(57)【要約】  本開示の実施形態は、体重増大又は減量を必要としている個体において体重を増大させること、又は低下させること（これには、例えば、脂肪量を増大させることによって、又は低下させることによってであることを含む）に関連する方法及び組成物に関する。そのような方法及び組成物は特定の実施形態においては、ホルモンのアスプロシンの効果的な量を与えて、脂肪量を、脂肪量が不十分である個体において増大させること、及び、アスプロシンの抗体又は阻害剤を肥満又は糖尿病の個体において与えて、例えば、脂肪量を低下させることに関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４からなるペプチドに特異的に結合する単離された抗体又は抗体フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体が、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体がヒト化抗体である、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体が単鎖抗体である、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体がナノボディである、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項６】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体が、ヒト化された単鎖抗体又はナノボディである、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体が二重特異性抗体である、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメントにおいて、前記抗体が、ヒト化された二重特異性抗体である、抗体又は抗体フラグメント。
【請求項９】
生物学的に活性なエフェクタードメインにコンジュゲート化される、請求項１に記載の抗体又は抗体フラグメント。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞。
【請求項１１】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載される抗体を含む組成物。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のハイブリドーマ細胞株。
【請求項１４】
請求項１３に記載される細胞株によって産生される抗体。
【請求項１５】
アスプロシンのレベルを個体由来のサンプルにおいて測定する方法であって、下記の工程：
ａ）配列番号４からなるペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントをサンプルと接触させる工程、
ｂ）複合体を前記抗体と、前記サンプルに由来するアスプロシンとの間で形成させる工程、及び
ｃ）前記抗体／アスプロシン複合体を検出し、前記サンプルにおけるアスプロシンのレベルを決定する工程
を含む方法。
【請求項１６】
前記個体は、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を有することが疑われる、あるいは、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を有することが知られている、あるいは、肥満又は過体重である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、血漿、血液、生検物、唾液、精液、尿、毛、脳脊髄液、口腔擦過物又はそれらの組合せを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体又は抗体フラグメントが支持体に固定化される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体／アスプロシン複合体が支持体に固定化される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体又は抗体フラグメントが、検出可能な標識にカップリングされる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
アスプロシンの前記レベルが参照レベルよりも高いならば、前記個体は、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を有するとして特定され、あるいは、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を発症する危険性がある、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
インスリン抵抗性、肥満、糖尿病及び／又は代謝症候群を個体において処置する方法であって、請求項１〜９、１１又は１４のいずれか一項に記載される抗体又は抗体フラグメントあるいは請求項１２に記載される組成物の効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法。
【請求項２３】
アスプロシンを個体において阻害する方法であって、請求項１〜９、１１又は１４のいずれか一項に記載される抗体又は請求項７に記載される組成物の効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法。
【請求項２４】
前記個体は、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病及び／又は代謝症候群を有する、あるいは、インスリン抵抗性、肥満、糖尿病及び／又は代謝症候群を有することが疑われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記個体はボディーマス指数（ＢＭＩ）が３０以上である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記個体はＢＭＩが２５〜２９．９である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
個体におけるアスプロシンレベルを低下させるための医薬品を製造するための、請求項１〜９、１１又は１４のいずれか一項に記載される抗体あるいは請求項１２に記載される組成物の使用。
【請求項２８】
前記個体は、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有する、あるいは、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有することが疑われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を個体において処置するための医薬品を製造するための、請求項１〜９、１１又は１４のいずれか一項に記載される抗体あるいは請求項１２に記載される組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国仮特許出願第６２／３２２，０４３号（２０１６年４月１３日出願）及び米国仮特許出願第６２／３７３５６５号（２０１６年８月１１日出願）に対する優先権を主張する（これらの出願の両方がそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０００２】
本発明は、ＮＩＤＤＫによって認められる１Ｋ０８ＤＫ１０２５２９のもとでの政府援助を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
［技術分野］
本開示の様々な実施形態には少なくとも、細胞生物学、分子生物学、内分泌学及び医学の分野が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
米国医師会は２０１３年に肥満を病気として分類した（Ｍｏｒｇｅｎ＆Ｓｏｒｅｎｓｏｎ、２０１４）。一方で、世界的規模での主な予防可能な死亡原因の１つとして、その遺伝的基礎及び分子的基礎のより明確な理解がより重要となったことはこれまでなかった（Ｍｏｒｇｅｎ＆Ｓｏｒｅｎｓｏｎ、２０１４；Ｍａｌｉｋ他、２０１３）。肥満は、エネルギー摂取量とエネルギー排出量との間における不均衡によって引き起こされる（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ他、２００１；Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ他、１９９６）。これらの２つのプロセスに影響を及ぼす器官の数及びエネルギー恒常性の複雑さのために、肥満の研究は依然として、重要な科学的課題である（Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ他、２００１）。歴史的には、エクストリーム・ヒューマン・バリエーションの研究がこれまで、様々な複雑な生物学的問題を解決するための、また、疾患に対する治療目標を開発するための強力なツールであった（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ他、２００９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ他、２００９）。本開示では、脂肪量の維持及び関連する血糖コントロールに関わる新しい循環ポリペプチドホルモンの減少が、新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）（Ｈｏｕ他、２００９；Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）として知られているヒトにおける極端な痩せ障害の表現型の原動力である分子機構として記載される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｒｇｅｎ＆Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１０、５１３〜５１４（２０１４）
【非特許文献２】Ｍａｌｉｋ他、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、９、１３〜２７（２０１３）
【非特許文献３】Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ＆Ｆｌｉｅｒ、Ｃｅｌｌ、１０４、５３１〜５４３（２００１）
【非特許文献４】Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ＆Ｆｌｉｅｒ、Ｃｅｌｌ、８７、３７７〜３８９（１９９６）
【非特許文献５】Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ＆Ｂｒｏｗｎ、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｅ．Ｂｉｏｌ．、２９、４３１〜４３８（２００９）
【非特許文献６】Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、８９、９７３Ｓ〜９７９Ｓ（２００９）
【非特許文献７】Ｈｏｕ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  ｎｅｏｎａｔｏｌｏｇｙ、５０、１０２〜１０９（２００９）
【非特許文献８】Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．Ａ、１４３Ａ、１４２１〜１４３０（２００７）
【発明の概要】
【０００６】
本開示の様々な実施形態が、個体の体重に影響を与える方法及び組成物に関連しており、この場合、ある特定の組成物が、個体の体重を増大させるために有用であり、ある特定の組成物が、個体の体重を減らすために有用である。体重の減少又は増大は、どのような手段であれ好適な手段によるものであり得るが、具体的な実施形態において、体重の減少又は増大は、脂肪量の対応する減少又は増大のためである。少なくとも部分的にはその食欲を増大させると個体の体重は増大するが、ある特定の実施形態においては、その体重が、その食欲を増大させなくても増大する。
【０００７】
本開示の実施形態には、フィブリリン−１のＣ末端フラグメント（これは本明細書中ではアスプロシンとして示される）又はその機能的フラグメントもしくは機能的誘導体を包含する方法及び組成物が含まれる。アスプロシンの増大、例えば、循環アスプロシンの増大等が、特定の実施形態においては個体の体重を増大させるために有用であり、これに対して、アスプロシンの低下が、特定の実施形態においては個体の体重を減らすために有用である。
【０００８】
特定の実施形態において、アスプロシン又はその機能的フラグメントもしくはその機能的誘導体が、脂肪量を増すことを必要としている場合を含めて、体重を増すことを必要としている個体に与えられる。そのような個体は、体重を増やすこと又は保持することを妨げる医学的状態を有するため、及び／又は、体重を増やすこと若しく又は保持することが、他の理由から、例えば、生来的に低体重であること等の理由で、又は外的原因によってできない、又は得られないため、体重を増すことを必要としている場合がある。具体的な実施形態において、医学的状態は、個体における１つ又は複数の遺伝的欠損のためである。ある特定の実施形態において、医学的状態は症状として悪液質を含む。
【０００９】
ある特定の実施形態において、個体は、体重を減らすことを必要としており、したがって、個体には、当該個体におけるネイティブアスプロシンの阻害剤の効果的な量が与えられる。阻害剤はどのような種類のものであってもよく、しかし、具体的な実施形態において、阻害剤は、抗体又は小分子であり、例えば、アスプロシンのＮ末端、アスプロシンのＣ末端、又はアスプロシンの内部領域におけるエピトープを標的とする抗体又は小分子を含む。
【００１０】
本開示の実施形態において、個体はグルコース制御の改善を必要としており、したがって、個体には、当該個体におけるネイティブアスプロシンの阻害剤の効果的な量が与えられる。阻害剤はどのような種類のものであってもよく、しかし、具体的な実施形態において、阻害剤は、抗体又は小分子であり、例えば、アスプロシンのＮ末端、アスプロシンのＣ末端、又はアスプロシンの内部領域におけるエピトープを標的とする抗体又は小分子を含む。又はそのような個体はどのような種類の個体であってもよく、しかし、具体的な実施形態において、個体は、糖尿病性、前糖尿病性（どちらも、又はそれらは、空腹時血漿グルコース試験、経口グルコース負荷試験及び／又はヘモグロビンＡ１Ｃ試験によって決定される場合がある）、及びインスリン抵抗性等が挙げられる。具体的な実施形態において、高血糖個体及びインスリン抵抗性個体には、効果的な量の１つ又は複数のアスプロシン阻害剤が与えられる。ある特定の実施形態において、個体には、当該個体が血糖の制御の改善を必要としているとき、効果的な量のアスプロシン阻害剤が与えられ、アスプロシン阻害剤は、とりわけそのような改善のためにこのような個体に与えられる。
【００１１】
本開示の実施形態には、アスプロシン又はその機能的フラグメントもしくは機能的誘導体を含む食欲刺激剤が含まれる。本開示の実施形態にはまた、１つ又は複数のアスプロシンの阻害剤を含む食欲抑制剤が含まれる。
【００１２】
１つの実施形態において、組換えアスプロシンポリペプチド又はその機能的誘導体もしくは機能的フラグメントが存在する。１つの具体的な実施形態において、アスプロシンポリペプチドは配列番号１の配列を含み、又は配列番号１の配列から本質的になり、又は配列番号１の配列からなる。特定の実施形態において、前記ポリペプチドは、医薬的に許容され得るキャリアにおいて含まれる。具体的な実施形態において、その機能的な誘導体又はフラグメントは、配列番号１と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個もしくは２０個又はそれ以上のアミノ酸改変を含む。その機能的誘導体もしくは機能的フラグメントは、ある特定の実施形態においては配列番号１のＮ末端短縮を含むことがあり、前記短縮は、最大でも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である場合があり、又は、前記短縮は、特定の実施形態においては少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、その機能的誘導体もしくは機能的フラグメントは配列番号１のＣ末端短縮を含み、例えば、例として、前記短縮は、最大でも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸であり、あるいは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、その機能的誘導体もしくは機能的フラグメントは配列番号１における内部欠失を含み、例えば、最大でも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である内部欠失、あるいは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である内部欠失を含む。いくつかの場合において、アスプロシンの機能的誘導体又はそのフラグメントは、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を配列番号１に対して有する配列を含むことがある。具体的な実施形態において、ポリペプチドは標識される。
【００１３】
１つの実施形態において、個体の体重を調節する方法であって、ネイティブアスプロシンのレベルを前記個体において調節する工程を含む方法が存在する。具体的な実施形態において、個体が不十分な体重を有するとき、ネイティブアスプロシンのレベルが増大させられる。具体的な実施形態において、個体が過度な体重を有するとき、ネイティブアスプロシンのレベルが低下させられる。特定の場合において、ネイティブアスプロシンのレベルが、アスプロシンの転写を調節することによって調節され、及び／又はアスプロシンの翻訳を調節することによって調節される。具体的な実施形態において、ネイティブアスプロシンのレベルが、細胞からのアスプロシンの分泌を調節することによって調節され、及び／又はアスプロシンの安定性を調節することによって調節される。
【００１４】
１つの実施形態において、個体の体重を増大させる方法であって、本明細書中において意図される任意のポリペプチドの効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が存在する。具体的な実施形態において、個体の食欲レベルが増大させられる。
【００１５】
１つの実施形態において、個体の体重を減らす方法であって、アスプロシンの阻害剤の効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が存在する。具体的な実施形態において、阻害剤は抗体であるが、阻害剤が小分子である場合がある。
【００１６】
１つの実施形態において、個体における血中のグルコースレベルを低下させる方法であって、アスプロシンの阻害剤の効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が存在する。
【００１７】
特定の実施形態において、個体における血中のグルコースレベルを増大させる方法であって、本明細書中において意図される任意のポリペプチドの効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が存在する。
【００１８】
１つの実施形態において、本明細書中において意図される任意のポリペプチドを含むキットであって、前記ポリペプチドは適切な容器に収容されるキットが存在する。
【００１９】
１つの実施形態において、個体の食欲を刺激する方法であって、本明細書中において意図される任意のポリペプチドの効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が存在する。
【００２０】
ある特定の実施形態において、本明細書中において意図される任意のポリペプチドの阻害剤が存在する。
【００２１】
本開示の実施形態は、配列番号４を含む、又は配列番号４からなる、又は配列番号４から本質的になるペプチドに特異的に結合するある種の単離された抗体又は抗体フラグメントを提供する。具体的な実施形態において、抗体又は抗体フラグメントは、配列番号４のペプチド上のエピトープに特異的に結合し、当該エピトープは配列番号４のペプチドの任意の領域に存在し得る。エピトープはペプチドの連続するアミノ酸を含む場合があり、又は、エピトープが特定の三次元立体配置であるとき等ではペプチドの連続するアミノ酸を含まない場合がある。具体的な場合において、抗体はモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体はヒト型又はマウス型であることがある。ある特定の局面において、アスプロシン抗体又は抗体フラグメントは、例えば、通常の方法によって、例えば、ウエスタンブロッティング等によって決定されるように、ＦＢＮ−１には実質的に結合しないという点でアスプロシンに対して特異的である。
【００２２】
本開示の実施形態には、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体、同様にまた、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞又はハイブリドーマ細胞株が包含される。
【００２３】
試料におけるアスプロシンのレベルを測定する方法が本開示において包含され、そのような方法は、アスプロシンに特異的に結合する抗体を利用する方法を含めて、どのような種類のものであってもよい。そのような抗体は、モノクローナル型を含めて、また、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体を含めて、どのような種類のものであってもよい。サンプルはどのような種類のものであってもよく、しかし、具体的な場合において、サンプルは哺乳動物由来であり、個体は、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有するか否か、あるいはインスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を発症する危険性があるか否かを決定することを必要としている。個体は過体重又は肥満である場合があり、あるいは過体重又は肥満である危険性がある場合がある（例えば、家族歴を有する場合がある）。
【００２４】
インスリン抵抗性、肥満、任意のタイプの糖尿病（少なくともＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病及び若年発症成人型糖尿病を含む）、肥満及び／又は代謝症候群を処置する様々な方法を含めて、様々な処置方法が本開示によって包含される。そのような方法では、アスプロシンに特異的に結合する１つ又は複数の抗体を投与することが利用されることがあり、抗体は、抗体フラグメントを含めて、どのような種類のものであってもよいが、具体的な実施形態において、抗体は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体である。
【００２５】
本開示の１つの実施形態は、配列番号４からなるペプチドに特異的に結合する単離された抗体又は抗体フラグメントを含む。具体的な実施形態において、抗体は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、単鎖抗体、ナノボディ、ヒト化単鎖抗体、ナノボディ、二重特異性抗体又はヒト化二重特異性抗体である。いくつかの場合において、抗体又は抗体フラグメントは、生物学的に活性なエフェクタードメインにコンジュゲート化される。本開示の実施形態はまた、本開示によって包含される任意の抗体又は抗体フラグメントを含む組成物を包含する。本開示の抗体又は抗体フラグメントはどれも、支持体に固定化される場合があり、及び／又は検出可能な標識に結合される場合がある。
【００２６】
１つの実施形態において、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたようなハイブリドーマ細胞が存在する。いくつかの実施形態において、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体が提供される。他の実施形態には、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のハイブリドーマ細胞株及びこの細胞株によって産生される抗体が含まれる。
【００２７】
ある特定の実施形態において、下記の工程を含む、アスプロシンのレベルを個体由来のサンプルにおいて測定する方法が存在する：ａ）配列番号４からなるペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントをサンプルと接触させる工程、ｂ）複合体を前記抗体と、前記サンプルに由来するアスプロシンとの間で形成させる工程、及びｃ）前記抗体／アスプロシン複合体を検出し、前記サンプルにおけるアスプロシンのレベルを決定する工程。具体的な実施形態において、個体は、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を有することが疑われ、あるいは、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を有することが知られており、あるいは、肥満又は過体重である。サンプルは、生物学的サンプル（例えば、血漿、血液、生検物、唾液、精液、尿、毛、脳脊髄液、口腔擦過物、乳頭吸引物又はそれらの組合せ等）を含めて、どのような種類のものであってもよい。この方法の様々な実施形態において、抗体又は抗体フラグメントが支持体に固定化され、あるいは抗体／アスプロシン複合体が支持体に固定化される。抗体又は抗体フラグメントは、検出可能な標識に結合される場合がある。特定の実施形態において、個体は、アスプロシンのレベルが参照レベルよりも高いならば、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を有するとして特定され、あるいは、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を発症する危険性があると特定される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を個体において処置する方法であって、本開示の抗体又は抗体フラグメント又は組成物の効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が存在する。
【００２９】
１つの実施形態において、アスプロシンを個体において阻害する方法であって、本開示によって包含される抗体又は抗体フラグメント又は組成物の効果的な量を前記個体に与える工程を含む方法が提供される。具体的な実施形態において、個体は、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有しており、あるいは、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有することが疑われる。具体的な実施形態において、個体はボディーマス指数（ＢＭＩ）が３０以上である。ある特定の実施形態において、個体はＢＭＩが２５〜２９．９の間である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、アスプロシンのレベルを個体において低下させるための医薬品を製造するための、本開示の抗体又は抗体フラグメント組成物の使用が存在する。ある特定の場合において、個体は、例えば、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有しており、あるいは、インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を有することが疑われる。インスリン抵抗性、肥満、ＩＩ型糖尿病及び／又は代謝症候群を個体において処置するための医薬品を製造するための、本開示の抗体又は抗体フラグメント又は組成物の使用もまた存在する。
【００３１】
上記では、本発明の特徴及び技術的利点が、下記の本発明の詳細な説明がよりよく理解され得るためにかなり広く概説されている。本発明の請求項の主題を形成する本発明のさらなる特徴及び利点が本明細書中下記において記載されるであろう。開示される概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するために他の構成を変更するための、又は設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者によって理解されなければならない。そのような同等な組立ては、添付された請求項において示されるような本発明の精神及び範囲から逸脱しないこともまた、当業者によって認識されなければならない。さらなる目的及び利点と一緒にではあるが、本発明の構成及び操作方法の両方に関して、本発明に特徴的であると考えられる新規な特徴が、添付されている図面に関連して検討されたとき、下記の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、図面のそれぞれが例示及び説明のためだけに提供されており、本発明の限界の定義として意図されないことが、明確に理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ−Ｄ】新生児早老症様症候群がＦＢＮ１の３'末端におけるデノボの、ヘテロ接合の短縮化変異から生じている。図１Ａ：主に顔面及び四肢に影響を及ぼし、その一方で、臀部領域は影響を受けない随伴したリポジストロフィーを示す２名のＮＰＳ患者の代表的な画像。図１Ｂ：２名のＮＰＳ患者のＦＢＮ１変異、ボディーマス指数（ＢＭＩ）及び家系図。図１Ｃ：本開示の２名のＮＰＳ患者と、発表された事例報告からの５名のＮＰＳ患者とにおける３'ＦＢＮ１変異。患者＃２はまた、良性であることが予測され、明快さのために図には示されていない、ＦＢＮ１にヘテロ接合のミスセンス変異（ｃ．８２２２Ｔ＞Ｃ）を有する。図１Ｄ：７つすべてのＮＰＳ変異（配列番号８〜１４）がフリン切断部位（赤色で示されるＲＧＲＫＲＲ［配列番号６］モチーフ）の周りに集中しており、これらは、ＲＧＲＫＲＲ（配列番号６）モチーフに続く黒色で示されるＣ末端ポリペプチドのすべて又は大部分のヘテロ接合消失を生じさることが予測される。フレームシフトに起因して付加される非天然アミノ酸が青色で示される。野生型（ＷＴ）配列が参考のために示される（配列番号７）。
【００３３】
【図２Ａ−Ｃ】ＦＢＮ１が白色脂肪組織において非常に、かつ動的に発現される。図２Ａ：ＦＢＮ１発現を、マウスの白色脂肪組織、褐色脂肪組織及び骨格筋において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した（各群において、ｎ＝５）。図２Ｂ：ＦＢＮ１発現を、脂肪産生分化に７日間供されるヒト前脂肪細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。ＣＥＢＰα発現が脂肪産生分化のマーカーとして示される。図２Ｃ：ＦＢＮ１発現を、標準固形飼料又は１０週間の高脂肪食を受けたオスのＷＴマウスから得られる鼠径部の白色脂肪組織において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した（各群において、ｎ＝５）。データが、平均±ＳＥＭとして示される。対応のないスチューデントｔ検定を統計学的有意性の評価のために使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３４】
【図３Ａ−Ｄ】アスプロシンは、フィブリリン−１の高度に保存された循環するＣ末端切断産物である。図３Ａ：ヒトＦＢＮ１遺伝子及びその進化的保存が、ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して描かれる。アスプロシンコード領域が四角で囲まれる。図３Ｂ：アスプロシンコード領域に寄与するエクソン６５及びエクソン６６の拡大図が、ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して描かれる。図３Ｃ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、標準固形飼料又は８週間の高脂肪食を受けた１４週齢のＷＴマウスから得られる血漿、あるいは、ｏｂとして知られている自然発症レプチン変異についてヘテロ接合又はホモ接合のどちらかである８週齢のオスのマウスから得られる血漿に対して行った。図３Ｄ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、肥満者又は標準体重のコントロール被験者から得られる血漿に対して行った。
【００３５】
【図４Ａ−Ｈ】アスプロシンは、ＰＳに随伴した脂肪産生分化異常をインビトロで救済する。図Ａ４：脂肪産生のいくつかの早期マーカー及び後期マーカーの発現を、脂肪産生分化に７日間供されるＮＰＳ患者由来（変異型）又は非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。図４Ｂ：ＷＴ型フィブリリン−１（ＷＴ  ＦＢＮ１）、シグナルペプチドを伴わないアスプロシン（ＦＢＮ１  ＣＴ）、及び、シグナルペプチドが連結したアスプロシン（ＦＢＮ１  ＣＴＳＰ）を発現する発現構築物の描写（すべてがＣＭＶプロモーターの制御下にある）。ネイティブフィブリリン−１の２７アミノ酸のシグナルペプチドが赤色で示される。図４Ｃ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、脂肪産生誘導に７日間さらされ、かつ、ＷＴ型フィブリリン−１（ＷＴ  ＦＢＮ１）、シグナルペプチドを伴わないアスプロシン（ＦＢＮ１  ＣＴ）、及び、シグナルペプチドが連結されるアスプロシン（ＦＢＮ１  ＣＴＳＰ）、又は、コントロールとしての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を駆動させる発現構築物に同時にさらされたＷＴ型ヒト皮膚線維芽細胞から得られる細胞培養培地に対して行った。図４Ｄ：脂肪産生の早期マーカー（ＣＥＢＰα）及び後期マーカー（ＡＰ２）の発現を、ＷＴ型フィブリリン−１（ＷＴ  ＦＢＮ１）又はＧＦＰを駆動させる発現構築物に同時にさらされながら脂肪産生分化に７日間供されるＮＰＳ患者由来（変異型）又は非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。統計学的比較が、変異型＋ＧＦＰの群と、変異型＋ＷＴ  ＦＢＮ１の群との間で示される。図４Ｅ：脂肪産生の早期マーカー（ＣＥＢＰα）及び後期マーカー（ＡＰ２）の発現を、シグナルペプチドを伴わないアスプロシン（ＦＢＮ１  ＣＴ）又はＧＦＰを駆動させる発現構築物に同時にさらされながら脂肪産生分化に７日間供されるＮＰＳ患者由来（変異型）又は非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。統計学的比較が、変異型＋ＧＦＰの群と、変異型＋ＦＢＮ１  ＣＴの群との間で示される。図４Ｆ：脂肪産生の早期マーカー（ＣＥＢＰα）及び後期マーカー（ＡＰ２）の発現を、シグナルペプチドが連結されるアスプロシン（ＦＢＮ１  ＣＴＳＰ）又はＧＦＰを駆動させる発現構築物に同時にさらされながら脂肪産生分化に７日間供されるＮＰＳ患者由来（変異型）又は非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。統計学的比較が、変異型＋ＧＦＰの群と、変異型＋ＦＢＮ１  ＣＴＳＰの群との間で示される。図４Ｇ：脂肪産生のいくつかの早期マーカー及び後期マーカーの発現を、６０ナノモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰに同時にさらされながら脂肪産生分化に７日間供される非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。ＣＥＢＰα発現の誘導が、３０ナノモル濃度から６２５ナノモル濃度までのアスプロシン用量の範囲に関して認められ���。図４Ｈ：脂肪産生の早期マーカー（ＣＥＢＰα）及び後期マーカー（ＡＰ２）の発現を、６０ナノモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰに同時にさらされながら脂肪産生分化に７日間供されるＮＰＳ患者由来（変異型）又は非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）のヒト皮膚線維芽細胞において定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定した。データが、平均±ＳＥＭとして示される。対応のないスチューデントｔ検定を統計学的有意性の評価のために使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３６】
【図５Ａ−Ｊ】高い循環アスプロシンは肥満誘発性かつ糖尿病誘発性である。図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用する脂肪量及び除脂肪量と、総体重とを、ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回尾静脈注射を受けたＷＴマウスにおいて測定した（各群において、ｎ＝６）。指定された日に測定を行った。図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ：磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用する脂肪量及び除脂肪量と、総体重とを、２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けたＷＴマウスにおいて測定した（各群において、ｎ＝６）。指定された日に測定を行った。図５Ｇ、図５Ｉ：グルコース負荷試験及びインスリン抵抗性試験を、ＦＢＮ１又はＧＦＰ（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた、絶食させたＷＴマウスに対して行った（各群において、ｎ＝６）。測定をアデノウイルス注射の１０日後に行った。図５Ｈ、図５Ｊ：グルコース負荷試験及びインスリン抵抗性試験を、２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた、絶食させたＷＴマウスに対して行った（各群において、ｎ＝６）。測定を初回注射の１０日後に行った。注目すべきことに、ＧＦＰマウス（アデノウイルス媒介送達及びペプチド媒介送達の両方）に対するインスリン抵抗性試験は、グルコメーターでの値が「低すぎて測定不能」と表示された６０分の時点での重度の低血糖によって複雑化した。それらのマウスには、致命的な低血糖を防止するために外因性グルコースを注射しなければならなかった。しかしながら、ＦＢＮ１アデノウイルス注射マウス及びアスプロシン注射マウスは、図に示されるようにそれらの血中グルコースレベルを維持した。データが、平均±ＳＥＭとして示される。統計学的有意性の評価のために、対応のないスチューデントｔ検定を、２つの群を比較するときには使用し、又は、ＡＮＯＶＡを、３つ以上の群を比較するときには使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３７】
【図６Ａ−Ｄ】短縮型プロフィブリリンのドミナントネガティブ影響。図６Ａ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、ＮＰＳ患者及び非罹患コントロール被験者（ＷＴ）から得られる血漿に対して行った。図６Ｂ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、脂肪産生誘導に７日間さらされ、かつ、ビヒクル、又は分泌経路を阻止するためのモネンシンに同時にさらされたＮＰＳ患者由来（ＮＰＳ）又は非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）の皮膚線維芽細胞から得られる細胞培養培地に対して行った。図６Ｃ：ＷＴ型フィブリリン−１（ＷＴ  ＦＢＮ１）、又は、フレームシフト及びＣ末端短縮を誘発するｃ．８２０７＿８２０８Ｉｎｓ１ｂｐ変異を有する変異プロフィブリリン（ＦＢＮ１  ＮＴΔ）を発現する発現構築物の描写。図６Ｄ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、脂肪産生誘導に７日間さらされ、かつ、ビヒクル、又は分泌経路を阻止するためのモネンシンと一緒に、ＧＦＰ又は変異型の短縮型プロフィブリリン（ＦＢＮ１  ＮＴΔ）を駆動させる発現構築物に同時にさらされた非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）の皮膚線維芽細胞から得られる細胞培養培地に対して行った。
【００３８】
【図７Ａ−Ｂ】ＦＢＮ１アデノウイルス又はアスプロシンの注射は循環アスプロシンの量を増大させる。図７Ａ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けたＷＴマウスから得られる血漿に対して行った。測定をアデノウイルス注射の１０日後に行った。図７Ｂ：アスプロシンを標的とするウエスタンブロット分析を、２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けたＷＴマウスから得られる血漿に対して行った。測定を初回注射の１０日後に行った。
【００３９】
【図８Ａ−Ｂ】より高い循環アスプロシンは、増大した脂肪細胞サイズをもたらす。図８Ａ：ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られるホルマリン固定された鼠径部白色脂肪組織切片を、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。切片をアデノウイルス注射の１０日後に得た。図８Ｂ：２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られるホルマリン固定された鼠径部白色脂肪組織切片を、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。切片をアデノウイルス注射の１０日後に得た。
【００４０】
【図９Ａ−Ｄ】増大した循環アスプロシンは脂肪由来ホルモンのより高い血漿中レベルをもたらす。図９Ａ、図９Ｂ：レプチン及びアディポネクチンを、ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られる血漿において測定した（各群において、ｎ＝６）。測定をアデノウイルス注射の１０日後に行った。図９Ｃ、図９Ｄ：レプチン及びアディポネクチンを、２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られる血漿において測定した（各群において、ｎ＝６）。測定を初回注射の１０日後に行った。
【００４１】
【図１０Ａ−Ｄ】増大した循環アスプロシンは、より低い血漿中脂質もたらす。図１０Ａ、図１０Ｂ：トリグリセリド及び遊離脂肪酸を、ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られる血漿において測定した（各群において、ｎ＝６）。測定をアデノウイルス注射の１０日後に行った。図１０Ｃ、図１０Ｄ：トリグリセリド及び遊離脂肪酸を、２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られる血漿において測定した（各群において、ｎ＝６）。測定を初回注射の１０日後に行った。
【００４２】
【図１１Ａ−Ｄ】増大した循環アスプロシンは高血糖症及び高インスリン症もたらす。図１１Ａ、図１１Ｂ：グルコース及びインスリンを、ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られる血漿において測定した（各群において、ｎ＝６）。測定をアデノウイルス注射の１０日後に行った。図１１Ｃ、図１１Ｄ：グルコース及びインスリンを、２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られる血漿において測定した（各群において、ｎ＝６）。測定を初回注射の１０日後に行った。
【００４３】
【図１２Ａ−Ｂ】より高い循環アスプロシンは、増大した肝臓脂質蓄積をもたらす。図１２Ａ：ＦＢＮ１又はＧＦＰのための（ＣＭＶプロモーター制御下の）ｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られるホルマリン固定された肝臓切片を、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色し、中性脂質についてはオイルレッドＯ染色により染色した。切片をアデノウイルス注射の１０日後に得た。図１２Ｂ：２．６マイクロモル濃度の組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた４時間絶食のＷＴマウスから得られるホルマリン固定された肝臓切片を、ヘマトキシリン及びエオシンにより染色し、中性脂質についてはオイルレッドＯ染色により染色した。切片をアデノウイルス注射の１０日後に得た。
【００４４】
【図１３】フィブリリン−１分泌に対する短縮型プロフィブリリンのドミナントネガティブ効果。フィブリリン−１を標的とするウエスタンブロット分析を、脂肪産生誘導に７日間さらされ、かつ、ビヒクル、又は分泌経路を阻止するためのモネンシンと一緒に、ＧＦＰ又は変異型の短縮型プロフィブリリン（ＦＢＮ１  ＮＴΔ）を駆動させる発現構築物に同時にさらされた非罹患コントロール被験者由来（ＷＴ）の皮膚線維芽細胞から得られる細胞培養培地に対して行った。
【００４５】
【図１４】非罹患ヒト由来（ＷＴ）及びＮＰＳ患者由来（変異型）の皮膚線維芽細胞を、脂肪産生培地に７日間曝露して成熟脂肪細胞に分化させ、その後、遺伝子発現分析を行った。細胞を、ｃＤＮＡ挿入物を有しないアデノウイルス、又は、シグナルペプチドに融合されるフィブリリン−１のＣ末端ポリペプチド（これはまた、本明細書中ではアスプロシンとして示されることがある）のためのｃＤＮＡ挿入物を有するアデノウイルスに７日間にわたって同時にさらした。ＡＰ２、ＣＥＢＰα、レプチン及びアディポネクチンが、脂肪産生マーカー遺伝子である。ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３及びＴＬＲ２が、炎症誘発（ｉｎｆｌａｍｍｏｇｅｎｉｃ）マーカー遺伝子である。「Ｍｕｔ＋Ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ」群と「Ｍｕｔ＋ＣＴポリペプチド」群との間における統計学的比較のみが、明快さのために図に示される。対応のないスチューデントｔ検定を統計学的分析のために使用した。１個のアスタリスクは、ｐ＜０．０５であることを示し、２個のアスタリスクは、ｐ＜０．０１であることを示し、３個のアスタリスクは、ｐ＜０．００１であることを示す。
【００４６】
【図１５】非罹患ヒト由来（ＷＴ）及びＮＰＳ患者由来（変異型）の皮膚線維芽細胞を、脂肪産生培地に７日間曝露して成熟脂肪細胞に分化させ、その後、遺伝子発現分析を行った。細胞をビヒクル又は１０ｕｇのフィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドに７日間にわたって同時に曝露した。ＡＰ２、ＣＥＢＰα、レプチン及びアディポネクチンが、脂肪産生マーカー遺伝子である。ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ１、ＣＣＬ３及びＴＬＲ２が、炎症誘発マーカー遺伝子である。「Ｍｕｔ＋ｖｅｈｉｃｌｅ」群と「Ｍｕｔ＋ＣＴポリペプチド」群との間における統計学的比較のみが、明快さのために図に示される。対応のないスチューデントｔ検定を統計学的分析のために使用した。１個のアスタリスクは、ｐ＜０．０５であることを示し、２個のアスタリスクは、ｐ＜０．０１であることを示し、３個のアスタリスクは、ｐ＜０．００１であることを示す。
【００４７】
【図１６】ウエスタンブロット分析を、フィブリリン−１のＣ末端を特異的に検出するマウスモノクローナル抗体を使用して、標準食又は高脂肪食のどちらかが与えられたＣ５７／Ｂｌ６マウスから得られる血漿に対して行った。１６ｋｄのバンドがフィブリリン−１のＣ末端の血漿中の画分に対応する。
【００４８】
【図１７】増大した量の血漿中ＣＴポリペプチド（アスプロシン）は、アスプロシンが注射されているマウスにおいて過食をもたらす。
【００４９】
【図１８Ａ−Ｅ】新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）変異は、ヒトにおいて正常血糖を維持しながら血漿中インスリンレベルを低下させる。（図１８Ａ）２名のＮＰＳ患者（ＮＰＳ）及び４名の非罹患コントロール被験者（ＷＴ）から得られる一晩絶食時の血漿中のグルコースレベル及びインスリンレベル。（図１８Ｂ）図１８Ａにおける２名のＮＰＳ患者のＦＢＮ１変異及び家系図。標準的な家系図記号が、黒塗り記号によって記される罹患状態に関して使用される。（図１８Ｃ）：７名のＮＰＳ患者（本明細書中で報告される２名及び公開された事例報告からの５名）における３'側でのＦＢＮ１変異。患者＃２はまた、良性であることが予測され、明快さのために図には示されていない、ＦＢＮ１におけるヘテロ接合のミスセンスバリアント（ｃ．８２２２Ｔ＞Ｃ）を有する。（図１８Ｄ）ＦＢＮ１遺伝子の３'末端におけるＮＰＳ変異のクラスター化を示す概略図。（図１８Ｅ）７つすべてのＮＰＳ変異がフリン切断部位（黄色で強調されたＲＧＲＫＲＲ［配列番号６］モチーフ）の周りに集中しており、これらは、１４０アミノ酸のＣ末端ポリペプチド（アスプロシン）のヘテロ接合消失を生じさせることが予測される。フレームシフトに起因する非天然アミノ酸が赤色で示される。患者＃２、事例３及び事例５は、示された変異タンパク質を生じさせることが示されているスプライスドナー部位に変異を有する（Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。データが、平均±ＳＥＭとして示される。（配列番号１５〜２２）
【００５０】
【図１９Ａ−Ｋ】アスプロシン、すなわち、プロフィブリリンのＣ末端切断産物は、絶食応答性の血漿タンパク質である。（図１９Ａ）６つの個々のヒト血漿サンプルに対するアスプロシン免疫ブロット（レーン２〜７）。細菌発現の組換えアスプロシンを陽性コントロールとして使用した（レーン８）。分子量マーカーがレーン１に示される。（図１９Ｂ）アスプロシンのサンドイッチＥＬＩＳＡの検量線。（図１９Ｃ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、一晩絶食のヒト、マウス及びラットにおいて血漿中アスプロシンレベルを測定した（各群において、ｎ＝７）。（図１９Ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、非罹患コントロール被験者（ＷＴ）、ｍＲＮＡナンセンス変異媒介分解機構のための閾値に達するほどの５'側でのヘテロ接合ＦＢＮ１フレームシフト変異（Ｃ．６７６９−６７７３ｄｅｌ５、ｃ．１３２８−２３＿ｃ．１３３９ｄｅｌ３５ｉｎｓＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴ）を有する２名の患者（近位短縮１＆２）、及び２名のＮＰＳ患者（遠位短縮１＆２）において血漿中アスプロシンレベルを測定した。（図１９Ｅ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血漿中アスプロシンを、完全な暗闇に同調させた概日性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから４時間毎に測定した（ｎ＝５）。摂食期間には陰影が付けられる。（図１９Ｆ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、自由摂食又は一晩絶食のヒト、マウス及びラットにおいて血漿中アスプロシンレベルを測定した（各群において、ｎ＝７）。（図１９Ｇ）ＧＴＥｘヒトＲＮＡｓｅｑデータベースを使用する全ヒト組織にわたるＦＢＮ１発現。（図１９Ｈ）様々なＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス器官をｑＰＣＲによってＦｂｎ１のｍＲＮＡ発現について評価した。（図１９Ｉ）血漿中アスプロシンを、６時間絶食させた１３週齢のオスのＷＴマウス及びＢｓｃｌ２ヌルマウスから得られる血漿に対するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して評価した。（図１９Ｊ〜図１９Ｋ）ＰＰＡＲγ２のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより、また、培地中のアスプロシンをサンドイッチＥＬＩＳＡにより、脂肪産生カクテルへの７日間の曝露を伴う、又は伴わない培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に対して評価した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、その後、分泌を評価するために２４時間、グルコース非含有の無血清培地にさらした。データが、平均±ＳＥＭとして示される。図２５、図２６及び図２７もまた参照のこと。
【００５１】
【図２０Ａ−Ｉ】循環アスプロシンの増大には、マウスにおける上昇した血中グルコース及び血中インスリンが伴う。（図２０Ａ）肝臓溶解物に対するプロフィブリリン（３５０ｋＤａ）の免疫ブロットで、ＷＴマウスが、ＦＢＮ１（レーン３、４及び５）又はＧＦＰ（レーン１及び２）のためのｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた１０日後の肝臓溶解物に対する免疫ブロット。マウスを屠殺前に同期化のために２時間絶食させた。（図２０Ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、図２０Ａにおけるマウスから血漿中アスプロシンレベルを測定した（各群において、ｎ＝５）。（図２０Ｃ）図２０Ａにおけるマウスからの血漿中のグルコースレベル及びインスリンレベル（各群において、ｎ＝５）。（図２０Ｄ）血漿中のグルコースレベル及びインスリンレベルを、ＷＴマウスが（５０ｎＭのピーク血漿レベルをもたらすことが確認された）３０μｇの組換えアスプロシン又は組換えＧＦＰの毎日の皮下注射を１０日間にわたって受けた１０日後に測定した（各群において、ｎ＝５）。（図２０Ｅ）血漿中グルコースを、注射前に２時間の絶食に供されているマウスにおける皮下での組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの３０μｇの単回投与の後の示された時間で測定した（各群において、ｎ＝６）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図２０Ｆ）血漿中インスリンを、図２０Ｅにおけるマウスから注射後１５分で測定した（各群において、ｎ＝６）。（図２０Ｇ）血漿中グルコースを、注射前に一晩（約１６時間）の絶食に供されているマウスにおける皮下による組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの３０μｇの単回投与後での示された時間で測定した（各群において、ｎ＝６）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図２０Ｈ）血漿中インスリンを、図２０Ｇにおけるマウスから注射後３０分で測定した（各群において、ｎ＝６）。（図２０Ｉ）血漿中のグルカゴン、カテコールアミン類及びコルチコステロンを、注射前に２時間の絶食に供されているマウスにおける皮下による組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの３０μｇの単回用量の後の１５分〜２０分で測定した（各群において、ｎ＝６）。データが、平均±ＳＥＭとして示される。
【００５２】
【図２１Ａ−Ｅ】細胞自律的作用で、アスプロシンは肝臓を標的として、血漿中グルコースを増大させる。（図２１Ａ）グルコース負荷試験を、注射前に同期化のために２時間絶食させられるＷＴマウスにおいて３０μｇの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰによる皮下注射の２時間後に行った（各群において、ｎ＝６匹のマウス）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図２１Ｂ）インスリン抵抗性試験を、注射前に同期化のために２時間絶食させたＷＴマウスにおいて３０μｇの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰによる皮下注射の２時間後に行った（各群において、ｎ＝６匹のマウス）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図２１Ｃ）基礎（１８時間絶食後）及びクランプ処理後の肝臓のグルコース産生を、ＷＴマウスが、ＦＢＮ１又はＧＦＰのためのｃＤＮＡを有するアデノウイルスの１０１１個のウイルス粒子の１回の尾静脈注射を受けた１０日後に、高インスリン性正常血糖クランプを使用して測定した（各群において、ｎ＝７匹のマウス）。（図２１Ｄ）グルコース処理速度を図２１Ｃからのマウスにおいて測定した（各群において、ｎ＝７匹のマウス）。（図２１Ｅ）培地中のグルコース蓄積を、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、０ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、６４ｎＭ、１３８ｎＭ、２７５ｎＭ、５５０ｎＭ又は１１００ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰとインキュベーションした２時間後に測定した。データが、平均±ＳＥＭとして示される。
【００５３】
【図２２Ａ−Ｅ】アスプロシンは生体内では肝臓に輸送され、高い親和性で、飽和可能かつ競合的な様式で肝細胞表面に結合する。（図２２Ａ）ＳＰＥＣＴ走査を、ビスマスが肝臓造影剤として事前に注射された生きている麻酔下のマウスにおいて、１５０μＣｉのＩ１２５−アスプロシン、煮沸Ｉ１２５−アスプロシン又は遊離Ｉ１２５による静脈内注射の１５分後に行った。３つの代表的な画像が横断面及び冠状面で示される。（図２２Ｂ）肝臓でのアスプロシン蓄積を、図２２Ａにおけるマウスから得られる肝臓の光子強度として測定した。（図２２Ｃ）（組織重量に対して正規化される）組織の放射能を、図２２Ｃからのマウスを注射後４５分で屠殺した後、γ−カウンターを使用して測定した（ｎ＝４匹のマウス）。（図２２Ｄ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血漿中のＨｉｓタグ（組換えアスプロシンはＮ末端Ｈｉｓタグを含む）を注射前に、そして３０μｇの組換えアスプロシンによる注射の１５分後、３０分後、６０分後及び１２０分後にＷＴマウスにおいて測定した。ピークシグナルが最大レベルの半分にまで低下するために要する時間が、矢印によって示される。（図２２Ｅ）肝細胞表面でのビオチンのレベルを、非プレーティングのマウス初代肝細胞を、１００倍過剰の組換えアスプロシンを培地中に存在させて（非特異的結合）、又は存在させることなく（総結合）、組換えアスプロシン−ビオチンコンジュゲートの濃度を増大させながらインキュベーションしたとき、比色アッセイを使用して測定した。特異的結合（赤色で示される）を２つの曲線の差として計算した。データが、平均±ＳＥＭとして示される。
【００５４】
【図２３Ａ−Ｍ】アスプロシンはｃＡＭＰセカンドメッセンジャー系を使用し、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を肝臓において活性化する。（図２３Ａ）肝臓のｃＡＭＰレベルを、注射前に２時間の絶食に供されているマウスにおける皮下による組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの３０μｇの単回投与の１５分後に測定した（各群において、ｎ＝６）。（図２３Ｂ）肝臓ＰＫＡ活性を図２３Ａからのマウスにおいて測定した。（図２３Ｃ）リン酸化されたＰＫＡ触媒サブユニットについての、又はリン酸化されたセリン／トレオニンＰＫＡ基質についてのイムノブロット分析を、図２３Ａにおけるマウスから得られる肝臓溶解物に対して行った。（図２３Ｄ）肝細胞のｃＡＭＰレベルを、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく５０ｎＭの組換えアスプロシンとインキュベーションした１０分後に測定した。（図２３Ｅ）肝細胞ＰＫＡ活性を図２３Ｄからのサンプルにおいて測定した。（図２３Ｆ）肝細胞ＰＫＡ活性を、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、０ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１６ｎＭ、３２ｎＭ、６４ｎＭ、１３８ｎＭ、２７５ｎＭ、５５０ｎＭ又は１１００ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰと２時間インキュベーションしたときに測定した。（図２３Ｇ）培地中のグルコース蓄積を、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、Ｇタンパク質阻害剤（スラミン）（５μＭ）の存在下又は非存在下、５０ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰとインキュベーションした２時間後に測定した。（図２３Ｈ）肝細胞ＰＫＡ活性を図２３Ｇからのサンプルにおいて測定した。（図２３Ｉ）培地中のグルコース蓄積を、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、ＰＫＡのｃＡＭＰ誘発活性化の競合的アンタゴニスト（ｃＡＭＰＳ−Ｒｐ）（２００μＭ）の存在下又は非存在下、５０ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰとインキュベーションした２時間後に測定した。（図２３Ｊ〜図２３Ｋ）培地中のグルコース蓄積を、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、５０ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰと、あるいは１０μｇ／ｍｌのグルカゴンとグルカゴン受容体の非競合的アンタゴニスト（Ｌ１６８，０４９）（１μＭ）の存在下又は非存在下で、あるいは１００μＭのエピネフリンとβ−アドレナリン作動性受容体のアンタゴニスト（プロプラノロール）（１００μＭ）の存在下又は非存在下でインキュベーションした２時間後に測定した。ｒＧＦＰコントロール及びｒアスプロシンコントロールがＪ及びＫについては共通している。（図２３Ｌ）肝細胞ＰＫＡ活性を、マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、ビヒクル又は１０ｍｇ／Ｌのインスリンと一緒に５０ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰとインキュベーションした２時間後に測定した。（図２３Ｍ）肝細胞のグルコース産生を図２３Ｌからのサンプルにおいて測定した��データが、平均±ＳＥＭとして示される。
【００５５】
【図２４Ａ−Ｍ】免疫学的又は遺伝学的なアスプロシン機能喪失は、肝臓のグルコース産生、血漿中グルコース及び血漿中インスリンを低下させる。（図２４Ａ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血漿中アスプロシンレベルを８名の肥満のインスリン抵抗性男性被験者と、性別及び年齢が一致する８名の非肥満のコントロール被験者とにおいて測定した。関連のある生理学的パラメーターもまた示される。（図２４Ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血漿中アスプロシンレベルを、高脂肪食（カロリーの６０％が脂肪から得られる）又は標準固形飼料を１２週間にわたって受けているオスのＷＴマウスにおいて測定し、また、５週齢のオスのＯｂ／＋マウス又はＯｂ／Ｏｂマウスから、同期化のための２時間の絶食を行ったときに測定した（各群において、ｎ＝５匹のマウス）。（図２４Ｃ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血漿中アスプロシンレベルを、高脂肪食（カロリーの６０％が脂肪から得られる）を１２週間にわたって受けているオスのＷＴマウスにおいて、同期化のための２時間の絶食の後で自由摂食させながら、５００μｇのＩｇＧ又は抗アスプロシンモノクローナル抗体の腹腔内注射の後での示された時間で測定した（各群において、ｎ＝６匹のマウス）。（図２４Ｄ）血漿中グルコースを図２４Ｃからのマウスにおいて測定した。（図２４Ｅ）血漿中インスリンを図２４Ｃからのマウスにおいて測定した。（図２４Ｆ）血漿中グルコースを、５週齢のオスのＷＴマウス又はＯｂ／Ｏｂマウスにおいて、同期化のための２時間の絶食の後で自由摂食させながら、５００μｇのＩｇＧ又は抗アスプロシンモノクローナル抗体の腹腔内注射の後、示された時間で測定した（各群において、ｎ＝６匹のマウス）。（図２４Ｇ）血漿中インスリンを図２４Ｆからのマウスにおいて測定した。（図２４Ｈ）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、血漿中アスプロシンレベルを、同期化のための２時間の絶食の後、オスのＷＴマウス又はホモ接合ＭｇＲマウスにおいて測定した（各群において、ｎ＝５匹のマウス）。（図２４Ｉ）血漿中グルコースを、２時間絶食の後又は２４時間絶食の後、オスのＷＴマウス又はホモ接合ＭｇＲマウスにおいて測定した（各群において、ｎ＝５匹〜７匹のマウス）。（図２４Ｊ）血漿中インスリンを図２４Ｉからのマウスにおいて測定した。（図２４Ｋ）基礎（１８時間絶食後）及びクランプ処理後の肝臓のグルコース産生を、１０週齢のＷＴマウス又はホモ接合ＭｇＲマウスにおいて高インスリン性正常血糖クランプを使用して測定した（各群において、ｎ＝６匹のマウス）。（図２４Ｌ）グルコース処理速度を図２４Ｋからのマウスにおいて測定した（各群において、ｎ＝６匹のマウス）。（図２４Ｍ）血漿中のグルコース及びインスリンを、一晩絶食の後のオスのＷＴマウス又はホモ接合ＭｇＲマウスにおいて、３０μｇの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの皮下注射の３０分後に測定した（各群において、ｎ＝５匹〜７匹のマウス）。データが、平均±ＳＥＭとして示される。図２８、図２９、図３０及び図３１もまた参照のこと。
【００５６】
【図２５Ａ−Ｅ】哺乳動物由来のアスプロシンは進化的に十分に保存されており、分子量が約３０ｋＤａであり、３つのＮ−結合型グリコシル化部位を含むことが予測される（図１９に関連する）。（図２５Ａ）ヒトＦＢＮ１遺伝子、及び１００種の脊椎動物種にわたるその進化的保存が、ＵＣＳＣゲノムブラウザを使用して描かれる。アスプロシンコード領域が四角で囲まれる。（図２５Ｂ）ＰｈｙｌｏＰツールを１００種の脊椎動物種にわたって使用したときの塩基対保存が、ＦＢＮ１のエクソン１〜６４、アスプロシンをコードするエクソン６５〜６６、及びエクソン６６（これは１４０個のアスプロシンアミノ酸のうちの１２９個に寄与する）について示される。エクソン６６は、分析から除外された３'非翻訳領域を含む。（図２５Ｃ）ＷＴマウス及びＦｂｎ１ヌルマウスの胚性線維芽細胞から得られる細胞溶解物及び培地に対するアスプロシン免疫ブロット。（図２５Ｄ）ＮｅｔＮＧｌｙｃアルゴリズムによって予測される３つのＮ−結合型グリコシル化部位（赤色）を示すヒトアスプロシン配列（配列番号２３）。（図２５Ｅ）ＮｅｔＮＧｌｙｃアルゴリズムによって予測されるアスプロシンのＮ−結合型グリコシル化部位が、配列位置及びアルゴリズム閾値を用いて概略図として示される。
【００５７】
【図２６Ａ−Ｂ】哺乳動物由来のアスプロシンタンパク質を、マウスの白色脂肪組織、及び成熟脂肪細胞に分化させられる培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞において細胞内で検出することができる（図１９に関連する）。（図２６Ａ）ＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから得られる白色脂肪組織溶解物に対するアスプロシン及びプロフィブリリンの免疫ブロット。（図２６Ｂ）脂肪産生カクテルへの７日間の曝露を伴う、又は伴わない培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞に対するアスプロシン及びプロフィブリリンの免疫ブロット。脂肪産生が、脂質液滴の可視化（示されず）及び脂肪産生マスター遺伝子（ＰＰＡＲｇ２（図１９Ｊ））の発現によって確認された。
【００５８】
【図２７Ａ−Ｅ】アスプロシンサンドイッチＥＬＩＳＡの開発及び検証、並びに、アスプロシン分泌に対する変異プロフィブリリンのドミナントネガティブ影響を評価するためのその使用（図１９に関連する）。（図２７Ａ）大腸菌で発現されるヒト組換えアスプロシンの配列（配列番号２４）。Ｎ末端のｈｉｓタグが黄色で示され、（サンドイッチＥＬＩＳＡ用の）捕捉抗体エピトープ及び検出抗体エピトープが太字で示され、下線が引かれる。（図２７Ｂ）ＷＴマウス及びＦｂｎ１ヌルマウスの胚性線維芽細胞に対するｑＰＣＲによるＦｂｎ１のｍＲＮＡ発現。（図２７Ｃ）ＷＴマウス及びＦｂｎ１ヌルマウスの胚性線維芽細胞から得られる無血清培地に対するアスプロシンのサンドイッチＥＬＩＳＡ。細胞を通常培地で成長させ、ＰＢＳにより洗浄し、その後、分泌されたタンパク質を評価するために２４時間、無血清培地にさらした。（図２７Ｄ）マウス初代肝細胞を、細胞をＷＴマウスから単離した１時間後、細胞をプレーティングすることなく、５０ｕｇのＩｇＧ又は抗アスプロシンモノクローナル抗体による１時間の前処理の後、５０ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰとインキュベーションした２時間後に培地中のグルコース蓄積を測定した。（図２７Ｅ）ＧＦＰ又はＣ末端短縮型ヒトプロフィブリリン（これは、フレームシフトによる中途終止コドン、及び、１４０個のＣ末端プロフィブリリンアミノ酸のうちの１３６個の消失を誘発するヒトＮＰＳ変異ｃ．８２０６＿８２０７ＩｎｓＡを有する）をコードするＣＭＶ駆動ベクターによりトランスフェクションされるＷＴ型ヒト皮膚線維芽細胞におけるｑＰＣＲによるＦＢＮ１のｍＲＮＡ発現。モネンシン（薬理学的な分泌阻止剤）を陰性コントロールとして使用した。（図２７Ｆ）アスプロシンを、図２７Ｅからの培地に対するサンドイッチＥＬＩＳＡによって評価した。細胞を通常培地で成長させ、ＰＢＳにより洗浄し、その後、分泌されたタンパク質を評価するために２４時間、無血清培地にさらした。データが、平均±ＳＥＭとして示される。統計的有意性の評価のために、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００５９】
【図２８】セカンドメッセンジャーとしてのｃＡＭＰの使用、ＰＫＡ活性の突発、及び循環へのグルコース放出を引き起こし、このことは結果として、血漿中グルコースを遅れずに正常化するインスリン応答を引き起こす、肝細胞表面でのアスプロシンの作用を描く概略図。図２４に関連する。
【００６０】
【図２９Ａ−Ｆ】アスプロシンの白色脂肪組織媒介分泌が負のフィードバックループでグルコースによって抑制される（図２４に関連する）。（図２９Ａ〜図２９Ｄ）ＰＰＡＲｇ２のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲにより、また、培地中のアスプロシンをサンドイッチＥＬＩＳＡにより、脂肪産生カクテルに７日間さらされている培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に対して評価した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、その後、分泌を評価するために２４時間、グルコース非含有又はグルコース含有のどちらかの無血清培地にさらした。（図２９Ｅ）脂肪産生カクテルへの７日間の曝露を伴う、又は伴わない培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞から得られる細胞溶解物に対するアスプロシンの免疫ブロット。成熟脂肪細胞をグルコース含有又はグルコース非含有の無血清培地に２４時間さらした。前脂肪細胞は、グルコース非含有の無血清培地に同じ期間だけ曝露した。（図２９Ｆ）アスプロシンを、生理食塩水又はストレプトゾトシンが腹腔内注射される（携帯型グルコメーターによる血中グルコース値が６００ｍｇ／ｄｌを超えるまで２週間の経過にわたって３回注射される）１２週齢のオスのＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから得られる血漿に対するサンドイッチＥＬＩＳＡによって評価した。マウスを屠殺前に同期化のために２時間絶食させた。データが、平均±ＳＥＭとして示される。統計的有意性の評価のために、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００６１】
【図３０Ａ−Ｂ】細胞内アスプロシンは、Ｎ末端のシグナルペプチドが存在しないにもかかわらず、分泌可能である（図２４に関連する）。（図３０Ａ）ヒトアスプロシンのコード配列（これはＣＭＶプロモーターによって駆動される）又は空のベクターをＦｂｎ１ヌルマウスの胚性線維芽細胞にトランスフェクションした。４８時間後、アスプロシンがトランスフェクションされた細胞をＰＢＳにより洗浄し、その後、分泌を評価するために２４時間、グルコース非含有又はグルコース含有の無血清培地にさらした。空ベクターでトランスフェクションされた細胞はグルコース非含有の無血清培地に同じ期間だけ曝露した。ヒトＦＢＮ１のエクソン６６（これは１４０個のアスプロシンアミノ酸のうちの１２９個をコードする）の発現がｑＰＣＲによって決定された。（図３０Ｂ）アスプロシンを、Ｓ６Ａから得られる無血清培地に対するサンドイッチＥＬＩＳＡによって評価した。細胞を通常培地で成長させ、ＰＢＳにより洗浄し、その後、分泌されたタンパク質を評価するために２４時間、グルコース含有又はグルコース非含有の無血清培地にさらした。空ベクターでトランスフェクションされた細胞はグルコース非含有の無血清培地にのみ曝露した。データが、平均±ＳＥＭとして示される。統計的有意性の評価のために、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００６２】
【図３１Ａ−Ｄ】インスリン抵抗性は脂肪組織及び骨格筋におけるＦｂｎ１のｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションをもたらす（図２４に関連する）。（図３１Ａ）様々なマウス器官を、１２週齢のオスのＷＴマウス及びＯｂ／ＯｂマウスにおいてｑＰＣＲを使用してＦｂｎ１のｍＲＮＡ発現について評価した。マウスを屠殺前に同期化のために２時間絶食させた。（図３１Ｂ）様々なマウス器官を、１２週齢のオスの自由摂食させたＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウス又は２４時間絶食させたＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいてｑＰＣＲを使用してＦｂｎ１のｍＲＮＡ発現について評価した。マウスを屠殺前に同期化のために２時間絶食させた。（図３１Ｃ）様々なマウス臓器を、図２９ＦからのマウスにおいてｑＰＣＲを使用してＦｂｎ１のｍＲＮＡ発現について評価した。（図３１Ｄ）組換えアスプロシン及び組換えＧＦＰにおけるエンドトキシンレベルを、（最終エンドトキシン濃度を２ＥＵ／ｍｌ以下にするために要求されるほど多数回の試みにわたって）これらの組換えタンパク質をエンドトキシン除去カラムに通す前及び通した後で求めた。データが、平均±ＳＥＭとして示される。統計的有意性の評価のために、対応のないスチューデントｔ検定を使用した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００６３】
【図３２】抗アスプロシンモノクローナル抗体は食物摂取を低下させる。
【００６４】
【図３３】循環アスプロシンの免疫学的隔離。
【００６５】
【図３４Ａ−Ｂ】抗アスプロシンモノクローナル抗体は、食餌誘発肥満に伴う高インスリン症を改善する。（図３４Ａ）血漿中グルコースレベルの測定。（図３４Ｂ）血漿中インスリンレベルの測定。
【００６６】
【図３５Ａ−Ｂ】抗アスプロシンモノクローナル抗体は、Ｏｂ変異に伴う高インスリン症を改善する。（図３５Ａ）血漿中グルコースレベルの測定。（図３５Ｂ）血漿中インスリンレベルの測定。
【００６７】
【図３６Ａ−Ｂ】抗アスプロシンモノクローナル抗体の１０日間の１クールではグルコースクリアランス及び体重が、ＤＩＯマウスにおいて改善する。（図３６Ａ）１１日目におけるグルコース負荷試験の結果が示される。（図３６Ｂ）１１日目における体重が示される。
【００６８】
【図３７Ａ−Ｂ】抗アスプロシンモノクローナル抗体の１０日間の１クールではグルコースクリアランス及び体重が、ＤＩＯマウスにおいて改善する。（図３７Ａ）１３日目におけるグルコース負荷試験の結果が示される。（図３７Ｂ）１３日目における体重が示される。
【００６９】
【図３８Ａ−Ｄ】抗アスプロシンモノクローナル抗体は、下記の用量を含めて、広い効果的な用量範囲を示す：（図３８Ａ）２００μｇ；（図３８Ｂ）１００μｇ；（図３８Ｃ）５０μｇ；及び（図３８Ｄ）２５μｇ。
【００７０】
【図３９Ａ−Ｄ】抗アスプロシンモノクローナル抗体は、下記の様々な用量を使用して糖尿病マウスにおいて高血糖症を改善する：（図３９Ａ）２００μｇ；（図３９Ｂ）１００μｇ；（図３９Ｃ）５０μｇ；及び（図３９Ｄ）２５μｇ。１１７０３１７８
【００７１】
【図４０Ａ−Ｂ】抗アスプロシンモノクローナル抗体は、より重篤な糖尿病モデル＝Ｄｂ変異に対して効果的である：（図４０Ａ）：１００μｇ、グルコース負荷試験；（図４０Ｂ）１００μｇ、％体重。
【００７２】
【図４１Ａ−Ｃ】２４時間食物摂取量を、抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の毎日の１００ｕｇ用量をレプチン受容体ノックアウトマウス（ｄｂ／ｄｂ）において７日間投与したときに測定した。正規化されていないデータ（図４１Ａ）、及び、体重に対して正規化されたデータ（図４１Ｂ）又は除脂肪量に対して正規化されたデータ（図４１Ｃ）が示される。このデータを添付物として送付する。
【００７３】
【図４２】毎日の体重測定を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の１００ｕｇの単回用量を投与したときに行った。このデータを添付物として送付する。
【００７４】
【図４３】新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）には食欲減退が伴う。座りがちな女性及び活動的な女性（それぞれ、２４歳及び１８歳）についての参照値と比較されるＮＰＳ患者におけるボディーマス指数、報告された食物摂取量及び測定された食物摂取量、並びに二重標識水法及び間接熱量測定法によるエネルギー消費（Ｔｒｕｍｂｏ他、２００２）。
【００７５】
【図４４Ａ−Ｇ】アスプロシンは血液脳関門を越えて、食欲を刺激する。（図４４Ａ）内在性アスプロシンを、サンドイッチＥｌｉｓａを使用して自由摂食ラット及び一晩絶食ラットの脳脊髄液において測定した（群あたり、ｎ＝７）。（図４４Ｂ）Ｎ末端Ｈｉｓタグ（細菌発現のアスプロシンには存在する）及び総アスプロシン（組換え＋内因性）を、サンドイッチＥｌｉｓａを使用して、細菌発現のＨｉｓタグ化アスプロシンを静脈内注射した後での絶食ラットの脳脊髄液において測定した（群あたり、ｎ＝４）。（図４４Ｃ）食物摂取量を、組換えＧＦＰ又は細菌発現アスプロシンの１回だけの皮下注射をマウスにおいて行った後の２４時間の期間を通して測定し、ＣＬＡＭｓシステムを使用して求めた（群あたり、ｎ＝５）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４４Ｄ）食物摂取量を、組換えＧＦＰ又は哺乳動物細胞発現アスプロシンの１回だけの皮下注射をマウスにおいて行った後の２４時間の期間を通して測定し、ＣＬＡＭｓシステムを使用して求めた（群あたり、ｎ＝６）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４４Ｅ）組換えＧＦＰ又は細菌発現アスプロシンの脳室内（ＩＣＶ）注射の後における概日同調マウスの暗期（１２時間）の期間を通した累積食物摂取量（群あたり、ｎ＝８）。（図４４Ｆ）組換えＧＦＰ又は細菌発現アスプロシンの１日１回の注射に１０日間さらされたマウスにおける２４時間にわたる累積食物摂取量を、ＣＬＡＭｓシステムを使用して求めた（群あたり、ｎ＝５）。（図４４Ｇ）図４４Ｅからのマウスにおける２４時間にわたるエネルギー消費を、ＣＬＡＭｓシステムを使用して求めた。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４４Ｈ）脂肪量を、図４４Ｆからのマウスにおいて組換えＧＦＰ又は細菌発現アスプロシンの１日１回の注射を行う前、及び１０日間行った後において磁気共鳴画像法を使用して求めた。（図４４Ｉ）ＧＦＰ又はＦＢＮ１のアデノウイルス過剰発現を行った１０日後のマウスにおける２４時間にわたる累積食物摂取量を、ＣＬＡＭｓシステムを使用して求めた（群あたり、ｎ＝５）。（図４４Ｊ）エネルギー消費を、ＣＬＡＭｓシステムを使用して、図４４Ｈからのマウスにおいて２４時間にわたって測定した。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４４Ｋ）脂肪量を、ＧＦＰアデノウイルス又はＦｂｎ１アデノウイルスによる注射の前及び１０日後に図４４Ｈからのマウスにおいて磁気共鳴画像法を使用して求めた。（図４４Ｌ）脂肪量を、ＧＦＰアデノウイルス又はＦｂｎ１アデノウイルスによる注射の１週間後及び３週間後にマウスにおいて磁気共鳴画像法を使用して求めた（群あたり、ｎ＝５）。
【００７６】
【図４５Ａ−Ｇ】アスプロシンは食欲促進性ＡｇＲＰニューロンを活性化する。（図４５Ａ）ＧＦＰ及び細菌発現の組換えアスプロシンによる処理の後におけるＡｇＲＰニューロンの代表的な活動電位（ＡＰ）発火軌跡。（図４５Ｂ）ＧＦＰ並びに１ｎＭ及び３４ｎＭの細菌発現アスプロシンによる処理の後におけるＡｇＲＰニューロンの応答比（ＲＭ≧２ｍＶは、脱分極したとして定義され、ＲＭ≦−２ｍＶは、過分極したとして定義され、−２ｍＶ＜ＲＭ＜２ｍＶは、無応答性であるとして定義される）（ｎは、図に示される）。（図４５Ｃ）細菌発現アスプロシンによる処理の前及び後でのＡｇＲＰニューロンにおける微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＳＰＣ）の代表的な軌跡。（図４５Ｄ）細菌発現アスプロシンによる処理の前及び後でのＡｇＲＰニューロンにおけるｍＥＰＳＣ頻度とｍＥＰＳＣ振幅（群あたり、ｎ＝６）。（図４５Ｅ）ＴＴＸ（１μＭ）（上段）及び阻害剤カクテル（ＡＰ−５：３０μＭ、ＣＮＱＸ：３０μＭ、ビククリン：５０μＭ、及びＴＴＸ：１μＭ）（下段）の存在下におけるＡｇＲＰニューロン静止膜電位の代表的な軌跡。（図４５Ｆ）ＧＦＰ、１ｎＭ及び３４ｎＭの細菌発現アスプロシン、又は３４ｎＭの細菌発現アスプロシンによる処理をＴＴＸ及び阻害剤カクテル（ＡＰ−５：３０μＭ、ＣＮＱＸ：３０μＭ、ビククリン：５０μＭ、及びＴＴＸ：１μＭ）の存在下で行った後でのＡｇＲＰニューロンにおける静止膜電位の振幅変化（ＧＦＰ、ｎ＝８；アスプロシン、１ｎＭ：ｎ＝１２、３４ｎＭ：ｎ＝４４、３４ｎＭ＋ＴＴＸ：ｎ＝１１、３４ｎＭ＋ＴＴＸ＋ＣＮＱＸ＋ＡＰ５＋ビククリン：ｎ＝１３）。（図４５Ｇ）細菌発現アスプロシンによる処理をＴＴＸ又は阻害剤カクテル（ＡＰ−５：３０μＭ、ＣＮＱＸ：３０μＭ、ビククリン：５０μＭ、及びＴＴＸ：１μＭ）の存在下で行った後でのＡｇＲＰニューロンの応答比（ｎは、図に示されるように数える）。
【００７７】
【図４６Ａ−Ｄ】アスプロシンはＧαｓ−ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路を用いて、ＡｇＲＰニューロンを用量応答様式で活性化する。細菌細胞又は哺乳動物細胞で産生されるアスプロシン濃度の増加に応答したｇＲＰニューロンの発火頻度及び膜電位の変化（発火頻度：細菌由来アスプロシン、０．０１ｎＭ：ｎ＝９、０．１ｎＭ：ｎ＝１１、１ｎＭ：ｎ＝８、１０ｎＭ：ｎ＝１２、３４ｎＭ：ｎ＝２４、１００ｎＭ：ｎ＝１４；哺乳動物由来アスプロシン、０．０１ｎＭ：ｎ＝１２、０．１ｎＭ：ｎ＝１５、１ｎＭ：ｎ＝１５、１０ｎＭ：ｎ＝１４、３４ｎＭ：ｎ＝１５、１００ｎＭ：ｎ＝１５。膜電位：細菌由来アスプロシン、０．０１ｎＭ：ｎ＝１３、０．１ｎＭ：ｎ＝１１、１ｎＭ：ｎ＝１３、１０ｎＭ：ｎ＝１０、３４ｎＭ：ｎ＝３３、１００ｎＭ：ｎ＝１５；哺乳動物由来アスプロシン、０．０１ｎＭ：ｎ＝１３、０．１ｎＭ：ｎ＝１６、１ｎＭ：ｎ＝１５、１０ｎＭ：ｎ＝１５、３４ｎＭ：ｎ＝１６、１００ｎＭ：ｎ＝１５）。（図４６Ｂ）ＧＦＰによる処理、細菌発現アスプロシンによる処理を異なる阻害剤の存在下で行った後でのＡｇＲＰニューロンにおけるＡＰ発火頻度及びＡＰ膜電位の変化（発火頻度：ＧＦＰ：ｎ＝８、アスプロシン：ｎ＝３９、アスプロシン＋１００μＭのＮＫＹ８０：ｎ＝１５、アスプロシン＋５０μＭのスラミン：ｎ＝１６、アスプロシン＋２０μＭのＮＦ４４９：ｎ＝１６、アスプロシン＋５０μＭのＰＴＸ：ｎ＝１２、アスプロシン＋１μＭのＰＫＩ：ｎ＝２３、アスプロシン＋１００μＭの［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ−６：ｎ＝１３。膜電位：ＧＦＰ：ｎ＝８、アスプロシン：ｎ＝４４、アスプロシン＋１００μＭのＮＫＹ８０：ｎ＝１５、アスプロシン＋５０μＭのスラミン：ｎ＝２５、アスプロシン＋２０μＭのＮＦ４４９：ｎ＝１６、アスプロシン＋５０μＭのＰＴＸ：ｎ＝１３、アスプロシン＋１μＭのＰＫＩ：ｎ＝２４、アスプロシン＋１００μＭの［Ｄ−Ｌｙｓ  ３］−ＧＨＲＰ−６：ｎ＝１６）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４６Ｃ）ＧＦＰによる処理、細菌発現アスプロシンによる処理を異なる阻害剤の存在下で行った後でのＡｇＲＰニューロンの応答比（ｎは、図に示されるように数える）。（図４６Ｄ）ＷＴ型コントロールマウス又はＡｇＲＰ消失マウスにおけるＧＦＰ又は細菌発現アスプロシンのＩＰ注射の後での２４時間の期間を通した累積食物摂取量（群あたり、ｎ＝６）。
【００７８】
【図４７Ａ−Ｈ】アスプロシンは食欲不振誘発性ＰＯＭＣニューロンを阻害する。（図４７Ａ）ＧＦＰ及び細菌発現アスプロシンによる処理の後におけるＰＯＭＣニューロンの代表的なＡＰ発火軌跡。（図４７Ｂ）ＧＦＰ、１ｎＭ及び３４ｎＭの細菌発現アスプロシンによる処理の後におけるＰＯＭＣニューロンの応答比（ｎは、図に示す）。（図４７Ｃ）阻害剤（ＡＰ−５：３０μＭ、ＣＮＱＸ：３０μＭ、及びＴＴＸ：１μＭ）の存在下での細菌発現アスプロシンによる処理の前及び後におけるＰＯＭＣニューロンの代表的な微小抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）軌跡。（図４７Ｄ）細菌発現アスプロシンによる処理の前及び後でのＰＯＭＣニューロンにおけるｍＩＰＳＣの頻度及び振幅（群あたり、ｎ＝１０）。（図４７Ｅ）様々な阻害剤の存在下での細菌発現アスプロシンの前及び後におけるＰＯＭＣニューロンの代表的なＡＰ発火軌跡。（図４７Ｆ）ＧＦＰ又は細菌発現アスプロシンによる処理のみの後、及び、異なる阻害剤（ＡＰ−５：３０μＭ、ＣＮＱＸ：３０μＭ、及びＴＴＸ：１μＭ）又は（ＴＴＸ：１μＭ、及びビククリン：５０μＭ）の存在下におけるＰＯＭＣ膜電位の振幅変化（ＧＦＰ：ｎ＝７、１ｎＭのアスプロシン：ｎ＝１５、３４ｎＭ：ｎ＝２１、３４ｎＭ＋ＴＴＸ＋ＣＮＱＸ＋ＡＰ５：ｎ＝１２、３４ｎＭ＋ＴＴＸ＋ビククリン：ｎ＝１０）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４７Ｇ）３４ｎＭの細菌発現アスプロシンによる処理をＴＴＸ＋ビククリンの存在下で行った後におけるＰＯＭＣニューロンの応答比。（図４７Ｈ）細菌発現アスプロシンによる処理の後でのＷＴマウス及びＡｇＲＰニューロン消失マウスにおけるＰＯＭＣニューロンの膜電位の振幅変化及び発火頻度（発火頻度：ｒアスプロシン、ＷＴ：ｎ＝８；ｒアスプロシン、ＡｇＲＰ消失体：ｎ＝１７。膜電位：ｒアスプロシン、ＷＴ：ｎ＝６；ｒアスプロシン、ＡｇＲＰ消失体：ｎ＝２３）。
【００７９】
【図４８Ａ−Ｊ】マウスの新生児早老症様症候群はそのヒト障害を表現型模写する。（図４８Ａ）ＮＰＳマウスを作製するために用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９戦略の概略図。小さい（１０ｂｐ）欠失がエクソン６５とイントロン６５との接合部に導入され、これにより、スプライス部位の喪失が生じ、エクソン６５の読み飛ばしと、プロフィブリリンの短縮化とが引き起こされる（これらは、知られているＮＰＳ患者における分子的事象と同一である）（Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。（図４８Ｂ）ＷＴマウス及びＮＰＳマウスの血漿における内在性アスプロシンについてのサンドイッチＥｌｉｓａ（ＷＴ：ｎ＝６、ＮＰＳ：ｎ＝７）。（図４８Ｃ）高脂肪食で３ヶ月間飼育される５ヶ月齢のオスのＷＴマウス及びＮＰＳ同腹子の代表的な写真。（図４８Ｄ）標準固形飼料で飼育されるＷＴマウス及びＮＰＳマウスについての、ＤＥＸＡスキャンを用いた体組成データ（ＷＴ：ｎ＝８、ＮＰＳ：ｎ＝７）。（図４８Ｅ）高脂肪食で３ヶ月間飼育されるＷＴマウス及びＮＰＳマウスについての、ＤＥＸＡスキャンを用いた体組成データ（群あたり、ｎ＝８）。（図４８Ｆ）４週齢〜１４週齢のＷＴマウス及びＮＰＳマウスの体重曲線（群あたり、ｎ＝６）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４８Ｇ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、自由摂食状態及び一晩絶食状態での図４８Ｄからのマウスにおける２４時間にわたる累積食物摂取量。（図４８Ｈ）エネルギー消費を、ＣＬＡＭｓシステムを使用して、図４８Ｄからのマウスにおいて２４時間にわたって測定した。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４８Ｉ）自由摂食及び一晩絶食のＷＴマウス及びＮＰＳマウスから得られるＡｇＲＰニューロンの発火頻度及び膜電位（発火頻度：摂食、ＷＴ：ｎ＝２４；摂食、ＮＰＳ：ｎ＝２３；絶食、ＷＴ：ｎ＝２５、絶食、ＮＰＳ：ｎ＝２０。膜電位：摂食、ＷＴ：ｎ＝２４；摂食、ＮＰＳ：ｎ＝２３；絶食、ＷＴ：ｎ＝２５；絶食、ＮＰＳ：ｎ＝２８）。（図４８Ｊ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、ＧＦＰ注射後のＷＴマウス及びＮＰＳマウス、並びに細菌発現アスプロシン注射後のＮＰＳマウスにおける２４時間にわたる累積食物摂取量（群あたり、ｎ＝５）。
【００８０】
【図４９Ａ−Ｉ】アスプロシンの免疫学的隔離は肥満に対して保護的である。（図４９Ａ）アイソタイプ一致ＩｇＧ又は抗アスプロシンモノクローナル抗体を注射した１２時間後でマウスから得られるＡｇＲＰニューロンにおける発火頻度及び膜電位（発火頻度：ＩｇＧ：ｎ＝２７、抗アスプロシンｍＡｂ：ｎ＝２６。膜電位：ＩｇＧ：ｎ＝３３、抗アスプロシンｍＡｂ：ｎ＝３４）。（図４９Ｂ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、アイソタイプ一致ＩｇＧ又は抗アスプロシンｍＡｂを１日１回の注射を自由摂食状態及び一晩絶食状態で受けた８週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける２４時間にわたる累積食物摂取量（群あたり、ｎ＝５）。（図４９Ｃ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、図４９Ｂからの自由摂食マウスにおける２４時間にわたるエネルギー消費。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４９Ｄ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、アイソタイプ一致ＩｇＧ又は抗アスプロシンｍＡｂの１日１回の注射を受けた８週齢のオスのｄｂ／ｄｂマウスにおける２４時間にわたる累積食物摂取量（群あたり、ｎ＝５）。（図４９Ｅ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、図４９Ｄからのマウスにおける２４時間にわたるエネルギー消費。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４９Ｆ）図４９Ｄからのマウス及び同腹子（群あたり、ｎ＝６）における経時的な体重変化。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４９Ｇ）ＣＬＡＭＳシステムを使用する、アイソタイプ一致ＩｇＧ又は抗アスプロシンｍＡｂが５日間にわたって毎日投与されるとともに、高脂肪食が３ヶ月間与えられる２０週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける２４時間の期間を通した累積食物摂取量（群あたり、ｎ＝５）。（図４９Ｈ）ＣＬＡＭｓシステムを使用する、図４９Ｇからのマウスにおける２４時間にわたるエネルギー消費。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。（図４９Ｉ）アイソタイプ適合ＩｇＧ又は抗アスプロシンｍＡｂが５日間にわたって毎日投与される図４９Ｇからのマウス及び同腹子における経時的な体重変化（群あたり、ｎ＝６）。ボンフェローニ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ｐ値を計算した。
【００８１】
【図５０Ａ−Ｄ】哺乳動物由来のアスプロシンはグリコシル化されており、血漿中の半減期がおよそ１４５分である。（図５０Ａ）哺乳動物細胞で発現されるアスプロシンについての免疫ブロット（レーン２）。同じサンプルを酵素により脱グリコシル化し、レーン３に負荷した。細菌発現のアスプロシンをレーン１においてコントロールとして負荷した。（図５０Ｂ）ＥＬＩＳＡによって求められるような哺乳動物由来アスプロシンの血漿中の半減期。半減期を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。（図５０Ｃ）ＧＦＰ又はＦＢＮ１が肝臓においてアデノウイルスにより過剰発現させられるマウスにおける血漿中のアスプロシン濃度を、アスプロシンに対するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して求めた。（図５０Ｄ）注射及びインビトロ実験のために使用される、哺乳動物細胞で発現されるアスプロシン（グリコシル化体、約３２ｋＤａ）、細菌細胞で発現されるアスプロシン（非グリコシル化体、約１６ｋＤａ）、及び陰性コントロールとして使用されるＧＦＰ（約３５ｋＤａ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル。
【００８２】
【図５１Ａ−Ｉ】ＮＰＳマウスはヒトにおけるＮＰＳを模倣する。（図５１Ａ）血漿中のレプチン、アディポネクチン及びグレリンを、標準固形飼料で飼育されるＷＴマウス及びＮＰＳマウスを使用してＥＬＩＳＡにより測定した（ｎ＝６）。（図５１Ｂ）血漿中のレプチン、アディポネクチン及びグレリンを、高脂肪食で６ヶ月の後でのＷＴマウス及びＮＰＳマウスにおいてＥＬＩＳＡを使用して測定した（ｎ＝６）。（図５１Ｃ）ＷＴマウス及びＮＰＳマウスの体重を高脂肪食での６ヶ月の後で測定した（ｎ＝６）。（図５１Ｄ）高脂肪食で６ヵ月の後でのＷＴマウス及びＮＰＳマウスにおける血漿中グルコース（ｎ＝６）。（図５１Ｅ）高脂肪食で６ヶ月の後でのＷＴマウス及びＮＰＳマウスにおけるグルコース負荷試験（ｎ＝６）。（Ｆ）ＷＴマウス及びＮＰＳマウスにおける２４時間にわたる呼吸交換率。（図５１Ｇ）ＷＴマウス及びＮＰＳマウスの心拍数、血圧（図５１Ｈ）及び体温（図５１Ｉ）（ＮＰＳについてはｎ＝５、ＷＴについてはｎ＝７）。
【００８３】
【図５２Ａ−Ｂ】ＡｇＲＰニューロンにおけるｃ−ｆｏｓについての免疫蛍光染色。（図５２Ａ）ＩｇＧコントロール又は抗アスプロシン抗体のどちらかを受け、その後、一晩絶食させたマウスの弓状核におけるｃ−ｆｏｓ（上段）、ＮＰＹ−ＧＦＰ（中段）、及び両者を合わせた合成（下段）についての免疫蛍光。（図５２Ｂ）（図５２Ａ）からの二重陽性ニューロンを計数し、定量化した。
【００８４】
【図５３Ａ−Ｅ】抗アスプロシン中和抗体の特徴づけ。（図５３Ａ）重鎖（上方バンド）及び軽鎖（下方バンド）を示す抗アスプロシンｍＡｂのＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル。重鎖及び軽鎖による総分子量への寄与の割合をそれぞれ、デンシトメトリーによって計算した。（図５３Ｂ）抗アスプロシンｍＡｂによって検出されるアスプロシンエピトープについてのエピトープマッピング。結合エピトープが赤色で強調される（配列番号２５〜３６）。（図５３Ｃ）様々な濃度の抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシンに対するＥｌｉｓａ。５０％阻害用量（ＩＣ５０）を、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムソフトウェアを使用して計算した。（図５３Ｄ）様々な濃度の抗アスプロシンｍＡｂを１回だけ注射した後での食餌誘発肥満マウスにおける血漿中グルコース（ｎ＝６）。（図５３Ｅ）膵臓β細胞が（ストレプトゾトシン−ＳＴＺ処置）により化学的に消失させられるマウスにおける、ＩｇＧ又は抗アスプロシンｍＡｂに対する応答での血漿中グルコース。
【００８５】
【図５４Ａ−Ｋ】抗アスプロシン中和抗体はＡｇＲＰニューロン及びＰＯＭＣニューロンに対するアスプロシンの影響を可逆的に阻害する。（図５４Ａ）細菌発現アスプロシンパフ（ｐｕｆｆ）、その後、１００倍過剰の抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシン、その後、アスプロシン、又はＩｇＧコントロール抗体とプレインキュベーションされたアスプロシンに対する応答におけるＡｇＲＰニューロンの代表的な軌跡。（図５４Ｂ）細菌発現アスプロシン、抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシンに対するＡｇＲＰニューロンの発火頻度応答、及び洗い流し後におけるアスプロシンに対する応答。（図５４Ｃ）細菌発現アスプロシン、抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシンに対するＡｇＲＰニューロンの膜電位応答、及び洗い流し後におけるアスプロシンに対する応答。（図５４Ｄ）細菌発現アスプロシン及びＩｇＧコントロール抗体に対するＡｇＲＰニューロンの発火頻度応答。（図５４Ｅ）細菌発現アスプロシン及びＩｇＧコントロール抗体に対するＡｇＲＰニューロンの膜電位応答。（図５４Ｆ）細菌発現アスプロシンパフ、その後、１００倍過剰の抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシン、その後、アスプロシン、又はＩｇＧコントロール抗体とプレインキュベーションされたアスプロシンに対する応答におけるＰＯＭＣニューロンの代表的な軌跡。（図５４Ｇ）細菌発現アスプロシン、抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシンに対するＰＯＭＣニューロンの発火頻度応答、及び洗い流し後におけるアスプロシンに対する応答。（図５４Ｈ）細菌発現アスプロシン、抗アスプロシンｍＡｂとプレインキュベーションされたアスプロシンに対するＰＯＭＣニューロンの膜電位応答、及び洗い流し後におけるアスプロシンに対する応答。（図５４Ｉ）細菌発現アスプロシン及びＩｇＧコントロール抗体に対するＰＯＭＣニューロンの発火頻度応答。（図５４Ｊ）細菌発現アスプロシン及びＩｇＧコントロール抗体に対するＰＯＭＣニューロンの膜電位応答。（図５４Ｋ）８週齢のオスのＷＴマウス及びＤｂ／Ｄｂ肥満マウスにおける血漿中アスプロシンについてのＥｌｉｓａ（ＷＴ、ｎ＝５；Ｄｂ／Ｄｂ、ｎ＝６）。
【００８６】
【図５５Ａ−Ｇ】２名のＮＰＳ患者の身体計測測定値及び体組成。（図５５Ａ）２名のＮＰＳ患者の身体計測測定値：体重及び身長を測定し、ＢＭＩをこれらのデータから計算した。＊（２０１６）；†Ｔｒｕｍｂｏ他（２００２）に従って、座りがちな女性及び活動的な女性（それぞれ、２４歳及び１８歳）について計算される標準値。（図５５Ｂ）体組成を、全身カリウム（ＴＢＫ）法、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）、ＢｉｏＰｏｄ空気置換プレチスモグラフィーを使用して測定した。これらのデータから、体組成を、Ｌｏｈｍａｎ−４Ｃモデルを使用して計算した。（図５５Ｃ）体内総水分量を、二重標識水法を使用して測定し、パラメーターを計算した。（図５５Ｄ）ＴＢＷ測定値から導かれるようなエネルギー消費。（図５５Ｅ）間接熱量測定法によるエネルギー消費。（図５５Ｆ）間接熱量測定法による２４時間の期間及び睡眠期の期間を通したエネルギー消費。（図５５Ｇ）間接熱量測定法による、様々なペースでの歩行の期間及び割り当てられていない自由時間の期間を通したエネルギー消費。
【００８７】
【図５６Ａ−Ｂ】２名のＮＰＳ患者の生命徴候及び選択されたホルモンのレベル。（図５６Ａ）２名のＮＰＳ患者の血圧（三回測定）、心拍数（三回／二回測定）、呼吸数及び体温。＊（２０１４）からの参照値。（図５６Ｂ）２名のＮＰＳ患者の血漿中のレプチン、グレリン及びアディポネクチン。
【００８８】
【図５７Ａ−Ｄ】２名のＮＰＳ患者の食事思い出し結果から算出される多量栄養素及び微量栄養素の摂取量。食事思い出し結果から算出される多量栄養素及び微量栄養素の摂取量：一次エネルギー源（図５７Ａ）、脂肪及びコレステロール（図５７Ｂ）、炭水化物（図５７Ｃ）、並びに繊維（図５７Ｄ）。
【００８９】
【図５８Ａ−Ｃ】２名のＮＰＳ患者の食事思い出し結果から算出される多量栄養素及び微量栄養素の摂取量。食事思い出し結果から算出される多量栄養素及び微量栄養素の摂取量：ビタミン（図５８Ａ）、カロテノイド（図５８Ｂ）及びミネラル（図５８Ｃ）。
【００９０】
【図５９Ａ−Ｅ】２名のＮＰＳ患者の食事思い出し結果から算出される多量栄養素及び微量栄養素の摂取量。食事思い出し結果から算出される多量栄養素及び微量栄養素の摂取量：脂肪酸（図５９Ａ）、アミノ酸（図５９Ｂ）、イソフラボン等（図５９Ｃ）、糖アルコール／ポリオール（図５９Ｄ）、及び他の食品内容物（図５９Ｅ）。
【００９１】
【図６０Ａ−Ｃ】間接熱量測定法の期間を通して測定されるような２名のＮＰＳ患者のビタミン、ミネラル及びエネルギー源の摂取量並びにそれらの推奨１日摂取量。（図６０Ａ）間接熱量測定法の期間を通して２名のＮＰＳ患者において測定される様々なエネルギー源に由来するエネルギーの割合、及び１日推奨摂取量の％。＊Ｔｒｕｍｂｏ他（２００２）からの推奨摂取量。（図６０Ｂ）間接熱量測定法の期間を通して２名のＮＰＳ患者において測定される２名のＮＰＳ患者のビタミンの摂取量、及び１日推奨摂取量の％。＊Ｔｒｕｍｂｏ他（２００２）からの推奨摂取量。（図６０Ｃ）間接熱量測定法の期間を通して２名のＮＰＳ患者において測定される２名のＮＰＳ患者のミネラルの摂取量、及び１日推奨摂取量の％。＊Ｔｒｕｍｂｏ他（２００２）からの推奨摂取量。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
長年にわたる特許法の慣例と一致して、"ａ"及び"ａｎ"の単語は、請求項を含めて、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）の単語と併せて本明細書において使用されるときには、"ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ"（１つ又は複数）を意味する。  本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つ又は複数の要素、方法工程及び／又は方法からなる場合があり、あるいは、本発明の１つ又は複数の要素、方法工程及び／又は方法から本質的になる場合がある。本明細書中に記載される方法又は組成物はどれも、開示される、そして、同じ結果又は類似する結果を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく依然として得る実施形態において記載されるどのような他の方法又は組成物に関してであっても実施され得ることが意図される。
【００９３】
「効果的な量」及び「治療効果的な量」は本明細書中では交換可能に使用され、特定の生物学的結果又は治療結果（例えば、本明細書中に開示される生物学的結果又は治療結果等（これらに限定されない））を達成するために効果的である、本明細書中に記載されるような抗体又はその機能的フラグメントの量を示す。抗体又はその抗原結合フラグメントの治療効果的な量は、様々な要因に応じて、例えば、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びに抗体又はその機能的フラグメントが所望の応答を個体において誘発する能力等に応じて変化する場合がある。そのような結果には、どのような手段であれこの技術分野において好適である手段によって決定されるように、がんの処置が含まれる場合があるが、これに限定されない。
【００９４】
［Ｉ．アスプロシン］
本開示の実施形態には、フィブリリン−１のＣ末端切断フラグメントであるアスプロシンに関連づけられる方法及び組成物が含まれる。ネイティブヒトアスプロシンの配列（フィブリリン−１のアミノ酸２７３２〜２８７１）は以下の通りである：ＳＴＮＥＴＤＡＳＮＩＥＤＱＳＥＴＥＡＮＶＳＬＡＳＷＤＶＥＫＴＡＩＦＡＦＮＩＳＨＶＳＮＫＶＲＩＬＥＬＬＰＡＬＴＴＬＴＮＨＮＲＹＬＩＥＳＧＮＥＤＧＦＦＫＩＮＱＫＥＧＩＳＹＬＨＦＴＫＫＫＰＶＡＧＴＹＳＬＱＩＳＳＴＰＬＹＫＫＫＥＬＮＱＬＥＤＫＹＤＫＤＹＬＳＧＥＬＧＤＮＬＫＭＫＩＱＶＬＬＨ（配列番号１）。アスプロシンが、ある特定の実施形態においてはヒト細胞から、したがって、もはや自然界の状態では存在していないヒト細胞から単離される場合があり、又は、アスプロシンは、ある特定の実施形態においては組換え体である場合がある。本明細書中で言及されるように、配列番号１のネイティブ配列が組換え手段によって作製されるとき、得られたポリペプチドは組換えアスプロシンとして示される場合がある。組換えアスプロシンの別の一例の配列は標識又はタグを含む。一例として、大腸菌における翻訳のための開始コドンを含むためにメチオニンと一緒にＮ末端に結合されるＨｉｓタグが下記の通りである：ＭＨＨＨＨＨＨＳＴＮＥＴＤＡＳＮＩＥＤＱＳＥＴＥＡＮＶＳＬＡＳＷＤＶＥＫＴＡＩＦＡＦＮＩＳＨＶＳＮＫＶＲＩＬＥＬＬＰＡＬＴＴＬＴＮＨＮＲＹＬＩＥＳＧＮＥＤＧＦＦＫＩＮＱＫＥＧＩＳＹＬＨＦＴＫＫＫＰＶＡＧＴＹＳＬＱＩＳＳＴＰＬＹＫＫＫＥＬＮＱＬＥＤＫＹＤＫＤＹＬＳＧＥＬＧＤＮＬＫＭＫＩＱＶＬＬＨ（配列番号２）。アスプロシンの様々な実施形態には、その機能的誘導体もしくは機能的フラグメントが含まれ、そのような誘導体又はフラグメントは、効果的な量で哺乳動物に与えられたとき、食欲及び／又は体重増加を当該哺乳動物において増大させる能力を有するならば、機能的であるとみなされる場合がある。そのような活性は、例えば、脂肪量における増大を評価するためのＭＲＩ走査、又は計量器を使用する体重測定を含めて、どのような手段であれ好適な手段によって測定される場合がある。特定の実施形態において、例えば、機能的活性を、脂肪細胞分化の促進についてインビトロでアッセイすることによって評価することができる。具体的な実施形態において、アスプロシン又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体は可溶性である。アスプロシン又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体は融合タンパク質に含まれる場合がある。
【００９５】
アスプロシンのタンパク質性組成物を、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現、天然源からのタンパク質性化合物の単離、あるいはタンパク質性物質の化学合成を含めて、どのような技術であれ当業者に知られている技術によって作製することができる。アスプロシンコード領域（例えば、フィブリリン−１内のアスプロシンコード領域等、だが、アスプロシンコード領域はフィブリリン−１から分離され得る）は、その増幅及び／又は発現が、本明細書中に開示される技術を使用して、又は当業者には知られているであろうような技術を使用して行われる場合がある。代替において、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な市販調製物が当業者には知られている。
【００９６】
ある特定の実施形態において、アスプロシン（又はそのフラグメントもしくは誘導体）のタンパク質性化合物が精製される場合がある。一般に、「精製される（された）」は、様々な他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを除くために分画化に供されている具体的な、又は、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの組成物で、例えば、この具体的な、又は所望されるタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドについて当業者には知られているようなタンパク質アッセイによって評価され得るようにその活性を実質的に保持するそのような組成物を示すであろう。アスプロシンの生物学的な機能同等物（そのような誘導体及びフラグメントを含む）が用いられる場合がある。様々な修飾及び／又は変化が、類似する特性又は改善された特性を有する様々な分子を得ながら、本発明に従ってアスプロシンのポリヌクレオチド及び／又はタンパク質の構造において行われ得るので、そのような生物学的に機能的な同等物もまた本発明の範囲内に包含される。
【００９７】
アスプロシンの機能的誘導体又はそのフラグメントは、配列番号１と比較して、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個もしくは２０個又はそれ以上のアミノ酸改変を含むことがある。アスプロシンの機能的誘導体又はそのフラグメントは配列番号１のＮ末端短縮を含むことがあり、例えば、前記短縮は、最大でも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸であり、あるいは、前記短縮は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である。アスプロシンの機能的誘導体又はそのフラグメントは配列番号１のＣ末端短縮を含むことがあり、例えば、前記短縮は、最大でも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸であり、あるいは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である。アスプロシンの機能的誘導体又はそのフラグメントは配列番号１における内部欠失を含むことがあり、例えば、前記内部欠失は、最大でも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸であり、あるいは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個又は１００個のアミノ酸である。具体的な実施形態において、アスプロシンの機能的誘導体又はそのフラグメントは、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を配列番号１に対して有する配列を含むことがある。
【００９８】
具体的な実施形態において、食欲刺激剤はアスプロシン又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体を含む。食欲刺激剤は具体的には、哺乳動物個体の食欲を刺激するためにアスプロシンとともに配合される場合がある。そのような刺激剤は、低体重、栄養不足、栄養不良である個体のなかでも、質量を増加させようとしている個体、農業動物の質量を増大させようとしている個体（例えば、ウシ、ブタ、子ヒツジ、ニワトリ等）に、また、ボディービルダー等のために与えられる場合がある。刺激剤組成物はアスプロシン以外の刺激剤を含む場合がある。
【００９９】
（Ａ．修飾されたポリヌクレオチド及びポリペプチド）
アスプロシンの生物学的な機能同等物が、異なる配列を含有するように操作されており、その一方で、同時に、「野生型」タンパク質又は基準となるタンパク質をコードする能力を保持するポリヌクレオチドから産生される場合がある。このことを、遺伝暗号の縮重に合わせて、すなわち、同じアミノ酸をコードする複数のコドンの存在に合わせて達成することができる。一例において、当業者は、制限酵素認識配列をポリヌクレオチドに導入し、一方で、そのポリヌクレオチドがタンパク質をコードする能力を妨げないことを望む場合がある。
【０１００】
別の一例において、作製されたアスプロシンポリヌクレオチドは、より有意な変化を有する生物学的な機能同等物である（また、より有意な変化を有する生物学的な機能同等物をコードする）。ある特定のアミノ酸が、様々な構造体（例えば、抗体の抗原結合領域、基質分子上の結合部位、及び受容体等）との相互作用的結合能の認められるほどの喪失を伴うことなくタンパク質構造において別のアミノ酸に置換される場合がある。いわゆる「保存的」変化はタンパク質の生物学的活性を妨げず、これは、この構造変化が、その設計された機能を実行する当該タンパク質の能力に影響を与えるものでないからである。したがって、様々な変化が、本発明の目的を依然として満たしながら、本明細書中に開示される遺伝子及びタンパク質の配列において行われ得ることが、本発明者らによって意図される。
【０１０１】
機能同等物に関して、「生物学的に機能同等な」タンパク質及び／又はポリヌクレオチドの定義につきまとうものとして、許容可能なレベルの同等な生物学的活性を有する分子を保持しながら分子の定義された部分の範囲内で行われ得る変化の数には限度があるという考えがあることが、当業者によって十分に理解されている。したがって、生物学的に機能的な同等物は、選択されたアミノ酸（又はコドン）でのそれらのタンパク質（及びポリヌクレオチド）が代わって使用され得るように本明細書中では定義される。
【０１０２】
一般には、分子の長さが短いほど、機能を保持しながら分子内で行うことができる変化は少なくなる。より長いドメインは、中間的な数の変化を有する場合がある。全長タンパク質は、より多数の変化について最も大きい許容度を有するであろう。しかしながら、構造に大きく依存するある種の分子又はドメインは修飾をほとんど又は全く許容しないことがあることを理解しなければならない。
【０１０３】
アミノ酸置換は一般には、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、それらの疎水性、親水性、電荷及び／又はサイズ等）に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状及び／又はタイプを分析することにより、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンはすべて、正荷電残基であること、アラニン、グリシン及び／又はセリンはすべて、類似するサイズであること、並びに／あるいは、フェニルアラニン、トリプトファン及び／又はチロシンはすべて、概ね類似する形状を有することが明らかにされる。したがって、これらの検討に基づいて、アルギニン、リシン及び／又はヒスチジンが、アラニン、グリシン及び／又はセリンが、並びに／あるいは、フェニルアラニン、トリプトファン及び／又はチロシンが、生物学的に機能的な同等物として本明細書では定義される。
【０１０４】
より定量的な変化をもたらすために、アミノ酸のヒドロパシー指標が考慮される場合がある。それぞれのアミノ酸には、それらの疎水性及び／又は電荷特性に基づいてヒドロパシー指標が割り当てられており、これらは下記の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（０．４）；トレオニン（０．７）；セリン（０．８）；トリプトファン（０．９）；チロシン（１．３）；プロリン（１．６）；ヒスチジン（３．２）；グルタミン酸（３．５）；グルタミン（３．５）；アスパラギン酸（３．５）；アスパラギン（３．５）；リシン（３．９）；及び／又はアルギニン（４．５）。
【０１０５】
相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与することにおけるアミノ酸のヒドロパシー指標の重要性がこの技術分野では一般に理解されている（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。ある特定のアミノ酸が、類似するヒドロパシー指標及び／又はヒドロパシースコアを有する、並びに／あるいは類似する生物学的活性を依然として保持する他のアミノ酸に取って代われ得ることが知られている。ヒドロパシー指標に基づいて変化させる際には、ヒドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、及び／又は、±０．５以内であるアミノ酸の置換が一層より特に好ましい。
【０１０６】
似ているアミノ酸の置換を、それによって作製された生物学的な機能同等のタンパク質及び／又はペプチドが本発明のある特定の実施形態での場合のように免疫学的な実施形態における使用のために意図される場合には特に、親水性に基づいて効果的に行うことができることもまた理解される。米国特許第４，５５４，１０１号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所的平均親水性がその免疫原性及び／又は抗原性と相関すること、すなわち、当該タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。
【０１０７】
米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されるように、下記の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（０．５）；ヒスチジン（０．５）；システイン（１．０）；メチオニン（１．３）；バリン（１．５）；ロイシン（１．８）；イソロイシン（１．８）；チロシン（２．３）；フェニルアラニン（２．５）；トリプトファン（３．４）。類似する親水性値に基づいて変化させる際には、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、及び／又は、±０．５以内であるアミノ酸の置換が一層より特に好ましい。
【０１０８】
（Ｂ．変更されたアミノ酸）
本発明は多くの局面において、適切なポリヌクレオチドの転写及び翻訳を介する細胞内でのペプチド及びポリペプチドの合成に依拠する。これらのペプチド及びポリペプチドは２０個の「天然」アミノ酸及びそれらの翻訳後修飾を含むであろう。しかしながら、インビトロ・ペプチド合成では、修飾アミノ酸及び／又は非通常アミノ酸の使用が可能である。例示的な、しかし限定されない様々な修飾アミノ酸及び／又は非通常アミノ酸がこの技術分野において知られている。
【０１０９】
（Ｃ．模倣体）
上記で議論される生物学的な機能同等物に加えて、本発明者らはまた、構造的に又は機能的に類似する化合物が、本発明のペプチド又はポリペプチドの重要な部分を模倣するために配合され得ることを意図する。そのような化合物（これはペプチド模倣体と称されることがある）は、本発明のペプチドと同じ様式で使用される場合があり、したがって、これもまた、機能同等物である。具体的な実施形態において、模倣体はアスプロシン由来の１つ又は複数のベータプリーツを含む。
【０１１０】
タンパク質の二次構造及び三次構造の様々な要素を模倣するある種の模倣体が、Ｊｏｈｎｓｏｎ他（１９９３）において記載される。ペプチド模倣体の使用の背後にある根本的な理論的根拠が、タンパク質のペプチド骨格が主に、分子相互作用（例えば、抗体及び／又は抗原の分子相互作用等）を促進させるような方法でアミノ酸側鎖を配向させるために存在するということである。したがって、ペプチド模倣体が、天然分子と類似する分子相互作用を可能にするために設計される。そのようなペプチド模倣体には、天然のアミノ酸又はアミノ酸側鎖を全く組み込まず、しかし、アスプロシンペプチド配列に基づいて設計され、機能的にアスプロシンに取って代わる能力を有する化合物が含まれる。
【０１１１】
［ＩＩ．アスプロシン又はアスプロシン受容体の阻害剤］
本開示の実施形態には、１つ又は複数のアスプロシンの又は阻害剤が含まれる。具体的な実施形態において、阻害剤は抗体又はその結合フラグメントであり、だが、いくつかの場合において、阻害剤は抗体ではない。具体的な実施形態において、阻害剤は、１つ又は複数の小分子、１つ又は複数のアプタマー、１つ又は複数の抗体以外のファージディスプレイ由来ペプチド、及びそれらの組合せ等である場合がある。具体的な実施形態において、アスプロシンの阻害剤はアスプロシンに特異的に結合し、アスプロシンを不活性化する。具体的な実施形態において、阻害剤は可溶性である。いくつかの実施形態において、アスプロシンの可溶性受容体媒介阻害のための方法及び組成物が存在する。特定の実施形態において、ＲＮＡｉ媒介及び／又はマイクロＲＮＡ媒介の阻害が、例えば、アスプロシンがＦＢＮ１とは別個のそれ自身の転写ユニットを有する特定の実施形態において用いられる場合がある。
【０１１２】
本開示の実施形態には、アスプロシン受容体（１つ又は複数）の１つ又は複数の阻害剤が含まれる。具体的な実施形態において、阻害剤は抗体であり、だが、いくつかの場合において、阻害剤は抗体ではない。具体的な実施形態において、阻害剤は、１つ又は複数の小分子、１つ又は複数のアプタマー、１つ又は複数の抗体以外のファージディスプレイ由来ペプチド、ＲＮＡｉ媒介又はマイクロＲＮＡ媒介の阻害剤、その下流側のシグナル伝達の特異的阻害剤、あるいはそれらの組合せ等である場合がある。具体的な実施形態において、アスプロシン受容体の阻害剤はアスプロシンに特異的に結合し、アスプロシンを不活性化する。１つの具体的な実施形態において、阻害剤はその発現を特異的に阻止し、又は、他の場合にはその機能的活性を低下させる。具体的な実施形態において、阻害剤は可溶性である。
【０１１３】
具体的な実施形態において、阻害剤は構造的モチーフ又は機能モチーフを標的とし、阻害剤のアスプロシン標的部位は知られている場合があり、又は知られていない場合がある。具体的な実施形態において、阻害剤はアスプロシン由来の１つ又は複数のベータプリーツを標的とする。具体的な実施形態において、アスプロシンの阻害剤は、アスプロシンについての受容体の阻害剤である。
【０１１４】
ある特定の実施形態において、１つ又は複数のアスプロシン阻害剤を含む食欲抑制剤が存在する。抑制剤組成物はアスプロシン以外の抑制剤を有する場合がある。抑制剤が具体的には、哺乳動物個体の食欲を抑制するためにアスプロシンとともに配合される場合がある。そのような抑制剤が、過体重である個体、肥満である個体、糖尿病を有する個体、及び、過体重になることについて危険性がある個体、及び肥満になることについて危険性がある個体等に与えられる場合がある。
【０１１５】
特定の実施形態において、阻害剤は抗体又はその結合フラグメントである。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、広義には免疫学的結合作用因（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等）をどれであっても示すことが意図される。一般には、ＩｇＧ及び／又はＩｇＭが、生理学的状況における最も一般的な抗体であるために、また、実験室環境において最も容易に作製されるために好ましい。用語「抗体」は、抗原結合領域を有する抗体様分子をどのようなものであっても示すために使用され、これには、様々な抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ及びｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）等が含まれる。抗体に基づく様々な構築物及びフラグメントの調製及び使用のための様々な技術がこの技術分野では広く知られている。抗体の調製及び特徴づけのための手段もまた、この技術分野では広く知られている（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）を参照のこと；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。本開示の抗体はその標的に特異的に結合する場合がある。標的に対して「特異的に結合する」又は「特異的に免疫反応性（である）」という表現は、他の生物学的産物の不均一集団の存在下における当該分子の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定された免疫アッセイ条件のもとでは、具体的に示された分子は特定の標的に対して優先的に結合し、サンプル中に存在する他の生物学的産物には有意な量で結合しない。そのような条件のもとでの標的に対する抗体の特異的結合は、当該抗体が当該標的に対するその特異性のために選択されることを必要とする。様々な免疫アッセイ形式が、特定のタンパク質との特異的な免疫反応性を有する抗体を選択するために使用される場合がある。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質との特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。例えば、特異的な免疫反応性を決定するために使用することができる免疫アッセイ形式及び条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ及び  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）を参照のこと。
【０１１６】
（Ａ．ポリクローナル抗体）
アスプロシンに対するポリクローナル抗体が一般には、アスプロシン又はそのフラグメントと、アジュバントとの複数回の皮下（ｓｃ）注射又は腹腔内（ｉｐ）注射によって動物において惹起される場合がある。アスプロシン又は標的アミノ酸配列を含有するフラグメントを、免疫化されることになる種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン又はダイズトリプシン阻害剤等）に、二官能性剤又は誘導体化剤（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲート化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して）、グリタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を使用してコンジュゲート化することが有用である場合がある。
【０１１７】
動物が、１ｍｇ又は１μｇのコンジュゲート（ウサギ又はマウスについてそれぞれ）を３体積のフロイト完全アジュバントと混合し、この溶液を複数の部位で皮内注射することによって、免疫原性のコンジュゲート又は誘導体に対して免疫化される場合がある。１ヵ月後、動物は、複数の部位における皮下注射によってフロイト完全アジュバントにおいてコンジュゲートの元の量の１／５〜１／１０により追加免疫される。７日後〜１４日後、動物は採血され、血清が抗アスプロシン抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトー状態になるまで追加免疫される。好ましくは、動物は、同じアスプロシンの、しかし、異なるタンパク質、及び／又は異なる架橋試薬を介してコンジュゲート化されるコンジュゲートにより追加免疫される。コンジュゲートはまた、タンパク質融合物として組換え細胞培養で作製することができる。また、凝集剤（例えば、ミョウバン等）が、免疫応答を増強するために使用される。
【０１１８】
（Ｂ．モノクローナル抗体）
具体的な実施形態において、モノクローナル抗体が、個体において使用されるためのアスプロシンの阻害剤として作製され、用いられる場合がある。いくつかの場合において、抗体は、体重を減らす方法、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病又は代謝症候群を処置する方法、あるいは肥満又は過体重である人において使用するための方法において使用される。モノクローナル抗体のための免疫原はアスプロシンポリペプチド全体である場合があり、又はそのフラグメントである場合がある。
【０１１９】
モノクローナル抗体の作製のために用いられ得る免疫原の例示的な配列は以下の通りである：
【０１２０】
ＨｕＦｂｎ１−２７４６：２７７０  ＥＴＥＡＮＶＳＬＡＳＷＤＶＥＫＴＡＩＦＡＦＮＩＳＨ（配列番号３）
【０１２１】
ＨｕＦｂｎ１  ２８３８：２８６５  ＫＫＫＥＬＮＱＬＥＤＫＹＤＫＤＹＬＳＧＥＬＧＤＮＬＫＭＫ（配列番号４）
【０１２２】
具体的な実施形態において、抗体は配列番号４のアミノ酸配列におけるエピトープに結合する。エピトープは配列番号４のアミノ酸配列のすべてである場合があり、又は配列番号４のフラグメントである場合がある。エピトープは、例えば、図５３Ｂに記されるように、配列番号４のフラグメントである場合がある。具体的な実施形態において、エピトープはアミノ酸の連続する配列であり、だが、いくつかの場合において、エピトープは、形態において連続していることがある、又は連続していないことがあるアミノ酸配列の三次元立体配置に結合する。いくつかの場合において、エピトープは長さが５個〜２０個のアミノ酸であり、５個〜１５個のアミノ酸であり、５個〜１０個のアミノ酸であり、８個〜２０個のアミノ酸であり、８個〜１５個のアミノ酸であり、８個〜１０個のアミノ酸であり、１０個〜２０個のアミノ酸であり、又は１０個〜１５個のアミノ酸である。エピトープは、配列番号４の５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個もしくは２０個又はそれ以上のアミノ酸を含む場合があり、あるいは、そのような数のアミノ酸からなる場合があり、あるいは、そのような数のアミノ酸から本質的になる場合があり、いくつかの実施形態において、前記アミノ酸は配列番号４において連続しており、これに対して、他の場合において、前記アミノ酸は配列番号４において連続していない。
【０１２３】
特定の実施形態において、配列番号４を含むペプチド、又は配列番号４から本質的になるペプチド、又は配列番号４からなるペプチドに特異的に結合する単離された抗体が存在する（これには、例えば、そのようなペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体又はｓｃＦｖが含まれる）。いくつかの場合において、抗体は、配列番号４を含むペプチド、又は配列番号４から本質的になるペプチド、又は配列番号４からなるペプチドに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合部分である。本開示の実施形態には、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５の寄託アクセション番号を有するハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体が含まれる。特定の実施形態において、抗体は、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５の寄託アクセション番号を有するハイブリドーマによって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列及び軽鎖ポリペプチド配列を含む。本開示はまた、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５の寄託アクセション番号を有するハイブリドーマの１つ又は複数の単離された細胞、同様にまた、ＰＴＡ−１２３０８５のＡＴＣＣ寄託番号を有するハイブリドーマ細胞株を包含する。本開示のいずれかの細胞株によって産生される抗体（ヒト化形態を含む）が本明細書中に包含される。具体的な実施形態には、ＰＴＡ−１２３０８５の寄託アクセション番号を有する途切れないハイブリドーマ細胞株によって産生される単離及び精製されたモノクローナル抗体が含まれる。
【０１２４】
モノクローナル抗体が、実質的に均質な抗体の集団から得られる場合がある。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、より少ない量で存在していてもよい起こり得る自然発生的な変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、当該抗体の特性を、個々別々の抗体の混合物ではないとして示す。
【０１２５】
例えば、本発明の抗アスプロシンモノクローナル抗体が、Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製される場合があり、又は組換えＤＮＡ法によって作製される場合がある［Ｃａｂｉｌｌｙ他、米国特許第４，８１６，５６７号］。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター等）が、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生する、又は産生することができるリンパ球を誘発させるために本明細書中上記で記載されるように免疫化される。代替において、リンパ球がインビトロで免疫化される場合がある。その後、リンパ球が、ハイブリドーマ細胞を形成させるために、好適な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール等）を使用してミエローマ細胞と融合される［Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）］。
【０１２６】
このようにして調製されるハイブリドーマ細胞は、融合されていない親のミエローマ細胞の成長又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培養培地において播種され、成長させられる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠くならば、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むことになる（ＨＡＴ培地）。これらの物質により、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長が妨げられる。
【０１２７】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル発現を支援し、かつ、所与の培地（例えば、ＨＡＴ培地等）に対して感受性であるミエローマ細胞である。とりわけ、好ましいミエローマ細胞株が、マウスのミエローマ株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、米国）から入手可能であるＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するミエローマ株等、並びに、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．、米国）から入手可能であるＳＰ−２細胞である。
【０１２８】
ハイブリドーマ細胞が成長し続ける培養培地が、アスプロシンに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によって、又はインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等）によって求められる。
【０１２９】
モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ＆Ｐｏｌｌａｒｄ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０））のスキャッチャード分析によって求めることができる。
【０１３０】
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、当該クローンが限界希釈法によってサブクローニングされ、標準的な方法によって成長させられる場合がある。Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９頁〜１０４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）。この目的のための好適な培養培地には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長させられる場合がある。
【０１３１】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は好適には、従来の免疫グロブリン精製手法（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等）によって、培養培地、腹水又は血清から分離される。
【０１３２】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡが、（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手法を使用して容易に単離され、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。いったん単離されると、ＤＮＡは発現ベクターの中に配置される場合があり、その後、この発現ベクターが、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得るために、免疫グロブリンタンパク質を他の場合には産生しない宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はミエローマ細胞等）にトランスフェクションされる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒトの重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインのためのコード配列を相同なマウス配列に置換することによって改変される場合があり（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、６８５１（１９８４））、あるいは、非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列のすべて又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合によりつなぐことによって改変される場合がある。そのようにして、本明細書中の抗アスプロシンモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」抗体又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１３３】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは本発明の抗体の定常ドメインに置換され、又は、アスプロシンに対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位とを併せ持つキメラな二価抗体を作出するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換される。
【０１３４】
キメラ抗体又はハイブリッド抗体はまた、架橋剤を伴う方法を含めて、合成タンパク質化学における公知の方法を使用してインビトロで調製される場合がある。例えば、免疫毒素が、ジスルフィド交換反応を使用して、又はチオエーテル結合を形成させることによって構築される場合がある。この目的のための好適な試薬の例には、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミダートが含まれる。
【０１３５】
診断適用のために、本発明の抗体は典型的には、検出可能な部分により標識される場合がある。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的又は間接的のどちらであっても生じさせることができるどのようなものも可能である。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等）、蛍光性もしくは化学発光性の化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン又はルシフェリン等）、ビオチン、放射性同位体標識（例えば、Ｉ、Ｐ、Ｃ又はＨ等）、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ等）である場合がある。
【０１３６】
抗体を検出可能な部分に離れてコンジュゲート化するためにこの技術分野において知られている方法はどれも用いられる場合があり、これらには、Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、１４４：９４５（１９６２）、Ｄａｖｉｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３：１０１４（１９７４）、Ｐａｉｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０：２１９（１９８１）、及びＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０：４０７（１９８２）によって記載されるそのような方法が含まれる。
【０１３７】
本発明の抗体は、どのような知られているアッセイ方法においてであっても用いられる場合があり、例えば、競合的結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ、並びに免疫沈降アッセイ等において用いられる場合がある。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７頁〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）。
【０１３８】
競合的結合アッセイは、標識された標準物（これはアスプロシン又はその免疫学的反応性部分である場合がある）が制限量の抗体との結合について試験サンプル中の分析物（アスプロシン）と競合することができるかに依拠する。試験サンプルに存在するアスプロシンの量は、抗体に結合する標準物の量に反比例している。結合する標準物の量を決定することを容易にするために、抗体は一般には、競合の前又は後において不溶化され、その結果、抗体に結合している標準物及び分析物が、非結合のままである標準物及び分析物から都合よく分離される場合がある。
【０１３９】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体を使用することを伴い、この場合、それぞれが、検出すべきタンパク質の異なる免疫原性部分又はエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイでは、試験サンプルの分析物が、固体支持体に固定化されている第１の抗体によって結合し、その後、第２の抗体がこの分析物に結合し、したがって、これにより、不溶性の三成分複合体が形成される。Ｄａｖｉｄ＆Ｇｒｅｅｎｅ、米国特許第４，３７６，１１０号。第２の抗体がそれ自体、検出可能な部分により標識される場合があり（直接的サンドイッチアッセイ）、又は、第２の抗体が、検出可能な部分により標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定される場合がある（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つのタイプがＥＬＩＳＡアッセイであり、その場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１４０】
（Ｃ．ヒト化抗体）
特定の実施形態において、アスプロシンに対する抗体がヒト化される。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術分野では広く知られている。一般には、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から当該ヒト化抗体に導入されている１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「インポート」残基と呼ばれることが多く、この場合、「インポート」残基は典型的には、「インポート」可変ドメインから選ばれる。ヒト化を本質的には、齧歯類のＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者らの方法［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１、５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９、１５３４〜１５３６（１９８８）］に従って行うことができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、ヒト可変ドメインが実質的に無傷でないほどに、非ヒト種に由来する対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（Ｃａｂｉｌｌｙ、上掲）。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されるヒト抗体である。
【０１４１】
抗体が、抗原に対する高い親和性及び他の好都合な生物学的特性を保持しながらヒト化されることが重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、様々なヒト化抗体が、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して親配列及び様々な概念的なヒト化産物を分析するプロセスによって調製される。様々な三次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。候補である選択された免疫グロブリン配列の確からしい三次元立体配座構造を例示し、また表示する様々なコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示体を精査することにより、候補である免疫グロブリン配列の機能発現における残基の起こり得る役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基を分析することが可能になる。このようにして、ＦＲ残基をコンセンサスなインポート配列から選択し、組み合わせることができ、その結果、所望の抗体特性（例えば、標的抗原（１つ又は複数）に対する増大した親和性等）が達成される。一般には、ＣＤＲ残基が、抗原結合に影響を与えることに直接的かつ最も実質的に関与する。さらなる詳細については、米国特許出願第０７／７１５，２７２号（１９９１年６月１４日）の一部継続出願である米国特許出願第０７／９３４，３７３号（１９９２年８月２１日出願）を参照のこと。
【０１４２】
（Ｄ．ヒト抗体）
ヒトモノクローナル抗体をハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生させるためのヒトミエローマ細胞株及びマウス−ヒトのヘテロミエローマ細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３、３００１（１９８４）、及び、Ｂｒｏｄｅｕｒ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１頁〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）によって記載されている。
【０１４３】
免疫化したとき、ヒト抗体のレパートリーを内在性の免疫グロブリン産生の非存在下で産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが現在では可能である。例えば、キメラな生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ．ｓｕｂ．Ｈ）遺伝子のホモ接合欠失は、内因性の抗体産生の完全な阻害を生じさせることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをそのような生殖系列変異マウスに移入することにより、ヒト抗体の産生が抗原チャレンジのときにもたらされることになる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、２５５１〜２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６２、２５５〜２５８（１９９３）を参照のこと。
【０１４４】
代替において、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５５２〜５５３［１９９０］）を、ヒト抗体及び抗体フラグメントを非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロで産生させるために使用することができる。この技術によれば、抗体のＶドメイン遺伝子が、繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３又はｆｄ等）の主要コートタンパク質遺伝子又は副コートタンパク質遺伝子のいずれかに読み枠を合わせてクローニングされ、機能的な抗体フラグメントとしてファージ粒子の表面に提示される。
【０１４５】
繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択により、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択もまたもたらされる。したがって、ファージはＢ細胞の特性をいくつか模倣する。ファージディスプレイを様々な形式で実施することができる。それらの総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．及びＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３、５６４〜５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイのために使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ他（Ｎａｔｕｒｅ、３５２、６２４〜６２８（１９９１））は、多様な一連の抗オキサゾロン抗体を免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリーから単離した。非免疫化ヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な一連の抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、本質的には下記によって記載される技術に従って単離することができる：Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２、５８１〜５９７（１９９１）、又はＧｒｉｆｆｉｔｈ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２、７２５〜７３４（１９９３）。自然免疫応答において、抗体遺伝子には変異が高率で蓄積する（体細胞高頻度変異）。導入された変化のいくつかが、より大きい親和性を与えるであろうし、また、高親和性の表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞がその後の抗原チャレンジの期間中に優先的に複製され、分化する。この自然過程を、「鎖シャッフリング」として知られている技術を用いることによって模倣することができる（Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０、７７９〜７８３（１９９２））。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性を、重鎖及び軽鎖のＶ領域遺伝子を非免疫化ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の自然発生的なバリアント（レパートリー）のレパートリーにより順次置換することによって改善することができる。この技術は、ｎＭ範囲での親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きいファージ抗体レパートリー（これはまた、「すべてのライブラリーの母」として知られている）を作製するための戦略が、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２１、２２６５〜２２６６（１９９３）によって記載されており、高親和性のヒト抗体がそのような大きいファージライブラリーから直接に単離されことが、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ他（ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）、印刷中）によって報告される。遺伝子シャッフリングもまた、ヒト抗体を齧歯類抗体から誘導するために使用することができ、この場合、ヒト抗体は、出発する齧歯類抗体と類似する親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」としてもまた示されるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られる齧歯類抗体の重鎖又は軽鎖のＶドメイン遺伝子がヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーにより置き換えられ、これにより、齧歯類−ヒトのキメラ体が作出される。抗原に対する選択により、機能的な抗原結合部位を回復させることができるヒト可変部が単離される。すなわち、エピトープはパートナーの選定を支配している（エピトープには、パートナーの選定が刷り込まれている）。このプロセスが、残る齧歯類Ｖドメインを置き換えるために繰り返されるとき、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９３／０６２１３（１９９３年４月１日公開）を参照のこと）。ＣＤＲグラフト化による齧歯類抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、齧歯類起源のフレームワーク残基又はＣＤＲ残基を全く有しない完全なヒト抗体をもたらす。
【０１４６】
（Ｅ．二重特異性抗体）
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルな抗体（好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体）である。この場合において、結合特異性の一方が、アスプロシンに対するものであり、他方が、他の抗原に対するものであり、好ましくは別の受容体又は受容体サブユニットに対するものである。例えば、アスプロシン及びアスプロシン受容体に特異的に結合する、又は２つの異なるアスプロシン受容体に特異的に結合する二重特異性抗体が、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４７】
二重特異性抗体を作製するための様々な方法がこの技術分野では知られている。従来、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいている（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子からなる潜在的な混合物を産生し、しかし、この場合、それらのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製（これは通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる）はかなり面倒であり、生成物収率は低い。類似する手法が、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ他、ＥＭＢＯ、１０、３６５５〜３６５９（１９９１）に開示される。
【０１４８】
異なるが、より好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。この融合は好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖結合のために必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を融合物の少なくとも１つに存在させて有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合には免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡが別々の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクションされる。これにより、構築において使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらすときの様々な実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調節する際の大きい柔軟性がもたらされる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等しい比率で発現させることにより、高い収率がもたらされるとき、又は比率が特に重要でないときには、２つ又は３つすべてのポリペプチド鎖のためのコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異性抗体は、第１の結合特異性を一方のアームにおいて有するハイブリッド型の免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド型の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対とから構成される。免疫グロブリン軽鎖がこの二重特異性分子の一方の半分のみに存在することは分離の容易な方法をもたらすので、この非対称な構造は、所望の二重特異性化合物を望まれない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にすることが見出された。このアプローチが、同時係属中の米国特許出願第０７／９３１，８１１号（１９９２年８月１７日出願）に開示される。
【０１４９】
二重特異性抗体を作製することのさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１、２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１５０】
（Ｆ．ヘテロコンジュゲート抗体）
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により連結された２つの抗体から構成される。そのような抗体が、例えば、免疫系細胞を望まれない細胞に対して標的化するために提案されており（米国特許第４，６７６，９８０号）、また、ＨＩＶ感染の処置のために提案されている（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／００３６０及び同ＷＯ９２／２００３７３；欧州特許ＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、どのような架橋方法であれ好都合な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤が、多数の架橋技術とともに、この技術分野では広く知られており、米国特許第４，６７６，９８０号に開示される。
【０１５１】
［ＩＩＩ．体重増加を必要としている個体］
本開示の実施形態には、体重増加を必要としている個体において体重を増大させるための方法及び組成物が含まれる。個体は、例えば、脂肪量における増大を必要としている場合がある。個体は、医学的な状態又は様相のためであること、又は別の理由のためであることを含めて、様々な理由から体重増加を必要としている場合がある。個体が医学的状態のために低体重である場合において、医学的状態は遺伝子状態である場合があり、又は遺伝子状態でない場合があり、あるいは先天的状態である場合があり、又は先天的状態でない場合がある。低体重であることの原因は、具体的な実施形態においては、遺伝学、代謝及び／又は病気のためである場合がある。具体的な実施形態において、医学的状態は、低体重であることを症状として有する。いくつかの場合において、低体重であるという症状が、当該医学的状態を有するすべての個体に存在しており、だが、当該症状が、当該医学的状態を有するすべてでない個体に存在する場合がある。低体重であるという症状は、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症プロセスに関連づけられる経路における欠損のためである場合があり、だが、いくつかの場合において、低体重であることは直接的には、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症プロセスに関連づけられない。個体はいくつかの場合において、新生児早老症様症候群、マルファン症候群、ＨＩＶ感染、甲状腺機能亢進症、がん、結核、胃腸又は肝臓の様々な問題、医学品副作用、あるいは精神疾患（例えば、神経性食欲不振症又は神経性過食症を伴う精神疾患等）のために低体重である場合がある。例えば、悪液質を有する個体は本開示の方法及び組成物を受ける場合がある。悪液質は、例えば、がん、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイドポリニューロパチー、水銀中毒及びホルモン不足等を含む何らかの理由である場合がある。
【０１５２】
具体的な実施形態において、体重増加を必要としている個体は、１８．５未満のボディーマス指数（ＢＭＩ）、又は、その年齢及び身長の群について標準である体重より１５％〜２０％低い体重を有する個体である。本開示の方法及び組成物を受ける個体は最初に、体重増加を必要としているとして医師によって特定される場合があり、治療組成物が、体重を増大させるという具体的な目的のために当該個体に送達される場合がある。
【０１５３】
［ＩＶ．体重増加を必要としている個体の処置］
本開示の実施形態において、個体は、例えば、その体重を測定すること、並びに／あるいはそのＢＭＩを測定すること、並びに／あるいは、脂肪量を測定するためのＭＲＩ走査及び／又は二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）走査を有すること等によって、体重増加を必要としていることが決定される。当該個体は、体重増加を必要としていることが知られている場合があり、又は体重増加が必要である懸念がある場合があり、又は体重増加を必要であるリスクがある場合がある。個体は、体重増加を必要としていることを自ら決定する場合があり、及び／又は、そのことが、適する医療従事者によって決定される場合がある。
【０１５４】
個体は、体重増加を必要としていること、又は体重増加を必要とするリスク又は懸念があることが分かった場合、個体には、好適かつ効果的な量のアスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントが与えられる場合がある。具体的な実施形態において、アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントの１つ又は複数が、例えば、１つの組成物で、又は複数の組成物で個体に与えられる。アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントを含む組成物が具体的には、治療用途のために特別に配合される場合がある。
【０１５５】
個体には、必要に応じて、又は通常の治療計画の一部として、アスプロシンの好適な用量が（１回又は複数回）与えられる場合がある。個体はまた、アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントを取ることに加えて、体重を増やすための他の対策及び／又は組成物を取り続ける場合がある。個体は、毎日、毎週、毎月等でアスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントを取る場合がある。個体は、食物の摂取とともに、又は空腹時にアスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントを取る場合がある。
【０１５６】
個体は、アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントによる治療計画の経過の期間を通して医師によってモニターされる場合があり、又はモニターされない場合がある。個体は、望ましい体重が達成されると、アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントを取ることを止める場合があり、そして、体重を増やすことをその後の時点で必要としていることになるならば、アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントを取ることを再開する場合がある。個体がアスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントの好適な量を超え、その結果、体重が過度に増えるようになる場合、個体は、例えば、運動、カロリー摂取量を減らすこと、及び／又はアスプロシンの阻害剤を取ることによることを含めて、任意の好適な手段によってその体重を減らす場合がある。
［Ｖ．減量を必要としている、及び／又は改善されたグルコース制御を必要としている個体］
【０１５７】
本開示の実施形態には、減量を必要としている個体において体重を減らすための方法及び組成物が含まれる。個体は、例えば、脂肪量における低下を必要としている場合がある。個体は、医学的な状態又は様相のためであること、又は別の理由のためであることを含めて、様々な理由から減量を必要としている場合がある。個体が医学的状態のために減量を必要としている場合において、医学的状態は遺伝子状態である場合があり、又は遺伝子状態でない場合があり、また、先天的状態である場合があり、又は先天的状態でない場合がある。減量を必要としていることの原因は、遺伝学、代謝及び／又は病気からである場合がある。具体的な実施形態において、医学的状態は、過体重又は肥満であることを症状として有する。いくつかの場合において、過体重又は肥満であるという症状が、当該医学的状態を有するすべての個体に存在しており、だが、当該症状が、当該医学的状態を有するすべてでない個体に存在する場合がある。過体重又は肥満であるという症状は、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症プロセスに関連づけられる経路における欠損のためである場合があり、だが、いくつかの場合において、過体重又は肥満であることは直接的には、脂肪代謝調節、脂肪貯蔵及び炎症プロセスに関連づけられない。個体は、糖尿病、甲状腺機能低下症、メタボリックシンドロームを含む代謝障害医薬品副作用、アルコール依存症、摂食障害、睡眠不足、制限された身体運動、座りがちな生活様式、栄養不足、依存の中断及び／又はストレスのために過体重又は肥満である場合があり、だが、いくつかの実施形態において、そのような状態は、過体重又は肥満であることの結果である。
【０１５８】
いくつかの方法において、個体は肝臓グルコース放出の調節を必要としており、そのような実施形態により、循環への急速なグルコース放出を制御する経路が調節される（例えば、活性化等される）場合がある。特定の実施形態において、個体はグルコース制御における欠損を有しており、そのような欠損における改善を必要とすると決定される。具体的な実施形態において、グルコース制御における欠損は、過度な量のグルコースが個体の血液に存在するということである。特定の実施形態において、個体は糖尿病を有しており、又は前糖尿病性であり、過体重もしくは肥満である場合もあり、又は過体重もしくは肥満でない場合もある。個体には、具体的な実施形態において、過度な血中グルコースのレベルを低下させることを含めて、血中グルコース制御を改善するために、アスプロシンの阻害剤のいずれかの１つ又は複数の効果的な量が与えられる。そのような処置が糖尿病の個体又は前糖尿病性の個体に施され、血中グルコース制御における改善が生じる。血中グルコースレベルにおける低下は、必要以上に正常な血中グルコースレベルである場合があり、又は、必要以上に正常な血中グルコースレベルでない場合がある。特定の実施形態において、血中グルコース制御における改善に加えて、糖尿病又は糖尿病前症の１つ又は複数の症状が、アスプロシンの１つ又は複数の阻害剤を投与したときに改善される。本開示のいくつかの方法により、インスリン抵抗性が、例えば、アスプロシンの血漿中レベルを含めて、アスプロシンのレベルを低下させること等によって処置される。前糖尿病性の個体については、糖尿病の発症が、アスプロシンの１つ又は複数の阻害剤を使用したときに防止される。インスリン抵抗性の個体については、アスプロシンの阻害は具体的な実施形態において、インスリン感受性の回復又は改善をもたらし、その結果、より良好なグルコースクリアランスをもたらす。
【０１５９】
具体的な実施形態において、減量を必要としている個体は過体重であり（２５〜２９の間でのＢＭＩ）、又は肥満である（３０以上のＢＭＩ）。本開示の方法及び組成物を受ける個体は最初に、減量を必要としているとして医師によって特定される場合があり、治療組成物が、体重を減らすという具体的な目的のために当該個体に送達される場合がある。
【０１６０】
本開示の実施形態において、アスプロシン又は機能的誘導体もしくは機能的フラグメントの個体への投与は当該個体における糖尿病の発症をもたらさない。具体的な実施形態において、個体は糖尿病を有しており、又は糖尿病を有していない。
【０１６１】
［ＶＩ．減量を必要としている個体の処置］
本開示の実施形態において、個体は、例えば、その体重を測定すること、並びに／あるいはそのＢＭＩを評価すること、並びに／あるいは、脂肪量を測定するためのＭＲＩ走査及び／又はＤＥＸＡ走査を有すること等によって、減量を必要としていることが決定される。当該個体は、減量を必要としていることが知られている場合があり、又は減量を必要である懸念がある場合があり、又は減量を必要としているリスクがある場合がある。個体は、減量を必要としていることを自ら決定する場合があり、及び／又は、そのことが、適する医療従事者によって決定される場合がある。
【０１６２】
個体は、減量を必要としていることが知られると、又は減量を必要とするリスクがあること、もしくは懸念があることが分かった場合、個体には、好適かつ効果的な量のアスプロシンの阻害剤が与えられる場合がある。具体的な実施形態において、１つ又は複数のアスプロシン阻害剤が、例えば、１つの組成物で、又は複数の組成物で個体に与えられる。アスプロシン阻害剤を含む組成物が具体的には、治療用途のために配合される場合がある。
【０１６３】
個体には、必要に応じて、又は通常の治療計画の一部として、アスプロシン阻害剤の好適な用量が（１回又は複数回）与えられる場合がある。個体はまた、アスプロシン阻害剤を取ることに加えて、減量するための他の対策及び／又は組成物を取り続ける場合がある。個体は、毎日、毎週、毎月等でアスプロシン阻害剤を取る場合がある。個体は、食物の摂取とともに、又は空腹時にアスプロシン阻害剤を取る場合がある。
【０１６４】
個体は、アスプロシン阻害剤による治療計画の経過の期間を通して医師によってモニターされる場合があり、又はモニターされない場合がある。個体は、望ましい体重が達成されると、アスプロシン阻害剤を取ることを止める場合があり、そして、減量することをその後の時点で必要としていることになるならば、アスプロシン阻害剤を取ることを再開する場合がある。個体がアスプロシン阻害剤の好適な量を超え、その結果、減量が過度になるようになる場合、個体は、例えば、カロリー摂取量を増大させたり、並びに／あるいはアスプロシン又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体を取ることによることを含めて、任意の好適な手段によってその体重を増大させる場合がある。
【０１６５】
［ＶＩＩ．体重調節を必要としている個体の診断］
ある特定の実施形態において、個体は、その身体におけるアスプロシンのレベル（例えば、その血漿におけるアスプロシンのレベルを含む）に基づいて、体重増加を必要としていると診断され、又は体重増加を必要としがちであると診断される。好適なサンプルが個体から得られ、当該サンプルを得る関係者によって、又は第三者によってそのどちらであれ処理される場合がある。サンプルは、分析に先立って、好適な条件のもとで貯蔵及び／又は輸送される場合がある。ある特定の実施形態において、アスプロシンのレベルが、ある特定のレベルを下回っていると決定されるとき、個体は、体重増加を必要としていることがわかり、又は体重増加を必要としがちであるあることがかり、好適な量のアスプロシン又はその機能的フラグメントもしくは機能的誘導体が当該個体に与えられる。具体的な実施形態において、個体が体重増加を必要としていること、又は体重増加を必要としがちであることを特定するためではなく、その代わりに、体重増加を必要としている、又は体重増加が必要である原因の特定のために、アスプロシンのレベルに基づいて診断が行われる。
【０１６６】
ある特定の実施形態において、個体は、その身体におけるアスプロシンのレベル（例えば、その血漿におけるアスプロシンのレベルを含む）に基づいて、体重における減少を必要としていると診断され、又は体重における減少を必要としがちであると診断される。好適なサンプルが個体から得られ、当該サンプルを入手した関係者によって、又は第三者によって何らかの処理がされる場合がある。サンプルは、分析に先立って、好適な条件のもとで貯蔵及び／又は輸送される場合がある。ある特定の実施形態において、アスプロシンのレベルが、ある特定のレベルを上回っていると決定されるとき、個体は、減量を必要としていることがわかり、又は減量を必要としがちであることがわかり、好適な量の１つ又は複数のアスプロシン阻害剤が当該個体に与えられる。具体的な実施形態において、個体が減量を必要としていること、又は減量を必要としがちであることを特定するためではなく、その代わりに、減量を必要としている、又はしがちである原因を特定するために、アスプロシンのレベルに基づいて診断が行われる。具体的な場合において、肥満個体は、過剰なアスプロシンの生成を引き起こすフィブリリン−１（又はその領域）の重複を有する場合がある。
【０１６７】
身体におけるアスプロシンのレベルを特定するための任意の好適な手段が用いられうる。具体的な実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、競合的な放射性標識結合アッセイ、受容体活性アッセイ、及び／又はアスプロシン誘発の細胞内／細胞外シグナル伝達カスケードの測定が、アスプロシンの血漿中レベルを特定するために用いられる。
【０１６８】
本開示の実施形態では、抗体が個体におけるアスプロシンの検出のために利用される。抗体は、基体（例えば、プレート、ウエル、ビーズ及びチップ等）に固定化される場合があり、又は固定化されない場合がある。検出は定性的又は定量的である場合があり、定量的方法では、個体又はある特定の医学的な様相又は状態を表す又は当該個体からのサンプルにおけるアスプロシンのレベルが決定される。このレベルは、アスプロシンに特異的に結合する抗体と、アスプロシンとの間での複合体を検出することにおいて決定される場合がある。アスプロシンのレベルを個体由来のサンプルにおいて測定する方法の様々な例では、アスプロシン（例えば、配列番号４を含む、又は配列番号４からなる、又は配列番号４から本質的になるペプチド等）に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントをサンプルと接触させること、その後、複合体を前記抗体とサンプル由来のアスプロシンとの間で形成させること、その後、前記抗体／アスプロシン複合体を検出し、アスプロシンのレベルを前記サンプルにおいて決定することが含まれる。抗体は、例えば、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１２３０８５のアクセション番号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される抗体である場合がある。アスプロシンのレベルが決定されると、対応する治療法を当該個体のために用いることができ、例えば、阻害剤を、アスプロシンの上昇したレベル（例えば、正常なレベルの個体から得られるサンプルと比較して上昇している等）を有する個体のために用いることができ、あるいは、対応する治療法を、アスプロシンの低下したレベル（例えば、正常なレベルの個体から得られるサンプルと比較して低下している等）を有する個体のために用いることができ、上記レベルは、正常なレベルの範囲に対して比較される場合がある）を有する個体のために用いることができる。
【０１６９】
（ＶＩＩＩ．医薬用調製物）
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容され得るキャリアに溶解又は分散されるアスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）の１つ又は複数の効果的な量を含み、あるいは、医薬的に許容され得るキャリアに溶解又は分散される１つ又は複数のアスプロシン阻害剤の効果的な量を含む。表現「医薬的な、又は薬理学的に許容され得る」は、動物（例えば、ヒト等）に適切なように投与されたとき、有害反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成物を示す。少なくとも１つのアスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいは少なくとも１つのアスプロシン阻害剤を含有する医薬組成物の調製が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００５；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）によって例示されるように、本開示に照らして当業者には知られているであろう。そのうえ、動物（例えば、ヒト）への投与のためには、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような無菌性基準、発熱性基準、一般的安全性基準及び純度基準を満たさなければならないことが理解されるであろう。
【０１７０】
本明細書中で使用される場合、「医薬的に許容され得るキャリア」には、当業者には知られているであろうようなありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑剤、甘味剤、香味矯臭剤、色素等、及びそれらの組合せが含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年、１２８９頁〜１３２９頁）を参照のこと；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。どのようなキャリアであれ従来のキャリアは有効成分と配合禁忌である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が意図される。
【０１７１】
アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤は、固体形態、液体形態又はエアロゾル形態で投与されることになるかどうかに依存して、また、注射のような投与経路のために無菌である必要があるかどうかに依存して、異なる様々なタイプのキャリアを含む場合がある。本発明は、当業者には知られているであろうように静脈内に、皮内に、経皮的に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、筋肉内に、皮下に、粘膜に、経口的に、局所的に、局在的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接に浸ける限局性灌流、カテーテルを介して、洗浄（ｌａｖａｇｅ）を介して、クリームにおいて、脂質組成物（例えば、リポソーム）において、又は他の方法によって、あるいは前述のどのような組合せによってでも施すことができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）を参照のこと；これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１７２】
アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤は、遊離塩基形態、中性形態又は塩形態で組成物に配合される場合がある。医薬的に許容され得る塩には、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離のアミノ基により形成される酸付加塩、あるいは、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸等）、又は、酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸により形成される酸付加塩が含まれる。遊離のカルボキシル基により形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄等）、あるいは、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインのような有機塩基に由来することができる。配合されると、溶液が、投薬処方と適合する様式で、かつ、治療効果的であるような量で投与されるであろう。配合物は、様々な投薬形態物で、例えば、非経口投与のために配合される投薬形態物（例えば、注射可能な溶液、又は肺送達用エアロゾル等）、又は消化管投与のために配合される投薬形態物（例えば、薬物放出カプセル等）等で容易に投与される。
【０１７３】
さらに、本発明によれば、投与のために好適である本発明の組成物は、不活性な希釈剤を伴って、又は伴うことなく、医薬的に許容され得るキャリアにおいて提供される。キャリアは同化可能でなければならず、液体キャリア、半固体キャリア（すなわち、ペースト）、又は固体キャリアを包含する。従来の媒体、薬剤、希釈剤又はキャリアはどれも、レシピエントに対して、又は、それらにおいて含有される組成物の治療有効性に対して有害である場合を除いて、本発明の方法の実施における使用のための投与可能な組成物におけるその使用が適切である。キャリア又は希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤及び増量剤等、又はそれらの組合せが含まれる。組成物はまた、１つ又は複数の成分の酸化を遅らせるための様々な酸化防止剤を含む場合がある。加えて、保存剤によって、例えば、パラベン類（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール又はそれらの組合せ（これらに限定されない）を含めて、様々な抗菌剤及び抗真菌剤等によって微生物の作用の防止をもたらすことができる。
【０１７４】
本発明によれば、組成物は、任意の好都合かつ実用的な様式で、すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化及び吸収等によってキャリアと組み合わされる。そのような手順は当業者にとっては日常的である。
【０１７５】
本発明の具体的な実施形態において、組成物は、半固体キャリア又は固体キャリアと完全に組み合わされ、又は混合される。混合を、どのような様式であれ従来の様式で、例えば、粉砕等において行うことができる。安定化剤もまた、組成物を治療活性の喪失から保護するために、すなわち、胃における変性から保護するために、混合プロセスにおいて加えることができる。組成物における使用のための安定剤の例には、緩衝剤、アミノ酸（例えば、グリシン及びリシン等）、炭水化物（例えば、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等）が含まれる。
【０１７６】
さらなる実施形態において、本発明は、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤、１つ又は複数の脂質、及び水性溶媒を含む医薬用脂質ビヒクル組成物の使用に関する場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「脂質」は、水に特徴的に不溶性であり、かつ、有機溶媒により抽出可能である幅広い範囲の様々な物質のいずれをも含むように定義されるであろう。この幅広いクラスの様々な化合物が当業者には広く知られており、用語「脂質」が本明細書中で使用される場合、これは、どのような構造であれ特定の構造に限定されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素及びそれらの誘導体を含有する化合物が含まれる。脂質は、天然に存在するもの、又は合成されたもの（すなわち、人によって設計又は製造されたもの）である場合がある。しかしながら、脂質は通常、生物学的物質である。様々な生物学的脂質がこの技術分野では広く知られており、これらには、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル結合脂肪酸及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、並びにそれらの組合せが含まれる。当然のことながら、脂質として当業者によって理解される本明細書中に具体的に記載される化合物でない化合物もまた、本発明の組成物及び方法によって包含される。
【０１７７】
当業者は、組成物を脂質ビヒクルに分散させるために用いることができる様々な技術の範囲に精通しているであろう。例えば、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤が、脂質を含有する溶液に分散される場合があり、脂質とともに溶解される場合があり、脂質とともに乳化される場合があり、脂質と混合される場合があり、脂質と組み合わされる場合があり、脂質に共有結合される場合があり、脂質における懸濁液として含有される場合があり、ミセルもしくはリポソームとともに含有される場合があり、又はミセルもしくはリポソームと複合体化される場合があり、あるいは、他の場合には、当業者には知られている任意の手段によって脂質又は脂質構造体と会合させられる場合がある。分散により、リポソームの形成がもたらされる場合があり、又はもたらされない場合がある。
【０１７８】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投薬量を、様々な物理的要因及び生理学的要因によって、例えば、体重、状態の重篤度、処置されている疾患のタイプ、以前の治療的介入又は同時の治療的介入、患者の特発性疾患等によって、また、投与経路に基づいて決定することができる。投薬量及び投与経路に依存して、好ましい投薬量及び／又は効果的な量の投与回数が、対象の応答に応じて変化する場合がある。投与責任者は、どのような場合においても、個体対象のための組成物における有効成分（１つ又は複数）の濃度及び適切な用量投与（１回又は複数回）を決定するであろう。
【０１７９】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性な化合物を含む場合がある。他の実施形態において、活性な化合物は、単位物の重量の約２％〜約７５％の間、又は、例えば、約２５％〜約６０％の間、及び、どのような範囲であれそれらにおいて導き出せる範囲を構成する場合がある。当然のこととして、それぞれの治療有用な組成物における活性な化合物（１つ又は複数）の量が、当該化合物の任意の単位用量物において好適な投薬量が得られるように調製することができる。様々な要因、例えば、溶解性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製造物の貯蔵寿命等、同様にまた、他の薬理学的検討事項が、そのような医薬用配合物を調製する技術分野の当業者によって意図されるであろうし、また、そのようなものとして、様々な投薬量及び処置レジメンが望ましい場合がある。
【０１８０】
他の限定されない例において、用量はまた、投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重又はそれ以上まで、及び、それらの中から導出可能な範囲を含み得る。本明細書中に列挙される数字から得られる導き出せる範囲の限定されない例において、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重等の範囲を、上記数字に基づいて投与することができる。
【０１８１】
（Ａ．消化管用の組成物及び配合物）
本発明の好ましい実施形態において、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤は、消化管経路を介して投与されるために配合される。消化管経路には、組成物が消化管と直接に接触しているすべての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書中に開示される医薬組成物は、経口投与、口腔投与、直腸投与又は舌下投与により投与される場合がある。そのようなものとして、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに、又は同化可能な食用キャリアとともに配合される場合があり、あるいは硬質ゼラチンカプセル又は軟質ゼラチンカプセルに封入される場合があり、あるいは錠剤に圧縮される場合があり、あるいは食事の食物とともに直接に取り込まれる場合がある。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、活性な化合物は賦形剤とともに取り込まれ、摂取可能な錠剤、口腔テーブル剤（ｂｕｃｃａｌ  ｔａｂｌｅｓ）、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁物、シロップ剤及びウエハ剤等の形態で使用される場合がある（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ他、１９９７；Ｈｗａｎｇ他、１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号、同第５，５８０，５７９号及び同第５，７９２，４５１号（これらのそれぞれが特に、その全体において参照によって本明細書中に組み込まれる））。錠剤、トローチ剤、ピル剤及びカプセル剤等はまた、下記のものを含有する場合がある：結合剤（例えば、トラガカントガム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、ゼラチン又はそれらの組合せ等）、賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム又はそれらの組合せ等）、崩壊剤（例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸又はそれらの組合せ等）、滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、甘味剤（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン又はそれらの組合せ等）、香味矯臭剤（例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、サクランボ香味料、オレンジ香味料等）等。投薬単位形態物がカプセル剤であるとき、カプセル剤は、上記タイプの材料に加えて、液体キャリアを含有する場合がある。様々な他の材料が、被覆剤として、又は、他の場合には、投与単位物の物理的形態を変更するために存在する場合がある。例えば、錠剤、ピル剤又はカプセル剤は、シェラック、砂糖又は両者により被覆される場合がある。投薬形態物がカプセル剤であるとき、カプセル剤は、上記タイプの材料に加えて、様々なキャリア（例えば、液体キャリア等）を含有する場合がある。ゼラチンカプセル剤、錠剤又はピル剤は腸溶性被覆される場合がある。腸溶性被覆により、ｐＨが酸性である胃又は上部腸における組成物の変性が防止される。例えば、米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に達したとき、小腸における塩基性ｐＨは被覆を溶解させ、組成物が放出され、特殊化された細胞（例えば、上皮腸細胞及びパイエル板Ｍ細胞）によって吸収されることを可能にする。エリキシル剤のシロップ剤は、活性な化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、並びに香味料（例えば、サクランボ香料又はオレンジ香料等）を含有する場合がある。当然のことながら、どのような投薬単位形態物であってもその調製において使用される材料はどれも、薬学的に純粋でなければならず、かつ、用いられる量において実質的に非毒性でなければならない。加えて、活性な化合物は、徐放性の調製物及び配合物に組み込まれる場合がある。
【０１８３】
経口投与のために、本発明の組成物は代替では、口内洗浄剤、歯磨き剤、口腔錠剤、経口噴霧剤又は舌下投与配合物の形態において１つ又は複数の賦形剤とともに組み込まれる場合がある。例えば、有効成分を必要量で適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）等）において組み込む口腔洗浄剤が調製される場合がある。代替において、有効成分が、経口用溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリン及び重炭酸カリウムを含有する経口用溶液等）に組み込まれる場合があり、又は歯磨き剤に分散される場合があり、又は、水、結合剤、研磨剤、香味矯臭剤、発泡剤及び湿潤剤を含む場合がある組成物に、治療効果的な量で加えられる場合がある。代替において、組成物は、舌下に置かれる場合がある、又はそうでない場合には口内で溶解する場合がある錠剤形態又は溶液形態にされる場合がある。
【０１８４】
他の様式の消化管投与のために好適であるさらなる配合物には、坐剤が含まれる。坐剤は、直腸内への挿入のための、通常の場合には薬物が添加された様々な重量及び形状の固体投薬形態物である。挿入後、坐剤は軟化し、溶融し、又は腔液に溶解する。一般には、坐剤のために、従来のキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリド又はそれらの組合せが含まれる場合がある。ある特定の実施形態において、坐剤が、例えば、有効成分を約０．５％〜約１０％の範囲で、好ましくは約１％〜約２％の範囲で含有する混合物から形成される場合がある。
【０１８５】
（Ｂ．非経口用の組成物及び配合物）
さらなる実施形態において、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤は、非経口経路を介して投与される場合がある。本明細書中で使用される場合、用語「非経口」には、消化管を迂回する経路が含まれる。具体的には、本明細書中に開示される医薬組成物は、例えば、しかし、限定されないが、静脈内に、皮内に、筋肉内に、動脈内に、クモ膜下腔内に、皮下に、又は腹腔内に投与される場合がある。米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号、同第５，６４１，５１５号及び同第５，３９９，３６３号（これらのそれぞれが具体的にその全体において参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１８６】
遊離塩基又は薬理学的に許容され得る塩としての活性な化合物の溶液が、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース等）と好適に混合される水において調製される場合がある。分散物はまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びそれらの混合物において、また、油において調製される場合がある。貯蔵及び使用の通常の条件のもとで、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。注射剤使用のために好適である医薬用形態物には、無菌の水性溶液又は水性分散物、及び無菌の注射可能な溶液又は分散物の即時調製のための無菌粉末が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号、これは特に、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。すべての場合において、形態物は無菌でなければならず、かつ、容易な注射性が存在する程度に流動性でなければならない。形態物は、製造及び貯蔵の条件のもとで安定でなければならず、かつ、微生物（例えば、細菌及び真菌等）の混入作用から保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（すなわち、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒体が可能である。適切な流動性が、例えば、被覆剤（例えば、レシチン等）の使用によって、分散物の場合には要求される粒子サイズの維持によって、また、界面活性剤の使用によって維持される場合がある。微生物の作用を防止することが、種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸及びチメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム等）を含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期にわたる吸収が、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を組成物において使用することによってもたらされ得る。
【０１８７】
水性溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であるならば、好適に緩衝化されなければならず、液体希釈剤が最初に、十分な生理食塩水又はグルコースにより等張性にされなければならない。これらの特定の水性溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与及び腹腔内投与のためにとりわけ適している。これに関連して、用いることができる様々な無菌水性媒体が、本開示に照らして当業者には知られているであろう。例えば、１つの投薬物が等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、皮下注入液に加えられる場合があるか、又は提案された注入部位において注射される場合があるかのどちらでもある（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５頁〜１０３８頁及び１５７０頁〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量における何らかの変動が、処置される対象の状態に依存して必然的に生じるであろう。投与責任者はどのような場合においても、個体対象のための適切な用量を決定するであろう。そのうえ、ヒトへの投与のために、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような無菌性基準、発熱性基準、一般的安全性基準及び純度基準を満たさなければならない。
【０１８８】
無菌の注射可能な溶液が、活性な化合物を必要量で、必要に応じて上記で列挙される様々な他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、その後、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散物が、様々な滅菌された有効成分を、基礎となる分散媒体と、上記で列挙される成分に由来する要求された他の成分とを含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌ろ過した溶液から有効成分と追加の所望の成分との粉末を生産する真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末化組成物は、安定化剤を伴って、又は伴うことなく、液体キャリア（例えば、水又は生理食塩水溶液等）と組み合わされる。
【０１８９】
［Ｃ．その他の医薬用の組成物及び配合物］
本発明の他の好ましい実施形態において、活性な化合物であるアスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤は、例えば、局所投与（すなわち、経皮投与）、粘膜投与（鼻腔内投与、膣投与等）及び／又は吸入のような様々な多岐にわたる経路を介する投与のために配合される場合がある。
【０１９０】
局所投与のための医薬組成物は、薬用塗布物（例えば、軟膏、ペースト、クリーム又は粉末剤等）のために配合される活性な化合物を含む場合がある。軟膏は、吸着、乳化及び水溶性に基づく局所適用用のすべての油性組成物を含み、一方で、クリーム及びローションは、乳化基剤のみを含むそのような組成物である。局所投与される医薬品は、皮膚を通した有効成分の吸着を容易にするための浸透強化剤を含有する場合がある。好適な浸透強化剤には、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン及びラウロカプラムが含まれる。局所適用用の組成物のためのふさわしい基剤には、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム及びワセリン、他の任意の好適な吸収軟膏基剤、乳化軟膏基剤又は水溶性軟膏基剤が含まれる。局所用調製物はまた、有効成分を保ち、かつ、均質な混合物を提供するために、必要に応じて、乳化剤、ゲル化剤及び抗菌性保存剤を含む場合がある。本発明の経皮投与はまた、「パッチ」の使用を含む場合がある。例えば、パッチは、１つ又は複数の活性な物質を所定の速度で、かつ、連続した様式で、一定の期間にわたって供給する場合がある。
【０１９１】
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、点眼剤、鼻腔内スプレー剤、吸入及び／又は他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達される場合がある。鼻腔エアロゾルスプレー剤を介して組成物を肺に直接送達するための方法が、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号及び同第５，８０４，２１２号に記載されている（これらのそれぞれその全体において参照によって本明細書中に具体的に組み込まれる）。同様に、薬物の送達で、鼻腔内微小粒子樹脂を使用する送達（Ｔａｋｅｎａｇａ他、１９９８）、及びリゾホスファチジルグリセロール化合物を使用する送達（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照によって本明細書中に具体的に組み込まれる）もまた、製薬技術分野において広く知られている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持体マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される（その全体が参照によって本明細書中に具体的に組み込まれる）。
【０１９２】
エアロゾルという用語は、液化されたガス噴射剤又は加圧されたガス噴射剤に分散される液体粒子の微細に分割された固体のコロイド系を示す。吸入のための本発明の典型的なエアロゾルは、液体噴射剤における、又は、液体噴射剤及び好適な溶剤の混合物における有効成分の懸濁物からなるであろう。好適な噴射剤には、炭化水素及び炭化水素エーテルが含まれる。好適な容器は、噴射剤の圧力要求に従って変化するであろう。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、並びに症状の重篤度及び応答に従って変化するであろう。
【０１９３】
［ＩＸ．本開示のキット］
本明細書中に記載される組成物のどれもがキットに含められる場合がある。限定されない一例において、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）並びに／あるいはアスプロシン阻害剤がキットに含められる場合がある。したがって、キットは、好適な容器手段において、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）並びに／あるいはアスプロシン阻害剤を含むであろう。
【０１９４】
キットの成分が、水性媒体において、又は凍結乾燥形態においてそのどちらでも包装される場合がある。キットの容器手段には一般に、成分が中に入れられることがある、好ましくは好適に小分けされることがある少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段が含まれるであろう。２つ以上の成分がキットに存在する場合、当該キットはまた一般には、さらなる成分が別々に入れられることがある第２、第３又は他のさらなる容器を含むであろう。しかしながら、成分の様々な組合せがバイアルに含められる場合がある。本発明のキットはまた、典型的には、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）並びに／あるいはアスプロシン阻害剤を含有するための手段と、どのような試薬容器であれ他の試薬容器とを商用販売のための厳重な閉じ込めで含むであろう。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形プラスチック容器又はブロー成形プラスチック容器が含まれる場合がある。
【０１９５】
キットの成分が１つ及び／又は複数の液体溶液で提供されるとき、液体溶液は水溶液であり、この場合、無菌の水溶液が特に好ましい。アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤の組成物はまた、シリンジ注入可能な組成物に配合される場合がある。そのような場合において、容器手段がそれ自体、シリンジ、ピペット及び／又は他の同様な装置である場合があり、これらから、配合物が身体の感染領域に適用される場合があり、動物体内に注入される場合があり、並びに／あるいは、それどころか、キットのそれ以外の成分とともに提供される場合があり、及び／又はキットのそれ以外の成分と混合される場合がある。
【０１９６】
しかしながら、キットの成分は、乾燥された粉末（１つ又は複数）として提供される場合がある。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供されるとき、粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成される場合がある。溶媒もまた、別の容器手段において提供され得ることが想定される。
【０１９７】
本発明のキットはまた、典型的には、バイアルを商用販売のための厳重な閉じ込めで含有するための手段、例えば、所望のバイアルが保持される射出成形プラスチック容器及び／又はブロー成形プラスチック容器等を含むであろう。
【０１９８】
キットは、アスプロシン（又は機能的フラグメントもしくは機能的誘導体）あるいはアスプロシン阻害剤を食欲刺激剤又は食欲抑制剤としてそれぞれ配合されて含む場合がある。
【０１９９】
具体的な実施形態において、キットはさらに、例えば、食欲抑制剤又は食欲刺激剤を含めて、減量又は体重増加のための１つ又は複数の組成物を含む。ある特定の実施形態において、キットは、サンプルを個体から得るための、及び／又はその処理のための１つ又は複数の装置及び／又は試薬を含む。
【実施例】
【０２００】
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。下記の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は本開示に照らして、多くの変化が、開示される、そして、同じ結果又は類似する結果を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく依然として得る具体的な実施形態においてなされ得ることを理解しなければならない。
【０２０１】
［実施例１］
（最適な脂肪量を維持するために不可欠な脂肪由来のポリペプチドホルモン）
新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）随伴リポジストロフィー−ＮＰＳが、主に顔面及び四肢に影響を及ぼす、皮下脂肪組織における減少に起因する先天性の極端な痩身によって特徴づけられる（Ｈｏｕ他、２００９；Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。この表現型が典型的には、皮下脂肪の不足に起因する薄い皮膚及び顕著な脈管構造を伴って出生時に（また子宮内発育遅延として出生前でさえ）現れる（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。患者は、すべての年齢において、年齢に関して標準よりも標準偏差で数倍低いボディーマス指数（ＢＭＩ）を呈する（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。ＮＰＳ患者は、顔面形成異常特徴及び低下した皮下脂肪のために早老症様であるようであるが、真の早老症の通常の特徴（例えば、白内障、早まった毛髪の白髪化、又はインスリン抵抗性等）を有しない（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。臨床検査を通じて、２名の個体がＮＰＳと特定され、その極端な痩身表現型の原動力となる機構が本明細書中において特徴づけられる。両名の患者はＢＭＩが極端に低く（図１Ｂ）、臀部領域においては比較的影響を伴わず、顔及び手足に主に影響を及ぼす低下した皮下脂肪を甚だしく呈する（図１Ａ）。これらの患者は患者家族の中の唯一の罹患者であり、このことから、潜在的なデノボ変異又は劣性遺伝のどちらかが初めて示唆される（図１Ｂ）。
【０２０２】
全エクソーム解析により、３'側でのＦＢＮ１変異がＮＰＳにおいて特定される−全エクソーム解析と、サンガー配列決定との組合せにより、デノボのヘテロ接合の３'変異が、両名の患者におけるＦＢＮ１遺伝子において特定された（図１Ｂ、図１Ｃ）。類似事例についての文献検索により、同一の表現型と、ＦＢＮ１の３'短縮化変異との両方を記載する５件の事例報告が明らかにされた（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｈｏｒｎ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２０１１；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１；Ｔａｋｅｎｏｕｓｃｈｉ他、２０１３；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。７名すべての患者（本開示の患者を含む）がＮＰＳと診断され、すべてが短縮化変異をおよそ８６００塩基対のコード領域の７１塩基対セグメントの内部に有していた（図１Ｃ）。７つすべての変異が、最後から２番目のエクソンの３'側の５０ヌクレオチドで生じており（図１Ｃ）、ナンセンス変異媒介分解機構からの回避をもたらしていることが予測され、そして、フレームシフトに起因するフィブリリン−１タンパク質のＣ末端短縮を引き起こしている（図１Ｄ）。ＦＢＮ１は、眼、大きい血管（例えば、大動脈等）及び骨格において典型的な影響を及ぼす結合組織障害であるマルファン症候群に関連する遺伝子である（Ｐｙｅｒｉｔｚ他、２００９）。患者は典型的には、背が高く、痩身であり、かつ、その身長に対して長い指端距離を有する（Ｐｙｅｒｉｔｚ他、２００９）。本開示の患者は、古典的なマルファン症候群患者とは非常に異なるように甚だしく見えたが、入念な理学的検査により、マルファン症候群の特徴の大部分が、マルファン症候群の診断のための改訂Ｇｈｅｎｔ疾病分類学に基づいて本開示の患者において明らかにされた（Ｌｏｅｙｓ他、２０１０）。このことが、ＮＰＳをＦＢＮ１における３'変異と関連させる５件の発表された事例例報告によって裏づけられた（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｈｏｒｎ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２０１１；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１；Ｔａｋｅｎｏｕｓｃｈｉ他、２０１３；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。したがって、これらのＮＰＳ患者は、マルファン症候群の表現型（血管、眼及び骨格の特徴）と、部分的リポジストロフィーとを合わせ持つ。リポジストロフィーは独特の外観をＮＰＳ患者に与え、随伴するマルファン症候群を診断するという作業を比較的困難なものにしている。このことにより、これらの患者におけるＦＢＮ１変異が特定される前は、数十年間もＮＰＳがなぜ、マルファン症候群と何ら関連がないそれ自身の独特の臨床実体として記載されたかが説明されるかもしれない（ＯＭＩＭ  ２６４０９０）。フィブリリン−１は、モジュールに影響を及ぼす変異により、モジュールが異なれば、異なる表現型（マルファン症候群、先端短肢異形成症（Ａｃｒｏｍｉｃｒｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、幸福顔貌骨異形成症（Ｇｅｌｅｏｐｈｉｓｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、皮膚硬化症候群（Ｓｔｉｆｆ  ｓｋｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ヴァイル・マルケサーニ症候群）が生じるという点でモジュールタンパク質である（Ｐｙｅｒｉｔｚ他、２００９；Ｄａｖｉｓ他、２０１２）。したがって、さらに別の症候群がフィブリリン−１変異と関連することは驚くべきことではない。信頼できる臨床的かつ分子的な診断を用いて、本実施例では、フィブリリン−１のＣ末端短縮化変異がリポジストロフィーをもたらす機構が解明される。
【０２０３】
ＦＢＮ１は白色脂肪組織において非常に、かつ動的に発現する−ＦＢＮ１は、低下した皮下脂肪のＮＰＳ表現型と一致して、ヒト脂肪組織において高レベルで発現している（Ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ、ホモ・サピエン（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎ）プローブセット：２０２７６５＿ｓ＿ａｔ）。マウスでは、Ｆｂｎ１が、褐色脂肪組織及び骨格筋と比較して白色脂肪組織において特異的に発現される（図２Ａ）。ヒト前脂肪細胞の脂肪細胞への分化はＦＢＮ１発現における増大をもたらし（図２Ｂ）、これに対して、鼠径部脂肪組織におけるＦｂｎ１発現における低下が、高脂肪食に数週間さらされたマウスにおいて認められた（図２Ｃ）。
【０２０４】
アスプロシンはプロフィブリリンの循環性Ｃ末端切断産物である−フィブリリン−１が２８７１アミノ酸のプロタンパク質として作製され、これが細胞から分泌され、フリンと呼ばれる細胞外プロテアーゼによってＣ末端で切断される（Ｍｉｌｅｗｉｃｚ他、１９９５；Ｒｉｔｔｙ他、１９９９；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ他、１９９９；Ｗａｌｌｉｓ他、２００３）。これにより、１４０アミノ酸のＣ末端切断産物（ＣＴポリペプチド）と、細胞外マトリックス成分として働く成熟フィブリリン−１との放出とが生じる（Ｍｉｌｅｗｉｃｚ他、１９９５；Ｒｉｔｔｙ他、１９９９；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ他、１９９９；Ｗａｌｌｉｓ他、２００３）。７つすべてのＮＰＳ変異が切断部位の周りに集中しており、その結果、ＣＴポリペプチドのヘテロ接合喪失が生じている（図１Ｄ）。ＣＴポリペプチドは、このタンパク質の他の部分と比較して、また、他の種と比較したとき、進化的に最も保存されていることを示し、このことから、重要な生物学的役割が示唆される（図３Ａ、図３Ｂ）。正常な生理学的条件のもとでは、ＣＴポリペプチドは安定なままであり、ＮＰＳ表現型に関連づけられる独立した機能を有すると考えられた。ウエスタンブロッティングにより、ヒト及びマウスから得られる血漿における独特かつ目立たない１６ｋＤａの交差反応性実体の存在が確認された（図３Ｃ、図３Ｄ）。肥満のマウス及びヒトから得られる血漿を使用したとき、ＣＴポリペプチドのレベルが両方の種において脂肪過多に比例していることが見出された（図３Ｃ、図３Ｄ）。ＦＢＮ１が白色脂肪組織において高発現し、ＮＰＳ表現型が白色脂肪量の低下によって臨床的に区別されるので、このＣＴポリペプチドは、「白色」のギリシャ語であるＡｓｐｒｏｓにちなんでアスプロシンと命名された。
【０２０５】
アスプロシンはＮＰＳ随伴の脂肪産生分化欠損をインビトロで救済する−ＮＰＳ変異の影響を、ＮＰＳ患者及び非罹患コントロール被験者に由来する皮膚線維芽細胞を使用してインビトロにおいて細胞の脂肪産生分化について調べた。細胞を、多数の転写因子及び脂肪特異的遺伝子の増大した発現を誘導する脂肪産生誘導カクテル（Ｊａａｇｅｒ他、２０１２）に７日間さらした。ＷＴ細胞と比較して、ＮＰＳ変異の線維芽細胞は脂肪産生分化において著しく不完全であった（図４Ａ）。この欠損は、ＷＴ型のＦＢＮ１（図４Ｄ）又は分泌型形態のアスプロシンのどちらかを過剰発現させることによって救済することができ、しかし、その細胞内捕捉をもたらすシグナルペプチドを伴うことなく発現されるアスプロシンによって救済することはできなかった（図４Ｃ、図４Ｅ、図４Ｆ）。アスプロシンの脂肪産生作用の細胞外の作用中心を確認するために、組換えアスプロシンを大腸菌において作製した。組換えアスプロシンの培養培地への添加はＷＴ細胞における脂肪産生分化を促進させており（図４Ｇ）、ＮＰＳ変異細胞における脂肪産生欠損を救済するために十分であった（図４Ｈ）。
【０２０６】
高い循環アスプロシンは肥満誘発性かつ糖尿病誘発性である−インビボでのアスプロシンの影響を最初に調べるために、アスプロシンを、標準的な固形飼料が与えられるＷＴマウスにおいて、ＷＴ型ＦＢＮ１又はＧＦＰのためのｃＤＮＡをＣＭＶプロモーターの制御下で有するアデノウイルスを使用して肝臓で発現させた。多量のアスプロシンが、ＦＢＮ１アデノウイルスにさらされたマウスにおいて循環中に存在し（図７Ａ〜図７Ｂ）、このことは、プロフィブリリンが肝臓によって正しく分泌され、切断されたことを示唆した。アデノウイルス注射の１０日後、マウスに対するＭＲＩ走査は、循環アスプロシンがより多いマウスでは脂肪量における２．５倍の増大を示し（図５Ａ）、しかし、除脂肪量においては変化がなかった（図５Ｂ）。そのようなマウスの体重は、コントロールマウスの体重を上回って比例的に増大した（図５Ｃ）。
【０２０７】
第２のアプローチは、高度に精製された組換え型のアスプロシン又はＧＦＰを、標準的な固形飼料が与えられたＷＴマウスにおいて１０日間にわたって毎日、皮下注射することに依拠した。アデノウイルスによるアプローチと同様に、１０日間の毎日の皮下アスプロシン注射は、ＧＦＰ注射と比較して、脂肪量における有意な増大を引き起こした（図５Ｄ）。アデノウイルス実験とは対照的に、アスプロシン注射マウス及びＧＦＰ注射マウスの両方の除脂肪量は、毎日の取扱い及び注射によってマウスに強いられるストレスを反映しているかもしれない、わずかではあるが、有意な低下を示した（図５Ｅ）。それにもかかわらず、両方のアプローチは、循環アスプロシンの量を急性的に増大させることがインビボにおける脂肪拡大の原動力となっていることを明らかにした。両方の実験において、鼠径部白色脂肪の顕微鏡検査では、より大きい脂肪細胞容積が、アスプロシンにさらされたマウスにおいて示された（図８Ａ〜図８Ｂ）。これらのマウスにおけるより大きな脂肪過多と一致して、血漿中のレプチン及びアディポネクチン（これらは、循環レベルが脂肪量に正比例していることが知られている脂肪由来ホルモンである）のより大きいレベルが認められた（図９Ａ〜図９Ｄ）。同時に、血漿中のトリグリセリド及び遊離脂肪酸のより低いレベルが認められた（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。このことは、より大きい脂肪細胞におけるより大きい脂質隔離を反映している可能性がある。
【０２０８】
より大きい循環アスプロシンにさらされたマウスにおいて肥満の開始があったことを考慮して、グルコース恒常性をこれらの動物においてアッセイした。絶食させたアスプロシン処置マウスは高血糖症及び高インスリン血症を示し（図１１Ａ〜図１１Ｄ）、このことはインスリン抵抗性を示唆した。グルコース負荷試験及びインスリン抵抗性試験はともに、大きい循環アスプロシンの糖尿病誘発作用と一致していた（図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ、図５Ｊ）。肥満の状態及びインスリン抵抗性と一致して、より大きい循環アスプロシンにさらされた動物の肝臓における増大した脂質蓄積が認められた（図１２Ａ〜図１２Ｂ）。要約すると、循環アスプロシンにおける急性的増大は、マウスにおいて肥満誘発かつ糖尿病誘発の強力な作用を有することが見出された。
【０２０９】
短縮型プロフィブリリンのドミナントネガティブ影響−極端に痩せていることに加えて、ＮＰＳ患者はまた、インスリン感受性である（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。多すぎる循環アスブロシンにさらされたマウスの正反対の生理学的プロフィルは、ＮＰＳ表現型が、低下した循環アスプロシンレベルのためである可能性が高いことを裏づけている。それらのヘテロ接合遺伝子型から、ＮＰＳ患者は、非罹患コントロールと比較して、循環アスプロシンが半減しているにちがいないことが予測され、しかし、検出可能な循環アスプラシンがこれらの患者では全く認められなかった（図６Ａ）。最近、ＣＴポリペプチドが細胞からのプロフィブリリン分泌のために必要であることが示されている（Ｊｅｎｓｅｎ他、２０１４）。その非存在下において、ナンセンス変異媒介分解機構を逃れる短縮型プロフィブリリンは、細胞内に閉じ込められたままである（Ｊｅｎｓｅｎ他、２０１４）。したがって、ＮＰＳにおける変異した短縮型プロフィブリリンは、ＷＴ型対立遺伝子に由来するプロフィブリリンの分泌を妨げるためにドミナントネガティブ様式で作用すると考えられた。このことはまた、ナンセンス変異媒介分解機構をその後に受けるより多くのＮ末端短縮化、又は遺伝子全体の欠失（これらの両方が短縮型プロフィブリリンを発現させないであろう）を有する患者においては少なくとも、ＮＰＳ表現型がなぜ、古典的なマルファン症候群と異なっているかが説明し得る。この理論を検証するために、アスプロシンのレベルを、ＮＰＳ細胞から得られる細胞培地において、同様にまた、変異した短縮型プロフィブリリンの過剰発現を有するＷＴ細胞から得られる細胞培地においてアッセイした。両方の場合において、予想されるように、培地中のアスプロシンレベルが顕著に低下していた（図６Ｂ、図６Ｄ）。加えて、ＷＴ細胞における変異プロフィブリリンの過剰発現は、培地中へのフィブリリン−１分泌量を低下させるために十分であり、このことから、ドミナントネガティブ様式の病理発生が、ＮＰＳとともに見られるマルファン症候群表現型について示唆された（図１３）。
【０２１０】
（方法）
研究被験者及び倫理表明−インフォームドコンセントをベイラー医科大学における３つの施設内審査委員会承認プロトコルの１つに従ってすべての被験者から参加前に得た。
【０２１１】
臨床評価−臨床医により、研究被験者が、直接の病歴、理学的検査及び家族歴分析によって評価された。カルテ記録及びメモの形式での臨床情報を再検討した。これらの被験者との面談もまた電話によって行った。家族が患者と一緒に面談を受けた。利用可能な場合にはいつも、以前の診断研究、手術報告又は放射線学的研究からの報告を再検討した。インフォームドコンセントの後、皮膚線維芽細胞の単離のための皮膚生検を適切な麻酔剤及び全般的な予防措置のもとで行った。
【０２１２】
全エクソームの取得及び配列決定−患者＃１及びその両親から得られるゲノムＤＮＡを全エクソーム解析に供した（トリオ分析）。全エクソーム解析のために利用される様々な方法が以前に詳しく記載されている（Ｌｕｐｓｋｉ他、２０１３）。要約すると、１ｍｇのゲノムＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓプレート（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）において超音波処理によって断片化した。ゲノムＤＮＡサンプルを、記載（Ｌｕｐｓｋｉ他、２０１３）のようにＩｌｌｕｍｉｎａ対形成末端ライブラリーに構築した。プリキャプチャー・ライブラリーを一緒にプールし、ＢＣＭ−ＨＧＳＣ  ＣＯＲＥのエクソームキャプチャー設計物に対して溶液中でハイブリダイゼーションさせた（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ他、２０１１）（５２Ｍｂ、Ｎｉｍｂｌｅ−Ｇｅｎ）。取得ＤＮＡフラグメントを、サンプルあたり９Ｇｂ〜１０Ｇｂをもたらし、かつ、２０６以上の最小深度にまで含まれる対象としたエクソーム塩基の平均９０％を達成するＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットホームで配列決定した。
【０２１３】
データ分析−得られた配列読み取りデータを、ＨＧＳＣ  Ｍｅｒｃｕｒｙ分析パイプラインを使用してＧＲＣｈ３７（ｈｇ１９）ヒトゲノム参照アセンブリに対してマッピングし、アライメントした。バリアントを、バリアント・コール・ファイル（ＶＣＦ）を作成するために適するＡｔｌａｓ２を使用して決定し、呼び出した。高品質のバリアントには、注釈づけを、自社開発された一式の注釈づけツールを使用して行った。
【０２１４】
サンガー配列決定−患者＃２から得られるゲノムＤＮＡをサンガー配列決定に供した。プライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用して、ＦＢＮ１遺伝子のイントロン−エクソン境界部を含むエクソン６５及びエクソン６６を包含するように設計した。サンガー読み取りデータを、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｓｅｑｍａｎソフトウェアを使用して分析した。
【０２１５】
動物−１０週齢のオスのＷＴ型Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをすべてのインビボ研究のために使用した。マウスを１２時間明期／１２時間暗期のサイクルでケージあたり２匹〜５匹で収容し、食物及び水を自由に摂らせた。マウスを尾静脈注射によるアデノウイルス媒介遺伝子導入（マウスあたり１０１１個のウイルス粒子）にさらした。マウスに、２．６マイクロモルの組換えＨｉｓタグ化アスプロシン又は組換えＧＦＰを皮下注射により１０日間にわたって毎日注射した。マウスをウイルス注入又はペプチド注射の１０日後に屠殺し、血漿及び様々な器官を単離した。ベイラー医科大学施設内動物管理利用委員会により、すべての実験が承認された。
【０２１６】
ＦＢＮ１アデノウイルス及びＧＦＰアデノウイルス−ＦＢＮ１のｃＤＮＡを有するアデノウイルスを、標準的なＡｄ５ベクター系を使用して、ＦＢＮ１コード領域をＣＭＶプロモーターの制御下にクローニングすることによって作製した。対応するＧＦＰアデノウイルスをベイラー医科大学におけるベクター開発施設から購入した。
【０２１７】
組換え型のアスプロシン及びＧＦＰ−ヒトＦＢＮ１（２７３２位〜２８７１位のアミノ酸）のｃＤＮＡをクローニングし、続いて大腸菌における発現のためのｐＳＰＥプラスミドにサブクローニングした。大腸菌で発現された融合タンパク質は、Ｎ末端における６アミノ酸のＨｉｓタグと、１４０アミノ酸の野生型Ｃ末端ＦＢＮ１（２７３２位〜２８７１位のアミノ酸）とから構成される１４６アミノ酸の長さである。Ｈｉｓタグ化ＧＦＰをコントロールポリペプチドとして、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【０２１８】
体組成及び血清分析−体組成をＥＣＨＯ−ＭＲＩシステム（Ｅｃｈｏ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｘａｓ）により分析した。マウス血清を心臓穿刺により得られた血液から調製し、ＣＯＢＡＳ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００  ｐｌｕｓ分析計（Ｒｏｃｈｅ）により分析した。レプチン、ＦＦＡ、アディポネクチン及びトリグリセリドの血漿中レベルを、マウスレプチンＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＮＥＦＡ  Ｃ試験キット（Ｗａｋｏ）、マウスアディポネクチンＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び血清／血漿トリグリセリド検出キット（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ使用して測定した。
【０２１９】
組織学−マウスの鼠径部脂肪組織サンプルをＨ＆Ｅ染色のために１０％ホルムアルデヒドにおいて固定処理した。凍結された肝臓を、肝臓のトリグリセリド含有量を評価するためのオイルレッドＯ染色のために使用した。
【０２２０】
グルコース負荷試験（ＧＴＴ）及びインスリン抵抗性試験（ＩＴＴ）−ＧＴＴのために、体重１ｋｇあたり１．５ｇのグルコースの腹腔内注射を６時間の絶食期間の後で行った。ＩＴＴのために、通常型インスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ；０．７５単位／体重ｋｇ）の腹腔内注射を４時間の絶食期間の後で行った。血中グルコースレベルを、グルコメーター（Ｌｉｆｅ  Ｓｃａｎ）を使用して測定した。
【０２２１】
発現ベクター−ＷＴ型ＦＢＮ１（１位〜２８７１位のアミノ酸）、１４０アミノ酸のアスプロシン（２７３２位〜２８７１位のアミノ酸）、及びネイティブの２７アミノ酸のＦＢＮ１シグナルペプチドがＮ末端に結合したアスプロシン（アミノ酸１〜２７＋アミノ酸２７３２〜２８７１）を、ｐＣＭＶ６−Ｎｅｏベクター系を使用してＣＭＶプロモーターの制御下にサブクローニングした。ＧＦＰを発現する同じベクター、又は空のベクターをコントロールとして使用した。
【０２２２】
細胞培養−ＮＰＳ被験者から単離されるヒト皮膚線維芽細胞、又は非罹患コントロール被験者から単離されるＷＴ型皮膚線維芽細胞を、標準的なプロトコルを使用して脂肪産生分化に供した。脂肪産生を刺激するために、培地には、２ｕＭのインスリン、１ｕＭのデキサメタゾン、０．２５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン及び１０−７Ｍのロシグリタゾンを７日間にわたって補充した。発現プラスミドを用いた標準的なトランスフェクション法をインビトロ遺伝子導入のために使用した。
【０２２３】
ＲＮＡ及びタンパク質の分析−標準的なＲＮＡ抽出手順（Ｑｉａｇｅｎから得られるＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いた。逆転写を、製造者のプロトコルを使用するＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行った。遺伝子発現分析のために、ＱＰＣＲを、配列特異的プライマーと、Ｒｏｃｈｅから得られるプローブ（ユニバーサルプローブライブラリー）とを使用して行った。ＴＢＰを、すべての遺伝子発現アッセイのための内部コントロールとして使用した。ウエスタンブロッティングを、アスプロシンに対するマウスモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａから購入した抗体、カタログ番号Ｈ００００２２００−Ｍ０１）を使用して、血漿又は細胞培養培地に対する標準的な方法を使用して行った。フィブリリン−１に対するマウスモノクローナル抗体をＡｂｃａｍから購入した（カタログ番号ａｂ３０９０）。培地に対するウエスタンブロッティングのために、細胞を脂肪産生分化に７日間にわたって供し、その後、誘導培地を、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈから得られるＣｅｌｌｇｒｏ  ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレン）が補充される無血清ＤＭＥＭで３日間にわたって置き換えた、その時点で、培地を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−２遠心分離フィルターユニットを使用して濃縮し、その後、ウエスタンブロッティングを進めた。
【０２２４】
統計学的方法−すべての結果が、平均±ＳＥＭとして示される。Ｐ値を、対応のないスチューデントｔ検定、又はＡＮＯＶＡによって適宜、計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２２５】
［実施例２］
（フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの機能獲得のインビボ影響を明らかにする。）
フィブリリン−１タンパク質は５０年前に特定された（Ｇｕｂａ他、１９６４）。多くのことが、細胞外マトリックスの維持におけるその機能（特に大動脈平滑筋におけるその機能）について、また、健康及び疾患におけるその役割について知られている（Ｄａｖｉｓ＆Ｓｕｍｍｅｒｓ他、２０１２；Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ他、１９９５）。その構造は「モジュール状」として知られており、このことは、このタンパク質の異なる部分における変異により、異なる臨床的結果を引き起こされることを意味する。そのようなものとして、それには、マルファン症候群、先端短肢異形成症、幸福顔貌骨異形成症、皮膚硬化症候群及びヴァイル・マルケサーニ症候群が関連している（Ｄａｖｉｓ＆Ｓｕｍｍｅｒｓ、２０１２）。全エクソーム解析、同様にまた、既存の文献を使用すると、それにはまた、新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）として知られている希な極端な痩身障害が関連する。
【０２２６】
ＮＰＳは、皮下脂肪組織における劇的な低下に起因する極端な痩身をもたらす常染色体優性の遺伝性障害である（図１Ａ〜図１Ｄ）（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７；Ｈｏｕ他、２００９）。患者の表現型は、表現型が当該患者のリポジストロフィーに及ぶときにはとりわけ、古典的なマルファン症候群と重複し、しかし、古典的なマルファン症候群とは全く異なっている（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ他、２０１３；Ｈｏｒｎ他、２０１１；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１）。したがって、変異の部位及びタイプを、その差異を説明するために特徴づけた。本開示において特定された２名の患者、及び以前に記載されている４名の患者（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ他、２０１３；Ｈｏｒｎ他、２０１１；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１）はすべて、ＦＢＮ１の最後から２番目のエクソンにおけるＣ末端短縮化変異を有する。これら６つの短縮化変異が約８６００ｂｐの遺伝子において互いに７０ｂｐ以内に存在する。特に、リポジストロフィーは、ＦＢＮ１の他の部分において見出される変異との関連では記載されたことがないので、これらの変異タンパク質の共通した特徴が脂肪の生物学に何かしらの影響を与えていることが明らかであるようである。これらの研究は、親タンパク質が細胞から分泌された後で親タンパク質から正常に切断される独立して機能的な、フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドを明らかにしている（Ｒｉｔｔｙ他、１９９９；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ他、１９９９；Ｗａｌｌｉｓ他、２００３；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ他、１９９５）。予備実験は、このＣ末端ポリペプチドについてハプロ不全により、不完全な脂肪分化が生じることを示している。１つの目的が、このポリペプチドの過剰発現が、ＷＴマウス及びリポジストロフィー性マウスに脂肪量を増やさせるために十分であるかどうかを特徴づけることである。このことは、脂肪量の減少をもたらす全身性及び局所性の両方のリポジストロフィー状態のための直接の治療的意味合いを有するであろう。
【０２２７】
脂肪恒常性におけるフィブリリン−１のＣ末端ペプチドの予測された十分性がインビボで調べられる場合がある。これらの研究では、脂肪付着成長能に対するＣ末端ペプチドの影響を組換えＣ末端ポリペプチドにより処理されたマウスにおいて、同様にまた、そのｃＤＮＡを有するアデノウイルスにより処理されたマウスにおいて評価することができる。全般的遺伝子発現及び代謝データのセットを、フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドによって用いられる経路に関する検証可能な仮説を立てるために作り出し、取り出すことができる。
【０２２８】
（実験アプローチ：）
Ａ．組換え型のフィブリリン−１のＣ末端ポリペプチド及びＧＦＰをマウスに注射する：８週齢のＣ５７／Ｂｌ６のＷＴマウス及びＰＰＡＲガンマヌル（リポジストロフィー性）マウスに、組換えＣ末端ポリペプチド又は組換えＧＦＰの各２０ｕｇを合計で５回について２日毎に、皮下アプローチを使用して注射する。これらの組換えポリペプチドは、細菌発現、それに続いて精製及びエンドトキシン除去を使用してあらかじめ作製されている。各２０ｕｇの用量は、マウスにおける内在性の血漿中レベルを評価する予備的データに基づいて決定された。それぞれの性一致群における８匹のマウスが注射後１０日ですべてのアッセイにおいて比較される。
【０２２９】
Ｂ．フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチド及びＧＦＰを有するアデノウイルスベクターをマウスに注射する：８週齢のＣ５７／Ｂｌ６のＷＴマウス及びＰＰＡＲガンマヌル（リポジストロフィー性）マウスに、シグナルペプチドに融合されたＣ末端ポリペプチド（図１４）を発現する以前に作製されたアデノウイルス、又はＧＦＰを発現するアデノウイルスのそれぞれ１０１１個のウイルス粒子を注射する。この技術を使用する以前の経験に基づけば、アデノウイルス負荷量の大部分が肝臓に感染することになる（Ｃｈｏｐｒａ他、２００８；Ｃｈｏｐｒａ他、２０１１）。肝細胞による過剰発現の後、Ｃ末端ポリペプチドが、これはネイティブフィブリリン−１シグナルペプチドと融合されているので、肝細胞によって分泌されるはずである。それぞれの性一致群における８匹のマウスが注射後２週間でポリペプチドの血漿中レベルについて比較され、その後、他の下流側アッセイが行われる。
【０２３０】
Ｃ．脂肪過多に対するＣ末端ポリペプチドの過剰発現の影響を見積もる：マウスに麻酔し、体重及び体長を記録する。マウスをＤＥＸＡ分析計に置き（Ｏｏｓｔｉｎｇ他、２０１２）、スカウト走査を、本来の測定走査を行う前に行う。マウスあたりの照射線量を３００μＳｖで設定する。データの分析のために、目的とする領域を定める。この分析は、頭部領域を除く全身測定からなる場合がある。カウント数データがソフトウェアによって骨成分及び非骨成分に変換される。情報が、各マウスの体重、体長、骨量及び脂肪量、骨量密度及び除脂肪量に関して得られる。ＤＥＸＡ測定及び分析が、ＢＣＭにおける"Ｍｏｕｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ"で行われる。安楽死の後、鼠径部の脂肪パッドを取り出し、写真撮影し、重量測定する。
【０２３１】
Ｄ．全般的な代謝変化に対するＣ末端ポリペプチドの過剰発現の影響を偏りのない血漿中代謝産物プロファイリングによって見積もる：フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの過剰発現の結果としての生物体全体に及ぶ代謝変化を特定するために、ＲＮＡｓｅｑが用いられる。絶食マウス及び摂食マウスから得られるＥＤＴＡ−血漿を放血によって集める。凍結されたコード化サンプルがＭｅｔａｂｏｌｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）に送られ、元の供給源のみに関連する固有の識別子によってＭｅｔａｂｏｌｏｎシステムに受け入れられる。再利用基準が、品質管理目的のために抜き取りプロセスにおける最初の工程に先立って加えられる。サンプル調製では、小分子の最大限の回収を可能にしながら、タンパク質を除くための独自の一連の有機抽出及び水性抽出が使用される。抽出サンプルが、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）プラットホーム及び液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）プラットホームによる分析のために等分割される。数個の技術的反復サンプルが、少量の各サンプルを含有する均一なプールから作製される。未処理のＭＳデータファイルがリレーショナル・データベースに読み込まれる。ピークが、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ社独自のピーク統合ソフトウェアを使用して特定され、成分部分が、別個の具体的に設計された複雑なデータ構造で格納される。化合物が、精製された標準物又は周期的に繰り返される未知実体のライブラリー登録物との比較によって特定される。既知の化学的実体の特定は、ＬＣプラットホーム及びＧＣプラットホームの両方に対する配布のためにＬＩＭＳに登録される１，０００を超える市販の精製された標準化合物との比較に基づく。人口統計学が、カテゴリー変数については頻度によって、連続変数については平均±標準偏差（平均±ＳＤ）によって示され、続いて、ボンフェローニ試験後分析が、統計学的有意性を得るために行われる。様々なクラスにおけるおよそ３０００の個々の血漿中の代謝産物（アシルカルニチン、有機酸、アミノ酸、ペプチド、イオン等）を、この技術を使用して、偏りのない様式で同時にアッセイすることができる。
【０２３２】
Ｅ．脂肪恒常性に対するＣ末端ポリペプチドの脂肪特異的な過剰発現の影響を、ＲＮＡｓｅｑを使用して全般的遺伝子発現のレベルで評価する：フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの過剰発現の結果としての脂肪組織におけるゲノム全体に及ぶ転写変化を特定するために、ＲＮＡｓｅｑが用いられる。総ＲＮＡを、以前に急速凍結された鼠径部脂肪組織から単離する。配列決定反応を、５匹の個々のマウスの鼠径部白色脂肪貯留槽から得られるプールされたＲＮＡサンプルに対して行う。フローセルの４つのレーンを、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩでのサンプルの配列決定のために使用する。Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）を３８サイクルにわたって運転する。ＧＡからの画像が、画像解析、塩基呼び出し、及び参照ゲノムに対する配列アラインメントに着手するために、サイクル１〜サイクル３８に対してＧＡパイプラインソフトウェア（ｖ１．３、Ｉｌｌｕｍｉｎａソフトウェア）を用いて分析される。配列が、ＥＬＡＮＤソフトウェアを用いてアライメントされる。アライメントされた読み取りデータが、参照ゲノムの遺伝子、エクソン及びスプライスジャンクション部に対するアラインメントを行う配列読み取りデータを数えるためにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＡＳＡＶＡプログラム（ｖ１．０）のための入力として使用される。特徴部（遺伝子、エクソン及びスプライスジャンクション部）に対してアラインメントする配列の未処理のカウント数が、未処理のカウント数を関連した特徴部の長さで除することによりＣＡＳＡＶＡによって正規化される。遺伝子あたりの読み取りのカウント数が、示差的に発現した遺伝子を特定するためにＤＥＧｓｅｑ及びＤＥｓｅｑのための入力として使用する。両方のツールが、統計学パッケージＲ及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを介して利用可能である。ＤＥＧｓｅｑ及びＤＥＳｅｑでは、異なる統計学的アプローチ（ポアソン分布、負の二項分布）が、異なる遺伝子発現についての確率を推定するために使用される。Ｐ≦０．００１と、発現レベルにおける（正規化された）２倍の変化とが、カットオフ基準として使用される。
【０２３３】
本明細書中に記載される様々な研究は、フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドが脂肪付着生成及び炎症の対となるプロセスのために十分であることを立証することが、具体的な実施形態において予想され得る。２つの機能獲得アプローチが、同じ終点を評価することを目指して本明細書中に記載される。一方のアプローチがたとえ不首尾であるとしても、他方のアプローチが確実な結末をもたらすことが予想される。血漿におけるネイティブポリペプチドの半減期に関する情報がないため、組換えポリペプチド実験は、ペプチドの大部分が急速に分解されるならば、失敗し得る。その場合、アデノウイルス媒介遺伝子導入のアプローチでは、この問題が、機能獲得をもたらすための十分な量でポリペプチドが絶え間なく産生されることにより回避されることが予想される。まさにその特性によって、過剰発現実験は、調べられているタンパク質の真の機能性を反映しない生理学的状態を生じさせる可能性が潜在的にある。したがって、過剰発現実験は慎重に解釈される必要があり、可能であれば、同時での機能喪失研究との関連で解釈される必要がある。本明細書中において提案される機能獲得研究及び機能喪失研究を合わせて解釈することにより、フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの真のインビボ機能についての正しい結論を引き出すことができる。
【０２３４】
［実施例３］
（フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの機能喪失のインビボ影響を明らかにする。）
フィブリリン−１タンパク質は、フリン／ＰＡＣＥファミリーの酵素によってタンパク質分解プロセシングを受けることが示されているＣ末端切断部位（ＲＧＲＫＲＲ［配列番号６］モチーフ）を含む（Ｒｉｔｔｙ他、１９９９；Ｒａｇｈｕｎａｔｈ他、１９９９；Ｗａｌｌｉｓ他、２００３；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ他、１９９５）。この結果、２つのフラグメント、すなわち、機能的なフィブリリン−１（約２５００のアミノ酸）（これは、細胞外マトリックス内への適切な挿入のための切断事象に依存している）（Ｒａｇｈｕｎａｔｈ他、１９９９；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ他、１９９５）と、より小さいＣ末端ポリペプチド（約１４０のアミノ酸）（その独立した機能は不明である）とがもたらされる。ＰＳ表現型の１つをもたらすＦＢＮ１における６つすべてのヘテロ接合変異の共通した結果が、Ｃ末端ポリペプチドの大部分の喪失である。事実、Ｃ末端フラグメントのハプロ不全がこの表現型の原因であるならば、そのフラグメントをその正常なレベルに回復させると、この表現型を救済することがもたらされるはずである。この考えをインビトロで詳しく探究し、Ｃ末端ポリペプチドの発現を回復させることにより、同様にまた、培地への添加によって変異細胞をＣ末端ポリペプチドに単にさらすだけにより、ＮＰＳに随伴する脂肪分化欠損及び炎症誘発性欠損が救済されることが見出された（図１５）。
【０２３５】
類似するアプローチがインビボで利用される。循環Ｃ末端ポリペプチド（図１６）が、このポリペプチドは脂肪付着生成のために必要であること、そして、肥満及び代謝症候群から保護するためのその可能性を解明するためにモノクローナル抗体を使用して免疫学的に隔離される。これは、純然たる脂肪付着生成から生じる状態である肥満及び代謝症候群の両方についての直接の治療的意味合いを有するであろう。
【０２３６】
（実験アプローチ：）
Ａ．フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドを標的とするモノクローナル抗体にＷＴマウス及び遺伝的肥満マウスをさらす：８週齢のＣ５７／Ｂｌ６のＷＴマウス及びｏｂ／ｏｂマウス（機能喪失レプチン変異を有する肥満マウス）に、５００ｕｇの抗ＣＴ−フィブリリン−１  ＩｇＧ又は非特異的なＩｇＧを、合計で５回について毎日、腹腔内アプローチを使用して注射する。フィブリリン−１のＣ末端抗体を標的とするモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ．から以前に得られ、社内で検証されている。それぞれの性一致群における８匹のマウスが注射後１０日ですべてのアッセイにおいて比較される。
【０２３７】
Ｂ．脂肪過多に対するＣ末端ポリペプチドの減少の影響を見積もる：脂肪過多に対するフィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの中和の影響を、本明細書中に記載されるようにＤＥＸＡ走査及び鼠径部脂肪パッド重量を使用して見積もる。抗ＣＴ−フィブリリン−１  ＩｇＧ及びコントロールＩｇＧにさらされた８匹の性一致した８週齢のＷＴマウス及びｏｂ／ｏｂマウスを評価する。
【０２３８】
Ｃ．全般的な代謝変化に対するＣ末端ポリペプチドの減少の影響を偏りのない血漿中代謝産物プロファイリングによって見積もる：抗ＣＴ−フィブリリン−１  ＩｇＧ及びコントロールＩｇＧにさらされた８匹の性一致した８週齢のＷＴマウス及びｏｂ／ｏｂマウスから得られるＥＤＴＡ−血漿を放血によって集める。メタボロミクス解析を本明細書中に記載されるように行う。
【０２３９】
Ｄ．脂肪恒常性におけるフィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドの減少の影響を、ＲＮＡｓｅｑを使用して全般的遺伝子発現のレベルで評価する：総ＲＮＡを、抗ＣＴ−フィブリリン−１  ＩｇＧ及びコントロールＩｇＧにさらされた１５匹の性一致した８週齢のＷＴマウス及びｏｂ／ｏｂマウスから得られるあらかじめ急速凍結された鼠径部脂肪組織から単離する。配列決定反応を、５匹の個々のマウスの鼠径部白色脂肪貯留槽から得られるプールされたＲＮＡサンプルに対して行う（Ｎ＝３）。ＲＮＡｓｅｑ分析を、本明細書中の他の箇所で記載されるように行う。
【０２４０】
本明細書中に記載される様々な研究は、フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドが脂肪付着生成のために必要であり、肥満から保護していることを立証することが、具体的な実施形態において予想され得る。フィブリリン−１のＣ末端ポリペプチドを標的とするモノクローナル抗体を使用して検討される研究は、遺伝子破壊研究ほどには明瞭でない。しかしながら、１つの目的が、そのようなモノクローナル抗体の使用を肥満に対する治療様式として研究することであることを考えると、少なくともいくつかの実施形態においては、非特異的抗体と比較してこのことを調べることは重要である。このアプローチが保護的役割をそのような抗体について肥満に対して実証する実施形態において、それらの結果が、例えば、遺伝子ノックアウト研究により確認される。
【０２４１】
［実施例４］
図１７は、増大した量の血漿中ＣＴポリペプチド（アスプロシン）により、過食が、アスプロシンが注射されているマウスにおいて生じることを示す。本開示の実施形態において、様々な方法が、効果的な量のＣＴポリペプチドを、体重を増やすこと、又は脂肪量を増大させることを必要としている個体に与えることを伴う。
【０２４２】
ＮＰＳ又は別の医学的状態を有する様々な個体において、個体が不十分な脂肪量を有する場合、当該個体は、ＮＰＳ又は他のそのような医学的状態を有しない個体と比較して少ない１日あたりのカロリー負荷量を消費する場合がある。これらの個体のための特定の実施形態において、当該個体には、効果的な量のアスプロシン又はその機能的誘導体が、例えば、その食欲を増大させること等によって、その毎日のカロリー負荷量を増大させるために与えられる場合がある。
【０２４３】
［実施例５］
（本開示の実施形態の意義）
レプチンの発見は、極端な体重をもたらす様々な遺伝的障害が、肥満、糖尿病及び代謝症候群の理解において非常に有益である可能性を有することを示している（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、２００９）。本明細書中には、最適な脂肪量の維持のために必要であり、その起源が細胞外マトリックスタンパク質のフィブリリン−１に結びつけられる新規なポリペプチドホルモン、すなわち、アスプロシンが記載される。その点では、アスプロシンは、エンドスタチン（異なる細胞外マトリックスタンパク質であるＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端切断産物である血管新生調節因子）に似ている（Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ他、１９９７）。したがって、いくつかの細胞外マトリックス成分は、それらの親タンパク質とは機能が異なるＣ末端切断産物のキャリアとして進化してきたかもしれないと考えることは妥当なことであろう。
【０２４４】
いくつかの以前の研究は、プロフィブリリンがどのように分泌され、そして、おそらくはフリンプロテアーゼ系によって細胞外に切断されるかを示している（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｈｏｒｎ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、２０１１；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ他、２０１３；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。この切断事象が、フィブリリン−１の正しいプロセシングと、細胞外マトリックス内へのその挿入とのために必要である（Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｈｏｒｎ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、２０１１；Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ他、２０１３；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。しかしながら、他方の切断産物、すなわち、１４０アミノ酸のＣ末端ポリペプチドの運命は不明なままである。ＮＰＳ患者の遺伝子型から、このＣ末端ポリペプチド、すなわち、アスプロシンが、脂肪の生物学において重要な役割を有する可能性が本開示の実施形態において示唆された。本開示のデータでは、アスプロシンが循環中に存在し、最適な脂肪量の維持のために必要であることが示される。ヒトにおけるアスプロシンの減少はリポジストロフィーをもたらしており、一方、マウスでは、過度なアスプロシンにより、脂肪拡大及びグルコース不耐性（これらは肥満及び不良な代謝健康状態の特徴である）の発達がもたらされている。実際、循環アスプロシンのレベルが、マウス及びヒトにおける不良な代謝健康状態と相関づけられる肥満状態において高まっている。反対に、循環アスプロシンが存在しないかそれに近いＮＰＳ患者の表現型は、極端な痩身及びインスリン感受性を呈しており、このことは、いくつかの実施形態において、アスプロシンを低下させることが、プラスの代謝プロフィルに好都合であることを示している。このことは、インスリン抵抗性をもたらすいくつかのタイプのリポジストロフィーとは対照的である（Ｎｏｌｉｓ他、２０１３）。
【０２４５】
１つの実施形態において、ＮＰＳにおけるインスリン感受性の保持が、推定ではインスリンに対する応答においてグルコース取り込み能を保持する特定の脂肪貯留槽（とりわけ臀部領域における脂肪貯留槽）の節約である。別の実施形態において、アスプロシン自体がインスリン抵抗性をマウスにおいて促進させ、したがって、ＮＰＳにおいてそれが存在しないことにより、直接的なインスリン抵抗性改善作用を有し得る。
【０２４６】
このデータは、ＮＰＳでの循環アスプロシンにおける極端な低下が、ＮＰＳ遺伝子型から予測されるであろうことを超えて、少なくとも部分的には、ナンセンス変異依存分解機構を逃れる細胞内捕捉された変異プロフィブリリンのドミナントネガティブ効果の結果であることを示している。具体的な実施形態において、このことが、フリン切断部位の近傍における遺伝子全体の欠失、非短縮化変異、又は短縮化変異により、マルファン症候群が生じ、しかし、ＮＰＳを特徴づけるリポジストロフィーのさらなる特徴が生じていない理由である（Ｐｙｅｒｉｔｚ他、２００９）。
【０２４７】
アスプロシンは２つの理由から注目に値する。外因性アスプロシンにさらされたマウスはその脂肪量の拡大及びインスリン抵抗性をちょうど１０日の期間で呈した。注目すべきことに、このことが、高脂肪食ではなく、むしろ標準的な固形飼料で達成された。第２に、そのコード領域は、プロフィブリリンの残部と比較して極めて大きい進化的保存を呈している。このことは、細胞表面受容体によって媒介される可能性が高い高度に保存された機能を示している。そのように仮定された受容体の正体は未だ不明である。その発現プロフィルに基づいて、脂肪組織は、アスプロシンの産生及び分泌のより一般的な部位の１つである可能性が高いので、アスプロシンが脂肪細胞分化のためにもまた必要であることは、矛盾しているように思え得る。しかしながら、それらの生成器官を調節するために働く分子の例は数えきれない。脂肪産生分化及び脂肪量の拡大のほかに、いくつかの実施形態において、アスプロシンはまた、脂肪組織及びおそらくは他の組織の他の機能を調節する。実際、グルコース恒常性のアスプロシン媒介による擾乱が、変化した脂肪量又は変化した脂肪活性の結果であるかどうかは、不明なままである。
【０２４８】
結果から、興味をそそる治療手段が提供される。最も明白なことが、ＮＰＳ患者における欠損が簡単に正されることである。しかしながら、組換えアスプロシンが、多様な病因（例えば、高齢、がん、ＨＩＶ感染等）に対して二次的である悪液質を有する患者において有用である。そのような患者は、他の原因の中でも、低下した脂肪量から生じる虚弱が著しく（Ｍｕｅｌｌｅｒ他、２０１４；Ｐｕｒｅｚａ＆Ｆｌｏｒｅａ、２０１３；Ｇｅｌａｔｏ他、２００７；Ａｇａｒｗａｌ他、２０１３；Ｋｕｌｓｔａｄ＆Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ、２００７）、アスプロシンによってもたらされる脂肪拡大から利益を得る場合がある。逆に、循環アスプロシンを低下させると、脂肪量における低下及び改善された血糖コントロールが、肥満患者及び糖尿病患者においてもたらされる場合がある。ある特定の実施形態において、ＮＰＳに随伴したリポジストロフィー及び肥満は、アスプロシン状態式の２つの結末である（少なすぎることが一方側であり、多すぎることが他方側である）。いずれにせよ、脂肪量が病理学的に変化した状態における循環アスプロシンのレベルを正すことは、有意な治療利益を本開示の特定の実施形態においてもたらす。
【０２４９】
［実施例６］
（アスプロシン、絶食により誘導されるグルコース生成性タンパク質ホルモン）
（序論）
ホルモン、その受容体、及び関連するシグナル伝達経路は、広範囲にわたるそれらの生物学的意義のために、注目せずにはいられない薬物標的となっている（Ｂｅｈｒｅｎｓ及びＢｒｏｍｅｒ、１９５８）。１つのサブクラスとしてのタンパク質ホルモンは、明確な特徴を有する。タンパク質ホルモンは通常の場合（必ずしも常にではないが）、より大きいプロタンパク質の切断から生じ、また、循環を介した標的器官への分泌輸送のときに生じる。標的器官において、タンパク質ホルモンは、高い親和性、飽和性及び競合能を呈する細胞表面受容体を使用して標的細胞に結合する。タンパク質ホルモンは、セカンドメッセンジャー系を使用して迅速なシグナル伝達を刺激し、続いて、測定可能な生理学的結果をもたらす。燃料としてのグルコースに対して脳は厳密に依存することから、血漿中のグルコースレベルは一連のホルモンによって正確に調節される（Ａｒｏｎｏｆｆ他、２００４）。これらには、栄養上のきっかけに応答して分泌されるものもあれば、一方で、グルコース自体に応答し、これにより、循環グルコースレベルの高度に連携した、かつ、正確な調節をもたらすものもある。このシステムにおける擾乱は、燃料としてのグルコースに対する脳の依存性を考えると、多くの場合には重大な結果を伴って、グルコースレベルにおける病理学的な変化を引き起こし得る。
【０２５０】
本実施例では、（ＦＢＮ１によってコードされる）プロフィブリリンのＣ末端切断産物であるアスプロシン（グルコース恒常性を調節するタンパク質ホルモン）に関連づけられる研究が提供される。ヒトにおけるその欠如は、正常血糖を維持しながら、血漿中インスリンの減少が伴う部分的リポジストロフィーを含む代謝調節不全の独特なパターンをもたらしている。
【０２５１】
［結果例］
新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）変異は、ヒトにおいて正常血糖を維持しながら血漿中インスリンレベルを低下させる。
ＮＰＳは、１９７７年に初めて記載されたものであり（ＯＭＩＭ  ２６４０９０）、主に顔面及び四肢に影響を及ぼす先天性の部分的リポジストロフィーによって特徴づけられる（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。ＮＰＳ患者は、顔面形成異常特徴及び低下した皮下脂肪のために早老症様であるようであるが、患者は、加速された老化を呈していないので、この用語は、誤った名称である。ＮＰＳを有する２名の血縁のない個体が特定された。部分的及び全身性の両方のリポジストロフィー障害にはしばしば、インスリン抵抗性が随伴するので（Ｂｉｎｄｌｉｓｈ他、２０１５）、両者のグルコース及びインスリンの恒常性状態を調べた。この意見とは対照的に、ＮＰＳ患者から得られる一晩絶食後の血漿中インスリンレベルが、正常血糖を維持しながら、非罹患被験者の２分の１よりも低かった（図１８Ａ）。
【０２５２】
全エクソーム解析及びサンガー配列決定により、ＦＢＮ１におけるデノボのヘテロ接合の３'短縮化変異が両方の患者において特定された（図１８Ｂ〜図１８Ｃ）。遺伝子診断に及んだとき、文献を類似事例について検索し、文献では、ＦＢＮ１の３'短縮化変異を伴うＮＰＳの５件の単独患者事例報告が発見された（Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ他、２０１１；Ｇｒａｕｌ−Ｎｅｕｍａｎｎ他、２０１０；Ｈｏｒｎ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ、２０１１；Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４；Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ他、２０１３）。本明細書中に報告される２名を含めて、７名の被験者はすべてがＮＰＳと診断され、すべてが短縮化変異をＦＢＮ１コード領域の３'末端における７１塩基対セグメントの内部に有しており、このことは、密接な遺伝子型−表現型の相関を呈している（図１８Ｄ）。７つすべての変異が、最後から２番目のエクソンの最後の５０ヌクレオチドの３'側で生じており、したがって、これらの変異は、ｍＲＮＡナンセンス変異媒介分解機構（ＮＭＤ）を逃れ、このことが、変異した短縮型プロフィブリリンタンパク質の発現を引き起こすことが予測される（図１８Ｅ）。
【０２５３】
プロフィブリリンは２８７１アミノ酸のプロタンパク質として翻訳され、このプロタンパク質がプロテアーゼのフリンによってＣ末端で切断される（Ｌｏｎｎｑｖｉｓｔ他、１９９８；Ｍｉｌｅｗｉｃｚ他、１９９５）。これにより、成熟フィブリリン−１（細胞外マトリックス成分）に加えて、１４０アミノ酸のＣ末端切断産物が生じる。７つすべてのＮＰＳ変異が切断部位の周りに集中しており、その結果、Ｃ末端切断産物（アスプロシン）のヘテロ接合消失をもたらしている（図１８Ｅ）（その運命及び機能は不明であった）。
アスプロシン（プロフィブリリンのＣ末端切断産物）は絶食応答性の血漿タンパク質である
【０２５４】
アスプロシンはＦＢＮ１の最終の２つのエクソンによってコードされる。エクソン６５が１１個のアミノ酸をコードし、一方、エクソン６６が１２９個のアミノ酸をコードする。一緒になってそれら２つのエクソンは、プロフィブリリンコード配列の残部と比較して、いくぶんかより大きい脊椎動物進化保存スコアを呈している（図２５Ａ〜図２５Ｂ）。アスプロシン特異的モノクローナル抗体を作製し、アスプロシンに対するその特異性を、Ｆｂｎ１−ＷＴ細胞及びＦｂｎ１ヌル細胞を使用して検証した（図２５Ｃ）。ヒト血漿の抗アスプロシン抗体による免疫ブロッティングでは、約３０ｋＤａでＳＤＳ−ＰＡＧＥを移動する単一タンパク質が示され、一方、細菌発現の組換えアスプロシンは約１７ｋＤａで移動する（図１９Ａ）。アスプロシンは、３つのＮ−結合グリコシル化部位と、潜在的ではあるが、細菌では欠いている他の翻訳後修飾とを有することが予測される（図２５Ｄ〜図２５Ｅ）。このことから、哺乳動物発現のアスプロシンと、細菌発現のアスプロシンとの間での分子量における違いがおそらく説明される。実際、哺乳動物細胞をアスプロシンの発現のために使用すると、培地中に分泌されるタンパク質が生じ、このタンパク質は、ヒト血漿、マウス胚性線維芽細胞に由来する細胞溶解物及び培地、並びに、培養された脂肪細胞及びマウス白色脂肪組織に由来する細胞／組織溶解物において認められるのと同じ分子量（約３０ｋＤａ）（Ｌｏｎｎｎｑｖｉｓｔ他、１９９８）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを移動した（図１９Ａ、図２５Ｃ、図２６Ａ〜図２６Ｂ）。
【０２５５】
循環アスプロシンのレベルを測定するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを開発した（図２７Ａ）。検量線を、組換えアスプロシンを使用して構築し、血漿中及び培地中のレベルを計算するために使用した（図１９Ｂ）。予想されるように、アスプロシンのサンドイッチＥＬＩＳＡは、ＷＴ細胞及びＦｂｎ１−／−細胞に由来する培地を使用した場合、高い特異性を呈した（図２７Ｃ）。アスプロシンが、ヒト、マウス及びラットでは一貫したナノモル濃度レベルで血漿中に存在することが見出された（図１９Ｃ）。興味深いことに、ＮＰＳ患者は、循環アスプロシンレベルにおける低下が、ＷＴ型コントロール被験者と比較した場合だけでなく、ｍＲＮＡナンセンス変異媒介分解機構を受けるように十分にＮ末端にプロフィブリリンのヘテロ接合短縮を有する患者と比較したときにも、患者のヘテロ接合の遺伝子型から予測されるよりも大きいことを呈した（図１９Ｄ）。このことから、ＮＰＳ細胞において（ｍＲＮＡ  ＮＭＤからの回避に起因して）発現されることが予測される変異プロフィブリリンは、ＷＴ型の対立遺伝子に由来するアスプロシンの分泌に対するドミナントネガティブ効果を発揮することが示唆される。この考えが、プロフィブリリンの短縮化された変異型をＷＴ細胞において過剰発現させることによって特徴づけられ、しかも、このことが、無関係のタンパク質（例えば、ＧＦＰ等）の過剰発現と比較して、アスプロシンを培地中に分泌するそのような細胞の能力を妨害することが見出された（図２７Ｅ〜図２７Ｆ）。
【０２５６】
循環アスプロシンの濃度における日々の変動を評価するために、マウスを、同調させるために１２時間明期／１２時間暗期のサイクルで７日間飼育し、続いて、常時暗期で飼育した。その後、血漿をこれらのマウスから４時間間隔で単離し、アスプロシンのＥＬＩＳＡ分析に供した。血漿中アスプロシンは、レベルにおける急性的低下が摂食開始と一致する概日性の周期的振動を呈する（図１９Ｅ）。反対に、ヒト、マウス及びラットにおける一晩の絶食は、増大した循環アスプロシンをもたらした（図１９Ｆ）。
【０２５７】
（脂肪組織はアスプロシンを生成し、分泌する）
ＦＢＮ１のｍＲＮＡプロフィルを、遺伝子型・組織発現プロジェクト（ＧＴｅｘ）のＲＮＡｓｅｑデータセットを使用してすべてのヒト組織にわたって調べた。脂肪組織が、すべての組織にわたって最も高いＦＢＮ１  ｍＲＮＡ発現を示した（図１９Ｇ）。このことをマウスにおいて確認するために、Ｆｂｎ１発現プロフィルを様々な代謝的に重要な器官にわたって評価した。ヒトでのプロフィルと一致して、白色脂肪組織が、最も高いＦｂｎ１  ｍＲＮＡ発現を呈した（図１９Ｈ）。白色脂肪組織は、広く知られている内分泌器官であること（Ｔｒａｙｈｕｒｎ他、２００６）を仮定して、白色脂肪組織が循環アスプロシンの供給源として働き得るかどうかを調べた。アスプロシンの血漿中レベルを、脂肪組織の遺伝子破壊を受けたマウスにおいて評価した。Ｂｓｃｌ２−／−マウスをこの目的のために使用した。ＢＳＣＬ２欠乏は、ヒトにおけるベラルディネリ・セイプ先天性リポジストロフィーを、脂肪組織における６０％〜７０％の低下を伴って生じさせる（ノックアウトマウスがこの表現型を模倣する）（Ｃｕｉ他、２０１１）。そのようなマウスにおいて、血漿中アスプロシンにおけるほぼ半減が認められた（図１９Ｉ）。使用した次の実験戦略は、培養下の脂肪細胞はアスプロシンの生成及び分泌が可能であるかどうかを評価することであった。このために、２つの異なる脂肪産生性細胞株、すなわち、３Ｔ３−Ｌ１及び間葉系幹細胞株のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２を成熟脂肪細胞に分化させ（図１９Ｊ〜図１９Ｋ）、細胞培養培地をアスプロシンタンパク質分析に供した。アスプロシンの堅固な蓄積が、成熟脂肪細胞に由来する無血清培地において認められ、前脂肪細胞では認められなかった（図１９Ｊ〜図１９Ｋ）、このことから、脂肪細胞はアスプロシンの生成及び分泌を行うことができることが示唆された。
【０２５８】
（組換えアスプロシンの単回用量はマウスにおいて血中のグルコース及びインスリンを上昇させる）
形質導入された器官（この場合には肝臓、なお、肝臓は通常、低い内因性のＦＢＮ１発現を示し（図１９Ｇ〜図１９Ｈ）、アデノウイルス感染の主要な標的である）が、生じたプロフィブリリンをプロセシングし、アスプロシンを循環に分泌するであろうことを期待して、アデノウイルスを使用する全長型ＦＢＮ１の異所的過剰発現を用いた。この戦略では、肝臓におけるプロフィブリリンタンパク質の堅固な過剰発現と、血漿中アスプロシンにおける２倍の上昇とが示された（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。第２の戦略は、細菌発現のアスプロシン（これは、注射後２０分で５０ｎＭのピークレベルをもたらすことが確認された−図２２Ｄ）又はコントロールとしての組換えＧＦＰの皮下注射を毎日行うことを伴った。増大した血漿中アスプロシンに連続様式（アデノウイルスによる過剰発現）又はパルス様式（組換えアスプロシンの毎日の注射）のどちらかで１０日間さらした場合、グルコースレベル及びインスリンレベルが、両方の実験戦略を使用する２時間絶食マウスにおいて上昇した（図２０Ｃ〜図２０Ｄ）。この結果は、細菌発現の組換えアスプロシンが、その内因的発現対応物によって示される生物学的活性を保持すること、そして、循環アスプロシンの上昇が、血中のグルコースレベル及びインスリンレベルを増大させるために十分であることを明らかにした。
【０２５９】
急性応答を理解するために、組換えアスプロシンの単回用量を、２時間の先行する絶食に供されたマウスにおいて皮下注射し、血漿中グルコースを、注射後１５分、３０分、６０分及び１２０分で測定した。マウスは、食物を取ることが実験の全期間を通じて許されなかった。単回のアスプロシン用量は、血中グルコースレベルにおける即座の急上昇をもたらした（図２０Ｅ）。この結果、（１５分の時点で測定される）代償性の高インスリン血症（図２０Ｆ）が生じ、これは血中グルコースレベルを注射後６０分までに正常化させた（図２０Ｅ）。類似する結果が、一晩の先行する絶食に供されたマウスにおいて得られ、だが、生じた血中グルコース急上昇の速度が、おそらくはグルコース生成性基質の絶食誘導による枯渇のために幾分か遅くなっていた（図２０Ｇ〜図２０Ｈ）。これらの結果から、アスプロシンのための標的器官として肝臓が、絶食期間中に速やかに循環に放出される（グリコーゲンとしての）貯蔵グルコースのための主要な部位としてのその役割のために、暗示された。興味深いことに、アスプロシン処置は、肝臓のグルコース放出を誘導することが知られている異化ホルモン（グルカゴン、カテコールアミン類、グルココルチコイド類）の血漿中レベルには何ら影響がなかった（図２０Ｉ）。
【０２６０】
（アスプロシンは、血漿中グルコースを細胞自律的様式で増大させるために肝臓を標的とする）
組換えアスプロシンの単回用量にさらされたマウスにおけるグルコース負荷試験及びインスリン抵抗性試験では、末梢器官（例えば、筋肉又は脂肪等）における変化したグルコース取り込みの証拠がほとんど示されず（グルコース処理の変化しない傾きが示され）、しかし、変化した最大グルコースレベルが示され、再度ではあるが、このことは肝臓を暗示した（図２１Ａ〜図２１Ｂ）。肝臓をアスプロシン作用部位として確認するために、高インスリン性の正常血糖クランプを行った。この試験では、上昇した血漿中アスプロシンは、増大した肝臓グルコース産生をもたらすこと（図２１Ｃ）、しかし、インスリンに応答してグルコースを取り込む末梢器官の能力には何ら影響がないこと（図２１Ｄ）が、曖昧さを伴うことなく示された。肝臓に対するアスプロシンの影響が細胞自律的であるかどうかを調べるために、単離された初代マウス肝細胞を組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの増大する濃度に２時間さらした。アスプロシンにさらされた細胞に由来する培地はグルコース濃度における増大を用量依存的様式で示し、このことから、肝細胞に対するアスプロシンの直接的な影響が実証された（図２１Ｅ）。
【０２６１】
（アスプロシンは生体内では肝臓に移動し、高い親和性で、飽和可能かつ競合的な様式で肝細胞表面に結合する）
組換えアスプロシンをヨウ素−１２５（Ｉ１２５）で標識し、マウスに静脈内注射し、その後、単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）走査を、蓄積部位を特定するために行った。等量の遊離Ｉ１２５、又は（アスプロシンの三次構造の喪失を誘導するために）５分間煮沸されるＩ１２５−アスプロシンを、コントロールとして使用した。遊離Ｉ１２５及び煮沸Ｉ１２５−アスプロシンについての蓄積パターンとは対照的に、冠状面及び横断面でのＳＰＥＣＴ走査（図２２Ａ）、並びに平均肝臓光子強度（図２２Ｂ）はともに、Ｉ１２５−アスプロシンが主に肝臓に輸送されること、そして、アスプロシンの三次構造がその肝臓への動員のために不可欠であることを示した。肝臓への輸送と一致して、血液及び内臓のガンマ計数では、血中の組換えアスプロシンレベルが肝臓での増大したレベルに呼応して低下することが示された（図２２Ｃ）。血漿中の半減期を測定するために、組換えアスプロシンタンパク質におけるＮ末端Ｈｉｓタグを標的とするサンドイッチＥＬＩＳＡシステムを、皮下注射後１５分、３０分、６０分及び１２０分で使用した。Ｉ１２５−アスプロシンのＩＶ注入を使用するときの結果と一致して、血漿中のＨｉｓタグ化アスプロシンは、およそ２０分の半減期と、注射後２０分で達成される５０ｎＭのピークレベルとを示した（図２２Ｄ）。
【０２６２】
肝細胞によるアスプロシンの特異的な結合を調べるために、マウス初代肝細胞を増大量のアスプロシン−ビオチンコンジュゲートとインキュベーションし、ＰＢＳにより洗浄し、肝細胞表面におけるビオチンの相対的レベルを測定した。アスプロシンは、用量応答的かつ飽和可能な様式で肝細胞表面に結合した（図２２Ｅ）。同じ手順を１００倍過剰の非コンジュゲート化アスプロシンの存在下で繰り返すと、影響がなくなり、このことは、潜在的な受容体結合部位に対する競合を示唆した（図２２Ｅ）。
アスプロシンはｃＡＭＰセカンドメッセンジャー系を使用し、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を肝臓において活性化する
【０２６３】
マウスを組換えアスプロシンの３０μｇの単回用量に２０分間さらすこと（これは、５０ｎＭのピークレベルをもたらすことが確認された）が、肝臓のｃＡＭＰ活性及びプロテインキナーゼＡ活性を増大させるために十分であった（図２３Ａ〜図２３Ｃ）。同一の結果が、マウス初代肝細胞を組換えアスプロシンと１０分間インキュベーションしたときに得られた（図２３Ｄ〜図２３Ｅ）。肝細胞ＰＫＡ活性が、組換えアスプロシンを加えたとき、用量応答的様式で増大し（図２３Ｆ）、これは、肝細胞グルコース放出に関して認められるのと類似していた（図２１Ｅ）。肝細胞グルコース放出及び肝細胞ＰＫＡ活性化の両方に対するアスプロシンの影響が、スラミン（一般的なヘテロ三量体Ｇタンパク質阻害剤）によって阻止された（図２３Ｇ〜図２３Ｈ）。加えて、アスプロシン媒介の肝細胞グルコース放出を、ｃＡＭＰＳ−Ｒｐ（ＰＫＡに対するｃＡＭＰ結合の競合的アンタゴニスト）を使用することによって阻止することができた（図２３Ｉ）。これらの結果は、アスプロシンが、肝細胞グルコース放出を、Ｇタンパク質−ｃＡＭＰ−ＰＫＡ軸を用いることによってインビボ及びインビトロにおいて増大させることを明らかにする。グルカゴン及びカテコールアミン類もまた、同じ細胞内シグナル伝達軸を用いているので、肝細胞グルコース放出を高めるアスプロシンの能力に対する、グルカゴン受容体又はβ−アドレナリン作動性受容体を阻害することの影響を調べた。それぞれの阻害剤がグルカゴン又はエピネフリンの作用を完全に阻止したが、これらの阻害剤は、肝細胞グルコース放出に影響を及ぼすアスプロシンの能力に対しては何ら影響を有していなかった（図２３Ｊ〜図２３Ｋ）。このことは、アスプロシンが、グルカゴン及びカテコールアミン類によって使用される細胞表面受容体系とは異なる細胞表面受容体系を使用することを示唆する。インスリンは、細胞内ｃＡＭＰにおける低下を（Ｇαｉ経路の活性化を介して）誘発することが知られているので、インシュリンが、肝細胞ＰＫＡ活性化及び肝細胞グルコース放出に対するアスプロシンの影響に対抗するであろうかどうかを調べた（なお、アスプロシンのこの影響は、細胞内ｃＡＭＰにおける増大に起因することが明らかにされている）。実際、インスリンは、アスプロシン媒介の肝細胞ＰＫＡ活性化（図２３Ｌ）及び肝細胞グルコース放出（図２３Ｍ）を抑制した。
【０２６４】
（アスプロシンの免疫学的隔離は代謝症候群随伴の高インスリン症に対して保護的である）
血漿中のアスプロシンレベルが、インスリン抵抗性を有するヒト対象において病理学的に上昇している（図２４Ａ）。類似する上昇が、インスリン抵抗性の２つの独立したマウスモデル（食餌誘発肥満及びＯｂ変異）において見られた（図２４Ｂ）。アスプロシン特異的モノクローナル抗体の単回用量の腹腔内注射が、血漿中アスプロシンレベルを注射後３時間及び６時間で急性的に低下させるために十分であった（この場合、血漿中アスプロシンレベルは注射後２４時間で正常なレベルに回復した）（図２４Ｃ）。マウスのインスリン抵抗性の（同期化のための２時間絶食の後での）両方の自由摂食モデルは、（正常血糖を維持しながらでの）血漿中インスリンレベルにおける急性的低下を血漿中アスプロシンの枯渇と同時に示した（図２４Ｄ〜図２４Ｇ）。潜在的なインスリン代償作用を伴わない肝細胞グルコース産生に対するアスプロシンの減少の影響を直接に調べるために、マウス初代肝細胞を、アスプロシンとのインキュベーションの前にアスプロシン特異的抗体により処理した。予想されるように、アスプロシン特異的抗体はアスプロシン媒介の肝細胞グルコース放出を阻止し、一方で、非特異的なコントロール抗体は影響が全くなかった（図２７Ｄ）。
【０２６５】
免疫学的隔離が、妥当な機能喪失戦略として有効であることを確認するために、ＦＢＮ１ハイポモルフのマウス（ホモ接合ＭｇＲマウス）を調べた。なお、このマウスはＷＴ型ＦＢＮ１転写物のほんの約２０％しか発現しない（Ｐｅｒｅｉｒａ他、１９９９）。ＭｇＲマウスは循環アスプロシンにおける７０％の低下を呈した（図２４Ｈ）。２時間絶食させたとき、ＭｇＲマウスは、正常血糖を維持しながら、半減による血漿中インスリンの欠乏を示した（これは、自由摂食マウスにおけるアスプロシンの免疫学的隔離に関して認められるのと類似していた）（図２４Ｉ〜図２４Ｊ）。しかしながら、２４時間絶食させたとき、すなわち、インスリンをマウスの循環から排除する生理学的状況（図２４Ｊ）では、ＭｇＲマウスは空腹時低血糖を呈し（図２４Ｉ）、このことから、インスリンの緩衝作用は、アスプロシンの機能喪失によって誘発される血漿中グルコースにおける低下を露呈させるために（長時間の絶食により）循環から取り除く必要があることが示唆される。このことを確認するために、高インスリン性の正常血糖クランプ研究を、約１８時間にわたって絶食させられたＭｇＲマウスに対して行った（基礎）。そのような条件のもと、肝臓グルコース産生（ＨＧＰ）における急性的欠乏が、ＷＴマウスと比較して、ＭｇＲマウスにおいて認められた（図２４Ｋ）。この結果は、ＨＧＰにおける増大をアスプロシンの機能獲得のときに示すクランプ結果と一致している（図２１Ｃ〜２１Ｄ）。予想通り、どちらのクランプ研究も、全身グルコース処理（インスリン感受性）における変化を明らかにしておらず（図２１Ｄ、図２４Ｌ）、このことは、グルコース恒常性に対するアスプロシンの影響が、ＨＧＰの刺激剤として働くことに限定され、血漿中インスリンレベルにおけるどのような変化も間接的であり、かつ、ＨＧＰにおける変化の下流側であることを示唆している。
【０２６６】
最後に、一晩絶食のＭｇＲマウスにおけるアスプロシンの１回だけの皮下投与が、これらのマウスによって示されるインスリン欠乏を完全に救済するために十分であった（図２４Ｍ）。この結果は、ＭｇＲマウスによって示されるインスリン欠乏が、完全に循環アスプロシンにおける不足に起因しており、機能的なフィブリリンタンパク質のＭｇＲマウスにおける低下した発現の何らかの間接的な影響には起因していないことを明らかにする。
【０２６７】
（ある特定の実施形態の意義）
循環アスプロシンの濃度が実験的に低下させられる場合（ＮＰＳ患者における遺伝的枯渇、ＭｇＲマウスにおける遺伝的枯渇、マウスにおける免疫学的隔離による急性的除去）、又は増大させられる場合（アデノウイルス媒介の過剰発現、直接の組換えタンパク質注射）にかかわらず、その結果は、血漿中のグルコース及びインスリンにおける対応する変化である。アスプロシンの機能喪失とともに、低血糖が、インスリンレベルをゼロに近づけるために十分に長くマウスを絶食させ、これにより、β細胞がインスリン分泌をさらに低下させ、血漿中グルコースを正常化する余地をほとんどなくすことによってβ細胞媒介の修正作用を取り除いたときにだけ現れる。
【０２６８】
概日性の周期的変動を呈する栄養応答性ホルモン（図１９Ｅ）が、比較的「静的」な構造タンパク質／ＥＣＭタンパク質であると思われるであろうものに由来するであろうことは予想外と考え得る。このため、本発明者らは、公開されているサーカディオミクス（ｃｉｒｃａｄｉｏｍｉｃｓ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｃｉｒｃａｄｉｏｍｉｃｓ．ｉｇｂ．ｕｃｉ．ｅｄｕ）を使用してＦＢＮ１転写物のプロフィルを調べるに至った。興味深いことに、Ｆｂｎ１転写物は、いくつかの組織（例えば、心臓、副腎、肺、白色脂肪及び腎臓等）において堅固な毎日の概日性の周期的変動を呈する。フィブリリン−１が静的な構造的分子であるという考えをさらに調べることができる。アスプロシンの起源となる一次組織もまたさらに調べることができる。脂肪は血漿中アスプロシンの供給源の少なくとも１つであることが明らかにされる。この所見は、内分泌器官及びエネルギー恒常性のセンサー／モジュレーターとしての脂肪の知られている機能と一致している。しかしながら、いくつかの器官におけるＦＢＮ１のかなり高い発現を考えると、脂肪のほかに他の器官もまた、血漿中アスプロシンの供給源として働き得る。具体的な実施形態において、アスプロシンの供給源には、膵島細胞、肺、心臓、血管平滑筋、副腎、内臓の平滑筋、卵巣、子宮、卵管、胎盤、子宮頸部、食道、乳房、脳、白色脂肪、褐色脂肪、骨格筋等が含まれる。
【０２６９】
アスプロシンは、血漿中グルコースレベルを増大させるように機能し、循環アスプロシンレベルが絶食（ベースライン時グルコース条件）によって増大し（図１９Ｆ）、摂食（高グルコース条件）によって低下する（図１９Ｅ）ので、グルコースは負のフィードバックループで血漿中アスプロシンレベルの抑制因子として働き得るかもしれないことが、いくつかの実施形態において考えられた。このことを明らかにするために、成熟脂肪細胞を培養において高グルコースレベルにさらした。この処理が、グルコース非含有状態にさらされた脂肪細胞と比較して、培地におけるアスプロシンの蓄積を強く阻害するために十分であった（図２９Ｂ、図２９Ｄ）。グルコース添加による細胞内アスプロシンタンパク質における低下は認められず（図２９Ｅ）、このことは、細胞外アスプロシンレベルのグルコース媒介ダウンレギュレーションが、転写、生合成又はプロセッシングのレベルで生じていないことを示唆した。この結果をインビボで確認するために、ＷＴマウスを、膵臓のβ細胞を消失させ、その結果、高い血中グルコースをもたらすことが知られているストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理に供した。そのようなマウスでは、血漿中アスプロシンは、正常な血中グルコースを有するマウスの場合よりもはるかに低いことが見出された（図２９Ｆ）。まとめると、これらのインビトロ結果及びインビボ結果は、グルコースが負のフィードバックループで血漿中アスプロシンレベルの負の影響因子として働くという見解と一致しており、また、他の主要なホルモンの調節と一致している（例えば、カルシウムは副甲状腺ホルモンの分泌を抑制し、グルコースはグルカゴン分泌を抑制する）（Ｃａｍｐｂｅｌｌ及びＤｒｕｃｋｅｒ、２０１５；Ｄｕｍｏｕｌｉｎ他、１９９５）。
【０２７０】
一般に、タンパク質ホルモンは小胞体及びゴルジ経路を介してプロセシングされ、細胞内顆粒に貯蔵され、その後、適切なきっかけに応答して分泌される。このことと一致して、プロセシングされたアスプロシンが、培養された線維芽細胞、マウス白色脂肪組織、及び培養された脂肪細胞において細胞内に検出された（図２５Ｃ、図２６Ａ〜図２６Ｂ）。アスプロシンは、シグナルペプチドを欠くにもかかわらず、細胞から分泌される能力を保持することが示されている。このことが、アスプロシンをコードするエクソンだけを哺乳動物細胞において過剰発現させ、その後、アスプロシンを培地において検出することによって明らかにされた（Ｌｏｎｎｑｖｉｓｔ他、１９９８）。このアッセイを、アスプロシンをコードするｃＤＮＡを（内因性アスプロシンからの混入を防ぐための）Ｆｂｎ１−／−細胞で過剰発現させることによって繰り返し、培地中へのアスプロシン分泌が検出された（図３０Ａ〜図３０Ｂ）。さらに、アスプロシン分泌をグルコースによって抑制することができ（図３０Ｂ）、これは、培養された脂肪細胞において認められる現象と一致していた（図２９Ｂ、図２９Ｄ）。いくつかの細胞外タンパク質（例えば、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２及びＩＬ−１β等）は、アスプロシンによって明らかにされるように、Ｎ末端のシグナルペプチドを欠いており、非古典的な分泌、又はリーダーレス分泌を使用して分泌される（Ｎｉｃｋｅｌ、２００３）。
【０２７１】
上昇したアスプロシンの組織源をインスリン抵抗性とともに評価するために、Ｆｂｎ１のｍＲＮＡプロフィルを、ＷＴマウス及びＯｂ／Ｏｂマウスから得られる様々なマウス組織にわたって評価した。Ｆｂｎ１のｍＲＮＡの強いアップレギュレーションが、白色脂肪組織、褐色脂肪組織及び骨格筋において認められた（図３１Ａ）（これらは、インスリン抵抗性の病理発生にしばしば関係する３つの器官である）。白色脂肪組織におけるアップレギュレーションはとりわけ強く、再度ではあるが、このことは白色脂肪組織を血漿中アスプロシンの主要な組織源として暗示した。本発明者らは、絶食及びストレプトゾトシン処置（血漿中アスプロシンにおける主要な変化を伴う２つの他の操作）によりこれらの器官のいずれにおいても、Ｆｂｎ１のｍＲＮＡにおける変化を何ら検出しなかった（図３１Ｂ〜図３１Ｃ）ので、脂肪及び骨格筋における増大したＦｂｎ１  ｍＲＮＡを介する血漿中アスプロシンのアップレギュレーションの機構が、インスリン抵抗性の病理発生に特有であるようである。ＩＩ型糖尿病は、孤立して、また、代謝症候群の一部として、依然として病的状態の主要な原因である。インスリン抵抗性の肝臓による不適切に上昇したグルコース産生が、その病理発生の根底にある主要な要因である（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ他、１９９２）。インスリン抵抗性のヒト及びマウスにおいて認められる上昇したアスプロシンレベルがこの一因である可能性がある。肥満のインスリン抵抗性マウスにおけるアスプロシンの免疫学的隔離のインスリン低下作用から、低下したアスプロシン活性が、この病理学的影響を急性的に打ち消すためのユニークなアプローチとして示唆される。それによれば、アスプロシン枯渇は、ＩＩ型糖尿病に対する重要な治療戦略となる場合がある。
【０２７２】
（実験手順例）
研究被験者及び倫理表明。生物学的材料を研究のために使用するためのインフォームドコンセント及び許可をベイラー医科大学において４つの施設内審査委員会承認プロトコルの１つに従ってすべての被験者から参加前に得た。
【０２７３】
臨床評価。試験被験者を、臨床履歴、理学的検査及び家族歴によって評価した。インフォームドコンセントの後、血漿単離、ボディーマス指数測定及び体脂肪率測定（ＤＥＸＡ）を標準的な全般的予防措置とともに行った。
【０２７４】
全エクソームの取得及び配列決定。患者＃１及びその両親から得られるゲノムＤＮＡを全エクソーム解析に供した（トリオ分析）。バリアントには注釈を付け、分析を、潜在的な劣性（ホモ接合及び複合ヘテロ接合）かつデノボのバリアントを探すために三つ組で行った。
【０２７５】
サンガーシーケンシング。両親から得られるゲノムＤＮＡをサンガーシーケンシングに供した。プライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ３を使用して、ＦＢＮ１遺伝子のイントロン−エクソン境界部を含めて、ＦＢＮ１遺伝子のエクソン６５及びエクソン６６を包含するように設計した。サンガー読み取りデータを、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  Ｓｅｑｍａｎソフトウェアを使用して分析した。患者＃１については、サンガー配列決定を、表現型に関するデノボ出現及び分離を確認するために、両親及び非罹患兄弟姉妹から得られるゲノムＤＮＡに対して行った。
【０２７６】
動物。本発明者らは１２週齢のオスのＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをインビボ研究のために使用した。ＭｇＲヘテロ接合マウスをＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得て、オスのＭｇＲホモ接合マウス及びＷＴ同腹子を得るために交配した。５週齢のオスのＯｂ／ＯｂマウスをＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから得た。マウスを１２時間明期／１２時間暗期のサイクルでケージあたり２匹〜５匹で収容し、食物及び水を自由に摂らせた。食餌誘発肥満の研究のために、マウスを、Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄによって６０％のカロリーを脂肪から提供する調節されたカロリー食に１２週間にわたって置いた。マウスを尾静脈注射によるアデノウイルス媒介遺伝子導入（マウスあたり１０１１個のウイルス粒子）にさらした。マウスを、皮下注射により１０日間にわたって毎日、３０μｇの組換えＨｉｓタグ化アスプロシン又は組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）にさらした。マウスをウイルス注射又はペプチド注射の１０日後に屠殺し、血漿及び様々な器官を単離した。単回用量の注射のために、毎日の注射の場合と同じプロトコルに従い、その後、血漿を、インスリン及びグルコースの測定のために尾採血により、示された時間で集めた。インスリン抵抗性試験及びグルコース負荷試験（ＩＴＴ及びＧＴＴ）を、標準的な手順を使用して行った。０．５Ｕ／ｋｇのインスリンボーラス投与をＩＴＴのために使用し、１．５ｍｇ／ｇのグルコースボーラス投与をＧＴＴのために使用した。免疫学的隔離実験のために、マウスに、アミノ酸１０６〜１３４（ヒトプロフィブリリンのアミノ酸２８３７〜２８６５）に対する特注（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）の抗アスプロシンマウスモノクローナル抗体の生理食塩水における５００μｇ用量、又は等用量のアイソタイプ一致のＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を腹腔内注射した。高インスリン性正常血糖クランプ研究を、以前に記載されたように（Ｓａｈａ他、２０１０）、ＵＰＬＣ精製された［３−３Ｈ］グルコースとの組合せで通常型ヒトインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ  Ｒ、用量：２．５ｍｕ／ｋｇ体重）を使用して非拘束マウスにおいて行った。ベイラー医科大学施設内動物管理利用委員会により、すべての実験が承認された。
【０２７７】
血漿代謝パラメーター。ヒト血漿中のインスリンを、ＡｂｃａｍによるヒトインスリンＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。マウス血漿中のインスリンを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅによるマウスインスリンＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。マウス血漿中のグルカゴン、エピネフリン、ノルエピネフリン及びコルチコステロンが、バンダービルト大学のホルモンアッセイ＆分析サービス施設によって測定された。
【０２７８】
組換え型のアスプロシン及びＧＦＰ。ヒトＦＢＮ１（２７３２位〜２８７１位のアミノ酸）のｃＤＮＡをクローニングし、続いて、大腸菌における発現のためのｐＥＴ−２２Ｂベクターにサブクローニングした。大腸菌で発現された融合タンパク質は、Ｎ末端における６アミノ酸のＨｉｓタグと、１４０アミノ酸の野生型アスプロシンとから構成される１４６アミノ酸の長さである。大腸菌で発現されるＨｉｓタグ化ＧＦＰを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからコントロールタンパク質として得た。Ｈｉｓ−アスプロシン及びＨｉｓ−ＧＦＰを大腸菌から単離し、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄカラムに結合させた。混入タンパク質を除くためにカラムを十分に洗浄した後、Ｈｉｓ−アスプロシン及びＨｉｓ−ＧＦＰを、１５０ｍＭイミダゾール緩衝液を使用してカラムから溶出した。これらの組換えタンパク質をさらに、サイズ排除カラムと、ポリミキシンＢに基づくエンドトキシン除去カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．によるＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）エンドトキシン除去ゲル）とを使用して、最終エンドトキシン濃度を２ＥＵ／ｍｌ以下にするために要求されるほど多数回の通過により精製し、ＰＢＳ−グリセロール緩衝液、又は２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ  ＮａＣｌ／１５０ｍＭイミダゾール緩衝液に緩衝液交換した。精製タンパク質を、純度レベルを決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。すべての組換えタンパク質実験において使用されるＨｉｓ−ＧＦＰタンパク質及びＨｉｓ−アスプロシンタンパク質は９０％超の純度であり、（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＡＬ発色エンドトキシン定量キットを使用して求められる）エンドトキシンレベルが、エンドトキシン除去カラムに通す前及び通した後において示される通りであった（図３１Ｄ）。
【０２７９】
細胞培養。初代マウス肝細胞を、標準的な方法論を使用して８週齢〜１２週齢のＷＴマウスから単離した。単離した数分のうちに、細胞をエッペンドルフチューブ内のグルコース非含有培地に入れ、５０ｎＭの組換えアスプロシン、５０ｎＭの組換えＧＦＰ、５μＭのスラミン（Ｔｏｃｒｉｓ）、２００μＭのｃＡＭＰＳ−Ｒｐ（Ｔｏｃｒｉｓ）、１μＭのＬ１６８，０４９（Ｔｏｃｒｉｓ）、１００μＭのエピネフリン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのグルカゴン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍｇ／Ｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ）又は１００μＭのプロプラノロール（Ｓｉｇｍａ）による処理に供した。この細胞を、ｃＡＭＰアッセイ及びＰＫＡアッセイのためには１０分間、インビトログルコース産生アッセイのためには２時間、５０ｎＭの組換え型のアスプロシン又はＧＦＰにより処理した。細胞を、アスプロシン、ＧＦＰ、グルカゴン又はエピネフリンによる処理に先立って１時間、様々な阻害剤により前処理した。ｃＡＭＰを、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓから得られるｃＡＭＰ直接免疫アッセイキットを使用して細胞溶解物から測定した。ＰＫＡ活性を、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．から得られるＰＫＡキナーゼ活性キットを使用して細胞溶解物から測定した。培地中のグルコース含有量を、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎから得られるグルコース比色アッセイキットを使用して測定した。結果をタンパク質含有量に対して正規化した。
【０２８０】
組換えアスプロシンを、Ｐｉｅｒｃｅから得られるＢａｓｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ  Ｋｉｔを使用してビオチンとコンジュゲート化した。初代肝細胞を、単独での、又は１００倍過剰の非コンジュゲート化アスプロシンの存在下での増大する濃度のアスプロシン−ビオチンコンジュゲートと４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を、溶解することなくＰＢＳにより３回洗浄し、その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加えた。生じた吸光度を比色測定し、結果をタンパク質含有量に対して正規化した。
【０２８１】
３Ｔ３−Ｌ１及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２の前脂肪細胞を脂肪産生カクテル（１μＭのインスリン、１μＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン及び３μＭのロシグリタゾン）に７日間さらした。脂肪産生を、脂質液滴及びＰＰＡＲｇ２のｍＲＮＡ発現を可視化することによって確認した。
【０２８２】
アスプロシンの分泌に対するグルコース媒介影響を測定するために、４．５ｇ／Ｌのグルコースを伴う、又は伴わない無血清ＤＭＥＭを使用した。
【０２８３】
ＷＴ型のヒト由来の１４０アミノ酸のアスプロシン（プロフィブリリンアミノ酸２７３２〜２８７１）と、フレームシフト及びＣ末端短縮を誘導するｃ．８２０６＿８２０７ＩｎｓＡ変異を有する変異プロフィブリリンとを、ｐＣＭＶ６−Ｎｅｏベクターシステムを使用してＣＭＶプロモーターの制御下にサブクローニングした。
【０２８４】
サンドイッチＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット。内在性アスプロシンのサンドイッチＥＬＩＳＡのために、アスプロシンのアミノ酸１０６〜１３４（ヒトプロフィブリリンのアミノ酸２８３８〜２８６５）に対する特注（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）のマウスモノクローナル抗アスプロシン抗体を捕捉抗体として使用し、アスプロシンのアミノ酸６〜１９（ヒトプロフィブリリンのアミノ酸２７３７〜２７５０）に対するＡｂｎｏｖａによるヤギ抗アスプロシンポリクローナル抗体を検出抗体として使用した。ＨＲＰに連結される抗ヤギ二次抗体を、シグナルを発生させるために使用した。ＨｉｓタグのサンドイッチＥＬＩＳＡのために、ヤギ抗Ｈｉｓポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を検出抗体として使用することを除いて同じ手順を使用した。組換えアスプロシン（これはＮ末端Ｈｉｓタグを含有する）の量を増大させて、両アッセイのための検量線を作成した。ＥＤＴＡ−血漿を血漿のサンドイッチＥＬＩＳＡのために使用し、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．によるＶｉｖａｓｐｉｎタンパク質濃縮スピンカラムを使用して濃縮される無血清ＤＭＥＭを培地のサンドイッチＥＬＩＳＡのために使用した。
【０２８５】
アスプロシンについての血漿のウエスタンブロッティングを、アスプロシンのアミノ酸１０６〜１３４（ヒトプロフィブリリンのアミノ酸２８３７〜２８６５）に対する特注（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）のマウスモノクローナル抗アスプロシン抗体を使用して行った。血漿から、免疫グロブリン及びアルブミンを、Ｐｉｅｒｃｅによるアルブミン／ＩｇＧ除去キットを使用して除去した。
【０２８６】
プロフィブリリンについてのウエスタンブロッティングを、プロフィブリリンアミノ酸４５１〜９０９に対するＡｂｃａｍによるマウスモノクローナル抗フィブリリン−１抗体を使用して行った。
【０２８７】
ホスホ−ＰＫＡ及び総ＰＫＡについてのウエスタンブロッティングを、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から得られる抗体を使用して行った
【０２８８】
統計学的方法。すべての結果が、平均±ＳＥＭとして示される。Ｐ値を、二元配置ＡＮＯＶＡによって示される場合を除いて、すべての結果について、対応のないスチューデントｔ検定によって計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０２８９】
［実施例７］
（抗アスプロシンモノクローナル抗体研究）
図３２−食物摂取量を、抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の単回用量の投与前、投与期間中及び投与後の示された時間で、それぞれ２４時間にわたって測定した。
【０２９０】
図３３−血漿中アスプロシンを、高脂肪食が３ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の単回用量を投与した後の示された時間で測定した。
【０２９１】
図３４Ａ−血漿中グルコースを、高脂肪食が３ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の単回用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後の示された時間で測定した。
【０２９２】
図３４Ｂ−血漿中インスリンを、高脂肪食が３ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の単回用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後の示された時間で測定した。
【０２９３】
図３５Ａ−血漿中グルコースを、ｏｂ／ｏｂマウス及びＷＴマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の単回用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後の示された時間で測定した。
【０２９４】
図３５Ｂ−血漿中インスリンを、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の単回用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後の示された時間で測定した。
【０２９５】
図３６Ａ−グルコース負荷試験を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の１０回の１日１回の用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後１１日目に行った。
【０２９６】
図３６Ｂ−体重を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の１０回の１日１回の用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後１１日目に測定した。
【０２９７】
図３７Ａ−グルコース負荷試験を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の１０回の１日１回の用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後１３日目に行った。
【０２９８】
図３７Ｂ−体重を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ）の１０回の１日１回の用量（５００ｕｇ／マウス）を投与した後１３日目に測定した。
【０２９９】
図３８Ａ−グルコース負荷試験を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の２００ｕｇの単回用量を投与した後で行った。
【０３００】
図３８Ｂ−グルコース負荷試験を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の１００ｕｇの単回用量を投与した後で行った。
【０３０１】
図３８Ｃ−グルコース負荷試験を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の５０ｕｇの単回用量を投与した後で行った。
【０３０２】
図３８Ｄ−グルコース負荷試験を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の２５ｕｇの単回用量を投与した後で行った。
【０３０３】
図３９Ａ−血漿中グルコースを、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の２００ｕｇの単回用量を投与した６時間後に測定した。
【０３０４】
図３９Ｂ−血漿中グルコースを、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の１００ｕｇの単回用量を投与した６時間後に測定した。
【０３０５】
図３９Ｃ−血漿中グルコースを、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の５０ｕｇの単回用量を投与した６時間後に測定した。
【０３０６】
図３９Ｄ−血漿中グルコースを、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の２５ｕｇの単回用量を投与した６時間後に測定した。
【０３０７】
図４０Ａ−グルコース負荷試験を、レプチン受容体ノックアウトマウス（ｄｂ／ｄｂ）において抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の１００ｕｇの単回用量を投与した後で行った。
【０３０８】
図４０Ｂ−毎日の体重測定を、レプチン受容体ノックアウトマウス（ｄｂ／ｄｂ）において抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の１００ｕｇの単回用量を投与したときに行った。
【０３０９】
図４１Ａ〜図４１Ｃ−２４時間食物摂取量を、抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の毎日の１００ｕｇ用量をレプチン受容体ノックアウトマウス（ｄｂ／ｄｂ）において７日間投与したときに測定した。正規化されていないデータ（図４１Ａ）、及び、体重に対して正規化されたデータ（図４１Ｂ）又は除脂肪量に対して正規化されたデータ（図４１Ｃ）が示される。このデータを添付物として送付する。
【０３１０】
図４２−毎日の体重測定を、高脂肪食が５ヶ月間与えられたマウスにおいて抗アスプロシンモノクローナル抗体（配列番号４）の１００ｕｇの単回用量を投与したときに行った。
【０３１１】
［実施例８］
（表題：アスプロシンは視床下部飢餓回路網を活性化する）
序論−限られた期間を食物なしで生き延びる能力は、進化及び地球上の生命の土台である。哺乳動物は、一連のホルモンによって正確に連携される相互につながったプロセスの巨大なカスケードを活性化することによって絶食に応答する。２つのそのような連携したプロセスが、摂食刺激と、循環への肝臓のグルコース放出とであり、これらは一緒になって、食物を得るための、また、脳に栄養が与えられることを保ち、そして、そのことが達成されている間は待機状態にあるための原動力を確かなものにしている。ヒトにおける希な遺伝的状態、すなわち、新生児早老症様症候群（マルファン・リポジストロフィー症候群、ＯＭＩＭ：６１６９１４）の研究を通して、脂肪組織において高発現し、分泌されたときには肝臓のグルコース放出を刺激する、絶食により誘発された約３０ｋＤａのホルモン（アスプロシン）が最近発見された（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。絶食期間中は肝臓のグルコース放出が必要であることと一致して、循環アスプロシンが急性的様式で絶食により上昇し、摂食により低下し、このことは、栄養状態との協調での概日リズム性を呈している。今回、末梢のアスプロシンが血液脳関門を越えて、視床下部の摂食回路網を作動させ、これにより、食欲刺激を引き起こし、また、脂肪過多の維持を長期間にわたって引き起こすことが本明細書中において明らかにされる。結果は、哺乳動物の絶食状態の２つの非常に重要な柱（食欲刺激及び肝臓のグルコース放出）の間における協調が、肝臓及び視床下部に存在する時空的に異なった機構を通して、絶食により誘発された同じホルモン（アスプロシン）を介してなされることを明らかにする。
【０３１２】
（結果）
新生児早老症様症候群（ＮＰＳ）患者は食欲減退を呈する−本発明者らをタンパク質ホルモンのアスプロシンに至らせたＮＰＳの複雑な分子遺伝学が以前に解明されていた（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。ＮＰＳの個体は、極端な痩せ（図１Ａ）（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７；Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、低下した皮下脂肪量（図１Ａ）（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）、及び部分的リポジストロフィーにもかかわらずインスリン感受性の維持（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）が伴う血漿中アスプロシンにおける欠乏（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）を呈する。ＮＰＳにおけるエネルギー収支式を観察された痩せの状況のなかでよりよく理解するために、食物摂取量及びエネルギー消費量を、それぞれ２つの独立した方法を用いて測定した。両方の個体が、家庭において、同様にまた、研究室環境において、年齢／性別が一致したその同輩よりも少ないカロリーを毎日消費した（図４３）。両個体の食欲減退が、間接熱量測定法又は二重標識水法を使用して測定した場合、日常的なエネルギー消費が異常なことと一致していた（図４３）、その結果、釣り合ったエネルギー式と、安定的ではあるが、少ない体重とを生じさせた。２４時間カロリー摂取及び２４時間エネルギー消費に加えて、約２７０の他のパラメーターを、ＮＰＳの包括的な生理学的見解を得るためにエネルギー収支に関連して測定した（図５５Ａ〜図５５Ｇ、図５６Ａ〜図５６Ｂ、図５７Ａ〜図５７Ｄ、図５８Ａ〜図５８Ｃ、図５９Ａ〜図５９Ｅ、及び図６０Ａ〜図６０Ｃ）。これらの結果に基づくと、ＮＰＳに随伴する痩せは少なくとも部分的には、アスプロシン欠乏によって説明され得ると考えられ、また、アスプロシンがヒトにおける正常な食欲レベルのために必要であると考えられた。
【０３１３】
アスプロシンが脳脊髄液（ＣＳＦ）に存在し、食欲を齧歯類において刺激する−アスプロシンレベルを、アスプロシン特異的（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してラットのＣＳＦにおいて評価し、アスプロシンが、血漿におけるレベルの１／４〜１／５であるレベルでＣＳＦに存在した（図４４Ａ）（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。血漿中のアスプロシンと同様に、ＣＳＦ中のアスプロシンが一晩の絶食によって誘導された（図４４Ａ）。血漿中アスプロシンが血液脳関門を越えて、ＣＳＦに入ることができるであろうかどうかを評価するために、ラットに組換えアスプロシンを静脈内注射し、ラットをＣＳＦにおけるＮ末端ｈｉｓタグの存在について調べた。ＩＶ注射の１時間後、ＣＳＦにおける強いｈｉｓタグシグナルが、ＣＳＦ中アスプロシンの６倍の上昇と似合って検出され、このことは、血漿中アスプロシンのＣＳＦ中への確固たる進入を示唆した（図４４Ｂ）。
【０３１４】
アスプロシンが食欲を刺激するかどうかを確認するために、細菌発現又は哺乳動物発現による組換え型のアスプロシン又はＧＦＰの単回用量をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下投与した。アスプロシン注射のマウスは、ＧＦＰ注射のマウスと比較して、どの組換えアスプロシン調製物が使用されたかにかかわらず、より多くの食物摂取をその後の２４時間にわたって呈した（図４４Ｃ〜図４４Ｄ）。注目すべきは、哺乳動物産生アスプロシンは、細菌産生アスプロシンの分子量の約２倍であり、以前に予測されたように（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、この相違は、主として哺乳動物型のグリコシル化に起因するものである（図５０Ａ）。哺乳動物産生アスプロシンの血漿中の半減期が、細菌産生型についての約２０分（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）と比較して、約１４５分である（図５０Ｂ）。興味深いことに、アスプロシンは、その食欲促進作用を発揮する前に数時間の潜在期を一貫して呈した（図４４Ｃ〜図４４Ｄ）：このことから、アスプロシンは、より急性の作用因（例えば、グレリン等）から区別される（Ｎａｋａｚａｔｏ他、２００１）。皮下注射と一致して、アスプロシンの食欲促進作用が、ＣＳＦ内への直接導入を脳室内（ＩＣＶ）注射により行ったときに認められた（図４４Ｅ）。長期の応答を理解するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを組換えアスプロシンの毎日の皮下用量により１０日間にわたって処置した。予想された過食に加えて（図４４Ｆ）、エネルギー消費における変化は認められず（図４４Ｇ）、脂肪過多における増大が認められ（図４４Ｈ）、このことは、エネルギー収支式が、増大したエネルギー摂取に有利になるように傾いていることを明らかにした。血漿中アスプロシンにおける約２倍の上昇をもたらすアデノウイルス媒介のＦＢＮ１遺伝子導入を使用する第２の１０日間の機能獲得戦略（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）（図５０Ｃ）は、類似した過食応答を示し（図４４Ｉ）、エネルギー消費における変化を何ら示さず（図４４Ｊ）、これらには、標準固形飼料での脂肪過多における増大が伴い（図４４Ｋ）、その増大が、動物を高脂肪食の状態に置くことによって増強された（図４４Ｌ）。
【０３１５】
アスプロシンは食欲促進性ＡｇＲＰニューロンを活性化する−アスプロシンの食欲促進機能の根底にある機構を立証するために、弓状核における視床下部摂食中枢に注目した。ＡｇＲＰニューロンは食欲促進性ニューロンのよく研究された集団であり（Ａｐｏｎｔｅ他、２０１１；Ｋｒａｓｈｅｓ他、２０１１；Ｌｕｑｕｅｔ他、２００５）、組換えアスプロシンは、発火頻度における増大及び膜電位における増大を介してその活性化を急性的に誘導し、一方で、予想されるように、組換えＧＦＰは活性を全く示さなかった（図４５Ａ）。ＡｇＲＰニューロンの約５０％のみがアスプロシン応答性であることが一貫して認められ、このことは、一部のサブセットのみが、アスプロシンシグナルを伝達するために必要である成分を含有することを示唆した（図４５Ｂ）。加えて、アスプロシンは、ＡｇＲＰニューロンの微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＳＰＣ）の振幅を増大させ、しかし、その頻度は増大させず、このことから、アスプロシンは、シナプス前の機構ではなく、むしろ、シナプス後の機構を介してＡｇＲＰニューロンを活性化することが示唆された（図４５Ｃ〜図４５Ｄ）。このことが、ＡｇＲＰニューロンへのシナプス入力を薬理学的に阻害することによって確認され、アスプロシン媒介活性化における低下が何ら認められなかった（図４５Ｅ〜図４５Ｇ）。
【０３１６】
Ｇαｓ−ｃＡＭＰ−ＰＫＡ軸がアスプロシン媒介のＡｇＲＰニューロン活性化のために必要である−ＡｇＲＰニューロンにおけるアスプロシン作用の用量依存性を、無処置の切片を細菌産生又は哺乳動物産生のどちらかの組換えアスプロシンにさらすことによって評価した。ＡｇＲＰニューロンの用量依存的活性化が両方の種類のアスプロシンについて発火頻度及び膜電位のレベルで認められた（図４６Ａ）。両方の種類のアスプロシンについてのＥＣ５０値が、ナノモル濃度〜ナノモル濃度以下の範囲にあることが見出され（このことは、大きい作用感受性を示している）、これらの値はまた、十分に内因性アスプロシンがＣＳＦに存在する範囲内である（図４６Ａ）。
【０３１７】
スラミン（ヘテロ三量体Ｇタンパク質阻害剤）、ＮＦ４４９（Ｇαｓ阻害剤）、ＮＫＹ８０（アデニル酸シクラーゼ阻害剤）及びＰＫＩ（プロテインキナーゼＡ阻害剤）による前処理によって、アスプロシン媒介のＡｇＲＰニューロン活性化を、発火頻度及び静止膜電位の両方のレベルで及び完全に妨げることができた（図４６Ｂ）。逆に、ＰＴＸ（Ｇαｉ阻害剤）又は［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ−６（グレリン受容体阻害剤）による前処理は、アスプロシンのＡｇＲＰニューロン活性化能に対して何ら影響を有していなかった（図４６Ｂ）。これらの結果は、Ｇタンパク質（具体的にはＧαｓ）、アデニル酸シクラーゼ、ｃＡＭＰ及びＰＫＡを介したシグナル伝達が、アスプロシン媒介のＡｇＲＰニューロン活性化のために必要であり、一方で、Ｇαｉ及びグレリン受容体は必ずしも必要でないことを示唆する。同じパターンが、アスプロシンによって活性化されるＡｇＲＰニューロンの割合のレベルで認められた（図４６Ｃ）。
【０３１８】
アスプロシン媒介の食欲刺激のためにＡｇＲＰニューロンが必要であることを確認するために、アスプロシンを、ＷＴマウス、及びＡｇＲＰニューロンの遺伝子破壊を有する変異マウス（Ｌｕｑｕｅｔ他、２００５）に注射した。予想されるように、ＡｇＲＰニューロンの消失は、アスプロシンの食欲促進作用を完全に取り除いた（図４６Ｄ）。
【０３１９】
アスプロシンは食欲不振誘発性ＰＯＭＣニューロンを阻害する−ＰＯＭＣニューロンは、ＡｇＲＰニューロンと協調して機能する弓状核内のニューロンの食欲不振誘発性集団である。アスプロシンは、ＰＯＭＣニューロンの静止膜電位及び発火頻度を低下させることによってＰＯＭＣニューロンの約８５％を急性的に阻害した（図４７Ａ〜図４７Ｂ）。加えて、アスプロシンは、ＰＯＭＣニューロンにおいて、微小抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）の頻度を増大させ、しかし、その振幅は増大させなかった（図４７Ｃ〜図４７Ｄ）。ＡｇＲＰニューロンに対する明らかにされた直接的な作用とは対照的に、アスプロシンのＰＯＭＣニューロン過分極化能は、無傷なＧＡＢＡ作動性入力に依存しており、このことは、周囲のＧＡＢＡ作動性ニューロンを介する間接的な作用を示唆した（図４７Ｅ〜図４７Ｇ）。他方で、グルタミン酸作動性入力の遮断は、アスプロシン媒介のＰＯＭＣニューロン過分極に影響しなかった（図４７Ｆ）。ＡｇＲＰニューロンは、ＰＯＭＣニューロンに投射する１つのそのようなＧＡＢＡ作動性集団であるので（Ａｔａｓｏｙ他、２０１２；Ｔｏｎｇ他、２００８）、アスプロシン媒介のＰＯＭＣ過分極に対するＡｇＲＰニューロン消失の影響を調べた。ＡｇＲＰニューロンの消失は、ＰＯＭＣニューロンにおけるアスプロシン媒介の過分極を完全に妨げ、しかし、発火頻度のレベルでは影響がほとんど認められなかった（図４７Ｈ）。このことから、ＡｇＲＰニューロンは、アスプロシンのシグナルをＰＯＭＣニューロンに伝達する上流側ＧＡＢＡ作動性ニューロンの少なくとも１つの集団であることが示唆される。
【０３２０】
マウスの新生児早老症様症候群はそのヒト障害の表現型を反映する−マウスにおけるヒトＮＰＳの遺伝子構造を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して再現した（図）。本発明者らは、エクソン−６５／イントロン−６５の境界部を包含する小さい欠失（１０ｂｐ）を導入した（図４８Ａ）。これにより、エクソン６５の飛び越しと、アスプロシンコード領域のヘテロ接合消失を引き起こすフレームシフトとがもたらされ（図４８Ａ）、これらは、知られているＮＰＳ患者における記録された分子的事象と同一であった（Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４）。ヒトＮＰＳと同様に、アスプロシンレベルが、おそらくは以前に仮定されたドミナントネガティブな作用機構（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）に起因して、ヘテロ接合性であるにもかかわらず、５０％よりはるかに低かった（図４８Ｂ）。ＮＰＳ患者と同様に、ＮＰＳマウスは極端な痩せを呈しており（図４８Ｃ）、このことが、体長における認められた変化を何ら伴うことなく、脂肪量及び除脂肪量の両方における低下のためであると、ＤＥＸＡ走査を使用して確認された（図４８Ｄ）（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）。除脂肪量における低下は、根底にあるマルファン症候群を考えると、驚くことではなく、この場合、この低下は、筋肉量における低下が随伴し、短縮したフィブリリン−１タンパク質に起因するＮＰＳ表現型の一部である（Ｊｕｄｇｅ及びＤｉｅｔｚ、２００５）。血漿中のレプチンレベル及びアディポネクチンレベルが、ＮＰＳマウスではそのリポジストロフィーと一致して、有意に低くなっていた（図５１Ａ〜図５１Ｂ）。
【０３２１】
マウスを高脂肪食状態に３ヶ月間置くと、体重及び脂肪量における拡大する差がＷＴマウスとＮＰＳマウスとの間で示された（図４８Ｅ）。標準的な固形飼料では、ＮＰＳマウスの体重曲線が３週齢から離れ、１０週において１０ｇの体重差に達した（図４８Ｆ）。マウスを糖尿病誘発かつ肥満誘発の重度のストレス（６ヶ月間の高脂肪食、６０％のカロリーが脂肪由来である）のもとに置くと、ＮＰＳマウスは、ＷＴマウスと比較して、肥満及び糖尿病の両方から完全に保護されたことが示された（図５１Ｃ〜図５１Ｅ）。ヒト障害と同様に、ＮＰＳマウスは、エネルギー消費における変化を伴うことなく、毎日の食欲減退を呈しており、このことが、エネルギー収支式を、脂肪過多及び体重における認められた低下に似合うように、低下したエネルギー摂取の方に傾かせた（図４８Ｇ〜図４８Ｈ）。ＡｇＲＰニューロンの活性が、ＷＴ同腹子と比較して、ＮＰＳマウスでは有意に低下していることが見出され、このことが、低下した発火頻度及び静止膜電位によって明らかにされた（図４８Ｉ）。最後に、組換えアスプロシンの単回皮下用量が、食欲減退を完全に救済するために十分であり、このことは、ＮＰＳ随伴の食欲減退が血漿中アスプロシンの欠乏に起因しており、変異したプロフィブリリンの何らかの間接的な影響に起因していないことを明らかにした（図４８Ｊ）。ＮＰＳマウスの呼吸交換率を評価すると、ＷＴマウスと比較して、基質の好みにおける有意差が見られなかった（図５１Ｆ）。基礎的な生命徴候（例えば、心拍数、血圧及び体温等）もまた、変化しないままであった（図５１Ｇ〜図５１Ｉ）。
【０３２２】
アスプロシンの免疫学的隔離は肥満マウスにおいて食物摂取及び体重を低下させる−モノクローナル抗体を使用するアスプロシンの免疫学的隔離は、ＡｇＲＰニューロンの発火頻度及び膜電位における低下を、標準固形飼料が与えられたマウスにおいてもたらした（図４９Ａ）。このことはまた、ｃ−ｆｏｓタンパク質の発現をＡｇＲＰニューロン活性のマーカーとして使用してインビボで認められた（図５２Ａ〜図５２Ｂ）。これには、エネルギー消費における関連した変化を伴うことなく、毎日の食物摂取における低下が伴っていた（図４９Ｂ〜図４９Ｃ）。この抗体（図５３Ａ）はアスプロシン特異性について本発明者らによって以前に確認されており（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、詳細なエピトープマッピングをこの抗体について行った（図５３Ｂ）。この抗体の中和活性をインビトロで調べ、この抗体の中和活性はそのＩＣ５０の計算を可能にし（図５３Ｃ）、また、その観察結果を、糖尿病マウスにおける可能性のある最小有効用量の計算にまで拡張した（図５３Ｄ）。インビボでの概念実証のために、ストレプトゾトシンにより処置されるマウスでは中和活性が完全になくなった（図５３Ｅ）：これは、そのような処置により、循環アスプロシンがほとんど存在しないことがもたらされると考えられたからであった（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。加えて、抗アスプロシン抗体は、ＡｇＲＰニューロンの活性化及びＰＯＭＣニューロンの阻害を引き起こすアスプロシンの能力を完全に中和し、一方で、無関係の抗体（アイソタイプ一致のＩｇＧ）は影響を何ら有していなかった（図５４Ａ〜図５４Ｊ）。
【０３２３】
ヒト及びマウス（高脂肪食、ホモ接合のｏｂ変異）の肥満には、血漿中アスプロシンにおける病理学的な増大が伴うことが、以前に明らかにされていた（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。これらの結果をマウス肥満の別のモデル（ホモ接合のｄｂ変異）にまで拡張した（図５４Ｋ）。インスリン抵抗性マウスの血糖プロフィルにおける以前に明らかにされた改善（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）と同様に、アスプロシンの免疫学的隔離は、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて、エネルギー消費に影響を与えることなく、毎日の食物摂取を低下させた（図４９Ｄ〜図４９Ｅ）。５日間にわたる毎日の腹腔内服用は、体重における改善を、低下した食物摂取と同調するように示した（図４９Ｆ）。事実上同一の結果が、ＨＦＤで飼育されるマウスを使用して得られた（図４９Ｇ〜図４９Ｉ）。これらの結果は、薬理学的実体（例えば、モノクローナル抗体等）を使用する長期のアスプロシン枯渇は、ヒト及びマウスでのアスプロシン枯渇の遺伝学的研究から予測されるであろうように、食物摂取及び体重の低下を生じさせることを示唆する。
【０３２４】
（ある特定の実施形態の意義）
循環アスプロシンの濃度が実験的に低下させられる場合（ＰＳ患者における遺伝的枯渇、ＰＳマウスにおける遺伝的枯渇、又はマウスにおける免疫学的隔離による急性的除去）、又は増大させられる場合（アデノウイルス媒介の過剰発現、又は組換えタンパク質注射）にかかわらず、その結果は、食物摂取及び脂肪過多における対応する変化である。アスプロシン媒介のＡｇＲＰニューロン活性化は、ＡｇＲＰニューロンの消失がアスプロシンの食欲促進原動力を無効にするので、これらの影響にとって中心的であるように思われる。しかしながら、アスプロシンはまた、ＡｇＲＰニューロンに加えて、食欲促進性ニューロン及び食欲不振誘発性ニューロンの他の集団を介してその食欲刺激作用を発揮し得るであろうという可能性が依然として存在する。
【０３２５】
肝臓において認められたこと（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）と同様に、Ｇαｓ−ｃＡＭＰ−ＰＫＡ軸が、アスプロシン媒介のＡｇＲＰニューロン活性化のために必要である。このことは、ＡｇＲＰニューロンにおけるＧαｓ及びｃＡＭＰのシグナル伝達の知られている食欲促進作用と一致しており（Ｎａｋａｊｉｍａ他、２０１６）、このことから、その食欲促進活性がこの経路に集中するこれまで知られていない循環因子が明らかにされる。さらに、アスプロシンは、無傷のＧＡＢＡ作動性シナプス入力に依存する、食欲不振誘発性ＰＯＭＣニューロンの阻害を生じさせる。ＡｇＲＰニューロンは、ＰＯＭＣニューロンに投射するＧＡＢＡ作動性ニューロンであり、その機能的関連性が、その消失はアスプロシン媒介のＰＯＭＣニューロン阻害を主に妨げるという観察結果によって確認される。
【０３２６】
ＮＰＳの個体は、食欲減退の様々な表現型パラメーター（図４３Ｂ）、低下した皮下脂肪量（図１Ａ）（Ｏ'Ｎｅｉｌｌ他、２００７）、及び非常に低いボディーマス指数（Ｊａｃｑｕｉｎｅｔ他、２０１４；Ｐａｓｓａｒｇｅ他、２０１６）と一緒に、有意な血漿中アスプロシンの欠乏を呈する（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。ヘテロ接合性のＮＰＳ変異対立遺伝子をマウスにおいて導入すると、ヒトＮＰＳの事実上の表現型模写が、血漿中アスプロシンにおける７５％の低下、食欲減退、低い脂肪量及び体重を伴ってもたらされる。このマウスはまた、ＡｇＲＰニューロン活性の低下したレベルを呈する。１回だけの皮下注射を介してであるが、血漿中アスプロシンの補充は、ＮＰＳマウスにおける食欲減退を完全に救済し、このことから、その表現型が血漿中アスプロシンの不足に依存していることが明らかにされる。
【０３２７】
アスプロシンが循環ホルモンであることを考えると、モノクローナル抗体を使用する免疫学的隔離は、潜在的な治療用途のための魅力的な逓減戦略である。この戦略の有効性が、インスリンレベルを高脂肪摂食マウス及びｏｂ／ｏｂマウスにおいて急性的に低下させるモノクローナル抗体処置を用いてインスリン抵抗性マウスにおけるアスプロシンの糖生成作用に対して明らかにされた（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。この場合、免疫学的なアスプロシン隔離はベースラインでのＡｇＲＰニューロン活性を低下させ、毎日の食物摂取における２０％の低下を生じさせることが見出された。それらの知見は、肥満の２つの独立したマウスモデル（食餌誘発肥満及びホモ接合ｄｂ変異）におけるアスプロシンの長期の免疫学的隔離が、体重の低下と一緒に、毎日の食物摂取量の２０％〜３０％の低下を生じさせることを明らかにすることによって肥満にまで拡張する。興味深いことに、レプチンのシグナル伝達がｄｂ変異の状況において存在しないことは、結果に影響を与えず、このことから、ＡｇＲＰニューロン及びＰＯＭＣニューロンにおいて２つのホルモンについて異なる作用機構が示唆された。これらの実験のいずれにおいてもエネルギー消費に対する影響が認められず、このことは、エネルギー収支式に対するアスプロシンの影響が食欲の刺激に限定されることを示唆した。注目すべきことに、ＡｇＲＰニューロンは、その食欲刺激機能に加えて、エネルギー消費を抑制することが知られている（Ｋｒａｓｈｅｓ他、２０１１）。しかしながら、アスプロシンによって活性化される一部のサブセットのＡｇＲＰニューロンは、アスプロシン非応答性のサブセットと比較して、エネルギー消費よりも食欲に対して大きい影響を有する可能性がある。
【０３２８】
ＦＢＮ１のｍＲＮＡが、脳では他の組織と比較してはるかに低いレベルで存在しており（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、また、血漿中アスプロシンによる血液脳関門の堅固な横断が認められたので、具体的な実施形態において、末梢産生のアスプロシンが、レプチンと同様に、中心的な食欲調節シグナルとして働いている。アスプロシンの器官特異的な消失、特に脂肪における消失は、この問題及び他の重要な問題に対処することに役立つにちがいない。１つの検討が、アスプロシンのシグナル伝達がどのように、既存の食欲促進性ホルモン及び食欲不振誘発性ホルモン（例えば、グレリン、レプチン及びインスリン等）によって発揮されるバランスに適合するかである。グレリン受容体は、アスプロシン媒介のＡｇＲＰニューロン活性化のために必ずしも必要でないこと（図４６Ｂ）、レプチン受容体（ｄｂ）は、食物摂取及び体重におけるアスプロシン機能喪失により誘発される低下のために必ずしも必要でないこと（図４９Ｄ〜図４９Ｆ）が明らかにされ、しかも、肝臓でのインスリンの糖調節作用とのクロストークが以前に明らかにされていた（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）。
【０３２９】
したがって、１つの実施形態において、アスプロシンは、脂肪に起源を有し、絶妙な感受性を全身のエネルギー状態に対して有し、これにより、絶食により高まり、摂食により減少する糖生成性かつ食欲促進性のホルモンとして存在する。アスプロシンは、両方の絶食関連機能を、異なった時空的様式で、同じｃＡＭＰセカンドメッセンジャー系を使用して果たす。具体的な実施形態において、アスプロシンのＡｇＲＰニューロンでの作用はその肝臓での作用を調節し、又は、その逆である。特定の実施形態において、ヒトのインスリン抵抗性及び肥満におけるアスプロシンの病理学的上昇、並びに、アスプロシンの免疫学的隔離の有効性が、マウスにおいてインスリン抵抗性に対して（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、また、肥満に対して認められたことは、アスプロシン枯渇がそのような疾患に対する独特な治療的手段として働くことを示している。
【０３３０】
（方法）
研究被験者及び倫理表明−生物学的材料を研究のために使用するためのインフォームドコンセント及び許可をベイラー医科大学において施設内審査委員会承認プロトコルに従ってすべての被験者から参加前に得た。以前に報告されたように（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、研究被験者を評価し、ゲノムＤＮＡを全エクソーム解析又はサンガーシーケンシングのどちらかによって分析した。
【０３３１】
二重標識水法（ＤＬＷ）−総エネルギー消費（ＴＥＥ）を、ＤＬＷ法を使用して１０日間にわたって測定した（Ｂｕｔｔｅ他、２００１；Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９８９；Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ、１９８８）。ベースライン時の尿サンプルが採取された後、それぞれの参加者が、０．０８６ｇ／ｋｇ体重の２Ｈ２Ｏ（９９．９原子％の２Ｈ）及び１．３８ｇ／ｋｇ体重のＨ２１８Ｏ（１０原子％の１８Ｏ）（Ｉｓｏｔｅｃ、Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ、ＯＨ）を経口によって受けた。７つの服用後の尿サンプル（１ｍＬ）が１日目〜１０日目に家で採取された。尿サンプルは、ガス同位体比質量分析法による分析に先立って凍結保存された。安定した水素同位体比測定のために、１０μＬの尿をさらに処理することなく、２００ｍｇの亜鉛試薬を用いて５００℃で３０分間、水素ガスに還元した。この水素ガスの２Ｈ／１Ｈ同位体比を、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｄｅｌｔａ−Ｅガス同位体比質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。安定した酸素同位体比測定のために、１００μＬの尿を、ＶＧ  ＩＳＯＰＲＥＰ−１８水−ＣＯ２平衡システム（ＶＧ  Ｉｓｏｇａｓ，Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、英国）を使用して、１８Ｏ含有量が既知である３００ｍｂａｒのＣＯ２と２５℃で１０時間にわたって平衡化させた。平衡化が終了したとき、このＣＯ２の１８Ｏ／１６Ｏ同位体比を、ＶＧ  ＳＩＲＡ−１２ガス同位体比質量分析計（ＶＧ  Ｉｓｏｇａｓ，Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、英国）を用いて測定した。
【０３３２】
室内呼吸熱量測定法（間接熱量測定法）−エネルギー消費を大型（３４ｍ３）の熱量計で２４時間にわたって測定した。２４時間熱量測定法の期間を通して、被験者は、身体活動（トレッドミル歩行）、摂食及び睡眠のスケジュールに従った。心拍数及び身体活動を、Ａｃｔｉｈｅａｒｔ（ＣａｍＮｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を使用して記録した。ＴＥＥ、非タンパク質性エネルギー消費（ＮＰＥＥ）、呼吸商（ＲＱ）及び正味の基質利用を、ＶＯ２、ＶＣＯ２及び尿中窒素排出量から計算した。ＢＭＲを、１２時間の絶食の後、起床時に３０分間にわたって測定した。睡眠時ＥＥを、心拍数及び運動センサーによって確認される夜間睡眠期間全体にわたって測定した。活動エネルギー消費（ＡＥＥ）を、食事性体温産生がＴＥＥの１０％であると仮定して、ＴＥＥ−ＢＭＲ−０．１ＴＥＥとして算出した。身体活動レベル（ＰＡＬ）をＴＥＥ／ＢＭＲとして定義した。１人の患者についての歩行のエネルギーコストを、２．５ｍｐｈ及び３．５ｍｐｈでの歩行をトレッドミル（Ｖｉｓｉｏｎ  Ｆｉｔｎｅｓｓ  Ｔ９６００）で１５分間行いながら測定した。
【０３３３】
食事思い出し−マルチプルパス２４時間食事思い出し法が、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＤＳＲ）（データベースバージョン２００５、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、ミネソタ大学、ミネアポリス）（Ｊｏｈｎｓｏｎ他、１９９６）並びに食物モデル及び家庭用の測定器具／食器を使用して登録栄養士によって、直接本人に会って記録された。２４時間思い出しは予告なしに行われた。マルチプルパス２４時間思い出し法では、３つの異なるパスが、先行する２４時間の期間を通した被験者の食物摂取に関する情報を集めるために使用される。水の消費及びビタミン・ミネラルのサプリメントは食事評価に含まれなかった。食物思い出しをＮＤＳＲによって分析し、栄養摂取量を算出し、これらの算定値を使用して、食餌摂取基準（ＤＲＩ）によって設定される標準に対して食事の量／質を評価した。
【０３３４】
動物−本発明者らは、６週齢〜１２週齢のオスのＷＴ型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをインビボ研究のために使用した。ｄｂ／ｄｂ肥満マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＡｇＲＰ消失マウスを、ＡｇＲＰ−ＤＴＲマウスにジフテリア毒素［５０ｎｇ／ｇ、皮下（ｓｃ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ０５６４］（ＤＴ）を出生後最初の１週間の期間中に注射することによって作製した（Ｄｅｎｉｓ他、２０１５；Ｌｕｑｕｅｔ他、２００５）。生理食塩水注射を受けたＡｇＲＰ−ＤＴＲマウスをコントロールマウスとして扱った。ＮＰＳマウスを、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９アプローチを使用してベイラー医科大学マウス胚性幹細胞施設で作製し、群体を施設内で維持した。Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９変異誘発を、変異部位の両側に位置するプライマーを使用してＰＣＲを行い、その後、ＰＣＲ産物を配列決定することによって確認した。６週齢〜１２週齢のオスのヘテロ接合のＷＴ同腹子及びＮＰＳ同腹子をすべての実験のために使用した。マウスを１２時間明期／１２時間暗期のサイクルでケージあたり２匹〜５匹で収容し、食物及び水を自由に摂らせた。食餌誘発肥満の研究のために、マウスを、６０％のカロリーを脂肪から提供する調節されたカロリー食（Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ）に１２週間〜１６週間にわたって置いた。マウスを、以前に記載されたように（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）、尾静脈注射を介してアデノウイルス媒介の遺伝子導入（マウスあたり１０１１個のウイルス粒子）にさらした。アスプロシン分析用のＣＳＦを得るために、本発明者らは、８週齢〜１２週齢のオスラットに、Ｈｉｓタグ化された組換えアスプロシンを静脈内注射し、その後、ラットを注射後１時間で屠殺し、ＣＳＦを得た。急速凍結ＣＳＦが、さらなる分析のために本発明者らに提供された。グルコース負荷試験（ＧＴＴ）を、標準的な手順を使用して行った。１．５ｍｇ／ｇのグルコースボーラス投与を使用した。ストレプトゾシン誘発の糖尿病マウスを以前の報告（Ｒｏｍｅｒｅ他、２０１６）のように作製した。
【０３３５】
電気生理学−全細胞パッチクランプ記録を、視床下部の弓状核（ＡＲＨ）を含有する脳切片における特定されたＡｇＲＰニューロン又はＰＯＭＣニューロンに対して行った。特に、ＡｇＲＰニューロンを特定するために、本発明者らは、ＴＯＭＡＴＯをＡｇＲＰ／ＮＰＹニューロンにおいて選択的に発現するＡｇＲＰ−Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ２６−ｔｄＴＯＭＡＴＯマウスを作製するために、Ｒｏｓａ２６−ｔｄＴＯＭＡＴＯ対立遺伝子を交雑により、通常のＡｇＲＰ−Ｃｒｅマウスに移した（Ｔｏｎｇ他、２００８）。いくつかの研究では、本発明者らはＮＰＹ−ＧＦＰマウス（Ｐｉｎｔｏ他、２００４）をＮＰＳマウスと交雑させて、ＮＰＳ変異を有する、又は有しないＮＰＹ−ＧＦＰマウスを作製した。弓状核におけるＧＦＰ標識ニューロンが記録された。ＰＯＭＣニューロンを記録するために、本発明者らは、ＴＯＭＡＴＯをタモキシフェン誘導（０．２ｍｇ／ｇ、ｉ．ｐ．、６週齢）のときに成熟ＰＯＭＣニューロンにおいて選択的に発現するＰＯＭＣ−ＣｒｅＥＲＴ２／Ｒｏｓａ２６−ｔｄＴＯＭＡＴＯマウスを作製するために、Ｒｏｓａ２６−ｔｄＴＯＭＡＴＯ対立遺伝子を交雑によりＰＯＭＣ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスに移した（Ｂｅｒｇｌｕｎｄ他、２０１３）。いくつかの研究では、本発明者らはまた、ＡｇＲＰ−ＤＴＲ対立遺伝子を交雑によりＰＯＭＣ−ＧＦＰマウスに移した。これらのマウスは、ＡｇＲＰニューロンが消失した、又は消失していないマウスを作製するために、（上記で記載される）ＤＴ又は生理食塩水の注射を受けた。
【０３３６】
６週齢〜１２週齢のマウスをイソフルランで深く麻酔し、１０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１９５ｍＭのスクロース、５ｍＭのグルコース、２．５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭのピルビン酸Ｎａ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２及び７ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する、スクロースに基づく改変された氷冷の切断溶液（ｐＨ７．３）（これには、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２が連続して吹き込まれる）（Ｒｅｎ他、２０１２）により経心的に灌流した。その後、マウスを断頭し、脳全体を取り出し、直ちに切断溶液に浸した。切片（２５０μｍ）を、Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ  ６５０Ｖビブラトーム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて切断した。弓状核を含有する３つの脳切片をそれぞれの動物について得た（ブレグマ、−２．０６ｍｍ〜−１．４６ｍｍ；両耳間、１．７４ｍｍ〜２．３４ｍｍ）。記録をこの脳領域全体にわたって様々なレベルで行った。切片を３４℃で１時間にわたって回復処理し、その後、１２６ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１１．１ｍＭのグルコース及び２１．４ｍＭのＮａＨＣＯ３を含有する人工脳脊髄液（ａＣＳＦ、ｐＨ７．３）で、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２を飽和させた人工脳脊髄液において室温で維持した後、記録を行った。
【０３３７】
切片を記録チャンバーに移し、記録する前に少なくとも１０分間にわたって平衡化させた。切片を１．８ｍｌ／分〜２ｍｌ／分の流速で、酸素化ａＣＳＦにおいて３４℃で表面灌流した。ＡＲＨにおけるＧＦＰ標識ニューロン又はＴＯＭＡＴＯ標識ニューロンを、可動ステージ（ＭＰ−２８５、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を備える正立顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＦＮ−１、Ｎｉｋｏｎ）での落射蛍光画像化及びＩＲ−ＤＩＣ画像化を使用して可視化した。３ＭΩ〜５ＭΩの抵抗を有するパッチピペットを、１２８ｍＭのグルコン酸Ｋ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＮａ−ＧＴＰ及び０．０５ｍＭのＭｇ−ＡＴＰを含有する細胞内溶液（ｐＨ７．３）で満たした。記録を、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用して行い、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａを使用してサンプリングし、ｐＣｌａｍｐ  １０．３ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてオフラインで分析した。直列抵抗を記録期間中モニターした。その値は一般に１０ＭΩ未満であり、補償されなかった。液間電位は＋１２．５ｍＶであり、実験後に補正された。直列抵抗が実験期間中に劇的に増大した場合、又は、活動電位についてのオーバーシュートがない場合、データは除外された。電流を増幅し、１ｋＨｚでフィルターリング処理し、２０ｋＨｚでデジタル化した。電流クランプを作動させて、神経の発火頻度及び静止膜電位（ＲＭ）をベースライン及びパフ送達の組換えアスプロシン（図に示される様々な濃度で５００ｍｓ）において調べた。アスプロシン抗体とのプレインキュベーション実験のために、アスプロシン及び抗アスプロシンｍＡＢ又はＩｇＧを１：１００の比率で穏やかに混合し、その後、記録する前に氷上で１時間保った。アスプロシン単独に対するＡｇＲＰニューロン又はＰＯＭＣニューロンの応答が確認された後、組換えアスプロシンと、抗アスプロシンｍＡＢ又はＩｇＧとの混合物を灌流して、ＡｇＲＰニューロン又はＰＯＭＣニューロンを４分間処理した。いくつかの実験において、ａＣＳＦ液はまた、シナプス前入力の大部分を阻止するために、１μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）（Ｓｏｈｎ他、２０１３）、及び高速シナプス阻害剤のカクテル、すなわち、ビククリン（５０μＭ；ＧＡＢＡ受容体アンタゴニスト）（Ｌｉｕ他、２０１３）、ＤＡＰ−５（３０μＭ；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）（Ｌｉｕ他、２０１２）及びＣＮＱＸ（３０μＭ；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）のカクテルを含有した；いくつかの実験において、ＤＡＰ−５（３０μＭ）及びＣＮＱＸ（３０μＭ）が、グルタミン酸作動性入力を阻止するためにａＣＳＦ液に含まれた；いくつかの実験において、ビククリン（５０μＭ）が、ＧＡＢＡ作動性入力を阻止するためにａＣＳＦ溶液に含まれた。微小興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）の記録のために、内部記録溶液は、１２５ｍＭのＣｓＣＨ３ＳＯ３、１０ｍＭのＣｓＣｌ、５ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭの（Ｍｇ）ＡＴＰ、０．３ｍＭの（Ｎａ）ＧＴＰ（ＮａＯＨによりｐＨ７．３）��含有した。ＡｇＲＰニューロンにおけるｍＥＰＳＣを、１μＭのＴＴＸ及び５０μＭのビククリンの存在下、−６０ｍＶの保持電位による電圧固定モードで測定した。ＰＯＭＣニューロンにおけるｍＩＰＳＣを、１μＭのＴＴＸ及びＤＡＰ−５（３０μＭ；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）及びＣＮＱＸ（３０μＭ；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）の存在下、−６０ｍＶの保持電位による電圧固定モードで測定した。周波数及びピーク振幅を、Ｍｉｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓプログラム（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．）を使用して測定した。ＲＭ、発火頻度、ｍＥＰＳＣ及びｍＩＰＳＣについての値を、ベースラインにおいて、又はアスプロシン処理後において２分の値域の中で平均化した。ニューロンは、膜電位における変化が振幅において少なくとも２ｍＶであるならば、脱分極している、又は過分極しているとみなされ、この応答は一時的にアスプロシンと関連していた。記録後、切片をＰＢＳにおける４％ホルマリンにより４℃で一晩、固定処理し、その後、ＡＲＨ内の記録されたニューロンの解剖学的場所の事後特定に供した。
【０３３８】
ＡｇＲＰニューロンにおけるｃ−ｆｏｓ免疫反応性−オスのＮＰＹ−ＥＧＦＰ遺伝子組換え成体マウスに、１００ｕｇのＩｇＧ又は１００ｕｇの抗アスプロシン抗体のいずれかを午後６時（暗期サイクルの開始時）に皮下注射し、食物を除いた。１６時間後、マウスを１０％ホルマリンで灌流した。脳切片を２５μｍ（１：５シリーズ）で切断した。固定処理された脳を集め、２５μｍの冠状切片に切断した。これらの脳切片を、以前のように（Ｙａｎ他、２０１６）、ｃ−ｆｏｓの免疫蛍光染色に供した。簡単に記載すると、切片を一次ウサギ抗ｃ−ｆｏｓ抗体（１：１０００；カタログ番号２２５０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と一晩インキュベーションし、続いて、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５９４（１：１０００；カタログＡ−２１２０７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１．５時間インキュベーションした。スライドをカバーガラスで覆い、ＯｐｔｉＧｒｉｄ構造化照明構成を有するＬｅｉｃａ  ＤＭ５５００蛍光顕微鏡を使用して分析した。ＡｇＲＰ／ＮＰＹニューロンをＡＲＨにおけるＧＦＰ標識ニューロンとして可視化し、これらのＡｇＲＰ／ＮＰＹニューロンと共標識化されたｃ−ｆｏｓ免疫反応性（赤色蛍光）の数を計数した。それぞれのマウスについて、ニューロンを、ＡＲＨを含有する１０枚〜１２枚の連続脳切片において計数し、平均をそのマウスについてのデータ値として処理した。
【０３３９】
マウスの食物摂取量及びエネルギー消費−食物摂取量及びエネルギー消費を、ＣＬＡＭＳシステム（包括的実験室動物モニタリングシステム、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して測定した。動物を記録チャンバーにおいて４８時間〜７２時間慣れさせ、続いて測定を明期サイクル及び暗期サイクルの期間中２４時間にわたって行った。マウスは、食物及び水を自由に、又は、示される場合には一晩の絶食の後で摂った。酸素消費量及び食物摂取量を記録した。
【０３４０】
以前に記載されたように（Ｙａｎ他、２０１６）、オスのマウスを吸入イソフルランにより麻酔し、ステンレス製カニューレ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｏｎｅ）を側脳室内に挿入した（ブレグマから０．３４ｍｍ尾側かつ１ｍｍ側方；深さ、２．３ｍｍ）。脳室内（ＩＣＶ）カニューレ挿入を、アンギオテンシンＩＩ（１０ｎｇ）を投与した後５分以内における飲水行動及びグルーミング行動が増加が実証されることにより確認した。これらのマウスには、１０ｎｇのＧＦＰ（１μｇ生理食塩水）が３日間連続して１日２回与えられ、１０ｎｇのアスプロシン（１μｇ生理食塩水において）が最終日に与えられた。ＢｉｏＤＡＱ食物摂取モニタリングシステム（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）を使用して、食物摂取をモニターし、最後のＧＦＰ注射及びアスプロシンからの食物摂取量を比較した。
【０３４１】
マウスの体組成−体組成を、ＥＣＨＯ−ＭＲＩシステム（Ｅｃｈｏ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｅｘａｓ）、又は示される場合にはＤＥＸＡ走査を使用して分析した。除脂肪量、脂肪量及び全体的体重を、製造業者が提供するソフトウェアを使用して計算した。
【０３４２】
組換え型のアスプロシン及びＧＦＰ−ヒトＦＢＮ１（２７３２位〜２８７１位のアミノ酸）のｃＤＮＡをクローニングし、続いて大腸菌における発現のためのｐＥＴ−２２Ｂベクターにサブクローニングした。大腸菌で発現された融合タンパク質は、Ｎ末端における６アミノ酸のＨｉｓタグと、１４０アミノ酸の野生型アスプロシンとから構成される１４６アミノ酸の長さである。大腸菌で発現されるＨｉｓタグ化ＧＦＰを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからコントロールタンパク質として得た。これらの組換えタンパク質をさらに、サイズ排除カラムと、ポリミキシンＢに基づくエンドトキシン除去カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．によるＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）エンドトキシン除去ゲル）とを使用して、最終エンドトキシン濃度を２ＥＵ／ｍｌ以下となるまで多数回の通過により精製し、ＰＢＳ−グリセロール緩衝液、又は２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）／３００ｍＭ  ＮａＣｌ／１５０ｍＭイミダゾール緩衝液に緩衝液交換した。精製タンパク質を、純度レベルを決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供した。すべての組換えタンパク質実験において使用されるＨｉｓ−ＧＦＰタンパク質及びＨｉｓ−アスプロシンタンパク質は９０％超の純度であり、（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＡＬ発色エンドトキシン定量キットを使用して求められる）エンドトキシンレベルが、エンドトキシン除去カラムに通す前及び通した後において示される通りであった（図Ｓ７Ｄ）。Ｃ末端の６ｘＨｉｓタグを有するヒトアプロシンが、ＵＮＣタンパク質発現・精製施設（ＵＮＣ、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）によって製造された。簡単に記載すると、タンパク質が、製造者により含められたプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション発現システム（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して発現させられた。培地が集められ、細胞が遠心分離によって除かれ、得られた清澄化培地が無菌ろ過され、その後、タンジェンシャルフローろ過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮され、Ｎｉ結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＰｏ４（ｐＨ７．４）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール）に緩衝液交換された。アプロシンが、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー、続いて、１０％グリセロールを含むＰＢＳにより平衡化された分析用Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってこの溶液から精製された。
【０３４３】
サンドイッチＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット−アスプロシンのサンドイッチＥＬＩＳＡのために、アスプロシンのアミノ酸１０６〜１３４（ヒトプロフィブリリンのアミノ酸２８３８〜２８６５）に対するマウス抗アスプロシンモノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、アスプロシンのアミノ酸６〜１９（ヒトプロフィブリリンのアミノ酸２７３７〜２７５０）に対するＡｂｎｏｖａによるヤギ抗アスプロシンポリクローナル抗体を検出抗体として使用した。ＨＲＰに連結される抗ヤギ二次抗体を、シグナルを発生させるために使用した。ＨｉｓタグのサンドイッチＥＬＩＳＡのために、ヤギ抗Ｈｉｓポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を検出抗体として使用することを除いて同じ手順を使用した。ＥＤＴＡ血漿を血漿のサンドイッチＥＬＩＳＡのために使用した。アスプロシンについての血漿のウエスタンブロッティングを、ＥＬＩＳＡの場合と同じマウスモノクローナル抗アスプロシン抗体を使用して行った。哺乳動物由来アスプロシンのウエスタンブロットのために、４０μｇの哺乳動物由来アスプロシンを、タンパク質脱グリコシル化ミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して酵素的に脱グリコシル化した。２０μｇのグリコシル化された哺乳動物由来アスプロシン、４０μｇの脱グリコシル化された哺乳動物由来アスプロシン、及び２０μｇの細菌由来スプロシンを分子量比較のために分析した。
【０３４４】
マウス抗アスプロシンモノクローナル抗体の特徴づけ−マウスＩｇＧモノクローナル抗体（ｍＡｂ）がアスプロシンを中和する可能性を調べるためのインビトロアッセイを行った。ｍＡｂの中和能を評価するために、１０ｎＭのアスプロシンを氷上で１時間、様々なモル比のｍＡｂとインキュベーションし、残留アスプロシンを、本発明者らのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。インビトロでのＩＣ５０を、残留濃度又は絶対的吸光度値のどちらかを使用して計算した。ＵＫ  ＮＣ３Ｒｓから得られる指針（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃ３ｒｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｏｕｓｅ−ｄｅｃｉｓｉｏｎ−ｔｒｅｅ−ｂｌｏｏｄ−ｓａｍｐｌｉｎｇ、検索日：２／１／２０１７）を、５０ｇのマウスの血液量を推定するために使用し、かつ、ｍＡｂの分子量を１５０ｋＤａで設定して、５０ｇのマウスあたり４４μｇのｍＡｂが、５０％の内在性アスプロシンを中和するために十分であると決定された。
【０３４５】
マウス抗アスプロシンモノクローナル抗体のエピトープマッピング−マウス抗アスプロシンモノクローナル抗体を開発するために使用された既知の免疫化ペプチド（ｋｋｋｅｌｎｑｌｅｄｋｙｄｋｄｙｌｓｇｅｌｇｄｎｌｋｍｋ（配列番号５））を網羅する、２アミノ酸の重なりを有する１１個のオクタマーペプチドを、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）によってスライドガラスにスポット状に押しつけ、このモノクローナル抗体とインキュベーションした。抗体を、ビオチン化抗マウス抗体を使用して、その後、蛍光団とコンジュゲート化されたストレプトアビジンを使用して検出した。特定のオクタマーペプチドに対応するスポットの蛍光を記録した。結果が、生の蛍光（任意設定の数）で報告された（この場合、最も大きい数字が、最も強い蛍光及び最も強い抗体結合を意味する）。
【０３４６】
アスプロシンの血漿中半減期−ＨＥＫ２９３で発現されるアスプロシンを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してビオチンで標識し、過剰のビオチンを、Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して除いた。最終タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して推定した。およそ３０ｕｇ／マウスの標識化アスプロシンをＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下注射した。採血を、注射前に（ベースライン）、及び注射後３０分、６０分、１２０分及び３６０分に、同様にまた２４時間後及び４８時間後に行った。ビオチン化アスプロシンを、特注設計のサンドイッチＥＬＩＳＡを使用し検出した。プレートを抗アスプロシンモノクローナル抗体（捕捉抗体）により被覆し、全血漿中アスプロシンを結合させ、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用してビオチン化アスプロシンのみを検出した。
【０３４７】
ヒト及びマウスのアディポネクチン、レプチン及びグレリン−ヒトアディポネクチン、マウスアディポネクチン、ヒトレプチン、マウスレプチン、（総）ヒトグレリン及び（総）マウスグレリンのためのＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、急速凍結された、これまでに解凍されたことがない血漿におけるそれぞれの血漿中パラメーターの濃度を製造者の説明書に従って求めた。
【０３４８】
統計学的方法−すべての結果が、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、二元配置ＡＮＯＶＡによって示される場合を除いて、すべての結果について、対応のないスチューデントｔ検定によって計算した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０３４９】
［参考文献］
明細書に記載された全ての特許及び出版物は当業者が発明を把握するにあたりその手掛かりとすることができる。全ての特許及び出版物はそれぞれの出版物が特異的にまた個別に下記の参考文献によって明細書に含まれる。
1. Agarwal, et al, Maturitas 76, 296-302 (2013 ) .
2. Aponte, Y., Atasoy, D., and Sternson, S.M. (2011). AGRP neurons are sufficient to orchestrate feeding behavior rapidly and without training. Nat Neurosci 14, 351- 355.
3. Aronoff, S.L., Berkowitz, K., and Shreiner, B. (2004). Glucose metabolism and regulation: beyond insulin and glucagon. Diabetes Spectrum.
4. Atasoy, D., Betley, J.N., Su, H.H., and Sternson, S.M. (2012). Deconstruction of a neural circuit for hunger. Nature 488, 172-177.
5. Bainbridge, et al, Genome Biol. 12, R68 (2011).
6. Behrens, O.K., and Bromer, W.W. (1958). Biochemistry of the protein hormones. Annual Review of Biochemistry 27, 57-100.
7. Berglund, E.D., Liu, C, Sohn, J.-W., Liu, T., Kim, M.H., Lee, C.E., Vianna, C.R., Williams, K.W., Xu, Y., and Elmquist, J.K. (2013). Serotonin 2C receptors in proopiomelanocortin neurons regulate energy and glucose homeostasis. J. Clin. Invest. 123, 5061-5070.
8. Bindlish, S., Presswala, L.S., and Schwartz, F. (2015). Lipodystrophy: Syndrome of severe insulin resistance. Postgrad Med 127, 511-516.
9. Butte, N.F., Wong, W.W., and Hopkinson, J.M. (2001). Energy requirements of lactating women derived from doubly labeled water and milk energy output. The Journal of Nutrition 131, 53-58.
10. Campbell, J.E., and Drucker, D.J. (2015). Islet a cells and glucagon- critical regulators of energy homeostasis. Nat Rev Endocrinol 11, 329-338.
11. Chopra, et al, CellMetab. 13 :35-43 (2011).
12. Chopra, et al, Science 322: 1395-99 (2008).
13. Cui, X., Wang, Y., Tang, Y., Liu, Y., Zhao, L., Deng, J., Xu, G, Peng, X., Ju, S., Liu, G., et al. (2011). Seipin ablation in mice results in severe generalized lipodystrophy. Hum Mol Genet 20, 3022-3030.
14. Davis & Summers, Molecular Genetics and Metabolism 107, 635-647 (2012). 
15. Denis, R.G.P., Joly-Amado, A., Webber, E., Langlet, F., Schaeffer, M., Padilla, S.L., Cansell, C, Dehouck, B., 15. Castel, J., Delbes, A.-S., et al. (2015). Palatability Can Drive Feeding Independent of AgRP Neurons. Cell Metab. 22, 646-657.
16. Dumoulin, G., Hory, B., Nguyen, N.U., Henriet, M.T., Bresson, C, Regnard, J., and Saint-Hillier, Y. (1995). Acute oral calcium load decreases parathyroid secretion and suppresses tubular phosphate loss in long-term renal transplant recipients. Am. J. Nephrol. 15, 238-244.
17. Esposito, et al, Plastic Reconstruc Surg. 118: 1048-1057 (2006).
18. Friedman, American Journal of Clinical Nutrition 89, 973 S-979S (2009).
19. Gelato, et al, Clin Ther. 29(11):2269-88, 2007.
20. Goldblatt, et al, Am. J. Med. Genet. A 155, 717-720 (2011).
21. Goldstein & Brown, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 29, 431-438 (2009).
22. Graul-Neumann, et al, Am. J. Med. Genet. A 152A, 2749-2755 (2010).
23. Guba & Harsanyi, Kiserletes orvostudomany 16:28-34 (1964).
24. Horn & Robinson, Am. J. Med. Genet. A 155, 721-724 (2011).
25. Hou, Pediatrics and neonatology 50, 102-109 (2009).
26. Jaager, et al, PLoS ONE 7, e38833 (2012).
27. Jacquinet, et al, Eur J Med Genet 57, 230-234 (2014).
28. Jensen, et al, Proceedings of the National Academy of Sciences 111, 10155-10160 (2014).
29. Johnson, R.K., Driscoll, P., and Goran, M.I. (1996). Comparison of multiple-pass 24-hour recall estimates of energy intake with total energy expenditure determined by the doubly labeled water method in young children. Journal of the American Dietetic Association 96, 1140-1144.
30. Judge, D.P., and Dietz, H.C. (2005). Marfan's syndrome. The Lancet 366, 1965-1976.
31. Krashes, M.J., Koda, S., Ye, C, Rogan, S.C., Adams, A.C., Cusher, D.S., Maratos-Flier, E., Roth, B.L., and Lowell, B.B. (2011). Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. J. Clin. Invest. 121, 1424-1428.
32. Kulstad, et al, Curr Opin Clin NutrMetab Care. 10(4):488-93, 2007.
33. Liu, T., Kong, D., Shah, B.P., Ye, C, Koda, S., Saunders, A., Ding, J.B., Yang, Z., Sabatini, B.L., and Lowell, B.B. (2012). Fasting Activation of AgRP Neurons Requires NMDA Receptors and Involves Spinogenesis and Increased Excitatory Tone. Neuron 73, 511-522.
34. Liu, Y., Liu, H., Sauvey, C, Yao, L., Zarnowska, E.D., and Zhang, S.-C. (2013). Directed differentiation of forebrain GABA interneurons from human pluripotent stem cells. Nat Protoc 8, 1670-1679.
35. Loeys, et al, J. Med. Genet. 47, 476-485 (2010).
36. Lonnqvist, L., Reinhardt, D., Sakai, L., and Peltonen, L. (1998). Evidence for furin-type activity-mediated C-terminal processing of profibrillin-1 and interference in the processing by certain mutations. Hum Mol Genet 7, 2039-2044.
37. Lupski, et al, Genome Med 5, 57 (2013).
38. Luquet, S., Perez, F.A., Hnasko, T.S., and Palmiter, R.D. (2005). NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates. Science 310, 683-685.
39. Magnusson, L, Rothman, D.L., and Katz, L.D. (1992). Increased rate of
gluconeogenesis in type II diabetes mellitus. A 13C nuclear magnetic resonance study. J. Clin. Invest. 90, 1323-1327.
40. Malik, et al, Nat Rev Endocrinol 9, 13-27 (2013).
41. Milewicz, et al, J. Clin. Invest. 95, 2373-2378 (1995).
42. Morgen & S0rensen, Nat Rev Endocrinol 10, 513-514 (2014).
43. Mueller, et al, World J Gastroentrol. 20(28):9361-73, 2014.
44. Nakajima, K.-L, Cui, Z., Li, C, Meister, J., Cui, Y., Fu, O., Smith, A.S., Jain, S., Lowell, B.B., Krashes, M.J., et al. (2016). Gs-coupled GPCR signalling in AgRP neurons triggers sustained increase in food intake. Nat Commun 7, 10268.
45. Nakazato, M., Murakami, N., Date, Y., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K., and Matsukura, S. (2001). A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature 409, 194-198.
46. Nickel, W. (2003). The mystery of nonclassical protein secretion. European Journal of Biochemistry 270, 2109-2119.
47. Nolis, J Human Genet. 59, 16-23 (2013).
48. O'Neill, et al, Am. J. Med. Genet. A 143 A, 1421-1430 (2007).
49. Oosting, et al, Fed Res. 72:362-9 (2012).
50. O'Reilly, et al, Cell 88, 277-285 (1997).
51. Passarge, E., Robinson, P.N., and Graul -Neumann, L.M. (2016). Marfanoid-progeroid-lipodystrophy syndrome: a newly recognized fibrillinopathy. Eur J Hum Genet 24, 1244-1247.
52. Pereira, L., Lee, S.Y., Gayraud, B., Andrikopoulos, K., Shapiro, S.D., Bunton, T., Biery, N.J., Dietz, H.C., Sakai, L.Y., and Ramirez, F. (1999). Pathogenetic sequence for aneurysm revealed in mice underexpressing fibrillin- 1. Proceedings of the National Academy of Sciences 96, 3819-3823.
53. Pinto, S., Roseberry, A.G., Liu, H., Diano, S., Shanabrough, M., Cai, X., Friedman, J.M., and Horvath, T.L. (2004). Rapid rewiring of arcuate nucleus feeding circuits by leptin. Science 304, 110-115.
54. Pureza & Florea, Curr Heart Fail Rep 10, 307-314 (2013).
55. Pyeritz, Heart 95, 173-175 (2009).
56. Raghunath, et al, Journal of cell science 112 ( Pt 7), 1093-1100 (1999).
57. Rajala, et al, Endocrin. 144:3765-73 (2003).
58. Reinhardt, et al, Ciba Foundation Symposium. 192: 138-43, discussion 143-127 (1995).
59. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. Lippincott Williams and Wilkins, 2005.
60. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990.
61. Ren, H., Orozco, I. J., Su, Y., Suyama, S., Gutierrez- Juarez, R., Horvath, T.L., Wardlaw, S.L., Plum, L., Arancio, O., and Accili, D. (2012). FoxOl Target Gprl7 Activates AgRP Neurons to Regulate Food Intake. Cell 149, 1314-1326.
62. Ritty, et al, Journal of Biological Chemistry 274, 8933-8940 (1999).
63. Roberts, S.B. (1989). Use of the doubly labeled water method for measurement of energy expenditure, total body water, water intake, and metabolizable energy intake in humans and small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 67, 1190-1198.
64. Rocha, et al, Nat Rev Cardiol 6:399-409 (2009).
65. Romere, C, Duerrschmid, C, Bournat, J., Constable, P., Jain, M., Xia, F., Saha, P.K., Del Solar, M., Zhu, B., York, B., et al. (2016). Asprosin, a Fasting-Induced Glucogenic Protein Hormone. Cell 165, 566-579.
66. Saha, P.K., Reddy, V.T., Konopleva, M, Andreeff, M., and Chan, L. (2010). The triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-l,9-dien-28-oic-acid methyl ester has potent anti-diabetic effects in diet-induced diabetic mice and Lepr(db/db) mice. J. Biol. Chem. 285, 40581-40592.
67. Schoeller, D.A. (1988). Measurement of energy expenditure in free-living humans by using doubly labeled water. The Journal of Nutrition 118, 1278-1289.
68. Shoelson, et al, Gastroentrol 132:2169-80 (2007).
69. Sohn, J.-W., Harris, L.E., Berglund, E.D., Liu, T., Vong, L., Lowell, B.B.,
Balthasar, N., Williams, K.W., and Elmquist, J.K. (2013). Melanocortin 4
Receptors Reciprocally Regulate Sympathetic and Parasympathetic Preganglionic Neurons. Cell 152, 612-619.
70. Spiegelman & Flier, Cell 104, 531-543 (2001).
71. Spiegelman & Flier, Cell 87, 377-389 (1996).
72. Takenouchi, et al, Am. J. Med. Genet. A 161, 3057-3062 (2013).
73. Tong, Q., Ye, C.-P., Jones, J.E., Elmquist, J.K., and Lowell, B.B. (2008). Synaptic release of GABA by AgRP neurons is required for normal regulation of energy balance. Nat Neurosci 11, 998-1000.
74. Trayhurn, et al, JNutr. 136: 1935S-39S (2006).
75. Trumbo, P., Schlicker, S., Yates, A.A., Poos, M., Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine, The National Academies (2002). Dietary reference intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids. Journal of the American Dietetic Association 102, 1621-1630.
76. Wallis, et al, Journal of cellular biochemistry 90, 641-652 (2003).
77. Xu, et al, J Clin Invest. 112: 1821-30 (2003).
78. Yan, C, He, Y., Xu, Y., Shu, G., Wang, C, Yang, Y., Saito, K., Xu, P., Hinton, A.O., Yan, X., et al. (2016). Apolipoprotein A-IV Inhibits AgRP/NPY Neurons and Activates Pro-Opiomelanocortin Neurons in the Arcuate Nucleus.
Neuroendocrinology 103, 476-488.
79. Zeyda & Stulnig, et al, Gerontol 55:379-86 (2009).
【０３５０】
本発明及びその利点が詳しく説明されているが、様々な変化、置換及び変更が、添付された請求項によって規定されるような本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行われ得ることを理解しなければならない。そのうえ、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法及び工程の特定の実施形態に限定されることは意図されない。当業者は本発明の開示から容易に理解するであろうように、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たす、又は本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ結果を達成するプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法及び工程は、現在存在するものであろうと、又は後に開発されることなるものであろうと、本発明に従って利用される場合がある。したがって、添付された請求項は、そのようなプロセス、装置、製造、物質の組成物、手段、方法又は工程をその範囲内に含むことが意図される。
【図１Ａ−Ｂ】
2019521077.tif 000003
【図１Ｃ−Ｄ】
2019521077.tif 000004
【図２】
2019521077.tif 000005
【図３Ａ−Ｂ】
2019521077.tif 000006
【図３Ｃ−Ｄ】
2019521077.tif 000007
【図４Ａ−Ｃ】
2019521077.tif 000008
【図４Ｄ−Ｈ】
2019521077.tif 000009
【図５Ａ−Ｆ】
2019521077.tif 000010
【図５Ｇ−Ｈ】
2019521077.tif 000011
【図５Ｉ−Ｊ】
2019521077.tif 000012
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｃ】
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【図１８Ｄ−Ｅ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図１９Ｃ−Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ−Ｉ】
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【図１９Ｊ−Ｋ】
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【図２０Ａ−Ｃ】
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【図２０Ｄ−Ｅ】
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【図２０Ｆ−Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｃ】
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【図２２Ｄ−Ｅ】
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【図２３Ａ−Ｅ】
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【図２３Ｆ−Ｉ】
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【図２３Ｊ−Ｍ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ−Ｅ】
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【図２４Ｆ−Ｊ】
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【図２４Ｋ−Ｍ】
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【図２５Ａ−Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６】
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【図２７Ａ−Ｆ】
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【図２８】
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【図２９Ａ−Ｄ】
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【図２９Ｅ−Ｆ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ−Ｂ】
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【図３８Ｃ−Ｄ】
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【図３９Ａ−Ｂ】
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【図３９Ｃ−Ｄ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ−Ｄ】
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【図４４Ｅ−Ｈ】
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【図４４Ｉ−Ｌ】
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【図４５Ａ−Ｃ】
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【図４５Ｄ−Ｅ】
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【図４５Ｆ−Ｇ】
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【図４６Ａ−Ｂ】
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【図４６Ｃ−Ｄ】
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【図４７Ａ−Ｃ】
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【図４７Ｄ−Ｅ】
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【図４７Ｆ−Ｈ】
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【図４８Ａ−Ｄ】
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【図４８Ｅ−Ｇ】
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【図４８Ｈ−Ｊ】
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【図４９Ａ−Ｄ】
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【図４９Ｅ−Ｉ】
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【図５０】
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【図５１Ａ−Ｄ】
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【図５１Ｅ−Ｉ】
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【図５２】
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【図５３Ａ−Ｃ】
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【図５３Ｄ−Ｅ】
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【図５４Ａ−Ｅ】
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【図５４Ｆ−Ｋ】
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【図５５Ａ−Ｄ】
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【図５５Ｅ−Ｇ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ−Ｃ】
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【図５９Ａ−Ｂ】
2019521077.tif 000100
【図５９Ｃ−Ｅ】
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【図６０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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