(57)【要約】  本発明は、培養皿の底面に溶液のカルシウムイオンの濃度の違いによって重合・脱重合の変化を行う高分子ゲルを薄層状にコーティングし、かつ、1細胞単位で細胞を培養するチャンバーをその上面に配置することで、1細胞単位で細胞培養ができ、かつ、カルシウムイオンのキレート剤を、回収したい細胞のチャンバー位置に作用させることで、1細胞単位の局所に培養細胞を剥離回収する装置ならびに方法を提供する。
2011102385.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養皿と、
前記培養皿の表面に形成された、ゾル化剤によりゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層と、
を備える細胞培養装置。
【請求項２】
細胞電位を計測することができる電極または複数の電極のアレイを、前記培養皿の表面と前記細胞担体層との間にさらに備える、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記電極に接続され、前記細胞電位を計測することができる細胞電位計測部と、
前記細胞電位計測部で計測した細胞電位に基づいて細胞の種類、細胞状態の変化を判断して回収する細胞を判別する細胞判別部とをさらに備える、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記細胞培養担体層が、薄膜状に形成された、細胞接着基質と混合されたアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムを含むアルギン酸ゲル層からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記ゾル化剤がカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンのキレート剤であり、
前記キレート剤を回収したい細胞の近傍に適用することで前記細胞培養担体層の該キレート剤が適用された部分がゾル化し、それによって1細胞単位で局所的に目的の培養細胞を剥離回収することが可能になる、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養装置であって、さらに、
前記担体層の上部表面に形成されたアガロース層であって、該アガロース層の一部が前記ゾル化剤によりゾル化して除去されることによって形成された、１細胞単位での細胞培養を可能にする容積を有するマイクロチャンバーおよび該マイクロチャンバーから伸びるマイクロチャネルを備える、アガロース層、
を備える細胞培養装置。
【請求項７】
前記ゾル化剤が適用される部分が、前記回収したい細胞の収容されているマイクロチャンバーである、請求項６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記マイクロチャンバーが、前記電極が配置されている位置に対応して形成されている、請求項６または７に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記マイクロチャネルが、細胞の移動は許容しないが、前記細胞から伸長した細胞突起を通過させることができる、請求項６または７に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
さらに、
前記マイクロチャンバー、マクロチャネルにおいて培養された細胞下の前記ゾル化剤を1マイクロチャンバーおよび１マイクロチャンネル単位で散布することができる手段と、
細胞の状態を計測することが出来る手段と、
剥離した細胞を回収することができる手段と、を備える、請求項６〜９のいずれかに記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
培養皿の表面にゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを薄層状にコーティングして、細胞培養担体層を形成する工程、
前記細胞培養担体層上にアガロース層を形成する工程、ならびに
前記アガロース層の一部をレーザー照射により除去して、１細胞単位で細胞培養できる容積のマイクロチャンバーおよび該マイクロチャンバーから伸びるマイクロチャネルを形成する工程、
を含む、細胞培養装置の製造方法。
【請求項１２】
前記細胞培養担体層を形成する工程の前に、前記培養皿の表面に細胞電位を計測することができる電極または複数の電極のアレイを配置する工程をさらに含み、
前記マイクロチャンバーおよびマイクロチャネルを形成する工程において、前記電極の位置に対応させて前記マイクロチャンバーを形成することを含む、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記高分子ゲルが、細胞接着基質と混合されたアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムを含むアルギン酸ゲルである、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記マイクロチャンバーおよびマイクロチャネルを形成する工程において、
水の吸収がある波長の集束赤外光をアガロース層に照射してその温度変化によってゲル状態のアガロースをゾル状態にし、
光学的に、その位置を確認しながらゾル状態にするアガロース領域を指定してチャンバーを構築することを含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１５】
前記培養細胞として神経細胞を用い、
前記マイクロチャンバーが、一細胞がちょうど接着できる程度の約50μmの直径を有し、前記マイクロチャネルが、神経の突起が前記神経細胞から直線上に伸張できる程度の約10μmの幅および約100μmの長さを有するように、前記マイクロチャネルおよび前記マイクロチャンバーを形成することを含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞培養装置を準備する工程、
前記細胞培養装置において細胞を培養する工程、
ゾル化剤を回収したい細胞の近傍の細胞培養担体層の部分に作用させる工程、および
1細胞単位で局所的に前記培養細胞を剥離回収する工程、
を含む、非侵襲的培養細胞剥離法。
【請求項１７】
前記細胞培養する工程において、
細胞の状態を光学的あるいは電気的に観察し、その観察結果に基づいて１つのチャンバー単位でゾル化剤を添加することで培養担体層をゾル化させ、
前記培養細胞を剥離回収する工程において、
下部の培養担体層がゾル化されたことによって浮遊した目的細胞を回収することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養装置の細胞培養担体層として、薄膜状に形成された、細胞接着基質と混合されたアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルを含むアルギン酸ゲル層を用い、
前記培養細胞を剥離回収する工程において、
ニードル内をゾル化剤としてのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA・2Na）入りの培養液で満たした、細胞から数細胞を同時に回収できる程度の内径を持つ中空のマイクロニードルを用意し、
培養数日後、接着し、光学的あるいは電気的計測手法によって表現型が明らかになった細胞に対して、前記マイクロニードルによって前記EDTA・2Na入り培養液を局所的に吹きかけることによって、局所的に前記培養細胞の足場となっているアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルをゾル化させ、
非侵襲的に目的の細胞を剥離させることを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養細胞の足場となっている前記アルギン酸ゲル層がゾル化したことによって浮遊した細胞をマイクロニードルによって回収することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法により非侵襲的に単離した培養細胞。
【請求項２１】
請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法により、人工的に作成した神経ネットワークの形状を維持しながら非侵襲的に細胞培養培地から剥離回収された培養神経細胞。
【請求項２２】
人工的に作成した神経ネットワークの形状を維持しながら非侵襲的に細胞培養培地から剥離回収された培養神経細胞。
【請求項２３】
培養皿の表面に形成された、ゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層を備える細胞培養皿を載置するＸ−Ｙステージを含むステージ部と、
前記細胞培養皿中の培養細胞を顕微鏡観察する光学顕微鏡系と、
前記光学顕微鏡系に光学的に接続され、前記光学顕微鏡からの光学イメージを撮像する光学カメラを含む撮像部と、
前記撮像部により撮像した画像を表示するディスプレイを含む表示部と、
前記高分子ゲルをゾル化させることができるゾル化剤を吐出するゾル化剤吐出用マイクロピペットを含む第１のマイクロピペット部と、
前記高分子ゲルをゾル化したことによって剥離可能となった培養細胞を回収する細胞回収用マイクロピペットを含む第２のマイクロピペット部と、
前記撮像した画像を記録する記録部と、
前記各部の動作を制御し、前記撮像した画像を解析する制御・解析部と、
を備える、培養細胞分離回収システム。
【請求項２４】
さらに、
前記細胞培養皿の表面と前記細胞培養担体層との間に配置された細胞電位を計測することができる電極または複数の電極のアレイを含む、前記細胞培養皿中の培養細胞の細胞電位を計測できる細胞電位計測系を備え、
前記表示部がさらに、前記細胞電位計測系により計測した細胞電位を表示することができるか、または前記細胞電位計測系により計測した細胞電位を表示する第２の表示部を備え、
前記記録部により前記細胞電位が記録され得るか、または前記細胞電位を記録する第２の記録部を備え、
前記制御・解析部により、前記細胞電位計測系により計測した前記細胞の細胞電位が解析され得るか、または前記細胞電位計測系により計測した前記細胞の細胞電位を解析するための細胞電位データ解析部を備える、請求項２３に記載の培養細胞分離回収システム。
【請求項２５】
前記撮像部により撮像した前記培養皿の表面に培養した細胞の光学イメージと、前記細胞電位計測系により計測した前記細胞の細胞電位とに基づいて、ターゲットとする細胞が選択的に回収され得る、請求項２３または２４に記載の培養細胞分離回収システム。
【請求項２６】
前記高分子ゲルがアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルを含むアルギン酸ゲルであり、前記ゾル化剤がカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンのキレート剤である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２７】
前記細胞回収用マイクロピペットで回収した細胞を再培養するための再培養用培養皿を備える、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれかに記載の培養細胞分離回収システムを用いて、細胞を分離する方法であって、
撮像部により取得した培養細胞の画像データを、所望のパラメータにより定量化し、所定の閾値を基準に前記培養細胞を選別する工程、
選別した細胞または細胞群の近傍に第１のマイクロピペット部を用いてゾル化剤を吐出して細胞培養担体層を溶解し、剥離可能となった前記選別した細胞または細胞群を第２のマイクロピペット部を用いて回収する工程、
を含む、細胞分離方法。
【請求項２９】
細胞電位を計測する計測部により取得した培養細胞の細胞電位データを、細胞表面に発現した各イオンチャンネルの脱分極後の解放時間に基づいて各イオンチャンネルの存在の有無および／もしくは発現のだいたいの量、ならびに／または接合する細胞間での脱分極刺激の伝達の有無および／もしくは程度をパラメータとして定量化し、所定の閾値を基準に前記培養細胞を選別する工程、
をさらに備える、請求項２８に記載の細胞分離方法。
【請求項３０】
前記回収した細胞をさらに再培養する工程を含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記パラメータが、細胞の形状、細胞周期、幹細胞コロニー解析、または細胞分化度である、請求項２８または３０に記載の方法。
【請求項３２】
ゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層をその表面に形成した培養皿を準備する工程、
所望のパターンの鋳型に前記高分子ゲルの変性剤を塗布する工程
前記鋳型で前記細胞培養担体層表面をスタンプして、前記変性剤を前記細胞培養担体層表面に配置する工程、
を含む、非侵襲的剥離用培養皿の製造方法。
【請求項３３】
前記高分子ゲルがアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルを含むアルギン酸ゲルであり、前記変性剤がポリリジンである、請求項３２に記載の製造方法。
【請求項３４】
培養細胞として神経細胞が使用される、請求項３２に記載の製造方法。
【請求項３５】
前記鋳型のパターンがタイル状のパターンである、請求項３２に記載の製造方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５のいずれかに記載の製造方法によって製造された非侵襲的剥離用培養皿。
【請求項３７】
培養中の細胞を非侵襲的に回収する方法であって、
請求項３６に記載の非侵襲的剥離用培養皿を用いて、細胞を培養する工程、
前記培養皿にゾル化剤を添加する工程、および
前記ゾル化剤によってゾル化した細胞培養担体層から培養細胞を剥離する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞を観察し、その観察評価結果から対象となる細胞を非侵襲的に剥離し再培養する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多細胞生物の組織から採取し初代培養した細胞には様々な種類の細胞が混在している。このように組織中、培養液中の特定の細胞を同定することは、生物学・医学的な分析においては重要な技術であるため、さまざまな方法が開発されているが、特に、細胞の形状の違いがほとんど無い場合には、蛍光抗体で染色した情報あるいは目視の情報を基に細胞を１つ１つ識別する必要があった。この技術については、例えば、近年、定量化イメージングサイトメトリー（Quantitative Imaging Cytometry）という技術として研究開発が進んでいる（非特許文献１：Harnett, M., “Laser scanning cytometry: understanding the immune system in situ. Nature Review Immunology, Vol. 7, pp. 897-904 (2007)）。このイメージングサイトメトリーは、従来の光学顕微鏡のイメージング法とサイトメトリーの概念を融合したもので、従来の組織のランダムな顕微鏡イメージングから、細胞形状や蛍光標識などの特定のインデックスについて基準値を設けて、組織中のすべての細胞を計測して統計処理するものである。しかし、これらを一旦培養皿上で培養すると、上記観察手法で目的の細胞を見出しても特定の細胞のみ剥離し再培養することは難しい。【０００３】
現状として癌細胞や線維芽細胞をはじめとする株化した細胞は、自身の増殖性のため培養皿から剥離し、継代、維持を行っている。この剥離には蛋白分解酵素であるトリプシンや、細胞外基質であるコラゲナーゼ等の酵素を用いる。しかしながら、このような細胞剥離剤は細胞にとって傷害性が高く一般的に組織から採取し培養した初代培養細胞の剥離は不可能である。そのため、一旦培養し，目的の細胞が見つかったとしてもそれを回収し再利用することは難しい。【０００４】
近年、再生医療の分野において組織の中から幹細胞を分離，あるいはES細胞を培養・分化し、臓器を再生する試みがなされている。しかし，培養皿上で分化した細胞を移植のように利用するためには非侵襲的に剥離することが必須になる。培養皿上で一旦分化した細胞を非侵襲的に剥離する技術が発展することで生理学的な細胞の性質、神経で例えるならば、発火頻度や興奮性・抑制性細胞、心筋細胞ならば、拍動周期の異なる細胞を一度確認した後回収し、再利用することが可能になる。培養液中の特定の細胞を分離し回収することは生物学・医学的な分析においては重要な技術である。【０００５】
この培養中の細胞を非侵襲的に剥離・回収する技術の一例としてポリN-イソプロピルアクリルアミド(PIPAAm)がある(特許文献1：特開2006-238707，特許文献2：特開2000-219708，特許文献3：特開2000-219709, 非特許文献2：J R Soc Interface. 6 Suppl 3:S293-309 (2009))。この物質は培養する温度である37℃付近では疎水性の性質を20℃付近では親水性の性質を持つ物質である。PIPAAmを培養皿にコーティングし、細胞培養したものを30分程度20℃付近に温度変化させることにより、細胞を非侵襲的に剥離することに成功している。この物質をコーティングしたシャーレでは酵素を使うこと無しに細胞を剥離できるため、細胞間同士の結合も外すことなくシャーレ上から回収することができる。そのため、細胞同士が結合した細胞シートを作製回収することが可能になる。これは初代培養された細胞や幹細胞から分化した様々な細胞を回収することが可能になることを意味する。しかし、この手段で細胞を剥がすとなると培養皿全体を冷やすことになる。そのため、培養皿中の細胞を全て剥がすことになり、目的の細胞のみを回収するまでに至っていない。さらに、線虫から採取した細胞のように、20℃で培養する細胞等の場合は培養すら不可能である。今後、再生医療の発展に伴い必要な細胞を一細胞単位から性質が揃った細胞を非侵襲的に回収する技術の需要は高まりつつあるため、新たな技術開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2006-238707
【特許文献２】特開2000-219708
【特許文献３】特開2000-219709
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Harnett, M., “Laser scanning cytometry: understanding the immune system in situ. Nature Review Immunology, Vol. 7, pp. 897-904 (2007)
【非特許文献２】Nagase K, Kobayashi J, Okano T. J R Soc Interface. 6 Suppl 3:S293-309 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、培養中の特定の細胞を一細胞単位から非侵襲的に、かつ任意の培養温度を維持しながら温度変化を与えることなく回収する非侵襲的培養細胞剥離装置ならびに非侵襲的培養細胞剥離法を提供するために、培養皿の底面に溶液のカルシウムイオンの濃度の違いによって重合・脱重合の変化を行う高分子ゲルを薄層状にコーティングし、1細胞単位で細胞を培養するチャンバーをその上面に配置し、そのチャンバー内で1細胞単位で細胞培養をした後、カルシウムイオンのキレート剤を、回収したい細胞のチャンバー位置に作用させることで、1細胞単位の局所に培養細胞を剥離回収する装置ならびに方法の開発を行ってきた。選択的に特定の細胞を1細胞レベルで回収できる細胞回収技術を有効に活用するためには、細胞状態を解析する技術と、細胞観察をして定量的に閾値を設けて、その閾値の値に応じて細胞を回収する技術が必要である。【０００９】
生体組織から分離した初代細胞を培養皿に培養し、表現型を観察できる状態まで分化した細胞は通常の培養方法では非侵襲的に剥がすことが非常に困難である。そのため、細胞の生理学的な解析はできても、それらを別な用途に再利用するため剥離する研究は未だなされていない。この問題は再生医療研究に大きく関わってくる。【００１０】
胚性幹細胞(ES細胞)や誘導多能性幹細胞(iPS細胞)は、通常、神経細胞や心筋細胞などの分化細胞に誘導させるためには培養皿上に接着することで行っている。そのため、培養皿上で分化した細胞を移植するためには非侵襲的に剥離する必要がある。また、分化した細胞は一種類の細胞のみに分化するわけではなく、様々なタイプの細胞に分化することが知られている。そのため、必要な細胞を確認しながら一細胞単位から、非侵襲的に回収する必要がある。また、細胞はその種類の違いによって、培養する温度条件が異なっており、かつ、細胞によっては温度変化を与えることが細胞の状態を変化させる可能性があることから、どのような温度環境でも培養を行うことができ、かつ、細胞を回収するときにも、この温度を保ったままで細胞回収が出来ることが望ましい。【００１１】
このように培養中の特定の細胞を一細胞単位から非侵襲的に、かつ任意の培養温度を維持しながら温度変化を与えることなく回収することが求められている。【００１２】
また、特定のターゲット細胞を選択的に回収するためには、ターゲットとなる細胞を識別する細胞観察要素であるサイトメトリー技術と細胞に対して非侵襲な細胞回収要素が融合した技術が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような状況に鑑み、本発明は、以下の細胞培養装置、細胞培養装置の製造方法、非侵襲的培養細胞剥離法、選択的な培養細胞の回収・再培養方法および培養細胞を提供する。【００１４】
［１］培養皿と、
上記培養皿の表面に形成された、ゾル化剤によりゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層と、
を備える細胞培養装置。
［２］細胞電位を計測することができる電極または複数の電極のアレイを、上記培養皿の表面と上記細胞担体層との間にさらに備える、上記［１］に記載の細胞培養装置。
［３］上記電極に接続され、上記細胞電位を計測することができる細胞電位計測部と、
上記細胞電位計測部で計測した細胞電位に基づいて細胞の種類、細胞状態の変化を判断して回収する細胞を判別する細胞判別部とをさらに備える、上記［２］に記載の細胞培養装置。
［４］上記細胞培養担体層が、薄膜状に形成された、細胞接着基質と混合されたアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムを含むアルギン酸ゲル層からなる、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［５］上記ゾル化剤がカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンのキレート剤であり、
上記キレート剤を回収したい細胞の近傍に適用することで上記細胞培養担体層の該キレート剤が適用された部分がゾル化し、それによって1細胞単位で局所的に目的の培養細胞を剥離回収することが可能になる、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［６］上記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞培養装置であって、さらに、
上記担体層の上部表面に形成されたアガロース層であって、該アガロース層の一部が上記ゾル化剤によりゾル化して除去されることによって形成された、１細胞単位での細胞培養を可能にする容積を有するマイクロチャンバーおよび該マイクロチャンバーから伸びるマイクロチャネルを備える、アガロース層、
を備える細胞培養装置。
［７］上記ゾル化剤が適用される部分が、上記回収したい細胞の収容されているマイクロチャンバーである、上記［６］に記載の細胞培養装置。
［８］上記マイクロチャンバーが、上記電極が配置されている位置に対応して形成されている、上記［６］または［７］に記載の細胞培養装置。
［９］上記マイクロチャネルが、細胞の移動は許容しないが、上記細胞から伸長した細胞突起を通過させることができる、上記［６］または［７］に記載の細胞培養装置。
［１０］さらに、
上記マイクロチャンバー、マクロチャネルにおいて培養された細胞下の上記ゾル化剤を1マイクロチャンバーおよび１マイクロチャンネル単位で散布することができる手段と、
細胞の状態を計測することが出来る手段と、
剥離した細胞を回収することができる手段と、を備える、上記［６］〜［９］のいずれかに記載の細胞培養装置。【００１５】
［１１］培養皿の表面にゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを薄層状にコーティングして、細胞培養担体層を形成する工程、
上記細胞培養担体層上にアガロース層を形成する工程、ならびに
上記アガロース層の一部をレーザー照射により除去して、１細胞単位で細胞培養できる容積のマイクロチャンバーおよび該マイクロチャンバーから伸びるマイクロチャネルを形成する工程、
を含む、細胞培養装置の製造方法。
［１２］上記細胞培養担体層を形成する工程の前に、上記培養皿の表面に細胞電位を計測することができる電極または複数の電極のアレイを配置する工程をさらに含み、
上記マイクロチャンバーおよびマイクロチャネルを形成する工程において、上記電極の位置に対応させて上記マイクロチャンバーを形成することを含む、上記［１１］に記載の製造方法。
［１３］上記高分子ゲルが、細胞接着基質と混合されたアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムを含むアルギン酸ゲルである、上記［１１］に記載の製造方法。
［１４］上記マイクロチャンバーおよびマイクロチャネルを形成する工程において、
水の吸収がある波長の集束赤外光をアガロース層に照射してその温度変化によってゲル状態のアガロースをゾル状態にし、
光学的に、その位置を確認しながらゾル状態にするアガロース領域を指定してチャンバーを構築することを含む、上記［１１］〜［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］上記培養細胞として神経細胞を用い、
上記マイクロチャンバーが、一細胞がちょうど接着できる程度の約50μmの直径を有し、上記マイクロチャネルが、神経の突起が上記神経細胞から直線上に伸張できる程度の約10μmの幅および約100μmの長さを有するように、上記マイクロチャネルおよび上記マイクロチャンバーを形成することを含む、上記［１１］〜［１４］のいずれかに記載の製造方法。【００１６】
［１６］上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の細胞培養装置を準備する工程、
上記細胞培養装置において細胞を培養する工程、
ゾル化剤を回収したい細胞の近傍の細胞培養担体層の部分に作用させる工程、および
1細胞単位で局所的に上記培養細胞を剥離回収する工程、
を含む、非侵襲的培養細胞剥離法。
［１７］上記細胞培養する工程において、
細胞の状態を光学的あるいは電気的に観察し、その観察結果に基づいて１つのチャンバー単位でゾル化剤を添加することで培養担体層をゾル化させ、
上記培養細胞を剥離回収する工程において、
下部の培養担体層がゾル化されたことによって浮遊した目的細胞を回収することを含む、上記［１６］に記載の方法。
［１８］上記細胞培養装置の細胞培養担体層として、薄膜状に形成された、細胞接着基質と混合されたアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルを含むアルギン酸ゲル層を用い、
上記培養細胞を剥離回収する工程において、
ニードル内をゾル化剤としてのエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA・2Na）入りの培養液で満たした、細胞から数細胞を同時に回収できる程度の内径を持つ中空のマイクロニードルを用意し、
培養数日後、接着し、光学的あるいは電気的計測手法によって表現型が明らかになった細胞に対して、上記マイクロニードルによって上記EDTA・2Na入り培養液を局所的に吹きかけることによって、局所的に上記培養細胞の足場となっているアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルをゾル化させ、
非侵襲的に目的の細胞を剥離させることを含む、上記［１６］または［１７］に記載の方法。
［１９］上記培養細胞の足場となっている上記アルギン酸ゲル層がゾル化したことによって浮遊した細胞をマイクロニードルによって回収することを含む、上記［１８］に記載の方法。【００１７】
［２０］上記［１６］〜［１９］のいずれかに記載の方法により非侵襲的に単離した培養細胞。
［２１］上記［１６］〜［１９］のいずれかに記載の方法により、人工的に作成した神経ネットワークの形状を維持しながら非侵襲的に細胞培養培地から剥離回収された培養神経細胞。
［２２］人工的に作成した神経ネットワークの形状を維持しながら非侵襲的に細胞培養培地から剥離回収された培養神経細胞。【００１８】
［２３］培養皿の表面に形成された、ゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層を備える細胞培養皿を載置するＸ−Ｙステージを含むステージ部と、
上記細胞培養皿中の培養細胞を顕微鏡観察する光学顕微鏡系と、
上記光学顕微鏡系に光学的に接続され、上記光学顕微鏡からの光学イメージを撮像する光学カメラを含む撮像部と、
上記撮像部により撮像した画像を表示するディスプレイを含む表示部と、
上記高分子ゲルをゾル化させることができるゾル化剤を吐出するゾル化剤吐出用マイクロピペットを含む第１のマイクロピペット部と、
上記高分子ゲルをゾル化したことによって剥離可能となった培養細胞を回収する細胞回収用マイクロピペットを含む第２のマイクロピペット部と、
上記撮像した画像を記録する記録部と、
上記各部の動作を制御し、上記撮像した画像を解析する制御・解析部と、
を備える、培養細胞分離回収システム。
［２４］さらに、
上記細胞培養皿の表面と上記細胞培養担体層との間に配置された細胞電位を計測することができる電極または複数の電極のアレイを含む、上記細胞培養皿中の培養細胞の細胞電位を計測できる細胞電位計測系を備え、
上記表示部がさらに、上記細胞電位計測系により計測した細胞電位を表示することができるか、または上記細胞電位計測系により計測した細胞電位を表示する第２の表示部を備え、
上記記録部により上記細胞電位が記録され得るか、または上記細胞電位を記録する第２の記録部を備え、
上記制御・解析部により、上記細胞電位計測系により計測した上記細胞の細胞電位が解析され得るか、または上記細胞電位計測系により計測した上記細胞の細胞電位を解析するための細胞電位データ解析部を備える、上記［２３］に記載の培養細胞分離回収システム。
［２５］上記撮像部により撮像した上記培養皿の表面に培養した細胞の光学イメージと、上記細胞電位計測系により計測した上記細胞の細胞電位とに基づいて、ターゲットとする細胞が選択的に回収され得る、上記［２３］または［２４］に記載の培養細胞分離回収システム。
［２６］上記高分子ゲルがアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルを含むアルギン酸ゲルであり、上記ゾル化剤がカルシウムイオンまたはマグネシウムイオンのキレート剤である、上記［２３］に記載のシステム。
［２７］上記細胞回収用マイクロピペットで回収した細胞を再培養するための再培養用培養皿を備える、上記［１９］に記載のシステム。【００１９】
［２８］上記［２３］〜［２７］のいずれかに記載の培養細胞分離回収システムを用いて、細胞を分離する方法であって、
撮像部により取得した培養細胞の画像データを、所望のパラメータにより定量化し、所定の閾値を基準に上記培養細胞を選別する工程、
選別した細胞または細胞群の近傍に第１のマイクロピペット部を用いてゾル化剤を吐出して細胞培養担体層を溶解し、剥離可能となった上記選別した細胞または細胞群を第２のマイクロピペット部を用いて回収する工程、
を含む、細胞分離方法。
［２９］細胞電位を計測する計測部により取得した培養細胞の細胞電位データを、細胞表面に発現した各イオンチャンネルの脱分極後の解放時間に基づいて各イオンチャンネルの存在の有無および／もしくは発現のだいたいの量、ならびに／または接合する細胞間での脱分極刺激の伝達の有無および／もしくは程度をパラメータとして定量化し、所定の閾値を基準に上記培養細胞を選別する工程、
をさらに備える、上記［２８］に記載の細胞分離方法。
［３０］上記回収した細胞をさらに再培養する工程を含む、上記［２８］または［２９］に記載の方法。
［３１］上記パラメータが、細胞の形状、細胞周期、幹細胞コロニー解析、または細胞分化度である、上記［２８］または［３０］に記載の方法。【００２０】
［３２］ゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層をその表面に形成した培養皿を準備する工程、
所望のパターンの鋳型に上記高分子ゲルの変性剤を塗布する工程
上記鋳型で上記細胞培養担体層表面をスタンプして、上記変性剤を上記細胞培養担体層表面に配置する工程、
を含む、非侵襲的剥離用培養皿の製造方法。
［３３］上記高分子ゲルがアルギン酸カルシウムまたはアルギン酸マグネシウムゲルを含むアルギン酸ゲルであり、上記変性剤がポリリジンである、上記［３２］に記載の製造方法。
［３４］培養細胞として神経細胞が使用される、上記［３２］に記載の製造方法。
［３５］上記鋳型のパターンがタイル状のパターンである、上記［３２］に記載の製造方法。
［３６］上記［３２］〜［３５］のいずれかに記載の製造方法によって製造された非侵襲的剥離用培養皿。【００２１】
［３７］培養中の細胞を非侵襲的に回収する方法であって、
上記［３６］に記載の非侵襲的剥離用培養皿を用いて、細胞を培養する工程、
上記培養皿にゾル化剤を添加する工程、および
上記ゾル化剤によってゾル化した細胞培養担体層から培養細胞を剥離する工程、
を含む、方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、培養細胞を一細胞単位から選択的に非侵襲的に培養皿から剥離し再利用することを実現できる。【００２３】
また、本発明により、再利用すべき培養細胞を効率的に選別、回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の細胞培養装置の構成の一例を概念的に示す模式図である。
【図２】図１の細胞培養装置におけるアガロース層の加工を行う装置の１例を模式的に示す装置構成図である。
【図３】図１における培養装置を用いて細胞を培養、剥離、回収、再培養する一例の手順を模式的に示す図である。
【図４】図３における手順に従って実際に細胞培養、剥離、回収、および再培養を行い、撮影した結果を示す図である。
【図５】細胞を光学的に観察し、その結果に基づいて細胞を回収して、さらに別の培養皿に再培養する装置の一例について概念的に示す模式図である。
【図６】細胞を光学的に観察し、その結果に基づいて細胞を回収して、さらに別の培養皿に再培養する手法および手順の一例について概念的に示す模式図である。
【図７】基板表面の加工法の一例について概念的に示す模式図である。
【図８】基板表面の加工の結果の一例を示す顕微鏡写真である。
【図９】図８に示すような非侵襲剥離用培養皿を用いて神経細胞を培養した後、培養した神経細胞を一細胞毎に非侵襲的に剥離する様子（Ｂ）を、従来の方法（Ａ）と対比して模式的に示した図である。
【図１０】培養細胞の電位を計測して細胞を培養、剥離、回収、再培養する一例の手順を模式的に示す図である。
【図１１】本発明の電極アレイ５００１を培養皿上に配置した細胞培養装置を用いて培養細胞を培養した一例を示す顕微鏡写真（A）と、その断面での構成を模式的に示す図（B）、ならびに実際に取得した細胞電位の時間変化の一例を示すグラフ（C）である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、一実施形態において、細胞培養装置を提供する。この細胞培養装置は、培養皿（culture plate）と、その培養皿の表面に形成された、ゾル化剤によってゾル化可能な高分子ゲルを含む細胞培養担体層（cell culture carrier layer）とを備える。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態では、上記の担体層の上部表面に形成されたアガロース層（agarose layer）をさらに備える。この実施形態では、このアガロース層の一部が除去されることによって、１細胞単位での細胞培養を可能にする容積を有するマイクロチャンバーおよび該マイクロチャンバーから伸びるマイクロチャネルが形成されている。
【００２７】
本発明において使用される「高分子ゲル」には、典型的には、EDTAあるいはEGTAなどの金属イオンのキレート剤によって金属イオンをキレートすることでゾル化する高分子ゲル、すなわち、例えば、アルギン酸カルシウムゲル、アルギン酸マグネシウムゲル等のアルギン酸ゲルが含まれるがこれらに限定されない。不溶化（または変性）されたアルギン酸ゲルには、例えば、アルギン酸ポリリジンゲルが含まれる。
【００２８】
アルギン酸ゲルの「ゾル化剤」には、金属イオンのキレート剤として、例えば、カルシウムイオンのキレート剤（例：EDTA・2Na、EGTA、NTA(Nitrilo Triacetic Acid)、クエン酸、フィチン酸等)（特に、アルギン酸カルシウムゲルの場合）、マグネシウムイオンのキレート剤（例：EDTA・2Na）（特に、アルギン酸マグネシウムゲルの場合）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
高分子ゲルまたはアルギン酸ゲルの「不溶化剤」または「変性剤」には、例えば、ポリリジン（ポリ-L-リジン：PLL）などのカチオン性試薬、および酸性試薬（アルギン酸より強酸の試薬）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明の細胞培養装置は、例えば、細胞接着基質（cell adhesive substrate）を混ぜたアルギン酸ナトリウムに塩化カルシウム溶液を作用させて薄層のアルギン酸カルシウムゲルを培養皿上に作成することで作製することができる。本発明のさらなる実施形態の細胞培養装置では、そのアルギン酸カルシウムゲル層の上に、さらにアガロースゲルの薄膜を積層・密着させ、アガロース層の一部を目的とする細胞培養に適した形状に局所的に除去して、細胞接着基質を混ぜたアルギン酸カルシウムをむき出しにしてマイクロチャンバーおよびそれから伸びるマイクロチャネルを構築する。したがって、本発明はまた、一実施形態において、細胞培養装置の製造方法を提供する。
【００３１】
本発明においては、アガロース層を局所的に溶解させることによって、細胞を配置するためのチャンバーを構築する。本発明によれば、水の吸収がある波長の集束赤外光をアガロース層に照射してその温度変化によってゲル状態のアガロースをゾル状態にし、光学的に、その位置を確認しながらゾル状態にするアガロース領域を指定してチャンバーを構築することができる。
【００３２】
本発明はまた、培養細胞の非侵襲的剥離方法を提供する。
【００３３】
１つの実施形態では、本発明は、培養皿の上にコーティングされたアルギン酸層のみ（アガロースゲル層なし）を用いて細胞を分散培養して組織化した集団細胞群を作成し、これを剥離することで、シート上の細胞を簡便に非侵襲的に回収する方法を提供する。
【００３４】
さらなる実施形態では、本発明は、アルギン酸層の上にアガロースゲル層を設け、そのアガロースゲル層の一部を除去してマイクロチャンバーとマイクロチャネルとを形成し、そのマイクロチャンバーおよびマイクロチャネル中で神経細胞を培養させることで神経ネットワークを人工的に作成した培養神経細胞を、ネットワークの形状を維持しながら非侵襲的に剥離し再利用する方法を提供する。
【００３５】
より具体的には、本発明は、培養皿の表面に形成したアルギン酸シート上のアガロース層を赤外集束光にて一部溶解し、一定の形のチャンバーおよびチャネルを形成して、その中で神経細胞を培養することにより神経細胞の分化程度を明らかにした上での非侵襲剥離方法を提供する。具体的には、一細胞がちょうど接着できる直径約50μm程度、アガロースを溶かして小規模のチャンバーを作成し(以下、マイクロチャンバーと呼ぶ)、追加工として神経の突起が直線上に伸張できる程度の幅約10μm長さ約100μm程度の溝(以下、マイクロチャネルと呼ぶ)をマイクロチャンバーにつなげるように作成(以下、パターニングと呼ぶ)し、パターニングした箇所に細胞を載せ、しばらく培養を続けるとマイクロチャネルに沿って神経突起が伸張してくることから、その様子を確認し剥離することで選択的剥離方法を提供する。
【００３６】
本発明の一実施形態における細胞培養装置のマイクロチャンバー内で、1細胞単位で細胞培養をし、細胞の状態を光学的あるいは電気的に観察する手段によって観察し、その観察結果に基づいて１つのチャンバー単位でゾル化剤（例：カルシウムイオンのキレートを行うことができる薬剤）を添加した溶液を添加することでアルギン酸ゲル（例：アルギン酸カルシウムゲル）層をゾル化し、下層がゾル化されたことによって浮遊した目的細胞を回収することによって、培養細胞を非侵襲的に単離することができる。
【００３７】
すなわち、例えば、培養皿の底面に溶液のカルシウムイオンの濃度の違いによって重合・脱重合の変化を行う高分子ゲルを薄層状にコーティングし、かつ、1細胞単位で細胞を培養するチャンバーをその上面に配置することで、1細胞単位で細胞培養ができ、かつ、カルシウムイオンのキレート剤（例：EDTA・2Na、EGTA、NTA (Nitrilo Triacetic Acid)、クエン酸、フィチン酸等）を、回収したい細胞のチャンバー位置に作用させることで、1細胞単位の局所に培養細胞を剥離回収することができる。
【００３８】
さらに、本発明によれば、一細胞から数細胞を同時に回収できる程度の内径を持つ中空のマイクロニードルを用意し、ニードル内を、例えば、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（EDTA・2Na）入りの培養液で満たし、この培養液中のEDTA・2Naによってアルギン酸カルシウムゲル内のカルシウムをキレーティングすることによりゾル化させることができることから、培養数日後、接着し、光学的あるいは電気的計測手法によって表現型が明らかになった細胞を対象に、上記のEDTA・2Na入り培地をマイクロニードルによって局所的に吹きかけることでチャンバー単位で、局所的に培養細胞の足場となっているアルギン酸カルシウムをゾル化することで、非侵襲的に目的の細胞のみを剥離させることができる。
【００３９】
さらに、本発明においては、培養細胞の足場となっているアルギン酸カルシウムがゾル化したことによって浮遊した細胞をマイクロニードルによって回収し、別な細胞培養皿に移すことができる。
【００４０】
以下、図面を参照して本発明の実施形態をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲がこれらの実施形態に限定されるものではない。
【００４１】
図１は、培養細胞非侵襲的剥離に使用する本発明の細胞培養装置の構成の一例を概念的に示す図である。図１Ａは、培養皿に薄膜状の細胞接着基質２０１を混ぜ込んだアルギン酸ゲル（例：アルギン酸カルシウムゲルまたはアルギン酸マグネシウムゲル）を培養皿１０１に作成した細胞培養装置の例を示す。図１Ｂは、培養皿１０１の上に敷かれた細胞接着基質２０１の上にアガロースシート３０１をコーティングし、局所加熱により一部アガロースが溶けたマイクロパターニングされた培養皿からなる細胞培養装置の例を示す。細胞接着基質２０１は培養する細胞によって変更可能である。本発明において使用されうる細胞接着基質としては、例えば、ポリリジンやポリエチレンイミン等のカチオン性試薬、コラーゲン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、レクチン等がある。ただし、アルギン酸ゲルはポリリジン（ポリ-L-リジン：PLL）などのカチオン性試薬や酸性試薬（アルギン酸より強酸の試薬）を混ぜ込むとEDTA・2Naのようなキレート剤によってゾル化しなくなる。そのためマイクロコンタクトプリンティング法などにより、不溶化する領域を広域のシート状にせず、一細胞程度が接着できる微小な区域をタイル上に作製することで細胞をアルギン酸シート上で培養しつつも一細胞毎にキレート剤で剥離できるような工夫を施す（図７〜９を参照）。また、その他の接着基質としては、アルギン酸ゲルを変性させにくい試薬（例：中性化したコラーゲンtype IV、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、レクチン等）を混ぜ込むことが好ましい。また、２０１は細胞結合ドメインであるアルギニン-グリシン-アスパラギン酸からなるタンパク質をアルギン酸とクロスリンクさせる事で接着能を上げたアルギン酸を使用しても良い。マイクロチャンバー３０２とマイクロチャネル３０３は図２に示すアガロース加工を行う装置によって作製する。
【００４２】
図２は、本発明の細胞培養装置のアガロース層の加工を行う際のアガロース加工装置の全体構成の模式図である。アガロース加工装置は、１４８０nmのラマンファイバーレーザー発生器５０１、レーザーシャッター７０２、ダイクロイックミラー７０３、対物レンズ７０１、ミラー７０６、CCDカメラ７０４、ｘｙステージ６０１から構成される。ラマンファイバーレーザー発生器５０１より発生したラマンファイバーレーザー５０２がダイクロイックミラー７０３で反射し、対物レンズ７０１で集束される。集束された１４８０nmレーザー集束光５０３によって非侵襲剥離用ディッシュ４０１上のアガロースを局所加熱しマイクロチャンバー３０２とマイクロチャネル３０３を作成する。マイクロチャンバー３０２、およびマイクロチャネル３０３の作成は、ラマンファイバーレーザー発生器５０１のレーザーの出力ならびに対物レンズ７０１の倍率、シャッター７０２のシャッタースピードを変更し、レーザー集束光５０３の出力ならびに焦点半径、照射時間を変更することによって行い、それにより様々な形状に加工することができる。マイクロチャネル３０３は照射光５０３を照射し続けながらｘｙステージ６０１を移動することで作成することができる。対物レンズ７０１、ミラー７０６、CCDカメラ７０４を利用して撮影像７０５を観察しながらこのような加工を行う。シャッター７０２、およびｘｙステージ６０１をコンピュータで自動制御することにより、自動的に加工することもできる。
【００４３】
図３は、非侵襲剥離培養皿上での細胞培養から、細胞剥離、細胞回収、再培養の一連のステップを経時的に示した模式図である。まず、ステップ１として、非侵襲剥離用培養皿４０１上で細胞培養を開始する。アガロースシート３０１上には細胞は接着せず細胞接着基質のアルギン酸シート２０１上に細胞が接着する。数日培養後、細胞が分化し、表現型を表したところで、ステップ２として、EDTA入り培地１００１をマイクロニードル９０１によって目的細胞付近に吹きかけることで細胞８０１下の細胞接着基質のアルギン酸シート２０１を局所的にゾル化させる。それにより、接着・分化していた細胞を非侵襲的に剥離する。ステップ３としてステップ２で使用したマイクロニードル９０１によって回収する。ステップ３にて回収した細胞は、ステップ４として別の培養皿に移すことにより、再培養を行う。ステップ４の再培養としては培養皿以外にも生体組織にそのまま移植しても良い。
【００４４】
図４は、図３における行程を実際に行い観察した結果を示す図である。図４では上段（A1, A2）にて細胞をアガロースゲル層のない非侵襲培養皿にて分散培養後の剥離・再培養の様子を示し、下段（B1, B2）にてアガロース層を備える培養皿においてアガロース加工後マイクロチャンバー・マイクロチャネル上で培養した細胞の非侵襲的剥離・回収・再培養の様子を時系列に撮影したものである。再培養は、剥離30分後から接着している様子が観察される。
【００４５】
図５は培養細胞の生理学的性質を解析した上で特徴のある細胞のみを剥離・回収する行程を自動化した装置システムの概略図を表したものである。XYステージ６０１上に非侵襲細胞剥離用培養皿４０１ならびに細胞回収用培養皿４０２を用意し、CCDカメラ７０４、制御用パソコン２００１を用いて細胞集団の生理学的特徴抽出を行った上でアルギン酸溶解液吐出用マイクロピペット９０２で目的の細胞の近傍に溶解液を吐出して局所的に目的の細胞を剥離し、細胞回収用マイクロピペット９０３にて剥離した目的の細胞を回収する。なお、図示していないが、本発明の装置システムは、XYステージ６０１上の培養皿中の細胞を観察するための光学顕微鏡系を備えており、CCDカメラ７０４はその光学顕微鏡系に光学的に接続されている。本発明において使用しうる光学顕微鏡としては、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、明視野顕微鏡、暗視野顕微鏡、走査型光学顕微鏡等が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
回収された細胞は細胞回収培養皿４０２にて再培養を行う。この作業に必要なCCDによる細胞画像解析、XYステージの制御、アルギン酸溶解液吐出の制御、細胞回収を制御用パソコン２００１にて自動で行う。これにより細胞の形状、細胞周期、細胞コロニー解析（ヘキスト試薬等の細胞呈色試薬や、走査型共焦点ラマン分光による細胞内分子の空間分布の特性、細胞コロニーの大きさ、あるいは細胞コロニーのサイズの経時変化など）、あるいは細胞内の核と細胞サイズとの比、細胞質の細胞内小器官の量・分布解析による細胞分化度等を指標として細胞の分離・回収ができる。
【００４７】
図６は培養シャーレ上に培養された培養細胞の画像解析による細胞ソーティングの手順である。まず、CCDカメラ７０４と制御用パソコン２００１により、非侵襲剥離用培養皿上の培養細胞を解析する。次に細胞の特徴を確認するパラメータ（例：細胞の形状、細胞周期、細胞コロニー形状ならびにサイズの経時解析、細胞分化度）の計測を行い、回収したい特徴を持つ領域（または閾値）を制御用パソコンにて設定する。次に、設定した特徴を持つ細胞をアルギン酸溶解液吐出用マイクロピペット９０２で剥がし、細胞回収用マイクロピペット９０３にて回収し細胞回収用培養皿４０２に移す。溶解液吐出用マイクロピペット９０２を含むマイクロピペット部は、溶解液を保持する溶解液槽および溶解液を送液するための手段（例：ポンプ、シリンジ、モータ等）などをさらに備えていてもよい。細胞回収用マイクロピペット９０３を含むマイクロピペット部は、細胞を吸引するための手段（例：ポンプ、シリンジ、モータ等）などをさらに備えていてもよい。
【００４８】
図７は神経細胞を剥離するための非侵襲剥離用培養皿の作製法の行程である。アルギン酸ゲル（例：アルギン酸カルシウムゲル、アルギン酸マグネシウムゲル）にPLLをスタンプするための鋳型をポリジメチルシロキサン（PDMA）で作製し、スタンプする場所にPLLを乾燥させる。次に、アルギン酸上に軽く押しつけることによりアルギン酸にスタンプされ、アルギン酸とPLLの反応によりコンタクトされたところのみ不溶化したマイクロパターンが形成される。
【００４９】
図８Ａはアルギン酸シート上にマイクロコンタクトプリンティングされたPLLの形状の一部を示す。また、図８ＢはPLLがマイクロコンタクトプリンティングされたアルギン酸シート上に初代海馬神経細胞を培養した時の図である。このように、所望のデザインの鋳型を利用することで、一細胞程度が接着できるような微小な区域を適宜（例えば、タイル状に）、不溶化する領域として、作製することができ、その結果、細胞をアルギン酸シート上で培養しつつも一細胞毎にキレート剤で剥離できるようになる。
【００５０】
図９は、図７および図８に示すような非侵襲剥離用培養皿を用いて神経細胞を培養した後、培養した神経細胞を一細胞毎に非侵襲的に剥離する様子を、従来の方法と対比して模式的に示した図である。図９Ａは、ＰＬＬを培養皿上のアルギン酸ゲル層の全面に作用させた場合、図９ＢはＰＬＬをタイル状に作用させた場合をそれぞれ示している。図９Ａのように、培養担体の全体が不溶化されたアルギン酸ゲル４００１になっていると、マイクロピペット９０４を用いてゾル化剤１００２を作用させたとしても一細胞毎に非侵襲的に培養皿から剥離することは困難である。これに対して、図９Ｂのように、ＰＬＬを図７、８で示すようにタイル状に適用させた場合は、タイル模様の目地部分は不溶化されていないアルギン酸ゲル４００２であるため、ゾル化剤１００２を作用させた場合にゾル化させることができ、それによって、培養細胞を一細胞毎に非侵襲的に培養皿から剥離することが可能となる。
【００５１】
図１０は、培養細胞の細胞電位を計測する多電極を底面に配置した非侵襲剥離培養皿上での細胞培養から、細胞剥離、細胞回収、再培養の一連のステップを経時的に示した模式図である。まず、図１０Aと図１０Bに模式的に示されているように、ステップ１として、非侵襲剥離用培養皿４０１上で細胞培養を開始する。培養皿１０１の上に細胞電位を計測することができる電極アレイ５００１が配置され、その上にアルギン酸層２０１が配置されている。さらに、アルギン酸層２０１の上に特定の形状で配置されているアガロースシート３０１上には細胞は接着せず細胞接着基質のアルギン酸シート２０１上に細胞が接着する。数日培養後、細胞が分化し、計測した細胞電位のパターンから細胞に発現した膜イオンチャンネルタンパク質等のタンパク質の発現が回収したい細胞種の表現型を表したところで、図１０Cに示したように、ステップ２として、EDTA入り培地１００１をマイクロニードル９０１によって目的細胞付近に吹きかけることで細胞８０１下の細胞接着基質のアルギン酸シート２０１を局所的にゾル化させる。それにより、接着・分化していた細胞を非侵襲的に剥離する。図１０Dおよび図１０Eに示したように、ステップ３としてステップ２で使用したマイクロニードル９０１によって回収する。さらに図１０Fあるいは図１０Gに示したように、ステップ３にて回収した細胞は、ステップ４として別の培養皿あるいは、電極付きの細胞培養皿に移すことにより、再培養を行う。ステップ４の再培養としては培養皿以外にも生体組織にそのまま移植しても良い。本装置においては、細胞電位の計測による細胞の識別のために取得するデータは、例えば、細胞表面に発現した各イオンチャンネルの脱分極後の解放時間に基づいて各イオンチャンネルの存在の有無および／もしくは発現のおおよその量、ならびに／または接合する細胞間での脱分極刺激の伝達の有無および／もしくは程度や伝達速度等をパラメータとして得るものとし、その各データについて域値を定めて、そのデータの組み合わせから細胞の分化状態あるいは表現型の変化を連続して計測して回収すべき細胞となったかどうかの確認を行ったり、あるいは細胞培養開始後、細胞が電極に接着し、細胞電位の計測が可能となったところで上記取得データによって単純に細胞種や表現型の同定を行ったりすることができ、その結果に基づいて回収する細胞を決定する。
【００５２】
図１１は、ヒトES細胞由来心筋細胞を例に本技術の利用法の一例を具体的に示す。図１１Aは、図１０Aに示した細胞電位を計測する電極アレイ５００１を配置した非侵襲剥離培養皿の一例の上で心筋細胞クラスターを培養している顕微鏡写真である。図１１Bは、この図１１Aの構成を具体的に模式化したものである、細胞電位を計測する各電極5002は、電線5003で細胞電位計測部5004と接続されており、各電極から、その電極上の細胞の電位を実時間で連続計測することができるようになっている。細胞電位計測部5004は、例えば、電極の電位のアナログ信号を増幅する電極数と同じ数だけ同時に並列処理が可能なアナログアンプアレイ部、増幅後のアナログ信号を並列で同時処理できるAD変換アレイ部、得られたデジタル信号を処理するデジタル演算回路部、細胞に強制刺激を与えるために各電極に一電極単位で刺激を与えることが可能なDA変換型刺激電流印加部、計測信号から刺激信号の印加タイミングをあらかじめ設定した条件で自動で指示するフィードバック制御部、細胞への刺激印加と細胞信号の受信時との間で回路をスイッチングするスイッチング回路アレイ部、また、必要に応じて初段でのアナログノイズフィルターアレイ等で構成されうる。また、この細胞電位計測部は、例えば、パソコン等からなる細胞電位データ解析部（または細胞判別部もしくは制御・解析部）５００５と接続されており、各電極上の細胞の電位データを解析して、細胞の種類、状態を解析して、その結果をモニターに表示できるようになっている。図１１Cは、得られた細胞電位データの一例のグラフである。このグラフで示されたように、細胞電位データを解析することで、細胞表面に発現したさまざまなイオンチャンネルの発現状態を分析し、特定の希望する細胞電位データを持つ細胞を選択することができる。特に、本技術を用いて長時間連続計測することで、細胞の特性を解析するだけでなく、細胞培養中に細胞で発現するタンパク質等の変化によって徐々に変化する細胞の電位データの特性の変化を追跡し、欲しい状態になったことを確認して、その時に細胞を回収することも可能となる。また。本実施例では、ヒト幹細胞から分化させた心筋細胞を用いたが神経細胞についても同様に計測して、その特性を確認することができる。さらに、自発発火の特性を持たない細胞については、各電極5002に電場を印加する回路を付加して、各電極上の細胞を刺激し、その応答を各電極5002によって計測することもできる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、培養細胞を一細胞単位で選択的にかつ非侵襲的に剥離し再利用することを実現するために有用である。特に、本発明の非侵襲的培養細胞剥離方法により得られる培養細胞は、再生医療の分野において組織から分離した細胞（例えば、幹細胞、ES細胞）を培養・分化し、臓器再生する場合に利用する培養細胞として有用である。また、細胞を浮遊した状態にし、流路中に流して細胞をソーティングするFACSやフローサイトソーターとは異なるパラメータ、細胞の形状等を利用した細胞のソーティングを可能にするため、より詳細な情報を持った細胞を再生医療等の産業に利用可能である。
【符号の説明】
【００５４】
１０１，１０２…培養皿
２０１…接着基質入りアルギン酸シート
３０１…アガロースシート
３０２…マイクロチャンバー
３０３…マイクロチャネル
４０１…非侵襲剥離用培養皿
４０２…細胞回収用培養皿
５０１…1480nmラマンファイバーレーザー発生器
５０２…1480nmラマンファイバーレーザー
５０３…1480nmレーザー集束光
６０１…xyステージ
７０１…対物レンズ
７０２…シャッター
７０３…ダイクロイックミラー
７０４…CCDカメラ
７０５…撮影像
７０６…ミラー
８０１…細胞
８０２…神経細胞
９０１…マイクロニードル
９０２…アルギン酸溶解液吐出用マイクロピペット
９０３…細胞回収用マイクロピペット
９０４…ゾル化剤吐出用マイクロピペット
１００１…EDTA入り培地
１００２…ゾル化剤
２００１…制御用パソコン
３００１…PMDS スタンプ
３００２…PLL
３００３…アルギン酸ゲル
４００１…不溶化されたアルギン酸ゲル
４００２…不溶化されていないアルギン酸ゲル
５００１…電極アレイ
５００２…電極
５００３…電線
５００４…細胞電位計測部
５００５…細胞電位データ解析部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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