(57)【要約】要約  煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中の高密度リポタンパク質３(HDL3)中のコレステロールを定量する方法が開示されている。HDL3中のコレステロールの定量方法は、被検試料にホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼを作用させ、コレステロールを反応系外に移行させる第１工程と、反応系内に残存するコレステロールを定量する第２工程を含む。被検試料中のＨＤＬ３コレステロールを、超遠心や前処理といった煩雑な作業を必要とせずに自動分析装置で特異的に定量することが可能となった。また、従来技術である被検体中ＨＤＬ総コレステロール定量法により得られた総ＨＤＬコレステロール量よりＨＤＬ３コレステロール量の差を算出することによりＨＤＬ２コレステロール量を定量することも可能となった。
2012011554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料にホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼを作用させ、コレステロールを反応系外に移行させる第１工程と、反応系内に残存するコレステロールを定量する第２工程を含む、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法。
【請求項２】
前記ホスフォリパーゼがホスフォリパーゼＣ及び／又はホスフォリパーゼＤである請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１工程を、高密度リポタンパク質３以外のリポタンパク質と反応する界面活性剤の存在下で行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルである少なくとも１種の非イオン界面活性剤である請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、アミドエーテルサルフェート及びポリオキシエチレン−ステアリルアミンから成る群より選ばれる少なくとも１種の陰イオン界面活性剤である請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤が、ヤシ油脂肪酸―アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル−アミノ酢酸ベタイン及びラウリルベタインから成る群より選ばれる少なくとも１種の両性界面活性剤である請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドである陽イオン界面活性剤である請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記第２工程を、少なくとも高密度リポタンパク質３と反応する界面活性剤の存在下で行う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第２工程で用いる界面活性剤が、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル及びp-イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマーから成る群より選ばれる少なくとも１種の非イオン界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
第２工程で用いる界面活性剤が、ラウリルジメチル−アミノ酢酸ベタイン、ポリオキシエチレンラウリルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種の両性界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
第２工程で用いる界面活性剤が、脂肪酸族リン酸エステルである少なくとも１種の陽イオン界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１２】
第２工程で用いられる界面活性剤が、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル及びポリオキシエチレンクミルフェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種の、ＨＬＢが１１〜１４の間の非イオン界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１３】
第２工程で用いる界面活性剤が、イミダゾリン型の少なくとも１種の両性界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１４】
第２工程で用いる界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種の非イオン界面活性剤である請求項８記載の方法。
【請求項１５】
第２工程で用いる界面活性剤が、ラウリルアルコールアルコキシレート及びポリオキシエチレン−アルキルフェニルエーテル硫酸エステルナトリウム塩から成る群より選ばれる少なくとも１種の陰イオン界面活性剤である請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高密度リポタンパク質３（以下、「HDL3」と呼ぶことがある）中のコレステロール（HDL3中のコレステロールを以下、「HDL3コレステロール」と呼ぶことがある）の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロールは動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、そのためコレステロール逆転送系ともいわれている。冠動脈硬化などの動脈硬化疾患と負の相関があることが知られており、ＨＤＬが低値であることは脂質異常症の一つとして低値限界が設けられており、動脈硬化の指標として有用であることが知られている。【０００３】
ＨＤＬはアポタンパク質とリン脂質、コレステロール、中性脂肪から構成されている。ＨＤＬは比重がｄ＝１．０６３〜１．２１０ｇ／ｍＬであり、さらにｄ＝１．０６３〜１．１２５ｇ／ｍＬであるＨＤＬ２とｄ＝１．１２５〜１．２１０ｇ／ｍＬであるＨＤＬ３の２つの分画に分類される。リポ蛋白の分布曲線によりｄ＝１．１２５部分にノッチが認められ、ここから比重の重い部分をＨＤＬ３とされる。また、ＨＤＬ中のアポタンパク質のうちアポリポ蛋白Ｅ含有量差から、アポＥの含有量の多いＨＤＬをアポＥ−ｒｉｃｈ  ＨＤＬとする亜分画の分け方も存在する。【０００４】
従来までのＨＤＬ蛋白全体だけではなく、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３それぞれの亜分画において異なった働きを示すことが知られている。臨床において、ＣＥＴＰ欠損によりＨＤＬがＬＤＬやＩＤＬに代謝されず、ＨＤＬコレステロール量が増加することが知られている。ＣＥＴＰ欠損により増加したＨＤＬはＨＤＬ２である。ＨＤＬ２には抗動脈硬化作用があると言われている。また、ＣＥＴＰ欠損によりアポＥ−ｒｉｃｈ  ＨＤＬが上昇するとも言われており、Ａｐｏ−Ｅ―ｒｉｃｈｉ  ＨＤＬはコレステロール引き抜き能が強く抗血小板作用があり、ＨＤＬの中でもより善玉であるとも言われている。また、肝性リパーゼ活性の低下によりＨＤＬ３がＨＤＬ２に変化せず、ＨＤＬ３が増加する。ＨＤＬ３の増加による冠動脈疾患の発症率の増加が示唆されている。これらの傾向からＨＤＬ亜分画それぞれを測定することは、動脈硬化疾患の有無や原因を判断する助けとなることが予想される。また、現在、これらＨＤＬ亜分画の働きを踏まえ、ＣＥＴＰの働きを阻害し、ＬＤＬコレステロール量を減少させ、ＨＤＬコレステロール量を増加させる治療薬の開発が各メーカーで進められている。【０００５】
ＨＤＬ亜分画の簡便な測定方法を確立することは詳細な働きの解明や、これらの治療の効果へと繋がる可能性がある。【０００６】
現在までにＨＤＬ亜分画の測定法として知られているものとしては、超遠心法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、ＨＤＬ３沈殿法（特許文献１）、ＮＭＲ法、などが知られている。【０００７】
超遠心は遠心によりリポ蛋白の比重の差を利用して画分する方法であり、作業に熟練が必要なこと、日数がかかること、また費用も高額となる欠点がある。岡崎らによるＨＰＬＣを用いたＨＤＬ２とＨＤＬ３とを分ける方法では、作業に時間を要し、特別な機器が必要である。ＨＤＬ３沈殿法は２価金属イオンおよびデキストラン硫酸を含む試薬によりＨＤＬ３以外を凝集させ、遠心により上清部分のＨＤＬ３を回収し自動分析装置で測定する方法である。やはり、作業に熟練が必要であること、また用手法であり検体の前処理操作が必要であることもあり、測定までにある程度の時間がかかるといった欠点があり、汎用的ではなかった。また、ＮＭＲ法は磁気共鳴によりリポ蛋白の粒子数を計測する方法であるが、特殊な機械が必要であり、一般的ではない。【０００８】
なお、ＨＤＬ亜画分の分析方法(特許文献２)が存在する。汎用自動分析装置により測定が可能であるが、界面活性剤を使用することによりＨＤＬ３以外のリポ蛋白を酵素の作用から阻害する方法を用いており、ＨＤＬ３反応中において、目的以外のリポ蛋白質が存在していることなり、測定への影響、もしくは、阻害しきれなかった場合は、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を測りこむ恐れがある。【０００９】
このような方法に変わり、簡便でかつコレステロール量をより選択的に定量できる試薬の発明が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００９−２０７４６３号公報
【特許文献２】特開２００１−３４６５９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中のHDL3を定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ホスフォリパーゼ及びスフィンゴミエリナーゼがリポタンパク質に作用するが、HDL3にはほとんど作用しないことを見出した。そして、被検試料にホスフォリパーゼ又はスフィンゴミエリナーゼを作用させ、コレステロールを消去し、次いで、残存するHDL3中のコレステロールを定量することにより被検試料中のHDL3コレステロールが定量可能であることに想到し、これが可能であることを実験的に確認して本発明を完成した。【００１３】
すなわち、本発明は、被検試料にホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼを作用させ、コレステロールを反応系外に移行させる第１工程と、反応系内に残存するコレステロールを定量する第２工程を含む、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、被検試料中のＨＤＬ３コレステロールを、超遠心や前処理といった煩雑な作業を必要とせずに自動分析装置で特異的に定量することが可能となった。また、従来技術である被検体中ＨＤＬ総コレステロール定量法により得られた総ＨＤＬコレステロール量よりＨＤＬ３コレステロール量の差を算出することによりＨＤＬ２コレステロール量を定量することも可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例において行った、第２工程の試薬Ｄを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において行った、第２工程の試薬Ｇを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において行った、第２工程の試薬Ｈを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例において行った、第２工程の試薬Ｉを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例において行った、第２工程の試薬Ｋを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例において行った、第２工程の試薬Ｌを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の方法に供される被検試料としては、その試料中のHDL3コレステロールを定量しようとするものであれば特に限定されないが、好ましくは、血清若しくは血漿又はこれらの希釈物であり、特に血清又はその希釈物が好ましい。
【００１７】
本発明の第１工程では、被検試料にホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼ（以下、両者を総称して「ホスフォリパーゼ等」と呼ぶことがある）を作用させる。ホスフォリパーゼとしては、少なくともホスファチジルコリンに作用するものであればよく、ホスフォリパーゼＡ、ホスフォリパーゼＣ及びホスフォリパーゼＤが好ましく、特にホスフォリパーゼＣ及びホスフォリパーゼＤが好ましい。ホスフォリパーゼ等は市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。ホスフォリパーゼ等は単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００１８】
ホスフォリパーゼ等の終濃度（２種類以上のものが用いられる場合にはその合計濃度、以下同じ）は０．１〜１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２〜５０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。
【００１９】
被検試料にホスフォリパーゼ等を作用させると、HDL3はほとんど作用を受けず、HDL3以外のリポタンパク質は作用を受けてそのコレステロールが反応系外に移行される。
【００２０】
本発明の方法の第１工程では、ホスフォリパーゼ等の作用を受けてコレステロールを反応系外に移行させる。ここで、「反応系外に移行させる」とは、コレステロール及びそのエステルを消去又は保護することにより、その後の工程において、コレステロール及びそのエステルが関与しないようにすることを意味する。
【００２１】
ここで、「消去」とは、被検試料中のリポ蛋白のコレステロールを分解し、その後の工程において、コレステロール測定の反応に作用させないようにすることである。リポ蛋白コレステロールを消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法が挙げられる。また、ペルオキシダーゼを用いて水素供与体と発生した過酸化水素を反応させ無色キノンに転化してもよいが、これらに限定されるものではない。コレステロールの消去の方法自体はこの分野において周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００２２】
「保護」とは、被検試料中のリポ蛋白をその後の工程においてコレステロール測定に反応しないように、保護を行なうことである。リポ蛋白を保護するのには、各リポ蛋白をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが作用しないように特異的に保護する界面活性剤を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
第１工程は、反応系外に移行させるための酵素系や界面活性剤を同時に添加しておくことにより、両工程を単一の工程として同時に行うこともできる。。
【００２４】
第１工程において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合、コレステロールエステラーゼの濃度（本明細書において、濃度は特に断りがない限り終濃度を意味する）は０．１〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２〜２．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。コレステロールオキシダーゼの濃度は０．０５〜１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．１〜１．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。なお、コレステロールエステラーゼは、エステル型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールエステラーゼ(ＣＥＢＰ、ＣＥＮ)や東洋紡社製のコレステロールエステラーゼ(ＣＯＥ−３１１、ＣＯＥ−３１２)などの市販品を用いることができる。また、コレステロールオキシダーゼは、遊離型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールオキシダーゼ(ＣＯＮII)や東洋紡社製のコレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３１１、ＣＯＯ−３２１、ＣＯＯ−３３１）などの市販品を用いることができる。
【００２５】
第１工程において、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼの濃度は２．０〜５．０単位/ｍL程度が好ましく、さらに３．０〜４．０単位/ｍL程度が好ましい。また、無色キノンに転化する化合物を用いる場合、その濃度は０．４〜０．８ｍｍ０ｌ／Ｌ程度が好ましい。
【００２６】
第一工程で用いる反応液には通常の生化学反応に用いられる各種の緩衝液を使用することができ、ｐＨが５〜８の間であるのが好ましい。溶液としては、グッド、トリス、リン酸、グリシンの緩衝溶液が好ましく、グッド緩衝液であるビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシエチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、ピペラジンー１、４−ビス（２−エタンスルフォン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジンー１、４−ビス（２−エタンスルフォン酸）、１．５ナトリウム塩、一水和物（ＰＩＰＥＳ１．５Ｎａ）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）―２―アミノエタンスルフォン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）およびピペラジン−１、４−ビス（２−ヒドロキシー３−プロパンスルフォン酸）（ＰＯＰＳＯ）が好ましい。
【００２７】
第一工程の反応温度は２５〜４０℃程度が好ましく、さらに３５〜３８℃が好ましく、３７℃が最も好ましい。反応時間は特に限定されず、通常、２〜１０分程度である。
【００２８】
本願発明者らは、さらに、HDL3以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤を見出した。第１工程は、界面活性剤の非存在下で行うことが可能であるが、HDLまたはHDL3以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤の共存下で行うことにより、HDL3コレステロールをより正確に定量することが可能になるので好ましい。
【００２９】
本発明中において界面活性剤に対して「反応する」という言葉を用いる場合は、界面活性剤がリポ蛋白質に対して、反応系外に導くために酵素が作用しやすくする、もしくはリポ蛋白に対して酵素が作用できないよう保護することを意味する。
【００３０】
HDL以外のリポ蛋白に反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムアミドノニオン、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル及びアミドノニオンのような陰イオン界面活性剤；及び／又はＨＬＢ値が１４〜１７のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルのような非イオン系界面活性剤を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。より具体的には、プルロニック、プルロニックＰ１２３（旭電化）プルロニックＦ８８（旭電化）、レベノールＷＸ（花王)ノニオンHS２２０(日本油脂) 、ナイミッドＭＴ−２１５（日本油脂）、Ｎｅｗｃｏｌ-７２３（日本油脂）、Ｎｅｗｃｏｌ−２６１４（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ−７１４（日本乳化剤）を挙げることができる。
【００３１】
HDL3以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル等の非イオン界面活性剤；ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物、アミドエーテルサルフェート及びポリオキシエチレン−ステアリルアミン等の陰イオン界面活性剤；ヤシ油脂肪酸―アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル−アミノ酢酸ベタイン及びラウリルベタイン等の両性界面活性剤；並びにラウリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン界面活性剤を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。より具体的には、非イオン界面活性剤としてはポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであるエマルゲンＡ５００（商品名、花王社製、以下、会社名は製造会社であり、会社名が併記されているものは全て商品名である）；陰イオンとしてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物であるプルロニックＦ１２７（旭電化）、プルロニックＦ６８（旭電化）プルロニックＰ１０３（旭電化）、アミドエーテルサルフェートであるサンアミドＣＦ−１０（日本油脂）、ポリオキシエチレン−ステアリルアミンであるナイミーンＳ２１０（日本油脂）；両性界面活性剤としてはヤシ油脂肪酸―アミドプロピルジメチル−アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＤＦ−ＳＦ（日本油脂）、アルキルジメチル−アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＦ（日本油脂）、ラウリルベタインであるアンヒトール２４Ｂ（花王）；陽イオン界面活性剤としては、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであるコータミン２４Ｐ（花王）、が挙げられる。これらは単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００３２】
HDL3以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤の濃度は、０．０１〜５.０重量％が好ましく、０．０３〜３．０重量％程度がより好ましい。
【００３３】
なお、第１工程に界面活性剤を共存させる場合でも、反応条件（反応温度、時間、緩衝液等）は上記の通りである。
【００３４】
続く第２工程では、反応系内に残存するコレステロールを定量する。これは、少なくともHDL3と反応する界面活性剤を反応させ、コレステロールを定量することにより行うことができる。「少なくともHDL3と反応する界面活性剤」には、HDL3と特異的に反応する界面活性剤、HDLと特異的に反応する（すなわち、HDL2とHDL3に反応する）界面活性剤及び全てのリポタンパク質に反応する界面活性剤が包含される。
【００３５】
第２工程に用いることができる界面活性剤としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル及びp-イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマー等の非イオン界面活性剤；ラウリルジメチル−アミノ酢酸ベタイン及びポリオキシエチレンラウリルエーテル等の両性界面活性剤；脂肪酸族リン酸エステル等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル及びポリオキシエチレンクミルフェニルエーテル等の、ＨＬＢが１１〜１４の間の非イオン界面活性剤；イミダゾリン型の両性界面活性剤；ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル及びポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等の非イオン界面活性剤；ラウリルアルコールアルコキシレート及びポリオキシエチレン−アルキルフェニルエーテル硫酸エステルナトリウム塩のような陰イオン界面活性剤を挙げることができる。これらは単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
【００３６】
より具体的には、ＨＤＬ３に特異的に反応する界面活性剤の例としては、非イオン界面活性剤として、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであるエマルゲンＡ９０（花王）、ポリオキシエチレンラウリルエーテルであるエマルゲン１２０（花王）、Ｐ−イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマーであるＴｒｉｔｏｎ−ＷＲ−１３３９（ナカライ）；両性界面活性剤として、ラウリルジメチル−アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＬ−ＳＦ（日本油脂）、ポリオキシエチレンラウリルエーテルであるパーソフトＮＫ−１００（日本油脂）；陽イオン界面活性剤として脂肪酸族リン酸エステルであるアデカコールＰＳ−４４０Ｅ（旭電化）が挙げられる。
【００３７】
ＨＤＬに特異的に反応する界面活性剤としては、ＨＬＢが１１〜１４の間の非イオン界面活性剤である、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンクミルフェニルエーテル、もしくは、両性界面活性剤のイミダゾリン型を用いることができる。具体的には、例えばエマルゲンＡ６０（花王）、エマルゲンＢ６６（花王）、エマルゲンＬＳ１１０（花王）、Ｎｅｗｃｏｌ−ＣＭＰ−１１（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ−７１０（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ−６１０（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ−２６０９（日本乳化剤）、ニッサンアノンＧＬＭ−Ｒ−ＬＶ（日本油脂）を使用することが可能である。
【００３８】
全てのリポ蛋白に特異的に反応する界面活性剤としては、非イオン界面活性剤としてポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルを使用することができる。陰イオン界面活性剤として、ラウリルアルコールアルコキシレート、ポリオキシエチレンーアルキルフェニルエーテル硫酸エステルナトリウム塩を使用することができる。具体的には、例えばエマルゲン７０７（花王）、エマルゲン９０９（花王）、エマルゲン１０８（花王）、ナイミーンＬ２０７（日本油脂）、アデカトールＬＢ８３（旭電化）、アデカトールＬＢ１０３（旭電化）、Ｎｅｗｃｏｌ−７０７（日本乳化剤）、を使用することが可能である。
【００３９】
第二工程における界面活性剤の濃度は０．０１〜５.０％（ｗ／ｖ）が好ましく、さらには０．０５〜２．０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００４０】
第２工程においては、これらの界面活性剤の反応によりコレステロールを定量する。なお、第１工程と第２工程では異なる界面活性剤を用いる。コレステロールの定量方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。例えば、リポ蛋白中のエステル型コレステロールにコレステロールエステラーゼを用いて加水分解し、遊離型コレステロールと脂肪酸が生じ、生じた遊離型コレステロールと元来リポ蛋白中に存在する遊離コレステロールとをコレステロールオキシダーゼを用いてコレステノンと過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下でキノン色素を形成させ定量する。キノン色素を発生させる化合物として、例えばＨＤＡＯＳ(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン）、ＤＡＯＳ(N-エチル-N(-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3, 5-ジメトキシアニリンナトリウム)又はＴＯＯＳ(N-エチル-N(-2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル)-3-メチルアニリンナトリウム二水和物）と４−アミノアンチピリンが挙げられるが、キノン色素を発生させることができる組み合わせであればこれらに限定されるものではない。第１工程でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合には、第２工程では、第１工程で用いたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼをそのまま用いることができ、新たに添加する必要はない。
【００４１】
キノン色素を発生させる化合物の濃度は、例えば、ＨＤＡＯＳであれば濃度は０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましく、４−アミノアンチピリンであれば０．１〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、また、ペルオキシダーゼの濃度は０．４〜５．０Ｕ／ｍＬが好ましい。また、第一工程で発生した過酸化水素をカタラーゼで分解する工程ではカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを使用し、第二工程の反応液中へ添加する。この場合のアジ化ナトリウムの濃度は、通常、０．１ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／Ｌ程度である。
【００４２】
第２工程の他の反応条件（反応温度、時間、緩衝液、ＰＨ等）は上記した第１工程の反応条件と同様でよい。
【００４３】
さらに、被検試料中のＨＤＬコレステロール量から第一工程と第二工程から得られたＨＤＬ３コレステロール量の差を算出し、被検試料中のＨＤＬ２コレステロール量を求めることも可能である。被検試料中のＨＤＬコレステロール量を求める方法は周知であり（例えば、特開2001-103998号公報）、そのためのキットも市販されているので、それらを用いて容易に定量することができる。
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
参考例１
以下の試薬組成の試薬Ａと試薬Ｂを調製し、試薬Ａに各種界面活性剤を０．１％（ｗ／ｖ）または１．０％（Ｗ／Ｖ）濃度添加した試薬をそれぞれ調製した。測定直前に各種界面活性剤入りの下記試薬Ａと試薬Ｂを１：３の割合で混合し、ＨＤＬ２分画とＨＤＬ３分画のコレステロールを反応させ、主波長７００ｎｍ、副波長６００ｎｍでの終吸光度を測定し比較した。【００４６】
ＨＤＬ２分画とＨＤＬ３分画は、以下の様にして画分した。ＨＤＬを含む被検試料、すなわち、血清に塩化ナトリウム及び臭化ナトリウムを用いた溶液を用いて、超遠心によりＨＤＬ２とＨＤＬ３との境目の比重(1.125)で別れるように画分し、それぞれの画分を回収した。【００４７】
下記表１には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が０．７５以下で、ＣＭ〜ＩＤＬ／ＨＤＬ３、ＬＤＬ／ＨＤＬ３が０．７５以下である界面活性剤を示し、これらをＨＤＬ３に反応する界面活性剤とする。表２には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が１．２５以上で、ＣＭ〜ＩＤＬ／ＨＤＬ２、ＬＤＬ／ＨＤＬ２の率が１．２５以上である界面活性剤を示し、これらをＨＤＬ３以外に反応する界面活性剤とする。表３には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が０．７５〜１．２５間で、ＣＭ〜ＩＤＬ/ＨＤＬ２、ＬＤＬ/ＨＤＬ２、ＣＭ〜ＩＤＬ／ＨＤＬ３、ＬＤＬ／ＨＤＬ３の率が０．７５以下である界面活性剤を示し、これらをＨＤＬに反応する界面活性剤とする。表４には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が０．７５〜１．２５間で、ＣＭ〜ＩＤＬ/ＨＤＬ２、ＬＤＬ/ＨＤＬ２、ＣＭ〜ＩＤＬ／ＨＤＬ３、ＬＤＬ／ＨＤＬ３の率が０．７５以上である界面活性剤を示し、これらを全てのリポ蛋白に反応する界面活性剤とする。表５には、上記にあてはまらない界面活性剤を示しこれらを、ＨＤＬ以外に反応する界面活性剤とする。【００４８】
試薬Ａ
ＢＥＳ緩衝液  (ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ【００４９】
試薬Ｂ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ６．６）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ０．１％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ  
ペルオキシダーゼ  ２．４Ｕ／ｍＬ【００５０】
【表１】
2012011554.tif 000003
（単位：Ａｂｓ×１００００）【００５１】
エマルゲンA90、エマルゲン120、ニッサンアノンBL-SF、Triton−WR-1339、パーソフトNK-100、アデカコールPS440EがHDL３に特異的に反応する界面活性剤であった。【００５２】
【表２】
2012011554.tif 000004
（単位：Ａｂｓ×１００００）【００５３】
エマルゲンA500、ニッサンアノンBDF-SF、ニッサンアノンBF、ナイミーンS210、プルロニックP103、コータミン24P、サンアミドCF-10、アンヒトール２４B、プルロニックF68、プルロニックF127がHDL３以外に反応する界面活性剤であった。【００５４】
【表３】
2012011554.tif 000005
（単位：Ａｂｓ×１００００）【００５５】
エマルゲンB66、エマルゲンA60、エマルゲンLS110、Nowol610、Newcol2609、Newcol-CMP-11、ニッサンアノンGLM−RLV、Newcol-710がHDLに特異に反応する界面活性剤であった。【００５６】
【表４】
2012011554.tif 000006
（単位：Ａｂｓ×１００００）【００５７】
エマルゲン108、エマルゲン707、Newcol707、アデカトールLB83、アデカトールLB103、エマルゲン909が全てのリポ蛋白に特異に反応する界面活性剤であった。【００５８】
【表５】
2012011554.tif 000007
（単位：Ａｂｓ×１００００）【００５９】
Newcol−714、Newcol-723、Newcol-2614、ナイミーンS215、プルロニックP123、レベノールWX、ナイミッドMT215、ノニオンHS220、プルロニックF88がHDL以外に特異に反応する界面活性剤であった。【００６０】
実施例１
超遠心を用いてＣＭ〜ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、参考例１で使用した試薬ＡにホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）を加えた試薬Ｅとを反応させ、さらに、下記試薬Ｄを添加し、測定を行なった。測定は、血清２μＬに試薬Ｅを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｄを添加しさらに５分加温反応させ、主波長７００ｎｍ、副波長６００ｎｍの吸光度を測定した。【００６１】
試薬Ｅ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ    ５．０Ｕ／ｍＬ【００６２】
試薬Ｄ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ６．６）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ０．１％
エマルゲンＢ６６  １．５％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ【００６３】
試薬Ｄが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図１に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応するのが見て取れる。【００６４】
実施例２
参考例１で使用した試薬Ａに界面活性剤とスフィンゴミエリナーゼを加えた試薬Ｆと、試薬Ｆを反応させた産物中のＨＤＬ３を測定する工程の試薬Ｇを以下の組成で調製し、超遠心を用いてＣＭ〜ＩＤＬ間の分画、ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、測定を行なった。試薬の測定手順は実施例１と同様に実施し、それぞれの測定時間における吸光度を測定した。【００６５】
試薬Ｆ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＦ６８  ０．０３ｗ／ｖ％
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ    ０．５Ｕ／ｍＬ【００６６】
試薬Ｇ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ６．６）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ０．１％
エマルゲンＡ９０  ２．０％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ【００６７】
試薬Ｇが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図２に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが見て取れる。【００６８】
実施例３
実施例２と同様の方法を用いて、実施例１で使用した試薬ＥのホスフォリパーゼをホスフォリパーゼＣに変更し界面活性剤を添加した試薬Ｈを用いて、吸光度を測定した。【００６９】
試薬Ｈ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＦ６８  ０．０３ｗ／ｖ％
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＣ    ５．０Ｕ／ｍＬ【００７０】
試薬Ｈが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図３に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが見て取れる。【００７１】
実施例４
実施例２と同様の方法を用いて、実施例３で使用した試薬ＨのホスフォリパーゼをホスフォリパーゼＤ（ＰＬＤＰ）に変更し界面活性剤を添加した試薬Ｉを用いて、吸光度を測定した。【００７２】
試薬Ｉ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＦ６８  ０．０３ｗ／ｖ％
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ    ５．０Ｕ／ｍＬ【００７３】
試薬Ｉが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図４に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが見て取れる。【００７４】
実施例５
実施例２と同様の方法を用いて、下記に記載の組成の試薬Ｊおよび試薬Ｋを用いて、吸光度を測定した。【００７５】
試薬Ｊ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＰ１０３  ０．０３ｗ／ｖ％
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ    ５．０Ｕ／ｍＬ【００７６】
試薬Ｋ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ６．６）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ０．１％
エマルゲン１２０  １．０％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ【００７７】
試薬Ｋが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図５に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが見て取れる。【００７８】
実施例６
実施例２と同様の方法を用いて、実施例５で使用した試薬Ｊと下記に記載の組成の試薬Ｌを用いて、吸光度を測定した。【００７９】
試薬Ｌ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ６．６）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
アジ化ナトリウム  ０．１％
エマルゲン９０９  １．０％
４−アミノアンチピリン  ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ    ２．４Ｕ／ｍＬ【００８０】
試薬Ｌが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図６に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが見て取れる。【００８１】
実施例７
以下の試薬Ｍを調製し、試薬Ｄと組み合わせることにより被検試料中のＨＤＬ−Ｃ（Ｃはコレステロール、以下同様）を測定し、その値から、実施例４の試薬Ｉ、試薬Ｄを使用しＨＤＬ３−Ｃを測定した値を除する事によりＨＤＬ２−Ｃを算出した。それぞれの検体のＨＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ３−Ｃ、ＨＤＬ２−Ｃ値を表６に示す。【００８２】
試薬Ｍ
ＢＥＳ緩衝液  （ｐＨ７．０）  １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＤＡＯＳ    ０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＰ８８  ０．１ｗ／ｖ％
カタラーゼ    ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ    １．４Ｕ／ｍＬ
コレステロールエステラーゼ    ０．８Ｕ／ｍＬ
ホスフォリパーゼＤ    ５．０Ｕ／ｍＬ【００８３】
【表６】
2012011554.tif 000008
（単位：ｍＡｂｓ）
【図１】
2012011554.tif 000009
【図２】
2012011554.tif 000010
【図３】
2012011554.tif 000011
【図４】
2012011554.tif 000012
【図５】
2012011554.tif 000013
【図６】
2012011554.tif 000014
【国際調査報告】
2012011554.tif 000015
2012011554.tif 000016
2012011554.tif 000017
2012011554.tif 000018