(57)【要約】  ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ経路の遮断は癌細胞を枯渇させる。この抗癌活性は、マクロファージ刺激剤がＣＤ４７遮断薬と併用された場合に増強される。この抗癌組み合わせ療法は、ＣＤ４７遮断薬がＳＩＲＰａＦｃである場合に特に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させることを必要とする対象においてＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させるための方法であって、前記対象に、ＳＩＲＰαＦｃ薬及びマクロファージ刺激剤を投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記マクロファージ刺激剤が、Ｍ１またはＭ２ｃであるマクロファージの形成を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マクロファージ刺激剤が、ＴＬＲアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＬＲアゴニストが、リポ多糖（ＬＰＳ）、レシキモド、及びポリ（Ｉ：Ｃ）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＬＲアゴニストが、ポリ（Ｉ：Ｃ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記マクロファージ刺激剤が、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、熱凝集ガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、及び形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記マクロファージ刺激剤が、インターフェロンガンマ及びインターフェロンアルファから選択されるインターフェロンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記マクロファージ刺激剤が、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、及びＩＬ−１０、ならびにこれらの混合物から選択されるインターロイキンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記マクロファージ刺激剤は、前記ＳＩＲＰαＦｃ薬が投与される前に投与され、それにより内在性マクロファージが前記ＳＩＲＰαＦｃ薬へ曝露されたときに活性化されるか、または極性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＩＲＰαＦｃ薬が、ＩｇＧ１に基づくＦｃを含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＩＲＰαＦｃ薬が、ＩｇＧ４に基づくＦｃを含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＩＲＰαＦｃ薬が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＩＲＰαＦｃ薬が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＳＩＲＰαＦｃ薬が、Ｌ４Ｖ／Ｉ、Ｖ６Ｉ／Ｌ、Ａ２１Ｖ、Ｖ２７Ｉ／Ｌ、１３１Ｔ／Ｓ／Ｆ、Ｅ４７Ｖ／Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ／Ｒ、Ｓ６６Ｔ／Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ９４Ｖ／Ｌ、Ｖ６３Ｉ、及びＦ１０３Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含むＳＩＲＰαのＣＤ４７結合領域を含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させるのに有効なＳＩＲＰαＦｃ薬、及びＣＤ４７＋疾患細胞の前記枯渇を増強するのに有効なマクロファージ刺激剤、ならびに請求項１〜１４のいずれか１項に記載の治療方法を教示する説明書の組み合わせ。
【請求項１６】
ＣＤ４７＋疾患細胞を提示する対象の治療のための、請求項１５に記載の組み合わせの使用。
【請求項１７】
前記ＣＤ４７＋疾患細胞が、ＣＤ４７＋癌細胞である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＣＤ４７＋癌細胞が、ＣＤ４７＋血液癌である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＣＤ４７＋癌細胞が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）、菌状息肉症、及び骨髄異形成症候群から選択される癌タイプの細胞である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記癌が、ホジキンリンパ腫、無痛性でも侵襲性でもある非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞濾胞性リンパ腫及び大細胞濾胞性リンパ腫から選択されるリンパ腫である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記癌が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、及び軽鎖またはベンス・ジョーンズ骨髄腫から選択される骨髄腫である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
インターフェロンガンマ１ｂ、インターフェロンアルファ２ａ、インターロイキン１β、インターロイキン４、インターロイキン−１０、マクロファージコロニー刺激因子、及び形質転換成長因子ベータから選択される作用剤との組み合わせにおけるＳＩＲＰａＦｃの、ＣＤ４７＋癌の治療のための、使用。
【請求項２３】
リポ多糖（ＬＰＳ）、レシキモド、及びポリ（Ｉ：Ｃ）から選択されるトール様受容体アゴニストとの組み合わせにおけるＳＩＲＰａＦｃの、ＣＤ４７＋癌の治療のための、使用。
【請求項２４】
前記ＳＩＲＰａＦｃ薬が、配列番号３を含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記ＳＩＲＰａＦｃ薬が、配列番号３を含む、請求項１５に記載の組み合わせ。
【請求項２６】
前記ＳＩＲＰａＦｃ薬が、配列番号８を含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記ＳＩＲＰａＦｃ薬が、配列番号８を含む、請求項１５に記載の組み合わせ。
【請求項２８】
ＳＩＲＰαＦｃ薬を用いて治療中である対象においてＣＤ４７＋癌を治療するための、マクロファージ刺激剤の使用。
【請求項２９】
マクロファージ刺激剤を用いて治療中である対象においてＣＤ４７＋癌を治療するための、ＳＩＲＰαＦｃ薬の使用。
【請求項３０】
ＳＩＲＰαＦｃ薬の抗癌作用を増強する方法であって、前記ＳＩＲＰαＦｃ薬を投与されている対象に、マクロファージ刺激剤を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年４月１５日出願の米国仮出願第６２／３２２，９３４号の、米国特許法第１１９号（ｅ）項に基づく利益を主張するものであり、該仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ相互作用を遮断する薬剤の使用方法に関する。より詳細には、本発明は、ＳＩＲＰαＦｃ薬を投与されている癌患者が、マクロファージ集団も刺激するために治療された場合に生じる改善に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌細胞は、癌細胞抗原へ結合する抗体によって、かつその抗体のＦｃ部分へのＦｃ受容体の結合によるマクロファージの動員及び活性化により破壊するために、標的化される。癌細胞上のＣＤ４７とマクロファージ上のＳＩＲｐａとの結合は、多くの腫瘍細胞がマクロファージによる検出及び破壊を免れることを可能にする「食べないで」シグナルを伝達する。ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ相互作用（ＳＩＲＰαＦｃ）の阻害が、マクロファージが標的ＣＤ４７＋癌細胞を「認識」して破壊することを可能にするということが示唆されている。ＳＩＲＰαＦｃによって癌を治療するためのＳＩＲＰαベースの作用剤の使用は、ＷＯ２０１０／１３００５３に説明されている。（ＳＩＲＰａ及びＳＩＲＰαは、本明細書においてＳＩＲＰアルファの同義語として相互交換可能に使用される。同様に、ＳＩＲＰａＦｃ及びＳＩＲＰαＦｃは、本明細書において相互交換可能に使用される。
【０００４】
ＷＯ２０１４／０９４１２２において、本発明者らは、ＣＤ４７とＳＩＲＰａとの相互作用を阻害する薬剤を説明している。このＳＩＲＰαＦｃ薬は、ＩｇＧ１に基づくＦｃ領域の特に有用な形態と連関した、その細胞外ドメインの特定の領域を組み込むヒトＳＩＲＰａの形態である。この形態において、ＳＩＲＰａＦｃ薬は、ＣＤ４７＋表現型を有する癌細胞の生存度に対して劇的な作用を示す。この効果は、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞及び他の多くのタイプの癌で見られる。一次構造が有意に変化し及びＣＤ４７結合親和性が増強されたＳＩＲＰの可溶性形態は、ＳｔａｎｆｏｒｄのＷＯ２０１３／１０９７５２に説明されている。腫瘍抗原結合部位を含むＳＩＲＰａＦｃ薬の別の類似の形態は、Ｍｅｒｃｋ  ＧＭＢＨのＷＯ２０１６／０２４０２１に説明されている。
【０００５】
他のＳＩＲＰαＦｃ薬は、文献に説明されており、これらは異なる抗原結合部位をそれぞれ含むが、共通して、ＣＤ４７への結合について内在性ＳＩＲＰａと競合し、それにより食作用を可能にし、最終的にはＣＤ４７＋癌細胞枯渇の速度を上昇させる能力を有する種々のＣＤ４７抗体（例えばＳｔａｎｆｏｒｄのＵＳ８５６２９９７及びＩｎｈｉｂＲｘのＷＯ２０１４／１２３５８０を参照されたい）を含む。これらの薬剤は、ＳＩＲＰαＦｃ作用を有するが、ＳＩＲＰａＦｃベースの薬によって提示されるものとはかなり異なるインビボでの活性を示す。後者は、例えば、赤血球への無視できる結合を示すのに対し、ＣＤ４７抗体の反対の特性は、投与後の薬剤「シンク」を収容する戦略についての必要性が生じる。
【０００６】
ＣＤ４７／ＳＩＲａ軸を遮断する上で使用するためのさらに他の作用剤が提案されている。これらには、ＣＤ４７Ｆｃタンパク質（ウイルス論理のＷＯ２０１０／０８３２５３を参照されたい）、ならびにＵＨＮのＷＯ２０１３／０５６３５２、ＳｔａｎｆｏｒｄのＷＯ２０１６／０２２９７１、ＥｂｅｒｈａｒｄのＵＳ６９１３８９４、及び他の箇所において説明されているようなＳＩＲＰａ抗体が含まれる。
【０００７】
これらの薬剤がその作用を発揮する機序は完全には理解されていない。利益は、ＣＤ４７シグナル伝達の阻害から直接実現されると考えられている。しかしながら、マクロファージが癌細胞の枯渇を促進する何らかの方法で協力することもあり得る。
【０００８】
ＣＤ４７遮断アプローチは、癌療法において大きな見込みを示す。これらの薬剤の作用を改善する、特にＳＩＲＰαＦｃ薬の作用を改善するための方法及び手段を提供することは有用であろう。
【発明の概要】
【０００９】
受容者が、マクロファージ刺激剤である１つ以上の作用剤との組み合わせで治療される場合、ＳＩＲＰαＦｃ薬の抗癌効果が増強されることが判明している。実施形態では、そのように刺激された内在性マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。
【００１０】
したがって、一態様において、ＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させることを必要とする対象においてＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させるのに有用な方法であって、対象に、（１）ＣＤ４７遮断薬としてのＳＩＲＰａＦｃと、（２）内在性マクロファージを活性化して、それによりＳＩＲＰａＦｃ薬の抗癌活性を増強するマクロファージ刺激剤と、を含む、方法が提供される。
【００１１】
ある特定の態様において、マクロファージ刺激剤は、Ｆｃ受容体型の脈絡においてＣＤ６４＋であるマクロファージの形成または蓄積を支持するかまたは好むものである。他の態様において、マクロファージ刺激剤は、Ｍ１型またはＭ２ｃ型を有するマクロファージの形成を支持するものである。さらに他の態様において、マクロファージ刺激剤は、Ｍ０、Ｍ２ａ、及びＭ２ｂ型マクロファージを極性化してＭ１及び／またはＭ２ｃマクロファージになるものである。
【００１２】
関連する態様において、ＴＡＭＳを含む内在性マクロファージの活性及び／または表現型を調節し、それによりＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させることを必要とする対象においてＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させるのに有効なマクロファージ刺激剤との組み合わせでのＳＩＲＰαＦｃ薬の使用が提供される。
【００１３】
別の態様では、マクロファージ刺激剤との組み合わせでのＳＩＲＰαＦｃ薬を含む、ＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させる必要のある対象においてＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させるのに有用な医薬としての組み合わせが提供される。実施形態において、この組み合わせは、本明細書に説明される治療方法における使用を教示する説明書とともに、キットなど、離散しかつ別個に製剤化された化合物の物理的組み合わせとして提供される。
【００１４】
実施形態において、マクロファージ刺激剤は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）、インターフェロンアルファ２ａ（ＩＦＮα−２ａ）リポ多糖（ＬＰＳ）などのインターフェロンアルファ、ならびにインターロイキン１β、インターロイキン４、及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）などのインターロイキン、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド、熱凝集ヒトガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）、ならびにこれらの任意の２つ以上の混合物から選択される。
【００１５】
本発明のこれらの及び他の態様は次に、添付の図面を参照してより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】インビトロでヒトＰＢＭＣから作製した６つの異なるマクロファージ部分集合によって、ＳＩＲＰａＦｃ（配列番号３、ＴＴＩ−６２１）が腫瘍細胞の食作用を増大させたことを示す。
【図２Ａ】インビトロでヒトＰＢＭＣから作製した６つの異なるマクロファージ部分集合におけるＦｃγＲ（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４）の相対的発現を示す。
【図２Ｂ】６つの異なるマクロファージ部分集合におけるＣＤ６４レベルとＳＩＲＰａＦｃによる食作用活性との相関を示す。
【図３Ａ】Ｍ０、Ｍ２ａ、及びＭ２ｂマクロファージによるＳＩＲＰａＦｃ（配列番号３）に対する食作用応答が、サイトカイン及びトール様受容体アゴニストによる再極性化によってさらに増大することを示す。
【図３Ｂ】図３Ａのつづき。
【図３Ｃ】図３Ｂのつづき。
【図４】サイトカイン及びトール様受容体アゴニストによる再極性化後のＭ０、Ｍ２ａ、及びＭ２ｂのマクロファージのＦｃγＲ発現の変化を示す。最も注目すべきは、ＣＤ６４発現の変化である。
【図５Ａ】ＳＩＲＰａＦｃ（配列番号３）をインターフェロンガンマとの組み合わせで処置したマウスにおける腫瘍成長を示す。
【図５Ｂ】図５Ａのつづき。
【図５Ｃ】図５Ｂのつづき。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＣＤ４７＋表現型を有する癌細胞及び腫瘍を示す対象を治療するための改善された方法を提供する。この方法において、対象は、ＳＩＲＰａＦｃとマクロファージ刺激剤との組み合わせを投与される。組み合わせにおいて、この組み合わせの抗癌作用は、いずれかの作用剤単独の作用よりも優れている。この改善は、特に、薬剤が配列番号３を有するＳＩＲＰａＦｃ薬である場合に生じると考えられる。
【００１８】
したがって、本発明において、治療方法は、ＳＩＲＰａＦｃ薬とマクロファージ刺激剤とを組み合わせる。ＳＩＲＰαＦｃ活性を有する薬剤は、ＣＤ４７がマクロファージ提示ＳＩＲＰａと相互作用する場合に生じるシグナル伝達に干渉する作用剤である。この特性は、ＳＩＲＰａＦｃ薬の種々の形態で認められる。
【００１９】
ＳＩＲＰαＦｃ薬は、ヒトＳＩＲＰａの細胞外領域に基づいている。ＳＩＲＰαＦｃ薬は、有効なＣＤ４７結合親和性及び特異性を付与するのに十分な細胞外領域の少なくとも１つの領域を含む。いくつかのＳＩＲＰａＦｃ薬は、文献に説明されており、ＮｏｖａｒｔｉｓのＷＯ２０１０／０７００４７及びＳｔａｎｆｏｒｄのＷＯ２０１３／１０９７５２ならびにＴｒｉｌｌｉｕｍ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＷＯ２０１４／０９４１２２に参照されているものを含み、すべてこれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
ＳＩＲＰａＦｃ薬において、ＳＩＲＰａのＣＤ４７結合領域は抗体定常部（Ｆｃ）に結合してＳＩＲＰａＦｃ融合体を形成する。より詳細には、この薬剤は、抗体定常部またはＦｃ（結晶化可能なフラグメント）と直接的または間接的に融合した形態で、ヒトＳＩＲＰαタンパク質の細胞外部分を適切に含む。別段の記載がない限り、本明細書で使用する「ヒトＳＩＲＰα」という用語は、野生型の、内在性の、成熟した形態のヒトＳＩＲＰαを指す。ヒトにおいて、ＳＩＲＰαタンパク質は２つの主要な形態で認められる。１つの形態であるバリアント１またはＶ１形態は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿５４２９７０．１（配列番号１３）（残基２７〜５０４は成熟型を構成する）として示されるアミノ酸配列を有する。別の形態であるバリアント２またはＶ２形態は、１３のアミノ酸が異なっており、ＧｅｎＢａｎｋにＣＡＡ７１４０３．１（配列番号１４）（残基３０〜５０４は成熟型を構成する）として示されるアミノ酸配列を有する。これらの２つの形態のＳＩ
ＲＰαは、ヒトに存在するＳＩＲＰαの形態の約８０％を構成し、両方とも「ヒトＳＩＲＰα」という用語によって本明細書に包含される。また、「ヒトＳＩＲＰα」という用語に包含されるのは、ヒトに内在性であり、ＣＤ４７との結合の際にＣＤ４７を介したシグナル伝達を誘発するのと同じ特性を有するその少数派の形態である。本発明は、最も詳細には、バリアント２形態またはＶ２を含む薬剤の組み合わせに関する。
【００２１】
本発明の薬剤の組み合わせにおいて、有用なＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質は、ヒトＳＩＲＰαの細胞外領域内にある３つのいわゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインのうちの１つを含む。より詳細には、本発明のＳＩＲＰαＦｃタンパク質は、現行の命名法により、Ｖ２形態のＩｇＶドメインを構成し及び定義する、ヒトＳＩＲＰαの残基３２〜１３７（１０６マー）を組み込む。以下に示すこのＳＩＲＰα配列は、本明細書では配列番号１として参照される。
ＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡ（配列番号１）
【００２２】
実施形態において、ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質は、配列番号１によって定義されるＩｇＶドメイン、及びＳＩＲＰα配列内で続いている追加の隣接残基を組み込む。ヒトＳＩＲＰαのＶ２形態の残基３１〜１４８によって表されるこの形態のＩｇＶドメインは、以下に示す配列番号５を有する１１８マーである。
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳ（配列番号５）
【００２３】
ＳＩＲＰαＦｃ薬として、ＳＩＲＰα融合タンパク質は、エフェクター機能を有するＦｃ領域を組み込むこともできる。Ｆｃは「結晶化可能なフラグメント」を指し、主として重鎖定常部とヒンジ部内の複数の成分とからなる抗体の定常部を表す。したがって、適切なＦｃ成分は、エフェクター機能を有するものである。「エフェクター機能を有する」Ｆｃ成分は、抗体依存性細胞障害作用への少なくともなんらかの寄与または補体を修復するなんらかの能力など、少なくともいくつかのエフェクター機能を有するＦｃ成分である。また、Ｆｃは少なくともＦｃ受容体に結合することになっている。これらの特性は、この目的のために確立されたアッセイを用いて明らかにすることができる。機能アッセイには、標的細胞溶解を検出する標準的なクロム放出アッセイが含まれる。この定義により、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４であるＦｃ領域はエフェクター機能を有するが、Ｐｒｏ２３３と、Ｖａｌ２３４と、Ａｌａ２３５と、Ｇｌｙ２３６（ＥＵ）の欠失とを含む変質連続の組み込みなどによる、エフェクター機能を除去するように変異したヒトＩｇＧ４のＦｃ領域は、エフェクター機能を有しないと考えられている。好ましい実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ１アイソタイプのヒト抗体に基づく。これらの抗体のＦｃ領域は、当業者に容易に識別可能であろう。実施形態において、Ｆｃ領域は、より低いヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部を含む。
【００２４】
具体的な実施形態において、Ｆｃ領域は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、残基１０４〜３３０のＰ０１８５７（配列番号１５）として示されるヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列に基づいており、以下に示し本明細書では配列番号２として参照されるアミノ酸配列を有する：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ
ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊（配列番号２）
【００２５】
したがって、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１定常部の野生型配列またはコンセンサス配列のいずれかを有する。あるいは、融合タンパク質の中に組み込まれたＦｃ領域は、エフェクターにより活性化される典型的な定常部を有する何らかのＩｇＧ１抗体に由来する。このようなＦｃ領域の配列は、例えば以下のＩｇＧ１配列（全てＧｅｎＢａｎｋから参照される）のいずれかのＦｃ領域、例えばＢＡＧ６５２８３（配列番号１６）（残基２４２〜４７３）、ＢＡＣ０４２２６．１（配列番号１７）（残基２４７〜４７８）、ＢＡＣ０５０１４．１（配列番号１８）（残基２４０〜４７１）、ＣＡＣ２０４５４．１（配列番号１９）（残基９９〜３２０）、ＢＡＣ０５０１６．１（配列番号２０）（残基２３８〜４６９）、ＢＡＣ８５３５０．１（配列番号２１）（残基２４３〜４７４）、ＢＡＣ８５５２９．１（配列番号２２）（残基２４４〜４７５）、及びＢＡＣ８５４２９．１（配列番号２３）（残基（２３８〜４６９）に対応し得る。
【００２６】
あるいは、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２配列またはＩｇＧ３配列の野生型配列またはコンセンサス配列であり得、その例を以下に示す。
【００２７】
例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースのＰ０１８５９（配列番号２４）に含まれるような、ヒトＩｇＧ２：ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９）。
【００２８】
例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースのＰ０１８６０（配列番号２５）に含まれるような、ヒトＩｇＧ３：ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１０）。
【００２９】
他の実施形態において、Ｆｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常部の配列を有する。代替的な実施形態において、融合タンパク質の中に組み込まれたＦｃ領域は、存在するが、天然ではＩｇＧ１  Ｆｃ領域よりも有意に効力が低いエフェクター活性を備えた定常部を有する何らかのＩｇＧ４抗体に由来する。このようなＦｃ領域の配列は、例えば、以下のＩｇＧ４配列、すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ由来のＰ０１８６１（配列番号２６）（残基９９〜３２７）及びＧｅｎＢａｎｋ由来のＣＡＣ２０４５７．１（配列番号２７）（残基９９〜３２７）のいずれかのＦｃ領域に対応し得る。
【００３０】
具体的な実施形態において、Ｆｃ領域は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、残基９９〜３２７におけるＰ０１８６１（配列番号２６）として示されるヒトＩｇＧ４のアミノ酸配列に基づいており、以下に示し配列番号６として参照されるアミノ酸配列を有する。
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ
ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号６）
【００３１】
Ｆｃ領域は、ある特定のＦｃ特性に影響するアミノ酸置換を含む、１つ以上の変質、通常約５以下のこのような変質を組み込むことができる。１つの具体的な好ましい実施形態において、Ｆｃ領域は、位置２２８（ＥＵ番号付け）におけるセリンがプロリンによって置換された（Ｓ２２８Ｐ）、この位置での変質を組み込み、それにより、Ｆｃ二量体内のジスルフィド結合を安定化させる。Ｆｃ領域内の他の変質は、グリシンまたはアラニンによるＡｓｎ２９７の置換などのグリコシル化、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５３Ｓ、及びＴ２５６Ｆなどの半減期延長変質、ならびに残基４０９変質などの多くのその他を含み得る。特に有用であるのは、Ｆｃ特性を増強するが、コンホメーションに関してサイレントのままである、例えばＦｃ受容体結合を保持している変質である。
【００３２】
具体的な実施形態において、Ｆｃ成分がＩｇＧ４  Ｆｃである場合、Ｆｃは、少なくともＳ２２８Ｐ変異を組み込み、以下に示され配列番号７として本明細書で参照されるアミノ酸配列を有する。
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号７）
【００３３】
この組み合わせにおいて有用なＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質は、ヒトＳＩＲＰαとヒトＣＤ４７との結合を阻害し、それにより、ＳＩＲＰα結合ＣＤ４７、ヒトＳＩＲＰα成分を含む融合タンパク質、及びこの融合タンパク質と融合したＦｃ成分を介して仲介されるシグナルの伝達を阻害または低下させるものであって、ＳＩＲＰα成分が、ヒトＳＩＲＰαＶ２の単一ＩｇＶドメインを含みまたはそれからなり、Ｆｃ成分が、エフェクター機能を有するヒトＩｇＧの定常部であるものである。
【００３４】
一実施形態において、融合タンパク質は、野生型ヒトＳＩＲＰαのＶ２形態の少なくとも残基３２〜１３７、すなわち配列番号１を含むかまたはそれからなるＳＩＲＰα成分を含む。好ましい実施形態において、ＳＩＲＰα成分は、ヒトＳＩＲＰαのＶ２形態の残基３１〜１４８、すなわち配列番号５からなる。別の実施形態において、Ｆｃ成分は、Ｐ０１８５７（配列番号１５）と呼ばれるヒトＩｇＧ１のＦｃ成分であり、具体的な実施形態において、より低いヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部、すなわち配列番号２を組み込むアミノ酸配列を有する。
【００３５】
それゆえ、好ましい実施形態において、本発明は、発現した一本鎖ポリペプチド及び／またはその分泌した二量体融合体としてＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質を提供し、ここで融合タンパク質は、配列番号１及び好ましくは配列番号５を有するＳＩＲＰα成分ならびに、これと融合して、エフェクター機能を有し及び配列番号２を有するＦｃ領域を組み込む。ＳＩＲＰα成分が配列番号１である場合、この融合タンパク質は、以下に示す配列番号２８を含む。
ＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ
ＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊（配列番号２８）
【００３６】
ＳＩＲＰαが配列番号５である場合、この融合タンパク質は、以下に示す配列番号３を含む。
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３）
【００３７】
代替的な実施形態において、融合タンパク質のＦｃ成分は、ＩｇＧ４、好ましくはＳ２２８Ｐ変異を組み込むＩｇＧ４に基づいている。この融合タンパク質が配列番号５の好ましいＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインを組み込む場合、得られるＩｇＧ４ベースのＳＩＲＰα−Ｆｃタンパク質は、以下に示す配列番号８を含む。
ＥＥＥＬＱＶＩＱＰＤＫＳＶＳＶＡＡＧＥＳＡＩＬＨＣＴＶＴＳＬＩＰＶＧＰＩＱＷＦＲＧＡＧＰＡＲＥＬＩＹＮＱＫＥＧＨＦＰＲＶＴＴＶＳＥＳＴＫＲＥＮＭＤＦＳＩＳＩＳＮＩＴＰＡＤＡＧＴＹＹＣＶＫＦＲＫＧＳＰＤＴＥＦＫＳＧＡＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号８）
【００３８】
好ましい実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＳＩＲＰα  ＩｇＶドメインとして、配列番号５である配列を含む。好ましいＳＩＲＰαＦｃは配列番号３である。別の実施形態において、ＳＩＲＰαＦｃは配列番号８である
【００３９】
文献に説明されているように、ＳＩＲＰαＦｃ薬内に組み込まれたＳＩＲＰａ配列は、変化させることができる。すなわち、ＳＩＲＰａ内の有用な置換には、以下、すなわちＬ４Ｖ／Ｉ、Ｖ６Ｉ／Ｌ、Ａ２１Ｖ、Ｖ２７Ｉ／Ｌ、１３１Ｔ／Ｓ／Ｆ、Ｅ４７Ｖ／Ｌ、Ｋ５３Ｒ、Ｅ５４Ｑ、Ｈ５６Ｐ／Ｒ、Ｓ６６Ｔ／Ｇ、Ｋ６８Ｒ、Ｖ９２Ｉ、Ｆ９４Ｖ／Ｌ、Ｖ６３Ｉ、及び／またはＦ１０３Ｖのうちの１つ以上を含み、アミノ酸位置番号は、本明細書の配列番号５を参照してつけられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１６／０２３０４０号（Ａｌｅｘｏ）も参照されたい。
【００４０】
ＳＩＲＰαＦｃ融合タンパク質において、ＳＩＲＰα成分及びＦｃ成分は、直接的または間接的に融合して、一本鎖ポリペプチドを提供し、この一本鎖ポリペプチドは一本鎖ポリペプチドがＦｃ領域内に形成される鎖内ジスルフィド結合によって結合する二量体として最終的に生成される。融合領域の性質は重要ではない。融合は、ＳＩＲＰ成分が融合体のＮ末端を構成し、Ｆｃ成分がＣ末端を構成する２つの成分の間で直接的であってもよい。あるいは、融合は、１つ以上のアミノ酸、望ましくは２、３、４、５、６、７、８、９
もしくは１０個のアミノ酸などの遺伝的にコードされたアミノ酸、または５〜５０、５〜３０もしくは５〜２０個のアミノ酸などの５〜１００個のアミノ酸、から構成されたリンカーを介して間接的であってもよい。リンカーは、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ及びＸｈｏＩ部位などの制限部位を構成するＤＮＡによってコードされるペプチドを含んでもよい。
【００４１】
リンカーアミノ酸は、典型的かつ望ましくは、Ｆｃ成分及びＳＩＲＰ成分が活性のある立体配座をとることのできるいくらかの可撓性を提供することになっている。このような可撓性を可能にする残基は、典型的にはＧｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒであるので、リンカー内のこれらの残基（ならびに特にＧｌｙ及びＳｅｒ）の実質的に何らかの組み合わせが所望の連結作用を提供するようである。一例において、このようなリンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（式中、ｎは１、２、３またはそれより多数である）として反復し得る、いわゆるＧ４Ｓ配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、配列番号１１）に基づいており、または（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｓｅｒ）ｎ、（Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｎもしくは（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎなどに基づいている。別の実施形態において、リンカーはＧＴＥＬＳＶＲＡＫＰＳ（配列番号４）である。この配列は、Ｃ末端にＩｇＶドメインに隣接するＳＩＲＰα配列を構成する（この隣接配列が、上述のＩｇＶ最小配列と結合した場合、ＩｇＶドメインのリンカーまたは異なる形態のいずれかとみなされ得ることは理解される）。融合領域またはリンカーは、この複数の成分が活性のある立体配座を採用することができるという点でのみ必要であり、このことは、当該技術分野で有用な何らかの形態のリンカーによって達成することができる。
【００４２】
ＳＩＲＰαＦｃ融合体は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用を阻害し、それによりこの軸を横切るシグナル伝達を遮断するのに有用である。ＣＤ４７によるマクロファージ上のＳＩＲＰαの刺激は、ミオシンＩＩ及びマクロファージ中へと標的を引っ張り込むことに関与する収縮性細胞骨格活性を失活させることによって、マクロファージ媒介性食作用を阻害することが知られている。それゆえ、このカスケードの活性化は、ＣＤ４７＋疾患細胞の生存にとって重要であり、この経路を遮断することにより、マクロファージはＣＤ４７＋疾患細胞集団を根絶することができる。
【００４３】
「ＣＤ４７＋」という用語は、ＳＩＲＰαＦｃ薬による結合を標的とする細胞の表現型に関して使用される。ＣＤ４７＋である細胞は、親和性リガンドとしてＣＤ４７抗体を用いて、フローサイトメトリーによって特定することができる。適切に標識されているＣＤ４７抗体は、この用途のために市販されている（例えば、クローンＢ６Ｈ１２はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である）。ＣＤ４７表現型について検査された細胞は、特に、内在性ＣＤ４７＋癌細胞を有すると疑われる対象から採取した血液試料を含む標準的な腫瘍生検試料を含むことができる。本発明の融合タンパク質による療法の標的として特に関心対象のＣＤ４７疾患細胞は、ＣＤ４７を「過剰発現する」ものである。これらのＣＤ４７＋細胞は、典型的には疾患細胞であり、所定のタイプの細胞ついての正常なＣＤ４７密度を超える当該細胞表面上の密度でＣＤ４７を提示する。ＣＤ４７過剰発現は、異なる細胞タイプにわたって変化することになっているが、本明細書で例示されるようなフローサイトメトリーによって、または免疫染色によって、または遺伝子発現分析などによって、当該細胞タイプについて正常であるＣＤ４７表現型を有する相手細胞に関して測定可能なレベルを上回っていると測定される何らかのＣＤ４７レベルを指すよう、本明細書で意味される。
【００４４】
本発明の薬剤の組み合わせは、好ましくは配列番号３であるＳＩＲＰαＦｃ薬と、マクロファージ刺激剤との両方を含む。これらのマクロファージ刺激剤は、マクロファージの活性を刺激し、マクロファージの極性に影響を与える多種多様な作用剤を含む。実施形態において、マクロファージ刺激剤は、ＴＬＲアゴニスト、成長因子、またはケモカインで
ある。
【００４５】
マクロファージは、異なるタイプ、すなわちＭ０、Ｍ１及びＭ２として存在すること、ならびにＭ２タイプはＭ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ及びＭ２ｄと呼ばれる４つの異なるサブタイプを有することが周知である。Ｍ１及びＭ２マクロファージは、異なるケモカイン特性及びケモカイン受容体特性を有し、Ｍ１は、Ｔｈ１細胞を誘引するケモカインＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０を分泌し、Ｍ２は、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２及びＣＣＬ２４を分泌する。マクロファージは、Ｍ２からＭ１への完全な再極性化が可能であり、こうした環境に応じて極性化を逆転させることができることが近年、インビトロで実証されている。極性化の変化は迅速であり、転写レベル及び翻訳レベルの両方でシグナル伝達ネットワークの再構成を伴う。
【００４６】
Ｍ１表現型は、細胞内病原体、細菌細胞壁成分、リポタンパク質、ならびにインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇまたはＩＦＮγ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）などのサイトカインによる活性化から結果的に生じる。Ｍ１マクロファージは、炎症性サイトカイン分泌及び酸化窒素（ＮＯ）の産生を特徴とし、結果的に炎症を引き起こす。概して、Ｍ１マクロファージは、癌の設定において良好な予後と関係している。Ｍ２の活性化は、真菌細胞、寄生虫、免疫複合体、補体、アポトーシス細胞、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、腫瘍成長因子ベータ（ＴＧＦβ）によって誘導される。Ｍ２マクロファージは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、血管新生因子及び走化性因子、ならびにＩＬ−１０を産生することが実証されている。Ｍ２マクロファージは、炎症応答を緩和し、創傷治癒を促進することができる。これらは、現在の文献において、抗炎症性、分裂促進性、創傷治癒性、組織修復性、及び栄養または調節性マクロファージと広く称されており、Ｍ１活性化マクロファージの良性反対物であるとみなされている。
【００４７】
また、マクロファージ活性化命名法の現行の枠組みに従って、インビトロで生じたマクロファージ（Ｍ０、Ｍ１、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ）の従来の命名法の代わりに、マクロファージ集団は、以下のように、当該集団を誘導する作用剤に従って命名することができる。すなわち、Ｍ（ＩＦＮ−γ）としてのＭ１、Ｍ（ＩＦＮγ＋ＬＰＳ）としてのＭ１＋ＬＰＳ、Ｍ（ＩＬ−４）としてのＭ２ａ、Ｍ（ＨＡＧＧ＋ＩＬ−１β）としてのＭ２ｂ、Ｍ（ＩＬ−１０＋ＴＧＦβ）サブセットとしてのＭ２ｃである。極性化していないＭ０マクロファージは、Ｍ（−）として示すことができる。
【００４８】
本明細書中に提供される実施例において実証されることになっているように、ＳＩＲＰαＦｃ薬は、マクロファージ集団が刺激される、例えば活性化される場合に改善された作用を有することが認められている。したがって、実施形態において、ＳＩＲＰαＦｃ薬を投与されている対象は、マクロファージが表現型を変化させ、活性化状態をとるようにすることになっているマクロファージ刺激剤を用いても治療される。好ましくは、このことは、ＣＤ６４過剰発現として、またはＭ１型もしくはＭ２ｃ型の採用として、またはより単純には既知のマクロファージ刺激剤を用いた治療の結果として、明らかになる。
【００４９】
望ましくは、この治療は、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）を発現するマクロファージの形成または蓄積を育成または促進するマクロファージ刺激剤を利用する。より詳細には、「形成を促進する」という用語は、ある特定のマクロファージの数の増加が、その作用剤を投与した結果または成り行きであることを単に意味するよう意図している。したがって、ＣＤ６４＋マクロファージの形成を促進するか、またはＣＤ６４＋マクロファージを育成する作用剤は、ＣＤ１６＋マクロファージまたはＣＤ３２＋マクロファージと比較して、ＣＤ６４＋マクロファージの数及び有病率の上昇を引き起こす作用剤である。
【００５０】
ＦｃγＲＩとしても知られているＣＤ６４は、何らかのタンパク質の、特に抗体のＦｃ
領域に結合する受容体として種々のタイプの免疫細胞に機能する。このことは、これらのタンパク質のクリアランスの原因となる。当該タンパク質のヒト形態では、ＣＤ６４は、既知のアミノ酸配列を有する７５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ６４は、ＩｇＧに対する高親和性受容体であり、食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性、及びサイトカイン産生に関与する。単球及びマクロファージはＣＤ６４を恒常的に発現する。成熟顆粒球及びリンパ球は陰性であるが、多形核白血球をＩＦＮγ及びＧ−ＣＳＦのようなサイトカインで処理すると、これらの細胞上でＣＤ６４発現を同様に誘導することができる。
【００５１】
したがって、実施形態において、マクロファージ刺激剤は、ＣＤ６４＋マクロファージを育成するものである。これらのマクロファージの存在は、ＳＩＲＰαＦｃ薬の活性を増強する。例えば、図３は、ＣＤ６４を他のＦｃγ受容体ＣＤ１６及びＣＤ３２に対して、ならびに対照と比較して（ヒストグラムの移行を非極性化対象と比較する）上昇させるいくつかのマクロファージ刺激剤を明らかにする。このことは、ＩＦＮ−アルファ及びＩＬ−１０で最も顕著である。これらは、単独でまたはＳＩＲＰαＦｃとともに組み合わせで使用することができる。ＣＤ６４マクロファージを育成するさらに他の作用剤は、本明細書に説明される実験的アプローチを用いて特定することができる
【００５２】
他のマクロファージ刺激剤は、当該技術分野において非常によく知られている。これらは、マクロファージを活性化させ、傷害に応答する作用剤である。この特性を有する作用剤は、微生物病原体の数多くの異なる成分を含む。これらは、トール様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれる異なるマクロファージ受容体によって認識される。
【００５３】
実施形態において、ＳＩＲＰａＦｃ薬は、以下から選択される少なくとも１つの作用剤との抗癌組み合わせにおいて使用される。
１）インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））及びインターフェロン−アルファ２ａ（ＩＦＮα−２ａ、Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））などのインターフェロン−アルファから選択されるインターフェロン、
２）単独または先の１）の下にある作用剤とともにあるリポ多糖（ＬＰＳ）、
３）インターロイキン１β、インターロイキン４、及びインターロイキン１０などのインターロイキン、
４）Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ならびに熱凝集ヒトガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）などのタンパク質、
５）ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ７リガンドまたはＴＬＲ８リガンドなどのトール様受容体（ＴＬＲ）リガンド、及びこれらのいずれか２つ以上の混合物。
【００５４】
実施形態において、ＳＩＲＰαＦｃ薬と併用されるマクロファージ刺激剤は、ＴＬＲアゴニスト、すなわち、これらの受容体のうちの１つに結合して刺激する作用剤である。特筆されるように、トール様受容体（ＴＬＲ）は、マクロファージ（及び他の細胞）が微生物構造を認識するために使用するパターン認識受容体である（ＴＬＲ３は二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ４はＬＰＳを認識し、ＴＬＲ７／８は一本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧモチーフを認識する）。概して、ＴＬＲの誘発は、マクロファージの「活性化」、すなわち、とりわけ、サイトカイン産生の亢進を結果的にもたらす。ＴＬＲ刺激は、Ｍ１マクロファージ表現型への極性化も促進する。
【００５５】
したがって、一実施形態において、本発明の方法は、ＴＬＲアゴニストのマクロファージ活性化作用及び極性化作用を利用する。これらには、ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８及び／またはＴＬＲ−９を含むＴＬＲのうちのいずれか１つ以上のアゴニストが含まれる。
【００５６】
ＴＬＲ１については、作用剤は、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）などの合成リガンドを含む、細菌性及びマイコバクテリアのトリアシル化リポペプチドを含み得る。
【００５７】
ＴＬＲ２については、有用なリガンドは、グラム陽性菌ペプチドグリカン、細菌性リポタンパク質、リポテイコ酸、ある特定のＬＰＳ、クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）由来のＧＰＩアンカータンパク質、血球凝集素（ＭＶ属）、フスホリポマンナン（カンジダ属）及びＬＡＭ（ミコバクテリア属）及びナイセリア属のポリンが含まれる。また、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、マクロファージ活性化リポペプチド２（ＭＡＬＰ２）、Ｈｉｂ−ＯＭＰＣ、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）ＣＧＤＰＫＨＰＫＳＦ（ＦＳＬ−１）（配列番号１２）及びジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）も知られている。
【００５８】
ＴＬＲ３は、複製中のある時点でほとんどのウイルスによって産生された二本鎖ＲＮＡを結合するヌクレオチド検出ＴＬＲである。これらのウイルスには、西ナイルウイルス、ならびにＲＳＶ及びＭＣＭＶなどの二本鎖ＲＮＡウイルスが含まれる。本方法において有用な合成リガンドには、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）及びポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡ：Ｕ）が含まれる。好ましい実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、二本鎖ＲＮＡの長い合成類似体であるポリ（Ｉ：Ｃ）である。これは、ポリ（Ｃ）鎖にアニールしたポリ（Ｉ）スタンドから構成することができ、１．５〜８ｋｂの平均サイズを有する。
【００５９】
ＴＬＲ４の場合、有用な病原体媒介リガンドには、ＬＰＳ（グラム陰性菌）、Ｆタンパク質（ＲＳＶ）、マンナン（カンジダ属）、糖イノシトールリン脂質（トリパノソーマ属）、エンベロープタンパク質（ＲＳＶ及びＭＭＴＶ）が含まれる。ＴＬＲ４を結合する内在性リガンドも存在し、これらには、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、フィブロネクチンドメインＡ、ならびにヒアルロナン、界面活性タンパク質Ａ及び高移動群１型タンパク質（ＨＭＧＢ−１）が含まれる。合成ＴＬＲ４リガンドも知られており、α−１酸糖タンパク質（ＡＧＰ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、ＲＣ−５２９と呼ばれるリピドＡ模倣物、マウスβデフェンシン２（ＭＤＦ２β）及びＣＦＡを含む。
【００６０】
ＴＬＲ５に関して、細菌フラゲリンは、本方法において有用な病原性リガンド及び合成リガンドの両方として機能する。
【００６１】
ＴＬＲ６の場合、有用な病原体関連リガンドは、ブドウ球菌由来のフェノール可溶性モジュリンである。表在性、ザイモサン（サッカロミセス属）、ＬＴＡ（ストレプトコッカス属）及びマイコプラズマ属由来のジアシル化ポリペプチド。内在性リガンドは未知であるが、有用な合成リガンドには、ＭＡＬＰ−２、Ｐａｍ２Ｃｙｓ及びＦＳＬ−１が含まれる。
【００６２】
ＴＬＲ７については、有用な合成リガンドには、グアノシン類似体、ロキソリビン、レシキモド、Ｒ８４８、Ａｌｄａｒａ（登録商標）、イミダゾキノリン、及びイミキモドが含まれるのに対し、内在性リガンドはヒトＲＮＡであり、病原性リガンドは特にインフルエンザ、ＶＳＶ、ＨＩＶ及びＨＣＶ由来のウイルス一本鎖ＲＮＡである。
【００６３】
ＴＬＲ８については、ＲＮＡウイルス由来の一本鎖ＲＮＡは病原体由来のリガンドであるのに対し、内在性リガンドはヒトＲＮＡであり、ＴＬＲ７と同様、有用な合成リガンドはイミダゾキノリン、ロキソリビン、一本鎖ポリＵ、及び３Ｍ−０１２が含まれる。
【００６４】
ＴＬＲ９については、病原体由来リガンドには、二本鎖ＤＮＡウイルス（ＨＳＶ、ＭＣＭＶ）、プラスモジウム属由来のヘモゾイン、ならびに細菌及びウイルス由来の非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡが含まれる。内在性リガンドには、ヒトＤＮＡ／染色質、及びＬＬ３７−ＤＮＡが含まれる。有用な合成リガンドには、ＣｐＧベースのオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００６５】
したがって、実施形態において、ＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させることを必要とする対象を、内在性マクロファージを活性化するのに有効なＳＩＲＰαＦｃ薬とＴＬＲアゴニストとを含む薬剤組み合わせで処置することによって、ＣＤ４７＋疾患細胞を枯渇させる方法が提供される。具体的な実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、直前に説明されたＴＬＲアゴニストのいずれかから選択される物理的に許容される作用剤であり、すなわち、細菌性及びマイコバクテリアのトリアシル化リポペプチド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、グラム陽性菌ペプチドグリカン、細菌性リポタンパク質、リポテイコ酸、ＬＰＳ、クルーズトリパノソーマ由来のＧＰＩアンカータンパク質、血球凝集素（ＭＶ）、フスホリポマンナン（カンジダ属）及びＬＡＭ（マイコバクテリア属）、ナイセリアポリン、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、マクロファージ活性化リポペプチド２（ＭＡＬＰ２）、Ｈｉｂ−ＯＭＰＣ、Ｓ−（２，３−ビスパルミトイルオキシプロピル）ＣＧＤＰＫＨＰＫＳＦ（ＦＳＬ−１）、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン、一本鎖ＲＮＡウイルス、ＲＳＶなどの二本鎖ＲＮＡならびにＭＣＭＶポリＩ；Ｃ及びポリＡ：Ｕ  ＬＰＳ（グラム陰性細菌）、Ｆプロテイン（ＲＳＶ）、マンナン（カンジダ属）、糖イノシトールリン脂質（トリパノソーマ属）、エンベロープタンパク質（ＲＳＶ及びＭＭＴＶ）である。Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、フィブロネクチンドメインＡ、ヒアルロナン、界面活性タンパク質Ａ、高移動群１タンパク質（ＨＭＧＢ−１）、α−１酸糖タンパク質（ＡＧＰ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、ＲＣ−５２９と呼ばれるリピドＡ模倣物、マウスβデフェンシン２（ＭＤＦ２β）、細菌フラジェリン、ブドウ球菌由来のフェノール可溶性モジュリン。（サッカロミセス属）、マイコプラズマ由来のジアシル化ポリペプチド、ＭＡＬＰ−２、Ｐａｍ２Ｃｙｓ及びＦＳＬ−１、グアノシン類似体、ロキソリビン、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）、Ｒ８４８、Ａｌｄａｒａ（登録商標）、イミダゾキノリン、及びイミキモド、ヒトＲＮＡ、ウイルス一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ポリＵ、３Ｍ−０１２、二本鎖ＤＮＡウイルス、プラスモジウム由来のヘモゾイン、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ／染色質、ＬＬ３７−ＤＮＡ及びＣｐＧベースのオリゴヌクレオチド。他の実施形態において、アゴニストはＣｐＧベースのオリゴヌクレオチドではない。
【００６６】
詳細な実施形態において、好ましいＴＬＲアゴニストとは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８のうちの１つのアゴニストである。好ましい実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、リポ多糖（ＬＰＳ）、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）としても知られているＲ８４８、及びポリ（Ｉ：Ｃ）からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、マクロファージ刺激剤はＴＬＲアゴニストではない。
【００６８】
マクロファージ刺激剤は、インビトロでマクロファージを駆動して、所望のマクロファージタイプへと極性化または再極性化するなんらかの作用剤でもあり得る。このことは、直前に説明したＴＬＲ刺激剤のうちの１つを用いて達成することができる。代替的または追加的に、刺激剤は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ならびに形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）などのサイトカインまたは成長因子であり得る。
【００６９】
一実施形態において、作用剤はインターフェロンである。インターフェロンは、特にＩＦＮγ−１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））などのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）またはインターフェロンアルファ２ａ（ＩＦＮα−２ａ）などのインターフェロ
ンアルファ、またはＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−α８、ＩＦＮ−α１０、ＩＦＮ−α１４及びＩＦＮ−α２１のうちの１つであり得る。
【００７０】
別の実施形態において、作用剤はインターロイキンである。インターロイキンは、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、またはインターロイキン１βであり得る。
【００７１】
さらに他の作用剤は、有用であり、但し、Ｍ１またはＭ２ｃである表現型に向けてインビトロでマクロファージを活性化することができることを条件とする。このような作用剤の１つは、熱凝集ヒトガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）である。
【００７２】
本明細書で有用な他のマクロファージ刺激剤は、ＣＤ６４＋マクロファージの蓄積を育成する、すなわちＣＤ６４＋マクロファージの有病率の上昇を引き起こすものである。これらのマクロファージは、ＳＩＲＰαＦｃ薬、特に配列番号３を含むＳＩＲＰａベースの薬剤の活性を増強することが示されている。ＣＤ６４＋マクロファージも育成する特に有用なマクロファージ刺激剤は、インターフェロンガンマ１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））及びインターロイキン１０である。このタイプのマクロファージ刺激剤を特定するのに有用なアッセイを本明細書に例示する。
【００７３】
マクロファージ刺激剤は、ＳＩＲＰαＦｃ薬と一緒に、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β、ならびにＨＡＧＧ及びＴＧＦβであり得る組み合わせで使用することができる。
【００７４】
概して、ＳＩＲＰαＦｃ薬は、内在性マクロファージを刺激し活性化するために、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と一緒に使用することもできる。
【００７５】
これらの組み合わせに含まれる各薬剤は、併用のために個別に製剤化することができる。薬剤は、両方の薬剤のレシピエントにおいて、一方の薬剤の作用がもう一方の薬剤の作用を増強するために使用される場合、薬剤は「組み合わせで」使用されると言われる。望ましくは、治療方法は、まずマクロファージ刺激剤を投与し、次に、マクロファージがその作用剤によって刺激された時点でＳＩＲＰａＦｃ薬を投与することを伴う。
【００７６】
このアプローチにおいて、各薬剤は、医薬として許容される担体を含む単位剤形で、かつ治療有効量で提供される。本明細書中で使用される場合、「医薬として許容される担体」は、タンパク質／抗体製剤の技術分野において生理学的に適合しかつ有用な何らかの及びすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびにこれらに類するものを意味する。医薬として許容される担体の例としては、水、塩類溶液、リン酸緩衝塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノール及びこれらに類するもの、ならびにそれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどのポリアルコールを含むことが好ましいことになっている。医薬として許容される担体は、薬理学的作用剤の保存期間または有効性を高める、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝液などの少量の補助物質をさらに含み得る。ＳＩＲＰαＦｃ融合体及びマクロファージ刺激剤は、治療剤を製剤化する分野における実施標準を用いて製剤化される。注射または注入などによる静脈内投与に適した液剤は特に有用である。
【００７７】
滅菌注射溶液は、活性のある化合物を必要な量で適切な溶媒中に上述の成分の１つまたは組み合わせと組み込んだ後、必要に応じて滅菌精密濾過を組み込むことによって調製することができる。概して、分散液は、活性のある化合物を、塩基性分散媒体と先に列挙し
たものに由来する必要な他の成分とを含有する滅菌済みビヒクルへと組み込むことによって調製される。調製のための滅菌粉末の場合、あらかじめ濾過滅菌した溶液から有効成分及び何らかの追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【００７８】
本明細書中で使用する場合、「有効量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量及び特定の期間にわたり有効な量を指す。組み合わせにおける各薬剤の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、ならびにレシピエントにおいて所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって変化し得る。治療有効量は、薬理学的作用剤の何らかの毒性のあるまたは有害な作用が、治療上有益な作用によって凌駕されるものでもある。
【００７９】
本発明の組み合わせにおける各薬剤の有効量は、いずれかの薬剤を単独でまたは独立して投与することから期待される数を超える多くの枯渇した癌細胞を生じることになっている。
【００８０】
単位剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される対象及び詳細な投与様式に依存して変化することになっている。単一の単位剤形を製造するのに必要な有効成分の量は概して、治療作用を生じる組成物の量であることになっている。概して、１００パーセントのうち、この量は、医薬として許容される担体との組み合わせにおける有効成分の約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、例えば約１パーセント〜約３０パーセントに及ぶことになっている。
【００８１】
マクロファージ刺激剤のうちのいくつかについては、本発明の組み合わせにおいて有用な量は、ヒトの使用のためにすでに承認されている用量であり得る。例えば、インターフェロンガンマは、慢性肉芽腫性疾患の治療または骨粗鬆症の用途に必要とされるものと同様の投与計画を用いて投与することができる。インターロイキン１βについては、すでに再発性黒色腫の治療に承認されている投薬を使用することができる。マクロファージ刺激剤がすでに承認された薬剤である場合、投与のエンドポイントはマクロファージ刺激のためであり、疾患自体を治療するためではないので、承認された用量より低いレベルでの投与を考慮すべきである。
【００８２】
ＳＩＲＰαＦｃ薬及びマクロファージ刺激剤は、連続して、または本質的に同時に投与することができる。すなわち、マクロファージ剤は、薬剤の投与前または投与後に与えることができる。マクロファージ刺激剤が最初に投与されることが望ましく、それによりマクロファージは、ＳＩＲＰαＦｃ薬が投与されたときに刺激される。
【００８３】
組み合わせにおける各薬剤は、当該技術分野で既知の種々の方法のうちの１つ以上を用いて、１つ以上の独立して選択された投与経路を介して個別に投与することができる。当業者によって理解されることになっているように、投与の経路及び／または様式は、所望の結果に応じて変化することになっている。本発明の組み合わせにおけるタンパク質に好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または例えば注射もしくは注入による投与のための他の非経口経路が含まれる。静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、腹腔内、経気管、皮下、皮内（ｓｕｂｃｕｔｉｃｕｌａｒ）、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入などの注射を含む「非経口投与」という句。
【００８４】
一実施形態において、ＳＩＲＰａＦｃ薬は、腫瘍内に投与される。
【００８５】
あるいは、組み合わせにおける薬剤は、点滴注入による、または局所、表皮もしくは粘
膜投与経路による、例えば、鼻内、経口、膣内、直腸内もしくは舌下でなどの非経口経路を介して投与することができる。
【００８６】
投薬治療計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、各薬剤の単回ボーラスを投与してもよく、またはいくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。投与の簡便さ及び投与量の均一性のために、単位剤形において非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書で使用される「単位剤形」は、治療されることになっている対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体に関連して所望の治療作用を生じるように計算された所定量の活性のある化合物を含有する。本発明の投与量単位形態の仕様は、（ａ）活性のある独特の特徴及び達成することになっている詳細な治療作用、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためにこのような活性のある化合物を化合する技術分野に固有の制限によって必要とされ、これに直接的に応じている。
【００８７】
薬剤は、組み合わせで製剤化することができ、それにより、１回の投与、例えば１回の注射または１回の注入バッグの中で組み合わせがレシピエントに導入されることができる。
【００８８】
薬剤組み合わせの投与のために、各薬剤の用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲内であることになっている。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｂ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。単位投与量形態において、ＳＩＲＰαＦｃ薬は、１、２、３、４、５、１０  ２５、５０、１００、２００、２５０、及び５００ｍｇ／用量などの１〜５００ｍｇの薬剤を含むことになっている。これら２つの薬剤は、ほぼ等モル量（＋／１０％）で投与することができる。例示的な治療投与計画は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回または３〜６か月に１回の投与を伴う。本発明の薬剤組み合わせに好ましい投与量投与計画には、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、各薬剤は、以下の投薬計画のうちの１つを用いて同時に与えられる。（ｉ）４週間ごとに６週間の後、３か月ごとに１回、（ｉｉ）３週間ごとに１回、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重で１回、次いで１ｍｇ／ｋｇ体重で３週間ごと。いくつかの方法では、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿融合タンパク質濃度を達成するように調整される。
【００８９】
ＳＩＲＰａＦｃ薬は、赤血球への無視できる結合を示す。したがって、他のＳＩＲＰαＦｃ薬が使用される薬剤の組み合わせを用いて投与する場合、ＲＢＣ「シンク」を考慮する必要はない。ＲＢＣの結合する他のＳＩＲＰαＦｃ薬と比較して、本発明のＳＩＲＰａＦｃ融合体は、ＣＤ４７抗体などの、ＲＢＣ結合性となる薬剤に必要な用量の半分未満である用量で有効であり得ると推定される。そのうえ、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＩＲＰα媒介シグナルの専用のアンタゴニストであり、これは、当該融合タンパク質への結合の際に無視できる程度のＣＤ４７拮抗を示すからである。したがって、薬剤によって誘導される何らかの刺激を説明することは、医学的に有用な単位投与量投与計画を確立する際には必要はない。
【００９０】
組み合わせにおける各薬剤は、持効放出性製剤として投与することもでき、この場合、必要とされる投与は相対的に少なくなる。投薬量及び頻度は、患者における融合タンパク質の半減期によって異なる。投薬量及び投与頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防的用途において、相対的に低い用量が、長期間にわたって相対的に低い頻度の間隔で投与される。一部の患者は、余生のために治療を受け続ける。治
療的用途において、相対的に短い間隔で相対的に高い投与量が時には必要となり、疾患の進行が低下または終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な寛解を示すまで、時々必要とされる。その後、予防的投与計画を用いて患者を治療することができる。
【００９１】
この薬剤の組み合わせは、種々のＣＤ４７＋疾患細胞を「治療する」ために有用である。治療は、標的疾患細胞の枯渇、すなわち、例えば腫瘍の大きさもしくは分布の低下、より直接的には循環腫瘍細胞または固形腫瘍細胞の数の減少において明らかにされる細胞の数の減少をもたらすことができる。「ＣＤ４７＋」という用語は、本発明のポリペプチドによる結合を標的とする細胞の表現型に関して使用される。ＣＤ４７＋である細胞は、親和性リガンドとしてＣＤ４７抗体を用いて、フローサイトメトリーによって特定することができる。適切に標識されたＣＤ４７抗体が、この用途のために市販されている（例えば、クローンＢ６Ｈ１２はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能である）。ＣＤ４７表現型について検査された細胞は、特に、内在性ＣＤ４７＋癌細胞を有すると疑われる対象から採取した血液試料を含む標準的な腫瘍生検試料を含むことができる。療法の標的として特に関心対象のＣＤ４７疾患細胞は、ＣＤ４７を「過剰発現する」ものである。これらのＣＤ４７＋細胞は、典型的には疾患細胞であり、所定のタイプの細胞についての正常なＣＤ４７密度を超える表面上の密度でＣＤ４７を提示する。ＣＤ４７過剰発現は、異なる細胞タイプにわたって変化することになっているが、本明細書で例示されるようなフローサイトメトリーによって、または免疫染色によってまたは遺伝子発現分析もしくはこれに類するものによって、相手細胞のタイプについて正常であるＣＤ４７表現型を有する相手細胞上で測定可能なレベルよりも大きな程度まで、測定される何らかのＣＤ４７レベルを指すよう、本明細書で意味される。
【００９２】
ＣＤ４７を過剰産生する細胞には、特に液体腫瘍及び固形腫瘍を含むＣＤ４７＋癌細胞が含まれる。固形腫瘍は、本発明の薬剤の組み合わせを用いて治療して、その大きさ、数または成長速度を低下させ、癌幹細胞の増殖を制御することができる。このような固形腫瘍には、膀胱、脳、乳房、肺、結腸、卵巣、前立腺、肝臓及び他の組織において同様にＣＤ４７＋腫瘍が含まれる。１つの実施形態において、薬剤の組み合わせは、血液学的癌の成長または増殖を抑制するために使用される。本明細書で使用する場合、「血液学的癌」は、血液の癌を指し、とりわけ、白血病、リンパ腫及び骨髄腫を含む。「白血病」は、感染と戦う上で有効ではないあまりにも多くの白血球ができ、したがって血小板及び赤血球などの血液を構成する他の部分を締め出す血液の癌を指す。白血病の症例が急性または慢性に分類されることが理解される。ある特定の形態の白血病は、例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）、及び骨髄異形成症候群であり得る。「リンパ腫」とは、とりわけホジキンリンパ腫、無痛性及び侵襲性の両非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞及び大細胞）を指し得る。骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞性骨髄腫、重鎖骨髄腫、及び軽鎖またはベンス・ジョーンズ骨髄腫を指し得る。
【００９３】
いくつかの実施形態において、薬剤の組み合わせを用いて治療される血液学的癌は、好ましくは急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性リンパ球性白血病、慢性リンパ性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、及び骨髄異形成症候群、好ましくはヒト急性骨髄性白血病から選択されるＣＤ４７＋白血病である。
【００９４】
他の実施形態では、ＳＩＲＰαＦｃタンパク質を用いて治療された血液学的癌は、ホジキンリンパ腫、無痛性及び侵襲性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リン
パ腫（小細胞及び大細胞）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞性骨髄腫、重鎖骨髄腫、及び軽鎖またはベンス・ジョーンズ骨髄腫ならびに骨髄肉腫から選択されるＣＤ４７＋リンパ腫または骨髄腫である。
【００９５】
一実施形態において、癌は菌状息肉腫である。
【００９６】
ＳＩＲＰαＦｃとマクロファージ極性化とを含む併用療法は、アジュバント療法におけるような手術などの標的適応症の治療において有用な何らかの他の作用剤または治療法とともに、あるいは術前補助療法におけるような追加の化学療法または放射線療法とともに利用することもできる。
【実施例】
【００９７】
Ｔｒｉｌｌｉｕｍ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．は、（１）対照Ｆｃ［ヒトＩｇＧ１領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）］、及び（２）配列番号３に示される、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域に融合したヒトＳＩＲＰａバリアント２のＶ領域を含むヒトＳＩＲＰａＦｃ、と命名された可溶性ＳＩＲＰａの形態として、あらかじめ製剤化されたＳＩＲＰαＦｃ薬及び対照を提供し、これらは使用するまで−８０℃で保存された。
【００９８】
実施例１
正常な健常ヒトドナーからヘパリン化全血を得（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、すべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ密度勾配（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で単離し、ＣＤ１４抗体でコーティングしたＭｉｃｒｏＢｅａｄの分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた陽性選択によってＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を単離した。２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で少なくとも１０日間培養することにより、単球をマクロファージへ分化させた。食作用アッセイの前日に、単球由来マクロファージをＭ−ＣＳＦ培地中で未処理のままにしておく（Ｍ０）か、またはＭ１として２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ及び３００ｎｇ／ｍＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、Ｍ１＋ＬＰＳとして５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−γ及び５０ｎｇ／ｍＬ
ＬＰＳ（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｍ２ａとして２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、Ｍ２ｂとして２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び５０ｕｇ／ｍＬの熱凝集ヒトＩｇＧ（ＨＡＧＧ）、またはＭ２ｃとして２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１０（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を用いて一晩処理した。翌日、酵素非含有細胞解離緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてマクロファージを収集した。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）を、バイオレット増殖色素４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、丸底非組織培養物で処理した９６ウェルプレート中のこれらの６サブセットは１：５のエフェクター：標的比で標識した。マクロファージ及び腫瘍細胞を、ＳＩＲＰａＦｃまたは対照Ｆｃタンパク質の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で２時間共培養した。その後、細胞をヒトＦｃ受容体結合阻害剤（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロッキングし、次に近赤外生存／死滅固定可能な死細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１４（６１Ｄ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＥ結合抗ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた染色を行った。細胞を洗浄し、安定化固定液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターで取得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。マクロファージを、単一のＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋生細胞と同定した。二重線はＳＳＣ−Ｗ及びＳＳＣ−Ｈ差別によって除外した。食作用％を、ＶＰＤ４５０＋であるマクロファージの％として評価した。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて対形成されていないｔ検定とアイソタイプ対照とによって計算し
た（ｐ＊＊＊＜０．００１）。
【００９９】
結果を図１に示す。示すように、１μＭのＳＩＲＰａＦｃを用いた腫瘍細胞上のＣＤ４７の遮断は、６つのマクロファージサブセットすべてによってＤＬＢＣＬトレド細胞株の食作用を増大させ、Ｍ１（±ＬＰＳ）及びＭ２ｃのＭＤＭは、Ｍ０、Ｍ２ａ及びＭ２ｂのサブセットと比較してＳＩＲＰαＦｃ誘導性食作用に優れていた。
【０１００】
実施例２
極性化したＭＤＭの食作用能力を駆動するものをさらに理解するために、本発明者らは６つの明確に極性化したマクロファージ上でのＦｃγＲ発現を分析した。
【０１０１】
実施例１に教示されるように、マクロファージを調製した。次に、近赤外生存／死滅固定可能な死細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１６（クローンＣＢ１６）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３２（クローンＦＬ１８．２６）及びＶ４５０結合抗ＣＤ６４（クローン１０．１）を、３つの独立したカクテル中で用いて染色した。細胞を洗浄し、安定化固定剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁し、データをＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメトリー機で取得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。マクロファージは、単一の生細胞と同定した。二重線はＳＳＣ−Ｗ及びＳＳＣ−Ｈ判別によって除外した。１μＭのＳＩＲＰαＦｃ処理後のマクロファージ食作用のパーセントを図１に説明する通り分析し、ＣＤ６４の蛍光強度中央値に対してプロットした。
【０１０２】
結果を図２Ａに要約する。Ｍ２ｃは最高レベルのＣＤ１６及びＣＤ３２を発現するのに対し、Ｍ２ｂは最低レベルのＣＤ３２を発現することが認められた。より興味深いことに、ＣＤ６４レベルは、非常に可変的であり、Ｍ１が最も高いレベルのＣＤ６４を発現し、Ｍ１（＋ＬＰＳ）及びＭ２ｃがそれに続き、ＳＩＲＰαＦｃに対する応答性と相関するパターンであることが認められた。％食作用を１０名の独立したドナーにわたって種々のマクロファージサブタイプにわたったＣＤ６４に対してプロットすると、本発明者らは、高親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）のＭＤＭ発現とＳＩＲＰαＦｃ処理後の食作用活性との間にｒ２＝０．５３（図２Ｂ）の正の相関を観察したのに対し、％食作用とＣＤ３２発現またはＣＤ１６発現との間には有意な相関は認められなかった。
【０１０３】
実施例３
正常な健常ヒトドナーからヘパリン化全血を得（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、すべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ密度勾配（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にわたって単離し、ＣＤ１４抗体でコーティングしたＭｉｃｒｏＢｅａｄ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて陽性選択によりＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を単離した。２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充したＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で少なくとも１０日間培養することにより、単球をマクロファージへ分化させた。マクロファージを洗浄し、２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）または５０ｕｇ／ｍＬの熱凝集ヒトガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）でそれぞれ１日培養することにより、Ｍ０、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂへと極性化した。極性化の翌日、極性化培地を洗い流し、細胞を２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮα２ａ（ＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１０（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０ｕｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｕｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）または１０ｕｇ／ｍＬのＯＤＮ２３９５  ＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて一晩処理した。翌日、マクロファージをフローベー
スの食作用アッセイのために無酵素細胞解離緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて収集した。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株トレド（Ｔｏｌｅｄｏ）をバイオレット増殖色素４５０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識し、１：５のエフェクター：標的比で、丸底非組織培養物で処理した９６ウェルプレート中で再極性化したマクロファージへ添加した。マクロファージ及び腫瘍細胞を、ＳＩＲＰａＦｃまたはＴＴＩ−４０２、対照Ｆｃタンパク質の存在下で３７℃、５％ＣＯ２で２時間共培養した後、ヒトＦｃ受容体結合阻害剤（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で遮断し、近赤外生存／死滅固定可能な死細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１４（６１Ｄ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＰＥ結合抗ヒトＣＤ１１ｂ（ＩＣＲＦ４４，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、洗浄し、安定化固定液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で再懸濁した。細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターで取得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。マクロファージは、単一のＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋生細胞と同定した。二重線はＳＳＣ−Ｗ及びＳＳＣ−Ｈ差別によって除外した。食作用は、ＶＰＤ４５０＋であるマクロファージの％として評価した。統計的有意性は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、対形成していないｔ検定対アイソタイプ対照によって計算した。
【０１０４】
結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。（統計的有意性は星印で示されている：＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１。）Ｍ０、Ｍ２ａ及びＭ２ｂのＭＤＭが、ＳＩＲＰａＦｃに応答してＭ１（±ＬＰＳ）及びＭ２ｃと比較して低い食作用能力を示すことが実証された（図１）。それゆえ、これらの３つのマクロファージサブセットを非常に食作用性のあるＭＤＭへと再極性化する試みにおいて、種々のサイトカイン及びトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを使用した。Ｍ０、Ｍ２ａ、及びＭ２ｂが本質的に著しく可塑性であることが認められた。ＩＦＮと、ＩＦＮαと、ＩＬ−１０と、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、Ｒ８４８を含むがＣｐＧは含まないトール様受容体アゴニストとを含むサイトカインを用いた再極性化による刺激の際に、ＳＩＲＰａＦｃに対する応答性を高めることができる。
【０１０５】
実施例４
正常な健常ヒトドナーからヘパリン化全血を得（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、すべてのドナーからインフォームドコンセントを得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ密度勾配（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で単離し、ＣＤ１４抗体でコーティングしたＭｉｃｒｏＢｅａｄ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて陽性選択によりＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を単離した。２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充したＸ−ＶＩＶＯ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で少なくとも１０日間培養することにより、単球をマクロファージへと分化させた。２０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）または５０ｕｇ／ｍＬの熱凝集ヒトガンマグロブリン（ＨＡＧＧ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）をそれぞれ用いて１日培養することにより、マクロファージを洗浄し、Ｍ０、Ｍ２ａ及びＭ２ｂへと極性化した。極性化の翌日、極性化培地を洗い流し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮａ２ａ（ＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１０（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、１０ｕｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、１ｕｇ／ｍＬのＬＰＳ（ＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｕｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、または１０ｕｇ／ｍＬのＯＤＮ２３９５  ＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いて一晩処理した。翌日、ＣＤ１６、ＣＤ３２及びＣＤ６４発現の分析のために、無酵素細胞解離緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてマクロファージを収集した。マクロファージをヒトＦｃ受容体結合阻害剤（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でブロッキングし、３つの独立したカクテルの中の近赤外生存／死滅固定可能な死細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１６（クローンＣＢ１６
）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３２（クローンＦＬ１８．２６）及びＶ４５０結合抗ＣＤ６４（クローン１０．１）を用いて染色した。細胞を洗浄し、安定化固定剤（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁し、データをＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメトリー機で取得し、データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。マクロファージは、単一生細胞と同定した。二重線は、ＳＳＣ−Ｗ及びＳＳＣ−Ｈ差別によって除外した。
【０１０６】
代表的な結果を図４に示す。Ｍ０、Ｍ２ａ及びＭ２ｂのＭＤＭは、ＳＩＲＰαＦｃに応答してＭ１（±ＬＰＳ）及びＭ２ｃと比較してわずかに低い食作用能を示すことが実証された（図１）。それゆえ、これらの３つのマクロファージサブセットを非常に食作用の高いＭＤＭに再極性化するために、種々のサイトカイン及びトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを使用した。Ｍ０、Ｍ２ａ、及びＭ２ｂは本質的に著しく可塑性であることが認められた。ＩＦＮαと、ＩＦＮγと、ＩＬ−１０と、ポリ（Ｉ：Ｃ）を含むが、ＬＰＳ、Ｒ８４８及びＣｐＧは含まないトール様受容体アゴニストを含むサイトカインによる一晩の刺激及び再極性化の際に、ＣＤ６４のそれらの発現を高めることができる。
【０１０７】
図５Ａ〜図５Ｃに示すように、ＳＩＲＰａＦｃ（配列番号３）及びＩＦＮ−γの影響を以下のように検査した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ中の１×１０７個のトレド細胞を０日後にＳＨｒＮ  ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（１群あたりｎ＝９匹）の右腹側部に皮下移植した。マウスは平均腫瘍サイズがおよそ２６０ｍｍ３で無作為化され、ＳＩＲＰａＦｃ１ｍｇ／ｋｇまたはＩＦＮｇ０．２５ｍｇ／ｋｇまたはこれら２種の組み合わせまたはビヒクルを腫瘍内（ＩＴ）注射された。組み合わせ治療において、ＩＦＮｇをＳＩＲＰａＦｃの前日に投与した。ＩＦＮｇ及び／またはＳＩＲＰａＦｃまたはビヒクルの投与は、最初の２回の投与の間に毎週実施し、頻度は２回目の投与後に週２回に増やした。本研究は、腫瘍接種後４４日目（ビヒクル処置マウスのすべてがエンドポイントに達した２日後）に終了した。図５Ａにおいて、各処置群の標準平均偏差を有する平均腫瘍体積が示されている。１群当たり２５％以上のマウスが屠殺にされたときに曲線は終止した。投薬計画は、逆三角形で示された。図５Ｂは、腫瘍を有するマウスの生存を示す。生存曲線の統計分析は、対数順位検定を用いて実施し、＊を示す場合。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１とした。図５Ｃは、各処置群の個々の腫瘍成長スパイダープロットを示す。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に説明されているが、当業者には、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、変形が可能であることが理解されることになっている。本明細書中に開示されるすべての文献は、参照により組み込まれる。
【図１】
2019511552.tif 000002
【図２Ａ】
2019511552.tif 000003
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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