(57)【要約】  可溶性Fasリガンド（sFasL）またはそのフラグメントを使用し、それは対象へのsFasLまたはそのフラグメントのrAAV媒介送達であってもよい、対象における緑内障および／またはFasリガンド依存性の炎症状態を処置するための方法。
2019520405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における緑内障を処置する方法であって、
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を、それを必要としている対象へ投与することを含み、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質および（ｉｉ）可溶性Fasリガンドまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む、前記方法。
【請求項２】
対象が、上昇した眼圧（ＩＯＰ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
別の抗緑内障の治療剤を対象へ投与することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象が、別の抗緑内障の治療剤を投与されるか、または投与されていた、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象がヒトである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
投与が、対象の目への、単離された核酸またはrAAVの送達をもたらす、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
投与が、注射、任意には網膜下注射または硝子体内注射を介する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
投与が、対象の目への局所投与を介する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
投与が、rAAVを対象へ１５か月に１回を超えない範囲で投与することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
投与が、緑内障の疾患の進行を低減させることをもたらす、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
投与が、対象において眼圧を低下させることをもたらす、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
投与が、対象において網膜グリア細胞を不活性化させることをもたらす、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
投与が、対象においてTNFα活性を阻害することをもたらす、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
投与が、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅および／または軸索変性を、低減させることをもたらす、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Fasリガンド依存性の炎症状態を処置する方法であって、
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を、それを必要としている対象へ投与することを含み、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質および（ｉｉ）可溶性Fasリガンドまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む、前記方法。
【請求項１６】
Fasリガンド依存性の炎症状態が、緑内障または皮膚ループスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Fasリガンド依存性の炎症状態を処置する方法であって、
（ａ）対象の組織中における膜結合型Fasリガンド（mFasL）および／または可溶性Fasリガンド（sFasL）の存在の有無を検出すること、
（ｂ）mFasLおよび／またはsFasLの存在の有無に基づいて対象を処置することを含み、ここで、対象を処置することは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を対象へ投与することを含み、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質および（ｉｉ）sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む、前記方法。
【請求項１８】
可溶性FasL（sFasL）またはそのフラグメントを、加齢に伴う上昇した眼圧を有する対象へ投与する方法であって、
sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を眼内投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
配列番号１に規定されたとおりの配列を有するAAVカプシドタンパク質、および、
可溶性Fasリガンド（sFasL）またはそのフラグメントを発現するように操作された核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）。
【請求項２０】
sFasLがヒトsFasLである、請求項１９に記載のrAAV。
【請求項２１】
ヒトsFasLが、配列番号２に規定されたとおりの核酸配列または配列番号３に規定されたとおりのタンパク質配列を含む、請求項２０に記載のrAAV。
【請求項２２】
核酸が、２つのAAV逆方向末端反復（ITR）をさらに含み、ここでITRは、導入遺伝子に隣接している、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のrAAV。
【請求項２３】
AAV ITRが、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5およびAAV8から選択される１つ以上の血清型のITRである、請求項２２に記載のrAAV。
【請求項２４】
核酸が、配列番号４に規定されたとおりのプロモーター配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のrAAV。
【請求項２５】
rAAVが、目への送達のために製剤化されている、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のrAAV。
【請求項２６】
請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のrAAVおよび薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項２７】
配列番号５に規定されたとおりの配列を有する、単離された核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により授与されたGM058724、CA090691およびEY021543の下での政府の支援でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願
【０００２】
本願は、35 U.S.C. §119（e）の下で２０１７年５月２６日に出願されて「AAV2-MEDIATED GENE DELIVERY OF SFASL AS A NEUROPROTECTIVE THERAPY IN GLAUCOMA」と題された米国仮出願番号62/511,629および２０１６年７月５日に出願されて「AAV2-MEDIATED GENE DELIVERY OF SFASL AS A NEUROPROTECTIVE THERAPY IN GLAUCOMA」と題された米国仮出願番号62/358,541の利益を主張し、夫々の内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
世界的に失明の主な原因である緑内障は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の進行性喪失によって特徴付けられる複雑な多因子疾患である。上昇した眼圧（ＩＯＰ）は、緑内障の発症についてのよく認識されたリスク因子であり、唯一の修正可能な疾患関連パラメーターのままである。しかしながら、ＩＯＰの低減は単独では、全ての患者においてＲＧＣの喪失を防止するものではなく、ＲＧＣの破壊はＩＯＰが首尾よく低下させられた後でさえも続く可能性がある。さらに、ＲＧＣの喪失を伴う緑内障の高い罹患率は、正常なＩＯＰを有する患者において生じる。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示の側面は、視神経の変性を防止するための組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、緑内障を処置するために有用である。いくつかの態様において、本開示は、Fasリガンド（FasL）が、例として緑内障における、組織損傷をもたらすアポトーシスおよび炎症を媒介するという発見に関する。いくつかの態様において、本開示は、可溶性Fasリガンド（sFasL）のrAAV媒介送達が、緑内障のマウスモデルにおける網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および軸索の死滅を防止するという発見に関する。
【０００５】
従って、本開示の１つの側面は、対象における緑内障を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法には、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を、それを必要としている対象へ投与することが関与し、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質、および、（ｉｉ）sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む。いくつかの例において、sFasLまたはそのフラグメントの量は、緑内障の疾患の進行を低減させること、対象において眼圧を低下させること、網膜グリア細胞を不活性化させること、TNFα活性を阻害すること、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅を低減させること、および／または軸索変性を低減させることにおいて、有効である。いくつかの態様において、新規な組成物および方法が、視神経の変性を防止するためおよび／または緑内障を処置するために提供される。
【０００６】
別の側面において、本開示は、Fasリガンド依存性の炎症状態を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法には、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を、それを必要としている対象へ投与することが関与し、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質、および、（ｉｉ）sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む。いくつかの態様において、Fasリガンド依存性の炎症状態は、緑内障または皮膚ループスである。
【０００７】
代替的には、本開示は、Fasリガンド依存性の炎症状態を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法には、対象の組織中における膜結合型Fasリガンド（mFasL）および／または可溶性Fasリガンド（sFasL）の存在の有無を検出すること、および、mFasLおよび／またはsFasLの存在の有無に基づいて対象を処置することが関与する。いくつかの態様において、方法には、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を対象へ投与することによって対象を処置することがさらに関与し、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質、および、（ｉｉ）sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む。
【０００８】
さらにもう一つの側面において、本開示は、可溶性FasL（sFasL）またはそのフラグメントを対象へ投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、加齢に伴う上昇した眼圧を有する。いくつかの態様において、方法には、sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を眼内投与することが、さらに関与する。
【０００９】
いくつかの態様において、本明細書に記載された方法における処置されるべき対象は、Fasリガンド依存性の炎症状態を有するかまたは有する疑いがある患者（例として、ヒト患者）である。いくつかの例において、対象は、緑内障を有するかまたは有する疑いがあるヒト患者である。かかるヒト患者は、上昇した眼圧（ＩＯＰ）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および／または軸索の喪失、増加したプロアポトーシス遺伝子（例として、Bax、FADD、Fas、およびFasL）、減少した抗アポトーシス遺伝子（例として、c-Flip、Bcl-2、およびCIAP-2）の発現、活性化された網膜グリア細胞、増加したTNFα活性、増加したmFasLの発現、および減少したsFasLの発現を呈し得る。
【００１０】
いくつかの態様において、本明細書に記載された方法により処置されるべき対象のいずれかは、別の緑内障治療（例として、点眼剤、経口薬、または外科手術）で処置されていてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載された方法は、別の抗緑内障処置を対象へ施すことをさらに含んでもよい。
【００１１】
本開示では、対象において緑内障を処置する使用のための医薬組成物（複数または単数）もまた提供される。いくつかの態様において、かかる医薬組成物は、本明細書に記載されたsFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む１つ以上のrAAV、および、薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、緑内障処置のための医薬の製造における、sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含むrAAVの使用もまた提供される。
【００１２】
本発明の１つ以上の態様の詳細が、以下の説明に規定される。本発明の他の特徴および利点は、以下の図面および数件の態様の詳細な説明、および添付の特許請求の範囲からも明白である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａは、膜型のFasLのみを発現するDBA/2Jマウスにおける、加速されたＲＧＣおよび軸索の喪失を示す。図１Ａは、月齢３、６および９か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスにおいて反跳式眼圧計によって取られたＩＯＰ測定を示す（Ｎ＝１６ D2-GP；Ｎ＝２２ D2、Ｎ＝２２ D2-ΔCS）。データは、平均ＩＯＰ±ＳＥＭとして提示されている。群あたりＮ＝１０の視神経。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、****Ｐ＜０．０００１。図１Ｂは、膜型のFasLのみを発現するDBA/2Jマウスにおける、加速されたＲＧＣおよび軸索の喪失を示す。図１Ｂは、月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離され、β−IIIチューブリンおよびＲＧＣ特異的マーカーおよびDAPIの核染色で染色された網膜フラットマウントの代表的な共焦点像を示し、スケールは７５μｍである。群あたりＮ＝１０の視神経。
【図１Ｃ】図１Ｃは、膜型のFasLのみを発現するDBA/2Jマウスにおける、加速されたＲＧＣおよび軸索の喪失を示す。図１Ｃは、ＲＧＣ密度／ｍｍ２網膜で表された、β−IIIチューブリン陽性ＲＧＣの定量化を示す。群あたりＮ＝１０個の目。群あたりＮ＝１０の視神経。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、****Ｐ＜０．０００１。
【図１Ｄ−１Ｅ】図１Ｄは、膜型のFasLのみを発現するDBA/2Jマウスにおける、加速されたＲＧＣおよび軸索の喪失を示す。図１Ｄは、月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSから取られたＰＰＤ視神経断面の代表的な顕微鏡写真を示し、スケールは１００×である。図１Ｅは、膜型のFasLのみを発現するDBA/2Jマウスにおける、加速されたＲＧＣおよび軸索の喪失を示す。図１Ｅは、軸索密度（１０４）／ｍｍ２で表された、健康な軸索の定量化を示す。群あたりＮ＝１０の視神経。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、****Ｐ＜０．０００１。
【００１４】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａは、sFasL非存在下において、加速されたアポトーシスがＲＧＣの喪失と符合することを示す。月齢３か月（図２Ａ）のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから取られたパラフィン埋め込み網膜切片における代表的なTUNEL染色、スケール１００μｍ。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；白い矢尻＝ＧＣＬ中のTUNEL陽性細胞；白い矢印＝ＩＮＬ中のTUNEL陽性細胞。図２Ｂは、sFasL非存在下において、加速されたアポトーシスがＲＧＣの喪失と符合することを示す。月齢３か月（図２Ｂ）で、ＧＣＬ中のTUNEL陽性細胞を定量した、これはTUNEL陽性細胞／網膜切片（９切片／網膜）で表され、群あたりＮ＝８である。ｎｓ−有意ではない、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。
【図２Ｃ−２Ｄ】図２Ｃは、sFasL非存在下において、加速されたアポトーシスがＲＧＣの喪失と符合することを示す。月齢６か月（図２Ｃ）のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから取られたパラフィン埋め込み網膜切片における代表的なTUNEL染色、スケール１００μｍ。ＧＣＬ、神経節細胞層；ＩＮＬ、内顆粒層；ＯＮＬ、外顆粒層；白い矢尻＝ＧＣＬ中のTUNEL陽性細胞；白い矢印＝ＩＮＬ中のTUNEL陽性細胞。図２Ｄは、sFasL非存在下において、加速されたアポトーシスがＲＧＣの喪失と符合することを示す。月齢６か月（図２Ｄ）で、ＧＣＬ中のTUNEL陽性細胞を定量した、これはTUNEL陽性細胞／網膜切片（９切片／網膜）で表され、群あたりＮ＝８である。ｎｓ−有意ではない、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。
【００１５】
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａは、D2-Gp、D2、およびD2-ΔCSの動物におけるFasの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、Fas（図３Ａ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。ｎｓ−有意ではない。図３Ｂは、D2-Gp、D2、およびD2-ΔCSの動物におけるFasLの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、FasL（図３Ｂ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。ｎｓ−有意ではない。*Ｐ＜０．０５。
【図３Ｃ−３Ｄ】図３Ｃは、D2-Gp、D2、およびD2-ΔCSの動物におけるFADDの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、FADD（図３Ｃ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。ｎｓ−有意ではない。****Ｐ＜０．０００１。図３Ｄは、D2-Gp、D2、およびD2-ΔCSの動物におけるFasLの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離された後眼杯（posterior eye cups）から調製したタンパク質ライセート（20μｇ／試料）からの代表的なウェスタンブロット（図３Ｄ）。sFasLまたはmFasLを過剰発現するL5178Y-R腫瘍形質転換体から調製したタンパク質ライセートを陽性対照として使用し、FasL-KOマウスから単離された後眼杯から調製したタンパク質ライセートを陰性対照として使用した。
【図３Ｅ−３Ｆ】図３Ｅは、D2-Gp、D2、およびD2-ΔCSの動物におけるFasLの発現を示す。mFasLの３４および３８ｋＤのバンド（図３Ｅ）のデンシトメトリー分析は、３つの独立した実験（実験あたり、群あたり１つの後部セグメントからなる３つの独立したブロット）の平均であり、エラーバーはＳＥＭ＋を表示する。N.D.−検出されない、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１。図３Ｆは、D2-Gp、D2、およびD2-ΔCSの動物におけるFasLの発現を示す。sFasLの２６ｋＤのバンド（図３Ｆ）のデンシトメトリー分析は、３つの独立した実験（実験あたり、群あたり１つの後部セグメントからなる３つの独立したブロット）の平均であり、エラーバーはＳＥＭ＋を表示する。ｎｓ−有意ではない。*Ｐ＜０．０５。
【００１６】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａは、D2-ΔCSマウスおよびAAV2.sFasLで処置されたD2マウスの網膜中のGFAPおよびTNFαの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから取られ、GFAPおよびDAPIについて染色されたパラフィン埋め込み網膜切片の代表的な共焦点顕微鏡画像、白い矢印＝ミュラー細胞（muller cells）中のGFAP、スケール１００μｍ（図４Ａ）。図４Ｂは、D2-ΔCSマウスおよびAAV2.sFasLで処置されたD2マウスの網膜中のGFAPの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、GFAP（図４Ｂ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。エラーバーはＳＥＭを表示する。ｎｓ−有意ではない、**＜０．０１。
【図４Ｃ−４Ｄ】図４Ｃは、D2-ΔCSマウスおよびAAV2.sFasLで処置されたD2マウスの網膜中のTNFαの発現を示す。月齢３および６か月のD2-Gp、D2、およびD2-ΔCSマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、TNFα（図４Ｃ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。エラーバーはＳＥＭを表示する。ｎｓ−有意ではない、**＜０．０１。図４Ｄは、D2-ΔCSマウスおよびAAV2.sFasLで処置されたD2マウスの網膜中のGFAPおよびTNFαの発現を示す。月齢１０か月のD2-Gp、D2-uninj.、D2-AAV2-eGFP、およびD2-AAV2-sFasLマウスから取られ、GFAPおよびDAPIについて染色されたパラフィン埋め込み網膜切片の代表的な共焦点顕微鏡画像、スケール１００μｍ（図４Ｄ）。
【図４Ｅ−４Ｆ】図４Ｅは、D2-ΔCSマウスおよびAAV2.sFasLで処置されたD2マウスの網膜中のGFAPの発現を示す。月齢１０か月のD2-Gp、D2-uninj.、D2-AAV2-eGFP、およびD2-AAV2-sFasLマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、GFAP（図４Ｅ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。エラーバーはＳＥＭを表示する。ｎｓ−有意ではない、**＜０．０１。図４Ｆは、D2-ΔCSマウスおよびAAV2.sFasLで処置されたD2マウスの網膜中のTNFαの発現を示す。月齢１０か月のD2-Gp、D2-uninj.、D2-AAV2-eGFP、およびD2-AAV2-sFasLマウスから単離された神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、TNFα（図４Ｆ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝６。エラーバーはＳＥＭを表示する。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１。
【００１７】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａは、DBA/2JマウスにおけるsFasLの過剰発現を示す。DBA/2Jマウスに、月齢２か月で、AAV2.sFasLまたは対照としてのAAV2.eGFPの１回の硝子体内注射を受けさせた。網膜全体にわたるAAV2.eGFPの発現を示す網膜フラットマウント、スケール５×および１００μｍ（図５Ａ）。図５Ｂは、DBA/2JマウスにおけるsFasLの過剰発現を示す。DBA/2Jマウスに、月齢２か月で、AAV2.sFasLまたは対照としてのAAV2.eGFPの１回の硝子体内注射を受けさせた。網膜の断面３Ｄ再構成（図５Ｂ）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、DBA/2JマウスにおけるsFasLの過剰発現を示す。DBA/2Jマウスに、月齢２か月で、AAV2.sFasLまたは対照としてのAAV2.eGFPの１回の硝子体内注射を受けさせた。ＧＣＬ−神経節細胞層、ＩＮＬ−内顆粒層。AAV2注射２週間後および８か月後の両方の２６ｋＤでのsFasLの過剰発現を示すウェスタンブロットの形の神経網膜ライセート（５μｇ／試料）、群あたりＮ＝３（図５Ｃ）。*Ｐ＜０．０５。
【図５Ｄ】図５Ｄは、DBA/2JマウスにおけるsFasLの過剰発現を示す。DBA/2Jマウスに、月齢２か月で、AAV2.sFasLまたは対照としてのAAV2.eGFPの１回の硝子体内注射を受けさせた。D2（未注射）、D2-AAV2.eGFP、およびD2-AAV2.sFasLにおいて、月齢３、５、７および９か月で、反跳式眼圧計によってＩＯＰ測定を取った（図５Ｄ）。データは、平均ＩＯＰ±ＳＥＭ ＩＯＰとして提示されている（群あたりＮ＝１０）。月齢９か月でのD2-Gp、D2(未注射)、D2-AAV.eGFPおよびD2-AAV.sFasLにおける色素散乱および虹彩実質萎縮。
【００１８】
【図６Ａ】図６Ａは、DBA/2Jマウスにおいて硝子体内へのAAV2.sFasLがＲＧＣおよび軸索を保護することを示す。DBA/2Jマウスに、月齢２か月で、AAV2.sFasLまたは対照としてのAAV2.eGFPの１回の硝子体内注射を受けさせた。月齢１０か月で、年齢をマッチさせたD2-uninj（未注射）およびD2.Gpマウスに加えて、AAV2.sFasLおよびAAV2.eGFP処置マウスを安楽死させ、ＲＧＣおよび軸索の分析のために網膜および視神経を処理した。D2-Gp、D2-未注射、D2-AAV2.eGFPおよびD2-AAV2.sFasLマウスから単離され、β−IIIチューブリン、ＲＧＣ特異的マーカー、およびDAPIで染色された網膜フラットマウントの代表的な共焦点像、スケール５０μｍ。ＲＧＣ密度／ｍｍ２網膜で表された、β−IIIチューブリン陽性ＲＧＣの定量化。群あたりＮ＝１０個の目（図６Ａ）。ｎｓ−有意ではない、***Ｐ＜０．００１。
【図６Ｂ】図６Ｂは、DBA/2Jマウスにおいて硝子体内へのAAV2.sFasLがＲＧＣおよび軸索を保護することを示す。DBA/2Jマウスに、月齢２か月で、AAV2.sFasLまたは対照としてのAAV2.eGFPの１回の硝子体内注射を受けさせた。月齢１０か月で、年齢をマッチさせたD2-uninj（未注射）およびD2.Gpマウスに加えて、AAV2.sFasLおよびAAV2.eGFP処置マウスを安楽死させ、ＲＧＣおよび軸索の分析のために網膜および視神経を処理した。D2-Gp、D2-未注射、D2-AAV2.eGFPおよびD2-AAV2.sFasLマウスから取られたＰＰＤ視神経断面の代表的な顕微鏡写真。軸索密度（１０４）／ｍｍ２で表された、健康な軸索の定量化。群あたりＮ＝１０の視神経（図６Ｂ）。スケール１００×、ｎｓ−有意ではない、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１、****Ｐ＜０．０００１。
【００１９】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａは、AAV2.sFasLで処置されたD2マウスにおけるプロアポトーシスおよび抗アポトーシスメディエーターの発現を示す。神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、プロアポトーシスメディエーターFas、FADD、およびBAX（図７Ａ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝５。エラーバーはＳＥＭを表示する。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１。図７Ｂは、AAV2.sFasLで処置されたD2マウスにおけるプロアポトーシスおよび抗アポトーシスメディエーターの発現を示す。神経網膜に対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、坑アポトーシスメディエーターcFLIP、Bcl2、およびcIAP2（図７Ｂ）のｍＲＮＡレベルを定量した。群あたりＮ＝５。エラーバーはＳＥＭを表示する。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１、****＜０．０００１。
【００２０】
【図８Ａ】図８Ａは、AAV2.sFasLでの処置が、疾患の始まる前または始まった後に与えられたとき、D2マウスにおいてＲＧＣおよび軸索の長期保護を提供することを示す。月齢２か月（前処置）でAAV2-eGFPまたはAAV2-sFasLで処置されたD2マウス（図８Ａ）からの、月齢１５か月での、β−IIIチューブリンおよびDAPIで染色された網膜全載からの代表的な共焦点顕微鏡画像（スケール１００μｍ）。年齢をマッチさせたD2-GpおよびD2-未注射マウスは、対照としての役割を果たした（スケール１００μｍ）。ＲＧＣ密度／ｍｍ２網膜で表された、β−IIIチューブリン陽性ＲＧＣの定量化。群あたりＮ＝１０個の目。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５。
【図８Ｂ】図８Ｂは、AAV2.sFasLでの処置が、疾患の始まる前または始まった後に与えられたとき、D2マウスにおいてＲＧＣおよび軸索の長期保護を提供することを示す。月齢２か月でAAV2-eGFPまたはAAV2-sFasLで処置されたD2マウス（図８Ｂ）の、月齢１５か月での、ＰＰＤで染色された視神経断面の代表的な顕微鏡写真。スケール１００×。年齢をマッチさせたD2-GpおよびD2-未注射マウスは、対照としての役割を果たした。軸索密度（１０４）／ｍｍ２で表された、健康な軸索の定量化。群あたりＮ＝１０個の目。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１。
【図８Ｃ】図８Ｃは、AAV2.sFasLでの処置が、疾患の始まる前または始まった後に与えられたとき、D2マウスにおいてＲＧＣおよび軸索の長期保護を提供することを示す。月齢７か月（疾患が開始した後）でAAV2-eGFPまたはAAV2-sFasLで処置されたD2マウス（図８Ｃ）からの、月齢１５か月での、β−IIIチューブリンおよびDAPIで染色された網膜全載からの代表的な共焦点顕微鏡画像（スケール１００μｍ）。年齢をマッチさせたD2-GpおよびD2-未注射マウスは、対照としての役割を果たした（スケール１００μｍ）。ＲＧＣ密度／ｍｍ２網膜で表された、β−IIIチューブリン陽性ＲＧＣの定量化。群あたりＮ＝１０個の目。ｎｓ−有意ではない、**＜０．０１。
【図８Ｄ】図８Ｄは、AAV2.sFasLでの処置が、疾患の始まる前または始まった後に与えられたとき、D2マウスにおいてＲＧＣおよび軸索の長期保護を提供することを示す。月齢７か月でAAV2-eGFPまたはAAV2-sFasLで処置されたD2マウス（図８Ｄ）の、月齢１５か月での、ＰＰＤで染色された視神経断面の代表的な顕微鏡写真。スケール１００×。年齢をマッチさせたD2-GpおよびD2-未注射マウスは、対照としての役割を果たした。軸索密度（１０４）／ｍｍ２で表された、健康な軸索の定量化。群あたりＮ＝１０個の目。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１。
【００２１】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａは、C57/BL6マウスにおいて、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ細胞の死滅に対して保護することを示す。生理食塩水およびマイクロビーズを注射されたB6.AAV2.eGFPおよびB6.AAV2.sFasLマウスにおける、マイクロビーズまたは生理食塩水注射４週間後の２６ｋＤでのsFasLならびにアクチンの発現を示す、ウェスタンブロットの形の神経網膜ライセート（５μｇ／試料）（図９Ａ）。図９Ｂは、C57/BL6マウスにおいて、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ細胞の死滅に対して保護することを示す。生理食塩水またはマイクロビーズで処置されたB6.AAV2.eGFPおよびB6.AAV2.sFasLマウスから、反跳式眼圧計によってＩＯＰ測定を取った（図９Ｂ）。データは、平均ＩＯＰ±ＳＥＭ ＩＯＰとして提示されている（群あたりＮ＝１０）。*Ｐ＜０．０５、**＜０．０１、****Ｐ＜０．０００１。
【図９Ｃ−９Ｄ】図９Ｃは、C57/BL6マウスにおいて、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ細胞の死滅に対して保護することを示す。マイクロビーズ注射２８日後に、ＲＧＣおよび軸索の定量化のために神経網膜および視神経を処理した。マイクロビーズまたは生理食塩水注射４週間後の、β−IIIチューブリン、ＲＧＣ特異的マーカーおよびDAPIで染色された網膜フラットマウントからの代表的な共焦点顕微鏡画像（図９Ｃ）。図９Ｄは、C57/BL6マウスにおいて、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ細胞の死滅に対して保護することを示す。ＲＧＣ密度／ｍｍ２網膜で表された、β−IIIチューブリン陽性ＲＧＣの定量化。スケール７５μｍ（図９Ｄ）。群あたりＮ＝５個の目。ｎｓ−有意ではない、**＜０．０１、***Ｐ＜０．００１。
【図９Ｅ−９Ｆ】図９Ｅは、C57/BL6マウスにおいて、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ細胞の死滅に対して保護することを示す。マイクロビーズまたは生理食塩水注射４週間後のＰＰＤで染色された視神経断面の代表的な顕微鏡写真、スケール１００×（図９Ｅ）。図９Ｆは、C57/BL6マウスにおいて、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ細胞の死滅に対して保護することを示す。軸索密度（１０４）／ｍｍ２で表された、健康な軸索の定量化（図９Ｆ）。群あたりＮ＝５個の目。ｎｓ−有意ではない、*Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本発明の側面は、対象へ送達されたときに対象における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅を処置または防止するのに有効な、あるタンパク質コード導入遺伝子（例として、可溶性Fasリガンド（sFasL）またはそのフラグメント）に関する。従って、本開示により記載されている方法および組成物は、いくつかの態様において、緑内障の処置のために有用である。
【００２３】
緑内障を処置するための方法
対象へ導入遺伝子（例として、sFasLタンパク質またはそのフラグメントをコードする遺伝子）を送達するための方法が、本開示により提供される。方法には、典型的には、sFasLタンパク質フラグメントをコードする単離された核酸、またはsFasLタンパク質フラグメントを発現させるための核酸を含むrAAVの有効量を、対象へ投与することが関与する。
【００２４】
Fasリガンド（FasL）は、TNFファミリーの４０ｋＤａのII型の膜貫通型タンパク質であり、元々はFas受容体陽性細胞においてアポトーシスを誘導するその能力によって同定された。FasLは、膜結合型タンパク質（mFasL）として発現するか、または、切断されて可溶性タンパク質（sFasL）として放出されることができる。
【００２５】
ヒトFasL遺伝子は、２８１アミノ酸のタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ヒトFasL遺伝子は、配列番号6に規定された、GenBank Accession Number NM_000639.2として記載されたとおりのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。いくつかの態様において、ヒトFasLのアミノ酸残基127-281に対応するヒトsFasLタンパク質が、配列番号３として規定されている。いくつかの態様において、ヒトsFasLタンパク質は、配列番号２に規定された核酸によってコードされる。
【００２６】
本開示の側面は、その一部において、sFasLが、例えば、ウイルスベクター（例として、rAAV）の投与を介して、それを必要としている対象において発現すると、ＲＧＣおよび軸索の喪失を防止するという驚くべき発見に基づく。
【００２７】
従って、いくつかの側面において、本開示は、sFasLタンパク質またはそのフラグメントをコードする、導入遺伝子を提供する。「sFasLタンパク質フラグメント」は、sFasLタンパク質の機能的な２〜１５４（例として、２〜１５４の間のあらゆる整数の）アミノ酸部分を指す。いくつかの態様において、sFasLタンパク質フラグメントは、sFasL（例として、配列番号３）の連続したアミノ酸部分（例として、アミノ酸１〜１５４）を含む。いくつかの態様において、sFasLタンパク質フラグメントは、sFasL（例として、配列番号３）の、１つ以上の（例として、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の）断続的なアミノ酸部分（例として、アミノ酸１〜１０、３２〜１２０および６４〜１５０）を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、本開示により記載されているsFasLまたはそのフラグメントをコードする導入遺伝子は、ＲＧＣおよび軸索の喪失を防止し、ひいては緑内障を処置するために有用である。一般的に、「緑内障」は、視神経を損傷するような目の状態の群を指す。いくつかの態様において、緑内障における視神経への損傷は、目における上昇した圧力によって引き起こされる。緑内障の例は、これに限定されるものではないが、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）、先天性緑内障、続発性緑内障、色素性緑内障、偽落屑緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、虹彩角膜内皮症候群（ＩＣＥ）、およびぶどう膜炎緑内障を含む。
【００２９】
いくつかの側面において、本開示は、それを必要としている対象における緑内障を処置するための方法を提供し、方法は、本開示により記載されているとおりの、単離された核酸またはrAAVの治療有効量を、緑内障を有する対象へ投与することを含む。
【００３０】
物質の「有効量」は、所望の効果を生み出すのに十分な量である。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、本明細書に記載されたとおりのsFasLタンパク質またはそのフラグメントをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸）の有効量は、対象の標的組織の十分な数の標的細胞を形質転換させる（または、rAAV媒介送達の文脈において、感染させる）のに十分な量である。いくつかの態様において、標的組織は、眼組織（例として、光受容細胞、桿体細胞、錐体細胞、網膜神経節細胞、網膜細胞、その他）である。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、rAAVを介して送達され得るもの）の有効量は、対象において、例として、興味対象の遺伝子またはタンパク質（例として、sFasL）の発現を増加させるかまたは補うこと、または対象において疾患の１つ以上の症状（例として、ＲＧＣ損傷などの緑内障の症状）を改善すること、その他、の治療的有用性を有するのに十分な量であり得る。有効量は、例えば、対象の種、年齢、重量、健康状態、および標的とすべき組織などの様々な因子に依存し、ゆえに、本開示の他の箇所に記載されているとおり、対象および組織間で変動し得る。
【００３１】
本明細書で使用される用語「処置する」は、緑内障、緑内障の症状、または緑内障になりやすい傾向を有する対象への、治すこと、癒すこと、緩和すること、軽減すること、変えること、治癒すること、良くすること、改善すること、または、障害、疾患の症状、もしくは緑内障になりやすい傾向に対して影響を及ぼすことを目的とした、sFasLまたはそのフラグメントを含む組成物の適用または投与を指す。
【００３２】
緑内障を緩和することは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患の重症度を低減させることを含む。疾患を緩和することは、必ずしも治癒的な結果を要しない。そこにおいて使用される、疾患（緑内障など）の発症を「遅延させること」は、疾患の進行を延期する、妨げる、減速させる、遅らせる、安定化させる、および／または先送りにすることを意味する。この遅延は、病気の履歴および／または処置される個人に依存して、変動する時間の長さである可能性がある。疾患の発症を「遅延させ」もしくは緩和し、または疾患の発病を遅延させる方法は、その方法を使用しない場合と比較して、時間枠の中で疾患の１つ以上の症状を発症する確率を低減させる、および／または所与の時間枠の中で症状の程度を低減させる方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な結果を与えるのに十分な数の対象を使用した臨床研究に基づく。
【００３３】
疾患の「発症」または「進行」は、疾患の初期兆候および／またはその後の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知である標準的な臨床技法を使用して検出可能であり、評価することができる。しかしながら、発症はまた、検出不可能であり得る進行も指す。この開示の目的のため、発症または進行は、症状の生物学的な経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発病を含む。本明細書で使用される、緑内障の「発病」または「発生」は、初回の発病および／または再発を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、sFasLまたはそのフラグメントは、対象において眼圧を少なくとも５％（例として、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きく）低下させるのに十分な量で、その処置を必要としている対象へ投与される。いくつかの態様において、sFasLまたはそのフラグメントは、対象において網膜グリア細胞を少なくとも５％（例として、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きく）不活性化させるのに十分な量で、その処置を必要としている対象へ投与される。いくつかの態様において、sFasLまたはそのフラグメントは、対象においてTNFα活性を少なくとも５％（例として、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きく）阻害するのに十分な量で、その処置を必要としている対象へ投与される。いくつかの態様において、sFasLまたはそのフラグメントは、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅および／または軸索変性を少なくとも５％（例として、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも大きく）低減させるのに十分な量で、その処置を必要としている対象へ投与される。
【００３５】
Fasリガンド依存性の炎症状態を処置するための方法および組成物もまた、本明細書において提供される。本明細書で使用される「Fasリガンド依存性の炎症状態」は、Fasリガンド依存性の炎症によって媒介される状態または疾患である。Fasリガンド依存性の炎症は、眼炎症性疾患に関与するものであり得る。眼炎症性疾患の非限定例は、これに限定されるものではないが、アレルギー性結膜炎、ブドウ膜炎、強膜炎、上強膜炎、視神経炎、角膜炎、眼窩偽腫瘍、網膜血管炎、慢性結膜炎、および、自己免疫に誘導された慢性炎症（例として、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス）を含む。しばしば、Fasリガンド依存性の炎症状態は、mFasLによって引き起こされる目の炎症に結び付けられる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、sFasLのrAAVベースの送達は、Fasリガンド依存性の炎症状態を有する対象において目の炎症を低減させる。
【００３６】
いくつかの態様において、Fasリガンド依存性の炎症状態を処置するための方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を対象へ投与することを含み、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質、および、（ｉｉ）sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む。
【００３７】
いくつかの態様において、Fasリガンド依存性の炎症状態を処置するための方法は、対象の組織中における膜結合型Fasリガンド（mFasL）および／または可溶性Fasリガンド（sFasL）の存在の有無を検出すること、ならびにmFasLおよび／またはsFasLの存在の有無に基づいて対象を処置することを含み、ここで、対象を処置することは、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の有効量を対象へ投与することを含み、ここでrAAVは、（ｉ）カプシドタンパク質、および、（ｉｉ）sFasLまたはそのフラグメントを発現するように操作された核酸を含む。
【００３８】
熟練者は、FasLタンパク質（例として、FasL、mFasL、またはsFasL）が、当該技術分野において知られているあらゆる方法により検出され得ることを認識する。いくつかの態様において、FasLタンパク質は、電気泳動、ウェスタンブロット、および質量分析を使用して検出される。いくつかの態様において、FasLタンパク質は、眼液（例として、眼内液、房水、または涙液）中において検出される。
【００３９】
併用療法
本明細書に記載されたsFasLまたはそのフラグメントと、別の抗緑内障の治療剤とを使用した、本明細書に記載されたものなどの併用療法もまた、本明細書において提供される。本明細書で使用されるとおりの、併用療法という用語は、これらの剤（例として、sFasLまたはそのフラグメントおよび抗緑内障の治療剤）の逐次的な様式での投与、つまり、各治療剤が異なる時間で投与されること、ならびに、これらの治療剤の、または、その剤の少なくとも２つの、実質的に同時の様式での投与を包含する。
【００４０】
各剤の逐次的なまたは実質的に同時の投与は、rAAV媒介送達、経口経路、静脈内経路、筋肉内、皮下経路、および、粘膜組織を通した直接吸収を含むがこれに限定されるものではない、あらゆる適切な経路により影響を及ぼされる可能性がある。剤は、同じ経路により、または異なる経路により投与することができる。例えば、第１の剤（例として、sFasLまたはそのフラグメント）を、rAAV媒介送達を介して投与することができ、第２の剤（例として、抗緑内障剤）を、経口投与することができる。
【００４１】
本明細書で使用される用語「逐次的な」は、別様に定めない限り、規則正しい順序または順番によって特徴付けられることを意味し、例として、投薬レジメンがsFasLまたはそのフラグメント、および抗緑内障剤の投与を含む場合に、逐次的投薬レジメンは、sFasLまたはそのフラグメントの投与を、抗緑内障剤の投与の前に、これと同時に、これと実質的に同時に、またはこれの後に含むことができるが、ただし両方の剤は、規則正しい順序または順番で投与されることになる。用語「別々に」は、別様に定めない限り、一方を他方から隔てておくことを意味する。
【００４２】
用語「同時」は、別様に定めない限り、同じ時間に起こっているかまたは行われたこと、すなわち、本発明の剤が同じ時間に投与されることを意味する。用語「実質的に同時」は、剤が互いの数分以内に（例として、互いの１０分以内に）投与されるということを意味し、結合投与（joint administration）ならびに連続的投与（consecutive administration）を包含することを意図するが、ただし投与が連続的である場合、それは時間でいうと短時間（例として、医師が２つの剤を別々に投与するのにかかる時間）だけしか分離されない。本明細書で使用される同時投与（concurrent administration）および実質的に同時の投与は、互換的に使用される。逐次的な投与は、本明細書に記載された剤の時間的に分離された投与を指す。
【００４３】
併用療法は、本明細書に記載された剤（例として、sFasLまたはそのフラグメントおよび抗緑内障剤）の、他の生物学的に活性な成分（例として、異なる抗緑内障剤）および非薬物療法（例として、外科手術）とのさらなる組み合わせでの投与もまた、包含することができる。
【００４４】
sFasLまたはそのフラグメントおよび別の抗緑内障剤（例として、点眼剤を介して送達される）のあらゆる組み合わせが、あらゆる順序で、緑内障を処置するために使用され得ることが、当然理解されるべきである。本明細書に記載された組み合わせは、数々の因子に基づいて選択し得、それらは、これに限定されるものではないが、緑内障の疾患の進行を低減させること、眼圧（ＩＯＰ）を低下させること、網膜グリア細胞を不活性化させること、TNFα活性を阻害すること、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死滅を低減させること、軸索変性を低減させること、および／または緑内障と関連付けられる少なくとも１つの症状を緩和することについての有効性、または、組み合わせにおける別の剤の副作用を和らげるための有効性を含む。例えば、本明細書に記載された併用療法は、組み合わせの個々の構成要素と関連付けられる副作用のいずれか、例えば、抗緑内障剤と関連付けられる副作用を低減させ得る。
【００４５】
いくつかの態様において、別の抗緑内障の治療剤は、点眼剤、経口薬、および／または外科的治療である。点眼剤は、１つ以上の治療剤、例えば、プロスタグランジン、ベータ遮断薬、アルファ−アドレナリンアゴニスト、炭酸脱水酵素阻害薬、縮瞳剤、およびコリン作動剤を含み得る。いくつかの態様において、経口薬は、炭酸脱水酵素阻害薬を含む。外科的治療の例は、これに限定されるものではないが、レーザー治療、濾過手術、ドレナージチューブ、および電気焼灼を含む。
【００４６】
単離された核酸
いくつかの側面において、本開示は、ヒトsFasLまたはそのフラグメントを発現させるために有用である単離された核酸を提供する。「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書で使用される用語「単離された」は、人工的に生産されたことを意味する。核酸に関して本明細書で使用される用語「単離された」は、以下を意味する：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、in vitroで増幅されている；（ｉｉ）クローニングにより、組み換えで生産されている；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離によるなどで、精製されている；または（ｉｖ）例えば化学合成により、合成されている。
【００４７】
単離された核酸は、当該技術分野において周知である組み換えＤＮＡ技法によって簡単に操作可能なものである。ゆえに、その５’および３’制限部位が知られているか、またはそのためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されているベクターに含有されるヌクレオチド配列は、単離されているとみなされるが、その天然状態でその自然宿主中に存在する核酸配列は、そうではない。
【００４８】
単離された核酸は実質的に精製されていてもよいが、そうである必要はない。例えばクローニングまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、それが存在している細胞内におけるごく微小なパーセンテージの材料を含み得るという点で、純粋ではない。かかる核酸は、しかしながら、本明細書で使用されている用語でいえば、単離されており、なぜなら、それは、当該技術分野において通常の知識を有する者に知られている標準的な技法によって観覧に操作可能であるからである。タンパク質またはペプチドに関して本明細書で使用される用語「単離された」は、それの自然環境から単離されたか、または人工的に生産された（例として、化学合成による、組み換えＤＮＡ技術による、その他）、タンパク質またはペプチドを指す。
【００４９】
熟練者はまた、カプシドタンパク質の機能的に等価なバリアントまたはホモログが提供されるように保存的アミノ酸置換がなされ得ることも当然認識する。いくつかの側面において本開示は、保存的アミノ酸置換をもたらす配列変異を包含する。本明細書で使用される保存的アミノ酸置換は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対電荷またはサイズ特性を改変しないアミノ酸置換を指す。
【００５０】
バリアントは、当該技術分野において通常の知識を有する者に知られているポリペプチド配列を改変するための方法、例えばかかる方法をまとめた参照物、例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkにおいて見出されるものなどに従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の間でなされる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。したがって、本明細書に開示されたタンパク質およびポリペプチドに対して保存的アミノ酸置換を生じさせることができる。
【００５１】
本発明の単離された核酸は、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター（rAAVベクター）であり得る。いくつかの態様において、本開示により記載されている単離された核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（AAV）逆方向末端反復（ITR）またはそのバリアントを含む領域（例として、第一領域）を含む。単離された核酸（例として、組み換えAAVベクター）は、カプシドタンパク質中にパッケージングされて、対象へ投与され、および／または選択された標的細胞へ送達されてもよい。「組み換えAAV（rAAV）ベクター」は、典型的には、最低限、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５’および３’AAV逆方向末端反復（ITR）から構成される。導入遺伝子は、本明細書の他の箇所に開示されているとおり、１つ以上のタンパク質（例として、ヒトsFasLまたはそのフラグメント）をコードする１つ以上の領域を含み得る。導入遺伝子はまた、本開示の他の箇所に記載されているとおり、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位および／または発現制御配列（例として、ポリＡテール）をコードする領域を含んでもよい。
【００５２】
一般的に、ITR配列は、長さ約１４５ｂｐである。好ましくは、実質的に、ITRをコードする全配列が分子の中で使用されるが、これらの配列のある程度の小さな修正は許容される。これらのITR配列を修正する能力は、当該技術分野における知識の範囲内である。（例として、Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などの、テキストを参照）。本発明において採用されるかかる分子の例は、選択された導入遺伝子配列および関連付けられる調節エレメントが５’および３’AAV ITR配列によって隣接されている、導入遺伝子を含有する、「シス作用（cis-acting）」プラスミドである。AAV ITR配列は、現在同定されている哺乳動物AAV型を含む、あらゆる知られているAAVから得られ得る。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、rAAVベクター）は、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびそのバリアントから選択される血清型を有する少なくとも１つのITRを含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、AAV2 ITRをコードする領域（例として、第一領域）を含む。
【００５３】
いくつかの態様において、単離された核酸は、第２のAAV2 ITRを含む領域（例として、第二領域、第三領域、第四領域、その他）をさらに含む。いくつかの態様において、第２のAAV2 ITRは、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびそのバリアントから選択される血清型を有する。いくつかの態様において、第２のITRは、機能的な末端解離部位（TRS）を欠いた変異ITRである。用語「末端解離部位を欠いている」は、ITRの末端解離部位（TRS）の機能を無効化する突然変異（例として、非同義変異などのセンス変異、またはミスセンス変異）を含むAAV ITRを、または、機能的なTRSをコードする核酸配列を欠いている短縮AAV ITR（例として、ΔTRS ITR）を、指すことができる。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的なTRSを欠いているITRを含むrAAVベクターは、自己相補的なrAAVベクター、例えば as described by McCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656により記載されているとおりのものを生産する。
【００５４】
組み換えAAVベクターについて上記に同定された重要なエレメントに加えて、ベクターはまた、ベクターで形質転換されたかまたは本発明によって生産されたウイルスに感染した細胞中におけるその転写、翻訳および／または発現を許容する様式で、導入遺伝子のエレメントと作動可能に（operably）結びついている、従来からある制御エレメントも含む。本明細書で使用される「作動可能に結びついている」配列は、興味対象の遺伝子に連続した発現制御配列、および、興味対象の遺伝子を制御するためにトランスにまたは距離が離れたところで作用する発現制御配列の、両方を含む。発現制御配列は、適切な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質性ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；および所望に応じて、コードされた産物の分泌を向上させる配列を含む。天然、構成的、誘導性、および／または組織特異的プロモーターを含む数々の発現制御配列が当該技術分野において知られており、および利用され得る。
【００５５】
本明細書で使用される核酸配列（例として、コード配列）と調節配列とは、それらが、核酸配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下に置かれるように共有結合的に結びついているときに、作動可能に結びついていると言われる。もしも核酸配列が機能的なタンパク質へと翻訳されることが所望される場合には、５’調節配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらすのであれば、および、２つのＤＮＡ配列の間の結びつきの性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさないか、（２）プロモーター領域の、コード配列の転写を命令する能力と干渉しないか、または（３）対応するＲＮＡ転写産物の、タンパク質へと翻訳される能力と干渉しないのであれば、２つのＤＮＡ配列が作動可能に結びついていると言われる。
【００５６】
ゆえに、プロモーター領域が、その結果得られる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るようにそのDNA配列の転写を行わせることを可能とするのであれば、プロモーター領域は、核酸配列に作動可能に結びついていることになる。同様に、２つ以上のコード領域は、共通のプロモーターからのそれらの転写が、インフレームにて翻訳された２つ以上のタンパク質の発現をもたらすように結びついているときに、作動可能に結びついている。いくつかの態様において、作動可能に結びついているコード配列は、融合タンパク質を産み出す。いくつかの態様において、作動可能に結びついているコード配列は、機能的なＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ）を産み出す。
【００５７】
「プロモーター」は、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列であって、遺伝子の個別具体的な転写を開始するのに要求されるものを指す。句「作動可能に位置している」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ核酸との関係において、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現のための正しい位置と向きにあることを意味する。
【００５８】
タンパク質をコードする核酸については、ポリアデニル化配列が、一般的には導入遺伝子配列の後、３’AAV ITR配列の前に挿入される。本開示において有用なrAAVコンストラクトは、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置するイントロンもまた含有し得る。１つの考え得るイントロン配列は、SV-40に由来し、SV-40 T イントロン配列と称される。別の使用され得るベクターエレメントは、内部リボソーム侵入部位（IRES）である。IRES配列は、単一の遺伝子転写物から１つよりも多くのポリペプチドを生産するのに使用される。IRES配列は、１つよりも多くのポリペプチド鎖を含有するタンパク質を生産するのに使用されることとなる。これらおよび他の普及しているベクターエレメントは従来からあり、数多くのかかる配列が入手可能である［例として、Sambrook et al.,およびそこにおいて引用された参照物、例えば頁3.18 3.26および16.17 16.27、ならびにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989を参照］。
【００５９】
いくつかの態様において、口蹄疫ウイルス２Ａ配列が、ポリプロテインに含まれる；これは、ポリプロテインの切断を媒介することが示されている小ペプチド（長さおよそ１８アミノ酸）である（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873；およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子治療ベクター（AAVおよびレトロウイルス）を含む人工的な系において既に実証されている（Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933；Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127；Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873;およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459；de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208；de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.；およびKlump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817）。
【００６０】
構成的プロモーターの例は、限定されることなしに、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（RSV）LTRプロモーター（任意に、RSVエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（任意に、CMVエンハンサーとともに）［例として、Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)を参照］、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモーター、およびEF1αプロモーター［Invitrogen］を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、強化ニワトリβ−アクチンプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、Ｕ６プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（CBA）プロモーターである。
【００６１】
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を許し、外から供給された化合物、温度などの環境因子、または個別具体的な生理学的状態の存在、例として、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞においてのみ、によって調節されることができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、様々な商業的供給源から入手可能であり、それらは限定されることなしに、Invitrogen、ClontechおよびAriadを含む。数多くの他の系が記載されており、当該技術分野における知識を有する者によって簡単に選択されることができる。
【００６２】
外から供給されたプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例は、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（MT）プロモーター、デキサメタゾン（Dex）誘導性マウス乳がんウイルス（MMTV）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)もまた参照）、RU486誘導系（Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)およびWang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）を含む。この文脈において有用であり得るさらに他の誘導性プロモーターのタイプは、個別具体的な生理学的状態、例として、温度、急性期、細胞の特定の分化状態、または複製細胞においてのみ、によって調節されるものである。
【００６３】
別の態様において、導入遺伝子のための天然プロモーターが使用されることとなる。天然プロモーターは、導入遺伝子が天然の発現を模倣することが所望されるときに、好ましいとされ得る。天然プロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的にもしくは発達に応じて、または組織特異的な様式で、または特異的な転写刺激に応答して、調節されなければならないときに、使用され得る。さらなる態様において、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列などの、他の天然発現制御エレメントもまた、天然の発現を模倣するのに使用され得る。
【００６４】
いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能を付与する。いくつかの場合において、組織特異的調節配列は、組織特異的な様式で転写を誘導する組織特異的転写因子を結合させる。かかる組織特異的調節配列（例として、プロモーター、エンハンサー、その他）は、当該技術分野において周知である。いくつかの態様において、組織特異的プロモーターは、眼特異的プロモーターである。眼特異的プロモーターの例は、これに限定されるものではないが、レチノスキシンプロモーター、K12プロモーター、ロドプシンプロモーター、桿体特異的プロモーター、錐体特異的プロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、GRK1プロモーター、光受容器間レチノイド結合タンパク質近位（IRBP）プロモーター、およびオプシンプロモーター（例として、赤オプシンプロモーター、青オプシンプロモーター、その他）を含む。
【００６５】
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）
いくつかの側面において、本開示は、単離されたAAVを提供する。AAVに関して本明細書で使用される用語「単離された」は、人工的に生産されたかまたは得られたAAVを指す。単離されたAAVは、組み換え法を使用して生産され得る。かかるAAVは、本明細書において、「組み換えAAV」と称される。組み換えAAV（rAAV）は、好ましくは、１つ以上のあらかじめ決められた組織（単数または複数）へrAAVの導入遺伝子が特異的に送達されるような、組織特異的標的能を有する。AAVカプシドは、これらの組織特異的標的能を決定するのに重要な要素である。ゆえに、標的とされる組織のために適切なカプシドを有するrAAVを、選択することができる。
【００６６】
所望のカプシドタンパク質を有する組み換えAAVを得るための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、US 2003/0138772を参照、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。典型的には、方法には、AAVカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的なrep遺伝子；組み換えAAVベクターAAV逆方向末端反復(ITRs)および導入遺伝子から構成された組み換えAAVベクター；およびAAVカプシドタンパク質中への組み換えAAVベクターのパッケージングを許容するのに十分なヘルパー機能、を含有する宿主細胞を培養することが関与する。
【００６７】
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、AAVのcap遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。AAVは、３つのカプシドタンパク質、ビリオンタンパク質１〜３（VP1、VP2およびVP3と名付けられている）を含み、これらの全ては、選択的スプライシングを介して、単一のcap遺伝子から転写されている。いくつかの態様において、VP1、VP2およびVP3の分子量は、夫々、約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。いくつかの態様において、翻訳されると、カプシドタンパク質は、球状の６０ｍｅｒのタンパク質シェルをウイルスゲノムの周りに形成する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達して宿主と相互作用させることである。いくつかの側面において、カプシドタンパク質は、組織特異的な様式で宿主へウイルスゲノムを送達する。
【００６８】
いくつかの態様において、AAVカプシドタンパク質は、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAVrh8、AAV9、およびAAV10からなる群から選択されるAAV血清型のものである。いくつかの態様において、AAVカプシドタンパク質は、非ヒト霊長類に由来する血清型のもの、例えばAAVrh8血清型である。いくつかの態様において、the AAVカプシドタンパク質は、対象の目への指向性を有する血清型のもの、例えば、対照の眼細胞を他のベクターよりも効率的に形質導入するAAV（例として、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39およびAAVrh.43）のものである。いくつかの態様において、AAVカプシドタンパク質は、AAV8血清型またはAAV5血清型のものである。いくつかの態様において、AAVカプシドタンパク質は、配列番号１に規定された配列を含む。
【００６９】
rAAVベクターをAAVカプシド中にパッケージングするために宿主細胞中において培養すべき構成成分は、宿主細胞へとトランスに提供されてもよい。代替的に、要求される構成成分（例として、組み換えAAVベクター、rep配列、cap配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上が、要求される構成成分の１つ以上を含有するように当該技術分野における知識を有する者に知られている方法を使用して操作された安定な宿主細胞によって、提供されてもよい。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、誘導プロモーターの制御下で要求される構成成分（単数または複数）を含有することになる。しかしながら、要求される構成成分（単数または複数）は、構成的プロモーターの制御下であってもよい。好適な誘導および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子とともに使用するのに好適な調節エレメントの考察において、本明細書において提供される。
【００７０】
さらに別の代替において、選択された安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下における選択された構成成分（単数または複数）および１つ以上の誘導性プロモーターの制御下における他の選択された構成成分（単数または複数）を含有し得る。例えば、安定な宿主細胞は、293細胞に由来するもの（構成的プロモーターの制御下におけるE1ヘルパー機能を含有するもの）が生成され得るが、これは誘導性プロモーターの制御下におけるrepおよび／またはcapタンパク質を含有するものである。さらに他の安定な宿主細胞も、当該技術分野における知識を有する者によって生成され得る。
【００７１】
いくつかの態様において、本開示は、宿主細胞核酸タンパク質（例として、sFasLタンパク質またはそのフラグメント）をコードするコード配列を含む核酸を含有する宿主細胞に関する。いくつかの態様において、本開示は、上記に記載した宿主細胞を含む組成物に関する。いくつかの態様において、上記の宿主細胞を含む組成物は、凍結保存剤をさらに含む。
【００７２】
本開示のrAAVを生産するのに要求される、組み換えAAVベクター、rep配列、cap配列、およびヘルパー機能は、あらゆる適切な遺伝子エレメント（ベクター）を使用して、パッケージング宿主細胞へ送達され得る。選択された遺伝子エレメントは、本明細書に記載されたものを含むあらゆる好適な方法によって送達され得る。この開示のあらゆる態様を構築するのに使用する方法は、核酸操作の知識を有する者に知られており、遺伝子工学的、組み換え工学的、および合成的技法を含む。例として、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照。 同様に、rAAVビリオンを生成する方法は周知であり、好適な方法の選択は、本開示に対する限定ではない。例として、K. Fisher et al., J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第5,478,745号を参照。
【００７３】
いくつかの態様において、組み換えAAVは、トリプルトランスフェクション法（米国特許第6,001,650号において詳細に記載されている）を使用して生産されえる。典型的には、組み換えAAVは、宿主細胞を、AAV粒子中へとパッケージングされるべき組み換えAAVベクター（導入遺伝子を含む）、AAVヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターで形質転換することによって生産される。
【００７４】
AAVヘルパー機能ベクターは、生産的なAAV複製およびカプシド形成（encapsidation）のためにトランスに機能する「AAVヘルパー機能」配列（すなわち、repおよびcap）をコードする。好ましくは、AAVヘルパー機能ベクターは、いかなる検出可能な野生型AAVビリオン（すなわち、機能的なrepおよびcap遺伝子を含有するAAVビリオン）も生産することなく効率的なAAVベクター生産を支持する。本開示とともに使用するのに好適なベクターの非限定例は、米国特許第6,001,650号において記載されているpHLP19および米国特許第6,156,303号において記載されているpRep6cap6ベクターを含み、その両方の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
補助機能ベクターは、AAVが複製のために依存する非AAV由来のウイルスおよび／または細胞機能（すなわち、「補助機能」）のヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、AAV複製に要求されるような機能を含み、それらは限定されることなしに、AAV遺伝子転写の活性化、段階特異的AAV ｍＲＮＡスプライシング、AAV ＤＮＡ複製、cap発現産物の合成、およびAAVカプシドアセンブリに関与している部分を含む。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの知られているヘルパーウイルスのいずれに由来するものとすることもできる。
【００７６】
いくつかの側面において、本開示は、形質転換された宿主細胞を提供する。用語「形質転換」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すのに使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入されているときに、細胞は「形質転換されている」。数々の形質転換技法が、当該技術分野において一般的に知られている。例として、Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier、およびChu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技法は、ヌクレオチド統合ベクターおよび他の核酸分子などの１つ以上の外因性の核酸を好適な宿主細胞中へと導入するのに使用することができる。
【００７７】
「宿主細胞」は、興味対象の物質を内部に持っているか、または内部に持つことを可能とする、あらゆる細胞を指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、AAVヘルパーコンストラクト、AAVミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組み換えAAVの生産と関連付けられる他のトランスファーＤＮＡについての、レシピエントとして使用され得る。用語は、形質転換された起源細胞の子孫を含む。ゆえに、本明細書で使用される「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列で形質転換された細胞を指し得る。自然、偶発的または意図的変異に起因して、単一の親細胞の子孫は必ずしもその元の親と形態学的にまたはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において完全に同一でないこともあり得ることが理解される。
【００７８】
本明細書で使用される用語「細胞株」は、in vitroで継続的または長期的な増殖および分裂を可能とする細胞の集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローン集団である。かかるクローン集団の保管または移動の間に、核型において自然発生的なまたは誘導された変化が生じる可能性があることが、当該技術分野においてさらに知られている。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は祖先細胞または培養物と厳密に同一でないこともあり得、言及される細胞株には、かかるバリアントが含まれる。
【００７９】
本明細書で使用される用語「組み換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写または生物学的に活性なＲＮＡなどの核酸の生産に至らせるＤＮＡセグメントなどの、外来性ＤＮＡセグメントが導入された細胞を指す。
【００８０】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、適した制御エレメントと関連付けられたときに複製を可能とするものであり、遺伝子配列を細胞間で移動させることができるものである、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン、その他、などのあらゆる遺伝子エレメントを含む。ゆえに、当該用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写されるべき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置しているようなベクターであることが企図される。
【００８１】
「プロモーター」は、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列であって、遺伝子の個別具体的な転写を開始するのに要求されるものを指す。句「作動可能に位置している」、「制御下」または「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ核酸との関係において、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現のための正しい位置と向きにあることを意味する。
【００８２】
用語「発現ベクターまたはコンストラクト」は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることを可能とするものである、核酸を含有する遺伝的コンストラクトのあらゆるタイプを意味する。いくつかの態様において、発現は、例えば生物学的に活性なポリペプチド産物または機能的なＲＮＡ（例として、ガイドＲＮＡ）を転写された遺伝子から生成するための、核酸の転写を含む。本開示のrAAVを生産するために所望のAAVカプシド中に組み換えベクターをパッケージングするための前述の方法は、限定することを意味するものではなく、他の好適な方法は、熟練者にとって明白である。
【００８３】
目へのsFasL導入遺伝子のrAAV媒介送達
対象における眼（例として、光受容体、例えば桿体細胞または錐体細胞、網膜細胞、その他）組織へ導入遺伝子を送達するための方法が、本明細書において提供される。方法には、典型的には、対象において導入遺伝子（例として、sFasLタンパク質またはそのフラグメント）を発現させるための核酸を含むrAAVの有効量を、対象へ投与することが関与する。rAAVの「有効量」は、対象における標的組織の十分な数の細胞を感染させるのに十分な量である。いくつかの態様において、標的組織は、眼（例として、光受容体、網膜、その他）組織である。
【００８４】
rAAVの有効量は、対象における治療的有用性を有するのに、例として、対象において疾患の１つ以上の症状を改善するのに、例として、緑内障の症状を改善するのに、十分な量であり得る。緑内障の症状の例は、これに限定されるものではないが、周辺および／または中心視野における盲点、トンネル視、重度の頭痛、眼痛、嘔気嘔吐、視界のぼやけ、光の周りに輪が見えること、および目の赤みを含む。有効量は、例えば、対象の種、年齢、重量、健康状態、および標的とすべき眼組織などの様々な因子に依存し、ゆえに、対象および組織間で変動し得る。
【００８５】
有効量はまた、使用されるrAAVにも依存し得る。本発明は、その一部において、カプシドタンパク質を含むあるrAAVが、眼（例として、光受容体、網膜、その他）細胞の効率的な形質導入を媒介する、という認識に基づく。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法において使用されるrAAVは、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、およびAAVrh.43からなる群から選択されるAAV血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、rAAVは、AAV2血清型のカプシドタンパク質（配列番号１）を含む。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、AAV2カプシドタンパク質である。
【００８６】
ある態様において、rAAVの有効量は、ｋｇあたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ゲノムコピーである。ある態様において、rAAVの有効量は、対象あたり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ゲノムコピーである。
【００８７】
有効量は、投与方式にもまた依存し得る。例えば、基質内投与または皮下注射によって眼（例として、光受容体、網膜、その他）組織を標的とすることは、いくつかの場合においては、別の方法（例として、全身投与、局所投与）によって眼（例として、光受容体、網膜、その他）組織を標的とする場合とは、異なる（例として、より高いかまたはより低い）用量を要し得る。いくつかの態様において、ある血清型（例として、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、およびAAVrh.43）を有するrAAVの基質内注射（ＩＳ）は、眼（例として、角膜、光受容体、網膜、その他）細胞の効率的な形質導入を媒介する。ゆえに、いくつかの態様において、注射は、基質内注射（ＩＳ）である。いくつかの態様において、投与は、注射、任意には網膜下注射または硝子体内注射を介する。いくつかの態様において、注射は、局所投与（例として、目への局所投与）である。いくつかの場合において、rAAVの複数回用量が投与される。
【００８８】
いくつかの態様において、本明細書に記載されたrAAVによる眼（例として、光受容体、網膜、その他）細胞の効率的な形質導入は、緑内障（例として、開放隅角緑内障）を有する対象の処置のために有用であり得る。従って、緑内障を処置するための方法および組成物もまた、本明細書において提供される。いくつかの側面において、本開示は、緑内障（例として、開放隅角緑内障）を処置するための方法を提供し、方法は、rAAVの有効量を、緑内障を有するかまたは有する疑いがある対象へ投与することを含み、ここでrAAVは、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.39、およびAAVrh.43からなる群から選択される血清型を有するカプシドタンパク質、および、（ｉｉ）導入遺伝子（例として、本開示により記載されているとおりのsFasＬタンパク質またはそのフラグメントをコードする導入遺伝子）と作動可能に結びついているプロモーターを含む核酸を含む。
【００８９】
いくつかの態様において、本開示により記載されているとおりのrAAV（または単離された核酸）の投与は、網膜神経細胞の形質導入をもたらす。網膜神経細胞の例は、これに限定されるものではないが、双極細胞、神経節細胞、水平細胞、網膜アマクリン細胞、桿体細胞および錐体細胞を含む。
【００９０】
いくつかの態様において、本開示により記載されているとおりのrAAV（または単離された核酸）の投与は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入をもたらす。ＲＧＣの例は、これに限定されるものではないが、Ｗ−神経節細胞、Ｘ−神経節細胞、Ｙ−神経節細胞、ミゼット（midget）細胞、パラソル（parasol）細胞、重層状(bistratified）細胞、光感受性神経節細胞、および、眼球運動のために上丘へ投射する他の神経節細胞を含む。
【００９１】
網膜神経節細胞は、それらのサイズ、接続、および視覚刺激に対する応答の面で有意に変動するが、それらは全て、脳へと広がる長い軸索を有するという決定的な特性を共有している。これらの軸索は、視神経、視交叉および視索を形成する。いくつかの態様において、本開示により記載されているとおりのrAAV（または単離された核酸）の投与は、ＲＧＣ、軸索、またはそれらの組み合わせの、死滅を防止する。
【００９２】
rAAVsは、当該技術分野において知られているあらゆる方法に従って、組成物にて対象へ送達され得る。rAAVは、好ましくは生理学的に適合性の担体中に（すなわち、蘇生物中に）懸濁されており、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または非ヒト霊長類（例として、マカクザル）などの宿主動物へ投与され得る。いくつかの態様において、宿主動物は、ヒトを含まない。
【００９３】
哺乳動物対象へのrAAVの送達は、例えば、眼内注射または局所投与（例として、点眼剤）によるものであり得る。いくつかの態様において、眼内注射は、基質内注射、結膜下注射、または硝子体内注射である。いくつかの態様において、注射は、局所投与ではない。投与方法の組み合わせ（例として、局所投与および基質内注射）もまた、使用することができる。
【００９４】
本開示の組成物は、rAAVを単独で、または１つ以上の他のウイルス（例として、１つ以上の異なる導入遺伝子を有するコードする第２のrAAV）との組み合わせで含み得る。いくつかの態様において、組成物は、夫々が１つ以上の異なる導入遺伝子を有する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上の異なるrAAVを含む。
【００９５】
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。好適な担体は、当該技術分野における知識を有する者により、rAAVが向けられた適応を考慮して簡単に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、様々な緩衝液（例として、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化されていてもよい生理食塩水を含む。他の例示の担体は、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナツ油、ゴマ油、および水を含む。担体の選択は、本開示についての限定ではない。
【００９６】
任意に、本開示の組成物は、rAAVおよび担体（単数または複数）に加えて、保存剤または化学安定剤などの他の医薬成分を含有し得る。好適な例示の保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールを含む。好適な化学安定剤は、ゼラチン、およびアルブミンを含む。
【００９７】
rAAVは、所望の組織（例として、光受容体、網膜、その他の組織などの眼組織）の細胞を形質転換するのに、ならびに過度の悪影響なしに遺伝子導入および発現の十分なレベルを提供するのに十分な量で投与される。薬学的に許容し得る投与経路の例は、これに限定されるものではないが、選択された器官への直接送達(例として、目への網膜下送達)、経口、吸入（経鼻および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の非経口の投与経路を含む。投与経路は、所望に応じて組み合わせてもよい。
【００９８】
特定の「治療効果」を達成するのに要求されるrAAVビリオンの用量、例として、ゲノムコピー／キログラム体重あたり（ＧＣ／ｋｇ）での用量の単位は、以下を含むがこれに限定されない複数の因子に基づくこととなる：rAAVビリオン投与の経路、治療効果を達成するのに要求される遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、処置される個別具体的な疾患または障害、および遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性。当該技術分野における知識を有する者は、特定の疾患または障害を有する患者を処置するためのrAAVビリオンの用量範囲を、前述の因子ならびに他の因子に基づいて簡単に決定することができる。
【００９９】
rAAVの有効量は、動物を標的として感染させ、所望の組織を標的とするのに、十分な量であり得る。有効量は、一次的には、対象の種、年齢、重量、健康状態、および標的とすべき組織などの因子に依存し、ゆえに、動物および組織間で変動し得る。例えば、rAAVの有効量は、一般的に、約１０９〜１０１６ゲノムコピーを含有する溶液約１ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲にある。いくつかの場合において、約１０１１〜１０１３の間のrAAVゲノムコピーの投薬量が適切である。ある態様において、１０９rAAVゲノムコピーが、眼組織（例として、角膜組織）を標的とするのに有効である。いくつかの態様において、１０９rAAVゲノムコピーよりも高濃度の用量は、対象の目へ投与されたときに毒性である。いくつかの態様において、有効量は、rAAVの複数回用量によって生み出される。
【０１００】
いくつかの態様において、rAAVの用量は、１暦日（例として、２４時間の期間）あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、１暦週（例として、７暦日）あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、隔週（例として、２暦週の期間に１回）を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、１暦月（例として、３０暦日に１回）あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、６暦月あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、１暦年（例として、３６５日またはうるう年において３６６日）あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、２暦年（例として、７３０日またはうるう年において７３１日）あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。いくつかの態様において、rAAVの用量は、３暦年（例として、１０９５日またはうるう年において１０９６日）あたり１回を超えない範囲で対象へ投与される。
【０１０１】
いくつかの態様において、rAAV組成物は、組成物中におけるAAV粒子の凝集を、特に、高いrAAV濃度（例として、約１０１３ＧＣ／ｍｌまたはそれ以上）が存在する場合に、低減させるように製剤化される。その凝集を低減させるための適切な方法、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整、その他（例として、Wright FR, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178を参照、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。）を含む、が使用され得る。
【０１０２】
薬学的に許容し得る賦形剤および担体溶液の製剤化は、様々な処置レジメンにて本明細書に記載された特定の組成物を使用するための好適な用量および処置レジメンの開発がそうであるように、当該技術分野における知識を有する者に周知である。活性成分（単数または複数）のパーセンテージはもちろん変動してもよく、便宜的に、全製剤の重量または体積の約１または２％と約７０％または８０％またはそれ以上との間であってもよいが、典型的には、これらの製剤は、少なくとも活性化合物の約０．１％またはそれ以上を含有し得る。当然のことながら、各々の治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、化合物のあらゆる所与の単位用量で好適な投薬量が得られるように調製され得る。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品有効期間、ならびに他の薬理学的な検討事項などの因子が、かかる医薬製剤を調製する技術の当業者によって企図されることになり、またそれゆえに、様々な投薬量および処置レジメンが望ましいとされ得る。
【０１０３】
いくつかの態様において、本明細書に開示された好適に製剤化された医薬組成物中のrAAVは、標的組織に直接的に、例として、眼組織（例として、光受容体、網膜、その他の組織）へ直接、送達される。しかしながら、ある状況においては、これとは別にまたは加えて、rAAVベースの治療用コンストラクトを、別の経路を介して、例として、皮下で、膵臓内で、経鼻で、非経口で、静脈内で、筋肉内で、髄腔内で、または経口で、腹腔内で、または吸入により、送達することが望ましいとされ得る。いくつかの態様において、米国特許第5,543,158号；第5,641,515号および第5,399,363号（夫々具体的にその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたとおりの投与のあり方が、rAAVを送達するのに使用され得る。いくつかの態様において、好ましい投与方式は、硝子体内注射または網膜下注射によるものである。
【０１０４】
注射可能な使用に好適な医薬形態は、滅菌された注射可能な溶液または分散液の即時調製のための、滅菌された水溶液または分散液および滅菌された粉末を含む。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中において、および油中において、調製されてもよい。通常の保管および使用の条件下にて、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。数多くの場合において、形態は、滅菌であり、容易な注射針通過性が存在する程度に流体である。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、および、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。
【０１０５】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合においては要求される粒子サイズの維持により、および、界面活性剤の使用により維持され得る。種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって、微生物の作用の防止を引き起こすことができる。数多くの場合において、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる剤、例えば、モノアステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの、組成物中における使用により、注射可能な組成物の長期的な吸収を引き起こすことができる。
【０１０６】
注射可能な水溶液の投与のために、例えば、溶液は、必要であれば好適に緩衝化されてもよく、液体の希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースで最初に等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のためにとりわけ好適である。これに関連して、好適な滅菌された水媒体が採用され得る。例えば、一投薬量が、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液中に溶解され、これは１０００ｍｌの皮下注入用の流体に添加されてもよいし、または提案される注入部位に注射されてもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第１５版、頁1035-1038および1570-1580を参照）。投薬量におけるいくらかの変動は、宿主の状態に応じて、必然的に生じることとなる。投与に対して責任を持つ者は、いかなる場合にも、個々の宿主にとって適切な用量を決定するものとする。
【０１０７】
滅菌された注射可能な溶液は、要求される量の活性なrAAVを、要求に応じて本明細書中に列挙された他の成分の種々のものとともに、適切な溶媒中に組み込み、濾過滅菌がこれに続くことによって、調製される。一般的に、分散液は、基礎的な分散媒および上記に列挙されたものからの要求される他の成分を含有する滅菌されたビヒクル中に種々の滅菌された有効成分を組み込むことにより調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合においては、好ましい調製の方法は、活性成分の粉末に既に滅菌濾過された溶液からのあらゆる追加の所望の成分が加わったものを産み出す、真空乾燥および凍結乾燥法である。
【０１０８】
本明細書に開示されたrAAV組成物はまた、中性または塩形態にて製剤化されてもよい。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成された）、および、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸とともに形成されたものを含む。遊離カルボキシル基とともに形成された塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等、に由来するものとすることもできる。製剤化されると、溶液は、投薬製剤と適合可能な様式にて、治療的に有効であるような量で投与されることとなる。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセル等のような様々な投薬形態にて、容易に投与される。
【０１０９】
本明細書で使用される「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使用は、当該技術分野において周知である。補助的な活性成分もまた、組成物中へと組み込むことができる。句「薬学的に許容し得る」は、宿主へ投与されたときにアレルギーまたはこれに類似する有害反応を生み出さない分子実体および組成物を指す。
【０１１０】
送達ビヒクル、例えばリポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、ベシクル等が、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用され得る。特に、rAAVベクターによって送達される導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、またはナノ粒子等のいずれにカプセル化されて送達のために製剤化されてもよい。
【０１１１】
かかる製剤は、本明細書に記載された核酸またはrAAVコンストラクトの薬学的に許容し得る製剤の導入のために、好ましいとされ得る。リポソームの形成および使用は、当該技術分野における知識を有する者に一般的に知られている。最近、改善された血清安定性および循環半減時間を有するリポソームが開発された（米国特許第5,741,516号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号および第5,795,587号）。
【０１１２】
リポソームは、普通は他の手順による形質転換に抵抗性であるような数々の細胞型とともに、首尾よく使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的であるＤＮＡ長の制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを様々な培養された細胞株および動物へ導入するのに効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介薬物送達の有効性を検査した、数件の成功した臨床試験が完了している。
【０１１３】
リポソームは、水媒体中に分散されたリン脂質から形成され、自然に多重膜同心二層ベシクル（多重膜ベシクル（ＭＬＶ）ともまた呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍから４μｍまでの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コアの中に水溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小さな一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０１１４】
代替的に、rAAVのナノカプセル製剤を使用してもよい。ナノカプセルは、一般的に、物質を安定かつ再現性のあるやり方で封入することができる。細胞内ポリマー過負荷（intracellular polymeric overloading）に起因する副作用を避けるために、in vivoで分解されることが可能であるポリマーを使用して、かかる超微細粒子(およそ0.1μｍのサイズである)を設計すべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリラートナノ粒子が、使用に企図される。
【０１１５】
キットおよび関連する組成物
本明細書に記載された剤は、いくつかの態様において、治療の、診断のまたは調査の用途におけるそれらの使用を容易化するための、医薬または診断または調査キットにまとめられてもよい。キットはまた、本開示の構成成分および使用説明書を収容する１つ以上の容器を含んでもよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載された１つ以上の剤を、これらの剤の意図する適用および適した使用を説明した指示と一緒に含み得る。ある態様において、キットにおける剤は、特定の適用に、および剤の投与の方法に好適な医薬製剤および投薬量であり得る。調査目的のためのキットは、種々の実験を実行するのに適切な濃度または分量で構成成分を含有し得る。
【０１１６】
いくつかの態様において、本開示は、rAAVを生産するためのキットに関し、キットは、配列番号３に規定されたアミノ酸配列を有するsFasLタンパク質またはそのフラグメントをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を収容する容器を含む。いくつかの態様において、キットは、AAVカプシドタンパク質、例えばAAV2カプシドタンパク質（例として、配列番号１）、をコードする単離された核酸を収容する容器をさらに含む。
【０１１７】
キットは、研究者らによって本明細書に記載された方法の使用を容易化するように設計されてもよく、多数の形態を取ることができる。キットの組成物の各々は、適用可能な場合、液体形態（例として、溶液中）にて、または個体形態（例として、乾燥粉末）にて提供されてもよい。ある場合において、組成物のいくつかは、例えば、キットとともに提供されてもされなくてもよい好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加により、構成可能（constitutable）または別様に処理可能（例として、活性型へと）であってもよい。
【０１１８】
本明細書で使用される「指示」は、指示および／または販売促進の構成成分を定義することができ、典型的には、本開示のパッケージ上にまたはこれと関連付けられて書かれた指示書が関与する。指示は、その指示がキットと関連すべきであることをユーザーが明確に認識することとなるような、あらゆる様式にて提供される、あらゆる口頭または電子的指示、例えば、オーディオビジュアル（例として、ビデオテープ、ＤＶＤ、その他）、インターネット、および／またはウェブに基づいた通信、その他をもまた含むことができる。指示書は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって定められた形であり得、これらの指示はまた、動物投与のための製造、使用または販売についての当局による承認を反映するものとすることもできる。
【０１１９】
キットは、本明細書に記載された構成成分のいずれか１つ以上を、１つ以上の容器中に、含有し得る。例として、一態様において、キットは、キットの１つ以上の構成成分を混合するための、および／または、試料を単離および混合して対象に適用するための、指示を含み得る。キットは、本明細書に記載された剤を収容する容器を含み得る。剤は、液体、ゲルまたは固体（粉末）の形態であり得る。剤は、無菌的に調製され、シリンジ中にパッケージングされて冷蔵で出荷されてもよい。代替的に、それは保管のためにバイアルまたは他の容器中に収容されてもよい。第２の容器は、無菌的に調製された他の剤を有してもよい。代替的に、キットは、あらかじめ混合されてシリンジ、バイアル、チューブ、または他の容器中にて出荷される活性薬剤を含んでもよい。
【０１２０】
本発明の例示態様を、以下の例により、より詳細に記載する。これらの態様は、本発明について例示的であり、当業者はこれらが例示態様に限定されないことを認識する。
【０１２１】
例
例１：mFasLの高いレベルはFas媒介アポトーシス性および非アポトーシス性炎症経路の活性化と符合する
材料および方法
動物
全ての動物実験は、Schepens Eye Research Instituteでの動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）により承認されており、Association of Research in Vision and Ophthalmology（Rockville, MD）のガイドライン下において行われた。DBA/2J-Gpnmb+/SjJマウス（D2-Gp）を購入した。ΔCSファウンダーマウスをJackson Laboratoriesから購入したDBA/2Jマウスに、１０世代交配していくことによって、ΔCS突然変異を発現するDBA/2Jマウスを作り出した。１０世代の後、ΔCS突然変異についてヘテロ接合のD2.ΔCSマウスを交雑させて、ΔCS突然変異（D2.ΔCS）マウスについてホモ接合のD2.ΔCSとそのＷＴの同腹子（D2）を作り出した。全３つの遺伝型（D2、D2.ΔCS、およびD2.Gp）を収容し、Schepens Eye Research Instituteにおける、AAALACに承認された動物施設中で、周期的な光（12L-30 lux:12D）条件下に維持した。
【０１２２】
ＩＯＰ測定
ＩＯＰを、反跳式眼圧計（Colonial Medical Supply, Espoo, Finland）によって測定した。マウスを、精密気化器によって送達される１００％酸素中の３％イソフルラン（誘導）とこれに続く１００％酸素中の１．５％イソフルラン（維持）によって麻酔した。動物がトーピンチ反射またはテールピンチ応答を無くしてから２〜３分以内に、ＩＯＰ測定を開始した。麻酔マウスをプラットホーム上に置き、圧力センサの先端を角膜中央からおよそ１／８に置いた。平均ＩＯＰは、６回の測定後、最高値および最低値の消去の後で自動表示された。この機械的に生成された平均が、１つの読み取り値とみなされ、６つの読み取り値が、各々の目に対して得られた。D2-Gp、D2、およびD2.ΔCSマウスについて、ＩＯＰを１か月に１回測定した。マイクロビーズでの研究については、ベースラインのＩＯＰをマイクロビーズ注射の１日前に得て、ＩＯＰを次に、マイクロビーズ注射後３日毎に測定した。１日の全体にわたるＩＯＰの変動ゆえ、全てのＩＯＰを、１日の同じ時刻（１０：００と１２：００の間の時間）に取った。
【０１２３】
網膜神経節細胞の定量化
神経網膜を単離し、室温で２時間、４％パラホルムアルデヒド中で固定した。網膜フラットマウントを、ＲＧＣ特異的マーカーに対する一次抗体およびβ−IIIチューブリン（Millipore,Billerica, MA）とともに、４℃で終夜、インキュベートした。Alexa Fluor 594コンジュゲート二次抗体（Invitrogen）を二次抗体として使用した。核を、DAPIで対比染色した。６０×油浸レンズを使用して、各々の象限内に４、５の画像を有する１６の非重複の画像を取った。神経節細胞層中における、β−IIIチューブリン抗体により陽性に標識された全ての細胞を数えた。各視網膜面積をImage J ソフトウェアで測定し、ＲＧＣ密度／ｍｍ２網膜を算出した。
【０１２４】
視神経軸索の定量化
軸索の定量化のために、視神経を解剖し、Karnovsky試薬（リン酸緩衝液中５０％）中で終夜固定した。球の１．０ｍｍ後方で取られた神経の半薄断面を解剖し、Karnovsky液（リン酸緩衝液中５０％）中で終夜固定した。光学顕微鏡法による査定のために、極薄（６０−９０ｎｍ）の視神経断面を調製し、１％ｐ−フェニレンジアミン（ＰＰＤ）で染色した。視神経断面の全領域をカバーする１０の非重複の顕微鏡写真を倍率１００×で取った。各視神経断面の総面積をImage J ソフトウェアで決定し、この値を、視神経断面あたりの総軸索密度を推定するのに使用した。
【０１２５】
TUNEL染色
アポトーシスを起こした細胞を、TUNEL染色によって査定した。目を摘出し、１０％ホルマリン中で固定した。目を処理して、スライド上に載せた２０μｍパラフィン切片を染色のために使用した。製造者のプロトコルに従って（In Situ Cell Death Detection Kit; Roche Applied Science, Mannheim Germany, 11684795910）、TUNELのために染色する前に、切片を脱パラフィン化した。切片を、VECTARSHIELD Mounting Medium with DAPI（Vector Laboratories, H-1200）を使用して取り付けた。切片を洗浄し、カバースリップで覆い、共焦点レーザー操作顕微鏡（Leica Microsystems、およびSP6ソフトウェアを使用して処理した）によって検査した。
【０１２６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
安楽死の時点で、麻酔マウスを、左心室を通して１０ｍｌの１×ＰＢＳでかん流した。かん流に続いて、目を摘出し、製造者のプロトコルに従ってQiagen RNeasy mini kit（Cat # 74104）を使用して神経網膜からＲＮＡを単離した。ゲノムDNAのコンタミネーションがないことを確実にするために、ＲＮＡをDNAse（Cat # AM222, Invitrogen）で処置した。ＲＮＡの５００ｎｇを使用し、Bio-RadからのiScript ｃＤＮＡ合成キット（Cat # 170-8890）を使用して、製造者のプロトコルに従ってｃＤＮＡを調製した。一本鎖ＲＮＡが存在しないことを確実にするために、ｃＤＮＡをRNaseH（18021-014, Invitrogen）で処置した。Invitrogenからのマスターミックス（Cat # 4472903）を使用して、製造者のプロトコルを使用して総体積１０μｌでデュプリケートにて、定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子β-actinに対する相対発現を、以下の式を使用して数値化した：
相対発現＝１０，０００×１／２＾（平均 遺伝子cT − 平均 β-actin cT）。
使用した全てのプライマーは、表１に列記されている。
【０１２７】
表１．リアルタイムPCRのために使用したＲＮＡプライマーの一覧。
【表１】
2019520405.tif 000003
【０１２８】
ウェスタンブロット分析
D2、D2.Gp、およびD2.ΔCSマウスの後部セグメントにおける総FasL発現を評価するために、タンパク質ライセート（２０μｇ／試料）を後眼杯（神経網膜、脈絡膜、および強膜）から調製した。AAV2処置された目の神経網膜におけるsFasLの過剰発現を評価するために、タンパク質ライセート（５μｇ／試料）を神経網膜のみから調製した。タンパク質を１２％トリス−グリシンゲル（Invitrogen, Carlsbad CA）上で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Invitrogen, Carlsbad CA）へと移動させた。抗Fasリガンドウサギポリクローナル抗体とこれに続くIRDye二次抗体（Li-Cor Biotechnology, Lincoln NE）を使用して、膜をFasリガンドについて探査した。均等なローディングを評価するために、マウスβアクチンを使用した。各ブロットを、LI-COR Odysseyイメージングシステム（LI-COR Biotechnology, Lincoln NE）を使用して確立した。Image Studio softwareを使用してデンシトメトリーを行った。sFasLまたはmFasLを過剰発現するL5178Y-R腫瘍形質転換体を陽性対照として使用し、FasL-KOマウスから調製された後眼杯から調製したタンパク質ライセートを陰性対照として使用した。
【０１２９】
統計
全てのデータは、平均±ＳＥＭとして提示されている。Graph pad prism 6（La Jolla, CA, USA）。比較のために２元配置ANOVA、１元配置ANOVAおよびTukeyの多重比較検定をD2-AAV2.eGFPおよびD2-AAV2.sFasLについて使用し、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのモデルについてはSidakの多重比較検定とした。０．０５未満のＰ値を、有意であるとみなした。
【０１３０】
結果
D2.ΔCSマウスにおける加速された緑内障
DBA/2J（D2）マウスは、虹彩実質萎縮および色素散乱を夫々誘発するGpnmbおよびTyrp1遺伝子における突然変異に起因して、加齢に伴う上昇した眼圧（ＩＯＰ）を自然に発症する。結果として、D2マウスは、月齢およそ６〜８か月までに上昇したＩＯＰを発症し、ＲＧＣおよび神経線維の喪失がこれに続く。膜型のFasLのみを発現するDBA/2Jマウス（D2.ΔCS）は、月齢５か月で、ＷＴ FasLを発現したD2マウスにおいて見られなかった顕著な神経線維層の薄化を見せたことが実証された。経線維層の早期の薄化は、緑内障の発症が加速されたことを示唆する。
【０１３１】
D2.ΔCSマウスにおける加速された緑内障の発症を実証するために、若齢および高齢のD2.ΔCSマウスにおける疾患の進行を、WT FasLを発現するD2の同腹子（陽性対照）、および、正常Gpnmb遺伝子（D2-Gp）を発現し、Tyrp1突然変異に起因する極めて軽症型の虹彩疾患を発症するが、上昇した眼圧（ＩＯＰ）または緑内障を発症しない、DBA/2Jコンジェニックマウス（陰性対照）と比較した。月齢３、６および９か月で反跳式眼圧計を使用してＩＯＰを測定した（図１Ａ）。D2およびD2.ΔCSマウスは、陰性対照D2.Gpマウスと比較して、月齢６か月にて始まる上昇したＩＯＰを見せた。しかしながら、いずれの年齢でも、D2とD2.ΔCSマウスの間でＩＯＰの有意な差はなく、ΔCS突然変異がＩＯＰに対して影響を及ぼさないことを暗示する。
【０１３２】
ＲＧＣおよび／または軸索の喪失がD2.ΔCSマウスにおいて加速されたかどうかを決定するために、マウスの群を、月齢３および６か月で麻酔し、網膜フラットマウントをＲＧＣ特異的マーカーβ−IIIチューブリンで染色してＲＧＣ密度を評価し、視神経切片をパラフェニレンジアミン（ＰＰＤ）で染色して軸索密度を評価した。D2マウスにおけるＲＧＣおよび軸索の喪失は、加齢に伴うものであり、月齢８か月を超えているマウスにおいてのみ発症する。したがって、月齢３および６か月では、D2は、D2.Gpマウスと比較して、ＲＧＣ（図１Ｂ−１Ｃ）または軸索（図１Ｄ−１Ｅ）の有意な喪失を見せなかった。対照的に、D2.ΔCSマウスは、ＲＧＣ（図１Ｂ−１Ｃ）および軸索（図１Ｄ−１Ｅ）の早期の喪失を６か月で発症しており、D2.ΔCSマウスにおける切断不可能なFasLの発現が、加速された緑内障の発症をもたらすということを示唆する。
【０１３３】
D2.ΔCSマウスにおける加速されたＲＧＣの死滅がアポトーシスに起因していたということを実証するために、月齢３および６か月のD2、D2.ΔCS、およびD2.Gpマウスからの網膜切片に対してTUNEL染色を行った。D2およびD2.Gpマウスと比較して、D2.ΔCSのＲＧＣ層において、月齢３か月（図２Ａ−２Ｂ）および月齢６か月（図２Ｃ−２Ｄ）の両方で、TUNEL＋細胞が検出された。しかも、月齢６か月では、D2.ΔCSマウスにおいて検出されたTUNEL陽性細胞は、もはやＲＧＣ層に限られなかった（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、D2.ΔCSマウスが、加速された緑内障の発症をもたらすアポトーシスを介した早期のＲＧＣの死滅および軸索の喪失を見せることを暗示する。
【０１３４】
D2.ΔCSマウスにおけるFas、FasLおよびFADDの発現
D2およびD2.ΔCSマウスにおけるFas誘導性アポトーシス経路の構成成分に対する上昇したＩＯＰの影響を決定するために、網膜をFas、FasL、およびFADDのｍＲＮＡレベルについての定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析し、ウェスタンブロットを使用してmFasLおよびsFasLの相対発現を決定した。
【０１３５】
D2、D2.ΔCS、またはD2.Gpマウスにおいて、月齢３または６か月のいずれでも、Fas ｍＲＮＡ発現における有意な差はなかった（図３Ａ）。対照的に、6か月齢のD2.ΔCSマウスは、Fas誘導性アポトーシスの外因性経路のメディエーターFasLおよびFADDについて、ｍＲＮＡにおける有意な増加を見せた（図３Ｂ−３Ｃ）。月齢６か月のD2.ΔCSマウスにおいてsFasL発現が検出不可能であった一方でmFasL発現が検出されたことから（図３Ｄ−３Ｆ）、FasLの増加は、増加したmFasLの発現に起因していた。FasLの検出不可能な発現は、D2.ΔCSマウスにおけるFasL切断部位のノック・イン変異が網膜内におけるsFasLの発現を防止することと一貫している。さらに、この実験は、FasLについてのＷＴアレルを保有していたマウス（D2.GpおよびD2マウス）において、sFasLが、網膜中で発現したFasLの優勢型であるということを明らかにしており、目の中では、恒常性条件下において、大部分のFasLが可溶型に切断されているということを示唆する。
【０１３６】
以上をまとめると、これらのデータは、６か月のD2.ΔCSマウスにおいて観察された加速されたＲＧＣの喪失が、増加したmFasLの発現およびFas誘導性アポトーシスの外因性経路のメディエーターの誘導と符合するということを実証する。
【０１３７】
D2.ΔCSマウスにおけるミュラー細胞活性化
全ての網膜層に広がるミュラー細胞は、網膜の主要なグリア細胞を構成し、網膜神経細胞への支持を提供する。正常な網膜においては、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）が、神経線維層中で星状膠細胞およびミュラー細胞の終足によって発現する。しかしながら、緑内障においては、反応性神経膠症の結果としてミュラー細胞中でGFAP発現が有意に増加しており、これは神経炎症の指標とみなされる。
【０１３８】
D2.ΔCSマウスにおける加速された緑内障の発症が、プロ炎症性ミュラー細胞の早期の活性化と符合するかどうかを決定するために、D2、D2.ΔCS、およびD2.Gpマウスにおいて月齢３および６か月で、ＲＴ−ＰＣＲ、および、抗GFAP抗体を使用した免疫組織化学的染色により、網膜におけるGFAP発現を測定した。月齢３か月では、３つのマウスの群の全てにおいてGFAP発現が神経線維層中の星状膠細胞およびミュラー細胞終足に限られており、D2、D2.ΔCS、およびD2.Gpマウスの間でGFAPの発現に有意な差がなかった（図４Ａ−４Ｂ）。しかしながら、月齢６か月までには、D2.ΔCSマウスにおけるGFAPの発現はもはや神経線維層中の星状膠細胞およびミュラー終足に限定されず、網膜ミュラー細胞全長の全体にわたって広がっており、これは、D2およびD2.Gpマウスと比較したGFAP ｍＲＮＡレベルの有意な増加と符合した（図４Ａ−４Ｂ）。GFAPの増加は、D2.ΔCSマウスにおけるD2およびD2.Gpマウスと比較したTNFα ｍＲＮＡレベルの有意な増加と符合した（図４Ｃ）。
【０１３９】
TNFαは、緑内障における活性化されたグリア細胞により生産され、グリアの活性化、炎症、およびＲＧＣ死滅の媒介に結び付けられる。これらのデータは、mFasLの高いレベルを発現するD2.ΔCSマウスにおける加速されたＲＧＣの喪失が、ＲＧＣのアポトーシスの誘導とだけでなく、グリアの活性化およびTNFαの誘導とも符合するということを暗示する。したがって、D2.ΔCSマウスにおけるmFasLの高いレベルは、Fas媒介アポトーシス性および非アポトーシス性炎症経路の活性化と符合する。
【０１４０】
例２：sFasLの送達は緑内障のマウスモデルにおいて治療効果を提供する
材料および方法
ウイルスベクター構築
アデノ随伴ベクターscAAV2-CB6-PI-eGFPおよびscAAV2-CB6-PI-sFasLectoを調製した。scAAV2-CB6-PI-sFasLectoベクターは、配列番号５に規定されたとおりの核酸配列を有する。シードプラスミドpAAVsc CB6 PI sFasLectoを、pcDNA3-sFasL-ecto plus ５’mGCSFからのsFasL ecto ５’GCSFの全ｃＤＮＡ配列に対応する５８２ｂｐのフラグメントを単離することにより作った。５８２ｂｐのフラグメントを、BamHI、HindIIIでダブルダイジェストされてAntarctic phosphatase処置されたpAAVsc-CB6-PIプラスミドにライゲーションした（T4リガーゼ NEB #M0202）。
【０１４１】
ライゲーション用混合物のアリコートでE.coliコンピテント細胞を形質転換し、ＬＢ寒天に５０μｇ／ｍｌカルベニシリンが加わったものの上からプレートした。コロニーを採り、ＬＢ−カルベニシリン媒体上で増殖させ、プラスミドのミニプレップを制限酵素およびシーケンシングにより確認した。大量のプラスミドを、１リットルの細菌培養物から調製し、ZR Plamid gigaprep kit （#D4056, Zymo Research, Irvine CA）を使用して単離した。
【０１４２】
硝子体内注射
縁に平行な結膜血管のすぐ後方に、硝子体内注射を行った。マウスに、両目の中への、AAV2CB6.sFasL（３×１０９ＰＦＵ／ｍｌ）またはAAV2CB6.eGFP（３×１０９ＰＦＵ／ｍｌ）を含有する１μｌの硝子体内注射を受けさせ、滅菌された生理食塩水をビヒクル対照として使用した。
【０１４３】
結果
AAV2を使用したsFasLの硝子体内送達
本明細書において示されるとおり、FasLの膜結合型の形態は、アポトーシスの誘導および炎症性サイトカインの生産の両方の原因となる。したがって、D2-ΔCSマウスにおける悪化した緑内障の発症は、増加した未切断のmFasLの発現によって容易に説明される。しかしながら、sFasLは、mFasLアンタゴニストとしての役割を果たし、および実際にFasL誘導性の炎症を阻止することが示された。
【０１４４】
sFasLが、緑内障におけるmFasLの効果をもまた阻止できたかどうかを決定するために、アデノ随伴ウイルス血清型２（AAV2）ベクターを使用して、単回の硝子体内注射を介してD2マウスのＲＧＣへsFasLを送達した。マウスにおけるAAV2ベクターの硝子体内投与は、長寿命の、ＲＧＣおよび内顆粒層の細胞の形質導入を一次的にもたらすということが実証された。結果として、AAV2を使用した遺伝子送達は、長期の持続的な発現を提供することができる。
【０１４５】
いずれの網膜細胞がAAV2により形質導入されたか査定するために、eGFPのみを発現するAAV2ベクター（AAV.eGFP）を２か月齢のマウスに硝子体内注射した。共焦点顕微鏡法を使用して、注射２週間後の網膜全載におけるeGFP発現を評価し、網膜全体にわたって均一なeGFP分布を示した（図５Ａ）。網膜の断面再構成は、神経節細胞層および内顆粒層の全体にわたって強いeGFP発現を示した（図５Ｂ）。
【０１４６】
D2マウスに、類似のAAV2.sFasLの注射を受けさせ、神経網膜中におけるsFasLのウェスタンブロット分析は、AAV2.eGFPで処置されたD2マウスまたは未注射対照マウスのいずれとも比較して、注射２週間後の早さでsFasL発現の有意な増加を示した（図５Ｃ）。しかも、網膜中におけるsFasLの増加は、単回注射に続いて研究期間全体（８か月）にわたって一貫したレベルで持続した。毎月のＩＯＰのモニタリングは、D2-未注射対照マウスとAAV2.eGFPまたはAAV2.sFasLのいずれかの処置を受けたD2マウスとの間で、いずれの年齢においても、ＩＯＰのレベルに有意差がないことを明らかにした（図５Ｄ）。さらに、月齢９か月で取られた代表的なスリットランプ画像は、D2-未注射対照マウスとAAV2.eGFPまたはAAV2.sFasLのいずれかの処置を受けたD2マウスとの間で、虹彩色素散乱または虹彩萎縮のいずれの重症度における違いも示さなかった（図５Ｄ）。
【０１４７】
以上をまとめると、これらの結果は、D2マウスへのAAV2.sFasLの単回の硝子体内注射が、sFasLの高いレベルの長期の安定的な発現を内網膜内において生み出し、虹彩色素散乱、虹彩萎縮、および上昇したＩＯＰの発症に何ら影響を有しないということを実証した。
【０１４８】
AAV2.sFasLの硝子体内送達はD2マウスにおいてＲＧＣおよび軸索の喪失を防止する
sFasLの過剰発現がD2マウスにおけるＲＧＣおよび軸索の喪失を防止するかどうかを決定するために、マウスに月齢２か月でAAV2.sFasLの硝子体内注射を受けさせ、８か月後に月齢１０か月で安楽死させた。β−IIIチューブリンで染色された網膜全載においてＲＧＣ密度を測定し、視神経切片において軸索密度を測定した。緑内障を発症するD2-未注射マウスおよびD2 AAV2.eGFPマウスでは、D2.Gp陰性対照マウスと比較すると、ＲＧＣおよび軸索密度の両方の有意な減少があった（図６Ａ−６Ｂ）。対照的に、AAV2.sFasLで処置されたD2マウスは、ＲＧＣまたは軸索密度のいずれにおいても、緑内障を発症しないD2.Gp対照マウスと比較して有意な喪失を見せなかった（図６Ａ）。これらのデータは、上昇したＩＯＰが存在してさえも、網膜におけるsFasLの過剰発現が、D2マウスにおける緑内障の発症およびＲＧＣおよび軸索の喪失を防止したということを実証する。
【０１４９】
sFasLはD2マウスにおいてプロ炎症性ミュラー細胞の活性化を防止する
本明細書において示されるとおり、緑内障におけるＲＧＣの喪失は、GFAPを発現するプロ炎症性ミュラー細胞の活性化、およびTNFαの誘導と符合する。AAV2.sFasL処置されたD2マウスにおいて緑内障が存在しないことが、低減されたミュラー細胞活性化と符合したかどうかを決定するために、ミュラー細胞におけるGFAP発現を免疫組織化学的染色により決定し、および、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、１０か月齢のD2-未処置、D2.AAV2.eGFP、D2.AAV2.sFasL、およびD2.Gpマウスの神経網膜におけるGFAPおよびTNFα ｍＲＮＡ発現を測定した。
【０１５０】
本明細書において示されるとおり、緑内障を発症するD2-未処置およびD2.AAV2.eGFPマウスは、共焦点像に見られるとおりGFAPの高いレベルを発現する活性化したプロ炎症性ミュラー細胞を見せ（図４Ｄ）、ＲＴ−ＰＣＲは、TNFα ｍＲＮＡ発現の有意な増加を明らかにした（図４Ｅ−４Ｆ）。対照的に、緑内障を発症しないD2.AAV2.sFasLマウスにおいては、ミュラー細胞は有意に少ないGFAPを発現し、TNFα ｍＲＮＡレベルは、D2.Gp正常対照マウスにおいて見られたものと同等であった（図４Ｄ−４Ｆ）。これらのデータは、D2.AAV2.sFasLマウスにおいて、ＲＧＣおよび軸索のsFasL媒介性保護は、プロ炎症性ミュラー細胞の活性化が防止されることと符合するということを暗示する。
【０１５１】
sFasLはD2マウスにおいてアポトーシス遺伝子のアップレギュレーションおよびプロ生存遺伝子（pro-survival genes）のダウンレギュレーションを防止する
緑内障においては、アポトーシスの外因性および内因性の両経路が、ＲＧＣアポトーシスのメディエーターとして同定されている。sFasLでの処置がアポトーシスの外因性および内因性の両経路の活性化を阻害したかどうかを決定するために、月齢１０か月のD2、D2.Gp、D2-AAV2.eGFP、およびD2-AAV2.sFasLマウスからの網膜組織についてｑＲＴ−ＰＣＲを行い、外因性および内因性経路の両方におけるアポトーシス遺伝子およびプロ生存遺伝子の発現を評価した。月齢１０か月で、プロアポトーシスメディエーターFas、FADD、およびBAXが、D2およびD2-AAV2.eGFPマウスにおいて上昇した（図７Ａ）。しかしながら、AAV2.sFasLでの処置は、これらの遺伝子のアップレギュレーションを防止しており、D2-AAV2.sFasLマウスにおけるFas、FADD、およびBAXのｍＲＮＡレベルは、D2.Gp対照マウスにおいて検出されたレベルと等しかった（図７Ａ）。
【０１５２】
同様に、プロ生存遺伝子cFLIP、BCL2、およびcIAP-2のレベル（図７Ｂ）は、D2およびD2 AAV2.eGFPマウスにおいてダウンレギュレーションされており、AV2.sFasLでの処置は、これらの遺伝子のダウンレギュレーションを防止しており、D2-AAV2.sFasLマウスにおけるcFLIP、Bcl2、およびcIAP2のｍＲＮＡレベルは、D2.Gp対照マウスにおいて検出されたレベルと等しかった。これらの結果は、上昇したＩＯＰが存在してさえも、sFasLの存在が、プロ生存遺伝子のFasL媒介性ダウンレギュレーションおよびアポトーシス遺伝子のFasL媒介性アップレギュレーションを阻止するということを実証する。
【０１５３】
例３：sFasL処置がＲＧＣ損傷の痕跡の後に投与されたときに治療効果を提供する
本明細書において提供されるデータは、D2マウスのAAV2.sFasLでの処置が、未処置およびAAV2.eGFP対照群と比較すると、ＲＣＧおよびそれらの軸索に対する有意な保護を提供したということを暗示する（図６Ａ−６Ｂ）。しかしながら、これらのマウスは、月齢１０か月までしか追わなかった。
【０１５４】
AAV2.sFasL処置がＲＧＣおよび軸索の死滅をただ遅延させるだけではなく長期保護を提供するということを実証するために、マウスの群を月齢１５ヶ月まで追った。ＲＧＣおよび軸索の定量化は、D2-未注射マウスおよびAAV2.eGFPマウスと比較すると、AAV2.sFasL処置されたD2マウスは、月齢１５ヶ月でさえも、ＲＧＣおよび軸索の有意な保護を見せ続けたことを明らかにした（図８Ａ−８Ｂ）。これらのデータは、上昇したＩＯＰが存在してさえも、前緑内障のD2マウスのAAV2.sFasLでの処置が、完全で持続するＲＧＣおよび軸索の保護をもたらすということを実証する。
【０１５５】
しかしながら、より臨床的に意義のある疑問は、AAV2.sFasL処置は、ＲＧＣ損傷が検出された後で与えられたときに、有意な保護を提供することができるかどうかである。D2マウスにおいては、月齢６か月の早さでＲＧＣアポトーシスの痕跡が報告されており、これは、本明細書において報告されたTUNEL染色と合致している（図２Ａ−２Ｄ）。したがって、７か月齢のD2マウスをAAV2.sFasLまたは陰性対照としてのAAV2.eGFPで処置し、マウスを、月齢１５か月まで追った。月齢１５か月でのＲＧＣおよび軸索の定量化は、未処置およびAAV2.eGFP対照群と比較すると、ＲＧＣおよび軸索の両方の有意な保存を明らかにした（図８Ｃ−８Ｄ）。
【０１５６】
これらのデータは、神経網膜におけるsFasLの過剰発現は、ＲＧＣ損傷の痕跡の後に投与されたときでさえも、D2マウスにおけるＲＧＣおよび軸索の両方に対する有意かつ長期の保護を提供するということを実証する。
【０１５７】
例４：sFasL処置は、マイクロビーズに誘導された緑内障のモデルにおいて治療効果を提供する。
材料および方法
上昇したＩＯＰの誘導
マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ；Ketaset; Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA）およびキシラジン（９ｍｇ／ｋｇ；TranquiVed; Vedco, Inc., St. Joseph, MO）の混合物の腹腔内注射、プロパラカイン（０．５％；Bausch & Lomb, Tampa, FL）の局所適用によって補足、によって麻酔した。外科用顕微鏡下で、各動物の右目の前房へのポリスチレンマイクロビーズ（FluoSpheres; Invitrogen, Carlsbad, CA；１５−μｍ径）の注射によって、一方的にＩＯＰの上昇を誘導した。
【０１５８】
手短にいうと、マイクロビーズを、滅菌生理食塩水中で５．０×１０６ビーズ／ｍＬの濃度で調製した。右角膜の中央付近を、鋭利なガラスマイクロピペット（World Precision Instruments Inc., Sarasota, FL）を使用して穏やかに穿刺した。このあらかじめ形成した穴を通して前房中へ少量（２μＬ）のマイクロビーズを注射し、Hamiltonシリンジと接続されたマイクロピペットを介しての気泡の注射がこれに続いた。炎症の兆候（角膜の混濁、浮腫状の角膜、その他）を発症したあらゆるマウスを、研究から除外した。
【０１５９】
結果
sFasLの神経保護効果は緑内障のDBA/2Jモデルに特有のことであったのかを決定するために、sFasLの、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのマウスモデルにおけるＲＧＣ喪失を防止する力を調べた。C57BL/6マウスに、AAV2.eGFPまたはAAV2.sFasLの硝子体内注射を受けさせ、マイクロビーズまたは陰性対照としての生理食塩水の前房注射がこれに続いた。
【０１６０】
AAV2注射３週間後に、ウェスタンブロット分析は、AAV2.eGFPマウスと比較してAAV2.sFasLマウスの神経網膜におけるsFasLの過剰発現を裏付けた（図９Ａ）。１５μｍのポリスチレンマイクロビーズの単回の前房への注射は、生理食塩水の対照と比較してAAV2.eGFPおよびAAV2.sFasLマウスの両方において、上昇したＩＯＰを２１日間までもたらした（図９Ｂ）。ＩＯＰは、マイクロビーズ注射１１日後にピークに達し、AAV2.sFasLまたはAAV2.eGFP処置マウスの間で、マイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰの経時変化または重大さにおいて有意な差がなかった。
【０１６１】
マイクロビーズ注射４週間後のＲＧＣ密度の定量化は、マイクロビーズを注射されたAAV2.eGFPで処置されたマウスにおいて、生理食塩水を注射された対照と比較したＲＧＣ密度の有意な減少を明らかにした（図９Ｃ−９Ｄ）。しかしながら、AAV2.sFasLでの処置は、ＲＧＣを保護しており、マイクロビーズを注射されたAAV2.sFasLマウスにおけるＲＧＣ密度は、生理食塩水を注射された対照におけるＲＧＣ密度と等しかった（図９Ｃ−９Ｄ）。類似の結果が、AAV2.eGFP処置された対照群と比較してAAV2.sFasL処置によって軸索の完全な保護を供与された視神経において観察された（図９Ｅ−９Ｆ）。
これらの結果は、慢性のDBA/2Jおよび急性のマイクロビーズに誘導された上昇したＩＯＰのモデルの両方において、AAV2.sFasLが完全な神経保護を提供するということを実証する。
【０１６２】
配列
配列番号１−AAVタイプ２カプシドタンパク質配列
【表２】
2019520405.tif 000004
【０１６３】
配列番号２−ヒト可溶性Fasリガンド（受託番号：NM_000639.2；核酸残基576-1040）ＤＮＡ配列
【表３】
2019520405.tif 000005
【０１６４】
配列番号３−ヒト可溶性Fasリガンド（受託番号：P48023.1；アミノ酸128-281）タンパク質配列
【表４】
2019520405.tif 000006
【０１６５】
配列番号４−Simian Virus 40（SV40）プロモーターＤＮＡ配列
【表５】
2019520405.tif 000007
【０１６６】
配列番号５−pAAVsc-CB6-PI-sFasLectoベクター配列
【表６−１】
2019520405.tif 000008
【表６−２】
2019520405.tif 000009
【表６−３】
2019520405.tif 000010
【表６−４】
2019520405.tif 000011
【０１６７】
配列番号６−ヒトFasリガンド（受託番号：P48023.1；アミノ酸1-281）タンパク質配列
【表７】
2019520405.tif 000012
【０１６８】
配列番号７−ヒトFasリガンド（受託番号：NM_000639.2；核酸残基195-1040）ＤＮＡ配列
【表８】
2019520405.tif 000013
【０１６９】
他の態様
この明細書において開示された全ての特徴は、あらゆる組み合わせにて組み合わせてもよい。この明細書において開示された各特徴は、同様の、同等の、または類似の目的にかなう代替の特徴によって置き換えられてもよい。ゆえに、別様に明記されていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の等価または類似の特徴の一例でしかない。上記の説明から、当業者は、容易に本開示の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適応させるために本開示の種々の変更および修正をすることができる。ゆえに、他の態様もまた、特許請求の範囲内にある。
【０１７０】
等価物および範囲
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載された個別具体的な態様に対する数多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図されておらず、その代わりに、添付の特許請求の範囲において規定されたとおりである。
【０１７１】
特許請求の範囲において、冠詞、例えば「a」、「an」、および「the」は、反対への表示がない限り、または文脈から別様に明らかでない限り、１つまたは１つよりも多いことを意味し得る。群の１つ以上の構成要素の間に「または」を含む請求項または説明は、反対への表示がない限り、または文脈から別様に明らかでない限り、群の構成要素の１つ、１つよりも多く、または全てが、所与の物またはプロセス中に存在するか、用いられるか、または別様に関係しているならば、満たされているとみなされる。本開示は、群のちょうど１つの構成要素が、所与の物またはプロセス中に存在するか、用いられるか、または別様に関係している態様を含む。本開示は、群の構成要素の１つよりも多くが、または全てが、所与の物またはプロセス中に存在するか、用いられるか、または別様に関係している態様を含む。
【０１７２】
さらに、本開示は、列記される請求項の１つ以上からの１つ以上の限定、要素、節、および記述用語が、別の請求項に導入される、全てのバリエーション、組み合わせ、および並べ替えを包摂する。例えば、他の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎クレームに従属する任意の別の請求項に見出される１つ以上の限定を含むように、修正され得る。要素が、例として、マーカッシュ群の形式で一覧として提示されるときには、要素の各下位群もまた開示されるものであり、いずれの要素（単数または複数）も群から取り除くことができる。一般に、本開示または本開示の側面が特定の要素および／または特徴を含むものと称される場合、本開示または本開示の側面についてのある態様は、かかる要素および／または特徴からなるか、または本質的になることが理解されるべきである。単純にする目的のため、それらの態様は具体的に本明細書においてこれらの言葉どおりには規定していない。
【０１７３】
用語「含む」および「含有する」は開放的であることが意図されており、さらなる要素またはステップの包含を許容することにもまた留意される。範囲が与えられている場合、端点も含まれる。さらに、範囲が示される場合、端点も含まれる。さらに、別様に表示されない限り、または文脈および当業者の理解から別様に明らかである場合を除いて、範囲として表現されている値は、文脈が明確に別様に決定付けるものでない限り、当該範囲の下限の単位の１／１０までの、本開示の種々異なる態様における述べられた範囲内のあらゆる個別具体的な値または部分範囲であることを前提とすることができる。
【０１７４】
本願は、種々の交付済み特許、公開済み特許出願、雑誌記事、および他の刊行物に言及しており、その全部が、参照により本明細書に組み込まれる。もしも組み込まれた参照物のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合には、本明細書に従う。加えて、本開示のいずれかの特定の態様であって従来技術に属するものは、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。かかる態様は当該技術分野において通常の知識を有する者に知られていると認められるので、それらは、その除外が本明細書において明示的に規定されていない場合であっても、除外され得る。本開示のあらゆる特定の態様を、従来技術の存在に関連するか否かに関わらず、あらゆる理由で、あらゆる請求項から除外することができる。
【０１７５】
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載された個別具体的な態様に対する数多くの均等物を認識するかまたは確認することができる。本明細書に記載された本態様の範囲は、上記の「発明を実施するための形態」に限定されることを意図されておらず、その代わりに、添付の特許請求の範囲において規定されたとおりである。当該技術分野において通常の知識を有する者には、この説明に対する種々の変更および修正が、以下の特許請求の範囲において定義される本開示の趣旨または範囲から逸脱することなくなされ得ることが当然理解される。
【図１Ａ−１Ｂ】
2019520405.tif 000014
【図１Ｃ】
2019520405.tif 000015
【図１Ｄ−１Ｅ】
2019520405.tif 000016
【図２Ａ−２Ｂ】
2019520405.tif 000017
【図２Ｃ−２Ｄ】
2019520405.tif 000018
【図３Ａ−３Ｂ】
2019520405.tif 000019
【図３Ｃ−３Ｄ】
2019520405.tif 000020
【図３Ｅ−３Ｆ】
2019520405.tif 000021
【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ−４Ｄ】
2019520405.tif 000023
【図４Ｅ−４Ｆ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2019520405.tif 000027
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2019520405.tif 000029
【図７Ａ−７Ｂ】
2019520405.tif 000030
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2019520405.tif 000034
【図９Ａ−９Ｂ】
2019520405.tif 000035
【図９Ｃ−９Ｄ】
2019520405.tif 000036
【図９Ｅ−９Ｆ】
2019520405.tif 000037
【配列表】
2019520405000001.app
【国際調査報告】
2019520405.tif 000038
2019520405.tif 000039