(57)【要約】本発明は、核磁気共鳴を用いてグリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにこれらの派生物を解析し、1H-NMRおよび1H-13C HSQCを用いてその特性信号の同定・相対定量化を実現するための方法について述べたものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の手順から成る1H-NMR一次元核磁気共鳴および/または1H-13C HSQC二次元核磁気共鳴を使用することで、ヘパリン鎖に存在する単糖類残基が含まれる組成を解析する方法：
ａ）ヘパリン鎖に少なくとも一種類の単糖類が含まれる組成を提示したうえで、ジメチルマロン酸（DMMA）を内部基準として使用して、その1H-NMR一次元核磁気共鳴スペクトルおよび/または1H-13C HSQC二次元核磁気共鳴スペクトルを入手する。
ｂ）NMRスペクトルに、以下から成る基から選択された少なくともひとつの残基に、少なくともひとつの信号があるかどうかを特定する：4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）、4,5-不飽和ウロン酸（ΔU）、2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン（1,6-an.A）、2-N-スルホ-1,6-アンヒドロマンノサミン（1,6-an.M）、2-N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン（ANS6S）、2,5-アンヒドロマンニトール、N-スルホグルコサミン、グルクロン酸、N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン、2-O-スルホイズロン酸、イズロン酸、N-スルホ-3-O-スルホグルコサミン、N-スルホ-3,6-ジ-O-スルホグルコサミン、ガラクツロン酸、キシロース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチル-6-O-スルホグルコサミン。
特徴として、DMMAにおける規格化積分の既定相対的比率に前述のNMR信号が存在するかの有無によって特定のパターンが形成され、このパターンを、同じ条件下で別のヘパリン用に取得した標準パターンの解析を通して得たパターンと比較することで、単糖類残基の由来となるヘパリンを同定できる。
【請求項２】
手順ｃ）において1H NMRスペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表１】
2019525166.tif 000035
従って、単糖類残基はエノキサパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項３】
手順ｃ）において1H-13C HSQC NMRスペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表２】
2019525166.tif 000036
ここでは、「LC」は「定量化の限界」を指す。
従って、単糖類残基はエノキサパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項４】
手順ｃ）において1H NMRスペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表３】
2019525166.tif 000037
従って、単糖類残基はベミパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項５】
手順ｃ）において1H-13C HSQC NMR スペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表４】
2019525166.tif 000038
従って、単糖類残基はベミパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項６】
手順ｃ）において1H NMRスペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表５】
2019525166.tif 000039
従って、単糖類残基はダルテパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項７】
手順ｃ）において1H-13C HSQC NMR スペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表６】
2019525166.tif 000040
従って、単糖類残基はダルテパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項８】
手順ｃ）において1H NMRスペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表７】
2019525166.tif 000041
従って、単糖類残基はチンザパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項９】
手順ｃ）において1H-13C HSQC NMRスペクトル内に以下のパターンが同定されることを特徴とする、請求項1に記載の手法：
【表８】
2019525166.tif 000042
従って、単糖類残基はチンザパリンナトリウムに由来していると判断される。 
【請求項１０】
N-アセチル基に相当する信号が、1H-NMR分光器の1.8〜2.1 ppmの領域に現れることを特徴とする、先行する請求項のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１１】
前述の残基の糖類環に相当する信号が、1H-NMR分光器の2.8〜6.0 ppmの領域に現れることを特徴とする、先行する請求項のいずれかひとつに記載の手法。 
【請求項１２】
アノマーH1陽子に相当する信号、そして前述のいずれかひとつの残基の非還元側に存在するH4陽子に相当する信号が、1H-NMR分光器の4.6〜6.0 ppm領域に現れることを特徴とする、先行する請求項のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１３】
M1H NMR分光器において、4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）信号が5.99 ppm（H4）および5.51 ppm（アノマー陽子）にて現れること、4,5-不飽和ウロン酸（ΔU）信号が5.82 ppm（H4陽子）にて現れること、2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン（1,6-an.A）信号が5.62 ppm（アノマー陽子）にて現れること、2-N-スルホ-1,6-アンヒドロ-マンノサミン（1,6-an.M）信号が5.57 ppm（アノマー陽子）にて現れること、そして2-N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン信号が5.41 ppmおよび4.21〜4.34 ppm（H1、H6、H6’陽子）にて現れることを特徴とする、先行する請求項のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１４】
1H-13C HSQC NMR分光器において、4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）信号が6.0〜109.0 ppm（H4-C4）、5.5〜100.2 ppm（H1-C1）、4.6〜77.4 ppm（H2-C2）、または4.3〜66.8 ppm（H3-C3）にて現れること、4,5-不飽和ウロン酸（ΔU）信号が5.8〜110.7 ppm（H4-C4）または5.2〜103.9 ppm（H1-C1）にて現れること、2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン（1,6-an.A）信号が5.6〜104.2 ppm（H1-C1）、3.2〜58.5 ppm（H2-C2）、または3.8〜67.5 ppm（H6-C6）にて現れること、2-N-スルホ-1,6-アンヒドロ-マンノサミン（1,6-an.M）信号が5.6〜103.9 ppm（H1-C1）、3.5〜55.1（H2-C2）、または3.8〜67.5 ppm（H6-C6）にて現れること、そして2-N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン信号が5.4〜99.4 ppm（H1-C1）、3.8〜80.9 ppm（H4-C4）、3.7〜3.8、42.3〜72.5 ppm（H3-C3）、4.1〜70.6〜71.7 ppm（H5-C5）、または3.3〜60.5〜60.8 ppm（H2-C2）にて現れることを特徴とする、先行する請求項のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１５】
解析で得られたパターンにより、単糖類残基が未分画ヘパリンに由来していることが特定されることを特徴とする、先行する請求項のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１６】
解析で得られたパターンにより、単糖類残基が低分子量ヘパリン（LMWH）に由来していることが特定されることを特徴とする、先行する請求項1〜8のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１７】
解析で得られたパターンにより、単糖類残基が超低分子量ヘパリン（ULMWH）に由来していることが特定されることを特徴とする、先行する請求項1〜8のいずれかひとつに記載の手法。
【請求項１８】
先行する請求項1〜17のいずれかひとつの方法を用いて同定されるエノキサパリンナトリウム。
【請求項１９】
先行する請求項1〜17のいずれかひとつの方法を用いて同定されるベミパリンナトリウム。
【請求項２０】
先行する請求項1〜17のいずれかひとつの方法を用いて同定されるダルテパリンナトリウム。
【請求項２１】
先行する請求項1〜17のいずれかひとつの方法を用いて同定されるチンザパリンナトリウム。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにこれらの派生物の特性化に向けて核磁気共鳴（1H-NMRおよび1H-13C HSQC）を用いて解析を行い、その定量分析を実現する手法について述べたものである。
【発明の背景】
【０００２】
核磁気共鳴（NMR）分光法は、グリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにこれらの派生物の特性化においてもっとも重要かつ広く用いられている分析技法のひとつである。
【０００３】
これは、実験を一次元と二次元の双方で実施できるため、分子構造の小さな変動も検出できる高い感度を誇る技法である。そのため、これらの化合物を適切に特性化するうえで非常に有効である。
【０００４】
グリコサミノグリカン（GAG）は負の電荷を帯びた線状多糖類であり、平均分子量は10〜100 KDaである（The Structure of Glycosaminoglycans and their Interactions with Proteins.Gandhi NS and Mancera RL.Chem Biol Drug Des 2008; 72:455-482）。グリコサミノグリカンには大きく分けて、非硫酸化型（ヒアルロン酸など）と硫酸化型（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸など）の2つのグループがある。グリコサミノグリカン鎖は二糖類単位によって、またはウロン酸（D-グルクロンまたはL-イズロン）とアミノ糖（D-ガラクトサミンまたはD-グルコサミン）から構成される二糖類によって形成される。
【０００５】
【化１】
2019525166.tif 000003
【０００６】
化学式1：各種グリコサミノグリカンの二糖類単位の一般構造
【０００７】
ヘパリンはグリコサミノグリカンファミリーに属する多糖類であり、ウロン酸（L-イズロンまたはD-グルクロン）とD-グルコサミンが交互に結合することで形成される。L-イズロン酸は、2-O-硫酸化合物およびD-グルコサミン、N-硫酸化合物および/または6-O-硫酸化合物、さらには比較的程度は低いがN-アセチル化合物または3-O-硫酸化合物となり得る（Mapping and quantification of the major oligosaccharides component of heparin.Linhardt RJ, Rice KG, Kim YS et al.Biochem J 1988; 254:781-787）。主な二糖類の反復構造単位は、三硫化二糖類、2-O-スルホL-イズロン酸（1→4）2-N-スルホ-6-O-スルホD-グルコサミンに相当する。
【０００８】
ヘパリンオリゴ糖鎖に生じるこの構造的変異の起源は、生合成ならびにこれを制御するメカニズムに見られる。そのため生合成の第一段階では、グルコース-ガラクトース-ガラクトース-キシロースによって形成される四糖類の断片がタンパク質のコアに結合し、糖タンパク質鎖の生合成が開始する。次に、グルクロン酸（GlcA）残基とN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）残基が交互に合体し、およそ300単位から成る多糖鎖が形成される。同時にこの鎖が伸長することで、そして様々な酵素の干渉によって、鎖が修飾される。そのため、N-デアセチラーゼ/N-スルホトランスフェラーゼ酵素の作用によってGlcNAc単位がN-脱アセチル化およびN-硫酸化し、これらがN-スルホグルコサミン（GlcNS）へと変換される。C5エピメラーゼによってGlcAの特定の単位がイズロン酸（IdoA）へと変換される過程が触媒され、続いて2-O-スルホトランスフェラーゼの作用によって2-O-硫酸化が引き起こされる。次に、6-O-スルホトランスフェラーゼによって6-O-スルホ基がGlcNS単位およびGlcNAc単位へと転移される。最後に、3-O-スルホトランスフェラーゼが特定のN-スルホ-6-O-スルホグルコサミン（GlcNS6S）単位に作用することで、N-スルホ-3,6-ジ-O-スルホグルコサミン（GlcNS3S6S）残基が生成される。
【０００９】
一見無作為で不完全のような初期のN-脱アセチル化の性質は、生合成の第一段階においてヘパリンに構造的不均一性が生じる主な原因となる。硫酸化の度合いと位置に生じる構造的変異は、生合成酵素による装飾の性質が不完全なためであり、これにより様々な二糖置換パターンを持つヘパリンナトリウム分子が生成される。
【００１０】
ヘパリンはナトリウム塩として用いられるのが好ましいが、他のアルカリ性またはアルカリ土類金属として使用することもできる。ヘパリンは主に、抗血栓剤および抗凝固剤として使用されている（Anticoagulant therapy for major arterial and venous thromboembolism.Tran HAM, Ginsberg JS.Basic principles and clinical practice.Colman RW, Marder VJ, Clowes AW, George JN, Goldhaber SZ (Ed).Lippincott Williams and Wilkins; 2006:1673-1688）。 
【００１１】
ヘパリンはその分子量に応じて、未分画ヘパリン（UFH）、低分子量ヘパリン（LMWH）（平均分子量8000 Da未満）、超低分子量ヘパリン（ULMWH）（平均分子量3000 Da未満）に分類される（Chemoenzymatic synthesis of homogenous ultra low molecular weight heparins.Xu Y. et al.Science 2011; 334: 498-501）。LMWHおよびULMWHは元のUFH分子の解重合に由来するが、その生成過程において分子の構造に元の特性が生じることがある。そのため、結果として生じる分子の構造は、一方では出発物質として使用されたヘパリンの構造に、もう一方では生成された残基の特性、さらには使用された生成方法の特性に由来する。
【００１２】
エノキサパリンナトリウムの生成過程（水媒体内のヘパリンのベンジルエステルにアルカリ処理を施すことによるベータ脱離）およびベミパリンナトリウムの生成過程（非水媒体内でアルカリ処理を施すによるベータ脱離）により、大半の物質が4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）の末端、非還元末端、2-N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン（分子の還元末端）で生成される。また、非還元末端は4,5-不飽和2-Oウロン酸（ΔU）の構造を持つこともある。上記の残基の還元末端では、他の2種類の1,6-アンヒドロ派生物（2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン（1,6-an.A）と2-N-スルホ-1,6-アンヒドロマンノサミン（1,6-an.M）に加え、2-N-スルホ-6-O-スルホマンノサミン（アルカリ処理によってC2内でのエピマー化が触媒）が見られることもある。
【００１３】
化学式2：エノキサパリンナトリウムおよびベミパリンナトリウムの還元末端および非還元末端の構造。 
【００１４】
【化２】
2019525166.tif 000004
【００１５】
これらの残基はその生成過程において、他の低分子量ヘパリンでも生成される。たとえば、チンザパリンナトリウム（ヘパリナーゼ処理によるベータ脱離を用いて取得）の非還元末端には、4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）が存在する。
【００１６】
【化３】
2019525166.tif 000005
【００１７】
化学式3：チンザパリンナトリウムの還元末端および非還元末端の構造
【００１８】
ダルテパリンナトリウムは、亜硝酸で処理し、2,5-アンヒドロマンニトール残基を分子の還元末端で生成することで取得する。
【００１９】
【化４】
2019525166.tif 000006
【００２０】
化学式4：ダルテパリンナトリウムの還元末端および非還元末端の構造
【００２１】
本特許明細書では、「ヘパリン鎖に存在する単糖類残基」をもとに、通常LMWH/UFH/GAG鎖に存在する当該単糖類残基または成分が同定される。これらの残基のリストには以下が含まれる：4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）、4,5-不飽和ウロン酸（ΔU）、2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン（1,6-an.A）、2-N-スルホ-1,6-アンヒドロマンノサミン（1,6-an.M）、2-N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン（ANS6S）、2,5-アンヒドロマンニトール、N-スルホグルコサミン、グルクロン酸、N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン、2-O-スルホイズロン酸、イズロン酸、N-スルホ-3-O-スルホグルコサミン、N-スルホ-3,6-ジ-O-スルホグルコサミン、ガラクツロン酸、キシロース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチル-6-O-スルホグルコサミン。
【００２２】
NMR分光法を用いることで、ヘパリンおよび低分子量ヘパリンの生成過程に特有の残基の同定が可能となる。
【００２３】
構造的特性化にNMRを使用する利点のひとつに、その解析において、サンプルへの事前の誘導体化またはクロマトグラフィー分別を必要としないことが挙げられる。つまり中間処理を施すことなく、サンプルを直接NMRで解析できる。
【００２４】
核磁気共鳴分光法は、これらの化合物に含まれる単糖類残基の配列を特定するために用いられる。これにより、オリゴ糖鎖全体におけるN-アセチル化およびN-/O-硫酸化の地点が明確に特定される。さらに同技法により、アノマー結合の配向を具体的に特定し、グルクロン酸エピマーに含まれるイズロン酸を識別できるようになる。（Advancing Analytical Methods for Characterization of Anionic Carbohydrate Biopolymers.Langeslay D.J.PhD Thesis UC Riverside 2013）。ただし、これらの化合物の高い微小不均一性と多分散性を踏まえると、ヘパリンおよび低分子ヘパリンの完全な特性化には未だ課題が残る。
【００２５】
さらに同技法は、ヘパリンおよび低分子量ヘパリンの生成過程に伴う、これらの構造的残基に関する情報（例：ウロン酸のエピマー化の状態（イズロン酸とグルクロン酸との比較）や、非還元末端での硫酸化と非硫酸化4,5-ウロン酸残基の比率（ベータ脱離またはヘパリナーゼ処理を用いて生成される低分子量ヘパリン向け）など）を得るために使用できる。
【００２６】
同様に、高い感度を誇る同技法は、グリコサミノグリカンに含まれる不純物を特定するためのスクリーニング技法として用いられている（Analysis and characterization of heparin impurities.Beni S. et al.Anal Bioanal Chem 2011, 399:527-539）。
【００２７】
現在の技術水準として、各種NMR技法および実験を用いたグリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリンおよび低分子量ヘパリンの構造的特性化の結果が公開されている。たとえば、13C-NMR分光法は様々な動物起源を持つヘパリンナトリウムにおける硫酸化の度合いを特定するために用いられている（Characterization of Sulfation Patterns of Beef and Pig Mucosal Heparins by Nuclear Magnetic Resonance.Casu B. et al.Arzneim.-Forsch./Drug Res.1996.46:472-477）。 
【００２８】
1H-NMR分光法では核を豊富に使用でき、磁気回転比も高いことから、これらの化合物の研究においてもっとも一般的に用いられている技法である。1.8〜2.1 ppmの領域は、還元末端側の（合成に用いられ得る）N-アセチル基またはメチル基に相当する信号から構成される。2.8〜4.6 ppmの領域は大部分の糖類環信号から構成され、これらは高度に重複している。そのため、この領域から構造情報を直接抽出することは困難である。4.6〜6.0 ppmの領域は、アノマー陽子に相当する信号である。この領域の信号密度ははるかに低いため、大量の情報を抽出できる。さらに、ベータ脱離機構を用いてLMWHを取得した場合、分子の非還元末端側に存在する、H4に相当する信号も含まれることになる。
【００２９】
二次元実験（2D NMR）は、一次元実験に伴う問題（主に信号の重複に起因するもの）を克服できる。また、スペクトルには2種類の周波数次元と追加の信号強度が存在するため、ヘパリンから抽出したオリゴ糖構造の特定において強力なツールとなる（Characterization of currently marketed heparin products: composition analysis by 2D-NMR.Keire D.A. et al.Anal.Methods 2013.5:2984-2994）。
【００３０】
TOCSY（TOtal Correlation SpectroscopY）スペクトルは、オリゴ糖の構造解析における格好の出発点となる。TOCSYで得た情報をもとに、同一のスピン系で検出される核（この場合は同一の単糖類内のすべての陽子）との相関が可能となるためである。
【００３１】
この種類の化合物の構造的特性化において特に重要となるもうひとつの二次元実験として、1H-13C HSQC（Heteronuclear Single-Quantum Correlation）がある。これは炭素13の陽子化学シフトと相関しているため、GAGから抽出したオリゴ糖の一次構造、ならびに単糖類の組成を特定できる（Structural elucidation of the tetrasaccharide pool in enoxaparin sodium.Ozug J. et al.Anal.Bioanal.Chem.2002.403:2733-2744; Structural features of low molecular weight heparins affecting their affinity to antithrombin.Bisio A. et al.Thromb.Hemost.2009.102:865-873）。 
【００３２】
この二次元技法でスペクトル分散が増加することで、（対応する一次元スペクトルで重ね合わされていた）信号の積分の定量化が可能となる（Low-molecular-weight heparins: structural differentiation by two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy.Guerrini M. et al.Semin Thromb Hemost 2007.33:478-487）。
【００３３】
核磁気共鳴は、共鳴線の強度が共鳴核（スピン）の数と正比例していることから、定量的分光技法と定義されている。原理上、これによって分子構造の数量を正確に特定できる。 
【００３４】
NMRで用いられる磁場の強度が増加することで、検出の限界が大幅に下げられる。ただし、実験的手法とスペクトルの処理・評価の双方について考慮し、これを制御するための正確な手法が存在しなければ、同一のサンプルに対する測定結果は実験室ごとに大きく変化する恐れがある（Validation of quantitative NMR.Malz F. and Jancke H. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2005.38:813-823）。
【００３５】
グリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにこれらの派生物の核磁気共鳴スペクトルは複雑であることから、その特性信号を定量化し、これらの化合物を適切に特性化・識別するための特異的な検証方法はこれまで開発されていない。
【００３６】
従って本発明の発案者は、現在の技術水準における障害を打破し、ヘパリンを他の物質と明確に区別するための手法の開発に成功した。本発明で開発された手法を用いれば、取得した単糖類組成のパーセント値をもとに、様々な生成過程を通して取得した低分子量ヘパリンを識別し、さらにはヘパリンナトリウムや他のグリコサミノグリカンも識別できるようになる。
【００３７】
[発明の要約]
本発明の発案者は、1H-NMR一次元核磁気共鳴および/または1H-13C HSQC二次元核磁気共鳴を用いて、グリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにこれらの派生物の特性信号を定量化するための手法を開発した。これらの信号を定量化することで、個々の化合物のオリゴ糖鎖に含まれる単糖類組成を特定できるようになる。この組成は化合物の特性を表すものとなる。
【００３８】
よって本発明における第一の態様として、本発明は、以下の手順から成る1H-NMR一次元核磁気共鳴および/または1H-13C HSQC二次元核磁気共鳴を使用することで、ヘパリン鎖に存在または由来する単糖類残基が含まれる組成の解析方法を提示する：
【００３９】
ａ)ヘパリン鎖に少なくとも一種類の単糖類が含まれる組成を提示したうえで、ジメチルマロン酸（DMMA）を内部基準として使用して、その1H-NMR一次元核磁気共鳴スペクトルおよび/または1H-13C HSQC二次元核磁気共鳴スペクトルを入手する。
【００４０】
ｂ)NMRスペクトルに、以下から成る基から選択された少なくともひとつの残基に、少なくともひとつの信号があるかどうかを特定する: 4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸（ΔU2S）、4,5-不飽和ウロン酸（ΔU）、2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン（1,6-an.A）、2-N-スルホ-1,6-アンヒドロマンノサミン（1,6-an.M）、2-N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン（ANS6S）、2,5-アンヒドロマンニトール、N-スルホグルコサミン、グルクロン酸、N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン、2-O-スルホイズロン酸、イズロン酸、N-スルホ-3-O-スルホグルコサミン、N-スルホ-3,6-ジ-O-スルホグルコサミン、ガラクツロン酸、キシロース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチル-6-O-スルホグルコサミン
【００４１】
特徴として、DMMAにおける規格化積分の既定相対的比率に前述の信号が存在するかの有無によって特定のパターンが形成され、このパターンを、同じ条件下で別のヘパリン用に取得した標準パターンの解析を通して得たパターンと比較することで、単糖類残基の由来となるヘパリンを同定できる。
【００４２】
これらの生成物の特性信号、ならびのその単糖類組成または特性残基を適切に定量化することで、個々の多糖類とその起源を適切に識別できるほか、低分子量ヘパリンについては、生成物が公表された手法に従って生成されたことを確証できる。
【００４３】
この残基の定量化はパーセント値として導き出され、各ヘパリンの完全構造に相対したものとなる。それぞれの構造の特徴的な「写真」を取得すれば、解析対象のヘパリンとその入手過程の双方を明確に演繹・同定できる。本発明の過程はこのようにして、（解析対象のヘパリンが同定された標準に相当するか、または不純物が混じったものであるかを評価するための）品質システムまたは品質手法としても、ヘパリンの新規構造特性信号を解析・特定するための手法としても使用できる。また後者については、後に本発明の手法を品質システムまたは品質手法として使用できる。
【００４４】
さらに、特定の低分子量ヘパリンを用いたバイオ後続品および/またはジェネリック医薬品に対する保健機関の承認は、エノキサパリンナトリウムの事例と同様、バイオ後続品/ジェネリック医薬品と参照分子との比較可能性を適切に示した後に得られる。その際、とりわけ双方の生成物の構造的類似性を適切な度合いで示す必要がある。構造レベルで示さなければならない基本的な態様のひとつに、オリゴ糖鎖を形成している単糖類の相対的比率が、統計的評価を経て、バイオ後続品の基準を満たしているかどうかが挙げられる。これについては、本発明の手法は特に選択的となる。
【００４５】
本発明の発案者は、核磁気共鳴による構造的特性化はこれらの化合物の特性化において広く利用されているものの、NMRによるグリコサミノグリカン解析における定量解析方法についての記述は文献には見られないことを確認している。このような手法が存在しないことから、適切に確立されていない実験条件のもとで研究・評価されている同一のサンプル間で、適切な比較可能性を示すことができない。
【００４６】
そのため、これらの化合物に含まれる様々な成分の残基に対して導き出された相対的比率が、互いに大きくことなっていること、すなわち不適切な手法であることを明確に示している旨を既刊文献で探すことが可能である。（Generic versions of enoxaparin available for clinical use in Brazil are similar to the original drug.Glauser B.F., Vairo B.C., Oliveira C.P.M., Cinelli L.P., Pereira M.S. and Mourao P.A.S.J Thromb Haemost 2011.9;1419-1422）。
【００４７】
選択的定量的手法を確立して、これらの化合物の構造に含まれる残基に相当する信号の比率を特定することで、それぞれの結果を適切に比較し、NMR実験条件に関連して生じるエラーを防ぐという目標を視野に、発案者は、様々な成分の単糖類に相当する信号の相対定量を導き出すための1H NMRおよびHSQC実験において、ジメチルマロン酸（DMMA）を内部標準として使用することが適していることを発見した。DMMAの大きな特徴として、アノマー陽子および炭素と同様、縦緩和時間（T1）が1秒未満であるためである（Molecular Weight of Heparin using 13C Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy.Desai U.R. and Linhardt R.J., J Pharm Sci 1995.84(2);212-215）。これによって良好な偏極移行が生じ、信号強度が増加して、本目的に適したものとなる。
【００４８】
そのため、これらの化合物のNMR解析過程の特徴として、第一に、これらの生成物の特性信号の定量化（双方とも1H-NMRと1H-13C HSQCを使用）において、ジメチルマロン酸（DMMA）を内部標準として使用することが挙げられる。
【００４９】
意外にも、1H-NMRと1H-13C HSQCの双方の用途においてジメチルマロン酸（DMMA）を内部標準として選択することで、グリコサミノグリカンに含まれる特性信号（通常はヘパリンの特異性、精度、再現性、ならびにNMRスペクトル信号間の直線性が高いことを示す）、ならびにグリコサミノグリカンの特性残基の濃度の、パーセンテージによる定量的決定が可能となることが判明している。これにより、これまでは存在しなかった、前述のグリコサミノグリカンの定量解析手法が実現する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヘパリン生合成過程の図
【図２】特異性。1H-NMRスペクトル
【図３】特異性。1H-13C HSQCスペクトル
【図４】1H-NMR直線性
【図５】1H-13C HSQC直線性
【図６】エノキサパリンナトリウムの1H-NMRスペクトル
【図７】エノキサパリンナトリウムの1H-13C HSQCスペクトル
【００５１】
[略語と頭字語]
本特許明細書では以下の略語と頭字語を使用する：
NMR：核磁気共鳴
HSQC：Heteronuclear Single-Quantum Correlation
GAG：グリコサミノグリカン
UFH：未分画ヘパリン
LMWH：低分子量ヘパリン
ULMWH：超低分子量ヘパリン
Da：ダルトン
ΔU2S：4,5-不飽和2-Oスルホウロン酸
ΔU：4,5-不飽和ウロン酸
1,6-an.A：2-N-スルホ-1,6-アンヒドログルコサミン
1,6-an.M：2-N-スルホ-1,6-アンヒドロ-マンノサミン
TOCSY：TOtal Correlation SpectroscopY
TSP：3-(トリメチルシリル)-プロピオン-D4酸のナトリウム塩
DMMA：ジメチルマロン酸
MHz：メガヘルツ
ppm：パーツ・パー・ミリオン（100万分の1）
δ：化学シフト
SW：分光幅
TD：時間領域
T1：縦緩和時間
ANS：N-スルホグルコサミン
G：グルクロン酸
ANS6S：N-スルホ-6-O-スルホグルコサミン
I2S：2-O-スルホイズロン酸
I：イズロン酸
ANS3S：N-スルホ-3-O-スルホグルコサミン
Gal：ガラクツロン酸
Xyl：キシロース
ANAc：N-アセチルグルコサミン
A6S：6-O-スルホグルコサミン
A6OH：グルコサミン
G2S：スルホグルクロン2-O酸
M：マンノサミン
MNS6S：N-スルホ-6-O-スルホマンノサミン
Epox：エポキシド
αred：αアノマー
βred：βアノマー
【００５２】
[発明の詳細な説明]
実験的アッセイ
Bruker AVIII-600またはAVIII-800核磁気共鳴（NMR）分光器を用いて定量的NMRアッセイが実施された。試薬として99.9%酸化重水素（D2O）、3-(トリメチルシリル)-プロピオン-D4酸（TSP）のナトリウム塩、そしてジメチルマロン酸（DMMA）（定量的NMRにおける内部標準、TraceCERTグレード）が使用された。
【００５３】
ａ）装置の状態
-  周波数：1H：600 / 800 MHz、13C：150.9 / 201.2 MHz
-  温度：298 K
【００５４】
ｂ）捕捉パラメーター（定量的1H NMR）
-  90oパルス：定性的1Hスペクトルをもとに特定
-  捕捉ウィンドウ：SW = 10〜12 ppm/TD = 64〜128k
-  スキャン間遅延（d1）はd1 + AQ≧20sの条件を満たす必要あり
-  スキャン数：12
【００５５】
ｃ）捕捉パラメーター（HSQC）
-  90oパルス：定性的1Hスペクトルをもとに特定）
-  捕捉ウィンドウ：SW2（1H）= 6 ppm / TD（F2）= 1k
SW1（13C）= 120 ppm / TD（F1）= 256〜384
-  パルス間隔 d1 = 1.8〜2s
-  スキャン数：12
【００５６】
ｄ）処理パラメーター（1H)
-  処理ウィンドウ：SI = 64〜256K
-  ウィンドウ関数：なし
-  相調整：手動
-  ベースライン調整：自動（abs）
【００５７】
ｅ）処理パラメーター（HSQC）
-  処理ウィンドウ：SI（F2）= 2k
-  処理関数：QSINE、SSB=2
-  相調整：手動
-  ベースライン調整：自動 
【００５８】
ｆ）サンプルの準備において下記の溶液が調製された：
-  溶液A [TSP] 1mg/mL
-  溶液B [D2O-TSP] 0.002 mg/mL：40 μL A [TSP] + 19.96 mL D2O、全容積 = 20 mL
-  溶液C [DMMA] 1.2 mg/mL
-  試験サンプル：研究対象の生成物50 mgを500 μLの溶液B [D2O-TSP]に入れ、溶液C [DMMA（ジメチルマロン酸）]を100 μL加え、直径5 mmのNMR管に入れた。
【００５９】
ｇ）処理
サンプルが入ったNMR管を分光器に設置した。次に磁場の均質性を調整し、1Hおよび13Cの核に対して波形を最大限に調和した。続いて定性的1Hスペクトルを実施した。以下の点を除き、上記と類似したパラメーターを使用した：
パルス間隔 d1 = 1〜2s
スキャン数：1〜4
【００６０】
次に、自動パルスプログラム（TOPSPIN）で90oパルスの値を特定した。続いて、定量的1Hスペクトルを実行した。パラメーターには、解析手法で示されているものと、前回算出した90oパルス値（P1）を使用した。上記のパラメーターを用いてHSQCスペクトルを取得した。次に上記のパラメーターに従って取得したスペクトルを処理し、化学シフト参照として考慮した（0 ppmにおけるTSP-d4信号）。
ジメチルマロン酸信号は以下の化学シフトにて現れた：
-  1H NMR：1.2〜1.4 ppmにて現れる一重項
-  HSQC：1.2〜1.4および26〜27 ppmにおける信号
【００６１】
定量的NMR手法の検証について特定するため、以下のパラメーターを評価した：
【００６２】
特異性
サンプルに他の化学物質が存在する可能性のある中、関心のある検体を明確に、そして同時または個別に測定および/または同定するための解析手法の能力を判定するものである。
【００６３】
これらの実験において、1H NMRスペクトルから以下のデータを取得した：
【００６４】
【表１】
2019525166.tif 000007
【００６５】
および1H 13C-HSQCスペクトル内：
【００６６】
【表２】
2019525166.tif 000008
【００６７】
1H NMRスペクトルにも1H 13C-HSQCスペクトルにも信号間の干渉が発生していないことが確認された（図2および3）。これは同手法によって、干渉を起こすことなく研究対象の化合物の構造を、サンプルに存在する他の生成物（溶液（酸化重水素（D2O）、内部標準（ジメチルマロン酸：DMMA）、化学シフト参照（TSP-d4）など）と区別できることを示している。
【００６８】
定量化および直線性における限界
これらのパラメーターのもとでは、適切な正確度と精度で定量化され得る形で検体の最小量が特定される一方、同手法で（数学的変換を用いて）結果を直接取得する能力は、一定の間隔内であれば、サンプル内の検体の濃度に比例している。
【００６９】
定量化および直線性の限界について評価するため、内部標準の7レベルの濃度（個々に計量したもの、およびで三部構成のもの）でドープしたエノキサパリンナトリウムにおいて、DMMA NMR信号の積分を定量化した（DMMAに相当するNMR信号領域の積分）。これらのレベルは、以下の作業濃度に相当した：
-  0.2 mM：作業濃度の13.5 %
-  0.3 mM：作業濃度の20.3 %
-  0.76 mM：作業濃度の50 %
-  1.2 mM：作業濃度の80.1 %
-  1.5 mM：作業濃度の100 %
-  1.8 mM：作業濃度の120 %
-  2.27 mM：作業濃度の150.2 %
【００７０】
この直線性基準を満たすために、取得した直線において双方の実験の相関係数が≧0.99であるということを許容基準として定めた。図4および5は、1H NMRおよび1H 13C-HSQCスペクトルにおいてDMMA信号間隔の値をDMMA濃度（mM）と比較したものである。許容基準は、一方でも他方でも容易に達成できた。
【００７１】
定量化の限界は、0.20 mMのDMMA濃度に対して定められた。そのため、この濃度に相当するDMMA信号強度よりも低い強度の研究対象サンプルは適切に定量化できず、結果として分子内に存在する残基の相対的比率を特定するために使用できない。
【００７２】
正確度
これは、実験で得られた値が、慣習的に許容される真値または参照値にどれだけ近いかを表すものである。サンプル濃度の実験値を算出・評価するために、前回のセクションで入手した直線の（直線性に関する）数式が考慮された。
【００７３】
正確度は、既知の内部標準量の評価において復元パーセンテージとして示される。
【００７４】
【数１】
2019525166.tif 000009
【００７５】
ここでは：
Xm：導き出された平均値
μ：真値として許容される値
【００７６】
濃度限度に相当する濃度では復元値が70.0〜130.0 %、それ以外のレベルでは80.0〜120.0 %であるということが許容基準として定められた。
【００７７】
1H NMRおよびHSQC実験では以下のデータが得られた：
【００７８】
【表３】
2019525166.tif 000010
【００７９】
このアッセイの結論として、1H NMR実験およびHSQC実験の双方において、この適合性が、サンプルに相当するこれらの信号を対象とした正確度パラメーターの許容基準に沿ったものであり、その強度は定量化限界の強度よりも高いことが導き出される。
【００８０】
精度 - 再現性 
同一のサンプル、同一の運転条件、同一の実験室で、そして短時間にわたって一連の解析を実施することで、同手法の変動性について調査した。 
【００８１】
そのために、それぞれの濃度で3回連続して実験が行われた。同手法の再現性は、一連の測定における変動係数（CV）として示され、以下のように数学的に算出された：
【００８２】
【数２】
2019525166.tif 000011
【００８３】
ここでは：
s：標準偏差
X：結果の算術平均。
【００８４】
これらの正確度基準を満たすため、すべてのレベルにおいて変動係数が≦7%であるという許容基準が定められた。
【００８５】
双方の実験において以下のデータが得られた：
【００８６】
【表４】
2019525166.tif 000012
【００８７】
このアッセイの結論として、1H NMR実験およびHSQC実験の双方において、この適合性が、サンプルに相当するこれらの信号を対象とした正確度パラメーターの許容基準に沿ったものであり、その強度は定量化限界の強度よりも高いことが導き出される。
【００８８】
[例]
以下の具体的な例は、本発明の性質を表したものである。これらの例は説明のために示されているに過ぎず、本書における発明の特許請求を限定するものと解釈されることはない。
【００８９】
例1
エノキサパリンナトリウムの1H NMRを用いた研究。
【００９０】
50 mgのエノキサパリンナトリウムを500 μLのD2O-TSP溶液（溶液B）で溶解し、100 μLのDMMA溶液（溶液C）を加える。派生溶液を直径5 mmの管に入れる。
解析対象となる、派生DMMA濃度は1.5 mMである。
実験はBruker AVIII-800核磁気共鳴分光器で実施された。
【００９１】
主に以下の信号が特定された：
【００９２】
【表５】
2019525166.tif 000013
【００９３】
双方（DMMAと他の残基）の積分の値が得られたら、この残基の正規化数を算出し、その積分の値をDMMA信号に相当する積分の値で除算する。内部標準の濃度はすべての実験において残基濃度に対して一定であるため、この正規化を実施することで、複数の連続製品バッチの解析において生じ得る、実験ごとの変動を避けることができる。
【００９４】
残基の正規化値を取得した後、以下の数式に従ってそれぞれの相対的比率を算出する：
【００９５】
【数３】
2019525166.tif 000014
【００９６】
ここで行った手順を明確にするため、エノキサパリンナトリウムの4つの連続サンプル（M1、M2、M3、M4）から得られた結果を示す： 
【００９７】
実験では、選択した信号ごとに以下の積分値が得られた：
【００９８】
【表６】
2019525166.tif 000015
【００９９】
ここでは、Mはサンプルに相当する。
【０１００】
研究対象となっている信号の正規化積分値を取得するため、これらをDMMA積分値で乗算した：
【０１０１】
【表７】
2019525166.tif 000016
【０１０２】
そして最後に、これらの正規化値をもとに、それぞれの信号の、全信号のセットに対する相対的比率を算出した：
【０１０３】
【表８】
2019525166.tif 000017
【０１０４】
エノキサパリンナトリウム（通常はアノマー陽子（H1）に相対したもの）の特性および高分化信号の定量化について、観測された相対的比率の値と併せて以下の表に示す：
【０１０５】
【表９】
2019525166.tif 000018
【０１０６】
既定のNMRスペクトルで検出されたピークに相当する信号セット（「相対的比率（%）」パラメーターによって示される当該正規化積分と相対的に比例）は、一次元1H-NMRであれ二次元1H-13C HSQCであれ、またはこれらが存在しないのであれ、本特許明細書において「信号パターン」または単に「パターン」呼ばれているものである。
【０１０７】
例2
例1で使用した解法は、1H-13C HSQCを用いた研究にも応用できる。主に以下の信号が特定された：
【０１０８】
【表１０−１】
2019525166.tif 000019
【０１０９】
【表１０−２】
2019525166.tif 000020
【０１１０】
これらの信号は分子の単糖類成分に関連付けることができるため、これを定量化することで、その単糖類組成を特定できる。 
【０１１１】
これらの各信号の積分値は、1H NMR実験で説明されているものと同じ工程を介して、DMMA積分に対して設定した値を起点に正規化できる。エノキサパリンナトリウムの特性信号の定量化について以下の表に示す：
【０１１２】
【表１１】
2019525166.tif 000021
【０１１３】
これらの実験は、上記の実験条件を適用することで、グリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにその派生物に対して核磁気共鳴（1H-NMRおよび1H-13C HSQC）を用いた解析が可能であり、ひいてはその定量的解析が可能であることを示している。
【０１１４】
例3
ベミパリンナトリウムの1H NMRを用いた研究。
【０１１５】
主に以下の信号が特定された：
【０１１６】
【表１２】
2019525166.tif 000022
【０１１７】
ベミパリンナトリウム（通常はアノマー陽子（H1）に相対したもの）の特性および高分化信号の定量化について、6つの連続サンプルから観測された相対的比率の値と併せて以下の表に示す：
【０１１８】
【表１３】
2019525166.tif 000023
【０１１９】
例4
例3で使用した解法は、1H-13C HSQCを用いた研究にも応用できる。主に以下の信号が特定された：
【０１２０】
【表１４−１】
2019525166.tif 000024
【０１２１】
【表１４−２】
2019525166.tif 000025
【０１２２】
これらの信号は分子の単糖類成分に関連付けることができるため、これを定量化することで、その単糖類組成を特定できる。
【０１２３】
これらの各信号の積分値は、1H NMR実験で説明されているものと同じ工程を介して、DMMA積分に対して設定した値を起点に正規化できる。ベミパリンナトリウムの信号特性の定量化について以下の表に示す：
【０１２４】
【表１５】
2019525166.tif 000026
【０１２５】
例5
ダルテパリンナトリウムの1H NMRを用いた研究。
【０１２６】
主に以下の信号が特定された：
【０１２７】
【表１６】
2019525166.tif 000027
【０１２８】
ダルテパリンナトリウム（通常はアノマー陽子（H1）に相対したもの）の特性および高分化信号の定量化について、6つの連続サンプルで観測された相対的比率の値と併せて以下の表に示す：
【０１２９】
【表１７】
2019525166.tif 000028
【０１３０】
例6
例5で使用した解法は、1H-13C HSQCを用いた研究にも応用できる。主に以下の信号が特定された：
【０１３１】
【表１８】
2019525166.tif 000029
【０１３２】
これらの信号は分子の単糖類成分に関連付けることができるため、これを定量化することで、その単糖類組成の特定が可能となる。
【０１３３】
これらの各信号の積分値は、1H NMR実験で説明されているものと同じ工程を介して、DMMA積分に対して設定した値を起点に正規化できる。ダルテパリンナトリウムの信号特性の定量化について以下の表に示す：
【０１３４】
【表１９】
2019525166.tif 000030
【０１３５】
例7
チンザパリンナトリウムの1H NMRを用いた研究。
【０１３６】
主に以下の信号が特定された：
【０１３７】
【表２０】
2019525166.tif 000031
【０１３８】
チンザパリンナトリウム（通常はアノマー陽子（H1）に相対したもの）の特性および高分化信号の定量化について、6つの連続サンプルで観測された相対的比率の値と併せて以下の表に示す：
【０１３９】
【表２１】
2019525166.tif 000032
【０１４０】
例8
例7で使用した解法は、1H-13C HSQCを用いた研究にも応用できる。主に以下の信号が特定された：
【０１４１】
【表２２】
2019525166.tif 000033
【０１４２】
これらの信号は分子の単糖類成分に関連付けることができるため、これを定量化することで、その単糖類組成の特定が可能となる。
【０１４３】
これらの各信号の積分値は、1H NMR実験で説明されているものと同じ工程を介して、DMMA積分に対して設定した値を起点に正規化できる。チンザパリンナトリウムの信号特性の定量化について以下の表に示す：
【０１４４】
【表２３】
2019525166.tif 000034
【０１４５】
これらの実験は、上記の実験条件を適用することで、グリコサミノグリカン全般、とりわけヘパリン、低分子量ヘパリン、ならびにその派生物に対して核磁気共鳴（1H-NMRおよび1H-13C HSQC）を用いた解析が可能であり、ひいてはその定量的解析が可能であることを示している。
【図１】
2019525166.tif 000043
【図２】
2019525166.tif 000044
【図３】
2019525166.tif 000045
【図４】
2019525166.tif 000046
【図５】
2019525166.tif 000047
【図６】
2019525166.tif 000048
【図７】
2019525166.tif 000049
【国際調査報告】
2019525166.tif 000050
2019525166.tif 000051
2019525166.tif 000052
2019525166.tif 000053
2019525166.tif 000054
2019525166.tif 000055