(57)【要約】以下の構造を有する化合物を提供する：これらの構造を含む組成物を使用して、グルコース輸送体を阻害し、がんの増殖を停止又は減少させ、危険性のある臓器拒絶を治療し、自己免疫疾患を治療することができる。2019504087.tif 000023
2019504087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるがんを治療する方法であって、以下：
【化１】
2019504087.tif 000015
【化２】
2019504087.tif 000016
【化３】
2019504087.tif 000017
ここで、残基 1 から 4 は下記に列記する任意のアミノ酸ビルディング・ブロック又はその改変体であることがあり、
【化４】
2019504087.tif 000018
のうちの 1 つからなる群から選択される化合物の抗増殖として有効な量を前記被験体に投与することを含み、それによってがんを治療する方法。
【請求項２】
前記化合物が式 A18 又は E11 である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載の取り出した化合物。
【請求項４】
合成スキーム I 又は II を含む、請求項３又は１７に記載の化合物を合成する方法。
【請求項５】
前記がんが、消化／胃腸管がん（alimentary/gastrointestinal tract cancer）、肝臓がん、皮膚がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、リンパ腫、白血病、腎臓がん（kidney cancer）、肺がん、筋肉がん、骨がん、膀胱がん、脳がん、眼又は眼球がん、直腸がん、結腸がん、子宮頸がん、膀胱がん、口腔がん、良性及び悪性腫瘍、胃がん、子宮体部（corpus uteri）がん、精巣がん、腎臓がん（renal cancer）、咽喉がん（throat cancer）、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫（Ewing's Sarcoma）、カポジ肉腫（Kaposi's Sarcoma）、基底細胞がん及び扁平上皮がん、小細胞肺がん、絨毛がん（choriocarcinoma）、横紋筋肉腫（rhabdomyosarcoma）、血管肉腫（angiosarcoma）、血管内皮腫（hemangioendothelioma）、ウィルムス腫瘍（Wilms Tumor）、神経芽細胞腫、口腔／咽頭がん（mouth/pharynx cancer）、食道がん（esophageal cancer）、咽頭がん（larynx cancer）、神経線維腫症（neurofibromatosis）、結節性硬化症、血管腫及びリンパ管形成からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記がんが転移性がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物を静脈投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
化学療法化合物又は以下：
【化５】
2019504087.tif 000019
のうちの 1 つからなる群から選択される化合物を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項３又は１７に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
臓器移植を受けている被験体における危険性のある臓器拒絶を治療する方法であって、前記被験体に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与することを含み、それにより危険性のある臓器拒絶を治療する方法。
【請求項１１】
前記化合物が、式 A18 又は E11 である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物を静脈投与する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
被験体における自己免疫疾患を治療する方法であって、前記被験体に有効な量の請求項１に記載の化合物を投与することを含み、それにより自己免疫疾患を治療する方法。
【請求項１４】
前記化合物が、式 A18 又は E11 である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物を静脈投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患が、急性播種性脳脊髄炎（ADEM）、アジソン病（Addison's disease）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性多内分泌腺／多腺性症候群（Autoimmune polyendocrine/polyglandular syndrome）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、バロー病（Balo disease）、ベーチェット病（Behcet disease）、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スプルー疱疹状皮膚炎（Celiac sprue-dermatitis herpetiformis）、慢性疲労免疫不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡（Cicatricial pemphigoid） 、セリアック病、寒冷凝集素症（Cold agglutinin disease）、CREST 症候群、クローン病（Crohn’s disease）、嚢胞性線維症、デゴス病（Degos disease）、皮膚筋炎、糖尿病（I型又は若年発症）、早期発症型認知症、湿疹、エンドトキシン・ショック、本態性混合型クリオグロブリン血症（Essential mixed cryoglobulinemia）、家族性地中海熱、線維筋痛症、線維筋炎、グッドパスチャー症候群（Goodpasture's syndrome）、グレーブス病（Graves' disease）、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre syndrome (GBS)）、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎（Hidradenitis suppurativa）、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgA 腎症、ランバート・イートン筋無力症候群（Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome）、白血病、扁平苔癬、メニエール病（Meniere disease）、混合性結合組織病（Mixed connective tissue disease）、多発性硬化症、多相性散在性脳脊髄炎（Multiphasic disseminated encephalomyelitis）、重症筋無力症、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica）、腫瘍随伴症候群（Paraneoplastic Syndromes）、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血 、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、プラーク乾癬（Plaque Psoriasis）、乾癬性関節炎、レイノー現象（Raynaud phenomenon）、ライター症候群（Reiter syndrome）、血管形成術後の再狭窄、リウマチ熱、関節リウマチ、リウマチ様乾癬（Rheumatoid psoriasis）、サルコイドーシス、強皮症、敗血症、セザリー病（Sezary’s disease）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、スティッフ−パーソン症候群（Stiff-person syndrome）、全身性エリテマトーデス（SLE）を含むループス、高安動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、移植又は同種移植片拒絶、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、移植片対宿主病、膿疱性乾癬、及びウェゲナー（Wegener）肉芽腫症（現在、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）と名付けられている）、炎症性腸疾患、急性壊死性出血性白質脳炎（Acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis）、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、抗GBM／抗 TBM 腎炎、抗リン脂質症候群（APS）、自己免疫性血管性浮腫（Autoimmune angioedema）、自己免疫性無形成性貧血（Autoimmune aplastic anemia,）、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経性ニューロパチー（Axonal & neuronal neuropathies）、キャッスルマン病（Castleman disease）、セリアック病、シャーガス病（Chagas disease）、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP)）、慢性再発性多発性骨髄炎（Chronic recurrent multifocal ostomyelitis (CRMO)）、チャーグ−ストラウス症候群（Churg-Strauss syndrome）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コガン症候群（Cogans syndrome ）、先天性心臓ブロック（Congenital heart block）、コクサッキー心筋炎（Coxsackie myocarditis）、CREST 病（CREST disease ）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎（Dermatitis herpetiformis）、デビック病（視神経脊髄炎）（Devic’s disease）、円盤状ループス、ドレスラー症候群（Dressler’s syndrome）、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群（Evans syndrome）、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）、橋本脳炎（Hashimoto’s encephalitis）、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病（Henoch-Schonlein purpura）、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgG4関連硬化性疾患（IgG4-related sclerosing disease）、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（I 型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群（Kawasaki syndrome）、ランバート−イートン症候群（Lambert-Eaton Syndrome）、白血球破砕性血管炎（Leukocytoclastic vasculitis）、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状 IgA 病（Linear IgA disease (LAD)）、ループス（SLE）、ライム病（Lyme disease）、慢性（chronic） 、顕微鏡的多発血管炎、モーレン潰瘍（Mooren’s ulcer）、ムッハ−ハーベルマン病（Mucha-Habermann disease）、筋炎、ナルコレプシー、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡（Ocular cicatricial pemphigoid）、視神経炎、パリンドローム・リウマチ、PANDAS（小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害（Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus））、傍腫瘍性小脳変性症（Paraneoplastic cerebellar degeneration）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、パリー・ロンベルグ症候群（Parry Romberg syndrome）、パーソネイジ−ターナー症候群（Parsonnage-Turner syndrome）、扁平部炎（Pars planitis (peripheral uveitis)）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎（Perivenous encephalomyelitis）、POEMS 症候群、I, II, & III 型多腺性自己免疫症候群、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆（Pure red cell aplasia）、反応性関節炎、反射交感神経ジストロフィー（Reflex sympathetic dystrophy）、再発性多発軟骨炎、むずむず脚症候群（Restless legs syndrome）、後腹膜線維症、リウマチ熱、シュミット症候群（Schmidt syndrome）、強膜炎、精子 & 精巣の自己免疫（Sperm & testicular autoimmunity）、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、スザック症候群（Susac’s syndrome）、交感性眼炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トロサ−ハント症候群（Tolosa-Hunt syndrome）、横断性脊髄炎、I 型糖尿病、未分化型結合組織病（UCTD）及び水疱性皮膚症からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
以下の構造を有する化合物：
【化６】
2019504087.tif 000020
【化７】
2019504087.tif 000021
ここで、残基 1 から 4 は下記に列記する任意のアミノ酸ビルディング・ブロック又はその改変体であることがある：
【化８】
2019504087.tif 000022
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、35 U.S.C. § 119(e) による優先権の利益を 2016 年 2 月 4 日に出願された米国仮特許出願第 62/291,453 号に対して主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
助成金に関する情報
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）の助成金 DP1CA174428 に基づく政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、広く細胞増殖の阻害剤に関するものであり、より具体的にはがんの治療に有用なラパフシン（rapafucin）化合物に関する。
【背景技術】
【０００４】
グルコースは、真核生物におけるエネルギーの主な供給源であり、代謝及び細胞のホメオスタシスにおいて中心的な役割を果たす。グルコース輸送体は、原形質膜を横切るグルコースの輸送を促進する膜タンパク質の広いグループである。腫瘍は急速に増殖しているため、細胞がフル能力で機能するためには、栄養分を細胞内に運ぶタンパク質が必要である。したがって、がん治療の重要な戦略の 1 つは、これらのタンパク質を阻害することであろう。GLUT ファミリーは、グルコース及び他の物質を細胞内に輸送する主要な膜輸送タンパク質の 1 つであるため、これらのタンパク質を阻害することは、がんが拡がることを止める上で重要である。さらに、GLUT は T リンパ球の活性化において重要な役割も果たしている。グルコース輸送の阻害は、免疫応答を調節することができ、移植片の拒絶から様々な自己免疫疾患にいたるまで、多種多様な免疫関連疾患の治療への関与が推測される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要約
本発明は、細胞増殖及び T 細胞活性化を阻害するラパフシン化合物の独創性に富む発見に基づく。
【０００６】
ある実施形態では、本発明は、被験体におけるがんを治療する方法であって、以下の化合物：
【化１】
2019504087.tif 000003
【化２】
2019504087.tif 000004
【化３】
2019504087.tif 000005
ここで、残基 1 から 4 は下記に列記した何れのアミノ酸ビルディング・ブロック又はその改変体であっても良く、
【化４】
2019504087.tif 000006
のいずれか 1 つの抗増殖として有効な量を前記被験体に投与することを含み、それによりがんを治療する方法を提供する。ある態様では、前記がんは、消化／胃腸管がん（alimentary/gastrointestinal tract cancer）、肝臓がん、皮膚がん、乳がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、リンパ腫、白血病、腎臓がん（kidney cancer）、肺がん、筋肉がん、骨がん、膀胱がん、脳がん、眼又は眼球がん、直腸がん、結腸がん、子宮頸がん、膀胱がん、口腔がん、良性及び悪性腫瘍、胃がん、子宮体部がん（corpus uteri）、精巣がん、腎臓がん（renal cancer）、咽喉がん（throat cancer）、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫（Ewing's Sarcoma）、カポジ肉腫（Kaposi's Sarcoma）、基底細胞がん及び扁平上皮がん、小細胞肺がん、絨毛がん（choriocarcinoma）、横紋筋肉腫（rhabdomyosarcoma）、血管肉腫（angiosarcoma）、血管内皮腫（hemangioendothelioma）、ウィルムス腫瘍（Wilms Tumor）、神経芽細胞腫、口腔／咽頭がん（mouth/pharynx cancer）、食道がん（esophageal cancer）、咽頭がん（larynx cancer）、神経線維腫症（neurofibromatosis）、結節性硬化症、血管腫、又はリンパ管形成である。ある態様では、がんは転移性がんである。ある態様では、本発明の化合物を静脈内に投与する。ある態様では、本発明は、本発明の化合物の投与の前、同時又は後に、化学療法化合物又は表１の化合物をさらに投与することを提供する。
【０００７】
表１：グルコース輸送体の阻害剤。
【表１】
2019504087.tif 000007
【０００８】
別の実施形態では、上記の化合物は、臓器移植を受けている被験体において、危険性のある臓器拒絶を治療するために使用することができる。
【０００９】
別の実施形態では、上記の化合物は、自己免疫疾患の治療に使用することができる。
【００１０】
上記化合物から取り出される化合物は、本発明の一実施形態に含まれる。さらに、合成スキーム I 又は II を含む図１ａに示される式 A18 又は E11 の化合物を合成する方法は本発明の一実施形態に含まれる。更に、発明の化合物を含む医薬組成物は本発明に含まれる。
【００１１】
スキーム I
【化５】
2019504087.tif 000008
【００１２】
A18 の合成。
試薬と条件：
(a) Fmoc-AA-OH、HATU、DIPEA、DMF、室温、2 時間；
(b) 20 % ピペリジン、DMF、室温、30 分；
(c) HATU、DIPEA、DMF、室温、2時間；
(d) ホベイダ‐グラブス触媒第2 世代 (30 mol%)、1,2-ジクロロエタン、電子レンジで 140  ℃、30 分
【００１３】
スキーム II
【化６】
2019504087.tif 000009
【００１４】
E11 の合成。
試薬と条件：
(a) Fmoc-AA-OH、HATU、DIPEA、DMF、室温、2 時間；
(b) 20 % ピペリジン、DMF、室温、30 分；
(c) HATU、DIPEA、DMF、室温、2 時間；
(d) ホベイダ‐グラブス触媒第2 世代 (30 mol%)、1,2-ジクロロエタン、電子レンジで 140  ℃、30 分
【００１５】
がん、自己免疫疾患及び危険性のある臓器拒絶を治療するのに使用されることがある追加の化合物としては、以下の一般的な構造によって示される：
【化７】
2019504087.tif 000010
【化８】
2019504087.tif 000011
残基 1 から 4 は表２に列記した何れのアミノ酸ビルディング・ブロック又はその改変体であっても良い。
【表２】
2019504087.tif 000012
表２：エフェクター領域（Effector Domain）内にある残基についてのアミノ酸ビルディング・ブロック。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａから１Ｃ：A18 及び E11 は強力な細胞増殖阻害剤である。（a）A18 及び E11 の化学構造。（b）A18 による異なるがん細胞における細胞増殖の阻害。（c）E11 による異なるがん細胞における細胞増殖の阻害。
【図２】図２Ａから２Ｄ：A18 及びE11 によるグルコース輸送の阻害。（a）A18 による A549 細胞における 3-O-メチル-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（b）E11 によるA549 細胞における 3-O-メチル-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（c）A18 による A549 16  細胞における 2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（d）E11 によるA549 細胞における 2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。
【図３】図３Ａから３Ｄ：A18 及びE11 によるグルコース輸送の阻害。（a）A18 によるヒト赤血球細胞における 3-O-メチル-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（b）E11 によるヒト赤血球細胞における 3-O-メチル-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（c）A18 による赤血球細胞ゴーストにおける 3-O-メチル-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（d）E11 による赤血球細胞ゴーストにおける 3-O-メチル-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。
【図４】図４Ａと４Ｂ：E11 は Glut1 の特異的阻害剤である。（a）ウエスタンブロッティングによって解析した、DLD-1 野生型及びノックアウト細胞における Glut1 タンパク質レベル。（b）E11 又はA18 による、DLD-1 野生型及びノックアウト細胞における 2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。
【図５】図５Ａから５Ｃ：E11 はFKBP 依存性である。（a）SLFの化学構造。（b）（c）E11、A18 及びFKBP リガンドによる A549 細胞における2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。
【図６】図６Ａと６Ｂ：A18 及びE11 のGlut1 への直接的な結合の同定。ウェスタン・ブロッティングで解析した A18 (a) 又はE11 (b) プル・ダウン・サンプル中の Glut1 タンパク質レベル。
【図７】図７Ａと７Ｂ：（a）A18 はHEK293T 細胞において AMPK を活性化し、S6K を阻害する。HEK293Ts を異なる時間（左）又は異なる濃度（右）の A18 で処理し、細胞溶解物をSDS-PAGE に供した後、記載した抗体でウェスタン・ブロット解析を行った。（b）A18 及び E11 は HEK293T 細胞において AMPK を活性化し、S6K を阻害する。
【図８】A18 及び E11 の抗がん作用に関して提案するメカニズム。
【図９】スクリーニング結果のヒート・マップ。スケール：0（赤）、完全な阻害；1（緑）、阻害なし。アラマー・ブルー・アッセイを用いた A549 肺がん細胞に対する毒性ヒット（toxicity hits）を求めたラパフシン・ライブラリーのスクリーニング。
【図１０】図１０Ａと１０Ｂ：A18 の HPLC（a）及び質量（b）スペクトル。
【図１１】図１１Ａと１１Ｂ：A18 の 1H-NMR（a）及び 13C-NMR（b）。
【図１２】図１２Ａと１２Ｂ：A18 の 2D COSY NMR（a）及び 2D HSQC（b）。
【図１３】図１３Ａと１３Ｂ：E11の 1 H-NMR（a）及び 13 C-NMR（b）。
【図１４】図１４：E11 の 2D COSY NMR。
【図１５】図１５Ａから１５Ｃ：高濃度のグルコースは、A18 及びE11 の抗増殖効果をわずかに無効にする。（a）（b）異なるグルコース濃度で培養したがん細胞における A18 及びE11 による細胞増殖の阻害。（c）（a）及び（b）から求めた A18 及びE11 の詳細なIC50 値。異なるグルコース濃度下で培養したがん細胞株で行ったアラマー・ブルー・アッセイに対する A18 及びE11 の効力。
【図１６】図１６Ａと１６Ｂ：A18 及び E11 によるグルコース輸送の阻害。サイトカラシンB（10 μM）、A18（3 μM）、E11（3 μM）及びDMSO対照を用いて、A549 細胞を10 分間（a）又は 1 分間（b）処理した。その後、処理した細胞におけるグルコース取り込みを 2-dexoy-D- [3H] グルコースの添加 1、3、10 及び 30 分後に測定した。
【図１７】図１７Ａと１７Ｂ：A18 及びその類縁体によるグルコース輸送の阻害。（a）100 nM の A18 及びその類縁体による A549 細胞における 2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（b）A18 及びその類縁体のアミノ酸配列。
【図１８】E11 及びその類縁体によるグルコース輸送の阻害。（a）200 nM の E11 及びその類縁体による A549 細胞における 2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。（b）E11 及びその類縁体のアミノ酸配列。
【図１９】図１９Ａから１９Ｃ：E11 は Glut1 の特異的阻害剤である。（a）（b）A549、DLD-1 野生型及び Glut1 ノックアウト細胞における A18 及び E11 による細胞増殖の阻害。（c）A549、DLD-1 野生型及び Glut1 ノックアウト細胞で行ったアラマー・ブルー・アッセイに対する A18 及びE11 の効力。
【図２０】図２０Ａから２０Ｃ：E11 は Glut1 の特異的阻害剤である。（a）ウェスタン・ブロッティングによって解析した野生型、Glut1 及びGlut3 過剰発現細胞の Glut1 及び Glut3 タンパク質レベル。（b）（c）A18 及び E11 による HEK293T、Glut1 及び Glut3 過剰発現細胞における細胞増殖の阻害。
【図２１】A18、E11 及びそれらの親和性プローブによる A549 細胞における2-デオキシ-D- [3H] グルコース取り込みの阻害。
【図２２】図２２Ａと２２Ｂ：A18-S2-ビオチン（a）及びE11-OHビオチン（b）の化学構造。A18 と E11 はGlut1 をプル・ダウンできる。
【図２３】A18 及び E11 は、72 時間以内には HEK 293T 細胞では DNA 損傷を誘導しない。HEK 293Ts を、濃度を増加させながらの A18 又は E11、陰性対照（DMSO）、及び陽性対照（ドキソルビシン）で、72 時間処理し、細胞溶解物を SDS-PAGE に供した後、記載した抗体でウェスタン・ブロット解析を行った。
【図２４】A18 及び E11 は、24 時間以内に HEK 293T 細胞においてアポトーシスを誘導しない。HEK 293Ts を異なる濃度の A18 又は E11 で処理し、細胞溶解物をSDS-PAGEに供した後、記載した抗体でウェスタン・ブロット解析を行った。
【図２５】図２５Ａから２５Ｃ：A18 及び E11 は、S 期における細胞周期の進行を阻害する。HEK 293T を、細胞周期解析のために採取する前に、DMSO（a）、5 μM の A18（b）又は 5 μM の E11（c）と共に 24 時間インキュベートした。
【図２６】A549 肺がん細胞における Glut1 及びGlut3 の過剰発現。
【図２７】ボトムアップ・アプローチ。
【図２８】図２８Ａから２８Ｄ：（a）A18 及びE11 は NFAT を阻害し、E11 ではなくA18 は SRE レポーター遺伝子シグナルを刺激する。（b）E11 は、Jurkat T 細胞において、NFAT、NF-κB 及びIL2 を阻害するが、MEF-2 又は AP-1 経路を阻害しない。（c）グルコース阻害剤は、SRE レポーター遺伝子シグナルを刺激する。（d）グルコース阻害剤は、NFAT レポーター遺伝子シグナルを阻害する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は、細胞増殖の新規阻害剤の同定に基づく。
【００１８】
本明細書で使用される場合、化合物の「治療に有効な量（therapeutically effective amount）」は、化合物の量であり、個体又は動物に投与されたときに、細胞増殖の顕著な阻害を引き起こすために、個体又は動物において、十分な高レベルにその化合物がある、化合物の量のことである。当業者には周知のように、投与の正確な用量及び頻度は、使用する本発明の具体的な化合物、治療を受ける具体的な症状、治療を受ける症状の重症度、具体的な患者の年齢、体重及び一般的な身体的状態並びに他の薬物（患者が服用している可能性がある）、に依存する。さらに、前記「治療に有効な量」を、治療を受ける患者の応答性及び／又は本発明の化合物を処方する医師の評価に依存して、減量する又は増量することができる。したがって、上記の有効 1 日量の範囲は、ガイドラインにしか過ぎない。用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的及び薬学的に許容される塩、例えば、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、且つそれに望ましくない毒性効果を与えない塩、を指す。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「がん」又は「がん性増殖」は、制御されていない異常な細胞の成長を意味し、その範囲内に、制御されていない及び異常な細胞増殖によって引き起こされる周知の疾患のすべてを含む。よく見られるがんの非限定的な例として、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、及び胃がん（gastric cancer）、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、肺がん、メラノーマ、多発性骨髄腫、白血病（例えば、 骨髄性白血病（myeloid）、リンパ球性白血病、骨髄性白血病（myelocytic）及びリンパ芽球性白血病）、非ホジキン・リンパ腫（non-hodgkin's lymphoma）、前立腺がん、直腸がん及び悪性黒色腫が含まれる。
【００２０】
本発明の化合物に加えて、当業者は、化学療法剤を、本発明の化合物での治療の前、同時又は後に使用することができることを認識するであろう。限定されるものではないが、例となる薬剤として、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、エチジウム・ブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシ・アントラセン・ジオン 、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにそれらの類縁体又はホモログを挙げることができる。治療用抗体又は他のタンパク質もまた、本発明の併用療法において想定される。
【実施例】
【００２１】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、限定するためのものではない。
【００２２】
（実施例１）
ヒト非小細胞肺がん（NSCLC）細胞株 A549 でのアラマー・ブルー細胞生存率アッセイを用いて、45,000 化合物及び 3000 プールのラパフシン・ライブラリーをスクリーニングした。化合物あたり 400 nM 又は 15 化合物のラパフシンのプールあたり 3 μM の最終濃度で、我々は A549 の有意な阻害を示した 50 以上のヒットを得た（図９）。ヒットの内、最も強力なプール 10 個を選択し、各プール中の個々の化合物それぞれを合成し、その後、それらのプール由来の各ラパフシンについて再試験を行った。幾つかの強力なラパフシン・ヒットが、A549 の細胞増殖を阻害するとして発見された。最も強力なラパフシン・ヒットを同定するために、最初のセットの活性化合物を、更に続けて用量依存的な解析に供した。2 つの最も強力なラパフシン A18 及び E11 の構造を図１ａに示す。それぞれを実験規模で再合成し、シリカ・ゲル・クロマトグラフィーで精製した後、HPLC精製し、一連の詳細な構造決定に供した（スキーム I 及び II；図１０から１４）。
【００２３】
次に、乳がん HCC1954 細胞、膵臓がん PANC10.05 細胞、白血病 Jurkat T 細胞及び結腸がん RKO 細胞を含む、いくつかの他のヒトがん細胞株において、A18 及びE11 による細胞増殖の用量依存的阻害を評価した（図１ｂ及び１ｃ）。2 つのラパフシンが、100 nM から700 nM の範囲の IC50 値で、これらのがん細胞株の生存率を有意に阻害することを見出した（表３）。加えて、A18 は、膵臓がん PANC10.05 以外のほとんどのがん細胞株において、E11 よりも強力な抗増殖活性を示す。これらの結果は、2 つのラパフシン A18 及びE11 が抗がん活性の広いスペクトルを有することを示唆した。（図１及び９；表３）
【００２４】
表３：異なるがん細胞株におけるアラマー・ブルー・アッセイに対する A18 及び E11 の効力。
【表３】
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【００２５】
2 つのラパフシン A18 及び E11 の分子標的を同定するために、一連の細胞ベース及び生化学的研究を行った。興味深いことに、A18 及びE11 の抗増殖効果は、細胞を高濃度のグルコース下で培養するとわずかに減少することが分かった（図１６）。低濃度のグルコース（1 g/L）と比較して、高濃度のグルコース（4 g/L）で培養した HEK293T 又は HeLa 細胞の場合では、A18 及び E11 の IC50 値は 2 から 3 倍増加した。グルコースの一定の取り込みは、哺乳類細胞における促進性のグルコース輸送体（GLUT）として知られている輸送体のファミリーによって媒介されるため、A18 及び E11 は GLUT を介したグルコースの輸送を阻害することによって作用すると推測された。実際、グルコース取り込みアッセイの結果は、A18 及び E11 が A549 細胞におけるグルコース輸送を有意に阻害することを示した（図１６）。さらに、A18 及び E11 によって誘導されるグルコース輸送の阻害は、アッセイを開始してから 1 分以内に起きたので（図１６ａ）、前記阻害活性が直接的かつ迅速なメカニズムを介して起こる可能性が示唆された。さらに、このアッセイによって、A549 細胞を薬物で 1 分間処理した場合、E11 については、僅か 50 ％のグルコース取り込み阻害しか達成されないことが明らかとなった。これは、E11の、その標的への結合が A18 よりも遅いこと、及び 2 つの化合物が異なる作用メカニズムを有することを示唆した。
【００２６】
次いで、異なるアミノ酸ビルディング・ブロックを用いて新しい類縁体を合成することにより、1 から 2 ラウンドの構造活性相関（SAR）の研究を行った。最初の SAR 解析（図１７及び１８）により、A18 のテトラペプチド部分でアミノ酸を置換することは全く許容できないことが明らかになった。しかしながら、E11 中、4 番目のアミノ酸 N-メチル-L-アラニンを N-メチル-L-ノルバリン又は N-メチル-L-ノルロイシンに置換すると、活性がわずかに増加した。E11-72-1-31 を、以下において E11 と命名した。
【００２７】
グルコース輸送体に対する直接作用を、グルコース輸送体によって輸送されるが、その先代謝されることがない（グルコース取り込みの初期速度の評価が可能になる）3H 標識3-O-メチルグルコースの取り込みをモニタリングすることによって測定した。このような条件下で、A18 及び E11 は、それぞれ 18.7 及び 38.2 nM の IC50 値で、この標識されたグルコース類縁体の取り込みを有意に阻害した（図２ａ及び２ｂ）。初期取り込みは、3H 標識 2-デオキシ-D-グルコース（グルコース輸送体を介して細胞に入り、ヘキソキナーゼによってリン酸化されるが、2 位の位置に酸素がないために更に代謝されることがない）の取り込みを測定することによって評価することもできる 。A18 及び E11 は、同様の効力で、この標識グルコース類縁体の取り込みを阻害した（図２ｃ及び２ｄ）。以前に報告されたグルコース輸送体阻害剤と比較して、A18 及びE11 は、50 nM 未満のIC50 値を有する最初の2つの化合物である（表１）。
【００２８】
A18 及びE11 は、幅広いスペクトラムの抗がん活性を有することが以前に示されている。もし抗がん活性がグルコース輸送体阻害を介して作用するならば、glut1 はほとんどすべての細胞型において基礎グルコース輸送を担っていて、又、glut1 は試験に供した多くのがん細胞においてアップレギュレートされていたので、A18 及びE11 の標的はGlut1 であると推測された。この仮説を試験するために、赤血球細胞（RBC）が Glut1 を唯一のグルコース輸送体として発現し、グルコース輸送の研究において頻繁に使用されてきているため、赤血球（RBC）を細胞モデルとして適用した。実際に、3H 標識 3-O-メチルグルコースの取り込みアッセイにより、A18 及び E11 がRBCにおけるグルコース輸送をそれぞれ 34.2 及び 74.2 nM の IC50 値で阻害することが示された。他の可能性を排除するために、前記グルコース取り込みアッセイを RBC 由来のゴースト（細胞内タンパク質及び酵素がすべて除去され、膜結合タンパク質（membrane-bound and membrane-associated proteins）のみが残されている）で繰り返した。興味深いことに、グルコース取り込みアッセイにより、A18 のみが、RBC 由来のゴーストにおいて、49.5 nM の IC50 で、グルコース輸送を阻害することが明らかになった。しかしながら、E11 ではその阻害活性が完全になくなり、このことは、E11 は、まず他の細胞内タンパク質に結合し、次いでグルコース輸送を阻害することを示唆した。（図２、３、１５から１８を参照）
【００２９】
現在までに、少なくとも 14 種類の異なる GLUT アイソフォームがヒト細胞で同定されてきている。次に、A18 及び E11 が GLUT1 の特異的阻害剤であるかどうかを検討することとした。この疑問に答えるために、結腸がん DLD-1 野生型及び GLUT1 遺伝子ノックアウト細胞株を細胞モデルとして選択した（図４ａ）。興味深いことに、3H 標識 2-デオキシ-D-グルコース取り込みアッセイ及びアラマー・ブルー細胞生存率アッセイによって、両方の細胞系において、A18 がグルコース輸送及び細胞増殖をここでも強力に阻害すること、が示された。しかしながら、E11 は、DLD-1 GLUT1 遺伝子ノックアウト細胞において全く阻害を示さず、野生型細胞において阻害活性を維持した（図４ｂ及び１９）。このことは、A18 ではなく、E11 が GLUT1 の特異的阻害剤であることを示唆した。がんに最も関連する GLUT は Glut1 及び Glut3 である。さらなる根拠を得るために、HEK 293T 細胞で Glut1 及び Glut3 を過剰発現させ、アラマー・ブルー細胞生存アッセイを再度行った。予想通り、E11 は GLUT3 過剰発現細胞において全く阻害を示さなかったが、GLUT1 過剰発現細胞においては部分的な阻害活性が維持された（図２０及び表４）。このことは、E11 が GLUT1 の特異的阻害剤であるという仮説を強く支持している（図４、１９、２０、２６；表４を参照）。
【００３０】
表４：HEK293T 及びそのGlut1 又は Glut3 過剰発現細胞におけるアラマー・ブルー・アッセイに対する A18 及びE11 の効力
【表４】
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【００３１】
ラパフシン・ライブラリーの設計の根底にある原則を考慮しながら、次に A18 又は E11 によるGLUT1 の阻害が FKBP に依存するかどうかを検討した。FKBP 依存性であることの一つの証明となる特徴は、その細胞効果が、FK506 及びラパマイシンについて示されてきているような生物活性を持たない又はそれから独立している（orthogonal）別の無関係な FKBP 結合リガンドによって、拮抗されることである。理由は分からないが、FK506及びラパマイシンの両方は、3H 標識 2-デオキシ-D-グルコース取り込みについて、 A18 又は E11 の阻害効果に拮抗することができなかった（図５ｂ）。しかし、FKBP（SLF）の合成リガンド（図５ａ）は、E11 の阻害活性を有意に損なわせ（図５ｃ）、このことは E11 の活性が FKBP を必要とすることを示唆している。
【００３２】
GLUT1 が A18 及び E11 の標的である可能性が高いことを示した後、GLUT1 に対する A18 及び E11 の直接的な相互作用を調べた。種々の位置を介した一連のビオチン又はジアズリン・アルキン・ラパフシン・コンジュゲートを合成した。グルコース取り込みアッセイを行うと、ほんの少数のコンジュゲートのみが A549 細胞において阻害活性を保持していることが示された（図２１）。最も強力なビオチン・ラパフシン・コンジュゲートを用いて（図２２）、プルダウン・アッセイを行い、続いて抗 GLUT1 抗体を用いたウエスタン・ブロットを行った。前記ビオチン・ラパフシン・コンジュゲートは、RBC 由来のゴースト細胞溶解物から GLUT1 をプル・ダウンできることが分かった（図６）。重要なことは、ビオチン・ラパフシン・プローブの GLUT1 への結合は、ラパフシンと競合することである。さらに、A18 プローブのGLUT1 への結合は E11 によって競合せず、その逆でも競合せず、2 つのラプフシンが異なる結合位置を有する可能性があることを示唆している。最後に、予想どおり、ラパフシン・プローブの GLUT1 への結合は、FK506 及びラパマイシンによって競合することがなかった。まとめると、プルダウン・アッセイは、ラパフシン A18 及び E11 が GLUT1 に直接結合できることを示した。（図６、図２１、図２２及び図２７）
【００３３】
A18 及び E11 が細胞死又は異なる経路を介してがん細胞を死滅させるかどうかを調べた。HEK 293T 細胞におけるリン酸化 -p53 レベル及び活性化カスパーゼ 3、7 及び 9 の増加は無く、A18 及び E11 が DNA 損傷又はアポトーシスを誘導しないことを示唆した（図２３及び２４）。しかしながら、フロー・サイトメトリー解析を行うと、A18 及び E11 処理によって細胞周期停止が引き起こされたことが明らかになった。A18 及び E11 処理によって、S 期にある細胞が約 10 ％多くなった。この発見は、グルコース輸送体阻害剤による処理が S 期の細胞周期停止を引き起こすことを初めて示したものである。
【００３４】
A18 及び E11 処理が重要な細胞増殖シグナル伝達タンパク質に影響を及ぼすかどうかを次に検討した。ウェスタン・ブロット解析を行うと、A18 及び E11 が AMPK のリン酸化を誘導し、mTOR 阻害を引き起こすことができることを明らかになった。しかし、A18 は ERK、AKT 又は JNK のリン酸化には影響を及ぼさない（図７）。以前に報告されたように、AMPK は、ATP 減少とその後のがん細胞阻害との間で鍵となるリンクとして作用する可能性が高い。（図７及び図２３から図２５）。ここで報告されたデータに基づいて、A18 及び E11 に関する作業モデルが図８に概説されているように提案された。A18 又は E11 処理後、がん細胞におけるグルコース供給が劇的に減少し、続いていくつかの重要な解糖酵素及び代謝産物（ATP）が減少した。これらは、AMPK のリン酸化のアップレギュレーション及び S6K のリン酸化のダウンレギュレーションをもたらした。これらの変化はすべて、細胞周期停止、ネクローシス又は老化を誘導し、最終的にがん細胞の阻害を誘導した。（図８）
【００３５】
A18 及び E11 の両方が、免疫抑制活性を示し、NFAT レポーター遺伝子の活性化及び IL-2 産生を阻害する（例えば、図２８参照）。このように、A18 及び E11 は、臓器移植拒絶及びあらゆる種類の自己免疫疾患を治療することに用途を有する免疫抑制剤として使用することができる。限定されるものではないが、治療することができる免疫関連疾患の例は以下を含む：急性播種性脳脊髄炎（ADEM）、アジソン病（Addison's disease）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ増殖症候群（ALPS）、自己免疫性多内分泌腺／多腺性症候群（Autoimmune polyendocrine/polyglandular syndrome）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、バロー病（Balo disease）、ベーチェット病（Behcet disease）、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スプルー疱疹状皮膚炎（Celiac sprue-dermatitis herpetiformis）、慢性疲労免疫不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性ニューロパチー、瘢痕性類天疱瘡（Cicatricial pemphigoid） 、セリアック病、寒冷凝集素症（Cold agglutinin disease）、CREST 症候群、クローン病（Crohn’s disease）、嚢胞性線維症、デゴス病（Degos disease）、皮膚筋炎、糖尿病（I型又は若年発症）、早期発症型認知症、湿疹、エンドトキシン・ショック、本態性混合型クリオグロブリン血症（Essential mixed cryoglobulinemia）、家族性地中海熱、線維筋痛症、線維筋炎、グッドパスチャー症候群（Goodpasture's syndrome）、グレーブス病（Graves' disease）、ギラン・バレー症候群（Guillain-Barre syndrome (GBS)）、橋本甲状腺炎、化膿性汗腺炎（Hidradenitis suppurativa）、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、IgA 腎症、ランバート・イートン筋無力症候群（Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome）、白血病、扁平苔癬、メニエール病（Meniere disease）、混合性結合組織病（Mixed connective tissue disease）、多発性硬化症、多相性散在性脳脊髄炎（Multiphasic disseminated encephalomyelitis）、重症筋無力症、視神経脊髄炎（Neuromyelitis Optica）、腫瘍随伴症候群（Paraneoplastic Syndromes）、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血 、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、プラーク乾癬（Plaque Psoriasis）、乾癬性関節炎、レイノー現象（Raynaud phenomenon）、ライター症候群（Reiter syndrome）、血管形成術後の再狭窄、リウマチ熱、関節リウマチ、リウマチ様乾癬（Rheumatoid psoriasis）、サルコイドーシス、強皮症、敗血症、セザリー病（Sezary’s disease）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、スティッフ−パーソン症候群（Stiff-person syndrome）、全身性エリテマトーデス（SLE）を含むループス、高安動脈炎、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られている）、移植又は同種移植片拒絶、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、移植片対宿主病、膿疱性乾癬、及びウェゲナー（Wegener）肉芽腫症（現在、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）と名付けられている）、炎症性腸疾患、急性壊死性出血性白質脳炎（Acute necrotizing hemorrhagic leukoencephalitis）、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、抗GBM／抗 TBM 腎炎、抗リン脂質症候群（APS）、自己免疫性血管性浮腫（Autoimmune angioedema）、自己免疫性無形成性貧血（Autoimmune aplastic anemia,）、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（AIED）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経性ニューロパチー（Axonal & neuronal neuropathies）、キャッスルマン病（Castleman disease）、セリアック病、シャーガス病（Chagas disease）、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP)）、慢性再発性多発性骨髄炎（Chronic recurrent multifocal ostomyelitis (CRMO)）、チャーグ−ストラウス症候群（Churg-Strauss syndrome）、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コガン症候群（Cogans syndrome ）、先天性心臓ブロック（Congenital heart block）、コクサッキー心筋炎（Coxsackie myocarditis）、CREST 病（CREST disease ）、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎（Dermatitis herpetiformis）、デビック病（視神経脊髄炎）（Devic’s disease）、円盤状ループス、ドレスラー症候群（Dressler’s syndrome）、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群（Evans syndrome）、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、多発血管炎性肉芽腫症（GPA）（以前はウェゲナー肉芽腫症と呼ばれていた）、橋本脳炎（Hashimoto’s encephalitis）、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病（Henoch-Schonlein purpura）、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgG4関連硬化性疾患（IgG4-related sclerosing disease）、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（I 型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群（Kawasaki syndrome）、ランバート−イートン症候群（Lambert-Eaton Syndrome）、白血球破砕性血管炎（Leukocytoclastic vasculitis）、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状 IgA 病（Linear IgA disease (LAD)）、ループス（SLE）、ライム病（Lyme disease）、慢性（chronic） 、顕微鏡的多発血管炎、モーレン潰瘍（Mooren’s ulcer）、ムッハ−ハーベルマン病（Mucha-Habermann disease）、筋炎、ナルコレプシー、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡（Ocular cicatricial pemphigoid）、視神経炎、パリンドローム・リウマチ、PANDAS（小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害（Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus））、傍腫瘍性小脳変性症（Paraneoplastic cerebellar degeneration）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、パリー・ロンベルグ症候群（Parry Romberg syndrome）、パーソネイジ−ターナー症候群（Parsonnage-Turner syndrome）、扁平部炎（Pars planitis (peripheral uveitis)）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎（Perivenous encephalomyelitis）、POEMS 症候群、I, II, & III 型多腺性自己免疫症候群、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆（Pure red cell aplasia）、反応性関節炎、反射交感神経ジストロフィー（Reflex sympathetic dystrophy）、再発性多発軟骨炎、むずむず脚症候群（Restless legs syndrome）、後腹膜線維症、リウマチ熱、シュミット症候群（Schmidt syndrome）、強膜炎、精子 & 精巣の自己免疫（Sperm & testicular autoimmunity）、亜急性細菌性心内膜炎（SBE）、スザック症候群（Susac’s syndrome）、交感性眼炎、血小板減少性紫斑病（TTP）、トロサ−ハント症候群（Tolosa-Hunt syndrome）、横断性脊髄炎、I 型糖尿病、未分化型結合組織病（UCTD）及び水疱性皮膚症。
【００３６】
本発明を上記の実施例を参照して説明したが、本発明の主旨及び範囲内において、改変及び変形が包含されることは理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【国際調査報告】
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