(57)【要約】  本発明は、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに、これを立体選択的に加水分解する酵素、該酵素を有する微生物の菌体、該菌体の処理物、該酵素を担体に固定化した固定化酵素、該菌体を担体に固定化した固定化菌体、および該菌体処理物を担体に固定化した固定化菌体処理物からなる群より選択される生体触媒を作用させて加水分解することによって、Ｄ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンまたはＤ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを製造する方法であって、該加水分解により生成するアンモニアを、加水分解の反応溶液から分離しながら該加水分解を行うことを特徴とする方法に関する。本発明によれば、アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素反応において、酵素または菌体もしくはその処理物あたり、かつ単位時間当たりの活性を高く維持することで、菌体やｐＨ調整用の酸を増量することなく反応溶液中の原料アミノ酸アミド濃度を高めることができ、その結果として廃塩や廃菌体の発生を増加させること無く、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンまたは光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの生産性を大幅に改善することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに、これを立体選択的に加水分解する酵素、該酵素を有する微生物の菌体、該菌体の処理物、該酵素を担体に固定化した固定化酵素、該菌体を担体に固定化した固定化菌体、および該菌体処理物を担体に固定化した固定化菌体処理物からなる群より選択される生体触媒を作用させて加水分解することによって、Ｄ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンまたはＤ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを製造する方法であって、
該加水分解により生成するアンモニアを、加水分解の反応溶液から分離しながら該加水分解を行うことを特徴とする、方法。
【請求項２】
アンモニアの反応溶液からの分離を、
前記反応溶液を減圧下に置き、アンモニアを蒸発させるか、または
陽イオン交換樹脂若しくはゼオライトへ、反応溶液中のアンモニアを吸着させる
ことにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アンモニアの反応溶液からの分離を、反応溶液を減圧下に置き、アンモニアを蒸発させることにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アンモニアの反応溶液からの分離を、陽イオン交換樹脂へ、反応溶液中のアンモニアを吸着させることにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アンモニアの反応溶液からの分離を、ゼオライトへ、反応溶液中のアンモニア光学活性アミノ酸または光学活性アミノ酸アミドを吸着させることにより行う、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
酵素が、キサントバクター  フラバス由来の酵素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
微生物が、キサントバクター  フラバス由来の酵素であって、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素の遺伝子を導入された微生物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
微生物が、ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和が、７０００ｐｐｍ以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２００９−２７６９３０号（出願日：２００９年１２月４日）、特願２００９−２７６９３１号（出願日：２００９年１２月４日）、特願２００９−２７６９３２号（出願日：２００９年１２月４日）、特願２００９−２７６９３３号（出願日：２００９年１２月４日）、特願２００９−２７６９３４号（出願日：２００９年１２月４日）、および特願２００９−２７６９３５号（出願日：２００９年１２月４日）に基づくものであって、それらの優先権の利益を主張するものであり、それらの開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、光学活性アミノ酸または光学活性アミノ酸アミドの製造方法に関する。詳しくは、本発明は、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンまたは光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
光学活性アミノ酸または光学活性アミノ酸アミドは、医薬品原料や不斉配位子として重要な化合物である。光学活性アミノ酸または光学活性アミノ酸アミドの製造法として、ＤＬ−アミノ酸アミドにＤ−またはＬ−体選択的なアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素を作用させて光学活性アミノ酸またはその対掌体である光学活性アミノ酸アミドを製造する方法が知られている（例えば、特開昭６３−８７９９８号公報）。【０００４】
一般的に、酵素反応を好適に進めるためには使用する酵素の至適条件となるｐＨや温度にて反応を行うことが重要であり、アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素によるアミノ酸アミドの加水分解反応においても酵素の至適条件に調整する方法が知られている（例えば、特開２００３−２２５０９４号公報）。しかし、このような至適条件で反応を開始しても、原料濃度が高濃度である場合には反応の進行とともに反応速度が低下し、目的とする反応を完結できない場合がある。このような事態を解決し、より高濃度の原料濃度で酵素反応を行えるように、一般的には原料の分割添加法（例えば、特開２００５−１１７９０５号公報）や、生成物を逐次取り出す方法（例えば、特開平１１−１３７２８６号公報）が報告されている。これらの方法でも解決しない場合、ｐＨ調整する酸の増量や、酵素の増量が必要となる。しかし、ｐＨ調整する酸の量を増やした場合、投入した酸を中和するために工程を増やす必要がある。さらに、中和に伴い廃棄物である大量の塩が副生する。また、酵素の生産には大量の廃菌体が生じるため、酵素の量を増やすことに比例して廃棄物となる廃菌体の量も増えるだけでなく、酵素反応後の菌体や塩の分離操作への負荷が増大するといった欠点を有しているため、これらの方法は工業的に好ましくない。【０００５】
アミノ酸アミドの加水分解反応では、光学活性アミノ酸と副生成物であるアンモニアが生じる。ところで、例えば、特許４１３９７７３号やＷＯ２００３／０２０９２９パンフレットでは、該酵素の酵素反応の緩衝液にアンモニウム塩緩衝液を用いている。さらには、特許３６４７０６５号においては、アミノ酸アミドを加水分解する酵素を用いた酵素反応のｐＨ調整のためにアンモニア水を添加している。したがって、アミノ酸アミドを加水分解する酵素の酵素反応において、アンモニア系緩衝液を用いることや、ｐＨ調整のためにアンモニアを添加することは広く一般的に行われているため、この酵素反応においてアンモニアもしくはアンモニウムイオンが与える影響は無視できるほど小さいか、影響が無いと認識されているといえる。【０００６】
特開２００６−１８０７５１号公報に、アミノ酸アミドを加水分解する酵素を用いた加水分解反応中に副生成物であるアンモニアを除去する方法が記載されている。しかしながら、この方法は、加水分解反応により生成したアミノ酸が析出するのを防ぐためにアミノ酸の溶解度向上を目的として高温で行っている操作であるため、アンモニアに着目した生産性向上の手法ではない。さらに、アンモニアがアミド加水分解活性を有する微生物触媒にとって活性や安定性の点で好ましくない（特開２００６−１８０７５１号公報）という記載はあるものの、それに着目した対策は示されていない。むしろ、アミノ酸アミドを加水分解する酵素反応において、アンモニア系緩衝液を用いることや、アンモニア水でのｐＨ調整が一般的であるともいえる。【０００７】
例えば、特開２００６−３４０６３０号公報には、アミノ酸アミドを加水分解する酵素においてアンモニアの影響があるとの記載がある。該文献では、新たな酵素を探索することでアンモニアの影響を回避する対策としているが、新規酵素の探索は多大なる労力と時間を必要とし、しかも、必ずしもアンモニアの影響を受けにくい新規酵素が見出せるとも限らない。さらには、特定の基質に対してアンモニアの影響を回避できても、他の基質に対してアンモニアの影響がある場合もある。したがって、新規酵素の探索は有効な手法とは言えない。【０００８】
アミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素による加水分解反応後に塩基の添加やストリッピングによりアンモニアまたはアンモニウム塩を除去する製造方法が知られている（例えば、特開２００７−２５４４３９号公報）。しかしながら、この方法は有機溶媒に対して溶解度の低いアンモニウム塩の除去を目的としており、加水分解反応後にアンモニアを除去するものである。【０００９】
他の酵素による加水分解反応においてアンモニアを除去する方法として、一般的なアンモニア除去の方法である蒸留除去や塩の添加を行うことができることが知られている（特表２００４−５２１６２３号公報、特開昭６１−２８５９９６号公報）。しかしながら、アミド加水分解活性を有する微生物触媒による反応を行いながらこれらのアンモニア除去を組み合わせた方法は知られていない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素反応について検討を行ったところ、ｐＨ調整用の酸の増量や酵素の増量を行わずに原料アミノ酸アミド濃度を高めると、ｐＨが酵素の至適範囲内にあるにもかかわらず、反応の進行とともに酵素が失活してついには反応が進行しなくなり、反応が完結しないという問題が生じた。また、固定化酵素のような固定化生体触媒を使用した場合であっても、同様に、固定化生体触媒の活性が著しく低下し、固定化生体触媒の繰り返し利用が極めて困難となる問題が生じた。そこで、原料の分割添加法、生成物であるアミノ酸を逐次取り出す方法およびこれらの方法を複合的に用いる方法を検討したが、問題の解決には至らなかった。
【００１１】
そこで、本発明者らは、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素の阻害要因を鋭意研究したところ、本発明で用いる酵素はアンモニアに対する阻害が見られないとの知見が他の基質（ＤＬ−２−メチルシステインアミド塩酸塩）で得られている（参考例３）にもかかわらず、驚くべきことにＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを基質とした場合においてはアンモニアおよびアンモニウムイオンが阻害要因となることを発見した。そこで、該酵素による加水分解反応中に連続的、または間欠的に反応溶液中からアンモニアを分離して溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和を低下させる事により、酵素の活性低下を大幅に低減でき、かつ、固定化生体触媒の場合にはその繰り返し利用を可能とすることを見出し、さらには活性低下に伴い反応率が低下する問題を解決することに成功した。このとき、反応溶液中からのアンモニアの分離には、減圧下での蒸発、陽イオン交換樹脂もしくはゼオライトによる吸着が有効であることもわかった。これらにより、反応溶液中の原料アミノ酸アミド濃度を高めることにより反応容器あたりの生産性を向上させることができた。その結果、廃棄物である廃塩、廃菌体を増大させることなく生産性を大幅に向上させることが可能となり、高品質かつ安価に光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンまたは光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを製造できることを見出した。
本発明はこれら知見に基づくものである。
【００１２】
よって、本発明の目的は、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素反応において、酵素または菌体もしくはその処理物あたり、かつ単位時間当たりの活性を高く維持することで、菌体やｐＨ調整用の酸を増量することなく反応溶液中の原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド濃度を高めることができ、その結果として廃塩や廃菌体の発生を増加させること無く生産性を大幅に改善した光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンまたは光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造法を提供する事にある。
【００１３】
本発明は、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに、これを立体選択的に加水分解する酵素、該酵素を有する微生物の菌体、該菌体の処理物、該酵素を担体に固定化した固定化酵素、該菌体を担体に固定化した固定化菌体、および該菌体処理物を担体に固定化した固定化菌体処理物からなる群より選択される生体触媒を作用させて加水分解することによって、Ｄ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンまたはＤ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを製造する方法であって、
該加水分解により生成するアンモニアを、加水分解の反応溶液から分離しながら該加水分解を行うことを特徴とする方法に関する。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の方法において、アンモニアの反応溶液からの分離を、
前記反応溶液を減圧下に置き、アンモニアを蒸発させるか、または
陽イオン交換樹脂若しくはゼオライトへ、反応溶液中のアンモニアを吸着させる
ことにより行う。
【００１５】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、アンモニアの反応溶液からの分離を、反応溶液を減圧下に置き、アンモニアを蒸発させることにより行う。
【００１６】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、アンモニアの反応溶液からの分離を、陽イオン交換樹脂へ、反応溶液中のアンモニアを吸着させることにより行う。
【００１７】
本発明のさらに別の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、アンモニアの反応溶液からの分離を、ゼオライトへ、反応溶液中のアンモニアを吸着させることにより行う。
【００１８】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、酵素は、キサントバクター  フラバス由来の酵素である。
【００１９】
本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、微生物は、キサントバクター  フラバス由来の酵素であって、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素の遺伝子を導入された微生物である。
【００２０】
本発明の一つのより好ましい態様によれば、本発明の方法において、微生物は、ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）である。
【００２１】
本発明の別の一つの好ましい態様によれば、本発明の方法において、反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、７０００ｐｐｍ以下である。
【００２２】
なお本発明の別の態様によれば、ＤＬ−アミノ酸アミドに、これを立体選択的に加水分解する酵素または前記酵素を有する微生物もしくは微生物処理物を作用させて加水分解し、Ｄ−若しくはＬ−アミノ酸またはＤ−若しくはＬ−アミノ酸アミドを製造する方法であって、前記加水分解により生成するアンモニアを反応溶液から分離しながら前記加水分解を行うことを特徴とするＤ−若しくはＬ−アミノ酸またはＤ−若しくはＬ−アミノ酸アミドの製造方法が提供される。
【００２３】
本発明によれば、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素反応において、廃塩、廃菌体を増加させることなく、原料濃度を向上させることが可能となるため、後工程の濃縮操作等の負荷を低減し、かつ反応容器当たりの生産性を大幅に改善した、Ｄ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンまたはＤ−若しくはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド、特にＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンまたはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの製造が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例Ａの結果を示す。
【図２】実施例Ａ−３および実施例Ｄ−２で使用した装置の概略図を示す。
【図３】実施例Ｂの結果を示す。
【図４】実施例Ｃの結果を示す。
【図５】実施例Ｄの結果を示す。
【図６】実施例Ｅの結果を示す。
【図７】実施例Ｆの結果を示す。
【発明の具体的説明】
【００２５】
以下、実施形態に基づいて本発明を詳細に説明する。本発明の範囲は、実施形態および実施例によって限定されるものではない。
【００２６】
本発明において、「ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド」とは、Ｄ体またはＬ体のｔｅｒｔ−ロイシンアミドの混合物、若しくは、ラセミ体を意味する。
【００２７】
本発明において、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解には、Ｌ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンに対応するＬ−またはＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する活性を有する酵素、該酵素を有する微生物の菌体、該菌体の処理物、該酵素を担体に固定化した固定化酵素、該菌体を担体に固定化した固定化菌体、および該菌体処理物を担体に固定化した固定化菌体処理物からなる群より選択される生体触媒を使用する。
【００２８】
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを立体選択的に加水分解する酵素を有する微生物としては、例えば、キサントバクター属、プロタミノバクター属、ミコバクテリウム属およびミコプラナ属等に属する微生物が挙げられる。具体的には、キサントバクター  フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ）、プロタミノバクター  アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）、ミコバクテリウム  メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ミコバクテリウム  メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ミコプラナ  ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ）、ミコプラナ  ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ）、バリオボラックス  パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）などの種が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに具体的な例を挙げると、キサントバクター  フラバス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ）ＮＣＩＢ  １００７１Ｔ、プロタミノバクター  アルボフラバス（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ８４５８、ミコバクテリウム  メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＢＴ−８４（ＦＥＲＭ  Ｐ８８２３）、ミコバクテリウム  メタノリカ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）Ｐ−２３（ＦＥＲＭ  Ｐ８８２５）、ミコプラナ  ラモサ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｒａｍｏｓａ）ＮＣＩＢ９４４０Ｔ、ミコプラナ  ディモルファ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｄｉｍｏｒｐｈａ）ＡＴＣＣ４２７９Ｔ、バリオボラックス  パラドクサス（Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）ＤＳＭ１４４６８が挙げられる。
【００２９】
また、これら微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株、例えば、キサントバクター  フラバス由来のアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する酵素の遺伝子が導入され該酵素を有するｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）等の株であっても上記酵素を有するものであれば、本発明において使用できる。また、菌体処理物とは、例えば菌体濃縮液、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、もしくは精製酵素が挙げられる。さらに、例えば無細胞タンパク質合成系など、微生物を用いない方法で得られた酵素を用いることもできる。
【００３０】
酵素または該酵素を有する微生物の菌体もしくは菌体処理物を担体に固定化させた固定化生体触媒（すなわち、固定化酵素、固定化菌体、および固定化菌体処理物）の調製は、当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、物理的吸着法、包括法などで行うことができる。固定化の際に使用される担体としては、固定化法に応じて慣用のものを適宜使用することができるが、具体例を挙げれば、アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、κ − カラギーナン等の天然高分子を用いた固定化、ポリアクリルアミド、光硬化性樹脂、ウレタンポリマー等の合成高分子を用いた固定化、マイクロカプセルなどが挙げられる。
【００３１】
原料であり酵素反応の基質であるＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドは、一般式（１）に示すものである。式中のＲは、ｔｅｒｔ−ブチル基である。
【化１】
2011068206.tif 000002
【００３２】
上記のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを水に溶解させ、そこに、前記酵素、該酵素を有する微生物の菌体、その菌体の処理物、固定化酵素、固定化菌体、又は固定化菌体処理物と、必要に応じて他の成分とを加えて反応溶液を調製し、立体選択的加水分解を行うと同時に生成するアンモニアを分離することにより、一般式（２）で示される光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンまたはこれと対掌体である一般式（３）の光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを製造する。なお、一般式（２）および（３）におけるＲは一般式（１）におけるＲと同一である。
【００３３】
【化２】
2011068206.tif 000003
【００３４】
【化３】
2011068206.tif 000004
【００３５】
立体選択的加水分解前の反応溶液における基質であるＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの濃度は、０．０１ｗｔ％〜ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの飽和濃度が好ましく、より好適には１０〜３０ｗｔ％である。ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド濃度を上記の範囲とすることで、基質濃度が低すぎることが無いために反応液体積あたりの生産性を高くすることができ、また、高濃度の基質による酵素の失活を招くことがない。
【００３６】
ＤＬ−アミノ酸アミドの立体選択的加水分解に適したｐＨは、使用する酵素により異なり一概に規定することはできないが、例えば酵素としてｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）を用いた場合にはｐＨ６〜１０において好適に進行する。ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの水溶液のｐＨは１０．５程度となるため、立体選択的加水分解を至適ｐＨ条件で実施するためには酸を添加してｐＨを調整する必要がある。
【００３７】
ｐＨ調整のために添加する酸としては、鉱酸でも有機酸でもよく特に制限されないが、中でも塩酸、酢酸が好適である。添加する酸の量は、上記ｐＨの範囲に収まるように決めればよく、例えば塩酸であれば、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して０．００５〜０．５モル倍量、好ましくは０．０５〜０．４モル倍量であり、酢酸であれば、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドに対して０．００５〜１モル倍量、好ましくは０．０５〜０．７モル倍量である。
【００３８】
酵素によっては金属イオンの添加により立体選択的加水分解速度が向上するものもあり、そのような場合には酵素の特性に合わせてＣａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋などの各種金属イオンを反応溶液中に、例えば１〜１００ｐｐｍ添加してもよい。
【００３９】
アミノ酸アミドを立体選択的加水分解する酵素によるＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解反応において、生成するＬ−又はＤ−ｔｅｒｔ−ロイシンと等ｍｏｌ量のアンモニアが発生する。このアンモニアを加水分解反応中に連続的もしくは断続的に反応溶液から分離する。本発明で使用する酵素は、基質としてＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを用いた場合においてはアンモニアにより阻害されるが、加水分解中にアンモニアを反応溶液から分離することにより、アンモニアの増加による酵素の失活を防ぐことにより反応速度の低下を抑え、ひいては原料濃度を増加することができる。
【００４０】
酵素がアンモニアおよびアンモニウムイオンにより失活する条件は、アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和のみによるものではなく、酵素、温度により異なる。そのため、反応溶液中のアンモニアの濃度は一概に規定することができない。ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの立体選択的加水分解反応において、例えば、酵素として菌体ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）を用い、４０℃の水溶液中で反応を行う場合には、反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は７０００ｐｐｍ以下、好ましくは６０００ｐｐｍ以下となるようにアンモニア分離の条件を設定する。
【００４１】
反応終了後に限外ろ過など当業者に周知の方法で反応溶液より酵素または該酵素を有する微生物もしくはその処理物を回収して再利用する場合には、反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は好ましくは３５００ｐｐｍ以下、より好ましくは２５００ｐｐｍ以下となるようにアンモニア分離の条件を設定する。
【００４２】
アミノ酸アミドを立体選択的加水分解する酵素もしくは該酵素を含有する菌体処理物を固定化生体触媒として用いる場合、アンモニアおよびアンモニウムイオンにより酵素が失活する条件は、酵素、固定化法、温度などの条件により異なる。例えば、菌体ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）を固定化生体触媒として立体選択的加水分解を行い、該固定化生体触媒の再利用を行う場合には、反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は３５００ｐｐｍ以下、好ましくは２５００ｐｐｍ以下となるようにアンモニア分離の条件を設定する。
【００４３】
アンモニアの分離を行う箇所は、加水分解反応を行っている反応釜でも、反応釜とは別に設けたアンモニア分離装置でもよい。
【００４４】
反応溶液からアンモニアを分離する方法としては、反応溶液を減圧下に置く減圧法、陽イオン交換樹脂に吸着させる方法、ゼオライトに吸着させる方法を用いることができる。
【００４５】
反応液からアンモニアを分離する他の方法として、反応液に通気する方法、反応液を加熱する方法が挙げられる。しかし、反応液に通気する方法では分離可能なアンモニア量が少なく反応が完結しないことがあり望ましくない。また、反応液を加熱する方法では、十分な量のアンモニア量を分離するための温度では酵素が失活することがあり必ずしも望ましくない。
【００４６】
減圧法
アンモニアを反応溶液から分離するために、反応溶液を減圧下に置き、アンモニアを蒸発させることができる。
【００４７】
減圧法による反応では、酵素として菌体ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）を用い、反応溶液の温度を４０℃とするならば、ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの加水分解反応中の圧力を反応溶液が沸騰する圧力である４０ｍｍHｇ以上で、該圧力より５０ｍｍHｇ高い圧力である９０ｍｍHｇ以下とすることが好適である。
【００４８】
アンモニアの分離に伴う水の蒸発により反応溶液が減少する場合、外部から水を加えてもよい。
【００４９】
陽イオン交換樹脂による吸着法
アンモニアを反応溶液から分離するために、陽イオン交換樹脂へ反応溶液中のアンモニアを吸着させることができる。
【００５０】
陽イオン交換樹脂を用いる場合、反応液中に共存させる陽イオン交換樹脂は、加水分解反応中に生成するアンモニアを吸着する能力があれば強酸性イオン交換樹脂や弱酸性イオン交換樹脂のいずれであってもよい。またその選定に当たってはその種類、形態等によって制限されることは無く、吸着能、イオン交換容量、強度、価格等を考慮して適宜決定されれば良く、例えばＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８（ダウ  ケミカル社製）やＤＩＡＩＯＮ  ＳＫ１１０（三菱化学株式会社製）、アンバーライトＩＲ１２０Ｂ（ローム  アンド  ハース社製）等が好適に使用できる。
【００５１】
反応液中に共存させる陽イオン交換樹脂の量は、陽イオン交換樹脂のイオン交換容量、吸着能によって異なるが、加水分解反応中に生成するアンモニアを吸着するのに充分な量であればよい。反応液中に共存させる陽イオン交換樹脂の量が、加水分解反応中に生成するアンモニアを吸着するのに充分な量に満たない場合、陽イオン交換樹脂を共存させる効果が充分に期待されず、反応の進行とともに反応速度が低下し、目的とする反応が完結しない場合がある。また、反応液中に共存させる陽イオン交換樹脂の量が極端に多い場合は、アミノ酸、アミノ酸アミド、菌体や酵素が陽イオン交換樹脂に吸着し、回収率や反応進行率が低下する場合がある。したがって、好適な陽イオン交換樹脂の量は、陽イオン交換樹脂のイオン交換容量が発生するアンモニアの０．０５〜２倍量となるように加えることが適当である。
【００５２】
使用する陽イオン交換樹脂は、活性型であればよく、使用後の陽イオン交換樹脂を活性化して再使用することもできる。
【００５３】
陽イオン交換樹脂を反応液中に共存させる方法は、陽イオン交換樹脂と反応液が実質上接していればよく、例えば、攪拌式反応槽内の反応液に陽イオン交換樹脂を直接添加して懸濁状態で使用する方法や、陽イオン交換樹脂をろ布や膜あるいは籠状の容器に充填して反応槽内に仕込む方法や、陽イオン交換樹脂を充填した塔に反応液を流通または循環させる方法等、任意の方法を用いることができる。攪拌式反応槽内の反応液に陽イオン交換樹脂を直接添加して懸濁状態で使用する方法は、簡便ではあるが、攪拌による樹脂の破損や、反応後の樹脂の回収を考慮すると、陽イオン交換樹脂をろ布や膜あるいは籠状の容器に充填して反応槽内に仕込む方法や、陽イオン交換樹脂を充填した塔に反応液を流通または循環させる方法が好適である。また、膜状あるいは繊維状に成形された陽イオン交換樹脂を使用することも可能である。
【００５４】
ゼオライトによる吸着法
アンモニアを反応溶液から分離するために、ゼオライトへ反応溶液中のアンモニアを吸着させることができる。
【００５５】
ゼオライトを用いる場合、反応液中に共存させるゼオライトは、加水分解反応中に生成するアンモニアを吸着する能力があればよく、その種類によって制限されることなく使用可能であり、例えば、モルデナイト、Ｙ型ゼオライト、シャバサイトなどを使用することができ、吸着能、イオン交換容量、単位重量あたり表面積、強度および価格等を総合的に判断して用いることができる。
【００５６】
反応液中に共存させるゼオライトの形態は、粉末状よりは強度が強く粉化しにくい成型体が好適に使用される。粉末状ゼオライトは、アンモニアの他に酵素をも吸着し、反応を阻害する。強度の弱い成型体は、一部粉末状となり、反応を阻害する傾向がある。粉末状ゼオライトへの酵素の吸着と反応阻害を回避するためには、成型体をろ布や膜あるいは籠状の容器に充填して反応槽内に仕込む方法や、成型体を充填した塔に反応液を流通または循環させる方法が好適である。
【００５７】
反応液中に共存させるゼオライトの量は、ゼオライトの種類、吸着能、イオン交換容量、単位重量あたり表面積によって異なるが、加水分解反応中に生成するアンモニアを吸着するのに充分な量であればよい。反応液中に共存させるゼオライトの量が、加水分解反応中に生成するアンモニアを吸着するのに充分な量に満たない場合、ゼオライトを共存させる効果が充分に発揮されず、反応の進行とともに反応速度が低下し、目的とする反応が完結しない場合がある。また、反応液中に共存させるゼオライトの量が極端に多い場合は、アミノ酸、アミノ酸アミド、菌体や酵素がゼオライトに吸着し、回収率や反応進行率が低下する場合がある。したがって、好適なゼオライトの量は、ゼオライトのイオン交換容量が発生するアンモニアの０．０５〜２倍量となるように加えることが適当である。
【００５８】
使用するゼオライトは、プロトン型などアンモニアを吸着できる状態であればよく、使用後のゼオライトを再びアンモニアを吸着できるよう処理して再使用することもできる。
【００５９】
ゼオライトを反応液中に共存させる方法は、ゼオライトと反応液が実質上接していればよく、例えば、攪拌式反応槽内の反応液にゼオライトを直接添加して懸濁状態で使用する方法や、ゼオライトをろ布や膜あるいは籠状の容器に充填して反応槽内に仕込む方法や、ゼオライトを充填した塔に反応液を流通または循環させる方法等、任意の方法を採ることができる。攪拌式反応槽内の反応液にゼオライトを直接添加して懸濁状態で使用する方法は、簡便ではあるが、攪拌による成型体の粉化や、反応後のゼオライトの回収、またゼオライトへの菌体の吸着等があり、ゼオライトをろ布や膜あるいは籠状の容器に充填して反応槽内に仕込む方法が最も好適な効果を得ることができる。
【００６０】
酵素反応後、当業者に周知の方法で反応溶液より光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンまたは光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを得ることができる。例えば、酵素反応後の反応溶液から菌体やタンパク質、核酸を活性炭に吸着除去し、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンと対掌体である光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドの溶解性が、例えば２−メチル−１−プロパノールに置換することで光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを析出でき、該溶液を濾過することで結晶として光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンを取得できる。さらに、ここで得られた濾液を濃縮乾固させることで、光学活性ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを取得できる。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例をあげて本願発明を詳細に説明するが、本願発明はこれによって限定されるものではない。【００６２】
実験方法および測定法：
反応の進行および光学純度の測定は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い、アンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和はキャピラリー電気泳動で測定した。分析条件は以下のとおりであった。【００６３】
〔ＨＰＬＣ分析条件１〕
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ−１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ【００６４】
〔ＨＰＬＣ分析条件２〕
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−５０００（４．６φ×５０ｍｍ）
溶離液：硫酸銅１０ｍＭ水溶液
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ【００６５】
〔ＨＰＬＣ分析条件３〕
カラム：ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ１００ＲＰ−１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＲＩ【００６６】
〔アンモニア分析条件〕
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ社製  キャピラリー電気泳動システム  ３ＤＣＥ
キャピラリー長：４０ｃｍ【００６７】
参考例１：  菌体の調製
下記の実施例および比較例で用いるＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド立体選択的加水分解酵素を有する形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４）は、Ｔｕｒｂｏ培地（Ａｔｈｅｎａ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．製、フナコシ株式会社より購入）を用い、３７℃で培養し、遠心分離により菌体濃縮液（乾燥菌体の重量として６．７ｗｔ％を含有）を得た。
なお、大腸菌の形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９は、２００４年（平成１６年）５月２１日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地 中央第６）に寄託されたものであり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３３４である。【００６８】
参考例２：  固定化生体触媒の調製
固定化生体触媒の調製方法は次の通りであった。ＰＥＧ−１０００ジメタクリレート（新中村化学工業株式会社製）２７．２ｇ、Ｎ, Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．９ｇ、テトラメチルエチレンジアミン１．０ｇ、ペルオキソ二硫酸アンモニウム０．０３ｇ、参考例１で得られた菌体濃縮液５２．２ｇ、純水１８．７ｇを均一になるまで混合し、常温にて静置させることにより固化させた。固化後、約３ｍｍ角に切断して、下記実施例において、固定化生体触媒として用いた。【００６９】
参考例３：  形質転換体ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９の他の基質に対するアンモニアの影響例
５００ｍＬのフラスコにＤＬ−２−メチルシステインアミド塩酸塩１６．３ｇ（０．０９６ｍｏｌ）を入れ、水１４１．３ｇを加えて溶解した。２８％アンモニア水３．２ｇを添加して攪拌した。このときのアンモニア濃度は５５００ｐｐｍとなる。さらに、塩化マンガン四水和物２．９７ｍｇを添加し、参考例１で調製した形質転換体ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９の菌体濃縮液０．０９ｇを添加し、３０℃、窒素気流下において撹拌して立体選択的加水分解を行った。ＨＰＬＣ条件３を用いて反応進行率を調べた結果、反応時間２４時間において、Ｌ−２−メチルシステインアミドのうち９５％以上がＬ−２−メチルシステインに変換された。このときのアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は１００００ｐｐｍであった。【００７０】
実施例Ａ：  減圧／酵素反応
実施例Ａ−１：  減圧（４０ｍｍＨｇ）／酵素反応
２００ｍＬのフラスコに２０．０ｇ（０．１５ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを入れ、水７８．４ｇを加えて溶解した。酢酸１．８６ｇ（０．０３１ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物６．８８ｍｇを添加し、形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９の菌体濃縮液０．６０ｇを添加し、４０℃、４０ｍｍＨｇにおいて撹拌して立体選択的加水分解を行った。【００７１】
ＨＰＬＣ分析条件１を用いた反応進行率の経時変化を図１に示す。図１の反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。反応時間２７時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．５％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。また、反応時間２７時間においてＨＰＬＣ分析条件２を用いて測定した結果、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後５時間目における５０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００７２】
反応溶液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体を除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール６５ｇを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過で濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール３０ｇで洗浄し、さらに２５℃のアセトン９０ｇで洗浄した後、常温で真空乾燥を行い、白色粉末を９．８ｇ取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、化学純度は９９．８％であった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９．５％以上であった。【００７３】
実施例Ａ−２：  減圧（６５ｍｍＨｇ）／酵素反応
立体選択的加水分解時に６５ｍｍＨｇで行う以外は実施例Ａ−１と同様に反応を行った。反応の進行結果を図１に示す。反応時間６８時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．５％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。また、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後７時間目における６０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００７４】
実施例Ａ−３：  減圧（４０ｍｍＨｇ）／酵素反応（アンモニア分離装置付き）
１）実験装置
装置の概略図を図２に示す。
反応釜１に反応液を入れ加熱器２で反応液の温度制御を行い攪拌しながら大気開放として反応を行う。同時に、反応液移送ポンプ３により反応液の一部がアンモニア分離装置である蒸発器４に送られる。蒸発器４は真空ポンプにて減圧されるとともに温度制御されており、反応液はアンモニアを分離された後に反応液移送ポンプ５によって反応釜１に戻される。また、反応中に加水ライン６から反応釜１に水を加えることができる。【００７５】
２）立体選択的加水分解
５００ｍＬのフラスコを反応釜とし、これに５０．３９ｇ（０．３８ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを入れ、水１９４．２４ｇを加えて溶解した。酢酸４．６２ｇ（０．０３１ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物９．０１ｍｇを添加し、形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９の菌体濃縮液１．８２ｇを添加し、４０℃、大気開放において撹拌して立体選択的加水分解を行った。反応開始と共に、４０℃、４０ｍｍＨｇの蒸発器に反応溶液の一部を３０ｍＬ／分で連続的に流通し、酵素反応に伴い発生するアンモニアを除去した。蒸発器により減少した水は、加水ラインより補った。反応の進行結果を図１に示す。反応時間３９時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．５％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後６時間目における３５００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００７６】
比較例Ａ−１
立体選択的酵素反応時に常圧で行う以外は実施例Ａ−１と同様に反応を行った。反応の進行結果を図１に示す。反応時間４５時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち４７．４％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、４５時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７８００ｐｐｍであった。従って、常圧条件では酵素反応完結には至らなかった。【００７７】
比較例Ａ−２
立体選択的酵素反応時に常圧で行い、窒素を反応溶液下部から１００ｍＬ／ｍｉｎで通気する以外は実施例Ａ−１と同様に反応を行った。反応の進行結果を図１に示す。反応時間２４時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち５２．０％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、２４時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７２００ｐｐｍであった。したがって、窒素通気では酵素反応完結に至らなかった。【００７８】
比較例Ａ−３
立体選択的酵素反応時に常圧で行い、酵素反応の温度を５５℃で行う以外は実施例Ａ−１と同様に反応を行った。反応の進行結果を図１に示す。反応時間２４時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち１５．８％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、２４時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大２０００ｐｐｍであった。したがって、該酵素と該基質の組み合わせでは、高温により酵素が失活してしまうため、反応完結には至らなかった。【００７９】
実施例Ｂ：  陽イオン交換樹脂吸着／酵素反応
実施例Ｂ−１
１００ｍＬのフラスコに１２．１３ｇ（０．０９３ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを入れ、水４４．３１ｇを加えて溶解した。酢酸３．３ｇ（０．０５６ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物５．９７ｍｇを添加し、反応ストック溶液を調製した。試験管にこの反応ストック溶液１０．０ｇを入れ、形質転換株ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９の培養濃縮液０．１２ｇ（乾燥菌体の重量として０．００８ｇを含有）を接種し、４０℃において撹拌により立体選択的加水分解を行った。陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８（ダウ  ケミカル社製）２．５ｇを反応溶液に懸濁した。【００８０】
反応の進行は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件１で確認した。結果を図３に示す。反応時間６９時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．８％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後２０時間目における５５００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００８１】
得られた反応溶液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体および陽イオン交換樹脂を除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール３５ｇを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過で濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール２５ｇで洗浄し、さらに２５℃のアセトン７５ｇで洗浄した後、常温で真空乾燥を行い、白色粉末を５．９ｇ取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、化学純度は９９．５％であった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９．５％以上であった。【００８２】
実施例Ｂ−２
実施例Ｂ−１の条件にて、陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８（ダウ  ケミカル社製）２．５ｇを不織布に袋状に包み、反応溶液へ投入した。酵素反応の結果を図３に示す。反応時間４５時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．８％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後２０時間目における６０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００８３】
比較例Ｂ−１
実施例Ｂ−１の条件にて、陽イオン交換樹脂を設置せずに反応を行った。反応の進行結果を図３に示す。反応時間４６時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち６８．５％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、４６時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大８０００ｐｐｍであった。【００８４】
比較例Ｂ−２
２００ｍＬのフラスコに２０．０ｇ（０．１５ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを入れ、水７８．４ｇを加えて溶解した。酢酸１．８６ｇ（０．０３１ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物６．８８ｍｇを添加し、参考例１で得られた菌体濃縮液０．６０ｇを添加し、４０℃において陽イオン交換樹脂を設置せずに撹拌して立体選択的加水分解を行った。反応の進行結果を図３に示す。反応時間４５時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち４７．４％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、４５時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７８００ｐｐｍであった。【００８５】
実施例Ｃ：  ゼオライト吸着／酵素反応
実施例Ｃ−１
１００ｍＬのフラスコに１２．１３ｇ（０．０９３ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを入れ、水４４．３１ｇを加えて溶解した。酢酸３．３ｇ（０．０５６ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物５．９７ｍｇを添加し、反応ストック溶液を調製した。試験管にこの反応ストック溶液１０．０ｇを入れ、参考例１で得られた菌体濃縮液０．２４ｇ（乾燥菌体の重量として０．０２ｇを含有）を接種し、４０℃において撹拌により立体選択的加水分解を行った。ゼオライトＳＡＰＯ−３４打錠成型体（特開２００４−０４３２９６号公報に記載の実施例６に従い調製）２．４ｇを不織布に充填し、反応溶液に浸るように試験管内に設置した。【００８６】
反応の進行は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析条件１で確認した。結果を図４に示す。図４の反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。反応時間４５時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．６％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後２０時間目における６０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００８７】
反応溶液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体およびゼオライトを除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール３５ｇを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過で濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール２５ｇで洗浄し、さらに２５℃のアセトン７５ｇで洗浄した後、常温で真空乾燥を行い、白色粉末を５．９ｇ取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、化学純度は９９．５％であった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９．５％以上であった。【００８８】
比較例Ｃ−１
実施例Ｃ−１の条件にて、ゼオライトを設置せずに反応を行った。反応の進行結果を図４に示す。反応時間４６時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち６８．５％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、４６時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大８０００ｐｐｍであった。【００８９】
比較例Ｃ−２
立体選択的酵素反応時に粉末状ゼオライトＳＡＰＯ−３４を懸濁状態で反応溶液に投入した以外は実施例１と同様に反応を行った。反応の進行結果を図４に示す。反応時間４６時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち３．６％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、４６時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大４００ｐｐｍであった。【００９０】
比較例Ｃ−３
２００ｍＬのフラスコに２０．０ｇ（０．１５ｍｏｌ）のＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドを入れ、水７８．４ｇを加えて溶解した。酢酸１．８６ｇ（０．０３１ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物６．８８ｍｇを添加し、参考例１で得られた菌体濃縮液０．６０ｇを添加し、４０℃においてゼオライトを設置せずに撹拌して立体選択的加水分解を行った。反応の進行結果を図４に示す。反応時間４５時間において、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち４７．４％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換され、残りはＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドとして残留した。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、４５時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７８００ｐｐｍであった。【００９１】
実施例Ｄ：  減圧下での固定化生体触媒を用いた酵素反応
実施例Ｄ−１：  減圧（４０ｍｍＨｇ）／固定化生体触媒を用いた酵素反応
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド６００．２ｇ（４．６１ｍｏｌ）を、水４６４２．８ｇで溶解した。酢酸５５．４ｇ（０．９２ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物０．３２ｇを添加したものを基質溶液とした。５００ｍＬフラスコに基質溶液２００ｇを入れ、参考例２で調製した固定化生体触媒１４．４ｇを添加し、４０℃、４０ｍｍＨｇにおいて撹拌して立体選択的加水分解を行った。【００９２】
反応開始から２４時間後に反応溶液を全量抜き出し、固定化生体触媒の表面およびフラスコを純水で洗浄後、新しく基質溶液２００ｇを添加し、４０℃、４０ｍｍＨｇにおいて撹拌して立体選択的加水分解を繰り返し行った。【００９３】
ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図５に示す。図５の反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。同一の固定化生体触媒を用いて反応を繰り返し１０回行った結果、いずれも２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．０％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。また、反応時間２４時間目においてＨＰＬＣ分析条件２を用いて測定した結果、いずれもＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後６時間目における２０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００９４】
実施例Ｄ−２：  減圧（４０ｍｍＨｇ）／固定化生体触媒を用いた酵素反応（アンモニア分離装置付き）
１）実験装置
装置の概略図を図２に示す。
反応液貯槽１に反応液を入れ加熱器２で反応液の温度制御を行い攪拌しながら大気開放とする。同時に、反応液移送ポンプ３により反応液の一部が固定化生体触媒を入れたアンモニア分離装置である反応塔兼蒸発器４に送られる。反応塔兼蒸発器４は真空ポンプにて減圧されるとともに温度制御されており、反応液は固定化生体触媒により反応すると共にアンモニアを分離された後に反応液移送ポンプ５によって反応液貯槽１に戻される。また、反応中に加水ライン６から反応液貯槽１に水を加えることができる。【００９５】
２）立体選択的加水分解
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド６００．５ｇ（４．６１ｍｏｌ）を、水２３５７．７ｇで溶解した。酢酸５６．２ｇ（０．９４ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物０．３２ｇを添加したものを基質溶液とした。５００ｍＬフラスコに基質溶液２００ｇを入れた。参考例２で調製した固定化生体触媒２９．６ｇを反応塔兼蒸発器に入れ、４０℃、４０ｍｍＨｇに設定した。基質溶液の一部を３０ｍＬ／分で連続的に流通し、立体選択的加水分解を行うと共にアンモニアを除去した。蒸発により減少した水は、加水ラインより補った。【００９６】
反応開始から２４時間後に反応溶液を全量抜き出し、フラスコ、反応塔兼蒸発器に純水を通水することで容器内部および固定化生体触媒表面を洗浄後、新しく基質溶液２００ｇをフラスコに添加して立体選択的加水分解を繰り返し行った。【００９７】
ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図５に示す。同一の固定化生体触媒を用いて反応を繰り返し１０回行った結果、いずれも２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．０％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。【００９８】
また、反応時間２４時間目においてＨＰＬＣ分析条件２を用いて測定した結果、いずれもＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後６時間目における３０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【００９９】
比較例Ｄ−１
常圧において反応を行う以外においては実施例Ｄ−１と同様に立体選択的加水分解を行った。ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図５に示す。図５の反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。反応の１回目は２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９６．９％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。一方、２回目以降は２４時間目の反応率が２７％未満となり、固定化生体触媒の再利用ができなった。
なお、１回目の反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後２４時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７０００ｐｐｍとなった。【０１００】
比較例Ｄ−２
実施例Ｄ−２と同様に９回の繰り返し立体選択的加水分解を行った。繰り返し７回目において、７．５時間から２２．５時間では反応塔兼蒸発器４を常圧で立体選択的加水分解を行った。続く繰り返し８、９回目は実施例２と同様に反応塔兼蒸発器４を４０ｍｍＨｇで立体選択的加水分解を行った。１〜６回目ならびに８、９回目の反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は最大３５００ｐｐｍであったのに対し、７回目では最大４５００ｐｐｍとなった。ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図５に示す。反応の７回目までは２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．５％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。一方、８回目以降は２４時間目の反応率が８９％未満となり、固定化生体触媒の再利用ができなった。【０１０１】
実施例Ｅ：  陽イオン交換樹脂吸着／固定化生体触媒を用いた酵素反応
実施例Ｅ−１
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド６００．２ｇ（４．６１ｍｏｌ）を、水４６４２．８ｇで溶解した。酢酸５５．４ｇ（０．９２ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物０．３２ｇを添加したものを基質溶液とした。試験管に基質溶液１０．０ｇを入れ、陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ  ５０ＷＸ８（ダウ  ケミカル社製）２．５ｇを反応溶液に懸濁した。さらに、参考例２で調製した固定化生体触媒２．９ｇを添加し、４０℃において撹拌して立体選択的加水分解を行った。【０１０２】
反応開始後２４時間後に反応溶液を全量抜き出し、固定化生体触媒を分離した。固定化生体触媒の表面および試験管を純水で洗浄後、新しく基質溶液１０．０ｇおよび陽イオン交換樹脂２．６ｇを添加し、４０℃で撹拌して立体選択的加水分解を繰り返し行った。【０１０３】
ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図６に示す。図６の反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。同一の固定化生体触媒を用いて反応を繰り返し５回行った結果、いずれも２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．０％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。【０１０４】
また、反応時間２４時間目においてＨＰＬＣ分析条件２を用いて測定した結果、いずれもＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後６時間目における２０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【０１０５】
反応溶液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体を除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール１０ｇを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過で濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール５ｇで洗浄し、さらに２５℃のアセトン１５ｇで洗浄した後、常温で真空乾燥を行い、白色粉末を０．９６ｇ取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、化学純度は９９．０％であった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９．５％以上であった。【０１０６】
比較例Ｅ−１
実施例Ｅ−１の条件にてイオン交換樹脂を添加せずに立体選択的加水分解を行った。ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図６に示す。反応の１回目は２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９６．９％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。一方、２回目以降は２４時間目の反応率が２７％未満となり、固定化生体触媒の再利用ができなった。【０１０７】
なお、１回目の反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後２４時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７０００ｐｐｍとなった。【０１０８】
実施例Ｆ：  ゼオライト吸着／固定化生体触媒を用いた酵素反応
実施例Ｆ−１
ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド６００．２ｇ（４．６１ｍｏｌ）を、水４６４２．８ｇで溶解した。酢酸５５．４ｇ（０．９２ｍｏｌ）を添加して撹拌した。このときのｐＨは８．３であった。さらに、塩化マンガン四水和物０．３２ｇを添加したものを基質溶液とした。試験管に基質溶液１０．０ｇを入れ、ゼオライトＳＡＰＯ−３４打錠成型体（特開２００４−０４３２９６号公報に記載の実施例６に従い調製）２．４ｇを不織布に充填し、反応溶液に浸るように試験管内に設置した。さらに、参考例２で調製した固定化生体触媒２．９ｇを添加し、４０℃において撹拌して立体選択的加水分解を行った。反応開始後２４時間後に反応溶液を全量抜き出し、固定化生体触媒を分離した。固定化生体触媒の表面および試験管を純水で洗浄後、不織布に充填したゼオライト２．４ｇを反応溶液に浸るように試験管内に設置し、新しく基質溶液１０．０ｇを添加し、４０℃で撹拌して立体選択的加水分解を繰り返し行った。【０１０９】
ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図７に示す。図７の反応進行率とは、原料ＤＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミド中のＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち何％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換されたかを示す。同一の固定化生体触媒を用いて反応を繰り返し５回行った結果、いずれも２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９９．０％以上がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。【０１１０】
また、反応時間２４時間目においてＨＰＬＣ分析条件２を用いて測定した結果、いずれもＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後６時間目における２０００ｐｐｍが最大であり、アンモニアの除去によって常にこの濃度以下を保っていた。【０１１１】
反応溶液に活性炭および濾過助剤を加えて濾過することにより菌体およびゼオライトを除去した濾液を取得した。濾液に２−メチル−１−プロパノール３５ｇを加え、２０ｋＰａにて含水濃度が１％に達するまで共沸脱水を行い、溶媒置換操作を行った。共沸脱水は沸点６０℃で進行し、共沸脱水終了時には沸点は７６℃であった。溶媒置換により析出したＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンを吸引濾過で濾取し、７０℃に加温した２−メチル−１−プロパノール２５ｇで洗浄し、さらに２５℃のアセトン７５ｇで洗浄した後、常温で真空乾燥を行い、白色粉末を５．９ｇ取得した。このＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンの化学純度をＨＰＬＣ条件１で分析したところ、化学純度は９９．５％であった。光学純度をＨＰＬＣ条件２で分析したところ、光学純度は９９．５％以上であった。【０１１２】
比較例Ｆ−１
実施例Ｆ−１の条件にてゼオライトを添加せずに立体選択的加水分解を行った。ＨＰＬＣ分析条件１を用いた２４時間後の反応進行率を図７に示す反応の１回目は２４時間目においてＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンアミドのうち９６．９％がＬ−ｔｅｒｔ−ロイシンに変換された。一方、２回目以降は２４時間目の反応率が２７％未満となり、固定化生体触媒の再利用ができなった。
なお、１回目の反応溶液中のアンモニア濃度およびアンモニウムイオン濃度の和は、反応開始後２４時間目まで反応の進行に伴い上昇し、最大７０００ｐｐｍとなった。
【符号の説明】
【０１１３】
１  反応釜もしくは反応液貯槽
２  加熱器
３  反応液移送ポンプ
４  蒸発器もしくは反応塔兼蒸発器
５  反応液移送ポンプ
６  加水ライン
【図１】
2011068206.tif 000005
【図２】
2011068206.tif 000006
【図３】
2011068206.tif 000007
【図４】
2011068206.tif 000008
【図５】
2011068206.tif 000009
【図６】
2011068206.tif 000010
【図７】
2011068206.tif 000011
【国際調査報告】
2011068206.tif 000012
2011068206.tif 000013
2011068206.tif 000014
2011068206.tif 000015