(57)【要約】細胞増殖に最適化されたポリマーまたは他の基材が記載され、これは気体透過性面を備えた極薄バッグの形態をとる。所定の厚さにバッグを保持し、バッグが崩壊するのを防ぎ、両側が互いにくっつくことを防止する、それらの間に延びる多数の小さなマイクロピラーまたは他のスペーサーを用いて、バッグの側部は互いに一定の距離に保持することができる。他の実施形態では、側部は、ガス圧だけで離れて保持される。バッグ外面上の０．０１μｍ〜１０００μｍパリレンまたは他の生体適合性コーティングは、バッグ材料の透過性を制御し、細胞増殖のための生物安全領域を提供する。代わりの構成は、生体適合性コーティングで被覆されたスキンを有する連続気泡発泡体を使用する。複数のバッグに入るチューブは、気体状酸素を送達するか、または二酸化炭素および他の排ガスを除去するマニホールドに接続することができる。複数のバッグ間にＯリングスペーサーを挟んでそれらをしっかりと積み重ねて、容器内に収容して、高表面積の超小型細胞増殖システムを形成することができる。バッグ上で増殖する細胞について、液体栄養素をチューブスペーサーで供給することができ、酸素および廃ガスはバッグの側面を通してバッグ内で輸送される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一対の気体透過性ポリマーシートと；
前記ポリマーシートの面間の接続点のアレイであって、接続点は２０００μｍ以下の中心間間隔を有する、アレイと；
前記シートの周囲を一緒に結合して当該シート間の内部空洞内に前記接続点を封入して耐膨張性バッグを形成している、密閉された端部と；
前記内部空洞に流体接続された前記バッグへの入口と；
前記気体透過性シートの少なくとも１つの外側を覆う生体適合性コーティングであって、０．０１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する生体適合性コーティングとを含む、細胞増殖基材装置。
【請求項２】
前記接続点の中心間間隔が、１００μｍ〜１０００μｍである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記接続点で前記シートを接続するスペーサーのアレイであって、前記スペーサーは、前記耐膨張性バッグを耐崩壊性とするのに十分な高さを有する、アレイをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記スペーサーの高さが、前記接続点の中心間間隔の５分の１以上である、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記スペーサーが、前記気体透過性シートの１つと一体的に形成されている、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記耐膨張性バッグの外側に隣接する複数の外側スペーサーをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記外側スペーサーが、多孔性チューブである、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記外側スペーサーが、生体適合性コーティングでコーティングされた球体である、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
前記外側スペーサーが、前記気体透過性シートの１つと一体的に形成されている、請求項６に記載の装置。
【請求項１０】
前記生体適合性コーティングが、パリレンＮ、パリレンＣ、パリレンＤおよびパリレンＡＦ−４からなる群より選択されるパリレンコーティングを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記パリレンコーティングの厚さが、２μｍ〜１０μｍである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記パリレンコーティングの厚さが、５μｍ〜６μｍである、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
細胞接着を改善するように構成された、前記生体適合性コーティング上の表面処理領域をさらに有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記表面処理領域が、酸素プラズマ処理、アンモニアプラズマ処理、または酸素プラズマ処理とアンモニアプラズマ処理の両方の生成物である、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記表面処理領域上の、アガロース、コラーゲン、乳酸、ラミニン、ポリ−Ｄ−リジン、またはポリ−Ｌ−リジンのコーティングをさらに含む、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記気体透過性ポリマーシートの材料が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン、およびポリウレタンからなる群より選択されるポリマーである、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
各気体透過性ポリマーシートが、厚さ２００μｍ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項１８】
前記内部空洞と流体接続された前記バッグからの出口をさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１９】
前記バッグへの入り口または前記バッグからの出口と流体接続された内腔を有するチューブをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
前記入口が、前記バッグの前記密閉された端部における穴を通っている、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
前記アレイの前記接続点が、互いに、幾何学的に規則的に間隔をおいて配置されている、請求項１に記載の装置。
【請求項２２】
１つの対向する面上に気体透過性スキンシートを有するポリマー連続気泡発泡体と；
前記気体透過性スキンシートの周囲を一緒に結合して、前記連続気泡発泡体を前記気体透過性スキンシート間の内部空洞に封入して耐膨張性耐崩壊性バッグを形成している、密閉された端部と；
前記内部空洞と流体接続された、前記バッグへの入口と；
前記気体透過性スキンシートの少なくとも１つの外側を覆う生体適合性コーティングであって、０．０１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する生体適合性コーティングとを含む、細胞増殖基材装置。
【請求項２３】
前記ポリマー連続気泡発泡体のシートが、厚さ０．１ｍｍ〜１．５ｍｍである、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
水密容器と；
前記容器内の生体適合性材料でコーティングされた平坦で耐膨張性の気体透過性バッグのスタックであって、各バッグは当該バッグの内部空洞に結合した入口を有する、スタックと；
前記耐膨張性気体透過性バッグの間のスペーサーとを含む、コンパクト細胞増殖装置。
【請求項２５】
前記気体透過性バッグが、垂直面内に積み重ねられている、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記スタックは、前記バッグそれ自体の上に折り畳まれた少なくとも１つの気体透過性バッグを含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記スタックは、前記バッグそれ自体の周りに巻かれた少なくとも１つの気体透過性バッグを含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
各バッグを離間させ、前記バッグの入口を互いにシールするＯリングをさらに含む、請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
一面にスペーサーを有するピラー化気体透過性シートを鋳造することと、ここで前記気体透過性シートは気体状分子酸素を透過させるのに十分な厚さを有するが、標準的な室温および大気圧で液体水が透過するのを防止する；
第２の気体透過性シートを製造することと；
スペーサーを介して第２の気体透過性シートを前記ピラー化気体透過性シートに結合することと；
前記気体透過性シートの周囲を一緒に密閉して耐膨張性バッグを形成することと；
前記耐膨張性バッグの少なくとも一方の面に生体適合性コーティングを堆積させることと、ここで前記生体適合性コーティングは０．１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する；
細胞接着を改善するために、前記生体適合性コーティングを処理することとを含む、細胞増殖装置の製造方法。
【請求項３０】
前記ピラー化気体透過性シートおよび第２の気体透過性シートが、ポリマーから構成されており、各シートは、２００μｍ未満の厚さを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記耐膨張性バッグに入口を形成することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の気体透過性シートに接着剤を塗布することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
一対の気体透過性ポリマーシートを密接に接触させることと；
貫通穴のアレイを有する断熱性マスクを前記ポリマーシートに対して配置することと、ここで前記貫通穴は２０００μｍ以下の中心間間隔を有する；
加熱された鉄を前記ポリマーシートの反対側の前記断熱性マスクに対してプレスすることと、ここで前記加熱された鉄の温度と前記プレスの時間は前記マスクの貫通穴によって露出した前記ポリマーシート間に溶接部のアレイを形成するのに十分である；
前記ポリマーシートの周囲を一緒に密閉して内部部分を有するバッグを形成することと；
前記バッグの少なくとも一面に生体適合性コーティングを堆積させることと、ここで前記生体適合性コーティングは０．１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する；
細胞接着を改善するために、前記生体適合性コーティングを処理することとを含む、細胞増殖装置の製造方法。
【請求項３４】
前記貫通穴のアレイが、マスク内にフォトリソグラフィーによって形成されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリマーシートが、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含み、前記断熱性マスクが、シリコーンゴムを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
耐膨張性気体透過性ポリマーバッグのスタックを準備することと、ここで各バッグは、マニホールドに接続された入口を有し、各バッグは生体適合性コーティングを有し、前記バッグは球状ビーズによって互いに離間している；
前記ビーズと前記バッグとの間隙に細胞を供給することと；
前記間隙に栄養素の液体培養物を流すことと；
分子酸素ガスを前記マニホールドを通して前記耐膨張性バッグ内に加圧することと；
前記細胞が増殖するのを待つことと、ここで栄養素および分子酸素ガスが細胞の増殖をサポートする；
トリプシンを前記細胞に適用することと；
前記ビーズから前記細胞を洗い流すこととを含む、細胞を増殖および回収する方法。
【請求項３７】
前記バッグを前記ビーズから除去することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞をウイルスで感染させることと、ここで前記細胞の増殖がウイルスの複製に役立つ；
複製されたウイルスを洗い流された細胞から分離することとをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１６年７月１２日に出願された米国仮出願第６２／３６１，３９０号の利益を主張するものであり、その全体があらゆる目的のために組み込まれる。
【０００２】
（連邦支援の研究開発の下でなされた発明に関する権利に関する声明）
適用なし
【背景技術】
【０００３】
１．技術分野
【０００４】
本発明の実施形態は、概して、微細加工された特徴およびコーティングを有する気体透過性の非崩壊性および／または非膨張性のバッグを含む、微生物および増殖細胞を培養するためのバイオリアクター装置、ならびに製造および使用方法に関する。
【０００５】
２．関連技術の説明
【０００６】
大規模な高密度細胞培養は、特定の分子、タンパク質、ウイルス、または他の産物を産生するために細胞が使用される多くのバイオテクノロジー用途にとって重要である。細胞密度を高めることで、単位体積あたりの生産量を増やすことができ、省スペースとより集中した産物によってコストを削減することに役立つ。
【０００７】
高密度細胞増殖の課題は、特に酸素、栄養素および廃棄物に関する物質輸送の制限に起因する。低密度細胞培養系では、代謝産物の受動的拡散がしばしば細胞の代謝要求を満たすのに十分である。しかし、高密度細胞培養系では、細胞の代謝要求が拡散単独からの供給を上回り、対流などのさらなる物質輸送機構を必要とする。
【０００８】
高密度細胞培養のさらなる要件は、特に付着細胞集団の場合、表面積対容積比が高いことである。これは、多くの細胞が単層で増殖し、コンフルエントに達すると増殖が阻害されるためである。
【０００９】
細胞工場システム、マイクロキャリアを有する波／撹拌バイオリアクター、および灌流透析膜システムを含む細胞密度を高めるためのいくつかの技術が開発されている。
【００１０】
細胞工場システムは、細胞工場システムが単一のフラスコ内に増殖基材の複数の層を含むことを除いて、従来のフラスコ培養システムと最も類似している。達成可能な細胞密度は、層間の大きな間隔のためそれほど高くなく、表面対体積比が低く、すべての代謝産物の拡散輸送に依存する。
【００１１】
ウェーブおよび撹拌式バイオリアクターシステムは、培地の容器内で細胞の接着および増殖に適した表面化学を有する小さな中性浮遊粒子である細胞マイクロキャリアを静かに混合することによって物質移動を促進する対流を加える。マイクロキャリアによってもたらされる高い表面積と対流混合との組み合わせは、細胞工場システムと比較してより高い細胞密度の達成を可能にする。しかし、対流混合はまた、細胞に、細胞死を引き起こし得るせん断力を生じ、それによって、達成され得る細胞への混合および物質輸送の程度を制限する。このようなシステムは、表面積が限られているのではなく、混合による物質移動を強化する必要があるため、しばしばせん断限界になる。
【００１２】
灌流透析膜システムは、密に充填された半透過性透析チューブを通して気体を灌流し、拡散が細胞に酸素を送達することを可能にすることによって、せん断問題を克服する。しかしながら、透析チューブの幾何学的形状は、非常に高い表面積対容積比が達成されることを防止する。さらに、細胞が増殖する高度に多孔性の膜から細胞を除去することには困難が伴う。
【００１３】
要約すると、高密度細胞成長のいくつかの課題には、１）高表面積対体積比を達成すること；２）システム内の適切な代謝産物輸送を維持すること；および３）細胞が経験するせん断力を致死レベル以下に維持することが、挙げられる。いくつかの既存の技術がこれらの課題を克服しようと試みてきたが、技術の改良の余地がまだ残っている。
【発明の概要】
【００１４】
一般に、拡張を防止するための微細加工溶接点および／または崩壊を防止する内部スペーサーなどの、内部接続点のアレイを有する非常に薄い気体透過性プラスチックバッグが提示される。バッグは、透過性を制御し、細胞が接着するための表面を提供するために、パリレンなどの薄い（例えば、２μｍおよび１０μｍの厚さの）生体適合性コーティングでコーティングされている。生体適合性コーティングは、酸素プラズマおよび／またはアンモニアプラズマ処理を受けてもよく、細胞接着をさらに改善するために、アガロースなどのコーティングをさらに適用してもよい。
【００１５】
膜を有する連続気泡フォームはまた、耐膨張性崩壊耐性バッグに形成されてもよい。外側の膜は生体適合性のコーティングで層状にされ、透過性を制御し、細胞増殖のための清潔な表面を提供し、端部を封止してバッグを形成する。入口は、空気、酸素、または他の気体をバッグの内部に流入させる。
【００１６】
使用時には、バッグは、栄養豊富な液体水培養物中に浸漬され、細胞増殖のための基材として作用するために気体状酸素が供給されるか、そうでなければ気体状酸素で膨らまされる。バッグに取り付けられるセルには、バッグの気体透過性膜を通して気体状酸素の穏やかな流れが供給され、バッグを通して気体状の二酸化炭素または他の廃ガスを放出することができる。一方、周囲の液体は細胞に栄養素を与え、その廃棄物を運び去る。
【００１７】
そのような気体透過性バッグの多くは、一緒に積み重ねられ、その入口は、Ｏリングによって接続され、便利なマニホールドを形成する。そのスタックは、バッグをスタック内にしっかりと保持する水槽のような囲いの中に沈めることができる。Ｏ−リングは、ビーズまたは他のスペーサーと同様に、バッグを分離した状態に保ち、細胞増殖のために大量の表面積が存在するように働く。バッグから離れるほど酸素が低下するが、バッグ間の距離は、２つのバッグ間の中心点が細胞増殖に十分な酸素を有するように最適化されてもよい。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態は、細胞増殖基材装置に関する。この装置は、一対の気体透過性ポリマーシートと、ポリマーシートの面間の接続点のアレイであって、２０００μｍ以下の中心間間隔を有する接続点のアレイと、シートの周囲を一緒に結合してシート間の内部空洞内に接続点を封入して耐膨張性バッグを形成する密閉された端部と、内部空洞に流体接続されたバッグへの入口と、気体透過性シートの少なくとも１つの外側を覆う生体適合性コーティングであって、その生体適合性コーティングは、０．０１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する生体適合性コーティングを含む。
【００１９】
接続点の中心間間隔は、１００μｍ〜１０００μｍであり得る。この装置は、接続点でシートを接続するスペーサーのアレイをさらに含み、スペーサーは、耐膨張性バッグを崩壊耐性にするのに十分な高さを有する。スペーサーの高さは、接続点の中心間間隔の５分の１以上にすることができる。スペーサーは、気体透過性シートの１つと一体的に形成することができる。この装置は、耐膨張性バッグの外側に隣接する複数の外側スペーサーを含むことができる。外側スペーサーは、生体適合性コーティングで被覆された多孔性チューブまたは球体であり得る。外側スペーサーは、気体透過性シートの１つと一体的に形成することができる。
【００２０】
生体適合性コーティングは、パリレンＮ、パリレンＣ、パリレンＤおよびパリレンＡＦ−４を含む群から選択されるパリレンコーティングを含むことができる。パリレンコーティングの厚さは、２μｍ〜１０μｍであり得る。パリレンコーティングの厚さは、好ましくは５μｍ〜６μｍであり得る。生体適合性コーティング上の表面処理領域は、細胞接着を改善するように構成することができる。表面処理領域は、酸素プラズマ処理、アンモニアプラズマ処理、または酸素プラズマ処理とアンモニアプラズマ処理の両方の生成物であってもよい。アガロース、コラーゲン、乳酸、ラミニン、ポリ−ｄ−リジン、またはポリ−ｌ−リジンのコーティングは、細胞増殖をさらに増強するために表面処理領域に存在し得る。
【００２１】
気体透過性ポリマーシートの材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン、およびポリウレタンを含む群から選択されるポリマーであり得る。気体透過性ポリマーシートは、２００μｍ未満の厚さであり得る。バッグからの出口は、内部空洞と流体接続することができる。バッグへの入口またはバッグからの出口と流体接続された内腔を有するチューブをバッグに取り付けることができる。入口は、バッグの密閉された端部の穴を通過することができる。アレイ内の接続点は、互いに、幾何学的に規則的に間隔を置いて配置されてもよく、または不規則に間隔をおいて配置されてもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態は、２つの対向する面上に気体透過性スキンシートを有するポリマー連続気泡発泡体、気体透過性スキンシートの周囲を一緒に結合して、連続気泡発泡体を気体透過性スキンシート間の内部空洞に封入して耐膨張性耐崩壊性バッグを形成する密閉された端部、内部空洞と流体接続された、バッグへの入口、および気体透過性スキンシートの少なくとも１つの外側の生体適合性コーティングであって、０．０１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する生体適合性コーティングを含む、細胞増殖基材装置に関する。ポリマー連続気泡発泡体のシートは、０．１ｍｍ〜１．５ｍｍの厚さとすることができる。
【００２３】
いくつかの実施形態は、水密容器、容器内の生体適合性材料でコーティングされた平坦で耐膨張性の気体透過性バッグのスタックであって、各バッグはバッグの内部空洞に結合した入口を有するスタック、および耐膨張性気体透過性バッグの間のスペーサーを含む、細胞増殖基材装置に関する。
【００２４】
気体透過性バッグは、垂直面内に積み重ねることができる。スタックは、バッグそれ自体の上に折り畳まれた少なくとも１つの気体透過性バッグを含むことができる。スタックは、バッグそれ自体の周りに巻かれた少なくとも１つの気体透過性バッグを含むことができる。装置は、各バッグを離間させ、バッグの入口を互いにシールするＯリングをさらに含むことができる。
【００２５】
いくつかの実施形態は、細胞増殖装置の製造方法に関する。この方法は、一面にスペーサーを有するピラー化気体透過性シートを鋳造することであって、気体透過性シートは気体状分子酸素を透過させるのに十分な厚さを有するが、標準的な室温および大気圧で液体水が透過するのを防止し、第２の気体透過性シートを製造すること、スペーサーを介して第２の気体透過性シートをピラー化気体透過性シートに結合すること、気体透過性シートの周囲を一緒に密閉して耐膨張性バッグを形成すること、耐膨張性バッグの少なくとも一方の面に生体適合性コーティングを堆積させることであって、生体適合性コーティングは０．１μｍ〜１０００μｍの厚さを有し、および細胞接着を改善するために生体適合性コーティングを処理することを含む。
【００２６】
ピラー化気体透過性シートおよび第２の気体透過性シートは、ポリマーから構成することができ、各シートは、２００μｍ未満の厚さを有することができる。この方法は、耐膨張性バッグに入口を形成することおよび／または第２の気体透過性シートに接着剤を塗布することをさらに含むことができる。
【００２７】
いくつかの実施形態は、細胞増殖装置の製造方法に関する。この方法は、一対の気体透過性ポリマーシートを密接に接触させること、貫通穴のアレイを有する断熱性マスクをポリマーシートに対して配置することであって、貫通穴は２０００μｍ以下の中心間間隔を有し、加熱された鉄をポリマーシートの反対側の断熱性マスクに対してプレスすることであって、加熱された鉄の温度とプレスの時間はマスクの貫通穴によって露出したポリマーシート間に溶接部のアレイを形成するのに十分であり、ポリマーシートの周囲を一緒に密閉して内部部分を有するバッグを形成すること、バッグの少なくとも一面に生体適合性コーティングを堆積させることであって、生体適合性コーティングが０．１μｍ〜１０００μｍの厚さを有し、および細胞接着を改善するために生体適合性コーティングを処理することを含む。
【００２８】
貫通穴は、フォトリソグラフィーによってマスク内に形成して、小さくすることができる。ポリマーシートはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むことができ、断熱性マスクはシリコーンゴムを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態は、細胞を増殖および回収する方法に関する。この方法は、耐膨張性気体透過性ポリマーバッグのスタックを準備することであって、各バッグは、マニホールドに接続された入口を有し、各バッグは生体適合性コーティングを有し、各バッグは球状ビーズによって互いに間隔を空けられ、バッグ間の間隙に細胞を供給すること、間隙に栄養素の液体培養物を流すこと、分子酸素ガスをマニホールドを通して耐膨張性バッグ内に加圧すること、細胞が増殖するのを待つことであって、栄養素および分子酸素ガスが細胞の増殖をサポートし、トリプシンを細胞に適用し、バッグまたはビーズ上でそれらの保持を切断すること、および、ビーズから細胞を洗い流すことを含む。
【００３０】
この方法は、バッグをビーズから取り除くことをさらに含むことができる。本方法は、細胞をウイルスで感染させることであって、ここで細胞の増殖がウイルスの複製に役立ち、および複製されたウイルスを洗い流された細胞から分離することをさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、一実施形態の気体透過性耐膨張性耐崩壊性バッグの等角図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１ＡのＢ−Ｂ断面を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図１ＡのＣ−Ｃ断面を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、一実施形態のスペーサーチューブを備える気体透過性バッグの等角図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａの気体透過性バッグの分解図である。
【図３Ａ】図３Ａは、一実施形態の気体透過性微細加工アレイ溶接バッグの等角図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３ＡのＢ−Ｂ断面を示す。
【図４】図４は、一実施形態の連続気泡発泡体気体透過性バッグの等角分解図である。
【図５】図５は、一実施形態のスペーサーチューブによって分離された複数のバッグを示す。
【図６】図６は、一実施形態のビーズによって分離された複数のバッグを示す。
【図７】図７は、一実施形態の積み重ねられた気体透過性バッグを有するバイオリアクター容器の等角図である。
【図８】図８は、一実施形態の櫛形栄養素および気体送達バッグを有するバイオリアクターの等角図である。
【図９Ａ】図９Ａは、一実施形態の微細加工バッグ製造プロセスの一部を示す断面図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの製造プロセスの一部を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａの製造プロセスの一部を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、図９Ａの製造プロセスの一部を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、図９Ａの製造プロセスの一部を示す。
【図９Ｆ】図９Ｆは、図９Ａの製造プロセスの一部を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、一実施形態のプロトタイプの耐膨張性耐崩壊バッグの写真である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａのプロトタイプの耐膨張性耐崩壊バッグの角部の写真である。
【図１１】図１１は、一実施形態のプロセスのフローチャートである。
【図１２】図１２は、一実施形態のプロセスのフローチャートである。
【図１３】図１３は、一実施形態のプロセスのフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
非常に高密度の細胞培養が可能な培養システム（例えば、箱、容器、その他の部品）が記載されている。本発明者らは、分子酸素（Ｏ２）が、細胞培地中でのその低い溶解度のために細胞増殖にとって最も制限的な代謝産物であることを認識した。気体対流送達を他の栄養送達から分離することにより、有害なせん断力を増大させることなく細胞への酸素送達を有意に増大させることが可能である。
【００３３】
バッグ内に形成された気体灌流可能な気体透過性膜シートは、高密度細胞増殖のために十分な酸素および気体交換を送達しながら高い表面積を提供する。これらのバッグは、高い表面積対体積比を達成するために折り畳まれて積み重ねられ得る。細胞は、膜の表面上に直接、または膜の間に挟まれた基材上で増殖させることができる。
【００３４】
酸素送達のための別個の膜の使用は有用であるが、他の栄養素、溶液、細胞およびウイルスの送達および除去を含む他の態様がある。例えば、積み重ねられた膜の間の隙間は、膜スタックの内部または外部への成分の送達または除去のための溶液で灌流することができる。灌流の間隔および速度は、装置内の適切なせん断速度を維持するように選択することができる。別の例では、気体供給とは別に供給するために、システム全体にわたってチューブまたはチャネルのネットワークを使用することができる。チューブまたはチャネルは、分子から細胞までの範囲の様々なサイズの粒子がチューブの内外に通過することを可能にする孔を含むことができる。これは、細胞を装置内に供給し、および／またはウイルスを感染細胞に送達することができる手段である。別の例では、膜自体に孔を形成して、それらの表面に垂直に積み重ねられた膜を灌流する手段を提供することができる。この構成では、流れの方向は細胞に対して平行ではないため、流れは細胞に最小のせん断力を誘発する；栄養素は、これらの孔から離れた拡散によって細胞に到達する。
【００３５】
細胞を供給する場合、膜の両側に等しく供給することができる。これは、膜を配向させ、重力場に平行に流れることによって達成することができる。細胞は自然に培地中に定着するので、沈降速度と方向が反対であるが大きさは等しい培地の灌流を適用して、膜に対する細胞の正味の速度がゼロに近くなるようにすることができる。対称性により、細胞は膜のいずれかの面に等しく接着しやすくなり、均一な供給が行われる。
【００３６】
膜材料に関しては、高い気体透過性を有するものが最も適している。これは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むシリコーンなどの高い気体透過性（溶解度と拡散速度の関数）を有する材料を使用することによって達成することができる。
【００３７】
あるいは、気体透過率が一般に膜の厚さに反比例するので、非常に薄い膜を使用することによってそれを達成することができる。非常に薄い寸法では、薄いパリレン（＜１０μｍ）で観察されるように、材料の透過性もまた著しく増大し得る。この事実を利用して、気体に対する障壁として従来考えられているポリマーは、適切に透過性になることができる。小さな孔の吹き出し点は、表面を通る気体の泡立ちを引き起こさずに中空膜から駆動される圧力を可能にするために十分に高くすることができるので、多孔質膜材料も使用することができる。また、膜の所望の高い気体透過特性を達成するために、複数のアプローチを組み合わせて使用することもできる。
【００３８】
バッグの表面処理は、細胞接着および増殖を達成することができる。広く適用可能なアプローチは、膜をパリレンの薄層で被覆すること、酸素プラズマ処理および／またはアンモニアプラズマ処理を使用してそれをプラズマエッチングして、それを親水性にすることである。
【００３９】
さらなる方法には、タンパク質（例えば、アガロース、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリン）によるコーティングまたは他のコーティング（例えば、乳酸、ラミニン、ポリ−Ｄ−リジンまたはポリ−Ｌ−リジン）が含まれる。
【００４０】
用語
【００４１】
「気体透過性」または「半透性」材料には、気体を透過させるが、液体水が浸透するのを防止するもの、または当技術分野で適用可能で既知であるものが含まれる。透過性は、標準室温（すなわち、２５℃）および大気圧または他の適用可能な温度および圧力で測定することができる。例えば、哺乳動物細胞の培養のための標準温度は３７℃である。好熱菌の場合、温度は１２２℃まで上昇することがある。圧力は、標準的な大気圧またはそれ以下から、水没している静水圧などまで上昇することができる。気体は、分子酸素、二酸化炭素、一酸化炭素、一般的な空気、または適用可能な別のものであってもよい。
【００４２】
「ピラー」または「マイクロピラー」は、表面から垂直に延びるカラムもしくは他の構造、または塔技術分野で公知のものを含む。「マイクロピラー」は、小型であるピラーを含み、マイクロメートル（ミクロン）またはマイクロインチのスケールであるピラーに限定されない。
【００４３】
「スペーサーのアレイ」は、シートを互いから一定の距離に保つように構成された高さおよびスペーサーの中心間の間隔を有するマイクロピラーまたは他のスペーサーの幾何学的に規則的もしくは不規則なパターン、または塔技術分野で公知の他のものを含む。
【００４４】
「耐崩壊性バッグ」は、対向する面の内面が通常の動作において互いに接触することが防止されるように、その内部にスペーサーを有するバッグを含む。
【００４５】
「耐膨張性バッグ」は、内部溶接点、接続されたスペーサー、または加圧されたときにバッグがバルーンのようになることを防止する他の接続部を有するバッグを含む。耐膨張性バッグは、実質的に平らに積むことができる。それは凸凹の凹みおよび湾曲を有することができる。
【００４６】
「密閉されている」とは、気密に封止されているか、または少なくとも液体に対しては透過性ではないが、おそらく気体に対して透過性であることを意味するか、または当技術分野で公知の他のものなどを意味する。
【００４７】
所定の実施形態に適合し得る連続気泡発泡体は、ＡＳＴＭ  Ｄ３１８３に従うスキンを有するＡｔｌａｎｔｉｃ  Ｇａｓｋｅｔ  Ｃｏｒｐ．  Ｓｔｙｌｅ  ＡＧ１３００−ＳまたはＡＧ１３００−ＳＭ連続気泡シリコーン発泡体、およびＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒシリコーン発泡体シートを含む。
【００４８】
図１Ａ〜図１Ｂは、一実施形態の気体透過性耐膨張性耐崩壊性バッグを示す。システム１００は、一対の気体透過性ＰＤＭＳポリマーシート１０２および１０３を含む。シートの外周は、それらの縁の周りを密閉されており、内部空洞１１３を有する耐膨張性バッグ１０１を形成する。
【００４９】
ボトムシート１０３は、その周縁部の周りに一体的に形成された端部１１２と、１つの面に沿って微細加工ピラー１０４であるスペーサーとを有する。マイクロピラー１０４は、幾何学的に規則的な列と行のアレイである。マイクロピラーの各列は距離１１０だけ離れており、マイクロピラーの各行は距離１１１だけ離れている。いくつかの実施形態では、距離は異なり；他では、距離は同じである。
【００５０】
互い違いの行または列、円弧のピラー、サブ形状および他のパターンを有する、幾何学的に規則的なアレイ、ならびにランダムに分布したピラーの斑点などの幾何学的に不規則なアレイを含む他の構成が考えられる。
【００５１】
製造中に、シート１０２またはマイクロピラーの頂部およびシート１０３の端部を未硬化ポリマーでコーティングし、次にシート１０２を硬化前にシート１０３の上に置いた。シート１０２，１０３および中間部分１１２は、層の耐崩壊性サンドイッチを形成する。
【００５２】
シート１０２および１０３の外側にパリレン生体適合性コーティング１１５がある。生体適合性コーティングは０．０１μｍ〜１０００μｍの厚さを有し、これは下にあるシートの気体透過性を制御し得る。すなわち、ＰＤＭＳは、その公称厚さで液体に対して透過性であり得る；しかしながら、パリレンの薄いコーティングは、液体がそれらを通って流れるのを防止するが、気体を許容し、したがってシートを気体透過性にする。
【００５３】
表面処理１１６は、生体適合性コーティング１１５の一部を覆う。パリレンは、細胞接着を改善するために、酸素プラズマ処理およびアンモニアプラズマ処理を受けた。
【００５４】
図１Ｃでは、上から下に向かって、上部生体適合性コーティング１１５は厚さ１０５を有し、シート１０２は厚さ１０６を有し、マイクロピラー１０４は等しい高さ１０７を有し、シート１０３は厚さ１０８を有し、底部生体適合性コーティング１１５は厚さ１０９を有する。生体適合性コーティングの厚さは、それがパリレンＮ、パリレンＣ、パリレンＤまたはパリレンＡＦ−４の場合、２μｍ〜１０μｍ、好ましくは５μｍ〜６μｍである。
【００５５】
マイクロピラースペーサー１０４の高さ１０７は、マイクロピラー接続点の中心間距離の１／５以上である。この高さは、対向するシート１０２および１０３が内部空洞内で内側に曲がり、互いにくっつくのを防止し、バッグを耐崩壊性にするのを助ける。
【００５６】
入口１１４は、上部シート１０２および生体適合性層１１５を貫通する穴として形成されている。入口１１４は、気体を供給するため、またはバッグ１０１から気体を除去するために使用され得る。
【００５７】
図２Ａ〜２Ｂは、一実施形態のスペーサーチューブを有する気体透過性バッグを示す。バッグ２０１は、中間層２１２を有するシート２０２および２０３上の生体適合性層２１５を含む。入口２１４は、シート２０２およびその生体適合性層２１５に形成されており、生体適合性層２１５はその上に示される表面処理２１６を有する。また、内部を見るためのカッタウェイ図も示されており、そこではマイクロピラー２０４がバッグを崩壊させないようにしている。
【００５８】
バッグ２０１の下には、外部スペーサーチューブ２１７がある。各スペーサーチューブ２１７は、液体、栄養分、種子細胞、および他の物質をそこから流出させる複数の穴２１８を有する。スペーサーチューブは、盲下水または庭のソーカーホースに似ている。しかしながら、スペーサーチューブは微細加工されており、セルサイズの材料またはより小さな材料を比較的均一に分配することができる。したがって、バッグ２０１が他のバッグと積み重ねられ、スペーサーチューブによって分離される場合、スペーサーチューブは、細胞を均一に供給し、栄養を広げ、排出された廃棄物を集めるために使用され得る。
【００５９】
図３Ａ〜３Ｂは、気体透過性微細加工アレイ溶接バッグを示す。システム３００では、バッグ３０１はシートを含み、シートを離して保持するための追加的に形成された内部ピラーはない。代わりに、シートは、バッグの内部の穏やかなガス圧によって離れて保持される。
【００６０】
溶接される領域のみがマスクの貫通穴によって露出される領域であるように、シートの間に断熱性のマスクを有するシートに対して加熱された鉄をプレスすることにより、接続点３１９のアレイが形成された。溶接部の周囲の領域は空気が自由に動くことができる。これは、膨張性のプールのエアマットレスにやや似ている。しかし、本実施形態の接続点は、互いに２０００μｍ以下離れている。いくつかの実施形態では、接続点溶接の中心間間隔は、１００μｍ〜１０００μｍである。このような小さな間隔は、フォトリソグラフィーなどの微細加工技術を用いて形成することができる。さらに、ポリマーシートは、例示的な実施形態では２００μｍ未満の厚さである。
【００６１】
周縁部３１２は密閉されてバッグ３０１を形成し、穴３１４は少なくとも１枚のシートに形成されている。ここでは、穴３１４がシート３０２に形成されている。生体適合性層３１５は、シート３０２および３０３の外側にある。
【００６２】
酸素が入口穴３１４を通って供給されると、内部３１３が開き、膨張する。供給された空気の圧力が十分に大きい場合、水中バッグの乾燥した内部３１３が開口して、気体がバッグの最も遠い範囲まで自由に流れることができる。次いで、酸素は、シート３０２および３０３を通って、生体適合性層３１５を通って、外側の消費細胞に均一に浸透する。
【００６３】
図４は、連続気泡発泡体気体透過性バッグを示す。
システム４００では、ポリマー連続気泡発泡体４２１の厚さ０．１ｍｍ〜１．５ｍｍのマットは、対向する面上に気体透過性スキンシート４２０を有する。すなわち、発泡体の対向する面上に自然に形成されたスキンは気体透過性である。発泡体の周縁部４１２（図の中央の発泡体領域から離れて分解して示されている）は、スキンシート４２０を一緒に結合し、内部空洞内に連続気泡発泡体を封入するように、密閉されている。発泡体は、バッグの膨張および崩壊を防止する。このようにして、耐膨張性耐崩壊性バッグが形成される。
【００６４】
生体適合性コーティング４１５は、バッグの外側スキン４２０上に積層され、それは０．０１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する。
【００６５】
図５は、スペーサーチューブによって分離された複数のバッグを示す。各バッグ５０１は断面で示され、各バッグは両方のシートを貫通する穴５１４を有する。断面で示されるＯリング５２５は、バッグを所定の間隔で離間させ、バッグの内部を互いにシールする。空気または酸素がＯリングを通して供給され、気体が各バッグに流入するようにしてもよい。
【００６６】
Ｏリングの他に、チューブスペーサー５１７もバッグ５０１の間隔をあけており、これらは断面で示されている。チューブスペーサー５１７は、穴、スリット、または栄養素、種子細胞、または他の物質が均一に分配するように送られ得る他の部分を有することができる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、チューブスペーサー５１７は、それらが示されている（すなわち、ページの内外に）のとは反対に上下に延びるように向けられてもよい。他の実施形態では、チューブスペーサーは、バッグの間を蛇行することができる。
【００６８】
図６は、ビーズによって分離された複数のバッグを示す。各バッグ６０１は断面で示され、各バッグは両方のシートを貫通する穴６１４を有する。断面で示されたＯリング６２５は、バッグを所定の間隔で離間させ、バッグの内部を互いにシールする。
【００６９】
バッグ６０１は、球状のビーズ６２６によって分離が保たれている。ビーズは、細胞増殖のために、バッグだけよりも広い表面積を提供する。ビーズとバッグとの間の間隙６２７に細胞を供給し、そこを通じて栄養素の液体培養物を流すことができる。ビーズの外側は、より良好な細胞接着、栄養素の保持などのために処理することができる。一方、気体は、Ｏリングマニホルドを通してバッグの乾燥した内部に供給される。
【００７０】
細胞が増殖した後、バッグを引き出すか、またはバッグの間からビーズを排出することによって、バッグをビーズから取り除くことができる。次いでビーズを処理して細胞をそれらから除去することができる。例えば、細胞とビーズ（およびバッグ）との間の結合を切断するためにトリプシンを添加してもよく、またはビーズを激しく洗浄して細胞が剥がれてもよい。
【００７１】
図７は、積層された気体透過性バッグを有するバイオリアクター容器の等角図である。システム７００において、バッグ７０１は、所定量離間され、それらの壁が重力に対して垂直になるように垂直面に吊り下げられている。他の構成では、長いバッグは、ペーパータオルロールのように、それ自体の周りに巻き付けることができる。
【００７２】
水密容器７３０はバッグを収容し、それらを液体培養物に浸漬する。マニホールドが酸素または空気をバッグに送達している間、液体を静かに循環させることができる。バッグへの開口部は、図５および図６のように互いに接続されてもよいし、またはバッグの内部に接続する内腔を有するチューブは、一般的なマニホールドと接続することができる。
【００７３】
図８は、櫛形栄養素および気体送達バッグを有するバイオリアクターの等角図である。システム８００において、気体バッグ膜８１３の構造８３１は、栄養送達膜８２６と交互配置されている。これは、気体と栄養素がバイオリアクター全体に提供される極めてコンパクトな構造を形成する。
【００７４】
バイオリアクターは、液体および細胞栄養素を収容するための容器（図示せず）に含まれていてもよい。
【００７５】
図９Ａ〜９Ｆは、微細加工バッグ製造プロセスを示す。図９Ａでは、平坦なシリコン基板の上に、上昇した縁部を有する連続的なドライフィルム型がセットされる。図９Ｂでは、ドライフィルムモールドをフォトリソグラフィーでエッチングして、ドライフィルムに貫通穴を形成する。図９Ｃでは、型の上にＰＤＭＳを塗布し、硬化させる。その結果、マイクロピラーと周囲に高い縁部を有するＰＤＭＳシートが得られる。
【００７６】
図９Ｄでは、図９Ａのそれと同様の型の上にＰＤＭＳを塗布し、硬化する。その結果、平らなＰＤＭＳのシートが得られる。次に、ＰＤＭＳの２枚のシートを、第１のシートのピラー側をそれらの間にして、一緒にし、薄いＰＤＭＳ層を用いて接着し、次いでそれを硬化させてバッグを作る。マイクロピラーは、微細加工されたバッグの膨張を防止し、崩壊を防止する。
【００７７】
図９Ｅでは、バッグの側部にチューブが挿入され、チューブの内腔が、バッグの密封された端部の穴を通ってバッグの内部空洞と接続する。図９Ｆでは、パリレンは、化学蒸着（ＣＶＤ）を用いて、バッグの上部、底部及び側面にコーティングされる。パリレンは、細胞のための清潔で生体適合性のある表面を提供する。パリレンはまた、シートの透過性を制御する。パリレンは、より良好な細胞接着特性のためにプラズマ処理することができる。
【００７８】
図１０Ａ〜図１０Ｂは、プロトタイプの耐膨張性耐崩壊性のバッグの顕微鏡写真である。バッグは透明であるため、その内部にあるマイクロピラーを見ることができる。図には、バッグ内のマイクロピラーの幾何学的に規則的なパターン、列および行が明白に示されている。行と列は約１００μｍ離れている。また、顕微鏡写真では暗く見える、バッグの密封された端部も示されている。
【００７９】
中空ＰＤＭＳバッグ／膜（１２０μｍの中央隙間を有する厚さ１２０μｍの膜）は、細胞接着のためのプラズマ処理されたパリレンＣの薄層（０．５μｍまで）でコーティングされている。バッグの縁部にはチューブが配管され、調節された酸素の供給に接続され、バッグの中空部分を酸素で灌流する。この隙間内の酸素はＰＤＭＳ膜を通って周囲の培地に拡散して細胞に栄養を与えることができる。細胞は、組織培養フラスコに匹敵する速度で膜上で直接増殖させることができる。
【００８０】
図１１は、一実施形態のプロセス１１００のフローチャートである。操作１１０１では、一方の面にスペーサーを有するピラー化気体透過性シートを鋳造する。気体透過性シートは、ガス状の分子酸素がそれを透過するのに十分な厚さを有するが、標準的な室温および大気圧では液体水がそれを透過するのを防止する。操作１１０２では、第２の気体透過性シートを製造する。操作１１０３では、第２の気体透過性シートに接着剤を塗布する。操作１１０４では、第２の気体透過性シートを、ピラー化ガス透過性シートとの間にスペーサーを介して、ピラー化気体透過性シートに接合する。操作１１０５では、ピラー化第１の気体透過性シートと第２の気体透過性シートの周囲を一緒に密閉して耐崩壊性バッグを形成する。操作１１０６では、耐崩壊性バッグに入口を形成する。操作１１０７では、生体適合性コーティングをバッグの少なくとも１つの面に堆積し、生体適合性コーティングは０．１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する。操作１１０８では、細胞接着を改善するために、生体適合性コーティングを処理する。
【００８１】
図１２は、一実施形態のプロセス１２００のフローチャートである。操作１２０１では、一対の気体透過性ポリマーシートを密接に接触させる。操作１２０２では、貫通孔のアレイを有する断熱性マスクをポリマーシート（一方の面）に配置し、貫通孔は中心間距離が１０００μｍ以下である。操作１２０３では、加熱された鉄をポリマーシートの反対側の断熱性マスクにプレスする、加熱された鉄の温度、およびプレスの時間は、マスクの貫通穴によって露出したポリマーシートの部分を一緒に溶接するのに十分である。操作１２０４では、ポリマーシートの周囲を一緒に密閉してバッグを形成する。操作１２０５では、生体適合性コーティングをバッグの少なくとも１つの面に堆積し、生体適合性コーティングは０．１μｍ〜１０００μｍの厚さを有する。操作１２０６では、細胞接着を改善するために、生体適合性コーティングを処理する。
【００８２】
図１３は、一実施形態のプロセス１３００のフローチャートである。操作１３０１では、耐膨張性気体透過性ポリマーバッグのスタックを準備し、各バッグは、マニホールドに接続された入口を有し、各バッグは生体適合性コーティングを有し、バッグは球状ビーズによって互いに間隔を置かれる。操作１３０２では、ビーズとバッグとの間の間隙に細胞を供給する。操作１３０３では、間隙に栄養素の液体培養物を流す。操作１３０４では、分子酸素ガスを、マニホールドを通して耐膨張性バッグに加圧する。操作１３０５では、細胞が成長し増殖するのを待って、栄養素および分子酸素ガスが細胞の増殖をサポートする。操作１３０６では、トリプシンを細胞に適用する。操作１３０７では、細胞をビーズから洗い流す。
【００８３】
本発明は、様々な具体的かつ例示的な実施形態を参照して説明されている。しかしながら、以下の特許請求の範囲の精神および範囲内にとどまりながら、多くの変形および修正を行うことができることを理解されたい。
【図１Ａ】
2019520049.tif 000002
【図１Ｂ】
2019520049.tif 000003
【図１Ｃ】
2019520049.tif 000004
【図２Ａ】
2019520049.tif 000005
【図２Ｂ】
2019520049.tif 000006
【図３Ａ】
2019520049.tif 000007
【図３Ｂ】
2019520049.tif 000008
【図４】
2019520049.tif 000009
【図５】
2019520049.tif 000010
【図６】
2019520049.tif 000011
【図７】
2019520049.tif 000012
【図８】
2019520049.tif 000013
【図９Ａ】
2019520049.tif 000014
【図９Ｂ】
2019520049.tif 000015
【図９Ｃ】
2019520049.tif 000016
【図９Ｄ】
2019520049.tif 000017
【図９Ｅ】
2019520049.tif 000018
【図９Ｆ】
2019520049.tif 000019
【図１０Ａ】
2019520049.tif 000020
【図１０Ｂ】
2019520049.tif 000021
【図１１】
2019520049.tif 000022
【図１２】
2019520049.tif 000023
【図１３】
2019520049.tif 000024
【国際調査報告】
2019520049.tif 000025