(57)【要約】本発明は、サンプル、特に食品サンプル中の１種以上のアレルゲンの存在および／または不在を検出するためのシステム、デバイス、シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）、検出剤および方法を提供する。検出システムは、個別のサンプラーと、試験サンプルを受け入れかつ処理するための少なくとも１つのディスポーザブル検出容器と、蛍光シグナルを測定するための検出デバイスとを含む。アレルゲンに結合する、アプタマーに由来するＳＰＮは、アレルゲン検出剤として提供される。ＳＰＮは、単一の開放構造を有し、かつフルオロフォアで標識される。サンプル中のアレルゲン含有率を計算するために、アレルゲンの結合時における検出剤の蛍光偏光の変化が測定される。
2019511715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲン検出システムにおいて、
（ａ）１種以上の対象のアレルゲンを含有すると推測される試験サンプルを捕集するための少なくとも１つのサンプラーと、
（ｂ）前記試験サンプルを受け入れかつ処理し、および検出剤を前記試験サンプル中に提示された前記１種以上のアレルゲンと接触させるための少なくとも１つの検出容器と、
（ｃ）前記検出剤と、前記試験サンプル中に提示された前記１種以上のアレルゲンとの結合相互作用からのシグナルを測定および可視化することにより、前記試験サンプル中のアレルゲン含有率を検出するための検出デバイスと
を備える、アレルゲン検出システム。
【請求項２】
前記サンプラーは、フードピックアップコアラーである、請求項１に記載の検出システム。
【請求項３】
前記フードピックアップコアラーは、先端部にトップキャップを備えた先端側部分と、サンプル捕集管を備えた基端側部分と、前記サンプル捕集管に接続される前記コアラーを取り扱うためのグリップと、前記トップキャップに接続された先端部および基端部のプランジャーチップを有する前記サンプル捕集管内のプランジャーとを有し、
前記基端側プランジャーチップは、前記試験サンプルを採取するためにサンプル捕集管から突出することができる、請求項２に記載の検出システム。
【請求項４】
前記フードピックアップコアラーは、採取される前記試験サンプルを秤量するための手段をさらに備える、請求項３に記載の検出システム。
【請求項５】
前記フードピックアップコアラーは、前記基端部にスナップをさらに備える、請求項３に記載の検出システム。
【請求項６】
前記検出容器は、ディスポーザブルである、請求項１に記載の検出システム。
【請求項７】
前記ディスポーザブル検出容器は、ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器であり、
前記ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器は、カップ蓋アセンブリーと、前記カップ蓋アセンブリーに接続されたより広い先端部および基端側ベースを有するカップ体とを含み、前記カップ蓋アセンブリーは、前記カップ蓋アセンブリーのトップキャップに３つのポート：フードピックアップコアラーを保持するためのポート（ａ）と、ホモジナイザーがアセンブルされるポート（ｂ）と、アレルゲン検出試験中、処理されたサンプル溶液の流量を駆動および制御するためのフロー制御手段への接続のためのポート（ｃ）と、前記カップ蓋アセンブリーおよび前記カップ体を、両方が一緒にアセンブルされて試験カップまたはカップ状容器を形成するときにアライメントおよび安定化するための任意選択的な手段とを備える、請求項６に記載の検出システム。
【請求項８】
前記カップ蓋アセンブリーは、前記試験サンプル中の前記１種以上のアレルゲンを検出するための、前記カップ蓋アセンブリーの前記トップキャップにおける２つ以上の反応チャンバーと、前記処理されたサンプル溶液を前記カップ体から前記２つ以上の反応チャンバーに搬送するための流体チャネルとをさらに含み、
前記２つ以上の反応チャンバーは、前記１種以上のアレルゲンに特異的な検出剤が存在する１つ以上のアレルゲン分析チャンバーからなる、請求項７に記載の検出システム。
【請求項９】
前記カップ蓋アセンブリーは、
（ａ）前記処理されたサンプル溶液が前記カップ体から前記２つ以上の反応チャンバーに流動されるフロー管と、
（ｂ）前記処理されたサンプル溶液中の大きい粒子をさらに濾過し、かつ前記２つ以上の反応チャンバー中の分子の加湿を防止するための、前記カップ蓋アセンブリーにおけるフロー管キャップおよびフィルターアセンブリーと
をさらに備える、請求項８に記載の検出システム。
【請求項１０】
前記カップ体は、２つ以上の反応チャンバーとフィルター膜とをさらに備え、前記２つ以上の反応チャンバーは、前記カップ体の底部に位置決めされ、および前記フィルター膜は、前記カップ体の前記底部の前記１つ以上の反応チャンバーの上に配置され、前記フィルター膜は、前記処理された試験サンプルを、それが前記カップ体の前記底部の前記１つ以上の反応チャンバーに流入する前に濾過するために使用される、請求項７に記載の検出システム。
【請求項１１】
前記カップ体は、２つの個別であるが接続されている部分に分割され、その第１の部分は、前記試験サンプルを受け入れかつ処理するように構成され、およびその第２の部分は、２つ以上の反応チャンバーを含み、前記２つの部分は、前記処理されたサンプル溶液が前記カップ体の前記第１の部分から前記カップ体の前記第２の部分内の前記２つ以上の反応チャンバーに流動される流体管およびバルブによって接続される、請求項７に記載の検出システム。
【請求項１２】
前記カップ体の前記第２の部分内の前記２つ以上の反応チャンバーは、サイドツーサイド配置、またはスタック配置、またはフロントツーバック配置、または対角配置で構成される、請求項１１に記載の検出システム。
【請求項１３】
前記カップ体は、前記コアラーによって捕集された前記試験サンプルを受け入れ、かつ前記カップ蓋アセンブリーの頂部の前記ポート（ｂ）を通してアセンブルされた前記ホモジナイザーを用いて前記試験サンプルを処理するように構成され、ホモジナイザーロータおよびステータは、前記カップ蓋アセンブリーの前記頂部の前記ポート（ｂ）を通して前記カップ体に挿入され、前記ホモジナイザーロータおよびステータの先端側キャップは、前記ポート（ｂ）に接続され、かつ前記ホモジナイザーロータおよびステータの基端側部分は、前記カップ体まで延在する、請求項７に記載のアレルゲン検出システム。
【請求項１４】
前記カップ体は、前記試験サンプルを解離させかつアレルゲンタンパク質を抽出するために使用される抽出緩衝液の体積を収容する、請求項１３に記載のアレルゲン検出システム。
【請求項１５】
前記検出デバイスは、
（ａ）ハウジングカバーとハウジングベースとからなる、前記検出デバイスのコンポーネントを支持するように構成された外部ハウジングと、
（ｂ）前記ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器および前記フードピックアップコアラーの挿入のために開放され得る第１の部分と、
（ｃ）アレルゲン検出試験を操作するために一体化されたコンポーネントと、
（ｄ）電源と
を備え、
前記検出試験を操作するために一体化された前記コンポーネント（ｃ）は、
（ｉ）前記試験サンプルをホモジナイズし、かつ前記カップ体内の抽出緩衝液中の前記試験サンプルからアレルゲンタンパク質を抽出するように構成されたホモジナイザーと、
（ｉｉ）前記ホモジナイゼーションを駆動および制御するための手段と、
（ｉｉｉ）前記アレルゲン検出試験のプロセス中、前記処理されたサンプル溶液のフローを駆動および制御するための手段と、
（ｉｖ）蛍光シグナルを検出するための光学アセンブリーと、
（ｖ）前記蛍光シグナルを変換およびデジタル化するための手段と、
（ｖｉ）前記検出シグナルを受け入れ、かつ前記試験サンプル中の前記アレルゲンの存在および不在のうちの少なくとも１つを示すための表示ウィンドウと
を備える、請求項１に記載のアレルゲン検出システム。
【請求項１６】
前記外部ハウジング（ａ）は、前記アレルゲン検出試験の前記プロセス中、前記ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器をアライメントするための、前記ハウジングのトップフロントにおけるアライメント部を含む、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項１７】
前記第１の部分（ｂ）は、前記ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器を挿入するための開放ウェルと、ドロアフレームとを含むドロアアセンブリーであり、前記ドロアフレームは、前記ドロアフレームの各側にそれぞれ１つのチャイムを含む、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項１８】
前記ホモジナイザー（ｉ）は、ホモジナイザーステータと、前記カップ蓋アセンブリーのトップキャップのポート（ｂ）を通して前記カップ体に挿入される、前記ステータ内のホモジナイザーロータと、前記ホモジナイザーステータおよび前記ロータをギアヘッドに結合するカップリングと、前記ホモジナイザーをギアトレインに接続するためのギアヘッドとを含み、前記ギアヘッドを通して、前記ホモジナイザーは、前記ホモジナイゼーションを駆動および制御するための前記手段（ｉｉ）に接続される、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項１９】
前記ホモジナイザーステータは、請求項７に記載のカップ蓋アセンブリーの頂部の前記ポート（ｂ）に接続されるキャップを備えた先端側部分と、請求項１３に記載のカップ体まで延在する、前記ステータの軸上に１つ以上のスロットを備えた基端部とを有する、請求項１８に記載の検出システム。
【請求項２０】
前記ホモジナイザー（ｉ）は、膜シールを通して前記カップ蓋アセンブリーのトップキャップのポート（ｂ）に溶接されるホモジナイザーロータを有する、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項２１】
前記ホモジナイゼーションを駆動および制御するための前記手段（ｉｉ）は、モータである、請求項１８に記載の検出システム。
【請求項２２】
真空マイクロポンプは、前記抽出されたアレルゲンタンパク質溶液の前記フローを駆動および制御するために使用され、前記真空マイクロポンプは、請求項７に記載のカップ蓋アセンブリーの前記トップキャップの前記ポート（ｃ）を通して前記ディスポーザブル試験カップに接続するプラテンの下側に接続される、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項２３】
前記プラテンは、請求項７に記載のカップ蓋アセンブリーの前記トップキャップの前記ポート（ｃ）に接続される真空ダクトと、エアチャネルと、ギアトレインに接続するように構成されたポートと、請求項７に記載のカップ蓋アセンブリーの前記トップキャップの前記ポート（ｃ）に接続するためのポートとを有する、請求項２２に記載の検出システム。
【請求項２４】
請求項７に記載のカップ蓋アセンブリーの前記トップキャップの前記ポート（ｃ）に接続するための前記プラテンの前記ポートは、真空ガスケットでシールされる、請求項２３に記載の検出システム。
【請求項２５】
前記光学アセンブリー（ｉｖ）は、平面偏光励起光を提供し、前記検出剤から再発光された光を検出し、かつ前記試験サンプル中の前記１種以上のアレルゲンの前記検出剤への結合時に検出可能なシグナルを測定するために前記試験カップ内の反応チャンバーに接続され、
前記光学アセンブリーは、光源、励起フィルターおよび励起偏光フィルターを含む励起光路と、発光フィルター、発光偏光フィルターの対およびフォトディテクターの対を含む発光光路とを有する、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項２６】
前記検出剤は、フルオロフォアでプローブ化されたアプタマーベースのシグナリングポリヌクレオチドであり、および前記検出可能なシグナルは、蛍光偏光の変化である、請求項２５に記載の検出システム。
【請求項２７】
前記発光偏光フィルターの対および前記フォトディテクターの対は、互いに９０度で配置される、請求項２６に記載の検出システム。
【請求項２８】
前記発光偏光フィルターの対および前記フォトディテクターの対は、互いに平行に配置される、請求項２６に記載の検出システム。
【請求項２９】
前記電源（ｄ）は、再充電可能または交換可能な電池である、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項３０】
前記ディスプレイは、プリント回路基板（ＰＣＢ）である、請求項１５に記載の検出システム。
【請求項３１】
シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）において、
（ａ）アレルゲンに特異的に結合するコア核酸配列と、
（ｂ）前記（ａ）のコア配列の５’末端および／または３’末端の短い核酸配列と、
（ｃ）前記シグナリングポリヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端または５’末端および３’末端の両方のフルオロフォア染料と
を含むシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）。
【請求項３２】
配列番号２、６、１３、２７、３５、４４、５７、６１、６５、７１、７８、８４、９８、１１０、１１９、１２６、１３２、１３７、１５０、１５８、１６８、１７８、１９０、１９４、２０４、２１５、２２０、２２８、２３７、２４７、２５１、２５５、２５９、２６３、２６７、２７１、２７９、２９６、３０８、３１６、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０および３４１〜３５３の核酸配列からなる群から選択されるコア核酸配列を含む、請求項３１に記載のＳＰＮ。
【請求項３３】
配列番号３、４、７〜１１、１４〜２５、２８〜３３、３６〜４２、４５〜５５、５８、５９、６２、６３、６６〜６９、７２〜７６、７９〜８２、８５〜９６、９９〜１０８、１１１〜１１７、１２０〜１２４、１２７〜１３０、１３３〜１３５、１３８〜１４８、１５１〜１５６、１５９〜１６６、１６９〜１７６、１７９〜１８８、１９１〜１９２、１９５〜２０２、２０５〜２１３、２１６〜２１８、２２１〜２２６、２２９〜２３５、２３８〜２４５、２４８、２４９、２５２、２５３、２５６、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、２７２〜２７７、２８０〜２９４、２９７〜３０６、３０９〜３１４および３１７〜３３０の核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項３１に記載のＳＰＮ。
【請求項３４】
前記フルオロフォア染料は、フルオレセイン、ローダミン、エオシン、テキサスレッド、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、スクアラインならびに誘導体Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕおよびスクエア（Ｓｑｕａｒｅ）染料、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、アントラキノン、ピレンおよび誘導体、オキサジン誘導体ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレットおよびオキサジン１７０、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン、ボディパイＴＭＲ染料、ボディパイＦＬ染料、テトラメチルローダミン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ＮＢＤ、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、レッド６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ならびにアレキサフルオル染料からなる群から選択される、請求項３１に記載のＳＰＮ。
【請求項３５】
前記フルオロフォア染料は、テキサスレッドである、請求項３４に記載のＳＰＮ。
【請求項３６】
サンプル中の対象のアレルゲンの存在および不在のうちの少なくとも一方の検出方法において、
（ａ）前記対象のアレルゲンを含有すると推測されるサンプルを得る工程と、
（ｂ）前記（ａ）のサンプルを抽出緩衝液で処理する工程と、
（ｃ）前記処理されたサンプルを検出剤と接触させる工程と、
（ｄ）前記接触された処理されたサンプルおよび検出剤を励起手段で処理する工程と、
（ｅ）前記処理されたサンプルに含有される前記対象のアレルゲンと前記検出剤との相互作用を可視化する工程とを備える、方法。
【請求項３７】
前記検出剤は、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のシグナリングポリヌクレオチドを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抽出緩衝液は、ユニバーサル緩衝液である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抽出緩衝液は、Ｔ緩衝液である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記励起手段は、偏光光である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記工程（ｅ）において、前記試験サンプル中の前記アレルゲンとの前記相互作用時における前記シグナリングポリヌクレオチド中のフルオロフォア染料の蛍光偏光の変化が測定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルは、食品サンプルである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
サンプル中の対象のアレルゲンの存在および不在のうちの少なくとも一方の検出方法において、
（ａ）サンプラーを用いて、対象のアレルゲンを含有すると推測される試験サンプルを得る工程と、
（ｂ）前記得られたサンプルをディスポーザブル容器内の抽出緩衝液中で処理および消化する工程と、
（ｃ）前記処理されたサンプルを、前記対象のアレルゲンに特異的な検出剤と混合する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）からの混合物を蛍光励起手段で処理し、かつ前記検出剤から発せられた蛍光シグナルを、光学システムを用いて検出する工程と、
（ｅ）前記検出されたシグナルをデジタル化し、かつ前記検出剤と前記対象のアレルゲンとの相互作用を可視化する工程とを備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験サンプル中の標的アレルゲン、例えば食品サンプル中の食物アレルゲンの存在および／または不在を検出するためのシステム、デバイス、アプタマー、シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ：ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、検出剤および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー（例えば、食物アレルギー）は、世界中の何百万もの人々が罹患している一般的な医学的病態である。米国では、成人の２パーセントまで、かつ子供、特に３歳未満の子供の８パーセントまでが食物アレルギーに罹患していると推定されており（約１５００万人）、この罹患率は増加しつつあると考えられる。アレルギー反応中、免疫系は、誤ってアレルゲンを脅威として標的とし、それを攻撃する。アレルギー反応は、皮膚、消化系、胃腸管、呼吸系、循環系および心血管系に影響を及ぼし得、いくつかのアレルギー反応では、複数の器官系が影響を受ける。アレルギー反応は、軽度〜重度の範囲内にあるかまたは命にかかわる。重度の症状には、呼吸困難、低血圧、胸痛、意識喪失およびアナフィラキシーが含まれ得る。アレルギーを有する人々は、現在、その特異的アレルゲンを含有する可能性のあるいかなる食品も避けることにより、アレルギーに対処している。こうした制限は、患者の生活の質に大きい影響を及ぼすが、依然として食品の真のアレルゲン含有率を評価する有効な方法は存在しない。米国では、食物アレルギー症状によって３分毎に救急室への搬送者が発生している。アレルゲンの存在を決定する迅速で感度の良い正確な方法はきわめて有益であろう。患者が食品を試験して正確かつ迅速にアレルゲン含有率を決定できるポータブルデバイスは、情報に基づいて摂取するか否かの決断を行うのに有益であろう。
【０００３】
研究者らは、こうした必要性を満たす好適なデバイスおよび方法の開発を試みてきた。この分野では、食品サンプルのアレルゲン含有率を検出する多くのデバイスおよびシステムが開示されている。例えば、マッケイ（ＭｃＫａｙ）の（特許文献１）には、吸収材料と、マット上の隔離ゾーンに適用された食物アレルゲン検出用の化学試薬の小さいスポットとで形成されたダイニングマットが教示されており、ユング（Ｊｕｎｇ）らの（特許文献２）および（特許文献３）には、１種以上のアレルゲンインジケータを分析するように構成されたマイクロ流体チップでサンプルを処理することと、１つ以上の検出ユニットでアレルゲンインジケータを検出することと、１つ以上の表示ユニットで結果を表示することとにより、アレルゲンを検出する方法が教示されており、スコット（Ｓｃｏｔｔ）らの（特許文献４）には、ハウジングと、サンプル入口ポートと、サンプル中の潜在的アレルゲンの存在を示す手段と、タグ付き抗体を用いて潜在的アレルゲンを検出するアレルゲン検出チップとを含む、食物アレルゲン検出用ポータブルデバイスが教示されており、ロイズ（Ｒｏｙｄｓ）の（特許文献５）には、ディスポーザブルサンプル容器と、ブレードアセンブリーを含む機械的液化機と、有害汚染物質に対して親和性を有し、かつ液化食品サンプル中の有害汚染物質の検出と有害汚染物質の認識時のビジュアルキューの生成とが可能である試薬を含む試験提供コンパートメントとを含む、食品サンプル中の有害汚染物質（アレルゲンを含む）の存在を同定するための食品試験デバイスが教示されており、およびスニ（Ｓｕｎｉ）らの（特許文献６）には、食物アレルギー検出用抗体が組み込まれたバイオエレクトロニクスタングが教示されている。
【０００４】
食品サンプルで感度の良い正確なアレルゲン検出を実現するうえで、アレルゲンを迅速に認識することができる特異的ディテクターが試験結果にとって重要である。現在、食品産業における食物アレルゲン検出および食物アレルギーを有する顧客のために免疫アッセイが通常使用される。特異的アレルゲンタンパク質は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ラテックス凝集アッセイ、ウェスタンブロッティングなどの免疫アッセイによって測定され得る。これらのアッセイでは、標的アレルゲンに対して特異性を有する抗体が必要とされる。特異的食物アレルゲンを検出するための多くの免疫アッセイが従来技術において開示されている。例えば、（特許文献７）には、甲殻動物トロポミオシンを検出するための免疫アッセイが開示されており、（特許文献８）には、食物アレルギーを有する患者の安全を確保するためにダイズアレルゲンに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡが教示されており、（特許文献９）は、複数のアレルゲンを検出するための免疫アッセイシステムに関し、および（特許文献１０）には、ラッカセイアレルゲンの免疫アッセイが開示されている。しかしながら、ほとんどの免疫アッセイは、時間がかかり、試験結果を解読するために熟練者を必要とし、小型化が困難であり、かつ十分に標準化されていない。さらに、免疫アッセイは、多くの場合にマトリックス効果および交差反応性に起因する妨害を受ける。このため、イムノアッセイ法は、多くの場合、フォールスポジティブ結果をもたらす。
【０００５】
アレルゲンに特異的に結合する抗体に加えて、アプタマーなどの核酸分子、ならびにそれをサンプル（例えば、食品サンプル）中のタンパク質の検出に使用するデバイスおよび方法がいくつかの特許および特許出願に開示されている。例えば、ラスーリ（Ｒａｓｏｏｌｙ）らの（特許文献１１）には、キャプチャー分子としてアプタマーを用いて半導体中のバイオ分子結合を電気的に検出するために「電気的パーコレーション」（ランダム抵抗ネットワークを介する電気の流れ）と呼ばれる物理的原理を利用する方法およびシステムが教示されており、ロウリー（Ｌｏｗｅｒｙ），Ｊｒ．らの（特許文献１２）には、アナライトの捕集および検出のためのＮＭＲシステムおよび方法が教示されており、リーバ（Ｌｉｅｂｅｒ）らの（特許文献１３）には、ナノスケールワイヤーに対してアプタマーを間接固定し得るものとしてアナライトを検出するための蛍光ベースのナノスケールワイヤーバイオセンサーデバイスおよび方法が教示されており、ホーンベック（Ｈｏｒｎｂｅｃｋ）らの（特許文献１４）には、癌腫および／または白血病で同定された新規なチロシンリン酸化部位を、アプタマーを用いて検出および定量するためのラテラルフローデバイスが教示されており、ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）らの（特許文献１５）には、アプタマーであり得るキャプチャー剤の組合せの使用を含む、サンプル中の少量のタンパク質アイソフォーム（例えば、選択的スプライシングに起因するもの、または異なる疾患タンパク質アイソフォームもしくは分解産物）を検出するための方法、試薬および装置が教示されており、ブルンナー（Ｂｒｕｎｎｅｒ）らの（特許文献１６）には、アプタマーベースの抗ＣＥＴＰ抗体誘導抗原を用いたアテローム硬化症の治療方法が教示されており、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）らの（特許文献１７）には、核酸がアプタマーであり得る、内因性カイロミクロンを利用することによって標的遺伝子発現を抑制するための核酸送達システムが教示されており、およびブキチェビッチ（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ）らの（特許文献１８）には、骨および軟組織の欠損および疾患の診断および治療のための骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ：ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の核酸バイオセンサーが教示されている（それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる）。タンパク質検出におけるアプタマーの使用の他の開示は、ＰＣＴ特許公開の（特許文献１９）、（特許文献２０）、（特許文献２１）および（特許文献２２）（参照により本明細書に組み込まれる）にも含まれる。
【０００６】
アプタマー由来の分子ビーコン（ＭＢ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）は、ほとんどが核酸剤として開発された検出剤である。これは、フルオロフォア部分とクエンチャー部分との両方を含有するヘアピン形オリゴヌクレオチドであり、スイッチのように作用する。閉状態では、フルオロフォアとクエンチャーとが一体化されて、共鳴エネルギー移動によって蛍光がクエンチされる（「オフになる」）。コンフォメーション変化によってヘアピン構造が開状態になると、フルオロフォアとクエンチャーとが分離されて、クエンチャーがもはやクエンチすることができないため、蛍光が回復される（「オンになる」）。ＭＢは、高い感度および優れた分子認識特異性を有するプローブを必要とする検出デバイスおよび診断アッセイに特に有用であり、優れた標的特異性があるため、単一ヌクレオチド程度のわずかな違いを有する核酸標的配列を無視する。ディテクターとしてのＭＢは、リアルタイムモニタリングおよび「分離を伴わない検出」を可能にし得る。この場合、過剰のハイブリダイズされていないプローブからプローブ−標的ハイブリッドを単離することは不可能であるかまたは望ましくない。ＭＢループ−ステム構造によって提供される特異性は、さまざまな生物学的環境に適用可能であることが実証されている。
【０００７】
例示的な分子ビーコンは、レオン（Ｌｅｕｎｇ）ら、２０１１年（非特許文献１）でレビューされ、かつリットマン（Ｌｉｔｍａｎ）らの（特許文献２３）に記載され、ここで、癌に関連するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ）配列ならびにアプタマーおよび分子ビーコンを用いたその検出が教示されており、マイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）らの（特許文献２４）には、アプタマーまたは分子ビーコンを用いた新規なプロテインキナーゼ、セリン／トレオニンホスファターゼ、プロリルオリゴペプチダーゼ、トリプシン、セリンプロテアーゼおよびユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼファミリーメンバーの検出が一般的に開示されており、およびカペラー−リバーマン（Ｋａｐｅｌｌｅｒ−Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ）らの（特許文献２５）にも、アプタマーまたは分子ビーコンを用いた３つの新規とされるプロテインキナーゼファミリーメンバーの検出が一般的に開示されている（それらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００８】
本発明の発明者らは、さまざまなアレルゲンタンパク質に対して高い特異性を有するアプタマーベースのシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を開発してきた。かかるシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）は、分子ビーコンに類似した閉状態のステム−ループ構造を有するように設計される。ＳＰＮは、ポリヌクレオチドの一方の末端のフルオロフォアと、他方の末端の蛍光クエンチャーとで標識される。閉状態のループ構造ではフルオロフォアとクエンチャーとが一体化されるが、ＳＰＮにアレルゲンが結合すると閉状態のループ構造が開状態になり、クエンチャーからフルオロフォアが遊離する。アレルゲン結合の前後の蛍光強度変化が測定され、サンプル中のアレルゲン含有率の検出に使用される。所有者が共通する２０１４年７月１８日出願の（特許文献２６）、２０１４年６月１０日出願の（特許文献２７）、２０１４年５月９日出願の（特許文献２８）、２０１４年２月１１日出願の（特許文献２９）、２０１３年１０月２８日出願の（特許文献３０）および２０１４年１０月２８日出願の（特許文献３１）（これらはすべて「アレルゲン検出」という名称である）ならびに２０１５年４月２９日出願の（特許文献３２）、２０１６年４月２１日出願の（特許文献３３）（これらは「アレルゲン検出のための組成物および方法」という名称である）（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、こうしたシグナリングポリヌクレオチドの配列、構造および検出方法が考察された。
【０００９】
本発明者らは、試験サンプル中のアレルゲンを検出するためにかかるＳＰＮを検出剤として用いた検出システム、デバイスを設計してきた。検出システムは、所有者が共通する２０１５年３月１６日出願の（特許文献３４）および２０１５年６月２２日出願の（特許文献３５）（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で考察されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，８２４，５５４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０１８２３３９号明細書
【特許文献３】米国特許第８，６１７，９０３号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０２１００３３号明細書
【特許文献５】米国特許第７，５２７，７６５号明細書
【特許文献６】米国特許第９，２０１，０６８号明細書
【特許文献７】米国特許第８，３７７，６９６号明細書
【特許文献８】米国特許第８，３６１，４６０号明細書
【特許文献９】米国特許第８，３４９，６２０号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，４４１，１４２号明細書
【特許文献１１】米国特許第８，６１４，４６６号明細書
【特許文献１２】米国特許第８，５６３，２９８号明細書
【特許文献１３】米国特許第８，２３２，５８４号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，９７７，４６２号明細書
【特許文献１５】米国特許第７，８５５，０５７号明細書
【特許文献１６】米国特許第８，６１８，０４６号明細書
【特許文献１７】米国特許第８，５０７，４５８号明細書
【特許文献１８】米国特許第７，８５０，９６４号明細書
【特許文献１９】国際公開第２００９／０１９００７号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第２００９／０４０１１３号パンフレット
【特許文献２１】国際公開第２０１０／１０８６５７号パンフレット
【特許文献２２】国際公開第２０１３／１０４５４０号パンフレット
【特許文献２３】米国特許第８，１８８，２５５号明細書
【特許文献２４】米国特許第７，２８２，３６０号明細書
【特許文献２５】米国特許第６，７３０，４９１号明細書
【特許文献２６】米国特許出願第６２／０２６，３６１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願第６２／００９，９５８号明細書
【特許文献２８】米国特許出願第６１／９９１，０６８号明細書
【特許文献２９】米国特許出願第６１／９３８，５２８号明細書
【特許文献３０】米国特許出願第６１／８９６，３９９号明細書
【特許文献３１】国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６２６５６号明細書
【特許文献３２】米国特許出願第６２／１５４，２００号明細書
【特許文献３３】国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０２９３５６号明細書
【特許文献３４】米国仮特許出願第６２／１３３，６３２号明細書
【特許文献３５】米国仮特許出願第６２／１８２，９００号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１２年、第４０巻、第３号、ｐ．９４１〜９５５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、本発明者らは、新しいＳＰＮおよびアレルゲン検出剤を開発するために、標的アレルゲンに特異的に結合するアプタマーの核酸配列をさらに改変する。アレルゲンに特異的に結合し得る同定されたアプタマーは、核酸配列の５’末端および３’末端が修飾され、ポリヌクレオチドの一方の末端がフルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態では、本シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）への標的アレルゲンの結合時における蛍光偏光（ＦＰ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）変化が測定され得、かつかかるＦＰシグナルを用いて食品サンプル中のアレルゲンの存在および／または不在が示されるであろう。
【００１３】
本発明の発明者らは、アプタマーベースのシグナルポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を用いてサンプル中のアレルゲンを高速かつ正確に検出するために、個別のサンプラーと、ディスポーザブル容器と、ディテクターとを含む検出システムおよびデバイスをさらに開発した。ＳＰＮの蛍光偏光の変化は、本検出デバイスによって測定され得、サンプル中のアレルゲン含有率を示すために使用される。検出デバイス／装置は、サンプル中の食物アレルゲンを検出するための小型ポータブルハンドヘルドデバイスであり得る。
【００１４】
本発明は、種々のタイプのサンプル、特に食品サンプルでアレルゲン検出に用いられるシステム、デバイス、検出容器および方法を提供する。アレルゲンタンパク質に特異的な核酸アプタマーおよびアプタマー由来のシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）などの検出剤も同様に提供される。
【００１５】
本発明の一態様は、サンプル中の１種以上のアレルゲンの存在および／または不在を検出するためのアレルゲン検出システムである。このシステムは、（ａ）試験サンプルを捕集するための少なくとも１つのサンプラーと、（ｂ）試験サンプルを受け入れかつ処理し、および試験サンプル中のアレルゲンと検出剤との相互作用を分析するための少なくとも１つの検出容器と、（ｃ）試験サンプル中のアレルゲンを検出するための検出デバイスとを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、サンプラーは、特定の試験サンプル採取量を確保する秤量手段を備え得る。いくつかの態様では、サンプラーは、所定サイズの食品サンプル部分を測定し、かつ／または捕集された食品サンプルを前処理するように構成されたフードピックアップコアラーである。フードコアラーは、先端部にコアラートップキャップを備えた先端側部分と、捕集管を備えた基端側部分と、捕集管に接続されるコアラーを取り扱うためのグリップと、トップキャップに接続された先端部、および食品サンプルを採取するために捕集管から突出することができる基端側プランジャーチップを有する捕集管内のプランジャーとを有し得る。限定されるものではないが、例として、フードピックアップコアラーは、食品サンプル採取量を示すためのスプリングをさらに含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、検出容器は、ディスポーザブルであり、１種の特定のアレルゲンに好適である。検出容器は、検出反応が行われる少なくとも１つの反応チャンバーを含む。いくつかの実施形態では、検出容器は、ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器である。ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器は、試験サンプルが処理され、および検出剤との相互作用によって試験サンプル中の対象のアレルゲンが検出される分析モジュールとして設計され得る。いくつかの態様では、試験カップまたはカップ状容器は、カップ体とカップ蓋とを含む。カップ蓋は、サンプラー（例えば、フードピックアップコアラー）と、ホモジナイザーアセンブリーと、処理された試験サンプル溶液を流動させるための手段とを保持するためのいくつかのポートを有する。カップ体は、１つの容器を含み得るか、または２つの個別であるが接続されている部分に分割され得る。
【００１８】
反応チャンバーは、限定されるものではないが、カップ蓋アセンブリーまたはカップ体の底部および／もしくは側部または分割されたカップ体の一部分を含めて試験カップ内の種々の位置で構成され得る。いくつかの実施形態では、カップ蓋アセンブリーは、１つ以上の反応チャンバーを含み得る。いくつかの態様では、反応チャンバーは、約１０μＬ〜約２００μＬの体積を収容するように構成され得る。
【００１９】
本発明の検出デバイスは、（ａ）検出デバイスのコンポーネントを支持する外部ハウジングと、（ｂ）アレルゲン検出試験を実施するときに検出容器（例えば、ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器）を挿入するために開放され得る第１の部分と、（ｃ）アレルゲン検出試験を操作するために一体化された手段と、（ｄ）検出デバイスおよび任意選択的な電源用プラグを持ち運ぶための任意選択的なテザーとを含む。
【００２０】
本発明によれば、検出デバイスの第１の部分は、ハウジングから引き出しかつスライドさせてハウジング内に戻すことができるドロアアセンブリーであり得る。ドロアアセンブリーは、アレルゲン検出試験を実施するときにディスポーザブル検出容器（例えば、試験カップまたはカップ状容器）を保持するためのウェル／ポートを有するように構成され得る。他の態様では、第１の部分は、検出容器（例えば、試験カップまたはカップ状容器）を挿入するために持ち上げられてウェル／ポートを開放することができるドアであり得る。
【００２１】
本発明によれば、アレルゲン検出試験を操作するために一体化される検出デバイスのコンポーネントは、（ｉ）ホモジナイザーを含む、試験サンプルを処理するための手段と、（ｉｉ）ホモジナイゼーションを駆動および制御するための手段と、（ｉｉｉ）アレルゲン検出試験のプロセス中、処理されたサンプルのフローを駆動および制御するための手段と、（ｉｖ）反応シグナルを検出するための光学サブシステムと、（ｖ）検出シグナルを変換およびデジタル化する手段とディスプレイウィンドウとを含む、検出結果を可視化するための手段と、（ｖｉ）電源とを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ホモジナイザーは、試験サンプルの低電力かつ高速のホモジナイゼーションに最適化される。一態様では、ホモジナイザーは、基端部の軸上に１つ以上のスロットを有するステータ内において、基端部にブレードを有するロータを含む。ホモジナイザーのロータおよびステータは、試験サンプルをホモジナイズするために、ロータおよびステータの移動を駆動および制御することができるモータに接続される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、液体フローを駆動しかつ流量を制御するための手段は、ポンプまたは外圧であり得る。ポンプは、ガスポンプもしくエアポンプまたはそれらの均等物であり得る。処理されたサンプル溶液は、検出容器（例えば、試験カップまたはカップ状容器）内に構成された反応チャンバーに流入される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、光学サブシステムは、アレルゲン検出試験中に生成された蛍光シグナルを検出することができる光学アセンブリーであり得る。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルは、蛍光偏光（ＦＰ）の変化である。光学サブシステムは、光源、フィルターおよび光の平面偏光を制御する偏光子と、フォトディテクターとを含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、プリント回路基板（ＰＣＢ：ｐｒｉｎｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｂｏａｒｄ）は、反応チャンバーおよび試験の読取り情報を表示するための光学サブシステムに直接または間接的に接続される。結果は、数字、アイコン、色および／もしくは文字または他の均等物として表示され得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本検出デバイスの電源は、再充電可能または交換可能な電池であり得る。他の実施形態では、検出デバイスは、ドッキングステーションおよび／またはＵＳＢチャージャを含み得る。さらなる実施形態では、検出デバイスは、ＡＣ／ＤＣコンバータなどの電源に直接接続されるように構成され得る。
【００２７】
いくつかの実施形態では、検出システムは、ソフトウェアアプリケーションによってアクセスおよび制御されるユーザインターフェースを含み得る。ソフトウェアは、パーソナルデバイス、例えばスマートフォン、タブレットコンピュータ、パーソナルコンピュータ、ラップトップコンピュータ、スマートウォッチおよび／または他のデバイスに搭載されたソフトウェアアプリケーションによって実行され得る。いくつかの場合、ソフトウェアは、インターネットブラウザーによって実行され得る。いくつかの実施形態では、ソフトウェアは、クラウドと呼ばれるリモートローカルサーバに接続され得る。
【００２８】
本発明の他の態様は、サンプル中のアレルゲンの存在および／または不在を決定するための検出剤として使用され得るＳＰＮであるアプタマーを提供する。いくつかの実施形態では、検出剤は、アプタマー由来のＳＰＮであり得る。本発明のＳＰＮは、標的アレルゲンに特異的に結合する核酸配列と、単一の開放構造を維持するように設計されている、ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかの改変核酸配列と、ポリヌクレオチドの一方の末端にプローブ化されたフルオロフォア標識とを有するアプタマーを含み得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明のＳＰＮは、表１および表２に示される核酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明のＳＰＮは、配列番号２、６、１３、２７、３５、４４、５７、６１、６５、７１、７８、８４、９８、１１０、１１９、１２６、１３２、１３７、１５０、１５８、１６８、１７８、１９０、１９４、２０４、２１５、２２０、２２８、２３７、２４７、２５１、２５５、２５９、２６３、２６７、２７１、２７９、２９６、３０８、３１６、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０および３４１〜３５３のポリヌクレオチド配列から選択されるコア核酸配列を含む。
【００３０】
他の実施形態では、本発明のＳＰＮは、配列番号３、４、７〜１１、１４〜２５、２８〜３３、３６〜４２、４５〜５５、５８、５９、６２、６３、６６〜６９、７２〜７６、７９〜８２、８５〜９６、９９〜１０８、１１１〜１１７、１２０〜１２４、１２７〜１３０、１３３〜１３５、１３８〜１４８、１５１〜１５６、１５９〜１６６、１６９〜１７６、１７９〜１８８、１９１〜１９２、１９５〜２０２、２０５〜２１３、２１６〜２１８、２２１〜２２６、２２９〜２３５、２３８〜２４５、２４８、２４９、２５２、２５３、２５６、２５７、２６０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、２７２〜２７７、２８０〜２９４、２９７〜３０６、３０９〜３１４および３１７〜３３０のポリヌクレオチド配列から選択される核酸配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明のＳＰＮは、標的アレルゲンの結合時における蛍光偏光（ＦＰ）の変化を検出し得る蛍光分子で５’末端または３’末端のいずれかが標識される。一態様では、蛍光分子は、テキサスレッドである。
【００３２】
本発明の他の態様は、サンプル中のアレルゲン含有率を検出するためのアレルゲン検出試験アッセイであって、（ａ）対象のアレルゲンを含有すると推測されるサンプルを得る工程と、（ｂ）（ａ）のサンプルを抽出緩衝液で処理する工程と、（ｃ）処理されたサンプルを検出剤と接触させる工程と、（ｄ）接触されたサンプルを励起手段で処理し、かつ蛍光偏光を測定する工程と、（ｅ）検出剤とアレルゲンとの相互作用を可視化する工程とを含むアレルゲン検出試験アッセイに関する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本検出方法は、（ａ）サンプラーを用いて、対象のアレルゲンを含有すると推測される試験サンプルを得る工程と、（ｂ）ホモジナイゼーションアセンブリーを用いて、抽出緩衝液中の得られたサンプルを処理および消化する工程と、（ｃ）処理されたサンプルを、対象のアレルゲンに特異的な検出剤と混合する工程と、（ｄ）工程（ｃ）の混合物を蛍光励起手段で処理し、かつ検出剤から発せられた蛍光シグナルを検出する工程と、（ｅ）検出シグナルをデジタル化し、かつ検出剤とアレルゲンとの相互作用を可視化する工程とを含み得る。検出剤は、特異的アレルゲンに特異的に結合し得るアプタマーベースのＳＰＮであり得る。ＳＰＮは、蛍光分子でプローブ化される。抽出緩衝液は、アレルゲンタンパク質を効率的に抽出するように最適化され得る。いくつかの態様では、蛍光シグナルは、蛍光偏光の変化であり得る。
【００３４】
本発明の他の特徴および実施形態は、以下の説明から明らかになるであろう。
上記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面を参照して例示される本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。添付の図面は、単に本発明の例示的な実施形態を示すことが目的であるにすぎず、本発明の範囲を例示的な実施形態に限定することが意図されるものではない。図面中の類似の参照数字は、異なる図面に示された同一または類似の要素を表すために利用される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１ａ】検出デバイス１００と、サンプラーの例としての個別のフードコアラー２００と、検出容器の例としてのディスポーザブル試験カップ３００と、任意選択的なテザー５０とを含む、本発明の検出システムの実施形態を例示する。
【図１ｂ】アレルゲン検出試験の実施プロセス中の、図１ａに示される検出システムのアセンブリーを例示する。
【図２ａ】フードコアラー２００の一部分を例示する。
【図２ｂ】フードコアラー２００の一部分を例示する。
【図２ｃ】サンプラーの例としてのアセンブルされたフードコアラー２００である。
【図３ａ】カップ蓋アセンブリー２１０とカップ体２２０とを有するアセンブルされたディスポーザブル試験カップ３００であり、ディスポーザブル試験カップ３００は、検出容器の例である。
【図３ｂ】ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。ラベル／最終流体シール２１１を例示する。
【図３ｃ】ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。光学ウィンドウ／流体シール２１６を例示する。
【図３ｄ】ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。ホモジナイザーロータ２４０を例示する。
【図３ｅ】ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。カップ蓋アセンブリー２１０を例示する。
【図３ｆ】ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。フロー管２２１とフロー管キャップおよびフィルターアセンブリー２２４とを例示する。
【図３ｇ】ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。カップ体２２０を例示する。
【図４ａ】膜シール２５０を通してロータポート２１２に接続される蓋アセンブリー２１０のホモジナイザーロータ２４０の代替構成をホモジナイザーステータ２３０なしで例示する。
【図４ｂ】蓋アセンブリー２１０の頂部の反応チャンバーの代替構成を例示する。
【図５ａ】カップ体２２０の底部に位置する反応チャンバー２２３の代替実施形態の側面図である。
【図５ｂ】反応チャンバー２２３および／または追加の対照チャンバー２２５（図示せず）への流体フローを制御するために提供されたバルブ２２８を示す、試験カップ３００の底部側の図である。
【図６ａ】２つの個別であるが接続されている部分に分割されたカップ体２２０’（左側パネルに側面図および右側パネルに上面図）の形状を示す。
【図６ｂ】２つの個別であるが接続されている部分に分割されたカップ体２２０’’（左側パネルに側面図および右側パネルに上面図）の形状を示す。
【図６ｃ】分割されたカップ体２２０を有するアセンブルされた試験カップ３００を例示する。
【図６ｄ】この代替設計のカップ蓋アセンブリー２１０の分解図を例示する。
【図７ａ】反応チャンバー２２３の形状およびレイアウトの他の例を示す。カップ体２２０の上面図である。
【図７ｂ】反応チャンバー２２３の形状およびレイアウトの他の例を示す。カップ体２２０の側面図を示す。
【図７ｃ】反応チャンバー２２３の形状およびレイアウトの他の例を示す。カップ体２２０の側面図を示す。
【図７ｄ】反応チャンバー２２３の形状およびレイアウトの他の例を示す。カップ体２２０の側面図を示す。
【図８ａ】フィルターアセンブリーの他の実施形態を例示する。カップベース２２２から特定の距離を隔てて代替フィルター膜２２６をカップ体２２０の底部に設け得ることを例示する。
【図８ｂ】フィルターアセンブリーの他の実施形態を例示する。フィルター膜２２６をカップ壁に平行にアライメントして、濾過されたサンプル溶液を受け入れるために小型チャンバー２２７をカップ体２２０に接続し得る他の代替形態を例示する。
【図９ａ】カップ体２２０内のフィルター膜２２６の代替設計を示す。設けられた単一フィルター膜２２６を例示する。
【図９ｂ】カップ体２２０内のフィルター膜２２６の代替設計を示す。設けられた二重フィルター膜２２６を例示する。
【図１０ａ】検出デバイス１００の外部部分を例示する。ハウジング１０を例示する。
【図１０ｂ】検出デバイス１００の外部部分を例示する。ドロアアセンブリー２０を例示する。
【図１１】爪状回転ドア４１０またはスイングハウジング構成を有する本発明の検出システムの代替アセンブリーを例示する。
【図１２ａ】検出デバイス１００のアセンブリーを例示する。検出デバイス１００の個別のコンポーネントを例示する。
【図１２ｂ】検出デバイス１００のアセンブリーを例示する。外部ハウジング１０（図示せず）内に構成された検出デバイス１００のコンポーネントを例示する。
【図１３ａ】アセンブルされたブレッドボードホモジナイザーアセンブリー５７０およびそのコンポーネントを例示する。
【図１３ｂ】ギアヘッド６１０を例示する。
【図１３ｃ】カプラー６３０を例示する。
【図１３ｄ】ホモジナイザーステータ２３０を例示する。
【図１３ｅ】ホモジナイザーロータ２４０を例示する。
【図１４】モータシャトル７１０およびモータ５１０のアセンブリーを例示する。
【図１５ａ】ポンプ５４０に接続されたギアトレイン／ドライブプラテン５３０を例示する。ギアトレイン／ドライブプラテン５３０の底面図である。
【図１５ｂ】ポンプ５４０に接続されたギアトレイン／ドライブプラテン５３０を例示する。ギアトレイン／ドライブプラテン５３０の上面図である。
【図１６】光学サブシステム５２０の実施形態を例示する。
【図１７】光学サブシステム５２０の代替形態を例示する。
【図１８】光学サブシステム５２０に接続されたプリント回路基板（ＰＣＢ）５５０を例示する。主制御ＰＣＢは、モータおよびポンプ／アクチュエータの制御電子部品を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の付随する説明に示される。本発明を実施または試験する際、本明細書に記載のものと類似のまたは均等な任意の材料および方法が使用され得るが、好ましい材料および方法を次に記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明から明らかになるであろう。説明では、単数形は、特に文脈上明確な規定がない限り、複数形も含む。特に定義がない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、本明細書が優先するものとする。
【００３７】
食品の安全性を確保するための分析デバイスの使用は、依然としてそれを保証するまでに至っていない。特に、簡単でありかつ正確で感度の良い迅速な検出スキームに基づくポータブルデバイスは、多様な既知のアレルゲンの検出用として依然として開発されていない。食品安全管理におけるアプタマーベースの分析に関するより最近のレビューの１つによると、アレルゲン検出のために多様な市販の分析ツールが開発されてきたが、そのほとんどは免疫アッセイに依拠することが示唆された。この群の成分に対するアプタマーの選択が新たに行われていることがさらに示唆された（アマヤ−ゴンザレス（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら著、センサーズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ）、２０１３年、第１３巻、ｐ．１６２９２〜１６３１１（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【００３８】
本発明は、さまざまな食品サンプル中の低濃度のアレルゲンを特異的に検出することができる検出システム、デバイスおよび作用剤を提供する。本検出システム、デバイスおよび方法では、検出剤としてアプタマーベースのシグナルポリヌクレオチド（ＳＰＮ）が使用される。本明細書で用いられる場合、「アレルゲン」という用語は、対象において免疫反応の原因となるか、それを誘発するか、またはそれをトリガーする化合物、物質または組成物を意味する。アレルゲンは、抗原とも呼ばれ得る。サンプル中のアレルゲン含有率を示すために、蛍光偏光（ＦＰ）などの蛍光シグナルが測定される。
【００３９】
一実施形態では、本発明の検出システムおよび／またはデバイスは、携帯性および動作信頼性を向上させるコンパクトサイズを有することが意図される小型ポータブルハンドヘルド製品である。ユーザは、本発明の検出システムおよびデバイスを持ち運んで、食品を摂取する前に食品サンプル中の１種以上のアレルゲンの存在および／または不在の迅速なリアルタイム試験を実施し得る。本発明に係る検出システムおよびデバイスは、家庭またはレストランなどの任意の場所でユーザによって使用され得る。
【００４０】
本発明の一実施形態では、検出システムおよび／またはデバイスは、標準的読取り情報として試験結果を表示し、検出は、検出システムおよびデバイスの操作方法の簡単な説明書に従って任意のユーザによって実施され得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、検出システムおよびデバイスは、簡単に高速で感度良く一工程で実施するように設計される。アレルゲン検出試験は、５分未満で終了し得る。
本発明によれば、検出システムおよびデバイスは、再充電可能または交換可能な電池、試験サンプルを処理するためのモータドライバー、検出デバイスのさまざまなコンポーネントへの処理されたサンプル溶液のフローを制御するためのポンプまたはアクチュエータ、および高速アレルゲン試験のためにさまざまなコンポーネントを一緒に組み合わせるコネクターを含む、アレルゲン検出試験のプロセスを実施および制御するための電気工学、機械工学および計算工学を統合したメカトロニック設計プロセスを含み得る。本発明の検出システムおよびデバイスはまた、試験サンプル中の対象のアレルゲンの存在および濃度を検出して検出シグナルを可読シグナルに変換するように構成された光学システムと、検出デバイスの他の部品を支持してさまざまな部品を機能製品として一体化させる機械部品とを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、検出システムおよび／またはデバイスは、すべての溶液をパックした状態で、１種以上の特異的アレルゲンに特有のディスポーザブル容器（例えば、ディスポーザブル試験カップまたはカップ状容器）が試験サンプルを受け入れかつ処理し、および検出試験を行うように設計されるものとして設計される。したがって、すべての溶液は、ディスポーザブルカップまたはカップ状容器に閉じ込められ得る。限定されるものではないが、例として、ディスポーザブルグルテン試験カップは、ユーザによって任意の食品サンプル中のグルテンを検出するために使用され、試験後に廃棄され得る。したがって、検出デバイスは乾燥デバイスであり得、溶液はディスポーザブルなものとしてパックされる。かかる設計によれば、異なるアレルゲン試験の相互汚染が回避されるであろう。
【００４３】
いくつかの実施形態では、試験サンプルを測定して所定のサイズにすることができる個別のサンプラーが提供される。一態様では、サンプラーは、アレルゲンタンパク質の抽出に好適なサンプルを作製するために、サンプルを小片にカットし、ブレンドし、研磨し、および／または粉砕するなど、試験サンプルをさらに前処理することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明の検出剤は、標的アレルゲンを特異的に認識し、かつ蛍光偏光の変化を検出シグナルとして生成するＳＰＮを含む。ＳＰＮは、標的アレルゲンに対する高い特異性および親和性を用いた選択プロセスを通して同定されるアプタマー配列を含み得る。
検出システム
一般的には、本発明のアレルゲン検出システムは、試験サンプルを捕集するための少なくとも１つのサンプラーと、アレルゲン検出試験を実施するための少なくとも１つのディスポーザブル検出容器と、検出試験の結果を検出および可視化するための検出デバイスとを含む。
【００４５】
図１ａおよび図１ｂに示されるように、本発明の検出システムの実施形態は、試験サンプルの処理、アレルゲン検出試験の実施、および検出試験の結果の検出を行うように構成された検出デバイス１００と、サンプラーの例としての個別のフードコアラー２００と、検出容器の例としてのディスポーザブル試験カップ３００とを含む。任意選択的に、検出デバイス１００を持ち運ぶためにテザー５０を含み得る。本明細書で用いられる場合、ディスポーザブル試験カップ３００は、カップまたはカップ状容器であり得る。検出デバイス１００は、検出デバイス１００のコンポーネント（図１２ａ〜１２ｂ、１３ａ、１４、１５ａ〜１５ｂおよび１６〜１８に示される）を支持する外部ハウジング１０と、ドロアフレーム２２とディスポーザブル試験カップ３００を保持するためのドロアウェル／ポート２３とを含むドロアアセンブリー２０とを含む。ドロアフレーム２２のフロント側に、ユーザがハウジング１０に対してドロアアセンブリーの出し入れを操作するためのドロアグリップ２１が追加され得る。外部ハウジング１０はまた、ユーザがデバイスを操作できるボタン用の表面スペースを提供する。ユーザによるアレルゲン検出試験の実施を可能にする実行／作動ボタン４０、ならびにユーザによる検出デバイス１００のオンおよび／またはオフの切替えを可能にするオン／オフスライダー３０が含まれ得る。表示ウィンドウ６０（図１ｂに示される）および外部電力充電用の任意選択的なプラグ（図示せず）も含まれ得る。任意選択的に、任意選択的なテザー５０を装着するためのランヤード５１は、外部ハウジング１０の外表面に含まれ得る。
【００４６】
アレルゲン検出試験を実施するプロセス中、図１ｂに示されるように、サンプルを採取したフードコアラー２００は、ディスポーザブル試験カップ３００に挿入され、ディスポーザブル試験カップ３００は、検出のために検出デバイス１００のドロアウェル／ポート２３に挿入される。
【００４７】
図１ａおよび図１ｂに示される検出システムのアセンブリーは、限定を意図するものではない。ディスポーザブル試験カップ３００と、フードコアラー２００と、検出デバイス１００とをアセンブルする他の方法は、本発明の範囲内である。一例を挙げると、検出デバイス１００は、図１１に示される代替アセンブリーのように、試験カップ３００の側部または頂部からディスポーザブル試験カップ３００を掴むように構成され得る。他の態様では、検出デバイス１００は、検出デバイス１００とディスポーザブル試験カップ３００およびフードコアラー２００とを接続するために持ち上げられ得るドアを有するように構成され得る。
検出システム  −  サンプラー
適正サイズのサンプルの捕集は、アレルゲン検出試験を実施するうえで重要な工程である。本発明のいくつかの実施形態では、試験サンプル（例えば、食品サンプル）を採取および捕集するための個別のサンプラーが提供される。一態様では、食品サンプルを採取および捕集するためのコアリング−パッカー−プランジャーの概念が本明細書に開示される。かかる機構は、アレルゲンタンパク質のホモジナイゼーションおよび試験サンプルからの抽出または放出を促進するために、１つまたは複数の所定サイズの食品サンプル部分を測定および捕集し、かつ切断、粉砕、研磨および／またはブレンディングなどの前処理工程を提供し得る。本発明によれば、個別のフードコアラー２００は、さまざまなタイプの食品サンプルを採取し、かつ所定サイズの試験サンプル部分を捕集するように設計される。
【００４８】
図２ａ〜図２ｃに示されるように、フードコアラー２００は、先端部にコアラートップキャップ１１０（図２ａ）を備えた先端側部分と、サンプル捕集管１４０（図２ｂ）を備えた基端側部分と、捕集管１４０に接続されたフードコアラー２００を取り扱うためのグリップ１２０（図２ｂ）と、コアラートップキャップ１１０に接続された先端部、および試験サンプルに直接接触して所定サイズの試験サンプル部分を採取するためにサンプル捕集管１４０から突出することができる基端側プランジャーチップ１５０を有するサンプル捕集管１４０内のプランジャー１３０（図２ａ）とを有する（図２ａ〜２ｃ）。基端側プランジャーチップ１５０の形状は、捕集されたサンプルを前処理するように構成され得る。フードコアラー２００の基端部は、捕集された試験サンプルをフードコアラー２００から試験カップ３００に移すときに、その流出の発生を低減させることができるスナップなどを有することをさらに特徴とし得る。
【００４９】
フードコアラー２００の部品は、取扱いが容易な任意の形状、例えば三角形、正方形、八角形、円形、長円形などとして設計され得る。
いくつかの実施形態では、フードコアラー２００のサイズは、カップ蓋アセンブリー２１０の頂部のコアラーポート２１３に嵌入するように設計される（図３ａ）。他の実施形態では、フードコアラー２００は、採取される試験サンプルを秤量するための手段、例えばスプリング、スケール、それらの均等物などをさらに備え得る。限定されるものではないが、例として、フードコアラー２００は、秤量テンションモジュールを備え得る。
【００５０】
代替的に、他のサンプルピックアップは、さまざまなタイプの試験サンプルを採取および捕集するように設計され得る。他のサンプルピックアップ設計は、シリンジの直径間にブレード（例えば、Ｘ−アクト（Ｘ−Ａｃｔｏ）ブレード）を有するシリンジコアラーであるバイセクティングコアラー、または代替的にＸ−アクト（Ｘ−ａｃｔｏ）ブレードの直上に配置されたシリンジコアラーを含み得る。ブレードは、コアリングされたサンプルを２つ以上の小片に分割することを促進し、より容易に処理およびホモジナイズされるようにし得る。
【００５１】
フードコアラー２００およびプランジャー１３０は、プラスチック材料、例えば、限定されるものではないが、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ）、アセタール（ＰＯＭ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）または任意のポリマーおよびそれらの組合せで作製され得る。プランジャー１３０は、熱、液体、ＵＶ光などに対する耐性を付与し得る任意の材料、例えばブナ−ｎ（Ｂｕｎａ−ｎ）、フルオロエラストマー、シリコーン、エチレンプロピレンジエンモノマー（ＥＰＤＭ）エラストマー、ネオプレン、ポリウレタン（ＰＵ））およびＰＴＦＥを用いてコアラーにシールされ得る。
検出システム  −  ディスポーザブル検出容器
本発明によれば、検出システムの一部分として少なくとも１つの個別の検出容器が提供される。検出容器は、ディスポーザブルで特定のアレルゲンに使用される。ディスポーザブル検出容器は、試験サンプルの処理、試験サンプルからのアレルゲンタンパク質の抽出、反応溶液および検出剤の貯蔵、試験サンプルと検出剤との接触／混合、ならびに／または蛍光シグナル測定用の光学ウィンドウの提供を行うように設計される。本発明のディスポーザブル検出容器は、分析検出アッセイが行われる１つ以上反応チャンバーを含む。すなわち、ディスポーザブル検出容器は、サンプルのアレルゲン試験のために１回のみ使用することが意図されるため、低コストのプラスチック材料、例えば透明な高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリビニルクロリド（ＰＶＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエステル（ＰＥＴ）または他の熱可塑性プラスチックで作製され得る。したがって、ディスポーザブル検出容器は、対象の任意の特定のアレルゲンに対して設計され得る。いくつかの実施形態では、こうしたディスポーザブル容器は、１種の特定のアレルゲンのみに対して設計され得、これにより他のアレルゲン反応との相互汚染を回避し得る。他の実施形態では、こうしたディスポーザブル容器は、試験サンプル中の２種以上の異なるアレルゲンを並行的に検出するように設計され得る。いくつかの態様では、ディスポーザブル容器は、２、３、４、５、６、７または８種の異なるアレルゲンを並行的に検出するよう設計され得る。
【００５２】
図３ａに示されるように、ディスポーザブル検出容器は、ディスポーザブル試験カップ３００またはカップ状容器であり得る。試験カップの一実施形態によれば、図３ａに示されるように、アセンブルされたディスポーザブル試験カップ３００は、試験サンプルの受入れ、試験サンプルの処理、および処理されたサンプルと検出剤（例えば、シグナルポリヌクレオチド（ＳＰＮ））との接触／混合を行うために、カップ蓋アセンブリー２１０とカップ体２２０とを含む。図３ｂ〜図３ｇは、ディスポーザブル試験カップ３００の分解図を示す。図３ｂは、試験カップでいずれのアレルゲンを検出することが意図されるかをユーザに通知し得るラベル／最終流体シール２１１を例示する。図３ｃは、試験カップポート２１４を有する光学ウィンドウ／流体シール２１６を例示する。光学ウィンドウ／流体シール２１６は、シグナル検出中に光を透過させるために検出デバイス１００の光学サブシステム５２０（図１６および図１７）にアライメントされ得る。図３ｄは、ホモジナイザーロータ２４０を例示する。ホモジナイザーロータ２４０は、ポート２１２を通して試験カップ３００に挿入され得る。図３ｅは、カップ蓋アセンブリー２１０を例示する。図３ｆは、フロー管キャップおよびフィルターアセンブリー２２４を例示する。図３ｇは、カップ体２２０を例示する。カップ蓋アセンブリー２１０は、ディスポーザブル試験カップ３００のクロージャに加えて、多くの機能を有する（図３ａ）。図３ａ、図３ｅおよび図６ｄに示されるように、カップ蓋アセンブリー２１０は３つのポート：ホモジナイザーロータ２４０およびホモジナイザーステータ２３０を収容するためのロータポート２１２、フードコアラー２００を受け入れかつ試験サンプルを受け入れるためのフードコアラーポート２１３、およびディスポーザブル試験カップ３００をフロー制御コンポーネント（例えば、真空ダクトまたは圧力ダクト）に接続するための試験カップポート２１４と、カップ蓋アセンブリー２１０とカップ体２２０とをアセンブルして試験カップ３００を形成するときに、カップ蓋アセンブリー２１０をアライメントおよび安定化するための手段２１８（図６ｄに示されるような）とを有する。
【００５３】
試験カップ３００は、１つ以上の反応チャンバー２２３を含む。すべての分析反応は反応チャンバー２２３内で行われる。反応チャンバー２２３は、処理されたサンプルが試験カップ３００内にあらかじめ貯蔵された検出剤と混合され、かつ検出可能なシグナル（例えば、蛍光シグナル）が生成される場所である。いくつかの態様では、反応チャンバー２２３は、実施される検出アッセイに依存して、試験サンプル中の全タンパク質含有率を測定するための対照チャンバーとして設計され得る。他の態様では、反応チャンバー２２３は、アッセイのタイプおよび測定される検出シグナルに依存して、他のバックグラウンドシグナルの測定に好適であるように設計され得る。代替的に、追加の対照チャンバー２２５は、試験カップの任意の一部分、例えば図４ｂに示されるカップ蓋アセンブリー２１０に追加され得る。複数の反応チャンバー２２３は、試験カップ３００内の種々の場所、例えば、限定されるものではないが、カップ蓋アセンブリー２１０（図３ａ、図３ｅおよび図４ａ〜４ｂ）、カップ体２２０の側部または底部（図５ａおよび図５ｂ）、分割されたカップ体２２０の個別の部分（図７ａ〜７ｄ）に構成され得る。複数の反応チャンバー２２３は、さまざまな形状を取り得、かつ互いに異なる方向を向く（図３ａ、４ｂ、５ａおよび７ａ〜７ｄ）。
【００５４】
検出システムの一実施形態では、反応チャンバー２２３は、カップ蓋アセンブリー２１０に含まれる（図３ａ〜３ｇおよび図４ａ〜４ｂ）。この実施形態では、カップ蓋アセンブリー２１０は、抽出されたサンプル溶液を２つの反応チャンバー２２３に運ぶための流体チャネル２１５をさらに含む（図３ａ〜３ｇ）。フードコアラー２００によって捕集された試験サンプルは、フードコアラーポート２１３を通して、アレルゲンタンパク質のホモジナイゼーションおよび抽出のためにカップ体２２０に投入され得る。試験サンプルから抽出されたアレルゲンタンパク質は、ディスポーザブル試験カップ３００を検出デバイス１００のフロー制御コンポーネントに結合するために使用される試験カップポート２１４を通して、カップ体２２０からポンプ送出またはプレス送出されてフロー管２２１を貫流し、流体チャネル２１５に入ってから２つの反応チャンバー２２３に入る。光学ウィンドウ／流体シール２１６は、液体シーリングおよび２つの反応チャンバー２２３への光学アクセスを提供する。ラベル／最終流体シール２１１は、最終液体シールおよびカップアセンブリーの同定（例えば、ディスポーザブル試験カップ３００がグルテンアレルゲンの検出に使用されることを示すグルテンの表示）を提供する。一態様では、フロー管キャップおよびフィルターアセンブリー２２４は、２つの反応チャンバー２２３内に保存された固体試薬の加湿およびホモジナイズされたタンパク質および／または緩衝溶液からの大粒子の濾過を防止するために提供される。
【００５５】
図３ａおよび図４ｂに示されるような好ましい一実施形態では、対象のアレルゲンに特異的な検出剤が提供されてアレルゲン検出反応が行われる１つのアレルゲン検出反応用分析チャンバーと、必要に応じて、試験サンプルのバックグラウンドシグナルを測定するための化学溶液が提供される１つのバックグラウンドシグナル測定用対照チャンバーとを含む２つの独立した反応チャンバー２２３がカップ蓋アセンブリー２１０に提供される。カップ蓋アセンブリー２１０の頂部の２つの反応チャンバー２２３は、抽出されたタンパク質溶液のフローを２つの反応チャンバー２２３にポンプ送入またはプレス送入する流体チャネル２１５に接続される。アレルゲンに特異的な検出剤および反応チャンバー２２３のバックグラウンドシグナルを測定するための化学溶液は、乾燥粉末であり得、かつフロー管２２１および流体チャネル２１５から反応チャンバー２２３に流動する処理されたサンプル溶液と混合され得る。代替的に、検出剤および化学溶液は、適切な緩衝液に再懸濁され得る。２つの反応チャンバー２２３は、並行的または逐次的に、好ましくは並行的に、処理されたサンプル溶液を受け入れるように構成され得る。アレルゲン分析チャンバーからの蛍光シグナル（例えば、蛍光強度および蛍光偏光）および対照チャンバーからのバックグラウンドシグナルは、検出デバイス１００の光学サブシステム（例えば、図１６および図１７に示される光学サブシステム５２０）によって検出されるであろう。いくつかの実施形態では、２つ以上のアレルゲン分析チャンバー、例えば２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、またはそれを超えるアレルゲン分析チャンバーがカップ蓋アセンブリー２１０の頂部に構成され得、そのいずれにおいても、さまざまなアレルゲンに特異的な検出剤を提供し得る。かかるマルチプレックス設計によれば、ユーザが複数のアレルゲンにアレルギーを示す病態では、試験サンプル中のいくつかのアレルゲンがユーザによって同時に検出されるであろう。いくつかの態様では、こうした反応チャンバーは、並行検出反応を行うように設計される。換言すれば、すべての反応は並行的に行われ得る。
【００５６】
以上に述べたようにおよび図４ｂに示されるように、３つ以上の反応チャンバー２２３がカップ蓋アセンブリー２１０の頂部に設計され得ることは本発明の範囲内である。特定の実施形態では、３つ以上のチャンバーがカップ蓋アセンブリー２１０の頂部に設計され得る。特定の一実施形態では、２つの反応チャンバー２２３と、アレルゲン検出アッセイの非特異的バックグラウンドシグナルを測定するために使用され得る１つの追加の対照チャンバー２２５とを含む３つのチャンバーが提供される。図４ｂは、カップ蓋アセンブリー２１０の頂部の３つのチャンバー、すなわち２つの反応チャンバー２２３および１つの対照チャンバー２２５の例示的な構成を例示する。この特定の構成は、その概念を示すために例示されたものであり、限定されるものではないことが当業者に理解可能である。各チャンバーの位置は、カップ蓋アセンブリー２１０の設計に依存して変更され得、いずれの数字表示も限定するものではない。各チャンバーは、検出剤と試験サンプル中の対象のアレルゲンとの相互作用のシグナルを検出するための分析チャンバー、試験サンプルから単離された全タンパク質を測定するためのチャンバー、または検出アッセイの非特異的バックグラウンドシグナルを測定するための対照チャンバーとして指定され得る。３つのチャンバーは、処理された試験サンプル溶液の一部分を、フロー管２２１を通して受け入れる流体チャネル２１５に接続し得る。検出結果の誤認識を引き起こし得る異なるチャンバー間の干渉を回避するために、流体チャネル２１５内に１つ以上のエアベント２１７（図４ｂ）を追加して、反応チャンバー２２３間の液体フローを防止し得る。
【００５７】
１つ以上の反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５が必ずしもカップ蓋アセンブリー２１０の頂部に設計されないことは本発明の範囲内である。１つ以上の反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５は、試験カップまたはカップ状容器３００の任意の部分に位置し得る。図３ａおよび図４ｂに例示される構成に加えて、代替実施形態も提供され得る。図５ａおよび５ｂに例示されるように、１つ以上の反応チャンバー２２３および／または任意選択的な対照チャンバー２２５（図５ａおよび図５ｂには示されていない）は、カップ体２２０の底部に位置し得、かつフィルター膜２２６（図５ａ）によって濾過された後の試験サンプル溶液を直接受け入れる。図５ｂは、試験カップ３００の底部の図をさらに例示する。この特定の実施形態によれば、光学ウィンドウ／流体シール２１６は、検出シグナルを読み取るウィンドウを提供するように反応チャンバー２２３および／または任意選択的な対照チャンバー２２５をシールするために使用される。加えて、バルブ２２８が提供され得、これにより、処理されたサンプル溶液のフローの制御を可能にする。バルブ２２８は、アンブレラバルブ、ダックビルバルブ、他のワンウェイバルブ、フラジャイルシールなどであり得る。例えば、サンプル溶液の制御放出を可能にするように内部フラジャイルシールが使用され得る。
【００５８】
代替的に、ディスポーザブル試験カップ３００のカップ体２２０は、２つの個別の部分（図６ａ〜６ｄおよび図７ａ〜７ｄ）、すなわち、フードコアラー２００または他のタイプのサンプラーによって捕集された試験サンプルを受け入れかつ処理し、および試験サンプルからアレルゲンタンパク質を抽出するように構成された一方の部分と、１つ以上の反応チャンバー２２３および／または任意選択的な対照チャンバー２２５を含むように構成された他方の部分とに分割され得る。分割されたカップ体２２０の各部分の形状はさまざまであり得る。限定されるものではないが、例として、図６ａは、試験サンプルを処理するための三角形状部分と、反応チャンバーを保持するための長方形部分とを有する代替カップ体設計２２０’を例示する。図６ｂは、試験サンプルを処理するための円形部分と、反応チャンバーを保持するための長方形部分とを有する他の代替カップ体設計２２０’’を例示する。
【００５９】
以上に述べたようにおよび図７ａ〜７ｄに示されように、反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５は、カップ体２２０の２つの個別の部分の一方に構成され得る。図７ａ〜７ｄは、カップ体２２０の個別の部分内の反応チャンバー２２３および／または任意選択的な対照チャンバー２２５の配置のいくつかの例を示す。反応チャンバー２２３（および任意選択的な対照チャンバー２２５）は、任意のレイアウト配置、例えば、並列（カップの頂部から見た図７ａ）、図７ｂに示されるスタック配向、フロントおよびバック（図７ｃ）または対角配向（図７ｄ）で構成され得る。
【００６０】
この態様では、試験カップ３００のカップ蓋アセンブリー２１０は、カップ体２２０の形状に一致するように造形され得る。図６ｃおよび６ｄに示されるように、カップ体２２０の２つの個別の部分を有するアセンブルされた試験カップ３００のカップ蓋アセンブリー２１０は、３つのポート２１２、２１３および２１４を含む。アセンブリーをアライメントおよび安定化するための手段２１８も含まれ得る。分割されたカップ体の１つの部分に反応チャンバーが含まれる実施形態では、図６ｄの分解図に示されるように、エアベント２１７と真空ポートシール２１９とを含む真空ガスケット８４０がカップ蓋アセンブリー２１０の下側に挿入され得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５は、任意の形状、例えば、限定されるものではないが、円形、三角形、長方形および楔形を取り得る。
【００６２】
操作可能な検出容器（すなわち試験カップ３００）を形成するために、カップ蓋アセンブリー２１０およびカップ体２２０は一体的にアセンブルされ得る。アセンブリーのアライメントおよび安定化のための手段（例えば、図６ｄに例示される特徴部２１８）が含まれ得る。ラベル／最終流体シール２１１は、アセンブルされた試験カップ、例えばカップ蓋アセンブリー２１０の頂部に装着される。ラベルは、試験カップ３００を用いて試験される対象の標的アレルゲンを示す。一例では、反応チャンバー２２３がカップ蓋アセンブリー２１０に組み込まれる場合、ラベル／最終流体シール２１１は、図３ｃに示されるように光学ウィンドウ／流体シール２１６の頂部に装着される。他の例では、反応チャンバー２２３がカップ体２２０の底部（図５ａ）またはカップ体２２０の２つの個別の部分の一方（図７ａ〜７ｄ）に位置決めされる場合、ラベル／最終流体シール２１１は、カップ蓋アセンブリー２１０に直接装着され、かつ試験カップ３００の最終シールとしても機能する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ホモジナイザーロータ２４０は、図４ａに示されるようにカップ蓋アセンブリー２１０のロータポート２１２に接続され得る。この特定の実施形態では、図３ａおよび図３ｅに示されるようにロータポート２１２に溶接されたホモジナイザーステータ２３０は、必ずしも必要ではない。ホモジナイザーロータ２４０は、膜シール２５０を通してカップ蓋アセンブリー２１０の内側でのロータポート２１２に直接結合し得る。シール材料としては、限定されるものではないが、熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）、熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、熱硬化性材料、例えばシリコーン、ゴム（例えば、ブナ−Ｎ（Ｂｕｎａ−Ｎ）、ネオプレンおよびサントプレン（Ｓａｎｔｏｐｒｅｎｅ））が挙げられ得る。異なる熱可塑性および硬度を有する材料で構成され得る接続される２つの部分は、ツーショットプラスチック射出成形を用いて作製され得る。ホモジナイザーロータ２４０とロータポート２１２との接続も、オーバーモールディング射出成形、熱溶接、超音波溶接および／もしくはグルー接合のプロセスまたは任意の他の適切な成形技術を用いて生成され得る。
【００６４】
試験カップ３００は、処理されたサンプル溶液を、それがアレルゲン検出試験のために反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に流入される前に濾過するフィルターをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、図３ａおよび図３ｆに記載されるように、フロー管キャップおよびフィルターアセンブリー２２４は、処理された試験サンプルを、それが反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に送達される前に濾過するためにフロー管２２１に装着され得る。代替的に、フロー管キャップおよびフィルターアセンブリー２２４は、図５ａ〜５ｂ、８ａ〜８ｂおよび９ａ〜９ｂに示されるように単純フィルター膜２２６で置き換えられ得る。いくつかの態様では、フィルター膜２２６は、カップベース２２２に対して特定の距離を有してカップ体２２０のカップベース２２２に平行にアライメントされ得る（図８ａ）。フィルター膜２２６とカップベース２２２との間のスペースは、濾過されたサンプル溶液の保持を可能にする。他の態様では、フィルター膜２２６は、カップ体２２０の壁に平行に、壁に対して特定の距離を有してカップ体２２０に挿入され得、かつ濾過されたサンプル溶液を、それが反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に送達（例えば、ポンプ操作または真空操作により）される前に保持するのに十分なスペースを与え得る。代替的に、フィルター膜２２６が装着されるカップ体２２０の側壁から突出する小型チャンバー２２７が提供され得る。小型チャンバー２２７は、濾過されたサンプル溶液を、それが反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に送達される前に保持するであろう（図８ｂ）。
【００６５】
分割されたカップ体２２０の個別の部分に反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５が組み込まれる実施形態では、単一フィルター膜２２６は、図９ａに示されるように、カップ体２２０の底部のバルブ２２８の下側に挿入され得る。次いで、処理されたサンプル溶液は、それがカップ体２２０の個別の部分に組み込まれた反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に流入される前に濾過される。
【００６６】
いくつかの態様では、２つ以上のフィルター膜２２６がカップ体２２０に挿入され得る。フィルター膜２２６は、フィルターステージを形成するようアセンブルされる。図９ｂに例示される一例では、１つのフィルター膜２２６は、処理されたサンプル溶液を、それがバルブ２２８を通って駆動される前に濾過するようにカップ体２２０の中央に位置決めされ得、他のフィルター膜２２６は、処理されたサンプル溶液を、それが反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に流入される前に再濾過するようにカップ体の底部に構成される。いくつかの態様では、トップフィルター膜２２６は、底部のフィルター膜２２６よりも大きい細孔サイズを有し得る。
【００６７】
フィルター膜２２６は、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ポレックス（Ｐｏｒｅｘ）（商標）または膜ポリマー、例えば混合セルロースエステル（ＭＣＥ）、セルロースアセテート、ＰＴＦＥ、ポリカーボネートなどであり得る。それは、高多孔度を有する薄膜（例えば、厚さ１５０μｍ）であり得る。いくつかの態様では、フィルター膜２２６の細孔サイズは、２０μｍ〜３００μｍの範囲内またはその間の任意のサイズであり得る。例えば、細孔サイズは、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍまたは３００μｍであり得る。
【００６８】
カップ蓋アセンブリー２１０は、熱可塑性物質、例えば、限定されるものではないが、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）およびポリビニルクロリド（ＰＶＣ）またはそれらの組合せで構成され得る。
【００６９】
カップ体２２０は、フードコアラー２００から試験サンプルを受け入れて、アレルゲンタンパク質の抽出のためにホモジナイズすることが意図され、カップ蓋アセンブリー２１０に接続されるより広い先端部とカップベース２２２とを有し得る（図３ｇ）。特定の実施形態では、カップ体２２０は、試験サンプルの抽出および消化のために所定の体積の抽出緩衝液を含有する。抽出緩衝液の体積は、約１００μＬ〜約５００μＬまたは約５００μＬ〜約２．５ｍＬの範囲内であり得る。カップでは、消化体積は、５００μＬ〜５ｍＬにすべきである。検出チャンバーでは、それは、１０μｌ〜３００μｌの範囲内にすべきである。いくつかの実施形態では、緩衝液の体積は、１００μＬ、または２００μＬ、または３００μＬ、または４００μＬ、または５００μＬ、または１ｍＬ、または１．２ｍＬ、または１．４ｍＬ、または１．６ｍＬ、または１．８ｍＬ、または２．０ｍＬ、または２．５ｍＬであり得る。
【００７０】
本発明の他の実施形態では、アレルゲン検出反応は、カップ体２２０内で行われ得、蛍光シグナルは、検出デバイス１００の光学サブシステム（例えば、光学サブシステム５２０）によって検出されるであろう。したがって、カップ体２２０は、試験対象の１種以上のアレルゲンに特異的に結合する検出分子（例えば、ＳＰＮ）を含み得る。検出剤は、カップ体２２０の任意の局所領域、例えばカップベース２２２の底部に閉じ込められ得、かつカップ内に放出して検出アッセイのために抽出されたタンパク質溶液と混合され得る。アレルゲンと検出剤との混合物は、シグナル解析のために反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５にポンプ送入またはプレス送入され得る。
【００７１】
典型的には、ディスポーザブル試験カップ３００は、約０．２５〜５ｇのサンプルに好適な容量を有する。抽出緩衝液中での試験サンプルの解離／ホモジナイゼーションが意図されたカップ体２２０は、約０．５ｍＬ〜１０ｍＬの容量を有し得る。
【００７２】
他の実施形態では、カップ体２２０は、軟質材料で作製され得る。かかる場合、試験サンプルの挿入後、内側に溶液を含むカップ体２２０は、検出デバイス１００からの圧力などの外圧により、カップ蓋アセンブリー２１０の頂部の反応チャンバー２２３の１つにプレス送入され得る。かかる圧力、圧縮またはアジテーションは、試験サンプルを処理するようにも機能し得る。
【００７３】
当業者であれば予想するであろうように、本ディスポーザブル検出容器、例えば本明細書に開示される試験カップ３００は、本検出システムでのその使用に限定されない。検出容器は、他の類似のアナライト検出システム（例えば、タンパク質、核酸および他の分子で操作できるようにさらに改変され得る。
検出システム  −  検出デバイス
いくつかの実施形態では、検出デバイス１００は、２つの部分：検出デバイス１００のコンポーネントに対する支持表面を提供する外部ハウジングと、ディスポーザブル試験カップ３００およびフードコアラー２００を挿入するために検出デバイス１００を開放することができる部分とを有するように構成され得る。本発明に係るアレルゲン検出デバイス１００の一実施形態は、図１ａ〜１ｂ、１０ａ〜１０ｂ、１１および１２ａ〜１２ｂに示される。図１ａおよび図１ｂに例示されるように、検出デバイス１００は、検出デバイスのコンポーネント１００を一体的に保持することを促進し、かつアレルゲン検出試験を実施するために機能的に健全なものとしてそれらを統合する外部ハウジング１０と、外部ハウジング１０から引き出され得、かつスライドさせて外部ハウジング内に戻され得るドロアアセンブリー２０とを含む。外部ハウジング１０は、プラスチック材料または他の好適な支持体材料で形成し得る。
【００７４】
図１０ａに示されるように、外部ハウジング１０は、実行／作動ボタン４０用のボタンポート４０ａ、ならびにオン／オフスライダー３０用のオン／オフスライダーポート３０ａが提供される、ハウジングカバー３１０とハウジングベース３２０とを含み得る。加えて、アライメント３４０は、アレルゲン検出試験を実施するときにディスポーザブル試験カップ３００を検出デバイス１００にアライメントするためのアライメントサイト３４０ａを外部ハウジング１０のトップフロントに組み込み得る。ハウジングベース３２０の底部の各側のグルーブ３３０は、ドロアアセンブリー２０をスレッディングさせるために使用される。ドロアアセンブリー２０（図１０ｂ）は、検出試験中にユーザがドロアアセンブリー２０を取り扱うように構成されたドロアグリップ２１がフロント側に存在するドロアフレーム２２と、ディスポーザブル試験カップ３００を挿入するためのドロアウェル／ポート２３とを含み得る。ドロアフレーム２２の各側のスレッド（またはチャイム）３５０は、ハウジングベース３２０のグルーブ３３０に沿ってドロアアセンブリー２０をスライドさせるために提供される。
【００７５】
検出デバイス１００が使用されないとき、ドロアアセンブリー２０がハウジング１０内に押し戻されるため、検出デバイス１００は、閉鎖されてバッグ（例えば、ハンドバック）で容易に持ち運ばれ得るか、またはバッグ内に保存され得る。
【００７６】
代替的に、ディスポーザブル試験カップ３００を保持するためのドロアウェル／ポート２３に到達可能にする他の構成が本発明に従って設計され得る。限定されるものではないが、例として、爪状回転ドア４１０が外部ハウジング１０に接続され得る（図１１に例示される）。検出デバイス１００は、操作中に爪状回転ドア４１０を閉鎖してカップを覆うことにより、ディスポーザブル試験カップ３００を覆うように配置され得る。限定されるものではないが、他の例として、アレルゲン検出試験中に外部ハウジング１０を開放するように持ち上げられ得るヒンジドアが設計され得る。
【００７７】
アレルゲン検出試験を実施するために、検出デバイス１００は、試験サンプルのホモジナイゼーションおよび抽出緩衝液中の試験サンプルからのアレルゲンタンパク質の抽出を行うように構成されたホモジナイザーと、ホモジナイザーおよびホモジナイザーにモータを接続するのに必要なコネクターを操作するための手段（例えば、モータ）と、アレルゲン検出試験のプロセス中、処理されたサンプル溶液のフローを駆動および制御するための手段と、蛍光励起を提供しかつ蛍光発光をフィルターするための光学サブシステムと、試験サンプル中のアレルゲンと検出剤との間の検出反応からの蛍光発光および対照チャンバーからのバックグラウンドシグナルを検出するための手段と、検出シグナルの変換およびデジタル化を含む検出シグナルを可視化するための手段と、試験結果を表示するユーザインターフェースと、電源とを備える。いくつかの実施形態では、標的アレルゲンに結合できないフルオロフォア染料（例えば、ランダムアプタマー）でプローブ化された分子は、対照チャンバーに貯蔵され得る。非結合分子は、粘度および温度の影響を補正するための手段を提供する。読み値と期待値との差を測定し、それを用いてアクティブ反応チャンバーからの測定値をスケーリングすることによるものである。
【００７８】
本発明の一実施形態では、図１２ａおよび１２ｂに示されるように、検出試験を操作するために一体化される検出デバイスのコンポーネント１００としては、カップ体２２０内にアセンブルされるホモジナイザーアセンブリー５７０に接続され得るモータ５１０（図示せず）と、ディスポーザブル試験カップ３００内の反応チャンバー２２３に接続される光学サブシステム５２０（図示せず）と、アレルゲン検出試験でホモジナイゼーション中にロータを駆動するためのギアトレイン／ドライブプラテン５３０と、流量を制御および調整するためのポンプ５４０、ＰＣＢ５５０と、電源５６０とが挙げられる。コンポーネントは、ドロアグリップ２１を有し得るドロアアセンブリー２０内に保持される。検出デバイスは、ハウジングカバー３１０およびハウジングベース３２０によって包囲される。図１２ａは、検出デバイス１００のさまざまなコンポーネントを例示し、一方、図１２ｂは、さまざまなコンポーネントを機能デバイスとしてフードコアラー２００および試験カップ３００と一緒にアセンブルするときの検出デバイス１００の図を例示する。
【００７９】
本発明によれば、ホモジナイザーは、ディスポーザブル試験カップ３００に嵌入するのに十分な程度に小さく設計される。加えて、検出デバイス１００のホモジナイザーは、サンプルのホモジナイゼーションおよびアレルゲンタンパク質の抽出の有効性を向上させるために最適化され得る。
【００８０】
図１３ａは、カップ体２２０内に保持されるアセンブルされたブレッドボードホモジナイザーアセンブリー５７０およびそのコンポーネントを例示する。図１３ｂ〜１３ｅは、ギアヘッド６１０、カプラー６３０、ホモジナイザーステータ２３０およびホモジナイザーロータ２４０を例示する。ホモジナイザーロータ２４０およびホモジナイザーステータ２３０は、ロータポート２１２を通してカップ蓋アセンブリー２１０の頂部にアセンブルされる（図示せず、図３ａを参照されたい）。ホモジナイザーロータ２４０は、トップロータキャップ６６０を備えた先端部と、１つ以上のロータブレード６７０またはその均等物を含む基端部とを有する（図１３ｅ）。ロータキャップ６６０は、ロータポート２１２（図示せず）に接続され得、ホモジナイザーロータ２４０は、ロータポート２１２（図示せず）を通してカップ蓋アセンブリー２１０（図示せず）に挿入される。ホモジナイザーロータ２４０は、ホモジナイザーステータ２３０内で回転し、かつ試験サンプルをフードコアラー２００（図示せず）から処理チャンバー６９０の底部に押し入れるように構成される。ホモジナイザーステータ２３０は、ステータキャップ６４０を備えた先端部と、カップ体２２０内に延在する、１つ以上の小さいステータスロット６５０を含む基端部とを有する（図１３ｄ）。ステータキャップ６４０を通して、ホモジナイザーステータ２３０は、カップ蓋アセンブリー２１０（図示せず）のロータポート２１２内に着座する。プロセシング中、試験サンプルは、ホモジナイザーステータ２３０の基端部のステータスロット６５０を通して半径方向に押し出される。ホモジナイザーステータ２３０は、主にフローブレーカとして作用してサンプルの回転を防止し、かつ非常に小さい空間に大きい力学的エネルギーを導入する。ホモジナイザーの先端側部分のカプラー６３０（図１３ｃ）は、ホモジナイザーロータ２４０と、モータ５１０（図示せず、図１２ｂおよび図１４を参照されたい）に接続するためのギアトレインまたはドライブの一部分であるギアヘッド６１０（図１３ｂ）とを結合する。ギアヘッド６１０は、モータ５１０の速度を低減しかつ液体中のトルクを増加させ、カプラー６３０は、アクチュエータシャフト６２０をホモジナイザーロータ２４０に接続する。ホモジナイザーの基端側部分（すなわちロータブレード６７０およびステータスロット６５０）は、カップ体２２０内で回転して、ホモジナイザーステータ２３０の固定ティースとホモジナイザーロータ２４０の回転タインとの間の液体中に剪断を生成する（図１３ａ）。ボルテックスは大幅に低減され、より多くのエネルギーがロータとステータとの間の剪断ギャップに導入される。粒子は、鋭いエッジとの衝突、ロータブレードのエッジとステータスロットのエッジとの間の剪断によってサイズが低減される。
【００８１】
いくつかの態様では、加熱システム（例えば、抵抗加熱またはペルチエヒータ）を提供してホモジナイゼーションの温度を上昇させることにより、サンプル解離の有効性の向上および処理時間の短縮を行い得る。温度は、６０℃〜９５℃に上昇させ得るが、９５℃未満である。温度上昇はまた、検出分子と検出されるアレルゲンとの間の結合を促進し得る。任意選択的に、試験の実施後に温度を急速に低下させるためにファンまたはペルチエクーラが提供され得る。
【００８２】
次に、図１４を見ると、本発明のいくつかの実施形態では、モータ５１０は、ホモジナイザーロータ２４０（図示せず）およびホモジナイザーステータ２３０（図示せず）に係合するようにモータシャトル７１０を通してホモジナイザーアセンブリー５７０（図示せず）に接続され得る。シャトル垂直ガイドピン６８０は、モータシャトル７１０のピンポート６８０ａを通してホモジナイザーアセンブリー５７０のギアヘッド６１０およびアクチュエータシャフト６２０をモータ５１０に案内する。モータシャトルリフトピン７２０は、リフトピンポート７２０ａを通してモータシャトル７１０およびモータ５１０のアライメントおよび上昇／下降をさらに行い得る。
【００８３】
サンプル処理カップ体２２０内では、カップ内にプレロードされた抽出緩衝液と、フードコアラー２００から押し込まれた試験サンプルとが混合される。モータ５１０によって駆動されて、ホモジナイザーアセンブリー５７０は、抽出緩衝液中で試験サンプルをホモジナイズし、アレルゲンタンパク質の解離／抽出を行う。処理されたサンプル溶液は、フロー管２２１を通してカップ蓋アセンブリー２１０の流体チャネル２１５にポンプ送入またはプレス送入され、次いで分析チャンバーの１つである反応チャンバー２２３に送られ、そこで、処理されたサンプル溶液は、検出試験のためにプレロードされた検出分子（例えば、ＳＰＮ）と混合される。並行的に、処理されたサンプル溶液の一部分は、カップ蓋アセンブリー２１０の頂部の反応チャンバー２２３の１つである他の対照チャンバーにポンプ送入またはプレス送入され、そこで抽出溶液のバックグラウンドシグナルが測定される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、処理された試験サンプルは、反応チャンバー２２３への抽出溶液の流動前に、処理されたサンプル溶液をフィルター膜に押し入れることができる手段（例えば、ホモジナイザーアセンブリー５７０に接続された濾過手段）を通してさらに濾過され得る。一例は、図３ｆに例示されるフロー管キャップおよびフィルターアセンブリー２２４である。フィルター細孔は、０．２μ〜３００μであり得る。フィルターは、任意の低結合性材料、例えば、限定されるものではないが、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ＰＣＴＥ（ポリカーボネート）またはＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）から作製され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、カプラー６３０は、カプラー６３０の各端が異なるサイズを有し得るか、またはカプラー６３０の各末端が同一のサイズを有し得る。
類似の構造設計を有する他のホモジナイザー（例えば、米国特許第６３９８４０２号明細書）と比較して、本発明のカスタムブレードコアは、食品の回転および牽引およびカスタムキャップの歯状表面への圧入を行う。カスタムのＯリングは、カスタムキャップと、ホモジナイゼーションの進行および結果の可視化のための透明であり得るカスタムカップとの間をシールする。ホモジナイザーロータは、任意の熱可塑性物質、例えば、限定されるものではないが、ポリアミド（ＰＡ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、高耐衝撃性ポリスチレン（ＨＩＰＳ）およびアセタール（ＰＯＭ）から作製され得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ホモジナイザーアセンブリー５７０は、特定の要件を満たすために、例えば、粉砕、切断、ブレンディング、研磨または混合運動を含め、食品を破壊する機械的支援を追加するために、異なるタイプの試験サンプルに対して異なるホモジナイゼーション機構を用いるように設計および変更され得る。いくつかの態様では、ホモジナイザーは、ホモジナイザーのアジテーションを向上させるための手段（例えば、ステータおよびコアラー）を含み得る。ホモジナイザーは、コアリングを支援するために捩られ得る「スターノブ」スタイルのハンドルを有し得る。ステータ／コアラーのハンドルは、ハーブグラインダー（エッジの周りのテクスチャーバンド）、またはピルクラッシャー（三弁花形ノブを有する）、またはピルクラッシャー（ツーウィングノブを有する）として設計され得る。他の態様では、ステータ／コアラーは、オブジェクトステータ（例えば、厚さ１ｍｍ）、ＰＰＥシリンジコアラー、ファインマイクロプレーン、コアースマイクロプレーンおよびパルベライザー、ビーズビーティング（大理石アジテータまたは鋼球アジテータ）であり得る。他の実施形態では、ホモジナイザーは、試験サンプルを解離させる混合プロセスを有するハイブリッド、例えば粉砕およびブレンディングによるものであり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、モータ５１０は、市販のモータ、例えばマクソン（Ｍａｘｏｎ）モータシステム：マクソン（Ｍａｘｏｎ）ＲＥ−マックス（ＲＥ−ｍａｘ）および／またはマクソン（Ｍａｘｏｎ）Ａ−マックス（Ａ−ｍａｘ）（米国カリフォルニア州サンマテオのマクソンモータ（Ｍａｘｏｎ  Ｍｏｔｏｒ）ａｇ）であり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ギアトレインまたはドライブは、モータ５１０をホモジナイザーアセンブリー５７０に接続するために使用され得る。ギアトレインおよび／またはドライブは、モータ５１０のパッケージングを可能にするため、食品サンプルをホモジナイザーアセンブリー５７０に導入するフードコアラー２００の能力を妨害せず、ホモジナイザーステータ２３０を上から駆動することを可能にし、かつ操作中に液密シールを必要としない。ラベル／最終流体シール２１１は、ステータキャップ６４０を取り囲む領域に近接して適用されるラベルまたは他の取外し可能なシールによって提供される。ギアトレインまたはドライブはまた、モータ５１０からのパワーを２つの直角方向に転向可能であるため、検出デバイス１００のユーザ経験とディスポーザブル試験カップ３００の機能要件との特定の組合せにとってきわめて重要である。
【００８９】
試験サンプルは、タンパク質抽出およびアレルゲン回収のために抽出緩衝液中で処理されるであろう。いくつかの実施形態では、抽出緩衝液は、タンパク質抽出を向上させるように最適化され得る。抽出緩衝液は、本出願人の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６２６５６号明細書（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、異なる試験サンプルに対して異なる作用剤を含有し得る。
【００９０】
本発明によれば、処理されたサンプル溶液のフローを駆動および制御し、かつ前記抽出溶液と１種以上の検出シグナル分子とを混合するための手段が提供される。いくつかの実施形態では、手段は真空システムまたは外圧であり得る。限定されるものではないが、例として、手段は、ギアトレインの軸を支持し得、かつポンプによってディスポーザブル試験カップ３００のカップ蓋アセンブリー２１０の試験カップポート２１４に真空を適用するようにポンプ操作（シールされたエアチャネル）を提供し得るという意味で多機能に構成されたプラテン（例えば、溶接されたプラスチッククラムシェル）であり得る。
【００９１】
図１５ａおよび図１５ｂを参照して、ギアトレイン／ドライブプラテン５３０は、ポンプ（例えば、ピエゾマイクロポンプ）５４０が接続される下側と、ディスポーザブル試験カップ３００のカップ蓋アセンブリー２１０（図示せず）の頂部の試験カップポート２１４（図３ｃに示される）に接続される真空ダクト８５０を備えた頂部側と、エアチャネル８６０とを有し得る。モータ５１０（図示せず）とホモジナイザーアセンブリー５７０（図示せず）とに接続されるギアトレインまたはドライブに接続するように構成されるギアトレイン／モータポート８１０である。ギアトレイン／ドライブプラテン５３０のエッジのギアトレイン／カップポート８３０は、カップ蓋アセンブリー２１０の頂部の試験カップポート２１４（図３ｃに示される）とギアトレイン／カップポート８３０との間の接続をシールする真空ガスケット８４０に取り囲まれる。フロー制御ポート８２０は、光学サブシステム５２０（図示せず、図１６および図１７に例示される）からのアクティブフィードバックにより、または小オリフィスもしくは疎水性膜などの流体力学的手段により、カップ体２２０（図示せず）から反応チャンバー２２３（図示せず）への抽出タンパク質溶液のフロー制御を提供する。
【００９２】
圧電マイクロポンプ（日本国名古屋市の高砂電気工業株式会社）などのポンプ５４０は、フローを制御して目標流量に自動調整するために使用され得る。ポンプの流量は、ドライバー電圧または駆動周波数のいずれかを変化させることによって調整可能である。図１５ａに示されるポンプ５４０は、濾過されたサンプル溶液を２つの反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に運ぶのに必要なアリコート機能に好適であり得ることを示唆する仕様を有する現在市販されているピエゾポンプの代表である。ポンプ５４０は、真空ポンプまたはＫＢＦポンプ（米国ニュージャージ州トレントンのＫＮＦニューバーガ（ＫＮＦ  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ））などの実験室用として設計された他の小型ポンプであり得る。
【００９３】
真空ガスケット８４０は、ギアトレイン／ドライブプラテン５３０とカップ蓋アセンブリー２１０の頂部の試験カップポート２１４との間のシールを提供する。いくつかの実施形態では、真空ガスケット８４０は、ディスポーザブル試験カップ３００に組み込んで検出デバイス１００の信頼性を向上させることもできる。エアチャネル８６０は、個別のチューブおよび取付け具を用いて達成することもできる。サンプルフロー管２２１は、緩衝溶液の蒸発によって早期に反応剤が溶解しないように、キャップ、ダックビルバルブ、アンブレラバルブ、コーンバルブ、Ｘ−フラグム（Ｘ−Ｆｒａｇｍ）（ミニバルブ（Ｍｉｎｉｖａｌｖｅ））、類似の装置などの手段により、流体チャネル２１５および反応チャンバー２２３から分離されるであろう。いずれのかかるバルブの開口圧力も、操作中に開放されるが、貯蔵／輸送中にカップ内の空気の膨張によって開放されないように制御されなければならない。いくつかの態様では、真空ガスケット８４０は、図６ｄに示されるようにカップ蓋アセンブリー２１０の真下に位置決めされる。真空ガスケット８４０は、蓋の対応するポートにアライメントされたフードコアラーポート２１３およびロータポート２１２と、蓋の試験カップポート２１４をシールするための１つ以上のエアベント２１７および真空ポートシール２１９とを含む。
【００９４】
本発明の検出デバイス１００は、サンプル中のアレルゲンと検出剤（例えば、ＳＰＮ）との相互作用から生成されたシグナル（例えば、蛍光シグナル）を検出する光学サブシステムを含む。光学サブシステムは、検出対象の蛍光シグナルのタイプに依存して、さまざまなコンポーネントおよびさまざま構成を含み得る。光学サブシステムは、検出容器、例えば以上で考察した試験カップ３００の反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５の近くにあり、かつそれらにアライメントされる。このため、光学サブシステムは、反応チャンバー２２３の光学ウィンドウ／流体シール２１６の近くにあり得、かつそれらにアライメントされ得る（図３ｃに示される通り）。
【００９５】
本発明によれば、検出剤と試験サンプル中のアレルゲンとの相互作用から生成される検出可能なシグナルは、蛍光シグナル、例えば、限定されるものではないが、吸光度、蛍光強度、発光、時間分解蛍光（ＴＲＦ：ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）および蛍光偏光（ＦＰ）であり得る。一態様では、試験サンプル中のアレルゲンと検出剤との結合相互作用から検出可能なシグナルは、蛍光プローブの蛍光偏光（ＦＰ）の変化、例えばフルオロフォアプローブ化ＳＰＮへのアレルゲンタンパク質の結合時のフルオロフォア標識シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）の蛍光偏光（ＦＰ）の変化であり得る。したがって、光学サブシステムは、蛍光偏光（ＦＰ）を測定するためにアセンブルされる。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「蛍光偏光（ＦＰ）」という用語は、蛍光分子が偏光光によって励起されたときに、分子が励起と発光との間で静止状態を維持すれば、その結果として発光する光も固定平面内で偏光した状態であろうという観測に関連する現象を意味する。蛍光標識剤に大分子化合物（例えば、タンパク質）が結合すると、蛍光分子の回転が変化して、励起光子の吸収と蛍光による光子の発光との間の時間であるその蛍光寿命中に蛍光偏光の変化が起こる。（チェコビッチ（Ｃｈｅｃｏｖｉｃｈ）ら著、「蛍光偏光  −  細胞分子生物学のための新しいツール（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９５年、第３７５巻、ｐ．２５４〜２５６（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。蛍光分子の蛍光偏光の測定は、バイオメディカル領域で集中的に利用されてきた。そうした中で、特異的生物学的化合物を決定するための多様なアッセイがＦＰ技術に基づいて開発されている。本方法は高速で感度が良くかつ正確である。
【００９７】
本発明によれば、図１６および図１７に示されるように、蛍光偏光を測定するように構成された光学サブシステム５２０が検出デバイス１００のディテクターとして含まれ得る。２つ以上の偏光フィルター（すなわち偏光子）が光路に含まれる。
【００９８】
図１６は、ＦＰシグナルを測定するための光学サブシステムの構成を例示する。検出デバイス１００の光学サブシステム５２０は、反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５に接続される。光学サブシステム５２０は、ＬＥＤハウジング（図示せず）によって保持された発光ダイオード（ＬＥＤ：ｌｉｇｈｔ  ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｄｉｏｄｅ）またはダイオードレーザ９１０（例えば、ルクセオンレベル（Ｌｕｘｅｏｎ  Ｒｅｂｅｌ）ＬＥＤのアバゴ（Ａｖａｇｏ）ＬＥＤ）、励起フィルター９２０および励起偏光フィルター９３０を含む励起光路と、発光フィルター９４０、任意選択的なビームスプリッター９７０、発光偏光フィルターまたは膜９６０の対およびフォトダイオードまたは光電子増倍管（ＰＭＴ：ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  ｔｕｂｅ）（フォトディテクター）９５０の対を含む発光光路とを含む。励起光路および発光光路は、カップ蓋アセンブリー２１０またはカップ体２２０内の反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５にアライメントされる。励起光路および発光光路の両方は、ビーム整形光学素子とコリメーション光学素子とを含有する。
【００９９】
ＬＥＤまたはダイオードレーザ９１０は、励起フィルター９２０を通してシグナリングポリヌクレオチドのフルオロフォアを励起するのに適切な励起波長の光を提供する。ＬＥＤは、さまざまな形状（例えば、バルブまたはプレート）を有し得る。この光は、次いで励起偏光フィルター９３０を透過することによって平面偏光される。得られた平面偏光励起光は、反応チャンバー２２３および任意選択的な対照チャンバー２２５内に方向付けられる。光ＬＥＤまたはダイオードレーザ光は、鉛直方向または水平方向のいずれかの方向に偏光される。フルオロフォアプローブ化検出剤が励起され、蛍光光は、再放出され、発光フィルター９４０、任意選択的なビームスプリッター９７０および発光偏光フィルターまたは膜９６０を逐次的に透過し、フォトディテクター９５０によって検出される。発光フィルター９４０は、フォトディテクター９５０による検出のために反応チャンバー２２３から発せられた蛍光のうち、対象の波長のみの透過を可能にし、検出前に光散乱および非特異的蛍光を遮断する。発光偏光フィルターまたは膜９６０およびフォトダイオードまたは光電子増倍管（ＰＭＴ）（フォトディテクター）９５０の対は、互いに９０°の角度で配置される。発光偏光フィルターまたは膜９６０の対は、フォトディテクター９５０のそれぞれに対して反応チャンバー２２３から再放出された光を反対の向きに偏光する。代替的に、ビームスプリッター９７０は、発光光の検出前に発光光路に挿入され得る。ディテクター（例えば、分光計およびカメラ）からのシグナルは、デジタルシグナルに変換され得るか、またはアナログシグナルとして処理され得る。また、シグナルに対応するアレルゲンの量は、ユーザインターフェーススクリーンとして機能する対応する表示ウィンドウ６０（図示せず、図１ｂを参照されたい）に示される。
【０１００】
図１７に示される代替構成では、ＦＰ測定用の光学サブシステムは、同一の光学コンポーネント：ＬＥＤハウジング（図示せず）によって保持された発光ダイオード（ＬＥＤ）またはダイオードレーザ９１０（例えば、ルクセオンレベル（Ｌｕｘｅｏｎ  Ｒｅｂｅｌ）ＬＥＤのアバゴ（Ａｖａｇｏ）ＬＥＤ）、励起フィルター９２０、励起偏光フィルター９３０、バッフル１１２０、発光フィルター９４０、発光偏光フィルターまたは膜９６０の対、フォトダイオードもしくは光電子増倍管（ＰＭＴ）（フォトディテクター）９５０の対を含む。発光偏光フィルターまたは膜９６０の対およびフォトディテクター９５０は、平行に配置される。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「偏光子または偏光フィルター」という用語は、特定の偏光の光を透過し、他の偏光の波を遮断する光学フィルター（例えば、プリズム）を意味する。それは、未確定偏光または混合偏光の光ビームを確定偏光のビーム、すなわち偏光光に変換し得る。通常使用される偏光子としては、直線偏光子および円偏光子が挙げられる。直線偏光子は、２つの一般的なカテゴリー：望ましくない偏光状態がデバイスによって吸収される吸収偏光子と、未偏光ビームが反対の偏光状態の２つのビームにスプリットされるビームスプリッティング偏光子とに分類され得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、図１７に示されるように、発光光路の２つの偏光子は直交偏光子であり得る。直交偏光子は、すべての光を排除するように透過方向が直角になるように配置された２つの直線偏光子である。
【０１０３】
光学サブシステム５２０に一体化されるＬＥＤは、アバゴ（Ａｖａｇｏ）ＬＥＤ（米国カリフォルニア州サンノゼのアバゴテクノロジーズ（Ａｖａｇｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））またはルクセオンレベル（Ｌｕｘｅｏｎ  Ｒｅｂｅｌ）ＬＥＤ（カナダ国オンタリオ州のルクセオンＬＥＤｓ（Ｌｕｘｅｏｎ  ＬＥＤｓ））であり得る。
【０１０４】
以上に記載の光学サブシステム５２０は、特定の実施形態の例示的な例である。いくつかの実施形態では、それらは、異なる構成および／または異なるコンポーネントを有し得る。いくつかの実施形態では、光学アセンブリーまたは代替光学アセンブリーは、吸光度測定アセンブリーと組み合わせて構成され得る。かかる構成では、コンポーネントのいくつか、例えば反応チャンバー、励起光源（ＬＥＤまたはダイオードレーザ）、ディテクター（例えば、フォトダイオードまたはＰＭＴ）、フィルターおよび／または他のコンポーネントは、アセンブリーによって共有され得る。
【０１０５】
図１８に示されるように、プリント回路基板（ＰＣＢ）５５０は、光学サブシステム５２０および分析チャンバー（すなわち反応チャンバー２２３）に接続される。ＰＣＢ５５０は、検出デバイス１００のサイズでコンパクトに構成され得ると同時に、試験結果を表示するのに十分な空間を提供し得る。
【０１０６】
したがって、試験結果は、バックライトアイコン、ＬＥＤもしくはＬＣＤスクリーン、ＯＬＥＤ、セグメントディスプレイまたは付属モバイルフォンアプリケーションで表示され得る。ユーザは、サンプルが処理中であることを示すインジケータ、サンプルが完全に処理されたことを示すインジケータ（全タンパク質インジケータ）および試験の結果を見ることができる。ユーザは、電池の状態およびどのような種類のカートリッジがデバイスに配置されたか（カートリッジまたはＬＥＤアセンブリー上のバーコード）も見ることができる。例えば、試験の結果は、１）ｐｐｍまたはｍｇでの実際の数、または２）あり／なしのバイナリー結果、または３）リスク分析  −  高／中／低または高／低、存在のリスク、または４）１ｐｐｍ未満／１〜１０ｐｐｍ／１０ｐｐｍ超のｐｐｍ範囲、または５）１ｍｇ未満／１〜１０ｍｇ／１０ｍｇ超のｍｇ範囲として表示されるであろう。結果は、数字、色、アイコンおよび／または文字としても表示され得る。本発明によれば、検出デバイス１００はまた、他の特徴部、例えば電源を提供するための手段およびプロセスの制御を提供するための手段を含み得る。いくつかの実施形態では、モータ、マイクロポンプおよび／またはギアトレインもしくはドライブを電源に接続するために１つ以上のスイッチが提供される。スイッチは、電池に接続しかつ電池への接続を解除することにより、検出デバイスのオンおよびオフを切り替えることができる単純なマイクロスイッチであり得る。
【０１０７】
電源５６０は、ＬｉイオンＡＡ式電池または小型メディカルデバイスをサポートするのに好適な任意の市販の電池、例えばリノ（Ｒｈｉｎｏ）６１０電池、ターンティジナノテック（Ｔｕｒｎｔｉｇｙ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ）高放電可能ＬｉＰｏ電池またはペンタックス（Ｐｅｎｔａｘ）Ｄ−Ｌ１６３電池であり得る。
本発明の検出剤
アレルゲンタンパク質を特異的に認識する分子、例えば抗体、核酸分子（例えば、アプタマー）および本発明者らによって開発されたＳＰＮは、本発明に使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明は、アレルゲンに特異的に結合するアプタマーに由来するシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）をさらに提供する。ＳＰＮは、核酸配列の一方の末端、すなわち５’末端または３’末端においてフルオロフォアマーカで標識され得る。
アプタマー
多様な市販の分析方法がアレルゲン検出のために開発されてきたが、そのほとんどは抗体ベースの免疫アッセイに依拠する。アレルゲン検出用の検出剤としての抗体は、大きい特異性を生成した。しかしながら、免疫アッセイは、時間がかかり、試験結果を解読するために熟練者を必要とし、小型化が困難であり、かつ十分に標準化されていない。さらに、イムノアッセイ法は、多くの場合、マトリックスおよび交差反応性に起因することが多いフォールスポジティブ結果を引き起こす。食品安全管理におけるアプタマーベースの分析に関するより最近のレビューの１つによると、この群の成分に対するアプタマーの選択が新たに行われていることがさらに示唆された（アマヤ−ゴンザレス（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら著、センサーズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ）、２０１３年、第１３巻、ｐ．１６２９２〜１６３１１（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、「アプタマー」という用語は、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的、ならびに細胞、組織および生物に結合するようにインビトロ選択の繰返しラウンドまたは均等にＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）によって工学操作された明確な三次元構造にフォールディングされるクラスの低分子一本鎖核酸種を意味する。標的分子に対する結合特異性および高親和性、周囲温度における感度および再現性、比較的低い製造コスト、ならびに任意のタンパク質を認識し得るアプタマーコア配列の開発可能性は、本明細書に記載の検出デバイスのセンサーに有効であるが依然として簡単である検出アッセイを保証する。
【０１０９】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）プロセス（本明細書で以下に記載される）の反復法を用いて、本質的に任意の分子標的（またはその一部分）に対するアプタマーを生成することができるため、検出剤のコア／結合配列を提供するのに特に好適である。かかるアプタマーは、その標的に対して高い親和性および結合特異性を有する。本発明者らは、コア／結合配列としてアプタマーを用いてシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）（以下に本明細書で詳細に説明する）を生成することにより、各種レポータ分子への便利な結合が可能になることを認識した。アプタマーコア／結合配列に基づくシグナリングポリヌクレオチドの比較的低い製造コストは、生体分子センサーのための簡単であるが依然として有効である検出アッセイの開発の目的にも有利である。本発明者らは、シグナリングポリヌクレオチドなどのアプタマーベースのディテクター配列を用いて各種マトリックスの食品製品中のアレルゲン検出を便利に行えることを認識した。これは、食品の安全性を確保するために、周囲温度において高い感度および再現性で繰返し使用され得る簡単なポータブルセンサーに使用するのに特に好適である。
【０１１０】
最近のレビューには、食品の安全性を確保するために病原体、アレルゲン、不純物、毒素および他の禁止汚染物質をコントロールするための、アプタマーを用いて開発された分析ストラテジーが記載されている（アマヤ−ゴンザレス（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら著、アプタマーベースの分析：食品安全管理のための有望な代替手段（Ａｐｔａｍｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｆｏｏｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）、センサーズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ）、２０１３、年、第１３巻、ｐ．１６２９２−１６３１１）、アマヤ−ゴンザレス（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら著、セリアック病トリガー疎水性タンパク質に結合するアプタマー：感度の良いグルテン検出システム（Ａｐｔａｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｏｅｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｇｌｕｔｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、２０１４年、第８６巻、第５号、ｐ．２７３３〜２７３９（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。グルテンの検出方法は、アマヤ−ゴンザレス（Ａｍａｙａ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ）らの国際出願第ＰＣＴ／スペイン特許出願公開第２０１３／０００１３３号明細書（２０１３年６月２８日）にも記載されている（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１１】
限定されるものではないが、例として、アナフィラキシー毒性アレルゲンのβ−コングルチン（Ｌｕｐ  ａｎ  １）に特異的な一本鎖ＤＮＡアプタマーのインビトロ選択のプロセスが報告されている（ナダル（Ｎａｄａｌ）ら著、「Ｌｕｐ  ａｎ  １食物アレルゲンに対するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ）」、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、２０１２年、第７巻、第４号、ｅ３５２５３（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。簡潔に述べると、ルーピン由来のβ−コングルチンサブユニットを精製して磁気ビーズに化学架橋した。ペプチドマスフィンガープリンティングを用いてビーズの表面上のβ−コングルチンの存在を保証した。１０１４の集団多様度を有するＤＮＡライブラリープールを、ホスホロチオエート化フォワードプライマーおよびＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを用いて増幅し、一本鎖９３ｍｅｒＤＮＡ配列を生成した。ライブラリープールをタンパク質コンジュゲート磁気ビーズと共にインキュベートした。ＰＣＲを用いてＳＥＬＥＸの各ラウンドをモニターし、タンパク質コンジュゲートビーズから遊離されたＤＮＡの量を、非コンジュゲートビーズから得られるものと比較した。酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓｓａｙ）および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて進化をモニターした。ＳＥＬＥＸの１５ラウンド後、富化ＤＮＡをクローニングし、シーケンスし、コンセンサスモチーフを同定し、このモチーフの親和性および特異性を評価し、その二次構造を予測した。得られたアプタマーをβ−コングルチンルーピンアレルゲンの検出および定量に関して競合ＥＬＯＮＡを用いて評価した。そのため、３．６×１０−７のＫＤを有する元の９３ｍｅｒを選択して、１．７×１０−９のＫＤを有する１１ｍｅｒにトランケートした（ナダル（Ｎａｄａｌ）ら著、「Ｌｕｐ  ａｎ  １（β−コングルチン）に対する高親和性１１ｍｅｒＤＮＡアプタマーのプローブ化（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  １１−ｍｅｒ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｌｕｐ  ａｎ  １（β−ｃｏｎｇｌｕｔｉｎ））」、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、２０１３年、第４０５巻、ｐ．９３４３〜９３４９（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。このトランケート１１ｍｅｒはグアニンリッチであり、グアニン間のフーグスティーン型水素結合により、およびテトラド間に位置するカチオンとの相互作用により安定化された、スタックグアニンテトラドで構成されたＧ四本鎖構造にフォールディングされると予測される。各モノマーアプタマーをドナー／アクセプター部分によってフランキングしたトランケート１１ｍｅｒ抗β−コングルチンアプタマーの高親和性二量体形を用いて、Ｌｕｐ  ａｎ  １の迅速で感度の良い検出に関して、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を活用する感度の良い方法が最近���告された。標的の不在下の二量体形は、励起フルオロフォアから近接する第２のフルオロフォアへのＦＲＥＴによって蛍光発光を生じる。しかしながら、β−コングルチンを添加すると特異的相互作用によって二アプタマー構造が変化して蛍光発光の増加をもたらす。本方法は、きわめて特異的で感度が良く、１５０ｐＭの検出限界を有し、室温においてわずか１分で食材中の毒性β−コングルチンサブユニットを直接検出するのに有効なツールを提供する（マイラル（Ｍａｉｒａｌ）ら著、「選択性のある感度の良いＬｕｐ  ａｎ  １アレルゲン検出のためのＦＲＥＴベースのダイマーアプタマープローブ（ＦＲＥＴ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｐｔａｍｅｒ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」、バイオセンサーズ・アンド・バイオエレクトロニクス（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）、２０１４年、第５４巻、ｐ．２０７〜２１０（それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１２】
核酸アプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、通常、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的、ならびに細胞、組織および生物に結合するようにインビトロ選択の繰返しラウンドまたは均等にＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）によって工学操作される。核酸アプタマーは、典型的なワトソン・クリック塩基対合以外の相互作用によって分子への特異的結合親和性を有する。核酸アプタマーは、ファージディスプレイまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって生成されたペプチドのように、選択された標的に特異的に結合可能であり、かつ結合を通してその標的の機能能力をブロックする。
【０１１３】
多くの場合に「化学抗体」と呼ばれるアプタマーは、抗体に類似した特徴を有する。典型的な核酸アプタマーは、約１０〜１５ｋＤａのサイズ（２０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的に少なくともナノモル親和性で結合し、かつ関連性の高い標的を識別する。
【０１１４】
アプタマーは、１価または多価のいずれかであり得る。アプタマーは、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、より高次のマルチマーであり得る。個別のアプタマーモノマーは、結合されてマルチマーアプタマー融合分子を形成し得る。限定されるものではないが、例として、結合オリゴヌクレオチド（すなわちリンカー）は、ダイマーアプタマーを形成するためにランダムアプタマーの５’アーム領域および３’アーム領域の両方に相補的な配列を含有するように設計され得る。トリマーまたはテトラマーのアプタマーでは、低分子トリマーまたはテトラマー（すなわちホリデイジャンクション様）ＤＮＡナノ構造は、ランダムアプタマーの３’アーム領域に相補的な配列を含むように工学操作されるであろうため、ハイブリダイゼーションを通してマルチマーアプタマー融合を生成する。加えて、３〜５または５〜１０ｄＴリッチなヌクレオチドをアプタマー結合モチーフ間の一本鎖領域としてリンカーポリヌクレオチドに工学操作によって導入し得るため、多重アプタマーの可撓性および自由度を提供することにより、細胞のリガンドまたはレセプターに配位してそれとの多価相互作用に相乗効果を示す。
【０１１５】
代替的に、マルチマーアプタマーは、ビオチン化アプタマーとストレプトアビジンとを混合することによって形成することもできる。
本明細書で用いられる場合、「マルチマーアプタマー」または「多価アプタマー」という用語は、モノマー単位のそれぞれがそれ自体でアプタマーであり得る複数のモノマー単位を含むアプタマーを意味する。多価アプタマーは多価結合特性を有する。マルチマーアプタマーは、ホモマルチマーまたはヘテロマルチマーであり得る。「ホモマルチマー」という用語は、同類の多重結合ユニットを含むマルチマーアプタマーを意味する。すなわち、各ユニットは、同一の標的分子の同一の結合部位に結合する。「ヘテロマルチマー」という用語は、異種の多重結合ユニットを含むマルチマーアプタマーを意味する。すなわち、各結合ユニットは、同一の標的分子の異なる結合部位に結合するか、または各結合ユニットは、異なる標的分子の結合部位に結合する。そのため、ヘテロマルチマーは、１つの標的分子の異なる結合部位に結合するマルチマーアプタマーまたは異なる標的分子に結合するマルチマーアプタマーを意味し得る。異なる標的分子に結合するヘテロマルチマーは、多重特異的マルチマーとも呼ばれ得る。
【０１１６】
核酸アプタマーは、一連の結合されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。こうしたポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと呼ばれる。本発明の例示的な核酸分子またはポリヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、Ｄ−またはＬ−核酸、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β−Ｄ−リボ構成を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ構成を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−ＬＮＡおよび２’−アミノ官能基化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含むＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドが挙げられる。
【０１１７】
当業者は、「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語が、発現されるかまたは天然に見出されるＲＮＡ分子だけでなく、１つ以上のリボヌクレオチドを含むＲＮＡのアナログおよび誘導体／本明細書に記載のまたは当技術分野で公知のリボヌクレオシドアナログまたは誘導体を包含することを認識するであろう。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基とリボース糖とを含み、「リボヌクレオチド」は、１、２または３個のリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書で用いられる場合、均等であると考えることができる。ＲＮＡは、核酸塩基構造、リボフラノシル環またはリボースホスフェート骨格において改変され得る。
【０１１８】
核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸と混合であり得る。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、またはリボ核酸とデオキシリボ核酸との混合であり得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、化学修飾は、糖位置での核酸の化学置換、ホスフェート位置での化学置換および塩基位置での化学置換から選択される。他の実施形態では、化学修飾は、修飾ヌクレオチドの取込み、３’キャッピング、高分子量非免疫原性化合物へのコンジュゲーション、親油性化合物へのコンジュゲーションおよびホスフェート骨格へのホスホロチオエートの取込みから選択される。好ましい実施形態では、高分子量非免疫原性化合物は、ポリアルキレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。他の分子、通常、薬剤または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合のプロセスは、ＰＥＧ化として知られる。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体を標的分子と共にインキュベートすることによってルーチンで達成される。薬剤または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合により、宿主の免疫系から作用剤をマスキングできるため、免疫原性および抗原性の低減が提供され、作用剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させることにより、腎クリアランスを低減させてその循環時間を延長することができる。ＰＥＧ化は、疎水性の薬剤およびタンパク質に水への溶解性を提供することもできる。
【０１２０】
他の好ましい実施形態では、３’キャップは、反転デオキシチミジンキャップである。
いくつかの実施形態では、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換のアルキルである）によって置き換えられた核酸アプタマーが提供される。結合基は、−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−の結合を通して隣接ヌクレオチドに装着され得る。核酸アプタマー中のすべての結合が同一である必要はない。
【０１２１】
限定されるものではないが、例として、核酸アプタマーは、Ｄ−リボースまたはＬ−リボースの核酸残基を含み得、かつ少なくとも１つの修飾リボヌクレオシド、例えば、限定されるものではないが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、反転デオキシリボヌクレオシドもしくは反転リボヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−フルオロ−修飾ヌクレオシド、２’−アミノ−修飾ヌクレオシド、２’−アルキル−修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデート、または非天然塩基を含むヌクレオシド、あるいはそれらの任意の組合せも含み得る。代替的に、核酸アプタマーは、少なくとも２個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個またはそれを超える分子の全長までの修飾リボヌクレオシドを含み得る。修飾は、核酸分子中のかかる複数の修飾デオキシリボヌクレオシドまたは修飾リボヌクレオシドのそれぞれに関して同一である必要はない。
【０１２２】
核酸ベースの検出剤は、核酸塩基（当技術分野では多くの場合に単に「塩基」と呼ばれる）の修飾または置換を含み得る。本明細書で用いられる場合、「非修飾」または「天然」の核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、他の合成および天然の核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−ダアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアアデニンが挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、「生化学、バイオテクノロジーおよび医学における修飾ヌクレオシド（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ヘルデウィジン（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ），Ｐ．編、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年に開示されたもの、「高分子科学工業のコンサイス百科事典（Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、ｐ．８５８−８５９、クロシュビッツ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ），Ｊ．Ｌら編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９０年に開示されたもの、エングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ）ら著、アンゲバンテ・ヘミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）、１９９１年、第３０巻、ｐ．６１３に開示されたもの、およびサングビ（Ｓａｎｇｈｖｉ），Ｙ  Ｓ．著、第１５章、「ｄｓＲＮＡの研究および応用（ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．およびレブルー（Ｌｅｂｌｅｕ），Ｂ．編、ｐ．２８９〜３０２、ＣＲＣプレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年に開示されたものが挙げられる。
【０１２３】
アプタマーに好適なヌクレオチド長は、約１５〜約１２０ヌクレオチド（ｎｔ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の範囲内であり得、種々の他の好ましい実施形態では、１５〜３０ｎｔ、２０〜２５ｎｔ、５０〜１２０ｎｔ、３０〜１００ｎｔ、３０〜６０ｎｔ、２５〜７０ｎｔ、２５〜６０ｎｔ、４０〜６０ｎｔ、２５〜４０ｎｔ、３０〜４０ｎｔ、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０ｎｔのいずれか、または４０〜７０ｎｔの長さであり得る。しかしながら、配列は、本明細書に記載の距離でアプタマーと２つの標的との相互作用に適合できるように十分な柔軟性を持たせて設計され得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、核酸アプタマーは、二本鎖特性の１つ以上の領域を含む。かかる二本鎖領域は、第２またはそれ以降のアプタマーまたはオリゴヌクレオチド分子との内部自己相補性または相補性から生じ得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、４〜１２、４〜１０、４〜８塩基対長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、５、６、７、８、９、１０、１１または１２塩基対であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、ステム領域を形成し得る。二本鎖特性を有するかかる伸長ステム領域は、核酸アプタマーを安定化させるように機能し得る。本明細書で用いられる場合、「二本鎖特性」という用語は、２つの核酸分子の任意の長さにわたり、それらの配列が長さの５０パーセント超の塩基対合（標準的または非標準的）を形成することを意味する。
【０１２５】
アプタマーは、ヌクレアーゼ活性および他の酵素活性からの保護を提供するようにさらに修飾され得る。アプタマー配列は、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって修飾され得る。例えば、ホスホロチオエートは、骨格中に組み込まれ得、５’−修飾ピリミジンは、ＤＮＡアプタマーのｓｓＤＮＡの５’末端に含まれ得る。ＲＮＡアプタマーでは、リボース骨格の２’−ＯＨ基の置換、例えば２’−デオキシ−ＮＴＰまたは２’−フルオロ−ＮＴＰなどの修飾ヌクレオチドは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ突然変異体を用いてＲＮＡ分子に組み込まれ得る。ヌクレアーゼに対するこれらの修飾アプタマーの耐性は、それらを精製ヌクレアーゼまたはマウス血清由来ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートすることによって試験され得、アプタマーの完全性は、ゲル電気泳動によって分析され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、かかる修飾核酸アプタマーは、全体が修飾ヌクレオチドから合成され得るか、または修飾ヌクレオチドのサブセットから合成され得る。修飾は同一であり得るかまたは異なり得る。すべてのヌクレオチドは、修飾され得、かつ同一の修飾を含み得る。すべてのヌクレオチドは、修飾され得るが、異なる修飾を含み得る。例えば、同一の塩基を含有するすべてのヌクレオチドは、１つのタイプの修飾を有し得る。一方、他の塩基を含有するヌクレオチドは、異なるタイプの修飾を有し得る。例えば、すべてのプリンヌクレオチドは、１つのタイプの修飾（または非修飾）を有し得る。一方、すべてのピリミジンヌクレオチドは、他の異なるタイプの修飾（または非修飾）を有し得る。こうして、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのライブラリーは、本明細書に開示される修飾の任意の組合せを用いて生成される。
【０１２７】
本発明に従って、ＳＥＬＥＸ法を用いて、８つの主要食物アレルゲン（すなわち、カシュー、卵、乳、ラッカセイ、グルテン、サカナ、甲殻動物およびダイズ）に結合するコア結合アプタマーを選択した。標的アレルゲンを特異的に認識し得る配列を有するいくつかのアプタマーを選択し、選択されたアプタマーの核酸配列をさらに改変してシグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）を生成した。高い選択性、特異性および安定性を有するアプタマーを選択して、検出剤としてさらに標識する。８つの主要アレルゲンに対して選択されたアプタマーの配列は、表１に列挙される。例えば、１５０１ＲｉｂｏＳＰＮ（配列番号１）は、カシューに結合するアプタマーの１つの全長配列である。全長配列は、スクリーニングに使用したプライマーとアプタマー（配列番号２）のコア結合配列とを含む。コア結合配列は、本明細書の以下に考察されるように、カシューに特異的なシグナリングポリヌクレオチドを生成するようさらに改変されるであろう。
シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）
本発明によれば、シグナリングポリヌクレオチドは、標的アレルゲン分子に特異的に結合する選択されたアプタマーから開発され得る。ポリヌクレオチド配列は、分子標的に高い親和性および特異性で結合するときに検出可能である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本発明のＳＰＮは、標的アレルゲン分子に対するＳＰＮの特異性および親和性を決定するコア結合配列を含む。選択されたアプタマーの全長配列は、標的アレルゲンに対する結合配列に影響を及ぼすことなく、アプタマー選択に使用したプライマーを欠失させることによって短縮され得る。また、各アプタマーの結合（コア）配列に影響を及ぼすことなく、追加のヌクレオチドが５’末端および／または３’末端に付加され得る。かかるＳＰＮの３Ｄ構造は、標準的構造予測ソフトウェアを用いて予測される。得られたポリヌクレオチドは、単一の開放構造を形成し得る。いくつかの態様では、５’末端および３’末端は、近接ループ構造を形成して両方の末端を一体化させる必要がない。他の態様では、末端に付加されるヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの安定性を向上させ得、かつ蛍光色素の結合を促進し得る。追加のヌクレオチドの長さおよび配列は、シグナリングポリヌクレオチドのコア結合配列との関連で変化し得る。通常のアレルゲンに対するアプタマーから生成されたＳＰＮは、表１に列挙される。例えば、１５０１−ＳＰＮ＿Ａ（配列番号３）および１５０１ＳＰＮ＿Ｂ（配列番号４）は、アプタマー１５０１ＲｉｂｏＳＰＮ（配列番号１）に由来する２つのポリヌクレオチドである。
【０１２９】
【表１】
2019511715.tif 000003
【０１３０】
2019511715.tif 000004
【０１３１】
2019511715.tif 000005
【０１３２】
2019511715.tif 000006
【０１３３】
2019511715.tif 000007
【０１３４】
2019511715.tif 000008
【０１３５】
2019511715.tif 000009
【０１３６】
2019511715.tif 000010
【０１３７】
2019511715.tif 000011
【０１３８】
2019511715.tif 000012
【０１３９】
2019511715.tif 000013
【０１４０】
2019511715.tif 000014
【０１４１】
2019511715.tif 000015
【０１４２】
2019511715.tif 000016
【０１４３】
2019511715.tif 000017
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本発明のＳＰＮは、文献に開示された元のアレルゲン結合アプタマーを改変することによって生成され得る。特異的アレルゲンに対する親アプタマー配列は、アプタマーの結合特異性および親和性を変化させることなく最短配列を含むように改変される。既知の親配列から改変されたいくつかの例示的なＳＰＮは、表２に列挙される。
【０１４５】
【表２】
2019511715.tif 000018
【０１４６】
一実施形態では、本発明のシグナリングポリヌクレオチドは、蛍光マーカ、例えば蛍光色素でプローブ化され得る。蛍光色素は、ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに付加され得る。いくつかの態様では、蛍光色素は、限定されるものではないが、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン（例えば、オレゴングリーン４８８染料、オレゴングリーン５１４染料）、エオシン、テキサスレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、スクアラインおよび誘導体、例えばＳｅｔａ（例えば、Ｓｅｔａ−ＡＰＣ−７８０、Ｓｅｔａ−ＰｅｒＣＰ−６８０、Ｓｅｔａ−５５５−ＮＨＳ、Ｓｅｔａ−５５５−アジド、Ｓｅｔａ−５５５−ＤＢＣＯ、Ｓｅｔａ−５８０−ＮＨＳおよびＳｅｔａ−Ｒ−ＰＥ−６７０）、ＳｅＴａｕ（例えば、ＳｅＴａｕ−３８０−ＮＨＳ、ＳｅＴａｕ−４２５−ＮＨＳ、ＳｅＴａｕ−６４７−ＮＨＳおよびＳｅＴａｕ−４０５−ＮＨＳ）およびスクエア（Ｓｑｕａｒｅ）染料、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾール、アントラキノン（例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫオレンジ）、ピレンおよび誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン、ボディパイＴＭＲ染料、ボディパイＦＬ染料、テトラメチルローダミン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ＮＢＤ、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、レッド６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｘローダミン、リサミンローダミンＢ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ならびにアレキサフルオル染料（例えば、アレキサフルオル４８８染料およびアレキサフルオル５９４染料）を含み得る。
【０１４７】
他の実施形態では、２つ以上のフルオロフォア分子がシグナリングポリヌクレオチドの同一の末端に付加され得る。限定されるものではないが、例として、シグナリングポリヌクレオチドの５’末端または３’末端のいずれかに２つのＦＡＭ（フルオレセイン）分子が逐次的に付加され得る。さらに他の実施形態では、シグナリングポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の両方にフルオロフォア分子が付加され得る。
検出剤
本発明の検出剤は、本明細書で考察されるＳＰＮを含む。本発明によれば、理論により拘束されることを望むものではないが、検出剤は、アレルゲンに完全にまたは部分的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本発明の検出剤は、アレルゲン分子に特異的に結合するコア配列として１つ以上のアプタマーを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明の検出剤は、検出可能なプローブ、例えば種々の有機低分子、無機化合物、ナノ粒子、量子ドット、酵素または酵素基質、蛍光材料、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン）、化学発光材料、放射性材料（例えば、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈまたは９９ｍＴｃ（例えば、ペルテクネテート（テクネテート（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４））、コントラスト剤（例えば、金（例えば、金ナノ粒子）およびブチレート量子ドット）を含み得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本発明の検出剤は、コンジュゲートをさらに含み得る。いくつかの態様では、検出剤は、他のポリヌクレオチド、染料、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば糖タンパク質またはペプチド、例えば共リガンドに対して特異的親和性を有する分子または抗体、例えば癌細胞、内皮細胞、骨細胞などの指定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモンレセプター、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子または薬剤にコンジュゲートされ得る。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態によれば、検出剤の変異体が提供される。いくつかの態様では、変異体はポリヌクレオチド変異体である。本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド変異体」という用語は、そのヌクレオチド配列が天然配列または参照配列と異なる分子を意味する。核酸配列変異体は、天然配列または参照配列と比較して、ヌクレオチド配列中の特定の位置に置換、欠失および／または挿入を有し得る。通常、変異体は、天然配列または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性（相同性）を有するであろう。好ましくは、天然配列または参照配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性（相同）であろう。「天然」配列または「参照」配列は、野生型配列と混同すべきではない。本明細書で用いられる場合、天然配列または参照配列は、比較され得る元の分子を参照する相対語である。「天然」または「参照」の配列または分子は、野生型（天然に見出されるその配列）を表し得るが、野生型配列である必要はない。いくつかの例では、天然配列または参照配列は、本明細書に開示されるシグナリングポリヌクレオチドの配列、例えば表１および表２に列挙されたラッカセイに特異的なＳＰＮであり得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、検出剤の誘導体も提供される。本明細書で用いられる場合、「誘導体」という用語は、「変異体」という用語と同義的に用いられ、参照分子と比べて何らかの改変または変化が加えられた分子を意味する。本明細書で参照される「誘導体」という用語は、有機タンパク質または非タンパク質の誘導体化剤による参照ポリヌクレオチドの修飾を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本発明の検出剤は、アレルゲンに対する抗体などの他の検出分子と組み合わせて使用され得る。
本発明のＳＰＮおよび検出剤は、検出分子とアレルゲンとの相互作用に有利な溶液中で配合され得る。かかる配合物は、任意の許容可能な容器クロージャを用いて、使用のために薬学的または診断的に許容可能なさまざまな容器にパッケージングされ得、許容可能な容器の例としては、限定されるものではないが、アンプルおよび前充填シリンジ、カートリッジなどが挙げられる。代替的に、配合物は、その適用前に２つのコンパートメントを一緒に混合し得るように、アドミックスバッグの１つのコンパートメントに凍結乾燥アプタマーを含み得、かつアドミックスバッグの個別のコンパートメントに許容可能な溶媒を含み得る。液体の形態の配合物は、冷蔵環境に貯蔵され得る。代替的に、凍結乾燥配合物は、室温で貯蔵され得るか、または冷蔵され得るか、または凍結され得る。好ましくは、配合物は無菌であり得る。本明細書で用いられる「無菌」配合物とは、無菌状態にした後で微生物汚染に暴露されていない配合物を意味する。すなわち、無菌組成物を保持する容器は損傷していない。無菌組成物は、一般に、米国食品医薬品局の現在の適正製造規範（「ｃＧＭＰ」）の規制に準拠して医薬製造業者によって調製される。いくつかの実施形態では、本発明の検出剤および組成物は、他の成分または試薬と組み合わされ得るか、あるいはキットのコンポーネントとしてまたは商業販売用もしくは配送用の他の小売り製品として調製され得る。キットは、投与および／またはキットの使用に関する説明書と共に化合物または組成物を含むであろう。キットはまた、以下：シリンジ、バッグまたはボトルの１つ以上を含み得る。
標的−アレルゲンタンパク質
いくつかの実施形態では、本発明の検出システムおよびデバイス、アプタマー、ＳＰＮならびに検出剤は、アレルゲンタンパク質またはその変異体の存在および／または不在を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態では、アプタマー、ＳＰＮおよび検出剤は、タンパク質またはそれ自体がアレルゲンに関連した他のバイオ分子に結合または会合するように設計され得る。アレルゲンとしては、食品、環境または非ヒトタンパク質、例えば家庭内ペットの鱗屑に由来するものが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、本発明の検出システムおよびデバイスは、例えば、試験サンプル中のアレルゲンタンパク質の存在および／または不在を検出する検出剤として本発明のＳＰＮを用いて、アレルゲン検出試験を実施するために使用され得る。
【０１５３】
食物アレルゲンとしては、限定されるものではないが、マメ科植物、例えばラッカセイ、エンドウ、ヒラマメおよびインゲンならびにマメ科近縁植物のルーピン、木の実、例えばアーモンド、カシュー、クルミ、ブラジルナッツ、ハシバミ／ヘーゼルナッツ、ペカン、ピスタシオ、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピンナッツ、ココヤシ、ギンナン、レイシナッツ、マカダミアナッツ、ナンガイナッツおよびパインナッツ、卵、サカナ、シェルフィッシュ、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、シュリンプおよびプローン、軟体動物、例えばクラム、カキ、イガイおよびスカラップ、乳、ダイズ、コムギ、グルテン、トウモロコシ、肉、例えば牛肉、豚肉、羊肉および鶏肉、ゼラチン、スルフィット、種子、例えばゴマ、ヒマワリおよびポピーシードならびにスパイス、例えばコリアンダー、ニンニクおよびカラシナ、果実、野菜、例えばセロリおよびコメに含まれるタンパク質が挙げられる。例えば、ルーピン、ヒマワリ、ケシなどの植物の種子は、種子入りパンなどの食品に使用される可能性があるか、または粉砕して粉にすることにより、パンもしくはペストリーの製造に使用される可能性がある。
【０１５４】
シーフードアレルゲンは、典型的には、タラのパルブアルブミンおよび甲殻動物のトロポミオシンを含む筋肉タンパク質の群に属し、アルギニンキナーゼおよびミオシン軽鎖などの他のアレルゲンもアレルゲン性に重要な役割を果たし得る。トロポミオシンは、甲殻動物と軟体動物との間の分子的および臨床的な交差反応性の原因となる主要なアレルゲンであり、ハウスダストダニおよび昆虫などの他の吸入される無脊椎動物が原因となるアレルゲンであると考えられる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、アレルゲンは食物アレルゲンである。食品に関連するアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、ブラインシュリンプ（Ａｒｔ  ｆｒ５）、カニ（Ｃｈａ  ｆ１）、ノースシーシュリンプ（Ｃｒａ  ｃ１、Ｃｒａ  ｃ２、Ｃｒａ  ｃ４、Ｃｒａ  ｃ５、Ｃｒａ  ｃ６、Ｃｒａ  ｃ８）、アメリカンロブスター（Ｈｏｍ  ａ１、Ｈｏｍ  ａ３、Ｈｏｍ  ａ６）、ホワイトシュリンプ（Ｌｉｔ  ｖ１、Ｌｉｔ  ｖ２、Ｌｉｔ  ｖ３、Ｌｉｔ  ｖ４）、ジャイアントフレッシュウォータプローン（Ｍａｃ  ｒ１）、シュリンプ（Ｍｅｔ  ｅ１、Ｐｅｎ  ａ１、Ｐｅｎ  ｉ１）、ノーザンシュリンプ（Ｐａｎ  ｂ１）、スピニーロブスター（Ｐａｎ  ｓ１）、ブラックタイガーシュリンプ（Ｐｅｎ  ｍ１、Ｐｅｎ  ｍ２、Ｐｅｎ  ｍ３、Ｐｅｎ  ｍ４、Ｐｅｎ  ｍ６）、ナロウクロウドクレイフィッシュ（Ｐｏｎ  ｉ４、Ｐｏｎ  ｉ７）、ブルースイマークラブ（Ｐｏｒ  ｐ１）、家畜のウシ（Ｂｏｓ  ｄ４、Ｂｏｓ  ｄ５、Ｂｏｓ  ｄ６、Ｂｏｓ  ｄ７、Ｂｏｓ  ｄ８、Ｂｏｓ  ｄ９、Ｂｏｓ  ｄ１０、Ｂｏｓ  ｄ１１、Ｂｏｓ  ｄ１２）、大西洋ニシン（Ｃｌｕ  ｈ１）、コモンカープ（Ｃｙｐ  ｃ１）、バルト海タラ（Ｇａｄ  ｃ１）、大西洋タラ（Ｇａｄ  ｍ１、Ｇａｄ  ｍ２、Ｇａｄ  ｍ３）、タラ（Ｇａｄ  ｃ１）、ニワトリ（Ｇａｌ  ｄ１、Ｇａｌ  ｄ２、Ｇａｌ  ｄ３、Ｇａｌ  ｄ４、Ｇａｌ  ｄ５）、バラムンダ（Ｌａｔ  ｃ１）、メグリム（Ｌｅｐｉｄｏｒｈｏｍｂｕｓ  ｗｈｉｆｆｉａｇｏｎｉｓ）（Ｌｅｐ  ｗ１）、シロザケ（Ｏｎｃ  ｋ５）、大西洋サケ（Ｓａｌ  ｓ１、Ｓａｌ  ｓ２、Ｓａｌ  ｓ３）、ニジマス（Ｏｎｃ  ｍ１）、モザンビークティラピア（Ｏｒｅ  ｍ４）、食用カエル（Ｒａｎ  ｅ１、Ｒａｎ  ｅ２）、パシフィックピルチャード（Ｓａｒ  ｓａ１）、海洋パーチ（Ｓｅｂ  ｍ１）、キハダ（Ｔｈｕ  ａ１、Ｔｈｕ  ａ２、Ｔｈｕ  ａ３）、メカジキ（Ｘｉｐ  ｇ１）、アワビ（Ｈａｌ  ｍ１）、ヒメリンゴマイマイ（Ｈｅｌ  ａｓ１）、イカ（Ｔｏｄ  ｐ１）、パイナップル（Ａｎａ  ｃ１、Ａｎａ  ｃ２）、アスパラガス（Ａｓｐａ  ｏ１）、オオムギ（Ｈｏｒ  ｖ１２、Ｈｏｒ  ｖ１５、Ｈｏｒ  ｖ１６、Ｈｏｒ  ｖ１７、Ｈｏｒ  ｖ２０、Ｈｏｒ  ｖ２１）、バナナ（Ｍｕｓ  ａ１、Ｍｕｓ  ａ２、Ｍｕｓ  ａ３、Ｍｕｓ  ａ４、Ｍｕｓ  ａ５）、バナナ（Ｍｕｓｘｐ１）、イネ（Ｏｒｙ  ｓ１２）、ライムギ（Ｓｅｃ  ｃ２０）、コムギ（Ｔｒｉ  ａ１２、Ｔｒｉ  ａ１４、Ｔｒｉ  ａ１８、Ｔｒｉ  ａ１９、Ｔｒｉ  ａ２５、Ｔｒｉ  ａ２６、Ｔｒｉ  ａ３６、Ｔｒｉ  ａ３７）、メイズ（トウモロコシ）（Ｚｅａ  ｍ１４、Ｚｅａ  ｍ２５）、キウイフルーツ（Ａｃｔ  ｃ１、Ａｃｔ  ｃ２、Ａｃｔ  ｃ５、Ａｃｔ  ｃ８、Ａｃｔ  ｃ１０、Ａｃｔ  ｄ１、Ａｃｔ  ｄ２、Ａｃｔ  ｄ３、Ａｃｔ  ｄ４、Ａｃｔ  ｄ５、Ａｃｔ  ｄ６、Ａｃｔ  ｄ７、Ａｃｔ  ｄ８、Ａｃｔ  ｄ９、Ａｃｔ  ｄ１０、Ａｃｔ  ｄ１１）、カシューナッツ（Ａｎａ  ｏ１、Ａｎａ  ｏ２、Ａｎａ  ｏ３）、セロリ（Ａｐｉ  ｇ１、Ａｐｉ  ｇ２、Ａｐｉ  ｇ３、Ａｐｉ  ｇ４、Ａｐｉ  ｇ５、Ａｐｉ  ｇ６）、ラッカセイ（Ａｒａ  ｈ１、Ａｒａ  ｈ２、Ａｒａ  ｈ３、Ａｒａ  ｈ４、Ａｒａ  ｈ５、Ａｒａ  ｈ６、Ａｒａ  ｈ７、Ａｒａ  ｈ８、Ａｒａ  ｈ９、Ａｒａ  ｈ１０、Ａｒａ  ｈ１１、Ａｒａ  ｈ１２、Ａｒａ  ｈ１３）、ブラジルナッツ（Ｂｅｒ  ｅ１、Ｂｅｒ  ｅ２）、オリエンタルマスタード（Ｂｒａ  ｊ１）、ナタネ（Ｂｒａ  ｎ１）、キャベツ（Ｂｒａ  ｏ３）、カブ（Ｂｒａ  ｒ１、Ｂｒａ  ｒ２）、ピーマン（Ｃａｐ  ａｌｗ、Ｃａｐ  ａ２）、ペカン（Ｃａｒ  ｉ１、Ｃａｒ  ｉ４）、クリ（Ｃａｓ  ｓ１、Ｃａｓ  ｓ５、Ｃａｓ  ｓ８、Ｃａｓ  ｓ９）、レモン（Ｃｉｔ  Ｉ３）、タンジェリン（Ｃｉｔ  ｒ３）、スイートオレンジ（Ｃｉｔ  ｓ１、Ｃｉｔ  ｓ２、Ｃｉｔ  ｓ３）、ハシバミ（Ｃｏｒ  ａ１、Ｃｏｒ  ａ２、Ｃｏｒ  ａ８、Ｃｏｒ  ａ９、Ｃｏｒ  ａ１１、Ｃｏｒ  ａ１２、Ｃｏｒ  ａ１３、Ｃｏｒ  ａ１４）、マスクメロン（Ｃｕｃ  ｍ１、Ｃｕｃ  ｍ２、Ｃｕｃ  ｍ３）、ニンジン（Ｄａｕ  ｃ１、Ｄａｕ  ｃ４、Ｄａｕ  ｃ５）、コモンバックウィート（Ｆａｇ  ｅ２、Ｆａｇ  ｅ３）、タータリアンバックウィート（Ｆａｇ  ｔ２）、イチゴ（Ｆｒａ  ａ１、Ｆｒａ  ａ３、Ｆｒａ  ａ４）、ダイズ（Ｇｌｙ  ｍ１、Ｇｌｙ  ｍ２、Ｇｌｙ  ｍ３、Ｇｌｙ  ｍ４、Ｇｌｙ  ｍ５、Ｇｌｙ  ｍ６、Ｇｌｙ  ｍ７、Ｇｌｙ  ｍ８）、ヒマワリ（Ｈｅｌ  ａ１、Ｈｅｌ  ａ２、Ｈｅｌ  ａ３）、クロクルミ（Ｊｕｇ  ｎ１、Ｊｕｇ  ｎ２）、セイヨウグルミ（Ｊｕｇ  ｒ１、Ｊｕｇ  ｒ２、Ｊｕｇ  ｒ３、Ｊｕｇ  ｒ４）、栽培レタス（Ｌａｃ  ｓ１）、レンズマメ（Ｌｅｎ  ｃ１、Ｌｅｎ  ｃ２、Ｌｅｎ  ｃ３）、ライチ（Ｌｉｔ  ｃ１）、ホソバアオバナルーピン（ｎａｒｒｏｗ−ｌｅａｖｅｄ  ｂｌｕｅ  ｌｕｐｉｎ）（Ｌｕｐ  ａｎ１）、リンゴ（Ｍａｌ  ｄ１、Ｍａｌ  ｄ２、Ｍａｌ  ｄ３、Ｍａｌ  ｄ４）、キャッサバ（Ｍａｎ  ｅ５）、クワ（Ｍｏｒ  ｎ３）、アボカド（Ｐｅｒｓ  ａ１）、サヤインゲン（Ｐｈａ  ｖ３）、ピスタチオ（Ｐｉｓ  ｖ１、Ｐｉｓ  ｖ２、Ｐｉｓ  ｖ３、Ｐｉｓ  ｖ４、Ｐｉｓ  ｖ５）、エンドウ（Ｐｉｓ  ｓ１、Ｐｉｓ  ｓ２）、アプリコット（Ｐｒｕ  ａｒ１、Ｐｒｕ  ａｒ３）、オウトウ（Ｐｒｕ  ａｖ１、Ｐｒｕ  ａｖ２、Ｐｒｕ  ａｖ３、Ｐｒｕ  ａｖ４）、セイヨウスモモ（Ｐｒｕ  ｄ３）、アーモンド（Ｐｒｕ  ｄｕ３、Ｐｒｕ  ｄｕ４、Ｐｒｕ  ｄｕ５、Ｐｒｕ  ｄｕ６）、モモ（Ｐｒｕ  ｐ１、Ｐｒｕ  ｐ２、Ｐｒｕ  ｐ３、Ｐｒｕ  ｐ４、Ｐｒｕ  ｐ７）、ザクロ（Ｐｕｎ  ｇ１）、ナシ（Ｐｙｒ  ｃ１、Ｐｙｒ  ｃ３、Ｐｙｒ  ｃ４、Ｐｙｒ  ｃ５）、トウゴマ（Ｒｉｃ  ｃ１）、アカラズベリー（Ｒｕｂ  ｉ１、Ｒｕｂ  ｉ３）、ゴマ（Ｓｅｓ  ｉ１、Ｓｅｓ  ｉ２、Ｓｅｓ  ｉ３、Ｓｅｓ  ｉ４、Ｓｅｓ  ｉ５、Ｓｅｓ  ｉ６、Ｓｅｓ  ｉ７）、イエローマスタード（Ｓｉｎ  ａ１、Ｓｉｎ  ａ２、Ｓｉｎ  ａ３、Ｓｉｎ  ａ４）、トマト（Ｓｏｌａ  Ｉ１、Ｓｏｌａ  Ｉ２、Ｓｏｌａ  Ｉ３、Ｓｏｌａ  Ｉ４）、ジャガイモ（Ｓｏｌａ  ｔ１、Ｓｏｌａ  ｔ２、Ｓｏｌａ  ｔ３、Ｓｏｌａ  ｔ４）、グリーンビーン（Ｖｉｇ  ｒ１、Ｖｉｇ  ｒ２、Ｖｉｇ  ｒ３、Ｖｉｇ  ｒ４、Ｖｉｇ  ｒ５、Ｖｉｇ  ｒ６）、ブドウ（Ｖｉｔ  ｖ１）、ナツメ（Ｚｉｚ  ｍ１）、アナカルディウム・オクシデンタル（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）（Ａｎａ  ｏ１．０１０１、Ａｎａ  ｏ１．０１０２）、アピウム・グラヴェオレンス（Ａ���ｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）（Ａｐｉ  ｇ１．０１０１、Ａｐｉ  ｇ１．０２０１）、ダウカス・カロタ（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）（Ｄａｕ  ｃ１．０１０１、Ｄａｕ  ｃ１．０１０２、Ｄａｕ  ｃ１．０１０３、Ｄａｕ  ｃ１．０１０４、Ｄａｕ  ｃ１．０１０５、Ｄａｕ  ｃ１．０２０１）、シトラス・シネンシス（Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（Ｃｉｔ  ｓ３．０１０１、Ｃｉｔ  ｓ３．０１０２）、グリシン・マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（Ｇｌｙ  ｍ１．０１０１、Ｇｌｙ  ｍ１．０１０２、Ｇｌｙ  ｍ３．０１０１、Ｇｌｙ  ｍ３．０１０２）、レンズ・クリナリス（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）（Ｌｅｎ  ｃ１．０１０１、Ｌｅｎ  ｃ１．０１０２、Ｌｅｎ  ｃ１．０１０３）、ピサム・サティバム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｐｉｓ  ｓ１．０１０１、Ｐｉｓ  ｓ１．０１０２）、リコペルシコン・サティバム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｓａｔｉｖｕｍ）（Ｌｙｃ  ｅ２．０１０１、Ｌｙｃ  ｅ２．０１０２）、フラグリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ）（Ｆｒａ  ａ３．０１０１、Ｆｒａ  ａ３．０１０２、Ｆｒａ  ａ３．０２０１、Ｆｒａ  ａ３．０２０２、Ｆｒａ  ａ３．０２０３、Ｆｒａ  ａ３．０２０４、Ｆｒａ  ａ３．０３０１）、マルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（Ｍａｌ  ｄ１．０１０１、Ｍａｌ  ｄ１．０１０２、Ｍａｌ  ｄ１．０１０３、Ｍａｌ  ｄ１．０１０４、Ｍａｌ  ｄ１．０１０５、Ｍａｌ  ｄ１．０１０６、Ｍａｌ  ｄ１．０１０７、Ｍａｌ  ｄ１．０１０８、Ｍａｌ  ｄ１．０１０９、Ｍａｌ  ｄ１．０２０１、Ｍａｌ  ｄ１．０２０２、Ｍａｌ  ｄ１．０２０３、Ｍａｌ  ｄ１．０２０４、Ｍａｌ  ｄ１．０２０５、Ｍａｌ  ｄ１．０２０６、Ｍａｌ  ｄ１．０２０７、Ｍａｌ  ｄ１．０２０８、Ｍａｌ  ｄ１．０３０１、Ｍａｌ  ｄ１．０３０２、Ｍａｌ  ｄ１．０３０３、Ｍａｌ  ｄ１．０３０４、Ｍａｌ  ｄ１．０４０１、Ｍａｌ  ｄ１．０４０２、Ｍａｌ  ｄ１．０４０３、Ｍａｌ  ｄ３．０１０１ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０１０２ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０２０１ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０２０２ｗ、Ｍａｌ  ｄ３．０２０３ｗ、Ｍａｌ  ｄ４．０１０１、Ｍａｌ  ｄ４．０１０２、Ｍａｌ  ｄ４．０２０１、Ｍａｌ  ｄ４．０２０２、Ｍａｌ  ｄ４．０３０１、Ｍａｌ  ｄ４．０３０２）、プルヌス・アビウム（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ）（Ｐｒｕ  ａｖ１．０１０１、Ｐｒｕ  ａｖ１．０２０１、Ｐｒｕ  ａｖ１．０２０２、Ｐｒｕ  ａｖ１．０２０３）およびプルヌス・ペルシカ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ）（Ｐｒｕ  ｐ４．０１０１、Ｐｒｕ  ｐ４．０２０１）ならびにそれらの変異体が挙げられる。食品に関連するアレルゲンの名称は、ＩＵＩＳアレルゲン命名小委員会（国際免疫学会連合アレルゲン命名小委員会、イソアレルゲンおよび変異体のリストを参照されたい）に準拠して体系名で命名および列挙されている。
【０１５６】
食物アレルゲンに加えて、本発明のアプタマー、シグナリングポリヌクレオチドおよび検出剤は、大気中微粒子／アレルゲンおよび他の環境アレルゲンを検出し得る。アレルゲンを含有するサンプルは、植物（例えば、雑草、イネ科植物、木、花粉）、動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、ラット、モルモット、マウス、アレチネズミなどの哺乳動物の鱗屑、尿、唾液、血液または他の体液にみられるアレルゲン）、真菌／カビ、昆虫（例えば、刺咬昆虫、ミツバチ、アシナガバチ、スズメバチおよびユスリカ（非ヌカカ）ならびに他の昆虫、例えばイエバエ、ミバエ、ヒツジクロバエ、スクリューワームフライ、穀物ゾウムシ、カイコ、ミツバチ、非ヌカカ幼虫、ハチミツガ幼虫、ゴミムシダマシ、ゴキブリおよびチャイロコメノゴミムシダマシ（Ｔｅｎｉｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ  ｂｅｅｔｌｅ）の幼虫、クモおよびダニ、ハウスダストダニ）、ゴム（例えば、ラテックス）、金属、化学物質（例えば、薬剤、タンパク質洗浄添加剤）ならびに自己アレルゲンおよびヒト自己アレルゲン（例えば、Ｈｏｍ  ｓ１、Ｈｏｍ  ｓ２、Ｈｏｍ  ｓ３、Ｈｏｍ  ｓ４、Ｈｏｍ  ｓ５）から得られ得る（アレルゲン命名法：国際免疫学会連合アレルゲン命名小委員会、アレルゲンのリストならびにアレルゲン命名法：国際免疫学会連合アレルゲン命名小委員会、イソアレルゲンおよび変異体のリストを参照されたい）。
【０１５７】
本発明のアプタマー、シグナリングポリヌクレオチドおよび検出剤を用いて検出され得る植物由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、灰（Ｆｒａ  ｅ１）、ヒノキ（Ｃｈａ  ｏ１、Ｃｈａ  ｏ２）、スギ（Ｃｒｙ  ｊ１、Ｃｒｙ  ｊ２）、イトスギ（Ｃｕｐ  ａ１）、セイヨウヒノキ（Ｃｕｐ  ｓ１、Ｃｕｐ  ｓ３）、ヤマスギ（Ｊｕｎ  ａ１、Ｊｕｎ  ａ２、Ｊｕｎ  ａ３、Ｊｕｎ  ｓ１）、ケードネズ（Ｊｕｎ  ｏ４）、イースタンレッドシダー（Ｊｕｎ  ｖ１、Ｊｕｎ  ｖ３）、スイート・バーナルグラス（Ａｎｔ  ｏ１）、サフランクロッカス（Ｃｒｏ  ｓ１、Ｃｒｏ  ｓ２）、バーミューダグラス（Ｃｙｎ  ｄ１、Ｃｙｎ  ｄ７、Ｃｙｎ  ｄ１２、Ｃｙｎ  ｄ１５、Ｃｙｎ  ｄ２２ｗ、Ｃｙｎ  ｄ２３、Ｃｙｎ  ｄ２４）、オーチャードグラス（Ｄａｃ  ｇ１、Ｄａｃ  ｇ２、Ｄａｃ  ｇ３、Ｄａｃ  ｇ４、Ｄａｃ  ｇ５）、メドーフェスキュー（Ｆｅｓ  ｐ４）、ベルベットグラス（Ｈｏｌ  Ｉ１、Ｈｏｌ  Ｉ５）、オオムギ（Ｈｏｒ  ｖ１、Ｈｏｒ  ｖ５）、ライグラス（Ｌｏｌ  ｐ１、Ｌｏｌ  ｐ２、Ｌｏｌ  ｐ３、Ｌｏｌ  ｐ４、Ｌｏｌ  ｐ１１）、バヒアグラス（Ｐａｓ  ｎ１）、カナリーグラス（Ｐｈａ  ａ１、Ｐｈａ  ａ５）、オオアワガエリ（ｔｉｍｏｔｈｙ）（Ｐｈｌ  ｐ１、Ｐｈｌ  ｐ２、Ｐｈｌ  ｐ４、Ｐｈｌ  ｐ５、Ｐｈｌ  ｐ６、Ｐｈｌ  ｐ７、Ｐｈｌ  ｐ１１、Ｐｈｌ  ｐ１２、Ｐｈｌ  ｐ１３）、ナツメヤシ（Ｐｈｏ  ｄ２）、ケンタッキーブルーグラス（Ｐｏａ  ｐ１、Ｐｏａ  ｐ５）、ライムギ（Ｓｅｃ  ｃ１、Ｓｅｃ  ｃ５、Ｓｅｃ  ｃ３８）、ジョンソングラス（Ｓｏｒ  ｈ１）、コムギ（Ｔｒｉ  ａ１５、Ｔｒｉ  ａ２１、Ｔｒｉ  ａ２７、Ｔｒｉ  ａ２８、Ｔｒｉ  ａ２９、Ｔｒｉ  ａ３０、Ｔｒｉ  ａ３１、Ｔｒｉ  ａ３２、Ｔｒｉ  ａ３３、Ｔｒｉ  ａ３４、Ｔｒｉ  ａ３５、Ｔｒｉ  ａ３９）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍ１、Ｚｅａ  ｍ１２）、ハンノキ（Ａｌｎ  ｇ１、Ａｌｎ  ｇ４）、アオゲイトウ（Ａｍａ  ｒ２）、ブタクサ（Ａｍｂ  ａ１、Ａｍｂ  ａ２、Ａｍｂ  ａ３、Ａｍｂ  ａ４、Ａｍｂ  ａ５、Ａｍｂ  ａ６、Ａｍｂ  ａ７、Ａｍｂ  ａ８、Ａｍｂ  ａ９、Ａｍｂ  ａ１０、Ａｍｂ  ａ１１）、ブタクサモドキ（Ａｍｂ  ｐ５）、オオブタクサ（Ａｍｂ  ｔ５）、ヨモギ（Ａｒｔ  ｖ１、Ａｒｔ  ｖ２、Ａｒｔ  ｖ３、Ａｒｔ  ｖ４、Ａｒｔ  ｖ５、Ａｒｔ  ｖ６）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖ１、ｂｅｔａ  ｖ２）、ヨーロッパシラカバ（Ｂｅｔ  ｖ１、Ｂｅｔ  ｖ２、Ｂｅｔ  ｖ３、Ｂｅｔ  ｖ４、Ｂｅｔ  ｖ６、Ｂｅｔ  ｖ７）、カブ（Ｂｒａ  ｒ５）、シデ（Ｃａｒ  ｂ１）、クリ（Ｃａｓ  ｓ１）、ツルニチニチソウ（Ｃａｔ  ｒ１）、アカザ（Ｃｈｅ  ａ１、Ｃｈｅ  ａ２、Ｃｈｅ  ａ３）、アラビアコーヒ（Ｃｏｆ  ａ１、Ｃｏｆ  ａ２、Ｃｏｆ  ａ３）、ハシバミ（Ｃｏｒ  ａ６、Ｃｏｒ  ａ１０）、ヘーゼルナッツ（Ｃｏｒ  ａ１．０４、Ｃｏｒａ２、Ｃｏｒ  ａ８）、ヨーロッパブナ（Ｆａｇ  ｓ１）、灰（Ｆｒａ  ｅ１）、ヒマワリ（Ｈｅｌ  ａ１、Ｈｅｌ  ａ２）、パラゴムノキ（Ｈｅｖ  ｂ１、Ｈｅｖ  ｂ２、Ｈｅｖ  ｂ３、Ｈｅｖ  ｂ４、Ｈｅｖ  ｂ５、Ｈｅｖ  ｂ６、Ｈｅｖ  ｂ７、Ｈｅｖ  ｂ８、Ｈｅｖ  ｂ９、Ｈｅｖ  ｂ１０、Ｈｅｖ  ｂ１１、Ｈｅｖ  ｂ１２、Ｈｅｖ  ｂ１３��Ｈｅｖ  ｂ１４）、カナムグラ（Ｈｕｍ  ｊ１）、イボタ（Ｌｉｇ  ｖ１）、メルクリアリス・アヌア（Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ａｎｎｕａ）（Ｍｅｒ  ａ１）、オリーブ（Ｏｌｅ  ｅ１、Ｏｌｅ  ｅ２、Ｏｌｅ  ｅ３、Ｏｌｅ  ｅ４、Ｏｌｅ  ｅ５、Ｏｌｅ  ｅ６、Ｏｌｅ  ｅ７、Ｏｌｅ  ｅ８、Ｏｌｅ  ｅ９、Ｏｌｅ  ｅ１０、Ｏｌｅ  ｅ１１）、ヨーロッパホップホーンビーン（Ｏｓｔ  ｃ１）、パリエタリア・ジュダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）（Ｐａｒ  ｊ１、Ｐａｒ  ｊ２、Ｐａｒ  ｊ３、Ｐａｒ  ｊ４）、パリエタリア・オフィシナリス（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（Ｐａｒ  ｏ１）、プランタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（Ｐａｌ  Ｉ１）、ロンドン・プレイン・ツリー（Ｐｌａ  ａ１、Ｐｌａ  ａ２、Ｐｌａ  ａ３）、プラタナス・オリエンタリス（Ｐｌａｔａｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（Ｐｌａ  ｏｒ１、Ｐｌａ  ｏｒ２、Ｐｌａ  ｏｒ３）、ホワイトオーク（Ｑｕｅ  ａ１）、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ  ｔｈｉｓｔｌｅ）（Ｓａｌ  ｋ１、Ｓａｌ  ｋ２、Ｓａｌ  ｋ３、Ｓａｌ  ｋ４、Ｓａｌ  ｋ５）、トマト（Ｓｏｌａ  Ｉ５）、ライラック（Ｓｙｒ  ｖ１、Ｓｙｒ  ｖ５）、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ−ｔｈｉｓｔｌｅ）（Ｓａｌ  ｋ１）、イギリスオオバコ（Ｐｌａ  ｌ１）、アムブロシア・アルテミシフォリア（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）（Ａｍｂ  ａ８．０１０１、Ａｍｂ  ａ８．０１０２、Ａｍｂ  ａ９．０１０１、Ａｍｂ  ａ９．０１０２）、プランタゴ・ランセオラタ（Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（Ｐｌａ  ｌ１．０１０１、Ｐｌａ  ｌ１．０１０２、Ｐｌａ  ｌ１．０１０３）、パリエタリア・ジュダイカ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）（Ｐａｒ  ｊ  ３．０１０２）、シノドン・ダクチロン（Ｃｙｎｏｄｏｎ  ｄａｃｔｙｌｏｎ）（Ｃｙｎ  ｄ１．０１０１、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０２、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０３、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０４、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０５、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０６、Ｃｙｎ  ｄ１．０１０７、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０１、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０２、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０３、Ｃｙｎ  ｄ１．０２０４）、ホルクス・ラナツス（Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）（Ｈｏｌ  Ｉ１．０１０１、Ｈｏｌ  Ｉ１．０１０２）、ロリウム・ペレネ（Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅ）（Ｐｈｌ  ｐ１．０１０１、Ｐｈｌ  ｐ１．０１０２、Ｐｈｌ  ｐ４．０１０１、Ｐｈｌ  ｐ４．０２０１、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０１、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０２、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０３、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０４、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０５、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０６、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０７、Ｐｈｌ  ｐ５．０１０８、Ｐｈｌ  ｐ５．０２０１、Ｐｈｌ  ｐ５．０２０２）、セカレ・セレアル（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）（Ｓｅｃ  ｃ２０．０１０１、Ｓｅｃ  ｃ２０．０２０１）、ベツラ・ベルコサ（Ｂｅｔｕｌａ  Ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）（Ｂｅｔ  ｖ１．０１０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０１０２、Ｂｅｔ  ｖ１．０１０３、Ｂｅｔ  ｖ１．０２０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０３０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０４０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０４０２、Ｂｅｔ  ｖ１．０５０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０６０１、Ｂｅｔ  ｖ１．���６０２、Ｂｅｔ  ｖ１．０７０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０８０１、Ｂｅｔ  ｖ１．０９０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１００１、Ｂｅｔ  ｖ１．１１０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１２０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１３０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１４０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１４０２、Ｂｅｔ  ｖ１．１５０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１５０２、Ｂｅｔ  ｖ１．１６０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１７０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１８０１、Ｂｅｔ  ｖ１．１９０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２００１、Ｂｅｔ  ｖ１．２１０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２２０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２３０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２４０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２５０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２６０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２７０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２８０１、Ｂｅｔ  ｖ１．２９０１、Ｂｅｔ  ｖ１．３００１、Ｂｅｔ  ｖ１．３１０１、Ｂｅｔ  ｖ６．０１０１、Ｂｅｔ  ｖ６．０１０２）、カルピナス・ベツルス（Ｃａｒｐｉｎｕｓ  ｂｅｔｕｌｕｓ）（Ｃａｒ  ｂ１．０１０１、Ｃａｒ  ｂ１．０１０２、Ｃａｒ  ｂ１．０１０３、Ｃａｒ  ｂ１．０１０４、Ｃａｒ  ｂ１．０１０５、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０６、Ｃａｒ  ｂ１．０１０７、Ｃａｒ  ｂ１．０１０７、Ｃａｒ  ｂ１．０１０８、Ｃａｒ  ｂ１．０２０１、Ｃａｒ  ｂ１．０３０１、Ｃａｒ  ｂ１．０３０２）、コリルス・アベラナ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ）（Ｃｏｒ  ａ１．０１０１、Ｃｏｒ  ａ１．０１０２、Ｃｏｒ  ａ１．０１０３、Ｃｏｒ  ａ１．０１０４、Ｃｏｒ  ａ１．０２０１、Ｃｏｒ  ａ１．０３０１、Ｃｏｒ  ａ１．０４０１、Ｃｏｒ  ａ１．０４０２、Ｃｏｒ  ａ１．０４０３、Ｃｏｒ  ａ１．０４０４）、リグストルム・ブルガレ（Ｌｉｇｕｓｔｒｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）（Ｓｙｒ  ｖ１．０１０１、Ｓｙｒ  ｖ１．０１０２、Ｓｙｒ  ｖ１．０１０３）、クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（Ｃｒｙ  ｊ２．０１０１、Ｃｒｙ  ｊ２．０１０２）およびキュプレッサス・セムパービレンス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）（Ｃｕｐ  ｓ１．０１０１、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０２、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０３、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０４、Ｃｕｐ  ｓ１．０１０５）ならびにそれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１５８】
ルーピンは、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）に属するマメ科の草本植物である。欧州では、ルーピンの粉および種子は、パン、クッキー、ペストリー、パスタ、ソース、乳または大豆の代用として飲料およびグルテンフリー食品で広く使用されている。国際免疫学会連合（ＩＵＩＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ）アレルゲン命名小委員会は、最近、β−コングルチンをＬｕｐ  ａｎ１アレルゲンと指定した（ナダル（Ｎａｄａｌ）ら著、２０１２年、Ｌｕｐ  ａｎ１食物アレルゲンに対するＤＮＡアプタマー（ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｌｕｐ  ａｎ  １  Ｆｏｏｄ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ）、プロス・ワン（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ）、第７巻、第４号、ｅ３５２５３）。より最近では、Ｌｕｐ  ａｎ１（β−コングルチン）に対する高親和性１１ｍｅｒＤＮＡアプタマーが報告された（ナダル（Ｎａｄａｌ）ら著、２０１３年、Ｌｕｐ  ａｎ１（β−コングルチン）に対する高親和性１１ｍｅｒＤＮＡアプタマーのプローブ化（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  １１−ｍｅｒ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｌｕｐ  ａｎ  １（β−ｃｏｎｇｌｕｔｉｎ））、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第４０５号、ｐ．９３４３〜９３４９）。
【０１５９】
本発明のアプタマー、シグナリングポリヌクレオチドおよび検出剤を用いて検出され得るダニ由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、ダニ（Ｂｌｏ  ｔ１、Ｂｌｏ  ｔ３、Ｂｌｏ  ｔ４、Ｂｌｏ  ｔ５、Ｂｌｏ  ｔ６、Ｂｌｏ  ｔ１０、Ｂｌｏ  ｔ１１、Ｂｌｏ  ｔ１２、Ｂｌｏ  ｔ１３、Ｂｌｏ  ｔ１９、Ｂｌｏｔ  ｔ２１）、アメリカハウスダストダニ（Ｄｅｒ  ｆ１、Ｄｅｒ  ｆ２、Ｄｅｒ  ｆ３、Ｄｅｒ  ｆ７、Ｄｅｒ  ｆ１０、Ｄｅｒ  ｆ１１、Ｄｅｒ  ｆ１３、Ｄｅｒ  ｆ１４、Ｄｅｒ  ｆ１５、Ｄｅｒ  ｆ１６、Ｄｅｒ  ｆ１７、Ｄｅｒ  ｆ１８、Ｄｅｒ  ｆ２２、Ｄｅｒ  ｆ２４）、デルマトファゴイデス・ミクロセラス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｍｉｃｒｏｃｅｒａｓ）（ハウスダストダニ）（Ｄｅｒｍ１）、ヨーロッパハウスダストダニ（Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、Ｄｅｒ  ｐ３、Ｄｅｒ  ｐ４、Ｄｅｒ  ｐ５、Ｄｅｒ  ｐ６、Ｄｅｒ  ｐ７、Ｄｅｒ  ｐ８、Ｄｅｒ  ｐ９、Ｄｅｒ  ｐ１０、Ｄｅｒ  ｐ１１、Ｄｅｒ  ｐ１４、Ｄｅｒ  ｐ１５、Ｄｅｒ  ｐ２０、Ｄｅｒ  ｐ２１、Ｄｅｒ  ｐ２３）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）（ハウスダストダニ）（Ｅｕｒ  ｍ２、Ｅｕｒ  ｍ２、Ｅｕｒ  ｍ３、Ｅｕｒ  ｍ４、Ｅｕｒ  ｍ１４）、貯蔵庫ダニ（Ａｃａ  ｓ１３、Ｇｌｙ  ｄ２、Ｌｅｐ  ｄ２、Ｌｅｐ  ｄ５、Ｌｅｐ  ｄ７、Ｌｅｐ  ｄ１０、Ｌｅｐ  ｄ１３、Ｔｙｒ  ｐ２、Ｔｙｒ  ｐ３、Ｔｙｒ  ｐ１０、Ｔｙｒ  ｐ１３、Ｔｙｒ  ｐ２４）、デルマトファゴイデス・ファリナエ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）（Ｄｅｒ  ｆ１．０１０１、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０２、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０３、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０４、Ｄｅｒ  ｆ１．０１０５、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０１、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０２、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０３、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０４、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０５、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０６、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０７、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０８、Ｄｅｒ  ｆ２．０１０９、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１０、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１１、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１２、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１３、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１４、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１５、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１６、Ｄｅｒ  ｆ２．０１１７）、デルマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）（Ｄｅｒ  ｐ１．０１０１、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０２、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０３、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０４、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０５、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０６、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０７、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０８、Ｄｅｒ  ｐ１．０１０９、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１０、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１１、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１２、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１３、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１４、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１５、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１６、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１７、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１８、Ｄｅｒ  ｐ１．０１１９、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２０、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２１、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２２、Ｄｅｒ  ｐ１．０１２３、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０１、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０２、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０３、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０４、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０５、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０６、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０７、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０８、Ｄｅｒ  ｐ２．０１０��、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１０、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１１、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１２、Ｄｅｒ  ｐ２．０１１３）、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｍａｙｎｅｉ）（Ｅｕｒ  ｍ２．０１０１、Ｅｕｒ  ｍ２．０１０２）、レピドグリファス・デストラクター（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）（Ｌｅｐ  ｄ２．０１０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０１０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０１０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０１０２、Ｌｅｐ  ｄ２．０２０１、Ｌｅｐ  ｄ２．０２０）およびグリシファガス・ドメスティカス（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（Ｇｌｙ  ｄ２．０１０１、Ｇｌｙ  ｄ２．０２０１）ならびにそれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１６０】
本発明のアプタマー、シグナリングポリヌクレオチドおよび検出剤を用いて検出され得る動物由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、畜牛（Ｂｏｓ  ｄ２、Ｂｏｓ  ｄ３、Ｂｏｓ  ｄ４、Ｂｏｓ  ｄ５、Ｂｏｓ  ｄ６、Ｂｏｓ  ｄ７、Ｂｏｓ  ｄ８）、イヌ（Ｃａｎ  ｆ１、Ｃａｎ  ｆ２、Ｃａｎ  ｆ３、Ｃａｎ  ｆ４、Ｃａｎ  ｆ５、Ｃａｎ  ｆ６）、畜馬（Ｅｑｕ  ｃ１、Ｅｑｕ  ｃ２、Ｅｑｕ  ｃ３、Ｅｑｕ  ｃ４、Ｅｑｕ  ｃ５）、ネコ（Ｆｅｌ  ｄ１、Ｆｅｌ  ｄ２、Ｆｅｌ  ｄ３、Ｆｅｌ  ｄ４、Ｆｅｌ  ｄ５ｗ、Ｆｅｌ  ｄ６ｗ、Ｆｅｌ  ｄ７、Ｆｅｌ  ｄ８）、マウス（Ｍｕｓ  ｍ１）、モルモット（Ｃａｖ  ｐ１、Ｃａｖ  ｐ２、Ｃａｖ  ｐ３、Ｃａｖ  ｐ４、Ｃａｖ  ｐ６）、ウサギ（Ｏｒｙ  ｃ１、Ｏｒｙ  ｃ３、Ｏｒｙ  ｃ４）ラット（Ｒａｔ  ｎ１）、ボス・ドメスティカス（Ｂｏｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（Ｂｏｓ  ｄ２．０１０１、Ｂｏｓ  ｄ２．０１０２、Ｂｏｓ  ｄ２．０１０３）およびエクゥウス・カバルス（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）（Ｅｑｕ  ｃ２．０１０１、Ｅｑｕ  ｃ２．０１０２）ならびにそれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１６１】
本発明のアプタマー、シグナリングポリヌクレオチドおよび検出剤を用いて検出され得る昆虫由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、黄熱病カ（Ａｅｄ  ａ１、Ａｅｄ  ａ２、Ａｅｄ  ａ３）、東ハイブハチ（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｈｉｖｅ  ｂｅｅ）（Ａｐｉ  ｃ１）、オオミツバチ（Ａｐｉ  ｄ１）、ミツバチ（Ａｐｉ  ｍ１、Ａｐｉ  ｍ２、Ａｐｉ  ｍ３、Ａｐｉ  ｍ４、Ａｐｉ  ｍ５、Ａｐｉ  ｍ６、Ａｐｉ  ｍ７、Ａｐｉ  ｍ８、Ａｐｉ  ｍ９、Ａｐｉ  ｍ１０、Ａｐｉ  ｍ１１、Ａｐｉ  ｍ１２）、鳩扁ダニ（Ａｒｇ  ｒ１）、チャバネゴキブリ（Ｂｌａ  ｇ１、Ｂｌａ  ｇ２、Ｂｌａ  ｇ３、Ｂｌａ  ｇ４、Ｂｌａ  ｇ５、Ｂｌａ  ｇ６、Ｂｌａ  ｇ７、Ｂｌａ  ｇ８、Ｂｌａ  ｇ１１）、クマバチ（Ｂｏｍ  ｐ１、Ｂｏｍ  ｐ４、Ｂｏｍ  ｔ１、Ｂｏｍ  ｔ４）、カイコガ（Ｂｏｍｂ  ｍ１）、ユスリカ（Ｃｈｉ  ｋ１０、Ｃｈｉ  ｔ１、Ｃｈｉ  ｔ１．０１、Ｃｈｉ  ｔ２、Ｃｈｉ  ｔ２．０１０１、Ｃｈｉ  ｔ２．０１０２、Ｃｈｉ  ｔ３、Ｃｈｉ  ｔ４、Ｃｈｉ  ｔ５、Ｃｈｉ  ｔ６、Ｃｈｉ  ｔ６．０１、Ｃｈｉ  ｔ７、Ｃｈｉ  ｔ８、Ｃｈｉ  ｔ９）、ネコノミ（Ｃｔｅ  ｆ１、Ｃｔｅ  ｆ２、Ｃｔｅ  ｆ３）、キイロスズメバチ（Ｄｏｌ  ａ５）、北米産スズメバチ（Ｄｏｌ  ｍ１、Ｄｏｌ  ｍ２、Ｄｏｌ  ｍ５）、ヌカカ（Ｆｏｒ  ｔ１、Ｆｏｒ  ｔ２）、サバンナツェツェバエ（Ｇｌｏ  ｍ５）、アジアテントウムシ（Ｈａｒ  ａ１、Ｈａｒ  ａ２）、シミ（Ｌｅｐ  ｓ１）、チャタテムシ（Ｌｉｐ  ｂ１）、ブルドッグアリキバハリアリ（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｊｕｍｐｅｒ  ａｎｔ）（Ｍｙｒ  ｐ１、Ｍｙｒ  ｐ２、Ｍｙｒ  ｐ３）、アメリカゴキブリ（Ｐｅｒ  ａ１、Ｐｅｒ  ａ３、Ｐｅｒ  ａ６、Ｐｅｒ  ａ７、Ｐｅｒ  ａ９、Ｐｅｒ  ａ１０）、ノシメマダラメイガ（Ｐｌｏ  ｉ１、Ｐｌｏ  ｉ２）、アシナガバチ（Ｐｏｌ  ａ１、Ｐｏｌ  ａ２、Ｐｏｌ  ａ５、Ｐｏｌ  ｅ１、Ｐｏｌ  ｅ４、Ｐｏｌ  ｅ５、Ｐｏｌ  ｆ５、Ｐｏｌ  ｇ１、Ｐｏｌ  ｇ５、Ｐｏｌ  ｍ５、Ｐｏｌｙ  ｐ１、Ｐｏｌｙ  ｓ５、Ｖｅｓ  ｖｉ５）、地中海コアシナガバチ（Ｐｏｌ  ｄ１、Ｐｏｌ  ｄ４、Ｐｏｌ  ｄ５）、熱帯ヒアリ（Ｓｏｌ  ｇ２、Ｓｏｌ  ｇ３、Ｓｏｌ  ｇ４）、ソレノプシス・インビクタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ）（アカヒアリ）（Ｓｏｌ  Ｉ１、Ｓｏｌ  Ｉ２、Ｓｏｌ  Ｉ３、Ｓｏｌ  Ｉ４）、クロヒアリ（Ｓｏｌ  ｒ２、Ｓｏｌ  ｒ３）、ブラジルヒアリ（Ｓｏｌ  ｓ２、Ｓｏｌ  ｓ３）、ウシアブ（Ｔａｂ  ｙ１、Ｔａｂ  ｙ２、Ｔａｂ  ｙ５）、マツカレハ（ｐｉｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｏｎａｒｙ  ｍｏｔｈ）（Ｔｈａ  ｐ１、Ｔｈａ  ｐ２）、オオサシガメ（Ｔｒｉａ  ｐ１）、モンスズメバチ（Ｖｅｓｐ  ｃ１、Ｖｅｓｐ  ｃ５）、ベスパ・マグニフィカ（Ｖｅｓｐａ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ）（スズメバチ）（Ｖｅｓｐ  ｍａ２、Ｖｅｓｐ  ｍａ５）、ベスパ・マンダリニア（Ｖｅｓｐａ  ｍａｎｄａｒｉｎｉａ）（アジアオオスズメバチ（Ｇｉａｎｔ  ａｓｉａｎ  ｈｏｒｎｅｔ））（Ｖｅｓｐ  ｍ１、Ｖｅｓｐ  ｍ５）、イエロージャケット（Ｖｅｓ  ｆ５、Ｖｅｓ  ｇ５、Ｖｅｓ  ｍ１、Ｖｅｓ  ｍ２、Ｖｅｓ  ｍ５）、ベスプラ・ゲルマニカ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（イエロージャケッ���）（Ｖｅｓ  ｐ５）、ベスプラ・スクアモサ（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｓｑｕａｍｏｓａ）（イエロージャケット）（Ｖｅｓ  ｓ１、Ｖｅ  ｓ  ｓ５）、ベスプラ・ブルガリス（Ｖｅｓｐｕｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（イエロージャケット）（Ｖｅｓ  ｖ１、Ｖｅｓ  ｖ２、Ｖｅｓ  ｖ３、Ｖｅｓ  ｖ４、Ｖｅｓ  ｖ５、Ｖｅｓ  ｖ６）、ブラテラ・ゲルマニカ（Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）（Ｂｌａ  ｇ  １．０１０１、Ｂｌａ  ｇ１．０１０２、Ｂｌａ  ｇ１．０１０３、Ｂｌａ  ｇ１．０２、Ｂｌａ  ｇ６．０１０１、Ｂｌａ  ｇ６．０２０１、Ｂｌａ  ｇ６．０３０１）、ペリプラネタ・アメリカナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）（Ｐｅｒ  ａ１．０１０１、Ｐｅｒ  ａ１．０１０２、Ｐｅｒ  ａ１．０１０３、Ｐｅｒ  ａ１．０１０４、Ｐｅｒ  ａ１．０２、Ｐｅｒ  ａ３．０１、Ｐｅｒ  ａ３．０２０１、Ｐｅｒ  ａ３．０２０２、Ｐｅｒ  ａ３．０２０３、Ｐｅｒ  ａ７．０１０１、Ｐｅｒ  ａ７．０１０２）、モンスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｃｒａｂｏ）（Ｖｅｓ  ｐｃ５．０１０１、Ｖｅｓ  ｐｃ５．０１０１）、ベスパ・マンダリナ（Ｖｅｓｐａ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）（Ｖｅｓｐ  ｍ１．０１、Ｖｅｓｐ  ｍ１．０２）ならびにそれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１６２】
本発明のアプタマー、シグナリングポリヌクレオチドおよび検出剤を用いて検出され得る真菌／カビ由来のアレルゲン性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、アルテルナリア・アルテルナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）（アルテルナリア属腐朽菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｒｏｔ  ｆｕｎｇｕｓ））（Ａｌｔ  ａ１、Ａｌｔ  ａ３、Ａｌｔ  ａ４、Ａｌｔ  ａ５、Ａｌｔ  ａ６、Ａｌｔ  ａ７、Ａｌｔ  ａ８、Ａｌｔ  ａ１０、Ａｌｔ  ａ１２、Ａｌｔ  ａ１３）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）（真菌（ｆｕｎｇｕｓ））（Ａｓｐ  ｆｌ１３）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）（真菌）（Ａｓｐ  ｆ１、Ａｓｐ  ｆ２、Ａｓｐ  ｆ３、Ａｓｐ  ｆ４、Ａｓｐ  ｆ５、Ａｓｐ  ｆ６、Ａｓｐ  ｆ７、Ａｓｐ  ｆ８、Ａｓｐ  ｆ９、Ａｓｐ  ｆ１０、Ａｓｐ  ｆ１１、Ａｓｐ  ｆ１２、Ａｓｐ  ｆ１３、Ａｓｐ  ｆ１５、Ａｓｐ  ｆ１６、Ａｓｐ  ｆ１７、Ａｓｐ  ｆ１８、Ａｓｐ  ｆ２２、Ａｓｐ  ｆ２３、Ａｓｐ  ｆ２７、Ａｓｐ  ｆ２８、Ａｓｐ  ｆ２９、Ａｓｐ  ｆ３４）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａｓｐ  ｎ１４、Ａｓｐ  ｎ１８、Ａｓｐ  ｎ２５）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ａｓｐ  ｏ１３、Ａｓｐ  ｏ２１）、アスペルギルス・ベルシカラー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（Ａｓｐ  ｖ１３）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）（酵母）（Ｃａｎｄ  ａ１、Ｃａｎｄ  ａ３）、カンジダ・ボイジニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）（酵母）（Ｃａｎｄ  ｂ２）、クラドスポリウム・クラドスポリオイデス（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）（Ｃｌａ  ｃ９、Ｃｌａ  ｃ１４）、クラドスポリウム・ヘルバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）（Ｃｌａ  ｈ２、Ｃｌａ  ｈ５、Ｃｌａ  ｈ６、Ｃｌａ  ｈ７、Ｃｌａ  ｈ８、Ｃｌａ  ｈ９、Ｃｌａ  ｈ１０、Ｃｌａ  ｈ１２）、カルブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）（同義語：コクリオ・ボルスルナトゥス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔｕｓ））（Ｃｕｒ  ｌ１、Ｃｕｒ  Ｉ２、Ｃｕｒ  Ｉ３、Ｃｕｒ  Ｉ４）、エピコッカム・パープラスセンス（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）（土壌菌）（Ｅｐｉ  ｐ１）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）（Ｎ．Ａ．）（Ｆｕｓ  ｃ１、Ｆｕｓ  ｃ２）、フザリウム・プラリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）（Ｆｕｓ  ｐ４）、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）（Ｐｅｎ  ｂ１３、Ｐｅｎ  ｂ２６）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）（Ｐｅｎ  ｃｈ１３、Ｐｅｎ  ｃｈ１８、Ｐｅｎ  ｃｈ２０、Ｐｅｎ  ｃｈ３１、Ｐｅｎ  ｃｈ３３、Ｐｅｎ  ｃｈ３５）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）（Ｐｅｎ  ｃ３、Ｐｅｎ  ｃ１３、Ｐｅｎ  ｃ１９、Ｐｅｎ  ｃ２２、Ｐｅｎ  ｃ２４、Ｐｅｎ  ｃ３��、Ｐｅｎ  ｃ３２）、ペニシリウム・クルストサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｒｕｓｔｏｓｕｍ）（Ｐｅｎ  ｃｒ２６）、ペニシリウム・オキサリカム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｏｘａｌｉｃｕｍ）（Ｐｅｎ  ｏ１８）、スタキボトリス・チャータラム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ）（Ｓｔａ  ｃ３）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）（Ｔｒｉ  ｒ２、Ｔｒｉ  ｒ４）、トリコフィトン・トンズランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）（Ｔｒｉ  ｔ１、Ｔｒｉ  ｔ４）、シロシベ・クベンシス（Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ  ｃｕｂｅｎｓｉｓ）（Ｐｓｉ  ｃ１、Ｐｓｉ  ｃ２）、キクバナイグチ（Ｃｏｐ  ｃ１、Ｃｏｐ  ｃ２、Ｃｏｐ  ｃ３、Ｃｏｐ  ｃ５、Ｃｏｐ  ｃ７）、ロドトルラ・ムシラギノーサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）（Ｒｈｏ  ｍ１、Ｒｈｏ  ｍ２）、マラセジア・フルフール（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）（Ｍａｌａｆ２、Ｍａｌａｆ３、Ｍａｌａｆ４）、マラセチア・シンポジアリス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）（Ｍａｌａｓ１、Ｍａｌａｓ５、Ｍａｌａｓ６、Ｍａｌａｓ７、Ｍａｌａｓ８、Ｍａｌａｓ９、Ｍａｌａｓ１０、Ｍａｌａｓ１１、Ｍａｌａｓ１２、Ｍａｌａｓ１３）およびアルタナリア・アルタナータ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔｅ）（Ａｌｔ  ａ１．０１０１、Ａｌｔ  ａ１．０１０２）ならびにそれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１６３】
追加のアレルゲンの例としては、限定されるものではないが、線虫（Ａｎｉ  ｓ１、Ａｎｉ  ｓ２、Ａｎｉ  ｓ３、Ａｎｉ  ｓ４）、蠕虫（Ａｓｃ  ｓ１）、軟体サンゴ（Ｄｅｎ  ｎ１）、ゴム（ラテックス）（Ｈｅｖ  ｂ１、Ｈｅｖ  ｂ２、Ｈｅｖ  ｂ３、Ｈｅｖ  ｂ５、Ｈｅｖ  ｂ６、Ｈｅｖ  ｂ７、Ｈｅｖ  ｂ８、Ｈｅｖ  ｂ９、Ｈｅｖ  ｂ１０、Ｈｅｖ  ｂ１１、Ｈｅｖ  ｂ１２、Ｈｅｖ  ｂ１３）、オベチェ（Ｔｒｉｐ  ｓ１）およびパラゴムノキ（Ｈｅｖ  ｂ６．０１、Ｈｅｖ  ｂ６．０２０１、Ｈｅｖ  ｂ６．０２０２、Ｈｅｖ  ｂ６．０３、Ｈｅｖ  ｂ８．０１０１、Ｈｅｖ  ｂ８．０１０２、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０１、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０２、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０３、Ｈｅｖ  ｂ８．０２０４、Ｈｅｖ  ｂ１０．０１０１、Ｈｅｖ  ｂ１０．０１０２、Ｈｅｖ  ｂ１０．０１０３、Ｈｅｖ  ｂ１１．０１０１、Ｈｅｖ  ｂ１１．０１０２）ならびにそれらの任意の変異体が挙げられる。
【０１６４】
いくつかの新しいアレルゲンとしては、ウマ鱗屑由来のアレルゲンのセクレトグロビン（米国特許第９，１６４，１０１号明細書）およびイヌ由来の前立腺カリクレインアレルゲン（米国特許第９，１８２，４００号明細書）が挙げられ得る。
他の標的分子
アレルゲンに加えて、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮおよび検出剤は、サンプル中の任意の標的の含有率を検出するために使用され得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮおよび検出剤は、病原微生物に特異的な１種以上の標的タンパク質を検出し得る。標的タンパク質は、病原体によって分泌された分子、表面タンパク質、病原体が攻撃する宿主内で誘導されたタンパク質または標的タンパク質の一部分であり得る。本発明は、細菌、酵母、真菌、胞子、ウイルス、プリオンなどの多様なタイプの病原微生物の検出および同定を可能にする。本明細書で用いられる場合、「病原体」という用語は、任意の疾患誘発因子（特にウイルスまたは細菌または他の微生物）を意味する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮおよび検出剤は、疾患、障害および他の臨床病態の診断、病気判定を行うために、疾患関連タンパク質などの他の標的分子を検出し得る。疾患関連タンパク質は、分泌されたポリペプチドおよびペプチド（例えば、循環分子）、細胞表面タンパク質（例えば、レセプター）、特定の疾患病態で発現または過剰発現されたバイオマーカ、疾患病態でのみ存在する特定のタンパク質のアイソフォーム、誘導体および／または変異体、障害の原因となる突然変異タンパク質、ならびにウイルス感染などの宿主内の臨床病態の原因となる他の生物由来のタンパク質であり得る。
【０１６７】
他の実施形態では、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮおよび検出剤は、非タンパク質標的分子、例えばガングリオシド、脂質、リン脂質、炭水化物、低分子（例えば、マイコトキシンおよび抗生物質）、ハプテンおよび核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、殺有害生物剤、肥料ならびに他のクロロ芳香族汚染物質を検出し得る。
アッセイおよび方法
本発明は、食品サンプル中の対象のアレルゲンの存在および／または不在を検出するための方法をさらに提供する。種々の方法およびアッセイは、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮ、検出剤および組成物と組み合わせて使用され得、その選択は適用分野に依存し得る。いくつかの実施形態では、検出剤としてアプタマーベースのシグナルポリヌクレオチドを用いてアレルゲン検出試験アッセイが提供される。いくつかの実施形態では、シグナルポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一方の末端がフルオロフォアで標識される。他の実施形態では、アレルゲンタンパク質の結合による蛍光偏光の変化を検出してアレルゲンの存在が測定され得る。いくつかの実施形態では、ＳＰＮおよび検出剤は、表１および表２に含まれる核酸配列を含み得る。
【０１６８】
一般的には、本発明のシステム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮおよび検出剤を用いてサンプル中の標的アレルゲンタンパク質を検出するためのアッセイおよび方法は、（ａ）対象のアレルゲンを含有すると推測される試験サンプルを得る工程と、（ｂ）（ａ）のサンプルを抽出緩衝液で処理する工程と、（ｃ）処理されたサンプルを、対象のアレルゲンに特異的な検出剤と接触させる工程と、（ｄ）混合された処理されたサンプルおよび検出剤を励起手段で処理する工程と、（ｅ）処理されたサンプルに含まれる対象のアレルゲンと検出剤との相互作用を可視化する工程とを含む。提供されたアッセイおよび方法は、サンプル中の対象のアレルゲンの存在および／もしくは不在の検出し、かつ／またはサンプル中のアレルゲンの量を決定することができる。
【０１６９】
サンプル中のアレルゲン含有率を検出するためのアッセイおよび方法は、何らの制限を受けることなく、アレルゲンを含有する食品に適用可能である。食品の例としては、卵、乳、肉、サカナ、甲殻動物および軟体動物、穀物、マメ科植物、果実、野菜、ビール酵母、およびナッツ、およびゼラチン、より特定的には卵の卵白および卵黄、乳および乳のチーズ、肉の豚肉、牛肉、鶏肉および羊肉、サカナのサバ、アジ、イワシ、マグロ、サケ、タラ、カレイおよびイクラ、甲殻動物および軟体動物のカニ、シュリンプ、ムラサキイガイ、イカ、タコ、ロブスターおよびアワビ、穀物のコムギ、コメ、ソバ、ライムギ、オオムギ、エンバク、トウモロコシ、ミレット、アワおよびイヌビエ、マメ科植物およびナッツのダイズ、ラッカセイ、カカオ、エンドウ、インゲンマメ、ヘーゼルナッツ、ブラジルナッツ、アーモンド、ココヤシおよびクルミ、果実のリンゴ、バナナ、オレンジ、モモ、キウイ、イチゴ、メロン、アボカド、グレープフルーツ、マンゴー、セイヨウナシ、ゴマおよびカラシナ、野菜のトマト、ニンジン、ジャガイモ、ホウレンソウ、タマネギ、ニンニク、タケノコ、カボチャ、サツマイモ、セロリ、パセリ、ヤムイモおよびマツタケキノコ、それらを含有する食品およびそれらの成分（例えば、オボアルブミン、オボムコイド、リゾチーム、カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトグロブリン、グルテンおよびα−アミラーゼ阻害剤）が挙げられる。
【０１７０】
食品は、動物由来の肉および／または野菜を含む生鮮食品、冷凍食品、冷却食品または加工食品であり得る。こうした食品は、加熱、凍結、乾燥、加塩、発酵、酵素処理などにより処理され得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、食品サンプルの処理は、ユニバーサル配合物の使用を含み得る。わずか約０．５ｇの食品サンプルで試験される食品に及ぼす影響を最小限に抑える試みがなされ、サンプル中のアレルゲン濃度がごくわずかである場合、痕跡量のアレルゲンの検出が可能になることから、このユニバーサル配合物は臨床的に適切であろう。この最適化されたタンパク質抽出プロセスは、任意の食品マトリックス中のアレルゲンの検出を可能にする高速で正確なユニバーサルプロトコルを提供するであろう。いくつかの態様では、ユニバーサル緩衝液は、Ｔｒｉｓベースの緩衝液（Ｔ緩衝液）、ＨＥＰＥＳベースの緩衝液、ＴＧＫベースの緩衝液またはＰＢＳベースの緩衝液であり得る。詳細な考察は以下に提供される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、食品マトリックスの性質に依存して１種以上の検出剤（例えば、ＳＰＮ）が使用され得る。いくつかの食品は、いくつかのアレルゲン性タンパク質を含有する。例えば、少なくとも８種のラッカセイタンパク質、例えばＡｒａ  ｈ１およびＡｒａ  ｈ２は、潜在的に免疫学的反応の原因となり得る。かかる場合、ラッカセイの不在または存在を検出するために、混合カクテルで２種以上のアレルゲン性タンパク質に対する２種以上のＳＰＮが使用され得る。他の態様では、サカナ、シェルフィッシュ、軟体動物などのいくつかの食品マトリックスは、１種の主要アレルゲン性タンパク質のみを含有する。この主要アレルゲンタンパク質に特異的に結合する１種以上のＳＰＮがアレルゲン検出に使用され得る。いくつかの態様では、検出剤は、検出システムにあらかじめ貯蔵され得、かつ検出アッセイのプロセス中、例えば、本発明のディスポーザブル試験カップに放出され得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明のアレルゲン検出アッセイおよび方法は、食品サンプル中のより低濃度のアレルゲンを検出し得る。核酸アプタマーおよびＳＰＮの感度ならびに光学設計は、０．０００１ｐｐｍ程度の少量のアレルゲンの存在の検出を可能にする。いくつかの態様では、検出可能なアレルゲンの濃度または量は、０．００１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、または０．００１ｐｐｍ〜０．１ｐｐｍ、または０．１ｐｐｍ〜３ｐｐｍ、または１ｐｐｍ〜５ｐｐｍ、または５ｐｐｍ〜１０ｐｐｍ、または１０ｐｐｍ〜３０ｐｐｍの範囲内であり得る。いくつかの態様では、検出可能な食品サンプル中のアレルゲンの濃度または量は、０．００１ｐｐｍ、０．００２ｐｐｍ、０．００３ｐｐｍ、０．００４ｐｐｍ、０．００５ｐｐｍ、０．００６ｐｐｍ、０．００７ｐｐｍ、０．００８ｐｐｍ、０．００９ｐｐｍ、０．０１ｐｐｍ、０．０２ｐｐｍ、０．０３ｐｐｍ、０．０４ｐｐｍ、０．０５ｐｐｍ、０．０６ｐｐｍ、０．０７ｐｐｍ、０．０８ｐｐｍ、０．０９ｐｐｍ、０．１ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ、０．３ｐｐｍ、０．４ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．６ｐｐｍ、０．７ｐｐｍ、０．８ｐｐｍ、０．９ｐｐｍ、１．０ｐｐｍ、１．５ｐｐｍ、２ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、３ｐｐｍ、３．５ｐｐｍ、４ｐｐｍ、４．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、２０ｐｐｍまたは３０ｐｐｍであり得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本発明のアレルゲン検出アッセイおよび方法は、５分間未満で実施され得る。いくつかの態様では、アッセイ時間は、１分間〜約５分間、約１分間〜約３分間、約２分間〜約１０分間、約５分間〜約１０分間であり得る。他の態様では、アッセイ時間は、１分間未満、２分間未満、３分間未満、４分間未満、５分間未満、６分間未満、７分間未満、８分間未満、９分間未満または１０分間未満にわたり継続され得る。さらに他の態様では、アッセイ時間は、約１０秒未満、約１５秒間未満、約２０秒間未満、約２５秒間未満、約３０秒間未満、約３５秒間未満、約４０秒間未満、約４５秒間未満、約５０秒間未満、約５５秒間未満または約６０秒間にわたり継続され得る。
【０１７５】
核酸分子（例えば、ＳＰＮ）とタンパク質との相互作用を検出および表示するために使用されるいずれの方法およびシステムも検出結果を表示するために使用され得る。いくつかの実施形態では、サンプル中の標的アレルゲンの存在および不在を示すために、標的アレルゲンの結合によるフルオロフォアプローブ化検出分子（例えば、ＳＰＮ）からの蛍光偏光（ＦＰ）の変化が測定され得る。蛍光偏光を測定するために、サンプルは直線偏光光で励起される。発光偏光子を偏光励起の方向に平行な向きにした場合、平行蛍光強度が測定され、発光偏光子を励起光の偏光平面に垂直な向きにした場合、垂直蛍光強度が測定される。蛍光発光は、励起状態の寿命中のフルオロフォアの回転拡散、エネルギー移動、再吸収を含むいくつかの現象によって脱偏光され得る。ＦＰ技術の原理に従うと、比較的小さいシグナリングポリヌクレオチドへの標的アレルゲンの結合は、有意に回転拡散を変化させ得る。かかる変化は、ＦＰの原因となり、結合された標的を定量するために使用され得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＦＰの変化は、光学システムを用いて測定され得、検出されたシグナルは、可視化されて消費者に報告され得る。一態様では、本発明のデバイスが使用され得る。したがって、システム内の偏光発光体は、ＳＰＮのフルオロフォアを励起するのに適切な励起波長を有する光を発し、システム内の光ディテクターは、ＳＰＮのフルオロフォアから発せられた蛍光をフィルターし、対象の波長を透過し得る。次いで、蛍光シグナルを処理して有用な読取り情報（すなわちデジタルシグナル）に変換するための手段が使用され得る。他の態様では、ＦＰの変化は、任意の市販のＦＰ装置で測定され得る。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、偏光光の波長は、２００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲内である。
いくつかの実施形態では、ＳＰＮと標的アレルゲンとの相互作用によるシグナルは、検出システムによって検出および可視化され得る。限定されるものではないが、いくつかの例としては、ラテラルフローデバイス（ＬＦＤ：ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ  ｄｅｖｉｃｅ）、マイクロ流体チップ（米国特許第８，６１７，９０３号明細書）、所有者が共通する２０１５年３月１６日出願の米国特許出願第６２／１３３，６３２号明細書および２０１５年６月２２日出願の同第６２／１８２，９００号明細書に記載のポータブル検出デバイス／システム、および所有者が共通する２０１４年１０月２８日出願の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第１４／６２６５６号明細書に記載のカートリッジが挙げられる（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７８】
本アッセイの検出結果は、表示ウィンドウなどのユーザが容易に読み取ることができるプラットフォームに表示され得る。一実施形態では、それは、コンピュータ、パッドおよび／またはスマートフォンのプラットフォームアプリケーションであり得る（コスカン（Ｃｏｓｋｕｎ）ら著、「携帯電話の個別化食物アレルゲン試験プラットフォーム（Ａ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｆｏｏｄ  ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｏｎ  ａ  ｃｅｌｌｐｈｏｎｅ）」、ラブ・オン・ア・チップ（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．）、２０１３年、第１３巻、第４号、ｐ．６３６〜６４０（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１７９】
一実施形態では、対象のアレルゲンタンパク質の存在および／または不在を検出するための方法は、本検出システムおよび組成物で実施され得る。本方法の詳細な説明は次の節に示される。
サンプリング
アレルゲン検出試験の信頼性のある感度の良い結果を提供するために、試験サンプルの適正なサイズが重要である。本発明の発明者らは、検出対象のアレルゲンタンパク質の高速かつ効率的な抽出のために、試験サンプルを効果的かつ非破壊的に捕集し得るサンプリング機構を開発した。
【０１８０】
例えば、所定サイズの試験サンプル部分は、図２ｃに例示されるフードコアラー２００を用いて捕集され得る。サンプルピックアップ（例えば、フードコアラー２００）は、検出試験のためにサイズを測定し、十分なタンパク質抽出を提供し得る適正サイズのサンプルを捕集することができる。所定サイズの部分は、０．１ｇ〜１ｇの範囲内の食品サンプルであり得る。さらに、フードコアラー２００は、切断、粉砕、研磨および／または濾過により、捕集された試験サンプルを前処理し得る。前処理された試験サンプルは、ホモジナイゼーションおよびアレルゲンタンパク質抽出のためにサンプル処理カップ体２２０に導入されるであろう。図１ａおよび図３ａに例示されるように、フードコアラー２００は、カップ蓋アセンブリー２１０の頂部のフードコアラーポート２１３に挿入され得、かつディスポーザブル試験カップ３００内に試験サンプルを放出し得る。
【０１８１】
捕集された試験サンプルは抽出緩衝液で処理される。いくつかの態様では、抽出緩衝液がカップ体２２０内に存在し、ホモジナイザーアセンブリー５７０によって試験サンプルと混合され得る。他の態様では、貯蔵場所からカップチャンバー内に手動押込みまたは自動放出を行うことにより、局所領域（例えば、カップ体２２０の底部）からカップ体２２０内に抽出緩衝液が放出され得る。試験サンプルおよび抽出緩衝液は、ホモジナイザーアセンブリー５７０およびホモジナイズされるサンプルによって一緒に混合されるであろう。
【０１８２】
抽出緩衝液は、任意の試験サンプルから十分な標的タンパク質（例えば、最小１ｍｇ／ｍｌの全タンパク質）を回収してタンパク質抽出およびアレルゲン回収を最大化するように最適化され得るユニバーサル標的抽出緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、ユニバーサルタンパク質抽出緩衝液の配合物は、室温においてかつ最小限の時間、例えば約２分未満、約１分未満または約３０秒未満でタンパク質を抽出し得る。食品のサンプリング、ホモジナイゼーションおよび濾過中に同一の緩衝液が使用され得る。ユニバーサル抽出緩衝液は、任意のアレルゲンおよびすべての食品に適用可能であろう（例えば、前処理または後処理）。加えて、ユニバーサル抽出緩衝液は、シグナリングポリヌクレオチド（ＳＰＮ）の結合親和性を向上させ、非特異的結合を最小限に抑え、かつシグナル対ノイズ比を向上させることができる。特定の態様では、抽出緩衝液は、１０％、２０％もしくは４０％エタノールを含有するＰＢＳベースの緩衝液、またはトリス塩基Ｐｈ８．０と、５ｍＭ  ＭＥＤＴＡと、２０％エタノールとを含有するＴｒｉｓベースの緩衝液、または改変ＰＢＳ、またはＴｒｉｓ緩衝液であり得る。いくつかの例では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳベースの緩衝液であり得る。改変ＰＢＳ緩衝液のいくつかの例は、Ｐ＋緩衝液およびＫ緩衝液を含み得る。Ｔｒｉｓベースの緩衝液のいくつかの例は、緩衝液Ａ＋、緩衝液Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅおよび緩衝液Ｔを含み得る。各改変緩衝液の詳細な説明は、国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６２６５６号明細書に開示されている（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８３】
抽出緩衝液の体積は、経時的にかつ異なる食品マトリックスにおいて効率的でありかつ再現性があることが確認されている０．５ｍＬ〜３ｍＬであり得る。
本発明によれば、試験サンプルは、高速ホモジナイゼーションを用いて試験サンプルを最大限に処理するように最適化されたホモジナイザー（例えば、ホモジナイザーアセンブリー５７０）を用いてホモジナイズおよび処理される。いくつかの態様では、濾過機構は、ホモジナイザーに結合され得る。次いで、ホモジナイズされたサンプル溶液は、フィルターを通して流動され、さらにアレルゲンタンパク質を抽出する処理を行って、試験サンプルから抽出される他の分子の量を低減させる。コーニング（ＣＯＲＮＩＮＧ）（米国ニューヨーク州のコーニング（ＣＯＲＮＩＮＧ））製の細胞ウォータなどのフィルター膜または類似のカスタム実施形態がホモジナイザーに接続され得る。フィルター細孔は、０．２μｍ〜６００μｍであり得る。フィルターは、任意の低結合性材料、例えば、限定されるものではないが、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ＰＣＴＥ（ポリカーボネート）またはＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）から作製され得る。濾過プロセスは、第１のフィルターから第２のフィルターに細孔サイズを変化させるマルチステージ配置であり得る。フィルターは、濾過ステージの上、下または任意のステージ間でフローバルブ（以上からこの適正な名称を得る）に対して任意の構成を取り得る。
【０１８４】
いくつかの態様では、サンプリング手順は、１分未満で有効なタンパク質抽出に達する。一態様では、消化のスピードは、食品の採取、消化および読取りを含めて２分未満であり得る。おおよそで、手順は、１５秒間、３０秒間、４５秒間、５０秒間、５５秒間または１分間であり得る。
センサーおよび検出剤
抽出されたアレルゲンタンパク質は、１種以上の対象のアレルゲンに特異的な１種以上の検出剤と混合され得る。アレルゲンタンパク質抽出物と検出剤との相互作用は、試験サンプル中の１種以上のアレルゲンの存在または不在または量を示す検出可能なシグナルを生成するであろう。本明細書で用いられる場合、「検出剤」または「アレルゲン検出剤」という用語は、サンプル中のかかるアレルゲンの検出を可能にするように１種以上のアレルゲンと相互作用し、かつ／もしくはそれに結合することが可能であるかまたはそうする任意の分子を意味する。
【０１８５】
本発明の一態様では、検出剤は、核酸分子ベースのＳＰＮである。
他の実施形態では、反応チャンバー２２３内で検出剤として使用され得るアプタマー分子は、２０１４年７月１８日出願の米国仮特許出願第６２／０２６，３６１号明細書、２０１４年６月１０日出願の米国仮特許出願第６２／００９，９５８号明細書、２０１４年５月９日出願の米国仮特許出願第６１／９９１，０６８号明細書、２０１４年２月１１日出願の米国仮特許出願第６１／９３８，５２８号明細書、２０１３年１０月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８９６，３９９号明細書および２０１４年１０月２８日出願の国際出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０６２６５６号明細書ならびに２０１５年４月２９日出願の米国仮特許出願第６２／１５４，２００号明細書（それらの各内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む、本出願人の関連特許出願に記載のアプタマーであり得る。
【０１８６】
アプタマーベースのＳＰＮに加えて、検出デバイス１００で使用される検出剤は、低分子、抗体、それらの変異体などの１種以上のアレルゲンに会合可能または結合可能な任意の分子または作用剤であり得る。抗体ディテクターは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメントおよび他の機能性変異体であり得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、蛍光マーカで標識された本発明のアプタマーおよびＳＰＮは、検出剤として使用され得る。ＳＰＮは、表１および表２に含まれる核酸配列を含み得る。いくつかの態様では、ＳＰＮは、蛍光マーカでポリヌクレオチドの一方の末端を標識し得る。この態様では、試験サンプル中に提示されたアレルゲンの結合による蛍光プローブ化検出剤の蛍光偏光の変化を測定して、試験サンプル中のアレルゲン含有率の計算に使用する。蛍光偏光の変化は、本検出システムの図１６およびそれ図１７に示される光学サブシステム５２０によって測定され得る。
【０１８８】
蛍光マーカのフルオロフォアは、好適には２００〜８００ｎｍの範囲内に励起極大を有し得、発光極大は３００〜７００ｎｍの範囲内であり得る。フルオロフォアは、１〜７ナノ秒、好ましくは３〜５ナノ秒の範囲内の蛍光緩和時間をさらに有し得る。限定されるものではないが、例として、ＳＰＮの１つの末端にプローブ化され得るフルオロフォアとしては、ボディパイの誘導体（例えば、ボディパイＴＭＲ染料、ボディパイＦＬ染料）、誘導体を含むフルオレセイン、誘導体を含むローダミン、誘導体を含むダンシル（例えば、ダンシルカダベリン）、テキサスレッド、エオシン、シアニン染料、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、スクアラインならびに誘導体Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕおよびスクエア（Ｓｑｕａｒｅ）染料、ナフタレンおよびその誘導体、クマリンおよびその誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、アントラキノン、ピレンおよびその誘導体、オキサジンおよび誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン、テトラメチルローダミン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、カスケードブルー、パシフィックブルー、パシフィックオレンジ、ＮＢＤ、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、レッド６１３、ＰｅｒＣＰ、ＴｒｕＲｅｄ、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）ならびにアレキサフルオル染料が挙げられ得る。
【０１８９】
蛍光偏光の変化に加えて、他の光学的性質、例えば、限定されるものではないが、吸光度、蛍光強度、蛍光スペクトルおよび蛍光寿命を測定することにより、フルオロフォアで標識された検出剤とアレルゲンとの特異的相互作用も検出され得る。蛍光シグナルの測定は、本検出アッセイのサンプル混合物などの環境の生化学的変化を監視する感度の良い方法を提供する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、８種の主要食物アレルゲン（すなわちコムギ、卵、乳、ラッカセイ、木の実、サカナ、シェルフィッシュおよびダイズ）の検出剤がディスポーザブル用品として提供され得る。一態様では、検出剤の構築物は、ＭｇＣｌと共に、またはＫＣｌがドープされた緩衝液と共に貯蔵され得る。ＭｇＣｌは、構築物を耐密に閉状態に維持し、一方、ＫＣｌは、結合のためにそれをわずかに開放する。
検出システム
アレルゲンタンパク質抽出物と検出剤との混合物は、反応チャンバー２２３内で分析される。以上に記載したように、フルオロフォア（例えば、テキサスレッド）でプローブ化された検出剤（例えば、ＳＰＮ）は、低分子であり高速で回転する。一般的には、フルオロフォアによって吸収された平面偏光励起光は、蛍光の発光前にフルオロフォアが受ける分子回転と同程度に回転する。蛍光発光は、励起状態の寿命中のフルオロフォアの回転拡散、エネルギー移動、再吸収を含むいくつかの現象によって脱偏光され得る。比較的より小さいシグナリングポリヌクレオチドへの標的アレルゲンの結合は、回転を有意に減速させて回転拡散を変化させることができ、かかる変化は、結合されたアレルゲンタンパク質を定量するために使用され得る。本発明によれば、図１６および図１７に示される光学サブシステム５２０は、かかるシグナルを測定して検出されたシグナルをデジタルシグナルに変換することにより、またはアナログシグナルと使用される閾値とを比較することにより、試験サンプル中のアレルゲンの存在、不在または量をユーザに示す。
【０１９１】
この範囲で光によって励起されるフルオロフォアは、安価なレーザ照明またはＬＥＤ照明を可能にするであろう。プリント回路基板（ＰＣＢ）５５０は、蛍光シグナルをデジタルシグナルに変換することにより、またはアナログシグナルと閾値とを比較して、検出試験の読取り情報をユーザに表示するために使用され得る。いくつかの実施形態では、蛍光読取りがポリスチレンウェルプレートの場合に非常に正確でありかつ再現性があるため、読取りのためにポリスチレンウィンドウが設計され得る。
【０１９２】
蛍光偏光測定を含む以上に記載の検出方法に加えて、検出機構は、化学発光測定、比色測定、ｐＨ測定、溶存酸素測定、レドックス測定および／または他の好適な測定に依拠し得る。
適用
本発明によれば、本明細書に記載の検出システム、デバイスおよび方法は、食品サンプルなどのサンプル中のアレルゲンを検出するためにアプタマーなどの核酸ベースのディテクター分子またはアプタマー由来のＳＰＮの使用を企図する。ポータブルデバイスは、ユーザがアレルギーを示す食品サンプル中の１種以上のアレルゲンの存在または不在をユーザが試験できるようにする。本明細書に記載のシステムおよび組成物を用いて検出され得るアレルゲンファミリーとしては、食品、環境または非ヒトタンパク質、例えば家庭内ペットの鱗屑に由来するアレルゲンが挙げられる。食物アレルゲンとしては、限定されるものではないが、マメ科植物、例えばラッカセイ、エンドウ、ヒラマメおよびインゲンならびにマメ科近縁植物のルーピン、木の実、例えばアーモンド、カシュー、クルミ、ブラジルナッツ、ハシバミ／ヘーゼルナッツ、ペカン、ピスタシオ、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピンナッツ、ココヤシ、ギンナン、レイシナッツ、マカダミアナッツ、ナンガイナッツおよびパインナッツ、卵、サカナ、シェルフィッシュ、例えばカニ、ザリガニ、ロブスター、シュリンプおよびプローン、軟体動物、例えばクラム、カキ、イガイおよびスカラップ、乳、ダイズ、コムギ、グルテン、トウモロコシ、肉、例えば牛肉、豚肉、羊肉および鶏肉、ゼラチン、スルフィット、種子、例えばゴマ、ヒマワリおよびポピーシードならびにスパイス、例えばコリアンダー、ニンニクおよびカラシナ、果実、野菜、例えばセロリおよびコメが挙げられ得る。アレルゲンは、穀粉またはミールまたは任意の形態の製品に存在し得る。例えば、ルーピン、ヒマワリ、ケシなどの植物の種子は、種子入りパンなどの食品に使用される可能性があるか、または粉砕して粉にすることにより、パンもしくはペストリーの製造に使用される可能性がある。デバイスは、これらのアレルゲンの存在または不在の確認ならびにこれらのアレルゲンの量の定量が可能である。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮ、検出剤およびアッセイは、病院において、臨床食物アレルギー試験または臨床アレルギー試験に、および患者がアレルギーを示す食品／アレルゲンを同定するために使用され得る。かかるアッセイおよび方法は、食品産業でアレルゲン汚染を監視するためにも使用され得る。加えて、それは、食品を摂取する前にアレルゲン含有率を試験するために、アレルギーを有する者によって家庭またはレストランでも使用され得る。
【０１９４】
広い概念では、本明細書に記載の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮ、検出剤および方法は、食品安全に加えて、多様な用途でサンプル中の任意のタンパク質含有率の検出のために、例えば民間および戦場の現場で医学的診断および疾患予後予測のために、環境監視／管理のために、ならびに生物兵器の検出で軍事使用のためなどに使用され得る。幅広い用途においても、本発明の検出システム、デバイス、ＳＰＮ、組成物および方法は、核酸ベースのディテクター分子が結合する任意のバイオ分子を検出するために使用され得る。限定されるものではないが、いくつかの例として、検出システム、デバイス、ＳＰＮ、作用剤および方法は、癌マーカのスポット検出、インフィールド診断（化学剤暴露、外傷性頭部損傷など）、第三世界用途（ＴＢ、ＨＩＶ試験など）、救急ケア（脳卒中マーカ、頭部外傷など）および多くの用途に使用され得る。
【０１９５】
限定されるものではないが、用途の例として、本発明の検出システム、デバイス、アプタマー、ＳＰＮ、検出剤および方法は、サンプル中の病原微生物を検出および同定し得る。検出可能な病原体としては、細菌、酵母、真菌、ウイルスおよびウイルス様生物が挙げられる。病原体は、動物および植物において疾患を引き起こし得るか、食品、水、土壌もしくは他の供給源を汚染し得るか、または戦場で生物剤として使用される。デバイスは、これらの病原体を検出および同定することが可能である。
【０１９６】
他の重要な用途としては、医療ケア、例えば疾患の診断、疾患進行の病期判定および特定の治療に対する反応の監視のための本発明の検出システム、デバイス、ＳＰＮ、検出剤および方法の使用が挙げられる。限定されるものではないが、例として、本発明の検出デバイスおよびＳＰＮは、疾患（例えば、癌）に関連するバイオマーカの存在または不在または量を試験して疾患または疾患進行を予測するために使用され得る。本発明の検出システム、デバイスおよび方法は、少量の試験サンプルを分析するように設計され、大規模な実験室トレーニングを行うことなくユーザによって実施され得る。
【０１９７】
食品安全分野以外の他の拡大用途としては、軍隊組織によるインフィールド使用、抗生物質および生物薬剤の試験、殺有害生物剤および肥料などの製品の環境試験、バルクで調製される食事サプリメントおよび種々の食品成分および添加剤、例えばカフェインおよびニコチンの試験、ならびに個体が有意レベルの個別のアレルゲンに暴露されてきたかを決定するための臨床サンプル、例えば唾液、皮膚および血液の試験が挙げられる。
定義
本明細書の種々の箇所において、本開示の化合物の置換基が群または範囲で開示される。本開示は、かかる群および範囲のメンバーのあらゆる個別の部分的組合せを含むことが特に意図される。以下に用語の定義が列挙されているが、これらに限定されない。
【０１９８】
約：本明細書で用いられる場合、測定可能な値、例えば重量、時間、用量などの量を参照するときの「約」という用語は、指定量から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、なおもさらに好ましくは±０．１％の変動があっても開示された方法が適切に行われるため、そうした変動を包含することを意味する。
【０１９９】
活性：本明細書で用いられる場合、「活性」という用語は、事象が起こっているかまたは行われている状態を意味する。本発明の組成物は活性を有し得、この活性は標的分子への結合を含み得る。
【０２００】
アレルゲン：本明細書で用いられる場合、「アレルゲン」という用語は、対象において免疫反応の原因となるか、それを誘発するか、またはそれをトリガーする化合物、物質または組成物を意味する。このため、アレルゲンは、典型的には、抗原と呼ばれる。アレルゲンは、典型的には、タンパク質またはポリペプチドである。
【０２０１】
アレルゲン検出剤：本明細書で用いられる場合、「アレルゲン検出剤」という用語は、サンプル中のかかるアレルゲンの検出を可能にするように１種以上のアレルゲンと相互作用し、かつ／もしくはそれに結合することが可能であるかまたはそうする任意の作用剤を意味し、本明細書では「アレルゲン検出剤」または「検出剤」と呼ばれる。
【０２０２】
結合親和性：本明細書で用いられる場合、「結合親和性」という用語は、標的（例えば、アレルゲン）を結合するかまたは結合しない検出分子（例えば、アプタマー）の傾向を意味し、標的に結合する検出分子の結合または親和性の強度の尺度を記述する。
【０２０３】
局所コンフォメーション形状：本明細書で用いられる場合、「局所コンフォメーション形状」という用語は、ポリヌクレオチドの定義可能な空間内に位置する構造性状を意味する。
【０２０４】
検出：本明細書で用いられる場合、「検出」という用語は、多くの非標的タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を抽出することを意味し、多くの非標的タンパク質の混合物からの標的タンパク質の不在、存在および／または量を示す。
【０２０５】
検出可能な標識：本明細書で用いられる場合、「検出可能な標識」とは、他のエンティティーへの装着、組込みまたは関連付けが行われる１つ以上のマーカ、シグナルまたは部分を意味し、ただし、これらのマーカ、シグナルまたは部分は、ラジオグラフィー、蛍光、化学発光、酵素活性、吸光度、免疫学的検出を含む当技術分野で公知の方法によって容易に検出されるものとする。検出可能な標識としては、放射性同位体、フルオロフォア、クロモフォア、酵素、染料、金属イオン、リガンド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドット、ポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、フラグタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグなどが挙げられる。検出可能な標識は、その装着、組込みまたは会合が行われるエンティティー中の任意の位置に位置決めされ得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質への装着、組込みまたは会合を行うとき、標識は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の内部に存在し得るか、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置決めされ得る。
【０２０６】
ドメイン：本明細書で用いられる場合、「ドメイン」という用語は、１つ以上の同定可能な構造または機能の特徴または性質（例えば、結合能、分子相互作用部位としての機能を有するポリヌクレオチドのモチーフを意味する。
【０２０７】
蛍光偏光（ＦＰ）：本明細書で用いられる場合、「蛍光偏光」（ＦＰ）という用語は、蛍光寿命中に有意な分子運動を行うフルオロフォアによってもたらされる平面偏光光の向きの変化を意味する。この寿命は、励起光子の吸収と蛍光を介する光子の放出との間の時間として定義される。一般的には、フルオロフォアによって吸収された平面偏光励起光は、蛍光の発光前にフルオロフォアが受ける分子回転と同程度に回転する。ほとんどのフルオロフォアは、低分子であり高速で回転する。その蛍光寿命中に偏光の測定可能な変化または平面偏光光の脱偏光が起こり得る。フルオロフォアが低分子リガンドに装着されても、依然として有意な脱偏光が起こり得る。脱偏光の程度は、標的（例えば、アレルゲンタンパク質）への蛍光リガンド（検出剤）の特異的結合を定量する根拠を提供する。低分子検出剤が有意により大きいサイズの標的（例えば、アレルゲンタンパク質）に結合すると、平面偏光光を脱偏光する検出剤の能力は大幅に低減され、標的タンパク質の分子体積の追加により、蛍光寿命にわたる分子回転は大幅に低減されるであろう。実際に、特異的結合の程度は、脱偏光の程度を測定することによって定量され得る。特異的結合が大きくなるほど、元の平面偏光光の脱偏光は小さくなる。ＦＰシグナルは蛍光強度の比として表される。そのため、シグナルは、検出剤の濃度変化によって引き起こされる強度変化の影響を受けない。なぜなら、光を脱偏光するフルオロフォアの能力がその濃度の関数でないためである。むしろ、それは、蛍光寿命中に自由に回転するその能力の関数である。
【０２０８】
含む：本明細書で用いられる場合、「含む」という用語は、「含むが限定されない」を意味する。「含む」および「含むが限定されない」は、同義的に用いられる。
相互作用：本明細書で用いられる場合、「相互作用」という用語は、２つ以上の分子が互いに影響を及ぼしあうときに起こるある種の作用を意味する。本発明との関連では、検出分子と標的との相互作用は、検出分子の構造に影響を及ぼし、かかる影響は、可視化可能なエネルギー変化を生成するであろう。
【０２０９】
ループ：本明細書で用いられる場合、「ループ」という用語は、配列の骨格の方向を逆転した４ヌクレオシド（またはヌクレオチド）残基以上を含むポリヌクレオチドの構造特徴部を意味する。
【０２１０】
ポリヌクレオチド：本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸塩基が糖リン酸結合（糖−リン酸骨格）によって接続された核酸塩基のポリマーまたはオリゴマーを意味する。例示的なポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドとしては、２’デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のポリマーおよびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、全体がリボヌクレオチドで構成され得るか、全体が２’デオキシリボヌクレオチドで構成され得るか、またはそれらの組合せで構成され得る。
【０２１１】
ポリヌクレオチド変異体：本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド変異体」という用語は、天然配列または出発配列と比較して、それらの核酸配列に何らかの差を有する分子を意味する。
【０２１２】
サンプル：本明細書で用いられる場合、「サンプル」という用語は、分析対象の標的を含有する可能性のある任意の組成物、例えば、限定されるものではないが、対象（以下に詳述されるようにヒトおよび動物を含む）から得られる生物学的サンプル、環境から得られるサンプル、例えば土壌サンプル、水サンプル、農業サンプル（植物および作物のサンプルを含む）または食品サンプルを意味する。食品サンプルは、生鮮食品、加工／調理食品または冷凍食品から得られ得る。
【０２１３】
感度：本明細書で用いられる場合、「感度」という用語は、標的分子に結合する検出分子の能力を意味する。
特異的に結合する：本明細書で用いられる場合、：特異的に結合する」という用語は、検出分子（例えば、アプタマー）が代替標的に対するよりも高頻度で、迅速に、長い持続時間でかつ／または大きい親和性を有してアレルゲンタンパク質などの特定の標的に反応または会合することを意味する。例えば、アレルゲンタンパク質に特異的に結合するアプタマーは、非関連タンパク質および／またはその断片に結合するよりも大きい親和性、結合活性で、容易にかつ／または長い持続時間でそのタンパク質またはその断片に結合する。この定義によれば、例えば、第１の標的に特異的に結合する検出分子（例えば、アプタマー）は、第２の標的に特異的に結合し得るかまたし得ないと当業者により理解される。このため、「特異的結合」は、他の分子の排他的結合または検出不能な結合を必ずしも必要とせず、これは「選択的結合」という用語に包含される。一般的には、必ずではないが、結合への参照は特異的結合を意味する。結合の特異性は、アプタマーおよび環境中の他の物質または一般に非関連分子に関する解離定数と比較して、標的に対するアプタマーの相対的な解離定数（Ｋｄ）によって定義される。典型的には、標的に対するアプタマーのＫｄは、標的および環境中の非関連物質または付随物質に関するＫｄの１／２、１／５または１／１０であろう。さらにより好ましくは、Ｋｄは、１／２５、１／５０、１／７５、１／１００、１／１５０または１／２００であろう。
【０２１４】
標的：本明細書で用いられる場合、「標的」および「標的分子」という用語は、試験サンプルに見出され得、かつアプタマーまたは抗体などの検出分子に結合可能である分子を意味する。
【０２１５】
末端：本明細書で用いられる場合、「末端」という用語は、ポリヌクレオチドの末端を意味する。かかる末端は、ポリヌクレオチドの最初または最後の部位のみに限定されず、末端領域の追加のヌクレオチドを含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、５’末端および３’末端の両方を有するものとして特徴付けられ得る。
【０２１６】
ユニバーサル緩衝液：本明細書で用いられる場合、「ユニバーサル緩衝液」という用語は、さまざまなサンプルに使用され得る緩衝液を意味する。
他の実施形態
使用されてきた語は、限定ではなく説明を行う語であり、本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、そのより広い態様において、添付の特許請求の範囲内で変更形態がなされ得ることを理解されたい。
【０２１７】
いくつかの記載の実施形態に関してかなり詳細にかなり具体的に記載してきたが、いかなるそのような特定事項もしくは実施形態またはいかなる特定の実施形態にも限定されず、添付の特許請求の範囲を参照しながら、先行技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能な限り広い意味の解釈を提供するように、したがって本発明の意図された範囲を効果的に包含するように解釈されるものとする。
【０２１８】
本明細書に挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参照文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。加えて、見出し項目、材料、方法および実施例は、例示的なものにすぎず、限定しようとするものではない。
【実施例】
【０２１９】
実施例１：アレルゲンタンパク質に結合するアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸ法に基づくインビトロスクリーニング実験を行い、カウンター標的（非標的タンパク質の組合せ）と対比して卵、グルテン、乳、ダイズ、サカナ、ラッカセイ、カシューおよび甲殻動物を含むアレルゲン標的に対するアプタマーを選択し、標的食物アレルゲンの検出能力に関してさらに工学操作した。
実施計画
種々のＲＮＡライブラリーを用いて、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ、０．１％ゼラチン、１％ＮＰ−４０（テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ））、０．５％デオキシコレートナトリウムからなる選択緩衝液中において２３℃で結合能力に関して選択した。いずれも緩衝液単独中でＲＮＡライブラリーメンバーをインキュベートすることから所与のラウンドの選択を開始し（ネガティブ選択）、次いで反応（すなわち切断）しなかったライブラリーの部分を捕集した。各ラウンドの第２の部分（必要に応じて）は、前のネガティブ選択工程からの非反応分子を、非ポジティブ標的の完全な組合せ（カウンターとして）と共に、または第２のネガティブ選択のために再び選択緩衝液単独と共にインキュベートすることからなった。ここでもまた、非反応（非切断）分子が捕集されるであろう。各ラウンドの最終工程は、前工程からの物質を緩衝液中のポジティブ標的（必要に応じてアレルゲンのそれぞれ）と共にインキュベートし、次いで反応物質（すなわち切断ＲＮＡ）を捕集することからなる。各選択ラウンドに続いて、逆転写によるｃＤＮＡの生成、ＰＣＲによるライブラリーの増幅および転写によるＲＮＡライブラリーの再生を行った。プロジェクトに依存して、再びさまざまなランダム配列の初期ライブラリーを選択のさまざまな逐次ラウンド（すなわちネガティブ選択、カウンター選択およびポジティブ選択）に付した後、富化ライブラリーを３つの画分に分割して並行評価を行った。
【０２２０】
ネガティブ選択、カウンター選択およびポジティブ選択のラウンド後に富化されたライブラリーの並行評価は、富化ライブラリーの１／３を選択緩衝液単独に、他の１／３を選択緩衝液中のカウンター標的複合体に、および富化ライブラリーの最後の１／３を緩衝液中の標的アレルゲンに同時に暴露することを含む。標的アレルゲンおよびカウンター標的の両方に無差別に反応するか、または依然として標的アレルゲンの不在下で反応を生じるいずれの残留ＲＮＡ分子も同定し、さらなるバイオインフォマティクス解析中に廃棄した。
【０２２１】
並行評価後の富化ＲＮＡライブラリーをＰＡＧＥゲル評価に付した。４０ピコモルの富化ライブラリーを選択緩衝液中のネガティブ（緩衝液のみ）、カウンター標的または標的アレルゲン（例えば、乳、コムギ、卵白およびラッカセイ）のいずれかに個別に暴露した。２３℃で５分間インキュベートした後、シーケンスおよびバイオインフォマティクス解析のために、ポジティブ反応（すなわち切断）物質を呈するライブラリーを捕集し、エタノール沈澱させ、逆転写し、かつＰＣＲ増幅した。
材料および方法
予備分析およびアプタマースクリーニングのためにＲＮアーゼフリーの水と組み合わせる前に、必要に応じて標的（カシュー、ラッカセイ、サカナ、乳、ダイズ、グルテン、卵および甲殻動物に由来するタンパク質複合体）を乾燥減量した。必要に応じて、選択でポジティブ標的に指定されなかった標的を適切量で組み合わせることにより、標的をプールしてカウンター標的混合物を生成した。初期アプタマーライブラリーの鋳型およびプライマーをＩＤＴ（アイオワ州のコーラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ））によって一本鎖ＤＮＡとして合成した。次いで、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（カリフォルニア州のマウンテンビュー）製のチタンＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてライブラリーをプライマー伸長させ、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ）を提供した。
【０２２２】
実施計画に従って、ライブラリーの所与の世代において、エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）（ウィスコンシン州のマディソン）製のアンプリスクライブ（ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ）Ｔ７転写キットを用いて、前のｄｓＤＮＡからＲＮＡを転写し、かつ１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて精製した。精製されたＲＮＡを選択緩衝液と組み合わせ、次いでネガティブ選択のために１×濃度（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＳＤＳ、０．１％ゼラチン、１％ＮＰ−４０（テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ））、０．５％デオキシコレートナトリウム）に希釈した。ネガティブ選択をリフォールディングサイクルから始めた。このサイクルは、サンプルを６５℃に加熱してＲＮＡを変性させた後、インキュベーションの残りの部分でサンプルを２３℃にすることを含んでいた。インキュベーション後、１０％変性ＰＡＧＥを用いて切断ＲＮＡから非切断ＲＮＡを分離した。回収された非切断物質を、選択工程に依存して、カウンター標的および緩衝液、標的および緩衝液または緩衝液単独と組み合わせ、２３℃でインキュベートし、かつ１０％変性ＰＡＧＥで分割した。必要に応じて、回収工程および他の選択工程を実施した。次いで、溶出させた選択後ライブラリーからスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素（カリフォルニア州カールスバッドのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてｃＤＮＡを生成し、次いでチタンＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア州マウンテンビューのクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いてＰＣＲ増幅し、１ラウンドの選択を終了した。数ラウンドの選択工程後、ライブラリーを富化したところ、ネガティブ切断量が３０％未満であり、かつカウンターと比較してポジティブ処理で少なくとも５％超の切断であることが示された。
【０２２３】
約１０１４のランダム配列からなる初期ライブラリーをリボザイムベースのＳＥＬＥＸのさまざまなラウンドに付して、選択の複数ラウンドにわたり、標的アレルゲンに結合する配列を富化し、かつカウンター標的に結合する配列を排除した。結果として、シーケンスされる集団は、潜在的なアプタマー候補物質の複数のコピーを含有すると予想される（ファン・シマエイス（Ｖａｎ  Ｓｉｍａｅｙｓ）ら著、「卵巣癌細胞を通して選択されたアプタマーの分子認識に関する研究−ＳＥＬＥＸ（Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ）」、ブロス・ワン（ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ）、２０１０年、第５巻、第１１号、ｅ１３７７０）。
シーケンシングおよびバイオインフォマティクス
選択後、ペアエンドリード技術を用いてイルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（カリフォルニア州サンディエゴ）ＭｉＳｅｑシステムを実施しアプタマーをシーケンスした。シーケンシングデータのバイオインフォマティクス解析によって候補アプタマー分子を同定した。ディープシーケンシング分析および後続のデータ分析は、スクリーニングプロセスに起因して誤りおよび偏りが導入される可能性のある多数の選択を行う従来の手法を軽減した（シュッツェ（Ｓｃｈｕｅｔｚｅ）ら著、次世代シーケンシングによるＳＥＬＥＸプロセスのプローブ化（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ブロス・ワン（ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ）、２０１１年、第６巻、第１２号、ｅ２９６０４）。
アプタマー候補物質の選択
配列ファミリー構築では、モチーフの存在に重点を置いた。すなわち、ポジティブ標的集団中の配列頻度を因子として組み込んだが、全集団中のサブ配列の出現度により大きい重点を置いた（全配列にわたって１００％のマッチでもファミリーに加える必要がない）。２つの他の因子を用いてモチーフファミリーサイズの重要性を調整することによって候補配列を決定した。１つの因子は、ネガティブおよびカウンター標的集団中の配列の存在である。３つのライブラリー：ポジティブ標的暴露ライブラリー、緩衝液単独ネガティブライブラリーおよびカウンター標的暴露ライブラリーを並行評価から捕集した。すべてのライブラリーを分析して、ネガティブまたはカウンター選択工程中にいまだに除去されずに依然として標的およびカウンター標的の両方に親和性を有するいずれの配列も発見した。所与の配列は、カウンター標的暴露集団よりもポジティブ集団で高頻度に現われるため、さらなる試験に対する魅力的候補物質となる。
【０２２４】
Ｍｆｏｌｄ二次構造モデリングソフトウェアを用いて所与の候補物質配列の二次構造も予測した（ズッカー（Ｚｕｃｋｅｒ）著、「核酸のフォールディングおよびハイブリダイゼーションの予測のためのＭｆｏｌｄウェブサーバ（Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２００３年、第３１巻、第１３号、ｐ．３４０６〜３４１５）。
【０２２５】
アプタマー配列のセットを選択し、カシュー、ラッカセイ、卵白、コムギ、サカナ、ダイズ、乳および甲殻動物を含むさまざまな食物アレルゲンを検出するためのシグナリングポリヌクレオチドとしてさらに設計した。全長配列および各アレルゲンに対する選択されたアプタマーの結合特異性を規定するコア配列は、表１に列挙されている。次いで、各食物アレルゲンに対して選択されたアプタマーの５’末端および３’末端のいずれか一方または両方をさらに修飾して、その標的アレルゲンに対する結合親和性を最適化した。５’末端にフルオロフォアプローブ（例えば、テキサスレッド）を有することが意図される改変配列は、本明細書に記載されるようにアレルゲン検出の試験が行われるシグナリングポリヌクレオチドである。
実施例２：シグナリングポリヌクレオチドの生成
概念実証の実施例として、実施例１に示されるスクリーニングから選択された２つのアプタマーを用いてさまざまなシグナリングポリヌクレオチドを設計した。ストラテジーは、スクリーニングに使用したプライマーをできる限り多く欠失させるが、標的アレルゲンに対する特異性を確保するためのコア結合配列を維持するものである。
ラッカセイに特異的なシグナリングポリヌクレオチド
ラッカセイに特異的なスクリーニング（実施例１）から選択されたアプタマーを使用した。アプタマーの全長配列は以下に示される。
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧＣＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣ３’（７  ＲｉｂｏＳＰＮ＿全長配列；配列番号８３）
ラッカセイに結合するコア配列は以下に示される。
５’ＣＴＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＧＴＧ３’（７ＳＰＮ−コア配列、配列番号８４）
配列番号８４の結合配列を変化させることなく５’末端および３’末端の両方のプライマーをできる限り多く欠失させるように配列番号８３の元の全長配列を改変した。また、５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方の末端に追加のヌクレオチドを付加した。結合配列に影響を及ぼすことなく単一の開放構造を形成する最短配列をアレルゲン検出に関して試験した。得られたシグナリングポリヌクレオチドには、７ＳＰＮ−Ａ（配列番号８５）、７ＳＰＮ−Ｂ（配列番号８６）、７ＳＰＮ−Ｃ（配列番号８７）、７ＳＰＮ−Ｄ（配列番号８８）、７ＳＰＮ−Ｅ（配列番号８９）、７ＳＰＮ−Ｆ（配列番号９０）、７ＳＰＮ−Ｇ（配列番号９１）、７ＳＰＮ−Ｈ（配列番号９２）、７ＳＰＮ−Ｉ（配列番号９３）、７ＳＰＮ−Ｊ（配列番号９４）、７ＳＰＮ−Ｋ（配列番号９５）および７ＳＰＮ−Ｌ（配列番号９６）が含まれる。
卵に特異的なシグナリングポリヌクレオチド
卵に特異的なスクリーニング（実施例１）から選択されたアプタマーを使用した。アプタマーの全長配列は以下に示される。
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＴＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧＣＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＣ３’（１７  ＲｉｂｏＳＰＮ＿全長配列；配列番号２２８）
ラッカセイに結合するコア配列は以下に示される。
５’ＣＣＡＡＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＧＣＴＴＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＡＧ３’（１７ＳＰＮコア配列、配列番号２２９）
配列番号２２９の結合配列を変化させることなく５’末端および３’末端の両方のプライマーをできる限り多く欠失させるように配列番号２２８の元の全長配列を改変した。また、５’末端もしくは３’末端のいずれかまたは両方の末端に追加のヌクレオチドを付加した。結合配列に影響を及ぼすことなく単一の開放構造を形成する最短配列をアレルゲン検出に関して試験した。得られたシグナリングポリヌクレオチドには、１７ＳＰＮ−Ａ（配列番号２３０）、１７ＳＰＮ−Ｂ（配列番号２３１）、１７ＳＰＮ−Ｃ（配列番号２３２）、１７ＳＰＮ−Ｄ（配列番号２３３）、１７ＳＰＮ−Ｅ（配列番号２３４）、１７ＳＰＮ−Ｆ（配列番号２３５）、１７ＳＰＮ−Ｇ（配列番号２３６）および１７ＳＰＮ−Ｈ（配列番号２３７）が含まれる。
【０２２６】
同様に、スクリーニングから選択されたアプタマーの配列（表１）および開示された文献の配列（表２）に基づいてシグナリングポリヌクレオチドを設計した。蛍光偏光の変化の測定によるアレルゲン検出のためにシグナリングポリヌクレオチドを使用する。
実施例３：蛍光偏光測定
ラッカセイアレルゲンに結合するシグナリングポリヌクレオチド７ＳＰＮ−Ａ（配列番号８５）、７ＳＰＮ−Ｂ（配列番号８６）、７ＳＰＮ−Ｃ（配列番号８７）の５’末端をフルオロフォアのテキサスレッドで標識する（ＳＰＮ−Ｐと表記する）。ラッカセイを含有するいくつかの異なる食品サンプルをＴ緩衝液で処理する。各試験に２０μｌのサンプルを使用する。ＳＰＮ−Ｐ（１００μＭの濃度で２０μｌのＳＰＮ−Ｐ）を用いるかまたはＳＰＮ−Ｐを用いない蛍光偏光を測定する。試験設計は表３に列挙される。ＦＰの変化は市販のＦＰ装置で測定される。
【０２２７】
【表３】
2019511715.tif 000019
【０２２８】
同様に、卵アレルゲンに結合するシグナリングポリヌクレオチド１７ＳＰＮ−Ａ（配列番号２３０）、１７ＳＰＮ−Ｂ（配列番号２３１）、１７ＳＰＮ−Ｃ（配列番号２３２）、１７ＳＰＮ−Ｄ（配列番号２３３）の５’末端をフルオロフォアのテキサスレッドで標識する。テキサスレッドで標識されたシグナリングポリヌクレオチドを用いてアレルゲン結合による蛍光偏光の変化を試験する。
【図１ａ】
2019511715.tif 000020
【図１ｂ】
2019511715.tif 000021
【図２ａ】
2019511715.tif 000022
【図２ｂ】
2019511715.tif 000023
【図２ｃ】
2019511715.tif 000024
【図３ａ】
2019511715.tif 000025
【図３ｂ】
2019511715.tif 000026
【図３ｃ】
2019511715.tif 000027
【図３ｄ】
2019511715.tif 000028
【図３ｅ】
2019511715.tif 000029
【図３ｆ】
2019511715.tif 000030
【図３ｇ】
2019511715.tif 000031
【図４ａ】
2019511715.tif 000032
【図４ｂ】
2019511715.tif 000033
【図５ａ】
2019511715.tif 000034
【図５ｂ】
2019511715.tif 000035
【図６ａ】
2019511715.tif 000036
【図６ｂ】
2019511715.tif 000037
【図６ｃ】
2019511715.tif 000038
【図６ｄ】
2019511715.tif 000039
【図７ａ】
2019511715.tif 000040
【図７ｂ】
2019511715.tif 000041
【図７ｃ】
2019511715.tif 000042
【図７ｄ】
2019511715.tif 000043
【図８ａ】
2019511715.tif 000044
【図８ｂ】
2019511715.tif 000045
【図９ａ】
2019511715.tif 000046
【図９ｂ】
2019511715.tif 000047
【図１０ａ】
2019511715.tif 000048
【図１０ｂ】
2019511715.tif 000049
【図１１】
2019511715.tif 000050
【図１２ａ】
2019511715.tif 000051
【図１２ｂ】
2019511715.tif 000052
【図１３ａ】
2019511715.tif 000053
【図１３ｂ】
2019511715.tif 000054
【図１３ｃ】
2019511715.tif 000055
【図１３ｄ】
2019511715.tif 000056
【図１３ｅ】
2019511715.tif 000057
【図１４】
2019511715.tif 000058
【図１５ａ】
2019511715.tif 000059
【図１５ｂ】
2019511715.tif 000060
【図１６】
2019511715.tif 000061
【図１７】
2019511715.tif 000062
【図１８】
2019511715.tif 000063
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月14日(2018.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511715000001.app
【国際調査報告】
2019511715.tif 000064
2019511715.tif 000065
2019511715.tif 000066
2019511715.tif 000067
2019511715.tif 000068