(57)【要約】  本発明は、求心性ニューロンの神経伝達またはシナプス伝達を阻害／サイレンシングする導入遺伝子を保持する転写カセットを保有するウイルス発現ベクターを含んでなる、ＮＤＯの処置のための方法および医薬組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）膀胱の求心性ニューロンにおいて選択的に活性な１つのプロモーター、
ｂ）前記プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含んでなる１つの転写カセット（ここで、前記ヌクレオチド配列は、転写された際にシナプス後細胞において神経伝達物質シグナルの伝達をサイレンシングまたは阻害する）、および
ｃ）前記転写カセットに作動可能に連結された、ＨＳＶ−１ゲノム由来のＬＴＥおよび／またはＤＮＡインスレーターとして知られるものなどの長期発現を付与する１つの配列
を少なくとも含んでなる、ウイルス発現ベクター。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、転写された際に、ＳＮＡＲＥ複合体および／もしくはリボソーム複合体を崩壊させることにより、並びに／またはＧＡＢＡ（Ａ）受容体を活性化することにより、並びに／または条件付きの標的化ニューロンアブレーションを誘導することにより、求心性ニューロンの神経伝達またはシナプス伝達をサイレンシングまたは阻害する、請求項１に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが、感覚神経受容器をコードする遺伝子のプロモーター、好ましくは、ＴＲＰ遺伝子ファミリーのプロモーター、より好ましくは、配列番号１のＴＲＰＶ１もしくは配列番号２のＴＲＰＭ８のプロモーター、または感覚神経調節物質もしくは感覚神経伝達物質をコードする遺伝子のプロモーター、優先的には、サブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、ＣＧＲＰ、ＡＤＶＬのプロモーター、より優先的には、配列番号３もしくは配列番号４のＣＧＲＰ、配列番号５もしくは配列番号６のＡＤＶＬのプロモーターから選択されるプロモーターである、請求項１または２に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項４】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、好ましくは、ＨＳＶ−１ベクターまたはＨＳＶ−２ベクター、より好ましくは、ＨＳＶに由来する欠陥型ウイルスベクター、例えば、組換えＨＳＶベクターまたはアンプリコンＨＳＶベクターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項５】
前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンから選択される少なくとも１つのタンパク質の合成を阻害する非コードヌクレオチド配列へと転写される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項６】
前記非コードヌクレオチド配列が、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、小ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、優先的には、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）から選択される、請求項５に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項７】
前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、ＳＮＡＲＥ複合体を崩壊させる野生型もしくは改変型細菌神経毒もしくはその活性フラグメント、または野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質もしくはその活性フラグメント、または野生型もしくは改変型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）もしくはその活性フラグメント、または野生型もしくは改変型ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）もしくはその活性フラグメントをコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項８】
前記の野生型または改変型細菌神経毒の活性フラグメントが前記細菌神経毒の軽鎖である、請求項７に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項９】
前記細菌神経毒が任意の血清型のボツリヌス菌の神経毒または破傷風菌の破傷風神経毒である、請求項７または８に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１０】
改変型細菌神経毒、並びに配列番号２８のシンタキシン１ａ（ＢｏＮＴＡ−ＳＴＸ）または配列番号３０の（ＢｏＮＴＢ−ＳＴＸ）のシグナルペプチドと配列番号３２のＶＡＭＰ２（ＢｏＮＴＣ−ＶＡＭＰ）のシグナルペプチドとの間で選択されるシグナルペプチドドメインを含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１１】
ａ）破傷風菌もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒、またはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｂ）転写物がタンパク質ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／もしくはシンタキシンの合成を阻害する１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｃ）野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｄ）野生型もしくは改変型ＲＩＰまたはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｅ）野生型もしくは改変型ＮＴＲまたはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列
を少なくとも含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１２】
ｉ．１つの前記長期発現配列が請求項１に記載の２つの転写カセットに作動可能に連結されているか；または
ｉｉ．２つの長期発現配列が両方とも請求項１に記載の１つの前記転写カセットに作動可能に連結され；かつ
ａ）請求項１に記載の１つの転写カセットが請求項７〜１０のいずれか一項に記載のコードヌクレオチド配列を保持し、請求項１に記載の第２の転写カセットが請求項５または６に記載の非コードヌクレオチドへと転写されるヌクレオチド配列を保持するか；あるいは
ｂ）請求項１に記載の両方の転写カセットが請求項５または６に記載の非コードヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を保持するか；あるいは
ｃ）請求項１に記載の両方の転写カセットが破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒もしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質もしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＲＩＰもしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＮＴＲもしくはその活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を保持する、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクター。
【請求項１３】
薬剤として使用するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のウイルス発現ベクターを含んでなる組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのウイルス発現ベクターを含んでなる医薬組成物。
【請求項１５】
神経因性排尿筋過活動の処置に同時、個別または交互使用するための、
ａ）請求項５もしくは６に定義される少なくとも１つのウイルス発現ベクター；および／または
ｂ）請求項７〜１０のいずれか一項に定義される少なくとも１つのウイルス発現ベクター；および／または
ｃ）請求項１１もしくは１２に定義される少なくとも１つのウイルス発現ベクター
を含んでなる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
神経因性排尿筋過活動の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのウイルス発現ベクターを含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つのウイルス発現ベクターまたは請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物と、尿が流れるようにする尿道括約筋弛緩の間隔で持続的な排尿筋収縮を達成するために間欠刺激パルス列を印加するための、Ｓ２−Ｓ３−Ｓ４などの仙骨前根に移植される電極を含んでなる電気刺激系とを含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経因性排尿筋過活動（ＮＤＯ）の処置のための遺伝子療法戦略として、膀胱の求心性神経を選択的に調整またはサイレンシングするウイルス発現ベクターおよびその医薬組成物を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
特に、本発明は、下部尿路の２つの機能的単位：（１）貯蔵器（膀胱）および（２）膀胱頸部、尿道、および外尿道括約筋（ＥＵＳ）の横紋筋からなる排出口の活動に依存する蓄尿および排尿の制御の分野に関する（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。これらの構造は、遠心性末梢神経の３つのセット：仙骨副交感神経（骨盤神経）、胸骨交感神経性（下腹神経および腰仙交感神経鎖）、および左右対称に分布する体性神経（陰部神経）により制御される（ｄｅ  Ｇｒｏａｔ  １９８６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）。これらの神経は、胸骨および仙髄レベルで始まる遠心性軸策からなる。副交感神経遠心性神経は、膀胱を収縮し、尿道を弛緩させる。交感神経遠心性神経は、膀胱を弛緩させ、尿道を収縮する。体性遠心性神経は、ＥＵＳを収縮する。これらの神経はまた、下部尿路から腰仙髄に情報を伝達する求心性ニューロンも含む。ヒト下部尿路の求心性ニューロンの細胞体は、Ｓ２−Ｓ４およびＴ１１−Ｌ２後根神経節（ＤＲＧ）に位置する。膀胱充満感は骨盤および下腹神経によって脊髄に伝達され、一方、膀胱頸部および尿道からの感覚入力は、陰部および下腹神経において運ばれる。
【０００３】
同様の分節機構が非ヒト霊長類、ネコおよびイヌに見られる。ラットでは、骨盤、陰部および下腹神経の求心性ニューロンの細胞体は、それぞれＬ６−Ｓ１およびＴ１１−Ｌ２  ＤＲＧに位置する。下部尿路機能を制御する神経経路は、膀胱と尿道口の間の相互関係を維持する単純なオン・オフスイッチ回路として組織化されている。蓄尿反射は膀胱充満中に活性化され、主として脊髄において組織化され、一方、排尿は、脳において組織化されている反射機構によって媒介される（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。膀胱充満中、排尿筋の副交感神経支配は阻害され、尿道括約筋の平滑部分および横紋部分が活性化され、不随意の排尿を防いでいる。このプロセスは、ひとまとめに「防衛反射」として知られる尿道反射によって組織化されている。それらは骨盤神経を介して伝達される膀胱の求心性活動により活性化され、脊髄のニューロン間回路構成により組織化されている（Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。
【０００４】
ＮＤＯは、脳血管疾患もしくは脳梗塞などの神経疾患；外傷、多発性硬化症、パーキンソン病、先天性奇形、例えば、二分脊椎症による脳もしくは脊髄損傷；または例えば中枢神経系の遺伝性痙性対麻痺、末梢神経障害、および種々の精髄病変、すなわち、椎骨骨折、頸椎および腰椎脊椎症、変形性脊椎症、脊椎すべり症、脊柱管狭窄症、椎間板ヘルニアなどによる脊髄圧迫および損傷などの疾患を有する患者において異常な膀胱機能が見られる病態を指す。
【０００５】
ＮＤＯは、充満相中の不随意の排尿筋（膀胱）収縮を特徴とし、自発性であるか、または関連の神経病態により誘発され得る。ＮＤＯは、膀胱括約筋筋失調に関連する場合が多い。
【０００６】
脊髄損傷（ＳＣＩ）によるＮＤＯは、最も重篤な形態のＮＤＯである。ＳＣＩの直後には、２〜１２週間持続する脊髄ショック期間があり、その間、膀胱は無反射となり、完全尿閉が説明できる。その後、脊髄排尿反射が段階的に進行し、これがＮＤＯの原因となる。ＳＣＩ患者については、これらの障害が尿失禁をもたらし、膀胱圧を高め、処置しなければ、これが上部尿路を傷害し、腎不全を促す。尿失禁は、多大な負担を伴い、生活の質を深刻に損なう。ＳＣＩ患者では、不完全な排尿による再発性尿路感染および腎不全がそれぞれ再入院の第一の原因および死亡率の第二の原因となり続ける。ＳＣＩは、排尿の随意的制御並びに膀胱および括約筋機能を統合する通常の反射経路を乱す。上仙骨性の(suprasacra)脊髄病変では、ＮＤＯは、膀胱求心性侵害受容性Ｃ線維により媒介される仙髄レベルでの分節反射がマスキングされない結果である（ｄｅ  ＧｒｏａｔおよびＹｏｓｈｉｍｕｒａ、２００６）。これらのサイレントＣ繊維は機械刺激感受性となり、ＳＣＩ後に自動排尿反射を誘発する。この反射は、上脊髄性制御の消失の後に促進される。膀胱求心性神経には可塑性が見られ、イオンチャネルの特性および求心性ニューロンの電気的興奮性の変化と関連し、脊髄および末梢標的器官において放出される神経栄養因子により部分的に媒介されると思われる。全体的に見れば、ＮＤＯの神経生物学的基質は、膀胱尿路上皮および尿路上皮下に機能的変化、並びに膀胱を起点とする脊髄への求心性感覚メッセージの増大を含む。無髄Ｃ型膀胱求心性ニューロンの肥厚および活動亢進から生じる求心性膀胱刺激の激化が、ＳＣＩ対象におけるＮＤＯの主要な発症機序である。
【０００７】
ＮＤＯの処置のための標準治療は、遠心性神経伝達を排尿筋レベルで阻害することからなる。よって、ＮＤＯ患者は、現在、ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性を遮断し、それにより、排尿筋収縮を阻害する抗ムスカリン作用薬、および／またはこの場合もまた膀胱遠心性に作用することにより排尿筋収縮を遮断するためのボツリヌス菌(Clostridium botulinum)神経毒Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）の反復的排尿筋内注射によって処置されている。両処置とも、間欠的膀胱カテーテル留置と組み合わせなければならない（５〜６回／日）。
【０００８】
ＢｏＮＴ−Ａ注射は、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を抑制して、神経伝達物質が充填された小胞と遠心性ニューロンの原形質膜との融合およびエキソサイトーシスの際のそれらの放出を遮断する。よって、ＢｏＮＴ−Ａの注射は、神経因性の、またはそうではない過活動膀胱を有する患者を治療するための投薬として使用される。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０３４８３およびＷＯ２０１０／０２２９７９は、種々の泌尿器障害の処置を目的として神経がその標的組織、例えば、筋肉、腺、または別の神経を刺激しないようにするためのＢｏＮＴ−Ａ注射の使用を開示している。
【０００９】
ＷＯ２０１３／１８０７９９は、改変型ボツリヌス菌神経毒をコードし、それにより、そのヒト受容体に対する結合特性が改善されたタンパク質を生産するウイルスベクターの使用を開示している。細胞株での生産の後、ひと度回収して上清から精製すれば、この神経毒は、ＮＤＯなどの望まないニューロン活性に関連する病態を処置するために局所適用することができる。しかしながら、これらのベクターは遺伝子療法アプローチには都合のよいものではない。
【００１０】
やはり、ボツリヌス菌神経毒の注射は毒素拡散の不都合を示し、これは大方は身体の他の領域への毒素の拡散によるものである。これらの有害作用は、眼瞼下垂および複視などの一過性の重篤でない事象から生命を脅かす事象、さらには死までに及ぶ。加えて、ＮＤＯに関しては、これらの注射は、経時的に有効性が低下するために平均６か月ごとに繰り返さなければならない。
【００１１】
上仙骨脊髄病変により引き起こされる、膀胱括約筋筋失調を伴うまたは伴わないＮＤＯは、膀胱求心性神経（ａδおよびｃ繊維）により媒介される異常な反射の出現によるものであり、ＮＤＯの処置の別のアプローチがＢｒｉｎｄｌｅｙ（Ｂｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  １９８６）によって開発された。このアプローチは、後仙骨神経根切断術と仙骨前根刺激（ＳＡＲＳ）を組み合わせたものである。この処置は、完全な上仙骨脊髄病変により引き起こされるＮＤＯに最も有効な治療法の１つであると思われており、仙骨神経根切断術は、恒久的に、膀胱のコンプライアンスを増し、排尿筋の活動亢進および排尿筋括約筋筋失調を排除し（これらは腎不全および尿失禁の主原因である）、一方、前脊髄根の刺激剤の移植は、患者の排尿誘発および制御を可能とする。
【００１２】
後仙骨神経根切断術による求心路遮断は、Ｂｒｉｎｄｌｅｙ（１９８６）により報告されているように、排尿筋筋肉からの感覚入力を提供するものを含む、脊髄Ｓ２−Ｓ４分節に対する総ての求心性神経線維の完全な外科的切断からなる。このように、排尿筋からの感覚刺激はもはや中枢神経系には達することができず、結果として、不制御の膀胱収縮を引き起こす、中枢神経系により生成される反射活動が阻害できる。この手順は、尿筋の激化した反射活動を妨げ、低い膀胱圧でより多量の尿を貯蓄可能とするために必要である。しかしながら、後仙骨神経根切断術（Ｓ２−Ｓ４）による広範囲の非選択的、不可逆的骨盤−会陰求心路遮断から得られる膀胱求心路遮断は、存在する場合には残存する骨盤−会陰感覚の喪失、存在する場合にはオルガスム、存在する場合には反射勃起および射精、並びに存在する場合には反射排尿および排便の障害、並びにおそらくは皮膚感覚神経支配の喪失による褥瘡の助長の原因となるので、多くの落とし穴および欠点を持つ。加えて、この規模の脳神経学的手順は高額なものとなり、脳脊髄液瘻の、長期的にはシャルコー脊椎関節症の原因となり得る。
【発明の概要】
【００１３】
結論として、上脊髄病変の場合のＮＤＯを処置するための、膀胱遠心性ニューロンを温存しつつ、同じ神経に伝達を行う他の求心ニューロンには影響を及ぼさずに、その病態生理学、すなわち、膀胱求心神経により媒介される異常な脊髄反射を特異的に標的とする、新たな戦略の必要がある。本発明者らが提案する戦略は、仙骨前根刺激と組み合わせた場合にＮＤＯ患者の自制と排尿を回復させるための選択的分子膀胱求心路遮断をもたらす遺伝子療法アプローチである。これは、
・求心ニューロンの神経伝達またはシナプス伝達を阻害／サイレンシングする能力；
・特に膀胱の求心ニューロンに対する高い選択性；
・高い有効性；
・経時的な発現の安定性；および
・標的外除神経の不在
を呈する治療用導入遺伝子を送達することができるウイルス発現ベクターを必要とする新たな戦略によって達成された。
【００１４】
本発明に関して、本発明者らは、驚くことに、ＮＤＯを処置するために経時的にタンパク質および／または転写物を安定発現するウイルス発現ベクターを用いると、膀胱求心ニューロンの神経伝達またはシナプス伝達を脊髄レベルで特異的に阻害／サイレンシングすることにより、膀胱壁にウイルス発現ベクターを注射した後に、膀胱の求心ニューロンにおいて選択的かつ安定な導入遺伝子発現を得ることが可能であることを見出した。
【００１５】
本発明は、求心ニューロンの神経伝達またはシナプス伝達を阻害／サイレンシングする導入遺伝子を保持する転写カセットを保有するウイルス発現ベクターを含んでなる、ＮＤＯの処置のための方法および医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明による方法および医薬組成物は、転写された際に膀胱求心ニューロンの神経伝達またはシナプス伝達を阻害／サイレンシングする、ＳＮＡＲＥ複合体および／もしくはリボゾーム複合体を崩壊させ、かつ／またはＧＡＢＡ（Ａ）受容体を活性化し、かつ／または条件付き標的化ニューロンアブレーションを誘導する導入遺伝子を保持する転写カセットを保有するウイルス発現ベクターを含んでなる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用語「転写カセット」は、本明細書で使用する場合、プロモーターおよび下流コード配列または導入遺伝子を含むいずれの核酸配列も指し、その発現は該プロモーターにより駆動され、その後にポリアデニル化シグナルが続く。用語「導入遺伝子」は、核酸配列が導入される細胞内で発現されるＲＮＡおよび／またはポリペプチドもしくはポリペプチドの一部をコードする特定の核酸配列を指す。用語「導入遺伝子」は、（１）その細胞に本来見られない核酸配列（すなわち、異種核酸配列）；（２）それが導入された細胞に本来見られる核酸配列の変異型である核酸配列；（３）それが導入された細胞に本来存在する同じ（すなわち、相同）もしくは類似の核酸配列のさらなるコピーを付加する働きをする核酸配列；または（４）それが導入された細胞に発現が誘導されるサイレントな天然または相同核酸配列を含む。「変異型」とは、野生型または天然配列とは異なる１以上のヌクレオチドを含む核酸配列を意味し、すなわち、変異型核酸配列は、１以上のヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を含む。場合によっては、導入遺伝子はまた、導入遺伝子産物が細胞から分泌されるように、リーダーペプチドまたはシグナル配列をコードする配列を含んでもよく、または導入遺伝子は、導入遺伝子が細胞膜に係留されて留まるように、リーダーペプチドまたはシグナル配列と膜係留ペプチドの両方を含むか、もしくはさらには２つの天然タンパク質もしくはそれらの一部の間の融合タンパク質であってもよい。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「リボゾーム複合体」は、翻訳と呼ばれるタンパク質の合成を触媒する８０Ｓおよび７０Ｓサブユニットなどのリボソームのサブユニットから本質的に構成される複合体を指す。
【００１８】
よって、第１の態様において、本発明は、
ａ）膀胱の求心性ニューロンにおいて選択的に活性な１つのプロモーター、
ｂ）前記プロモーターに機能的に連結されたヌクレオチド配列を含んでなる１つの転写カセット、ここで、前記ヌクレオチド配列は、転写された際にシナプス後細胞において神経伝達物質シグナルの伝達をサイレンシングまたは阻害する、および
ｃ）前記転写カセットに機能的に連結された、ＨＳＶ−１ゲノム由来のＬＴＥ（Ｌｏｋｅｎｓｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）として知られるものおよび／またはＤＮＡインスレーターを含有するものなどの長期発現を付与する１つの配列
を少なくとも含んでなる、ウイルス発現ベクターを提供する。
【００１９】
好ましい実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターのヌクレオチド配列は、転写または翻訳された際に、ＳＮＡＲＥ複合体および／もしくはリボソーム複合体を崩壊させることにより、並びに／またはＧＡＢＡ（Ａ）受容体を活性化することにより、並びに／または条件付き標的化ニューロンアブレーションを誘導することによって神経伝達またはシナプス伝達をサイレンシングまたは阻害する。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターのヌクレオチド配列は、転写された際に、ＳＮＡＲＥ複合体の一部であるＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５もしくはシンタキシン１ａから選択されるタンパク質のうち少なくとも１つを崩壊させるか、またはタンパク質ＧＡＤ６７もしくはその活性フラグメントをコードするか、またはリボソーム複合体を崩壊させるタンパク質もしくはその活性フラグメントをコードするか、または条件付き標的化ニューロンアブレーションを誘導するタンパク質もしくはその活性フラグメントをコードする。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明による、リボソーム複合体を崩壊させる該タンパク質は、野生型または改変型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）またはその活性フラグメントであり、優先的には、前記ＲＩＰは、１型または２型のＲＩＰから選択され、優先的には、１型のＲＩＰは、サポリン、ゲロニン、ジアンチン、トリコサンチンから選択され、２型のＲＩＰは、リシン、ボルケンシンおよびアブリンから選択され、より優先的には、前記１型のＲＩＰは、サポリンＳ６またはその活性フラグメントである。
【００２２】
用語「条件付き標的化ニューロンアブレーションを誘導するタンパク質」は、標的とされる細胞種、すなわち、膀胱の求心ニューロンの細胞特異的アブレーションを提供する、メトロニダゾール（ＭＴＺ）などの無害のプロドラッグ基質を細胞傷害性ＤＮＡ架橋剤に変換するタンパク質に関する。条件付き標的化ニューロンアブレーションを誘導するこのようなタンパク質の例は、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）である。
【００２３】
よって、本発明による条件付き標的化ニューロンアブレーションを誘導するタンパク質は、野生型もしくは改変型ＮＴＲまたはその活性フラグメントからなる群から選択される。優先的には、前記ＮＴＲは、野生型もしくは改変型酸素不感受性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼまたはその活性フラグメントからなる群から選択され、より優先的には、前記ＮＴＲは、野生型または改変型大腸菌(E. coli)ニトロレダクターゼからなる群から選択され、いっそうより優先的には、前記ＮＴＲは、野生型もしくは改変型大腸菌ｎｆｎＢまたはその活性フラグメントである。
【００２４】
用語「ウイルスベクター」または「ウイルス発現ベクター」は、本明細書で使用する場合、ウイルスゲノムの少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルス粒子にパッケージングされ得る核酸ベクターを指す。本発明に関して、用語「ウイルスベクター」は、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）並びにその生成されたウイルス粒子を含むと広く理解されなければならない。本発明によれば、ウイルス発現ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、好ましくは、ＨＳＶ−１ベクターまたはＨＳＶ−２ベクター、いっそうより好ましくは、ＨＳＶ−１に由来する欠陥型ウイルスベクターである。本明細書で使用する場合、用語「欠陥型ウイルスベクター」は、ウイルス生活環を首尾良く完了するために必要な遺伝子または遺伝子の一部を欠いているウイルスベクターを指すものとする。
【００２５】
本発明によれば、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスそれ自体、または組換えＡＡＶベクター粒子を含むその誘導体を指す。さらに、本明細書で使用する場合、用語「ＡＡＶ」は、ヒトおよび非ヒト霊長類両方のサンプルから単離された多くの異なる血清型を含む。好ましいＡＡＶ血清型は、ヒト血清型、より好ましくは、血清型２、５および９のヒトＡＡＶ、最も好ましくは、最高レベルの向神経性を示す血清型である血清型５のヒトＡＡＶである。
【００２６】
本発明によれば、用語「ＨＳＶに由来する欠陥型ウイルスベクター」は、欠陥型組換えＨＳＶベクターおよびアンプリコンＨＳＶベクターの両方を指す。用語「欠陥型組換えＨＳＶ」は、本明細書で使用する場合、ヘルパー非依存性ベクターを表し、そのゲノムは、ＩＣＰ４およびＩＣＰ２７として知られる２つの必須タンパク質をコードする遺伝子の完全欠失を少なくとも含む。ＩＣＰ４遺伝子は、ウイルスゲノムのｃおよびｃ’として知られる逆向きの反復配列で存在する２コピーで存在し、この遺伝子の両方のコピーが欠失される。ＩＣＰ２７をコードする遺伝子は、ウイルスゲノムのユニークロング（ＵＬ）配列内に位置する。優先的には、本発明によるヘルパー非依存性ベクターは、ＬＡＴ（潜伏関連転写物(Latency Associated Transcript)）遺伝子座に埋め込まれた治療転写カセットを保有し（Ｂｅｒｔｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００およびＢｅｒｔｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）、この遺伝子座は、ウイルスゲノムのｂおよびｂ’として知られる逆向きの反復配列で含まれる反復遺伝子座である。より優先的には、この転写カセットは、潜伏関連プロモーター(Latency Associated Promoter)（ＬＡＰ）と長期発現(Long-Term Expression)（ＬＴＥ）領域の間（部位１）か、またはＬＴＥ領域とＬＴＥの下流にあるＤＮＡインスレーター（ＩＮＳ）配列の間（部位２）に位置する（図１に示される通り）。本発明による欠陥型組換えＨＳＶ−１ベクターは、神経伝達を阻害／サイレンシングするために上記の種々の導入遺伝子を発現する、すなわち、野生型もしくは改変型軽鎖ボツリヌス菌毒素、および／またはアンチセンスＲＮＡ（ＡＳ−ＲＮＡ）標的化ＳＮＡＲＥタンパク質、および／またはＧＡＤ６７、および／またはＲＩＰ、およびまたはＮＴＲを発現する転写カセットを保有し、これらの遺伝子は総て、本発明に記載されるように長期ＤＲＧ特異的プロモーターにより駆動される。ウイルスゲノムのｂおよびｂ’配列は、それぞれＴＲＬ（ターミナルリピートＬ(Terminal Repeat L)およびＩＲＬ（インターナルリピートＬ(Internal Repeat L)）としても知られ、一方、ｃ’およびｃ配列は、ＩＲＳ（インターナルリピートＳ(Internal Repeat S））およびＴＲＳ（ターミナルリピートＳ(Terminal Repeat S））としても知られ、ここで、ＬおよびＳはそれぞれＨＳＶ−１ゲノムのユニークロング（Ｌ）およびユニークショート（Ｓ）配列を指す。さらに、本発明によるヘルパー非依存性ベクターは、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５５、ＵＬ５６、およびＵＬ４１タンパク質などの非必須タンパク質をコードする遺伝子におけるさらなる欠失を含んでなり得る。これらの欠陥型ＨＳＶベクターは、タンパク質ＩＣＰ４およびＩＣＰ２７を同時に発現する細胞株において増幅される（Ｍａｒｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ，２０１０）。
【００２７】
ＷＯ２００６／０５０２１１は、疼痛の遺伝子療法のための欠陥型ＨＳＶ−１ベクターの使用を開示する。
【００２８】
しかしながら、本発明によるベクターは、ＷＯ２００６／０５０２１１に記載のベクターとは、本発明によるベクターの有用性および有効性に関して重要ないくつかの重要な点で異なる。本発明による最も重要なトランスジェニック転写カセットはＬＡＴ遺伝子座に導入され、それはこの領域が本発明による転写カセット内の導入遺伝子発現を駆動するＤＲＧ特異的プロモーターに長期発現を付与するＬＴＥおよびＤＮＡインスレーター配列（ＩＮＳ）の両方を含むからであり、一方、ＷＯ２００６／０５０２１１に記載のベクターは短期作用のために考案および証明され、従って、それらの転写カセットは遍在性プロモーターにより駆動され、ＬＡＴ領域には導入されなかった。
【００２９】
「アンプリコンまたはアンプリコンベクター」とは、ヘルパー依存性ベクターを意味し、そのゲノムはウイルスタンパク質をコードするほとんどのまたは総てのＨＳＶ遺伝子を欠く。アンプリコンベクターのゲノムは、対象とするトランスジェニックＤＮＡ（すなわち、転写カセット）に加え、ＨＳＶ−１ゲノム由来の１つのＤＮＡ複製起点と１つのパッケージングシグナルを保有し、アンプリコンプラスミドとして知られるプラスミドのタンデムの複数コピーから構成されるコンカテマーＤＮＡである。本発明によるアンプリコンプラスミドは、神経伝達を阻害／サイレンシングするために上記の種々の導入遺伝子を発現する、すなわち、野生型もしくは改変型軽鎖ボツリヌス菌毒素、および／または干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）標的化ＳＮＡＲＥタンパク質、および／またはＧＡＤ６７、および／またはＲＩＰ、および／またはＮＴＲを発現する転写カセットを保有し、これらの化合物は総て、本発明に記載されるように長期プロモーター、優先的には長期ＤＲＧ特異的プロモーターにより駆動される（図２参照）。
【００３０】
好ましい実施形態では、本発明によるベクターは、必須タンパク質ＩＣＰ４およびＩＣＰ２７をコードする遺伝子を少なくとも欠いている欠陥型組換えベクター、優先的には、ＩＣＰ４およびＩＣＰ２７の両方を欠いているベクターである。このベクターは、ＩＣＰ３４．５、ＵＬ５５、ＵＬ５６および／またはＵＬ４１遺伝子タンパク質などの非必須タンパク質をコードする他の遺伝子を欠くことでき、ベクターゲノムのＬＡＴ領域に埋め込まれた図７に記載のＤＲＧ特異的転写カセットを保有する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明によるベクターは、本明細書の他の部分に記載されるように、長期ＤＲＧ特異的プロモーターにより駆動される上記の転写カセットを保有するアンプリコンベクターである。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明による転写カセットは、ＬＡＴ遺伝子座に導入される。
【００３３】
「組換えＤＮＡ」という表現は、本明細書で使用する場合、その起源または操作のために、それが本来会合しているポリヌクレオチドの全体または一部と会合していない、核酸分子、すなわち、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、および／または合成起源のポリヌクレオチドを表す。用語「組換え」は、ウイルスに関して使用する場合、組換えゲノム、または突然変異、欠失もしくは遺伝子を含む１以上の異種ポリヌクレオチドを導入するように操作されたゲノムを保有するウイルスを意味する。用語「組換え」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換え核酸の発現により産生されるポリペプチドを意味する。用語「組換え」は、宿主細胞に関して使用される場合、宿主細胞または細胞内に、そのゲノム内に挿入される組換えＤＮＡを含む組換えＤＮＡを保有する組換えベクターを意味する。用語「感染」は、ウイルスベクターの、宿主細胞または対象に侵入する能力を指す。
【００３４】
ＨＳＶに由来する欠陥型ベクターは、隣接する感覚ニューロンに感染し、感染の部位に応じて三叉神経節または後根神経節（ＤＲＧ）に位置する、これらのニューロンの核内で潜伏感染を確立することができる。特に、ＨＳＶ−１は、天然に感覚ニューロンに感染し、これらのニューロンの核内で終生の潜伏感染を確立する。従って、膀胱壁に注射した後、ＨＳＶ−１に由来するベクターなどのベクターは、適切な膀胱求心ニューロン特異的プロモーターがそれらの発現を駆動する限り、それらが治療用導入遺伝子を安定発現する場所から膀胱を神経支配する感覚ＤＲＧに到達すると仮定することができる。しかしながら、ＨＳＶ−１もまた自律神経ニューロンに感染し、潜伏感染を確立することができ（Ｆｕｒｕｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９７８）、予備的結果は、ベクターが膀胱に接種される場合、これが実際にそうであることを証明する。従って、これらのニューロン（すなわち、求心ニューロン）でのみ有意な導入遺伝子発現を得る、従って、遠心性とも呼ばれる自律神経ニューロンにおける発現を回避するためには、ベクターからの発現が、選択的プロモーターまたは選択的求心ニューロン特異的プロモーターとも呼ばれる求心性特異的プロモーターにより完全に制御されることが必須である。膀胱求心ニューロンの選択的分子または生化学的（手術とは対照的な）求心路遮断は、存在する場合には残存する骨盤−会陰感覚、存在する場合にはオルガスム、存在する場合には反射勃起および射精、並びに存在する場合には反射排尿および排便を温存することが重要であるので本発明の最も重要な側面であり、これらは総て、膀胱に起源しない骨盤の知覚神経により伝達される。さらに、選択的膀胱求心路遮断は、膀胱遠心性ニューロンを温存することも可能とし、これをその後、例えば電極を介した電気刺激によって刺激することができる。いくつかの研究が、転写カセットが一過性プロモーター（Ｍｉｙａｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）または長期プロモーター（Ｐｕｓｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍｉｙａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；ＷＯ２０１５／００９９５２Ａ１）のいずれかを含んでなるＨＳＶ−１に基づくベクターの使用を記載している。しかしながら、Ｐｕｓｃｏｖｉｃ（ＬＡＰ２）、Ｍｉｙａｚａｔｏ（ＨＣＭＶプロモーター）およびＭｉｙａｇａｗａ（人工ＣＡＧプロモーター）の研究に使用されたプロモーターは非選択性であり、自律神経ニューロン、脳ニューロン、および非神経細胞を含む多くの細胞種にそれらの導入遺伝子の発現をもたらす。対照的に、ウイルス調節配列と求心ニューロン特異的細胞プロモーターを組み合わせることにより、本発明によるベクターのいくつかは、対象とする導入遺伝子の有意により高い求心ニューロン特異的発現を可能とする（図１３参照）。
【００３５】
本発明の実施において使用されるベクターは、ＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド（通常にはＤＮＡ）に機能的に連結された、求心ニューロンにおいて選択的に活性な少なくとも１つのプロモーターを含む。「機能的に連結される」とは、本明細書では、ベクター内で、プロモーターがＲＮＡをコードするヌクレオチドと、そのプロモーターがそれらのヌクレオチドからのＲＮＡの転写（すなわち、発現）を駆動できるように会合されることを意味する。例えばＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写がよく理解されている。
【００３６】
「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、機能的に連結された下流（３’配向）配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明の目的で、プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで対象とする遺伝子の転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを少なくとも含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、並びにＲＮＡポリメラーゼ結合ドメインがある。真核生物プロモーターは、常にではないが多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス、およびその他のＤＮＡモチーフ、例えば、「ＣＡＴ」または「ＳＰ１」ボックスを含む。本発明によるプロモーターは、特定の関連遺伝子産物をコードするメッセンジャーの開始部位の少なくとも２ｋｂ、好ましくは３ｋｂ、より好ましくは４ｋｂ上流から始まるＤＮＡ配列を含んでなる。これらの配列は好ましくは、既知のプロモーターの配列エレメント、例えば、特異的転写結合部位、およびさらなる調節エレメントを含む遺伝子の上流の遠位配列を含む。
【００３７】
「求心ニューロンにおいて選択的に活性な」とは、本明細書では、プロモーターが主としてまたは唯一求心ニューロン、好ましくは、膀胱の求心ニューロンで活性であり、そのＲＮＡの転写（すなわち、発現）を駆動することを意味する。
【００３８】
また、当業者は、多くのこのような哺乳動物求心ニューロン特異的プロモーターが既知であり、さらなる求心ニューロン特異的プロモーターが発見され続けていることを認識するであろう。このような総ての求心ニューロン特異的プロモーターが本発明により包含される。しかしながら、多くの細胞特異的プロモーター候補は、それらが細胞染色体内のそれらの内的位置から発現する場合にのみ選択性を示すことが示されている（ＭｃＣａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｖａｓｓａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ＨＳＶベクターなどの非組込み型発現ベクターのゲノムに導入された場合にこれらのプロモーターがどのように持たれるのかを予測する方法はない。特に、求心ニューロン特異的プロモーターは同じ求心ニューロン特異的活性を保持するかどうかは予想できない。これは、（ａ）プロモーターに結合されたヌクレオソームは、そのプロモーターの位置に応じて（染色体内か、染色体外ベクターゲノム内か、またはさらには細胞染色体内の異なる位置と位置の間か）、いくつかの点で異なる可能性がある（例えば、それらは抑制的構成または許容的構成であり得る）、およびまた（ｂ）正または負の転写因子の接近性も異なる可能性があるという両方の理由による。これは、本発明者らが実験的に行ったところ（実施例１１および図１３の結果を参照）、総てのプロモーター候補が、それがベクターゲノム中に置かれた場合にその求心ニューロン特異的活性を保持するか否かを確定するために、それぞれの特定の状況（すなわち、エピソームベクターか染色体内の位置か）で徹底的に検討されなばければならなかったことを意味する。
【００３９】
好ましい実施形態では、本発明によるプロモーターは、一過性受容器電位バニロイド(Transient Receptor Potential Vanilloid)（ＴＲＰＶ１）もしくは一過性受容器電位チャネル(Transient Receptor Potential cation channel)サブファミリーＭメンバー８（ＴＲＰＭ８）などの感覚神経受容器をコードする遺伝子のプロモーター、またはサブスタンスＰ、ＰＡＣＡＰ、配列番号３もしくは配列番号４のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(Calcitonin Gene Related Peptide)（ＣＧＲＰ）のプロモーターなどの、感覚神経調節物質もしくは感覚神経伝達物質をコードする遺伝子のプロモーターから選択される。優先的には、本発明による感覚神経受容器をコードする遺伝子のプロモーターは、ＴＲＰ遺伝子ファミリーのプロモーター、より優先的には、配列番号１のプロモーターＴＲＰＶ１または配列番号２のＴＲＰＭ８である。優先的には、本発明による感覚神経調節物質または感覚神経伝達物質をコードする遺伝子のプロモーターは、配列番号３もしくは配列番号４のＣＧＲＰ、または感覚ニューロンにおける神経突起成長およびストレス応答に関与する遺伝子のプロモーター、好ましくは、配列番号５または配列番号６のアドビリン（ＡＤＶＬ）をコードする遺伝子のプロモーターである。
【００４０】
本発明のウイルス発現ベクターは、より詳しくは、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、霊長類およびヒトに向けられる。よって、当業者は、このようなプロモーターは種に特異的であり、対象とする特定の種の相同配列を選択可能であることを認識するであろう。特に、本発明によるプロモーターは、とりわけ配列番号１のラットＴＲＰＶ１のヒトホモログ、または配列番号２のヒトＴＲＰＭ８、または配列番号３のラットＣＧＲＰ、または配列番号４のヒトＣＧＲＰ、または配列番号５のラットアドビリン、または配列番号６のヒトアドビリンである。
【００４１】
「長期発現配列」または「長期発現エレメント（ＬＴＥ）」とは、ウイルス発現ベクターの配列に含まれ、１５〜４５日または３０〜４５日、好ましくは４５〜９０日、より好ましくは９０〜３６５日、いっそうより好ましくは３６５日〜数年を超えて、またはいっそうより好ましくは患者の寿命の間、遺伝子産物の発現を持続することを可能とする転写カセットに機能的に連結されたヌクレオチド配列を意味する。
【００４２】
長期発現（ＬＴＥ）配列は、ＨＳＶ−１において、ＬＡＴ関連プロモーター（ＬＡＰ）に起源する潜伏関連転写物（ＬＡＴ）の領域として同定された。このＬＴＥは、ＬＡＴ転写開始部位の下流に位置する。実際に、ＬＡＴプロモーターの３’のＤＮＡフラグメントを保持するウイルスは、潜伏中に検出可能なプロモーター発現を維持した（Ｌｏｋｅｎｓｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｂｅｒｔｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，２００１）。好ましくは、ＬＴＥは、ＬＡＴ転写開始部位の下流約１．５ｋｂ〜約３ｋｂに含まれる（Ｐｅｒｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。より最近では、ＤＮＡインスレーターとして知られるさらなる配列も、ＬＴＥ領域の上流および下流の両方に記載されている（Ａｍｅｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの配列はまた、おそらくエピジェネティックサイレンシングを阻害することによって所与の転写カセットへの長期発現の提供に寄与し、これもまた転写カセットに長期発現を付与するためにＬＴＥエレメントの一部として本発明に組み込まれよう。興味深いことに、転写カセットに長期発現を付与する配列（ＬＴＥ配列とＤＮＡインスレーター配列の両方）は、転写カセットの上流および／または下流のいずれに配置することもできる。
【００４３】
当業者は、他のＬＴＥ様配列、並びに他のＤＮＡインスレーター配列も記載されており、発見され続けていることを認識するであろう。このような総てのＬＴＥ様配列およびＤＮＡインスレーター配列が本発明により包含される。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明のウイルス発現ベクターは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシン（これらはＳＮＡＲＥ複合体の一部である）から選択される少なくとも１つのタンパク質の合成を阻害する非コードヌクレオチド配列へと転写される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる。
【００４５】
ＳＮＡＲＥ複合体（可溶性Ｎ−エチルマレイミド感受性因子結合タンパク質受容体(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)）は、ＳＭ（Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８）タンパク質との膜融合機構の２つの重要な成分のうちの一方である。ＳＮＡＲＥ複合体は、種々の融合事象を媒介するために集合して複合体となる、小胞関連「ｖ−ＳＮＡＲＥ」（小胞関連膜タンパク質(Vesicle Associated Membrane Protein)、ＶＡＭＰ、特に、ＶＡＭＰ１、２および３）および標的膜結合性(target membrane-associated)「ｔ−ＳＮＡＲＥ」シンタキシン（Ｓｙｎ−１、２、３、および４）および２５ｋＤａのシナプトソーム関連タンパク質(Synaptosome-Associated Protein)（ＳＮＡＰ−２５）を含んでなる。
【００４６】
よって、本発明の１つの実施形態は、特定の遺伝子をサイレンシングすること、および／または対応するコードタンパク質（「対象とする遺伝子」または「標的とされる遺伝子」または「選択される遺伝子」）を破壊することができる方法を対象とする。遺伝子を「サイレンシングする」とは、本発明者らは、その伝子産物の発現が、サイレンシングされない対応する対照遺伝子に比べて低減または排除されることを意味する。当業者は、対照と試験の結果を用いて得られた結果を比較する概念に精通している。理論に縛られるものではないが、サイレンシングは、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または任意の他の形態の干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）などの非コード相補配列が細胞に発現した後の、特定のｍＲＮＡ分解またはｍＲＮＡ翻訳遮断を特徴とすると考えられる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「アンチセンス」は、一般に比較的短く、細胞内に存在する標的の全プールの中でユニークな配列とハイブリダイズすることができる非修飾型または化学修飾型の一本鎖核酸分子に関し、前記核酸分子の配列は、ワトソン・クリックの塩基対ハイブリダイゼーションにより特定のｍＲＮＡと相補的であり、前記ｍＲＮＡの発現を阻害し、次いで、ＤＮＡからタンパク質への遺伝情報の伝達の遮断を誘導することができる。
【００４８】
本発明に関して、「ＲＮＡ干渉」（以下、ＲＮＡｉと呼称）は、所与のセンス核酸配列を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、前記核酸配列に特異的な様式で、前記核酸配列を含んでなる総てのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解をもたらすプロセスとして解釈される。ＲＮＡｉプロセスは、最初にカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)で証明されたが、現在では、ＲＮＡｉプロセスは極めて一般的な現象であることが明らかであり、ＲＮＡｉによるヒト遺伝子の阻害が達成されている。
【００４９】
ＲＮＡｉのプロセスは、低分子干渉ＲＮＡ（またはｓｉＲＮＡ）を用いて達成することができる。これらのｓｉＲＮＡは、それらのセンス配列に、標的ｍＲＮＡのフラグメントと相補性の高い配列を含んでなる、３０ヌクレオチド長未満ｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡが原形質膜を渡ると、細胞の反応は、ｓｉＲＮＡおよび相補の高い配列を含んでなる総ての配列を破壊することである。よって、ｓｉＲＮＡ配列と相補性の高いフラグメントを有するｍＲＮＡは破壊され、従って、この遺伝子の発現は阻害される。
【００５０】
ｓｈＲＮＡはもまた本発明による阻害剤として使用可能である。本明細書で使用する場合、「ｓｈＲＮＡ分子」は従来のステム−ループｓｈＲＮＡを含み、これは前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を形成する。「ｓｈＲＮＡ」はまた、マイクロ−ＲＮＡに埋め込まれたｓｈＲＮＡ（ｍｉＲＮＡに基づくｓｈＲＮＡ）を含み、この場合、ｍｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖とパッセンジャー鎖が既存の（もしくは天然の）ｍｉＲＮＡに、または修飾または合成（設計）ｍｉＲＮＡに組み込まれている。転写された際に、従来のｓｈＲＮＡ形態は、プライマリーｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）または天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに極めて類似した構造を形成する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、次に、Ｄｒｏｓｈａおよびその補因子によりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。よって、用語「ｓｈＲＮＡ」は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ｍｉｒ）分子およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ分子を含む。
【００５１】
一般に、「低減または排除」は、遺伝子産物の検出可能な量を少なくとも約１０％〜約１００％、または好ましくは少なくとも約２５％〜１００％、またはより好ましくは約５０％〜約１００％、最も好ましくは約７５％〜約１００％の範囲の量まで低減または排除することを指す。要すれば、低減または排除は、当業者に周知のいくつかの方法のいずれによって決定してもよく、サイレンシグされる遺伝子に応じて場合により異なり得る。例えば、遺伝子の発現のこのような低減または排除は、遺伝子産物の定量（例えば、生産されるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの量を決定することによる）または遺伝子産物の活性の定量（例えば、シグナル伝達もしくは輸送活性などの活性、細胞の構造成分としての活性、酵素活性などの活性など）により、または対照細胞と比較した場合の標的とされる細胞の表現型の特徴の観察および定量（例えば、特異的抗体を用いたタンパク質の存在および不在）によって決定することができる。標的とされる遺伝子がサイレンシングされたかどうかを決定するためのいずれの好適な手段も使用可能である。
【００５２】
一つの実施形態では、本発明による非コードヌクレオチド配列は、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンから選択される少なくとも１つのタンパク質の合成を阻害する、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または任意の他の干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）から選択される。
【００５３】
一つの実施形態では、ウイルス発現ベクターは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンの合成を阻害するａｓＲＮＡへと転写される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる。特に、本発明に関して使用されるａｓＲＮＡの配列は、配列番号７のＶＡＭＰ２アンチセンス、配列番号８のＳＮＡＰ２５アンチセンスおよび配列番号９のシンタキシンアンチセンスである。
【００５４】
特定の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンの合成を阻害するｓｈＲＮＡへと転写される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる。
【００５５】
別の実施形態では、ウイルス発現ベクターは、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンの合成を阻害するｍｉＲＮＡへと転写される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる。
【００５６】
本発明の構築物によりコードされるＲＮＡ分子は、それが転写される細胞内で、最終的に二本鎖ＲＮＡ分子を形成する。一般に、二本鎖ＲＮＡ構造の一本鎖は、約１０〜約３０リボヌクレオチド長、好ましくは約１９〜約２５リボヌクレオチド長の範囲である。ａｓＲＮＡの場合、二本鎖ＲＮＡ構造の一方は、約１００〜数百リボヌクレオチド長の範囲である。それは実際に標的ｍＲＮＡと同様の長さであってもよい。当業者は、このような二本鎖ＲＮＡを形成するためのいくつかの実行可能な方法が存在することを認識するであろう。
【００５７】
さらに、同じ求心ニューロン特異的プロモーターを有するが異なるサイレンシングＲＮＡをコードしている複数のウイルスベクターの提供が、本発明の実施の範囲内で使用可能である。
【００５８】
さらに、単一のウイルスベクター内で、単一の求心ニューロン特異的プロモーターにより、またはタンデムに配置された１を超えるプロモーター（例えば、２以上のプロモーター）により駆動される１を超えるサイレンシングＲＮＡを発現させることも可能なはずである。よって、本発明は、１を超える遺伝子をサイレンシングするために単一のウイルスベクターを使用することを企図する。
【００５９】
別の実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターは、ＳＮＡＲＥ複合体もしくはリボソーム複合体を崩壊させる野生型もしくは改変型毒素またはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる。
【００６０】
有利には、毒素の活性フラグメントは細菌神経毒であり、優先的には、前記細菌神経毒は、前記細菌神経毒の軽鎖である。特に、本発明に関して使用される毒素軽鎖の配列は、配列番号１０（コードヌクレオチド配列は配列番号１１）のボツリヌス菌神経毒Ａ（ＢｏＮＴ−Ａ）タンパク質配列軽鎖、配列番号１２（コードヌクレオチド配列は配列番号１３）のボツリヌス菌神経毒Ｂ（ＢｏＮＴ−Ｂ）のタンパク質配列軽鎖、配列番号１４（コードヌクレオチド配列は配列番号１５）のボツリヌス菌神経毒Ｃ１（ＢｏＮＴ−Ｃ１）のタンパク質配列軽鎖、配列番号１６（コードヌクレオチド配列は配列番号１７）のボツリヌス菌神経毒Ｅ３（ＢｏＮＴ−Ｅ３）のタンパク質配列軽鎖、配列番号１８（コードヌクレオチド配列は配列番号１９）おのボツリヌス菌神経毒Ｆ１（ＢｏＮＴ−Ｆ１）のタンパク質配列軽鎖よび配列番号２０（コードヌクレオチド配列は配列番号２１）の破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）のタンパク質配列軽鎖である。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターは、野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、優先的には、配列番号２２（コードヌクレオチド配列は配列番号２３）の野生型ＧＡＤ６７タンパク質またはその活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなる。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターは、野生型もしくは改変型ＲＩＰまたはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなり、優先的には、前記ＲＩＰは、配列番号２４（コードヌクレオチド配列は配列番号２５）のサポリンＳ６タンパク質またはその活性フラグメントである。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターは、野生型もしくは改変型ＮＴＲまたはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなり、優先的には、前記ＮＴＲは、配列番号２６（コードヌクレオチド配列は配列番号２７）のニトロレダクターゼｎｆｎＢタンパク質またはその活性フラグメントである。
【００６４】
本明細書で使用する場合、用語「コード配列」は、翻訳された際に対象とするポリペプチドを産生するリボ核酸（例えば、ＲＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列によって、または全長もしくはフラグメントの所望の活性もしくは機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、そのコード配列のいずれか一部によってコードされてよい。
【００６５】
一つの実施形態では、本発明は、任意の血清型のボツリヌス菌の野生型もしくは改変型ボツリヌス菌神経毒またはその活性フラグメント、好ましくは、任意の血清型のボツリヌス菌神経毒の軽鎖をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなるウイルス発現ベクターに関する。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、破傷風菌(Clostridium tetani)の野生型もしくは改変型破傷風神経毒またはその活性フラグメント、好ましくは、破傷風菌神経毒の軽鎖をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなるウイルス発現ベクターを対象とする。
【００６７】
クロストリジウム神経毒は、クロストリジウム属の様々な種、例えば、いくつかの系統のボツリヌス菌および破傷風菌により産生される。クロストリジウム毒素分子がニューロンに入ると、軽鎖がシナプス前神経終末に位置するＳＮＡＲＥ複合体を形成するタンパク質を破壊する。これは神経伝達物質が充填されたシナプス小胞のシナプス前膜への結合を妨げ、従って、シナプス前神経終末からの神経伝達物質のエキソサイトーシスを阻害する。現在のところ、８種の異なるクラスの神経毒が知られている：その血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧにおける破傷風菌毒素およびボツリヌス菌神経毒、これらは総て相同性と類似の分子構造を共有する。前記血清型の中で、サブタイプＡ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３などのサブタイプも十分に記載されている。
【００６８】
ボツリヌス菌神経毒血清型Ａ、Ｃ、およびＥは、シナプス前神経終末の原形質膜に位置するＳＮＡＰ−２５タンパク質を切断する。ＳＮＡＰ−２５は、神経伝達物質が充填された小胞と原形質膜との融合およびエキソサイトーシスの際のそれらの放出に必要であるので、その切断は、体性および自律神経シナプス前神経終末における小胞の神経伝達物質放出の特異性の高い遮断を引き起こす。ボツリヌス菌神経毒血清型Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧは、シナプトブレビン（ＶＡＭＰ）タンパク質を切断し、その結果、小胞は細胞膜に結合することができない。ＳＮＡＰ２５およびシンタキシン１ａの両方を切断するボツリヌス菌神経毒Ｃまたはその軽鎖フラグメント以外、各ボツリヌス菌神経毒またはその軽鎖フラグメントはＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。好ましくは、本発明によれば、ボツリヌス菌神経毒の血清型はＡ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦである。
【００６９】
クロストリジウム神経毒の構造は十分に記載されており（Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８６；Ｓｕｇｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  １９８０）；これらの文献のそれぞれはその全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。これに関して、クロストリジウム神経毒は、ジスルフィド結合によって相互に連結されたおよそ１００ｋＤａの分子量を有する重鎖（Ｈ鎖）とおよそ５０ｋＤａの分子量を有する軽鎖（Ｌ鎖）の２つのポリペプチド鎖を含んでなる。
【００７０】
ボツリヌス菌毒素の異なる血清型は、それらが影響を及ぼす動物種並びにそれらが引き起こす麻痺の重篤度および持続期間が異なる。例えば、マウスでＬＤ５０により測定した場合、ボツリヌス菌毒素Ａ型はボツリヌス菌毒素Ｂ型の５００倍の効力であると決定された。加えて、ボツリヌス菌毒素Ｂ型は、ボツリヌス菌毒素Ａ型の霊長類ＬＤ５０の約１２倍である４８０Ｕ／ｋｇの用量で霊長類において非毒性であると決定された。本来、ボツリヌス菌毒素は高い親和性でニューロンに結合し、ニューロン中へ移行し、神経伝達物質の放出を遮断する。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明は、タンパク質ＶＡＭＰ−２を切断するために、破傷風菌の野生型もしくは改変型破傷風神経毒またはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなるウイルス発現ベクターを対象とする。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明は、タンパク質ＶＡＭＰ−２を切断するために、血清型Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧのボツリヌス菌の野生型もしくは改変型ボツリヌス菌神経毒またはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなるウイルス発現ベクターを対象とする。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明は、タンパク質ＳＮＡＰ−２５を切断するために、血清型ＡおよびＥのボツリヌス菌の野生型もしくは改変型ボツリヌス菌神経毒またはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなるウイルス発現ベクターを対象とする。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明は、タンパク質ＳＮＡＰ２５およびシンタキシン１ａを切断するために、血清型Ｃのボツリヌス菌の野生型もしくは改変型ボツリヌス菌神経毒またはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなるウイルス発現ベクターを対象とする。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明による導入遺伝子のヌクレオチド配列は、シナプス後細胞において神経伝達物質シグナルの伝達をサイレンシングまたは阻害する野生型もしくは改変型タンパク質をコードし、これがシグナルペプチドドメインと融合される。本発明によるシグナルペプチドは、シナプス後細胞において神経伝達物質シグナルの伝達をサイレンシングまたは阻害するために標的とされる転写物またはタンパク質が位置する細胞内コンパートメントに応じて選択される。よって、当業者は、このようなシグナルペプチドが細胞内コンパートメントに特異的であること、および本発明に従い、神経伝達またはシナプス伝達をサイレンシングまたは阻害するタンパク質をコードするヌクレオチド配列と融合させる適当な対応するヌクレオチド配列を選択することを可能とすることを認識するであろう。特に、本発明によるシグナルペプチドは、ＶＡＭＰ２またはシンタキシン１ａから選択されるタンパク質の管腔、膜貫通または細胞質ドメインを少なくとも含んでなる。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明による融合タンパク質は、管腔、膜貫通または細胞質シグナルペプチドドメイン、優先的には、ＳＮＡＲＥタンパク質、サブスタンスＰまたはＣＧＲＰ配列の管腔、膜貫通または細胞質シグナルペプチドドメインから選択されるシグナルペプチドドメインを含んでなる。このようなシグナルペプチドドメインには、特に、配列番号３０（コードヌクレオチド配列は配列番号３１）のシンタキシン１ａのシグナルペプチド（ＢｏＮＴＢ−ＳＴＸ）および配列番号３２（コードヌクレオチド配列は配列番号３３）のＶＡＭＰ２のシグナルペプチド（ＢｏＮＴＣ−ＶＡＭＰ）が含まれる。よって、本発明の特定の実施形態によれば、融合タンパク質は、例えば改変型ボツリヌス菌神経毒などの改変型細菌神経毒と、例えば配列番号２８のシンタキシン１ａのシグナルペプチド（ＢｏＮＴＡ−ＳＴＸ）または配列番号３０（コードヌクレオチド配列は配列番号３１）の（ＢｏＮＴＢ−ＳＴＸ）および配列番号３２（コードヌクレオチド配列は配列番号３３）のＶＡＭＰ２のシグナルペプチド（ＢｏＮＴＣ−ＶＡＭＰ）などのシグナルペプチドを含んでなる。
【００７７】
一つの特定の実施形態では、本発明による融合タンパク質は、シンタキシン１ａのシグナルペプチドと連結された、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥまたはＦの野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒を含んでなり、優先的には、融合タンパク質は、配列番号２８（コードヌクレオチド配列は配列番号２９）のシンタキシン１ａのシグナルペプチドと連結された血清型Ａの野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴＡ−ＳＴＸ）を含んでなるか、または融合タンパク質は、配列番号３０（コードヌクレオチド配列は配列番号３１）のシンタキシン１ａのシグナルペプチドと連結された血清型Ｂの野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴＢ−ＳＴＸ）を含んでなる。
【００７８】
一つの特定の実施形態では、本発明による融合タンパク質は、ＶＡＭＰ２のシグナルペプチドに連結された血清型Ａ、ＣおよびＥの野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒を含んでなり、優先的には、融合タンパク質は、配列番号３２（コードヌクレオチド配列は配列番号３３）のＶＡＭＰ２のシグナルペプチドに連結された血清型Ｃの野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒（ＢｏＮＴＣ−ＶＡＭＰ）を含んでなる。
【００７９】
一つの特定の実施形態では、本発明による融合タンパク質は、サブスタンスＰのシグナルペプチドに連結された任意の血清型の野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒を含んでなる。
【００８０】
一つの特定の実施形態では、本発明による融合タンパク質は、ＣＧＲＰ配列のシグナルペプチドに連結された任意の血清型の野生型または改変型ボツリヌス菌神経毒を含んでなる。
【００８１】
本発明はまた、
ａ）破傷風菌もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒またはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｂ）転写物がタンパク質ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンの合成を阻害する１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｃ）野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質またはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｄ）野生型もしくは改変型ＲＩＰまたはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｅ）野生型もしくは改変型ＮＴＲまたはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列
を少なくとも含んでなる、本発明によるウイルス発現ベクターを対象とする。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明によるウイルス発現ベクターは、
ｉ．２つの本発明による転写カセットに機能的に連結された１つの前記長期発現配列；または
ｉｉ．両方が１つの本発明による前記転写カセットに機能的に連結された２つの長期発現配列
を含んでなり、かつ、
ａ）１つの本発明による転写カセットが、本発明によるコード配列を保持し、本発明による第２の転写カセットが、本発明による非コードヌクレオチドへと転写される配列を保持するか；あるいは
ｂ）両方の本発明による転写カセットが、本発明による非コードヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を保持するか；あるいは
ｃ）両方の本発明による転写カセットが、破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒もしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質もしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＲＩＰもしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＮＴＲもしくはその活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を保持する。
【００８３】
特定の実施形態では、本発明は、
ｉ．１つの前記長期発現（ＬＴＥ）配列が、２つの本発明によるトランスジェニック転写カセットに機能的に連結されているか；または
ｉｉ．２つの分離した長期発現（ＬＴＥ）配列が、１つの本発明による前記転写カセットにそれぞれ機能的に連結され；かつ
ａ）１つの本発明による転写カセットが、本発明による細菌神経毒、ＧＡＤ６７、ＲＩＰ、またはＮＴＲをコードする配列を保持し、本発明による第２のトランスジェニック転写カセットが、タンパク質ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンの合成を阻害する本発明による非コードヌクレオチド配列へと転写される配列を保持するか；あるいは
ｂ）両方の本発明による転写カセットが、ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンから選択される少なくとも１つのタンパク質の合成を阻害する本発明による非コードヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を保持するか；あるいは
ｃ）両方の本発明によるトランスジェニック転写カセットが、プロモーターと、破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒もしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＧＡＤ６７タンパク質もしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＲＩＰもしくはその活性フラグメント；または野生型もしくは改変型ＮＴＲもしくはその活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列とを保持する、
ウイルス発現ベクターに関する。
【００８４】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち少なくとも１つがプロモーターと、野生型タンパク質ＧＡＤ６７またはその活性フラグメントをコードする配列とを保持する、ウイルス発現ベクターに関する。
【００８５】
より好ましい実施形態では、本発明は、本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち１つが、プロモーターと、野生型タンパク質ＧＡＤ６７またはその活性フラグメントをコードする配列とを保持し、かつ、本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち１つが、プロモーターと、破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒またはその活性フラグメントをコードする配列とを保持する、ウイルス発現ベクターに関する。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち少なくとも１つが、プロモーターと、野生型ＲＩＰまたはその活性フラグメントをコードする配列とを保持する、ウイルス発現ベクターに関する。
【００８７】
より好ましい実施形態では、本発明は、本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち１つが、プロモーターと、野生型ＲＩＰまたはその活性フラグメントをコードする配列とを保持し；かつ、本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち１つが、プロモーター、破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒もしくはその活性フラグメントをコードする配列；並びに／または野生型タンパク質ＧＡＤ６７もしくはその活性フラグメントをコードする配列、並びに／または野生型ＮＴＲもしくはその活性フラグメントをコードする配列を保持する、ウイルス発現ベクターに関する。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明によるトランスジェニック転写カセットのうち少なくとも１つが、プロモーターと、野生型ＮＴＲまたはその活性フラグメントをコードする配列とを含んでなる、ウイルス発現ベクターに関する。
【００８９】
より好ましい実施形態では、本発明は、前記ウイルス発現ベクターが、少なくとも２つのトランスジェニック転写カセットを含んでなり、
本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち少なくとも１つが、プロモーターと、野生型ＮＴＲまたはその活性フラグメントをコードする配列とを含んでなり；かつ
本発明による前記トランスジェニック転写カセットのうち少なくとも１つが、プロモーター、破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒もしくはその活性フラグメントをコードする配列；並びに／または野生型タンパク質ＧＡＤ６７もしくはその活性フラグメントをコードする配列；並びに／または野生型ＲＩＰもしくはその活性フラグメントをコードする配列を含んでなる、ウイルス発現ベクターに関する。
【００９０】
第２の態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明のウイルス発現ベクターを含んでなる組成物に関する。
【００９１】
第３の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明によるウイルス発現ベクターを含んでなる医薬組成物を対象とする。
【００９２】
有利には、本発明による医薬組成物はＮＤＯの処置のために使用される。
【００９３】
本発明はまた、ＮＤＯを処置するために同時、個別または交互使用するための、
ａ）ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５およびシンタキシンから選択される少なくとも１つのタンパク質の合成を阻害するために、好ましくは、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される非コードヌクレオチド配列、より好ましくは、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）へと転写される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１つのウイルス発現ベクター；並びに／あるいは
ｂ）ＳＮＡＲＥ複合体を崩壊させる野生型もしくは改変型細菌神経毒またはその活性フラグメント、好ましくは、細菌神経毒の軽鎖をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１つのウイルス発現ベクター、ここで、前記細菌神経毒は有利には、任意の血清型の、好ましくは、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦの破傷風菌および／またはボツリヌス菌の神経毒である；並びに／あるいは
ｃ）下記のものを少なくとも含んでなる少なくとも１つのウイルス発現ベクター：
・破傷風菌もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒またはその活性フラグメントをコードする１つのヌクレオチド配列、および
・転写物がタンパク質ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／またはシンタキシンの合成を阻害する１つのヌクレオチド配列；並びに／あるいは
ｄ）下記の通りである、少なくとも１つの本発明によるウイルス発現ベクター：
ｉ．１つの前記長期発現（ＬＴＥ）配列が、２つの本発明によるトランスジェニック転写カセットに機能的に連結されているか；または
ｉｉ．２つの長期発現（ＬＴＥ）配列が、１つの本発明による前記トランスジェニック転写カセットにそれぞれ機能的に連結され；かつ、
・１つの本発明によるトランスジェニック転写カセットがプロモーターと前記神経毒をコードする配列とを保持し、本発明による第２のトランスジェニック転写カセットがプロモーターとタンパク質ＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／もしくはシンタキシンの合成を阻害する配列ヌクレオチドとを保持するか；または
・両方の本発明によるトランスジェニック転写カセットがプロモーターとＶＡＭＰ、ＳＮＡＰ−２５および／もしくはシンタキシンから選択される少なくとも１つのタンパク質の合成を阻害する非コードヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列とを保持するか；または
・両方の本発明によるトランスジェニック転写カセットが、破傷風菌および／もしくはボツリヌスの野生型もしくは改変型神経毒またはその活性フラグメントをコードするヌクレオチド配列を保持する、
を含んでなる医薬組成物に関する。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、野生型タンパク質ＧＡＤ６７および／もしくはＲＩＰおよび／もしくはＮＴＲまたはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１つのウイルス発現ベクターをさらに含んでなる。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、野生型タンパク質ＧＡＤ６７もしくはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列；並びに／または破傷風菌および／もしくはボツリヌス菌の野生型もしくは改変型神経毒もしくはその活性フラグメント；並びに／または野生型ＲＩＰもしくはその活性フラグメント；並びに／または野生型ＮＴＲもしくはその活性フラグメントをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１つのウイルス発現ベクターを含んでなる。
【００９６】
第４の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明によるウイルス発現ベクターもしくは医薬組成物、または本発明による医薬組成物と、尿が流れるようにする尿道括約筋弛緩の間隔で持続的な排尿筋収縮を達成するために間欠刺激パルス列を印加するための、Ｓ２−Ｓ３−Ｓ４などの仙骨前根に移植される電極を含んでなる電気刺激系とを含んでなるキットに関する。
【００９７】
「電気刺激」とは、電極を介して数秒より長いギャップで離された数秒のバーストで電気刺激を印加し、バースト間に外尿道括約筋を急速に弛緩させてこれらのギャップ中に尿を流出させつつ、膀胱内の圧力を維持することを意味する。好ましい電気刺激系は、Ｆｉｎｅｔｅｃｈ−Ｂｒｉｎｄｌｅｙスティミュレーター（Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５の６  ａ  １９参照）。
【００９８】
本発明は、さらに、
ａ）少なくとも１つの本発明によるウイルス発現ベクターを作製する工程；
ｂ）工程ａ）のウイルス発現ベクターを膀胱壁（排尿筋）に注射する工程；
ｃ）数秒より長いギャップで離された数秒のバーストでの刺激により、バースト間に外尿道括約筋を急速に弛緩させて尿を流出させつつ膀胱内に持続的圧力を誘発するために、Ｓ２−Ｓ４またはＳ３−Ｓ４などの仙骨前根に移植した電極を介する電気刺激系を移植する工程
を含んでなる、ＮＤＯを患う患者の処置方法に関する。
【００９９】
以下の例は単に本発明を説明することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】組換え欠陥型ＨＳＶ−１ベクターのゲノム。  （Ａ）：図の上の部分は、本発明において使用されるＨＳＶ−１ゲノムの骨格を示す。ＨＳＶ−１ゲノムは、ユニークロング（ＵＬ）およびユニークショート（ＵＳ）として知られる２つのユニークな領域を含み、それぞれにターミナルリピートＬ／インバーテッドリピートＬ（ＴＲＬ／ＩＲＬ）およびインバーテッドリピートＳ／ターミナルリピートＳ（ＩＲＳ／ＴＲＳ）として知られる反復逆向き配列が隣接している。ＴＲＬ／ＩＲＬはａｂ／ｂ’ａ’とも呼称され、ＩＲＳ／ＴＲＳはａ’ｃ’／ｃａとも呼称される。よって、ゲノムは直接の繰り返し配列「ａ」で始まり、また終わる。ＵＬ内の黒い四角は、必須ＩＣＰ２７タンパク質をコードする遺伝子が、本発明において使用されるベクターでは欠失されていることを示す。同様に、ＩＲＳ／ＴＲＳリピート内の２つの黒い四角は、必須ＩＣＰ４タンパク質をコードする２つの遺伝子も欠失されていることを示す。ＵＬ内の白い丸、並びにＩＲＳおよびＴＲＳ領域内の２つの白い丸は、ＨＳＶ−１のＤＮＡ複製の起点を示す（それぞれＯｒｉＬおよび２コピーのＯｒｉＳ）。ＵＬ４１、ＵＬ５５およびＵＬ５６などの非必須タンパク質をコードする他の遺伝子もまた欠失させることができる。さらに、ＩＲＳおよびＴＲＳに位置する両コピーのＩＥ４／５プロモーターは、これらのプロモーターが初期動態で（野生型ウイルスゲノムの場合のような前初期動態ではなく）発現するように改変されている（１つのＴＡＡＴＧＡラット配列の欠失）。  （Ｂ）：図の中段の部分は、ウイルスゲノムのｂ’ａ’ａ’ｃ’領域の詳細を示し、特に、潜伏関連転写物（ＬＡＴ）を発現する遺伝子を含む、ＩＲＬ領域のＬＡＴ遺伝子座の局在を示す。  （ＣおよびＣ’）：図の下の部分は、治療用ＤＲＧ特異的転写カセット（図では矢印で表示される導入遺伝子として示される）を保持する、ＬＡＴ遺伝子座の５’部分の詳細な構造を示す。この遺伝子座は、上流ＤＮＡインスレーター（ＩＮＳ）配列、潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、長期発現付与領域（ＬＴＥ）および下流ＤＮＡインスレーター（ＩＮＳ）を含む。治療用ＤＲＧ特異的転写カセットは、ＬＡＰとＬＴＥの間（Ｃの部位１）かまたはＬＴＥと第２のＤＮＡインスレーターの間（Ｃ’の部位２）のいずれかに導入される。ＬＡＴ近傍の他の遺伝子もＢに示される（矢印）。組換えベクターを作製するためにＬＡＴ領域に導入される種々のＤＲＧ特異的転写カセットを図３に示す。領域ｂ’ａ’ａ’ｃ’は逆向きのｃａａｂ領域と同一であり、ウイルスゲノムが感染の開始時に細胞核で環状化するようになると形成することが強調されるべきである。このことは、ＩＣＰ４の両方のコピーが欠失されること、およびＬＡＴ遺伝子座の両方のコピーにトランスジェニック転写カセットが導入できることを意味する。
【図２】アンプリコンベクター（アンプリコンプラスミド）のゲノム  アンプリコンプラスミドは、一般に以下の３つのモジュールを保有する標準的な大腸菌プラスミドである：（１）細菌内でのプラスミド複製のためのＣｏｌ  Ｅ１配列と、抗生物質、一般にアンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子とを含む細菌モジュール（黒）。（２）ＤＮＡ複製のＨＳＶ−１起点、一般に、ＯｒｉＳ（Ｏ）と、コンカテマー型のアンプリコンプラスミドの増幅およびパッケージングを可能とするパッケージングシグナル（ａ）とを含むアンプリコンモジュール（桃色）；加えて、このモジュールは一般に、ＨＳＶ−１前初期プロモーターＩＥ４／５により駆動されるリポータータンパク質（本発明者らの場合では、ＧＦＰタンパク質または融合ＧＦＰ／ウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）タンパク質のいずれか）を発現する。（３）第３のモジュール（白）は、本発明に記載されるように、感覚ニューロンにおいて安定かつ選択的神経伝達を阻害またはサイレンシングするように設計された、ＬＴＥ配列とＩＮＳ配列の間に置かれた、ＤＲＧ特異的転写カセット（灰色の矢印で表示される導入遺伝子）を含む転写単位である。アンプリコンベクターを作製するためにアンプリコンプラスミドに導入される種々の転写カセットを図３に示す。
【図３】Ａ．この図は、２つの真核生物転写カセットを保有する、本発明において使用されるアンプリコンベクターのゲノムの領域を示す。それらのうち１つは、ＨＳＶ−１のＩＥ４／５前初期プロモーターの制御下でリポーターＧＦＰ（または融合ＧＦＰ−ｒＬｕｃ）遺伝子を発現する。第２の転写カセットは、本発明に記載されるように、神経伝達を阻害またはサイレンシングする治療的機能のいずれかを発現する。ＤＲＧ特異的プロモーターは転写カセットの発現を駆動し、一方、カセット全体の前後には長期発現付与配列（黒い四角）がある。Ｂ．この図は、遺伝子構築体の有効性および選択性を証明するためにこの試験で使用される転写カセットのいくつかを示す。これらは、ベクターＡＨＣＭＶ−ＴｅＮＴ軽鎖、（ＬＣ）；ベクターＢ：ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）；ベクターＣ：ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）；ベクターＤ：ＳＮＡＰ２５アンチセンスＲＮＡ；ベクターＥ：ＨＣＭＶ−ルシフェラーゼ；ベクターＦ：ＴＲＰＶ１−ルシフェラーゼである。ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）およびＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）は、利用可能な有効な抗ＢｏＮＴ抗体が無いことから、Ｃ末端ＨＩＳタグを発現する融合タンパク質である。ＨＣＭＶは強力かつ遍在性のウイルスプロモーターであり、ＴＲＰＶ１はＤＲＧ選択的プロモーターである。他のボツリヌス菌毒素、または融合ＳＮＡＲＥ／軽鎖毒素、または他のＳＮＡＲＥタンパク質に接近するアンチセンスＲＮＡ、またはヒトＧＡＤ６７タンパク質、またはサポリンＳ６などのＲＩＰタンパク質を発現する他のベクターは、この図には示されていない。
【図４】図４は、Ｇｌｉ３６細胞株（ヒト膠芽腫に由来する細胞株）およびＢＨＫ２１（ハムスター線維芽細胞）細胞株におけるＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）およびＴｅＮＴ（ＬＣ）の発現を示す。Ｇｌｉ３６およびＢＨＫ２１細胞に、アンプリコンベクターＨＣＭＶ−Ｌｕｃ、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）、またはＨＣＭＶ−ＴｅＮＴ（ＬＣ）（図２Ｂに示される）を感染させた。次に、感染細胞を固定し、毒素の発現をウエスタンアッセイで特異的抗体を用いて証明した。抗ＴｅＮＴ抗体を、ＴｅＮＴ（ＬＣ）を可視化するために用い、抗ＨＩＳ抗体を、ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）およびＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）の両方を可視化するために用いた。
【図５】図５は、Ｇｌｉ３６細胞で発現され、細胞抽出液中に存在する毒素ＴｅＮＴ（ＬＣ）は、ＶＡＭＰ２に対するタンパク質分解活性を有することを示す。Ｇｌｉ３６細胞に、ＨＣＭＶ−ＴｅＮＴ（ＬＣ）を発現するアンプリコンベクターを多重感染度（ＭＯＩ）１で感染させた。感染を２日後に終わらせ、タンパク質抽出液を調製した。これらの抽出液をＴｅＮＴの標的タンパク質、すなわちＶＡＭＰ２を含有する好適なバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭジチオトレイトールおよび２μＭ  ＺｎＳＯ４）中でインキュベートした。３７℃で２４時間、２．５、５、および１０μＬの細胞抽出液とともにインキュベートした後、ＴｅＮＴ（ＬＣ）発現のタンパク質分解活性を可視化するために抗ＶＡＭＰ２抗体を用い、ウエスタンブロットを行った。
【図６】図６Ａは、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）を発現するアンプリコンベクターによるヒト神経芽腫ＳＨ−Ｓ５Ｙ５細胞の感染後４８時間（ｈｐｉ）に（図３Ｂ参照）、ルシフェラーゼ発現ベクター（ＨＣＭＶ−Ｌｕｃ）を感染させたまたは非感染（Ｍｏｃｋ）の対照細胞に比べて、ＳＮＡＰ２５タンパク質レベルの細胞内での有意な低下が見られることを示す。タンパク質レベルは、抗ＳＮＡＰ２５抗体を用いるウエスタンブロットアッセイにより検出した。ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）はＳＮＡＰ２５を２つのフラグメントに切断することに留意されたい。これらの試験で使用した抗体は、天然ＳＮＡＰ２５タンパク質（上のバンド）および切断されたタンパク質大きなフラグメント（下のバンド）の両方を認識する。図６Ｂは、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）を発現するアンプリコンベクターによるヒト神経芽腫ＳＨ−Ｓ５Ｙ５細胞の感染後４８時間（ｈｐｉ）に（図３Ｂ参照）、ルシフェラーゼ発現ベクター（ＨＣＭＶ−Ｌｕｃ）または非感染（Ｍｏｃｋ）の対照細胞に比べて、ＳＮＡＰ２５およびシンタキシン（ＳＴＸ）の両方のタンパク質レベルの細胞内での有意な低下が見られることを示す。タンパク質レベルは、抗ＳＮＡＰ２５抗体および抗ＳＴＸ抗体を用いるウエスタンブロットアッセイにより検出した。ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）はＳＮＡＰ２５を２つのフラグメントに切断することに留意されたい。これらの試験で使用した抗体は、天然ＳＮＡＰ２５タンパク質（上のバンド）および切断されたタンパク質の大きなフラグメント（下のバンド）の両方を認識する。
【図７】組換えおよびアンプリコンベクターゲノムにより保有される転写カセット。  この図は、組換えおよびアンプリコンＨＳＶ−１ベクターにより保有され、発現される転写カセットのいくつかを示す。これらの転写カセットは３つのファミリーに分類される。Ａ２ファミリーのメンバーは、強力かつ遍在性のＨＣＭＶプロモーターによって駆動される種々の治療遺伝子産物（タンパク質またはアンチセンスＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を発現する転写カセットである。Ａ２転写カセットを保有するベクターは、神経伝達に対するこれらの遺伝子産物の影響（ＳＮＡＲＥタンパク質の切断および神経伝達物質放出の阻害）を調べるために使用され、従って、本発明に関して最も有効な導入遺伝子を選択することを可能とする。Ａ５ファミリーのメンバーは、種々のＤＲＧ選択的候補プロモーターによって駆動されるリポーター遺伝子ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）を発現する転写カセットである。これらのベクターは、培養ニューロンおよび外植した末梢神経節における発現の強度、選択性および持続期間を調べるために使用され、従って、本発明に関して最も選択性の高いベクターを同定することを可能とする。最後に、ベクターのＡ８ファミリーのメンバーは、治療転写カセット（ＤＲＧ選択的プロモーターによって駆動される治療遺伝子産物）を発現し、従って、本発明に関して、イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において高い治療能を有するベクターを選択することを可能とする。図２に示されるように、アンプリコンベクターはまた、ＨＳＶ−１  ＩＥ４／５プロモーターによって駆動されるＧＦＰ／ｒＬｕｃ導入遺伝子も発現することに留意すべできである。略号：遺伝子産物：ＴｅＮＴ：破傷風神経毒の軽鎖ＢｏＮＴ−Ｘ：ボツリヌス菌神経毒ＢｏＮＴ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、またはＦの軽鎖ＢｏＮＴ−Ｘ−ＳＮＡＲＥ−Ｙ：ボツリヌス菌神経毒の軽鎖がＳＮＡＲＥタンパク質のシグナルペプチドおよび膜貫通ペプチドに融合される融合タンパク質。より厳密には、これらの導入遺伝子は、ＢｏＮＴ−Ａ−シンタキシン、ＢｏＮＴ−Ｂ−シンタキシンまたはＢｏＮＴ−Ｃ−Ｖａｍｐ２を発現する。ＧＡＤ６７：６７ｋＤのグルタミン酸デカルボキシラーゼＮＴＲ：ニトロレダクターゼＬｕｃ：ホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）アンチセンスＳＮＡＲＥ：ＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ２５、ＶＡＭＰ２またはシンタキシンに対するアンチセンスＲＮＡプロモーター：ヒト延長因子１プロモーター（ＥＦ１Ａ）、ラット一過性受容器電位バニロイド１（ｒＴＲＰＶ１）、ヒトおよびラットカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｈＣＧＲＰおよびｒＣＧＲＰ）、ラット酸感受性イオンチャネル３（ｒＡＳＩＣ３）、およびヒトおよびラットアドビリン（ｈＡＤＶＬおよびｒＡＤＶＬ）プロモーター
【図８】アンプリコンベクターから発現されたＢｏＮＴ−ＡはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞内でＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ２５を切断する。  ヒト神経芽腫細胞（ＳＨ−Ｓ５Ｙ５）に、転写単位Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）またはＡ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃ（両場合ともＨＣＭＶプロモーターにより駆動される）を発現するアンプリコンベクターを、０１、１．０、および１０．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。翌日、感染を停止させ、細胞タンパク質を、ＢｏＮＴ−Ａ  ＬＣおよびＳＮＡＰ２５に特異的な抗体を用いるウエスタンブロットにより分析する。ウエスタンブロットの上部は、漸増量のＢｏＮＴ−Ａ  ＬＣが漸増量のＭＯＩに相当することを示し、使用されたベクターが感染細胞内でこのタンパク質を発現することを証明する。ブロットの下部は、ＢｏＮＴ−Ａの天然標的であるＳＮＡＲＥ複合体由来のタンパク質ＳＮＡＰ２５の切断を示し、従って、２つのフラグメントを生じる。低いＭＯＩでは、主として天然（非切断）型のＳＮＡＰ２５が見られる。中間のＭＯＩでは、天然型と切断型（やや下のバンド）の両方が観察できる、高いＭＯＩでは、二重バンドの下のフラグメントだけが観察できるので、ほとんどのＳＮＡＰ２５タンパク質が切断される。このことは、ＳＨ−Ｓ５Ｙ５細胞内で合成されたＢｏＮＴ−Ａ  ＬＣがＳＮＡＰ２５を切断できることを証明する。これに対して、Ｌｕｃ発現ベクターを感染させたＳＨ−Ｓ５Ｙ５細胞では、ＳＮＡＰ２５の切断は見られない。
【図９】ボツリン神経毒の軽鎖は感染ニューロンにおいてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する。  ラット胚性後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの初代培養物に、転写単位Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｂ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｅ、およびＡ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｆを発現するアンプリコンベクターを１０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させる。ニューロンにはまた、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ−シンタキシン（ＳＴＸ）、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｂ−シンタキシン（ＳＴＸ）、およびＡ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ−ＶＡＭＰ２（Ｖ２）を発現するアンプリコンベクターも感染させた。Ａ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するベクターを陰性対照として使用した。総ての場合で、ＨＣＭＶプロモーターは転写カセットの発現を駆動した。翌日、感染を停止させ、細胞タンパク質をウエスタンブロットにより分析した。図に示されるように、ニューロン内で合成された各ＢｏＮＴ  ＬＣは予想されたＳＮＡＲＥタンパク質を切断し、よって、ＢｏＮＴ−Ａ、−Ｃおよび−Ｅの軽鎖は、このタンパク質のサイズの縮小から明らかなように、ＳＮＰ２５を切断し、一方、ＢｏＮＴ−Ｂ、および−Ｆの軽鎖はＶＡＭＰ２を切断し、これはこのブロットではもはや検出可能でない。加えて、ＢｏＮＴ−Ｃはまたシンタキシン（ＳＴＸ）も切断し、これもまたブロットではもはや見えない。ＢｏＮＴ−Ｃは、２つの異なるＳＮＡＲＥタンパク質（ＳＮＡＰ２５およびＳＴＸ）を切断することが記載されている唯一のボツリン毒素である。ＳＮＡＲＥタンパク質のシグナルペプチドおよび膜貫通ペプチドと融合されたボツリヌス菌毒素の軽鎖は、親の非融合毒素と同様に正確に、対応するＳＮＡＲＥタンパク質を切断した。レーンＬｕｃは、天然の非切断型ＳＮＡＲＥタンパク質の位置を示す（矢印）。よって、この図は、ベクター感染の際に感覚ニューロンで合成されるボツリン毒素の軽鎖（ＳＮＡＲＥタンパク質のフラグメントと融合したまたは融合していない）は、それらの対応する標的タンパク質を切断することができることを証明する。
【図１０】ボツリン毒素の軽鎖は感覚ニューロンにおいてニューロペプチドの放出を阻害する。  ラット胚性ＤＲＧニューロンの初代培養物に、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｂ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｄ、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｅ、およびＡ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｆを発現するアンプリコンベクターを、漸増ＭＯＩ（０．５〜３ｐｆｕ／細胞）で感染させる。ニューロンにはまた、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ−シンタキシン、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｂ−シンタキシン、およびＡ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ−ＶＡＭＰ２を発現するアンプリコンも感染させた。Ａ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するベクターを陰性対照として使用した。また、ニューロンにはビヒクル単独（ｍｏｃｋ）での感染も行った。翌日、感染したニューロンを７５ｍＭ  ＫＣｌで処理して、ＤＲＧニューロンで通常合成されるニューロペプチドであるＣＧＲＰの放出を刺激した。ＫＣｌ処理の３０分前と３０分後に、１００マイクロリットルのアリコートを培養培地から採取し、ＥＬＩＳＡ（Ｓｐｉ  ＢｉｏからのＣＧＲＰ  ＥＬＩＳＡキット、参照番号Ａ０５４８２を使用）によりＣＧＲＰの存在に関して評価した。対数変換後に線形回帰プロファイルとして表される結果は、総ての毒素がＣＧＲＰ放出を阻害したが、それらはＣＧＲＰ放出を異なる強度で阻害し、これに関してはＢｏＮＴ−Ｆ、ＢｏＮＴ−ＣおよびＢｏＮＴ−Ａが最も有効であったことを示す。ｍｏｃｋ感染ニューロン、並びにＬｕｃ発現ベクターを感染させたニューロンでは、ＣＧＲＰ放出の阻害は見られなかった。これらの結果は、ＢｏＮＴ  ＬＣによるＳＮＡＲＥタンパク質の切断がニューロペプチド放出の阻害をもたらすこと、およびこれに関してＢｏＮＴ−Ｆが最も有効であることを明らかに示す。
【図１１】アンプリコンベクターから発現されたＧＡＤ６７はＧＡＢＡ（γアミノ酪酸）の合成および細胞外放出を誘導する。  ７Ａ）膠芽腫細胞（Ｇｌｉ３６）に、Ａ２−ＣＭＶ−ＧＡＤ６７またはＡ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するアンプリコンベクターを、０．１、１．０および１０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。翌日、感染を停止させ、細胞タンパク質を、ＧＡＤ６７およびＧＡＰＤＨ（内部対照として使用するハウスキーピング遺伝子）に特異的な抗体を用い、ウエスタンブロットにより分析した。内因性のＧＡＤ６７を同定するためにラット脳からの抽出液を陽性対照として使用した。図１１Ａは、ＧＡＤ６７の発現はＭＯＩとともに増大することを示し、ベクターＡ２−ＣＭＶ−ＧＡＤ６７がこのタンパク質を発現することが証明される。７Ｂ）ラット胚性ＤＲＧニューロンの初代培養物に、Ａ２−ＣＭＶ−ＧＡＤ６７またはＡ２−ＣＭＶ  Ｌｕｃを発現するベクターを、ＭＯＩ０．１、１．０および１０ｐｆｕ／細胞で感染させた。翌日、感染を停止させ、ＧＡＢＡの細胞内および細胞外の両方の濃度を、ＧＡＢＡの蛍光結合アッセイであるレサズリンアッセイ（このアッセイはＩｐｐｏｌｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に示されている通りに実施する）を用いて評価した。上のパネルは、細胞内ＧＡＢＡの量がＭＯＩとともに増加することを示し、下のパネルは、細胞外ＧＡＢＡの増加を示す。チャネル標識ＧＡＢＡは、レサズリンアッセイの陽性対照である。この結果は、Ａ２−ＣＭＶ−ＧＡＤ６７ベクターからのＧＡＤ６７の発現が細胞内ＧＡＢＡの合成および細胞外媒体へのその放出を増加させることを明らかに示す。
【図１２】ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）はニトロ化合物７’ニトロクマリンを活性化し、メトロニダゾール（ＭＴＺ）の存在下で細胞死を誘導する。  ８Ａ）ヒト膠芽腫（Ｇｌｉ３６）細胞に、Ａ２−ＣＭＶ−ＮＴＲまたはＡ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するアンプリコンベクターを、１．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。２日後、感染を停止させ、タンパク質抽出液を調製し、蛍光結合アッセイ（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５と同様に実施するアッセイ）を用い、７’ニトロクマリンの活性化を評価するために使用した。図１２Ａは、ベクターＡ２−ＣＭＶ−ＮＴＲを感染させた細胞から抽出されたタンパク質だけが７’ニトロクマリンの有意な活性化を誘導したことを示し、Ａ２−ＣＭＶ−ＮＴＲを感染させたＧｌｉ３６細胞において機能的ＮＴＲが発現されたことが証明される。  ８Ｂ）ＮＴＲの発現がメトロニダゾール（ＭＴＺ）の存在下で細胞死を誘導したかどうかを評価するために、Ｇｌｉ３６細胞に、アンプリコンベクターＡ２−ＣＭＶ−ＮＴＲまたはＡ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃを、１．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。翌日、細胞をＭＴＺ（０．５ｍＭ）とともに、または伴わずに２４時間インキュベートした。次に、感染を停止させ、ＭＴＴアッセイ（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７により示される通り）を用いて細胞生存率を評価した。図は、ＭＴＺが感染細胞の細胞死を有意に増加したことを示す。Ｍｏｃｋ：非感染細胞。
【図１３】成体ラット由来の自律神経節および感覚神経節におけるＤＲＧ選択的プロモーター候補の発現の選択性の分析  ラット成体感覚神経節（ＤＲＧ）、自律神経系交感神経節（上頸神経節、ＳＣＧ）、および自律神経系副交感神経節（頸傍神経節、ＧＰＣ）を外植し、器官型培養物として維持した。３日後、神経節にＡ５−ＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ、Ａ５−ｒＣＧＲＰ−Ｌｕｃ、Ａ５−ＡＳＩＣ３−Ｌｕｃ、またはＡ５−ＥＦ１Ａ−Ｌｕｃを発現するベクターを個々に感染させた。なお、これらは総てホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）を発現するが、それぞれ以下のプロモーター：ラットＴＲＰＶ１（ｒＴＲＰＶ１）、ラットＣＧＲＰ（ｒＣＧＲＰ）、ラットＡＳＩＣ３（ｒＡＳＩＣ３）、および一般対照として非選択的プロモーターとして用いるＥＦ１ａにより駆動される。各神経節に１０６のベクター粒子を感染させた。これらのベクターはまた、ウイルスプロモーター（ＨＳＶ−１  ＩＥ４／５）により駆動されるウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）もまた発現する。翌日、感染を停止させ、Ｐｒｏｍｅｇａからの二重ルシフェラーゼリポーターアッセイ系を用いるルシフェラーゼ試験のために細胞抽出液を調製した。結果はｆＬｕｃ／ｒＬｕｃの比として表し、ＤＲＧ（左）、ＳＣＧ（中央）およびＧＰＣ（右）のそれぞれにおいて、ＥＦ１ａプロモーターの発現のパーセンテージとして正規化した。図１３は、ｒＴＲＰＶ１およびｒＣＧＲＰプロモーターなどのいくつかの候補プロモーターは、自律神経節よりもＤＲＧにおいて有意に高いレベルのｆＬｕｃを発現するが、ｒＡＳＩＣ３などの他のプロモーターはＤＲＧにおいて優先的活性を示さないことを示す。これらの結果によれば、ｒＴＲＰＶ１およびｒＣＧＲＰプロモーターはＤＲＧに対して選択的活性を示すと思われるが、ｒＡＳＩＣ３は、ウイルスゲノムから発現された場合にこのような選択性を示さない。
【図１４】図１４は、リポータータンパク質ＧＦＰを発現するアンプリコンベクターは胚性ラットＤＲＧニューロンの初代培養物および成体ラットＤＲＧ外植体に感染し、これらのニューロン内で導入遺伝子ＧＦＰを発現することができることを示す。
【図１５】欠陥型ＨＳＶ−１ベクターの排尿筋内接種は後根神経節（ＤＲＧ）に達し、膀胱を神経支配する感覚ニューロンにおいて導入遺伝子を発現する。  ＩＥ４／５−ＧＦＰおよびＨＣＭＶ−ルシフェラーゼを発現するウイルスベクター（図３Ｂに示される）は、脊髄損傷（ＳＣＩ）ラットの膀胱壁への接種後に、膀胱求心ニューロンに浸透し、両方のトランスジェニックタンパク質を発現する能力を有する。ＧＦＰとルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の両方を発現するＤＲＧニューロンはＤＲＧ神経節Ｌ６に示され、それから膀胱を神経支配するニューロン延伸する。しかしながら、膀胱を神経支配しないＤＲＧ神経節Ｔ１３では、これらの結果は陰性である。感染１週間後、動物を犠牲にし、トランスジェニックタンパク質は、ＧＦＰおよびルシフェラーゼに対する特異的抗体を用いるＩＨＣにより可視化した。これらの結果は、膀胱壁への接種の後、ベクターは、膀胱を神経支配する求心ニューロンに侵入し、ウイルスゲノムが両方のトランスジェニックタンパク質を発現する場所から、軸策を介してニューロンの細胞体へと、後根神経節（ＤＲＧ）にあるＬ６神経節へ逆輸送されることを示す。ベクターは、膀胱を神経支配しないニューロン（Ｔ１３）には到達せず、そこで発現することはできない。
【図１６】図１６は、ルシフェラーゼがＲＧ選択的ＴＲＰＶ１プロモーターにより駆動される場合に、後根神経節（ＤＲＧ）におけるウイルスベクターの発現の高い細胞選択性を示す。ルシフェラーゼは求心ニューロンでのみ有意に発現され、自律神経ニューロン（交感神経または副交感神経）では発現されない。結果は、強力ではあるが非特異的なＨＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するベクターからの発現に対するルシフェラーゼ発現のパーセンテージとして正規化した（両方のベクターを図３Ｂに示す）。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：欠陥型組換えおよびアンプリコンＨＳＶ−１ベクターの構築
材料および方法
本発明は、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ４の完全欠失（両方のコピー）を含んでなり、加えて、前記カセットに長期発現を与えるために、図１および図２に示されるように、ＬＡＰ配列とＬＴＥ配列の間（部位１）またはＬＴＥ配列とＩＮＳ配列の間（部位２）のいずれかにＬＡＴ遺伝子座に埋め込まれた治療転写カセットを保有する、欠陥型組換えＨＳＶ−１ベクターのセットを提供する。これらのベクターを作製するために使用した転写カセットのいくつかを図３に示す。
【０１０２】
前記転写カセットは、求心ニューロン特異的プロモーターの制御下に置かれた場合に、求心ニューロンにおいて特異的に神経伝達を阻害／サイレンシングするために、クロストリジウム毒素の軽鎖（ＬＣ）ＴｅＮＴ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ  Ｂ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ  Ｅ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｆ（ＬＣ）、またはＳＮＡＲＥタンパク質であるＶＡＭＰ２、ＳＮＡＰ２５およびシンタキシンに対するアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、または融合ＳＮＡＲＥ／軽鎖毒素、またはヒトＧＡＤ６７タンパク質、またはサポリンＳ６などのＲＩＰタンパク質、または大腸菌ＮＴＲ  ｎｆｎＢを発現する。
【０１０３】
これらのベクターを作製するために、本発明者らは、Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ，２００３に記載されているものなどの細菌人工染色体（ＢＡＣ）にクローニングされたＦ株の全長ＨＳＶ−１ゲノムを使用した。遺伝子欠失および遺伝子挿入は細菌における相同組換えによって導入し、次に、すでに記載されているように（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）、これらのベクターを許容細胞株のトランスフェクションにより再構築した。これらのベクターの一般構造を図１Ａに示す。
【０１０４】
ＨＳＶ−１アンプリコンベクターのゲノム。図２。
本発明はまた、図７に列挙される、組換えベクターと同じトランスジェニック治療転写カセットを発現する欠陥型アンプリコンベクターのセットを提供する。長期発現付与配列（ＬＴＥおよびＩＮＳ）が転写カセットの前後にある（図２）。図２はまた、アンプリコンベクターが、治療転写カセットに加えて、リポータータンパク質（ＧＦＰまたは融合タンパク質ＧＦＰ／ウミシイタケルシフェラーゼのいずれか）（いずれの場合にもＨＳＶ−１  ＩＥ４／５プロモーターにより駆動される）を発現する第２の転写カセットを保有することを示す。
【０１０５】
アンプリコンベクターは、欠陥型ＬａＬｄｅｌｔａＪウイルスと、ベクターゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるタンパク質セットを発現するＥｐｓｔｅｉｎおよび共同研究者（Ｚａｕｐａ、Ｒｅｖｏｌ−ＧｕｙｏｔおよびＥｐｓｔｅｉｎ，２００３）によりすでに記載されている相補細胞株とをヘルパーとして用いて生産される。
【０１０６】
組換えおよびアンプリコンベクターゲノムにより保有される転写カセット。図７。
本明細書に記載の組換えおよびアンプリコンベクターは、図１および２に示されるような両タイプのベクターで、長期発現を付与するＨＳＶ−１配列（ＬＡＰ、ＬＴＥ、ＩＮＳ）に埋め込まれたランスジェニック転写カセットを保有し、発現する。本発明において使用される転写カセットのいくつかの例を図７に挙げる。
【０１０７】
実施例２：ＨＳＶ−１アンプリコンベクター
本発明はまた、欠陥型アンプリコンベクターのセットを提供し、これらのベクターのいくつかは、リポータータンパク質（ルシフェラーゼ）、またはクロストリジウム毒素の軽鎖（ＬＣ）（ＴｅＮＴ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ  Ｂ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ  Ｅ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｆ（ＬＣ））、またはＳＮＡＲＥタンパク質であるＶＡＭＰ２、ＳＮＡＰ２５およびシンタキシンに対するアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、またはキメラＳＮＡＲＥ／軽鎖毒素、またはヒトＧＡＤ６７タンパク質、またはサポリンＳ６などのＲＩＰタンパク質、またはｎｆｎＢなどのニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）タンパク質のいずれかを発現するこれらの導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター（ｐｒｏｍ）は、非特異的プロモーター（ＨＣＭＶ、ＥＦ１Ａ）、または求心ニューロン特異的プロモーター（ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＭ８、ＡＳＩＣ３、ＧＣＲＰ、ＡＤＶｌ）のいずれかである。さらなる長期発現付与配列（ＬＴＥおよびＤＮＡインスレーター配列）がこれらのプロモーターのいくつかに付加される（図３Ａ）。アンプリコンベクター中に存在する、リポーターＧＦＰ、またはＧＦＰ−ｒＬｕｃ融合タンパク質の発現を神経支配するプロモーターは、ＨＳＶ−１  ＩＥ４／５プロモーターとして知られるウイルス前初期プロモーターである。本明細書で使用されるアンプリコンベクターのいくつかの一般構造を図３Ｂに示す。
【０１０８】
実施例３：ＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−ＣおよびＴｅＮの発現  図４
ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）およびＴｅＮＴ（ＬＣ）の発現は、Ｇｌｉ３６細胞株（ヒト膠芽腫由来の細胞株）およびＢＨＫ２１（ハムスター線維芽細胞）細胞株で実施する。Ｇｌｉ３６およびＢＨＫ２１細胞に、ＨＣＭＶ−Ｌｕｃ、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）、またはＨＣＭＶ−ＴｅＮＴ（ＬＣ）を発現するアンプリコンベクターを感染させた。次に、これらの細胞を固定し、毒素の発現を、ＴｅＮＴ（ＬＣ）を可視化するために抗ＴｅＮＴ抗体を、またＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）およびＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）を可視化するために抗ＨＩＳ抗体を用い、ウエスタンブロットにより証明した。実際に、利用可能な有効な抗ＢｏＮＴ抗体は無く、従って、ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）およびＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）は、Ｃ末端ＨＩＳタグを有する融合タンパク質として発現させる。図４は、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＨＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）、およびＨＣＭＶ−ＴｅＮＴ（ＬＣ）をコードする遺伝子を保有するウイルスベクターが、Ｇｌｉ３６細胞およびＢＨＫ２１細胞の両方で、それぞれＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）、ＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）およびＴｅＮＴ（ＬＣ）を発現することを示す。
【０１０９】
実施例４：組換え毒素ＴｅＮＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質分解活性  図５
ＶＡＭＰ２に対する毒素ＴｅＮＴ（ＬＣ）のタンパク質分解活性を、抗ＶＡＭＰ２抗体を用い、ウエスタンブロットにより評価した。毒素ＴｅＮＴ（ＬＣ）は、ＨＣＭＶ−ＴｅＮＴ（ＬＣ）を発現するウイルス発現ベクターに感染した後のＧｌｉ３６細胞で発現された。２日後に感染を終わらせ、タンパク質抽出液を調製した。これらの抽出液をＴｅＮＴの標的タンパク質、すなわち、ＶＡＭＰ２を含有する好適なバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭジチオトレイトールおよび２μＭ  ＺｎＳＯ４を含有）中でインキュベートした。２．５、５、および１０μＬの細胞抽出液を用い、ウエスタンブロット（図５）を行った。非処理サンプル、導入遺伝子（ｐＡ−１）を発現するベクターに感染させた細胞由来のサンプル、およびＨＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するベクターに感染させた細胞由来のサンプル（１０μＬ）を陰性対照として使用した。様々な量の組換えＴｅＮＴ（ｒｅｃＴｅＮＴ）を陽性対照として使用した。結果は、ＴｅＮＴ（ＬＣ）を発現するタンパク質抽出液が増加するとＶＡＭＰ２の量は減少することを示し、このことは、タンパク質抽出液中に存在する毒素が、ＶＡＭＰ２に対してタンパク質分解活性を示すということを証明する。
【０１１０】
実施例５：組換え毒素ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）およびＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）の細胞内タンパク質分解活性  図６
ＢｏＮＴ−Ａ（ＬＣ）またはＢｏＮＴ−Ｃ（ＬＣ）を発現するアンプリコンベクターによる感染の後の細胞内ＳＮＡＰ２５およびシンタキシン１ａ（ＳＴＸ）切断を追跡するために、ＳＨ−Ｓ５Ｙ５ヒト神経芽腫細胞株を、それらの自発的にＳＮＡＲＥタンパク質を発現する特性のために使用した。ＳＮＡＰ２５およびＳＴＸレベルを、それぞれ抗ＳＮＡＰ２５抗体または抗ＳＴＸ抗体を用い、ウエスタンブロットアッセイにより検出した。陰性対照として、細胞を非感染（Ｍｏｃｋ）とするか、またはＨＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するベクターに感染させた。結果（図６ａおよび６ｂ）は、ＢｏＮＴ−ＡまたはＢｏＮＴ−Ｃの軽鎖を発現するベクターによるＳＨ−Ｓ５Ｙ５細胞の感染４８時間後（ｈｐｉ）に、それぞれ切断、およびルシフェラーゼを発現する対照ベクターに感染させた細胞に比べての、細胞内ＳＮＡＰ２５（図６ａ）またはＳＮＡＰ２５およびＳＴＸ（図６ｂ）タンパク質レベルの有意な低減が見られることを示す。
【０１１１】
実施例６：アンプリコンベクターから発現されたＢｏＮＴ−Ａは、ＳＨ−ＳＹＳ５細胞においてＳＮＡＲＥタンパク質ＳＮＡＰ２５を発現する  図８
この実験は、ＢｏＮＴ−Ａの軽鎖を発現するベクターがこのタンパク質を発現するかどうかを評価するため、およびこの毒素が完全な神経毒（軽鎖＋重鎖）と同じ生物活性、すなわち、その標的ＳＮＡＲＥタンパク質（ＳＮＡＰ２５）を切断する能力を有するかどうか検討するために計画された。図８に示されるように、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａを発現するアンプリコンに、漸増多重度で感染された細胞は、漸増量の毒素を発現する。さらに、細胞が高いＭＯＩで感染されると、事実上総てのＳＮＡＰ２５が切断され、ＢｏＮＴ−Ａの軽鎖の機能活性を明らかに証明する。
【０１１２】
実施例７：ボツリン神経毒の軽鎖は感染したニューロンにおいてＳＮＡＲＥタンパク質を切断する  図９
この実験は、ベクター感染ニューロンにおいて合成された総てのＢｏＮＴ軽鎖が感覚ニューロンにおいてそれらの天然ＳＮＡＲＥ標的タンパク質を切断できることを確認するために計画された。このために、ラット胚性ＤＲＧニューロンの初代培養物に、Ａ２−ＣＭＶ−ＢｏＮＴ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび−Ｆ、または陰性対照としてのＡ２−ＣＭＶ−Ｌｕｃを発現するアンプリコンベクターを、ＭＯＩ  １０で感染させた。翌日、感染を停止させ、細胞抽出液をウエスタンブロットにより分析した。図９に示されるように、これらのベクターにより発現されたボツリヌス菌神経毒のそれぞれは、その天然標的ＳＮＡＲＥタンパク質を切断した。よって、ＢｏＮＴ−Ａおよび−ＥはＳＮＡＰ２５を切断し、ＢｏＮＴ−Ｂ、−Ｄおよび−ＦはＶＡＭＰ２を切断し、一方、ＢｏＮＴ−ＣはＳＮＡＰ２５とシンタキシンの両方を切断した。このことは、総ての神経毒の軽鎖が完全な神経毒（軽鎖＋重鎖）と同じ生物活性を示すことを明らかに証明する。
【０１１３】
実施例８：ボツリン毒素の軽鎖は感覚ニューロンにおいてニューロペプチドの放出を阻害する  図１０
この実験は、ボツリヌス菌神経毒の軽鎖が神経伝達物質の放出の阻害を誘導したかどうかを評価するため、およびこれに関してそれらの相対的有効性を評価するために計画された。ラット胚性ＤＲＧニューロンの初代培養物に、図１０に記載のベクターを漸増ＭＯＩで感染させた。翌日、感染ニューロンを、ニューロペプチドＣＧＲＰの放出を刺激するためにＫＣｌで処理し、ＣＧＲＰの細胞外濃度をＥＬＩＳＡにより評価した。図１０に示されるように、総ての神経毒がＣＧＲＰの放出の阻害を誘導した。さらに、図６は、これに関してＢｏＮＴ−Ｆが最も有効であり、ＢｏＮＴ−Ａおよび−Ｃがこれに次ぐことを示す。
【０１１４】
実施例９：アンプリコンベクターから発現されたＧＡＤ６７はＧＡＢＡの合成および細胞外放出を誘導する  図１１
この実験の目的は、ＧＡＤ６７を発現するベクターが阻害性神経伝達物質ＧＡＢＡの合成および放出を誘導するかどうかを評価することである。このために、膠芽腫細胞（Ｇｌｉ３６）に、図１１に記載されるアンプリコンベクターを漸増ＭＯＩで感染させ、翌日、感染細胞抽出液を、ＧＡＤ６７およびＧＡＰＤＨに特異的な抗体を用い、ウエスタンブロットにより分析した。図１１は、ＧＡＤ６７の発現がＭＯＩとともに増すことを示し、ベクターＡ２−ＣＭＶ−ＧＡＤ６７がこのタンパク質を発現することが証明される。加えて、ラット胚性ＤＲＧニューロンの初代培養物に同じベクターを種々のＭＯＩで感染させた。翌日、感染を停止させ、細胞内および細胞外両方のＧＡＢＡの濃度を、レサズリンアッセイを用いて評価した（図１１の凡例に示されている通り）。この図の上のパネルは、細胞内ＧＡＢＡの量はＭＯＩとともに増すことを示し、下のパネルは、細胞外ＧＡＢＡの増加を示し、Ａ２−ＣＭＶ−ＧＡＤ６７ベクターからのＧＡＤ６７の発現が、細胞内ＧＡＢＡの合成および細胞外培地へのその放出を増加させることが明らかに証明される。
【０１１５】
実施例１０：ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）はニトロ化合物７’ニトロクマリンを活性化させ、メトロニダゾール（ＭＴＺ）の存在下で細胞死を誘導する  図１２
この実験は、アンプリコンベクターから発現されたニトロレダクターゼがメトロニダゾールの存在下では細胞死を誘導し、不在下では誘導しないかどうかを評価するために計画された。利用可能な、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）に特異的な抗体は無い。従って、このタンパク質がＡ２−ＣＭＶ−ＮＴＲ感染細胞で発現されることを評価するために、本発明者らは、７’ニトロクマリンの還元の評価に基づく機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を使用した。図１２は、Ａ２−ＣＭＶ−ＮＴＲを発現するアンプリコンベクターがニトロ化合物を活性化することを示す。さらに、図１２は、ＮＴＲの発現がメトロニダゾール（ＭＴＺ）の存在下で有意な細胞死を誘導したことを示す。このことは、ＮＴＲがＭＴＺを活性化してこの分子を細胞傷害薬に変換することができるという事実によって説明される。
【０１１６】
実施例１１：成体ラット由来の自律神経節および感覚神経節におけるＤＲＧ選択的プロモーター候補の発現の選択性の分析  図１３
この試験は、通常、求心ニューロンのみでまたは主として求心ニューロンで活性化される求心ニューロン特異的プロモーター候補が、それらが非複製ＨＳＶ−１ベクターゲノムから発現された場合にもそれらの求心ニューロン特異的活性を保持しているかどうかを検討するために計画された。ラット成体求心性神経節（ＤＲＧ）、自律神経交感神経節（ＳＣＧ）、および自律神経副交感神経節（ＧＰＣ）を外植し、器官型培養として維持した。神経突起成長に要される期間である３日後に、神経節に個々に、図１３の凡例に記載される３×１０６のベクター粒子を感染させた。これらのベクターは、以下のプロモーター：ラットＴＲＰＶ１（ｒＴＲＰＶ１）、ラットＣＧＲＰ（ｒＣＧＲＰ）、ラットＡＳＩＣ３（ｒＡＳＩＣ３）（これらは総て求心性ニューロン特異的プロモーターと考えられる）、および一般対照として使用される非選択的プロモーターＥＦ１ａにより駆動されるホタルルシフェラーゼ（ｆＬｕｃ）を発現する。これらのベクターはまた、ｆＬｕｃに加え、ウイルスプロモーター（ＨＳＶ−１  ＩＥ４／５）により駆動されるウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）も発現する。翌日、感染を停止させ、細胞抽出液をルシフェラーゼ試験のために調製した。結果は、ｆＬｕｃ／ｒＬｕｃの比およびＥＦ１ａにより駆動されるルシフェラーゼ活性のパーセンテージとして表される。図１３は、ｒＴＲＰＶ１およびｒＣＧＲＰがＤＲＧで優先的にホタルルシフェラーゼ活性を発現し、従って、それらがベクターゲノムから発現する場合でもＤＲＧ特異的と見なすことができることを示す。これに対して、ｒＡＳＩＣ３はＤＲＧにおいてこのような優先的発現を示さず、このプロモーターがベクターゲノムから発現された場合にその選択性を保持しないことが証明される。よって、この実施例は、ｒＴＲＰＶ１およびｒＣＧＲＰプロモーターなどのいくつかのＤＲＧ特異的プロモーター候補はＤＲＧに対するそれらの選択性を保持するが、ｒＡＳＩＣ３などの他のプロモーター候補は、それが細胞染色体から発現する場合にはＤＲＧ特異的プロモーターと見なされるものの、ベクターゲノムから発現される場合にはこの特異性は保持されないことを示す。よって、いずれの特定のＤＲＧ特異的プロモーター候補の挙動も予測できず、実験的に評価しなければならない。
【０１１７】
実施例１２：細胞培養における感染および組換えタンパク質の発現
胚性ＤＲＧ由来の初代ラットニューロン培養物および成体ラットＤＲＧ外植体の器官型培養物にＨＳＶ−１前初期ＩＥ４／５プロモーターにより駆動されるＧＦＰを発現するアンプリコンベクターを感染させた。結果は、ウイルス発現ベクターは初代ラット感覚ニューロン培養物および成体ラット神経節（ＤＲＧ）外植体の両方で感染し、導入遺伝子（ＧＦＰ）を発現したことを示す（図１４）。
【０１１８】
実施例１３：ニューロンにおける組換えタンパク質のイン・ビボ発現
脊髄損傷（ＳＣＩ）ラットに、ＧＦＰおよびＬｕｃリポータータンパク質を同時に発現するアンプリコンベクターＨＣＭＶ−Ｌｕｃを感染させた。感染１週間後に、動物を犠牲にし、トランスジェニックタンパク質発現をＩＨＣにより可視化した。ＩＨＣにより示されるように、膀胱に接種した場合、アンプリコンベクターは膀胱を神経支配する求心ニューロンに侵入していき、その後、軸策を介して、後根神経節（ＤＲＧ）に位置し、ウイルスゲノムが両方のトランスジェニックタンパク質を発現するニューロンの細胞体へ逆輸送される。結果は、アンプリコンベクターＨＣＭＶ−Ｌｕｃは、このようにそれらの膀胱壁への接種の後に膀胱求心ニューロンに浸透し、特異的にトランスジェニックタンパク質を発現することができることを示す（図１５）。さらに、ＧＦＰおよびＬｕｃを発現するニューロンは、膀胱を神経支配するニューロンが延伸する神経節（Ｌ６神経節）にのみ見られる。これに対し、膀胱を神経支配しない神経節Ｔ１３では、導入遺伝子発現は見られなかった（データは示されていない）。
【０１１９】
実施例１４：ウイルス発現ベクターの細胞特異性発現
プロモーターＴＲＰＶ１（求心ニューロンで選択的に活性なプロモーター）の制御下でルシフェラーゼを発現するアンプリコンベクターＴＲＰＶ１−Ｌｕｃ、および非選択的ＨＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するＨＣＭＶ−Ｌｕｃを用いて、感覚神経節または自律神経節（交感神経節および副交感神経節の両方）に感染させた。結果は、ＴＲＰＶ１プロモーター下でのルシフェラーゼの発現は、感覚神経節（後根神経節、ＤＲＧ）の求心ニューロンで特異的に発現され、自律神経ニューロン（交感神経または副交感神経）では発現されないことを示す（図１６）。結果は、総てのタイプの神経節で等しく高い、非選択的ＨＣＭＶプロモーターにより駆動される発現のパーセンテージとして表される。
【０１２０】
書誌参照
2019518471.tif 000002
2019518471.tif 000003
【図１】
2019518471.tif 000004
【図２】
2019518471.tif 000005
【図３】
2019518471.tif 000006
【図４】
2019518471.tif 000007
【図５】
2019518471.tif 000008
【図６】
2019518471.tif 000009
【図７】
2019518471.tif 000010
【図８】
2019518471.tif 000011
【図９】
2019518471.tif 000012
【図１０】
2019518471.tif 000013
【図１１】
2019518471.tif 000014
【図１２】
2019518471.tif 000015
【図１３】
2019518471.tif 000016
【図１４】
2019518471.tif 000017
【図１５】
2019518471.tif 000018
【図１６】
2019518471.tif 000019
【国際調査報告】
2019518471.tif 000020
2019518471.tif 000021
2019518471.tif 000022
2019518471.tif 000023