(57)【要約】  本発明は、プロテアソーム阻害剤及び目的遺伝子をコードするウイルスベクターを眼に投与することにより、対象の眼へのウイルスベクターの送達を向上させる方法を提供する。【選択図】  図１Ａ−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の眼への目的遺伝子の送達を向上させる方法であって、プロテアソーム阻害剤及び目的遺伝子をコードするウイルスベクターを眼に投与することを含む、方法。
【請求項２】
プロテアソーム阻害剤がドキソルビシン（ＤＯＸ）、アクラルビシン、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム  エピガロカテキン−３−ガラート  マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ−０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）  エポキソミシン、ＭＧ１３２、ベータ‐ヒドロキシ‐ベータ‐メチル酪酸又はカルフィルゾミブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的遺伝子がオプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
オプシンが、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、メラノプシン、ピノプシン（ｐｉｎｅａｌ  ｏｐｓｉｎ）、バクテリオロドプシン及びプロテオロドプシン又はそれらの機能的バリアントから成るグループから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
目的遺伝子が機能的に細胞特異的プロモーターに連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスベクターがナノ粒子、ポリマー又はリポソームにカプセル化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が眼疾患又は障害を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
眼疾患が、網膜芽細胞腫、眼内黒色腫、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症又は眼組織の炎症である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターが、同時に又は連続的に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスベクターが網膜細胞に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
網膜細胞が、網膜神経節細胞、網膜双極細胞、網膜水平細胞、アマクリン細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞又は網膜色素上皮細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターが眼の硝子体に投与される、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項１３】
プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターが、投与が注入又は点滴による経路により投与される、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項１４】
プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターが、網膜下に投与されない、請求項１又は９に記載の方法。
【請求項１５】
プロテアソーム阻害剤及びオプシンをコードするウイルスベクターを眼の硝子体に投与することを含む、対象において光感受性を増大させる又は視覚を改善若しくは回復させる方法。
【請求項１６】
前記オプシンが、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、メラノプシン、ピノプシン（ｐｉｎｅａｌ  ｏｐｓｉｎ）、バクテリオロドプシン及びプロテオロドプシン又はそれらの機能的バリアントから成るグループから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象が眼疾患又は障害を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
眼疾患が、網膜芽細胞腫、眼内黒色腫、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症又は眼組織の炎症である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／３３１，２８１号に基づく優先権及び利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列リストの参照による組み込み
２０１７年５月３日に作成され、サイズが５６ＫＢであるテキストファイル名「ＲＴＲＯ−７０６−００１ＷＯ＿ＳＴ２５」の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与されたＥＹ０１７１３０の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００４】
本発明の技術分野
本発明は、概して細胞のウイルス形質導入等の遺伝子送達の有効性を改善させるための方法に関する。とりわけ、本発明は網膜細胞等の細胞にウイルス及び／又はウイルスベクターを導入する方法の効率を安全かつ確実に改善させるのに有益な方法及び材料を提供する。
【背景技術】
【０００５】
眼は、光を検出し、光を一連の電気シグナルに変換し、これらのシグナルを脳に伝達し、最終的に我々の世界の表現を生成する複雑な視覚系である。眼疾患及び障害は、視力の低下、光感受性の低下、及び失明を引き起こす可能性がある。
【０００６】
形質導入効率が低いことは網膜神経細胞におけるウイルス媒介遺伝子治療にとって主要な課題であり、このため、ウイルスベクターの眼への送達を向上させる方法が長年必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、眼への治療遺伝子送達を向上又は改善するための方法が長年必要とされていることに対し、解決策を提供する。
【０００８】
本発明は、プロテアソーム阻害剤及び目的遺伝子をコードするウイルスベクターを眼に投与することにより、対象の眼への目的遺伝子の送達を向上させる方法を特徴とする。
【０００９】
プロテアソーム阻害剤はドキソルビシン、アクラルビシン、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム  エピガロカテキン−３−ガラート  マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ−０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）  エポキソミシン、ＭＧ１３２、ベータ‐ヒドロキシ‐ベータ‐メチル酪酸又はカルフィルゾミブである。
【００１０】
好ましくは、プロテアソーム阻害剤はドキソルビシン、アクラルビシン又はＭＧ１３２である。
【００１１】
目的遺伝子はオプシンである。オプシン遺伝子の例は、限定されないが、チャネルロドプシン（即ち、チャネルロドプシン‐１、チャネルロドプシン‐２、ボルボックスカルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）チャネルロドプシン１又は２）、メラノプシン、ピノプシン（ｐｉｎｅａｌ  ｏｐｓｉｎ）、フォトプシン、ハロロドプシン、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン又はそれらの機能的バリアント（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ）若しくは断片を含む。
【００１２】
オプシンはチャネルロドプシン、ハロロドプシン、又はそれらの機能的バリアント若しくは断片である。
【００１３】
ウイルスベクターは目的遺伝子（即ち導入遺伝子）をコードするＡＡＶウイルスベクター（即ち、組換えＡＡＶ又はｒＡＡＶ）である。
【００１４】
例えば、ＡＡＶウイルスベクターはＡＡＶ２、ＡＡＶ３、又はＡＡＶ８である。本開示の方法のある実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶ２である。
【００１５】
好ましくは、目的遺伝子は細胞特異的プロモーターに機能的に連結されている。例えば、細胞特異的プロモーターはｍＧｌｕＲ６、ＮＫ−３及びＰｃｐ２  （Ｌ７）である。ある実施形態では、細胞特異的プロモーターはｍＧｌｕＲ６である。
【００１６】
ウイルスベクターはナノ粒子、ポリマー又はリポソームにカプセル化されても良い。
【００１７】
一態様において、プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターは同時に又は連続的に送達される。
【００１８】
本発明は、ウイルスベクターが網膜細胞に送達される方法を提供する。網膜細胞は、網膜神経節細胞、網膜水平細胞、網膜双極細胞、アマクリン細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞又は網膜色素上皮細胞である。
【００１９】
一態様において、プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターは眼の硝子体に投与される。
【００２０】
他の態様において、プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターは、投与が注入又は点滴による経路により投与される。
【００２１】
更なる態様においては、プロテアソーム阻害剤及びウイルスベクターは、網膜下ではない経路により投与される。
【００２２】
本発明はさらに、プロテアソーム阻害剤及びオプシンをコードするウイルスベクターを眼の硝子体に投与することを含む、対象において光感受性を増大又は回復させる方法を提供する。本発明はまた、プロテアソーム阻害剤及びオプシンをコードするウイルスベクターを硝子体に投与することを含む、対象において視覚を改善又は回復させる方法を提供する。
【００２３】
対象における眼疾患又は障害の治療のためのプロテアソーム阻害剤を含む組成物の使用もまた、本明細書において提供される。
【００２４】
対象は眼疾患又は障害を患っている。眼疾患は、網膜芽細胞腫、眼内黒色腫、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症、任意の眼組織の炎症である。好ましくは、眼疾患又は障害は光受容体の変性と関連する。
【００２５】
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が一般的に理解するのと同一の意味を有する。本発明の実施においては、本明細書において記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を使用することできるが、適切な方法及び材料を下に記載する。本明細書において言及するすべての刊行物、特許出願、特許、その他の参照は、その全体が参照により明確に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
【００２６】
さらに、本明細書に記載される材料、方法、及び実施例は単なる実例であり、限定することを意図していない。
【００２７】
本発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求項から明らかであり、それらに含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ−１】図１Ａ、１Ｂは、ウイルス注入の１か月後の網膜双極細胞におけるＡＡＶ媒介の導入遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現に対するプロテアソームの影響を表す１連の写真及びグラフである。図１Ａ：ウイルス形質導入された網膜双極細胞の代表的な画像。ｍＧｌｕＲ６プロモーターを有するｒＡＡＶ２ベクターにより、網膜双極細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの標的発現を達成した。ウイルスベクター（１μ１）を、５ｘ１０１２ｖｇ（ウイルスゲノム接触粒子（ｖｉｒａｌ−Ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅ））／ｍＬの力価で、プロテアソーム阻害剤を含め、又は含めずに約１か月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの眼の硝子体内に注入した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現を評価するために、ウイルス注入の１か月後に動物を安楽死させた。ＤＯＸ：ドキソルビシン、Ａｃｌａ：アクラルビシン、ＭＧ：ＭＧ１３２。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１の続き。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂは、ウイルス注入の１か月後の網膜双極細胞におけるＡＡＶ媒介の導入遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現に対するプロテアソームの影響を表す１連の写真及びグラフである。図１Ｂ：ウイルス注入の１か月後の双極細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度を評価するための統計データ。双極細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現は、３００μＭ以上の濃度でのＤＯＸの同時注入により有意に増大した。
【図２Ａ−１】図２Ａ、２Ｂは、ウイルス注入の３か月後の網膜双極細胞におけるＡＡＶ媒介の導入遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現に対するＤＯＸの影響を表す１連の写真及びグラフである。図２Ａ：ウイルス注入の３か月後のウイルス形質導入された網膜双極細胞の代表的な画像。ウイルスベクターを様々な濃度のＤＯＸと同時注入した。
【図２Ａ−２】図２Ａ−１の続き。
【図２Ｂ】図２Ａ、２Ｂは、ウイルス注入の３か月後の網膜双極細胞におけるＡＡＶ媒介の導入遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現に対するＤＯＸの影響を表す１連の写真及びグラフである。図２Ｂ：  ウイルス注入の３か月後の双極細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度を評価するための統計データ。双極細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの発現は、２００μＭ以上の濃度でのＤＯＸの同時注入により有意に増大した。
【図３Ａ−１】図３Ａ、３Ｂは、ウイルス形質導入された網膜の形態学的特性に対するＤＯＸの影響を表す１連の写真及び１組のグラフである。図３Ａ：様々な濃度のＤＯＸとのウイルスの同時注入の３か月後の網膜垂直断面の代表的な画像。高いＤＯＸ濃度では、双極細胞層がより薄く見える。赤：ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入された双極細胞。緑：ＰＫＣ抗体で標識された桿体双極細胞。青：ＤＡＰＩ染色された核。
【図３Ａ−２】図３Ａ−１の続き。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂは、ウイルス形質導入された網膜の形態学的特性に対するＤＯＸの影響を表す１連の写真及び１組のグラフである。図３Ｂ：光受容細胞体層及び双極細胞層の厚さの比較のための統計データ。ウイルス注入の３か月後に動物を安楽死させた。３００μＭ又は５００μＭの濃度でＤＯＸを同時注入した場合、双極細胞層はコントロールの双極細胞層よりも統計的に薄かった。
【図４Ａ−１】図４Ａ、４Ｂは、網膜神経節細胞に対するＤＯＸの影響を表す１連の写真及びグラフである。図４Ａ：様々な濃度のＤＯＸを用いた、及び用いない、双極細胞でのウイルス形質導入後の、ＤＡＰＩ染色により網膜神経節細胞の密度を評価するための代表的な画像。ウイルス注入の１か月及び３か月後に動物を安楽死させた。
【図４Ａ−２】図４Ａ−１の続き。
【図４Ｂ】図４Ａ、４Ｂは、網膜神経節細胞に対するＤＯＸの影響を表す１連の写真及びグラフである。図４Ｂ：ドキソルビシン（ＤＯＸ）を用いた、及び用いないウイルス注入の１か月及び３か月後の、網膜神経節細胞の密度を評価するための統計データ。３００μＭ及び５００μＭのＤＯＸでのウイルス注入の３か月後、網膜神経節細胞の密度はコントロールの密度よりも統計的に低かった。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、概して、改善された遺伝子治療組成物及び疾患を治療、予防又は改善するために同上のものを使用する方法に関する。遺伝子治療の１つの重要な課題は、対象に送達される治療遺伝子を含む細胞の形質導入効率を増大させることである。
【００３０】
本発明は、一部において、プロテアソーム阻害剤がウイルス媒介形質導入効率を向上させることが見いだされたという、予想外の発見に基づいている。したがって、本発明は、疾患の治療における遺伝子治療の効率を改善させることについての満たされていない臨床ニーズに取り組むものである。
【００３１】
本発明は、プロテアソーム阻害剤及び治療剤を投与することによりウイルス媒介遺伝子送達の効率を向上させるための方法を提供する。治療剤は目的遺伝子をコードするウイルスベクターである。好ましくは、プロテアソーム阻害剤及び治療剤は眼に送達される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤及び治療剤は、網膜及び網膜細胞への送達を向上させるために硝子体に送達されても良い。網膜細胞は、例えば、光受容細胞（例えば、桿体、錐体、及び感光性網膜神経節細胞）、水平細胞、網膜双極細胞、アマクリン細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、及び網膜色素上皮細胞を含む。他の実施形態では、プロテアソーム阻害剤及び治療剤は、例えば、後部、前部、強膜、脈絡膜、結膜、虹彩、水晶体、又は角膜に送達されても良い。
【００３３】
網膜は、桿体及び錐体と呼ばれる特殊な光受容細胞を含む、眼の裏側の複雑な組織である。光受容体は視覚情報の局所処理のための神経細胞のネットワークにつながっている。この情報は脳に送られ、視覚イメージに解読される。網膜は、黄斑変性、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症（ＤＲ）、網膜色素変性（ＲＰ）、緑内障、及び他の遺伝性網膜変性、ブドウ膜炎、網膜剥離、及び眼がん（眼内黒色腫及び網膜芽細胞腫）を含む、様々な疾患にかかりやすい。これらはそれぞれ視覚の損失又は完全な失明につながる可能性がある。
【００３４】
網膜への治療化合物の送達は、眼の構造が複雑であるため、難題である。硝子体内注入及び硝子体送達デバイスは、網膜に治療化合物を送達するために頻繁に使用されるが、送達効率は内境界膜（ＩＬＭ）及び網膜の細胞の多数の層により損なわれる。
【００３５】
プロテアソーム阻害剤及び治療剤は、当該技術分野において知られている任意の方法により眼に送達されても良い。投与経路は、限定されないが、硝子体内、前房内、結膜下、テノン嚢下、眼球後方（ｒｅｔｒｏｂｕｌｂａｒ）、強膜近傍後方（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｊｕｘｔａｓｃｌｅａｌ）、又は局所を含む。送達方法は、例えば、注射器、及び移植された硝子体送達デバイス（即ち、ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ(登録商標)）等の薬剤送達デバイスによる注入を含む。
【００３６】
好ましくは、プロテアソーム阻害剤及び治療剤は、網膜への送達のために硝子体内注入により硝子体に投与される。
【００３７】
一実施形態では、プロテアソーム阻害剤は治療剤と同時に、又は連続的に投与される。同時投与のために、プロテアソーム阻害剤は治療剤と共に、当業者に知られている方法により、送達、例えば注入、に適した単一の組成物中に製剤化することができる。あるいは、プロテアソーム阻害剤は、別々の組成物で、同時に又は連続的に注入することができる。好ましい実施形態では、プロテアソーム阻害剤は治療剤の投与の前に投与しても良い。
【００３８】
このような製剤は、生理的ｐＨを維持するための、緩衝生理食塩水又はその他の緩衝液、例えばＨＥＰＥＳ等の、薬学的に及び／又は生理学的に許容可能なビヒクル、希釈剤、担体又は賦形剤を含む。そのような成分及びそれらの製剤化の議論については、一般的に、Ｇｅｎｎａｒｏ，  ＡＥ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；  ２００３又は最新版を参照。ＷＯ００／１５８２２も参照。製剤を長期間保存する場合は、例えばグリセロールの存在下で、凍結させても良い。
【００３９】
投与されるそのプロテアソーム阻害剤の用量は当業者によって最適化され得る。ある標的眼組織への送達には、標的組織の位置、介在する眼組織、及び薬剤が標的組織に浸透する能力によって、低用量のプロテアソーム阻害剤又は高用量のプロテアソーム阻害剤が必要となり得る。好ましくは、投与されるプロテアソーム阻害剤の用量は、片眼あたり（ｐｅｒ  ｅｙｅ）約５０〜２０００μＭ、好ましくは１００〜１０００μＭである。より好ましくは、片眼あたり２００〜８００μＭである。例えば、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００μＭのプロテアソーム阻害剤が眼に送達される。
【００４０】
プロテアソーム阻害剤は当該技術分野において知られている。例えば、プロテアソーム阻害剤は、ドキソルビシン、アクラルビシン、ボルテゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム  エピガロカテキン−３−ガラート  マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ−０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）  エポキソミシン、ＭＧ１３２、ベータ‐ヒドロキシ‐ベータ‐メチル酪酸又はカルフィルゾミブである。好ましい実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ドキソルビシン、アクラルビシン又はＭＧ１３２である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される向上した送達方法は治療剤の有効性の増大を提供し得る。治療剤の有効性の増大は、治療剤の治療効果を測定することにより決定することができる。治療が対象において症状の改善等の臨床的利益をもたらす場合、治療は有効である。例えば、網膜色素変性等の網膜変性疾患において、光感受性又は別の側面の視覚が改善又は回復された場合、治療が有効である。治療が予防的に適用される場合、「有効」とは、治療が眼疾患若しくは障害を遅らせる若しくは予防する、又は眼疾患若しくは障害の臨床症状の症状を予防若しくは改善することを意味する。有効性は特定の眼疾患又は障害を診断又は治療するための任意の既知の方法と関連して決定される。
【００４２】
本明細書に記載の方法により送達される目的遺伝子は、当該技術分野において疾患を治療、改善、低減、又は予防することで知られている、任意の目的遺伝子（即ち、治療導入遺伝子）である。好ましくは、目的遺伝子（即ち、治療導入遺伝子）は、当該技術分野において眼疾患、眼障害又は眼症状の症状を治療、改善、低減、又は予防することで知られている。
【００４３】
本明細書に記載の方法における使用に適した核酸の例は、限定されないが、治療導入遺伝子（即ち、チャネルオプシン、又はハロロドプシン）、ＲＮＡ干渉分子（即ち、ショートヘアピン、ｓｉＲＮＡ、又はｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードするウイルスベクターを含む。特に好ましい実施形態では、治療剤は遺伝子治療のための導入遺伝子をコードするウイルスベクターである。特に好ましいウイルスベクターは、光感受性を回復させるために網膜で発現させるためのチャネルオプシン又はハロロドプシン等のロドプシンをコードするｒＡＡＶベクターである。
【００４４】
本明細書に記載の方法における使用に適した抗体の例は、限定されないが、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ(登録商標)）、ＶＥＧＦ抗体（Ｅｙｌｅａ(登録商標)）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ(登録商標)）、インフリキシマブ、エタネルセプト、及びアダリムマブを含む。
【００４５】
本明細書に記載の薬剤のいずれかは、任意でナノ粒子、ポリマー又はリポソーム等の担体にカプセル化されても良い。これらの担体は、治療剤の眼への送達をさらに向上させるのに役立つ可能性がある。いくつかの態様では、担体は例えば安定性（半減期）を増加させる、又は治療剤に維持放出性を与える等して、治療剤の性質を変える可能性がある。あるいは、担体は同一の送達用組成物に製剤化された場合、治療剤をプラスミンのタンパク質分解活性から保護し得る。
【００４６】
多数の眼疾患及び障害が様々な眼組織における異常な遺伝子発現に起因するため、遺伝子治療の効果的な治療としての可能性は増大している。しかしながら、眼における遺伝子治療の有効性は、任意の眼組織全般にわたる、治療ウイルスベクターの効率的な送達及び形質導入という課題のために限定されてきた。
【００４７】
したがって、本発明は、眼疾患又は障害を治療するため、又は視覚を回復又は改善させるために、眼への導入遺伝子の送達効率を増大させるための方法を提供する。光感受性又は視覚を回復させるために特に目的となる導入遺伝子は、オプシン遺伝子又はロドプシン遺伝子等の感光性タンパク質（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含む。本明細書において使用される「導入遺伝子」は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝子治療に適した核酸発現ベクター（例えば、ＡＡＶ等のウイルスベクター）中に存在するポリヌクレオチドを指す。
【００４８】
先行研究は、チャネルオプシン‐２等の導入遺伝子をコードする組換えアデノ随伴ウイルスベクターを注入すると、ベクターの送達が悪く、内部の網膜細胞、特に双極細胞におけるＣｈｏｐ２の発現が低くなることを示した。非ヒト霊長類では、ＡＡＶ媒介遺伝子トランスフェクションが周辺網膜、中心窩において、及び血管に沿ってより効率的であることが分かっており、これは網膜と硝子体空間（ｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｓｐａｃｅ）との間の境界である内境界膜（ＩＬＭ）が主要な障壁となることを示唆する（Ｉｖａｎｏｖａ等，２０１０）。
【００４９】
本発明は、プロテアソーム依存ウイルス分解を阻害又は低減するためにプロテアソーム阻害剤を用いることにより、この問題に対する解決策を提供する。したがって、治療剤は網膜、特に網膜双極細胞、網膜神経節細胞、ミュラーグリア細胞、及び網膜色素上皮細胞等の網膜内部の細胞によりアクセスしやすくなる。本明細書に記載の方法は、向上した治療ウイルスベクターの送達を提供する。向上したウイルスベクターの送達は、形質導入効率の増大、治療導入遺伝子（即ち、Ｃｈｏｐ２）の発現の増大、治療化合物の有効性の増大（即ち、光感受性の増大又は視覚の回復）により実証される。
【００５０】
遺伝子治療における使用に適した核酸発現ベクターは当該技術分野において既知である。例えば、核酸発現ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、若しくはレンチウイルスベクター、又は当該技術分野において既知の任意の改変若しくは組換えウイルスベクターであっても良い。特に好ましいウイルスベクターは、アデノ随伴ベクター、例えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２又は当該技術分野において既知の任意の改変若しくは組換えＡＡＶである。特に好ましい実施形態では、ベクターは組換えＡＡＶ−２（ｒＡＡＶ２）である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＶＶ）ベクターは、ベクターの標的細胞、例えば網膜双極細胞（例えばＯＮ又はＯＦＦ型網膜双極細胞；桿体及び錐体双極細胞）、の形質導入効率を改善させることを可能とする、チロシン残基の変異を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの場合には、ｒＡＡＶはさらに、標的細胞において目的タンパク質の発現を駆動することができるプロモーター（例えば、ｍＧｌｕＲ６又はその断片）を含む。
【００５２】
１つの実施形態では、変異は、ＡＡＶ１−１２又はハイブリッドＡＡＶのカプシドタンパク質の任意の１つ以上のチロシン残基において行われても良い。特定の実施形態では、これらは表面に露出したチロシン残基である。関連の実施形態では、チロシン残基はＶＰ１、ＶＰ２又はＶＰ３カプシドタンパク質の一部である。例示的な実施形態では、変異は、ＡＡＶ−ＶＰ３カプシドタンパク質の１つ以上の下記のアミノ酸残基において行われても良い：Ｔｙｒ２５２、Ｔｙｒ２７２、Ｔｙｒ４４４、Ｔｙｒ５００、Ｔｙｒ７００、Ｔｙｒ７０４、Ｔｙｒ７３０；Ｔｙｒ２７５、Ｔｙｒ２８１、Ｔｙｒ５０８、Ｔｙｒ５７６、Ｔｙｒ６１２、Ｔｙｒ６７３又はＴｙｒ７２０。例示的な変異は、限定されないが、Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ２７５Ｆ、Ｙ２８１Ｆ、Ｙ５０８Ｆ、Ｙ５７６Ｆ、Ｙ６１２Ｇ、Ｙ６７３Ｆ及びＹ７２０Ｆを含む、チロシンからフェニルアラニンへの変異である。特定の実施形態では、これらの変異はＡＡＶ２血清型において行われる。いくつかの場合には、ＡＡＶ２血清型はＹ４４４Ｆ変異を含み、及び／又はＡＡＶ８血清型はＹ７３３Ｆ変異を含む。ここで、４４４及び７３３は、ウイルスカプシドのチロシン点変異の位置を示す。さらなる実施形態では、このような変異ＡＡＶ２及びＡＡＶ８血清型は光感受性タンパク質をコードし、また、このような光感受性タンパク質の発現を駆動するために改変ｍＧｌｕＲ６プロモーターを含む。このようなＡＡＶベクターは例えば、Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ等，  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，  ２０１１  １９：２９３−３０１に記載されている。
【００５３】
いくつかの実施形態では、治療導入遺伝子の発現は構成的プロモーター、即ちＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＬＴＲ、により駆動される。他の実施形態では、プロモーターは、誘導性又は細胞特異的プロモーターである。特定の細胞亜集団、即ち網膜神経細胞又は変性細胞、における導入遺伝子の発現を可能にする、細胞型特異的プロモーターが好まれ得る。これらの細胞は、限定されないが、網膜神経節細胞、光受容細胞、双極細胞、桿体双極細胞、ＯＮ−型錐体双極細胞、網膜神経節細胞、感光性網膜神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ＡＩＩアマクリン細胞、又は網膜色素上皮細胞を含み得る。細胞型特異的プロモーターは、当該技術分野においてよく知られている。特に好まれる細胞型特異的プロモーターは、限定されないが、ｍＧｌｕＲ６、ＮＫ−３及びＰｃｐ２（Ｌ７）を含む。発現効率及び選択的標的化を増大させるために当該技術分野において既知の組み換えＤＮＡ技術を用いて改変された細胞型特異的プロモーターもまた、本発明に包含される。例えば、改変ｍＧｌｕＲ６プロモーターは、米国特許出願公開第２０１７−００２１０３８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の、ｍＧｌｕＲ６遺伝子由来の調節エレメントの組み合わせを含む。
【００５４】
本発明の一実施形態において、目的遺伝子（即ち治療導入遺伝子）は任意の光感受性オプシンであっても良い。オプシン遺伝子ファミリーは、脊椎動物（動物）及び無脊椎動物のオプシンを含む。動物のオプシンは、イオンチャネルの活性を調節する、７本の膜貫通へリックスを有するＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲｓ）である。無脊椎動物のロドプシンは、通常はＧＰＣＲｓではなく、光感受性又は光活性化（ｌｉｇｈｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）イオンポンプ又はイオンチャネルである。改変ｍＧｌｕＲ６遺伝子プロモーター、
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【００５５】
本明細書に記載の通り、オプシン遺伝子又は光感受性タンパク質は、限定されないが、チャネルロドプシン、チャネルオプシン（即ちＣｈＲｌ、ＣｈＲ２、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ由来のｖＣｈＲ１、ｖＣｈＲ２、及び任意の脊椎動物、無脊椎動物又は微生物から同定された他のバリアント）、ハロロドプシン（ＮｐＨＲ）、メラノプシン、ピノプシン、フォトプシン、バクテリオロドプシン、プロテオロドプシン、及びその機能的バリアント若しくはキメラを含む。本発明の光感受性タンパク質は、植物、動物、古細菌、藻類、又は細菌の細胞に自然に生じるものであっても良く、あるいは、実験技術を通して作られても良い。オプシン遺伝子の例は、以下でより詳細に議論される。
【００５６】
本発明における導入遺伝子としてのチャネルロドプシン、又はチャネルオプシンの例は、チャネルロドプシンＣｈｏｐ１（ＣｈＲ１としても知られる。）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０５８８９０（配列番号３）／ＡＦ３８５７４８（配列番号４））、Ｃｈｏｐ２（ＣｈＲ２としても知られる）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号  ＡＢ０５８８９１（配列番号５）／ＡＦ４６１３９７（配列番号６））、緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来の２つのロドプシンである（Ｎａｇｅｌ，２００２；Ｎａｇｅｌ，２００３）。
【００５７】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＢ０５８８９０を含むか、又は、これから成る。
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【００５８】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＢＡＢ６８５６６を含むか、又は、これから成る。
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2019518729.tif 000008
【００５９】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＦ３８５７４８を含むか、又は、これから成る。
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【００６０】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＡＬ０８９４６を含むか、又は、これから成る。
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2019518729.tif 000011
【００６１】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＢ０５８８９１を含むか、又は、これから成る。
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2019518729.tif 000013
【００６２】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＢＡＢ６８５６７．１を含むか、又は、これから成る。
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【００６３】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＦ４６１３９７を含むか、又は、これから成る。
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【００６４】
本開示の例示的なＣｈｏｐ１をコードする対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＡＭ１５７７７を含むか、又は、これから成る。
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【００６５】
チャネルオプシンは、発色団ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチナールに結合すると光スイッチ可能（光感受性）となる、７回膜貫通ドメインタンパク質（ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）である。チャネルオプシンは、シッフ塩基結合によりレチナール分子と結合すると光駆動性、非特異的、内向き整流性、陽イオンチャネルの、いわゆるチャネルロドプシンを形成する。これらの光感受性チャネルは、神経組織において発現及び活性化された場合、細胞が光で刺激されたときに脱分極するのを可能とする（Ｂｏｙｄｅｎ，２００５）。Ｃｈｏｐ２断片（３１５アミノ酸）（配列番号７）は、マウスの光受容体変性モデルにおいて光感受性及び視覚を効率よく増大させることが示されている（Ｂｉ等，Ｎｅｕｒｏｎ，２００６、及び米国特許第８，４７０，７９０号；両方とも本明細書に参照により組み込まれる）。
【００６６】
３１５アミノ酸を含む、Ｃｈｏｐ２タンパク質の合成断片
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【００６７】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１３４２９５（本明細書に参照により組み込まれる）に記載のＣｈｏｐ２変異体及びバリアントもまた、本明細書に記載のプロモーターを用いて発現させても良い。本発明はまた、Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉチャネルロドプシン（即ちｖＣｈＲ１及びｖＣｈＲ２）の使用を提供する。
【００６８】
ＮｐＨＲ（ハロロドプシン）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＦ４７４０１８）及び（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ０６４３８７）は好塩好アルカリ性古細菌Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ  ｐｈａｒａｏｎｉに由来する。ある実施形態では、ＮｐＨＲバリアントが作出されても良い。特定の実施形態では、ＮｐＨＲタンパク質に対する単一の又は複数の点変異はＮｐＨＲバリアントをもたらし得る。特定の実施形態では、哺乳類のコドンに最適化したバージョンのＮｐＨＲが使用されても良い。一実施形態では、ＮｐＨＲバリアントが使用される。一つの特定の実施形態では、ｅＮｐＨＲ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＮｐＨＲ）が使用される。アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶをＮｐＨＲのＣ末端に加えるとともに、ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニット由来のシグナルペプチドをＮｐＨＲのＮ末端に加えることにより、ｅＮｐＨＲが構築される。
【００６９】
本開示の例示的なＮｐＨＲ（ハロロドプシン）をコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＥＦ４７４０１８を含むか、又は、これから成る。
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【００７０】
本開示の例示的なＮｐＨＲ（ハロロドプシン）をコードする対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＢＯ６４３８７を含むか、又は、これから成る。
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【００７１】
メラノプシン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号６６９３７０２）及び（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１４７７８９＿１）は、概日リズムの調節、瞳孔対光反射、及びその他の非視覚的な光応答に関与する網膜の特殊な光感受性神経節細胞において発見された光色素（ｐｈｏｔｏｐｉｇｍｅｎｔ）である。構造上、メラノプシンは、Ｇタンパク質共役受容体のレチニリデンタンパク質種（ｒｅｔｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｒｉｅｔｙ）であるオプシンである。メラノプシンは、そのアミノ酸配列と下流シグナル伝達カスケードを含む多くの点において、無脊椎動物のオプシンに似ている。無脊椎動物のオプシンのように、メラノプシンは、双安定の（ｂｉｓｔａｂｌｅ）光色素であり、内因性のフォトイソメラーゼ活性を有すると考えられる。ある実施形態では、メラノプシンのバリアントが作出されても良い。特定の実施形態では、メラノプシンタンパク質に対する単一の又は複数の点変異は、メラノプシンバリアントをもたらし得る。
【００７２】
本開示の例示的なメラノプシンをコードする核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号６６９３７０２を含むか、又は、これから成る。
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【００７３】
本開示の例示的なメラノプシンをコードする対応するアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号ＡＦ１４７７８９１を含むか、又は、これから成る。
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【００７４】
光感受性タンパク質はまた、本明細書に記載の任意の光感受性タンパク質と少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％同一であるタンパク質（即ち、ＣｈＲｌ、ＣｈＲ２、ｖＣｈＲｌ、ｖＣｈＲ２、ＮｐＨＲ及びメラノプシン）を含んでも良い。本発明の光感受性タンパク質はまた、少なくとも１つの変異を有するタンパク質を含んでも良い。当該変異は点変異であっても良い。
【００７５】
いくつかの実施形態では、光感受性タンパク質は、神経回路内のシグナル伝達を調節し、単一の神経細胞のレベルでイオンコンダクタンスの挙動を双方向に制御することができる。いくつかの実施形態では、神経細胞は、網膜神経細胞、網膜双極細胞（例えば、ＯＮ又はＯＦＦ型網膜双極細胞；桿体及び錐体双極細胞）、網膜神経節細胞、光受容細胞、又は網膜アマクリン細胞である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ｐｏｌｙＡ尾部が、本発明の発現カセット又は核酸発現ベクターにおける導入遺伝子の下流に挿入されても良い。適切なｐｏｌｙＡ尾部は、当該技術分野において既知であり、例えば、ヒト成長ホルモンｐｏｌｙＡ尾部（ｈＧＨｐＡ）、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ尾部（ｂＧＨｐＡ）、ウシｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ、及びＡＶ４０ｐＡを含む。
【００７７】
好ましい量の光放射により照射されると、ロドプシンタンパク質はチャネル孔を開き、それを通ってＨ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋及び／又はＣａ２＋イオンが細胞外空間から細胞内に流れ込む。ロドプシンチャネルが活性化すると、典型的には、チャネルを発現する細胞が脱分極する。細胞の脱分極により、緩電位及び又は活動電位が生じ、情報がロドプシン発現細胞から網膜又は脳の他の細胞に運ばれ、光感受性が増大又は視覚が回復する。チャネルオプシン（又はそのバリアント）をコードするベクターを投与することにより視覚又は光感受性を改善する方法は、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６８２６３に記載されており、その内容はその全体において本明細書に組み込まれる。
【００７８】
従って、二重のロドプシン系は視覚処理及び視力に不可欠なＯＮ及びＯＦＦ経路を再現するのに使用することができる。簡潔には、本発明のＣｈｏｐ２タンパク質は特にＯＮ型網膜神経細胞（即ち、ＯＮ型神経節細胞及び／又はＯＮ型双極細胞）を標的とし、一方、低分極光センサー（ｈｙｐｏｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｓｅｎｓｏｒ）（即ち、ハロロドプシン又は当該技術分野において既知の他の塩素イオンポンプ）はＯＦＦ型網膜神経細胞（即ち、ＯＦＦ型神経節細胞及び／又はＯＦＦ型双極細胞）を標的とし、ＯＮ及びＯＦＦ経路を作ることができる。好ましい細胞亜集団を特異的に標的とすることは、様々な細胞型特異的プロモーターを使用することによって、達成することができる。例えば、Ｃｈｏｐ２の発現は、ＯＮ型網膜神経細胞（即ち、ＯＮ型神経節細胞及び／又はＯＮ型双極細胞）における標的化された発現のためにｍＧｌｕＲ６プロモーターにより駆動されても良く、一方、ハロロドプシン等の低分極チャネルの発現は、ＯＦＦ型網膜神経細胞（即ち、ＯＦＦ型神経節細胞及び／又はＯＦＦ型双極細胞）における標的化された発現のためにＮＫ−３プロモーターにより駆動される。
【００７９】
網膜においてＯＮ及びＯＦＦ経路を回復させる別のアプローチは、ＣｈＲ２等の脱分極光センサーを桿体双極細胞又はＡＩＩアマクリンに発現させることにより、達成される。このアプローチでは、桿体双極細胞又はＡＩＩアマクリン細胞の脱分極は、錐体双極細胞及び下流の網膜神経節細胞のレベルでＯＮ及びＯＦＦ応答をもたらすことができる。このようにして、網膜固有のＯＮ及びＯＦＦ経路が維持される。
【００８０】
選択したプロモーター、好ましくは構成的ＣＭＶプロモーター又はｍＧｌｕＲ６等の細胞特異的プロモーター、の制御下でロドプシンＤＮＡをコードする核酸配列を有するｒＡＡＶビリオンの有効量は、好ましくは、１回の注入当たり約２５〜約８００μｌの体積で約１０１０〜約１０１３ｒＡＡＶの感染単位の範囲にある。ｒＡＡＶ感染単位は、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ＳＫ等，１９８８，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２：１９６３に従って測定できる。より好ましくは、有効量は約１０１０〜約１０１２ｒＡＡＶ感染単位であり、注入量は、好ましくは約５０〜約１５０μｌである。好ましくはこれらの範囲内であるがこれらの範囲外であっても良い、他の投与量及び体積は、年齢、体重、健康全般、特定の眼障害の性質及び重症度を含む、治療されている対象（好ましくはヒト）の身体的状態を考慮して、治療専門家により選択されても良い。
【００８１】
追加用量（「ブースター」）の本核酸又はｒＡＡＶ組成物を投与することが望ましい場合もある。例えば、眼の標的細胞内における導入遺伝子の発現の継続時間に応じて、６カ月後又は年１回、二次治療が施されても良く、同様に繰り返されても良い。使用される経路及び用量を考慮すると、ＡＡＶに対する中和抗体は生成しないと予想され、それにより反復治療ラウンドが可能となる。
【００８２】
このような追加用量が必要か否かは、例えば、よく知られる電気生理学的試験、他の網膜及び視覚機能の試験及び視覚行動試験を用いて、治療専門家により監視され得る。治療専門家は、当該技術分野における通常の技能を適用し、適切な試験を選択することができる。単一又は複数用量でより多い容量の組成物を注入し、関連する結果パラメーターをさらに改善することが望ましい場合がある。
【００８３】
眼障害
本発明の方法が対象とし、１つ以上の視覚パラメーターを改善するために使用され得る眼障害は、限定されないが、眼の前部及び後部の両方に発症する発達異常を含む。前部の障害は、緑内障、白内障、角膜ジストロフィー、円錐角膜を含む。後部の障害は、網膜ジストロフィー及び網膜変性により引き起こされる光受容体の機能不全及び／又は死によりもたらされる、失明性障害（ｂｌｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）を含む。網膜障害は、先天性停止性夜盲、加齢黄斑変性、先天性錐体ジストロフィー及び網膜色素変性（ＲＰ）関連障害の大きな群を含む。これらの障害は、様々な年齢で発生する、遺伝的に起こりやすい網膜における光受容細胞、桿体及び錐体の死を含む。これらには、年齢とともに進行し、小児期から成人早期に失明を引き起こすＲＰ自体のサブタイプ等の重度の網膜症、及び頻繁に小児期、早ければ生後１年にも視覚の損失をもたらすＬＣＡの遺伝的サブタイプ等のＲＰ関連疾患が含まれる。後者の障害は一般的に、光受容細胞、桿体及び錐体の重度の減少、時には完全な損失により特徴づけられる。本明細書に記載の方法から恩恵を受け得る他の眼疾患は、限定されないが、網膜芽細胞腫、眼内黒色腫、糖尿病網膜症、高血圧性網膜症、任意の眼組織の炎症（即ち、脈絡網膜炎、強膜炎、角膜炎、ブドウ膜炎等）、又は感染症（即ち、細菌感染又はウイルス感染）を含む。
【００８４】
特に、本発明の方法を用いたウイルス媒介のロドプシンの送達は、機能が損失するにも関わらず眼組織の構造が長期間保存されること、及び機能の損失と対象の眼の細胞における正常な遺伝子の欠陥又は欠如とが関連することにより特徴づけられる、ＲＰＥ関連の網膜症等の眼障害により視覚を損失した対象に対する治療及び／又は少なくとも一部の視覚の回復に有益である。様々なこのような障害、例えば小児期発症の失明性疾患（ｂｌｉｎｄｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、網膜色素変性、黄斑変性、及び糖尿病網膜症、並びに当該技術分野において既知の眼の失明性疾患等が知られている。これらの他の障害、並びに後に上記と同一の記載により特徴づけられる、現在知られていない原因の盲目性疾患もまた、本明細書に記載の方法によりうまく治療し得ることが予測される。このように、本発明により治療される特定の眼障害は、上述の障害及びまだそれほど特徴づけられていない多数の疾患を含み得る。
【００８５】
光感受性の回復
これらの本明細書に記載の方法は、正常な及び／又は損なわれた視覚を有する対象において使用され得る。本明細書に記載の向上した治療化合物の送達は、視覚を保存、改善又は回復させ得る。本明細書において使用される「視覚（ｖｉｓｉｏｎ）」という用語は、生物が識別又は活動のための刺激として光を有用に検出する能力と定義される。視覚は下記を包含することが意図されている：
１．光の検出と知覚‐光が存在するか否か認識する能力；
２．光投影能（ｌｉｇｈｔ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）‐光刺激が来る方向を認識する能力；
３．分解能‐格子又は文字標的において、異なる明るさ（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）レベル（即ちコントラスト）を検出する能力；及び
４．認識‐視覚標的の形状を、標的内の異なるコントラストレベルを参照することにより認識する能力。
このように、「視覚」は光の存在を単純に検出する能力を含む。本発明の方法は視覚を改善又は回復させるために使用することができ、視覚の改善又は回復は、例えば光の検出又は知覚の増大、光刺激への応答における光感受性又は感光性の増大、光刺激が来る方向を認識する能力の増大、異なる明るさレベルを検出する能力の増大、視覚標的の形状を認識する能力の増大、及び視覚誘発電位又は網膜から皮質への伝達の増大を含む。このように、視覚の改善又は回復は、視力の完全な回復（即ち、本発明により治療される患者の視覚が罹患していない個体の視覚の程度にまで回復される）を含んでも良く、又は含まなくても良い。下述の動物実験において記載される視覚の回復は、ヒトの場合には、完全な視力を回復させずに視覚の一側面（即ち、光感受性又は視覚誘発電位）を増大させることにより、そのヒトを視覚機能の低い状態にする可能性がある。それにも関わらず、そのようなレベルにすることは大きな利益となるだろう。なぜなら、これらの個体は移動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）において、及び潜在的に低分解能のタスクにおいて訓練され得、それにより全盲に比べて大きく改善されたレベルの視覚的な独立が彼らに提供されるからである。基本的な光の知覚でさえ視覚に障害のある個体により使用され得、その視覚は本組成物及び方法を用いて改善され、特定の日常のタスクを達成し、一般的な移動性、能力及び生活の質を改善する。
【００８６】
視覚の回復の程度は、例えば、Ｃｈｏｐ２、ハロロドプシン又はその両方等の治療導入遺伝子をコードするＤＮＡを含むベクターの投与前、及び好ましくは投与後の視覚の測定により決定され得る。視覚は、任意の当該技術分野において周知の多くの方法、又はまだ確立されていない方法を用いて測定され得る。本発明により改善又は回復された視覚は、以下の視覚応答のいずれかにより測定され得る：
１．光刺激への暴露後の対象による光検出応答‐この応答では、光が点灯したときの対象個体による光のおおよその方向の指示又は動作という信頼できる反応についての証拠が求められる；
２．光刺激への暴露後の対象による光投影応答、この応答では、光が点灯したときの個体による特定の光の方向の指示又は動作という信頼できる応答についての証拠が求められる；
３．明対暗パターンの視覚刺激の対象による光分解能、これは、以下により証明される、明対暗パターンの視覚刺激を解像する対象の能力を測定する：
ａ．  実証可能で信頼できる視運動的に生じる、標的（上記を参照）を追っていることを実証する眼振様の眼の動き及び／又は関連する頭部又は体の動きの存在、及び／又は
ｂ．  パターン化視覚刺激を識別し、このような識別を、例えば指さし又はバー若しくはボタンを押すことを含む非言語的手段又は言語的手段により示す、信頼できる能力の存在；又は、
４．閃光刺激又はパターン化視覚刺激に対する視覚皮質応答の電気的記録、これは回復した網膜から視覚皮質への電気的伝達のエンドポイントであり、視覚誘発電位（ＶＥＰ）とも呼ばれる。測定は、皮質表面における、視覚皮質領域の頭皮表面における電気的記録、及び／又は視覚皮質の細胞内の記録により行われても良い。
【００８７】
このように、本発明による視覚の改善又は回復は、限定されないが、網膜細胞の光刺激に応答した光電流の振幅若しくは動態、又は電気的応答の増大、網膜細胞の光感受性の増大（即ち、光刺激に応答した光電流又は電気的応答の開始に必要な光強度の閾値を低下させ、それにより、光電流を誘発するのにより少ない又はより弱い光しか必要としないこと）、光誘発スパイク又はスパイク発火の数又は振幅の増大、網膜又は網膜細胞から視覚皮質又は脳に伝達される視覚誘発電位の増大を含む、視覚皮質への光応答の増大を含み得る。
【００８８】
本発明の様々なパラメーターを評価するために、ヒトの失明性眼障害の認められた動物モデルを含む、インビトロとインビボの研究の両方を使用し得る。ヒト網膜症、例えば小児期の失明の大型動物モデルは有用である。本明細書に提供される実施例により、当業者はこの方法が様々な網膜疾患の治療に同様に使用され得ることを容易に予測することができる。
【００８９】
他者による先行研究では、遺伝子治療技術により網膜変性が遅らされ得ることが実証されたが、本発明は、行動パラメーターを含む視覚の様々なパラメーターを生成又は改善することが予想される明白な生理学的機能の回復を実証する。
【００９０】
行動測定は、既知の動物モデル及び試験、例えば、視覚が保存又は様々な程度にまで回復された対象が光に向かって泳ぐ水迷路における成績を用いて得ることができる（Ｈａｙｅｓ，ＪＭ等，１９９３，Ｂｅｈａｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：３９５−４０３）。
【００９１】
失明が成人期に誘発される、又は先天性失明が十分遅く進行し個体が視覚を失う前に視覚を経験するモデルでは、様々な試験において対象の訓練を行うことができる。この方法では、視覚の損失後にこれらの試験を再度行い、視覚回復効果に関し本組成物及び方法の有効性を試験する場合、動物は盲目の状態で新たにタスクを学習しなくても良い。他の行動試験は学習を必要とせず、特定の行動の本能の状態（ｉｎｓｔｉｎｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）に依存する。例は、視運動性眼振試験である（Ｂａｌｋｅｍａ  ＧＷ等，１９８４，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２５：７９５−８００；Ｍｉｔｃｈｉｎｅｒ  ＪＣ等，１９７６，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．  １６：１１６９−７１）。
【００９２】
本発明はまた、当該技術分野において視覚を改善又は回復させることが知られている、他の形態の視覚治療と組み合わせて使用され得る。例えば、網膜インプラント、皮質インプラント、外側膝状体核インプラント、又は視神経インプラントを含む視覚プロテーゼ（ｖｉｓｕａｌ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）の使用。このように、本方法を用いた生存網膜神経の遺伝子組み換えに加え、治療を受ける対象は、当該分子的方法が用いられる前、それと同時、又はその後に、視覚プロテーゼを提供されても良い。視覚プロテーゼの有効性は個体を訓練することにより改善され、従って本明細書に企図される患者の細胞のＣｈｏｐ２形質転換の潜在的な影響を向上し得る。（ｉ）様々なレベルの光及び／又はパターン化刺激、及び／又は（ｉｉ）当業者に理解されるような一般的な光源又は物体からの環境刺激、を認識するよう対象を訓練することにより特徴づけられる習慣訓練（ｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎ  ｔｒａｉｎｉｎｇ）；及び訓練しない場合よりも効率的に近くの物体を視覚的に検出し該物体の間を移動するよう、対象を訓練することにより特徴づけられる定位移動訓練（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｔｒａｉｎｉｎｇ）等の、訓練方法。実際、低視覚リハビリテーションの分野において典型的に使用される任意の視覚刺激技術が、本明細書において適用することができる。
【００９３】
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本発明の目的のために、下記の用語は以下に定義される。
【００９４】
「ベクター」という用語は、本明細書において他の核酸分子を導入又は輸送することができる核酸分子を指すために使用される。導入される核酸は一般的に、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入される。ベクターは、細胞内において自己複製を誘導する配列を含んでも良く、また、宿主細胞のＤＮＡへの組み込みを可能とするのに十分な配列を含んでも良い。有用なベクターは、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体及びウイルスベクターを含む。有用なウイルスベクターは、例えば、複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスを含む。
【００９５】
当業者には明白であるように、「ウイルスベクター」という用語は、通常核酸分子の導入又は細胞ゲノムへの組み込みを促進するウイルス由来の核酸要素を含む核酸分子（例えば、トランスファープラスミド）を指すか、又は、核酸の導入を媒介するウイルス粒子を指すために、広く使用される。ウイルス粒子は、通常様々なウイルス成分、場合によっては核酸に加え宿主細胞の成分も含む。
【００９６】
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞に導入することができるウイルス若しくはウイルス粒子、又は導入される核酸自体を示し得る。ウイルスベクター及びトランスファープラスミドは、主にウイルス由来の構造的及び／又は機能的遺伝因子（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む。「アデノ随伴ウイルスベクター」という用語は、主にアデノウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝因子、又はそれらの一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的及び機能的遺伝因子、又はそれらの一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来する、ＬＴＲを含む、構造的及び機能的遺伝因子、又はそれらの一部を含むウイルスベクター又はプラスミドを指す。「ハイブリッド」という用語は、ウイルス及び非ウイルスの配列の両方を含むベクター、ＬＴＲ、又は他の核酸を指す。
【００９７】
特定の態様では、「ウイルスベクター」、「ウイルス発現ベクター」という用語は、ウイルスのトランスファープラスミド、及び／又は感染性ウイルス粒子を指すために使用され得る。本明細書においてクローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）等の要素に言及する場合、これらの要素の配列は、本発明のウイルス粒子においてＲＮＡの形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドにおいてはＤＮＡの形態で存在すると理解すべきである。
【００９８】
プロウイルスの各末端には、「長い末端反復（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）」又は「ＬＴＲ」と呼ばれる構造がある。「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、自然の配列の状態では、順向きの反復（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔｓ）であり、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域を含む、レトロウイルスＤＮＡの末端に局在する塩基対ドメインを指す。ＬＴＲは一般的に、ウイルス遺伝子の発現（例えば促進、開始及び遺伝子転写産物のポリアデニル化）及びウイルス複製に不可欠な機能を与える。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル並びにウイルスゲノムの複製及び組み込みに必要な配列を含む、多数の調節シグナルを含む。ウイルスのＬＴＲはＵ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域はエンハンサー及びプロモーターエレメントを有する。Ｕ５領域はプライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（反復）領域はＵ３及びＵ５領域に挟まれている。Ｕ３、Ｒ及びＵ５領域から成るＬＴＲは、ウイルスゲノムの５’及び３’末端の両方に出現する。５’ＬＴＲの近隣には、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）及びウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（Ｐｓｉ部位）がある。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」又は「パッケージング配列」という用語は、ウイルスゲノム内にある、ウイルスＲＮＡのウイルスカプシド又は粒子への挿入に必要な配列を指す（Ｃｌｅｖｅｒ等，１９９５．  Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照）。本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「ｐｓｉ」という用語、及び「ＰＳＩ」という記号は、ウイルス粒子の形成の際にレトロウイルスのＲＮＡ鎖がカプシドで包まれるのに必要な非コード配列を指すのに使用される。
【０１００】
様々な態様において、ベクターは改変された５’ＬＴＲ及び／又は３’ＬＴＲを含む。３’ＬＴＲの改変は、ウイルスを複製欠損とすることによりウイルス系の安全性を改善するためによく行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、感染性ビリオンが産生されないような、完全で効果的な複製ができないウイルスを指す（例えば、複製欠損レンチウイルス子孫）。「複製可能」という用語は、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生できるような、複製することができる野生型ウイルス又は変異体ウイルスを指す（例えば、複製可能レンチウイルス子孫）。
【０１０１】
「自己不活性化（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）」（ＳＩＮ）ベクターは、ウイルス複製の第１ラウンドを超えたウイルス転写を防ぐために、Ｒ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー‐プロモーター領域が（例えば、欠失及び／又は置換により）改変された、複製欠損ベクターを指す。これは、右（３’）ＬＴＲのＵ３領域がウイルス複製の際に左（５’）ＬＴＲのＵ３領域のテンプレートとして使用され、従って、Ｕ３エンハンサー‐プロモーターがなければウイルス転写物が生じないからである。本発明のさらなる態様では、Ｕ５領域が例えば、異種又は合成のｐｏｌｙ（Ａ）配列、１つ以上のインスレーターエレメント、及び／又は誘導性プロモーターに置換されるよう、３’ＬＴＲが改変される。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、又は３’と５’ＬＴＲの両方への改変等のＬＴＲへの改変もまた、本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１０２】
５’ＬＴＲのＵ３領域を、ウイルス粒子の産生の際ウイルスゲノムの転写を駆動する異種プロモーターに置き換えることにより、さらに安全性が向上する。使用可能な異種プロモーターの例は、例えば、ウイルスのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期又は後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば前初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターを含む。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ−非依存的方法で高い転写レベルを駆動することができる。この置換は、複製可能ウイルスを生成する組換えの可能性を低減させる。なぜなら、当該ウイルス産生系には完全なＵ３配列がないからである。特定の態様では、異種プロモーターは誘導性であっても良く、ウイルスゲノムの全部又は一部の転写は１つ以上の誘導因子が存在する場合にのみ起こる。誘導因子は、限定されないが、１つ以上の化学的化合物、又は宿主細胞が培養される温度やｐＨ等の生理学的条件を含む。
【０１０３】
いくつかの態様では、ウイルスベクターはＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えばＨＩＶ）のＬＴＲのＲ領域にある「トランス‐活性化応答（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」遺伝因子を指す。この因子はウイルスのトランスアクチベーター（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔａｔ））遺伝因子と相互作用してウイルス複製を向上させる。しかし、この因子は、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターに置き換えられる態様では、必要とされない。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、配列がＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２等のレトロウイルスのセントラルポリプリン領域及びセントラルターミネーション配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）を含む核酸を指す。適切なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ等，  ２０００，  Ｃｅｌｌ，  １０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１逆転写の際、セントラルポリプリン領域（ｃＰＰＴ）でのプラス鎖ＤＮＡの中央開始、及びセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）での中央終結により、３本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１セントラルＤＮＡフラップが形成される。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、ＤＮＡフラップはレンチウイルスゲノムの核内インポートのシス‐作用性決定因子（ｃｉｓ−ａｃｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）として機能する可能性があり、及び／又は、ウイルス力価を増加させる可能性がある。特定の態様では、レトロウイルス又はレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の異種目的遺伝子の上流又は下流に１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の態様では、トランスファープラスミドがＦＬＡＰエレメントを含む。一態様では、本発明のベクターはＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
【０１０５】
一態様では、ウイルスのトランスファーベクターは、１つ以上のエクスポートエレメントを含む。「エクスポートエレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写産物の輸送を調節する、シス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡエクスポートエレメントの例は、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えばＣｕｌｌｅｎ等，  １９９１．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：  １０５３；及びＣｕｌｌｅｎ等，  １９９１．  Ｃｅｌｌ  ５８：  ４２３を参照）、及びＢ型肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）を含む。一般的に、ＲＮＡエクスポートエレメントは遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つ又は複数コピーとして挿入され得る。
【０１０６】
特定の態様では、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的ポリアデニル化部位、及び、任意で転写終結シグナルをベクターに組み込むことにより増大する。様々な転写後調節エレメントは、タンパク質での異種核酸の発現を増大させ得る、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ等，１９９９，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、及びＢ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）など（Ｌｉｕ等，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）。特定の態様では、本発明のベクターはＷＰＲＥ又はＨＰＲＥ等の転写後調節エレメントを欠く、又は含まない。なぜなら、ある場合にはこれらのエレメントは、細胞の形質転換のリスクを増大させ、及び／又はｍＲＮＡ転写産物の量又はｍＲＮＡの安定性を実質的に若しくは著しく増大させないためである。従って、いくつかの態様では、本発明のベクターは、追加の安全対策として、ＷＰＲＥ又はＨＰＲＥを欠く、又は含まない。
【０１０７】
効率的な終結及び異種核酸転写産物のポリアデニル化を誘導するエレメントは、異種遺伝子発現を増大させる。転写終結シグナルは一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。本明細書で使用される「ｐｏｌｙＡ部位」又は「ｐｏｌｙＡ配列」という用語は、終結及びＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物のポリアデニル化の両方を誘導するＤＮＡ配列を示す。ｐｏｌｙＡ尾部を欠く転写産物は不安定ですぐに分解されるため、組み換え転写産物の効率的なポリアデニル化は望ましい。本発明のベクターに使用され得るｐｏｌｙＡシグナルの説明となる例は、理想的なｐｏｌｙＡ配列（例えばＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ  ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンｐｏｌｙＡ配列（ＢＧＨｐＡ），ウサギβ‐グロビンｐｏｌｙＡ  配列（ｒ．ｂｅｔａ．ｇｐＡ）、又は当該技術分野において既知の他の適切な異種若しくは内生ｐｏｌｙＡ配列を含む。
【０１０８】
特定の態様では、ウイルスベクターはさらに、１つ以上のインスレーターエレメントを含む。インスレーターエレメントは、ゲノムＤＮＡに存在するシス作用性エレメントにより媒介され得、導入配列の発現の脱調節をもたらす、組み込み部位の影響（即ち、位置効果；例えばＢｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ等，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、及びＺｈａｎ等，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照）から、レンチウイルス‐発現配列、例えば治療ポリペプチドを保護することに寄与し得る。特定の態様では、トランスファーベクターは３’ＬＴＲに１つ以上のインスレーターエレメントを有し、プロウイルスが宿主ゲノムへ組み込まれると、当該プロウイルスは３’ＬＴＲの複製により５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの両方に１つ以上のインスレーターを有することとなる。本発明での使用に適したインスレーターは、限定されないが、ニワトリβ‐グロビンインスレーターを含む（例えば、本明細書に参照により組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ等，  １９９３．Ｃｅｌｌ  ７４：５０５、Ｃｈｕｎｇ等，１９９７．ＰＮＡＳ  ９４：５７５、及びＢｅｌｌ等，１９９９．Ｃｅｌｌ  ９８：３８７を参照）。インスレーターエレメントの例は、限定されないが、ニワトリＨＳ４等のβ‐グロビン遺伝子座由来のインスレーターを含む。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「形質導入効率を増大させるのに十分な時間」という用語は、細胞集団がプロテアソーム阻害剤とともに培養され、細胞集団がアデノウイルス等の遺伝子送達媒体と接触し、高い形質導入効率（プロテアソーム阻害剤なしで同様の遺伝子送達媒体と接触する同様の細胞集団と比較した、遺伝子送達媒体により形質導入される細胞のパーセンテージとして定義される）で、細胞が遺伝子送達媒体により形質導入される時間を指す。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「形質導入効率」という用語は、プロスタグランジンシグナル伝達を増大させる化合物と共に培養され、遺伝子送達媒体により形質導入される細胞の、増大させる化合物なしで同様の遺伝子送達媒体と接触する同様の細胞集団と比較した、パーセンテージを指す。
【０１１１】
「小分子」、「有機小分子」、又は「小分子化合物」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、又は約０．５ｋＤ未満の分子量を有する、低分子量の化合物を指す。特定の態様では、小分子は、核酸、ペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、及び他の有機小分子化合物又は薬剤等を含み得る。菌類、細菌、又は藻類の抽出物等の化学的及び／又は生物学的混合物のライブラリーが当該技術分野において知られており、本発明の任意のアッセイでスクリーニングされても良い。分子ライブラリーの合成方法の例は以下に見られる：Ｃａｒｅｌｌ等，１９９４ａ；Ｃａｒｅｌｌ等，１９９４ｂ；Ｃｈｏ等，１９９３；ＤｅＷｉｔｔ等，１９９３；Ｇａｌｌｏｐ等，１９９４；  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ等，１９９４。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは１本鎖及び２本鎖ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の参照配列（例えば、配列リストを参照）に対し少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はバリアントを含み、典型的には当該バリアントは参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する。様々な実例となる態様では、本発明は一部では、ウイルスベクター及びトランスファープラスミドポリヌクレオチド配列及び同上のものを含む組成物を企図する。特定の態様では、本発明は、１つ以上の治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び／又は他の目的遺伝子を提供する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」等の用語は、以下に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズする、参照ポリヌクレオチド配列又はポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語は、参照ポリヌクレオチドと比較して１つ以上の核酸が付加、欠失、又は異なる核酸と置換されているポリヌクレオチドを含む。これに関し、変異、付加、欠失及び置換を含む、特定の改変が参照配列に対し行われ、それにより改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は活性を保持することは、当該技術分野においてよく理解されていることである。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、本来の状態では通常付随する成分を実質的に又は本質的に含まない物質、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞を意味する。特定の態様では、「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」又は「由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は単離されたと同義に用いられる。例えば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、天然の状態において隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、そのフラグメントに通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。
【０１１５】
ポリヌクレオチドの方向を表す用語は、５’（通常遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。５’から３’への方向であるか３’から５’への方向であるかについてポリヌクレオチド配列に注釈がつけられ得る。
【０１１６】
「相補的」及び「相補性」との用語は、塩基対合則により結び付けられるポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列はよく、左に５’末端、右に３’末端を有する逆相補体５’ＣＡＴＧＡＣＴ３として記載される。配列がその逆相補配列と同じ配列は、回文配列であると言われる。「相補性」は「部分的」であり、いくつかの核酸の塩基のみが塩基対合則により符合されても良い。又は、核酸間に「完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」又は「全（ｔｏｔａｌ）」相補性があっても良い。
【０１１７】
本明細書で使用される「核酸カセット」という用語は、ＲＮＡを発現させ続いてポリペプチドを発現させることのできるベクター内の遺伝子配列を指す。一態様では、核酸カセットは目的遺伝子、例えば目的ポリヌクレオチドを含む。別の態様では、核酸カセットは１つ以上の発現制御配列及び目的遺伝子、例えば目的ポリヌクレオチドを含む。ベクターは１、２、３、４、５又はそれ以上の核酸カセットを含んでも良い。カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要な場合はタンパク質又はポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞内で活性に必要な適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画を標的とすること又は細胞外区画への分泌により生物活性のために適切な区画に移行させられるよう、核酸カセットはベクター内で位置及び順序が決められる。好ましくは、カセットはベクターへの迅速な挿入に適した３’及び５’末端を有し、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明の好ましい態様では、核酸カセットは、眼障害などの遺伝性障害を治療、予防、又は改善するのに使用される治療遺伝子の配列を含む。カセットは単一ユニットとして取り出され、プラスミド又はウイルスベクターに挿入され得る。
【０１１８】
ポリヌクレオチドは目的ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「目的ポリヌクレオチド」という用語は、発現ベクターに挿入される１つ以上のポリヌクレオチド、例えばポリペプチド（即ち目的ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。
【０１１９】
「発現制御配列」という用語は、機能的に連結されたポリヌクレオチドの転写又は発現を誘導、増大、調節、又は制御することができる、１つ以上のプロモーター、エンハンサー、他の転写制御エレメント又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチド配列を指す。特定の態様では、本発明のベクターは、特定の細胞、細胞型、又は細胞系統、例えば標的細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む。すなわち、特定の細胞、細胞型、又は細胞系統に特異的な発現制御配列に機能的に連結されているポリヌクレオチドの発現は、標的細胞で発現され、他の非標的細胞では発現されない。各々の１つ以上の細胞特異的なベクター内発現制御配列は、所望の治療に応じて同一の又は異なる細胞型で発現しても良い。好ましい態様では、ベクターは、造血細胞、例えば造血幹細胞又は造血前駆細胞、に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む。他の好ましい態様では、ベクターは、赤血球細胞に特異的な１つ以上の発現制御配列を含む。
【０１２０】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の認識部位を指す。「エンハンサー」という用語は、転写を向上させることのできる配列を含み、ある場合には他の制御配列に対する向きとは独立して機能し得るＤＮＡ部分を指す。エンハンサーはプロモーター及び／又は他のエンハンサーエレメントと協調的に又は相加的に機能し得る。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方を与えることのできる配列を含むＤＮＡ部分を指す。
【０１２１】
特定の態様では、本発明のベクターは、外来、内在、又は異種のプロモーター及び／又はエンハンサー等の制御配列を含む。「内在」制御配列とは、本来ゲノム内で特定の遺伝子に天然で連結されている制御配列である。「外来」制御配列とは、遺伝子の転写が連結されるエンハンサー／プロモーターにより誘導されるよう、遺伝子操作という手段（即ち、分子生物学的技術）により遺伝子に並列に置かれる制御配列である。「異種」制御配列とは、遺伝的に操作される細胞と異なる種に由来する外来配列である。「合成」制御配列は、１つ以上の内在及び／又は外来配列、及び／又はインビトロ若しくはインシリコで特定の遺伝子治療について最適なプロモーター及び／又はエンハンサー活性を与えると判定された配列のエレメントを含み得る。
【０１２２】
「機能的に連結された」という用語は、記載された構成要素が意図されたように機能することができる関係にあるよう並置されていることを指す。一態様では、当該用語は、核酸発現制御配列（プロモーター及び／若しくはエンハンサー、又は他の発現制御配列）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば目的ポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指令することを指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、機能的に連結された配列の転写を継続的（ｃｏｎｔｉｎｕａｌｌｙ）又は連続的に（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ）可能とするプロモーター、エンハンサー、又はプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多種多様な細胞及び組織種での発現を可能とする「ユビキタス」プロモーター、エンハンサー若しくはプロモーター／エンハンサー、又は限られた種類の細胞及び組織種での発現を可能とする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系統特異的」、若しくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー若しくはプロモーター／エンハンサーであっても良い。実例となるユビキタス発現制御配列は、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ウイルスのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期又は後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５及びＰ１１プロモーター、伸長因子１−α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １−ａｌｐｈａ、ＥＦ１ａ）プロモーター、初期成長応答１（ｅａｒｌｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  １、ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａβ１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β‐キネシン（ｂｅｔａ−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ等，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，  １４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター、及びβ‐アクチンプロモーターを含む。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、限定されないが、誘導性の発現、抑制可能な発現、特定の生理学的、生物学的、又は疾患の状態等を有する細胞若しくは組織での発現を含む、任意のタイプの条件付き発現を指し得る。この定義は細胞型又は組織特異的な発現を除外することを意図しない。本発明の特定の態様は、目的ポリヌクレオチドの条件付き発現を提供する。例えば、ポリヌクレオチドを発現させる、又は目的ポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現を増大若しくは減少させる処理または条件を、細胞、組織、生物等に課すことで、発現が制御される。
【０１２５】
誘導性プロモーター／システムの実例となる例は、限定されないが、グルココルチコイド又はエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター等のステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理により誘導可能）、メタロチオネインプロモーター（様々な重金属での処理により誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンにより誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン‐調整可能システム（Ｓｉｒｉｎ等，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節システム等を含む。
【０１２６】
条件付き発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを用いることにより達成されても良い。本発明の特定の態様によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される少なくとも１つの（典型的には２つの）組み換え部位を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」又は「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０等）の組み換え部位を伴う組み換え反応に関与する切除性の（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）又は融合性の（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）タンパク質、酵素、補因子又は関連タンパク質を含み、それらは野生型のタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７  （１９９３）を参照）、又はそれらの変異体、誘導体（例えば、組み換えタンパク質の配列又はその断片を含む融合タンパク質）、断片及びバリアントであっても良い。本発明の特定の態様での使用に適したリコンビナーゼの実例となる例は、限定されないが、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、．ＰＨＩ．Ｃ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１及びＰａｒＡを含む。
【０１２７】
ベクターは、任意の多種多様な部位特異的リコンビナーゼのための１つ以上の組み換え部位を含んでも良い。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位はベクターの組み込みに必要な任意の部位に追加的であることは理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「組み換え配列」、「組み換え部位」、又は「部位特異的組み換え部位」とは、リコンビナーゼが認識し結合する特定の核酸配列を示す。
【０１２８】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの１つの組み換え部位は、８塩基対のコア配列を挟む２つの１３塩基対の逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照）。他の例示的なｌｏｘＰ部位は、限定されないが、１ｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：２２８７−２３００，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ及びＳａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ；２５：２８２８−２８３４，１９９７）；ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ及びＳａｉｔｏ，Ｇｅｎｅ．２１６：５５−６５，１９９８）；ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ及びＳａｉｔｏ，Ｇｅｎｅ．２１６：５５−６５，１９９８）；ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：３０６７−３０７７，２００２）；ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．；７：６４９−６５９，１９９５）及びｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ等，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．；７：６４９−６５９，１９９５）を含む。
【０１２９】
ＦＬＰリコンビナーゼに適した認識部位は、限定されないが、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ等，１９９６）、Ｆｌ、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ及びＢｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ及びＢｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ等，１９８８）及びＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ等，１９８８）を含む。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」又は「ＩＲＥＳ」とは、シストロン（タンパク質をコードする領域）のＡＴＧ等の開始コドンへの直接の内部リボソーム侵入を促進し、それにより遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ等，１９９０．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３、並びにＪａｃｋｓｏｎ及びＫａｍｉｎｓｋｉ．  １９９５．  ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照。特定の態様では、本発明により企図されているベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的ポリヌクレオチドを含む。特定の態様では、複数のポリペプチド各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列又は自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により分離されても良い。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「コザック（Ｋｏｚａｋ）配列」とは、リボソーム小サブユニットへのｍＲＮＡの最初の結合を大きく促進し、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号１）である。ここで、Ｒはプリン（Ａ又はＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．  Ｃｅｌｌ．  ４４（２）：２８３−９２，及びＫｏｚａｋ，１９８７．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５（２０）：８１２５−４８）。特定の態様では、本発明により企図されるベクターは、コンセンサスコザック配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１３２】
特定の態様では、ベクターは選択可能マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）とも呼ばれる選択遺伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ）を含む。例示的な選択遺伝子、例えばバチルスのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、メトトレキサート、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）、ブラストサイジン（Ｂｌａｓｔｏｃｉｄｉｎ）、又はテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。任意の数の選択システムが形質転換された細胞系統を回収するのに使用され得る。これらは限定されないが、ｔｋ−、ａｐｒｔ−細胞でそれぞれ使用され得る単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ等，１９７７．  Ｃｅｌｌ  １１：２２３−２３２）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ等，１９９０．  Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−８２３）を含む。
【０１３３】
様々な態様において、本発明のベクターは、１つ以上のポリペプチドの発現を増大、確立、及び／又は維持させるために使用される。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書において同義で使用され、アミノ酸残基のポリマー、並びにそのバリアント及び合成類似体を指す。従って、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成非天然のアミノ酸、例えば対応する天然アミノ酸の化学的類似体、であるアミノ酸ポリマー、及び天然のアミノ酸ポリマーに適用する
【０１３４】
本発明の特定の態様はまた、ポリペプチド「バリアント」を含む。ポリペプチド「バリアント」との記載は、少なくとも１アミノ酸残基の付加、欠失、トランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、及び／又は置換により参照ポリペプチドと区別され、生物学的活性を保持するポリペプチドを指す。特定の態様では、ポリペプチドバリアントは、当該分野において知られているように、保存的又は非保存的であっても良い１つ以上の置換により参照ポリペプチドと区別される。
【０１３５】
特定の態様では、バリアントポリペプチドは、対応する参照ポリペプチド配列に対し少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、アミノ酸の付加又は欠失は参照ポリペプチドのＣ−末端及び／又はＮ−末端で起こる。
【０１３６】
上述の通り、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、トランケーション、及び挿入を含む様々な方法により改変され得る。このような操作のための方法は、当該技術分野において一般的に知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントはＤＮＡの変異により調製され得る。当然変異生成及びヌクレオチド配列改変のための方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ等（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．  Ｄ．等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ，１９８７）及びそれらに引用される参考文献を参照。目的タンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ等，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見つけられ得る。
【０１３７】
「宿主細胞」は、本発明の組み換えベクター又はポリヌクレオチドによりｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクト、感染、又は形質導入される細胞を含む。宿主細胞はパッケージング細胞、プロデューサー細胞、及びウイルスベクターが感染した細胞を含み得る。特定の態様では、本発明のウイルスベクターが感染した宿主細胞は治療の必要のある対象に投与される。特定の態様では、「標的細胞」という用語は宿主細胞と同義に使用され、トランスフェクト、感染、形質導入された、所望の細胞型の細胞を指す。
【０１３８】
ウイルス粒子の大量生産は適度なウイルス力価を達成するのに大抵必要となる。ウイルス粒子は、ウイルスの構造及び／又はアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、若しくはｎｅｆ遺伝子、又は他のレトロウイルス遺伝子、を含むパッケージング細胞系統にトランスファーベクターをトランスフェクトすることにより、産生される。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠き、１、２、３、４、又はそれ以上の数のウイルス構造及び／又はアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター又はウイルスベクターを指す。典型的には、パッケージングベクターはパッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入又は感染により細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入又は感染のための方法は当業者により広く知られている。本発明のレトロウイルス／レンチウイルストランスファーベクターは、トランスフェクション、形質導入又は感染によりパッケージング細胞系統に導入され、プロデューサー細胞又は細胞系統を生成し得る。本発明のパッケージングベクターは、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションを含む標準的な方法により、ヒト細胞又は細胞系統に導入されても良い。いくつかの態様では、パッケージングベクターが、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎ合成酵素、又はＡＤＡ等の優性選択マーカーと共に、細胞に導入された後、適切な薬剤の存在下で選択されクローンが単離される。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクターによりコードされる遺伝子に、例えばＩＲＥＳ又は自己切断ウイルスペプチドによって物理的に結合されても良い。
【０１４０】
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、前記細胞系統により生成される組み換えレトロウイルスにより最終的に感染され形質転換され得る宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ及びＥＩＶ等のレンチウイルスの場合、ｅｎｖタンパク質はｇｐ４１及びｇｐ１２０を含む。好ましくは、前述のように本発明のパッケージング細胞により発現されるウイルスｅｎｖタンパク質は、ウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子とは別のベクター上でコードされる。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞系統」という用語は、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を安定的に又は一時的に発現させる、細胞系統を指すのに使用される。任意の適切な細胞系統が、本発明のパッケージング細胞を用意するのに使用され得る。一般的に細胞は哺乳類細胞である。特定の態様において、パッケージング細胞系統を生産するのに使用される細胞はヒト細胞である。使用され得る適切な細胞系統は、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ  ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ  １細胞、ＢＳＣ  ４０細胞、ＢＭＴ  １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣＳ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞を含む。好ましい態様では、パッケージング細胞は２９３細胞、２９３Ｔ細胞、又はＡ５４９細胞である。他の好ましい態様では、細胞はＡ５４９細胞である。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞系統」という用語は、組み換えレトロウイルス粒子を産生することのできる細胞系統を指し、パッケージング細胞系統及びパッケージングシグナルを有するトランスファーベクターコンストラクトを含む。感染性ウイルス粒子及びウイルスストック溶液の生産は、従来の技術を用いて行われても良い。ウイルスストック溶液を調製する方法は、当該技術分野において既知であり、Ｙ．  Ｓｏｎｅｏｋａ等（１９９５）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：６２８−６３３、及びＮ．  Ｒ．  Ｌａｎｄａｕ等（１９９２）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：５１１０−５１１３により例示されている。感染性ウイルス粒子は従来の技術を用いてパッケージング細胞から回収されても良い。例えば、当該技術分野で既知のように、感染性粒子は細胞溶解又は細胞培養の上清の回収により回収され得る。必要な場合は、任意で、回収されたウイルス粒子は精製されても良い。適切な精製技術は当業者によく知られている。
【０１４３】
「向上する」、「促進する」、「増大する」、又は「拡大する」により、一般的に、本発明の組成物及び／又は方法が、ビヒクル又はコントロール分子／組成物により形質導入される細胞の数に比べ、多数の形質導入細胞を誘発し、引き起こし、又は生産することができることを指す。一実施形態では、本発明の組成物及び方法で形質導入される造血幹細胞は、既存の形質導入組成物及び方法に比べ、形質導入細胞の数の増大を含む。細胞形質導入の増大は、当該技術分野において既知の方法、特にレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、及び、細胞表面のタンパク質発現など、を用いて確かめられ得る。「増加した」又は「向上した」形質導入細胞の量は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、ビヒクル、コントロール組成物、又は他の形質導入方法により形質導入される細胞数の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍又はそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（すべての整数とその間で１より大きい小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８等、を含む）である増大を含み得る。
【０１４４】
「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「低下させる（ｌｏｗｅｒ）」、「少なくする（ｌｅｓｓｅｎ）」、「低減させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、及び「弱める（ａｂａｔｅ）」により、一般的に、本発明に記載の組成物及び／又は方法で形質導入される細胞に比べ、形質導入される細胞が比較的少なくなる組成物又は方法を指す。「減少した」又は「低減した」形質導入細胞の量とは、典型的には、「統計学的に有意な」量であり、本発明に記載の組成物及び／又は方法により生産される形質導入細胞の数（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍又はそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（すべての整数とその間で１より大きい小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８等、を含む）である減少を含み得る。
【０１４５】
「維持する」、「保存する」、「維持すること」、「変化のない」、「実質的に変化のない」、又は「実質的に減少させない」により、一般的に、ビヒクルとコントロール分子／組成物のいずれかにより引き起こされる応答又は特定の細胞系統における応答に匹敵する生理学的応答を指す。匹敵する応答とは、参照応答と著しい差異、又は測定可能な差異のない応答である。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「対象」は個体を意味する。従って、「対象」は、飼い慣らされた動物（例えばネコ、イヌ等）、家畜（例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット等）及びトリを含み得る。「対象」はまた、霊長類又はヒト等の哺乳類を含み得る。好ましくは、対象はヒトである。「それを必要とする対象」とは、眼疾患又は障害に罹患した、又は発症若しくは罹患のリスクを有する対象である。眼疾患又は障害を発症又は罹患するリスクを有する対象は、当該技術分野における常法を用いて医師又は眼の専門家により診断され得る。
【０１４７】
本明細書で使用される「治療」又は「治療すること」は、疾患又は病的状態の症状又は病状に対する任意の有益な又は好ましい影響を含み、治療される疾患又は状態の１つ以上の測定可能なマーカーの減少をたとえ最小限でも含み得る。治療は、疾患若しくは状態の症状の低減若しくは改善、又は疾患若しくは状態の進行を遅らせることを任意で含み得る。「治療」は、疾患、状態、又はそれらの関連症状の完全な根絶又は治癒を必ずしも示すものではない。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、及び「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」等の同様の単語は、疾患又は状態の発生又は再発の可能性を予防、阻害、又は低減させるためのアプローチを示す。それはまた、疾患若しくは状態の発症若しくは再発を遅らせること、又は疾患若しくは状態の症状の発生若しくは再発を遅らせることを指す。本明細書で使用される場合、「予防」及び同様の単語はまた、疾患又は状態の発症又は再発の前に、疾患又は状態の強さ、影響、症状及び／又は負荷を低減させることを含む。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益な若しくは所望の予防又は治療結果を達成するための、ウイルス又は形質導入治療細胞の「有効な量（ａｍｏｕｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」又は「有効量（ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を指す。
【０１５０】
「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するのに有効なウイルス又は形質導入治療細胞の量を指す。必ずではないが典型的には、予防用量は疾患の前又は初期段階で対象に使用されるため、予防上有効な量は治療上有効な量よりも少ない。
【０１５１】
ウイルス又は形質導入治療細胞の「治療上有効な量」は、個体の病状、年齢、性別、及び体重等の要素、並びに幹細胞及び前駆細胞が個体において所望の応答を誘発する能力に応じて、異なり得る。治療上有効な量はまた、任意のウイルス又は形質導入治療細胞の毒性の又は有害な効果よりも治療上有益な効果が上回る量である。「治療上有効な量」という用語は、対象（例えば患者）を「治療する」のに有効な量を含む。
【０１５２】
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という冠詞は、本明細書において１つ又は１つ以上（即ち少なくとも１つ）の冠詞の文法上の対象を指すのに使用される。例として、「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つのエレメント又は１つ以上のエレメントを意味する。
【０１５３】
選択肢（例えば「又は（ｏｒ）」）の使用は選択肢の一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義に使用される。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」又は「おおよそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、参照の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、又は長さに対し１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％程異なる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一態様では、「約」又は「おおよそ」という用語は、参照の量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％又は±１％である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、又は長さの範囲を指す。
【０１５５】
本明細書を通して、文脈上他の意味に解す必要がある場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、述べられた工程、要素、又は工程若しくは要素のグループを含むことを意味し、他のいかなる工程、要素、又は工程若しくは要素のグループを除外することを意味しないことは理解されるだろう。「から成る」とは、「から成る」という語句に続くものすべてを含み、かつ、それらに限定されることを意味する。従って、「から成る」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素は存在しなくても良いことを示す。「から本質的に成る」という語句は、当該語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素についての本開示において詳述される活性又は作用を妨げず、又はそれらに貢献しない他の要素に限定される要素を含むことを意味する。従って、「から本質的に成る」という語句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意ではなく、列挙された要素の活性又は作用に影響するか否かに応じて存在してもしなくても良いことを示す。
【実施例】
【０１５６】
［実施例１：網膜双極細胞におけるＡＡＶ媒介形質導入効率に対するプロテアソーム阻害剤の評価］
導入遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙの発現を用いてＭＶ形質導入効率を評価した。ｍＧｌｕＲ６プロモーターを有するｒＭＶ２ベクターにより、網膜双極細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙの標的発現を達成した。ｒＭＶベクターを、５ｘ１０１２  ｖｇ（ウイルスゲノム接触粒子（ｖｉｒａｌ−Ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ  ｐａｒｔｉｃｌｅ））／ｍＬの濃度で、約１か月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの眼の硝子体内にプロテアソーム阻害剤と共に、又は阻害剤なしで注入した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現を評価するために、ウイルス注入の約１か月後に動物を安楽死させた。
【０１５７】
結果：３つのプロテアソーム阻害剤、ＭＧ１３２、ドキソルビシン、及びアクラルビシンの、網膜双極細胞におけるｒＭＶ媒介形質導入効率に対する影響を試験した。２００μＭ〜８００μＭのドキソルビシンで処理した網膜は、濃度依存的な形質導入効率の増大を示した。２０００Ｍの濃度のドキソルビシンは、網膜が薄くなることから明らかなように、細胞毒性を生じさせ、ｍＣｈｅｒｒｙ発現双極細胞の数を減少させた。ＭＶ形質導入効率を向上させるのに最適なドキソルビシンの濃度は５００μＭであった。ＭＧ１３２（１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ）、及びアクラルビシン（５０μＭ、１００μＭ）は形質導入効率を向上させることは確認されなかった（図１〜４）。
【０１５８】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、上述の記載は説明することを目的とし、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを目的としない。他の態様、利益、及び改変は、本願の特許請求の範囲に含まれる。
【０１５９】
本明細書で参照される特許及び科学文献は、当業者が利用できる知識を定める。本明細書に引用されるすべての米国特許及び発行若しくは未発行の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用されるすべての発行された外国の特許及び特許出願は、本明細書に参照により組み込まれる。本明細書に引用される、すべての他の発行された参照、文書、写本、及び科学文献は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０１６０】
本発明はその好ましい実施形態に言及して具体的に明らかにされ、説明されているが、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から離れずに、その中で形態及び細部において様々な変更を行い得ることは、当業者により理解されるだろう。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月22日(2019.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明はさらに、プロテアソーム阻害剤及びオプシンをコードするウイルスベクターを眼の硝子体に投与することを含む、対象において光感受性を増大又は回復させる方法を提供する。本発明はまた、プロテアソーム阻害剤及びオプシンをコードするウイルスベクターを眼の硝子体に投与することを含む、対象において視覚を改善又は回復させる方法を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「形質導入効率」という用語は、プロスタグランジンシグナル伝達を増大させる化合物と共に培養され、遺伝子送達媒体により形質導入される細胞の、プロスタグランジンシグナル伝達を増大させる化合物なしで同様の遺伝子送達媒体と接触する同様の細胞集団と比較した、パーセンテージを指す。
【国際調査報告】
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