(57)【要約】  本発明は、腫瘍浸潤制御性T細胞において選択的に脱制御される多数のマーカーを開示する。本発明は、少なくとも１つのそのようなマーカーの発現及び／又は機能を調節することが出来る分子であって、腫瘍の阻止及び／又は処置における使用の為の当該分子に関する。好ましくは、該分子は、マーカーに特異的に結合し且つ抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)を誘発する。本発明はさらに、少なくとも１つのそのようなマーカーの発現及び／又は機能を調節することが出来る分子であって、対象者における腫瘍浸潤制御性T細胞をイン・ビボで枯渇させる為の方法において使用する為の、又は対象者における腫瘍免疫を高める為の方法において使用する為の当該分子に関する。対応する医薬組成物がまた企図される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍浸潤制御性T細胞において選択的に脱制御される少なくとも１つのマーカーの発現及び／又は機能を調節することができる分子であって、腫瘍の阻止及び／又は処置における使用の為の上記分子。
【請求項２】
上記少なくとも１つのマーカーに特異的に結合し且つ抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)を誘発することができる、請求項1に記載の使用の為の分子。
【請求項３】
上記腫瘍浸潤制御性T細胞を選択的に枯渇させることができる、請求項１又は２に記載の使用の為の分子。
【請求項４】
下記からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用の為の分子：
a)  抗体又はそのフラグメント；
b)  ポリペプチド；
c)  小分子；
d)  上記の抗体又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれらの機能的誘導体；
e)  ポリヌクレオチド、例えばアンチセンス構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNA干渉構築物又はsiRNA、
e)  d)又はe)において定義されるポリヌクレオチドを含む又は発現するベクター；
f)  上記のポリペプチド若しくは抗体を発現する又はd)若しくはe)において定義されるポリヌクレオチドを含む、遺伝子的に組み換えられた宿主細胞。
【請求項５】
上記マーカーが下記からなる群から選択され、ここで、下記のマーカー名のそれぞれが、「Ensembl  gene  id」によって特徴付けられており且つその中に開示されたアイソフォームタンパク質配列の全てを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
2019518452.tif 000058
2019518452.tif 000059
2019518452.tif 000060
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【請求項６】
上記マーカーが、膜貫通タンパク質、サイトカイン、エピジェネティック因子、キナーゼホスファターゼ又は転写因子からなる群から選択される、請求項５に記載の使用の為の分子。
【請求項７】
上記マーカーが、SEQ  ID  NO：1-661からなる群から選択される膜貫通タンパク質である、請求項６に記載の使用の為の分子。
【請求項８】
上記マーカーが、下記からなる群から選択される、請求項７に記載の使用の為の分子：LAYN(SEQ  ID  NO：1-9)、CCR8(SEQ  ID  NO：10-11)、IL21R(SEQ  ID  NO：12-14)、IL1R2(SEQ  ID  NO：206-209)、LY75(SEQ  ID  NO：78)、SIRPG(SEQ  ID  NO：122-126)、CD177(SEQ  ID  NO：651-653)、CD7(SEQ  ID  NO：549-554)、FCRL3(SEQ  ID  NO：452-457)、CADM1(SEQ  ID  NO：570-583)、NTNG2(SEQ  ID  NO：621-622)、CSF2RB(SEQ  ID  NO：134-137)、SECTM1(SEQ  ID  NO：349-356)、TSPAN5(SEQ  ID  NO：497-503)、TMPRSS3(SEQ  ID  NO：448-451)、TMPRSS6(SEQ  ID  NO：605-611)、METTL7A(SEQ  ID  NO：600-604)、THADA(SEQ  ID  NO：237)、NDFIP2(SEQ  ID  NO：148-151)、CHRNA6(SEQ  ID  NO：392-394)。
【請求項９】
上記マーカーが、LAYN(SEQ  ID  NO：1-9)、CCR8(SEQ  ID  NO：10-11)、IL21R(SEQ  ID  NO：12-14)からなる群から選択される、請求項８に記載の使用の為の分子。
【請求項１０】
上記サイトカインが、IL32(SEQ  ID  NO：19-30)、IL7(SEQ  ID  NO：168-174)、EBI3(SEQ  ID  NO：175)、SECTM1(SEQ  ID  NO：349-356)、CSF1(SEQ  ID  NO：585-592)及びLTA(SEQ  ID  NO：657-658)からなる群から選択される、請求項６に記載の使用の為の分子。
【請求項１１】
上記エピジェネティック因子が、TDRD3(SEQ  ID  NO：712-718)、KAT2B(SEQ  ID  NO：719)、FOXA1(SEQ  ID  NO：720-721)及びRCBTB1(SEQ  ID  NO：722-723)からなる群から選択される、請求項６に記載の使用の為の分子。
【請求項１２】
上記キナーゼホスファターゼが、GSK3B(SEQ  ID  NO：724-725)、SSH1(SEQ  ID  NO：111-112)、CDK6(SEQ  ID  NO：726-727)、MINPP1(SEQ  ID  NO：181-183)、PTPRJ(SEQ  ID  NO：395-400)、CALM3(SEQ  ID  NO：728-735)及びPTP4A3(SEQ  ID  NO：593-598)からなる群から選択される、請求項６に記載の使用の為の分子。
【請求項１３】
上記転写因子が、VDR(SEQ  ID  NO：204)、ZNF334(SEQ  ID  NO：736-741)、CREB3L2(SEQ  ID  NO：565-567)、ETV7(SEQ  ID  NO：31又は32)、SOX4(SEQ  ID  NO：735)、TWIST1(SEQ  ID  NO：743-745)、TP73(SEQ  ID  NO：746-756)、FOXP3、NFE2L3(SEQ  ID  NO：76)、ARNTL2(SEQ  ID  NO：757-764)、BATF(SEQ  ID  NO：765-766)、PTTG1(SEQ  ID  NO：767-770)、HIVEP3(SEQ  ID  NO：771-772)、FOXA1(SEQ  ID  NO：720-721)、ZBTB38(SEQ  ID  NO：561)、FOXM1(SEQ  ID  NO：773-778)、TADA3(SEQ  ID  NO：779-782)、NFAT5(SEQ  ID  NO：160，783-791，742)からなる群から選択される、請求項６に記載の使用の為の分子。
【請求項１４】
上記マーカーが、MAGEH1(SEQ  ID  NO：708又は709)である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用の為の分子。
【請求項１５】
上記腫瘍が、固形又は液性の腫瘍である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用の為の分子。
【請求項１６】
上記固形の腫瘍が非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌からなる群から選択される、又は該腫瘍が転移癌、好ましくは骨、脳若しくは肝臓の転移癌、である、請求項１５に記載の使用の為の分子。
【請求項１７】
上記転移癌が、結腸直腸癌又は非小細胞肺癌に由来する、請求項１６に記載の使用の為の分子。
【請求項１８】
対象者における腫瘍浸潤制御性T細胞をイン・ビボで枯渇させる為の方法において使用する為の又は対象者における腫瘍免疫を高める為の方法において使用する為の請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分子と少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２０】
治療剤、好ましくは抗腫瘍剤における治療剤、をさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍の阻止及び／又は処置において使用する為の、又は、
対象者における腫瘍浸潤制御性T細胞をイン・ビボで枯渇させる為の方法において使用する為の、又は、
対象者における腫瘍免疫を高める為の方法において使用する為の、
請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
対象者における腫瘍の発生の危険を予測する及び／又は診断する及び／又は評価する為の、及び／又は対象者における腫瘍の進行を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置の有効性を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置をスクリーニングする為のイン・ビトロ方法であって、
a)  上記対象者から得られた単離された生物学的サンプルにおいて、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のマーカーの少なくとも１つを検出すること、そして
b)  適切な対照と比較すること
の工程を含む、上記方法。
【請求項２３】
対象者における腫瘍の発生の危険を予測する及び／又は診断する及び／又は評価する為の、及び／又は対象者における腫瘍の進行を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置の有効性を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置をスクリーニングする為の、請求項２２に記載のイン・ビトロ方法であって、検出されるべきマーカーがLAYN、MAGEH1及びCCR8からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーである、上記方法。
【請求項２４】
対象者における結腸直腸癌又は非小細胞肺癌を予測する為の請求項２３に記載のイン・ビトロ方法であって、
a)  上記対象者から得られた単離された生物学的サンプルにおいて、LAYN、MAGEH1及びCCR8からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを検出すること、そして
b)  適切な対照と比較すること
の工程を含み、
対象者から得られた単離された生物学的サンプル中の上記少なくとも１つのマーカーの、対照量よりも高い量が、上記対象者が予後不良を有することを示す、上記方法。
【請求項２５】
腫瘍の処置及び／又は阻止の為の方法であって、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の分子を対象者に投与することを含む、上記方法。
【請求項２６】
抗腫瘍としての分子作用を識別する為の方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのマーカーに対する候補分子の結合特異性について該候補分子をアッセイすること；
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の少なくとも１つのマーカーに対する特異的結合活性を有する分子を選択すること；
好ましくは腫瘍浸潤制御性T細胞を選択的に枯渇させることによって、より好ましくは抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)を誘発することによって、増殖を阻害する及び／又は細胞系においてアポトーシス応答を誘発する能力について該特異的結合分子を試験すること
の工程を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍浸潤制御性T細胞において選択的に脱制御される少なくとも１つのマーカーの発現及び／又は機能を調節することができる分子又は腫瘍浸潤制御性T細胞において選択的に脱制御される少なくとも１つのマーカーに特異的に結合することができ且つ抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性(ADCC：antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity)を誘発することができる分子であって、癌の阻止及び／又は処置における使用の為の又は対象者における腫瘍浸潤制御性T細胞をイン・ビボで枯渇させる為の方法における使用の為の又は対象者における腫瘍免疫を高める為の方法及び相対的医薬組成物において使用する為の分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての腫瘍に特有である遺伝子変異と後成的修飾との組み合わせは、Tリンパ球及びBリンパ球が腫瘍細胞を特異的に認識する為に使用することができる抗原を生成する(Jamal-Hanjani等．，2013年)。主組織適合複合体(MHC：major  histocompatibility  complex)分子によって提示される腫瘍由来ペプチドを認識するTリンパ球は癌の免疫療法及び慣用的な化学放射線療法において中心的な役割を果たすことが益々明らかになっている(Galluzzi等．，2015年)。事実、抗腫瘍T細胞応答は癌患者において生じるが、悪性細胞と腫瘍微環境との間の相互作用によって引き起こされる抑制機構によって腫瘍進行に応じて無効にされる(Munn  and  Bronte，2015年)。腫瘍依存性免疫抑制機構は、機能が部分的にのみ特徴付けられている一連の調節性分子（免疫チェックポイントと総称される）を上方制御する湿潤性の白血球及びリンパ球の統合作用に依存する(Pardoll，2012年)。それ故に、抗原特異的T細胞応答を増強するための共刺激複合体のアゴニスト又は抑制分子のアンタゴニストの探索は、現在の抗腫瘍研究の主な目標である(Sharma  and  Allison，2015年；Zitvogel等．，2013年)。実際には、臨床試験は、免疫チェックポイントの遮断が、癌治療におけるパラダイムシフトを生み出した強力な方法で自発的な抗腫瘍免疫応答を解放することを明白に示している(Sledzinska等．，2015年；Topalian等．，2015年)。
【０００３】
ブロッキング戦略によって標的とされる免疫チェックポイントのうち、CTLA-4は、治療用途において最初に翻訳されたものの１つである。
【０００４】
抗CTLA-4モノクロナール抗体(mAb)は、転移性メラノーマにおいて及びもっと最近では、非小細胞肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、尿路上皮癌及び卵巣癌において顕著な成功を示した(Carthon等．，2010年；Hodi等．，2010年；van  den  Eertwegh等．，2012年；Yang等．，2007年)。しかしながら、応答しない患者の割合は高いままであり、腫瘍による免疫応答の調節を支持するメカニズムのより深い研究を促している。最近の実験的証拠は、抗CTLA-4mAbの有効性が、腫瘍微小環境内のCD4+制御性T細胞(Treg細胞)のFcγR介在性枯渇に依存することを示した(Peggs等．，2009年；Selby等．，2013年；Simpson等．，2013年；Twyman-Saint  Victor等．，2015年)。
【０００５】
免疫学的自己寛容及び免疫ホメオスタシスの維持に生理学的に携わっているTreg細胞(Josefowicz等．，2012年；Sakaguchi等．，2008年)は、エフェクター細胞の強力なサプレッサであり且つ癌の様々なタイプにおいて高頻度で見出される(Fridman等．，2012年；Nishikawa  and  Sakaguchi，2010年)。興味深いことに、Treg細胞は、それらが炎症性環境に暴露される様々なサイトカインに転写プログラムを適応させる(Campbell  and  Koch，2011年)。この多様性は、他のエフェクターCD4+T細胞サブセットの分化に一般に関連付けられれた転写因子によって制御され、独自の特徴及び免疫調節性機能を有する様々なTreg細胞集団をもたらす(Duhen等．，2012年；Geginat等．，2014年)。その上、非リンパ系組織を湿潤するTreg細胞は、それらがそれらの十分に確立された抑制的役割、例えば脂肪組織における代謝調節(Cipolletta等．，2012年)又は骨格筋における(Burzyn等．，2013年)及び肺組織における(Arpaia等．，2015年)組織修復の調節、を超える機能を示すことが報告されているので、独自の表現型及び転写署名を示すことが報告されている。
【０００６】
Treg細胞枯渇は抗腫瘍特異的免疫応答を増加させること及び且つ腫瘍負担を軽減させることを報告している(Marabelle等．，2013年；Teng等．，2010年；Walter等．，2012年)。有望な臨床結果がTreg細胞を枯渇する戦略で達成されているけれども、幾つかの関連する問題がこれらの治療のより安全で、より効果的で且つより広い臨床適用の為に取り組まれるべきである。第１に、全身性Treg細胞枯渇(Nishikawa  and  Sakaguchi，2010年)に続いて、重度の自己免疫が生じ、それは腫瘍浸潤Treg細胞の選択的な枯渇が実現可能である場合に避けられることができる。第２の問題は、標的化の特異性に関し、実際にTreg細胞は、治療の標的化された分子の大部分をエフェクターリンパ球と共有し、それは腫瘍特異的エフェクター細胞をまたできる限り枯渇させることができる。それ故に、異なる腫瘍部位でのTreg細胞の分子特性化は、それらの署名分子のより良い記述及び腫瘍微環境におけるTreg細胞機能を調節するネットワークのより良い記述を通じて治療標的をより明確にするのに役立つはずである。
【０００７】
非小細胞肺癌(NSCLC：Non-small-cell  lung  cancer)及び結腸直腸癌(CRC：colorectal  cancer)は、両方の性別において２つの最も頻度の高い癌である(Torre等．，2015年)。NSCLCは、初期段階でもその高い死亡率の故に、最も悪い予後を有する。CRC生存率は診断時の腫瘍ステージに高い依存性を有するが、患者の約50%が転移性癌に進行する(Gonzalez-Pons  and  Cruz-Correa，2015年)。両方の腫瘍は、チェックポイント阻害剤に対するモノクロナール抗体に基づく治療法を標的としていたが結果が異なった。NSCLCにおいて顕著な臨床上の成功が得られているが、ミスマッチ修復欠損CRC病変を除いて、CRCにおける耐久性応答の証拠は乏しい(Jacobs等．，2015年；Kroemer等．，2015年；Le等．，2015年)。
【０００８】
その上、癌の処置及び／又は阻止の為に腫瘍浸潤Treg細胞を標的とする剤についての必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
腫瘍浸潤制御性Tリンパ(Treg)は、腫瘍抗原に特異的なエフェクターT細胞を抑制することができる。新しい抗癌免疫療法は免疫チェックポイントを標的化することによってエフェクターT細胞を解放することを目的としているので、腫瘍湿潤性リンパ球のより深い分子定義が新しい治療機会を提供することができる。結腸直腸又は非小細胞肺癌を湿潤するTヘルパー1(Th1)、Th17及びTreg細胞のトランスクリプトームは、正常組織からの同じサブセットのトランスクリプトームと比較され、そして単一細胞レベルで検証された。本発明者等は、腫瘍浸潤Treg細胞が高度に抑制的であり、幾つかの免疫チェックポイントを上方制御し、及び細胞表面特異的署名分子、例えば、Treg細胞に以前に記載されていなかったインターロイキン-1受容体2(IL1R2)、プログラムされた死滅(PD：programmed  death)-1リガンド1、PD-1リガンド2及びCCR8ケモカイン、上に発現することを見出した。注目すべきことに、Treg署名遺伝子、例えばLAYN、MAGEH1又はCCR8、の腫瘍サンプル全体における高い発現は、予後不良(poor  prognosis)と相関した。本発明は、ヒト腫瘍浸潤Treg細胞の分子識別及び機能についての新しい洞察を提供し、及び腫瘍免疫療法についての新しい潜在的標的を定義する。
【００１０】
本発明において、本発明者等は、NSCLC又はCRC及びそれらの合致する正常組織を湿潤するヒトCD4+Treg細胞及びエフェクター細胞(Th1及びTh17)の包括的なトランスクリプトーム解析を提供する。
【００１１】
本発明者等は、これらの２つの癌のタイプにおいて腫瘍浸潤Treg細胞の分子署名を定義し、且つ単一細胞分析によってこれらの署名の関連性を確認した。これらのデータは、腫瘍部位での機能的役割のより良い理解を助け、且つ癌治療におけるTreg細胞のより特異的且つより安全な調節の為の治療標的の識別への道を開くことが出来た。
【００１２】
本発明者等の知見は、Treg細胞の阻害メカニズムに関する新たな洞察を提供し、且つ癌免疫療法についての正確な標的を提供する。
【００１３】
従って、本発明は、腫瘍の阻止及び／又は処置における使用の為の分子であって、腫瘍浸潤制御性T細胞において選択的に脱制御される少なくとも１つのマーカーの発現及び／又は機能を調節することができる上記分子を提供する。
【００１４】
好ましくは、本発明に従う分子は、少なくとも１つのマーカーに特異的に結合し且つ抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)を誘発することができる。
【００１５】
上記分子は好ましくは、腫瘍浸潤制御性T細胞を選択的に枯渇させることができる。
【００１６】
上記分子は好ましくは、下記からなる群から選択される：
a)  抗体又はそのフラグメント；
b)  ポリペプチド；
c)  小分子；
d)  上記の抗体又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれらの機能的誘導体；
e)  ポリヌクレオチド、例えばアンチセンス構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNA干渉構築物又はsiRNA,
e)  d)又はe)において定義されるポリヌクレオチドを含む又は発現するベクター；
f)  上記のポリペプチド若しくは抗体を発現する又はd)若しくはe)において定義されるポリヌクレオチドを含む、遺伝子的に組み換えられた宿主細胞。
【００１７】
好ましくは、上記マーカーは下記の表VIIIにおいて開示されている少なくとも１つのマーカーからなる群から選択され、ここで、下記のマーカー名のそれぞれが、「Ensembl  gene  id」によって特徴付けられており且つその中に開示されたアイソフォームタンパク質配列の全てを含む。
【００１８】
【表１】
2019518452.tif 000002
2019518452.tif 000003
2019518452.tif 000004
2019518452.tif 000005
2019518452.tif 000006
【００１９】
表VIIIの各遺伝子は、公共データベースEnsEMBL(http://www.ensembl.org)において検索可能であるそのENSG(nsembl  Gene  accession  number)によって特徴付けられ、且つ存在していれば、公共データベースNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)において検索可能であるそのEntrez  Gene  IDによって特徴付けられる。
【００２０】
好ましくは、上記マーカーは、膜貫通タンパク質、サイトカイン、エピジェネティック因子、キナーゼホスファターゼ又は転写因子からなる群から選択される。
【００２１】
より好ましくは、上記マーカーは、SEQ  ID  No：1-661からなる群から選択される膜貫通タンパク質である。さらにより好ましくは、上記マーカーは、LAYN(SEQ  ID  No：1-9)、CCR8(SEQ  ID  No：10-11)、IL21R(SEQ  ID  No：12-14)、IL1R2(SEQ  ID  No：206-209)、LY75(SEQ  ID  No：78)、SIRPG(SEQ  ID  No：122-126)、CD177(SEQ  ID  No：651-653)、CD7(SEQ  ID  No：549-554)、FCRL3(SEQ  ID  No：452-457)、CADM1(SEQ  ID  No：570-583)、NTNG2(SEQ  ID  No：621-622)、CSF2RB(SEQ  ID  No：134-137)、SECTM1(SEQ  ID  No：349-356)、TSPAN5(SEQ  ID  No：497-503)、TMPRSS3(SEQ  ID  No：448-451)、TMPRSS6(SEQ  ID  No：605-611)、METTL7A(SEQ  ID  No：600-604)、THADA(SEQ  ID  No：237)、NDFIP2(SEQ  ID  No：148-151)、CHRNA6(SEQ  ID  No：392-394)から成る群から選択される：又は下記からなる群から選択される：LAYN(SEQ  ID  No：1-9[
2019518452.tif 000007
2019518452.tif 000008
2019518452.tif 000009
【００２２】
上記サイトカインは好ましくは、IL32(SEQ  ID  No：19-30)、IL7(SEQ  ID  No：168-174)、EBI3(SEQ  ID  No：175)、SECTM1(SEQ  ID  No：349-356)、CSF1(SEQ  ID  No：585-592)及びLTA(SEQ  ID  No：657-658)からなる群から選択される。
【００２３】
上記エピジェネティック因子は好ましくは、TDRD3(SEQ  ID  No：712-718)、KAT2B(SEQ  ID  No：719)、FOXA1(SEQ  ID  No：720-721)及びRCBTB1(SEQ  ID  No：722-723)からなる群から選択される。
【００２４】
上記キナーゼホスファターゼは好ましくは、GSK3B(SEQ  ID  No：724-725)、SSH1(SEQ  ID  No：111-112)、CDK6(SEQ  ID  No：726-727)、MINPP1(SEQ  ID  No：181-183)、PTPRJ(SEQ  ID  No：395-400)、CALM3(SEQ  ID  No：728-734)及びPTP4A3(SEQ  ID  No：593-598)からなる群から選択される。
【００２５】
上記転写因子は好ましくは、VDR(SEQ  ID  No：204)、ZNF334(SEQ  ID  No：736-741)、CREB3L2(SEQ  ID  No：565-567)、ETV7(SEQ  ID  No：31又は32)、SOX4(SEQ  ID  No：735)、TWIST1(SEQ  ID  No：743-745)、TP73(SEQ  ID  No：746-756)、FOXP3、NFE2L3(SEQ  ID  No：76)、ARNTL2(SEQ  ID  No：757-764)、BATF(SEQ  ID  No：765-766)、PTTG1(SEQ  ID  No：767-770)、HIVEP3(SEQ  ID  No：771-772)、FOXA1(SEQ  ID  No：720-721)、ZBTB38(SEQ  ID  No：561)、FOXM1(SEQ  ID  No：773-778)、TADA3(SEQ  ID  No：779-782)、NFAT5(SEQ  ID  No：160，783-791，742)からなる群から選択される。
【００２６】
好ましい実施態様において、上記マーカーは、MAGEH1(SEQ  ID  No：708又は709)である。
2019518452.tif 000010
【００２７】
本発明において、上記腫瘍は好ましくは、固形又は液性の腫瘍である。好ましくは、上記固形の腫瘍が、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌、胃癌からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様において、該腫瘍は転移癌、好ましくは骨、脳又は肝臓の転移癌、である。
【００２９】
好ましくは、上記転移が、結腸直腸癌又は非小細胞肺癌に由来する。
【００３０】
本発明の他の目的は、対象者における腫瘍浸潤制御性T細胞をイン・ビボで枯渇させる為の方法において使用する為の又は対象者における腫瘍免疫を高める為の方法において使用する為の上記に定義された分子である。
【００３１】
本発明の他の目的は、上記に定義された分子と少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００３２】
本発明の更なる目的は、腫瘍の阻止及び／又は処置において使用する為の、又は対象者における腫瘍浸潤制御性T細胞をイン・ビボで枯渇させる為の方法において使用する為の、又は対象者における腫瘍免疫を高める為の方法において使用する為の、上記に定義された分子を含む医薬組成物である。
【００３３】
本発明に従う医薬組成物は、治療剤、好ましくは抗腫瘍剤における治療剤、をさらに含みうる。
【００３４】
本発明の他の目的は、対象者における腫瘍の発生の危険を診断する及び／又は評価する及び／又は対象者における腫瘍を予測する為の、及び／又は対象者における腫瘍の進行を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置の有効性を監視する為の、及び／又は対象者
における腫瘍の治療的処置をスクリーニングする為のイン・ビトロ方法であって、
a)  上記対象者から得られた単離された生物学的サンプルにおいて、上記に定義されたマーカーの少なくとも１つを検出すること、そして
b)  適切な対照と比較すること
の工程を含む、上記方法である。
【００３５】
本発明の他の目的は、対象者における腫瘍の展開の危険を診断し及び／又は評価する為の、及び／又は対象者における腫瘍の進行を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置の有効性を監視する為の、及び／又は対象者における腫瘍の治療的処置をスクリーニングする為のイン・ビトロ又はエクス・ビボの方法であって、検出されるべきマーカーがLAYN、MAGEH1及びCCR8からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーである、上記方法である。
【００３６】
好ましくは、上記方法は、対象者における結腸直腸癌又は非小細胞肺癌を予測する為の方法であって、
a)  上記対象者から得られた単離された生物学的サンプルにおいて、LAYN、MAGEH1及びCCR8からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを検出すること、そして
b)  適切な対照と比較すること
の工程を含み、
対象者から得られた単離された生物学的サンプル中の上記少なくとも１つのマーカーの、対照量よりも高い量が、上記対象者が予後不良を有することを示す、上記方法である。
【００３７】
上記の方法において、好ましくは、工程a)は、上記対象者から得られた上記単離された生物学的サンプルにおいて、上記マーカー若しくはそのフラグメントの量、又は上記タンパク質(DNA又はmRNA)をコードするポリヌクレオチド若しくはそのフラグメントの量を測定することを含み、工程b)は、工程a)の測定された量を適切な対照量と比較することを含む。
【００３８】
好ましくは、上記に定義された腫瘍の治療的処置の進行を監視する為の、及び／又は腫瘍の治療的処置の有効性を監視する為のイン・ビトロ方法は、
a  )上記対象者から得られた上記単離された生物学的サンプルにおいて、上記マーカー若しくはそのフラグメントの量の変化若しくは活性の変化、又は上記タンパク質若しくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドの量の変化若しくは活性の変化を測定すること、そして、
b)  工程a)の測定された変化を適切な対照変化
の工程を含む、上記方法を含む。
【００３９】
本発明の他の目的は、上記に定義された分子を対象者に投与することを含む、腫瘍の処置及び／又は阻止の為の方法である。
【００４０】
更なる目的は、抗腫瘍としての分子作用を識別する為の方法であって、
上記に定義された少なくとも１つのマーカーに対する候補分子の結合特異性について該候補分子をアッセイすること；
上記に定義された少なくとも１つのマーカーに対する特異的結合活性を有する分子を選択すること；
好ましくは腫瘍浸潤制御性T細胞を選択的に枯渇させることによって、より好ましくは抗体依存性の細胞介在性細胞傷害活性(ADCC)を誘発することによって、増殖を阻害する及び／又は細胞系においてアポトーシス応答を誘発する能力について該特異的結合分子を試験すること
の工程を含む、上記方法である。
【００４１】
好ましくは、生物学的サンプルは、流体、細胞又は組織サンプルであり、より好ましくは該サンプルは血漿又は血清である。
【００４２】
語「生物学的サンプル」は、臨床サンプルを包含し、及びまた外科的切除により得られる組織、生検によって得られる組織、培養における細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織サンプル、器官、骨髄、血液、血漿、血清などを含む。
【００４３】
本教示の文脈において「サンプル」は、対象者から単離される任意の生物学的サンプルを云う。サンプルは、体液のアリコートに制限されず、全血、血清、血漿、個体組織サンプル、例えば組織生検、又は織培養物若しくはそれから得られる細胞及びその子孫、滑液、リンパ液、腹水液、及び間質液又は細胞外液を含む。語「サンプル」はまた、歯肉溝滲出液、骨髄、脳脊髄液(CSF：cerebrospinal  fluid)、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿、又は任意の他の体液を含む、細胞間の空間における流体を包含する。「血液サンプル」は、血清及び血漿を含む全血又はその任意の画分を云うことができる。サンプルは、静脈穿刺、排泄、射精、マッサージ、生検、針吸引、洗浄、掻爬、外科的切開、若しくは介入、又は当分野において公知の他の手段を含むがこれらに制限されない手段によって対象者から得られることができる。該定義はまた、それらの調達後に下記の任意の様式において操作されているサンプルを含む：例えば試薬による処置；洗浄；又は或る細胞集団（例えば癌細胞若しくは制御性T細胞が単離され、そして次に分析される又はサンプル）の富化。該定義はまた、特定のタイプの分子、例えば核酸、ポリペプチドなど、について富化されているサンプルを含む。
【００４４】
本発明の他の目的は、上記の方法を実行する為のキットであって、
上記マーカー若しくはそのフラグメントの量若しくは活性を測定する手段、及び／又は上記タンパク質若しくはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドの量を測定する手段、及び任意的に
制御手段
を含む、上記キットである。
【００４５】
上記マーカーの任意の組み合わせが、本発明内に含まれる。マーカーの好ましい組み合わせは、LAYN及びMAGEH1；LAYN及びCCR8；CCR8及びMAGEH1；LAYN、MAGEH1及びCCR8である。
【００４６】
好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、RNAi阻害剤であり、好ましくはsiRNA、miRNA、shRNA、stRNA、snRNA及びアンチセンス核酸、又はそれらの機能的誘導体からなる群から選択される。
【００４７】
NSCLC及びCRCを湿潤するCD4+T細胞からの遺伝子発現アレイの比較分析が、表IVに列挙されている通り、328個のマーカーのTreg特異的発現を明らかにした。それ故に、これらのマーカーを介するTreg細胞の操作は、癌の免疫療法を高める為に使用されることができる。
【００４８】
表現「調節することができる分子」及び「モジュレータ」は、本明細書において交換可能である。語「モジュレータ」によって、それは、上記に定義された少なくとも１つのマーカーの発現及び／又は機能における変化をもたらす分子を意味する。
【００４９】
上記変化は、モジュレータの非存在下において発現及び／又は機能の正常な又はベースラインのレベルに関連するが、その他の点では同様の条件下であり、及びそれは、正常な／ベースラインの発現及び／又は機能において、増加（例えば、誘導因子又は活性化因子を使用することによって）又は減少（例えば、サプレッサ又は阻害剤を使用することによって）を表しうる。本発明の文脈において、「モジュレータ」は、癌の阻止及び／又は処置における使用の為の分子であって、腫瘍浸潤制御性T細胞における選択的に脱制御される少なくとも１つのマーカーの発現及び／又は機能を抑制しうる又は阻害しうる該分子である。
【００５０】
語「サプレッサ又は阻害剤」又は「（選択的に）抑制する又は阻害する分子」によって、それは、標的の発現及び／又は機能における変化をもたらす分子を意味する。
【００５１】
本発明の文脈において、「モジュレータ」は、癌の阻止及び／又は処置における使用の為の分子であって、腫瘍浸潤制御性T細胞において選択的に脱制御される少なくとも１つのマーカーの発現及び／又は機能を誘発しうる又は活性化しうる分子である。
【００５２】
上記変化は、モジュレータの非存在下において発現及び／又は機能の正常な又はベースラインのレベルに関連するが、その他の点では同様の条件下であり、及びそれは、正常な／ベースラインの発現及び／又は機能において、増加（例えば、誘導因子又は活性化因子を使用することによって）又は減少（例えば、サプレッサ又は阻害剤を使用することによって）を表しうる。
【００５３】
標的の発現及び／又は機能の抑制又は阻害は、当業者に公知の任意の手段によって評価されうる。該標的の発現レベルの又は存在の評価は好ましくは、古典的な分子生物学技術、例えば(リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応)qPCR、マイクロアレイ、ビーズアレイ、RNAse保護分析又はノーザンブロット分析、又はクローニング及び配列決定、を使用して実行される。
【００５４】
標的機能の評価は好ましくは、標的と相互作用するタンパク質を識別する為にイン・ビトロサプレッションアッセイ、全トランスクリプトーム解析、質量分析解析によって実行される。
【００５５】
本発明の文脈において、該標的（又は上記マーカー）は、フラグメント、誘導体、変異体、アイソフォームなどを含む遺伝子、mRNA、cDNA又はそのコードされたタンパク質でありうる。好ましくは、該マーカーは、公共データベースEnsEMBL(http://www.ensembl.org))で検索可能なその受託番号(すなわち、NCBI  Entrez  ID；Ensembl遺伝子受託番号(ENSG：Ensembl  Gene  accession  number)、Ensemblトランスクリプト受託番号(ENST：Ensembl  transcript  accession  number)及びEnsemblタンパク質受託番号(ENSP：Ensembl  protein  accession  number)、及び／又は本明細書において開示されているアミノ酸配列及びヌクレオチド配列によって特徴付けられている。
【００５６】
本発明の文脈において、CD4+T細胞に言及する場合、語「処置する」（又は「処置される」、「処置」など）は例えば、上記に定義された外因性モジュレータへの細胞の暴露を意味する。過剰発現は例えば、本発明の分子を発現するウィルスベクターで細胞を感染させることによって得られうる。マーカー発現の阻害は、例えばsiRNAを用いて、ポリヌクレオチドでトランスフェクションすることによって得られうる。語「処置する」はまた、マーカーを過剰発現又はサイレンシングさせる為に細胞が操作されることを意味しうる。過剰発現又はサイレンシングは例えば、細胞を遺伝子的に改変することによって達成されうる。
【００５７】
制御手段が、規定されたマーカーの量又は量の増加を適切な対照と比較する為に使用されることができる。適切な対照は例えば、正常な対象者から若しくは正常な集団から、又は腫瘍湿潤性制御性T細胞若しくは制御性T細胞とは異なるT細胞から、既存の標準を参照して得られうる。
【００５８】
上記に定義された少なくとも１つのマーカーの量を測定する為の手段は好ましくは、少なくとも１つの抗体、機能的類似体又はその誘導体である。上記抗体、機能的類似体又はその誘導体は、上記マーカーに特異的である。
【００５９】
本発明の文脈において、抗体は好ましくは完全型免疫グロブリン、Fv、scFv(単一鎖Fvフラグメント)、Fab、F(ab’)2、「抗体様」ドメイン、「抗体-模倣ドメイン」、単一抗体ドメイン(VHドメイン又はVLドメイン)、多量体抗体、組み換え又は合成の抗原結合フラグメント、ペプチド又はエピトープ結合領域を含むタンパク分解性のフラグメントからなる群から選択される。語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、同じ意味で使用されることができ、且つ本明細書において最も広い意味で使用され、且つ様々な抗体及び抗体模倣構造物を包含し、例えばそれらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、キメラ抗体、ナノボディ、抗体誘導体、抗体フラグメント、アンチカリン、DARPins、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファーボディ、アヴィマー、フィノマー、モノボディ及び他の結合ドメインを含むがこれらに限定されない。
【００６０】
語  免疫グロブリンはまた、その「複合体(conjugate)」を含む。本発明の文脈において、本発明の抗体に関連する「複合体」は、治療活性、例えば抗腫瘍活性及び／又は細胞致死活性、を有する物質(化合物など)、又は細胞毒性薬、例えば様々なA鎖毒素、リボソーム不活性化タンパク質、リボヌクレアーゼ；腫瘍を殺傷する為の細胞機構を誘発するように設計された二重特異性抗体(例えば、米国特許第4,676,980号明細書及び第4,954,617号明細書を参照)、と複合された抗体(又はそのフラグメント)を含む。該複合体は、単一のタンパク質(融合タンパク質)(免疫毒素)としてそれが発現することを許す為に、上記抗体分子と抗腫瘍活性及び／又は細胞致死活性を有する物質とを別々に予め調製し、そして次に、それらを組み合わせる（免疫複合体）ことによって、又は遺伝子組み換え技術に従って、抗腫瘍活性及び／又は細胞致死活性を有するそのような物質として使用されるタンパク質毒素を遺伝子上の抗体遺伝子にライゲーションすることによって形成されうる。
【００６１】
「抗体フラグメント」は、完全な抗体が結合する抗原に結合する完全な抗体の一部を含む、完全な抗体以外の分子を云う。
【００６２】
抗体フラグメントの例は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子(例えば、scFv)；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、これらに制限されない。VH又はVL  Fvsはまた、「ナノボディ」とも呼ばれる。
【００６３】
語「抗体模倣」(antibody  mimetics)は、抗体誘導体ではないが、抗体がするように抗原に特異的に結合することができるそれらの有機化合物又は結合ドメインを云う。それらは、アンチカリン、DARPins、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファーボディ、アヴィマー、フィノマー、モノボディなどを含む。
【００６４】
語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来する抗体を云い、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる供給源又は種に由来する。語「完全長抗体」、「完全な抗体」及び「全抗体」は、本明細書において同じ意味で使用されており、自然抗体構造物と実質的に類似の構造を有する抗体、又は本明細書において定義されたFc領域を含む重鎖を有する抗体を云う。
【００６５】
好ましい実施態様において、本発明のキットは、
上記化合物に特異的な固相接着した抗体と；
リガンド特異的マーカー複合体の検出手段と
を含む。
【００６６】
代替的に、試薬は、懸濁液又は懸濁可能な形態における試薬、例えばフローサイトメトリーに適したビーズ、好ましくは抗体捕捉で被覆された磁気ビーズ、に結合された試薬、を含むキットとして提供されることができる。該指示書は、抗体ベースのフローサイトメトリーアッセイを実施する為の指示書を含みうる。
【００６７】
検出手段は好ましくは、記載されたマーカーの量を検出及び／又は測定することたできる手段、例えば酵素複合された二次抗体としての複合体抗原-抗体、発光性の基体、抗体捕捉で被覆された磁気ビーズ、カスタマイズされた乾燥された抗体カクテル、及び／又は、サイズフィルターカートリッジを有するカラム及び／又は特異的抗体フィルター(SAF)と組み合わされたカラムを検出することができる手段、である。
【００６８】
実施態様において、該方法はさらに、分析に基づいて最適治療計画(therapeutic  regimen)を選択することを含む。実施態様において、該方法はさらに、分析に基づいて対象者についての処置過程を決定することを含む。他の手段は例えば、RT  PCRの為の特異的プライマー及びプローブでありうる。本発明に従うキットはさらに、通例の助剤、例えばバッファ、担体、マーカーなど、及び／又は使用の為の指示書を含むことができる。
【００６９】
本発明の文脈において、語「検出する」は、「量を測定する」又は「変化を測定する」としても意図されうる。腫瘍の危険を評価すること、及び／又は腫瘍を診断すること、及び／又は腫瘍を予測することの為の方法又はキットの場合、適切な対照は、健康な患者から又は別の障害若しくは病理に冒された患者から採取されたサンプルであってもよく、及び適切な対照の量又は活性は、健康な患者から又は別の障害若しくは病理に冒された患者から採取されたサンプルにおいて測定された同じタンパク質又はポリヌクレオチドの量又は活性であってもよい。
【００７０】
腫瘍の進行を監視する為の方法又はキットの場合、癌の進行が監視され、及び適切な対照が、様々な時間で同じ対象者から採取されたサンプル又は他の患者から採取されたサンプルであってもよく、及び適切な対照の量又は活性は、様々な時間で同じ対象者から又は他の患者から採取されたサンプルにおいて測定された同じタンパク質又はポリヌクレオチドの量又は活性であってもよい。
【００７１】
治療的処置の有効性を監視する為の方法又はキットの場合、適切な対照は、治療の開始前に同じ対象者から採取されたサンプル又は治療の過程の間に様々な時間で採取されたサンプルであってもよく、及び適切な対照の量又は活性は、治療の開始前に同じ対象者から採取されたサンプル又は治療の過程の間に様々な時間で採取されたサンプルにおいて測定された同じタンパク質又はポリヌクレオチドの量又は活性であってもよい。
【００７２】
治療的処置の有効性をスクリーニングする為の方法又はキットの場合、適切な対照は、処置無しの対象者から採取されたサンプル、アッセイされるべき物質で処置された対象者から採取されたサンプル、又は参照処置で処置された対象者から採取されたサンプルであってもよく、及び適切な対照の量又は活性は、処置無しの対象者から採取されたサンプル、アッセイされるべき物質で処置された対象者から採取されたサンプル、又は参照処置で処置された対象者から採取されたサンプルであってもよく、及び適切な対照の量又は活性は、処置無しの対象者から採取されたサンプル及びアッセイされるべき物質で処置された対象者から採取されたサンプル、又は参照処置で処置された対象者から採取されたサンプルにおいて測定された同じタンパク質又はポリヌクレオチドの量又は活性の平均でありうる。この場合、対象者から得られた単離された生物学的サンプルにおけるMAGEH1及び／又はLAYN及び／又はCCR8、又はそれらのポリヌクレオチドの量又は活性が対照の量又は活性よりも低いか或いは等しい場合に、それは、試験される物質が腫瘍の処置の為に有効であることを示しうる。
【００７３】
本発明において、表現「量を測定する」は、個々のタンパク質及び／又はそのmRNA及び／又はそのDNAの量（又は活性）又は濃度又はレベル、好ましくは半定量的又は定量的、を測定することを意図されることができる。タンパク質の測定は、直接的又は間接的に行われることができる。直接測定は、タンパク質から直接的に得られたシグナルに基づく、マーカーの量又は濃度の測定を云い、及びそれは、サンプル中に存在するタンパク質分子の数と直接的に相関する。強度シグナルとしても言われることができるこのシグナルは例えば、マーカーの化学的又は物理的な特性の強度値を測定することによって得られることができる。間接測定は、二次成分(例えば、遺伝子発現産物からの異なる成分)及生物学的測定システムから得られる測定(例えば、細胞応答、リガンド、「タグ」又は酵素反応生成物の測定)を含む。
【００７４】
本明細書において使用される場合、語「量」は、タンパク質及び／又はそのmRNA及び／又はそのDNAの絶対量又は相対量、及びそれらに関連付けられた任意の他の値若しくはパラメータ、又はそれらから生じうる任意の他の値を云うが、これらに制限されない。そのような値又はパラメータは、直接測定によって得られた、タンパク質の物理的又は化学的特性のいずれかから得られたシグナルの強度値、例えば免疫アッセイ、質量分析又は核磁気共鳴における強度値、を含む。さらに、これらの値又はパラメータは、間接測定、例えば本明細書において記載された任意の測定システム、によって得られた値又はパラメータを含む。サンプル中のmRNA及びDNAを測定する方法は、当分野において知られている。核酸レベルを測定する為に、試験サンプル中の細胞は溶解されることができ、及び溶解物中の又は溶解物から生成された若しくは半精製されたRNA中のmRNAのレベルは、当業者に知られた任意の様々な方法によって測定されることができる。そのような方法は、検出可能に標識付けされたDNA又はRNAプローブを用いる(すなわち、ノーザンブロッティング)又は適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して定量的又は半定量的RT-PCR方法論を用いるハイブリダイゼーションアッセイを含む。代替的に、定量的又は半定量的なイン・シチュー・ハイブリダイゼーションアッセイは、例えば組織切片、又は未溶解細胞懸濁液及び検出可能に標識付けされた(例えば、蛍光又は酵素の標識付けされた)DNA又はRNAプローブを用いて実行されることができる。mRNAを定量する為の追加の方法は、RNA保護アッセイ(RPA：RNA  protection  assay)、cDNA及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、代表差異分析(RDA：representation  difference  analysis)、ディファレンシャルディスプレイ、EST配列分析、及び遺伝子発現の連鎖解析(SAGE：serial  analysis  of  gene  expression)を含む。
【００７５】
上記マーカーの測定された量若しくは活性又は上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの測定された量若しくは活性を対照サンプルから得られる量又は活性と比較することによって、対象者から単離されたサンプル中の上記マーカーの量又は活性がより高い値に対応する場合、該対象者は癌を示すか或いは疾病の悪化に向かいうる。
【００７６】
上記マーカーの測定された量若しくは活性又は上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの測定された量若しくは活性を対照サンプルから得られる量又は活性と比較することによって、対象者から単離されたサンプル中の上記マーカーの量又は活性が同じか又はより低い値に対応する場合、該対象者は、それぞれ、癌に影響を受けないか或いは癌の改善に向かいうる。
【００７７】
代替的に、表現「検出する」又は「量を測定する」は、分子の変化を測定することを意図している。該変化は、上記で定義された分子の量又は活性における増加又は減少を反映することができる。タンパク質の又はマーカーの活性の又は上記マーカーをコードするポリヌクレオチドの増加は、癌の悪化に関連付けられることができる。タンパク質の又はマーカーの活性の又は上記マーカーをコードするポリヌクレオチドの減少は、癌の改善又は対象者の回復に関連付けられることができる。
【００７８】
表現「マーカー」はまた、マーカーオルソロガスな又はホモロガスな遺伝子、機能的変異体、機能的誘導体、機能的フラグメント又は類似体、アイソフォーム、それらのスプライス変異体からコードされた対応するタンパク質を含むことを意図される。
【００７９】
表現「マーカー」が遺伝子に言及される場合、それはまた、対応するオルソロガスな又はホモロガスな遺伝子、機能的変異体、機能的誘導体、機能的フラグメント又は類似体、そのアイソフォームを含むことが意図される。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「フラグメント」は好ましくは、少なくとも1000ヌクレオチド、1100ヌクレオチド、1200ヌクレオチド、1300ヌクレオチド、1400ヌクレオチド、1500ヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチドを云う。
【００８１】
本明細書において使用される場合、「フラグメント」は、好ましくは少なくとも10のアミノ酸、より好ましくは少なくとも15、少なくとも17のアミノ酸、又は少なくとも20のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも25のアミノ酸、又は少なくとも37又は40のアミノ酸の長さ、及びより好ましくは少なくとも50、又は100、又は150、又は200、又は250、又は300、又は350、又は400、又は450、又は500のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを云う。
【００８２】
語「ポリヌクレオチド」はまた、修飾されたポリヌクレオチドを云う。
【００８３】
本明細書において使用される場合、語「ベクター」は、発現ベクターを云い、及び例えばプラスミド、ウィルス粒子、ファージなどの形態でありうる。そのようなベクターは、細菌プラスミド、ファージDNA、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージDNAとの組み合わせから誘導されるベクター、ウィルスDNA、例えばワクシニア、アデノウィルス、レンチウィルス、鶏痘ウィルス及び仮性狂犬病を含みうる。多数の適切なベクターが当業者に知られており、且つ商業的に入手可能である。
【００８４】
ポリヌクレオチド配列、好ましくはベクター中のDNA配列は、適切な1以上の発現制御配列(プロモーター)に作用可能に連結されて、mRNA合成を指示する。そのようなプロモーターの代表例として、人々は、原核又は真核のプロモーター、例えばCMV即時初期（immediate  early）、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウィルスからのLTR、及びマウス・メタロチオネインプ-I、を言及することができる。発現ベクターはまた、翻訳開始の為のリボソーム結合部位及び転写ベクターを含みうる。該ベクターはまた、発現を増幅する為の適切な配列を含みうる。加えて、該ベクターは好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択の為の表現型形質、例えば真核細胞培養の為のジヒドロ葉酸レダクターゼ若しくはネオマイシン耐性、又はE．coliにおけるテトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性、を提供する為に、１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【００８５】
本明細書において使用される場合、語「遺伝子組み換えが行われている宿主細胞」は、ポリヌクレオチドで又は左記に記載されたベクターで形質導入されている、形質転換されている又はトランスフェクトされている宿主細胞に関する。適切な宿主細胞の代表例は、細菌細胞、例えばE．coli、ストレプトマイセス、サルモネラ・チフィリウム、真菌細胞、例えば酵母、昆虫細胞、例えばSf9、動物細胞、例えばCHO又はCOS、植物細胞などを引用することができる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内であると見做される。好ましくは、該宿主細胞は動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００８６】
ポリヌクレオチドの又は上述のベクターの宿主細胞内への導入は、当業者に周知の方法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウィルス感染、熱ショック、によって果たされる。
【００８７】
該ポリヌクレオチドは、ベクター、例えばウィルスベクター、でありうる。
【００８８】
上記に定義されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中に複製し且つポリヌクレオチド又はタンパク質を複製するベクター内の核酸として処置されるべき対象者の体内に導入されることができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物の適切な投与経路は、経口、直腸、経粘膜、腸、経腸、局所、座薬、吸入、髄腔内、脳室内、腹腔内、鼻腔内、眼内及び非経口（例えば、静脈内、筋肉内、髄内、及び皮下）を含むがこれらに制限されない。追加の適切な投与経路は、化学塞栓療法を含む。他の適切な投与方法は、注射、ウィルス輸送、リポソームの使用、例えばカチオン性リポソーム、経口摂取及び／又は皮膚適用を含む。
【００９０】
或る実施態様において、本発明の医薬組成物は、投与単位の形態(例えば、錠剤、カプセル、巨丸剤など)で投与される。
【００９１】
医薬用途の為に、該組成物は、溶液の形態、例えば注射可能な溶液、エマルジョン、懸濁液など、でありうる。該担体は、任意の適切な医薬担体でありうる。好ましくは、標的細胞に入る為にRNA分子の有効性を増加することができる担体が使用される。そのような担体の適切な例がリポソームである。
【００９２】
上記で定義されたモジュレータは、薬学的に有効な投薬量で投与され、ポリヌクレオチドの場合に、それは投与経路及び疾病の型又は重症度に応じて0.001pg/kg体重から10mg/kg体重でありうる。
【００９３】
語「医薬組成物」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを許すような形態であり、且つ製剤が投与される対象者に対して容認できないほど毒性である追加成分を含まない製剤を云う。本発明において、語「有効量」は、そのような効果が当業者に理解されるように、所望の効果又は治療効果を達成する量を意味するべきである。本発明において、抗体は、化学療法又は放射線療法でありうる別の治療的処置と同時に又は連続して投与されうる。本発明は、本明細書において開示されている抗体の治療的有効量、約4.5〜約8.5のpHを維持するバッファ、及び任意的に界面活性剤を含む製剤を提供する。該製剤は典型的に、本明細書において開示されている抗体、約0.1mg/ml〜約100mg/mlの活性成分濃度としての本発明の組み換え又は合成の抗原結合フラグメントに関する。或る実施態様において、該抗体、組み換え又は合成の抗原結合フラグメントの濃度は、約0.1mg/ml〜1mg/ml；好ましくは1mg/ml〜10mg/ml、好ましくは10〜100mg/ml、である。
【００９４】
１又は複数の治療製剤が、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、所望の純度を有する抗体を、任意の生理学的に許容される担体、添加物又は安定剤と混合することによって調製されることができる(Remington's  Pharmaceutical  Sciences  16th  edition，Osol，A．Ed．，1980年)。
【００９５】
本発明の抗体を含有する医薬組成物は例えば、様々な周知の混合、溶解、造粒、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥の工程によって製造しうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。非経口投与は、本発明の多くの観点において好ましい。
【００９６】
静脈内、筋肉内及び皮下の注射を含むがこれらに限定されるものでない注射の為に、本発明の化合物は、水性溶液、好ましくは生理学的適合バッファ、例えば生理食塩バッファ、又はピロリドン若しくはジメチルスルホキシドを含むがこれらに制限されない極性溶媒、において処方されうる。
【００９７】
注射の為の製剤は、単位投与形態において、例えばアンプルにおいて、又は複数回投与容器において提供されうる。有用な組成物は、油性又は水性ビヒクルにおける懸濁液、溶液又はエマルジョンを含むがこれらに制限されず、且つ補助剤、例えば懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤、を含みうる。非経口投与の為の医薬組成物は、水溶性形態の水性溶液、例えばこれらに限定されないが、活性化合物の塩、を含む。さらに、活性化合物の懸濁液は、親油性ビヒクル中で調製されうる。適切な親油性ビヒクルは、脂肪油、例えばごま油、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル及びトリグリセリド、又はリポソームなどの物質を含む。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン、を含みうる。任意的に、該懸濁液はまた、安定剤及び／又は、化合物の溶解度を高めて、高濃度の溶液の調製を許す適切な剤を含みうる。代替的に活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば殺菌した、パイロジェンフリーの水、を構成する為の粉末形態でありうる。吸入による投与の為に、本発明の抗体は、加圧パック又はネフライザー及び適切な噴射剤を用いて、エアロゾルスプレーの形態で都合よく運ばれることができる。抗体はまた、慣用的な坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリド、を用いて、直腸組成物、例えば座薬又は停留浣腸剤、中に処方されうる。先に記載された製剤に加えて、抗体がまた、デポ製剤として製剤化されうる。そのような長時間作用型の製剤は、(例えば、皮下又は筋肉内)注入によって又は筋肉内注射によって投与されうる。本発明の化合物は、イオン交換樹脂を有する適切なポリマー性若しくは疎水性物質(例えば、薬理学的に許容される油を有するエマルジョン)で、又は難溶性の誘導体、例えば限定されないが難溶性の塩、としてこの投与経路の為に処方されうる。加えて、該抗体は、持続放出系、例えば治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックス、を用いて運ばれうる。他の送達系、例えばリポソーム及びエマルジョン、がまた、使用されることができる。
【００９８】
治療的有効量は、癌又は癌の再発症状を阻止し、緩和し又は寛解させる為に有効な化合物の量を云う。治療的有効量の決定は、特に本明細書の開示に照らして、当業者の能力の範囲内である。本発明において使用される任意の抗体について、治療的有効量は、最初にイン・ビトロアッセイから推定されることができる。次に、投与量は、有効投与量を含む循環濃度範囲を達成する為に、動物モデルにおける使用の為に処方されることができる。次に、そのような情報は、患者に有用な投与量をより正確に決定する為に使用されることができる。投与される組成物の量は、その中に含まれる親分子に依存するだろう。一般に、処置方法において使用される量は、哺乳動物における所望の治療的効果を効果的に達成する量である。当然のことながら、様々な化合物の投与量は、化合物、イン・ビボでの加水分解などに依存して幾分変化しうる。加えて、投与量は勿論、剤形及び投与経路に依存して変化することができる。上記の範囲は実例であり、及び当業者は、臨床経験及び処置適応に基づいて選択された化合物の最適な投与量を決定するであろう。その上、正確な製剤、投与経路及び投与量は、患者の状態及び最も有効な投与経路(例えば、静脈内、皮下、皮内)を考慮して、個々の医師によって選択されることができる。さらに、本明細書に記載の抗体及び他の治療剤の毒性及び治療有効性は、当分野において周知の方法を用いて、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順によって決定されることができる。所望の臨床結果及び生物学的結果が得られるまで、該処置は1以上のサイクルに渡って与えられるだろうことが企図される。本発明の化合物の投与の正確な量、頻度及び期間は勿論、患者の性別、年齢及び医薬的状態並びに担当医師によって決定される疾病の重篤度及びタイプに依存して変化するだろう。
【００９９】
本発明のモジュレータは、単一のタイプのモジュレータ又は複数の異なるモジュレータを含みうる。
【０１００】
制御性T細胞の機能は、マーカー活性及び／又は発現を阻害することによって、又はT細胞集団におけるそのようなマーカーについて陽性である細胞数を減少させることによって(例えば、少なくとも１つの上記マーカーを結合し、そして抗体依存性の細胞介在性細胞傷害(ADCC：antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity)を誘発することによって)阻害されうる。有機体における制御性T細胞の機能を阻害することは、そのような応答が例えば癌を患っている患者において望ましいそれらの状況において免疫T細胞応答を高める為に使用されうる。
【０１０１】
マーカータンパク質又はmRNAに結合する阻害剤で癌患者を処置する場合、人々は、抗腫瘍ワクチン又は治療を任意的に同時投与しうる。そのようなワクチンは、単離された抗原に又は抗原のグループに、又は腫瘍細胞全体に向けられうる。阻害剤を化学治療剤で又は放射線療法と一緒に投与することが望ましい場合がある。
【０１０２】
複数の剤での処置は、薬剤の混合物を用いて行われる必要性はないが、個々の医薬製剤を用いて行われうる。該調製物は、同じ正確な時間に運ばれる必要はないが、処置の同じ時間の間に、すなわち1週間又は1ヶ月以内に、患者に運ばれるように調製されうる。
【０１０３】
従って、2つの活性成分を含む組成物は、患者の体内に構成されうる。任意の適切な抗腫瘍処置が、マーカーを標的とする本発明の処置と連携されることができる。同様に、感染症を有する患者を処置する場合、他の抗感染剤がマーカーを標的とする本発明の処置と連携されることができる。そのような剤は、小分子薬物、ワクチン、抗体などでありうる。
【０１０４】
T細胞集団におけるマーカー＋細胞の数は、マーカーに選択的に結合する抗体又は他の剤を用いることによって変更することができる。マーカー＋細胞は、制御性T細胞機能を高める為に、T細胞の元の供給源内又は別の適合する宿主内に戻すことができる制御性T細胞の豊富な集団を表す。代替的に、該マーカー細胞は、一般的なT細胞活性を保持しながら、制御性T細胞機能を阻害し又は減少させる為に、T細胞又は別の適合する宿主の元の供給源内に再導入されることができる制御性T細胞活性を欠損するT細胞の集団を表す。
【０１０５】
マーカー活性を増加する又は減少するのいずれかの（調節する）ための任意の所望の手段は、本発明の方法において使用されることができる。これは、マーカータンパク質の機能を直接的に調節すること、マーカーシグナル伝達を調節すること、転写又は翻訳またはそれらの両方を調節することによってT細胞におけるマーカーの発現を調節することを含む。マーカー活性を選択的に調節するそれらの手段は、非選択的モジュレータよりも好ましい。また、T細胞の集団において一過的な(transient)マーカー欠損を生成し、それは次にマーカー活性の正常なレベルに戻すそれらの阻害手段が、一時的な(temporary)T細胞欠損を処置する為に好ましい場合がある。一過的に欠損したT細胞は、マーカーに関して遺伝子的に正常であるであろうT細胞で減少したT細胞集団を再構成する為に使用されうる。マーカー活性の調節は、イン・ビトロで細胞上において又はイン・ビボで動物全体において実行されることができる。イン・ビトロで処置される細胞は、細胞の元の供給源又は無関係な個体のいずれかの患者に投与されることができる。
【０１０６】
マーカー(アンタゴニスト)の機能を阻害する為に、マーカー抗体又は小分子阻害剤が使用されることができる。この目的の為に有用な抗体又は抗体フラグメントは、マーカーに結合し且つ機能する為のその能力を阻止することができるそれらであるだろう。そのような抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、可溶性MHCクラスII分子、抗体フラグメントなどでありうる。
【０１０７】
マーカーポリペプチドに対して生成される抗体は、マーカーポリペプチドの動物への直接注射によって又はマーカーポリペプチドを動物、好ましくは非ヒト、に投与することによって得られることができる。次に、そのようにして得られた抗体は、マーカーポリペプチドそれ自体に結合するだろう。この様式において、マーカーポリペプチドのフラグメントのみをコードスル配列であっても、天然マーカーポリペプチド全体に結合する抗体を生成する為に使用されることができる。
【０１０８】
モノクロナール抗体の調製の為に、連続細胞株培養によって生産された抗体を提供する任意の技術が使用されることができる。例は、ハイブリドーマ技術(Kohler  and  Milstein，1975年，Nature，256：495-497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor等．，1983年，Immunology  Today  4：72)及びヒトモノクロナール抗体を生成する為のEBV-ハイブリドーマ技術(Cole等，1985年，Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy，Alan  R．Liss，Inc．，pp．77-96)を含む。
【０１０９】
一本鎖抗体の生産について記載された技術(米国特許第4,946,778号明細書)は、マーカーポリペプチドに対する一本鎖抗体を生産する為に容易に使用されることができる。また、遺伝子導入マウスは、免疫原性のマーカーポリペプチドに対するヒト化抗体を発現する為に使用されうる。マーカーの機能を高める又は活性化する為に、マーカーのレベルを又はT細胞における既存のマーカーの活性を増加させる任意の剤が使用されうる。そのような剤は、以下に記載するスクリーニングアッセイを用いて識別されうる。該マーカーをコードする発現ベクターは、遺伝子投与量を増加させる為にまた投与されることができる。発現ベクターは、当分野において知られている通り、プラスミドベクター又はウィルスベクターであることができる。任意のベクターが、特に望ましい特性について当分野において選択されることができる。本発明の文脈において、語「ポリヌクレオチド」は、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノムDNA)及びRNA分子(例えば、mRNA、siRNA、shRNA)及びヌクレオチド類似体を用いて生成されたDNA又はRNAの類似体を含む。該ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖でありうる。該ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド類似体又は誘導体(例えば、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド)を用いて合成されうる。
【０１１０】
上記に定義したRNAi阻害剤は好ましくは、特異的標的配列の全て又は一部にハイブリダイズすることができる。それ故に、RNAi阻害剤は、標的配列の全て又は一部に、完全に又は部分的に相補的でありうる。
【０１１１】
RNAi阻害剤は、中から高のストリンジェンシー条件下で特定された標的配列にハイブリダイズされうる。
【０１１２】
RNAi阻害剤は、それが標的とすることが意図される配列の逆相補体に対する特定の配列の同一性を参照して定義されうる。アンチセンス配列は典型的には、それらの標的配列の逆相補体と少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%又は少なくとも約99%の配列同一性を有する。
【０１１３】
語  ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、その誘導体及びその機能的フラグメントを含む。
【０１１４】
本発明の文脈において、上記で定義した少なくとも少なくとも１つの遺伝子又はマーカーは好ましくは、表VIII又は表VIに記載された通り、そのEnsembl  Gene  ID又はNCBI受託番号(Accession  Numbers)によって特定される配列の少なくとも１つ又はSEQ  ID  No：1-709の少なくとも1つによって特徴付けられている。
【０１１５】
本明細書において語  遺伝子はまた、その対応するオルソロガスな又はホモロガスな遺伝子、アイソフォーム、変異体、対立遺伝子多型、機能的誘導体、機能的フラグメントを含む。表現「タンパク質」はまた、その対応するオルソロガスな又はホモロガスな遺伝子、機能的変異体、機能的誘導体、機能的フラグメント又は類似体、アイソフォームからコードされる対応するタンパク質を含む。
【０１１６】
本明細書においてタンパク質を言及して使用される場合に「類似体」は修飾されたペプチドを意味し、ここで、ペプチドの１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、及び／又はここで、１以上のアミノ酸残基がペプチドから削除されている、及び／又はここで、１以上のアミノ酸残基がペプチドから削除されている、及び／又はここで、１以上のアミノ酸残基がペプチドに付加されている。アミノ酸残基のそのような付加又は削除は、ペプチドのN末端で及び／又はペプチドのC末端で生じることができる。
【０１１７】
「誘導体」は、上記で定義されたポリヌクレオチドをコードする、DNA分子としての核酸分子、又は上記で定義されたポリヌクレオチドを含む核酸分子、又は相補配列のポリヌクレオチドでありうる。本発明の文脈において、語「誘導体」はまた、本明細書において言及されている配列と又はそれらの相補配列と又はそれらのDNA又はRNAの対応配列と少なくとも41%、50%、60%、65%、70%又は75%、より好ましくは少なくとも85%、例として少なくとも90%、及びさらにより好ましくは少なくとも95%又は100%、の同一のパーセントを有するより長い又はより短いポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを云う。語「誘導体」及び語「ポリヌクレオチド」はまた、修飾された合成オリゴヌクレオチドを含む。該修飾された合成オリゴヌクレオチドは好ましくは、LNA(ロックド核酸：Locked  Nucleic  Acid)、ホスホロチオール化されたオリゴ又はメチル化されたオリゴ、モルホリノ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチド、及びコレステロール複合された2'-O-メチル修飾されたオリゴヌクレオチド(アンタゴマー)である。
【０１１８】
語「誘導体」はまた、ヌクレオチド類似体、すなわち天然に生じるリボヌクレオチド又は天然に生じていないヌクレオチドによって置換されたデオキシリボヌクレオチドを含みうる。
【０１１９】
語「誘導体」はまた、核酸又はポリペプチドの配列の1以上のヌクレオチド又はアミノ酸、等価体又は前駆体配列を突然変異させることによって生成されうる核酸又はポリペプチドを含む。語「誘導体」はまた、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの機能的フラグメントを含む。
【０１２０】
本発明の文脈において、「機能的」は、例えば「それらの活性を維持する」ことを意図されている。
【０１２１】
本発明の文脈において、上記に定義されたベクターは好ましくは、プラスミド、ウィルスベクター及びファージからなる群から選択され、より好ましくはウィルスベクターがレンチウィルスベクターである。
【０１２２】
本発明の文脈において、上記に定義された宿主細胞は好ましくは、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞からなる群から選択され、好ましくは動物細胞である。
【０１２３】
１以上のマーカーに特異的に結合する抗体の混合物を含む組成物；及び抗癌ワクチンは、イン・ビトロで製造されることができる。好ましくは、該組成物は、それが医薬組成物として使用する為に適している条件下で製造される。
【０１２４】
医薬組成物は、殺菌し且つパイロジェンフリーでありうる。該組成物の成分はまた、患者の体内に同時に存在するように或る期間内に患者に別々に投与されることができる。そのような時分割投与は、患者の体内に抗体及びワクチンの混合物の形成をもたらす。抗体及びワクチンが時分割様式で投与される場合、それらはキット内で一緒に供給されうる。該キット内で、該成分は個々に包装されていてもよく又は含まれていてもよい。他の成分、例えば添加物、担体、他の免疫モジュレータ又はアジュバント、抗体及びワクチンの投与の為の指示書、及び注射装置、は、キットにも供給されることができる。指示書は、書面、ビデオ又は音声の形式であることができ、紙、電子媒体、又はさらに他の供給源、例えばウェブサイト若しくは参照マニュアル、への参照であることができる。
【０１２５】
本発明の抗マーカー抗体は、抗癌ワクチン又は抗癌治療に対する癌患者の抗癌応答の大きさを増加させる為に使用されることができる。それはまた、癌患者の集団におけるレスポンダーの数を増加させる為に使用されることができる。従って、該抗体は、抗癌ワクチン又は処置に難治性の患者において見られる免疫抑制を克服する為に使用されることができる。抗癌ワクチンは、当分野において公知である任意のものであることができ、例えば腫瘍細胞ワクチン全体、単離された腫瘍抗原、又は１以上のエピトープ若しくは腫瘍抗原を含むポリペプチドを包含する。
【０１２６】
T細胞におけるマーカーの発現は、転写レベル又は翻訳レベルで調節されることができる。そのような調節が可能である剤は、以下に記載するスクリーニングアッセイを用いて識別されることができる。
【０１２７】
マーカーmRNAの翻訳は、リボザイム、アンチセンス分子、siRNA(small  interference  RNA；Elbashir，S．M．等．，"Duplexes  of  21-nucleotide  RNAs  mediate  RNA  interference  in  cultured  mammalian  cells"，Nature  411：494-498(2001年)を参照)、又はマーカーmRNAを標的とするこの方法の小分子阻害剤を用いることによって阻害されることができる。アンチセンス技術は、三重らせん形成又はアンチセンスDNA若しくはRNAを通じて遺伝子発現を制御する為に使用されることができ、それらの両方の方法は、ポリヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、約10〜40の塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する為に使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され(三重らせん--Lee等．，Nucl．Acids  Res．，6：3073(1979年)；Cooney等，Science，241：456(1988年)；及びDervan等．，Science，251：1360(1991年))、それによって転写及びマーカーの生産を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、イン・ビボでmRNAにハイブリダイズし、且つmRNA分子のマーカーポリペプチドへの翻訳をブロックする(アンチセンス--Okano，J．Neurochem．，56：560(1991年)；Oligodeoxynucleotides  as  Antisense  Inhibitors  of  Gene  Expression，CRC  Press，Boca  Raton，Fla．(1988年)を参照)。上記されたオリゴヌクレオチドは、アンチセンスRNA又はDNAがマーカーの生成を阻害する為にイン・ビボで発現されうるようにアンチセンス発現構築物によって細胞に運ばれることがまたできる。そのような構築物は、当分野において周知である。アンチセンス構築物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNA干渉構築物又はsiRNA二本鎖RNA分子は、マーカーの発現を妨害する為に使用されることができる。典型的に、マーカーmRNA配列の相補体の少なくとも15、17、19又は21のヌクレオチドがアンチセンス分子に十分である。典型的に、少なくともマーカーの19、21、22又は23のヌクレオチドがRNA干渉分子にとって十分である。好ましくは、RNA干渉分子は、2のヌクレオチドの3'オーバーハングを有するだろう。RNA干渉分子が、構築物から、例えばヘアピン分子から又は所望のマーカー配列の逆方向反復からの細胞において発現される場合、次に内因性細胞機構がオーバーハングを生成するだろう。siRNA分子は、化学合成、イン・ビトロ転写、又はRnase  III若しくはDicerによる長いdsRNAの消化によって調製されることができる。これらは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、又は当分野において公知の他の方法によって細胞内に導入されることができる(Hannon，GJ，2002年，RNA  Interference，Nature  418：244-251；Bernstein  E等，2002年，The  rest  is  silence．RNA  7：1509-1521；Hutvagner  G等，aL9  RNAi：Nature  harbors  a  double-strand．Curr．Opin．Genetics  &  Development  12：225-232，2002年，A  system  for  stable  expression  of  short  interfering  RNAs  in  mammalian  cells．Science  296：550-553；Lee  NS，Dohjima  T，Bauer  G，Li  H，Li M-J，Ehsani  A，Salvaterra  P，and  Rossi  J．(2002年)を参照)。低分子干渉RNAの発現は、ヒト細胞におけるHIV-1  rev転写物に対して目標とした。Nature  Biotechnol．20：500-505；Miyagishi  M，and  Taira  K．(2002年)。4つのウリジン3'オーバーハングを有するU6-プロモーター駆動siRNAは、哺乳動物細胞における標的化された遺伝子発現を効率的に抑制する。Nature  Biotechnol．20：497-500；Paddison  PJ，Caudy  AA，Bernstein  E，Hannon  GJ，and  Conklin  DS．(2002年)。ショートヘアピンRNAs(shRNAs)は、哺乳動物 細胞において配列特異的サイレンシングを誘発する。Genes  &  Dev．16：948-958；Paul  CP，Good  PD，Winer  I，and  Engelke  DR．(2002年)。Effective  expression  of  small  interfering  RNA  in  human  cells．Nature  Biotechnol．20：505-508；Sui  G，Soohoo  C，Affar  E-B，Gay  F，Shi  Y，Forester  WC，and  Shi  Y．(2002年)。A  DNA  vector-based  RNAi  technology  to  suppress  gene  expression  in  mammalian  cells．Proc．Natl．Acad．Sci．USA  99(6)：5515-5520；Yu J-Y，DeRuiter  SL，and  Turner  DL．(2002年)。RNA  interference  by  expression  of  short-interfering  RNAs  and  hairpin  RNAs  in  mammalian  cells．Proc．Natl．Acad．Sci．USA  99(9)：6047-6052。
【０１２８】
既存のモジュレータに加えて、本発明の方法において有用であるマーカー活性の追加のモジュレータが、2つのハイブリッド・スクリーニング、慣用的な生化学的アプローチ、及び細胞に基づくスクリーニング技術、例えばマーカーに結合する能力の為のスクリーニング候補分子又は細胞培養におけるマーカー活性を阻害する化合物の為のスクリーニング、を用いて同定されることができる。
【０１２９】
これは、マーカー活性モジュレータをスクリーニングする為の簡単なイン・ビトロアッセイ系を提供する。
【０１３０】
該方法は、マーカーと直接的に相互作用し且つ調節する剤、並びにマーカーシグナル伝達経路における工程に影響を及ぼすことによってマーカー活性を間接的に調節する剤を識別しうる。
【０１３１】
マーカーを発現する細胞を用いる、細胞ベースのアッセイは、哺乳動物から単離され且つマーカーを自然に発現する細胞を用いることができる。代替的に、マーカーを発現する為に遺伝子組み換えが行われている細胞が使用されることができる。好ましくは、遺伝子組み換えが行われている細胞はT細胞である。
【０１３２】
マーカー遺伝子発現を調節することによってマーカー活性を調節する剤は、候補剤の存在下又は非存在下で細胞中のマーカータンパク質の量を測定することによって細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて識別されることができる。マーカータンパク質は、例えば、抗マーカー特異的モノクロナール抗体を用いてフローサイトメトリーによって検出し且つ測定されることができる。マーカーmRNAはまた、当分野において公知の技術、例えばノーザンブロット、RT-PCR及びアレイハイブリダイゼーションを含むがこれらに制限されない、を用いて検出し且つ測定されることができる。
【０１３３】
本発明の教示に従うと、マーカー阻害剤は、有機体中のT細胞の数を増加させる為に有機体に投与されうる。この方法は、低いT細胞集団をもたらす状態を患っている有機体を処置する為に有用でありうる。そのような状態は、望ましくない細胞の浸潤又は成長、例えば腫瘍成長又は癌、を含む障害を含む。マーカー阻害剤はまた、T細胞増殖感受性障害を処置する為に慣用的な治療剤と組み合わせて投与される場合に有用でありうる。例えば、T細胞増殖感受性障害である腫瘍は慣用的に、急速に分裂する細胞を死滅させることによって機能する化学治療剤で処置される。本発明のマーカー阻害剤は、化学治療剤と併用されて投与される場合に、T細胞増殖を刺激して腫瘍細胞の免疫学的拒絶反応を高めることによって化学治療剤の殺腫瘍効果を高める。
【０１３４】
本発明の教示に従うと、マーカー活性化因子(アゴニスト)又は発現エンハンサーが有機体に投与されて、有機体中のT細胞、特に腫瘍浸潤制御性T細胞、の数を減少させて、そしてそれによって有害なT細胞活性を減少させうる。本発明の方法は、マーカーを発現するT細胞を含む任意の有機対に適用されうる。これは、任意の哺乳動物を含むがこれらに制限されず、例えば特にヒト及びマウスを含む。
【０１３５】
本発明の方法がイン・ビボで実行される場合に、使用されるマーカーモジュレータの有効量は、使用される特定のモジュレータ、処置される特定の状態、処置される対象者の年齢及び身体状態、状態の重篤度、処置の期間、併用療法の性質(もしあれば)、特定の投与経路、並びに医療従事者の知識及び専門知識内の同様の因子で変化するだろう。例えば、有効量は、固体が異常に低下したレベルのT細胞を有する程度に依存することができる。
【０１３６】
投与される場合、本発明の医薬製剤は、医薬的に許容される量において及び医薬的に許容される組成物において適用される。そのような調製物は日常的に、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性のある担体、及び任意的に他の治療剤を含みうる。医薬に使用される場合、塩は医薬的に許容されるべきであるが、医薬的に許容されない塩は、それらの医薬的に許容される塩を調製する為に都合よく使用されてもよく、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的に且つ医薬的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などが含まれるが、これらに制限されるものでない。また、医薬的に許容される塩は、アルカリ金属塩又はアルカリ土類塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩、として調製されることができる。マーカーモジュレータは、任意的に医薬的に許容される担体と組み合わせられうる。本明細書で使用される場合に、語「医薬的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適している１以上の適合する固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化する物質を意味する。語「担体」は、有機又は無機の成分、天然又は合成の成分を意味し、それらを用いて活性成分が組み合わされて適用を容易にする。医薬組成物の成分はまた、所望の薬理学的効果を実質的に損なう相互作用がない様式において、本発明の分子と且つ互いに混じり合うことができる。
【０１３７】
医薬組成物は、適切な緩衝剤、例えば塩での酢酸；塩でのクエン酸；塩でのホウ酸；塩でのリン酸、を含みうる。医薬組成物はまた、任意的に、適切な防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベン及びチメロサール、を含みうる。
【０１３８】
非経口投与に適している組成物は、抗炎症剤の殺菌した水性調製物を都合よくは含み、それは好ましくはレシピエントの血液と等張である。この水性調製物は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いる既知の方法に従って処方されうる。
【０１３９】
殺菌した注射用製剤はまた、例えばブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の殺菌した注射溶液又は懸濁液でありうる。用いられうる許容されるビヒクル及び溶媒の中には、水、リンガー溶液、及び等張食塩水がある。さらに、殺菌した固定油は慣用的に、溶媒又は懸濁媒体として用いられている。この目的の為に、任意の無刺激性の固定油、例えば合成のモノ又はジグリセリドを包含する、が用いられうる。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸、は、注射剤の調製において使用されうる。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適している担体製剤は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences，Mack  Publishing  Co．，Easton，Paにおいて見つけられることができる。
【０１４０】
様々な投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、選択される特定の薬物、処置される状態の重篤度、及び治療有効性に必要とされる容量に勿論依存するだろう。本発明の方法は、一般的に言えば、臨床的に許容されない副作用を引き起こすこと無しに、有効なレベルの活性化合物を生成する任意の様式を意味する、医学的に許容される任意の投与様式を用いて実施されうる。そのような投与様式は、経口、直腸、局所、経鼻、皮内又は非経口投与を含む。
【０１４１】
語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内又は点滴を含む。
【０１４２】
静脈内又は筋肉内の経路は、長期間の治療及び阻止に特に適していない。しかしながら、それらは緊急事態において好まれることができる。経口投与は、患者にとっての利便性及び投与スケジュールの為に好ましい。医薬組成物は都合よくは、単位投与形態で提供されてもよく、そして薬学の分野において周知の任意の方法によって調製されてもよい。全ての方法は、活性剤を、１以上の副成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。一般的に、組成物は、活性剤を、液体担体、細かく分割した固体担体又はその両方と均一且つ密接に混ぜ合わせ、そして次に、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。経口投与に適している組成物は、個別の単位、例えばカプセル、錠剤、薬用キャンデー(lozenges)、として提供されてもよく、それぞれは活性剤の所定の量を含む。他の組成物は、水性液体又は非水性液体、例えばスロップ、エリキシル又はエマルジョン、中の懸濁液を含む。
【０１４３】
他の送達系は、除放(time-release)、遅延放出、又は持続放出(sustained  release)の送達系を含みうる。そのような系は、活性剤の反復投与を避けることができ、対象者及び医者の利便性を高める。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリマーベース系、例えばポリ（ラクチド−グルコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリ無水物、を含む。薬物を含有する上記のポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許第5,075,109号明細書に記載されている。送達系はまた、ステロール、例えばコレステロール、コレステロールエステル、及び脂肪酸又は中性脂肪、例えばモノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドを含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック(sylastic)系；ペプチドに基づく系；ワックスコーティング；慣用的な結合剤及び添加物を用いた圧縮錠剤；部分的に融合したインプラント；などである非ポリマー系を含む。具体的な例は以下を含むがこれらに制限されない：(a)抗炎症剤が米国特許第4,452,775号明細書、米国特許第4,667,014号明細書、米国特許第4,748,034号明細書及び米国特許第5,239,660号明細書に記載されているようなマトリックス内の形態で含まれる浸食系、及び(b)活性成分が米国特許第3,832,253号明細書及び米国特許第3,854,480号明細書に記載されているようなポリマーから、制御された速度で浸透する拡散系。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系が使用されることができ、そのうちの幾つかは注入の為に適合されている。
【０１４４】
長期持続放出インプラントの使用は特に、慢性状態の処置に適切でありうる。本明細書において使用される場合、長期放出は、少なくとも30日間、及び好ましくは60日間、活性成分の治療レベルを運ぶように構築され且つ配置されることを意味する。長期持続放出インプラントは当業者に周知であり、且つ上記された放出系の幾つかを含む。本発明は本発明を実施する為の現在の好ましい態様を含む特定の例に関して記載されているが、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神及び範囲内である上記された系及び技術の多くの変形及び置換があることを、当業者は理解するだろう。
【０１４５】
本発明は、以下の図を参照して、非限定的な実施例によって説明されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１Ａ】腫瘍浸潤細胞における免疫チェックポイントの精製、機能的特徴及び発現。(A)腫瘍又は正常組織を湿潤するTreg細胞の選別戦略の表現。(B)同じ患者の腫瘍(NSCLC又はCRC)、正常な肺及び血液から単離されたTreg細胞の抑制活性を示す代表的なフローサイトメトリープロット。健康なドナーからの、4x105のカルボキシフルオセイン二酢酸スクシニミジルエステル(CFSE：carboxyfluorescein  diacetate  succinimidyl  ester)で標識付けされたCD4+ナイーブなT細胞は、CD3特異的mAb及びCD1c+CD11c+樹状細胞と共に、同数のTreg細胞で4日間共培養された。増殖細胞のパーセントが示されている。データは、3つの独立した実験の代表である。
【図１Ｂ】腫瘍浸潤細胞における免疫チェックポイントの精製、機能的特徴及び発現。(C)免疫チェックポイント遺伝子のZ-スコアの正規化されたRNA-seq発現値がヒートマップとして表されている。細胞集団がグラフの上部に報告されており、一方遺伝子名がヒートマップの行に割り当てられている。階層クラスタリングの結果が、マトリックスの左側に描かれた系統樹として示されている。結腸組織がCとして、肺組織がLとして、及び末梢血がBとして表されている。図6をまた参照。
【図２】示差的発現分析は、腫瘍浸潤Treg細胞における同時調節遺伝子を識別する。列挙された細胞サブセットにわたる腫瘍浸潤Tregにおいて優先的に発現される遺伝子のZ-スコアの正規化された発現値(Wilcoxon  Mann  Whitney  test  p<2.2x10-16)。結腸組織がCとして、肺組織がLとして、及び末梢血がBとして表されている。
【図３Ａ】腫瘍浸潤Treg細胞の単一細胞分析。(A)実験ワークフローの概略図。実験が、CRC、NSCLCを湿潤するTreg細胞又は健康なドナーから単離された末梢血(PB：peripheral  blood)から単離されたTreg細胞；5つのサンプルが各組織について集められた。
【図３Ｂ】腫瘍浸潤Treg細胞の単一細胞分析。(B)署名遺伝子のFOXP3及びIL2RAとの共発現のパーセント(C)共発現のパーセントによって分類された署名遺伝子の発現レベルが箱ひげ図として表されている。
【図３Ｃ】腫瘍浸潤Treg細胞の単一細胞分析。(D)CRC、NSCLC又はPBを湿潤するTreg細胞における発現分布(バイオリン図(violin  plots))。受容体、シグナル伝達活性及び酵素活性、サイトカイン活性及び転写因子のオントロジークラスを表す該バイオリン図が示されている(Wilcoxon  Mann  Whitney  test  p<0.05)。グレースケールの勾配は、3つの区画から単離されたTreg細胞における各遺伝子を表す細胞のパーセントを示す。
【図３Ｄ】腫瘍浸潤Treg細胞の単一細胞分析。(E)異なる腫瘍型における腫瘍Treg署名遺伝子の遺伝子発現分析。発現値がlog2(2^-DCt)として表されている。
【図４Ａ】CRC及びNSCLCサンプルにおける腫瘍浸潤Treg細胞タンパク質署名の発現。(A)示されたタンパク質の発現の為に解析された腫瘍正常組織湿潤性Treg細胞及び末梢血Treg細胞の為の代表的なフローサイトメトリー図。
【図４Ｂ】CRC及びNSCLCサンプルにおける腫瘍浸潤Treg細胞タンパク質署名の発現。(B)示されたタンパク質の発現の為に解析された腫瘍正常組織湿潤性Treg細胞及び末梢血Treg細胞の為の代表的なフローサイトメトリー図。
【図５】腫瘍浸潤Treg細胞の署名転写物の予後値。(A)CRC(n=177)及びNSCLC(n=263)試験についてCD3Gに対して正規化された腫瘍Treg署名転写物(CCR8、MAGEH1、LAYN)の高発現と低発現とを比較するカプランマイヤー(Kaplan-Meier)生存曲線。単変量解析は、高発現及び低発現を有する患者を比較した全生存曲線ににおける有意差を確認した。統計的有意性が対数順位検定によって決定された(CRC：CCR8についてp=0.05、MAGEH1についてp=1.48x10-3、LAYNについてp=2.1x10-4；NSCLC：CCR8についてp=0.0125、MAGEH1についてp=0.035、LAYNについてp=0.0131)。各表は、指定された時点でのカプランマイヤー推定値を示す。(B)CRC患者のコーホートにおける手術時の腫瘍病期分類に従うCCR8、MAGEH1及びLAYNの発現分布。図9をまた参照。
【図６Ａ】図6は図1に関連している。腫瘍浸潤リンパ球のトランスクリプトーム解析。(A)Treg細胞湿潤性結腸直腸腫瘍又は正常組織の選別戦略の表現。(B)健康なドナーのCRC(C)、NSCLC(L)又は末梢血(PB)からのCD4+  Th1、Th17及びTreg細胞におけるFOXP3、TBX21及びRORCのRNA-seq発現値(正規化された計数)。
【図６Ｂ】図6は図1に関連している。腫瘍浸潤リンパ球のトランスクリプトーム解析。(C)選択された免疫チェックポイント及びそれらのリガンドについてのRNA-seq正規化された計数データがヒストグラム図として示されている。細胞集団名が各グラフの下部において報告されており、一方遺伝子名が上部に示される。
【図６Ｃ】図6は図1に関連している。腫瘍浸潤リンパ球のトランスクリプトーム解析。(C)選択された免疫チェックポイント及びそれらのリガンドについてのRNA-seq正規化された計数データがヒストグラム図として示されている。細胞集団名が各グラフの下部において報告されており、一方遺伝子名が上部に示される。
【図６Ｄ】図6は図1に関連している。腫瘍浸潤リンパ球のトランスクリプトーム解析。(C)選択された免疫チェックポイント及びそれらのリガンドについてのRNA-seq正規化された計数データがヒストグラム図として示されている。細胞集団名が各グラフの下部において報告されており、一方遺伝子名が上部に示される。
【図６Ｅ】図6は図1に関連している。腫瘍浸潤リンパ球のトランスクリプトーム解析。(C)選択された免疫チェックポイント及びそれらのリガンドについてのRNA-seq正規化された計数データがヒストグラム図として示されている。細胞集団名が各グラフの下部において報告されており、一方遺伝子名が上部に示される。
【図７】図7は、図3に関連する。腫瘍浸潤Treg細胞の単一細胞分析。NSCLC及びCRCから精製された単一Treg細胞におけるCD4+  Treg、Th1、Th17、Th2、CD8+  T細胞及びB細胞マーカー発現(発現細胞のパーセント)の評価。
【図８】図8は、図4に関連する。CD4+  Treg対Th17細胞におけるBATF発現の比較。腫瘍組織又は末梢血から単離されたCD4+  Treg及びTh17サブセットにおけるBATF発現レベル(RNA-seq正規化された計数データ)。
【図９Ａ】図9は図5に関連する。腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子の発現レベル。RNA-seq正規化された計数は、列挙された細胞集団に渡る3つの腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子(MAGEH1(パネルA)、LAYN(パネルB)及びCCR8(パネルC))のデータを計数する。
【図９Ｂ】図9は図5に関連する。腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子の発現レベル。RNA-seq正規化された計数は、列挙された細胞集団に渡る3つの腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子(MAGEH1(パネルA)、LAYN(パネルB)及びCCR8(パネルC))のデータを計数する。
【図９Ｃ】図9は図5に関連する。腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子の発現レベル。RNA-seq正規化された計数は、列挙された細胞集団に渡る3つの腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子(MAGEH1(パネルA)、LAYN(パネルB)及びCCR8(パネルC))のデータを計数する。
【図１０Ａ】SIRPGの為に注釈された異なるトランスクリプトアイソフォームを識別することができる特異的プライマーを用いて腫瘍浸潤Treg細胞(L=NSCLC、C=CRC、-=ntc)からのcDNA上で行われたRT-PCR分析の結果。
【図１０Ｂ】SIRPGの為に注釈された異なるトランスクリプトアイソフォームを識別することができる特異的プライマーを用いて腫瘍浸潤Treg細胞(L=NSCLC、C=CRC、-=ntc)からのcDNA上で行われたRT-PCR分析の結果。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
実験手順
【０１４８】
ヒト初代組織
初代ヒト肺又は結腸直腸腫瘍及び非腫瘍性対応部分が、Fondazione  IRCCS  Ca’  Granda，Policlinico又はSan  Gerardo  Hospitals(イタリア)で治療目的の為の手術を受けた15人及び14人の患者からそれぞれ得られた。記録が、全ての場合について入手可能であり且つ診断での患者の年齢、性別、喫煙習慣（肺癌患者について）、臨床病理学的段階(Sobin等．，2009年)、腫瘍ヒストタイプ(histotype)及び等級(grade)が含まれていた(表II)。緩和手術又はネオアジュバント化学療法及び／又は放射線療法を受けた患者はいなかった。インフォームドコンセントが全ての患者から得られ、そして該研究は、Fondazione  IRCCS Ca’  Grandaの機関審査委員会(Institutional  Review  Board)によって承認された(承認番号30/2014)。
【０１４９】
非小細胞肺癌(NSCLC)が断片に切断され、そして単一細胞懸濁液が、添付の標準プロトコルに従って腫瘍分離キット(Tumor  Dissociation  Kit)，human  and  the gentleMACS(商標)  Dissociator(Miltenyi  Biotech  cat．130-095-929)を用いることによって調製された。次に、細胞懸濁液が、フィコール・ハイパック(ficoll-hypaque)密度勾配遠心分離(Amersham  Bioscience)によって単離された。結腸直腸癌(CRC：Colorectal  cancer)標本が断片に切断され、そしてDTT  0.1mM(Sigma-Aldrich)中で、10分間インキュベーションされ、次にHBSS(Thermo  Scientific)中で広範囲にわたって洗われ、そして5%  CO2の存在下で、1mM  EDTA(Sigma-Aldrich)中で、50分間、37°Cでインキュベーションされた。次に、それらが洗われ、D型コラーゲン溶液  0.5mg/mL(Roche  Diagnostic)中で、4時間、37°Cでインキュベーションされた。腫瘍浸潤リンパ球を含む上清が、100μm細胞ストレーナーを通じて濾過され、遠心分離され、そして1800Xgで、30分間、4°Cで、100%、60%及び40%及び30%  パーコール(Percoll)溶液(Pharmacia)かならる4段階の勾配で分画された。T細胞画分は、パーコール(Percoll)層の60%と40%との間の界面から回収された。
【０１５０】
CD4T細胞サブセットが、以下の蛍光色素で複合化された抗体を用いたFACS選別により精製された：FACSAria  II(BD)を用いて、抗-CD4  APC/Cy7(Biolegend  clone  OKT4)、抗-CD27パシフィック・ブルー(Pacific  Blue)(Biolegend，クローンM-T271)、抗-IL7R  PE(Milteniy，クローンMB15-18C9)、抗-CD25  PE/Cy7(eBioscience，クローンBC96)，抗-CXCR3  PE/Cy5(BD，クローン1C6/CXCR3)、抗-CCR6  APC(Biolegend，クローンG034E3)及び抗-CCR5  FITC(Biolegend，クローンj418F1)。
【０１５１】
フローサイトメトリー
表面マーカー発現を確認する為に、細胞が以下の蛍光色素で複合化された抗体で直接染色され、そしてフローサイトメトリーにより解析された：抗-CD4(Biolegend，クローンOKT4)；抗-PD-L2(Biolegend，クローンCL24F.10C12)；抗-CD127(eBioscience，クローンRDR5)；抗-BATF(eBioscience，クローンMBM7C7)、抗-GITR(eBioscience，クローンeBIOAITR)、抗-CD25(Miltenyi，クローン4E3)及び抗4-1BB(eBioscience，クローン4B4)、抗CCR8(Biolegend，クローンL263G8)、抗CD30(eBioscience，クローンBer-H2)、抗PD-L1(Biolegend，クローン29E.2A3)、抗TIGIT(eBioscience，クローンMBSA43)、抗IL1R2(R  and  D，クローン34141)、IL21R(Biolegend，クローン2G1-K12)、抗OX40(Biolegend，クローンBer-ACT35)。細胞内染色が、製造者のプロトコル(eBioscience  cat  00-5523-00)に従い、eBioscience  Foxp3染色キットを用いて行われた。簡単に、細胞が収穫され、そして固定／透過化バッファー中で、30分間、4°Cで固定化され、そして次に、透過化バッファー中で、30分間、4°Cで、抗-FOXP3抗体(eBioscience，クローン236A/E7)及び抗-BATF(eBioscience，クローンMBM7C7)で染色された。次に、細胞が2回洗浄され、FACS洗浄バッファ中で再懸濁され、そしてフローサイトメトリーによって解析された。
【０１５２】
サプレッションアッセイ
健康なドナーからの、4×104のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFSE：carboxyfluorescein  diacetate  succinimidyl  ester)で標識付けされた(1μM)レスポンダーナイーブ+T細胞が、CRC又はNSCLCを有する患者のTILs又はPBMCsから選別された、標識付けされていないCD127-CD25lowCD4+T細胞と、FACS  Aria  II(BD  Biosciences)を用いて、抗原提示細胞としてのCD11c+CD1c+樹枝状細胞及び0.5mg/mlの抗-CD3(OKT3)mAbの存在下で共培養された。CFSEで標識付けされた細胞の増殖が、96時間培養後に、フローサイトメトリーによって評価された。
【０１５３】
RNA単離及びRNA配列決定
腫瘍浸潤のリンパ球由来のRNAが、mirVana  Isolationキットを用いて単離された。残存する混入しているゲノムDNAが、Turbo  DNA-free(Thermo  Fisher)を用いて、全RNA画分から除去された。RNA収率が、QuantiFluor  RNA  System(Promega)を用いて定量され、且つRNA品質がAgilent  2100  Bioanalyzer(Agilent)によって評価された。Illumina配列決定の為のライブラリーが、Illumina  TruSeq  RNAサンプル調製物キット  v2(セットA)を用いて50ngの全RNAから構築された。生成されたライブラリーは、HiSeq  Flow  cell  v3上でクラスター化する為に、cBot(Illumina)上にロードされた。次に、フロー細胞が、高出力モードにおけるHiSeq  2500(Illumina)を用いて配列決定された。ペアーエンド(2×125)ランが実行された。
【０１５４】
RNA-seqデータ分析
Raw.fastqファイルがFastQC  v0.11.3を用いて解析され、及びアダプター除去がcutadapt  1.8を用いて実行された。Cutadaptは、デフォルト・パラメータ[--anywhere<adapter1>--anywhere<adapter2>--overlap10--times2--mask-adapter].で、逆方向配列と順方向配列の両方で実行される。ライブラリー調製に用いられるアダプター配列は、下記の通りである。
アダプター1：AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(SEQ  ID  No：710)
アダプター2：AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT(SEQ  ID  No：711)
【０１５５】
トリミングが、Trimmomaticを用いて、生の読み取りで行われた(Bolger等．，2014年)：phred33コード化の為の標準的なパラメータが用いられた：ILLUMINACLIP(LEADING：3  TRAILING：3  SLIDINGWINDOW：4：15)，MINLENパラメーターが50に設定された。
【０１５６】
マッピング及び定量化：参照ゲノム(GRCh38)に対する読み取りマッピングが、STAR2.4.1c：[STAR --genomeDir <index_star> --runThreadN <cpu_number>--readFilesIn <trimmed>_R1.fastq.gz <trimmed>_R2_P.fastq.gz--readFilesCommand zcat]を用いて、品質検査及びトリムされた読み取りで実行された。参照注釈は、Ensembl  v80である。参照.gtfにおいて見つけられた注釈特徴を有する読み取りの重複が、HT-seq  v0.6.1を用いて計算された。次に、各サンプルのそれぞれに対して計算された出力（生の読み取り計数）が、DESeq2分析に対する入力として用いられた。生の計数がDESeq2's関数'rlog'を用いて正規化され、そして正規化された計数が主成分分析(PCA：Principal  Component  Analysis)の結果を実行及び視覚化する為に(DESeq2's'plotPCA'関数を用いて)使用された。
【０１５７】
示差的発現分析：腫瘍浸潤CD4+  Treg/Th1/Th17サブセット  対  PBMCからのCD4+  Treg/Th1/Th17の示差的発現解析が、DESeq2を用いて行われた。
上方制御された遺伝子／下方制御された遺伝子が、0.05FDRの閾値を超えることが見つけられた場合に(Benjamini-Hochberg  correction)、それらの発現値がその後の解析のために選択される。
【０１５８】
単一細胞の捕捉、cDNA及び単一細胞PCRの調製
5つのCRC及び5つのNSCLC標本からのTreg細胞が、以前に記載された通り単離された(表IIをまた参照)。単一細胞が、C1系(Fluidigm)上のマイクロ流体チップ上で捕捉され、全トランスクリプトームが増幅された。cDNAが、SMARTer  Ultra  Low  RNAキット(Clontech)を用いてチップ上で調製された。細胞が3-5E5細胞/mlの濃度でチップ上にロードされ、生存能力について染色され(生／死の細胞生存能力アッセイ；Thermo  Fisher)、そして位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡によって画像化されて、捕捉部位当たりの細胞の数及び生存能力を評価した。単一の、そして生きている細胞のみが解析に含まれた。qPCR実験の為に、収穫されたcDNAが、qPCRの為に使用されるべき同じ遺伝子発現アッセイから調製されたプライマーの0.2Xプールを用いて予め増幅された。前増幅は、多重配列特異的増幅の為に78個の標的を許す。詳細には、1.25μlのアリコートの単一細胞cDNAが、1μlのPreAmp  Master  Mix(Fluidigm)及び1.25μlのプールされたTaqMan  assay  mix(0.2x)を用いて5μlの最終容量で前増幅された。cDNAが、95°Cで15秒間、変性し、そして60°C、4分間、20サイクルでのアニーリングにより増幅された。サイクルの後、前増幅されたcDNAが、20μlのTEバッファーを最終5μl反応容量に加えて総容量の25μlにすることによって1.5倍に希釈された。
【０１５９】
単一細胞遺伝子発現実験が、96x96の定量的PCR(qPCR)DynamicArrayマイクロ流体チップ(Fluidigm)を用いて行われた。増幅されたcDNAの2.25μlアリコートが、2.5μlのTaqMan  Fast  Adavanced  Master  Mix(Thermo  Fisher)及び0.25μlのFluidigmの「サンプルローディング剤」と混合されて、そして次にチップ「サンプル」注入口の１つ内に挿入された。各20XTaqManアッセイの2.5μlアリコートが2.5μlのFluidigmの「アッセイローディング剤」と混合されて、そしてチップ「アッセイ」注入口の１つ内に個々に挿入された。サンプル及びプローブがIFC  Controller  HX(Fluidigm)を用いて96x96のチップ内にロードされ、次に製造者の指示書に従ってBioMarkリアルタイムPCRリーダー(Fluidigm)に移された。この研究で用いられた78個のTaqManアッセイのリストが、以下に提供される。
【０１６０】
表Vは、図3に関連する。
RT-qPCR単一細胞実験において使用されるTaqManプローブ及びアッセイ番号のリスト。
【０１６１】
【表２】
2019518452.tif 000011
【０１６２】
単一細胞データ分析：BioMark(商標)分析ソフトウェアにおける品質閾値(Quality  Threshold)は、各増幅曲線の「品質」を測定する為に設計された定性的ツールである。基本的に、各増幅曲線は、理想的な指数曲線と比較され、且つ品質スコアが1に近づくにつれて理想に近づく。該曲線が理想から遠いほど、品質スコアは０に近づく。デフォルトのカットオフ値0.65は、Fluidigmによって設定された任意の値である。0.65を超える任意の曲線が通過する。それより下の任意の曲線は失敗する。ベースライン補正は、線形(導関数)[デフォルト]に設定された。Ct閾値方法が、自動(検出器)上に設定された。この方法は、チップ上の各検出器について閾値を独立して計算する。クラスタリング及び下流分析の為に、生のCtsは、35の検出限界(LOD：Limit  of  Detection)を使用することによってLog2Expに変換され、それは最後のＰＣＲサイクルに対応する。共発現分析は、FOXP3及びIL2RAの両方が少なくとも2%まで共発現されたそれらの遺伝子についてCRCサンプル及びNSCLCサンプルの両方を考慮することによって行われている。バックグラウンドよりも上の遺伝子のレベルは、ggplot2(v.2.1.10)によるlog2スケール変換後のバイオリン図として描かれた。バイオリンの色勾配は、関心のある遺伝子を発現している細胞のパーセントであり、且つカラースケールの上限は遺伝子セット全体の遺伝子を発現する細胞の最大パーセントである。
【０１６３】
発現値が「ドロップアウト」効果によって影響される転写物の除去の為の手順。単一細胞qPCRデータは本質滴にノイズが多く、そして現在の技術の限界の故に、或る数の遺伝子の発現パターンが「ドロップアウト効果」によって影響されうる。本発明者等は、この「ドロップアウト」効果を考慮に入れて、その発現値が二値比較（腫瘍抹消対血液）において確実に使用することができないそれら遺伝子を廃棄する為に遺伝子選択手順を実行した。
【０１６４】
本発明者等は、腫瘍細胞(NSCLC及びCRCの両方)の総数上に検出された遺伝子の比に多くのパラメトリック分布を当て嵌め、そして最良適合として相互の逆ガウス連続確率変数を選択した。
【０１６５】
次に、本発明者等は、適合分布のメジアン値を計算し、そして検出率がこの閾値未満（検出の少なくとも8.4%）であるそれらの遺伝子を破棄した。本発明者等は、これらの遺伝子が「ドロップアウト」効果による影響をより受けやすいと推論した。この閾値を用いて、本発明者等は、ノンパラメトリックのT検定(Wilcoxon  Mann  Whitney検定p<0.05)が（腫瘍サンプル対末梢血サンプルを比較することによって）行われた45個の遺伝子を選択した。
【０１６６】
メタ分析カプラン・マイヤー(Kaplan-Meier)及び段階相関。
統計分析が、R生存パッケージ(Therneau  T．2013年)を用いることによって行われた。生存期間は、最初の病理学的診断から死亡までの日数、又は最初の病理学的診断から最後に患者が生きていると報告されるまでの日数として計算された。カプラン・マイヤー(KM)が、CRC(GSE17536)患者及びNSCLC(GSE41271)患者のいずれかにおいても腫瘍-Treg細胞署名転写物の高発現レベルと低発現レベルとを比較する為に用いられる。両方の研究について、注釈が、4つの腫瘍段階(1,2,3,4)に正規化された。GSE41271試験について、5人の患者が不完全な又は不正確な注釈である故に除外され(GSM1012883，GSM1012884，GSM1012885，GSM1013100，GSM1012888)、合計233人の患者が保持された。両方の研究からの患者は、それらの相対発現値が決定境界（サンプルの平均）を超えたか否かにかかわらず、「高」、「低」として標識付けされた。
【０１６７】
2019518452.tif 000012
【０１６８】
【数１】
2019518452.tif 000013
【０１６９】
2019518452.tif 000014
【０１７０】
【数２】
2019518452.tif 000015
【０１７１】
ここで、T(上限,下限)は、決定境界の上限及び下限を表す。
【０１７２】
【数３】
2019518452.tif 000016
【０１７３】
本発明者等は、対数順位(log-rank)統計を用いることによって腫瘍Treg細胞転写物の予後的意義を調べた；0.05未満のp-値が、統計的に有意であると見なされた。
【０１７４】
対数順位検定は0.05未満のp-値を結果として生じたので、箱ひげ図表現によるポスト段階比較を行って、CRC患者のコーホートにおける転写物の発現レベルと腫瘍段階の発現レベルとの間の相関度を評価する為に行われた。注釈が、4つの腫瘍段階(1,2,3,4)に正規化された。
【０１７５】
受託番号
本データの受託番号は下記の通りである：ENA：RNA-seqの腫瘍及び組織湿潤リンパ球の為のPRJEB11844；ArrayExpress：RNA-seqのヒトリンパ球データセットの為のE-MTAB-2319；ArrayExpress：Illumina  Human  BodyMap  2.0  projectの為のE-MTAB-513；GEO：RNA-seqのデータセットCRCの為のGSE50760；GEO：RNA-seqのデータセットNSCLCの為のGSE40419；GEO：アレイによるCRC発現プロファイリングの為のGSE17536；及びGEO：アレイによるNSCLC発現プロファイリングの為のGSE41271。
【０１７６】
表面暴露された且つ膜に関連付けられたタンパク質の予測
関心のある遺伝子によってコードされるタンパク質の表面暴露の確率が、4つの異なる細胞局在化予測アルゴリズムの組み合わせによって決定された：Yloc(Briesemeister等，2010年)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、シグナルP(http://www.cbs.dtu.dk/services/シグナルP/)及びPhobius(Kail等，2007年)。特に、Ylocは、動物版で複数の予測モデルを提供する解釈可能なシステムである；本発明者等は、4箇所（細胞核、細胞質、ミトコンドリア、分泌経路）に予測するYLoc-LowRes及び9箇所(細胞外空間、血漿膜、細胞核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体、ペルオキシソーム、ゴルジ装置及びリソソーム)に予測するYloc-HighResの両方を用いた。
【０１７７】
TMHMM及びシグナルPが、膜貫通ヘリックスを並びにアミノ酸配列におけるシグナルペプチド切断部位の存在及び位置をそれぞれ予測する為に、デンマーク工科大学のバイオインフォマティクスユニットによって開発された。フォビアス(Phobius)は、複合型の膜貫通トポロジー及びシグナルペプチド予測因子である。
【０１７８】
腫瘍浸潤制御性T細胞(Treg細胞)によって発現される転写物アイソフォームのRT-PCR分析
全RNAがmiRCURY  RNA単離キット(Exiqon)を用いて腫瘍Treg細胞(NSCLC又はCRC)から抽出され、そして1gがiScript逆転写スーパーミックス(BIORAD)を用いて逆転写された。その後、25ngのcDNAが、種々のアイソフォームを識別できる複数の遺伝子特異的プライマーを用いて、DreamTaq  Green  PCR  Master  Mix(ThermoScientific)で増幅された。PCR生成物が、アガロースゲル上で泳動された。特定の転写物の発現は、予想されたバンドサイズに基づいて評価された。
【０１７９】
結果
【０１８０】
腫瘍浸潤Treg細胞は免疫チェックポイントを上方制御し且つ非常に抑制的である。
腫瘍浸潤CD4+T細胞の遺伝子発現状況を評価する為に、本発明者等は、2つの異なる腫瘍(NSCLC及びCRC)から、隣接する正常組織から、及び末梢血サンプルから種々のCD4+リンパ球サブセットを単離した。全てのこれらの組織から、本発明者等は、フローサイトメトリー(図1A及び図6A及び図6B)によってCD4+Treg細胞(18の個体からの36個のサンプル)、Th1細胞(21の個体からの30個のサンプル)及びTh17細胞(14の個体からの22個のサンプル)を精製した(表I及び表II)。
【０１８１】
【表３】
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【０１８２】
RNA配列決定の起源組織によってプロファイルされた各細胞サブセットについて、選別の為に使用される表面マーカーの組み合わせ、プロファイルされたサンプルの数、並びにマッピングされた配列決定読み取りの数が含まれる。M，百万；CRC，結腸直腸癌；NSCLC，非小細胞肺癌；PB，末梢血。
【０１８３】
表IIは表Iに関連する。患者情報及び組織学的解析。
RNA配列決定によってプロファイルされた各細胞サブセットについて、診断時の年齢、性別、喫煙習慣（肺癌患者について）、臨床病理学的段階(TNM分類)腫瘍ヒストタイプ(histotype)及び等級(grade)を含む患者記録が示されている。
【０１８４】
qPCR実験の為に単離されたTreg細胞について、各腫瘍から捕捉され且つ単一細胞分析の為に利用可能な生細胞の数をまた含む同じ情報が入手可能である。
【０１８５】
CRC(colorectal  cancer)：結腸直腸癌；NSCLC(non-small  cell  lung  cancer)：非小細胞肺癌；(T)：腫瘍サンプル；(H)：健康な組織；ADC(Adenocarcinoma)：腺癌；SCC(Squamous  Cell  Carcinoma)：扁平上皮癌；MUC  ADC(Mucinous  Adenocarcinoma)：粘液腺癌。
【０１８６】
【表４】
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【０１８７】
Treg細胞機能を評価する為に、本発明者等はそれらのサプレッサ活性を試験し、且つどちらのタイプの腫瘍組織にも湿潤するTreg細胞は、同じ患者の隣接の正常組織及び末梢血から単離されたTreg細胞と比較してイン・ビトロで顕著に強力な抑制活性を有することを示した(図1B)。
【０１８８】
次に、ソートされたCD4+  Treg、Th1及びTh17細胞から抽出されたポリアデニル化されたRNA画分は、ペアー末端RNA配列決定によって解析され、約40億個のマッピングされた「読み取り」を得た(表I)。第１に、本発明者等は、既知の免疫チェックポイント及びそれらのリガンドのmRNA発現を定量する為に、CRC及びNSCLCの両方並びにそれらの合致する正常組織を湿潤するCD4+T細胞のRNA配列決定データを調べた。第２に、本発明者等は、CRC及びNSCLCのRNA配列データ並びに正常な結腸及び肺のサンプルのRNA配列データを解析した。本発明者等は、幾つかの免疫チェックポイント及びそれらのリガンド転写物が正常組織及び末梢血由来のTreg細胞の両方並びに末梢血単核細胞(PBMCs：peripheral  blood  mononuclear  cells)から精製されたTリンパ球及びBリンパ球のサブセットに比べて、腫瘍浸潤Treg細胞において顕著に上方制御されることを見出した(図1C及び図6C並びに表III)。
【０１８９】
表IIIは図1に関連する。全てのサブセットにおける免疫チェックポイント遺伝子の発現レベルが解析された。
【０１９０】
【表５】
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【０１９１】
全てのサブセットにおいて、選択された免疫チェックポイント遺伝子及びそれらのリガンドサブセットについてRNA-seq正規化された計数データが解析された。
【０１９２】
これらの知見は、腫瘍浸潤Treg細胞及びエフェクター細胞における免疫チェックポイントの特異的発現パターン及びそれらのリガンドを強調し、且つそれらの機能的関連性は、腫瘍部位で直接的に調査されるべきであることを提案する。
【０１９３】
腫瘍浸潤Treg細胞は、特異的な遺伝子署名を発現する。
次に、本発明者等は、腫瘍浸潤Treg細胞が特異的な遺伝子発現パターンによって定義されることができるかどうかを尋ねた。
【０１９４】
腫瘍浸潤Treg細胞の署名転写物を識別する為に、本発明者等はPBMCsから精製した種々のT及びBリンパ球サブセットから以前に得られたトランスクリプトームデータセットを解析することを含む(Ranzani等．，2015年)。そうすることで、本発明者等は、その発現が腫瘍浸潤Treg細胞においてより高い328個の転写物の署名を得た(Wilcoxon  Mann  Whitney  test  p<2.2x10-16)。(図2、及び表IVが健康な又は腫瘍性の患者の非腫瘍性の組織から及びPBMCsから精製された他のリンパ球サブセットによって比較された。
【０１９５】
表IVは、図2に関連する。全てのサブセットにおける腫瘍浸潤Treg遺伝子署名の発現レベル。列挙された細胞集団にわたる腫瘍湿潤性Treg署名遺伝子の正規化された発現値
【０１９６】
【表６】
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【０１９７】
要するに、データは、Treg細胞が、正常組織及び腫瘍組織を湿潤するCD4+T細胞サブセットの間で転写物発現における最も顕著な差を示すことを示している。本発明者等は、腫瘍浸潤Treg細胞の特異的遺伝子発現プロファイルを記述する署名遺伝子のサブセットを定義した。
【０１９８】
腫瘍浸潤Treg細胞の遺伝子署名は、原発性及び転移性のヒト腫瘍中に存在する。
次に、本発明者等は、腫瘍浸潤Treg細胞の署名遺伝子の示差的発現プロファイルについて単一細胞レベルを調べた。本発明者等は、5個のCRCサンプル及び5個のNSCLC腫瘍サンプルから並びに健康な人の5個のPBMCsからCD4+T細胞を単離し(表II)、Treg細胞を精製し、そして自動化されたマイクロ流体システム(C1  Fluidigm)を用いて、単一細胞(合計858個のTreg細胞：CRCから320個及びNSCLCから286個；健康なヒトのPBMCsから252個)を捕捉した。次に、本発明者等は、高度に発現された(>10  FKPM)腫瘍Treg細胞署名遺伝子のうちの79個の遺伝子の発現をハイスループットRT-qPCR(Biomark  HD，Fluidigm)によって評価した(図3A、図3C及び図7)。
【０１９９】
注目すべきことに、腫瘍浸潤Treg細胞署名の大多数(75超79；95%)が、本物のTreg細胞マーカー(すなわち、FOXP3+及びIL2RA)と同時に発現されていることが見出された(図3B)。これらのTreg細胞マーカーと腫瘍湿潤性Treg細胞署名遺伝子の間から選択された79個の遺伝子との間の共発現のパーセントは、81%のTIGITと0.59%のCGAとの間の範囲であった(図3B)。全Treg細胞集団のRNA-seqにおけるTreg署名遺伝子の発現は、異なる遺伝子を発現する単一細胞のパーセントと相関した(図3C)。単一細胞データの「ドロップアウト」効果を減少させる為に（すなわち、転写物が逆転写工程の間に「見逃される」ために、転写物が或る細胞内で検出されるが別の細胞内では検出されない事象）(Kharchenko等．，2014年)、閾値(メジアン値  t=8.4%)が、各転写物についての発現分布に基づいて定義され、且つこの閾値よりも低い遺伝子が捨てられた。この閾値を超えて検出された腫瘍浸潤Treg細胞の署名転写物の45個は、ほとんどの場合、両方の腫瘍からのTreg細胞において(39超45,87%；Wilcoxon  Mann  Whitney  test  p<0.05)又は1つの腫瘍型において(43超45,96%；図3D)、有意に過剰発現された。精製された組織湿潤性Treg細胞の均一性は、他のリンパ球サブセットからの細胞のキャリーオーバーによって影響されることができる。このありうる混入を定量する為に、Treg細胞の単一細胞RT-qPCR分析が、他のリンパ球サブセット(すなわち、Th1、Th2、Th17、Tfh、CD8のT細胞、B細胞)を含めて行われた(図7)。我々のデータは、精製された単一細胞の非常に低い割合のみがTreg細胞と異なるリンパ球サブセットのマーカーを示したことを示した(図7)。
【０２００】
CRC及びNSCLCの湿潤性Treg細胞における署名遺伝子間の重複(図2)は、この署名がまたTreg細胞湿潤性の他の腫瘍においても富化されているかどうかを評価することを我々に促した。このようにして、RNAは、乳癌、胃癌、NSCLCの脳転移癌、及びCRCの肝臓転移癌を湿潤するTreg細胞から抽出された。腫瘍浸潤Treg署名遺伝子がまたこれらの腫瘍においても大部分上方制御されたことがRT-qPCRによって見つけられた(図3E)。
【０２０１】
全体的に、これらのデータは、腫瘍浸潤Treg細胞署名遺伝子が単一細胞レベルでFOXP3及びIL2RAと共発現されること、及び幾つかの原発性及び転移性のヒト腫瘍は腫瘍浸潤Treg細胞署名を示した。
【０２０２】
腫瘍浸潤Treg細胞の遺伝子署名は、タンパク質署名に翻訳される。
次に、本発明者等は、CRC及びNSCLCの湿潤性Treg細胞、隣接の正常組織、並びに患者PBM中に存在する10個の代表的な署名遺伝子のタンパク質発現をフローサイトメトリーによって単一細胞レベルで評価された。10個のタンパク質のうち、2個はTreg細胞生物学との関連性が実証されているタンパク質(OX40及びTIGIT)(Joller等．，2014年；Voo等．，2013年)、7個はその発現が腫瘍浸潤Treg細胞において記載されたことがないタンパク質(BATF、CCR8、CD30、IL-1R2、IL-21R、PDL-1及びPDL-2)、1つのタンパク質、4-1  BB、は幾つかの造血細胞上で発現される補助刺激分子受容体であり、そのTreg細胞上での発現は、抗原活性化細胞をマーク付けすることが示されている(Schoenbrunn等．，2012年)。我々の知見は、全てのこれらのタンパク質が、正常組織に存在するTreg細胞と比較して、腫瘍浸潤Treg細胞において異なる程度で上方制御された(図4A及び図4B)ことを示した。
【０２０３】
全体として、我々のデータは、腫瘍浸潤Treg細胞の分子署名があることを示し、それはmRNAレベルで及びタンパク質レベルの両方で検出されることができる。
【０２０４】
腫瘍Treg署名遺伝子の発現は、患者の生存率と負の相関がある。
我々の知見を臨床成果と相関させる試みにおいて、本発明者等は、腫瘍-Treg署名転写物の発現がCRC患者及びNSCLC患者における疾病予後と相関するかどうかを尋ねた。それ故に、本発明者等は、177人のCRC患者のコーホート(GSE17536(Smith等．，2010年)の及び263人のNSCLC患者のコーホート(GSE41271-(Sato等．，2013年)の切除された腫瘍組織から得られたTreg署名遺伝子トランスクリプトーム・データセットの発現を調査し、そして、5年生存データと高い及び低い遺伝子発現レベルと相関された。発現が腫瘍浸潤Treg細胞において高度に豊富化されているそれらの遺伝子の中で、LAYN、MAGEH1及びCCR8は、それらがより選択的に発現される3つの遺伝子である場合に選択された(図9A〜図9C)。切断された腫瘍組織内のT細胞密度における差を正規化する為に、本発明者等は、選択された署名遺伝子とCD3Gとの発現の間の比率のを使用した。注目すべきことに、3つの署名遺伝子の高発現が、全ての場合において有意に減少した生存率と相関することが見出された(図5A)。興味深いことに、3つの署名遺伝子の発現がCRC患者の腫瘍病期分類とともに増加することがまた観察された(図5B)。
【０２０５】
結論として、腫瘍浸潤Treg細胞において特異的且つ高度に発現される3つの遺伝子(LAYN、MAGEH1及びCCR8)の全腫瘍サンプルにおける高発現が、NSCLC患者及びCRC患者の両方における予後不良と相関する。
【０２０６】
腫瘍浸潤Tregの表面上に特異的に過剰発現された潜在的標的の選択。
328個の遺伝子によってコードされ、公共データベースEnsEMBL(http://www.ensembl.org)で検索可能な全ての注釈付きタンパク質アイソフォームが、4つの予測アルゴリズムを用いて同時に分析され、そして表面暴露されるべきであると予測される少なくとも１つのアイソフォームをコードする遺伝子が潜在的標的として考慮された。328個の遺伝子のうち、193個が、4つの予測子のうちの少なくとも１つに基づいて少なくとも１つの潜在的細胞表面タンパク質アイソフォームをコードする。膜に関連付けられていると予測されるタンパク質アイソフォームのリストが、表VIにおいて報告されている。
【０２０７】
【表７】
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【０２０８】
表VIの遺伝子は、公共データベースEnsEMBL(http://www.ensembl.org)で検索可能な、それらのEnsembl  Gene受託番号(ENSG：Ensembl  Gene  accession  number)によって特徴付けられている。各関連したタンパク質アイソフォームは、Ensembl転写物受託番号 (ENST：Ensembl  transcript  accession  number)及びEnsemblタンパク質受託番号(ENSP：Ensembl  protein  accession  number)によって特徴付けられている。
【０２０９】
腫瘍Treg細胞によって発現される転写物アイソフォームの識別
腫瘍-Tregの潜在的標的において検証されるべき重要な局面は、細胞局在化アルゴリズムによって暴露された表面／関連付けられた膜であると予測されるタンパク質アイソフォームが実際に腫瘍Treg細胞において発現されることである。従って、全RNAがNSCLCサンプル又はCRCサンプルから単離された腫瘍Treg細胞から抽出され、そして各遺伝子について注釈付けされた種々のアイソフォームを識別することができる特異的プライマー対を用いてRT-PCRに付された。腫瘍Treg細胞において暴露され且つ検出された表面であると予測されるタンパク質アイソフォームの例示的な結果が表VIIにおいて報告される。その上、SIRPGについて実行されたRT-PCR分析の例が、図10において報告されている。
【０２１０】
【表８】
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【０２１１】
議論
腫瘍浸潤Treg細胞の多様性は、それらの機能的関連性及び種々のタイプの癌における予後的意義を理解する為に、及び腫瘍浸潤Treg細胞の選択的枯渇を通じてTreg細胞調節の治療有効性をおそらく改善する為に十分に解明されるべきである。CRC及びNSCLCの湿潤性T細胞上で行われるトランスクリプトーム解析は、腫瘍浸潤Treg細胞が循環Treg及び正常組織湿潤Tregの両方とは異なることを示し、腫瘍微環境がTreg細胞における特異的遺伝子発現に影響を及ぼすことを示唆する。我々の知見はさらに、種々の組織からのTreg細胞が環境因子によって種々の遺伝子発現プロファイルを示すように指示されるという見解を支持する(Panduro等．，2016年)。事実、署名遺伝子のリストは、種々の腫瘍型から単離された腫瘍浸潤Treg細胞において一貫して上方制御される多数の分子を含み、及びこれらの署名遺伝子は、本発明者等が腫瘍浸潤Treg細胞を特異的にプロファイリングしなければ識別されていなかっただろう。腫瘍湿潤Treg署名遺伝子は、CRC湿潤性細胞とNSCLC湿潤性細胞との間で大部分共有されているだけでなく、乳癌及び胃癌において並びにCRC転移性腫瘍及びNSCLC転移性腫瘍(肝臓及び脳それぞれ)において保存されていることがわかり、これらの遺伝子の発現は、腫瘍微環境内のTreg細胞特異的機能と相関しうる腫瘍浸潤Treg細胞の共通特徴であることを示唆する。リンパ球に対する免疫チェックポイントの機能に関する我々の知識はまだ不完全であるが、チェックポイントを標的とするアゴニスト又はアンタゴニストのモノクロナール抗体は臨床開発中である。興味深いことに、これらのチェックポイント(例えば、GITR、OX40、TIGIT、LAG-3及びTIM-3)の幾つか及びそれらのリガンド(例えば、OX40LG、ガレクチン-9、CD70)の幾つかはまた腫瘍浸潤Treg細胞においても上方制御されていることが見つけられ、そしてこの事実はチェックポイント阻害剤での臨床結果の解釈において考慮されるべきである。実際には、腫瘍浸潤リンパ球の様々なサブセットにおけるチェックポイントの発現及びそれらのリガンドの評価は、相反する結果を明らかにし、且つ併用療法の理論的根拠を提供するのに役立つであろうと思われる。それ故に、チェックポイントの発現パターンは、腫瘍浸潤リンパ球及び腫瘍細胞の両方において評価されるべきである。選択された腫瘍Treg署名遺伝子での分析は、全トランスクリプトームデータを確認し、且つこれらの遺伝子の発現頻度に関する情報を提供した。腫瘍浸潤Treg細胞は、増大したサプレッサ活性、例えば十分に特徴付けられたOX40、CTLA4及びGITR、に関連付けられている高頻度遺伝子を発現する。その上、その特異的発現がタンパク質レベルでまた検証された、興味深く期待されていない多くの遺伝子がある。例えば、IL-1R2上方制御は、腫瘍内在性Treg細胞がエフェクター細胞上のIL-1β機能の中和を通じて抗腫瘍免疫応答を弱めるために別のメカニズムであることができる。PD-L1及びPD-L2発現は、活性化されたT細胞又はAPCで最近報告されている(Boussiotis等．，2014年；Lesterhuis等．，2011年；Messal等．，2011年)が、我々の知る限りでは、PD-L2もPD-L1のいずれの発現もTreg細胞において報告されておらず、及びそれらが腫瘍浸潤Treg細胞において過剰発現されているという我々の知見は、腫瘍微環境内のPD1/PD-Ls免疫調節性軸に追加のレベルの複雑さを加える��BATFは、Th17展開及びCD8+T細胞分化に主に関連している転写因子である(Murphy等．，2013年)。我々の知見は、BATF転写物が腫瘍浸潤Th17細胞よりも腫瘍浸潤Treg細胞において上方制御されることを示す(図8)。興味深いことに、CD8+T細胞におけるBATFの発現はIL-21によって誘発され(Xin等．，2015年)、そしてIL21Rが腫瘍浸潤Treg細胞において高度に発現されることが見出された(図4)。
【０２１２】
腫瘍浸潤Treg細胞は、TcR介在性活性化のマーカーである4-1BB(CD137)を大量に発現することが示され(Schoenbrunn等．，2012年)、そしてそれらがエフェクターT細胞増殖に対して非常に高い抑制機能を示すことを示している。署名遺伝子の発現が高められた抑制能力と相関し、そしてその為に腫瘍部位での強力な免疫抑制環境の確立に寄与した可能性がある。我々の知見に対する推論は、腫瘍環境中のTreg細胞の増加した数が最悪の臨床結果と関連するはずであろう。事実、LAYN、MAGEH1及びCCR8(それは腫瘍浸潤Treg細胞における最も富化された遺伝子の3つを表す)が全腫瘍サンプルにおいて高度に検出される場合、CRC患者及びNSCLC患者の両方の5年生存率の有意な悪化がある。c型レクチンと相同性を有する膜貫通タンパク質であるLAYNのTreg細胞(Borowsky  and  Hynes，1998年)及びメラノーマ抗原遺伝子ファミリーのメンバーであるMAGEH1のTreg細胞(Weon  and  Potts，2015年)における機能的役割は不明であるけれども、ケモカイン受容体CCR8の高発現は、代わりに興味をそそる。事実、CCR8のリガンドである(Islam等．，2013年)CCL18は、NSCLCを含む種々の腫瘍において高度に発現されている(Chen等．，2011年；Schutyser等．，2005年)。腫瘍浸潤Treg細胞に対するCCR8発現の高い特異性は、CCR8を発現しない他のエフェクターT細胞の動員を妨げること無しに、Treg細胞が腫瘍部位に移動するのを阻害することが新たな興味深い治療標的であることができることを示唆する。腫瘍部位での免疫調節性分子ネットワークを理解する為に、免疫療法に対する臨床反応を予測する為に、及び新規な治療標的を定義する為に、かなりの努力がリンパ球遺伝子発現データを利用する洗練されたバイオインフォマティクスアプローチの開発において最近置かれた(Bindea等．，2013年a；Bindea等．，2013年b；Gentles等．，2015年)。本明細書において提示されたデータは、腫瘍浸潤のヒトCD4+Treg、Th1及びTh17細胞に対して行われた最初の包括的なRNA配列決定分析を表す。我々の知見は、腫瘍部位でのリンパ球の遺伝子発現パターンの評価の関連性を強調し、種々の癌タイプから精製された腫瘍浸潤リンパ球サブセットのより多くのトランスクリプトームのデータの生成は、腫瘍微環境における免疫調節の基礎となるダイナミクスのより良い理解に寄与しうる。その上、我々のデータは、腫瘍浸潤Treg細胞生物学に関する我々の知識を増加させるだろう新規な仮説を生成し及び検証する為のリソースを表す。
【０２１３】
参考文献
Arpaia, N., Green, J.A., Moltedo, B., Arvey, A., Hemmers, S., Yuan, S., Treuting, P.M., and Rudensky, A.Y. (2015年). A Distinct Function of Regulatory T Cells in Tissue Protection. Cell 162, 1078-1089. 
Bindea, G., Galon, J., and Mlecnik, B. (2013a). CluePedia Cytoscape plugin: pathway insights using integrated experimental and in silico data. Bioinformatics 29, 661 -663. 
Bindea, G., Mlecnik, B., Tosolini, M., Kirilovsky, A., Waldner, M., Obenauf, A.C., Angell, H., Fredriksen, T., Lafontaine, L., Berger, A., et al. (2013b). Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer. Immunity 39, 782-795. 
Bolger, A.M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014年). Trimmomatic: a flexible trimmer for lllumina sequence data. Bioinformatics 30, 21 14-2120. 
Borowsky, M.L., and Hynes, R.O. (1998年). Layilin, a novel talin-binding transmembrane protein homologous with C-type lectins, is localized in membrane ruffles. J Cell Biol 143, 429-442. 
Boussiotis, V.A., Chatterjee, P., and Li, L. (2014年). Biochemical signaling of PD-1 on T cells and its functional implications. Cancer J 20, 265-271 . 
Burzyn, D., Kuswanto, W., Kolodin, D., Shadrach, J.L., Cerletti, M., Jang, Y., Sefik, E., Tan, T.G., Wagers, A.J., Benoist, C, et al. (2013年). A special population of regulatory T cells potentiates muscle repair. Cell 155, 1282-1295. 
Campbell, D.J., and Koch, M.A. (2011年). Phenotypical and functional specialization of FOXP3+ regulatory T cells. Nat Rev Immunol 11, 1 19-130. 
Carthon, B.C., Wolchok, J.D., Yuan, J., Kamat, A., Ng Tang, D.S., Sun, J., Ku, G., Troncoso, P., Logothetis, C.J., Allison, J. P., etal. (2010年). Preoperative CTLA-4 blockade: tolerability and immune monitoring in the setting of a presurgical clinical trial. Clin Cancer Res 16, 2861 -2871 . 
Chen, J., Yao, Y., Gong, C, Yu, F., Su, S., Chen, J., Liu, B., Deng, H., Wang, F., Lin, L., et al. (2011年). CCL18 from tumor-associated macrophages promotes breast cancer metastasis via PITPNM3. Cancer Cell 19, 541 -555. 
Cipolletta, D., Feuerer, M., Li, A., Kamei, N., Lee, J., Shoelson, S.E., Benoist, C, and Mathis, D. (2012年). PPAR-gamma is a major driver of the accumulation and phenotype of adipose tissue Treg cells. Nature 486, 549-553. 
Duhen, T., Duhen, R., Lanzavecchia, A., Sallusto, F., and Campbell, D.J. (2012年). Functionally distinct subsets of human FOXP3+ Treg cells that phenotypically mirror effector Th cells. Blood 119, 4430-4440. 
Fridman, W.H., Pages, F., Sautes-Fridman, C, and Galon, J. (2012年). The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer 12, 298-306. Galluzzi, L., Buque, A., Kepp, O., Zitvogel, L., and Kroemer, G. (2015年). Immunological Effects of Conventional Chemotherapy and Targeted Anticancer Agents. Cancer Cell 28, 690-714. 
Geginat, J., Paroni, M., Maglie, S., Alfen, J.S., Kastirr, I., Gruarin, P., De Simone, M., Pagani, M., and Abrignani, S. (2014年). Plasticity of human CD4 T cell subsets. Front Immunol 5, 630. 
Gentles, A.J., Newman, A.M., Liu, C.L., Bratman, S.V., Feng, W., Kim, D., Nair, V.S., Xu, Y., Khuong, A., Hoang, CD., et al. (2015年). The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nat Med 21, 938-945. 
Gonzalez-Pons, M., and Cruz-Correa, M. (2015年). Colorectal Cancer Biomarkers: Where Are We Now? Biomed Res Int 2015, 149014. 
Hodi, F.S., O'Day, S.J., McDermott, D.F., Weber, R.W., Sosman, J.A., Haanen, J.B., Gonzalez, R., Robert, C, Schadendorf, D., Hassel, J.C., et al. (2010年). Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 363, 71 1 -723. 
Huang da, W., Sherman, B.T., and Lempicki, R.A. (2009年). Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc 4, 44-57.
Islam, S.A., Ling, M.F., Leung, J., Shreffler, W.G., and Luster, A.D. (2013年). Identification of human CCR8 as a CCL18 receptor. J Exp Med 210, 1889-1898. 
Jacobs, J., Smits, E., Lardon, F., Pauwels, P., and Deschoolmeester, V. (2015年). Immune Checkpoint Modulation in Colorectal Cancer: What's New and What to Expect. J Immunol Res 2015, 158038. 
Jamal-Hanjani, M., Thanopoulou, E., Peggs, K.S., Quezada, S.A., and Swanton, C. (2013年). Tumour heterogeneity and immune-modulation. Curr Opin Pharmacol 13, 497-503. 
Joller, N., Lozano, E., Burkett, P.R., Patel, B., Xiao, S., Zhu, C, Xia, J., Tan, T.G., Sefik, E., Yajnik, V., et al. (2014年). Treg cells expressing the coinhibitory molecule TIGIT selectively inhibit proinflammatory Th1 and Th17 cell responses. Immunity 40, 569-581 . Josefowicz, S.Z., Lu, L.F., and Rudensky, A.Y. (2012年). Regulatory T cells: mechanisms of differentiation and function. Annu Rev Immunol 30, 531 -564. 
Kharchenko, P.V., Silberstein, L., and Scadden, D.T. (2014年). Bayesian approach to single-cell differential expression analysis. Nat Methods 11, 740-742. 
Kroemer, G., Galluzzi, L., Zitvogel, L., and Fridman, W.H. (2015年). Colorectal cancer: the first neoplasia found to be under immunosurveillance and the last one to respond to immunotherapy? Oncoimmunology 4, e1058597. 
Le, D.T., Uram, J.N., Wang, H., Bartlett, B.R., Kemberling, H., Eyring, A.D., Skora, A.D., Luber, B.S., Azad, N.S., Laheru, D., et al. (2015年). PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency. N Engl J Med 372, 2509-2520. 
Lesterhuis, W.J., Steer, H., and Lake, R.A. (2011年). PD-L2 is predominantly expressed by Th2 cells. Mol Immunol 49, 1 -3. 
Loffler-Wirth, H., Kalcher, M., and Binder, H. (2015年). oposSOM: R-package for high-dimensional portraying of genome-wide expression landscapes on bioconductor. Bioinformatics 31, 3225-3227. 
Marabelle, A., Kohrt, H., Sagiv-Barfi, I., Ajami, B., Axtell, R.C., Zhou, G., Rajapaksa, R., Green, M.R., Torchia, J., Brody, J., et al. (2013年). Depleting tumor-specific Tregs at a single site eradicates disseminated tumors. J Clin Invest 123, 2447-2463. 
Messal, N., Serriari, N.E., Pastor, S., Nunes, J.A., and Olive, D. (2011年). PD-L2 is expressed on activated human T cells and regulates their function. Mol Immunol 48, 2214-2219. 
Munn, D.H., and Bronte, V. (2015年). Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol 39, 1-6. 
Murphy, T.L., Tussiwand, R., and Murphy, K.M. (2013年). Specificity through cooperation: BATF-IRF interactions control immune-regulatory networks. Nat Rev Immunol 13, 499-509. 
Nishikawa, H., and Sakaguchi, S. (2010年). Regulatory T cells in tumor immunity. Int J Cancer 127, 759-767. 
Panduro, M., Benoist, C, and Mathis, D. (2016年). Tissue Tregs. Annu Rev Immunol 34, 609-633. 
Pardoll, D.M. (2012年). The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 12, 252-264. 
Peggs, K.S., Quezada, S.A., Chambers, C.A., Korman, A.J., and Allison, J. P. (2009年). Blockade of CTLA-4 on both effector and regulatory T cell compartments contributes to the antitumor activity of anti-CTLA-4 antibodies. J Exp Med 206, 1717-1725. 
Ranzani, V., Rossetti, G., Panzeri, I., Arrigoni, A., Bonnal, R.J., Curti, S., Gruarin, P., Provasi, E., Sugliano, E., Marconi, M., et al. (2015年). The long intergenic noncoding RNA landscape of human lymphocytes highlights the regulation of T cell differentiation by linc- MAF-4. Nature immunology 16, 318-325. 
Ripley, B. D. (1996年) Pattern Recognition and Neural Networks. Cambridge: Cambridge University Press, [i, 2, 8, 36, 42, 59, 69, 73, 79, 91 , 92] 
Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., and Ono, M. (2008年). Regulatory T cells and immune tolerance. Cell 133, 775-787. 
Sato, M., Larsen, J.E., Lee, W., Sun, H., Shames, D.S., Dalvi, M.P., Ramirez, R.D., Tang, H., DiMaio, J.M., Gao, B., et al. (2013年). Human lung epithelial cells progressed to malignancy through specific oncogenic manipulations. Mol Cancer Res 11, 638-650.
Schoenbrunn, A., Frentsch, M., Kohler, S., Keye, J., Dooms, H., Moewes, B., Dong, J., Loddenkemper, C, Sieper, J., Wu, P., et al. (2012年). A converse 4-1 BB and CD40 ligand expression pattern delineates activated regulatory T cells (Treg) and conventional T cells enabling direct isolation of alloantigen-reactive natural Foxp3+ Treg. J Immunol 189, 5985-5994. 
Schutyser, E., Richmond, A., and Van Damme, J. (2005年). Involvement of CC chemokine ligand 18 (CCL18) in normal and pathological processes. J Leukoc Biol 78, 14-26. 
Selby, M.J., Engelhardt, J.J., Quigley, M., Henning, K.A., Chen, T., Srinivasan, M., and Korman, A.J. (2013年). Anti-CTLA-4 antibodies of lgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer Immunol Res 1, 32-42.
Sharma, P., and Allison, J. P. (2015年). Immune checkpoint targeting in cancer therapy: toward combination strategies with curative potential. Cell 161, 205-214. 
Simpson, T.R., Li, F., Montalvo-Ortiz, W., Sepulveda, M.A., Bergerhoff, K., Arce, F., Roddie, C, Henry, J.Y., Yagita, H., Wolchok, J.D., et al. (2013年). Fc-dependent depletion of tumor-infiltrating regulatory T cells co-defines the efficacy of anti-CTLA-4 therapy against melanoma. J Exp Med 210, 1695-1710. 
Sledzinska, A., Menger, L., Bergerhoff, K., Peggs, K.S., and Quezada, S.A. (2015年). Negative immune checkpoints on T lymphocytes and their relevance to cancer immunotherapy. Mol Oncol. 
Smith, J.J., Deane, N.G., Wu, F., Merchant, N.B., Zhang, B., Jiang, A., Lu, P., Johnson, J.C., Schmidt, C, Bailey, C.E., et al. (2010年). Experimentally derived metastasis gene expression profile predicts recurrence and death in patients with colon cancer. Gastroenterology 138, 958-968. 
Sobin, L.H., Gospodarowicz, M.K., Wittekind, C, International Union against Cancer., and ebrary Inc. (2009年). TNM classification of malignant tumours (Chichester, West Sussex, UK ; Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell,), pp. 100-105, 138-146, 7th edition 
Teng, M.W., Ngiow, S.F., von Scheldt, B., McLaughlin, N., Sparwasser, T., and Smyth, M.J. (2010年). Conditional regulatory T-cell depletion releases adaptive immunity preventing carcinogenesis and suppressing established tumor growth. Cancer Res 70, 7800-7809. 
Therneau T. 2013. A package for survival analysis in S. R package version 2.37-4. 
Topalian, S.L., Drake, C.G., and Pardoll, D.M. (2015年). Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell 27, 450-461 . 
Torre, L.A., Bray, F., Siegel, R.L., Ferlay, J., Lortet-Tieulent, J., and Jemal, A. (2015年). Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin 65, 87-108. 
Twyman-Saint Victor, C, Rech, A.J., Maity, A., Rengan, R., Pauken, K.E., Stelekati, E., Benci, J.L., Xu, B., Dada, H., Odorizzi, P.M., et al. (2015年). Radiation and dual checkpoint blockade activate non-redundant immune mechanisms in cancer. Nature 520, 373-377. 
van den Eertwegh, A.J., Versluis, J., van den Berg, HP., Santegoets, S.J., van Moorselaar, R.J., van der Sluis, T.M., Gall, H.E., Harding, T.C., Jooss, K., Lowy, I., et al. (2012年). Combined immunotherapy with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced allogeneic prostate cancer cells and ipilimumab in patients with metastatic castration-resistant prostate cancer: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet Oncol 13, 509-517. 
Voo, K.S., Bover, L., Harline, M.L., Vien, L.T., Facchinetti, V., Arima, K., Kwak, L.W., and Liu, Y.J. (2013年). Antibodies targeting human OX40 expand effector T cells and block inducible and natural regulatory T cell function. J Immunol 191, 3641 -3650. 
Walter, S., Weinschenk, T., Stenzl, A., Zdrojowy, R., Pluzanska, A., Szczylik, C, Staehler, M., Brugger, W., Dietrich, P.Y., Mendrzyk, R., et al. (2012年). Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival. Nat Med 18, 1254-1261 . 
Weon, J.L., and Potts, P.R. (2015年). The MAGE protein family and cancer. Curr Opin Cell Biol 37, 1 -8. 
Wirth, H., von Bergen, M., and Binder, H. (2012年). Mining SOM expression portraits: feature selection and integrating concepts of molecular function. BioData Min 5, 18.
Xin, G., Schauder, D.M., Lainez, B., Weinstein, J.S., Dai, Z., Chen, Y., Esplugues, E., Wen, R., Wang, D., Parish, I.A., et al. (2015年). A Critical Role of IL-21 -Induced BATF in Sustaining CD8-T-Cell-Mediated Chronic Viral Control. Cell Rep 73, 1 1 18-1 124. 
Yang, J.C., Hughes, M., Kammula, U., Royal, R., Sherry, R.M., Topalian, S.L., Suri, K.B., Levy, C, Allen, T., Mavroukakis, S., et al. (2007年). Ipilimumab (anti-CTLA4 antibody) causes regression of metastatic renal cell cancer associated with enteritis and hypophysitis. J Immunother 30, 825-830. 
Zitvogel, L., Galluzzi, L., Smyth, M.J., and Kroemer, G. (2013年). Mechanism of action of conventional and targeted anticancer therapies: reinstating immunosurveillance. Immunity 39, 74-88. 
Sebastian Briesemeister, Jorg Rahnenfuhrer, and Oliver Kohlbacher, (2010年). Going from where to why - interpretable prediction of protein subcellular localization, Bioinformatics, 26(9):1232-1238. 
Lukas Kail, Anders Krogh and Erik L. L. Sonnhammer.Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction-the Phobius web server. Nucleic Acids Res., 35:W429-32, July 2007
【図１Ａ】
2019518452.tif 000066
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2019518452.tif 000079
【図６Ｅ】
2019518452.tif 000080
【図７】
2019518452.tif 000081
【図８】
2019518452.tif 000082
【図９Ａ】
2019518452.tif 000083
【図９Ｂ】
2019518452.tif 000084
【図９Ｃ】
2019518452.tif 000085
【図１０Ａ】
2019518452.tif 000086
【図１０Ｂ】
2019518452.tif 000087
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019518452.tif 000089
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