(57)【要約】  本開示は、例えば、電気化学的検査において新規のＬＥおよび／またはＨＮＥ基質を用いることによって、活性白血球細胞の存在を測定するための組成物、方法および試験装置に関する。
2019515681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ、式ＩＩおよび式ＩＩＩのうちの１つで表される白血球酵素基質を含む組成物：
【化１】
2019515681.tif 000013
ここで、Ａはエステル切断部位でアシル基であり、Ｂは酸化還元反応に関与することができる部位であり、Ｃはアルコールまたはアミン保護基である；
【化２】
2019515681.tif 000014
ここで、Ｘ１およびＸ２は独立してＯまたはＮＲａであり、ＲａはＨ、アルキルまたはアリール基であり、
Ｙ１およびＹ２は独立してＯまたはＮＲａであり、
Ｒ１とＲ２は独立してアルキルまたはアリール基であり、
Ｒ３とＲ４は独立してアルキル、保護基またはペプチド部分であり、
環上のＲ５の各々は独立してハロゲン原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基（トリフルオロＣ１−Ｃ６アルキルを含む）、Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルオキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルケニルオキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルキニルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ基、モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基、シアノＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基、シアノＣ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシイミノＣ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基、ニトロ基、またはシアノ基であり、
ｎは０、１、２、３または４である；
【化３】
2019515681.tif 000015
ここで、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４は、酵素活性部位として働くコアテトラペプチド骨格配列を表し、Ｂは、酸化還元反応に加わることのできる部位を含み、Ｃはアシル基を含む。
【請求項２】
前記白血球酵素基質が式Ｉで表される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ａが、アミノ基およびエーテル基のうちの１つを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｂが、フェノールの誘導体、キノン、ヒドロキノン、置換キノン、および置換ヒドロキノンのうちの１つを含む、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｃがトシル保護基を含む、請求項２乃至４の何れか１項に記載の組成物。
【請求項６】
酸素結合Ｂがアミノ基で置換されている、請求項２乃至５の何れか１項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｂが、フェニレンジアミンまたは置換フェニレンジアミンのうちの１つを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ａが、アミノ基およびエーテル基のうちの１つを含む、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｃがトシル保護基を含む、請求項６乃至８の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記白血球酵素基質が、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネートまたは４−（（（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノエートを含む請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記白血球酵素基質が式ＩＩＩで表される請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４が、ＡＡＰＶ（配列番号１）又は本質的に配列番号１からなり保存的置換を有するペプチド配列である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｂが、フェノール、キノン、ヒドロキノン、置換キノン又は置換ヒドロキノン誘導体を含む、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｃが、Ｎ−メトキシスクシニルを含む、請求項１１乃至１３の何れか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記白血球酵素基質が、３−{[（１Ｓ）−１−{[（２Ｓ）−１−（５−{[（１Ｓ）−１−（{４−[（２Ｓ）−２−（{１−[（２Ｓ）−２−[（２Ｓ）−２−（３−カルボキシプロパンアミド）プロパンアミド]プロパノイル]ピロリジン−２−イル}ホルムアミド）−３−メチルブタンアミド]フェニル}カルバモイル）−２−メチルプロピル]カルバモイル}イミダゾリジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}プロパン酸を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
ａ）請求項１乃至１５の何れか１項に記載の白血球酵素基質、およびｂ）電気化学的測定装置を含む電気化学的検査。
【請求項１７】
前記電気化学的測定装置が、ｉ）作用電極、ｉｉ）参照電極、およびｉｉｉ）補助電極を含む、請求項１６に記載の電気化学的検査。
【請求項１８】
白血球酵素を含む試料を、検査において請求項１乃至１５の何れか１項に記載の白血球酵素基質と接触させることを含む、サンプル中の白血球酵素を検出する方法。
【請求項１９】
前記検査が電気化学的検査である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検査が内部較正電気化学的連続酵素検査（「ＩＣＥＣＥＡ」）である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項１８乃至２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的サンプルが、尿、痰、滑液、腹水、胸膜液、心膜液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および中耳液のうちの１つを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的サンプル中の白血球酵素の存在が、前記サンプル中の白血球の存在を示す、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプル中の白血球の存在が、前記サンプルが採取された患者が感染していることを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染が、人工関節感染症（ＰＪＩ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、および自発性細菌性腹膜炎（ＳＢＰ）のうちの１つを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
感染の危険性がある患者をスクリーニングする方法であって、電気化学的検査によって白血球酵素の存在を検出することを含み、
ｉ．白血球酵素の基質への、白血球酵素の反応物または生成物の第１のアリコートの添加と、
ｉｉ．電気化学的検査の電極を流れる電流の最初の測定と、
ｉｉｉ．白血球酵素の基質への、白血球酵素の反応物または生成物の少なくとも１つの更なるアリコートの添加と、
ｉｖ．電気化学的検査の電極を最初に流れる電流の２回目の測定と、
ｖ．白血球酵素の基質への白血球酵素の添加と、
ｖｉ．電気化学的検査の電極を最初に流れる電流の３回目の測定、
の工程を含み、白血球酵素の基質は、請求項１乃至１５の何れか１項に記載の白血球酵素基質を含む、方法。
【請求項２７】
感染の危険性がある患者をスクリーニングする方法であって、電気化学的検査によって白血球酵素の存在を検出することを含み、
ｉ．白血球酵素の基質への、白血球酵素の第１のアリコートの添加と、
ｉｉ．電気化学的検査の電極を流れる電流の最初の測定と、
ｉｉｉ．白血球酵素の基質への、白血球酵素の少なくとも１つの更なるアリコートの添加と、
ｉｖ．電気化学的検査の電極を最初に流れる電流の２回目の測定と、
ｖ．白血球酵素の基質に対する白血球酵素の反応物または生成物と、
ｖｉ．電気化学的検査の電極を最初に流れる電流の３回目の測定、
の工程を含み、白血球酵素の基質は、請求項１乃至１５の何れか１項に記載の白血球酵素基質を含む、方法。
【請求項２８】
白血球酵素の基質が電解質溶液中に存在する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記電気化学的検査が、内部較正電気化学的連続的酵素検査（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む、請求項２６乃至２８の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３１１，４０５号、及び２０１６年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／３５２，５６０号に基づく優先権を主張するものである。これらの開示の全体が参考として取り入れられている。
【発明の分野】
【０００２】
本開示は、試験サンプル内の白血球細胞の活性を決定するための、電気化学的検査の新しい適用に関する。特に、本開示は、活性を有する白血球細胞から放出される酵素、特に、感染症を発症するリスクがある患者における、白血球エステラーゼ及びヒト好中球エラスターゼの活性を決定する新しい方法及びキットに関する。
【発明の背景】
【０００３】
尿中の異常に多数の白血球の存在は、感染過程の指標として一般的に用いられている。歴史的に、検査者は、顕微鏡下における、手作業の目視による計測に頼ってきた。この目視の技術は、泌尿生殖器感染症の発見のためのディップスティック検査に大きく取って代わられてきた。このような商業的な「ディップスティック」検査の大多数において、酵素である白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）の活性が、活性を有する白血球細胞の存在の代替として用いられている。また、ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）検査は、男性の尿道感染の診断において非常に高い感度を有することが報告されている。
【０００４】
既知のＬＥ検査は発色するものであり、酵素活性の存在は、色の変化により報告される。一般的に、色試験紙は、３０ｎｇ／ｍＬから１５００ｎｇ／ｍＬを超えるＬＥの濃度を示す、増加する色強度（ゼロから２＋／３＋）の３〜４増分を有するカラーチャートに適合させることができる。しかし、比色検査には明確な不利な点がある。たった３〜４つの利用可能な色強度の増分では、白血球エステラーゼ濃度の違いの分解はとても困難である。更に、このような色の増分の分類における検者間及び検者内信頼性は乏しい。これは、ディップスティックの結果が確定的でない場合に特に当てはまり（微量、又は１＋）、このような場合の試験結果は治療法の決定をするに際して余りに信頼性に欠けるものである。このように、ディップスティックの結果の利用は白血球エステラーゼ活性が極めて高い場合に限られる。また、尿の色を変化させるあらゆる物質（例えば、ニトロフラントイン、フェナゾピリジン）も、ディップスティックの測定値に影響を与える。
【０００５】
近年、白血球エステラーゼ試験は、関節、肺、腹部、または中耳の滲出液等の漿液を用いた応用について、医師の関心を呼んでいる。人工関節周囲感染症（ＰＪＩ）の診断には有望な結果が得られているが、比色試験は、血液または破片の存在に起因して１７〜２９％もの試料で実用的ではない。他の体腔でも同様のことが言えるが、吸引は、しばしば透明な液体を常に産生するものではない。更に、比色法による白血球エステラーゼ試験は、血清試料に対して試みることができない。
【０００６】
より最近では、乳酸エステル基質は、ＬＥ検査の感度および速度を改善することが実証されている。アルコール部分はヒドロキシル−ピロール化合物として放出され、次いでジアゾニウム塩と反応して紫色のアゾ染料を生成する。しかしながら、そのような検査は、血液を含む液体または濁った液体の状態における有用性に限界があり、精密で定量的な測定を行うためには、高価な光学センサが必要になる。従って、サンプル中の白血球および白血球酵素を検出するための、改善された基質およびアッセイが緊急に必要となっている。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本開示は、感染の危険性がある患者、または感染に関連する症状をすでに示している患者の感染をスクリーニング、検出および確認する方法に関する。一実施形態では、この方法は、必要とする被験体から試料を採取し、試料中の白血球マーカーの存在または非存在を検出し、試料中の白血球マーカーの程度および存在に基づいて治療計画を確立する工程に続く。
【０００８】
いくつかの実施形態では、白血球マーカーは、サイトカイン、ケモカイン、酸素および窒素ラジカル、白血球エラスターゼ、白血球エステラーゼ、好中球エラスターゼ、ゼラチナーゼ、ＩＬ−１β、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシンＡやカテプシンＢ等のカテプシン、ホスホリパーゼＡやホスホリパーゼＢ等のホスホリパーゼ等のマーカーの１つまたは任意の組み合わせであり得る。
【０００９】
一態様では、本開示は、白血球酵素または特に好中球酵素基質を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、白血球酵素は、白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）を含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は、ＬＥ基質を含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）を含む。いくつかの実施形態では、白血球酵素基質はＨＮＥ基質を含む。 別の実施形態では、組成物は、ＬＥ基質とＨＮＥ基質の両方を含む。さらに別の実施形態では、組成物は、ＬＥおよびＨＮＥよりも、他の酵素またはバイオマーカーに特異的な更なる基質を含み得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、基質はＬＥまたはＨＮＥに特異的である。いくつかの実施形態では、基質は、以下に示す式Ｉで表される。
【００１１】
【化１】
2019515681.tif 000003
式Ｉ
【００１２】
ここで、Ａはエステル開裂部位でアシル基を決定し、Ｂはレドックス反応に関与することができる部分を含み、Ｃはアルコールまたはアミンブロック基を含む。いくつかの実施形態では、Ａはアミノ基を含む。いくつかの実施形態では、Ａはエーテル基を含む。いくつかの実施形態では、Ｂはレドックス活性アルコール中間体を含む。いくつかの実施形態では、Ｂはキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂはヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、置換キノンまたは置換ヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはトシル保護基を含む。いくつかの実施形態では、式ＩのＢの連結酸素はアミノ基で置換されている。さらなる実施形態では、Ｂはフェニレンジアミンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは置換フェニレンジアミンを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＬＥ基質は、以下に示す式ＩＩで表される化合物を含む。
【００１４】
【化２】
2019515681.tif 000004
式ＩＩ
【００１５】
Ｘ１およびＸ２は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲａである。ＲａはＨ、アルキル基またはアリール基である。Ｘ１及びＸ２は、いずれも酸素又はいずれもＮＲａであることができる。あるいは、Ｘ１およびＸ２の一方は酸素であり、他方はＮＲａである。
【００１６】
Ｙ１およびＹ２は独立してＯまたはＮＲａである。Ｒａは上記の通りである。Ｙ１及びＹ２は、いずれも酸素又はいずれもＮＲａであることができる。あるいは、Ｙ１およびＹ２の一方は酸素であり、他方はＮＲａである。
【００１７】
Ｒ１およびＲ２は独立してアルキルまたはアリール基または置換アルキル、置換アリールまたは保護基である。いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２はともにメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２はトシルであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２はトシルであってもよい。
【００１８】
Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルキル、保護基またはペプチド部分である。保護基の例として、トシル、ベンゾイル、ベンジル、トリメチルシリル、[ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル]、カルボベンジロキシ、tert−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを含む。一実施形態では、Ｒ４はトシルであってもよい。ペプチド部分は、天然及び/又は非天然アミノ酸の任意の組み合わせを含むことができる。
【００１９】
環上のＲ５の各々は独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基（トリフルオロＣ１−Ｃ６アルキルを含む）、Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルオキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルケニルオキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルキニルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ基、モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基、シアノＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基、シアノＣ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシイミノＣ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基、ニトロ基、又はシアノ基である。ｎは０、１、２、３、又は４である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ＬＥ基質は、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、LE基質は４−（（（Ｓ）−2−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノアートを含む。いくつかの実施形態では、ＬＥ基質は、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネートおよび４−（（（S）−２−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノエートを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、ＨＮＥ基質は以下に示す式ＩＩＩで表される化合物を含む。
【００２２】
【化３】
2019515681.tif 000005
式ＩＩＩ
【００２３】
ここで、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４は、酵素活性部位として働くコアテトラペプチド骨格配列を表し、Ｂはレドックス反応に関与することができる部分を含み、Ｃはアシル基を含む。いくつかの実施形態では、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４はＡＡＰＶ（配列番号1）を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１は保存的置換を有する。いくつかの実施形態では、Ｂはレドックス活性アルコール中間体を含む。いくつかの実施形態では、Ｂはフェノールの誘導体を含む。Ｂはキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂはヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、置換キノンまたは置換ヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、ＣはＮ−メチルオキシスクシニルを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＨＮＥ基質は、３−{［（１Ｓ）−１−{［（２Ｓ）−１−（５−｛［（１Ｓ）−１−（{４−［（２Ｓ）−２−（{１−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−（３−カルボキシプロパンアミド）プロパンアミド]プロパノイル]ピロリジン−２−イル}ホルムアミド）−３−メチルブタンアミド]フェニル}カルバモイル）−２−メチルプロピル]カルバモイル}イミダゾリジン−１−オキソプロパン−２−イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}プロパン酸を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、白血球酵素基質は検査に含まれる。いくつかの実施形態では、検査は電気化学的検査を含む。別の実施形態では、検査は、電気化学的検査と組み合わせた比色測定ステップを含むことができる。いくつかの実施形態において、電気化学的検査は、内部較正された電気化学的連続的酵素検査（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む。いくつかの実施形態において、電気化学的検査は、本開示の白血球基質および電気化学的測定デバイスを含む。いくつかの実施形態では、電気化学的測定装置は、作用電極、基準電極、および補助電極を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中の白血球酵素の存在を検出し、治療計画を立てる方法に関する。いくつかの実施形態では、試料中の白血球酵素の存在は、試料中の白血球の存在を示す。いくつかの実施形態では、白血球酵素はＬＥを含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、ヒト好中球エラスターゼＨＮＥを含む。いくつかの実施形態において、白血球酵素は、酵素を酵素の基質と接触させることによって検出される。いくつかの実施形態では、基質は、本開示の任意のＬＥ基質である。いくつかの実施形態では、基質は、本開示の任意のＨＮＥ基質である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する白血球酵素の量が定量される。いくつかの実施形態において、試料中の白血球の存在は、感染の指標である。いくつかの実施形態では、感染は尿路感染症（「ＵＴＩ」）を含む。いくつかの実施形態では、感染症は、人工関節感染症（「ＰＪＩ」）を含む。いくつかの実施形態では、感染症は自発性細菌性腹膜炎（「ＳＢＰ」）を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは生物学的サンプルを含む。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、尿、痰、滑液、胸膜液、心膜液、腹腔液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および中耳液のうちの１つを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、検査において白血球酵素を基質と接触させることによって、試料中の白血球酵素の存在を検出するステップに従って、感染を発症するリスクのある患者をスクリーニングする方法である。いくつかの実施形態では、検査は電気化学的検査を含む。いくつかの実施形態において、電気化学的検査は、内部較正された電気化学的連続的酵素検査（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、電気化学的検査において白血球酵素の存在を検出する方法は、白血球酵素の基質に白血球酵素の反応物または生成物の第１のアリコートを添加するステップを含む。いくつかの実施形態では、白血球酵素基質は電解質溶液中にある。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学的検査の電極を流れる電流を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、白血球酵素の基質に白血球酵素の反応物または生成物の少なくとも１つのさらなるアリコートを添加するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学的検査の電極を流れる電流を２回目に測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、白血球酵素の基質に白血球酵素を添加するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学的検査の電極を流れる電流を３回目に測定するステップを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、白血球酵素の第１のアリコートを白血球酵素の基質に添加する工程を含む方法の後に、電気化学的検査において白血球酵素の存在を検出することによって患者をスクリーニングする方法である。いくつかの実施形態では、白血球酵素基質は電解質溶液中にある。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学的検査の電極を流れる電流を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、白血球酵素の少なくとも１つのさらなるアリコートを白血球酵素の基質に添加するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学的アッセイの電極を流れる電流を２回目に測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、白血球酵素の生成物または反応物を白血球酵素の基質に添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、電気化学的アッセイの電極を流れる電流を３回目に測定するステップを含む。
【００３１】
別の態様では、本開示は、最適な基質、結果を最適化するための指示、および任意に、観察された結果に基づいて患者に特異的な治療計画を提供することを含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、最初のヒドロキノン基質および第１のエステル加水分解工程を示す。
【図２】図２は、セミキノン中間体および第２のエステル加水分解工程を表す。
【図３】図３は、最終ベンゾキノン酸化生成物を表す。
【図４】図４は、内部較正された電気化学的連続的酵素検査（ＩＣＥＣＥＡ）において４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニナート（「ＴＡＰＴＡ」）を使用した結果を表す。
【図５】図５は、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニナート（「ＴＡＰＴＡ」）のＮＭＲを表す。
【発明の詳細な説明】
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「a」、「and」および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の意味を含む。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「白血球」は、任意の白血球（「ＷＢＣ」）を指してもよい。白血球は、感染症および侵入する病原体から身体を保護することに関与する免疫系の細胞である。すべての白血球／ＷＢＣは、互いを区別する形態学的特徴に基づいて５つのクラスに分類される。それらには、好中球、好酸球、好塩基球、単球、およびリンパ球が含まれる。好中球は約４０〜７５％の白血球を含み、好酸球は約１〜６％の白血球を含み、好塩基球は１％未満の白血球を含み、単球は約２〜１０の白血球を含み、リンパ球（例えばＢリンパ球およびＴリンパ球）は約２０〜４５％の白血球を含む。
【００３５】
本明細書で使用される「患者」という用語は、処置を施すことができる生物学的システムを指すことができる。生物学的システムは、例えば、個々の細胞、細胞のセット（例えば、細胞培養物）、器官、組織、または多細胞生物体を含むことができる。「患者」は、ヒト患者または非ヒト患者を指すことができる。好ましい実施形態では、患者はヒト患者である。
【００３６】
本明細書で使用する用語「有効量」または「治療有効量」は、治療対象において医学的に望ましい結果を生じさせることができる化合物または薬剤の量を指してもよい。治療方法は、インビボまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬物または治療と組み合わせて実施することができる。治療上有効な量は、１回以上の投与、適用または投薬で投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定されるものではない。
【００３７】
疾患の「治療する」または「治療」という用語は、疾患の兆候または症状を緩和するために、患者（ヒトまたは他のもの）に１つまたは複数の薬物を投与することを含むプロトコルを実行することを指す。緩和は、出現した後および出現した疾患の兆候または症状の前に行うことができる。したがって、「治療する」または「治療」には、疾患の「予防」または「予防」が含まれる。「予防する」または「予防する」という用語は、予防的および／または予防的手段を指し、目的は、標的とされた病的状態または障害を予防または緩徐化することである。
【００３８】
本開示は、活性白血球細胞によって放出される酵素の迅速な検出（相対活性の測定を含む）、例えば、特に白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）およびヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）によって放出される白血球酵素である。
【００３９】
本開示の少なくとも1つの態様において、被験体を感染させるためにスクリーニングする方法が記載され、該方法は、（ａ）感染を発症するリスクのある被験体から組織または体液のサンプルを採取し、（ｂ）ＬＥおよび／またはＨＮＥのうちの少なくとも１つに特異的な少なくとも１つの基質を含み、少なくとも１つの閾値レベルを検出するように適合され、前記少なくとも１つの基質は、ＬＥおよび／またはＨＮＥの少なくとも１つの閾値レベルを検出するように適合され、前記閾値レベルは、感染の存在と相関する検出器にサンプルを注入し、（ｃ）前記サンプル中に存在するＬＥおよび／またはＨＮＥの閾値レベルを確認し、ＬＥおよび／またはＨＮＥのそれぞれの濃度が閾値レベルを超える場合、さらにそのような測定は感染の陽性スクリーニングである。
【００４０】
本開示は、感染が人工関節感染症（ＰＪＩ）である方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＰＪＩの検出のための白血球エステラーゼ（ＬＥ）の閾値レベルは、少なくとも約２０ｐｇ／ｍｌの滑液サンプル中の白血球エステラーゼである。
【００４１】
迅速検出のための組成物および方法は、白血球酵素を検出するための特異的基質、例えば、ＬＥおよびＨＮＥはそれぞれＬＥ基質およびＨＮＥ基質と呼ばれる。迅速検出のための組成物および方法は、白血球酵素を検出するための電気化学的検査、特に内部較正電気化学的連続酵素検査（「ＩＣＥＣＥＡ」）を利用することができるが、必ずしもそのように限定されない。
【００４２】
いくつかの実施形態では、基質はＬＥを検出することができる。このような基質は、ＬＥによって容易に加水分解されて、酸化還元中間体を生成し、検出可能な電気化学的応答を提供することができる。いくつかの実施形態では、ＬＥを検出するための基質（すなわち、「ＬＥ基質」）は、以下に示す式Ｉで表すことができる。
【００４３】
【化４】
2019515681.tif 000006
式Ｉ
【００４４】
Ａは白血球エステラーゼに対する酵素特異性を有するエステル開裂部位であるアシル基、例えば、アラニンまたは乳酸塩であり、Ｂは酸化還元反応に関与することができる部分であり、これは電気化学的検査を用いて（例えばＩＣＥＣＥＡを用いて）検出することができる。アシル基Ａは、任意の有効なアミンまたはアルコールブロッキング基Ｃ（例えば、トシル基）を用いて保護される。エステラーゼによる加水分解時に放出されるエステル、部分Ｂのアルコール中間体はレドックス基質であり、レドックス反応に関与する。さらに、式１のＢを連結する酸素は、−ＮＨ連結部分（すなわち、式１に示されるエステル基はアミド基で置換されていてもよい）で置換されていてもよく、本開示の範囲内である。
【００４５】
アミンまたはアルコール封鎖基Ｃは、以下の通りである。すなわち、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＮ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル[（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル]（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えば、ＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＴＩＰＳ）、メチルエーテル、およびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、カルバメート、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、トリクロロエチルクロロホルメート（Ｔｒｏｃ）、および他のスルホンアミド（例えば、ノシルおよびＮｐｓ）である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、レドックス部分Ｂは、そのヒドロキシル基を介してエステルを形成し得るフェノールの誘導体である。このような中間体は酸化を受けて電子を放出することができる。例えば、必ずしも限定されないが、1つのフェノール誘導体であるヒドロキノンは、２つのヒドロキシル基をパラ立体配座で含む。各ヒドロキシル基は、結合して別個の乳酸エステルを形成することができ、それは独立して白血球エステラーゼの基質である（図１）。得られた二重鎖基質は、白血球エステラーゼ活性のための２つの潜在的な標的部位を有し、基質の分解は段階的である。第１の標的での白血球エステラーゼによるエステル加水分解は、活性部位の分子的妨害のために比較的遅く起こり、しかし、その後の第２の活性部位の加水分解は、より迅速に起こる。これは、非特異的加水分解がカスケードを開始する可能性が低いため、電気化学的検査の特異性を効果的に改善し得る。最初のエステル加水分解ステップの後、酸化反応は、水素原子の除去を伴って電子を放出して、セミキノン乳酸エステル中間体を形成することができる（図２）。残りのエステルを引き続いて加水分解した後、キノンベースの中間体が放出され、さらに酸化してパラ−ベンゾキンを形成することができる。パラベンゾキノンは、低電位で還元され、試料中の他の酸化還元活性種からの干渉を最小限に抑え、検査の選択性を改善し得る。最終生成物を図３に示す。
【００４７】
他の態様では、ＬＥおよびＨＮＥが陽性を示す患者を治療する方法が記載される。一実施形態では、グラム陽性細菌によって引き起こされる重篤な感染症は、現在、これらの病原体の多くが標準の抗菌剤に耐性があるため、治療が困難である。この目的のために、本開示の少なくとも１つの態様は、感染リスクを最小限に抑えるために侵襲的手術の前に患者を予防的に治療することである。少なくとも１つの実施形態では、感染に罹患していると同定された患者に対しては、活動的な感染症に対抗するのに有用である、ペニシリアン、セフロスポリン、テトラサイクリン、ダプトマイシン、チゲサイクリン、リネゾリド、キヌプリスチン／ダルホプリスチンおよびダルババンシンなどの抗菌剤を投与することを含む包括的な治療計画を開始することができる。他の実施形態では、薬物耐性グラム陽性およびグラム陰性による感染症の治療に有用な開発により、ＰＪＩのリスクをスクリーニングまたは検出する方法。
【００４８】
いくつかの実施形態では、Ｂはキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂはヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは、置換キノンまたは置換ヒドロキノンを含む。いくつかの実施形態では、Ｃはトシル保護基を含む。いくつかの実施形態では、式ＩＩのＢ連結酸素は、アミノ基で置換されている。さらなる実施形態では、Ｂはフェニレンジアミンを含む。いくつかの実施形態では、Ｂは置換フェニレンジアミンを含む。
【００４９】
式Ｉの範囲内にある白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）を検出するための基質の２つの具体的で明示的に非限定的な例には、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニネート）及び４−（（（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノイル）オキシ）フェニル（Ｓ）−２−（トシルオキシ）プロパノアート（下記化合物Ｂ）が含まれる。
【００５０】
化合物Ａは本明細書では「ＴＡＰＴＡ」とも呼ばれる。化合物ＡのＮＭＲを図５に示し、これはトシル部分構造およびその結合を示している。化合物Ａおよび化合物Ｂのフェニルエチレンジアミン変異体（すなわち、パラ酸素はＮＨリンカーで置き換えられる）もまた、本開示の範囲内であると考えられ、同様に本開示の電気化学的検査（例えば、ＩＣＥＣＥＡ）に含めるのに適している。
【００５１】
【化５】
2019515681.tif 000007
化合物Ａ
【００５２】
【化６】
2019515681.tif 000008
化合物Ｂ
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＬＥ基質は、以下の式ＩＩに記載の組成物を含む。
【００５４】
【化７】
2019515681.tif 000009
式ＩＩ
【００５５】
Ｘ１およびＸ２は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲａである。ＲａはＨ、アルキル基またはアリール基である。Ｘ１及びＸ２は、両方とも酸素又は両方ともＮＲａであることができる。あるいは、Ｘ１およびＸ２の一方は酸素であり、他方はＮＲａである。
【００５６】
Ｙ１およびＹ２は、独立して、Ｏ、ＳまたはＮＲａである。Ｒａは上記の通りである。Ｙ１及びＹ２は、両方とも酸素又は両方ともＮＲａであることができる。あるいは、Ｙ１およびＹ２の一方は酸素であり、他方はＮＲａである。
【００５７】
Ｒ１およびＲ２は、独立して、アルキルまたはアリール基または置換アルキル、置換アリールまたは保護基である。いくつかの実施形態では、Ｒ１またはＲ２またはその両方がメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ１またはＲ２またはその両方は、トシルであり得る。一実施形態では、Ｒ２はトシルである。
【００５８】
Ｒ３およびＲ４は、独立して、アルキル、トシル、ベンゾイル、ベンジル、トリメチルシリル、[ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル]、カルボベンジルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、またはペプチド部分のような保護基である。一実施形態では、Ｒ４はトシルである。ペプチド部分は、天然及び／又は非天然アミノ酸の任意の組み合わせを含むことができる。
【００５９】
Ｒ２及びＲ４は、以下のものを含むことができる。ベンジル（Ｂｎ）、β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、メチルオキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシトリチル[（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル]（ＭＭＴ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル（Ｐｉｖ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、トリチル（Ｔｒ）、シリルエーテル（例えばＴＭＳ、ＴＢＤＭＳ、ＴＯＭ、ＴＩＰＳ）、メチルエーテルおよびエトキシエチルエーテル（ＥＥ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルボニル（ＭｏｚまたはＭｅＯＺ）、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、カルバメート、３，４−ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ−メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トシル（Ｔｓ）、トリクロロエチルクロロホルメート（Ｔｒｏｃ）、および他のスルホンアミド（例えば、ノシルおよびＮｐｓ）。一実施形態において、保護基は、トシル、ベンゾイル、ベンジル、トリメチルシリル、[ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル]、カルボベンジルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルのいずれか1つであり得る。
【００６０】
環上のＲ５の各々は独立して、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ２−Ｃ６アルケニル基、Ｃ２−Ｃ６アルキニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル基（トリフルオロＣ１−Ｃ６アルキルを含む）、Ｃ２−Ｃ６ハロアルケニル基、Ｃ２−Ｃ６ハロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ６ハロシクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルオキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルケニルオキシ基、Ｃ２−Ｃ６アルキニルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニル基、アミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボニルアミノ基、モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノ基、ヒドロキシＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルチオＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルフィニルＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキルスルホニルＣ１−Ｃ６アルキル基、シアノＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルＣ１−Ｃ６アルキルオキシ基、Ｃ１−Ｃ６ハロアルコキシＣ１−Ｃ６アルコキシ基、シアノＣ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ６アシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシイミノＣ１−Ｃ６アルキル基、カルボキシル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、モノ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）アミノカルボニル基、ニトロ基、またはシアノ基である。ｎは０、１、２、３または４である。少なくとも１つの実施形態において、Ｘ１およびＸ２は、独立して、０またはＮＲａである。ＲａはＨ、アルキル基またはアリール基である。Ｘ１及びＸ２は、両方が酸素又は両方がＮＲａであることができる。あるいは、Ｘ１およびＸ２の一方は酸素であり、他方はＮＲａである。さらに別の実施形態では、Ｙ１およびＹ２は独立して０またはＮＲａである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、基質は、ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）を検出する。いくつかの実施形態において、ＨＮＥを検出するための基質（すなわち、「ＨＮＥ基質」）は、以下に示すように式ＩＩＩに従うことができる。
【００６２】
【化８】
2019515681.tif 000010
式ＩＩＩ
【００６３】
Ａ１からＡ４（すなわち、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４）は、酵素活性部位（すなわち、ヒト好中球エラスターゼ／ＨＮＥの活性部位）として働くコアテトラペプチド骨格配列を表す。Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（ＡＡＰＶ）（配列番号１）のテトラペプチド配列が最も一般的であるが、ＨＮＥに対する基質感受性を向上させるために、４つのペプチド部位のいずれかを天然または非天然アミノ酸で置換することができる。例えば、保存的置換を配列番号１に対して行うことができ、それでもなお本開示の範囲内にある。本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン 、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００６４】
式ＩＩＩ中のＢは、上記式Ｉに示されるＬＥ基質と同様の酸化還元部分を表す。例えば、Ｂは、そのヒドロキシル基を介してエステルを形成することができるフェノールの誘導体、例えば酸化還元活性アルコール中間体を含むことができる。これは、例えば、ヒドロキノン中間体又はヒドロキノン系レドックス基を含むことができる。式ＩＩＩ中のＣは、アシル基、例えば、Ｎ−メトキシスクシニルを表す。アシル基は、ＨＮＥの基質感受性を改善するのに役立ち、いくつかのアシル基、例えばＮ−メトキシスクシニルも基質溶解性を増加させることができる。
【００６５】
式ＩＩＩの範囲内にあるＨＮＥを検出するための基質の特定の明示的に限定されない一例は、３−{[（１Ｓ）−１−{[（２Ｓ）−１−（５−{[（１Ｓ）−１−（{４−[（２Ｓ）−２−（{１−[（２Ｓ）−２−[（２Ｓ）−２−（３−カルボキシプロパンアミド）プロパンアミド]プロパノイル]ピロリジン−２−イル}ホルムアミド）−３−メチルブタンアミド]フェニル}カルバモイル）−２−メチルプロピル]カルバモイル}イミダゾリジン−１−イル）−１−オキソプロパン−２−イル]カルバモイル}エチル]カルバモイル}プロパン酸、すなわち下記の化合物Ｃを含む。
【００６６】
【化９】
2019515681.tif 000011
化合物Ｃ
【００６７】
本明細書に記載されているように、白血球は、本開示の電気化学的検査（すなわち、ＩＣＥＣＥＡ）によって検出および／または定量することができる白血球酵素を産生することができる。
【００６８】
白血球酵素は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／０３６９３０号パンフレットに記載されているように、例えば、ＩＬ−１β、白血球エラスターゼ、白血球エステラーゼおよび／またはゼラチナーゼＢ）およびヒト好中球エラスターゼを含む。白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）は、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）によって産生されるエステラーゼである。ＬＥは、例えば、感染に関連する白血球／ＷＢＣの存在および他の異常に関する尿検査の対象である。ヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）は、ヒト白血球エラスターゼ（「ＨＬＥ」）としても知られ、セリンプロテアーゼである。これはキモトリプシンと同じファミリーに属し、基質活性が広い。ＨＮＥは、本明細書に記載の５つのクラスの白血球のうちの２つである好中球およびマクロファージによって分泌される。ＨＮＥは２１８アミノ酸長であり、２つのアスパラギン結合炭水化物鎖を有する。ＨＮＥにはＩＩａとＩＩｂとみなされる２つの形態がある。
【００６９】
本明細書で使用される用語「サンプル」は、インビボまたはインビトロで得られた生物学的組織または液体起源のサンプルを含む生物学的サンプルを指してもよい。生物学的サンプルは、体液（例えば、漿液、血液、血漿、血清または尿）、器官、組織、画分、および例えばヒトを含む哺乳動物から単離された細胞であり得るが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織を含む生物学的サンプルのセクションを含み得る。生物学的サンプルはまた、生物学的サンプル、例えば生物学的流体（例えば、血液、血清、腹腔液および／または尿）からの抽出物を含み得る。特に重要であるが、明白に限定されないが、尿、喀痰（例えば、嚢胞性線維症と診断された患者）、腹腔液（例えば、肝硬変および腹水を有する患者）および他の漿液、例えば、これらに限定されないが、滑液、胸膜液、心膜液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）および中耳液。
【００７０】
いくつかの実施形態では、白血球の存在、すなわち前記生物学的試料中に存在する白血球酵素（例えば、ＬＥおよび／またはＨＮＥ）の量を検出および／または定量することによって決定される場合、被験体における感染の存在を示すことができる。そのような実施形態は、本明細書に記載の電気化学的検査、特にＩＣＥＣＥＡにおいて、本開示のＬＥおよび／またはＨＮＥ基質を利用することができる。例えば、尿中のＬＥおよび／またはＨＮＥの存在は、尿路感染症（「ＵＴＩ」）を有する被験者を示し得る。同様に、滑液中のＬＥおよび／またはＨＮＥの存在は、例えば人工関節感染症（「ＰＪＩ」）に限定されるものではないが、関節感染を有する被験者を示し得る。感染の存在を示すこれらの例は、本開示の基質の単なる例示的な使用であり、電気化学的検査、例えばＩＣＥＣＥＡにおいて利用されてもされなくてもよいので、それ自体に限定されない。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本開示の基質は、人工関節周囲感染（ＰＪＩ）を有する被験体を示すために使用される。ＰＪＩは、全関節の関節形成手術をもたらす致命的な合併症であり、診断および治療を行う両方の外科医にとって依然として課題である。ＰＪＩの正確かつタイムリーな診断を確立することは、治療上の決定を下す上で非常に重要である。痛みを伴う人工器官を使用している患者にとっては、感染症の存在を除外するか診断するために精密検査を完了することが重要である。ほとんどの場合、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む血清検査は、選択の初期スクリーニング試験である。血清学的マーカーが上昇しているか、感染の疑いが高い患者であっても、次のステップは、滑液の検査のための共同吸引を行うことである。古典的には、滑液の細菌培養がＰＪＩの診断を行うために使用されてきた。細菌培養はそれ自体が十分に敏感ではなく、感染症の３０％も培養陰性であるため、整形外科医は血清検査の結果、滑液白血球数および多形核パーセンテージ、および組織学的分析を行い診断する。残念なことに、細菌培養および伝統的な滑液検査は、結果を得るのに数週間もの日数を要する可能性がある。
【００７２】
したがって、いくつかの実施形態では、痛みを伴う関節から吸引された滑液を、本開示の酵素基質を用いてＬＥおよび／またはＨＮＥ活性について試験する。例えば、これは、本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡ検査の使用によって達成され得る。そのような実施形態では、ＬＥおよび／またはＨＮＥの活性は、絶対濃度の連続測定として報告される。これは、診療現場の意思決定のための結果を数分で得るために、オフィスまたは手術室で行うことができる。
【００７３】
集団データの蓄積に基づいて、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性のレベルを追加の測定基準と組み合わせて、感染が存在する可能性を予測することができる。追加の測定基準には、関節の種類、感染前の病歴、血清検査の結果（ＥＳＲおよびＣＲＰ）が含まれる。外科医は、患者にとって最も適切な治療アルゴリズムを決定するために感染が存在する可能性を考慮することができる。感染が存在する可能性が高いケースでは、人工器官の摘出および抗生物質スペーサーの配置、切開および創面切除、または長期抗生物質抑制などのＰＪＩの治療を、感染の激しさなどに基づいて考慮することができる。感染が存在する可能性が中程度である場合は、外科医は治療の開始または追加の診断結果を待つことを検討することができる。最後に、痛みを伴う人工器官についての他の病因として、感染の可能性が低いか、または感染が主に排除されている場合が考慮され得る。
【００７４】
感染の最初の診断を行うことに加えて、現在の開示の基質は、例えば、新しい人工器官の再移植の正確なタイミングを決定するために、検査（例えば、ＩＣＥＣＥＡ）で使用されるようなＰＪＩの分解能を確立するために用いることができる。ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性のレベルは、血清学的マーカーおよび他の滑液検査に加えて、上記のような治療の成功を決定するために使用され得る。持続的に上昇するＬＥおよび／またはＨＮＥを有する患者の場合、外科医は静脈内の抗生物質の投与を継続するか、または抗生物質スペーサーの交換を試みて、感染の完全解消の見込みを改善することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本開示の基質は、自発的細菌性腹膜炎（ＳＢＰ）を有する被験体を示すために使用される。ＳＢＰは、重篤かつ生命を脅かす合併症であり、肝硬変および腹水を有する患者に比較的一般的なものである。この合併症のある患者では、迅速な診断と抗生物質の早期投与が生存に不可欠であり、院内死亡率は２０％に上る場合がある。腹水を有する患者において、熱の症状、精神状態の変化、および腹部の圧痛は、よく見られるＳＢＰの兆候である。そのような場合、診断的穿刺術が行われ、２５０細胞/ｍｍ３を超える絶対好中球数および／または細菌培養に基づいて診断が行われる。
【００７６】
したがって、いくつかの実施形態では、診断用穿刺から得られた腹水を、本開示の酵素基質を用いてＬＥおよび／またはＨＮＥ活性について試験する。例えば、これは、本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡ検査の使用によって達成され得る。ＬＥまたはＨＮＥの活性は、ＩＣＥＣＥＡ検査を用いて、絶対濃度の連続測定として報告される。ＬＥおよび／またはＨＮＥの絶対濃度は、多くの患者から集められた集団データの蓄積に基づきＳＢＰが存在する確率の計算を行うために絶対的な標準診断基準と比較される。感染の可能性は、治療医に最も適切な治療アルゴリズムを知るために使用することができる。測定されたＬＥまたはＨＮＥのレベルはまた、重要な予後情報を提供することができ、高いレベルである場合には、予後を悪化させることを示す。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本開示の基質は、泌尿生殖器感染としても知られる尿路感染（ＵＴＩ）を有する被験体を示すために使用される。排尿障害や頻尿等の典型的なＵＴＩの症状を有し、膣分泌物や刺激が無い健康な女性の場合、ＵＴＩの診断は、典型的には臨床症状を診ることのみによって行うことができる。反対に、症状がはっきりとしない女性、無症候性の妊娠女性、高齢の患者、および子供は、ＵＴＩのプレテストの信頼性がはるかに低い。本開示は、女性のＵＴＩの検査に限定されない。ＵＴＩの診断のための絶対的な基準は、中流尿培養（１０３-１０５生物以上）または膿尿（１０４個以上の白血球／ｍｌ）である。
【００７８】
したがって、いくつかの実施形態では、症候性患者の中流尿を、本開示の酵素基質を用いて、白血球エステラーゼ（「ＬＥ」）および／またはヒト好中球エラスターゼ（「ＨＮＥ」）活性について試験する。例えば、これは、本明細書に記載のＩＣＥＣＥＡ検査の使用によって達成され得る。集団データに基づいて、感染の可能性は、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性の測定、ならびに特定の症状および患者の特徴（すなわち、年齢、性別、妊娠）の存在等の追加因子の両方に基づいて決定することができる。感染の可能性に応じて、医師は経口抗生物質を投与するか否かを決定することができる。
【００７９】
本開示の臨床応用のための集団データ（感染症を有する患者を示すが、これらに限定されない、ＰＪＩ、ＳＢＰ、および／またはＵＴＩ）は、ＬＥの尺度および／またはＨＮＥ活性を、感染の存在の予測確率へと変換するために用いることができる。試験装置自体は、そのような母集団ベースのデータを収集して配布するための媒体として使用することができる。例えば、電気化学的バイオセンサに接続されたスマートフォン（または類似のデバイス）は、医師が選択された情報を集中データベースに提供することを可能にし、その後、感染尤度の計算を連続的に改善するために使用され得る。バイオセンサは、ＬＥおよび／またはＨＮＥ活性およびそれらの治療アルゴリズムを改善するために使用できる追加の測定基準に基づいて、個々の患者の感染の可能性を外科医に報告することもできる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、白血球酵素を検出するための基質、例えば、ＬＥおよび／またはＨＮＥ基質は、検査に組み込まれる。そのような検査は、例えば、電気化学的検査を含み得る。電気化学的検査は、費用効果が高く、高感度であり、較正プロセスを単純化する。さらに、そのような方法は、血が混じった流体または濁った流体に特に効果的である。好ましい電気化学的検査は、内部較正された電気化学的連続的酵素検査（「ＩＣＥＣＥＡ」）を含む。ＩＣＥＣＥＡにおける本開示のＬＥ基質（「ＴＡＰＴＡ」）の使用は、下記の実施例１に記載されている。ＩＣＥＣＥＡは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７１３およびＵＳ２０１６／００４２０９に一般に開示されており、その開示内容全体が本明細書に組み込まれる。ＩＣＥＣＥＡは、連続実験において、酵素を含まないプレ検査較正と電気化学的酵素検査との組み合わせを利用する。これは、サンプル中に存在する酵素、すなわちＬＥ及びＨＮＥの選択的かつ高感度の測定を可能にする、独特の形状の電流滴定トレースをもたらすと考えられる。
【００８１】
ＩＣＥＣＥＡは、一般に、米国特許出願公開第２０１６／００４０２０９号に記載されているように、以下の方法に従う。最初に、酵素基質（例えば、本開示のＬＥおよび／またはＨＮＥ基質）をバックグラウンド電解質中に配置する。次に、酵素の酵素反応の反応物または生成物を、第１の酵素基質／バックグラウンド電解質に添加し、これが「第１の検査混合物」として記載されるものを作り出す。次いで、第１の検査混合物が形成された後に、電気化学的検査の電極を流れる電流が測定される。次に、酵素（例えば、ＬＥおよび／またはＨＮＥ）を「第１の検査混合物」に加えて「第２の検査混合物」を作製し、電流を所定の時間にわたって再度測定する。酵素活性は、酵素の添加によって引き起こされる経時的な電流の変化に基づいて決定される。最適には、反応物／生成物を酵素基質に添加した後に酵素を添加するのが最適であるが、順序を切り替えることができる、すなわち、酵素を基質に最初に加え、次いで反応物／生成物を加える。
【００８２】
ＩＣＥＣＥＡには、電気化学的測定装置が含まれている。電気化学的測定装置は、作用電極と、参照電極と、補助電極とを含む。電流は作用電極を通して測定される。作用電極は、貴金属電極、金属酸化物電極、炭素同素体からなる電極、または改質電極であってもよい。補助電極は白金線であってもよい。参照電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ／ＮａＣｌまたは任意の他の参照電極であってもよい。電気化学的検査システムは、作用電極および参照電極のみで構成することもできる。電流の変化を測定することは、電流の電流測定トレースを収集することによって行うことができる。
【００８３】
一般に、ＩＣＥＣＥＡにおいて、電気化学的検査系において（電解質中の）酵素基質に反応物／生成物を加えることは以下の工程を含む。最初に、反応物／生成物の第１のアリコートを（電解質中の）酵素基質に添加する。第１のアリコートを加えた後、電気化学的検査系の電極を流れる電流を測定する。反応物／生成物の１つ以上のさらなるアリコートが混合物に加えられ、電気化学的検査システムの電極を流れる電流が再び測定される。好ましくは、反応物／生成物の少なくとも３つのアリコートが、酵素が混合物に添加される前に酵素基質（電解質中）に添加される。あるいは、酵素を混合物に加えた後、反応物／生成物のアリコートを（電解質中の）基質に添加する。
【００８４】
酵素の酵素活性は、所定の時間、所定間隔で反応物／生成物が基質に添加された後に（本明細書に記載されているように、酵素が添加される前、またはその逆）、電気化学的検査システムの作用電極を通って流れる電流を測定することから作成された線の勾配により決定することができる。この方法の利点は、（電解質中の）基質への反応物／生成物の添加および酵素の添加が、同じ電極を用いて同じ容器内で行われることである。
【００８５】
少なくとも１つの実施形態では、バックグラウンド電解質中に酵素基質および他の必要な反応物の溶液、酵素反応のレドックス活性成分の溶液、及び検査された酵素の溶液を含有するカスタマイズされたキットが記載されている。このように、電流測定は、電流測定法を用いた任意の電気化学測定装置と、酵素基質を含む溶液に浸漬された作用電極、参照電極および対電極を有する従来の電気化学セルを使用することによって行われる。作用電極は、基準電極の電位に対して電位Ｅで保持される。電位Ｅは、酵素反応のレドックス活性成分を含む溶液中に存在する種の酸化または還元のいずれかに適切である。実験は、レドックス活性含有溶液の１つまたは複数の既知のアリコート、続いて分析された酵素を含む溶液の１つのアリコートを、酵素基質および他の必要な反応物を含む攪拌溶液に混合し、作用電極を流れる電流を測定することによって実施する。
【００８６】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
本明細書に開示された刊行物は、本発明の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。さらに、提供された公開日は、実際に公開された日付とは異なる可能性があり、それは独立して確認する必要がある。
【００８８】
本明細書に引用されている出願および特許、ならびにそれぞれの出願および特許に引用されている、特許文献または非特許文献である各文献または参考文献（それぞれの発行された特許の出願審査中の「出願引用文献」を含む）、これらの出願および特許のいずれかに対応するおよび／またはこれらに基づく優先権を主張するＰＣＴ出願および外国出願、および、出願引用文献において引用又は参照された各文献は、その全部が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。より一般的には、本明細書中に文書または参考文献が引用されており、本明細書に引用された各文献（製造業者の取扱説明書、指示書などを含む）に引用されている各文書または参考文献は引用により本明細書に明示的に組み込まれる。
【００８９】
以下の非限定的な実施例は、本開示をさらに説明するのに役立つ。
【実施例】
【００９０】
内部較正電気化学的連続的酵素分析（ＩＣＥＣＥＡ）における４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニナートの使用
以下の化合物Ａ（「ＴＡＰＴＡ」とも呼ばれる）の基質、４−（（トシル−Ｌ−アラニル）オキシ）フェニルトシル−Ｌ−アラニナートを、内部較正電気化学的連続酵素検査（ＩＣＥＣＥＡ）による白血球エステラーゼ（ＬＥ）の活性測定のための基質として用いた。結果を図４に示す。
【００９１】
【化１０】
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化合物Ａ
【００９２】
ＩＣＥＣＥＡは、上記の詳細な説明と同様に、米国特許出願第２０１６／００４０２０９号に一般的に記載されているように実施した。簡潔には、プレ検査段階において、酵素基質（「ＴＡＰＴＡ」）の溶液及び必要な反応物を、酵素反応の酸化還元活性成分の溶液と混合することによって、３つの異なる較正ステップを実施した。これらの３つの別個の較正ステップは、図４において太字「ａ」で示されている。較正後、検査段階は、検査された酵素（ＬＥ）の１つのアリコートを酵素基質溶液に添加することによって開始された。このステップは、図４において太字「ｂ」で示されている。酵素反応に続いて、作用電極を流れる電流を測定した。酵素検査では、０&#12316;２５０μｇ／Ｌの範囲のＬＥ濃度について較正した。ＬＥの酵素活性は、ＬＥ濃度に対して線形応答を示し、感染が予測された。
【００９３】
上述の実施例および好ましい実施形態の説明は、特許請求の範囲によって規定される本開示を限定するのではなく、例示として取られるべきである。容易に理解されるように、請求項に記載された本開示から逸脱することなく、上述した特徴の多くの変形および組み合わせを利用することができる。そのような変形は、開示の範囲からの逸脱と見なされず、そのような変形はすべて、以下の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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