(57)【要約】  本開示は、ＴＧＦ−ベータ抗体及びそれらの結合フラグメント、それらをコードするＤＮＡ、前記ＤＮＡを含む宿主細胞、及び宿主細胞中において抗体を発現させるか又はフラグメントに結合させる方法に関する。本開示は、抗体又はそれらの結合フラグメントを含む医薬組成物、及び線維症を含む様々な疾患の治療における抗体、結合フラグメント及びそれらを含む組成物の使用にも拡張される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖を含むヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であって、重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、上記抗体。
【請求項２】
重鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
軽鎖を含むヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、上記抗体。
【請求項４】
軽鎖をさらに含み、前記軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項５】
軽鎖の可変ドメインが、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を含む、請求項３又は４に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であって、重鎖の可変ドメインが、３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｈ１の配列が、配列番号４に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ２の配列が配列番号５に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有し、及びＣＤＲ−Ｈ３の配列が、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する、上記抗体。
【請求項７】
可変ドメインが３つのＣＤＲを含む軽鎖をさらに含み、ＣＤＲ−Ｌ１の配列が、配列番号１に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ２の配列が、配列番号２に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有し、及びＣＤＲ−Ｌ３の配列が、配列番号３に示す配列に少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０又は配列番号９４に示す配列を含む重鎖を含む、請求項１から７までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号３８に示す配列を含む軽鎖を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体分子が、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はそのフラグメントからなる群から選択され、例えば、Ｆａｂ、修飾されたＦａｂ’、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖフラグメントを含む群から選択される、請求項１から９までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０又は配列番号９４に示す配列を含む重鎖、配列番号３８に示す配列を含む軽鎖を有する、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体。
【請求項１２】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であって、軽鎖の可変ドメインが、請求項１１の抗体の軽鎖の可変ドメインに少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含み、重鎖の可変ドメインが、請求項１１の抗体の重鎖の可変ドメインに少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む、上記抗体。
【請求項１３】
配列番号５９、配列番号７３、配列番号８７又は配列番号１０１に示す配列を含む重鎖、及び配列番号４５に示す配列を含む軽鎖を有する、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体。
【請求項１４】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であって、重鎖及び軽鎖が、請求項１３の抗体の対応する重鎖及び軽鎖と少なくとも８０％同一であるか又は類似している、上記抗体。
【請求項１５】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であって、配列番号１１４のアミノ酸２５〜３４と９０％同一の配列、及び任意選択により配列番号１１４のアミノ酸９０〜９５の少なくとも１つと接触する、上記抗体。
【請求項１６】
配列番号１１４のアミノ酸６０、９７及び１０１の少なくとも１つとさらに接触する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
エフェクター又はレポーター分子が結合されている、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２、ＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９の配列に示すＣＤＲを含む抗体の結合をクロスブロックする、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体。
【請求項１９】
抗体がブロックされるエピトープと同じエピトープに結合することにより結合をブロックする、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
ヒトＴＧＦ−ベータ１に対する２００ｐＭ以上の結合親和性、ヒトＴＧＦ−ベータ２に対する３００ｐＭ以上の結合親和性、及びヒトＴＧＦ−ベータ３に対する２５００ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
ヒトＴＧＦ−ベータ１に対する１００ｐＭ以上の結合親和性、ヒトＴＧＦ−ベータ２に対する２００ｐＭ以上の結合親和性、及びヒトＴＧＦ−ベータ３に対する２０００ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
組換えＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２又はＴＧＦ−ベータ３のＨＥＫ−ＳＥＡＰ−ＳＢＥレポーター遺伝子アッセイにおいて、ヒトＴＧＦ−ベータ１活性を０．５ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害する、ヒトＴＧＦ−ベータ２活性を０．０５ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害する、及びヒトＴＧＦ−ベータ３活性を２ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害する、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
内因性ＴＧＦ−ベータのＨＥＫ−ＳＥＡＰ−ＳＢＥレポーター遺伝子アッセイにおいて、ヒトＴＧＦ−ベータを、１０ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害する、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
前記抗体又はそれらの結合フラグメントがモノクローナルヒト化抗体である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体の重鎖及び／又は軽鎖（単数若しくは複数）をコードする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２６】
請求項２６に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項２７】
配列番号４５又は配列番号４６に示す軽鎖ＤＮＡ配列、及び／又は配列番号６０、配列番号６１、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号１０２又は配列番号１０３に示す重鎖ＤＮＡ配列を含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項２２の宿主細胞を培養すること及び抗体を単離することを含む、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体を産生するための方法。
【請求項３０】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１種又は複数との組合せで、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
他の有効成分をさらに含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記医薬組成物が、例えば霧化、エアロゾル及び／又は乾燥粉末による吸入投与のために適切である、請求項３０又は３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３の増大したレベルと関連する病理学的障害の治療又は予防に使用するための、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体又は請求項３０から３２までのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
ＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３の増大したレベルと関連する病理学的障害の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３５】
ＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３に媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３の増大したレベルと関連する病理学的障害を患う又はそのリスクがあるヒト対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の抗体の有効量を投与することを含む、上記方法。
【請求項３６】
ＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３の増大したレベルと関連する肺障害の、吸入投与、例えば霧化、エアロゾル及び／又は乾燥粉末による治療又は予防に使用するための、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメント。
【請求項３７】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントの使用であって、ＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３の増大したレベルと関連する肺障害の、例えば霧化、エアロゾル及び／又は乾燥粉末による吸入投与による治療又は予防のための医薬の製造における、上記使用。
【請求項３８】
ＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２若しくは３の増大したレベルと関連する肺障害を患うか又はそのリスクにあるヒト対象を治療する方法であって、前記対象にヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する、有効量の拮抗性抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、例えば、霧化、エアロゾル及び／又は乾燥粉末による吸入投与により投与することを含む、上記方法。
【請求項３９】
抗体が、請求項１から２４までのいずれか一項で規定される、請求項３６に記載の抗体、請求項３７に記載の使用又は請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記肺障害が：肺線維症、例えば突発性肺線維症、嚢胞性線維症など、又は全身性硬化症の続発性線維症など、及び肺動脈高血圧症などの肺高血圧症からなる群から選択される、請求項３６に記載の抗体、請求項３７に記載の使用、又は請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトには、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３で存在する３種のＴＧＦ−ベータのアイソフォームがある。アイソフォームは相同性であり、約７０％の配列同一性を共有する。それらは、全て、ＴＧＦ−ベータが他の２種のポリペプチド、潜在的ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）及び潜伏期が関係するペプチド（ＬＡＰ）と複合体化した潜在的複合体として（ＴＧＦ−ベータ遺伝子の生成物のＮ末端領域に由来するタンパク質）合成されて分泌される。プラスミンなどの血清プロテイナーゼが、複合体からの活性な成熟ＴＧＦ−ベータの放出を触媒する。
【０００２】
それらの活性形態において、ＴＧＦ−ベータのアイソフォームは、約２５ＫＤａのホモダイマーのタンパク質として存在する。全て３種のアイソフォームは、同じ膜貫通受容体ＴベータＲＩ及びＴベータＲＩＩを通してシグナルを送信する。ＴＧＦ−ベータは、最初、ＴベータＲＩＩに結合し、それが次にＴベータＲＩとヘテロテトラマー複合体を形成して、ＴベータＲＩのリン酸化及びそれに続くシグナル伝達経路の活性化をもたらす（Ｄｅｒｙｎｃｋ及びＭｉｙａｚｏｎｏ（編）、２００８年、ＴＧＦベータファミリー（Ｔｈｅ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  Ｆａｍｉｌｙ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。同じ受容体複合体を通るシグナル伝達であるにもかかわらず、各々異なる表現型を有する個々のアイソフォームの遺伝的欠失を含むマウスにより体現される３種のアイソフォームの性質の異なる重なり合わない機能が注目されてきた（Ｓｈｕｌｌら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９巻：６９３〜６９９頁；Ｓａｎｆｏｒｄら、１９９７年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２４巻：２６５９〜２６７０頁；Ｐｒｏｅｔｚｅｌら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、１１巻：４０９〜４１４頁）。
【０００３】
ＴＧＦ−ベータは、生物学的プロセスの範囲に包含される多面発現性の分子である。ＴＧＦ−ベータは、上皮、内皮、造血及び免疫細胞を含む多くの細胞型の増殖を阻害する。免疫細胞のエフェクター機能は、ＴＧＦ−ベータ及びＴＧＦ−ベータにも応答性であり、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞の分化を抑制するが、制御性細胞を刺激して、したがってＴＧＦ−ベータは、主に免疫抑制機能を有する（Ｌｉら、２００６年、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：９９〜１４６頁；Ｒｕｂｔｓｏｖ及びＲｕｄｅｎｓｋｙ、２００７年、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：４４３〜４５３頁）。ＴＧＦ−ベータの発現は、非常に調節されて、組織のホメオスタシスの維持に関与する。しかしながら、ＴＧＦ−ベータの慢性的過剰発現が、癌及び線維症などの疾患状態における疾患進行の推進と連結されている。
【０００４】
様々なヒトの障害におけるヒトＴＧＦ−ベータの役割に基づいて、治療戦略は、ＴＧＦ−ベータの活性を阻害するか又は打ち消すようにデザインされてきた。特に、ＴＧＦ−ベータに結合して中和する抗体が、ＴＧＦ−ベータ活性を阻害する手段として捜し求められてきた。ＴＧＦ−ベータに対する抗体は、当技術分野で公知である。全身的に投与された抗ＴＧＦ−ベータ１抗体（カタログ番号１９２）が、全身性硬化症患者において、第Ｉ／ＩＩ相の試行で評価されて、１０ｍｇ／ｋｇまでの用量で効力の証拠はなかった（Ｄｅｎｔｏｎら、２００７年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ、５６巻：３２３〜３３３頁）。ＴＧＦ−ベータ１に対する活性が最適化されたヒト化抗体（ＴベータＭ１）が、転移癌を有する患者における第Ｉ相試行で評価されたが、抗腫瘍効果は認められなかった（Ｃｏｈｎら、２０１４年、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．、４５巻：２２２１〜２２３１頁）。ヒトＴＧＦ−ベータ２抗体（カタログ番号１５２）が、線維柱帯切除術後の瘢痕形成の予防について評価されたが、プラセボとの差は認められなかった（ＣＡＴ−１５２０１０２  線維柱帯切除術研究グループ、２００７年、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１１４巻：１８２２〜１８３０頁）。全身的に投与された、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３に特異的な全長ＩｇＧ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ、ＧＣ１００８）が、ある種の癌及び繊維症の疾患の治療について調査された。しかしながら、抗体の全身的送達と関連して現れる皮膚病変を含む副作用が報告された（Ｌａｃｏｕｔｕｒｅら、２０１５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、６４巻：４３７〜４４６頁）。
【０００５】
線維症は、創傷治癒に対する異常な応答であり、過剰な繊維状の結合組織が、器官又は組織で形成される。正常な創傷治癒中における改造相において、新しいコラーゲンの合成が、それが分解される速度を超えて、瘢痕形成を生ずる。正常な創傷治癒の最終プロセスは、低下したコラーゲン合成及び増大したコラーゲン分解の組合せにより起こる瘢痕分解であり、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び顆粒球、マクロファージ、表皮性細胞、及び筋線維芽細胞により産生されるメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰＳ）の組織阻害剤により制御されるプロセスである。したがって創傷治癒は、堆積の刺激に続く分解による代謝平衡における偏移を包含する。この平衡における任意の乱れは、マトリックス構成要素の過剰な堆積をもたらして、組織の硬化及び瘢痕形成並びに正常組織構造の破壊及び組織機能の欠陥を生じさせることもあり；この乱れを線維症と称する。
【０００６】
異常な上皮と間葉系の相互作用、変化した線維芽細胞の表現型、肥大化した線維芽細胞増殖、及びコラーゲン及び細胞間質の過剰な堆積は、全て、繊維症の疾患の原因となる重要なプロセスである。このプロセスにおける最も重要な細胞型は、筋線維芽細胞である。筋線維芽細胞の活性化は、Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンのそれらの増大した分泌を生じさせる。線維症において突出した役割を演ずると考えられる他の細胞型は、上皮細胞及びマクロファージを含む。ＴＧＦ−ベータは、線維症の支配的制御因子であり、マクロファージ及び線維芽細胞を含む数種類の細胞型に対する作用により繊維症のプロセスの原因になると考えられる（Ｌｅａｓｋ及びＡｂｒａｈａｍ、２００４年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１８巻：８１６〜８２７頁）。最も重要な繊維症促進活性は、線維芽細胞移動の刺激及び線維芽細胞の筋線維芽細胞への形質転換、刺激する過剰なＥＣＭ堆積を含む。ＴＧＦ−ベータは、マクロファージ移動及びマクロファージからのＰＤＧＦなどの間葉系の成長因子の産生の刺激、並びにＴＩＭＰ３などのプロテアーゼ阻害剤の増大した発現によるＥＣＭ分解の阻害にも関与する。
【０００７】
繊維症疾患は、病的状態及び死亡率の主要な原因であり、多くの組織及び器官系に影響し得る。間質性肺疾患はこの疾患の群に含まれる。突発性肺線維症（ＩＰＦ）は、間質性肺疾患の最も一般的形態であり、突発性間質性肺炎（ＩＩＰ）の７通りの性質の異なる群の１種である。間質は、肺胞の上皮の基底膜と毛細管内皮の間の顕微鏡的隙であり、血液−ガスバリアの部分を形成する。ＩＩＰは、炎症性細胞による間質性区画の拡大により特徴づけられて、線維症と関連し、特にＩＰＦのために注目される。
【０００８】
ＩＰＦ患者は、進行性肺実質性線維症とともに進行性労作性の呼吸困難及び咳を呈して、肺制限及び低酸素血を生ずる。ＩＰＦの診断は、臨床、Ｘ線撮影検査及び病理学的基準の組合せを使用して確定され、通常間質性肺炎（ＵＩＰ）と呼ばれる特徴的な病理学的パターンと関連する。
【０００９】
ＩＰＦは、任意の年齢で診断され得るが、５０歳を超えた高齢者で最も一般的であり、有病率は、女性よりも男性で高い。ＩＰＦは、死亡率が多くの新生物の疾患より高く、３年生存率は５０％及び５年生存率は僅か２０％にすぎない。ＩＰＦの原因は、未知であるが、未だ同定されていない外因性及び内因性刺激による上皮細胞活性化の複数の事象があると想定され、それは、治療せずに放置されれば進行性肺傷害及び最終的に線維症に至る。肺胞の上皮の乱れには、間葉系の細胞の移動、増殖及び活性化が続いて、線維症／筋線維芽細胞のＥＣＭの過剰な蓄積を有する病変部の形成を生ずる。
【００１０】
ＴＧＦ−ベータ発現は、ＩＰＦ患者の繊維症の肺で増大しており（Ｂｒｏｅｋｅｌｍａｎｎら、１９９１年、ＰＮＡＳ、８８巻：６６４２〜６６４６頁；Ｋｈａｌｉｌら、１９９１年、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、５巻：１５５〜１６２頁）、同時に、繊維症の機構を推進することにおけるＴＧＦ−ベータの役割は完全に確立され、ＴＧＦ−ベータの阻害は、ＩＰＦ患者の治療のために効果的な機構と考えられるべきである。
【００１１】
ＩＰＦ患者のために利用可能な効果的な療法はない。コルチコステロイド、シクロホスファミド及びアゾチアプリンを含む抗炎症剤は、患者のための利益が殆どないこと、及び関連する副作用を有することが証明された。最近、２種の低分子薬物、プリフェニドン及びニンテダニブが、ＩＰＦの治療のために承認された。両方の薬物は、疾患の進行を遅らせることが示されたが、疾患は治癒せず、多くの患者の辞退が続いている。それに加えて、治療に関係する有害事象、例えば、胃腸事象、発疹及び光過敏症などが顕性である（Ｃｏｔｔｉｎ及びＭａｈｅｒ、２０１５年、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｖ、２４巻：５８〜６４頁；Ｍａｚｚｅｉら、２０１５年、Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ．）。今日まで、繊維症の適応症のために承認された標的とする療法及び抗体療法はない。
【００１２】
さらに、ＴＧＦ−ベータは、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）などの肺高血圧症とも関連する。肺高血圧症の患者におけるＴＧＦ−ベータの増大した発現は、免疫組織化学により示され（Ｂｏｔｎｅｙら、１９９４年、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１４４巻：２８６〜２９５頁）、肺高血圧症患者からの血液及び肺ホモジェネートにおいても注目された（Ｓｅｌｉｍｏｖｉｃら、２００９年、Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ、３４巻：６６２〜６６８頁；Ｇｏｒｅら、ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ（２０１４年）、９巻（６号）：ｅ１００３１０頁）。ＴベータＲＩキナーゼ阻害剤も、肺高血圧症のモノクロタリン誘発モデルを阻害することが示された（Ｚａｉｍａｎら、２００８年、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１７７巻：８９６〜９０５頁）。肺高血圧症は、詳細に認識されているＩＰＦの合併症であり、これらのデータは、症状が、間質性線維症及び肺高血圧症の両方により進行を速められるＩＰＦ患者は、抗ＴＧＦ−ベータ療法が可能性としてさらにより効果的であり得た患者の亜集団である可能性があったという仮説を支持する。
【００１３】
それ故、治療に適用するために適切な３種類の全てのアイソフォームのＴＧＦ−ベータに結合して阻害することができるために、適切な及び／又は改善された抗体に対する必要性が、当技術分野において存在する。そのような抗体は、肺を適応症として治療するためにより効果的である可能性もあり、及び／又は吸入により送達されれば、副作用がより少なくなり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ＴＧＦ−ベータに特異的な新規な抗体及びそれらの結合フラグメント、特に拮抗性抗体及びフラグメントに関係する。
【００１５】
一態様において、重鎖を含む、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体が提供され、ここで、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。
【００１６】
一態様において、軽鎖を含むヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体が提供され、ここで、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。
【００１７】
本開示は、本明細書に記載する抗体又はフラグメントをコードするＤＮＡなどのポリヌクレオチドに拡大される。
【００１８】
宿主細胞を含む前記ポリヌクレオチドも提供される。
【００１９】
抗体又はそれらの結合フラグメントを発現させる方法が、本明細書で提供される。
【００２０】
本開示は、前記抗体又はそれらの結合フラグメントを含む医薬組成物にも関する。
【００２１】
一実施形態において、本明細書に記載する治療有効量の抗体、フラグメント又は組成物を投与することを含む治療方法が提供される。
【００２２】
本開示は、治療で、特に、癌及び／又は繊維症の疾患の治療で使用するための、本開示による抗体、結合フラグメント又は組成物にも拡大される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａ〜Ｉは、本開示のある種の抗体のアミノ酸及びポリヌクレオチド配列を示す図である。
【図１Ａ】抗体４８５６（配列番号１〜９）からのＣＤＲ配列を提供する図である。
【図１Ｂ】抗体４８５６についてウサギ配列（配列番号１０〜２５）を提供する図である。
【図１Ｃ】抗体４８５６についてマウス化配列（配列番号２６〜３３）並びにマウスのアクセプタ配列（配列番号３４〜３７）を提供する図である。
【図１Ｄ】抗体４８５６ｇＬ３について軽鎖配列（配列番号４５〜５１）及び可変領域配列（配列番号３８〜４４）を提供する図である。
【図１Ｅ】抗体４８５６ｇＨ１３についてＦａｂ重鎖配列（配列番号５９〜６５）及び可変領域配列（配列番号５２〜５８）を提供する図である。
【図１Ｆ】抗体４８５６ｇＨ２０についてＦａｂ重鎖配列（配列番号７３〜７９）及び可変領域配列（配列番号６６〜７２）を提供する図である。
【図１Ｇ】抗体４８５６ｇＨ２３について、Ｆａｂ重鎖配列（配列番号８７〜９３）及び可変領域配列（配列番号８０〜８６）を提供する図である。
【図１Ｈ】抗体４８５６ｇＨ２９について、Ｆａｂ重鎖配列（配列番号１０１〜１０７）及び可変領域配列（配列番号９４〜１００）を提供する図である。
【図１Ｉ】ヒト受容体のフレームワーク配列（配列番号１０８〜１１１）提供する図である。
【図２】抗体４８５６の様々な軽鎖及び重鎖（図２Ｂ）のアミノ酸配列のアラインメント（図２Ａ）及びアクセプタ配列を示す図である。
【図３Ａ】ヒト潜伏期と関連するペプチド及びＴＧＦ−ベータ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｂ】成熟ヒトＴＧＦ−ベータ１のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｃ】ヒトの潜伏期と関連するペプチド及びＴＧＦ−ベータ２のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｄ】成熟ヒトＴＧＦ−ベータ２のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｅ】ヒトの潜伏期と関連するペプチド及びＴＧＦ−ベータ３のアミノ酸配列を示す図である。
【図３Ｆ】成熟ヒトＴＧＦ−ベータ３のアミノ酸配列を示す図である。
【図４Ａ−４Ｃ】（Ａ）ＴＧＦ−ベータ１、（Ｂ）ＴＧＦ−ベータ２及び（Ｃ）ＴＧＦ−ベータ３のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイにおけるウサギ抗体４８５６Ｆａｂの効果を示す図である。
【図５】内因性ＢｘＰＣ３−ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子の共培養アッセイにおける４８５６ウサギＦａｂの効果を示す図である。
【図６】１０ｎＭのアドリアマイシンに対する応答における及び４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９又は対照Ｆａｂの増大濃度の存在におけるＨＲＭＣによるＥＣＭ堆積の画像を示す図である。
【図７Ａ−７Ｃ】アドリアマイシンで治療されたＨＲＭＣからの（Ａ）フィブロネクチン、（Ｂ）コラーゲンＩ及びＩＩＩ及び（Ｃ）コラーゲンＩＶの堆積に対する４８５６ＦａｂグラフトのｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９の効果を示す図である。
【図８】４８５６ＦａｂグラフトのｇＬ３ｇＨ１３及び対照Ｆａｂの増大する濃度の存在における、ＳＡＥｐＣ及びＩＰＦ線維芽細胞の共培養によるＥＣＭ堆積の画像を示す図である。
【図９Ａ−９Ｃ】ＳＡＥｐＣ及びＩＰＦ線維芽細胞の共培養からの（Ａ）フィブロネクチン、（Ｂ）コラーゲンＩ及びＩＩＩ、及び（Ｃ）コラーゲンＩＶの堆積に対する４８５６ＦａｂグラフトのｇＬ３ｇＨ１３及び対照Ｆａｂの効果を示す図である。
【図１０Ａ−１０Ｃ】ヒト腎臓近位の管状上皮細胞の単独培養からの、（Ａ）ＴＧＦ−ベータ１、（Ｂ）ＴＧＦ−ベータ２、及び（Ｃ）ＴＧＦ−ベータ３により誘発されたフィブロネクチン堆積の阻害に対する４８５６ＦａｂグラフトのｇＬ３ｇＨ１３の効果を示す図である
【図１０Ｄ】ヒト腎臓近位の管状上皮細胞及びヒト腎臓線維芽細胞の共培養からのフィブロネクチン堆積の阻害に対する４８５６ＦａｂグラフトのｇＬ３ｇＨ１３の効果を示す図である。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ヒト腎臓近位の管状上皮細胞の単独培養からのＴＧＦ−ベータ１により誘発された（Ａ）コラーゲンＩ及びＩＩＩ、（Ｂ）コラーゲンＶの堆積の阻害に対する４８５６ＦａｂグラフトのｇＬ３ｇＨ１３の効果を示す図である。
【図１２】ブレオマイシンを用いた攻撃後７日におけるマウスにおけるＰＡＩ−１の発現に対する、指示された４８５６Ｆａｂを鼻腔内投与した効果の比較を示す図である。
【図１３】ブレオマイシンを用いた攻撃後７日におけるマウスにおけるＰＡＩ−１の発現に対する、鼻内投与された４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂの投与量の比較を示す図である。
【図１４Ａ−Ｂ】（Ａ）ブレオマイシンによって誘発されたコラーゲンの堆積（ＰＳＲ染色）及び（Ｂ）肺中におけるヒドロキシプロリン含量に対する、１〜２８日鼻内投与された４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂの効果を示す図である。
【図１５Ａ−Ｂ】Ａ）ブレオマイシンによって誘発されたコラーゲンの堆積（ＰＳＲ染色）及びＢ）肺中におけるヒドロキシプロリン含量に対する、１３〜２８日鼻内投与された４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂの効果を示す図である。
【図１６Ａ−Ｂ】肺中におけるブレオマイシンによって誘発された筋線維芽細胞分化に対する、Ａ）１〜２８日、又はＢ）１３〜２８日鼻内投与された４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂの効果を示す図である。
【図１７Ａ−Ｂ】１型コラーゲンを発現する細胞におけるブレオマイシンによって誘発されたｐＳｍａｄ２／３発現に対する、Ａ）１〜２８日、又はＢ）１３〜２８日鼻内投与された４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂの効果を示す図である。
【図１８Ａ】４８５６ＦａｂｇＬ３ｇＨ１３との相互作用に関与する残基（下線付き）及びＴベータＲＩ及びＴベータＲＩＩとの相互作用に必須の残基（太字）を有する成熟ヒトＴＧＦ−ベータ１の配列（配列番号１１４）を、結晶学のデータを使用して４Åの分解能で示す図である。
【図１８Ｂ】４８５６ＦａｂｇＬ３ｇＨ１３との相互作用に関与する残基（下線付き）及びＴベータＲＩ及びＴベータＲＩＩとの相互作用に必須の残基（太字）を有する成熟ヒトＴＧＦ−ベータ１の配列（配列番号１１４）を、結晶学のデータを使用して５Åの分解能で示す図である。
【図１８Ｃ】成熟ヒトＴＧＦ−ベータ２の配列を示す（配列番号１１６）図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示の抗体は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３に結合する。一実施形態において、本開示の抗体は、成熟ＴＧＦ−ベータ、成熟ＴＧＦ−ベータ１（配列番号１１４）、成熟ＴＧＦ−ベータ２（配列番号１１５）及び成熟ＴＧＦ−ベータ３（配列番号１１８）の３種類の全てのアイソフォームと結合する。一実施形態において、本開示の抗体は、成熟ＴＧＦ−ベータ、成熟ＴＧＦ−ベータ１（配列番号１１４）のホモダイマー、成熟ＴＧＦ−ベータ２（配列番号１１５）のホモダイマー及び成熟ＴＧＦ−ベータ３（配列番号１１８）のホモダイマー３種類のアイソフォームの各ホモダイマーと結合する。一実施形態において、本開示の抗体は、配列番号１１３、配列番号１１５及び配列番号１１７で示した、潜伏期と関連するペプチド（ＬＡＰ）を含むＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の潜在的形態と結合しない。
【００２５】
一実施形態において、本明細書に記載する抗体は拮抗する。本明細書において使用する用語「拮抗性抗体」は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の生物学的シグナル伝達活性を、例えば、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３のＴベータＲＩ及び／又はＴベータＲＩＩに対する結合を、阻止するか又は結合を実質的に低減することにより、阻害及び／又は中和して、したがってＴＧＦ−ベータと受容体の複合体の形成及び活性化を阻害することができる抗体を記載する。
【００２６】
ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の生物学的シグナル伝達活性を阻害及び／又は中和する抗体の能力を決定するために適切なアッセイは、本明細書中の実施例に記載されており、例えば、例１及び例２に記載された組換えＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３を使用するＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイ、又は例３に記載されたＢｖＰＣによるＴＧＦ−ベータ３細胞の産生により推進されるＢｘＰＣ３とＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子の共培養アッセイが記載されている。
【００２７】
一実施形態において、本発明の抗体分子は、組換えＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２又はＴＧＦ−ベータ３のＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイにおいて、阻害活性を有し、ここで、該抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータ１の活性を、０．５ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害し、ヒトＴＧＦ−ベータ２の活性を、０．０５ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害し、及びヒトＴＧＦ−ベータ３の活性を、２ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害する。一実施形態において、該抗体は、内因性ＴＧＦ−ベータのＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイにおいて、ＴＧＦ−ベータを、１０ｎＭ以上のＩＣ５０で阻害する。
【００２８】
本発明の抗体分子は、高い結合親和性を有することが適切である。親和性は、表面プラズモン共鳴などの技法を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、例えば、本明細書中の実施例に記載された、単離された天然の又は組換えのＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３又は適切な融合タンパク質／ポリペプチドを使用して測定することができる。一実施形態において、本発明の抗体分子は、以下のオーダーの結合親和性、ヒトＴＧＦ−ベータ１について最高、ヒトＴＧＦ−ベータ２がそれに続き、及びヒトＴＧＦ−ベータ３について最低の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒトＴＧＦ−ベータ１について１０から３０時間、例えば１５から２５時間の結合親和性を有し、ヒトＴＧＦ−ベータ３についての結合親和性より高い。一実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒトＴＧＦ−ベータ２について、２から２０時間、例えば５から１５時間の結合親和性を有し、ヒトＴＧＦ−ベータ３についての結合親和性より高い。
【００２９】
適切には、本発明の抗体分子は、単離されたヒトＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３に対して、約２０００ｐＭ又は２０００ｐＭ未満の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒトＴＧＦ−ベータ１に対して、５００ｐＭ未満、例えば２００ｐＭ未満又は１００ｐＭ未満の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒトＴＧＦ−ベータ２に対して、５００ｐＭ未満、例えば、３００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の抗体分子は、ヒトＴＧＦ−ベータ３に対して、３０００ｐＭ未満、例えば、２５００ｐＭ未満、２０００ｐＭ未満の結合親和性を有する。
【００３０】
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータ１に対して１００ｐＭ未満の結合親和性、ヒトＴＧＦ−ベータ２に対して２００ｐＭ未満の結合親和性、及びヒトＴＧＦ−ベータ３に対して２０００ｐＭ以上の結合親和性を有する。
【００３１】
親和性の数値が低いほど、ＴＧＦ−ベータのアイソフォームに対する抗体又はフラグメントの親和性は高い。
【００３２】
本発明者らは、ヒト化抗体を含む新しい抗ＴＧＦ−ベータ抗体を用意した。該抗体は、成熟ＴＧＦ−ベータ１及び成熟ＴＧＦ−ベータ２を用いたウサギの免疫化から発生した。
【００３３】
抗体可変ドメインにおける残基は、Ｋａｂａｔら、１９８７年により考案されたシステムに従って慣習的にナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（以降「Ｋａｂａｔら（上述）」）に記載されている。別段の指摘がなければ、本明細書ではこのナンバリングシステムを用いる。
【００３４】
Ｋａｂａｔ残基の呼称は、アミノ酸残基の直鎖のナンバリングと必ずしも直接的に対応するわけではない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであっても、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であっても、構成成分の短縮又は構成成分中への挿入に相当する、厳密なＫａｂａｔナンバリングにおけるよりも少数の、又は付加的なアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基を、「標準の」Ｋａｂａｔナンバリングした配列とアラインメントすることにより、所与の抗体ごとに決定することができる。
【００３５】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａによると（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１〜９１７頁（１９８７年））、ＣＤＲ−Ｈ１に等価なループは残基２６から残基３２まで伸長する。よって、別段の指摘がなければ、本明細書で用いる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジーのループ定義との組合せによって記載される通り、残基２６から３５を指すものとされる。
【００３６】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００３７】
本開示で使用するための抗体は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して得ることができる。融合タンパク質を含むＴＧＦ−ベータポリペプチド／タンパク質、該ポリペプチドを（組換えで又は天然で）発現する細胞は、ＴＧＦ−ベータを特異的に認識する抗体を産生するために使用することができる。該ポリペプチドは、配列番号１１３、１１５及び１１７で示されたＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の「成熟」ポリペプチド又はそれらの生物学的に活性なフラグメント又は誘導体であることができる。宿主を免疫化するのに用いるためのポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から、当技術分野ではよく知られている方法によって調製してもよく、又は天然の生物学的供給源から回収してもよい。本開示では、「ポリペプチド」の用語には、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質が含まれる。これらは、別段の指摘がなければ、交換可能に用いられる。ＴＧＦ−ベータポリペプチドは、場合によっては、より大きいタンパク質、例えば、親和性タグ、リーダー配列、又は他の配列に融合している融合タンパク質などの一部であってもよい。
【００３８】
ＴＧＦ−ベータポリペプチドに対して産生された抗体を得てもよく、この場合、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト動物に、よく知られている、ルーチンのプロトコールを用いて投与することにより、動物を免疫化することが必要であり、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編集）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６年）を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタなどの多くの温血動物を免疫化してもよい。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが、全般的に最も適切である。
【００３９】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻、７２頁）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．）など、当技術分野では知られている任意の方法により調製してもよい。
【００４０】
抗体は、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、７８４３〜７８４８頁；ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ０４／０５１２６８、及び国際特許出願第ＷＯ０４／１０６３７７号によって記載されている方法などにより、特異的な抗体を生成するために選択された単一のリンパ球から産生された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニング及び発現させることにより、単一リンパ球抗体方法を用いてやはり産生してもよい。
【００４１】
抗体に対するスクリーニングは、ヒトＴＧＦ−ベータへの結合を測定するアッセイ、及び／又は受容体に対するリガンド結合をブロックする能力を測定するアッセイを用いて行うことができる。適切なアッセイの例を、本明細書で実施例に記載する。
【００４２】
本明細書で用いる「特異的」は、それに対して抗体が特異的である抗原のみを認識する抗体、又はそれに対して抗体が非特異的である抗原への結合に比べて、それに対して抗体が特異的である抗原に対して著しく高い結合親和性、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を指すものとされる。
【００４３】
本開示によるある種の抗体のアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列を、図１及び２に示す。
【００４４】
本発明の一態様において、抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する重鎖を含む拮抗性抗体であり、ここで、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。好ましくは重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列を含む。
【００４５】
本発明の第２の態様において、抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する、軽鎖を含む拮抗性抗体であり、ここで、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。好ましくは、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を含む。
【００４６】
本発明の抗体分子は、相補性軽鎖又は相補性重鎖を、それぞれ含むことが適切である。
【００４７】
一実施形態において、本発明の抗体は、上で定義された重鎖を含み、それに加えて軽鎖を含む、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であり、ここで、軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む。軽鎖の可変ドメインは、好ましくは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を含む。
【００４８】
一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体であり、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９に示す配列を含み；軽鎖の可変ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を含む。
【００４９】
ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３に対して結合する抗体の能力、及びＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の活性を中和する能力を有意に変化させずに、１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失が、本発明により提供されるＣＤＲに対して行われ得ることが理解されよう。任意のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失の効果は、当業者により、例えば、本明細書に記載する方法、特に実施例で例示された方法を使用することにより、容易に試験されて、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の結合、並びにＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３と受容体の相互作用の阻害を決定することができる。一実施形態においては、少なくとも１つのアミノ酸が：
ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３の任意の１つ；
ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ２、ＣＤＲ−Ｈ１及びＨ３、ＣＤＲ−Ｈ１及びＬ１、ＣＤＲ−Ｈ１及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ２及びＨ３、ＣＤＲ−Ｈ２及びＬ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ２及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ３及びＬ１、ＣＤＲ−Ｈ３及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ３及びＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１及びＬ２、ＣＤＲ−Ｌ１及びＬ３、ＣＤＲ−Ｌ２及びＬ３；
ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＨ３、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＬ１、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３及びＬ１、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ３、Ｌ１及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ３、Ｌ１及びＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３の任意の組合せの１つ；
ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＬ１、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＨ１、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＨ２、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＨ３、ＣＤＲ−Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ２、
ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１及びＬ２、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１及びＬ３、ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ２及びＬ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ２、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ３、ＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ２及びＨ３の任意の組合せの１つ；並びに
ＣＤＲ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の組合せ
から独立になる群から選択される１つ又は複数のＣＤＲで保存的置換により置き換えられる。
【００５０】
したがって、本発明は、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸、例えば、本明細書において下で規定される類似のアミノ酸で置換された、ＣＤＲＨ−１（配列番号４）、ＣＤＲＨ−２（配列番号５）、ＣＤＲＨ−３（配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９）、ＣＤＲＬ−１（配列番号１）、ＣＤＲＬ−２（配列番号２）及びＣＤＲＬ−３（配列番号３）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体を提供する。
【００５１】
一実施形態において、本発明は、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸が、例えば本明細書において下で規定される類似の別のアミノ酸で置換された、ＣＤＲＨ−１（配列番号４）、ＣＤＲＨ−２（配列番号５）、ＣＤＲＨ−３（配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９）、ＣＤＲＬ−１（配列番号１）、ＣＤＲＬ−２（配列番号２）及びＣＤＲＬ−３（配列番号３）を含む、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体を提供する。
【００５２】
一実施形態において、本明細書で開示された重鎖のドメインは、１、２、３又は４個の保存的アミノ酸置換を有する配列を含み、例えば、置換はフレームワーク中である。
【００５３】
一実施形態において、重鎖の可変領域のフレームワークは、挿入され、欠失され、置換された又はそれらが組み合わされた１、２、３、又は４個のアミノ酸を含む。一実施形態において、置換されたアミノ酸は、ドナー抗体からの対応するアミノ酸である。
【００５４】
一実施形態において、本明細書で開示された軽鎖の可変領域は、１、２、３又は４個の保存的アミノ酸置換を有する配列を含み、例えば、置換は、フレームワーク中である。
【００５５】
一実施形態において、軽鎖可変領域のフレームワークは、挿入され、欠失され、置換され又はそれらが組み合わされた１、２、３又は４個のアミノ酸を含む。一実施形態において、置換されたアミノ酸は、ドナー抗体からの対応するアミノ酸である。
【００５６】
本発明の一態様において、抗ＴＧＦ−ベータ抗体又はその結合フラグメントが提供され、ここで、重鎖の可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｈ１の配列は、配列番号４に示す配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｈ２の配列は、配列番号５に示す配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の同一性又は類似性を有し、及びＣＤＲ−Ｈ−３の配列は、配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９に示す配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性又は類似性を有する。好ましくは、抗ＴＧＦ−ベータ抗体又はその結合フラグメントは、それに加えて軽鎖を含み、ここで、軽鎖の可変ドメインは、３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１の配列は、配列番号１に示す配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性又は類似性を有し、ＣＤＲ−Ｌ２の配列は、配列番号２に示す配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性又は類似性を有し、及びＣＤＲ−Ｌ３の配列は、配列番号３に示す配列に少なくとも６０％同一性又は類似性を有する。
【００５７】
一実施形態において、可変領域は、本明細書で開示された可変領域配列に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性又は類似性を以て提供される。
【００５８】
一実施形態において、本発明は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体を提供し、抗体は、配列番号１１４のアミノ酸２４〜３５及び任意選択により配列番号１１４のアミノ酸９０〜９５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一である配列と接触する。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１１４と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列と接触する。一実施形態において、抗体は、配列番号１１４のアミノ酸６０、９７及び１０１の少なくとも１つとさらに接触する。さらなる実施形態において、抗体は、本明細書で提供されるアミノ酸以外のアミノ酸とも接触する。「接触する（contacts）」又は「接触している（contacting）」により、相互作用が、標準Ｘ線結晶学技法を、適切な分解能、例えば５Å又は４Åなどで使用して検出され得ることが意味される。
【００５９】
別の実施形態では、ＴベータＲＩ及び／又はＴベータＲＩＩに対する結合について、本発明の抗体又はフラグメントの結合と競合する抗ＴＧＦ−ベータ抗体が提供される。
【００６０】
一実施形態において、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２、ＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９の配列に示す６つのＣＤＲを含む抗体の結合をクロスブロックする抗ＴＧＦ−ベータ抗体が提供され、特に、クロスブロックはアロステリックである。
【００６１】
一実施形態において、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２、ＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５及び配列番号６又は配列番号７又は配列番号８、又はＣＤＲ−Ｈ３については配列番号９の配列に示す６つのＣＤＲを含む抗体の結合をクロスブロックする抗ＴＧＦ−ベータ抗体が提供され、特に、該抗体は、それがブロックする抗体と同じエピトープによる結合により結合をクロスブロックする。
【００６２】
一実施形態において、抗体又は結合フラグメントは、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ科の動物又は他の哺乳動物種からのものである。例えば、抗体又は結合フラグメントは、ウサギからであってもよい。そのような抗体の可変領域の例は、配列番号１０〜１７で提供される。
【００６３】
一実施形態において、抗体又は結合フラグメントはキメラである。一般的に、キメラ抗体又は結合フラグメントは、２種以上の種からのエレメントを含むが、その種のある一定の特性を保持する。例えば、キメラ抗体又は結合フラグメントは、１つの種、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は他の哺乳動物などの種からの可変領域、及び別の種、例えばヒトからの定常領域の全部又は一部を含むこともできる。
【００６４】
一実施形態において、本発明による抗体又は結合フラグメントはヒト化されたものである。
【００６５】
本明細書において使用する用語「ヒト化抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプタ抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域のフレームワーク中にグラフト化されているドナー抗体（例えばマウスのモノクローナル抗体）（例えばヒト抗体）からの１つ又は複数のＣＤＲを含む（所望であれば、１又はそれを超える修飾されているＣＤＲを含む）抗体（単数又は複数）分子を指す（例えば米国特許第５，５８５，０８９号；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）。概説には、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻、５３５〜５３９頁、１９９８年を参照されたい。一実施形態において、ＣＤＲ全体を移動させるよりもむしろ、本明細書上記に記載するいずれか１つのＣＤＲから１つ又は複数の特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻、２５〜３４頁を参照されたい）。一実施形態において、本明細書上記に記載する１つ又は複数のＣＤＲから、特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。別の一実施形態において、本明細書上記に記載する各ＣＤＲから、特異性決定残基のみを、ヒト抗体フレームワークに移動させる。ＣＤＲ又は特異性決定残基をグラフト化する場合、マウス、霊長動物、及びヒトのフレームワーク領域を含めた、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプに関して、任意の好適なアクセプタ可変領域フレームワーク配列を用いることができる。
【００６６】
適切には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプタフレームワーク領域、及び本明細書に特に提供する１つ又は複数のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。よって、一実施形態において、可変ドメインがヒトアクセプタフレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、ヒトＴＧＦ−ベータ1、ＴＧＦ−ベータ２、及びＴＧＦ−ベータ３に結合するヒト化抗体を提供する。
【００６７】
本発明において用いることができるヒトフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、上述）がある。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に用いることができ、ＲＥＩは軽鎖に用いることができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方に用いることができる。或いは、ヒト生殖系列配列を用いてもよく、ヒト生殖系列配列はｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ又はｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ、どちらも最終アクセス２０１６年１月７日、で入手できる。
【００６８】
本発明のヒト化抗体では、アクセプタ重鎖及び軽鎖は必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合性の鎖を含むことができる。
【００６９】
一実施形態において、ヒトフレームワークは、１、２、３、又は４個のアミノ酸の置換、付加又は欠失、例えば、ドナー残基の１、２、３又は４個の保存的置換（単数又は複数）を含む。
【００７０】
一実施形態において、ヒトフレームワークとして使用される配列は、本明細書で開示された配列に８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超えて類似しているか又は同一である。
【００７１】
本発明のヒト化抗体の重鎖に対する適切なフレームワーク領域の１つは、ＪＨ５（配列番号１１１）とともにヒト亜群ＶＨ３配列ＩＧＨＶ３〜２１に由来する。
【００７２】
本発明のヒト化抗体の軽鎖に適する適切なフレームワーク領域は、ＪＫ４（配列番号１０９）とともにヒト亜群ＶＫ１配列ＩＧＫＶ１〜５配列に由来する。
【００７３】
したがって、一例において、ヒト化抗体を含むＣＤＲ−Ｈ１については配列番号４に示す配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号５に示す配列、及びＣＤＲ−Ｈ３については配列番号６又は配列番号７又は配列番号８又は配列番号９に示す配列が提供され、ここで、重鎖フレームワーク領域は、ヒト亜群ＶＨ３配列ＩＧＨＶ３〜２１からＪＨ５（配列番号１１１）と一緒に由来する。
【００７４】
一例において、抗体の重鎖の可変ドメインは、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０又は配列番号９４に示す配列を含む。
【００７５】
本発明のヒト化抗体の軽鎖として適切なフレームワーク領域は、ヒト生殖細胞系列の亜群ＶＫ１配列ＩＧＫＶ１〜５配列からＪＫ４（配列番号１０９）と一緒に由来する。
したがって、一例において、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号１に示す配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号２に示す配列、及びＣＤＲ−Ｌ３については配列番号３に示す配列を含むヒト化抗体が提供され、ここで、軽鎖のフレームワーク領域は、ヒト亜群ＶＫ１配列ＩＧＫＶ１〜５配列からＪＫ４（配列番号１０９）と一緒に由来する。
一例において、抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号３８に示す配列を含む。
【００７６】
本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプタ抗体の配列と正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、稀な残基は、アクセプタ鎖のクラス又はタイプに対してより頻繁に生じる残基に変化してもよい。或いは、アクセプタフレームワーク領域における選択された残基は、これらがドナー抗体における同じ位置に見出される残基に対応するように変化してもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２４頁を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小に維持しなければならない。変化する必要があり得る、アクセプタフレームワーク領域における残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に記載されている。
【００７７】
本明細書で用いるドナーの残基とは、ＣＤＲを供与した非ヒト抗体（例えばマウスの又はウサギ抗体）からの残基を指す。
【００７８】
一実施形態において、重鎖の可変ドメインが如何なるドナーの残基も含まないヒト化抗体が提供される。
【００７９】
同様に、一実施形態において、「マウス化」抗体又は結合フラグメントが提供される。そのような抗体又は結合フラグメントは、ウサギのドナー及びマウスの受容体を有していてもよい。そのような抗体の例は、配列番号２６〜３３で提供される。マウスのアクセプタ配列の例は、配列番号３４〜３７で提供される。
【００８０】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０又は配列番号９４に示す重鎖の可変ドメイン配列を含む重鎖、及び配列番号３８に示す軽鎖の可変ドメイン配列を含む軽鎖を有する、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体を提供する。
【００８１】
一実施形態において、本開示は、本明細書で開示された配列と８０％、例えば、関係する配列の一部又は全部にわたって８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれを超えて、類似の又は同一の抗体配列を提供する。一実施形態において、関連の配列は配列番号５２、配列番号６６、配列番号８０又は配列番号９４である。一実施形態において、関連の配列は配列番号３８である。
【００８２】
本明細書で用いる「同一性」は、アラインした配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で同一であることを指摘する。本明細書で用いる「類似性」は、アラインした配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基が、配列間で類似のタイプであることを指摘する。例えば、ロイシンは、イソロイシン又はバリンに対して置換することができる。相互にしばしば置換することができる他のアミノ酸には、それだけには限定されないが、以下が含まれる：
−  フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
−  リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びに
−  システイン及びメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）。同一性及び類似性の度合いは、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編集、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年、ＮＣＢＩから入手できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウエア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻：２６６〜２７２頁、Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６巻：１３１〜１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７巻：６４９〜６５６頁）。
【００８３】
本発明の抗体分子は、全長の重鎖及び軽鎖を有する完全な抗体分子又はそれらの結合フラグメントを含むことができ、Ｆａｂ、修飾されているＦａｂ、Ｆａｂ’、修飾されているＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、２価、３価又は４価の抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ、及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントであってもよいが、これらに限定されない（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ、  ２００５、  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２３巻（９）、１１２６〜１１３６頁；Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、２巻（３）、２０９〜２１７頁を参照されたい）。これらの抗体フラグメントを創出及び製造するための方法は当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６巻、１６５〜１８１頁を参照されたい）。本発明で用いるための他の抗体フラグメントには、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、ＷＯ０５／００３１７０、及びＷＯ０５／００３１７１に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、二特異的など、多重の特異性を含むことができ、又は単一特異性でもよい（例えば、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照されたい）。
【００８４】
本明細書で用いる抗体の結合フラグメントは、そのフラグメントを抗原に対して特異的であると特徴づける親和性を以て抗原に結合することができるフラグメントを指す。
【００８５】
一実施形態において、本開示による抗体は、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されたような、免疫グロブリンの一部、例えばＦａｂ又はＦａｂ’フラグメント、及びそれらに直接又は間接的に連結された１つ又は２つの単鎖ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含むＴＧＦ−ベータ結合抗体融合タンパク質として提供される。
【００８６】
一実施形態において、融合タンパク質は、例えば、任意選択によりジスルフィド結合により連結された可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）の対形成として、２ドメイン抗体を含む。
【００８７】
一実施形態において、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’エレメントは、単一ドメイン抗体（単数又は複数）と同じか又は類似の特異性を有する。一実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’は、単一ドメイン抗体（単数又は複数）と異なる特異性を有する、即ち、融合タンパク質は多価である。一実施形態において、本発明による多価融合タンパク質は、アルブミン結合部位を有し、例えば、それにおけるＶＨ／ＶＬ対は、アルブミン結合部位を提供する。
【００８８】
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在するならば、抗体分子の提案された機能、及び特に必要とされうるエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭのドメインであってもよい。特に、ヒトＩｇＧの定常領域ドメインは、特に、抗体分子が治療用途を意図されており、及び抗体のエフェクター機能が必要とされる場合には、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプが使用され得る。或いは、抗体分子が、治療目的のためを意図されて、抗体エフェクター機能は必要とされない、例えば、単にＴＧＦ−ベータ活性をブロックするだけを意図される場合には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することもできる。
【００８９】
これらの定常領域のドメインの配列バリアントも使用され得ることが理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌら、１９９３年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３年、３０巻：１０５〜１０８頁に記載されたように、２４１の位置におけるセリンがプロリンに替えられたＩｇＧ４分子を使用することもできる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体はＳ２４１Ｐの突然変異を含むこともある。
【００９０】
抗体が、翻訳後に様々な修飾を受けることもあることは、当業者により理解されると予想される。これらの修飾のタイプ及び程度は、抗体を発現させるために使用された宿主細胞系統並びに培養条件にしばしば依存する。そのような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパルタート異性化及びアスパラギン脱アミド化における変動を含むこともある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用に基づくカルボキシ末端の塩基性残基の喪失である（リシン又はアルギニンなど）（Ｈａｒｒｉｓ、ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５巻：１２９〜１３４頁、１９９５年に記載されたように）。しかしながら、本発明の実施形態Ａｂ４８５６の重鎖又は軽鎖のいずれにもＣ末端リシンがない。
【００９１】
一例において、本明細書で提供される１つ又は複数のＣＤＲは、望ましくない残基又は部位、例えば、システイン残基又はアスパラギン酸（Ｄ）異性化部位又はアスパラギン（Ｎ）脱アミド化部位を除去するように、修飾することもできる。
【００９２】
例えば、ＣＤＲのいずれか１つにおける１つ又は複数のシステイン残基が、セリンなどの別のアミノ酸で置換されていてもよい。
【００９３】
一例において、アスパラギンの脱アミド化部位は、１つ又は複数のＣＤＲから、アスパラギン残基（Ｎ）及び／又は隣接残基を、任意の他の適切なアミノ酸に突然変異させることにより、除去されていてもよい。一例において、アスパラギンのＮＧ又はＮＳなどの脱アミド化部位は、例えばＮＡ又はＮＴに突然変異されてもよい。
【００９４】
一例において、アスパラギン酸の異性化部位は、１つ又は複数のＣＤＲから、アスパラギン酸残基（Ｄ）及び／又は隣接残基を、任意の他の適切なアミノ酸に突然変異させることにより除去されていてもよい。一例において、ＤＧ又はＤＳなどのアスパラギン酸の異性化部位は、例えばＥＧ、ＤＡ又はＤＴに突然変異されていてもよい。
【００９５】
一例において、ＮＬＳなどのＮ−グリコシル化部位は、アスパラギン残基（Ｎ）を任意の他の適切なアミノ酸、例えばＳＬＳ又はＱＬＳに突然変異させることにより除去されていてもよい。一例において、ＮＬＳなどのＮ−グリコシル化部位は、セリン残基（単数又は複数）を、トレオニン（Ｔ）以外の任意の他の残基に突然変異させることにより除去されていてもよい。
【００９６】
一実施形態において、抗体の重鎖は、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体の軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
【００９７】
一実施形態において、抗体の重鎖は、ＣＨ１ドメインを含み、抗体の軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
【００９８】
一実施形態において、本発明により提供される抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータに対する特異性を有する拮抗性抗体であり、重鎖の定常領域が修飾されているヒンジ領域を含む。したがって、本発明は、重鎖が、配列番号５９、配列番号７３、配列番号８７又は配列番号１０１に示す配列を含むか又はそれらからなる抗体を提供する。
【００９９】
本発明は、軽鎖が、配列番号４５に示す配列を含むか又はそれらからなる抗体も提供する。
【０１００】
本発明により提供される抗体は、配列番号５９、配列番号７３、配列番号８７又は配列番号１０１に示す配列を含む重鎖、及び配列番号４５に示す配列を含む軽鎖を有する。
【０１０１】
重鎖及び軽鎖が、配列番号５９、配列番号７３、配列番号８７又は配列番号１０１に示す配列を含む重鎖、配列番号４５に示す配列を含む軽鎖と、少なくとも８０％（好ましくは８５％、９０％、９５％，９６％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える）同一又は類似の、抗ＴＧＦ−ベータ抗体又はその結合フラグメントも提供される。一実施形態において、軽鎖は、配列番号４５に示す配列を有するか又はそれからなり、重鎖は、配列番号５９、配列番号７３、配列番号８７又は配列番号１０１に示す配列を有するか又はそれらからなる。別の実施形態において、軽鎖は、配列番号４５の配列を有するか又はそれからなり、重鎖は、配列番号５９の配列を有するか又はそれからなる。
【０１０２】
本発明により提供される抗体、特に重鎖配列ｇＨ１３（配列番号５９）及び／又は軽鎖配列ｇＬ３（配列番号４５）を含む抗体４８５６が結合した、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２又は３の特定の領域又はエピトープも、本発明により提供される。
【０１０３】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、２、又は３ポリペプチドのこの特定の領域又はエピトープは、当技術分野で公知の任意の適切なエピトープマッピング方法により、本発明により提供される抗体のいずれか１つとの組合せで同定することができる。そのような方法の例は、抗体により認識されるエピトープの配列（例えば、約５から２０、好ましくは約７アミノ酸の長さの領域中のペプチド）を含む抗体に特異的に結合することができる最小のフラグメントで、本発明の抗体に結合する、ＴＧＦ−ベータに由来する、長さが変化するペプチドのスクリーニングを含む。ＴＧＦ−ベータペプチドは、合成で又はＴＧＦ−ベータポリペプチドのタンパク質分解消化により産生され得る。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分析法により同定することができる。別の例では、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を、本発明の抗体が結合したエピトープを同定するために使用することができる。同定されれば、本発明の抗体に結合するエピトープのフラグメントは、必要であれば、同じエピトープに結合する追加の抗体を得るために、免疫原として使用することができる。
【０１０４】
本発明による抗体特に、重鎖配列（配列番号５９）及び軽鎖配列（配列番号４５）を含む抗体の結合をクロスブロックする抗体は、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３の活性に拮抗することにおいて、同様に有用であり得る。したがって、本発明は、上で記載された抗体のいずれか１つの、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３に対する結合のクロスブロック及び／又はこれらの抗体の任意の１つとの結合により、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３と結合することからクロスブロックされる、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する特異性を有する、拮抗性抗体も提供する。一実施形態において、そのような抗体は、上で本明細書に記載する抗体と同じエピトープに結合する。別の実施形態において、クロスブロックして中和する抗体は、上で本明細書に記載する抗体が結合したエピトープと接触及び／又は重複するエピトープに結合する。別の実施形態において、本発明のこの態様の、クロスブロックして中和する抗体は、前記エピトープと接触及び／又は重複する本発明の抗体又はエピトープと同じエピトープに結合しない。
【０１０５】
クロスブロックする抗体は、当技術分野における任意の適切な方法を使用して、例えば、クロスブロックする抗体のヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３に対する結合が本発明の抗体の結合を防止するか又はその逆もある競合ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用することにより、同定され得る。
【０１０６】
一実施形態において、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する特異性を有する拮抗性抗体が提供され、それは、重鎖が配列番号５９で示される配列を含み、軽鎖が配列番号４５で示される配列を含む抗体の、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する結合をクロスブロックする。一実施形態において、本発明により提供されるクロスブロックする抗体は、配列番号５９で示される重鎖配列及び配列番号４５で示される軽鎖配列を含む抗体の結合を、８０％を超えて、例えば８５％を超えて、例えば９０％を超えて、特に９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて又はそれを超えて阻害する。
【０１０７】
或いは又はそれに加えて、本発明のこの態様による拮抗性抗体は、配列番号５９で示される重鎖配列及び配列番号４５で示される軽鎖配列を含む抗体により、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する結合をクロスブロックされ得る。それ故、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に結合することを、配列番号５９で示される重鎖配列及び配列番号４５で示される軽鎖配列を含む抗体によりクロスブロックされる、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する特異性を有する拮抗性抗体分子も提供される。一実施形態において、本発明のこの態様により提供される拮抗性抗体は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、２及び３に結合することを、配列番号５９で示される重鎖配列及び配列番号４５で示される軽鎖配列を含む抗体により、８０％を超えて、例えば、８５％を超えて、例えば９０％を超えて、特に９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて又はそれを超えて阻害される。
【０１０８】
一実施形態において、本発明により提供されるクロスブロックする抗体は、完全にヒト抗体である。一実施形態において、本発明により提供されるクロスブロックする抗体はヒト化抗体である。一実施形態において、本発明の抗体は、例えば、霧化による吸入送達に適する。一例において、本発明の抗体の物理的性質、例えば、結合親和性及び力価は、霧化により実質的に変化しない。一例において、本発明の抗体は非常に安定である。抗体の安定性の１つの測定は、融解温度（Ｔｍ）である。融解温度は、当技術分野で公知の任意の適切な方法により、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（Ｅｒｉｃｓｓｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５７（２００６年）２８９〜２９８頁）又はＤＳＣ（示差走査熱量測定）を使用して決定することができる。好ましくは、本発明により提供される抗体は、典型的には、少なくとも７５℃の高い融解温度（Ｔｍ）を有する。一例において、本発明の抗体は、少なくとも７５℃のＴｍを有する。一例において、本発明の抗体は、少なくとも７７℃のＴｍを有する。一例において、本発明の抗体は、少なくとも７９℃のＴｍを有する。
【０１０９】
抗体又はフラグメントなどの生物学的分子は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含み、それによって分子に正味の正又は負の電荷を与える。全体的に「観察される」電荷の量は、実体の絶対的なアミノ酸配列、３Ｄ構造において荷電している基の局所環境、及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又は溶媒が接近できるその表面が正味の電荷を保有しないｐＨである。一例において、本発明のＴＧＦ−ベータ抗体及びフラグメントを、好適な等電点を有するように操作してもよい。これにより、より頑強な性質、特に適切な溶解性及び／若しくは安定性のプロファイル、並びに／又は改善された精製の特徴を有する抗体及び／若しくはフラグメントがもたらされ得る。
【０１１０】
よって、一態様において、本発明は、初めに同定された抗体の等電点と異なる等電点を有するように操作した、ヒト化ＴＧＦ−ベータ抗体を提供する。抗体は、例えば、酸性アミノ酸残基を、１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基で置き換えるなど、アミノ酸残基を置き換えることにより操作してもよい。或いは、塩基性アミノ酸残基を導入してもよく、又は酸性アミノ酸残基を除去してもよい。或いは、分子が、容認できないほど高いｐＩ値を有する場合は、必要に応じて、酸性残基を導入してｐＩを下げてもよい。ｐＩを操作する場合、抗体又はフラグメントの所望の活性を保持するよう注意を払わなければならないことが重要である。よって、一実施形態において、操作した抗体又はフラグメントは、「非修飾の」抗体又はフラグメントと同じ又は実質的に同じ活性を有する。
【０１１１】
＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ（２０１５年１２月２１日にアクセス）などのプログラムを用いて、抗体又はフラグメントの等電点を予想してもよい。
【０１１２】
一実施形態において、クロスブロックする抗体は、少なくとも７、例えば、少なくとも８、例えば８．５、８．６、８．７、８．８又は８．９又は少なくとも９、例えば９．０、９．１、９．２、９．３又は９．４の等電点を有する。
【０１１３】
本発明が提供する抗体の親和性は、当技術分野では知られている任意の適切な方法を用いて変更してもよいことを理解されよう。したがって、本発明は、ＦｃＲｎに対する改善された親和性を有する、本発明の抗体分子のバリアントにも関する。このようなバリアントは、ＣＤＲの変異を含めたいくつかの親和性成熟のプロトコール（Ｙａｎｇら、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４巻、３９２〜４０３頁）、チェインシャフリング（Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻、７７９〜７８３頁）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異誘発株の使用（Ｌｏｗら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０巻、３５９〜３６８頁）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８巻、７２４〜７３３頁）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６巻、７７〜８８頁、１９９６年）、及びセクシュアル（ｓｅｘｕａｌ）ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻、２８８〜２９１頁）により得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上述）は、これら親和性成熟の方法を論じている。
【０１１４】
所望により、本発明において用いるための抗体を、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートしてもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に付着することができる単一の部分を形成するように連結されている、２つ以上のこのような分子を含むことができることが理解されよう。エフェクター分子に連結している抗体フラグメントを得るのが望ましい場合、この抗体フラグメントは、抗体フラグメントがエフェクター分子に対して直接又はカップリング剤によってのいずれかで連結される、標準の化学的手順又は組換えＤＮＡ手順により調製することができる。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野ではよく知られている（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編集、１９８７年、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２巻：１１９〜５８頁、及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３巻、６７〜１２３頁を参照されたい）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６、及びＷＯ０３／０３１５８に記載されているものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５などに記載されている、組換えＤＮＡ手順を用いて実現してもよい。
【０１１５】
本明細書で用いるエフェクター分子という用語には、例えば、抗悪性腫瘍性の薬剤、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらのフラグメント、放射性核種、特に、放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化された金属、ナノ粒子、及びレポーター群、例えば、蛍光化合物、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光光度法によって検出することができる化合物が含まれる。
【０１１６】
エフェクター分子の例には、細胞にとって有害である（例えば、死滅させる）任意の薬剤を含めた細胞毒素又は細胞毒性薬剤が含まれ得る。例として、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎ）、ヘミアステルリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又はホモログが含まれる。
【０１１７】
エフェクター分子には、それだけには限定されないが、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン、又はデュオカルマイシン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれる。
【０１１８】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化された放射性核種、又はそれだけには限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩインヒビター、タキソイド、及びスラミンなどの薬物が含まれ得る。
【０１１９】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象の酵素には、それだけには限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、それだけには限定されないが、免疫グロブリン；毒素、例えば、アブリン、リシン（ｒｉｃｉｎ）Ａ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素；タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、又は組織プラスミノゲンアクチベータ、抗血栓剤（ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、又は抗血管形成薬剤、例えば、アンジオスタチン若しくはエンドスタチン；又は生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の成長因子及び免疫グロブリンが含まれる。
【０１２０】
他のエフェクター分子には、診断などにおいて有用な、検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放出性金属（ポジトロン放出断層撮影において用いるための）、及び非放射性の常磁性金属イオンが含まれる。全般的に、診断として用いるための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンには、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、セイヨウワサビのベルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ、適切な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、及びフィコエリスリンが含まれ、適切な発光材料にはルミノールが含まれ、適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【０１２１】
別の一例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大し得、且つ／又は抗体の免疫原性を低減し得、且つ／又は上皮のバリアを横切った免疫系への抗体の送達を増強し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又はアルブミン結合化合物、例えば、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。
【０１２２】
一実施形態において、ＴＧＦ−ベータと無関係であるエフェクター分子が提供する半減期が有利である。
【０１２３】
エフェクター分子がポリマーである場合、エフェクター分子は全般的に、合成の、又は天然に存在するポリマー、例えば、任意選択により置換されている直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルキレン、ポリアルケニレン、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝若しくは非分枝の多糖、例えば、ホモ多糖若しくはヘテロ多糖であってよい。
【０１２４】
上記に言及した合成ポリマー上に存在し得る具体的な、任意選択の置換基には、ヒドロキシ、メチル、又はメトキシ基の１つ又は複数が含まれる。
【０１２５】
合成ポリマーの具体的な例には、任意選択により置換されている直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、又はこれらの誘導体、特に任意選択により置換されているポリ（エチレングリコール）、例えば、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はその誘導体が含まれる。
【０１２６】
具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はこれらの誘導体が含まれる。
【０１２７】
一実施形態において、ポリマーは、アルブミン又はそのフラグメント、例えば、ヒト血清アルブミン又はそのフラグメントである。
【０１２８】
本明細書で用いる「誘導体」には、反応性の誘導体、例えば、チオール選択性反応性基、例えばマレイミドなどが含まれるものとされる。反応性基は、直接、又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結していてもよい。このような基の残基は、ある場合には、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されよう。
【０１２９】
ポリマーのサイズは、所望により変動することができるが、全般的に、平均分子量範囲５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば、５０００から４００００Ｄａ、例えば、２００００から４００００Ｄａである。ポリマーのサイズは、特に、腫瘍などある種の組織に局在する能力、又は循環半減期を延長する能力など、生成物の意図する使用に基づいて選択することができる（再考には、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、５３１〜５４５頁を参照されたい）。よって、例えば、腫瘍の処置において用いるために、生成物が循環を離れ、組織に浸透することを意図する場合などは、分子量およそ５０００Ｄａを有するなど、低分子量のポリマーを用いるのが有利であり得る。生成物が循環にとどまる適用には、２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲の分子量を有するなど、より高分子量のポリマーを用いるのが有利であり得る。
【０１３０】
適切なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）又は特に、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はこれらの誘導体などの、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが含まれる。
【０１３１】
一例において、本発明において用いるための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着している。特定の一例において、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端のアミノ酸官能基、例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル、又はカルボキシル基を介して付着していてもよい。このようなアミノ酸は、抗体フラグメントにおいて天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ方法を用いてフラグメント中に操作してもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一例において、本発明の抗体分子は修飾されているＦａｂフラグメントであり、修飾は、エフェクター分子の付着を可能にするための、その重鎖のＣ末端終端に対する１つ又は複数のアミノ酸の付加である。さらなるアミノ酸が、それに対してエフェクター分子が付着し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾されているヒンジ領域を形成するのが適切である。多重の部位を用いて２つ以上のＰＥＧ分子を付着することができる。
【０１３２】
ＰＥＧ分子が、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合性に連結しているのが適切である。修飾されている抗体フラグメントに付着している各ポリマー分子は、フラグメントに位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合性に連結していてもよい。共有結合性の連結は、一般的にジスルフィド結合であり、又は特にイオウ−炭素結合である。チオール基を付着点として用いる場合、マレイミド及びシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体など、好適に活性化されたエフェクター分子を用いてもよい。活性化されたポリマーを、上記に記載するポリマー修飾されている抗体フラグメントの調製における出発材料として用いてもよい。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドなど、チオール反応性基を含む任意のポリマーであってよい。このような出発材料は、市場から得てもよく（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）、又は市販の出発材料から慣例的な化学的手順を用いて調製してもよい。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【０１３３】
一実施形態において、抗体は、修飾されているＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はｄｉＦａｂであり、ｄｉＦａｂは、ＰＥＧ化されている、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示されている方法に従って、それに共有結合性に付着しているＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する［「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編集）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編集）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、並びに「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、１９９８年、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２年、５４巻：５３１〜５４５頁も参照されたい］。一例において、ＰＥＧは、ヒンジ領域においてシステインに付着している。一例において、ＰＥＧが修飾するＦａｂフラグメントは、修飾されているヒンジ領域において単一のチオール基に共有結合性に連結しているマレイミド基を有する。リシン残基が、マレイミド基に、及びリシン残基上の各アミン基に、共有結合性に付着していてもよく、分子量およそ２０，０００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーに付着していてもよい。Ｆａｂフラグメントに付着しているＰＥＧの合計分子量は、したがって、およそ４０，０００Ｄａであってよい。
【０１３４】
特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２００００）が修飾しているリシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。
【０１３５】
ＰＥＧリンカーの代替の供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ３（構造中、ｍが５未満である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍが２であり、ｎがおよそ４５０である）を供給するＮＯＦが含まれる。
【化１】
2019520818.tif 000002
【０１３６】
すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
【０１３７】
よって、一実施形態において、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られている、Ｍｗ４０，０００の、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分枝ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬである。
【０１３８】
以下のタイプのさらなる代替のＰＥＧエフェクター分子：
【化２】
2019520818.tif 000003
【０１３９】
一実施形態において、鎖中における約アミノ酸２２６（逐次番号づけによる）、例えば重鎖のアミノ酸２２６における又はその付近のシステインアミノ酸残基を通して結合されてペグ化された（例えば、本明細書に記載するＰＥＧを用いて）抗体、例えば、全長抗体が提供される。一実施形態において、ＰＥＧは、配列番号１０１のＣｙｓ２２６に結合される。
【０１４０】
一実施形態において、本開示は、１種又は複数のＰＥＧポリマー、例えば、４０ｋＤａのポリマー（単数又は複数）などの１種又は２種のポリマーを含むＦａｂ−ＰＥＧ分子を提供する。
【０１４１】
本開示によるＦａｂ−ＰＥＧ分子は、それらがＦｃフラグメントと独立の半減期を有することにおいて特に有利であり得る。
【０１４２】
一実施形態において、ＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子などのポリマーとｓｃＦｖとのコンジュゲートが提供される。
【０１４３】
一実施形態において、抗体又はフラグメントは、デンプン分子にコンジュゲートして、例えば、半減期を延長する。デンプンをタンパク質にコンジュゲートする方法は、参照により本明細書に援用されるＵＳ８，０１７，７３９に記載される通りである。
【０１４４】
本発明で使用されるレポーター分子は、検出可能な分子、例えば蛍光色素、放射性標識又は他の検出可能な実体である。
【０１４５】
本発明は、本発明の抗体分子の、重鎖及び／又は軽鎖（単数又は複数）をコードする単離されたＤＮＡ配列も提供する。ＤＮＡ配列が、本発明の抗体分子の重鎖又は軽鎖をコードするのが適切である。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、化学的プロセシング、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組合せにより生成される合成ＤＮＡを含むことができる。
【０１４６】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者にはよく知られている方法によって得ることができる。例えば、抗体の重鎖及び軽鎖を一部又は全てコードするＤＮＡ配列を、決定されたＤＮＡ配列から、又は対応するアミノ酸配列に基づいて、所望により合成することができる。
【０１４７】
アクセプタフレームワーク配列をコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、これらの知られているアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０１４８】
分子生物学の標準的技術を用いて、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全に、又は部分的に合成することができる。部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を、適宜用いてもよい。
【０１４９】
適切なＤＮＡ配列の例を、図１に提供する。
【０１５０】
本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターにも関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、クローニングベクター又は発現ベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは、配列番号４６又は配列番号４７に示す軽鎖のＤＮＡ配列及び／又は配列番号６０、配列番号６１、配列番号７４、配列番号７５、配列番号８８、配列番号８９、配列番号１０２又は配列番号１０３に示す重鎖のＤＮＡ配列を含む。クローニングベクター又は発現ベクターは、本発明の抗体分子の軽鎖及び重鎖をコードする２つのＤＮＡ配列、好ましくはそれぞれ配列番号４７及び配列番号６１、及び適切なシグナル配列を含むことが適切である。一例において、ベクターは、重鎖と軽鎖との間に遺伝子間配列を含む（ＷＯ０３／０４８２０８を参照されたい）。
【０１５１】
それによりベクターを構築することができる一般的方法、トランスフェクション方法、及び培養方法は、当業者にはよく知られている。この点に関して、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ製作のｔｈｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。
【０１５２】
本発明の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む、１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるのに用いることができる。大腸菌などの細菌の、及び他の微生物系を用いてもよく、又は哺乳動物などの真核生物の、宿主細胞の発現系も用いてもよい。適切な哺乳動物の宿主細胞には、ＨＥＫ、ＣＨＯ、ミエローマ、又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１５３】
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらすのに適する条件下で培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む、本発明による抗体分子を生成するための方法も提供する。
【０１５４】
抗体分子は、重鎖又は軽鎖のポリペプチドのみを含むことができ、その場合、重鎖又は軽鎖のポリペプチドをコードする配列だけが、宿主細胞にトランスフェクトされるために必要である。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物を産生するために、細胞系統は、２つのベクター、軽鎖のポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖のポリペプチドをコードする第２のベクターをトランスフェクトされ得る。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを用いてもよい。
【０１５５】
本開示による抗体及びフラグメントは、宿主細胞から良好なレベルで発現される。したがって、抗体及び／又は結合フラグメントの性質は、市販の規模で発現されるために適切である。
【０１５６】
よって、宿主細胞を培養し、抗体又はそのフラグメントを発現させ、後者を単離し、任意選択によりそれを精製して単離された抗体又はフラグメントを提供するための方法を提供する。一実施形態において、方法は、エフェクター分子を、単離された抗体又はフラグメントにコンジュゲートする、例えば、特に本明細書に記載するＰＥＧポリマーをコンジュゲートするステップをさらに含む。
【０１５７】
一実施形態において、不純物がカラムに保持されて、抗体が溶出されるような非結合様式で、アニオン交換クロマトグラフィーを実施することを含む、抗体（特に、本発明による抗体又はフラグメント）を精製するための方法が提供される。
【０１５８】
一実施形態において、精製は、ＴＧＦ−ベータカラムでの親和性による捕捉を使用する。
【０１５９】
一実施形態において、精製は、アルブミン融合又はコンジュゲート分子を精製するための、シバクロンブルー又は同様品を使用する。
【０１６０】
方法において用いるのに適するイオン交換樹脂には、Ｑ．ＦＦ樹脂（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅにより供給される）が含まれる。ステップは、例えば、ｐＨ約８で行ってもよい。
【０１６１】
方法は、例えば、約４から５、例えば４．５のｐＨで実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを使用する初期の捕捉ステップをさらに含むこともできる。カチオン交換クロマトグラフィーは、例えば、ＣａｐｔｏＳ樹脂又はＳＰセファロースＦＦ（ＧＥ−ＨＥＡＬＴＨにより供給される）などの樹脂を使用することもできる。次いで、抗体又はフラグメントを、例えば、濃度２００ｍＭの塩化ナトリウムなどのイオン性塩溶液を用いて、樹脂から溶出することができる。
【０１６２】
したがって、クロマトグラフィーステップ（単数又は複数）は、適宜１つ又は複数の洗浄ステップを含むことができる。
【０１６３】
精製プロセスは、透析ろ過のステップなど、１つ又は複数のろ過ステップも含むことができる。
【０１６４】
よって、一実施形態において、外毒素及び／又は宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡから実質的に精製されている、特にこれらがない、又は実質的にない、精製された抗ＴＧＦ−ベータ抗体又はフラグメント、例えば、ヒト化抗体又はフラグメント、特に本発明による抗体又はフラグメントを提供する。
【０１６５】
上述で用いられる精製されている形態は、少なくとも純度９０％、例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９重量％又はそれを超えて純粋であることを指すものとされる。
【０１６６】
外毒素が実質的にないことは、一般的に、外毒素含量が抗体生成物１ｍｇあたり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇあたり０．５又は０．１ＥＵであることを指すものとされる。
【０１６７】
宿主細胞のタンパク質又はＤＮＡが実質的にないことは、一般的に、抗体生成物１ｍｇあたり宿主細胞のタンパク質及び／又はＤＮＡ含量が４００μｇ以下、例えば、適宜、１ｍｇあたり１００μｇ以下、特に１ｍｇあたり２０μｇであることを指すものとされる。
【０１６８】
本発明は、本開示により、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体（又はそれらを含む医薬組成物）も、医薬として使用するために提供する。本発明は、本開示により、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体（又はそれらを含む医薬組成物）を、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３の増大したレベルと関連する病理学的障害の治療又は予防で使用するために提供する。
【０１６９】
本発明は、本開示によるヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体の、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３の増大したレベルと関連する病理学的障害の治療又は予防のための医薬の製造における使用も提供する。
【０１７０】
本発明は、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３の増大したレベルと関連する病理学的障害を患うか又はそのリスクにあるヒト対象の治療のための、対象に有効量の本開示による抗体を投与することを含む方法も提供する。本出願において、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３の増大したレベルと関連する病理学的障害は、任意の適切な障害であってもよい。一実施形態において、病理学的障害は、例えば、突発性肺線維症などの肺線維症、例えば肺動脈高血圧症などの肺高血圧症からなる群から選択される。
【０１７１】
本開示による抗体は、肺動脈高血圧症を含む肺疾患の治療で使用することもできる。
【０１７２】
本開示による抗体は、突発性肺線維症及び肺動脈高血圧症を患う患者を治療することに使用することもできる。
【０１７３】
本発明は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３の増大したレベルと関連する病理学的障害の、吸入投与による治療又は予防で使用するためにも提供する。
【０１７４】
本発明は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する拮抗性抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／又は３の増大したレベルと関連する病理学的障害を吸入投与により治療又は予防するための医薬の製造のためにも提供する。
【０１７５】
本発明は、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３の増大したレベルと関連する病理学的障害を患うか又はそのリスクにあるヒト対象を治療する方法も提供し、該方法は、ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２、及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する、有効量の拮抗性抗体のＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントを、対象に吸入投与により投与することを含む。
【０１７６】
吸入投与による治療に適切な病理学的障害は、ＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３により媒介されるか又はＴＧＦ−ベータ１、２及び／若しくは３の増大したレベルと関連する任意の肺疾患、例えば：肺線維症、例えば突発性肺線維症（ＩＰＦ）、例えば軽症の、中程度の及び／又は重症のＩＰＦ、及び嚢胞性線維症及び肺高血圧症、例えば肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）からなる群から選択される疾患であってもよい。別の実施形態において、抗体は、軽症のＩＰＦ、例えば肺高血圧症と関連する軽症のＩＰＦ、特にＰＡＨ又は不均衡性肺高血圧症を治療するために使用することもできる。一実施形態において、抗体は、ＩＰＦ及び肺高血圧症、例えばＩＰＦ及びＰＡＨなどを患う患者を治療するために使用することもできる。別の実施形態において、抗体は、全身性硬化症を治療するために使用することもできる。さらなる実施形態において、抗体は、以下の：肺線維症（ＳＳｃ−ＩＬＤ）；肺高血圧症、例えば結合組織病と関連する肺高血圧症；又はＩＰＦ及び肺高血圧症の両方の少なくとも１つと関連する全身性硬化症を治療するために使用することもできる。
【０１７７】
ヒトＴＧＦ−ベータ１、ヒトＴＧＦ−ベータ２及びヒトＴＧＦ−ベータ３に結合する吸入された抗体の使用は、肺への局所投与により副作用のリスクを、抗体の全身投与と比較して低減することができる。
【０１７８】
本開示による抗体及びフラグメントは、治療又は予防に使用することができる。
【０１７９】
本発明の抗体分子は、診断において、例えば、ＴＧＦ−ベータに関与する疾患状態のｉｎ  ｖｉｖｏの診断及び画像化において用いてもよい。
【０１８０】
本発明の抗体は病理学的状態の処置及び／又は予防において有用であるため、本発明は、本発明の抗体分子を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と組み合わせて含む、医薬又は診断用組成物も提供する。したがって、本発明の抗体の、医薬を製造するための使用を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体を通常含む、無菌の医薬組成物の一部として通常供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。
【０１８１】
本発明は、本発明の抗体分子を、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とともに加え、及び混合するステップを含む、医薬又は診断用組成物を調製するための方法も提供する。
【０１８２】
抗体分子は、医薬若しくは診断用組成物における唯一の有効成分であってもよい。或いは、抗体は、組合せで、例えば同時に、順次に又は別々に、１種又は複数の他の治療的に有効成分とともに投与されてもよい。したがって、医薬又は診断用組成物中の抗体分子に、他の抗体成分、例えば内皮性成長因子受容体ファミリー（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来の成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）抗体を含む他の有効成分、又は非抗体成分、例えば、イマチニブ、ダサチニブ、ニオルチニブ、バスチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、バンデタニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ボリノスタト、ロミデプシン、ボルテゾミブ、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、ペルフェニドン、ニンテダニブ、ステロイド又は他の薬物分子、特にその半減期がＴＧＦ−ベータ結合と無関係である薬物分子などが伴ってもよい。特定の実施形態において、抗体は、例えばＩＰＦの治療のために、ニンテダニブとともに投与される。
【０１８３】
本明細書で用いる有効成分とは、薬理学的効果、例えば、有意味な投与量で治療効果を有する成分を指す。
【０１８４】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体を含むのが適切である。本明細書で用いる「治療有効量」という用語は、標的の疾患又は状態を、処置、軽減、若しくは防止するのに、又は検出可能な治療若しくは予防効果を表すために必要とされる治療剤の量を指す。任意の抗体に対して、治療有効量は、細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデル、通常、齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊長動物においてのいずれかで、最初に推定することができる。動物モデルを用いて、好適な濃度範囲及び投与経路を決定してもよい。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定することができる。
【０１８５】
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物併用（単数又は複数）、反応の感受性、並びに治療に対する認容性／応答に依存する。この量は、ルーチンの実験によって決定することができ、医師の判断の範囲内にある。一般的に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１００ｍｇ／ｋｇである。特に、治療有効量は、０．００１から１００ｍｇ／ｋｇの間と予想される。
【０１８６】
医薬組成物は、１用量あたり、予め決定された量の本発明の有効薬剤を含む単位剤形において提示すると便利であり得る。
【０１８７】
本開示による抗体の治療的用量は、明白な又は有限の毒性効果をｉｎ  ｖｉｖｏで示さない。
【０１８８】
組成物は、患者に個々に投与してもよく、又は他の薬剤、薬物、若しくはホルモンと併用して（例えば、同時に、逐次的に、若しくは別々に）投与してもよい。
【０１８９】
様々な炎症性疾患を治療するために使用されるべき抗体は、単独で又は様々な他の抗炎症剤と組み合わされて使用することができる。
【０１９０】
様々な繊維症疾患を治療するために使用されるべき抗体は、単独で又は様々な他の抗繊維症の薬剤と組み合わされて使用することができる。そのような薬剤の例は、プリフェにドン及び／又はニンテダニブである。
【０１９１】
本発明の抗体分子が投与される投与量は、治療されるべき状態の性質、存在する状態の重症度、及び抗体分子が、予防的に使用されるか又は存在する状態を治療するために使用されるかに依存する。
【０１９２】
投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依存すると予想される。抗体分子が短い半減期（例えば、２から１０時間）を有すれば、１日に１回又は複数回の用量を与えることが必要であり得る。或いは、抗体分子が、長い半減期（例えば２から１５日）、及び／又は長く続く薬力学（ＰＤ）プロファイルを有していれば、１日に１回、１週に１回又はさらに１又は２カ月毎に１回だけの投与を与えることが必要なだけであることもある。
【０１９３】
本明細書で用いる半減期は、循環中の、例えば、血清／血漿中における分子の持続時間を指すことが意図される。
【０１９４】
本明細書で用いる薬力学は、本開示による分子の、プロファイル、特に生物学的作用の持続時間を指す。
【０１９５】
薬学的に許容される担体は、それ自体、組成物を投与する個体に有害な抗体の生成を誘発してはならず、毒性であってはならない。適切な担体は、大型で、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性なウイルス粒子であってよい。
【０１９６】
鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩、又は有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩など、薬学的に許容される塩を用いることができる。
【０１９７】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセリン、及びエタノールなどの液体をさらに含むことができる。加えて、補助的な物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体により、医薬組成物は、患者が摂取するための、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として調合できるようになる。
【０１９８】
投与に適する形態には、例えば、ボーラス注射又は持続的注入などによる注射又は注入による、非経口投与に適する形態が含まれる。生成物が注射又は注入用である場合、生成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤、又は乳剤の形態をとることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含むことができる。或いは、抗体分子は、使用前に好適な無菌の液体と再構成するために乾燥形態であってもよい。
【０１９９】
調合後は、本発明の組成物を、対象に直接投与してもよい。処置しようとする対象は動物でもよい。しかし、１つ又は複数の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適応される。
【０２００】
適切には、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又はフラグメントの等電点の値に同様ではなく、例えば、製剤のｐＨが７である場合、ｐＩが８〜９又はそれを超える範囲の製剤が好適であり得る。理論によって拘泥しようとするものではないが、これは最終的に、溶液中に抗体又はフラグメントが残存するなど、安定性が改善された最終製剤を提供し得ると考えられる。
【０２０１】
一例において、ｐＨが４．０から７．０の範囲である医薬組成物は、本開示による抗体を１から２００ｍｇ／ｍＬ、バッファーを１から１００ｍＭ、界面活性剤を０．００１から１％、ａ）安定化剤を１０から５００ｍＭ、ｂ）安定化剤を１０から５００ｍＭ及び等張化剤を５から５００ｍＭ、又はｃ）等張化剤を５から５００ｍＭ含む。
【０２０２】
本発明の医薬組成物は、それだけには限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮膚（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内、又は直腸の経路を含めた任意の数々の経路によって投与することができる。皮下噴射器も、本発明の医薬組成物を投与するのに用いることができる。典型的に、治療用組成物は、液体の液剤又は懸濁剤いずれかとして、注射可能として調製することができる。注射前に液体のビヒクル中の液剤、又は懸濁剤に適する固体形態も調製することができる。好ましくは、本発明の抗体分子は、皮下に、吸入により又は局所的に投与される。例えば、抗体は、鼻内に又は経口的に、吸入によりなどで投与することもできる。
【０２０３】
組成物の直接的な送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内、若しくは筋肉内の注射により、又は組織の間質腔に対する送達により遂行する。組成物を、病変中に投与することもできる。用量処置は、単一用用量スケジュールでも、又は複数の用量スケジュールでもよい。
【０２０４】
組成物中の有効成分は抗体分子であることが理解されよう。抗体分子はそれ自体、消化管において分解を受けやすい。よって、組成物を、消化管を用いた経路によって投与しようとする場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収された後は抗体を放出する薬剤を含む必要がある。
【０２０５】
薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９１年）において得ることができる。
【０２０６】
一実施形態において、製剤を、吸入を含めた局所投与用の製剤として提供する。
【０２０７】
適切な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、プロペラントガスを含む計量用エアロゾル、又はプロペラントガスのない吸入可能な溶液が含まれる。（霧化可能な溶液又は懸濁液など）。有効物質を含む本開示による吸入可能な粉末は、上記に言及した有効物質のみからなってもよく、又は上記に言及した有効物質の生理学的に許容される賦形剤との混合物からなってもよい。
【０２０８】
これら吸入可能な粉末には、単糖（例えば、グルコール若しくはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらの相互の混合物が含まれ得る。適切には単糖又は二糖が用いられ、ラクトース又はグルコースは、特定には、ただしそれに限定されないが、それらの水和物の形態で用いられる。
【０２０９】
肺中に堆積させるための粒子は、１０ミクロン未満、例えば、１〜９ミクロン、例えば０．１から５μｍ、特に１から５μｍの粒子サイズを必要とする。有効成分（抗体又はフラグメントなど）の粒子サイズは、それが、本発明の抗体又は結合フラグメントを用いる治療に適切な肺の領域における堆積と相互に関係すると考えられるので、第１に重要である。例えば、１０μｍ以下、例えば０．１から５μｍ、特に１から５μｍの粒子は、より肺の肺胞の構造中に堆積しやすいと予想される。
【０２１０】
吸入可能なエアロゾルを調製するために用いることができるプロペラントガスは当技術分野では知られている。適切なプロペラントガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、又はイソブタンなどの炭化水素、並びに、メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化された誘導体などのハロ炭化水素の間から選択される。上記に言及したプロペラントガスは、単独で、又はこれらの混合物において用いることができる。
【０２１１】
特に適切なプロペラントガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記に言及したハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）、並びにこれらの混合物が特に適切である。
【０２１２】
プロペラントガス含有の吸入可能なエアロゾルは、共溶媒、安定化剤、表面活性剤（界面活性剤）抗酸化剤、滑沢剤、及びｐＨを調整するための手段など、他の成分も含むことができる。これらの成分は全て、当技術分野では知られている。
【０２１３】
本発明によるプロペラントガス含有の吸入可能なエアロゾルは、最高５重量％の有効物質を含むことができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２から５重量％、０．０１から３重量％、０．０１５から２重量％、０．１から２重量％、０．５から２重量％、又は０．５から１重量％の有効成分を含む。
【０２１４】
或いは肺への局所投与は、例えば、ネブライザーなどの装置、例えば、コンプレッサに接続されたネブライザーを使用する、液体溶液又は懸濁液製剤の投与によってもよい。
【０２１５】
一実施形態において、製剤は、霧化により送達するための単位投与量を含む離散的アンプルとして提供される。
【０２１６】
一実施形態において、抗体は、再構成のために凍結乾燥された形態で、又は或いは懸濁液製剤として供給される。
【０２１７】
本発明の抗体は、溶媒中に分散させて、例えば、液剤又は懸濁剤の形態において送達することができる。本発明の抗体は、好適な生理学的溶液、例えば、食塩水、又は他の薬理学的に許容される溶媒若しくは緩衝溶液中に懸濁することができる。当技術分野で公知のバッファー溶液は、ｐＨを約４．０から５．０にするために、１ｍｌの水当たり０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのオデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含むことができる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体を使用することができる。
【０２１８】
治療用懸濁剤又は液剤の製剤は、１つ又は複数の賦形剤も含むことができる。賦形剤は、当技術分野ではよく知られており、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセリンを含む。液剤又は懸濁剤は、リポソーム又は生分解性の微粒子中に封入することができる。製剤は、一般的に、無菌製造方法を使用して、実質的に無菌の形態において提供する。
【０２１９】
これには、当業者にはなじみのある方法による、製剤に用いる緩衝溶媒／溶液のろ過による生成及び滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁、及び製剤の無菌容器中への分配が含まれ得る。
【０２２０】
本開示による霧化可能な製剤を、例えば、ホイルエンベロープ中に包装した単回用量単位（例えば、密封されたプラスチックコンテナー又はバイアル）として提供してもよい。各バイアルは、溶媒／溶液バッファー２ｍＬなどの体積中に単位用量を含む。
【０２２１】
本明細書に開示する抗体は、霧化による送達に適し得る。
【０２２２】
本発明の抗体は、遺伝子治療の使用により投与してもよいことが、やはり想定される。これを実現するために、好適なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチューで構築されるように、患者中に導入する。
【０２２３】
一実施形態において、本開示は、例えば、レポーター分子にコンジュゲートされている、診断用試薬としての抗体又はそのフラグメントの使用を含む。したがって、標識されている、本開示による抗体又はフラグメントが提供される。一態様において、本開示による抗体又はフラグメントを含むカラムが提供される。
【０２２４】
したがって、以下のような使用のための試薬として用いるための抗ＴＧＦ−ベータ抗体又は結合フラグメントが提供される：
１）マトリクスにコンジュゲートしており、アフィニティーカラムとして、又は（抗ＴＧＦ−ベータの修飾された形態として）沈殿剤として（例えば、修飾されていてもよい、任意選択により抗Ｆｃ試薬によって沈殿される別の分子によって認識されるドメインを有する修飾されている形態として）用いられるＴＧＦ−ベータタンパク質（又はそれらの結合フラグメント）の精製
２）生存している又は固定された（ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞又は組織又は細胞切片で）細胞上又は細胞中のＴＧＦ−ベータの検出及び／又は定量。このための使用には、抗ＴＧＦ−ベータ処置の効果を追跡するための生物マーカーとしてのＴＧＦ−ベータの定量が含まれ得る。この目的では、候補物質は、修飾されている形態において（例えば、遺伝的融合タンパク質又は化学的コンジュゲートとして、例えば、レポーター分子、例えば検出の目的に用いる蛍光タグの添加など、別の部分の添加により）用いてもよい。
３）（１）及び（２）に例示した方法によって修飾される候補物質に結合することにより標識される、ＴＧＦ−ベータ保有細胞の精製又は選別。
【０２２５】
本明細書の文脈における含む（comprising）は、「含む（including）」を意味するものとされる。
【０２２６】
技術的に好適である場合、本発明の実施形態を組み合わせてもよい。
【０２２７】
実施形態を、ある種の特徴／要素を含むものとして本明細書で説明する。本開示は、前記の特徴／要素からなり、又は前記の特徴／要素から本質的になる別の実施形態にも拡張される。
【０２２８】
特許及び出願などの技術的な参考文献が、参照により本明細書に援用される。
【０２２９】
本明細書で特定して及び明示的に挙げた任意の実施形態は、単独又は１つ若しくは複数のさらなる実施形態との組合せのいずれも注意書きの根拠を形成し得る。
【０２３０】
以下の実施例において、単なる例示の目的でさらに本発明を説明する：
【実施例】
【０２３１】
以下の実施例において、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３という用語の使用は、図３ｂ、３ｄ及び３ｆにそれぞれ示したＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３の成熟配列を指す。
【０２３２】
（例１）
免疫化及びＢ細胞培養上清の１次及び２次スクリーニング
４匹の雌のＨａｌｆ−Ｌｏｐウサギ（＞２ｋｇ）を、２５０ｕｇのヒトＴＧＦ−ベータ２タンパク質（図３ｄ）と混合した２５０ｕｇのヒトＴＧＦ−ベータ１（図３ｂ）タンパク質を等体積の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とを激しく混合することにより乳化した１匹のウサギ当たり５００ｕｇの合計投与量を用いて、皮下免疫化した。ウサギに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いてブースター注入を２１日間隔で与えて、免疫後１４日に耳から採血した。アイソフォーム１／２混合物の３用量を、ヒトＴＧＦ−ベータ２タンパク質のみの最終投与（５００ｕｇ）前に投与した。最終のブーストの後１４日に停止して、脾臓、骨髄の単一の細胞懸濁液及び末梢血液の単核細胞を調製して、１０％ＤＭＳＯ／ＦＣＳ中−８０℃で凍結した。
【０２３３】
発生した免疫応答を、ＥＬＩＳＡによって決定した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ（商標）１Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）９６ウェルのマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦ−ベータ１タンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；＃１００−２１Ｃ）、ヒトＴＧＦ−ベータ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；３０２−Ｂ２−０１０／ＣＦ）又はＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦ−ベータ−３タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ；２４３−Ｂ３−０１０／ＣＦ）のいずれかでコートして、終夜４℃でインキュベートした。プレートを各層後に洗浄した（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンを用いる自動化された、４×２００ｍｌの洗浄）。ウェルをＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のカゼイン（ＶＷＲ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；４４０２０３Ｈ）で、室温（ＲＴ）における１時間のインキュベーションによりブロックした。血清を、１／１００から１％カゼイン中で対数希釈して、加えて１時間半室温でインキュベートした。１００μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃに特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ；１１１−０３６−０４６）を、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）カゼインで１／３０００希釈して、各ウェルに加えて、１時間室温でインキュベートした。基質の１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン、可溶性）を加えて、反応を５０μｌのｄＨ２Ｏ中２．５％フッ化ナトリウム溶液で停止させた。光学密度（ＯＤ）を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して６１０ｎｍで決定した。
【０２３４】
Ｂ細胞培養液を、Ｚｕｂｌｅｒら（１９８５）により記載されたのと類似の方法を使用して調製した。簡潔に述べると、免疫化ウサギからの末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来するＢ細胞を、バーコード付き９６−ウェル組織培養プレートで、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％ベータ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．２％のＮｏｒｍｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、１％の活性化されたヒト末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）の上清及びγ−線照射突然変異ＥＬ４マウスの胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中、１ウェル当たり約５０００細胞の密度で培養して、７日間３７℃で５％ＣＯ２の雰囲気中において培養した。
【０２３５】
ＴＧＦ−ベータ１結合についての１次スクリーニング：
Ｂ細胞培養上清中におけるＴＧＦ−ベータ１タンパク質特異的抗体の存在を、均一な蛍光ベースの結合アッセイを用いてビオチン化ＴＧＦ−ベータ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）でコートされたＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して決定した。ＴＧＦ−ベータ１タンパク質は、Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ビオチン化キット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をメーカーの使用説明書に従って使用してビオチン化した。
【０２３６】
１０μｌのＢ細胞培養上清を、バーコード付き９６−ウェル組織培養プレートから、ビーズ上に固定化されたＴＧＦ−ベータ１（１０ｕｌ／ウェル）を含むバーコード付き３８４−ウェル黒壁アッセイプレートに、Ｂｒａｖｏの自動化された液体取り扱い装置（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して移した。結合を、ヤギ抗ウサギＩｇＧＦｃγ−特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて顕在化した。プレートをＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ（登録商標）の検出システムで読んだ。
【０２３７】
１次スクリーニングに続いて、ＴＧＦ−ベータ１の結合に対して陽性の上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ｈｉｔ−ｐｉｃｋｉｎｇロボットを用いて９６−ウェルのバーコード付きマスタープレートで整理統合して、細胞培養プレート中のＢ細胞を−８０℃で凍結した。
【０２３８】
ＴＧＦ−ベータ１、２及び３への結合についての２次スクリーニング：
異なるアイソフォームのＴＧＦ−ベータに結合する抗体の能力を決定するために、これらのマスタープレート中のＢ細胞上清を、ＴＧＦ−ベータの３種の異なるアイソフォームに対するＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングした。ＥＬＩＳＡアッセイは、３８４−ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｎｕｎｃ）上への異なるＴＧＦ−ベータのアイソフォーム１、２、３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）のＰＢＳ中２ｕｇ／ｍｌにおけるコーティングを必要とした。プレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックして、次に１０ｕｌ／ウェルのＢ細胞培養上清でインキュベートした。２次ＨＲＰ−コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに加え、続いてＴＭＢ基質（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；１０μｌ／ウェル）を用いて結合を可視化した。光学密度は、６３０ｎＭで、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０２３９】
１次スクリーニング及び２次スクリーニングの結果
７９匹のマウス、ラット及びウサギを、ヒトＴＧＦ−ベータ１（配列番号１１４；図３ｂ）だけで免疫化して、陽性ＴＧＦ−ベータ１結合剤のレベルを変化させて、ＴＧＦ−ベータ１結合についてスクリーニングした。これらの７９匹の異なる免疫化されたラット、マウス及びウサギの動物から、２６５６種の抗ヒトＴＧＦ−ベータ１結合剤が同定された。しかしながら、これらのウェルのうち８３１だけが、２次スクリーンで３種類の全てのアイソフォームへの結合を示した。
【０２４０】
上で記載したように、４匹のウサギを、ヒトＴＧＦ−ベータ１及びヒトＴＧＦ−ベータ２の両方で免疫化した。これら４匹のウサギからの全血清において１次スクリーンで分析して、ＴＧＦ−ベータ１結合について１３６７個の陽性ウェルが示されて、次に２次スクリーンニングで３種の全てのＴＧＦ−ベータアイソタイプ１、２及び３への結合をスクリーニングすると、ＴＧＦ−ベータの３種類の全てのアイソタイプに結合した１０２６個のウェルがあった。
【０２４１】
１次及び２次スクリーニングに続いて、３種類の全てのアイソフォームへの結合を示すＢ細胞のウェルを、次にブロック活性についてアッセイした。
【０２４２】
組換えＴＧＦ−ベータ１を使用するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイ
レポーター遺伝子アッセイをＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞（ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞系統；Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して開発した。ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞系統は、ＴＧＦ−ベータの存在にＳＥＡＰの発現により応答して、それは比色検出試薬で検出される。ＴＧＦ−ベータを中和し得る抗体は、レポーター細胞系統で発生されるシグナルにおける低下を生じさせると予想される。ＴＧＦ−ベータ１を中和する試験薬の能力を評価した。
【０２４３】
抗体を３倍希釈滴定するか又は単一濃度で加えて、ヒトＴＧＦ−ベータのアイソフォーム１、２又は３（５０ｐｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータのアイソフォーム）と試験培地（ＤＭＥＭ、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ  Ｎｏｒｍｏｃｉ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中で３０分間インキュベートした後、５０，０００のＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞を添加して、１６時間３７℃でインキュベートした。ＴＧＦ−ベータによる活性化に応答する細胞によるＳＥＡＰ産生を、Ｑｕａｎｔｉ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）試薬の添加により３７℃で１時間で、６３０ｎｍにおける吸光度により検出した。最大シグナルは、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞及びＴＧＦ−ベータを含むウェルから発生されて、ＴＧＦ−ベータ及び最小シグナルは過剰のＴＧＦ−ベータ−中和抗体の使用で発生した。
【０２４４】
ＢＳＮ．４８５６を含むＢ細胞培養上清を、１点ＴＧＦ−ベータ１レポーター遺伝子アッセイでアッセイした（マスタープレート３１４２、ウェルＤ０１２から）。抗体は、ＴＧＦ−ベータ１の８０％阻害を示した。濃度応答アッセイからの阻害率（パーセント）は、アッセイプレートにおける最大及び最小シグナルに基づいて計算した。
【０２４５】
（例２）
Ｂ細胞からの可変領域遺伝子のクローニング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける組換えＦａｂ活性の発現及びキャラクタリゼーション
例１における結合ＥＬＩＳＡ及びブロックレポーター遺伝子アッセイのデータにより、可変領域回復のためのウェルの選択が可能になった。抗体可変領域遺伝子を対象のウェルから回復するために、デコンボリューションのステップを行って、所与のウェル中における抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にしなければならなかったが、それはＢ細胞の不均一な集団が存在するからであった。この蛍光輝点方法（Fluorescent foci method）（Ｃｌａｒｇｏら、ｍＡｂｓ  ６巻、１号、２０１４年）を用いて実現した。簡潔に述べると、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、ビオチン化ＴＧＦ−ベータ１及びヤギ抗ウサギＦｃγフラグメント特異的ＦＩＴＣコンジュゲートの１：１２００最終の希釈（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でコートされたストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。１時間、３７℃の静的なインキュベート後、抗原特異的Ｂ細胞は、Ｂ細胞を取り囲む蛍光のハロが存在したため、同定することができた。Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を用いて同定した、これら個々のＢ細胞を、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレータで拾い、ＰＣＲチューブ中に堆積させた。
【０２４６】
抗体可変領域の遺伝子を、単一の細胞から、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲにより、重鎖及び軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを用いて回収した。３’及び５’末端に制限部位を組み込まれているネステッド２°ＰＣＲにより２ラウンドのＰＣＲを行い、可変領域の、ウサギＦａｂｎｏヒンジ（ＶＨ）又はウサギκ（ＶＬ）哺乳動物の発現ベクター中へのクローニングを可能にした。重鎖及び軽鎖構造を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｅｘｐｉ−２９３細胞中に同時トランスフェクトして、組換え抗体を、１ｍｌの体積４８個の深いウェルブロック中又はコニカルフラスコ中３０ｍＬ規模で発現させた。発現の７日後に、未精製の一過性上清を収集して、結合をＥＬＩＳＡにより、ブロックを例１で記載されたレポーター遺伝子アッセイで再び試験した。全て３種のアイソフォームに対する結合を、組換え４８５６ウサギＦａｂによりＥＬＩＳＡで確認した。配列を図１Ｂに示す。
【０２４７】
発現された４８５６ウサギＦａｂ分子を、親和性捕捉により小規模の真空に基づく精製システムを用いて精製した。簡潔に述べると、３０ｍｌの細胞培養からの上清を、０．２２μｍで滅菌濾過した後、１ｍｌのＧａｍｍａＢｉｎｄプラス（商標）ビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を加えた。上清／ビーズ混合物を、次に１時間回転させた後、上清を真空の適用により除去した。ビーズをＰＢＳで洗浄した後、０．１ＭグリシンによりｐＨ２．７で溶出させた。溶出分画を中和して、バッファーをＰＢＳに交換した後、０．２２μｍで滅菌濾過した。最終の分析は、Ａ２８０による濃度；ＳＥＣ−ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００カラム、Ｗａｔｅｒｓ）による純度；及びＰＴＳ−Ｅｎｄｏｓａｆｅ（商標）カートリッジシステム（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）による内毒素の決定からなる。
【０２４８】
（例３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける組換えウサギＦａｂ活性のキャラクタリゼーション、組換えＴＧＦ−ベータ１、２及び３を使用するＨＥＫ−ＳＥＡＰ−ＳＢＥレポーター遺伝子アッセイ：
精製されたウサギＦａｂを、次に、例１で記載されたＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイで、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する１０点投与量応答で試験した（ｎ＝２）。ＴＧＦ−ベータのアイソフォーム１、２及び３を、５０ｐｇ／ｍｌで加えて、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３を中和する抗体の能力を評価した。
【０２４９】
データを、４パラメーターロジスティック回帰を用いて適合させた（図４ａ、４ｂ及び４ｃ）。ＩＣ５０を、曲線の変曲点に基づいて計算した（表１）。
【０２５０】
【表１】
2019520818.tif 000004
【０２５１】
精製されたウサギＦａｂ４８５６は、ＴＧＦ−ベータ１、ＴＧＦ−ベータ２及びＴＧＦ−ベータ３により進められるＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイを、それぞれ、０．０４、０．０１、及び０．５４ｎＭのＩＣ５０で阻害した。
【０２５２】
内因性ＴＧＦ−ベータＢｘＰＣ３及びＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子共培養アッセイ：
Ｂｘ−ＰＣ３細胞（ＡＴＣＣ）及びＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞系統（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）からなる共培養システムを開発した。ＢＸＰＣ−３細胞は、ＴＧＦ−ベータを構成して産生し、活性化する。ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞系統は、活性ＴＧＦ−ベータの存在に、ＳＥＡＰの発現により応答して、それは比色検出試薬で検出される。ＴＧＦ−ベータを中和することができる抗体は、レポーター細胞系統で発生されるシグナルの低下を生じさせると予想される。
【０２５３】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＧＦ−ベータ細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中１ウェル当たり１０００００細胞でプレート培養して、９０分間３７℃でインキュベートした。試験薬剤を、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ中で３倍希釈滴定して、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞に加えた。ＢｘＰＣ３細胞を、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭに、１ウェル当たり５００００細胞で加えて、１８時間３７℃でインキュベートした。最大シグナルは、ＢＸ−ＰＣ３及びＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータ細胞の両方を含むウェルから発生して、最小シグナルは、過剰のＴＧＦ−ベータ−中和抗体の使用で発生した。ＳＥＡＰは、ＱｕａｎｔｉＢｌｕｅ試薬を添加して３７℃で１時間に、吸光度を６３０ｎｍで測定することにより検出した。
【０２５４】
精製された４８５６ウサギＦａｂを、ＢｘＰＣ３−ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子との共培養アッセイ（ｎ＝３）でアッセイした。濃度応答アッセイからの阻害パーセントを、アッセイにおける最大及び最小シグナルに基づいて計算し、データを４パラメーターロジスティック回帰を用いて適合させた（図５）。ＩＣ５０は、曲線の変曲点に基づいて計算した（表２）。
【０２５５】
【表２】
2019520818.tif 000005
ＢＳＮ．４８５６．ｒｂＦａｂは、ＢｘＰＣ３−ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子の共培養アッセイを３．７ｎＭのＩＣ５０で阻害する。
【０２５６】
４８５６ウサギＦａｂの親和性
ＴＧＦ−βのアイソフォーム１、２、及び３に対する４８５６ウサギＦａｂの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴により決定した。
【０２５７】
ＴＧＦ−βのアイソフォーム１、２、及び３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、Ｆｌｏｗｃｅｌｌ  ２、３及び４（それぞれ）でＣＭ５シリーズＳチップに、アミンカップリング化学により約１５０ＲＵのレベルで固定化した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨ  ＣＡＲＥ）をランニングバッファーとして使用した。４８５６ウサギＦａｂを、３種類の全てのアイソフォームについて様々な濃度（２００ｎＭから１２．５ｎＭ）で３０μＬ／分の流速で滴定した。表面を、１０ｕＬ／分の流速で１０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬ注入により再生した。
【０２５８】
バックグラウンド減算結合曲線を標準手順に続いてＢｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェア（バージョン１．０）を用いて分析した。４８５６ウサギＦａｂについて動的パラメーターを、「不均一リガンド適合（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｉｔｔｉｎｇ）アルゴリズムを、ＲＩ＝０で使用して決定した。動的パラメーターを表３にまとめてある。
【０２５９】
リシン残基を通したＴＧＦβの各アイソフォームのＢｉａｃｏｒｅ（商標）センサチップへの固定化は、１つの結合ドメインに対する抗体の結合を閉塞して、２次的な弱い相互作用（ＫＤ１）を生ずると考えられる。データを不均一モデルに適合させて２つの独立結合事象を説明した。より高い親和性構成要素（ＫＤ２）が、閉塞されていない相互作用、それ故、最も代表的な試験抗体の親和性測定を表すと考えられる。
【０２６０】
【表３】
2019520818.tif 000006
【０２６１】
（例４）
抗体４８５６のキメラ及びヒト化グラフトの発生
抗体Ｆａｂ４８５６を、ＴＧＦ−ベータの３種類の全てのアイソフォームを高い親和性で結合するその能力と組み合わせた、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ＳＢＥレポーター遺伝子アッセイ及びＢｘＰＣ３−ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ＳＢＥレポーター遺伝子共培養アッセイの両方におけるその優れた阻害活性に基づいて、さらに最適化するために選択した。
【０２６２】
キメラ抗体４８５６
抗体４８５６の可変領域を別々の重鎖及び軽鎖発現ベクターにクローニングして、ヒトＦａｂ（ヒンジなし）フラグメントを発現させた。
【０２６３】
ＶＨ遺伝子（配列番号１７）を、ヒンジを切り落として６個のヒスチジン残基のＣ末端タグを有するヒトγ−１ＣＨ１の定常領域をコードするＤＮＡを含むベクターｐＭｈＦａｂ−ＨＩＳ６中にクローニングした（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）。ＶＬ遺伝子（κ）（配列番号１３）は、ヒトκ定常領域をコードするＤＮＡを含むベクターｐＭｈＣＫ中にクローニングした（Ｋ１ｍ３アロタイプ）。
【０２６４】
抗体を、重鎖及び軽鎖ベクターのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞への一過性共トランスフェクションにより発現させた。
【０２６５】
ヒト化抗体４８５６
ウサギ抗体のＶ領域からのＣＤＲをヒト生殖細胞系列抗体のＶ領域のフレームワークにグラフト化させることにより、抗体４８５６をヒト化した。
【０２６６】
抗体の活性を回復させるために、ウサギのＶ領域からの多くのフレームワーク残基も、ヒト化配列中に保持させた。これらの残基は、Ａｄａｉｒら（１９９１）（ヒト化抗体。ＷＯ９１／０９９６７）により概説されているプロトコールを用いて選択した。ウサギ抗体（ドナー）Ｖ領域配列の、ヒト生殖系列（アクセプタ）Ｖ領域配列とのアラインメントを図２Ａ及び２Ｂに、デザインしたヒト化配列とともに示す。
【０２６７】
ドナーからアクセプタ配列にグラフト化されているＣＤＲは、Ｋａｂａｔら（前出）により、組み合わされたＣｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔ定義が使用されるＣＤＲＨ１を例外として（Ａｄａｉｒら。前出を参照されたい）、定義された。
【０２６８】
多くの重鎖及び軽鎖のバリアントのＶ領域配列をコードする遺伝子をデザインして、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃによる自動合成の取り組みにより構築した。重鎖及び軽鎖両方のＶ領域のさらなるバリアントを、幾つかの場合に、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾するＣＤＲ内突然変異を含む、オリゴヌクレオチド特異的突然変異生成により、ＶＨ及びＶＫ遺伝子を修飾することによって創出した。
【０２６９】
これらの遺伝子を、多くのベクター中にクローニングして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び哺乳動物の細胞におけるヒト化４８５６Ｆａｂ抗体の発現を可能にした。バリアント鎖、及びこれらの組合せを、親抗体に対するこれらの作用強度、これらの生物物理学的性質、及び下流のプロセシングに対する適合性に対して評価し、ｇＬ３軽鎖グラフト及びｇＨ１３重鎖グラフトが選択された。
【０２７０】
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１−５プラスＪＫ４Ｊ領域（図１Ｉ、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ，、最終アクセス２０１６年１月５日からも入手可能）を、抗体４８５６軽鎖のＣＤＲに対する受容体として選択した。グラフトｇＬ３中の軽鎖フレームワーク残基は、残基１、２、３及び７１を除いて、全て、ヒト生殖細胞系列遺伝子からであり（Ｋａｂａｔの番号づけ）、ドナー残基アラニン（Ａ１）、チロシン（Ｙ２）、アスパラギン酸（Ｄ３）及びチロシン（Ｙ７１）が、それぞれ保持されている。残基Ａ１、Ｙ２、Ｄ３及びＹ７１の保持は、ヒト化抗体の全力価のために必須である。
【０２７１】
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３−２１プラスＪＨ５Ｊ領域（図１Ｉ、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ，、最終アクセス２０１６年１月５日からも入手可能）を、抗体４８５６の重鎖のＣＤＲに対する受容体として選択した。多くのウサギ抗体に共通して、抗体４８５６のＶＨ遺伝子は、選択されたヒト受容体より短い。ヒトアクセプタ配列でアラインされた場合、抗体４８５６のＶＨ領域のフレームワーク１は、Ｎ末端残基を欠くが、これはヒト化抗体では保持される（図２ｂ）。４８５６ウサギＶＨ領域のフレームワーク３は、ベータシートのストランドＤとＥの間のループ中における２つの残基（７５及び７６）も欠き：グラフトｇＨ１３では、ギャップは、選択されたヒトアクセプタ配列からの対応する残基（リシン７５、Ｋ７５；アスパラギン７６、Ｎ７６）で満たされている（図２ｂ）。グラフトｇＨ１３、ｇＨ２３及びｇＨ２９中の重鎖フレームワーク残基は、残基４８、４９、７３及び７８（Ｋａｂａｔ番号づけ）を除いて、全てヒト生殖細胞系列遺伝子からのものであり、ドナー残基イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、セリン（Ｓ７３）及びバリン（Ｖ７８）が、それぞれ保持されていた。残基Ｅ１、Ｖ２、Ｑ３、Ｉ４８、Ｇ４９、Ｓ７３及びＶ７８の保持は、ヒト化抗体の全力価のために必須であった。
【０２７２】
グラフトｇＨ２０においては、フレームワーク残基は、全て、残基４８、６９、７１、７３及び７８（Ｋａｂａｔ番号づけ）を除いて、全てヒト生殖細胞系列遺伝子からのものであり、ドナー残基イソロイシン（Ｉ４８）、メチオニン（Ｍ６９）、リシン（Ｋ７１）、セリン（Ｓ７３）及びバリン（Ｖ７８）が、それぞれ保持されていた。
【０２７３】
グラフトｇＨ１３、ｇＨ２０、ｇＨ２３及びｇＨ２９のＣＤＲＨ３中の残基９８は、グリシン（Ｇ９８）からアラニン（Ａ９８）残基に突然変異して、したがってｇＨ１３、ｇＨ２０、ｇＨ２３及びｇＨ２９配列から潜在的アスパラギン酸異性化部位が除去されていた。
【０２７４】
残基Ｎ１００ｅ及びＧ１００ｆにおける潜在的アスパラギン脱アミド化部位（図２ｂ）は、ｇＨ２３グラフトではＧ１００ｆからＡ１００ｆに突然変異することにより除去されており、ｇＨ２９グラフトではＮ１００ｅからＤ１００ｅに突然変異することにより除去されていた。
【０２７５】
ヒト化４８５６Ｆａｂの発現
元の４８５６Ｆａｂフラグメントは、哺乳動物の発現ベクターとして構築されて試験された。最高の収率を実現するために、グラフトのコドン用法を変化させて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の周辺質発現にあわせた。グラフトを、歴史的に一貫して高収率及びフレームワーク配列に適合するように変化した対応するコドンを生じた以前のヒト化Ｆａｂとアラインした。
【０２７６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるヒト化４８５６Ｆａｂの発現のために、ヒト化重鎖Ｖ領域の遺伝子（配列番号５４、配列番号６８、配列番号８２又は配列番号９６）及び軽鎖Ｖ領域の遺伝子（配列番号４０）を、ヒトＣ−κ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）及びヒトγ−１ＣＨ１領域（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）をコードするＤＮＡを含むＵＣＢ発現ベクターｐＴＴＯＤ中にクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｆｋｐＡ及びｄｓｂＣ遺伝子を、該発現プラスミド中に導入したが、それは、これらのシャペロンタンパク質の共発現が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の株ＭＸＥ０１６におけるヒト化Ｆａｂの収率を改善することが、Ｆａｂ発現を誘発するＩＰＴＧを使用するバッチ供給の発酵中に見出されたからである。４８５６Ｆａｂの軽鎖及び重鎖及びＦｋｐＡ及びＤｓｂＣポリペプチドは、全て、ＩＰＴＧを誘発し得るｔａｃプロモーターの制御下で、単一のマルチシストロンから発現された。
【０２７７】
Ｆａｂの発現を、５ｍｌの自己誘発方法を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の産生株ＭＸＥ０１６で試験した。ＦｋｐＡ及びＤｓｂＣシャペロンの組合せは、実質的に得られるＦａｂの収率を増大させた。
【０２７８】
哺乳動物の細胞におけるヒト化４８５６Ｆａｂの発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトＣ−κ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列と接合して、隣接する軽鎖遺伝子（配列番号４１）を創出した。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトγ−１ＣＨ１領域（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）をコードするＤＮＡ配列に接合して、隣接する重鎖遺伝子（配列番号５５、配列番号６９、配列番号８３又は配列番号９７）を創出した。重鎖及び軽鎖の遺伝子を、哺乳動物の発現ベクターｐＭＸＥ６９２  ＣｅｌｌｃａベクターＤＧＶ４８５６ｇＬ３ｇＨ１３ＶＬＶＨ中にクローニングした。
【０２７９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する４８５６ＦａｂｇＬ３ｇＨ１３のＢｉａｃｏｒｅ親和性決定
上で記載された方法に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生された抗体４８５６ｇＬ３ｇＨ１３を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴により決定されたＴＧＦ−βのアイソフォーム１、２、及び３に対する親和性について試験した。ヒトＴＧＦ−βのアイソフォーム１、２、及び３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、ＣＭ５シリーズＳチップにアミンカップリング化学を通して、Ｆｌｏｗｃｅｌｌ  ２、３及び４（それぞれ）で、約２０ＲＵのレベルで固定化した。ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨ  ＣＡＲＥ）を、ランニングバッファーとして使用した。抗体４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂを、３種類の全てのアイソフォームにわたって様々な濃度（２００ｎＭから１．５６ｎＭ）で３０μＬ／分の流速で滴定した。表面を、１０ｕＬ／分の流速の１０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬ注入により再生した。
【０２８０】
バックグラウンド減算結合曲線を、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０；ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨ  ＣＡＲＥ）を使用して標準手順に従って分析した。動的パラメーターを、例３で記載したように、不均一適合アルゴリズムをＲＩ＝０で用いて決定して、値を表４に示す。表３中のＦａｂのウサギバージョンについて、前のように、表４のＫＤ２は、抗体４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂについて閉塞されていない結合値を表すと考えられる。
【０２８１】
【表４】
2019520818.tif 000007
分析用ゲル濾過を実施して、抗体グラフト４８５６ｇＬ３ｇＨ１３が、潜伏期と関連するペプチドを含むＴＧＦ−ベータ１の全長配列に結合するかどうかを決定した。データは、抗体４８５６ｇＬ３ｇＨ１３が、潜伏期と関連するペプチドを含む全長ＴＧＦ−ベータ１に結合しないことを示した（データ掲載せず）。
【０２８２】
（例５）
ヒト化グラフトのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害活性
組換えＴＧＦ−ベータ１、２及び３を使用するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイにおける阻害活性：
４８５６ヒト化グラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９の阻害活性を、例１に記載された、組換えＴＧＦ−ベータ１、２及び３を用いる、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３に対する１０点投与量応答における、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイで分析した。ＴＧＦ−ベータアイソフォーム１、２及び３を、５０ｐｇ／ｍｌで加えて、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３を中和する抗体の能力をアッセイした。データを、４パラメーターロジスティック回帰を用いて適合させた。ＩＣ５０は、曲線の変曲点に基づいて計算した（表５）。ヒト化グラフト、特にｇＬ３ｇＨ１３及びｇＬ３ｇＨ２０は、ＴＧＦ−ベータ１、２及び３の活性を中和することに効果的であることが、表５からわかる。
【０２８３】
【表５】
2019520818.tif 000008
内因性ＴＧＦ−ベータＢｘＰＣ３及びＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子の共培養アッセイにおける阻害活性：
４８５６ヒト化グラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９の阻害活性を、例３で記載されたＢｘＰＣ３及びＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子の共培養アッセイで分析した。濃度応答アッセイから阻害率（％）を、アッセイにおける最大及び最小シグナルに基づいて計算し、データを４パラメーターロジスティック回帰を用いて適合させた。ＩＣ５０は、曲線の変曲点に基づいて計算して、結果を表６に示す。ヒト化グラフト、特にｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０及びｇＬ３ｇＨ２９は、このアッセイで細胞により発現されて活性化されたＴＧＦ−ベータを中和することに効果的であったことを表６から見ることができる。
【０２８４】
【表６】
2019520818.tif 000009
【０２８５】
（例６）
腎臓線維症のアドリアマイシンによって誘発されたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるヒト化４８５６グラフトの阻害活性
アドリアマイシンによって誘発された腎障害は、ヒト糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症と類似の病理学的特徴を有する後天性腎臓線維症の十分に特徴づけられた齧歯類モデルである。糸球体間質の細胞は、アドリアマイシンに対する応答における繊維症の表現型に含まれる主な細胞型の１つである。アドリアマイシン処置に対する繊維症の応答のためのヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを確立して、抗体４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９を中和して、この系における細胞間質（ＥＣＭ）構成要素の堆積を調整するＴＧＦ−ベータの能力を評価した。
【０２８６】
主要なヒト腎臓糸球体間質の細胞（ＨＲＭＣ、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）を、１０ｎＭのアドリアマイシン及び試験４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９及び対照Ｆａｂの存在下において（０．２から６０００ｎＭの範囲で逐次３倍希釈）、１．６×１０４細胞／ｃｍ２でプレートに載せた。細胞を、６日間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートして、次に０．２５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓで溶解して（３７℃で３０分）、堆積したＥＣＭを氷冷メタノールで固定した（−２０℃で３０分）。個々のＥＣＭ構成要素の堆積を、フィブロネクチン、コラーゲンＩ及びＩＩＩ（ミリポアウサギポリクローナル抗体ＡＢ７４５及びＡＢ７４７）、及びコラーゲンタイプＩＶ（Ｅｆｌｕｏｒ６６０−コンジュゲート、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５０−９８７１−８０）を免疫染色した後（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲート，Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５３−９８６９−８２）を免疫染色した後、ハイコンテント画像化により検出した。画像を得て、蛍光強度をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎにより検出した。最大シグナルは、Ｆａｂの不在でアドリアマイシン処置された細胞を含むウェルから発生し、最小シグナルは、細胞がアドリアマイシンに曝露されなかったウェルで得られた。
【０２８７】
濃度応答アッセイから阻害率（％）を、アッセイにおける最大及び最小蛍光強度に基づいて計算して、データを４パラメーターロジスティック回帰を用いて適合させた。示した画像及びプロットは、３回の反復実験の代表的なものである。
【０２８８】
図６は、１０ｎＭのアドリアマイシンに対する応答、及びＴＧＦ−ベータを中和する４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９又は対照Ｆａｂの指示された濃度の存在下における、ＨＲＭＣによるＥＣＭ堆積の代表的画像を示す。
【０２８９】
図７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるアドリアマイシンにおける４８５６ＦａｂグラフトｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９に対する代表的濃度応答曲線を示す。
【０２９０】
試験された４種のＴＧＦ−ベータを中和するＦａｂグラフトは、アドリアマイシンによって誘発されたＨＲＭＣによるＥＣＭ堆積を阻害した（表７）。
【０２９１】
【表７】
2019520818.tif 000010
【０２９２】
（例７）
ヒト肺間質性線維症のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるヒト化４８５６グラフトの阻害活性
上皮の損傷及び線維芽細胞の活性化は、繊維症のプロセス中にＥＣＭの蓄積に至る厳しい事象である。肺間質性線維症のｉｎ−ｖｉｔｒｏモデルを確立するために、ＩＰＦ患者から単離されたヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥｐＣ、ＡＴＣＣ）及び肺線維芽細胞（ＡＴＣＣ）を用いてアッセイを開発した。上皮細胞培地中におけるこれらの２種の細胞型の共培養は、追加の刺激が無くてさえ、有意のＥＣＭ堆積を誘発して、抗繊維症薬の研究を可能にした。
【０２９３】
１ｃｍ２当たり１．８×１０４のヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥｐＣ）及び等数のＩＰＦ肺線維芽細胞をプレートに載せて（合計３．６×１０４細胞／ｃｍ２）、及び７日間３７℃、５％ＣＯ２で共培養した。４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３、及び対照Ｆａｂを、０．０３から１０００ｎＭの範囲内で３倍希釈滴定した。７日共培養した後、細胞の生存能力をＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅで評価して、次に、細胞を０．２５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（３７℃で３０分）で溶解し、堆積したＥＣＭを氷冷メタノールで固定した（−２０℃で３０分）。個々のＥＣＭ構成要素の堆積を、フィブロネクチン及びコラーゲンタイプＩ、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶを免疫染色した後ハイコンテント画像化により検出した。画像を得て、蛍光強度をＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎにより検出した。最大シグナルは未処理の共培養で発生し、最小シグナルは、過剰Ｆａｂの使用で発生した。
【０２９４】
濃度応答アッセイから阻害率（％）を、アッセイにおける最大及び最小シグナルに基づいて計算し、データを、４パラメーターロジスティック回帰を用いて適合させた。ＩＣ５０は、曲線の変曲点に基づいて計算した。示された画像及びプロットは、３回の反復実験の代表的なものである。
【０２９５】
図８は、ＳＡＥｐＣ及び指示された濃度の４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３及び対照Ｆａｂの存在下におけるＩＰＦ線維芽細胞の共培養によるＥＣＭ堆積の画像を示す。
【０２９６】
図９は、ヒト肺共培養アッセイにおける４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３及び対照Ｆａｂの濃度応答曲線を示す。
【０２９７】
【表８】
2019520818.tif 000011
ＳＡＥｐＣ及びＩＰＦ線維芽細胞の共培養におけるＥＣＭ堆積は、４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３により阻害された。
【０２９８】
（例８）
ヒト腎臓線維症のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおけるヒト化４８５６グラフトの阻害活性
ヒト初代腎臓細胞におけるフィブロネクチン及びコラーゲン堆積を阻害する４８５６ＦａｂｇＬ３ｇＨ１３の能力を、ＴＧＦ−ベータ１、２又は３で刺激されたヒト腎臓近位の管状上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）の単独培養、及びヒト腎臓近位の管状上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）とヒト腎臓線維芽細胞（ＨＲＦ）との共培養（無刺激）における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蓄積のアッセイを用いて評価した。
【０２９９】
ヒト腎臓近位の管状上皮細胞（ＲＰＴＥＣ、Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）及びヒト腎臓線維芽細胞（ＨＲＦ、ＩｎｎｏＰｒｏｔ）を、３８４ウェル黒色透明底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、ＲＰＴＥＣの単独培養のためには、０．１から１００μｇ／ｍＬ（０．２〜２０００ｎＭ）の抗ＴＧＦ−ベータ抗体（ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂ）又は対照Ｆａｂ及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−ベータ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＴＧＦ−ベータ２（Ｒ＆Ｄ）又はＴＧＦ−ベータ３（Ｒ＆Ｄ）を存在させて、又はＲＰＴＥＣ及びＨＲＦの共培養のためには、外因性ＴＧＦ−ベータなしで（無刺激）、＋０．５％Ｆｃｓ及びサプリメントを添加した腎臓上皮細胞用の基底培地（ＡＴＣＣ）中において５０μＬの最終体積で、１ウェル当たり２，０００細胞（共培養における比１：１）で播種した。
【０３００】
３７℃、５％ＣＯ２で７日インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄して、２０μｌの０．２５Ｍ  ＮＨ４ＯＨ／２５ｍＭ  Ｔｒｉｓを用いて１５分３７℃で溶解した。マトリックスを３時間ＰＢＳで洗浄して、４０μｌの１００％メタノールで３０分間、−２０℃で固定して、ＰＢＳで３時間洗浄した後、抗フィブロネクチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗コラーゲンＩ（ミリポア）、抗コラーゲンＩＩＩ（ミリポア）、抗コラーゲンＩＶ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗コラーゲンＶ（Ａｂｃａｍ）抗体を用いて染色した。プレートを、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ  ＨＣリーダーで、「Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＣｅｌｌＨｅａｌｔｈ」のプロファイリングバイオアプリケーションの３チャネルプロトコール及び１０×対物（新しいＸ１カメラ）２×２ビニング（１１０４×１１０４ピクセル／視野）を用いてスキャンした。
データをコラーゲンＩＶ読み出しのために発生させたが、結果は、許容できないアッセイ窓及び変動のために排除した。
【０３０１】
結果を、表９及び図１０ａ、ｂ、ｃ及びｄ並びに図１１ａ及びｂに示すが、これらは、ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂが、ＲＰＴＥＣの単独培養システムでＴＧＦ−ベータ１、２及び３によって誘発された、及びＲＰＴＥＣ及びＨＲＦの共培養システムにより内因性で産生されたＴＧＦ−ベータによる、フィブロネクチン及びコラーゲンＩ、ＩＩＩ及びＶの蓄積を阻害することができることを示す。
【０３０２】
【表９】
2019520818.tif 000012
（例９）
肺線維症のｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデル
ｉ）７日の攻撃
ブレオマイシンによって誘発された急性肺傷害のモデルは、グリコペプチドであるブレオマイシンのマウスの肺への直接局所投与を含む。これは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害因子−１（ＰＡＩ−１）の増大と関連する炎症性応答を誘発して、最終的に肺線維症を生じさせる。ＰＡＩ−１は、ＴＧＦ−ベータにより転写で調節されて、炎症性細胞の動員及び細胞間質（ＥＣＭ）の堆積を誘発する強い線維形成メディエーターとして作用することができる（Ｇｈｏｓｈ及びＶａｕｇｈａｎ、２０１２年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２２７巻：４９３〜５０７頁）。
【０３０３】
抗ＴＧＦ−ベータＦａｂの試験における線維形成を制限する任意の効果、例えばＰＡＩ−１阻害などは、汎特異的抗ＴＧＦ−ベータブロックＦａｂの肺への直接送達は、ヒトにおける肺線維症のための実現性がある治療法であることを支持する証拠を提供する。
【０３０４】
４８５６Ｆａｂグラフト（ヒト化）を、鼻腔内（ｉ．ｎ）経路を通してマウスの肺に直接局所投与した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、４８５６ｇＬ３ｇＨ１３又は４８５６ｇＬ３ｇＨ２９（ｉ．ｎ；２００μｇ／マウス）を、ブレオマイシン攻撃（ｏ．ｐ；０．０５Ｕ／マウス）の１時間前及び６時間後に投与した。マウスは、その後、４８５６ｇＬ３ｇＨ１３又は４８５６ｇＬ３ｇＨ２９（ｉ．ｎ；２００μｇ／マウス）を、それが７日目に停止されるまで１２時間毎に受けた。停止後直ちに気管支肺洗浄液（ＢＡＬ）を捕集して、全ＰＡＩ−１濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。統計分析を、ブレオマイシン処置された対照群に対して一元配置分散分析で実施した。
【０３０５】
２種の４８５６Ｆａｂ（４８５６ｇＬ３ｇＨ１３及び４８５６ｇＬ３ｇＨ２９）のこの投与の結果を、図１２に示す。図１２は、ブレオマイシンで攻撃されたマウスは、ＢＡＬにおいて、食塩水で攻撃された対照マウスと比較して大きく上昇したＰＡＩ−１レベルを有したこと、及びヒト化Ｆａｂ４８５６ｇＬ３ｇＨ１３及び４８５６ｇＬ３ｇＨ２９は、肺に直接送達されたときに、ブレオマイシンによって誘発されたＰＡＩ−１を、それぞれ、４９％及び６４％阻害することができたことを示す。
【０３０６】
第２の研究で、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、ヒト化４８５６のｇＬ３ｇＨ１３（ｉ．ｎ；２０、６０、２００μｇ／マウス）を、ブレオマイシン攻撃（ｏ．ｐ；０．０５Ｕ／マウス）の１時間前及び６時間後に投与した。その後マウスは、４８５６ｇＬ３ｇＨ１３を、それが７日目に停止されるまで１２時間毎に受けた。停止後直ちにＢＡＬを捕集して全ＰＡＩ−１濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。統計分析を、ブレオマイシン処置された対照群に対して一元配置分散分析で実施した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．００５、＊＊＊ｐ≦０．０００５、＊＊＊＊ｐ≦０．００００５。
【０３０７】
このシステムにおける４８５６ｇＬ３ｇＨ１３の優れた効力を示すために、図１３で、ブレオマイシンによって誘発されたＰＡＩ−１に対する異なる用量における４８５６ｇＬ３ｇＨ１３の効果を例示する。前に示したように、ブレオマイシンは、ＢＡＬにおけるＰＡＩ−１レベルの増大を誘発し、その増大は、２００μｇ／マウスのｉ．ｎ  ４８５６ｇＬ３ｇＨ１３を使用して７６％まで、及び６０μｇ／マウスのｉ．ｎ  ４８５６ｇＬ３ｇＨ１３を使用して４５％まで有意に阻害することができる。
【０３０８】
このことは、局所的に送達された（ｉ．ｎ）４８５６ｇＬ３ｇＨ１３が、ブレオマイシンによって誘発された急性ＰＡＩ−１を有意に阻害すること、及び肺においてＴＧＦ−ベータを局所的に阻害することが可能であり、望ましくない全身的事象を回避する可能性があることを示す。
【０３０９】
ｉｉ）２８日の攻撃
ブレオマイシン攻撃のより長い期間の効果が、肺線維症を生じさせて、それ故、類似の研究がマウスで２８日間実施され、マウス化４８５６ｇＬ３ｇＨ１３（今後４８５６と称する）が、ブレオマイシン攻撃の１日目から並びに１３日目から予防的に投与された。この後の方の４８５６の投与は、治療が開始される前に、線維症が肺でより完全に確立されることを可能にする。
【０３１０】
ブレオマイシンによって誘発された肺線維症に対する４８５６の影響を、肺におけるＥＣＭ堆積及び筋線維芽細胞分化の減弱により評価した。ＥＣＭ堆積は、パラフィンに包埋された肺組織で、Ｐｉｃｒｏ  Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（ＰＳＲ）を用いてコラーゲンの染色により組織学的に決定した。これは、消化された肺組織におけるより定量的なヒドロキシプロリンレベルの分析によって支持された。ヒドロキシプロリンは、コラーゲンの主要な構成要素であり、組織におけるコラーゲンの量を推定するために使用することができる。それに加えて、筋線維芽細胞；肺におけるコラーゲン堆積の原因となると考えられる主要な細胞型の数を、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を使用して決定した。さらに、デカペンタプレジック同族体２及び３（ｐ−Ｓｍａｄ２／３）に対するリン酸化マザー（phosphorylated-Mothers）の阻害も、ＩＨＣにより決定して、４８５６によるＴＧＦβシグナル伝達経路の特異的阻害を示した。全ての統計は、割り当てられたブレオマイシン攻撃対照群に対する独立ｔ検定を用いて決定した。＊ｐ＝０．０５；＊＊ｐ＝０．０１；＊＊＊ｐ＝０．００１；＊＊＊＊ｐ＝０．０００１。
【０３１１】
ａ）４８５６はブレオマイシンによって誘発されたコラーゲン堆積を軽減する。
１〜２８日の間４８５６を用いる処置：マウス（雄ｃ５７ＢＬ／６；ｎ＝８／群）を、食塩水（ｉ．ｔ、５０μＬ）又はブレオマイシン（ｉ．ｔ、５０μＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ）で２８日間処置した。それに加えて、マウスをビヒクル（ｉ．ｎ、２５μＬ）又は４８５６（ｉ．ｎ、２５μＬ；４００μｇ／マウス）のいずれかで１日に２回、１〜２８日の間処置した。
【０３１２】
１３〜２８日の間４８５６で処置されたマウス（雄ｃ５７ＢＬ／６；ｎ＝８／群）を、食塩水（ｉ．ｔ、５０μＬ）又はブレオマイシン（ｉ．ｔ、５０μＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ）で１２日又は２８日の間処置した。それに加えて、マウスを、ビヒクル（ｉ．ｎ、２５μＬ）又は４８５６（ｉ．ｎ、２５μＬ；４００μｇ／マウス）のいずれかで１日に２回、１３〜２８日の間処置した。
【０３１３】
アッセイ：左肺葉全体を、４％ホルマリン中で６時間固定して、パラフィンで包埋した。５μｍの切片を切ってＰＳＲで染色した。画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｂａｄｈｏｅｖｅｄｏｒｐ、オランダ）を使用して撮り、１匹のマウス当たり最少４視野で、繊維症の区域を、ＩｍａｇｅＪ（Ｖ．１．４２ｑ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米国）を使用して分析した。右肺の３箇所の下肺葉（不対の肺葉、心肺葉及び横隔膜肺葉）中のコラーゲンタンパク質の量を、ヒドロキシプロリンアッセイにより決定した。６Ｍ  ＨＣｌにより３時間１２０℃で分解した後、試料のｐＨを６Ｍ  ＮａＯＨで調節して６にした。その後、０．０６ＭのクロラミンＴを各試料に添加して、２０分間室温でインキュベートした。次に、３．１５Ｍの過塩素酸及び２０％のｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを加えて、試料を、さらに２０分間６０℃でインキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ１９０マイクロプレート分光光度計を用いて５５７ｎｍで吸光度を決定した。
【０３１４】
結果：ミクロ噴霧器（５０μＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ）を使用するブレオマイシンの気管内（ｉ．ｔ）点滴注入は、食塩水の点滴注入（０．９％ＮａＣｌ、ブレオマイシンの溶媒）のｉ．ｔで処置された対照マウスと比較して、顕著な肺線維症を誘発した。これは、増強されたＰＳＲ染色及び肺中における上昇したヒドロキシプロリン含量により示される（図１４及び１５）。それに加えて、これらの繊維症の変化は、１２日後より２８日後の方がより顕著であったので（図１５）、線維症の重症度が経時的に進行したことが示唆される。
【０３１５】
４８５６による１〜２８日の処置（２５μＬ  ｉ．ｎ；４００μｇ／マウス；１日に２回）は、肺中におけるＰＳＲ（図１４Ａ）及びヒドロキシプロリン両方の含量の有意の低下を生じた（図１４Ｂ）。これは、４８５６が、ブレオマイシンによって誘発された肺線維症を予防することができることを示唆する。さらに、ブレオマイシンで攻撃されたマウスへの１３〜２８日の４８５６の投与は、ビヒクルで処置されたマウスと比較したときに、ＰＳＲ（図１５Ａ）及びヒドロキシプロリン（図１５Ｂ）の進行性増大を有意に制限したことが２８日目に観察された。これは、４８５６は、線維症がすでに顕性になった後で与えられても、疾患の進行を制約することができることを示唆する。
【０３１６】
ｂ）４８５６は、肺におけるブレオマイシンによって誘発された筋線維芽細胞分化を軽減する。
マウス（雄ｃ５７ＢＬ／６；ｎ＝８／群）を、食塩水（ｉ．ｔ、５０μＬ）又はブレオマイシン（ｉ．ｔ、５０μＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ）で１２又は２８日間処置した。それに加えて、マウスを、ビヒクル（ｉ．ｎ、２５μＬ）又は４８５６（ｉ．ｎ、２５μＬ；４００μｇ／マウス）のいずれかで１日に２回、１〜２８日又は１３〜２８日の間処置した。筋線維芽細胞は、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現により特徴づけられた。α−ＳＭＡに対して陽性の線維芽細胞は、モノクローナル抗αＳＭＡ抗体（クローン１Ａ４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）とのインキュベーションにより検出された。発現を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された２次抗体及び３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で可視化した。モノクローナルマウスＩｇＧ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）をアイソタイプの対照として使用した。１匹のマウス当たり４箇所の異なる視野を評価した。
【０３１７】
ブレオマイシンの投与は、α−ＳＭＡの発現によりＩＨＣにより特徴づけられた肺中における筋線維芽細胞分化の増大も誘発した（図１６）。図１６Ａは、肺におけるブレオマイシンによって誘発された筋線維芽細胞分化が、１〜２８日の４８５６のｉ．ｎ投与により阻害されたことを例示する。それに加えて、ブレオマイシン処置の１２日と２８日の間におけるα−ＳＭＡ発現に有意の増大はなかったが、１３〜２８日の４８５６の投与は、筋線維芽細胞分化における有意の減弱も惹起した。さらに、これは、１２日間のブレオマイシン単独の処置後に観察されたα−ＳＭＡ発現のレベル未満に低下したので、この時点において繊維症のプロセスの逆行が可能なことを示唆している（図１６Ｂ）。
【０３１８】
ｃ）４８５６は、肺においてブレオマイシンによって誘発されたＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害する。
マウス（雄ｃ５７ＢＬ／６；ｎ＝８／群）を、食塩水（ｉ．ｔ、５０μＬ）又はブレオマイシン（ｉ．ｔ、５０μＬ；０．５ｍｇ／ｍＬ）で１２日又は２８日間処置した。それに加えて、マウスを、ビヒクル（ｉ．ｎ、２５μＬ）又は４８５６（ｉ．ｎ、２５μＬ；４００μｇ／マウス）のいずれかで１日に２回１〜２８日又は１３〜２８日処置した。肺切片を、ヤギ抗ｐＳｍａｄ２／３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）及びＩ型コラーゲンの抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を用いて染色した。ＨＲＰ−コンジュゲート−又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を２次抗体として使用した。同等な無関係なアイソタイプが対照として役立った。核をＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて染色した。染色をＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｂａｄｈｏｅｖｅｄｏｒｐ、オランダ）を使用して可視化した。１型コラーゲンに陽性の細胞におけるｐＳｍａｄ２／３の発現を１匹のマウス当たり３箇所の異なる視野で評価した。
【０３１９】
ブレオマイシンによって誘発された肺線維症は、１２日及びより大きい程度で２８日の両方で、食塩水で処置された対照と比較して１型コラーゲン陽性細胞におけるｐＳｍａｄ２／３発現の増大と関連した（図１７Ｂ）。１〜２８日（図１７Ａ）及び１３〜２８日（図１７Ｂ）の４８５６による処置は、ｐＳｍａｄ２／３発現を、食塩水で処置された対照マウスの場合未満に有意に阻害して、ＴＧＦβ依存性のＳｍａｄ２／３リン酸化が、４８５６によって完全に阻止されたことを示唆する。それに加えて、１３〜２８日投与された４８５６は、ブレオマイシンによって誘発されたｐＳｍａｄ２／３の発現における増大を逆行させることができることが、ブレオマイシン攻撃プラスビヒクルの１２日後に観察され、これは筋線維芽細胞分化で見られた効果と相関する。
【０３２０】
ｄ）まとめ
４８５６は、ブレオマイシンによって誘発された肺線維症のマウスのモデルで強い抗繊維症の効果を発揮して、コラーゲン堆積（ＰＳＲ染色）、コラーゲン蓄積（ヒドロキシプロリンアッセイ）、筋線維芽細胞分化（α−ＳＭＡ発現）、及び標準的なＴＧＦ−βシグナル伝達の活性化（ｐＳｍａｄ２／３発現）における組織学的変化を軽減した。さらに、４８５６は、予防的に１〜２８日投与された場合又は繊維症の変化がすでに顕性になった後１３〜２８日の介入のいずれでも効果的であることが証明された。このことは、肺においてＴＧＦβを局所的に阻害することが可能であり、望ましくない全身的事象を回避できる可能性があるという仮説を支持する。
【０３２１】
（例１０）
ヒト化４８５６Ｆａｂグラフトの生物物理学的分析
抗体４８５６のヒト化グラフト：開発及び投与安定性のために、ｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３、ｇＬ３ｇＨ２９を一連の生化学的及び生物物理学的分析にかけて、最も頑強な分子をスクリーニングして選択した。分析には、（アンフォールディング中間点での融解温度）；実験的等電点（ＰＩ）及び空気−液体界面での凝集安定性（製造におけるせん断応力の模倣及び噴霧療法安定性）；及び脱アミド化傾向などの特性の比較が含まれた。
【０３２２】
熱安定性の測定（Ｔｍ）
蛍光サーマルシフトアッセイ（fluorescence-based thermal shift assay）（thermofluor assayともいわれる）を実施して、Ｔｍ（アンフォールディング中間点での融解温度）を得、精製された分子の熱安定性を推定した。反応混合物は、５０００×ストック溶液からＰＢＳで希釈された５μｌの３０ｘＳＹＰＲＯ（登録商標）オレンジ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１２ｍｇｍｌ−１で４５μｌの試料（ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）を含んでいた。１０μｌの混合物を３８４ＰＣＲ光学ウェルプレートに４連で分注し、７９００ＨＴＦａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。ＰＣＲシステムの加熱装置を２０℃から９９℃に、上昇速度を１．１℃ｍｉｎ−１に設定した。電荷結合素子でウェル中の蛍光変化をモニターした。強度の増大をプロットして、勾配（単数又は複数）の変曲点を用いてＴｍを得た。
【０３２３】
Ｔｍ（アンフォールディング中間点での融解温度）を、サーモフルオロアッセイにより決定した。この方法では、ＳＹＰＲＯオレンジ（蛍光性色素）を使用して、温度上昇中に曝露される疎水性領域に対する結合によりアンフォールディングプロセスをモニターする。Ｔｍ値が高いほど、展開性及び霧化応力に対する分子の安定性及び頑強性が大きいことに釣り合う。
【０３２４】
予想される１つのアンフォールディングドメインが、全ての分子について観察され、Ｆａｂのアンフォールディングドメインと同数であった。結果を表１０にまとめる。
【０３２５】
分子をそれらの融解温度に基づいて順位付けすることが可能であり、ｇＬ３ｇＨ１３が最高の融解温度を有することが示された。ＨＣＣＤＲ３（ｇＬ３ｇＨ２９）におけるＮ１０９ＧのＤ１０９Ｇへの置換は、融解温度において２℃の低下を生じて、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２０の両方が、融解温度でさらに２℃の低下を示した。ｇＬ３ｇＨ１３は、７９℃という最高の融解温度を有し、そのことにより、それは、Ｆａｂが霧化後も十分な生物学的活性を保持しなければならない噴霧療法による肺への局所送達で使用するための優れた候補になる。
【０３２６】
【表１０】
2019520818.tif 000013
【０３２７】
実験的ＰＩ及び電荷バリアントの分析
精製された試料を、イメージキャピラリー等電点電気泳動システム（whole-capillary imaged cIEF ICE3 system）ｃＩＥＦ  ＩＣＥ３（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して分析した。試料は、下記：試料（ＨＰＬＣ等級の水中の１ｍｇ／ｍｌのストックから）３０μｌ、１％メチルセルロース溶液（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）３５μｌ、ｐＨ３〜１０の両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）４μｌ、４．６５合成ｐＩマーカー０．５μｌ及び９．７７合成ｐＩマーカー０．５μｌ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）、８Ｍ尿素溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１２．５μｌを混合することによって調製した。ＨＰＬＣ等級水を使用して、最終容量を１００μｌにした。混合物を短時間ボルテックスして、完全な混合を確実にし、分析の前に、１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、気泡を除去した。試料に１．５ｋＶで１分間、続いて３ｋＶで５分間焦点を当てて、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅソフトウエアを使用して、キャピラリーのＡ２８０画像を撮影した。得られた電気泳動図を、まずｉＣＥ３ソフトウエアを使用して分析し、ｐＩ値を割り当てた（ｐＩマーカー間の直線関係）。続いて、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、較正した電気泳動図を統合した。
【０３２８】
全て主要な候補のｐＩが高く（表１１を参照されたい）、予想される製剤のｐＨで、分子が約ゼロの全分子電荷を有する（凝集が増大するリスクがない）ことはありそうもない。実験のｐＩは、全ての分子で同様であることが見出されて、したがってそれらの間を識別することができない。
【０３２９】
【表１１】
2019520818.tif 000014
空気−液体界面における凝集物の傾向
１ｍｇｍｌ−１でＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の精製された試料（３×２５０μｌのアリコート）を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｉｘｍａｔｅを使用して１．５ｍＬのエッペンドルフ中で２５℃にて１４００ｒｐｍでボルテックスした。分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を使用して５９５ｎｍでの吸収を獲得することによって、ボルテックス後の様々な時点で、濁度発生に関して試料を分析した。データを時間に対してプロットした。
【０３３０】
全ての主要な候補を、ボルテックス処理により応力にかけて、空気液体界面における凝集安定性に関する情報を提供した。これは、製造中の剪断並びに霧化中の潜在的安定性を模倣するために役立った。凝集安定性を、５９５ｎｍにおける濁度の測定により１４４時間までモニターした。凝集速度は遅く（低い吸光度値）、グラフト間で差は観察されなかった。
【０３３１】
脱アミド化状態のＡｓｎ（Ｎ）１０９（重鎖ＣＤＲ３）の分析。
【０３３２】
ｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０（両方共Ｎ１０９Ｇ）及びｇＬ３ｇＨ２３（Ｎ１０９Ａ）に対する重鎖ＣＤＲ３中に脱アミド化モチーフが存在する。この部位における化学的不安定性は、生成物の不均一性及び免疫原性をもたらし得る。グラフトｇＬｇＨ２９は、脱アミド化のリスクを最小化しながら、候補としての適合性を試験するために、この部位にＤ１０９Ｇ（脱アミド生成物）を有する。
【０３３３】
ｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０及びｇＬ３ｇＨ２３に対する精製直後の重鎖ＣＤＲ３中のＮ１０９における基礎的脱アミド化率（％）を、（ｉ）トリプシンによって生じた消化／ペプチドマッピング／質量分析法、及び（ｉｉ）キャピラリーイメージ等電集束法（capillary imaged isoelectric focussing；ＩＣＥ３）によって決定した。Ｎ１０９部位が脱アミドする（アンモニアの消失；酸性種の発生）速度／傾向を、上記３分子を、脱アミド化を促進することが知られている加速された応力条件にかける（ｐＨ８、３７℃）ことにより決定した。
【０３３４】
（ｉ）質量分析法
アリコート（５０μｇ）をＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化して、次にトリプシンで（１：２０ｗ／ｗ）終夜室温で消化した。消化物（約２μｇ）を０．２％ギ酸／水で平衡化されたＣ１８カラム（１×１５０ｍｍ  ＢＥＨ−３００）に注入することにより分析した。その結果生じたペプチドを、アセトニトリル勾配を用いて２０μＬ／分で、＋ｖｅイオン様式で作動中のＴｈｅｒｍｏ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分光計に溶出させた。データ依存獲得（ＤＤＡ）は、オービトラップ（orbitrap）全走査（分解能１２００００）とそれに続くＨＣＤフラグメンテーション及び最も強力な前駆体のイオントラップ測定からなる。ＭＳデータを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒを使用して分析した。得られたスペクトルを抗体の予想される配列に対して適合させた。
【０３３５】
ｇＬ３ｇＨ１３及びｇＬ３ｇＨ２０中の部位Ｎ１０９Ｇ（重鎖ＣＤＲ３）における脱アミド化（アンモニア損失）の基底レベルのパーセントは、同様であったが（約４％）、それに対して、ｇＬ３ｇＨ２３のＮ１０９Ａでは脱アミド化は認められなかった。
【０３３６】
加速された応力（４℃及び３７℃、ｐＨ８で２週間）の後、どのＦａｂグラフトでも、脱アミド化のレベルに変化はなかった（表１２）。
【０３３７】
全体として、Ｎ１０９ＧのＮ１０９Ａによる置換により、脱アミド化リスクがより低い可能性があるｇＬ３ｇＨ２３が生じた。しかしながら、基底レベルが全て低かったこと及び加速された応力後に増大した傾向がなかったことから、全ての分子が、治療候補として適当な脱アミド化レベルを有する。
【０３３８】
【表１２】
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（ｉｉ）キャピラリーイメージ等電点集束（ＩＣＥ３）
ｐＩ測定のために、ＩＣＥ３を上で記載されたように実施した結果、ｇＬ３ｇＨ１３、ｇＬ３ｇＨ２０、ｇＬ３ｇＨ２３及びｇＬ３ｇＨ２９グラフトの間で、加速された応力の前及び後の荷電（％）種（Species Pre and Post Accelerated Stress）（ｐＨ８）に有意の差はないことが示された。
【０３３９】
（例１１）ヒト化４８５６ＦａｂのグラフトｇＬ３ｇＨ１３の噴霧療法の研究
Ｆａｂ４８５６グラフトｇＬ３ｇＨ１３（今後４８５６と称する）の霧化により加えられる剪断力に対する凝集安定性を、研究用ＰＡＲＩｅＦｌｏｗ（登録商標）ネブライザー（ＰＡＲＩ  Ｐｈａｒｍａ  ＧｍＢｈ、Ｇｒａｆｅｌｉｎｇ、ドイツ）を利用して決定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が発現したＦａｂ４８５６をｐＨ６．０のバッファー中で、約１００ｍｇ／ｍＬから、名目濃度２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ及び８０ｍｇ／ｍＬに希釈して、ｐＨ７．４のバッファーで名目濃度２０ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【０３４０】
異なる濃度及びバッファーで予備濾過／滅菌された４８５６試料の試料（約１．０ｍＬ）を、ｅＦｌｏｗ（登録商標）ネブライザーを使用して霧化した。
【０３４１】
（ｉ）霧化の濃度に対する効果
希釈された試料（２８０ｎｍで＜１ＡＵ）を、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０−ＢｉｏＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用して測定した。濃度は、１．７２ＡＵの消光係数を使用して計算した（２８０ｎｍ、１ｍｇ／ｍＬ、及びビーム路長１ｃｍ）。
【０３４２】
噴霧される前と後の試料で、濃度（ｍｇ／ｍＬ）における差は観察されなかった。
【０３４３】
（ｉｉ）サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）
この分析で、可溶な凝集及びフラグメント化された材料の発生をモニターした。
【０３４４】
試料を、１ｍｇ／ｍＬ（注入体積２５μＬ）又は５ｍｇ／ｍＬ（注入体積２０μＬ）に希釈した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００システムに接続されたＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ（７．７ｍｍ  Ｉ．Ｄ×３０．０ｃｍ）カラムを使用して実施し、０．２Ｍリン酸ナトリウムを使用して、３０℃、ｐＨ７、１．０ｍＬ／分で１７分間、等張で溶出させた。ピークを２８０ｎｍでモニターした。
【０３４５】
噴霧化の前及び後の材料中に存在する高分子量種（ＨＭＷ）のパーセントにおける差は観察されなかった。それ故、霧化は、可溶性凝集の発生を生じなかった。いかなる低分子量材料に対する証拠もなく、したがって、霧化の結果としてフラグメンテーションは観察されなかった。
【０３４６】
（ｉｉｉ）動的光散乱（ＤＬＳ）
この分析で、大きい分子量種（ＳＥＣ  ＨＰＬＣカラムマトリックスにより濾過されると予想される不溶性粒子状材料）の発生をモニターした。ヒスチジン及び塩化ナトリウムを含むｐＨ６．０のバッファー中で、Ｆａｂ４８５６を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ  ＺＳ装置を使用して動的光散乱により試験した。
【０３４７】
噴霧療法の試料化の前及び後で、５０ｍｇ／ｍＬまで、４８５６の強度サイズ分布プロファイル（ＳＤＰ）からの主ピーク強度（％）における差は観察されなかった。多分散のパーセント（％ＰＤ）に関して、強度分布は、より大きい分子量の材料に大きく重きを置かれており（散乱は、分子量の２乗に比例する）、これが、存在する複数の種の相対比を表す体積分布に変換された場合、最小の重要でない変化が５０ｍｇ／ｍＬまで観察された。
【０３４８】
（ｉｖ）ＳＤＳＰＡＧＥ（非還元及び還元条件）
この分析では、ｐＨ６．０でヒスチジン及びＮａＣｌを含むバッファー中における凝集物／フラグメンテーションの発生をモニターした。
【０３４９】
非還元条件では、１ｍｇ／ｍＬで１０μＬの試料を、１０μＬのＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳの試料バッファー（２×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２μＬの１００ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミドと混合して、１００℃で２分間加熱した。
【０３５０】
還元条件では、１ｍｇ／ｍＬで１０μＬの試料を、１０μＬのＴｒｉｓ／グリシンＳＤＳ試料バッファー（２×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２μＬのＤＴＴ（１０×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合して、１００℃で３分間加熱した。
【０３５１】
遠心分離後、１０μＬ（４．５μｇ）の各試料を、Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ／グリシン（４〜２０％）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングして、１２５ｍＶで（定電圧）１００分間電気泳動させた。バンドをクーマジーブルーにより可視化した。
【０３５２】
霧化の前及び後の試料間で、２０ｍｇ／ｍＬまで差は観察されなかった。
【０３５３】
（ｖｉ）機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ。
【０３５４】
この分析は、ｐＨ６．０のヒスチジン、ＮａＣｌ中において、２０、５０及び８０ｍｇ／ｍＬで実施した。
【０３５５】
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ＴＧＦ−ベータレポーター遺伝子アッセイを、組換えＴＧＦ−ベータ１を使用して、例３で記載されたように実施した。
【０３５６】
霧化される前及び後の試料間で任意の濃度において、ＩＣ５０における有意の差は観察されなかった。
【０３５７】
（ｖ）呼吸シミュレーションにおける霧化された抗体のエアロゾルのキャラクタリゼーション
この分析で、Ｆａｂ４８５６の液滴サイズ並びに送達投与量及び霧化時間を、５０ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ６．０）の濃度で、ＰＡＲＩ  ｅＦｌｏｗ（登録商標）ネブライザーを使用してモニターした。簡潔に述べると、ネブライザーを副鼻腔ポンプ（sinus pump）に接続して、霧化された材料を含むエアロゾル滴を吸気捕集フィルターで捕集した。成人の呼吸パターンを使用して、１分当たり１５回の呼吸で５００ｍｌの１回換気体積、及び５０：５０の吸気：呼気比にした。完了後、捕集フィルターを洗浄して霧化された材料を抽出し、それをＨＰＬＣにより分析した（表１３）。
【０３５８】
【表１３】
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送達投与量（ＤＤ）を、呼吸シミュレーション実験により決定した。ＤＤ［％］は、６８％（２．９μｍ、ＭＭＤ）及び６４％（３．７μｍ、ＭＭＤ）であり、それはＤＤ値として典型的な良好な結果であると判定され、稀に７０％を超えた。残余は、１４％（２．９μｍ、ＭＭＤ）及び２１．９％（３．７μｍ、ＭＭＤ）であったが、それも典型的な範囲内である。＜５μｍ（ＲＤ＜５μｍ）の吸入可能な用量は、５０％（３．７μｍ、ＭＭＤ）に対して６３％（２．９μｍＭＭＤ）であった。粒子サイズは、呼吸経路の異なる領域への送達に影響して、及びＲＤ＜５μｍは肺胞への送達に対応する。
【０３５９】
これらのデータにより、霧化による送達に対して４８５６Ｆａｂが適切であることが確認される。
【０３６０】
（例１２）Ｘ線結晶学構造
抗体４８５６を、ＴＧＦ−ベータ１とともに結晶化させて抗体が接触するアミノ酸残基を決定した。
【０３６１】
ｉ）試料調製
５ｍＭ  ＨＣｌ中２．２５ｍｇ／ｍｌで２ｍｌの成熟ＴＧＦ−ベータ１を、ｐＨ８の３０ｕｌの２Ｍ  Ｔｒｉｓの添加によりｐＨ７に調節した。ＲＴで１時間のインキュベーション後、沈殿を遠心分離により除去して、２ｍｌを２．１ｍｇ／ｍｌで残した。これに３２ｍｇ／ｍｌで０．４６ｍｌのＦａｂ４８５６ｇＬ３ｇＨ１３（１４．７ｍｇ）を加えて、ＴＧＦ−ベータ１：Ｆａｂのモル比を約１：１．１にした。これをＲＴで１時間放置して、次に、予め５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５％グリセロールで、ｐＨ７．５で平衡させておいたＳ２００１６／１６０カラムにローディングした。複合体のピーク分画をプールして結晶構造解析のために１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０３６２】
ｉｉ）結晶化
【表１４】
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Ｑｉａｇｅｎから入手できる様々な条件（約２０００条件）を使用して、スクリーニングを実施した。インキュベーション及び画像化を、Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ  ＲｏｃｋＩｍａｇｅｒ  １０００によって行なった（２１日の合計インキュベーション期間の間）。
【０３６３】
ｉｉｉ）データ収集及び構造精製
【表１５】
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４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂと相互作用するＴＧＦ−ベータ１の残基を図１８Ａ及び１８Ｂに示す。４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂは、受容体結合領域と重なる領域に結合して、４８５６ｇＬ３ｇＨ１３Ｆａｂによる受容体ブロックは、競合により、抗ＴＧＦ−ベータ１は優れた親和性により効果的であることを示唆する。軽鎖でトレオニンに対するアルパラギン置換（配列番号４５の位置５）を含む４８５６ｇＬ３Ｈ１３のバリアントも、試験されて、構造における変化を引き起こすことはないことが見出された。
【０３６４】
同様に、抗体４８５６（ｓｃＦｖ４８５６、配列番号１０８）の単鎖抗体フォーマットを、ＴＧＦ−ベータ２（配列番号１１６）とともに結晶化させて、抗体が接触するアミノ酸残基を決定した。ｓｃＦｖ４８５６と相互作用するＴＧＦ−ベータ２の残基を、図１８Ｃに示すが、ＴＧＦ−ベータ１のＦａｂ結合に関して示された同じ領域における結合を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０３６５】
配列番号１：＜２２３＞ＣＤＲＬ１
配列番号２；＜２２３＞ＣＤＲＬ２
配列番号３：＜２２３＞ＣＤＲＬ３
配列番号４：＜２２３＞ＣＤＲＨ１
配列番号５：＜２２３＞ＣＤＲＨ２
配列番号６：＜２２３＞ＣＤＲＨ３
配列番号７：＜２２３＞ＣＤＲＨ３ｖａｒ１
配列番号８：＜２２３＞ＣＤＲＨ３ｖａｒ２
配列番号９：＜２２３＞ＣＤＲＨ３ｖａｒ３
配列番号１０〜１１：＜２２３＞ウサギ４８５６ＶＬ
配列番号１２〜１３：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６ＶＬ領域
配列番号１４〜１５：＜２２３＞ウサギ４８５６ＶＨ
配列番号１６：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６ＶＨ
配列番号１７：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６ＶＨ
配列番号１８：＜２２３＞ウサギ４８５６軽鎖
配列番号１９：＜２２３＞ウサギ４８５６軽鎖
配列番号２０：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６軽鎖
配列番号２１：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６軽鎖、下線付き
配列番号２２：＜２２３＞ウサギ４８５６Ｆａｂ重鎖
配列番号２３：＜２２３＞ウサギ４８５６Ｆａｂ重鎖
配列番号２４：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６Ｆａｂ重鎖、下線付き
配列番号２５：＜２２３＞シグナル配列を含むウサギ４８５６Ｆａｂ重鎖
配列番号２６：＜２２３＞マウス４８５６ｍＬ１．１Ｖ領域
配列番号２７：＜２２３＞マウス４８５６ｍＬ１．１Ｖ領域
配列番号２８：＜２２３＞シグナル配列を含むマウス４８５６ｍＬ１．１Ｖ領域
配列番号２９：＜２２３＞シグナル配列を含むマウス４８５６ｍＬ１．１Ｖ領域
配列番号３０：＜２２３＞マウス４８５６ｍＨ２．１Ｖ領域
配列番号３１：＜２２３＞マウス４８５６ｍＨ２．１Ｖ領域
配列番号３２：＜２２３＞シグナル配列を含むマウス４８５６ｍＨ２．１Ｖ領域
配列番号３３：＜２２３＞シグナル配列を含むマウス４８５６ｍＨ２．１Ｖ領域
配列番号３４：＜２２３＞マウスＩＧＫＶ１５−１０３ＪＫ１アクセプターフレームワーク
配列番号３５：＜２２３＞マウスＩＧＫＶ１５−１０３ＪＫ１アクセプターフレームワーク
配列番号３６：＜２２３＞マウスＩＧＨＶ４−Ｓ１ＪＨ３アクセプターフレームワーク
配列番号３７：＜２２３＞マウスＩＧＨＶ４−Ｓ１ＪＨ３アクセプターフレームワーク
配列番号３８：＜２２３＞４８５６ｇＬ３Ｖ領域
配列番号３９：＜２２３＞４８５６ｇＬ３Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号４０：＜２２３＞４８５６ｇＬ３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号４１：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３Ｖ領域
配列番号４２：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３Ｖ領域
配列番号４３：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号４４：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号４５：＜２２３＞４８５６ｇＬ３軽鎖
配列番号４６：＜２２３＞４８５６ｇＬ３軽鎖（哺乳動物による発現）
配列番号４７：＜２２３＞４８５６ｇＬ３軽鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号４８：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３軽鎖
配列番号４９：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３軽鎖（哺乳動物による発現）
配列番号５０：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３軽鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号５１：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇｌ３軽鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号５２：＜２２３＞４８５６ｇＨ１３Ｖ領域
配列番号５３：＜２２３＞４８５６ｇＨ１３Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号５４：＜２２３＞４８５６ｇＨ１３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号５５：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号５６：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号５７：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号５８：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号５９：＜２２３＞４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖
配列番号６０：＜２２３＞４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号６１：＜２２３＞４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号６２：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号６３：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号６４：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号６５：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ１３Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号６６：＜２２３＞４８５６ｇＨ２０Ｖ領域
配列番号６７：＜２２３＞４８５６ｇＨ２０Ｖ領域
配列番号６８：＜２２３＞４８５６ｇＨ２０Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号６９：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号７０：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号７１：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号７２：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号７３：＜２２３＞４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖
配列番号７４：＜２２３＞４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）（哺乳動物による発現）
配列番号７５：＜２２３＞４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号７６：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号７７：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号７８：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号７９：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２０Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号８０：＜２２３＞４８５６ｇＨ２３Ｖ領域
配列番号８１：＜２２３＞４８５６ｇＨ２３Ｖ領域
配列番号８２：＜２２３＞４８５６ｇＨ２３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号８３：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号８４：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号８５：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号８６：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号８７：＜２２３＞４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）
配列番号８８：＜２２３＞４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）（哺乳動物による発現）
配列番号８９：＜２２３＞４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号９０：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号９１：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号９２：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号９３：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２３Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号９４：＜２２３＞４８５６ｇＨ２９Ｖ領域
配列番号９５：＜２２３＞４８５６ｇＨ２９Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号９６：＜２２３＞４８５６ｇＨ２９Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号９７：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号９８：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｖ領域（哺乳動物による発現）
配列番号９９：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号１００：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｖ領域（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号１０１：＜２２３＞４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）
配列番号１０２：＜２２３＞４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）（哺乳動物による発現）
配列番号１０３：＜２２３＞４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（Ｖ＋ヒトガンマ−１ＣＨ１）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号１０４：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号１０５：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（哺乳動物による発現）
配列番号１０６：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号１０７：＜２２３＞シグナル配列を含む４８５６ｇＨ２９Ｆａｂ重鎖（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現）
配列番号１０８：＜２２３＞４８５６ｓｃＦｖ
配列番号１０９：＜２２３＞ヒトＩＧＫＶ１−５ＪＫ４アクセプターフレームワーク
配列番号１１０：＜２２３＞ヒトＩＧＫＶ１−５ＪＫ４アクセプターレームワーク
配列番号１１１：＜２２３＞ヒトＩＧＨＶ３−２１ＪＨ５アクセプターフレームワーク
配列番号１１２：＜２２３＞ヒトＩＧＨＶ３−２１ＪＨ５アクセプターフレームワーク
配列番号１１３：＜２２３＞ヒトＬＡＰ及びＴＧＦｂ１
配列番号１１４：＜２２３＞成熟ヒトＴＧＦｂ１
配列番号１１５：＜２２３＞ヒトＬＡＰ及びＴＧＦｂ２
配列番号１１６：＜２２３＞成熟ヒトＴＧＦｂ２
配列番号１１７：＜２２３＞ヒトＬＡＰ及びＴＧＦｂ３
配列番号１１８：＜２２３＞成熟ヒトＴＧＦｂ３
【図１Ａ】
2019520818.tif 000019
【図１Ｂ−１】
2019520818.tif 000020
【図１Ｂ−２】
2019520818.tif 000021
【図１Ｂ−３】
2019520818.tif 000022
【図１Ｂ−４】
2019520818.tif 000023
【図１Ｃ−１】
2019520818.tif 000024
【図１Ｃ−２】
2019520818.tif 000025
【図１Ｄ−１】
2019520818.tif 000026
【図１Ｄ−２】
2019520818.tif 000027
【図１Ｄ−３】
2019520818.tif 000028
【図１Ｄ−４】
2019520818.tif 000029
【図１Ｅ−１】
2019520818.tif 000030
【図１Ｅ−２】
2019520818.tif 000031
【図１Ｅ−３】
2019520818.tif 000032
【図１Ｅ−４】
2019520818.tif 000033
【図１Ｆ−１】
2019520818.tif 000034
【図１Ｆ−２】
2019520818.tif 000035
【図１Ｆ−３】
2019520818.tif 000036
【図１Ｆ−４】
2019520818.tif 000037
【図１Ｇ−１】
2019520818.tif 000038
【図１Ｇ−２】
2019520818.tif 000039
【図１Ｇ−３】
2019520818.tif 000040
【図１Ｇ−４】
2019520818.tif 000041
【図１Ｈ−１】
2019520818.tif 000042
【図１Ｈ−２】
2019520818.tif 000043
【図１Ｈ−３】
2019520818.tif 000044
【図１Ｈ−４】
2019520818.tif 000045
【図１Ｉ】
2019520818.tif 000046
【図２Ａ】
2019520818.tif 000047
【図２Ｂ】
2019520818.tif 000048
【図３Ａ】
2019520818.tif 000049
【図３Ｂ】
2019520818.tif 000050
【図３Ｃ】
2019520818.tif 000051
【図３Ｄ】
2019520818.tif 000052
【図３Ｅ】
2019520818.tif 000053
【図３Ｆ】
2019520818.tif 000054
【図４Ａ】
2019520818.tif 000055
【図４Ｂ】
2019520818.tif 000056
【図４Ｃ】
2019520818.tif 000057
【図５】
2019520818.tif 000058
【図６】
2019520818.tif 000059
【図７Ａ】
2019520818.tif 000060
【図７Ｂ】
2019520818.tif 000061
【図７Ｃ】
2019520818.tif 000062
【図８】
2019520818.tif 000063
【図９Ａ】
2019520818.tif 000064
【図９Ｂ】
2019520818.tif 000065
【図９Ｃ】
2019520818.tif 000066
【図１０Ａ】
2019520818.tif 000067
【図１０Ｂ】
2019520818.tif 000068
【図１０Ｃ】
2019520818.tif 000069
【図１０Ｄ】
2019520818.tif 000070
【図１１Ａ】
2019520818.tif 000071
【図１１Ｂ】
2019520818.tif 000072
【図１２】
2019520818.tif 000073
【図１３】
2019520818.tif 000074
【図１４】
2019520818.tif 000075
【図１５】
2019520818.tif 000076
【図１６】
2019520818.tif 000077
【図１７】
2019520818.tif 000078
【図１８Ａ】
2019520818.tif 000079
【図１８Ｂ】
2019520818.tif 000080
【図１８Ｃ】
2019520818.tif 000081
【配列表】
2019520818000001.app
【国際調査報告】
2019520818.tif 000082
2019520818.tif 000083
2019520818.tif 000084
2019520818.tif 000085
2019520818.tif 000086
2019520818.tif 000087