(57)【要約】  本発明は、体内の様々な過程をイメージングし、疾患病状に関連する分子の位置を検出し、疾患の進行をモニタリングするための１８Ｆ−標識ミラモレキュラーの合成および使用に関する。
2019520328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(Ｉ)
【化１】
2019520328.tif 000040
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル基である)
の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。
【請求項２】
式(ＩＩ)
【化２】
2019520328.tif 000041
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基である)
である、請求項１記載の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。
【請求項３】
式(ＩＩＩ)
【化３】
2019520328.tif 000042
である、請求項１記載の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。
【請求項４】
式(ＩＶ)
【化４】
2019520328.tif 000043
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、ＲがＣ１−Ｃ６アルキル基である)
の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。
【請求項５】
式(Ｖ)
【化５】
2019520328.tif 000044
である、請求項４記載の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。
【請求項６】
請求項１記載の化合物の画像を得る方法であって、以下の工程：
ａ)化合物を対象に投与する工程；
ｂ)インビボでの該化合物の分布を、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)スキャンによりイメージングを行なう工程、
を特徴とする、方法。
【請求項７】
画像化された請求項１記載の化合物の分布が、疾患の存在または非存在の指標である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
対象における疾患の進行をモニターする方法であって、以下の工程：
(ａ)最初の時点で、疾患の存在に関係する標的分子に結合する請求項１記載の化合物を、それが必要な患者に投与して、疾患細胞または組織の量を決定するために、対象の少なくとも１部分の画像を得る工程；および
(ｂ)その後の１以上の時点で、対象に請求項１記載の化合物を投与して、各時点での対象の少なくとも１部分の画像を得る工程；ここで、各時点での該疾患細胞または組織の体積および位置は疾患の進行の指標である、
を特徴とする、方法。
【請求項９】
対象における疾患細胞または組織を定量する方法であって、以下の工程：
(ａ)疾患細胞または組織を有する対象に、該疾患細胞または組織に位置する標的分子に結合する請求項１記載の化合物を投与する工程；および
(ｂ)該疾患細胞または組織において、１８Ｆの放射性放射を検出する工程；ここで、該疾患細胞または組織の放射性放射の量および分布は、疾患細胞または組織の定量的な測定基準である、
を特徴とする、方法。
【請求項１０】
疾患が、固体癌、造血癌、血液癌、自己免疫性疾患、神経変性疾患、循環器疾患および病原性感染からなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ＰＤ−Ｌ１を発現している組織または細胞の定量画像を得る方法であって、以下の工程：
細胞または組織に、ＰＤ−Ｌ１に結合する請求項１記載の化合物を接触させる工程；および
陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)を用いて、ＰＤ−Ｌ１が発現している組織を検出または定量する工程、
を特徴とする、方法。
【請求項１２】
疾患を治療する薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程：
(ａ)ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を、候補薬剤の存在および非存在下において、ＰＤ−Ｌ１に結合する請求項１記載の化合物と接触させる工程；および
(ｂ)該候補薬剤の存在および非存在下において、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)を用いて、該細胞のイメージングを行なう工程；ここで、該候補薬剤の存在下における放射性放射の量の減少は、該候補薬剤がＰＤ−Ｌ１に結合しているという指標である、
を特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１記載の化合物を製造する際に使用するための反応前駆体、および請求項１の化合物を製造するための説明書を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１６年５月１９日に出願した米国仮出願第６２／３３８,８７２号の優先権を主張するものであり、その内容は引用により本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般的に、１８Ｆ−補欠分子族を含有する免疫修飾因子に関するもので、体内の様々なプロセスをイメージングするため、疾患病状に関連する分子の位置を検出するため、および疾患の進行をモニターするための、１８Ｆ−標識免疫修飾因子の合成および使用に関する。
【０００３】
陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)は、高い感受性(フェムトモル)および高分解能(４〜１０ｍｍ)を有し、組織成長を定量化することができる、診断医学および創薬において最も広く用いられる方法のうちの１つになっている非侵襲性のイメージング技術である。ＰＥＴイメージングによって得られる生体内の生物学的プロセスに関する有益なインビボ機能の情報によって、前臨床および臨床の両方において同じ手段を用いることができるという、固有の翻訳可能な医療上の利点もまた得られる。
【０００４】
ＰＥＴは、１８Ｆ、６４Ｃｕ、１１Ｃ、１５０、１３Ｎ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、８６Ｙおよび１２４Ｉなどの陽電子放出放射性同位体によって標識される分子の設計および合成を利用する。インビボにおいて、これらの放射性トレーサーまたは放射性リガンドは同位体の核から、用いられる同位体に応じてエネルギーの異なる陽電子を放出する。放出された陽電子のエネルギーは、陽電子が電子と衝突して反対方向に５１１ｋｅＶの２つのガンマ線を放出する前に、陽電子が移動する平均距離を制御する。この陽電子消滅によって生じるガンマ線が、ＰＥＴイメージングスキャナーによって検出され、放射性トレーサーの分布を時間関数として明らかにする平面および断層画像が得られる。そのため、ＰＥＴイメージングにおいて、対消滅の前の陽電子の移動距離および、ガンマ線、アルファ粒子またはベータ粒子など他の放出によって起こる線量測定の問題を最小化するためには、低い放出エネルギーを持つ同位体の純粋な陽電子放射体である同位体が好ましい。
【０００５】
さらに、ＰＥＴイメージングに用いられる同位体の半減期は、放射性トレーサー分子の合成および解析、患者への注入、インビボでの局在化、非標的組織からのクリアランス、および鮮明な画像の取得に耐えうる十分な長さでなければならない。１８Ｆ(β＋ ６３５ｋｅＶ ９７％、ｔ１／２ １１０分)は、陽電子放出エネルギーが低く、副次的な放出がなく、適切な半減期であるため、最も広く用いられるＰＥＴ放出同位体の１つである。
【０００６】
本発明は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部位および末端アジドに結合したニトロ−ピリジンを含む１８Ｆ−標識補欠分子族で置換されたミラモレキュラーに関する。いくつかの実施態様において、二価結合性(bifunctional conjugating)基(例えば、環束縛アルキン基)を含むミラモレキュラーは、１８Ｆ−標識補欠分子族の末端アジドと「クリック」生体直交性反応を介して共有結合を形成し、生理学的条件下で安定な放射性標識プローブを生成する。最終産物のＵＶ吸光度はさらに、生成物の放射化学的純度を決定するために、実用的で、高感度かつ迅速な解析方法につながる。これらの１８Ｆ標識されたミラモレキュラーは、細胞および組織(例えば、腫瘍)において、貴重な治療情報を提供することができるＰＤ-Ｌ１の存在を検出するのに有用である。
【０００７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明白であるが、これらを制限として理解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、左右相称にＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７およびＰＤ−Ｌ１(−)異種移植腫瘍を持つマウスにおける[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチドの代表的なＰＥＴ／ＣＴ画像である。
【図２】図２は、[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーについての平均的な時間放射能曲線を示す。
【図３】図３は、非ヒト霊長類における[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーの代表的なＰＥＴ画像を示す。
【図４】図４は、異種移植(Ａ＆Ｂ)およびヒト非小細胞肺癌生検組織(Ｃ＆Ｄ)における[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーのオートラジオグラム画像を示す。
【０００９】
第一態様において、本明細書は、式(Ｉ)
【化１】
2019520328.tif 000003
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル基である)
の化合物、あるいはその医薬的に許容され得る塩を提供する。
【００１０】
第二態様において、本明細書は、式(ＩＩ)
【化２】
2019520328.tif 000004
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、ＲはＣ１−Ｃ６アルキル基である)
の化合物、あるいはその医薬的に許容され得る塩を提供する。
【００１１】
第三態様において、本明細書は、式(ＩＩＩ)
【化３】
2019520328.tif 000005
の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。
【００１２】
第四態様において、本明細書は、式(ＩＶ)
【化４】
2019520328.tif 000006
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、Ｒは、Ｃ１−Ｃ６アルキル基である)
の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。
【００１３】
第五態様において、本明細書は、式(Ｖ)
【化５】
2019520328.tif 000007
の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。
【００１４】
第六態様において、本発明は、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩の画像を得る方法を提供するものであって、該方法は、
ａ)該化合物を対象に投与する工程；および
ｂ)インビボでの化合物の分布を、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)スキャンによりイメージングを行なう工程、
を特徴とする。
【００１５】
第六態様の第一実施形態において、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物、あるいはその医薬的に許容され得る塩の画像分布が、疾患の存在または非存在を示す。
【００１６】
第七態様において、本発明は、対象における疾患の進行をモニターする方法を提供するものであって、該方法は、
(ａ)最初の時点で、疾患の存在に関係する標的分子に結合する式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を、それが必要な対象に投与して、疾患細胞または組織の量を決定するために、対象の少なくとも１部分の画像を得る工程；および
(ｂ)その後の１以上の時点で、対象に化合物を投与して、各時点での対象の少なくとも１部分の画像を得る工程；ここで、各時点での該疾患細胞または組織の体積および位置は疾患の進行の指標である、
を特徴とする。
【００１７】
第八態様において、本発明は、対象における疾患細胞または組織を定量する方法を提供するものであって、該方法は、
(ａ)疾患細胞または組織を有する対象に、疾患細胞または組織に位置する標的分子に結合する式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を投与する工程；および
(ｂ)疾患細胞または組織において、１８Ｆの放射性放射を検出する工程；ここで、該疾患細胞または組織の放射性放射の量および分布は、疾患細胞または組織の定量的な測定基準である、
を特徴とする。
【００１８】
第八態様の第一実施形態において、疾患が、固体癌、造血癌、血液癌、自己免疫性疾患、神経変性疾患、循環器疾患および病原性感染からなる群から選択される。
【００１９】
第九態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１を発現している組織または細胞の定量画像を得る方法を提供するものであって、該方法は、細胞または組織を、ＰＤ−Ｌ１に結合する式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩と接触させる工程、および陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)を用いて、ＰＤ−Ｌ１を発現している組織を検出または定量する工程、を特徴とする。
【００２０】
第十態様において、本発明は、疾患を治療する薬剤のスクリーニング方法を提供するものであって、該方法は、
(ａ)候補薬剤の存在および非存在下において、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞を、ＰＤ−Ｌ１に結合する式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩と接触させる工程；および
(ｂ)該候補薬剤の存在および非存在下において、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)を用いて、該細胞のイメージングを行なう工程；ここで、該候補薬剤の存在下における放射性放射の量の減少は、該候補薬剤がＰＤ−Ｌ１に結合しているという指標である。
【００２１】
第十一態様において、本発明は、式(Ｉ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含む診断剤または医薬組成物を提供する。
【００２２】
第十二態様において、本発明は、式(Ｉ)の化合物の製造において使用するための反応前駆体、ならびに式(Ｉ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を製造するための指示書を含むキットを提供する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、イメージング剤として使用するための、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、対象における疾患の診断において使用するための、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。典型的には、診断とは、対象における疾患の進行を検出またはモニターすることを含む。一実施形態に従って、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物は、診断を必要する対象に投与され、陽電子放出断層撮影を用いて疾患細胞および組織の直接的な可視化が行なわれる。
【００２５】
別の態様において、本発明は、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を用いて、対象において、組織および細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の量および分布に関連する疾患をエクソビボで診断する方法を提供する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、インビトロでの対象における疾患の進行をモニターする方法を提供するものであって、該方法は、
(ａ)最初の時点で、一人の対象の細胞または組織を、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物と接触させて(ここで、該化合物は、疾患の存在に関係する標的分子に結合する)、陽電子放出断層撮影を用いて画像を得る工程；および
(ｂ)その後の１以上の時点で、細胞または組織の別のサンプルを、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物と接触させて、各時点での画像を得る工程；ここで、各時点での該疾患細胞または組織の体積および位置は、疾患の進行の指標である、
を特徴とする。
【００２７】
別の態様において、本発明は、対象における疾患細胞または組織をインビトロで定量する方法を提供するものであって、該方法は、
(ａ)対象の細胞または組織のサンプルを、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物と接触させて(ここで、該化合物は、疾患の存在に関係する標的分子に結合する)、陽電子放出断層撮影を用いて画像を得る工程；および
(ｂ)疾患細胞または組織中における１８Ｆの放射性放射を検出する工程；ここで、該疾患細胞または組織中の放射性放射の量および分布は、疾患細胞または組織の定量的な測定基準である、
を特徴とする。
【００２８】
本発明のいずれかの態様の一実施形態に従って、該疾患は、ＰＤ−Ｌ１を発現している組織および細胞中の量および分布に関連がある。通常、該疾患は、固体癌、造血癌、血液癌、自己免疫性疾患、神経変性疾患、循環器疾患および病原性疾患からなる群から選択される。別の実施形態において、該疾患は、固体癌である。
【００２９】
別の態様に従って、本発明は、式(Ｉ)〜(Ｖ)の化合物を製造する方法を提供する。
【００３０】
本明細書において、１８Ｆ−補欠分子族および当該１８Ｆ−補欠分子族を製造するための方法が記述される。本明細書において、１８Ｆ−補欠分子族を含む放射性標識組成物が記述され、また疾患細胞および／または組織および関連する生物学的状態を、診断、局在化、モニターおよび／または評価するために、これらの放射性標識組成物の使用もまた記述されている。
【００３１】
本開示がさらに容易に理解されうるために、いくつかの用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明に記載される。特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持ち、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、生化学、ＤＮＡ組み換え技術および薬理学の従来の方法が用いられる。
【００３２】
本明細書で用いられる単数形の冠詞「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を指していない限り、複数の指示対象を含む。「または」または「および」の使用は、特に明示されていない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「例えば(ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ)」並びに「含む(ｉｎｃｌｕｄｅ)」、「含む(ｉｎｃｌｕｄｅｓ)」および「含まれる(ｉｎｃｌｕｄｅｄ)」などの他の形態の使用は、限定的なものではない。
【００３３】
本明細書で用いられる「約」は、数字の１０％増減以内であることを意味する。例えば、「約１００」は、９０から１１０の間のいずれかの数字を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる「医療用イメージング」は、臨床的目的(疾患を解明し、診断し、モニターしようとする医療処置)または医学(通常の解剖学または生理学の研究など)のために、対象の体(またはその一部)の画像を得るのに用いられる技術およびプロセスをいう。
【００３５】
本明細書で用いられる「陽電子放出断層撮影」または「ＰＥＴ」は、体内のトレーサーの位置の３次元画像を得る、非侵襲性の核医学技術をいう。当該方法は、体内の生物学的に活性な分子に導入された陽電子放出核種(トレーサー)によって、間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。ＰＥＴイメージング方法は、前臨床的および臨床的な両方の創薬において、様々な種類の用途があり、助けとなる。応用例としては、標的のインビボでの飽和の直接的な可視化；毒性または患者ごとの変動を予測するための、正常組織における取り込みのモニター；疾患組織の定量化；腫瘍の転移；および薬剤の経時的な効果または経時的な耐性のモニターが挙げられる。
【００３６】
用語「生体直交性化学」は、従来の生化学的プロセスに干渉せずに、生物系の内部で起こりうるいずれかの化学反応をいう。当該用語は、生理学的ｐＨまたは水の存在下におけるインビトロで起こる化学反応である化学反応を含む。生体直交性であるためには、反応は選択的であり、出発化合物に存在する他の官能基との副反応を避ける必要がある。さらに、反応相手との間に形成された共有結合は強く、生物学的反応に化学的に不活性でなければならず、目的分子の生物学的活性に影響してはならない。
【００３７】
用語「クリックケミストリー」は、新たな化合物および組み合わせライブラリーの迅速な合成のための、確実で選択的な生体直交性反応をいう。クリック反応の性質としては、生理学的条件下で安定な化合物を生成するための、モジュール性、範囲の広さ、高収率、立体選択性、および簡単な生成物の単離(非クロマトグラフィー的な方法による不活性な副生成物の分離)が挙げられる。放射化学および放射性薬学において、クリックケミストリーは、選択的でモジュール式の構成要素を利用し、触媒なしで放射性標識された生物学的に関連のある化合物の化学選択的な連結を可能にする一連の標識化反応の総称である。「クリック反応」は、銅を用いてもよく、または銅フリーのクリック反応であってもよい。
【００３８】
用語「補欠分子族」または「二価性標識薬剤」は、ミラモレキュラーに結合させることのできる放射性核種(例えば、１８Ｆ)を含む有機小分子をいう。
【００３９】
本明細書で用いられる、一般的に「生物学的標的」と呼ばれる「標的」は、細胞、組織(例えば、癌または腫瘍)、病原性微生物(例えば、細菌、ウイルス、真菌、植物、プリオン、原生生物またはその一部)または組織の炎症、プラーク形成などの生物学的経路もしくは生物学的現象に関連する他の分子をいう。
【００４０】
用語「標的リガンド」、「標的薬剤」または「標的分子」は、他の分子に結合する、ペプチド、ミラモレキュラーなどの分子を指すために互換的に用いられる。いくつかの実施態様において、標的薬剤は、特定の細胞、組織、病原体または生物学的経路に関連する分子を「標的」にするために、当該１８Ｆ−補欠分子族に結合している。
【００４１】
本明細書で互換的に用いられる用語「特異的に結合」、「特異的結合」、「選択的結合」、および「選択的に結合」は、これらに限定はされないが、スキャチャード解析および／または競合結合測定(例えば、競合ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイ)などの当技術分野において利用可能な技術を用いて測定される、生物学的標的に対する親和性を発揮するが、他の分子に対する有意な結合を示さない(例えば、約１０％未満の結合)ペプチドまたはポリペプチドをいう。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「ＩＣ５０」は、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大の阻害反応の５０％、すなわち最大の阻害反応および未反応の中間水準まで反応を阻害する、１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブの濃度をいう。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「結合した」は、２つ以上の分子の結合をいう。当該結合は、共有結合または非共有結合でありうる。
【００４４】
用語「診断」または「検出」は、互換的に用いられうる。診断は、通常、組織の特定の組織学的状態を定義することをいう一方で、検出は、特定の検出可能な標的を含む組織、病変または生物を認識して見つけ出す。
【００４５】
用語「検出可能」は、バックグラウンドのシグナルに対して、シグナルを検出することができることをいう。本明細書でイメージング剤および診断の文脈において用いられる用語「検出可能なシグナル」は、これに限定はされないが、陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)などの非侵襲性のイメージング技術によって生じるシグナルである。この検出可能なシグナルは、検出可能であり、かつ対象から発生しうる他のバックグラウンドシグナルと区別できる。言い換えれば、検出可能シグナルとバックグラウンドの間に、測定可能および統計的に有意な違いが存在する(例えば、統計的に有意な違いは、検出可能なシグナルおよびバックグラウンドを区別するのに十分な違いであり、例えば検出可能なシグナルおよびバックグラウンドの違いが約０.１％、１％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または４０％またはそれ以上である)。検量線および／または較正曲線が、検出可能なシグナルおよび／またはバックグラウンドの相対強度を決定するために用いられうる。
【００４６】
本明細書に記載のイメージング剤を含む組成物の「検出可能な有効量」は、臨床的使用が可能な装置を用いて、許容可能な画像を得るのに十分な分量と定義される。本明細書で提供されるイメージング剤の検出可能な有効量は、１回以上の注射によって投与されうる。検出可能な有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢、性別および体重、個体の特異体質反応などの因子によって変化しうる。イメージング組成物の検出可能な有効量はまた、用いられる機器および方法に従って変化しうる。このような因子の最適化は、十分に当分野の技術の範囲内である。
【００４７】
本明細書においてイメージング剤に関連して用いられる「投与する」は、当業者にとって周知の様々な方法および送達システムのいずれかを用いて、イメージング剤を含む組成物を対象に物理的に導入することをいう。本明細書に記載のイメージング剤の好ましい投与経路としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または、例えば注射もしくは点滴などによる他の非経口経路による投与が挙げられる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、例として、これらに限定はされないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴、並びにインビボエレクトロポーションが挙げられる。あるいは、本明細書に記載のイメージング剤は、局所、上皮または粘膜経路による投与など、例えば鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所投与などの、非−非経口投与(ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ)によって投与されうる。投与はまた、例えば、１回、複数回で、および／または１回以上の長期間にわたって実行されうる。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「併用投与」などは、選択された医薬品を１人の患者に投与すること含むことを意味し、当該薬剤が同じもしくは異なる投与経路によって、または同じもしくは異なる時点において投与されるレジメンを含むことが意図される。
【００４９】
用語「患者」および「対象」は、本明細書に記載のイメージング剤を含む組成物を与えられるヒトまたは非ヒト動物のいずれかをいう。インビトロ診断および応用研究などのインビトロでの応用のために、前記の対象の血液、尿または組織サンプルなどの、体液および細胞サンプルは使用に適している。
【００５０】
用語「試料」は、組織試料、細胞試料、液体試料などを表しうる。当該試料は対象から採取されうる。組織試料としては、髪(毛根を含む)、口腔粘膜検体、血液、唾液、精液、筋肉、またはいずれかの内臓からの試料が挙げられる。液体試料は、これらに限定はされないが、尿、血液、腹水、胸膜液、髄液などでありうる。体内組織としては、これらに限定はされないが、皮膚、筋肉、子宮内膜、子宮、および頸部組織が挙げられる。
【００５１】
用語「同位体的に純粋な」とは、ある同位体が他の同位体に対してより多くの割合で含まれる成分、化合物または組成物を意味する。いくつかの実施態様において、当該成分、化合物、または組成物は約４０％、５０％、または６０％を超えて同位体的に純粋である。
【００５２】
本明細書で用いられるように、標的分子の画分を出発混合物と比較して濃縮するために、標的分子が部分的にまたは全体的に非標識分子から分離される場合に、標的分子が「精製」される。「精製」された標的分子は、標識および非標識分子の混合物を、これらに限定はされないが、約５：９５；１０：９０；１５：８５；２０：８０；２５：７５；３０：７０；４０：６０；５０：５０；６０：４０；７０：３０；７５：２５；８０：２０；８５：１５；９０：１０；９５：５；９７：３；９８：２；９９：１または１００：０などのほとんどいずれかの割合で有する混合物を含みうる。
【００５３】
「ＯＴｆ」基は、式ＣＦ３ＳＯ３またはトリフルオロメタンスルホン酸を有するトリフラートをいう。
【００５４】
用語「ハロ」または、その代わりの「ハロゲン」もしくは「ハライド」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【００５５】
本明細書全体にわたって、基およびその置換基は、安定な部位および化合物、並びに医薬的に許容され得る化合物として利用可能な化合物、並びに／または医薬的に許容され得る化合物の製造において利用可能な中間化合物を提供するように、当業者によって選択されうる。
【００５６】
本明細書に記載の様々な局面は、下記のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【００５７】
１８Ｆ放射性標識補欠分子族
一態様において、本明細書は、以下の構造：
【化６】
2019520328.tif 000008
(式中、ｘは、１〜８の整数である)
を有するアジドに共有結合したＰＥＧ化１８Ｆ−ピリジン、またはその医薬的に許容され得る塩を有する。いくつかの実施態様において、ｘは、２〜６の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは、３〜５の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは４である。関連する実施態様において、１８Ｆは、ピリジンのＮ原子に対してオルト位に結合している。いくつかの実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ基は、ピリジン環の窒素に対して１〜３位に存在する。いくつかの実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ基は、ピリジン環の窒素に対して１〜２位に存在する。他の実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ基は、ピリジン環の窒素に対して１〜４位に存在する。
【００５８】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識化合物は、以下の構造：
【化７】
2019520328.tif 000009
(式中、ｘは１〜８の整数である)
を有する化合物またはその医薬的に許容され得る塩である。いくつかの実施態様において、ｘは、２〜６の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは、３〜５の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは４である。いくつかの実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ基は、ピリジン環の窒素に対して１〜３位に存在する。いくつかの実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ基は、ピリジン環の窒素に対して１〜２位に存在する。別の実施態様において、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘ基は、ピリジン環の窒素に対して１〜４位に存在する。
【００５９】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識化合物は、以下の構造：
【化８】
2019520328.tif 000010
(式中、ｘは、１〜８の整数である)を有する化合物である。いくつかの実施態様において、ｘは、２〜６の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは、３〜５の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは４である。
【００６０】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識化合物は、[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(１８Ｆ−ＦＰＰＥＧＡ)であり、下記構造を有する：
【化９】
2019520328.tif 000011
。
【００６１】
別の実施態様において、１８Ｆ−放射性標識補欠分子族は、フッ素化反応と干渉しないピリジン環に追加の基を含有し得る。ある実施態様において、ピリジン環への付加は、Ｃ１−６アルキル基、例えばメチル、エチルおよびプロピルを含む。
【００６２】
更に別の実施態様において、１８Ｆ−放射性標識補欠分子族は、以下の構造:
【化１０】
2019520328.tif 000012
(式中、「ＯＰＥＧ」は、[Ｏ(ＣＨ２)２]ｘであり、ｘは１〜８の整数である)
を有する縮合環系である。いくつかの実施態様において、ｘは、２〜６の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは、３〜５の整数である。いくつかの実施態様において、ｘは４である。
【００６３】
関連する態様において、本明細書は、以下の構造：
【化１１】
2019520328.tif 000013
(式中、ｘは、１〜８の整数である)
を有するアジドに共有結合したＰＥＧ化１８Ｆ−ピリジンの製造方法であり、該方法は、
(ａ)以下の構造：
【化１２】
2019520328.tif 000014
(式中、ｘは、１〜８の整数であり、Ｒは、ＮＯ２、Ｂｒ、Ｆまたは
【化１３】
2019520328.tif 000015
であり、ピリジン環のＮ原子に対してオルト位である)
を含む化合物ａの溶液を提供する工程；
(ｂ)１８Ｆ／１８Ｏ水、４,７,１３,１６,２１,２４−ヘキサオキサ−１,１０−ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサンおよび弱塩基の混合物を提供する工程；
(ｃ)工程(ｂ)の混合物を乾燥させて、固体を形成させる工程；および
(ｄ)工程(ａ)の溶液を、工程(ｃ)の固体と反応させて、１８Ｆ−標識された化合物を形成させる工程、
を含んでいる。
【００６４】
いくつかの実施態様において、該方法は、以下の構造ｂ：
【化１４】
2019520328.tif 000016
(式中、１８Ｆは、Ｎ原子に対してオルト位である)
を有する１８Ｆ−ピリジン補欠分子族を製造するものであり、該方法は、
(ａ)下記構造：
【化１５】
2019520328.tif 000017
(式中、Ｘは、Ｎ原子に対してオルトであり、Ｘは、ＮＯ２、Ｂｒまたは
【化１６】
2019520328.tif 000018
である)
の化合物の溶液を提供する工程；
(ｂ)１８Ｆ／１８Ｏ水、４,７,１３,１６,２１,２４−ヘキサオキサ−１,１０−ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサンおよび弱塩基(例えば、Ｋ２ＣＯ３)の混合物を提供する工程；
(ｃ)工程(ｂ)の混合物を乾燥させて、固体を形成させる工程；および
(ｄ)工程(ａ)の溶液を工程(ｃ)の固体と反応させて、１８Ｆ−標識された化合物を形成させる工程、を含んでいる。
【００６５】
いくつかの実施態様において、該方法は、以下に示されるスキームＩに従って、
以下の構造ａ：
【化１７】
2019520328.tif 000019
を有する化合物を製造する工程をさらに含む。
【化１８】
2019520328.tif 000020
【００６６】
いくつかの実施態様において、該方法は、以下の反応条件に従って、ｄからｅ、
【化１９】
2019520328.tif 000021
即ち、１８Ｆ−ピリジン補欠分子族[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(１８Ｆ−ＦＰＰＥＧＡ)を製造することを含む。
【００６７】
製剤
医薬的に許容され得る担体と共に製剤化される、本明細書に記載の１８Ｆ−標識標的薬剤のうちの１つ、またはそれらの組み合わせを含む、組成物、例えば医薬組成物がさらに示される。このような組成物は、本明細書に記載の薬剤のうちの１つ、またはそれらの組み合わせ(例えば、２つまたはそれ以上)を含みうる。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、１８Ｆ−標識標的薬剤および薬剤の組み合わせを含みうる。
【００６８】
本明細書で用いられる「医薬的に許容され得る担体」は、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤など、生理学的に適合性のあるもののいずれかおよび全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴による)に適切である。投与経路に従って、１８Ｆ−標識標的薬剤は、当該化合物を酸および、当該化合物を不活性化しうる他の自然条件の作用から保護する物質によってコーティングされうる。
【００６９】
本明細書に記載の医薬的に許容され得る化合物は、１つ以上の医薬的に許容され得る塩を含みうる。「医薬的に許容され得る塩」は、元の化合物の望ましい生物学的活性を保持し、いずれの望ましくない毒性効果も与えない塩をいう(例えば、Berge，S.M.，et al.(1977)J．Pharm.Sci.66:1-19を参照されたい)。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、並びに脂肪族モノ−およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びにＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【００７０】
本明細書に記載の医薬組成物はまた、医薬的に許容され得る抗酸化剤を含みうる。医薬的に許容され得る抗酸化剤の例としては、以下が挙げられる：(１)アスコルビン酸、システイン塩酸、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウムなどの、水溶性の抗酸化剤；(２)パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチルヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの、脂溶性の抗酸化剤；および(３)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの、金属キレート剤。
【００７１】
本明細書に記載の医薬組成物に用いられうる適切な水性および非水性の担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レチシンなどのコーティング物質を用いることによって、分散の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持されうる。
【００７２】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバンドを含みうる。微生物の生存を防ぐことは、前記の滅菌処置、並びに、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノールなどの様々な抗細菌および抗真菌剤を含有することの両方によって確保されうる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましい。さらに、注入可能な剤形の吸収遅延は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含有することによってもたらされうる。
【００７３】
医薬的に許容され得る担体としては、無菌水溶液または分散液、および注入可能な無菌溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような溶媒および薬剤の使用は、当技術分野において既知である。通常の溶媒または薬剤のいずれかが、当該活性化合物に対して不適合である場合を除いて、本明細書に記載の医薬組成物中のこれらを使用することが考慮される。さらなる活性化合物もまた、当該組成物に含まれうる。
【００７４】
医薬組成物は、一般に製造および保管状態において、無菌および安定でなければならない。当該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または、高い薬剤濃度に適切な他の秩序構造として製剤化されうる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合は必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持されうる。多くの場合において、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の吸収遅延は、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物中に含有することによってもたらされうる。
【００７５】
注入可能な無菌溶液は、必要な分量の１８Ｆ−標識標的薬剤を適切な溶媒中に、必要に応じて前記で列挙される成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせと共に加え、精密濾過によって滅菌を行うことによって製造されうる。一般に、分散液は、活性化合物を標準的な分散媒および前記に列挙される他の必要な成分を含む無菌溶媒中に加えることによって製造される。注入可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい製造方法は真空乾燥およびフリーズ・ドライ(凍結乾燥)であり、活性成分に加えて、あらかじめ濾過された無菌溶液中のさらに必要ないずれかの成分を含む粉末が得られる。
【００７６】
単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせられうる１８Ｆ−標識標的薬剤の分量は、治療される対象および特定の投与方法に応じて変化する。単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせられうる１８Ｆ−標識標的薬剤の分量は、一般に検出可能な効果が得られる当該組成物の分量である。一般に、百分率で、この分量は医薬的に許容され得る担体との組み合わせにおいて、約０.０１パーセントから約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０.１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセントから約３０パーセントの活性成分に及ぶ。
【００７７】
投与およびイメージング
本明細書に記載の１８Ｆ−標識標的薬剤は、様々なインビボイメージングの応用(例えば、組織または全身のイメージング)において有用である。いくつかの実施態様において、１８Ｆ−標識標的薬剤は、例えば標的発現性腫瘍などの標的に陽性である細胞または組織をイメージングするために用いられうる。例えば、標識された１８Ｆ−標識標的薬剤は、対象の組織に１８Ｆ−標識標的薬剤が取り込まれるのに十分な分量で、対象に投与される。対象は、次いで、ＰＥＴなどのイメージングシステムを用いて、１８Ｆ放射性核種に必要な時間にわたってイメージングされる。標的物質を発現している細胞または組織に結合した１８Ｆ−標識標的薬剤が、その後イメージングシステムによって検出される。
【００７８】
一般に、イメージングのために、単一の静脈内注入として約１ｍｇから２００ｍｇの範囲のミラモレキュラーの用量を患者に投与することが望ましいが、低容量または高容量もまた状況に応じて投与されうる。一般に、典型的な成人に対して、体表面積の平方メートルあたり約１ｍｇから１０ｍｇのタンパク質またはペプチドの範囲の用量を患者に投与することが望ましいが、低容量または高容量もまた状況に応じて投与されうる。イメージングの目的のためにヒトの対象に投与されうるタンパク質またはペプチドの用量の例としては、約１から２００ｍｇ、約１から７０ｍｇ、約１から２０ｍｇ、約１から１０ｍｇが挙げられるが、高容量または低容量もまた用いられうる。
【００７９】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識−ミラモレキュラーの分量は、１日に約０.００５μｇ／体重ｋｇから約５０μｇ／体重ｋｇの間、通常は０.０２μｇ／体重ｋｇから約３μｇ／体重ｋｇの間で投与される。ＰＥＴトレーサーに関連する質量は、自然同位体の形態、すなわち１８Ｆ ＰＥＴトレーサーにおいて１９Ｆのものである。本発明の組成物の特定の分析用量としては、約０.５μｇから約１００μｇの１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーが挙げられる。用量は、通常は約１μｇから約５０μｇの１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーである。
【００８０】
用量レジメンは、１８Ｆ−標識標的薬剤を取り込む組織または細胞の鮮明なイメージを得るために最適化された検出可能な分量を提供するように調整される。特に有利であるのは、投与の簡便性および用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形として製剤化することである。本明細書で用いられる単位剤形は、１８Ｆ−標識標的薬剤が投与される対象に対して均一な用量として適合された、物理的に個別の単位をいう。本明細書に記載の単位剤形のための仕様(specification)は、以下によって決定および直接影響される：(ａ)１８Ｆ−標識標的薬剤の標的部位固有の特性；(ｂ)標的とされる組織または細胞；(ｃ)用いられるイメージング技術固有の制約。
【００８１】
１８Ｆ−標識標的薬剤の投与のために用いられる用量は、疾患の種類、用いられる標的化合物、対象の年齢、健康状態および性別、疾患の程度、診察される部位などによって変化する。特に、対象の照射線量についての十分な配慮を行わなければならない。好ましくは、１８−Ｆの飽和用量が患者に投与される。例えば、１８Ｆ−標識標的薬剤の放射線量は通常、３.７メガベクレルから３.７ギガベクレル、好ましくは、１８メガベクレルから７４０メガベクレルに及ぶ。あるいは、用量は、例えばミリキュリーによって測定されうる。いくつかの実施態様において、イメージング実験のために投与される１８Ｆイメージング剤の分量は、５から１０ｍＣｉである。別の実施態様において、有効量は約１〜５ｍＣｉの範囲の放射を生じるのに十分な化合物の分量である。
【００８２】
本明細書に記載の医薬組成物における活性成分の実際の用量段階は、特定の患者の細胞または組織、組成物、および投与方法において、患者に毒性がなく、１８Ｆ−標識標的薬剤の望ましい取り込みが生じるのに有効な活性成分の分量を得るために変化しうる。しかし、当然のことながら、本開示の１８Ｆ−標識標的薬剤の１日の総用量は、健全な医学的判断の範囲で、主治医または他の担当の専門家によって決定される。いずれかの特定の対象に固有の有効な用量段階は、例えば、用いられる特定の組成物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活；投与時間；投与経路；用いられる特定の化合物の排出率；治療の継続時間；用いられる特定の組成物との組み合わせにおいて使用される別の薬剤、化合物および／または物質、治療患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康状態、および以前の病歴、並びに医療分野において周知の因子などの、様々な因子によって変化する。いくつかの実施態様において、ヒトの対象に投与されるイメージングに必要な１８Ｆ−放射性標識プローブの分量は、処方医によって決定され、一般に当該用量は１８Ｆ−放射性核種からの放射量に従って変化する。
【００８３】
本明細書に記載の組成物は、当技術分野において周知の様々な方法の１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路によって投与されうる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または方法は、求められる結果に従って変化する。本明細書に記載の１８Ｆ−標識標的薬剤の好ましい投与経路としては、例えば注射もしくは点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与が挙げられる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、例として、これらに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴が挙げられる。いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識標的化合物は静脈内投与される。
【００８４】
あるいは、本明細書に記載の１８Ｆ−標識標的薬剤は、局所、上皮または粘膜、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所などの投与経路によって非−非経口(ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ)投与されうる。
【００８５】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の１８Ｆ−標識標的薬剤は、インビボで適切に分布されるように製剤化されうる。例えば、血液脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高親水性化合物を排除する。薬剤は、例えばリポソーム内に製剤化されることによってＢＢＢを通過しうる。リポソームを製剤化する方法としては、例えば、米国特許第４,５２２,８１１号；５,３７４,５４８号；および５,３９９,３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１つ以上の部位を含み得、そのため薬剤の標的送達を向上させうる(例えば、V. V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。標的部位の例としては、葉酸またはビオチン(例えば、米国特許第5,416,016号、Low et al.を参照されたい)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140；M .Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；サーファクタントタンパク質Ａ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられ、K. Keinanen;M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123；J. J. Killion；I. J. Fidler (1994) もまた参照されたい。
【００８６】
以下の実施手順は、診療所において、ＰＥＴイメージングを用いて患者を診察する際に用いられうる。患者は、実施日のしばらく前に、非標識ミラモレキュラーを前投与され、少なくとも１２時間は絶食とするが、水の自由摂取は認められる。放射性トレーサーの投与を血液内に集中させるため、２０Ｇ２−インチ静脈カテーテルが対側尺骨静脈に挿入される。
【００８７】
患者はＰＥＴカメラに配置され、１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラー(＜２０ｍＣｉ)のＰＥＴトレーサーのトレーサー量が静脈カテーテルを通して投与される。未代謝のＰＥＴトレーサーである血漿中の[１８Ｆ]実施例２化合物の割合を解析および定量するために、動脈または静脈血液試料のいずれかが、ＰＥＴスキャンの間の適切な時間間隔において採取される。画像は最大で１２０分にわたって得られる。放射性トレーサーの注射の１０分以内およびイメージング時間の終わりに、ＰＥＴトレーサーの前に投与され得た非標識ミラモレキュラーの血漿濃度を決定するため、１ｍＬの血液試料が採取される。
【００８８】
画像再構成から断層画像が得られる。放射性トレーサーの分布を決定するため、関心領域(ＲＯＩ)が、これらに限定はされないが、肺、肝臓、心臓、腎臓、皮膚または他の臓器または組織などが、再構成画像上に描かれる。これらの領域における放射性トレーサーの経時的な取り込みは、試験される様々な投与パラダイムにおいて、あらゆる治療介入の非存在下、または非標識ミラモレキュラーの存在化で得られる時間放射能曲線(ＴＡＣ)を作成するために用いられる。データは、単位容量あたりの単位時間あたりの放射能(μＣｉ／ｃｃ／注入用量のｍＣｉ)として表される。ＴＡＣデータは当技術分野において周知の様々な方法によって処理され、非占有標的陽性組織の密度に比例する結合能(ＢＰ)または体積分布(ＶＴ)などの定量パラメーターが得られる。
【００８９】
キットおよび製造品
本明細書に記載の１８Ｆ−放射性標識標的組成物の生成のためのキットおよび使用のための説明書もまた示される。キットには、一般に、所定量の試薬と説明書のパッケージ化された組み合わせおよびキットの内容物の意図される用途を表すラベルが含まれる。用語ラベルには、キットに組み込まれたまたはキットに含まれる、またはそうでなければ、キットに付随する、あらゆる文書または記録されたものが含まれる。
【００９０】
例えば、いくつかの実施態様において、キットは補欠分子族が１８Ｆによって当該部位でフッ素化され、次いで投与前に放射性標識補欠分子族がＢＦＣ−結合標的分子(例えば、タンパク質またはペプチド)に結合する条件において必要な試薬を含む。
【００９１】
いくつかの実施態様において、キットは、１８Ｆ標識抗ＰＤ−Ｌ１ミラモレキュラーであるインビボのイメージング剤、例えば本明細書においてさらに記述される剤を形成するのに必要な１つ以上の試薬を含む。例えば、キットは、抗ＰＤ−Ｌ１ミラモレキュラーを含む第一のバイアル、および[１８Ｆ]ＦＰＰＥＧＡを含む第二のバイアルを含みうる。キットは、抗ＰＤ−Ｌ１ミラモレキュラーを含む第一バイアル、４−ＰＥＧ−トシル−アジドを含む第二バイアル、およびＯ１８水中の１８Ｆを含む第三バイアルを含みうる。キットはさらに、バイアル、溶液および適宜ＰＤ−Ｌ１ミラモレキュラー−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ−１８Ｆの生成に必要な追加の試薬を含みうる。
【００９２】
いくつかの実施態様において、キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬(例えば、医薬的に許容され得る担体)を含みうる。いくつかの実施態様において、当該キットは、本明細書において開示される方法に従って標識プローブを生成するために用いられる反応前駆体を含む。キットの成分は、本明細書に記載されるような、モニターされる特定の生物学的条件に合わせて調整されうる。宿主細胞または宿主生物に、前記で列挙される成分の様々な組み合わせを投与するために、キットはさらに当技術分野において周知の適切な緩衝液および試薬を含みうる。イメージング剤および担体は、溶液または凍結乾燥された形態で提供されうる。キットのイメージング剤および担体が凍結乾燥された形態である場合、キットは、適宜、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水などの、無菌および生理学的に許容可能な再構成溶媒を含んでもよい。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたは樹脂などの様々な物質から形成されうる。さらに、商業上および利用者の観点から望ましい他の物質、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用説明書に付随する添付文書もまた挙げられる。
【００９３】
使用
１８Ｆ−標識標的薬剤を用いたイメージング方法が本明細書において示される。１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのＰＥＴプローブなどの陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)トレーサーは、インビトロおよびインビボでの画像診査および診断の画像応用において使用するための、現在利用可能なＰＥＴ技術と共に用いられうる。ＰＥＴスキャンによる１８Ｆイメージングのためのイメージング技術および装置は、当技術分野において周知であり(例えば、米国特許第６,３５８,４８９号；６,９５３,５６７号；Page et al., Nuclear Medicine and Biology, 21:911-919, 1994;Choi et al., Cancer Research 55:5323-5329, 1995;Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582,1992を参照されたい)、このような周知のＰＥＴイメージング技術または装置のいずれかが用いられうる。
【００９４】
本明細書に示されるイメージング方法のインビボでの応用としては、疾患の診断、疾患の進行のモニター、予後、対象の治療への応答の可能性の決定、治療への適格性の決定、治療への臨床的応答のモニター、治療化合物の臨床的評価および用量選択、動物モデルにおける潜在的な候補薬剤の前臨床試験、並びに、組織および臓器における標的分子の局所分布および濃度の観測が挙げられる。インビトロでの応用としては、細胞アッセイ(例えば、競合アッセイ、親和性アッセイなど)における候補薬剤のスクリーニングが挙げられる。
【００９５】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−標識標的薬剤は、候補治療化合物による組織占有度と患者の臨床効果の関係を決定するため；長期間の臨床試験の開始前に、候補薬剤の臨床試験のための用量選択を決定するため；および、異なる候補薬剤の有効性を比較するために用いられうる。
【００９６】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識標的化合物は、正常または疾患組織および／または臓器(例えば、肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚)のインビボイメージングのための方法において用いられる。例えば、１８Ｆ−放射性標識標的化合物は、対象の細胞または組織に１８Ｆ−放射性標識標的化合物の取り込みが生じるのに有効な分量において、対象に投与される。対象は、次いで、適切なイメージングシステム(例えば、ＰＥＴシステム)を、１８Ｆ−放射性標識標的化合物を検出できる十分な時間にわたって受ける。１８Ｆ−放射性標識標的化合物から検出されたシグナルの位置は、所定の細胞または組織の位置と相関しうる。いくつかの実施態様において、当該位置の範囲もまた決定されうる。インビボのイメージングは本明細書において記述される。以下もまた参照されたい：米国特許第６,１２６,９１６号；６,０７７,４９９号；６,０１０,６８０号；５,７７６,０９５号；５,７７６,０９４号；５,７７６,０９３号；５,７７２,９８１号；５,７５３,２０６号；５,７４６,９９６号；５,６９７,９０２号；５,３２８,６７９号；５,１２８,１１９号；５,１０１,８２７号；および４,７３５,２１０号、それぞれは引用により本明細書に援用される。
【００９７】
そのため、いくつかの局面において、１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブの画像を得る方法が示され、対象に１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブを投与する工程、およびＰＥＴによる１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブのインビボでの分布をイメージングする工程を含む方法が示される。
【００９８】
いくつかの実施態様において、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、類人猿、サル、ラットまたはマウスである。
【００９９】
いくつかの局面において、対象における疾患の存在を診断する方法であって、疾患の存在に関係する標的分子に結合する、１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブを、それを必要とする対象に投与する工程、および１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブの存在または非存在を検出するために、対象の少なくとも１部分の放射線画像を得る工程を含む方法が示される。
【０１００】
いくつかの実施態様において、疾患は、固形癌、造血癌、血液癌、自己免疫性疾患、神経変性疾患、心血管疾患または病原性感染である。
【０１０１】
１８Ｆ−放射性標識標的化合物を用いたＰＥＴイメージングは、標的化合物を定性的または定量的に検出するために用いられうる。１８Ｆ−放射性標識標的化合物イメージング剤は、バイオマーカーとして用いられ得、対象の陽性シグナルの存在もしくは非存在は、例えば、対象が癌治療などの所定の治療に対して応答すること、または対象が治療に応答するかどうかを示しうる。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、当該方法のステップは、疾患の位置および／または大きさが、時間および／または治療に応じてモニターされうるように、所定の間隔において繰り返されうる。いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識標的化合物は、治療(例えば、化学療法など)を受けている対象の、治療に対する応答を可視化することを補助するために用いられうる。例えば、患者の疾患の進行または退縮をモニターするために、１８Ｆ−放射性標識標的化合物は、一般に、治療前および治療中に、定期的に(例えば、毎日、毎週、毎月、それらの間の間隔、など)、可視化および測定される。
【０１０３】
そのため、いくつかの実施態様において、それを必要とする対象における疾患の進行をモニターする方法であって、疾患の存在に関係する標的分子に結合する１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブを、最初の時点において対象に投与し、そして疾患細胞または組織の分量を決定するために、対象の少なくとも１部分の画像を得る工程、および１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブをその後の１回以上の時点において、対象に投与し、そしてその後の各時点において、対象の少なくとも１部分(例えば、最初の時点と同じ部分)の画像を得る工程を含む方法が示される。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、癌治療(例えば、化学療法、放射線療法)を受けている対象において、腫瘍の大きさがモニターされ得、腫瘍の退縮度合いが、１８Ｆ−放射性標識腫瘍標的の検出に基づいてリアルタイムでモニターされうる。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、本明細書の方法は、治療に対する患者の応答を評価するために用いられる。いくつかの実施態様において、当該方法は、治療化合物の用量を選択または修正するために用いられる。いくつかの実施態様において、当該方法は、毒性または患者ごとの差異を分析するために、正常組織における１８Ｆ−放射性標識標的化合物の取り込みをモニターするために用いられる。いくつかの実施態様において、当該方法は、薬効をモニターするため、または薬剤耐性を検出するために用いられる。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、放射性標識化合物は、標準的な薬務に従って、単体でまたは医薬的に許容され得る担体または希釈剤との組み合わせのいずれかの医薬組成物において、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。このような組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸および局所投与経路などの、経口または非経口投与されうる。いくつかの実施態様において、投与は静脈内投与である。いくつかの実施態様において、当該放射性標識化合物は、合成から１時間未満の間に静脈内注射される。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、１８Ｆ−放射性標識標的薬剤のインビボでの生物学的活性は、臓器特異的な取り込みに関して、生体内分布観測、および適切な動物モデルにおける小動物ＰＥＴ動的イメージングによって測定されうる。例えば、生体内分布観測のために、動物群は、１８Ｆ−放射性標識標的薬剤を注射され、その小集団を１回以上の時間間隔(例えば、５分、１０分、３０分、６０分、２時間)において犠死させる。対象の臓器および組織は、迅速に切除および重量測定され、放射能が決定される。臓器および選択された組織において蓄積された放射能は、注入量の割合(％ＩＤ)として算出される。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、本明細書において示される１８Ｆ−放射性標識標的薬剤は、治療組織または細胞において用いるための化合物を選択するスクリーニング手段としてインビトロで用いられる。例えば、いくつかの実施態様において、疾患細胞は、１つ以上の候補薬剤に晒露される間またはその後に、１８Ｆ−放射性標識標的化合物と共に培養される。候補薬剤が疾患に作用する能力は、１８Ｆ−放射性標識標的化合物を用いて経時的にイメージングされうる。
【０１０９】
例えば、インビトロでの１８Ｆ−放射性標識標的薬剤の生物学的活性の統合性は、選択された標的分子への特異的結合および放射性標識組成物の取り込みに関して、標的分子を発現している細胞株において評価される。結合および細胞結合アッセイのために、細胞は４℃または３７℃において、適切な時間にわたり、１８Ｆ−放射性標識標的組成物と共に培養される。過剰の非標識標的薬剤を加えることによって、非特異的結合が観測される。特異的結合の程度は、全結合から非特異的結合を差し引くことによって算出される。取り込みは、タンパク質のマイクログラムあたりの、細胞へ添加された標的薬剤の総用量の割合(％ＩＤ／μｇ細胞タンパク質)として表される。
【０１１０】
関連する局面において、本発明は１８Ｆ−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブ、および医薬的に許容され得る担体を含む、インビボまたはインビトロのための診断または放射性医薬組成物を提供する。
【０１１１】
引用による援用
特許文献およびウェブサイトなどの、本明細書に記載の全ての文書および参考文献は、本明細書において全体または一部が記載された場合と同じ程度に、引用により個別に本明細書に援用される。
【０１１２】
本発明は、以下の実施例を参照することによって説明されるが、実施例は例証するのみであり、本発明を限定するものではない。本発明は詳細に、およびそれらの特定の実施態様に関連して記述されているが、様々な変化および変更が、それらの趣旨および範囲から逸脱することなくなされうることが当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１１３】
分析条件Ａ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８，２.０ｘ５０ｍｍ，１.７μｍ粒子；移動相Ａ：５：９５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５ アセトニトリル：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：０％Ｂ，３分かけて０〜１００％Ｂ，次いで１００％Ｂで０.５分間保持；流量：１ｍＬ／ｍｉｎ；検出：２２０ｎｍのＵＶ.
【０１１４】
分析条件Ｂ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ Ｃ１８，２.０ｘ５０ｍｍ，１.７μｍ粒子；移動相Ａ：５：９５ メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；温度：５０℃；グラジエント：０％Ｂ，３分かけて０〜１００％Ｂ，次いで１００％Ｂで０.５分間保持；流量：０.５ｍＬ／ｍｉｎ；検出：２２０ｎｍのＵＶ．
【０１１５】
シングルカップリング法:
先の工程からの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ、５.０ｍＬ)を添加した。混合物を、３または５分間周期的に撹拌し、溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ、５.０ｍＬ)を添加した。混合物を３または５分周期的撹拌し、溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり５回連続的に洗浄した。各洗浄時、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を容器の上部から添加し、得られた混合物を６０秒周期的撹拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸(ＤＭＦ中０.２Ｍ、５.０ｍＬ、１０当量)、次いでＨＡＴＵまたはＨＣＴＵ(ＤＭＦ中０.２Ｍ、５.０ｍＬ、１０当量)および最後にＮＭＭ(ＤＭＦ中０.８Ｍ、２.５ｍＬ、２０当量)を添加した。混合物を６０分周期的撹拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に４回洗浄した。各洗浄時、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を容器の上部から添加し、得られた混合物を３０秒周期的撹拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ、５.０ｍＬ)の溶液を添加した。混合物を１０分周期的撹拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に４回洗浄した。各洗浄時、ＤＭＦ(４.０ｍＬ)を容器の上部から添加し、得られた混合物を９０秒周期的撹拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次工程で使用した。
【０１１６】
ダブルカップルカップリング法:
先の工程からの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ、５.０ｍＬ)の溶液を添加した。混合物を３分周期的撹拌し、溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ(２０：８０ｖ／ｖ、５.０ｍＬ)の溶液を添加した。混合物を３分周期的撹拌し、溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に３回洗浄した。ＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出し、その後ＤＭＦ(７ｍＬ)を下部から洗い出し、最後にＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出した。反応容器にアミノ酸(ＤＭＦ中０.２Ｍ, ２.５ｍＬ、５当量)、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中０.５Ｍ、１.０ｍＬ、５当量)およびＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中２Ｍ、０.５ｍＬ、１０当量)を添加した。混合物を５０℃でカップリングするＦｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ以外の全アミノ酸について、５分間、７５℃でＮ２バブリングにより混合し、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に３回洗浄した：ＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出し、その後ＤＭＦ(７ｍＬ)を下部から洗い出し、最後にＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出した。反応容器にアミノ酸(ＤＭＦ中０.２Ｍ、２.５ｍＬ、５当量)、ＨＡＴＵ(ＤＭＦ中０.５Ｍ、１.０ｍＬ、５当量)およびＤＩＰＥＡ(ＮＭＰ中２Ｍ、０.５ｍＬ、１０当量)を添加した。混合物を、５０℃でカップリングするＦｍｏｃ−Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)−ＯＨ以外の全アミノ酸について、５分間、７５℃でＮ２バブリングにより混合し、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に３回洗浄した：ＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出し、その後ＤＭＦ(７ｍＬ)を下部から洗い出し、最後にＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出した。反応容器に酢酸無水物：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ(１０：１：８９ｖ／ｖ／ｖ、５.０ｍＬ)の溶液を添加した。混合物を、２分間、６５℃で周期的にバブリングし、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に３回洗浄した。ＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出し、その後ＤＭＦ(７ｍＬ)を下部から洗い出し、最後にＤＭＦ(７ｍＬ)を上部から洗い出した。得られた樹脂を、直接次工程で使用した。
【０１１７】
【化２０】
2019520328.tif 000022
以下のペプチドを、１ｍｍｏｌで合成した。下線を引いた工程はダブルカップリング法を用いて、斜体の基は、３０分間のシングルカップリング法を用いてカップリングした。
2019520328.tif 000023
；ここで、(Ｓ)プロパルギルグリシンを、２−クロロトリチル樹脂上に組み込んだ。上記方法に従って脱保護および環化後、化合物を、下記の通りに精製した：粗生成物を、プレパラティブＬＣ／ＭＳにより、以下の条件を用いて精製した：カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８，１９ｘ２００ｍｍ，５μｍ粒子；移動相Ａ：５：９５メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；移動相Ｂ：９５：５メタノール：水(１０ｍＭ 酢酸アンモニウムを含む)；グラジエント：３０分かけて４５〜８５％Ｂ、次いで１００％Ｂで５分間保持；流量：２０ｍＬ／ｍｉｎ。目的の生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーターにより乾燥させた。生成物の収量は１６.４ｍｇであり、ＬＣＭＳ分析によるその算出純度は９６％であった。分析条件Ａ：保持時間＝１.４９ｍｉｎ；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ９９２.３(Ｍ＋２Ｈ)，最も多いイオン。分析条件Ｂ：保持時間＝３.０２ｍｉｎ；ＥＳＩ−ＭＳ(＋)ｍ／ｚ９９２.３(Ｍ＋２Ｈ)，最も多いイオン；ＥＳＩ−ＨＲＭＳ(＋)ｍ／ｚ：計算値：９９１.９９５３(Ｍ＋２Ｈ)．実測値：９９１.９９２６(Ｍ＋２Ｈ).
【０１１８】
[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの合成
【化２１】
2019520328.tif 000024
【０１１９】
実施例１：２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネートの製造
【化２２】
2019520328.tif 000025
((オキシビス(エタン−２,１−ジイル)ビス(オキシ))ビス(エタン−２,１−ジイル)ビス(４−メチルベンゼンスルホネート)(５ｇ，９.９５ｍｍｏｌ)およびアジ化ナトリウム(０.６４７ｇ，９.９５ｍｍｏｌ)の混合物を、エタノール(５０ｍＬ)に溶解して、反応溶液を、１７時間かけて９０℃で還流した。溶媒を、部分真空を用いて除去して、次いで４０ｇｒａｍシリカカートリッジでロードして、フラッシュクロマトグラフィー(ＩｓｃｏＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ、１０％酢酸エチル／ヘキサンから開始して４５分間かけて９０％酢酸エチル／ヘキサンまでの、直線グラジエント方法を用いて溶出した)。集めた画分を、ＴＬＣにより確認して、これを合わせて、２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネートを無色油状物として得た。２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネート生成物の反応特性から、この物質をいずれの更なる特性分析も行なわず「そのまま」使用した。
【０１２０】
実施例２：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの製造
【化２３】
2019520328.tif 000026
水素化ナトリウム(０.１２９ｇ，３.２１ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(１０ｍＬ)の懸濁液に、０℃で、２−フルオロピリジン−３−オール(０.３６３ｇ，３.２１ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(５ｍＬ)の攪拌溶液、次いで２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル  ４−メチルベンゼンスルホネート(１.００ｇ，２.６８ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(５ｍＬ)の溶液を滴加した。懸濁液を、０℃で１０分間保持して、次いで１時間周囲温度として、６０℃で４時間更に加熱した。溶媒を、真空除去した。酢酸エチル(１００ｍＬ)を加えて、その後濃縮ブライン溶液を用いた３つの別個の洗浄抽出液を加えた。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過して、濃縮した。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(ＩｓｃｏＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ−１０〜５０％ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘで溶出した)を用いて精製して、無色油状物を得た。３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(７０２ｍｇ，２.２３３ｍｍｏｌ，８３％収率)を、透明な油として単離した。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ) δ ７.７５(ｄｔ，Ｊ＝４.９，１.６Ｈｚ，１Ｈ)，７.３３(ｄｄｄ，Ｊ＝１０.０，８.１，１.５Ｈｚ，１Ｈ)，７.１０(ｄｄｄ，Ｊ＝７.９，４.９，０.７Ｈｚ，１Ｈ)，４.３０−４.１６(ｍ，２Ｈ)，３.９５−３.８３(ｍ，２Ｈ)，３.８０−３.６１(ｍ，１０Ｈ)，３.３８(ｔ，Ｊ＝５.１Ｈｚ，２Ｈ) １３Ｃ ＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)ｄ １４２.３，１３７.７，１３７.５，１２３.４，１２３.４，１２１.７，１２１.６，７７.３，７６.７，７０.９，７０.７，７０.６，７０.０，６９.４，６９.０，５０.６．１９Ｆ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ)δ−８３.５５.ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)理論値：Ｃ１３Ｈ２０ＦＮ４Ｏ４＋  ｍ／ｚ  ３１５.４６４；実測値３１５.１４６３.
【０１２１】
実施例３：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジンの製造
【化２４】
2019520328.tif 000027
水素化ナトリウム(０.１２１ｇ，３.０１ｍｍｏｌ)(６０％油中懸濁液)を、ＤＭＦ(７.０ｍＬ)に溶解して、得られる懸濁液を０℃に冷却した。２−ニトロピリジン−３−オール(０.３８４ｇ，２.７４ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(１.５ｍＬ)の溶液を、ゆっくと加えて、次いで２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル ４−メチルベンゼンスルホネート(１.０２３ｇ，２.７４ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(１.５ｍＬ)を滴加した。懸濁液を、０℃で１０分間保持して、次いで２時間周囲温度まで昇温させて、次いで６０℃で７２時間加熱した。この反応溶液を、ＤＩ水(１０ｍＬ)でクエンチして、次いで酢酸エチル(３ｘ１０ｍＬ)で抽出した。集めたＥｔＯＡｃ抽出液を、濃縮ブライン溶液(１０ｍＬ)で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過して、減圧下でエバポレートして、淡黄色油状物を得た。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製した。シリカカートリッジ(２４ｇ)を、２５ｍＬ/ｍｉｎにて、１０％酢酸エチル/ヘキサンを用いて開始して、その後２５分かけて５０％酢酸エチル/ヘキサンへと直線的に変化させる。この後に、グラジエントを、この溶媒組成で１０分間保持して、次いで１０分かけて１００％酢酸エチルへと変えた。３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジンを、３０〜４０分のクロマトグラム部分を溶出し、集めた画分を減圧下でエバポレートして、次いで真空下で２時間エバポレートして、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジン(６８７ｍｇ，１.９７３ｍｍｏｌ，７２.０％収率)を淡黄色油状物として得た。１ＨＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ) δ ８.１１(ｄｔ，Ｊ＝４.９，１.６Ｈｚ，１Ｈ)，７.６０(ｄｄｄ，Ｊ＝１０.０，８.１，１.５Ｈｚ，１Ｈ)，７.５２(ｄｄｄ，Ｊ＝７.９，４.９，０.７Ｈｚ，１Ｈ)，４.３０−４.１６(ｍ，２Ｈ)，３.９５−３.８３(ｍ，２Ｈ)，３.８０−３.６１(ｍ，１０Ｈ)，３.３８(ｔ，Ｊ＝５.１Ｈｚ，２Ｈ)．１３ＣＮＭＲ(１０１ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ) ｄ １４７.３，１３９.５，１２８.４，１２４.４.７１.１，７０.７，７０.６，７０.０，６９.９，６９.３，５０.７.
ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)理論値：Ｃ１３Ｈ２０Ｎ５Ｏ６＋  ｍ／ｚ  ３４２.１４０８；実測値：３４２.１４０９.
【０１２２】
実施例４：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ブロモピリジンの合成
【化２５】
2019520328.tif 000028
水素化ナトリウム(ＮａＨ，２５.７ｍｇ，０.６４３ｍｍｏｌ)／ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ，５ｍＬ)の懸濁液に、０℃で、２−ブロモピリジン−３−オール(１１２ｍｇ，０.６４３ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(１ｍＬ)、次いで２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル４−メチルベンゼンスルホネート(２００ｍｇ，０.５３６ｍｍｏｌ)／ＤＭＦ(１ｍＬ)の溶液を滴加した。この懸濁液を、０℃で１０分間保持して、次いで周囲温度まで昇温させて、１時間保持して、次いで６０℃に４時間加熱した。加熱完了時に、粗製反応混合物の溶媒を真空除去した。粗反応物を、酢酸エチル(５０ｍＬ)に溶かして、ブライン水溶液(２x５０ｍＬ)で洗い、有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過して、真空濃縮した。粗生反応物を、逆相ＨＰＬＣを用いて精製して、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ブロモピリジン,ＴＦＡ(１１２ｍｇ，０.２２９ｍｍｏｌ，４２.７％収率)を、淡黄色油状物として得た。ＨＲＭＳ ＥＳＩｍ／ｚ(Ｍ＋Ｈ)，理論値：Ｃ１３Ｈ２０ＢｒＮ４Ｏ４  ３７５.０６６４，実測値：３７５.０６６２；１ＨＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６) δ ７.９７(ｄｄ，Ｊ＝４.６，１.５Ｈｚ，１Ｈ)，７.５４(ｄｄ，Ｊ＝８.２，１.６Ｈｚ，１Ｈ)，７.４０(ｄｄ，Ｊ＝８.１，４.６Ｈｚ，１Ｈ)，４.２４(ｄｄ，Ｊ＝５.３，３.９Ｈｚ，２Ｈ)，３.８５−３.７８(ｍ，２Ｈ)，３.６８−３.６２(ｍ，２Ｈ)，３.６２−３.５２(ｍ，８Ｈ)，３.４２−３.３４(ｍ，２Ｈ).
【０１２３】
トリメチルアニリウム化合物の合成
【化２６】
2019520328.tif 000029
【０１２４】
実施例５：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミンの合成
【化２７】
2019520328.tif 000030
ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ，２.５ｍＬ)中の３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(１６０ｍｇ，０.５０９ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(Ｋ２ＣＯ３，８４ｍｇ，０.６１１ｍｍｏｌ)およびジメチルアミン(水中で４０％, ０.０９７ｍＬ，０.７６４ｍｍｏｌ)の混合物を、１１０℃で１４時間、密閉耐圧バイアル内で加熱した。加熱完了時に、粗製反応混合物の溶媒を、真空除去した。粗製反応物を、酢酸エチル(５０ｍＬ)に溶かして、ブライン水溶液(２ｘ５０ｍＬ)で洗い、有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥して、濾過して、真空濃縮した。粗製反応物を、順相クロマトグラフィーを用いて精製して、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミン(１４０ｍｇ，０.４１３ｍｍｏｌ，８１％収率)を、無色油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ) δ ７.８６(ｄｄ，Ｊ＝４.９，１.５Ｈｚ，１Ｈ)，７.０２(ｄｄ，Ｊ＝７.８，１.５Ｈｚ，１Ｈ)，６.７３(ｄｄ，Ｊ＝７.８，４.９Ｈｚ，１Ｈ)，４.２０−４.０７(ｍ，２Ｈ)，３.９８−３.８６(ｍ，２Ｈ)，３.８１−３.６１(ｍ，９Ｈ)，３.３８(ｔ，Ｊ＝５.１Ｈｚ，２Ｈ)，３.１３−２.９４(ｍ，６Ｈ)，１.６９(ｓ，２Ｈ)．ＨＲＭＳ(ＥＳＩ)  理論値：Ｃ１５Ｈ２６Ｎ５Ｏ４＋ ｍ／ｚ ３４０.１９８０；実測値：３４０.１９７９.
【０１２５】
実施例６：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウムの合成
【化２８】
2019520328.tif 000031
メチルトリフルオロメタンスルホネート(０.０６５ｍＬ，０.５８９ｍｍｏｌ)を、一定の窒素流下において、密閉容器内で３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ−ジメチルピリジン−２−アミン(４０ｍｇ，０.１１８ｍｍｏｌ)/トルエン(１.５ｍＬ)の溶液に加えた。反応混合物を、１４時間かけて、室温で攪拌した。溶媒を除去して、得られる残留物を、エーテル(２ｘ１０ｍＬ)で洗い、ジクロロメタン(２x１ｍＬ)と共に共沸乾燥させて、高圧真空下にて終夜乾燥して、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウム，トリフルオロメタンスルホネート塩を定量的収量にて粘性の無色油状物として得た。
ＬＣＭＳ ｍ／ｚ ３５４.３３；１ＨＮＭＲ(４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６)δ８.２４−８.１７(ｍ，１Ｈ)，７.９８(ｄ，Ｊ＝８.３Ｈｚ，１Ｈ)，７.７５(ｄｄｄ，Ｊ＝８.２，４.６，３.２Ｈｚ，１Ｈ)，４.４４(ｂｒ.ｓ.，２Ｈ)，３.８８(ｄ，Ｊ＝３.９Ｈｚ，２Ｈ)，３.６９−３.４５(ｍ，２１Ｈ).
【０１２６】
実施例７：３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウム，トリフルオロメタンスルホネート塩を用いる[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの合成
【化２９】
2019520328.tif 000032
【０１２７】
[１８Ｆ]−フルオリド水溶液(２.０ｍＬ，３３.３ＧＢｑ／９００ｍＣｉ)を、ペンシルベニア州ウエスト・ポイント、Ｐ.Ｅ.Ｔ.Ｎｅｔ(登録商標)Pharmaceuticalsから購入し、直接Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡに移した[The Sep-Pak light QMA カートリッジを、使用前に、０.５Ｍ カリウム炭酸水素塩(５ｍｌ)、脱イオン水(５ｍＬ)およびＭｅＣＮ(５ｍＬ)を順に用いて事前処理した]。移行が完了してから、[１８Ｆ]フルオリド水溶液を、炭酸カリウム(１５ｍｇ／ｍｌ；０.１ｍｌ)、次いで炭酸カリウム(３０ｍｇ／ｍｌ，０．１ｍＬ)、４,７,１３,１６,２１,２４−ヘキサオキサ−１,１０−ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサン(１５ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ)およびＭｅＣＮ(１．２ｍＬ)の混合物を、連続的に加えることにより、ＱＭＡ Ｓｅｐ−Ｐａｋから溶出した。溶媒を、９０℃で真空にて、窒素の穏やかな気流下にて、エバポレートした。共沸乾燥を、アセトニトリル(１ｍＬ)を用いて２回繰り返して、無水Ｋ.２.２.２／Ｋ[１８Ｆ]Ｆ複合体を生成した。３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルピリジン−２−アミニウム，トリフルオロメタンスルホネート塩(２ｍｇ，５.６μｍｏｌ)を、５００マイクロリットルのＤＭＳＯに溶解し、乾燥クリプタンドに加えた。この溶液を１２０℃で１０分間加熱した。その後、粗製反応混合物を３ｍｌのＤＩ水で希釈した。次いで、粗製反応混合物の全量を、逆相ＨＰＬＣに移し、ロードし、以下の条件で精製した：ＨＰＬＣカラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０ｘ１０, 溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ／ＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡ／アセトニトリル，流量：４.６ｍｌ／分，ＵＶ２８０ｎｍでモニターしながら、アイソクラチック法の３２％Ｂを用いる。[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを、クロマトグラムの２４分のピークにて単離し、２分間かけて回収した。この生成物を１０ｍｌのＤＩ水を含む１００ｍｌのフラスコ中に回収し、全ての内容物を、ＷａｔｅｒｓのＳｅｐ-Ｐａｋ Ｖａｃ tＣ１８ ６cc １g ｓｅｐ ｐａｃｋに移した。[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン(６.１ＧＢｑ／１６４ｍＣｉ)を、この反応から単離した。これを、エタノール(３ｍＬ)を用いてｓｅｐ−ｐａｋから溶出して、この溶液を、９８℃の熱源、窒素の安定な気流および真空で１５分間、当該バイアルにフィルムのみが残るまで蒸発させた。最終生成物を、１００％１ｘＰＢＳ緩衝液に溶解したが、３７℃で１時間以上この溶媒中で安定であった。
【０１２８】
[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを用いて、アルキンを含む適切なペプチドとの「クリック」アジド−アルキン反応を利用することにより１８Ｆ−標識生成物(例えば、以下に記載した通りの１８Ｆ−標識抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチド)を製造してもよい。
【０１２９】
実施例８：「クリックケミストリー」を用いる１８Ｆ−放射性標識された大環状ペプチドの作成
Ａ．[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを形成するための４−ＰＥＧ−トシル−アジド前駆体のフッ素化
[１８Ｆ]−フルオリド水溶液(２.０ｍＬ，２９.６ＧＢｑ／８００ｍＣｉ)は、ＴｏｗａｄａにあるＩＢＡから購入して、ＢＭＳ Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＮＪ ｓｉｔｅに出荷された。この試料を、特注の遠隔操作性合成機器内に移した。この溶液を、Ｓｅｐ-Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡ[The Sep-Pak light QMA cartridgeは、使用前に０.５Ｍ 炭酸水素カリウム(５ｍｌ)、脱イオン水(５ｍＬ)およびＭｅＣＮ(５ｍＬ)を順に用いて予め適切に調整された]に移した。この移行が完了してから、[１８Ｆ]フルオリド水溶液を、炭酸カリウム(３０ｍｇ／ｍｌ／蒸留水(ＤＩ)，０.１ｍＬ)、４,７,１３,１６,２１,２４−ヘキサオキサ−１,１０−ジアザビシクロ[８.８.８]ヘキサコサン(１５ｍｇ，０.０４ｍｍｏｌ)およびアセトニトリル(１.４ｍＬ)の混合物を加えて、ＱＭＡ Ｓｅｐ-Ｐａｋから溶出した。溶媒を、９０℃真空にて窒素の穏やかな気流下においてエバポレートした。共沸乾燥を、１ｍＬのアセトニトリルを用いて２回繰り返して、無水Ｋ.２.２.２／Ｋ[１８Ｆ]Ｆ錯体を生成した。この処理が完了した後に、クリプタンドを完全な真空下にて１５分間更に乾燥した。全ての処理は、完了するまで３５分間を要した。
【０１３０】
この乾燥した[１８Ｆ]／クリプタンド固体に、３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−ニトロピリジン／ＤＭＳＯ(２ｍｇ，０.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、１２０℃で１０分間加熱した。この後に、粗製反応混合物を、蒸留水(３ｍＬ)で希釈して、全ての内容物を、以下のＨＰＬＣカラムおよび条件にてロードした：ＨＰＬＣカラム：Luna C18 250 x 10 mm；溶媒Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／ＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡ／アセトニトリル；流量４.６ｍｌ／ｍｉｎ；圧力１８２０ＰＳＩ；アイソクラチック法３２％Ｂ；ＵＶ−２８０ｎｍ。[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジン([１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡ)生成物を、クロマトグラムの２４分の時点で単離して、２分かけて収集した。この生成物を、ＤＩ水(１５ｍＬ)を含有するフラスコ(１００ｍＬ)に集めて、全量をＳｅｐ ＰａｋＶａｃ ｔＣ１８ ６ｃｃ １ｇ ｓｅｐ ｐａｃｋ(ＰＮ ＷＡＴ０３６７９５)に移した。[１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡを、エタノール(２.５ｍＬ)を用いてＳｅｐ Ｐａｋから溶出して、この溶液を、１５分間かけて乾燥するまで９８℃のＮ２および真空において減少させた。この化合物を、ＤＩ水(０.１ｍＬ)に溶解した。この生成物を、Varian HPLC HPLC Column Luna C18 (2) 4.6 x 150 mmを用いて分析した。溶媒Ａ：０.１％ＴＦＡ／ＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡ／アセトニトリル；流量１.０ｍｌ／ｍｉｎ；グラジエント法、０分 ９０％Ａ  １０％Ｂ；１５分 ３０％Ａ  ７０％Ｂ；１７分 ３０％Ａ  ７０％Ｂ；１８分 ９０％Ａ  １０％Ｂ；２０分 ９０％Ａ  １０％Ｂ；ＵＶ−２８０ｎｍ。１４.１ ＧＢｑ(３８０ｍＣｉ)の[１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡを単離した。この生成物を、アルキンを含むＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチドを用いて、「クリック」ケミストリーを完了させた。
【０１３１】
Ｂ．[１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡと大環状ペプチドとのカップリング
[１８Ｆ]−放射性標識された大環状ペプチドを合成するためのスキームは、スキーム(ａ)に示される。
(Ｓ)−２−(２−((６Ｓ,９Ｓ,１２Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,３０Ｓ,３３Ｓ,３６Ｓ,３８ａＳ,４０Ｒ,４４Ｒ,４７Ｓ,４９ａＳ)−３６−((１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−６−(２−アミノ−２−オキソエチル)−３３−(２−アミノエチル)−４７−(アミノメチル)−２４,２７−ジブチル−３０−((１−(カルボキシメチル)−１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−４０−ヒドロキシ−１２−(４−ヒドロキシベンジル)−２１,４４−ジイソブチル−９,１０,２５,２８−テトラメチル−５,８,１１,１４,２０,２３,２６,２９,３２,３５,３８,４３,４６,４９−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−１Ｈ,５Ｈ−ジピロロ[２,１−ｇ１：２',１'−ｘ][１]チア[４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,３１,３４,３７,４０,４３]トリデカアザシクロペンタテトラコンチン−１８−カルボキサミド)アセトアミド)ペンタ−４−イン酸(０.７５ｍｇ，０.３７８μｍｏｌ)を、ＤＩ水(０.２５０ｍＬ)およびｔｅｒｔ−ブチルアルコール(０.２５ｍＬ)に溶解した。この溶液に、硫酸銅(１ｍｇ)を含有するＤＩ水溶液(０.２５０ｍＬ)およびアスコルビン酸ナトリウム(１ｍｇ)を加えた。最終的に、１４.１ＧＢｑ(３８０ｍＣｉ)の[１８Ｆ]−ＦＰＰＥＧＡ(セクションＡに記述したように製造した)(０.１ｍＬ溶液)を加えて、この反応混合物を、周囲温度で２０分間混合した。この粗製反応混合物の内容物に、アセトニトリル(０.５ｍＬ)、ＤＩ水(１.５ｍＬ)を加えて、この混合物を、逆相ＨＰＬＣカラムを用いて精製した。ＨＰＬＣカラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０ｘ１０ｍｍ；溶媒Ａ：０.１％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／ＤＩ水；溶媒Ｂ：０.１％ＴＦＡ／アセトニトリル；流量４.６ｍｌ／ｍｉｎ；圧力１８２０ＰＳＩ；アイソクラチック法３７％Ｂ；ＵＶ−２２０ｎｍ。生成物を、クロマトグラムの２７〜３１分の間で単離して、図(ｂ)に示したように４分かけて収集した。２.５ＧＢｑ(６７ｍＣｉ)の[１８Ｆ]−(Ｓ)−２−(２−((６Ｓ,９Ｓ,１２Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,３０Ｓ,３３Ｓ,３６Ｓ,３８ａＳ,４０Ｒ,４４Ｓ,４７Ｓ,４９ａＳ)−３６−((１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−６−(２−アミノ−２−オキソエチル)−３３−(２−アミノエチル)−４７−(アミノメチル)−２４,２７−ジブチル−３０−((１−(カルボキシメチル)−１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−４０−ヒドロキシ−１２−(４−ヒドロキシベンジル)−２１,４４−ジイソブチル−９,１０,２５,２８−テトラメチル−５,８,１１,１４,２０,２３,２６,２９,３２,３５,３８,４３,４６,４９−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−１Ｈ,５Ｈ−ジピロロ[２,１−ｇ１：２',１'−ｘ][１]チア[４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８,３１,３４,３７,４０,４３]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−１８−カルボキサミド)アセトアミド)−３−(１−(２−(２−(２−(２−((２−フルオロピリジン−３−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル)プロパン酸を単離した。この溶液を、さらに、ＤＩ水(２０ｍＬ)で希釈して、この溶液を、Ｃ-１８ｓｅｐ-ｐａｋ(Ｗａｔｅｒｓ ５０ｍｇ、これはエタノール(５ｍＬ)、その後にＤＩ水(１０ｍＬ)を用いて予め活性化された)に移して、全ての有機溶媒を該溶液から除去する。このｓｅｐ-ｐａｋを、さらに注射用の滅菌水(１０ｍＬ)で洗った。この生成物を、エタノール(０.５ｍＬ)を用いてｓｅｐ-ｐａｋから溶出し、滅菌バイアル中へ滅菌濾過して、注射用生理食塩水を用いて溶液重量まで５％エタノールに希釈した。この生成物を、図(ｂ)に示されたとおりに逆相ＨＰＬＣを介して分析した：非放射性標準物を同時にインジェクションすることにより、放射性化学物質の純度および化学的純度、比活性を化学的に特定した。非放射性参照標準物と共に溶出したこの単離生成物は、１００％放射性化学的純度であり、９５％化学的純度であって、０.３７(１０ｍＣｉ)ＧＢｑ／ｎｍｏｌの比活性を有する。
【０１３２】
分析逆相ＨＰＬＣを、以下のパラメーターで行った：
Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ-Ｃ１８ ２５０ｘ４.６ｍｍカラム；溶媒Ａ：０.０５％ギ酸／ＤＩ水；溶媒Ｂ：アセトニトリル中で０.０５％；流量１.０ｍｌ／ｍｉｎ；グラジエント法、２０分かけて３０％〜５０％Ｂ；ＵＶ−２２０ｎｍ.
【０１３３】
スキーム(ａ)
[１８Ｆ]−放射性標識されたＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチドを合成するためのスキーム
【化３０】
2019520328.tif 000033
[１８Ｆ]−(Ｓ)−２−(２−((６Ｓ,９Ｓ,１２Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,３０Ｓ,３３Ｓ,３６Ｓ,３８ａＳ,４０Ｒ,４４Ｓ,４７Ｓ,４９ａＳ)−３６−((１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−６−(２−アミノ−２−オキソエチル)−３３−(２−アミノエチル)−４７−(アミノメチル)−２４,２７−ジブチル−３０−((１−(カルボキシメチル)−１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−４０−ヒドロキシ−１２−(４−ヒドロキシベンジル)−２１,４４−ジイソブチル−９,１０,２５,２８−テトラメチル−５,８,１１,１４,２０,２３,２６,２９,３２,３５,３８,４３,４６,４９−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−１Ｈ,５Ｈ−ジピロロ[２,１−ｇ１：２',１'−ｘ][１]チア[４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８,３１,３４,３７,４０,４３]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−１８−カルボキサミド)アセトアミド)−３−(１−(２−(２−(２−(２−((２−フルオロピリジン−３−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル)プロパン酸を、様々なインビトロおよび／またはインビボでの画像用途、例えば、診断用画像、基礎研究および放射線治療用途に使用できる。診断イメージングおよび放射性治療応用の可能な特定の例としては、哺乳動物またはその臓器もしくは組織試料における、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の位置、相対的な活性および／または定量化の決定、ＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の放射免疫アッセイ、並びにＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の分布を決定するためのオートラジオグラフィーが挙げられる。
【０１３４】
特に、[１８Ｆ]−(Ｓ)−２−(２−((６Ｓ,９Ｓ,１２Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,３０Ｓ,３３Ｓ,３６Ｓ,３８ａＳ,４０Ｒ,４４Ｓ,４７Ｓ,４９ａＳ)−３６−((１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−６−(２−アミノ−２−オキソエチル)−３３−(２−アミノエチル)−４７−(アミノメチル)−２４,２７−ジブチル−３０−((１−(カルボキシメチル)−１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−４０−ヒドロキシ−１２−(４−ヒドロキシベンジル)−２１,４４−ジイソブチル−９,１０,２５,２８−テトラメチル−５,８,１１,１４,２０,２３,２６,２９,３２,３５,３８,４３,４６,４９−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−１Ｈ,５Ｈ−ジピロロ[２,１−ｇ１：２',１'−ｘ][１]チア[４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８,３１,３４,３７,４０,４３]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−１８−カルボキサミド)アセトアミド)−３−(１−(２−(２−(２−(２−((２−フルオロピリジン−３−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル)プロパン酸は、ヒトおよび実験動物の肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚ならびに他の臓器におけるＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)イメージングに有用である。[１８Ｆ]−(Ｓ)−２−(２−((６Ｓ,９Ｓ,１２Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,３０Ｓ,３３Ｓ,３６Ｓ,３８ａＳ,４０Ｒ,４４Ｓ,４７Ｓ,４９ａＳ)−３６−((１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−６−(２−アミノ−２−オキソエチル)−３３−(２−アミノエチル)−４７−(アミノメチル)−２４,２７−ジブチル−３０−((１−(カルボキシメチル)−１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−４０−ヒドロキシ−１２−(４−ヒドロキシベンジル)−２１,４４−ジイソブチル−９,１０,２５,２８−テトラメチル−５,８,１１,１４,２０,２３,２６,２９,３２,３５,３８,４３,４６,４９−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−１Ｈ,５Ｈ−ジピロロ[２,１−ｇ１：２',１'−ｘ][１]チア[４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８,３１,３４,３７,４０,４３]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−１８−カルボキサミド)アセトアミド)−３−(１−(２−(２−(２−(２−((２−フルオロピリジン−３−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル)プロパン酸を用いるＰＥＴイメージングを用いて、以下の情報を得ることができる：ＰＤ−Ｌ１腫瘍-候補治療薬による組織占有度と患者の臨床効果との関係；長期間の臨床試験の開始前の、ＰＤ−Ｌ１腫瘍−候補治療薬の臨床試験のための用量選択；構造的に新しいＰＤ−Ｌ１腫瘍−治療薬の相対的な有効性；ＰＤ−Ｌ１腫瘍−治療薬を用いた臨床的標的の治療の期間のインビボでの輸送体親和性および密度への影響の調査；有効および非有効治療中のＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍の密度および分布における変化。
【０１３５】
実施例９：ＧＥ ＴＲＡＣＥＲｌａｂ ＦＸ２ Ｎ 合成ユニット上での放射性物質合成のための一般方法に従う[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動製造
【化３１】
2019520328.tif 000034
市販のＴＲＡＣＥＲｌａｂ ＦＸ２ Ｎ 合成モジュール(ＧＥ)を用いる自動合成
[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動合成を、非カセット型のＧＥ ＴＲＡＣＥＲｌａｂ ＦＸ２ Ｎ合成モジュールを用いて行なった。合成ユニットの配置は表にまとめられる。[１８Ｆ]−フルオリド水溶液(２.０ｍＬ，２９.６ＧＢｑ／８００ｍＣｉ)を、Ｓｅｐ-Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡ[Sep-Pak light QMA カートリッジは、使用前に０.５Ｍ炭酸水素カリウム塩(５ｍｌ)、脱イオン水(５ｍＬ)およびアセトニトリル(５ｍＬ)を順に用いて事前に適切に処理された]に移した。この移行が完了してから、反応容器に、溶出用混合液を加えることにより(「Ｖ１」から)、[１８Ｆ]フルオライド水溶液を、ＱＭＡ Ｓｅｐ−Ｐａｋから溶出させた。溶媒を、窒素の穏やかな気流および真空下において、エバポレートした。前駆体の溶液(“Ｖ３”から)を、乾燥クリプタンド残留物に加え、この反応混合物を１２０℃で１０分間加熱した。次いで、４ｍｌの蒸留水を(「Ｖ４」から)、反応容器中の粗製反応混合物に加え、混合物を、ローディングの終わりを制御する液体センサーを介して、半分取ＨＰＬＣの５ｍｌ試料注入ループに移した。混合物を、半分取ＨＰＬＣカラム(Luna C18(2). 250x10mm, Phenomenex)にロードした。０.１％トリフルオロ酢酸水溶液中の３５％アセトニトリルの混合液を、毎分４.６ｍｌの速度でカラムに通した。生成物をこのＨＰＬＣカラムから、１５ｍｌの蒸留水を含む希釈フラスコに回収し、その全ての内容物を、ｔＣ１８(１グラム)の固相抽出カートリッジに移した。３ｍｌのエタノールによって、このカートリッジから３５２ｍＣｉ(１３ＧＢｑ)の[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを溶出させて(「Ｖ１４」から)、これを用いて、アルキンを含む適切なペプチドとの「クリック」アジド−アルキン反応を利用した１８Ｆ標識ペプチド製剤を生成し得る。
【表１】
2019520328.tif 000035
【０１３６】
実施例１０：ＩＢＡ Ｓｙｎｔｈｅｒａ合成ユニット上で合成放射性物質を合成するために一般方法に従う[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動製造
【化３２】
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市販のＳｙｎｔｈｅｒａ合成モジュール(ＩＢＡ)を用いる自動合成
[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンの自動合成を、カセット型のＩＢＡ Ｓｙｎｔｈｅｒａ合成モジュールおよび適切に組み立てられた流体プロセッサー積算キットを用いて行なった。この合成のために、流体プロセッサー積算(ＩＦＰ)キットは、適切な前駆体とともにロードされ、表()にまとめられる。精製を、Ｖａｒｉａｎ ＨＰＬＣ ｕｎｉｔ上で行なった。ＨＰＬＣのインジェクションループの充填は、ＨＰＬＣユニットの安定な窒素気流によって制御された。両方の自動装置の組み立ては、表()にまとめられる。[１８Ｆ]−フルオリド水溶液(２.０ｍＬ，２９.６ＧＢｑ／８００ｍＣｉ)を、Ｓｅｐ-Ｐａｋ ｌｉｇｈｔ ＱＭＡ[The Sep-Pak light QMA cartridgeは、使用前に０.５Ｍ 炭酸水素カリウム塩(５ｍｌ)、脱イオン水(５ｍＬ)およびアセトニトリル(５ｍＬ)を順に用いて事前に処理された]に移した。この移行が完了してから、[１８Ｆ]フルオリド水溶液を、反応容器への溶出混合物(「Ｖ１」から)の添加により、ＱＭＡ Ｓｅｐ-Ｐａｋから溶出した。溶媒を、窒素の穏やかな気流および真空下でエバポレートした。前駆体の溶液を(「Ｖ２」から)、乾燥クリプタンド残留物に加え、この反応混合物を１２０℃で１０分間加熱した。次いで、３ｍｌの蒸留水を(「Ｖ４」から)、反応容器中の粗製反応混合物に加えて、混合物を、ローディングの終わりを制御する液体センサーを介して、半分取ＨＰＬＣの５ｍｌの試料注入ループに移した。混合物を、半分取ＨＰＬＣカラム(Luna C18(2). 250 x 10mm, Phenomenex)にロードした。０.１％トリフルオロ酢酸水溶液中の３５％アセトニトリルの混合液を、毎分４.６ｍｌの速度でカラムに通した。生成物をこのＨＰＬＣカラムから、１５ｍｌの蒸留水を含む希釈フラスコに回収し、全ての内容物を、ｔＣ１８ １グラムの固相抽出カートリッジに移した。エタノール(３ｍＬ)によって、このカートリッジから３２５ｍＣｉ(１２ＧＢｑ)の[１８Ｆ]−３−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−２−フルオロピリジンを溶出させ、これを使用して、アルキンを含有する適切なペプチドとの「クリック」アジド-アルキン反応を利用した１８Ｆ標識ペプチド生成物を生成し得る。
【表２】
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【０１３７】
実施例１１：抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドイメージング剤を用いるＰＤ−Ｌ１−陽性腫瘍とＰＤ−Ｌ１−陰性腫瘍の識別
ＰＥＴ画像にとって、迅速な血液クリアランス速度は、非関連組織から“バックグラウンド”プローブシグナルを枯渇させるために必要な時間を最小とすることで、抗体などのより遅いクリアリング剤を超える利点を提供する。診療所において、血液半減期が長い抗体を基にしたＰＥＴトレーサーは、画像を収集するためには、注入後に数日間待つことを必要とする。プローブを迅速にクリアランスするということは、プローブを注入したその日に高分解性の画像収集を可能にするという道を開くものであり、そのことが、実験動物または試験患者に対する全体の放射線暴露を減少させるのに役立ち得ることは非常に重要である。
【０１３８】
この実験において、[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチドを、上記実施例において記述された通りに製造して、マウスにおけるｈＰＤ−Ｌ１−陽性腫瘍およびｈＰＤ−Ｌ１−陰性腫瘍を識別するその能力を試験した。
【０１３９】
両側性の異種移植片腫瘍を持つマウスを、マウスの両側に、２×１０６ｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７ヒト肺癌細胞および４×１０６ｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞を皮下導入することにより作成した。腫瘍がおよそ３００ｍｍ３に達してから(細胞移植の後おおよそ２〜３週間)、イメージングのために動物を選択した。各試験の体重および腫瘍サイズを、イメージング法の前に、イメージングの実施日に測定し、記録した。マウスを、麻酔誘導チャンバー内に置いて、１〜１.５Ｌ／ｍｉｎの速度で、１００％Ｏ２中に３％イソフルラン吸入麻酔を送気した。一旦鎮静させてから、マウスを、誘導チャンバーから出して、プレキシガラス製の４つのチャンバーマウスホテル(BMS-Applied Biotechnology groupにより特注)に入れて、ノーズコーンを介して２Ｌ／ｍｉｎの速度で１００％Ｏ２に送気して、１〜１.５％イソフルラン吸入麻酔を行ない続けた。イメージング中の低体温症を防ぐために、外付けのスタンドアローン温度調節ユニット(M2M Imaging Corp)を用いて動物を温め続けた。マウスの呼吸を、イメージング手法の間、連続的にモニターし、また麻酔の深さに拠ってイソフルランを調整されてもよい。次いで、マウスは、４匹動物を収容できるカスタム動物ホルダー内に入れられ、そこで試験の継続期間中、麻酔下に保たれた。動物ホルダーを、ｍｉｃｒｏＰＥＴ(登録商標) Ｆ１２０(商標) ｓｃａｎｎｅｒ(Siemens Preclinical solutions, Knoxville, TN)に移した。この機器の軸方向視野は７.６ｃｍである。この制限のために、動物は、スキャン領域が眼の直前から、おおよそ尾の付け根までとなるよう置かれる。最終的なＰＥＴ画像を減衰補正するために、５７Ｃｏの点光源を用いて最初に１０分間の透過像を得た。透過スキャンに続いて、放射性トレーサー溶液を、予め取り付けられた尾静脈カテーテルを介して投与して、２時間のエミッション画像を得た。注入された放射性トレーサー溶液を、ＨＴ−２９については腫瘍体積２０３．０±５１.４ｍｍ３を有し、またＬ２９８７については腫瘍体積４２２．９±１２８.４ｍｍ３を有する全８匹(体重：２２.２±２.０gram)に注入して、移殖１６〜１７日後にイメージングを行なった。各マウスは、[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド(１２４.０±８.４μＣｉ，トレーサー量：１.０±０.４μｇ／ｋｇ)のＩＶ注射の３０分前に、ＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチド６０ｍｇ／ｋｇ(Ｎ＝４)または生理食塩水(Ｎ＝４)のＳＣ投薬の単回注入を受容した。画像は、得られた透過像を用いて減衰補正をした最大事後(ＭＡＰ)アルゴリズムを用いて再構築し、放射性同位体の崩壊について補正した。最終的な画像において、ASIPro software(Siemens Preclinical Solutions)を用いて、腫瘍の境界付近に関心領域(ＲＯＩ)を描いた。それぞれのＲＯＩについて時間放射曲線を算出し、２時間のエミッション画像の経過における腫瘍体積中の放射性トレーサーの定量画像を得た。最終的な比較のために、個々の時間放射能曲線は、それぞれの特定の動物に対して注入された放射性トレーサーの用量に基づいて標準化した。放射性トレーサーの取り込みを、それぞれの時間放射能曲線の最後の１０分(放射性トレーサーの注入後９０〜１００分)を用いて、腫瘍全域にわたって比較した。この手法を用いて、ｈＰＤ−Ｌ１(��)Ｌ２９８７異種移植片における放射性トレーサーの取り込みは、[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーのみを受容した動物のｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植片に見られるものに対して８.１×であった。放射性トレーサーの注入の３０分前にＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチド６０ｍｇ／ｋｇのＳＣ投薬を受容した動物において、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７異種移植片における取り込みは、ｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９異種移植片において見られるものに対してわずか０.７×であった(図１、図２および表３)。
【０１４０】
表３：実施例１１におけるＰＥＴ画像から得たＨＴ−２９およびＬ２９８７腫瘍中の標準取り込み値(ＳＵＶ)
【表３】
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【０１４１】
これらの結果は、インビボにおいてｈＰＤ−Ｌ１(＋)とｈＰＤ−Ｌ１(−)の異種移植腫瘍を識別する直接的な可視化を提供する。特異性は、放射性トレーサーの注入３０分前にＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチド６０ｍｇ／ｋｇを予め投与することにより検証され、ｈＰＤ−Ｌ１(＋)腫瘍における放射性トレーサーの取り込みは、ｈＰＤ−Ｌ１(−)異種移植片の程度まで減少した。この事実は、ＰＥＴ画像を用いて、ＰＤ−Ｌ１組織発現を可視化するためのＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドの使用に関する正当性を立証している。
【０１４２】
実施例１２：抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドイメージング剤を用いる非ヒト霊長類におけるＰＥＴ画像
抗ＰＤ−Ｌ１ミラモレキュラーを基にしたイメージング剤は、カニクイザルにおいて行なった場合にも同様の結果を示した。これらの試験において、上記実施例において記述したとおりに製造した[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチドは、カニクイザルにおいて高分解性画像を提供するその能力について試験された。本明細書に記述した抗ＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドは、カニクイザルＰＤ−Ｌ１(しかし、げっ歯類ＰＤ−Ｌ１に対しては低い親和性を有する)に対して高い親和性を維持する。さらに、カニクイザルは、マウスモデルに見られるようなＰＤ−Ｌ１(＋)腫瘍を含有せず、イメージングの性能を、内因性ＰＤ−Ｌ１発現(バックグラウンドが低いため、ＰＤ−Ｌ１(＋)組織の高感度検出が可能になる)に関連する画像において測定されるバックグラウンド量を第一に評価した。バックグラウンド量にて主に評価した。これらの試験から、得られるＰＥＴ画像におけるバックグラウンド量は極めて低く、顕著な放射性トレーサーの蓄積は、主に、腎臓、脾臓および膀胱に見られた。
【０１４３】
あらかじめ血管アクセスポート(ＶＡＰ)を導入したオスのカニクイザルを、０.０２ｍｇ／ｋｇのアトロピン、５ｍｇ／ｋｇのテラゾールおよび０.０１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンＩ.Ｍ.によって麻酔した(全てを単一のシリンジから注入した)。次いで、イメージング手順の間に給水を維持する点滴投与のために、静脈カテーテルを頭部血管に設置した。動物を気管内チューブ−通常は３.０ｍｍと共にインキュベートし、ｍｉｃｒｏＰＥＴ(登録商標)Ｆ２２０ＴＭ ＰＥＴ機器(Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN)の撮影台に移した。イメージング処理の間、麻酔をイソフルランおよび酸素によって維持し、静脈内輸液(ＬＲＳ)を６ｍｌ／ｋｇ／時間の速度で投与した。ｍｉｃｒｏＰＥＴ(登録商標)Ｆ２２０ＴＭ機器の軸方向視野はわずか７.６ｃｍであるため、心臓の直上からおよそ骨盤までの動物の合成画像を作成するために、５つの異なる台の位置における画像を得た。
【０１４４】
それぞれの視野において、最終的なＰＥＴ画像を減衰補正するために、５７Ｃｏの点光源を用いて１０分の透過像を最初に得た。全ての台の位置において透過像が得られた後、およそ１.７ｍＣｉ(およそ０.１２μｇ／ｋｇ)の[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーを、導入されたＶＡＰを介して投与した。次いで、動物の心臓の中心付近のポジション１から始まり、骨盤に向かって動く、５分間の継続したエミッションスキャンを、それぞれの台の位置で順に行った。それぞれの位置(１から５)において画像を得た後、撮影台をポジション１の台に戻し、この手順を繰り返した。この手順を用いて、イメージング実験の継続時間にわたり、それぞれの台の位置について合計５つの異なる画像を得た。
【０１４５】
個々の画像は、得られた透過像を用いて減衰補正したフィルター逆投影(ＦＢＰ)アルゴリズムを利用して再構築し、放射性同位体崩壊について補正された。最終的な合成画像は、次いで、イメージング実験の継続時間の間、１回の通過によって得られた全ての５つの台の位置の画像を整列させることによって得られた(すなわち、１つの合成画像は、台の位置１から５の逐次的な画像のそれぞれのセットから生成された)。最終的な画像は、放射性トレーサーの取り込みが、可視領域(すなわち、脾臓、腎臓、膀胱)およびバックグランド組織(筋肉)に見られるために、視覚的に調査された(図３)。[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーのバックグラウンドの蓄積は極めて低く、筋肉などのバックグラウンド組織においてはわずかなシグナルしか可視化されなかった。さらに、免疫組織学的かつｍＲＮＡ発現に基づいてＰＤ−Ｌ１(＋)である脾臓において、取り込みが検証された。このように、カニクイザルにおける実験によって、内因性ＰＤ−Ｌ１に関連する高感度のＰＤ−Ｌ１イメージングについての可能性が実証される。カニクイザルの脾臓における特異的結合の特性を決定するために、以下の方法でブロッキング試験を行なった。
【０１４６】
カニクイザル(４.４ｋｇ，オス)は、ベースラインで[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサー(〜１.７ｍＣｉ，量：０．２１μｇ／ｋｇ)の単回ＩＶ注射を受容した。次の日に(投薬後)、同じＮＨＰは、放射性トレーサー注射の２時間前に単回ＳＣ用量の２ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチドを受容した(〜１．７ｍＣｉ，量：０.１２μｇ／ｋｇ)。種々の臓器におけるこのトレーサー取り込みを、表４に挙げる。ベースラインおよび投薬後の代表的なＰＥＴ画像を、図３にプロットした。抗ＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチドの血漿濃度を、各々イメージングの日に、放射性トレーサー注射後の０、１０、３０、６０、９０分に測定した(表４)。特異的結合シグナルを、非ヒトげっ歯類霊長類の脾臓内で観察すると、９３％のトレーサー取り込みが、２ｍｇ／ｋｇの特異的ＰＤ−Ｌ１に結合する大環状ペプチド(２ｍｇ／ｋｇ)によりブロックされた。
【０１４７】
齧歯類およびカニクイザルにおけるＰＥＴ実験において、１８Ｆ標識抗ヒトＰＤ−Ｌ１大環状ペプチドは、ＰＤ−Ｌ１発現量が低い組織の高感度検出を可能にする、インビボでのＰＤ−Ｌ１陽性組織の標識のための強力で特異的なプローブを提供することが示される。
【０１４８】
インビボでのイメージング実験を抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて行ない、このイメージング剤が検出した領域は、ＰＤ−Ｌ１イメージング剤を用いて検出した領域と同じ領域であり、即ち、抗ＰＤ−Ｌ１ミラモレキュラーイメージング剤が、インビボでのＰＤ−Ｌ１陽性細胞の検出に成功したことが確認された。
【０１４９】
【表４】
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【０１５０】
実施例１３：[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーを用いるインビトロのオートラジオグラフィー
ヒトの肺腫瘍組織を、ＯＣＴに埋め込んで、凍結するまで２−メチルブタン中で２〜５分間冷却した。サンプルを、−８０℃の冷凍庫に使用するまで保存した。ヒトの異種移植組織もアッセイに含めた。両側性の異種移植片を有するマウスは、２×１０６ ｈＰＤ−Ｌ１(＋)Ｌ２９８７ヒト肺癌細胞および４×１０６ｈＰＤ−Ｌ１(−)ＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞をマウスの反対側に皮下導入することにより作成した。得られる異種移植腫瘍が、適切なサイズ(約２００〜３００ｍｍ３)に達してから、マウスを２％イソフルランで麻酔して、頸椎脱臼により屠殺した。新たに腫瘍組織を切り出して、ＯＣＴに浸漬し、２−メチルブタン中で凍結するまで２〜５分間凍らせた。次いで組織を、ｆｏｉｌ/ＺＩＰＬＯＣ(登録商標)バッグで包み、−８０℃で使用するまで保存した。全ての組織(ヒトの肺腫瘍および異種移植片)について、５μｍ厚の切片(２切片/スライドとして回収した)を、クリオスタットを用いて切り出して、顕微鏡用ガラススライド上で溶融解凍して、おおよそ３０分風乾させた。ブロッキング試験は、各々０.１ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭのコールド(非標識)ペプチドを用いる。個々のスライド(濃度につき１枚のスライド)を、インキュベーションのためにガラススライドインキュベーションチャンバーに移した。これとは別に、０.２５ｎＭの[１８Ｆ]−(Ｓ)−２−(２−((６Ｓ,９Ｓ,１２Ｓ,１８Ｒ,２１Ｓ,２４Ｓ,２７Ｓ,３０Ｓ,３３Ｓ,３６Ｓ,３８ａＳ,４０Ｒ,４４Ｓ,４７Ｓ,４９ａＳ)−３６−((１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−６−(２−アミノ−２−オキソエチル)−３３−(２−アミノエチル)−４７−(アミノメチル)−２４,２７−ジブチル−３０−((１−(カルボキシメチル)−１Ｈ−インドール−３−イル)メチル)−４０−ヒドロキシ−１２−(４−ヒドロキシベンジル)−２１,４４−ジイソブチル−９,１０,２５,２８−テトラメチル−５,８,１１,１４,２０,２３,２６,２９,３２,３５,３８,４３,４６,４９−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−１Ｈ,５Ｈ−ジピロロ[２,１−ｇ１：２',１'−ｘ][１]チア[４,７,１０,１３,１６,１９,２２,２５,２８,３１,３４,３７,４０,４３]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−１８−カルボキサミド)アセトアミド)−３−(１−(２−(２−(２−(２−((２−フルオロピリジン−３−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１Ｈ−１,２,３−トリアゾール−４−イル)プロパン酸のストック溶液を、ｔｗｅｅｎ８０(３００ｍＬ)を用いる元々の放射性リガンド溶液(実験時に７０６４ｎＭ)(１０.６μｌ)を希釈して作った。このストック溶液から、４０ｍＬを各インキュベーションチャンバーに加えた。これらのチャンバーの１つは、放射性リガンド緩衝液のみを含有しており、これは全結合切片として参照される。別のインキュベーションチャンバーには、ブロッキング化合物の参照濃度と共に(０.１ｎＭ、１ｎＭまたは１０ｎＭの非標識ペプチド)このストック溶液(４０ｍＬ)を入れた。スライドを、個々の緩衝溶液中で、最大結合に達するように室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、各処置群からのスライドを、インキュベーション溶液から取り出して、氷冷した洗浄緩衝液(Ｔｗｅｅｎ８０)中に３分間置いて、４回に分けてリンスした。スライドを、お���よそ３０分間冷風下にて乾燥させた。風乾したスライドを、終夜室温で、スライドをイメージングプレート(ＢＡＳ−ＳＲ３５４５Ｓ)上に置いて暴露した。バイオイメージング分析器(Fujifilm Fluorescent Image Analyzer, FLA-9000)を用いて、イメージングプレートを、スキャンした。オートラジオグラム画像の画素サイズは１００μｍであった。マルチゲージソフトウェアを用いて画像解析を行った。全ての試験群において、腫瘍組織全体を包囲するように、関心領域(ＲＯＩ)を描いた。組織に関連する放射能のオートラジオグラフィーシグナルを、これらのＲＯＩから定量した。ヒトの肺腫瘍切片ならびにヒトの異種移植切片の双方において、非標識ペプチドの３つの異なる濃度(０.１ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭ)について、全結合切片と比較した場合の、[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーの明らかな置き換えが測定された。非標識ペプチドの添加に伴う用量依存性の[１８Ｆ]標識された大環状ＰＤ−Ｌ１ペプチド放射性トレーサーの置き換えが(図４)、全ての組織切片において見られた。各組織からの一連の５μｍの連続組織切片を、抗ヒトＰＤ−Ｌ１免疫組織化学手法に供して、ヒトの肺サンプルにおけるＰＤ−Ｌ１発現が確認されたサンプル中のＰＤ−Ｌ１抗原の発現量を実証した。
【０１５１】
当業者は、本明細書に記載の特定の実施態様の多くの均等物を認識し、単なる通常の実験だけで確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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