(57)【要約】  ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８がチック障害、および、大脳基底核障害の治療または予防に有益な効果をもたらすという驚くべき発見をした。本発明は、被検体の運動障害を治療または予防する方法を提供する。方法は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の有効量の細胞を被検体に投与することを含む。
2019521157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の運動障害を治療または予防する方法であって、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の有効量の細胞を被検体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８は、配列番号３に記載の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与される前記ＰＳ１２８の前記細胞の量は、少なくとも１日当たり１０６コロニー形成単位である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＳ１２８は、細菌全体の形態で用いることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＳ１２８の細菌は、生存していているかまたは生存していない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＳ１２８は、細菌の部分的な細胞、または、生存細胞と一部または全体が死んでいる細胞との細胞混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＳ１２８は、組成物または混合物として調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
投与される前記ＰＳ１２８の細胞の量は、１日当たり１０６〜１０１４コロニー形成単位である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物または混合物は、栄養または医薬組成物または混合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物または混合物は、医薬品、食品、健康食品、栄養剤、または、病人向けの特別食である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物または混合物は、カプセル、錠剤、ドリンク、粉末、または、乳製品として調製される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＳ１２８は、経口投与用である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記運動障害は、大脳基底核疾患、本態性振戦、レビー小体疾患、運動低下疾患、さまざまな種類の末梢神経障害、ジストニア、無動症を含む運動低下症、運動異常、または、チック障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記大脳基底核疾患は、片側バリスムス、ジストニア、精神刺激薬中毒、ハンチントン病、パーキンソン病、トゥレット症候群、または、強迫性障害である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記チック障害は、トゥレット症候群、ＤＯＩによるチック関連障害、慢性運動障害、または、発声チック障害である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＳ１２８は、大脳基底核における神経伝達物質であるドーパミンを調整する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記神経伝達物質は、ドーパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、および、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）からなるグループから選ばれる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＰＳ１２８は、前頭前皮質におけるドーパミンの代謝回転率を高める、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、運動障害を防止または治療する方法に関する。より詳しくは、本発明は、乳酸菌を用いて、チック障害、および、大脳基底核疾患を予防または治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
大脳基底核は、脊椎動物の前脳の基底部にある線条体、淡蒼球、黒質、および、視床下核を含む複数の皮質下核からなる。大脳基底核は、皮質、視床、および、脳幹を含む脳の他のいくつかの部位と強固に相互接続している。大脳基底核は、随意運動、手続き学習、習慣的行動、眼球運動、認識、および、感情の制御といったさまざまな大脳機能に関与していることが多くの研究で示されている。大脳基底核の機能障害には非常に多くの神経学的状態が関わっており、行動制御に影響を与える。大脳基底核の機能障害は、例えば、片側バリスムス（視床下核の損傷によって身体の片側の動きが制御できなくなる）、ジストニア（代謝、血管、および、構造的異常による不随意運動、および、意図的動作の緩慢）、精神刺激薬中毒、および、ハンチントン病（主に線条体の損傷）などの多動障害；パーキンソン病（黒質緻密部におけるドーパミン生成細胞の変性）などの多動障害；および、トゥレット症候群（非運動ループの機能障害によるチック障害）、強迫性障害（ＯＣＤ、思考または行為の制御不能）などの非運動障害などが挙げられる。（Maya Bronfeld、ニューロサイエンス＆バイオビヘヴィオラル・レビュー３７（２０１３年）１１０１〜１１１９；Sean C. Godar, ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・メソッド２３８（２０１４年）５４〜６９；J. F. Cheer, ニューロファーマコロジー３８（１９９９年）５３３〜５４１；A. M. Ouagazzal, ニューロサイコファーマコロジー（２００１）第２５巻、Ｎｏ．４、５６５〜５７５；Toshihide Kuroki,ブレインリサーチ９２７（２００３年）２１６〜２２１；およびJunji Ichikawa、ブレインリサーチ６９８（１９９５年）２０４〜２０８）。
【０００３】
線条体は、使用する経路を選択する役割を果たす。線条体は、要求される運動を示す皮質からの入力を受け、その入力を、刺激する必要がある運動皮質の領域のための直接路と、抑制する必要がある領域のための間接経路とを活性化する信号に変換する。大脳基底核の主な役割は、興奮と抑制とのバランスを取ることであるということが研究によりわかっている。運動皮質の活動の質は、直接路と間接路という２つの異なる経路を用いて調整される。どちらの経路も皮質から大脳基底核を通り、視床を介して運動皮質へと戻るが、それぞれ逆の効果をもたらす。直接路は、運動皮質へと戻る興奮性信号を視床に送らせて活性を高める。直接路から信号を受けた運動皮質の一部によって制御される筋肉は、より活性化され、収縮することによって、所望の運動を促進する。間接路は、運動皮質への抑制信号を視床に送らせて活性化を抑制する。抑制信号を受けた運動皮質の領域によって制御される筋肉は弛緩し、筋動作を抑制するので運動を妨げることになる。
【０００４】
ジルドラトゥレット症候群（ＧＴＳ）は、トゥレット症候群（ＴＳ）またはトゥレット障害とも呼ばれ、遺伝性の神経障害が小児期に発症し、多くの場合、強迫性障害（ＯＣＤ）および注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）と共存するか、または、併発する。トゥレット症候群の患者は、多種類の運動性チックと少なくとも１つの音声チックとを発症するという特徴を有する。チックには、突然出現し、素早く繰り返される非律動性の運動（運動性チック）、または、不連続な筋肉の動きを含む発声（音声チック）がある。トゥレット症候群のはっきりした原因は、まだ知られていないが、多くの研究は、ドーパミンなどの脳内化学物質または神経伝達物質の異常活動を含む、脳の視床、大脳基底核、および、前頭皮質の機能障害によってチックが生じることを示している。
【０００５】
パーキンソン病は、運動を制御する脳の部位における神経細胞またはニューロンが損なわれたおよび／または死んだときに発症する。一般的に、ニューロンは、ドーパミンとして知られる重要な脳内化学物質を産生するが、死ぬか損なわれたニューロンは、ドーパミンをほとんど産生しない。ドーパミンが欠乏すると、パーキンソン病特有の運動障害をもたらす。
【０００６】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、グラム陽性菌の一種であり、一般的に発酵食品の生産に用いられる。食事、および、臨床用途における乳酸菌の利点は、広く研究されている。しかしながら、乳酸菌の有効性は、菌種によって異なる。食品担体の生産および製造方法がプロバイオティック株の性質に影響を及ぼし、臨床的介入の研究結果にも影響を与えることを多くの研究が示している。最近の研究では、腸内微生物叢が異なる経路（神経、免疫、および、内分泌）によって中枢神経系（ＣＮＳ）と通じていることがわかっており、腸−脳軸（ＧＢＡ）という概念が発表されている。「サイコバイオティクス」とも呼ばれる特定の乳酸菌株は、脳の機能に影響を与え、腸−脳軸を介して行動変化を改善する。
ラクトバチルス・ヘルベティカスＲＯＯ５２は、齧歯動物における不安様行動を抑制することがわかっている（Ohland CL, Kish L, Bell H, Thiesen A, Hotte N, Pankiv E, Madsen KL（２０１３年）マウスの行動へのラクトバチルス・ヘルベティカスの効果は、食餌および遺伝子型に依存し、腸内微生物叢の変化と相関する。サイコニューロンドクリノロジー３８：１７３８〜１７４７）。ラクトバチルス・ラムノサスＪＢ−１は、迷走神経を介して、マウスにおけるストレスによるコルチコステロンの上昇、不安およびうつ病関連行動、および、ＧＡＢＡ受容体の発現を抑制し得る（Bravo JA, Forsythe P, Chew MV, Escaravage E, Savignac HM, Dinan TG, Bienenstock J, Cryan JF（２０１１年）乳酸菌株の経口摂取は、迷走神経を介して、マウスにおける情動行動、および、ＧＡＢＡ受容体の発現を制御する。米国科学アカデミー紀要１０８：１６０５０〜１６０５５）。加熱殺菌したラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３は、ラットにおける遠心性胃迷走神経活動、および、遠心性腸迷走神経活動のいずれをも高める。ラクトバチルス・ロイテリは、腸の知覚神経におけるイオンチャネルを標的とすることにより疼痛知覚に影響を与える可能性がある（Horii Y, Nakakita Y, Misonou Y, Nakamura T, Nagai K（２０１５年）セロトニン受容体は、加熱殺菌したラクトバチルス・ブレビスＳＢＣ８８０３によって誘導される自律神経伝達、および、胃腸通過における変化の仲介を果たす。Benef Microbes６（６）：８１７〜２２）。
【０００７】
ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４は、ラットモデルにおける血漿コルチコステロンの濃度を低下させ、内臓痛を緩和することがわかっている（McKernan DP, Fitzgerald P, Dinan TG, Cryan JF.（２０１０年）。プロバイオティック・ビフィドバクテリウム・インファンティス３５６２４は、ラットにおける内臓性抗侵害効果を示す。Neurogastroenterol Motil  ２２（９）：１０２９〜３５，ｅ２６８）。ビフィドバクテリウム・ロングム１７１４は、ストレス、不安、および、うつ病関連行動を緩和し、ビフィドバクテリウム・ブレーベ１２０５は、不安関連行動全般を緩和し、体重減少を抑制する（Savignac HM, Kiely B, Dinan TG, Cryan JF.（２０１４年）ビフィズス菌は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのストレス関連行動および生理に株特異性効果をもたらす。Neurogastroenterol Motil、１１月号；２６（１１）：１６１５〜２７、ｄｏｉ：１０．１１１１／ｎｍｏ．１２４２７）。うつ病は、脳内の神経伝達物質であるセロトニンの欠乏により引き起こされ得る。うつ病の他の原因は、脳内のドーパミンの欠乏である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
一方、パーキンソン病は、神経細胞またはニューロンの損傷および／または死を招き、トゥレット症候群は、ドーパミン過剰、または、シナプス後ドーパミン受容体の過感受性などのドーパミン機能障害を招く。うつ病の原因およびメカニズムがトゥレット症候群およびパーキンソン病とは異なるのは明らかであり、したがって、トゥレット症候群およびパーキンソン病の治療、予防、および／または、阻害を、うつ病の治療、予防、および／または、阻害から導き出すことはできない。
【０００９】
先に述べたように、ビフィドバクテリウム株は、病気または疾患の治療または予防に対するさまざまな機能を発揮し、有益な効果をもたらす。よって、ビフィドバクテリウム株の新たな機能を探究することが求められている。
【００１０】
本発明により、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８（以下“ＰＳ１２８”と称する）が運動障害の治療または予防に効果を示すことが明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、被検体の運動障害を治療または予防する方法を提供する。方法は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の有効量の細胞を被検体に投与することを含む。方法は、さらに、被検体の運動障害を治療または予防するための製剤の製造における、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の使用を提供する。いくつかの実施形態では、製剤は、薬剤、健康食品、または、食品である。
【００１２】
一実施形態では、ＰＳ１２８は、配列番号３に記載の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する。一実施形態では、ＰＳ１２８は、生存していているかまたは生存していない可能性のある細菌全体の形態で用いられ得る。一実施形態では、ＰＳ１２８は、組成物または混合物として調製される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、運動障害は、これらに限定されないが、大脳基底核疾患、本態性振戦、レビー小体疾患、運動低下疾患、さまざまな種類の末梢神経障害、ジストニア、運動低下症（無動症を含む）、運動異常、および、チック障害を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ラクトバチルス・プランタルム株のＥＲＩＣ−ＰＣＲ法によるプロファイルを示す電気泳動写真を示す。Ｍは、ＤＮＡラダー、ＡＴＣＣ１４９１７Ｔは、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルム、ＢＣＲＣ１７６３８Ｔは、ラクトバチルス・プランタルム亜種アルゲントラテンシスを示す。
【図２Ａ】ＭＰＴＰを腹腔内注射した後のポールテストの結果を示す（ｎ≧６，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２Ｂ】ＭＰＴＰを腹腔内注射した後のナロービームテストの結果を示す（ｎ≧６，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２Ｃ】ＭＰＴＰを腹腔内注射した後のロータロッドテストの結果を示す（ｎ≧６，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３Ａ】黒質領域におけるＴＨ陽性細胞の免疫蛍光染色写真を示す。
【図３Ｂ】黒質領域におけるＴＨ陽性細胞を数量化したグラフを示す。
【図４】３５分間の二次処置の直後に数えたＢＭＣの数を示す。
【図５Ａ】ラットの前頭前皮質における総ドーパミン（ＤＡ）レベルを示す。
【図５Ｂ】ラットの前頭前皮質における総ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）レベルを示す。
【図５Ｃ】ラットの前頭前皮質における総ホモバニリン酸（ＨＶＡ）レベルを示す。
【図５Ｄ】ラットの前頭前皮質における神経伝達物質の代謝回転率（ＤＯＰＡＣ＋ＨＶＡ／ＤＡ）を示す。
【図６Ａ】ラットの線条体におけるＤＡＴの発現量を示す。
【図６Ｂ】ラットの線条体におけるＤＡＲＰＰのリン酸化レベルを示す。
【図６Ｃ】ラットの線条体におけるＥＲＫのリン酸化レベルを示す。
【図７Ａ】ラットの前頭前皮質におけるＤＡＴの発現量を示す。
【図７Ｂ】ラットの前頭前皮質におけるＤＡＲＰＰのリン酸化レベルを示す。
【図７Ｃ】ラットの前頭前皮質におけるＥＲＫのリン酸化レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８が運動障害、特にチック障害、および、大脳基底核障害の治療または予防に有益な効果をもたらすという驚くべき発見をした。
【００１６】
本願明細書中で特に定義されていない用語は、開示内容に照らして当業者によって与えられる意味をもつと理解されたい。しかしながら、特に指定しない限り、本願明細書中で用いられる以下の用語は、以下の慣例に示される意味を有する。
【００１７】
接続詞「および」で結ばれた言葉は、それらの言葉の１つ１つがグループ分けされた中に存在するのではなく、特に指定のない限り「および／または」として読むべきである。同様に、接続詞「または」で結ばれた言葉は、グループ内で互いを排除するものではなく、特に指定のない限り「および／または」として読むべきである。さらに、本発明の要素または構成要素などの項目は、単数形で記載またはクレームされてよいが、単数であることが明確に示されているのでない限り、複数も本発明の範囲内であることが意図される。
【００１８】
本願明細書中で使用される単数を表す冠詞は、特に明記しない限り単数および複数のどちらも意味する。したがって、単数形を表す冠詞（必要に応じて文法上変化する）は、１つ以上を意味する。
【００１９】
本願明細書中で用いられる用語「障害」は、「疾病」または「疾患」と置き換えられる。
【００２０】
「治療」とは、特定の疾病または疾患の少なくとも１つの兆候、症状、徴候、または、影響を低下または減少させることを意味するものと理解される。本願明細書中で用いられる「予防」とは、発病率もしくは発病度を制限、低下させるか、または、疾病もしくは疾患の少なくとも１つの兆候もしくは徴候の進行を阻害することであると理解される。
【００２１】
用語「プロバイオティクス」とは、適切な量で投与されたとき宿主に健康的効果をもたらす微生物として当技術では認識されている。プロバイオティクス微生物は、毒性のないこと、生存度、付着性、および、有益な効果に関していくつかの要件を満たさなくてはならない。これらのプロバイオティクスの特徴は、同種の細菌においてさえも株に依存する。
【００２２】
本願明細書中で用いられる用語「医薬的に許容される」とは、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または、妥当な利益／危険比に比例する他の問題もしくは合併症なしで被検体（ヒトまたはヒトでない動物）の組織と接触して用いるのに適した、健全な医学的判断の範囲内での化合物、材料、組成物、および／または、剤形のことを指す。担体、賦形剤などは、それぞれが製剤の他の成分と共存できるという意味において「許容される」ものでなければならない。適切な担体、賦形剤などは、標準的な製薬の教科書で確認することができる。
【００２３】
用語「食用担体」とは、被検体の組織と接触して用いるのに適した化合物、材料、組成物、および／または、剤形のことを指す。各担体もまた、製剤の他の成分と共存できるという意味において「許容される」ものでなければならない。
【００２４】
本願明細書中で用いられる用語「有効量」とは、健全な医学的判断の範囲内において、治療される症状が著しく快方に向かうために十分多く、深刻な副作用を避けるために十分少ない（妥当な利益／危険比での）組成物における各株のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の量を指す。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、被検体の運動障害を治療または予防する方法を提供する。方法は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の有効量の細胞を被検体に投与することを含む。本発明は、また、被検体の運動障害を治療または予防するための製剤の製造における、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の使用を提供する。本発明は、さらに、被検体の運動障害を治療または予防するためのＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２で寄託されたラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８を提供する。いくつかの実施形態では、製剤は、薬剤、健康食品、または、食品である。
【００２６】
一実施形態では、ＰＳ１２８は、配列番号３に記載の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する。
【００２７】
一実施形態では、ＰＳ１２８は、生存していているかまたは生存していない可能性のある細菌全体の形態で用いられ得る。好ましくは、細菌細胞は、生きているまたは生存細胞として存在する。一実施形態では、ＰＳ１２８は、細菌の部分的な細胞、または、生存細胞と一部または全体が死んでいる細胞との細胞混合物であり得る。
【００２８】
一実施形態では、ＰＳ１２８は、組成物または混合物として調製される。
【００２９】
運動障害は、これらに限定されないが、大脳基底核疾患、本態性振戦、レビー小体疾患、運動低下疾患、さまざまな種類の末梢神経障害、ジストニア、運動低下症（無動症を含む）、運動異常、および、チック障害を含む。
【００３０】
一実施形態では、大脳基底核障害は、大脳基底核として知られる脳内の神経核群が望ましくない運動を適切に抑制できなくなるか、または、運動機能を開始するよう上位運動ニューロン回路をきちんと準備しなくなる場合に生じる物理的機能障害群を指す。大脳基底核からの出力が増えると、視床皮質投射ニューロンを阻害する。このニューロンの適正な活性化または不活化は、適正な運動のための不可欠な要素である。もし何かによって大脳基底核の出力が過剰になった場合、視床皮質投射ニューロンが過度に阻害されて随意運動を開始できなくなる。このような疾患は、運動低下障害として知られる。しかしながら、大脳基底核からの出力を異常に低下させる疾患は、視床皮質投射ニューロンの抑制の相対的欠如をもたらす。このような状況になると、望ましくない運動を抑制できなくなる。このような疾患は、多動障害として知られる。いくつかの実施形態では、大脳基底核疾患は、これらに限定されないが、片側バリスムス（視床下核の損傷によって身体の片側の動きが制御できなくなる）、ジストニア（代謝、血管、および、構造的異常による不随意運動、および、意図的動作の緩慢）、精神刺激薬中毒、ハンチントン病（主に線条体の損傷）、パーキンソン病（黒質緻密部におけるドーパミン生成細胞の変性）、トゥレット症候群（非運動ループの機能障害によるチック障害）、および、強迫性障害（ＯＣＤ）（思考または行為の制御不能）を含む。
【００３１】
一実施形態では、運動障害は、パーキンソン病、ＭＰＴＰ誘導運動障害、運動の緩慢さおよび困難、または、慢性運動障害である。
【００３２】
一実施形態では、チック障害は、トゥレット症候群、ＤＯＩ（２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン）によるチック関連障害、慢性運動障害、または、発声チック障害である。
【００３３】
一実施形態では、ＰＳ１２８は、宿主の中枢神経系におけるドーパミン作動系を保護する。さらなる実施形態では、ＰＳ１２８は、ＭＰＴＰによるドーパミン作動性細胞の変性を防ぎ、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の発現量を増加させる。
【００３４】
一実施形態では、ＰＳ１２８は、大脳基底核におけるドーパミン神経伝達を調整する。さらなる実施形態では、ＤＯＩは、皮質ドーパミンの増加を誘導するが、ＰＳ１２８を投与することによって、この傾向が調整され、前頭前皮質におけるドーパミン代謝産物の総量、および、ドーパミンの代謝回転率が著しく上昇する。好ましくは、神経伝達物質は、ドーパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、および、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）からなるグループから選ばれる。
【００３５】
他のさらなる実施形態では、ＰＳ１２８は、前頭前皮質および線状体におけるドーパミン輸送体の発現量を増加させる。さらに、ＤＯＩの処置の間にドーパミンの下流のシグナル伝達（細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、および、ドーパミンおよびｃＡＭＰ調節型リンタンパク質（ＤＡＲＰＰ））活性が著しく弱まるが、ＰＳ１２８の投与後、ラットの線条体および前頭前皮質におけるドーパミンの下流のシグナル伝達活性が増えた。さらなる他の実施形態では、ＰＳ１２８は、運動障害を改善し得るドーパミン系安定剤（ＤＳＳ）としての能力を示すとともに、宿主の中枢神経系の神経保護的効果を示す。ＰＳ１２８は、ドーパミン伝達を調節し、優勢なドーパミン作動状態に応じて機能亢進および機能抑制のどちらも調整し得る。
【００３６】
Ｐ１２８の細胞は、投与に適したいかなる形態、特に、経口投与に適した形態の組成物または混合物として調製され得る。形態は、例えば、固体、半固体、液体、および、粉末を含む。
【００３７】
ＰＳ１２８細胞の投与量は、上述のようなＰＳ１２８の株の１日当たり少なくとも１０６コロニー形成単位、１日当たり少なくとも１０７コロニー形成単位、１０８コロニー形成単位、または、１０９コロニー形成単位である。
【００３８】
好ましくは、ＰＳ１２８細胞の投与量は、１日当たり１０６〜１０１４、１０７〜１０１４、１０８〜１０１４、１０９〜１０１４、１０１０〜１０１４、１０１１〜１０１４、１０１２〜１０１４、１０１２〜１０１４、１０１３〜１０１４、１０６〜１０１３、１０６〜１０１２、１０６〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０９、１０６〜１０８、１０６〜１０７、１０７〜１０１３、１０７〜１０１２、１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０７〜１０１２、１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０７〜１０９、１０７〜１０８、１０８〜１０１３、１０８〜１０１２、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０８〜１０９、１０９〜１０１３、１０９〜１０１２、１０９〜１０１１、または、１０９〜１０１０コロニー形成単位である。
【００３９】
ＰＳ１２８の組成物または混合物の例としては、食品、特に、乳製品を含む栄養組成物または混合物が挙げられる。
【００４０】
組成物または混合物は、例えば、カプセル、錠剤、飲料、粉末、または、乳製品であり得る。任意で、他の乳酸菌株が存在してもよい。好ましくは、本願の栄養組成物または混合物は、ベビーフード、乳児用調合乳、または、乳児用フォローオン調合乳である。好ましくは、本願の組成物または混合物は、栄養補助食品、医薬品、食品、健康食品、栄養強化食品、または、病人向けの特別食である。
【００４１】
本発明の栄養組成物または混合物は、補助食品、および、機能性食品を含む。「補助食品」とは、通常食品に用いられる化合物から生成される製品であって、錠剤、粉末、カプセル、ポーション、または、食物とは通常関係のない他の形状をなし、被検体の健康に有益な効果をもたらす。「機能性食品」とは、被検体の健康に有益な効果をもたらす食物である。特に、補助食品、および、機能性食品は、疾病、例えば、慢性疾患に効く、または、疾病から守ってくれる生理学的効果を有し得る。
【００４２】
本発明による組成物または混合物が栄養補助食品である場合、水、ヨーグルト、牛乳、または、果汁などの適切な飲料液と混ぜるか、または、固体もしくは流動食と混ぜるなどして投与し得る。その場合、栄養補助食品は、錠剤、丸薬、カプセル、トローチ剤、顆粒、粉末、懸濁液、小袋、トローチ、菓子、バー、シロップ、および、通常は単位用量形態である対応する剤形であり得る。好ましくは、栄養補助食品は、栄養補助食品を調製する従来の工程で製造される錠剤、トローチ剤、カプセル、または、粉末の形態で投与される、本発明の組成物または混合物を含む。
【実施例】
【００４３】
図面の簡単な説明に続く発明を実施するための形態は、以下の実施例でより詳細に説明される。言うまでもなく、これらの実施形態は、例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。特に明記しない限り、パーセントは、重量パーセントで示される。
【００４４】
実施例１  ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８の単離および遺伝子型決定
ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムＰＳ１２８（以下ＰＳ１２８と称する）を台湾の伝統的なカラシナの発酵食品フーツァィから単離し、特殊な人工培地で培養した。ＰＳ１２８の１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子（配列番号３）を、ＰＣＲ増幅した１６Ｓ  ｒＤＮＡの約１０００個のヌクレオチドを直接配列決定することで分析した。配列番号１および２のプライマーを用いた。以下の表１に示す条件の下で、ゲノムＤＮＡ抽出、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＰＣＲによる増幅、ＰＣＲ産物の精製、および、精製したＰＣＲ産物の配列決定を行った。
【００４５】
得られた配列を国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のオンライン(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)で入手したアラインメントソフトウエアに入力し、手作業でアラインメントし、フィルミクテス門に属する微生物の代表的な１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と比較した。比較のための１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩのデータベースからオンラインで得た。分析の結果として、ＰＳ１２８の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と最も近い１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する微生物を以下の表２に示す。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
ＰＣＲ条件：９８℃、２．５分；１５サイクル（９８℃、１５秒；５０℃、３０秒；７２℃、２０秒）；７２℃、５分；４℃、無限（∞）。
【００４８】
【表２】
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【００４９】
ＰＳ１２８の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列は、部分的に、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムと最も高い類似性を示している。したがって、ＰＳ１２８は、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムの株であるものの、ラクトバチルスの新種であることを表している。
【００５０】
Ｐ１２８は、２０１４年３月３１日に、ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクションにブダペスト条約に基づき寄託され、国際寄託機関によってＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２８６３２が付与されている。この生物材料は、さまざまな生死判別試験に合格したものである。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
実施例２  ＥＲＩＣ−ＰＣＲ法によるプロファイルを用いたＰＳ１２８の新規な菌株の同定
高い配列相同性を有する亜種の細菌をさらに識別するためにＥＲＩＣ−ＰＣＲ法を実施した。表３に示す条件の下で、ラクトバチルス・プランタルム株のＥＲＩＣ−ＰＣＲ分析が実施された。ＰＳ１２８から抽出したＤＮＡと、２つのラクトバチルス・プランタルム株とをテンプレートとして用いた。得られた増幅産物を電気泳動にかけ、図１に示すようにパターンを比較した。配列番号４および５のプライマーを用いた。
ＥＲＩＣ１Ｒ：（５’−ＡＴＧＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣ−３’）（配列番号４）
ＥＲＩＣ２Ｆ：（５’−ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ−３’）（配列番号５）
【００５３】
【表４】
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【００５４】
ＰＣＲ条件：９４℃、５分；３５サイクル（９４℃、３０秒；４５度、１分；６５℃、６分）；６５℃、６分；４分、無限（∞）。
【００５５】
図１に示すように、レーンＭは、ＤＮＡラダー（２５０〜１００００ｂｐ）を示し、；ＡＴＣＣ  １４９１７Ｔは、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムを示し、；ＢＣＲＣ  １７６３８Ｔは、ラクトバチルス・プランタルム亜種アルゲントラテンシスを示す。
【００５６】
白い矢印で示すように、ＰＳ１２８のバンドは、ＡＴＣＣ  １４９１７ＴまたはＢＣＲＣ  １７６３８Ｔのバンドに比べて位置が独特であり、よって、図１では、ＰＳ１２８およびＡＴＣＣ  １４９１７Ｔはすべてラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムに属しているにもかかわらず、異なる菌株であることが示されている。したがって、ＰＳ１２８は、ラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムの新しい株であることがわかる。
【００５７】
実施例３  ＡＰＩ（分析プロファイル指数）による分類
本発明に用いられるＰＳ１２８の糖利用をＡＰＩ  ５０  ＣＨＬキット（Biomerieux、フランス）で調べ、その結果を表４に示した。発酵試験は、ＰＳ１２８がラクトバチルス・プランタルム亜種プランタルムと類似した生化学的性質を有することを示している。
【００５８】
【表５】
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【００５９】
実施例４  動物の治療のためのＰＳ１２８の調製
ＰＳ１２８を培地（１０％の脱脂乳、１％のイースト粉末、０．１％のツイーン８０、および、２％のグルコース）に接種し、３７℃で１８時間培養し、遠心分離により収穫した。ＰＳ１２８を、保護剤（１％の脱脂乳、２％の砂糖、２％のオリゴフルクトース、３％のマルトデキストリン、および、２％のグリセリン）、および、受容菌と共に凍結乾燥させ、粉末グラム当たり５×１０９コロニー形成単位の最終濃度に調整した。ＰＳ１２８粉末を−２０℃で保存し、動物の治療に使用する前に、食塩水中で１０１０コロニー形成単位／ｍＬになるよう溶解した。
【００６０】
実施例５  ＰＳ１２８によるＭＰＴＰ誘導運動障害の改善、および、マウスの脳におけるドーパミン作動系の保護
（１）動物および飼育
６〜８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２０〜２２ｇ）を国立実験動物センター（台北、台湾）から購入した。マウスを一定の温度および湿度で１２時間の明暗サイクルで飼育し、餌および水へのアクセスは自由とした。すべての動物実験手順は、国立陽明大学の動物管理委員会によってチェックされ、承認されている。
【００６１】
（２）実験手順
マウスにＰＳ１２８（１日当たり１０９コロニー形成単位／ｍｌ）、または、生理食塩水（１日当たり０．２ｍＬ）を経口投与した。２４日目〜２８日目から、１日当たり３００ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰをマウスに腹腔内注射した。２８日目に最後のＭＰＴＰ処置をした後に、ポールテスト、ナロービームテスト、および、ロータロッドテストを行った。Ｌ−ＤＯＰＡ（レボドパ）群には、２４日目〜２８日目から、１００ｍｇ／ｋｇのＬ−ＤＯＰＡ＋２５ｍｇ／ｋｇのベンセラシドを経口投与し、かつ、１日当たり３００ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを腹腔内投与してポジティブコントロールとして示した。さらなる分析のために、すべての行動試験の後にマウスを殺して脳組織、盲腸の部分、および、血液を採取した。
【００６２】
（３）ポールテスト
ポールテストとは、マウスの運動障害を評価するのに有効な方法である。図２Ａにポールテストの結果を示す。垂直に立てた面の粗いポール（直径１ｃｍ、高さ５０ｃｍ）の先端に上を向かせたマウスを置き、床まで降りる時間を最大１２０秒までとして記録した。マウスが途中まで降りて落下してしまっても、床にたどり着くまで、行動を採点した。マウスが下を向くことができず、ポールから落ちてしまった場合は、最も重症であると判断して移動運動活性時間（ＴＬＡ）を１２０秒（デフォルト値）とした。
【００６３】
（４）ナロービームテスト
ナロービームテストは、マウスの運動協調性および平衡感覚を評価するのに有効な方法である。図２Ｂにナロービームテストの結果を示す。ビーム装置は、２本のポール上のテーブル面から５０ｃｍ上に幅０．８ｃｍの平面を有する５０ｃｍの梁からなる。
終点としての梁の一端に暗箱を配置する。ケージ内の餌を暗箱に置き、マウスを終点に惹きつける。訓練日に、環境に馴染ませるためにマウスを５分間、暗箱に入れた。その後、それぞれのマウスは梁を５ｃｍ横断することを３回、続いて１５ｃｍ、さらに３０ｃｍ、５０ｃｍ横断するという梁の訓練を行った。試験当日、各マウスにビームテストを３回実施し、横断時間を記録した。
【００６４】
（５）ロータロッドテスト
ロータロッドテストは、齧歯動物の運動協調性を評価するために広く用いられている。
図２Ｃにロータロッドテストの結果を示す。ドラム、自動タイマ、および、落下センサを備えたロータロッドマシンを使用した。ＭＰＴＰを注射する前に、マウスはロータロッドテスト前の訓練（１８０秒間の回転数３０ｒｐｍ）を３日間受けた。試験当日、各マウスにロータロッドテスト（１８０秒間の回転数３０ｒｐｍ）を３回連続（各テスト間隔は１分）で実施し、残り時間を記録した。
【００６５】
（６）免疫組織化学によるチロシンヒドロキシラーゼ−陽性ドーパミン作動性細胞の数量化
マウスをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心臓潅流した後、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳで固定した。直ちに脳を取り出し、同固定液に入れ、４℃の３０％ショ糖液に移し、その後、クリオスタットで４０μｍに切断した。
【００６６】
切片を洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％のトリトンＸ−１００および０．０１％のアジ化ナトリウム）で３回洗浄した後、室温で振盪しながらブロック緩衝液中で１時間インキュベートした。ブロッキングの後、切片を、一次抗体（抗チロシンヒドロキシラーゼ、１：３００、ミリポア）、および、ヘキスト３３２５８（１：２０００、ライフテクノロジーズ）と共にＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．３％のトリトンＸ−１００、０．０１％のＢＳＡ、０．０１％のアジ化ナトリウム、および、３％のロバ血清）中で、４℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液中で振盪しながら３回洗浄した後、切片を、二次抗体（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）共役アフィニピュアロバ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）、１：３００、ジャクソンイムノリサーチ）、および、ヘキストと共に、ＰＢＳＴ中で、室温で振盪しながら２時間インキュベートした。その後、切片を洗浄緩衝液で３回洗浄し、封入剤を塗布したカバースリップをマウントして密封した。
【００６７】
免疫染色した切片を共焦点顕微鏡ＺＥＩＳＳ  ＬＳＭ７００によって撮像した。
ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）陽性細胞の数を、多波長スコアリングアプリケーションを用い、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）ソフトウエアによって、ブレグマから−２．９２〜−３．８ｍｍの位置で１つおきの切片で決定した。図３Ａは、黒質領域におけるＴＨ陽性細胞の免疫蛍光染色写真を示し、図３Ｂはそれを生理食塩水のコントロールに対する％として数量化したものを示している。
【００６８】
実施例６  ＤＯＩによる背筋収縮、および、ラットの脳内のドーパミンシグナル伝達経路の異常のＰＳ１２８による改善
（１）動物および飼育
６〜８週齢のオスのウィスターラット（２２０〜３３０ｇ）をバイオラスコ台湾社（台北、台湾）から購入した。ラットを一定の温度および湿度で１２時間の明暗サイクルで飼育し、餌および水へのアクセスは自由とした。すべての動物実験手順は、国立陽明大学の動物管理委員会によってチェックされ、承認されている。
【００６９】
（２）実験手順および背筋収縮（ＢＭＣ）数の計数
マウスにＰＳ１２８（１日当たり１０１０コロニー形成単位／ｍＬ）、または、生理食塩水（１日当たり１ｍＬ）を１５日間経口投与した。５−ＨＴ２Ａ／Ｃ受容体拮抗薬である２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（ＤＯＩ）を２回分投与することによってチックのような行動が現れ、背筋収縮（ＢＭＣ）の頻度が大幅に増した。１４日目に、ラットに、一次処置としてＤＯＩ（２００μｇ／ｋｇ）を静脈内注射し、１５日目に、二次処置としてＤＯＩ（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射した。３５分間の二次処置の直後に背筋収縮数を数えた。ハロペリドール（Ｈａｌ）群には、ドーパミン拮抗薬であるハロペリドール（１日当たり１ｍｇ／ｋｇ）を１５日間投与し、ポジティブコントロールとして示した。図４では、はっきりした力強い収縮が首の後ろから尾にかけて背中を走ったときのみ数えたものを示している。さらなる分析のために、背筋収縮回数の記録後にマウスを殺して脳組織、盲腸の部分、および、血液を採取した。
【００７０】
（３）高速液体クロマトグラフィ・電気化学検出法（ＨＰＬＣ−ＥＣＤ）によるモノアミンおよびその代謝産物の数量化
ＨＰＬＣ−ＥＣＤシステムは、マイクロポンプ（ＣＭＡ−１００、ＣＭＡ、スウェーデン、ストックホルム）、オンラインインジェクタ―（ＣＭＡ−１６０）、マイクロテックＬＣポンプ（マイクロテックサイエンティフック、米国カリフォルニア州サニーベール）、ＢＡＳ−４Ｃ電子化学検出器（バイオアナリティカルシステムズ、米国インディアナ州ウエストラファイエット）、および、逆相カラム（キネテクスＣ１８、２．６ｕｍ、１００×２．１ｍｍ  ＩＤ；フェノメネクス、米国）を備える。室温（２５℃）において、Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極に対し、ガラス状炭素作用電極の電位を＋６５０ｍＶに設定した。０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、８％のメタノール、０．７４ｍＭの１−オクタンスルホン酸ナトリウム（ナトリウム塩）、０．０３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、および、２ｍＭの塩化カリウムを含む移動相をリン酸（Ｈ３ＰＯ４）によりｐＨ３．７４に調整した。前頭前皮質および線状体を超音波処理によって溶解し、１２，０００×ｇの遠心分離に１０分かけ、その上澄を０．２２ｍｍのポリフッ化ビニリデン膜（４ｍｍのシリンジフィルター；Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ、ミリポア、米国）で分析前にろ過した。希釈したろ過液（２０μＬ）をクロマトグラフシステムに０．２ｍＬ／分の流量で注入した。サンプル内のドーパミン（ＤＡ）、ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、セロトニン（５−ＨＴ）、および、５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）の濃度を、１〜１００ｎｇ／ｍＬの標準物質（シグマアルドリッチ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて補間した。
【００７１】
図５は、組織湿重量当たり（ｎｇ／ｇ）のラットの前頭前皮質における総ＤＡレベル（図５Ａ）、ＤＯＰＡＣレベル（図５Ｂ）、ＨＶＡレベル（図５Ｃ）を示し、前頭前皮質における神経伝達物質の代謝回転率（ＤＯＰＡＣ＋ＨＶＡ／ＤＡ）を示す（図５Ｄ）。図５Ａでは、２番目のＰＳ１２８のバーは、ＰＳ１２８だけを投与したものであり（細菌のみのコントロール）、ドーパミンの総量にほとんど影響を及ぼさなかったことを示している。４番目のバーは、ハロペリドール（Ｈａｌ）を投与したものであり、最後のＰＳ１２８のバーは、ＤＯＩを与えられているマウスにＰＳ１２８を投与したものである。３番目および４番目のバーは、ＤＯＩによって前頭前皮質内のドーパミン量が著しく増加し、ＰＳ１２８を投与することでこの傾向が変化することを示している。図５Ｂ〜図５Ｄは、ＤＯＩを与えられたマウスにＰＳ１２８を投与するとドーパミンの代謝率が上昇し、よって、ＰＳ１２８は、脳内のドーパミンシグナル伝達の異常な増強を調整する能力があることを示している。
【００７２】
（４）ウエスタンブロット法
ＤＯＩによるドーパミンシグナル伝達経路の異常に対するＰＳ１２８の効果をウエスタンブロット法でラットの前頭前皮質および線状体における総タンパク質量を調べることにより確認した。抽出物を１０％のポリアクリルアミドゲル上で分別し、ポリフッ化ビニリデン膜（ロシュ）に電気泳動により移動させ、ブロッキング緩衝液および５％の脱脂乳を含むＴＢＳＴで１時間ブロックし、一次抗体（抗ＤＡＴ  １:５００；抗ｐＤＡＲＰＰ３２  １：５００；抗ｐＥＲＫ  １：１０００；ＤＡＲＰＰ３２  １：１０００；ＥＲＫ  １：１０００；サンタクルスバイオテクノロジー）と共に、ブロッキング緩衝液中、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで２回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にブロッキング緩衝液中でインキュベートした。抗体−タンパク質複合体をイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標））ウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（ミリポア）によって視覚化し、ルミノ・イメージ・アナライザ（富士フイルムホールディングス株式会社）によって検出した。図６は、ラットの線条体におけるＤＡＴの発現量（図６Ａ）、ラットの線条体におけるＤＡＲＰＰのリン酸化レベル（図６Ｂ）、ラットの線条体におけるＥＲＫのリン酸化レベル（図６Ｃ）のコントロールに対する倍率変化を示す。図７は、ラットの前頭前皮質におけるＤＡＴの発現量（図７Ａ）、ラットの前頭前皮質におけるＤＡＲＰＰのリン酸化レベル（図７Ｂ）、ラットの前頭前皮質におけるＥＲＫのリン酸化レベル（図７Ｃ）のコントロールに対する倍率変化を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
2019521157.tif 000019
【図６Ｂ】
2019521157.tif 000020
【図６Ｃ】
2019521157.tif 000021
【図７Ａ】
2019521157.tif 000022
【図７Ｂ】
2019521157.tif 000023
【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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