(57)【要約】  血清アルブミンと特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）、血清アルブミン特異的ＦＮ３ドメインをコードする能力を有する関連ポリヌクレオチド、ＦＮ３ドメインを発現する細胞、ならびに関連ベクター、検出可能に標識されたＦＮ３ドメイン、および異種部分に融合したＦＮ３ドメインは、診断および治療上の用途において、分子の半減期を延長するのに有用である。
2019521662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、前記ＦＮ３ドメインが、ヒト血清アルブミンのドメインＩまたはＩＩＩに特異的に結合し、前記ＦＮ３ドメインの血清半減期が、配列番号６７のアミノ酸配列を有するＴｅｎｃｏｎ２５タンパク質の血清半減期よりも少なくとも１０倍高い、単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項２】
カニクイザル血清アルブミンと交差反応する、請求項１に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項３】
ａ．配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列もしくは配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７アミノ酸配列に基づき、配列番号１の前記アミノ酸配列もしくは配列番号４の前記アミノ酸配列が、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、および／もしくは８６において置換を任意選択的に有する、または
ｂ．配列番号２、３、５、６、７、もしくは８のアミノ酸配列を含むライブラリーから単離された、
請求項１に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項４】
配列番号１のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列と比較して、Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、および／またはＦＧループ内に修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項５】
配列番号５１のアミノ酸配列と９０％同一である、または配列番号５５のアミノ酸配列と比較したとき、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４個の置換を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項６】
配列番号５１〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項７】
前記ＦＮ３ドメインの血清半減期が、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ２５アミノ酸配列を含むタンパク質の血清半減期よりも少なくとも１０倍高い、請求項４から６のいずれか一項に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項８】
前記ＦＮ３ドメインの血清半減期が、カニクイザルにおいて少なくとも約２５時間である、請求項４から７のいずれか一項に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項１２】
ＦＮ３ドメインを産生する方法であって、請求項１１に記載の単離された宿主細胞を、前記ＦＮ３ドメインが発現するような条件下で培養すること、および前記ＦＮ３ドメインを精製することを含む、方法。
【請求項１３】
請求項１から８のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
生体サンプル中のヒト血清アルブミンの存在を検出する方法であって、前記生体サンプルを、請求項１から８のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインと接触させること、および前記生体サンプルと前記ＦＮ３ドメインとの結合を評価することを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを含む、キット。
【請求項１６】
第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む単離された二重特異性ＦＮ３分子であって、前記第１のＦＮ３ドメインが、請求項１から８のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインと結合し、それを含み、前記第２のＦＮ３ドメインが、ヒト血清アルブミン以外の標的タンパク質と結合する、単離された二重特異性ＦＮ３分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、本明細書に、その全体が参照により組み込まれている。２０１７年５月３１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、ＪＢＩ５０８９ＷＯＰＣＴ．ｔｘｔであり、そのサイズは４９，２２８バイトである。
【０００２】
技術分野
本発明は、血清アルブミンに特異的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに関する。そのようなＦＮ３ドメインは、例えば、それにコンジュゲートしている薬物またはタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期を延長するのに利用され得る。そのような分子の製造方法およびそれらを含む医薬組成物も提供される。
【０００３】
背景
生物学的治療用分子が血流から急速に除去されると、このような分子の臨床的有効性を限定的にする原因となり得、またはより高頻度での患者への投薬をもたらし得る。一般的に生ずる除去方式の１つとして、糸球体濾過に起因する腎クリアランスが挙げられる。腎臓濾過速度は５０，０００ダルトンより大きい分子量を有する分子では大幅に低減するので、この除去経路は、より小型の生物学的製剤と最も関連性が高い（Kontermann, Curr Opin Biotechnol 2011）。いくつかの承認された生物学的治療用薬物は、それ自体が濾過限界を下回り、したがって迅速に排除される活性な部分を含有する。この限界を克服するために、治療用分子サイズを有効に増加させて腎臓濾過を低減させるいくつかの技術が導入されている。
【０００４】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を付加する治療用タンパク質の修飾が、タンパク質の流体力学的半径を増加させ、糸球体濾過を低減させるのに有効な手段であることが示されている。ＨＳＡは、ＦｃＲｎのリサイクリングに起因するｉｎ  ｖｉｖｏでの長期半減期を示し、ＨＳＡは約４０ｇ／Ｌの濃度を有し、血液中に見出される最も豊富なタンパク質である。ＦｃＲｎのリサイクリングは、ヒトでは約１９日間の長期半減期をもたらす。さらに、生体分布試験より、アルブミンは、身体内において、標的とする疾患にとって重要なエリア、例えば炎症性の関節または腫瘍に分布する可能性があることが示唆される（Wunder, Muller-Ladner, Stelzer, Funk, Neumann, Stehle, Pap, Sinn, Gay and Fiehn, J Immunol 170: 4793-4801 2003）。したがって、いくつかのタンパク質を、ＨＳＡとのＣ末端またはＮ末端融合体として産生させることにより、そのようなタンパク質の血清半減期が増加した。融合に成功したものとして、とりわけ、インターフェロンアルファ（Flisiak and Flisiak, Expert Opin Biol Ther 10: 1509-1515 2010）、ヒト成長ホルモン（Osborn, Sekut, Corcoran, Poortman, Sturm, Chen, Mather, Lin and Parry, Eur J Pharmacol 456: 149-158 2002）、腫瘍壊死因子（Muller, Schneider, Pfizenmaier and Wajant, Biochem Biophys Res Commun 396: 793-799 2010）、凝固因子ＩＸ（Metzner, Weimer, Kronthaler, Lang and Schulte, Thromb Haemost 102: 634-644 2009）、凝固因子ＶＩＩａ（Schulte, Thromb Res 122 Suppl 4: S14-19 2008）、インスリン（Duttaroy, Kanakaraj, Osborn, Schneider, Pickeral, Chen, Zhang, Kaithamana, Singh, Schulingkamp, Crossan, Bock, Kaufman, Reavey, Carey-Barber, Krishnan, Garcia, Murphy, Siskind, McLean, Cheng, Ruben, Birse and Blondel, Diabetes 54: 251-258 2005）、ウロキナーゼ（Breton, Pezzi, Molinari, Bonomini, Lansen, Gonzalez De Buitrago and Prieto, Eur J Biochem 231: 563-569 1995）、ヒルジン（Sheffield, Smith, Syed and Bhakta, Blood Coagul Fibrinolysis 12: 433-443 2001）、および二重特異性抗体断片（Muller, Karle, Meissburger, Hofig, Stork and Kontermann, J Biol Chem 282: 12650-12660 2007）が挙げられる。ＨＳＡ融合タンパク質は、長い血清半減期を有し得るが、ただしそのような融合タンパク質の大スケール製造は、真核生物発現系に限定される。さらに、ＨＳＡはサイズが大きいので、立体障害に起因する治療薬の活性喪失を引き起こし得る。
【０００５】
アルブミンの長い血清半減期の利益を享受する代替的方法として、血液中の血清アルブミンに結合するペプチドまたはタンパク質ドメインとの融合体として治療用タンパク質を作り出すことが挙げられる。このような分子は、様々な親和性でアルブミンに結合するように選択可能であり、融合タンパク質がアルブミンと結合し、そして定義されたｉｎ  ｖｉｖｏでの速度および滞留時間でそれから放出するのを可能にする。例えば、異なる種のアルブミンに結合する一連のシステインコンストレインドペプチド（cysteine-constrained peptide）を選択するのに、ファージディスプレーが使用された。このペプチドとの融合体としてＦａｂ抗体断片を発現させると、マウスおよびウサギにおけるＦａｂの血清半減期が有意に増加した（Dennis, Zhang,  Meng, Kadkhodayan, Kirchhofer, Combs and Damico, J Biol Chem 277: 35035-35043 2002）（米国特許出願公開第２００４０２５３２４７号明細書）。後続する試験より、このペプチドを抗体断片と融合させると、同じ抗原を標的とするＦａｂおよびｍＡｂ分子と比較して、腫瘍蓄積ピークがより良好となり、また腫瘍分布がより均質となることを示した（Dennis, Jin, Dugger, Yang, McFarland, Ogasawara, Williams, Cole, Ross and Schwall, Cancer Res 67: 254-261 2007）（米国特許出願公開第２００５０２８７１５３号明細書）。アルブミンと特異的に結合するいくつかの抗体断片が、同様に選択されている。ＨＳＡと結合するラクダ類ＶＨＨ抗体断片（ナノボディー）を、ＴＮＦ−アルファと結合する別のナノボディーに融合させた。この分子の血清半減期は、マウスにおいて５４分から２．２日に延長し、そして関節リウマチのマウスモデルにおいて炎症性の関節への蓄積および有効性を示した（Coppieters, Dreier, Silence, de Haard, Lauwereys, Casteels, Beirnaert, Jonckheere, Van de Wiele, Staelens, Hostens, Revets, Remaut, Elewaut and Rottiers, Arthritis Rheum 54: 1856-1866 2006）。同じアルブミン結合性ナノボディーを、抗ＥＧＦＲナノボディーに融合させたが、その結果、異種移植モデルにおいて半減期が増加し、腫瘍蓄積の良化をもたらした（Tijink, Laeremans, Budde, Stigter-van Walsum, Dreier, de Haard, Leemans and van Dongen, Mol Cancer Ther 7: 2288-2297 2008）。同様に、アルブミンに結合する抗アルブミンドメイン抗体（ｄＡｂ）が生成された。このようなｄＡｂｓをインターロイキン−１受容体と融合させると、ラットにおいて半減期が２分から４．３時間に増加した（Holt, Basran, Jones, Chorlton,  Jespers, Brewis and Tomlinson, Protein Eng Des Sel 21: 283-288 2008）。また、この技術は、インターフェロンアルファ２ｂとの融合にも適用された（Walker, Dunlevy, Rycroft, Topley, Holt, Herbert, Davies, Cook, Holmes, Jespers and Herring, Protein Eng Des Sel 23: 271-278 2010）。同様の方式で、アルブミンに対して親和性を有する細菌由来の天然アルブミン結合ドメインが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を延長するために検討された（Anderson et al. 2011, Orlova et al., 2013, Malm et al., 2014）。Ｊａｃｏｂｓらは、コンセンサス設計された（consensus designed）アルブミン結合ドメインについて最近記載し、アルブミンに対する親和性に基づき血清曝露プロファイルを調節することについて、その可能性を実証した（Jacobs, Gibbs, Conk, Yi, Maguire, Kane, O’Neil, Protein Eng Des Sel 10:385-93, 2015）。研究ツールとして、それらの有用性は実証されているにもかかわらず、治療用途での、そのような細菌由来のドメインの有用性は、それらが免疫原性を有する可能性、および生じた抗体による薬物排出により限定される可能性がある。
【０００６】
したがって、治療薬の血清半減期を増加可能であり、望ましい生物物理学的特性（例えば、実質的に単量体で、十分に折り畳まれた状態等）を保持可能であり、コスト的に有効な方式で製造可能であり、および組織透過を可能にするのに十分小型である血清アルブミン結合分子が必要とされている。
【０００７】
概要
本発明は、血清アルブミン結合フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを含む。また、提示されたＦＮ３ドメインをコードする能力を有する関連ポリヌクレオチド、提示されたＦＮ３ドメインを発現する細胞、ならびに関連ベクターについても記載されている。さらに、提示されたＦＮ３ドメインを使用する方法について記載されている。例えば、アルブミンの血清半減期が長いことを踏まえれば、アルブミン結合ペプチドは、血清半減期が長い治療用タンパク質の構築において理想的な融合パートナーとなる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、単離されたＦＮ３ドメインを含み、該ＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミンのドメインＩまたはＩＩＩと結合し、ＦＮ３ドメインの血清半減期は、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ配列の血清半減期よりも少なくとも１０倍長い。他の実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミンおよびカニクイザル血清アルブミンと結合する。なおも他の実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づく。さらなる実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づく。いくつかの実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号１または配列番号４に基づき、任意選択的に、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、および／または８６に置換を有する。いくつかの実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号２、３、５、６、７、または８の配列を含むライブラリーから単離される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列と比較して、Ｃ、ＣＤ、Ｆ、およびＦＧループ内に修飾されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号５１〜５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、カニクイザルにおいて少なくとも約２５時間の血清半減期を有する。
【００１０】
記載されているアルブミン特異的ＦＮ３ドメインに加えて、記載されている抗体および抗原結合断片をコードする能力を有するポリヌクレオチド配列も提供される。本明細書のアルブミン特異的ＦＮ３ドメインを発現する細胞と同様に、記載されているポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。開示されるベクターを発現する能力を有する細胞についても記載されている。このような細胞は、哺乳動物細胞（例えば２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えばＳｆ７細胞）、酵母菌細胞、植物細胞、または細菌細胞（例えば大腸菌（E. coli））であり得る。記載されているＦＮ３ドメインの製造方法も提供される。
【００１１】
本発明は、記載されているアルブミン特異的ＦＮ３ドメインを様々な分子に融合させ、または、さもなければ会合させてそのような分子の半減期を延長する方法も含む。例えば、血清アルブミンの血清半減期は長期化していることから、血清アルブミンは、血清半減期が長い治療用タンパク質を構築するための理想的な融合パートナーとなる。したがって、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、治療用薬物の半減期を延長するのに有用である。
【００１２】
一実施形態では、アルブミン特異的ＦＮ３ドメインを含む医薬組成物は、治療パートナーのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期を改善するために投与される。そのような半減期の延長は、例えば、アルブミン結合ＦＮ３ドメインの薬物動態を監視することを含む、当技術分野において公知の様々な方法によりアッセイ可能である。このような方法のための特異的アッセイが実施例で提示される。
【００１３】
本発明の範囲に含まれるものとして、開示されるアルブミン特異的（結合性）ＦＮ３ドメインを含むキットが挙げられる。該キットは、本明細書に提示するアルブミン特異的ＦＮ３ドメインを使用する方法、または当業者にとって公知のその他の方法を実施するのに使用され得る。いくつかの実施形態では、記載されているキットは、本明細書に記載するＦＮ３ドメイン、および生体サンプル中のヒト血清アルブミンの存在を検出する際に使用される試薬を含み得る。記載されているキットは、本明細書に記載するＦＮ３ドメインのうちの１つまたは複数、ならびに本明細書に記載するような、未使用時にＦＮ３ドメインを収納する容器、固体支持体に固定されたＦＮ３ドメインおよび／またはＦＮ３ドメインの検出可能に標識された形態の使用説明書を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アルブミン結合ＦＮ３ドメインを使用する、カニクイザルおよびヒト血清からの内因性アルブミンの間接的プルダウンを示す図である。アルブミンのドメイン１に結合するＦＮ３ドメインを点線四角で示す；アルブミンのドメイン３に結合するＦＮ３ドメインを実線四角で示す。すべての構築物は、１つのヌルＦＮ３ドメイン（ＴＣ２５）および１つのアルブミン結合ＦＮ３ドメインを用いた二重特異性遺伝子融合として調製される。＊ＡＢＤは、アルブミン結合ドメインを表す（J.T. Andersen, R. Pehrson, V. Tolmachev, M.B. Daba, L. Abrahmsen, C. Ekblad, J. Biol. Chem. 286:5234-5241 2011を参照）。
【図２】１ｍｇ／ｋｇ（Ｈ９）または２ｍｇ／ｋｇ（ＡＬＢ１８、またはＡＬＢ３３）をＩＶで単回投与した後の、カニクイザルにおけるアルブミン結合ＦＮ３ドメインの薬物動態プロファイルを示す図である。
【００１５】
実施形態の詳細な記述
定義
本記載の態様に関係する様々な用語が、本明細書および特許請求の範囲全体を通じて使用される。そのような用語は、別途明示しない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。他の特に定義された用語は、本明細書に提示する定義と整合するように解釈される。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」には、記載内容が別途明確に定義しない限り複数形の指示物が含まれる。したがって、例えば「細胞（a cell）」という場合、２つ以上の細胞の組合せ等が含まれる。
【００１７】
用語「約」は、本明細書で使用する場合、測定可能な数値、例えば量、時間等を指すとき、所定の数値から最大±１０％の変動を包含するように意図されており、したがって変動は開示される方法を実施するのに適する。別途明示しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、特性を表すすべての数字、例えば分子量、反応条件等は、すべての事例において、用語「約」により修飾されるものと理解される。したがって、そうでないと明示しない限り、下記の明細書および添付の特許請求の範囲に記載する数値パラメーターは、本発明により取得されるように追及される所望の特性に依存して変化し得る近似値である。最低限度において、また特許請求の範囲に対する同等物の原則の適用に制限を加えるつもりもなく、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らし、および通常の丸め技法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００１８】
本発明の幅広い範囲を定める数値範囲およびパラメーターは近似であるものの、具体的な実施例において記載される数値は、できる限り正確に報告されている。ただし、任意の数値は、それらのそれぞれの試験測定に見出される標準偏差に必然的に起因する一定の誤差を本質的に含有する。
【００１９】
「単離された」とは、成分が自然に生ずる生物の他の生体成分、すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離した、それらとは区別して産生された、またはそれらを取り除いて精製された生体成分（例えば核酸、ペプチド、またはタンパク質）を意味する。「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質には、したがって、標準精製法により精製された核酸およびタンパク質が含まれる。「単離された」核酸、ペプチド、およびタンパク質は、組成物の一部であり得、そのような組成物が、核酸、ペプチド、またはタンパク質の本来の環境の一部でなくても、なおも単離され得る。該用語は、宿主細胞内での組換え発現により調製された核酸、ペプチド、およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。「単離された」ＦＮ３ドメインは、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有するその他のＦＮ３ドメインを実質的に含まないＦＮ３ドメインを指すように意図されている（例えば、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミン以外の抗原と特異的に結合するＦＮ３ドメインを実質的に含まない）。ヒト血清アルブミンのエピトープ、アイソフォーム、またはバリアントに特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、ただし、例えばその他の種に由来するその他の関連抗原（例えば、血清アルブミンの種間相同体）と交差反応性を有してもよい。
【００２０】
用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）とは、本明細書で使用する場合、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内の細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、および原核生物の酵素を含むタンパク質において高頻度で生ずるドメインを意味する（Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990）。例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５の異なるＦＮ３ドメインであり、この１５の異なるＦＮ３ドメインは、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）、および例えば米国特許第８，２７８，４１９号明細書に記載されている非天然の合成ＦＮ３ドメイン中に存在する。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質の名称により、例えば、テネイシンの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、またはフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）のように命名される。
【００２１】
用語「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、本明細書で使用する場合、約１×１０−６Ｍ以下、例えば、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、約１×１０−１０Ｍ以下、約１×１０−１１Ｍ以下、約１×１０−１２Ｍ以下、または約１×１０−１３Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、事前に決定された抗原に結合する本発明のＦＮ３ドメインの能力を意味する。典型的には、記載されているＦＮ３ドメインは、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を使用する表面プラズモン共鳴法により測定されるように、非特異的抗原（例えば、カゼイン）に対するそのＫＤよりも少なくとも１／１０未満であるＫＤで、事前に決定された抗原（すなわち、ヒト血清アルブミン）と結合する。ヒト血清アルブミンと特異的に結合する、記載されているＦＮ３ドメインは、ただしその他の関連抗原、例えばその他の種、例えばマカク・ファシクラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイザル、ｃｙｎｏ）またはパン・トログロダイト（Pan troglodytes）（チンパンジー）に由来する、同一の事前に決定された抗原（相同体）との交差反応性を有してもよい。
【００２２】
「血清半減期」とは、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドの血清濃度が、例えば、天然の機構による配列もしくは化合物の分解、および／または配列もしくは化合物の排出もしくは隔離に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏで５０％低減するのに要する時間として一般的に定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期は、それ自体が公知である任意の方式、例えば薬物動態分析により決定可能である。好適な技術は、当業者にとって明白であり、また例えば、温血動物（すなわち、ヒト、または別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ、もしくは霊長類、例えば、マカク属（genus Macaca）（例えば、特に、カニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））および／またはアカゲザル（マカク・ムラッタ（Macaca mulatta）））、ならびにヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Papio ursinus））に由来するサル）に、好適な用量の本開示のアミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドを好適に投与し；前記動物から血液サンプルまたはその他のサンプルを収集し；前記血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列、化合物、もしくはポリペプチドのレベルまたは濃度を決定し；このようにして得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列、化合物、またはポリペプチドのレベルまたは濃度が、投薬時の初期のレベルと比較して５０％低減するまでの時間を計算するステップを一般的に含み得る。例えば、下記の実験パート、ならびに標準ハンドブック、例えばKenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)等を参照されたい。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982)も参照されたい。
【００２３】
当業者にとってやはり明白なように（例えば、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの６および７頁、ならびに同号で引用されたさらなる参考資料を参照）、半減期は、パラメーター、例えばｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して表すことができる。本明細書では、「半減期」とは、このようなパラメーターのうちの任意の１つ、例えばこのようなパラメーターのうちの任意の２つ、または本質的にこのようなパラメーターの３つすべての減少を意味する。
【００２４】
用語「薬物動態（pharmacokinetics）」または「薬物動態学的（pharmacokinetic）」は、その技術分野で受け入れられている意味に基づき使用され、身体内での薬物の作用、例えば薬物作用の効果および期間、薬物が身体により吸収、分配、代謝、および除去される速度等の試験を意味する。
【００２５】
用語「置換すること」もしくは「置換された」、または「変異すること」もしくは「変異した」とは、本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列内の１つもしくは複数のアミノ酸またはヌクレオチドを変化させ、削除し、または挿入して、当該配列のバリアントを生成することを意味する。
【００２６】
用語「ランダム化すること」もしくは「ランダム化」、または「多様化した」もしくは「多様化すること」とは、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列内に少なくとも１つの置換、挿入、または欠損を作出することを意味する。
【００２７】
「バリアント」とは、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の修飾、例えば置換、挿入、または欠損により、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。
【００２８】
用語「ライブラリー」とは、バリアントの集合を意味する。ライブラリーは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドバリアントから構成され得る。
【００２９】
「Ｔｅｎｃｏｎ」とは、本明細書で使用する場合、配列番号１に示す、および米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号明細書に記載されている配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを意味する。
【００３０】
「核酸分子」、「ヌクレオチド」、または「核酸」と同義的に呼ばれる「ポリヌクレオチド」とは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、非修飾型のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾型のＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより一般的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三重鎖領域を意味する。ポリヌクレオチドという用語には、１つもしくは複数の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性またはその他の理由により修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含まれる。「修飾された」塩基として、例えば、トリチル化された塩基およびまれな塩基、例えばイノシンが挙げられる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに加えることができ；したがって、「ポリヌクレオチド」は、一般的に天然において見出されるような化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびにウイルスおよび細胞に特有の化学的形態のＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。また「ポリヌクレオチド」は、多くの場合オリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短い核酸の鎖も包含する。
【００３１】
「ベクター」は、レプリコン、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルスであり、その中に別の核酸セグメントが、該セグメントの複製または発現を引き起こすために作動可能に挿入され得る。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、任意の種類の細胞、例えば、初代細胞、培養中の細胞、または細胞株由来の細胞であり得る。特別な実施形態では、用語「宿主細胞」とは、核酸分子がトランスフェクトされた細胞、およびそのような細胞の子孫または潜在的子孫を意味する。そのような細胞の子孫は、例えば、後継世代において生ずる可能性がある変異もしくは環境影響、または宿主細胞ゲノム内への核酸分子の組み込みに起因して、核酸分子がトランスフェクトされた親細胞と同一でない可能性がある。用語「発現」および「産生」は、本明細書では同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を指す。このような用語は、ＲＮＡへの遺伝子の転写を包含する。またこのような用語は、１つまたは複数のポリペプチドへのＲＮＡの翻訳も包含し、またあらゆる天然の転写後および翻訳後修飾をさらに包含する。抗体またはその抗原結合断片の発現または産生は、細胞の細胞質内、または細胞外環境、例えば細胞培養の増殖培地内であり得る。「実質的に同一」の意味は、該用語が使用される文脈に応じて異なる可能性がある。天然に生ずる配列変動が重鎖および軽鎖ならびにそれらをコードする遺伝子において存在する可能性があるので、本明細書に記載するアミノ酸配列または抗体もしくは抗原結合断片をコードする遺伝子において、それらの固有の結合特性（例えば、特異性および親和性）にほとんどまたはまったく影響を与えることのない、あるレベルの変動が見出されるものと予想される。そのような予想は、遺伝子コードの縮重、ならびに保存的なアミノ酸配列変動の進化的奏功に一部起因し、これらはコードされたタンパク質の性質を目立つ程に変化させることはない。
【００３３】
開示されるＦＮ３ドメインの概要
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン−Ｃに由来する１５のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、非天然型のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012;米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号明細書）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインに特徴的である７つのベータ−ストランド、すなわちＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと呼ばれるベータ−ストランドを結びつける６つの表面露出型ループを示し、該ループはＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、およびＦＧループと呼ばれる（Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992;米国特許第６，６７３，９０１号明細書）。このようなループまたは各ループ内の選択された残基は、血清アルブミンと結合する新規分子を選択するのに使用され得るフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化され得る。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）内の各ループおよびベータ−ストランドの位置および配列を示す。
【００３４】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づき設計されたライブラリーは、したがってランダム化したＦＧループ、またはランダム化したＢＣおよびＦＧループ、例えば以下に記載するようなライブラリーＴＣＬ１またはＴＣＬ２を有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ  ＢＣループは長さが７アミノ酸であり、したがって１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸が、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づき設計された、ＢＣループにおいて多様化しているライブラリー内でランダム化され得る。Ｔｅｎｃｏｎ  ＦＧループは長さが７アミノ酸であり、したがって１、２、３、４、５、６、または７個のアミノ酸が、ＦＧループにおいて多様化している、およびＴｅｎｃｏｎ配列に基づき設計されたライブラリー内でランダム化され得る。Ｔｅｎｃｏｎライブラリー内のループにおけるさらなる多様性は、ループでの残基の挿入および／または欠損により達成され得る。例えば、ＦＧループおよび／またはＢＣループは、アミノ酸１〜２２個分延長され得る、またはアミノ酸１〜３個分減少し得る。Ｔｅｎｃｏｎ内のＦＧループは長さが７アミノ酸であり、抗体重鎖内の対応するループは４〜２８残基の範囲である。多様性を最大にするために、長さの範囲が４〜２８残基の抗体ＣＤＲ３に対応するように、ＦＧループを配列ならびに長さにおいて多様化させることができる。例えば、ＦＧループは、１、２、３、４、または５個の追加のアミノ酸によりループを延長することで、長さにおいてさらに多様化可能である。
【００３５】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づき設計されたライブラリーは、ＦＮ３ドメインの側面に形成され、そして２個以上のベータストランド、および少なくとも１つのループを含むランダム化された代替表面も有し得る。１つのそのような代替表面は、ＣおよびＦのベータ−ストランドならびにＣＤおよびＦＧのループ内のアミノ酸により形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。Ｔｅｎｃｏｎの代替的Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づくライブラリー設計は、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号明細書に記載されている。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づき設計されたライブラリーには、Ｔｅｎｃｏｎバリアント、例えば残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６（配列番号１に対応する残基ナンバリング）に置換を有するＴｅｎｃｏｎバリアント、およびどのバリアントが熱安定性の改善を示すかに基づき設計されたライブラリーも含まれる。例示的なＴｅｎｃｏｎバリアントが、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号明細書に記載されており、配列番号１のＴｅｎｃｏｎと比較したとき、置換Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、およびＥ８６Ｉを有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号４）を含む。
【００３６】
【表１】
2019521662.tif 000003
【００３７】
Ｔｅｎｃｏｎおよびその他のＦＮ３配列に基づくライブラリーは、ランダムな、または定義された一連のアミノ酸を使用して、選択した残基位置においてランダム化され得る。例えば、ランダムな置換を有するライブラリー内のバリアントは、２０種類すべての天然アミノ酸をコードするＮＮＫコドンを使用して生成され得る。他の多様化スキームでは、ＤＶＫコドンが、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、およびＣｙｓをコードするのに使用され得る。あるいは、ＮＮＳコドンは、２０種類すべてのアミノ酸残基を生じさせ、同時に終止コドンの頻度を低減させるのに使用され得る。多様化される位置においてアミノ酸分布が偏っているＦＮ３ドメインのライブラリーが、例えば、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（http:_//www_sloning_com）を使用して合成され得る。この技術は、数千もの遺伝子合成プロセスにとって十分なユニバーサル構成ブロックとして作用する既製の二本鎖トリプレットのライブラリーを使用する。トリプレットライブラリーは、任意の所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、考えられ得るすべての配列の組合せを代表する。コドンの名称は、周知のＩＵＢコードに基づく。
【００３８】
スキャフォールドタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片にライゲートして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳後に形成されたタンパク質−ＤＮＡ複合体（この場合、各タンパク質は、該タンパク質をコードするＤＮＡと安定的に会合している）のプールを生成するために、ｃｉｓディスプレーを使用して、ＦＮ３ライブラリー、例えばＴｅｎｃｏｎライブラリーを生成すること（米国特許第７，８４２，４７６号明細書；Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004）、および当技術分野において公知であり、また実施例に記載する任意の方法により該ライブラリーをヒト血清アルブミンとの特異的結合についてアッセイすることにより、本明細書に記載する、ヒト血清アルブミンと特異的に結合するＦＮ３ドメインが単離され得る。使用可能である例示的な周知の方法としては、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ法、ならびに競合的および非競合的アッセイ法がある（例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照）。ヒト血清アルブミンに特異的に結合する、同定されたＦＮ３ドメインは、所望の特徴に基づきさらに特徴づけられる。
【００３９】
本明細書に記載する、ヒト血清アルブミンと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、テンプレートとして任意のＮ３ドメインを使用してライブラリーを生成し、該ライブラリーを本文書内で提供される方法を使用してヒト血清アルブミンと特異的に結合する分子についてスクリーニングして、生成され得る。使用され得る例示的なＦＮ３ドメインは、テネイシンＣの第３のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号６８）、フィブコン（Fibcon）（配列番号６９１４６）、およびフィブロネクチンの第１０のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号７０）である。標準的なクローニングおよび発現技術が、ライブラリーをベクター中にクローン化して、またはライブラリーの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成して、ライブラリーをｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現もしくは翻訳するのに使用される。例えば、リボソームディスプレー（Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997）、ｍＲＮＡディスプレー（Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997）、またはその他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号明細書）が使用可能である。ＦＮ３ドメインバリアントのライブラリーが、例えば、任意の適するバクテリオファージの表面に提示される融合タンパク質として発現され得る。バクテリオファージの表面に融合ポリペプチドを提示する方法は周知されている（米国特許出願公開第２０１１／０１１８１４４号明細書；国際公開第２００９／０８５４６２号パンフレット；米国特許第６，９６９，１０８号明細書；同第６，１７２，１９７号明細書；同第５，２２３，４０９号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，４７２，１４７号明細書）。
【００４０】
本明細書に記載するいくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列、または配列番号４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づき、配列番号１または配列番号４は、任意選択的に、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、および／または８６に置換を有する。
【００４１】
本開示のヒト血清アルブミンと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、それらの特性を改善する、例えば熱安定性、および熱フォールディングとアンフォールディングとの可逆性を改善するために修飾され得る。高度に耐熱性の類似した配列との比較に基づく合理的な設計、ジスルフィド架橋を安定化させる設計、アルファ−ヘリックスの性質を増大する変異、塩橋のエンジニアリング、タンパク質の表面電荷の変更、指向性進化、およびコンセンサス配列の構成を含むいくつかの方法が、タンパク質および酵素の見かけの熱安定性を増加させるのに適用されてきた（Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001）。高温での安定性は、発現タンパク質の収率を増大し、溶解度または活性を改善し、免疫原性を減少させ、および製造におけるコールドチェーンの必要性を最低限にする可能性がある。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を改善するために置換され得る残基は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、または８６であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号明細書に記載されている。このような残基に対応する置換は、本発明の分子を含有するＦＮ３ドメインに組み込まれ得る。
【００４２】
タンパク質の安定性およびタンパク質の易変性を測定すれば、タンパク質の完全性について、その同一の側面または異なる側面が見えてくる。タンパク質は、熱、紫外線または電離照射を原因とする変性、液体溶液中では周囲の浸透圧およびｐＨの変化、微細ポアサイズ濾過により引き起こされた機械的剪断力、紫外線照射、ガンマ線照射等による電離照射、化学的脱水もしくは加熱脱水、またはタンパク質の構造破壊の原因となり得る任意の他の作用もしくは力に対して感受性が高い、または「不安定」である。分子の安定性は、標準的な方法を使用して決定可能である。例えば、分子の安定性は、標準的な方法を使用して、熱融解（「Ｔｍ」）温度、分子の半分が折り畳まれていない状態となるセルシウス（℃）で表される温度を測定することにより決定可能である。一般的に、Ｔｍが高いほど、分子の安定性が高まる。熱に付加して、化学的環境もまた特定の３次元構造を維持するタンパク質の能力を変化させる。
【００４３】
一実施形態では、本開示のヒト血清アルブミンと特異的に結合するＦＮ３ドメインは、Ｔｍの増加により測定したとき、エンジニアリング前の同一のドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％以上増大した安定性を示し得る。
【００４４】
化学的変性は、様々な方法により同様に測定可能である。化学的変性剤として、グアニジニウム塩酸塩、グアニジニウムチオシアン酸塩、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）；還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ベータ−メルカプトエタノール、ジニトロチオベンゼン、および水素化物、例えば水素化ホウ素ナトリウム）、非イオン性およびイオン性界面活性剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、および標的型変性剤が挙げられる。変性度の定量は、機能的特性、例えば標的分子と結合する能力の喪失、または物理化学的特性、例えば凝集傾向、今まで溶媒が接近不可能な残基の露出、またはジスルフィド結合の破壊もしくは形成に立脚することができる。
【００４５】
本開示のＦＮ３ドメインは、単量体、二量体、または多量体として、例えば標的分子結合の結合価、したがってアビディティーを増加させる手段、または２つ以上の異なる標的分子と同時に結合する二重もしくは多重特異性スキャフォールドを生成する手段として生成され得る。二量体および多量体は、例えば、アミノ酸リンカー、例えば、ポリ−グリシン、グリシンおよびセリン、またはアラニンおよびプロリンを含有するリンカーの組入れにより、単一特異性、二重または多重特異性タンパク質スキャフォールドを連結させることにより生成され得る。例示的なリンカーとして、（ＧＳ）２、（配列番号５４）、（ＧＧＧＳ）２（配列番号５５）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号５６）、（ＡＰ）２（配列番号５７）、（ＡＰ）５（配列番号５８）、（ＡＰ）１０（配列番号５９）、（ＡＰ）２０（配列番号６０）、およびＡ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号６１）が挙げられる。二量体および多量体は、ＮからＣ方向で相互に連結し得る。天然ならびに人工ペプチドリンカーを使用してポリペプチドを結びつけ、新規連結型融合ポリペプチドにすることは、文献で周知されている（Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996;米国特許第５，８５６，４５６号明細書）。
【００４６】
ヒト血清アルブミン結合体
ＦＮ３ドメインは、それらのサイズが約１０ｋＤａと小さいことに起因する腎臓濾過、および分解により循環から急速に排出される。ある特定の側面では、本開示は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と特異的に結合してＦＮ３ドメインの半減期を延ばすＦＮ３ドメインを提供する。
【００４７】
記載されているアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミンのドメインＩまたはＩＩＩに結合し、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ配列の血清半減期と比較して、それより少なくとも１０倍より高い血清半減期を有し、これによりそれとコンジュゲートした薬物またはタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの血清半減期を延長する効率的な手段を提供する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号６２のヒト血清アルブミンのドメインＩに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号６２のヒト血清アルブミンのドメインＩＩＩに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、アルブミン特異的抗体は、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ配列の血清半減期と比較して、それより少なくとも１０倍より高い血清半減期を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインは、配列番号６３のマカク・ファシクラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイザル）の血清アルブミンと交差反応する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミン結合ＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端に連結したイニシエータメチオニン（Ｍｅｔ）を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミン結合ＦＮ３ドメインは、ＦＮ３ドメインのＣ末端に連結したシステイン（Ｃｙｓ）を含む。
【００５２】
Ｎ末端Ｍｅｔおよび／またはＣ末端Ｃｙｓの付加は、半減期延長分子の発現および／またはコンジュゲーションを促進する可能性がある。
【００５３】
いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１、５２、または５３のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１のアミノ酸配列と比較したときに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンと特異的に結合する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６１に対応する少なくとも１つの残基位置、またはＣ末端にシステイン残基を含む。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号５１〜５３に記載する配列を含み得るが、その場合、Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、およびＦＧループは、記載されているアルブミン特異的ＦＮ３ドメイン配列のいずれかに由来する特定のＣストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、およびＦＧループのそれぞれのセット（すなわち、配列番号５１〜５３）、または４コアＦＮ３ドメイン配列のＣストランド、ＣＤループ、Ｆストランド、およびＦＧループ配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列と置き換える。
【００５８】
いくつかの実施形態では、単離されたアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号５１に記載する配列を含む。このアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミンのドメインＩまたはＩＩＩと結合し得る。このアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ配列の血清半減期と比較して、少なくとも１０倍より高い血清半減期を有し得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、単離されたアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号５２に記載する配列を含む。このアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミンのドメインＩまたはＩＩＩと結合し得る。このアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ配列の血清半減期と比較して、少なくとも１０倍より高い血清半減期を有し得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、単離されたアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号５３に記載する配列を含む。このアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、ヒト血清アルブミンのドメインＩまたはＩＩＩと結合し得る。このアルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号６７のＴｅｎｃｏｎ配列の血清半減期と比較して、少なくとも１０倍より高い血清半減期を有し得る。
【００６１】
ヒト血清アルブミン特異的ＦＮ３ドメインの融合
本開示の１つの態様は、血清アルブミン結合ＦＮ３ドメインおよび少なくとも１つの追加部分を含むコンジュゲートを提供する。追加部分は、あらゆる診断上、画像化上、または治療上の目的に有用であり得る。
【００６２】
ある特定の実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインに融合した部分の血清半減期は、ＦＮ３ドメインにコンジュゲートしていないときの該部分の血清半減期と比較して、それより増加している。ある特定の実施形態では、ＦＮ３ドメイン融合体の血清半減期は、記載されているＦＮ３ドメインと融合していないときの該部分の血清半減期と比較して、それより少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００、または３０００％より長い。他の実施形態では、ＦＮ３ドメイン融合体の血清半減期は、記載されているＦＮ３ドメインと融合していないときの該部分の血清半減期を、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍上回る。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメイン融合体の血清半減期は、カニクイザルでは少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、または４０時間である。
【００６３】
したがって、本明細書にも記載されている、記載されているＦＮ３ドメイン融合分子は、治療部分と記載されているＦＮ３ドメインとの間の融合を形成することにより、該治療部分の半減期を増加させるのに有用である。そのような融合分子は、融合体に含有される治療部分の生物学的活性に応答する状態を治療するのに使用され得る。本開示は、下記のタンパク質または分子のいずれかの異常調節により引き起こされた疾患での、記載されているＦＮ３ドメイン融合分子の使用について検討する。
【００６４】
異種部分
いくつかの実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインは、低有機分子、核酸、またはタンパク質である第２の部分に融合している。いくつかの実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインは、受容体、受容体リガンド、ウイルス外被タンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原、または細胞シグナル伝達タンパク質を標的とする治療部分に融合している。融合体は、第２の部分を、記載されているＦＮ３ドメインのいずれかの端部に、すなわち、ＦＮ３ドメイン−治療分子、または治療分子−ＦＮ３ドメインの配置で結合させることにより形成され得る。
【００６５】
他の例示的な実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインは、１つまたは複数の追加のＦＮ３ドメインに融合している。例えば、記載されているＦＮ３ドメインは、１、２、３、４個以上の追加のＦＮ３ドメインに融合し得る。追加のＦＮ３ドメインは、同一の標的または血清アルブミン以外の異なる標的と結合し得る。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本出願は、式：ＦＮ３−Ｘ  Ｙ、またはＹ−Ｘ  ＦＮ３（式中、ＦＮ３は本明細書に記載するようなＦＮ３ドメインであり（任意のＮ末端および／またはＣ末端延長部分を含む）、Ｘｉはポリペプチドリンカーであり（適するリンカーとして、例えば、配列番号５４〜６１のうちのいずれか１つが挙げられる）、およびＹは本明細書に記載するような治療部分である）により表され得るＦＮ３−Ｙ融合体を提供する。
【００６７】
ある特定の実施形態では、本出願は、式：ＦＮ３−Ｘｉ−Ｃｙｓ−Ｘ２−Ｙ、またはＹ−Ｘｉ−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＦＮ３（式中、ＦＮ３は本明細書に記載するような単離されたＦＮ３ドメインであり（任意のＮ末端および／またはＣ末端延長部分を含む）、Ｘｉは任意選択的なポリペプチドリンカーであり（適するリンカーとして、例えば、配列番号５４〜６１のうちのいずれか１つが挙げられる）、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ２は化学的に誘導されたスペーサーであり、Ｙは本明細書に記載するような治療部分である）により表され得るＦＮ３−Ｙ融合体を提供する。例示的な実施形態では、化学的に誘導されたスペーサーは、本明細書でさらに記載されるマイケル付加反応により、治療部分を記載されているＦＮ３ドメインのＣ末端Ｃｙｓとコンジュゲートさせる、または記載されているＦＮ３ドメインを治療部分のＣ末端Ｃｙｓとコンジュゲートさせるのに使用され得るマレイミド部分を包含する。他の側面では、記載されているＦＮ３ドメインは、２つ以上の治療部分と結合し得る。例えば、２つの部分は、様々な配置で、例えば、融合配列のＮ末端からＣ末端へ、Ｘ−Ｙ−ＦＮ３、Ｘ−ＦＮ３−Ｙ、またはＦＮ３−Ｘ−Ｙで、記載されているＦＮ３ドメインと結合可能であり、ここで、ＸおよびＹは２つの異なる治療部分を表す。２つの異なる治療部分は、本明細書に開示の部分のいずれかから選択され得る。
【００６８】
結合ポリペプチドの脱免疫化（deimmunization）
血清アルブミン結合体およびそれらの融合体のアミノ酸配列は、１つもしくは複数のＢ細胞またはＴ細胞エピトープを取り除くために変更し得る。本明細書に記載されている、記載されているＦＮ３ドメイン融合体を含むタンパク質は、所与の種に対して免疫原性を有さない、または免疫原性がより少なくなるように脱免疫化され得る。脱免疫化は、タンパク質に構造的な変更を加えることにより達成され得る。当業者にとって公知の任意の脱免疫化技術が用いられ得、例えば、その開示が本明細書においてその全体が組み込まれている国際公開第００／３４３１７号パンフレットを参照のこと。
【００６９】
一実施形態では、血清アルブミン結合体およびそれらの融合体の配列は、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析可能である。例えば、sitewehil.wehi.edu.auの国際的なウェブ上で、「モチーフ」データベースを検索することにより、例えばＭＨＣ結合モチーフのデータベースと比較することができる。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは、計算スレッディング法、例えばＡｌｔｕｖｉａら（J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)）により考案されたものを使用して同定することができ、それによってポリペプチドに由来する連続した重複ペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質に対するそれらの結合エネルギーについて試験している。計算方式の結合予測アルゴリズムとして、ｉＴｏｐｅ（商標）、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ）、およびＭＨＣｐｒｅｄが挙げられる。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの同定を支援するために、提示に成功したペプチドと関連する関連配列特性、例えば両親媒性およびＲｏｔｈｂａｒｄモチーフ、ならびにカテプシンＢおよびその他のプロセシング酵素の切断部位について検索可能である。
【００７０】
潜在的な（例えば、ヒトの）Ｔ細胞エピトープを同定したら、Ｔ細胞エピトープを取り除く必要があることから、このようなエピトープは、次に１つまたは複数のアミノ酸の変更により取り除かれる。通常、これは、Ｔ細胞エピトープそのものの中の１つまたは複数のアミノ酸の変更を含む。これは、タンパク質の一次構造においてエピトープに隣接しているアミノ酸、または一次構造では隣接していないが、分子の二次構造において隣接しているアミノ酸の変更を含み得る。検討される通常の変更は、アミノ酸置換であるが、ある特定の状況では、アミノ酸の付加または欠損が適切であり得る。最終分子が例えば十分に確立された方法により組換え宿主からの発現により調製され得るように、すべての変更が組換えＤＮＡ技術により実現可能であるが、分子を変更するタンパク質化学または任意のその他の手段の使用も使用可能である。
【００７１】
同定されたＴ細胞エピトープが除去されたら、新たなＴ細胞エピトープが形成されなかったこと、およびＴ細胞エピトープが形成された場合には、該エピトープが除去可能であることを確実にするために、脱免疫化された配列が再度分析され得る。
【００７２】
計算上同定されたすべてのＴ細胞エピトープが除去される必要はない。当業者であれば、特定のエピトープの「強度」、またはむしろ潜在的免疫原性の重要性について理解するであろう。様々な計算方法により、潜在的エピトープのスコアが生成される。当業者であれば、高スコアのエピトープに限り除去する必要があり得ることを認識するであろう。また当業者であれば、潜在的エピトープを除去することと、タンパク質の結合親和性またはその他の生物学的活性を維持することとの間にバランスが存在することも認識するであろう。したがって、１つの戦略としては、記載されているＦＮ３ドメインまたはＦＮ３ドメイン融合タンパク質に置換を連続的に導入し、次いで標的結合またはその他の生物学的活性および免疫原性について試験することがある。
【００７３】
追加の修飾
ある特定の実施形態では、血清アルブミン結合体およびそれらの融合体は、翻訳後修飾をさらに含み得る。例示的な翻訳後のタンパク質修飾として、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水基の付加が挙げられる。その結果、修飾された血清アルブミン結合体およびそれらの融合体は、非アミノ酸要素、例えば脂質、多糖または単糖、およびリン酸塩を含有し得る。好ましいグリコシル化の形態は、１つまたは複数のシアル酸部分をポリペプチドとコンジュゲートさせるシアリル化である。シアル酸部分は、溶解度および血清半減期を改善する一方、タンパク質の考え得る免疫原性も低減させる。例えば、Raju et al. Biochemistry. 2001 Jul 31;40(30):8868-76を参照。そのような非アミノ酸要素が血清アルブミン結合体またはその融合体の機能性に与える効果は、特定の血清アルブミン（例えば、ＨＳＡまたはＲｈＳＡ）と結合するそれらの能力、および／または融合の文脈において、特異的非ＦＮ３部分により付与された機能的役割（例えば、ＦＧＦ２１のグルコースの取り込みに対する効果）について試験され得る。
【００７４】
ベクターおよびポリヌクレオチドの実施形態
本明細書に記載するタンパク質のいずれかをコードする核酸配列も本開示に含まれる。当業者が認識するように、第３塩基の縮重（third base degeneracy）により、ほとんどすべてのアミノ酸をコーディングヌクレオチド配列において２つ以上のトリプレットコドンにより表すことができる。さらに、軽微な塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列内で保存的置換を引き起こす可能性があるが、遺伝子産物の生物学的活性を実質的に変化させないものと予想される。したがって、本明細書に記載するタンパク質をコードする核酸配列は、配列についてわずかに修飾され得るが、なおもそのそれぞれの遺伝子産物をコードする。本明細書に記載する血清アルブミン結合体およびそれらの融合体をコードするある特定の例示的核酸には、配列番号６９〜７２に記載する配列を有する核酸が含まれる。
【００７５】
本明細書に開示の様々なタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸が、化学的に合成可能である。コドンの利用法は、細胞内での発現を改善するために選択され得る。そのようなコドンの利用法は、選択された細胞型に依存する。特殊なコドンの利用パターンが、大腸菌（E.coli）、およびその他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母菌細胞、および昆虫細胞について開発されている。例えば、Mayfield et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 100(2):438- 42; Sinclair et al. Protein Expr Purif. 2002 (1):96-105; Connell ND. Curr Opin Biotechnol. 2001 (5):446-9; Makrides et al. Microbiol Rev. 1996 60(3):512-38; and Sharp et al. Yeast. 1991 7(7):657-78を参照。
【００７６】
核酸操作に関する一般的な技法は、当業者の理解の範囲内であり、また例えば、本明細書に参照により組み込まれているSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed., 1989、またはF. Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)、および定期的更新版にも記載されている。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来する、好適な転写上または翻訳上の制御要素と作動可能に連結している。そのような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写を制御する任意選択的なオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列が挙げられる。複製開始点によって通常付与される宿主内複製能力、および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が追加的に組み込まれる。好適な調節エレメントは、当技術分野において周知されている。
【００７７】
本明細書に記載するタンパク質および融合タンパク質は、好ましくはシグナル配列である異種ポリペプチド、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有するその他のポリペプチドとの融合タンパク質として産生され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識および処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。天然のシグナル配列を認識および処理しない原核生物宿主細胞では、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母の分泌では、天然のシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ａ因子リーダー（サッカロマイセス（Saccharomyces）およびクリヴェロマイセス（Kluyveromyces）アルファ因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼリーダー、または国際公開第９０／１３６４６号パンフレットに記載のシグナルによって置換され得る。哺乳動物細胞の発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレーム内で、タンパク質をコードするＤＮＡにライゲートされ得る。
【００７８】
真核生物宿主細胞（例えば、酵母菌、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物に由来する有核細胞）で使用される発現ベクターは、転写の終了およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、真核生物もしくはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’非翻訳領域から一般的に入手可能である。このような領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内で、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終了成分として、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域が挙げられる。国際公開第９４／１１０２６号パンフレットおよびそこで開示される発現ベクターを参照。
【００７９】
組換えＤＮＡは、タンパク質を精製するのに有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列も含むことができる。タンパク質タグの例として、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用される適切なクローニングおよび発現ベクターは、その関連する開示が本明細書に参照により組み込まれているCloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York, 1985)に見出すことができる。当業者にとって明白であるように、発現構築物は、宿主細胞にふさわしい方法を使用して宿主細胞に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、またはその他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染（ここで、ベクターは感染因子である）を含む、ただしこれらに限定されない、核酸を宿主細胞に導入するための多様な方法が、当該技術分野において公知である。
【００８０】
好適な宿主細胞として、原核細胞、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が挙げられる。好適な細菌として、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌（E.coli）またはバチルス属（Bacillus spp.）が挙げられる。好ましくは、サッカロマイセス（Saccharomyces）種、例えばＳ．セレビシエ（S.cerevisiae）に由来する酵母もまた、ポリペプチドの産生に使用され得る。様々な哺乳動物または昆虫細胞の培養系を用いて、組換えタンパク質を発現させることもできる。昆虫細胞における異種タンパク質産生用のバキュロウイルス系が、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（Bio/Technology, 6:47, 1988）によってレビューされている。いくつかの事例では、例えばグリコシル化のために脊椎動物細胞内でタンパク質を産生するのが望ましく、培養（組織培養）での脊椎動物細胞増殖がルーチン手順となっている。好適な哺乳動物宿主細胞株の例として、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。多くの用途において、本明細書に記載するする小型のタンパク質多量体を用いる場合、大腸菌（E.coli）が好ましい発現方法となる。
【００８１】
タンパク質の産生
宿主細胞を、本明細書に記載のタンパク質産生用の発現またはクローニングベクターで形質転換し、そしてプロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて修飾された従来型の栄養培地内で培養する。
【００８２】
本発明のタンパク質を産生させるために使用される宿主細胞は、様々な培地内で培養され得る。市販の培地、例えばハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が、宿主細胞を培養するのに好適である。加えて、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４号明細書；同第４，６５７，８６６号明細書；同第４，９２７，７６２号明細書；同第４，５６０，６５５号明細書；もしくは同第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０／０３４３０号パンフレット；同第８７／００１９５号パンフレット；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号明細書に記載の培地のいずれも、宿主細胞用の培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要であれば、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。その他の任意の必要なサプリメントも、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、発現用に選択された宿主細胞でこれまでに使用されている条件であり、当業者には明白であろう。
【００８３】
本明細書に開示するタンパク質は、細胞翻訳系を使用しても産生可能である。そのような目的のために、タンパク質をコードする核酸を修飾して、ｍＲＮＡを産生させるためのインビトロ転写を可能にし、利用する特定の無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にしなければならない。例示的な真核細胞を含まない翻訳系として、例えば、哺乳動物または酵母菌の細胞を含まない翻訳系が挙げられ、例示的な原核細胞を含まない翻訳系として、例えば、細菌細胞を含まない翻訳系が挙げられる。
【００８４】
また、本明細書に開示するタンパク質は、化学合成によって（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載の方法によって）も産生させることができる。またタンパク質の修飾も化学合成によって産生することができる。
【００８５】
本明細書に開示のタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般的に公知のタンパク質の単離／精製法によって精製可能である。非制限的な例として、抽出、再結晶、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配法、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、濾過および透析を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の様々な方法によって、タンパク質は、異なる緩衝液中に交換され得る、および／または濃縮され得る。
【００８６】
精製されたタンパク質は、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、および最も好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の数値が正確であってもなくても、タンパク質は、医薬品として使用するのに十分に純粋である。
【００８７】
画像化、診断、およびその他の用途
本明細書に提供するＦＮ３ドメイン融合体は、記載されているＦＮ３ドメインに融合した異種の分子の同一性に基づき、様々な疾患および障害を治療するのに使用され得る。ＦＮ３ドメイン融合体の用途は、当技術分野における知識および本明細書に提供する情報に基づき、当業者により決定され得る。様々なＦＮ３ドメイン融合タンパク質に関する使用は、本明細書に詳細に記載されている。ＦＮ３ドメイン融合体は、ヒトおよび非ヒトの生物の両方を含む、任意の哺乳動物の対象または患者に投与され得る。
【００８８】
本明細書に記載する血清アルブミン結合体および融合分子は、検出可能に標識され得るが、また例えば、画像化または診断の用途で、融合分子が結合するタンパク質を発現する細胞と接触させるのに使用される。Hunter, et al, Nature 144:945 (1962); David, et al, Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain, et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); および Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)により記載される方法を含め、タンパク質を検出可能な部分にコンジュゲートさせるための当技術分野において公知の任意の方法が用いられ得る。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する血清アルブミン結合体および融合分子は、検出可能な標識とさらに結合する（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補助因子であり得る）。標識は、放射性の薬剤、例えば放射性の重金属、例えば鉄キレート、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放出体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３Ｔ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃ等であり得る。そのような部分に取り付けられた血清アルブミン結合体または融合分子は、造影剤として使用可能であり、また哺乳動物、例えばヒトを対象とする診断用途において有効な量で投与され、そして造影剤の局在位置および蓄積が次に検出される。造影剤の局在位置および蓄積は、放射性シンチグラフィー、核磁気共鳴画像化法、コンピュータ断層映像法、または陽電子放出型コンピュータ断層撮影法により検出可能である。当業者にとって明白なように、投与される放射性同位体の量は、放射性同位体に依存する。当業者は、活性な部分として使用される所与の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づき、投与される造影剤の量を容易に処方することができる。
【００９０】
血清アルブミン結合体および融合分子は、アフィニティー精製剤としても有用である。このプロセスでは、タンパク質は、適する支持体、例えばセファデックス樹脂または濾紙に、当技術分野において周知の方法を使用して固定化される。タンパク質は、任意の公知のアッセイ法、例えば競合結合アッセイ法、直接および間接サンドイッチアッセイ法、および免疫沈降アッセイ等で用いられ得る（Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)）。代表的な
【００９１】
治療用製剤および投与様式
本発明は、記載されているＦＮ３ドメインと融合した治療部分を投与する方法を提供し、該記載されているＦＮ３ドメインと融合しているとき、治療部分の半減期は延長化している。融合構築物を投与するための技術および投薬量は、記載されているＦＮ３ドメインと融合している治療部分の種類に応じて変化するが、治療される特定の状態は、当業者により容易に決定可能である。一般的に、規制当局は、治療薬として使用されるタンパク質試薬は、パイロジェンのレベルが許容できるほどに低くなるように製剤化されることを要求する。したがって、治療用製剤は、該製剤が実質的にパイロジェンフリーであり、または少なくとも該当する規制当局（例えば、ＦＤＡ）により決定されるパイロジェン許容レベルを超えないレベルでパイロジェンを含有するという点において、その他の製剤とは一般的に区別される。ある特定の実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインおよびのそれらの融合分子の医薬製剤は、ｐＨ４．０〜７．０において、例えば、１〜２０ｍＭのコハク酸、２〜１０％のソルビトール、および１〜１０％のグリシンを含む。例示的な実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインおよびそれらの融合分子の医薬製剤は、ｐＨ６．０において、例えば、１０ｍＭのコハク酸、８％のソルビトール、および５％のグリシンを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、記載されているＦＮ３ドメインおよびその融合体は、哺乳動物、特にヒトにとって薬学的に許容される。「薬学的に許容される」ポリペプチドとは、重大で有害な医学的結果を伴わずに動物に投与されるポリペプチドを意味する。本明細書に開示の薬学的に許容されるＦＮ３ドメインおよびその融合体の例として、インテグリン−結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠くＦＮ３ドメイン、および実質的にエンドトキシンフリーである、またはエンドトキシンレベルが非常に低い組成物が挙げられる。
【００９３】
治療組成物は、単位投与剤形で、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に投与され得る。投与は、非限定的な例であるが、非経口（例えば、静脈内、皮下）、経口、または局所的であり得る。組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、または持続放出型錠剤；静脈内、皮下、または非経口投与用の液体；あるいは局所投与用のゲル剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、もしくはポリマー、またはその他の持続放出型媒体の形態であり得る。
【００９４】
製剤作製のための当技術分野において周知の方法は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」(20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)に見出される。非経口投与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、植物起源の油、または水素化ナフタレンを含有し得る。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、化合物の放出を制御することができる。ナノ粒子製剤（例えば、生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を用いて、化合物の生体内分布を制御することができる。その他の可能性のある有用な非経口送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入システム、およびリポソームが含まれる。製剤中の化合物の濃度は、投与される薬物の投薬量および投与経路を含む、いくつかの要因によって変化する。
【００９５】
ポリペプチドは、薬学的に許容される塩、例えば製薬業界で一般的に使用される非毒性の酸付加塩または金属錯体等として任意選択的に投与され得る。酸付加塩の例として、有機酸、例えば酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸等；ポリマー酸、例えばタンニン酸、カルボキシメチルセルロース等；および無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などが挙げられる。金属錯体としては、亜鉛、鉄などが挙げられる。１つの例では、ポリペプチドは、熱安定性を増大するために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。経口使用のための製剤として、非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に有効成分を含有する錠剤が挙げられる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）、滑沢剤、流動促進剤、および付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）であり得る。
【００９６】
また経口使用のための製剤は、咀嚼錠剤として、または有効成分が不活性固体希釈剤とともに混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または有効成分が水もしくは油媒体とともに混合されている軟ゼラチンカプセル剤としても提供され得る。
【００９７】
治療的に有効な用量とは、投与された場合に、治療的効果を生み出す用量を意味する。正確な用量は、治療される障害に依存し、公知の技術を用いて当業者によって確認され得る。一般に、ＦＮ３ドメイン融合体は、１日当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、１日１回、２回、３回、または４回）、またはより低い頻度で（例えば、２日に１回、１週間に１もしくは２回、または１ヶ月に１回）提供され得る。さらに、当技術分野で公知なように、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に応じた調整が必要とされる場合もあり、当業者によるルーチン的な実験で確認することができる。
【００９８】
ヒト血清アルブミンを検出するためのキット
生体サンプル中のヒト血清アルブミンを検出するキットが本明細書で提示される。このようなキットは、本明細書に記載する１つまたは複数の血清アルブミン特異的ＦＮ３ドメインおよびキットの使用説明書を含む。
【００９９】
提供される血清アルブミン特異的ＦＮ３ドメインは、溶液の状態であるか、凍結乾燥されるか、基材、担体、もしくはプレートに取り付けられるか、または検出可能に標識され得る。
【０１００】
記載されているキットは、本明細書に記載する方法を実施するのに役立つ追加の成分も含み得る。例として、キットは、対象からサンプルを取得する手段、対照もしくは参照サンプル、例えば、ゆっくりと進行するがんを有する対象および／もしくはがんを有さない対象から得たサンプル、１つもしくは複数のサンプルコンパートメント、ならびに／または本発明の方法の性能を記載する説明資料および組織特異的な対照もしくは標準物質を含み得る。
【０１０１】
血清アルブミンのレベルを決定する手段は、例えば、バッファーまたは血清アルブミンのレベルを決定するアッセイで使用されるその他の試薬をさらに含むことができる。説明書は、例えば、アッセイを実施するための印刷された説明書、および／または血清アルブミンのレベルを評価するための説明書であり得る。
【０１０２】
記載されているキットは、対象からサンプルを単離するための手段も含み得る。このような手段は、対象から体液または組織を取得するのに使用可能である機器または試薬のうちの１つまたは複数の品目を含み得る。対象からサンプルを取得する手段は、血液サンプルから血液成分、例えば血清を単離する手段も含み得る。好ましくは、キットは、ヒト対象で使用されるように設計される。
【実施例】
【０１０３】
下記の実施例は、これまでの開示を補完し、および本明細書に記載する主題のより良好な理解を提供するために提示される。このような実施例は、記載されている主題を制限するものとみなしてはならない。本明細書に記載する実施例および実施形態は、説明目的に限定され、およびそれらを前提した様々な修正または変更は当業者にとって明白であり、および本発明の真の範囲に含まれるものであり、ならびにその範囲から逸脱せずになし得るものと理解される。
【０１０４】
[実施例１]
ランダム化ループを有するＴＥＮＣＯＮライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテネイシン−Ｃ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様スキャフォールドであるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Jacobs et al.,  Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; 米国特許第８，２７８，４１９号明細書）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７つのベータストランドを結びつける６つの表面露出型ループを示す。このようなループ、または各ループ内の選択された残基は、特定の標的に結合する新規分子を選択するのに使用可能であるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリーを構築するためにランダム化され得る。
Ｔｅｎｃｏｎ：
【０１０５】
【化１】
2019521662.tif 000004
ｔｅｎｃｏｎスキャフォールドおよび様々な設計戦略を使用して、様々なライブラリーを生成した。一般的に、ライブラリーＴＣＬ１およびＴＣＬ２は良好な結合体を産生した。ＴＣＬ１およびＴＣＬ２ライブラリーの生成は、国際公開第２０１４０８１９４４Ａ２号パンフレットに詳記されている。
【０１０６】
ＴＣＬ１ライブラリーの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみをランダム化するように設計されたライブラリー、ＴＣＬ１を、ｃｉｓ−ディスプレー系で使用するために構築した（Jacobs et al.,  Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012）。この系では、Ｔａｃプロモーターの配列、Ｔｅｎｃｏｎライブラリーコーディング配列、ＲｅｐＡコーディング配列、ｃｉｓ−エレメント、およびｏｒｉエレメントを組み込む二本鎖ＤＮＡが産生される。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳系において発現させたら、タンパク質をコードするＤＮＡとｃｉｓで結合したＴｅｎｃｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体を産生する。以下に記載するように、標的分子に結合する複合体を次に単離し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。
【０１０７】
ｃｉｓ−ディスプレーで使用されるＴＣＬ１ライブラリーの構築を、連続ラウンドのＰＣＲを実施して二等分の最終的な直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子を産生することにより実現した；５’断片はプロモーターおよびＴｅｎｃｏｎ配列を含有する一方、３’断片はｒｅｐＡ遺伝子およびｃｉｓ−エレメントとｏｒｉエレメントを含有する。これらの二等分を、全構築物を産生するために、制限消化により組み合わせた。ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号３２）内にランダムなアミノ酸のみが組み込まれるように、ＴＣＬ１ライブラリーを設計した。ＮＮＳコドンを、このライブラリーの構築で使用したが、その結果、ＦＧループ内に２０種類のアミノ酸すべて、および１つの終止コドンが組み込まれたはずである。ＴＣＬ１ライブラリーは、６つの異なるサブライブラリーを含有し、それぞれ、さらに多様性を増加させるために、長さが７〜１２残基の異なるランダム化ＦＧループを有する。
ＴＣＬ１ライブラリー（配列番号２）
【０１０８】
【化２】
2019521662.tif 000005
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、ならびに
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、およびＸ１２は、任意のアミノ酸である、または欠損している）
【０１０９】
ＴＣＬ２ライブラリーの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣループおよびＦＧループの両方がランダム化されたＴＣＬ２ライブラリーを構築し、各位置のアミノ酸の分布を厳密に制御した。表２は、ＴＣＬ２ライブラリー内の所望のループ位置におけるアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は、２つの目的を有した。第１に、ライブラリーは、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造分析に基づき、および／または相同性モデリングから、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディングおよび安定性にとって構造的に重要であると予測された残基に偏りを有した。例えば、２９位の残基はＴｅｎｃｏｎフォールドの疎水的コア内に埋め込まれているので、疎水性アミノ酸のサブセットのみとなるように２９位を固定した。設計の第２層には、高親和性の結合体が能率的に産生するように、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に優先的に見出される残基のアミノ酸分布に偏りを持たせることが含まれた（Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007）。これを最終目的とした場合、表１の「設計された分布」とは、６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、および４％バリンの分布を意味する。この分布は、メチオニン、システイン、および終止コドンを欠損している。
ＴＣＬ２ライブラリー（配列番号３）
【０１１０】
【化３】
2019521662.tif 000006
（式中、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＴｙｒであり、
Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＴｈｒであり、
Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである）。
【０１１１】
【表２】
2019521662.tif 000007
【０１１２】
その後、野生型のｔｅｎｃｏｎと比較したときに、Ｅ１１Ｒ／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉの置換（Ｔｅｎｃｏｎ２７；配列番号４）が組み込まれた安定化したＴｅｎｃｏｎフレームワーク上でのライブラリー構築（米国特許第８，５６９，２２７号明細書）、ならびにＢＣループおよびＦＧループ内のランダム化された位置の変更を含む様々な手段により、このライブラリーを改善した。Ｔｅｎｃｏｎ２７は、国際公開第２０１３０４９２７５号パンフレットに記載されている。これから、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ（ライブラリーＴＣＬ９）のみ、またはＢＣループおよびＦＧループの組合せ（ライブラリーＴＣＬ７）をランダム化するように設計された新しいライブラリーを生成した。これらのライブラリーを、ｃｉｓ−ディスプレー系で使用されるように構築した（Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004）。この設計の詳細を下記に示す：
安定化したＴｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）（配列番号４）
【０１１３】
【化４】
2019521662.tif 000008
ＴＣＬ７（ランダム化したＦＧループおよびＢＣループ）（配列番号５）
【０１１４】
【化５】
2019521662.tif 000009
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８、およびＸ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙである、または削除されている）。
ＴＣＬ９（ランダム化したＦＧループ）（配列番号６）
【０１１５】
【化６】
2019521662.tif 000010
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、およびＸ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙである、または削除されている）。
【０１１６】
ライブラリーの構築において、ライブラリーのアミノ酸分布を制御し、および終止コドンを取り除くために、ランダム化したＢＣループ（長さ６〜９位）またはＦＧループ（長さ７〜１２位）をコードするＤＮＡ断片を、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ）を使用して合成した。ＢＣループまたはＦＧループをランダム化するＤＮＡ分子の２つの異なるセットを独立に合成し、その後ＰＣＲを使用して組み合わせ、完全ライブラリー生成物を産生した。
【０１１７】
ＦＧループライブラリーの構築（ＴＣＬ９）
５’Ｔａｃプロモーターとそれに続くＴｅｎｃｏｎの完全遺伝子配列、ただし例外的にＦＧループ内にランダム化したコドンを有する同配列からなる一連の合成ＤＮＡ分子を産生した（配列番号２６〜３１）。ＦＧループのランダム化では、システインおよびメチオニンを除くすべてのアミノ酸が、等しい割合でコードされた。多様化された部分の長さは、それらがＦＧループ内の７、８、９、１０、１１、または１２個のアミノ酸をコードするような長さである。各長さが変化したサブライブラリーを、２μｇのスケールで個別に合成し、次にｏｌｉｇｏｓ  Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ（配列番号９）およびＳｌｏｎｉｎｇ−Ｒｅｖ（配列番号１０）を使用してＰＣＲにより増幅した。
【０１１８】
ライブラリーの３’断片は、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、およびｃｉｓ−エレメントとｏｒｉエレメントを含む、ディスプレーのためのエレメントを含有する一定のＤＮＡ配列である。Ｍ１３フォアワードプライマーおよびＭ１３リバースプライマーを有するテンプレートとして、プラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してこの断片を増幅するために、ＰＣＲ反応を実施した。得られたＰＣＲ産物を、ＰｓｐＯＭＩにより一晩で消化し、そしてゲル精製した。ライブラリーＤＮＡの５’部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含有する３’ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌ（約５４０ｎｇ〜５６０ｎｇ）の５’ＤＮＡを、等モル（約１．２５μｇ）の３’ｒｅｐＡ  ＤＮＡに、ＮｏｔＩおよびＰｓｐＯＭＩ酵素およびＴ４リガーゼの存在下、３７℃で、一晩ライゲートした。ライゲートしたライブラリー生成物を、ｏｌｉｇｏｓ  ＰＯＰ２２５０（配列番号１１）およびＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号１２）とともに１２サイクルのＰＣＲを使用することにより増幅した。サブライブラリー毎に、１２回のＰＣＲ反応から得られたＤＮＡを組み合わせ、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムにより精製した。ＴＣＬ９の各サブライブラリーの収率は、３２〜３４μｇの範囲であった。
【０１１９】
ＦＧ／ＢＣループライブラリーの構築（ＴＣＬ７）
ＴＣＬ７ライブラリーは、ランダム化したＴｅｎｃｏｎのＢＣループおよびＦＧループを有するライブラリーを提供する。このライブラリーでは、長さが６〜９アミノ酸のＢＣループを、長さが７〜１２アミノ酸のランダム化されたＦＧループとコンビナトリアルに混合した。タンパク質のＮ末端部分を残基ＶＸまで、これを含めてコードするＴｅｎｃｏｎ遺伝子を含むように、合成Ｔｅｎｃｏｎ断片ＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、およびＢＣ９（配列番号１３〜１６）を産生したが、そうすれば、ＢＣループは、６、７、８、または９個のランダム化したアミノ酸で置き換わる。これらの断片を、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、およびＥ８３Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）の発見前に合成したが、これらの変異は、以下に記載する分子生物学ステップに導入された。この断片をランダム化したＦＧループをコードする断片と組み合わせるために、下記のステップを実施した。
【０１２０】
第１に、Ｔａｃプロモーターおよびアミノ酸Ａ１７をコードするヌクレオチドまでＴｅｎｃｏｎの５’配列をコードするＤＮＡ断片（１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ、配列番号１７）を、ｏｌｉｇｏｓ  ＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号１８）およびＬＳ１１１４（配列番号１９）を使用してＰＣＲにより産生した。ライブラリー（ＣＥＮ５２４３）内にＬ１７Ａ変異を含むようにこれを実施した。次に、ランダム化したＢＣループを含むＴｅｎｃｏｎ残基Ｒ１８〜Ｖ７５をコードするＤＮＡ断片を、テンプレートとしてＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８、またはＢＣ９、ならびにｏｌｉｇｏｓ  ＬＳ１１１５（配列番号２０）およびＬＳ１１１７（配列番号２１）を使用してＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲステップでは、ＢｓａＩ部位が３’末端に導入された。これらのＤＮＡ断片を、その後、ｏｌｉｇｏｓ  ＰＯＰ２２２２ｅｘｔおよびＬＳ１１１７をプライマーとして使用して、オーバーラッピングＰＣＲにより繋いだ。２４０ｂｐの得られたＰＣＲ産物をプールし、そしてＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットにより精製した。精製されたＤＮＡをＢｓａＩ−ＨＦで消化し、そしてゲル精製した。
【０１２１】
ＦＧループをコードする断片を、ＦＧ７（配列番号３１）、ＦＧ８（配列番号３０）、ＦＧ９（配列番号２９）、ＦＧ１０（配列番号２８）、ＦＧ１１（配列番号２７）、およびＦＧ１２（配列番号２６）をテンプレートとして使用して、オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号２２）およびＳＤＧ２４（配列番号２３）とともにＰＣＲにより増幅して、ＢｓａＩ制限部位、ならびにＮ４６ＶおよびＥ８６Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）を組み込んだ。
【０１２２】
消化したＢＣ断片およびＦＧ断片を、３ウェイライゲーションを使用する単一ステップで一緒にライゲートした。１６個の有望な組合せで４回のライゲーション反応を計画し、各ライゲーション反応では、２つのＢＣループ長を２つのＦＧループ長と組み合わせた。各ライゲーションは、約３００ｎｇの全ＢＣ断片および３００ｎｇのＦＧ断片を含有した。これらの４つのライゲーションプールを、次にｏｌｉｇｏｓ  ＰＯＰ２２２２（配列番号２４）およびＳＤＧ２８（配列番号２５）を使用してＰＣＲにより増幅した。各反応生成物、７．５μｇを、次にＮｏｔ１で消化し、そしてＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製カラムを用いて洗浄した。このＤＮＡ、５．２μｇを、ＰｓｐＯＭＩで消化した等モル量のＲｅｐＡ  ＤＮＡ断片（約１４μｇ）にライゲートし、生成物をｏｌｉｇｏｓ  ＰＯＰ２２２２を使用してＰＣＲにより増幅した。
【０１２３】
[実施例２]
代替的結合表面を有するＴＥＮＣＯＮライブラリーの生成
特定のライブラリー設計においてランダム化される残基の選択により、形成される相互作用表面の全体的な形状が支配される。ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧの各ループがランダム化されているライブラリーから、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と結合するように選択されたスキャフォールドタンパク質を含有するＦＮ３ドメインについてＸ線結晶解析を行い、ＭＢＰの活性部位に適合する概ね湾曲した界面を有することが明らかとなった（Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104: 6632-6637, 2007）。対照的に、ＭＢＰに結合するように選択されたアンキリンリピートスキャフォールドタンパク質は、はるかに平面的な相互作用表面を有し、また活性部位からは遠いＭＢＰの外部表面に結合することが判明した（Binz et al., Nat Biotechnol 22: 575-582, 2004）。このような結果は、スキャフォールド分子の結合表面の形状（湾曲型と平面型）が、どの標的タンパク質、またはそのような標的タンパク質上のどの特異的エピトープが、スキャフォールドと有効に結合することができるか、について説明し得ることを示唆する。タンパク質と結合するためのＦＮ３ドメインを含有するタンパク質スキャフォールドのエンジニアリングに関する公表された努力は、標的と結合するための隣接ループを工学的に作出すること、したがって湾曲した結合表面を産生することに準拠する。このアプローチは、そのようなスキャフォールドが接近できる標的およびエピトープの数に限界をもたらす可能性がある。
【０１２４】
Ｔｅｎｃｏｎおよびその他のＦＮ３ドメインは、分子の対向面上に位置する２セットのＣＤＲ様のループ、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループにより形成される第１のセット、およびＡＢ、ＣＤ、およびＥＦループにより形成される第２のセットを含む。２セットのループは、ＦＮ３構造の中心部を形成するベータストランドにより分離している。Ｔｅｎｃｏｎの画像を９０度回転させれば、代替的表面が可視化され得る。このわずかに凹な面は、ＣＤループおよびＦＧループ、ならびに２つのアンチパラレルベータストランドであるＣおよびＦのベータストランドにより形成され、本明細書ではＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ばれる。Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面は、該表面を形成する残基のサブセットをランダム化することにより、タンパク質スキャフォールド相互作用表面のライブラリーを設計するためのテンプレートとして使用可能である。ベータストランドは、一つおきにタンパク質の表面に露出した残基の側鎖を備えた反復構造を有する。したがって、ライブラリーは、ベータストランド内の一部または全部の表面露出残基をランダム化することにより作成可能である。ベータストランド内のふさわしい残基を選択することにより、その他のタンパク質と相互作用するための独特なスキャフォールド表面を提供しつつ、損なわれるＴｅｎｃｏｎスキャフォールドの固有の安定性は最低限度に抑えられるはずである。
【０１２５】
ライブラリーＴＣＬ１４（配列番号７）を、Ｔｅｎｃｏｎ２７スキャフォールド（配列番号４）内に設計した。
【０１２６】
このライブラリーを構築するために使用される方法の詳細説明は、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号明細書に記載されている。
ＴＣＬ１４ライブラリー（配列番号７）：
【０１２７】
【化７】
2019521662.tif 000011
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ，Ｙ、またはＭである）。
【０１２８】
Ｔｅｎｃｏｎ２７においてＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を形成する２つのベータストランドは、ランダム化され得る合計９個の表面露出残基、Ｃストランド：Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６；Ｆストランド：Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２、およびＶ７４を有する一方、ＣＤループは、６個の潜在的残基：Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２、およびＥ４３を有し、ならびにＦＧループは、７個の潜在的残基：Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０、およびＮ８１を有する。２２個すべての残基がランダム化された場合、ライブラリーの理論的サイズが大型化するため、選択残基は、ＴＣＬ１４設計に組み込まれるように選択した。
【０１２９】
Ｔｅｎｃｏｎ内の１３個の位置、すなわちＣストランド内のＬ３２、Ｑ３４、およびＱ３６、ＣＤループ内のＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、およびＶ４１、Ｆストランド内のＴ６８、Ｓ７０、およびＹ７２、ＦＧループ内のＨ７８、Ｒ７９、およびＮ８１を選択してランダム化した。ＣおよびＦストランドでは、Ｓ３０およびＥ６６はＣＤループおよびＦＧループのすぐ向こう側に位置すること、ならびに明らかにＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の一部とは思われないことから、それらをランダム化しなかった。ＣＤループの場合、可撓性をもたらすグリシンはループ領域において有用であり得、Ｅ４３は表面接合部に位置するので、Ｇ４２およびＥ４３はランダム化しなかった。ＦＧループでは、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、およびＳ８０を除外した。上記理由からグリシンを除外したが、一方、結晶構造の慎重な調査から、Ｓ８０はコアと重要な接触を引き起こし、安定なＦＧループを形成するのに役立っていることが判明した。Ｋ７５は、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ面の表面とは異なる方向を向いており、ランダム化の候補としては魅力に欠けた。上記残基はオリジナルのＴＣＬ１４設計においてランダム化されなかったが、それらの残基は、新規選択、または例えば選択ＴＣＬ１４標的特異的ヒット上の親和性熟成ライブラリーに対して追加の多様性を提供するために、後続するライブラリー設計に含めることも可能であった。
【０１３０】
ＴＣＬ１４の産生に後続して、類似設計の追加のＴｅｎｃｏｎライブラリー３つを産生した。これらの２つのライブラリー、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３は、ＴＣＬ１４と同一の位置においてランダム化されるが（上記を参照）、ただしこれらの位置で生ずるアミノ酸の分布は異なる（表３）。ＴＣＬ１９およびＴＣＬ２１を、各位置において、システインおよびメチオニンのみを除く１８種類の天然アミノ酸について等しい分布を含むように設計した（各５．５５％）。表２の記載にするように、各ランダム化位置が、機能的抗体のＨＣＤＲ３ループに見出されるアミノ酸分布に匹敵するように、ＴＣＬ２３を設計した（Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-1528, 2008）。ＴＣＬ２１ライブラリーと同様に、システインおよびメチオニンを除外した。
【０１３１】
その他のライブラリーの潜在的標的結合表面を拡張するために、第３の追加のライブラリーを構築した。このライブラリー、ＴＣＬ２４では、ライブラリーＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、およびＴＣＬ２３と比較して、４つの追加のＴｅｎｃｏｎ位置がランダム化された。これらの位置には、Ｄストランドに由来するＮ４６およびＴ４８、ならびにＧストランドに由来するＳ８４およびＩ８６が含まれる。位置４６、４８、８４、および８６の残基側鎖は、ベータストランドＤおよびＧから表面曝露しており、またＣおよびＦストランドのランダム化部分と構造的に隣接した場所に位置し、したがって標的タンパク質が結合するために接近できる表面積が増加するので、これらの位置を特に選択した。ＴＣＬ２４おいて各位置で使用されるアミノ酸分布は、表２でＴＣＬ１９およびＴＣＬ２１について記載した分布と同一である。
ＴＣＬ２４ライブラリー（配列番号８）
【０１３２】
【化８】
2019521662.tif 000012
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷである）。
【０１３３】
【表３】
2019521662.tif 000013
【０１３４】
ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４ライブラリーの生成
アミノ酸分布を制御するために、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリー技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を使用して、ＴＣＬ２１ライブラリーを生成した。Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を使用してＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４の遺伝子断片を生成させ、アミノ酸分布を制御した。ループライブラリーについて上記したように、初期の合成後に、ＰＣＲを使用して各ライブラリーを増幅し、その後、ｃｉｓ−ディスプレー系を使用する選択で使用されるようにＲｅｐＡの遺伝子にライゲートした（Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004）。
【０１３５】
[実施例３]
ヒト血清アルブミンと結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ライブラリースクリーニング
ｃｉｓ−ディスプレーを、ＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、およびＴＣＬ２４ライブラリーからヒト血清アルブミン結合ドメインを選択するのに使用した。血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から精製したヒトおよびウサギ血清アルブミンを、標準法を使用してビオチン化し、そしてパニングで使用した。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳（ＩＴＴ）では、３μｇのライブラリーＤＮＡを、０．１ｍＭの完全アミノ酸、１×Ｓ３０の事前混合成分、および１５μＬのＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに、総容積５０μＬでインキュベートし、３０℃でインキュベートした。１時間後、３７５μＬのブロッキング溶液（（０．１％のカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、１００ｍｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、１ｍｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を添加し、反応物を氷上で１５分間をインキュベートした。選択では、ビオチン化された抗原を、４００ｎＭ（ラウンド１）、２００ｎＭ（ラウンド２および３）、および１００ｎＭ（ラウンド４および５）の濃度で添加した。結合したライブラリーメンバーを、ニュートラアビジンマグネットビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）（ラウンド１、３、および５）、またはストレプトアビジンマグネットビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（ラウンド２および４）を使用して回収し、ビーズを５００μＬのＰＢＳＴで５〜１４回洗浄し、その後に５００μＬのＰＢＳで２回洗浄することにより、未結合のライブラリーメンバーを除去した。親和性が改善したスキャフォールド分子を同定するために、追加の選択ラウンドを実施した。要するに、ラウンド５からのアウトプットを上記のように調製し、そして下記の変更を加えて選択の追加の反復ラウンドにかけた：ビオチン化された抗原とのインキュベーションを１時間から１５分に減らし、およびビーズ捕捉を２０分から１５分に減らし、ｂｔ−ＨＳＡを２５ｎＭ（ラウンド６および７）、または２．５ｎＭ（ラウンド８および９）に減らし、ならびに過剰の非ビオチン化標的タンパク質の存在下で追加の１時間洗浄を実施した。このような変更の目的は、オンレート（on-rate）がより速く、かつオフレート（off-rate）がより遅いと思われる結合体を同時に選択して、実質的により低いＫＤを得ることである。
【０１３６】
パニングの後、選択されたＦＮ３ドメインを、ｏｌｉｇｏｓ  Ｔｃｏｎ６（配列番号３３）およびＴｃｏｎ５ｓｈｏｒｔＥ８６Ｉ（配列番号３４）を使用してＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ１５−ＬＩＣ中にアニーリングすることによりサブクローン化し、大腸菌（E.coli）で可溶性発現させるために、標準的な分子生物学技術を使用してＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に変換した。単一クローンを取り出し、９６ディープウェルプレートにおいて、アンピシリンを含むＬＢ、１ｍＬ中で飽和するまで３７℃で増殖させた。翌日、２５μＬを、９６ディープウェルプレートにおいて新鮮なＬＢ−Ａｍｐ培地、１ｍＬに移し、３７℃で２時間増殖させた。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加し、タンパク質の発現を３０℃で１６時間誘発した。遠心分離により細胞を採取し、その後、最終０．２ｍｇ／ｍＬの鶏卵卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が補充されたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）により溶解した。溶菌液を遠心分離により清澄化し、上清を新しい９６ディープウェルプレートに移し、ＥＬＩＳＡにより標的タンパク質との結合について試験した。
【０１３７】
ヒト血清アルブミンと結合するＦＮ３ドメインの選択
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、選択されたパニングアウトプットに由来する個々のクローン上で実施して、ヒト血清アルブミン結合体を同定した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、５μｇのＨＳＡ、ｒａｂＳＡ、または５μｇ／ｍｌのオバルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて一晩コーティングし、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）、ｐＨ７．４で洗浄し、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して遮断した。清澄化した溶菌液（上記）を、ＨＳＡ、ｒａｂＳＡ、およびオバルブミンがコーティングされたプレートのウェルに適用した。プレートを、１時間インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、センチリン（centyrin）の結合を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５プレートリーダーを使用して、ｐＡｂ２５−ＨＲＰ（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｒ＆Ｄ、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ  ＰＡ）およびＰＯＤ化学発光基質（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）により検出した。ヒットを、［ヒト血清アルブミンに対する結合シグナル／オバルブミンに対する結合シグナル］＞１０として定義した。
【０１３８】
クローンを、異なるヒト血清アルブミンドメイン構築物との結合、および様々な種に由来するアルブミン：アルブミンドメインＩ（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、ドメインＩＩ（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、ドメインＩＩＩ（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、ドメインＩ−ＩＩ（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）、アカゲザル血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、およびマウス血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）との交差反応性について、上記ＥＬＩＳＡアッセイにおいてさらに特徴付けた。ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩを、１μｇ／ｍｌの濃度で、ドメインＩ−ＩＩを２μｇ／ｍｌの濃度で、ならびに完全長アカゲザルアルブミンおよびマウスアルブミンを３μｇ／ｍｌで、陽性結合対照として働く３μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含めコーティングした。選択されたＦＮ３ドメインのアルブミン結合ドメイン特異性を表４に示す。表５は、選択されたＦＮ３ドメインの全アミノ配列を示す。
【０１３９】
【表４】
2019521662.tif 000014
【０１４０】
【表５】
2019521662.tif 000015
【０１４１】
同定されたＦＮ３ドメイン結合ヒト血清アルブミンの小規模発現および精製
選択ＦＮ３ドメインクローンを取り出し、そして１００μｇ／ｍＬのアンピシリンが補充されたルリアブロス（Luria Broth）（ＬＢ）（ＬＢ−Ａｍｐ培地）、１ｍＬ中で飽和するまで９６ディープウェルプレートにおいて３７℃で増殖させた。翌日、２５μＬを、２４ディープウェルプレート内の新鮮なＬＢ−Ａｍｐ培地、５ｍＬに移し、３７℃で２時間増殖させた。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加し、タンパク質の発現を３０℃で１６時間誘発した。細胞を遠心分離により採取し、最終０．２ｍｇ／ｍＬの鶏卵卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が補充されたＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）で溶解した。溶菌液を遠心分離により清澄化し、上清を新しい９６ディープウェルプレートに移した。製造業者（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の推奨に従い、９６ウェルＮｉ−ＮＴＡ  Ｍｕｌｔｉｔｒａｐプレートを使用して、Ｈｉｓタグ付きＦＮ３ドメインを精製した。
【０１４２】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを、ＦＮ３ドメイン結合ヒト血清アルブミンの凝集状態を決定するのに使用した。各精製されたＦＮ３ドメインの一定分量（１０μＬ）を、０．３ｍＬ／分の流速で、移動相がＰＢＳ、ｐＨ７．４でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５  ５／１５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。カラムからの溶出を、２８０ｎｍにおける吸収によりモニタリングした。ＳＥＣにより高レベルの凝集を示したＦＮ３ドメインを、さらなる分析から除外した。
【０１４３】
[実施例４]
ヒト血清アルブミン結合ＦＮ３ドメインの特徴付け
ヒト血清アルブミン−ＦＮ３ドメイン複合体の免疫沈降
結合体の機能性を評価するために、選択されたＦＮ３ドメインを、通常の血清内で内因性アルブミンと複合体形成するそれらの能力について試験した。選択されたＦＮ３ドメインが別のＦＮ３ドメインのアミノまたはカルボキシ末端に結合したときに、アルブミン結合が保たれることを確実にするために、２価のＦＮ３遺伝子を調製して、構築物ＡＬＢ１８、ＡＬＢ３０、ＡＬＢ２１、ＡＬＢ３３、ＡＬＢ３４、およびＡＬＢ３５を生成した（表６）。
【０１４４】
【表６】
2019521662.tif 000016
【０１４５】
Ｃ末端にＨｉｓ６タグ化された（配列番号７２）２価のＦＮ３ドメイン（カルシウムまたはマグネシウムを含まない１×ＤＰＢＳ中で０．２５〜２．０ｍｇ／ｍＬの濃度）を、通常の血清と１：１の容積比で混合し、そして室温で１時間インキュベートして、血清中での内因性アルブミンとの結合を可能にした。Ｈｉｓ６タグ化された（配列番号７２）ＦＮ３ドメイン−アルブミン複合体を、５００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのイミダゾールを含有する５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．０で事前平衡化した５μＬの樹脂ベッドを含有する２００＋ＰｈｙＴｉｐカラム（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＬＬＣ製ＰｕｒｅＳｐｅｅｄ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｉｐ  ＩＭＡＣ；Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）を使用して、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（immobilized metal affinity chromatography）（ＩＭＡＣ）により血清から回収した。未結合の血清タンパク質を、平衡バッファーを用いた樹脂の徹底洗浄により除去した。結合したタンパク質を、２５〜１００μＬの溶出バッファー（５００ｍＭのＮａＣｌおよび２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．５を含有する５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．０）を用いて溶出させた。溶出液を、アルブミンの共沈殿についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、コロイダルクーマシーで染色した。アルブミン結合ＦＮ３ドメインを含有するレーンは、血清アルブミン＋ＦＮ３ドメインの分子量と一致する高強度のバンドを有した。対照的に、Ｔｅｎｃｏｎ２５（配列番号７３）の場合、アルブミンは複合体を形成せず、血清アルブミンに対して親和性を有さないＦＮ３ドメインを、ＩＭＡＣ精製により血清から抽出した（図２を参照）。
【０１４６】
カニクイザルにおけるアルブミン結合ＦＮ３ドメインの薬物動態：
ＡＬＢ１８およびＡＬＢ３３についてｉｎ−ｖｉｖｏ試験を実施した。試験品は、２．０ｍｇ／ｍＬで試験施設に提供され、−７０±１０℃で保管された。投薬前にＦＮ３ドメインを室温で２４時間解凍し、２〜８℃で保管した。投薬当日、試験品を室温まで加温した。投薬時２．０〜４．０ｋｇの範囲内にある未処置の雌カニクイザル９匹を３群に分割した。ＦＮ３ドメインを、静脈内（ＩＶ）ボーラス注射（全体的な投与容積に対して、目標時間１〜３分）により、１日目に２ｍｇ／ｋｇで投与した。送達される各用量の容積（ｍＬ）は、投薬前に１〜２日間記録した個々の動物の体重に基づいた。投与前１日、投与後１０分および６時間および２４時間において、末梢血管から全血、約１ｍＬを収集した。追加のサンプルを、３、４、５、６、７、９、１１、１４、および２１日目に、１日のうちほぼ同一時刻において収集した。すべての血液サンプルを、抗凝固剤を含まない血清分離チューブ内に収集した。血液サンプルを３０分間凝固させ、次に冷却した遠心機内で１５分間遠心分離した。血清、約１ｍＬを、２つのエッペンドルフチューブに移し（各０．５ｍＬ）、スポンサーに出荷するまで−６５℃で保管した。
【０１４７】
Ｈ９を以下の通り評価した。２．２〜４．４ｋｇの範囲の未処置の雄カニクイザル３匹に、１ｍｇ／ｋｇのＨ９（ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬに調製した）を、２ｍＬ／ｋｇのＩＶボーラス注射で投与した。血液サンプル（約１ｍＬ）を、橈側皮静脈または大腿静脈から、抗凝固剤を含まないＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（商標）３．５ｍＬチューブ（カタログ番号３６７９５７）内に収集した。下記の時点：すなわち投与前（ｔ＝０）、および投与後１０分、１時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間（４日目）、１６８時間（８日目）、２４０時間（１１日目）、３３６時間（１５日目）、および５０４時間（２２日目）において、サンプルを取得した。各時点における血液サンプルを、室温で３０〜６０分間凝固させた後、室温で１５分間遠心分離した。約０．５ｍＬの血清を、予めラベル表示したポリプロピレンマイクロチューブ内に移し、ドライアイス上に速やかに置いた後、−７０℃以下で保管した。血清サンプルをドライアイス同梱で出荷した。
【０１４８】
血清サンプル中に存在するＦＮ３ドメインの濃度を決定するために、アルブミン結合ＦＮ３ドメインのＨ９、ＡＬＢ１８、およびＡＬＢ３３について、標準曲線を、３００ｎｇ／ｍｌおよびアッセイバッファー（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＴＢＳ）ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１０％対照未処理カニクイザル血清（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ））中での連続３倍希釈において調製して１１ｐｔ曲線を得た。すべての試験血清サンプルを室温で解凍し、アッセイバッファー中、１：１０の希釈で調製し、アッセイバッファー中での５倍希釈法を使用してさらに連続希釈した。捕捉および検出用の均質なマスターミックスを、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ中で０．６２５μｇ／ｍｌに調製したビオチン化された捕捉およびルテニウム標識検出抗体（ポリクロナール抗ＦＮ３ドメイン抗体ｐａｂ１３９、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して生成した。４０μＬのマスターミックスおよび１０μＬの希釈サンプル、標準または対照を、９６ウェルＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｇｏｌｄプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）に添加した。プレートを、遮光して室温で２時間インキュベートした。プレートを３００μＬのＴＢＳ−Ｔ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を使用して洗浄し、そして乾燥ブロットした。界面活性剤を含むＲｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔの１×溶液（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を蒸留水中で調製した。Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒを、アッセイプレートに１５０μＬ／ウェルで添加し、そしてＱｕｉｃｋＰｌｅｘ  ＳＱ  １２０リーダー（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して電気化学ルミネセンスを測定した。
【０１４９】
Ｘ軸およびＹ軸をＸ＝ｌｏｇ（Ｘ）およびＹ＝ｌｏｇ（Ｙ）に変換することにより、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ内で標準曲線を生成した。シグモイド型の用量応答性（可変性のスロープ）を使用して非線形回帰（曲線近似）を実施した；未知の値は標準曲線から内挿した。初期の変換について補正するために、内挿した結果の平均値を、Ｘ＝１０＾ＸおよびＹ＝１０＾Ｙを使用して変換した。標準曲線の直線部分を、目視により決定した。すべての内挿された濃度を、アッセイで使用した希釈係数について補正した。最終濃度を、すべての希釈について有効な結果を平均化し、ｇ／ｍｌからｎＭに変換することにより決定した。
【０１５０】
エクセル用のＰＫＳｏｌｖｅｒ  ａｄｄ−ｉｎ（Zhang, Y. et al. (2010) Comput. Methods Programs Biomed., 99 306-314）をＰＫ分析に使用した。非コンパートメント解析を動物毎に実施した。構築物毎に３動物について半減期および排出を平均化して、最終結果を決定した。アルブミン結合ＦＮ３ドメインの薬物動態データを、図２および表７に示す。アルブミンドメイン３結合体のＨ９、およびＡＬＢ１８は、類似した曝露プロファイルおよび末端半減値（terminal half-life value）（３３〜４７時間）を示した。アルブミンドメイン１結合体のＡＬＢ３３は、中間的な曝露および約２６時間の末端半減期を実証する。
【０１５１】
【表７】
2019521662.tif 000017
【０１５２】
配列情報
配列番号１＝オリジナルのＴｅｎｃｏｎ配列
【０１５３】
【化９】
2019521662.tif 000018
配列番号２＝ＴＣＬ１ライブラリー
【０１５４】
【化１０】
2019521662.tif 000019
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、およびＸ１２は、任意のアミノ酸である、または削除されている）
配列番号３＝ＴＣＬ２ライブラリー
【０１５５】
【化１１】
2019521662.tif 000020
（式中
Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＴｙｒであり、
Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＴｈｒであり、
Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり、
Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌである）。
配列番号４＝安定化したＴｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）
【０１５６】
【化１２】
2019521662.tif 000021
配列番号５＝ＴＣＬ７（ＦＧループおよびＢＣループ）
【０１５７】
【化１３】
2019521662.tif 000022
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８、およびＸ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙである、または削除されている）
配列番号６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）
【０１５８】
【化１４】
2019521662.tif 000023
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、およびＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、
Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、およびＸ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙである、または削除されている）。
配列番号７＝ＴＣＬ１４ライブラリー
【０１５９】
【化１５】
2019521662.tif 000024
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ，Ｙ、またはＭである）。
配列番号８＝ＴＣＬ２４ライブラリー
ＴＣＬ２４ライブラリー（配列番号８）
【０１６０】
【化１６】
2019521662.tif 000025
（式中
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、およびＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷである）。
配列番号９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ
【０１６１】
【化１７】
2019521662.tif 000026
配列番号１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＲＥＶ
【０１６２】
【化１８】
2019521662.tif 000027
配列番号１１＝ＰＯＰ２２５０
【０１６３】
【化１９】
2019521662.tif 000028
配列番号１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖ
【０１６４】
【化２０】
2019521662.tif 000029
配列番号１３＝ＢＣ９
【０１６５】
【化２１】
2019521662.tif 000030
配列番号１４＝ＢＣ８
【０１６６】
【化２２】
2019521662.tif 000031
配列番号１５＝ＢＣ７
【０１６７】
【化２３】
2019521662.tif 000032
配列番号１６＝ＢＣ６
【０１６８】
【化２４】
2019521662.tif 000033
配列番号１７＝１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ
【０１６９】
【化２５】
2019521662.tif 000034
配列番号１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔ
【０１７０】
【化２６】
2019521662.tif 000035
配列番号１９＝ＬＳ１１１４
【０１７１】
【化２７】
2019521662.tif 000036
配列番号２０＝ＬＳ１１１５
【０１７２】
【化２８】
2019521662.tif 000037
配列番号２１＝ＬＳ１１１７
【０１７３】
【化２９】
2019521662.tif 000038
配列番号２２＝ＳＤＧ１０
【０１７４】
【化３０】
2019521662.tif 000039
配列番号２３＝ＳＤＧ２４
【０１７５】
【化３１】
2019521662.tif 000040
配列番号２４＝ＰＯＰ２２２２
【０１７６】
【化３２】
2019521662.tif 000041
配列番号２５＝ＳＤＧ２８
【０１７７】
【化３３】
2019521662.tif 000042
配列番号２６＝ＦＧ１２
【０１７８】
【化３４】
2019521662.tif 000043
配列番号２７＝ＦＧ１１
【０１７９】
【化３５】
2019521662.tif 000044
配列番号２８＝ＦＧ１０
【０１８０】
【化３６】
2019521662.tif 000045
配列番号２９＝ＦＧ９
【０１８１】
【化３７】
2019521662.tif 000046
配列番号３０＝ＦＧ８
【０１８２】
【化３８】
2019521662.tif 000047
配列番号３１＝ＦＧ７
【０１８３】
【化３９】
2019521662.tif 000048
配列番号３２  ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ
【０１８４】
【化４０】
2019521662.tif 000049
配列番号３３＝Ｔｃｏｎ６
【０１８５】
【化４１】
2019521662.tif 000050
配列番号３４＝Ｔｃｏｎ５Ｅ８６Ｉｓｈｏｒｔ
【０１８６】
【化４２】
2019521662.tif 000051
配列番号３５  オリジナルのｔｅｎｃｏｎＣストランド
【０１８７】
【化４３】
2019521662.tif 000052
配列番号３６  ＡＬＢ−Ｅ０５  Ｃストランド
【０１８８】
【化４４】
2019521662.tif 000053
配列番号３７  ＡＬＢ−Ｅ０７  Ｃストランド
【０１８９】
【化４５】
2019521662.tif 000054
配列番号３８  ＡＬＢ−Ｈ９  Ｃストランド
【０１９０】
【化４６】
2019521662.tif 000055
配列番号３９  オリジナルのｔｅｎｃｏｎ  ＣＤループ
【０１９１】
【化４７】
2019521662.tif 000056
配列番号４０  ＡＬＢ−Ｅ０５  ＣＤループ
【０１９２】
【化４８】
2019521662.tif 000057
配列番号４１  ＡＬＢ−Ｅ０７  ＣＤループ
【０１９３】
【化４９】
2019521662.tif 000058
配列番号４２  ＡＬＢ−Ｈ９  ＣＤループ
【０１９４】
【化５０】
2019521662.tif 000059
配列番号４３  オリジナルのｔｅｎｃｏｎ  Ｆストランド
【０１９５】
【化５１】
2019521662.tif 000060
配列番号４４  ＡＬＢ−Ｅ０５  Ｆストランド
【０１９６】
【化５２】
2019521662.tif 000061
配列番号４５  ＡＬＢ−Ｅ０７  Ｆストランド
【０１９７】
【化５３】
2019521662.tif 000062
配列番号４６  ＡＬＢ−Ｈ９  Ｆストランド
【０１９８】
【化５４】
2019521662.tif 000063
配列番号４７  オリジナルのｔｅｎｃｏｎ  ＦＧループ
【０１９９】
【化５５】
2019521662.tif 000064
配列番号４８  ＡＬＢ−Ｅ０５  ＦＧループ
【０２００】
【化５６】
2019521662.tif 000065
配列番号４９  ＡＬＢ−Ｅ０７  ＦＧループ
【０２０１】
【化５７】
2019521662.tif 000066
配列番号５０  ＡＬＢ−Ｈ９  ＦＧループ
【０２０２】
【化５８】
2019521662.tif 000067
配列番号５１  ＡＬＢ−Ｅ０５
【０２０３】
【化５９】
2019521662.tif 000068
配列番号５２  ＡＬＢ−Ｅ０７
【０２０４】
【化６０】
2019521662.tif 000069
配列番号５３  ＡＬＢ−Ｈ９
【０２０５】
【化６１】
2019521662.tif 000070
配列番号５４（ＧＳ）２
【０２０６】
【化６２】
2019521662.tif 000071
配列番号５５（ＧＧＧＳ）２
【０２０７】
【化６３】
2019521662.tif 000072
配列番号５６（ＧＧＧＧＳ）２
【０２０８】
【化６４】
2019521662.tif 000073
配列番号５７（ＡＰ）２
【０２０９】
【化６５】
2019521662.tif 000074
配列番号５８（ＡＰ）５
【０２１０】
【化６６】
2019521662.tif 000075
配列番号５９（ＡＰ）１０
【０２１１】
【化６７】
2019521662.tif 000076
配列番号６０（ＡＰ）２０
【０２１２】
【化６８】
2019521662.tif 000077
配列番号６１  Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ
【０２１３】
【化６９】
2019521662.tif 000078
配列番号６２  ヒト血清アルブミン
【０２１４】
【化７０】
2019521662.tif 000079
配列番号６３  カニクイザル血清アルブミン
【０２１５】
【化７１】
2019521662.tif 000080
配列番号６４  ＡＬＢ−Ｅ０５核酸配列
【０２１６】
【化７２】
2019521662.tif 000081
配列番号６５  ＡＬＢ−Ｅ０７核酸配列
【０２１７】
【化７３】
2019521662.tif 000082
配列番号６６  ＡＬＢ−Ｈ９核酸配列
【０２１８】
【化７４】
2019521662.tif 000083
配列番号６７  Ｔｅｎｃｏｎ２５
【０２１９】
【化７５】
2019521662.tif 000084
配列番号６８  第３ＦＮ３ドメイン  ヒトテネイシンＣ
【０２２０】
【化７６】
2019521662.tif 000085
配列番号６９  フィブコン（Fibcon）
【０２２１】
【化７７】
2019521662.tif 000086
配列番号７０  第１０ＦＮ３ドメイン  ヒトフィブロネクチン
【０２２２】
【化７８】
2019521662.tif 000087
【図１】
2019521662.tif 000088
【図２】
2019521662.tif 000089
【配列表】
2019521662000001.app
【国際調査報告】
2019521662.tif 000090
2019521662.tif 000091
2019521662.tif 000092