｐ、Ｘ２６１Ｑ、Ｘ２６１Ｒ、Ｘ２６１Ｓ、Ｘ２６１Ｔ、Ｘ２６１Ｖ、Ｘ２６１Ｗ、及びＸ２６１Ｙから選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、Ｘは、あらゆるアミノ酸であり；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｐ１９Ｅ、Ｐ１９Ｖ、Ｔ３８Ｅ、Ｔ３８Ｉ、Ｔ３８Ｌ、Ｔ３８Ｍ、Ｔ３８Ｑ、Ｔ３８Ｒ、Ｔ３８Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｎ６７Ａ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｅ、Ｎ６７Ｇ、Ｎ６７Ｐ、Ｎ６７Ｑ、Ｎ６７Ｓ、Ｎ６７Ｖ、Ｎ７１Ｄ、Ｎ７１Ｈ、Ｎ９７Ｅ、Ｎ９７Ｌ、Ｎ９７Ｐ、Ｎ９７Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ、Ｋ１４３Ｒ、Ｐ１６８Ａ、Ｐ１６８Ｅ、Ｐ１６８Ｇ、Ｐ１６８Ｌ、Ｐ１６８Ｍ、Ｐ１６８Ｓ、Ｐ１６８Ｔ、Ｑ１８４Ｄ、Ｑ１８４Ｆ、Ｑ１８４Ｈ、Ｑ１８４Ｌ、Ｑ１８４Ｍ、Ｑ１８４Ｐ、Ｇ２２５Ａ、Ｇ２２５Ｃ、Ｇ２２５Ｐ、Ｇ２２５Ｗ、Ｔ２２８Ａ、Ｔ２２８Ｇ、Ｔ２２８Ｈ、Ｔ２２８Ｉ、Ｔ２２８Ｋ、Ｔ２２８Ｓ、Ｔ２２８Ｖ、Ｔ２２８Ｙ、Ｙ２３５Ｇ、Ｙ２３５Ｉ、Ｙ２３５Ｌ、Ｙ２３５Ｑ、Ｙ２３５Ｓ、Ｙ２３５Ｖ、Ｋ２４４Ａ、Ｋ２４４Ｃ、Ｋ２４４Ｇ、Ｋ２４４Ｌ、Ｋ２４４Ｍ、Ｋ２４４Ｐ、Ｋ２４４Ｓ、Ｓ２５８Ａ、Ｓ２５８Ｄ、Ｓ２５８Ｅ、Ｓ２５８Ｇ、Ｓ２５８Ｍ、Ｓ２５８Ｎ、Ｓ２５８Ｐ、Ｓ２５８Ｔ、Ｎ２６１Ｉ、Ｎ２６１Ｍ、Ｎ２６１Ｐ、Ｎ２６１Ｑ、Ｎ２６１Ｒ、Ｎ２６１Ｓ、Ｎ２６１Ｔ、Ｎ２６１Ｖ、Ｎ２６１Ｗ、及びＮ２６１Ｙから選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００６９】
別の実施形態は、１９、３８、６７、９７、１２９、１６８、１８４、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｘ１９Ｅ、Ｘ１９Ｖ、Ｘ３８Ｅ、Ｘ３８Ｉ、Ｘ３８Ｌ、Ｘ３８Ｍ、Ｘ３８Ｑ、Ｘ３８Ｒ、Ｘ３８Ｖ、Ｘ６７Ａ、Ｘ６７Ｄ、Ｘ６７Ｅ、Ｘ６７Ｇ、Ｘ６７Ｐ、Ｘ６７Ｑ、Ｘ６７Ｓ、Ｘ６７Ｖ、Ｘ９７Ｅ、Ｘ９７Ｌ、Ｘ９７Ｐ、Ｘ９７Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ、Ｘ１６８Ｅ、Ｘ１６８Ｇ、Ｘ１６８Ｌ、Ｘ１６８Ｍ、Ｘ１６８Ｓ、Ｘ１６８Ｔ、Ｘ１８４Ｄ、Ｘ１８４Ｆ、Ｘ１８４Ｈ、Ｘ１８４Ｌ、Ｘ１８４Ｍ、Ｘ１８４Ｐ、Ｘ２４４Ａ、Ｘ２４４Ｃ、Ｘ２４４Ｇ、Ｘ２４４Ｌ、Ｘ２４４Ｍ、Ｘ２４４Ｐ、Ｘ２４４Ｓ、Ｘ２５８Ａ、Ｘ２５８Ｄ、Ｘ２５８Ｅ、Ｘ２５８Ｇ、Ｘ２５８Ｍ、Ｘ２５８Ｎ、Ｘ２５８Ｐ、Ｘ２５８Ｔ、Ｘ２６１Ｉ、Ｘ２６１Ｍ、Ｘ２６１Ｐ、Ｘ２６１Ｑ、Ｘ２６１Ｒ、Ｘ２６１Ｓ、Ｘ２６１Ｔ、Ｘ２６１Ｖ、Ｘ２６１Ｗ、及びＸ２６１Ｙから選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、Ｘは、あらゆるアミノ酸であり；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｐ１９Ｅ、Ｐ１９Ｖ、Ｔ３８Ｅ、Ｔ３８Ｉ、Ｔ３８Ｌ、Ｔ３８Ｍ、Ｔ３８Ｑ、Ｔ３８Ｒ、Ｔ３８Ｖ、Ｎ６７Ａ、Ｎ６７Ｄ、Ｎ６７Ｅ、Ｎ６７Ｇ、Ｎ６７Ｐ、Ｎ６７Ｑ、Ｎ６７Ｓ、Ｎ６７Ｖ、Ｎ９７Ｅ、Ｎ９７Ｌ、Ｎ９７Ｐ、Ｎ９７Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ、Ｐ１６８Ｅ、Ｐ１６８Ｇ、Ｐ１６８Ｌ、Ｐ１６８Ｍ、Ｐ１６８Ｓ、Ｐ１６８Ｔ、Ｑ１８４Ｄ、Ｑ１８４Ｆ、Ｑ１８４Ｈ、Ｑ１８４Ｌ、Ｑ１８４Ｍ、Ｑ１８４Ｐ、Ｋ２４４Ａ、Ｋ２４４Ｃ、Ｋ２４４Ｇ、Ｋ２４４Ｌ、Ｋ２４４Ｍ、Ｋ２４４Ｐ、Ｋ２４４Ｓ、Ｓ２５８Ａ、Ｓ２５８Ｄ、Ｓ２５８Ｅ、Ｓ２５８Ｇ、Ｓ２５８Ｍ、Ｓ２５８Ｎ、Ｓ２５８Ｐ、Ｓ２５８Ｔ、Ｎ２６１Ｉ、Ｎ２６１Ｍ、Ｎ２６１Ｐ、Ｎ２６１Ｑ、Ｎ２６１Ｒ、Ｎ２６１Ｓ、Ｎ２６１Ｔ、Ｎ２６１Ｖ、Ｎ２６１Ｗ、及びＮ２６１Ｙから選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００７０】
一実施形態は、１０、１９、３８、５９、６０、６２、６３、６６、６７、６８、７０、７１、７４、７５、７８、７９、８０、９７、１２９、１３１、１３５、１３６、１４３、１６７、１６８、１８４、２１３、２１４、２２５、２２８、２３５、２４２、２４４、２５８、２５９、２６１、及び２８３から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｘ１０Ｑ／Ｔ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｘ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｘ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｘ７０Ｒ／Ｖ、Ｘ７１Ｄ／Ｈ、Ｘ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｘ７５Ｉ、Ｘ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｘ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｘ８０Ｑ／Ｔ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１３１Ｐ、Ｘ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ｘ１３６Ｅ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２１３Ｅ、Ｘ２１４Ｃ／Ｑ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４２Ｓ／Ｅ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｘ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＸ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｎ／Ｔ１０Ｑ／Ｔ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｇ／Ｓ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ／Ｑ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｅ／Ｔ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｉ／Ｌ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ／Ｔ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｋ／Ｒ７０Ｒ／Ｖ、Ｅ／Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｅ／Ｎ／Ｓ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｌ／Ｖ７５Ｉ、Ｄ／Ｑ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｎ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｈ／Ｋ８０Ｑ／Ｔ、Ａ／Ｎ／Ｓ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｓ／Ｔ１３１Ｐ、Ｄ／Ｓ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ａ１３６Ｅ、Ｄ／Ｋ／Ｑ１４３Ｑ／Ｒ、Ｆ／Ｙ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｄ／Ｎ２１３Ｅ、Ｋ／Ｑ２１４Ｃ／Ｑ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ／Ｄ／Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｅ／Ｑ２４２Ｓ／Ｅ、Ｋ／Ｒ／Ｙ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｅ／Ｇ／Ｓ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＤ／Ｇ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔ、又は（ｉｉ）Ｎ１０Ｑ／Ｔ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｓ５９Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｑ／Ｔ、Ｌ６０Ｆ／Ｍ／Ｖ、Ｔ６２Ｅ／Ｉ／Ｑ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｌ６６Ｃ／Ｔ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ６８Ｌ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｋ７０Ｒ／Ｖ、Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｎ７４Ｅ／Ｃ／Ｑ／Ｖ、Ｖ７５Ｉ、Ｑ７８Ａ／Ｄ／Ｌ／Ｍ、Ｎ７９Ｅ／Ｆ／Ｗ、Ｋ８０Ｑ／Ｔ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｔ１３１Ｐ、Ｓ１３５Ａ／Ｃ／Ｑ、Ａ１３６Ｅ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｆ１６７Ｌ／Ｓ／Ｗ／Ｙ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｎ２１３Ｅ、Ｋ２１４Ｃ／Ｑ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｑ２４２Ｓ／Ｅ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、Ｇ２５９Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｗ、Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、及びＤ２８３Ｇ／Ｈ／Ｔから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００７１】
さらに別の実施形態は、（ｉ）１９、３８、６３、６７、７１、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１、又は（ｉｉ）１９、３８、６７、９７、１２９、１４３、１６８、１８４、２２５、２２８、２３５、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６３Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ７１Ｄ／Ｈ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１４３Ｑ／Ｒ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｘ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｋ６３Ｌ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ７１Ｄ／Ｈ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ａ／Ｎ／Ｓ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｄ／Ｋ／Ｑ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ａ／Ｄ／Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＤ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｋ１４３Ｑ／Ｒ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｔ２２８Ａ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｓ／Ｖ／Ｙ、Ｙ２３５Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００７２】
別の実施形態は、（ｉ）１９、３８、６７、１２９、１６８、１８４、２２５、２４４、２５８、及び２６１、又は（ｉｉ）１９、３８、６７、９７、１２９、１６８、１８４、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。別の実施形態は、（ｉ）１９、３８、６７、１２９、１６８、１８４、２２５、２４４、２５８、及び２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉ）Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｘ１９Ｅ／Ｖ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｘ１２９Ｍ、Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であり；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＤ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、又は（ｉｉｉ）Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｎ９７Ｅ／Ｌ／Ｐ／Ｑ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、Ｐ１９Ｅ／Ｖ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ、Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ、Ｙ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｇ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｋ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｓ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＮ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙから選択される１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００７３】
更なる実施形態は、（ｉ）８５、１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１、又は（ｉｉ）１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１から選択される１つ又は複数の位置にて、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）８５、１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１、又は（ｉｉ）１９−８５、３８−８５、６７−８５、８５−１２９、８５−１６８、８５−１８４、８５−２２５、８５−２４４、８５−２５８、及び８５−２６１から選択される１つ又は複数の位置にて１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。別の実施形態は、（ｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒ、又は（ｉｉｉ）Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であるが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｘ８５Ｌ、Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒ、又は（ｉｉｉ）Ｘ１９Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ３８Ｅ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ６７Ｄ−Ｘ８５Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１２９Ｍ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１６８Ｓ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ１８４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２２５Ｐ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２４４Ｌ、Ｘ８５Ｌ−Ｘ２５８Ｄ、及びＸ８５Ｌ−Ｘ２６１Ｒから選択される１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；Ｘは、あらゆるアミノ酸であり；前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。さらに別の実施形態は、（ｉ）Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ／Ｖ８５Ｌ−Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｎ／Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｓ／Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｎ／Ｅ２６１Ｒ、（ｉｖ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒ、又は（ｖ）Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒから選択される、配列番号２に対する１つ又は複数の変異を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが；前記変異の１つ又は複数が、天然に存在しないことを条件とし；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、（ｉ）Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｄ／Ｈ／Ｎ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ／Ｖ８５Ｌ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｌ／Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ／Ｔ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ／Ｖ８５Ｌ−Ｐ／Ｓ／Ｔ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ／Ｖ８５Ｌ−Ｄ／Ｅ／Ｎ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｒ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｖ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ａ／Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｓ／Ｔ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｍ／Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ａ／Ｃ／Ｐ／Ｗ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｌ／Ｍ／Ｐ／Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｍ／Ｎ／Ｐ／Ｔ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｉ／Ｍ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ／Ｙ、（ｉｉｉ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｎ／Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ／Ｙ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｇ／Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｋ／Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｓ／Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｎ／Ｅ２６１Ｒ、（ｉｖ）Ｐ８５Ｌ、Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒ、又は（ｖ）Ｐ１９Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｔ３８Ｅ−Ｐ８５Ｌ、Ｈ６７Ｄ−Ｐ８５Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｆ１２９Ｍ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ１６８Ｓ、Ｐ８５Ｌ−Ｑ１８４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｈ２２５Ｐ、Ｐ８５Ｌ−Ｒ２４４Ｌ、Ｐ８５Ｌ−Ｐ２５８Ｄ、及びＰ８５Ｌ−Ｅ２６１Ｒから選択される１つ又は複数の置換を含むアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し；変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。
【００７４】
別の実施形態は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含むマンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅに関し、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに：位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆ又はＹであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）（「モチーフ１」）；位置２６３〜２７４にてＬＤＸＸＸＧＰＸＧＸＬＴ（配列番号１２）のモチーフ（式中、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）（「欠失モチーフ１」）；位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍ又はＬであり、Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）（「欠失モチーフ２」）；及び位置２６３〜２７４にてＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフ（「欠失モチーフ３」）から選択される１つ又は複数のモチーフを含み、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられている。更なる実施形態は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含むマンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅに関し、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに：位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆ又はＹであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）；位置２６３〜２７４にてＬＤＸＸＸＧＰＸＧＸＬＴ（配列番号１２）のモチーフ（式中、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）；位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍ又はＬであり、Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）；及び位置２６３〜２７４にてＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフ（「欠失モチーフ３」）から選択される１つ又は複数のモチーフを含み、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３１、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＰｐａＭａｎ２、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＰｓｐＭａｎ９、ＡＥＸ６０７６２、ＷＰ＿０４６２１４４６２、ＹＰ＿００３８６８９８９、ＹＰ＿００３９４４８８４、ＷＰ＿０１７４２７９８１、ＡＡＸ８７００２、ＷＰ＿００９５９３７６９、ＹＰ＿００６１９０５９９、そしてＷＰ＿０１９９１２４８１でないことを条件とする。
【００７５】
更なる実施形態は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含むマンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅに関し、前記変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフを含み、Ｘａは、Ｆであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸であり、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３１、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、そしてＡＥＸ６０７６２でないことを条件とする。更なる実施形態は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含むマンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅに関し、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフを含み、Ｘａは、Ｆであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸であり、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３１、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＡＥＸ６０７６２、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする。
【００７６】
更なる実施形態において、マンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅは、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含み、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）又はＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフを含み、Ｘ１は、Ｍであり；Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮであり、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、そしてＷＰ＿０４６２１４４６２でないことを条件とする。更なる実施形態において、マンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅは、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含み、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）又はＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフを含み、Ｘ１は、Ｍであり；Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮであり、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０４６２１４４６２、そしてＰａｍＭａｎ２でないことを条件とする。更なる実施形態において、マンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅは、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含み、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、（ｉ）位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）、及び（ｉｉ）位置２６３〜２７４にてＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）又はＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍであり；Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）を含み、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、そしてＷＰ＿０１７６８８７４５でないことを条件とする。更なる実施形態において、マンナナーゼのＮＤＬ−Ｃｌａｄｅは、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含み、前記変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、（ｉ）位置３１〜４０にてＷＸａＫＮＤＬＸＸＡＩ（配列番号１１）のモチーフ（式中、Ｘａは、Ｆであり、Ｘは、あらゆるアミノ酸である）、及び（ｉｉ）位置２６３〜２７４にて、ＬＤＸ１Ｖ／ＡＴ／ＡＧＰＸ２ＧＸ３ＬＴ（配列番号１３）又はＬＤＭ／ＬＡＴＧＰＮ／ＡＧＳ／ＴＬＴ（配列番号１４）のモチーフ（式中、Ｘ１は、Ｍであり；Ｘ２は、Ｎ、Ａ、又はＳであり；Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、又はＮである）を含み、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けられているが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、そしてＰａｍＭａｎ２でないことを条件とする。
【００７７】
別の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関する。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％又は８５％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＡＥＸ６０７６２、そしてＷＰ＿０４６２１４４６２でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％又は８５％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＡＥＸ６０７６２、ＷＰ＿０４６２１４４６２、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％又は８５％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＡＥＸ６０７６２、ＷＰ＿０４６２１４４６２、そしてＥＰ２２６０１０５−０４１８でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８０％又は８５％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＷＰ＿０４６２２７９３１、ＷＰ＿０１７８１３１１１、ＡＥＸ６０７６２、ＷＰ＿０４６２１４４６２、ＥＰ２２６０１０５−０４１８、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８８％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、そしてＡＡＸ８７００３でないことを条件とする。別の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８８％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８８％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、そしてＥＰ２２６０１０５−０４１８でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８８％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＷＰ＿０５３７８２１２７、ＷＰ＿０２４６３３８４８、ＡＡＸ８７００３、ＥＰ２２６０１０５−０４１８、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、ＰｔｕＭａｎ２、ＰｐａＭａｎ２、そしてＰｓｐＭａｎ９でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９２％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、そしてＷＰ＿０１７６８８７４５でないことを条件とする。更なる実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９２％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関するが、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ＡＣＵ３０８４３、ＥＴＴ３７５４９、ＷＰ＿０３６６０８４７８、ＷＰ＿０３６６７０７０７、ＷＰ＿０１７６８８７４５、ＰａｍＭａｎ２、ＰａｍＭａｎ３、そしてＰｔｕＭａｎ２でないことを条件とする。別の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含むマンナナーゼ変異体、又は組換えポリペプチド若しくは活性断片に関する。
【００７８】
一実施形態において、基準ポリペプチドは、ＧＨ５マンナナーゼである。別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、基準ポリペプチドのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。さらに別の実施形態において、基準ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７から選択される。さらに別の実施形態において、基準ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される。
【００７９】
更なる実施形態において、配列番号２は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体が由来する基準ポリペプチドである。さらに更なる実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。さらに更なる実施形態において、配列番号８は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体が由来する基準ポリペプチドである。更なる実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、配列番号８のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。別の実施形態において、配列番号９は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体が由来する基準ポリペプチドである。さらに別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、配列番号９のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。さらに更なる実施形態において、配列番号１０は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体が由来する基準ポリペプチドである。別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。さらに別の実施形態において、配列番号１５又は１７は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体が由来する基準ポリペプチドである。さらに別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、配列番号１５又は配列番号１７のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。更なる実施形態において、配列番号１６は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体が由来する基準ポリペプチドである。更なる実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体は、配列番号１６のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。また更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体は、ＧＨ５マンナナーゼである。
【００８０】
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、単離されている。他の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体は、エンド−β−マンナナーゼである。更なる実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、マンナナーゼ活性を有する。さらに他の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、界面活性剤の存在下でマンナナーゼ活性を有する。一部の実施形態において、マンナナーゼ活性は、マンナンガム、ローカストビーンガムガラクトマンナン、及び／又はコンニャクグルコマンナンに対する活性である。更なる実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、洗剤組成物中で洗浄活性を有する。さらに他の実施形態は、プロテアーゼの存在下でマンナナーゼ活性を有するマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関する。更なる実施形態は、グアーガム、ローカストビーンガム、及びそれらの組合せからなる群から選択される基質を加水分解するマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関する。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、炭水化物結合モジュールを含まない。
【００８１】
一部の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、広い範囲のｐＨ条件にわたって酵素活性を有する。特定の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、約４．０〜約１１．０のｐＨで酵素活性を有する。更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、約４．０〜約１１．０、約４．５〜約９．０、約５．５〜約８．５、又は約６．０〜約７．５のｐＨにて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％のマンナナーゼ活性を有する。
【００８２】
更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、２０℃〜約９０℃、約３０℃〜約８０℃、約２０℃〜約５０℃、又は約３０℃〜約６６℃に及ぶ温度にて、マンナナーゼ活性を有する。特定の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、約２０℃〜約９０℃、約３０℃〜約８０℃、約２０℃〜約５０℃、又は約３０℃〜約６６℃の温度範囲にて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％のマンナナーゼ活性を有する。
【００８３】
更なる実施形態は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、４．５〜９．０、５．５〜８．５、又は６．０〜７．５のｐＨ範囲にて、その最大マンナナーゼ活性を少なくとも７０％保持する。一部の実施形態は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に関し、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、３．０、３．５、４．０、若しくは４．５を超えるｐＨにて、又は９．０、９．５、若しくは１０．０未満のｐＨにて、その最大マンナナーゼ活性を少なくとも７０％保持する。一部の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、約２０〜７０℃、約３０〜７０℃、約４０〜７０℃、約４５〜６５℃、約５０〜６０℃、約６０〜７０℃、又は約６０℃の温度にて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％の残留マンナナーゼ活性を保持する。更なる実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、約４０〜７０℃、約４５〜７５℃、約４５〜６５℃、約５０〜６０℃、又は約６０〜７０℃の温度範囲にて、その最大マンナナーゼ活性を少なくとも７０％保持する。他の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、若しくは４０℃を超える温度にて、又は６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、若しくは８０℃未満の温度にて、その最大マンナナーゼ活性を少なくとも７０％保持する。更なる実施形態において、保持される最大マンナナーゼ活性の量は、５分間にわたって判定される。
【００８４】
他の特定の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ポリペプチドの構造及び／又は機能に実質的に影響を及ぼさない置換を含む。例示的な置換は、表Ｉに要約されるような保存的突然変異である。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
一部の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、１，４−β−Ｄ−マンノシドヒドロラーゼ活性を有し、これとして、マンナナーゼ、エンド−１，４−β−Ｄ−マンナナーゼ、エキソ−１，４−β−Ｄ−マンナナーゼガラクトマンナナーゼ、及び／又はグルコマンナナーゼの活性が挙げられる。１，４−β−Ｄ−マンノシドヒドロラーゼ活性は、本明細書中に記載されるアッセイを用いて、又は当該技術分野において知られている他のアッセイによって、判定且つ測定され得る。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、洗剤組成物の存在下で、活性を有する。
【００８７】
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、例えば、抽出、検出、及び／又は精製を補助し、且つ／あるいは機能的特性を変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に付加するための、Ｎ末端融合タンパク質及び／又はＣ末端融合タンパク質として産生される。融合タンパク質パートナーの例として、以下に限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ＸＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメイン及び／又は転写活性化ドメイン）、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＢＣＥ１０３（国際公開第２０１０／０４４７８６号パンフレット）、又は当業者に周知の他のタグが挙げられる。一部の実施形態において、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質パートナーと注目するタンパク質配列との間に提供されて、融合タンパク質配列の除去が可能となる。好ましくは、融合タンパク質は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の活性を妨害しない。
【００８８】
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、リーダーペプチド、プロペプチド、１つ若しくは複数の結合ドメイン（モジュール）、及び／又は触媒ドメインが挙げられる機能ドメインに融合される。適切な結合ドメインとして、以下に限定されないが、種々の特異性の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）が挙げられ、これは、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の使用中に存在する炭水化物成分への親和性の増大を付与する。本明細書中に記載されるように、ＣＢＭと、本発明のポリペプチドの触媒ドメインとは、作動可能に結合される。
【００８９】
ＣＢＭは、炭水化物結合活性を有する折畳みが控え目な（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）、炭水化物活性酵素内の連続アミノ酸配列と定義される。少数の例外として、タンパク質中のセルロソームスカフォールド内のＣＢＭ、及び独立した推定のＣＢＭの稀な例がある。より大きな酵素内にモジュールとして存在するＣＢＭの要件は、炭水化物結合タンパク質のこのクラスを、レクチン及び糖輸送タンパク質等の他の非触媒糖結合タンパク質から区別する。ＣＢＭは以前に、セルロースに結合するいくつかのモジュールの初期の発見に基づいて、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）と分類された（Ｔｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７０：５７５−５８１，１９８８；及びＧｉｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６３：１０４０１−１０４０７，１９８８）。しかしながら、セルロース以外の炭水化物に結合するが、それを別にすればＣＢＭ基準を満たす、炭水化物活性酵素中の追加的なモジュールが引き続いて発見されている。それゆえに、より包括的な専門用語を用いてこれらのポリペプチドを分類し直す必要がある。セルロース結合ドメインの以前の分類は、アミノ酸類似性に基づいていた。ＣＢＤのグループ化が、「型」と呼ばれており、ローマ数字の番号が付けられる（例えばＩ型ＣＢＤ又はＩＩ型ＣＢＤ）。グリコシドヒドロラーゼ分類に合わせて、当該グループ化は現在、ファミリーと呼ばれており、アラビア数字の番号が付けられる。ファミリー１〜１３は、Ｉ型からＸＩＩＩ型と同じである（Ｔｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（Ｓａｄｄｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．  ＆  Ｐｅｎｎｅｒ，Ｍ．，ｅｄｓ．），Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ：ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ｐｐ．１４２−１６３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９５））。ＣＢＭの構造及び結合モードについての詳細なレビューが、Ｂｏｒａｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３８２：７６９−８１，２００４に見出され得る。ＣＢＭのファミリー分類は、ＣＢＭの同定を補助し、結合特異性を予測し、機能残基の同定を補助し、進化関係を明らかにし、且つポリペプチドの折畳みをおそらく予測できると予想される。タンパク質の折畳みは、その配列よりもよく保存されているので、ＣＢＭファミリーの一部は、スーパーファミリー又はクランにグループ化され得る。現在のＣＢＭファミリーは、１〜６３である。ＣＢＤは、タンパク質のＮ末端及びＣ末端に見出され、又は内部にある。酵素ハイブリッドが、当該技術分野において知られており（例えば、国際公開第９０００６０９号パンフレット及び国際公開第９５１６７８２号パンフレット参照）、これは、本明細書において記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするＤＮＡ配列に、リンカーと共に、又はリンカー無しで、ライゲーションされたセルロース結合ドメインをコードするＤＮＡの少なくとも断片を含むＤＮＡ構築物を宿主細胞に形質転換して、当該宿主細胞を増殖させて融合遺伝子を発現させることによって、調製され得る。
【００９０】
酵素ハイブリッドは、以下の式によって記載され得：ＣＢＭ−ＭＲ−Ｘ又はＸ−ＭＲ−ＣＢＭ、式中、ＣＢＭは、少なくとも炭水化物結合モジュールに対応するアミノ酸配列のＮ末端領域又はＣ末端領域であり；ＭＲは、中間の領域（リンカー）であり、且つ約２〜約１００個の炭素原子、約２〜約４０の炭素原子、約２〜約１００個のアミノ酸、又は約２〜約４０個のアミノ酸の結合基であっても短い結合基であってもよく；そしてＸは、マンナナーゼ触媒活性を有する、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片のＮ末端領域又はＣ末端領域である。加えて、マンナナーゼは、非解糖機能の複数のＣＢＭ又は他のモジュール／ドメインを含有してよい。用語「モジュール」及び「ドメイン」は、本開示において互換的に用いられる。
【００９１】
触媒ドメインの非限定的な更なる例として、以下が挙げられる：セルラーゼ；ヘミセルラーゼ、例えばキシラナーゼ；エキソ−マンナナーゼ；グルカナーゼ；アラビナーゼ；ガラクトシダーゼ；ペクチナーゼ；並びに／又は他の活性物質、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、酸ホスファターゼ、及び／若しくはその他、あるいはそれらの機能断片。融合タンパク質は、場合によっては、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と融合ドメインとを、いずれの成分の特性にも大きな影響を及ぼすことなく単純に結合するリンカー配列により結合され、あるいはリンカーは、場合によっては、意図される用途にとっての機能的重要性を有する。
【００９２】
これ以外にも、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、注目する１つ又は複数の追加的なタンパク質と併用される。注目するタンパク質の非限定な例として、以下が挙げられる：アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エキソ−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、及び／又は他の酵素。
【００９３】
他の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、変異体、又はそのポリペプチド若しくは活性断片の細胞外分泌を導くシグナルペプチドに融合される。例えば、特定の実施形態において、シグナルペプチドは、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の固有のシグナルペプチドである。他の実施形態において、シグナルペプチドは、外来のシグナルペプチド、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥシグナルペプチドである。
【００９４】
一部の実施形態において、本発明のポリペプチドは、異種生物、すなわちパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種以外の生物中で発現される。例示的な異種生物として、グラム（＋）細菌、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（以前はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））・ステアロサーモフィラス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、又はＳ．ミュリナス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）；グラム（−）細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属種、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；並びに糸状菌類、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、例えばニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はクロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）がいる。核酸をこれらの生物に形質転換する方法は、当該技術分野において周知である。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属宿主細胞の形質転換に適した手順が、ＥＰ２３８０２３号明細書に記載されている。
【００９５】
特定の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、異種生物中で分泌ポリペプチドとして発現され、この場合、組成物及び方法は、異種生物中に分泌されたポリペプチドとしての変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を発現する方法を包含する。
【００９６】
更なる実施形態は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を生産する方法であって：マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主細胞を安定して形質転換することと；形質転換された宿主細胞を、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を産生するのに適した条件下で培養することと；マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を回収することとを含む方法に関する。
【００９７】
さらに別の実施形態は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするポリヌクレオチドに関する。一態様において、ポリヌクレオチドは、異種生物、例えば本明細書中で同定される生物中に含有される発現ベクター内に含有される。ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるコードされた変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の発現を補助する調節要素（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等）に作動可能に結合されていてよい。
【００９８】
一部の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするポリヌクレオチドに関する。更なる実施形態は、配列番号１に対する同一性が少なくとも５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であるポリヌクレオチドに関する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、異なる宿主中での発現のためにコドン最適化され、クローニング部位を導入するように突然変異され、又はそれ以外では官能性を付加するように変更されている。
【００９９】
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするポリヌクレオチドは、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の細胞外分泌を導くシグナルペプチドのコーディング配列の下流に融合される。発現ベクターは、本明細書中に記載される変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を発現するのに適した、あるいは適切な宿主細胞中に導入する前に発現ベクターを増殖させるのに適した異種宿主細胞内に提供されてよい。
【０１００】
一部の実施形態において、変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするポリヌクレオチドは、指定されたハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のポリヌクレオチド又はその相補体にハイブリダイズする。例示的な条件は、本明細書中に記載されるストリンジェントな条件及び高度にストリンジェントな条件である。
【０１０１】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするＤＮＡは、公開されている配列から化学的に合成され得、又は遺伝子を有する宿主細胞から直接（例えば、ｃＤＮＡライブラリース洗浄又はＰＣＲ増幅によって）得られ得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現カセット内に含まれ、且つ／又は標準的な分子クローニング技術によって適切な発現ベクター中にクローニングされる。そのような発現カセット又はベクターは、転写の開始、そして終結を補助する配列（例えば、プロモーター及びターミネーター）を含有し、且つ選択可能なマーカーを一般に含有する。
【０１０２】
発現カセット又はベクターは、適切な発現宿主細胞中に導入されて、これが次に、本明細書中に記載される、対応するマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を発現する。特に適した発現宿主は、細菌属の発現宿主であり、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）又はＰ．スタッツェレイ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｅｉ））、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属（例えばＰ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ））、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属（例えばＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ））、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＳ．カルノサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ））、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えばＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（枯草菌（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、巨大菌（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、リケニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）その他）が挙げられる。また、特に適しているのは、酵母発現宿主、例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、又はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。とりわけ適しているのは、真菌発現宿主、例えば、Ｃ．ラクノウェンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属（例えば、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）その他）又はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）である。また、適しているのは、哺乳類発現宿主、例えば、マウス（例えばＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）の細胞株である。他の真核生物宿主、例えば、昆虫細胞又はウィルス発現システム（例えば、バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージ若しくはラムダ、又はウィルス、例えばバキュロウイルス）もまた、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を生産するのに適している。
【０１０３】
注目する特定の宿主中で分泌されるタンパク質と関連するプロモーター及び／又はシグナル配列は、当該宿主における、又は他の宿主におけるマンナナーゼの異種生産及び異種分泌に用いられる候補である。一例として、糸状菌系において、セロビオヒドラーゼＩ（ｃｂｈ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、ＴＡＫＡ−アミラーゼ（ａｍｙＡ）、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄ−プロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈｌｌ、エンドグルカナーゼ遺伝子ＥＧＩ−ＥＧＶ、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｅｇｌ１−ｅｇｌ５、ｇｐｄプロモーター、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ−１ａｌｐｈａ、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１、及びｈｅｘ１の遺伝子を駆動するプロモーターが特に適しており、いくつかの異なる生物（例えば、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、及びＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））に由来し得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を、細胞外（又はペリプラズム）空間中に分泌する適切な相同シグナル配列又は非相同シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを組換えにより伴うことによって、細胞上澄み（又はペリプラズム空間又は溶解液）における酵素活性の直接の検出を可能にする。当該技術分野において知られている大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、他のグラム陰性菌、及び他の生物に特に適したシグナル配列として、ＨｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、又はＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を駆動するものが挙げられる。当該技術分野において知られている枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、グラム陽性生物、及び他の生物に特に適したシグナル配列としてさらに、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢの発現を駆動するものが、そして出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は他の酵母について、キラー毒素、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、接合因子アルファ、Ｉｎｕ１Ａ、又はＧｇｐｌｐシグナル配列が挙げられる。シグナル配列は、いくつかのシグナルペプチダーゼによって切断されることで、残りの発現されたタンパク質から除去され得る。一部の実施形態において、残りのポリペプチドは、単独で、又は、Ｎ末端若しくはＣ末端に位置決めされる他のペプチド、タグ、若しくはタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、又はＦＬＡＧタグ）との融合体として、発現される。適切な融合体として、親和性精製又は検出を促進するタグ、ペプチド、又はタンパク質（例えば、ＢＣＥ１０３、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシン、又はＦＬＡＧタグ）、及び標的マンナナーゼの発現、分泌、又はプロセシングを促進するものが挙げられる。適切なプロセシング部位として、インビボ又はインビトロでの切断のための、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、Ｋｅｘ２、又は他のプロテアーゼ切断部位が挙げられる。
【０１０４】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、いくつかの形質転換方法によって発現宿主細胞中に導入され得、当該方法として、以下に限定されないが、電気穿孔法、脂質支援形質転換又は形質移入（「リポフェクション」）、化学的に媒介される形質移入（例えば、ＣａＣｌ及び／又はＣａＰ）、酢酸リチウム媒介形質転換（例えば、宿主細胞プロトプラストの形質転換）、バイオリスティック「遺伝子ガン」形質転換、ＰＥＧ媒介形質転換（例えば、宿主細胞プロトプラストの形質転換）、プロトプラスト融合（例えば、細菌プロトプラスト又は真核生物プロトプラストを用いる）、リポソーム媒介形質転換、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アデノウイルス、又は他のウィルス若しくはファージの形質転換又は形質導入が挙げられる。
【０１０５】
これ以外にも、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、細胞内に発現され得る。場合によっては、酵素変異体の細胞内発現、又は上記されるようなシグナル配列を用いたペリプラズム空間中への分泌の後に、上澄み中にポリペプチドを放出する浸透化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）工程又は溶解工程が用いられてよい。膜バリアの崩壊が、機械的手段、例えば超音波、圧力処理（フレンチプレス）、キャビテーションの使用、又は膜消化酵素、例えばリゾチーム若しくは酵素混合物の使用によってもたらされる。更なる代替法として、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片をコードするポリヌクレオチドは、適切な無細胞発現システムの使用によって発現され得る。無細胞システムにおいて、注目するポリヌクレオチドは典型的に、プロモーターにより転写されるが、環状の発現ベクターを形成するためのライゲーションは、任意選択である。他の実施形態において、無細胞システム内にＲＮＡが、転写されることなく外生的に加えられて、又は生じて、翻訳される。
【０１０６】
別の実施形態は、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含む洗浄組成物、及びそのような組成物を洗浄用途に用いる方法に関する。洗浄用途として、以下に限定されないが、洗濯物又は織物の洗浄、洗濯物又は織物の柔軟仕上げ、食器洗い（手動及び自動）、及び染み前処理が挙げられる。特定の用途として、マンナン（例えば、ローカストビーンガム、グアーガムその他）が、除去されるべき汚れ又は染みの成分であるものがある。
【０１０７】
洗浄組成物は典型的に、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の有効量を含み、有効量は例えば、少なくとも０．０００１重量パーセント、約０．０００１〜約１重量パーセント、約０．００１〜約０．５重量パーセント、約０．０１〜約０．１重量パーセント、約０．１〜約１重量パーセント、又はそれ以上である。マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の有効量が洗浄組成物中に存在する結果、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、マンナン含有基質、例えばローカストビーンガム、グアーガム、又はそれらの組合せを加水分解するのに十分な酵素活性を有する。
【０１０８】
一部の実施形態は、粉末、液体、顆粒、バー、固体、半固体、ゲル、ペースト、エマルジョン、タブレット、カプセル、単位用量、シート、及び泡から選択される形態の洗浄組成物に関する。一部の実施形態において、洗浄組成物は、洗剤組成物である。他の実施形態において、洗浄組成物又は洗剤組成物は、洗濯洗剤、布地柔軟仕上げ洗剤、食器洗い洗剤、及び硬質表面洗浄洗剤から選択される。
【０１０９】
特段の記載がない限り、本明細書で提供される全ての成分又は組成物のレベルは、その成分又は組成物の活性レベルを基準に調整され、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残存溶媒又は副産物を含まない。酵素成分の重量は、総活性タンパク質に基づいている。全てのパーセンテージ及び比率は、特段の記載がない限り、重量で計算される。全てのパーセンテージ及び比率は、特段の記載がない限り、総組成物に基づいて計算される。例示的な洗剤組成物では、酵素のレベルは、総組成物の重量によって純粋酵素で表され、そして特段の記載がない限り、洗剤成分は、総組成物の重量によって表される。
【０１１０】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、界面活性剤を含む。一部の実施形態において、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、半極性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、並びにそれらの組合せ及び混合物から選択される。更なる実施形態において、界面活性剤は、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、界面活性剤を、組成物の重量で約０．１％〜約６０％、約１％〜約５０％、又は約５％〜約４０％含む。例示的な界面活性剤として、以下に限定されないが、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２−１４パレス−７、Ｃ１２−１５パレス−７、Ｃ１２−１５パレス硫酸ナトリウム、Ｃ１４−１５パレス−４、ラウレス硫酸ナトリウム（例えばＳｔｅｏｌ  ＣＳ−３７０）、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、Ｃ１２エトキシレート（Ａｌｆｏｎｉｃ  １０１２−６、Ｈｅｔｏｘｏｌ  ＬＡ７、Ｈｅｔｏｘｏｌ  ＬＡ４）、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（例えばＮａｃｃｏｎｏｌ  ９０Ｇ）、並びにそれらの組合せ及び混合物が挙げられる。陰イオン性界面活性剤として、以下に限定されないが、直鎖アルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）、アルファ−オレフィンスルホネート（ＡＯＳ）、硫酸アルキル（脂肪アルコールサルフェート）（ＡＳ）、アルコールエトキシサルフェート（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、第二アルカンスルホネート（ＳＡＳ）、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸が挙げられる。非イオン性界面活性剤として、以下に限定されないが、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグルコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際公開第９２０６１５４号パンフレットに記載）、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴＷＥＥＮ）、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンイソアルコール、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ及びＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール又はオクチルフェニル−エチレンオキシド縮合物（例えばＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ４０）、脂肪族アルコールとのエチレンオキシド縮合物（例えばＬＵＢＲＯＬ）、ポリオキシエチレンノニルフェノール、ポリアルキレングリコール（ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ  Ｆ１０８）、糖型界面活性剤（例えば、グルコピラノシド、チオグルコピラノシド）、並びにそれらの組合せ及び混合物が挙げられる。
【０１１１】
更なる実施形態において、本明細書中で開示される洗剤組成物はさらに、以下に限定されないが、５〜１５％陰イオン性界面活性剤、＜５％非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、ホスホネート、石鹸、酵素、香料、ブチルフェニルプロピオン酸メチル、ゲラニオール、ゼオライト、ポリカルボキシレート、ヘキシルシンナマル、リモネン、陽イオン性界面活性剤、シトロネロール、及びベンズイソチアゾリノンを含む界面活性剤混合物を含む。
【０１１２】
本明細書中で記載される洗浄組成物は追加的に、１つ又は複数の洗剤ビルダー又はビルダー系、錯体形成剤、ポリマー、漂白系、安定化剤、泡ブースター、起泡抑制剤、腐食防止剤、汚れ懸濁化剤、再汚染防止剤、色素、殺菌剤、ヒドロトロープ、変色阻害剤、蛍光増白剤、布地コンディショナ、及び香料を含んでもよい。本明細書中に記載される洗浄組成物はまた、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、ペクチン分解酵素、キシログルカナーゼ、又は追加的なカルボン酸エステルヒドロラーゼから選択される追加的な酵素を含んでもよい。
【０１１３】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、ビルダーを、洗浄組成物の重量で約１％〜、約３％〜約６０％、又は約５％〜約４０％含む。ビルダーとして、以下に限定されないが、ポリホスフェートのアルカリ金属、アンモニウム塩、及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸アルカリ金属、炭酸アルカリ土類金属及び炭酸アルカリ金属、アルミノシリケート、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、エチレン又はビニルメチルエーテルとの無水マレイン酸のコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸、例えばエチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸の種々のアルカリ金属、アンモニウム塩、及び置換アンモニウム塩、並びにポリカルボキシレート、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びそれらの可溶性の塩が挙げられる。
【０１１４】
一部の実施形態において、ビルダーは、水溶性硬度イオン錯体（例えば、封鎖性ビルダー）、例えば、シトレート及びポリホスフェート（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物）を形成する。当該技術分野において知られているものが挙げられるあらゆる適切なビルダーが、本明細書中に記載される組成物に用いられ得る（例えばＥＰ２１００９４９号明細書参照）。
【０１１５】
本明細書中で示されるように、一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、補助剤成分を含み、補助剤成分として、以下に限定されないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ遊離ポリマー、色素転移剤、色素転移阻害剤、触媒物質、過酸化水素、過酸化水素のソース、予め形成された過酸、ポリマー分散剤、土汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、起泡抑制剤、色素、香料、着色剤、フィラー塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナ、加水分解性界面活性剤、溶媒、腐食防止剤、抗酸化剤、抗収縮剤、しわ防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、色ムラ防止剤（ｃｏｌｏｒ  ｓｐｅｃｋｌｅ）、シルバーケア、抗変色剤及び／又は腐食防止剤、アルカリソース、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、並びにｐＨ制御剤が挙げられる（例えば、米国特許第６６１０６４２号明細書；米国特許第６６０５４５８号明細書；米国特許第５７０５４６４号明細書；米国特許第５７１０１１５号明細書；米国特許第５６９８５０４号明細書；米国特許第５６９５６７９号明細書；米国特許第５６８６０１４号明細書；及び米国特許第５６４６１０１号明細書参照）。一部の実施形態において、１つ又は複数の補助剤は、例えば、洗浄されることになる基質の処理用に洗浄性能を補助若しくは強化するために、又は香料、着色剤、色素等の場合と同様に洗浄組成物の美観を改変するために、組み込まれる。そのようなあらゆる補助剤成分は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片とは別である。これらの追加的な成分の正確な性質、及びその組込みレベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が用いられることになる洗浄操作の性質によって決まることとなる。
【０１１６】
１つ又は複数の補助剤成分が、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と適合しない実施形態において、洗浄補助剤成分及びマンナナーゼを、２つの成分の組合せがふさわしくなるまで、分離させて（すなわち、互いと接触させずに）維持する適切な方法が使用されてよい。そのような分離方法として、当該技術分野において知られているあらゆる適切な方法（例えば、ジェルキャップ、カプセル化、タブレット、物理的分離その他）が挙げられる。適切な補助剤成分の具体的な選択は、洗浄されることになる表面、アイテム、又は布地、及び使用中（例えば、洗い用洗剤の使用中）の洗浄条件について組成物の所望される形態を考慮することによって、容易になされる。
【０１１７】
本明細書中に記載される洗浄組成物は、例えば、洗濯用途、硬い表面の洗浄、食器洗い用途、及び美容用途に有利に使用される。さらに、本発明のポリペプチドは、顆粒状組成物及び液体組成物に用いられ得る。
【０１１８】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はまた、添加製品の洗浄にも用いられ得る。一部の実施形態では、添加剤は、洗浄プロセスへの添加のために適した剤形にパッケージングされる。一部の実施形態では、添加剤は、過酸素（ｐｅｒｏｘｙｇｅｎ）の供給源が利用され、高い漂白効果が望まれる洗浄プロセスへの添加のために剤形にパッケージングされる。限定されるものではないが、ピル、タブレット、ジェルキャップ、又は他の単回用量単位、例えば、予備計量された粉末又は液体を含む、任意の適切な単回用量単位形態を本開示に使用することができる。一部の実施形態では、充填剤又は担体物質が、このような組成物の嵩を増すために含められる。適切な充填剤又は担体物質としては、限定されるものではないが、硫酸塩、炭酸塩、及びケイ酸塩の様々な塩、並びにタルク及び粘土などが挙げられる。液体組成物に適した適切な充填剤又は担体物質としては、限定されるものではないが、水、又はポリオール及びジオールを含む低分子量の第１級アルコール及び第２級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定されるものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノールが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、約５％〜約９０％のこのような材料を含む。酸性充填剤は、ｐＨを下げるために使用することができる。あるいは、一部の実施形態では、洗浄添加剤は、１つ又は複数の補助剤成分を含む。
【０１１９】
一実施形態において、洗浄組成物又は洗浄添加物は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の有効量を、場合によっては他のマンナナーゼ及び／又は付加的な酵素と組み合わせて、含有する。特定の実施形態において、付加的な酵素として、以下に限定されないが、アシルトランスフェラーゼ、アミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルカナーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エキソ−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、脂肪分解酵素、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、及びそれらの組合せから選択される少なくとも１つの酵素が挙げられる。更なる実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物又は洗浄添加物はさらに、プロテアーゼ及び／又はアミラーゼを含む。
【０１２０】
本明細書の洗浄組成物は、典型的には、水性洗浄作業で使用中に、洗い水のｐＨが約３．０〜約１１となるように調合される。液体製品調合物は、典型的には、約３．０〜約９．０の正味のｐＨを有するように調合される。顆粒状洗濯用製品は、典型的には、約８．０〜約１１．０のｐＨを有するように調合される。一部の実施形態では、中性ｐＨ条件は、洗浄組成物が２０℃の脱イオン水で１：１００（ｗｔ：ｗｔ）に溶解されたときに、従来のｐＨ計を用いて測定することができる。ｐＨを推奨される使用レベルに調整する技術は、緩衝液、アルカリ、酸などの使用を含み、当業者に周知である。
【０１２１】
適切な低いｐＨの洗浄組成物は典型的に、正味のｐＨが約３．０〜約５．０、又は約３．５〜約４．５である。低ｐＨ洗浄組成物は典型的に、そのようなｐＨ環境において加水分解する界面活性剤がない。そのような界面活性剤として、少なくとも１つのエチレンオキシド部分、又は約１〜約１６モルのエチレンオキシドを含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。そのような洗浄組成物は典型的に、正味のｐＨが約３．０〜約５．０であるそのような洗浄組成物を提供するのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸を含む。そのような組成物は典型的に、少なくとも１つの酸安定酵素を含む。一部の実施形態において、組成物は液体である一方、他の実施形態では固体である。そのような液体組成物のｐＨは典型的に、正味のｐＨとして測定される。そのような固体組成物のｐＨは、溶媒が蒸留水である、組成物の１０％固体溶液として測定される。これらの実施形態において、全てのｐＨ測定値は、特に明記されない限り、２０℃にて測定される。
【０１２２】
適切な高いｐＨの洗浄組成物は典型的に、正味のｐＨが約９．０〜約１１．０であり、又は正味のｐＨが９．５〜１０．５である。そのような洗浄組成物は典型的に、正味のｐＨが約９．０〜約１１．０であるそのような洗浄組成物を提供するのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸を含む。そのような組成物は典型的に、少なくとも１つの塩基安定酵素を含む。一部の実施形態において、組成物は液体である一方、他の実施形態では固体である。そのような液体組成物のｐＨは典型的に、正味のｐＨとして測定される。そのような固体組成物のｐＨは、溶媒が蒸留水である、前記組成物の１０％固体溶液として測定される。これらの実施形態において、全てのｐＨ測定値は、特に明記されない限り、２０℃にて測定される。
【０１２３】
一部の実施形態において、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、保存の間に顆粒状組成物の他の成分から保護するために、カプセル化粒子の形態である。加えて、カプセル化は、洗浄プロセスの間の、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の有効性を制御する手段でもある。一部の実施形態において、カプセル化は、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片、及び／あるいは付加的な酵素の性能を高める。この点に関して、マンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、当該技術分野において知られているあらゆる適切なカプセル化材料で封入される。典型的には、カプセル化材料は、水溶性及び／又は水分散性である。一部の実施形態では、カプセル化材料は、０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。ガラス転移温度は、国際公開第９７１１１５１号パンフレットにさらに詳細に記載されている。カプセル化材料は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ガム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びこれらの組み合わせから選択される。カプセル化材料が炭水化物である場合は、カプセル化材料は、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。一部の典型的な実施形態では、カプセル化材料はデンプンである（例えば、ＥＰ０９２２４９９号明細書；及び米国特許第４９７７２５２号明細書；同第５３５４５５９号明細書、及び同第５９３５８２６号明細書を参照されたい）。一部の実施形態では、カプセル化材料は、プラスチック、例えば、熱可塑性樹脂、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物から形成されるミクロスフェア；限定されるものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって供給されるミクロスフェア、並びにＰＭ６５４５、ＰＭ６５５０、ＰＭ７２２０、ＰＭ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ  Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）を含む、使用できる市販のミクロスフェアである。
【０１２４】
用語「顆粒状組成物」は、不連続な固体の、巨視的粒子の集塊を指す。粉末は、小さな粒子サイズに起因する特別なクラスの顆粒状物質である。これにより、より凝集性となり、且つより容易に懸濁される。
【０１２５】
典型的な洗い液中の洗剤組成物の濃度は、世界中で、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（低洗剤濃度の地域）、例えば、日本での約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍ（「中間洗剤濃度の地域」）、例えば、米国での約９７５ｐｐｍ、ブラジルの約１５００ｐｐｍ、そして約２０００ｐｐｍ超（「高洗剤濃度の地域」）、例えば、欧州での約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍ及び高泡立ちリン酸塩ビルダーの地域での約６０００ｐｐｍまでである。
【０１２６】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗剤組成物は、約１０℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約３０℃〜約６０℃、約４０℃〜約６０℃、約４０℃〜約５５℃、又は１０℃から６０℃の全ての範囲内の温度にて利用されてよい。一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗剤組成物は、約１０℃〜約４０℃、約２０℃〜約３０℃、約１５℃〜約２５℃、約１５℃〜約３５℃、又は１０℃から４０℃の全ての範囲内の温度での「冷水洗い」に用いられる。
【０１２７】
更なる例として、異なる地域は、典型的には異なる水の硬度を有する。水の硬度は通常、１ガロン当たりのＣａ２＋／Ｍｇ２＋の合計グレーン数を単位として記載される。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国の殆どの水は硬水であるが、硬さの程度は様々である。中程度に硬い（６０〜１２０ｐｐｍ）から硬い（１２１〜１８１ｐｐｍ）水は、６０〜１８１ｐｐｍの硬度の鉱物を有する（ｐｐｍからグレーン／米国ガロンへの換算では、ｐｐｍ数を１７．１で除した値がグレーン／ガロンに等しい）。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
欧州の水の硬度は、典型的には、１ガロン当たり約１０．５（例えば、約１０．５〜約２０．０）の合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋グレーン（例えば、１ガロン当たり約１５の合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋グレーン）を超える。北米の水の硬度は、典型的には、日本の水の硬度よりも高いが、欧州の水の硬度よりも低い。例えば、北米の水の硬度は、約３〜約１０グレーン、約３〜約８グレーン、又は約６グレーンであり得る。日本の水の硬度は、典型的には北米の水の硬度よりも低く、通常は約４未満、例えば、約３合計Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋グレーン／ガロンである。
【０１３０】
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、洗い性能が、市販のマンナナーゼに匹敵する。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、市販のマンナナーゼと比較して高い洗い性能を示す。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、高い酸化安定性、高い熱安定性、種々の条件下での高い洗浄能力、及び／又は高いキレーター安定性を示す。加えて、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、洗剤を含まない洗浄組成物に、ここでも単独で、又はビルダー及び安定化剤と組み合わされて、用いられてよい。
【０１３１】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片に加えて、あらゆる他の適切なマンナナーゼが、本明細書中に記載される組成物に単独で、あるいは本明細書中に記載される変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と組み合わされて、用いられてよい。適切なマンナナーゼとして、以下に限定されないが、グリコシルヒドロラーゼのＧＨ２６ファミリーのマンナナーゼ、グリコシルヒドロラーゼのＧＨ５ファミリーのマンナナーゼ、酸性マンナナーゼ、中性マンナナーゼ、及びアルカリ性マンナナーゼが挙げられる。アルカリ性マンナナーゼの例として、米国特許第６０６０２９９号明細書；米国特許第６５６６１１４号明細書；及び米国特許第６６０２８４２号明細書；並びに国際公開第９５３５３６２号パンフレット、国際公開第９９６４５７３号パンフレット、国際公開第９９６４６１９号パンフレット、及び国際公開第２０１５０２２４２８号パンフレットに記載されるものが挙げられる。加えて、適切なマンナナーゼとして、以下に限定されないが、動物、植物、真菌、又は細菌起源のものが挙げられる。化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体が、本開示によって包含される。
【０１３２】
有用なマンナナーゼの例として、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属エンド−β−マンナナーゼ、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６０６０２９９号明細書及び国際公開第９９６４５７３号パンフレット参照）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種Ｉ６３３エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＡＡＩ１２エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）、バチルス（Ｂ．）属種ＡＡ３４９エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）、Ｂ．アガラドヘレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）ＮＣＩＭＢ  ４０４８２エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）エンド−β−マンナナーゼ、Ｂ．クラウジィ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９Ａ１号パンフレット参照）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属エンド−β−マンナナーゼ、例えばＨ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）、及びカルドセルロシルプトル（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ）属エンド−β−マンナナーゼ、例えばカルドセルロシルプトル属種エンド−β−マンナナーゼ（例えば、米国特許第６５６６１１４号明細書及び国際公開第９９６４６１９号パンフレット参照）が挙げられる。
【０１３３】
さらに、いくつかの同定されているマンナナーゼ（すなわち、エンド−β−マンナナーゼ及びエキソ−β−マンナナーゼ）が、本開示の一部の実施形態に用いられ、これらとして、以下に限定されないが、マッシュルーム（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）マンナナーゼ（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，［２００１］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２２９８−２３０３参照）、Ａ．タマリィ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）マンナナーゼ（Ｃｉｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，［１９８４］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１９：８５７−８６３参照）、Ａ．アクレアツス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）マンナナーゼ（Ｃｈｒｉｓｔｇａｕ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９４］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３：９１７−９２５参照）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）マンナナーゼ（Ｓｅｔａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，［２００１］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｐｕｒｉｆ．２１：１０５−１１４参照）、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）マンナナーゼ（Ｐｕｃｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，［２００４］Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ．１６７４：２３９−２５０参照）、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）マンナナーゼ（Ａｄｅｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９８］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３：１９９−２１０参照）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＮＲＲＬマンナナーゼ（Ｒｅｇａｌａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．８０：１３４３−１３５０参照）、Ａ．スルフレウス（Ａ．ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｓ）マンナナーゼ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，［２００７］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２８（３）：４５２−４６１参照）、Ａ．テルス（Ａ．ｔｅｒｒｕｓ）マンナナーゼ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，［２００７］Ｗｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．４７（２）：２８０−２８４参照）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属種及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種マンナナーゼ（米国特許第６３７６４４５号明細書参照）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属ＡＭ００１マンナナーゼ（Ａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，［１９８９］Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：１０−１５参照）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）マンナナーゼ（Ａｒａｕｊｏ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，［１９９０］Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６８：２５３−２６１参照）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｋ−１マンナナーゼ（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９８］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（３）：５１４−５２０参照）、Ｂ．ポリミキサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）マンナナーゼ（Ａｒａｕｊｏ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，［１９９０］Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６８：２５３−２６１参照）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＪＡＭＢ−７５０マンナナーゼ（Ｈａｔａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，［２００５］Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．９：４９７−５００参照）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種Ｍ５０マンナナーゼ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］Ｗｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．４０：６２−６８参照）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属���Ｎ１６−５マンナナーゼ（Ｙａｎｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，［２００４］Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ  ８：４４７−４５４参照）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マンナナーゼ（Ｔａｌｂｏｔ  ａｎｄ  Ｓｙｇｕｓｃｈ，［１９９０］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：３５０５−３５１０参照）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）マンナナーゼ（Ｍｅｎｄｏｚａ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９４］Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：５１−５４参照）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ３６マンナナーゼ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，［２００６］Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ（Ｃ）．６１：８４０−８４６）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＭ９６０２マンナナーゼ（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］Ｗｅｉ  Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．３９（１）：６０−６３参照）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＡ−２２マンナナーゼ（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，［２００３］Ｓｈｅｎｇ  Ｗｕ  Ｇｏｎｇ  Ｃｈｅｎｇ  Ｘｕｅ  Ｂａｏ．１９（３）：３２７−３３０参照）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８マンナナーゼ（Ｈｅｌｏｗ  ａｎｄ  Ｋｈａｔｔａｂ，［１９９６］Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇ．４３：２８９−２９９参照）、Ｂ．オバツス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）マンナナーゼ（Ｇｈｅｒａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，［１９８７］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０３８−２０４３参照）、Ｂ．ルミニコラ（Ｂ．ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）マンナナーゼ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９１］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：６９１９−６９２６参照）、Ｃ．セルロボランス（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）マンナナーゼ（Ｓｕｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：６６４−６７０参照）、Ｃ．サッカロリティカス（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）マンナナーゼ（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９５］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：２２６２−２２６９参照）、Ｃ．サッカロリチカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）マンナナーゼ（Ｂｉｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９１］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：３３７−３４３参照）、Ｃ．フィミ（Ｃ．ｆｉｍｉ）マンナナーゼ（Ｓｔｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５（６）：２５９８−２６０５参照）、Ｃ．ブチリカム／ベイジェリンキィ（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ／ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）マンナナーゼ（Ｎａｋａｊｉｍａ  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｕｒａ，［１９９７］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１７３９−１７４２参照）、Ｃ．セルロリティカム（Ｃ．ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）マンナナーゼ（Ｐｅｒｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，［２００４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：２５５−２５９参照）、Ｃ．テルティウム（Ｃ．ｔｅｒｔｉｕｍ）マンナナーゼ（Ｋａｔａｏｋａ  ａｎｄ  Ｔｏｋｉｗａ，［１９９８］Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８４：３５７−３６７参照）、Ｃ．サーモセラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）マンナナーゼ（Ｈａｌｓｔｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：３１０１−３１０８参照）、Ｄ．サーモフィルム（Ｄ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）マンナナーゼ（Ｇｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９（６）：３５１−３５７参照）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種マンナナーゼ（Ｚａｋａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９８］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６５５−６６０参照）、Ｇ．プルモナタ（Ｇ．ｐｕｌｍｏｎａｔａ）マンナナーゼ（Ｃｈａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｕｌａｎｄ，［２００１］Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｚｏｏｌ．２９０：１２５−１３５参照）、タマキビ（Ｌ．ｂｒｅｖｉｃｕｌａ）マンナナーゼ（Ｙａｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９６］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：６７４−６７６参照）、トマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）マンナナーゼ（Ｆｉｌｉｃｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３４：１０８０−１０８７参照）、Ｐ．カードラノリティカス（Ｐ．ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）マンナナーゼ（Ｐａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒａｔａｎａｋｈａｎｏｋｃｈａｉ，［２００６］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：２４８３−２４９０参照）、Ｐ．ポリミキサ（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）マンナナーゼ（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，［２００６］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３（３）：６１８−６３０参照）、Ｐ．クリソスポリウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）マンナナーゼ（Ｗｙｍｅｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，［２００５］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１８：１７−３４参照）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属種マンナナーゼ（Ｆａｎｕｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９５］Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４９）：２９３１４−２９３２２参照）、Ｐ．インスラルス（Ｐ．ｉｎｓｕｌａｒｓ）マンナナーゼ（Ｙａｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９３］Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：１３１６−１３１９参照）、Ｐ．フルオレッセンス亜種セルローサ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｅｌｌｕｌｏｓａ）マンナナーゼ（Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９５］Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０５：１００５−１０１０参照）、Ｒ．マリヌス（Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓ）マンナナーゼ（Ｐｏｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３（６）：７１５−７２１参照）、Ｓ．ロルフシィ（Ｓ．ｒｏｌｆｓｉｉ）マンナナーゼ（Ｓａｃｈｓｌｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，［２０００］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８０：１２７−１３４参照）、Ｓ．ガルバス（Ｓ．ｇａｌｂｕｓ）マンナナーゼ（Ｋａｎｓｏｈ  ａｎｄ  Ｎａｇｉｅｂ，［２００４］Ａｎｔｏｎ．ｖａｎ．Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ．８５：１０３−１１４参照）、Ｓ．リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）マンナナーゼ（Ａｒｃａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９０：８５７−８６３参照）、Ｔ．ポリサッカロリティカム（Ｔ．Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）マンナナーゼ（Ｃａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９９］Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：１６４３−１６５１参照）、Ｔ．フスカ（Ｔ．ｆｕｓｃａ）マンナナーゼ（Ｈｉｌｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９８］Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１４３３−１４４４参照）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）マンナナーゼ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，［２００１］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：３２２−３３３参照）、Ｔ．ネアポリタナ（Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）マンナナーゼ（Ｄｕｆｆａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９７］Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１６９−１７７参照）、Ｔ．ハルジアナム（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）株Ｔ４マンナナーゼ（Ｆｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，［２００４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４０：２５５−２５９参照）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）マンナナーゼ（Ｓｔａｌｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９３］Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：２２９−２４２参照）、並びにビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属種マンナナーゼ（Ｔａｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，［１９９７］Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８３：２０１−２０５参照）が挙げられる。
【０１３４】
例示的な市販のマンナナーゼとして、エンド−β−マンナナーゼ、例えばＨＥＭＩＣＥＬＬ（登録商標）（Ｃｈｅｍｇｅｎ）；ＧＡＭＡＮＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）；ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）Ｍ  １０００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（登録商標）Ｍ  １００、ＰＵＲＡＢＲＩＴＥ（商標）、及びＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（登録）（ＤｕＰｏｎｔ）；並びにＰＹＲＯＬＡＳＥ（登録商標）１６０及びＰＹＲＯＬＡＳＥ（登録商標）２００（Ｄｉｖｅｒｓａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
他の実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、及び１つ又は複数の付加的酵素を含む。１つ又は複数の付加的酵素は、アシルトランスフェラーゼ、アルファ−アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−ベータ−１，４−グルカナーゼ、エンド−ベータ−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、付加的マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、リダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、及びそれらのあらゆる組合せ又は混合物から選択される。一部の実施形態は、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼのような従来の酵素を、本明細書中に記載される１つ若しくは複数のマンナナーゼ変異体及び／又は１つ若しくは複数の付加的マンナナーゼと併せて含む酵素の組合せ（すなわち「カクテル」）に関する。
【０１３６】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、プロテアーゼを含む。一部の実施形態において、組成物は、プロテアーゼを、組成物の重量で約０．００００１％〜約１０％含む。別の実施形態において、洗浄組成物は、プロテアーゼを、組成物の重量で約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、又は約０．００５％〜約０．５％含む。
【０１３７】
一実施形態において、プロテアーゼはセリンプロテアーゼである。適切なプロテアーゼとして、動物、植物、又は微生物起源のものが挙げられる。一部の実施形態において、プロテアーゼは、微生物プロテアーゼである。他の実施形態において、プロテアーゼは、化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体である。別の実施形態において、プロテアーゼは、アルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。例示的なアルカリプロテアーゼとして、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に由来するサブチリシン（例えば、サブチリシン、レンタス（ｌｅｎｔｕｓ）、アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８）が挙げられる。例示的な付加的プロテアーゼとして、以下に限定されないが、国際公開第９２２１７６０号パンフレット、国際公開第９５２３２２１号パンフレット、国際公開第２００８０１０９２５号パンフレット、国際公開第０９１４９２００号パンフレット、国際公開第０９１４９１４４号パンフレット、国際公開第０９１４９１４５号パンフレット、国際公開第１００５６６４０号パンフレット、国際公開第１００５６６５３号パンフレット、国際公開第２０１００５６６３５６号パンフレット、国際公開第１１０７２０９９号パンフレット、国際公開第２０１１１３０２２号パンフレット、国際公開第１１１４０３６４号パンフレット、国際公開第１２１５１５３４号パンフレット、国際公開第２０１５０３８７９２号パンフレット、国際公開第２０１５０８９４４７号パンフレット、国際公開第２０１５０８９４４１号パンフレット、国際公開第２０１５／１４３３６０号パンフレット、国際公開第２０１６０６１４３８号パンフレット、国際公開第２０１６０６９５４８号パンフレット、国際公開第２０１６０６９５４４号パンフレット、国際公開第２０１６０６９５５７号パンフレット、国際公開第２０１６０６９５６３号パンフレット、国際公開第２０１６０６９５６９号パンフレット、国際公開第２０１６０６９５５２号パンフレット、国際公開第２０１６１４５４２８号パンフレット、米国特許出願公開第２００８００９０７４７号明細書、米国特許第５８０１０３９号明細書、米国特許第５３４０７３５号明細書、米国特許第５５００３６４号明細書、米国特許第５８５５６２５号明細書、ＲＥ３４６０６号明細書、米国特許第５９５５３４０号明細書、米国特許第５７００６７６号明細書、米国特許第６３１２９３６号明細書、米国特許第６４８２６２８号明細書、米国特許第８５３０２１９号明細書、米国仮特許出願第６２／３３１２８２号明細書、米国仮特許出願第６２／３３２４１７号明細書、米国仮特許出願第６２／３４３６１８号明細書、及び米国仮特許出願第６２／３５１６４９号明細書、並びにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／３２５１４号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３８２４５号明細書に記載されるもの、並びに国際公開第１９９９０１４３４１号パンフレット、国際公開第１９９９０３３９６０号パンフレット、国際公開第１９９９０１４３４２号パンフレット、国際公開第１９９９０３４００３号パンフレット、国際公開第２００７０４４９９３号パンフレット、国際公開第２００９０５８３０３号パンフレット、国際公開第２００９０５８６６１号パンフレット、国際公開第２０１４０７１４１０号パンフレット、国際公開第２０１４１９４０３２号パンフレット、国際公開第２０１４１９４０３４号パンフレット、国際公開第２０１４１９４０５４号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１９４１１７号パンフレットに記載されるメタロプロテアーゼが挙げられる。例示的なプロテアーゼとして、以下に限定されないが、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及び国際公開第８９０６２７０号パンフレットに記載されるフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属プロテアーゼが挙げられる。例示的な市販のプロテアーゼとして、以下に限定されないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えばＰ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＢＬＡＺＥ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＢＬＡＺＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）１６Ｌ、ＣＯＲＯＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ  ＥＶＥＲＩＳ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＧＲＥＳＳ  ＵＮＯ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ）；ＬＡＶＥＲＧＹ（商標）ＰＲＯ  １０４Ｌ（ＢＡＳＦ）、並びにＫＡＰ（Ｂ．アルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）サブチリシン（花王株式会社））が挙げられる。
【０１３８】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、適切なアミラーゼを含む。一実施形態において、組成物は、アミラーゼを、組成物の重量で約０．００００１％〜約１０％、約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、又は約０．００５％〜約０．５％含む。アルカリ溶液での使用に適したあらゆるアミラーゼ（例えば、アルファ及び／又はベータ）が、そのような組成物に含めるのに有用であり得る。例示的なアミラーゼは、化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体であってよい。例示的なアミラーゼとしては、限定されるものではないが、例えば、英国特許第１２９６８３９号明細書、国際公開第９１００３５３号パンフレット、同第９４０２５９７号パンフレット、同第９４１８３３１４号パンフレット、同第９５１０６０３号パンフレット、同第９５２６３９７号パンフレット、同第９５３５３８２号パンフレット、同第９６０５２９５号パンフレット、同第９６２３８７３号パンフレット、同第９６２３８７４号パンフレット、同第９６３０４８１号パンフレット、同第９７１０３４２号パンフレット、同第９７４１２１３号パンフレット、同第９７４３４２４号パンフレット、同第９８１３４８１号パンフレット、同第９８２６０７８号パンフレット、同第９９０２７０２号パンフレット、同第９９０９１８３号パンフレット、同第９９１９４６７号パンフレット、同第９９２３２１１号パンフレット、同第９９２９８７６号パンフレット、同第９９４２５６７号パンフレット、同第９９４３７９３号パンフレット、同第９９４３７９４号パンフレット、同第９９４６３９９号パンフレット、同第００２９５６０号パンフレット、同第００６００５８号パンフレット、同第００６００５９号パンフレット、同第００６００６０号パンフレット、同第０１１４５３２号パンフレット、同第０１３４７８４号パンフレット、同第０１６４８５２号パンフレット、同第０１６６７１２号パンフレット、同第０１８８１０７号パンフレット、同第０１９６５３７号パンフレット、同第０２０９２７９７号パンフレット、同第０２１０３５５号パンフレット、同第０２３１１２４号パンフレット、同第２００４０５５１７８号パンフレット、同第２００４１１３５５１号パンフレット、同第２００５００１０６４号パンフレット、同第２００５００３３１１号パンフレット、同第２００５０１８３３６号パンフレット、同第２００５０１９４４３号パンフレット、同第２００５０６６３３８号パンフレット、同第２００６００２６４３号パンフレット、同第２００６０１２８９９号パンフレット、同第２００６０１２９０２号パンフレット、同第２００６０３１５５４号パンフレット、同第２００６０６３５９４号パンフレット、同第２００６０６６５９４号パンフレット、同第２００６０６６５９６号パンフレット、同第２００６１３６１６１号パンフレット、同第２００８０００８２５号パンフレット、同第２００８０８８４９３号パンフレット、同第２００８０９２９１９号パンフレット、同第２００８１０１８９４号パンフレット、同第２００８／１１２４５９号パンフレット、同第２００９０６１３８０号パンフレット、同第２００９０６１３８１号パンフレット、同第２００９１００１０２号パンフレット、同第２００９１４０５０４号パンフレット、同第２００９１４９４１９号パンフレット、同第２０１０／０５９４１３号パンフレット、同第２０１００８８４４７号パンフレット、同第２０１００９１２２１号パンフレット、同第２０１０１０４６７５号パンフレット、同第２０１０１１５０２１号パンフレット、同第１０１１５０２８号パンフレット、同第２０１０１１７５１１号パンフレット、同第２０１１０７６１２３号パンフレット、同第２０１１０７６８９７号パンフレット、同第２０１１０８０３５２号パンフレット、同第２０１１０８０３５３号パンフレット、同第２０１１０８０３５４号パンフレット、同第２０１１０８２４２５号パンフレット、同第２０１１０８２４２９号パンフレット、同第２０１１０８７８３６号パンフレット、同第２０１１０９８５３１号パンフレット、同第２０１３０６３４６０号パンフレット、同第２０１３１８４５７７号パンフレット、同第２０１４０９９５２３号パンフレット、同第２０１４１６４７７７号パンフレット、及び同第２０１５０７７１２６号パンフレットに記載されているアミラーゼが挙げられる。例示的な市販のアミラーゼとしては、限定されるものではないが、ＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）、ＡＭＰＬＩＦＹ  ＰＲＩＭＥ（登録商標）、ＢＡＮ（商標）、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）ＵＬＴＲＡ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）ＥＶＩＴＹ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）Ｓ１０００、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ１００、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）Ｓ１１０、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）Ｓ２０００、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。
【０１３９】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、適切なペクチン分解酵素を含む。本明細書中で用いられる「ペクチン分解酵素」は、アラビナナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９９）、ガラクタナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８９）、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１５）、エキソ−ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６７）、エキソ−ポリ−アルファ−ガラクツロノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８２）、ペクチンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１０）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ  ３．１．１．１１）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）、エキソ−ポリガラクツロ酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．９）、及びヘミセルラーゼ、例えばエンド−１，３−β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３２）、キシラン−１，４−β−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３７）、及びα−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５５）を包含する。ペクチン分解酵素は、上述の酵素活性物質の天然の混合物である。したがって、ペクチン酵素として、ペクチンメチルエステル結合を加水分解するペクチンメチルエステラーゼ、ガラクツロン酸分子間のグリコシド結合を切断するポリガラクツロナーゼ、及びペクチン酸に作用して、α−１，４グリコシド結合の非加水分解切断をもたらして、ガラクツロン酸の不飽和誘導体を形成するペクチントランスアミナーゼ又はリアーゼが挙げられる。
【０１４０】
適切なペクチン分解酵素として、植物、真菌、又は微生物起源のものが挙げられる。一部の実施形態において、化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体が含まれる。一部の実施形態において、ペクチン分解酵素は、アルカリペクチン分解酵素、すなわち、酵素活性が、約７．０〜約１２のｐＨにて最大活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、又は少なくとも４０％である酵素である。他の特定の実施形態において、ペクチン分解酵素は、約７．０〜約１２のｐＨにて最大活性を有する酵素である。アルカリペクチン分解酵素は、好アルカリ性微生物、例えば、細菌、真菌、及び酵母微生物、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種によって産生される。一部の実施形態において、微生物は、特開昭５６−１３１３７６号公報及び特開昭５６−０６８３９３号公報に記載されるＢ．フィルムス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。アルカリペクチン分解酵素として、以下に限定されないが、ガラクツラン−１，４−α−ガラクツロナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６．７）、ポリ−ガラクツロナーゼ活性物質（ＥＣ  ３．２．１．１５）、ペクチンエステラーゼ（ＥＣ  ３．１．１．１１）、ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）、及びそれらのイソ酵素が挙げられ得る。アルカリペクチン分解酵素は、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属種により産生され得る。一部の実施形態において、アルカリペクチン分解酵素は、特開昭５９−０６６５８８号公報、特開昭６３−０４２９８８号公報、及びＷｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（８，２，１１５−１２０）１９９２に記載されるように、Ｅ．クリサンテミ（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、Ｅ．カロトボラ（Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、Ｅ．アミロボラ（Ｅ．ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、Ｅ．ヘルビコラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、及びＥ．ジソルベンス（Ｅ．ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ）によって産生される。他の特定の実施形態において、アルカリペクチン酵素は、ＪＰ７３００６５５７号明細書及びＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２），３６（２）２８５−９３に開示されるように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種によって産生される。一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、ペクチン分解酵素を、組成物の重量で約０．００００１％〜約１０％、約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、又は約０．００５％〜約０．５％含む。
【０１４１】
一部の他の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、適切なキシログルカナーゼを含む。適切なキシログルカナーゼとして、以下に限定されないが、植物、真菌、又は細菌起源のものが挙げられる。化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体が、一部の実施形態において含まれる。本明細書中で用いられる「キシログルカナーゼ」は、Ｖｉｎｃｋｅｎ及びＶｏｒａｇｅｎ（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）［Ｖｉｎｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４，９９−１０７］によって記載される酵素のファミリーを包含し、そしてＨａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０，１３９−１６８に記載されるように、キシログルカンを分解させることができる。Ｖｉｎｃｋｅｎらは、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）（エンド−ＩＶ−グルカナーゼ）から精製されるキシログルカナーゼによる、単離したリンゴ細胞壁のセルロースからのキシログルカンコーティングの除去を実証した。この酵素は、細胞壁に埋もれたセルロースの酵素分解、及びペクチン酵素との相乗効果による働きを高める。ＤＳＭ由来のラピダーゼＬＩＱ＋は、キシログルカナーゼ活性を含有する。一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、キシログルカナーゼを、組成物の重量で約０．００００１％〜約１０％、約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、又は約０．００５％〜約０．５％含む。他の特定の実施形態において、特定の用途用のキシログルカナーゼは、アルカリキシログルカナーゼ、すなわち、酵素活性が、７から１２に及ぶｐＨにて最大活性の少なくとも１０％、少なくとも２５％、又は少なくとも４０％である酵素である。特定の他の実施形態において、キシログルカナーゼは、約７．０〜約１２のｐＨにて最大活性を有する酵素である。
【０１４２】
一部の更なる実施形態において、本明細書中に記載される洗剤組成物はさらに、適切なセルラーゼを含む。一実施形態において、組成物は、セルラーゼを、組成物の重量で約０．００００１％〜約１０％、０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、又は約０．００５％〜約０．５％含む。あらゆる適切なセルラーゼが、本明細書中に記載される組成物に用いられ得る。例示的なセルラーゼとして、化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体があり得る。例示的なセルラーゼとして、以下に限定されないが、細菌又は真菌起源のもの、例えば、国際公開第２００５０５４４７５号パンフレット、国際公開第２００５０５６７８７号パンフレット、米国特許第７４４９３１８号明細書、米国特許第７８３３７７３号明細書、米国特許第４４３５３０７号明細書；ＥＰ０４９５２５７号明細書；及び米国仮特許出願第６２／２９６６７８号明細書に記載されるものが挙げられる。例示的な市販のセルラーゼとして、以下に限定されないが、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＥＮＤＯＬＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＮＯＺＹＭＥ（登録商標）、及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）ＰＲＥＭＩＵＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（商標）１００、ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（商標）２００／２２０、及びＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（登録商標）２０００（ＤｕＰｏｎｔ）；並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。一部の実施形態において、セルラーゼは、成熟した野生型セルラーゼ又は変異型セルラーゼの、Ｎ末端の一部が欠失している部分又は断片として組み込まれる（例えば、米国特許第５８７４２７６号明細書参照）。
【０１４３】
更なる実施形態において、本明細書中に記載される洗剤組成物はさらに、適切なリパーゼを含む。一部の実施形態において、組成物は、リパーゼを、組成物の重量で約０．００００１％〜約１０％、約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、又は約０．００５％〜約０．５％含む。例示的なリパーゼは、化学的に、又は遺伝的に改変された突然変異体であり得る。例示的なリパーゼとして、以下に限定されないが、例えば、細菌又は真菌起源のもの、例えば、Ｈ．ラヌギノーザ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ（例えば、ＥＰ２５８０６８号明細書及びＥＰ３０５２１６号明細書参照）、Ｔ．ラヌギノサス（Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ（例えば、国際公開第２０１４／０５９３６０号パンフレット及び国際公開第２０１５／０１０００９号パンフレット参照）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（例えばＥＰ２３８０２３号明細書参照）、カンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属リパーゼ、例えばＣ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークティカ（Ｃ．ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）リパーゼＡ又はＢ）（例えばＥＰ２１４７６１号明細書参照）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属リパーゼ、例えばＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）リパーゼ（例えばＥＰ２１８２７２号明細書参照）、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）リパーゼ（例えばＥＰ３３１３７６号明細書参照）、Ｐ．スタツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）リパーゼ（例えばＧＢ１３７２０３４号明細書参照）、Ｐ．フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）リパーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属リパーゼ（例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リパーゼ（Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：２５３−２６０（１９９３））、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば特表昭６４−７４４９９２号公報参照）、及びＢ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）リパーゼ（例えば国際公開第９１／１６４２２号パンフレット参照））が挙げられる。クローニングされた例示的なリパーゼとして、以下に限定されないが、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０３：６１−６７（１９９１）参照）、ゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３−３８８（１９８９）参照）、及び種々のリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属リパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（Ｒ．ｄｅｌｅｍａｒ）リパーゼ（Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０９：１１７−１１３（１９９１）参照）、Ｒ．ニベアス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６−７１９（１９９２））、及びニホンコウジカビ（Ｒ．ｏｒｙｚ���ｅ）リパーゼが挙げられる。他の脂肪分解酵素、例えばクチナーゼもまた、本明細書中に記載される１つ又は複数の組成物に用いられ得、以下に限定されないが、例えば、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）に由来するクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号パンフレット参照）及び／又はフザリウム・ソラニピシ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉｐｉｓｉ）に由来するクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号パンフレット参照）が挙げられる。例示的な市販のリパーゼとして、以下に限定されないが、Ｍ１  ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ  ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ＤｕＰｏｎｔ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）、及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；並びにＬＩＰＡＳＥ  Ｐ（商標）（天野エンザイム株式会社）が挙げられる。
【０１４４】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、ペルオキシダーゼを、過酸化水素又はそのソース（例えば、ペルカーボネート、ペルボレート、又はペルサルフェート）と組み合わせて含む。一部の代替の実施形態では、オキシダーゼは、酸素と組み合わせて使用される。両方のタイプの酵素は、「溶液漂白（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｌｅａｃｈｉｎｇ）」のために（すなわち、洗い液中で複数の布地が一緒に洗われたときに染色された布地から他の布地へ織物染料が転移するのを防ぐために）、好ましくは増強剤とともに使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号パンフレット及び同第９５／０１４２６号パンフレットを参照されたい）。適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、限定されるものではないが、植物、細菌、又は真菌由来のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを含む。化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が一部の実施形態に含められる。一部の実施形態では、本開示の洗浄組成物は、この組成物の重量に対して約０．００００１％〜約１０％、約０．０００１％〜約１０％、約０．００１％〜約５％、約０．００１％〜約２％、約０．００５％〜約０．５％のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼをさらに含む。
【０１４５】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、以下に限定されないが、ペルヒドロラーゼ（例えば国際公開第０５／０５６７８２号パンフレット参照）が挙げられる付加的な酵素を含む。一部の実施形態は、上述の１つ又は複数のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又はセルラーゼの混合物に関する。
【０１４６】
一部の実施形態は、洗浄組成物、例えば、米国特許第６６０５４５８号明細書に記載されるものに関する。一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、コンパクトな顆粒状の布地洗浄組成物である一方、他の実施形態では組成物は、着色された布地の洗濯に有用な顆粒状の布地洗浄組成物である。更なる実施形態において、組成物は、洗い容量について柔軟仕上げをもたらす顆粒状の布地洗浄組成物であり、更なる実施形態において、組成物は、重質液体（ＨＤＬ）布地洗浄組成物である。他の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、布地洗浄組成物、例えば、米国特許第６６１０６４２号明細書及び米国特許第６３７６４５０号明細書に記載されるものである。代替の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、硬い表面の適切な洗浄組成物である。硬い表面の適切な洗浄組成物として、例えば、米国特許第６６１０６４２号明細書；米国特許第６３７６４５０号明細書；及び米国特許第６３７６４５０号明細書に記載されるものが挙げられる。更なる実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、食器洗い組成物である。一部の更なる実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、オーラルケア組成物、例えば、米国特許第６３７６４５０号明細書及び米国特許第６６０５４５８号明細書に記載されるものである。上述の米国特許第６３７６４５０号明細書；米国特許第６６０５４５８号明細書；及び米国特許第６６１０６４２号明細書に含有される化合物及び洗浄補助物質の配合及び記載は、本発明のポリペプチドに用いられる。
【０１４７】
更なる実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、布地柔軟仕上げ組成物、例えば、ＧＢ４００８９８号明細書、ＧＢ５１４２７６号明細書、ＥＰ００１１３４０号明細書、ＥＰ００２６５２８号明細書、ＥＰ０２４２９１９号明細書、ＥＰ０２９９５７５号明細書、ＥＰ０３１３１４６号明細書、及び米国特許第５０１９２９２号明細書に記載されるものである。
【０１４８】
本明細書中に記載される洗浄組成物は、適切なあらゆる形態に製剤化され得、且つ製剤者によって選択されるあらゆるプロセスによって調製され得、それらの非限定的な例が、米国特許第５８７９５８４号明細書；米国特許第５６９１２９７号明細書；米国特許第５５７４００５号明細書；米国特許第５５６９６４５号明細書；米国特許第５５６５４２２号明細書；米国特許第５５１６４４８号明細書；米国特許第５４８９３９２号明細書；及び米国特許第５４８６３０３号明細書に記載されている。低いｐＨの洗浄組成物が所望される場合、そのような組成物のｐＨは、モノエタノールアミン等の物質、又はＨＣｌ等の酸性物質の付加により調整される。
【０１４９】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物は、タブレット、カプセル、サシェ、パウチ、シート、及び多区画パウチが挙げられる単位用量形態で提供される。一部の実施形態において、単位用量形式は、多区画パウチ（又は他の単位用量形式）内の成分の放出制御を実現するように設計される。適切な単位用量及び放出制御形式が、当該技術分野において知られている（例えば、ＥＰ２１００９４９号明細書、ＥＰ２１００９４７号明細書、国際公開第０２／１０２９５５号パンフレット、国際公開第０４／１１１１７８号パンフレット、国際公開第２０１３／１６５７２５号パンフレット、並びに米国特許第４７６５９１６号明細書及び米国特許第４９７２０１７号明細書参照）。一部の実施形態において、単位用量形態は、水溶性フィルム又は水溶性パウチで包まれたタブレットによって実現される。
【０１５０】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、少なくとも１つのキレート剤を含む。適切なキレート剤として、以下に限定されないが、銅キレート剤、鉄キレート剤、及び／又はマンガンキレート剤、並びにそれらの混合物が挙げられ得る。少なくとも１つのキレート剤が使用される実施形態では、本開示の洗浄組成物は、この洗浄組成物の重量に対して約０．１％〜約１５％、又はさらに約３．０％〜約１０％のキレート剤を含む。
【０１５１】
一部のなお更なる実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、少なくとも１つの沈着助剤をさらに含む。適切な沈着助剤としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、防汚ポリマー、例えば、ポリテレフタル酸、粘土、例えば、カオリナイト、モンモリロナイト、アタプルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１５２】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、少なくとも１つの再付着防止剤を含む。一部の実施形態において、再付着防止剤は、例えば、ＥＰ２１００９４９号明細書に記載される非イオン性界面活性剤である。自動食器洗いの一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤が、特に敷布地用の表面改変剤として、被膜形成及び染み形成を回避するのに、且つ光沢を向上させるのに用いられる。
【０１５３】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、１つ以上の染料転移抑制剤を含む。適切なポリマー性染料転移抑制剤としては、限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物をさらに含む。本明細書中に記載される洗浄組成物は、この洗浄組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又はさらに約０．１重量％〜約３重量％の染料転移抑制剤を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、ケイ酸塩をさらに含む。一部のこのような実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロケイ酸塩）を使用することができる。一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、この組成物の約１％〜約２０％、約５重量％〜約１５重量％のケイ酸塩を含む。
【０１５５】
一部のなお更なる実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、１つ又は複数の分散剤をさらに含む。適切な水溶性有機物質は、限定されるものではないが、ホモ若しくはコポリマー酸又はこれらの塩を含み、このポリカルボン酸は、２つ以下の炭素原子によって互いに隔てられている少なくとも２つのカルボキシ基を含む。
【０１５６】
一部の更なる実施形態では、洗浄組成物に使用される酵素は、任意の適切な技術によって安定化される。一部の実施形態では、本明細書で利用される酵素は、完成組成物中のカルシウム及び／又はマグネシウムイオンの水溶性源の存在によって安定化される。一部の実施形態では、酵素安定剤としては、オリゴ糖、多糖、及び無機二価金属塩が挙げられ、この無機二価金属塩は、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩を含む。酵素安定化のための様々な技術を本明細書で使用できることが企図される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で利用される酵素は、完成組成物中の亜鉛（ＩＩ）イオン、カルシウム（ＩＩ）イオン、及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオン、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ））の水溶性源の存在によって安定化される。塩化物及び硫酸塩も、一部の実施形態に使用することができる。適切なオリゴ糖及び多糖（例えば、デキストリン）の例は、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第０７／１４５９６４号パンフレットを参照されたい）。一部の実施形態では、可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルホウ酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドも、安定性をさらに改善するために使用することができる。
【０１５７】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、１つ又は複数の漂白剤、漂白活性化剤、及び／又は漂白触媒をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、限定されるものではないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられ得る。一部の実施形態では、無機過水和物塩はアルカリ金属塩である。一部の実施形態では、無機過水和物塩は、追加の保護なしに結晶性固体として含められるが、一部の別の実施形態では、この塩は被覆される。適切な塩として、例えば、ＥＰ２１００９４９号明細書に記載されるものが挙げられる。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度での洗浄の過程で漂白作用を高める有機過酸前駆体である。本明細書で使用するのに適した漂白活性化剤は、過加水分解条件下で、好ましくは約１〜約１０の炭素原子、特に約２〜約４の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸、及び／又は任意選択で置換される過安息香酸を与える化合物を含む。適切な漂白活性化剤として、例えば、ＥＰ２１００９４９号明細書に記載されるものが挙げられる。漂白触媒として典型的に、例えば、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト、銅、マンガン、及び鉄の錯体が、そして米国特許第４２４６６１２号明細書；米国特許第５２２７０８４号明細書；米国特許第４８１０４１０号明細書；並びに国際公開第９９／０６５２１号パンフレット及びＥＰ２１００９４９号明細書に記載されるものが挙げられる。
【０１５８】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される洗浄組成物はさらに、１つ又は複数の触媒金属錯体を含む。他の実施形態では、金属含有漂白触媒を使用することができる。一部の実施形態では、金属漂白触媒は、指定された漂白触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンのカチオン）、漂白触媒活性を殆ど又は全く有しない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、触媒及び補助金属カチオンに対して指定された安定性定数を有する封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）、及びこれらの水溶性塩を含む触媒系を含む（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号明細書を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、マンガン化合物によって触媒される。このような化合物及び使用のレベルは、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号明細書を参照されたい）。更なる実施形態では、コバルト漂白触媒を、本明細書中に記載される洗浄組成物に使用することができる。様々なコバルト漂白触媒が、当技術分野で公知であり（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号明細書、及び同第５，５９５，９６７号明細書を参照されたい）、公知の方法によって容易に調製される。
【０１５９】
一部の更なる実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、マクロ多環式剛性リガンド（ＭＲＬ）の遷移金属錯体をさらに含む。実際の問題として、かつ限定としてではなく、一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物及び洗浄プロセスは、水性洗い媒体中に少なくとも１億分の１部程度の活性ＭＲＬ種を提供するように調整され、他の実施形態では、洗い液中に約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、又は約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを提供する。
【０１６０】
一部の実施形態では、本遷移金属漂白触媒中の遷移金属は、限定されるものではないが、マンガン、鉄、及びクロムを含む。他の実施形態では、ＭＲＬは、限定されるものではないが、架橋された特別な超剛性リガンド（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）を含む。適切な遷移金属ＭＲＬは、公知の方法によって容易に調製される（例えば、国際公開第２０００／３２６０１号パンフレット及び米国特許第６，２２５，４６４号明細書を参照されたい）。
【０１６１】
一部の実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、金属クリーナー剤（ｍｅｔａｌ  ｃａｒｅ  ａｇｅｎｔ）をさらに含む。金属クリーナー剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）を含む金属の変色、腐食、及び／又は酸化の防止及び／又は低減に使用することができる。適切な金属クリーナー剤は、ＥＰ２１００９４９号明細書、国際公開第９４／２６８６０号パンフレット、及び同第９４／２６８５９号パンフレットに記載された金属クリーナー剤を含む。一部の実施形態では、金属クリーナー剤は亜鉛塩である。一部の更なる実施形態では、本明細書中に記載される洗浄組成物は、約０．１重量％〜約５重量％の１つ以上の金属クリーナー剤を含む。
【０１６２】
本明細書中に記載される洗浄組成物は、表面、皿類、又は布地を洗浄するのに用いられ得る。典型的には、表面、皿類、又は布地の少なくとも一部が、少なくとも１つの（ｉ）本明細書中に記載される変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片、あるいは（ｉｉ）本明細書中に記載される少なくとも１つの洗浄組成物と接触してから、表面、皿類、又は布地は、場合によっては洗われ、且つ／又は濯がれる。本開示の目的のために、「洗い」は、以下に限定されないが、こすり洗い及び機械的撹拌を含む。一部の実施形態において、洗浄組成物は典型的に、溶液中約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度にて使用される。洗い溶媒が水である場合、水の温度は典型的に、約５℃〜約９０℃に及び、そして布地が包含される場合、水対布地の質量比は典型的に、約１：１〜約３０：１である。
【０１６３】
一部の実施形態は、洗浄方法であって、（ｉ）本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片、あるいは（ｉｉ）本明細書中に記載される洗浄組成物の有効量を、マンナンを含む汚れ又は染みを含むアイテム又は表面と接触させて、汚れ又は染みに含有されるマンナンを加水分解することを含む洗浄方法に関する。
【０１６４】
一部の実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、織物及び布地から選択される１つ又は複数のアイテム上のバイオフィルムを阻止し、削減し、且つ／又は除去するのに用いられる。
【０１６５】
本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、以下に限定されないが、マンナン、ガラクトマンナン、及びグルコマンナンが挙げられる、マンノース単位を含有する多糖鎖を加水分解することで、そのようなポリペプチドが、１，４−β−Ｄマンノシド結合を含有する多糖基質に関与するマンナン加水分解反応を実行するのに特に有用となる。一般的には、ドナー分子は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の存在下で、マンナン加水分解反応を実行するのに適した条件下でインキュベートされ、場合によっては、その後、反応から産物が単離される。これ以外にも、食品の文脈では、製品は、単離されない食品の成分となり得る。特定の実施形態において、ドナー分子は、以下に限定されないが、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、及びガラクトグルコマンナンが挙げられる、マンノース単位を含む多糖鎖である。
【０１６６】
一実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、パーム核油を抽出するプロセスに用いられる。別の実施形態は、パーム核又はパーム核ミールからパーム核油を抽出するプロセスであって、パーム核及び／又はパーム核ミールを用意することと、前記種子又はケーキを、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片で処理することとを含むプロセスに関する。
【０１６７】
一実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含む組成物は、動物の飼料又は人間の食物を加工し、且つ／又は製造するのに用いられる。更なる実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ヒト以外の動物用の飼料への添加物であり得る。別の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、人間の食物に、例えば人間の食物への添加物として、有用であり得る。
【０１６８】
いくつかの栄養因子が、動物の飼料及び人間の食物を調製するのに用いられ得る安価な植物材料の量を制限するおそれがある。例えば、オリゴマンナン、例えばマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン、及びガラクトグルコマンナンを含有する植物材料は、栄養化合物、例えば鉱物、ビタミン、糖、及び脂肪を消化吸収する動物の能力を引き下げるおそれがある。当該悪影響は、特に、マンナン含有ポリマーの高い粘度に、そして栄養化合物を吸収するマンナン含有ポリマーの能力に起因する。当該影響は、飼料中に、マンナン含有ポリマーを分解する酵素、例えば本明細書中に記載されるエンド−β−マンナナーゼ酵素を含めることによって引き下げられ得、これにより、安価な植物材料中に典型的に見出されるマンナン含有ポリマーがより高い割合で飼料中に含まれてよく、このことで最終的に飼料のコストが引き下げられる。加えて、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、マンナン含有ポリマーをより単純な糖に分解することができ、これは、より容易に同化されて、付加的なエネルギーを提供することができる。
【０１６９】
更なる実施形態において、植物材料を含有する動物の飼料は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の存在下で、マンナン含有ポリマーを分解するのに適した条件下で、インキュベートされる。
【０１７０】
別の実施形態において、パン改良組成物が、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を、場合によってはマンナン、グルコマンナン、又はガラクトマンナンのソースと組み合わせて、そしてさらに場合によっては、１つ又は複数の他の酵素と組み合わせて、含む。
【０１７１】
用語「ヒト以外の動物」は、全ての非反芻動物及び反芻動物を含む。特定の実施形態において、非反芻動物は、以下に限定されないが、ウマ、並びに単胃動物、例えば、以下に限定されないが、ブタ、家禽、及び魚からなる群から選択される。更なる実施形態において、ブタは、以下に限定されないが、子ブタ、成長中のブタ、及び雌ブタであってよく；家禽は、以下に限定されないが、シチメンチョウ、カモ、及びニワトリ（以下に限定されないが、ブロイラー雛及びレイヤーが挙げられる）であってよく；そして魚は、以下に限定されないが、サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及びコイ；並びにエビが挙げられるがこれに限定されない甲殻類であってよい。更なる実施形態において、反芻動物は、以下に限定されないが、ウシ、若いカーフ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、ムース、ヘラジカ、ヤク、スイギュウ、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン、及びニルガイからなる群から選択される。
【０１７２】
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、飼料添加物としての代わりに、飼料を前処理するのに用いられる。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、離乳したてのブタ、保育中のブタ、子ブタ、肥育中のブタ、成長中のブタ、仕上げブタ、産卵鶏、ブロイラー雛、及びシチメンチョウ用の飼料に加えられ、又はこれを前処理するのに用いられる。
【０１７３】
別の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、植物材料、例えばパーム核、ココナッツ、コンニャク、ローカストビーンガム、グアーガム、ダイズ、オオムギ、エンバク、アマ、コムギ、トウモロコシ、アマニ、柑橘類の果肉、綿実、ラッカセイ、ナタネ、ヒマワリ、エンドウ、及びルピナス由来の飼料に加えられ、又はこれを前処理するのに用いられる。
【０１７４】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、熱安定性であり、そして結果として、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ペレット化された飼料を生産するプロセスに用いられ得、そこではペレット化工程前に熱が飼料混合物に加えられる。別の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、ペレット化工程に先立って他の飼料成分に、又はペレット化工程の後に他の飼料成分に（すなわち、すでに形成された飼料ペレットに）加えられる。
【０１７５】
さらに別の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を含有する食物プロセシング組成物又は飼料補助剤組成物は、場合によってはさらに、着色剤、芳香化合物、安定化剤、ビタミン、鉱物、及び他の飼料又は食物増強酵素から選択される他の置換基を含有してよい。これは、いわゆるプレミックスに特に当てはまる。
【０１７６】
更なる実施形態において、本発明に従う食品添加物は、他の食物成分、例えば禾穀類タンパク質又は植物タンパク質と適切な量で組み合わされて、加工された食品が形成されてよい。
【０１７７】
一実施形態において、動物の飼料組成物及び／又は動物の飼料添加組成物及び／又はペットフードが、本明細書中に記載されるポリペプチドを含む。
【０１７８】
別の実施形態は、動物の飼料組成物及び／又は動物の飼料添加組成物及び／又はペットフードを調製する方法であって、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を、１つ又は複数の、動物の飼料成分及び／又は動物の飼料添加成分及び／又はペットフード成分と混合することを含む方法に関する。
【０１７９】
更なる実施形態は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の、動物の飼料成分及び／又は動物の飼料添加成分及び／又はペットフードを調製するための使用に関する用語「ペットフード」は、家庭動物、例えば、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、ファンシーラット、モルモット；鳥類ペット、例えば、カナリア、インコ、及びオウム；爬虫類ペット、例えば、カメ、トカゲ、及びヘビ；水生動物、例えば、熱帯魚及びカエル用の試料を意味すると理解されるものとする。
【０１８０】
用語「動物飼料組成物」、「試料」、及び「飼い葉」は、互換的に使用され、以下の群から選択される１つ以上の動物飼料材料を含み得る：（ａ）穀類、例えば、小さい穀物（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オート麦、及びこれらの組み合わせ）、及び／又は大きい穀物、例えば、トウモロコシ又はモロコシなどの大粒；（ｂ）穀類からの副産物、例えば、トウモロコシグルテンミール、ＤＤＧＳ（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（特にトウモロコシをベースとするＤＤＧＳ（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、小麦ミドリング（ｗｈｅａｔ  ｍｉｄｄｌｉｎｇ）、小麦ショーツ、米ぬか、籾殻、オート麦、パーム核、及び柑橘類果肉；（ｃ）供給源、例えば、大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、綿、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、及びゴマから得られるタンパク質；（ｄ）植物及び動物起源から得られる油及び脂肪；及び（ｅ）鉱物及びビタミン。
【０１８１】
一態様において、食物組成物又は食物添加物は、液体であっても固体であってもよい。
【０１８２】
本発明の態様において、食物組成物は、以下に限定されないが発酵飲料、例えばビール及びワインが挙げられる飲料である。
【０１８３】
本発明の文脈では、用語「発酵飲料」は、発酵プロセス、例えば微生物発酵、例えば細菌発酵及び／又は酵母発酵を含む方法によって生産されるあらゆる飲料を含むことを意味する。
【０１８４】
本発明の態様において、発酵飲料は、ビールである。用語「ビール」は、デンプン含有植物材料の発酵／醸造によって生産されるあらゆる発酵麦汁を含むことを意味する。多くの場合、ビールは、麦芽、又はデンプン含有植物材料としての補助剤、又は麦芽及び補助剤のあらゆる組合せから生産される。本明細書中で用いられる用語「麦芽」は、あらゆる禾穀類穀粒麦芽、例えばオオムギ麦芽又はコムギ麦芽として理解される。
【０１８５】
本明細書中で用いられる用語「補助剤」は、麦芽でない、例えばオオムギ麦芽でもコムギ麦芽でもないあらゆるデンプン及び／又は糖含有植物材料を指す。補助剤の例として、例えば、一般的なトウモロコシグリッツ、精製トウモロコシグリッツ、醸造者の粉砕酵母、イネ、モロコシ、精製コーンスターチ、オオムギ、オオムギデンプン、脱穀オオムギ、コムギ、コムギデンプン、加熱乾燥した（ｔｏｒｒｉｆｉｅｄ）禾穀類、禾穀類フレーク、ライムギ、エンバク、ジャガイモ、タピオカ、キャッサバ、並びにシロップ、例えばトウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、転化糖シロップ、オオムギシロップ、及び／又はコムギシロップ等が挙げられ、これらがデンプンのソースとして用いられ得る。
【０１８６】
本明細書中で用いられる用語「マッシュ」は、穀粉等のあらゆるデンプン及び／又はシュガー含有植物材料の水性スラリーを指し、例えば、水と混合された後に、麦汁及び使い終った穀粒に分離される、破砕オオムギ麦芽、破砕オオムギ、及び／若しくは他の補助剤又はそれらの組合せを含む。
【０１８７】
本明細書中で用いられる用語「麦汁」は、マッシング中の穀粉の抽出後に溢れ出した非発酵液を指す。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、発酵飲料、例えばビールを調製する方法であって、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を、麦芽及び／又は補助剤と混合することを含む方法に関する。
【０１８９】
例示的なビールは、十分な麦芽で造られたビール、「Ｒｅｉｎｈｅｉｔｓｇｅｂｏｔ」の下で醸造されたビール、エール、ＩＰＡ、ラガー、ビター、発泡酒（第２のビール）、第３のビール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽リカー、ノンアルコールビール、ノンアルコール麦芽リカー、並びに代替の禾穀類飲料及び麦芽飲料、例えば果実風味の麦芽飲料、例えば柑橘風味の、例えばレモン、オレンジ、ライム、若しくはベリー風味の麦芽飲料；リカー風味の麦芽飲料、例えば、ウォッカ、ラム、若しくはテキーラ風味の麦芽リカー；又はコーヒー風味の麦芽飲料、例えばカフェイン風味の麦芽リカーを含むが、これらに限定されない。
【０１９０】
本発明の一態様は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の、発酵飲料、例えばビールの生産における使用に関する。
【０１９１】
別の態様は、発酵飲料を提供する方法であって、マッシュ及び／又は麦汁を、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と接触させる工程を含む方法に関する。
【０１９２】
更なる態様は、発酵飲料を提供する方法であって：（ａ）マッシュを調製する工程と、（ｂ）当該マッシュを濾過して、麦汁を得る工程と、（ｃ）当該麦汁を発酵させて、発酵飲料、例えばビールを得る工程とを含み、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片が：（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の麦汁、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の麦汁に加えられる、方法に関する。
【０１９３】
さらに別の態様に従えば、（１）マッシュ及び／又は麦汁を、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と接触させる工程；及び／あるいは（２）（ａ）マッシュを調製する工程、（ｂ）当該マッシュを濾過して、麦汁を得る工程、（ｃ）当該麦汁を発酵させて、発酵飲料、例えばビールを得る工程を含み、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片が：（ｉ）工程（ａ）のマッシュ、及び／又は（ｉｉ）工程（ｂ）の麦汁、及び／又は（ｉｉｉ）工程（ｃ）の麦汁に加えられる、方法によって、発酵飲料、例えばビールが生産又は提供される。
【０１９４】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、コーヒー抽出液中に存在するガラクトマンナンを加水分解するのにも用いられ得る。一態様において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、コーヒー抽出液の凍結乾燥中のゲル形成を阻害するのに用いられる。抽出液の粘度の低下により、乾燥中のエネルギー消費が引き下げられる。特定の他の態様において、本発明のポリペプチドは、固定化された形態で用いられて、酵素の消費を引き下げ、且つコーヒー抽出液の汚染を回避する。この使用は、ＥＰ６７６１４５号明細書においてさらに開示されている。
【０１９５】
一般的には、コーヒー抽出液は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の存在下で、液体コーヒー抽出液中に存在するガラクトマンナンを加水分解するのに適した条件下でインキュベートされる。
【０１９６】
別の態様において、本発明は、ベイクド製品を調製する方法であって、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を生地に加えてから、当該生地を焼くことを含む方法に関する。ベイクド製品の例は、当業者に周知であり、パン、ロールパン、パフペストリー、甘い発酵生地、バンズ、ケーキ、クラッカー、クッキー、ビスケット、ワッフル、ウェハース、トルティーヤ、朝食のシリアル、押出し製品等が挙げられる。
【０１９７】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、パン改良剤組成物の一部として生地に加えられてよい。パン改良剤は、種々の成分を含有する組成物であり、生地の特性、及びベーカリー製品、例えばパン及びケーキの品質を向上させる。パン改良剤は多くの場合、その有益な影響、例えば生地の安定性、並びにパンの質感及び容量のため、産業的なベーカリープロセスに加えられる。パン改良剤は通常、脂肪及び油、並びに乳化剤、酵素、酸化防止剤、酸化剤、安定化剤、及び還元剤のような添加物を含有する。本発明のいずれかのポリペプチドに加えて、パン改良剤中に存在してもよいし、それ以外では本発明のいずれかのポリペプチドと併用されてもよい他の酵素として、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミロース分解性複合体、リパーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、非デンプン性多糖分解酵素、及びグルコースオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、又はアスコルビン酸オキシダーゼのようなレドックス酵素が挙げられる。
【０１９８】
一実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、生地にパン改良剤組成物の一部として加えられてよく、これはまた、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナンソース、例えばコンニャクガム、グアーガム、ローカストビーンガム（イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａ  ｓｉｌｉｑｕａ））、コプラミール、アイボリーナットマンナン（オオミゾウゲヤシ（Ｐｈｙｔｅｌｅｐｈａｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ））、海草マンナン抽出物、ココナッツミール、及び醸造酵母の細胞壁（乾燥していてもよいし、醸造酵母抽出液の形態で用いられてもよい）も含む。本発明に用いられる他の許容可能なマンナン誘導体として、枝状に分かれていないβ−１，４−結合したマンナンホモポリマー及びマンノオリゴサッカライド（マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、及びマンノペントース）が挙げられる。本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、単独で用いられてもよいし、生地の寛容性；生地の可撓性及び／又は生地の粘着性；及び／又はパン粉の構造、並びにパンのステーリングの遅延（ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ｓｔａｌｉｎｇ）を向上させるために、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナン及び／又はガラクトグルコマンナンと併用されてもよい。別の態様において、マンナナーゼ加水分解物は、可溶性のプレバイオティクス、例えばマンノオリゴサッカライド（ＭＯＳ）として作用し、これは、結腸中で好ましい集団密度にて見出される場合に、良好な健康状態と一般的に関連する乳酸菌の増殖を促進する。一態様において、本発明のいずれかのポリペプチドが加えられる生地は、純粋な小麦粉に加えて、又はその代わりに、ブラン、又はエンバク、イネ、雑穀、トウモロコシ、又は豆類の粉を含む（すなわち、純粋な白色の小麦粉生地でない）。
【０１９９】
別の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、乳又は他のあらゆる乳製品に加えられてよく、これには、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナンも加えられている。典型的なグルコマンナン及び／又はガラクトマンナンソースは、ベーカリーの態様において先で一覧にされており、グアー又はコンニャクガムが挙げられる。本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片の、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナンとの組合せは、マンナナーゼ加水分解物（マンノオリゴサッカライド）を放出し、これは、大腸又は結腸中で好ましい集団密度にて見出される場合に、良好な健康状態と一般的に関連するプロバイオティック細菌（とりわけビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）属及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属乳酸菌）の選択的な増殖を促進することによって、可溶性のプレバイオティクスとして作用する。
【０２００】
別の態様は、乳又は乳製品を調製する方法であって、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片、及びあらゆるグルコマンナン、ガラクトマンナン、又はガラクトグルコマンナンを加えることを含む方法に関する。
【０２０１】
別の態様において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、プレバイオティックマンナン加水分解物を含む乳業ベースの食品を生産するために、乳業ベースの食品に加えられる前に、又は加えられた後に、あらゆるグルコマンナン又はガラクトマンナンと併用される。更なる態様において、このように生産されたマンノオリゴサッカライド含有乳製品は、有益なヒト腸内ミクロフローラの集団を増大させることができ、そして更なる態様において、乳業ベースの食品は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片を、グルコマンナン及び／又はガラクトマンナン及び／又はガラクトグルコマンナンのあらゆるソース、並びにヒト大腸において有益であることが知られている細菌（例えばビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）属及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属）の少なくとも１つの株の接種に十分な用量と一緒に含んでよい。一態様において、乳業ベースの食品は、ヨーグルト又は乳飲料である。
【０２０２】
本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はさらに、紙パルプ、例えば化学パルプ、半化学パルプ、クラフトパルプ、機械パルプ、及び亜硫酸塩法によって調製されるパルプの酵素補助漂白に用いられる。一般的には、紙パルプは、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と、紙パルプを漂白するのに適した条件下でインキュベートされる。
【０２０３】
一部の実施形態において、パルプは、酸素、オゾン、パーオキシド、又はペルオキシ酸で漂白された塩素フリーのパルプである。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、低いリグニン含有量を示す、改変され、又は連続的なパルプ化法によって生産されたパルプの酵素補助漂白に用いられる。一部の他の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、単独で、又は好ましくはキシラナーゼ及び／又はエンドグルカナーゼ及び／又はアルファ−ガラクトシダーゼ及び／又はセロビオヒドラーゼ酵素と組み合わされて、使用される。
【０２０４】
グアーガム及びローカストビーンガム等のガラクトマンナンは、例えば食物（例えばアイスクリーム）、及び織物印刷用の印刷ペースト、例えばＴシャツへの印刷物中で、増粘剤として広く用いられる。ゆえに、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片はまた、マンナン含有基質の厚さ又は粘度の引下げに用いられる。一部の実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、食物（例えばアイスクリーム）中のガラクトマンナンを加水分解して廃棄流を形成するのに用いられる。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、加工装置内の残留食物の粘度を引き下げることによって、加工後の洗浄を促進するのに用いられる。特定の他の実施形態において、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、印刷ペーストの粘度を引き下げることによって、織物印刷後の過剰印刷ペーストの洗いを促進するのに用いられる。一般的には、マンナン含有基質は、本明細書中に記載されるマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片と、マンナン含有基質の粘度を引き下げるのに適した条件下でインキュベートされる。
【０２０５】
更なる実施形態において、本明細書中に記載される１つ又は複数のマンナナーゼ変異体、又はその組換えポリペプチド若しくは活性断片は、油ガス業界において、例えば、掘削液の粘度を制御し；水圧破砕に用いられる流体が、ボアホールから岩中に延びる地下部の破損を生じさせる割合を増大させ；ボアホールの濾過ケーキを洗浄し；且つそれらを組み合わせて行うのに用いられ得る。
【０２０６】
本組成物及び本方法の他の態様及び実施形態が、上述の記載及び以下の実施例から明らかとなろう。本明細書中に記載される実施形態を越える種々の代替の実施形態が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本発明を実行する際に使用され得る。したがって、本明細書中に記載される特定の実施形態ではなく特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義する。したがって、特許請求の範囲内の方法及び構造、並びにそれらの等価物は、特許請求の範囲によって包含される。
【実施例】
【０２０７】
実施例１
アッセイ
以下に記載する実施例に用いる以下のアッセイは、標準的なアッセイである。時折、特定のプロトコルが、これらの標準的なアッセイからの逸脱を必要とする。そのような場合、以下の標準的なアッセイプロトコルからの逸脱を、実施例において同定する。
【０２０８】
性能指数
酵素の性能指数（ＰＩ）は、変異体の性能（測定値）を親酵素（理論値又は測定値）と、同じタンパク質濃度にて比較している。親酵素の洗浄性能についての理論値を、親酵素の標準曲線のＬａｎｇｍｕｉｒフィットから抽出したパラメータを用いて算出することができる。１を超えるＰＩ（ＰＩ＞１）は、特定の親、例えばＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）又はＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）と比較して、変異体による性能の向上を示す一方、１のＰＩ（ＰＩ＝１）は、特定の親と同じ性能で実行する変異体を同定し、１未満のＰＩ（ＰＩ＜１）は、特定の親よりも悪い性能で実行する変異体を同定する。
【０２０９】
タンパク質判定アッセイ
タンパク質濃度判定を、積分ピーク面積を測定する高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法を用いて実行して、９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で増殖させた培養液由来の上澄み中でのタンパク質の発現レベルを判定した。サンプルを、濾過した培養液の上澄みから得て、２５ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５中の４倍希釈液として調製した。逆相ＨＰＬＣを、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  ３００ＳＢ−Ｃ８カラム（２．１×７５ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣ系で、０．１％ＴＦＡをそれぞれ補った水及びアセトニトリルの溶媒で構成した勾配溶離を用いて実行した。サンプルを、５０℃にて２ｍＬ／分の流量で溶出した。タンパク質を、２２０ｎｍでの吸光度を測定することによって検出して、ピークを、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて積分した。サンプルのタンパク質濃度を、精製した親タンパク質（例えば、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）又はＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６））の標準曲線に基づいて判定した。
【０２１０】
マンナナーゼ活性アッセイ
後に続く実施例において記載するマンナナーゼ変異体のマンナナーゼ活性を、溶液中ローカストビーンガム（ＬＢＧ）ガラクトマンナン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ０７５３）（おおよそ０．３％（ｗ／ｖ）のＬＢＧ基質）の加水分解を測定することによって試験した。用いた試薬溶液は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５（基質希釈バッファ）、及び５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ、ｐＨ７．２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０含有（酵素希釈バッファ）であった。作用基質溶液を調製するために、ＬＢＧ粉末（製品Ｎｏ．Ｇ０７５３，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、５０ｍＭトリスＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５の加熱溶液中に撹拌下で溶解させた。室温に冷却して直ぐに、溶液を遠心分離して、澄明な上澄みを基質溶液として用いた。
【０２１１】
酵素を、酵素希釈バッファ（５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）中に希釈して、希釈した酵素溶液のアリコートを、ＬＢＧ基質溶液を含有する平底クリアポリスチレンＭＴＰに加えた。プレートをシールして、９００ｒｐｍでの撹拌（例えばｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）により４０℃にて１０分間、インキュベートした。
【０２１２】
インキュベーションの後、放出された還元糖を、ＢＣＡ試薬アッセイ（カタログＮｏ．２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて定量化した。詳細には、ＬＢＧアッセイプレートの各ウェル由来のアリコートを、ＢＣＡ作用試薬溶液（メーカーの説明書に従って調製した）を含有するＰＣＲプレートに加えた；サンプル対作用試薬の比は、１：９（ｖ／ｖ）であった。プレートをシールして、サーモサイクラー（例えばＴｅｔｒａｄ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）内で９５℃にて２〜３分間インキュベートした。
【０２１３】
プレートを３０℃に冷却した後、反応溶液を、フレッシュな平底クリアポリスチレンＭＴＰ（例えばＣｏｓｔａｒ  ９０１７）に移して、吸光度をプレートリーダー分光光度計（例えばＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）内で５６２ｎｍにて測定した。マンナナーゼを含有しないサンプル（ブランク）の吸光度の値を、マンナナーゼ含有サンプルの吸光度の値から減算した。生じた吸光度を、マンナナーゼ活性の尺度とした。生じた吸光度を、タンパク質判定アッセイから算出したタンパク質濃度で割ることによって、親マンナナーゼ及びその変異体の比活性を算出した。変異体のマンナナーゼ比活性を、親のマンナナーゼ比活性で割ることによって、マンナナーゼ活性ＰＩ値を算出した。
【０２１４】
安定性アッセイ
後に続く実施例において記載するマンナナーゼ変異体の安定性を、５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ、ｐＨ７．２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０中の５７℃でのストレス条件下で、高温での５分間のインキュベーション後にサンプルの残留活性を測定することによって試験した。初期の（ストレスのない）活性を測定するために、先の節「マンナナーゼ活性アッセイ」に記載したアッセイを用いて、酵素サンプルを、５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ、ｐＨ７．２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０中に希釈して、直ちに、ＬＢＧに対する活性についてアッセイした。ストレスを受けた活性を測定するために、先の節「マンナナーゼ活性アッセイ」に記載したように、５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ、ｐＨ７．２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０中に希釈した酵素サンプルを、シールしたＰＣＲプレート内で、サーモサイクラー（Ｔｅｔｒａｄ２  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において５７℃にて５分間インキュベートしてから、活性についてアッセイした。
【０２１５】
残留活性の計算
先に記載したように、ストレスを受けた活性の値及びストレスのない活性の値を、ＬＢＧ基質の加水分解によって一旦測定して、ストレスを受けた活性の、ストレスのない活性に対する比率をとって、１００を乗じることによって、％残留活性を算出した。変異体の残留活性を親の残留活性で割ることによって、安定性ＰＩ値を得た。
【０２１６】
ミクロスワッチアッセイを用いたマンナナーゼ変異体の洗浄性能
変異体を、ＬＢＧミクロスワッチ（ＣＦＴ  Ｃ−Ｓ−７３，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に対する洗浄性能について、親の性能と比較して試験した。
【０２１７】
人為的な汚れからのガラクトマンナン除去を測定するために開発された高スループットアッセイを用いて、洗浄性能を測定した。アッセイは、ＬＢＧを含有する人為的な汚れからのＬＢＧの放出を測定する。市販の試薬（カタログＮｏ．２３２２５，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いたＢＣＡ反応を用いて、酵素の存在下での溶液中のオリゴサッカライドの還元末端を、ブランク対照と比較して測定した。この測定値は、酵素の洗浄性能と相関する。マンナナーゼがガラクトマンナンを加水分解するので、還元末端を有する様々な長さのオリゴサッカライドが、おそらく、ワタスワッチから放出される。次に、ＢＣＡ試薬中のビシンコニン酸により、Ｃｕ２＋の還元によって形成されるＣｕ１＋の高度に感度の良い比色検出が可能となる。
【０２１８】
５．５ｃｍ直径の２つのＬＢＧミクロスワッチ（ＣＦＴ  Ｃ−Ｓ−７３，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、平底ノンバインディング９６ウェルアッセイプレート（例えばＣｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）の各ウェルに入れた。酵素を、５０ｍＭ  ＭＯＰＳバッファ、ｐＨ７．２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０含有中に希釈した。ミクロスワッチアッセイバッファ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）及び希釈酵素のアリコートを、９６ウェルミクロスワッチアッセイプレートの各ウェルに、組み合わせて１００μＬ容量になるように加えた。プレートをシールして、（例えば、ｉＥＭＳインキュベーター／シェーカー、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡにおいて）１１５０ｒｐｍにて２０分間撹拌しながら、２５℃にてインキュベートした。
【０２１９】
インキュベーションの後、放出された還元糖を、上記の節「マンナナーゼ活性アッセイ」に記載したＢＣＡ試薬アッセイを用いて定量化した。生じた吸光度を、洗浄性能の尺度とした。変異体の洗浄性能を、同じタンパク質濃度の親の洗浄性能で割ることによって、洗浄性能ＰＩ値を算出した。上記の節「性能指数
」に記載した、親の標準曲線について測定した値のＬａｎｇｍｕｉｒフィットから抽出したパラメータを用いて、関連タンパク質濃度での親の洗浄性能についての理論値を算出した。
【０２２０】
実施例２
ＰｓｐＭａｎ４の部位評価ライブラリの作成
ＰｓｐＭａｎ４タンパク質配列中に単一アミノ酸置換を導入するための標準的な分子生物学プロトコルを用いて、ＰｓｐＭａｎ４についての部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を作成した。ＰｓｐＭａｎ４遺伝子（配列番号１）を含有する鋳型プラスミドを構築した。ＳＥＬを、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）の成熟した領域における予め選択した位置にて生産した。ＳＥＬにおける各アミノ酸部位についてのフォワードＮＮＳオリゴマー及びリバースＮＮＳオリゴマー、並びに外側のプライマー（発現カセットの始点又は終点にハイブリダイズする）を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡに注文した。
【０２２１】
発現カセットは、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子由来のプロモーター（配列番号３）及びシグナルペプチド（配列番号４）、ＰｓｐＭａｎ４遺伝子（配列番号１）、並びにＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＰＮ’遺伝子由来のターミネーター（配列番号５）からなった。適切なプライマー対及び鋳型プラスミドによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行して、変異遺伝子を生じさせた。
【０２２２】
ＰＣＲ断片をアセンブルして、適切な枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株を、アセンブルしたＤＮＡで形質転換した。形質転換した細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコールを有するＬｕｒｉａアガー上にプレーティングした。各ライブラリについて、単一の細菌コロニーを採取して、Ｌｕｒｉａブロス中で５ｐｐｍクロラムフェニコール選択下で増殖させてから、ＤＮＡを単離して、遺伝子配列を分析した。各変異体のヌクレオチド配列を、次世代ＤＮＡ分析（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって確認した。
【０２２３】
生化学的特徴付け用にＰｓｐＭａｎ４親及びその変異体のサンプルを作製するために、マンナナーゼの選択的増殖を、９６ウェルＭＴＰ中で３７℃にて６８時間、各ウェル内に含有される培地（主要な窒素源としての尿素、主要な炭素源としてのグルコースを有し、ロバストな細胞増殖のために１％ソイトンを補った、ＭＯＰＳバッファに基づく半規定富化培地）中で実行した。培養物を、３６００ｒｐｍにて４５分間の遠心分離によって収穫して、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）フィルタプレート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）により、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空系を用いて濾過した。濾過した培養液の上澄みを、実施例１において先に記載したアッセイに用いた。
【０２２４】
ＳＥＬを作成するのに用いられるＰｓｐＭａｎ４遺伝子の核酸配列を、配列番号１として示す。ＰｓｐＭａｎ４遺伝子によってコードされるＰｓｐＭａｎ４タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２として示す。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥプロモーターの核酸配列を、配列番号３として示す。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥシグナルペプチドの核酸配列を、配列番号４として示す。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のａｐｒＥターミネーターの核酸配列を、配列番号５として示す。
【０２２５】
実施例３
ＰｓｐＭａｎ４突然変異の評価
コンビナブル突然変異を、コンビナトリアル変異体を作製するのに用いることができる、分子中の置換として説明することができる。コンビナブル突然変異は、分子の少なくとも１つの所望される特性を向上させる一方で、発現、活性、又は安定性をいずれも大きく低下させないものである。生産的位置を、特性の向上を示すコンビナトリアル変異体を作製するのに最も有用な、分子内の位置として説明し、当該位置はそれ自体、少なくとも１つのコンビナブル突然変異を許容する。
【０２２６】
ＰｓｐＭａｎ４変異体の清澄化した培養液上澄みサンプルを、実施例１に記載した方法：マンナナーゼ活性アッセイ、安定性アッセイ、洗浄性能アッセイ、及びタンパク質濃度を用いて試験した。実施例１に記載したように、比較用に親としてＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）を用いて、ＰＩ値を算出した。
【０２２７】
ＰｓｐＭａｎ４中のコンビナブル突然変異を、以下の基準を用いて同定した：ａ）タンパク質発現＞１４０ｐｐｍ；ｂ）マンナナーゼ活性、洗浄性能、及び安定性の全てについて、ＰＩ≧０．７；並びにｃ）マンナナーゼ活性、洗浄性能、及び安定性の少なくとも１つについて、ＰＩ≧１．０。コンビナブル突然変異基準を満たすＰｓｐＭａｎ４中の部位を、表１に示す。ＰｓｐＭａｎ４中の生産的位置として：１０、１９、３８、５９、６０、６２、６３、６６、６７、６８、７０、７１、７４、７５、７８、７９、８０、９７、１２９、１３１、１３５、１３６、１４３、１６７、１６８、１８４、２１３、２１４、２２５、２２８、２３５、２４２、２４４、２５８、２５９、２６１、及び２８３が挙げられ、ＰｓｐＭａｎ４のアミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている。
【０２２８】
【表３−１】
2019504616.tif 000005
【０２２９】
【表３−２】
2019504616.tif 000006
【０２３０】
【表３−３】
2019504616.tif 000007
【０２３１】
【表３−４】
2019504616.tif 000008
【０２３２】
表１に示すように、１つ又は複数の特性に有益であった複数の置換を、これらのほぼ全ての部位にて観察した。多くの場合において、複数のコンビナブル置換（例えば、表１に一覧にしたもの）を、ＰｓｐＭａｎ４配列中に導入すると、生じたマンナナーゼは、親分子と比較して、安定性及び洗浄性能の向上を示した。これらの部位の２つ以上を含むコンビナトリアル変異体はさらに、２０１５年１１月５日出願の特許出願第６２／２５１５１６号明細書、及び２０１６年１月１３日出願の特許出願第６２／２７８３８７号明細書に記載されている。
【０２３３】
実施例４
ＰｓｐＭａｎ４変異体の結晶構造
２つのＰｓｐＭａｎ４変異体、ＰｓｐＭａｎ１１８及びＰｓｐＭａｎ１４８の三次元構造を、Ｘ線結晶学的方法を用いて判定した。
【０２３４】
突然変異Ｐ１９Ｅ／Ｔ３８Ｅ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ９７Ｄ／Ｙ１２９Ｍ／Ｐ１６８Ｓ／Ｑ１８４Ｌ／Ｋ２４４Ｌ／Ｓ２５８Ｄ／Ｎ２６１Ｒを有するＰｓｐＭａｎ１１８（配列番号６）（アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている）を、ハンギングドロップ法を用いて、５０ｍＭ塩化ナトリウムを有する５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ、ｐＨ６．０中１％タンパク質溶液で始めて結晶化させた。リザーバー溶液は、０．７Ｍリン酸ナトリウム、０．８Ｍリン酸カリウム、及び０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５を含有した。結晶は、一分子が単位格子定数（ｕｎｉｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）ａ＝５３．２Å、ｂ＝７６．７Å、及びｃ＝７７．３Åの非対称単位である空間群Ｐ２１２１２１に成長した。
【０２３５】
突然変異Ｎ１０Ｔ／Ｐ１９Ｅ／Ｓ３０Ｔ／Ｔ３８Ｅ／Ｓ５９Ｖ／Ｌ６０Ｑ／Ｋ６３Ｒ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ９７Ｄ／Ｙ１２９Ｍ／Ｋ１４３Ｑ／Ｐ１６８Ｓ／Ｑ１８４Ｌ／Ｇ２２５Ｐ／Ｔ２２８Ｖ／Ｙ２３５Ｌ／Ｋ２４４Ｌ／Ｓ２５８Ｄ／Ｎ２６１Ｒ／Ｚ２９８．０１Ｑを有するＰｓｐＭａｎ１４８（配列番号７）（アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている）を、ハンギングドロップ法を用いて、５０ｍＭ塩化ナトリウムを有する５０ｍＭ  ＭＥＳバッファ、ｐＨ６．０中１％タンパク質溶液で始めて結晶化させた。リザーバー溶液は、１６％  ２−プロパノール、０．１６Ｍ塩化カルシウム、及び８０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６を含有した。結晶は、一分子が単位格子定数ａ＝５２．８Å、ｂ＝７７．０Å、及びｃ＝７８．５Åの非対称単位である空間群Ｐ２１２１２１に成長した。
【０２３６】
ＰｓｐＭａｎ１１８結晶及びＰｓｐＭａｎ１４８結晶についてのデータを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｘ８  Ｐｒｏｔｅｕｍ回折系で、それぞれ１．８Å及び１．７Åの分解能で収集した。データ収集についての付加的な統計を、表２に示す。
【０２３７】
ＰｓｐＭａｎ１１８の構造を、出発モデルとしてのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種ＪＡＭＢ−６０２マンナナーゼ（受託番号ＢＡＤ９９５２７．１、ＰＤＢエントリ１ＷＫＹ＿Ａ）由来の残基２７〜３２６の座標との分子置換を用いて判定した。モデルを、Ｃｏｏｔソフトウェアパッケージを用いてフィットさせた［Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ；６６：４８６−５０１］。
【０２３８】
ＰｓｐＭａｎ１４８の構造を、出発モデルとしてのＰｓｐＭａｎ１１８の座標との分子置換を用いて判定した。付加的な置換について電子密度を合わせるように座標を調整して、Ｃｏｏｔソフトウェアパッケージを用いてフィットさせた。ＰｓｐＭａｎ１４８のＣ末端に挿入された付加的な残基、Ｑについて、疎らな弱い密度が観察された。フィッティング調整及びリフィッティング調整の後に、双方の構造についての座標を、ＣＣＰ４ソフトウェアスイートにおいて標準的なデフォルト設定のＲＥＦＭＡＣプログラムを用いてリファインした。
【０２３９】
表３に報告するように、最終モデルは立体化学が良好であった。参照のため、ＰｓｐＭａｎ１１８変異体及びＰｓｐＭａｎ１４８変異体の座標をアラインすることができ、１９５４個の共通原子について、全体のｒｍｓ（二乗平均平方根）偏差が０．１３３Åであった。
【０２４０】
【表４】
2019504616.tif 000009
【０２４１】
【表５】
2019504616.tif 000010
【０２４２】
ＰｓｐＭａｎ１１８モノマーの座標を、２つの他のマンナナーゼ構造：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属種株ＪＡＭＢ−６０２マンナナーゼ（ＰＤＢエントリ１ＷＫＹ＿Ａ）及びＢ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）株ＮＣＩＭＢ  ４０４８２マンナナーゼ（ＰＤＢエントリ２ＷＨＬ＿Ａ）の触媒ドメインと重ねると、全ての共通原子を用いて、全体のｒｍｓ偏差がそれぞれ０．３８Å及び０．４２Åである。ゆえに、これらの３つの酵素が、ＰｓｐＭａｎ４の残基１〜２９５に対して約６０％のみのアミノ酸配列同一性を共有するにしても、３つのマンナナーゼは全て、触媒ドメインについて共通の折畳みを共有する。
【０２４３】
図１は、１ＷＫＹ＿Ａマンナナーゼの、ＰｓｐＭａｎ１１８マンナナーゼ変異体との構造比較を表しており、１ＷＫＹ＿Ａの主鎖折畳み（灰色で示す）を、ＰｓｐＭａｎ１１８の主鎖折畳み（黒色で示す）と比較している。図１は、ＰｓｐＭａｎ１１８が、１ＷＫＹ＿Ａと共通の陽イオン結合部位を共有することを、そして１ＷＫＹ＿Ａが、付加的な炭水化物結合ドメインを有することを示す。ＰｓｐＭａｎ１１８が１ＷＫＹ＿Ａと共有する陽イオン結合部位は、Ｇｌｙ２２５残基のカルボニル酸素、Ａｓｐ２３１の側鎖、Ｔｈｒ２３２のカルボニル酸素、及びＧｌｕ２３４の側鎖によって形成される。
【０２４４】
ＰｓｐＭａｎ１１８及びＰｓｐＭａｎ１４８は、他のＧＨ５マンナナーゼ配列、例えば１ＷＫＹ＿Ａ及び２ＷＨＬ＿Ａによって例示されるものに対して、２つのモチーフ：（ｉ）位置Ｎ３４Ｄ３５Ｌ３６のＮＤＬモチーフ、及び（ｉｉ）位置２６３〜２７４にまたがる欠失モチーフ（アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている）によってさらに特徴付けられ得る。図２は、ＰｓｐＭａｎ１１８の、１ＷＫＹ＿Ａとの更なる構造比較を表しており、この比較は、ＰｓｐＭａｎ１１８のＮＤＬモチーフ及び欠失モチーフを包含する残基が、互いに近接であることを示す。
【０２４５】
Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）２ＷＨＬ＿Ａマンナナーゼ構造は、マンノトリオシル−酵素複合体として報告されてきた。ＰｓｐＭａｎ１４８の構造を、２ＷＨＬ＿Ａとアラインして、活性部位において結合するマンノトリオースに対する変異部位の位置を研究した。ＰｓｐＭａｎ１４８を比較のために選択した。というのもこれは、ＰｓｐＭａｎ１１８に存在する１０個の置換を全て、そしてＣ末端の９個の付加的置換及び１個の挿入を含むからである。ＰｓｐＭａｎ１１８と同様に、ＰｓｐＭａｎ１４８の構造を２ＷＨＬの構造とアラインすることができ、結果として、１６６０個の共通原子について、０．４０５Åの全体的なｒｍｓ偏差が生じる。ＰｓｐＭａｎ１４８構造及び２ＷＨＬ＿Ａ構造の重ね合せを、図３Ａ〜図３Ｃに表す。
【０２４６】
図３Ａにおいて、２ＷＨＬ＿Ａの主鎖折畳みを淡い灰色で概略的に示し、そしてマンノトリオースを淡い灰色のスティックとして示す。ＰｓｐＭａｎ１４８の主鎖を黒色で示し、１９個の置換アミノ酸の側鎖を黒色のスティック図として示す。ＰｓｐＭａｎ１４８内に挿入されたアミノ酸Ｚ２９８．０１Ｑは、電子密度地図において乱れ（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）、この図に含まれていない。
【０２４７】
ＰｓｐＭａｎ１４８における１９個の置換のうち７個が、基質結合部位に位置する。これらは、Ｓ３０Ｔ、Ｓ５９Ｖ、Ｌ６０Ｑ、Ｋ６３Ｒ、Ｔ２２８Ｖ、Ｓ２５８Ｄ、及びＮ２６１Ｒを含む（アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている）。図３Ｂは、ＰｓｐＭａｎ１４８構造及び２ＷＨＬ＿Ａ構造の重ね合せを示し、基質結合部位の置換を黒色の球として示す。これらの置換のうち、Ｌ６０Ｑは、１ＷＫＹ＿Ａ構造及び２ＷＨＬ＿Ａ構造の双方における相同位置にて見られ得る側鎖を導入している。
【０２４８】
図３Ｂにおいて、２ＷＨＬ＿Ａ構造におけるマンナナーゼに結合したマンノトリオシル部分を、灰色のスティックとして示して、基質結合部位の相対的位置を示す。ＰｓｐＭａｎ１４８における基質結合部位の周りの、且つ近くの、７個の置換（Ｓ３０Ｔ、Ｓ５９Ｖ、Ｌ６０Ｑ、Ｋ６３Ｒ、Ｔ２２８Ｖ、Ｓ２５８Ｄ、及びＮ２６１Ｒ）の位置を、黒色の球として示す。
【０２４９】
図３Ｃに見られるように、ＰｓｐＭａｎ１４８中の残りの１２個の置換は、分子の表面上に分配されている（黒色の球として示す）。これらの１２個の置換のうち、Ｑ１８４Ｌ及びＧ２２５Ｐに特に注目する。Ｑ１８４Ｌ置換は、Ａｒｇ１４９とＧｌｕ１８２との間の塩架橋を保護するロイシン側鎖を導入することによって、タンパク質を安定化させる。Ｇ２２５Ｐ置換は、剛性付与（ｒｉｇｉｄｉｆｙｉｎｇ）プロリン残基を導入し、そこで主鎖カルボニル酸素は、陽イオン（ＰｓｐＭａｎ１４８中のカルシウムイオン）に対するリガンドを形成することによって、結合したカルシウムを潜在的に安定化させて、これにより酵素は、洗剤製剤中に存在するキレート剤に対する感度がより低くなる。
【０２５０】
図４Ａ〜図４Ｂは、ＭＵＳＣＬＥソフトウェアを用いた、ＰｓｐＭａｎ４（配列番号２）、ＰｓｐＭａｎ１４８（配列番号７）、ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３３０）（配列番号１５）、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）、ＷＯ２０１５０２２４２８−００１５（配列番号８）、及び２ＷＨＬ＿Ａ（配列番号９）のマンナナーゼドメインの複数の配列アラインメントを示し、ＰｓｐＭａｎ４中の生産的位置を、下線を引いた太字のフォントで示す。これらのマンナナーゼ間の強い構造的類似性を考慮すると、１ＷＫＹ＿Ａマンナナーゼ又は２ＷＨＬ＿Ａマンナナーゼ等の他の相同ＧＨ５マンナナーゼ中の構造的相同部位にてＰｓｐＭａｎ４の向上を付与する置換を導入することで、これらの分子に、性能及び／又は安定性の類似した向上が付与され得ると予想することができる。
【０２５１】
他の骨格のＰｓｐＭａｎ４骨格において生産的であると同定した置換の効果を評価するために、同じ置換：Ｐ１９Ｅ、Ｔ３８Ｅ、Ｈ６７Ｄ、Ｆ１２９Ｍ、Ｐ１６８Ｓ、Ｑ１８４Ｌ、Ｈ２２５Ｐ、Ｒ２４４Ｌ、Ｐ２５８Ｄ、Ｅ２６１Ｒを、ＢｓｐＭａｎ５マンナナーゼ（配列番号１６）骨格中に、実施例５において以下に記載するようにして導入した。
【０２５２】
実施例５
ＢｓｐＭａｎ５及びその変異体のクローニング及び異種発現
ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）は、ＵＳ６５６６１１４−００２（残基３２〜３４０）（配列番号１７）の変異体であり、ＢｓｐＭａｎ５のアミノ酸配列は、突然変異：Ｐ８５Ｌ、及びＮ末端に挿入されたアミノ酸ＡＧＫを有し、アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている。
【０２５３】
ＢｓｐＭａｎ５（配列番号１６）マンナナーゼをコードする遺伝子を、Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって合成して発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，５５：４０−５２，２００７）中に挿入して、以下を含有する発現ベクターが生じた：ａｐｒＥプロモーター、ａｐｒＥシグナル配列（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において標的タンパク質分泌を導くのに用いられる）、標的タンパク質の分泌を促進するペプチドＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓをコードする、ＡＧＫｐｒｏＡｐｒＥと名付けられたオリゴヌクレオチド、及び注目するマンナナーゼ遺伝子の成熟した領域をコードする合成ヌクレオチド配列。Ｇｅｎｅｒａｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）により、ＢｓｐＭａｎ５親遺伝子の１０個の単一点変異体が生産されて、これらが同じ発現ベクター中にクローニングされた。
【０２５４】
適切な枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株を、各発現プラスミドで形質転換して、形質転換した細胞を、５ｐｐｍクロラムフェニコールを補ったＬｕｒｉａアガープレート上に広げた。各マンナナーゼを生産するために、プラスミドを含有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体を、２５０ｍｌの振盪フラスコ内で、付加的な５ｍＭ  ＣａＣｌ２を補ったＭＯＰＳベースの規定培地中で増殖させた。
【０２５５】
発現プラスミド中に挿入される親ＢｓｐＭａｎ５マンナナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１８として示す。遺伝子は、遺伝子の５’末端に、代替の開始コドン（ＧＴＧ）、及び３つの残基付加（ＡＧＫ）をコードするオリゴヌクレオチドを有する。ｐ２ＪＭプラスミドから発現されるＢｓｐＭａｎ５前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１９として示す。プラスミドから発現される、予測される成熟したタンパク質、ＢｓｐＭａｎ５のアミノ酸配列を、配列番号１６として示す。
【０２５６】
当該技術分野において知られている分子生物学技術を用いて、ＢｓｐＭａｎ５遺伝子上に点突然変異をもたらすことによって、ＢｓｐＭａｎ５変異体が生じた。各変異体の特性を、後の実施例において探究した。ＢｓｐＭａｎ５変異体のリストを、特定の各親に対する置換の一覧と共に、表４に示しており、アミノ酸位置は、配列番号２のアミノ酸配列との対応によって番号を付けている。成熟したＢｓｐＭａｎ５変異体：ＢｓｐＭａｎ６〜１５のアミノ酸配列を、配列番号２０〜２９に示す。
【０２５７】
【表６】
2019504616.tif 000011
【０２５８】
ＢｓｐＭａｎ５及びその変異体の精製
ＢｓｐＭａｎ５〜１５を、清澄化した枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養ブロスから精製した。イオン交換、疎水性相互作用、又はサイジング分画樹脂が挙げられるカラムクロマトグラフィの組合せを用いた。ＬＢＧに対する活性を、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２４８，１９７２）を介して試験することによって、マンナナーゼを含有する画分を同定した。注目する画分をプールして、１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ装置を用いて濃縮して、サンプルを４０％グリセロールに調整して、長期間の保存用に−２０℃にて保存した。
【０２５９】
実施例６
ＢｓｐＭａｎ５及びその変異体の熱安定性
熱安定性を、Ｔ５０値を判定することによって評価した。これは、アッセイの条件下で酵素が活性を５０％保持する温度として定義される。各酵素を、サーモサイクラー内で、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファｐＨ６．０中で、以下の温度にて２時間インキュベートした：４０、４１．７、４４．７、４９．４、５５、５９．７、６３、６５、６７、及び７０℃。ＬＢＧを基質として用いて（５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファｐＨ６．０中、０．４５％ＬＢＧ溶液）、５０℃にて１０分のインキュベーション後に、酵素活性を測定した。放出された還元糖を、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２７３，１９７２）で定量化した。氷上で維持した各酵素サンプルのアリコートを試験して、１００％の活性値を判定した。Ｔ５０温度値を、２時間のインキュベーション後に測定して、残留活性を判定した。データをプロットして、各酵素サンプルについてＴ５０値を判定して、表５に示す。
【０２６０】
【表７】
2019504616.tif 000012
【０２６１】
実施例７
ＢｓｐＭａｎ５及びその変異体の洗浄性能
人為的な汚れからのＬＢＧの放出を測定するミクロスワッチアッセイで、ＢｓｐＭａｎ５〜１５マンナナーゼの洗浄性能を評価した。放出された還元糖を、ＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）アッセイ（Ｌｅｖｅｒ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４７：２７３，１９７２）を用いて定量化した。２つのＣＳ−７３ミクロスワッチ（直径５．５ｃｍ）（ＣＦＴ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ）を、平底ノンバインディング９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに入れた。酵素サンプルを、脱イオン水中に希釈した。表６に、用いた洗剤及び購入場所を一覧にする。表７に、以下が挙げられる、用いた洗剤条件を一覧にする：洗浄アッセイ用の用量、ｐＨ、バッファ系（用いる場合）、硬度（３：１  Ｃａ：Ｍｇ；ｐｐｍ）、温度（℃）、及び洗い時間（分）。２．５ｐｐｍの最終用量に希釈した酵素、及び洗剤溶液を各ウェルに加えて、総容量を１００μｌにした。プレートをシールして、洗剤のそれぞれの洗浄条件下でインキュベートした。洗浄評価時間を終えた後、１０μｌの各反応混合液を、ウェルあたり１００μｌのＰＡＨＢＡＨ溶液を含有するＰＣＲプレートに移した。プレートをシールして、ＰＣＲ機器内で９５℃にて５分間インキュベートした。後に、プレートを２５℃に冷却して、８０μｌの上澄みを、フレッシュな平底ＭＴＰに移して、４０５ｎｍでの吸光度を分光光度計で測定した。４０５ｎｍでの吸光度の増加を、マンナンベースのＣＳ−７３ミクロスワッチに対する洗浄性能の尺度として用いた。結果を、ＰＩ値として表８に示す。これは、変異体の吸光度の、ＢｓｐＭａｎ５親酵素について観察された値に対する比率をとることによって算出した。
【０２６２】
【表８】
2019504616.tif 000013
【０２６３】
【表９】
2019504616.tif 000014
【０２６４】
【表１０】
2019504616.tif 000015
【図１】
2019504616.tif 000016
【図２】
2019504616.tif 000017
【図３Ａ】
2019504616.tif 000018
【図３Ｂ】
2019504616.tif 000019
【図３Ｃ】
2019504616.tif 000020
【図４Ａ】
2019504616.tif 000021
【図４Ｂ】
2019504616.tif 000022
【配列表】
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【国際調査報告】
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