(57)【要約】  本発明は凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスに関し、本デバイスは、生体サンプル（６）を収容するための収容空間（２）と、収容空間を閉じるためのカバー（３）とを有するサンプル容器（１）を備える。本デバイスは、サンプル容器の内部、特に収容空間及び／又はカバー内に位置するチャンバを更に備え、そのチャンバの内部空間（１２、２２、３２、４２）は収容空間（２）と流体的に接続されておらず、少なくとも一種の指標物質（７）で部分的にのみ充填されていて、その指標物質の融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。本発明は凍結保存サンプルの温度監視用の方法を更に有し、本方法は、温度監視用のデバイス（１０、２０、３０、４０）を提供するステップと、指標物質を凍結させるステップとを備え、少なくとも一つのチャンバを、指標物質の凍結の際には第一位置に移動させ、凍結後に指標物質の融点未満の温度において、指標物質の融解が重力の影響の結果としてチャンバ充填物の少なくとも部分的な変位及び／又は形状変化をもたらすことになる第二位置に移動させる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイス（１０、２０、３０、４０）であって、
（ａ）生体サンプル（６）を収容するための収容空間（２）と、前記収容空間を閉じるためのカバー（３）とを有するサンプル容器（１）と、
（ｂ）前記サンプル容器の内部、特に前記収容空間及び／又は前記カバー内に位置するチャンバ（１１、２１、２１ａ、３１、４１）とを備え、該チャンバの内部空間（１２、２２、３２、４２）が前記収容空間（２）に流体的に接続されておらず且つ少なくとも一種の指標物質（７）で部分的にのみ充填されていて、該指標物質（７）の融点が−２０℃から−１４０℃の範囲内にある、デバイス。
【請求項２】
前記サンプル容器（１）がクライオチューブであることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記チャンバ（２１ａ）の内部空間（２２ａ）が、互いに分離されていて且つそれぞれ指標物質（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）で部分的にのみ充填されている複数の部分空間に分割されていて、該指標物質（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）の融点が−２０℃から−１４０℃の範囲内にあり、前記複数の部分空間内の指標物質（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）が異なる融点を有することを特徴とする請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
（ａ）前記カバー（３）が、前記収容空間（２）の上端領域に嵌め込まれるシャフト（５）を有することと、
（ｂ）前記チャンバ（１１、３１、４１）が前記シャフト（５）内に組み込まれていることとを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記チャンバが、前記カバー（３）の下の前記サンプル容器（１）の収容空間（２）内に位置する閉じた中空体（２１、２１ａ）であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記閉じた中空体（２１、２１ａ）が、前記収容空間内に存在する凍結保存生体サンプル（６）の上に固定されずに位置することを特徴とする請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記指標物質（７）の密度よりも高い密度を有する少なくとも一つの固体の物体（３３、４３）が前記チャンバ（３１、４１）の内部空間に固定されずに位置することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記指標物質（７）の融点が−１００℃未満であることを特徴とする請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
前記指標物質（７）の体積よりも大きな体積を有する固体の物体（４３）が前記チャンバ（４１）内に固定されずに位置することを特徴とする請求項７又は８に記載のデバイス。
【請求項１０】
（ａ）少なくとも二つの固体の物体（３３）が前記内部空間（３２）に存在することと、
（ｂ）前記少なくとも二つの固体の物体（３３）それぞれの体積が前記指標物質（７）の体積よりも小さいこととを特徴とする請求項７又は８に記載のデバイス。
【請求項１１】
（ａ）チャンバの壁が少なくとも一点において透明又は半透明であること、及び／又は、
（ｂ）前記指標物質が着色されていることを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記チャンバ内の指標物質及び／又は固体の物体の位置を検出するように形成された光学的、電気的又は光電気的測定デバイスを備えることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
凍結保存サンプルの温度監視用の方法であって、
（ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載のデバイス（１０、２０、３０、４０）を提供するステップと、
（ｂ）前記指標物質を凍結させるステップとを備え、
前記少なくとも一つのチャンバを、前記指標物質の凍結の際には第一位置に移動させ、凍結後に前記指標物質の融点未満の温度において、前記指標物質の融解が重力の影響の結果としてチャンバ充填物の少なくとも部分的な変位及び／又は形状変化をもたらすことになる第二位置に移動させる、方法。
【請求項１４】
前記指標物質として選択される物質が、超過が監視される所定の閾値温度に対応する融点を有するか、又は融解した指標物質の粘度が所定の設定値を超えることになる閾値温度を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）前記サンプル容器内に凍結保存サンプルを保管するステップと、
（ｂ）前記指標物質の融点を一時的に超えたことによってチャンバ充填物の少なくとも部分的な変位及び／又は形状変化が生じたかどうかを決定するステップとを備えることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記指標物質が、１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択された少なくとも一種のアルコールと、任意で少なくとも一種の染料とを備えることを特徴とする請求項１から１２のいずれか一項に記載のデバイス又は請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記染料が、トリフェニルメタン染料、ローダミン染料、特にキサンテン、アゾ染料、フェナジン染料、及び、フェノチアジン染料から成る群から選択される、請求項１６に記載のデバイス又は方法。
【請求項１８】
前記指標物質が、１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択された少なくとも二種のアルコール成分を備え、及び／又は、前記指標物質が、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、ローダミンＢ、ニュートラルレッド、メチレンブルー、及び細胞学において細胞を着色するのに用いられる他の染料から成る群から選択された少なくとも一種の染料を備えることを特徴とする請求項１６又は１７に記載のデバイス又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法に関する。本発明は、更に、凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の低温保存（凍結保存）は、生理的温度に温めた後に再始動可能なように細胞レベルにおいて生命活動を可逆的に停止させる（生命力を維持する）ことができる現状で唯一の可能性である。凍結保存は、大型のバイオバンクによって最近数十年にわたって開発されてきて、病院、製薬会社、種の保存、環境保護、健康対策にとって重要な要素となっている。生体物質は、多様なサイズの低温適合性サンプル容器（クライオ容器）、例えば、チューブ、ストロー、バッグに保管される。凍結保存の場合、保管された生体物質は、そのサンプル物質の生命力を維持しながら凍結され、通常は−８０℃未満の温度で、生体収集用には−１４０℃未満から液体窒素の温度で凍結される。以下では、「低温サンプル（クライオサンプル）」との用語が、凍結保存されたサンプルや、凍結保存されるサンプルに対して使用される。
【０００３】
低温でのサンプル保管については、巨視的サンプル、例えば血液や組織用に多数の方法が開発されている。最近の医薬、遺伝子工学、生物学では、小型サンプルを凍結保存させることが益々多くなっている傾向にある。例えば、懸濁させた細胞や細胞集団を有する僅かな体積の懸濁液（ミリリットル単位以下）を凍結させる。ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ（インビトロ，体外）培養の細胞の凍結保存は、主に懸濁液中において行われる。しかしながら、生物医学的に重要な細胞の多くは、その伝播及び適切な発達のために基質との接触を要する。従って、サンプルは、例えば培養後に、基質に結合された状態で凍結される。
【０００４】
サンプルは国家資源として病院での細胞治療や、製薬やバイオテクノロジー製品の開発、他の多数の事柄において使用されるものであるので、サンプルの質は極めて重要なものである。保管期間は数日から数十年と様々であるが、長期保管の傾向にある。サンプルは冷却容器に保管され、通常は金属の引き出しやラック内に置かれるが、これによって、新たに入れる際や取り出す際にサンプルが温度変動を受ける。生体保管（細胞、細胞懸濁液、組織片）の場合、途切れない連続的な冷却チェーンだけではなくて、深冷段階において大きな温度ジャンプを防止することが、極めて重要な役割を果たす。低温容器（クライオ容器）から取り出す間にサンプルが凍結したままではあるが、気付かぬままに−８０℃から−２０℃の温度に温められると、質の低下が気付かぬままに生じ、サンプルの価値を低下させるだけではなくて、臨床分野で用いられる際には生命を脅かす事態に繋がり得る。サンプルが短時間解けただけの場合であっても、その再凍結状態においてサンプルが元々の状態に最早一致していないかどうかを見て取ることはできない。生体物質の解凍を特定するだけではなくて、−１４０℃から−２０℃の間の範囲内の閾値温度を超えたことを記録実証することが特に重要である。各サンプルに対する温度の制御及び記録実証は、現状では満たされることが稀な要件であり、満たされるとしても高い技術的コストを伴う。また、解凍後の広範な臨床試験も、貴重なサンプル物質を使用するものであって、低温サンプルがその間に無用なものになった場合であってもコストを発生させることに留意されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の一つの目的は、従来の方法の欠点を回避することができ、単純な方法の実行を特徴とする凍結保存生体サンプルの温度監視用の改善された方法を提供することである。更なる目的は、従来の方法の欠点を回避することができる凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスを提供することである。
【０００６】
更なる目的は、低温サンプルが僅かな時間であっても所定の閾値温度を超えて温められたかどうかをマーカーから可能な限り単純に特定することができる可能性を提供することである。凍結に先立って−２０℃から−１４０℃までの間の範囲内で閾値温度を設定することができなければならない。これは、数百万個のサンプルに対し、その個別の低温サンプルにおいて素早く簡単に可能とされなければならず、生体物質を変化させてはならず、深冷状態において為されたものでなければならない。サンプルが保管場所から取り出され戻される度に一般的にはラック全体が引き出されるので、複数のサンプルにサンプル変化の危険性があるため、可能であれば、保管容器内においてもサンプルの状態を検出できることが望ましい。本デバイス及び方法は取り扱いが簡単で、低温耐性があり、調整可能であることが望ましい。冷却状態での生体サンプルの保管が総支出において数ユーロしか掛からないことが望ましいので、エネルギーがほとんど又は全く消費されず、コストを最小にしなければならない。また、使用される物質がこの要求を満たさなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的は、独立請求項に記載の特徴を有するデバイス及び方法によって達成される。本発明の有利な実施形態及び応用は従属請求項から明らかとなるものであり、図面を部分的に参照する以下の説明においてより詳細に説明されるものである。
【０００８】
本発明の第一態様によると、上記目的が、凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法によって達成される。凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスが本方法を実行するために提供される。
【０００９】
本発明の第二態様によると、凍結保存生体サンプルの温度監視用の本デバイスは特許請求可能なものとして開示される。デバイスに関する実施形態、特にその有利な実施形態の変形例については、繰り返しを避けるために、本デバイスに関するデバイスの特徴、また本方法に従って関係するデバイスの特徴として開示されているとみなされるべきものであり、特許請求可能なものである。
【００１０】
凍結保存生体サンプルの温度監視用の本デバイスは、サンプル（特に生体サンプル）を収容するための収容空間を有するサンプル容器を備える。収容キャビティが凍結保存生体サンプルを含むことができる。
【００１１】
本デバイスはチャンバを更に備え、チャンバの内部空間は収容空間と流体的に接続されない。更に、内部空間は、少なくとも一種の指標物質で部分的にのみ充填されて、指標物質の常圧（つまり、１０１３．２５ｍｂａｒ）での融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。
【００１２】
追加の区画が、指標物質で部分的に充填されていることの結果としての指標要素又は指標装置として用いることができるように、本発明に係るデバイスのチャンバによって提供され、閾値温度を望ましくなく超えたことを表示するようにする。従って、指標物質で部分的に充填されたチャンバは以下において指標装置とも称される。
【００１３】
特に好ましい一実施形態によると、チャンバは、サンプル容器の内部に、特に収容空間及び／又はカバーの中に配置される。サンプル容器の内部への配置は、サンプル容器の外部に追加の設置スペースを要さないという特有の利点を有する。しかしながら、チャンバは、サンプル容器の外部にも配置可能であり、又は、収容空間の壁に組み込み可能でもある。
【００１４】
サンプル容器は、凍結保存（低温保存）に適した容器、例えば、血液や幹細胞の保管用のバッグ（袋）、チューブ、ストロー（シードチューブとも称される）や、凍結保存に適した箱や他の容器である。そのため、このような容器は、低温チューブ（クライオチューブ）、低温ストロー（クライオストロー）、低温バッグ（クライオバッグ）、低温箱（クライオボックス）、まとめて低温容器（クライオ容器）とも称される。
【００１５】
特に好ましい一実施形態によると、サンプル容器は低温チューブ（クライオチューブ）である。低温チューブ（クライオチューブ）はバイオバンクチューブや低温バンク（精子バンク）チューブとも称される。低温チューブは、生体サンプルを収容するための内部キャビティを形成する収容空間を有する。更に、低温チューブは、通常は、収容空間を閉じるためのカバーを有する。カバーは嵌め込み部を有することができて、ツールを用いその嵌め込み部を介してカバーを回転させることができる。また、低温チューブは、マーク、例えば機械可読コードを有する基部（底部）要素を有することもできる。
【００１６】
本方法は、指標物質を凍結させることを更に備え、ここで、指標物質を凍結させるためにチャンバを第一位置に移動させて、液体状態の指標物質がチャンバの第一部分空間に流れてそこで凍結するようにする。その後、特に低温保管の監視段階の前と間において、凍結した指標物質を有するチャンバを、指標物質の融解が重力の影響の結果としてチャンバ充填物の形状構成変化をもたらす第二位置に移動させる。形状構成変化は、チャンバ充填物の少なくとも部分的な変位及び／又はチャンバ充填物の形状変化であり得る。チャンバ充填物は、指標物質によって形成され、又は指標物質と一つ以上の固体の物体とによって形成され、その固体の物体は、チャンバ内に配置されて、指標物質の密度よりも高い密度を有する。
【００１７】
つまり、指標物質が、そのような幾何学的特性や位置において凍結され、チャンバが、深冷状態において、例えば保管温度や少なくとも指標物質の設定閾値温度や融点未満でその位置が変更されるので、指標物質の融解は、その位置の変化後に、液体の眼に見える変位やその区別可能な幾何学的特性をもたらし、又はチャンバ内に配置されていて指標物質の融解後には最早その中で固まっていない固体の物体の変位をもたらす。
【００１８】
このチャンバ充填物の形状構成変化に基づいて、閾値温度を超えたかどうかを目視検査で又は技術的に自動化された方法でも直ちに決定することができる。
【００１９】
本方法によると、凍結保存サンプルを有するサンプル容器と、凍結指標物質を有する少なくとも一つのチャンバとを有するデバイスを凍結保存用に保管することができ、温度監視用の少なくとも一つのチャンバは第二位置においてサンプル容器に対して配置される。
【００２０】
後の時点において、指標物質の融点を超えることによって引き起こされるチャンバ充填物の形状構成変化が生じたかどうか、例えば、チャンバ充填物の少なくとも部分的な変位及び／又は形状変化が生じたかどうかを確認して決定することができる。
【００２１】
これが当てはまる場合には、指標物質の融点、つまりは監視される閾値温度を超えたと、特に短時間であっても超えたと結論付けることができる。
【００２２】
本発明特有の利点の一つは、チャンバ充填物、例えば指標物質の形状構成変化が、低温サンプルが、短時間であっても、所定の閾値温度を超えて温まったかどうかを直接示すという点である。これは、目視によっても、これに応じて構成された測定装置を用いた技術的に自動化された方法であっても、サンプル容器からサンプルを取り出したり、サンプルを解凍したりせずに、決定可能である。
【００２３】
特に好ましい一実施形態によると、チャンバの内部空間は、互いに分離された複数の部分空間に分割され、それぞれ指標物質で部分的にのみ充填され、それら指標物質の融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にあり、複数の部分空間内の指標物質は異なる融点を有する。従って、異なる温度閾値を監視することができ、監視したい温度閾値に融点が対応するように各指標物質が選択されて、及び／又は混合比が調整される。本実施形態は、サンプルが達した到達温度範囲をより正確に限定することができるという利点を有する。
【００２４】
更に、サンプル容器及びチャンバ壁は、その少なくとも一点において透明又は半透明であり、指標物質の形状構成変化、例えば位置変化が生じたかどうかを外部から視ることができる。好ましくは、サンプル容器及びチャンバの壁全体が透明又は半透明で実現される。
【００２５】
検出性能を改善するため、指標物質は、指標物質の物理的特性の検出性能を向上させる指標添加剤を含有することができる。例えば、指標添加剤は染料であり、指標物質が着色又は染色されて透明ではなくなり、その形状及び／又は位置が光学的により明らかになる。
【００２６】
原理的には、少なくとも以下の条件を満たすものが染料として可能である：
‐  少量低濃度であっても強力な染色性能（例えば、＜１体積％（一般的には１０００分の１又はそれ以下の範囲）の範囲で飽和染料溶液に追加することから始める）；
‐  不凍性；
‐  取り出し温度及び関連する低温における耐光性；
‐  指標物質の全成分における可溶性；
‐  凍結中に分離しないこと；
‐  指標物質と接触することになるプラスチック物質に反応しないこと。
【００２７】
好ましくは、染料は、トリフェニルメタン染料、ローダミン染料、特にキサンテン、アゾ染料、フェナジン染料、フェノチアジン染料から成る群から選択される。
【００２８】
より具体的な実施形態では、染料は、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、ローダミンＢ、ニュートラルレッド、メチレンブルー、及び細胞学において細胞を染色するのに用いられる他の染料から成る群から選択される。
【００２９】
指標添加剤は、指標物質に当たる電磁放射に対する指標物質の散乱作用及び／又は偏光作用を増大させる粒子、特にナノ粒子であり得る。結果として、光透過測定、散乱測定及び／又は偏光測定を用いて、指標物質の形状構成変化をより確実に検出することができる。指標添加剤は導電性粒子であり得る。指標物質の導電性又はインピーダンスは導電性粒子を加えることによって影響され得る。このようにして、指標物質の形状構成変化を導電性測定又はインピーダンス測定を用いて検出することができる。
【００３０】
好ましい一実施形態によると、本デバイスは、チャンバ充填物の形状構成状態、例えばチャンバ内の指標物質の位置を検出するように形成された測定装置を有することができる。測定装置は、光学的又は光電気的な測定装置であり得て、指標物質の形状構成変化を、例えば、光透過、散乱光又は反射の測定で決定することができる。
【００３１】
指標物質として選択可能な物質は、その融点が所定の閾値温度に対応し、それを超過することを監視したいというものである。指標物質は一種の液体又は異なる液体の混合物であり、その融点が所望の閾値温度に対応する。単に例として、水（Ｈ２Ｏ）とエタノール（Ｃ２Ｈ６Ｏ）の混合物、水（Ｈ２Ｏ）と水酸化カリウム（ＫＯＨ）の混合物、又は、水と不凍剤の混合物が指標物質として選択可能である。混合比は、混合比の関数として融点のプロファイルを示す各場合の融点図に従って調整されて、液体混合物の融点が所望の値、つまりは監視される閾値温度を有するようにされる。
【００３２】
好ましい一実施形態によると、指標物質は、１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択された少なくとも一種のアルコールを備える。少なくとも一種のアルコールは、特に好ましくは、プロパン‐１，３‐ジオール、プロパン‐１，２‐ジオール、及び、２‐ブタノールから選択される。
【００３３】
好ましい他の実施形態によると、指標物質は、以下の少なくとも二種の異なるアルコール成分を備える：
（ａ）１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択されたアルコール；
（ｂ）１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択され、（ａ）のアルコール成分よりも低い融点を有するアルコール；
ここで、（ａ）の成分と（ｂ）の成分の混合比は、混合物の融点が、−２０℃から−１６０℃、特に−２５℃から−１６０℃、又は−５０℃から−１５０℃の範囲内にあるように調整される。
【００３４】
より具体的な実施形態は、指標物質が（ａ）の成分と（ｂ）の成分の以下の組み合わせのうち一つを備えることを特徴とする：
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐オクタノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐オクタノールと１‐ペンタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐オクタノールとプロパン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ノナノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ノナノールとプロパン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ノナノールと１‐ペンタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールとプロパン‐１，３‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールとブタン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，３‐ジオールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，３‐ジオールとブタン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のペンタン‐１，５‐ジオールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のベンジルアルコールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ペンタノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ペンタノールとメタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールとプロパン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールと１‐ペンタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールとブタン‐１，２‐ジオール；
ここで、示されている混合比の値は、それぞれ、両成分の混合物中の前者の成分の比に関する。
【００３５】
特に好ましい実施形態によると、この指標混合物は、例えば、４０体積％から６０体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールと２‐ブタノール（略−９０℃の融点となる）、３０体積％から７０体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールとプロパン‐１，３‐ジオール、又は、３０体積％から７０体積％の混合比のプロパン‐１，３‐ジオールと２‐ブタノールを備える。
【００３６】
また、指標物質は、好ましくは、少なくとも一種のアルコールに加えて、上述のような少なくとも一種の染料も備える。この染料は、特に好ましくは、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、及びローダミンＢから成る群から選択される。
【００３７】
より具体的な実施形態では、指標物質が、プロパン‐１，３‐ジオール、プロパン‐１，２‐ジオール、及び２‐ブタノールから選択された二種のアルコール（ａ）及び（ｂ）を備え、好ましくは上述の混合比で備え、また、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、及びローダミンＢから成る群から選択された染料を備えることを特徴とする。
【００３８】
アルコール成分中の染料の濃度は、染料とアルコールとに応じて、大きく異なり得る。
【００３９】
強力な着色の場合には、一般的に、濃度は可能な限り低く保たれることが望ましく、染料分子が、それが溶解されるアルコールの凝固及び融解の特性を変化させたり、粘度を増大させたりしないようにする。染料の濃度は、典型的には、＜１０体積％、特に＜１体積％又は＜０．１体積％の範囲、つまり、１０００分の１又はそれ以下の範囲内にある。
【００４０】
本発明の一変形例では、監視される閾値温度は、指標物質の融点に直接対応せず、融点を超える温度に対応し、その温度において、必要とされる液体の移動を可能とする程度にまで融解した物質の粘度が下がるものとする。
【００４１】
この温度も閾値温度と称され、典型的には、公称の融点より３〜３０℃、又は５〜３０℃、例えば３〜１０℃、３〜２０℃、５〜１０℃、又は５〜２０℃高い温度範囲にある。
【００４２】
従って、有利な一実施形態によると、指標物質は、その融点より３〜３０℃又は５〜３０℃高い温度範囲において液体混合物が、１０から１０６ｍＰａ×ｓ、好ましくは１０から１０４ｍＰａ×ｓの範囲内の粘度を有することを特徴とする。
【００４３】
サンプル容器は、収容空間を閉じるように設けられたカバーを有し得る。カバーは、収容空間の上端領域に嵌め込まれるシャフトを有し得る。シャフトはカバーのヘッド部上に形成され得て、カバーが配置された又はねじ込まれた状態において、ヘッド部が収容空間の上に存在し、シャフトが収容空間の上端領域に嵌め込まれるようになる。
【００４４】
特に好ましい一実施形態によると、チャンバは、カバー内に組み込まれ、例えば、ヘッド部及び／又はシャフト内に組み込まれ得る。これは、組み込まれた指標装置が収容空間に保管された生体サンプルに接触せずに、使用時には常にカバー中に含まれているので、生体サンプルを汚染しないという利点を有する。更なる利点は、指標装置として機能するチャンバをカバーと共に、サンプル容器の残りの部分とは空間的に別に保管及び準備すること（例えば、第一位置において指標物質を凍結させること）ができる点である。カバーのシャフト内にチャンバを組み込むことが特に有利である。この変形例によると、カバーのシャフトが、指標物質で部分的に充填されたキャビティを有する。特に、低温チューブ（クライオチューブ）の場合には、収容空間の下部の部分空間のみが生体サンプルで充填されることが多く、上部の部分空間を指標物質を配置するために使用することができる。
【００４５】
更に好ましい実施形態によると、チャンバは、カバーの下においてサンプル容器の収容空間内に位置する閉じた中空体として実現される。この変形例は、従来の低温容器が使用可能であるという利点を有する。
【００４６】
本実施形態の場合、閉じた中空体は、収容空間内に存在する凍結保存生体サンプルの上に緩く固定されずに配置され得て、例えば、生体サンプルの上に乗っけられる。
【００４７】
本発明を実現する一つの可能性では、指標物質の密度よりも高い密度を有する少なくとも一つの固体の物体をチャンバの内部空間に緩く固定せずに配置する。緩く固定せずに配置するとは、少なくとも一つの物体が、チャンバの内部空間内に位置し、少なくとも指標液体が液体状態にあって、指標物質によって物体が固められていない限りは、原理的にその中を自由に移動可能であることを意味する。
【００４８】
一変形例によると、指標物質の体積よりも大きな体積を有する一つの固体物体が、チャンバ内に緩く固定されずに配置され得る。更なる変形例によると、少なくとも二つの固体の物体がチャンバの内部空間に存在し得て、各固体の物体の体積は指標物質の体積よりも小さい。
【００４９】
これらの配置構成は、−１００℃未満の融点、好ましくは−１００℃よりもはるかに低い融点を有し、通常は非常に高い粘性を有する液体であっても使用可能にするという利点を有する。そのような指標物質はチャンバの底に向かって壁を流れずに、チャンバの上部に留まったままとなる。対照的に、チャンバ内に緩く固定されずに配置された重量のある物体は、液体から底へと落下する。これは、適切に実現される測定装置、例えば、光学センサ、導電率測定センサ等によって検出可能である。目視での状態決定も可能である。
【００５０】
サンプル容器との用語は、特に、凍結保存用に構成された容器のことを称する。好ましくは、サンプル容器は、−１４０℃未満の温度の低温適合性プラスチック物質を用いて製造される。プラスチック物質は、変化したり損傷したりせずに繰り返しの温度変化に耐えることができる。プラスチック物質は、好ましくは、正味質量の＜１％（１％未満）、特に正味質量の＜０．１％（０．１％未満）の吸水性能のものが使用される。本発明に係る低温保管要素は、例えば、ポリウレタンやポリエチレンに基づく。
【００５１】
「生体サンプル」との用語は、サンプル容器中で凍結保存され、適切な場合には、懸濁液中にあり及び／又は基質物質と組み合わせられる細胞、組織、細胞成分、生体高分子等の生体物質のことを称する。生体サンプルの一部である生体細胞に付着して受容するように構成されている基質を収容空間内に配置することができる。
【００５２】
上記本発明の好ましい実施形態及び特徴は互いに組み合わせ可能である。以下、添付図面を参照して、本発明の更なる詳細及び利点について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスの多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図２】凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスの多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図３】凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスの多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図４】凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスの多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図５】凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法の例示的な実施形態を示すフローチャートを示す。
【図６Ａ】液体混合物の融点図を示す。
【図６Ｂ】液体混合物の融点図を示す。
【図７Ａ】液体混合物の融点図を示す。
【図７Ｂ】多種の純液体の融点の表を示す。
【図８】溶媒の混合可能性のマトリクスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
同一の要素や機能的に等価な要素は全図面において同じ参照番号で指称され、一部は個別に記載されていない。
【００５５】
図１のＡからＥの模式的断面図は、本発明の第一の例示的な実施形態を示す。
【００５６】
図１Ａには、低温チューブ（クライオチューブ）のシリンダ状の収容部１が断面で示されている。シリンダ状の収容部１によって形成された収容キャビティ２は、生体サンプル６で既に充填されたものとなっている。生体サンプル６は例えば細胞懸濁液であり得る。図１Ｂには、ネジ山８を介して低温チューブ１、３にねじ込み可能なカバー３が示されていて、カバー３は上下逆さまにされて、収容部１を閉じ、任意選択的に、その頂部に嵌め込み部４を有し、自動化の場合には、その嵌め込み部を介してツール（図示せず）を用いてカバー３を回転させることができる。カバーは、ねじ込み部、つまり、ねじ込まれた状態で収容空間２に係合するシャフト５の中に、中空空間１２を形成するチャンバ１１を有する。中空空間１２は液体又は液体混合物の形態の指標物質７で部分的に充填され、液体又は液体混合物の凝固点／融点は、混合比を介して−２０℃から−１００℃の温度内で選択されて、その融点が、監視される温度閾値を有するようにする。これについては、図５から図８に基づいて以下でより詳細に説明する。
【００５７】
こうした生体サンプル６を保管するため、低温チューブ１は、図１Ａに示されるように、開いた状態で保管温度に深冷され、カバー３も図１Ｂに示されるように上下逆さまの位置で深冷される。指標物質７は、まず、液体状態において重力の影響下でチャンバ１１の中空空間１２の部分空間１２ｂに集まり、保管温度、又は、少なくとも指標物質７の融点未満の温度への冷却中において、そこで凍結する。
【００５８】
保管温度、少なくとも指標物質７の融点未満において、図１Ｃ及び図１Ｄに示されるように、ネジ式のカバー３を１８０°回転させてねじ込んで、図１Ａに示されるシリンダ状の収容部１を閉じる。部分空間１２ｂ内で固体に凍結した指標物質７はチャンバの上部の部分空間１２ｂ内に在るままである。下部の部分空間１２ａには実質的に指標物質７が存在しない。
【００５９】
そして、このようにして温度監視用に形成されたデバイス１０を低温保管することができる。この状態では通常は低温コンテナの格納部に垂直に立てて、デバイス１０が保管される。
【００６０】
保管タンク内での何らかの操作や損傷によって、生体サンプル６が指標物質７の融点を超える温度にされると、指標物質は液体になり、滴り落ちて、図１Ｅに示される状態になる。他方、サンプルが適切に保管されていたのであれば、指標物質は、保管の後においてもチャンバ１１の部分領域１２ｂ内に位置したままとなり、図１Ｄに示される状態になる。このようにして、サンプル６が許容不能に温まったことが簡単に分かる。チャンバ１１内での指標物質の位置は、目視検査によって光学的に検出可能である。低温チューブ１、３が透明又は半透明の実施形態の場合には、破線１００で模式的に示されるように、水平方向検出で自動化された光学的な方法において、指標物質７の位置を決定することもできる。
【００６１】
デバイス１０の更なる利点は、カバー１１の再利用性と、自由に選択可能な凝固点を有する指標物質７として用いられるマーカー液体の使用である。生体用ラックの場合、−８０℃付近の融点が推奨される。何故ならば、この場合、細胞内及びその付近での氷の明らかな再結晶化が生じて、低温サンプルの質を低下させるからである。−８０℃で保管される遺伝物質や体液の保管の場合には、−３０℃付近の融点が推奨される。
【００６２】
図２は、凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイス２０の更なる例示的な実施形態を示す。デバイス２０は、サンプル容器としての低温チューブ（クライオチューブ）と、指標装置２１とを備え、その指標装置２１は、低温チューブの内部に配置可能であり、中空のシリンダ２１又は２１ａの形態であり、指標物質７で部分的に充填される。
【００６３】
図２Ａは、例えば深冷可能な低温チューブ（クライオチューブ）を示す。低温チューブは、収容キャビティ２を形成するシリンダ状の収容部１を備え、図２Ａでは、収容キャビティ２は生体サンプル６で既に充填されたものになっている。低温チューブは、収容部１を閉じる低温チューブ用のカバー２３を更に備える。
【００６４】
この場合、指標物質７で部分的に充填されて閉じられた中空シリンダ２１を、温度監視用の指標装置として使用することができ、後に臨界的な閾値温度を超えたことを検出するのに用いられる。この場合も、指標物質７は、その融点が−２０℃から−１００℃の範囲内にあり、監視される温度閾値を有するように選択される。
【００６５】
中空シリンダ２１は、図２Ｂに示される位置において低温チューブの外部で凍結される。指標物質は、下部の部分空間２２ｂに集まり、そこで固体に凍結する。
【００６６】
次いで、図２Ａに示される低温チューブ１、２３を開け、カバー２３のねじを緩めて取り外し、中空シリンダ２１を１８０°回転させて、既に凍結した生体サンプル６の上に置き、再び低温チューブ１、２３を閉じて、図２Ｃに示される状態にする。中空シリンダ２１は生体サンプルの上に並んで緩く固定されずに乗っかったものとなり、指標物質は、最初は、キャビティ２２の上部に凍結した状態で位置する。
【００６７】
指標物質７の融点に達した場合には、液体が部分空間２２ａにおいてシリンダ２１の底に位置して、臨界的な閾値温度を超えたことが分かる。
【００６８】
図２Ｄには、中空シリンダ２１の代わりに同様に使用可能であって、低温チューブ１、２３に同様に挿入可能な四チャンバの中空シリンダ２１ａが示されている。この場合、中空シリンダ２１ａの内部空間は分離壁２５によって四つの流体的に分離された部分キャビティに分割されて、それぞれ指標物質で部分的に充填される。部分キャビティ内の指標物質７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄは異なるものであって、異なる融点を有する。
【００６９】
指標物質７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄの融点は段階的に異なるよう有利に選択されて、例えば、指標物質７ａについて−２０℃、指標物質７ｂについて−５０℃、指標物質７ｃについて−８０℃、指標物質７ｄについて−１１０℃と選択される。
【００７０】
検査中において、凍結した指標物質７ａから７ｃが中空シリンダの上部の領域２２ｂに位置したままである一方で、指標物質７ｄが底（部分領域２２ａ）に位置する場合には、サンプル６が−１１０℃の温度を超えたことになる。指標物質７ｃが底に位置する場合には、−８０℃を超えたことになり、全てのマーカー液体７ａから７ｄが底に位置する場合には、−２０℃を超えたことになる。
【００７１】
収容空間２内に入れられる中空シリンダ２１又は２１ａは、その表面が殺菌されていること、又は無菌で汚染されていないことが望ましい。
【００７２】
図３は、凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイス３０の更なる例示的な実施形態を示す。図１に示されるデバイス１０と比較してのデバイス３０特有の特徴は、低温チューブのカバー３内に組み込まれたチャンバ３１が指標物質７で部分的に充填されているだけではなくて、小型の固体物体３３を更に含み、その小型の固体物体３３がチャンバ３１の内部空間又はキャビティ３２内に緩く固定されずに取り込まれていることである。
【００７３】
図３Ａは、図１Ａと同様の断面図において低温チューブ（クライオチューブ）の収容部１を示す。図３Ｂには、上下逆さまでカバー３のシャフト５内に組み込まれたチャンバが示されていて、そのチャンバの底のみが指標物質７で充填されている。指標物質よりも相対的に高い密度、つまりは重い小型の物体３３は、チャンバ内に位置する。物体３３は例えば金属ボールであり得る。収容部１と上下逆さまのカバー３とを保管温度にする。その結果として、小型の物体３３は指標液体７中で固まる。図１の場合のように、そして図３Ｃに示されるように、カバーを１８０°回転させてねじ込むと、チャンバ充填物（小型の物体３３を固定して凍結した指標物質７）が、チャンバ３１のキャビティ３２の上部に位置する。
【００７４】
低温保管中に指標物質７の融点を超えていなければ、図３Ｄに示される状態になる。チャンバ充填物の形状構成は変化しておらず、指標物質７及び小型の物体３３がどちらも固まったままで、チャンバ３１のキャビティ３２の上部に位置する。
【００７５】
指標物質７の融点を超えた場合には、少なくとも重量がある物体３３がチャンバ３１のキャビティ３２の底に落下して、図３Ｅに示されるようになる。この配置構成は、−１００℃よりもはるかに低い融点を有し、通常は非常に高い粘性を有する液体も使用可能にするという利点を有する。指標物質７はキャビティ３２の底に向かって壁を流れずに、上部に留まったままとなる。対照的に、図３Ｅに示されるように、重量がある物体３３は液状化した指標物質７から底に落下する。これは、センサ（導電率センサ、光学的センサ等）によって検出可能である。その状態の目視での決定も可能である。
【００７６】
図４は、凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイス４０の更なる例示的な実施形態を示す。図３に示されるデバイス３０と比較しての本デバイス４０特有の特徴は、複数の小型の物体の代わりに、比較的大型で重量がある物体４３を、カバー３に組み込まれたチャンバ４１内において指標物質の隣に配置することである。
【００７７】
図４Ａも、断面図において生体サンプル６用の低温チューブ（クライオチューブ）の収容部１を示す。図４Ｂも、低温チューブの上下逆さまのカバー３を示し、カバーの内部にはチャンバ４１が組み込まれていて、指標物質７で部分的に充填されるキャビティ４２を形成する。更に、大型で重量がある物体４３がキャビティ４２中に緩く固定されずに入れられる。指標物質の凍結及びデバイス４０の保管は、デバイス３０の場合と同様に行われる。図３に示されるデバイスと同様の方法において、指標物質７の融点を超えた場合に、大型の物体４３の脱離は失敗し難く、物体４３は、落下の際に、光学的に透明な部分を遮るか、遮らなくなる。光学的に透明な部分は図４Ｅに破線１００で示されている。
【００７８】
図５は、凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法のフローチャートを示す。ステップＳ１では、温度監視用のデバイスを、例えば、デバイス１０、２０、３０、４０のいずれかを提供する。この場合、低温保管において監視される温度の閾値に応じて、適切な液体又は液体混合物が使用物質７として選択される。
【００７９】
適切な液体と液体混合比との選択を介して、その融点は、所望の値、特に−２０℃から−１４０℃の範囲内の値に設定可能である。
【００８０】
例えば、図６Ａは、アルコールと水との混合比の関数として融点のプロファイルを示し、温度低下と共に粘度が適度に増大し、０℃から−１１８℃までの温度範囲をカバーすることができる。例えば、−１１８℃の温度閾値を監視する場合、エタノール比が９３．５％に設定され得る。−６０℃を僅かに下回る値までの融点は、水に水酸化カリウム（ＫＯＨ）を加えることによっても設定可能である、その融点図は図６Ｂに示されている。また、水と不凍剤との混合物を指標物質として用いることもでき、これは図７Ａの融点図に示されている。図７Ｂの表は、単体で又は他の液体との混合物として指標物質に使用可能な更なる純液体の凝固点／融点を列挙している。指標物質に適した更なる液体混合物として、クロロホルム／シクロヘキサンの混合物や、例えば、図８の溶媒の混合可能性のマトリクスから推測可能な他の混合可能な液体が挙げられる。
【００８１】
低温において優れた濡れ性と低い粘性とを有する液体及びプラスチック物質は、主に、位置変化を可能な限り広範なものにして、追加の区画を可能な限り小さくするように選択される。
【００８２】
低温保管中に複数の温度閾値が監視される場合や、サンプルが達する到達温度範囲をより正確に限定することが望まれる場合には、それに応じて、融点の異なる複数の異なる指標物質を用いて、チャンバの異なる部分キャビティ内に配置することができる。
【００８３】
ステップＳ２では、チャンバ中の指標物質を凍結させるが、指標物質の凍結の際には、チャンバを第一位置に移動させる。異なる複数の指標物質と複数のチャンバの場合、それぞれ同様に第一位置に移動させて、凍結させる。第一位置は、図１、図３、図４それぞれの例示的な実施形態において、図１Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂに示されるようにカバー３の上下逆さまの位置に対応する。
【００８４】
その後、ステップＳ３では、凍結した指標物質を有する少なくとも一つのチャンバを第二位置に移動させ、サンプル容器の内部に配置する。図１から図４に示される例示的な実施形態によると、第二位置は、第一位置を１８０°回転させたものである。図１、図３及び図４に示される例示的な実施形態によると、チャンバは、カバー３を収容部１にねじ込むことによって、第二位置に移動する。図２の実施形態の変形例の場合には、中空シリンダを１８０°回転させて、凍結した生体サンプル６に対して収容空間２内に配置する。
【００８５】
この状態において、融点未満の保管温度で、デバイスを、サンプル容器の収容空間内の低温サンプルと共に保管することができる（ステップＳ４）。
【００８６】
その後、保管プロセス中の所望の時点において、チャンバ充填物の状態を調べることによって、望ましくなく一時的であっても低温サンプルが温まったかどうかを調べることができる（ステップＳ５）。このため、図１から図４の場合について上述したように、融解過程に起因してチャンバ充填物の少なくとも部分的な変位及び／又は形状変化が生じたかどうかを調べる。これが当てはまる場合には、監視される閾値温度を超えたと結論付けることができる。
【００８７】
具体的な例示的な実施形態に関して本発明を説明してきたが、当業者には、本発明の範囲を逸脱せずに多様な変更が可能であり、また等価物との置換が可能であることは明らかである。従って、本発明は開示されている例示的な実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に落とし込まれる全ての例示的な実施形態を含むものである。特に、本発明は、引用先の請求項に関係なく、従属請求項の特徴及び主題の保護も請求するものである。
【符号の説明】
【００８８】
１  サンプル容器
２  収容空間
３  カバー
６  生体サンプル
７  指標物質
１０、２０、３０、４０  デバイス
１１、２１、３１、４１  チャンバ
１２、２２、３２、４２  内部空間
【図１】
2019515286.tif 000003
【図２Ａ】
2019515286.tif 000004
【図２Ｂ】
2019515286.tif 000005
【図２Ｃ】
2019515286.tif 000006
【図２Ｄ】
2019515286.tif 000007
【図３】
2019515286.tif 000008
【図４Ａ】
2019515286.tif 000009
【図４Ｂ】
2019515286.tif 000010
【図４Ｃ】
2019515286.tif 000011
【図４Ｄ】
2019515286.tif 000012
【図４Ｅ】
2019515286.tif 000013
【図５】
2019515286.tif 000014
【図６Ａ】
2019515286.tif 000015
【図６Ｂ】
2019515286.tif 000016
【図７Ａ】
2019515286.tif 000017
【図７Ｂ】
2019515286.tif 000018
【図８】
2019515286.tif 000019
【国際調査報告】
2019515286.tif 000020
2019515286.tif 000021
2019515286.tif 000022
2019515286.tif 000023
2019515286.tif 000024
2019515286.tif 000025