(57)【要約】生体試料中のＲＫＩＰタンパク質およびｐ−ＲＫＩＰタンパク質を定量的に測定する方法であって、以下の工程を含む方法：ａ）以下の抗体を２つの別個の担体に共に作用させる工程：ａ１）ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第１のアミノ酸配列を認識する抗体、およびａ２）ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第１のアミノ酸配列を認識する抗体；ｂ）ブロッキング溶液を両担体に添加する工程、ｃ）生体試料を添加する工程；ｄ）各担体に以下の抗体を添加する工程、ｄ１）ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第２のアミノ酸配列を認識する抗体、およびｄ２）ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第２のアミノ酸配列を認識する抗体を添加する工程、ここで前記第１および第２のアミノ酸配列の一方はＲＫＩＰとｐ−ＲＫＩＰとの間で共通であり、他方はセリン１５３のリン酸化を含む配列であるため、ｐ−ＲＫＩＰとＲＫＩＰとの間で異なっている；ｅ）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、前記第２のアミノ酸配列に結合している前記抗体の量に比例した光学的性質の変化を測定できるマーカーを添加する工程；ｆ）２つの試料の光学的性質を測定し、２系列の担体の同様の光学的性質を測定することによって得られる検量線と比較する工程、ここで２系列の担体には以下が順番に添加されている：ｉ）前記系列の第１の系列について、ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列を認識する抗体、および前記系列の第２の系列について、ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列を認識する抗体；ｉｉ）ブロッキング溶液；ｉｉｉ）前記系列の第１の系列について、ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む既知の増加量の組換えハイブリット標準、前記系列の第２の系列について、ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む、既知の増加量の組換えハイブリット標準；ｉｖ）ｐ−ＲＫＩＰ中に存在する前記第２のアミノ酸配列、またはＲＫＩＰ中に存在する前記第２の配列をそれぞれ特異的に認識する抗体；ｖ）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、前記第２のアミノ酸配列に結合している前記抗体の量に比例した光学的性質の変化を測定できるマーカー。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のＲＫＩＰタンパク質およびｐ−ＲＫＩＰタンパク質を定量的に測定する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）以下の抗体を２つの別個の担体に共に作用させる工程：
ａ１）ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第１のアミノ酸配列を認識する抗体、および
ａ２）ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第１のアミノ酸配列を認識する抗体；
ｂ）ブロッキング溶液を両担体に添加する工程、
ｃ）前記生体試料を添加する工程；
ｄ）各担体に以下の抗体を添加する工程、
ｄ１）ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第２のアミノ酸配列を認識する抗体、および
ｄ２）ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第２のアミノ酸配列を認識する抗体；
ここで、前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の一方はＲＫＩＰとｐ−ＲＫＩＰとの間で共通であり、他方はセリン１５３のリン酸化を含む配列であるため、ｐ−ＲＫＩＰとＲＫＩＰとの間で異なっている；
ｅ）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、前記第２のアミノ酸配列に結合している前記抗体の量に比例した光学的性質の変化を測定できるマーカーを添加する工程；
ｆ）２つの試料の光学的性質を測定し、２系列の担体の同様の光学的性質を測定することによって得られる検量線と比較する工程、ここで２系列の担体には以下が順番に添加されている：
ｉ）前記系列の第１の系列について、ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列を認識する抗体、および前記系列の第２の系列について、ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列を認識する抗体；
ｉｉ）ブロッキング溶液；
ｉｉｉ）前記系列の第１の系列について、ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む既知の増加量の組換えハイブリット標準、および前記系列の第２の系列について、ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む既知の増加量の組換えハイブリット標準；
ｉｖ）ｐ−ＲＫＩＰ中に存在する前記第２のアミノ酸配列、またはＲＫＩＰ中に存在する前記第２の配列をそれぞれ特異的に認識する抗体；
ｖ）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、前記第２のアミノ酸配列に結合している前記抗体の量に比例した光学的性質の変化を測定できるマーカー。
【請求項２】
ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む前記組換えハイブリット標準が以下に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１記載の方法：
ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ−（リンカー）−ＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡｐＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡ。
【請求項３】
ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む前記組換えハイブリット標準が以下に記載されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１または２記載の方法：
ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ−（リンカー）−ＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡ。
【請求項４】
ＲＫＩＰ中に存在する前記第１の配列およびｐ−ＲＫＩＰ中に存在する前記第１の配列の両方が以下に記載される配列と同じであることを特徴とする、請求項３記載の方法：ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ。
【請求項５】
ＲＫＩＰ中に存在する前記第２の配列がＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡであり、ｐ−ＲＫＩＰ中に存在する前記第２の配列がＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡｐＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記担体がＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェルであること、
工程ｄ）後に以下の工程を導入すること：
ｄ３）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体に特異的なＨＲＰ標識された抗体を各担体に添加する工程、
工程ｉｖ）後に、前記第２のアミノ酸配列を認識する抗体に特異的なＨＲＰ標識された抗体を前記系列のウェルに添加すること、および
前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、光学的性質の変化を測定できる前記マーカーがＴＭＢであり、前記光学的性質が光学濃度であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記担体がクロマトグラフィーカートリッジであること、
前記生体試料をカートリッジの末端に添加すること、
前記第１のアミノ酸配列を認識する前記抗体を、吸収紙から遠位の前記カートリッジの領域において共に作用させること、および
前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体が、吸収紙の近位の領域において前記カートリッジのクロマトグラフ表面に付着していること、および
前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、光学的性質の変化を測定できる前記マーカーが蛍光プローブであり、前記光学的性質が特定の波長における蛍光であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料が、尿、血清、血漿、唾液、気管支肺胞液、脳脊髄液、便、精液、細胞タンパク質抽出物、組織タンパク質抽出物、または細胞培養培地のうち１つであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
腎明細胞がんの診断のための診断方法であって、以下の工程を含む方法：
請求項１〜８のいずれかに記載の方法を用いて、尿試料中のｐ−ＲＫＩＰ量を測定する工程；
ｐ−ＲＫＩＰが尿試料中に存在しない場合に、腎明細胞がんと診断する工程。
【請求項１０】
腎明細胞がんの発生を予測する予後判定方法であって、以下の工程を含む方法：
請求項１〜６のいずれかに記載の方法を用いて、尿試料中のＲＫＩＰ量を測定する工程；
ＲＫＩＰ量が閾値よりも高い場合、良好な予後を推定する工程；
測定されたＲＫＩＰ量が閾値よりも低い場合、良好でない予後を推定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿または他の生体試料中のＲＡＦキナーゼ阻害剤（ＲＫＩＰ）と呼ばれるタンパク質のリン酸化型および非リン酸化型の単一または組合せの定量的評価のための方法に関する。
【０００２】
本発明の分野
ゲノミクス、プロテオミクスおよび分子病理学の向上は、潜在的な臨床価値を有する多くのバイオマーカー候補を生成してきたが、主に学術研究とバイオテクノロジー産業の研究との間の手法および観点の大きな隔たり（これは学術研究とバイオテクノロジー産業の研究の協調を制限する）のために、これらのバイオマーカー候補は日常的にそれほど使用されていない。
【０００３】
潜在的なバイオマーカーの数と市場に到達している開発されたそれらのテストの数との間の大きな差異は、ｐｕｂｍｅｄ検索エンジンを介して、主要な生体液において記述されているバイオマーカーと市場で現在利用されているテストとの間の比較分析を実行することによって認識できる。そのようなバイオマーカーおよび血清のキーワードを入力することによって、百を超える論文がｐｕｂｍｅｄに現れ、総説は７０００を超える。２１０００を超える論文（約２８００が総説である）における泌尿生殖器系の病理学のバイオマーカー研究について理想的な生体液として記述される尿に対して同様のことが起こる。文献に記載されている血清および尿のバイオマーカーの大部分（血清のための７５０００を超える原著論文およびその５０００の総説、ならびに尿のための約１００００の原書および１４００の総説）はタンパク質の性質によるものである。がんに関連する血清および尿のバイオマーカーのみを考慮すると、科学的な原書の数は血清のバイオマーカーについて約３００００、および尿のバイオマーカーについて約４５００に減少する。これらの数はおおよその値として考慮しなければならないとしても、多く研究されているいくつかのバイオマーカーについて、様々な分野および種々の目的におけるそれらの応用を記述した数百の論文が存在することは明白であるため、現在１００種のＥＬＩＳＡテストのみが（様々な新生物の診断、予後判定および／または予測の使用のために承認された多くの腫瘍バイオマーカーとして関連する）市場で利用可能であることは驚くべきことである。
【背景技術】
【０００４】
最近、Powers et al.は、タンパク質が細胞プロセスを制御する最終的なエフェクターであるため、ＤＮＡおよび転写物と比較して、タンパク質は現在もなお、個体の健常な表現型および／または病的な表現型をより正確に記述できる分子であることを強調している。
【０００５】
特に、最近の論文は、腫瘍マーカーにおけるＲａｆキナーゼ阻害剤タンパク質（ＲＫＩＰ）のさらにより重要な役割を報告している。ＲＫＩＰは発達年齢において多くの組織（特に精巣、脳、精巣上体、肝臓および腎臓）で広く発現する。ＲＫＩＰは多くの腫瘍に関連して記述されており、その下方制御が一般に転移の主要なリスクに相関するため、タンパク質の新たな分類である転移抑制因子に導入されている。
【０００６】
ＲＫＩＰの減少はほとんど全ての腫瘍において記述されており、特に前立腺がん、大腸がん、乳がん、メラノーマ、インスリノーマ、肝細胞がん、未分化甲状腺がん、および腎細胞がんにおいて中期および長期生存ならびに再発の発生と相関している。したがってＲＫＩＰは、その発現レベルが低下するほど、腫瘍が悪性および湿潤性となるような予後判定のバイオマーカーであると考えられる。ＲＫＩＰはリン酸化されていない遊離型、またはその二量体化を仲介し、その細胞内および分子標的を変化させるリン酸化型において見出され得る。多くの研究者の最近の注目は、場合により非リン酸化型ＲＫＩＰよりも高い予後判定の能力を示すリン酸化型ＲＫＩＰ（ｐ−ＲＫＩＰ）に移っている。この役割は、肺がん、乳がん、メラノーマおよびより最近には上咽頭がんについて記述されている。
【０００７】
現在までに生じている研究は主要な免疫組織化学技術を用いることによる、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ発現レベルの組織評価に集中している。この技術が分子診断学において最も普及した分析の１つであったとしても、いくつかの重要な制限（例えば、侵襲分析（例えば生検）によって組織を取得する必要性、および一般的には、施設間のばらつきを決定する、結果の主観的な解釈による半定量的な値）がある。この技術のために、全世界の臨床施設で広く承認されている場合でさえ、試料調製に使用される手法を標準化する必要性が未だに存在するため、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの定量が、現在までに利用されていない異なる手法を必要とすることは明らかである。
【０００８】
ＥＬＩＳＡ技術（酵素結合免疫アッセイ）は生化学において広く使用されている免疫学的分析法であり、１以上の抗体（その内１つに酵素が結合する）を用いることによって物質の存在を検出する：このような分析方法は免疫酵素テストに属し、試料中のタンパク質、抗体または抗原の存在を検出および／または定量するために免疫学において主に使用される。
【０００９】
免疫組織化学およびサイトフルオロメトリー(cytofluorimetry)と同様に、ＥＬＩＳＡはより多くのマーカーを高感度および高特異度で同時に分析できる。様々なマーカーを同時に測定できるマルチタンパク質ＥＬＩＳＡテストが存在し、その例は、６種のマーカーの血清レベルを測定することによって、卵巣がんを９５．３％の感度および９９．４％の特異度で同定できるＥＬＩＳＡテストである。この技術の利点には、その定量的な性質、実行の迅速性、試料採取におけるより低い侵襲性に関連する生体液（結果として、患者によるより広い容認）への好ましい応用がある。
【００１０】
ＲＫＩＰレベルを測定するＥＬＩＳＡテストが市場に存在したとしても、これは主な使用の指標として細胞タンパク質抽出物におけるＲＫＩＰの評価を有する。さらに現在まで、ｐ−ＲＫＩＰの定量に特異的なＥＬＩＳＡテストは市場で利用されていない。結局、多くの会社がリン酸化型および非リン酸化型の特定のタンパク質の組合せの定量に有用なＥＬＩＳＡテストを提供したとしても、この方法によってＲＫＩＰ／ｐ−ＲＫＩＰを同時に測定できるテストは市場に存在しない。最先端の技術において、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ発現ウェスタンブロット解析による公知の評価の例が存在するが、これはこの方法を再現可能とせず、かつ／または定量的としない制限を有する。
【００１１】
第１の例はVENERA CARDILE et. Al : "Raf kinase inhibitor protein (RKIP) and phospho-RKIP expression in melanomas" (ACTA HISTOCHEMICA, vol. 115, no 8 - 2013 - p. 795-802)に記載されている。「ウェスタンブロッティング」の節において、ＲＫＩＰ発現およびｐＲＫＩＰ発現が、ウサギから得られたポリクローナル抗体を使用し、濃度測定の任意単位として表される非定量的な値を導く方法による、ＷＭ３５メラニン細胞のウェスタンブロット解析によって評価されることが記載されている。ＷＯ２０１１／０５８１３６において生体試料中のタンパク質を測定する方法が記載され、この方法は対象のエピトープを認識できる較正試薬を使用する。記載されている方法において、較正試薬は以下を含む：１２〜２５アミノ酸長の対象のリン酸化エピトープを含むペプチド；リンカー（２〜１０アミノ酸のペプチド）；アレイに結合するキャリアタンパク質。ＷＯ２０１１／０５８１３６に記載の方法において基準の検量線を検出するために、較正試薬をまず複数の既知の濃度で様々なアレイのウェルに結合させ、次いで較正試薬に対してアフィン(affine)である第２の検出可能な試薬を添加する。次に較正試薬の各濃度について、信号の光学濃度を測定する。
【００１２】
現在のところ、生体試料中のタンパク質の存在を測定するためには、１以上の試料をアレイのウェルに結合させ、検出されるタンパク質に対してアフィンである抗体を添加する。次いで、信号の光学濃度を測定し、検量線のために測定された光学濃度と比較する。
【００１３】
該方法にはいくつかの技術的な欠点がある：実際には、提案されているように生体試料をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに直接添加すると、試料中の複数のタンパク質（これらの種類および量は未知である）の存在は、ウェル表面に結合するために複数のタンパク質間における競合を引き起こす。したがって、この方法をＲＫＩＰおよびｐＲＫＩＰの定量に適用すると、これらのタンパク質が生体試料中において、より代表的な他のタンパク質に対して微量で存在する場合は常に、これらのタンパク質はウェルに結合することさえできない。いずれにせよ、一般的にＲＫＩＰの量の１％未満であるリン酸化ＲＫＩＰ（ｐ−ＲＫＩＰ）の量については特に、ウェルに結合している量は該方法では再現できないほど低い。さらに、最先端の技術において公知の方法には、交差反応の可能性に関連付けられる制限がある。実際、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰに存在する配列（エピトープ）に非常によく似た配列を含み、検出のために生体試料に添加される抗体によって認識されるが、ＲＫＩＰおよびｐＲＫＩＰとは異なるタンパク質が試料中に存在すると仮定すると、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰによって生じる信号と区別できない非特異的な信号が生じ得る。したがって、１つのアミノ酸配列のみの同定は擬陽性を生じるのに十分である。
【発明の概要】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、生体試料中のリン酸化型ＲＫＩＰタンパク質（ｐ−ＲＫＩＰ）を測定する定量的な方法を提供することである。
【００１５】
別の目的において、本発明は生体試料中のリン酸化型および非リン酸化型ＲＫＩＰタンパク質を測定する定量的な方法を提供する。
【００１６】
別の目的において、本発明は新規なＥＬＩＳＡテストを提供し、これは非リン酸化型ＲＫＩＰ（ＲＫＩＰ）およびリン酸化型ＲＫＩＰ（ｐ−ＲＫＩＰ）の生体試料への定量に特異的であり、それぞれの型およびそれらの間の比率の定量的な測定を得る。
【００１７】
さらに、本発明の別の目的は、本方法の感度および特異度が増大するように、テストされる生体試料におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ検出のためにそれぞれ使用される同一の捕獲抗体および同一のトレーサー抗体に結合することによって、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの両方の検量線を検出するのに使用できる数種の標準組換えペプチドを提供することである。
【００１８】
さらに本発明は、生体試料中にＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰを定量する方法を提供し、この方法は、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ以外のタンパク質によって生じる非特異的な信号を取得する可能性が実質的に無い。提案される方法はまた、試料を濃縮し、測定を再現できるように、捕獲抗体の添加によって対象のタンパク質をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートウェルに選択的に結合させることを可能にする。
【００１９】
さらに別の目的において、本発明は、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ尿レベルを個別および／または組合せで測定することによって、腎細胞がんの診断および／または予後判定を得ることを可能にする、ＥＬＩＳＡテストを提供する。
【００２０】
本発明は生体試料中においてＲＫＩＰタンパク質およびｐ−ＲＫＩＰタンパク質を定量的に測定する方法であって、以下の工程を含む方法であるため、所定の目的を実現する：
ａ）以下の抗体を２つの別個の担体に共に作用させる工程：ａ１）ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第１のアミノ酸配列を認識する抗体、およびａ２）ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第１のアミノ酸配列を認識する抗体；
ｂ）ブロッキング溶液を両担体に添加する工程、
ｃ）生体試料を添加する工程；
ｄ）各担体に、以下の抗体を添加する工程、
ｄ１）ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第２のアミノ酸配列を認識する抗体、およびｄ２）ＲＫＩＰタンパク質中に存在する第２のアミノ酸配列を認識する抗体、ここで、前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の一方はＲＫＩＰとｐ−ＲＫＩＰとの間で共通であり、他方はセリン１５３のリン酸化を含む配列であるため、ｐ−ＲＫＩＰとＲＫＩＰとの間で異なっている；
ｅ）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、前記第２のアミノ酸配列に結合している前記抗体の量に比例した光学的性質の変化を測定できるマーカーを添加する工程；
ｆ）２つの試料の光学的性質を測定し、２系列の担体の同様の光学的性質を測定することによって得られる検量線と比較する工程、ここで２系列の担体には以下が順番に添加されている：
ｉ）前記系列の第１の系列について、ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列を認識する抗体、および前記系列の第２の系列について、ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列を認識する抗体；
ｉｉ）ブロッキング溶液；
ｉｉｉ）前記系列の第１の系列について、ｐ−ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む既知の増加量の組換えハイブリット標準、および前記系列の第２の系列について、ＲＫＩＰタンパク質中に存在する前記第１のアミノ酸配列および第２のアミノ酸配列の両方を含む既知の増加量の組換えハイブリット標準；
ｉｖ）ｐ−ＲＫＩＰ中に存在する前記第２のアミノ酸配列、またはＲＫＩＰ中に存在する前記第２の配列をそれぞれ特異的に認識する抗体；
ｖ）前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体と接触させると、前記第２のアミノ酸配列に結合している前記抗体の量に比例した光学的性質の変化を測定できるマーカー。
【００２１】
第１の好ましい実施態様において、該方法はＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを用いて実現され得る。
【００２２】
第２の好ましい実施態様において、該方法はラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイによって実現され得る。この場合において、担体はクロマトグラフィーカートリッジであり、試料はカートリッジの末端にある吸収紙に添加され、第１の前記アミノ酸配列を認識する抗体を吸収紙から遠位のクロマトグラフィーカートリッジの領域において共に作用させ、前記第２のアミノ酸配列を認識する抗体は吸収紙の近位の領域においてクロマトグラフ表面の一部に存在する。
【００２３】
さらに、好ましいが限定されない様式において、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを使用する場合、前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体（生体試料中で測定するため、および検量線を決定するための両方）に、前記抗体に特異的なＨＲＰ標識された抗体、および前記ＨＲＰ抗体と接触させると光学的性質の変化を測定できるマーカーとしての色素原（ＴＭＢ）を前記第２のアミノ酸配列を認識する前記抗体に結合しているＨＲＰ抗体の量に比例して添加し得る。この場合において、測定される光学的性質は４５０ｎｍにおける光学濃度である。
【００２４】
別の実施態様において、ＨＲＰ標識された抗体を使用する代わりに、市場で利用可能な蛍光プローブ（例えばAlexa Fluorファミリーの１つ）のうち、様々な波長を有する蛍光プローブが第２のアミノ酸配列を認識する抗体のマーカーとして使用され得る。この場合、信号の検出は蛍光リーダーによって取得され、修正された光学的性質は所定の波長における蛍光である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
これらの利点および他の利点は、図１〜３を参照している本発明の詳細な説明から明白である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
第１の実施態様は、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを用いたテストの実現に関して記述されている。本発明の範囲を逸脱することなく、このテストは種々の担体（例えば、ラテラルフローイムノクロマトグラフィー（Sajida M et al., Journal of Saudi Chemical Society 2015; 19 (6) 689-705）またはマイクロ流体デバイス（Sardesai NP, et al. Anal Bioanal Chem. 013 April; 405 (11) : 3831-3838））を用いることによって実行され得ることが反復されるはずである。
【００２７】
第１に、以下で言及される生体試料は好ましくは尿であるが、対象の分析物を含むあらゆる他の生体液（例えば血清、血漿、唾液、気管支肺胞液、脳脊髄液、便、精液）または他の生体試料（例えば細胞タンパク質抽出物、組織タンパク質抽出物、または細胞培養培地）であり得ることが記述される。
【００２８】
以下の様々な実施態様のためのさらに別の前文の妥当性は、信号検出に使用される手法に関連している。好ましい実施態様において、検出のために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合している抗体および３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の添加に基づく発色法が考慮される。検出はまた、本発明の範囲を逸脱することなく、（例えばルミノール／Ｈ２Ｏ２／エンハンサーシステムを使用することによる）化学発光もしくは（抗体を、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなどの基質と結合させることによる）化学蛍光によって実行され得、または干渉センサー（例えば、Duval et al (Silicon Photonic Based Biosensors: The Future of Lab-on-a-Chip Diagnostic devices; IEEE PHOTONICS SOCIETY NEWLETTER, August 2012)によって記述される干渉センサー）の使用に基づき得ることが意図されるはずである。
【００２９】
同様に、記述される実施態様の実用的な実施のための詳細な実験手順は、本発明の目的から逸脱することなく、優れた技術標準に従って規定され得る。例示のみの方法として、プロテインＡまたはＧを予め共に作用させたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートが捕獲抗体をより安定に結合するために使用され得る。
【００３０】
生体試料中のＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの量の測定
好ましい実施態様において、テストされる生体試料におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの定量は、好ましいが限定されない様式において以下に記載のアミノ酸配列（添付の配列表の配列番号１：ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ）を有する、ＲＫＩＰ／ｐ−ＲＫＩＰの共通する領域に存在するエピトープを認識する、以下に規定される捕獲抗体（９）における抗体を使用する。
【００３１】
捕獲抗体（９）をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル（１）に共に作用させ、次いで１〜５％の最適濃度のＢＳＡ、乳汁またはウシ胎仔血清で作製されたブロッキング溶液（これは結合部位を飽和させ、捕獲抗体によって認識される分析物以外の分析物を付着できなくするのに役立つ）を添加する。
【００３２】
以下において、生体試料は定量の前の捕獲される分析物を得るために導入される。実際、捕獲抗体をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートにあらかじめ共に作用させた場合、生体試料中に存在し、捕獲抗体に認識されるタンパク質のみが結合し得ることが明記される。そして、それらのタンパク質はＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ、またはＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰと共通する同一のアミノ酸配列を含むタンパク質のみである。同様に、生体試料の後にＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰに特異的なトレーサー抗体を添加する（以下の節参照）と、それらはＲＫＩＰまたはｐ−ＲＫＩＰ特有の領域に結合する。したがって、このタンパク質は、捕獲抗体によって認識される正確な配列およびトレーサー抗体によって認識される正確な配列の両方を含むはずであるため、対象のタンパク質以外のタンパク質が信号を生じ得ることはあり得ず、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰ以外のタンパク質によって信号が生じる可能性はほとんどない。
【００３３】
生体試料に次いで、まずＲＫＩＰ（３）およびｐ−ＲＫＩＰ（６）に特異的なトレーサー抗体をそれぞれ添加し、次にＲＫＩＰ（４）およびｐ−ＲＫＩＰ（７）に特異的なＨＲＰ標識された抗体を添加する。
【００３４】
トレーサー抗体は、非リン酸化型タンパク質（ＲＫＩＰに特異的なトレーサー抗体）またはリン酸化型タンパク質（ｐ−ＲＫＩＰに特異的なトレーサー抗体）に存在する配列を特異的に認識する抗体である。
【００３５】
ＨＲＰ標識された抗体はトレーサー抗体に特異的に結合し、結合しているトレーサー抗体の量に比例して、比色反応によってウェル内部において測定される吸光度（光学濃度）を変化させる。
【００３６】
ＨＲＰ標識された抗体の添加後、色素原（３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン−ＴＭＢ）を添加し、これは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）としてのペルオキシダーゼ作用を有する酵素による過酸化水素の水への還元ための電子供与体として作用する。したがって色素原は青色を呈色し、その強度は各ウェルに存在するＨＲＰ抗体の量に比例し、これは反応停止（酸（硫酸または塩酸）の添加によって得られる）後に黄色に変化し、４５０ｎｍの吸光度で読み取ることができる。
【００３７】
試料の光学濃度と検量線（専用の節を参照のこと）を決定するのに使用されるウェルの光学濃度との比較によって、試料中に存在するＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰタンパク質の量を決定することが可能となる。
【００３８】
検量線の検出
以下において、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの定量的な存在の決定に使用される検量線を検出するために従うべき手順を記載する。
【００３９】
記載する前に、組換えハイブリットペプチド（または組換えハイブリット標準）の定義を与える：対象のタンパク質について、組換えハイブリットペプチドは以下を有するペプチドである：
ｉ）対象のタンパク質の保持配列(kept sequence)、ここでこの保持配列は保持配列に特異的な捕獲抗体によって結合され得る；
ｉｉ）対象のタンパク質の第２の配列、ここでこの配列は特定の翻訳後修飾（リン酸化、アセチル化、グリコシル化など）を含み得、修飾の存在または非存在を選択的に認識できる第２の抗体（トレーサー抗体）に結合され得る。
【００４０】
本発明おける方法の場合、トレーサー抗体はＲＫＩＰペプチド鎖のセリン１５３におけるリン酸化を有する、または有さないＲＫＩＰ配列に特異的である。
【００４１】
検量線は、２つの組換えハイブリット標準（その配列は以下に記載される）を用いて取得される：
ＲＫＩＰ（２）組換えハイブリット標準：
ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ−（リンカー）−ＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡ
ｐ−ＲＫＩＰ（５）組換えハイブリット標準：
ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ−（リンカー）−ＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡｐＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡ。
【００４２】
添付の配列表に関して、ＲＫＩＰハイブリット組換え標準は配列：配列番号２−リンカー−配列番号３を有し、ｐ−ＲＫＩＰハイブリット組換え標準は配列：配列番号４−リンカー−配列番号５を有する。
【００４３】
したがって、２つの各ハイブリットペプチドは以下を有する：
捕獲抗体（９）に結合され得る共通領域（配列番号２＝配列番号４）；
リンカー；
一方においてＲＫＩＰ特有のトレーサー抗体に結合され得、他方においてｐ−ＲＫＩＰ特有のトレーサー抗体に結合され得る特有の領域（配列番号３および配列番号５）。
【００４４】
検量線を検出するために、捕獲抗体（９）をＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートの２系列のウェル（１）において共に作用させ、次にウェル表面の結合部位のブロッキングをＢＳＡ、乳汁またはウシ胎児血清を用いて行う。次いで、増加量のＲＫＩＰ組換えハイブリット標準（２系列のウェルの一方）またはｐ−ＲＫＩＰ組換えハイブリット標準（２系列のウェルの他方）を添加する。
【００４５】
捕獲抗体（９）は、共通領域（ＤＰＤＡＰＳＲＫＤＰＫＹＲＥ）によって両方の組換え標準に結合する。
【００４６】
次の２つのトレーサー抗体（一方はＲＫＩＰに特異的であり、他方はｐ−ＲＫＩＰに特異的である）の添加は、ＲＫＩＰ組換えハイブリット標準に特有の領域（ＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡ−配列表における配列番号３）およびｐ−ＲＫＩＰ組換えハイブリット標準に特有の領域（ＧＤＨＲＧＫＦＫＶＡｐＳＦＲＫＫＹＥＬＲＡ−配列表における配列番号５）に結合することを可能にする。
【００４７】
最後に、ＨＲＰ標識された抗体および色素原の添加によって、各ウェルに添加された組換え標準の量に対応する光学濃度を測定することが可能となり、したがってこれは基準の検量線を規定し、特定の光学濃度がそれぞれ組換え標準の既知の濃度に関連している。
【００４８】
結合部位のブロッキング後、テストされる生体試料（８）を種々のウェルに添加し、抗体（９）と共に作用させる。これらのウェルにおいて、ＲＫＩＰ（３）およびｐ−ＲＫＩＰ（６）のためのトレーサー抗体、ＲＫＩＰトレーサー（４）およびｐ−ＲＫＩＰトレーサー（７）を認識するＨＲＰ標識された抗体ならびに色素原をそれぞれ添加した後、光学濃度を測定し、測定した光学濃度を検量線の光学濃度と比較することによって、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの濃度を規定する。
【００４９】
記載されている本方法は、本発明の分野を逸脱することなく、２つのトレーサー抗体がウェルに共に作用し得（したがって捕獲となる）、捕獲酵素が検出のために使用され得る（したがってトレーサーとなる）ように、使用される抗体の逆位を提供し得ることを注記しておく。
【００５０】
明らかに、ＨＲＰ標識された適切な抗体を使用する必要がある。
【００５１】
実現の種類とは無関係に、このテストはＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの定量的な決定を提供するという目的を達成する。現在の発明者の知る限りにおいて、ｐ−ＲＫＩＰを定量的に測定する免疫酵素テストおよびＲＫＩＰ／ｐ−ＲＫＩＰレベルを同時に測定するテストはこれまでに存在しない。
【００５２】
好ましい実施態様において、このテストの尿試料への応用は腎細胞がん（ＲＣＣ）の早期診断および予後判定を可能にし得、したがって生体試料中のｐ−ＲＫＩＰ濃度に基づく診断のパラメータおよびＲＫＩＰレベルに基づく予後判定のパラメータを規定する。
【００５３】
ＲＣＣ診断が略式のイベントであることが多く、現在まで腎生検を行うことによってのみ確認され得ることを考慮すると、この態様は非常に重要なものをもたらす。提案される発明はＲＣＣスクリーニングを単純、迅速およびほとんど非侵襲的にすることを可能にし得、したがって最初の疾患発生段階におけるＲＣＣ診断を著しく拡大することを可能にし、これは結果として予後および患者の平均余命の改善を伴う。経済および予防期間において、テストをリスクの高い特定の患者の分類（例えば、疾患を早期に識別するためにごくまれに腎臓超音波検査を受けている、肥満の人、高血圧の人、および末期腎疾患の患者）に応用することはさらにより重要であり、これらの人々はＲＫＩＰ／ｐ−ＲＫＩＰテストによって、腎細胞がんが発生するリスクについて、および陽性の場合には診断が早いほど有利な予後について、迅速で非侵襲的な指標を取得できる。肥満の人および高血圧の人のみを考慮しても、潜在的にスクリーニングに適している人口は全世界で１０億人を超える。さらに本発明ががんの診断に対して与える影響は、肺がん（全世界で毎年１８０万件を超える）、乳がん（１６０万件を超える）および大腸がん（約１４０万件）の中で、様々ながんの発生および進行におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰのさらにより重要な役割を強調している最近の文献によって示される。
【００５４】
本発明の対象は、あらゆる種類の細胞および組織におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの細胞内発現を決定するのに使用され得る。この場合、唯一の差異は、ＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰを決定する細胞タンパク質抽出物を生体試料としてＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル（１）に添加することである。したがって、このテストは単純、迅速、かつ定量的な方法であるため、様々な病状におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの機能的役割の特徴付けに傾倒している研究チームによって広く使用され得る。
【００５５】
特に本発明は、尿試料中のｐ−ＲＫＩＰタンパク質の定量的な測定に基づく腎明細胞がんの診断のための診断方法、および尿試料中のＲＫＩＰタンパク質の定量的な測定に基づく腎明細胞がんの予後判定の方法を提供する。これらの両測定は、記述されている態様のいずれか１つに従って簡便に実行され得る。
【００５６】
腎明細胞がんの診断方法は以下の工程を含む：
尿試料中のｐ−ＲＫＩＰ量を測定する工程；
尿試料中にｐ−ＲＫＩＰが存在しない場合に、腎明細胞がんと診断する工程。
【００５７】
尿試料中にｐ−ＲＫＩＰが存在する場合には、診断は陰性である（腎がんは存在しない）。
【００５８】
試料中にｐ−ＲＫＩＰが存在しないことは、捕獲抗体＋トレーサー抗体＋ＨＲＰ標識された抗体＋ＴＭＢを使用することによる本発明における方法を用いて、テストの検査条件において測定可能な信号が存在しないこと（試料において測定される光学濃度が、生体試料が存在しない場合に取得される光学濃度と同等であること）を意図することは明らかである。
【００５９】
これは信号を増幅できる検出システム（例えばストレプトアビジン−ビオチン；蛍光など）を用いることによって、腎明細胞がんを有する患者の尿試料においてもｐ−ＲＫＩＰの存在が検出できることを除外しない。信号を増幅せずに検出できる最小濃度と本発明における方法を用いて検出できる最小濃度との間の差異はいずれにせよ、信号が本発明における方法を用いて検出されない場合に、患者の尿におけるｐ−ＲＫＩＰ濃度が０と等しいと見なされ得る程度である。
【００６０】
腎明細胞がんの発生を予測する予後判定の方法は以下の工程を含む：
尿試料中のＲＫＩＰ量を測定する工程；
ＲＫＩＰ量が閾値よりも高い場合、良好な予後を推定する工程；
測定されたＲＫＩＰ量が閾値よりも低い場合、良好でない予後を推定する工程。
【００６１】
カットオフとして使用される閾値の正確な決定に関して、閾値を正確に規定するには数千回の測定が必要であることから、これまで尿試料中のＲＫＩＰ含量のための閾値を規定することは不可能であったことは明らかである。しかし、尿試料は一般に腎組織で生じたことを反映するため、この閾値が規定できることは明白である。これはOncotarget journal (Urinary RKIP/p-RKIP is a potential diagnostic and prognostic marker of clear cell Renal Cell Carcinoma" Papale et. Al, Oncotarget 2017)に発表された研究において確認され、この研究は腎明細胞がんを有する患者における組織発現レベルとＲＫＩＰおよびｐＲＫＩＰの尿排出量との間の直接的な相関関係を示している。
【００６２】
Hill B et al (Oncotarget. 2014 Sep 15; 5 (17) : 7406- 19, "Common reduction of the Raf kinase inhibitory protein in clear cell renal cell carcinoma")は、ＲＫＩＰレベルと腎がんの進行との間に線形相関が存在することを示している。組織マイクロアレイ解析（ＴＭＡ）が腎明細胞がんを有する患者の６００を超える組織に対して実行され、これは２６０を超えるＨスコア（ＴＭＡ実験によって生成するデータの解析に通常使用されるパラメータ）が通常の組織を同定し、２２０のスコアがＲＣＣの存在を同定し、２０４のスコアが原発性転移性ＲＣＣの存在を同定し、１８１のスコアが長期の転移の出現を同定することを示した。さらにＨスコアが２０４を超える患者は一般に良好な予後を有するが、Ｈスコアが２０４未満の患者は良好な予後を有しない（症例の５０％が死亡する）。常にＴＭＡ解析を用いて、Papale et al.は、４０人の腎明細胞がん（ｃｃＲＣＣ）患者の腎組織、１９人の慢性腎疾患（ＣＫＤ）の患者の腎組織および明らかに健常な５個の組織におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰのレベルを、スコア＝０（信号が存在しない）、１（低い信号）、２（中程度の信号）および３（高い信号）を与えることによって評価した。この手法を用いると、全ての正常組織はＲＫＩＰのスコアが３であり、ＣＫＤ組織はスコアが２〜３であったが、８／４０のｃｃＲＣＣのスコアは１〜２（中間〜低い）であり、その他はタンパク質が検出できなかった。ｐ−ＲＫＩＰについても同様に実行され、これは正常組織における非常な発現、ＣＫＤにおける減少、ならびに段階、内臓転移の存在、腫瘍のサイズおよびリンパ節の関与に関わらず、全てのｃｃＲＣＣ組織における完全な消失をもたらした。
【００６３】
これまでに述べたように、尿試料は一般に腎組織において見出され得ることを反映するが、現在の測定技術は尿試料におけるＲＫＩＰおよびｐ−ＲＫＩＰの定量的な測定を普及させることを可能にしない。これは本発明における方法に代わることによって可能となる。最先端の技術において、代わりに免疫ブロット法によってのみ定量的なデータが取得でき、これはその困難性および再現性の制限が周知である半定量的技術である。
【００６４】
本発明の対象は、（ｐＲＫＩＰ以外の）リン酸化タンパク質解析のために市場で現在利用できるＥＬＩＳＡアッセイに関して、いくつかの技術革新を導入する。実際、主要なバイオテクノロジーの会社（Thermofisher, SigmaAldrich, R&D systems, Raybiotech）がリン酸化タンパク質の定量に特異的なＥＬＩＳＡテストを市場に最近投入したとしても、ほとんどの場合標準試料の使用を提供せず、したがってテストされる様々な条件のための同体積の細胞抽出物をウェルに入れることによって実行される、同一のタンパク質の全形態およびリン酸化型の同時定量のための解析を制限する。この手法が特定の文脈においてリン酸化された標的タンパク質の量を把握するのに有用であり得たとしても、いずれにせよバイオマーカーの定量を実行するのに適していない。
【００６５】
しかしながら、標準試料を使用する会社が存在する：ほとんどの場合、標準物質は標的タンパク質のリン酸化を得るために特定の増殖因子で刺激された細胞抽出物で作製される。刺激された細胞抽出物の段階希釈を用いて基準の検量線を作製するが、これはタンパク質およびそのリン酸化型の絶対的定量を可能としない。
【００６６】
記述されている解決策の別の利点は、制限された数のリンタンパク質（約３２種）のための関連する組換えタンパク質を標準物質として使用するＥＬＩＳＡテストを開発している（NOVEX内の）会社は現在ほとんどないという点に関して強調される。Phospho-ELISA kit TAU [pS199] test (Novex-Thermofisher、カタログ番号KHB7041)によって、例が提供される。
【００６７】
この態様は、テストを定量的にするのに適した標準物質が全てではないタンパク質においてどのように存在するのかを強調するため、非常に重要である。実際、組換え体を作製する全ての設備が天然型およびリン酸化型の両方を提供できるわけではない。
【００６８】
さらに、提案された解決策の経済的利点を強調することは重要である：組換えタンパク質の合成は、本発明において提案されるハイブリットペプチドの合成よりもはるかに長く、高価である（約５ｍｇのハイブリットペプチドおよび約５ｍｇのｐ−ＲＫＩＰハイブリットペプチドの合成を得るための約１５００ユーロに対して、対象のタンパク質の天然タンパク質および可能な限りリン酸化型のタンパク質の大腸菌における合成は約７０００ユーロである）。したがって、同等の性能において、提案される手法は従来の解決策よりも簡便で効率的であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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