(57)【要約】本開示により提供されるのは、抗体に有用な性質を付与するＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域を含む抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である。ある特定の実施形態において、そのような性質として、熱安定性（例えば、上昇した融点）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡとの効率的な結合、またはその両方が挙げられる。ある特定の態様において、抗体は、腫瘍関連抗原ＥｐｈＡ２に特異的に結合する内部移行抗体である。【選択図】図１
2019515645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）抗体であって、以下：
以下を含むＶＨ：
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
以下を含むＶＨ  ＣＤＲ２
１７のアミノ酸からなる以下のアミノ酸配列：
Ｘ１７ＩＳＰＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）、
配列中：
Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；
Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰであり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴであり；
ならびに
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；ならびに
以下を含むＶＬ：
アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；
アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及び
アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３；
を含み、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、前記抗体。
【請求項２】
プロテインＡと結合するポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
ａ）ＸａＸ１７ＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号１９８）、配列中
Ｘａは、Ｓ、Ｔ、またはＡであり；
Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、Ｎ、またはＨであり、
Ｘ１８及びＸ１９は、任意のアミノ酸であり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴであり；
ｂ）ＸａＶＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号１９９）、配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、またはＮであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｐ、またはＳであり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴであり；
ｃ）ＸａＶＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号２００）、配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、またはＮであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり；及び
Ｘ２０は、ＴまたはＫであり；
あるいは
ｄ）ＸａＸ１７ＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号２０１）、配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７は、Ｖであり；
Ｘｂは、Ｐであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり；及び
Ｘ２０は、ＴまたはＫである、
を含む、前記ポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、配列番号１７７〜１９７のうち１つのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、以下：
ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１７７〜２０１のうち１つのアミノ酸配列を含むプロテインＡ結合配列；及び
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＶＨ及びＶＬを含む抗体であって、前記ＶＨは、請求項２から４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、前記抗体。
【請求項６】
前記抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、以下：
（ａ）アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むヒトＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むヒトＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸であり、
（ｃ）アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むヒトＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸であり、
（ｄ）アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むヒトＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、またはＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸であり
（ｅ）アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むヒトＶＬフレームワーク領域２（ＶＬ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸であり、ならびに
（ｆ）アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むヒトＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、またはＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸であり、ならびに
（ｇ）アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むヒトＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、またはＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である、
からなる群より選択される少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項１または６に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体は、以下：
（ａ）アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むヒトＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、
（ｂ）アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含むヒトＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、
（ｃ）アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むヒトＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸であり、
（ｄ）アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むヒトＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、またはＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸であり
（ｅ）アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むヒトＶＬフレームワーク領域２（ＶＬ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸であり、ならびに
（ｆ）アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むヒトＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、またはＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸であり、ならびに
（ｇ）アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むヒトＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、またはＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である、
からなる群より選択される少なくとも１つのフレームワーク領域を含む、請求項５または７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号８）を含むＶＨ  ＦＲ１を含む、請求項１及び５から７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号９）またはＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴ（配列番号１０）を含む、請求項１及び６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、かつ配列中、Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸である、請求項１及び５から１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、かつ配列中、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＴであり、及びＸ７はＴである、請求項１及び５から１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、かつ配列中、Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、及びＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸である、請求項１及び５から１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、かつ配列中、Ｘ８はＳであり、またはＸ９はＴである、請求項１及び５から１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、かつ配列中、Ｘ８はＳであり、及びＸ９はＴである、請求項１及び５から１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬ  ＦＲ２を含み、かつ配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸である、請求項１及び５から１６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記抗体は、アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬ  ＦＲ２を含み、かつ配列中、Ｘ１０はＫである、請求項１及び５から１６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬ  ＦＲ３を含み、かつ配列中、Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、及びＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸である、請求項１及び５から１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２０】
前記抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬ  ＦＲ３を含み、かつ配列中、Ｘ１１はＳであり、Ｘ１２はＳであり、Ｘ１３はＴであり、またはＸ１４はＡである、請求項１及び５から１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２１】
前記抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）を含み、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、及びＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である、請求項１及び５から１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
前記抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬ  ＦＲ３を含み、配列中：Ｘ１５はＳであり、またはＸ１６はＧである、請求項１及び５から１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２３】
前記抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）を含み、配列中：Ｘ１５はＳであり、及びＸ１６はＧである、請求項１及び５から１８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２４】
以下：
アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬフレームワーク領域２（ＶＬ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸であり；ならびに
アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中、Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、及びＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸である、
を含む、請求項１または６に記載の抗体。
【請求項２５】
以下：
アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、またはＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸であり；ならびに
アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、及びＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である、
を含む、請求項１、６、または２４に記載の抗体。
【請求項２６】
以下
アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬフレームワーク領域２（ＶＬ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸であり；ならびに
アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中、Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、及びＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸である、
を含む、請求項５または７に記載の抗体。
【請求項２７】
以下：
アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸であり；
アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、またはＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸であり；及び
アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、及びＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である、
を含む、請求項５、６、または２６に記載の抗体。
【請求項２８】
前記抗体は、示差走査蛍光定量法を用いて測定した場合に６７℃以上の融点（Ｔｍ）を有する、請求項１及び５から２７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体は、ヒト抗体である、請求項１及び５から２７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３０】
前記抗体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＩｇＧ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、または（ｓｃＦｖ’）２である、請求項１及び５から２７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体は、ｓｃＦｖである、請求項１及び５から２７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３２】
前記ＶＨ  ＣＤＲ２の前記Ｘ１７は、Ｖであり；Ｘ１８は、ＨまたはＤであり；Ｘ１９は、ＨまたはＮであり；及びＸ２０は、Ｔである、請求項１及び５から３１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３３】
前記ＶＨ  ＣＤＲ２は、以下：
ａ．ＶＩＳＰＡＧＮＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）、
ｂ．ＶＩＳＰＡＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）、
ｃ．ＶＩＳＰＤＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）、
ｄ．ＶＩＳＰＨＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）、
ｅ．ＶＩＳＲＲＧＤＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、
ｆ．ＶＩＳＮＮＧＨＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、
ｇ．ＶＩＳＰＡＧＰＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）、
ｈ．ＶＩＳＰＳＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）、
ｉ．ＶＩＳＰＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１）、
ｊ．ＡＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２）、
ｋ．ＶＩＳＰＴＧＡＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３３）、
ｌ．ＶＩＳＰＨＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）、
ｍ．ＶＩＳＮＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３５）、
ｎ．ＶＩＳＰＡＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３６）、
ｏ．ＶＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）、
ｐ．ＶＩＳＨＤＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、
ｑ．ＶＩＳＲＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９）、及び
ｒ．ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４０）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１及び５から３２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】
抗体であって、以下
ＶＨ配列、前記ＶＨ配列は、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で：
（ｉ）ＶＨ  ＦＲ１配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）、
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ１  ＳＹＡＭＨ（配列番号１０）、
（ｉｉｉ）ＶＨ  ＦＲ２配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴ（配列番号３）または
ＶＨ  ＦＲ２配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号２）、いずれか
（ｉｖ）ＶＨ  ＣＤＲ２配列Ｘ１７ＩＳＰＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）、
（ｖ）ＶＨ  ＦＲ３配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号４）、
（ｖｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１２）、
（ｖｉｉ）ＶＨ  ＦＲ４配列ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５）、
を含み、
ならびに
ＶＬ配列、前記ＶＬ配列は、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で：
（ｖｉｉｉ）ＶＬ  ＦＲ１配列ＳＳＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＶＴＩＴＣ（配列番号６）、
（ｉｘ）ＶＬ  ＣＤＲ１配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号１３）、
（ｘ）ＶＬ  ＦＲ２配列ＷＹＱＱＫＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号７）、
（ｘｉ）ＶＬ  ＣＤＲ２配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号１４）、
（ｘｉｉ）ＶＬ  ＦＲ３配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＴＳＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号８）、
（ｘｉｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号１５）、
（ｘｉｖ）ＶＬ  ＦＲ４配列ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号９）、
を含み、
かつ配列中
Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、またはＰであり；及びＸ２０は、ＫまたはＴである、
を含む、前記抗体。
【請求項３５】
前記ＶＨ  ＣＤＲ２は、以下：
ａ．ＶＩＳＰＡＧＮＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）、
ｂ．ＶＩＳＰＡＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）、
ｃ．ＶＩＳＰＤＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）、
ｄ．ＶＩＳＰＨＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）、
ｅ．ＶＩＳＲＲＧＤＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、
ｆ．ＶＩＳＮＮＧＨＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、
ｇ．ＶＩＳＰＡＧＰＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）、
ｈ．ＶＩＳＰＳＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）、
ｉ．ＶＩＳＰＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１）、
ｊ．ＡＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２）、
ｋ．ＶＩＳＰＴＧＡＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３３）、
ｌ．ＶＩＳＰＨＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）、
ｍ．ＶＩＳＮＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３５）、
ｎ．ＶＩＳＰＡＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３６）、
ｏ．ＶＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）、
ｐ．ＶＩＳＨＤＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、
ｑ．ＶＩＳＲＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９）、及び
ｒ．ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４０）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
ＶＨ及びＶＬを含む抗体であって、前記ＶＨ及びＶＬは、以下：
配列番号６０［ｓｃＦｖ１］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号６２［ｓｃＦｖ２］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号６４［ｓｃＦｖ３］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号６６［ｓｃＦｖ４］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号６８［ｓｃＦｖ５］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号７０［ｓｃＦｖ６］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号７２［ｓｃＦｖ７］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号７４［ｓｃＦｖ８］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号７６［ｓｃＦｖ９］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号７８［ｓｃＦｖ１０］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号８０［ｓｃＦｖ１１］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号８２［ｓｃＦｖ１２］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号８４［ｓｃＦｖ１３］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号８６［ｓｃＦｖ１４］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号８８［ｓｃＦｖ１５］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号９０［ｓｃＦｖ１６］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号９２［ｓｃＦｖ１７］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号９４［ｓｃＦｖ１８］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号９６［ｓｃＦｖ１９］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号９８［ｓｃＦｖ２０］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
配列番号１００［ｓｃＦｖ２１］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、または
配列番号１０２［ｓｃＦｖ２２］のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、
と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、前記抗体。
【請求項３７】
ｓｃＦｖである抗体であって、以下：
以下を含むＶＨ：
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
以下の１８のアミノ酸配列のうち１つを有するＶＨ  ＣＤＲ２：
（Ｉ）ＶＩＳＰＡＧＮＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２３）、
（ＩＩ）ＶＩＳＰＡＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２４）、
（ＩＩＩ）ＶＩＳＰＤＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２５）、
（ＩＶ）ＶＩＳＰＨＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）、
（Ｖ）ＶＩＳＲＲＧＤＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２７）、
（ＶＩ）ＶＩＳＮＮＧＨＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２８）、
（ＶＩＩ）ＶＩＳＰＡＧＰＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２９）、
（ＶＩＩＩ）ＶＩＳＰＳＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）、
（ＩＸ）ＶＩＳＰＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１）、
（Ｘ）ＡＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３２）、
（ＸＩ）ＶＩＳＰＴＧＡＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３３）、
（ＸＩＩ）ＶＩＳＰＨＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３４）、
（ＸＩＩＩ）ＶＩＳＮＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３５）、
（ＸＩＶ）ＶＩＳＰＡＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３６）、
（ＸＶ）ＶＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３７）、
（ＸＶＩ）ＶＩＳＨＤＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、
（ＸＶＩＩ）ＶＩＳＲＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３９）、または
（ＸＶＩＩＩ）ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４０）
及び
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
を含み、
前記ＶＨ  ＣＤＲは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し：ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、
ならびに、前記ｓｃＦｖは、さらに以下：
以下を含むＶＬ：
アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を有するＶＬ  ＣＤＲ３；
を含み、
前記ＶＬ  ＣＤＲは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し：ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３；
前記ｓｃＦｖは、さらに、以下のヒトフレームワーク：
ＶＨ  ＦＲ１  ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号８）
ＶＨ  ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号９）
ＶＨ  ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１１）
ＶＨ  ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
ＶＬ  ＦＲ１  ＳＳＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＶＴＩＴＣ（配列番号１３）
ＶＬ  ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１４）
ＶＬ  ＦＲ３  ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＴＳＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１５）
及び
ＶＬ  ＦＲ４  ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１６）
を含み、
かつ前記抗体は、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する、前記抗体。
【請求項３８】
前記ＶＨは、前記ＶＬに対してアミノ末端側である、請求項３７に記載のｓｃＦｖである抗体。
【請求項３９】
前記ｓｃＦｖは、少なくとも約６７℃のＴｍを示す、請求項３７または３８に記載のｓｃＦｖである抗体。
【請求項４０】
前記ｓｃＦｖは、少なくとも約７０℃のＴｍを示す、請求項３７から３９のいずれか１項に記載のｓｃＦｖである抗体。
【請求項４１】
前記ＶＨは、前記ＶＬに対してアミノ末端側であり、長さが１０〜３０アミノ酸のポリペプチドリンカーを介して前記ＶＬと連結されている、請求項１及び５から４０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４２】
前記リンカーは、以下：
ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、
ＡＳＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号４４）、
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号４５）、
ＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＴＳＧＳ（配列番号４６）、及び
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４７）
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１及び５から４１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４３】
前記ｓｃＦｖリンカーは、配列ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を含む、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
ＶＨ及びＶＬを含む抗体であって、前記ＶＨは、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、または１７５のアミノ酸配列と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記抗体。
【請求項４５】
前記ＶＬは、配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、または１７６のアミノ酸配列と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
ｓｃＦｖである抗体であって、以下：
配列番号６０［ｓｃＦｖ１］、
配列番号６２［ｓｃＦｖ２］、
配列番号６４［ｓｃＦｖ３］、
配列番号６６［ｓｃＦｖ４］、
配列番号６８［ｓｃＦｖ５］、
配列番号７０［ｓｃＦｖ６］、
配列番号７２［ｓｃＦｖ７］。
配列番号７４［ｓｃＦｖ８］、
配列番号７６［ｓｃＦｖ９］、
配列番号７８［ｓｃＦｖ１０］、
配列番号８０［ｓｃＦｖ１１］、
配列番号８２［ｓｃＦｖ１２］、
配列番号８４［ｓｃＦｖ１３］、
配列番号８６［ｓｃＦｖ１４］、
配列番号８８［ｓｃＦｖ１５］、
配列番号９０［ｓｃＦｖ１６］、
配列番号９２［ｓｃＦｖ１７］、
配列番号９４［ｓｃＦｖ１８］、
配列番号９６［ｓｃＦｖ１９］、
配列番号９８［ｓｃＦｖ２０］、
配列番号１００［ｓｃＦｖ２１］、または
配列番号１０２［ｓｃＦｖ２２］、
のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、前記抗体。
【請求項４７】
さらに、Ｃ末端に、ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号５４）を含む、請求項１及び５から４６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４８】
請求項１及び５から４７のいずれか１項に記載の抗体またはｓｃＦｖ、及び前記抗体と結合した部分、を含む抗体複合体。
【請求項４９】
前記部分は、脂質ナノ粒子である、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５０】
前記脂質ナノ粒子は、リポソームである、請求項４９に記載の複合体。
【請求項５１】
前記部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５２】
前記部分は、治療薬を含む、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５３】
前記治療薬は、細胞毒性剤である、請求項５２に記載の複合体。
【請求項５４】
前記部分は、検出可能な標識を含む、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５５】
前記検出可能な標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影剤である、請求項５４に記載の複合体。
【請求項５６】
以下：
請求項１及び５から５５のいずれか１項に記載の抗体、ｓｃＦｖ、または抗体複合体；及び
薬学上許容される担体、
を含む、組成物。
【請求項５７】
前記組成物は、非経口投与用に配合される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
容器に入った請求項５６または５７に記載の組成物を含む、キット。
【請求項５９】
請求項１から４７のいずれか１項に記載の抗体、ポリペプチド、またはｓｃＦｖをコードする、核酸。
【請求項６０】
請求項１から４７のいずれか１項に記載の抗体またはｓｃＦｖの、可変軽鎖ポリペプチド、可変重鎖ポリペプチド、またはその両方をコードする、単離された核酸。
【請求項６１】
以下：
請求項５９または６０に記載の核酸；及び
前記核酸と機能的に連結した真核生物プロモーター、
を含む、発現ベクター。
【請求項６２】
請求項６１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６３】
前記細胞は、前記可変軽鎖ポリペプチド、前記可変重鎖ポリペプチド、またはその両方を発現する、請求項６２に記載の宿主細胞。
【請求項６４】
ＥｐｈＡ２発現がんを有する対象の治療方法であって、前記方法は、以下：
ＥｐｈＡ２発現がんを有する対象に、請求項１及び５から５５に記載の抗体、ｓｃＦｖ、または抗体複合体、あるいは請求項５６または５７に記載の組成物を投与すること
を含む、前記方法。
【請求項６５】
ＥｐｈＡ２発現がんの治療に使用するための組成物であって、前記組成物は、請求項１及び５から５５のいずれか１項に記載の抗体、ｓｃＦｖ、または抗体複合体、あるいは請求項５６または５７に記載の組成物を含む、前記組成物。
【請求項６６】
ＥｐｈＡ２発現がんの治療における組成物の使用であって、前記組成物は、請求項１及び５から５５のいずれか１項に記載の抗体、ｓｃＦｖ、または抗体複合体、あるいは請求項５６または５７に記載の組成物を含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年３月１６日出願の米国仮出願第６２／３０９，３６５号、及び２０１６年３月１６日出願の米国仮出願第６２／３０９，３８３号、及び２０１６年３月１６日出願の米国仮出願第６２／３０９，３７４号の優先権を主張し、これらはそれぞれ、その全体が本明細書に参照として援用される。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞は、様々なタンパク質を異常発現することが多く、例えば、細胞表面受容体などある特定の細胞表面抗原の発現または過剰発現が起こる。そのような異常発現したタンパク質は、治療抗体の標的として活用することができ、複数のがんで発現する細胞表面受容体に特異的な抗体は、標的免疫療法の開発に利用されてきた。そうした治療薬の多くは、抗体薬物複合体（免疫リポソーム及び免疫毒素を含む）、及び抗体による標的指向性核酸送達ビヒクルも含めて、細胞表面抗原に結合するだけでなく、結合することで細胞内への内部移行も起こす抗体を必要とする。例えば、がん細胞が発現する細胞表面受容体を認識する抗体は、既に化学療法薬との結合が行われており、現在、ホジキンリンパ腫（ブレンツキシマブベドチン）及び転移性乳癌（アド−トラスツズマブエムタンシン）の治療に使用されている。
【０００３】
治療のための標的に検討されている細胞表面受容体の１つは、複数のがんで異常発現することが知られていることから、ＥｐｈＡ２である。ＵＳ９，２２０，７７２の記載によれば、抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ抗体は、多段階スクリーニングプロセスを用いて単離され、このプロセスは、ヒト乳癌細胞を用いて内部移行する抗体を選出する最初の総合ファージ選択、続いてＥｐｈＡ２の細胞外ドメインを発現する酵母菌に対する結合で選出することを含む。抗体Ｄ２−１Ａ７は、ＥｐｈＡ２発現細胞により強力に取り込まれるリガンドブロックｓｃＦｖとして同定された。
【０００４】
抗体安定性は、着実かつ規模変更が可能な抗体製造プロセスを可能にする、有用な性質である。さらに、治療用途の抗体製造を促進するために、抗体は、親和性樹脂で精製することが可能であることが望ましい。ほとんどの治療用抗体について、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、初期の重要な工程である。なぜなら、これは、複合溶液、例えば回収した細胞培養液などから抗体と選択的かつ効率的に結合することが可能であり、１回の工程で生成不純物の＞９９．５％を除去して、大幅なウイルスクリアランスをもたらすからである。
【０００５】
細胞表面受容体に結合し、しかも工業生産及び医薬用途に適した安定性及び他の製造関連性質を示す新規抗体は引き続き必要とされている。本明細書に開示される新規改変抗体は、この需要を解決するとともに、さらなる利点を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、抗体に有用な性質を付与するＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域を含む抗体（例えば、ｓｃＦｖ）を提供する。ある特定の実施形態において、そのような性質として、熱安定性（例えば、上昇した融点）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡとの効率的な結合、またはその両方が挙げられる。ある特定の態様において、抗体は、腫瘍関連抗原ＥｐｈＡ２に特異的に結合する内部移行抗体である。
【０００７】
本開示は、熱安定性を持つ（≧６７℃または≧７０℃の融点を示す）内部移行する抗ＥｐｈＡ２抗体（Ａｂ）（例えば、ｓｃＦｖ）を提供する。同じく提供されるのは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓプロテインＡとの実質的な（例えば、実施例１のアッセイを用いて、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡ（本明細書に以下、「プロテインＡ」）樹脂に添加されたＩｇの少なくとも５０％、６０％、または７０％が結合し、その樹脂に保持されるような度合いでの）結合を示すＡｂ（例えば、ｓｃＦｖｓ）である。所望のプロテインＡ結合性を付与するポリペプチド、ならびにそのようなプロテインＡ結合ポリペプチドを含有する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）；所望のプロテインＡ結合性を付与するＶＨ  ＣＤＲ２ポリペプチド、ならびにそれを含有する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）；所望の熱安定性を提供するＶＨ及びＶＬフレームワークポリペプチド（共通フレームワーク配列を含む）、ならびにそのようなフレームワーク配列を有する抗体（例えば、ｓｃＦｖ）；ならびにそのようなプロテインＡ結合ポリペプチド、ＶＨ  ＣＤＲ２ポリペプチド、及び熱安定性向上フレームワークの組み合わせを有するＡｂ（例えば、ｓｃＦｖ）が、提供される。また、開示されるＡｂは、商業規模のリポソーム結合及び他の製造プロセスに、ならびに治療用途に望ましい他の性質を示す。
【０００８】
すなわち、商業生産用及び医療用途向けに設計され適合した抗ＥｐｈＡ２抗体、ならびに関連する複合体、組成物、及び使用方法が開示される。使用方法は、リポソーム治療薬用の標的指向性要素としての使用、ならびに診断薬としての、及びスクリーニング方法における使用を包含する。
【０００９】
したがって、本開示は、以下：
以下を含むＶＨ：
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含む、ＶＨ  ＣＤＲ１；
１７のアミノ酸からなる以下の配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２：
Ｘ１７ＩＳＰＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０ＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１８）、配列中：
Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；
Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰであり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴであり；及び
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；ならびに
以下を含むＶＬ：
アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；
アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及び
アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３；
を含む抗エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）抗体であって、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する抗体を提供する。
【００１０】
本開示は、プロテインＡと結合するポリペプチドも提供し、このポリペプチドは、以下の式のアミノ酸配列：
ａ）ＸａＸ１７ＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号１９８）、配列中
Ｘａは、Ｓ、Ｔ、またはＡであり；
Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、Ｎ、またはＨであり、
Ｘ１８及びＸ１９は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；及び／または、配列中、Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰであり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴであり；
ｂ）ＸａＶＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号１９９）、配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、またはＮであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｐ、またはＳであり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴであり；
ｃ）ＸａＶＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号２００）、配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、またはＮであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり；及び
Ｘ２０は、ＴまたはＫであり；
あるいは
ｄ）ＸａＸ１７ＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号２０１）、配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７は、Ｖであり；
Ｘｂは、Ｐであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であるが、実施形態によっては、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであるが、実施形態によっては、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰであり；及び
Ｘ２０は、ＴまたはＫである、
を含む。
【００１１】
関連実施形態において、プロテインＡ結合ポリペプチドは、配列番号：１７７〜１９７のアミノ酸配列のうち１つを含む。
【００１２】
実施形態によっては、プロテインＡ結合ポリペプチドは、以下：
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号：１７７〜２０１のアミノ酸配列のうち１つを含むプロテインＡ結合配列；及び
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【００１３】
本開示は、ＶＨ及びＶＬを含む抗体も提供し、ＶＨは、本明細書に上記で記載のとおり、プロテインＡ結合ポリペプチドを含む。
【００１４】
ある特定の実施形態において、抗体は、以下のフレームワーク領域：
（ａ）アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むヒトＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸である、及び／または
（ｂ）アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むヒトＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸である；もしくは、抗体が、配列番号：１７７〜２０１のアミノ酸配列のうち１つを含むプロテインＡ結合ポリペプチドを含む場合、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含むヒトＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、及び／または
（ｃ）アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むヒトＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸である、及び／または
（ｄ）アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むヒトＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、もしくはＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸である、及び／または
（ｅ）アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むヒトＶＬフレームワーク領域２（ＶＬ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸である、及び／または
（ｆ）アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むヒトＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、もしくはＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸である、及び／または
（ｇ）アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むヒトＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、もしくはＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である、
の少なくとも１つを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号８）を含むＶＨ  ＦＲ１を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号９）またはＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴ（配列番号１０）を含むＶＨ  ＦＲ２を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、配列中、Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、配列中、Ｘ３はＳであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＶであり、Ｘ６はＴであり、Ｘ７はＴである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、配列中、Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、及びＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、配列中、Ｘ８はＳであり、またはＸ９はＴである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬ  ＦＲ１を含み、配列中、Ｘ８はＳであり、及びＸ９はＴである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬ  ＦＲ２を含み、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬ  ＦＲ２を含み、配列中、Ｘ１０はＫである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬ  ＦＲ３を含み、配列中、Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、及びＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬ  ＦＲ３を含み、配列中、Ｘ１１はＳであり、Ｘ１２はＳであり、Ｘ１３はＴであり、またはＸ１４はＡである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）を含み、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬ  ＦＲ３を含み、���列中：Ｘ１５はＳであり、またはＸ１６はＧである。ある特定の実施形態において、抗体は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）を含み、配列中：Ｘ１５はＳであり、及びＸ１６はＧである。
【００１６】
ある特定の実施形態において、抗体は、以下：
アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸である；
アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸である；
アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、及びＸ７は、Ｓ以外のアミノ酸である；
アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むＶＬフレームワーク領域２（ＶＬ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸である；ならびに
アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中、Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、及びＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸である、
を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態において、抗体は、以下：
アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むＶＨフレームワーク領域１（ＶＨ  ＦＲ１）、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸である；
アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むＶＨフレームワーク領域２（ＶＨ  ＦＲ２）、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸である；
アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むＶＬフレームワーク領域１（ＶＬ  ＦＲ１）、配列中：Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、またはＸ９は、Ｓ以外のアミノ酸である；ならびに
アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むＶＬフレームワーク領域３（ＶＬ  ＦＲ３）、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、及びＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸である
を含む。
【００１８】
ある特定の実施形態において、抗体は、示差走査蛍光定量法を用いて測定した場合に６７℃以上の融点（Ｔｍ）を有する。
【００１９】
ある特定の実施形態において、抗体は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＩｇＧ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、または（ｓｃＦｖ’）２である。ある特定の実施形態において、抗体は、ｓｃＦｖである。ある特定の実施形態において、抗体は、ヒト抗体配列を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態において、抗体は、ＶＨ、ＶＬ、及びフレームワークを含むｓｃＦｖであり、ｓｃＦｖ中：
ＶＨは、以下を含み：
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
以下の１８のアミノ酸配列のうち１つを有するＶＨ  ＣＤＲ２：
（Ｉ）ＶＩＳＰＡＧＮＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２３）、
（ＩＩ）ＶＩＳＰＡＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２４）、
（ＩＩＩ）ＶＩＳＰＤＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２５）、
（ＩＶ）ＶＩＳＰＨＧＲＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２６）、
（Ｖ）ＶＩＳＲＲＧＤＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２７）、
（ＶＩ）ＶＩＳＮＮＧＨＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２８）、
（ＶＩＩ）ＶＩＳＰＡＧＰＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号２９）、
（ＶＩＩＩ）ＶＩＳＰＳＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３０）、
（ＩＸ）ＶＩＳＰＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３１）、
（Ｘ）ＡＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３２）、
（ＸＩ）ＶＩＳＰＴＧＡＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３３）、
（ＸＩＩ）ＶＩＳＰＨＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３４）、
（ＸＩＩＩ）ＶＩＳＮＮＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３５）、
（ＸＩＶ）ＶＩＳＰＡＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３６）、
（ＸＶ）ＶＩＳＰＰＧＨＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３７）、
（ＸＶＩ）ＶＩＳＨＤＧＴＮＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３８）、
（ＸＶＩＩ）ＶＩＳＲＨＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号３９）、
または
（ＸＶＩＩＩ）ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号４０）；
及び
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
そこで、ＶＨ  ＣＤＲは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し：ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、
ならびに
ＶＬは、以下を含み：
アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を有するＶＬ  ＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を有するＶＬ  ＣＤＲ３；
そこで、ＶＬ  ＣＤＲは、アミノからカルボキシル末端に向かって以下の順で存在し：ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３；
ｓｃＦｖフレームワークは、以下を含み：
ＶＨ  ＦＲ１  ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号８）
ＶＨ  ＦＲ２  ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡ（配列番号９）
ＶＨ  ＦＲ３  ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１１）
ＶＨ  ＦＲ４  ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１２）
ＶＬ  ＦＲ１  ＳＳＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＶＴＩＴＣ（配列番号１３）
ＶＬ  ＦＲ２  ＷＹＱＱＫＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号１４）
ＶＬ  ＦＲ３  ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＴＳＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号１５）
及び
ＶＬ  ＦＲ４  ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号１６）
かつ、抗体は、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）の細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。
【００２１】
ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖのＶＨは、ＶＬに対してアミノ末端側である。
【００２２】
ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、少なくとも約６７℃のＴｍを示す。ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、少なくとも約７０℃のＴｍを示す。
【００２３】
ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬを連結するリンカーを含み、リンカーは、以下：
ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、
ＡＳＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号４４）、
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号４５）、
ＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＴＳＧＳ（配列番号４６）、及び
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４７）
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、アミノ酸配列ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を含む。ある特定の実施形態において、抗体は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＨは、配列番号１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、または１７５のアミノ酸配列と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。関連実施形態において、これらの抗体のＶＬは、配列番号１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、または１７６のアミノ酸配列と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態において、抗体は、Ｃ末端に、ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号５４）を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるとおりの抗体；及び抗体と結合した部分を含む、抗体複合体を提供する。ある特定の実施形態において、結合した部分は、脂質ナノ粒子である。ある特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、リポソームである。ある特定の実施形態において、結合した部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ある特定の実施形態において、結合した部分は、治療薬を含む。ある特定の実施形態において、治療薬は、細胞毒性剤である。ある特定の実施形態において、結合した部分は、検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態において、検出可能な標識は、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影剤である。
【００２７】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の抗体または複合体；及び薬学上許容される担体を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、組成物は、非経口投与用に配合される。ある特定の実施形態において、本開示は、容器に入った本開示の組成物を含むキットを提供する。
【００２８】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示のｓｃＦｖをコードする、単離された核酸を提供する。
【００２９】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の抗体の、可変軽鎖ポリペプチド、可変重鎖ポリペプチド、またはその両方をコードする、単離された核酸を提供する。
【００３０】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の核酸、及び核酸と機能的に連結した真核生物プロモーターを含む発現ベクターを提供する。
【００３１】
ある特定の実施形態において、本開示は、本開示の発現ベクターを含む非ヒト宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は、可変軽鎖ポリペプチド、可変重鎖ポリペプチド、またはその両方を発現する。
【００３２】
ある特定の実施形態において、本開示は、ＥｐｈＡ２発現がんを有する対象の治療方法を提供し、本方法は、ＥｐｈＡ２発現がんを有する対象に、本開示の、抗体、抗体複合体、あるいは抗体及び／または抗体複合体を含む組成物を投与することを含む。
【００３３】
ある特定の実施形態において、本開示は、ＥｐｈＡ２発現がんの治療に使用するための組成物を提供し、組成物は、本開示の抗体及び／または抗体複合体を含む。
【００３４】
本開示は、ＥｐｈＡ２発現がんの治療における組成物の使用を提供し、組成物は、本開示の抗体及び／または抗体複合体を含む。
【００３５】
図３及び図４で、番号１〜２２により識別されるｓｃＦｖは、配列表でｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２として識別される該当アミノ酸配列を含み、同一の識別スキームが、ｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２のアミノ酸配列をコードする核酸配列についても使用される。核酸配列は、さらに、コードされたｓｃＦｖを発現する哺乳類（例えば、ヒトまたは齧歯類）細胞により切り落とされるＮ末端リーダー配列をコードする。図１、図３、及び図４で使用される場合、「Ｆ５」は、ｓｃＦｖ  Ｆ５を示す。「ＴＳ１」は、ｓｃＦｖ  ＴＳ１を示す。「ＴＳ１＊」は、ｓｃＦｖ  ＴＳ１＊を示し（なお、ＴＳ１＊のＶＬは、ＴＳ１のＶＬと同一であり、図１ではそのように示されている）、「Ａ７」は、ｓｃＦｖ  Ｄ２−１Ａ７を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】プロテインＡ結合アッセイの結果を示す（実施例１を参照）。ｓｃＦｖ  Ｆ５、ｓｃＦｖ  ＴＳ１、ｓｃＦｖ  ＴＳ１＊、及びＤ２−１Ａ７のＶＨ領域とＶＬ領域を連結して１つにすることにより、ｓｃＦｖを作製した。図に示すとおり、プロテインＡ結合アッセイを用いて、これらのハイブリッドｓｃＦｖを、ｓｃＦｖ  Ｆ５、ｓｃＦｖ  ＴＳ１、ｓｃＦｖ  ＴＳ１＊、及びＤ２−１Ａ７とともにスクリーニングした。Ｆ５  ｓｃＦｖが、望ましいプロテインＡ結合性を示したので、これを陽性対象として用いた。ｓｃＦｖ  Ｄ１−２Ａ７は、陰性対象として用いた。
【図２】パネルＡ〜Ｄは、ｓｃＦｖ  ＴＳ１のＣＤＲ−Ｈ２変異体の異なるクローン５０，０００種超を含有するように設計された一セットのｓｃＦｖをＦＡＣＳ選別した結果を示す。ＣＤＲ−Ｈ２変異体は、標的指向型変異誘発を用いて作製した。パネルＡは、ＦＡＣＳを１ラウンド行った後の未染色酵母菌を示す。パネルＢは、ＦＡＣＳを１ラウンド行った後の染色酵母菌を示し、蛍光標識化プロテインＡ（ｘ軸）及びＥｐｈＡ２に対するＡｂ（ｙ軸）で標識された。次いで、単離されたクローンを、再度選別した。パネルＣは、未染色酵母菌を示し、パネルＤは、ＦＬＡＧ（商標）エピトープ（ｘ軸）及びＥｐｈＡ２（ｙ軸）に対する標識化Ａｂで染色した酵母菌を示す。
【図３】ＥｐｈＡ２のプロテインＡ結合アッセイの結果を示す。ＣＤＲ−Ｈ２変異型ｓｃＦｖを、哺乳類一過性システム中で可溶性タンパク質として発現させ、プロテインＡ結合を、プロテインＡ結合アッセイを用いて測定した。Ｆ５  ｓｃＦｖを陽性対象として用い、ＴＳ１を陰性対象として用いた。
【図４】パネルＡ〜Ｃは、ＥｐｈＡ２を発現する細胞株でのＡｂの結合及び内部移行に関するデータを示す。ＣＬＩＡアッセイを用いて、抗体を、３種の細胞株で、結合及び内部移行の能力について評価した（実施例５）。ＥｒｂＢ２に結合する（ＥｐｈＡ２には結合しない）Ｆ５  ｓｃＦｖを陰性対象として用い、すべてのデータを、ｓｃＦｖ  ＴＳ１の結合及び内部移行に対して正規化した。
【図５】本明細書に記載されるとおりの、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖリンカー、Ｎ末端ペプチド、Ｃ末端タグ、Ｃ末端リンカー及びタグ、Ｃ末端システイン含有配列、及びＥｐｈＡ２の例の配列を提供する。ｓｃＦｖ〜ｓｃＦｖ２２のアミノ酸配列中、下線部は、リンカーのアミノ酸配列（ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１））を示し、下線のある配列に対してＮ末端のアミノ酸配列は、ＶＨアミノ酸配列であり、下線のある配列に対してＣ末端のアミノ酸配列はＶＨＬアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
提供されるのは、新規の有用な抗体（例えば、一本鎖抗体、例えば、ｓｃＦｖ）である。同じく提供されるのは、抗体を含む、複合体、組成物、及びキットである。例えば、免疫リポソームの製造における、Ａｂの使用方法も、提供される。
【００３８】
定義
本明細書で使用される場合、「抗体」（「Ａｂ」）は、免疫グロブリン（「Ｉｇ」）、または抗原結合Ｉｇ断片、あるいは免疫グロブリンから得られるまたは派生する相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含む他の抗原結合ポリペプチド（例えば、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）など）であり、これらは、免疫特異的抗原結合、すなわち、ＣＤＲが介在する抗原結合を示す。天然起源のＡｂは、一般に、少なくとも４本のポリペプチド鎖を含み、これらの鎖は、少なくとも２本の重鎖及び少なくとも２本の軽鎖の両方を含むが、ある特定の哺乳類Ａｂは、単独の（軽）鎖（例えば、ベンスジョーンズタンパク質）を含有する、または１本の軽鎖及び１本の重鎖を含有することが知られている。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεと分類することができ、これらはさらに、それぞれ、天然起源のヒトＩｇクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、を定める。典型的なＩｇＧ、ＩｇＤ、またはＩｇＥヒトＡｂの例として、ポリペプチド鎖の対２つで構成され、各対が１本の「軽」鎖及び１本の「重」鎖を有する、四量体の構造単位を有するものがある。
【００３９】
「ヒト抗体」（「ヒトＡｂ」）は、本明細書で使用される場合、その抗体がどのような特定の方法により製造されることも必要とせず、また抗体が天然起源であることも必要としない。そうではなく、「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体、その抗原結合断片、またはヒト抗体のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク）を含むが、そのＣＤＲ及び／またはフレームワークは、自然には一緒に生じない（すなわち、天然起源ではない）ことを示す。
【００４０】
「抗ＥｐｈＡ２  Ａｂ」は、ＥｐｈＡ２、例えば、ＥｐｈＡ２のＥＣＤに免疫特異的に結合するＡｂを示す。ＥｐｈＡ２特異的Ａｂは、ＥｐｈＡ２タンパク質に存在しない抗原に対して、免疫特異的に結合しない。
【００４１】
「ＣＤＲ」は、相補性決定領域を示す。
【００４２】
「ＣＬＩＡ」は、キレート化リガンド誘導型内部移行アッセイを示す。
【００４３】
「ＤｉＩ５」は、染料１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジスルホン酸を示す。
【００４４】
「ＤＯＤ−トリ−ＮＴＡ」は、以下に記載されるとおりのジオクタデシルアミノ−トリ−ＮＴＡ化合物（化合物１２）を示す：Ｈｕａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  ‘‘Ｆａｃｉｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＮＴＡ）  ａｎｄ  ＮＴＡ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’’，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００６，  ｖｏｌ．１７，  ｐ．  １６９２−１６００。ＮＴＡは、ニトリロ三酢酸を示す。
【００４５】
「ＤＳＦ」は、示差走査蛍光定量法を示す。
【００４６】
「ＤＳＰＥ」は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを示す。
【００４７】
「ＥＣＤ」は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを示す。
【００４８】
「ＥｐｈＡ２」は、エフリンＡ型受容体２を示し、これは「上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）」とも称する、エフリンＡリガンドと結合し、これにより活性化することが可能な受容体チロシンキナーゼである膜貫通タンパク質である。「ＥｐｈＡ２」という用語は、ＥｐｈＡ２の天然起源のアイソフォームのどれでも示すことができる。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号第ＮＰ＿００４４２２．２号として記録されている。
【００４９】
「エピトープ」とは、抗原上のある部位、例えばＥｐｈＡ２  ＥＣＤ上のある部位であり、そこにＡｂが免疫特異的に結合する。エピトープは、近接アミノ酸、またはタンパク質を形成するポリペプチド鎖の折り畳み（例えば、三次折り畳み）により並置される非近接アミノ酸のどちらからも形成される可能性がある。
【００５０】
「Ｆａｂ」は、Ｉｇの抗原結合断片（どのように調製されたかを問わず）を示し、可変領域及び第一の定常ドメインを含む。
【００５１】
「ＦＡＣＳ」は、蛍光標示式細胞分取法を示す。
【００５２】
「Ｈｉｓ６」は、ヘキサヒスチジンペプチドを示す。
【００５３】
「ＨＳＰＣ」は、水素添加ダイズホスファチジルコリンを示す。
【００５４】
「Ｉｇ」は、免疫グロブリンを示す。Ｉｇの軽鎖または重鎖可変領域は、複数の「フレームワーク」領域（ＦＲ）が３つの超可変領域（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称する）と交互に並ぶことで構成されている。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、公開データベースで見られる配列との相同性に基づいて定義することができる。例えば、‘‘Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，’’  Ｅ．  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ（１９８７）を参照。本明細書で使用されるＡｂ配列付番は全て、Ｋａｂａｔらにより定義されるとおりである。
【００５５】
「ＩｇＧ」は、Ｇアイソタイプの免疫グロブリンを示す。
【００５６】
「単離された」は、関心対象の実体（例えば、タンパク質、例えば、Ａｂ）が、自然発生する可能性のある環境、またはそれが製造もしくは合成される可能性のある環境とは異なる環境にある場合の、その実体を示す。「単離された」実体は、その実体が作られる細胞または反応容器中でその実体に付随する要素の全てまたは一部から、分離されている。対象Ａｂは、実質的に純粋であることが可能である。「実質的に純粋」は、少なくとも組成物全体の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超が、関心対象の実体（例えば、本明細書で開示される抗ＥｐｈＡ２  Ａｂ）である組成物を示すことができる。
【００５７】
「Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ」は、マレイミド−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］を示す。
【００５８】
「ＭＦＩ」は、蛍光強度中央値を示す。
【００５９】
「ＮＴＡ（Ｎｉ）」は、ニッケル−ニトリロ三酢酸を示す。
【００６０】
「ＰＢＳ」は、リン酸緩衝食塩水を示す。
【００６１】
「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールを示す。
【００６２】
「ＰＥＧ−ＤＳＰＥ」は、メトキシ−ＰＥＧ（２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを示す。
【００６３】
「ｓｃＦｖ」は、一本鎖Ｆｖを示し、これは、ＶＨ及びＶＬが、典型的にはＶＨ及びＶＬのＣＤＲからなる機能的抗原結合部位の形成を可能にするリンカーペプチドを介して、互いに共有結合した一本鎖ポリペプチド鎖で構成されるタンパク質である。
【００６４】
「ＳＥＣ」は、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【００６５】
「ＳＭ」は、スフィンゴミエリンを示す。
【００６６】
「Ｔｍ」は、融点を示す。
【００６７】
「ＴＳ１」は、以下に開示されるとおりのｓｃＦｖ−ＴＳ１を示す。
【００６８】
「ＴＳ１＊」は、以下に開示されるとおりのｓｃＦｖ−ＴＳ１＊を示す。
【００６９】
「ＶＨ」は、Ｉｇ重鎖の可変領域を示し、これはＶＨポリペプチドと称する場合もある。
【００７０】
「ＶＬ」は、Ｉｇ軽鎖の可変領域を示し、これはＶＬポリペプチドと称する場合もある。
【００７１】
抗体
本開示が提供するのは、Ａｂに有用な性質を付与するフレームワーク配列及びＣＤＲ配列を含む、抗ＥｐｈＡ２Ａｂである。実施例に記載されるＡｂはｓｃＦｖであるものの、本明細書で開示されるＣＤＲ及びヒトフレームワーク配列は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭＡｂに、容易にかつ有益に組み込むことができる。ある特定の実施形態において、そのような性質として、安定性（例えば、熱安定性、例えば、６５℃超、６７℃以上、または少なくとも約７０℃の融点）、プロテインＡとの≧３０％、≧４０％、または≧５０％の結合、あるいはその両方が挙げられる。
【００７２】
フレームワーク領域
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、ＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の１つまたはそれらの任意の組み合わせを含み：
【００７３】
ＶＨ  ＦＲ１は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含むヒトＶＨ  ＦＲ１であり、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、Ｘ１はＱであり；
【００７４】
ＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＸ２（配列番号２）を含むヒトＶＨ  ＦＲ２であり、配列中、Ｘ２は、Ｓ以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、Ｘ２はＡであり；
【００７５】
ＶＬ  ＦＲ１は、アミノ酸配列Ｘ３ＳＸ４ＬＴＱＰＰＳＶＳＸ５ＡＰＧＱＸ６ＶＴＩＸ７Ｃ（配列番号３）を含むヒトＶＬ  ＦＲ１であり、配列中：Ｘ３は、Ｑ以外のアミノ酸であり、Ｘ４は、Ｖ以外のアミノ酸であり、Ｘ５は、Ｇ以外のアミノ酸であり、Ｘ６は、Ｒ以外のアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｓ以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、Ｘ４はＶであり、Ｘ５はＧであり、及びＸ６はＲであり；
【００７６】
ある特定の実施形態において、ＶＬ  ＦＲ１は、アミノ酸配列Ｘ８ＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＸ９Ｃ（配列番号４）を含むヒトＶＬ  ＦＲ１であり、配列中、Ｘ８は、Ｑ以外のアミノ酸であり、配列中、Ｘ９は、Ｓ以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、Ｘ８はＳであり、及び／またはＸ９はＴであり；
【００７７】
ＶＬ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＹＱＱＸ１０ＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号５）を含むヒトＶＬ  ＦＲ２であり、配列中、Ｘ１０は、Ｌ以外のアミノ酸であり、及び／または、ある特定の実施形態において、Ｘ１０はＫであり；
【００７８】
ならびに
【００７９】
ＶＬ  ＦＲ３は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１１Ｘ１２ＳＧＴＳＡＳＬＸ１３ＩＴＧＸ１４ＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号６）を含むヒトＶＬ  ＦＲ３であり、配列中：Ｘ１１は、Ｆ以外のアミノ酸であり、Ｘ１２は、Ｋ以外のアミノ酸であり、Ｘ１３は、Ａ以外のアミノ酸であり、またはＸ１４は、Ｌ以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、Ｘ１１はＳであり、Ｘ１２はＳであり、Ｘ１３はＴであり、及び／またはＸ１４はＡであり；
【００８０】
ある特定の実施形態において、ＶＬ  ＦＲ３は、アミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＸ１５Ｘ１６ＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣ（配列番号７）を含むヒトＶＬ  ＦＲ３であり、配列中：Ｘ１５は、Ｆ以外のアミノ酸であり、またはＸ１６は、Ｋ以外のアミノ酸であり、及びある特定の実施形態において、Ｘ１５はＳであり、及び／またはＸ１６はＧである。
【００８１】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるＡｂは、表１に記載されるＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の１つまたはそれらの任意の組み合わせを含む。１つの実施形態において、Ａｂは、ｓｃＦｖであり、表１のフレームワークの全てを含有する。
2019515645.tif 000003
【００８２】
ある特定の態様において、本明細書で開示されるＡｂ（例えば、ｓｃＦｖ）は、例えば、そのＡｂは堅牢かつ規模変更が可能な製造によく適しているような熱安定性を有する。本明細書で使用される場合、「熱安定性」Ａｂとは、例えば、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて測定した場合に、７０℃以上の融点（Ｔｍ）を有するＡｂである。適切な融点を有するＡｂの例は、以下の実験セクションに記載される。
【００８３】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるＡｂは、例えば、実施例１に記載されるアッセイを用いて測定した場合に、プロテインＡに対して３０％、４０％、または有益には５０％以上の結合を示す。
【００８４】
ＥｐｈＡ２結合
特に関心対象である抗体として、ＥｐｈＡ２ポリペプチドの細胞外ドメイン、すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号第ＮＰ＿００４４２２．２またはＵｎｉＰｒｏｔ受入番号第Ｐ２９３１７に記載の配列の少なくともアミノ酸残基の２５〜５３４位にわたるＥｐｈＡ２タンパク質の一部分に結合する抗ＥｐｈＡ２Ａｂが挙げられる。
【００８５】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示される抗ＥｐｈＡ２抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含み、これらはそれぞれ、表２Ａに記載のとおりの配列を持つ。他の実施形態において、ＶＨ  ＣＤＲ２配列（ＣＤＲＨ２とも称する）は、表２Ｂに記載の１８の異なるＶＨ  ＣＤＲ２配列から選択される任意の１種となる。
2019515645.tif 000004
【００８６】
表２Ａ及び表３のＶＨ  ＣＤＲ２について：Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、またはＰであり；及び、Ｘ２０は、ＫまたはＴである。ある特定の実施形態において：Ｘ１７は、Ａであり；Ｘ１８は、ＨまたはＰであり；あるいは、Ｘ１９は、ＲまたはＰである。ある特定の実施形態において：Ｘ１７は、Ｖであり；Ｘ１８は、ＨまたはＰであり；Ｘ１９は、ＲまたはＮであり；及び、Ｘ２０は、ＫまたはＴである。ある特定の実施形態において：Ｘ１７は、Ｖであり；Ｘ１８は、ＨまたはＤであり；Ｘ１９は、ＨまたはＮであり；及び、Ｘ２０はＴである。
【００８７】
適切なＶＨ  ＣＤＲ２配列の１８の特別例を、表２Ｂに記載する：
2019515645.tif 000005
【００８８】
本開示が提供するｓｃＦｖの例を、図５に提示する。図５は、ｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２のアミノ酸配列、ならびに、対応するコード核酸配列を提示する。ｓｃＦｖ２〜ｓｃＦｖ２２の各アミノ酸配列中の下線部は、リンカーのアミノ酸配列（ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）を示す。ｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２の下線のあるアミノ酸配列に対してＮ末端のアミノ酸配列は、ｓｃＦｖのＶＨポリペプチドのアミノ酸配列である。ｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２の下線のあるアミノ酸配列に対してＣ末端のアミノ酸配列は、ｓｃＦｖのＶＬポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００８９】
したがって、本開示は、ＶＨ及びＶＬを有する抗体（ｓｃＦｖを含む）を提供し、このＶＨは、図５に記載されるとおりのｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２のいずれか１つのＶＨと、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。本開示はまた、ＶＨ及びＶＬを含む抗体（ｓｃＦｖを含む）を提供し、このＶＨは、図５に記載されるとおりのｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２のいずれか１つのＶＨ及びＶＬのＶＨ及びＶＬと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。本開示はまた、ＶＨ及びＶＬを有する抗体（ｓｃＦｖを含む）を提供し、ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、図５のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を含む。
【００９０】
図５のｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列は、以下のとおりである：ｓｃＦｖ１のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１３３及び１３４）、ｓｃＦｖ２のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１３５及び１３６）、ｓｃＦｖ３のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１３７及び１３８）、ｓｃＦｖ４のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１３９及び１４０）、ｓｃＦｖ５のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１４１及び１４２）、ｓｃＦｖ６のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１４３及び１４４）、ｓｃＦｖ７のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１４５及び１４６）、ｓｃＦｖ８のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１４７及び１４８）、ｓｃＦｖ９のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１４９及び１５０）、ｓｃＦｖ１０のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１５１及び１５２）、ｓｃＦｖ１１のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１５３及び１５４）、ｓｃＦｖ１２のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１５５及び１５６）、ｓｃＦｖ１３のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１５７及び１５８）、ｓｃＦｖ１４のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１５９及び１６０）、ｓｃＦｖ１５のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１６１及び１６２）、ｓｃＦｖ１６のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１６３及び１６４）、ｓｃＦｖ１７のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１６５及び１６６）、ｓｃＦｖ１８のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１６７及び１６８）、ｓｃＦｖ１９のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１６９及び１７０）、ｓｃＦｖ２０のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１７１及び１７２）、ｓｃＦｖ２１のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１７３及び１７４）、またはｓｃＦｖ２２のＶＨ及びＶＬ（それぞれ、配列番号１７５及び１７６）。
【００９１】
本開示はまた、配列番号６０［ｓｃＦｖ１］、配列番号６２［ｓｃＦｖ２］、配列番号６４［ｓｃＦｖ３］、配列番号６６［ｓｃＦｖ４］、配列番号６８［ｓｃＦｖ５］、配列番号７０［ｓｃＦｖ６］、配列番号７２［ｓｃＦｖ７］、配列番号７４［ｓｃＦｖ８］、配列番号７６［ｓｃＦｖ９］、配列番号７８［ｓｃＦｖ１０］、配列番号８０［ｓｃＦｖ１１］、配列番号８２［ｓｃＦｖ１２］、配列番号８４［ｓｃＦｖ１３］、配列番号８６［ｓｃＦｖ１４］、配列番号８８［ｓｃＦｖ１５］、配列番号９０［ｓｃＦｖ１６］、配列番号９２［ｓｃＦｖ１７］、配列番号９４［ｓｃＦｖ１８］、配列番号９６［ｓｃＦｖ１９］、配列番号９８［ｓｃＦｖ２０］、配列番号１００［ｓｃＦｖ２１］、または配列番号１０２［ｓｃＦｖ２２］のアミノ酸配列と少なくとも９５％アミノ酸配列同一性を有するｓｃＦｖ、ならびにそれらをコードする核酸を提供する。本開示はまた、配列番号６０［ｓｃＦｖ１］、配列番号６２［ｓｃＦｖ２］、配列番号６４［ｓｃＦｖ３］、配列番号６６［ｓｃＦｖ４］、配列番号６８［ｓｃＦｖ５］、配列番号７０［ｓｃＦｖ６］、配列番号７２［ｓｃＦｖ７］、配列番号７４［ｓｃＦｖ８］、配列番号７６［ｓｃＦｖ９］、配列番号７８［ｓｃＦｖ１０］、配列番号８０［ｓｃＦｖ１１］、配列番号８２［ｓｃＦｖ１２］、配列番号８４［ｓｃＦｖ１３］、配列番号８６［ｓｃＦｖ１４］、配列番号８８［ｓｃＦｖ１５］、配列番号９０［ｓｃＦｖ１６］、配列番号９２［ｓｃＦｖ１７］、配列番号９４［ｓｃＦｖ１８］、配列番号９６［ｓｃＦｖ１９］、配列番号９８［ｓｃＦｖ２０］、配列番号１００［ｓｃＦｖ２１］、または配列番号１０２［ｓｃＦｖ２２］のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ、ならびにそれらをコードする核酸を提供する。
【００９２】
本開示はまた、プロテインＡと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００９３】
ＸａＸ１７ＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号１９８）
配列中
Ｘａは、Ｓ、Ｔ、またはＡであり；
Ｘ１７は、ＡまたはＶであり；
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、Ｎ、またはＨであり、
Ｘ１８及びＸ１９は、任意のアミノ酸であり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴである。
【００９４】
１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；及び、Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰである。
【００９５】
１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１９８の式のプロテインＡ結合配列、配列中、Ｘ１８は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであり；及び配列中、Ｘ１９は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、もしくはＰであり；ならびに
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３、
を含む。
【００９６】
配列番号１９８のポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む場合がある。１つの実施形態において、ポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である場合、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＨ  ＦＲ２の一方または両方を含み、このＶＨ  ＦＲ１は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、Ｘ１はＱであり；このＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含む。そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３の１つまたは複数も含む場合がある。１つの実施形態において、そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１のＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の任意の組み合わせを１つまたは複数含む。
【００９７】
本開示はまた、プロテインＡと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む：
【００９８】
ＸａＶＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号１９９）、
配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、またはＮであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｐ、またはＳであり；及び
Ｘ２０は、ＫまたはＴである。
【００９９】
１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号１９９のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴである。
【０１００】
１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号１９９のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；及び、Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰである。
【０１０１】
１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号１９９の式のプロテインＡ結合配列、配列中、Ｘ１８は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであり；及び配列中、Ｘ１９は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、もしくはＰであり；ならびに
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１０２】
配列番号１９９のポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む場合がある。１つの実施形態において、ポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である場合、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＨ  ＦＲ２の一方または両方を含み、このＶＨ  ＦＲ１は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、Ｘ１はＱであり；このＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含む。そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３の１つまたは複数も含む場合がある。１つの実施形態において、そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１のＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の任意の組み合わせを１つまたは複数含む。
【０１０３】
本開示はまた、プロテインＡと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む：
【０１０４】
ＸａＶＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号２００）
配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘｂは、Ｐ、Ｒ、またはＮであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり；及び
Ｘ２０は、ＴまたはＫである。
【０１０５】
１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号２００のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴである。１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号２００のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；及び、Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰである。
【０１０６】
１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号２００の式のプロテインＡ結合配列、配列中、Ｘ１８は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであり；及び配列中、Ｘ１９は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、もしくはＰであり；ならびに
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１０７】
配列番号２００のポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む場合がある。１つの実施形態において、ポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である場合、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＨ  ＦＲ２の一方または両方を含み、このＶＨ  ＦＲ１は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、Ｘ１はＱであり；このＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含む。そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３の１つまたは複数も含む場合がある。１つの実施形態において、そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１のＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の任意の組み合わせを１つまたは複数含む。
【０１０８】
本開示はまた、プロテインＡと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体中（例えば、ｓｃＦｖ）に存在していてもよく、かつ、これは、以下のアミノ酸配列を含む：
【０１０９】
ＸａＸ１７ＩＳＸｂＸ１８ＧＸ１９ＮＸ２０（配列番号２０１）、
配列中
Ｘａは、ＳまたはＴであり、
Ｘ１７は、Ｖであり；
Ｘｂは、Ｐであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸であり；
Ｘ１９は、Ｈ、Ｎ、Ｒ、またはＴであり；及び
Ｘ２０は、ＴまたはＫである。
【０１１０】
１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴである。
【０１１１】
１つの実施形態において、ポリペプチド（これは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよい）は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１８は、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり；及び、Ｘ１９は、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、またはＰである。
【０１１２】
１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号２０１の式のプロテインＡ結合配列、配列中、Ｘ１８は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、もしくはＴであり；及び配列中、Ｘ１９は任意のアミノ酸、または、Ａ、Ｒ、Ｈ、Ｎ、もしくはＰであり；ならびに
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１１３】
配列番号２０１のポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む場合がある。１つの実施形態において、ポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である場合、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＨ  ＦＲ２の一方または両方を含み、このＶＨ  ＦＲ１は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、Ｘ１はＱであり；このＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含む。そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３の１つまたは複数も含む場合がある。１つの実施形態において、そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１のＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の任意の組み合わせを１つまたは複数含む。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本開示は、プロテインＡと結合するポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよく、かつ、これは、図５に記載されるとおりの配列番号：１７７〜１９７から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
１つの実施形態において、このポリペプチドは、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在していてもよく、かつ、これは、配列番号：１７７〜１９７のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【０１１６】
１つの実施形態において、そのようなポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下
アミノ酸配列ＳＹＡＭＨ（配列番号１７）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号：１７７〜１９７のうちの１つのプロテインＡ結合配列；及び
アミノ酸配列ＡＳＶＧＡＴＧＰＦＤＩ（配列番号１９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１１７】
配列番号１７７〜１９７のポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）中に存在する場合、抗体は、アミノ酸配列ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＧＥＮＮＲＰＳ（配列番号２１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＮＳＲＤＳＳＧＴＨＬＴＶ（配列番号２２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む場合がある。１つの実施形態において、ポリペプチドが抗体（例えば、ｓｃＦｖ）である場合、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、ＶＨ  ＦＲ１及びＶＨ  ＦＲ２の一方または両方を含み、このＶＨ  ＦＲ１は、アミノ酸配列ＱＶＱＬＶＸ１ＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ（配列番号１）を含み、配列中、Ｘ１は、Ｅ以外のアミノ酸であり、及び、ある特定の実施形態において、Ｘ１はＱであり；このＶＨ  ＦＲ２は、アミノ酸配列ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ（配列番号２０２）を含む。そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ２、及び配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＬ  ＦＲ３の１つまたは複数も含む場合がある。１つの実施形態において、そのような抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は、表１のＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３の任意の組み合わせを１つまたは複数含む。
【０１１８】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるＡｂは、内部移行する抗ＥｐｈＡ２  Ａｂである。そのようなＡｂが、適切な条件下、生細胞の外側表面に存在するＥｐｈＡ２分子のＥＣＤに結合すると、その結果Ａｂの内部移行が起こる。この内部移行は、Ａｂが、細胞膜を境界とする細胞内部へと輸送されることを特徴とする。内部移行するＡｂは、例えば、治療用途で、例えば、薬物、毒素、酵素、ナノ粒子（例えば、リポソーム）、ＤＮＡなどを標的指向送達するためのビヒクルとしての利用を見出す。
【０１１９】
本明細書で開示される特定のＡｂは、一本鎖ＦｖＡｂ、例えば、ｓｃＦｖまたは（ｓｃＦｖ’）２である。そのようなＡｂでは、ＶＨ及びＶＬポリペプチドは、２通りの向き（すなわち、ＶＬに対してＶＨがＮ末端、またはＶＨに対してＶＬがＮ末端）いずれかで、直接またはアミノ酸リンカーを介していずれかで、互いに連結されている。そのようなリンカーは、例えば、長さが１〜５０、５〜４０、１０〜３０、または１５〜２５アミノ酸である場合がある。ある特定の実施形態において、アミノ酸リンカーの残基の８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％が、セリン（Ｓ）及び／またはグリシン（Ｇ）である。適切なｓｃＦｖリンカーの例として、以下の配列であるものまたは以下の配列を含むものが可能である：
ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４１）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４２）、
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３）、
ＡＳＴＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号４４）、
ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号４５）、
ＴＰＳＨＮＳＨＱＶＰＳＡＧＧＰＴＡＮＳＧＴＳＧＳ（配列番号４６）、または
ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号４７）。
【０１２０】
内部移行する抗ＥｐｈＡ２  Ａｂの例として、以下のｓｃＦｖ  ＴＳ１が挙げられる：
2019515645.tif 000006
【０１２１】
上記のＴＳ１において、ＣＤＲは、下線が付してあり、以下の順で存在する：ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３。すなわち、ｓｃＦｖ  ＴＳ１において、及び本明細書で開示されるある特定の他のｓｃＦｖにおいて、ｓｃＦｖのＨＶは、ｓｃＦｖのアミノ末端にあり、リンカー（ここでは、斜体になっている）によりＶＬと連結されている。
【０１２２】
同じく提供されるのは、ＴＳ１のＶＨ  ＣＤＲ２を除く全てのフレームワーク領域及びＣＤＲが未改変であるが、ＶＨ  ＣＤＲ２は、上記の表２Ｂに記載される１８の異なるＣＤＲＨ２配列から選択されたいずれかのＣＤＲに置き換えられている、ｓｃＦｖ  ＴＳ１の変異体である。
【０１２３】
Ａｂ作製方法
本明細書で提供される情報を用いて、本明細書で開示されるＡｂを、標準技法を用いて調製することができる。例えば、本明細書で提供されるアミノ酸配列を用いて、Ａｂをコードする適切な核酸配列を決定することができ、次いで、核酸配列を用いて、１つまたは複数のＡｂを発現させることができる。核酸配列（複数可）は、標準方法に従って様々な発現系にとっての特定コドン「優先性」を反映するように最適化することができる。
【０１２４】
本明細書で提供される配列情報を用いて、核酸を、複数の標準方法に従って合成することができる。オリゴヌクレオチド合成は、市販されている固相オリゴヌクレオチド合成機器で便利に行うことも、手作業で、例えば、固相ホスホルアミダイトトリエステル法を用いて、合成することもできる。いったん本明細書で開示されるＡｂをコードする核酸が合成されたら、標準方法に従ってそれを増幅及び／またはクローン化することができる。
【０１２５】
本明細書で開示されるＡｂをコードする天然または合成の核酸の発現は、Ａｂをコードする核酸をプロモーター（これは、構成型でも誘導型でもよい）と機能的に連結し、構築物を発現ベクターに組込んで、組換え発現ベクターを作製することにより達成できる。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方における複製及び組込みに適したものが可能である。典型的なクローニングベクターは、機能的に適切に方向付けられた転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにＡｂをコードする核酸の発現の制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、任意選択で、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、例えばシャトルベクターで見られるとおりの真核生物及び原核生物の両方でカセットの複製を許容する配列、ならびに真核生物及び原核生物系両方用の選択マーカーを含有する遺伝子発現カセットを含有する。
【０１２６】
クローン化核酸の発現を高レベルで得るため、転写を指示する強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳ターミネーターを含有し、これらがそれぞれ互いに対して及びタンパク質コード配列に対して機能的方向にある、発現プラスミドを構築することが一般的である。Ａｂ遺伝子（複数可）は、同定、精製、及び操作をしやすくするためのタグ配列、例えば、ＦＬＡＧ（商標）またはＨｉｓ６などを、Ａｂ（例えばｓｃＦｖ）のＣ末端またはＮ末端に付加することを可能にする発現ベクターにサブクローン導入することもできる。いったんＡｂをコードする核酸が単離及びクローン化されたら、その核酸を様々な組換え操作された細胞で発現させることができる。そのような細胞の例として、細菌、酵母菌、糸状菌、昆虫、及び哺乳類の細胞が挙げられる。
【０１２７】
本明細書で開示されるＡｂの単離及び精製は、培養上清から、Ａｂを分泌する細胞から単離し、続いてアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することにより達成でき、あるいは、タンパク質を構成的に及び／または誘導に際して発現するように遺伝子修飾された細胞のライセートから、または合成反応混合物から単離することができ、精製、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたタンパク質Ｇを用いる）による精製を合わせて行うことができる。単離されたＡｂは、さらに、透析及びタンパク質精製で通常採用される他の方法により精製することができる。
【０１２８】
本開示は、対象Ａｂを産生する細胞も提供する。例えば、本開示は、本明細書で開示されるＡｂ、またはそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸で遺伝子修飾された組換え宿主細胞を提供する。ＤＮＡは、例えば、細菌（例えば、バクテリオファージ）、酵母菌（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ）、昆虫（例えば、バキュロウイルス）、または哺乳類発現系にクローン導入される。適切な技法の１つは、糸状バクテリオファージベクター系を使用する。例えば、ＵＳ５，８８５，７９３；ＵＳ５，９６９，１０８；及びＵＳ６，５１２，０９７を参照。
【０１２９】
Ａｂ修飾
本開示は、所望の特長を提供するように、例えば、対象中の特定の組織型及び／または細胞型への（例えば、腫瘍への）送達を促進する、血清半減期を延長する、抗がん活性を追加する、などを行うように修飾されたＡｂ（及びＡｂをコードする核酸）を包含する。本明細書で開示されるＡｂは、修飾ありまたはなしで提供することができ、ヒトＡｂを模範例とするが、ヒト化ＡｂまたはキメラＡｂとして容易に修飾及び調製することができる。Ａｂ（例えば、ｓｃＦｖ）を修飾する１つのやり方は、１つまたは複数の配列要素を、Ａｂに含まれるポリペプチド鎖のＮ及び／またはＣ末端で、またはＡｂの任意のアミノ酸（内部アミノ酸を含む）に結合（例えば連結）させることである。そのような追加配列要素として、例えば、リポソーム、別のタンパク質、検出可能な標識（例えば、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質、発色タンパク質、色素、蛍光発光金属、化学発光化合物など）、薬物、及び／または担体分子が挙げられる。任意選択で、そのような結合は、Ａｂを追加配列要素（複数可）と接続させるリンカー部分を介している。
【０１３０】
１つまたは複数の追加配列要素で修飾された本明細書で開示されるＡｂは、１つまたは複数の追加配列要素の性質を利用して１つまたは複数の追加特性を与えながらも、その結合特異性は保持する。
【０１３１】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されるＡｂは、治療部分への付加、例えば、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム、中実脂質ナノ粒子、またはミセル）の外側への付加、あるいは化学療法薬、例えば、マイタンシノイド（例えば、ＤＭ１、ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンの化学療法薬部分）またはアウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ、ブレンツキシマブベドチンの化学療法薬部分）などへの付加により配合される。脂質微小粒子に付加される場合、Ａｂは、脂質膜に挿入するのに適した脂質と結合している重合体と（例えば、重合体の末端で）共有結合させることができる。Ａｂが結合したリポソームを、本明細書で、「免疫リポソーム（複数可）」と称する。本明細書で開示されるＡｂは、免疫リポソーム標的指向化要素として作用することができ、免疫リポソームががん細胞の表面のＥｐｈＡ２に特異的に結合することを可能にする。免疫リポソームには、小分子（例えば、化学療法薬）、または核酸（例えばｓｉＲＮＡ）などの抗がん剤を１種または複数ロードして含有させることができる。リポソーム及び免疫リポソームなど、脂質ナノ粒子を作製及びロードする方法は、例えば、ＵＳ２０１０／００６８２５５、ＵＳ２０１０／０００８９７８、ＵＳ２００９／０１７１０７７、ＵＳ２００９／０１５５２７２、ＵＳ２００７／０１１６７５３、ＵＳ２００７／０１１０７９８、ＵＳ２００７／００３１４８４、ＵＳ２００６／０１４７５１３、ＵＳ２００５／０１１２０６５、ＵＳ２００４／００３７８７４、ＵＳ２００４／０２０９３６６、ＵＳ２００３／０００３１４３、ＵＳ７，１３５，１７７、ＵＳ７，０２２，３３６、ＵＳ６，８０３，０５３、ＵＳ６，５２８，０８７、ＵＳ６，２１４，３８８、ＵＳ６，２１０，７０７、ＵＳ６，１１０，４９１、ＵＳ５，９８０，９３５、ＵＳ５，３８０，５３１、ＵＳ７，５０７，４０７、ＵＳ７，４７９，２７６，及びＵＳ７，４６２，６０３に記載されている。
【０１３２】
Ａｂに付加させる上記配列要素のどれでも、リンカー、例えば可動性リンカー、例えばペプチドリンカーまたはポリエチレングリコールリンカーを介してＡｂに連結させることができる。存在する場合、リンカー分子は、一般に、例えば、脂質ナノ粒子の表面に結合した場合に、Ａｂ及びリンカー部分が、Ａｂにある程度運動の自由度を与えられるようにするのに十分な長さのものである。
【０１３３】
組成物
同じく本開示が提供するのは、組成物、例えば、本明細書で開示されるＡｂもしくは複合体、または本明細書で開示されるＡｂのいずれかをコードする核酸のいずれかを含む組成物である。ある特定の態様において、組成物は、対象（例えば、ヒト）でのがん治療に用途を見出し、疾患のどの段階中でも治療に適している可能性がある。１種、２種、またはそれより多くの異なるＡｂを含有する組成物は、医薬組成物として提供することができ、それを必要としている哺乳類（例えば、ヒト）に投与することができる。
【０１３４】
上記のとおり、リポソームは、本明細書で開示されるＡｂとは異なるＡｂを１種または複数含有する場合がある。リポソームは、そのリポソームが複数の異なるＡｂを付加により有しており、本明細書で開示されるＡｂが結合するＥｐｈＡ２エピトープの他に少なくとも１種のさらなるエピトープまたは抗原に対して特異的であるという点で、二重特異性、多重特異性、などである場合がある。
【０１３５】
合剤は、単独の配合物で提供することも、別々の配合物として提供することも可能であり、例えば、キットとして、別々の容器に入っており、これらの容器をさらにより大きな容器に入れることができ、別々の配合物は、例えば、１種類のＡｂ、または複数種の異なるＡｂを含有することができる。そのような別々の配合物は、投与の前に混合することも、別々に注射することにより投与することもできる。
【０１３６】
本明細書で開示されるＡｂまたは免疫リポソームは、薬学上許容される担体に配合する、例えば、記載される方法で使用するための非経口投与用に配合することができる。ある特定の実施形態において、例えば、Ａｂが注射液（例えば、静脈内注射に適したもの）として投与される場合、Ａｂ配合物は、滅菌、無パイロジェンの水性液剤が可能であり、この液剤は、塩（例えば、浸透圧を調節するための）、緩衝剤、保存剤、アミノ酸、ならびに他の薬学上許容される担体及び賦形剤の１つ、または複数、あるいは全部を含み、またＡｂ配合物は、例えば、すぐに使える剤形として、または再構築可能な貯蔵安定性粉末または液体として提供することが可能である。対流向上送達を介した投与用配合物は、例えば、ＵＳ２００９０２０８４２２に記載のとおりである場合がある。
【０１３７】
本開示の組成物は、治療上有効量の対象抗体、ならびに必要に応じて任意の他の適合成分を含むことができる。「治療上有効量」は、個体にその量で投与することが、単回投与であれ、一連の同一または異なる抗体または組成物の一部であれ、対象におけるがん性細胞の増殖及び／または転移を低減する、あるいは任意の他の検出可能な治療効果を提供するのに有効であることを意味する。そのような治療上有効量の抗体及び細胞増殖に対するその影響として、１つまたは複数の他の療法（例えば、免疫療法、化学療法、放射線療法など）との併用における細胞増殖の協同的及び／または相乗的阻害が挙げられる。以下に記載のとおり、治療上有効量は、投薬レジメン及び対象の状態の診断解析（例えば、ＥｐｈＡ２に特異的な抗体を用いて細胞表面エピトープの有無についてモニタリングすること）などと関連して調節することができる。
【０１３８】
量及び投薬
正確な用量は、当業者により確認可能となる。投薬量は、様々な要因に依存する可能性があり、そのような要因として、使用される特定化合物の強度、対象の状態、及び対象の体重、ならびに疾病の重篤度及び疾患の段階が挙げられる。投薬量はまた、特定化合物の投与に付随する可能性がある任意の有害副作用の存在、性質、及び程度により決まることになる。当該分野で既知のとおり、年齢、体重、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、及び状態の重篤度に基づいた調節が、必要である場合があり、常用実験を用いて当業者により確認可能となる。治療上有効量は、治療上有益な効果が抗体のどの毒性効果または有害効果にも勝る場合のものでもある。
【０１３９】
対象、例えば、ヒトに投与される組成物の量は、本開示の文脈において、妥当な時間枠にわたって動物に予防的または治療的反応をもたらすのに十分でなければならず、投与の目的、治療される個体の健康状態及び身体状態、年齢、所望の消散度合い、抗体組成物の配合、治療に当たる医師の病状の評価、ならびに他の関連要因に依存して変化する。すなわち、この量は、比較的広範囲に含まれることが予想されるが、そうであっても、対象の様々な特長、例えば上記したものなどを通じて常用的に決定することができる。
【０１４０】
例として、対象抗体の治療的または予防的有効量の範囲は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであるが、これらに限定されない。
【０１４１】
医薬配合物中の抗体濃度は、重量で、約０．１％未満、通常は約２％または少なくとも約２％から、最大で２０％〜５０％以上まで変わる可能性があり、選択した投与の特定様式及び患者の必要に従って、主に液体体積、粘度などを考慮して選択することになる。
【０１４２】
同じく、適切な用量及び投薬レジメンは、所望の増殖阻害または免疫抑制反応に影響を及ぼすことが既知である抗がん剤または免疫抑制剤との比較により決定される可能性がある。そのような投薬量として、目立った副作用なしに細胞増殖の低用量阻害をもたらす投薬量が挙げられる。ある特定化合物を適切な用量で適切な投与で用いる場合、本開示の化合物は広範囲の細胞内効果、例えば、細胞増殖の部分阻害から本質的に完全な阻害までをもたらすことができる。投薬治療は、単回用量計画の場合も、複数用量計画の場合もある（例えば、漸増漸減及び維持量を含む）。以下に示すとおり、対象組成物は、他の作用剤と併用して投与することができ、したがって、用量及びレジメンは、この文脈でも同様に、対象の必要を満たすように変化させることができる。
【０１４３】
併用療法
多種多様ながん治療のどれであっても、本開示の抗体と組み合わせた組成物にすることができる。例えば、化学療法剤を用いる治療または生体反応修飾剤治療で使用される作用剤が、免疫リポソームなどの抗体を含む医薬組成物中に存在する場合がある。
【０１４４】
化学療法薬は、がん細胞の増殖を低減する非タンパク質性化合物であり、細胞毒性剤及び細胞分裂阻害剤を包含する。化学療法薬の例として、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、植物アルカロイド（例えば、ビンカアルカロイド）、核酸、例えば抑制性核酸など（例えばｓｉＲＮＡ）、及びステロイドホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
代謝拮抗剤として、例えば、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０１４６】
適切な自然産物及びそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍性抗生物質、酵素、リンホカイン、及びエピポドフィロトキシン）は、抗がん剤として使用できる。例えば、タキサン、例えば、パクリタキセルなど、ならびに任意の活性タキサン誘導体、例えばドセタキセルなど、またはタキサンプロドラッグ、例えば２’−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−パクリタキセル、７−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−パクリタキセル、２’−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−ドセタキセル、もしくは７−（２−（Ｎ，Ｎ’−ジエチルアミノ）プロピオニル）−ドセタキセルなど、が適切である。
【０１４７】
他の抗増殖性細胞毒性剤として、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒａｚｏｌｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、ラロキシフェン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イホスファミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、及びドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）がある。抗増殖性活性を有する微小管作用剤も、使用に適している。ホルモン修飾剤及びステロイド（合成類似体を含む）は、使用に適している。
【０１４８】
方法
治療方法
本開示の抗体は、様々ながんに治療用途を見出す。がんを有する、有する疑いがある、または発症するリスクがある対象は、本明細書に記載される療法及び診断法の対象として企図される。
【０１４９】
「治療」は、宿主に影響を及ぼす健康状態に関連した症候の少なくとも寛解が達成されることを意味し、寛解は、広義で使用されて、治療される健康状態に関連したパラメーター、例えば症候などの規模の少なくとも低下を示す。そのため、治療は、病理学的状態、または少なくともそれに関連した症候が、完全に阻止される、例えば、発生が予防される、または停止される、例えば宿主がその健康状態、もしくは少なくともその健康状態を特徴付ける症候によりもはや苦しんでいないように、終結するなどの状況も含む。すなわち、治療は、以下を含む：（ｉ）予防、すなわち、臨床症候の発生リスクの低下であり、これには、臨床症候が発生しない状態を引き起こすこと、例えば、疾患が有害な段階へと進行するのを防ぐことが含まれる；（ｉｉ）阻害、すなわち、臨床症候の発生またはさらなる発生の抑止、例えば、腫瘍量を減少させるように、例えば、活動性疾患を軽減または完全に阻害すること、この減少として、検出可能ながん性細胞（例えば転移性がん細胞）の除去を挙げることができる；及び／または（ｉｉｉ）緩和、すなわち、臨床症候の退縮を引き起こすこと。
【０１５０】
様々な対象を、本方法により治療することができる。一般に、そのような対象は、「哺乳類（ｍａｍｍａｌ）」または「哺乳類（ｍａｍｍａｌｉａｎ）」であり、これらの用語は、哺乳綱に含まれる生物を記載するために広義で使用され、そのような生物として、食肉目（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、ならびに霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）が挙げられる。多くの実施形態において、対象は、ヒトになる。
【０１５１】
関連実施形態において、治療される対象は、腫瘍関連抗原、及び／またはＥｐｈＡ２を発現する（例えば過剰発現する）がんを有する。抗原は、がん細胞表面で発現し、相当する非がん性細胞上よりも高いレベルで存在することが多い。この態様は、ＥｐｈＡ２を発現するまたは提示する細胞が本開示の抗体を用いた治療に適している可能性があるという点で、本開示の方法の文脈において有益となる可能性がある。抗体は、例えば、抗原の存在が検出可能ではない時点で治療が開始される場合に、対象に投与することができ、したがって、何ら制限を意図しない。疾患症候の最初の兆候の前に、または疾患の診断前もしくは後に、抗体治療を開始することも可能である。
【０１５２】
がん
本開示の抗ＥｐｈＡ２抗体組成物及び／または抗ＥｐｈＡ２抗体複合体組成物は、抗がん治療、特にがん性細胞が細胞外から接触可能な細胞表面にＥｐｈＡ２を提示する場合に、使用可能である。例えば、本明細書に記載される抗体組成物及び／または治療抗体複合体組成物は、がん性細胞の増殖を低減させるため、例えば、腫瘍の大きさを減少させる、がん量を減少させる、転移を減少させる、及び／または患者の臨床転帰を改善するために、対象（例えばヒト患者）に投与することができる。本明細書で企図されるがんに関連した方法として、例えば、抗体治療の単独でのまたは抗がんワクチンもしくは治療と併用での使用が挙げられる。
【０１５３】
抗体治療に特に適したがんは、本明細書に記載される診断方法と同様な方法及び当該分野で既知の他の方法により同定することができる。
【０１５４】
抗がん治療が、上記の抗体組成物の投与を含む場合、抗がん治療は、対象抗体と結合するエピトープを細胞表面で接触可能なように及び／または溶媒と接触するように発現する、転移性癌をはじめがん性細胞を特に目指すように仕向けることができる。
【０１５５】
治療に適したＥｐｈＡ２発現がんの例として、固形腫瘍、半固形腫瘍、及び液性腫瘍が挙げられる。治療に適したＥｐｈＡ２発現がんの例として、乳房、脳、卵巣、膀胱、前立腺、膵臓、食道、肺（例えば、非小細胞肺癌）、及び胃のＥｐｈＡ２陽性癌が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、また、結腸、外陰部、皮膚（例えば、黒色腫）、腎臓、及び神経膠腫（例えば、多形神経膠芽腫、星状細胞腫）、白血病、ならびにリンパ腫を挙げることができる。
【０１５６】
なお、ＥｐｈＡ２は、がん細胞で非がん性細胞よりも高いレベルで発現する可能性があるものの、このことは、本明細書に開示される治療の制限とはならない。
【０１５７】
本明細書で開示される方法による治療に適したＥｐｈＡ２発現細胞がんとして、食道癌、肝細胞癌、基底細胞癌（皮膚癌の１形態）、有棘細胞癌（種々の組織）、移行細胞癌（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌、気管支原性癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む肺癌、副腎皮質癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、腎細胞癌、非浸潤性乳管癌または胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、骨原性癌、上皮癌、及び上咽頭癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
本明細書で開示される方法による治療に適したＥｐｈＡ２発現肉腫として、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、及び他の軟部組織肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５９】
本明細書で開示される方法による治療に適したさらなるＥｐｈＡ２発現固形腫瘍として、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
本明細書で開示される方法による治療に適する可能性があるＥｐｈＡ２発現白血病として、以下：ａ）慢性骨髄増殖症候群（多分化能造血幹細胞の腫瘍性障害）；ｂ）急性骨髄性白血病（多分化能造血幹細胞または系列可能性が限定された造血細胞の腫瘍性形質転換；ｃ）慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ；免疫学的に未熟及び機能的に無能な小リンパ球のクローン増殖）、これにはＢ細胞ＣＬＬ、Ｔ細胞ＣＬＬ前リンパ性白血病、及び有毛細胞白血病が含まれる；ならびにｄ）急性リンパ芽球性白血病（リンパ芽球の蓄積を特徴とする）、が挙げられるが、これらに限定されない。方法を用いて治療可能なリンパ腫として、Ｂ細胞リンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
本明細書で開示される方法による治療に適した他のがんとして、非定型髄膜腫（脳）、膵島細胞癌（膵臓）、髄様癌（甲状腺）、間葉細胞腫（腸管）、肝細胞癌（肝臓）、肝芽腫（肝臓）、腎明細胞癌（腎臓）、及び縦隔神経線維腫が挙げられる。
【０１６２】
本明細書で開示される方法を使用する治療に適する可能性があるがんの他の例として、上皮及び神経外胚葉起源のＥｐｈＡ２発現がんが挙げられるが、これらに限定されない。上皮起源のＥｐｈＡ２発現がんの例として、小細胞肺癌、乳房、眼水晶体、結腸、膵臓、腎臓、肝臓、卵巣、及び気管支上皮の癌が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法は、ＥｐｈＡ２を過剰発現することが既知であるがん細胞の治療に用いることができる。
【０１６３】
神経外胚葉起源のＥｐｈＡ２発現がんの例として、ユーイング肉腫、脊椎腫瘍、脳腫瘍、新生児テント上未分化神経外胚葉腫瘍、管状嚢胞癌、粘液性尿細管細胞及び紡錘細胞癌、腎腫瘍、縦隔腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、ならびに思春期及び青年期の肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
他の癌療法との併用
上記のとおり、本方法の別の特長は、抗体が、１種または複数の他の療法と併用して対象に投与可能であるということである。そのような療法は、組み合わせて１つの組成物にする場合も、対象抗体と結合させる場合もある。本明細書に開示される抗体と物理的に組み合わせる（例えば、複合体として、またはリポソームもしくは他の脂質ナノ粒子に入れて）だけでなく、１種または複数の抗がん剤、例えば上記の表４に列挙されるものなどを、本明細書に開示される抗体の投与と併用して、同時にまたは前後いずれかで、投与することができる。
【０１６５】
抗体組成物の投与以外の療法または治療は、対象抗体の投与と同時から、それより最長５時間以上、例えば、１０時間、１５時間、２０時間以上前または後までのいつでも投与することができる。対象抗体及び他の治療介入は、順次、例えば、対象抗体を別の治療的処置の前後に投与することで、投与または施行される。対象抗体及び他の治療は、例えば、対象抗体及び第二の治療が同時に投与される、例えば、第二の治療が薬物である場合に、それが対象抗体と併せて、２つの別個の配合物としてまたは１つの組成物に組み合わされて対象に投与される場合に、同時に投与される。投与が、上記のとおり順次であるか同時であるかにかかわらず、これらの治療は、本開示において、一緒にまたは併用で投与されたとみなされる。
【０１６６】
対象抗体と併用して投与されるかどうかはわからないが、さらなる標準抗がん治療として、免疫療法、化学療法薬、及び手術（例えば、以下でさらに記載されるとおりのもの）が挙げられるが、これらに限定されない。また、対象抗体の治療的投与は、抗がん治療を受けた対象の治療後処置であることも可能であり、この場合の抗がん治療は、例えば、手術、放射線療法、化学療法薬の投与などが可能である。本明細書に記載されるもの以外の抗体、特に標的細胞の補体介在型死滅、及び／または抗体依存性細胞性細胞障害型死滅をもたらすことが可能なモノクローナル抗体も、使用することができる。
【０１６７】
例えば、対象抗体は、１種または複数の化学療法薬（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾン（ＣＨＯＰ））と併用して、及び／または放射線治療と併用して、及び／または手術介入（例えば、腫瘍除去手術前もしくは手術後）、放射線療法、骨髄移植、生体反応修飾剤治療、及びこれらのある特定の組み合わせと併用して、投与することができる。放射線療法として、ビームとしてなど外部からの照射線源として、または小放射線源の移植により、送達されるＸ線またはガンマ線が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
投与経路
本方法を実施するにあたり、投与経路（対象抗体が対象にもたらされる経路）は変わる可能性があり、対象抗体の代表的な投与経路を、以下にさらに詳細に記載する。上記の対象抗体は、単独でまたは併用して、全身に（例えば、非経口、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、脳室内、もしくは皮下投与により）または局所的に（例えば、局所腫瘍部位で、例えば、腫瘍内投与（例えば、固形腫瘍中へ、リンパ腫もしくは白血病の関連リンパ節中へ、または例えば、ＵＳ２００９０２０９９３７に開示されるとおり、例えば脳中への対流向上送達により）、固形腫瘍が供給を受けている血管中への投与などにより）、体腔または管腔中に、あるいは臓器に、投与することができる。これらの異なる投与経路は、注射または輸液により行うことができる。
【０１６９】
非経口投与に適した配合物として、水性及び非水性の、等張性滅菌注射液剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び配合物を目的レシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができ、ならびに水性及び非水性の、滅菌懸濁剤が挙げられ、これらは、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むことができる。配合物は、単位用量または複数用量の密閉容器、例えばアンプル及びバイアルなどに入れて提供することができ、また、使用直前に注射用に滅菌液状賦形剤、例えば、水を加えるだけでよい凍結乾燥（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。注射液剤及び懸濁剤は、上記した類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。非経口投与可能な組成物の調製方法は、当業者には既知または自明であるだろう。
【０１７０】
治療の投与は、所望の期間にわたり繰り返すことができ、例えば、約１日〜約５日にわたり繰り返す、または約１ヶ月、約２ヶ月などにわたり、数日ごとに、例えば、約５日ごとに１回で繰り返すことができる。治療は、他の治療的介入、例えばがん性細胞を除去する手術介入などの前、同時、または後に投与することもできる。抗体は、併用療法の一部としても投与することができ、併用療法では、免疫療法、がん化学療法、または放射線療法の少なくとも１種が、対象に投与される（上記でより詳細に記載されるとおり）。
【０１７１】
検出方法
本開示は、対象中の生体試料中または対象から単離された試料中の、例えば、ＥｐｈＡ２発現細胞上の、ＥｐｈＡ２を検出する方法を提供する。本方法は、診断目的及び予後診断目的の両方に有用である。対象方法は、概して、細胞含有試料を、本開示の抗体または抗体複合体と接触させること；及び試料中の細胞に対する抗体または抗体複合体の結合を検出することを含む。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであることが可能であり、この場合、細胞は、がん細胞を有することが疑われる対象、癌治療を受けている対象、または治療に対する感受性について試験されている対象から得られる生体試料中にある。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏであることが可能であり、例えば、細胞は、がん細胞を有することが疑われる対象、がん治療を受けている対象、または治療に対する感受性について試験されている対象中にある。
【０１７２】
本明細書に記載される検出アッセイは、対象の有するがんが、抗体に基づく療法を用いた治療にどれだけ適しているか判断するため、ならびに対象における治療の進行をモニタリングするために使用することができる。このアッセイは、他の併用療法の過程を評価するために使用することもできる。すなわち、診断アッセイは、医師が療法及び治療レジメンを選択するための情報を提供することができる。
【０１７３】
抗体は、免疫診断技法を介して、ＥｐｈＡ２発現がん性細胞を有するまたは有することが疑われる対象の生体試料中のＥｐｈＡ２発現細胞を検出するために使用することができる。そのような診断は、以下で開示される治療法に適した患者を同定する、及び／または治療法に対する反応をモニタリングするのに有用となる可能性がある。
【０１７４】
適切な免疫診断技法として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ（撮像）方法の両方が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、抗ＥｐｈＡ２抗体は、検出可能なように標識化し、ＥｐｈＡ２の細胞表面発現を特徴とするがんを有することが疑われる対象に投与して、結合した検出可能な標識化抗体を、当該分野で利用可能な撮像方法を用いて検出することができる。
【０１７５】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像」という語句は、本明細書で使用される場合、生きた哺乳類全身での抗体（例えば検出可能な標識化２Ｄ６）の存在の検出方法を示す。光学的に検出可能なタンパク質、例えば、蛍光抗体及びルシフェラーゼ結合抗体などは、ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像により検出することが可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像を使用して、哺乳類の二次元画像ならびに三次元画像を提供することができる。放射標識化抗体を、例えば、対象に投与することができ、その対象をガンマカメラで撮像することができる。電荷結合素子カメラ、ＣＭＯＳ、または三次元断層撮影機を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ撮像を行うことができる。コンピューター断層撮影法、核磁気共鳴画像法、超音波断層法、ポジトロン放出断層撮影法、単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ撮像の方法は、当該分野で周知である。多くのｉｎ  ｖｉｖｏ撮像法から得られる情報は、上記されるものなどと同様に、対象中のがん細胞についての情報を提供することができる。
【０１７６】
方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏのものである場合、生体試料は、がん細胞が存在する可能性のある任意の試料が可能であり、そのような試料として、血液試料（全血、血清などを含む）、組織、細胞全体（例えば、インタクト細胞）、及び組織または細胞抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アッセイは、生細胞または組織学的組織試料中の細胞上でＥｐｈＡ２を検出することを含むことができる。特に、検出は、生細胞の細胞外表面で評価することができる。例えば、組織試料は、固定することができ（例えば、ホルマリン処理により）、支持体に（例えば、パラフィンに）包埋させて、または固定されていない組織を凍結させて、提供することができる。
【０１７７】
アッセイは、競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイなど、多種多様な形態を取ることができる。例として、以下が挙げられる：ウエスタンブロット法；凝集検査；酵素標識化及び酵素介在型免疫アッセイ、例えば酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など；ビオチン／アビジン型アッセイ；放射免疫アッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈降法など。反応は、概して、抗体と結合した検出可能標識を含む。標識として、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、酵素分子、及び／または色素分子、あるいは試料中の抗原と、それと反応する抗体（複数可）との複合体形成を検出する他の方法のものが挙げられる。固体支持体が使用される場合、固体支持体は、抗体が支持体に十分に固定されるように、通常、適切な反応条件下、固相成分と最初に反応する。カップリング剤、例えばタンパク質（例えば、血清アルブミン（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）など）、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン）、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体などを用いて、固体支持体への固定を促進することができる。
【０１７８】
アッセイは、抗体と抗原が、沈殿条件下で複合体を形成するように、溶液中で行うことができる。適切な結合条件下、抗体で被覆した粒子を、標的抗原を含有することが疑われる生体試料と接触させて、粒子−抗体−抗原複合凝集体を形成させることができ、この凝集体は、沈殿可能で、洗浄及び／または遠心を用いて試料から分離することができる。上記の免疫診断方法など複数ある標準方法のいずれかを用いて、反応混合物を分析して、抗体抗原複合体の有無を判定することができる。
【０１７９】
本開示のアッセイは、例えば、ＥｐｈＡ２発現がん性細胞の検出方法として生細胞による本開示の抗体及び／または抗体複合体の細胞取り込みを検出するアッセイを含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示の抗体及び／または抗体複合体がＥｐｈＡ２発現細胞により取り込まれる場合、ＥｐｈＡ２発現細胞を含有することが疑われる試料を、そのような抗体と接触させ、抗体及び／または抗体複合体の内部移行を可能にするのに十分な時間でインキュベートすることができる。続いて洗浄する。内部移行した抗体は、細胞に含有される抗体の標識を介して検出することができる（例えば、ＦＡＣＳ、分光計、放射性同位体カウンターなど）。内部移行抗体は、ＵＳ７，０４５，２８３に記載のとおりに選択することもできる。
【０１８０】
上記のアッセイ試薬は、本開示の抗体も含めて、上記のとおり免疫アッセイを行う目的で、キットに入れて、適切な説明書及び他の必要な試薬とともに、提供することができる。キットは、使用される特定の免疫アッセイに応じて、適切な標識ならびに他のパッケージ化試薬及び材料（すなわち洗浄緩衝液など）も含有することができる。標準免疫アッセイ、例えば上記で記載されるものなどは、これらのキットを用いて行うことができる。
【０１８１】
以下の実施例は例示を提供するもので、限定するものではない。
【実施例】
【０１８２】
実施例１−Ｄ２−１Ａ７の熱安定性及びプロテインＡとの結合
Ｄ２−１Ａ７  ｓｃＦｖを、熱安定性について及びプロテインＡ樹脂との結合について特性分析した。
【０１８３】
熱安定性の測定は、示差走査型蛍光（ＤＳＦ）により、以下のとおりに行った：１０μＭのｓｃＦｖ及び１×Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ（Ｓｉｇｍａ）を含む１×ＰＢＳ、２５μｌを、２０℃から９０℃まで、速度１℃／分で加熱し、その結果生じる蛍光データを収集した。加熱及び蛍光データの生成は、ＩＱ５リアルタイム検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標））を用いて行った。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析した。報告されるＴｍは、一次導関数の最大値での温度である。
【０１８４】
複数試料についてのプロテインＡ結合を、以下のとおり測定した：哺乳類細胞が発現したｓｃＦｖを、４０００ｇで１５分間遠心して細胞を除去することにより、培養物から得た。上清のｓｃＦｖ力価を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏを用いて測定した。プロテインＡ結合は、９６ウェルプロテインＡプレート（プロテインＡ９６ウェルタンパク質精製プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、プロテインＡ  ＨＰ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（登録商標））を用いてアッセイした。このプレートは、多孔質底を持つウェルにプロテインＡ結合樹脂を含有しており、ウェル中の液体を、遠心または吸引を介して底面から収集することを可能にする。プレートの各ウェルを、１×ＰＢＳで洗い、タンパク質２５０μｇを含有する上清を各ウェルに添加した。次いで、真空マニホールド（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標））を用いて、圧１０ｍｂａｒで上清をプロテインＡ樹脂から分離し、各ウェルからの流出液を、別々に標準９６ウェルプレートの空ウェルへと集める。次いで、プロテインＡプレートのウェルを６００μＬの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．６）で洗った。樹脂と結合したＡｂを溶出させるため、各ウェルに２００μＬの０．１Ｍ酢酸を加え、室温で３〜１０分間インキュベートした。プレートを第二のプレートに重ねて、溶出液を捕捉し、１００×ｇで２分間遠心し、２０μＬの１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えて、溶出液中のＡｂを中和した。プロテインＡ結合のパーセンテージを求めるため、流出液に残存するｓｃＦｖの濃度を、最初に添加したタンパク質の量（２５０ｕｇ）と比較した。
【０１８５】
結論：測定された６５℃というＴｍは、有効かつ商業的生産性のあるリポソーム結合には容認し難い低さであり、測定された１０％未満というプロテインＡ結合は、商業生産には容認し難い低さである。
【０１８６】
実施例２−Ｔｍを改善するためのフレームワーク操作
Ｔｍを含む安定特性を向上するための最初のアプローチとして、Ｄ２−１Ａ７のＣＤＲを、異なるＩｇのフレームワークに移植した。Ｄ２−１Ａ７の重鎖可変領域のフレームワークは、ＩＧＨＶ３−３０である。ＶＨ３は、一般に、非常に安定であり、典型的には、プロテインＡと結合する能力を有し、治療用Ａｂのフレームワークとして一般的に用いられる。したがって、ＶＨ３ファミリー内の重鎖は保持して、Ｄ２−１Ａ７の重鎖をＩＧＨＶ３−２３骨格に移植することにした。ＩＧＨＶ３−２３骨格は、最も一般的なアイソタイプである。さらに、２つの安定化変異をＩＧＨＶ３−２３フレームワーク内で行った：Ｅ６Ｑ及びＳ４９Ａである。
【０１８７】
Ｄ２−１Ａ７の軽鎖可変領域のフレームワークは、ＩＧＶλ３−１９であり、これは、天然ヒトＡｂレパートリー中では一般に見つからない。そのため、Ｄ２−１Ａ７軽鎖ＣＤＲを、より一般的なフレームワークＩＧＶλ１−４０に移植することにした。ＩＧＶλ１−４０は、ＩＧＶＨ３−２３と対になっているのも頻繁に見つかる。２種の熱安定変異体、ＴＳ１及びＴＳ２を、設計した。相同性モデリングに基づいて、１位及び２２位が、抗原と相互作用すると考えられたので、両変異体を、逆変異させて、Ｄ２−１Ａ７中でそれらの位置において生じる残基を有するようにした（Ｑ１Ｓ、Ｓ２２Ｔ）。ＴＳ１では、表面の電荷を調節しながらも（Ｖ３Ｅ、Ｒ１８Ｔ）、安定性にとって重要であると思われる疎水性ポケットは保持させた（Ｇ１３Ｖ、Ｌ７８Ａ）。アミノ酸配列をナイーブ配列のレパートリーと比較して、Ｌ３９Ｋ（ＴＳ１）、Ｆ６５Ｓ（両方）、Ｋ６６Ｇ（ＴＳ２）またはＫ６６Ｓ（ＴＳ１）、及びＡ７４Ｔ（ＴＳ１）を含む共通アミノ酸を導入した。
2019515645.tif 000007
【０１８８】
結論：ＴＳ１は、熱安定性に顕著な改善を示し、Ｔｍが６℃上昇する。このクローンは、使用、またはプロテインＡ結合を改善するための追加操作に適している。
【０１８９】
実施例３−プロテインＡ結合を防ぐ領域の同定
ｓｃＦｖの熱安定性が７１℃に改善されたので、次に、プロテインＡ親和性を操作してＡｂに導入し、製造しやすくした。ＶＨ３フレームワークは、プロテインＡと結合できることが文献で広く報告されている。ＴＳ１のＶＨ３−２３フレームワークを操作したが、残念ながら、ＴＳ１は、プロテインＡと十分に結合しなかった。重鎖の可変領域内において、ＦＲ１、ＣＤＲ２、及びＦＲ３内の残基は、プロテインＡ結合に関与することが示されてきている。ＴＳ１の構造解析から、以下に示す位置の生殖系列から逸脱したアミノ酸で、結合に重要なものはないことが明らかとなった：Ｈ１５、Ｈ１７、Ｈ１９、Ｈ５７、Ｈ５９、Ｈ６４、Ｈ６５、Ｈ６６、Ｈ６８、Ｈ７０、Ｈ８１、Ｈ８２ａ、Ｈ８２ｂ。生殖系列配列を考慮しても、どのアミノ酸がプロテインＡとＡｂの間の相互作用に負の影響を及ぼすのかは不明のままであったので、プロテインＡ結合アッセイを開発した。
【０１９０】
Ｄ２−１Ａ７、ＴＳ１、ＴＳ１＊、及びＦ５の重鎖及び軽鎖を異種間で対にして含む、一連の変異体ｓｃＦｖを設計し、調製した。ＣＤＲ−Ｈ２配列の効果を直接試験する目的で、ＴＳ１のＣＤＲ−Ｈ２がＦ５のＣＤＲ−Ｈ２で置き換えられた（ＴＳ１＊）ｓｃＦｖも作製した。変異体を、哺乳類細胞で一過性に発現させ、発現したｓｃＦｖの力価を、バイオレイヤー干渉法（ｆｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標））を用いて定量した。プロテインＡ結合分析を、実施例１に記載のとおり、９６ウェルプレートで行った。流出液中に残存するｓｃＦｖの量を、バイオレイヤー干渉法を用いて測定し、プロテインＡ樹脂に結合したｓｃＦｖのパーセンテージを計算し、結果をプロットした（図１）。
結論：Ｆ５は、プロテインＡに対して７５％結合を示した。ＴＳ１は、２９％というプロテインＡ結合を示し、商業生産に容認できるとみなされる５０％限度よりはるかに低かった。Ｆ５のＣＤＲ−Ｈ２をＴＳ１に移植する（ｓｃＦｖ  ＴＳ１＊を得る）と、ＥｐｈＡ２結合を抑止しながらも、プロテインＡ結合の顕著な改善を示し（６５％）、このことは、ＴＳ１のＣＤＲ−Ｈ２が、プロテインＡ結合に負の影響を及ぼしていることを示唆する。
【０１９１】
実施例４−酵母菌ディスプレイを用いたＣＤＲ−Ｈ２設計及びｓｃＦｖ選択
ＴＳ１ＣＤＲＨ２の変異体セットを、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３）  ｍＡｂｓ，  ５：２，  ２３７−２５４に記載のとおりに酵母菌ディスプレイ用に調製し；ＥｐｈＡ２結合を保持し、かつプロテインＡ結合の改善を示すクローンを選出した。このセットは、５０，０００を超える異なるＣＤＲＨ２配列を含むように設計された。このセットの各ｓｃＦｖは、Ｃ末端に組み込まれたＦＬＡＧ（商標）エピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ−配列番号４９）を有する。このセットは、プロテインＡ結合に重要であることが疑われるＣＤＲ−Ｈ２位置、ならびにＥｐｈＡ２結合に寄与することが疑われるＣＤＲ−Ｈ２位置に多様性を組み込んであった。次いで、設計を、ＮＣＢＩからダウンロードしたヒトＡｂレパートリーのデータベースならびに非免疫患者レパートリーのＮＧＳ配列決定と比較して、高度に保存された残基を温存するように調節した。最終的に、ＣＤＲＨ２残基のＶＨ４９、ＶＨ５０、ＶＨ５２Ａ、ＶＨ５３、ＶＨ５５、及びＶＨ５７を、変異誘発用に特定した。同じくヒトレパートリーに基づいて、ほとんどの位置について、一組のアミノ酸サブセットだけを選択した（表４を参照）。これにより、５３，４６０の異なる配列を含むように設計されたｓｃＦｖのセットを作製し試験した。
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【０１９２】
所望の性質を持つｓｃＦｖを単離するための酵母菌細胞表面で個別に発現させたｓｃＦｖのセットの迅速な選別は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（登録商標）（ＢＤ）Ａｒｉａ（登録商標）システムで酵母菌をＦＡＣＳ選別することにより行った。誘導された酵母菌細胞を、２００ｎＭのＨｉｓ６タグ付ＥｐｈＡ２及び１０μｇ／ｍＬの蛍光標識化プロテインＡとともにインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．４）で２回洗い、未結合抗原を除去した。次いで、抗原結合及びプロテインＡ結合細胞を、２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ６４７標識化Ｍ２抗ＦＬＡＧ（商標）Ａｂ及び２μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ４８８標識化抗Ｈｉｓ６Ａｂとともに３０分間インキュベートした。２回洗った後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、蛍光シグナルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（登録商標）機器を用いて測定した。蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェアを用いて決定した。ＥｐｈＡ２  ＭＦＩ（抗Ｈｉｓ６−Ａｌｅｘａ４８８）を、発現ＭＦＩ（抗Ｆｌａｇ−Ａｌｅｘａ６４７）に対して正規化した。選択の第一ラウンドについては、ＥｐｈＡ２及びプロテインＡ結合の両方について選出し（図２、パネルＢ）、選出されたのは集団の数パーセントだった。組換えＥｐｈＡ２に結合した集団が同定されたことを確実にするため、単離されたクローンを、ＥｐｈＡ２結合について再選出した（図２、パネルＤ）。
【０１９３】
結論：所望の特徴を示すクローンが得られた。
【０１９４】
実施例５−ｓｃＦｖの、熱安定性、ＥｐｈＡ２結合／内部移行、及びプロテインＡ結合に関する特性決定
酵母菌で提示させた場合にプロテインＡ及びＥｐｈＡ２結合に関して陽性だったｓｃＦｖを、配列決定し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））で、可溶性タンパク質として一過性発現させた。次いで、それらを、実施例１に記載のとおりに、プロテインＡ結合について測定した。実施例４に記載のとおりにして得られた２２の独特な変異体を試験したところ、２０％〜８０％の範囲でプロテインＡ結合を示した（図３）。これら２２のｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ１〜ｓｃＦｖ２２）のアミノ酸配列及びコード核酸配列を図５に提示する。
【０１９５】
試験した２２のｓｃＦｖのうち、１５は、タンパク質の少なくとも５０％がプロテインＡと結合する結果となったので、これらを、さらなる特性決定用に選択した。全ての変異体のＴｍを、ＤＳＦを用いて測定した。４つを除く全てのｓｃＦｖが、６５℃を２℃より大きく超える（すなわち、少なくとも６７℃）の望ましいＴｍを有していた。１１のｓｃＦｖが、さらにより好ましい≧７０℃のＴｍを有していた。
2019515645.tif 000009
【０１９６】
結合及び内部移行アッセイ：
これらの変異体ｓｃＦｖの抗ＥｐｈＡ２活性を試験するため、これらのＡｂで外側修飾されたリポソームの結合及び内部移行を、ＥｐｈＡ２発現細胞株でアッセイした。高速ハイスループットキレート化リガンド誘導型内部移行アッセイ（ＣＬＩＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００６，  ７：２４）を用いて、結合及び内部移行評価のための抗ＥｐｈＡ２−ｓｃＦｖ標的指向性リポソームを選択した。ＥｐｈＡ２受容体を高レベルで発現する２種の細胞株、ＯＶＣＡＲ−３及びＵ−２５１、ならびにマウスＥｐｈＡ２発現マウス細胞株、ＣＴ−２６（マウスＥｐｈＡ２に対する交差反応性が、改変ｓｃＦｖにより保持されるかどうかを試験するため）を試験した。各ｓｃＦｖのＣ末端Ｈｉｓ６タグによるニッケル結合を介して、ｓｃＦｖは、ＮＴＡ（Ｎｉ）結合脂質を含む蛍光標識化リポソーム（Ｄｉｌ５−ＮＴＡリポソーム）と結合した。
【０１９７】
試験リポソームの調製及び内部移行アッセイ
Ｄｉｌ５−ＮＴＡリポソームを、以下のとおり調製した。ＮＴＡ結合脂質、ＤＯＤ−トリ−ＮＴＡは、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００６，  ｖｏｌ．１７，  ｐ．１５９２−１６００に記載のとおりに合成した。水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール、メトキシ−ＰＥＧ（２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＤＯＤ−トリ−ＮＴＡ、及び蛍光脂質色素、Ｄｉｌ５、（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、カタログ番号Ｄ１２３７０）を、それぞれ１００：６６．７：５：０．５：０．３のモル比でクロロホルムに混合して溶液にし、溶液を減圧エバポレートして乾固させて脂質フィルムを形成した。フィルムをＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水（「ＨＢＳ−６．５」−５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）に入れて６８℃で水和させ、得られる脂質懸濁液を、凍結（ドライアイス−アセトン）及び融解（６８Ｃ）のサイクルに数回供し、Ｌｉｐｅｘ（商標）サーモバレル押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、２枚重ねのポリカーボネート膜（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を通して押し出した。ポリカーボネート膜の孔径は、２００ｎｍ（６回）及び１００ｎｍ（１０回）であった。このプロトコルは、典型的には、ｚ平均径１００〜１１０ｎｍ及び多分散指数０．１未満の単層小胞を生成させる。押し出されたリポソームを室温に冷却し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムからＨＢＳ−６．５で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより精製し、次いで、０．２μｍフィルターを通過させることにより滅菌した。次いで、酸消化後に、リポソームリン脂質の濃度を、リンモリブデン酸分光測定法を用いて測定した。細胞とともにインキュベーションする前に、リポソームをハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に希釈して０．４ｍＭのリン脂質とし、ＮｉＳＯ４を０．１ｍＭで加えた。ヘキサヒスチジンｓｃＦｖを、細胞培養培地（以下を参照）に希釈して、ｓｃＦｖの濃度を２５μｇ／ｍＬとし、等体積のリポソーム溶液と混合した（「蛍光ＮＴＡ−リポソーム／ｓｃＦｖ混合物」）。
【０１９８】
イミダゾールを用いた洗浄はＨｉｓ６／Ｎｉ複合体を破壊し、それにより外部（内部移行していない）ヒスチジンタグ付ｓｃＦｖを放出及び除去するので、インキュベーション／イミダゾールを用いた洗浄の前後で細胞の蛍光を測定することにより、内部移行したＡｂのパーセンテージを定量する。試験細胞（ヒトがん細胞株ＯＶＣＡＲ−３及びＵ−２５１ならびにマウスがん細胞株ＣＴ−２６）を、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、及びＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ−６４０細胞培養培地中、付着状態で、９０％コンフルエンスまで増殖させ、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて回収した。細胞浮遊液を、１００，０００細胞／ウェルで、９６ウェル「Ｖ」型底ポリプロピレン細胞培養プレートに分注し、細胞を１×ＰＢＳで洗い、次いで、１００μＬの蛍光ＮＴＡ−リポソーム／ｓｃＦｖ混合液に再懸濁させた。プレートをプレート密封テープで覆い、光から保護して、シェーカー上、５％ＣＯ２雰囲気中で、３７℃で４時間インキュベートした。細胞を遠心によりペレット化し、上清を吸引し、細胞を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳに再懸濁させてあらゆる未結合細胞外リポソームを除去する、または２００μＬ／ウェルの０．２５Ｍイミダゾール含有ＰＢＳ（ｐＨ７．５）に再懸濁させてあらゆる未結合細胞外リポソーム及び表面結合リポソームを除去する、いずれかにより２回洗ったが、ただしこれらは内部移行したリポソームは除去しなかった。細胞付随リポソームの相対量を、ＦＡＣＳ（Ｃｙ５蛍光チャネル）により評価した。「結合」量には、細胞表面結合及び内部移行リポソームの両方が含まれており、この量は、イミダゾール洗浄なしでの細胞蛍光に比例した。これは、図４に、ｓｃＦｖ  ＴＳ１で装飾されたマッチするリポソームによるリポソーム結合に対するパーセントとして示されている。内部移行データは、内部移行したリポソームの量を、細胞付随リポソーム全体に対するパーセントとして示す。クローンの大部分は、ＴＳ１と同様に、ヒト及びマウスＥｐｈＡ２への結合及び内部移行を保持していた（図４）。試験したクローンの１種、ｓｃＦｖ−１２だけ（及びＦ５陰性対照）が、ＥｐｈＡ２に結合しなかった。
【０１９９】
結論：試験した新規クローン２２種のうち２１種（ｓｃＦｖ−１２を除く全て）が、容認できる結合及び内部移行性質を有するとして同定された。２２種のうち１８種（ｓｃＦｖ１〜４、６〜１３、１５〜１６、及び１８〜２１）は、望ましい熱安定性を示し、Ｔｍが≧６７℃であったが、それらのうち１０種（ｓｃＦｖ１〜３、８〜１１、１３、１５、及び１８）は、より商業的に好ましい熱安定性基準も満たし、それぞれ、≧７０℃のＴｍを示した。
【０２００】
実施例６−抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖの結合安定性の試験
選択したｓｃＦｖを、それらのＣ末端で組換え修飾して、Ｈｉｓ６タグを外して、リポソーム結合に適合したＣ末端ペプチド−−ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＣｙｓ（配列番号５４）を付加した。これらの修飾ｓｃＦｖは、それらが由来するｓｃＦＶの該当する名前に続けて文字Ｃを付けることにより識別する。ＡｂとＰＥＧ−ＤＳＰＥ（リポ重合体）との結合（ＵＳ６，２１０，７０７に記載の方法を用いる）を、得られるリポ重合体結合ｓｃＦｖが、効率的に及び結合性（複数の結合したｓｃＦｖを介した抗原に対するリポソーム結合の全親和性として測定、以下で結合活性と称する）を失わずに、抗原結合能力を保持しているかどうか（抗原結合親和性として測定して）、ならびにリポ重合体複合体がリポソームの外側膜に進入する（リポ重合体のＤＳＰＥ部分を介して）能力を持つか（ＰＥＧテザーｓｃＦｖを外側に露出させて残す）と合わせて、次に試験した。
【０２０１】
ｓｃＦｖとリポ重合体リンカーとの結合：精製ｓｃＦｖの溶液を、３０℃で１時間、１５ｍＭのＬ−システイン、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０〜６．２に調整）で処理し、各ｓｃＦｖのカルボキシ末端システイン残基のチオール基を還元／活性化した。過剰なシステインを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムから結合緩衝液（５ｍＭのクエン酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより除去した。次に、Ａｂを、以下のとおり、リポ重合体リンカー、マレイミド−ＰＥＧ（２０００）−ＤＳＰＥ（ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、カタログ番号８８０１２６）と結合させた。処理したｓｃＦｖに、水性ミセル貯蔵液の形状のＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（Ａｖａｎｔｉ）を加え、脂質／タンパク質モル比を４：１とした。混合物を、攪拌しながら、室温で２〜４時間インキュベートし、システインを最終濃度０．５ｍＭで加えて５分間未反応マレイミドをクエンチすることにより、反応を停止させた。クエンチした反応混合物を、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４重力カラムのクロマトグラフィーに供し、Ｓ１０Ｃ−６．５緩衝液（１００ｇ／Ｌの低エンドトキシンスクロース、１０ｍＭのクエン酸ＵＳＰ、ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整）で溶出させ、溶出タンパク質濃度を２８０ｎｍで読んだ。最初の（空隙容量）タンパク質ピークに精製ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体が含まれていたので、これを収集した。ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により評価した。
【０２０２】
試験リポソームの調製及びｓｃＦｖリポ重合体複合体のリポソーム膜への挿入：卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ、ＮＯＦ、Ｊａｐａｎ、ＮＭ−１０）、コレステロール（Ａｖａｎｔ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、＃７７０１００）、メトキシ−ＰＥＧ（２０００）−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ、ＮＯＦ、Ｊａｐａｎ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＧＳ−０２０）、及びＤｉＩ５（実施例５を参照）を、それぞれ１００：６６．７：８：０．３のモル比で、７０℃で無水エタノールに溶解させ、攪拌しながら、７０℃で、１０体積分のＣＳ−２５０緩衝液（２５０ｍＭの水性ＮａＣｌ、５ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ５．５）に希釈して、リン脂質の最終濃度を１００ｍＭとした。脂質懸濁液を、上記の実施例５に記載したとおり、７０℃で、２００ｎｍ及び１００ｎｍポリカーボネート膜フィルターを通して押し出し、押し出された材料を、室温に冷却し、リポソームを、ＭｉｎｉＫｒｏｓ（登録商標）中空繊維カートリッジ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＷＣＯ  ５００ｋＤ）を用い、１０体積分のＣＳ−２５０緩衝液交換を介して、及び０．２μｍ滅菌フィルターを通過させて、タンジェンシャルフロー透析濾過により精製した。このプロトコルは、典型的には、ｚ平均径１００〜１１０ｎｍ及び多分散指数０．１未満の単層小胞を生成させる（「Ｄｉｌ５−ＳＭリポソーム」）。ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体の膜挿入の前に、リポソームを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラム（ＰＤ−１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、ブドウ糖クエン酸緩衝液（１７％水性ブドウ糖、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ５．７）に交換した。
【０２０３】
次いで、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体を、Ｄｉｌ５−ＳＭリポソーム含有ブドウ糖クエン酸緩衝液と混合し、タンパク質／リン脂質比を１０〜１２ｇ／ｍｏｌとした。混合物を６０℃に急速加熱し、攪拌しながら３０分間その温度に維持した。次いで、混合物を氷上で冷却し、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体が膜に進入したリポソームを、セファロース（商標）ＣＬ−４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムからクエン酸生理食塩水緩衝液で溶出させるゲルクロマトグラフィーにより、あらゆる残存未進入複合体から分離した。ｓｃＦｖ連結リポソームをカラムの空隙容量に収集し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗原結合活性についてｆｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標）を用いて、及び細胞取り込みについてサイトフローメトリーを用いて、それぞれ以下に記載のとおり分析した。リポソーム上のｓｃＦｖの存在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認及び定量を行った。
【０２０４】
ｆｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標）を介したＥｐｈＡ２結合の分析
Ｃ末端にＨｉｓ６が添付されたヒトＥｐｈＡ２をコードする核酸を、発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）＃Ｖ０４４−５０）にクローン導入し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）＃Ｋ９００００１）にポリエチレンイミン形質移入して、一過性で発現させた。Ｈｉｓ６タグ付組換えヒトＥｐｈＡ２タンパク質をＮｉ−ＮＴＡセファロース（商標）樹脂（Ｑｕｉａｇｅｎ（登録商標）、ＵＳＡ）を用いて、細胞培養培地から精製した。ｆｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６システム用抗Ｈｉｓセンサー（ｆｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標）−Ｐａｌｌ（登録商標）＃１８−５１１６）を、ｈｉｓタグ付組換えヒトＥｐｈＡ２を用いて、１０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で３００秒間コーティングし、バックグラウンド測定をＰＢＳ中で６０秒間行った。ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体の場合、次いで、センサーを、２．５μｇ／ｍｌ（試験１）または４．０μｇ／ｍｌ（試験２）の複合体含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）とともにインキュベートし、会合曲線の傾きを、インキュベーションの３〜３０秒の間で求め、緩衝液のみのバックグラウンドに対して補正し、変異体にまたがって比較した。ＳｃＦｖ連結リポソームは、ＰＢＳ中、０．０２５ｍＭのリポソームリン脂質でセンサーとともにインキュベートし、会合曲線の傾きを、インキュベーションの３〜２０秒の間で求め、緩衝液のみのバックグラウンドに対して補正し、変異体にまたがって比較した。
【０２０５】
結果を以下の表６に示す。表中、欄Ａは、ｓｃＦｖ識別子を提示する；欄Ｂは、ｓｃＦｖ／リポ重合体リンカー複合体の収率パーセントを示す；欄Ｃは、ｓｃＦｖ−複合体（リポソームが結合していない）ＥｐｈＡ２結合の結合速度をパーセントで提示する；欄Ｄは、ｓｃＦｖ−複合体−リポソームＥｐｈＡ２結合の結合速度をパーセントで提示する；ならびに欄Ｅ（試験１）及び欄Ｆ（試験２）は、熱ストレス後のｓｃＦｖ複合体（リポソームが結合していない）に残存する抗原結合速度をパーセントで提示する。
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【０２０６】
結論：試験したクローンは全て、十分に結合したが、ｓｃＦｖ  ４Ｃ、７Ｃ、１１Ｃ、１６Ｃ、及び１９Ｃは、結合の熱ストレス後、１０％未満の抗原結合を示した。
【０２０７】
実施例７−選択した変異体の製造可能性についての分析
実施例６の実験と並行して、９種のクローン（及び対照として親クローンＴＳ１）を、商業生産のための安定性を求めるため試験した。スクリーニング戦略は、発現が少ない、プロテインＡ結合能力が低い、または凝集体含有量が高い分子を排除するように設計した。ｓｃＦｖを、１Ｌ規模で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）＃Ｋ９００００１）中一過性で発現させ、プロテインＡ精製し、ｐＨ６．０に中和した。結果を表７にまとめる。
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【０２０８】
全てのＡｂ力価は、バイオレイヤー干渉法（ｆｏｒｔｅＢＩＯ（登録商標））を用いて計算した。凝集体のパーセンテージは、ＳＥＣを用いて以下のとおり測定した。試料５０μｇを、泳動緩衝液として５０ｍＭリン酸ナトリウム（＋０．４Ｍ過塩素酸ナトリウム）ｐＨ７．０を用いて、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（Ｔｏｓｏｈ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入した。全ての測定は、オートサンプラー、バイナリポンプ、及びダイオードアレイ検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１１００  ＨＰＬＣを用いて行った。データは、Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標））ソフトウェアを用いて分析した。
【０２０９】
プロテインＡ結合能力の改善倍数値（ＴＳ１Ｃと比較した場合）は、実施例１に記載のとおりに測定した。
【０２１０】
評価した最初の基準は、ｓｃＦｖの発現レベルであった。抗体は、典型的には、安定形質移入細胞株で（例えば、チャイニーズハムスター卵巣「ＣＨＯ」細胞で）製造される。しかしながら、一過性発現を介して得られた力価は、安定形質移入細胞での発現挙動を予測するものである。上記の表７に示すとおり、新規Ａｂの多くは、これまでより非常に良好な力価を有した（ＴＳ１Ｃと比較した場合約２倍以上の改善）。中和損失は、変異体によっては少し高くなったが、最終精製収率は全て、ＴＳ１Ｃに匹敵するかまたはそれより良好であった。最後に、下流プロセス開発が上手くいくには、凝集体含有量が低いことが望ましい。全ての変異体の中和後凝集体含有量は、同等な及び容認できるものであった。ｓｃＦｖ−２Ｃ及びｓｃＦｖ−４Ｃは例外で、これらの新規Ａｂは、大幅に改善された発現、凝集、及びプロテインＡ結合能力を有していた。全てを、結合プロセス中の安定性についてさらに特性決定した。
【０２１１】
結論：試験したクローン（クローン２、３、４、７、８、９、１０、１１、及び１３）は全て、試験したパラメーターについて容認できる商業開発可能性を示した。
【０２１２】
等価物
当業者なら、本明細書に記載される具体的な実施形態の多くの等価物がわかるだろう、あるいは常用実験にすぎないものを用いてそれらに気づくまたはそれらを実行することができるだろう。そのような等価物は、上記の説明及び以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。特定の実施形態（及び従属項）に開示される実施形態の任意の組み合わせが、本開示の範囲内に含まれることが企図される。
【０２１３】
参照による援用
本明細書に言及されるありとあらゆる米国及び外国の特許及び出願中の特許ならびに刊行物の開示は、その全体が、本明細書に参照として特別に援用される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図５−９】
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【図５−１０】
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【図５−１１】
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【図５−１２】
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【図５−１３】
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【図５−１４】
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【図５−１５】
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【図５−１６】
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【図５−１７】
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【図５−１８】
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【図５−１９】
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【図５−２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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