(57)【要約】本発明は、化合物、その組成物、およびそれを使用する方法を提供する。式Ｉの化合物：2019511562.tif 000183または薬学的に許容されるその塩（式中、リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、Ｔ１は二価のテザー基であり、ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分である）。標的ＲＮＡおよび本発明の化合物を含み、Ｒｍｏｄが該標的ＲＮＡへの共有結合を形成している、ＲＮＡコンジュゲート。標的ＲＮＡに結合しその機能をモジュレートする小分子を同定する方法であって、該標的ＲＮＡへの結合について本発明の１つまたは複数の化合物をスクリーニングするステップ、およびＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物：
【化４７】
2019511562.tif 000180
または薬学的に許容されるその塩（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分である）。
【請求項２】
式ＩＩの化合物：
【化４８】
2019511562.tif 000181
または薬学的に許容されるその塩（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１およびＴ２のそれぞれは独立して二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基である）。
【請求項３】
式ＩＩＩの化合物：
【化４９】
2019511562.tif 000182
または薬学的に許容されるその塩（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１は三価のテザー基であり、
Ｔ２は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基である）。
【請求項４】
リガンドが、マクロライド、アルカロイド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、図３４に示すものから選択されるＳＭＮ２リガンド、プレウロムチリン、テオフィリンまたはその類似体、リボシルまたはその類似体、置換されたアントラセン、置換されたトリプチセン、オキサゾリジノン、およびＣＰＮＱまたはその類似体からなる群から選択され、リガンドは１つまたは複数の置換基により任意選択で置換されていてもよい、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
リガンドが、エリスロマイシン、アジスロマイシン、ベルベリン、パルマチン、パロモマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン、プレウロムチリン、テオフィリンまたはその類似体、リボシルまたはその類似体、ＮＶＳ−ＳＭ１、置換されたアントラセン、置換されたトリプチセン、リネゾリド、テジゾリド、およびＣＰＮＱまたはその類似体からなる群から選択され、リガンドは１つ、２つ、３つ、または４つの置換基により任意選択で置換されていてもよい、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｔ１が、図４６〜５３に示すものから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｔ１が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、任意選択で置換されているＣ１〜１２の脂肪族基、または１〜８個のアミノ酸を含むペプチドから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｔ２が、図４６〜５３に示すものから選択される、請求項２または３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒｍｏｄが、ハロゲン化スルホニル、アレーンカルボニルイミダゾール、活性エステル、エポキシド、オキシラン、酸化剤、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化ベンジル、またはイソシアネートから選択され、Ｒｍｏｄは、リガンドが結合する標的ＲＮＡの拘束されていない２’−ヒドロキシル基と反応して、２’−共有結合修飾ＲＮＡを産生する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
ＲＣＧが、クリック実行可能基、またはニトロン／シクロオクチン反応、オキシム／ヒドラゾン形成、テトラジンライゲーション、イソシアニドベースのクリック反応、もしくはクアドリシクランライゲーションを起こすことができる基から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＲＣＧがクリック実行可能基である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１２】
リガンドが、標的ＲＮＡ中のジャンクション、ステムループ、またはバルジに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
リガンドが、核酸の三方向ジャンクション（３ＷＪ）に結合する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記３ＷＪが、２つのＲＮＡ分子の間のトランス３ＷＪである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記３ＷＪが、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間のトランス３ＷＪである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
標的ＲＮＡおよび請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物を含み、Ｒｍｏｄが該標的ＲＮＡへの共有結合を形成している、ＲＮＡコンジュゲート。
【請求項１７】
標的ＲＮＡに結合しその機能をモジュレートする小分子を同定する方法であって、該標的ＲＮＡへの結合について請求項１〜１５のいずれか一項に記載の１つまたは複数の化合物をスクリーニングするステップ、およびＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、２０１６年２月１日に出願した米国仮出願第６２／２８９，６７１号の利益を主張する。この出願の全体が、これにより参考として援用される。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、ＲＮＡ転写物の生物学をモジュレートして様々な疾患および状態を治療するために有用な化合物および方法に関する。本発明はまた、化合物に結合し、したがってドラッガブルなＲＮＡ転写物を同定し、薬物候補をスクリーニングする方法、ならびに標的ＲＮＡ上の薬物結合部位および／または反応性部位を決定する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リボ核酸（ＲＮＡ）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のタンパク質コードセクションがＲＮＡに転写された後にそれがタンパク質に翻訳される際の、遺伝子とタンパク質との間の一過性の中間物に過ぎないと従来考えられてきた。ＲＮＡには確固とした三次構造がないと考えられ、たとえ三次構造が存在した場合でも、それは一過性のメッセンジャーとしてのＲＮＡの機能にはほとんど関連しないと考えられていた。この理解は、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含めてＲＮＡは細胞内で数多くの決定的に重要な調節的役割を果たしており、またＲＮＡは複雑かつ確固とした三次構造を有することができるという認識によって疑問を投げかけられている。
【０００４】
全ての哺乳動物の疾患は、究極的にはトランスクリプトームによって媒介される。メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はトランスクリプトームの一部分であり、また全てのタンパク質の発現はｍＲＮＡに由来するという限りにおいて、関連タンパク質の発現をモジュレートすることによって、そして対応する上流のｍＲＮＡの翻訳をモジュレートすることによって、タンパク質媒介性の疾患に介入できる可能性がある。しかしｍＲＮＡはトランスクリプトームの小さな部分に過ぎない。ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、および偽遺伝子を含めて（しかしこれらに限定されない）その他の転写されたＲＮＡもまた、ＲＮＡ構造物（例えば、リボ核タンパク質）の構造および機能によって直接的に、ならびにタンパク質の発現および作用を介して、細胞の生物学を調節する。このレベルで介入する薬物は、任意のおよび全ての細胞プロセスをモジュレートできる可能性がある。アンチセンスＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどの既存の治療モダリティーは、大抵の場合、薬物送達、吸収、標的臓器への分配、薬物動態、および細胞透過などの重大な課題を未だ克服していない。対照的に、小分子はこれらの障壁およびこれらの質を乗り越えるのに成功し、薬物として好適なものとされてきた長い歴史があり、またそのような課題を克服するために一連の類似体を通じて最適化が容易である。著しく対照的に、一般にＲＮＡ標的への結合について小分子をスクリーニングする立証された一般的方法はなく、細胞内においてはなおさらである。治療的利益をもたらすＲＮＡ用のリガンドとして小分子を適用することは創薬コミュニティからほとんどまたは全く注目されていない。
【０００５】
小分子モジュレーターを用いてＲＮＡトランスクリプトームを標的化することは、様々なＲＮＡ媒介性の疾患を治療するための未開発の治療アプローチを表す。したがって、治療剤として有用な小分子ＲＮＡモジュレーターを開発する必要性が残されたままである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、フックアンドクリック（ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ；ＲＮＡライゲーションの近接推進型活性化（Proximity-Enhanced  Activation  of  RNA  Ligation））法の基本ステップを示す。小分子リガンドが標的ＲＮＡ構造（ここではステムループ機構）に結合し、小分子に結合した修飾部分（Ｒｍｏｄ）が標的ＲＮＡの近接した２’−ＯＨとの共有結合を形成し、そしてその後の変性およびシークエンシングにより修飾の位置を明らかにする。
【０００７】
【図２】図２は、本明細書中に記載の３つの広範な類型、すなわちＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型化合物の一般構造を示す。これらの類型は、任意選択のクリック実行可能基（click-ready  group）の存在または位置において異なる。（ＲＮＡリガンド＝フォールディングしたＲＮＡへの小分子結合剤；Ｘ＝連結；テザー＝ＲＮＡリガンドをＲＮＡ弾頭（RNA  warhead）に接続する；ＲＮＡ弾頭＝リボースの２’−ＯＨ基をアシル化またはスルホニル化する広範な求電子剤；クリック基＝プルダウンおよび集中的なアッセイ（シークエンシングが挙げられる）を可能とするクリック実行可能基）
【０００８】
【図３】図３は、本明細書中に記載の３つの広範な類型、すなわちＩ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型のＲＮＡコンジュゲートの一般構造を示す。これらの類型は、任意選択のクリック実行可能基の存在または位置において異なる。標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡのリボースの２’−ＯＨ基の１つとの共有結合を介してＲＮＡ弾頭、すなわち修飾部分に共有結合的にコンジュゲートしている。
【０００９】
【図４】図４は、例示的なフックアンドクリック化合物（ここでは、カルボニル（イミダゾリル）アシル化基およびアジドメチルクリック実行可能基を有するピリジンを含む修飾部分にテザー連結したテオフィリン）が標的ＲＮＡに結合し、それをアシル化（「フック連結」）し、次いで、アビジンまたはその他のビオチン結合タンパク質を用いるさらなるプルダウン手順に使用するためにビオチンに結合した４−ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯ）基とのクリック反応を受けるスキームを示す。
【００１０】
【図５】図５は、アミド結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００１１】
【図６】図６は、アミド結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００１２】
【図７】図７は、アミド結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００１３】
【図８】図８は、アミド結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す（図５とは反対方向）。
【００１４】
【図９】図９は、アミド結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す（図６とは反対方向）。
【００１５】
【図１０】図１０は、アミド結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す（図７とは反対方向）。
【００１６】
【図１１】図１１は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミド結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００１７】
【図１２】図１２は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミド結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００１８】
【図１３】図１３は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミド結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００１９】
【図１４】図１４は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミド結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２０】
【図１５】図１５は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミド結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２１】
【図１６】図１６は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミド結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２２】
【図１７】図１７は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミド結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２３】
【図１８】図１８は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミド結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２４】
【図１９】図１９は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミド結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２５】
【図２０】図２０は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミド結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２６】
【図２１】図２１は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミド結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２７】
【図２２】図２２は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミド結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２８】
【図２３】図２３は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００２９】
【図２４】図２４は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００３０】
【図２５】図２５は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のエーテル結合およびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のエーテル結合によって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。
【００３１】
【図２６】図２６は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミドおよびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミドによって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。このアプローチは二酸テザー、すなわち各末端にカルボン酸を有するテザーを用いる。
【００３２】
【図２７】図２７は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミドおよびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミドによって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。このアプローチは二酸テザー、すなわち各末端にカルボン酸を有するテザーを用いる。
【００３３】
【図２８】図２６は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミドおよびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミドによって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。このアプローチは二酸テザー、すなわち各末端にカルボン酸を有するテザーを用いる。
【００３４】
【図２９】図２９は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミドおよびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミドによって連結されるＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。このアプローチはジアミンテザー、すなわち各末端にアミノ基を有するテザーを用いる。
【００３５】
【図３０】図３０は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミドおよびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミドによって連結されるＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。このアプローチはジアミンテザー、すなわち各末端にアミノ基を有するテザーを用いる。
【００３６】
【図３１】図３１は、ＲＮＡリガンドとテザーとの間のアミドおよびテザーとＲＮＡ弾頭（修飾因子部分）との間のアミドによって連結されるＩＩＩ型化合物のコンポーネントを集合させるための一般化されたスキームを示す。このアプローチはジアミンテザー、すなわち各末端にアミノ基を有するテザーを用いる。
【００３７】
【図３２】図３２は、テトラサイクリンの構造上のテザー基（tethering  group）のための結合点を示す。
【００３８】
【図３３】図３３は、テオフィリン、トリプチセン、リネゾリド、およびアントラセン−マレイミドディールス・アルダー付加体である小分子リガンドの構造上のテザー基のための結合点を示す。
【００３９】
【図３４】図３４は、ＳＭＮ２リガンドの構造上のテザー基のための結合点を示す。
【００４０】
【図３５】図３５は、アミノグリコシドカナマイシンＡの構造上のテザー基のための結合点を示す。
【００４１】
【図３６】図３６は、リボシルの構造上のテザー基のための結合点を示す。
【００４２】
【図３７】図３７は、テザー基のための結合点を有するテオフィリンリガンドの構造を示す。
【００４３】
【図３８】図３８は、テザー基のための結合点を有するテトラサイクリンリガンドの構造を示す。
【００４４】
【図３９】図３９は、テザー基のための結合点を有するトリプチセンリガンドの構造を示す。
【００４５】
【図４０】図４０は、テザー基のための結合点を有するトリプチセンリガンドの構造を示す。
【００４６】
【図４１】図４１は、テザー基のための結合点を有するアントラセン−マレイミドディールス・アルダー付加体リガンドの構造を示す。
【００４７】
【図４２】図４２は、テザー基のための結合点を有するリボシルリガンドの構造を示す。
【００４８】
【図４３】図４３は、テザー基のための結合点を有するＳＭＮ２リガンドの構造を示す。
【００４９】
【図４４】図４４は、テザー基のための結合点を有するリネゾリドおよびテジゾリドリガンドの構造を示す。
【００５０】
【図４５】図４５は、例示的なクリック実行可能基の構造を示す。
【００５１】
【図４６】図４６は、ＲＮＡリガンドと修飾部分とを連結するための例示的なテザー基を示す。
【００５２】
【図４７】図４７は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５３】
【図４８】図４８は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５４】
【図４９】図４９は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５５】
【図５０】図５０は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５６】
【図５１】図５１は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５７】
【図５２】図５２は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５８】
【図５３】図５３は、テザー基のさらなる例を示す。
【００５９】
【図５４】図５４は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得る修飾基の例示的な広範なクラスを示す。
【００６０】
【図５５】図５５は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るラクトンおよびラクタム修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６１】
【図５６】図５６は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るアレーンカルボニルイミダゾール（arenecarbonyl  imidazole）修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６２】
【図５７】図５７は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るアレーンカルボニルフェニルエステル修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６３】
【図５８】図５８は、スルホニルベースの修飾基の構造を示す。上の３つの構造は、セリンプロテアーゼ中の触媒部位のセリンをスルホニル化することが知られている特定の剤である。残りの構造は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るフッ化スルホニル修飾基の例示的なクラスである。
【００６４】
【図５９】図５９は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るフランカルボニルフェニルエステル修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６５】
【図６０】図６０は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るフランカルボニルフェニルエステル修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６６】
【図６１】図６１は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るアレーンカルボニルフェニルエステル修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６７】
【図６２】図６２は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るアレーンカルボニルフェニルエステル修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６８】
【図６３】図６３は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るイサト酸無水物修飾基の例示的なクラスを示す。
【００６９】
【図６４】図６４は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るベータラクトン修飾基の例示的なクラスを示す。
【００７０】
【図６５】図６５は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るベータラクタム修飾基の例示的なクラスを示す。
【００７１】
【図６６】図６６は、例示的なトリプチセンベースのフック化合物（小分子リガンド＋テザー基＋修飾基）を示す。
【００７２】
【図６７】図６７は、例示的なテオフィリンベースのフック化合物（小分子リガンド＋テザー基＋修飾基）を示す。
【００７３】
【図６８】図６８は、例示的なテオフィリンベースのフックアンドクリック化合物（小分子リガンド＋テザー基＋修飾基＋クリック実行可能基）を示す。
【００７４】
【図６９】図６９は、ビオチンおよびクリック実行可能基と反応できる基を含む、例示的なプルダウン部分を示す。
【００７５】
【図７０】図７０は、様々な例示的なテザー基および修飾部分と共に小分子リガンドとしてのテトラサイクリンを含む、例示的な化合物を示す。
【００７６】
【図７１】図７１は、様々な例示的なテザー基および修飾部分と共に小分子リガンドとしての置換されたトリプチセンを含む、例示的な化合物を示す。一部はクリック実行可能基も含んでいる。
【００７７】
【図７２】図７２は、様々な例示的なテザー基、修飾部分、およびクリック実行可能基と共に小分子リガンドとしての置換されたトリプチセンを含む、例示的な化合物を示す。
【００７８】
【図７３】図７３は、様々な例示的なテザー基、修飾部分、およびクリック実行可能基と共に小分子リガンドとしてのＳＭＮ２転写物結合化合物を含む、例示的な化合物を示す。
【００７９】
【図７４】図７４は、様々な例示的なテザー基、修飾部分、およびクリック実行可能基と共に小分子リガンドとしてのリボシルを含む、例示的な化合物を示す。
【００８０】
【図７５】図７５は、様々な例示的なテザー基および修飾部分と共に小分子リガンドとしての置換されたトリプチセンを含む、例示的な化合物を示す。一部はクリック実行可能基も含んでいる。
【００８１】
【図７６】図７６は、ＳＨＡＰＥ法（ＳＨＡＰＥ＝プライマー伸長によって分析される選択的２’−ヒドロキシルアシル化（Selective  2’-hydroxyl  acylation  analyzed  by  primer  extension）；ＭａＰ＝突然変異プロファイリング（Mutational  profiling））の基本ステップを示す。最初に、比較的接近可能なヌクレオチドの２’−ＯＨ基において反応するＳＨＡＰＥ試薬にＲＮＡを曝露し、共有結合付加体を形成させる。修飾ＲＮＡを単離し、逆転写する。逆転写酵素は、ＲＮＡ中の化学的付加体を「読み飛ばし」、元々の配列に相補的でないヌクレオチド（赤色）をｃＤＮＡ中に組み込む。任意の超並列アプローチによるシークエンシングにより突然変異のプロファイルを集める。シークエンシング読み取りを参照配列と比較し、各ヌクレオチドでの突然変異率を決定し、バックグラウンド訂正し、正規化して、ＳＨＡＰＥ反応性プロファイルを作成する。ＳＨＡＰＥ反応性は二次構造と相関し、競合的および代替的な構造を明らかにすることができ、または局所ヌクレオチドへの接近可能性に対する効果を定量化することができる。
【００８２】
【図７７】図７７は、テザー基のための結合点を含む数個のテオフィリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８３】
【図７８】図７８は、テザー基のための結合点を含む数個のテオフィリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８４】
【図７９】図７９は、テザー基のための結合点を含む数個のテオフィリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８５】
【図８０】図８０は、テザー基のための結合点を含む数個のテオフィリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８６】
【図８１】図８１は、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８７】
【図８２】図８２は、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８８】
【図８３】図８３は、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００８９】
【図８４】図８４は、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９０】
【図８５】図８５は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９１】
【図８６】図８６は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９２】
【図８７】図８７は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９３】
【図８８】図８８は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９４】
【図８９】図８９は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９５】
【図９０】図９０は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９６】
【図９１】図９１は、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９７】
【図９２】図９２は、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９８】
【図９３】図９３は、テザー基および修飾部分を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【００９９】
【図９４】図９４は、テザー基および修飾部分を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【０１００】
【図９５】図９５は、記載した方法において生じる可能性がある曖昧性、および２’−ＯＨ  ＲＮＡリボースの近接誘発性の修飾からの配列データにおいて曖昧性を除去する方法を示す。１つのリガンド結合事象は、ＲＮＡの一次配列の点では遠位であるがフォールディングした構造においては近位であるリボースの修飾を生じ得るので、２つまたはそれより多くの潜在的なリガンド結合部位が存在する。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰおよび／またはテザー基のＳＡＲからのデータはこの曖昧性を解消することができる。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰおよびＲＩＮＧ−ＭａＰは、ＲＮＡの実際のリガンド非結合構造を決定できる。テザー基の異なる長さおよびその他の特徴によりＳＨＡＰＥ修飾パターンは異なる反応をして、曖昧性を解消する。
【０１０１】
【図９６】図９６は、フック化合物ライブラリーの並列合成スキームを示す。
【０１０２】
【図９７】図９７は、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【０１０３】
【図９８】図９８は、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【０１０４】
【図９９】図９９は、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【０１０５】
【図１００】図１００は、化合物ＡＲＫ−１８８の合成経路を示す。
【０１０６】
【図１０１】図１０１は、化合物ＡＲＫ−１９０の合成経路を示す。
【０１０７】
【図１０２】図１０２は、化合物ＡＲＫ−１９１の合成経路を示す。
【０１０８】
【図１０３】図１０３は、化合物ＡＲＫ−１９５の合成経路を示す。
【０１０９】
【図１０４】図１０４は、化合物ＡＲＫ−１９７の合成経路を示す。
【０１１０】
【図１０５】図１０５は、リボシル足場に基づく化合物の合成経路を示す。
【０１１１】
【図１０６】図１０６は、３ＷＪ  ＲＮＡ構築物の濃度に対する蛍光の依存性を決定するための較正実験を示す。
【０１１２】
【図１０７】図１０７は、様々な濃度において２つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物を用いる化合物Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８の蛍光消光実験の結果を示す。
【０１１３】
【図１０８】図１０８は、三角形で示す小分子リガンドのための推定上の結合部位を有する以下の３つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物についての考えられる構造を示す。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）。
【０１１４】
【図１０９】図１０９は、以下のＲＮＡ構築物との化合物Ａｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４の相互作用を測定する蛍光消光データを示す。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）。
【０１１５】
【図１１０】図１１０は、３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ  ＲＮＡ構築物を用いて試験した化合物Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８についてのサーマルシフトデータを示す。データ解析は、約５℃の融解温度シフト（すなわち、６１．２℃から６５．６℃）を伴ってＡｒｋ０００００７についての有意な効果を示している。対照的に、Ａｒｋ０００００８についてはわずかな効果しか観察されなかった。これらのデータは、Ａｒｋ０００００７の存在が３ＷＪの安定性を増大させることを示唆する。
【０１１６】
【図１１１】図１１１は、ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）の存在下でのＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４についてのサーマルシフトデータを示す。
【０１１７】
【図１１２】図１１２は、分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭの存在下でのＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４についてのサーマルシフトデータを示す。
【０１１８】
【図１１３】図１１３は、分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭの存在下でのＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４についてのサーマルシフトデータを示す。
【０１１９】
【図１１４】図１１４は、ＣＰＮＱの構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。
【０１２０】
【図１１５】図１１５は、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１の構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、ピリジン環のプロトンがベンゼン環よりもＲＮＡにより近接することを示唆する。脂肪族ＣＨ２基は、その領域における緩衝液シグナルの重複に起因して観察できなかった。
【０１２１】
【図１１６】図１１６は、ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２の構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、複素環に最も近い芳香族プロトンがＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。脂肪族プロトン共鳴は、直接飽和のアーティファクト／その領域における緩衝液シグナルの重複に起因してＳＴＤによって評価できなかった（ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹによるエピトープマッピング）。
【０１２２】
【図１１７】図１１７は、ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３の構造を示しており、プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を与えている。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。シグナルの重複に起因して、ＣＨ２基の個々の割り当てはできなかった。データは、両方のＲＮＡ構築物について、フラン部分のプロトンがフェニルよりもＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。
【０１２３】
【図１１８】図１１８は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【０１２４】
【図１１９】図１１９は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【０１２５】
【図１２０】図１２０は、ＤＥＬ実験において使用するためのＲＮＡ標的配列のＰＡＧＥ分析を示す。ゲルのレーンは以下を示す。１：ＮＭＲ緩衝液中のＨＴＴ１７ＣＡＧ、２：ニュートラアビジン樹脂とのインキュベーション前、３：ニュートラアビジン樹脂とのインキュベーション後の上清、４：室温での１時間のＤＥＬ化合物とのインキュベーション後のＲＮＡ。ＲＮＡは樹脂からの放熱後に回収した。
【０１２６】
【図１２１】図１２１は、本発明において使用するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法の例示的ステップを示す。
【０１２７】
【図１２２】図１２２は、本発明において使用するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法の例示的ステップを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２８】
ある実施形態の詳細な説明
１．本発明のある特定の実施形態の概説；定義
ＲＮＡ標的ならびに疾患および障害との関連
治療のために取り組まれてきた分子標的の大部分はタンパク質である。しかしながら、様々なＲＮＡ分子が健常細胞および疾患細胞の両方において重要な調節的役割を果たすことが今や理解されている。タンパク質をコードするのはヒトゲノムのわずか１〜２％であるが、ゲノムの大部分が転写されることが現在では知られている（Carninciら、Science  ３０９巻：１５５９〜１５６３頁、２００５年）。よって、非コーディング転写物（非コーディングトランスクリプトーム）は新たな治療標的の大きな群を表す。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などの非コーディングＲＮＡは、転写、スプライシング、ｍＲＮＡの安定性／分解、および翻訳を調節する。加えて、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、およびイントロンなどのｍＲＮＡの非コーディング領域は、ｍＲＮＡの発現レベル、選択的スプライシング、翻訳効率、ならびにｍＲＮＡおよびタンパク質の細胞内局在への影響において調節的役割を果たすことができる。ＲＮＡの二次構造および三次構造は、これらの調節的な活動にとって決定的に重要である。
【０１２９】
顕著なことに、非コーディングトランスクリプトームにはコーディング転写物と比べてヒト疾患に関連するはるかに多くの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が存在することをＧＷＡＳ研究は示した（Mauranoら、Science  ３３７巻：１１９０〜１１９５頁、２０１２年）。したがって、非コーディングＲＮＡおよびｍＲＮＡの非コーディング領域を治療のために標的化することで、以前は難治性であったヒト疾患を治療するための新規の剤をもたらすことができる。
【０１３０】
ｍＲＮＡを遮断する現行の治療アプローチは、遺伝子療法（Naldini、Nature  ２０１５年、５２６巻、３５１〜３６０頁）、ゲノム編集（Coxら、Nature  Medicine  ２０１５年、２１巻、１２１〜１３１頁）、または広範なオリゴヌクレオチド技術（アンチセンス、ＲＮＡｉなど）（BennettおよびSwayze、Annu.  Rev.  Pharmacol.  Toxicol.  ２０１０年、５０巻、２５９〜２９３頁）などの方法を必要とする。オリゴヌクレオチドは、標準的な塩基／塩基ハイブリダイゼーションを介してＲＮＡの作用をモジュレートする。このアプローチの魅力は、遮断にさらされる配列から直接的に、オリゴヌクレオチドの基本的なファーマコフォアを定義できることである。これらの治療モダリティーのそれぞれは、重大な技術的、臨床的、および調節的な課題を抱えている。治療薬としてのオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス、ＲＮＡｉ）のいくつかの限界としては、好ましくない薬物動態、経口バイオアベイラビリティの欠如、および血液脳関門通過の欠如が挙げられ、後者は神経学的疾患の治療用の非経口の薬物投与後に脳または脊髄に送達することを不可能にする。加えて、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子などの複雑な送達系なしでは固形腫瘍内に効果的に取り込まれない。最後に、細胞および組織内に取り込まれたオリゴヌクレオチドの大部分はエンドソームなどの非機能性の区画に留まり、そこを逃れて標的が位置するサイトゾルおよび／または核に入る物質はごくわずかである。
【０１３１】
「伝統的な」小分子は、腸からの優れた吸収、標的臓器への優れた分配、および優れた細胞透過を示すように最適化することができる。本発明は、標的ＲＮＡに結合してその活性をモジュレートする有益な薬物特性を有する「伝統的な」（すなわち、「リピンスキーに適合した」（Lipinskiら、Adv.  Drug  Deliv.  Rev.  ２００１年、４６巻、３〜２６頁）小分子の使用を企図する。したがって、一態様では、本発明は、標的ＲＮＡに結合しその機能をモジュレートする小分子を同定する方法であって、標的ＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、スクリーニング方法は、スクリーニングライブラリーを使用して新たなＲＮＡ標的を同定する。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたは非コーディングＲＮＡから選択される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合アッセイは、標的ＲＮＡ上の結合部位（複数可）の一次配列中の位置を同定する。一部の実施形態では、小分子は、リピンスキーに適合している。
【０１３２】
ｍＲＮＡの標的化
ｍＲＮＡ内の非コーディング領域は、ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルに影響することができる。簡潔に述べれば、これらは、翻訳効率に影響するＩＲＥＳおよび上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）、スプライシング効率および選択的スプライシングパターンに影響するイントロン配列、ｍＲＮＡおよびタンパク質の局在性に影響する３’ＵＴＲ配列、ならびにｍＲＮＡの分解および半減期を制御するエレメントを含む。これらのＲＮＡエレメントの治療的モジュレーションは有益な効果を持つことができる。また、ｍＲＮＡは、トリヌクレオチドリピートなどの単純反復配列の伸長を含み得る。ＲＮＡを含むこれらのリピート伸長は毒性であり得、特にある特定の神経学的および筋骨格疾患において、疾患病理を推進することが観察されている（GatchelおよびZoghbi、Nature  Rev.  Gen.  ２００５年、６巻、７４３〜７５５頁を参照）。加えて、翻訳の間の未熟な終止を軽減するために、スプライシングをモジュレートして終止コドンを導入する突然変異を有するエクソンをスキップすることができる。
【０１３３】
小分子を使用して、様々な状況下での治療的利益のためにｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートすることができる。その一例は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。ＳＭＡは運動ニューロン（ＳＭＮ）のタンパク質の不十分な生存量の結果である。ヒトは、ＳＭＮ１およびＳＭＮ２という２つのバージョンのＳＭＮ遺伝子を持つ。ＳＭＡ患者は変異したＳＭＮ１遺伝子を持つため、この患者らのＳＭＮタンパク質はＳＭＮ２のみに依存する。ＳＭＮ２遺伝子は非効率的なスプライシングを引き起こすサイレント変異をエクソン７に有するため、ＳＭＮ２転写物の大部分においてエクソン７がスキップされ、細胞内で急速に分解される欠陥タンパク質の生成に繋がる。その結果、この遺伝子座から産生されるＳＭＮタンパク質の量が制限される。ＳＭＮ２転写物のスプライシングの間にエクソン７が効率的に含まれるのを促進する小分子は、ＳＭＡの効果的な治療となるであろう（Palacinoら、Nature  Chem.  Biol.、２０１５年、１１巻、５１１〜５１７頁）。したがって、一態様では、本発明は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングをモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を同定する方法であって、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ｐｒｅ−ｍＲＮＡはＳＭＮ２転写物である。一部の実施形態では、疾患または障害は脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
【０１３４】
欠陥のあるスプライシングが疾患を引き起こさない場合であっても、スプライシングパターンの変化は疾患を正すために使用することができる。未熟な翻訳終結に繋がるナンセンス変異は、エクソン配列がインフレームであれば、エクソンスキッピングによって取り除くことができる。これにより、少なくとも部分的に機能的なタンパク質を創出することができる。エクソンスキッピングの使用の一例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィン遺伝子である。ＤＭＤ患者における未熟な終結コドンに繋がる様々な異なる変異は、オリゴヌクレオチドによって促進されるエクソンスキッピングによって取り除くことができる（Faircloughら、Nature  Rev.  Gen.、２０１３年、１４巻、３７３〜３７８頁で総説されている）。ＲＮＡ構造に結合し、スプライシングに影響する小分子は、類似の効果を有することが予測される。したがって、一態様では、本発明は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングパターンをモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を同定する方法であって、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ｐｒｅ−ｍＲＮＡはジストロフィン遺伝子転写物である。一部の実施形態では、小分子は、エクソンスキッピングを促進して未熟な翻訳終結を取り除く。一部の実施形態では、疾患または障害はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【０１３５】
最後に、ｍＲＮＡおよびその翻訳産物の発現は、非コーディング配列ならびに５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ内の構造を標的化することによって影響され得る。例えば、５’ＵＴＲ内のＲＮＡ構造は翻訳効率に影響することができる。５’ＵＴＲ内のヘアピンなどのＲＮＡ構造は翻訳に影響することが示されている。一般に、ＲＮＡ構造は、ｍＲＮＡの翻訳において決定的に重要な役割を果たすと考えられている。これらの２つの例としては、メインオープンリーディングフレームの翻訳レベルに影響することができる内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）である（KomarおよびHatzoglou、Frontiers  Oncol.  ５巻：２３３頁、２０１５年；Weingarten-Gabbayら、Science  ３５１巻：ｐｉｉ：ａａｄ４９３９、２０１６年；Calvoら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０６巻：７５０７〜７５１２頁；Le  Quesneら、J.  Pathol.  ２２０巻：１４０〜１５１頁、２０１０年；Barbosaら、PLOS  Genetics  ９巻：ｅ１００３５５２９頁、２０１３年）。例えば、全てのヒトｍＲＮＡのうちの半分近くがｕＯＲＦを有しており、これらの多くはメインＯＲＦの翻訳を低下させる。これらのＲＮＡを標的化する小分子は、治療的利益のために特定のタンパク質レベルをモジュレートするために使用され得る。したがって、一態様では、本発明は、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡの発現または翻訳効率をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を産生する方法であって、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、小分子の結合部位は、５’ＵＴＲ、内部リボソーム進入部位、または上流オープンリーディングフレームである。
【０１３６】
本発明は、その同族ｍＲＮＡを標的化することに基づく特定のタンパク質の発現を上方調節または下方調節するための小分子の使用を企図する。したがって、本発明は、小分子を用いて標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現をモジュレートする方法であって、この小分子は、本明細書中に開示したスクリーニング方法にしたがって同定されている、方法を提供する。別の態様では、本発明は、標的ｍＲＮＡに関連する下流タンパク質の発現をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を産生する方法であって、標的ｍＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。
【０１３７】
一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡによって媒介される疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与するステップを含む、方法を提供する。そのような化合物は本明細書中に詳細に説明されている。
【０１３８】
調節ＲＮＡの標的化
ＲＮＡ標的の最大のセットは、転写されるがタンパク質に翻訳されない、「非コーディングＲＮＡ」と呼ばれるＲＮＡである。非コーディングＲＮＡは高度に保存されており、多くの種類の非コーディングＲＮＡが広範な調節機能を果たしている。本明細書中で使用する場合、「非コーディングＲＮＡ」という用語は、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、競合内因性ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）、および偽遺伝子を包含するが、これらに限定されない。非コーディングＲＮＡのこれらの下位カテゴリーのそれぞれは、有意な治療的可能性を有する多数のＲＮＡ標的を与える。したがって、一部の実施形態では、本発明は、非コーディングＲＮＡによって媒介される疾患を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、または偽遺伝子によって引き起こされる。別の態様では、本発明は、標的非コーディングＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を産生する方法であって、標的非コーディングＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、または偽遺伝子である。
【０１３９】
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を調節する短い二本鎖ＲＮＡである（ElliottおよびLadomery、Molecular  Biology  of  RNA、第２版を参照）。各ｍｉＲＮＡは多くのヒト遺伝子の発現に影響することができる。ヒトには２，０００近くのｍｉＲＮＡが存在する。これらのＲＮＡは、細胞分化、細胞運命、運動性、生存、および機能を含めて多くの生物学的プロセスを調節する。ｍｉＲＮＡ発現レベルは、組織、細胞種、および疾患状況ごとに異なる。それらは、正常組織に対して腫瘍中で頻繁に異常発現し、それらの活性はがんにおいて重大な役割を果たし得る（総説については、Croce、Nature  Rev.  Genet.  １０巻：７０４〜７１４頁、２００９年；Dykxhoorn、Cancer  Res.  ７０巻：６４０１〜６４０６頁、２０１０年を参照）。ｍｉＲＮＡはがん遺伝子および腫瘍抑制因子を調節することが示されており、またそれら自体ががん遺伝子または腫瘍抑制因子として作用できる。一部は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）ならびにがん細胞の侵襲性および転移を促進することが示されている。発がん性ｍｉＲＮＡの場合、それらの阻害は効果的な抗がん治療となり得る。したがって、一態様では、本発明は、標的ｍｉＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を産生する方法であって、標的ｍｉＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはがん遺伝子または腫瘍抑制因子を調節し、あるいはがん遺伝子または腫瘍抑制因子として作用する。一部の実施形態では、疾患はがんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【０１４０】
ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１、およびｍｉＲ−１０ｂを含めて、治療的に標的化され得る多数の発がん性ｍｉＲＮＡが存在する（StahlhutおよびSlack、Genome  Med.  ２０１３年、５巻、１１１頁を参照）。ｍｉＲ−１５５は、炎症、高血圧、心不全、およびがんにおいて病理学的役割を果たす。がんにおいて、ｍｉＲ−１５５は発がんカスケードおよびアポトーシス抵抗性、ならびにがん細胞侵襲性の増大を誘起する。ｍｉＲ−１５５の発現の変化が、病期、進行、および治療転帰を反映して多数のがんで報告されている。ｍｉＲ−１５５の過剰発現が報告されているがんとしては、乳がん、甲状腺癌、結腸がん、子宮頸がん、および肺がんである。ｍｉＲ−１５５は、乳がんの薬物耐性における役割を果たすことが報告されている。ｍｉＲ−１７〜９２（Ｏｎｃｏｍｉｒ−１とも呼ばれる）は、ｍｉＲ−１７、２０ａ、１８ａ、１９ａ、９２−１、および１９ｂ−１を含む多シストロン性の１ｋｂの一次転写物である。これはＭＹＣによって活性化される。ｍｉＲ−１９は多数の造血細胞において遺伝子発現およびシグナル伝達経路を変化させ、また白血病誘発およびリンパ腫発生を誘起する。これは多様なヒト固形腫瘍および血液がんに関与する。ｍｉＲ−２１は発がん性ｍｉＲＮＡであり、多数の腫瘍抑制因子の発現を低下させる。これはがん細胞の侵襲を刺激し、また胸部、卵巣、頸部、結腸、肺、肝臓、脳、食道、前立腺、膵臓、および甲状腺のがんを含めてヒトの多様ながんに関連する。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７〜９２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−２１、またはｍｉＲ−１０ｂから選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺癌、結腸がん、肝臓がん、脳のがん、食道がん、前立腺がん、肺がん、白血病、またはリンパ節がんから選択されるがんである。一部の実施形態では、がんは固形腫瘍である。
【０１４１】
腫瘍学を超えて、ｍｉＲＮＡは、心臓血管疾患および代謝性疾患を含めて多くのその他の疾患において役割を果たす（QuiantおよびOlson、J.  Clin.  Invest.  １２３巻：１１〜１８頁、２０１３年；Olson、Science  Trans.  Med.  ６巻：  ２３９ｐｓ３、２０１４年；Baffy、J.  Clin.  Med.  ４巻：１９７７〜１９８８頁、２０１５年）。
【０１４２】
多くの成熟ｍｉＲＮＡは長さが比較的短いため、小分子によって標的化されるために十分なフォールディングした三次元構造（thrtee-dimensional  structure）を欠くことがある。しかしながら、そのようなｍｉＲＮＡのレベルは、一次転写物またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡに結合して成熟ｍｉＲＮＡの生合成を妨げる小分子によって低下され得ると考えられる。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的ｍｉＲＮＡは一次転写物またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。
【０１４３】
ｌｎｃＲＮＡは２００ヌクレオチド（ｎｔ）を上回るＲＮＡであり、タンパク質をコードしない（RinnおよびChang、Ann.  Rev.  Biochem.  ２０１２年、８１巻、１４５〜１６６頁を参照；（総説については、MorrisおよびMattick、Nature  Reviews  Genetics  １５巻：４２３〜４３７頁、２０１４年；MattickおよびRinn、Nature  Structural  &  Mol.  Biol.  ２２巻：５〜７頁、２０１５年；Iyerら、Nature  Genetics  ４７巻（：１９９〜２０８頁、２０１５年）を参照）。ｌｎｃＲＮＡは、転写、スプライシング、およびｍＲＮＡの分解のレベルでタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現に影響することができる。ｌｎｃＲＮＡはクロマチン構造を変化させることによって転写を増加または低下させるエピジェネティック調節因子を動員することによって転写を調節できることを相当数の研究が示している（例えば、HolochおよびMoazed、Nature  Reviews  Genetics  １６巻：７１〜８４頁、２０１５年）。ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患、および心臓血管疾患を含めてヒト疾患に関連する（例えば、PresnerおよびChinnaiyan、Cancer  Discovery  １巻：３９１〜４０７頁、２０１１年；Johnson、Neurobiology  of  Disease  ４６巻：２４５〜２５４頁、２０１２年；GutscherおよびDiederichs、RNA  Biology  ９巻：７０３〜７１９頁、２０１２年；Kumarら、PLOS  Genetics  ９巻：ｅ１００３２０１、２０１３年；van  de  Vondervoortら、Frontiers  in  Molecular  Neuroscience、２０１３年；Liら、Int.  J.  Mol.  Sci.  １４巻：１８７９０〜１８８０８頁、２０１３年）。ｌｎｃＲＮＡを標的化することで、治療的利益のために特定の遺伝子およびタンパク質の発現を上方調節または下方調節し得る（例えば、Wahlestedt、Nature  Reviews  Drug  Discovery  １２巻：４３３〜４４６頁、２０１３年；GuilおよびEsteller、Nature  Structural  &  Mol.  Biol.  １９巻：１０６８〜１０７５頁、２０１２年）。一般に、ｌｎｃＲＮＡは、ｍＲＮＡと比べて低いレベルで発現される。多くのｌｎｃＲＮＡは、クロマチンと物理的に会合しており（Wernerら、Cell  Reports  １２巻、１〜１０頁、２０１５年）、タンパク質をコードする遺伝子に近接して転写される。ｌｎｃＲＮＡはしばしば、転写の部位において物理的に会合したままであり、シスで局所的に作用して隣接ｍＲＮＡの発現を調節する。ｌｎｃＲＮＡの突然変異および調節異常はヒト疾患に関連するため、治療標的となり得る数多くのｌｎｃＲＮＡが存在する。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡはｌｎｃＲＮＡである。一部の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、がん、炎症性疾患、神経学的疾患、または心臓血管疾患に関連する。
【０１４４】
ｌｎｃＲＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し、多くの異なるレベルで作用して転写、選択的スプライシング、およびｍＲＮＡの分解に影響する。例えば、ｌｎｃＲＮＡは、エピジェネティック調節因子であるＰＲＣ２に結合して遺伝子へのその動員を促進し、次いでこの遺伝子の転写はクロマチン修飾を介して抑止されることが示されている。ｌｎｃＲＮＡは、様々な調節タンパク質とのその会合を媒介する複雑な構造を形成し得る。これらのｌｎｃＲＮＡ構造に結合する小分子は、個々のｌｎｃＲＮＡによって通常調節される遺伝子の発現をモジュレートするために使用され得る。
【０１４５】
１つの例示的な（examplary）標的ｌｎｃＲＮＡはＨＯＴＡＩＲであり、これはヒト第１２染色体上のＨｏｘＣ遺伝子座から発現されるｌｎｃＲＮＡである。その（is）発現レベルは低い（細胞あたり約１００ＲＮＡコピー）。多くのｌｎｃＲＮＡと異なり、ＨＯＴＡＩＲは、トランスで作用して遠位の遺伝子の発現に影響することができる。ＨＯＴＡＩＲは、エピジェネティックリプレッサーＰＲＣ２、および別の抑止的エピジェネティック調節因子であるＬＳＤ１／ＣｏＲＥＳＴ／ＲＥＳＴ複合体に結合する（Tsaiら、Science  ３２９巻、６８９〜６９３頁、２０１０年）。ＨＯＴＡＩＲは、高度に構造化されたＲＮＡであり、そのヌクレオチドの５０％より多くが塩基対形成に関与している。ＨＯＴＡＩＲは、様々な種類のがんにおいて頻繁に異常調節されている（しばしば上方調節されている）（Yaoら、Int.  J.  Mol.  Sci.  １５巻：１８９８５〜１８９９９頁、２０１４年；Dengら、PLOS  One  ９巻：ｅ１１００５９頁、２０１４年）。ＨＯＴＡＩＲの発現レベルが高いがん患者は、発現レベルが低い患者と比べて、予後が著しく不良である。ＨＯＴＡＩＲは、アポトーシスの制御、増殖、転移、血管新生、ＤＮＡ修復、化学療法抵抗性、および腫瘍細胞代謝に関与することが報告されている。ＨＯＴＡＩＲは転移性乳がんにおいて高発現する。原発性胸部腫瘍における高レベルの発現はその後の転移および死の有意な予測因子である。ＨＯＴＡＩＲは、食道扁平上皮癌に関連することも報告されており、また結腸直腸がん、子宮頸がん、胃がん、および子宮内膜癌における予後診断因子である。したがって、ＨＯＴＡＩＲ結合性小分子は新規の抗がん薬物候補である。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡはＨＯＴＡＩＲである。一部の実施形態では、疾患または障害は、乳がん、食道扁平上皮癌、結腸直腸がん、子宮頸がん、胃がん、または子宮内膜癌である。
【０１４６】
ｌｎｃＲＮＡの中で別の潜在的ながん標的はＭＡＬＡＴ−１（metastasis-associated  lung  adenocarcinoma  transcript  1）であり、これはＮＥＡＴ２（nuclear-enriched  abundant  transcript  2）としても知られている（Gutschnerら、Cancer  Res.  ７３巻：１１８０〜１１８９頁、２０１３年；Brownら、Nat.  Structural  &  Mol.  Biol.  ２１巻：６３３〜６４０頁、２０１４年）。ＭＡＬＡＴ−１は高度に保存された７ｋｂの核内ｌｎｃＲＮＡであり、核スペックル内に局在化する。ＭＡＬＡＴ−１は正常組織内で遍在的に発現されるが、多くのがんにおいて上方調節されている。ＭＡＬＡＴ−１は、肺がんを含めた多数のがんにおいて転移進行の予測マーカーである。ＭＡＬＡＴ−１は遺伝子発現の調節因子として機能して転写および／またはスプライシングに影響する可能性があるようである。ＭＡＬＡＴ−１ノックアウトマウスは表現型を有さず、このことはＭＡＬＡＴ−１の正常機能が限られていることを示している。しかしながら、ＭＡＬＡＴ−１欠損がん細胞は遊走に障害があり、マウス異種移植腫瘍モデルにおいて形成する腫瘍がより少ない。ＭＡＬＡＴ−１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、マウスにおいて腫瘍生着後の転移形成を防止する。いくつかのマウス異種移植腫瘍モデルのデータは、ＡＳＯによるＭＡＬＡＴ−１のノックダウンは原発性腫瘍の成長および転移の両方を阻害し得ることを示している。よって、ＭＡＬＡＴ−１を標的化する小分子は、腫瘍成長および転移の阻害に効果的であることが予測される（exptected）。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的非コーディングＲＮＡはＭＡＬＡＴ−１である。一部の実施形態では、疾患または障害は、肺がんなどのＭＡＬＡＴ−１が上方調節されるがんである。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明は、非コーディングＲＮＡ（ＨＯＴＡＩＲまたはＭＡＬＡＴ−１など）によって媒介される疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与するステップを含む、方法を提供する。そのような化合物は本明細書中に詳細に説明されている。
【０１４８】
毒性ＲＮＡ（リピートＲＮＡ）の標的化
ｍＲＮＡ中の単純反復はしばしばヒト疾患に関連する。これらはしばしば、排他的ではないが、ＣＡＧなどの３ヌクレオチドの反復（「トリプレットリピート」）である（総説については、GatchelおよびZoghbi、Nature  Reviews  Genetics  ６巻：７４３〜７５５頁、２００５年；Krzyzosiakら、Nucleic  Acids  Res.  ４０巻：１１〜２６頁、２０１２年；BudworthおよびMcMurray、Methods  Mol.  Biol.  １０１０巻：３〜１７頁、２０１３年を参照）。トリプレットリピートはヒトゲノム中に豊富に存在し、世代を経るにつれて伸長する傾向がある。おおよそ４０のヒト疾患が反復配列の伸長に関連している。トリプレットの伸長によって引き起こされる疾患は、トリプレットリピート伸長疾患（ＴＲＥＤ）として知られる。健常個体は様々な数のトリプレットリピートを持つが、それより多い反復数になると疾患を引き起こす閾値が存在する。閾値は障害ごとに様々である。トリプレットリピートは不安定であり得る。遺伝子が引き継がれるにつれて反復数が増加することがあり、世代が進むにつれて状態がより重篤となり得るか、またはより早期に発症し得る。個体が正常範囲内でいくつかの反復を持つ場合、次の世代に引き継がれる時に反復は伸長されないことが予期される。反復数が前突然変異の範囲内（正常であるが、不安定な反復数）にある場合、次の世代への遺伝の際に反復が伸長することもあるし、しないこともある。前突然変異を持つ正常個体は該状態を有しないが、完全な突然変異の範囲内にあるトリプレットリピートを受け継ぎ罹患することになる子供を持つリスクがある。ＴＲＥＤは、常染色体顕性、常染色体劣性、またはＸ連鎖性であり得る。より頻繁に見られるトリプレットリピート障害は常染色体顕性である。
【０１４９】
反復はｍＲＮＡのコーディング部分または非コーディング部分にあることができる。非コーディング領域内の反復の場合、反復は５’ＵＴＲ配列、イントロン、または３’ＵＴＲ配列内に存在し得る。コーディング領域内の反復配列によって引き起こされる疾患のいくつかの例を表１に示す。
【表１】
2019511562.tif 000002
【０１５０】
ｍＲＮＡの非コーディング領域内にある反復配列によって引き起こされる疾患のいくつかの例を表２に示す。
【表２】
2019511562.tif 000003
【０１５１】
反復配列に起因する毒性は、毒性ＲＮＡそれ自体の作用の直接の結果であり得るか、あるいは、リピート伸長がコード配列内にある場合、ＲＮＡおよび／または異常タンパク質の毒性に起因し得る。リピート伸長ＲＮＡは、決定的に重要なＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）をフォーカス内に隔離することによって作用することができる。隔離されるＲＢＰの一例は、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄファミリーのタンパク質ＭＢＮＬ１である。ＲＢＰの隔離は、スプライシングの欠陥ならびにＲＮＡおよびタンパク質の核細胞質輸送の欠陥に繋がる。ＲＢＰの隔離はｍｉＲＮＡ生合成にも影響することができる。ＲＮＡ生物学におけるこれらの擾乱は、ニューロンの機能および生存に大きく影響して様々な神経学的疾患に繋がり得る。
【０１５２】
ＲＮＡ中の反復配列は、ＲＢＰに結合し、正常なＲＮＡ生物学に影響する二次構造および三次構造を形成する。疾患の一具体例は、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１；筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））であり、これは筋肉衰弱および収縮後の筋肉の緩慢な弛緩によって特徴付けられるよく見られる遺伝性の筋肉疾患である（Machuca-Tziliら、Muscle  Nerve  ３２巻：１〜１８頁、２００５年）。これは筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica）プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲのＣＵＧ伸長によって引き起こされる。この反復を含むＲＮＡは、スプライシング調節因子ＭＢＮＬ１およびＣＵＧリピート結合タンパク質（ＣＥＬＦ１）への影響を通じていくつもの発生的に調節される転写物の選択的スプライシングの誤調節を引き起こす（Wheelerら、Science  ３２５巻：３３６〜３３９頁、２００９年）。ＤＭＰＫの転写物内のＣＵＧリピートに結合する小分子は、ＲＮＡ構造を変化させ、病巣形成を防止し、これらのスプライシング（spicing）調節因子への影響を軽減するであろう。最もよく見られる遺伝性の精神遅滞である脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、ＦＭＲ１遺伝子の５’ＵＴＲ内のＣＧＧリピート伸長の結果である（Lozanoら、Intractable  Rare  Dis.  Res.  ３巻：１３４〜１４６頁、２０１４年）。ＦＭＲＰは、多くのｍＲＮＡの翻訳の調節、およびタンパク質輸送にとって決定的に重要であり、またシナプス発生および神経可塑性のために必須のタンパク質である。よって、その欠損は神経病理に繋がる。このＣＧＧリピートＲＮＡを標的化する小分子は、ＦＭＲ１  ｍＲＮＡおよびＦＭＲＰタンパク質の発現の抑制を軽減し得る。満たされていない非常に大きな医学上の必要性を持つ別のＴＲＥＤはハンチントン病（ＨＤ）である。ＨＤは、運動、認知、および精神医学的な変化を伴う進行性の神経学的障害である（Zuccatoら、Physiol  Rev.  ９０巻：９０５〜９８１頁、２０１０年）。ＨＴＴ遺伝子のコード配列内のＣＡＧリピートは、転写、小胞輸送、ミトコンドリア機能、およびプロテアーゼ活性への有害な影響を持つらしいポリグルタミンリピートを有するタンパク質に繋がるので、ＨＤはポリグルタミンまたはポリＱ障害として特徴付けられる。しかしながら、ＨＴＴのＣＡＧリピートＲＮＡそれ自体もまた、核内封入体内へのＭＢＮＬ１タンパク質の隔離を含めて毒性を示す。その他の一具体例は、Ｃ９ｏｒｆ７２（chromosome  9  open  reading  frame  72）遺伝子内のＧＧＧＧＣＣリピート伸長であり、これは家族性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の両方においてよく見られる（Lingら、Neuron  ７９巻：４１６〜４３８頁、２０１３年；Haeuslerら、Nature  ５０７巻：１９５〜２００頁、２０１４年）。リピートＲＮＡ構造は、決定的に重要なＲＮＡ結合タンパク質を隔離する核内フォーカスを形成する。ＧＧＧＧＣＣリピートＲＮＡはまた、ＲａｎＧＡＰ１に結合してそれを隔離して、ＲＮＡおよびタンパク質の核細胞質間輸送を害する（Zhangら、Nature  ５２５巻：５６〜６１頁、２０１５年）。これらのリピート伸長ＲＮＡのいずれかを選択的に標的化することは、これらの神経学的疾患における治療的利益を与え得る。
【０１５３】
本発明は、タンパク質の発現の仲介またはタンパク質の発現の調節を通じて作用するのではなく、異常なＲＮＡそれ自体が病原性効果を引き起こす疾患または障害を治療する方法を企図する。一部の実施形態では、疾患または障害は、上記したものまたは表１および２に記載のものなどの、リピートＲＮＡによって媒介される。一部の実施形態では、疾患または障害は、反復がｍＲＮＡのコーディング領域内にあるリピート伸長疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、反復がｍＲＮＡの非コーディング領域内にあるリピート伸長疾患である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、または、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、もしくはＳＣＡ１７から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）から選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は、脆弱性Ｘ症候群、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１または筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、もしくはＳＣＡ１２から選択される脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、またはＣ９ＦＴＤ（筋萎縮性側索硬化症またはＡＬＳ）から選択される。
【０１５４】
一部の実施形態では、疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋強直性ジストロフィー（ＤＭ１または筋強直性ジストロフィー（dystrophia  myotonica））、または脆弱性Ｘ症候群である。
【０１５５】
一部の実施形態では、本発明は、リピートＲＮＡによって媒介される疾患または障害を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の化合物を投与するステップを含む、方法を提供する。そのような化合物は本明細書中に詳細に説明されている。
【０１５６】
標的リピート伸長ＲＮＡの活性をモジュレートして疾患または障害を治療する小分子を産生する方法であって、標的リピート伸長ＲＮＡへの結合について１つまたは複数の開示した化合物をスクリーニングするステップ、および本明細書中に開示したＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法も提供される。一部の実施形態では、リピート伸長ＲＮＡは、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＢＭＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、またはＳＣＡ１７から選択される疾患または障害を引き起こす。一部の実施形態では、疾患または障害は、脆弱性Ｘ症候群、ＤＭ１、ＦＲＤＡ、ＳＣＡ８、ＳＣＡ１０、ＳＣＡ１２、またはＣ９ＦＴＤから選択される。
【０１５７】
その他の標的ＲＮＡおよび疾患／状態
多数のさらなるＲＮＡと疾患または状態との間に関連が存在することが知られており、そのいくつかを下記の表３に示す。したがって、上記の方法の一部の実施形態では、標的ＲＮＡは表３に示すものから選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は表３に示すものから選択される。
【表３−１】
2019511562.tif 000004
【表３−２】
2019511562.tif 000005
【表３−３】
2019511562.tif 000006
【表３−４】
2019511562.tif 000007
【０１５８】
２．化合物およびその実施形態
本発明の化合物、および薬学的に許容されるその組成物は、創薬において使用するための剤として、標的ＲＮＡに関連する疾患または状態を治療し、予防し、または改善するためのＲＮＡモジュレーターとして、ならびに活性部位またはアロステリック部位の位置および／または構造、および／または標的ＲＮＡの三次構造を決定する方法において使用するために効果的であることが今や分かっている。
【０１５９】
一態様では、本発明の化合物、およびその医薬組成物は、標的ＲＮＡ上の１つまたは複数の結合部位（活性部位またはアロステリック部位など）に選択的に結合して標的ＲＮＡに関連する疾患または状態を治療し、予防し、または改善する小分子リガンドを同定するのに有用である。
【０１６０】
別の態様では、本発明の化合物、およびその医薬組成物は、例えば、標的ＲＮＡをモジュレートして、標的ＲＮＡに関連する疾患または状態を治療し、予防し、または改善するための治療剤として有用である。例えば、理論に縛られることを望まないが、開示した化合物は、小分子リガンドの結合部位の近位にある標的ＲＮＡの２’−ＯＨへの修飾部分の共有結合による標的ＲＮＡの非可逆的な阻害剤として作用し得る。
【０１６１】
別の態様では、本発明の化合物、およびその医薬組成物は、活性部位またはアロステリック部位の位置および／または構造、ならびに／あるいは標的ＲＮＡの三次構造を決定するのに有用である。
【０１６２】
一部の実施形態では、本発明は、
（ａ）標的ＲＮＡ上の１つまたは複数の結合部位に選択的に結合する小分子リガンド、
（ｂ）標的ＲＮＡの１つまたは複数の２’−ＯＨへの共有結合を形成する修飾部分（または「弾頭」）、
（ｃ）任意選択で、クリック実行可能基、
（ｄ）任意選択で、プルダウン基、および
（ｅ）小分子リガンドと修飾部分、および任意選択でクリック実行可能基とを共有結合的に連結するテザー基
を含む化合物を提供する。
【０１６３】
いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、本発明の化合物は、標的ＲＮＡ上の１つまたは複数の活性部位またはアロステリック部位、あるいは小分子リガンドと標的ＲＮＡの構造との間の結合相互作用によって決定されるその他の部位に選択的に結合すること、標的ＲＮＡの１つまたは複数の２’−ＯＨ基を共有結合的に修飾すること、および２’−ＯＨの修飾パターンはＲＮＡリガンドをＲＮＡ弾頭に接続するテザーの長さおよびコンフォメーションによって拘束されるので２’−ＯＨ修飾ヌクレオチドの分布のシークエンシング解析によって活性部位またはその他の結合部位を同定するためにその後に使用され得ると考えられる。標的ＲＮＡは、該化合物との接触前に細胞内、細胞溶解物中、または単離された形態で存在し得る。開示した化合物のライブラリーのスクリーニングにより、標的ＲＮＡの活性の非常に強力な小分子モジュレーターが同定される。そのようなスクリーニングによって同定されるそのような小分子は、それを必要とする患者において疾患または状態を治療し、予防し、または改善するための標的ＲＮＡのモジュレーターとして使用され得ることが理解される。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、提供される化合物は、図２および図５〜３１に示すような、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型という３つの群に分類される。
【０１６５】
Ｉ型の化合物は、一般式Ｉ：
【化１】
2019511562.tif 000008
または薬学的に許容されるその塩を有する（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、各記号は下記に定義される通りである）。
【０１６６】
ＩＩ型の化合物は、一般式ＩＩ：
【化２】
2019511562.tif 000009
または薬学的に許容されるその塩を有する（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１およびＴ２のそれぞれは独立して二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基であり、各記号は下記に定義される通りである）。
【０１６７】
ＩＩＩ型の化合物は、一般式ＩＩＩ：
【化３】
2019511562.tif 000010
または薬学的に許容されるその塩を有する（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１は三価のテザー基であり、
Ｔ２は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基であり、各記号は下記に定義される通りである）。
【０１６８】
別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡおよび式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのいずれかの化合物を含むＲＮＡコンジュゲート（式中、Ｒｍｏｄは標的ＲＮＡへの共有結合を形成している）を提供する。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明は、式ＩＶのＲＮＡコンジュゲート：
【化４】
2019511562.tif 000011
（式中、リガンドは標的ＲＮＡに結合する小分子であり、
ＲＮＡは標的ＲＮＡを表し、
Ｔ１は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲｍｏｄとＲＮＡとの間の−Ｏ−は標的ＲＮＡの２’ヒドロキシルからＲｍｏｄへの共有結合を表し、各記号は下記に定義される通りである）を提供する。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明は、式ＶのＲＮＡコンジュゲート：
【化５】
2019511562.tif 000012
（式中、リガンドは標的ＲＮＡに結合する小分子であり、
ＲＮＡは標的ＲＮＡを表し、
Ｔ１は三価のテザー基であり、
Ｔ２は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基であり、
ＲｍｏｄとＲＮＡとの間の−Ｏ−は標的ＲＮＡの２’ヒドロキシルからＲｍｏｄへの共有結合を表し、各記号は下記に定義される通りである）を提供する。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、式ＶＩのＲＮＡコンジュゲート：
【化６】
2019511562.tif 000013
（式中、リガンドは標的ＲＮＡに結合する小分子であり、
ＲＮＡは標的ＲＮＡを表し、
Ｔ１およびＴ２は各々独立して二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基であり、
ＲｍｏｄとＲＮＡとの間の−Ｏ−は標的ＲＮＡの２’ヒドロキシルからＲｍｏｄへの共有結合を表し、各記号は下記に定義される通りである）を提供する。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、標的ＲＮＡ式ＩＩまたはＩＩＩの化合物、およびプルダウン基を含むコンジュゲート（式中、Ｒｍｏｄは標的ＲＮＡへの共有結合を形成している）を提供する。
【０１７３】
一部の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩのＲＮＡコンジュゲート：
【化７】
2019511562.tif 000014
（式中、リガンドは標的ＲＮＡに結合する小分子であり、
ＲＮＡは標的ＲＮＡを表し、
Ｔ１は三価のテザー基であり、
Ｔ２は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基であり、
ＲＰＤはプルダウン基であり、
ＲｍｏｄとＲＮＡとの間の−Ｏ−は標的ＲＮＡの２’ヒドロキシルからＲｍｏｄへの共有結合を表し、各記号は下記に定義される通りである）を提供する。一部の実施形態では、ＲＣＧは、
【化８】
2019511562.tif 000015
である。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩのＲＮＡコンジュゲート：
【化９】
2019511562.tif 000016
（式中、リガンドは標的ＲＮＡに結合する小分子であり、
ＲＮＡは標的ＲＮＡを表し、
Ｔ１およびＴ２は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＰＤはプルダウン基であり、
ＲｍｏｄとＲＮＡとの間の−Ｏ−は標的ＲＮＡの２’ヒドロキシルからＲｍｏｄへの共有結合を表し、各記号は下記に定義される通りである）を提供する。一部の実施形態では、ＲＣＧは、
【化１０】
2019511562.tif 000017
である。
【０１７５】
一部の実施形態では、化合物またはコンジュゲートは、図５〜３１に示す式、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。
【０１７６】
一部の実施形態では、化合物は、図６６〜６８、７０〜７５、もしくは７７〜９４に示す化合物、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。
【０１７７】
小分子ＲＮＡリガンド
ＲＮＡに結合できる新規の小分子リガンドの設計および合成は、大部分が未開発の治療的可能性を表す。マクロライド（例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン）、アルカロイド（例えば、ベルベリン、パルマチン）、アミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、ネオマイシンＢ、カナマイシンＡ）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン）、テオフィリン、リボシル、トリプチセン、およびオキサゾリジノン（例えば、リネゾリド、テジゾリド）を含めて、ある特定の小分子リガンドはＲＮＡに結合することが知られており、ＲＮＡ標的化薬物としての小分子の探索の道を開く。さらには、キノリン核を含むある特定の化合物（その１つはＣＰＮＱである）はＲＮＡに結合できることが今や分かっている。ＣＰＮＱは下記の構造：
【化１１】
2019511562.tif 000018
を有する。
【０１７８】
したがって、一部の実施形態では、小分子リガンドはＣＰＮＱまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。他の実施形態では、リガンドは、ＣＰＮＱに関連するキノリン化合物から選択され、該化合物は例えば、下記の表６もしくは表７のいずれか１つ、または図９７〜１０５のいずれか１つにおいて提供される化合物、あるいは薬学的に許容されるその塩などである。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＣＰＮＱまたはＣＰＮＱに関連するキノリンは、本明細書中に記載するようなそれぞれの実施形態にしたがって、１つまたは複数の利用可能な位置において修飾されて水素がテザー（−Ｔ１−および／または−Ｔ２−）、クリック実行可能基（−ＲＣＧ）、または弾頭（−Ｒｍｏｄ）によって置き換えられている。例えば、ＣＰＮＱまたはＣＰＮＱに関連するキノリンは、以下の式：
【化１２】
2019511562.tif 000019
（式中、Ｒｍｏｄは、任意選択で−ＲＣＧまたは−Ｔ２−ＲＣＧにより置換されており、さらに任意選択でプルダウン基により置換されている）の１つ、または薬学的に許容されるその塩を有し得る。式ＩＸまたは式Ｘの化合物は、さらに任意選択で、下記に定義されるような１つまたは複数の任意選択の置換基（例えば、１つまたは２つの任意選択の置換基）により置換されていてもよい。
【０１８０】
有機色素、アミノ酸、生物学的補因子、金属錯体、およびペプチドもまたＲＮＡ結合能力を示す。リボスイッチ、伸長されたヌクレオチドリピートを有するＲＮＡ分子、およびウイルスＲＮＡエレメントなどのＲＮＡをモジュレートすることが可能である。
【０１８１】
本明細書中で使用する場合、「標的ＲＮＡに結合する小分子」、「小分子ＲＮＡ結合剤」、「親和性部分」、または「リガンド部分」という用語は、開示した方法での使用、または標的ＲＮＡに関連する疾患を治療し、予防し、もしくは改善するための使用のために十分な親和性および特異性を以って標的ＲＮＡに結合できる小分子と一般に分類される全ての化合物を包含する。本発明において使用するためのＲＮＡに結合する小分子は、標的ＲＮＡの１つまたは複数の二次構造または三次構造のエレメントに結合し得る。これらの部位としては、ＲＮＡトリプレックス、ヘアピン、バルジループ、シュードノット、内部ループ、および本明細書において記載または参照するその他のより高次のＲＮＡ構造モチーフが挙げられる。
【０１８２】
したがって、一部の実施形態では、標的ＲＮＡ（例えば、上記式Ｉ〜ＶＩＩＩのリガンド）に結合する小分子は、マクロライド、アルカロイド、アミノグリコシド、テトラサイクリンファミリーのメンバー、オキサゾリジノン、ＳＭＮ２リガンド（例えば、図３４に示すもの）、リボシルもしくはその類似体、アントラセン、トリプチセン、テオフィリンもしくはその類似体、またはＣＰＮＱもしくはその類似体から選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡに結合する小分子は、パロモマイシン、ネオマイシン（ネオマイシンＢなど）、カナマイシン（カナマイシンＡなど）、リネゾリド、テジゾリド、プレウロムチリン、リボシル、ＮＶＳ−ＳＭ１、アントラセン、トリプチセン、またはＣＰＮＱもしくはその類似体から選択され、ここで各小分子は、任意選択で、以下で定義するような１つまたは複数の「任意選択の置換基」（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ（例えば、１つまたは２つ）の任意選択の置換基）により置換されていてもよい。一部の実施形態では、小分子は、図３２〜３６に示すもの、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。一部の実施形態では、小分子は、図３７〜４４に示すもの、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。一部の実施形態では、小分子は、図９７〜１０５に示すもの、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。一部の実施形態では、小分子は、表６もしくは表７に示すもの、または薬学的に許容されるその塩、立体異性体、もしくは互変異性体から選択される。
【０１８３】
一部の実施形態では、リガンドは、標的ＲＮＡ中のジャンクション、ステムループ、またはバルジに結合する。一部の実施形態では、リガンドは、核酸の三方向ジャンクション（three-way  junction）（３ＷＪ）に結合する。一部の実施形態では、３ＷＪは、２つのＲＮＡ分子の間のトランス３ＷＪである。一部の実施形態では、３ＷＪは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間のトランス３ＷＪである。
【０１８４】
本発明の化合物は、本明細書中に一般的に記載した化合物を包含し、さらに本明細書中に開示したクラス、サブクラス、および種によって示されている。本明細書中で使用する場合、別段の記載がなければ以下の定義が適用される。本発明の目的のために、化学元素は、Handbook  of  Chemistry  and  Physics、第７５版中のＣＡＳ方式の元素周期表にしたがって特定される。さらに、有機化学の一般原則は、「Organic  Chemistry」、Thomas  Sorrell、University  Science  Books、Sausalito：１９９９年、および「March's  Advanced  Organic  Chemistry」、第５版、Smith,  M.B.およびMarch,  J.編、John  Wiley  &  Sons、New  York：２００１年（これらの内容の全体は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１８５】
本明細書中で使用する場合、「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、直鎖（すなわち、非分岐鎖）または分岐鎖の、置換または非置換の、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含む炭化水素鎖、あるいは、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含むが、芳香族ではない単環式炭化水素または二環式炭化水素（本明細書中で「炭素環」、「脂環式」、または「シクロアルキル」とも称する）であって、分子の残部への単一の結合点を有するものを意味する。別段の規定がなければ、脂肪族基は１〜６個の脂肪族炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は１〜５個の脂肪族炭素原子を含む。他の実施形態では、脂肪族基は１〜４個の脂肪族炭素原子を含む。また他の実施形態では、脂肪族基は１〜３個の脂肪族炭素原子を含み、さらに他の実施形態では、脂肪族基は１〜２個の脂肪族炭素原子を含む。一部の実施形態では、「脂環式」（または「炭素環」もしくは「シクロアルキル」）とは、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含むが、芳香族ではなく、分子の残部への単一の結合点を有する単環式Ｃ３〜Ｃ６炭化水素を指す。好適な脂肪族基としては、直鎖または分岐鎖の、置換または非置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびこれらのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキル、または（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
本明細書中で使用する場合、「架橋二環式」という用語は、任意の二環式環系、すなわち、炭素環または複素環の、飽和または部分不飽和の、少なくとも１つの橋を有する、二環式環系を指す。ＩＵＰＡＣによって定義される通り、「橋」とは、２つの橋頭を接続する複数原子の非分岐鎖、または１つの原子もしくは原子価結合であり、ここで「橋頭」とは、３つまたはそれより多くの骨格原子（水素を除く）に結合しているその環系の任意の骨格原子である。一部の実施形態では、架橋二環式基は、７〜１２個の環員、および独立して窒素、酸素、または硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する。そのような架橋二環式基は当該技術分野において周知であり、そして各基が任意の置換可能な炭素原子または窒素原子において分子の残部に結合している、以下に記載する基を包含する。別段の規定がなければ、架橋二環式基は、任意選択で、脂肪族基について記載したような１つまたは複数の置換基で置換されている。追加的または代替的に、架橋二環式基の任意の置換可能な窒素は、任意選択で置換されている。例示的な架橋二環式としては、
【化１３】
2019511562.tif 000020
【化１４】
2019511562.tif 000021
が挙げられる。
【０１８７】
「低級アルキル」という用語は、Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。例示的な低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルである。
【０１８８】
「低級ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数のハロゲン原子で置換されている、Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。
【０１８９】
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素（窒素、硫黄、リン、またはケイ素の任意の酸化形態、任意の塩基性窒素の四級化形態、あるいは複素環式環の置換可能な窒素（例えば、（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）Ｎ、（ピロリジニルにおけるような）ＮＨ、または（Ｎ−置換ピロリジニルにおけるような）ＮＲ＋を包含する）のうちの１つまたは複数を意味する。
【０１９０】
本明細書中で使用する場合、「不飽和」という用語は、ある部分が１つまたは複数の不飽和単位を有することを意味する。
【０１９１】
本明細書中で使用する場合、「二価のＣ１〜８（もしくはＣ１〜６）の飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖」という用語は、本明細書において定義するような、直鎖または分岐鎖の、二価のアルキレン鎖、アルケニレン鎖、およびアルキニレン鎖を指す。
【０１９２】
「アルキレン」という用語は、二価のアルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎは正の整数、好ましくは１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、または２〜３である。置換アルキレン鎖は１つまたは複数のメチレン水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては、置換脂肪族基について下記するものが挙げられる。
【０１９３】
「アルケニレン」という用語は、二価のアルケニル基を指す。置換アルケニレン鎖は、少なくとも１つの二重結合を含み、１つまたは複数の水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては置換脂肪族基について下記するものが挙げられる。
【０１９４】
本明細書中で使用する場合、「シクロプロピレニル」という用語は、以下の構造：
【化１５】
2019511562.tif 000022
の二価のシクロプロピル基を指す。
【０１９５】
「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
【０１９６】
単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、もしくは「アリールオキシアルキル」におけるようにより大きい部分の一部として使用される「アリール」という用語は、合計５〜１４個の環員を有し、その系内の少なくとも１つの環が芳香族であり、かつその系内の各環が３〜７個の環員を含む、単環式または二環式環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と互換的に使用され得る。本発明のある特定の実施形態では、「アリール」とは芳香環系を指し、これにはフェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが含まれるがこれらに限定されず、またこれらは１つまたは複数の置換基を有していてもよい。本明細書中で使用する場合、「アリール」という用語の範囲には、芳香環が１つまたは複数の非芳香環に縮合している基（例えば、インダニル、フタルイミジル、ナフタイミジル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルなど）も含まれる。
【０１９７】
単独で、またはより大きい部分（例えば、「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアラルコキシ」）の一部として使用される「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語は、５〜１０個の環原子、好ましくは５個、６個、または９個の環原子を有し、環状配置で共有された６個、１０個、または１４個のπ電子を有し、かつ炭素原子に加えて１〜５個のヘテロ原子を有する基を指す。「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、または硫黄を指し、窒素または硫黄の任意の酸化形態、および塩基性窒素の任意の四級化形態を包含する。ヘテロアリール基としては、限定するものではないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。本明細書中で使用する場合、「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語はまた、複素芳香環が１つまたは複数のアリール環、脂環式環、またはヘテロシクリル環に縮合しており、そのラジカルまたは結合点がその複素芳香環上にある基を包含する。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、およびピリド［２，３−ｂ］−１，４−オキサジン−３（４Ｈ）−オンが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環式であっても二環式であってもよい。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」という用語と互換的に使用されてよく、これらの用語のいずれも、任意選択で置換されている環を包含する。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールにより置換されたアルキル基を指し、ここでアルキル部分およびヘテロアリール部分は独立して、任意選択で置換されている。
【０１９８】
本明細書中で使用する場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式ラジカル」、および「複素環式環」という用語は、互換的に使用され、安定な５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、かつ炭素原子に加えて１つまたは複数の、好ましくは１〜４個の、上で定義したようなヘテロ原子を有するものを指す。複素環の環原子に関して使用する場合、「窒素」という用語は、置換された窒素を包含する。一例としては、酸素、硫黄または窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和または部分不飽和の環において、窒素は、（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおけるような）Ｎ、（ピロリジニルにおけるような）ＮＨ、または（Ｎ−置換ピロリジニルにおけるような）＋ＮＲであり得る。
【０１９９】
複素環式環は、そのペンダント基に、安定な構造をもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子において結合することができ、環原子のいずれかは任意選択で置換されていてもよい。そのような飽和または部分不飽和の複素環式ラジカルとしては、限定するものではないが、例えば、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式ラジカル」という用語は、本明細書中で互換的に使用され、そしてまた、ヘテロシクリル環が１つまたは複数のアリール環、ヘテロアリール環、または脂環式環に縮合している基（例えば、インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロキノリニルなど）を包含する。ヘテロシクリル基は、単環式であっても二環式であってもよい。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルにより置換されたアルキル基を指し、ここでアルキル部分およびヘテロシクリル部分は独立して、任意選択で置換されている。
【０２００】
本明細書中で使用する場合、「部分不飽和」という用語は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分を指す。「部分不飽和」という用語は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書中で定義するようなアリール部分またはヘテロアリール部分を包含することは意図しない。
【０２０１】
本明細書中に記載する場合、本発明の化合物は、「任意選択で置換されている」部分を含み得る。一般に、「置換されている」という用語は、「任意選択で」という用語が先行しようと先行しまいと、指定される部分の１つまたは複数の水素が好適な置換基で置き換えられていることを意味する。別段に示さない限り、「任意選択で置換されている」基は、その基の各置換可能な位置において好適な置換基（「任意選択の置換基」）を有してもよく、任意の所与の構造中の１つより多くの位置が特定の基から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、その置換基はあらゆる位置で同じであってもよいし、異なっていてもよい。本発明によって想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらす組合せである。本明細書中で使用する場合、「安定な」という用語は、それらの産生、検出、およびある特定の実施形態では、それらの回収、精製、および本明細書中に開示した１つまたは複数の目的のための使用を可能にする条件に供された時に、実質的に変化しない化合物を指す。
【０２０２】
「任意選択で置換されている」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０〜４Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４ＯＲ○；−Ｏ（ＣＨ２）０〜４Ｒｏ、−Ｏ−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＣＨ（ＯＲ○）２；−（ＣＨ２）０〜４ＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｐｈ（これはＲ○で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ（これはＲ○で置換されていてもよい）；−ＣＨ＝ＣＨＰｈ（これはＲ○で置換されていてもよい）；−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１−ピリジル（これはＲ○で置換されていてもよい）；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ○３；−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）Ｒ○；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０〜４ＳＲ−、ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°；−（ＣＨ２）０〜４ＳＣ（Ｏ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ°；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ°、−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（ＮＯＲ○）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４ＳＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ○２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｐ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ○）２；ＳｉＲ○３；−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２；または−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２であり、ここで各Ｒ○は、以下で定義するように置換されていてもよく、かつ独立して、水素、Ｃ１〜６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、−ＣＨ２−（５〜６員のヘテロアリール環）、または、独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環であるか、あるいは上記定義にかかわらず、Ｒ○の２個の独立した存在は、それらの間にある原子（複数可）と一緒になって、独立して窒素、酸素、または硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、３〜１２員の飽和、部分不飽和、またはアリールの単環式環または二環式環を形成し、これは以下で定義するように置換されていてもよい。
【０２０３】
Ｒ○（またはＲ○の２個の独立した存在がこれらの間の原子と一緒になって形成された環）上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０〜２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０〜２ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＣＨ（ＯＲ●）２；−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、ここで各Ｒ●は置換されていないか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、そして独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。Ｒ○の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【０２０４】
「任意選択で置換されている」基の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、以下のもの：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｏ−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｓ−が挙げられ、ここでＲ＊の各独立した存在は、水素、以下で定義するように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。「任意選択で置換されている」基の近隣の置換可能な炭素に結合した好適な二価の置換基としては−Ｏ（ＣＲ＊２）２〜３Ｏ−が挙げられ、ここでＲ＊の各独立した存在は、水素、以下で定義するように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。
【０２０５】
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基としては、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２が挙げられ、ここで各Ｒ●は置換されていないか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、そして独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環である。
【０２０６】
「任意選択で置換されている」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、−ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†が挙げられ、ここで各Ｒ†は独立して水素、以下で定義するように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、非置換の−ＯＰｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環であるか、あるいは上記定義にかかわらず、Ｒ†の２つの独立した存在は、これらの間にある原子（複数可）と一緒になって、独立して窒素、酸素、または硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の３〜１２員の飽和、部分不飽和、またはアリールの単環式環または二環式環を形成する。
【０２０７】
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立してハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２であり、ここで各Ｒ●は置換されていないか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、そして独立してＣ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または独立して窒素、酸素、もしくは硫黄から選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環である。
【０２０８】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしで、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するために好適であり、そして合理的な利益／リスク比に見合う、塩を指す。薬学的に許容される塩は当該技術分野において周知である。例えば、S.  M.  Bergeらは、J.  Pharmaceutical  Sciences、１９７７年、６６巻、１〜１９頁において薬学的に許容される塩を詳細に説明しており、これは参照により本明細書に組み込まれる。本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、好適な無機および有機の酸および塩基に由来する塩が挙げられる。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例としては、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸など）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸）と形成されたか、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用されるその他の方法を使用することによって形成された、アミノ基の塩である。その他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、ブチル酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。
【０２０９】
適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切である場合、例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホン酸イオン、アリールスルホン酸イオンなどの対イオンを使用して形成された、非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。
【０２１０】
別段の言及がなければ、本明細書中に示す構造は、その構造の全ての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何（または配座））形態（例えば、各不斉中心についてＲ配置およびＳ配置、Ｚ体およびＥ体の二重結合異性体、ならびにＺ体およびＥ体の配座異性体）をも包含することを意図する。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学的異性体、ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何（または配座）混合物は本発明の範囲内である。別段の言及がなければ、本発明の化合物の全ての互変異性形態は本発明の範囲内である。さらに、別段の言及がなければ、本明細書中に示す構造はまた、１つまたは複数の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ異なる化合物を包含することも意図する。例えば、水素がジュウテリウムもしくはトリチウムで置き換えられたもの、または炭素が１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素で置き換えられたものを含めて本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。そのような化合物は例えば、分析ツールとして、生物学的アッセイにおけるプローブとして、または本発明による治療剤として有用である。ある特定の実施形態では、提供される化合物の弾頭部分Ｒ１は、１つまたは複数のジュウテリウム原子を含む。
【０２１１】
本明細書中で使用する場合、「阻害剤」という用語は、測定可能な親和性で標的ＲＮＡに結合しかつ／または標的ＲＮＡをモジュレートしもしくは阻害する化合物と定義される。ある特定の実施形態では、阻害剤は、約１００μＭ未満、約５０μＭ未満、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＩＣ５０および／または結合定数を有する。
【０２１２】
本明細書中で使用する場合、「測定可能な親和性」および「測定可能に阻害する」という用語は、本発明の化合物もしくはその組成物、および標的ＲＮＡを含む試料と、前記化合物もしくはその組成物なしで該標的ＲＮＡを含む同等の試料との間での下流の生物学的影響における測定可能な変化を意味する。
【０２１３】
本明細書中で使用する場合、「ＲＮＡ」（リボ核酸）という用語は、供給源（例えば、ＲＮＡは、ヒト、動物、植物、ウイルス、または細菌によって産生され得るか、あるいは合成起源であり得る）、生物学的背景（例えば、ＲＮＡは、核内、血液循環中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、または細胞溶解物中にあり得るか、あるいは単離されているまたは純粋形態であり得る）、または物理形態（例えば、ＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、または三本鎖形態（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを包含する）であり得るか、エピジェネティックな修飾、天然の転写後修飾、人工修飾（例えば、化学的なまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの修飾によって得られるもの）、またはその他の修飾を含んでいてもよいか、例えば、金属イオン、小分子、タンパク質シャペロン、または補因子に結合していてもよいか、あるいは、例えば、ジャンクション（例えば、シスまたはトランスの三方向ジャンクション（３ＷＪ））、四重鎖、ヘアピン、トリプレックス、ヘアピン、バルジループ、シュードノット、および内部ループなど、およびＲＮＡがとる任意の一時的な形態または構造などの、任意の天然または非天然の二次構造または三次構造を含めて、変性、部分変性、またはフォールディングの状態にあってもよい）とは独立して、天然に存在するまたは合成のオリゴリボヌクレオチドを意味する。一部の実施形態では、ＲＮＡは１００個またはそれより多くのヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＲＮＡは２５０個またはそれより多くのヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、３５０個、４５０個、５００個、６００個、７５０個、または１，０００個、２，０００個、３，０００個、４，０００個、５，０００個、７５００個、１０，０００個、１５，０００個、２５，０００個、５０，０００個、あるいはこれらより多いヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＲＮＡは２５０個と１，０００個との間のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ｐｒｅ−ＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、またはプレ転写物である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｃｅＲＮＡ、偽遺伝子、ウイルスＲＮＡ、または細菌ＲＮＡである。本明細書中で使用する場合、「標的ＲＮＡ」という用語は、本明細書中に記載の小分子リガンドに結合できる二次構造または三次構造を有する任意の種類のＲＮＡを意味する。標的ＲＮＡは、細胞内、細胞溶解物中、または該化合物との接触前には単離された形態にあり得る。
【０２１４】
共有結合修飾因子部分
様々な共有結合修飾因子部分（すなわち、例えば上記式Ｉ〜Ｘに示すＲｍｏｄ）が本発明において使用され得る。一部の実施形態では、共有結合修飾因子は、アリール−Ｃ（Ｏ）−Ｘ、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−Ｘ、アリール−ＳＯ２−Ｘ、またはヘテロアリール−ＳＯ２−Ｘであり、ここでＸは例えばハロゲン化物またはＮ−ヘテロアリール（例えば、イミダゾリル）などの適切な脱離基である。一部の実施形態では、共有結合修飾因子部分は、図５４〜６５に示すもののうちの１つである。
【０２１５】
本明細書中で使用する場合、「共有結合修飾因子部分」または「弾頭」という用語は、ＲＮＡの拘束されていないヌクレオチドと選択的に共有結合を形成して２’修飾ＲＮＡを産生することができる反応性官能基を含む任意の小分子基を意味する。一部の実施形態では、共有結合修飾因子部分は、反応性官能基に結合した芳香族またはヘテロ芳香族の基である。一部の実施形態では、反応性官能基は、ハロゲン化スルホニル、アレーンカルボニルイミダゾール、活性エステル、エポキシド、オキシラン、酸化剤、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化ベンジル、イソシアネート、またはHermanson、Bioconjugate  Techniques、第２版、Academic  Press、２００８年に記載されるものなどのその他の基から選択される。一部の実施形態では、反応性官能基は活性エステルである。活性エステルは、ＲＮＡの拘束されていない２’−ヒドロキシル基（または隣接する２’−ヒドロキシル基よりも反応性の高いその他の基）と反応して２’−共有結合修飾ＲＮＡを産生し得る。一部の実施形態では、活性エステルはアシルイミダゾールである。一部の実施形態では、反応性官能基は、アリールエステル、ヘテロアリールエステル、ハロゲン化スルホニル、ラクトン、ラクタム、α，β−不飽和ケトン、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、またはハロゲン化ベンジルから選択される。一部の実施形態では、反応性官能基は、アリールエステル、ヘテロアリールエステル、フッ化スルホニル、またはラクタムから選択される。
【０２１６】
一部の実施形態では、共有結合修飾因子部分は、１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）、ベンゾイルシアニド（ＢｚＣＮ）、２−メチルニコチン酸イミダゾリド（ＮＡＩ）、または２−メチル−３−フロン酸イミダゾリド（ＦＡＩ）である。
【０２１７】
本発明において使用するために好適な共有結合修飾因子部分のさらなる例は、ＷＯ２０１５／０５４２４７、米国特許出願公開第２０１４／０１５４６７３号、および米国特許第８，３１３，４２４号に記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
テザー基
本発明は、多様な二価または三価のテザー基（テザー、例えば、例えば上記式Ｉ〜Ｘに示すような記号Ｔ１およびＴ２）を使用して標的ＲＮＡの結合部位の近位にある２’−ＯＨ基に対する最適な結合および反応性を提供することを企図する。一部の実施形態では、Ｔ１およびＴ２は、図４６〜５３に示すものから選択される。例えば、一部の実施形態では、Ｔ１および／またはＴ２は、例えば、１〜１０個のエチレングリコールサブユニットのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基である。一部の実施形態では、Ｔ１および／またはＴ２は、任意選択で置換されているＣ１〜１２脂肪族基、または１〜８個のアミノ酸を含むペプチドである。
【０２１９】
一部の実施形態では、テザーの長さ、剛性、疎水性、および／またはその他の特性などの物理的特性は、標的ＲＮＡの２’−ＯＨと修飾部分（弾頭）との間の近接誘発性共有結合形成のパターンを最適化するように選択される。一部の実施形態では、テザーの物理的特性（例えば、上記したもの）は、標的ＲＮＡの活性部位またはアロステリック部位に化合物が結合すると、修飾部分が、活性部位またはアロステリック部位の近位にある標的ＲＮＡの１つまたは複数の２’−ＯＨ基と選択的に反応するように選択される。
【０２２０】
クリック実行可能基
様々な生体直交型反応パートナー（例えば、上記式Ｉ〜ＸにおけるＲＣＧ）は、本明細書中に記載の化合物をプルダウン部分とカップリングさせるために本発明において使用され得る。本明細書中で使用する場合、「生体直交型化学」または「生体直交型反応」という用語は、天然の生化学プロセスを妨害することなく生体系内で起こることができる任意の化学反応を指す。したがって、「生体直交型反応パートナー」は、適切な反応パートナーと生体直交型反応を起こして本明細書中に記載の化合物をプルダウン部分にカップリングさせることができる化学的部分である。一部の実施形態では、生体直交型反応パートナーは、化学修飾部分またはテザー基と共有結合的に結合する。一部の実施形態では、生体直交型反応パートナーは、クリック実行可能基、またはニトロン／シクロオクチン反応、オキシム／ヒドラゾン形成、テトラジンライゲーション、イソシアニドベースのクリック反応、もしくはクアドリシクランライゲーションを起こすことができる基から選択される。
【０２２１】
一部の実施形態では、生体直交型反応パートナーはクリック実行可能基である。「クリック実行可能基」という用語は、アジドまたはアルキンなどのクリック反応を起こすことができる化学的部分を指す。
【０２２２】
クリック反応は、広範囲の選択的結合形成事象を生じる十分に定義された反応座標を有する高エネルギーの（「ばね式の」）試薬を伴う傾向がある。例としては、歪んだ環の求電子剤（エポキシド、アジリジン、アジリジニウムイオン、エピスルホニウムイオン）の求核的捕捉、ある特定のカルボニル反応性（例えば、アルデヒドとヒドラジンまたはヒドロキシルアミンとの反応）、およびいくつかの環化付加反応が挙げられる。アジド−アルキン１，３−双極子環化付加およびディールス・アルダー環化付加は２つのそのような反応である。
【０２２３】
このようなクリック反応（すなわち、双極子環化付加）は、高い活性化エネルギーを伴い、したがって熱または触媒を必要とする。実際、銅触媒の使用がクリック反応において日常的に用いられている。しかしながら、クリック化学が特に有用なある特定の例では（例えば、バイオコンジュゲーション反応において）、銅の存在は有害であり得る（Wolbers,  F.ら；Electrophoresis  ２００６年、２７巻、５０７３頁を参照）。したがって、金属触媒を使用せずに双極子環化付加反応を行う方法が開発された。このような「金属フリー」のクリック反応は、環化付加を促進するために、活性化部分を利用する。したがって、本発明は、金属フリーのクリック化学のために好適なクリック実行可能基を提供する。
【０２２４】
ある特定の金属フリーのクリック部分が文献で公知である。例としては、４−ジベンゾシクロオクチノール（ＤＩＢＯ）（Ningら；Angew  Chem  Int  Ed、２００８年、４７巻、２２５３頁より）、ｇｅｍ−二フッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯまたはＤＦＯ）（Codelliら；J.  Am.  Chem.  Soc.  ２００８年、１３０巻、１１４８６〜１１４９３頁より）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）（Jewettら；J.  Am.  Chem.  Soc.  ２０１０年、１３２巻、３６８８頁より）、またはビシクロノニン（ＢＣＮ）（Dommerholtら；Angew  Chem  Int  Ed、２０１０年、４９巻、９４２２〜９４２５頁より）が挙げられる。
【０２２５】
本明細書中で使用する場合、「金属フリーのクリック化学のために好適な部分」という表現は、金属触媒を使用することなく双極子環化付加ができる官能基を指す。そのような部分としては、アジドにカップリングして環化付加生成物（例えば、トリアゾールまたはイソオキサゾール）を形成するための、活性化アルキン（例えば、歪んだシクロオクチン）、オキシム（例えば、ニトリルオキシド前駆体など）、またはオキサノルボルナジエンが挙げられる。
【０２２６】
一部の実施形態では、クリック実行可能基は、図４５または６９に示すものから選択される。
【０２２７】
プルダウン基
いくつかのプルダウン基（例えば上記式Ｉ〜ＸにおけるＲＰＤ）が本発明において使用され得る。一部の実施形態では、プルダウン基は、クリック実行可能基と反応してプルダウン基を化合物の残部に結合させる生体直交型反応パートナー、ならびにプルダウンされた化合物の選択的な単離または検出を可能にする適切な基を含む。例えば、プルダウン基においてアビジンまたはストレプトアビジンを使用することで、以下にさらに詳細に説明するように、「フック連結された」ＲＮＡのみの単離が可能となる。一部の実施形態では、プルダウン基は、図６９に示すものから選択される。
【０２２８】
集中的なプルダウンのための別の方法は、目的のＲＮＡの配列に相補的な配列を提示するＤＮＡマイクロアレイを使用して目的のＲＮＡをプルダウンする標準的な方法を用いる。これは、目的のＲＮＡの選択的な単離を可能とし、このＲＮＡをシークエンシングを介してアッセイして、任意のフック構築物が結合しているかどうかを決定することができる。
【０２２９】
３．本発明の化合物を提供する一般的方法
本発明の化合物は、一般に、類似化合物について当業者に公知の合成および／または半合成の方法によって、ならびに本明細書中の実施例および図面に詳細に記載する方法によって、調製または単離され得る。例えば、様々な本発明の化合物は、図５〜３１または図７７〜９４または図９６を参照して合成され得る。
【０２３０】
特定の保護基（「ＰＧ」）、脱離基（「ＬＧ」）、または変換条件を示す詳細な説明、実施例、および図面に示すスキームおよび化学反応において、その他の保護基、脱離基、および変換条件も好適であり、企図されることを当業者は理解するであろう。そのような基および変換は、March's  Advanced  Organic  Chemistry:  Reactions,  Mechanisms,  and  Structure、M.  B.  SmithおよびJ.  March、第５版、John  Wiley  &  Sons、２００１年；「Comprehensive  Organic  Transformations」、R.  C.  Larock、第２版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年；ならびにProtecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年において詳細に説明されており、これらのそれぞれの全体は、本明細書で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
本明細書中で使用する場合、「脱離基」（ＬＧ）という表現は、ハロゲン（例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、スルホネート（例えば、メシレート、トシレート、ベンゼンスルホネート、ブロシレート、ノシレート、トリフレート）、ジアゾニウムなどを包含するが、これらに限定されない。
【０２３２】
本明細書中で使用する場合、「酸素保護基」という表現は、例えば、カルボニル保護基、ヒドロキシル保護基などを包含する。ヒドロキシル保護基は当該技術分野において周知であり、Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年において詳細に説明されるものが挙げられ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。好適なヒドロキシル保護基としては、例えば、エステル、アリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテル、およびアルコキシアルキルエーテルが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなエステルとしては、例えば、ホルメート、アセテート、カルボネート、およびスルホネートが挙げられる。具体例としては、ホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート、ピバロエート（トリメチルアセチル）、クロトネート、４−メトキシ−クロトネート、ベンゾエート、ｐ−ベンジルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート、カルボネート（例えば、メチル、９−フルオレニルメチル、エチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（フェニルスルホニル）エチル、ビニル、アリル、およびｐ−ニトロベンジルなど）が挙げられる。そのようなシリルエーテルとしては、例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリル、およびその他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。アルキルエーテルとしては、メチル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、トリチル、ｔ−ブチル、アリル、およびアリルオキシカルボニルエーテルまたは誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、例えば、メトキシメチル、メチルチオメチル、（２−メトキシエトキシ）メチル、ベンジルオキシメチル、ベータ−（トリメチルシリル）エトキシメチル、およびテトラヒドロピラニルエーテルなどのアセタールが挙げられる。アリールアルキルエーテルとしては、例えば、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル（ＭＰＭ）、３，４−ジメトキシベンジル、Ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ならびに２−および４−ピコリルが挙げられる。
【０２３３】
アミノ保護基は当該技術分野において周知であり、Protecting  Groups  in  Organic  Synthesis、T.  W.  GreeneおよびP.  G.  M.  Wuts、第３版、John  Wiley  &  Sons、１９９９年において詳細に説明されるものが挙げられ、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。好適なアミノ保護基としては、アラルキルアミン、カルバメート、環状イミド、アリルアミン、アミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。そのような基としては、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、エチルオキシカルボニル、メチルオキシカルボニル、トリクロロエチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、ベンジルオキソカルボニル（ＣＢＺ）、アリル、フタルイミド、ベンジル（Ｂｎ）、フルオレニルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、フェニルアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイルなどが挙げられる。
【０２３４】
当業者は、例えば、脂肪族基、アルコール、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ハロゲン、およびニトリルなどの本発明の化合物中に存在する様々な官能基は当該技術分野において周知の技術（還元、酸化、エステル化、加水分解、部分酸化、部分還元、ハロゲン化、脱水、部分水和、および水和が挙げられるが、これらに限定されない）によって相互変換できることを理解するであろう。「March's  Advanced  Organic  Chemistry」、第５版、Smith,  M.  B.およびMarch,  J.編、John  Wiley  &  Sons、New  York：２００１年（その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。そのような相互変換は、上述の技術のうちの１つまたは複数を必要とし得、本発明の化合物を合成するためのある特定の方法を実施例および図面において以下に記載する。
【０２３５】
４．使用、製剤化、および投与
薬学的に許容される組成物
別の実施形態によれば、本発明は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその誘導体および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む組成物を提供する。本発明の組成物中の化合物の量は、生体試料中または患者中の標的ＲＮＡまたはその変異体を測定可能に阻害またはモジュレートするのに効果的である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物中の化合物の量は、生体試料中または患者中の標的ＲＮＡを測定可能に阻害またはモジュレートするのに効果的である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、そのような組成物を必要とする患者に投与するために製剤化されている。一部の実施形態では、本発明の組成物は、患者に経口投与するために製剤化されている。
【０２３６】
本明細書中で使用する場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０２３７】
「薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、共に製剤化した化合物の薬理活性を壊さない非毒性の担体、アジュバント、またはビヒクルを指す。本発明の組成物において使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（例えば、ホスフェートなど）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイダルシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
「薬学的に許容される誘導体」は、本発明の化合物の非毒性の塩、エステル、エステルの塩、またはその他の誘導体のいずれかであって、レシピエントに投与されると、直接的または間接的に、本発明の化合物またはその阻害活性代謝産物もしくは残留物を与えることができるものを意味する。
【０２３９】
本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸内に、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または埋め込み式リザーバーを介して、投与され得る。本明細書中で使用する場合、「非経口」という用語には、皮下の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、滑膜内の、胸骨内の、髄腔内の、肝内の、病巣内の、および頭蓋内の注射または注入技術が包含される。好ましくは、組成物は、経口的に、腹腔内に、または静脈内に投与される。本発明の組成物の滅菌注射形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当該技術分野で公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など）であり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来通りに用いられる。
【０２４０】
この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含めて任意のブランド固定油を用い得る。例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に許容される油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にこれらのポリオキシエチレン化されたバージョンなど）と同様に、注射物質の調製において有用である。これらの油性溶液または油性懸濁物はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、または薬学的に許容される製剤剤形（エマルションおよび懸濁液が挙げられる）の製剤化においてよく使用される類似の分散剤など）を含有し得る。その他のよく使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および薬学的に許容される固体、液体、またはその他の剤形の製造においてよく使用されるその他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤など）もまた、製剤化の目的のために使用され得る。
【０２４１】
本発明の薬学的に許容される組成物は、任意の経口的に許容される剤形（カプセル剤、錠剤、水性懸濁液、または液剤が挙げられるが、これらに限定されない）として経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、よく使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。例えばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も通常加えられる。カプセル剤形態での経口投与のために有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁液が必要な場合、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と組み合わせられる。所望の場合、ある特定の甘味剤、香味剤、または着色剤を加えてもよい。
【０２４２】
代替的には、本発明の薬学的に許容される組成物は、直腸投与用の坐薬の形態で投与され得る。これらは、室温で固体であるが直腸の温度で液体であるため直腸内で溶けて薬物を放出する好適な非刺激性の賦形剤と該剤を混合することによって調製することができる。そのような物質としては、ココアバター、ビーズワックス、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２４３】
本発明の薬学的に許容される組成物はまた、局所投与され得る。これは、眼、皮膚、または下部腸管の疾患を含めて局所適用によって容易に接近可能な領域または臓器を治療標的が含む場合に特に当てはまる。これらの領域または臓器のそれぞれのために好適な局所製剤は容易に調製される。
【０２４４】
下部腸管用の局所適用は、直腸坐薬製剤（上記を参照）または好適な浣腸製剤において行うことができる。局所経皮パッチを使用してもよい。
【０２４５】
局所適用のために、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤として製剤化され得る。本発明の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローション剤またはクリーム剤として製剤化することができる。好適な担体としては、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４６】
眼用途のために、提供される薬学的に許容される組成物は、等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微細化懸濁液として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの防腐剤を含むもしくは含まない等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の液剤として、製剤化され得る。代替的には、眼用途のために、薬学的に許容される組成物は、ワセリンなどの軟膏剤中に製剤化され得る。
【０２４７】
本発明の薬学的に許容される組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。そのような組成物は、医薬製剤化の技術分野において周知の技術にしたがって調製され、ベンジルアルコールまたはその他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを増進するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／またはその他の従来用いられる可溶化剤または分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製され得る。
【０２４８】
最も好ましくは、本発明の薬学的に許容される組成物は、経口投与のために製剤化される。そのような製剤は、食品と共にまたは食品を伴わずに投与され得る。一部の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食品を伴わずに投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食品と共に投与される。
【０２４９】
単一剤形中の組成物を産生するために担体物質と組み合わせられ得る本発明の化合物の量は、治療される宿主、具体的な投与方式に応じて様々である。好ましくは、提供される組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与量の阻害剤をこれらの組成物を与えられる患者に投与できるように製剤化されるべきである。
【０２５０】
任意の特定の患者のための具体的な投与量および治療レジメンは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組合せ、治療医の判断、および処置される具体的な疾患の重篤度を含めて様々な要因に依存することが理解されるべきである。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物中の具体的な化合物にも依存する。
【０２５１】
化合物および薬学的に許容される組成物の使用
本明細書中に記載の化合物および組成物は、一般に、標的ＲＮＡをモジュレートしてＲＮＡ媒介性の疾患または状態を再処置するために有用である。
【０２５２】
標的ＲＮＡをモジュレートするために本発明において利用される化合物の活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、または細胞株においてアッセイされ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとしては、標的ＲＮＡのモジュレーションを決定するアッセイが挙げられる。代替的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、標的ＲＮＡに結合する化合物の能力を定量化する。標的ＲＮＡをモジュレートするために本発明において利用される化合物をアッセイするための詳細な条件は、下記の実施例中に記載されている。
【０２５３】
本明細書中で使用する場合、「治療」、「治療する（treat）」、および「治療する（treating）」という用語は、本明細書中に記載するような疾患もしくは障害またはその１つまたは複数の症状を反転させ、軽減し、その発症を遅延させ、またはその進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、治療は、１つまたは複数の症状が発症した後に施され得る。他の実施形態では、治療は、症状の非存在下で施され得る。例えば、治療は、（例えば、症状の履歴、および／または遺伝因子もしくはその他の感受性因子を考慮して）症状の発症前に感受性個体に施され得る。治療はまた、例えば再発を防止しまたは遅延させるために、症状の解消後にも継続され得る。
【０２５４】
提供される化合物は標的ＲＮＡのモジュレーターであり、したがって標的ＲＮＡ（例えばその下流）に関連するまたはそれが影響する１つまたは複数の障害を治療するために有用である。よって、ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、ＲＮＡ媒介性の障害を治療するための方法を提供する。
【０２５５】
本明細書中で使用する場合、本明細書中で使用する「ＲＮＡ媒介性の」障害、疾患、および／または状態という用語は、例えば過剰発現の、過少発現の、変異体の、ミスフォールディングした、病原性の、または発がん性（ongogenic）のＲＮＡなどのＲＮＡが役割を果たすことが公知である任意の疾患またはその他の有害な状態を意味する。したがって、本発明の別の実施形態は、例えば過剰発現の、過少発現の、変異体の、ミスフォールディングした、病原性の、または発がん性のＲＮＡなどのＲＮＡが役割を果たすことが公知である１つまたは複数の疾患を治療し、またはその重篤度を小さくすることに関する。
【０２５６】
一部の実施形態では、本発明は、細胞増殖性障害が挙がられるがこれに限定されない１つまたは複数の障害、疾患、および／または状態を治療するための方法を提供する。
【０２５７】
細胞増殖性障害
本発明は、標的ＲＮＡをモジュレートすることによる、細胞増殖性障害（例えば、がん）の診断および予後診断用、ならびにこれらの障害の治療用の方法および組成物を特徴とする。本明細書中に記載の細胞増殖性障害としては、例えば、がん、肥満症、および増殖依存性の疾患が挙げられる。そのような障害は、当該技術分野で公知の方法を使用して診断され得る。
【０２５８】
がん
一実施形態では、限定するものではないが、がんとしては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病または非ホジキン病）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、重鎖病、および固形腫瘍が挙げられ、固形腫瘍としては、例えば肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫）などである。一部の実施形態では、がんは黒色腫または乳がんである。
【０２５９】
別の実施形態では、限定するものではないが、がんとしては、中皮腫、肝胆道（hepatobilliary）（肝臓および胆管（billiary  duct））、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内の黒色腫、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、胃腸のがん（胃がん、結腸直腸がん、および十二指腸がん）、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺がん、精巣がん、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓のまたは尿管のがん、腎細胞癌、腎盂の癌、非ホジキン（non  hodgkins's）リンパ腫、脊髄軸の腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質がん、胆嚢がん、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽腫、網膜芽腫、または以上のがんの１つまたは複数の組合せが挙げられる。
【０２６０】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に本明細書中に記載の化合物、塩、または医薬組成物のいずれかを投与することを含む、該患者において腫瘍を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍は、本明細書中に記載のがんのいずれかを含む。一部の実施形態では、腫瘍は黒色腫がんを含む。一部の実施形態では、腫瘍は乳がんを含む。一部の実施形態では、腫瘍は肺がんを含む。一部の実施形態では、腫瘍は小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を含む。一部の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、腫瘍は、腫瘍のさらなる成長を阻むことによって治療される。一部の実施形態では、腫瘍は、腫瘍の大きさ（例えば、体積または質量）を治療前の腫瘍の大きさと比べて少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９９％減少させることによって治療される。一部の実施形態では、腫瘍は、患者における腫瘍の量を治療前の腫瘍の量と比べて少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９９％減少させることによって治療される。
【０２６２】
その他の増殖性疾患
その他の増殖性疾患としては、例えば、肥満症、良性前立腺過形成、乾癬、異常角質化、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ系の細胞が異常増殖する障害）、慢性関節リウマチ、動脈硬化症、再狭窄、および糖尿病性網膜症が挙げられる。参照により本明細書に組み込まれる増殖性疾患としては、米国特許第５，６３９，６００号および同７，０８７，６４８号に記載されたものが挙げられる。
【０２６３】
炎症性障害および疾患
本発明の化合物は、皮膚の炎症性またはアレルギー性の状態の治療においても有用であり、該状態としては、例えば、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形紅斑（erythema  multiforma）、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、紅斑性狼瘡、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、後天性表皮水疱症、尋常性ざ瘡、および皮膚のその他の炎症性またはアレルギー性の状態である。
【０２６４】
本発明の化合物は、炎症性要素を有する疾患または状態などのその他の疾患または状態の治療のためにも使用され得、これは例えば、眼の疾患および状態（例えば、眼のアレルギー、結膜炎、乾性角結膜炎、および春季結膜炎など）、鼻に影響する疾患（アレルギー性鼻炎が挙げられる）、および自己免疫反応が関与するまたは自己免疫の要素もしくは病因を有する炎症性疾患（自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆、および特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症（Wegener  granulamatosis）、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーヴンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、過敏性腸症候群、セリアック病、歯周炎、肺硝子膜症、腎臓病、糸球体疾患、アルコール性肝臓病、多発性硬化症、内分泌性眼症（endocrine  opthalmopathy）、グレーブス病、サルコイドーシス、肺胞炎、慢性過敏性肺炎、多発性硬化症、原発性胆汁性胆管炎、ぶどう膜炎（前部および後部）、シェーグレン症候群、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、クリオピリン関連周期性症候群、腎炎、血管炎、憩室炎、間質性膀胱炎、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群を伴うものおよび伴わないもの、例えば、突発性ネフローゼ症候群または微小変化型腎症（minal  change  nephropathy）が挙げられる）、慢性肉芽腫性疾患、子宮内膜症、レプトスピラ腎疾患（leptospiriosis  renal  disease）、緑内障、網膜疾患、加齢、頭痛、痛み、複合性局所疼痛症候群、心臓肥大、筋肉消耗、異化障害、肥満症、胎児発育遅延、高コレステロール血症、心臓病、慢性心不全、中皮腫、無汗型外胚葉異形成症（anhidrotic  ecodermal  dysplasia）、ベーチェット病、色素失調症、パジェット病、膵炎、遺伝性周期熱症候群、喘息（アレルギー性および非アレルギー性、軽度、中等度、重篤、気管支炎（bronchitic）、および運動誘発性）、急性肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、好酸球増加症、過敏症、アナフィラキシー、副鼻腔炎、眼のアレルギー、シリカ誘発性疾患、ＣＯＰＤ（損傷の減少、気道炎症、気管支過敏症、再構築、または疾患進行）、肺疾患、嚢胞性繊維症、酸誘発性肺傷害、肺高血圧症、多発性神経障害、白内障、全身性硬化症を伴う筋肉の炎症、封入体筋炎、重症筋無力症、甲状腺炎、アジソン病、扁平苔癬、１型糖尿病または２型糖尿病、虫垂炎、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頚管炎、胆管炎、胆嚢炎、慢性移植片拒絶、大腸炎、結膜炎、クローン病、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、全腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合組織炎、胃炎、胃腸炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、肝炎、化膿性汗腺炎、免疫グロブリンＡ腎症、間質性肺疾患、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、睾丸炎、骨炎、中耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺臓炎、肺炎、多発性筋炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、潰瘍性大腸炎、ぶど��膜炎、膣炎、血管炎、または外陰炎が挙げられる）の治療である。
【０２６５】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は皮膚疾患である。一部の実施形態では、炎症性皮膚疾患は、接触性皮膚炎（contact  dermatitits）、アトピー性（atompic）皮膚炎、円形脱毛症、多形紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性血管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、後天性表皮水疱症、および皮膚のその他の炎症性またはアレルギー性の状態から選択される。
【０２６６】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は、急性および慢性痛風、慢性痛風性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎（ＳＪＩＡ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、および変形性関節症から選択される。
【０２６７】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は、ＴＨ１７媒介性の疾患である。一部の実施形態では、ＴＨ１７媒介性の疾患は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎が挙げられる）から選択される。
【０２６８】
一部の実施形態では、本発明の方法にしたがって治療され得る炎症性疾患は、シェーグレン症候群、アレルギー性疾患、変形性関節症、眼の状態（例えば、眼のアレルギー、結膜炎、乾性角結膜炎および春季結膜炎など）、および鼻に影響する疾患（例えば、アレルギー性鼻炎など）から選択される。
【０２６９】
代謝性疾患
一部の実施形態では、本発明は、代謝性疾患を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、代謝性疾患は、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、または肥満症から選択される。
【０２７０】
本発明の方法によれば、該化合物および組成物は、がん、自己免疫疾患、増殖性障害、炎症性障害、神経変性または神経学的障害、統合失調症、骨関連の障害、肝臓病、または心臓障害を治療するまたはその重篤度を小さくするのに効果的な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身の状態、感染の重篤度、具体的な剤、その投与方式などに応じて、対象ごとに様々である。本発明の化合物は、好ましくは、投与を容易にしかつ投薬量を均一にするために単位剤形に製剤化される。本明細書中で使用する場合、「単位剤形」という表現は、治療がなされる患者に適した剤の物理的に切り離された単位を指す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の１日あたりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者または生物に特異的な有効用量レベルは様々な要因に依存し、該要因としては、治療されている障害および障害の重篤度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、および排出速度；治療の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、および医療分野で周知の同様の要因が挙げられる。本明細書中で使用する場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０２７１】
本発明の薬学的に許容される組成物は、治療がなされる感染の重症度に応じて、経口的に、直腸内に、非経口的に、嚢内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（散剤、軟膏剤、またはドロップ剤による）、口腔内に、経口または経鼻噴霧剤などとして、ヒトおよびその他の動物に投与することができる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために、１日に１回または複数回、１日あたり、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで経口的または非経口的に投与され得る。
【０２７２】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション剤、液剤、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。液体剤形は、活性化合物に加えて、当該技術分野において通常使用される不活性希釈剤（例えば、水またはその他の溶媒）、可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など）を含有し得る。経口組成物は、不活性希釈剤の他に、アジュバント（例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤など）、甘味剤、香味剤、および芳香剤も含み得る。
【０２７３】
注射調製物、例えば滅菌注射用の水性または油性懸濁液は、好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用して公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁液、または乳濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来通りに用いられる。この目的のために、任意のブランド固定油（合成モノまたはジグリセリドが挙げられる）を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射物質の調製において使用される。
【０２７４】
注射製剤は、使用前に、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、あるいは滅菌水その他の滅菌注射媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【０２７５】
本発明の化合物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅くすることがしばしば望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶質または非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成され得る。化合物の吸収速度はその溶解速度に依存し、そして溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。代替的には、非経口的に投与される化合物形態の遅延吸収は、油性ビヒクルへの化合物の溶解または懸濁によって達成される。注射デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に化合物のマイクロカプセル封入マトリックスを形成することによって作製される。化合物のポリマーに対する比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御できる。その他の生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射製剤はまた、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルション内に化合物を捕捉することによっても調製される。
【０２７６】
直腸または膣投与用の組成物は好ましくは坐薬であり、坐薬は、好適な非刺激性の賦形剤または担体（例えば、周囲温度で固体であるが体温で液体であるため、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスなど）と本発明の化合物を混合することによって調製できる。
【０２７７】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性の、薬学的に許容される賦形剤または担体（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど）、および／または、ａ）充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、ｂ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidinone）、スクロース、およびアカシアなど）、ｃ）保湿剤（例えば、グリセロールなど）、ｄ）崩壊剤（例えば、寒天−−寒天（agar--agar）、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなど）、ｅ）溶解遅延剤（例えば、パラフィンなど）、ｆ）吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物など）、ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）、ｈ）吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなど）、およびｉ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物など）と混合されている。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。
【０２７８】
同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティングおよび医薬品製剤化の技術分野で周知のその他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。これらは、任意選択で乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分のみにおいてまたは該部分において優先的に、任意選択で、遅延的様式で活性成分（複数化）を放出する組成物であり得る。使用できる埋め込み組成物としては、例えば、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコール（polethylene  glycols）などを使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤としても用いられ得る。
【０２７９】
活性化合物はまた、上述の１つまたは複数の賦形剤を有するマイクロカプセル形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティング、および医薬品製剤化の分野で周知のその他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されていてもよい。そのような剤形はまた、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の追加的な物質、例えば、錠剤成形滑沢剤およびその他の錠剤成形助剤（ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなど）も含み得る。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。これらは、任意選択で乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分のみにおいてまたは該部分において優先的に、任意選択で、遅延的様式で活性成分（複数化）を放出する組成物であり得る。使用できる埋め込み組成物としては、例えば、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０２８０】
本発明の化合物の局所または経皮投与用剤形としては、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、噴霧剤、吸入剤、またはパッチ剤が挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体および任意の必要とされる防腐剤または緩衝液と、必要に応じて混合される。眼科用製剤、点耳薬、および点眼薬もまた本発明の範囲内にあると企図される。さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、これは身体への化合物の制御された送達を提供するという追加の利点を有する。そのような剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解しまたは分散させることによって作製することができる。皮膚を通過する化合物の流れを増大させるために、吸収促進剤も使用することができる。速度は、速度制御膜を設けることによって、またはポリマーマトリックスまたはゲル中に化合物を分散させることによって、制御することができる。
【０２８１】
一実施形態によれば、本発明は、生体試料中の標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記生体試料を本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０２８２】
別の実施形態によれば、本発明は、生体試料中の標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、前記生体試料を本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む、方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、生体試料中の標的ＲＮＡの活性を非可逆的に阻害する方法であって、前記生体試料を本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む、方法に関する。
【０２８３】
本明細書中で使用する場合、「生体試料」という用語は、限定するものではないが、細胞培養物またはその抽出物、哺乳動物から得られた生検材料またはその抽出物、および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙液、もしくはその他の体液、またはその抽出物を包含する。
【０２８４】
本発明の別の実施形態は、患者における標的ＲＮＡの活性をモジュレートする方法であって、本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法に関する。
【０２８５】
別の実施形態によれば、本発明は、患者における標的ＲＮＡの活性を阻害する方法であって、本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法に関する。ある特定の実施形態によれば、本発明は、患者における標的ＲＮＡの活性を非可逆的に阻害する方法であって、本発明の化合物、または前記化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法に関する。他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者において標的ＲＮＡによって媒介される障害を治療するための方法であって、本発明による化合物または薬学的に許容されるその組成物を前記患者に投与するステップを含む、方法を提供する。そのような障害は本明細書中に詳細に説明されている。
【実施例】
【０２８６】
例証
以下の実施例に示すように、ある特定の例示的な実施形態では、化合物は以下の一般的手順にしたがって調製され、本明細書中に一般的に記載される生物学的アッセイおよびその他の手順において使用される。一般的方法はある特定の本発明の化合物の合成を示しているが、以下の一般的方法および当業者に公知のその他の方法は、本明細書中に記載するような全ての化合物ならびにこれらの化合物のそれぞれのサブクラスおよび種に適用できることが理解されるであろう。同様に、アッセイおよびその他の分析は当業者の知識にしたがって適応させることができる。
【０２８７】
（実施例１）
ＲＮＡ中の修飾の部位を突き止め、定量化するためのＳＨＡＰＥ−ＭａＰの手順
上記で論じたように、様々なＲＮＡ分子が細胞内で重要な調節的役割を果たす。ＲＮＡの二次構造および三次構造はこれらの調節的活性にとって決定的に重要である。ＲＮＡ構造を決定するために様々なツールが利用可能である。最も効果的な方法の１つがＳＨＡＰＥ（選択的な２’−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）である。この方法論は、全てのＲＮＡ中のリボース基は２’−ヒドロキシルを有し、この２’−ヒドロキシルの反応性は局所的なヌクレオチドの柔軟性および溶媒への接近可能性によって影響されるという特徴を利用する。この２’−ヒドロキシルは、一本鎖かつ柔軟なＲＮＡの領域内で反応性であるが、塩基対を形成したヌクレオチドにおいては非反応性である。すなわち、ＳＨＡＰＥ反応性は、ヌクレオチドがＲＮＡ二次構造内で塩基対を形成している確率に反比例する。この２’−ヒドロキシルにおいてＲＮＡを化学修飾する試薬は、ＲＮＡ構造を識別するプローブとして使用することができる。ＳＨＡＰＥ試薬は、柔軟なヌクレオチドの２’−ヒドロキシル基と反応して２’−Ｏ−付加体を形成する、例えば１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）およびベンゾイルシアニド（ＢｚＣＮ）などの小分子である。１Ｍ７の他には、例えば２−メチルニコチン酸イミダゾリド（ＮＡＩ）および２−メチル−３−フロン酸イミダゾリド（ＦＡＩ）などのその他のアシル化求電子剤を利用できるであろう。この化学修飾が起こる部位は、プライマー伸長またはエキソリボヌクレアーゼ消化からの保護のいずれかによって検出できる。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ（ＳＨＡＰＥ突然変異プロファイリング）は、ＲＮＡ化学修飾を読み飛ばし、元々の鋳型ＲＮＡに相補的でないヌクレオチドを組み込む逆転写酵素の能力を利用する。この誤った組込みを通じて、ＳＨＡＰＥ試薬による２’−ＯＨ修飾の部位を記録し、ｃＤＮＡのディープシークエンシングによって検出する。変性ＲＮＡなどの対照と比べた各ＲＮＡヌクレオチドの位置におけるＳＨＡＰＥ反応性の値を決定することによって、ＲＮＡの二次構造を解明することができる。
【０２８８】
特定のＲＮＡ分子は健常および疾患ヒト細胞において決定的に重要な調節的役割を果たすので、確固としたＲＮＡ構造に選択的に結合する小分子は、これらの生物学的および病態生理学的プロセスをモジュレートできる可能性があり、また見込みのある新規の治療的候補であり得る。ＲＮＡ構造を決定するためのＳＨＡＰＥ−ＭａＰの使用に加えて、修正版のＳＨＡＰＥ−ＭａＰを用いて、（ａ）ＲＮＡに結合する小分子化合物を同定すること、および（ｂ）標的ＲＮＡ上のこれらの化合物の相互作用部位を決定することができる可能性がある。本発明の主要な特徴は、ＳＨＡＰＥ試薬への小分子または小分子ライブラリーのテザー連結である。アシル化性のＳＨＡＰＥ試薬の場合、テザーは、アシル化事象をリガンド結合事象と結び付ける。アシル化剤の活性はＲＮＡ上のリガンド結合性ポケットの近位にあるリボースに拘束されるので、ＲＮＡ上のアシル化パターンは決定的に変化する。よって、シークエンシングデータに現れるようなＳＨＡＰＥ−ＭａＰアシル化パターンの変化から、リガンド結合性ポケットの存在および位置を推測することができる。
【０２８９】
ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ分析は、フォールディングしたＲＮＡの三次元構造への信頼できる道を提供する。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰの本質は、（１）ＲＮＡの骨格全体に沿って見出される溶媒に露出した２’−ＯＨ基の低レベルのベンゾイル化である。この反応の成功は、その他のより反応性が低いアルコールと比べた、リボース（ｐＫａ１３）の２’−ＯＨの相対的酸性度に依拠する。
【化１６】
2019511562.tif 000023
（２）これらの共有結合修飾ＲＮＡの変性に続く、対応するｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの酵素媒介性の形成。（３）鍵となる発見は、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーが形成される時に、標的ＲＮＡ中のベンゾイル化されたＲＮＡリボースが相補的ｃＤＮＡ鎖において塩基のランダムな組込みを誘発することである。換言すれば、「読み飛ばし」があるが、２’−Ｏ−ベンゾイルリボースはｃＤＮＡ中に「突然変異」を誘発する。（４）生じたｃＤＮＡのシークエンシング時に、ランダム突然変異を有する部位は、溶媒に露出した元々のフォールディングしたＲＮＡにおける部位を反映する。次いで、フォールディングしたＲＮＡのうちのどの部分が溶媒に露出しているかに関するこれらの暗示を、ＲＮＡ構造を予測するための計算モデルへの拘束として課した時に、ＲＮＡの３Ｄ構造の高い正確性のモデルを開発することができる。
【０２９０】
代替的な試薬、条件、およびデータ解析を含めてＳＨＡＰＥ法のさらなる詳細は、ＷＯ２０１５／０５４２４７、米国特許出願公開第２０１４／０１５４６７３号、米国特許第７，７４５，６１４号、および米国特許第８，３１３，４２４号に記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９１】
（実施例２）
小分子ＲＮＡリガンドを同定するためのＳＨＡＰＥ−ＭａＰの修正（フックザワーム・アンド・フックアンドクリック（Hook  the  Worm  and  Hook  and  Click）（ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ）法）
ＲＮＡに結合する小分子リガンドを同定する歴史的な努力は、塩基対形成、または二本鎖ＲＮＡにおける標準的な構造モチーフ（すなわち、塩基間のインターカレーションおよび／または溝結合）に集中してきた。しかし、これらのモチーフは特定のＲＮＡへの小分子の選択的結合を支持しない。しかしながら、ＲＮＡは極めて多様な複雑な三次構造にフォールディングし、その三次構造が小分子（ポケットが与える形状および静電力に相補的な小分子）の結合に資するポケットを与える。形状および静電力の詳細がＲＮＡの基礎的配列を反映する限りにおいて、小分子はタンパク質ポケットに結合する時と同じだけの選択性を達成できる。
【０２９２】
実際、多くがＦＤＡ承認済である、ＲＮＡに結合する薬物様小分子が現在ではいくつか報告されている（下記表４を参照）。
【０２９３】
クラスによる小分子リガンド
フォールディングしたＲＮＡへの結合が広範な小分子化学種について実証されているが（GuanおよびDisney、ACS  Chem.  Biol.  ２０１２年  ７巻、７３〜８６頁；参照により本明細書に組み込まれる）、ＲＮＡ結合性リガンドを同定するための大きなライブラリー（＞１０５の化合物）のハイスループットスクリーニングの報告は限られている。したがって、ＲＮＡ結合性のために合成により最適化された小分子の報告もほとんどない。本発明は、これらの欠陥に対する救済の道を開く。下記は広範な化学種を要約する表であり、これらの化学種は実証可能なＲＮＡ結合性を有し、我々のスクリーニング方法を最適化しかつ立証する出発点としてはたらくであろう。そして、このスクリーニング方法により、治療的目的のＲＮＡ構造に対する本質的に全ての公知の化学種の体系的なスクリーニングが可能となるであろう。
【表４】
2019511562.tif 000024
【０２９４】
これらの発見は、予期されていなかった作用の分子メカニズムを明らかにした。技術的課題の大きさから、フォールディングしたＲＮＡに結合する小分子の意図的設計はほとんど追及されておらず、１つの注目すべき例はＲＮＡ三方向ジャンクションに選択的に結合できるトリプチセンベースのリガンドの設計である（Barrosら、Angew.  Chem.  Int.  Ed.  ２０１４年、５３巻、１３７４６〜１３７５０頁。そのため、トリプチセンベースのリガンドは、記載するスクリーニング方法における別の出発点としてはたらくための、ＲＮＡ結合能力を有する別の化学種を提供する。ＲＮＡに結合する小分子の研究における技術的課題としては、多くのＲＮＡが溶液中で不安定であること、溶液中のありのままのＲＮＡに対して細胞内での天然の構造はかなり異なること、および変性後に元々の（生物学的に妥当であると推定される）フォールディングを回収することは度々困難であることが挙げられる。加えて、タンパク質標的とは対照的に、細胞内での標的ＲＮＡの特定の分子「パートナー」およびＲＮＡ上のサブサイトはしばしば未知である。最後に、Ｘ線結晶構造解析法、ＮＭＲ、およびクライオＥＭなどのその他の生体分子（例えば、ＤＮＡ、タンパク質）の構造決定にしばしば用いられる方法は、商業的に妥当な時間枠内でＲＮＡを正確に構造決定するための信頼できる道ではない。これらの課題の全てが重なって、ＲＮＡは小分子ライブラリーに対してスクリーニングするのに困難な標的とされている。
【０２９５】
小分子ＲＮＡモジュレーターを発見するための本発明の方法の一要素は、ＳＨＡＰＥ−ＭａＰとは異なる目的のために標的ＲＮＡ上の２’−ＯＨ求核剤の遍在性を活用する（図１を参照）。例えばアシル化剤またはスルホニル化剤（「弾頭」としても知られる）をＲＮＡ結合性リガンドにテザー連結することによって、これは２’−ＯＨ共有結合修飾の部位に新規のバイアスを課すことになる。具体的には、テザー連結は、リガンド結合部位の近位にあるヌクレオチドのリボースのアシル化を強く好む。ＲＮＡはフォールディングされるので、近接性は配列内で近くにあるリボースに限定されない。弾頭およびテザーの最適化は、フォールディングしたＲＮＡ上の結合性ポケットとのリガンド媒介性の前会合によって加速されない「バックグラウンド」のアシル化を最小化することによって、アシル化プロセスを高度に選択的なものにする。細胞内でのアシル化事象を実行できる限りにおいて、細胞内でのＲＮＡ構造と比べた自由溶液中でのＲＮＡ構造の不良な忠実度に関するあらゆる残りの懸念が回避される。これらのデータから、創薬および最適化に決定的に重要な広範な情報を推論することができる。
・小分子に相補的なＲＮＡ上のポケットの存在
・同定された小分子に結合する標的ＲＮＡ上のサブサイト
・結合性ポケットの近位にあるフォールディングしたＲＮＡの３Ｄ構造の情報を与える拘束
・所与の小分子が同様に結合するその他のＲＮＡの素性
【０２９６】
上記方法に加えて、シークエンシングの幅を制限する様々なプルダウン法を可能とする官能基を組み込むこともできる。弾頭またはテザー上にいわゆる「クリック」基を組み込むことができる。これらのクリック基は、ＲＮＡリガンド媒介性のアシル化後に、ビオチンの簡易な組込みを可能とし、そしてこのビオチンの組込みによって、フック構築物によって標的化されたＲＮＡのみのストレプトアビジンまたはアビジン媒介性の単離が可能となる。これは、発見プロセス全体を加速させ、必要とされるシークエンシングの量を制限する。
【０２９７】
細胞内の単一のＲＮＡまたはＲＮＡのクラスを集中的にスクリーニングするための別の方法は、目的のＲＮＡの配列に相補的な配列を提示するＤＮＡマイクロアレイを使用して目的のＲＮＡをプルダウンする標準的な方法を用いる。これは、目的のＲＮＡの選択的な単離を可能とし、この選択的に単離したＲＮＡをシークエンシングを介してアッセイして、任意のフック構築物が結合しているかどうかを判定することができる。細胞内の単一のＲＮＡに対する集中的なスクリーニングはまた、特定のプライマー伸長技術を介して標的をシークエンシングすることによっても達成でき、これにより目的のＲＮＡを単離する必要性が回避される。
【０２９８】
細胞内のＲＮＡ標的に対して小分子リードを同定することの追加の利点は、三次元のフォールディングの正確な形状、および小分子結合性ポケットのくぼんだ表面に影響する多くの転写後修飾が存在することである。これらの転写後修飾は、完全に同定することが難しく、病的細胞内で評価することが難しく、そして細胞外で化学的または酵素的に復元することがよりいっそう難しいという限りにおいて、天然環境にあるＲＮＡ標的に取り組むことができることは大きな利点である。下記は、スクリーニングの標的としてのＲＮＡの複雑性に寄与する一部の主要な転写後修飾の表である。
【表５】
2019511562.tif 000025
【０２９９】
共有結合親和性トランスクリプトミクス
方法：
１．溶液中または細胞内のいずれかにおいてＲＮＡに結合する可能性を評価する目的のスクリーニングのために、小分子リガンドを選択する。分子の数は、少なくてもよいし（１〜１０）、多くてもよい（＞１，０００，０００）。ロボット式液体処理プラットフォーム上でこの技術を実行することにより、単一のスクリーニング行為により１０，０００を上回る分子のスクリーニングが可能となる。
２．ＲＮＡ上のリボースの２’−ＯＨとの選択的な（つまり、近接誘発性の）共有結合の形成が可能な弾頭に、選択した全てのリガンドをテザー連結させる。この作業の焦点となる反応はアシル化およびスルホニル化である。
【化１７】
2019511562.tif 000026
３．構築物は、任意選択で、追加的な試薬（最も重要なものとしてはビオチン）との生体直交型かつ生体適合性の共有結合を可能とする「クリック反応」に関与できる官能基を含むことができる。
４．リガンド−テザー−弾頭構築物またはリガンド−テザー−弾頭−クリック構築物（それぞれ、「フック」または「クリック実行可能性フック」）を必要に応じて１分から１時間、単離したＲＮＡ、合成ＲＮＡ、または細胞内のＲＮＡに曝露して、共有結合修飾を完了まで進めさせる。
５．単離したＲＮＡまたは合成ＲＮＡを洗浄して過剰の「フック」を除去する。細胞内のＲＮＡについては、細胞を溶解し、ＲＮＡ含有画分を単離する。
６．いずれの構築物を用いるかに応じて、プロセス全体はここで少なくとも３つの可能な経路に分かれる。
７．全てのＲＮＡをシークエンシングできる。ＲＮＡからｃＤＮＡを生じる条件は、アシル化またはスルホニル化されているがその部位の反対にランダムな塩基組込みを有するヌクレオチドを「読み飛ばす」逆転写酵素を使用する。ランダムな組込み（または「突然変異」）を示す配列内の塩基は、元々のＲＮＡのどこでアシル化またはスルホニル化が起きたかを明らかにする。「フック」を使用する場合、それらのアシル化またはスルホニル化は、「フック」のリガンド部分に結合するポケットに三次元的に近位にあるヌクレオチドにおいて起こる。換言すれば、配列内の突然変異は、標的ＲＮＡ上のどこで所与のリガンドが結合したのかを示す「シグナル」である。
８．代替的には、周知技術を使用して、目的のＲＮＡのみを単離してそれらのみをシークエンシングすることができる。この経路は、二次標的とのリガンドの会合を検出しないという欠点を持つが、生成および分析が必要なシークエンシングデータの量を削減するという利点を持つ。細胞内の単一ＲＮＡに対する集中的なスクリーニングは、特定のプライマー伸長技術を介して標的をシークエンシングすることによっても達成することができ、これにより目的のＲＮＡを単離する必要性が回避される。
９．第３の経路は、「フック」がクリック可能な官能基も有する場合に利用可能である。この経路では、「フック連結」後に単離されたＲＮＡを周知技術を使用するクリック反応に供して、クリック生成物を創出する。典型的なクリック反応はアジド／アルキン環化付加（Ｃｕ触媒ありもしくはＣｕ触媒なしのいずれか）またはディールス・アルダー環化付加であるが、その他の化学も「フック」の説明に見合う。ほとんどの適用では、クリック反応を使用して、ビオチンを「フック連結」した全てのＲＮＡに結合させる。アビジンまたはストレプトアビジンを用いるその後のプルダウンにより、「フック連結」したＲＮＡのみを生じさせる。この経路は、所与のリガンドによって「フック連結」した全てのＲＮＡがシークエンシングに供され、またトランスクリプトーム全体をシークエンシングする必要がないという両方の利点を享受する。多数のリガンドをスクリーニングするために、クリックステップが与える効率はかなりのものである。
【０３００】
（実施例３）
フックアンドクリック化合物を用いて使用するためのＳＨＡＰＥ−ＭａＰ手順（代替的には本明細書中でＰＥＡＲＬ−ｓｅｑと称する）
ＳＨＡＰＥ実験では、反応して柔軟なＲＮＡヌクレオチドにおいて共有結合性２’−Ｏ−付加体を形成する２’−ヒドロキシル選択的試薬を使用する。ＳＨＡＰＥは、精製したＲＮＡまたはインタクトな細胞を使用して行うことができる。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰアプローチは、逆転写酵素がＳＨＡＰＥ修飾されたヌクレオチドを読み間違えて、元々の配列に相補的でないヌクレオチドを新たに合成されるｃＤＮＡ中に組み込む条件を活用する。ＳＨＡＰＥ付加体の位置および相対頻度をｃＤＮＡの一次配列中の突然変異として記録する。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ実験では、ＲＮＡをＳＨＡＰＥ試薬で処理するかまたは溶媒のみで処理して、ＲＮＡを修飾する。各実験条件のＲＮＡを逆転写した後、生じたｃＤＮＡをシークエンシングする。未処理の試料について得られたデータから処理した試料についてのデータを減算し、かつ変性した（フォールディングしていない）対照ＲＮＡのデータに対して正規化することによって、反応性の位置を特定する。
【０３０１】
この過程を図７６（Weeksら、PNAS  ２０１４年、１１１巻、１３８５８〜６３頁からの図；Siegfriedら、Nature  Methods  ２０１４年；１１巻：９５９〜９６５頁も参照。これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる）に示す。
【０３０２】
ＳＨＡＰＥ−ＭａＰは、詳細な公表された方法（Martinら、RNA  ２０１２年；１８巻：７７〜８７頁；McGuinnessら、J.  Am.  Chem.  Soc.  ２０１２年；１３４巻：６６１７〜６６２４頁；Siegfriedら、Nature  Methods  ２０１４年；１１巻：９５９〜９６５頁；Lavenderら、PLoS  Comput.  Biol.  ２０１５年；１１巻（５号）ｅ１００４２３０頁；McGuinnessら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ２０１５年；１１２巻：２４２５〜２４３０頁）にしたがって実施し、かつ分析することができる。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ配列データは、ＳｈａｐｅＦｉｎｄｅｒ（Vasaら、RNA  ２００８年；１４巻：１９７９〜１９９０頁）またはＳｈａｐｅＭａｐｐｅｒ（Siegfriedら、Nature  Methods  ２０１４年；１１巻：９５９〜９６５頁）あるいはその他のソフトウェアを使用して分析することができる。以上の刊行物のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０３】
ＳＨＡＰＥ−ＭａＰは、合成ＲＮＡまたは任意の原核細胞もしくは真核細胞から単離されたＲＮＡに対して行うことができる。加えて、ＳＨＡＰＥ−ＭａＰはヒト細胞を含めてインタクトな細胞に対して行うことができる。
【０３０４】
純粋なＲＮＡでのＳＨＡＰＥ−ＭａＰ
純粋なＲＮＡを用いて行うＳＨＡＰＥ−ＭａＰ実験の場合、分析されるＲＮＡは様々な異なる方法で生成できる。ＲＮＡはオリゴヌクレオチドとして化学合成できる。通常、合成オリゴヌクレオチドは短く、おおよそ２０〜１００ヌクレオチド（ｎｔ）の長さである。しかしながら、約２００ｎｔもの長さのオリゴヌクレオチドを化学合成できる。非常に長い転写物を含めて２００ｎｔを上回るＲＮＡについて、当該分野で周知かつ様々な供給元（例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）からキットが市販されているＴ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用してＲＮＡを産生することができ、また様々なキット（例えば、ＭｅｇａＣｌｅａｒキット；Ａｍｂｉｏｎ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡをクリーンアップすることができる。
【０３０５】
ＲＮＡを変性させた後に再生させてＲＮＡをフォールディングさせる。代替的には、天然のＲＮＡ構造を維持する条件下で細胞からＲＮＡを穏やかに抽出した後（Chillonら、Methods  Enzymol.  ２０１５年；５５８巻：３〜３７頁）、このＲＮＡに対してｅｘ  ｖｉｖｏでＳＨＡＰＥ−ＭａＰを行うことができる。変性および再生させたＲＮＡを使用する場合、ＲＮＡを９５℃で２分間変性させ、氷上で２分間スナップ冷却した後、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で３０分間３７℃で再フォールディングさせる。
【０３０６】
様々なＳＨＡＰＥ試薬が利用できる。この例では、ＳＨＡＰＥ試薬は１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７）である。１００〜１０００ｎｇのＲＮＡをＳＨＡＰＥ反応において使用する。ＲＮＡを１０ｍＭの１Ｍ７と共に３７℃で３分間インキュベートする。ＳＨＡＰＥ試薬を欠きかつ１Ｍ７ではなくＤＭＳＯを含む対照反応を並行して行う。付加体検出における配列特異的バイアスを明らかにするために、９５℃の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０％ホルムアミドの強変性条件下で１Ｍ７を使用してＲＮＡを修飾する。修飾後、ＲＮＡ親和性カラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）またはＧ−５０スピンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを使用してＲＮＡを精製することができる。
【０３０７】
次いで、伝統的な方法によってｃＤＮＡライブラリーを構築するために、標的ＲＮＡに特異的なプライマーを使用して、処理したＲＮＡを逆転写（ＲＴ）する。具体的には、付加体誘発性の逆転写の停止が最小となり、かつ全長ｃＤＮＡ生成物の産生が最大となるような酵素条件を選択する。試験する二価金属イオンのうち、マンガンはかさばった２’−Ｏ−付加体の部位での酵素読み飛ばしを最も効果的に促進する。６ｍＭ  Ｍｎ２＋をＲＴ反応（０．７ｍＭの予め混合したｄＮＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  ＭｎＣｌ２、および１４ｍＭ  ＤＴＴ）において使用する。好ましい逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。ＲＴ反応は３時間、またはそれより長く続ける。Ｇ−５０スピンカラムを使用して反応生成物をクリーンアップする。超並列シークエンシング用の二本鎖ＤＮＡライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用のＮＥＢＮｅｘｔ試料調製モジュールを使用して生成する。ｃＤＮＡライブラリーの第２鎖の合成（ＮＥＢ  Ｅ６１１１）は、１００ｎｇのインプットＤＮＡを使用して行い、ライブラリーはＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ＰＣＲクリーンアップキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋ３１０２５０）を使用して精製する。二本鎖ＤＮＡライブラリーの末端修復は、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ  Ｅ６０５０）を使用して行う。反応容量を１００μｌに調整し、クリーンアップステップ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓ  Ａ６３８８０、１．６：１のビーズ対試料比）に供し、ｄ（Ａ）を末端に付加し（ＮＥＢ  Ｅ６０５３）、ｑｕｉｃｋ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ  Ｍ２２００）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ適合性の分岐アダプター（ＴｒｕＳｅｑ）にライゲートする。Ｑ５  ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ，ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ  Ｍ０４９３）を使用するエマルションＰＣＲ４４（３０サイクル）を行って、ライブラリー試料の多様性を維持する。生じたライブラリーを定量化し（Ｑｕｂｉｔ蛍光高度計；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して検証し、プールし、そしてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑシークエンシングプラットフォームを使用するシークエンシングに供する。ＳＨＡＰＥ−ＭａＰ配列データは、Siegfriedら、Nature  Methods  ２０１４年；１１巻：９５９〜９６５頁に記載されるようなＳｈａｐｅＭａｐｐｅｒデータ解析パイプラインを使用して解析することができる。
【０３０８】
細胞内でのＳＨＡＰＥ−ＭａＰ
１Ｍ７などのＳＨＡＰＥ−ＭａＰ試薬を細胞に直接加えることができる。標的ＲＮＡに特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにしたがって個々のＲＮＡをシークエンシングすることができる。あるいは、ＳＨＡＰＥ−ＭａＰトランスクリプトーム全体のディープシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって、数多くのＲＮＡを分析することができる。抽出したＲＮＡはプルダウンなしで分析することができるか、あるいはストレプトアビジンビーズまたはストレプトアビジンカラムを使用することによるビオチン修飾ＲＮＡのプルダウンによって修飾ＲＮＡを単離することができる。
【０３０９】
１Ｍ７の他に、２−メチルニコチン酸イミダゾリド（ＮＡＩ）および２−メチル−３−フロン酸イミダゾリド（ＦＡＩ）などのその他のアシル化求電子剤を利用してもよい。この細胞の例では、ＮＡＩが使用される。
【０３１０】
様々な細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞を使用してもよい。好ましくは、細胞はヒトである。ＨｅＬａまたは２９３などの確立されたヒト細胞株を用いてもよい。代替的には、分析されるＲＮＡが疾患の遺伝子型の状況にあることが望まれる場合には、線維芽細胞などの患者由来細胞を使用してもよい。遺伝性の神経学的または筋骨格疾患（ＴＲＥＤはそのような例である）の場合、ニューロンまたは筋肉細胞に分化する患者由来ｉＰＳ細胞を用いてもよい。細胞を化合物と接触させる直前に細胞を溶解しまたは他の何らかの方法で破砕することも可能である。
【０３１１】
哺乳動物細胞を推奨される培養培地（通常、１０％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤ−ＭＥＭ培養培地）中で生育させる。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて細胞を３回洗浄した後に剥がし取り、２５℃で５分間、７００ｒｐｍで遠心沈降させる。細胞（約３〜６×１０７）をＰＢＳおよびＤＭＳＯ（陰性対照；１０％最終濃度）またはＤＭＳＯ中に所望の最終濃度（通常、２００ｍＭ）まで加えたＮＡＩ中に再懸濁する。細胞懸濁液を３７℃に置き、様々な期間反応させる。次いで、反応物を遠心沈降し、デカンテーションする。ペレット細胞に１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ（Ａｍｂｉｏｎ）、続いて２００ｕｌのクロロホルムを加える。Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳの製造業者の指示書にしたがってＲＮＡを沈殿させる。７０％エタノールを用いてペレットを２回洗浄し、１０ｕｌのＲＮａｓｅフリーの水中に再懸濁する。逆転写、ｃＲＮＡライブラリー構築、シークエンシング、およびデータ解析を上記の通りに行う。
【０３１２】
場合によっては、小分子と反応したＲＮＡは、ストレプトアビジン−ビオチン系などのツールを使用してＲＮＡをプルダウンすることによって濃縮することができる。強いストレプトアビジン−ビオチン結合は、様々な生体分子を互いにまたは固体支持体上に結合させるために使用することができる。ストレプトアビジンは、ビオチンへのコンジュゲートによってタグ化された高分子を精製するために使用することができる。ビオチンは、クリック化学を介してＲＮＡ結合性小分子−テザー−反応性弾頭中に組み込むことができる。細胞ベースのＳＨＡＰＥ−ＭａＰ実験では、細胞を上記化合物（複数可）で処理し、ＲＮＡを細胞から抽出し、ＲＮＡ全体をストレプトアビジンカラム（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可）に通すことによって、または製造業者の指示書にしたがってストレプトアビジン磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、またはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可）を使用することによって、反応したＲＮＡを単離する。
【０３１３】
（実施例４）
共有結合親和性トランスクリプトミクス
基本概念の概要
本発明の重要な特徴はテザーである。テザーはアシル化事象をリガンド結合事象と結び付けるので、アシル化パターンを決定的に変化させる。これは、リガンド結合性ポケットの近位にあるリボースのみがアシル化されるためであり、そしてこの変化したアシル化パターンがシークエンシングにおいて「突然変異」として観察される。このことから、標的化されたＲＮＡ上の小分子結合部位の存在、およびトランスクリプトームにわたってのこれらのリガンド結合部位の位置を推定する。クリック官能基も有するＲＮＡリガンド／テザー／弾頭構築物（「フック」）は、クリック可能なビオチンにクリックした後、ビーズ上のストレプトアビジンと複合体化させることによってプルダウンできる。このクリック／プルダウンプロトコールにより、「フック」によって共有結合的に修飾されたＲＮＡのみをシークエンシングすることが可能となる。標的化されたＲＮＡ上で別々に実行されるＳＨＡＰＥ−ＭａＰおよびＲＩＮＧ−ＭａＰのプロトコールにより、「共有結合親和性トランスクリプトミクス」の配列データの解釈を促進する枠組みとして、標的化されたＲＮＡの構造モデルの構築が可能となる。
【０３１４】
成功は細胞内での遊離リガンドの生物活性によって測定する。
【０３１５】
プラットフォームを開発するための実験（化合物およびＲＮＡ標的）
ライブラリーの構築
共有結合親和性トランスクリプトミクスを可能とするライブラリーは、標的ＲＮＡ中のリボースの２’−ヒドロキシルと非可逆的に共有結合を選択的に形成する求電子性弾頭にテザー連結した小分子（「ＲＮＡリガンド」）を含む。ライブラリーの多様性には、ＲＮＡリガンド構造、テザー構造、および弾頭構造のバリエーションが包含される。
【０３１６】
ＲＮＡ親和性の構造決定因子に関する仮説に基づいてＲＮＡリガンドを設計し、合成し、そしてテザーおよび弾頭に結合させる。一例としては、トリプチセン系のリガンドは、ＲＮＡ中の三方向ジャンクション（３ＷＪ）に結合するように設計する。代替的には、ＲＮＡリガンドは、既知のＲＮＡリガンドへの類似性またはＲＮＡ結合性ポケットへの相補性に基づいて市販の供給元から選択し、購入し、そしてさらなる合成に供してテザーおよび弾頭に結合させる。例としては、テトラサイクリン抗生物質、アミノグリコシド抗生物質、テオフィリンおよび類似の構造（例えば、キサンチン）、ならびにリボシルおよび類似の構造、リネゾリドおよび類似の構造が挙げられるが、これらに限定されない。第３の相補的なアプローチでは、コンビナトリアル化学技術を使用してＲＮＡリガンドのライブラリーを調製する。具体的には、選択したテザーを一連の合成化学ステップを通じて有機合成を支持するポリマーに取り付け、化合物を１ビーズ１化合物の形式にさせる。これらのステップは、最終のＲＮＡリガンドにおける、広範な官能基によって接続された広範な断片および反応物の組込みに繋がる。これらの化合物を放出し、最後のオフビーズステップはＲＮＡ弾頭の結合である。
【０３１７】
ライブラリーの機能的帰結の鍵となる要素として、各ＲＮＡリガンドおよびＲＮＡ弾頭について、テザーの長さ、テザーの柔軟性、および追加的な機能性（特に、クリック官能基）を許容する能力を最適化するために、いくつかの構造的に多様なテザーを組み込む。研究されている具体的なテザーとしては、１〜６個のエチレン単位を含むオリゴエチレングリコール、柔軟性の高い（例えば、１〜６個のアミノ酸を含むオリゴグリシンもしくはオリゴ−Ｎ−メチルグリシン）またはより剛性の（例えば、１〜６個のアミノ酸を含むオリゴプロリンまたはオリゴ−４−ヒドロキシプロリン）オリゴペプチドが挙げられる。オリゴエチレングリコールテザー中へのクリック官能基の組込みは、ＲＮＡリガンドまたはテザーのＲＮＡ弾頭末端のいずれかにおいて、クリック可能な官能基を有するアミノ酸を挿入することを必要とする。オリゴペプチドテザー中へのクリック官能基の組込みは、アミノ酸残基のいずれか１つを、クリック可能な官能基を有するアミノ酸と置き換えることを単純に必要とする。
【０３１８】
ＲＮＡ弾頭は、最初に、リボースの２’−ＯＨ基においてＲＮＡをアシル化することが既に実証されている特定の弾頭および関連する官能基に基づいて選択する。そのような弾頭としては、イサト酸無水物、アシルイミダゾール、アリールエステル（例えば、アスピリン）、およびフッ化スルホニルが挙げられる。追加的な弾頭は、（１）上述の弾頭への合成修飾によりＲＮＡ弾頭についての構造／活性相関を確立すること、および（２）リボースの２’−ＯＨ基をアシル化する能力について市販の求電子剤をスクリーニングすることによって特定する。後者の例としては、ベータラクタム抗生物質および関連する構造、ベータラクトン、ならびにセリンヒドロラーゼ中の触媒性のセリンを共有結合的に修飾することが公知の電子不足性カルバメートが挙げられる。
【０３１９】
クリック官能基は、公表されたクリック試薬および反応物の標準的な「ツールキット」から選択される。本研究は、アジド、アルキン（末端および歪んだものの両方）、ジエン、テトラジン、およびジエノフィルに集中する。テザーセグメント（上記）中に組み込まれる場合は、通常、組み込まれたアミノ酸の側鎖上である。ＲＮＡ弾頭中に組み込まれる場合は、その強化されたＲＮＡ弾頭の同時的なオーダーメイド合成と共に、より慎重かつコンパクトな設計が必要とされる。
【０３２０】
プラットフォームの構築  −  Ｉ型フック
「フック」を用意したら、最初のステップは、ＲＮＡリガンドにテザー連結したＲＮＡ弾頭が、結合部位へのテザーに拘束された近接性を反映したリボース修飾をもたらすことを実証することである。この一連の結果は、既知のＲＮＡ／リガンド対における近接誘発性および親和性誘発性のリボース２’−ＯＨ共有結合修飾のさらなる最適化の基礎となる。３０ＳリボソームＲＮＡ［Brodersenら、Cell  ２０００年、１０３巻、１１４３〜１１５４頁］および進化型アプタマー［Ferre-D'Amareら、Chem  &  Bio、２００８年］の両方へのテトラサイクリンの結合部位および結合様式は、Ｘ線結晶構造解析法によって決定されている。ＲＮＡ弾頭にテザー連結したテトラサイクリンはこれら２つのＲＮＡに対して最初に研究されて、これらのＲＮＡにおける近接誘発性のリボース修飾を実証する。トリプチセンリガンドは、ＲＮＡ三方向ジャンクション中の形状相補的な空洞に結合することが実証されている［BarrosおよびChenoweth、Angew.  Chem.  ２０１４年］。ＲＮＡ弾頭にテザー連結したトリプチセンは、三方向ジャンクション中の近接した修飾にプローブすることを可能とする。両方の系（テトラサイクリンおよびトリプチセン）は前例および構造に基づいてよく制御され、テザーの長さおよびテザーの剛性の同様によく制御された最適化ならびにＲＮＡ弾頭のＳＡＲを可能とする。これらの２つの系（テトラサイクリンおよびトリプチセン）は、新たなＲＮＡ弾頭の文脈におけるシークエンシング方法の最適化も可能とする。
【０３２１】
単離されたモデルＲＮＡにおいて近接誘発性のリボース修飾パターンが実証されたら、同じＲＮＡを細胞中で発現させ、最適な「フック」をそれらの細胞に曝露させ、「フック」が細胞内に入り、標的ＲＮＡに結合し、そして非細胞条件と実質的に同じパターンでそれを共有結合的に修飾できることを実証する。最初に、ＰＣＲ用の標的特異的なプライマー配列を使用することによって、シークエンシングは目的のＲＮＡ標的のみに集中する。しかしながら、同じ実験における広範なＰＣＲおよびディープシークエンシングにより、テトラサイクリンフックまたはトリプチセンフックによって同様に結合された細胞中の全てのＲＮＡの調査がもたらされる。これらのデータは、選択したＲＮＡリガンドの固有の選択性、およびこのシークエンシング方法を使用してトランスクリプトームにわたっての選択性を評価する能力の両方を反映する。
【０３２２】
究極的な目標は、「フック」から解放されて目的の細胞生物学を示すことができるＲＮＡリガンドを同定することであるので、最初のステップは一連の競合実験である。（１）最初の無細胞のフック実験では、遊離の（テザー連結していない）ＲＮＡリガンドを溶液に加えた時に、それは小分子結合性ポケットの占有について同族の「フック」と競合し、近接誘発性のリボース修飾を抑制するはずである。（２）同様に細胞実験では、遊離の（テザー連結していない）ＲＮＡリガンドを加えると、（リガンドおよび同族の「フック」によって標的化された全てのＲＮＡにわたってであるが）同じ競合を生じることになる。
【０３２３】
プラットフォームの構築  −  ＩＩ型およびＩＩＩ型フック
リボース２’−ＯＨの近接誘発性の共有結合修飾が実証されたら、生化学的および細胞内の両方で、それぞれテザー中またはＲＮＡ弾頭中にクリック可能な官能基を組み込んだ「ＩＩ型」または「ＩＩＩ型」を用いて同じ実験を実行する。これらの「フック」を調査して、それらが上記の結果を繰り返すこと、および加えたクリック可能な官能基（複数可）がＲＮＡ「フック」としてのそれらの機能を損なわせないことを実証する。ＲＮＡへのＩＩ型およびＩＩＩ型「フック」の曝露後に、生化学的または細胞内のいずれかで、生じたフック／ＲＮＡ付加体をビオチンを有する相補的な市販のクリック剤に曝露する。最初の実施例では、「フック」上のクリック可能な官能基はアジドであり、クリック可能なビオチンは、銅フリーの環化付加を可能とする歪んだシクロオクチンである。クリック反応の程度をモニタリングして、クリック反応が完了に到達することを確実にすることが重要である。実験を細胞内で行う場合、クリック反応の前または後のいずれかにおいて、細胞を溶解することができる。
【０３２４】
次いで、生じたクリックを受けた付加体をビーズ上のストレプトアビジンに曝露し、ビーズをプルダウンする。細胞デブリおよび付加しなかったＲＮＡを洗浄により除去し、プルダウンしたＲＮＡを変性およびシークエンシングすることができる。
【０３２５】
目的の標的を追求するための化合物および条件
家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の両方の分子病態は、一連の世代にわたっての、ｃ９ｏｒｆ７２中の（ＧＧＧＧＣＣ）ヘキサヌクレオチドリピートの蓄積に帰着させることができる。脳内のこの異常ＲＮＡを選択的に遮断することは、有力な治療的可能性を有する。このＲＮＡは、「フック」ライブラリー技術によく見合った最初の、そして臨床的に高い価値を持つ標的である。
【０３２６】
上記のライブラリーを、（１）溶液中の様々な長さの合成ＲＮＡ、および（２）このＲＮＡを発現する患者からの疾患細胞中という、２つの状況下でｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピートのＲＮＡ構造に曝露する。これらの曝露はウェルあたり１「フック」とする。シークエンシングは標的特異的なプライマーを使用して実行するので、初期研究ではクリック可能な「フック」は必要とされない。クリック可能な「フック」は、ヘキサヌクレオチドリピートに結合すると判定された剤についてトランスクリプトームワイドな選択性を評価するために、二次的スクリーニングとして使用する。
【０３２７】
ｃ９ｏｒｆ７２ヘキサヌクレオチドリピートに結合する分子について前例がほとんどまたは全くないという限りにおいて、このＲＮＡ標的に取り組むには、「フック」ライブラリーのリガンドの広い多様性が必要である。さらには、標的のコンフォメーションは細胞の微小環境（例えば、ＲＮＡ結合タンパク質）によって強く影響され得るという限りにおいて、このＲＮＡ標的に取り組むには、細胞内で小分子をスクリーニングする能力も必要である。特に興味深いのは、標的上の独特の部位に結合する分子が同定されるかどうか、または標的の周期性がフォールディングした形態中で保持され、周期的な一連の結合性ポケットをもたらすかどうかであろう。
【０３２８】
最後に、ｃ９ｏｒｆ７２  ＲＮＡ標的の近接誘発性の修飾をもたらす「フック」について、「フック」構築物へのテザー連結なしでＲＮＡリガンドセグメントを再合成または再単離し、内因性のｃ９ｏｒｆ７２  ＲＮＡ標的への結合と合致する生物学的活性について試験する。
【０３２９】
同じプロトコールをいくつかの価値の高い初期標的に適用する：ＭＹＣおよびその他のｐｒｅ−ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ中のＵＯＲＦ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ中のイントロン、ｍｉＲ−１５５に繋がる一次転写物（ｐｒｉ−ｐｒｅ−ｍｉＲ−１５５）、ならびにｌｎｃＲＮＡであるＭＡＬＡＴ−１およびＨＯＴＡＩＲ。
【０３３０】
オムニプレックス実験
広範かつ多様な「フック」ライブラリーを用いて完全にバイアスのない様式で細胞ベースのスクリーニングを実行できることを指摘することは興味深い。そのような場合、十分なシークエンシング資源を用いて可能となるのは、包括的なトランスクリプトームワイドの標的同定である。よって、本発明の一部の実施形態では、（１）クリック可能な「フック」のライブラリーが細胞に対してスクリーニングされ、（２）ＲＮＡ弾頭によって「フック連結」した各ウェル中の全てのＲＮＡがプルダウンおよびシークエンシングされ、かつ（３）生じた配列データを分析して、使用した「フック」ライブラリー中の全てのリガンドによって取り組まれた全ての標的を見出すことができる。
【０３３１】
（実施例５）
弾頭タイプ１Ａの合成
【化１８】
2019511562.tif 000027
【０３３２】
２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸、弾頭タイプ１Ａ。
１，４−ジオキサン（１６０ｍＬ）中の２−アミノテレフタル酸（２．０ｇ、１１．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリホスゲン（３．２８ｇ、１１．０５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応混合物をＤＭ水（４００ｍＬ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、弾頭＿タイプ＿１Ａ（２．２ｇ、９６．２％）をオフホワイトの固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.67  ppm  (1H,  broad),  11.89  ppm  (1H,  broad),  8.03-8.01  ppm  (1H,  d),  7.73-7.68  ppm  (2H,  m).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ５ＮＯ５［ＭＨ］−の計算値  ２０６．０２、実測値  ２０６．１７。
【０３３３】
（実施例６）
弾頭タイプ１Ｂの合成
【化１９】
2019511562.tif 000028
１，４−ジメチル２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボキシレート（１）。
【０３３４】
アセトン（１５０ｍＬ）中のジメチル２−アミノベンゼン−１，４−ジカルボキシレート（１０．０ｇ、０．０５ｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（１９．８ｇ、０．１４３ｍｏｌ）および硫酸ジメチル（１８．１ｇ、０．１４３ｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を６０℃で２４時間撹拌した。反応混合物をゆっくりと室温に冷却し、水（２００ｍＬ）で希釈した。次いで、得られた混合物を酢酸エチル（４×７５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１を褐色固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（７％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、１（４．５ｇ、４２％）を淡黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ１３ＮＯ４［ＭＨ］＋の計算値  ２２４．０８、実測値  ２２４．２。
【０３３５】
２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボン酸（２）。
【０３３６】
ＴＨＦ（１００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中のジメチル２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボキシレート（１）（４．５ｇ、０．０２ｍｏｌ）の溶液に、水酸化カリウム（３．４ｇ、０．０６ｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を７０℃で４時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水（２００ｍＬ）で希釈し、重硫酸カリウムを使用して酸性化した。次いで、得られた混合物を酢酸エチル（４×７５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の２（３．０ｇ、７６．３３％）を淡黄褐白色固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.14  ppm  (1H,  s),  7.87-7.85  ppm  (1H,  d,  J=8.0  Hz),  7.21-7.21  ppm  (1H,  d,  J=1.6  Hz),  7.10-7.07  (1H,  dd,  J=8.0),  2.87  (1H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ９ＮＯ４［ＭＨ］＋の計算値  １９６．０５、実測値  １９６．２１。
【０３３７】
１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸、弾頭タイプ１Ｂ。
【０３３８】
テトラヒドロフラン（９０ｍＬ）中の２−（メチルアミノ）ベンゼン−１，４−ジカルボン酸（２）（３．０ｇ、０．０１５ｍｏｌ）の懸濁液に、トリホスゲン（２．２８ｇ、０．０７６ｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を３０℃で３０分間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の弾頭タイプ１Ｂを黄色固体として得た。粗混合物を、ジエチルエーテルを使用する摩砕により精製して、弾頭タイプ１Ｂ（３．１ｇ、９１．１７％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.78  ppm  (1H,  s),  8.12-8.09  (1H,  d,  J=8.4),  7.82-7.80  (2H,  m),  3.51  (3H,  S).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ７ＮＯ５［ＭＨ］−の計算値  ２２０．０３、実測値  ２２０．０７。
【０３３９】
このタイプと同様のさらなる弾頭としては、Ｎ−メチルイサト酸無水物、１−メチル−６−ニトロイサト酸無水物および１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物が挙げられる。これらは、市販されている。
【０３４０】
（実施例７）
弾頭タイプ２の合成
【化２０】
2019511562.tif 000029
７−メトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（１）。
【０３４１】
１，４−ジオキサン（４００ｍＬ）中の２−アミノ−４−メトキシ安息香酸（２０ｇ、１１９．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリホスゲン（１７．８ｇ、５９．８６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で６時間撹拌した。反応混合物をＤＭ水（１Ｌ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、１（２０．５ｇ、８８％）をオフホワイトの固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  11.66  ppm  (1H,  broad),  7.85-7.83  ppm  (1H,  d,  J=8.8  Hz),  6.85-6.83  ppm  (1H,  dd,  J=2.4,  6.4  Hz),  6.59-6.58  ppm  (1H,  d,  J=2.4  Hz),  3.86  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ７ＮＯ４［ＭＨ］−の計算値  １９２．０４、実測値  １９２．１６。
【０３４２】
７−メトキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（２）。
【０３４３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２００ｍＬ）中の７−メトキシ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（１）（２０．５ｇ、１０６．２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１４．６５ｇ、１０６．２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた反応混合物を１０分間撹拌した。これに、ヨウ化メチル（１８．０８ｇ、１２７．４４ｍｍｏｌ）を室温で滴下添加した。反応混合物をＤＭ水（１Ｌ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の２を得た。粗製物を、ヘキサンで摩砕することにより精製して、２（１７．９ｇ、９３．２３％）をオフホワイトの固体として得た。生成物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  7.95-7.93  ppm  (1H,  d,  J=8.4  Hz),  6.94-6.91  ppm  (1H,  dd,  J=2.4,  6.4  Hz),  6.86-6.85  ppm  (1H,  d,  J=2  Hz),  3.94  ppm  (3H,  s),  3.46  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ９ＮＯ４［ＭＨ］＋の計算値  ２０８．０５、実測値  ２０８．２。
【０３４４】
７−ヒドロキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（３）。
【０３４５】
０℃のジクロロメタン（５００ｍＬ）中の７−メトキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（２）（１０ｇ、４８．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＢｒ３（ジクロロメタン中１Ｍ溶液）（７２．４４ｍＬ、７２．４４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間撹拌し、ゆっくりと室温にし、２４時間さらに撹拌した。反応混合物をｎ−ヘキサン（５００ｍＬ）で希釈し、得られた残留物を濾過した。収集した固体をｎ−ヘキサン（３×５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させた。固体を水（１Ｌ）中にさらに懸濁させ、ジクロロメタン（５×３５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、３（７．９ｇ、８４．７４％）を褐色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  MeOD)  δ  7.96-7.94  ppm  (1H,  d,  J=8.8  Hz),  6.78-6.75  ppm  (1H,  dd,  J=2,  6.4  Hz),  6.69-6.69  ppm  (1H,  d,  J=2.4  Hz),  3.52  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ９Ｈ７ＮＯ４［ＭＨ］−の計算値  １９２．０４、実測値  １９１．９６。
【０３４６】
ベンジル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート（４）。
【０３４７】
アセトン（８００ｍＬ）中の７−ヒドロキシ−１−メチル−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−２，４（１Ｈ）−ジオン（３）（７．９ｇ、４０．９３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１４．１２ｇ、１０２．３１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２０分間撹拌した。これに、ベンジル−２−ブロモアセテート（１１．２５１ｇ、４９．１１１ｍｍｏｌ）を室温で滴下添加し、得られた反応混合物を５時間さらに撹拌した。反応混合物を濾過し、収集した残留物をアセトン（３×２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮して、固体塊を得た。固体塊を酢酸エチル（１Ｌ）に溶解し、水（３×３００ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の４を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ｎ−ヘキサン）により精製して、純粋な４（０．３９ｇ、６２．９％）を黄色油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  7.94-7.92  ppm  (1H,  d,  J=8.4  Hz),  7.38-7.35  ppm  (5H,  m),  6.95-6.92  ppm  (1H,  dd,  J=2,  6.8  Hz),  6.87-6.87  ppm  (1H,  d,  J=2  Hz),  5.23  ppm  (2H,  s),  5.14  ppm  (2H,  s),  3.40  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ１５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ３４２．０９、実測値  ３４２．２８。
【０３４８】
２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）酢酸、弾頭＿タイプ＿２。
【０３４９】
ＴＨＦ：ＥｔＯＡｃの１：１混合物（４００ｍＬ）中の１０％Ｐｄ／Ｃ（乾燥基準）（１．２５ｇ、５％ｗ／ｖ）の懸濁液に、ベンジル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート（４）（６．５ｇ、１９．０５７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。Ｈ２ガスを反応混合物中に室温で３時間パージした。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の弾頭＿タイプ＿２を得た。粗混合物を、ｎ−ヘキサン（３×２０ｍＬ）で摩砕することにより精製して、弾頭＿タイプ＿２（０．３９ｇ、６２．９％）をオフホワイトの固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  13.25  ppm  (1H,  br  s),  7.95-7.92  ppm  (1H,  d,  J=8.4  Hz),  6.92-6.88  ppm  (2H,  m),  4.94  ppm  (2H,  s),  3.44  ppm  (3H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ９ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ２５２．０４、実測値  ２５２．４７。
【０３５０】
（実施例８）
ＡＲＫ−１（Ａｒｋ０００００７）の合成
【化２１】
2019511562.tif 000030
カナマイシンＡ遊離塩基、１。
【０３５１】
２５０ｍＬのビーカー内で、カナマイシンＡ一硫酸塩（５．０ｇ、８．５８２ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解し、得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基１（３．８ｇ、９１％）を白色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ３６Ｎ４Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  ４８５．２３、実測値  ４８５．２６。
【０３５２】
１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、２。
【０３５３】
ＤＭＳＯ（１４０ｍＬ）および水（４０Ｌ）（１８０ｍＬ）中のカナマイシンＡ遊離塩基（１）（３．７ｇ、７．６４１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ無水物（２０ｇ、９１．６９２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた反応混合物を７０℃で２０時間加熱した。室温に冷却した後、ＮＨ４ＯＨの水溶液（３０ｍＬ）を、得られた反応混合物に添加した結果、沈殿物を得た。沈殿物を濾過によって収集し、水（２×３５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させて、純粋な２（５．７ｇ、８４％）を白色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  6.92  ppm  (1H,  s),  6.62    ppm  (1H,  s),  6.53-6.51  ppm  (1H,  d,  J=6.8  Hz),  6.38  ppm  (1H,  s),  5.40  ppm  (1H,  broad  s),  5.27  ppm  (1H,  broad  s),  4.71  ppm  (1H,  broad  s),  4.22  ppm  (1H,  broad  s),  3.80-3.25ppm  (15H,  broad  m),  3.07  ppm  (1H,  broad  s),  1.82-1.75  ppm  (1H,  broad  s),  1.37  ppm  (36H,  broad  s);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ６８Ｎ４Ｏ１９［ＭＨ］＋の計算値  ８８５．４４、実測値  ９０７．７（Ｍ＋Ｎａ付加体）。
【０３５４】
６’’−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、３。
【０３５５】
ピリジン（３５ｍＬ）中の１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ（２）（２ｇ、２．２６１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ピリジン（４ｍＬ）中の２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（４．１１ｇ、１３．５６７ｍｍｏｌ）の溶液を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２０時間撹拌した。この後、反応混合物をメタノール（３０ｍＬ）に添加し、３０分間さらに撹拌した。次いで、反応混合物を、冷却した１０％ＨＣｌ溶液（４００ｍＬ）に注ぎ入れ、酢酸エチル（４×２００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の３を黄色固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム）により精製して、純粋な３（０．５ｇ、７３％）を薄黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ９０Ｎ４Ｏ２１Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １１５１．５８、実測値  ９０８．６（Ｍ−ＴＩＰＢＳフラグメント  ＋Ｎａ付加体）。
【０３５６】
６’’−アジド−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、４。
【０３５７】
３５ｍＬの圧力バイアルに、６’’−（２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル）−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ（３）（０．５ｇ、０．４３４ｍｍｏｌ）、ＮａＮ３（０．５６５ｇ、８．６９１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１５ｍＬ）を室温で入れた。得られた反応混合物にマイクロ波下、１２０℃で３時間照射を行った。室温に冷却した後、反応混合物を冷水（１５０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の４を褐色油状物として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な４（０．１１ｇ、２７％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CD3OD)  δ  5.11-5.02  ppm  (2H,  t,  J=9.6  Hz),  4.37-4.35  ppm  (1H,  d),  3.73-3.36  ppm  (15H,  m),  3.23-3.18  ppm  (1H,  t,  J=9.2  Hz),  2.07-2.04  ppm  (1H,  d,  J=13.2  Hz  ),  1.47-1.45  ppm  (36H,  br  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ６７Ｎ７Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  ９１０．４５、実測値  ９３２．６７（Ｍ＋Ｎａ付加体）。
【０３５８】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０３５９】
（Ａ）Ｈ２Ｏ中１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＩＰＡ（９０：１０）（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０×１９ｍｍ、５Ｕｎを使用：
【表１２】
2019511562.tif 000031
【０３６０】
６’’−アジド−カナマイシンＡトリフルオロ酢酸塩（triflouroacetate  salt）、ＡＲＫ−１−ＴＦＡ塩。
【０３６１】
６’’−アジド−１，３，６’，３’’−テトラ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）カナマイシンＡ、（４）（０．１１ｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ：ＴＦＡの１：１混合物（３．２ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテルを使用して摩砕して、純粋なＡＲＫ−１−ＴＦＡ塩（０．１２ｇ、１０２％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  5.39-5.38  ppm  (1H,  d,  J=3.6  Hz),  4.95-4.94  ppm  (1H,  d,  J=3.2  Hz),  3.796-3.71  ppm  (5H,  m),  3.64-3.31  ppm  (11H,  m),  3.07-3.01  ppm  (1H,  q,  J=14.4,9.2  Hz),  2.40-2.37  ppm  (1H,  m),  1.77-1.74  ppm  (1H,  q,  J  =  12.8  Hz),  1.09-1.02  ppm  (1H,  m).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ３５Ｎ７Ｏ１０＋３ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ５０９．２４、実測値  ５１０．４。ＨＰＬＣ保持時間：７．１０３分。
【０３６２】
６’’−アジド−カナマイシンＡ塩酸塩、ＡＲＫ−１−ＨＣｌ塩（Ａｒｋ０００００７）。
【０３６３】
６’’−アジド−カナマイシンＡトリフルオロ酢酸塩、ＡＲＫ−１−ＴＦＡ塩（０．１２ｇ、０．１２４ｍｍｏｌ）を水（４０ｍＬ）に溶解し、得られた水溶液をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、ＡＲＫ−１を遊離塩基として得た。遊離塩基を０．０１Ｎ  ＨＣｌ（４ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を凍結乾燥して、純粋なＡＲＫ−１−ＨＣｌ−塩（０．０６ｇ、７７％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  5.41-5.40  ppm  (1H,  d,  J=2.4  Hz),  4.96  ppm  (1H,  br  s),  3.90-3.76  ppm  (5H,  m),  3.62-3.60  ppm  (2H,  d,  J=8.8  Hz),  3.55-3.19  ppm  (10H,  m,  ),  3.07-3.01  ppm  (1H,  m),  2.41-2.38  ppm  (1H,  d,  J  =  12),  1.82-1.73  ppm  (1H,  q,  J  =  12.8  Hz).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１８Ｈ３５Ｎ７Ｏ１０．３  ＨＣｌ［ＭＨ］＋の計算値  ５１０．２４、実測値  ５１０．２。ＨＰＬＣ保持時間：１４．８９７分。
【０３６４】
（実施例９）
ＡＲＫ−７（Ａｒｋ０００００１３）の合成
【化２２】
2019511562.tif 000032
２，７，１５−トリニトロ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン、１ａ。
【０３６５】
濃ＨＮＯ３（４００ｍＬ）をトリプチセン（１０ｇ、３９．３ｍｍｏｌ）に室温で滴下添加し、得られた反応混合物を８０℃で１６時間加熱した。得られた褐色溶液を室温に冷却し、氷冷水（３０００ｍＬ）に注ぎ入れ、３０分間撹拌した。得られた沈殿物を収集し、冷水で洗浄し、次いで空気中で乾燥させて、１ａと１ｂとの粗混合物を得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、純粋な生成物１ａ（２．２３ｇ、１４．１０％）を白色固体として得た。１ａ  ｍｐ：＞３００℃1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.37-8.36  ppm  (3H,  d,  J=2  Hz),  8.08-8.06  ppm  (3H,  dd,  J=8  Hz,  J=2  Hz),  7.66-7.64  ppm  (3H,  d,  J=8.4  Hz),  5.87  ppm  (1H,  S),  5.84  ppm  (1H,  s),  13C  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  150.24,  145.91,  145.76,  126.10,  122.60,  119.93,  52.18,  51.48;  MS  (ESI-MS):  m/z  calcd  for  C20H21N3O6  [MH]+  390.06,質量の応答は認められない。
【０３６６】
１ｂ  ｍｐ：１７８〜１８０℃1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  8.36-8.35  ppm  (3H,  m),  8.09-8.06  ppm  (3H,  m),  7.69-7.65  ppm  (3H,  m),  5.86  ppm  (1H,  s),  5.85  ppm  (1H,  s)  13C  NMR  150.93,  150.57,  145.72,  145.33,  144.92,  125.97,  122.54,  119.93,  55.33,  51.98,  51.74.
【０３６７】
９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン、２。
【０３６８】
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の２，７，１５−トリニトロ−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン（１ａ）（２．２３ｇ、５．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ラネーニッケル（１．０ｇ）を添加し、得られた反応混合物を０℃に冷却した。ヒドラジン水和物（４ｍＬ）を、得られた混合物に０℃で添加した。反応混合物を６０℃で１時間撹拌した。得られた反応混合物を室温に冷却し、ＴＨＦで溶出しながらセライトに通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、粗製の２（１．５ｇ、８８．２３％）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.09-7.07  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  6.75-6.75  ppm  (3H,  d,  J=2  Hz),  6.29-6.27  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=2  Hz),  5.10ppm  (1H,  S),  5.02  ppm  (1H,  s),  3.51-3.35  ppm  (  6H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２０Ｈ１７Ｎ３［ＭＨ］＋の計算値  ３００．１４、実測値  ３００．４。
【０３６９】
２，７，１５−トリヨード−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン、３。
【０３７０】
１００ｍＬの丸底フラスコ内で、９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．９ｇ、３．０１ｍｍｏｌ）を濃塩酸（７．５ｍＬ）および水（１５ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を０℃に冷却した。これに、水（７．５ｍＬ）中の亜硝酸ナトリウム（０．７２ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の溶液を１０分間かけて滴下添加し、得られた反応混合物を０℃で２０分間撹拌した。この後、水（１０ｍＬ）中のヨウ化カリウム（３．７４ｇ、２２．５８ｍｍｏｌ）の溶液を反応混合物に０℃で滴下添加し、５分間さらに撹拌した。次いで、反応混合物をゆっくりと室温に加温し、８０℃で２時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、飽和重硫酸ナトリウム（３×３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の３を褐色半固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、純粋な生成物３（０．５７ｇ、３０．０％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.74-7.73  ppm  (3H,  d,  J=1.6  Hz),  7.39-7.36ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=1.6  Hz),  7.66-7.64  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  5.31ppm  (1H,  S),  5.26  (1H,  s).
【０３７１】
９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボニトリル、４。
【０３７２】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の２，７，１５−トリヨード−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン（３）（０．５５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）の溶液に、シアン化亜鉛（０．３３ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を窒素ガスで２０分間脱気した。これに、テトラキス（０．１０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を１４０℃で１６時間撹拌した。室温に冷却した後、反応混合物をセライトに通して濾過し、冷水（２０ｍＬ）でクエンチし、ジクロロメタン（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の４を褐色半固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、純粋な生成物４（０．２ｇ、７０．０％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  7.74-7.74  ppm  (3H,  d,  J=1.2  Hz),  7.39-7.36  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=1.6  Hz),  7.66-7.64  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  5.31  ppm  (1H,  S),  5.26  (1H,  s).
【０３７３】
９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボン酸、５。
【０３７４】
ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボニトリル（４）（０．４０ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、１５％ＮａＯＨ水溶液（５ｍＬ、１８．２４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた反応混合物を６０℃で１６時間撹拌した。室温に冷却した後、過剰のＭｅＯＨを減圧下で除去し、得られた混合物を氷冷水（５０ｍＬ）に注ぎ入れた。この水溶液のｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌを使用して約２に調整し、得られた残留物を濾過によって収集して、粗製の５（０．３０ｇ、６５．３％）を白色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。1H  NMR  (400  MHz,  MeOD)  δ  8.12  ppm  (3H,  d,  J=1.2  Hz),  7.79-7.77  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz,  J=1.6  Hz),  7.58-7.56  ppm  (3H,  d,  J=4  Hz),  5.832ppm  (2H,  S);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ２６Ｏ６［ＭＨ］−の計算値  ３８５．０７、実測値  ３８５．１。
【０３７５】
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）カルバメート、２ａ。
【０３７６】
０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＮ１−（３−アミノプロピル）−Ｎ１−メチルプロパン−１，３−ジアミン（５ｇ、３８．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ無水物（１．５０ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、得られた混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れた。水性混合物を酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、純粋な２ａ（１．３ｇ、１５．４％）を無色油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  d6-DMSO)  δ  6.80-6.79  ppm    (1H,  d,  J=4  Hz),  3.17  (3H,  broad  s)  2.94-2.89ppm  (2H,  dd,  J=12.4,  6  Hz),  2.51  ppm  (2H,  broad  s),  2.28-2.21ppm  (4H,  m),  2.08-2.07  (2H,  d,  J=4  Hz),  1.50-1.44  ppm  (4H,  m),  1.37  (9H,  s);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ２６Ｎ２Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ２４６．２１、質量の応答は認められない。
【０３７７】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（３−（（３−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、６。
【０３７８】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（３−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）カルバメート（２ａ）（０．７１ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボン酸（０．３５ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．１ｇ、２．９１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１．０ｍＬ、５．８２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の６を褐色油状物として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な生成物６（０．２ｇ、２０．７％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  d6-DMSO)  δ  8.40-8.37  (3H,  t,  J=5.2  Hz),  7.93  (3H,  s)  7.55-7.49ppm  (6H,  dd,  J=16,  7.6  Hz  ),  6.78  ppm  (3H,  broad  s),  5.87  ppm  (2H,  broad  s),  3.23-3.21  ppm  (6H,  m),    2.93-2.90  (6H,  m),  2.30-2.22  (12H,  m),  1.61-1.58  (6H,  m),  1.50-1.46  (6H,  m),  1.31  (27H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５９Ｈ８９Ｎ９Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０６８．６８、実測値  １０６８．９。
【０３７９】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０３８０】
（Ａ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）で、１５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８  ２５０ｍｍ×１９ｍｍ、５．０μＭを使用：
【表１３】
2019511562.tif 000033
【０３８１】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（３−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、ＡＲＫ−７。
【０３８２】
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のＮ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（３−（（３−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノプロピル）（メチル）アミノ）プロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド（６）（０．２ｇ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、ＡＲＫ−７の純粋な塩酸塩（０．０７２ｇ、５０．３％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.70  ppm  (3H,  s),  7.42-7.40  ppm  (3H,  d,  J=7.6  Hz),  7.34-7.32  ppm  (3H,  d,  J=  8  Hz),  5.73  ppm  (1H,  s),  5.71  (1H,  s),  3.34-3.30  ppm  (6H,  t),  3.23-3.03  ppm  (12H,  m),  2.97-2.93  ppm  (6H,  t),  2.76  ppm  (9H,  s),  2.06-1.92  ppm  (12H,  m),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ６５Ｎ９Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７６８．５２、実測値  ７６８．７。ＨＰＬＣ保持時間：４．２７７分。
【０３８３】
（実施例１０）
ＡＲＫ−８（Ａｒｋ０００００１４）の合成
【化２３】
2019511562.tif 000034
ＡＲＫ−８を、上記のＡＲＫ−７のための方法に従って合成して、中間体５を得た。次いで、これを以下の中間体２ａとカップリングさせ、下記の通りにＡＲＫ−８に変換した。
【０３８４】
ｔｅｒｔ−ブチル（７−アミノヘプチル）カルバメート、２ａ。
【０３８５】
０℃のＴＨＦ（１０ｍＬ）中のヘプタン−１，７−ジアミン（５ｇ、３８．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ無水物（１．６８ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＴＨＦを減圧下で除去し、得られた混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れた。水性混合物を酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、純粋な２ａ（１ｇ、１１．３％）を無色油状物として得た。1H  NMR  (400  MHz,  CDCl3)  δ  6.80-6.77  (1H,  t,  J=5.2  Hz),  2.91-2.85  (2H,  dd,  J=13.2,  6.8  Hz)  2.55-2.44ppm  (2H,  m),  1.36  ppm  (11H,  s),  1.31ppm  (4H,  s),  1.23  (6H,  s),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ２６Ｎ２Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ２３１．２０、実測値  ２３１．５。
【０３８６】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（７−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノヘプチル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、６。
【０３８７】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（７−アミノヘプチル）カルバメート（２ａ）（０．５１ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボン酸（０．２７ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．８５、２．２４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．７７ｍＬ、４．４７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を水（５０ｍＬ）に注ぎ入れ、ジクロロメタン（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４を使用して乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗製の６を褐色半固体として得た。粗混合物をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（０．５％ＭｅＯＨ／クロロホルム）により精製して、純粋な生成物６（０．６５ｇ、９１．５％）を薄黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  8.34-8.32    (3H,  d,  J=8.8  Hz),  7.93  (3H,  s)  7.53  ppm  (6H,  s),  6.75  ppm  (3H,broad  s),  5.87  ppm  (1H,  s),  5.76  ppm  (1H,  s),    3.20-3.14  (6H,  d,  J=  24  Hz),  2.29  (6H,  s),  1.37  (27H,  s),  1.25-1.24  (30H,  m),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５９Ｈ８６Ｎ６Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０２３．６５、実測値  １０４５．５（Ｍ＋２３）。
【０３８８】
Ｎ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（７−アミノヘプチル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド、ＡＲＫ−８。
【０３８９】
１，４−ジオキサン（５ｍＬ）中のＮ２，Ｎ７，Ｎ１５−トリス（７−ｔｅｒｔ−ブチルカルボニルアミノヘプチル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリカルボキサミド（６）（０．７ｇ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（３ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、ＡＲＫ−８の粗塩酸塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８＿ＨＣｌ塩（０．２ｇ、４０．５％）を白色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.62  ppm  (3H,  broad  s),  7.13ppm  (3H,broad  s),  7.01  ppm  (3H,  broad  s),  5.53ppm  (1H,  S),  5.2  (1H,  s),  2.92ppm  (6H,  broad  s),  2.60ppm  (6H,  broad  s),  1.22ppm  (6H,  broad  s),  1.07ppm  (6H,  broad  s),  0.76ppm  (6H,  broad  s),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ４４Ｈ６２Ｎ６Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７２４．０、実測値  ７２３．６。ＨＰＬＣ保持時間：４．９４７分。
【０３９０】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０３９１】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣ  ＧＲ）で、２２．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＳＥＬＥＣＴフルオロフェニルカラム  ２５０×１９ｍｍ、５．０μＭを使用：
【表１４】
2019511562.tif 000035
【０３９２】
（実施例１１）
ＡＲＫ−９（Ａｒｋ００００１５）、ＡＲＫ−１０（Ａｒｋ００００１６）、ＡＲＫ−１１（Ａｒｋ００００１７）およびＡＲＫ−１２（Ａｒｋ００００１８）の合成
【化２４】
2019511562.tif 000036
【化２５】
2019511562.tif 000037
ＡＲＫ−９は、化合物２を介して上記のＡＲＫ−７と同様に調製した。したがって、化合物２を下記の通りにＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨとカップリングさせ、次いで脱保護して、ＡＲＫ−９を得た（Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨに置き換えることにより、ＡＲＫ−１０（Ａｒｋ００００１６）を同様に得た）。同様のやり方で、保護されたＬまたはＤ−Ｈｉｓアミノ酸とカップリングさせることによりＡＲＫ−１１（Ａｒｋ００００１７）およびＡＲＫ−１２（Ａｒｋ００００１８）を得た。
【０３９３】
ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｓ，５’Ｓ，５’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート、３。
【０３９４】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．１ｇ、０．３３４４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．３７ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．４０６、１．０７ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２５８ｇ、２．００６ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。得られた反応混合物を氷冷水に注ぎ入れた。得られた固体沈殿物を濾過により収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３（０．３８ｇ、８８．５７％）を白色固体として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ１０１Ｎ９Ｏ１５［ＭＨ］＋の計算値  １２８３．７４、実測値  １１８５．０（Ｍ−１００）。
【０３９５】
（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２，６−ジアミノヘキサンアミド）、ＡＲＫ−９。
【０３９６】
前ステップから得た粗生成物、ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｓ，５’Ｓ，５’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート（３）（０．３ｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ中に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−９塩酸塩を白色固体として得た。粗生成物を、以下に示す方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、ＡＲＫ−９の純粋な塩（０．１９ｇ、４６．９１％）を白色固体として得た。ＡＲＫ−９の純粋な塩をＤＭ水（４ｍＬ）に溶解し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基（０．１５ｇ）を白色固体として得た。遊離塩基（０．０５ｇ）を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）で処理し、物質を凍結乾燥して、ＡＲＫ−９の塩酸塩（０．０５ｇ、８３．３３％）を白色固体として生成した。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.56-7.55  ppm  (3H,  d,  J=1.6  Hz),  7.41-7.39  ppm  (3H,  d,  J=8.0  Hz),  7.01-6.99  ppm  (H,  dd,  J=8  Hz,  J=1.6  Hz),  5.62  ppm  (1H,  S),  5.59  ppm  (1H,  s),  4.01-3.98  ppm  (3H,  t),  2.88-2.84  ppm  (6H,  t),  1.90-1.86  ppm  (6H,  m),  1.61-1.57  ppm  (6H,  3),  1.40-1.36  ppm  (6H,  m),ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２７Ｎ５Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ６８４．４、実測値  ６８４．７。ＨＰＬＣ保持時間：５．０９２分。
【０３９７】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０３９８】
（Ａ）水中０．１％ＴＦＡおよび（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣグレード）で、１２．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＳＥＬＥＣＴフルオロフェニルカラム  ２５０×１９ｍｍ、５．０μｍを使用：
【表１５】
2019511562.tif 000038
【０３９９】
ＡＲＫ−１０（Ａｒｋ００００１６）の合成：
【０４００】
ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｒ，５’Ｒ，５’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート、３。
【０４０１】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．３ｇ、１．００ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（１．１ｇ、３．２１０ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．２ｇ、３．２１０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．７７４ｇ、６．００ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を室温で６０分間撹拌した。得られた反応混合物を氷冷水に注ぎ入れた。得られた固体沈殿物を濾過により収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な３（０．２５ｇ、１９．５３％）を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ１０１Ｎ９Ｏ１５［ＭＨ］＋の計算値  １２８３．７４、実測値  １１８５．０（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個の脱保護）。
【０４０２】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４０３】
（Ａ）水中１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）ＡＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣ  ＧＲ）で、２８．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＢＲＩＤＧＥ  ２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１６】
2019511562.tif 000039
【０４０４】
（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２，６−ジアミノヘキサンアミド）、ＡＲＫ−１０。
【０４０５】
前ステップから得た粗生成物、ヘキサ−ｔｅｒｔ−ブチル（（５Ｒ，５’Ｒ，５’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（６−オキソヘキサン−６，１，５−トリイル））ヘキサカルバメート（３）（０．２５ｇ、０．１９４７ｍｍｏｌ）を、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ中に懸濁させ、室温で２時間撹拌した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１０塩酸塩を白色固体として得た。粗生成物を、以下に示す方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、ＡＲＫ−１０の純粋な塩（０．１４ｇ、２６．４１％）を白色固体として得た。ＡＲＫ−１０の純粋な塩をＤＭ水（４ｍＬ）に溶解し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基（０．０７ｇ）を白色固体として得た。遊離塩基（０．０７ｇ）を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）で処理し、凍結乾燥して、ＡＲＫ−１０の塩酸塩（０．０８５ｇ、９２．３９％）を薄褐色固体として生成した。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  7.54-7.53  ppm  (3H,  d,  J=2  Hz),  7.38-7.36  ppm  (3H,  d,  J=8.0  Hz),  6.99-6.97  ppm  (3H,  dd,  J=8  Hz,  J=2  Hz),  5.60  ppm  (1H,  S),  5.56  (1H,  s),  3.99-3.96  ppm  (3H,  t),  2.86-2.82  ppm  (6H,  t),  1.89-1.82  ppm  (6H,  m),  1.61-1.53  ppm  (6H,  m),  1.40-1.34  ppm  (6H,  m).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ２７Ｎ５Ｏ２［ＭＨ］＋の計算値  ６８４．４、実測値  ６８４．６。ＨＰＬＣ保持時間：６．３９３分。
【０４０６】
分取ＨＰＬＣの方法：
【０４０７】
（Ａ）水中０．１％ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ：ＩＰＡ（６５：２５：１０）（ＨＰＬＣ  ＧＲ）で、１５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ  ＳＥＬＥＣＴ  ＰＦＰ  Ｃ１８、２５０×１９ｍｍ、５ｕｍを使用：
【表１７】
2019511562.tif 000040
【０４０８】
ＡＲＫ−１１およびＡＲＫ−１２の合成。
【０４０９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート。
【０４１０】
ＤＭＦ（６ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（０．８２ｇ、３．２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．２２ｇ、３．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．８ｇ、６．２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、得られた残留物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３（０．６５ｇ、６５％）を薄褐色固体として得、これを精製することなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０１１．１５、実測値  １０１１．９。
【０４１１】
（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２−アミノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパンアミド）塩酸塩、ＡＲＫ−１１＿ＨＣｌ塩。
【０４１２】
ジクロロメタン（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（３）（０．６５ｇ、０．６４３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ）を０℃で添加した。得られた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１１を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な生成物、ＡＲＫ−１１＿ＴＦＡ塩（０．３２ｇ、６４．４２％）を無色粘性油状物として得た。ＡＲＫ−１１＿ＴＦＡ塩をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した。これに、ポリマー結合テトラアルキルアンモニウムカーボネートおよび得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物をセライトに通して濾過し、得られた濾液を減圧下で濃縮して、ＡＲＫ−１１＿遊離塩基を得た。遊離塩基を０．０１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を凍結乾燥して、純粋なＡＲＫ−１１＿ＨＣｌ塩（０．１６ｇ、６１．０６％）を白色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  8.56  ppm  (3H,  s),  7.51  ppm  (3H,  s),  7.39-7.31  ppm  (6H,  m),  6.93-6.91  ppm  (3H,  s),  5.61-5.58  ppm  (2H,  s),  4.26  ppm  (3H,  s),  3.36-3.34  ppm  (6H,  m),  3.21  ppm  (2H,  s);ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ３８Ｎ１２Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７１０．８、実測値  ７１２．２。ＨＰＬＣ保持時間：５．７７０分。
【０４１３】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４１４】
（Ａ）水中０．１％ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）アセトニトリル中１０％ＩＰＡ（ＨＰＬＣグレード）で、３５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１８】
2019511562.tif 000041
【０４１５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート。
【０４１６】
ＤＭＦ（６ｍＬ）中の９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリアミン（２）（０．２５ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ−Ｄ−ヒスチジン（０．６８ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．０１ｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．６９ｇ、５．３５ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、得られた残留物を濾過によって収集し、減圧下で乾燥させて、粗製の３（０．７５ｇ、８８．９％）を白色固体として得、これを精製することなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １０１１．４８、実測値  １０１１．６。
【０４１７】
（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（２−アミノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロパンアミド）塩酸塩、ＡＲＫ−１２＿ＨＣｌ塩。
【０４１８】
ジクロロメタン（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｓ，２’Ｓ，２’’Ｓ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（３）（０．７５ｇ、０．７４２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジオキサン中４Ｎ  ＨＣｌ（５ｍＬ）を０℃で添加した。得られた反応混合物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な生成物、ＡＲＫ−１２＿ＴＦＡ塩（０．７０ｇ、７２．５３％）を白色固体として得た。ＡＲＫ−１２の純粋な塩をＤＭ水（４ｍＬ）に溶解し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲＡ−４００  −ＯＨ形イオン交換樹脂に通過させた。遊離塩基を、ＤＭ水を使用して溶出し、収集した画分を凍結乾燥して、遊離塩基（０．０６ｇ）を白色固体として得た。遊離塩基（０．０６ｇ）を１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（３ｍＬ）に溶解し、物質を凍結乾燥して、ＡＲＫ−１２の塩酸塩（０．０７ｇ、１０．１６％）を白色固体として生成した。1H  NMR  (400  MHz,  D2O)  δ  8.54  ppm  (3H,  s),  7.50  ppm  (3H,  s),  7.37-7.35  ppm  (3H,  d,  J=8  Hz),  7.28  ppm  (3H,  S),  6.90-6.88  ppm  (3H,  dd,  J=7.6  Hz),  5.59  ppm  (1H,  s),  5.56  ppm  (1H,  s),  4.25-4.22  ppm  (3H,  t,  J=7.2  Hz  ),  3.33-3.31  ppm  (6H,  d,  J=7.2  Hz).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ３８Ｈ３８Ｎ１２Ｏ３［ＭＨ］＋の計算値  ７１１．３２、実測値  ６８４．６。ＨＰＬＣ保持時間：６．３４７分。
【０４１９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４２０】
水中０．１％ＴＦＡ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）アセトニトリル中１０％ＩＰＡ（ＨＰＬＣグレード）で、３５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表１９】
2019511562.tif 000042
【０４２１】
（実施例１２）
ＡＲＫ−７７およびＡＲＫ−７７Ａ（Ａｒｋ００００３３およびＡｒｋ００００３４）の合成
【化２６】
2019511562.tif 000043
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０４２２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中のＡＲＫ−２０（２．０ｇ、８．６１４ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（２．３４ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２．６２ｇ、６．８９ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．３３ｇ、２５．８４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（３．５ｇ、９１．６％）を褐色半固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５５６．２１、実測値  ５７３．４３（Ｍ＋１８、水付加体）。
【０４２３】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０４２４】
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート（１０）（３．５ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３．１５ｍＬ、３１．５２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（４．３ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ２５Ｎ７Ｏ６Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ４５６．１６、実測値  ４５６．３２。
【０４２５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０４２６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（１．２５ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（２．０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．８３３ｇ、２．１９２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．９４２ｇ、７．３１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（３．２％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（２．３ｇ、８２．１７％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７９Ｈ１１３Ｎ１３Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５３２．８１、実測値  １４３３．１９（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４２７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０４２８】
アセトニトリル（３０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（２．２ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．９９ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．４４ｍＬ、４．３１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（１．１ｇ、５６．８８％）を薄黄色固体として得た。黄色固体を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）精製、続いて凍結乾燥にさらに供して、純粋な１３（０．４１ｇ、５２．１７％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１１０Ｎ１２Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３４７．８４、実測値  １３４９．２８。
【０４２９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４３０】
（Ａ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）水（ＨＰＬＣグレード）中１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、以下の流速および勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表２０】
2019511562.tif 000044
【化２７】
2019511562.tif 000045
【０４３１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４３２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２ｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ｂ）（０．０３９ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０６８ｇ、０．１７８ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３８ｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）により精製し、続いて凍結乾燥して、１４（０．１２ｇ、５２．１７％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８３Ｈ１１５Ｎ１３Ｏ１６［ＭＨ］＋の計算値  １５５０．８６、実測値  １４５２．４２（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４３３】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４３４】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２１】
2019511562.tif 000046
【０４３５】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７７＿ＨＣｌ塩。
【０４３６】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０７９ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（１．５ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。この間に、固体残留物が析出し始めた。懸濁液を３０分間さらに撹拌し、最後に室温で静置した。固体残留物がフラスコの底に堆積し始めた。溶媒をデカントし、残った残留物をアセトニトリル（３×３ｍＬ）で摩砕した。最後に、固体を減圧下、２５℃で乾燥させて、純粋なＡＲＫ−７７＿ＨＣｌ＿塩（０．０５４ｇ、６９．２８％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.91  ppm  (3H,  broad),  8.09-8.03  ppm  (1H,  m),  7.90  ppm  (8H,  broad),  7.67  ppm  (3H,  broad),  7.37-7.33  ppm  (2H,  m),  7.29-7.27  ppm  (3H,  m),  7.23  ppm  (3H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.01  ppm  (1H,  m),  4.86-4.79  ppm  (1H,  m),  4.31-4.23  ppm  (1H,  m),  4.09  ppm  (1H,  m),  3.79-3.64  ppm  (4H,  m),  3.48  ppm  (14H,  m),  3.44-3.40  ppm  (4H,  m),  3.18  ppm  (1H,  s),  3.08-3.01  ppm  (6H,  m),  2.77-2.66  ppm  (7H,  m),  2.25  ppm  (6H,  broad  s),  1.53  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ９１Ｎ１３Ｏ１０［ＭＨ］＋の計算値  １２５０．７０、実測値  １２５１．４８。
【化２８】
2019511562.tif 000047
【０４３７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４３８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１５６ｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ａ）（０．０２９ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０５３ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３ｇ、０．２３２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な１４（０．０９３ｇ、５２．１７％）を白色アモルファス粉末として得た。分取画分を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８２Ｈ１１３Ｎ１３Ｏ１６［ＭＨ］＋の計算値  １５３６．８４、実測値  １４３７．４１（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４３９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４４０】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、以下の流速および以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２２】
2019511562.tif 000048
【０４４１】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７７Ａ＿ＨＣｌ塩。
【０４４２】
１，４−ジオキサン（乾燥）（３ｍｌ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０６ｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１．２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。固体物質はフラスコの底で安定しており、溶媒を不活性雰囲気下でデカントし、次いで固体物質をアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）（３×３ｍＬ）で摩砕した。残った固体を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮して、純粋なＡＲＫ−７７Ａ＿ＨＣｌ＿塩（０．０５４ｇ、６９．２８％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  12.04-11.95  ppm  (1H,  d),  9.91  ppm  (3H,  broad),  7.98-7.96  ppm  (1H,  m),  7.89  ppm  (7H,  broad),  7.71-7.67  ppm  (3H,  broad),  7.29-7.27  ppm  (4H,  d),  7.23  ppm  (3H,  broad),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.03-5.01  ppm  (1H,  m),  4.86-4.79  ppm  (1H,  m),  4.30-4.23  ppm  (1H,  m),  4.07  ppm  (1H,  m),  3.76  ppm  (1H,  m),  3.35-3.44  ppm  (2H,  m),  3.17  ppm  (1H,  s),  3.08-3.04  ppm  (5H,  m),  2.99-2.84  ppm  (1H,  m),  2.79-2.68  ppm  (7H,  m),  2.25-2.23  ppm  (6H,  t),  1.53  ppm  (12H,  broad),  1.27  ppm  (18H,  broad).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６７Ｈ８９Ｎ１３Ｏ１０［ＭＨ］＋の計算値  １２３６．６９、実測値  １２３８．４６。
【０４４３】
（実施例１３）
ＡＲＫ−７８およびＡＲＫ−７８Ａ（Ａｒｋ００００３５およびＡｒｋ００００３７）の合成
【化２９】
2019511562.tif 000049
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０４４４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中のＡＲＫ−２１（２．４ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（２．９６ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（３．９６ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．３６ｇ、２６．０５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（４．０ｇ、７６．９％）を黄色粘性液体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２４Ｈ３７Ｎ７Ｏ９  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６００．１８、実測値  ６１７．５（Ｍ＋１８）。
【０４４５】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０４４６】
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（１０）（４．０ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（２．５８ｍＬ、３３．３８ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（７．５ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１９Ｈ２９Ｎ７Ｏ７  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５００．１８、実測値  ５００．３１。
【０４４７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０４４８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（２．６９ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（４．０ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．６７ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．４１ｇ、１０．９６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（４．３％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（４．７ｇ、８１．６％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８１Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５７６．８４、実測値  １５７８．４。
【０４４９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０４５０】
アセトニトリル（５０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（４．７ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２．０６ｇ、１４．９１ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．９２ｍＬ、８．９５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（１．９ｇ、４５．８％）を薄黄色固体として得た。黄色固体を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）精製、続いて凍結乾燥にさらに供して、純粋な１３（０．３４ｇ、８．２％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １３９１．８６、実測値  １３９２．３。
【０４５１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４５２】
（Ａ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）水（ＨＰＬＣグレード）中１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、３０．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表２３】
2019511562.tif 000050
【化３０】
2019511562.tif 000051
【０４５３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４５４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチルトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１４ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ｂ）（０．０２７ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０４６ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０２６ｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．１ｇ、６２．５％）を薄黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ１３Ｏ１７［ＭＨ］＋の計算値  １５９４．８８、実測値  １４９６．６１（Ｍ−１００）。
【０４５５】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７８＿ＨＣｌ塩。
【０４５６】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０６７ｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（１．５ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。この間に、固体残留物が析出し始めた。懸濁液を３０分間さらに撹拌し、最後に室温で静置した。固体残留物がフラスコの底に堆積し始めた。溶媒をデカントし、残った残留物をアセトニトリル（３×３ｍＬ）で摩砕した。最後に、固体を減圧下、２５℃で乾燥させて、純粋なＡＲＫ−７８＿ＨＣｌ＿塩（０．０４５ｇ、７６．３％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.91  ppm  (3H,  broad  s),  8.11-7.97  ppm  (1H,  m),  7.89  ppm  (8H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.37-7.34  ppm  (2H,  broad  s),  7.29-7.22  ppm  (6H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  4.97  ppm  (1H,  m),  4.82  ppm  (1H,  m),  4.28  ppm  (2H,  m),  4.03  ppm  (1H,  m),  3.74  ppm  (1H,  m),  3.64  ppm  (3H,  broad  s),  3.57  ppm  (12H,  broad  s),  3.50-3.47  ppm  (5H,  m),  3.15-3.03  ppm  (7H,  m),  2.90-2.85  ppm  (2H,  d),  2.75-2.72  ppm  (7H,  m),  2.25-2.23  ppm  (6H,  broad  s),  1.54  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (17H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７０Ｈ９５Ｎ１３Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  １２９４．７３、実測値  １２９５．４１。
【化３１】
2019511562.tif 000052
【０４５７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４５８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．０７５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ａ）（０．０１３ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０２４ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１４ｇ、０．１０８ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な１４（０．０４ｇ、５２％）を白色アモルファス粉末として得た。分取画分を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７［ＭＨ］＋の計算値  １５８０．８８、実測値  １４８１．７５（Ｍ−１００）。
【０４５９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４６０】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１６．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２４】
2019511562.tif 000053
【０４６１】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７８Ａ＿ＨＣｌ塩。
【０４６２】
１，４−ジオキサン（ＡＲグレード）（２ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０４ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。固体物質はフラスコの底で安定しており、溶媒を不活性雰囲気下でデカントし、固体物質をアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）（３×３ｍＬ）で摩砕した。残った固体を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮して、純粋なＡＲＫ−７８Ａ＿ＨＣｌ＿塩（０．０３２ｇ、９１．４３％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  11.99-11.95  ppm  (1H,  t),  9.91-9.90  ppm  (3H,  d),  8.01-7.94  ppm  (1H,  m),  7.87  ppm  (8H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.32-7.22  ppm  (7H,  m),  7.16-7.11  ppm  (1H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  4.99-4.95  ppm  (1H,  t),  4.83-4.82  ppm  (1H,  m),  4.29-4.22  ppm  (1H,  m),  4.15-3.98  ppm  (1H,  m),  3.76-3.71  ppm  (1H,  m),  3.64-3.61  ppm  (4H,  m),  3.52  ppm  (2H,  broad  s),  3.34-3.32  ppm  (2H,  m),  3.15  ppm  (2H,  m),  3.10-3.03  ppm  (7H,  m),  2.89-2.86  ppm  (1H,  d),  2.76-2.72  ppm  (7H,  m),  2.26-2.23  ppm  (6H,  t),  1.53  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (17H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６９Ｈ９３Ｎ１３Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  １２８０．７１、実測値  １２８１．５０。
【０４６３】
（実施例１４）
ＡＲＫ−７９およびＡＲＫ−７９Ａ（Ａｒｋ００００３６およびＡｒｋ００００３８）の合成
【化３２】
2019511562.tif 000054
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート、１０。
【０４６４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中のＡＲＫ−２２（３．１ｇ、９．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（３．９６ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（４．４１４ｇ、１１．６２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．５ｇ、１９．３６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（４ｇ、６４．２％）を黄色固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２６Ｈ４１Ｎ７Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６４４．２６、実測値  ５４４．３６（Ｍ＋１８）。
【０４６５】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０４６６】
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート（１０）（３ｇ、４．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１．８ｍＬ、２３．３２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（３．１ｇ、定量的収率）を暗黄色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２１Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ５４４．２１、実測値  ５４４．４７。
【０４６７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０４６８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（２．８８ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（４．０ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．６７ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．３６ｇ、１８．２７ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（５．４％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（５．９ｇ、９９．７％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８３Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６２０．８７、実測値  １５２２．３１（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４６９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０４７０】
アセトニトリル（６０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（５．９ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２．５１ｇ、１８．２１ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（１．１１ｍＬ、１０．９３ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（１．９ｇ、３６．３％）を薄黄色固体として得た。黄色固体を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）精製、続いて凍結乾燥にさらに供して、純粋な１３（０．５１ｇ、９．８％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７７Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１４［ＭＨ］＋の計算値  １４３５．８９、実測値  １４３７．４１。
【０４７１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４７２】
（Ａ）水（ＨＰＬＣグレード）中１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）水中１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（ＨＰＬＣグレード）で、２２．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＧＲＡＣＥ  ＤＥＮＩＬ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×２５ｍｍ×５μｍを使用：
【表２５】
2019511562.tif 000055
【化３３】
2019511562.tif 000056
【０４７３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４７４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、１−メチル−２，４−ジオキソ−２，４−ジヒドロ−１Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ｂ）（０．０３９ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０１８ｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を分取ＨＰＬＣ（下記の方法）により精製し、続いて凍結乾燥して、１４（０．０５３ｇ、４６．５％）を白色アモルファス粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８７Ｈ１２３Ｎ１３Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  １６３８．９１、実測値  １５４０．４０（Ｍ−１００）。
【０４７５】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４７６】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２６】
2019511562.tif 000057
【０４７７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７９＿ＨＣｌ塩。
【０４７８】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０３５ｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。この間に、固体残留物が析出し始めた。懸濁液を３０分間さらに撹拌し、最後に室温で静置した。固体残留物がフラスコの底に堆積し始めた。溶媒をデカントし、残った残留物をアセトニトリル（３×３ｍＬ）で摩砕した。最後に、固体を減圧下、２５℃で乾燥させて、純粋なＡＲＫ−７９＿ＨＣｌ＿塩（０．０２５ｇ、８０．６％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.89  ppm  (3H,  broad  s),  8.10-8.08  ppm  (1H,  m),  7.89  ppm  (9H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.38-7.37  ppm  (1H,  d),  7.33-7.22  ppm  (6H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.95-4.90  ppm  (1H,  m),  4.25  ppm  (1H,  m),  4.06  ppm  (1H,  m),  3.75  ppm  (1H,  m),  3.63-3.57  ppm  (10H,  d),  3.38-3.33  ppm  (5H,  m),  3.10-3.04  ppm  (7H,  m),  2.88-2.84  ppm  (1H,  d),  2.74-2.72  ppm  (7H,  broad  s),  2.25-2.23  ppm  (6H,  t),  1.60-1.53  ppm  (12H,  d),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７２Ｈ９９Ｎ１３Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３３８．７５、実測値  １３３９．５５。
【化３４】
2019511562.tif 000058
【０４７９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４８０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２ｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）の溶液に、２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボン酸（弾頭＿タイプ＿１Ａ）（０．０３５ｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０６４ｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３６ｇ、０．２７９ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で３０分間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４を得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋な１４（０．０４ｇ、１７．７％）をオフホワイトのアモルファス粉末として得た。分取画分を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８６Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  １６２４．８９、実測値  １５２５．７６（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４８１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０４８２】
（Ａ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％テトラヒドロフラン（ＨＰＬＣグレード）で、１８．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配、すなわち、２０分間の９８％Ａおよび２％を用いるＳＵＮＦＩＲＥシリカ、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用。
【０４８３】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−７９Ａ＿ＨＣｌ塩。
【０４８４】
１，４−ジオキサン（乾燥）（３ｍｌ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−カルボニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０４ｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１．２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。固体物質はＲＢＦの底で安定しており、溶媒を不活性雰囲気下でデカントし、固体物質をアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）（３×３ｍＬ）で摩砕した。残った固体を窒素雰囲気下、２５℃で減圧により濃縮して、純粋なＡＲＫ−７９Ａ＿ＨＣｌ＿塩（０．０３３ｇ、９４．２８％）をオフホワイトのアモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  11.97-11.95  ppm  (1H,  d),  9.90  ppm  (3H,  broad  s),  8.02-7.98  ppm  (1H,  m),  7.88  ppm  (8H,  broad  s),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.32-7.22  ppm  (7H,  m),  7.16-7.08  ppm  (1H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  4.96-4.91  ppm  (1H,  m),  4.80  ppm  (1H,  m),  4.28-4.20  ppm  (1H,  m),  4.05  ppm  (1H,  m),  3.75-3.73  ppm  (1H,  m),  3.64  ppm  (3H,  broad  s),  3.57  ppm  (11H,  broad  s),  3.54  ppm  (2H,  m),  3.39-3.38  ppm  (2H,  m),  3.34-3.32  ppm  (3H,  d),  3.16  ppm  (2H,  broad  s),  3.08-3.02  ppm  (8H,  m),  2.87-2.83  ppm  (1H,  d),  2.76-2.68  ppm  (7H,  m),  2.27-2.23  ppm  (6H,  t),  1.60-1.53  ppm  (12H,  broad  s),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７１Ｈ９７Ｎ１３Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３２４．７４、実測値  １３２５．５０。
【０４８５】
（実施例１５）
ＡＲＫ−８０、ＡＲＫ−８９、ＡＲＫ−１２５（Ａｒｋ００００２４、Ａｒｋ００００２７およびＡｒｋ００００３０）の合成
【化３５】
2019511562.tif 000059
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０４８６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中のＡＲＫ−２０（１．０ｇ、４．３０７ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（１．１７ｇ、３．４４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．９６ｇ、５．１７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．６７ｇ、１２．９２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（２．５２ｇ、定量的収率）を褐色半固体として得た。粗混合物をさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２２Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５５６．２１、実測値  ５７３．４３（Ｍ＋１８）。
【０４８７】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０４８８】
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のトリｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート（１０）（２．５ｇ、４．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１．７２ｍＬ、２２．５１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（４．１２ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ２５Ｎ７Ｏ６Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ４５６．１６、実測値  ４５６．３２。
【０４８９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０４９０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３０ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（１．７５ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（２．８ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．１７ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６６ｇ、５．１２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（１．５％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（１．４８ｇ、３７．８％）を暗黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７９Ｈ１１３Ｎ１３Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５３２．８１、実測値  １４３３．１９（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４９１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０４９２】
アセトニトリル（１５ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（１．４８ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．６７ｇ、４．８３ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．３ｍＬ、２．８９ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（０．７６ｇ、５８．４％）を薄黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１１０Ｎ１２Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３４７．８４、実測値  １３４９．２８。
【化３６】
2019511562.tif 000060
【０４９３】
ペルフルオロフェニル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート、中間体−Ａ。
【０４９４】
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の弾頭−２（０．０４ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．０３５ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、０℃で添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中のペンタフルオロフェノール（０．０３ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、０℃で滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間さらに撹拌した。反応混合物を、後処理および単離をすることなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ８Ｆ５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ４１８．０３、この化合物は質量の応答を示さなかった。注記：中間体−Ａを単離せず−  反応塊をそのまま次のステップの反応塊に移した。
【０４９５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０４９６】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２７ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ペンタフルオロフェニル［（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−イル）オキシ］アセテート（弾頭＿タイプ＿２）（０．０７１ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の１４（０．３８ｇ、定量的収率）を黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７［ＭＨ］＋の計算値  １５８０．８７、実測値  １４８２．２９（Ｍ−１００；Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０４９７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８０＿ＨＣｌ塩。
【０４９８】
テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．３８ｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８０＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８０＿ＨＣｌ塩（０．０１２ｇ、３．６％）を白色アモルファス粉末として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.93-9.91  ppm  (3H,  broad  s),  7.92-7.85  ppm  (10H,  broad  s),  7.65  ppm  (4H,  broad  s),  7.40  ppm  (2H,  broad  s),  7.27-7.15  ppm  (8H,  m),  6.87-6.71  ppm  (3H,  m),  6.54  ppm  (1H,  s),  5.36  ppm  (1H,  s),  5.10-5.02  ppm  (3H,  m),  4.83  ppm  (2H,  m),  4.66-4.56  ppm  (2H,  m),  4.39-4.28  ppm  (2H,  m),  4.06-4.01  ppm  (2H,  m),  3.58-3.55  ppm  (4H,  m),  3.47-3.41  ppm  (7H,  m),  3.13-2.94  ppm  (9H,  m),  2.71-2.66  ppm  (8H,  m),  2.22  ppm  (7H,  broad  s),    1.52-1.50  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６９Ｈ９３Ｎ１３Ｏ１１［ＭＨ］＋の計算値  １２８０．７１、実測値  １２８１．４３。
【０４９９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５００】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＢＲＩＤＧＥ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２７】
2019511562.tif 000061
【化３７】
2019511562.tif 000062
【０５０１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５０２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３１ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパン酸（０．０４３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０７０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０３６ｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．４５ｇ、定量的収率）を暗黄色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８２Ｈ１１７ＦＮ１２Ｏ１５Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５６１．８５、実測値  １４６３．４５（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５０３】
Ｎ，Ｎ’Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８９＿ＨＣｌ塩。
【０５０４】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．４５ｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加した。得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８９＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８９＿ＨＣｌ塩（０．０５３ｇ、１２．８％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.95  ppm  (3H,  broad  s),  8.03-7.95  ppm  (10H,  m),  7.67-7.62  ppm  (5H,  m),  7.28-7.21  ppm  (6H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.77    ppm  (0.5H,  m),  4.59-4.49  ppm  (1H,  m),  4.31-4.21  ppm  (1H,  m),  4.02-3.96  ppm  (2H,  m),  3.62-3.44  ppm  (6H,  m),  3.22-3.03  ppm  (8H,  m),  2.98-2.88  ppm  (4H,  m),  2.74-2.60  ppm  (10H,  m),  2.24-2.23  ppm  (7H,  t),  1.53-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６７Ｈ９３ＦＮ１２Ｏ９Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １２６１．７０、実測値  １２６２．３１。
【０５０５】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５０６】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  ＦＰ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２８】
2019511562.tif 000063
【化３８】
2019511562.tif 000064
【０５０７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５０８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３０ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニル安息香酸（０．０５４ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．１０１ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０７９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．３８８ｇ、定量的収率）を黄色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８０Ｈ１１３ＦＮ１２Ｏ１５Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５３２．８１、実測値  １４３４．３５（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５０９】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−１２５＿ＨＣｌ塩。
【０５１０】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．３８ｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２５＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−１２５＿ＨＣｌ＿塩（０．１１０ｇ、３３．０％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.96-9.93  ppm  (3H,  broad  s),  8.24-8.21  ppm  (2H,  m),  7.97  ppm  (8H,  broad  s),  7.87-7.82  ppm  (2H,  m),  7.71-7.68  ppm  (3H,  m),  7.32-7.19  ppm  (6H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.05-5.01  ppm  (1H,  m),  4.87-4.80  ppm  (1H,  m),  4.30-4.20  ppm  (1H,  m),  3.89  ppm  (18H,  broad  s),  3.70-3.55  ppm  (5H,  m),  3.48-3.38  ppm  (3H,  m),  3.18  ppm  (1H,  s),  3.08-3.04  ppm  (6H,  m),  2.79-2.68  ppm  (7H,  m),  2.25  ppm  (6H,  broad  s),    1.54-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６５Ｈ８９ＦＮ１２Ｏ９Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １２３３．６５、実測値  １２３４．３４。
【０５１１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５１２】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  ＦＰ、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表２９】
2019511562.tif 000065
【０５１３】
（実施例１６）
ＡＲＫ−８１、ＡＲＫ−９０およびＡＲＫ−１２６（Ａｒｋ００００２５、Ａｒｋ００００２８およびＡｒｋ００００３１）の合成
【化３９】
2019511562.tif 000066
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エトキシ）エチル）（メチル）カルバメート、１０。
【０５１４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のＡＲＫ−２１（０．９ｇ、３．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（１．３３ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．４ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８５ｇ、６．５２ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（１．５ｇ、７８．９％）を褐色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２４Ｈ３７Ｎ７Ｏ９  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６００．１８、実測値  ６１７．５（Ｍ＋１８）。
【０５１５】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０５１６】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（２Ｒ，２’Ｒ，２’’Ｒ）−（（９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−１−オキソプロパン−１，２−ジイル））トリカルバメート（１０）（１．５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．９６ｍＬ、１２．５２ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（１．４ｇ、９１．５０％）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１９Ｈ２９Ｎ７Ｏ７  Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ５００．１８、実測値  ５００．３１。
【０５１７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０５１８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エトキシ）エチル）−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（０．５６ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（０．５ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（１．４４ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１２ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（１．５％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（０．６ｇ、８４．５％）を褐色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８１Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５７６．８４、実測値  １５７８．４。
【０５１９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０５２０】
アセトニトリル（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（０．６ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．２６ｇ、１．９０ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．１２ｍＬ、１．１４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（０．４ｇ、８４．９％）を薄黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ５３Ｈ６２Ｎ１２Ｏ９［ＭＨ］＋の計算値  １３９１．８６、実測値  １３９２．３。
【化４０】
2019511562.tif 000067
【０５２１】
ペルフルオロフェニル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート、中間体−Ａ。
【０５２２】
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の弾頭−２（０．０４８ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．０３７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、０℃で添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中のペンタフルオロフェノール（０．０３６ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、０℃で滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間さらに撹拌した。反応混合物を、後処理および単離をすることなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ８Ｆ５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ４１８．０３、この化合物は質量の応答を示さなかった。注記：中間体−Ａを単離せず−  反応塊をそのまま次のステップの反応塊に移した。
【０５２３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５２４】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中の（（（９−（３−（（２−（２−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチルピロリジン−２−カルボキサミド）エトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−オキソプロピル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．２７ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ペンタフルオロフェニル［（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−イル）オキシ］アセテート（弾頭＿タイプ＿２＿中間体＿Ａ）（０．０８１ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の１４（０．３ｇ、８０．２１％）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８６Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８［ＭＨ］＋の計算値  １６２３．８９、実測値  １５２５．４６（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５２５】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ塩。
【０５２６】
テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．３ｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ塩（０．０３４ｇ、１２．８％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ    9.94  ppm  (3H,  br  S),  7.79-7.86  ppm  (8H,  m),  7.66  ppm  (2H,  S),  7.43  ppm  (1H,  S),  7.31-7.18  ppm  (7H,  m),  6.88-6.82  ppm  (1H,  m),  6.78-6.76  ppm  (1H,  m),  5.38  ppm  (1H,  S),  5.11-5.02  ppm  (1H,  m),  4.80  ppm  (1H,  br  S),  4.36-4.31  ppm  (1H,  m),  4.03-4.01  ppm  (1H,  m),  3.62-3.42  ppm  (15H,  m),  3.37-3.26  ppm  (4H,  m),  3.16  ppm  (1H,  s),  3.05-2.99  ppm  (5H,  m),  2.89  ppm  (1H,  s),  2.81-2.71  ppm  (7H,  m),  2.24  ppm  (6H,  S),  1.53-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  S).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７１Ｈ９７Ｎ１３Ｏ１２［ＭＨ］＋の計算値  １３２３．７４、実測値  １３２５．４。
【０５２７】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５２８】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表３０】
2019511562.tif 000068
【化４１】
2019511562.tif 000069
【０５２９】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５３０】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．４ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパン酸（０．０７ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．１３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０８ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．４ｇ、８７％）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１２１ＦＮ１２Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６０５．８８、実測値  １５０６．５（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５３１】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−９０＿ＨＣｌ塩。
【０５３２】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．４ｇ、０．００２５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加した。得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−９０＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−９０＿ＨＣｌ塩（０．０３５ｇ、７．１１％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  9.89  ppm  (3H,  broad  s),  8.03-8.00  ppm  (2H,  t),  7.66-7.56  ppm  (5H,  m),  7.29-7.20  ppm  (6H,  m),  5.33  (1H,  s),  3.62-3.52ppm  (6H,  m)  3.49-3.44  ppm  (3H,  m),  3.44-3.02  ppm  (6H,  m),  3.05-2.99  ppm  (8H,  m),  2.93  ppm  (3H,  broad  s),2.76-2.70  ppm  (10H,  m),  2.23(6H,  s),  1.519  (14H,  s),  1.52  (21H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６８Ｈ９５ＦＮ１２Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １３０４．７２、実測値  １３０６．３。ＨＰＬＣ保持時間：１０．８９４分。
【０５３３】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５３４】
水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、３５．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＷＡＴＥＲＳ  Ｘ−ＢＲＩＤＧＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ×５μｍを使用：
【表３１】
2019511562.tif 000070
【化４２】
2019511562.tif 000071
【０５３５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５３６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．１ｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニル安息香酸（０．０１８ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０３３ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０１８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．１２ｇ、定量的収率）を黄色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８２Ｈ１１７ＦＮ１２Ｏ１６Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １５７７．８４、実測値  １４７８．４６（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５３７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−１２６＿ＨＣｌ塩。
【０５３８】
１，４−ジオキサン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１１−ジメチル−１，１２−ジオキソ−５，８−ジオキサ−２，１１−ジアザテトラデカン−１４−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．１２ｇ、０．０００７ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２６＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−１２６＿ＨＣｌ＿塩（０．０３ｇ、２８．５７％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  9.93-9.91  ppm  (3H,  broad  s),  8.26-8.13  ppm  (2H,  m),  7.87  ppm  (9H,  broad  s),  7.78-7.76  ppm  (1H,  d),  7.67  ppm  (3H,  broad  s),  7.29-7.22  ppm  (6H,  m),  5.39  ppm  (1H,  s),  5.010-4.969  ppm  (0.5H,  t),  4.86-4.82  ppm  (0.5H,  m),  4.72-4.60  ppm  (1H,  m),  4.44-4.36  ppm  (1H,  m),  4.30-4.21  ppm  (1H,  m),  4.14-4.00  ppm  (1H,  m),  3.64-3.61  ppm  (20H,  m)  3.48-3.37  ppm  (6H,  m),  3.19-3.11  ppm  (3H,  m),  3.07-3.03  ppm  (5H,  m),  2.89-2.84  ppm  (2H,  broad  s),  2.76  -2.68  ppm  (7H,  m),  2.26-2.23  ppm  (6H,  t),  1.53  ppm  (12H,  s),  1.27  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６７Ｈ９３ＦＮ１２Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １２７７．６８、実測値  １２７８．３５。
【０５３９】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５４０】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、１９．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＦＩＲＥ  Ｃ１８、１５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表３２】
2019511562.tif 000072
【０５４１】
（実施例１７）
ＡＲＫ−８２、ＡＲＫ−９１およびＡＲＫ−１２７（Ａｒｋ００００２６、Ａｒｋ００００２９およびＡｒｋ００００３２）の合成
【化４３】
2019511562.tif 000073
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート、１０。
【０５４２】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中のＡＲＫ−２２（０．４１ｇ、１．２８１ｍｍｏｌ）の溶液に、（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−カルボン酸（０．５２ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．５８４ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３３ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１０（０．８ｇ、９７．２％）を褐色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２６Ｈ４１Ｎ７Ｏ１０Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  ６４４．２６、実測値  ５４４．３６（Ｍ−１００）。
【０５４３】
（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩、１１。
【０５４４】
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２−メチル−１−オキソ−５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）（メチル）カルバメート（１０）（０．８ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．４８ｍＬ、６．２１ｍｍｏｌ）を室温で添加した。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、こうして収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１１（１．０５ｇ、定量的収率）を褐色油状物として得、これをさらに精製することなく使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ２１Ｈ３３Ｎ７Ｏ８Ｓ．ＴＦＡ［ＭＨ］＋の計算値  ５４４．２１、実測値  ５４４．４７。
【０５４５】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１２。
【０５４６】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍＬ）中の（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−Ｎ−メチル−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）−Ｎ−（５，８，１１−トリオキサ−２−アザトリデカン−１３−イル）ピロリジン−２−カルボキサミド＿ＴＦＡ塩（１１）（０．６５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（２，７，１５−トリス（８−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）プロパン酸（ＡＲＫ−１８）（０．９ｇ、０．８２２ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３７５ｇ、０．９８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水に注ぎ入れ、酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下で濃縮して、粗製の１２を得た。粗混合物をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（１．５％メタノール／クロロホルム）により精製して、１２（１．７２ｇ、定量的収率）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８３Ｈ１２１Ｎ１３Ｏ１８Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６２０．８７、実測値  １５２２．３１（Ｍ−１００）。
【０５４７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１３。
【０５４８】
アセトニトリル（６０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（（２−ニトロフェニル）スルホニル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１２）（０．７ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（０．２９ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）およびチオフェノール（０．１３ｍＬ、１．２９６ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。得られた反応混合物を８０℃で２時間撹拌した。反応混合物をセライトベッドに通して濾過し、収集した濾液を減圧下で濃縮して、粗製の１３を黄色油状物として得た。粗混合物を逆相クロマトグラフィーに供して、１３（０．３９ｇ、６２．９％）を薄黄色固体として得た。粗製物をｎ−ペンタンによる摩砕により精製して（未反応のチオフェノールを除去した）、１３（０．３９ｇ、６２．９％）を黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７７Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１４［ＭＨ］＋の計算値  １４３５．８９、実測値  １４３７．４１。
【化４４】
2019511562.tif 000074
【０５４９】
ペルフルオロフェニル２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセテート、中間体−Ａ。
【０５５０】
テトラヒドロフラン（１ｍＬ）中の弾頭−２（０．０５５ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．０４７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、０℃で添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌した。これに、テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）中のペンタフルオロフェノール（０．０４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、０℃で滴下添加した。得られた反応混合物を０℃で１時間さらに撹拌した。反応混合物を、後処理および単離をすることなく次のステップにおいて直接使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ１７Ｈ８Ｆ５ＮＯ６［ＭＨ］＋の計算値  ４１８．０３、この化合物は質量の応答を示さなかった。注記：中間体−Ａを単離せず−  反応塊をそのまま次のステップの反応塊に移した。
【０５５１】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５５２】
テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ペンタフルオロフェニル［（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンゾオキサジン−７−イル）オキシ］アセテート（弾頭＿タイプ＿２）（０．０８７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、得られた反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製の１４（０．５４ｇ、定量的収率）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８８Ｈ１２５Ｎ１３Ｏ１９［ＭＨ］＋の計算値  １６６８．９２、実測値  １５７０．４１（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５５３】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−８２＿ＨＣｌ塩。
【０５５４】
テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（２−（（１−メチル−２，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３］オキサジン−７−イル）オキシ）アセチル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．５４ｇ、０．００３２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を窒素雰囲気下で４時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−８２＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−８１＿ＨＣｌ塩（０．０４９ｇ、１０．２％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.95  ppm  (3H,  br  S),  7.99  ppm  (8H,  broad  s),  7.90-7.88  ppm  (2H,  d),  7.66  ppm  (3H,  broad  s),  7.46  ppm  (2H,  broad  s),  7.33  ppm  (2H,  broad  s),  7.28-7.25  ppm  (5H,  m),  7.23-7.21  ppm  (2H,  d),  6.89-6.85  ppm  (1H,  m),  6.78-6.76  ppm  (1H,  m),  6.55  ppm  (2H,  broad  s),  5.38  ppm  (1H,  s),  5.12-5.00  ppm  (2H,  m),  4.77  ppm  (1H,  m),  4.37-4.34  ppm  (3H,  m),  4.06-4.05  ppm  (1H,  m),  3.82  ppm  (1H,  m),  3.63-3.43  ppm  (15H,  m),  3.09-3.01  ppm  (7H,  m),  2.96-2.94  ppm  (1H,  d),  2.82-2.80  ppm  (1H,  d),  2.76-2.64  ppm  (7H,  m),  2.24  ppm  (7H,  broad  s),  1.54-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７３Ｈ１０１Ｎ１３Ｏ１３［ＭＨ］＋の計算値  １３６８．７６、実測値  １３７０．２５。
【０５５５】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５５６】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、２０．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＫＩＮＥＴＥＸビフェニル、２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ×５μｍを使用：
【表３３】
2019511562.tif 000075
【化４５】
2019511562.tif 000076
【０５５７】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５５８】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．３０ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパン酸（００．０５８ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０９５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０５４ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．５５ｇ、定量的収率）を褐色固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８６Ｈ１２５ＦＮ１２Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６４９．８９、実測値  １５５１．２９（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５５９】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−アミノオクタンアミド）、ＡＲＫ−９１＿ＨＣｌ塩。
【０５６０】
１，４−ジオキサン（９．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（３−（４−（フルオロスルホニル）フェニル）プロパノイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．５５ｇ、０．００３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（４ｍＬ）を室温で添加した。得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−９１＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−９１＿ＨＣｌ塩（０．０９ｇ、１８．５％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.94  ppm  (3H,  broad  s),  8.04-8.00  ppm  (2H,  m),  7.96  ppm  (6H,  broad  s),  7.66  ppm  (4H,  broad  s),  7.62-7.52  ppm  (1H,  m),  7.31-7.18  ppm  (6H,  broad  s),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.71-4.66  ppm  (1H,  m),  4.25  ppm  (9H,  m),  3.40-3.99  ppm  (1H,  m),  3.63-3.49  ppm  (9H,  m),  3.44-3.35  ppm  (5H,  m),  3.31-3.24  ppm  (2H,  m),  3.16-3.15  ppm  (2H,  m),  3.09-3.00  ppm  (6H,  m),  2.95-2.91  ppm  (3H,  m),  2.77-2.69  ppm  (7H,  m),  2.26-2.23  ppm  (6H,  t),  1.54-1.52  ppm  (12H,  d),  1.26  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ７１Ｈ１０１ＦＮ１２Ｏ１１Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １３４９．７４、実測値  １３５０．３８。
【０５６１】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５６２】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、２３．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＸ−ＳＥＬＥＣＴ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×３０ｍｍ、５μｍを使用：
【表３４】
2019511562.tif 000077
【化４６】
2019511562.tif 000078
【０５６３】
トリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート、１４。
【０５６４】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジドピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１３）（０．０５ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロスルホニル安息香酸（０．０９ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．０１６ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。反応混合物を５分間撹拌した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０９ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を滴下添加し、得られた反応混合物を室温で１時間さらに撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）により希釈し、氷冷水（３×３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、減圧下、２５℃で濃縮して、粗製の１４（０．０７５ｇ、定量的収率）を黄色半固体として得、これをさらに精製することなく次のステップにおいて使用した。ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ８４Ｈ１２１ＦＮ１２Ｏ１７Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １６２１．８７、実測値  １５２３．４７（Ｍ−１００、Ｂｏｃ基１個が脱落した）。
【０５６５】
４−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−２−（メチル（１２−メチル−１３−オキソ−１５−（２，７，１５−トリス（８−アミノオクタンアミド）−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−９（１０Ｈ）−イル）−３，６，９−トリオキサ−１２−アザペンタデシル）カルバモイル）ピロリジン−１−カルボニル）ベンゼンスルホニルフルオリド、ＡＲＫ−１２７＿ＨＣｌ塩。
【０５６６】
１，４−ジオキサン（３．０ｍＬ）中のトリ−ｔｅｒｔ−ブチル（（（９−（１−（（２Ｓ，４Ｓ）−４−アジド−１−（４−（フルオロスルホニル）ベンゾイル）ピロリジン−２−イル）−２，１４−ジメチル−１，１５−ジオキソ−５，８，１１−トリオキサ−２，１４−ジアザヘプタデカン−１７−イル）−９，１０−ジヒドロ−９，１０−［１，２］ベンゼノアントラセン−２，７，１５−トリイル）トリス（アザンジイル））トリス（８−オキソオクタン−８，１−ジイル））トリカルバメート（１４）（０．０７５ｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中４Ｍ  ＨＣｌ（１ｍＬ）を室温で添加し、得られた反応混合物を４時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮して、粗製のＡＲＫ−１２７＿ＨＣｌ＿塩を黄色固体として得た。粗混合物を、以下の方法を使用する分取ＨＰＬＣにより精製して、純粋なＡＲＫ−１２７＿ＨＣｌ＿塩（０．０１４ｇ、２１．２％）を黄色固体として得た。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO-d6)  δ  9.89  ppm  (3H,  broad  s),  8.26-8.22  ppm  (1H,  m),  8.16  ppm  (1H,  m),  7.89-7.85  ppm  (9H,  m),  7.75  ppm  (1H,  m),  7.69-7.66  ppm  (3H,  m),  7.29-7.22  ppm  (5H,  m),  5.38  ppm  (1H,  s),  4.99-4.87  ppm  (2H,  m),  4.39-4.38  ppm  (1H,  m),  4.28-4.16  ppm  (1H,  m),  4.05-4.02  ppm  (1H,  m),  3.81-3.74  ppm  (1H,  m),  3.64-3.52  ppm  (9H,  m),  3.38-3.28  ppm  (7H,  m),  3.17-2.99  ppm  (8H,  m),  2.76-2.65  ppm  (8H,  m),  2.34-2.23  ppm  (5H,  t),  1.54  ppm  (11H,  broad  s),  1.27  ppm  (18H,  broad  s).ＭＳ（ＥＳＩ−ＭＳ）：ｍ／ｚ  Ｃ６９Ｈ９７ＦＮ１２Ｏ１１Ｓ［ＭＨ］＋の計算値  １３２１．７１、実測値  １３２２．４２。
【０５６７】
分取ＨＰＬＣのための方法：
【０５６８】
（Ａ）水中０．０５％ＨＣｌ（ＨＰＬＣグレード）および（Ｂ）１００％アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）で、２０．０ｍＬ／分の流速で以下の勾配を用いるＳＵＮＦＩＲＥ  Ｃ１８、２５０ｍｍ×１９ｍｍ×５μｍを使用：
【表３５】
2019511562.tif 000079
【０５６９】
（実施例１８）
ＣＰＮＱ類似体および他のキノリンベースのリガンドの調製
ＣＰＮＱおよび他のキノリン骨格に基づく例示的な小分子リガンドを、図９７〜１０５に示す合成スキームに基づいて調製した。調製した化合物に関する分析データを以下の表６に示す。
【表６−１】
2019511562.tif 000080
【表６−２】
2019511562.tif 000081
【表６−３】
2019511562.tif 000082
【表６−４】
2019511562.tif 000083
【０５７０】
（実施例１９）
例示的な化合物データ
調製を上記した化合物に関する追加データ、ならびにさらなる例示的な化合物の構造を、以下の表７に示す。
【表７−１】
2019511562.tif 000084
【表７−２】
2019511562.tif 000085
【表７−３】
2019511562.tif 000086
【表７−４】
2019511562.tif 000087
【表７−５】
2019511562.tif 000088
【表７−６】
2019511562.tif 000089
【表７−７】
2019511562.tif 000090
【表７−８】
2019511562.tif 000091
【表７−９】
2019511562.tif 000092
【表７−１０】
2019511562.tif 000093
【表７−１１】
2019511562.tif 000094
【表７−１２】
2019511562.tif 000095
【表７−１３】
2019511562.tif 000096
【表７−１４】
2019511562.tif 000097
【表７−１５】
2019511562.tif 000098
【表７−１６】
2019511562.tif 000099
【表７−１７】
2019511562.tif 000100
【表７−１８】
2019511562.tif 000101
【表７−１９】
2019511562.tif 000102
【表７−２０】
2019511562.tif 000103
【表７−２１】
2019511562.tif 000104
【表７−２２】
2019511562.tif 000105
【表７−２３】
2019511562.tif 000106
【表７−２４】
2019511562.tif 000107
【表７−２５】
2019511562.tif 000108
【表７−２６】
2019511562.tif 000109
【表７−２７】
2019511562.tif 000110
【表７−２８】
2019511562.tif 000111
【表７−２９】
2019511562.tif 000112
【表７−３０】
2019511562.tif 000113
【表７−３１】
2019511562.tif 000114
【表７−３２】
2019511562.tif 000115
【表７−３３】
2019511562.tif 000116
【表７−３４】
2019511562.tif 000117
【表７−３５】
2019511562.tif 000118
【表７−３６】
2019511562.tif 000119
【表７−３７】
2019511562.tif 000120
【表７−３８】
2019511562.tif 000121
【表７−３９】
2019511562.tif 000122
【表７−４０】
2019511562.tif 000123
【表７−４１】
2019511562.tif 000124
【表７−４２】
2019511562.tif 000125
【表７−４３】
2019511562.tif 000126
【表７−４４】
2019511562.tif 000127
【表７−４５】
2019511562.tif 000128
【表７−４６】
2019511562.tif 000129
【表７−４７】
2019511562.tif 000130
【表７−４８】
2019511562.tif 000131
【表７−４９】
2019511562.tif 000132
【表７−５０】
2019511562.tif 000133
【表７−５１】
2019511562.tif 000134
【表７−５２】
2019511562.tif 000135
【表７−５３】
2019511562.tif 000136
【表７−５４】
2019511562.tif 000137
【表７−５５】
2019511562.tif 000138
【表７−５６】
2019511562.tif 000139
【表７−５７】
2019511562.tif 000140
【表７−５８】
2019511562.tif 000141
【表７−５９】
2019511562.tif 000142
【表７−６０】
2019511562.tif 000143
【表７−６１】
2019511562.tif 000144
【表７−６２】
2019511562.tif 000145
【表７−６３】
2019511562.tif 000146
【表７−６４】
2019511562.tif 000147
【表７−６５】
2019511562.tif 000148
【表７−６６】
2019511562.tif 000149
【表７−６７】
2019511562.tif 000150
【表７−６８】
2019511562.tif 000151
【表７−６９】
2019511562.tif 000152
【表７−７０】
2019511562.tif 000153
【表７−７１】
2019511562.tif 000154
【表７−７２】
2019511562.tif 000155
【表７−７３】
2019511562.tif 000156
【表７−７４】
2019511562.tif 000157
【表７−７５】
2019511562.tif 000158
【０５７１】
（実施例２０）
調製したＲＮＡ配列
化合物結合の試験（予測される結合様式の検証、またはそれが公知でない場合は結合様式の同定を含む）および本発明の方法の立証において使用するために以下のＲＮＡ配列を設計し、調製した。
【表８−１】
2019511562.tif 000159
【表８−２】
2019511562.tif 000160
【表８−３】
2019511562.tif 000161
【表８−４】
2019511562.tif 000162
【表８−５】
2019511562.tif 000163
【０５７２】
（実施例２１）
蛍光消光による結合アッセイ
このアッセイは、ＲＮＡ三方向ジャンクション（３８ｎｔ構築物など）について化合物の結合を試験するために使用する。これは、蛍光タグとしてＦＡＭを、消光剤としてアイオワブラックを利用する蛍光消光アッセイである。タグはそれぞれ３’末端および５’末端に結合させる。化合物結合時の３ＷＪの安定な形成は、アイオワブラックタグとの近接性に起因してＦＡＭ蛍光の消光に繋がる。アッセイの読み取り：ＦＡＭ（４８５〜５２０ｎｍ）蛍光強度。
【０５７３】
核酸ジャンクションは遍在的な構造モチーフであり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方で起こる。それらは、複製および組換えなどの生物学的プロセスにおいて重要な、そして時には一過性の構造を表すが、いくつかの神経変性疾患に関連するトリプレットリピート伸長においても起こる。核酸ジャンクションはウイルスゲノム中に遍在しており、リボスイッチにおける重要な構造モチーフである。三方向ジャンクションは、多くのナノ構造、ソフトマテリアル、多重発色団集合体、およびアプタマーベースのセンサー中に存在する鍵となる構成要素である。アプタマーベースのセンサーの場合、ＤＮＡ三方向ジャンクションは重要な構造モチーフとしてはたらく。
【０５７４】
このアッセイは、容易に観察可能な読み取りを用いる制御された系の文脈で３ＷＪへの結合を試験することによってＲＮＡ結合性小分子を発見するためのツールキットの一部分としてはたらくことができる。次いで、本明細書中に開示したＰＥＡＲＬ−ｓｅｑまたはその他の方法を使用して、化合物をさらにスクリーニングし得る。
【０５７５】
使用したアッセイ試料緩衝液：１０ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２、３０ｍＭ  ＮａＣｌ。Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水中の緩衝液調製物（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０５７６】
化合物の調製
乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製する。ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ濃度のストック溶液を室温で貯蔵する。
【０５７７】
ハードウェア
サンプルプレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８４０７６、黒、３８４（希釈プレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４ウェル、透明）。蛍光強度デバイス：Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  １０４０２８５
【０５７８】
アッセイプロトコール
アッセイ緩衝液の調製
毎日交換（１０ｍｌ）：１ｍｌ  １００ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２および０．３ｍｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水で１０ｍｌまで満たす。
【０５７９】
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
アッセイ緩衝液中、ＲＮＡを１：１０（最終１０μＭ）に希釈する。
【０５８０】
希釈したＲＮＡを５分間、９０℃まで加熱する（密封したエッペンドルフチューブ）。
【０５８１】
ＲＮＡプローブをゆっくりと室温まで冷却する。
【０５８２】
化合物の調製
化合物をＤＭＳＯ中で８００μＭとなるまで希釈する（アッセイ：８μＭ）。
【０５８３】
試料の調製
７１．２〜７８．４μＬのアッセイ緩衝液をＧｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４中にピペットで入れる（各ウェルが必要）。
【０５８４】
０．８〜８μＬのＲＮＡ溶液（１００ｍＭ）を加える。
【０５８５】
０．８μＬの化合物溶液（８００ｍＭ）を加える。
【０５８６】
マルチチャネルピペットを用いて穏やかに混合する。
【０５８７】
試料中の最終濃度：１〜１０μＭ  ＲＮＡ、８μＭ化合物、１％ＤＭＳＯ
サーマルシフト測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０）
【０５８８】
２５μＬの試料溶液をＧｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号７８４０７６、黒、３８４中にピペットで入れる。
【０５８９】
試料の移送が完了したら上部の蓋を取る。
【０５９０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（チャネル：４８５／５２０ｎｍ）を用いて９６プレートを測定する。
【０５９１】
読み取り
ソフトウェアはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｒを使用した。
【表３６】
2019511562.tif 000164
【０５９２】
結果
ＣａｃｏＫ緩衝液中またはＮａＰＯ４緩衝液中のいずれかにおいて様々なＲＮＡ濃度での予想される蛍光シグナルの較正を最初に行った。塩を含む緩衝液中の実験は明確な蛍光消光挙動を示す。ＣａｃｏＫ緩衝液用の較正実験を図１０６に示す。ＮａＰＯ４緩衝液について類似の結果が得られた（結果は示さず）。
【０５９３】
最初に２つの化合物（すなわち、Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８）を蛍光消光アッセイで試験して、蛍光シグナルに対する濃度依存的な影響を評価した。Ａｒｋ０００００７のみが、５μＭより高い濃度において３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ構築物に対して消光効果の増大を示した（図１０７）。残りの緩衝液および試料条件は、蛍光シグナルに対する化合物の有意な影響を示さなかった。
【０５９４】
化合物Ａｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４に対して蛍光消光実験を繰り返して、以下のものとの結合を測定した。
【０５９５】
Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）
【０５９６】
Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）
【０５９７】
Ｃ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）
【０５９８】
これらの配列についての考えられる構造を図１０８に示し、実験結果を図１０９に示す。蛍光消光アッセイでは、両方の化合物を２つの濃度点で試験して、研究に利用するＲＮＡ構築物への効果を評価した。Ａｒｋ００００１３（図中の化合物１３に関連する曲線）は、使用した３つ全てのＲＮＡ構築物への有意な濃度依存的な効果を示す（シス３ＷＪについては最小の効果、トランス３ＷＪについては等しい効果）。データは、３ＷＪ構築物とのＡｒｋ００００１３の特異的相互作用を示唆する。Ａｒｋ００００１４（化合物１４）はＲＮＡ構築物に対するより小さい効果を示す（分岐３ＷＪ＿２はより大きい効果を示す）。この化合物はＲＮＡ標的の種と相互作用しているようである。
【０５９９】
（実施例２２）
サーマルシフト結合アッセイ
目的：ＲＮＡ三方向ジャンクション（例えば、３８ｎｔの構築物）について化合物の結合を試験する。サーマルシフトアッセイは、蛍光タグとしてＦＡＭを、消光剤としてアイオワブラックを利用する確立された蛍光消光アッセイに基づく。タグはそれぞれ３’末端および５’末端に結合させた。化合物結合時の３ＷＪの安定な形成は、アイオワブラックタグとの近接性に起因してＦＡＭ蛍光の消光に繋がる。サーマルアンフォールディングは蛍光発光の増大に繋がる。アッセイの読み取り：ＦＡＭ（４６５〜５１０ｎｍ）サーマルシフト。
【０６００】
このアッセイは、容易に観察可能な読み取りを用いる制御された系の文脈で３ＷＪへの結合を試験することによってＲＮＡ結合性小分子を発見するためのツールキットの一部分としてはたらくことができる。次いで、本明細書中に開示したＰＥＡＲＬ−ｓｅｑまたはその他の方法を使用して、化合物をさらにスクリーニングし得る。
【０６０１】
使用したアッセイ試料緩衝液：１０ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２、３０ｍＭ  ＮａＣｌ。Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水中の緩衝液調製物（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０６０２】
化合物の調製
乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製する。ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ濃度のストック溶液を室温で貯蔵する。
【０６０３】
ハードウェア
サンプルプレート：Ｒｏｃｈｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ９６、白、製品番号０４７２９６９２００１。（希釈プレート：Ｇｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４ウェル、透明）。サーマルシフトデバイス：Ｒｏｃｈｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０。
【０６０４】
アッセイプロトコール
アッセイ緩衝液の調製
毎日交換（１０ｍｌ）：１ｍｌ  １００ｍＭ  ＣａｃｏＫ  ｐＨ７．２および０．３ｍｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、Ｄｎａｓｅ／Ｒｎａｓｅフリーの蒸留水で１０ｍｌまで満たす。
【０６０５】
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
アッセイ緩衝液中、ＲＮＡを１：１０（最終１０μＭ）に希釈する。
【０６０６】
希釈したＲＮＡを５分間、９０℃まで加熱する（密封したエッペンドルフチューブ）。
【０６０７】
ＲＮＡプローブをゆっくりと室温まで冷却する。
【０６０８】
化合物の調製
化合物をＤＭＳＯ中で８００μＭとなるまで希釈する（アッセイ：８μＭ）。
【０６０９】
試料の調製
７８．４μＬのアッセイ緩衝液をＧｒｅｉｎｅｒ、製品番号７８１１０１、ＰＳ−Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、３８４中にピペットで入れる（各ウェルが必要）。
【０６１０】
０．８μＬのＲＮＡ溶液（１００ｍＭ）を加える。
【０６１１】
０．８μＬの化合物溶液（８００ｍＭ）を加える。
【０６１２】
マルチチャネルピペットを用いて穏やかに混合する。
【０６１３】
試料中の最終濃度：１μＭ  ＲＮＡ、８μＭ化合物、１％ＤＭＳＯ
【０６１４】
サーマルシフト測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０）
２０μＬの試料溶液をＲｏｃｈｅ、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ９６、白、製品番号０４７２９６９２００１中にピペットで入れる。
【０６１５】
試料の移送が完了したら、透明なトップシール（製品番号０４７２９６９２００１の一部分）を用いてプレートを密封する。
【０６１６】
卓上デバイスを用いてプレートを遠心分離して、試料を遠心沈降させる。
【０６１７】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０（チャネル：４８０／５１０ｎｍ；温度：４１〜９１℃）を用いて９６プレートを測定する。
【０６１８】
ＭｅｌｔｉｎｇＣｕｒｖｅＧｅｎｏｔｙｐｉｎｇモードで測定データを解析する。
【０６１９】
ソフトウェア
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＬＣＳ４８０  １．５．１．６２  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＴｈｅｒｍａｌＳｈｉｆｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
【０６２０】
設定：取得モード：連続；ランプ速度：０．１Ｃ°／秒；取得：６／Ｃ°
【０６２１】
全ての試料についての融解曲線ジェノタイピング
チャネル    ４８０／５１０ｎｍ
【０６２２】
プログラム名（Progam  Name）    Ｐｒｏｇｒａｍ
【０６２３】
標準設定    Ａｕｔｏ−Ｇｒｏｕｐ
【０６２４】
感度    標準
【０６２５】
温度範囲    ４１〜９１℃
【０６２６】
スコア    ０．７
【０６２７】
解像度（Res.）    ０．１
【０６２８】
曲線は生データおよび正規化データを用いてフィッティングする。
【０６２９】
結果
融解曲線解析は、約５１℃の融解温度（Ｔｍ）を示す。ＲＮＡの濃度範囲を試験し、アッセイウィンドウを決定した（０．５〜１μＭの濃度範囲が最良の結果を与える）。緩衝液の選択もまたＴｍに影響した。サーマルシフトアッセイにおいて、ＲＮＡ構築物を異なる緩衝液条件下（特に塩の存在下）で試験した。塩濃度の増加は融解温度を上昇させる傾向を示す。しかしながら、蛍光消光アッセイについて既に見たように、この観察は緩衝液条件に強く依存する。１μＭのＲＮＡ濃度において３０ｍＭの塩のＣａｃｏＫを使用して３ＷＪの安定性に対する化合物の効果を試験した。サーマルシフトアッセイにおいて、ＲＮＡ構築物を異なる緩衝液条件下（特に塩の存在下）で試験した。予想したように、塩濃度の増加は融解温度を上昇させる傾向を示す。しかしながら、蛍光消光アッセイについて既に見たように、この観察は緩衝液条件に強く依存する。ＲＮＡ構築物はより高い塩濃度の存在下でフォールディングし、より低い塩濃度での５１℃に対して６１℃の融解温度を有していた。これらの条件を試験化合物のスクリーニングに使用した。
【０６３０】
化合物Ａｒｋ０００００７およびＡｒｋ０００００８を３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ  ＲＮＡ構築物を用いたサーマルシフトアッセイにおいて試験した（図１１０）。データ解析は、約５℃の融解温度シフト（すなわち、６１．２℃から６５．６℃）を伴ってＡｒｋ０００００７についての有意な効果を示している。対照的に、Ａｒｋ０００００８については非常に小さい効果しか観察されなかった。これらのデータは、Ａｒｋ０００００７の存在が３ＷＪの安定性を増大させることを示唆する。
【０６３１】
また、以下の３つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物に対するサーマルシフトアッセイにおいて化合物Ａｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４を試験した。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）。
【０６３２】
ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭを用いて化合物を試験した時のデータ解析は、化合物の存在下で有意により低い蛍光シグナルを伴って、融解曲線におけるＡｒｋ００００１３の有意な効果を示した（図１１１）。
【０６３３】
正規化データは、Ａｒｋ００００１３の存在下で適切な融解曲線を示さず、データ解析ソフトウェアのアルゴリズムでは、意味のある融解点を決定できなかった。Ａｒｋ００００１４については、約３℃の融解温度シフト（すなわち、６５．６℃から６８．４℃）を伴って、より弱い効果が観察された。データは、Ａｒｋ００００１３の存在は結合時に３ＷＪのフォールディングの安定性を増大させるが、Ａｒｋ００００１４ははるかに目立たない効果を示すことを示唆する。これらの結果は蛍光消光アッセイに合致している。
【０６３４】
上記Ｂ）のＲＮＡ（分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ）の存在下のデータ解析は、約２１℃の融解温度シフト（すなわち、３７．５℃から５８．２℃）を伴ってＡｒｋ００００１３について有意な効果を示した（図１１２）。わずか約１℃の融解温度シフト（すなわち、３７．５℃から３８．８℃）を伴ってＡｒｋ００００１４については小さな効果のみが観察された。データは、Ａｒｋ００００１３の存在は結合時に３ＷＪのフォールディングの安定性を増大させるが、Ａｒｋ００００１４ははるかに目立たない効果を示したことを示唆する。２つのＲＮＡ分子からトランスで形成された３ＷＪは、シスでフォールディングした３ＷＪよりも有意に低い安定性を示す（化合物の非存在下および存在下）。特に化合物の非存在下では、より大きいバルジを有するステムループ構造は最も多いコンフォメーションであるかもしれない。
【０６３５】
上記Ｃ）のＲＮＡ（分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ）の存在下のデータ解析は、約１３℃の融解温度シフト（すなわち、４４．０℃から５６．９℃）を伴ってＡｒｋ００００１３について有意な効果を示した（図１１３）。わずか約１℃の融解温度シフト（すなわち、４４．０℃から４４．７℃）を伴ってＡｒｋ００００１４については小さな効果のみが観察された。データは、Ａｒｋ００００１３の存在は結合時に３ＷＪのフォールディングの安定性を増大させるが、Ａｒｋ００００１４ははるかに目立たない効果を示すことを示唆する。トランス３ＷＪの研究はシス３ＷＪよりも低い安定性を示しているようであるが、分岐＿２の３ＷＪは分岐＿１よりも安定なコンフォメーションを取る（化合物の非存在下）。化合物の存在下では、トランス３ＷＪの分岐＿１および分岐＿２の両方について融解温度は類似しており、化合物の存在下での３ＷＪのフォールディングの形成を示唆する。
【０６３６】
いくつかのＲＮＡ構築物を用いてＡｒｋ０００００１３およびＡｒｋ０００００１４を試験した。結果を下記の表９および表１０に示す。異なるＲＮＡ：リガンド比（すなわち、１：１、１：３）でのシスでフォールディングしたＲＮＡ  ３ＷＪに対するサーマルシフトアッセイにおいても化合物Ａｒｋ００００３９を試験した。構築物３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭについての生データはＡｒｋ００００３９について融解曲線における有意な効果を示さない（等モル濃度においても３倍モル過剰においても）。また、正規化データは、化合物Ａｒｋ００００３９について有意な効果を示さない。Ａｒｋ００００３９は３ＷＪのフォールディングの安定性に有意に影響しないらしく、したがってＡｒｋ００００３９について結合を示すものは観察されなかった。配列ＲＮＡ３ＷＪ＿３．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭおよびＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭを用いた試験においてもこれと同じく影響は見られなかった。
【表９】
2019511562.tif 000165
【表１０】
2019511562.tif 000166
【表１１−１】
2019511562.tif 000167
【表１１−２】
2019511562.tif 000168
【０６３７】
興味深いことに、リガンド、テザー、弾頭、およびクリック実行可能基を有するフックアンドクリック化合物（ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ化合物）（ＡＲＫ００００３１およびＡＲＫ００００３２など）は、＋２４．１℃および＋１５．０℃という大きいサーマルシフト値を示し、これはＲＮＡ標的配列への強い結合を示している。
【０６３８】
（実施例２３）
リガンド観察ＮＭＲ結合アッセイ
目的：ＲＮＡ三方向ジャンクション（３ＷＪ）に対する化合物の直接結合を試験する。このリガンド観察ＮＭＲアッセイを使用して、ＲＮＡ標的（例えば、３８ｎｔの合成ＲＮＡの３ＷＪ、および以下に記載するようなその他のもの）に対する化合物の直接結合を試験する。リガンド観察アッセイを単一化合物のヒット検証研究のために使用した。確立された実験を最終的に使用して、以下に記載する集団エピトープマッピングを行う。
【０６３９】
アッセイの試薬およびハードウェア
試料緩衝液：１０ｍＭ  カコジレート、ｐＨ７．１；０．６８ｇ［ＭＷ：１３７．９９ｇ／ｍｏｌ］；ミリポアＨ２Ｏで５００ｍｌまで満たす。
【０６４０】
化合物の調製
化合物ストック：乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製した。乾燥粉末として提供される試験化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液として調製した。ｄ６−ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ濃度のストック溶液を４℃で貯蔵した。
【０６４１】
ハードウェア
試料チューブ：ＮＭＲチューブ；Ｎｏｒｅｌｌ、品目番号ＳＴ５００−７、ＮＭＲ試料測定用
【０６４２】
ＮＭＲ分光計：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ６００分光計、１Ｈについて６００．０ＭＨｚで作動。５ｍｍのｚ軸勾配のＴＸＩクライオプローブ。
【０６４３】
アッセイの手順
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
乾燥したＲＮＡペレットを試料緩衝液（１０ｍＭカコジレート、ｐＨ７．１）中に可溶化する。
【０６４４】
２００μＭ（ストック濃度）のＲＮＡアリコートを３分間９５℃で変性させ、氷上で３分間スナップ冷却する。
【０６４５】
試料の調製
２３μＬのｄ６−ＤＭＳＯを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中にピペットで入れ、試料中にロッキング剤として５％  ｄ６−ＤＭＳＯが存在することを確実にする。
【０６４６】
２μＬの各断片（５０ｍＭストック溶液）を加える。
【０６４７】
４５０μＬのアッセイ緩衝液を加える。
【０６４８】
ＲＮＡの３ＷＪの均質化したＲＮＡストック溶液（２００μＭストック溶液）２５μＬを加える。
【０６４９】
試料をボルテックスして適切な混合を確実にし、そしてＮＭＲ分光計中に置いて試料の測定を開始する。
【０６５０】
試料中の最終濃度：２００μＭの各化合物および１０μＭのＲＮＡ標的分子
【０６５１】
ＮＭＲ測定
試料を磁石中に置き、温度を２８８Ｋに調整する。分光計の周波数を６００ＭＨｚに合わせ、チューニングする。磁場をシミングし、試料の周りの磁場を均一化する。
【０６５２】
プロトンの９０°パルスを決定し、水共鳴周波数を最大の水抑制を確実にするように調整する。決定した値を、各々の試料について記録するＮＭＲ実験に移す。
【０６５３】
実験手順は、水抑制用のウォーターゲート配列、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ（ＷＬＯＧＳＹ）を用いるプロトン１Ｄ実験、およびＲＮＡへの化合物の直接結合を試験するための１Ｄ飽和移動差（ＳＴＤ）実験を含む。
【０６５４】
１Ｄウォーターゲート実験の詳細：各１Ｄウォーターゲートスペクトルについて１２８回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計８１９２の複素点を取得した（実験時間４分）。スペクトル幅は１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０６５５】
ＷＬＯＧＳＹ実験の詳細：ＷＬＯＧＳＹスペクトルについて２５６回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間２５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０６５６】
ＳＴＤ実験の詳細：ＳＴＤスペクトルについて１０２４回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間６５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。オン共鳴実験について、飽和は−２５００Ｈｚの飽和周波数において２．０秒に設定する。オフ共鳴実験について、飽和周波数は１０２００Ｈｚに設定する。
【０６５７】
読み取り
ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ（商標）バージョン：２．１（２００７年１０月２４日）
【０６５８】
測定モード：１Ｄ
【０６５９】
Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、アッセイのセットアップ、スクリーニング、およびデコンボリューション処理において全ての記録したスペクトルを処理する。
【０６６０】
化合物の直接結合シグナルについてスペクトルを解析した。同定された単一化合物のヒットを報告した。
【０６６１】
ＣＡＧリピートＲＮＡのリガンド観察ＮＭＲ結合アッセイ
上記手順にしたがって、様々なツール化合物および試験化合物を結合についてアッセイした。最初の一連の実験では、１７ＣＡＧまたは４１ＣＡＧ（試料は３μＭのＲＮＡ）への結合について化合物を試験した。化合物ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ａ０８、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ａ０６、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｄ１０、および４１の小分子断片の初期スクリーニングのほとんどは、ＲＮＡ標的種１７ＣＡＧおよび４１ＣＡＧの両方について結合シグナルにおける有意差を示さなかった。しかしながら、いくつかの化合物は、２つのＲＮＡ標的種の存在下でシグナルの有意な変化を示した。
【表３７】
2019511562.tif 000169
【０６６２】
ＮＭＲ結合アッセイにおいてＡＲＫ０００００１３も試験した。試験試料：１０μＭ  ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ  ＋／−  ２００  Ａｒｋ００００１３。記録したＡｒｋ００００１３の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用した（注記：芳香族シグナルは７．４〜７．９ｐｐｍの間で観察され、中心のトリプチセン足場の対照性に起因して９プロトン全ては磁気的に同等である）。ＲＮＡの存在下で負のサインのシグナルの明らかな減少がＡｒｋ００００１３共鳴について起こった。データは、標的種としての３ＷＪ  ＲＮＡへのＡｒｋ００００１３の結合を示唆した。ＳＴＤ実験は、結合を定数的に確認するのに十分な小さいシグナルを示した。
【０６６３】
エピトープマッピング
いくつかの化合物に関してエピトープマッピングを行った。最初の実施例として、化合物ＣＰＮＱを５０μＭの濃度で分析した。スペクトルの芳香族領域への拡大を用いて１Ｈ  １Ｄウォーターゲートスペクトルを得た。この実施例および以下の実施例のための１Ｈ共鳴の事前の割り当ては、化学シフトの分布、カップリングパターン、およびＮＭＲスペクトルのシミュレーション（ｗｗｗ．ｎｍｒｄｂ．ｏｒｇ）に基づいて行った。プロトン共鳴、ＮＭＲスペクトル、およびエピトープマッピングの結果を割り当てたＣＰＮＱの構造を図１１４に示す。シグナルの重複に起因して、ピペラジン環系の個々の割り当ては出来なかった。条件：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＤＴＴ、５％  ＤＭＳＯ−ｄ６；Ｔ＝２８８．１Ｋ。エピトープマッピング実験は、上記のＳＴＤ実験の条件を使用して４１ＣＡＧおよび１７ＣＡＧの配列の存在下で行った。ＣＰＮＱの場合、データは、両方のＲＮＡ構築物についてクロロフェニル部分のプロトンがニトロキノリンよりもＲＮＡに近接する傾向を示唆する。
【０６６４】
類似の条件下で化合物ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１について同じ実験を行った（図１１５を参照）。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、ピリジン環のプロトンがベンゼン環よりもＲＮＡにより近接することを示唆する。脂肪族ＣＨ２基は、その領域における緩衝液シグナルの重複に起因して観察できなかった。
【０６６５】
類似の条件下で化合物ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２について同じ実験を行った（図１１６を参照）。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。データは、両方のＲＮＡ構築物について、複素環に最も近い芳香族プロトンがＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。脂肪族プロトン共鳴は、直接飽和のアーティファクト／その領域における緩衝液シグナルの重複に起因してＳＴＤによって評価できなかった（ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹによるエピトープマッピング）。
【０６６６】
類似の条件下で化合物ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３について同じ実験を行った（図１１７を参照）。スケール化したＳＴＤ効果を事前の割り当てにしたがって分子上にプロットした。シグナルの重複に起因して、ＣＨ２基の個々の割り当てはできなかった。データは、両方のＲＮＡ構築物について、フラン部分のプロトンがフェニルよりもＲＮＡプロトンにより近接することを示唆する。
【０６６７】
ＮＭＲ競合実験
競合実験も行った。試験試料：２．５μＭ  ４１ＣＡＧ  ＲＮＡ（４７６ｎｔ）を以下のものと組み合わせた：１００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１（Ａ）；＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）；および＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）。記録したＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用する。競合物（すなわち、ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３またはＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２のいずれか）の存在下、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルは１：４の化合物対競合物の比においても観察された。実験は、利用した化合物混合物においていかなる競合的挙動の兆候も明らかにしなかった。データは、化合物は同じ単一の結合部位について競合しないことを示唆する。
【０６６８】
さらなる実験では、１００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）または１００μＭ  ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）；＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１（Ａ）の存在下で試験試料として２．５μＭ  ４１ＣＡＧ  ＲＮＡ（４７６ｎｔ）を使用した。記録した単一化合物の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用した。競合物（すなわち、ＨＰ−ＡＣ００８００２−Ｅ０１（Ａ））の存在下、ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）またはＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルは１：４の化合物対競合物の比においても観察された。実験は、利用した化合物混合物においていかなる競合的挙動の兆候も明らかにしなかった。データは、化合物は同じ単一の結合部位について競合しないことを示唆する。
【０６６９】
さらなる実験では、１００μＭ  ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）  ＋／−  ２００〜４００μＭ  ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ）の存在下で試験試料として２．５μＭ  ４１ＣＡＧ  ＲＮＡ（４７６ｎｔ）を使用した。記録した単一化合物ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２の１Ｈ  １ＤウォーターゲートスペクトルおよびＷａｔｅｒＬＯＧＳＹスペクトルを基準として使用した。競合物（すなわち、ＨＰ−ＡＴ００５００３−Ｃ０３（Ｃ））の存在下、ＨＰ−ＡＣ００８００１−Ｅ０２（Ｂ）のＷａｔｅｒＬＯＧＳＹシグナルは１：４の化合物対競合物の比においても観察された。実験は、利用した化合物混合物においていかなる競合的挙動の兆候も明らかにしなかった。データは、化合物は同じ単一の結合部位について競合しないことを示唆する。
【０６７０】
（実施例２４）
ＣＡＧリピートＲＮＡのリガンド観察ＮＭＲ結合アッセイ
目的：ｈｔｔｍＲＮＡ（４１個のＣＡＧリピートを有する４７４ｎｔの構築物）および以下に記載するようなその他のものに対する化合物の直接結合を試験する。リガンド観察ＮＭＲアッセイでＲＮＡ標的（例えば、４１個のＣＡＧリピートを有する４７４ｎｔの構築物）への断片の直接結合を試験する。直交型アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、ＳＰＲ）によるさらなる特徴付けのために単一化合物のヒットを特定した。一次スクリーニングおよび単一断片ヒットへのデコンボリューションのためにリガンド観察アッセイを使用した。確立された実験を最終的に集団エピトープマッピングのために使用した。
【０６７１】
特定遺伝子のタンパク質コーディング部分におけるＣＡＧリピート伸長は、カテゴリーＩのリピート伸長疾患として分類される。現在、９種の神経学的障害が、ＣＡＧリピート（通常、さもなければ無関係のタンパク質のコーディング領域内）の数の増加によって引き起こされることが公知である。タンパク質合成の間に、伸長したＣＡＧリピートは一連の解釈されないグルタミン残基に翻訳され、ポリグルタミン鎖（「ポリＱ」）として公知であるものを形成する。
【０６７２】
このアッセイは、ｈｔｔｍＲＮＡへの化合物の直接結合を試験し、またその他のリピートＲＮＡのために適応され得る。プールされた化合物を試験する（すなわち、一次スクリーニングにおいては各試料中１２断片のプールサイズ、デコンボリューションの間はより小さいプールサイズ、そして最終的には単一化合物の測定）。
【０６７３】
アッセイの試薬およびハードウェア
試料緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．７８ｇ［ＭＷ：１５７．５６ｇ／ｍｏｌ］；７５ｍＭ  ＫＣｌ、２．７９ｇ［ＭＷ：７４．５５ｇ／ｍｏｌ］；３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１４ｇ［ＭＷ：９５．２１ｇ／ｍｏｌ］；ミリポアＨ２Ｏで５００ｍＬまで満たす。
【０６７４】
化合物の調製
化合物ストック：断片ライブラリーのストック溶液を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中１００ｍＭ濃度で提供する。乾燥粉末として提供されるツール化合物を１００％  ｄ６−ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストック溶液として調製した。ｄ６−ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ濃度のストック溶液を４℃で貯蔵した。
【０６７５】
ハードウェア
試料チューブ：ＮＭＲチューブ；Ｎｏｒｅｌｌ、品目番号ＳＴ５００−７、ＮＭＲ試料測定用
【０６７６】
ＮＭＲ分光計：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ６００分光計、１Ｈについて６００．０ＭＨｚで作動。５ｍｍのｚ軸勾配のＴＸＩクライオプローブ。
【０６７７】
アッセイの手順
ＲＮＡの調製（ＲＮＡ試料の均質化）
乾燥したＲＮＡペレットを試料緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に可溶化する。１３．９μＭ（ストック濃度）のＲＮＡアリコートを３分間９５℃で変性させ、氷上で３分間スナップ冷却し、３０分間３７℃でリフォールディングさせる。
【０６７８】
試料の調製
１３〜２４μＬのｄ６−ＤＭＳＯを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中にピペットで入れ、試料中にロッキング剤として５％  ｄ６−ＤＭＳＯが存在することを確実にする（調製した試料のプールサイズに依存する）。１μＬの各断片（１００ｍＭストック溶液）を加える。
【０６７９】
３６７μＬのアッセイ緩衝液を加える。
【０６８０】
ｈｔｔｍＲＮＡの均質化したＲＮＡストック溶液（１３．９μＭストック溶液）１０８μＬを加える。
【０６８１】
試料をボルテックスして適切な混合を確実にし、そしてＮＭＲ分光計中に置いて試料の測定を開始する。
【０６８２】
試料中の最終濃度：２００μＭの各断片および３μＭのＲＮＡ標的分子
【０６８３】
ＮＭＲ測定
試料を磁石中に置き、温度を２８８Ｋに調整する。分光計の周波数を６００ＭＨｚに合わせ、チューニングする。磁場をシミングし、試料の周りの磁場を均一化する。
【０６８４】
プロトンの９０°パルスを決定し、水共鳴周波数を最大の水抑制を確実にするように調整する。決定した値を、各々の試料について記録するＮＭＲ実験に移す。
【０６８５】
実験手順は、水抑制用のウォーターゲート配列、ＷａｔｅｒＬＯＧＳＹ（ＷＬＯＧＳＹ）を用いるプロトン１Ｄ実験、およびＲＮＡへの化合物の直接結合を試験するための１Ｄ飽和移動差（ＳＴＤ）実験を含む。
【０６８６】
１Ｄウォーターゲート実験の詳細：各１Ｄウォーターゲートスペクトルについて１２８回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計８１９２の複素点を取得した（実験時間４分）。スペクトル幅は１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０６８７】
ＷＬＯＧＳＹ実験の詳細：ＷＬＯＧＳＹスペクトルについて２５６回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間２５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。
【０６８８】
ＳＴＤ実験の詳細：ＳＴＤスペクトルについて１０２４回のスキャンでｆ１（１Ｈ）の計１０２４の複素点を取得した（実験時間６５分）。１Ｈのキャリア周波数は水共鳴（約４．７ｐｐｍ）に設定した。スペクトル幅は直接次元（１Ｈ）において１６．６６ｐｐｍに設定した。オン共鳴実験について、飽和は−２５００Ｈｚの飽和周波数において２．０秒に設定する。オフ共鳴実験について、飽和周波数は１０２００Ｈｚに設定する。
【０６８９】
読み取り
ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ（商標）バージョン：２．１（２００７年１０月２４日）
【０６９０】
測定モード：１Ｄ
【０６９１】
Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、アッセイのセットアップ、スクリーニング、およびデコンボリューション処理において全ての記録したスペクトルを処理した。化合物の直接結合シグナルについてスペクトルを解析した。同定された単一化合物のヒットを報告した。
【０６９２】
（実施例２５）
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプターを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの調製
目的：ＳＨＡＰＥ試薬またはＰＥＡＲＬ−ｓｅｑ化合物で処理した後の短い合成ＲＮＡのディープシークエンシングを可能とすること。本明細書中に記載のライブラリー調製プロトコールは、両末端にアダプターをライゲートすることによって小さい合成ＲＮＡから次世代シークエンシングライブラリーを生成する方法を記載する。ライゲーションは、ライゲートしたアダプターからのｃＤＮＡの合成、したがって標的ＲＮＡ全体のシークエンシングを可能とするために必要とされる。この技術は、ＳＨＡＰＥシークエンシングのプロセス中の一ステップを表す。ＳＨＡＰＥシークエンシングは、コンフォメーション選択的なＳＨＡＰＥ試薬で処理した後の突然変異頻度を決定することによってＲＮＡ二次構造を解析することを目的とする。
【０６９３】
この実施例用の標的の名称：標的ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿ｎｏＬａｂ”、配列ｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣ。生理学的役割：三方向ジャンクションの二次構造を形成できる合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド。アッセイの原理：１）標的ＲＮＡへの３’−アダプターのライゲーション、２）標的ＲＮＡの５’末端のリン酸化、３）ライゲートしたアダプターからの第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡの合成、４）ＰＣＲによるバーコード化されたＩｌｌｕｍｉｎａプライマーの組込みおよび増幅。アッセイの読み取り：アガロースゲル電気泳動、サンガーシークエンシング。
【０６９４】
アッセイの試薬およびハードウェア
−  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型ＫＱ（ＮＥＢ＃Ｍ０３７３Ｓ）
−  ５０％  ＰＥＧ８０００（ＮＥＢ＃Ｍ０３７３Ｓに同梱）
−  ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１（ｓｓＲＮＡリガーゼ）（ＮＥＢ＃Ｍ０２０４Ｓ）
−  １０ｍＭ  ＡＴＰ（ＮＥＢ＃Ｍ０２０４Ｓに同梱）
−  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
−  Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  Ｍ０５３５）
−  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）
−  Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＨＳ  ＤＮＡアッセイキット（Ｉｎｉｖｔｒｏｇｅｎ）
−  ０．２Ｍ  カコジル酸
【表３８】
2019511562.tif 000170
【０６９５】
オリゴヌクレオチド
標的ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿ｎｏＬａｂ」（ＩＤＴ特注合成（synthese））
５’  ｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＧｒＵ  ｒＧｒＣｒＣ  ３’
３’アダプターＤＮＡオリゴ「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋｅｒ」（ＮＥＢ  Ｓ１３１５Ｓ）
５’  ｒＡｐｐＣＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴ−ＮＨ２  ３’
５’アダプターＲＮＡオリゴ
５’  ｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＣｒＧｒＡｒＣｒＧｒＡｒＵｒＣ  ３’
【０６９６】
逆転写用プライマー：（ＮＮＮＮＮＮは８塩基の「固有分子識別子」タグを示す）
第１鎖合成用プライマー（Ｐ７  ＲＴ−Ａｎｔｉ  ＵＣＬ）
５’  ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣ  ＣＴＡＣＡＧ  ３’
第２鎖合成用プライマー（Ｐ５  ２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ）
５’  ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣ  ＧＡＣＧＡＴＣ  ３’
【０６９７】
ライブラリーのＰＣＲ増幅用プライマー：全てのプライマーは、ライブラリーのデコンボリューション用に必要な特定の８ｎｔインデックス配列タグ（インデックス）を含む。
いくつかのフォワードＰＣＲ用プライマー
５’  ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（ＩＮＤＥＸ）ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣ  ＴＴＣＣＧＡＴＣＴ  ３’
いくつかのリバースＰＣＲ用プライマー
５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（ＩＮＤＥＸ）ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ  ３’
【０６９８】
ｑＰＣＲ／シークエンシング用プライマー：
Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｆｗ  ５’  ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ  ３’
Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｒｖ  ５’  ＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ  ３’
【０６９９】
アッセイの手順
調製
ＲＮａｓｅフリーの水を用いて標的ＲＮＡを１００μＭまで溶解する。
【０７００】
１８０μｌを３アリコートおよび追加的な小容量のアリコート（５μｌ）をピペットで入れる。貯蔵：−８０℃。
【０７０１】
ライゲーション用に、凍結乾燥したＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋｅｒ（ＵＣＬ）を１００μＭのストック濃度までＲＮＡｓｅフリーの水中に再懸濁する。１μｌのＵＣＬの濃度は１００ｐｍｏｌ（１００μＭ）である。
【０７０２】
ＲＮａｓｅフリーの水を用いてアダプター濃度を１０ｐｍｏｌ／μｌ（１０μＭ）に調整する（１：１０の希釈）。
【０７０３】
ＲＮＡのフォールディング
溶解した標的ＲＮＡを緩衝液１で１：１０を用いて希釈して１０μＭのライゲーション溶液を得る。
【０７０４】
９０℃で５分間インキュベートし、ゆっくりと室温に冷却し、氷上で貯蔵する。
３’アダプターのライゲーション
【０７０５】
３’アダプター（ＵＣＬ）を３０秒間６５℃で変性させ、直ちに氷上で急冷する。
【０７０６】
ＡＴＰの非存在下、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いてライゲーションを実行する。
【０７０７】
以下のものを用いてライゲーション反応物を準備する。
【表３９−１】
2019511562.tif 000171
【表３９−２】
2019511562.tif 000172
【０７０８】
反応物を２５℃で４時間または１８℃で終夜インキュベートする。注記：ライゲーション反応はＡＴＰの非存在下で行わなければならない。熱による不活化：６５℃で２０分。
【０７０９】
５’アダプターのライゲーション
５’アダプターＲＮＡオリゴ（１０μＭ、ＲＮａｓｅフリーの水中）を３０秒間６５℃で変性させ、直ちに氷上で急冷する。
【０７１０】
２０μｌの３’アダプター−ＲＮＡ−混合物を以下のものに加える。
【表４０】
2019511562.tif 000173
【０７１１】
反応物を２５℃で４時間または１８℃で終夜インキュベートする。熱による不活化：６５℃で１５分。注記：小さいＲＮＡの３’末端は、３’末端にアミン基を有する３’アダプターに既にライゲートされており、もはやライゲーション反応に関与できないため、その５’末端をＡＴＰの存在下でＲＮＡオリゴにライゲートし得る。
【０７１２】
逆転写（第１鎖のｃＤＮＡの合成）
使用前に各成分を混合し、軽く遠心分離する。
【０７１３】
０．２ｍｌのＰＣＲチューブ中に以下のものを合わせる。
【表４１】
2019511562.tif 000174
【０７１４】
６５℃で５分間インキュベートした後、少なくとも１分間氷上に置く。
【０７１５】
各成分を示した順序で加えて以下のｃＤＮＡ合成混合物を調製する。
【表４２】
2019511562.tif 000175
【０７１６】
２０μｌのｃＤＮＡ合成混合物を各ＲＮＡ／プライマー混合物に加え、穏やかに混合し、軽く遠心分離することによって収集する。５０℃で５０分間インキュベートする。５分間８５℃において反応を終了させる。氷上で急冷する。軽く遠心分離することによって反応物を収集する。ｃＤＮＡ合成反応物を−２０℃で貯蔵するか、または直ちにＰＣＲに使用することができる。
【０７１７】
第２鎖のｃＤＮＡの合成
以下のＰＣＲ混合物を調製する。
【表４３】
2019511562.tif 000176
【０７１８】
ＰＣＲ分析装置中に試料を入れ、以下のサイクリングプログラムを実行する。
【０７１９】
変性：９５℃で３分
アニーリング：６５℃で１０秒、０．１℃／秒で６５℃〜５５℃に低下させる
伸長：７２℃で３分
４℃に冷却する∞
ＰＣＲ濃縮まで−２０℃で貯蔵する。
【０７２０】
ＰＣＲ濃縮
以下のＰＣＲ混合物を調製する。
【表４４】
2019511562.tif 000177
【０７２１】
ＰＣＲ分析装置中に試料を入れ、以下のサイクリングプログラムを実行する。
開始：変性  ９８℃で３０秒
１５サイクル：
１．変性  ９８℃で１０秒
２．アニーリング  ７２℃で２０秒＊
３．伸長  ７２℃で１５秒
最終の伸長  ７２℃で３分
４〜１０℃で保持する
【０７２２】
＊所与のプライマーセットのための最適なアニーリング温度を決定するために、ＮＥＢのＴｍ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを使用することが強く推奨される。
【０７２３】
残りのＲＴ生成物を−２０℃で貯蔵することができる。
【０７２４】
読み取り
適切な分子量マーカーを使用して２％アガロースゲル上でＰＣＲ生成物を分離する。注記：正確にライゲートおよび増幅したライブラリーのサイズは２３３塩基である。バンドを切り出し、ＱｉａｇｅｎのＭｉｎＥｌｕｔｅキットを用いて生成物をゲル精製する。
【０７２５】
「Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｆｗ」プライマーまたは「Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｒｖ」プライマーのいずれかを使用して、精製した断片を直接的サンガーシークエンシング（選択した提供業者にて）に供する。関与するステップおよび配列を図１１８に示す。
【０７２６】
（実施例２６）
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを産生するための代替的な手順
５’アダプターを標的ＲＮＡにライゲートするさらなるステップを含む、所望のＲＮＡライブラリーを産生するための代替的な手順を開発した。この代替法の主要なステップは、１）標的ＲＮＡへの３’−アダプターのライゲーション、２）標的ＲＮＡの５’末端のリン酸化、３）標的ＲＮＡへの５’−アダプターのライゲーション、４）ライゲートしたアダプターからの第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡの合成、５）ＰＣＲによるバーコード化されたＩｌｌｕｍｉｎａプライマーの組込みおよび増幅である。
【０７２７】
この追加のステップを行うために、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ）を試薬に含めた。追加のリン酸化ステップを以下の通りに行った。
【０７２８】
Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅを用いたリン酸化
非放射性のリン酸化のために、最大３００ｐｍｏｌの５’末端を使用する。
【表４５】
2019511562.tif 000178
【０７２９】
３７℃で３０分間インキュベートする。最適な活性のためには新鮮な緩衝液が必要である（酸化によるＤＴＴの損失は活性を低下させる）。
【０７３０】
また、その後の５’アダプターライゲーションステップの間に、２０μｌの代わりに４０μｌのリン酸化３’アダプター−ＲＮＡ−混合物を使用した。
【０７３１】
２つのライブラリー産生方法に関与するステップおよび配列を図１１８および１１９に示す。
【０７３２】
（実施例２７）
ＤＥＬ（ＤＮＡコードライブラリー）の調製および固定化
配列ＨＴＴ４１ＣＡＧおよびＨＴＴ１７ＣＡＧを合成し、以下に記載する選択緩衝液中で２時間インキュベーションした後にリフォールディングさせることに成功した。これはネイティブＰＡＧＥによって確認した（結果は示さず）。ネイティブＰＡＧＥ：３分間９５℃で変性させ、氷上で３分間スナップ冷却し、３０分間３７℃でリフォールディングさせた（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、７５ｍＭ  ＫＣｌ、および３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。約５０％のＲＮＡ標的をニュートラアビジン樹脂上に固定化した。ＲＮＡ標的は、ゲル電気泳動後に染色剤を適用する改良後に選択条件下で安定であった。固定化の間のｓｓＤＮＡおよびＲｎａｓｅ阻害剤の濃度を減少させることもまた役に立つ。
【０７３３】
選択条件
ＤＥＬの詳細：ＤＥＬセット１＝６１０のＤＥＬライブラリー、計５５億２千百万の化合物；ＤＥＬセット２＝２０５のＤＥＬライブラリー、計７千万の化合物（これらのセットは別々にスクリーニングする）
【０７３４】
選択のラウンド：３〜４
【０７３５】
選択の様式：固定化した標的
【０７３６】
捕捉樹脂：ニュートラアビジン樹脂
【０７３７】
標的の量：１００ｐｍｏｌ
【０７３８】
固定化緩衝液の組成：ＮＭＲ緩衝液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０３ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ、２ｍＭ  バナジルリボヌクレオシド複合体
【０７３９】
選択緩衝液の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．３ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ、２０ｍＭ  バナジルリボヌクレオシド複合体
【０７４０】
容量、温度、および時間：１００ｕＬ、室温、１時間
【０７４１】
洗浄条件
緩衝液の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０７４２】
回数および容量：２×２００ｕＬ
【０７４３】
温度および時間：室温、高速
【０７４４】
溶出条件：
溶出の様式：熱溶出
【０７４５】
緩衝液の組成：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
【０７４６】
容量、温度、および時間：８０ｕＬ；８０℃；１５分
【０７４７】
室温で２時間選択緩衝液中でインキュベーションすることによってＲＮＡ複合体の安定性を確認した。リフォールディングしたＲＮＡを樹脂上に固定化することに成功した。
【表４６】
2019511562.tif 000179
【０７４８】
結論：
固定化の間のｓｓＤＮＡおよびＲｎａｓｅ阻害剤の濃度を減少させた後、５０％のリフォールディングしたＨＴＴ１７ＣＡＧをニュートラアビジン樹脂上に吸着させ、ＤＥＬ化合物とのインキュベーション後、リフォールディングしたＨＴＴ１７ＣＡＧをニュートラアビジン樹脂から回収すれば、標的は親和性選択のために用いることができる。
【０７４９】
（実施例２８）
表面プラズモン共鳴実験
図１２１および１２２は、目的の標的ＲＮＡへの結合についてリガンドおよびフックアンドクリック構築物をスクリーニングするために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる考えられる方法を示す。ＳＰＲは生体分子の相互作用をリアルタイムでモニタリングするために特に有用である。通常、標的種および無関係の対照をセンサーチップに固定化した後、分析物（化合物／断片）を表面上に流す。標的種への化合物の結合により、ＳＰＲシグナルの増大がもたらされる（会合相）。緩衝液を用いて結合した化合物を洗浄除去することにより、ＳＰＲシグナルの減少がもたらされる（解離相）。異なる化合物濃度で記録したセンサーグラムを適切な相互作用モデルに対してフィッティングする。この方法は、速度論的パラメーター（ｋａ、ｋｄ→ＫＤ）の抽出を可能とする。必要条件／制限としては、ｋａ／ｋｄ値が合理的な範囲内にあること、および標的サイズが大きすぎてはならないこと（＜１００ｋＤａ）が挙げられる。これは、断片をスクリーニングし、ヒットをプロファイルまたは検証するために優れた方法である。ＢＣ４０００を一次スクリーニング（最大４０００データポイント／週）のために使用してもよい。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００は、ヒットのプロファイリングおよび検証のために好適である。
【０７５０】
ＰＥＡＲＬ−ｓｅｑの文脈では、ＳＰＲは、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーへの「フック」の結合のモニタリングを可能とする。標的種をセンサーチップに固定化し、分析物（すなわち、フック）を表面上に流し（会合相）、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマーを表面上に流し（プラトー相）、競合化合物を表面上に洗い流し（解離相）、結合データを得る。必要条件／制限としては再び、ｋａ／ｋｄ値が合理的な範囲内にあり、各々の目的のために適合するものでなければならないことである。さらには、標的サイズは１００ｋＤａ未満でなければならない。加えて、準備を可能とするために、ステップ１およびステップ２を実施する（最初の試験）必要がある。適合する親和性を有する競合物もまた必要とされる。
【０７５１】
結合してＲＮＡ（３ＷＪ）を捕捉する相互作用パートナー（ＲＮＡ／ＤＮＡ）を同定する目的で、以下のステップが企図される。
【０７５２】
ビオチン化捕捉ＲＮＡ（ｂｉｏ３ＷＪ）を使用して二次構造にフォールディングさせ、
弾頭トリプチセンリガンドの結合を可能とし、
弾頭への共有結合によって、相互作用するＲＮＡ／ＤＮＡを釣り上げ、
ストレプトアビジンビーズへのｂｉｏ３ＷＪの結合を介して複合体を沈殿させ、
洗浄および溶出し、かつ
溶出液からライブラリーを生成し、シークエンシングする。
【０７５３】
細胞溶解物またはＲＮＡ調製物の円滑な生成のためのプロトコールが必要である。１つの例示的なプロトコールは以下のステップを伴う。
【０７５４】
ＲＴ−ｑＰＣＲに使用できる細胞溶解物の調製
【０７５５】
２４ウェルプレート中のＭＤＣＫロンドン細胞をＰＢＳ（１ｍＬ／ウェル）を用いて１回洗浄した。２００ｍＬ／ウェルの細胞溶解（ＣＬ）緩衝液に細胞単層を曝露することによって細胞溶解物を調製する。ＣＬ緩衝液の最終配合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．２５％  Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる。ＣＬ緩衝液は適切なストック溶液から新たに調製する。全ての試薬は分子生物学グレードであり、希釈はＤＥＰＣ処理水（３５１−０６８−７２１；Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）を用いて行う。ある特定の実験のためには、ＣＬ緩衝液は、ＭｇＣｌ２（Ｍ１０２８；Ｓｉｇｍａ）またはＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎ２６１５；Ｐｒｏｍｅｇａ）も含む。細胞を適切な期間（通常、ＣＬ緩衝液について５分）曝露する。生じた溶解物を、細胞単層残存物を壊すことなく注意深く収集し、直ちに分析するか、または冷凍保存する。例えば、Shatzkesら、「A  simple,  inexpensive  method  for  preparing  cell  lysates  suitable  for  downstream  reverse  transcription  quantitative  PCR」、Scientific  Reports  ４巻、論文番号：４６５９（２０１４年）を参照。
【０７５６】
Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用する単純溶解緩衝液により、まだ全て（ポリＡ濃縮やタンパク質除去がない）を含んでいる粗細胞溶解物を生成する。
【０７５７】
可能な異なるプロトコール：小ＲＮＡのワークフロー：アダプターライゲーション、ｃＤＮＡ合成、ライブラリー（小クラスター）；またはＲＮＡ全体のワークフロー：ＲｉｂｏＺｅｒｏを用いるまたは用いないランダムプライミング、標準的ライブラリー調製物（通常クラスター）。
【０７５８】
本発明のいくつかの実施形態を記載したが、我々の基本的な実施例を改変して、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供し得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、実施例によって提示した特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるべきことが理解されるであろう。
【図１】
2019511562.tif 000184
【図２】
2019511562.tif 000185
【図３】
2019511562.tif 000186
【図４】
2019511562.tif 000187
【図５】
2019511562.tif 000188
【図６】
2019511562.tif 000189
【図７】
2019511562.tif 000190
【図８】
2019511562.tif 000191
【図９】
2019511562.tif 000192
【図１０】
2019511562.tif 000193
【図１１】
2019511562.tif 000194
【図１２】
2019511562.tif 000195
【図１３】
2019511562.tif 000196
【図１４】
2019511562.tif 000197
【図１５】
2019511562.tif 000198
【図１６】
2019511562.tif 000199
【図１７】
2019511562.tif 000200
【図１８】
2019511562.tif 000201
【図１９】
2019511562.tif 000202
【図２０】
2019511562.tif 000203
【図２１】
2019511562.tif 000204
【図２２】
2019511562.tif 000205
【図２３】
2019511562.tif 000206
【図２４】
2019511562.tif 000207
【図２５】
2019511562.tif 000208
【図２６】
2019511562.tif 000209
【図２７】
2019511562.tif 000210
【図２８】
2019511562.tif 000211
【図２９】
2019511562.tif 000212
【図３０】
2019511562.tif 000213
【図３１】
2019511562.tif 000214
【図３２】
2019511562.tif 000215
【図３３】
2019511562.tif 000216
【図３４】
2019511562.tif 000217
【図３５】
2019511562.tif 000218
【図３６】
2019511562.tif 000219
【図３７】
2019511562.tif 000220
【図３８】
2019511562.tif 000221
【図３９】
2019511562.tif 000222
【図４０】
2019511562.tif 000223
【図４１】
2019511562.tif 000224
【図４２】
2019511562.tif 000225
【図４３】
2019511562.tif 000226
【図４４】
2019511562.tif 000227
【図４５】
2019511562.tif 000228
【図４６】
2019511562.tif 000229
【図４７】
2019511562.tif 000230
【図４８】
2019511562.tif 000231
【図４９】
2019511562.tif 000232
【図５０】
2019511562.tif 000233
【図５１】
2019511562.tif 000234
【図５２】
2019511562.tif 000235
【図５３】
2019511562.tif 000236
【図５４】
2019511562.tif 000237
【図５５】
2019511562.tif 000238
【図５６】
2019511562.tif 000239
【図５７】
2019511562.tif 000240
【図５８】
2019511562.tif 000241
【図５９】
2019511562.tif 000242
【図６０】
2019511562.tif 000243
【図６１】
2019511562.tif 000244
【図６２】
2019511562.tif 000245
【図６３】
2019511562.tif 000246
【図６４】
2019511562.tif 000247
【図６５】
2019511562.tif 000248
【図６６】
2019511562.tif 000249
【図６７】
2019511562.tif 000250
【図６８】
2019511562.tif 000251
【図６９】
2019511562.tif 000252
【図７０】
2019511562.tif 000253
【図７１】
2019511562.tif 000254
【図７２】
2019511562.tif 000255
【図７３】
2019511562.tif 000256
【図７４】
2019511562.tif 000257
【図７５】
2019511562.tif 000258
【図７６】
2019511562.tif 000259
【図７７】
2019511562.tif 000260
【図７８】
2019511562.tif 000261
【図７９】
2019511562.tif 000262
【図８０】
2019511562.tif 000263
【図８１】
2019511562.tif 000264
【図８２】
2019511562.tif 000265
【図８３】
2019511562.tif 000266
【図８４】
2019511562.tif 000267
【図８５】
2019511562.tif 000268
【図８６】
2019511562.tif 000269
【図８７】
2019511562.tif 000270
【図８８】
2019511562.tif 000271
【図８９】
2019511562.tif 000272
【図９０】
2019511562.tif 000273
【図９１】
2019511562.tif 000274
【図９２】
2019511562.tif 000275
【図９３】
2019511562.tif 000276
【図９４】
2019511562.tif 000277
【図９５】
2019511562.tif 000278
【図９６】
2019511562.tif 000279
【図９７】
2019511562.tif 000280
【図９８】
2019511562.tif 000281
【図９９】
2019511562.tif 000282
【図１００】
2019511562.tif 000283
【図１０１】
2019511562.tif 000284
【図１０２】
2019511562.tif 000285
【図１０３】
2019511562.tif 000286
【図１０４】
2019511562.tif 000287
【図１０５】
2019511562.tif 000288
【図１０６】
2019511562.tif 000289
【図１０７】
2019511562.tif 000290
【図１０８】
2019511562.tif 000291
【図１０９】
2019511562.tif 000292
【図１１０】
2019511562.tif 000293
【図１１１】
2019511562.tif 000294
【図１１２】
2019511562.tif 000295
【図１１３】
2019511562.tif 000296
【図１１４】
2019511562.tif 000297
【図１１５】
2019511562.tif 000298
【図１１６】
2019511562.tif 000299
【図１１７】
2019511562.tif 000300
【図１１８】
2019511562.tif 000301
【図１１９】
2019511562.tif 000302
【図１２０】
2019511562.tif 000303
【図１２１】
2019511562.tif 000304
【図１２２】
2019511562.tif 000305
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月5日(2018.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【図４０】図４０は、テザー基のための結合点を有するトリプチセンリガンドの構造を示す。Ｘ＝ＣＨ、ＮまたはＣ−ＯＨ；Ｙ＝ＣＨまたはＮ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３＝それぞれが独立してハロ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（任意選択で置換されているＣ１〜１０脂肪族）、任意選択で置換されているＣ１〜１０脂肪族、またはその他の記載したテザー基から選択される。修飾因子部分は、Ｒ１、Ｒ２、もしくはＲ３上の任意の位置、または上記構造上のその他の官能基において結合されてよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【図４１】図４１は、テザー基のための結合点を有するアントラセン−マレイミドディールス・アルダー付加体リガンドの構造を示す。注記：反対の立体化学的配向でスクシンイミド基を有する対応する構造もまた調製され得る。各Ｒは独立してハロ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−ＮＨ２、−ＮＨ−（任意選択で置換されているＣ１〜１０脂肪族）、任意選択で置換されているＣ１〜１０脂肪族、またはその他の記載したテザー基から選択される。修飾因子部分は、Ｒ上の任意の位置、または上記構造上のその他の官能基において結合されてよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【図５８】図５８は、スルホニルベースの修飾基の構造を示す。上の３つの構造は、セリンプロテアーゼ中の触媒部位のセリンをスルホニル化することが知られている特定の剤である。残りの構造は、ＲＮＡの２’−ＯＨとの共有結合付加体を形成するために使用され得るフッ化スルホニル修飾基の例示的なクラスである。注記：セリンプロテアーゼ中の触媒性のセリンをスルホニル化できる特定の剤。加水分解の半減期は、ＪＢＣ  １９８２年、２５７巻、５０７７頁；ＪＡＣＳ  １９７４年、９６巻、２３３頁；Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７８年、８６巻、５７４頁；ＪＯＣ  １９７０年、３５巻、１８２５頁；ＢＢＡ  １９７９年、５６８巻、１１頁に見付けることができる。ＪＡＣＳ  １９６８年、９０巻、１８６０頁；ＪＡＣＳ  １９７５年、９７巻、４１２１頁；Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８１年、１０巻、１１８頁；Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９８１年、１０巻、１３３頁も参照。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
【図６６】図６６Ａ〜図６６Ｂは、例示的なトリプチセンベースのフック化合物（小分子リガンド＋テザー基＋修飾基）を示す。
【図６６Ａ】図６６Ａ〜図６６Ｂは、例示的なトリプチセンベースのフック化合物（小分子リガンド＋テザー基＋修飾基）を示す。
【図６６Ｂ】図６６Ａ〜図６６Ｂは、例示的なトリプチセンベースのフック化合物（小分子リガンド＋テザー基＋修飾基）を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
【図７４】図７４Ａ〜図７４Ｂは、様々な例示的なテザー基、修飾部分、およびクリック実行可能基と共に小分子リガンドとしてのリボシルを含む、例示的な化合物を示す。
【図７４Ａ】図７４Ａ〜図７４Ｂは、様々な例示的なテザー基、修飾部分、およびクリック実行可能基と共に小分子リガンドとしてのリボシルを含む、例示的な化合物を示す。
【図７４Ｂ】図７４Ａ〜図７４Ｂは、様々な例示的なテザー基、修飾部分、およびクリック実行可能基と共に小分子リガンドとしてのリボシルを含む、例示的な化合物を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
【図８３】図８３Ａ〜図８３Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図８３】図８３Ａ〜図８３Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図８３】図８３Ａ〜図８３Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
【図８５】図８５Ａ〜図８５Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図８５Ａ】図８５Ａ〜図８５Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図８５Ｂ】図８５Ａ〜図８５Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
【図８７】図８７Ａ〜図８７Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図８７Ａ】図８７Ａ〜図８７Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図８７Ｂ】図８７Ａ〜図８７Ｂは、テザー基のための結合点を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
【図９３】図９３Ａ〜図９３Ｂは、テザー基および修飾部分を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図９３Ａ】図９３Ａ〜図９３Ｂは、テザー基および修飾部分を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図９３Ｂ】図９３Ａ〜図９３Ｂは、テザー基および修飾部分を含む数個のテトラサイクリン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【図９４】図９４Ａ〜図９４Ｂは、テザー基および修飾部分を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図９４Ａ】図９４Ａ〜図９４Ｂは、テザー基および修飾部分を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【図９４Ｂ】図９４Ａ〜図９４Ｂは、テザー基および修飾部分を含む数個のトリプチセン小分子リガンドに接近するための反応スキームを示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
【図９７】図９７Ａ〜図９７Ｂは、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【図９７Ａ】図９７Ａ〜図９７Ｂは、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【図９７Ｂ】図９７Ａ〜図９７Ｂは、化合物ＡＲＫ−１３２の合成経路を示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
【図９８】図９８Ａ〜図９８Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【図９８Ａ】図９８Ａ〜図９８Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【図９８Ｂ】図９８Ａ〜図９８Ｄは、化合物ＡＲＫ−１３４の合成経路を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
【図９９】図９９Ａ〜図９９Ｃは、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【図９９Ａ】図９９Ａ〜図９９Ｃは、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【図９９Ｂ】図９９Ａ〜図９９Ｃは、化合物ＡＲＫ−１３５およびＡＲＫ−１３６の合成経路を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
【図１０５】図１０５Ａ〜図１０５Ｂは、リボシル足場に基づく化合物の合成経路を示す。
【図１０５Ａ】図１０５Ａ〜図１０５Ｂは、リボシル足場に基づく化合物の合成経路を示す。
【図１０５Ｂ】図１０５Ａ〜図１０５Ｂは、リボシル足場に基づく化合物の合成経路を示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
【図１０８】図１０８は、三角形で示す小分子リガンドのための推定上の結合部位を有する以下の３つのＲＮＡ  ３ＷＪ構築物についての考えられる構造を示す。Ａ）ＲＮＡ３ＷＪ＿１．０．０＿５ＩＢ＿３ＦＡＭ（シス３ＷＪ、１つの対形成していないヌクレオチドを有する）（配列番号３１）、Ｂ）分岐３ＷＪ．１＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．１＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）（それぞれ、出現する順に、配列番号５２〜５３）、およびＣ）分岐３ＷＪ．２＿上＿５ＩＢ＋分岐３ＷＪ．２＿下＿３ＦＡＭ（トランス３ＷＪ、１：１の混合）（それぞれ、出現する順に、配列番号５４〜５５）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【図１１８】図１１８Ａ〜図１１８Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号３１、４２、５６、４３、５７、４４、５７、５８、４５、５９、５８、４６、６０、４９、４８、４６、６１、６２、４６、６１および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１８Ａ】図１１８Ａ〜図１１８Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号３１、４２、５６、４３、５７、４４、５７、５８、４５、５９、５８、４６、６０、４９、４８、４６、６１、６２、４６、６１および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１８Ｂ】図１１８Ａ〜図１１８Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号３１、４２、５６、４３、５７、４４、５７、５８、４５、５９、５８、４６、６０、４９、４８、４６、６１、６２、４６、６１および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１８Ｃ】図１１８Ａ〜図１１８Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号３１、４２、５６、４３、５７、４４、５７、５８、４５、５９、５８、４６、６０、４９、４８、４６、６１、６２、４６、６１および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１８Ｄ】図１１８Ａ〜図１１８Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号３１、４２、５６、４３、５７、４４、５７、５８、４５、５９、５８、４６、６０、４９、４８、４６、６１、６２、４６、６１および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１８Ｅ】図１１８Ａ〜図１１８Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号３１、４２、５６、４３、５７、４４、５７、５８、４５、５９、５８、４６、６０、４９、４８、４６、６１、６２、４６、６１および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
【図１１９】図１１９Ａ〜図１１９Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号６３、４２、６４、６４、４３、６５、４４、６５、５８、４５、５９、５８、４６、４７、４９、４８、４６、５９、６２、４６、５９および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１９Ａ】図１１９Ａ〜図１１９Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号６３、４２、６４、６４、４３、６５、４４、６５、５８、４５、５９、５８、４６、４７、４９、４８、４６、５９、６２、４６、５９および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１９Ｂ】図１１９Ａ〜図１１９Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号６３、４２、６４、６４、４３、６５、４４、６５、５８、４５、５９、５８、４６、４７、４９、４８、４６、５９、６２、４６、５９および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１９Ｃ】図１１９Ａ〜図１１９Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号６３、４２、６４、６４、４３、６５、４４、６５、５８、４５、５９、５８、４６、４７、４９、４８、４６、５９、６２、４６、５９および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１９Ｄ】図１１９Ａ〜図１１９Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号６３、４２、６４、６４、４３、６５、４４、６５、５８、４５、５９、５８、４６、４７、４９、４８、４６、５９、６２、４６、５９および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【図１１９Ｅ】図１１９Ａ〜図１１９Ｅは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１アデニル化アダプター（それぞれ、出現する順に、配列番号６３、４２、６４、６４、４３、６５、４４、６５、５８、４５、５９、５８、４６、４７、４９、４８、４６、５９、６２、４６、５９および６２）を使用する、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製物の産生ステップを示す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
【図１２２】図１２２Ａ〜図１２２Ｂは、本発明において使用するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法の例示的ステップを示す。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
反復はｍＲＮＡのコーディング部分または非コーディング部分にあることができる。非コーディング領域内の反復の場合、反復は５’ＵＴＲ配列、イントロン、または３’ＵＴＲ配列内に存在し得る。コーディング領域内の反復配列によって引き起こされる疾患のいくつかの例を表１に示す。
【表１】
2019511562.tif 000306
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
ｍＲＮＡの非コーディング領域内にある反復配列によって引き起こされる疾患のいくつかの例を表２に示す。
【表２】
2019511562.tif 000307
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５７１】
（実施例２０）
調製したＲＮＡ配列
化合物結合の試験（予測される結合様式の検証、またはそれが公知でない場合は結合様式の同定を含む）および本発明の方法の立証において使用するために以下のＲＮＡ配列を設計し、調製した。
【表８−１】
2019511562.tif 000308
【表８−２】
2019511562.tif 000309
【表８−３】
2019511562.tif 000310
【表８−４】
2019511562.tif 000311
【表８−５】
2019511562.tif 000312
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９３】
この実施例用の標的の名称：標的ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿ｎｏＬａｂ”、配列ｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵ  ｒＧｒＵｒＧｒＣｒＣ（配列番号３１）。生理学的役割：三方向ジャンクションの二次構造を形成できる合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド。アッセイの原理：１）標的ＲＮＡへの３’−アダプターのライゲーション、２）標的ＲＮＡの５’末端のリン酸化、３）ライゲートしたアダプターからの第１鎖および第２鎖のｃＤＮＡの合成、４）ＰＣＲによるバーコード化されたＩｌｌｕｍｉｎａプライマーの組込みおよび増幅。アッセイの読み取り：アガロースゲル電気泳動、サンガーシークエンシング。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９５】
オリゴヌクレオチド
標的ＲＮＡオリゴヌクレオチド「ＲＮＡ３ＷＪ＿０．０．０＿ｎｏＬａｂ」（ＩＤＴ特注合成（synthese））
５’  ｒＧｒＧｒＣｒＡｒＣｒＡｒＡｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＡｒＣｒＡｒＣｒＵｒＧｒＣｒＡｒＵｒＵｒＡｒＣｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＧｒＧｒＵｒＵｒＧｒＵ  ｒＧｒＣｒＣ  ３’（配列番号３１）
３’アダプターＤＮＡオリゴ「Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｍｉＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋｅｒ」（ＮＥＢ  Ｓ１３１５Ｓ）
５’  ｒＡｐｐＣＴＧＴＡＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴ−ＮＨ２  ３’（配列番号４２）
５’アダプターＲＮＡオリゴ５’  ｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒＵｒＣｒＵｒＡｒＣｒＡｒＧｒＵｒＣｒＣｒＧｒＡｒＣｒＧｒＡｒＵｒＣ  ３’（配列番号４３）
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９６】
逆転写用プライマー：（ＮＮＮＮＮＮは８塩基の「固有分子識別子」タグを示す）
第１鎖合成用プライマー（Ｐ７  ＲＴ−Ａｎｔｉ  ＵＣＬ）
５’  ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣ  ＣＴＡＣＡＧ  ３’（配列番号４４）
第２鎖合成用プライマー（Ｐ５  ２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ）
５’  ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＣＴＡＣＡＧＴＣＣ  ＧＡＣＧＡＴＣ  ３’（配列番号４５）
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９７】
ライブラリーのＰＣＲ増幅用プライマー：全てのプライマーは、ライブラリーのデコンボリューション用に必要な特定の８ｎｔインデックス配列タグ（インデックス）を含む。
いくつかのフォワードＰＣＲ用プライマー
５’  ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ（ＩＮＤＥＸ）ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣ  ＴＴＣＣＧＡＴＣＴ  ３’（それぞれ、配列番号４６〜４７）
いくつかのリバースＰＣＲ用プライマー
５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（ＩＮＤＥＸ）ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ  ３’（それぞれ、配列番号４８〜４９）
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６９８】
ｑＰＣＲ／シークエンシング用プライマー：
Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｆｗ  ５’  ＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧ  ３’（配列番号５０）
Ｑｕａｎｔｉ  ｑＰＣＲ  １＿ｒｖ  ５’  ＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ  ３’（配列番号５１）
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７５８】
本発明のいくつかの実施形態を記載したが、我々の基本的な実施例を改変して、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供し得ることは明らかである。したがって、本発明の範囲は、実施例によって提示した特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるべきことが理解されるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
式Ｉの化合物：
【化４７】
2019511562.tif 000313
または薬学的に許容されるその塩（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分である）。
（項目２）
式ＩＩの化合物：
【化４８】
2019511562.tif 000314
または薬学的に許容されるその塩（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１およびＴ２のそれぞれは独立して二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基である）。
（項目３）
式ＩＩＩの化合物：
【化４９】
2019511562.tif 000315
または薬学的に許容されるその塩（式中、
リガンドは小分子ＲＮＡ結合剤であり、
Ｔ１は三価のテザー基であり、
Ｔ２は二価のテザー基であり、
ＲｍｏｄはＲＮＡ修飾部分であり、
ＲＣＧはクリック実行可能基である）。
（項目４）
リガンドが、マクロライド、アルカロイド、アミノグリコシド、テトラサイクリン、図３４に示すものから選択されるＳＭＮ２リガンド、プレウロムチリン、テオフィリンまたはその類似体、リボシルまたはその類似体、置換されたアントラセン、置換されたトリプチセン、オキサゾリジノン、およびＣＰＮＱまたはその類似体からなる群から選択され、リガンドは１つまたは複数の置換基により任意選択で置換されていてもよい、項目１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目５）
リガンドが、エリスロマイシン、アジスロマイシン、ベルベリン、パルマチン、パロモマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン、プレウロムチリン、テオフィリンまたはその類似体、リボシルまたはその類似体、ＮＶＳ−ＳＭ１、置換されたアントラセン、置換されたトリプチセン、リネゾリド、テジゾリド、およびＣＰＮＱまたはその類似体からなる群から選択され、リガンドは１つ、２つ、３つ、または４つの置換基により任意選択で置換されていてもよい、項目１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
（項目６）
Ｔ１が、図４６〜５３に示すものから選択される、項目１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
（項目７）
Ｔ１が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、任意選択で置換されているＣ１〜１２の脂肪族基、または１〜８個のアミノ酸を含むペプチドから選択される、項目１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
（項目８）
Ｔ２が、図４６〜５３に示すものから選択される、項目２または３のいずれか一項に記載の化合物。
（項目９）
Ｒｍｏｄが、ハロゲン化スルホニル、アレーンカルボニルイミダゾール、活性エステル、エポキシド、オキシラン、酸化剤、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化ベンジル、またはイソシアネートから選択され、Ｒｍｏｄは、リガンドが結合する標的ＲＮＡの拘束されていない２’−ヒドロキシル基と反応して、２’−共有結合修飾ＲＮＡを産生する、項目１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１０）
ＲＣＧが、クリック実行可能基、またはニトロン／シクロオクチン反応、オキシム／ヒドラゾン形成、テトラジンライゲーション、イソシアニドベースのクリック反応、もしくはクアドリシクランライゲーションを起こすことができる基から選択される、項目１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１１）
ＲＣＧがクリック実行可能基である、項目１１に記載の化合物。
（項目１２）
リガンドが、標的ＲＮＡ中のジャンクション、ステムループ、またはバルジに結合する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１３）
リガンドが、核酸の三方向ジャンクション（３ＷＪ）に結合する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
（項目１４）
前記３ＷＪが、２つのＲＮＡ分子の間のトランス３ＷＪである、項目１３に記載の化合物。
（項目１５）
前記３ＷＪが、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間のトランス３ＷＪである、項目１４に記載の化合物。
（項目１６）
標的ＲＮＡおよび項目１〜１５のいずれか一項に記載の化合物を含み、Ｒｍｏｄが該標的ＲＮＡへの共有結合を形成している、ＲＮＡコンジュゲート。
（項目１７）
標的ＲＮＡに結合しその機能をモジュレートする小分子を同定する方法であって、該標的ＲＮＡへの結合について項目１〜１５のいずれか一項に記載の１つまたは複数の化合物をスクリーニングするステップ、およびＲＮＡ結合アッセイによって結果を分析するステップを含む、方法。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511562000001.app
【手続補正２９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019511562.tif 000316
【図２】
2019511562.tif 000317
【図３】
2019511562.tif 000318
【図４】
2019511562.tif 000319
【図５】
2019511562.tif 000320
【図６】
2019511562.tif 000321
【図７】
2019511562.tif 000322
【図８】
2019511562.tif 000323
【図９】
2019511562.tif 000324
【図１０】
2019511562.tif 000325
【図１１】
2019511562.tif 000326
【図１２】
2019511562.tif 000327
【図１３】
2019511562.tif 000328
【図１４】
2019511562.tif 000329
【図１５】
2019511562.tif 000330
【図１６】
2019511562.tif 000331
【図１７】
2019511562.tif 000332
【図１８】
2019511562.tif 000333
【図１９】
2019511562.tif 000334
【図２０】
2019511562.tif 000335
【図２１】
2019511562.tif 000336
【図２２】
2019511562.tif 000337
【図２３】
2019511562.tif 000338
【図２４】
2019511562.tif 000339
【図２５】
2019511562.tif 000340
【図２６】
2019511562.tif 000341
【図２７】
2019511562.tif 000342
【図２８】
2019511562.tif 000343
【図２９】
2019511562.tif 000344
【図３０】
2019511562.tif 000345
【図３１】
2019511562.tif 000346
【図３２】
2019511562.tif 000347
【図３３】
2019511562.tif 000348
【図３４】
2019511562.tif 000349
【図３５】
2019511562.tif 000350
【図３６】
2019511562.tif 000351
【図３７】
2019511562.tif 000352
【図３８】
2019511562.tif 000353
【図３９】
2019511562.tif 000354
【図４０】
2019511562.tif 000355
【図４１】
2019511562.tif 000356
【図４２】
2019511562.tif 000357
【図４３】
2019511562.tif 000358
【図４４】
2019511562.tif 000359
【図４５】
2019511562.tif 000360
【図４６】
2019511562.tif 000361
【図４７】
2019511562.tif 000362
【図４８】
2019511562.tif 000363
【図４９】
2019511562.tif 000364
【図５０】
2019511562.tif 000365
【図５１】
2019511562.tif 000366
【図５２】
2019511562.tif 000367
【図５３】
2019511562.tif 000368
【図５４】
2019511562.tif 000369
【図５５】
2019511562.tif 000370
【図５６】
2019511562.tif 000371
【図５７】
2019511562.tif 000372
【図５８】
2019511562.tif 000373
【図５９】
2019511562.tif 000374
【図６０】
2019511562.tif 000375
【図６１】
2019511562.tif 000376
【図６２】
2019511562.tif 000377
【図６３】
2019511562.tif 000378
【図６４】
2019511562.tif 000379
【図６５】
2019511562.tif 000380
【図６６】
2019511562.tif 000381
【図６６Ａ】
2019511562.tif 000382
【図６６Ｂ】
2019511562.tif 000383
【図６７】
2019511562.tif 000384
【図６８】
2019511562.tif 000385
【図６９】
2019511562.tif 000386
【図７０】
2019511562.tif 000387
【図７１】
2019511562.tif 000388
【図７２】
2019511562.tif 000389
【図７３】
2019511562.tif 000390
【図７４】
2019511562.tif 000391
【図７４Ａ】
2019511562.tif 000392
【図７４Ｂ】
2019511562.tif 000393
【図７５】
2019511562.tif 000394
【図７６】
2019511562.tif 000395
【図７７】
2019511562.tif 000396
【図７８】
2019511562.tif 000397
【図７９】
2019511562.tif 000398
【図８０】
2019511562.tif 000399
【図８１】
2019511562.tif 000400
【図８２】
2019511562.tif 000401
【図８３】
2019511562.tif 000402
【図８３Ａ】
2019511562.tif 000403
【図８３Ｂ】
2019511562.tif 000404
【図８４】
2019511562.tif 000405
【図８５】
2019511562.tif 000406
【図８５Ａ】
2019511562.tif 000407
【図８５Ｂ】
2019511562.tif 000408
【図８６】
2019511562.tif 000409
【図８７】
2019511562.tif 000410
【図８７Ａ】
2019511562.tif 000411
【図８７Ｂ】
2019511562.tif 000412
【図８８】
2019511562.tif 000413
【図８９】
2019511562.tif 000414
【図９０】
2019511562.tif 000415
【図９１】
2019511562.tif 000416
【図９２】
2019511562.tif 000417
【図９３】
2019511562.tif 000418
【図９３Ａ】
2019511562.tif 000419
【図９３Ｂ】
2019511562.tif 000420
【図９４】
2019511562.tif 000421
【図９４Ａ】
2019511562.tif 000422
【図９４Ｂ】
2019511562.tif 000423
【図９５】
2019511562.tif 000424
【図９６】
2019511562.tif 000425
【図９７】
2019511562.tif 000426
【図９７Ａ】
2019511562.tif 000427
【図９７Ｂ】
2019511562.tif 000428
【図９８】
2019511562.tif 000429
【図９８Ａ】
2019511562.tif 000430
【図９８Ｂ】
2019511562.tif 000431
【図９８Ｃ】
2019511562.tif 000432
【図９８Ｄ】
2019511562.tif 000433
【図９９】
2019511562.tif 000434
【図９９Ａ】
2019511562.tif 000435
【図９９Ｂ】
2019511562.tif 000436
【図９９Ｃ】
2019511562.tif 000437
【図１００】
2019511562.tif 000438
【図１０１】
2019511562.tif 000439
【図１０２】
2019511562.tif 000440
【図１０３】
2019511562.tif 000441
【図１０４】
2019511562.tif 000442
【図１０５】
2019511562.tif 000443
【図１０５Ａ】
2019511562.tif 000444
【図１０５Ｂ】
2019511562.tif 000445
【図１０６】
2019511562.tif 000446
【図１０７】
2019511562.tif 000447
【図１０８】
2019511562.tif 000448
【図１０９】
2019511562.tif 000449
【図１１０】
2019511562.tif 000450
【図１１１】
2019511562.tif 000451
【図１１２】
2019511562.tif 000452
【図１１３】
2019511562.tif 000453
【図１１４】
2019511562.tif 000454
【図１１５】
2019511562.tif 000455
【図１１６】
2019511562.tif 000456
【図１１７】
2019511562.tif 000457
【図１１８】
2019511562.tif 000458
【図１１８Ａ】
2019511562.tif 000459
【図１１８Ｂ】
2019511562.tif 000460
【図１１８Ｃ】
2019511562.tif 000461
【図１１８Ｄ】
2019511562.tif 000462
【図１１８Ｅ】
2019511562.tif 000463
【図１１９】
2019511562.tif 000464
【図１１９Ａ】
2019511562.tif 000465
【図１１９Ｂ】
2019511562.tif 000466
【図１１９Ｃ】
2019511562.tif 000467
【図１１９Ｄ】
2019511562.tif 000468
【図１１９Ｅ】
2019511562.tif 000469
【図１２０】
2019511562.tif 000470
【図１２１】
2019511562.tif 000471
【図１２２】
2019511562.tif 000472
【国際調査報告】
2019511562.tif 000473
2019511562.tif 000474
2019511562.tif 000475