(57)【要約】本発明は、ファージディスプレイ技術を用いたにきび菌に特異的に結合するヒト抗体およびその用途に関し、より詳細には、（抗原）に特異的に結合する抗体；これを含むヒト抗体；これを用いたファージディスプレイ技術；これを用いた化粧料組成物および薬学的組成物を提供する。
2019521678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）に特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体：
（ａ）配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｂ）配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｃ）配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（ｄ）配列番号１９で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２４で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体：
（ａ）配列番号２５で表される重鎖可変領域および配列番号２６で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｂ）配列番号２７で表される重鎖可変領域および配列番号２８で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｃ）配列番号２９で表される重鎖可変領域および配列番号３０で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｄ）配列番号３１で表される重鎖可変領域および配列番号３２で表される軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜4のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換される、形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または改善用化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または治療用薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体をにきびに対する予防または改善用化粧料組成物に使用するための用途。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むにきびに対する予防または治療用薬学的組成物の用途。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を薬学的に有効な量で必要な個体に投与する段階を含む、にきびの治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ファージディスプレイ技術を用いたにきび菌に特異的に結合するヒト抗体およびその用途に関し、より詳細には、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）に特異的に結合する抗体およびこれを用いた化粧料組成物並びに薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
にきびは、まだ発生原因が明確に明らかにされていないが、顔、首、胸、背中、肩等で皮脂分泌の増加、毛嚢内異常角化、にきび誘発菌であるプロピオニバクテリウムアクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の群落形成等、複合的原因による炎症反応により形成される限局性慢性炎症性皮膚疾患である。
【０００３】
にきびは、１０代の場合、８５％、成人の場合、１１％の皮膚で観察されるほど頻繁に発病する皮膚疾患であって、一般的に１０代初めに発生し、成人になれば減少するが、成人になった後に発生したり、かえってその症状がひどくなる場合もある。青少年期のにきびは、男性においてさらに頻繁に発生するが、成人にきびの場合、女性においてさらに頻繁に発生し、これは、女性ホルモンの変化のためであり、女性は、月経前に着床と関連するプロゲストロンの分泌量が多くなって、男性ホルモンの分泌を刺激するようになり、そのため、成人にきびの症状が悪化する場合が多く存在する。にきび誘発菌Ｐ．ａｃｎｅｓは、耐気性嫌気性細菌であって、大部分の健康な成人の皮膚で発見され、Ｐ．ａｃｎｅｓは、正常なヒトには、疾患を引き起こさない日和見感染病原菌であり、にきびをはじめとして関節補綴物感染、心内膜炎、サルコイドーシス、内眼球炎、菌血症等多様な炎症疾患と関連がある。
【０００４】
Ｐ．ａｃｎｅｓは、毛穴内嫌気的条件で各種酵素を分泌して、毛嚢内の皮脂の脂肪酸とトリグリセリドを短鎖脂肪酸とプロピオン酸に分解して養分を得、Ｐ．ａｃｎｅｓが毛穴内で群落を形成しながら、周辺細胞に損傷を加え、皮脂を分解しつつ発生する各種副産物が毛穴を塞ぐことによって、ヒトの免疫体系により炎症反応が引き起こされると、にきびが発生する。
【０００５】
したがって、にきびを治療するために、抗生剤およびホルモンの局所塗布（クリンダマイシン、エリスロマイシン等）および経口投与（レチノイド系等）、外科的切開、紫外線治療等多様な方法が試みられているが、まだ成功的な治療法はなく、抗生剤やホルモンを長期的に使用すると、耐性の発生および肝毒性の誘発、消化性潰瘍、奇形児の誘発等の深刻な副作用を発生させたり、局所塗布剤の場合、皮膚刺激および紅潮の発生、皮膚炎の発生等の副作用があり、患部への浸透が円滑でないという問題点がある。また、外科的切開は、皮膚切開による損傷および傷跡が残ることがあるという問題点があり、紫外線治療の場合、紫外線による皮膚損傷を誘発し、特殊装備が必要であるという限界点がある。
【０００６】
これより、ファージディスプレイ技術は、英国のＭｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌで１９９０年に初めて開発されたもので、ヒト抗体ライブラリーを製造して抗体断片（Ｆａｂ、ＳｃＦｖ）の形態でバクテリオファージの表面に発現させて、特定抗原に対する抗体クローンを選別する技術である。抗原と特異的に反応するほぼすべての種類のヒト組換えモノクローナル抗体を単一ｐｏｔ抗体ライブラリーシステムから選別することができる可能性が提案され、これは、ファージディスプレイ抗体技術を活用する場合、体内診断や治療に応用できる多様な抗体断片（ＦａｂまたはＳｃＦｖ形態）を獲得することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記モノクローナル抗体の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）に特異的に結合する、モノクローナル抗体を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記発現ベクターで形質転換される形質転換体を提供する。
【００１２】
本発明の好ましい一実施例において、前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい：
（ａ）配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｂ）配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｃ）配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（ｄ）配列番号１９で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２４で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
【００１３】
本発明の好ましい一実施例において、前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい：
（ａ）配列番号２５で表される重鎖可変領域および配列番号２６で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｂ）配列番号２７で表される重鎖可変領域および配列番号２８で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｃ）配列番号２９で表される重鎖可変領域および配列番号３０で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｄ）配列番号３１で表される重鎖可変領域および配列番号３２で表される軽鎖可変領域を含む抗体。
【００１４】
本発明の好ましい一実施例において、前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体であってもよい。
【００１５】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によるモノクローナル抗体は、にきび菌を特異的に認知し、結合することができる。これにより、にきび菌に対して抗菌活性を示す化合物または酵素と結合した形態の抗体であることを利用することによって、副作用なしに、にきび症状を緩和したり除去することができるものと期待される。
【００１８】
したがって、本発明のモノクローナル抗体は、原料として使用して長期的に使用しても耐性および副作用がないにきび改善用化粧料組成物および薬学的組成物を提供できるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の一具現例による補強クロストリジウム培地（Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ；ＲＣＭ）で培養されたＰ．ａｃｎｅｓに関する写真である。
【図２】図２は、本発明の一具現例によるファージディスプレイ技術に関する図である。
【図３】図３は、本発明の一具現例による３次Ｐ．ａｃｎｅｓのパンニングおよび滴定に関する写真である。
【図４】図４は、本発明の一具現例によるＰｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ファージＥＬＩＳＡの結果に関するグラフである。
【図５】図５は、本発明の一具現例によるＭｏｎｏ−ｓｃＦｖ−ファージＥＬＩＳＡの結果に関するグラフである。
【図６】図６は、本発明の一具現例によるＩｇＧ  ｆｏｒｍに転換するための方法に関する図である。
【図７】図７は、本発明の一具現例によるヒト抗体発現および精製に関する実験データである。
【図８】図８は、本発明の一具現例による製作されたヒト抗体とＰ．ａｃｎｅｓ間のＥＬＩＳＡの結果に関するグラフである。
【図９】図９は、本発明の一具現例による製作されたヒト抗体とＰ．ａｃｎｅｓ間のＥＬＩＳＡを用いた親和度分析結果に関するグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の一具現例による製作されたヒト抗体のＰ．ａｃｎｅｓの生長抑制効果を確認した結果に関するグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明で使用した用語を説明する。
【００２１】
本発明で使用される用語「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体をすべて含む概念である。また、前記用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）および異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）のような遺伝工学により生産された形態を含む。前記用語は、さらに、ＦｃＲｎに対する結合機能を有する単鎖抗体、ｓｃＡｂ、抗体不変領域の誘導体およびタンパク質スキャフォールドに基づく人工抗体を含む。
【００２２】
本発明で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、当該分野に公知となった用語であって、単一抗原性部位に対して指示される高度の特異的な抗体を意味する。通常、異なるエピトープ（抗原決定基）に対して指示される異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは異なって、モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指示される。モノクローナル抗体は、抗原−抗体結合を利用する診断および分析学的分析法の選択性と特異性を改善させるという長所があり、また、ハイブリードマ培養により合成されるので、他の免疫グロブリンにより汚染されないという他の長所を有する。
【００２３】
典型的に、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有し、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域および可変領域（前記部位は、「ドメイン」としても知られている）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下、「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３個の可変領域および４個の「構造領域」（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的に、Ｎ−末端から始まって順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、特定のＣＤＲが位置している鎖により識別される。
【００２４】
本発明で使用される用語「可変」とは、抗体間に特定領域の配列が大きく異なっており、特定抗原に対してそれぞれの特定抗体の結合特異性を示すのに使用されることを称するために使用される。抗体の可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布するものではなく、ＣＤＲに集中する。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを有し、これらの領域がにきび菌の表面抗原を認識することによって、抗原−抗体複合体を形成する。このようなＣＤＲは、それぞれのモノクローナル抗体ごとに特徴的な配列を有し、一つのモノクローナル抗体が特定エピトープを認識するために、これら６個のＣＤＲの一部または全部が相互作用することができる。
【００２５】
本発明で使用される用語「ファージディスプレイ技術」は、ファージライブラリーから標的抗原と有意的結合能を示すファージのみを選別することを通じて、抗原との結合能を示すｓｃＦｖを選別する技術を示す。前記技術において、「パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」は、ファージの外壁（ｃｏａｔ）にペプチドを発現（ｄｉｓｐｌａｙ）するファージライブラリーから標的分子（抗体、酵素、細胞表面レセプター等）と結合する性質を有するペプチドを表面に発現しているファージのみを選別する過程を称する。このような過程を３〜１０回繰り返して、標的抗原に対して有意的結合能を示すｓｃＦｖを選別することができ、最終的に選別されたｓｃＦｖをヒト化モノクローナル抗体に製造することができる。
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２７】
本発明は、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）に特異的に結合する、モノクローナル抗体を提供する。
【００２８】
具体的に、前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つの配列を含むことができる：
（ａ）配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｂ）配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｃ）配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（ｄ）配列番号１９で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２４で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
【００２９】
より具体的に、前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つの抗体であることが好ましい。
（ａ）配列番号２５で表される重鎖可変領域および配列番号２６で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｂ）配列番号２７で表される重鎖可変領域および配列番号２８で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｃ）配列番号２９で表される重鎖可変領域および配列番号３０で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｄ）配列番号３１で表される重鎖可変領域および配列番号３２で表される軽鎖可変領域を含む抗体。
【００３０】
より具体的には、モノクローナル抗体の重鎖可変部位が配列番号２５、２７、２９および３１よりなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含むか、またはＣＤＲ領域内でこのような配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である配列を含むか；または／およびそれらの軽鎖可変部位が配列番号２６、２８、３０および３２よりなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含むか、またはＣＤＲ領域内でこのような配列との同一性が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である配列を含むことができる。
【００３１】
本発明のモノクローナル抗体は、生物学的試料と反応させ、抗原−抗体複合体の形成を検出することによって、プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を検出するのに使用することができる。
【００３２】
前記「抗原−抗体複合体」は、試料のうちＰ．ａｃｎｅｓタンパク質抗原とこれを認知する本発明によるモノクローナル抗体との結合体を意味し、このような抗原−抗体複合体の形成は、比色法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）、視覚的評価（ｖｉｓｕａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）およびシンチレーション計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）よりなるグループから選ばれる任意の方法で検出することができる。しかしながら、必ずこれらにのみ制限されず、多様な応用と適用が可能である。
【００３３】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するために様々な標識体を使用することができる。具体例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、放射性同位元素よりなるグループから選ばれることができ、必ずこれらにのみ限定されものではない。好ましくは、抗原−抗体複合体を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を利用して検出することができる。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）には、固体支持体に付着した抗原を認知する標識された抗体を利用する直接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗原を認知する抗体の複合体で捕獲抗体を認知する標識された二次抗体を利用する間接的ＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認知する標識された他の抗体を利用する直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、固体支持体に付着した抗体と抗原の複合体で抗原を認知するさらに他の抗体と反応させた後、この抗体を認知する標識された２次抗体を利用する間接的サンドイッチＥＬＩＳＡ等多様なＥＬＩＳＡ方法を含む。前記モノクローナル抗体は、検出標識を有することができ、検出標識を有しない場合は、これらのモノクローナル抗体を捕獲することができ、検出標識を有する他の抗体を処理して確認することができる。
【００３４】
また、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。
【００３５】
また、本発明は、前記発現ベクターで形質転換される形質転換体を提供する。
【００３６】
本発明の抗体を暗号化するポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）に因って、または前記抗体を発現させようとする生物で選好されるコドンを考慮して、コーディング領域から発現する抗体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われ得、コーディング領域を除いた部分でも遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内で多様な変形または修飾が行われ得、そのような変形遺伝子もやはり本発明の範囲に含まれることを当業者はよく理解することができる。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、これと同等な活性を有するタンパク質をコーディングする限り、一つ以上の核酸塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組合せにより変異され得、これらも、本発明の範囲に含まれる。このようなポリヌクレオチドの配列は、単鎖または二重鎖であってもよく、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子であってもよい。
【００３７】
前記発現ベクターの製作時には、前記抗体を生産しようとする宿主細胞の種類によってプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、終止子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）等のような発現調節配列、膜標的化または分泌のための配列等を適切に選択し、目的に応じて多様に組み合わせることができる。
【００３８】
本発明の発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクター等を含むが、これらに制限されない。好適な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーのような発現調節エレメントの他にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造され得る。発現ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であってもよい。前記シグナル配列には、宿主がエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）菌である場合には、ＰｈｏＡシグナル配列、ＯｍｐＡシグナル配列等を用いることができ、宿主がバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）菌である場合には、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列等を用いることができ、宿主が酵母（ｙｅａｓｔ）である場合には、ＭＦαシグナル配列、ＳＵＣ２シグナル配列等を用いることができ、宿主が動物細胞である場合には、インスリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列等を用いることができるが、これらに制限されない。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができ、複製可能な発現ベクターである場合、複製起源を含む。
【００３９】
また、本発明は、（１）前記形質転換体を培地に接種して培養する段階と、（２）前記段階（１）で培養した培養液からＰ．ａｃｎｅｓに特異的に結合するモノクローナル抗体を精製する段階とを含む、モノクローナル抗体の製造方法を提供する。
【００４０】
本発明による前記発現ベクターを好適な宿主細胞、例えば、大腸菌または酵母細胞等に形質転換させた後、形質転換された宿主細胞を培養することによって、本発明による抗体を大量生産することができる。宿主細胞の種類による好適な培養方法および培地条件等は、当該分野における通常の技術者に知られている公知の技術から当業者が容易に選択することができる。前記宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような原核生物であってもよい。また、サカロマイセスセルビシア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞に由来する真核細胞であってもよい。より好ましくは、前記動物細胞は、ヒト由来の細胞株であってもよい。前記宿主細胞への発現ベクター導入方法は、当業者に公知となったいずれの方法を使用してもよい。
【００４１】
また、本発明は、本発明によるＰ．ａｃｎｅｓに特異的に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または改善用化粧料組成物を提供する。
【００４２】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体をにきびに対する予防または改善用化粧料組成物に使用するための用途を提供する。
【００４３】
本発明の化粧料組成物は、前記ヒト抗体以外に化粧料組成物に通常的に用いられる成分が含まれ、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常の補助剤、そして担体を含む。
【００４４】
本発明の化粧料組成物において、通常的に含有される化粧料組成物に対する本発明のモノクローナル抗体は、０．１〜５０重量％、好ましくは１〜１０重量％の量で添加され得る。
【００４５】
本発明の化粧料組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造され得、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーションおよびスプレー等に剤形化され得るが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水（スキンソフナー）、栄養化粧水（乳液）、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造され得る。
【００４６】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛等が用いられ、前記剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーである場合には、さらに、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【００４７】
本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタン脂肪酸エステルがある。
【００４８】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガカント等が用いられる。
【００４９】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステル等が用いられる。
【００５０】
また、本発明は、本発明によるＰ．ａｃｎｅｓに特異的に結合するモノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００５１】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を含むにきびに対する予防または治療用薬学的組成物の用途を提供する。
【００５２】
本発明のモノクローナル抗体は、臨床投与時に非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。非経口的な投与方法としては、これらに制限されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸内投与であってもよい。
【００５３】
非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は、好適な非経口用担体と共に、注射剤、経皮投与剤および鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知となった方法により剤形化され得る。前記注射剤の場合には、必ず滅菌されなければならず、バクテリアおよび真菌のような微生物の汚染から保護されなければならない。注射剤の場合、好適な担体の例としては、これらに限定されものではないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、これらの混合物および／または植物油を含む溶媒または分散媒質であってもよい。より好ましくは、好適な担体としては、ハンクス溶液、リンガー液、トリエタノールアミンが含有されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコールおよび５％デキストロースのような等張溶液等を使用することができる。前記注射剤を微生物の汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等のような多様な抗菌剤および抗真菌剤をさらに含むことができる。また、前記注射剤は、多くの場合、糖またはナトリウムクロリドのような等張剤をさらに含むことができる。
【００５４】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロゾル剤等の形態が含まれる。前記で「経皮投与」は、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して薬学的組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に伝達されることを意味する。
【００５５】
吸入投与剤の場合、本発明によって使用される化合物は、好適な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を使用して、加圧パックまたは煙霧機からエアロゾルスプレー形態で便利に伝達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を伝達する弁を提供して決定することができる。例えば、吸入器または吹込器に使用されるゼラチンカプセルおよびカートリッジは、化合物、およびラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤の粉末混合物を含有するように剤形化することができる。非経口投与用剤形は、すべての製薬化学に一般的に公知となった処方書である文献（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７５．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １８０４２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８７：Ｂｌａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）に記載されている。
【００５６】
本発明の薬学的組成物は、本発明によるモノクローナル抗体を有効量で含むとき、好ましいにきび予防または治療の効果を提供することができる。本明細書で、「有効量」というのは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を言い、好ましくはＰ．ａｃｎｅｓ菌の死滅またはにきび減少の効果を示すのに十分な量をいう。本発明の薬学的組成物に本発明によるモノクローナル抗体が０．０１〜９９．９９％含まれ得、残量は、薬学的に許容可能な担体が占めることができる。本発明の薬学的組成物に含まれる本発明によるモノクローナル抗体の有効量は、組成物が製品化される形態等によって変わる。
【００５７】
本発明の薬学的組成物の総有効量は、単回投与量（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ）で患者に投与され得、複数回投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ）で長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）により投与され得る。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度によって有効成分の含量を異にすることができる。非経口投与時は、前記本発明によるモノクローナル抗体を基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．０１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．１〜３０ｍｇの量で投与されるように、そして、経口投与時は、本発明によるモノクローナル抗体を基準として一日に体重１ｋｇ当たり好ましくは０．０１〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１０  ｍｇの量で投与されるように１回〜数回に分けて投与することができる。しかしながら、前記本発明によるモノクローナル抗体の用量は、薬学的組成物の投与経路および治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食事および排泄率等多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、このような点を考慮するとき、当該分野における通常の知識を有する者なら、本発明によるモノクローナル抗体をにきび予防または治療のための特定の用途に応じた好適な有効投与量を決定することができる。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路および投与方法に特に制限されない。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療または生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００５９】
本発明の薬学的組成物は、また、本発明によるモノクローナル抗体を有効成分として含む外用剤の剤形で提供することができる。
【００６０】
本発明の薬学的組成物を皮膚外用剤として使用する場合、さらに脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤およびゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤または脂質小胞等皮膚外用剤に通常的に使用される任意の他の成分のような皮膚科学分野において通常的に使用される補助剤を含有することができる。また、前記成分は、皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入され得る。
【００６１】
本発明の薬学的組成物が皮膚外用剤として提供される場合、これらに制限されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリームまたは噴霧剤等の剤形であってもよい。
【発明の実施のための形態】
【００６２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明だろう。
【００６３】
［実施例１］プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）の培養
本発明のモノクローナル抗体を生産するための抗原菌として、にきびを誘発するプロピオニバクテリウムアクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）菌を培養して準備した。Ｐ．ａｃｎｅｓは、グラム陽性の細菌であり、細胞膜に特異的な抗原が多数存在して、病原菌自体を特異的に認知し結合するヒト抗体を製造しようとした。
【００６４】
固体培地で継代培養するために、補強クロストリジウム培地(ＲＣＭ培地）にＰ．ａｃｎｅｓを塗抹し、嫌気培養器またはＡｎａｅｒｏＰａｃｋＴＭ−Ａｎａｅｒｏ（Ａ−０４，ＭＧＣ）を入れて密封したボックスに入れ、３７℃で５日間培養した（図１ａ）。
【００６５】
液体培地で培養するために、補強クロストリジウム培地ブロス（ＲＣＭ液体培地）をチューブに１．５ｍｌ加えた後、継代培養したＰ．ａｃｎｅｓのコロニーを接種した後、３７℃で５日間静置培養した。培養した培養液は、遠心分離して菌株を収穫し、５０ｍｌのＲＣＭ液体培地を満たした遠心分離機チューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）に収穫した菌株を加えて、さらに３７℃で５日間静置培養した（図１ｂ）。
【００６６】
［実施例２］  Ｐ．ａｃｎｅｓに特異的に結合するモノクルローン抗体の製造
＜２−１＞ファージディスプレイ技術を用いたＰ．ａｃｎｅｓ結合抗体候補群製作
Ｐ．ａｃｎｅｓに対して特異的に結合するモノクローナル抗体を製造するために、まず、図２の模式図で示すファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）技術を用いてＰ．ａｃｎｅｓ結合抗体候補群を製造した。
【００６７】
具体的に、２．７×１０１０の多様性を有するヒト由来ｓｃＦｖライブラリーファージ（ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｈａｇｅ）１ｍｌと表皮ブドウ球菌であるスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）２ｍｌを２時間反応させて、皮膚に無害な菌にも結合する可能性があるｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅをまず除去した（段階１）。除去後に残ったｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅをＰ．ａｃｎｅｓと２時間反応させて、Ｐ．ａｃｎｅｓにのみ特異的に結合するｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを溶出して、ｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅとして確保した（段階２）。確保したＰｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ファージをＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させて増幅し、増幅したＰｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ファージを使用して前記段階１および段階２の過程を総３回繰り返して行うことによって、親和力が良いファージのみを選択的に増幅させた（パンニング段階：ｐａｎｎｉｎｇ  ｓｔｅｐ）。最終的に確保したｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを希釈し、滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を分析し、増幅水準を確認した。
【００６８】
それぞれのパンニング段階で増幅されたファージ候補群のレベルは、下記の表１に示された通りである。Ｐ．ａｃｎｅｓと反応前に１ｍｌの反応液に含まれたｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅの数は、それぞれ１×１０１３個、１．６×１０１３個および５×１０１２個であり、Ｐ．ａｃｎｅｓと反応して結合するものとして収得したｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅの数は、それぞれ２×１０４個、８×１０４個および１×１０５個であった（図３）。
【００６９】
【表１】
2019521678.tif 000003
【００７０】
選別したｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅがＰ．ａｃｎｅｓと親和力を示すかを確認するために、各パンニング段階でのｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅを対象としてＥＬＩＳＡ分析を行った。
【００７１】
ＥＬＩＳＡ分析のために、まず、Ｐ．ａｃｎｅｓまたは対照群細胞（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を培養してＰＢＳで洗浄して準備した後、吸光度が０．５になるように希釈して、９６ウェルプレートの各ウェル当たり１００μｌずつ分注し、４℃で１６時間以上培養してコーティングした。その後、すべてのウェルにある反応液を除去し、各ウェル当たりＰＢＳＡを１００μｌずつ分注した後、４℃で２時間培養して遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ＰＢＳＡを除去した。除去後、ウェルにｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ含有溶液を１００μｌずつ分注し、４℃で１時間反応した。その後、すべてのウェルにある反応液を除去し、希釈したＰＢＳＴをウェル当たり２００μｌずつ分注して洗浄する段階を２回繰り返した。洗浄が完了した後、各ウェルに１：４，０００で希釈したｈＦｃ−ＨＲＰを１００μｌずつ分注し、室温の暗室で１０分間反応させて、発色を誘導した。青色に変わる発色反応を終了させるために、停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を各ウェル当たり１００μｌずつ分注し、反応物の色が黄色に変わると、マイクロプレートリーダー機を利用して４５０ｎｍの波長で各ウェル別に吸光度を測定した。
【００７２】
その結果、下記の表２および図４に示されたように、パンニング実行の回数が増加するほどｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅとＰ．ａｃｎｅｓの結合力が増加することを確認し、他方で、対照群細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｌｌ）とは結合しないことを確認した。
【００７３】
【表２】
2019521678.tif 000004
【００７４】
＜２−２＞  Ｐ．ａｃｎｅｓ結合抗体候補群から高い結合力の単一ファージ選別
前記段階＜２−１＞で収得したＰ．ａｃｎｅｓ結合ｐｏｌｙ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅから、高い親和力を示す１０個の単一のファージを選別した。選別した単一のファージは、さらにＥＬＩＳＡを行って、Ｐ．ａｃｎｅｓとの結合力を確認した（図５）。
【００７５】
【表３】
2019521678.tif 000005
【００７６】
＜２−３＞選別した単一ファージの配列分析
確保された１０個のＭｏｎｏ−ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅの配列を分析して、配列相同性によって群に分けた。その結果、下記表４に示されたように、３、６、７、８、９、１０番のクローンが重複なしに互いに異なるＣＤＲ３を有することを確認した。これらがＰ．ａｃｎｅｓに対して示す結合力をＥＬＩＳＡ分析で確認した結果、３、６、８および１０番の総４個のクローンが最も優れた結合力を示すことを確認した。
【００７７】
【表４】
2019521678.tif 000006
【００７８】
［実施例３］Ｐ．ａｃｎｅｓ特異的なヒトモノクローナル抗体の発現および精製
Ｐ．ａｃｎｅｓに対して高い親和力を示すものとしてした４個のクローンをｓｃＦｖ形態でヒト抗体のＩｇＧ形態に転換するために重鎖および軽鎖をそれぞれ動物細胞発現ベクターであるｐＮＡＴＶＨとｐＮＡＴＶＬにクローニングした（図６）。クローニングした発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換して、ベクターを増幅した。増幅した８種のプラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３Ｆ細胞に共同−形質感染し、６日間培養した後、親和度クロマトグラフィー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行って、発現した抗体を精製回収した。精製した抗体タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分子量および純粋分離度を確認した（図７ａ）。その後、抗−Ｆｃ−ＨＲＰ抗体を２次抗体として使用してウェスタンブロットを行って、ヒト化モノクローナル抗体の製造を検証した（図７ｂ）。
【００７９】
製造したモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲ領域配列、および軽鎖および重鎖可変領域配列は、下記の表５に示された通りである。
【００８０】
【表５】
2019521678.tif 000007
2019521678.tif 000008
【００８１】
［実施例４］Ｐ．ａｃｎｅｓに対するヒトモノクローナル抗体の親和力確認
本発明で製造したモノクローナル抗体がＰ．ａｃｎｅｓに対して示す親和力をＥＬＩＳＡ分析で確認した。
【００８２】
その結果、下記の表６、図８および図９に示されたように、総４種の抗体（３Ｆ、６Ｆ、８Ｆおよび１０Ｆ）は、いずれも、対照群細胞に比べてＰ．ａｃｎｅｓに結合親和的であることを確認し、特に６Ｆおよび８Ｆ抗体がＰ．ａｃｎｅｓに対する優れた結合力を示す抗体であることを確認した。ＥＬＩＳＡ測定値を利用して各抗体の解離定数（ＫＤ）を計算し、６ＦのＫＤは、２．６×１０−１０、８ＦのＫＤは、１．０×１０−９であって、ＫＤ＝１０−６以下より極めて低い解離定数値を有するので、これは、Ｐ．ａｃｎｅｓに対する６Ｆと８Ｆ抗体が高い親和度を有することを確認した（図９）。
【００８３】
【表６】
2019521678.tif 000009
【００８４】
［実施例５］ヒトモノクローナル抗体のＰ．ａｃｎｅｓ生長抑制効果確認
本発明で製造したヒト抗体が有意的ににきび菌に対して死滅効果を示すことができるかを確認した。
【００８５】
まず、Ｐ．ａｃｎｅｓを液体培地に接種して一晩培養した後、製造した６Ｆ抗体または８Ｆ抗体を３０μｇ／ｍｌの濃度で添加したり、６Ｆ抗体および８Ｆ抗体を同一割合で混合し、３０μｇ／ｍｌの濃度で添加して、２４時間追加培養して反応させた。その後、固体培地に反応した培地を塗抹し、さらに一晩培養して形成されたコロニーの数を計数した。対照群として使用するために、同一条件で抗体の代わりにＰＢＳのみを添加して、２４時間を培養した未処理対照群を準備した。コロニーの数を計数した後、抗体処理前（０時間）のコロニー数に比べて２４時間処理群の相対的なコロニーの数を計算して、Ｐ．ａｃｎｅｓの生長率を計算した。
【００８６】
その結果、下記の表７および図９に示されたように、未処理対照群では、Ｐ．ａｃｎｅｓの生長率が約１５０％を示すのに対し、６Ｆ抗体または８Ｆ抗体を単独で添加した実験群でそれぞれ２２．２％、３０．８％のみを示すので、未処理対照群に比べて有意的な生長率減少効果を示すことができることを確認した。また、６Ｆ抗体および８Ｆ抗体を同時に処理した実験群では、０時間に比べてＰ．ａｃｎｅｓの生長率が８３．５％を示すので、１６．５％減少したレベルの生存率を示すことを確認して、６Ｆおよび８Ｆ抗体を同時に処理することを通じてＰ．ａｃｎｅｓの生長抑制の相乗効果が得られて、有意的ににきび菌を死滅する効果を示すことができることを確認した。
【００８７】
【表７】
2019521678.tif 000010
【００８８】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることことを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【００８９】
以下、本発明の組成物のための製造例を例示する。
【００９０】
［製造例１］化粧品の製造
＜１−１＞柔軟化粧水（スキンソフナー）
本発明のモノクローナル抗体を含む柔軟化粧水を製造するために、下記の表７に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【００９１】
【表８】
2019521678.tif 000011
【００９２】
＜１−２＞栄養化粧水（ローション）
本発明のモノクローナル抗体を含む栄養化粧水を製造するために、下記の表９に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【００９３】
【表９】
2019521678.tif 000012
【００９４】
＜１−３＞エッセンス
本発明のモノクローナル抗体を含むエッセンスを製造するために、下記の表１０に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【００９５】
【表１０】
2019521678.tif 000013
【００９６】
＜１−４＞洗顔剤（クレンジングフォーム）
本発明のモノクローナル抗体を含む洗顔剤（クレンジングフォーム）を製造するために、下記の表１１に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【００９７】
【表１１】
2019521678.tif 000014
【００９８】
＜１−５＞栄養クリーム
本発明のモノクローナル抗体を含む栄養クリームを製造するために、下記の表１２に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【００９９】
【表１２】
2019521678.tif 000015
【０１００】
＜１−６＞マッサージクリーム
本発明のモノクローナル抗体を含むマッサージクリームを製造するために、下記の表１３に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【０１０１】
【表１３】
2019521678.tif 000016
【０１０２】
＜１−７＞パック
本発明のモノクローナル抗体を含むパックを製造するために、下記の表１４に記載されたように配合して、通常の化粧品分野における製造方法に従って製造することができる。
【０１０３】
【表１４】
2019521678.tif 000017
【０１０４】
以上の本発明は、上記に記述された実施例および製造例により限定されず、通常の技術者により多様な変形および変更をもちらすことができ、その他の色彩化粧品を含む多様な用途の化粧品に適用され得るものであり、その効能によって人体に薄く塗布して塗ることができる薬剤、すなわち軟膏への製造に用いられ、これは、添付の請求項で定義される本発明の趣旨と範囲に含まれる。
【図１】
2019521678.tif 000018
【図２】
2019521678.tif 000019
【図３】
2019521678.tif 000020
【図４】
2019521678.tif 000021
【図５】
2019521678.tif 000022
【図６】
2019521678.tif 000023
【図７】
2019521678.tif 000024
【図８】
2019521678.tif 000025
【図９】
2019521678.tif 000026
【図１０】
2019521678.tif 000027
【配列表】
2019521678000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月6日(2019.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
その結果、下記の表７および図１０に示されたように、未処理対照群では、Ｐ．ａｃｎｅｓの生長率が約１５０％を示すのに対し、６Ｆ抗体または８Ｆ抗体を単独で添加した実験群でそれぞれ１２２．２％、１３０．８％のみを示すので、未処理対照群に比べて有意的な生長率減少効果を示すことができることを確認した。また、６Ｆ抗体および８Ｆ抗体を同時に処理した実験群では、０時間に比べてＰ．ａｃｎｅｓの生長率が８３．５％を示すので、１６．５％減少したレベルの生存率を示すことを確認して、６Ｆおよび８Ｆ抗体を同時に処理することを通じてＰ．ａｃｎｅｓの生長抑制の相乗効果が得られて、有意的ににきび菌を死滅する効果を示すことができることを確認した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ：Ｐ．ａｃｎｅｓ）に特異的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体：
（ａ）配列番号１で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｂ）配列番号７で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号８で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１０で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１２で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（ｃ）配列番号１３で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号１８で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（ｄ）配列番号１９で表される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０で表される重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２１で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ２および配列番号２４で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体は、下記（ａ）〜（ｄ）よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体：
（ａ）配列番号２５で表される重鎖可変領域および配列番号２６で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｂ）配列番号２７で表される重鎖可変領域および配列番号２８で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｃ）配列番号２９で表される重鎖可変領域および配列番号３０で表される軽鎖可変領域を含む抗体；
（ｄ）配列番号３１で表される重鎖可変領域および配列番号３２で表される軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体は、ヒト抗体であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を暗号化するポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターで形質転換される、形質転換体。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または改善用化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を有効成分として含む、にきびに対する予防または治療用薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体をにきびに対する予防または改善用化粧料組成物に使用するための用途。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含むにきびに対する予防または治療用薬学的組成物の用途。
【国際調査報告】
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