(57)【要約】  本明細書では、新血管新生に関連する障害（例えば、腫瘍関連性新血管新生、例えば眼メラノーマ）および同一物に関連する症状を治療するためのイムノコンジュゲート融合タンパク質が提供される。本方法は、上記患者に１回以上の投与セッションにおいて有効量の本明細書に記載した上記イムノコンジュゲートタンパク質のいずれか１つ以上を含む組成物を投与することを含み、ここで各イムノコンジュゲートは、免疫グロブリンＩｇ  Ｆｃ二量体にコンジュゲート化された少なくとも１つの変異第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質を含む。
2019515904.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの二量体化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ単量体および変異第ＶＩＩ因子タンパク質を含むイムノコンジュゲートであって、前記変異第ＶＩＩ因子タンパク質は、前記Ｆｃ単量体の一方にのみ融合しており、前記変異第ＶＩＩ因子タンパク質は、野生型第ＶＩＩ因子タンパク質と比較して、哺乳動物宿主において減少した凝固反応を示すイムノコンジュゲート。
【請求項２】
前記変異第ＶＩＩ因子タンパク質は、哺乳動物宿主において凝固反応を示さない、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３】
前記Ｉｇ  Ｆｃ単量体と前記第ＶＩＩ因子タンパク質との間にリンカー配列をさらに含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項４】
前記Ｉｇ  Ｆｃ単量体のそれぞれは、ヒンジ配列を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項５】
前記Ｉｇ  Ｆｃ単量体の１つ以上は、リンカー配列およびヒンジ配列を含む、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項６】
前記リンカーおよび／またはヒンジ配列は、１つ以上のシステインアミノ酸残基を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項７】
前記２つの二量体化Ｉｇ  Ｆｃ単量体は、１つ以上のジスルフィド結合によって一緒に連結されている、請求項６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８】
前記二量体化Ｉｇ  Ｆｃは、ホモ二量体である、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項９】
前記二量体化Ｉｇ  Ｆｃは、ヘテロ二量体である、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ヘテロ二量体は、Ｔ３６６Ｙ突然変異を備えるＦｃ単量体およびＹ４０７Ｔ突然変異を備えるＦｃ単量体を含む、またはＴ３６６Ｙ突然変異に対応する突然変異を備えるＦｃ単量体およびＹ４０７Ｔ突然変異に対応する突然変異を備えるＦｃ単量体を含む、請求項９に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１１】
前記Ｉｇ  Ｆｃ単量体の１つ以上は、配列番号２７の前記アミノ酸配列からなる、請求項７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１２】
リンカーの前記存在は、リンカーが欠如する前記イムノコンジュゲートと比較して、前記イムノコンジュゲートの生成収率の増加を生じさせる、請求項３および５〜１１のいずれか一項に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１３】
前記Ｉｇ  Ｆｃ単量体は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１４】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される、請求項１３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１５】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ１の単量体である、請求項１４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１６】
前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体は、配列番号１３、１５、１７、２６、２７、２９および３１から選択される前記アミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１７】
前記変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、Ｌｙｓ３４１またはＳｅｒ３４４で単一点突然変異を含む、請求項１〜１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１８】
前記単一点突然変異は、Ｌｙｓ３４１からＡｌａ３４１である、請求項１７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項１９】
前記単一点突然変異は、Ｓｅｒ３４４からＡｌａ３４４である、請求項１７に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２０】
前記変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、Ｌｙｓ３４１およびＳｅｒ３４４で点突然変異を含む、請求項１〜１６に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２１】
前記変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、Ｓｅｒ３４４からＡｌａ３４４の点突然変異をさらに含む、請求項２０に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２２】
前記変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、配列番号１２の前記アミノ酸配列を含む、請求項２１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２３】
前記イムノコンジュゲートは、フコシル化、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化または無フコシル化されている、請求項１〜２２に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２４】
前記ヒンジ配列は、配列番号１９〜２５の任意の１つとの少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、請求項６〜２３に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２５】
前記ヒンジ配列は、配列番号１９〜２５のいずれか１つにおける少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を備えるアミノ酸配列を含む、請求項６〜２４に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２６】
前記リンカーは、少なくとも８個のアミノ酸残基を含む、請求項６〜２５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２７】
前記リンカーは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）アミノ酸配列からなる、請求項６〜２５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２８】
前記リンカーは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）アミノ酸配列の１つ以上のタンデムリピートを含む、請求項６〜２５に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項２９】
前記イムノコンジュゲートにはリンカー配列が欠如する、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の前記イムノコンジュゲートを含む組成物。
【請求項３１】
それを必要とする患者における癌関連新血管新生を減少させるための方法であって、前記患者に請求項１〜２９に記載の前記イムノコンジュゲートまたは請求項３０に記載の前記組成物のいずれか１つを投与することを含む方法。
【請求項３２】
それを必要とする患者における癌関連新血管新生の進行を緩徐化するための方法であって、前記患者に請求項３０に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
それを必要とする患者における新規な癌関連新血管新生を予防するための方法であって、前記患者に請求項３０に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
【請求項３４】
それを必要とする患者における癌関連新血管新生を逆転させるための方法であって、前記患者に請求項３０に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
【請求項３５】
それを必要とする患者の眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するための方法であって、前記患者に請求項３０に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記ウエット型ＡＭＤを治療することは、治療を必要とする前記患者の眼における脈絡膜血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
それを必要とする患者の眼における眼の血管新生を予防する、阻害する、または逆転させるための方法であって、前記患者に請求項３０に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
【請求項３８】
それを必要とする患者における腫瘍新血管新生を逆転させるための方法であって、前記患者に請求項３０に記載の前記組成物を投与することを含む方法。
【請求項３９】
前記新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、新生児網膜症（ＲＯＰ）または血管新生緑内障と関連する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または血管新生緑内障に続発性である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記新血管新生は、脈絡膜血管新生である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者は、前記眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）であると以前に診断されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記脈絡膜血管新生は、ウエット型ＡＭＤに続発性である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者の前記眼は、脈絡膜血管新生またはウエット型ＡＭＤに対して以前に治療されていない、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記患者は、脈絡膜血管形成に対して、抗血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）療法、レーザー療法または手術を用いて以前に治療されている、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４６】
投与することは、硝子体内注射を含む、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
投与することは、脈絡上板注射を含む、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
全身性投与を含む、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
投与することは、複数回の投与セッションを含む、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数回の投与セッションは、２回以上、３回以上、４回以上または５回以上の投与セッションを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
各投与セッションは、約２０日間〜約５０日間、または約２０日間〜約４０日間、または約２０日間〜約３０日間の間隔を空けている、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記複数回の投与セッションは、１２〜２４回の投与セッションを含む、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
投与することは、前記患者の前記眼内への２８日間毎に１回、３０日間毎に１回または３５日間毎に１回の前記組成物の硝子体内注射を含む、請求項４９〜５２に記載のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
投与することは、静脈内注射を含む、請求項３１〜４５および４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
投与することは、腫瘍内注射を含む、請求項３１〜４５および４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記患者は、投与する工程の前の前記患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定と比較して、ＢＣＶＡ測定において文字の消失が１５文字未満であることによって測定されるように、前記投与する工程の後に彼（または彼女）の視力を実質的に維持する、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記患者は、前記投与する工程の前の前記患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定と比較して、ＢＣＶＡ測定において１５文字の増加によって測定されるように、前記投与する工程に引き続いて視力の改善を経験する、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記投与する工程に引き続いて、蛍光眼底血管造影法または光干渉断層撮影法によって測定されるように、前記ＣＮＶ領域は、前記投与する工程の前の前記ＣＮＶ領域と比較して、前記患者の前記眼内で減少する、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＮＶ領域は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％減少する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記投与する工程に引き続いて、前記患者の前記眼の前記網膜厚は、前記患者の前記眼においては、前記治療開始前の前記眼の前記網膜厚と比較して減少する、請求項３５〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記網膜厚は、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１７５μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約２２５μｍまたは少なくとも約２５０μｍ減少する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記網膜厚は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％減少する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚（ＣＳＴ）、減少した中心点厚（ＣＰＴ）または減少した中心窩厚（ＣＦＴ）である、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に前記患者の前記眼における前記眼内圧（ＩＯＰ）を測定することをさらに含む、請求項３５〜５３および５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者の前記眼における前記ＩＯＰを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の後に約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間または約１時間測定することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記患者の前記眼における前記ＩＯＰを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間または約１時間測定することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＩＯＰは、眼圧測定法によって測定される、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者に有効量の新血管新生阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３１〜３３および３５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記新血管新生阻害剤は、前記有効量の前記イムノコンジュゲートと前記同一組成物中に存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記新血管新生阻害剤は、前記有効量の前記イムノコンジュゲートとは異なる組成物中に存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記新血管新生阻害剤は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤またはＰＤＧＦ受容体阻害剤である、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記新血管新生阻害剤は、ラニビズマブである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
ラニビズマブの前記用量は、約０．２ｍｇ〜約１ｍｇである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ラニビズマブの前記用量は、０．３ｍｇまたは０．５ｍｇである、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
ラニビズマブは、硝子体内注射によって前記患者の前記眼に投与される、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記有効量の前記新血管新生阻害剤を含む前記組成物は、硝子体内注射によって前記患者の前記眼に投与される、請求項６８〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記有効量の前記新血管新生阻害剤を含む前記組成物は、前記複数回の投与セッションのそれぞれで投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
１アームドおよび２アームドイムノコンジュゲート両方の混合物を含む組成物であって、前記１アームドおよび２アームドイムノコンジュゲートは、１：１、１：５、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１００：１、５０：１、２５：１、１０：１または５：１の比率で存在する組成物。
【請求項７９】
前記第ＶＩＩ因子タンパク質は、ヒト第ＶＩＩ因子タンパク質である、請求項１に記載のイムノコンジュゲート。
【請求項８０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の前記イムノコンジュゲートおよび医薬上許容される賦形剤を含む製剤。
【請求項８１】
前記製剤は、ラニビズマブをさらに含む、請求項８０に記載の製剤。
【請求項８２】
前記製剤は、アルギニン溶液をさらに含む、請求項８０または８１に記載の製剤。
【請求項８３】
前記製剤は、下記の：ＨＥＰＥＳ溶液、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ポリソルベート−８０およびアルギニン溶液のうちの１つ以上をさらに含む、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８４】
前記癌関連新血管新生には、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、膵臓癌、膀胱癌、肝臓癌、眼メラノーマ、肺癌、子宮内膜癌、胃癌およびリンパ腺癌が関連する、請求項３１に記載の方法。
【請求項８５】
前記新血管新生阻害剤は、同時に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８６】
前記新血管新生阻害剤は、連続的に投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項８７】
前記新血管新生阻害剤は、アフリベルセプトである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させる、請求項３０または７８に記載の組成物。
【請求項８９】
前記組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を２アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも１．５倍以上減少させる、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記前炎症性サイトカインは、ＩＬ−８またはＧＭ−ＣＳＦである、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記投与は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させる、請求項３０〜７７および８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を２アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも１．５倍以上減少させる、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記前炎症性サイトカインは、ＩＬ−８またはＧＭ−ＣＳＦである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
１アームドイムノコンジュゲートを含む組成物であって、２アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物。
【請求項９５】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の前記イムノコンジュゲートを含む組成物であって、２アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１４日に出願され、その内容が参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／３２２，５４０号に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に付随する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。本配列表を含むテキストファイルの名称は、ＩＣＴＨ＿００３＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは、１６８ＫＢであり、２０１７年４月１３日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
新血管新生（本明細書では、血管形成と互換的に呼ばれる）は、一般に既存の血管の成長および新規血管の形成に関し、様々な疾患において観察される。新血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移を可能にし、眼の障害における視覚的機能不全を誘発し、炎症性障害において白血球血管外遊出を促進する、および／またはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の転帰に影響を及ぼす。
【０００４】
新血管新生は、成人健常者においては、主として創傷治癒中および所定の再生事象中に極めてまれにのみ発生する。疾患を促進または誘発する新血管新生は、病理的新血管新生と呼ぶことができ、そのような新生血管構造は、病理的新生血管構造（ＰＮＶ）と呼ぶことができる。ＰＮＶは、数種の疾患に固有であり、眼メラノーマを含む固形癌および黒色腫の増殖を促進する発癌性新血管新生を含む。
【０００５】
固形腫瘍の残存および増殖は、支持新生血管構造の発達に決定的に左右される（Folkman,J.(1995)N.Engl.J.Med.333,1757-1763）。腫瘍関連新血管新生は、それが酸素および栄養分を供給するので、癌の進行を支持することに決定的に重要である。新血管新生は、さらに関節リウマチにおいて重要な役割を果たす（Szekanez,Z.,et al.(1998)J.Invest.Med.46,27-41）。新血管新生は、例えば、眼メラノーマや加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）における、結果として壊滅的な失明を生じさせる大多数の眼の疾患の基礎になっている（Friedlander,M.,et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,9764-9769）。
【０００６】
新血管新生は、脈絡膜、虹彩および毛様体を含む眼球血管膜の黒色腫である眼メラノーマに関与している。小サイズおよび中サイズの眼の腫瘍に対する標準治療法は、典型的には放射線療法である。６０％を超える患者が、プラーク放射線療法（小線源療法）または陽子線照射療法のいずれかである何らかの形態の放射線療法を受けている。しかし、放射線療法は高度に侵襲性であり、例えば網膜症、白内障、緑内障および重大な失明などの合併症を引き起こし得る。大きな腫瘍の場合は、腫瘍または眼の外科的切除が実施される場合がある。上記の治療は、いずれも転移性疾患が発生する割合に影響を及ぼさない。眼における局所再発はまれであるが、全ブドウ膜黒色腫のほぼ半数は、主として肝臓での遠隔転移を発生するであろう。
【０００７】
加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、結果として中心視覚の消失を生じさせる斑点の慢性の進行性退行性病理を意味する。新血管ＡＭＤ（滲出性または「ウエット型」ＡＭＤとも呼ばれる）は、工業化された世界において５０歳を超える高齢患者における重度の視力喪失および失明の主要な原因である。
【０００８】
組織因子（ＴＦ）は、血管内皮細胞上に存在するサイトカイン受容体である。ＴＦは、細胞内末端ドメイン、膜貫通ドメインならびに第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）および第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ活性化第ＶＩＩ因子）に対する細胞外結合ドメインを備える内在性膜糖タンパク質である。ＴＦは、血液凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）の活性化形に対する細胞関連受容体として機能する；この複合体の形成は、血液凝固を開始させ、細胞内シグナル伝達を媒介する。ＴＦは、新血管新生およびサイトカイン放出の炎症カスケードのプロセスに関係しており、どちらのプロセスもＰＮＶに含まれている。癌では、ＴＦは、腫瘍増殖、腫瘍血管形成、病原性新血管新生、転移および血栓症を調節することにおける癌増殖の複数の態様において重要な役割を果たす。腫瘍内微小環境では、非形質転換細胞と比較して、ＴＦは、腫瘍細胞、血管細胞、間質細胞および一部の炎症細胞によって過剰発現する。
【０００９】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、凝固カスケードにおける血液の凝固を誘発するセリンプロテアーゼ酵素である。典型的なホメオスタシス中、血管構造系の内皮は、その循環リガンドであるＦＶＩＩからＴＦを分離する。内皮障壁の破損は、血管外ＴＦのＦＶＩＩへの曝露をもたらすので、したがって凝固カスケードの迅速な活性化を引き起こす。
【００１０】
病理学的新血管新生に関連する障害および疾患、特に癌を治療するための１つのアプローチは、新生血管構造の機能または成長を傷つけることであった。これは、ＴＦを阻害することによって達成され得るが、ＴＦはホメオスタシスにとって決定的に重大な複数の生物学的活性を発揮するので、ＴＦを単純に阻害することは実行可能な薬理学的解決策ではない。マウスにおいてＴＦ遺伝子をノックアウトすることは致死性であり、ＴＦの阻害が大量出血を誘発し得ることは公知である（Chu.Int.J.Inflam.2011.2011:30）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、低侵襲性であり、耐久性のある利点を提供し、発病を緩徐化する、またはさらなる疾患進行（転移など）を防止さえする、新血管新生（例えば、腫瘍関連新血管新生）に関連する障害を治療するためには、新規な治療戦略に対する未だ満たされていない医学的ニーズがある。本発明は、この必要や他のニーズに対応する。
【００１２】
本明細書において参照された特許、特許出願、特許出願公開、学術論文およびプロトコールは、それらの全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
一部の実施形態では、本開示は、２つの二量体化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ単量体および変異第ＶＩＩ因子タンパク質を含むイムノコンジュゲートであって、変異第ＶＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃ単量体の一方にのみ融合しており、変異第ＶＩＩ因子タンパク質は、野生型第ＶＩＩ因子タンパク質と比較して、哺乳動物宿主において減少した凝固反応を示すイムノコンジュゲートに向けられる。また別の実施形態では、変異第ＶＩＩ因子タンパク質は、哺乳動物宿主において凝固反応を示さない。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、Ｉｇ  Ｆｃ単量体と第ＶＩＩ因子タンパク質との間にリンカー配列を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ  Ｆｃ単量体は、ヒンジ配列を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ  Ｆｃ単量体の１つ以上は、リンカー配列およびヒンジ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーおよび／またはヒンジ配列は、１つ以上のシステインアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、２つの二量体化Ｉｇ  Ｆｃ単量体は、１つ以上のジスルフィド結合によって一緒に連結されている。一部の実施形態では、二量体化Ｉｇ  Ｆｃは、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。一部の実施形態では、ヘテロ二量体は、Ｔ３６６Ｙ突然変異を備えるＦｃ単量体およびＹ４０７Ｔ突然変異を備えるＦｃ単量体を含む、またはＴ３６６Ｙ突然変異に対応する突然変異を備えるＦｃ単量体およびＹ４０７Ｔ突然変異に対応する突然変異を備えるＦｃ単量体を含む。一部の実施形態では、Ｉｇ  Ｆｃ単量体の１つ以上は、配列番号２７のアミノ酸配列からなる。
【００１４】
１つの実施形態では、リンカーの存在は、リンカーが欠如するイムノコンジュゲートと比較して、イムノコンジュゲートの生成収率の増加を生じさせる。１つの実施形態では、Ｉｇ  Ｆｃ単量体は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体である。また別の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される。１つの実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体は、ＩｇＧ１のＦｃ単量体である。１つの実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ単量体は、配列番号１３、１５、１７、２６、２７、２９および３１から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、Ｌｙｓ３４１またはＳｅｒ３４４で単一点突然変異を含む。１つの実施形態では、単一点突然変異は、Ｌｙｓ３４１からＡｌａ３４１である。１つの実施形態では、単一点突然変異は、Ｓｅｒ３４４からＡｌａ３４４である。１つの実施形態では、変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、Ｌｙｓ３４１およびＳｅｒ３４４で点突然変異を含む。１つの実施形態では、変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、Ｓｅｒ３４４からＡｌａ３４４への点突然変異をさらに含む。１つの実施形態では、変異ヒトＦＶＩＩタンパク質は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、フコシル化、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化または無フコシル化されている。１つの実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号１９〜２５の任意の１つとの少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号１９〜２５の任意の１つとの少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を備えるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、リンカーは、少なくとも８個のアミノ酸残基を含む。１つの実施形態では、リンカーは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）アミノ酸配列からなる。１つの実施形態では、リンカーは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）アミノ酸配列の１つ以上のタンデムリピートを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはリンカー配列が欠如する。１つの実施形態では、請求項１〜２９のいずれか一項のイムノコンジュゲート。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、さらにそれを必要とする患者における癌関連新血管新生を減少させるための方法であって、該患者に本開示のイムノコンジュゲートまたは組成物のいずれか１つを投与することを含む方法にさらに向けられる。１つの実施形態では、それを必要とする患者における癌関連新血管新生の進行を緩徐化するための方法であって、該患者に本開示の組成物を投与することを含む方法。
【００１７】
一部の実施形態では、組成物の投与は、それを必要とする患者における新規な癌関連新血管新生を予防するための方法であって、該患者に請求項３０に記載の組成物を投与することを含む方法である。１つの実施形態では、組成物の投与は、それを必要とする患者における癌関連新血管新生を逆転させるための方法である。１つの実施形態では、組成物の投与は、それを必要とする患者の眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するための方法であって、該患者に請求項３０に記載の組成物を投与することを含む方法である。一部の実施形態では、ウエット型ＡＭＤを治療することは、治療を必要とする患者の眼における脈絡膜血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む。１つの実施形態では、それを必要とする患者の眼における眼性新血管新生を予防する、阻害する、または逆転させるための、該患者に本組成物を投与することを含む方法。１つの実施形態では、それを必要とする患者における腫瘍新血管新生を逆転させるための、該患者に本組成物を投与することを含む方法。１つの実施形態では、新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、新生児網膜症（ＲＯＰ）または血管新生緑内障と関連する。
【００１８】
１つの実施形態では、新血管新生は、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）または血管新生緑内障に続発性である。１つの実施形態では、新血管新生は、脈絡膜血管新生である。本方法の１つの実施形態では、患者は、眼におけるウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）であると以前に診断されている。１つの実施形態では、脈絡膜血管新生は、ウエット型ＡＭＤに続発性である。１つの実施形態では、患者の眼は、脈絡膜血管新生またはウエット型ＡＭＤに対して以前に治療されていない。本方法の１つの実施形態では、患者は、脈絡膜血管形成に対して、抗血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）療法、レーザー療法または手術を用いて以前に治療されている。
【００１９】
１つの実施形態では、本方法は、硝子体内注射、脈絡膜上注射または全身性投与を含む。一部の実施形態では、投与は、複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、複数回の投与セッションは、２回以上、３回以上、４回以上または５回以上の投与セッションを含む。１つの実施形態では、各投与セッションは、約２０日間〜約５０日間、または約２０日間〜約４０日間、または約２０日間〜約３０日間の間隔を空けている。１つの実施形態では、複数回の投与セッションは、１２〜２４回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本組成物を投与することは、患者の眼内への２８日間毎に１回、３０日間毎に１回または３５日間毎に１回の本組成物の硝子体内注射を含む。１つの実施形態では、投与することは、静脈内投与を含む。１つの実施形態では、本組成物を投与することは、腫瘍内注射を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、本組成物の投与は、投与する工程の前の患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定と比較して、ＢＣＶＡ測定において文字の消失が１５文字未満であることによって測定されるように、患者が投与する工程の後に彼（または彼女）の視力を実質的に維持することを生じさせる。１つの実施形態では、患者は、投与する工程の前の患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定と比較して、ＢＣＶＡ測定において１５文字の増加によって測定されるように、投与する工程に引き続いて患者は視力の改善を経験する。１つの実施形態では、投与する工程に引き続いて、蛍光眼底血管造影法または光干渉断層撮影法によって測定されるように、ＣＮＶ領域は、投与する工程の前のＣＮＶ領域と比較して、患者の眼内では減少する。１つの実施形態では、ＣＮＶ領域は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％減少する。１つの実施形態では、投与する工程に引き続いて、患者の眼において患者の眼の網膜厚は、治療開始前の眼の網膜厚と比較して減少する。
【００２１】
１つの実施形態では、本組成物の投与は、網膜厚の少なくとも約５０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１７５μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約２２５μｍまたは少なくとも約２５０μｍの減少を生じさせる。１つの実施形態では、網膜厚は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％減少する。１つの実施形態では、減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚（ＣＳＴ）、減少した中心点厚（ＣＰＴ）または減少した中心窩厚（ＣＦＴ）である。１つの実施形態では、本方法は、各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に患者の眼における眼内圧（ＩＯＰ）を測定することをさらに含んでいる。１つの実施形態では、本方法は、患者の眼におけるＩＯＰを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の後に約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間または約１時間測定することをさらに含んでいる。１つの実施形態では、本方法は、患者の眼におけるＩＯＰを各硝子体内注射または脈絡膜上注射の前に約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間または約１時間測定することをさらに含む。１つの実施形態では、ＩＯＰは、眼圧測定法によって測定される。
【００２２】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートを投与する本方法は、患者に有効量の新血管新生阻害剤を投与することをさらに含む。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、有効量のイムノコンジュゲートと同一組成物中に存在する。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、有効量のイムノコンジュゲートとは異なる組成物中に存在する。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤またはＰＤＧＦ受容体阻害剤である。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、ラニビズマブである。１つの実施形態では、ラニビズマブの用量は、約０．２ｍｇ〜約１ｍｇである。１つの実施形態では、ラニビズマブの用量は、０．３ｍｇまたは０．５ｍｇである。１つの実施形態では、ラニビズマブは、硝子体内注射によって患者の眼に投与される。１つの実施形態では、有効量の新血管新生阻害剤を含む組成物は、硝子体内注射によって患者の眼に投与される。１つの実施形態では、有効量の新血管新生阻害剤を含む組成物は、複数回の投与セッションのそれぞれで投与される。
【００２３】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート組成物は、１アームドおよび２アームドイムノコンジュゲート両方の混合物であって、１アームドおよび２アームドイムノコンジュゲートは、１：１、１：５、１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１００：１、５０：１、２５：１、１０：１または５：１の比率で存在する混合物を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート第ＶＩＩ因子タンパク質は、ヒト第ＶＩＩ因子タンパク質である。一部の実施形態では、本開示は、医薬上許容される賦形剤をさらに含むイムノコンジュゲートを含む製剤に向けられる。１つの実施形態では、本製剤は、さらにラニビズマブを含む。１つの実施形態では、本製剤は、さらにアルギニン溶液を含む。１つの実施形態では、本製剤は、次の：ＨＥＰＥＳ溶液、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、ポリソルベート−８０およびアルギニン溶液のうちの１つ以上をさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、癌関連新血管新生には、黒色腫、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、膵臓癌、膀胱癌、肝臓癌、眼メラノーマ、肺癌、子宮内膜癌、胃癌およびリンパ腺癌が関連する。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、同時に投与される。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、連続的に投与される。１つの実施形態では、新血管新生阻害剤は、アフリベルセプトである。
【００２５】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達における疾患を生じさせる。１つの実施形態では、本組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を２アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも１．５倍以上減少させる。１つの実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＩＬ−８またはＧＭ−ＣＳＦである。
【００２６】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、前炎症性サイトカインシグナル伝達における疾患を生じさせる。一部の実施形態では、２アームドイムノコンジュゲート二量体よりも少なくとも１．５倍大きい。一部の実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＩＬ−８またはＧＭ−ＣＳＦである。１つの実施形態では、１アームドイムノコンジュゲートの生成は、２アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物を生じさせる。１アームドイムノコンジュゲートを含む組成物であって、ここで本組成物は２アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、本発明の１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートの１つの実施形態および本発明の２アームドＩＣＯＮ−１．０イムノコンジュゲートの１つの実施形態の非限定的なグラフ表示である。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示のイムノコンジュゲートの複数の実施形態の非限定的なグラフ表示であり、図２Ａは、２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質変異体を表す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示のイムノコンジュゲートの複数の実施形態の非限定的なグラフ表示であり、図２Ｂは、１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質変異体を表す。
【図３Ａ】図３Ａは、セルベース結合親和性に関する、ＩＣＯＮ−１．５  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃ変異体の特性解析からのデータの視覚的表示を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関する、ＩＣＯＮ−１．５  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃ変異体の特性解析からのデータの視覚的表示を示す図である。
【図４】図４は、ＩＣＯＮ−１とＩＣＯＮ−１．５との間の生成収率における差を示す図である。
【図５】図５は、ＦＣ二量体がノブ−ホール（knob-hole）突然変異を含む、本発明の典型的なイムノコンジュゲート実施形態を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、セルベース結合親和性に関する、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来ＩＣＯＮ−１対ＣＨＯ−Ｓ細胞由来ＣＯＮ−１．５の特性解析からのデータの視覚的表示を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関する、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来ＩＣＯＮ−１対ＣＨＯ−Ｓ細胞由来ＣＯＮ−１．５の特性解析からのデータの視覚的表示を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、セルベース結合親和性に関する、ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカーが欠如するＨＥＫ２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１．５対ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカーを備えるＨＥＫ２９３細胞由来ＣＯＮ−１．５の特性解析からのデータの視覚的表示を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）に関する、ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカーが欠如するＨＥＫ２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１．５対ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカーを備えるＨＥＫ２９３細胞由来ＣＯＮ−１．５の特性解析からのデータの視覚的表示を示す図である。
【図８】図８は、上記構築物を含む細胞から収集した上清の２回の複製ウェスタンブロットトランスファーが付随する、本発明のイムノコンジュゲートを生成する際に利用された構築物の視覚的表示である。図の左側のブロットは抗ＦＶＩＩ抗体を利用し、図の右側のブロットは抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを利用した。説明文は、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２０）改変Ｆｃヒンジに付着させたＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカーについて説明している。
【図９】図９は、上記の図からの構築物を発現する、細胞から単離したタンパク質のサイズ排除クロマトグラムを示す図であり（実施例１を参照）、「単量体」と表示されたサンプル中の腫瘍ピークがＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートを含むことを詳細に証明しており、本発明のイムノコンジュゲートの効果的な単離および精製を実証している。
【図１０】図１０は、ＣＨＯおよび２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよび抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）レポーターアッセイを示す図である。左のパネルは結合アッセイであり、右のパネルはＡＤＣＣレポーターアッセイである。ＧＧＳＳリンカーは、配列番号１１に対応する。
【図１１】図１１は、ＢＨＫ細胞および２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよび抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）レポーターアッセイを示す図である。左のパネルは結合アッセイであり、右のパネルはＡＤＣＣレポーターアッセイである。
【図１２】図１２は、ＩＣＯＮ−１および／またはＩＣＯＮ−１．５がＦＶＩＩａ誘導性ＦＸ活性化の結果として凝固反応を妨害するかどうかを決定するための、ＦＸａ蛍光発生基質を利用したセルベース第Ｘａ因子変換アッセイを示す図である。
【図１３】図１３は、組換えＦＶＩＩａがインビトロＴＦ  ＦＸａｓｅアッセイにおいて３つの形態のＴＦと相互作用する能力に関して、ＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ−１．５が類似の阻害活性を共有することを示す、組換えＴＦ因子Ｘａｓｅアッセイからのデータを含有する表を示している。
【図１４】図１４は、ＢＨＫ細胞由来のＩＣＯＮ−１および２９３細胞由来のＧＧＳＳリンカー（配列番号１１）を備えるＩＣＯＮ−１．５を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性（ＡＤＣ）アッセイを示す図である。左のパネルは、二次抗体としての抗チューブリン剤であるＭＭＡＦに結合した抗ＦｃＦａｂ断片を利用している。右のパネルは、ＤＮＡインターカレーターＰＮＵ−１５９２６８に結合した抗ＦｃＦａｂ断片を利用している。
【図１５】図１５は、２９３細胞由来のＩＣＯＮ−１．５およびＢＨＫ細胞由来のＩＣＯＮ−１を用いたＡＤＣアッセイを示す図である。左のパネルは、扁平上皮癌細胞系Ａ４３１中においてチューブリン阻害剤ＭＭＡＦを利用している。右のパネルは、膵臓腺癌細胞系ＢｘＰＣ３中においてチューブリン阻害剤ＭＭＡＦを利用している。
【図１６】図１６は、二次抗体がトリプルネガティブ乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においてチューブリン阻害剤ＭＭＡＦとコンジュゲート化している、２９３細胞由来のＩＣＯＮ−１．５およびＢＨＫ細胞由来のＩＣＯＮ−１を用いたＡＤＣアッセイを示す図である。
【図１７】図１７は、ＢＨＫ細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１および２９３細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１．５がＦＶＩＩａ誘導性細胞シグナル伝達に及ぼす作用を示す図である。左のパネルは、ＩＬ−８を測定する。右のパネルは、ＧＭ−ＣＳＦを測定する。
【図１８】図１８は、ＴＦに対して向けられた薬剤がインビボ腫瘍増殖に及ぼす潜在的影響を評価した、雌性無胸腺ヌードマウス（Crl:NU(NCr)-Foxn1nu、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において実施した異種移植片試験からのデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
用語「１つ」は、１つ以上のその実体を意味する、すなわち複数の指示対象を意味することができる。したがって、用語「１つ」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用される。さらに、不定冠詞「１つ」による「１つの要素」の言及は、その状況が１つの要素が存在する、および１つの要素しか存在しないことを明白に要求していない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。
【００２９】
本明細書の全体を通して「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「１つの態様」または「ある態様」との言及は、その実施形態と結び付けて記載された特定の特徴、構造または特性が本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通して様々な場所での語句「１つの実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、必ずしもすべてが同一実施形態を意味している訳ではない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の組合わせで任意の好適な方法で組み合わせることができる。
【００３０】
本明細書の特定の実施形態において使用する用語「約」または「およそ」は、数値に先行する場合は、数値±１０％の範囲を示す。
【００３１】
本明細書の特定の実施形態において使用する用語「実質的に含まない」は、９５％以上を含まないと理解すべきである。例えば、組成物Ｘが分子Ｙを実質的に含まない場合は、組成物Ｘは、分子Ｙを少なくとも９５％含まないと理解すべきである。組成物Ｘは、５％未満の分子Ｙを含有する。
【００３２】
既存血管の異常な成長および新規血管の作製（本明細書では集合的に新血管新生と呼ぶ）は、様々な疾患において観察され、典型的には血管内皮細胞に対する特異的成長因子の放出によって引き起こされる。新血管新生は、固形腫瘍の増殖および転移を可能にし、眼の障害における視覚的機能不全を誘発し、炎症性障害において白血球血管外遊出を促進する、および／またはアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患の転帰に影響を及ぼす。
【００３３】
本明細書では、ターゲティングドメイン（変異第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質；本明細書では互換的にＦＶＩＩと呼ばれる）およびエフェクタードメイン（Ｆｃドメイン）を含むイムノコンジュゲート分子が提供されるが、ここでターゲティングドメインおよびエフェクタードメインはコンジュゲート化されている。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、１アームド変異体（本明細書では互換的にＩＣＯＮ−１．５と呼ばれる）であり、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の２Ｆｃエフェクター成分を含むが、ここでＦｃ成分の１つは変異ＦＶＩＩａにコンジュゲート化されており、２つのＩｇＧ  Ｆｃ単量体は二量体化されている。
【００３４】
本明細書で提供するイムノコンジュゲート分子は、罹患組織、腫瘍および支持間質（例えば、血管構造、浸潤性単核球）中の組織因子（ＴＦ）を標的としてそれらに結合し、さらにＦｃ受容体にも結合する。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲート分子は、変異第ＶＩＩ因子タンパク質（本明細書では互換的にＦＶＩＩドメインＦＶＩＩ成分と呼ばれる）および２つの免疫グロブリンＦｃタンパク質（本明細書では互換的にＦｃドメインＦｃ成分およびＦｃエフェクター成分と呼ばれる）を含む。他の実施形態では、本イムノコンジュゲート分子は、変異第ＶＩＩ因子タンパク質および免疫グロブリンＦｃタンパク質の二量体を含む。ＶＩＩタンパク質はターゲティングドメインであり、Ｆｃタンパク質はエフェクタードメインであるが、ここで各ＶＩＩタンパク質はＦｃタンパク質にコンジュゲート化されている。単一ＦＶＩＩタンパク質しか存在しない場合は、ＦＶＩＩタンパク質はＦｃタンパク質の一方にのみコンジュゲート化される。イムノコンジュゲート二量体のターゲティングドメインは、変異ＦＶＩＩａタンパク質を含む。イムノコンジュゲート二量体のエフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃエフェクタードメインを含む。イムノコンジュゲート分子は、二量体化エフェクタードメインにコンジュゲート化された単一ターゲティングドメインを含み得る、または２つのエフェクタードメインにコンジュゲート化された２つのターゲティングドメインを含み得る。
【００３５】
本明細書に提供したように、イムノコンジュゲートはＴＦに結合するが、凝固カスケードを開始させない、または凝固カスケードの減少した開始を示す。変異ＦＶＩＩａタンパク質を含むイムノコンジュゲートは、凝固カスケードを開始させるためのＦＶＩＩａの正常な役割が発生しないように、または減少させられるように設計される。
【００３６】
本明細書では、アテローム硬化症、関節リウマチ、眼メラノーマ、ＢＲＡＦ突然変異メラノーマ、固形腫瘍、原発性または転移性固形腫瘍（メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）および血管新生緑内障を含むがそれらに限定されない病理学的新血管新生に関連する疾患を有する患者を治療する際にイムノコンジュゲート分子を使用する方法が提供される。
【００３７】
イムノコンジュゲート
本明細書では、罹患組織、腫瘍および支持間質（例えば、血管構造、浸潤性単核球）中の（ＴＦ）を標的としてそれらに結合し、さらにＦｃ受容体にも結合するイムノコンジュゲートが提供される。
【００３８】
本明細書で記載したイムノコンジュゲートは、ターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを含むが、ここでターゲティングドメインおよびエフェクタードメインはコンジュゲート化されている。１つの実施形態では、エフェクタードメインおよびターゲティングドメインは、ヒンジドメイン（本明細書では、互換的にヒンジ領域、ヒンジ成分または単純にヒンジと呼ばれる）によって一緒にコンジュゲート化されている。以下では、ヒンジについてより詳細に説明する。本明細書で提示するように、一部の実施形態では、エフェクタードメインはヒンジ領域を含んでいる。他の実施形態では、エフェクタードメインは、ヒンジ領域を含んでいない。一部の実施形態では、コンジュゲート化は、さらにリンカーの含有を含む。以下では、リンカーについてより詳細に説明する。イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、変異ＦＶＩＩａタンパク質（組織因子ターゲティングドメイン）を含む。イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、Ｉｇ  Ｆ１免疫グロブリンのＦｃエフェクター成分を含む。１つの実施形態では、ターゲティングドメインは、変異ヒトＦＶＩＩａタンパク質であり、エフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンのヒトＦｃエフェクター成分である。また別の実施形態では、ターゲティングドメインは、変異ヒトＦＶＩＩａタンパク質であり、エフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンの非ヒトＦｃエフェクター成分である。１つの実施形態では、ターゲティングドメインは、非変異ヒトＦＶＩＩａタンパク質であり、エフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンのヒトＦｃエフェクター成分である。１つの実施形態では、ターゲティングドメインは、非変異ヒトＦＶＩＩａタンパク質であり、エフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンの非ヒト（ターゲティングドメインと同一種由来）Ｆｃエフェクター成分である。１つの実施形態では、ターゲティングドメインは、非変異ヒトＦＶＩＩａタンパク質であり、エフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンの非ヒト（ターゲティングドメインの種とは異なる種由来の）Ｆｃエフェクター成分である。一部の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ１以外のイソタイプ由来である。
【００３９】
本明細書に提供したように、イムノコンジュゲートはＴＦに結合するが、（１）凝固カスケードを開始しない、または（２）凝固カスケードの減少した開始を示す。変異ＦＶＩＩａタンパク質を含むイムノコンジュゲートは、ＦＶＩＩａの凝固カスケードを開始させる標準の役割が発生しないように、または減少させられるように設計される。
【００４０】
本明細書で使用する「１つのイムノコンジュゲート」または「複数のイムノコンジュゲート」は、２種のタイプのコンジュゲート化タンパク質または融合タンパク質：（１）変異ＦＶＩＩタンパク質がＦｃ単量体の一方にのみ融合している、２つの二量体化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ単量体および変異ＦＶＩＩタンパク質を含む１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であるＩＣＯＮ−１．５、および（２）２つの変異ＦＶＩＩタンパク質に融合した２つの二量体化免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ単量体を含む２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質であるＩＣＯＮ−１を意味する（図１および図２Ｂを参照）。
【００４１】
ＩＣＯＮ−１．５は、例えば非コンジュゲート化ＦＶＩＩもしくはＦｃ（単量体もしくは二量体）またはＦｃに融合した単量体ＦＶＩＩの存在などの不純物を含まない均質な分子として製造される。これに関連して、ＩＣＯＮ−１．５の生成は、製造環境における重大な利点を提供し、ＩＣＯＮ−１．５ではない関心対象の生成物の数を減少させる。
【００４２】
ＩＣＯＮ−１．５は、ＩＣＯＮ−１と比較して自己会合する傾向が低いため、結果として容易な操作性が生じる。ＩＣＯＮ−１．５およびＩＣＯＮ−１は、以下でより詳細に提示するように、類似の程度の（１）結合とＡＤＣＣ活性、および（２）ＦＸａ変換率を共有する。
【００４３】
一部の実施形態では、１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートは、サイトカインシグナル伝達に２アームドＩＣＯＮ１−１より実質的に大きな阻害作用を示す。一部の実施形態では、１アームドイムノコンジュゲートの投与は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させる。一部の実施形態では、１アームドイムノコンジュゲートの投与は、前炎症性サイトカインシグナル伝達を２アームドイムノコンジュゲートが前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させるよりも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０または１００倍超減少させる。一部の実施形態では、１アームドイムノコンジュゲートの投与は、２アームドイムノコンジュゲートが前炎症性サイトカインシグナル伝達を減少させるよりも約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約５０または約１００倍超減少させる。
【００４４】
１つの典型的な実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＩＬ−８である。また別の典型的な実施形態では、前炎症性サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦである。
【００４５】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域には、天然ヒンジ領域が含まれ、イムノコンジュゲートは、ＦＶＩＩタンパク質とＦｃ領域のヒンジ領域との間に直接的に融合している。他の実施形態では、ＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートは、リンカー領域によって分離されている。一部の実施形態では、ヒンジ領域および／またはリンカー領域は、イムノコンジュゲートには存在しない。
【００４６】
図１および図２Ａは、２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃタンパク質の多数の非限定的実施形態の一般的構造を提供しており、他方図２Ｂは、１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃタンパク質の多数の非限定的実施形態の一般的構造を提供している。
【００４７】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、癌細胞上で発現したＴＦに結合する。さらに別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、癌細胞またはＴＦを過剰発現もしくは異所性で発現する他の細胞に結合する。
【００４８】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション（glypiation）、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化（butrylation）、γ−カルボキシル化、グリコシル化（Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化）、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれるがそれらに限定されない。
【００４９】
一部の実施形態では、患者に投与する際に利用される本開示の組成物には、１アームドイムノコンジュゲートおよび２アームドイムノコンジュゲート両方が含まれる。一部の実施形態では、本組成物は、約１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１５０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６５、１：６０、１：５５、１：５０、１：４５、１：４０、１：３５、１：３０、１：２５、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２または１：１の比率で１アームドイムノコンジュゲートおよび２アームドイムノコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、本組成物は、約１：１０００、１：９００、１：８００、１：７００、１：６００、１：５００、１：４００、１：３００、１：２００、１：１５０、１：１００、１：９５、１：９０、１：８５、１：８０、１：７５、１：７０、１：６５、１：６０、１：５５、１：５０、１：４５、１：４０、１：３５、１：３０、１：２５、１：２０、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２または１：１の比率で２アームドイムノコンジュゲートおよび１アームドイムノコンジュゲートを含む。
【００５０】
一部の実施形態では、本組成物は、２アームドイムノコンジュゲートの存在量と比較して、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の相対存在量で１アームドイムノコンジュゲートを含む。
【００５１】
全体を通して提供されるように、本明細書に記載した実施形態では、変異第ＶＩＩａ因子ドメインを含組織因子ターゲティングドメインを含むイムノコンジュゲートが提供される。ターゲティングドメインは、組織因子への結合親和性を低下させることなく凝固経路の開始を阻害（または減少）させるために突然変異させられている変異第ＶＩＩａ因子を含む。１つの実施形態では、ヒト第ＶＩＩａ因子における突然変異は、残基３４１での単一点突然変異である。また別の実施形態では、ヒト第ＶＩＩａ因子における突然変異はＬｙｓ３４１からＡｌａ３４１である。変異第ＶＩＩａ因子が非ヒト種由来である他の実施形態では、ヒト第ＶＩＩａ因子の残基３４１での突然変異に対応する突然変異を含み得る。本明細書に提供したイムノコンジュゲートには、凝固経路を阻害する他の突然変異が含まれる。変異第ＶＩＩａ因子ドメイン（ＴＦターゲティングドメインとも呼ばれる）は、本明細書に提供した態様では、組織因子に高度の親和性および特異性で結合するが、組織因子結合に通常は関連する凝固を開始しない、または凝固を最小限に抑える。
【００５２】
本明細書に提供したイムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、ＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃエフェクター成分を含む。１つの実施形態では、エフェクタードメインは、補体経路およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性経路の両方を媒介する。１つの実施形態では、例えばＮＫ細胞およびマクロファージなどの免疫細胞の細胞毒性は、免疫系の細胞上に存在するＦｃ受容体に結合するとＦｃエフェクター成分を活性化することによって活性化される。ＩｇＧ１  Ｆｃエフェクタードメインは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞経路および補体経路によって、イムノコンジュゲートに結合する細胞に対して溶解反応を引き起こす。１つの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃエフェクタードメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＣＨ２領域およびＣＨ３領域の両方を含む。
【００５３】
ＦＶＩＩａとＴＦとの間の反応は、種特異的である（Janson et al.,1984;Schreiber et al.,2005;Peterson et al.,2005）：マウスＦＶＩＩは、ウサギ、ブタおよびヒトを含む多数の異種において活性であると思われるが、他方ヒトＦＶＩＩａは、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ウサギおよびブタにおいて明らかに活性である。これとは逆に、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインは、ヒトおよびマウスの両方において活性である。したがって、患者に依存して、イムノコンジュゲートは、対応する種に由来する、またはその患者において活性であることが公知である種に由来するターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを使用して構築される。例えば、本明細書に提供したヒトのための治療では、突然変異組織因子ターゲティングドメインは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦＣ領域を含むエフェクタードメインにコンジュゲート化したヒト第ＶＩＩａ因子に由来し得る。
【００５４】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４もしくは約２５ｍＭのＨＥＰＥＳまたは他の医薬上許容されるバッファーを含む組成物中に存在する。
【００５５】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５ｍＭのＨＥＰＥＳまたは他の医薬上許容されるバッファーを含む組成物中に存在する。
【００５６】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５または約２２０ｍＭのＮａＣｌを含む組成物中に存在する。
【００５７】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５または２２０ｍＭのＮａＣｌを含む組成物中に存在する。
【００５８】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０もしくは約７５ｍＭのアルギニン、グリシン、ヒスチジンまたは任意の天然型アミノ酸を含む組成物中に存在する。一部の実施形態では、本組成物は、アミノ酸、例えばアルギニンおよびヒスチジンの組合わせを含む。
【００５９】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０もしくは７５ｍＭのアルギニン、グリシン、ヒスチジンおよび／または任意の天然型アミノ酸を含む組成物中に存在する。
【００６０】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約７．０、約７．０５、約７．１０、約７．１５、約７．２、約７．２５、約７．３、約７．３５、約７．４、約７．４５、約７．５、約７．５５、約７．６、約７．６５、約７．７、約７．７５または７．７５のｐＨを備える組成物中に存在する。
【００６１】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、７．０、７．０５、７．１０、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、７．５、７．５５、７．６、７．６５、７．７、７．７５または７．７５のｐＨを備える組成物中に存在する。
【００６２】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約０．００１％、約０．００１５％、約０．００２％、約０．００２５％、約０．００３％、約０．００３５％、約０．００４％、約０．００４５％、約０．００５％、約０．００５５％、約０．００６％、約０．００６５％、約０．００７％、約０．００７５％、約０．００８５％、約０．００９％、約０．００９５％、約０．０１％、約０．０１５％、約０．０２％、約０．０２５％、約０．０３％、約０．０３５％、約０．０４％、約０．０４５％または約０．０５％のポリソルベート−８０を含む組成物中に存在する。
【００６３】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、０．００１％、０．００１５％、０．００２％、０．００２５％、０．００３％、０．００３５％、０．００４％、０．００４５％、０．００５％、０．００５５％、０．００６％、０．００６５％、０．００７％、０．００７５％、０．００８５％、０．００９％、０．００９５％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％または０．０５％のポリソルベート−８０を含む組成物中に存在する。
【００６４】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．６５、約０．７、約０．７５、約０．８、約０．８５、約０．９、約０．９５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０ＣａＣｌ２を含む組成物中に存在する。
【００６５】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ＣａＣｌ２を含む組成物中に存在する。
【００６６】
組織因子（ＴＦ）
ＴＦは、セリンプロテアーゼ第ＶＩＩａ因子に対する細胞表面受容体である。ＴＦは、細胞および生物レベルでの様々な機能に関係しているが、ＴＦは、血液凝固において果たす役割について最も広く知られている。第ＶＩＩａ因子と複合体形成したＴＦは、第ＩＸ因子を活性化し、第Ｘ因子の変換を触媒して凝固の一般的経路のために不可欠なプロテアーゼである第Ｘａ因子を活性化する。ＴＦは、多数のタイプの癌によって発現する。ＴＦ依存性活性化は、癌関連性血栓症および転移に関係付けられてきた。凝血促進活性を有することに加えて、ＴＦは、細胞シグナル伝達特性を有する。腫瘍細胞の表面上でのＴＦ活性化ＦＶＩＩ複合体の形成は、Ｇタンパク質結合受容体ＰＡＲ２の切断および活性化を引き起こす。ＴＦ−ＦＶＩＩａ−ＰＡＲ２シグナル伝達経路は、腫瘍増殖を促進する。Van den Berg.2012.Blood.119(4):924-932およびKasthuri.2009.J.Clin.Oncol.27(29):4834-4838)を参照されたい。
【００６７】
本発明の１つの態様では、例えば癌、血行性転移、癌関連性血栓塞栓症などのＴＦの異所性発現に関連する疾患または障害を有する患者を治療するための方法が提供される。本明細書に記載するように、投与は、療法に関係する疾患または障害のタイプに依存して、局所的または全身性であってよい。
【００６８】
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）
時々はＴＦターゲティングドメインとも呼ばれる第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、ＴＦに高度の親和性および特異性で結合する。ＦＶＩＩは、凝固カスケードにおいて血液が凝固するのを誘発するタンパク質の１つである。ＦＶＩＩは、ＴＦに結合して活性化し、順に凝固カスケードを開始させることによって、凝固カスケードの開始に関係している。ＦＶＩＩへの所定の突然変異は、ＴＦに結合する能力を維持するが、凝固を開始させない、または非突然変異形と比較して、通常はＴＦに結合することに関連する凝固を示さないＦＶＩＩを生じさせ得る。
【００６９】
ＦＶＩＩとＴＦとの間の反応は、種特異的であると報告されている（Janson et al.,1984;Schreiber et al.,2005;Peterson et al.,2005）。マウスＦＶＩＩは、ウサギ、ブタおよびヒトを含む多数の異種において活性であると思われるが、他方ヒトＦＶＩＩはヒト、イヌ、ウサギおよびブタにおいて明らかに活性であると報告されてきた。したがって、患者に依存して、イムノコンジュゲートは、対応する種に由来する、またはその患者において活性であることが公知である種に由来するターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを使用して構築される。例えば、本明細書に提供したヒトの治療方法では、突然変異組織因子ターゲティングドメインは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦＣ領域を含むエフェクタードメインにコンジュゲート化したヒト第ＶＩＩ因子に由来してよい。例えば、１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの変異ＦＶＩＩ成分は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、リンカーおよび／またはヒンジ領域を介してエフェクタードメイン（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ）に結合したターゲティングドメイン（変異ＦＶＩＩドメイン）を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、ターゲティングドメインは、組織因子への結合親和性を低下させることなく凝固経路の開始を阻害するために変異させられている変異第ＶＩＩ因子を含む。１つの実施形態では、第ＶＩＩ因子における突然変異は、残基３４１での単一点突然変異である。また別の実施形態では、突然変異はＬｙｓ３４１からＡｌａ３４１である。また別の実施形態では、突然変異はＳｅｒ３４４からＡｌａ３４４である。しかし、凝固経路を阻害する他の突然変異は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートに含まれている。
【００７１】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートはＦＶＩＩを含み、ＦＶＩＩは重鎖および軽鎖を含む。１つの実施形態では、ＦＶＩＩは、重鎖しか含まない。また別の実施形態では、ＦＶＩＩは、重鎖の断片からなる。１つの実施形態では、ＦＶＩＩは、軽鎖しか含まない。また別の実施形態では、ＦＶＩＩは、軽鎖の断片からなる。一部の実施形態では、軽鎖断片は、ＦＶＩＩ軽鎖のアミノ酸残基１〜１２０、１〜１２５、１〜１３０、１〜１３５、１〜１４０、１〜１５０、１〜１５５、１〜１６０、１〜１６５、１〜１７０からなる。一部の実施形態では、軽鎖断片は、アミノ酸残基１〜１４５、１〜１４６、１〜１４７、１〜１４８、１〜１４９、１〜１５０、１〜１５１、１〜１５２、１〜１５３、１〜１５４、１〜１５５、１〜１５６、１〜１５７、１〜１５８、１〜１５９または１〜１６０からなる。
【００７２】
一部の実施形態では、本開示の１アームドおよび２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ２７２７７４によってコードされた野生型第ＶＩＩドメインもしくは第ＶＩＩドメインを含むイムノコンジュゲートまたはそれらの組成物と比較して、インビトロまたはインビボで減少した凝固反応を示す。一部の実施形態では、本開示の１アームドおよび２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートは、インビトロまたはインビボの凝固反応を示さない。
【００７３】
一部の実施形態では、ＦＶＩＩは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション（glypiation）、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化（butrylation）、γ−カルボキシル化、グリコシル化（Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化）、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれる。
【００７４】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号１２、配列番号３３または配列番号３４から選択されるＦＶＩＩターゲティングドメインを含み得る。
【００７５】
Ｆｃタンパク質
断片結晶化可能（Ｆｃ）タンパク質は、一般に抗体テイル領域を含む抗体断片である。Ｆｃタンパク質は、補体系の細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）およびタンパク質と自然に相互作用し、この特性はＦｃ領域が宿主免疫系を活性化することを可能にする。イムノコンジュゲートの免疫グロブリンＦｃエフェクタードメインは、イムノコンジュゲートに結合する細胞に対する細胞溶解反応を引き起こし得る。細胞溶解反応は、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および補体経路によって引き起こされ得る。一部の実施形態では、Ｆｃエフェクタードメインは、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の両方を含む。一部の実施形態では、Ｆｃエフェクタードメインは、ＣＨ２領域しか含まない。一部の実施形態では、Ｆｃエフェクタードメインは、ＣＨ３領域しか含まない。一部の実施形態では、Ｆｃは、また別の免疫グロブリン、すなわちＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡなど由来である。一部の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートにおいて改変されている。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、配列番号１３を含む。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃは、配列番号１３と比較してｐｒｏｔＡ突然変異を含む配列番号１４を含む。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、配列番号１３と比較してＴ３６６Ｙ突然変異を含む配列番号１５を含む。ＦｃのＴ３６６Ｙ突然変異は、ノブ突然変異と呼ばれる。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、配列番号１３と比較してＹ４０７Ｔ突然変異を含む配列番号１７を含む。ＦｃのＹ４０７Ｔ突然変異は、ホール突然変異と呼ばれる。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１または配列番号３２を含む。発現した場合にノブ／ホールＦｃヘテロ二量体を含むイムノコンジュゲートを一緒に作製するノブおよびホール突然変異は、イムノコンジュゲート分子を含有する完全に形成されたＦｃの増加した収率を生じさせる。Ridgway et al.(1996.Protein Engineering.9(7):617-621)を参照されたい。一部の実施形態では、Ｓ３５４ＣまたはＴ３６６Ｗは実行可能なノブ突然変異であり、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖは実行可能なホール突然変異である。上述のノブおよびホール突然変異は、増加した安定性によって収率に寄与するが、Klein et al.(2012.MAbs.4(6):653-663)は、Ｆｃを安定化させるための追加の改変について説明している。特異的参照残基の非存在下では、ホール突然変異についての言及はＹ４０７Ｔであると解釈すべきであり、ノブ突然変異についての言及はＴ３６６Ｙであると解釈すべきである。さらに、他のＦｃ変異体における残基番号は異なる可能性があり、それらの場合にはＹ４０７（ホール突然変異の場合）およびＴ３６６（ノブ突然変異の場合）に対応する残基が言及されている。
【００７６】
１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ｐｒｏｔＡ突然変異を含む配列番号１４または配列番号２８を含む。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、Ｔ３６６Ｙノブ突然変異およびｐｒｏｔＡ突然変異を含む配列番号１６または配列番号３０を含む。１つの実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、Ｙ４０７Ｔホール突然変異およびｐｒｏｔＡ突然変異を含む配列番号１８または配列番号３２を含む。ノブおよびホールを含む他の突然変異ならびにエフェクター機能を変化させる、または改良する突然変異は、イムノコンジュゲートにおいて使用され得る。一部の実施形態では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートのＩｇＧ  Ｆｃ領域を含むエフェクタードメインは、補体経路およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞毒性経路の両方を媒介する。
【００７７】
一部の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４領域と置換される。一部の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域とまた別のＩｇＧ  Ｆｃ領域との置換は、エフェクター機能を調節する。一部の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域とまた別のＩｇＧ  Ｆｃ領域との置換は、エフェクター機能における増加を誘発する。一部の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域とまた別のＩｇＧ  Ｆｃ領域との置換は、エフェクター機能における減少を誘発する。一部の実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域とまた別のＩｇＧ  Ｆｃとの置換は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の調節を生じさせる。一部の実施形態ではＦｃ二量体はホモ二量体であり、他の実施形態では、Ｆｃ二量体はヘテロ二量体である。
【００７８】
一部の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション（glypiation）、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化（butrylation）、γ−カルボキシル化、グリコシル化（Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化）、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれる。他の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃはフコシル化が除去されるように改変される。また別の実施形態では、Ｆｃのフコシル化の除去は、エフェクター機能を増加させる。
【００７９】
１つの実施形態では、二量体のＦｃ単量体の一方で発生するノブ突然変異（配列番号１５または２９）および他方のＦｃ単量体において発生するホール突然変異（配列番号１７または３１）を備える二量体のＩｇＧ  Ｆｃ領域は、相補的ノブ−ホール突然変異体であるように遺伝子操作した（１つの実施形態については図５を参照されたい）。１つの実施形態では、接合ノブ−ホールＦｃ突然変異体の使用は、結果として２アームドコンジュゲートと比較して１アームドイムノコンジュゲートの優先的な生成を生じさせる。米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい。一部の実施形態では、Ｆｃ単独（ＦＶＩＩ融合なし）二量体の除去を容易にするために、プロテインＡ突然変異はＦｃ、Ｆｃノブ突然変異体、Ｆｃホール突然変異体に遺伝子操作される。米国特許第８，５８６，７１３号を参照されたい。
【００８０】
一部の実施形態では、二段階精製戦略：（１）一般に使用されるMabSelect SuRe樹脂を用いるプロテインＡ捕捉工程、その後の（２）２アームドホモ二量体およびＦｃ単独ホモ二量体を除去するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはアニオン交換クロマトグラフィーが利用される。
【００８１】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２から選択されるＩｇＧ  Ｆｃエフェクタードメインを含み得る。
【００８２】
ヒンジ領域
免疫グロブリンのヒンジ領域は、ジスルフィド結合によって重鎖を一緒に連結するための起支点である免疫グロブリンの重鎖内の柔軟性アミノ酸ストレッチである。ヒンジ領域は、安定性および／または柔軟性を増加もしくは減少させるために調節され得る特性である、安定性および柔軟性の両方を付与する構造である。それらの結合特性に影響を及ぼすことなくイムノコンジュゲートの製造性の容易さを改良するためには、ヒンジ領域を改変することができる。ＩｇＧ１のヒンジ領域は、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の二量体化を生じさせる１つ以上のジスルフィド結合を形成するシステインアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１９〜２５のいずれか１つを含む。典型的なＩｇヒンジ領域については、国際公開第２０１２１２３５８６Ａ１号を参照されたい。
【００８３】
１つの実施形態では、ヒンジ領域は、天然型である。また別の実施形態では、ヒンジ領域は、非天然型である。１つの実施形態では、ヒト起源である。１つの実施形態では、ＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域、例えばヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジ領域は、本明細書に記載したイムノコンジュゲート内でＦＶＩＩ領域をＦｃ領域に連結させるために利用される。
【００８４】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのヒンジ領域は、ＩｇＧ１ヒンジ領域、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号２１）である。一部の実施形態では、ヒンジは、配列番号１９〜２５のいずれか１つから選択される。１つの実施形態では、天然ＩｇＧ  Ｆｃヒンジ領域は、本開示のＩｇＧ  ＦｃのＮ末端部分として含まれている。
【００８５】
一部の実施形態では、ヒンジ領域には、（例えば、図１および２に描出されたように）モノマー鎖間で１つ以上のジスルフィド結合を形成する１つ以上のシステインアミノ酸が含まれる。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、改変されている。理論によって拘束されることを望まなくても、そのような改変はイムノコンジュゲートの収率に役立ち得ると考えられる。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートのヒンジ領域は、その間に領域の柔軟性を維持しながら、ＴｃまたはＦｃ受容体への結合特性に影響を及ぼすことなくイムノコンジュゲートの製造性を改良するために変化させられる。
【００８６】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ配列が欠如する。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、配列番号８〜１１および１９〜２５のいずれか１つのアミノ酸配列との少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列同一性を共有する。
【００８７】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、保存アミノ酸置換を含むが、ここで少なくとも１つのアミノ酸残基は、同一クラスでは他のアミノ酸残基と置換されるが、ここでアミノ酸は、次の非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒのように、非極性、酸性、塩基性および中性クラスに分類される。また別の実施形態では、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の保存アミノ酸残基が同一クラス内で他のアミノ酸残基と置換される。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、作製される非保存アミノ酸置換を含むが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されず、塩基性アミノ酸と中性または非極性アミノ酸との置換である。また別の実施形態では、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の非保存アミノ酸残基が置換されるが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されない。また別の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、保存アミノ酸置換および非保存アミノ酸置換の両方で置換される。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、長さが少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個または少なくとも３０個のアミノ酸残基である。
【００８９】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、Ｎ末端および／またはＣ末端天然型ヒンジ配列から少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個の残基の欠失を有する。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのヒンジは、Ｎ末端および／またはＣ末端天然型ヒンジから少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個の残基の付加を有する。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ領域が欠如し、ＦｃおよびＦＶＩＩのヒンジのない部分を含む。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ領域が欠如し、Ｆｃ、ＦＶＩＩおよびこれら２つの間のリンカーのヒンジのない部分を含む。一部の実施形態では、他の手段によって二量体化を維持するためのジスルフィド結合が達成される。
【００９０】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１９〜２５のいずれか１つを含み得る。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートにはヒンジ配列が欠如する。
【００９１】
リンカー領域
イムノコンジュゲートのリンカー領域は、ＦＶＩＩとＦｃとの間の架橋またはコンジュゲート化点として機能する。リンカー領域の組成物は、イムノコンジュゲートの製造の容易さならびに安定性および柔軟性において役割を果たす。リンカー組成物を調節することは、イムノコンジュゲートの結合特性に影響を及ぼすことなく実施することができる。
【００９２】
一部の実施形態では、リンカー領域は、イムノコンジュゲート中でＦＶＩＩタンパク質とＦｃ領域との間で発生する。一部の実施形態では、リンカー領域は、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）の１つ以上を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはリンカー領域が欠如する。
【００９３】
一部の実施形態では、リンカーは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）のリンカー領域は改変されている。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカー領域は、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）と少なくとも２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％共有する。
【００９４】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは保存アミノ酸置換を含むが、ここで少なくとも１つのアミノ酸残基は、同一クラス内で他のアミノ酸残基と置換されるが、ここでアミノ酸は、次の非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；中性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒのように、非極性、酸性、塩基性および中性クラスに分類される。また別の実施形態では、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の保存アミノ酸残基が同一クラス内で他のアミノ酸残基と置換される。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、作製された非保存アミノ酸置換を含むが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されず、塩基性アミノ酸と中性または非極性アミノ酸との置換である。また別の実施形態では、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個の非保存アミノ酸残基が置換されるが、ここでこれらの残基は同一クラスには分類されない。また別の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、保存アミノ酸置換および非保存アミノ酸置換の両方で置換される。
【００９５】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個または少なくとも３０個のアミノ酸残基である。
【００９６】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個の残基の欠失を有する。一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートのリンカーは、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個もしくは少なくとも６個の残基の付加を有する。
【００９７】
一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０リピートのＧＳＡ、ＧＧＧおよび／またはＧＧＳＳ（配列番号１１）を含み得る。
【００９８】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）を含むリンカー領域を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートにはリンカー領域が欠如する。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、ＧＳＡ、ＧＧＧまたはＧＧＳＳ（配列番号１１）の１つ以上のリピートを含む。
【００９９】
典型的なイムノコンジュゲート
本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の成分についての典型的な配列は、表１に提供した。表２Ａおよび２Ｂは、典型的なイムノコンジュゲートを提供する；これらの典型的なイムノコンジュゲートは、本開示の範囲内に提示したイムノコンジュゲートの属を決して制限しない。
【０１００】
本明細書に記載した１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号４のタンパク質である、またはそれを含む。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号４のタンパク質である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号６または７の配列によってコードされる。
【０１０１】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号４のタンパク質である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、配列番号４の配列からなる。
【０１０２】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号５のタンパク質である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、配列番号５の配列からなる。
【０１０３】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号１、２、１２、３３もしくは３４から選択されたＦＶＩＩおよび配列番号２６〜３２から選択されたＦｃである、またはそれらを含むが、ここでヒンジはＦｃをＦｖから分離し、ヒンジは配列番号１９〜２５の１つから選択される。１つの実施形態では、リンカーは、ＦＶＩＩをヒンジから分離する。１つの実施形態では、リンカーは、ＦＶＩＩをＦｃから分離する。
【０１０４】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号１の配列である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号１の配列からなる。
【０１０５】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号２の配列である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号２の配列からなる。
【０１０６】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号１２の配列である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号１２の配列からなる。
【０１０７】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号３３の配列である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号３３の配列からなる。
【０１０８】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号３４の配列である、またはそれを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのターゲティングドメインは、配列番号３４の配列からなる。
【０１０９】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１３の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクターは、配列番号１３の配列からなる。
【０１１０】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１４の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１４の配列からなる。
【０１１１】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１５の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１５の配列からなる。
【０１１２】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１６の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１６の配列からなる。
【０１１３】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１７の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１７の配列からなる。
【０１１４】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１８の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号１８の配列からなる。
【０１１５】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２６の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２６の配列からなる。
【０１１６】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２７の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２７の配列からなる。
【０１１７】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２８の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２８の配列からなる。
【０１１８】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２９の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号２９の配列からなる。
【０１１９】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号３０の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号３０の配列からなる。
【０１２０】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号３１の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号３１の配列からなる。
【０１２１】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号３２の配列を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートのエフェクタードメインは、配列番号３２の配列からなる。
【０１２２】
１つの実施形態では、配列番号１２の配列を含むターゲティングドメインはエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）にコンジュゲート化されており、ここでエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列を含む。
【０１２３】
１つの実施形態では、配列番号３３の配列を含むターゲティングドメインはエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）にコンジュゲート化されており、ここでエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列を含む。
【０１２４】
１つの実施形態では、配列番号３４の配列を含むターゲティングドメインはエフェクタードメインにコンジュゲート化されており、ここでエフェクタードメインは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８の配列を含む。
【０１２５】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの要素はエフェクタードメインのいずれか１つをターゲティングドメインのいずれか１つにコンジュゲート化され得ることが企図されるようにモジュール式であるが、ここでリンカー配列のいずれかがエフェクタードメインをターゲティングドメインから分離することができる。一部の実施形態では、ヒンジ配列はＦｃをＦＶＩＩから分離することができる、またはリンカーをＦｃから分離することができる。
【０１２６】
【表１】
2019515904.tif 000003
【０１２７】
【表２】
2019515904.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2019515904.tif 000005
【０１２９】
イムノコンジュゲートの生成
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートを生成する方法は、例えばＢＨＫ細胞などの哺乳動物細胞内での発現が含まれる。また別の実施形態では、細胞系は、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯおよびＳＰ２／０を含み得る。２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートは、表２Ａに記載した発現構築物の哺乳動物発現によって生成され得る。１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートは、表２Ｂに記載した発現構築物の共発現によって生成される。２アームド分子および無アームドＦｃ分子もまた含有し得る細胞培養上清から１アームド分子を生成するためには、２段階精製プロセスを利用し得る。一部の実施形態では、１アームドもしくは２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートは、融合タンパク質（ＦＶＩＩ−Ｆｃ）として生成される、または化学的コンジュゲートとして生成される。
【０１３０】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートの生成は、宿主細胞を感染させるウイルスベクターからの一過性発現を経由する。他の実施形態では、本イムノコンジュゲートの生成は、宿主細胞ゲノム内の安定性に形質転換された発現ベクターの発現を経由する。
【０１３１】
一部の実施形態では、ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートを生成するためには、配列番号３５〜５９の配列の１つ以上を利用することができる。
【０１３２】
一部の実施形態では、１アームドイムノコンジュゲートの生成は、２アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物を生じさせる。一部の実施形態では、２アームドイムノコンジュゲートの生成は、１アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない組成物を生じさせる。一部の実施形態では、１アームドイムノコンジュゲートを含む組成物または製剤は、２アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない。一部の実施形態では、２アームドイムノコンジュゲートを含む組成物または製剤は、１アームドイムノコンジュゲートを実質的に含まない。
【０１３３】
１アームドイムノコンジュゲートの発現は、２つのオープンリーディングフレームの利用を含む。第１オープンリーディングフレーム（ＦＶＩＩ−Ｆｃ発現構築物）は、リンカー領域を伴う、または伴わないウィンフレーム、ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列を伴う、または伴わない変異ＦＶＩＩ配列およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（配列番号２７）をコードする。第２オープンリーディングフレーム（Ｆｃ単独発現構築物）は、ヒトＩｇＧ１ヒンジおよびＦｃ配列（配列番号２６）をコードする。一過性トランスフェクションのためには、オープンリーディングフレームの発現は、例えばＢＨＫ２１細胞、ＣＨＯ−Ｓ細胞およびＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物発現宿主中での発現を可能にする哺乳動物プロモーター配列を用いて実施される。
【０１３４】
１アームドイムノコンジュゲートは、対応する供給業者のトランスフェクションプロトコールを使用してＥｘｐｉＣＨＯまたはＥｘｐｉ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって生成され得る（カタログ番号Ａ２９１３３およびＡ１４６３５；ThermoFisher Scientific,Waltham,MA）。製造業者が推奨した細胞密度および生存能力にある細胞は、培養１ｍＬ当たり１μｇのＤＮＡを用いてトランスフェクトされるが、ＤＮＡの１／３（すなわち、０．６６μｇ／ｍＬ）はＦＶＩＩ−Ｆｃ発現構築物であり、ＤＮＡの２／３（すなわち、０．３３μｇ／ｍＬ）はＤＮＡＦｃ単独発現構築物である。トランスフェクション後の当日、細胞に適切な試薬を供給する。生存性が７０％〜８０％の間になったら、細胞培養上清を遠心分離およびデプス濾過によって収集する。イムノコンジュゲートは、MabSelect SuRe樹脂を使用してプロテインＡ捕捉工程を用いて透明な上清から単離する（GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA）。１アームドイムノコンジュゲートは、引き続き中性化親和性溶出液から適切な樹脂を使用してサイズ排除クロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィーによって単離する（GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA）。サイズ排除および／またはアニオン交換クロマトグラフィーは、親和性溶出液中に存在する場合は、タンパク質凝集体、２アームドイムノコンジュゲートおよびＦｃ単独ホモ二量体の除去を可能にする。
【０１３５】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、翻訳後に改変される。翻訳後改変には、ミリストイル化、グリピエーション（glypiation）、パルミトイル化、プレニル化、リポイル化、アシル化、アルキル化、ブトリル化（butrylation）、γ−カルボキシル化、グリコシル化（Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、フコシル化およびマンノシル化）、プロピオニル化、スクシニル化および硫酸化が含まれる。
【０１３６】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、安定性で発現する。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、一過性で発現する。
【０１３７】
【表４】
2019515904.tif 000006
【０１３８】
【表５】
2019515904.tif 000007
【０１３９】
【表６】
2019515904.tif 000008
【０１４０】
イムノコンジュゲートのアーミング
一部の実施形態では、放射性核種、放射性同位体または例えば毒素などの他の実体は、本開示のイムノコンジュゲートに結合させられる。一部の実施形態では、放射性核種をイムノコンジュゲートに連結させるためには二官能性キレート剤が利用される。１つの実施形態では、キレート剤は最初にイムノコンジュゲートに付着させられ、キレート剤−イムノコンジュゲートは金属放射性同位体と接触させられるので、したがって放射性核種または放射性同位体にさらにコンジュゲート化したイムノコンジュゲートに達する。タンパク質に放射性核種をコンジュゲート化させる方法は、米国特許第４，８２４，６５９号、同第５，５７４，１４０号および米国特許出願公開第２００４０１３６９０８Ａ１号に開示されている。
【０１４１】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートへの分子のコンジュゲート化は、ＦｃもしくはＦＶＩＩ領域のリシンまたはシステイン残基を介して実施されてよい。１つの実施形態では、アーミング分子は、イムノコンジュゲートのＦｃ領域のリシンまたはシステイン残基でイムノコンジュゲートにコンジュゲート化される。１つの実施形態では、コンジュゲート化は、Ｆｃ二量体のＦｃ単量体の一方でのみ発生する。１つの実施形態では、コンジュゲート化は、Ｆｃ二量体のＦｃ単量体の両方で発生し、イムノコンジュゲートにコンジュゲート化された複数のアーミング分子を生じさせる。１つの実施形態では、アーミング分子は、リシンまたはシステイン残基でイムノコンジュゲートのＦＶＩＩにコンジュゲート化される。
【０１４２】
一部の実施形態では、二官能性キレート剤には、以下のアミノ酸のジチレントリアミン（dithylenetriamine）五酢酸（ＤＴＰＡ）シリーズ、ヒドロキサム酸をベースとする二官能性キレート剤、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−オクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−六酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ＮＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２−ベンジル−ＤＴＰＡのモノメチルまたはシクロヘキシルアナログ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、大環状ポリエーテル、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ポリオキシムおよびチオセミカルバゾンが含まれる。
【０１４３】
一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、細胞毒性剤にコンジュゲート化される。本明細書で使用する用語「細胞毒性剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止する、および／または細胞の崩壊を誘発する物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、６０ＣｏおよびＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、アルキル化剤ならびに毒素、例えばそれらの合成アナログおよび誘導体を含む、低分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素を含むことが意図されている。
【０１４４】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートにコンジュゲート化された、例えば細胞毒性剤、抗血管新生薬、プロアポトーシス剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素または他の作用物質などの治療薬を使用することができる。有用な薬物は、抗有糸分裂薬、抗キナーゼ薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、アルカロイド剤、抗血管新生薬、プロアポトーシス剤およびそれらの組合わせからなる群から選択される医薬上の特性を有し得る。
【０１４５】
一部の実施形態では、光増感剤が本開示のイムノコンジュゲートにコンジュゲート化されてよい。一部の実施形態では、光増感剤は、光力学色素（標的組織を破壊できる光力学色素）、ヘマトポルフィリン剤、例えばジヘマトポルフィリンエーテルおよびそれらの二量体および三量体、アミノレブリン酸、ポルフィリン剤、例えばホウ素化ポルフィリン剤およびベンゾポルフィリン、メロシアニン、ポルフィセン、ポルフィマーナトリウム、ベルテポルフィン、VYSUDINE,CIBA VISION, PHOTOFRIN II、ＰＨ−１０、コリン類、亜鉛フタロシアニン、プルプリン、フェノホルヒド、ＳｎＣｅ６およびモノクローナル抗体−色素コンジュゲートから選択され得る。全てが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９３，０９３号、同第６，４４３，９７６号、同第４，９６８，７１５号、同第５，１９０，９６６号、同第５，０２８，６２１号、同第４，８６６，１６８号、同第４，６４９，１５１号、同第５，４３８，０７１号、同第５，０７９，２６２号、同第４，８８３，７９０号、同第４，９２０，１４３号、同第５，０９５，０３０号、同第５，１７１，７４９号、同第５，１７１，７４１号、同第５，１７３，５０４号、同第５，１６６，１９７号、同第５，１９８，４６０号、同第５，００２，９６２号および同第５，０９３，３４９号を参照されたい。一部の実施形態では、標的光力学的療法（ＰＤＴ）は、コンジュゲート化光増感剤を活性化するため、したがって最近位にある細胞を脆弱化／溶解させるために利用される。１つの実施形態では、ＰＤＴは、非熱的レーザーを備える光増感剤を活性化する。
【０１４６】
一部の実施形態では、有用な薬剤は、５−フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラブブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウロルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、エトポシドリン酸塩、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質転移酵素阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、レノリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトテン、ナベルビン、ニトロソ尿素、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形）、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、メイタンシノイド、メイタンシノイドアナログ、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ１０６５アナログ、デュオカルマイシン、デュオカルマイシンアナログ、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチンアナログ、オーリスタチン、トメイマイシン誘導体およびレプトマイシン誘導体を含み得る。
【０１４７】
一部の実施形態では、有用な毒素には、リシン、アブリン、α毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えば、オンコナーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcal）エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス属（Pseudomonas）外毒素およびシュードモナス属（Pseudomonas）内毒素を含み得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、有用なケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＰ−１０を含み得る。
【０１４９】
一部の実施形態では、抗血管新生薬、例えばアンジオスタチン、バキュロスタチン、カンスタチン、マスピン、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｐ１ＧＦペプチドおよび抗体、抗血管成長因子抗体、抗Ｆｌｋ−１抗体、抗Ｆｌｔ−１抗体およびペプチド、抗Ｋｒａｓ抗体、抗ｃＭＥＴ抗体、抗ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子）抗体、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン−１２、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−Ｂ、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキサミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット、ペントサンポリサルフェート、アンジオポイエチン−２、インターフェロン−α、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド（ロキノミメックス）、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンが有用であり得る。
【０１５０】
一部の実施形態では、有用な免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチンおよびそれらの組合わせから選択され得る。特に有用であるのは、リンホトキシン、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、例えばインターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン、例えばインターフェロンα、βまたはγおよび幹細胞成長因子、例えば「Ｓｉ因子」と名付けられた因子である。サイトカインに特に含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板成長因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポイエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−βおよび−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子およびＬＴである。
【０１５１】
一部の実施形態では、本開示のイムノコンジュゲートは、ＩＬ−１５と共投与される。
【０１５２】
一部の実施形態では、有用な放射性核種または放射性同位体には、γ線エミッター、β線エミッター、α線エミッター、ポジトロンエミッターおよびそれらの２つ以上の組合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、有用な放射性核種には、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１３７Ｂａ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６０Ｃｏ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、１３７Ｃｓ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが含まれるがそれらに限定されない。
【０１５３】
一部の実施形態では、放射性核種は、好ましくは、オージェエミッターについては２０〜６，０００ｋｅＶの範囲内、好ましくは６０〜２００ｋｅＶ、β線エミッターについては１００〜２，５００ｋｅＶ、γ線エミッターについては２０〜４，０００ｋｅＶおよびα線エミッターについては４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲内の崩壊エネルギーを有する。有用なβ粒子放射性核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶおよび最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。さらに好ましいのは、オージェ放射粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種である。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２。有用なβ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶおよび最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。さらに好ましいのは、α粒子を生成しながら実質的に崩壊する放射性核種である。そのような放射性核種には：Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が含まれるがそれらに限定されない。有用なα粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶおよび最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
【０１５４】
一部の実施形態では、追加の有用な放射性核種には、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３Ｉｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどがふくまれる。一部の有用な診断用放射性核種には、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４Ｔｃ、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃまたは１１１Ｉｎが含まれる。
【０１５５】
一部の実施形態では、有用な治療薬には、光活性剤または光活性染料を含み得る。例えば蛍光色素および他の色原体などの蛍光組成物または例えば可視光に感受性であるポルフィリンなどの色素は、好適な光線を病変に方向付けることによって病変を検出および治療するために使用されてきた。療法では、これは光線照射、光線療法または光力学的療法と呼ばれてきた。Jori et al.(eds.),Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases(Libreria Progetto 1985);van den Bergh,Chem.Britain(1986),22:430を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体は、光線療法を達成するために光活性化色素と結合されてきた。Mew et al.,J.Immunol.(1983),130:1473;idem.,Cancer Res.(1985),45:4380;Oseroff et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744;idem.,Photochem.Photobiol.(1987),46:83;Hasan et al.,Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471;Tatsuta et al.,Lasers Surg.Med.(1989),9:422;Pelegrin et al.,Cancer(1991),67:2529を参照されたい。
【０１５６】
一部の実施形態では、有用な他の治療薬には、オリゴヌクレオチド、例えばｂｃｌ−２またはｐ５３などの癌遺伝子および癌遺伝子産物に対して向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを含み得る。１つの実施形態では、治療用オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡである。
【０１５７】
一部の実施形態では、例えば細胞毒性剤、抗血管新生薬、プロアポトーシス剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬剤、プロドラッグ、毒素、酵素または他の作用物質などの治療薬は、リンカーによって本開示のイムノコンジュゲートに連結できる、またはコンジュゲート化できる。本明細書に開示したリンカーは、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号、同第２００９／０２７４７１３号および国際公開第２００９／０１３４９７６号に記載されている。
【０１５８】
１つの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、非切断可能なリンカー、親水性リンカーおよびジカルボン酸ベースのリンカーの群から選択され得る。好適なリンカーは当分野において公知であり、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基およびエステラーゼ不安定基を含み得る。リンカーは、さらに荷電リンカーおよびそれらの親水性形を含み得る。
【０１５９】
１つの実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノエート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングルコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群から選択され得る。所定の実施形態では、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である。
【０１６０】
本発明の方法
本明細書では、新血管新生に関連する疾患または障害（例えば、腫瘍関連性新血管新生、例えば癌）を有する患者を治療するための方法であって、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体を使用するための方法が提供される。本明細書に提供する方法は、アテローム硬化症、関節リウマチ、子宮内膜症、眼メラノーマ、固形腫瘍、原発性または転移性固形腫瘍（メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）および血管新生緑内障を含むがそれらに限定されない病理学的新血管新生に関連する疾患を有する患者を治療するために治療有効量の本明細書に提供された１つ以上のイムノコンジュゲート二量体を投与することを含む。本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。１つの実施形態では、任意の癌のために患者を治療するための方法が提供される。１つの実施形態では、眼メラノーマを治療するための方法が提供される。
【０１６１】
本明細書で使用する用語「患者」には、ヒトおよび他の哺乳動物種を含む他の種の両方が含まれる。したがって、本発明は、医学的用途および獣医学的用途の両方を有する。獣医学的組成物および治療においては、イムノコンジュゲートは、対応する種に由来するターゲティングドメインおよびエフェクタードメインを使用して構築される。
【０１６２】
１つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、眼メラノーマの治療を必要とする患者の眼に投与される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートの単量体は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、配列番号２、配列番号１２、配列番号３３および配列番号３４のターゲティングドメインを含む。１つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、眼メラノーマの転移を治療するために投与される。そのような転移には、眼に遠位で、すなわち、肝臓、肺、骨、皮膚、脳、リンパ節および副腎組織で発生する転移事象が含まれる。
【０１６３】
１つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、ウエット型ＡＭＤの治療を必要とする患者の眼に投与される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、配列番号２、配列番号１２、配列番号３３または配列番号３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。
【０１６４】
１つの実施形態では、ウエット型ＡＭＤを治療する方法は、治療を必要とする患者の眼における脈絡膜血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む。また別の実施形態では、脈絡膜血管新生は、治療前の患者の罹患した眼中に存在した脈絡膜血管新生と比較して、治療後に少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％逆転させられる。
【０１６５】
眼の血管新生に関連する他の眼の障害は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートおよび方法を用いると治療可能である。１つの実施形態では、眼の血管新生は、脈絡膜血管新生である。また別の実施形態では、眼の血管新生は、網膜血管新生である。さらにまた別の実施形態では、眼の血管新生は、角膜血管新生である。さらにまた別の実施形態では、眼の血管新生は、腫瘍関連性の眼の血管新生である。したがって、１つの実施形態では、脈絡膜、網膜または角膜血管新生に関連する眼の障害は、本明細書に提供した方法の１つ以上によって治療可能である。さらにまた別の実施形態では、本方法は、それを必要とする患者の眼に、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の１つを投与することを含む。また別の実施形態では、本治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、配列番号１２、配列番号３３または配列番号３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。さらにまた別の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、配列番号１３〜１８のヒトＩｇＧ１領域にコンジュゲート化した配列番号２の変異ＦＶＩＩドメインを含む。コンジュゲート化は、１つの実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ領域、例えば配列番号８〜１１および１９〜２５の配列を介してである。また別の実施形態では、コンジュゲート化は、ＧＳＡ、ＧＧＧもしくはＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカーまたはそれらのリピートを介してである。
【０１６６】
例えば、１つの実施形態では、増殖性糖尿病性網膜症、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、または血管新生緑内障の治療を必要とする患者は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートの１つを用いて、例えば、罹患した眼中へのイムノコンジュゲートの硝子体内注射、脈絡膜上注射または局所投与（例えば、点眼剤による）を介して治療される。１つの実施形態では、治療は複数回の投与セッションにわたり行われる。上述の障害に関連して、眼の血管新生は、各障害と「関連する」または「続発性である」と言うべきである。
【０１６７】
１つの実施形態では、網膜上膜閉塞症（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫の治療を必要とする患者は、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体の１つによって治療される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、２、１２、３３または３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与を介して投与される。
【０１６８】
また別の実施形態では、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）の治療を必要とする患者は、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体の１つによって治療される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、２、１２、３３または３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与によって投与される。いっそうまた別の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、各投与セッション時に硝子体内投与される。
【０１６９】
さらにまた別の実施形態では、糖尿病性網膜症は、本明細書に提供したイムノコンジュゲートの１つによって、それを必要とする患者に、例えばＤＭＥを有する患者において治療される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、２、１２、３３または３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与によって投与される。いっそうまた別の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、患者に複数回の投与セッションにわたり、例えば、各投与セッション時に硝子体内投与によって投与される。
【０１７０】
本明細書に記載した１つの実施形態では、本明細書に提供した１つ以上のイムノコンジュゲートは、それを必要とする患者、例えば、癌患者における腫瘍血管新生に関連する疾患または障害を治療するための方法において使用される。１つの実施形態では、本方法は、患者に、例えば腫瘍内または静脈内注射によって、本明細書に記載した治療有効量のイムノコンジュゲート二量体を含む組成物を投与することを含む。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、２、１２、３３または３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。
【０１７１】
癌の治療においては、イムノコンジュゲート二量体は、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含むがそれらに限定されない様々な癌、特に原発性または転移性固形腫瘍を治療するために使用される。１つの実施形態では、癌は、婦人科癌である。また別の実施形態では、婦人科癌は、漿液性癌、明細胞癌、類内膜または未分化卵巣癌である。１つの実施形態におけるイムノコンジュゲート二量体は、腫瘍血管構造、特に血管内皮細胞および／または腫瘍細胞を標的とするために使用される。理論によって拘束することを望まなくても、腫瘍血管構造を標的とすることは、以下のように、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の１つ以上を用いる癌免疫療法の複数の利点を提供できる。（ｉ）組織因子を含む血管標的の一部は全腫瘍にとって同一であるはずである；（ｉｉ）血管構造に標的化されるイムノコンジュゲートは、それらの標的に到達するために腫瘤に浸潤する必要がない；（ｉｉｉ）腫瘍血管構造の標的化は、各血管がその生存性が血管の機能的完全性に依存する極めて多数の腫瘍細胞に栄養分を与えるために、増幅した治療応答を生成するはずである；および（ｉｖ）血管構造は、血管を内張りしている全内皮層の修飾を必要とするであろうために、イムノコンジュゲートへの耐性を発生する可能性が低い。以前に記載された新規血管増殖を阻害する抗血管形成法とは異なり、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、新生血管構造に対する細胞溶解反応を引き出す。
【０１７２】
また別の実施形態では、本明細書に記載した１つ以上のイムノコンジュゲートは、アテローム硬化症または関節リウマチを治療するための方法において使用される。１つの実施形態では、治療は、本イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、２、１２、３３または３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８および／または配列番号２６のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。
【０１７３】
イムノコンジュゲート二量体を用いて例えば眼メラノーマなどの眼の障害を治療するための方法、例えば、ウエット型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫またはウエット型ＡＭＤなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法の１つの実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値における１５文字未満の消失によって測定されるように、治療（例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション）後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の消失文字数は、治療を受ける前の患者のＢＣＶＡ測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値において１０文字未満、８文字未満、６文字未満または５文字未満である。
【０１７４】
イムノコンジュゲート二量体を用いて例えば眼の障害を治療するための方法、例えば、眼メラノーマ、ウエット型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、腫瘍関連性新血管新生またはウエット型ＡＭＤなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法のまた別の実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値における１５文字以上の獲得によって測定されるように、治療（例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション）後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のＢＣＶＡ測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値において約１５文字以上、約２０文字以上または約２５文字以上である。いっそうさらに別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のＢＣＶＡ測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値において約１５〜約３０文字、約１５文字〜約２０文字、約１５文字〜約２０文字である。
【０１７５】
イムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼の障害を治療するための方法、例えば、ウエット型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または例えば本明細書に提供したウエット型ＡＭＤなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法の１つの実施形態では、眼の血管新生領域、例えば患者の眼の脈絡膜血管新生の領域は、治療前の眼の血管新生（例えば、ＣＮＶ領域）と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は１回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、１つの実施形態では眼の血管新生領域（例えば、ＣＮＶ領域）の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、眼の血管新生領域（例えば、ＣＮＶ領域）は、フルオレセイン血管造影法によって測定して少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％減少させられる。
【０１７６】
イムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼の障害を治療するための方法、例えば、ウエット型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または例えばウエット型ＡＭＤなどの眼の障害に続発性の脈絡膜血管新生を治療するための方法の１つの実施形態では、治療される眼の網膜厚は、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）によって測定して、治療前の網膜厚と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は１回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、１つの実施形態では網膜厚の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、網膜厚は、ＯＣＴによって測定して少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％減少させられる。また別の実施形態では、減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚（ＣＳＴ）、減少した中心点厚（ＣＰＴ）または減少した中心窩厚（ＣＦＴ）である。
【０１７７】
本開示の方法の１つの実施形態では、患者は、１回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さと比較して、１回以上の投与セッションの後に眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さの減少を示す。また別の実施形態では、眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さとの減少は、超音波、高分解能超音波生体顕微鏡検査法、磁気共鳴イメージング法および／またはコンピューター横断断層撮影法によって測定される。
【０１７８】
本開示の方法の１つの実施形態では、患者は、１回以上の投与セッションの前の網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および／または液体貯留と比較して、１回以上の投与セッションの後に網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および／または液体貯留の減少を示す。また別の実施形態では、腫脹および／または液体貯留の減少は、眼干渉断層撮影法によって測定される。
【０１７９】
本開示の方法の１つの実施形態では、患者は、１回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さと比較して、１回以上の投与セッションの後には眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さの減少を示す。さらに別の実施形態では、この減少は、蛍光眼底血管造影法またはインドシアニングリーン血管造影法によって測定される。
【０１８０】
本開示の方法の１つの実施形態では、１回以上の投与セッションの前の虹彩絞りのサイズおよび／または数と比較して、１回以上の投与セッションの後に虹彩絞りのサイズおよび／または数の減少を示す。さらにまた別の実施形態では、この減少は、隅角鏡、細隙灯生体顕微鏡および／または検眼鏡によって測定される。
【０１８１】
本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、病理学的新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。例えば、１つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体は、眼メラノーマの治療を必要とする患者の眼に投与される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲート二量体の複数回の投与セッションを含む。全体を通して提供されるように、イムノコンジュゲート二量体は、それぞれがヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）Ｆｃドメインにコンジュゲート化された変異ヒト第ＦＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）タンパク質を含む単量体単位を含む。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４または５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号４のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。また別の特定の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体の単量体単位は、配列番号１、２、１２、３３または３４のターゲティングドメインを含み、配列番号１３〜１８および２６〜３２のエフェクタードメイン（ヒンジ領域を含む）を含む。
【０１８２】
１つの実施形態では、眼メラノーマを治療する方法は、治療を必要とする患者の眼における腫瘍関連性新血管新生を予防する、阻害する、または逆転させることを含む。また別の実施形態では、新血管新生は、治療前の患者の罹患した眼中に存在した脈絡膜血管新生と比較して、治療後に少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％逆転させられる。
【０１８３】
イムノコンジュゲート二量体を用いて眼メラノーマなどの眼の障害を治療するための方法の１つの実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値における１５文字未満の消失によって測定されるように、治療（例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション）後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の消失文字数は、治療を受ける前の患者のＢＣＶＡ測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値において１０文字未満、８文字未満、６文字未満または５文字未満である。
【０１８４】
イムノコンジュゲート二量体を用いて眼メラノーマを治療するための方法のまた別の実施形態では、本治療方法を受ける患者は、治療を受ける前の患者の最良矯正視力（ＢＣＶＡ）測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値における１５文字以上の獲得によって測定されるように、治療（例えば、単回投与セッションもしくは複数回の投与セッション）後には彼または彼女の視力を実質的に維持する。また別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のＢＣＶＡ測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値において約１５文字以上、約２０文字以上または約２５文字以上である。いっそうさらに別の実施形態では、患者の獲得文字数は、治療を受ける前の患者のＢＣＶＡ測定値と比較して、ＢＣＶＡ測定値において約１５〜約３０文字、約１５文字〜約２０文字、約１５文字〜約２０文字である。
【０１８５】
本明細書に提供したイムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼メラノーマを治療するための１つの実施形態では、患者の眼の血管新生領域は、治療前の眼の血管新生領域と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は１回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、１つの実施形態では眼の血管新生領域（例えば、ＣＮＶ領域）の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、眼の血管新生領域（例えば、ＣＮＶ領域）は、蛍光眼底血管造影法によって測定して少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％減少させられる。
【０１８６】
イムノコンジュゲート二量体を用いてそれを必要とする患者の眼における眼メラノーマを治療するための方法の１つの実施形態では、治療される眼の網膜厚は、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）によって測定して、治療前の網膜厚と比較して、患者の眼において減少させられる。本明細書で提供するように、治療は１回の投与セッションまたは複数回の投与セッションを含むことができ、１つの実施形態では網膜厚の減少は、個別投与セッションまたは複数回の投与セッション後に評価される。また別の実施形態では、網膜厚は、ＯＣＴによって測定して少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％減少させられる。また別の実施形態では、減少した網膜厚は、減少した網膜中心部分体厚（ＣＳＴ）、減少した中心点厚（ＣＰＴ）または減少した中心窩厚（ＣＦＴ）である。
【０１８７】
本開示の方法の１つの実施形態では、患者は、１回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さと比較して、１回以上の投与セッションの後に眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さの減少を示す。また別の実施形態では、眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さとの減少は、超音波、高分解能超音波生体顕微鏡検査法、磁気共鳴イメージング法および／またはコンピューター横断断層撮影法によって測定される。
【０１８８】
本開示の方法の１つの実施形態では、患者は、１回以上の投与セッションの前の網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および／または液体貯留と比較して、１回以上の投与セッションの後に網膜もしくは脈絡膜の下方の腫脹および／または液体貯留の減少を示す。また別の実施形態では、腫脹および／または液体貯留の減少は、眼干渉断層撮影法によって測定される。
【０１８９】
本開示の方法の１つの実施形態では、患者は、１回以上の投与セッションの前の眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さと比較して、１回以上の投与セッションの後には眼メラノーマのサイズ、容積および／または厚さの減少を示す。さらに別の実施形態では、この減少は、蛍光眼底血管造影法またはインドシアニングリーン血管造影法によって測定される。
【０１９０】
本開示の方法の１つの実施形態では、１回以上の投与セッションの前の虹彩絞りのサイズおよび／または数と比較して、１回以上の投与セッションの後に虹彩絞りのサイズおよび／または数の減少を示す。さらにまた別の実施形態では、この減少は、隅角鏡、細隙灯生体顕微鏡および／または検眼鏡によって測定される。
【０１９１】
１つの実施形態では、固形腫瘍は、本開示のイムノコンジュゲートを用いて、本イムノコンジュゲートの全身性投与を用いて治療される。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートの全身性投与は、近付きがたい固形腫瘍を考慮して局所投与よりも優先される。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは全身性および局所的両方で投与される。
【０１９２】
他の実施形態では、本発明のイムノコンジュゲートは、ＴＦの異所性発現が観察される任意の疾患または障害において使用するために適用できる。例えば、１つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、ＴＦ発現性グリオーマの治療を必要とする患者に投与される。
【０１９３】
一部の実施形態では、本明細書に提供されるイムノコンジュゲートは、新血管新生が関与する任意の疾患または障害において使用するために適応できる。例えば、１つの態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、ウエット型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療を必要とする患者の眼に投与される。また別の態様では、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、眼メラノーマの治療を必要とする患者の眼に投与される。１つの実施形態では、治療は、イムノコンジュゲートの複数回の投与セッションを含む。
【０１９４】
癌の治療における一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、メラノーマ、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、膵臓癌、膀胱癌、子宮内膜癌および肺癌を含む様々な癌、特に原発性または転移性固形腫瘍を治療するために使用される。一部の実施形態では、本イムノコンジュゲートは、さらに次の癌：ユーイング腫瘍、ウィルムス腫瘍、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、甲状腺癌、胸腺癌、精巣癌、胃癌、小腸癌、メルケル細胞癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血漿、軟部組織肉腫、唾液腺癌、横紋筋肉腫、網膜芽腫、前立腺癌、下垂体癌、陰茎癌、膵臓癌、グリオーマ、婦人科癌（漿液癌、明細胞癌、子宮内膜癌、未分化卵巣癌）、骨肉腫、中咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、鼻咽頭癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、肺癌（小細胞性、非小細胞性、カルチノイド腫瘍）、肝臓癌、白血病（急性リンパ球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性単球性）、咽頭癌、下咽頭癌、腎臓癌、カポジ肉腫、ホジキン病、妊娠絨毛性疾患、胃腸腫瘍（間質腫瘍、カルチノイド腫瘍）、胆嚢癌、眼癌、食道癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、乳癌、脳腫瘍、ＣＮＳ、骨肉腫、膀胱癌、胆管癌、肛門癌および副腎癌を治療するために使用される。
【０１９５】
１つの実施形態では、癌は、婦人科癌である。また別の実施形態では、婦人科癌は、漿液性癌、明細胞癌、類内膜または未分化卵巣癌である。
【０１９６】
１つの実施形態におけるイムノコンジュゲートは、腫瘍血管構造、特に血管内皮細胞および／または腫瘍細胞を標的とするために使用される。理論によって拘束することを望まなくても、腫瘍血管構造を標的とすることは、以下のように、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体の１つ以上を用いる癌免疫療法の複数の利点を提供する：（ｉ）組織因子を含む血管標的の一部は全腫瘍にとって同一であるはずである；（ｉｉ）血管構造に標的化されるイムノコンジュゲートは、それらの標的に到達するために腫瘤に浸潤する必要がない；（ｉｉｉ）腫瘍血管構造の標的化は、各血管がその生存性が血管の機能的完全性に依存する極めて多数の腫瘍細胞に栄養分を与えるために、増幅した治療応答を生成するはずである；および（ｉｖ）血管構造は、血管を内張りしている全内皮層の修飾を必要とするであろうために、イムノコンジュゲートへの耐性を発生する可能性が低い。以前に記載された新規血管増殖を阻害する抗血管形成法とは異なり、本明細書に提供したイムノコンジュゲートは、新生血管構造に対する細胞溶解反応を引き出す。
【０１９７】
製剤、用法および用量
本明細書では、本イムノコンジュゲートまたはイムノコンジュゲートを含む組成物のための用法および用量の実施形態が提供される。一部の実施形態では、投与は、療法に関係する病理学的状態のタイプに依存して、局所的または全身性であってよい。
【０１９８】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲートは、液剤または懸濁剤として投与される。１つの実施形態におけるイムノコンジュゲート二量体は、アルギニンまたはプロテインＡを含む。また別の実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、アルギニンを含む。いっそうまた別の実施形態では、アルギニンは、組成物中に約２０ｍＭ〜約４０ｍＭ、例えば２５ｍＭで存在する。１つの実施形態における組成物の他の成分は、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム、ポリソルベート−８０、塩化カルシウムまたはそれらの組合わせを含んでいた。１つの実施形態では、ヒスチジンが存在する。
【０１９９】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、１μｇ〜１５００μｇの用量で投与される。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、１０μｇ〜６００μｇ、１０μｇ〜５００μｇ、１０μｇ〜４００μｇ、１０μｇ〜３００μｇ、１０μｇ〜２００μｇ、１０μｇ〜１００μｇ、１０μｇ〜５０μｇ、５０μｇ〜６００μｇ、５０μｇ〜５００μｇ、５０μｇ〜４００μｇ、５０μｇ〜３００μｇ、５０μｇ〜２００μｇ、５０μｇ〜１００μｇ、１００μｇ〜６００μｇ、１００μｇ〜５００μｇ、１００μｇ〜４００μｇ、１００μｇ〜３００μｇ、１００μｇ〜２００μｇ、２００μｇ〜６００μｇ、２００μｇ〜５００μｇ、２００μｇ〜４００μｇ、２００μｇ〜３００μｇ、３００μｇ〜５００μｇ、３００μｇ〜４００μｇまたは４００μｇ〜５００μｇの用量で投与される。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、３００μｇの単回投与で投与される。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、各３００μｇの複数回投与で投与される。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、６００μｇの単回投与で投与される。１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、各６００μｇの複数回投与で投与される。
【０２００】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、約１μｇ、１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１２５μｇ、約１５０μｇ、約１７５μｇ、約２００μｇ、約２２５μｇ、約２５０μｇ、約２７５μｇ、約３００μｇ、約３２５μｇ、約３５０μｇ、約３７５μｇ、約４００μｇ、約４２５μｇ、約４５０μｇ、約４７５μｇ、約５００μｇ、約５２５μｇ、約５５０μｇ、約５７５μｇ、約６００μｇ、約６２５μｇ、約６５０μｇ、約６７５μｇ、約７００μｇ、約７２５μｇ、約７５０μｇ、約７７５μｇ、約８００μｇ、約８２５μｇ、約８５０μｇ、８７５μｇ、約９００μｇ、約９２５μｇ、約９５０μｇ、約９７５μｇ、約１０００μｇ、約１１００μｇ、約１２００μｇ、約１３００μｇ、約１４００μｇまたは約１５００μｇからなる用量で投与される。
【０２０１】
一部の実施形態では、単回用量のイムノコンジュゲート二量体が投与される。一部の実施形態では、２回以上の用量のイムノコンジュゲート二量体が投与される。典型的な実施形態では、各３００μｇの２回の投与が、１週間（７日間）の間隔を空けて投与される。典型的な実施形態では、各６００μｇの２回の投与が、１週間（７日間）の間隔を空けて投与される。
【０２０２】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、１０μＬ〜２００μＬ、１０μＬ〜１８０μＬ、１０μＬ〜１６０μＬ、１０μＬ〜１４０μＬ、１０μＬ〜１２０μＬ、１０μＬ〜１００μＬ、１０μＬ〜８０μＬ、１０μＬ〜６０μＬ、１０μＬ〜４０μＬ、１０μＬ〜２０μＬ、１０μＬ〜１５μＬ、２０μＬ〜２００μＬ、２０μＬ〜１８０μＬ、２０μＬ〜１６０μＬ、２０μＬ〜１４０μＬ、２０μＬ〜１２０μＬ、２０μＬ〜１００μＬ、２０μＬ〜８０μＬ、２０μＬ〜６０μＬ、２０μＬ〜４０μＬ、４０μＬ〜２００μＬ、４０μＬ〜１８０μＬ、４０μＬ〜１６０μＬ、４０μＬ〜１４０μＬ、４０μＬ〜１２０μＬ、４０μＬ〜１００μＬ、４０μＬ〜８０μＬ、４０μＬ〜６０μＬ、６０μＬ〜２００μＬ、６０μＬ〜１８０μＬ、６０μＬ〜１６０μＬ、６０μＬ〜１４０μＬ、６０μＬ〜１２０μＬ、６０μＬ〜１００μＬ、６０μＬ〜８０μＬ、８０μＬ〜２００μＬ、８０μＬ〜１８０μＬ、８０μＬ〜１６０μＬ、８０μＬ〜１４０μＬ、８０μＬ〜１２０μＬ、８０μＬ〜１００μＬ、１００μＬ〜２００μＬ、１００μＬ〜１８０μＬ、１００μＬ〜１６０μＬ、１００μＬ〜１４０μＬ、１００μＬ〜１２０μＬ、１２０μＬ〜２００μＬ、１２０μＬ〜１８０μＬ、１２０μＬ〜１６０μＬ、１２０μＬ〜１４０μＬ、１４０μＬ〜２００μＬ、１４０μＬ〜１８０μＬ、１４０μＬ〜１６０μＬ、１６０μＬ〜２００μＬ、１６０μＬ〜１８０μＬまたは１８０μＬ〜２００μＬの溶質容積で投与される。
【０２０３】
１つの実施形態では、本イムノコンジュゲート二量体は、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、約３５μＬ、約４０μＬ、約４５μＬ、約５０μＬ、約５５μＬ、約６０μＬ、約６５μＬ、約７０μＬ、約７５μＬ、約８０μＬ、約８５μＬ、約９０μＬ、約９５μＬまたは約１００μＬからなる溶質容積で投与される。
【０２０４】
本発明の典型的な組成物は、下記の表３〜５に提供した。
【０２０５】
【表７】
2019515904.tif 000009
【０２０６】
【表８】
2019515904.tif 000010
【０２０７】
【表９】
2019515904.tif 000011
【０２０８】
特定の実施形態では、本製剤は、様々な濃度で、アルギニンを含み得る、もしくはヒスチジンを含み得る；またはアルギニンおよびヒスチジンを含み得る。本製剤は、追加して、または代わりに、他のアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体を含み得る。
【０２０９】
本明細書に提供した方法によって含まれる投与方法には、硝子体内注射、脈絡膜上注射、局所投与（例えば、点眼剤）、静脈内および腫瘍内投与または治療対象の状態もしくは疾患に依存して任意の他の方法が含まれるがそれらに限定されない。他の実施形態では、投与は、本イムノコンジュゲートもしくは複製欠損性アデノウイルスベクターまたは本イムノコンジュゲートの分泌形をコードするｃＤＮＡを運ぶ他のウイルスベクターの静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、滑液嚢内、眼内、プラーク内、クモ膜下もしくは皮内注射を介してである。１つの実施形態では、全身性投与は、非経口注射によって行われ得る。１つの実施形態では、治療を必要とする患者は、１つ以上のイムノコンジュゲートタンパク質の硝子体内、静脈内もしくは腫瘍内注射、または他の部位での注射によって１つ以上の融合タンパク質が投与される。または、１つの実施形態では、治療を必要とする患者は、１つ以上の融合タンパク質が、本明細書に提供した１つ以上の融合タンパク質の分泌形をコードするｃＤＮＡを運ぶ１つ以上の発現ベクターの静脈内もしくは腫瘍内注射、または他の部位での注射によって投与される。一部の実施形態では、患者は、有効量の１つ以上の複製欠損性アデノウイルスベクターまたは１つ以上のタイプのイムノコンジュゲートタンパク質の分泌形をコードするｃＤＮＡを運ぶ１つ以上のアデノ関連ベクターの静脈内または腫瘍内注射によって治療される。
【０２１０】
一部の実施形態では、１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの全身性投与は、静脈内、筋肉内、皮下または皮内注射によって行われ得る。一部の実施形態では、本明細書で利用される全身性投与は、必要とする患者への本開示の物質の投与であって、その物質が循環系に進入し、必要とする患者の全身内に分散する投与である。１つの実施形態では、本開示の物質の全身性投与には、物質の血液脳関門を越えた分布が含まれる。
【０２１１】
１つの実施形態では、硝子体内注射の方法が使用される。また別の実施形態では、注射のために１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートを調製する場合には、滅菌手袋、滅菌ドレープおよび滅菌眼瞼検鏡（または同等物）の使用によって、無菌技術が使用される。１つの実施形態では、患者は、注射前に麻酔および広域殺菌剤を受ける。
【０２１２】
本明細書に提供したイムノコンジュゲートの１つ以上の硝子体内注射は、１ｃｃのツベルクリンシリンジに取り付けられた５μの１９ゲージフィルターニードルを通してイムノコンジュゲート組成物溶液のウイルス含量を抜き出すことによって調製される。また別の実施形態におけるフィルターニードルは、その後廃棄され、硝子体内注射のための滅菌３０ゲージ×１／２インチニードルと置換される。ウイルスの含量は、プランジャーチップが送達のために適切な容量をマークするシリンジ上のラインと整列させられるまで排出される。
【０２１３】
また別の実施形態では、本明細書に提供した治療方法は、複数回の投与セッションを含む。さらに別の実施形態では、複数回の投与セッションは、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの１つの複数回の眼内注射である。１つの実施形態での複数回の投与セッションは、２回以上、３回以上、４回以上または５回以上の投与セッションを含む。また別の実施形態では、各投与セッションは、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの１つの眼内注射、または本明細書に記載したイムノコンジュゲートの１つの腫瘍内注射（すなわち、発現したタンパク質として、または可溶性融合タンパク質をコードするベクターによってのいずれかで）を含む。また別の実施形態では、上記の２回以上、３回以上、４回以上または５回以上の投与セッションのそれぞれは、全身性投与を含み得る。
【０２１４】
１つの実施形態では、約２回〜約２４回の投与セッション、例えば、約２回〜約２４回の眼内投与セッション（例えば、硝子体内注射または脈絡膜上注射）が使用される。さらに別の実施形態では、約３回〜約３０回、または約５回〜約３０回、または約７回〜約３０回、または約９回〜約３０回、または約１０回〜約３０回、または約１２回〜約３０回の投与セッションが使用される。
【０２１５】
複数回の投与セッションが使用される１つの実施形態では、投与セッションは、約１０日間〜約６０日間、または約１０日間〜約５０日間、または約１０日間〜約４０日間、または約１０日間〜約３０日間、または約１０日間〜約２０日間の間隔を空けて投与される。複数回の投与セッションが使用されるまた別の実施形態では、各投与セッションは、約２０日間〜約６０日間、または約２０日間〜約５０日間、または約２０日間〜約４０日間、または約２０日間〜約３０日間の間隔を空けている。いっそうまた別の実施形態では、複数回の投与セッションは、隔週に１回（例えば、約１４日間毎）、月１回（例えば、約３０日間毎）、または隔月に１回（例えば、約６０日間毎）である。さらにまた別の実施形態では、投与セッションは、約２８日の間隔を空けている。
【０２１６】
共投与
一部の実施形態では、本明細書に記載したイムノコンジュゲートは、上述の疾患または障害の１つに対して患者を治療するため、例えば、ウエット型ＡＭＤまたは新血管新生に関連するまた別の眼の疾患を治療するために共治療レジメンで投与される。本方法は、第２活性剤の（併用または非併用のいずれかの）投与を含む。１つの実施形態では、第２活性剤は、イムノコンジュゲートと同一組成物中で投与される。しかし、別の実施形態では、第２活性剤は、別個の組成物中で投与される。１つの実施形態では、第２活性剤は、新血管新生阻害剤、血管形成阻害剤または癌化学療法薬である。１つの実施形態では、第２活性剤は、チェックポイント阻害剤（抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ１／ＰＤＬ１）である。また別の実施形態では、第２活性剤は、免疫療法薬／免疫療法である。
【０２１７】
１つの実施形態では、第２活性剤は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）阻害剤またはＰＤＧＦ受容体阻害剤である。
【０２１８】
また別の実施形態では、新血管新生阻害剤である第２活性剤は、インテグリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、接着分子アンタゴニスト（例えば、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、血小板内皮細胞接着分子（ＰＣＡＭ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ））、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１））、塩基性線維芽細胞増殖因子アンタゴニスト、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）モデュレーターまたは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）モデュレーター（例えば、ＰＤＧＦアンタゴニスト）である。患者がインテグリンアンタゴニストに応答する可能性が高いかどうかを決定する１つの実施形態では、インテグリンアンタゴニストは、低分子インテグリンアンタゴニスト、例えば、Paolillo et al.（全体として参照により本明細書に組み込まれるMini Rev Med Chem,2009,volume 12,pp.1439-1446）によって記載されたアンタゴニスト、またはその全体として本明細書に参照により組み込まれる米国特許第６，５２４，５８１号に記載された白血球接着誘導性サイトカインもしくは成長因子アンタゴニスト（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）および血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ））である。
【０２１９】
また別の実施形態では、新血管新生阻害剤である第２活性剤は、次の血管形成阻害剤：インターフェロンγ１β、ピルフェニドンを含むインターフェロンγ１β（Actimmune（登録商標））、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、アプリジン、サルビアおよびチョウセンゴミシ（schisandra chinensis）を含むレンゲ属（astragalus）膜性円板抽出物および、アテローム硬化症性プラークブロッカー、アゾール、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織成長因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、Esbriet、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、ヘベロンαＲ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、ミクロＲＮＡ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ１７を含むＰＹＮ２２、レリベルゲン、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、トランスフォーミング成長因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド、ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５またはそれらの組合わせの１つ以上である。
【０２２０】
また別の実施形態では、第２活性剤は、内因性血管形成阻害剤である。また別の実施形態では、内因性血管形成阻害剤は、エンドスタチン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン由来の２０ｋＤａのＣ末端断片、アンジオスタチン（プラスミンの３８ｋＤａ断片）またはタンパク質のトロンボスポンジン（ＴＳＰ）ファミリーのメンバーである。また別の実施形態では、血管形成阻害剤は、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４およびＴＳＰ−５である。次の血管形成阻害剤：可溶性ＶＥＧＦ受容体、例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−１およびニューロピリン１（ＮＰＲ１）、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、バソスタチン、カルレチキュリン、血小板因子−４、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４）、軟骨由来血管形成阻害剤（例えば、ペプチドトロポニンＩおよびクロノドモデュリンＩ）、トロンボスポンジンモチーフ１を備えるジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケモカイン、例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを有するケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、さらにインターフェロンγ誘導性タンパク質１０または小誘導性サイトカインＢ１０）、インターロイキンサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）、プロトロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＴＮＦＳＦ１５遺伝子によってコードされたタンパク質、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質の１つ以上への応答の可能性を決定するための方法もまた提供される。
【０２２１】
１つの実施形態では、下記の新血管新生阻害剤：アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、トロンボスポンジン、カルレチキュリン、血小板因子４、ＴＩＭＰ、ＣＤＡＩ、インターフェロンα、インターフェロンβ、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＩ）ｍｅｔｈ−１、ｍｅｔｈ−２、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レスチン、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、インターフェロンγ１β、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、アプリジン、サルビアおよびチョウセンゴミシ（schisandra chinensis）を含むレンゲ属（astragalus）膜性円板抽出物および、アテローム硬化症性プラークブロッカー、アゾール、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織成長因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、Esbriet、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、ヘベロンαＲ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、ミクロＲＮＡ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、ピレスパ、ピルフェネックス、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ１７を含むＰＹＮ２２、レリベルゲン、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、トランスフォーミング成長因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド、ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５またはそれらの組合わせの１つ以上が、本明細書に記載したイムノコンジュゲートとともに投与される。
【０２２２】
さらにまた別の併用療法実施形態は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの１つと次の：パゾパニブ（Votrient）、スニチニブ（Sutent）、ソラフェニブ（Nexavar）、アキシチニブ（Inlyta）、ポナチニブ（Iclusig）、バンデタニブ（Caprelsa）、カボザンチニブ（Cometrig）、ベバシズマブ（Avastin）、ラムシルマブ（Cyramza）、レゴラフェニブ（Stivarga）、ジブ−アフリベルセプト（Zaltrap）またはそれらの組合わせの１つ以上との投与を含む。また別の実施形態では、血管形成阻害剤は、ＶＥＧＦ阻害剤である。また別の実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブまたはモテサニブである。１つの典型的な実施形態では、併用療法は、１アームドイムノコンジュゲート二量体（ＩＣＯＮ−１．５）とアフリベルセプトの投与を含む。
【０２２３】
他の実施形態では、追加の併用療法は、本明細書に記載したイムノコンジュゲートの１つと次の免疫チェックポイント阻害剤：イピリミウマブ、ニボルマン、ペンブロリズマブおよび腫瘍微小環境に影響を及ぼす他の分子の１つ以上との投与を含む。
【０２２４】
１つの実施形態では、血管形成阻害剤は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。また別の実施形態では、血管形成阻害剤は、ラニビズマブである。１つの典型的な実施形態では、併用療法は、１アームドイムノコンジュゲート二量体（ＩＣＯＮ−１．５）とラニビズマブの投与を含む。いっそうさらにまた別の実施形態では、ラニビズマブは、１投与セッションあたり０．５ｍｇまたは０．３ｍｇの用量で投与され、LUCENTISについての処方情報に規定されたように投与される。
【０２２５】
１つの実施形態では、併用療法は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーのアンタゴニスト、例えば、ＰＤＧＦ受容体（ＰＥＧＦＲ）のシグナル伝達および／または活性を阻害する、減少させる、もしくは調節する薬物の投与を含む。例えば、１つの実施形態におけるＰＤＧＦアンタゴニストは、抗ＰＤＧＦアプタマー、抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその断片、抗ＰＤＧＦＲ抗体もしくはその抗体または低分子アンタゴニストである。１つの実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βのアンタゴニストである。１つの実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、抗ＰＤＧＦ−βアプタマーＥ１００３０、スニチニブ、アキシチニブ、ソレフェニブ、イマチニブ、イマチニブメシレート、ニンテダニブ、パゾパニブＨＣｌ、ポナチニブ、ＭＫ−２４６１、ドビチニブ、パゾパニブ、クレノラニブ、ＰＰ−１２１、テラチニブ、イマチニブ、ＫＲＮ６３３、ＣＰ６７３４５１、ＴＳＵ−６８、Ｋｉ８７５１、アムバチニブ、チボザニブ、マシチニブ、モテサニブ二リン酸、ドビチニブ二乳酸、リニファニブ（ＡＢＴ−８６９）である。
【０２２６】
医薬組成物
本出願は、１種以上の医薬上許容される賦形剤とともに本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体のいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、無菌である。医薬組成物は、一般に有効量のイムノコンジュゲート二量体を含む。
【０２２７】
キットおよび製造品
本出願は、本明細書に記載したイムノコンジュゲート二量体を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、医薬上許容される賦形剤および取扱説明書をさらに含む。１つの特定の実施形態では、キットは、１種以上の医薬上許容される賦形剤とともに本明細書に記載した治療用組成物のいずれか１つ以上を含む。本出願は、本明細書に記載した治療用組成物またはキットのいずれか１つを含む製造品をさらに提供する。製造品の例には、バイアル（密閉バイアルを含む）が含まれる。
【０２２８】
本発明は、以下の実施例を参照することによってより十分に理解されるであろう。しかしそれらの実施例は、要求した本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載した実施例および実施形態は、例示するためにのみ記載されていると理解されている。
【実施例】
【０２２９】
実施例
本発明について、以下の実施例を参照しながら詳細に例示する。実施例は、上述した実施形態と同様に、例示することを目的としており、決して本発明の範囲を制限するものであると解釈すべきではない。
【０２３０】
実施例１
加齢性黄斑変性症に続発性のＣＮＶを有する患者におけるＩＣＯＮ−１．５の発現および精製
本試験では、ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートを発現させて精製した。哺乳動物ＣＨＯ−Ｓ細胞を利用して本発明に関連する様々な構築物を生成した。図８に示したように、構築物をＣＨＯ−Ｓ細胞内に共形質転換させ、細胞培養上清を収集し、本発明に関連するタンパク質、特に抗ＦＶＩＩ抗体および抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体に結合しているタンパク質の存在について評価した。
【０２３１】
トランスフェクション後の当日、細胞に適切な試薬を供給した。生存性が７０％〜８０％の間になったら、細胞上清を遠心分離およびデプス濾過によって収集した。
【０２３２】
次の上清をウェスタンブロット上で２回ずつランしたが、１回のランでは抗ＦＶＩＩに曝露させ、もう１回のランでは抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに曝露させた。レーン１は、変異ＦＶＩＩ−Ｆｃ（配列番号４）を含む構築物の純正トランスフェクション由来の上清を含むが、他方レーン２および３はそれぞれ、ＩｇＧ１の下方ヒンジに、その後に残りのＩｇＧ１配列（配列番号１３）に接続されたＧＧＳＳリンカー（配列番号１１）に融合した変異ＦＶＩＩ（配列番号１２）を含むＦＶＩＩ−Ｆｃの変異体４（ｖ４）を含む単独構築物だけを用いてトランスフェクトされている細胞由来の上清を有する。レーン４は、Ｖ４構築物およびＦｃ単独発現構築物（配列番号１３）である第２構築物を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン５は、Ｖ４構築物およびプロテインＡ突然変異を備えるＦｃを発現する第２構築物（配列番号１４）を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン６は、ホール構築物（しかしＦｃホール突然変異を特徴とするｖ４であり、ここで配列番号１３は配列番号１７と置換される）、およびプロテインＡおよびノブ突然変異を備えるＦｃを発現する第２構築物（配列番号１６）を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン７は、Ｖ４構築物およびノブ突然変異を備えるＦｃを発現する第２構築物（配列番号１５）を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン８は、ｖ４ノブ構築物（しかしＦｃホール突然変異を特徴とするｖ４であり、ここで配列番号１３は配列番号１５と置換される）、およびプロテインＡおよびホール突然変異を備えるＦｃを発現する第２構築物（配列番号１８）を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。レーン９は、Ｖ４ノブ構築物およびホール突然変異を備えるＦｃタンパク質を発現する第２構築物（配列番号１７）を用いて共トランスフェクトされた細胞由来の上清を含む。
【０２３３】
ウェスタンブロットは、１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートが、特にノブ−ホール突然変異Ｆｃヘテロ二量体を利用した細胞内で、２アームドイムノコンジュゲートより大量で発現することを証明した。
【０２３４】
イムノコンジュゲートは、図９において「単量体」と表示したＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートを含む優勢ピークを描出している図９によって証明されたように、サイズ排除クロマトグラフィーを通して上清から単離した。したがって、ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートを単離し、さらに細胞上清から精製することができる。
【０２３５】
実施例２
ＩＣＯＮ−１．５  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの特性解析
ＩＣＯＮ−１．５  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性について特性解析した。ＴＦを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系Ａ４３１（ATCC CRL-1555（商標）、Manassas, Virginia）由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した（１８種の異なる濃度の）タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Ｆｃ二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した（図３Ａ参照）。
【０２３６】
次にＩＣＯＮ−１．５  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート変異体は、免疫学的エフェクター細胞内で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化するために抗体に関してさらに特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット（カタログ番号Ｇ７０１８、Fitchburg, Wisconsin）を利用して抗体のＡＤＣＣ活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性ＮＦＡＴ応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のＦｃ領域との係合後、特異的ＦｃγＲを発現するＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてＮＦＡＴ媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる（図３Ｂ参照）。ＡＤＣＣアッセイにおいて利用された細胞系は、ＴＦを発現する細胞系であり、これはこれらがインビトロアッセイであることを前提にすると、血管構造が非存在である場合でさえ、１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートを備えるＡＤＣＣの明白な誘導であることを証明している。
【０２３７】
実施例３
ＩＣＯＮ−１．５  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート対ＩＣＯＮ−１  ２アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの生成収率
ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよびＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートは、別個の実験においてＣＨＯ−Ｓ哺乳動物細胞内で一過性で発現させた。ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートの生成収率は、ＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートの生成収率より１６倍高かった。
【０２３８】
実施例４
ＣＨＯ−Ｓ細胞由来イムノコンジュゲート内での１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート対２アームドイムノコンジュゲートのＩＣＯＮ−１．５結合および活性の特性解析
ＩＣＯＮ−１．５  １アームドイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性に関してＩＣＯＮ−１  ２アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。ＴＦを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系Ａ４３１（ATCC CRL-1555（商標）、Manassas, Virginia）由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した（１８種の異なる濃度の）タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なＡＦ４８８標識抗Ｆｃ二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した（図６Ａ参照）。結果は、ＩＣＯＮ−１．５がＩＣＯＮ−１と少なくとも同等に効果的に結合することを証明している。
【０２３９】
次にＩＣＯＮ−１．５  １アームドイムノコンジュゲートは、免疫学的エフェクター細胞内で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化する能力に関して、ＩＣＯＮ−１  ２アームドイムノコンジュゲートと一緒にさらに特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット（カタログ番号Ｇ７０１８、Fitchburg, Wisconsin）を利用して抗体のＡＤＣＣ活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性ＮＦＡＴ応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のＦｃ領域との係合後、特異的ＦｃγＲを発現するＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてＮＦＡＴ媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる（図６Ｂ参照）。結果は、ＩＣＯＮ−１．５がＡＤＣＣを活性化する能力においてＩＣＯＮ−１と同等の活性を示すことを証明している。ＡＤＣＣアッセイにおいて利用された細胞系は、ＴＦを発現する細胞系であり、これはこれらがインビトロアッセイであることを前提にすると、血管構造が非存在である場合でさえ、１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートを備えるＡＤＣＣの明白な誘導であることを証明している。
【０２４０】
実施例５
ＨＥＫ２９３細胞由来イムノコンジュゲート内での１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート対２アームドイムノコンジュゲートのＩＣＯＮ−１．５結合および活性の特性解析
ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列を含むＨＥＫ２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１  １アームドイムノコンジュゲートを抗体のセルベース結合親和性に関してＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列が欠如するＨＥＫ２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１．５  １アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。ＴＦを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系Ａ４３１（ATCC CRL-1555（商標）、Manassas, Virginia）由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した（１８種の異なる濃度の）タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Ｆｃ二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性から死細胞を同定して排除するためにＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物染色アッセイを使用して決定したように、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告した（図７Ａ参照）。結果は、ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列が欠如するＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートを結合に関して上記リンカー配列を含むＩＣＯＮ−１．５から識別不能であったことを証明している。
【０２４１】
ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列を含むＨＥＫ２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１  １アームドイムノコンジュゲートを免疫学的エフェクター細胞内で、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化する能力に関して、ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列が欠如するＨＥＫ２９３細胞由来ＩＣＯＮ−１．５  １アームドイムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット（カタログ番号Ｇ７０１８、Fitchburg, Wisconsin）を利用して抗体のＡＤＣＣ活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性ＮＦＡＴ応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のＦｃ領域との係合後、特異的ＦｃγＲを発現するＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてＮＦＡＴ媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる（図７Ｂ参照）。結果は、ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列が欠如するＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートが、ＡＤＣＣを活性化する能力における活性に関して、上記リンカー配列を含むＩＣＯＮ−１．５から識別不能であったことを証明している。ＡＤＣＣアッセイにおいて利用された細胞系は、ＴＦを発現する細胞系であり、これはこれらがインビトロアッセイであることを前提にすると、血管構造が非存在である場合でさえ、１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートを備えるＡＤＣＣの明白な誘導であることを証明している。
【０２４２】
実施例６
加齢性黄斑変性症に続発性のＣＮＶを有する患者におけるＩＣＯＮ−１．５を評価する無作為割り付け二重盲験多施設共同実薬対照試験
本試験では、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）に続発性の脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）を有する患者におけるラニビズマブ単剤療法と比較して、単剤療法として、またはラニビズマブ（LUCENTIS）と併用して投与した１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの硝子体内注射の安全性を評価する。
【０２４３】
さらに、ラニビズマブ単剤療法と比較して、単剤療法として、またはラニビズマブ（LUCENTIS）と併用して投与した１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの生物活性および薬力学的効果を評価する。
【０２４４】
本実施例に提示した試験は、無作為割り付け二重盲験実薬対照試験として計画されている。患者は、ＣＮＶに対する治療をこれまで受けていない。患者は、１：１：１の比率で選択した試験眼において次の３つの治療群の１つに無作為割り付けされる：
・  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート単剤療法（０．３ｍｇ）＋偽薬注射
・  ラニビズマブ単剤療法（０．５ｍｇ）＋偽薬注射
・  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート（０．３ｍｇ）＋ラニビズマブ（０．５ｍｇ）併用療法
【０２４５】
無作為化は、ベースライン時の試験眼における最良矯正視力（ＢＣＶＡ）文字スコア（≦５４文字対≧５５文字）および試験実施施設によって階層化する。
【０２４６】
患者は、注射のための各来院時に２回までの硝子体内注射を受ける。治療群間の試験遮蔽を維持するために、単剤療法を受けている患者においては偽薬注射を使用する。
【０２４７】
患者には第０月、第１月および第２月に４週間毎に１回、試験眼に硝子体内注射が投与される。第３月以後（第３月、第４月および第５月）は、患者は、彼らの個々の観察された治療応答に基づいて、彼らの割り付けられた治療群にしたがって再治療される。遮蔽された試験担当者は、次の再治療基準を使用してこれらの来院時に治療が必要とされるかどうかを（個々の患者の応答のカテゴリーに基づいて）決定する：
・  以前の計画来院時と比較してＡＭＤに起因するＢＣＶＡの≧５文字の消失。
・  ＢＣＶＡ変化とは無関係に、以前の計画来院時と比較して増加したＣＮＶ活性（例えば、新規もしくは増加した液体および／または漏出、出血）の任意の解剖学的証拠。
・  ベースライン時（第２回来院）と比較してＢＣＶＡの変化は見られないが、持続性ＣＮＶ活性の解剖学証拠（例えば、ベースライン時と比較して同一の持続性液体およびＣＳＴ）がある。
【０２４８】
０．５ｍｇのラニビズマブを用いた救命治療は、６カ月間の治療中および下記の状態のいずれかが発生した場合のフォローアップ器官中の任意の時点にアドオン療法として試験眼に投与される。
・  ベースライン（第２回来院）時と比較してＡＭＤに起因するＢＣＶＡの≧１５文字の消失。
・  ２回の連続来院時に確証されるＡＭＤに起因するＢＣＶＡのベースライン（第２回来院）時からの≧１０文字の消失。ベースライン時と比較して≧１０文字の消失を有する患者は、７日間以内に、または計画外の来院時の追加のフォローアップのためにできる限り速く病院に再来院することを要請される。
【０２４９】
遮蔽された試験担当者は、上記の基準にしたがって救命治療が必要かどうかの決定を下すことになる。
【０２５０】
救命治療が計画された注射のための来院中に試験眼に投与される場合は、試験遮蔽が維持されていることを保証するために、非遮蔽医師が救命治療を施すが、患者の計画された試験治療／再治療は下記のとおりである。
・  １アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート単剤療法群：イムノコンジュゲート単量体（０．３ｍｇ）＋救命療法（０．５ｍｇのラニビズマブ）
・  ラニビズマブ単剤療法群：ラニビズマブ（０．５ｍｇ）＋偽薬注射
・  併用療法：１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲート（０．３ｍｇ）＋ラニビズマブ（０．５ｍｇ）
【０２５１】
救命治療が計画外の来院時に試験眼に投与される場合は、遮蔽されていない医師が要請に応じて救命治療を施す。
【０２５２】
救命治療が試験眼に投与される場合は、患者は、プロトコールにしたがって次の来院について試験来院スケジュールを継続し、割り付けられた無作為割り付け群にしたがって試験治療を受け続ける。
【０２５３】
安全性は、有害事象の追跡、臨床検査室試験（血清化学、血液学および凝固）、バイタルサイン測定、簡易身体検査、細隙灯生体顕微鏡検査、眼内圧（ＩＯＰ）および拡張検眼鏡検査によって評価する。薬力学的および生物学的活性は、ＥＴＤＲＳ視力表によるＢＣＶＡ、スペクトル−ドメイン光コヒーレンス断層撮影法（ｓｄＯＣＴ）、カラー眼底撮影法（ＣＦＰ）、蛍光眼底血管造影法（ＦＡ）、眼底自己蛍光法（ＦＡＦ）、コントラスト感受性およびマイクロペリメトリーによって測定される。薬物力学的（ＰＫ）および免疫原性は、ｈＩ−ｃｏｎ１および抗薬物抗体の血漿中濃度を測定することによって評価する。
【０２５４】
実施例７
ＣＨＯ細胞および２９２細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよびＡＤＣＣレポーターアッセイ
ＣＨＯ細胞および２９３細胞中で生成されたＧＧＳＳリンカー配列［配列番号１２、１１および１５の連鎖と共発現した配列番号１８］を含有する１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートをＦｃ融合タンパク質のセルベース結合親和性に関して生成宿主細胞系の効果を評価するためにＢＨＫ細胞および２９３細胞中で生成された２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートと一緒に特性解析した。ＴＦを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系Ａ４３１（ATCC CRL-1555（商標）、Manassas, Virginia）由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した（１８種の異なる濃度の）タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Ｆｃ二次抗体を使用するフローサイトメトリーによって検出した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物染色アッセイを使用することによって、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告し、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を備えるＥＣ５０値は、４パラメーターフィット法を使用して引き出した。図１０の左側のパネルを参照。結果は、２９３細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１．５がＢＨＫ細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１と類似してＴＦに結合するが、他方ＣＨＯ細胞中で生成されたどちらの形態も減少した結合を有する。
【０２５５】
ＣＨＯ細胞および２９３細胞中で生成された１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートは、免疫学的エフェクター細胞中で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化する能力に関して、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞中で生成された２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートと一緒にさらに特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット（カタログ番号Ｇ７０１８、Fitchburg, Wisconsin）を利用してＦＣ融合タンパク質のＡＤＣＣ活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性ＮＦＡＴ応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のＦｃ領域またはＦｃ融合タンパク質との係合後、特異的ＦｃγＲを発現するＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてＮＦＡＴ媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる（図１０の右側のパネルを参照。結果は、ＢＨＫ細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１が、ＣＨＯ細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１ならびにＣＨＯ細胞および２９３細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートよりも低いＥＣ５０および高い絶対シグナルによって観察されるように、より強力なＡＤＣＣ活性を示すことを証明している。これらの所見に基づくと、ＩＣＯＮ−１．５はさらにＢＨＫ細胞中でも生成されたので、同一タイプのアッセイにおける試験を受けた。図１１を参照。
【０２５６】
実施例８
ＢＨＫ細胞および２９２細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲート分子についての結合アッセイおよびＡＤＣＣレポーターアッセイ
ＧＧＳＳ（配列番号１１）リンカー配列（配列番号１２および１５の連鎖を用いて共発現した配列番号１８）を伴わないＢＨＫ細胞１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートは、ＢＨＫ細胞ＩＣＯＮ−１と一緒に特性解析した。ＴＦを発現するヒト扁平上皮細胞癌細胞系Ａ４３１（ATCC CRL-1555（商標）、Manassas, Virginia）由来の細胞を利用した。抗体結合は、連続的に希釈した（１８種の異なる濃度の）タンパク質を使用して実施した。試験タンパク質の結合は、適切なフィコエリトリン標識抗Ｆｃ二次抗体を使用して検出した。フローサイトメトリーを利用して抗体−細胞結合親和性を決定した。全測定は、結合親和性アッセイから死細胞を同定して排除するためにＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物染色アッセイを使用することによって、生存細胞について実施した。結合は、生存細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として報告し、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を備えるＥＣ５０値は、４パラメーターフィット法を使用して引き出した。図１１の左側のパネルを参照。結果は、ＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートが結合に関してＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１から識別不能であったことを証明している。
【０２５７】
１アームドＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートは、免疫学的エフェクター細胞中で抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化する能力に関して、ＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１と一緒に特性解析した。製造業者によって提供されたプロトコールにしたがって、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイキット（カタログ番号Ｇ７０１８、Fitchburg, Wisconsin）を利用してＦＣ融合タンパク質のＡＤＣＣ活性を決定した。このアッセイからのデータ読み出しは、蛍ルシフェラーゼの発現を駆動する誘導性ＮＦＡＴ応答エレメント由来の発光シグナルである。標的細胞に結合した関連抗体のＦｃ領域またはＦｃ融合タンパク質との係合後、特異的ＦｃγＲを発現するＡＤＣＣバイオアッセイエフェクター細胞は、細胞内シグナルを変換し、結果としてＮＦＡＴ媒介性ルシフェラーゼ活性を生じさせる。図１１の右側のパネルを参照。結果は、ＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートがＡＤＣＣを活性化する能力における活性に関してＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１から識別不能であったことを証明している。
【０２５８】
実施例９
セルベースＦＸａ変換アッセイ
ＦＶＩＩａのＴＦへの結合はＦＸ酵素原を組立て、活性凝固プロテアーゼＦＸａへの転換をもたらすが、これはＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体からの放出が生じると、トロンビン生成および血餅形成を促進する。ＩＣＯＮ−１．５の潜在的抗凝固活性およびＦＶＩＩａ誘導性ＦＸ活性化を妨害する能力を決定するために、細胞は、２００ｎＭのＦＸ酵素原および２０ｎＭのＦＶＩＩａの存在下で指示した濃度のＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ１．５とともにインキュベートした。５分間のインキュベーション後、反応はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて停止させ、ＦＸから生成したＦＸａの量はＳＮ−７と呼ばれる蛍光原基質（Ｈａｅｍｔｅｃｈ  ＳＮ−７  ６−アミノ−１−ナフタレンスルホンアミドベースの（ＡＮＳＮ）蛍光原基質）の変換を測定することによって評価した。このアッセイの結果は、ＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ−１．５がＦＶＩＩａ誘導性ＦＸ活性化を妨害する、匹敵する限定された能力を有することを示している。図１２を参照。
【０２５９】
実施例１０
組換えＴＦ因子キサーゼアッセイ
キサーゼは、ＴＦ、ＦＶＩＩａ、リン脂質およびＣａ＋＋からなるタンパク分解性複合体である。キサーゼは、第Ｘ因子を第Ｘａ因子に切断する。アッセイの根拠は、キサーゼ複合体を単独または試験分子と組み合わせてインキュベートし、次に第Ｘ因子を添加することである。試験分子がＦＶＩＩａアナログ、例えばＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ−１．５である場合は、反応は、それらの凝結促進活性を評価するために、添加されたＦＶＩＩａの非存在下でランすることができる。反応は、Ｃａ＋＋をキレート化するＥＤＴＡを含有する溶液の添加によって、規定の時点に停止させる。Spectrazyme ＦＸａは、次にＦＸａと一緒にＦＸを含有するキレート化反応混合物に添加される。切断されたSpectrazyme ＦＸａの量は、存在するＦＸａｓｅの量に正比例している。試験品目がＦＶＩＩａのＴＦへの結合を妨害する場合は、これはＦＸａｓｅ活性の減少を生じさせるであろう。ＢＨＫ細胞由来１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートは、ＴＦの３種の形態：Innovin、RecombiplasTin 2Gおよび胎盤ＴＦを使用してＦＸａｓｅを調節する能力に関して、ＢＨＫ細胞由来ＩＣＯＮ−１と一緒に特性解析した。データは、反応混合物に２０ｎＭで添加されたＦＶＩＩａを用いて２１０秒間で観察された活性の百分率として表示する。これらの結果は、ＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ−１．５がＦＸａｓｅを媒介する、匹敵する弱い能力を有する（ＦＶＩＩａを用いて観察された２０％未満の活性）。結果は、ＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ−１．５がインビトロＦＸａｓｅ活性において３つの形態のＴＦと相互作用する組換えＦＶＩＩａの能力に類似の阻害活性を有することもさらに示している。図１３を参照。
【０２６０】
実施例１１
二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性（ＡＤＣ）アッセイ
二次ＡＤＣアッセイは、その受容体への結合後に、抗体またはＦｃ融合タンパク質がこの抗体またはＦＣ融合タンパク質へのペイロードの直接的コンジュゲート化を伴わずに内在化して細胞死滅を媒介する能力を評価することを可能にする。二次抗体、この場合は抗チューブリン剤ＭＭＡＦに結合した抗Ｆｃ  Ｆａｂ断片（モノメチルアウリスタチンＦ）またはＤＮＡ挿入剤ＰＮＵ−１５９２６８（ネモルビシンの誘導体）は、分子のＦｃ部分に結合する。細胞がコンジュゲート化した二次抗体との複合体中に抗体またはＦｃ融合タンパク質を内在化する場合は、用量依存性細胞殺滅が観察される。培養中の生存細胞の数をＡＴＰ（代謝的に活性な細胞のインジケーター）の定量に基づいて決定するための方法であるCellTiter-Glo 2.0（ＣＴＧ）アッセイを使用した。
【０２６１】
２９３細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよびＢＨＫ細胞中で生成されたＩＣＯＮ−１は、高レベルのＴＦを発現するブドウ膜メラノーマ細胞系Ｍｅｌ２９０を用いた二次ＡＤＣアッセイにおいて評価した。１０ｎＭのＩＣＯＮ−１またはＩＣＯＮ−１．５および６０ｍＭの二次試薬で出発する１０時点の３．５倍滴定を細胞に加えた。細胞を３日間インキュベートし、その後にＣＴＧアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む１アームドＩＣＯＮ−１．５および２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートについて匹敵するＩＣ５０が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図１４を参照。
【０２６２】
実施例１２
多数の細胞背景由来の二次抗体を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性（ＡＤＣ）アッセイ
２９３細胞中で生成した１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよびＢＨＫ細胞中で生成した２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートは、二次抗体が、どちらの細胞系も高レベルのＴＦを発現する扁平上皮癌細胞系Ａ４３１および膵臓腺癌細胞系ＢｘＰＣ３中のチューブリン阻害剤ＭＭＡＦとコンジュゲート化させられるＡＤＣアッセイにおいて評価した。１０ｎＭのＩＣＯＮ−１およびＩＣＯＮ−１．５および６０ｍＭの二次試薬で出発する１０時点の３．５倍滴定を細胞に加えた。細胞を３日間インキュベートし、その後にＣＴＧアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む１アームドＩＣＯＮ−１．５および２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートについて匹敵するＩＣ５０が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図１５を参照。
【０２６３】
実施例１３
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌細胞系由来の二次抗体を用いた二次抗体−薬物コンジュゲート細胞毒性（ＡＤＣ）アッセイ
２９３細胞中で生成した１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよびＢＨＫ細胞中で生成した２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートは、二次抗体が高レベルのＴＦを発現するトリプルネガティブ乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１中のチューブリン阻害剤ＭＭＡＦとコンジュゲート化させられるＡＤＣアッセイにおいて評価した。１０ｎＭのＩＣＯＮ−１またはＩＣＯＮ−１．５および６０ｍＭの二次試薬で出発する１０時点の３．５倍滴定を細胞に加えた。細胞を３日間インキュベートし、その後にＣＴＧアッセイによる細胞生存性の評価を実施した。両方のペイロードを含む１アームドＩＣＯＮ−１．５および２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートについて匹敵するＩＣ５０が観察されたが、これは類似の内在化率を示していた。図１６を参照。
【０２６４】
実施例１４
ＢＨＫ細胞由来のＩＣＯＮ−１および２９３細胞由来のＩＣＯＮ−１．５がＦＶＩＩａ誘導性細胞シグナル伝達に及ぼす作用
ＦＶＩＩａのＴＦへの結合は、ＰＡＲ２およびＭＡＰＫシグナル伝達のタンパク質溶解活性化を含む、複数のシグナル伝達カスケードの活性化を媒介する。これらの事象は、例えばＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＣＸＣＬ１などの前炎症性サイトカインのアップレギュレーションをもたらし、結果として新血管新生、腫瘍増殖および転移を促進する。２９３細胞中で生成した１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよびＢＨＫ細胞中で生成した２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートをＦＶＩＩａ誘導性細胞シグナル伝達において試験した。これらの実験のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を２時間にわたり血清飢餓させ、その後にＩＣＯＮ−１またはＩＣＯＮ−１．５（２５０ｎＭで開始して７時点、４倍の滴定）との３０分間のインキュベーションを続けた。次にＦＶＩＩａは、培地および細胞を含有するＦＣ融合タンパク質に５時間にわたって加え、上清を収集した。ＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。これらの結果は、１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートがサイトカインシグナル伝達に２アームドＩＣＯＮ１−１より実質的に大きな阻害作用を有することを示している。図１７を参照。
【０２６５】
実施例１５
マウス異種移植片試験においてインビボ腫瘍増殖上のＴＦに対して向けられた作用物質の作用
ＴＦに対して向けられた作用物質がインビボでの腫瘍増殖に及ぼす潜在的作用を評価するために、雌性無胸腺ヌードマウス（Ｃｒｌ：ＮＵ（ＮＣｒ）−Ｆｏｘｎ１ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）において異種移植片試験を実施した。Ａ４３１細胞を指数増殖中に採取し、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に再懸濁させた。移植当日、各試験マウスには、右側腹部の皮下に１×１０７Ａ４３１細胞（０．１ｍＬの細胞懸濁液）を移植し、細胞増殖が平均サイズが１００〜１２５ｍｍ３の標的範囲に近付く様子を監視した。試験の第１日と指定された７日後、動物を３コホート（ｎ＝１０）に分類したが、個々の腫瘍容積は８８〜１７２ｍｍ３の範囲内であり、群平均腫瘍容積は１０８〜１４０ｍｍ３であった。２９３細胞中で生成された１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよびＢＨＫ細胞中で生成された２アームドＩＣＯＮ−１イムノコンジュゲートが腫瘍増殖に及ぼす作用を試験するために、タンパク質を３週間にわたり週１回、１０ｍｇ／ｋｇの用量の腹腔内注射によって送達した。
【０２６６】
腫瘍は、サイズを監視するために２次元のカリパスを用いて第１日に出発して週２回測定した。試験エンドポイントは、コントロール群における２，０００ｍｍ３の平均腫瘍容積または２２日間のいずれか早い方であると規定した。試験は、第２２日に終了した。これらの結果は、１アームドＩＣＯＮ−１．５イムノコンジュゲートおよび２アームドＩＣＯＮ−１が腫瘍増殖に類似の作用を有したことを示している。図１８を参照。
【０２６７】
実施例１７
レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のウサギモデルにおけるＩＣＯＮ−１．５の有効性を評価する薬理学的試験
本試験は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のウサギモデルにおける抗ＶＥＧＦ単剤療法と比較して、単剤療法または抗ＶＥＧＦ剤、例えばラニビズマブ（LUCENTIS）またはアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）との併用療法として投与された１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの硝子体内注射の有効性を評価する。１群当たり動物４匹および６群。群は：（１）ビヒクル群、（２）３００μｇ群、（３）６００μｇ群、（４）９００μｇ群、（５）アフリベルセプト２．０ｍｇ群、および（６）アフリベルセプト２．０ｍｇ＋６００μｇのＩＣＯＮ−１（並行研究ではＩＣＯＮ−１．５）群からなる。
【０２６８】
ウサギは第０日（Ｄ０）に両眼についてレーザー治療する（ＯＵ）。試験製品およびビヒクルは、Ｄ７に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって両眼に投与する。ラニビズマブ（LUCENTIS）またはアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）は、レーザー直後の第０日（Ｄ０）に投与する。併用群（第７群）では、抗ＶＥＧＦ剤はＤ０に注射し、１アームドＦＶＩＩ−ＦｃイムノコンジュゲートをＤ７に注射する。
【０２６９】
眼検査：眼検査のための散瞳は、局所的１％トロピカミドＨＣＬ（試験１５分前に各眼に１滴）を使用して実施する。眼の表面形態、前区および後区炎症、白内障形成および網膜変化を評価するための側像検眼鏡検査および細隙灯生体顕微鏡検査を使用する完全眼検査（Hackett and McDonaldの変法）は、ベースライン時およびＤ１４に獣医学眼科医によって実施する。
【０２７０】
蛍光眼底血管造影法（ＦＡ）：ＦＡは、レーザー治療後のＤ７、Ｄ１０およびＤ１４に全動物の両眼で実施する。ＦＡのための散瞳は、局所的１％トロピカミドＨＣＬ（試験１５分前に各眼に１滴）を使用して実施する。全ＦＡは、硝子体内フルオレセインナトリウム注射（１２ｍｇ／ｋｇ）の１〜５分後に実施する。得られた遮蔽画像は、読取者が分析する。最大フルオレセイン漏出面積は、各病変についてＩｍａｇｅ  Ｊを使用して測定する。
【０２７１】
インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）およびフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン染色によって検出された脈絡膜血管分布のフラットマウント分析のために全眼を収集した。
【０２７２】
実施例１８
レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のブタモデルにおけるＩＣＯＮ−１．５の有効性を評価する薬理学的試験
本試験は、レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のブタモデルにおける抗ＶＥＧＦ単剤療法と比較して、単剤療法または抗ＶＥＧＦ剤、例えばラニビズマブ（LUCENTIS）またはアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）との併用療法として投与された１アームドＦＶＩＩ−Ｆｃイムノコンジュゲートの硝子体内注射の有効性を評価する。１群当たり動物４匹および６群。群は：（１）ビヒクル群、（２）３００μｇ群、（３）６００μｇ群、（４）９００μｇ群、（５）アフリベルセプト２．０ｍｇ群、および（６）アフリベルセプト２．０ｍｇ＋６００μｇのＩＣＯＮ−１（並行研究ではＩＣＯＮ−１．５）群からなる。
【０２７３】
ブタは第０日（Ｄ０）に両眼についてレーザー治療する（ＯＵ）。試験製品およびビヒクルは、Ｄ７に硝子体内（ＩＶＴ）注射によって両眼に投与する。ラニビズマブ（LUCENTIS）またはアフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）は、レーザー直後の第０日（Ｄ０）に投与する。併用群（第７群）では、抗ＶＥＧＦ剤はＤ０に注射し、１アームドＦＶＩＩ−ＦｃイムノコンジュゲートをＤ７に注射する。
【０２７４】
眼検査：眼検査のための散瞳は、局所的１％トロピカミドＨＣＬ（試験１５分前に各眼に１滴）を使用して実施する。眼の表面形態、前区および後区炎症、白内障形成および網膜変化を評価するために側像検眼鏡検査および細隙灯生体顕微鏡検査を使用する完全眼検査（Hackett and McDonaldの変法）は、ベースライン時およびＤ１４に獣医学眼科医によって実施する。
【０２７５】
蛍光眼底血管造影法（ＦＡ）ＦＡは、レーザー治療後のＤ７、Ｄ１０およびＤ１４に全動物の両眼で実施する。ＦＡのための散瞳は、局所的１％トロピカミドＨＣＬ（試験１５分前に各眼に１滴）を使用して実施する。全ＦＡは、硝子体内フルオレセインナトリウム注射（１２ｍｇ／ｋｇ）の１〜５分後に実施する。得られた遮蔽画像は、読取者が分析する。最大フルオレセイン漏出面積は、各病変についてＩｍａｇｅ  Ｊを使用して測定する。
【０２７６】
全眼は、ＩＳＨおよびフラットマウント分析のために収集する。
【０２７７】
本発明は本発明の特定の実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者であれば、様々な変更を加えることができ、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱せずに同等物と置換できることを理解できるはずである。さらに、ここに記載した発明の客観的趣旨および範囲に対する特定の状態、材料、合成物、プロセス、プロセス工程（単数または複数）を採用するために、多数の修飾を加えることができる。そのようなすべての修飾は、添付の特許請求項の範囲内に含まれることが意図されている。
【０２７８】
本明細書において参照された特許、特許出願、特許出願公開、学術論文およびプロトコールは、それらの全体があらゆる目的に関して参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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