(57)【要約】本明細書で提供するのは、複数の単細胞に由来する核酸を含んだシーケンシングライブラリを調製する方法である。一実施形態では、シーケンシングライブラリは、複数の単細胞に由来するゲノム核酸を全て含む。一実施形態では、本方法は、核の完全性を維持しながら化学処理によりヌクレオソーム除去核を生成するステップを含む。また、本明細書では、化学処理されたヌクレオソーム除去単離核を含んだ組成物などの組成物も提供する。
2019520828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の単細胞に由来する核酸を含むシーケンシングライブラリを調製する方法であって：
（ａ）複数の細胞から単離核を提供するステップと；
（ｂ）前記単離核の完全性を維持しながら、前記単離核を化学処理にかけてヌクレオソーム除去核を生成するステップと；
（ｃ）前記ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第１の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、各コンパートメントの前記トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと第１インデックス配列を含み、該第１インデックス配列はその他のコンパートメントの第１インデックス配列とは異なる、ステップと；
（ｄ）前記ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第１インデックする配列を、前記核酸断片の少なくとも１つの鎖に組み込んで、インデックス付き核酸断片を含んだインデックス付き核を生成するステップであって、前記インデックス付き核酸断片は、トランスポザーゼに付着したままである、ステップと；
（ｅ）前記インデックス付き核を組み合わせてプールされたインデックス付き核を生成するステップと；
（ｆ）前記プールされたインデックス付き核のサブセットを、第２の複数のコンパートメントに分配するステップと；
（ｇ）各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片に第２インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するステップであって、各コンパートメントの前記第２インデックス配列は、その他のコンパートメントの第２インデックス配列とは異なる、ステップと；
（ｈ）前記二重インデックス断片を組み合わせることにより、前記複数の単細胞に由来する全ゲノム核酸を含むシーケンシングライブラリを生成するステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記化学処理には、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能なカオトロピック剤を用いた処理が含まれる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記カオトロピック剤は、リチウム３，５−ジヨードサリチル酸を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
前記化学処理には、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能な界面活性剤を用いた処理が含まれる、請求項３の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる、請求項２〜４の何れかの方法。
【請求項６】
前記核は、ステップ（ｂ）の前に架橋剤で処理される、請求項５の方法。
【請求項７】
前記架橋剤はホルムアルデヒドである、請求項６の方法。
【請求項８】
前記ホルムアルデヒドの濃度は、約０．２％〜約２％の範囲である、請求項７の方法。
【請求項９】
前記ホルムアルデヒドの濃度は約１．５％以下である、請求項７の方法。
【請求項１０】
ホルムアルデヒドによる前記架橋は、ステップ（ｆ）の後とステップ（ｇ）の前に逆転される、請求項７の方法。
【請求項１１】
前記架橋の逆転には、約５５℃〜約７２℃でのインキュベートを含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記トランスポザーゼは、前記架橋の逆転の前に前記インデックス付き核酸断片から解離される、請求項１０または１１の何れか一項の方法。
【請求項１３】
前記トランスポザーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用して前記インデックス付き核酸断片から解離される、請求項１２の方法。
【請求項１４】
前記核はステップ（ｄ）の前に制限酵素で処理される、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記核は、前記制限酵素での処理の後、リガーゼで処理される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）および（ｆ）における分配は、蛍光活性化核ソーティングにより実行される、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記ヌクレオソーム除去核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含む、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオソーム除去核のサブセットは、１〜約２０００個の核を含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記第１の複数のコンパートメントはマルチウェルプレートである、請求項１の方法。
【請求項２０】
前記マルチウェルプレートは９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記プールされたインデックス付き核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含む、請求項１の方法。
【請求項２２】
前記プールされたインデックス付き核のサブセットは、１〜約２５個の核を含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも１０分の１である、請求項１の方法。
【請求項２４】
前記プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも１００分の１である、請求項１の方法。
【請求項２５】
前記第２の複数のコンパートメントはマルチウェルプレートである、請求項１の方法。
【請求項２６】
前記マルチウェルプレートは９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットが分配された後、前記トランスポソーム複合体を前記コンパートメントに加えるステップを含む、請求項１の方法。
【請求項２８】
前記トランスポソーム複合体はそれぞれトランスポゾンを含み、前記トランスポゾンはそれぞれ転移鎖を含む、請求項１の方法。
【請求項２９】
前記転移鎖は、前記第１インデックス配列と、第１ユニバーサル配列を含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｇ）における第２インデックス配列の組み込みは、各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片を、第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーに接触させるステップであって、前記第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーはそれぞれインデックス配列を含み、それぞれ前記第１ユニバーサル配列の一部と同一または相補的な配列を含む、ステップと、指数関数的増幅反応を実施するステップとを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
前記第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、前記第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、前記第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体とは異なる、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記第１ユニバーサルプライマーは、さらに、第１捕捉配列と、前記二重インデックス断片の３´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第１アンカー配列とを含む、請求項３０の方法。
【請求項３４】
前記第１捕捉配列は、Ｐ５プライマー配列を含む、請求項３０〜３３の何れかの方法。
【請求項３５】
前記第２ユニバーサルプライマーは、さらに、第２捕捉配列と、前記二重インデックス断片の５´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第２アンカー配列とを含む、請求項３０の方法。
【請求項３６】
前記第２捕捉配列は、Ｐ７プライマー配列の逆相補体を含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記指数関数的増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる、請求項３０の方法。
【請求項３８】
前記ＰＣＲは１５〜３０サイクルを含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記二重インデックス断片に対し特異性を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した、二重インデックス断片の濃縮をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４０】
前記捕捉オリゴヌクレオチドは、固体基板の表面に固定化される、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記捕捉オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル結合対の第１メンバーを含み、前記結合対の第２メンバーは固体基板の表面に固定化される、請求項３９〜４０の何れか一項の方法。
【請求項４２】
前記二重インデックス断片をシーケンシングして、前記複数の単細胞に由来する核酸のヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項４３】
複数の増幅部位を含む表面を提供するステップであって、前記増幅部位は、遊離３´末端を有する付着した一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団を含む、ステップと；
増幅部位を含む前記表面を、個々の二重インデックス断片からのアンプリコンのクローン集団をそれぞれが含む複数の増幅部位を生成するのに適切な条件下で、前記二重インデックス断片と接触させるステップをさらに含む、請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記二重インデックス断片の数は、増幅部位の数を上回り、前記二重インデックス断片は前記増幅部位に流体アクセスし、前記増幅部位にはそれぞれ、前記シーケンシングライブラリ中のいくつかの二重インデックス断片のための容量がある、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記接触ステップは、（ｉ）前記二重インデックス断片を平均輸送速度で前記増幅部位に輸送するステップと、（ｉｉ）前記増幅部位にある二重インデックス断片を平均増幅速度で増幅させるステップとを同時に含み、前記平均増幅速度は前記平均輸送速度を上回る、請求項４３〜４４の何れか一項の方法。
【請求項４６】
化学的に処理されたヌクレオソーム除去単離核を含み、前記単離核は、インデックス付き核酸断片を含む、組成物。
【請求項４７】
前記単離核は、非天然架橋を含む、請求項４６の組成物。
【請求項４８】
前記組成物は、オーバーハングを含む切断制限部位において終端するインデックス付き核酸断片を含む、請求項４６の組成物。
【請求項４９】
前記単離核は、再編成ゲノムＤＮＡを含む、請求項４６〜４８の何れか一項の組成物。
【請求項５０】
ウェルが請求項４６〜４９の何れか一項の組成物を含む、マルチウェルプレート。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年７月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３６５９１６号と、２０１７年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５１３０５号の利益を主張するものであり、該文献はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
〔配列表〕
本出願は、サイズが２７キロバイトで、２０１７年７月１８日に作成した、「1592SeqListing_ST25.txt」と題した、ＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に電子的に提出した配列表を含む。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【技術分野】
【０００３】
本開示の実施形態は、核酸のシーケンシングに関する。特に、本明細書で提供する方法および組成物の実施形態は、インデックス付き単細胞シーケンシングライブラリを生成し、それから配列データを得ることに関する。
【背景技術】
【０００４】
単細胞シーケンシングにより、哺乳類の脳の体細胞異数性（McConnell, M. J. et al. Science (80.). 342, 632-637 (2013), Cai, X. et al. Cell Rep. 8, 1280-1289 (2014), Knouse, K. A. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 111, 13409-13414 (2014), Rehen, S. K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 13361-6 (2001)）および腫瘍内不均一性（Navin, N. et al. Nature 472, 90-94 (2011), Eirew, P. et al. Nature 518, 422-6 (2014), Gawad, C. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 17947-52 (2014), Gao, R. et al. Nat. Genet. 1-15 (2016). doi: 10.1038/ng. 3641）を含め、種々の文脈における細胞間のゲノム不均一性の広がりが明らかにされた。研究では、２つのアプローチ：単一ヌクレオチド変異体検出用の細胞ごとの高深度のシーケンシング（Cai, X. et al. Cell Rep. 8, 1280-1289 (2014), Zong, C. et al. Science (80-. ). 338, 1622-1626 (2012)）、または、コピー数多型（ＣＮＶ）と異数性を特定するローパスシーケンシング（McConnell, M. J. et al. Science (80.). 342, 632-637 (2013), Baslan, T. et al. Genome Res. 125, 714-724 (2015), Knouse, K. A. et al. Genome Res. gr. 198937.115‐ (2016). doi: 10.1101/gr. 198937.115）の一方が利用された。後者のアプローチでは、多数の単細胞ライブラリを生成するための効率的で費用効果的な方法が欠如していたため、集団規模でＣＮＶのある細胞の頻度を定量すること、または、がんの文脈における不均一性について確実な解析を提供することが難しかった（Gawad, C. et al. Nat. Rev. Genet. 17, 175-88 (2016)）。
【０００５】
最近では、隣接性を保持した転移（ＣＰＴ−ｓｅｑ）、トランスポザーゼをベースにした組み合わせインデックス付加戦略を使用して、それぞれにバーコードを付加した連結配列リードライブラリを数千個生成する方法が確立された（Adey, A. et al. Genome. Biol. 11, R119 (2010), Amini, S. et al. Nat. Genet. 46, 1343-9 (2014), Adey, A. et al. Genome Res. 24, 2041-2049 (2014)）。当社はＣＰＴ−ｓｅｑを、ゲノムハプロタイプ分解能（Amini, S. et al. Nat. Genet. 46, 1343-9 (2014)）と、ｄｅ  ｎｏｖｏゲノムアセンブリ（Adey, A. et al. Genome Res. 24, 2041-2049 (2014)）の問題に適用した。次に、この概念を、クロマチンアクセシビリティーアッセイ、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ（Buenrostro, J. D. et al.Nat. Methods 10, 1213-8 (2013)）と統合して、数千の単細胞中の活性調節エレメントのプロファイルを生成した（Cusanovich, D. a et al.Science 348, 910-4 (2015)）（ｓｃｉＡＴＡＣ−ｓｅｑ、図４ａ）。組み合わせインデックスを付加する場合、９６個のインデックス付きシーケンシングアダプターの１つをトランスポザーゼを介して組み込むことにより、核が最初にバーコード化される。次に、９６個の反応を組み合わせ、これらのランダムにインデックスを付加された核のうち１５−２５個を、蛍光活性化核ソーティング（ＦＡＮＳ、図５）によりＰＣＲプレートの各ウェルに配置する。そのため、任意の２つの核が同じトランスポザーゼバーコードを有する確率は低い（６−１１％）（Cusanovich, D. a et al.Science 348, 910-4 (2015)）。次に、各ＰＣＲウェルを、インデックス付きプライマーを使用してユニークにバーコード化する。このプロセスの終わりに、各配列リードは２つのインデックス：トランスポザーゼプレートからのインデックス１と、ＰＣＲプレートからのインデックス２を含み、これらは単細胞の識別を容易にする。原理の証明として、Ｃｕｓａｎｏｖｉｃｈと同僚らは、１５０００超のｓｃｉＡＴＡＣ−ｓｅｑプロファイルを生成し、これらを使用して、２つの細胞タイプの混合物を、それらの到達可能クロマチンランドスケープによって分離した（Cusanovich, D. a et al.Science 348, 910-4 (2015)）。
【０００６】
高細胞カウント単細胞シーケンシングは、トランスクリプトーム、クロマチンアクセシビリティー、および変異の違いにより複雑な組織内で集団を分離することには効率性を示したが、これまで、単細胞の全ゲノムを含んだ配列情報を得ることは不可能だった。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書で提供するのは、複数の単細胞に由来する核酸を含んだシーケンシングライブラリを調製する方法である。一実施形態において、本方法は、複数の細胞から単離核を提供するステップと；前記単離核の完全性を維持しながら、前記単離核を化学処理にかけてヌクレオソーム除去核を生成するステップと；前記ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第１の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、各コンパートメントの前記トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと第１インデックス配列を含み、該第１インデックス配列は、その他のコンパートメントの第１インデックス配列とは異なる、ステップと；前記ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第１インデックス配列を、前記核酸断片の少なくとも１本の鎖に組み込んで、インデックス付き核酸断片を含んだインデックス付き核を生成するステップであって、前記インデックス付き核酸断片は、前記トランスポザーゼに付着したままである、ステップと；前記インデックス付き核を組み合わせて、プールされたインデックス付き核を生成するステップと；前記プールされたインデックス付き核のサブセットを、第２の複数のコンパートメントに分配するステップと；各コンパートメントのインデックス付き核酸断片に、第２インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するステップであって、各コンパートメントの前記第２インデックス配列は、その他のコンパートメントの第２インデックス配列と異なる、ステップと；前記二重インデックス断片を組み合わせることにより、前記複数の単細胞に由来するゲノム核酸を全て含んだシーケンシングライブラリを生成するステップとを含む。
【０００８】
一実施形態では、化学処理には、リチウム３，５−ジヨードサリチル酸などの、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能なカオトロピック剤を用いた処理が含まれる。一実施形態では、化学処理には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能な界面活性剤を用いた処理が含まれる。
【０００９】
一実施形態では、核がホルムアルデヒドなどの架橋剤で処理されてから、単離核が化学処理にかけられる。架橋剤は、約０．２％〜約２％の濃度であり得、一実施形態では、約１．５％である。一実施形態では、ホルムアルデヒドによる架橋は、プールされたインデックス付き核のサブセットの分配後、かつ、各コンパートメントのインデックス付き核酸断片に第２インデックス配列が組み込まれる前に、逆転される。一実施形態では、架橋の逆転には、約５５℃〜約７２℃でのインキュベーションが含まれる。一実施形態では、トランスポザーゼは、架橋の逆転の前にインデックス付き核酸断片から分離される。一実施形態では、トランスポザーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用して、インデックス付き核酸断片から分離される。
【００１０】
一実施形態では、核が制限酵素で処理されてから、ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸が複数の核酸断片に断片化され、第１インデックス配列が組み込まれる。一実施形態では、制限酵素での処理の後、核はリガーゼで処理される。
【００１１】
一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットの分配、プールされたインデックス付き核のサブセットの分配、またはその組み合わせは、蛍光活性化核ソーティングにより実行される。一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含み、一実施形態では、ヌクレオソーム除去核のサブセットは、１〜約２０００個の核を含む。一実施形態では、プールされたインデックス付き核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含み、一実施形態では、プールされたインデックス付き核のサブセットは、１〜約２５個の核を含む。一実施形態では、プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも１０分の１であるか、または、ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも１００分の１である。
【００１２】
一実施形態では、第１の複数のコンパートメント、第２の複数のコンパートメント、またはその組み合わせは、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。
【００１３】
一実施形態では、トランスポソーム複合体は、ヌクレオソーム除去核のサブセットがコンパートメントに分配された後に、コンパートメントに加えられる。一実施形態では、トランスポソーム複合体はそれぞれトランスポゾンを含み、トランスポゾンはそれぞれ転移鎖を含む。一実施形態では、転移鎖は、第１インデックス配列と、第１ユニバーサル配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、第２インデックス配列のインデックス付き核酸断片への組み込みは、各コンパートメントのインデックス付き核酸断片を、第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーと接触させるステップであって、前記第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーはそれぞれインデックス配列を含み、それぞれ第１ユニバーサル配列の一部と同一または相補的な配列を含む、ステップと、指数関数的増幅反応を実施するステップとを含む。一実施形態では、指数関数的増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり得、一実施形態では、ＰＣＲは１５〜３０サイクルを含み得る。一実施形態では、第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体であり、別の実施形態では、第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体とは異なる。一実施形態では、第１ユニバーサルプライマーは、さらに、第１捕捉配列と、二重インデックス断片の３´末端のユニバーサル配列に対して相補的な第１アンカー配列とを含み、一実施形態では、第１捕捉配列は、Ｐ５プライマー配列を含む。一実施形態では、第２ユニバーサルプライマーは、さらに、第２捕捉配列と、二重インデックス断片の５´末端のユニバーサル配列に対して相補的な第２アンカー配列とを含み、一実施形態では、第２捕捉配列は、Ｐ７プライマー配列の逆相補体を含む。
【００１５】
本方法は、また、二重インデックス断片に対し特異性を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した、二重インデックス断片の濃縮を含み得る。一実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドは、固形基板の表面に固定化され、一実施形態では、捕捉オリゴヌクレオチドがユニバーサル結合対の第１メンバーを含み、結合対の第２メンバーが、固形基板の表面に固定化される。
【００１６】
本方法は、また、複数の単細胞に由来する核酸のヌクレオチド配列を決定する二重インデックス断片のシーケンシングを含み得る。一実施形態では、本方法は、複数の増幅部位を含む表面を提供するステップであって、該増幅部位は、遊離３´末端を有する付着した一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団を含む、ステップと、増幅部位を含む表面を、個々の二重インデックス断片からのアンプリコンのクローン集団をそれぞれが含む複数の増幅部位を生成するのに適切な条件下で、二重インデックス断片と接触させるステップとを含む。一実施形態では、二重インデックス断片の数は増幅部位の数を上回り、二重インデックス断片は増幅部位に流体アクセスし、増幅部位にはそれぞれ、シーケンシングライブラリ中のいくつかの二重インデックス断片のための容量がある。一実施形態では、接触ステップは、（ｉ）二重インデックス断片を平均輸送速度で増幅部位に輸送するステップと、（ｉｉ）増幅部位にある二重インデックス断片を平均増幅速度で増幅させるステップを同時に含み、ここにおいて、平均増幅速度は平均輸送速度を上回る。
【００１７】
また、本明細書では、組成物も提供する。一実施形態では、組成物は、化学的に処理されたヌクレオソーム除去単離核を含み、該単離核は、インデックス付き核酸断片を含む。一実施形態では、単離核は、非天然の架橋を含む。一実施形態では、組成物は、オーバーハングを含む切断制限部位において終端するインデックス付き核酸断片を含む。一実施形態では、単離核は、再編成されたゲノムＤＮＡを含む。別の実施形態では、組成物はマルチウェルプレートに含まれ、マルチウェルプレートのウェルは、化学的に処理されたヌクレオソーム除去単離核を含み、単離核はインデックス付き核酸断片を含む。
【００１８】
本開示の例示的な実施形態についての以下の詳細な説明は、以下の図面と併せて読んだ場合に最良に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本開示の単細胞組み合わせインデックス付加の一般的で例示的な方法の、一般的なブロック図である。
【図２】インデックス付き核酸断片の例示的な実施形態の略図である。
【図３】二重インデックス断片の例示的な実施形態の略図である。
【図４】ヌクレオソーム除去を用いた単細胞組み合わせインデックス付加を示す図である。（図４ａ）単細胞組み合わせインデックス付加のワークフロー。（図４ｂ）標準的な単離の後に、リチウム随伴ヌクレオソーム除去（ＬＡＮＤ）または架橋とＳＤＳ処理（ｘＳＤＳ）を使用したヌクレオソーム除去を続けることにより生成された、インタクトな核の位相差画像。スケールバー：１００μｍ。（図４ｃ）ヌクレオソーム除去により、クロマチンアクセシビリティー部位に限定されない、ゲノム全体での均一なカバレッジが得られる。
【図５】蛍光活性化核ソーティング（ＦＡＮＳ）を示す図である。単一核のＦＡＮＳソーティングによる代表的なプロット。全てのプロットは、注意書きがない場合、第２（ＰＣＲ）プレートのソーティングからのものである。（図５ａ）ＡＴＡＣ−ｓｅｑ核、（図５ｂ）ＬＡＮＤ、（図５ｃ）ＨｅＬａ  Ｓ３および３Ｔ３、（図５ｄ）ｘＳＤＳ、（図５ｅ）ＰＤＡＣ  Ｓｏｒｔ１トランスポザーゼプレート、（５ｆ）ＰＤＡＣ  Ｓｏｒｔ２  ＰＣＲプレート。
【図６】混合モデルを使用した、ＳＣＩ−ｓｅｑ単細胞決定を示す図である。ＨｅＬａ．ＬＡＮＤ３を図示。ＲパッケージミックスツールのｎｏｒｍａｌｍｉｘＥＭを使用して、各分布：ノイズインデックス組み合わせ（左のピーク）と単細胞ライブラリ（右のピーク）を特定した。インデックス組み合わせを単細胞ライブラリとして考えるためのリードカウント閾値は、単細胞分布の平均を１標準偏差下回る値（ｌｏｇ１０領域において）か、ノイズ分布の平均を２上回る値（ｌｏｇ１０領域において、したがって１００倍大きい）の大きい方で、最低１，０００である。図示するライブラリでは、単細胞成分の平均を１標準偏差下回る値がより大きく、そのためこれをリードカウント閾値として使用する。
【図７】ＳＣＩ−ｓｅｑを用いた、ＬＡＮＤとｘＳＤＳのヌクレオソーム除去の比較を示す図である。（図７ａ）ＧＭ１２８７８における６個のＬＡＮＤ  ＳＣＩ−ｓｅｑ調製物の１つの複雑度。右、リードカウントの分布を示すヒストグラム。破線は、単細胞リードのカットオフを表す。（図７ｂ）３つのＰＣＲプレートのうち１つでのｘＳＤＳヌクレオソーム除去であることを除き、図７ａと同じ。（図７ｃ）左、ＧＭ１２８７８  ｘＳＤＳ調製物でダウンサンプリングしたリードで作られ、カバレッジの最高深度を予測するために使用されるモデル。右、ＬＡＮＤ調製物の１つと完全ｘＳＤＳ調製物についての予測。陰影は、多数のモデル全体のｓ．ｄ．を表す。点は、実際のシーケンシング深度を表す。（図７ｄ）ＬＡＮＤまたはｘＳＤＳを使用したＳＣＩ−ｓｅｑと、準ランダムプライミング（ＱＲＰ）および変性オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＤＯＰ）での、カバレッジ均一性スコア。（図７ｅ）分散フィルタの付加ありおよびなしでの、全調製物における、染色体腕レベルで異数性を示す細胞のパーセンテージについての要約。（図７ｆ）５０個のＧＭ１２８７８細胞の核型決定の結果。（図７ｇ、図７ｈ）ＬＡＮＤ（図７ｇ）またはｘＳＤＳ（図７ｈ）を使用して生成した単一ＧＭ１２８７８のウィンドウ付きのコピー数コールと、クラスタ化についての要約。各パネルにおいて、上部は、全細胞の獲得頻度または損失頻度についての染色体腕規模での要約を表し；下部は、少なくとも１つのＣＮＶコールを含む細胞のクラスタ化プロファイルである。
【図８】全調製物についてのＳＣＩ−ｓｅｑライブラリの複雑度と、インデックスリードカウント分布を示す図である。各調製物について２つのプロットを示す。左：各点は、ユニークなインデックスの組み合わせを表し、ｘ軸はそのインデックスの組み合わせに割り当てられたユニークリードの割合であり、ｙ軸はインデックスの組み合わせのｌｏｇ１０ユニークリードカウントである。等高線は、点密度を表す。右：インデックスの組み合わせそれぞれの、ｌｏｇ１０ユニークリードカウントのヒストグラムである。我々は、潜在的なインデックスの組み合わせの大多数は単細胞ライブラリを表さず、そのため、含まれるユニークリードは非常に少数で（最も左の分布）、単細胞ライブラリは、はるかに多くのリードカウントを有する（右の分布またはよりパフォーマンスの低いライブラリのテール）と予測する。プロットはｌｏｇ１０スケールであることから、ノイズ分布は、実際には、全リードカウントのうち少数しか取り上げていない。
【図９】ヒトおよびマウス細胞の混合物におけるＳＣＩ−ｓｅｑを示す図である。全パネルについて、各インデックス成分のリード数が、ヒト参照ゲノムまたはマウス参照ゲノムに整列したカウントに基づき、プロットされている。（図９ａ、ｂ）ヒト（ＧＭ１２８７８）およびマウス（３Ｔ３）におけるＬＡＮＤヌクレオソーム除去、（図９ｃ、ｄ）ヒト（ＨｅＬａ  Ｓ３）およびマウス（３Ｔ３）におけるＬＡＮＤヌクレオソーム除去、（９ｅ）ヒト（ＨｅＬａ  Ｓ３）およびマウス（３Ｔ３）におけるｘＳＤＳヌクレオソーム除去。
【図１０】より深いシーケンシング後のＳＣＩ−ｓｅｑライブラリの複雑度と、インデックスリードカウントの分布を示す図である。Ｓ２において、左のプロットが、各インデックスの組み合わせについてのユニークリード割合対ユニークリードカウントを示すように、各調製物について２つのプロットが示される。一方、右のプロットは、各インデックスの組み合わせについてのリードカウントのヒストグラムを示す。より深くシーケンシングされたウェルの細胞は、該ウェルが属するプレートの残りと共に示される。より複雑度の低い細胞集団（左側）は、より深くシーケンシングされた集団である。
【図１１】同じ単細胞において、隣接した転移事象のシーケンシングより観察される、９ｂｐのリードオーバーラップを示す図である。（図１１ａ）９ｂｐのコピーが転移事象から如何に起こるかについてのダイアグラム。（図１１ｂ）９ｂｐで破線を入れた、全アンプリコンオーバーラップのサイズを示す、代表的な単細胞。
【図１２】ＨＭＭとＣＢＳについてコピー数をコールするコンピュータワークフローを示す図である。コール後、ＣＢＳおよびＨＭＭについてのコールセットを、Ｇｉｎｋｇｏと交差させ、３つのセット全てに存在するコールのみを、最終コールセットとして維持した。
【図１３】ＧＭ１２８７８上で単細胞をシーケンシングの標準的な方法を使用したＣＮＶアセスメントを示す図である。上：染色体腕の増幅および欠失についての要約、下：細胞の階層的クラスタ化。
【図１４】全方法にわたる、ウィンドウサイズによる分散とリードカウントカットオフを示す図である。プロットは、ウィンドウサイズとセルごとのリードカウントの関数として、ＭＡＤまたはＭＡＰＤスコアの変化を示す。
【図１５】分散スコアカットオフ全体でのＧＭ１２８７８異数性率を示す図である。各点は、所与のスコアカットオフ（ｘ軸）に含まれる細胞数により調整した、細胞集団の異数性率（ｙ軸）である。
【図１６】準ランダムプライミング（ＱＲＰ）を使用した、アカゲザル前頭皮質、個体１のＣＮＶプロファイルを示す図である。（図１６ａ）Ｇｉｎｋｇｏコール、（図１６ｂ）ＣＢＳコール、（図１６ｃ）ＨＭＭコール、（図１６ｄ）３つ全ての交差、（図１６ｅ）ＣＢＳとＨＭＭのみの交差。
【図１７】変性オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ（ＤＯＰ）を使用した、アカゲザル前頭皮質、個体１のＣＮＶプロファイルを示す図である。（図１７ａ）Ｇｉｎｋｇｏコール、（図１７ｂ）ＣＢＳコール、（図１７ｃ）ＨＭＭコール、（図１７ｄ）３つ全ての交差、（図１７ｅ）ＣＢＳとＨＭＭのみの交差。
【図１８】ＬＡＮＤヌクレオソーム除去ありでＳＣＩ−ｓｅｑを使用した、アカゲザル前頭皮質、個体１のＣＮＶプロファイルを示す図である。（図１８ａ）Ｇｉｎｋｇｏコール、（図１８ｂ）ＣＢＳコール、（図１８ｃ）ＨＭＭコール、（図１８ｄ）３つ全ての交差、（図１８ｅ）ＣＢＳとＨＭＭのみの交差。
【図１９】ｘＳＤＳヌクレオソーム除去ありでＳＣＩ−ｓｅｑを使用した、アカゲザル前頭皮質、個体１のＣＮＶプロファイルを示す図である。（図１９ａ）Ｇｉｎｋｇｏコール、（図１９ｂ）ＣＢＳコール、（図１９ｃ）ＨＭＭコール、（図１９ｄ）３つ全ての交差、（図１９ｅ）ＣＢＳとＨＭＭのみの交差。
【図２０】アカゲザルの脳内の体細胞ＣＮＶを示す図である。（図２０ａ）コピー数多型を示す３つの単細胞例と、ＳＣＩ−ｓｅｑ調製物の１つの代表的な正倍数性細胞（ＨＭＭ）。（図２０ｂ）フィルタリングありおよびなしの方法それぞれにより求められた、異数性の頻度。
【図２１】アカゲザルの前頭皮質個体１の、カバレッジ均一性についての比較を示す図である。均一性の測定は、ＧＭ１２８７８調製物の測定（図７ｂ）と非常に似ている。
【図２２】分散スコアカットオフ全体でのアカゲザルの異数性率を示す図である。各点は、所与のスコアカットオフ（ｘ軸）に含まれる細胞数により調整した、細胞集団の異数性率（ｙ軸）である。
【図２３】ｘＳＤＳヌクレオソーム除去ありでＳＣＩ−ｓｅｑを使用した、アカゲザル前頭皮質、個体２のＣＮＶプロファイルを示す図である。（図２３ａ）Ｇｉｎｋｇｏコール、（図２３ｂ）ＣＢＳコール、（図２３ｃ）ＨＭＭコール、（図２３ｄ）３つ全ての交差、（図２３ｅ）ＣＢＳとＨＭＭのみの交差。
【図２４】ステージＩＩＩヒト膵管腺がん（ＰＤＡＣ）のＳＣＩ−ｓｅｑ解析を示す図である。（図２４ａ）ＳＣＩ−ｓｅｑライブラリの複雑度。右パネル、リードカウントの分布を示すヒストグラムは。破線は、単細胞リードのカットオフを表す。（図２４ｂ）ｌｏｇ２配列深さ比の切断点コール（上）と、切断点ウィンドウマトリックス。（図２４ｃ）切断点マトリックスについての主な成分解析およびｋ−ｍｅａｎｓクラスタ化。（図２４ｄ）各クラスタからの凝集細胞における１００ｋｂｐ分解能ＣＮＶコール。（図２４ｅ）全クラスタに存在するクラスタ特異性ＣＮＶとＣＥＢＰＡ増幅（ｋ４を図示する）。
【図２５】膵管腺がんでの、ｘＳＤＳをベースとしたヌクレオソーム除去を使用したＳＣＩ−ｓｅｑを示す図である。解析で使用したコピー数をコールする３つの方法：（図２５ａ）Ｇｉｎｋｇｏ、（図２５ｂ）ＣＢＳ、および（図２５ｃ）ＨＭＭでの２．５Ｍｂｐウィンドウでのコピー数コールの要約を示す図である。
【図２６】ｘＳＤＳ  ＳＣＩ−ｓｅｑを使用した一次ＰＤＡＣでの単細胞ＣＮＶコールを示す図である。代表的な単細胞シグナルプロット。
【図２７】切断点解析のワークフローの図式を示す。まず、個々の細胞の切断点を解析する。全細胞の切断点を合わせ、上記の閾値を超える場合は局所的に合計する。インターバルは、局所的に共有される切断点の間で定義され、平均比スコアは各インターバル内に見つけられる。
【図２８】コピー数多型コールについて隠れマルコフモデル法を使用し、ＨｅＬａｖＳ３においてＬＡＮＤをベースにしたヌクレオソーム除去を使用したＳＣＩ−ｓｅｑを示す図である。ウィンドウ化（２．５Ｍｂｐ）コールと、細胞の階層クラスタ化の要約。ＣＢＣコピー数コールは、サブ染色体コールに対し重度のバイアスを生み、Ｇｉｎｋｇｏは、細胞数の倍数性を正しく特定することができず、コール細胞の大多数が全体的に増幅される結果となった。
【図２９】隠れマルコフモデル法を使用し、単細胞でのＨｅＬａ  Ｓ３コピー数多型コールにおいてＬＡＮＤをベースにしたヌクレオソーム除去を使用した、ＳＣＩ−ｓｅｑを示す図である。代表的な単細胞シグナルプロット。１のシグナルは、２．９８の平均倍数性に相当する。
【図３０】ＨｅＬａの切断点解析を示す図である。（図３０ａ）２．５Ｍｂｐウィンドウを使用したＨＭＭ解析により、ＨｅＬａ細胞株において特定された切断点。（図３０ｂ）ＧＭＩ１２８７８に正規化された、細胞のＨｅＬａ切断点ウィンドウのＬｏｇ２マトリックス。
【図３１】ＨｅＬａ切断点ウィンドウについてのＰＣＡを示す図である。ＨｅＬａは、細胞株の安定性に基づいて予想される単一集団を生成する。赤および青の点は、異なる調製物を示す。
【図３２】保存ステージＩＩの直腸がんサンプルにおける、ｘＳＤＳに基づいたヌクレオソーム除去を使用したＳＣＩ−ｓｅｑを示す図である。２．５Ｍｂｐウィンドウでの交差したコピー数コールの要約。
【図３３】前方散乱、側方散乱、およびＤＡＰＩ強度パラメータを使用した、トランスポザーゼを用いた処置の後で、単一核を単離するのに使用したゲーティング機構を示す図である。
【図３４】本開示の単細胞組み合わせインデックス付加およびゲノムと染色体の立体配座の一般的で例示的な方法の一実施形態の、一般的なブロック図である。
【図３５】種々のホルムアルデヒド濃度および架橋逆転時間を使用する方法から得られた、ライブラリ複雑度とユニークリードカウントを示す図である。
【図３６】ＨｅＬａにおいてｓｃｉ−ＧＣＣを使用した単細胞ライブラリの例を示す図である。キメラライゲーション接合部リードにより生成されたシグナルは、ｘ軸に第１ウィンドウを、ｙ軸に連結ウィンドウを有する１０Ｍｂｐウィンドウにわたる、ゲノムの遠位領域間に示される。強調表示したのはＨｅＬａに存在する既知の転座であり、ここではトランス染色体３Ｃシグナルが高まる。
【００２０】
略図は、必ずしも縮尺されているわけではない。図で使用する同様の数字は、同様の要素、ステップ等を指す。しかしながら、所与の図の要素を指すために数字を使用することにより、同じ数字を標識された別の図の要素を限定する意図はないことが理解されよう。さらに、要素を指すために異なる数字を使用することにより、別の数字を付けられた要素が、他の数字を付けられた要素と同じではあり得ないまたは類似し得ないことを示す意図はない。
【００２１】
〔例示的な実施形態の詳細な説明〕
本明細書で使用する場合、用語「生物」、「対象」は、区別なく使用され、動物および植物を指す。動物の例は、哺乳動物、例えばヒトなどである。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「細胞種」は、形態、表現型、発生学的起源、または他の既知のもしくは認識可能な目立った細胞特徴に基づき、細胞を特定することを意図する。種々の異なる細胞型が、単一の生物（または、同じ種の生物）より得られ得る。例示的な細胞型としては、限定するわけではないが、膀胱、膵臓上皮、膵α、膵β、膵臓内皮、骨髄リンパ芽球、骨髄Ｂリンパ芽球、骨髄マクロファージ、骨髄赤血球、骨髄樹状、骨髄脂肪細胞、骨髄骨細胞、骨髄軟骨細胞、前骨髄球、骨髄巨核芽球、膀胱、脳Ｂリンパ球、脳グリア、ニューロン、脳アストロサイト、神経外胚葉、脳マクロファージ、脳ミクログリア、脳上皮、皮質ニューロン、脳線維芽細胞、脳上皮、結腸上皮、結腸Ｂリンパ球、乳房上皮、乳房筋上皮、乳房線維芽細胞、結腸細胞、頸部上皮、卵巣上皮、卵巣線維芽細胞、乳管上皮、舌上皮、扁桃腺樹状、扁桃腺Ｂリンパ球、末梢血リンパ芽球、末梢血Ｔリンパ芽球、末梢血皮膚Ｔリンパ球、末梢血ナチュラルキラー、末梢血Ｂリンパ芽球、末梢血単球、末梢血骨髄芽球、末梢血単芽球、末梢血前骨髄球、末梢血マクロファージ、末梢血好塩基球、肝臓内皮、肝臓マスト、肝臓上皮、肝臓Ｂリンパ球、脾臓内皮、脾臓上皮、脾臓Ｂリンパ球、肝細胞、肝臓線維芽細胞、肺上皮、気管支上皮、肺線維芽細胞、肺Ｂリンパ球、肺シュワン、肺扁平上皮、肺マクロファージ、肺骨芽細胞、神経内分泌、肺胞、胃上皮、および胃線維芽細胞が挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「組織」は、一緒に作用して生物において１つまたは複数の特異的な機能を果たす細胞の集合または凝集物を意味することを意図する。細胞は、任意選択的に、形態的に類似している可能性がある。例示的な組織としては、限定するわけではないが、目、筋肉、皮膚、腱、静脈、動脈、血液、心臓、脾臓、リンパ節、骨、骨髄、肺、気管支、気管、腸、小腸、大腸、結腸、直腸、唾液腺、舌、胆嚢、虫垂、肝臓、膵臓、脳、胃、皮膚、腎臓、尿管、膀胱、尿道、生殖腺、精巣、卵巣、子宮、卵管、胸腺、下垂体、甲状腺、副腎、または副甲状腺が挙げられる。組織は、ヒトまたは他の生物の種々の臓器の何れかに由来し得る。組織は健康な組織である場合も不健康な組織である場合もある。不健康な組織の例としては、限定するわけではないが、肺、乳房、大腸、前立腺、上咽頭、胃、精巣、皮膚、神経系、骨、卵巣、肝臓、血液組織、膵臓、子宮、腎臓、リンパ組織などの悪性腫瘍が挙げられる。悪性腫瘍は、種々の組織学的サブタイプ、例えば、細胞種、腺がん、肉腫、繊維腺がん、神経内分泌、または未分化のものなどであり得る。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオソーム」は、クロマチンの基本的な反復単位を指す。ヒトゲノムは、平均直径が〜１０μｍの細胞の核内に圧縮された数メートルのＤＮＡからなる。真核生物の核では、ＤＮＡは、クロマチンとして知られるヌクレオプロテイン複合体にパッケージ化されている。ヌクレオソーム（クロマチンの基本的な反復単位）は、典型的には、コアなヒストン八量体の周りに、約１．７回巻かれたＤＮＡの〜１４６塩基対を含む。ヒストン八量体は、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のそれぞれの２つのコピーからなる。ヌクレオソームは、紐上のビーズの要領で、ＤＮＡに沿って規則正しく間隔を置いて配置される。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「コンパートメント」は、何かを他のものから分離させるまたは単離する領域または体積を意味することを意図する。例示的なコンパートメントとしては、限定するわけではないが、バイアル、管、ウェル、液滴、ボーラス、ビーズ、容器、面フィーチャ、または、流体の流れ、磁気、電流等などの物理的な力により分離された領域もしくは体積が挙げられる。一実施形態では、コンパートメントは、９６または３８４ウェルプレートなどの、マルチウェルプレートのウェルである。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「トランスポソーム複合体」は、統合認識部位を含む、統合酵素と核酸を指す。「トランスポソーム複合体」は、トランスポザーゼと、転移反応を触媒可能なトランスポザーゼ認識部位とにより形成される機能的複合体である（例えば、Gunderson et al.、国際公開第２０１６／１３０７０４号を参照）。統合酵素の例としては、限定するわけではないが、インテグラーゼまたはトランスポザーゼが挙げられる。統合認識部位の例としては、限定するわけではないが、トランスポザーゼ認識部位が挙げられる。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、当技術分野におけるその用途と合致していることを意図し、自然発生的核酸またはその機能類似体を含む。特に有用な機能類似体は、配列特異的に核酸とハイブリダイズすることができる、または特定のヌクレオチド配列を複製するための鋳型として使用され得る。自然発生的核酸は、概して、リン酸ジエステル結合を含む主鎖を有する。類似体構造は、当技術分野で既知の種々のもののうち何れかを含む、代替的主鎖結合を有し得る。自然発生的核酸は、概して、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見られる）、またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見られる）を有する。核酸は、当技術分野で既知であるこれらの糖部分の種々の類似体の何れかを含み得る。核酸は、天然または非天然の塩基を含み得る。この点に関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チアミン、シトシン、またはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有することができ、リボ核酸は、アデニン、ウラシル、シトシン、またはグアニンからなる群から選択される１つまたは複数の塩基を有し得る。核酸に含めることができる有用な非天然の塩基は当技術分野で既知である。非天然の塩基の例としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）および架橋核酸（ＢＮＡ）が挙げられる。ＬＮＡ塩基およびＢＮＡ塩基はＤＮＡオリゴヌクレオチドに組み込まれ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション強度と特異性を高め得る。ＬＮＡ塩基およびＢＮＡ塩基と斯かる塩基の使用は、当業者にとって既知であり、ルーチンである。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ヌクレアーゼ」は、核酸を切断する任意の酵素を指す。ヌクレアーゼは、ヒドロラーゼと呼ばれる酵素クラスに属し、通常は、作用において特異的であり、リボヌクレアーゼはリボ核酸（ＲＮＡ）に優先的に作用し、デオキシリボヌクレアーゼは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に優先的に作用する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「標的」は、核酸に関して使用する場合、本明細書で記載する方法または組成物の文脈では、核酸に対する意味論上の識別子として意図し、必ずしも、明示的に指示されているものを超えて、核酸の構造または機能を限定するものではない。標的核酸は、本質的には、既知のまたは未知の配列の任意の核酸であり得る。例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの断片であり得る。シーケンシングは、標的分子の全体または一部の配列の決定をもたらし得る。標的は、一次核酸サンプル、例えば、核などに由来し得る。標的は、また、ｃＤＮＡへの逆転写により、一次ＲＮＡサンプルより得ることも可能である。一実施形態では、標的は処理されて、各標的断片の末端へユニバーサル配列を配置することにより、増幅に適した鋳型になり得る。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ユニバーサル」は、ヌクレオチド配列を説明する際に使用する場合、２つ以上の核酸分子に共通の配列領域を指し、ここにおいて、分子は、互いに異なる配列領域も有する。分子集合の異なるメンバーに存在するユニバーサル配列により、ユニバーサル捕捉配列などの、ユニバーサル配列の一部に対し相補的な捕捉オリゴヌクレオチドなどのユニバーサル捕捉核酸の集団を使用した、多数の異なる核酸の捕捉が可能になる。ユニバーサル捕捉配列の非限定的例としては、Ｐ５およびＰ７プライマーと同一または相補的な配列が挙げられる。同様に、分子集合の異なるメンバーに存在するユニバーサル配列により、ユニバーサル配列の一部に対し相補的なユニバーサルプライマー、例えば、ユニバーサルアンカー配列の集団を使用した、多数の異なる核酸の増幅または複製（例えばシーケンシング）が可能になる。そのため、補足オリゴヌクレオチドまたはユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズし得る配列を含む。ハイブリダイズする２つのユニバーサル配列は、ユニバーサル結合対という。例えば、ハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドとユニバーサル捕捉配列は、ユニバーサル結合対である。
【００３１】
用語「Ｐ５」および「Ｐ７」は、ユニバーサル捕捉配列または捕捉オリゴヌクレオチドを指す場合に使用し得る。用語「Ｐ５´」（Ｐ５プライム）および「Ｐ７´」（Ｐ７プライム）は、それぞれ、Ｐ５とＰ７の相補体を指す。任意の適切なユニバーサル捕捉配列または捕捉オリゴヌクレオチドを本明細書に示す方法で使用することが可能であり、Ｐ５とＰ７の使用は、単なる例示的な実施形態であることが理解されよう。Ｐ５およびＰ７などの捕捉オリゴヌクレオチドまたはその補体をフローセル上で使用することは、国際公開第２００７／０１０２５１号、同第２００６／０６４１９９号、同第２００５／０６５８１４号、同第２０１５／１０６９４１号、同第１９９８／０４４１５１号、および同第２０００／０１８９５７号の開示により例示されるように、当技術分野で既知である。例えば、任意の適切な増幅フォワードプライマーは、固定化されていても、溶液中にあっても、本明細書に提示の方法において、相補的な配列に対するハイブリダイゼーションおよび配列の増幅に有用であり得る。同様に、任意の適切な増幅リバースプライマーも、固定化されていても、溶液中にあっても、本明細書に提示の方法において、相補的な配列に対するハイブリダイゼーションおよび配列の増幅に有用であり得る。当業者であれば、本明細書に提示の核酸の捕捉および／または増幅に適切なプライマー配列を、如何に設計し使用するか、理解しよう。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「プライマー」およびその誘導体は、概して、関心の標的配列にハイブリダイズし得る任意の核酸を指す。典型的には、プライマーは、ヌクレオチドがポリメラーゼにより重合され得る基質として機能するが；一部の実施形態では、プライマーは、合成核酸鎖に組み込まれ、別のプライマーがハイブリダイズして、その合成核酸分子に相補的な新しい鎖の合成を刺激し得る部位を提供し得る。プライマーは、ヌクレオチドまたはその類似体の任意の組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、プライマーは一本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は本明細書では区別なく使用し、任意の長さの高分子形態のヌクレオチドを指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その類似体、またはその混合物が含まれ得る。該用語は、同等物として、ヌクレオチド類似体より作成されるＤＮＡまたはＲＮＡの何れかの類似体を含み、一本鎖（例えば、センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖のポリヌクレオチドに適用可能であることを理解されたい。本明細書で使用する場合、該用語は、また、相補的であるか、または、例えば、逆転写酵素の作用によりＲＮＡ鋳型により生成されるコピーＤＮＡである、ｃＤＮＡを包含する。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、該用語には、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ならびに、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「アダプター」およびその誘導体、例えば、ユニバーサルアダプターは、概して、本開示の核酸分子にライゲーションし得る、任意の直鎖オリゴヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、アダプターは、サンプル中に存在する任意の標的配列の３´末端または５´末端に対し、実質的に非相補的である。一部の実施形態では、適切なアダプター長さの範囲は、約１０−１００ヌクレオチド長、約１２−６０ヌクレオチド長、または約１５−５０ヌクレオチド長である。概して、アダプターは、ヌクレオチドおよび／または核酸の任意の組み合わせを含み得る。一部の態様では、アダプターは、１つまたは複数の場所に１つまたは複数の切断可能基を含み得る。別の態様では、アダプターは、プライマー、例えばユニバーサルプライマーの少なくとも一部に対し、実質的に同一であるか、または実質的に相補的である配列を含み得る。一部の実施形態では、アダプターは、下流のエラー修正、特定、またはシーケンシングを補助するバーコード（本明細書ではタグまたはインデックスともいう）を含み得る。用語「アダプター（ａｄａｐｔｏｒ）」と「アダプター（ａｄａｐｔｅｒ）」は、区別なく使用する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「各」は、文脈上、明確に他の指示がない限り、事項の集合に関し使用する場合は、集合における個別事項を特定することを意図するが、必ずしも集合におけるすべての事項について言及するものではない。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「輸送」は、流体を通じた分子の移動を指す。該用語は、分子の濃度勾配に沿った分子の移動などの受動輸送（例えば、受動拡散）を含み得る。該用語は、また、分子がその濃度勾配に沿って、または濃度勾配に逆らって移動し得る能動輸送も含み得る。したがって、輸送は、エネルギーを適用して、１つまたは複数の分子を所望の方向または所望の場所、例えば、増幅部位などへ移動させることを含み得る。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「増幅する」、「増幅すること」、または「増幅反応」、およびその派生語は、概して、核酸分子の少なくとも一部が、少なくとも一つの追加の核酸分子に複製またはコピーされる、任意の作用またはプロセスを指す。追加の核酸分子は、任意選択的に、鋳型核酸分子の少なくとも一部と実質的に同一または実質的に相補的である配列を含む。鋳型核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、追加の核酸分子も、独立して、一本鎖でも二本鎖でもよい。増幅には、任意選択的に、線形または指数関数的な核酸分子の複製が含まれる。一部の実施形態では、斯かる増幅は、等温条件を使用して実行され得；他の実施形態では、斯かる増幅には熱サイクリングが含まれ得る。一部の実施形態では、増幅は、単一増幅反応での複数の標的配列の同時増幅を含む多重増幅である。一部の実施形態では、「増幅」には、ＤＮＡおよびＲＮＡをベースにした核酸の少なくとも一部の単独でのまたは組み合わせての増幅が含まれる。増幅反応は、当業者に既知の増幅プロセスの何れかを含み得る。一部の実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「増幅条件」およびその派生語は、概して、１つまたは複数の核酸配列を増幅するのに適した条件を指す。斯かる増幅は、線形である場合も指数関数的である場合もある。一部の実施形態では、増幅条件は、等温条件を含む場合もあるし、代わりに、熱サイクリング条件または等温および熱サイクリング条件の組み合わせを含む場合もある。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸配列を増幅するのに適した条件には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）条件が含まれる。典型的には、増幅条件は、ユニバーサル配列が隣接する１つもしくは複数の標的配列などの核酸を増幅するか、または、１つもしくは複数のアダプターにライゲーションした増幅標的配列を増幅するのに十分な反応混合物を指す。概して、増幅条件には、増幅または核酸合成用の触媒、例えばポリメラーゼと；増幅する核酸に対しある程度の相補性を有するプライマーと；いったん核酸にハイブリダイズしたらプライマーの伸長を促進する、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのヌクレオチドとを含む。増幅条件は、プライマーの核酸へのハイブリダイゼーションまたはアニーリング、プライマーの伸長、および伸長したプライマーが、増幅が進む核酸配列から分離される変性ステップを必要とする場合がある。典型的には、必ずしもというわけではないが、増幅条件には熱サイクリングが含まれ得；一部の実施形態では、増幅条件には、アニーリング、伸長、および分離のステップが繰り返される複数のサイクルが含まれる。典型的には、増幅条件にはＭｇ２＋またはＭｎ２＋などのカチオン含まれ、また、イオン強度の種々の修飾因子も含まれ得る。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「再増幅」およびその派生語は、概して、増幅核酸分子の少なくとも一部がさらに任意の適切な増幅プロセス（一部の実施形態では「二次」増幅という）により増幅されることにより、再増幅核酸分子を生成する任意のプロセスを指す。二次増幅は、増幅核酸分子が生成された最初の増幅プロセスと同一である必要も、再増幅核酸分子が、増幅核酸分子と完全に同一または完全に相補的である必要もなく；再増幅核酸分子が、増幅核酸分子の少なくとも一部またはその補体を含めば十分である。例えば、再増幅は、異なる増幅条件および／または一次増幅以外の別の標的特異的プライマーを含む、異なるプライマーの使用を伴い得る。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）」は、Mullis米国特許第４６８３１９５号明細書および同第４６８３２０２号明細書の方法を指し、前記文献は、クローン化も精製もなしに、ゲノムＤＮＡの混合物における関心のポリヌクレオチドのセグメントの濃度を高める方法について記載する。この関心のポリヌクレオチドを増幅するプロセスは、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の関心のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ混合物に導入し、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で一連の熱サイクリングが続くことからなる。２つのプライマーは、関心の二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖に対し、相補的である。混合物はまず高温で変性され、プライマーが、次に、関心の分子のポリヌクレオチド内の相補的配列にアニールする。アニーリングに続き、プライマーがポリメラーゼで伸長して、新たな相補的鎖の対を形成する。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長のステップは、何度も繰り返されて（熱サイクリングという）、所望の関心のポリヌクレオチドの増幅セグメントを高濃度で得ることが可能である。所望の関心のポリヌクレオチドの増幅セグメント（アンプリコン）の長さは、プライマーの互いに対する相対的な位置により決定され、そのため、この長さは制御可能なパラメータである。プロセスを繰り返すことから、この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（以後、「ＰＣＲ」）という。所望の関心のポリヌクレオチドの増幅セグメントが、混合物中で主な核酸配列（濃度の点で）になることから、それらは「ＰＣＲ増幅された」という。上記で論じた方法に対する修正では、標的核酸分子は、複数の異なるプライマー対、一部の場合では関心の標的核酸分子ごとに１つまたは複数のプライマー対を使用してＰＣＲ増幅され得、それにより、多重ＰＣＲ反応が形成される。
【００４０】
本明細書で定義する場合、「多重増幅」は、少なくとも１つの標的特異的プライマーを使用した、サンプル内の２つ以上の標的配列の選択的で非ランダムな増幅を指す。一部の実施形態では、多重増幅は、標的配列の一部またはすべてが単一反応容器内で増幅されるように実行される。所与の多重増幅の「ｐｌｅｘｙ」または「ｐｌｅｘ」は、概して、単一多重増幅時に増幅される、異なる標的特異的配列の数を指す。一部の実施形態では、ｐｌｅｘｙは、約１２ｐｌｅｘ、２４ｐｌｅｘ、４８ｐｌｅｘ、９６ｐｌｅｘ、１９２ｐｌｅｘ、３８４ｐｌｅｘ、７６８ｐｌｅｘ、１５３６ｐｌｅｘ、３０７２ｐｌｅｘ、６１４４ｐｌｅｘ、またはそれ以上であり得る。また、いくつかの別の方法論により増幅標的配列を検出することが可能である（例えば、ゲル電気泳動後の濃度測定、バイオアナライザまたは定量的ＰＣＲを用いた定量化、標識プローブでのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組み込み後のアビジン−酵素抱合体検出；３２Ｐ−標識化デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅標的配列への組み込み）。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「増幅標的配列」およびその派生語は、概して、標的特異的プライマーと本明細書で提供する方法を使用して、標的配列を増幅することにより生成される核酸配列を指す。増幅標的配列は、標的配列に対し、同一センス（つまり、プラス鎖）またはアンチセンス（つまり、マイナス鎖）の何れかであり得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「ライゲーションすること」、「ライゲーション」、およびその派生語は、概して、２つ以上の分子が共に共有結合するプロセス、例えば、２つ以上の核酸分子が互いに共有結合するプロセスを指す。一部の実施形態では、ライゲーションには、核酸の隣接ヌクレオチド間のニックを結合することを含む。一部の実施形態では、ライゲーションには、第１核酸分子の末端と、第２核酸分子の末端の間に共有結合を形成することを含む。一部の実施形態では、ライゲーションには、ある核酸の５´リン酸基と、第２核酸の３´ヒドロキシル基の間に共有結合を形成することにより、ライゲーションされた核酸分子を形成することを含み得る。概して、本開示では、増幅標的配列は、アダプターにライゲーションされて、アダプターライゲーション増幅標的配列を生成し得る。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「リガーゼ」およびその派生語は、概して、２つの基質分子のライゲーションを触媒し得る任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、リガーゼには、核酸の隣接ヌクレオチド間のニックの結合を触媒し得る酵素が含まれる。一部の実施形態では、リガーゼには、ある核酸分子の５´リン酸と、別の核酸分子の３´ヒドロキシルの間での共有結合の形成を触媒することにより、ライゲーションした核酸分子を形成し得る酵素が含まれる。適切なリガーゼとしては、限定するわけではないが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼが挙げられ得る。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「ライゲーション条件」およびその派生語は、概して、２つの分子を互いにライゲーションするのに適切な条件を指す。一部の実施形態では、ライゲーション条件は、核酸間のニックまたはギャップを埋めるのに適している。本明細書で使用する場合、用語ニックまたはギャップは、当技術分野における該用語の使用と同じである。典型的には、ニックまたはギャップは、適切な温度およびｐＨでのリガーゼなどの酵素の存在下でライゲーションされ得る。一部の実施形態では、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、約７０−７２℃の温度で核酸間のニックを結合し得る。
【００４５】
用語「フローセル」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の流体試薬が流れ得る固体表面を含むチャンバを指す。フローセルおよび関連する流体系ならびに本開示の方法で容易に使用することが可能な検出プラットフォームの例は、例えば、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、国際公開第０４／０１８４９７号；米国特許第７０５７０２６号明細書；国際公開第９１／０６６７８；同第０７／１２３７４４号；米国特許第７３２９４９２号明細書；同第７２１１４１４号明細書；同第７３１５０１９号明細書；同第７４０５２８１号明細書、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書に記載されている。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「アンプリコン」は、核酸に関して使用する場合、核酸をコピーした産物を意味し、該産物は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同じまたは相補的なヌクレオチド配列を有する。アンプリコンは、核酸またはそのアンプリコンを鋳型として使用する種々の増幅方法の何れか（例えば、ポリメラーゼ伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ライゲーション伸長、またはライゲーション連鎖反応を含む）により生成される。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列の単一コピー（例えば、ＰＣＲ産物）またはヌクレオチド配列の多数のコピー（例えば、ＲＣＡのコンカテマー産物）を有する核酸分子であり得る。標的核酸の第１アンプリコンは、典型的には相補的なコピーである。後続のアンプリコンは、第１アンプリコンの生成の後に、標的核酸または第１アンプリコンから作成されるコピーである。後続のアンプリコンは、標的核酸に対し実質的に相補的であるか、または、標的核酸と実質的に同一である配列を有し得る。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「増幅部位」は、１つまたは複数のアンプリコンが生成され得る、アレイ内またはアレイ上の部位を指す。増幅部位は、該部位で生成される少なくとも１つのアンプリコンを含むか、保持するか、または付着させるようにさらに構成され得る。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「アレイ」は、相対的な場所により互いに識別可能な部位の集合を指す。アレイの異なる部位にある異なる分子は、アレイの部位の場所により互いに識別可能である。アレイの個々の部位は、１つまたは複数の特定のタイプの分子を含み得る。例えば、部位が、特定の配列を有する単一標的核酸分子を含む場合もあるし、部位が、同じ配列（および／またはその相補的配列）を有するいくつかの核酸分子を含む場合もある。アレイの部位は、同じ基板上に位置する別のフィーチャであり得る。例示的なフィーチャとしては、限定するわけではないが、基板内のウェル、基板内または基板上のビーズ（もしくは他の粒子）、基板からの突起、基板上のリッジ、または基板内チャネルが挙げられる。アレイの部位は、別の分子をそれぞれ担持する別個の基板であり得る。別個の基板に付着している異なる分子は、基板が結合している表面上での基板の位置により、または、液体もしくはゲル内の基板の位置により特定され得る。表面上に別箇の基板が位置している例示的なアレイとしては、限定するわけではないが、ウェル中にビーズを有するものが挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「容量」は、部位および核酸物質に関して使用する場合、部位を占有し得る核酸物質の最大量を意味する。例えば、該用語は、特定の条件において部位を占有し得る核酸分子の総数を指し得る。例えば、特定の条件において部位を占有し得る、核酸物質の総量または特定のヌクレオチド配列のコピーの総数を含め、他の尺度も同様に使用され得る。典型的には、標的核酸用部位の容量は、標的核酸のアンプリコン用部位の容量と実質的に同等となる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「捕捉剤」は、標的分子（例えば、標的核酸）に付着、それを保持またはそれと結合可能な、物質、化学物質、分子またはその部分を指す。例示的捕捉剤としては、限定するわけではないが、標的核酸の少なくとも一部と相補的である捕捉核酸（本明細書では捕捉オリゴヌクレオチドという）、標的核酸（もしくはそれに付着している連結部分）と結合可能な受容体−リガンド結合対のメンバー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、レクチン、炭水化物、核酸結合タンパク質、エピトープ、抗体など）、または標的核酸（もしくはそれに付着している連結部分）と共有結合を形成可能な化学試薬が挙げられる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「クローン集団」とは、特定のヌクレオチド配列に関して均一である核酸の集団を指す。均一配列は、典型的には、少なくとも１０ヌクレオチド長であるが、例えば、少なくとも５０、１００、２５０、５００または１０００ヌクレオチド長を含め、さらにより長い場合もある。クローン集団は、単一の標的核酸または鋳型核酸に由来し得る。典型的には、クローン集団中の核酸のすべてが、同一ヌクレオチド配列を有する。クローン集団では、クローン性から逸脱することなく、少数の突然変異（例えば、増幅アーチファクトによる）が起こり得ることが理解されよう。
【００５２】
本明細書で使用する場合、組成物、物品、核酸、または核の文脈における「供与すること」は、組成物、物品、核酸、もしくは核を作ること、組成物、物品、核酸、もしくは核を購入すること、または化合物、組成物、物品、もしくは核を別の方法で得ることを意味する。
【００５３】
用語「および／または」は、列挙した要素の１つもしくは全て、または、列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００５４】
単語「好適な」および「好適には」は、ある状況下で利益をもたらし得る、本開示の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態も、同じまたは他の状況下で好適であり得る。さらに、１つまたは複数の好適な実施形態の記載は、他の実施形態が有用ではないことを含意するものではなく、本開示の範囲から他の実施形態を除外することを意図するものでもない。
【００５５】
用語「含む」およびその変形は、これらの用語が明細書および特許請求の範囲にある場合、限定的な意味を有さない。
【００５６】
実施形態が本明細書において「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含み（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の言語と共に記載されている場合は、常に、「からなる」および／または「から本質的になる」という用語で記載される他の類似の実施形態も提供されることを理解されたい。
【００５７】
別段の定めがない限り、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「少なくとも１つ」は、区別なく使用され、１つまたは複数を意味する。
【００５８】
また、本明細書では、端点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
【００５９】
別個のステップを含む本明細書に開示の任意の方法では、そのステップは、任意の実現可能な順で実行されてよい。また、適切に、２つ以上のステップの任意の組み合わせは、同時に実行されてよい。
【００６０】
本明細書全体で、「一実施形態」、「実施形態」、「ある実施形態」、または「いくつかの実施形態」などへの言及は、実施形態に関連して記載される特定の特色、構成、組成、または特徴が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の種々の場所において斯かる句が出現することは、必ずしも、本開示の同一の実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特色、構成、組成、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられ得る。
【００６１】
本明細書で提供する方法を使用して、複数の単細胞の全ゲノムを含むシーケンシングライブラリを生成することが可能である。一実施形態では、本方法を使用して、コピー数多型（ＣＮＶ、例えば、細胞の遺伝子型における、特定の配列、例えば、遺伝子などのコピー数）を検出することが可能である。例えば、本方法を使用して、生物由来の体細胞サンプルにおける、ＣＮＶを有する核の頻度を定量化する、または、ある症状、例えばがんなどの文脈において、不均一性についての情報を提供することが可能である。
【００６２】
本明細書で提供する方法は、複数の細胞から単離した核を提供するステップを含む（図１、ブロック１２；図３４、ブロック１２）。細胞は、任意の生物、および、その生物の任意の細胞型または任意の組織に由来し得る。本方法は、さらに、細胞を分離する、および／または、核を単離するステップを含み得る。細胞から核を単離する方法は、当業者にとって既知であり、ルーチンである。核の数は少なくとも２つであり得る。上限は、本明細書に記載する方法の他のステップで使用する機器（例えば、マルチウェルプレート）の実用上の限界に左右される。例えば、一実施形態では、核の数は１，０００，０００，０００以下、１００，０００，０００以下、１０，０００，０００以下、１，０００，０００以下、１００，０００以下、１０，０００以下、または１，０００以下であり得る。当業者は、各核の核酸分子が、生物の全遺伝子相補体（生物の全ゲノムともいう）を表し、イントロンおよびエクソン配列の両方と、プロモーターおよびエンハンサー配列などの非コーディング調節配列とを含むゲノムＤＮＡ分子であることを理解しよう。
【００６３】
単離した核は、ヌクレオソームフリーである場合も、ヌクレオソームの核を除去する条件に従い、ヌクレオソーム除去核を生成する場合もある（図１、ブロック１３；図３４ブロック１３）。ヌクレオソーム除去核は、細胞の全ゲノムのＤＮＡ配列を決定する方法において有用である。
【００６４】
一実施形態では、ヌクレオソーム除去に使用される条件は、単離核の完全性を維持する。典型的には、ヌクレオソーム除去方法は、単細胞のペレットまたは懸濁液において使用され、したがって、細胞の供給源として接着細胞培養物または組織が使用される実施形態では、その供給源を処理して単細胞のペレットまたは懸濁液を得る。
【００６５】
一実施形態では、ヌクレオソーム除去の条件には、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能なカオトロピック剤を用いた化学処理が含まれる。有用なカオトロピック剤の例としては、限定するわけではないが、３，５−ジヨードサリチル酸リチウムが挙げられる。３，５−ジヨードサリチル酸リチウムを使用する条件には、それを、細胞ペレットに加え、氷上でインキュベートすることが含まれる。
【００６６】
別の実施形態では、条件には、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能な界面活性剤を用いた化学処理が含まれる。有用な界面活性剤の例としては、限定するわけではないが、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。ＳＤＳを使用する条件には、それを細胞ペレットに加え、４２℃などの高温でインキュベートし、次に、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００などの非イオン性界面活性剤を加え、４２℃などの高温でインキュベートすることが含まれる。
【００６７】
一部の実施形態では、ＳＤＳなどの界面活性剤を使用する場合、核は、ヌクレオソーム除去の前に架橋剤にさらされる。一実施形態では、核は、細胞内にありながら架橋剤にさらされ（図３４、ブロック１１）、別の実施形態では、単離核が架橋剤にさらされる。架橋剤の有用な例としては、限定するわけではないが、ホルムアルデヒドが挙げられる（Hoffman et al., 2015, J. Biol. Chem., 290:26404-26411)。ホルムアルデヒドを用いた細胞の処理には、細胞懸濁液にホルムアルデヒドを加えることと、室温でインキュベートすることが含まれ得る。一実施形態では、ホルムアルデヒドの濃度は、０．２％〜２％、例えば、０．２％超かつ１．５％以下であり得る。ホルムアルデヒド処理の後、核は、グリシンと、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）などの非イオン性非変性界面活性剤にさらされ得る。核を単離する前に細胞を架橋する場合、架橋は、５５℃〜７２℃、例えば６８℃などで３０分〜１６時間、例えば１時間インキュベートすることにより逆転され得、典型的には、そうである（図３４、ブロック１９）。逆転は、典型的には、より遅くに、プールされたインデックス付き核のサブセットを第２の複数のコンパートメントに分配した後（図３４、ブロック１８）かつ二重インデックス断片を生成する前（図３４、ブロック２０）に起きる。サブセットの分配および二重インデックス断片の生成についても、本明細書で記載する。
【００６８】
架橋剤を使用する一部の実施形態では、本方法は、また、核内の染色体構造についての情報を提供する操作、例えば、クロマチンフォールディング解析、および、限定するわけではないが、転座などのゲノム再編成の検出を含み得る。斯かるタイプの解析は、当技術分野において、ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）および関連方法（４Ｃ、５Ｃ、およびＨｉ−Ｃ）として知られている。操作には、典型的には、核内のゲノムＤＮＡの消化（図３４、ブロック１４）と、それに続く、近接しているゲノム断片の末端のライゲーションが含まれる（図３４、ブロック１５）。これらのステップはキメラ断片をもたらすが、キメラ断片は核内で物理的に近接して側にあり、核もまた、典型的には配列スペースにおいて近くにある（Nagano et al., 2013, Nature, 502:59-64）。典型的には、核が架橋剤にさらされた後、かつ、核酸を断片化する前に、核に存在するゲノムＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼで消化される（図３４、ブロック１４）。任意の制限エンドヌクレアーゼを使用することが可能であり、一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、核酸を切断して、当業者には接着性のある末端としても知られる、２つのオーバーハングをもたらす。制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムＤＮＡを消化した後、核をリガーゼにさらして、ゲノムＤＮＡの断片を連結させる（図３４、ブロック１５）。
【００６９】
単離核のヌクレオソームを除去するプロセス時に（図１、ブロック１３；図３４ブロック１３）、単離核の完全性は維持される。ヌクレオソームを除去する条件にさらした後も核がインタクトなままであるかは、位相差画像法などの常法によって核の状態を可視化することにより求められ得る。一実施形態では、少なくとも１００，０００個の核が、ヌクレオソーム除去の後、インタクトである。
【００７０】
本明細書で提供する方法は、ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第１の複数のコンパートメントに分配するステップを含む（図１、ブロック１４；図３４、ブロック１６）。サブセット、ひいては各コンパートメントに存在する核の数は、少なくとも１であり得る。一実施形態では、サブセットに存在する核の数は、１，０００，０００以下、１００，０００以下、１０，０００以下、４，０００以下、３，０００以下、２，０００以下、または１，０００以下であり得る。一実施形態では、サブセットに存在する核の数は、１〜１，０００、１，０００〜１０，０００、１０，０００〜１００，０００、または１００，０００〜１，０００，０００である。一実施形態では、核サブセットに存在する核の数は、ほぼ等しい。核をサブセットに分配する方法は、当業者にとって既知であり、ルーチンである。例としては、限定するわけではないが、蛍光活性化核ソーティング（ＦＡＮＳ）が挙げられる。
【００７１】
各コンパートメントは、トランスポソーム複合体を含む。トランスポソーム複合体は、核のサブセットがコンパートメントに加えられる前、その後、またはそれと同時に各コンパートメントに加えられ得る。トランスポソーム複合体、トランスポザーゼ認識部位に結合したトランスポザーゼは、「タグメンテーション」と呼ばれることもあるプロセスにおいて、トランスポザーゼ認識部位を、核内の標的核酸に挿入することが可能である。一部の斯かる挿入事象では、トランスポザーゼ認識部位の一方の鎖は、標的核酸に転移され得る。斯かる鎖は、「転移鎖」という。一実施形態では、トランスポソーム複合体は、２つのサブユニットを有する二量体トランスポザーゼと、２つの非連続トランスポゾン配列を含む。別の実施形態では、トランスポザーゼは、２つのサブユニットを有する二量体トランスポザーゼと、連続トランスポゾン配列を含む。
【００７２】
一部の実施形態は、機能亢進性のＴｎ５トランスポザーゼと、Ｔｎ５−型トランスポザーゼ認識部位の使用（Goryshin and Reznikoff, J. Biol. Chem., 273:7367 (1998)）、またはＭｕＡトランスポザーゼとＲ１およびＲ２の末端配列を含むＭｕトランスポザーゼ認識部位の使用（Mizuuchi, K., Cell, 35: 785, 1983; Savilahti, H, et al., EMBO J., 14: 4893, 1995）を含み得る。Ｔｎ５モザイク末端（ＭＥ）配列も、当業者により最適化されて使用され得る。
【００７３】
本明細書で提供する組成物および方法のある実施形態と共に使用され得る転移系のより多くの例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔｎ５５２（Colegio et al., J. Bacteriol., 183: 2384-8, 2001, Kirby C et al., Mol. Microbiol., 43: 173-86, 2002）、Ｔｙ１（Devine & Boeke, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72, 1994、および国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Craig, N L, Science. 271: 1512, 1996; Craig, N L, Review in: Curr Top Microbiol Immunol., 204:27-48, 1996）、Ｔｎ／ＯおよびＩＳ１０（Kleckner N, et al., Curr Top Microbiol Immunol., 204:49-82, 1996）、マリナートランスポザーゼ（Lampe D J, et al., EMBO J., 15: 5470-9, 1996）、Ｔｃ１（Plasterk R H, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 204: 125-43, 1996）、Ｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（Gloor, G B, Methods Mol. Biol., 260: 97-114, 2004）、Ｔｎ３（Ichikawa & Ohtsubo, J Biol. Chem. 265:18829-32, 1990）、細菌挿入配列（Ohtsubo & Sekine, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204: 1-26, 1996）；レトロウイルス（Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86:2525-9, 1989）、ならびにイーストのレトロトランスポゾン（Boeke & Corces, Annu Rev Microbiol. 43:403-34, 1989）が挙げられる。より多くの例としては、ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、およびトランスポザーゼファミリー酵素の操作バージョンが挙げられる（Zhang et al., (2009) PLoS Genet. 5:e1000689. Epub 2009 Oct 16; Wilson C. et al (2007) J. Microbiol. Methods 71: 332-5）。
【００７４】
本明細書で提供する方法および組成物と共に使用することができるインテグラーゼの他の例としては、レトロウイルスインテグラーゼと、斯かるレトロウイルスインテグラーゼに対するインテグラーゼ認識配列、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＰＦＶ―１、ＲＳＶからのインテグラーゼなどが挙げられる。
【００７５】
本明細書に記載する方法および組成物に有用なトランスポゾン配列は、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、同第２０１２／０２０８７２４号明細書、および国際特許出願公開第２０１２／０６１８３２号で提供される。一部の実施形態では、トランスポゾン配列は、第１トランスポザーゼ認識部位、第２トランスポザーゼ認識部位、および、２つのトランスポザーゼ認識部位間に存在するインデックス配列を含む。
【００７６】
本明細書で有用ないくつかのトランスポソーム複合体は、２つのトランスポゾン配列を有するトランスポザーゼを含む。一部の斯かる実施形態では、２つのトランスポゾン配列は互いに連結せず、言い換えると、トランスポゾン配列は、互いに非連続である。斯かるトランスポソームの例は、当技術分野で既知である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書参照）。
【００７７】
一部の実施形態では、トランスポソーム複合体は、２つのトランスポザーゼサブユニットを結合して「ループ状複合体」または「ループ状トランスポソーム」を形成する、トランスポゾン配列核酸を含む。一例では、トランスポソームは、二量体トランスポザーゼとトランスポゾン配列を含む。ループ状複合体は、元の標的ＤＮＡの順序情報を維持しながら、標的ＤＮＡを断片化することなく、トランスポゾンが標的ＤＮＡに挿入されることを保証することができる。理解されるように、ループ状構造は、標的核酸の物理的結合性を維持しながら、所望の核酸配列、例えばインデックスなどを標的核酸に挿入する。一部の実施形態では、ループ状トランスポソーム複合体のトランスポゾン配列は、該トランスポゾン配列が断片化されて２つのトランスポゾン配列を含むトランスポソーム複合体を作成するように、断片化部位を含み得る。斯かるトランスポソーム複合体は、トランスポゾンが挿入される隣接する標的ＤＮＡフラグメントが、アッセイの後期段階で明瞭にアセンブルされ得るコードの組み合わせを確実に受け取るようにするのに有用である。
【００７８】
トランスポソーム複合体は、また、トランスポザーゼインデックスともいう、少なくとも１つのインデックス配列を含む。インデックス配列は、トランスポゾン配列の一部として存在する。一実施形態では、インデックス配列は、転移鎖、つまり、標的核酸に転移されるトランスポザーゼ認識部位の鎖に存在し得る。インデックス配列は、タグまたはバーコードともいい、特定の標的核酸が存在したコンパートメントに特徴的なマーカーとして有用である。トランスポソーム複合体のインデックス配列は、各コンパートメントで異なる。したがって、この実施形態では、インデックスは、特定のコンパートメントに存在する標的核酸のそれぞれに付着する核酸配列タグであり、その存在は、本方法のこの段階で核集団が存在するコンパートメントを示すか、または、該コンパートメントを特定するために使用される。
【００７９】
インデックス配列は、最大２０ヌクレオチド長であり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０であり得る。４つのヌクレオチドタグは、同一アレイ上で２５６サンプルの多重化を可能にし、６つの塩基タグは、４０９６個のサンプルを同一アレイ上で処理することを可能にする。
【００８０】
一実施形態では、転移鎖は、また、ユニバーサル配列を含み得る。ユニバーサル配列についても、本明細書で記載する。したがって、転移鎖が標的核酸に転移される一部の実施形態では、標的核酸は、トランスポザーゼインデックス、ユニバーサル配列、またはその組み合わせを含む。
【００８１】
本方法は、また、インデックス付き核を生成するステップも含む（図１、ブロック１５；図３４ブロック１７）。一実施形態では、インデックス付き核の生成は、ヌクレオソーム除去核のサブセットに存在する核酸（例えば、各コンパートメントに存在する核酸）を複数の核酸断片に断片化することを伴う。核酸を断片化した後も、トランスポザーゼは核酸断片に付着したままであり、その結果、同じゲノムＤＮＡ分子に由来する核酸断片は、物理的に連結されたままである（Adey et al., 2014, Genome Res., 24:2041-2049）。
【００８２】
一実施形態では、核酸の断片化は、核酸に存在する断片化部位を使用することにより達成される。典型的には、断片化部位は、トランスポソーム複合体を使用することにより、標的核酸に導入される。例えば、ループ状トランスポソーム複合体は、断片化部位を含み得る。断片化部位を使用して物質を切断することが可能であるが、標的核酸に挿入されたインデックス配列間の情報の関連性は切断されない。切断は、生化学的手段、化学的手段、または他の手段によりなされ得る。一部の実施形態では、断片化部位は、種々の手段により断片化され得るヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含み得る。断片化部位の例としては、限定するわけではないが、制限エンドヌクレアーゼ部位、ＲＮＡｓｅで切断可能な少なくとも１つのリボヌクレオチド、ある化学薬品の存在下で切断可能なヌクレオチド類似体、過ヨウ素酸での処理により切断可能なジオール結合、化学的還元剤で切断可能なジスルフィド基、光化学切断にかけることができる切断可能部、および、ペプチダーゼ酵素または他の適切な手段により切断可能なペプチド（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２０８７０５号明細書、同第２０１２／０２０８７２４号明細書、および国際公開第２０１２／０６１８３２号参照）。断片化の結果は、インデックス付き核の集団であり、ここで各核はインデックス付き核酸断片を含む。インデックス付き核酸断片は、少なくとも一本の鎖に、特定のコンパートメントを示すインデック配列を含み得るものであり、典型的には、それを含む。インデックス付き核酸断片の例を、図２に示す。インデックス付き核酸断片２０の一本鎖は、トランスポザーゼインデックスと、増幅および／またはシーケンシングに使用可能なユニバーサル配列とを含む、トランスポソーム複合体の転移鎖に由来するヌクレオチド２１および２２を含む。インデックス付き核酸断片は、また、核２３のゲノムＤＮＡに由来するヌクレオチドも含む。
【００８３】
多数のコンパートメントに由来するインデックス付き核は、組み合わせることが可能である（図１、ブロック１６；図３４ブロック１８）。例えば、２〜９６個のコンパートメント（９６ウェルプレートを使用する場合）からのインデックス付き核または２〜３８４個のコンパートメント（３８４ウェルプレートを使用する場合）が、組み合わされる。これらの組み合わせたインデックス付き核のサブセットは、本明細書ではプールされたインデックス付き核といい、これは、次に、第２の複数のコンパートメントに分配される。サブセット、ひいては各コンパートメントに存在する核の数は、本方法のこのステップで同じコンパートメントに行き着く同じトランスポザーゼインデックスを有する２つの核の存在である、インデックス衝突を減少させたいという願望に一部基づく。この実施形態で、サブセットに存在する核の数は、２〜３０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０などであり得る。一実施形態では、サブセットに存在する核の数は、２０〜２４、例えば、２２などである。一実施形態では、各サブセットに存在する核の数は、ほぼ等しい。一実施形態では、各サブセットに存在する核の数は、ヌクレオソーム除去核のサブセットの核の少なくとも１０分の１である（図１、ブロック１４；図３４ブロック１６）。一実施形態では、各サブセットに存在する核の数は、ヌクレオソーム除去核のサブセットの核の少なくとも１００分の１である（図１、ブロック１４；図３４ブロック１６）。核をサブセットに分配する方法は当業者にとって既知であり、ルーチンである。例としては、限定するわけではないが、蛍光活性化核ソーティング（ＦＡＮＳ）が挙げられる。
【００８４】
核をサブセットに分配した後、各コンパートメントのインデックス付き核酸断片に第２インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するが、各コンパートメントの第２インデックス配列は、その他のコンパートメントの第２インデックス配列とは異なる。これは、固定化およびシーケンシングの前に、インデックス付き核酸断片のさらなるインデックス付加をもたらす（図１、ブロック１７；図３４ブロック２０）。細胞が架橋剤により架橋される実施形態では、インデックス付き核酸断片に付着したトランスポザーゼは、インデックス付き核酸断片から解離される。一実施形態では、付着したトランスポザーゼは、架橋が逆転される前に解離される（図３４、ブロック１９）。界面活性剤を使用してトランスポザーゼを解離させることが可能であり、一実施形態では、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００８５】
一実施形態では、組込みは、典型的には、ＰＣＲなどの指数関数的増幅反応による。インデックス付き核酸断片の末端に存在するユニバーサル配列は、プライマーとして機能し得るユニバーサルアンカー配列の結合のために使用され、増幅反応で伸長され得る。典型的には、２つの異なるユニバーサルプライマーが使用される。１つのプライマーがインデックス付き核酸断片の一方の鎖の３´末端でユニバーサル配列とハイブリダイズし、第２プライマーが、インデックス付き核酸断片のもう一方の鎖の３´末端でユニバーサル配列とハイブリダイズする。したがって、各プライマーのアンカー配列は異なり得る。適切なプライマーは、それぞれ、ユニバーサル捕捉配列などの追加のユニバーサル配列と、別のインデックス配列とを含み得る。各プライマーは、インデックスを含み得ることから、このステップは、１つまたは２つのインデックス配列、例えば、第２および任意選択的な第３のインデックスの付加をもたらす。第２および任意選択的な第３のインデックスを有するインデックス付き核酸断片は、二重インデックス断片という。第２および第３のインデックスは、互いの逆相補体である場合もあるし、第２および第３インデックスは、互いの逆相補体ではない配列を有する場合もある。この第２インデックス配列および任意選択的な第３インデックスは、分配されるインデックス付き核が置かれる各コンパートメントに対し特有である（図１、ブロック１６；図３４ブロック１８）。
【００８６】
一実施形態では、第２インデックス配列の組み込みは、各コンパートメントのインデックス付き核酸断片を、第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーと接触させるステップを含む。第１ユニバーサルプライマーは、第１ユニバーサル配列の一部と同一である配列を含み、第２ユニバーサルプライマーは、第１ユニバーサル配列の一部に対し相補的な配列を含む。各プライマーは、インデックス配列を含む。一実施形態では、第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体である。別の実施形態では、第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体とは異なる。
【００８７】
一実施形態では、第１ユニバーサルプライマーは、また、第１捕捉配列と、二重インデックス断片の３´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第１アンカー配列とを含む。一実施形態では、第１捕捉配列は、Ｐ５プライマー配列を含む。一実施形態では、第２ユニバーサルプライマーも、第２捕捉配列と、二重インデックス断片の５´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第２アンカー配列とを含む。一実施形態では、第２捕捉配列は、Ｐ７プライマー配列の逆相補体を含む。
【００８８】
別の実施形態では、組み込みは、インデックス付き核酸断片を、断片の両末端へ追加の配列をライゲーションする条件に従わせるステップを含む。一実施形態では、平滑末端ライゲーションが使用され得る。別の実施形態では、例えば、デオキシアデノシン（Ａ）などの単一デオキシヌクレオチドをインデックス付き核酸断片の３´末端に付加する、非鋳型依存性末端トランスフェラーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓポリメラーゼなどのある種のＤＮＡポリメラーゼの活性により、単一オーバーハングヌクレオチドを有する断片が調製される。斯かる酵素を使用して、単一ヌクレオチド「Ａ」を、断片の核鎖の平滑末端である３´末端に付加することが可能である。したがって、「Ａ」が、ＴａｑまたはＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓポリメラーゼを用いた反応により二本鎖標的断片の各鎖の３´末端に付加される一方で、断片の各末端に付加される追加の配列の、付加される二本鎖核酸の各領域の３´末端には、適合性のある「Ｔ」オーバーハングが存在し得る。この末端修飾は、また、この実施形態で付加される配列に隣接するインデックス付き核酸断片の形成に偏りを生じさせる核酸のセルフライゲーションを防ぐ。
【００８９】
本明細書に記載する方法による核酸分子の断片化は、平滑末端と３´−および５´−オーバーハング末端の不均一な混合を有する断片を生じさせ得る。一部の実施形態では、そのため、当技術分野既知の方法またはキット（例えば、Ｌｕｃｉｇｅｎ  ＤＮＡターミネーター末端修復キットなど）を使用して断片末端を修復して、例えば、クローニングベクターの平滑部位への挿入に最適な末端を生成することが望ましい。特定の実施形態では、核酸集団の断片末端は、平滑末端化される。より具体的には、断片末端は平滑末端化およびリン酸化される。リン酸部分は、例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを使用した酵素処理により導入され得る。
【００９０】
一実施形態では、インデックス付き核酸断片は、まず、同一のユニバーサルアダプター（「ミスマッチアダプター」ともいう）（その一般的な特徴は、Gormley et al.、米国特許第７７４１４６３号明細書、およびBignell et al.、米国特許第８０５３１９２号明細書に記載されている）を、インデックス付き核酸断片の５´および３´末端にライゲーションすることにより処理されて、二重インデックス断片を形成する。一実施形態では、ユニバーサルアダプターは、１つまたは２つのインデックス配列と、二重インデックス断片をアレイに固定化するための配列を含め、シーケンシングに必要な全ての配列を含む。シーケンシングする核酸は、単細胞に由来するため、二重インデックス断片のさらなる増幅は、シーケンシングのために十分な数の二重インデックス断片を達成するのに有益である。
【００９１】
一実施形態では、第２インデックス配列の組み込みは、ユニバーサルアダプターを、各コンパートメントのインデックス付き核酸断片にライゲーションするステップを含む。ユニバーサルアダプターは、２本の核酸鎖を含み、各鎖は第２インデックス配列を含む。一実施形態では、ユニバーサルアダプターの一方の鎖の第２インデックス配列は、ユニバーサルアダプターの第２鎖の第２インデックス配列の逆相補体である。他の実施形態では、ユニバーサルアダプターの一方の鎖の第２インデックス配列は、ユニバーサルアダプターの第２鎖の第２インデックス配列の逆相補体とは異なる。
【００９２】
一実施形態では、ユニバーサルアダプターは、また、第１捕捉配列と第１アンカー配列も含む。一実施形態では、第１捕捉配列は、Ｐ５プライマー配列を含む。一実施形態では、ユニバーサルアダプターは、また、第２捕捉配列と第２アンカー配列も含む。一実施形態では、第２捕捉配列は、Ｐ７プライマー配列の逆相補体を含む。
【００９３】
別の実施形態では、インデックス付き核酸断片にライゲーションされたユニバーサルアダプターが、シーケンシングに必要な全ての配列を含まない場合、ＰＣＲなどの指数関数的増幅ステップを使用して、固定化およびシーケンシングの前に、各インデックス付き核酸断片に存在するユニバーサルアダプターをさらに修飾することが可能である。例えば、初期のプライマー伸長反応が、インデックス付き核酸断片に存在するユニバーサル配列に対し相補的なユニバーサルアンカー配列を使用して行われ、各個別のインデックス付き核酸断片の両鎖に対し相補的な伸長産物が形成される。典型的には、ＰＣＲにより、ユニバーサル捕捉配列などの追加のユニバーサル配列と、別のインデックス配列が付加される。各プライマーは、インデックスを含み得ることから、このステップは、１つまたは２つのインデックス配列、例えば、第２および任意選択的な第３のインデックスの付加と、アダプターライゲーションによるインデックス付き核酸断片へのインデックス付加をもたらす（図１、ブロック１７；図３４ブロック２０）。
【００９４】
ユニバーサルアダプターが付加された後、シーケンシングに必要な全ての配列を含むユニバーサルアダプターをライゲーションする単一ステップの方法により、または、ユニバーサルアダプターをライゲーションし、次に、指数関数的に増幅してユニバーサルアダプターをさらに修飾するという２ステップの方法の何れかにより、最終的な二重インデックス断片は、ユニバーサル捕捉配列、第２インデックス配列、および任意選択的な第３インデックス配列を含むことになる。第２および第３のインデックスは、互いの逆相補体である場合もあるし、第２および第３インデックスは、互いの逆相補体ではない配列を有する場合もある。これらの第２インデックス配列および任意選択的な第３インデックス配列は、分配されるインデックス付き核が、第１インデックスがタグメンテーションにより付加された後で置かれる各コンパートメントに対し、特有である（図１、ブロック１７；図３４ブロック２０）。ユニバーサルアダプターを各末端に付加した結果は、図３に示す、二重インデックス断片に類似したまたは同一の構造を有する複数の二重インデックス断片または二重インデックス断片のライブラリである。二重インデックス断片３０の一本鎖は、３´フローセルアダプター（例えば、Ｐ５）および５´プロ―セルアダプター（例えば、Ｐ７´）ともいう、捕捉配列３１および３８それぞれと、ｉ５およびｉ７などのインデックス３２および３７を含む。二重インデックス断片３０は、また、トランスポザーゼインデックス３４と、増幅および／またはシーケンシングに使用することが可能なユニバーサル配列３５とを含む、トランスポソーム複合体３３の転移鎖に由来するヌクレオチドも含む。二重インデックス断片は、また、核３６のゲノムＤＮＡに由来するヌクレオチドも含む。
【００９５】
結果として生じる二重インデックス断片は、共同で、固定化され、次いでシーケンシングされ得る核酸ライブラリを提供する。用語ライブラリは、本明細書ではシーケンシングライブラリともいい、これは、３´および５´末端に既知のユニバーサル配列を含む単細胞由来の核酸断片の集合を指す。ライブラリは、１つまたは複数の単離核に由来する全ゲノム核酸を含む。
【００９６】
二重インデックス断片は、１５０〜４００ヌクレオチド長、例えば、１５０〜３００ヌクレオチドなどの所定のサイズ範囲を選択する条件を課される場合がある。結果として生じる二重インデックス断片はプールされ、任意選択的に、組み込まれていないユニバーサルアダプターまたはプライマーの少なくとも一部を除去することによりＤＮＡ分子に対する純度を高める、クリーンアッププロセスにかけられ得る。電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー等などの任意の適切なクリーンアッププロセスが使用され得る。一部の実施形態では、可逆的固相固定化常磁性ビーズを利用して、所望のＤＮＡ分子を、付着していないユニバーサルアダプターまたはプライマーより分離して、サイズに応じて核酸を選択することができる。可逆的固相固定化常磁性ビーズは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ）、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ（ＭａｇＪｅｔ）、Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｋ（Ｍａｇ−Ｂｉｎｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｅａｄｓ（ＰｒＯｍｅｇａ）、およびＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｋａｐａ  Ｐｕｒｅ  Ｂｅａｄｓ）より商業的に入手可能である。
【００９７】
複数の二重インデックス断片が、シーケンシングのために調製され得る。二重インデックス断片は、プールされた後、典型的には固定化および／または増幅により濃縮されてからシーケンシングされる（図１、ブロック１８；図３４ブロック２１）。１つまたは複数の供給源からの二重インデックス断片を基板に付着させる方法は、当技術分野で既知である。一実施形態では、二重インデックス断片は、二重インデックス断片に対し特異性を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用して濃縮され、捕捉オリゴヌクレオチドは、固定基板の表面に固定化され得る。例えば、捕捉オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル結合対の第１メンバーを含み得、結合対の第２メンバーは、固定基板の表面に固定化される。同様に、固定化された二重インデックス断片を増幅する方法としては、限定するわけではないが、架橋増幅および動力学的排除（kinetic exclusion）が挙げられる。シーケンシングの前に固定化および増幅する方法は、例えば、Bignell et al.（米国特許第８０５３１９２号明細書）、Gunderson et al.（国際公開第２０１６／１３０７０４号）、Shen et al.（米国特許第８８９５２４９号明細書、およびPipenburg et al.（米国特許第９３０９５０２号明細書）に記載されている。
【００９８】
プールされたサンプルは、シーケンシング用の調製時に固定化され得る。シーケンシングは、単一分子のアレイとして実行される場合もあるし、シーケンシングの前に増幅される場合もある。増幅は、１つまたは複数の固定化プライマーを使用して実行され得る。固定化プライマーは、例えば、平面表面上またはビーズのプール上のローンであり得る。ビーズのプールはエマルジョンに単離され得、エマルジョンの各「コンパートメント」には単一ビーズがある。「コンパートメント」毎に１つの鋳型のみという濃度では、単一鋳型のみが各ビーズ上で増幅される。
【００９９】
用語「固相増幅」は、本明細書で使用する場合、固体支持体上でまたはそれに関連して実行され、その結果、増幅産物の全てまたは一部が、それらが形成された固体支持体に固定化される、任意の核酸増幅反応を指す。特に、該用語は、フォワード増幅プライマーおよびリバース増幅プライマーの一方または両方が固体支持体に固定化されていることを除き、標準的な液相増幅と類似した反応である、固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）と、固相等温増幅を包含する。固相ＰＣＲは、あるプライマーがビーズに係留され、他のプライマーが自由溶液中にある、エマルジョンと、あるプライマーが表面に係留され、あるプライマーが自由溶液中にある固相ゲルマトリックス中にある、コロニー形成などの系をカバーする。
【０１００】
一部の実施形態では、固体支持体は、パターン化表面を含む。「パターン化表面」は、固体支持体の露出層内または露出層上での異なる領域の配置を指す。例えば、１つまたは複数の領域は、１つまたは複数の増幅プライマーが存在するフィーチャであり得る。フィーチャは、増幅プライマーが存在しない間隙領域により分離され得る。一部の実施形態では、パターンは、行と列のフィーチャのｘｙ形式であり得る。一部の実施形態では、パターンは、フィーチャおよび／または間隙領域の反復配置であり得る。一部の実施形態では、パターンは、フィーチャおよび／または間隙領域のランダムな配置であり得る。本明細書に記載する方法および組成物で使用することが可能な例示的なパターン化表面は、米国特許第８７７８８４８号明細書、同第８７７８８４９号明細書、および同第９０７９１４８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２４号明細書に記載されている。
【０１０１】
一部の実施形態では、固体支持体は、表面にウェルまたはくぼみのアレイを含む。これは、限定するわけではないが、フォトリソグラフィ、プレス加工技法、成型技法、およびマイクロエッチング技法を含む種々の技法を使用して、当技術分野で一般的に知られているように作製され得る。当業者には理解されようが、使用される技法は、アレイ基板の組成および形に左右されよう。
【０１０２】
パターン化表面のフィーチャは、パターン化された、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−ｃｏ−アクリルアミド）などの共有結合ゲルを有する、ガラス、シリコン、プラスチック、または他の適切な固体支持体上のウェル（例えば、マイクロウェルまたはナノウェル）のアレイ中のウェルであり得る（ＰＡＺＡＭ、例えば、米国特許出願公開第２０１３／１８４７９６号明細書、国際公開第２０１６／０６６５８６号、および同第２０１５／００２８１３号を参照されたい）。本プロセスにより、多数のサイクルを有するシーケンシングランで安定的であり得る、シーケンシングに使用されるゲルパッドが作成される。ウェルへのポリマーの共有結合は、種々の使用時に、構造化基板の耐用年数にわたり、構造化されたフィーチャにゲルを維持するのに有益である。しかしながら、多くの実施形態では、ゲルはウェルに供給結合する必要はない。例えば、一部の条件では、構造化基板のどの部分にも共有結合しないシランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ、例えば、米国特許第８５６３４７７号明細書参照）を、ゲル材料として使用可能である。
【０１０３】
特定の実施形態では、構造化基板は、固体支持体材料にウェル（例えば、マイクロウェルまたはナノウェル）をパターン化し、パターン化支持体をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、または化学修飾されたその変異体、例えば、ＳＦＡのアジド化バージョン（アジド−ＳＦＡ）など）でコーティングし、ゲルコーティング支持体を、例えば、化学的研磨または機械的研磨により研磨することにより、ウェル内のゲルは維持しつつ、ウェル間の構造化基板表面上の間隙領域からゲルの全てを除去するかまたは実質的に不活化することによって、作成され得る。プライマー核酸は、ゲル材料に付着させることができる。次いで、二重インデックス断片溶液を研磨した基板に接触させ、その結果、個々の二重インデックス断片が、ゲル材料に付着したプライマーとの相互作用により個々のウェルに播種されるようにすることが可能であるが；ゲル材料が欠如しているかまたは不活性化されているため、標的核酸が間隙領域を占有することはない。間隙領域においてゲルが欠如しているかまたは不活性化されていることにより、成長する核酸コロニーが外に移動することを妨げられるため、二重インデックス断片の増幅はウェル内に限定されよう。このプロセスは、スケーラブルであり、従来のマイクロまたはナノ加工法を利用して、都合良く製造することが可能である。
【０１０４】
本開示は、１つの増幅プライマーのみを固定化する（他のプライマーは、通常、遊離溶液中に存在する）「固相」増幅法を包含するが、一実施形態では、固体支持体に、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方が固定化されることが好ましい、実際には、増幅プロセスは、増幅を維持するために過剰なプライマーを要することから、「複数」の同一のフォラードプライマーおよび／または「複数」の同一のリバースプライマーが固体支持体に固定化されるだろう。したがって、本明細書において、フォワードプライマーおよびリバースプライマーに言及することは、文脈上他の意味が示される場合を除き、「複数」の斯かるプライマーを包含していると解釈すべきである。
【０１０５】
当業者には理解されようが、任意の所与の増幅反応は、増幅する鋳型に対し特異的な、少なくとも一種類のフォワードプライマーと、少なくとも一種類のリバースプライマーを必要とする。しかしながら、ある実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、同一配列の鋳型特異的部分を含む場合も、完全に同一のヌクレオチド配列および構造（任意の非ヌクレオチド修飾を含む）を有する場合もある。言い換えると、一種類のプライマーのみを使用して固相増幅を行うことが可能であり、斯かる単一プライマー方法も本開示の範囲に含まれる。他の実施形態は、同一の鋳型特異的配列を含むがいくつかの他の構造特徴は異なる、フォワードプライマーとリバースプライマーを使用し得る。例えば、ある種類のプライマーは、他には存在しない非ヌクレオチド修飾を含み得る。
【０１０６】
本開示の全実施形態において、固相増幅用プライマーは、好適には、プライマーの５´末端でまたはその近くで、固体支持体に共有結合する単一点により固定化され、プライマーの鋳型特異的部分をその同族鋳型とアニールするように遊離させ、３´ヒドロキシ基をプライマー伸長のために遊離させる。当技術分野で既知の任意の適切な共有結合手段を、この目的で使用してよい。選択される付着化学反応は、固体支持体の性質と、それに適用される任意の誘導体化または機能化に左右されよう。プライマー自体は、付着を容易にするヌクレオチド以外の化学修飾であり得る部分を含み得る。特定の実施形態では、プライマーは、硫黄含有求核試薬、例えば、ホスホロチオエートまたはチオホスフェートを５´末端に含み得る。固体支持されたポリアクリルアミドハイドロゲルの場合、この求核試薬は、ハイドロゲル中に存在するブロモアセトアミド基に結合しよう。プライマーおよび鋳型を固体支持体に付着させるより具体的な手段は、国際公開第０５／０６５８１４号に記載されているように、重合したアクリルアミドおよびＮ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を含むハイドロゲルへの５´ホスホロチオエート付着を介する。
【０１０７】
本開示のある実施形態は、例えば、ポリヌクレオチドなどの生体分子への共有結合を可能にする反応性基を含む中間材料の層またはコーティングを適用することにより、「機能化」された、不活性基板または不活性マトリックス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）を含む固体支持体を利用し得る。斯かる支持体の例としては、限定するわけではないが、ガラスなどの不活性基板に支持されたポリアクリルアミドハイドロゲルが挙げられる。斯かる実施形態では、生体分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、中間材料（例えば、ハイドロゲル）に直接結合し得るが、中間材料自体は、基板またはマトリックス（例えば、ガラス基板）に共有結合し得ない。従って、用語「個体支持体に共有結合した」は、この種の配置を包含すると解釈すべきである。
【０１０８】
プールされたサンプルはビーズ上で増幅され得、各ビーズは、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーを含む。特定の実施形態では、二重インデックス断片ライブラリを使用して、固相増幅、より具体的には固相等温増幅により、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、米国特許第７１１５４００号明細書、国際公開第００／１８９５７号、および同第９８／４４１５１号に記載されているものに類似した、クラスタ化された核酸コロニーのアレイを調製する。用語「クラスタ」および「コロニー」は、本明細書では、区別なく使用されて、複数の同一の固定化核酸鎖と複数の同一の固定化された相補的な核酸鎖を含んだ固体支持体上の別個の部位を指す。用語「クラスタ化アレイ」は、斯かるクラスタまたはコロニーより形成されたアレイを指す。この文脈では、用語「アレイ」は、順序よく並べられたクラスタ配置を必要とすると解されるべきではない。
【０１０９】
用語「固相」または「表面」は、プライマーが平坦な表面、例えば、ガラス、シリカもしくはプラスチックの顕微鏡スライド、もしくは類似のフローセルデバイスに付着した平面アレイ；１つもしくは２つのプライマーが付着し、増幅されるビーズ；または、ビーズが増幅された後の表面上のビーズアレイを意味するために使用される。
【０１１０】
クラスタ化アレイは、国際公開第９８／４４１５１号に記載されている熱サイクリングのプロセスか、または、温度が一定に維持され、伸長および変性のサイクルが試薬の変更を用いて行われるプロセスの何れかを使用して調製され得る。斯かる等温増幅法は、特許出願番号である国際公開第０２／４６４５６号および米国特許出願公開第２００８／０００９４２０号明細書に記載されている。等温プロセスで有用な温度は低いため、これは特に一部の実施形態において好ましい。
【０１１１】
本明細書に記載するまたは当技術分野で一般的に既知である任意の増幅方法は、固定化ＤＮＡ断片を増幅するためのユニバーサルプライマーまたは標的特異的プライマーと共に使用可能であることが理解されよう。増幅のための適切な方法としては、限定するわけではないが、米国特許第８００３３５４号明細書に記載されているように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。上記の増幅法を利用して、１つまたは複数の関心の核酸を増幅することができる。例えば、多重ＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等を含むＰＣＲを利用して、固定化されたＤＮＡ断片を増幅することができる。一部の実施形態では、関心のポリヌクレオチドを特異的に対象とするプライマーが、増幅反応に含まれる。
【０１１２】
ポリヌクレオチドの増幅のための他の適切な方法としては、オリゴヌクレオチド伸長およびライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ（Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)）、ならびにオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（一般的に、米国特許第７５８２４２０号明細書、同第５１８５２４３号明細書、同第５６７９５２４号明細書、および同第５５７３９０７号明細書；欧州特許第０３２０３０８号明細書；同第０３３６７３１号明細書；同第０４３９１８２号明細書；国際公開第９０／０１０６９号；同第８９／１２６９６号；および同第８９／０９８３５号参照）技法が挙げられ得る。これらの増幅方法は、固定化されたＤＮＡ断片を増幅するために設計され得ることが理解されよう。例えば、一部の実施形態では、増幅方法には、関心の核酸を特異的に対象とするプライマーを含む、ライゲーションプローブ増幅またはオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応が含まれ得る。一部の実施形態では、増幅方法には、関心の核酸を特異的に対象とするプライマーを含む、プライマー伸長−ライゲーション反応が含まれ得る。関心の核酸を増幅するように特異的に設計され得るプライマー伸長およびライゲーションのプライマーの非限定的例として、増幅は、米国特許第７５８２４２０号明細書および同第７６１１８６９号明細書に例示されるように、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）に使用されるプライマーを含み得る。
【０１１３】
本開示の方法で使用することができる例示的な等温増幅方法としては、限定するわけではないが、例えば、Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)に例示されるような多置換増幅（ＭＤＡ）、または、例えば、米国特許第６２１４５８７号明細書に例示されるような等温鎖置換核酸増幅が挙げられる。本開示で使用し得る他のＰＣＲをベースとしない方法としては、例えば、Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995；米国特許第５４５５１６６号明細書、同第５１３０２３８号明細書、およびWalker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)に記載される鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または、例えば、Lage et al., Genome Res. 13:294-307 (2003)に記載される超分岐鎖置換増幅が挙げられる。等温増幅方法は、例えば、鎖置換Ｐｈｉ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージ断片、ゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅用５´→３´エキソと共に使用され得る。これらのポリメラーゼの使用は、その高い処理能力と鎖置換作用を利用する。高い処理能力により、ポリメラーゼは１０−２０ｋｂ長の断片を生成することが可能となる。上に記載したように、より小さい断片は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼなどの処理能力と鎖置換作用が低いポリメラーゼを使用する等温条件下で生成され得る。増幅反応、条件、および成分についての追加の説明は、米国特許第７６７０８１０号明細書の開示に詳細に記載されている。
【０１１４】
本開示で有用な別の増幅方法は、例えば、Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)に記載されている、定常５´領域の後にランダム３´領域を有する２ドメインプライマーの集団を使用するＴａｇｇｅｄ  ＰＣＲである。増幅の第１ラウンドを実行して、個別ハイブリダイゼーションに基づく熱変性ＤＮＡにおいてランダムに合成された３´領域から多数の開始を可能にする。３´領域の性質により、開始部位はゲノム全体を通してランダムであると考えられる。その後、非結合プライマーは除去され、さらに、定常５´領域に対し相補的なプライマーを使用した複製が起き得る。
【０１１５】
一部の実施形態では、ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＥｘＡｍｐ）ともいう動力学的排除増幅（ＫＥＡ）を使用した等温増幅が実行され得る。本開示の核酸ライブラリは、増幅試薬を反応させて、部位に播種された個々の標的核酸に由来するアンプリコンの実質的クローン集団をそれぞれが含む複数の増幅部位を生成するステップを含む方法を使用して作製され得る。一部の実施形態では、増幅反応は、各増幅部位の容量を満たすのに十分な数のアンプリコンが生成されるまで進行する。このようにすでに播種された部位が容量まで満たされると、標的核酸が、その部位に着地して増幅され、それによりその部位でアンプリコンのクローン集団が生成されることは妨げられる。一部の実施形態では、増幅部位が容量まで満たされていなくても、第２標的核酸がその部位に到達する前に、見かけのクローン性は達成され得る。いくつかの条件下では、第１標的核酸の増幅は、十分な数のコピーが、その部位に輸送される第２標的核酸からのコピーの生成を効率的に打ち負かすまたは圧倒するほど作成されるまで、進行し得る。例えば、直径が５００ｎｍより小さい円形フィーチャ上で架橋増幅プロセスを使用する実施形態では、第１標的核酸の指数関数的増幅を１４サイクル行った後、同じ部位での第２標的核酸による汚染では、不十分な数の汚染性アンプリコンしか生成されず、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでのシーケンシング・バイ・シンセシス解析に悪影響を及ぼすことはないことが分かっている。
【０１１６】
一部の実施形態では、アレイの増幅部位は、完全にクローン性である場合もあるが、必ずしもそうである必要はない。むしろ、いくつかの用途では、個々の増幅部位には、第１の二重インデックス断片由来のアンプリコンが主に集合するが、該部位は、第２標的核酸由来の低レベルの汚染性アンプリコンも有し得る。アレイは、汚染レベルが、その後のアレイの使用に許容できない影響を与えない限り、低レベルの汚染性アンプリコンを有する１つまたは複数の増幅部位を有し得る。例えば、アレイが検出用途で使用される場合、許容される汚染レベルとは、ノイズに対する信号または検出技法の分解能に、許容できない形では影響を与えることがないレベルである。したがって、見かけのクローン性は、概して、本明細書に記載する方法によって作成されたアレイの特定の使用または用途に関係がある。特定の用途のために、個々の増幅部位で許容され得る例示的な汚染レベルとしては、限定するわけではないが、多くても０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、または２５％汚染性アンプリコンが挙げられる。アレイは、これらの例示的なレベルの汚染性アンプリコンを有する１つまたは複数の増幅部位を含み得る。例えば、アレイの増幅部位の最大５％、１０％、２５％、５０％、７５％、またはさらには１００％が、いくつかの汚染性アンプリコンを有し得る。アレイまたは他の部位集合において、少なくとも５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、またはそれ以上の部位がクローン性であるかまたは見かけ上クローン性であり得ることが理解されよう。
【０１１７】
一部の実施形態では、プロセスが、別の事象またはプロセスが起きるのを効果的に排除するのに十分な速い速度で起きる場合に、動力学的排除は起こり得る。アレイの部位に溶液からの二重インデックス断片がランダムに播種され、二重インデックス断片のコピーが増幅プロセスで生成されて播種された各部位を容量まで満たす、核酸アレイの作成を例にとる。本開示の動力学的排除法では、播種および増幅プロセスは、増幅速度が播種速度を超える条件下で、同時に進み得る。したがって、第１標的核酸が播種された部位でコピーが作成される比較的速い速度は、第２核酸が増幅のためにその部位に播種されることを効果的に排除するだろう。動力学的排除増幅方法は、米国特許出願公開第２０１３／０３３８０４２号明細書の開示に詳細に記載されているように実行され得る。
【０１１８】
動力学的排除は、増幅を開始する比較的遅い速度（例えば、二重インデックス断片の第１コピーを作成する遅い速度）対二重インデックス断片の（または、二重インデックス断片の第１コピー）の後続のコピーを作成する比較的速い速度を利用することが可能である。前段落の例では、動力学的排除は、二重インデックス断片播種の比較的遅い速度（例えば、比較的遅い拡散または輸送）対二重インデックス断片シードのコピーで部位を満たすように増幅が起きる比較的速い速度に起因して起きる。別の例示的な実施形態では、動力学的排除は、部位に播種された二重インデックス断片の第１コピーの形成の遅れ（例えば、活性化の遅れまたは遅い活性化）対後続のコピーが部位を満たすように作成される比較的速い速度に起因して起き得る。この例では、個々の部位は、いくつかの異なる二重インデックス断片で播種されている場合がある（例えば、いくつかの二重インデックス断片が、増幅前の各部位に存在し得る）。しかしながら、任意の所与の二重インデックス断片の第１コピーの形成がランダムに活性化され、その結果、第１コピー形成の平均速度が、後続のコピーが生成される速度と比較して比較的遅くなる場合がある。この場合、個々の部位にいくつかの異なる二重インデックス断片が播種されている場合もあるが、動力学的排除により、その二重インデックス断片の１つのみを増幅することが可能になろう。より具体的には、いったん第１の二重インデックス断片が増幅のために活性化されると、部位は迅速にそのコピーで容量まで満たされ、それにより、第２の二重インデックス断片のコピーが、その部位で作成されるのは妨げられよう。
【０１１９】
一実施形態では、本方法は、（ｉ）二重インデックス断片を平均輸送速度で増幅部位に輸送することと、（ｉｉ）増幅部位にある二重インデックス断片を平均増幅速度で増幅することが同時に実行され、ここにおいて、平均増幅速度は、平均輸送速度を上回る（米国特許第９１６９５１３号明細書）。したがって、動力学的排除は、比較的遅い輸送速度を使用することにより、斯かる実施形態で達成され得る。例えば、所望の平均輸送速度を達成するために、十分に低い濃度の標的核酸が選択され得、低濃度ほど、遅い平均輸送速度をもたらす。あるいはまたはさらに、輸送速度を低下させるために、高粘度溶液および／または溶液における分子密集試薬の存在が使用され得る。有用な分子密集試薬の例としては、限定するわけではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、フィコール、デキストランまたはポリビニルアルコールが挙げられる。例示的な分子密集試薬および製剤は、米国特許第７３９９５９０号明細書に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれるものとする。所望の輸送速度を達成するために調整され得る別の因子は、標的核酸の平均サイズである。
【０１２０】
増幅試薬は、アンプリコン形成を促進する、いくつかの場合では、アンプリコン形成の速度を増大させるさらなる成分を含み得る。一例は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼは、反復侵入／伸長を可能にすることによりアンプリコン形成を促進し得る。より具体的には、リコンビナーゼは、ポリメラーゼによる二重インデックス断片の侵入と、アンプリコン形成の鋳型として二重インデックス断片を使用するポリメラーゼによるプライマーの伸長を促進し得る。このプロセスは、侵入／伸長の各ラウンドから生成されたアンプリコンが、後続のラウンドで鋳型として機能する連鎖反応として反復され得る。このプロセスは、変性サイクル（例えば、加熱または化学変性による）が必要ではないため、標準ＰＣＲよりも迅速に起こり得る。したがって、リコンビナーゼによって促進される増幅は、等温で実施され得る。増幅を促進するためには、リコンビナーゼによって促進される増幅試薬中に、ＡＴＰまたは他のヌクレオチド（またはいくつかの場合では、その非加水分解性類似体）を含むことが概して望ましい。リコンビナーゼおよび一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢが増幅をさらに促進し得るため、特に有用である。リコンビナーゼによって促進される増幅用の例示的な製剤としては、ＴｗｉｓｔＤｘ（英国ケンブリッジ）よりＴｗｉｓｔＡｍｐキットとして商業的に販売されているものが挙げられる。リコンビナーゼによって促進される増幅試薬の有用な成分および反応条件は、米国特許第５２２３４１４号明細書および同第７３９９５９０号明細書に記載されている。
【０１２１】
アンプリコン形成を促進する、いくつかの場合では、アンプリコン形成速度を増大させるために増幅試薬中に含まれ得る成分の別の例は、ヘリカーゼである。ヘリカーゼは、アンプリコン形成の連鎖反応を可能にすることによってアンプリコン形成を促進し得る。このプロセスは、変性サイクル（例えば、加熱または化学的変性による）が必要ではないため、標準ＰＣＲよりも迅速に起き得る。したがって、ヘリカーゼによって促進される増幅は、等温で実施され得る。ヘリカーゼおよび一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質の混合物は、ＳＳＢが増幅をさらに促進し得るため特に有用である。ヘリカーゼによって促進される増幅のための例示的な製剤としては、Ｂｉｏｈｅｌｉｘ（マサチューセッツ州ビバリー）からＩｓｏＡｍｐキットとして商業的に販売されているものが挙げられる。さらに、ヘリカーゼタンパク質を含む有用な製剤の例は、米国特許第７３９９５９０号明細書および同第７８２９２８４号明細書に記載されている。
【０１２２】
アンプリコン形成を促進する、いくつかの場合では、アンプリコン形成速度を増大させるために増幅試薬中に含まれ得る成分のさらに別の例は、起点結合タンパク質である。
【０１２３】
二重インデックス断片の表面への付着に続き、固定化され、増幅された二重インデックス断片の配列が決定される。シーケンシングは、任意の適切なシーケンシング技法を使用して実行され、鎖の再合成を含んだ、固定化され増幅された二重インデックス断片の配列を決定する方法は、当技術分野で既知であり、例えば、Bignell et al.（米国特許第８０５３１９２号明細書）、Gunderson et al.（国際公開第２０１６／１３０７０４号）、Shen et al.（米国特許第８８９５２４９号明細書）、およびPipenburg et al.（米国特許第９３０９５０２号明細書）に記載されている。
【０１２４】
本明細書で記載する方法は、種々の核酸シーケンシング技法と併せて使用することが可能である。特に適用可能な技法は、核酸が、その相対位置が変化しないようにアレイ中の固定された場所に付着し、そのアレイが繰り返し撮像されるものである。例えば、あるヌクレオチド塩基種を別のものと識別するのに使用される異なる標識と符号する、異なる色チャネルで画像が得られる実施形態が、特に適用可能である。一部の実施形態では、二重インデックス断片のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであり得る。好適な実施形態には、シーケンシング・バイ・シンセシス（「ＳＢＳ」）技法が含まれる。
【０１２５】
ＳＢＳ技法は、概して、鋳型鎖に対するヌクレオチドの反復付加により、新生核酸鎖を酵素的に伸長させることを伴う。ＳＢＳの従来の方法では、単一ヌクレオチドモノマーが、各送達において、ポリメラーゼの存在下で標的ヌクレオチドに供与され得る。しかしながら、本明細書に記載の方法では、２種類以上のヌクレオチドモノマーを、各送達において、ポリメラーゼの存在下で標的核酸に供与することが可能である。
【０１２６】
一実施形態では、ヌクレオチドモノマーは、ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）を含む。ヌクレオチドモノマーにおいてＬＮＡまたはＢＮＡを使用することにより、ヌクレオチドモノマーと、固定化二重インデックス断片に存在するシーケンシングプライマー配列とのハイブリダイゼーション強度が高まる。
【０１２７】
ＳＢＳは、ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマーを使用する場合もあるし、ターミネーター部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用する場合もある。ターミネーターを欠くヌクレオチドモノマーを使用する方法としては、例えば、パイロシーケンシング、および、本明細書でさらに詳細に記載する、γ−リン酸標識ヌクレオチドを使用するシーケンシングが挙げられる。ターミネーターを欠くヌクレオチドモノマーを使用する方法では、各サイクルで付加されるヌクレオチドの数は、一般的に可変であり、鋳型配列およびヌクレオチド送達方法に左右される。ターミネーター部分を有するヌクレオチドモノマーを利用するＳＢＳ技法では、ターミネーターは、ジデオキシヌクレオチドを利用する従来のＳａｎｇｅｒシーケンシングの場合のように、使用されるシーケンシング条件下で効果的に不可逆的である場合もあるし、ターミネーターは、Ｓｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）により開発されたシーケンシング法の場合のように、可逆的である場合もある。
【０１２８】
ＳＢＳ技法は、標識部分を有するヌクレオチドモノマーを使用する場合もあるし、標識部分を欠くヌクレオチドモノマーを使用する場合もある。したがって、標識の蛍光などの標識の特徴；分子量または電荷などのヌクレオチド分子の特徴；ピロリン酸の放出などのヌクレオチド組み込みの副産物；等に基づいて、組込み事象が検出され得る。２つ以上の異なるヌクレオチドがシーケンシング試薬に存在する実施形態では、異なるヌクレオチドは、互いに識別可能である場合もあるし、あるいは、２つ以上の異なる標識は、使用される検出技法下では識別不能である場合もある。例えば、シーケンシング試薬中に存在する異なるヌクレオチドは異なる標識を有し得、それらはＳｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ.）により開発されたシーケンシング法により例示されるような適切な光学系を使用して識別することが可能である。
【０１２９】
好適な実施形態には、パイロシーケンシング技法が含まれる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれたときの無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.” Analytical Biochemistry 242(1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) “Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. " Genome Res. 11(1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) “A sequencing method based on real-time pyrophosphate. ", Science 281(5375), 363；米国特許第６２１０８９１号明細書；同第６２５８５６８号明細書、および同第６２７４３２０号明細書）。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることによって検出され得、生成されたＡＴＰのレベルがルシフェラーゼ産生光子を介して検出される。配列決定される核酸は、アレイにおいてフィーチャに付着し得、アレイは、アレイのフィーチャにおけるヌクレオチドの組み込みに起因して生成される化学発光シグナルを捕捉するように画像化され得る。画像は、アレイを特定のヌクレオチド種（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）により処理した後で得られる。各ヌクレオチド種の付加後に得られる画像は、アレイ内のどのフィーチャが検出されたかという点で異なる。画像内のこれらの違いは、アレイ上のフィーチャの異なる配列内容を反映している。しかしながら、各フィーチャの相対的な位置は、画像において不変である。画像は、本明細書に記載の方法を使用して保存、処理、および解析することが可能である。例えば、アレイをそれぞれ異なるヌクレオチド種で処理した後で得られる画像は、可逆的ターミネーターをベースにしたシーケンシング法のための異なる検出チャネルから得られる画像について本明細書で例示するのと同じ方法で、扱うことが可能である。
【０１３０】
別の例示的な種類のＳＢＳにおいて、サイクルシーケンシングは、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号および米国特許第７０５７０２６号明細書に記載されるように、例えば、切断可能または光脱色可能な色素標識を含有する可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的な付加により達成される。このアプローチは、Ｓｏｌｅｘａ（現Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）により商品化されており、また、国際公開第９１／０６６７８号および同第０７／１２３７４４号にも記載されている。両方の終結が可逆的である蛍光標識ターミネーターと、切断される蛍光標識が利用可能であることは、効率的な周期性可逆的終結（cyclic reversible termination、ＣＲＴ）シーケンシングを容易にする。ポリメラーゼはまた、これらの修飾ヌクレオチドを効率的に組み込み、その修飾ヌクレオチドから伸長するように同時操作することが可能である。
【０１３１】
可逆的ターミネーターをベースにしたシーケンシングのいくつかの実施形態では、標識はＳＢＳ反応の条件下では、伸長を実質的に阻害しない。しかしながら、検出標識は、例えば切断または分解により除去可能である。画像は、標識がアレイ化された核酸フィーチャに組み込まれた後に取得され得る。特定の実施形態において、各サイクルは、４つの異なるヌクレオチド種を同時にアレイに送達することを含み、各ヌクレオチド種はスペクトルが異なる標識を有する。次いで、４つの異なる標識の１つに対し選択的な検出チャネルをそれぞれ使用して、４つの画像を得ることが可能である。あるいは、異なるヌクレオチド種を順次付加し、各付加ステップの間でアレイの画像を取得することが可能である。斯かる実施形態では、各画像は、特定の種類のヌクレオチドを組み込んだ核酸フィーチャを示すだろう。各フィーチャの配列内容が異なるため、異なる画像には、異なるフィーチャが存在または欠如するだろう。しかしながら、フィーチャの相対的な位置は画像において不変であろう。斯かる可逆的ターミネーター−ＳＢＳ法により得られる画像は、本明細書に記載するように、保存、処理、および解析することが可能である。画像取得ステップに続き、後続のヌクレオチドの付加および検出サイクルのために、標識を除去し、可逆的ターミネーター部分を除去することが可能である。標識が特定のサイクルで検出された後かつ後続のサイクルの前で標識を除去することは、バックグランドシグナルとサイクル間のクロストークを減少させるという利点をもたらし得る。有用な標識および除去方法の例を以下に記載する。
【０１３２】
特定の実施形態において、一部またはすべてのヌクレオチドモノマーは可逆的ターミネーターを含み得る。斯かる実施形態では、可逆的ターミネーター／切断可能フルオロフォアは、３´エステルリンケージを介してリボース部分に結合したフルオロフォアを含み得る（Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005)）。他のアプローチは、ターミネーターの化学作用を蛍光標識の切断から切り離した（Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)）。Ruparelらは、小さい３´アリル基を用いて伸長をブロックするが、パラジウム触媒を用いた手短な処理により容易に脱ブロック化できる、可逆的ターミネーターの開発について記載した。フルオロフォアを、長波長ＵＶ光に３０秒当てることによって容易に切断され得る光切断可能なリンカーを介して塩基に付着させた。したがって、ジスルフィド還元または光切断の何れかを光切断可能なリンカーとして使用することが可能である。可逆的終結に対する別のアプローチは、ｄＮＴＰに大量の色素を配置した後に起きる自然な終結を用いるものである。ｄＮＴＰにおける帯電した大量の色素の存在は、立体障害および／または静電的障害を通して効果的なターミネーターとして作用し得る。色素が除去されない限り、１つの組み込み事象の存在によりさらなる組み込みが妨げられる。色素の切断によりフルオロフォアは除去され、終結は効果的に反転させられる。修飾ヌクレオチドの例は、米国特許第７４２７６７３号明細書および同第７０５７０２６号明細書にも記載されている。
【０１３３】
本明細書に記載の方法およびシステムと共に利用することが可能な追加の例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号明細書、同第２００６／０１８８９０１号明細書、同第２００６／０２４０４３９号明細書、同第２００６／０２８１１０９号明細書、同第２０１２／０２７０３０５号明細書、および同第２０１３／０２６０３７２号明細書、米国特許第７０５７０２６号明細書、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、ならびに国際公開第０６／０６４１９９号および同第０７／０１０２５１号に記載されている。
【０１３４】
一部の実施形態は、４つ未満の異なる標識を用いた４つの異なるヌクレオチドの検出を使用され得る。例えば、ＳＢＳは、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書に組み込まれた資料に記載された方法およびシステムを使用して実行することが可能である。第１の例として、ヌクレオチド種の対は同じ波長で検出され得るが、これは、該対のうち一方の強度をもう一方と比較した差に基づいて、または、目に見えるシグナルの出現または消失を引き起こす（例えば、化学的修飾、光化学的修飾、または物理的修飾を介した）該対の一方の変化と、該対のもう一方で検出されるシグナルとの比較に基づいて、識別することが可能である。第２の例としては、４つの異なるヌクレオチド種のうち３つが特定の条件下において検出され得る一方で、４番目のヌクレオチド種は、該条件下で検出可能な標識を欠くか、または、該条件下では最小限にしか検出されない（例えば、バックグランド蛍光などによる最小限の検出）。最初の３つのヌクレオチド種の核酸への組み込みは、その個々のシグナルの存在に基づき求めることが可能であり、４番目のヌクレオチド種の核酸への組み込みは、任意のシグナルの欠如または該シグナルの最小限の検出に基づき求めることが可能である。第３の例としては、１つのヌクレオチド種が、２つの異なるチャネルで検出される標識を含み得るのに対し、他のヌクレオチド種は各チャネルの１つのみで検出される。上記３つの例示的な構成は互いに排他的であるとはみなされず、種々の組み合わせで使用することが可能である。３つの例を全て組み合わせる例示的な実施形態は、第１チャネルで検出される第１ヌクレオチド種（例えば、第１励起波長により励起された場合に第１チャネルにおいて検出される標識を有するｄＡＴＰ）と、第２チャネルで検出される第２ヌクレオチド種（例えば、第２励起波長により励起された場合に第２チャネルにおいて検出される標識を有するｄＣＴＰ）と、第１チャネルおよび第２チャネルの両方で検出される第３ヌクレオチド種（例えば、第１および／または第２励起波長により励起された場合に両チャネルにおいて検出される標識を少なくとも１つ有するｄＴＴＰ）と、いずれのチャネルでも検出されないか、または最小限のみ検出される、標識を欠く第４のヌクレオチド種（例えば、標識を持たないｄＧＴＰ）を用いる、蛍光ベースのＳＢＳ法である。
【０１３５】
さらに、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書に組み込まれた資料に記載されているように、シーケンシングデータは、単一チャネルを用いて得ることが可能である。このようないわゆる一色素シーケンシングアプローチでは、第１ヌクレオチド種は標識化されるが、該標識は第１画像が生成された後で除去され、第２ヌクレオチド種は第１画像が生成されて初めて標識化される。第３ヌクレオチド種は、第１画像および第２画像の両方でその標識を保持し、第４ヌクレオチド種は両画像で標識化されないままである。
【０１３６】
一部の実施形態は、ライゲーション技法によるシーケンシングを使用することが可能である。斯かる技法は、ＤＮＡリガーゼを使用してオリゴヌクレオチドを組み込み、そのオリゴヌクレオチドの組み込みを特定する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列の特定のヌクレオチドの同一性と相関する異なる標識を有する。他のＳＢＳ法と同様に、画像を、核酸フィーチャのアレイを標識化シーケンシング試薬で処置した後で得ることが可能である。各画像は、組み込まれた特定の種類の標識を有する核酸フィーチャを示すだろう。各フィーチャの配列内容が異なるために、異なる画像には異なるフィーチャが存在または欠如するだろうが、フィーチャの相対的位置は、画像において不変であろう。ライゲーションをベースとするシーケンシング法により得られる画像は、本明細書に記載するように保存、処理、および解析することが可能である。本明細書に記載の方法およびシステムとともに利用することが可能な例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許第６９６９４８８号明細書、同第６１７２２１８号明細書、および同第６３０６５９７号明細書に記載されている。
【０１３７】
一部の実施形態は、ナノポアシーケンシングを使用することが可能である（Deamer, D. W. & Akeson, M. “Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing. " Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)；Deamer, D. and D. Branton, “Characterization of nucleic acids by nanopore analysis”, Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)；Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, “DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope” Nat. Mater. 2:611-615 (2003)）。斯かる実施形態では、二重インデックス断片はナノポアを通過する。ナノポアは、合成ポアまたはα−ヘモリシンなどの生体膜タンパク質であり得る。二重インデックス断片がナノポアを通過する際、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することにより、各塩基対を特定することが可能である。（米国特許第７００１７９２号明細書；Soni, G. V. & Meller, “A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores.” Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)；Healy, K. “Nanopore-based single-molecule DNA analysis.” Nanomed. 2, 459-481 (2007)；Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. “A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution. " J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)）。ナノポアシーケンシングにより得られるデータは、本明細書に記載するように保存、処理、および解析することが可能である。特にデータは、本明細書に記載する光学画像および他の画像の例示的処理に従って、画像として処理することが可能である。
【０１３８】
一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を使用することが可能である。ヌクレオチドの組み込みは、例えば米国特許第７３２９４９２号明細書および同第７２１１４１４号明細書に記載されているように、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ−ホスフェート標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の相互作用を介して検出することが可能であり、または、ヌクレオチドの組み込みは、例えば米国特許第７３１５０１９号明細書に記載されているようにゼロモード導波路を用いて、ならびに、例えば米国特許第７４０５２８１号明細書および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書に記載されているように、蛍光ヌクレオチド類似体および操作ポリメラーゼを用いて、検出することが可能である。照射は、蛍光標識ヌクレオチドの組み込みを低バックグラウンドで観察することが可能であるように、表面結合ポリメラーゼの周りのゼプトリットルスケールの体積に制限することが可能である（Levene, M. J. et al. “Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations. " Science 299, 682-686 (2003)；Lundquist, P. M. et al. “Parallel confocal detection of single molecules in real time.” Opt. Lett. 33: 1026-1028 (2008)；Korlach, J. et al. “Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)）．斯かる方法で得られた画像は、本明細書に記載するように保存、処理および解析することが可能である。
【０１３９】
いくつかのＳＢＳ実施形態には、ヌクレオチドが伸長産物に組み込まれる際に放出されるプロトンの検出が含まれる。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ社（コネチカット州ギルフォード、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の子会社）より商業的に入手可能な電気検出器および関連技法、または、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書、同第２００９／０１２７５８９号明細書、同第２０１０／０１３７１４３号明細書、および同第２０１０／０２８２６１７号明細書に記載のシーケンシング法およびシステムを使用することが可能である。動力学的排除を使用して標的核酸を増幅する本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するために使用される基板に容易に適用させることができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生成することが可能である。
【０１４０】
上記のＳＢＳ法は、多数の異なる二重インデックス断片が同時に操作されるように、多重形式で有利に実行することが可能である。特定の実施形態では、異なる二重インデックス断片を共通の反応容器または特定の基板の表面で処理することが可能である。これは、シーケンシング試薬の簡便な送達、未反応試薬の除去、および組み込み事象を多重的に検出することを可能にする。表面結合した標的核酸を使用する実施形態では、二重インデックス断片はアレイ形式であり得る。アレイ形式では、二重インデックス断片は、典型的には、空間的に識別可能な方法で表面に結合し得る。二重インデックス断片は、直接的な共有結合、ビーズもしくは他の粒子への結合、または、表面に付着したポリメラーゼもしくは他の分子への結合により、結合し得る。アレイは、二重インデックス断片の単一コピーを各部位（フィーチャともいう）において含む場合もあるし、同一配列を有する多数のコピーが各部位またはフィーチャに存在する場合もある。多数のコピーは、以下にさらに詳細に記載するように、ブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲなどの増幅法により生成され得る。
【０１４１】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０フィーチャ／ｃｍ２、１００フィーチャ／ｃｍ２、５００フィーチャ／ｃｍ２、１，０００フィーチャ／ｃｍ２、５,０００フィーチャ／ｃｍ２、１０，０００フィーチャ／ｃｍ２、５０,０００フィーチャ／ｃｍ２、１００，０００フィーチャ／ｃｍ２、１，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、５，０００，０００フィーチャ／ｃｍ２、またはそれより高いものを含む、任意の種々の密度でフィーチャを有するアレイを使用することが可能である。
【０１４２】
本明細書に記載の方法の利点は、該方法が、複数のｃｍ２の迅速かつ効率的な検出を並行して行うことである。したがって、本開示は、本明細書で例示したものなどの当技術分野で既知の技法を使用して核酸を調製および検出することが可能な、統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬および／またはシークエンシング試薬を１つまたは複数の固定化された二重インデックス断片に送達することが可能な流体コンポーネントを備えることができ、該システムは、ポンプ、バルブ、リザーバ、および流体ラインなどコンポーネントを備える。フローセルは、標的核酸の検出用統合システムにおいて構成および／または使用され得る。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号明細書および米国特許出願番号第１３／２７３６６６号明細書に記載されている。フローセルで例示されるように、統合システムの１つまたは複数の流体コンポーネントを、増幅法と検出法に使用することが可能である。核酸シーケンシングの実施形態を例にとると、統合システムの１つまたは複数の流体コンポーネントは、本明細書に記載の増幅法と、上記で例示するようなシーケンシング法におけるシーケンシング試薬の送達に使用することが可能である。あるいは、統合システムは、増幅法を実行するためおよび検出法を実行するための、別個の流体システムを備えることが可能である。増幅核酸を作成し、核酸配列を決定することも可能な統合シーケンシングシステムの例としては、限定するわけではないが、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）、および米国特許出願番号１３／２７３６６６号明細書に記載されている装置が挙げられる。
【０１４３】
本明細書では、組成物も提供する。本明細書に記載の方法の実施時に、種々の組成物が生じ得る。例えば、化学的に処理されたヌクレオソーム除去単離核を含み、該単離核はインデックス付き核酸断片を含む、組成物が生じ得る。また、マルチウェルプレートも提供するが、ここで、該マルチウェルプレートのウェルは、インデックス付き核酸断片を有する単離核を含む。一実施形態では、単離核は、架橋剤、例えばホルムアルデヒドにより形成される種類の架橋などの、非天然架橋を含み得る。一実施形態では、インデックス付き核酸断片は、オーバーハングを有する切断制限部位において終端する。一実施形態では、単離核は、再編成ゲノムＤＮＡを含む。
【０１４４】
実施形態
実施形態１．複数の単細胞に由来する核酸を含むシーケンシングライブラリを調製する方法であって：
（ａ）複数の細胞から単離核を提供するステップと；
（ｂ）前記単離核の完全性を維持しながら、前記単離核を化学処理にかけてヌクレオソーム除去核を生成するステップと； 
（ｃ）前記ヌクレオソーム除去核のサブセットを、第１の複数のコンパートメントに分配し、各サブセットをトランスポソーム複合体と接触させるステップであって、各コンパートメントの前記トランスポソーム複合体は、トランスポザーゼと第１インデックス配列を含み、該第１インデックス配列はその他のコンパートメントの第１インデックス配列とは異なる、ステップと；
（ｄ）前記ヌクレオソーム除去核のサブセット中の核酸を複数の核酸断片に断片化し、前記第１インデックする配列を、前記核酸断片の少なくとも１つの鎖に組み込んで、インデックス付き核酸断片を含んだインデックス付き核を生成するステップであって、前記インデックス付き核酸断片は、トランスポザーゼに付着したままである、ステップと；
（ｅ）前記インデックス付き核を組み合わせてプールされたインデックス付き核を生成するステップと；
（ｆ）前記プールされたインデックス付き核のサブセットを、第２の複数のコンパートメントに分配するステップと；
（ｇ）各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片に第２インデックス配列を組み込んで、二重インデックス断片を生成するステップであって、各コンパートメントの前記第２インデックス配列は、その他のコンパートメントの第２インデックス配列とは異なる、ステップと；
（ｈ）前記二重インデックス断片を組み合わせることにより、前記複数の単細胞に由来する全ゲノム核酸を含むシーケンシングライブラリを生成するステップとを含む、方法。
【０１４５】
実施形態２．前記化学処理には、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能なカオトロピック剤を用いた処理が含まれる、実施形態１の方法。
【０１４６】
実施形態３．前記カオトロピック剤は、リチウム３，５−ジヨードサリチル酸を含む、実施形態２または３の方法。
【０１４７】
実施形態４．前記化学処理には、核酸−タンパク質の相互作用を阻害することが可能な界面活性剤を用いた処理が含まれる、実施形態１〜３の何れかの方法。
【０１４８】
実施形態５．前記界面活性剤にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる、実施形態１〜４の何れかの方法。
【０１４９】
実施形態６．前記核は、ステップ（ｂ）の前に架橋剤で処理される、実施形態１〜５の何れかの方法。
【０１５０】
実施形態７．前記架橋剤はホルムアルデヒドである、実施形態１〜６の何れかの方法。
【０１５１】
実施形態８．前記ホルムアルデヒドの濃度は、約０．２％〜約２％の範囲である、実施形態１〜７の何れかの方法。
【０１５２】
実施形態９．前記ホルムアルデヒドの濃度は約１．５％以下である。実施形態１〜８の何れかの方法。
【０１５３】
実施形態１０．ホルムアルデヒドによる前記架橋は、ステップ（ｆ）の後とステップ（ｇ）の前に逆転される、実施形態１〜９の何れかの方法。
【０１５４】
実施形態１１．前記架橋の逆転には、約５５℃〜約７２℃でのインキュベートを含む、実施形態１〜１０の何れかの方法。
【０１５５】
実施形態１２．前記トランスポザーゼは、前記架橋の逆転の前に前記インデックス付き核酸断片から解離される、実施形態１〜１１の何れかの方法。
【０１５６】
実施形態１３．前記トランスポザーゼは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を使用して前記インデックス付き核酸断片から解離される、実施形態１〜１２の何れかの方法。
【０１５７】
実施形態１４．前記核はステップ（ｄ）の前に制限酵素で処理される、実施形態１〜１３の何れかの方法。
【０１５８】
実施形態１５．前記核は、前記制限酵素での処理の後、リガーゼで処理される、実施形態１〜１４の何れかの方法。
【０１５９】
実施形態１６．ステップ（ｃ）および（ｆ）における分配は、蛍光活性化核ソーティングにより実行される、実施形態１〜１５の何れかの方法。
【０１６０】
実施形態１７．前記ヌクレオソーム除去核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含む、実施形態１〜１６の何れかの方法。
【０１６１】
実施形態１８．前記ヌクレオソーム除去核のサブセットは、１〜約２０００個の核を含む、実施形態１〜１７の何れかの方法。
【０１６２】
実施形態１９．前記第１の複数のコンパートメントはマルチウェルプレートである、実施形態１〜１８の何れかの方法。
【０１６３】
実施形態２０．前記マルチウェルプレートは９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートである、実施形態１〜１９の何れかの方法。
【０１６４】
実施形態２１．前記プールされたインデックス付き核のサブセットは、ほぼ等しい数の核を含む、実施形態１〜２０の何れかの方法。
【０１６５】
実施形態２２．前記プールされたインデックス付き核のサブセットは、１〜約２５個の核を含む、実施形態１〜２１の何れかの方法。
【０１６６】
実施形態２３．前記プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも１０分の１である、実施形態１〜２２の何れかの方法。
【０１６７】
実施形態２４．前記プールされたインデックス付き核のサブセットに含まれる核は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットの少なくとも１００分の１である、実施形態１〜２３の何れかの方法。
【０１６８】
実施形態２５．前記第２の複数のコンパートメントはマルチウェルプレートである、実施形態１〜２４の何れかの方法。
【０１６９】
実施形態２６．前記マルチウェルプレートは９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートである、実施形態１〜２５の何れかの方法。
【０１７０】
実施形態２７．ステップ（ｃ）は、前記ヌクレオソーム除去核のサブセットが分配された後、前記トランスポソーム複合体を前記コンパートメントに加えるステップを含む、実施形態１〜２６の何れかの方法。
【０１７１】
実施形態２８．前記トランスポソーム複合体はそれぞれトランスポゾンを含み、前記トランスポゾンはそれぞれ転移鎖を含む、実施形態１〜２７の何れかの方法。
【０１７２】
実施形態２９．前記転移鎖は、前記第１インデックス配列と、第１ユニバーサル配列を含む、実施形態１〜２８の何れかの方法。
【０１７３】
実施形態３０．ステップ（ｇ）における第２インデックス配列の組み込みは、各コンパートメントの前記インデックス付き核酸断片を、第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーに接触させるステップであって、前記第１ユニバーサルプライマーおよび第２ユニバーサルプライマーはそれぞれインデックス配列を含み、それぞれ前記第１ユニバーサル配列の一部と同一または相補的な配列を含む、ステップと、指数関数的増幅反応を実施するステップとを含む、実施形態１〜２９の何れかの方法。
【０１７４】
実施形態３１．前記第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、前記第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体である、実施形態１〜３０の何れかの方法。
【０１７５】
実施形態３２．前記第１ユニバーサルプライマーのインデックス配列は、前記第２ユニバーサルプライマーのインデックス配列の逆相補体とは異なる、実施形態１〜３１の何れかの方法。
【０１７６】
実施形態３３．前記第１ユニバーサルプライマーは、さらに、第１捕捉配列と、前記二重インデックス断片の３´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第１アンカー配列とを含む、実施形態１〜３２の何れかの方法。
【０１７７】
実施形態３４．前記第１捕捉配列は、Ｐ５プライマー配列を含む、実施形態１〜３３の何れかの方法。
【０１７８】
実施形態３５．前記第２ユニバーサルプライマーは、さらに、第２捕捉配列と、前記二重インデックス断片の５´末端のユニバーサル配列に対し相補的な第２アンカー配列とを含む、実施形態１〜３４の何れかの方法。
【０１７９】
実施形態３６．前記第２捕捉配列は、Ｐ７プライマー配列の逆相補体を含む、実施形態１〜３５の何れかの方法。
【０１８０】
実施形態３７．前記指数関数的増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる、実施形態１〜３６の何れかの方法。
【０１８１】
実施形態３８．前記ＰＣＲは１５〜３０サイクルを含む、実施形態１〜３７の何れかの方法。
【０１８２】
実施形態３９．前記二重インデックス断片に対し特異性を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを使用した、二重インデックス断片の濃縮をさらに含む、実施形態１〜３８の何れかの方法。
【０１８３】
実施形態４０．前記捕捉オリゴヌクレオチドは、固体基板の表面に固定化される、実施形態１〜３９の何れかの方法。
【０１８４】
実施形態４１．前記捕捉オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル結合対の第１メンバーを含み、前記結合対の第２メンバーは固体基板の表面に固定化される、実施形態１〜４０の何れかの方法。
【０１８５】
実施形態４２．前記二重インデックス断片をシーケンシングして、前記複数の単細胞に由来する核酸のヌクレオチド配列を決定するステップをさらに含む、実施形態１〜４２の何れかの方法。
【０１８６】
実施形態４３．
複数の増幅部位を含む表面を提供するステップであって、前記増幅部位は、遊離３´末端を有する付着した一本鎖捕捉オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団を含む、ステップと；
増幅部位を含む前記表面を、個々の二重インデックス断片からのアンプリコンのクローン集団をそれぞれが含む複数の増幅部位を生成するのに適切な条件下で、前記二重インデックス断片と接触させるステップをさらに含む、実施形態１〜４２の何れかの方法。
【０１８７】
実施形態４４．前記二重インデックス断片の数は、増幅部位の数を上回り、前記二重インデックス断片は前記増幅部位に流体アクセスし、前記増幅部位にはそれぞれ、前記シーケンシングライブラリ中のいくつかの二重インデックス断片のための容量がある、実施形態１〜４３の何れかの方法。
【０１８８】
実施形態４５．前記接触ステップは、（ｉ）前記二重インデックス断片を平均輸送速度で前記増幅部位に輸送するステップと、（ｉｉ）前記増幅部位にある二重インデックス断片を平均増幅速度で増幅させるステップとを同時に含み、前記平均増幅速度は前記平均輸送速度を上回る、実施形態１〜４４の何れかの方法。
【０１８９】
実施形態４６．化学的に処理されたヌクレオソーム除去単離核を含み、前記単離核は、インデックス付き核酸断片を含む、組成物。
【０１９０】
実施形態４７．前記単離核は、非天然架橋を含む、実施形態４６の組成物。
【０１９１】
実施形態４８．前記組成物は、オーバーハングを含む切断制限部位において終端するインデックス付き核酸断片を含む、実施形態４６または４７の何れかの組成物。
【０１９２】
実施形態４９．前記単離核は、再編成ゲノムＤＮＡを含む、実施形態４６〜４８の何れかの組成物。
【０１９３】
実施形態５０．ウェルが実施形態４６〜４９の何れかの組成物を含む、マルチウェルプレート。
【０１９４】
本開示は、以下の例により例示される。特定の例、材料、量、および手順は、本明細書に記載の開示内容の範囲および趣旨に従って、広く解釈されるべきであることを理解されたい。
【０１９５】
実施例１
組み合わせインデックス付加を伴う、数千個の単細胞ゲノムの生成およびシーケンシング
単細胞ゲノムのシーケンシングは、特に腫瘍進化の文脈において、体細胞変異を検出するのに有益であることが分かっている。現在の技法は、ライブラリ構築が高コストであるという欠点を持ち、これにより評価可能な細胞数が制限され、その結果、組織内の不均一性を測定する機能が制限されている。ここで、単細胞組み合わせインデックス付加シーケンシング（Single cell Combinatorial Indexed Sequencing、ＳＣＩ−ｓｅｑ）を、体細胞コピー数多型を検出するための、数千個のローパス単細胞ライブラリを同時に生成する手段として提示する。１６，６９８個の単細胞のライブラリを、培養細胞株、霊長類の前頭皮質組織、および膵臓腫瘍内のサブクローン性変異の詳細な評価を含む、２つのヒト腺がんの組み合わせより構築した。この実施例は、または、Vitak et al. (2017, Nature Methods, 14, 302-308,  doi: 10.1038/nmeth. 4154)としても入手可能である。
【０１９６】
方法
サンプル調製および核の単離
組織培養細胞株を、接着性の場合は（ＨｅＬａ  Ｓ３、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２．２；ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）、トリプシン処理してからペレット化し、懸濁液中で増殖させた場合は（ＧＭ１２８７８、Ｃｏｒｉｅｌｌ；ＯＨＳＵ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで核型分析済み）、ペレット化し、続いて、氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、それらを架橋して（ｘＳＤＳ法の場合）または直接、ヌクレオソームを除去してまたは除去しないで、核単離緩衝液（ＮＩＢ、１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）、１Ｘプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．１１８７３５８０００１））を使用する核調製へ進めた。組織サンプル（ＲｈｅｓｕｓＦｃｘ１，ＲｈｅｓｕｓＦｃｘ２，ＰＤＡＣ，ＣＲＣ）をＮＩＢ中でダウンスホモジナイズし、次に３５μｍの細胞ストレーナーに通してから、ヌクレオソームを除去した。アカゲザル凍結前頭皮質サンプルであるＲｈｅｓｕｓＦｃｘ１（４歳、メス）およびＲｈｅｓｕｓＦｃｘ２（９歳、メス）を、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒより、加齢非ヒト霊長類リソースの一部として入手した。
【０１９７】
標準的な単細胞ライブラリの構築
ＱＲＰ（quasi-random priming）とＤＯＰ（degenerate oligonucleotide primed PCR）を使用して構築した単細胞ライブラリを、ヌクレオソームを除去せずに単離核から調製し、ＮＩＢで１ｍＬとし、５μＬの５ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｄ１３０６）で染色し、次に、単細胞モードのＳｏｎｙ  ＳＨ８００でＦＡＮＳソーティングした。１つの核を、それぞれのサンプル緩衝液を含む各単一ウェルに置いた。ＱＲＰライブラリは、ＰｉｃｏＰｌｅｘ  ＤＮＡ−ｓｅｑ  Ｋｉｔ（Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｒ３００３８１）を製造業者のプロトコルに従って使用し、キットで提供されたインデックス付きＰＣＲプライマーを使用して、調製した。ＤＯＰライブラリは、ＳｅｑＰｌｅｘ  ＤＮＡ増幅キット（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．ＳＥＱＸＥ−５０ＲＸＮ）を製造業者のプロトコルに従って使用し、ただし、１０ｂｐインデックス配列を含むカスタムＰＣＲインデックス付きプライマーを使用して、調製した。過剰増幅を避けるため、増幅をモニタリングし、指数関数的増殖の半ばまで到達した反応を除去する目的で、全てのＱＲＰライブラリとＤＯＰライブラリを、ＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸサーモサイクラーにおいて、０．５μＬの１００Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｔ．５０５１３）を付加して増殖させた。
【０１９８】
ヌクレオソーム除去
リチウム補助ヌクレオソーム除去（ＬＡＮＤ）：調製した核をペレット化し、氷上で、５分間、２００μＬの１２．５ｍＭのリチウム３，５−ジヨードサリチル酸（本文では、ジヨードサリチル酸リチウムともいう、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｄ３６３５）を追加したＮＩＢに再懸濁してから、８００μＬのＮＩＢを加え、次いで、フローソーティングに直接かけた。
【０１９９】
架橋およびＳＤＳヌクレオソーム除去（ｘＳＤＳ）：細胞を１０ｍＬの培地（細胞培養液）中で、または、核を、１．５％のホルムアルデヒドを含む１０ｍＬのＨＥＰＥＳ  ＮＩＢ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％ｉｇｅｐａｌ（登録商標）、１Ｘプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．１１８７３５８０００１））（組織サンプル）中で、室温で１０分間インキュベートすることにより、架橋を達成した。架橋反応は、反応物を２００ｍＭのグリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｇ８８９８−５００Ｇ）に持っていき、氷上で５分間インキュベートすることにより中和させた。細胞培養サンプルを架橋し、次に、１０ｍＬの氷冷の１ｘ  ＰＢＳで１回洗浄し、氷上で２０分間、ＮＩＢ緩衝液中でインキュベートすることにより核を単離し、再度ペレット化した。次に、核を、０．３％  ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｌ３７７１）を有する８００μＬの１ｘ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ２．１（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｂ７２０２Ｓ）に再懸濁し、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で３０分間激しく振とうしながら４２℃でインキュベートした。次に、ＳＤＳを、２００μＬの１０％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．９００２−９３−１）を加えることによりクエンチし、３０分間激しく振とうしながら４２℃でインキュベートした。
【０２００】
タグメンテーションおよびＰＣＲを介した組み合わせインデックス付加
核を、５μＬの５ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｄ１３０６）で染色し、３５μｍの細胞ストレーナーに通した。Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｃａｔ．ＦＣ−１２１−１０３１）の１ｘ  Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）タグメントＤＮＡ（ＴＤ）緩衝液１０μＬを各ウェルにおいてＮＩＢで希釈して、９６ウェルプレートを準備した。Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００フローソーターを使用して、迅速ソートモードで、２０００個の単一核を９６ウェルタグメンテーションプレートの各ウェルにソートした。次に、ユニークにインデックス付けした２．５μＭトランスポザーゼ−アダプター複合体（トランスポソーム）１μＬを、各ウェルに加えた。これらの複合体および関連する配列は、Amini et. al. (Amini, S. et al. Nat. Genet. 46,1343-9, 2014）に記載されている。反応物を５５℃で１５分間インキュベートした。室温まで冷却した後、全てのウェルをプールして、前記のようにＤＡＰＩで染色した。８．５μＬの０．０５８％ＳＤＳ、８．９ｎＭのＢＳＡ溶液、および２．５μＬの１０μＭの２つのユニークにバーコード化されたプライマー含む各ウェルを有する、第２の９６ウェルプレートまたは９６ウェルプレートのセットを準備した。次に、９６個の反応のプールから、２２個のタグメンテーション後の核を、同じ機器上で、ただし単細胞ソートモードで第２プレートの各ウェルにフローソートし、次に、５５℃で５分間ＳＤＳ溶液中でインキュベートして、核骨格を壊し、トランスポザーゼ酵素を解離させた。６８℃で１時間インキュベートすることにより架橋を逆転させた（ｘＳＤＳ）。次に、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｃａｔ．ＦＣ−１２１−１０３１）７．５μＬならびに１００ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｔ．５０５１３）０．５μＬおよび水４μＬを加えることにより、ＳＤＳを希釈した。次に、まず反応物を７２℃で５分間、次に９８℃で３分間インキュベートし、［９８℃で２０秒、６３℃で１５秒、および７２℃で２５秒］を１５−２０サイクル行うことにより、リアルタイムＰＣＲをＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸサーモサイクラー上で実行した。反応をモニタリングし、指数関数的増幅がウェルの大部分で観察されたら、反応を止めた。次に、各ウェルの５μＬをプールし、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．２８１０４）を使用して精製し、３０μＬのＥＢで溶出した。
【０２０１】
ライブラリの定量化およびシーケンシング
ライブラリを、２００ｂｐおよび１ｋｂｐの範囲の間で、Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｃａｔ．５０６７−４６２６）において定量化した。ライブラリを、０．８ｐＭをロードしたＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００において、カスタムシーケンシングケミストリープロトコル（リード１：５０イメージ化サイクル；インデックスリード１：８イメージ化サイクル、２７ダークサイクル、１０イメージ化サイクル；インデックスリード２：８イメージ化サイクル、２１ダークサイクル、１０イメージ化サイクル；リード２：５０イメージ化サイクル）を用い、Amini et. al. (Amini, S. et al. Nat. Genet. 46,1343-9, 2014）に記載されるカスタムシーケンシングプライマーを使用して、シーケンシングした。ＱＲＰおよびＤＯＰライブラリを、二重インデックス付加を伴うｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ７５サイクルキットを使用して、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００において、標準的なプライマーを使用して、シーケンシングした。ＱＲＰでは、リードの最初の１５ｂｐを「Ｇ」塩基について高度に濃縮するという追加の課題があるが、これは、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）２色化学作用では蛍光性ではなく、そのため、機器におけるクラスタの特定はできない。そのため、この領域をスキップするカスタムシーケンシングプロトコルを使用して、ライブラリをシーケンシングした（リード１：１５ダークサイクル、５０イメージ化サイクル；インデックスリード１：１０イメージ化サイクル；インデックスリード２：１０イメージ化サイクル）。
【０２０２】
シーケンシングリード処理
ＳＣＩ−ｓｅｑの生のリードを処理するソフトウェアは、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のsci-seq. sourceforge. netで入手可能である。シーケンスランを、−−ｃｒｅａｔｅ−ｆａｓｔｑ−ｆｏｒ−ｉｎｄｅｘ−ｒｅａｄｓオプションと−−ｗｉｔｈ−ｆａｉｌｅｄ−ｒｅａｄｓオプションを有するｂｃｌ２ｆａｓｔｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、バージョン２．１５．０）を使用し処理して、ｆａｓｔｑファイルを生成した。インデックスリードを連結し（全部で３６ｂｐ）、末端に付加されたユニークリード番号を用いてリード名として使用した。次に、これらのインデックスを、対応するインデックス参照セットとマッチングさせ、４つのインデックス成分（ｉ７−トランスポザーゼ（８ｂｐ）、ｉ７−ＰＣＲ（１０ｂｐ）、ｉ５−トランスポザーゼ（８ｂｐ）、およびｉ５−ＰＣＲ（１０ｂｐ））のそれぞれについてハミング距離２を許容し、次に、四重インデックス組み合わせにマッチングしたリードを正確なインデックスに名称を変え（かつ、ユニークなリードナンバーは保持し）、これを、続いて、細胞識別子として使用した。次に、リードをアダプタートリミングし、次いで対にし、対になっていないリードをＢｏｗｔｉｅ２により参照ゲノムに整列させ、混合した。ヒト調製物をＧＲＣｈ３７に整列させ、アカゲザル調製物をＲｈｅＭａｃ８に整列させ、ヒト／マウス混合調製物を組み合わせたヒト（ＧＲＣｈ３７）およびマウス（ｍｍ１０）参照の組み合わせに整列させた。整列させたｂａｍファイルは、Ｂｏｗｔｉｅ２により報告されるように、１０未満の整列スコアのリードと共に、各バーコードを基準に同一の整列座標を有するリードを取り除くカスタムスクリプトを使用する、ＰＣＲ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ除去にかけた。
【０２０３】
単細胞識別
各ＰＣＲプレートについて、全部で９，２１６個のユニークなインデックスの組み合わせが可能であるが（１２個のｉ７−トランスポザーゼインデックス×８個のｉ５−トランスポザーゼインデックス×１２個のｉ７−ＰＣＲインデックス×８個のｉ５−ＰＣＲインデックス）、これについては、インデックス組み合わせの大部分が存在しないはずである―つまり、核のトランスポザーゼインデックス組み合わせが所与のＰＣＲウェルにソートされなかった―ことから、少数だけが実質的なリードカウントを有するはずである。これらの「空の」インデックスが含むリードは、典型的には非常に少なく（ランの１−３％）、リードの大部分は真の単細胞インデックス組み合わせに分類される（ランの９７−９９％）。結果として生じる、インデックス組み合わせについてのｌｏｇ１０ユニークリードカウントのヒストグラム（図６）は、２つの正規分布：ノイズ成分と単細胞成分の混合を生成する。次に、Ｒパッケージ「ｍｉｘｔｏｏｌ」を使用し、混合モデルにフィットさせて（ｎｏｒｍａｌｍｉｘＥＭ）、各成分の比率（λ）、平均（μ）、および標準偏差（σ）を特定した。単細胞ライブラリとして認定するためのリードカウント閾値は、ｌｏｇ１０領域の単細胞成分の平均を１標準偏差下回る値か、ノイズ成分の平均の１００倍大きい値（ｌｏｇ１０領域では＋２）の大きい方であるように設定し、最小値は１，０００ユニークリードでなければならなかった。
【０２０４】
ヒト−マウス混合実験
ｉ）細胞段階（ＨｕｍＭｕｓ．ＬＡＮＤ１およびＨｕｍＭｕｓ．ＬＡＮＤ２）で混合するか、またはｉｉ）核段階（ＨｕｍＭｕｓ．ＬＡＮＤ３，ＨｕｍＭｕｓ．ＬＡＮＤ４、およびＨｕｍＭｕｓ．ｘＳＤＳ）で混合する２つのアプローチのうち一方を、ヒト（ＧＭ１２８７８またはＨｅＬａ  Ｓ３）とマウス（３Ｔ３）細胞の混合物に対し利用した。後者を利用して、ダブレットを生じさせる可能性がある核の架橋または凝集を制御した。２つの別個のＤＡＰＩ陽性集団がフローソート時に観察されるようなライブラリを本明細書に記載するように構築し、該ライブラリは、比率が歪まないように、同じゲートの集団を両方含んだ。リードは他の実験のように処理したが、ただし、リードは、ＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）およびｍｍ１０を含む参照配列に整列させた。マッピングクオリティ１０フィルタにより、両ゲノムの保存領域に整列したリードを効率的に除去し、次に、特定された単細胞それぞれについて、各種に対するリードを記録し、これを使用して衝突頻度を推定した。初期のＬＡＮＤ調製物では、２５個のインデックス付き核をＰＣＲウェル毎にソートし、２８．１％および１０．４％という総衝突率（つまり、ヒト−マウス衝突率の２倍）を得た。第２の２つのＬＡＮＤ調製物では、ＰＣＲウェル毎に２２個の核をソートしたが、これは、一方の調製物では４．３％の総衝突率を生成し、もう一方では、検出可能な衝突はなかった。ｘＳＤＳ調製物で２つのＦＡＮＳソート条件もテストしたが、一方は寛大で、より広い範囲のＤＡＰＩ蛍光を許容し、もう一方はより制限的とし、同じＰＣＲプレートの別の部位で両方を調製した。許容的なゲーティングでは、２３．６％の総衝突率を観察したが、より制限的なゲーティングでは実質的に減少し、８．１％だった。これらの結果に基づき、より制限的なＦＡＮＳを使用して、ＰＣＲウェル毎に２２個の核のソートを続けることにした。
【０２０５】
ライブラリ深度予測
ライブラリプールをより深い深度までシーケンシングする場合、またはシーケンシングする際のライブラリプールの性能を評価するため、ランダムなリードを、各ＳＣＩ−ｓｅｑ調製物から、非整列リードおよび総生リードの１％毎に置換を含まない低質リードを含む全ての組み合わせインデックスにわたって、漸増的にサンプリングした。各点で、各単細胞インデックスに割り当てられた高品質（ＭＱ≧１０）な整列リードの総数と、ユニークなＰＣＲ複製物ではないリードの割合、および、対応する、そのインデックスに割り当てられたサンプリング総リードの割合を特定した。これらの点を使用して、非線形モデルとヘインズ−ウルフ変換モデルの両方をフィットさせて、プール内の各個別の単細胞ライブラリについてさらなるシーケンシングを予測し、５％という、細胞でのユニークリードパーセンテージの中央値まで予想した。モデルの正確性を測るため、細胞毎のユニークリードパーセンテージの中央値が９０％である点に到達すると考えられる、ダウンサンプリングした各ライブラリの生リードの数を求めたが、これは、低カバレッジでシーケンシングしたライブラリで到達されたものよりも幾分低い。次に、３０回の反復のために所定の数のリードをサブサンプリングし、各反復で各細胞について新しいモデルを構築し、次に、達成された真のシーケンシング深度までの、各細胞のユニークリードカウントを予測した。次に、全細胞の全ての反復にわたる真のリードカウントの標準偏差を計算した。
【０２０６】
ゲノムウィンドウ生成
ゲノムウィンドウを、カスタムツールを使用して、各ライブラリベースで決定した。各染色体について、全染色体のサイズを標的ウィンドウサイズにより分割して、染色体毎のウィンドウ数を生成した。全単細胞（完全コピー数が決定された全ヒトサンプルおよび平均コピー数と比較して増幅または欠失が確認されたプールされた各サンプルとして、ＧＭ１２８７８）のプール全体で要約した染色体の総リードカウントを、次に、ウィンドウカウントにより分割して、ウィンドウごとの平均リードカウントを求めた。次に、染色体を移動させ、プールからの配列リードを符号させ、ウィンドウごとの標的リードカウントが達成されたらウィンドウブレイクを作成した。染色体の境界でのウィンドウは、それが、その染色体について、ウィンドウ限界ごとに７５％超の平均リードを含む場合にのみ含めた。動的ウィンドウを使用することにより、高度反復領域、動原体、および、固定サイズビン２２の場合にリードドロップアウトを引き起こし得る他の複合領域などのバイアスを説明した。
【０２０７】
ＧＣバイアス修正
リードを可変サイズのビンに置き、動的ウィンドウのＧＣ含量ではなく、個々のリードのＧＣ含量に基づいてＧＣを修正した。単細胞解析に必要な大きいビンは、より小規模のＧＣ含量変化を平均するものと仮定する。さらに、ＳＣＩ−ｓｅｑは、ゲノムの大きい領域が増幅されるプレ増幅を伴わないため、ＧＣバイアスはＰＣＲによってのみ生じ、アンプリコン特異的である。リードの修正量を計算するため、所与のＧＣを有する全リードの割合を、同じＧＣ割合で平均挿入サイズを有するシミュレートした総リードの割合と比較した。次に、この量をリードカウントの代わりに使用し、所与のウィンドウにおける前リードにわたって合計した。ＤＡＣブラックリスト化領域に存在する全領域は、ヒトサンプル解析のための解析からは除外した（http: //genome. ucsc. edu/cgi-bin/hgFileUi?db=hg19&g=wgEncodeMapability）１９。ＧＣ修正後、全てのリードを、ゲノムにわたって、ビン毎に平均リード数により正規化した。最後に、各ウィンドウで、各細胞の正規化リードカウントをとり、それを、プールしたサンプルベースラインにより割って、比率スコアを生成した。
【０２０８】
データのばらつきの測定
データの質を測定するため、カバレッジのばらつきについての２つの異なる測定値：中央絶対偏差（ＭＡＤ）、中央絶対対差（median absolute pairwise difference、ＭＡＰＤ）を計算した。各スコアについて、細胞内の平均ビンカウントにより正規化された近傍のビンの間の全ての対の差の絶対値の中央値を計算した（ＭＡＰＤスコアについてはｌｏｇ２−正規化比率）。これらのスコアは、頻度の低い２，２２、コピー数状態の変化ではなく、技術的なノイズに起因する正規化ビンリードのばらつきを測定するものである。
【０２０９】
コピー数多型コール
ＣＮＶコールを、２つの異なるセグメント化戦略を利用する２つの利用可能なＲパッケージ：隠れマルコフモデルアプローチ（ＨＭＭｃｏｐｙ，バージョン３．３．０，Ha, G. et al., Genome Res. 22, 1995-2007, 2012）およびＣｉｒｃｕｌａｒ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＤＮＡｃｏｐｙ，バージョン１．４４．０，Olshen et al. Biostatistics5, 557-572, 2004）を用いて、ウィンドウ化し、ＧＣを修正し、バルクサンプルを正規化したリードにおいて実行した。値は、インプットについて変換したＬｏｇ２（ＣＢＳに対し２＊ｌｏｇ２）であり、コピー数コールは、Knouse et al. 2016, Knouse et al., Genome Res. gr. 198937.115, 2016,  doi: 10.1101/gr. 198937.115）からの最適化パラメータに基づいて行った。サイズ≧５Ｍｂのコピー数コールを検出するための最適な感度および特異性のため、セグメント伸長（Ｅ）の確率をＨＭＭでは０．９９５に設定し、ＣＢＳでは、コピー数変化（α）を認める有意水準が０．０００１であるように選択した。損失および獲得をコールするＬｏｇ２カットオフは、ＨＭＭでは０．４および−０．３５とし、ＣＢＳでは１．３２および０．６とした。ＣＮＶコールのための追加のツールとして、データ正規化のために別の方法を使用するＧｉｎｋｇｏ２２を使用した。各細胞に対するベッドファイルと、Ｐｉｃａｒｄ  Ｔｏｏｌｓ（ダウンサンプル確率０．１を使用）を用いて作成した量を減らしてサンプリングしたベッドファイルをアップロードした。解析には、ダウンサンプリングしたバルクベッドファイルで単細胞を分割することを選択し、サンプルについて倍数性が既知である場合は、ＦＡＣＳファイルを作成して、Ｇｉｎｋｇｏにその倍数性を正規化させた。３つの方法でのコールを、各ウィンドウを基準に交差させるか、または、全長が染色体腕の≧８０％であるコールのみを含むようにフィルタリングし、次に、異数性解析のために交差させた。
【０２１０】
腫瘍切断点解析
孤発型の異数性の評価とは異なり、腫瘍構造多型は、染色体内に切断点の大部分を有し、はるかに複雑である。さらに、腫瘍の任意の所与のサブクローン内の孤発型の異数性も、存在する亜集団の正確なプロファイルほどの妥当性はない。そのため、ＨＭＭおよびＣＢＳにより分割した比率スコアマトリックスを使用して、細胞中の分割領域の境界を一致させることにより、切断点を特定した。次に、結果として生じた、ゲノム中で共有される染色体切断点の分布を使用して、コールが作成された特異的なウィンドウの可変性を説明する極大値を特定し、次に、細胞の少なくとも５％に存在するものを保持した。次に、各切断点の全長内の全てのウィンドウを合わせ、正倍数性集団の平均値を超える、各異数体細胞の新しいｌｏｇ２比を計算した。次に、主な成分の解析を実行してから、シルエット解析で求めたｋ値を用いてｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングを行った。仮想単細胞の〜１０％を占め得るダブレットの影響を最小化し、また、低パフォーマンス細胞を除外するため、それぞれの重心に近いもののみを保持した。次に、各クラスタ内の全細胞の配列リードを合わせ、次に、ＨＭＭ戦略を使用して高分解能ＣＮＶ解析（標的ウィンドサイズ１００ｋｂｐ）を実行し、その後、完全なコピー数状態の特定と、スライディングウィンドウ外れ値戦略２０を使用した極限的増幅および欠失の特定を行った。腫瘍内のクローン関係は、構造的な変化は、細胞に対しより影響力の強いＤＮＡの切断を伴うという仮定に基づくセグメントのコピー数のずれとは対照的に、共有された切断点により最も正確に捕捉される。したがって、高分解能（１００ｋｂｐ）ＣＮＶ解析を使用して特定された、セグメント総数の少なくとも９０％で重複する（コピー数変化としてコールされた、正確なウィンドウのノイズを説明する）、切断点間のセグメント比率を評価することにより、細胞を比較した。
【０２１１】
結果
均一なゲノムカバレッジのためのヌクレオソーム除去
均一に分配された配列リードを生成するために組み合わせインデックス付加を適応させることに対するハードルは、核の完全性を損なうことなくゲノムＤＮＡへのヌクレオソーム結合を除去することである。ｓｃｉＡＴＡＣ−ｓｅｑ方法を天然のクロマチン上で実行することにより、ＤＮＡを、オープンクロマチン（ゲノムの１−４％）の領域内でのみ、ライブラリ分子に変換することが可能になる１８。この制限は、エピジェネティックな特徴付けのために望ましいが；ＣＮＶ検出では、それは、生物学的なバイアスと、著しく制限されたリードカウント（細胞毎に〜３０００個）を生じさせる１７。したがって、我々は、ＳＣＩ−ｓｅｑライブラリ構築のために核の完全性を維持しながら、ヌクレオソームをゲノムＤＮＡから解放する、２つの戦略を開発した。第１のリチウム補助ヌクレオソーム除去（ＬＡＮＤ）は、カオトロピック剤であるジヨードサリチル酸リチウムを利用して、細胞におけるＤＮＡ−タンパク質の相互作用を阻害し、その結果、ＤＮＡをヒストンから放出させる。第２のＳＤＳを用いた架橋（ｘＳＤＳ）は、界面活性剤ＳＤＳを使用して、ヒストンタンパク質を変性し、ヒストンタンパク質がＤＮＡに結合できないようにする。しかしながら、ＳＤＳは、核の完全性に対し破壊的な作用を有し、そのため、インタクトな核を維持するために、変性前に架橋ステップを必要とする。
【０２１２】
これらの戦略の実行可能性をテストするため、クロマチンアクセシビリティーおよびゲノム構造を広範に測定したＨｅＬａ  Ｓ３細胞株において、バルク（３０，０００個の核）調製を行い１９，２０、標準的な対照と共に、ＬＡＮＤまたはｘＳＤＳ処理を行った。これらの３つのケースにおいて、核はインタクトなままだった（これが、ＳＣＩ−ｓｅｑワークフローの重要な要件である）（図４ｂ）。次に、調製した核を、標準的なＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリ構築に進めた１６。未処理核から調製されたライブラリは、予想されたＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを生成し、１０．８倍に濃縮された配列リードが、注釈を付けたＨｅＬａ  Ｓ３のアクセシビリティー部位に整列した。ＬＡＮＤ調製物とｘＳＤＳ調製物の両方の濃縮は、それぞれ、２．８倍および２．２倍と実質的により低く、ショットガンシーケンシングで観察された１．４倍に近かった（図４ｃ、表１）。さらに、ＬＡＮＤ調製物およびｘＳＤＳ調製物に存在するユニーク配列リードの予想数は、それぞれ１７億個および７億９８００万個であり、１億７０００万個の標準ライブラリよりはるかに大きく、ゲノムのより多くの部分が、実行可能なシーケンシング分子に変換されたことを示唆した。
【０２１３】
表１．バルクライブラリ統計。ヌクレオソーム除去を評価するために構築したバルク細胞ライブラリについての情報。＊ＳＨＯＴライブラリは、アクセッション：ｐｈｓ０００６４０．ｖ４．ｐ１下のＨｅＬａ  ｄｂＧａＰリポジトリより得た、６０Ｍリードのランダムなサンプリングである（The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature489, 57-74 (2012)。ライブラリサイズの推定値は、Ｐｉｃａｒｄツールの機能「EstimateLibraryComplexity」を使用して生成した。ショットガンシーケンシングでは、使用したリードは重複除去されるため、重複率とライブラリサイズの推定値は求めなかった。
【０２１４】
【表１】
2019520828.tif 000003
【０２１５】
ヌクレオソームの除去を伴うＳＣＩ−ｓｅｑ
当社の単細胞組み合わせインデックス付加ワークフローを用いた、ヌクレオソーム除去の性能を評価するため、まず、深く測定した、正倍数性リンパ芽球様細胞株ＧＭ１２８７８に焦点を当てた１４，１５，１９。ＰＣＲインデックス付加段階での単一９６ウェルプレートをそれぞれ使用した、種々のＬＡＮＤ条件の全部で６個のＳＣＩ−ｓｅｑライブラリと、３×９６ウェルＰＣＲプレートを用いる単一ｘＳＤＳライブラリを生成した。既存の方法との比較として機能させるため、準ランダムプライミング（ＱＲＰ、４０個がＱＣを通過）を使用した４２個の単細胞ライブラリと、変性オリゴヌクレオチドｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ（ＤＯＰ、４５個がＱＣを通過）を使用した５１を調製した。最後に、５０個の細胞の核型を決定して、異数性測定の非シーケンシング手段として機能させた（表２）。
【０２１６】
【表２ａ】
2019520828.tif 000004
【０２１７】
【表２ｂ】
2019520828.tif 000005
【０２１８】
表２．ＳＣＩ−ｓｅｑライブラリ概要。ライブラリ構築についての情報および各ＳＣＩ−ｓｅｑライブラリ調製について得られた実際の深度についての統計値。（ａ）ライブラリ構築物と、単細胞ライブラリのリードカウント閾値を求めるために使用する混合モデルについての詳細。（ｂ）ライブラリにおける、本研究で得られた実際の配列深度についての詳細。
【０２１９】
各ＳＣＩ−ｓｅｑ調製物では、潜在的なインデックス組み合わせの数は９６（トランスポザーゼインデックス付加）×Ｎ（ＰＣＲインデックス付加、プレートごとに９６）であるが；各ＰＣＲウェルは、１５−２５個のトランスポザーゼインデックス付加核のみを含むことから、全てのインデックス組み合わせが単細胞ライブラリを表すわけではない。空ではないインデックス組み合わせを特定するため、潜在的なインデックス組み合わせそれぞれについて、ユニークで（つまり、非ＰＣＲ重複）、高品質（ＭＱ≧１０）の整列リードのｌｏｇ１０変換ヒストグラムを生成した。これは、５０〜２００リードに集中した低リードカウントのノイズ成分と、１０，０００〜１００，０００リードに集中した高リードカウントの単細胞成分を含んだ二峰性分布を生成した（図７ａ、ｂ、図８）。次に、混合モデルを使用して、この高リードカウント成分に当てはまるインデックスを特定したところ（図６）、ヌクレオソーム除去のためにＬＡＮＤを使用した６つのＳＣＩ−ｓｅｑ調製物では４，６４３個の単細胞ライブラリが生じ、ｘＳＤＳ調製物では３，１２３個が生じた。
【０２２０】
仮想の単細胞ライブラリの大部分が真の単細胞を含むことを確かめるため、ＬＡＮＤを使用したヒト細胞とマウス細胞の混合物（全部で２，３６９細胞）において４つのＳＣＩ−ｓｅｑライブラリを調製し、ＰＣＲウェル毎に２２または２５個の核を入れ、１つの調製では、２つのＦＡＮＳ条件の間でｘＳＤＳ分離を使用した（総細胞１，３６７個；図９）。各実験では、リードの≧９０％がヒトまたはマウスゲノムに独占的に整列する仮想単細胞の比率を解析した。残りの細胞は、ヒト−マウス衝突（つまり、ダブレット）を表し、これは、総衝突率の約半分を占めた（残りの半分はヒト−ヒトまたはマウス−マウスである）。総衝突率は０−２３．６％の間で変動し、これを使用して、ｓｃｉＡＴＡＣ−ｓｅｑ１７と比較可能な、＜１０％という標的ダブレット頻度に対する制限的ソート条件、または、高スルーアウト単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ技法２１では、ウェル毎に２２個の核とすることを決定した。
【０２２１】
ＳＣＩ−ｓｅｑ調製物の各ライブラリについて生成されるユニークリードカウントは、ライブラリ複雑度およびシーケンシング深度の関数である。開発時にあらゆる調製物を深くシーケンシングすることは抑制的コストとなることから、当社は、モデルを実行して、予測リードカウントと、深いシーケンシング深度で達成されるであろうＰＣＲ重複パーセンテージを予測した（図７ｃ、方法）。質を評価する手段として、いくつかの他の測定基準と共に、追加のシーケンシングが過剰になる点を表す（つまり、追加リードの５０％超が新しい情報を提供しない）、細胞のリードの５０％の中央値がＰＣＲ重複（Ｍ５０）である深さを特定した（表３）。シーケンシングしたリードのサブセットからのモデル予測は、全ライブラリにわたる中央値の０．０２％以内（最大２．２５％、平均０．４１％）で、ユニークリードカウントの実際の中央値を正確に予測した。さらなる確認として、いくつかの調製物からのＰＣＲウェルのサブセットを追加してシーケンシングし、ユニークリードカウントを生成したが、これは、当社のモデルにより予測されたものの中央値の０．１３％以内（最大３．５６％、平均０．７２％）だった（図１０）。
【０２２２】
【表３ａ】
2019520828.tif 000006
【０２２３】
【表３ｂ】
2019520828.tif 000007
【０２２４】
表３．ＳＣＩ−ｓｅｑライブラリ予測統計値。深いシーケンシング深度が得られた場合の、各ＳＣＩ−ｓｅｑライブラリの予測統計値についての情報。予測には、方法セクションに記載したモデルを使用する。失敗した（ＧＭ１２８７８．ＬＡＮＤ２およびＨｅＬａ．ＬＡＮＤ２）または、予測が当てはまらないほど飽和するまでシーケンシングしたライブラリ（アカゲザル．ｉｎｄ１．ｘＳＤＳおよびアカゲザル．ｉｎｄ２．ｘＳＤＳ）は含めていない。（ａ）その点に到達する生リードカウントを含む、所与の複雑性中央値までの予測。（ｂ）ライブラリを、飽和するまでシーケンシングした場合、種々のリードカウント閾値を満たす単細胞数を列挙する（複雑性中央値５％）。
【０２２５】
カバレッジの均一性を、平均絶対偏差（ＭＡＤ）２２および平均絶対対偏差（ＭＡＰＤ）２を使用して評価したところ、ＬＡＮＤよりもｘＳＤＳを使用して、著しく良好な均一性が示された（ＭＡＤ：平均１．５７倍の改善，ｐ＝＜１ｘ１０−１５；ＭＡＰＤ：１．７０倍の改善，ｐ＝＜１ｘ１０−１５、ウェルチのｔ検定）。ｘＳＤＳを使用した偏差は、多置換増幅法に類似しているが、ＱＲＰとＤＯＰよりもはるかに高い（図７ｄ）２２。ＬＡＮＤ調製物がより高いカバレッジバイアスを有した一方、該調製物は、ｘＳＤＳ（例えば、ＧＭ１２８７８調製物でＭ５０が６３，２２３）と比較した場合、細胞毎でより高度にユニークなリードカウントを生成した（例えば、３つのＨｅＬａ  ＬＡＮＤ調製物のうち１つでＭ５０が７６３，８１３）。全てのライブラリについて、転移１３，２３の機構に起因した、隣接するリード対の特徴的な９塩基対の重複が観察されたが、これは、トランスポザーゼ挿入事象の何れかの側で分子を配列決定可能であることを示す（図１１）。
【０２２６】
ＳＣＩ−ｓｅｑを使用したコピー数多型コール
任意の単細胞ゲノムシーケンシング研究では、真の異数体細胞を除去することなく、如何に不良ライブラリをフィルタにかけ除去するかを決定することは、著しい難題である。他の方法と直接比較するため、最初に、どのフィルタリングもなしに、当社のＳＣＩ−ｓｅｑ調製物において、ＣＮＶコールを進めた。全ての調製物について、ＣＮＶコールのために、可変サイズのゲノムウィンドウ（標的中央値は２５０万ｂｐ）を用いて、最低で５０，０００個のユニークで高品質な整列リードを有する細胞を使用し（全ＬＡＮＤライブラリで８６８個、ｘＳＤＳライブラリでは１，０５６個）、Ｇｉｎｋｇｏ２２、Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＣＢＳ）２４、およびＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）２５を適用し（図１２）、３つの方法全ての交差を保存的に維持した。核型を決定した細胞を用いる当社のシーケンシングに基づくコールと比較するために、染色体腕レベルの事象に焦点を当てた（図７ｅ、ｆ）。カバレッジ均一性の差と一致して、当社のＬＡＮＤ  ＳＣＩ−ｓｅｑ調製物は、高い異数性比率（６１．９％）を生成し、これは、カバレッジ均一性の欠如による偽陽性の存在を示唆する（図７ｅ、ｇ）。しかしながら、ＳＣＩ−ｓｅｑを用いたｘＳＤＳヌクレオソーム除去戦略は、２２．６％の異数性頻度をもたらし、これは、核型決定結果（図７ｅ、ｈ）ならびにＤＯＰおよびＱＲＰ（それぞれ、１５．０％および１３．５％）にはるかに近かった（図１３）。
【０２２７】
当社は、次に、種々の分解能およびリードカウント閾値にわたって、ＭＡＤおよびＭＡＰＤスコアに基づき、フィルタリング基準を決定した（図１４）。この解析により、当社のＳＣＩ−ｓｅｑ調製物の分解能におけるより広い可変性範囲が明らかになったが、これは、標準的な方法と比較した場合に、細胞毎のより広い範囲のユニークリードにより主に引き起こされるものである。全方法に０．２のＭＡＤ偏差フィルタを適用することにより、ｘＳＤＳ、ＤＯＰ、およびＱＲＰの異数性比率はそれぞれ１２．２％、９．７％、および１０．５％まで落ち、全て、核型決定により決められた比率を下回ったが、フィルタリング前よりも互いにより近くなった（図１５）。
【０２２８】
アカゲザルの脳内のコピー数多型
哺乳類の脳における異数性および大規模なＣＮＶ頻度の推定値は、＜５％〜３３％と広く変動する１−４。この不確実性は、主に、定量測定に十分な数の単細胞を測定ことが不可能であることから生じる。ヒトサンプルが入手困難で、生涯の環境曝露における高い可変性により混同されることから、アカゲザルが、脳の異数性の存在を定量化するのに理想的なモデルである。さらに、アカゲザルの脳は、げっ歯類よりも、系統的、構造的、および生理学的によりヒトに似ている２６。
【０２２９】
当社のプラットフォームの多用途性を実証するため、ＬＡＮＤとｘＳＤＳのＳＣＩ−ｓｅｑを、ＱＲＰを使用した３８個の細胞（３５個がＱＣを通過）およびＤＯＰを使用した３５個の細胞（３０個がＱＣを通過）と共に、記録した前頭皮質組織（個体１）に適用した。当社の低容量ＬＡＮＤ調製物（１６ＰＣＲインデックス）は、ユニークリードカウント中央値が１４１，４４９（２４８細胞≧５０，０００ユニークリード）である３４０個の単細胞ライブラリを生成し、ｘＳＤＳ調製物は、ユニークリードカウント中央値が５５，１４２（９２細胞≧５０，０００ユニークリード）である１７１個の単細胞ライブラリを生成した。当社のｘＳＤＳ調製物で生成された細胞数は、追加の細胞脱凝集ステップにより修正され得るソート時の核凝集を主な原因として、予想より少なかった。
【０２３０】
ライブラリ構築の全方法にわたり、アカゲザルの参照ゲノムの質が低めであることにおそらく起因して（２８４，７０５コンティグ＜１Ｍｂｐ）、ヒト解析（図１６−１９）よりも３つのＣＮＶコールアプローチ間により大きな矛盾が観察され、これは、「プラチナ」品質の参照ゲノムの必要性を強調した２７。そのため、当社は、サブ染色体コールについてのＨＭＭ結果に焦点を当て（図２０ａ）、ＣＢＳおよびＨＭＭのコールの交差を使用した異数性解析を実施した。当社の細胞株の結果と一致して、ＬＡＮＤ調製物は、より高い異数性率（９５．１％）を生成し、これは、カバレッジの非均一性に由来する偽陽性を示唆した（図２１−２２）。ｘＳＤＳ  ＳＣＩ−ｓｅｑの非フィルタリング異数性率（２５．０％）は、ＤＯＰ調製物（１８．５％）に近く、ＱＲＰははるかに低い比率（３．１％；図２０ｂ）を生成した。ＭＡＤスコア０．２以下のセルに対し、分散フィルタを課した後の異数性率は、ｘＳＤＳ調製物で１２．０％、ＤＯＰで８．７％にまで下落し、ＱＲＰ調製物では３．１％で同じままだった。これらの比率は、第２個体の前頭皮質の２００ｍｍ３切片（３８１単細胞、中央値リードカウント６２，７３１、２１３細胞≧５０，０００ユニークリード）においてｘＳＤＳ  ＳＣＩ−ｓｅｑにより生成された比率と類似しており、１２．１％および１０．３％のフィルタリングなしの異数性率とフィルタリングありの異数性率を生成した（図２３）。
【０２３１】
原発腫瘍サンプルにおけるＳＣＩ−ｓｅｑにより、クローン集団を明らかになる
単細胞ゲノムのシーケンシングの主な適用の一つは、腫瘍の不均一性の測定およびがんにおけるクローン進化を理解することである。これは、それが、治療耐性に関連するためである５−８。約２５０ｍｍ３の新たに取得したステージＩＩＩの膵管腺がん（ＰＤＡＣ）サンプルにおいて、単一ｘＳＤＳ  ＳＣＩ−ｓｅｑ調製を行い、これにより、１，７１５個の単細胞のライブラリを生成し、細胞毎のユニークリードカウント中央値が４９，２７２とシーケンシングされた（Ｍ５０は７１，３７８；ライブラリがシーケンシングされた深度で８４６細胞≧５０，０００ユニークリード；図２４ａ）。まず、比較のための正倍数体基線として当社のＧＭ１２８７８ライブラリを使用し、ＣＮＶコールを実施して、信頼度の高い正倍数体細胞のセット（２９８、３５．２％）を特定し、これを次に、個体および調製物に対し特異的な新たな基線として使用した（図２３、２５、２６）。サブ染色体コピー数の変化（ゲノムの不安定性により引き起こされる）は、全染色体異数性（細胞分裂時のエラーに起因する）よりもサブクローン集団を特定するのにより有益であると仮定して、新しいウィンドウ境界として使用する低分解能での仮想コピー数切断点を特定する戦略を開発し（方法、図２７）、その後、主成分解析（ＰＣＡ）およびｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングにより層別化した。最初にこの方法を当社のＨｅＬａライブラリ（全部で２，３６１単細胞）に適用し、明確な不均一性がないことを明らかにし、さらに、ＨｅＬａ細胞株の安定性を支持し２０（図２８−３１）、次に、当社の主要なＰＤＡＣサンプルにおいて、シルエット分析により、最適なクラスタカウント４を明らかにした（図２４ｂ、ｃ）。
【０２３２】
これらのクラスタの１つ目（ｋ３）は、最初の解析で正倍数性の信頼度が高いとは考えられず、そのため除去されなかった、正倍数性細胞の集団である。これらを含める場合、正倍数性集団は、ＰＤＡＣで予想される範囲内で、最終腫瘍細胞純度４６．０％で３８９まで上昇した２８。残りのｋ１（１９９細胞）、ｋ２（１１５細胞）、およびｋ４（９１細胞）では、各重心に近い細胞から全てのリードを集め（方法）、１００ｋｂｐウィンドウ、最初の解析よりも２５倍高い分解能を使用してＣＮＶコールを実施し、次に、完全コピー数状態を決定した２０（図２４ｄ）。
【０２３３】
３つの腫瘍クラスタ全体で、コピー数セグメントのかなりの部分が共有され（４４．８％）、これは、それらが、共通の前駆集団より生じたことを示唆する。これには、ＡＭＬにおいて高頻度で変異し、エンハンサー結合タンパク質をコードするＣＥＢＰＡの、コピー数７の極限的増幅を宿し２９、最近では、膵臓腫瘍においてエピジェネティック制御が変化することが示された３０、高度に再編成された染色体１９が含まれた（図２４ｅ）。網羅的な一対比較により、クラスタｋ２およびｋ４が最も類似しており、コピー数セグメントの６５．９％を共有し、次に、ｋ１とｋ４が５８．３％、ｋ１とｋ２が５５．０％で続くことが明らかになった。いくつかのクラスタ特異的ＣＮＶには、潜在的に機能的に関連する遺伝子が含まれる（図２４ｅ）。これには、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路において重要なセリンキナーゼをコードする３１、クラスタｋ１のＩＫＢＫＢのコピー数６への極限的な増幅と；遺伝子ＤＳＣ１，２，３およびＤＳＧ１，２，３，４（これらは全て、細胞−細胞付着と細胞位置決めに関連するタンパク質をコードし、がんにおいてしばしば誤制御される３２）を含むクラスタｋ１のコピー数５への極限的増幅と；細胞増殖シグナル伝達に関連するチロシンキナーゼ細胞表面受容体をコードし、がんにおいて高頻度に変異する３３クラスタｋ２に対し特異的な、ＰＤＧＲＦＢを含む領域の欠失とが含まれる。
【０２３４】
最後に、ｘＳＤＳ  ＳＣＩ−ｓｅｑを、５００ｍｍ３の凍結ステージＩＩ直腸腺がんに適用した。調製時に、多量の核デブリに気づき、１４６個の単細胞ライブラリ（ユニークリードカウント中央値７１，３７８；Ｍ５０が３５２，１６８；１１１細胞≧５０，０００ユニークリード）の調製物（１６ＰＣＲインデックス）の収率を下げる可能性のあった核を破裂させた。ＰＤＡＣサンプルのように同じＣＮＶコールアプローチを実施したが；高頻度の切断点は観察されず、サブクローン集団は特定できなかった（図３２）。これは、直腸がんに共通の処置である照射による核の変質の結果であるかもしれず、全ての単細胞方法１２に共有される高品質の単細胞または核の懸濁液を生成する難しさを強調する。
【０２３５】
考察
当社は、組み合わせインデックス付加ワークフローにおいて核の除去を利用して数千個の単細胞ゲノムシーケンシングライブラリを生成する方法である、ＳＣＩ−ｓｅｑを開発した。ＳＣＩ−ｓｅｑを使用して、単細胞ゲノムリサーチの２つの主要な領域である：体細胞異数性とがんを代表する、一次組織単離物を含む無数のサンプルから、１６，６９８個の単細胞ライブラリ（このうち５，３９５個は、ＣＮＶコールに十分な深度までシーケンシングした）を生成した。スループットの利点に加え、プラットフォームは、特別なマイクロフルイディクス機器も液滴乳化技法も必要としない。当社のより均一なヌクレオソーム除去戦略であるｘＳＤＳを使用して、２５０ｋｂｐの桁での分解能を達成することができたが、別の架橋剤などのさらなる最適化により、分解能の改善に十分な深度が提供され得ると思われる。また、当社は、増殖、転位に影響を与え得る、または他の分子サブタイプを駆動する可能性がある３４、サブクローン特異性ＣＮＶを明らかにしたこの戦略の膵管腺がんへの適用により、凝集し得るクローン集団を特定して高分解能のＣＮＶコールを容易にすることが可能であることを実証する。
【０２３６】
この技法を使用して、ＳＣＩ−ｓｅｑ、またはＴＨＳ−ｓｅｑ３５、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ変形体などにおけるＴ４  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の組み込みの前に、核骨格内にｉｎ  ｓｉｔｕプレ増幅を含ませて、結果として生じるカバレッジをブーストし、単一ヌクレオチド変異体検出を容易にすることが可能であり得る。任意の新しい方法と同様に、最適化が可能であるが、当社は、ＳＣＩ−ｓｅｑにより提供されるスループットが、哺乳動物の体細胞ゲノムの安定性についての深い定量化への扉を開くと共に、ＤＮＡメチル化およびクロマチン構造を含む単細胞の他の特性を評価するためのプラットフォームとして機能すると考える。
【０２３７】
アクセッションコード
ＮＣＢＩ  ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ  ＩＤ：ＰＲＪＮＡ３２６６９８
ＨｅＬａ  ｄｂＧａＰアクセッション：ｐｈｓ０００６４０
【０２３８】
データ利用可能性
ＧＭ１２８７８およびアカゲザルの配列データは、ＮＣＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅａｄ  Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）を介して、無制限アクセス用のＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ  ＩＤ：ＰＲＪＮＡ３２６６９８の下で、アクセス可能である。ＨｅＬａ配列データは、Ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ（ｄｂＧａＰ）のデータベースを介して、アクセッション番号ｐｈｓ０００６４０の下、調査の一部として、アクセス可能である。ヒト腫瘍サンプルはｄｂＧａＰへ提出され、ｓｔｕｄｙアクセッションの割り当てを待っている。このプロジェクトに対し特異的に開発されたソフトウェアは、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のsci-seq. sourceforge. net.で利用可能である。
【０２３９】
実施例１で引用した参考文献
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【０２４０】
〔実施例２〕
実施例２で使用した試薬
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．１００１００２３）
・０．２５％トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．１５０５００５７）
・トリス（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｔ１５０３）
・ＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ａ１４４）
・ＮａＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｍ−１１６２４）
・ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｍ８２２６）
・Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ，Ｉ８８９６）
・プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．１１８７３５８０００１）
・３，５−ジヨードサリチル酸リチウム（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｄ３６３５）−ＬＡＮＤのみ
・ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｆ８７７５）−ｘＳＤＳのみ
・グリシン（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｇ８８９８）−ｘＳＤＳのみ
・ＨＥＰＥＳ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．ＢＰ３１０）−ｘＳＤＳのみ
・ＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１（ＮＥＢ，Ｃａｔ．Ｂ７２０２）−ｘＳＤＳのみ
・ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．Ｌ３７７１）−ｘＳＤＳのみ
・Ｔｒｉｔｏｎ（商標）−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．９００２−９３−１）−ｘＳＤＳのみ
・ＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｄ１３０６）
・Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標）キットのＴＤ緩衝液およびＮＰＭ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｃａｔ．ＦＣ−１２１−１０３１）
・９６インデックス付きトランスポソーム（公開済みの方法を使用して組み立てまたはＩｌｌｕｍｉｎａより入手、表４に示すオリゴ）
・インデックス付きｉ５およびｉ７  ＰＣＲプライマー（表５）
・ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｔ．５０５１３）
・Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．２８１０４）
・ｄｓＤＮＡ高感度ｑｕｂｉｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｑ３２８５１）
・高感度バイオアナライザキット（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｃａｔ．５０６７−４６２６）
・ＮｅｘｔＳｅｑシーケンシングキット（ＨｉｇｈまたはＭｉｄ  １５０サイクル）
・シーケンシングプライマー（表６）
【０２４１】
実施例で使用した機器
・ダウンス型ホモジナイザー
・３５μＭの細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ．３５２２３５)
・Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００セルソータ―（Ｓｏｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．ＳＨ８００）またはＤＡＰＩをベースにした単一核ソートが可能なＦＡＣＳ機器
・ＣＦＸ  Ｃｏｎｎｅｃｔ  ＲＴサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｔ．１８５５２００）または他のリアルタイムサーモサイクラー
・Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０フルオロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．Ｑ３２８６６）
・２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｃａｔ．Ｇ２９３９Ａ）
・ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｃａｔ．ＳＹ−４１５−１００１）
【０２４２】
【表４】
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【０２４３】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【０２４４】
【表６】
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【０２４５】
Ｉ．３，５−ジヨードサリチル酸リチウム（ＬＡＮＤ）またはＳＤＳ（ｘＳＤＳ）を使用した核の調製
Ａ．核調製および核除去のＬＡＮＤ法
細胞が細胞培養懸濁液中にある場合、培養物をそっと砕いて細胞凝集塊を破壊し、４℃で５分間、５００ｘｇで回転することにより細胞をペレット化し、５００μＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した。
【０２４６】
細胞が接着細胞培養物中にある場合、培地を吸引し、細胞を３７℃のＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次に、３７℃の０．２５％トリプシンを十分に与えて、単層を覆った。３７℃で５分間インキュベートした後、または、細胞の９０％が表面に接着しなくなるまで、３７℃の培地を１：１の比率で加えてトリプシンをクエンチした。４℃で５分間、５００ｘｇで回転することにより細胞をペレット化し、次に、５００μＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した。
【０２４７】
組織を使用する場合、組織サンプルを氷上でダウンス型ホモジナイザー２ｍＬに置いた。２ｍＬのＮＩＢ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４、１０ＭＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）、１ｘプロテアーゼ阻害剤）をサンプルに加え、氷上で５分間インキュベートした。サンプルをｌｏｏｓｅペッスルで５回ダウンスし、続いて、ｔｉｇｈｔペッスルで１５ストロークし、次に、３５μＭの細胞ストレーナーに通し、必要に応じて追加のストレーナーを使用した。
【０２４８】
細胞培養懸濁液、接着細胞培養物、または組織サンプルからの細胞を、５分間５００ｘｇで回転することによりペレット化し、次に、ＮＩＢ緩衝液中の１２．５ｍＭ  ＬＩＳ２００μＬ（２．５μＬの１Ｍ  ＬＩＳ＋１９７．５μＬのＮＩＢ緩衝液）に再懸濁した。氷上で５分間インキュベートした後、８００μＬのＮＩＢ緩衝液と５μＬのＤＡＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。細胞を、３５μＭの細胞ストレーナーにそっと通した。
【０２４９】
Ｂ．核調製およびヌクレオソーム除去のｘＳＤＳ法
細胞が細胞培養懸濁液中にある場合、培地をそっと砕いて細胞凝集塊を破壊した。培地中の細胞１０ｍＬに、３７％ホルムアルデヒド４０６μＬを加え、室温で１０分間、軽く振とうしながらインキュベートした。８００マイクロリットルの２．５Ｍグリシンを細胞に加え、氷上で５分間インキュベートし、次に、４℃で８分間、５５０ｘｇで遠心分離した。１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５ｍＬの氷冷ＮＩＢ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ  ｐＨ７．４，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％Ｉｇｅｐａｌ（登録商標），１ｘ  プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で２０分間、静かに混ぜながらインキュベートした。
【０２５０】
細胞が接着細胞培養物中にある場合、培地を吸引し、細胞を３７℃のＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次に、３７℃の０．２５％トリプシンを十分に加えて、単層を覆った。３７℃で５分間インキュベートした後、または、細胞の９０％が表面に接着しなくなるまで、３７℃の培地を１：１の比率で加えてトリプリンをクエンチし、体積を培地で１０ｍＬにした。細胞を１０ｍＬの培地に再懸濁し、４０６μＬの３７％ホルムアルデヒドを加え、室温で１０分間、軽く振とうしながらインキュベートした。８００マイクロリットルの２．５Ｍグリシンを細胞に加え、氷上で５分間インキュベートした。４℃で８分間、５００ｘｇで細胞を遠心分離し、１０ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した。５ｍＬの氷冷ＮＩＢに細胞を再懸濁した後、氷上で２０分間、静かに混ぜながらインキュベートした。
【０２５１】
組織を使用する場合、組織サンプルを氷上でダウンス型ホモジナイザー２ｍＬに置いた。２ｍＬのＨＥＰＥＳ  ＮＩＢ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ＭＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ｉｇｅｐａｌ、１ｘプロテアーゼ阻害剤）緩衝液をサンプルに加え、氷上で５分間インキュベートした。サンプルをｌｏｏｓｅペッスルで５回ダウンスし、続いて、ｔｉｇｈｔペッスルで１５ストロークし、次に、３５μＭの細胞ストレーナーに通し、必要に応じて追加のストレーナーを使用した。体積をＨＥＰＥＳ−ＮＩＢで１０ｍＬにし、４０６μＬの３７％ホルムアルデヒドを１０ｍＬの体積に加えた。８００マイクロリットルの２．５Ｍグリシンを加え、氷上で５分間インキュベートした。
【０２５２】
細胞培養懸濁液または接着細胞培養物からの細胞または核を、５分間５００ｘｇで回転することによりペレット化し、９００μＬの１ｘ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１で洗浄した。５分間５００ｘｇで回転した後、ペレットを、１２μＬの２０％ＳＤＳを有する８００μＬの１ｘ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ２．１に再懸濁し、３０分間激しく振とうしながら４２℃でインキュベートし、次に、２００μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を加え、３０分間激しく振とうしながら４２℃でインキュベートした。細胞を、３５μＭの細胞ストレーナーにそっと通し、５μＬのＤＡＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。
【０２５３】
ＩＩ．核ソートおよびタグメンテーション
タグメンテーションプレートを、１０μＬの１Ｘ  ＴＤ緩衝液を用いて準備し（１プレートに対し：５００μＬのＮＩＢ緩衝液＋５００μＬのＴＤ緩衝液）、２０００個の単一核をタグメンテーションプレートの核ウェルにソートした。このステップでは、ウェル毎の核の数は、ウェル毎の核の数が全プレートで変わらない限り、多少変化してよい。また、トランスポザーゼインデックスが保存されることから、異なるサンプルをプレートの異なるウェルに多重化することも可能である。細胞を図３３に従いゲート化した。プレートを回転した後、２．５ｎＭのユニークにインデックス付加したトランスポソーム１μＬを、各ウェルに加えた。封止した後、プレートを、５５℃で１５分間、軽く振とうしながらインキュベートした。次に、プレートを室温に戻し、次に氷上に置いた。全てのウェルをプールし、５μＬのＤＡＰＩ（５ｍｇ／ｍＬ）を加え、次に、細胞を３５μＭの細胞ストレーナーに通した。
【０２５４】
ＩＩＩ．第２ソートおよびＰＣＲインデックス付加
各ウェルに対し、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ０．２５μＬ、１％ＳＤＳ０．５μＬ、およびＨ２Ｏ７．７５μＬを用いてマスターミックスを調製した。マスターミックス（８．５μＬ）と、それぞれ（ｉ５およびｉ７）１０μＭのプライマー２．５μＬを、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。単一核（１５−２２個）を、最もストリンジェントなソート設定を使用して、各ウェルにソートした。次に、プレートを沈降させた。ＬＡＮＤ法を使用して調製した核を、５５℃で５分間インキュベートして、トランスポザーゼを変性させた。ｘＳＤＳ法を使用して調製した核を６８℃で４５分間インキュベートして、トランスポザーゼを変性させ、架橋を逆転させた。
【０２５５】
緩衝液を調製し（１プレートに対し：７５０μＬのＮＰＭ、４００μＬのＨ２Ｏ、および５０μＬの１００ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）、緩衝液１２μＬを、ストリップチューブの各ウェルに加えた。以下のＰＣＲサイクルを実行した：７２℃で５分間、９８℃で３０秒、次に、（９８℃で１０秒、６３℃で３０秒、７２℃で１分間、その後、プレートリードおよび追加で７２℃で１０秒）の連続サイクル。これらのサイクルを、ウェルの大部分がＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ蛍光により求められる指数関数的増幅を示すまで、繰り返した。
【０２５６】
ＩＶ．ライブラリのクリーンアップおよび定量化
ＰＣＲプレートの５μＬの各ウェルを使用して、ライブラリをプールし、次に、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製カラムを使用して精製し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．５（ＥＢ）３０μＬに溶出した。２マイクロリットルを使用して、ｄｓＤＮＡ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０フルオロメーターを製造業者のプロトコルに従って用いて、ＤＮＡの濃度を定量化した。Ｑｕｂｉｔ（登録商標）の読み取りを使用して、ライブラリを〜４ｎｇ／ｕＬまで希釈し、１μＬを、製造業者のプロトコルに従って、Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  ２１００の上を走らせた。次に、ライブラリを、２００ｂｐ−１ｋｂｐの範囲で定量化して、プールを、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのために１ｎＭに希釈した。
【０２５７】
Ｖ．シーケンシング
ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００を、以下の変更を除いて、１ｎＭのサンプル用の製造業者の指示通りにラン用にセットした  ライブラリプールを濃度０．８ｐＭ、総体積１．５ｍＬで充填し、カートリッジポジション１０に置き；１００μＭのストックシーケンシングプライマー１の９μＬを、全部で１．５ｍＬのＨＴ１緩衝液に希釈し、カートリッジポジション７に入れることにより、カスタムプライマーをセットし；１００μＭのストックシーケンシングプライマー２の９μＬを、全部で１．５ｍＬのＨＴ１緩衝液に希釈し、カートリッジポジション８に入れることにより、シーケンシングプライマーをセットし；１００μＭのストック濃度の各カスタムインデックスシーケンシングプライマーの１８μＬを、全部で３ｍＬのＨＴ１緩衝液に希釈し、カートリッジポジション９に入れることにより、カスタムインデックスシーケンシングプライマーをセットした（表７参照）。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００を、スタンドアロンモードで操作し；ＳＣＩｓｅｑカスタム化学処方（Amini et al., 2014, Nat. Genet. 46, 1343-1349）を選択し；二重インデックスを選択し；適切な数のリードサイクルを入力し（５０推奨）、各インデックスにつき１８サイクル；全リードとインデックスに対しカスタムチェックボックスを選択した。
【０２５８】
【表７】
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【０２５９】
〔実施例３〕
単細胞組み合わせインデックス付加およびゲノムと染色体の立体配座
単離核の制限エンドヌクレアーゼ消化とその後のライゲーションを使用して、クロマチンフォールディング解析およびゲノム再編成検出など、核内の染色体構造についての情報を入手した。斯かるタイプの解析は、ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ（３Ｃ）および関連方法（４Ｃ、５Ｃ、およびＨｉ−Ｃ）として、当技術分野で既知である。
【０２６０】
実施例１および２に記載する方法と併せて使用することが可能な、単細胞組み合わせインデックス付加と、ゲノムおよび染色体の立体配座（single-cell combinatorial indexing and genome and chromosome conformation、ｓｃｉ−ＧＣＣ）の方法を、図３４に記載する。具体的には、単細胞組み合わせインデックス付加と、ゲノムおよび染色体の立体配座の方法は、図３４に示すように、ブロック１２、１３、１４、および１９を含む。単細胞のゲノムと染色体の立体配座解析の他の方法（Nagano et al., 2013, Nature, 502:59-64）とは異なり、本明細書に記載の方法は、ゲノムとクロマチンの両方の立体配座配列データを得るために、ビオチン充填もビオチンプルダウンも必要としない。
【０２６１】
細胞を架橋するための条件を評価して、細胞を架橋し、核の完全性を維持するのに必要なホルムアルデヒドの最終濃度を求めた。ＨｅＬａ細胞を、該細胞を０．２％、０．３５％、１．５％のホルムアルデヒドにさらすことにより、またはホルムアルデヒドにさらすことなく架橋し、図３４に記載の方法の簡易版を行い、結果として生じる核の数を求めた。
【０２６２】
ホルムアルデヒドにさらしていないか、または０．２％ホルムアルデヒドにさらした細胞からは、インタクトな核は単離されなかった。０．３５％ホルムアルデヒドにさらした細胞は、３．８×１０５個の通常の形態の核を産生し、１．５％ホルムアルデヒドにさらした細胞は、６．４×１０５個の通常の形態の核を産生した。
【０２６３】
架橋を逆転させる条件も評価した。ＨｅＬａ細胞を、細胞を０．３５％、０．７５％、１．５％のホルムアルデヒドにさらすことにより、またはホルムアルデヒドにさらすことなく架橋し、図３４に記載の方法の簡易版を実施した。単離した核を６８℃で１時間または１６時間インキュベートすることにより、架橋を逆転させた（図３５）。
【０２６４】
データは、６８℃で１時間のインキュベーションという逆転条件と共に、０．３５％ホルムアルデヒドを使用することが最良であったことを示す。
【０２６５】
シーケンシングしたｓｃｉ−ＧＣＣライブラリから、ゲノム全域にわたる同等のユニークなリードカウントが、実施例１および２、ならびに図３５に記載する方法でのように得られた。ゲノム配列リードに加え、配列リードの５％〜１５％は、Nagano et al., (2013, Nature, 502:59-64)に記載のクロマチン立体配座シグナルに特徴的である、キメラライゲーションジャンクションを含んだ。平均して、架橋最適化調製物において、細胞毎に４０，０００超のユニークな平均キメラライゲーションジャンクションリードカウントを有する、既存の単細胞ＨｉＣ戦略（例えば、Nagano et al., 2013, Nature, 502:59-64参照）と比較しで、より多くのユニークなキメラライゲーションジャンクションリードカウントが得られた。ＨｅＬａでは、これらのライブラリにより、ＨｅＬａにおける既知の転座を含め、クロマチン構造を明確に特定するのに十分なキメラジャンクションリードが生成された（図３６）。
【０２６６】
本明細書で引用する、全ての特許、特許出願、および刊行物、ならびに電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列提出物、および例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出物、およびＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑにおける注釈付のコード領域からの翻訳を含む）の完全な開示は、参照によりその全体が組み込まれるものとする。刊行物において参照される補助資料（例えば、補足表、補足図面、補足的な資料および方法、ならびに／または補足的な実験データ）も同様に参照によりその全体が組み込まれるものとする。本出願の開示と、参照により本明細書に組み込まれる任意の文献の開示との間にいかなる矛盾が存在する場合も、本出願の開示が優先されるものとする。前述の詳細な説明及び実施例は、単に理解しやすくするために記載した。これらにより、不必要な制限が課されるものではない。当業者にとって明らかな変更は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれるため、本発明は、示し記載する正確な詳細に限定されない。
【０２６７】
別段の記載がない限り、本明細書及び特許請求の範囲の中で使用される成分の量、分子量等を表わす数値は全て、「約」という用語により、すべての場合において修正されているものと理解されたい。従って、反対のことが明示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載する数値パラメータは、本発明で得られるように試みられる所望の特性に応じて変化し得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲に均等論を限定しようとするものではなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を踏まえて、通常の四捨五入法の適用によって解釈すべきである。
【０２６８】
本発明の広い範囲を記載する数値範囲およびパラメータは近似値であるものの、特定の例に記載した数値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、すべての数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差より必然的に生じる範囲を本質的に含む。
【０２６９】
全ての見出しは、読者の便宜のためであり、特段の記載がない限り、見出しに続く文章の意味を限定するために使用されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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