(57)【要約】  本発明は、一般的には、補体Ｃ５タンパク質に多型を有する患者において補体関連の疾患または障害の予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害の予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗Ｃ５抗体が、ｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において補体活性化を阻害可能である、請求項１に記載の使用のための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗Ｃ５抗体がヒト抗Ｃ５抗体である、請求項１または２に記載の使用のための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗Ｃ５抗体がテシドルマブまたはその抗原結合フラグメントである、請求項３に記載の使用のための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記患者がｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓ多型を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記患者がｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓ多型を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記Ｃ５補体関連の疾患が、ａＨＵＳ、ＰＮＨ、骨髄不全、再生不良性貧血、または血栓症、たとえばＰＮＨである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を前記患者に投与することを含む方法で医薬として使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項９】
Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害を治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントであって、前記方法が、有効量の抗Ｃ５抗体を前記患者に投与することを含み、かつ前記抗Ｃ５抗体が、前記患者において補体活性化を阻害可能である、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記方法が、前記患者から得られる生物学的サンプルから、前記患者のＣ５補体タンパク質が、前記Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内に、エクリズマブエピトープ内に突然変異または多型のいずれかまたはｐ．Ａｒｇ８８５多型を含むかを決定する工程を含み、かつ前記生物学的サンプルが前記患者から単離された組織または流体である、請求項８または９に記載の方法において医薬として使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
必要とする患者において補体関連の疾患または障害を治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントであって、前記方法が、
ａ．前記患者からの生物学的サンプルを採取することと、
ｂ．前記患者のＣ５をコードする遺伝子内で突然変異または多型をスクリーニングすることと、
ｃ．前記患者が前記Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内に、エクリズマブエピトープ内に突然変異または多型のいずれかを有するか、または前記Ｃ５補体タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有するかを決定することと、
ｄ．工程ｃ）に規定された少なくとも突然変異または多型を有する患者において、補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を投与することであって、前記生物学的サンプルが前記患者から単離された組織または流体である、投与することと、
を含む、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記補体関連の疾患または障害が、Ｃ５補体関連の疾患または障害、たとえば、ＰＮＨまたはａＨＵＳである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗Ｃ５抗体がテシドルマブまたはその抗原結合フラグメントである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ＰＮＨまたはａＨＵＳを治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントであって、前記方法が、
ａ．患者から得られた生物学的サンプルから、前記患者がＣ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内に、エクリズマブエピトープ内に突然変異または多型のいずれかを有するか、またはＣ５補体タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有するかを決定することであって、前記生物学的サンプルが前記患者から単離された組織または流体である、決定することと、
ｂ．有効量のテシドルマブまたはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することと、
を含む、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
必要とする患者において補体関連の疾患または障害、たとえば、ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントであって、前記患者がエクリズマブ治療に反応しない、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記患者が補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する、請求項１４または１５に記載の使用のための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用するためのテシドルマブまたはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、ＰＮＨまたはａＨＵＳを予防または治療するための医薬の製造のための、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１９】
前記抗Ｃ５抗体がテシドルマブまたはその抗原結合フラグメントである、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補体Ｃ５タンパク質内に多型または突然変異を有する患者における補体関連の疾患または障害の防止または治療に使用される抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
先天性免疫系の主成分である補体は宿主防御に重要である。補体は、感染から保護したり、適応免疫および先天免疫に関連したり、ならびに免疫複合体および炎症傷害産物を廃棄したりする働きをする（Ｗａｌｐｏｒｔ  ２００１）。補体系は、３つの既知の活性化経路、すなわち、古典経路（抗体複合体）、レクチン経路（レクチン複合体）、および代替経路（可溶性補体タンパク質Ｃ３の自発的加水分解）を介して作用する２５種を超える血漿中タンパク質からなる。
【０００３】
補体成分Ｃ５は、一本鎖前駆体分子として主に肝臓で合成される約１８９ｋＤａのタンパク質（可能なグリコシル化を考慮に入れない）である。Ｃ５は、マクロファージならびに特異的タイプの上皮細胞および線維芽により合成されることも示されているが、Ｃ５の血清中濃度への異なる組織の相対寄与は知られていない。３つの補体経路はすべてＣ３活性化で合流する。Ｃ３の主要な活性化産物Ｃ３ｂはＣ５コンバターゼの必須成分である。補体活性化のレベルが高いとき、Ｃ３ｂの分子はＣ３コンバターゼに会合してＣ５コンバターゼを形成するという提案がなされてきた。この会合は、酵素の活性をモジュレートしてＣ３の代わりに補体成分Ｃ５を優先的に切断する（Ｍ．Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１６  Ｎａｔｕｒｅ  Ａｍｅｒｉｃａ）。Ｃ５α鎖は、補体活性化プロセス時に形成されるＣ５コンバターゼにより切断されてＣ５ａ鎖およびＣ５α’鎖を形成する。Ｃ５α’鎖およびＣ５β鎖は一緒になってＣ５ｂを形成する。
【０００４】
ヒトＣ５（Ｕｎｉｐｒｏｔエントリ  Ｐ０１０３１）は、ジスルフィド架橋により結合されたα鎖（９９９アミノ酸）とβ鎖（６５５アミノ酸）とからなる分泌マルチドメイン糖タンパク質である。α鎖内のＡｒｇ７５１とＬｅｕ７５２との間のペプチド結合は、Ｃ５コンバターゼにより切断されて、小さな７４アミノ酸長のＣ５ａフラグメントと大きなＣ５ｂフラグメント（１５８０アミノ酸）とを生成する。Ｃ５からＣ５ｂへの変換は大きなコンフォメーション変化を含み、続いてＣ６結合をもたらす。
【０００５】
ヒトＣ５は結晶化された（Ｄｉｓｃｉｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９８；Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｓｅｃｔ  Ｄ：Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ；５４：６４３−６４６）。３．１Åの分解能でのタンパク質結晶学によるＣ５タンパク質の三次元構造の決定は、Ｃ５がマルチドメインタンパク質であること、すなわち、Ｃ５が、８つのＭＧドメイン（ＭＧ１〜ＭＧ８）と、ＣＵＢドメインと、Ｃ５ｄドメインと、Ｃ５ａドメイン（「アナフィラトキシン」とも呼ばれる）と、ＭＧ１〜ＭＧ２とＭＧ４〜ＭＧ６との間に充填された伸長リンカー領域と、を含有することを示した（Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ；Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ；９：７５３−７６０，２００８）。
【０００６】
Ｃ５ａは、好中球の走化性、内皮細胞の活性化、および炎症誘発性サイトカインの放出に関与する主要なアナフィラトキシンである。Ｃ５ａのこれらの機能は、そのレセプターＣ５ａＲへの結合を必要とする。Ｃ５ｂは、非酵素方式でＣ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９を逐次的にリクルートして膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する。ＭＡＣは、標的膜中に溶解性細孔を形成し、病原体を死滅させる。Ｃ５ａおよびＣ５ｂの機能は病原体の死滅を支援するが、それらは宿主細胞を損傷するおそれのある過剰炎症反応を引き起こす原因ともなりうる。したがって、Ｃ５の機能は、宿主において他のタンパク質との相互作用により厳密に調節される。調節タンパク質は宿主生成因子または病原性因子のいずれかでありうる。
【０００７】
異常調節された補体活性化は、補体関連の疾患または障害としてまとめて参照可能な疾患表現型を招くおそれがある。たとえば、それらは、調節不全Ｃ３および／またはＣ５活性化により、とくに過剰Ｃ５ａおよび／またはＭＡＣ依存活性により、トリガーされうる。有意なＣ５補体調節不全成分が存在する補体Ｃ５関連の疾患または障害は、特異的補体関連の疾患または障害である。
【０００８】
Ｃ５補体関連疾患の例は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）である。ＰＮＨは、赤血球が損なわれひいては正常赤血球よりも急速に破壊される血液に影響を及ぼす高い罹患率を有する命にかかわる疾患である。現在のＰＮＨ治療はＣ５ブロッケードを含む。これは、上流成分のクリティカルな免疫保護機能および免疫調節機能の保持をもたらし、結果的にＣ３ｂ媒介オプソニン化および免疫クリアランスに至る。終末補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合してＣ５コンバターゼによるＣ５ａおよびＣ５ｂへの切断を阻害するヒト化モノクローナル抗体であるエクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）、Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、ＰＮＨの治療に有効であることが示されており、ＰＮＨに対して承認された唯一の薬剤である。
【０００９】
エクリズマブもまた、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）に対して承認されている。ａＨＵＳは、遺伝的成分を有することの多いきわめて珍しい命にかかわる進行性疾患である。ほとんどの場合、それは補体系の慢性的無制御活性化が原因である。
【００１０】
日本では、エクリズマブを摂取した３４５名のＰＮＨ患者のうち１１名の患者は不十分な反応を有していた。これらの１１名の日本人患者はすべて、多型ｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓが予測される単一ミスセンスＣ５ヘテロ接合突然変異ｃ．２６５４Ｇ→Ａを有していた。ＰＮＨ患者でのこの突然変異の出現度（３．２％）は、健常日本人での出現度（３．５％）に類似していた。この多型はまた、漢民族集団でも同定された。そのほか、エクリズマブに対して不十分な反応を有していたアジア系アルゼンチン患者は、多型ｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓが予測される異なる突然変異ｃ．２６５３Ｃ→Ｔを有していた。非突然変異および突然変異のＣ５は両方ともｉｎ  ｖｉｔｒｏで溶血を引き起こしたが、非突然変異Ｃ５のみはエクリズマブに結合してそれによりブロックされた。Ａｒｇ８８５に突然変異を有するＣ５変異体の機能的能力は、エクリズマブによるブロッケードに失敗したものと合わせて、こうした突然変異（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７０；７）を有する患者におけるこの作用剤に対する不十分な反応を説明する。エクリズマブ治療の代替手段の欠如が原因で、エクリズマブ治療に反応しない患者の治療ができない。そのため、古典経路および／または代替経路に関連付けられる疾患および障害とくにＰＮＨを治療するための現在の治療選択肢にもかかわらず、非反応患者集団に好適な治療を見いだす必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害、たとえば、ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用される抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００１２】
本開示のさまざまな（列挙された）実施形態が本明細書に記載されている。各実施形態に規定された特徴を他の特定の特徴と組み合わせることにより本開示のさらなる実施形態を提供しうることは、分かるであろう。補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を前記患者に投与することを含む方法で医薬として使用するための、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、エクリズマブエピトープと識別可能なかつ任意選択的にそれから離れたＣ５タンパク質のエピトープに結合する抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１３】
補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえば補体Ｃ５タンパク質内にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者の治療方法に使用される抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントが提供される。ただし、本方法は、有効量の抗Ｃ５抗体を前記患者に投与することを含み、かつ前記抗Ｃ５抗体は、前記患者において補体活性化を阻害可能である。
【００１４】
補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者を治療する方法で医薬として使用するための、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントが提供される。ただし、前記方法は、患者のＣ５補体タンパク質がエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型を含むかを患者から得られた生物学的サンプルから決定する工程を含み、生物学的サンプルは、前記患者から単離された組織または流体である。
【００１５】
必要とする患者において補体関連の疾患または障害を治療する方法に使用するための、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントが提供される。本方法は、
ａ．患者からの生物学的サンプルを採取することと、
ｂ．前記患者のＣ５をコードする遺伝子内で突然変異または多型をスクリーニングすることと、
ｃ．患者が補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、Ｃ５補体タンパク質内にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有するかを決定することと、
ｄ．かかる突然変異または多型を有する患者において、Ｃ５補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を前記突然変異または多型を有する患者に投与することであって、生物学的サンプルが患者から単離された組織または流体である、投与することと、
を含む。
【００１６】
補体関連の疾患または障害、たとえば、ＰＮＨまたはａＨＵＳを治療する方法に使用するための、エクリズマブエピトープ以外のＣ５補体タンパク質、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントに結合可能な抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントがさらに提供される。本方法は、
ａ．患者から得られた生物学的サンプルから、患者が補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、Ｃ５補体タンパク質内にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有するかを決定することであって、生物学的サンプルが患者から単離された組織または流体である、決定することと、
ｂ．有効量の前記抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することと、
を含む。
【００１７】
また、必要とする患者において補体関連の疾患または障害の予防または治療で使用するための、抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、エクリズマブエピトープと識別可能なかつ任意選択的にそれから離れたＣ５タンパク質エピトープに結合する抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントも提供される。ただし、患者はエクリズマブ治療に反応しない。
【００１８】
また、ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用するための、エクリズマブエピトープと識別可能なかつ任意選択的にそれから離れたＣ５タンパク質エピトープに結合する抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、およびかかる使用のための特異的投与レジメンも提供される。
【００１９】
さらに、ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用するための、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメント、およびかかる使用のための特異的投与レジメンが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】テシドルマブ−Ｃ５インターフェースの拡大図。Ｃ５のＣＵＢドメインおよびＴＥＤ／Ｃ５ｄドメイン（グレー略画図）は、それぞれ、ダークグレーおよびライトグレーであり、エピトープに寄与するペプチドストレッチは、破線ボックス内に見られる。テシドルマブＦａｂも示される。
【図２】８８５位のＣ５多型は、テシドルマブにより認識されるエピトープに影響を及ぼさない。Ａｒｇ８８５の位置がテシドルマブのエピトープに対してＣ５の反対側にあることを示すＣ５（グレー略画図）とテシドルマブＦａｂ（ブラック略画図）との複合体の全体図。
【図３】Ｃ５枯渇血清中にＣ５（ｗｔまたは突然変異体）をスパイクしたときの膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成。エクリズマブではなくテシドルマブが突然変異体Ｃ５の活性を阻害する。
【図４】テシドルマブは、Ｃ５変異体および非変異体ＰＮＨで抗溶血作用を示す。
【図５】テシドルマブとエクリズマブとのＣ５変異体および非変異体ＰＮＨでの抗溶血作用の比較。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
現在、ＰＮＨに利用可能な最も有効な治療剤は抗Ｃ５抗体エクリズマブである。最近、補体Ｃ５タンパク質のＡｒｇ８８５に突然変異を有するある特定の患者サブ集団はエクリズマブ治療に不十分に反応することが発見された。本発明者らは、Ａｒｇ８８５に突然変異を有するＣ５変異体を認識する、かつ補体Ｃ５タンパク質内にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者においてＣ５補体関連の疾患または障害の治療に使用するのに好適である、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントを同定した。
【００２２】
一態様では、本発明は、補体Ｃ５タンパク質内にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者においてＣ５補体関連の疾患または障害の予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【００２３】
「補体Ｃ５タンパク質」または「Ｃ５」または「Ｃ５タンパク質」または「Ｃ５補体タンパク質」という用語は、同義的に用いられ、異なる種での補体Ｃ５タンパク質をも意味する。たとえば、ヒトＣ５は、表１の配列番号１に示される配列を有し、カニクイザルＣ５は、表１の配列番号２（マカカ・ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））に示される配列を有する。ヒトＣ５は、Ｑｕｉｄｅｌ（カタログ番号Ａ４０３）から得られる。ヒトＣ５（Ｕｎｉｐｒｏｔエントリ  Ｐ０１０３１）は、ジスルフィド架橋により結合されたα鎖（９９９アミノ酸）とβ鎖（６５５アミノ酸）とからなる分泌マルチドメイン糖タンパク質である。α鎖のＡｒｇ７５１とＬｅｕ７５２との間のペプチド結合をＣ５コンバターゼにより切断すると小さな７４アミノ酸長Ｃ５ａフラグメントと大きなＣ５ｂフラグメント（１５８０アミノ酸）とを生成する。Ｃ５からＣ５ｂへの変換は大きなコンフォメーション変化を含み、続いてＣ６結合をもたらす。
【００２４】
８８５位のヒトＣ５の２つの遺伝的変異体、すなわち、Ａｒｇ８８５→ＨｉｓおよびＡｒｇ８８５→Ｃｙｓ変異体が発見された。多型ｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓが予測される単一ミスセンスＣ５ヘテロ接合突然変異ｃ．２６５４Ｇ→Ａは、日本人および漢民族の集団で記載されている（表１の配列番号３）。
【００２５】
ｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓが予測される他の突然変異（ｃ．２６５３Ｃ→Ｔ）は、アジア系アルゼンチン人集団で記載されている（表１の配列番号４）。非突然変異体Ｃ５のみは、エクリズマブに結合してそれによりブロックされた。８８５位のヒトＣ５のこれらの２つの遺伝的変異体は、エクリズマブ治療（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７０；７）に対して不十分な反応を示すＰＮＨ患者で観測された。これらのＣ５変異体は、機能的であるが、エクリズマブによりブロックされなかった。Ａｒｇ８８５は、Ｃ５のＭＧ７ドメイン内に見いだされ、エクリズマブエピトープに（またはその近傍に）位置決めされる。
【００２６】
そのため、一実施形態では、本発明は、補体Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内にまたは補体Ｃ５タンパク質のエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、補体Ｃ５タンパク質内にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害の予防または治療で使用するための、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。ただし、前記突然変異または多型はｐ．Ａｒｇ８８５多型である。他の実施形態では、本発明は、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害の予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。ただし、前記ｐ．Ａｒｇ８８５はｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓ多型またはｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓ多型である。
【００２７】
本明細書で用いられる「多型」という用語は、ゲノム配列のヌクレオチドが改変されたときに起こるＤＮＡ配列変異を意味する。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）とは、ゲノム配列の単一ヌクレオチドが改変されたときに起こるＤＮＡ配列変異のことである。本明細書で用いられる「補体Ｃ５タンパク質のｐ．Ａｒｇ８８５多型」という用語は、他のアミノ酸、たとえば、ｐ．Ａｒｇ８８５ＨｉｓのＨｉｓ、ｐ．Ａｒｇ８８５ＣｙｓのＣｙｓによるＣ５のＡｒｇ８８５の置換をもたらすミスセンスＣ５ヘテロ接合突然変異を意味する。
【００２８】
Ｃ５多型は、患者から得られたサンプルをアッセイすることにより検出可能である。「アッセイ」という用語は、同定、スクリーニング、プロービング、または決定の行為を意味するものとして用いられる。ただし、行為は、任意の従来の手段により行いうる。たとえば、マーカーがサンプルに存在するかを検出するために、ＥＬＩＳＡアッセイ、ノーザンブロット、イメージングなどを用いて特定のマーカーの存在に関して、サンプルをアッセイしうる。「アッセイ」および「決定」という用語は、生物学的サンプル、たとえば、血液サンプルまたは他の組織サンプルを物理的試験に付すことにより、ある状態から他の状態に、物質を変換することを企図する。さらに、本明細書で用いられる場合、「アッセイ」および「決定」という用語は、試験および／または測定を意味するものとして使用される。「…のために患者からの生物学的サンプルをアッセイする」などという語句は、サンプルが所与の因子の存在もしくは不在のいずれかまたは特定の因子のレベルに関して（直接的もしくは間接的のいずれかで）試験しうることを意味するものとして用いられる。物質の存在が１つの可能性を表し、物質の不在が異なる可能性を表す状況では、かかる物質の存在または不在のいずれかを治療決定を案内するために使用しうることは、理解されよう。
【００２９】
アッセイの工程は、ノーザンブロット解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎベースアッセイ、ダイレクトシーケンシング、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰ配列、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイ、プライマー伸長アッセイ、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、一本鎖コンフォメーション多型の分析、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高性能液体クロマトグラフィー、高分解能溶融分析、ＤＮＡのミスマッチを結合するタンパク質アッセイ、ＳＮＰＬｅｘ（登録商標）、キャピラリー電気泳動、サザンブロット、免疫アッセイ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析からなる群から選択される技術を含む。
【００３０】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能なおよび／またはかかる結合に直接関与するタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸や糖側鎖などの分子の化学活性表面集団からなり、通常、特異的三次元構造特性さらには特異的電荷特性を有している。コンフォメーショナルエピトープおよび非コンフォメーショナルエピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合が失われるのに対して後者への結合が失われないという点で識別される。本発明によれば、「エピトープ」は、コンフォメーショナルエピトープおよび非コンフォメーショナルエピトープを包含する。
【００３１】
「エクリズマブエピトープ」という用語は、エクリズマブが結合可能なおよび／またはかかる結合に直接関与するＣ５タンパク質の一部分たとえばそのアミノ酸を意味する。ただし、エクリズマブ結合は、Ｃ５活性化の調節不全を誘発する。エクリズマブエピトープは、Ｃ５のＭＧ７ドメイン内に見いだされる８８５位のアミノ酸Ａｒｇ（Ａｒｇ８８５）を含有する。
【００３２】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合フラグメント（すなわち「抗原結合部分」）またはそれらの一本鎖を含む。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）と重鎖定常領域とで構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）と軽鎖定常領域とで構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬの領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が介在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分可能である。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ、すなわち、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の各種細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）をはじめとする宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介しうる。
【００３３】
本明細書で用いられる抗体の「抗原結合部分」という用語は、所与の抗原（たとえばＣ５）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、抗体のフラグメントにより発揮可能である。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとからなるＦｄフラグメント、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００３４】
さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインＶＬおよびＶＨは個別の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ領域とＶＨ領域とがペアになって１価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製できるようにする人工ペプチドリンカーにより組換え法を用いて連結することが可能である（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。たとえば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」を１つ以上含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは、抗体と同様に有用性に関してスクリーニングされる。
【００３５】
抗原結合部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディー、ミニボディー、イントラボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ｖ−ＮＡＲ、およびビスｓｃＦｖにも取込み可能である（たとえば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１２６−１１３６を参照されたい）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づくスキャフォールド内にグラフト可能である（フィブロネクチンポリペプチドモノボディーが記載されている米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照されたい）。
【００３６】
本発明は、Ｃ５タンパク質（たとえば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）への特異的結合を介する補体活性化のＣ５成分を阻害可能な抗体を提供する。かかる抗Ｃ５抗体は各種機能アッセイにより特徴付け可能である。たとえば、それらは、溶血アッセイでのそれらの赤血球溶解阻害能、それらのＣ５（たとえばＣ５ヒトおよび／またはカニクイザル）タンパク質親和性、それらのエピトープビニング、それらのタンパク質分解耐性、およびそれらの補体活性化ブロック能、たとえば、それらのＭＡＣ形成阻害能により特徴付け可能である。
【００３７】
一実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体は、補体Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはそのエクリズマブエピトープ内の突然変異または多型の影響を受けない補体Ｃ５タンパク質のエピトープを標的とする。たとえば、本発明の抗Ｃ５抗体は、ｐ．Ａｒｇ８８５多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓまたはｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓの影響を受けない補体Ｃ５タンパク質のエピトープを標的とする（たとえばそれに結合する）。
【００３８】
他の実施形態では、本発明の抗体は、Ｃ５タンパク質に効果的に結合するその能力により規定される。一方、Ｃ５タンパク質へのかかる結合は、補体Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内の突然変異または多型により影響を受けない。たとえば、本発明の抗Ｃ５抗体は、ｐ．Ａｒｇ８８５多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓまたはｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓを含有するＣ５タンパク質に効果的に結合可能である。
【００３９】
本発明に係る抗Ｃ５抗体は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン、エクリズマブエピトープ（コンフォメーショナルエピトープを含む）、またはＡｒｇ８８５から離れて位置する補体Ｃ５タンパク質内のエピトープを標的とすることが可能である。
【００４０】
他の実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体は、いずれの既知のＮ結合グリコシル化部位も含まないＣ５タンパク質内のエピトープを標的とする。
【００４１】
一実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体は、Ｃ５タンパク質にそのタンパク質のＣＵＢドメインでまたはその近くで、たとえば、Ｃ５タンパク質のＣＵＢドメインとＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインとのインターフェースで結合する。
【００４２】
一実施形態では、投与される抗Ｃ５抗体は、国際公開第２０１０／０１５６０８号パンフレット、“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ５”および米国特許第８，２４１，６２８号明細書（参照により組み込まれる）に記載のテシドルマブである。テシドルマブのＣＤＲ配列は、本明細書の表１に含まれる。すなわち、カバット定義で定義されるように、ＨＣＤＲ１配列（配列番号５）、ＨＣＤＲ２配列（配列番号６）、ＨＣＤＲ３配列（配列番号７）、ＬＣＤＲ１配列  配列番号８）、ＬＣＤＲ２配列（配列番号９）、およびＬＣＤＲ３配列（配列番号１０）である。
【００４３】
他の実施形態では、投与される抗Ｃ５抗体は、配列番号５〜１０に記載されるように、テシドルマブのＣＤＲ配列を有する任意の抗体である。他の実施形態では、投与される抗Ｃ５抗体は、テシドルマブと同一のエピトープに特異的に結合する。
【００４４】
したがって、新たな抗体は、Ｃ５結合アッセイたとえば競合結合アッセイで本明細書に開示された他の抗体と交差競合する（たとえば、統計的に有意な方式で結合を競合阻害する）それらの能力に基づいて同定可能である。Ｃ５タンパク質（たとえば、ヒトおよび／またはカニクイザルＣ５）への本発明の抗体の結合を阻害する試験抗体の能力は、Ｃ５に結合する抗体と試験抗体が競合可能であることを実証する。かかる抗体は、非限定的な理論によれば、競合する抗体と同様にＣ５タンパク質上の同一または関連（たとえば、構造的類似または空間的近接）のエピトープに結合しうる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体と同様にＣ５上の同一のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製および単離が可能である。
【００４５】
既知の競合結合アッセイは、Ｃ５タンパク質への結合に関してＣ５結合抗体と参照Ｃ５結合抗体との競合を評価するために使用可能である。これらは、たとえば、固相直接もしくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接もしくは間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ、Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２）、および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）を含む。典型的には、かかるアッセイは、固体表面に結合された精製抗原またはこれらのいずれかを有する細胞と、非標識試験Ｃ５結合抗体と、標識参照抗体と、の使用を含む。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合された標識の量を決定することにより測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）としては、参照抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および立体障害が起こるために参照抗体が結合するエピトープに十分に近接する隣接エピトープに結合する抗体が挙げられる。
【００４６】
選択されたＣ５結合モノクローナル抗体がユニークエピトープに結合するか決定するために、市販の試薬（たとえば、Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ  ＵＳＡ製の試薬）を用いて各抗体をビオチン化可能である。非標識モノクローナル抗体とビオチン化モノクローナル抗体とを用いた競合研究は、Ｃ５ポリペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートを用いて実施可能である。ビオチン化モノクローナル抗体結合は、連鎖球菌アビジンアルカリホスファターゼプローブを用いて検出可能である。精製されたＣ５結合抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを実施可能である。たとえば、マイクロタイタープレートのウェルを４℃で１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧで一晩被覆可能である。１％ＢＳＡでブロックした後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下のモノクローナルＣ５結合抗体または精製アイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルと、ヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼ共役プローブのいずれかと、を反応可能である。次いで、精製抗体のアイソタイプを決定できるように、プレートを発色分析する。
【００４７】
Ｃ５ポリペプチドを発現する生細胞へのモノクローナルＣ５結合抗体の結合を実証するために、フローサイトメトリーを使用可能である。簡潔に述べると、Ｃ５を発現する細胞系（標準的成長条件下で成長させた）と、０．１％ＢＳＡと１０％ウシ胎仔血清とを含有するＰＢＳ中の種々の濃度のＣ５結合抗体と、を混合し、３７℃で１時間インキュベートすることが可能である。洗浄後、一次抗体染色と同一の条件下で細胞とフルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体とを反応させる。光および側方散乱性を用いてＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）により単一細胞でゲートすることによりサンプルを分析可能である。フローサイトメトリーアッセイ（に加えてまたはその代わりに）蛍光顕微鏡観察を用いて代替アッセイを行いうる。以上に記載のように細胞を正確に染色し、蛍光顕微鏡法により調べることが可能である。この方法は、個別細胞の可視化を可能にするが、抗原の密度に依存して感度が低下しうる。
【００４８】
本発明のＣ５結合抗体は、Ｃ５ポリペプチドまたは抗原性断片との反応性に関してウェスタンブロッティングによりさらに試験可能である。簡潔に述べると、精製されたＣ５ポリペプチドもしくは融合タンパク質またはＣ５を発現する細胞からの細胞抽出物を調製し、ナトリウムドデシルスルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動に付すことが可能である。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎仔血清でブロック化し、試験対象のモノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出可能であり、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基材タブレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ＵＳＡ）を用いて発色可能である。
【００４９】
本発明は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内に突然変異または多型、たとえば、エクリズマブエピトープ内の突然変異または多型、たとえば、ｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において補体活性化を阻害可能な抗Ｃ５抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害、の治療に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。ただし、前記抗Ｃ５抗体は、ｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する前記患者において補体経路を阻害することが可能である。
【００５０】
溶血アッセイや結合親和性アッセイなどのアッセイを用いて、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内の突然変異または多型、たとえば、エクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえばＣ５補体関連の疾患または障害の治療に使用するための抗Ｃ５抗体の好適性を試験可能である。たとえば、抗Ｃ５抗体に対する薬力学的反応を決定するために、ヒト血清補体溶血アッセイで抗体感作ニワトリ赤血球を溶解させる患者の血清の能力を測定可能である（Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５０：５５２−９）。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａによれば、２０％未満の残留溶血は、このアッセイシステムで溶血の完全ブロッケードの指標となる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７０：７）。Ｃ５およびＣ５の異なる変異体に対する抗Ｃ５抗体の結合は、結合親和性アッセイを用いて検出可能である。以上のＮｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）キャプチャー法を用いて、表面プラズモン共鳴分析（Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００）によりＣ５への抗Ｃ５抗体の結合を評価可能である。
【００５１】
一実施形態では、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、ｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体経路を阻害可能な抗Ｃ５抗体は、ヒト抗Ｃ５抗体である。「ヒト抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方がヒト起源配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、かかるヒト配列、たとえば、ヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列の突然変異変種に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基を含みうる（たとえば、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは体細胞突然変異ｉｎ  ｖｉｖｏで導入された突然変異）。ある特定の実施形態では、前記抗体は、Ｃ５を標的とする完全ヒトＦｃサイレントＩｇＧ１／λモノクローナル抗体たとえばテシドルマブである。好ましい実施形態では、本発明は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、補体Ｃ５タンパク質のｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、Ｃ５補体関連の疾患または障害、たとえば、ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体テシドルマブに関する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメインの外側またはそれから離れた結合性エピトープを有する抗Ｃ５抗体に関する。他の実施形態では、本発明は、Ａｒｇ８８５から離れたまたはＡｒｇ８８５位置とオーバーラップしない結合性エピトープを有する抗Ｃ５抗体に関する。前記抗Ｃ５抗体によるＣ５中和は、エクリズマブ非応答者で観測されるＡｒｇ８８５多型による影響を受けないので、前記抗体は、本発明に好適である。Ａｒｇ８８５から離れた結合性エピトープを有する抗Ｃ５抗体の例としては、テシドルマブまたはＮ１９−８が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明は、テシドルマブに関する。
【００５３】
本発明は、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害を有するヒト患者の治療に有用である。「個体」、「宿主」、「被験者」、および「患者」という用語は、治療、観測、および／または実験の対象である動物を意味するものとして同義的に用いられる。一般的には、かかる個体、宿主、被験者、または患者はヒトであるが、他の哺乳動物は本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
「治療」という用語は、疾患の症状、合併症、または生化学的指標の発生の予防または遅延、疾患、病態、または障害の症状の軽減またはさらなる進行の停止もしくは阻害を行うための、組成物または抗体の投与を含む。治療は、予防（疾患の発症の防止もしくは遅延、または臨床症状もしくはその準臨床症状の出現の防止）、あるいは疾患の出現後の症状の治療的抑制または軽減でありうる。
【００５５】
本明細書で用いられる「Ｃ５補体関連の疾患または障害」という用語は、無制御のＣ５機能、たとえば、調節不全のＣ５活性化、たとえば、Ｃ５活性化の増加が疾患表現型をもたらしうる疾患または障害を意味する。
【００５６】
既知の補体関連の疾患または障害の例としては、神経障害、多発性硬化症、脳卒中、ギランバレー症候群、外傷性脳傷害、パーキンソン病、アルツハイマー病、不適切なまたは望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、ＩＬ−２療法時のインターロイキン−２誘発毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、熱傷または凍傷を含む熱傷害、虚血後再灌流病態、バラケル・サイモンズ症候群、心筋梗塞、バルーン血管形成術、心肺バイパス時または腎臓バイパス時のポストポンプ症候群、血液透析、腎虚血、皮膚腺再構築後の腸間膜動脈血栓症、感染性疾患または敗血症、免疫複合体障害および自己免疫疾患、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖腎炎、溶血性貧血、および重症筋無力症が挙げられる。そのほか、他の公知の補体関連の疾患は、肺の疾患および障害、たとえば、呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、肺塞栓症、肺炎、線維形成性塵肺症および梗塞、不活性ダスト・ミネラル症（たとえば、シリコン症、炭塵症、ベリリウム症、およびアスベスト症）、肺線維症、有機ダスト疾患、化学傷害（刺激性ガスおよび化学品、たとえば、塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニア、および塩酸に起因する）、煙害、熱傷害（たとえば、熱傷、凍結）、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫性疾患、グッドパスチャー症候群、肺血管炎、免疫複合体関連炎症、ａＨＵＳ、糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、および膜性増殖性糸球体腎炎ＩＩ型（ＭＰＧＮ  ＩＩ）、地図状萎縮（ＧＡ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ならびに重症筋無力症（ＭＧ）である。
【００５７】
具体的な実施形態では、既知のＣ５補体関連の疾患または障害の例としては、地図状萎縮（ＧＡ）、ギランバレー症候群、重症筋無力症、ＳＬＥ腎炎、増殖腎炎、喘息、関節リウマチ、敗血症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）が挙げられる。
【００５８】
ＰＮＨは、血液の命にかかわる疾患であり、とくに、異常な造血、補体媒介血管内溶血、および血栓症傾向により特徴付けられる。ＰＮＨは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー生合成の初期工程に必要な酵素をコードするホスファチジルイノシトールグリカンアンカー生合成クラスＡ（ＰＩＧＡ）をコードする遺伝子で体細胞突然変異を取得した造血幹細胞のクローン拡大の結果として生じる。得られる造血細胞は、補体調節タンパク質ＣＤ５５およびＣＤ５９を含めてグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質が欠損しており、これは、ＰＮＨの一次臨床病変である血管内溶血を説明する。ＰＮＨは、骨髄不全とくに再生不良性貧血を含む障害との関連で発生することが多い。血栓症は、ＰＮＨ関連の罹患率および死亡率の主な原因である。
【００５９】
ＰＮＨに関連付けられる障害の例としては、貧血、血栓塞栓性イベント、平滑筋筋緊張症、慢性腎疾患、勃起不全、肺高血圧症、および疲労が挙げられる。
【００６０】
ａＨＵＳは、遺伝的成分を有することの多いきわめて珍しい命にかかわる進行性疾患である。それは、補体媒介血栓性微小血管症（ＴＭＡ）および命にかかわる帰趨の慢性リスクに関連付けられる疾患である。ａＨＵＳは、ＴＭＡ（血小板減少症、微小血管症性溶血、および器官機能不全症状）の臨床的特徴を伴って現れる疾患として定義され、子供と同様に成人にも影響を及ぼす。
【００６１】
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は、網膜の黄斑域として知られる眼の内側ライニングの中心部が薄層化、萎縮、ときには出血を起こす主に高齢者に見られる医学障害である。これにより中心視覚が損なわれるおそれがあり、微細部が見えなくなったり、読めなくなったり、顔の認識ができなくなったりする。新しい脈絡膜血管形成の病理発生はよく理解されていないが、炎症、虚血炎症、および血管形成因子の局所産生などの因子が重要であると考えられる。疾患の進行形態は、「ウェット」（新生血管）形態と「ドライ」（地図状萎縮）形態に分類される。
【００６２】
地図状萎縮（ＧＡ）はドライＡＭＤの進行萎縮形態である。ＧＡは、黄斑内の光受容体、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、および脈絡毛細管板の損失が特徴である。
【００６３】
好ましい実施形態では、Ｃ５補体関連の疾患または障害はＰＮＨである。
【００６４】
一態様では、本発明は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体経路を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を前記患者に投与することを含む方法で医薬として使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントに関する。
【００６５】
さらなる態様では、本発明は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、たとえば、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害を予防または治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントに関する。ただし、本方法は、前記患者において補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を投与することを含む。とくに、それは、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、Ｃ５補体関連の疾患または障害を予防または治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントに関する。ただし、本方法は前記患者において補体活性化を阻害可能な有効量の前記抗Ｃ５抗体を投与することを含む。
【００６６】
他のさらなる態様では、本発明は、必要とする患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害を予防または治療する方法に関する。ただし、かかる患者は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５多型を有し、前記方法は、補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントを前記患者に投与することを含む。
【００６７】
「投与」という用語は、眼疾患において複数の硝子体内用量として、本発明の抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、好ましくはテシドルマブを投与することを包含する。「投与」という用語はまた、ＰＮＨやａＨＵＳなどのＣ５関連疾患において、単一および複数の静脈内（ＩＶ）用量で、本発明の抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメント、好ましくはテシドルマブを投与することを包含する。「有効量」または「治療上有効量」の抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントという用語は、被験者の生物学的もしくは医学的な反応を誘発する、たとえば、タンパク質活性を低減もしくは阻害する、または症状を改善する、または病態を軽減する、または疾患進行を低速化もしくは遅延する、または疾患を予防する、本開示の抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントの量を意味する。「有効量」または「治療上有効量」という用語は、治療される病態のベースラインの臨床的に観測可能な徴候および症状を超えて観測可能な改善を提供するのに十分な量を意味するものとして本明細書では定義される。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、ＰＮＨまたはａＨＵＳを予防または治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント、好ましくはテシドルマブに関する。
【００６９】
本発明によれば、投与される抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントたとえばテシドルマブの用量は、１０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇである。
【００７０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体たとえばテシドルマブは、治療持続時間にわたり１、２、３、４、５、６回、またはそれ以上投与される。たとえば、１〜３、１〜４、２〜４、２〜５、２〜６、３〜６、４〜６、６〜８回、またはそれ以上投与される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体たとえばテシドルマブは、少なくとも毎週１回、少なくとも２週間に１回、少なくとも毎月１回投与される。
【００７２】
本発明の抗Ｃ５抗体たとえばテシドルマブは、少なくとも６週間、少なくとも９週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１年間、生涯にわたり投与可能である。
【００７３】
一実施形態では、ＰＮＨまたはａＨＵＳの予防または治療に使用するために、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントたとえばテシドルマブが提供される。ただし、前記抗Ｃ５抗体は、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇで、毎週１回または２週間に１回、少なくとも１週間にわたり、たとえば少なくとも１ヶ月間、たとえば少なくとも６週間、たとえば３ヶ月間、たとえば６ヶ月間、たとえば９ヶ月間、たとえば１年間にわたり、たとえば生涯にわたり投与される。前記抗体は、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの用量でかつ２回の投与間のインターバルを１ヶ月間以下、たとえば２週間として、繰り返し投与しうる。前記抗体は、少なくとも３ヶ月間、たとえば６ヶ月間、たとえば９ヶ月間、たとえば１年間、たとえば生涯にわたり投与しうる。
【００７４】
さらなる実施形態では、ＰＮＨの治療に使用するための本発明の抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントたとえばテシドルマブでは、前記抗Ｃ５抗体は、少なくとも６週間〜６ヶ月間にわたり少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週１回投与され、次いで、少なくとも３ヶ月間、６ヶ月間、９ヶ月間、１年間、生涯にわたり少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの用量で２週間に１回投与される。
【００７５】
他の実施形態では、ａＨＵＳの予防または治療に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントたとえばテシドルマブが提供され、前記抗Ｃ５抗体は、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの用量で毎週１回または２週間に１回、たとえば少なくとも３０ｍｇ／ｋｇで毎週１回または２週間に１回投与される。投与は、少なくとも１ヶ月間にわたり、たとえば少なくとも６週間、たとえば３ヶ月間、たとえば６ヶ月間、たとえば９ヶ月間、たとえば１年間、たとえば生涯にわたりうる。
【００７６】
本発明の抗Ｃ５抗体たとえばテシドルマブは、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、たとえば３０ｍｇ／ｋｇの用量で、２回の投与間のインターバルを１ヶ月間以下、たとえば２週間として繰り返し投与しうる。抗Ｃ５抗体たとえばテシドルマブは、少なくとも３ヶ月間、たとえば６ヶ月間、たとえば９ヶ月間、たとえば１年間、たとえば生涯にわたり投与しうる。
【００７７】
一実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体またはその抗原フラグメントたとえばテシドルマブが患者に投与され、患者はナイーブ患者であり、たとえば、前記患者は、以前にいずれの抗Ｃ５抗体またはその抗原フラグメント治療にも、とくにエクリズマブ治療（エクリズマブナイーブ患者）にも付されていなかった。エクリズマブナイーブ患者の集団は、次の３つの異なるグループ、すなわち、（ａ）新たに診断された患者、（ｂ）エクリズマブを利用していない診断患者、および（ｃ）治療を開始するほどの疾患重症度でない初期疾患患者、たとえば、血栓イベントがなかった患者を包含する。
【００７８】
そのほかのさらなる実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体またはその抗原フラグメントたとえばテシドルマブが患者に投与され、患者には抗Ｃ５抗体またはその抗原フラグメントとくにエクリズマブがすでに投与されていた。他の実施形態では、本発明の抗Ｃ５抗体またはその抗原フラグメントたとえばテシドルマブが患者に投与され、患者には抗Ｃ５抗体またはその抗原フラグメントとくにエクリズマブがすでに投与されており、かつ患者は前記前治療たとえばエクリズマブ治療に反応せず、とくに患者は補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する。
【００７９】
一態様では、本発明は、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害、たとえばＰＮＨまたはａＨＵを予防または治療するための医薬の製造のための、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントたとえばテシドルマブの使用に関する。一実施形態では、本発明は、Ｃ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、Ｃ５補体関連の疾患または障害を治療するための医薬を製造するための、抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。ただし、前記抗Ｃ５抗体たとえばテシドルマブは、前記患者において補体活性化を阻害可能である。たとえば、補体Ｃ５タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有する患者において、Ｃ５補体関連の疾患または障害、たとえばＰＮＨまたはａＨＵＳを予防または治療するための医薬の製造のための、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントの使用が提供される。
【００８０】
一実施形態では、補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害を予防または治療する本方法は、患者のＣ５補体タンパク質がＣ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内またはエクリズマブエピトープ内に突然変異または多型たとえばｐ．Ａｒｇ８８５多型を含むかを、患者から得られた生物学的サンプルから決定する工程をさらに含む。ただし、生物学的サンプルは、患者から単離された組織または流体である。
【００８１】
本明細書で用いられる「生物学的サンプル」という用語は、検体源から採取された任意の他の検体を代表するようにサンプリングにより得られた生物学的検体を意味する。一実施形態では、生物学的サンプルは、患者から単離された組織または流体である。
【００８２】
一態様では、本発明は、必要とする患者において補体関連の疾患または障害、たとえば、Ｃ５補体関連の疾患または障害を治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体または抗原結合フラグメントに関する。本方法は、（ａ）患者から生物学的サンプルを採取することと、（ｂ）前記患者のＣ５をコードする遺伝子の突然変異または多型をスクリーニングすることと、（ｃ）患者がＣ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内に、エクリズマブエピトープ内に突然変異もしくは多型のいずれかを有するかまたはＣ５補体タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有するかを決定することと、（ｄ）工程（ｃ）の下で検出された少なくとも突然変異または多型を有する患者において補体活性化を阻害可能な有効量の抗Ｃ５抗体を投与することであって、生物学的サンプルが患者から単離された組織または流体である、投与することと、を含む。好ましい実施形態では、前記抗Ｃ５抗体はテシドルマブである。他の実施形態では、Ｃ５タンパク質の突然変異または多型は、ｐ．Ａｒｇ８８５多型、たとえばｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓまたはｐ．Ａｒｇ８８５Ｃｙｓである。
【００８３】
他の態様では、本発明は、ＰＮＨまたはａＨＵＳを治療する方法に使用するための抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。本方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルから、患者がＣ５タンパク質のＭＧ７ドメイン内に、エクリズマブエピトープ内に突然変異もしくは多型のいずれかを有するかまたはＣ５補体タンパク質にｐ．Ａｒｇ８８５多型を有するかを決定することであって、生物学的サンプルが患者から単離された組織または流体である、決定することと、（ｂ）有効量の抗Ｃ５抗体またはその抗原結合フラグメント、たとえば、テシドルマブまたはその抗原結合フラグメントを前記患者に投与することと、を含む。
【００８４】
【表１−１】
2019521105.tif 000002
【００８５】
【表１−２】
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【００８６】
【表１−３】
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【００８７】
【表１−４】
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【００８８】
【表１−５】
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【００８９】
【表１−６】
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【００９０】
【表１−７】
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【００９１】
以下の実施例は以上に記載の本発明を例示するものであるが、なんら本発明の範囲を限定することを意図するものではない。関連技術分野の当業者にそのようなものとして知られる他の試験モデルもまた、特許請求された本発明の有益な効果を決定しうる。
【実施例】
【００９２】
実施例１：ヒトＣ５との複合体としてのテシドルマブＦａｂの結晶化
テシドルマブは、ヒトおよびカニクイザル（マカカ・ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））の補体Ｃ５にピコモル親和性で結合してＣ５活性化ならびにＣ５ａおよびＣ５ｂの放出を防止するヒトモノクローナル抗体である。ヒトＣ５との複合体としてのテシドルマブの詳細分析を行った。
【００９３】
方法：
テシドルマブＦａｂの発現および精製
ＴＧ１Ｆ−Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＡＣＥ２５０９０）でテシドルマブＦａｂのクローニングおよび発現を行った。凍結細胞ペレットを１５０ｍｌ溶解緩衝液に懸濁させてホモジナイズした（溶解緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４、５０ｍｌ緩衝液当たり１錠のＥＤＴＡフリーｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）使用、４５０μｌの１．０Ｍ  ＭｇＣｌ２、および１５μｌのベンゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ））。遠心分離（１６，０００ｇ、４℃で３０分間）の後、上清を無菌濾過し（０．２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルター）、そして溶解緩衝液で平衡化された５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５２４７−０１）にロードした（２．５ｍｌ／ｍｉｎ）。２０ｍＭ次いで５０ｍＭイミダゾールで２回の洗浄工程を行った後、５０ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾールの１００ｍｌグラジエントでＦａｂを溶出させた。溶出液を５ｍｌ画分で捕集し、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ＮｕＰａｇｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。選択された画分をプールし、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３ｋコンセントレーター）により４℃で５ｍｌに濃縮し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムにロードした。捕集された画分を前と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、プールし、そして限外濾過により濃縮した。次いで、０．０〜１．０Ｍ  ＮａＣｌグラジエントを溶出に用いて、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で平衡化されたＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０陽イオン交換カラムでＦａｂを精製した。プール画分を濃縮し、そして数回のランでＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  ３００  ＧＬカラムに再びロードし、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＮａＣｌでアイソクラティック溶出を行った。
【００９４】
テシドルマブＦａｂとヒトＣ５との複合体の調製および精製
ヒト補体タンパク質Ｃ５をＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（カタログ番号Ａ１２０ロット１６ａ）から購入し、さらなる精製を行うことなく使用した。２．５倍モル過剰のテシドルマブＦａｂをヒトＣ５に添加し、１０ｍＭトリスｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化されたＳ３００Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ１６／６０カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより複合体を精製した。
【００９５】
テシドルマブＦａｂとヒトＣ５との複合体の結晶化
１０ｍＭトリスｐＨ７．４、２５ｍＭ  ＮａＣｌ中のテシドルマブＦａｂとヒトＣ５との複合体を限外濾過により１７．８ｍｇ／ｍｌに濃縮し、２０℃で結晶化スクリーニングに付した。９６ウェルＩｎｎｏｖａｄｙｎｅ  ＳＤ２プレート（ＣＨＢＳ＿１９８１４＿Ｇ１２＿１）でシッティングドロップ蒸気拡散により結晶化条件を最初に同定した。次いで、２４ウェルＶＤＸプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いてハンギングドロップ法で蒸気拡散技術により２μｌドロップでより大きな結晶（ＣＨＢＳ＿２００８８＿Ｂ３＿１）を成長させた。
【００９６】
テシドルマブＦａｂとヒトＣ５との複合体のＸ線データ収集および構造決定
テシドルマブＦａｂ複合体の結晶から２つの回折データセットを収集した。前と同様にＸＤＳおよびＸＳＣＡＬＥ（Ｋａｂｓｃｈ  １９９３）で両方のデータセットを処理した。相関統計ＣＣ＊（Ｋａｒｐｌｕｓ  ａｎｄ  Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ  ２０１２）で依然として有意パーセントを有していた４．１Å分解能を超える弱い回折データをリファインメント時に含めるために、第２のデータセットをＸＳＣＡＬＥの２０１２年７月４日バージョンで後で再処理した。
【００９７】
１．０００００Å波長のＸ線を用いてＭＡＲ  ＣＣＤ２２５ｍｍ検出器を備えたＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のビームラインＸ０６ＤＡ（ＰＸＩＩＩ）でデータセット１を捕集した。この実験で使用した結晶は、液体窒素中に直接フラッシュ冷却したものであった。全体として、結晶と検出器との距離を３８０ｍｍとしてそれぞれ１．０°の振動角で１８０画像を記録した。この回折データセットは４．５Åの分解能であった。
【００９８】
１．０００００Å波長のＸ線を用いてＰｉｌａｔｕｓピクセル検出器を備えたＳｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｐａｕｌ  Ｓｃｈｅｒｒｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のビームラインＸ１０ＳＡ（ＰＸＩＩ）でデータセット２を捕集した。液体窒素中にフラッシュ冷却する前、この実験に使用した結晶を１０μＭ  ＣｄＣｌ２が追加された母液に短時間浸漬した。全体として、結晶と検出器との距離を６００ｍｍとしてそれぞれ０．２５°の振動角で７２０画像を記録した。この回折データセットは４．１Åの分解能であった。
【００９９】
マルチプルＰｈａｓｅｒラン（ＭｃＣｏｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）を用いて分子置換により構造を解明した。全長ヒトＣ５（ＰＤＢエントリ  ３ＣＵ７，鎖Ａ；Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）をサーチモデルとして使用したとき、分子置換解を見いだすことができなかった。また、Ｃ３４５Ｃドメインなしの全長Ｃ５を用いた第２のＰｈａｓｅｒランもうまく行かなかった。きわめて対照的に、Ｃ５β鎖をサーチモデルとして使用したとき、空間群Ｐ４３で明解な分子置換解が容易に見いだされた（ＴＦＺスコア＝８．２）。次いで、Ｃ５β鎖の解を固定して、Ｃ３４５Ｃドメインなしのα鎖で明解な分子置換解が見いだされた（ＴＦＺスコア＝２２．８）。後続のＰｈａｓｅｒランからＣ３４５Ｃドメインの明解な解が得られた（ＴＦＺスコア＝１３．５）。次いで、テシドルマブＦａｂ（結晶形２から２．１Å分解能でリファインされた構造）の可変ドメインおよび定常ドメインをサーチモデルとして使用した。ＶＬ／ＶＨフラグメントは非常に明解な分子置換解を与えた（ＴＦＺスコア＝２３．５）。ＣＬ／ＣＨ１ドメインはより弱いシグナルを与えたが（ＴＦＺスコア＝６．６）、有意な解（すでに位置決めされたＶＬ／ＶＨドメインへの接続性から判断した）が容易に見いだされた。最初に、４．５Å回折データセットを用いて分子置換計算を行い、次いで、４．１Åデータが利用可能になったとき繰り返したところ、同一の全体解がもたらされた。
【０１００】
完全分子置換モデルをＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）で検査し、３．３Å分解能のすべての回折データに対してＢｕｓｔｅｒ  ２．１１．２（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ  ２０１１）を用いてリファインした。データの分解能が限られるので、リファインメント時に局所構造類似性制限（ＬＳＳＲ；Ｓｍａｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）を課した。ＬＳＳＲに使用したターゲット構造は、２．１Å分解能でリファインされたテシドルマブＦａｂ構造と、自動ＮＣＳ制限およびＦｒｅｄｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２００８）により最初に定義されたＴＬＳグループを用いたＢｕｓｔｅｒリファインメント後のＰＤＢエントリ  ３ＣＵ７（鎖Ａ）由来の遊離Ｃ５構造と、であった。このリファインメント工程は、元のＰＤＢエントリと比較して最終モデルのラマチャンドラン統計を向上させた（ラマチャンドランプロットのコア領域、許容領域、および限界領域の残基はそれぞれ７９．５％、１８．６％、および１．１％であり、これに対して、元のＰＤＢエントリでは７４．９％、２３．０％、１．５％であった）。最終結晶モデルのＲｗｏｒｋ値およびＲｆｒｅｅ値は、それぞれ、２３．３％および２９．３％であり、ｒｍｓｄは、結合長では０．０１０Åおよび結合角では１．２４°であった。
【０１０１】
構造解析
プログラムＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）またはＰｙＭＯＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて構造オーバーレイを実施した。プログラムＣｏｏｔおよびＰＲＯＣＨＥＣＫ  ｖ３．３（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９２）を用いて最終リファインモデルの品質を評価した。テシドルマブ抗体の結合時に溶媒にアクセスしにくくなるヒトＣ５の残基をＣＣＰ４プログラムスイートのプログラムＡＲＥＡＩＭＯＬ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，１９９４）により同定した。
【０１０２】
結果：
全体構造：
ヒトＣ５は総合計１３の構造ドメインを含む。β鎖（プレプロＣ５の残基１９〜６７３、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリ  Ｐ０１０３１）は、６つのαマクログロブリン様ドメイン（ＭＧ１〜６）と１つのリンカードメインとで作製される。α鎖（残基６７８〜１６７６）は、Ｃ５ａ（アナフィラトキシン）ドメインと、２つのαマクログロブリン様ドメイン（ＭＧ７、ＭＧ８）と、１つのＣＵＢ（「補体Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ、Ｂｍｐ１」）ドメインと、チオエステル様ＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインと、カルボキシ末端Ｃ３４５Ｃドメインと、を含む。α鎖はまたＭＧ６ドメインに寄与し、このドメイン内のジスルフィド架橋を介してβ鎖に共有結合で装着される。
【０１０３】
テシドルマブＦａｂはＣ５α鎖に結合して、ＣＵＢドメインおよびＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインの両方に接触する（図１）。ＣＵＢドメインはβサンドイッチフォールドを有し、大きなαヘリカルＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインはＣＵＢドメインのβ３鎖とβ４鎖との間に挿入される。ＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインの最後のαヘリックスとＣＵＢドメインのβ４鎖とを接続するペプチドセグメントは、テシドルマブ抗体の抗原結合部位に広がっているので、テシドルマブエピトープの１つの主要成分を構成する。
【０１０４】
ヒトＣ５のテシドルマブエピトープ：
テシドルマブＦａｂはヒトＣ５と１：１複合体を形成し、合計６つのペプチドセグメントを含む標的タンパク質抗原の不連続エピトープまたは「コンフォメーショナル」エピトープを認識する（図１）。ＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインの最後のαヘリックス（α１２）とＣＵＢドメインのβ４鎖（残基１３０５〜１３１０）とを接続するループは、Ｃ５のテシドルマブエピトープで中心的な役割を果たす。そのほか、ＣＵＢドメインからの３つの他のペプチドセグメントは、エピトープ：β１’−β２（残基９４７〜９５０）ループ、β５−β６（残基１３２７〜１３３１）ループ、およびβ７−β８（残基１３５３〜１３５４）ループに寄与する。ＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインはまた、さらに２つの構造要素がエピトープα２−α３ループ（残基１０２９〜１０３３）およびヘリックスα１１のアミノ末端（残基１２６４〜１２６５および１２６８）に寄与する。
【０１０５】
Ｃ５は、位置７４１、９１１、１１１５、および１６３０に４つのアノテートＮ結合グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。これらのグリコシル化部位のうち２つは、７４１位および９１１位にＸ線結晶解析により観測された（Ｆｒｅｄｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ  ２００８）。４つの位置はすべて、エピトープから離れているので、Ｃ５抗原のグリコシル化状態はテシドルマブ結合に影響を及ぼさないと予想される。
【０１０６】
ヒトＣ５のＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインとＣＵＢドメインとの間の接続はテシドルマブ結合で中心的な役割を果たす：
ＴＥＤ／Ｃ５ｄドメインとＣＵＢドメインとの間の接続は、テシドルマブの抗原結合部位の中心領域に沿ってＶＨ／ＶＬインターフェースにほぼ平行に広がる。このペプチドセグメントのアミノ酸配列は１３０５−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−１３１０である。Ｌｙｓ１３０５およびＡｒｇ１３０８の側鎖は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の方向を向いており、寄与する可能性が最も高い強い静電相互作用である。Ａｒｇ１３０８は、とくに、抗体のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ３、およびＨ−ＣＤＲ３超可変ループによりライニングされた抗原結合部位の中心キャビティーに進入している。したがって、Ａｒｇ１３０８は、ヒトＣ５のテシドルマブ認識および結合で中心的な役割を果たし、この残基は、このタンパク質−タンパク質インターフェースのホットスポットであることが、この構造から強く示唆される。
【０１０７】
８８５位のＣ５多型はテシドルマブエピトープに影響を及ぼさない：
エクリズマブは、ＰＮＨ（Ｒｏｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００７）に関連付けられる補体媒介溶血の予防に使用されるヒト化抗ヒトＣ５治療用抗体である。ヒトＣ５の８８５位の２つの遺伝的変異体Ａｒｇ８８５→Ｈｉｓ変異体およびＡｒｇ８８５→Ｃｙｓ変異体は、エクリズマブ治療に対して不十分な反応を示す患者で観測された（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。これらのＣ５変異体は、機能的であるが、エクリズマブによりブロックされなかった。Ａｒｇ８８５はＣ５のＭＧ７ドメイン内に見いだされる。Ａｒｇ８８５の位置はテシドルマブエピトープから離れていることが、テシドルマブＦａｂ複合体のＸ線構造検査から示される（図２）。したがって、テシドルマブによるＣ５中和は、エクリズマブ非応答者で観測されるＡｒｇ８８５多型による影響を受けない。
【０１０８】
実施例２：ＭＡＣ形成Ｃ５はエクリズマブではなくテソズルマブが突然変異体Ｃ５を阻害することを実証する
７μｇ／ｍｌのｗｔＣ５（Ａｒｇ８８５）または突然変異体Ｃ５（Ｈｉｓ８８５）でスパイクされたＣ５枯渇血清を用いてＷｉｅｓｌａｂアッセイによりテシドルマブおよびエクリズマブを試験した。
【０１０９】
突然変異体Ｃ５でスパイクされたＣ５枯渇血清中でエクリズマブではなくテシドルマブが膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成をブロックすることが、結果から示される。抗体は両方とも、ｗｔＣ５でスパイクされた血清中でＭＡＣ形成を同じように阻害する能力があった。テシドルマブは、正常Ｃ５または突然変異体Ｃ５でスパイクされた血清中で同じような能力があった。これとは対照的に、エクリズマブは、突然変異体Ｃ５（図３）でスパイクされた血清中で活性を示さなかった。
【０１１０】
実施例３：テシドルマブはＣ５変異体ＰＮＨおよびＣ５非変異体ＰＮＨで抗溶血作用を示す
Ｃ５変異体ＰＮＨ患者およびＣ５非変異体ＰＮＨ患者でテシドルマブ（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、１週間に２回）を試験するために、オープンラベル単腕研究を行った。
【０１１１】
方法：
テシドルマブに対する薬力学的反応を決定するために、ヒト血清補体溶血アッセイで抗体感作ニワトリ赤血球を溶解させる患者の血清の能力を測定可能である（Ｈｉｌｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００４；３５０：５５２−９）。２０％未満の残留溶血は、このアッセイシステムで溶血の完全ブロッケードの指標となる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７０；７）。
【０１１２】
結果：
８．５週間の平均治療持続時間の後、５名の患者（２つのＣ５変異体）で分析を実施した。主要な安全性の問題は同定されなかった（治療中断、治療関連安全性有害イベントは見られなかった）。ベースラインから７４〜９１％のＬＤＨ低下により実証されるＰＮＨでの抗溶血作用は、Ｃ５変異体患者およびＣ５非変異体患者の両方で見られた（図４および５）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019521105.tif 000013
【国際調査報告】
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