(57)【要約】  全溶液プロセスによる電極作製方法を提供する。この電極作製方法は、ｉ）導電性膜を堆積させるために、収縮性ポリマー基板を準備して活性化する工程；ｉｉ）前記基板に修飾を施し、リンカーを導入する工程；ｉｉｉ）前記基板のリンカーに導電性材料の粒子を固定して、前記基板上に導電性膜を形成する工程；ならびにｖｉ）修飾した前記基板を、前記ポリマー基板を収縮させて前記導電性膜にマイクロテクスチャ構造および／またはナノテクスチャ構造を形成することができる温度まで加熱する工程を含む。この方法は、ポリマー基板と、該基板に結合した、テクスチャ構造を有する導電性膜とを含む新規のマルチスケール電極デバイスを製造できるという点で有利である。
2019515281.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
収縮性ポリマー基板と、
該基板に結合した、テクスチャ構造を有する導電性膜と
を含むマルチスケール電極デバイス。
【請求項２】
前記ポリマー基板が、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロピレン、ポリエチレン（例えば、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、メタロセンＬＬＤＰＥ（ｍＬＬＤＰＥ）、超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ）、メタロセンポリエチレン（ｍＰＥ）、シングルサイト系メタロセン触媒（ＳＳＣ）を用いて重合したＬＬＤＰＥなど）、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、エチレンメタクリレート（ＥＭＡ）およびこれらの組み合わせ、コポリマーまたはターポリマーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記導電性膜が、銅、チタン、酸化チタン、窒化チタン、タングステン、アルミニウム、クロム、導電性ポリマー、貴金属または絶縁体を含むことを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記導電性ポリマーが、ポリピロール、ポリアニリンおよびポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記貴金属が、金、銀および白金からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３に記載のデバイス。
【請求項６】
前記絶縁体が、酸化物および窒化物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のデバイス。
【請求項７】
前記導電性膜が、リンカーによって前記基板に結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
前記リンカーが、シロキサンリンカー、アミンリンカー、カルボキシルリンカーおよびチオールリンカーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
イオン、血液ガス、生体分子または低分子の検出に適したバイオ認識層を設けることにより、前記導電性膜に機能性が付与されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
検出しようとする標的物質と結合または相互作用するバイオ認識層を設けることにより機能性が付与されており、該結合または相互作用により電気化学的特性が変化する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記バイオ認識層が、反応性基、核酸、アプタマー、抗体、ＤＮＡザイムおよび分子鋳型ポリマーから選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記導電性膜が、マクロ構造およびナノ構造を含むことを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記基板がポリスチレンであり、前記リンカーがシロキサンリンカーであり、前記導電性粒子が金粒子であることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
ｉ）導電性膜を堆積させるために、収縮性ポリマー基板を準備して活性化する工程；
ｉｉ）前記基板に修飾を施し、リンカーを導入する工程；
ｉｉｉ）前記基板のリンカーに導電性材料の粒子を固定して、前記基板上に導電性膜を形成する工程；ならびに
ｖｉ）修飾した前記基板を、前記ポリマー基板を収縮させて前記導電性膜にマイクロテクスチャ構造および／またはナノテクスチャ構造を形成することができる温度まで加熱する工程
を含む全溶液プロセスによる電極作製方法。
【請求項１５】
前記ポリマー基板が、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロピレン、ポリエチレン（例えば、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、メタロセンＬＬＤＰＥ（ｍＬＬＤＰＥ）、超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ）、メタロセンポリエチレン（ｍＰＥ）、シングルサイト系メタロセン触媒（ＳＳＣ）を用いて重合したＬＬＤＰＥなど）、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、エチレンメタクリレート（ＥＭＡ）およびこれらの組み合わせ、コポリマーまたはターポリマーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記導電性膜が、銅、チタン、酸化チタン、窒化チタン、タングステン、アルミニウム、クロム、導電性ポリマー、貴金属または絶縁体を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーが、シロキサンリンカー、アミンリンカー、カルボキシルリンカーおよびチオールリンカーからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記導電性膜を、印刷、スプレーコーティング、ドロップキャスティング、スピンコーティング、電着、無電解めっきおよびレイヤーバイレイヤー累積により、前記基板上に設けることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記導電性膜を前記基板上に設けるために、
前記基板のリンカーに導電性材料の粒子を固定してシード層を形成し、
次いでリンカーと導電性粒子を交互に加えることによってさらなる層を追加する、または
修飾されてシード層を有する前記基板を、前記導電性材料の粒子を含むめっき液に浸漬し、前記基板上に導電性膜が形成されるよう十分な時間インキュベートすることによってさらなる層を追加する
ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記基板がポリスチレンであり、前記リンカーがシロキサンリンカーであり、前記導電性粒子が金粒子であり、前記導電性膜が無電解めっきまたはレイヤーバイレイヤー累積により形成されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として電極に関し、より詳細には電気化学的検出において用いられる電極および該電極の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
診療現場で診断に用いられるラボオンチップ（ＬＯＣ）装置は、ここ２０年で研究が大幅に進み、商業的な関心が高まっている。一般に大量の試薬を用いて行われる手動かつ労働集約型の処理・分析作業を、集積型かつマイクロスケールのＬＯＣ装置へと小型化できれば、従来の診断システムに代わる極めて魅力的で安価なものになる。これまでに様々なＬＯＣシステムが開発されているが、コンセプトから量産可能なＬＯＣ装置という形へと導くには費用も時間もかかるため、ＬＯＣシステムの商業化は遅れており、いまだ限局的である。これまで多くのＬＯＣ装置がシリコン基板およびガラス基板を用いて作製されてきたが、近年、ポリマーの利用に大きな関心が寄せられている。ポリマーの利点としては、低コストであること、安価で拡張可能なロール・ツー・ロール加工に適合していること、および新しいフォームファクタの装置を作製できる可能性を有していることが挙げられる。そのため、ポリマーを用いたＬＯＣ装置の研究が幅広く行われており、安価で使い捨てのバイオセンシングプラットフォームの研究所から市場への移行の促進が図られている。
【０００３】
電極は、ＬＯＣ装置において、電気化学的／電気的な検知、生物試料の調製や取扱、流体の流れを発生させるための能動的方策、および小型センサーと外部回路との接続に関わる重要な部分である。ポリマー基板上に導電性電極を堆積するために、マイクロエレクトロニクス産業から借用した蒸発またはスパッタリングなどの真空蒸着技術を用いることができる。このような方法により、堆積膜の厚さを精密に制御することが可能であるが、当該方法は金属蒸着に選択的でなく、さらなるパターン形成工程と組み合わせる必要がある。写真平版術およびリフトオフ法でよく用いられる基板マスキングは、電極に、機能的装置での使用に適した特定の形状のパターンを施す上で必須である。したがって、上記の方法では、複数の加工工程と高価な真空機器が必要となるため、発想を機能的装置として形にするためには、工程が複雑で、コストも高く、多大な時間がかかる。従来の真空薄膜蒸着および写真平版術によるパターン形成の限界を克服するために、別の卓上型溶液プロセス技術が研究されている。
【０００４】
卓上で行うポリマー基板上への電極作製は、密着焼付け、インクジェット印刷、スクリーン印刷などの様々な直接描画方法により行われてきた。この種の方法は、リザーバーの導電性インクを空間的に制御しながら基板上へ堆積させることに基づく方法である。直接描画印刷方法は、スピーディかつ安価に行えるが、高温を必要とする焼結のような印刷後工程を行わないことには、得られた電極に導電率の問題が生じる。しかし、そのような工程は、概して多くのポリマー基板に不適である。さらに、直接描画法では、堆積された電極の厚さを制御することや、高いアスペクト比構造を形成することは難しい。
【０００５】
無電解めっき法は、様々な導電性または非導電性の基板上に高品質な金属膜を作製する簡便で安価な溶液ベースの方法へと進化している。この溶液ベースの方法には、金属塩が、活性化された基板上で選択的に固体の金属へと化学的に還元される自己触媒性酸化還元工程が含まれる。この方法で作製された金属膜は、均一で連続している。無電解めっき法では、高品質な導電性膜の作製は可能であるが、機能的なマイクロ／ナノ構造や有効高さ（＞１μｍ）を有する電極は得られない。
【０００６】
上記に鑑み、既存の電極の１以上の欠点を克服した新規の電極、例えば、ＬＯＣ装置において有用な新規の電極を提供することができれば望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
今般、ポリマー基板上に新規のナノテクスチャ構造および／またはマイクロテクスチャ構造を有する電極を作製するための、平版印刷を使用しない全溶液プロセスによる作製方法を開発することに成功した。この方法で得られる電極は、感度のよい電気化学的検出が可能であり、ラピッドプロトタイピングに適しており、また、工業生産用のスケールアップにも適用可能である。
【０００８】
したがって、本発明の一態様において、マルチスケール電極デバイスが提供される。この電極デバイスは、収縮性ポリマー基板と、該基板に結合した、テクスチャ構造を有する導電性膜とを含む。
【０００９】
本発明の別の態様において、全溶液プロセスによる電極作製方法が提供される。この作製方法は、
ｉ）導電性膜を堆積させるために、収縮性ポリマー基板を準備して活性化する工程；
ｉｉ）前記基板に修飾を施し、リンカーを導入する工程；
ｉｉｉ）前記基板のリンカーに導電性材料の粒子を固定して、前記基板上に導電性膜を形成する工程；ならびに
ｖｉ）修飾した前記基板を、前記ポリマー基板を収縮させて前記導電性膜にマイクロテクスチャ構造および／またはナノテクスチャ構造を形成することができる温度まで加熱する工程
を含む。
【００１０】
本発明におけるこれらの態様およびその他の態様は、下記の詳細な説明の項目において以下の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（ａ）は、全溶液プロセスによるひだ状電極の作製工程を示した図である。ｉ）予め応力を印加した所望のＰＳ基板を洗浄し切断する工程、ｉｉ）空気プラズマで表面を活性化する工程、ｉｉｉ）前記基板をアミノシラン層で修飾し、所望の電極形状を作成するためのビニール製パターンフィルムで前記基板を被覆する工程、ｉｖ）金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）の固定化を１６時間行うことによりシード層を作製する工程、ｖ）無電解金（Ａｕ）めっきを行う工程、ｖｉ）マスクを除去する工程、ｖｉｉ）得られたデバイスを加熱することにより、ひだ状電極構造を作成する工程。（ｂ）は、電極断面のＴＥＭ画像であり、１次および２次のひだ形成を、ｉ）高倍率およびｉｉ）低倍率で示すものである。
【００１２】
【図２】電極の構造および特性に対する無電解めっき時間の効果を示した図である。ａ）経時的な電極厚さの推定値；ｂ）電極の粗さ（Ｒａ）および凸凹の高低差（ＰＶ）の測定値；ｃ）収縮前と収縮後の電極デバイスのシート抵抗値；ｄ）電気化学的に測定した、収縮前と収縮後の電極デバイスの表面積。１分間めっきを施したデバイスの「収縮前」の電気活性表面積は、導電率が不十分であったため、計測不能であった。
【００１３】
【図３】全溶液プロセスによるひだ状電極およびナノ多孔性ひだ状電極を用いて実施した非酵素系のグルコース検知を示した図である。（ａ）作製した金電極の模式図；（ｂ）０．１Ｍ  ＮａＯＨ中、グルコースの存在下（実線）および非存在下（点線）で記録した、めっき時間が１分のナノ多孔性ひだ状電極のサイクリックボルタモグラム。矢印は走査方向を示す；種々のグルコース濃度（０ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭおよび２０ｍＭ）における、（ｃ）めっき時間が１分のひだ状デバイス、（ｄ）めっき時間が２０分のひだ状デバイス、および（ｅ）めっき時間が２０分の平面デバイスのサイクリックボルタンメトリー；（ｆ）サイクリックボルタモグラムの０．２〜０．３Ｖの範囲で観測された最大ピークから求めた、めっき時間が１分のひだ状デバイス（赤色）、めっき時間が２０分のひだ状デバイス（青色）、およびめっき時間が２０分の平面デバイス（黒色）の感度。本実験に使用した電極の幾何学的表面積はすべて同じである；（ｇ）（ｆ）で示したデータを幾何学的表面積で標準化したもの（上段）。ここで開発した３種類の電極の表面積および感度の概要（下段）。ボルタモグラムはすべてＡｇ／ＡｇＣｌを基準にしてプロットされたものである。エラーバーはいずれも１標準偏差を示す。
【００１４】
【図４】（ａ）ひだ状Ａｕ  ＮＰ層作製方法の模式図である。この作製方法は、（ｉ）ＰＳを空気プラズマで処理する工程、（ｉｉ）活性化ＰＳを、ＡＰＴＥＳでシラン化する工程、（ｉｉｉ）Ａｕ  ＮＰをシラン化ＰＳ上に固定する工程、ならびに（ｉｖ）得られたデバイスを、ポリスチレンのガラス転移点（Ｔｇ）を超える温度に加熱して、収縮およびひだ形成を誘導する工程を含む。（ｂ）一軸方向のひだ形成（上段）および二軸方向のひだ形成（下段）を示す模式図であり、矢印は収縮過程で生じる圧縮力を示す。
【００１５】
【図５】ひだ状ナノ粒子膜の可変性を示した図である。ａ）粒径の異なるＡｕ  ＮＰを用いて形成した一軸方向ひだおよび二軸方向ひだのＳＥＭ画像（左側のカラム）および断面のＴＥＭ画像（右側のカラム）。電子顕微鏡画像の白色で表示されたスケールバーは５００ｎｍである；ｂ）層数の異なる粒径１２ｎｍのＡｕ  ＮＰ層に形成した一軸方向ひだおよび二軸方向ひだのＳＥＭ画像（左側のカラム）および断面のＴＥＭ画像（右側のカラム）。電子顕微鏡画像の白色で表示されたスケールバーは５００ｎｍである；ｃ）一軸方向および二軸方向にひだを形成した、粒径約１２ｎｍのＡｕ  ＮＰ単層を高倍率で撮影した断面のＴＥＭ画像；ｄ）各種膜の収縮前の有効膜厚を示した表；ｅ）粒径の異なるＡｕ  ＮＰ、層数の異なる粒径１２ｎｍのＡｕ  ＮＰ層、および連続したＡｕスパッタ膜のそれぞれの有効Ａｕ膜厚に対する一軸方向ひだの波長。エラーバーは標準偏差を示す。傾向線は近似直線であり、Ｒ２は＞０．９５である。
【００１６】
【図６】修飾によりｓｓＤＮＡプローブが導入された平面デバイス、ひだ状デバイスおよびナノ多孔性ひだ状デバイスを用いた、ＤＮＡハイブリダイゼーションの検出を示した図である。（ａ）相補的ターゲット（左側）および非相補的ターゲット（右側）でインキュベートする前（灰色）とインキュベートした後（黒色）の、Ａｇ／ＡｇＣｌを基準とする微分パルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）の走査結果；（ｂ）めっき時間が２分、８分および２０分のひだ状デバイス、ならびにめっき時間が２０分の平面デバイスを用いた微分パルスボルタンメトリーにより得られた、ハイブリダイゼーションに起因するピーク電流の変化率（黒色）のグラフ。非相補的ターゲットのシグナル変化率を灰色で示す；（ｃ）インキュベーション時間を変化させて蛍光性アッセイにより測定した、平面デバイス（中抜き四角）およびめっき時間が２分のナノ多孔性ひだ状デバイス（塗りつぶし円）のハイブリダイゼーション効率を示すドットプロット。
【００１７】
【図７】ＢＤＮＦ検知デバイスの作製過程を示す模式図である。チオール結合により、第１のリンカーであるシスタミンを固定する。次いで、反応性の第２のリンカーであるグルタルアルデヒドを固定して、アルデヒド基の自己組織化単層を作製する。抗ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、第２のリンカーを介して固定し、バイオ認識層を作製する。未反応のアルデヒド基を、５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングする。標的分析物であるＢＤＮＦタンパク質が、インキュベーションにより、モノクローナル抗体に結合する。［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−の酸化還元レポーターシステムを用いて、ＢＤＮＦタンパク質を電気化学的に検出する。微分パルスボルタンメトリーにより、ＢＤＮＦと抗体の結合が接触面の電子伝達反応を阻害し、電流シグナルの低下が起こることが示される。
【００１８】
【図８】脳由来神経栄養因子の検出および定量における、多孔性ひだ状電極の適用可能性を示した図である。ａ）ＰＢＳで調製した１ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦを用いた場合の平面免疫センサー（灰色のバー）および多孔性免疫センサー（暗色のバー）の感度を比較したグラフ、ｂ）ＰＢＳで調製した様々な濃度のＢＤＮＦを含む２．５ｍＭの［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−電気化学的溶液中で標的分析物と共にインキュベーションして測定したシグナル変化率のグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
収縮性ポリマー基板と、該基板に結合した、テクスチャ構造を有する導電性膜とを含むマルチスケール電極デバイスが提供される。
【００２０】
本発明の電極デバイスに組み込まれる好適なポリマー基板は、収縮性ポリマー基板であり、例えば、収縮時に長さおよび／または幅が少なくとも約１０％減少する任意のポリマー、好ましくは、長さおよび／または幅が少なくとも約２０％、３０％、４０％または５０％以上減少する任意のポリマーが挙げられる。好適な収縮性ポリマーとしては、さらに、収縮時に厚さが少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約５０〜１００％またはそれ以上増大するものが挙げられる。一実施形態において、前記ポリマー基板は、加熱により収縮する。前記ポリマー基板の収縮に必要な熱量がポリマーの種類によって異なることは、当業者であれば十分に理解できるであろう。一実施形態において、前記ポリマーを、そのガラス転移点を超える温度まで加熱して収縮させる。好適なポリマーとしては、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロピレン、ポリエチレン（例えば、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、直鎖状低密度ポリエチレン（ＬＬＤＰＥ）、メタロセンＬＬＤＰＥ（ｍＬＬＤＰＥ）、超低密度ポリエチレン（ＶＬＤＰＥ）、メタロセンポリエチレン（ｍＰＥ）、シングルサイト系メタロセン触媒（ＳＳＣ）を用いて重合したＬＬＤＰＥなど）、エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、エチレンメタクリレート（ＥＭＡ）およびこれらの組み合わせ、コポリマーまたはターポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。選択したポリマーに予め応力を印加して、その特性を向上させてもよい。
【００２１】
導電性膜は、リンカーを介して前記基板に結合される。様々なリンカーを用いることが可能であり、以下に限定されないが、アミノシラン、グリシドキシシランまたはメルカプトシランを用いて、シラン化により結合させるシロキサンリンカー；アミンリンカー；カルボキシルリンカー；およびチオールリンカーを用いることができる。
【００２２】
前記導電性膜は、銅、チタン、酸化チタン、窒化チタン、タングステン、アルミニウム、クロム、導電性ポリマー（ポリピロール、ポリアニリン、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）などが挙げられるが、これらに限定されない）、貴金属（金、銀、白金など）、絶縁体（酸化物、窒化物など）を含んでいてもよい。金（Ａｕ）は、高い導電性を有すること、非腐食性／化学的不活性であること、また、例えば、末端部にチオールを有するバイオ認識分子により機能性が付与されることなどから、バイオセンシングデバイスに使用される電極に含まれる金属として特に好ましい。
【００２３】
導電性膜を基板に結合させた後、本明細書でより詳細に説明されているように、該基板を収縮させることによりテクスチャ構造を形成し、該導電性膜にマイクロ構造および／またはナノ構造を付与する。本明細書において、「テクスチャ」という用語は、導電性膜に形成される細孔、ひだ、たわみ、折り目、凸凹面などを意味する。テクスチャ構造は、マイクロサイズ（例えば、１〜１０００μｍの範囲）であってもよく、ナノサイズ（例えば、１〜１０００ｎｍの範囲）であってもよい。
【００２４】
本発明の電極の導電性膜は、様々な物質の検出、例えば、以下に限定されないが、イオン（Ｋ＋、Ｃａ２＋など）、血液ガス（酸素、ＣＯ２など）、生体分子（例えば、核酸、タンパク質、グルコース）および低分子などの検出に適した機能性が付与されていてもよい。例えば、検出しようとする標的物質と結合または相互作用するバイオ認識層を設けることにより、前記導電性膜に機能性が付与されていてもよい。このような結合またはその他の相互作用により、電極または検出器の電気化学的特性が変化する。バイオ認識層としては、反応性基、核酸、アプタマー、抗体、ＤＮＡザイム、分子鋳型ポリマーなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明により得られたテクスチャ構造を有する電極は、対応する平面電極と比較して、電気化学的感度が向上していることが確認された。本発明のテクスチャ構造を有する電極の感度は、対応する平面電極の感度と比較すると、約５０％高く、いくつかの実施形態においては、少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％または５００％以上高い。「平面電極」という用語は、本発明の一態様における電極に含まれるマクロテクスチャ構造およびナノテクスチャ構造を含まない電極を意味する。電極の感度は、テクスチャ構造を有する電極の具体的な特徴、例えば、使用する基板ポリマー、使用する導電層、導電層の堆積時間、収縮条件、表面積および導電層の多孔率などにより異なることは、当業者であれば十分に理解できるであろう。
【００２６】
本発明の電極は、多工程プロセスで作製される。基板上に導電層を堆積させるために、様々な方法を用いることができる。例えば、導電層の堆積に、印刷、スプレーコーティング、ドロップキャスティング、スピンコーティング、スパッタリングなどの真空金属蒸着法、電着、無電解めっきおよび／またはレイヤーバイレイヤー自己組織化累積を用いてもよい。
【００２７】
一実施形態において、全溶液プロセスによる電極作製方法が提供される。この方法は、ｉ）導電性膜を堆積させるために、収縮性ポリマー基板を準備して活性化する工程；ｉｉ）前記基板に修飾を施し、リンカーを導入する工程；ｉｉｉ）前記基板のリンカーに導電性材料の粒子を固定して、シード層を形成する工程；ｉｖ）工程ｉｉｉ）を繰り返して、前記基板上に導電性膜を形成する（レイヤーバイレイヤー累積）工程、または工程ｉｉｉ）で得られた修飾基板を、前記導電性材料の粒子を含むめっき液中でインキュベートして、前記基板上に導電性膜を形成する（無電解めっき）工程、ならびにｖｉ）修飾した前記基板を、前記ポリマー基板を収縮させて前記導電性膜にマイクロテクスチャ構造および／またはナノテクスチャ構造を形成することができる温度まで加熱する工程を含む。
【００２８】
まず、導電性膜を堆積させるために、収縮性ポリマー基板を準備するが、この工程には、洗浄および活性化が含まれる。基板の洗浄には、エタノールおよび脱イオン化水を用いてもよい。次いで、基板の表面を、後に修飾が施されるように活性化する。基板の活性化は、空気プラズマ処理で基板表面を活性化および修飾することにより行うことができる。これにより、後にリンカー要素が結合できるような反応性基（ヒドロキシル基など）が導入される。
【００２９】
次いで、基板に修飾を施し、導電性膜が結合可能なリンカー要素を導入してもよい。例えば、シロキサン基を導入するために、基板を、（３−アミノプロピル）−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン（ＡＰＤＥＭＳ）、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）および（３−アミノプロピル）−トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）などのアミノシラン；（３−グリシドキシプロピル）−ジメチル−エトキシシラン（ＧＰＭＥＳ）などのグリシドキシシラン；または（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）および（３−メルカプトプロピル）−メチル−ジメトキシシラン（ＭＰＤＭＳ）などのメルカプトシランを含む溶液と反応させることによってシラン化してもよい。また、その他のリンカーとして、アミノリンカー、カルボキシルリンカーまたはチオールリンカーなどを、シリカナノ粒子、金ナノ粒子などの金属ナノ粒子およびグラフェンなどの中間層を介して基板上に導入してもよい。
【００３０】
次いで、得られた修飾基板上に、選択した導電性材料の粒子を固定する。導電性材料の粒子の固定は、基板を導電性材料の粒子（例えば、金粒子）を含む溶液中でインキュベートして、基板表面のリンカーに該粒子を結合させることにより行うことができる。導電性粒子のシード層を形成した後、その上に導電性膜を形成するが、導電性膜の形成は、基板を該導電性材料の粒子で繰り返し処理するレイヤーバイレイヤー累積によって行ってもよく、また選択した粒子を含むめっき液中で修飾基板をインキュベートすること（例えば、無電解めっき）によって行ってもよい。また、シード層は、インクジェット印刷、密着焼付けなどの直接堆積により、または類似の方法により基板上に設けてもよい。導電層もまた、印刷、スプレーコーティング、ドロップキャスティング、スピンコーティングおよび電着によって前記ポリマー上に堆積させてもよい。
【００３１】
めっき液中でインキュベートを行う前に、得られる電極が特定の所望の形状を有するように基板を処理してもよい。例えば、導電層の特定の形状を規定するパターンを有するマスクまたはステンシルを基板に取り外し可能に固定してもよい。マスク（例えば、ビニールマスク）にパターンを形成する方法としては、クラフト切断機、打抜き、回転式打抜き、写真平版術、ジューログラフィーまたはその他の除去加工法が挙げられる。次いで、マスクの切り抜きパターンに合わせて、めっきまたは堆積により、シード層および／または導電層を基板上に形成する。導電層を形成した後、マスクを基板から、例えば、適切な方法で、例えば、ピンセットを用いて除去する。
【００３２】
電極にテクスチャ構造を形成するために、修飾した基板を、ポリマー基板が収縮する条件に晒す。一実施形態において、修飾した基板を、ポリマー基板を収縮させるには十分であるが導電性膜は収縮させない温度、例えば、該基板のガラス転移点を超える温度に加熱する。ポリマー基板が収縮すると、その水平方向の寸法が縮小し（長さおよび／または幅が縮小）、平面電極がテクスチャ構造を有する電極へと変形する。すなわち、電極の導電性膜（これは収縮しない）に、ひだ、たわみ、折り目などが生じ、その結果、導電性膜にマイクロテクスチャ構造および／またはナノテクスチャ構造が形成される。このようなテクスチャ構造を有することから、得られた電極を、マルチスケール電極、マルチレングススケール電極、ナノ構造電極、マイクロ構造電極、ひだ状電極、折り目状電極、凸凹状電極、またはその他の類似の形態を有する電極と称する場合がある。また電極は、上記の堆積法を実施した結果として、また電気溶解、脱合金化もしくは類似の方法などの除去加工法によって、多孔性構造を有していてもよい。
【００３３】
上述した通り、ナノ粒子の自己組織化、無電解めっきおよびジューログラフィーにより、ポリマー基板上に微小金属電極のパターン形成を施すことが可能である。この全溶液プロセスによる電極の堆積とパターン形成技術とを組み合わせることにより、形状記憶ポリマー基板または収縮性ポリマー基板を用いて、（１）微小金属電極を小型化すること、（２）電極構造、表面積、およびシート抵抗などの性状において制御可能なナノ／マイクロ構造化を誘導することにより、電極の特性を調節または調整すること、ならびに（３）電極コンダクタンスを向上させることが初めて可能になった。さらに、この電極を、例えば、非酵素系のグルコース検出、核酸検出、タンパク質検出などの生体分子検出方法に適用する場合は、このような電極構造の可変性を電極機能の可変性に変換することも可能である。
【００３４】
上記の作製方法を、直接的バイオセンシング用途およびメディエータを介するバイオセンシング用途とさらに融合させて、診療現場で診断に用いられるバイオセンサーを開発してもよい。
【００３５】
このような融合により、非酵素系のグルコースバイオセンシングおよび親和性を利用したバイオセンシングなどの高感度な電気化学的検出が可能な、テクスチャ構造を有するナノ構造微小金属電極をポリマー基板上に作製するための、平版印刷を用いない全溶液プロセスによる作製方法が開発された。ジューログラフィー、ナノ粒子自己組織化、無電解めっきおよび熱誘導ひだ形成を組み合わせることにより、マルチスケール微小電極を、卓上でスピーディかつ安価に作製することができる。マクロスケールのパターン形成は、導電性膜の様々な形状／パターンを規定する粘着マスクをポリマー基板上に固定して行われる。導電性薄膜層のマイクロスケールのパターン形成は、加熱によりポリマー基板を収縮させることにより誘導される。得られる電極の最小形体サイズ、多孔率、トポグラフィー（表面の立体的形状）、電気活性表面積およびシート抵抗値は、ナノ粒子自己組織化、無電解めっきパラメータおよびひだ形成／収縮方法の調整により制御可能であることが分かった。得られる電極を構造的に変化させて、電気的に、また電気化学的に解析したところ、電極の機能の差として現れることが確認された。
【００３６】
電極接触面の３次元マイクロおよびナノ構造化により、平面状のバルク電極との比較において、電極接触面の電気的挙動、磁気的挙動、光学的挙動、菌体溶解挙動および／または電気化学的挙動の改善、ならびに活性表面積の増加および感度の上昇が認められ、ＬＯＣデバイスの性能が向上することが示された。薄膜面内の圧縮によるひだ形成は、平面電極にマルチスケール構造を付与するとともに該電極を小型化できる、スピーディかつ安価な方法である。また、得られるひだ状電極のサイズおよび構造を容易に予測し、様々な機能的な目的に合わせて調整することができる。無電解めっき膜と薄膜ひだ形成とを組み合わせることで、物理的蒸着法の限界を克服することが初めて可能となり、例えば、安価で真空不要であることに加えて、ポリマー基板に望ましくない変形が生じないよう低温で実施できる全溶液方法の提供が可能になる。したがって、この方法により、（１）調整可能な３次元電極の作製、（２）電極の導電率の向上、および（３）デバイスの小型化による、電極の実現可能な最小形体サイズの縮小をスピーディに行うことができる。
【実施例】
【００３７】
以下の具体的な実施例において、本発明の実施形態について説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００３８】
実施例１：テクスチャ構造を有する電極を作製するための全溶液系プロセス
固相のデバイスと溶液相のサンプルとの界面で作動する電極に課せられる構造的な要求に応えるために、スパッタ薄膜に３次元マイクロ／ナノ構造を作成する際に従来専ら適用されてきたポリマー誘導薄膜ひだ形成方法を、全溶液プロセスによる膜に適用することができるかどうかを調べた。この目的のために、図１に概略的に示すような作製方法を開発した。
【００３９】
この方法では、予め応力を印加した清潔なポリスチレン（ＰＳ）基板を、空気プラズマで処理する（１８ＷのＲＦ電力で１分）ことにより、次に行うシラン化の準備として、基板表面を活性化し、ヒドロキシル（ＯＨ）基（空気プラズマ処理で生じる）で修飾する。次いで、活性化基板を、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の１０％溶液中でインキュベートする。ＡＰＴＥＳにより、アミンと金との化学作用を利用してポリスチレン基板に金ナノ粒子を結合させるための分子リンカー（例えば、シロキサンリンカー）が形成される。次いで、粘着性ビニール製シャドーマスク（ビニールはＦＤＣ  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ｆｉｌｍｓ社製であり、Ｇｒａｐｈｔｅｃ  Ｒｏｂｏ  Ｐｒｏ  ＣＥ５０００−４０−ＣＲＰ  ビニール切断機（Ｇｒａｐｈｔｅｃ社）を用いて切削したもの）にジューログラフィーでパターンを施し、所望の電極形状を有する状態で、基板に結合させる。次いで、マスクで被覆したＰＳ基板を、金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）溶液（クエン酸三ナトリウム水溶液中に分散した金ナノ粒子の１ｍＭコロイド溶液）中でインキュベートすることにより、基板上に金ナノ粒子からなる薄い均一なシード層を形成する。
【００４０】
次いで、電極構造の可変性に変換できる調整可能な高さを有する高導電性電極を得るために、シアニド非含有の効率的かつ環境にやさしいめっき液を用いて、シード層に無電解めっきを施し、金電極を作製する。パターン形成されたシード層を有する修飾ＰＳ基板を、四塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）とを含むめっき液に浸漬するが、まず、Ａｕ  ＮＰで被覆したＰＳ基板を、５ｍＬの０．１％ＨＡｕＣｌ４溶液中に浸漬し、室温にて２５０ｒｐｍに設定したシェーカー上で振盪する。次いで、この溶液に２５０μＬの３０％Ｈ２Ｏ２を加えて、無電解金めっき反応を進行させる。Ｈ２Ｏ２は、熱力学的に還元剤として作用するため、前駆体であるＨＡｕＣｌ４のＡｕ３＋イオンを還元する（式１）。
２ＡｕＣｌ４−＋３Ｈ２Ｏ２→２Ａｕ＋３Ｏ２＋８Ｃｌ−＋６Ｈ＋  ＋０．３０７Ｖ（式１）
【００４１】
ＰＳ上の単層に含まれるＡｕ  ＮＰは、連続的なＡｕ層の成長および形成のための核生成サイトとして機能し、バルク溶液中の金の還元を最小限に抑える。連続したＡｕ層が形成された後、ビニール製シャドーマスクをピンセットを用いて手作業で除去し、電極形状を露出させる。次いで、基板を、ＰＳのガラス転移点を超える１６０℃に設定したオーブンで３分間加熱することにより熱収縮させる。予め応力を印加したＰＳをガラス転移点を超えた温度で加熱することにより、デバイスの長さおよび幅が６０％以上減少し、厚さは６００％以上増大する。ポリマー基板が収縮すると、Ａｕ膜に圧縮力が加わり、ＰＳ基板上のＡｕ膜にたわみおよびひだが生じる。
【００４２】
このポリマー誘導ひだ形成が全溶液プロセスによる薄膜で観察されるかどうかを確認するために、作製プロセスの各工程で得られたデバイスのマイクロスケールおよびナノスケールのトポグラフィー、ならびにマイクロスケールおよびナノスケールの構造を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を用いて解析した。
【００４３】
もともと平滑なＰＳ表面を、まずＡＰＴＥＳ層で被覆し、ここにＡｕ  ＮＰを結合させる。Ａｕ  ＮＰがＰＳ基板上に均一な層を形成していることは、対応するＳＥＭ画像およびＡＦＭ測定により確認することができる。次の無電解めっきにより、基板上にＡｕの平滑な層が形成される。
【００４４】
予め応力を印加したＰＳ基板を加熱すると、堆積したＡｕ薄膜とＰＳ基板との剛性の差により、Ａｕ層にひだが生じ、１次および２次のひだが形成され、マイクロメートルスケールでの高さの変化が生じる。ひだ状電極断面の高倍率および低倍率のＴＥＭ画像（図１（ｂ））は、Ａｕ層とＰＳとの共形境界面と、この境界面の１次の（小さい）ひだ形成（ｉ）および２次の（大きな）ひだ形成（ｉｉ）とを示している。収縮前のＡｕ電極は、光沢のある平滑なめっき膜を有し、ＰＳ基板全体にわたって一様であったことに留意されたい。収縮後のＡｕ電極は、収縮前のＡｕ電極と同じ電極レイアウトであるが、電極をひだ状構造にすることにより、Ａｕ電極は小型化したように見え、暗い金色を呈し、光沢も失われている。このひだ形成現象モデルでは、ひだの波長は、薄膜の厚さと、基板の弾性率に対する薄膜の弾性率の比率の立方根とに対して直線的に増加する。
【００４５】
ポリマー基板の収縮とそれにより得られたひだ状のＡｕ層は、収縮前の平面デバイスと比較して、いくつかの物理的な利点を有する。例えば、電極の水平方向の寸法の縮小、電極の構造形成、電極と基板との接着性の向上などが挙げられる。水平方向の寸法の縮小により、従来より小型の電極形状および従来より小型の装置の開発が可能になる。実際、この作製方法により、ラインアンドスペースが７５μｍの配列だけでなく、１５０μｍの円形体も作製することができた。卓上クラフト切断機を使用したビニール製マスクで作製可能な最小形体サイズは、これが限界であった。また、電極と基板との接着性の強さは、電圧、高圧または液浸に晒される電極デバイスを作製する際に重要である。この収縮プロセスの前後でデバイスを用いてセロハンテープ接着試験を行ったところ、収縮前はＡｕ層の一部が剥離したが、収縮・ひだ形成プロセス後のＡｕ層は剥離できなかった。電極断面のＴＥＭ画像に示されるように、この接着性の向上は、ＰＳひだ内にＡｕ膜が効果的に固定されることによるものと考えられる。
【００４６】
電極構造の可変性は、特定の機能的な要求に応えるバイオセンシングデバイスの作製にとって重要である。電極の最小形体サイズ、多孔率、トポグラフィーおよび表面積の可変性を実現するために、電極構造に対する無電解めっき時間の効果を調べた。本発明の材料を実用的なデバイスに組み込む上で、高導電性の実現は重要であるので、電極の導電率に対するめっき時間の効果も確認した。電極構造は、ＳＥＭ、ＡＦＭ、白色干渉法およびステップ高さ測定により評価した。電気的特性は、四探針法により評価した。表面積は、電気化学的手法により評価した。収縮後のＡｕ膜のＳＥＭ画像から、ひだサイズおよび形態は、無電解めっき時間に強く依存することが示唆された。作製したひだ状膜を観察したところ、始めは多孔性を有していたが、８〜１０分後に連続した層が形成されるまで、細孔の密度は減少した。このような細孔の存在は、収縮前にポリスチレン上で成長する金皮膜が、無電解めっき時間が短い段階では不連続であることに関係していると考えられた。無電解めっき時間が８分を超えると、無電解めっき時間が長くなるほど、大きなひだが得られることがＳＥＭ画像において確認された。
【００４７】
めっき時間が長いほど堆積したＡｕ層が厚くなることを調べるために、上記作製プロセスをガラス基板上でめっき時間を変えて実施し、膜高を測定することにより、収縮前の膜厚の推定値を得た（図２（ａ））。この測定を、ポリマー基板上の収縮前のＡｕ電極で直接的に実施することはできなかった。これは、ＰＳが平滑でなく柔らかく正確な測定値が得られる状態ではなかったためである。Ａｕ層の高さは、経時的に２つの成長段階を有することが分かった。１０分より短い時間では、堆積膜の厚さは、経時的にわずかしか増大しないが、無電解めっき時間が１０分を超えると、膜高は、無電解めっき時間の経過につれて急激に増大する。めっき時間が短い（＜１０分）段階では、Ａｕの成長によって、主に多孔性構造の細孔が埋められるとみられるが、めっき時間がそれより長くなると（＞１０分）、膜の成長は主に垂直方向に進む。
【００４８】
ＡＦＭデータから、トポグラフィー（表面の立体的形状）も無電解めっき時間の影響を受けることが示された。無電解めっき時間が増加すると、それに対応してひだ状電極表面の立体的な形状変化も大きくなることが分かった。ひだ状Ａｕ電極の表面粗さに関しても、白色干渉法によりその特性が明らかになった（図２（ｂ））。めっき時間の増加に伴い、表面粗さ（Ｒａ）および凸凹の高低差（ＰＶ）の測定値は、１０分の間で急激に増大した。１０〜２０分の間では、表面粗さおよびＰＶの値は増大するものの、その増加量は小さくなった。これは、１０分までの間にひだの第１層のサイズが増大し、その後（めっき時間＞１０分）は膜が厚くなるにつれて、２次のひだ形成効果が増大することに起因すると考えられる。２次のひだ形成効果が大きくなると、ひだ形成は規則的でなくなり、１次のひだが斜めに発生する可能性がある。このような不規則なひだ形成の結果として、種々のひだのピークが重なり互いに接触する可能性がある。これにより、真上から見たときに見えない空間のポケットが生じる。白色干渉法によるＲａおよびＰＶの測定は、表面に対して垂直な入射光を用いて行うため、傾斜したひだの下に隠れた空間は測定値に反映されない。このことは、デバイスのＴＥＭ断面図（図１（ｂ））に明確に示されている。ひだが重なりあった複数の箇所で、ひだの下に空間が閉じ込められていることが確認できる。低倍率画像（図１（ｂ）（ｉｉ））において、画像の最も右側に位置するひだの重なりを見れば、測定値に影響が生じた理由が分かる。ここでは、ＰＳ基板に最も深く入り込んだひだが形成されているにもかかわらず、上から見ると表面の傾斜したひだが空間を隠してしまうため、この特徴的な形体によって本来もたらされるべきＲａまたはＰＶの測定値の増大は得られない。無電解めっき時間の増大により、この効果が電極全体で増大するので、無電解めっき時間が長くなると、Ｒａ値およびＰＶ値の勾配が小さくなる（図２（ｂ））。
【００４９】
電極間の構造的な差異が、電極の電気的特性の差異にどの程度変換されるかを調べるために、収縮前と収縮後のデバイスで四探針法によるシート抵抗測定を行った（図２（ｃ））。この測定より、２つの領域が観察された。第１の領域（１〜１０分）では、めっき時間の増大に伴い、ひだ状電極のシート抵抗値は急激に減少した。第２の領域（＞１０分）では、めっき時間の増大に伴うシート抵抗値の減少の程度が小さくなることが確認された。第１の領域中で見られた急激な低下は、この段階のめっき工程において、多孔性構造の細孔が埋められることによると考えられる。さらに、シート抵抗値は収縮後に著しく低下することから、電極の電気的特性は、めっき時間に拘わらず、収縮プロセスにより向上することが確認された。また、無電解めっき時間が短いほど、収縮後のシート抵抗値の減少の程度が大きく、めっき時間が２０分の場合は、収縮後のシート抵抗値は３９％減少したのに対し、めっき時間が２分の場合は４７％減少した。これは、無電解めっき時間が短い場合は、Ａｕ膜層が薄く、より密に詰まったひだが形成されることに起因すると考えられる。ひだが密集することにより、隣接する折り目間の連結性が増し、電流が流れる総経路長が短くなる。無電解めっきを１分間行って作製されたデバイスでは、十分な導電性が得られなかったため、収縮前のシート抵抗値が得られなかったが、同じめっき時間でもひだ状にした電極では、シート抵抗値を得るための測定閾値を上回ったことに留意されたい。また、全溶液プロセスによるデバイス（めっき時間８分のひだ状、０．３６Ω／□）と、ほぼ同じ厚さのスパッタコーティングしたデバイス（約１００ｎｍ  ひだ状、０．１９４Ω／□）との比較を行ったところ、無電解めっきを施したデバイスのシート抵抗値は、スパッタコーティングしたデバイスのシート抵抗値の２倍未満であった。総じて、この溶液プロセスによる作製方法により、０．２５Ω／□（例えば、約０．２５〜０．９０Ω／□）という低いシート抵抗値を有するデバイスを作製することができた。
【００５０】
実施例２：テクスチャ構造を有する電極の電気化学的使用
実施例１と同様にして作製した溶液プロセスによる電極の電気化学的用途における適合性を評価するために、また、該電極の表面積を測定するために、電気化学的測定を行い、電極の電気活性表面積を求めた（図２（ｄ））。
【００５１】
幾何学的表面積（０．０２８ｃｍ２）が同じで、めっき時間が１分、２分、３分、８分および２０分の電極に対して、それぞれ収縮前後で評価を行った。めっき時間が８分および２０分の電極で電気化学的測定により求めた表面積は、それぞれ収縮前の投影表面積とほぼ同じであった。しかし、めっき時間が２分および３分のデバイスで測定した表面積は、それぞれ収縮前の投影表面積と比べて１０６％および２０％増加した。これは、めっき時間が短い場合に電極膜内に存在する細孔に起因するものと考えられる。めっき時間が１分のデバイスの収縮前の電気活性表面積は、導電率が不十分であったため、計測不能であった。
【００５２】
すべてのひだ状電極で、それぞれ収縮前の平面状態と比較して電気活性表面積が顕著に増加することが示された。これらのひだ状電極は、平面状態のときより表面積が少なくとも約１００％、好ましい場合では、少なくとも約２００％以上、例えば３００％、４００％および５００％以上増加していた。無電解めっき時間が２分のデバイスは、収縮後の表面積が最も大きく（０．２０４ｃｍ２）、その値は投影表面積の７倍を超える値に相当する。めっき時間が３分（０．１４２ｃｍ２）の場合、さらに８分（０．１１６ｃｍ２）の場合に見られる表面積の減少は、Ａｕ膜内の多孔性構造の細孔が部分的または完全に埋められることにそれぞれ起因すると考えられる。めっき時間が２０分のデバイスの収縮後の表面積（０．１４１ｃｍ２）は、めっき時間が８分のデバイスの収縮後の表面積より大きく、これは、めっき時間が２０分のデバイスではひだがさらに分離していることから、ひだが小さいめっき時間が８分のものよりも溶液と接触しやすかったのではないかと考えられる。全溶液プロセスによる電極の電気活性表面積は、無電解めっき時間によって精密に制御することができることは明らかであり、無電解めっき時間は、電極の多孔率、厚さおよびひだ形成構造を調整する１つの手段である。ここで開発された方法で得られる構造的な可変性により、全溶液プロセスを、３次元高表面積電極が必要とされる用途に拡張することができる。
【００５３】
実施例３：テクスチャ構造を有する電極の特性
ひだ状金電極がエポキシ絶縁体で被覆した線材を介して接触パッドに連結されているセンサーを、全溶液プロセスにより作製した（図３（ａ））。ひだ状多孔性電極（めっき時間が１分のデバイス）の触媒活性の評価は、塩基性電解質（０．１ＮａＯＨ）中、グルコースの存在下および非存在下でサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を実施することにより行った。図３（ｂ）に示すＣＶ走査結果から、グルコース非存在下では、順方向への走査において、０．２５Ｖ付近で金の酸化が始まり、逆方向への走査において、生成した金酸化物の還元が０．１５Ｖ付近で始まることが分かる。また、−０．１６Ｖで認められる酸化還元性の特徴は、アルカリ性溶液中のＯＨ−の金への化学吸着によるものである。このＣＶ挙動は、以前に報告された、ＮａＯＨ溶液中で行ったＡｕのＣＶ走査の結果と一致している。グルコースの存在下では、順方向への走査において、−０．５Ｖ付近のピーク（ピークＡ）および−０．２Ｖ付近で立ち上がり０．４Ｖ付近で下降する幅広のピーク（ピークＢ）が観測されている。逆方向の走査において、グルコース非存在下で観測された金酸化物の還元という特徴が見られ、その後、０．１Ｖ付近で立ち上がる酸化ピーク（ピークＡ’）が続く。
【００５４】
以前の研究から、最も負電位で観測される酸化ピーク（ピークＡ）は、ＡｕＯＨ（ＮａＯＨの存在下で形成される）の触媒作用により、グルコースのＣ１のアルデヒド基の吸着およびさらなる酸化によるものであることが分かっている。幅広のピークＢは、グルコースのＣ６の第一アルコールの酸化、エンジオール中間体の酸化、およびグルコースの炭素原子Ｃ１とＣ２との結合の切断に起因する３つのピークに分解することができる。電極上に形成されたＯＨ−層は、電極表面におけるグルコースおよびその中間体の吸着にとって重要である。逆方向の走査において、金酸化物層が還元されると、ＡｕＯＨ層が形成されると考えられ、このＡｕＯＨ層が、グルコースの酸化ピークの再出現に関与している。ＡｕＯＨが多く含まれる層は、このように多様なグルコース酸化経路を触媒するために重要である。
【００５５】
このように、全溶液プロセスによるひだ状電極は、酵素触媒作用を必要とせずに、５９１μＡ  ｍＭ−１ｃｍ−２の感度で生理的濃度のグルコースを直接検出することが確認された。
【００５６】
非酵素系のグルコース検出を目的としてここで開発された、３つの構造、すなわち、ナノ多孔性ひだ状（短時間のめっき／収縮）、ひだ状（長時間のめっき／収縮）および平面（無収縮）の感度を比較するために、臨床的に意味のある濃度（３〜８ｍＭ）のグルコース溶液と、この範囲より高濃度および低濃度のグルコース溶液とをそれぞれ準備した。これら３つの構造を用いて、異なるグルコース濃度で得られたＣＶ走査結果を図３（ｃ）〜（ｅ）に示す。各図は、グルコース酸化に関連する最も重要なピーク（ピークＢおよびピークＡ’）を含む電位窓の範囲で表示している。両ピークの高さは、グルコース濃度の上昇と共に増大するが、ピークＢの方が、より大きな勾配で単調増大することが分かる。次いで、順方向の走査（０．２〜０．３Ｖの範囲）における最大ピークの高さを、グルコース濃度の関数としてプロットし（図３（ｆ））、３つの構造それぞれのグルコース感度および表面積の概要をまとめた（図３（ｇ））。
【００５７】
この解析により、感度は表面積の増加と共に上昇することが確認されたが、平面電極を基準とする感度上昇倍率では、ナノ多孔性構造の感度上昇倍率は、その表面積増加倍率より大きく、ひだ状構造の感度上昇倍率は、その表面積増加倍率より小さかった。感度は以下の通りであった。平面電極：８９μＡ／ｍＭ・ｃｍ２、ひだ状電極：２６１μＡ／ｍＭ・ｃｍ２、ひだ状多孔性電極：５９１μＡ／ｍＭ・ｃｍ２。これは、表面積の増大は感度の上昇にとって重要であるとともに、構造の種類（例えば、多孔度、露出した結晶構造など）も感度の向上にとって重要であることを示している。構造による感度の差は、各構造におけるＯＨ−の吸着の違いによるものであると考えられ、ＯＨ−の吸着の違いは、各構造の触媒活性に影響を及ぼす。また、ここで開発された平面構造の感度（８９μＡ／ｍＭ・ｃｍ２）は、以前に報告された、金ディスク電極を用いた数値（０．７２μＡ／ｍＭ・ｃｍ２）よりはるかに大きいことにも留意されたい。これは、ここで作製された全溶液プロセスによる平面電極の粗さによるものと考えられる。当該平面電極の電気活性表面積をその幾何学的表面積で除することで得られる粗さ係数は１．６３である。
【００５８】
実施例４：テクスチャ構造を有する電極のレイヤーバイレイヤー累積
無電解めっき後のひだ状電極の作製に加えて、形状記憶ポリマー上に金ナノ粒子のレイヤーバイレイヤー累積により直接ひだ状薄膜を作製するための方法を開発した。この方法は、プラズマ処理により形状記憶ポリスチレン（ＰＳ）基板を活性化すること、アミノシラン分子のリンカー層を堆積すること、および金ナノ粒子（Ａｕ  ＮＰ）のレイヤーバイレイヤー累積を行うことを含むものであった（図４（ａ））。Ａｕ  ＮＰと基板の結合には、アミノシラン（（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ））を用い、そのシラン末端と、プラズマ処理した基板上のヒドロキシル基との化学反応、およびＡＰＴＥＳのアミン末端と、クエン酸塩で安定化されたＡｕ  ＮＰとの静電相互作用を利用した（ＡＰＴＥＳ層とＡｕ  ＮＰ層を交互に得ることができる）。ＰＳ基板を、そのガラス転移点（Ｔｇ：約１０３℃、同一商標の市販の形状記憶ＰＳ基板を用いて示差走査熱量測定法により以前に測定したもの）を超えるよう加熱し、１６０℃で３分間加熱し続けることによってＰＳ基板を収縮させてＡｕ  ＮＰ膜に対する機械的な圧縮力を発生させた。この圧縮力は、この軟性ポリマー基板とそれより堅いＡｕ  ＮＰ薄膜層との熱膨張ミスマッチにより発生する。この機械的な圧縮力は、Ａｕ  ＮＰ膜の座屈により緩和され、その結果、ひだ状のＡｕ  ＮＰ表面が得られることが予想された。ここで用いた市販のＰＳ基板は、２次元で収縮し（ひずみ量４０％）、１次元で拡張する。一軸方向のひだ形成方法を検討するために、ＰＳ基板を、物理的制約により一方向に収縮させ、また物理的制約を加えずに二軸方向にひだ形成させた（図４（ｂ））。
【００５９】
機能材料構造を設計する場合、特に臨界境界面における材料の構成要素の構造および組織化を調整することが望ましい。したがって、ひだの波長および振幅を調整することができるひだ状ナノ粒子層が望まれている。この目的のために、主要な構成要素（Ａｕ  ＮＰ）のサイズおよび組織化を調整することで、２次的なひだ状構造を設計通りに作製することが可能かどうかを検討した。まず、薄膜層を形成するＡｕ  ＮＰの粒径を変化させ、例として、粒径が約１２ｎｍ、約１８ｎｍおよび約３６ｎｍのＡｕ  ＮＰを用いた。図５（ａ）のＳＥＭ画像および断面の走査電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像に示すように、これら３種類のサイズのＡｕ  ＮＰを用いて、一軸方向のひだ状表面および二軸方向のひだ状表面を作製した。一軸方向にひだを形成した場合も二軸方向にひだを形成した場合も、マイクロメートル未満の波長を有する周期的なひだ構造がデバイスの表面全体に見られることが、ＳＥＭ画像から分かる。また、ＴＥＭ断面図には、Ａｕ  ＮＰ膜とポリスチレン基板の境界面にシャープなひだ状境界が示されており、この結果から、ポリスチレンは１６０℃に加熱されると、自己組織化Ａｕ  ＮＰ層を通り抜けることができなくなり、ひだ状Ａｕ  ＮＰ膜に合わせてそれ自体もひだ状構造を形成することが示唆された。さらに、一軸方向に配列したひだは、二軸方向のひだより振幅が顕著に小さかった。これは、二軸方向のひだ形成過程中に複数のＡｕ  ＮＰ層が積み重なる（サンプルの高解像度ＴＥＭ断面図（図５（ｃ））で確認される）ことに起因しているのではないかと考えられる。
【００６０】
また、図５（ｃ）のサンプルの高解像度ＴＥＭ断面図において、個々のナノ粒子が明確に確認された。このことは、この作製方法の加熱によるひだ形成の工程中にナノ粒子層は融解せずに連続した膜を形成することを示唆している。Ａｕ  ＮＰのサイズが増大すると、得られるひだの波長（ＳＥＭ画像および断面のＴＥＭ画像で見られる）および振幅（断面のＴＥＭ画像で見られる）も増大することが確認された。一軸方向ひだの波長を抽出して、プロットしたものを図５（ｅ）に示す。図５（ｅ）から、Ａｕ  ＮＰの粒径の増大に伴い、波長が増大していることが分かる。波長は、粒径約１２ｎｍのＡｕ  ＮＰでは７５．４±１５．２ｎｍであり、粒径約１８ｎｍのＡｕ  ＮＰおよび粒径約３６ｎｍのＡｕ  ＮＰではこれより大きく、それぞれ１３６．９±３０．７ｎｍおよび４２７．２±９４．９ｎｍであった。Ａｕ  ＮＰ層の有効厚さは、Ａｕ  ＮＰの粒径と直接的な関係があり、該粒径とほぼ等しいという観察結果（図５（ｄ））から、ナノ粒子サイズを用いることにより、形成するひだのサイズを設計通りに作製できることが分かった。Ａｕ  ＮＰの粒径が増大すると、得られる膜層の有効厚さも増大し、その結果、ひだが大きくなる。
【００６１】
Ａｕ  ＮＰ膜の有効厚さを増大してひだサイズを調整する別の方法を、多層のＡｕ  ＮＰ膜の作製により検討した。レイヤーバイレイヤー構造を、粒径約１２ｎｍのＡｕ  ＮＰ層を多数積層して作製した。各層の連結には、分子リンカーであるＡＰＴＥＳを用いた（メルカプトシランリンカーを用いる類似の方法はＦａｎら、Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１１，７３８１−７３８９（２００９）に記載されている）。Ａｕ  ＮＰをＰＳ基板に堆積させて１層〜６層まで作製し、次いで、一軸方向または二軸方向に収縮させてひだを形成した。一軸方向にひだを形成した場合も二軸方向にひだを形成した場合も、Ａｕ  ＮＰ層の数の増加により、ひだのサイズも増大することが確認された（図５（ｂ））。これは、Ａｕ  ＮＰ層が表面に追加される毎に薄膜層の有効厚さ（数値を図５（ｄ）に示す）が増大するという観察結果による。追加された層の平均厚さは、構成要素であるＡｕ  ＮＰの粒径（約１２ｎｍ）と一致する。得られたひだの波長は、有効厚さに対して線形傾向を示し（図５（ｅ））、層を追加する毎に増大し、２層膜では８９．０±２０．０ｎｍであったが、６層膜では２４６．１±５８．０ｎｍまで増大した。したがって、Ａｕ  ＮＰ層の数の変化は、形成するひだの波長を設計通りに作製するためのもう１つの手段である。Ａｕ  ＮＰのレイヤーバイレイヤー累積を用いた場合の、ここで観察されたひだの波長は、ひだ状膜に関してこれまで報告されたもの中でも最小に属するものである。これは、Ａｕ  ＮＰの粒子間間隙の存在によって、ナノ粒子単層またはスパッタ金にはない特異な機械的特性（剛性を含む）を有するナノ多孔性膜が形成されることによるものであると考えられる。
【００６２】
実施例５：核酸検出のための修飾電極
ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸の検出は用途が広く、疾病管理、健康管理、科学捜査および環境モニタリングにおいて利用されている。ナノ多孔性ひだ状電極をこれらの用途で使用するためには、（１）当該電極を、配列特異的な核酸捕捉のためのバイオ認識層と連結すること、および（２）当該電極を、核酸のハイブリッド形成を電気化学的電流に変換する電気化学的測定法と融合させることが望ましい。
【００６３】
この目的のために、チオールで修飾した２０ヌクレオチド長のｓｓＤＮＡプローブを用いて、本発明の全溶液プロセスによる電極（めっき時間が２０分の平面デバイス、ならびにめっき時間が２分、８分および２０分のひだ状デバイス）に機能性を付与した。次いで、このプローブと相補的な２０ヌクレオチド長の標的ｓｓＤＮＡおよび非相補的な２０ヌクレオチド長の標的ｓｓＤＮＡ（標的ＤＮＡの濃度：１μＭ、脱イオン化水で調製）を用いて、以前に開発した電解触媒性レポーターシステム（Ｌａｐｉｅｒｒｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５，６３２７−６３３３（２００３））を含む溶液中で、ハイブリダイゼーション実験を行い、ＤＮＡ結合イベントの検出におけるひだ状電極の選択性を調べた。この電解触媒性レポーターシステムは、静電性レポーター（ルテニウムヘキサミン（ＲｕＨｅｘ））と触媒（フェリシアン化物（ＦｉＣＮ））とを含む。静電性レポーターは、ＤＮＡの糖リン酸骨格が負に帯電していることから、電極表面に存在する負電荷の指標となる。また、触媒は、酸化還元反応が繰り返し行われるよう、上記静電性レポーターを再生するためのものである。このシステムは、ＤＮＡのハイブリダイゼーションによって電極表面に付加された負電荷を変換するための有効なシステムであり、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が存在すると、酸化還元レポーターの還元電流が増大する。
【００６４】
相補的な標的ＤＮＡおよび非相補的な標的ＤＮＡの導入前と導入後にプローブ修飾電極上で記録された代表的な微分パルスボルタモグラム（ＤＰＶ）を図６（ａ）に示す。相補的（Ｃ）ＤＮＡおよび非相補的（ＮＣ）ＤＮＡを導入した後の、めっき時間が２分、８分および２０分のひだ状デバイスにおけるピーク電流の変化率を図６（ｂ）に示す。相補的ターゲットの導入による平均ピーク電流の変化率は、めっき時間が２０分の平面デバイス、ならびにめっき時間が２分、８分および２０分のひだ状デバイスでそれぞれ、２２．５７±６．３９％、７０．０８±６．６９％、１８．５５±６．９２％および３２．７３±１９．３６％であった。観測された電流の変化率は、めっき時間が２分のひだ状デバイスが最大であり、以下、めっき時間が２０分のひだ状デバイス、めっき時間が８分のひだ状デバイス、めっき時間が２０分の平面デバイスの順で続き、測定した電気活性表面積と同じ傾向を示している。表面積の増加により、標的の捕捉に利用可能なプローブの総数が増加すると考えられることから、捕捉された標的ＤＮＡの数も増えるはずである。その結果、ハイブリダイゼーション後に電流が増大すると考えられるが、同時にハイブリダイゼーション前に測定される電流も増大すると考えられる。よって、表面積が大きい電極ほど、ＤＰＶのピーク電流の総変化率が高くなることは予想していなかった。しかし、この分析が１μＭという比較的高い標的ＤＮＡ濃度で行われたことを考慮すると、この濃度における標的の捕捉は表面反応律速過程であると予想されるため、多孔性表面のナノスケールの表面形態は、この特定の構造のハイブリダイゼーション効率の向上に関与すると考えられる。したがって、めっき時間が２分のデバイスでより大きいピーク電流の変化率が見られたことは、他のデバイスと異なる特徴であるひだ状表面の多孔性と関係があると考えられる。この仮説を確めるために、ナノ多孔性ひだ状デバイスのハイブリダイゼーション効率を測定し、平面電極のハイブリダイゼーション効率と比較した（図６（ｃ））。この２種類の電極は、同様のハイブリダイゼーション動態を示し、いずれのデバイスもインキュベーション時間が約２時間の時点で最大のハイブリダイゼーション効率を示した。しかし、ハイブリダイゼーション効率のピークは、平面デバイス（約５０％）より、めっき時間が２分のデバイス（約８０％）の方が顕著に高い。これは、平面デバイスと比較して、ナノ多孔性ひだ状デバイスに固定したプローブの方が接近しやすいという仮説と一致する。ここで作製した、全溶液プロセスによるひだ状電極は、バイオ認識層および電気化学的測定システムとの融合が期待できるものであり、安価で使い捨ての電気的なバイオセンシングカートリッジの開発に適用できる可能性がある。このナノ多孔性ひだ状デバイスは、試験に用いたデバイスの中で、ハイブリダイゼーションによる電気化学的な電流の変化率が最大であり、このことは、このデバイスの定常ハイブリダイゼーション効率の高さと関係があることを示している。
【００６５】
実施例６：免疫センサーとして使用するための電極
免疫センサーを開発するために、シスタミンの自己組織化単層を、チオール結合により電極の金表面に固定した。シスタミンのアミン官能基により、二官能性リンカーであるグルタルアルデヒドをさらに電極に結合させることができる。グルタルアルデヒドのケトン官能基は、抗体との結合に有用である。本発明の（ナノ多孔性ひだ状）電極に、各化学物質の水溶液を加えて（２ｍＭシスタミン溶液で一晩インキュベートした後、２．５％グルタルアルデヒド溶液で１時間インキュベートした）、これらのリンカーを形成させた。最後に、標的分析物であるＢＤＮＦタンパク質と特異的に結合するバイオ認識剤として、抗ＢＤＮＦモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を電極表面に結合させた（図７）。簡潔に説明すると、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調製した１０μｇ／ｍＬ抗ＢＤＮＦ抗体を、電極デバイスと共に室温で１時間インキュベートした。次いで、ＰＢＳで２回、それぞれ５分間洗浄した後、ＰＢＳで調製した５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを、センサー表面に滴下した。これは、未反応のアルデヒド基をブロッキングして、電気化学的シグナルとの干渉を防ぐためである。その後、センサーをＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで調製した漸増濃度のＢＤＮＦ（０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬおよび２ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ、免疫センサーに滴下して３７℃で４０分間静置し、その後、ＰＢＳと水とで洗浄して電気化学的測定値の評価を行った。
【００６６】
ＢＤＮＦタンパク質を分析するために、微分パルスボルタンメトリーにより、標的となるＢＤＮＦタンパク質の捕捉前と捕捉後の溶液媒介性酸化還元レポーター（［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−／４−）（２．５ｍＭ）からの電荷移動を測定した。微分パルスボルタンメトリーシグナルは、電位増加分５ｍＶ、パルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍｓ、パルス期間１００ｍｓで取得した。タンパク質分析物の存在下と非存在下の電気化学的シグナルを比較したところ、タンパク質が存在すると、酸化還元レポーターの電極表面へのアクセスが妨げられることから、タンパク質の捕捉後は、シグナルの減少が観測された（図７）。
【００６７】
平面電極と本発明の多孔性ひだ状電極の性能を比較するために、各電極を標的タンパク質とインキュベートし、シグナル変化率の比較測定を行った。多孔性ひだ状電極は、いずれの場合も、錯体形成によるシグナル変化率が大きいことが分かる（図８（ａ））。また、ＢＤＮＦタンパク質の濃度を変化させた場合のシグナル変化率も、タンパク質捕捉イベント後に測定した（図８（ｂ））ところ、２ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．２５ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ濃度の間で統計学的に有意な変化が認められ、ＢＤＮＦ濃度の増加と共にシグナル変化率が増大することが分かった。
【００６８】
以上をまとめると、導電性かつマルチスケールのひだ状電極を作製するための、全溶液プロセスによるスピーディな方法であって、本明細書に記載されているような、スマートポリマー基板上へのナノ粒子の無電解めっきまたはレイヤーバイレイヤー累積、および予め応力を印加したポリマー基板の熱収縮を含む方法が開発された。この研究を通じて、（１）得られる電極構造、トポグラフィーおよび形態の可変性は、無電解めっきパラメータ、ナノ粒子の粒径、ナノ粒子層の数、および収縮によるひだ形成により証明され；（２）コンダクタンス、表面積、表面粗さおよび電気化学的挙動などの機能的なパラメータに対する電極の構造制御の効果が明らかになり；（３）バイオセンシング用途、すなわち、グルコースの電解触媒性かつ非酵素系の直接的検出に合わせて電極を機能的に最適化するための構造制御が決定され；（４）バイオセンシング用途、すなわち、ＤＮＡハイブリダイゼーションの電気化学的検出に合わせて電極を機能的に最適化するための構造制御が決定され；かつ（５）免疫センシングに合わせて電極を機能的に最適化するための構造制御が決定された。
【００６９】
本発明の電極は、作製スピードが速く、作製が容易で、表面積当たりのコストが低い（約＄０．０１／ｃｍ２）という点で有利である。また、この機能的な電極デバイスは、様々な電子的／電気化学的ＬＯＣデバイスで使用するために作製することも可能である。
【００７０】
別段の指示がない限り、実施例およびその他の項目に記載の定義および実施形態は、適切であれば、本明細書に記載されている本願のすべての実施形態および態様に適用可能であることが意図されており、このことは、当業者であれば理解できるであろう。
【００７１】
本明細書において、「実質的に」、「約」、「ほぼ」などの程度を示す用語は、これらの用語が修飾する用語の、最終結果が著しく変化しないような適正な偏倚量を意味する。また、程度を示すこれらの用語は、修飾される用語の意味が否定されない限りは、修飾される用語の少なくとも±５％の偏差を含むものと解釈されるべきである。
【００７２】
本明細書に引用されている参考文献は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−ｂ】
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【図５ｃ−ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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