(57)【要約】  一方の末端にシアル酸を含有するシアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、スフィンゴ脂質を除く炭素数１４〜１８の脂肪酸がアミド結合してなり、かつ分子量が４００〜１，４００であることを特徴とするシアル酸含有糖鎖複合体、該複合体を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤、該抗インフルエンザウイルス剤を担持するフィルター。
2011158388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方の末端にシアル酸を含有するシアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、スフィンゴ脂質を除く炭素数１４〜１８の脂肪酸がアミド結合してなり、かつ分子量が４００〜１，４００であることを特徴とするシアル酸含有糖鎖複合体。
【請求項２】
シアル酸のカルボキシル基がアミド化された請求項１に記載のシアル酸含有糖鎖複合体。
【請求項３】
シアル酸含有糖鎖が、１個〜５個の単糖で構成される請求項１から２のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体。
【請求項４】
シアル酸含有糖鎖が、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と、ガラクトース（Ｇａｌ）とからなるシアリルガラクトース鎖（Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ）を含む請求項１から３のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体。
【請求項５】
シアル酸含有糖鎖が、３’−シアリルガラクトース鎖（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ）、及び、６’−シアリルガラクトース鎖（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ）のいずれかを有する請求項１から４のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体。
【請求項６】
シアル酸含有糖鎖が、３’−シアリルラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、６’−シアリルラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、３’−シアリルラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、６’−シアリルラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、３’−シアリルアミドラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、６’−シアリルアミドラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、３’−シアリルアミドラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、６’−シアリルアミドラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、３’−シアリルガラクトシルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ）、６’−シアリルガラクトシルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ）、３’−シアリルガラクトシルガラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ）、及び６’−シアリルガラクトシルガラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ）からなる群より選択される請求項１から５のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法であって、一方の末端にシアル酸を含有するシアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、スフィンゴ脂質を除く炭素数１４〜１８の脂肪酸を、化学反応により結合させることを特徴とするシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法。
【請求項８】
シアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端を、アシルアミド化する請求項７に記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法。
【請求項９】
シアル酸含有糖鎖のシアル酸のカルボキシル基を、アシルアミド化する請求項７から８のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法。
【請求項１０】
シアル酸含有糖鎖と炭酸水素アンモニウムとを反応させ、次いで、得られた反応物と脂肪酸とを縮合剤の存在下で反応させる請求項７から９のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体を有効成分として含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項１２】
シアル酸含有糖鎖複合体を構成するシアル酸含有糖鎖が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン認識部位を有する請求項１１に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項１３】
インフルエンザウイルスのヘマグルチニン認識部位が、３’−シアリルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ）、及び、６’−シアリルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ）のいずれかである請求項１２に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
【請求項１４】
請求項１１から１３のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤を担持したことを特徴とするフィルター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なシアル酸含有糖鎖複合体及びその効率的な製造方法、並びに、該シアル酸含有糖鎖複合体を有効成分として含有する抗インフルエンザウイルス剤、及び該抗インフルエンザウイルス剤を担持したフィルターに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、そのエンベロープに存在するスパイクタンパク質の１つであるヘマグルチニン（ＨＡ）が、標的細胞の細胞膜表面に存在する複合糖質のシアル酸を含む糖鎖を認識し、該糖鎖に結合して、標的細胞への感染を成立させることが一般に知られている。
また、鳥インフルエンザウイルスは、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ−といった糖鎖を、ヒトインフルエンザウイルスは、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ−といった糖鎖をそれぞれ特異的に認識し、このことがインフルエンザウイルス感染の特異性を作り出す要因であると考えられている。【０００３】
現在、インフルエンザの予防又は治療方法としては、ワクチンの予防接種や、抗インフルエンザ薬として使用認可されているアマンタジン（シンメトレル（登録商標））やオセルタミビル（タミフル（登録商標））の投与が主である。
しかし、これらの予防又は治療方法には、それぞれ一長一短があることが既に知られている。例えば、ワクチンは、該ワクチンの接種により産生されたＩｇＡが、呼吸器系の粘液中に分泌されることにより、ウイルスの細胞への付着を防ぐことができるが、タイプの異なる新型ウイルスに対しては無力であることが知られている。また、アマンタジンは、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質のイオンチャンネル作用を阻害し、標的細胞に侵入した後のインフルエンザウイルスの脱殻を抑制することができるが、Ｍ２タンパク質のないＢ型、Ｃ型ウイルスに対する効果はなく、強い副作用や耐性菌の発現が問題とされている。また、タミフルは、インフルエンザウイルスのエンベロープに存在するスパイクタンパク質の１つであるノイラミニダーゼ（ＮＡ）の作用を阻害し、複製されたインフルエンザウイルスが感染した標的細胞から遊離して他の細胞に感染を広げることを抑制することができるが、その効果の発現のためには、感染初期（４８時間以内）の服用が必須とされ、また、近年、若年者に対する副作用が問題となっている。【０００４】
前記従来のワクチンや抗インフルエンザ薬の問題点を克服できるような、新たなインフルエンザの予防又は治療方法の研究開発は、広く行われている。例えば、ウイルス受容体の被認識部位を含む糖鎖を持つスフィンゴ糖脂質を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤が報告されている（特許文献１参照）。具体的には、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であるガングリオシド類のうち、天然物から抽出したＧＭ４（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ−Ｃｅｒ）、ＧＭ３（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、ＧＤ１ａ（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−３）ＧａｌＮＡｃ（β１−４）（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３））Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）、及びＳＰＧ（シアリルパラグロボシド：Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ（β１−４）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｃｅｒ）に、インフルエンザウイルスに対する感染阻止活性が認められ、その感染阻止力の強さは、ＳＰＧ＞ＧＤ１ａ＞ＧＭ３＞ＧＭ４の順であったことが開示されている。【０００５】
しかし、前記特許文献１に開示された抗インフルエンザウイルス剤は、未だ実用化には至っておらず、また、前記抗インフルエンザウイルス剤として開示されたガングリオシド類はミンククジラの脳やヒト赤血球といった天然物から抽出されたものであることから、抗インフルエンザ薬としての実用化には有効成分の大量調製が望まれる点を鑑みると、やや困難があるのではないかと考えられる。
また、インフルエンザの流行は大きな問題であり、現在使用されているアマンタジンやタミフルなどの既存薬も、前記したようにそれぞれ副作用や服用時期の制限、耐性株の出現の危険性などといった欠点を有している。【０００６】
また、本出願人らは、以前にシアル酸含有糖鎖複合体が抗インフルエンザウイルス活性を有することを見出した（特許文献２参照）。
しかし、この報告における実施例では脂肪酸アミドの脂肪酸の炭素数が１２のシアル酸含有糖鎖複合体しか開示されておらず、脂肪酸アミドの脂肪酸の炭素数が１２のシアル酸含有糖鎖複合体では抗インフルエンザウイルス活性が不十分であり、更なる抗インフルエンザウイルス活性の向上が望まれていた。【０００７】
したがって、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、投与時期や投与対象の年齢などに制限がなく、かつ副作用がなく安全性の高い、新たな抗インフルエンザウイルス剤についての早急な研究開発及び実用化が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−２３３７７３号公報
【特許文献２】特開２００７−３０８４４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、抗インフルエンザウイルス活性を有する、新規なシアル酸含有糖鎖複合体及びその効率的な製造方法、並びに、該シアル酸含有糖鎖複合体を含有し、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、投与時期や投与対象の年齢などに制限がなく、かつ副作用がなく安全性の高い抗インフルエンザウイルス剤、及び前記抗インフルエンザウイルス剤を担持したフィルターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
標的細胞が有する成分を認識して標的細胞に結合し、感染を成立させるウイルスや細菌に対しては、前記ウイルスや細菌に認識される標的細胞の糖鎖と同程度の、又は、それ以上に強い親和性を有する成分を外部から添加すれば、前記ウイルスや細菌による感染が阻害されると考えられる。
ところが、前記ヘマグルチニン（ＨＡ）認識部位を有する糖鎖であるにもかかわらず、シアリルオリゴ糖である、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）及び３’−シアリルラクトサミン（３’−ＳＬＮ：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）は、抗インフルエンザウイルス活性を示さなかった。【００１１】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、抗インフルエンザウイルス活性を示さなかったシアリルオリゴ糖に対して、一定の分子量を有し、一定の炭素数の脂肪酸を結合させた、シアリルオリゴ糖と脂肪酸との複合体を新たに作製したところ、得られた複合体は、優れた抗インフルエンザウイルス活性を示すようになったことを見出し、本発明の完成に至った。【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  一方の末端にシアル酸を含有するシアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、スフィンゴ脂質を除く炭素数１４〜１８の脂肪酸がアミド結合してなり、かつ分子量が４００〜１，４００であることを特徴とするシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜２＞  シアル酸のカルボキシル基がアミド化された前記＜１＞に記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜３＞  シアル酸含有糖鎖が、１個〜５個の単糖で構成される前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜４＞  シアル酸含有糖鎖が、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と、ガラクトース（Ｇａｌ）とからなるシアリルガラクトース鎖（Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ）を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜５＞  シアル酸含有糖鎖が、３’−シアリルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ）、及び、６’−シアリルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ）のいずれかを有する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜６＞  シアル酸含有糖鎖が、３’−シアリルラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、６’−シアリルラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、３’−シアリルラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、６’−シアリルラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、３’−シアリルアミドラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、６’−シアリルアミドラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、３’−シアリルアミドラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、６’−シアリルアミドラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、３’−シアリルガラクトシルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ）、６’−シアリルガラクトシルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ）、３’−シアリルガラクトシルガラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ）、及び６’−シアリルガラクトシルガラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ）からなる群より選択される前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜７＞  脂肪酸の炭素数が、１６〜１８である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜８＞  分子量が、７５０〜９５０である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体である。
＜９＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法であって、一方の末端にシアル酸を含有するシアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、スフィンゴ脂質を除く炭素数１４〜１８の脂肪酸を、化学反応により結合させることを特徴とするシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法である。
＜１０＞  シアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端を、アシルアミド化する前記＜９＞に記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法である。
＜１１＞  シアル酸含有糖鎖のシアル酸のカルボキシル基を、アシルアミド化する前記＜９＞から＜１０＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法である。
＜１２＞  シアル酸含有糖鎖と炭酸水素アンモニウムとを反応させ、次いで、得られた反応物と脂肪酸とを縮合剤の存在下で反応させる前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法である。
＜１３＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のシアル酸含有糖鎖複合体を有効成分として含有することを特徴とする抗インフルエンザウイルス剤である。
＜１４＞  シアル酸含有糖鎖複合体を構成するシアル酸含有糖鎖が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン認識部位を有する前記＜１３＞に記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜１５＞  インフルエンザウイルスのヘマグルチニン認識部位が、３’−シアリルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ）、及び、６’−シアリルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ）のいずれかである前記＜１３＞から＜１４＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤である。
＜１６＞  前記＜１３＞から＜１５＞のいずれかに記載の抗インフルエンザウイルス剤を担持したことを特徴とするフィルターである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、抗インフルエンザウイルス活性を有する、新規なシアル酸含有糖鎖複合体及びその効率的な製造方法、並びに、該シアル酸含有糖鎖複合体を含有し、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、投与時期や投与対象の年齢などに制限がなく、かつ副作用がなく安全性の高い抗インフルエンザウイルス剤、及び前記抗インフルエンザウイルス剤を担持したフィルターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、従来の製造方法及び本発明の製造方法で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２）のＴＬＣの結果を示す図である。
【図２】図２は、製造例１で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）のＴＬＣの結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例１において本発明の製造方法で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２）のＴＬＣの結果を示す図である。「Ｍ」は、マーカーとして使用したクジラ脳ガングリオシド混合液を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例１で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２）及び製造例２で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６）のＴＬＣの結果を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、製造例１で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）及び製造例３で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８）のＴＬＣの結果を示す図である。「Ｍ」は、マーカーとして使用したクジラ脳ガングリオシド混合液を示す。
【図４】図４は、製造例１で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）、製造例５で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４）、及び製造例６で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）のＴＬＣの結果を示す図である。「Ｍ」は、マーカーとして使用したクジラ脳ガングリオシド混合液を示す。
【図５】図５は、製造例１〜３で製造したシアル酸含有糖鎖複合体の原料として使用したシアリルオリゴ糖（３’−ＳＬ）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図６】図６は、製造例３で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図７】図７は、製造例４で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、製造例５で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４）のＬＣ／ＭＳのスペクトルを示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、製造例５で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４）のＬＣ／ＭＳのスペクトルを示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、製造例５で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、製造例５で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図９】図９は、製造例５及び製造例８で製造したシアル酸含有糖鎖複合体の原料として使用したシアリルオリゴ糖（６’−ＳＬＮ）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、製造例６で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、製造例６で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１１】図１１は、製造例６及び７で製造したシアル酸含有糖鎖複合体の原料として使用したシアリルオリゴ糖（６’−ＳＬ）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１２】図１２は、製造例７で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、製造例８で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、製造例８で製造したシアル酸含有糖鎖複合体（６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８）のプロトンＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、試験例５におけるマウスの体重変動を示す図である。「○」は対照群、「＊」は３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与対照群、「■」は３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群、「▲」は３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経鼻投与群、及び「◆」はウイルス投与群を示す。縦軸：体重（ｇ）、横軸：インフルエンザウイルス投与後日数。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、試験例５におけるマウスの生存率を示す図である。縦軸：生存率（％）、横軸：インフルエンザウイルス投与後日数。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、試験例５におけるマウスの血清中のＩＬ−６濃度を示す図である。縦軸：ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍＬ）。「＊」は、ｐ＜０．０５（ｔ検定）を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、試験例５におけるマウスの血清中のＩＮＦ−γ濃度を示す図である。縦軸：ＩＮＦ−γ濃度（ｐｇ／ｍＬ）。「＊」は、ｐ＜０．０５（ｔ検定）を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、試験例５におけるマウスの肺組織中のウイルス力価を示す図である。縦軸：ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）。「＊」は、ｐ＜０．０５（ｔ検定）を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、試験例５におけるマウスの生存率の変化を示す図である。縦軸：生存率（％）、横軸：インフルエンザウイルス投与後日数。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、試験例５におけるマウスの血清中のＩＬ−６濃度を示す図である。縦軸：ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍＬ）。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、試験例５におけるマウスの肺組織中のウイルス力価を示す図である。縦軸：ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）。
【図１６】図１６は、試験例１０において、シアル酸含有糖鎖複合体におけるシアル酸のカルボキシル基がアミド化した場合のシアリダーゼ抵抗性を確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（シアル酸含有糖鎖複合体）
本発明のシアル酸含有糖鎖複合体は、シアル酸含有糖鎖と脂肪酸とが結合してなる。
【００１６】
＜分子量＞
前記シアル酸含有糖鎖複合体の分子量としては、４００〜１，４００であり、４３０〜９５０が好ましく、５９０〜９５０がより好ましく、７５０〜９５０が更に好ましく、８００〜９５０が特に好ましい。
前記分子量が、４００未満であると、所望の程度の抗インフルエンザウイルス活性を示さないことがあり、１，４００を超えると、水溶液中で抗インフルエンザウイルス活性に有利なミセル構造を形成しないことがあり、そのため、所望の程度の抗インフルエンザウイルス活性を示さないことがある。一方、前記分子量が、７５０〜９５０の範囲内であると、水溶液中で抗インフルエンザウイルス活性に有利なミセル構造を形成し易い点で、有利である。
【００１７】
＜脂肪酸＞
前記脂肪酸としては、炭素数１４〜１８の脂肪酸であるが、炭素数１６〜１８の脂肪酸が、抗インフルエンザ活性が強い点で好ましい。ただし、スフィンゴ脂質は、前記脂肪酸から除外されるものとする。前記脂肪酸から除外されるスフィンゴ脂質の具体例としては、セラミドが挙げられる。
【００１８】
前記脂肪酸は、疎水性であることが好ましい。前記脂肪酸が疎水性であると、前記シアル酸含有糖鎖複合体は全体として両親媒性となり、水溶液中でミセル構造をとるようになると考えられる。前記シアル酸含有糖鎖複合体が水溶液中でミセル構造をとると、好ましくはインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の認識部位を有する糖鎖が、外側に位置するようになる。そのため、該糖鎖は、よりヘマグルチニンタンパク質に認識され易くなり、インフルエンザウイルスの該糖鎖への結合が促進されて、結果として、インフルエンザウイルスの本来の標的細胞への結合を、より効率よく阻害することができるようになると考えられる。
【００１９】
前記脂肪酸としては、炭素数１４〜１８であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、直鎖脂肪酸、不飽和脂肪酸、分岐脂肪酸などが挙げられる。これらの中でも、前記脂肪酸は、水溶液中で抗インフルエンザウイルス活性に有利なミセル構造を形成し易い点や、安定性の点で、直鎖脂肪酸が好ましい。
なお、前記不飽和脂肪酸は二重結合が酸化されやすく、抗インフルエンザウイルス剤中で不安定要素になり得るという欠点があることから、前記脂肪酸として前記不飽和脂肪酸を使用する場合には、例えば、酸化防止剤と併用するなどの使用方法が好ましい。
【００２０】
＜シアル酸含有糖鎖＞
前記シアル酸含有糖鎖としては、一方の末端にインフルエンザウイルスの結合部位となるシアル酸を有する糖鎖であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましい抗インフルエンザウイルス活性を有するという点で、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン認識部位に該当する糖鎖部位を有していることが好ましい。
インフルエンザウイルスのヘマグルチニンが糖鎖を認識するには、前記糖鎖がシアル酸を有していることのみならず、前記シアル酸と、前記シアル酸と結合しているガラクトースとの結合様式が重要であることが知られている。なお、鳥インフルエンザウイルスは、シアル酸がガラクトースの３位に結合した、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ−といった糖鎖を、ヒトインフルエンザウイルスは、シアル酸がガラクトースの６位に結合した、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ−といった糖鎖を、それぞれ特異的に認識することが知られている。
【００２１】
したがって、前記シアル酸含有糖鎖は、一方の末端にインフルエンザウイルスの結合部位となるシアル酸を有することが必要であり、また、シアル酸とガラクトースが結合したシアリルガラクトース鎖を有することが好ましく、これらの中でも、前記シアル酸含有糖鎖は、３’−シアリルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ）、及び、６’−シアリルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ）のいずれかを有することがより好ましく、３’−シアリルラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、６’−シアリルラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、３’−シアリルラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、６’−シアリルラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、３’−シアリルアミドラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、６’−シアリルアミドラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）、３’−シアリルアミドラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、６’−シアリルアミドラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）、３’−シアリルガラクトシルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ）、６’−シアリルガラクトシルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ）、３’−シアリルガラクトシルガラクトサミン鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ）、及び、６’−シアリルガラクトシルガラクトサミン鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ）からなる群より選択されることが、特に好ましい。
【００２２】
また、前記シアル酸含有糖鎖を構成する単糖の個数としては、目的に応じて適宜選択することができるが、１個〜５個が好ましく、２個〜３個がより好ましく、３個が特に好ましい。即ち、前記シアル酸含有糖鎖としては、シアル酸のみからなるものであってもよいが、シアル酸と一糖又は二糖からなるものがより好ましく、シアル酸と二糖（合計三糖）からなるものが特に好ましい。
【００２３】
一般に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と結合する糖鎖部は、シアル酸含有糖鎖の先端二糖部分であることが知られている。上述のとおり、例えば、鳥インフルエンザウイルスは、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌといった糖鎖を、ヒトインフルエンザウイルスは、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ−といった糖鎖をそれぞれ特異的に認識する。
本発明のシアル酸含有糖鎖複合体が合計三糖を有する場合、第三番目の糖がＮ−アセチル化されていると、水溶液中で集合体（ミセル等）を形成した際に、Ｎ−アセチル化されていない場合と比較して単分子専有面積が広がることでスペース的な余裕ができ、各分子の糖鎖提示性が高まるために、インフルエンザウイルスによりＮｅｕ５Ａｃ（α２−３）ＧａｌやＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ等の構造がより認識され易くなり、また隣接分子による障害がなくなるために、インフルエンザウイルスの該糖鎖への結合が促進されて、結果として、インフルエンザウイルスの本来の標的細胞への結合を、より効率よく阻害することができるようになると考えられる。
【００２４】
前記シアル酸含有糖鎖を構成する単糖の個数が２個以上である場合、前記シアル酸に隣接する単糖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ガラクトース（Ｇａｌ）が好ましい。また、前記シアル酸含有糖鎖を構成する単糖の個数が３個以上である場合、前記シアル酸に隣接する単糖に、更に隣接する単糖（シアル酸の隣の隣の単糖）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ガラクトース（Ｇａｌ）、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、及び、グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からなる群より選択されることが好ましい。
これらの中でも、インフルエンザウイルスに対する前記シアル酸含有糖鎖の結合性が高く、抗インフルエンザウイルス活性により優れることが期待されるという点で、ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がより好ましく、ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が特に好ましい。
【００２５】
また、前記シアル酸含有糖鎖を構成するシアル酸は、更にカルボキシル基がアミド化されていることが、抗インフルエンザウイルス活性により優れる点で好ましい。
シアル酸のカルボキシル基がアミド化された場合であっても、シアル酸含有糖鎖複合体の分子量にはほとんど影響しない。したがって、ヘマグルチニン（ＨＡ）の認識部位に大きな立体構造の変化が生じることがなく、インフルエンザウイルスとの結合を阻害することがない点で好ましい。
また、シアル酸のカルボキシル基がアミド化すると、カルボキシル基におけるマイナスチャージがなくなるため、合成後にシアル酸含有糖鎖複合体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析する際に分析を容易に行うことができるようになる点で有利である。
更に、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されると、シアリダーゼ活性に対する抵抗性が生じる。インフルエンザウイルスが感染細胞から娘ウイルスが放出される際には、娘ウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）と、宿主細胞のレセプターのシアル酸含有糖鎖との結合を切ることが必要となるため、インフルエンザウイルスのシアリダーゼ活性を阻害することで、インフルエンザウイルスの感染及び増殖のサイクルを抑制することができる点で有利である。
【００２６】
＜結合＞
前記シアル酸含有糖鎖と前記脂肪酸との結合としては、前記シアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、前記脂肪酸がアミド結合されていれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ここで、「シアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、前記脂肪酸がアミド結合している」とは、シアル酸含有糖鎖の糖と、脂肪酸のカルボキシル基とが、−ＮＨ−を介して結合していることをいい、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される。
Ａ−（Ｂ）ｎ−ＮＨ−Ｃ  ・・・一般式（Ｉ）
上記一般式（Ｉ）において、「Ａ」はシアル酸を表し、「Ｂ」は単糖を表し、「Ｃ」は脂肪酸を表す。また、「ｎ」は０又は１以上の整数を表し、０〜４が好ましく、１〜２がより好ましく、２が特に好ましい。
【００２７】
前記結合方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記シアル酸含有糖鎖への、前記脂肪酸に対応したアシル基の導入法などが挙げられる。前記シアル酸含有糖鎖への前記アシル基の導入法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、Ｏ−グリコシド化、Ｎ−グリコシド化、Ｓ−グリコシド化、Ｃ−グリコシド化による導入法などが好ましく、Ｎ−グリコシド化（アシルアミド化、アミド結合）による導入法が、安定性の点で特に好ましい。
【００２８】
前記シアル酸含有糖鎖複合体は、前記シアル酸含有糖鎖と前記脂肪酸とが、任意の組み合わせで結合してなる。
このような、前記シアル酸含有糖鎖複合体の好ましい具体例としては、例えば、３’−シアリルラクトシルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、３’−シアリルラクトシルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、３’−シアリルラクトシルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。）、６’−シアリルラクトシルミリスチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、６’−シアリルラクトシルパルミチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、６’−シアリルラクトシルステアリン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。）、３’−シアリルラクトサミニルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、３’−シアリルラクトサミニルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、３’−シアリルラクトサミニルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。）、６’−シアリルラクトサミニルミリスチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、６’−シアリルラクトサミニルパルミチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、６’−シアリルラクトサミニルステアリン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。））、３’−シアリルアミドラクトシルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「３’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、３’−シアリルアミドラクトシルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「３’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、３’−シアリルアミドラクトシルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「３’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。）、６’−シアリルアミドラクトシルミリスチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、６’−シアリルアミドラクトシルパルミチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、６’−シアリルアミドラクトシルステアリン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。）、３’−シアリルアミドラクトサミニルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「３’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、３’−シアリルアミドラクトサミニルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「３’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、３’−シアリルアミドラクトサミニルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「３’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。）、６’−シアリルアミドラクトサミニルミリスチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４；以下、「６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４」と称することがある。）、６’−シアリルアミドラクトサミニルパルミチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１６；以下、「６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１６」と称することがある。）、６’−シアリルアミドラクトサミニルステアリン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８；以下、「６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８」と称することがある。））、３’−シアリルガラクトシルガラクトシルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ−Ｎ−Ｃ１４）、３’−シアリルガラクトシルガラクトシルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ−Ｎ−Ｃ１６）、３’−シアリルガラクトシルガラクトシルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ−Ｎ−Ｃ１８）、６’−シアリルガラクトシルガラクトシルミリスチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ−Ｎ−Ｃ１４）、６’−シアリルガラクトシルガラクトシルパルミチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ−Ｎ−Ｃ１４）、６’−シアリルガラクトシルガラクトシルステアリン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇａｌ−Ｎ−Ｃ１８）、３’−シアリルガラクトシルガラクトサミニルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４）、３’−シアリルガラクトシルガラ��トサミニルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１６）、３’−シアリルガラクトシルガラクトサミニルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８）、６’−シアリルガラクトシルガラクトサミニルミリスチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４）、６’−シアリルガラクトシルガラクトサミニルパルミチン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１６）、６’−シアリルガラクトシルガラクトサミニルステアリン酸アミド（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧａｌＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８）、これらのシアル酸のカルボキシル基がアミド化されたシアル酸含有糖鎖複合体などが挙げられる。
【００２９】
＜用途＞
前記シアル酸含有糖鎖複合体は、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有しているため、後述する本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として好適に利用可能である。
【００３０】
（シアル酸含有糖鎖複合体の製造方法）
本発明のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法は、一方の末端にシアル酸を含有するシアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端に、脂肪酸を、化学反応により任意の結合方法で結合させて製造する方法である。前記結合方法は、前記シアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端を、アシルアミド化する方法が好ましい。
【００３１】
＜シアリルオリゴ糖脂肪酸アミドの製造方法＞
以下に、前記シアル酸含有糖鎖が前記３’−シアリルラクトース鎖（以下、「３’−ＳＬ」と称することがある。）、前記６’−シアリルラクトース鎖（以下、「６’−ＳＬ」と称することがある。）、前記３’−シアリルラクトサミン鎖（以下、「３’−ＳＬＮ」と称することがある。）、及び、前記６’−シアリルラクトサミン鎖（以下、「６’−ＳＬＮ」と称することがある。）のいずれかであり、かつ、前記脂肪酸がスフィンゴ脂質を除く炭素数１４〜１８の脂肪酸であって、前記シアル酸含有糖鎖のシアル酸末端以外の末端にアミド結合している場合を例に挙げ、このようなシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法の一例を説明する。
なお、以下、前記した３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、３’−ＳＬＮ、６’−ＳＬＮを総称して、「シアリルオリゴ糖」と称することがある。
また、以下、前記シアリルオリゴ糖と前記脂肪酸とがアミド結合してなるシアル酸含有糖鎖複合体を、「シアリルオリゴ糖脂肪酸アミド」と称することがある。前記シアリルオリゴ糖脂肪酸アミドは、前記シアル酸含有糖鎖複合体の好ましい態様の１つである。
【００３２】
−シアリルオリゴ糖−
３’−ＳＬ、６’−ＳＬ、３’−ＳＬＮ、６’−ＳＬＮなどの前記シアリルオリゴ糖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ウシ等の哺乳動物由来のシアリルオリゴ糖などを使用することができる。また、前記シアリルオリゴ糖としては、市販品を使用することもできる。前記市販品は、例えば、シグマアルドリッチ社、生化学工業株式会社などから入手することができる。
前記シアル酸含有糖鎖複合体は、天然の材料で構築した物質であることから、後述する抗インフルエンザウイルス剤に使用した場合、安全性が高い点で有利である。
【００３３】
−シアリルオリゴ糖のアシルアミド化−
前記シアリルオリゴ糖を、例えば、アシルアミド化することにより、前記脂肪酸が前記シアリルオリゴ糖にアミド結合したシアリルオリゴ糖脂肪酸アミドを得ることができる。
前記シアリルオリゴ糖のアシルアミド化は、例えば、前記シアリルオリゴ糖と炭酸水素アンモニウムとを反応させ（以下、「工程（Ｉ）」と称することがある。）、次いで、得られた反応物と脂肪酸とを反応させる（以下、「工程（ＩＩ）」と称することがある。）ことにより行うことができる。より具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００３４】
−工程（Ｉ）−
前記工程（Ｉ）は、シアリルオリゴ糖と炭酸水素アンモニウムとを反応させる工程である。
前記反応させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記シアリルオリゴ糖を、過飽和の炭酸水素アンモニウム水溶液に添加し、撹拌しながら、室温条件下で反応させる方法などが挙げられる。ここで、室温とは、１０℃〜４０℃をいい、２０℃〜２５℃が好ましい。
【００３５】
前記工程（Ｉ）におけるシアリルオリゴ糖と炭酸水素アンモニウムとの反応の進行具合は、例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により確認することができる。
【００３６】
前記工程（Ｉ）の反応終了後、前記反応により得られた反応液は、例えば、ロータリーエバポレーターなどを用いて、水分と共に、炭酸水素アンモニウムを除去した後、以下の工程（ＩＩ）に供することが、反応効率がよい点で好ましい。
【００３７】
−工程（ＩＩ）−
前記工程（ＩＩ）は、前記工程（Ｉ）で得られた反応物と、脂肪酸とを反応させる工程である。
前記反応方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記工程（Ｉ）で得られた反応物と塩化脂肪酸とを、炭酸ナトリウムの存在下、０℃条件下で反応させる方法、前記工程（Ｉ）で得られた反応物と脂肪酸とを、縮合剤の存在下、室温条件下で反応させる方法などが挙げられる。これらの中でも、前記工程（ＩＩ）は、前記工程（Ｉ）で得られた反応物と脂肪酸とを、縮合剤の存在下、室温条件下で反応させる方法が、短い反応時間でシアリルオリゴ糖脂肪酸アミドを得ることができ、反応効率がよい点で好ましい。
【００３８】
前記工程（ＩＩ）が、前記反応物と前記塩化脂肪酸とを、炭酸ナトリウムの存在下で反応させる方法で行われる場合、前記塩化脂肪酸の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記シアリルオリゴ糖の使用量に対して、モル比で、塩化脂肪酸：シアリルオリゴ糖＝５：１となるような量で使用することができる。
また、前記炭酸ナトリウムの使用量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記塩化脂肪酸の使用量に対して、モル比で、炭酸ナトリウム：塩化脂肪酸＝１：１となるような量で使用することができる。
【００３９】
前記工程（ＩＩ）が、前記反応物と前記脂肪酸とを、縮合剤の存在下で反応させる方法で行われる場合、前記脂肪酸の使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記シアリルオリゴ糖の使用量に対して、モル比で、脂肪酸：シアリルオリゴ糖＝５：１となるような量で使用することができる。
また、前記縮合剤の使用量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記脂肪酸の使用量に対して、モル比で、縮合剤：脂肪酸＝１：１となるような量で使用することができる。
【００４０】
前記縮合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＷＳＣ、ＤＣＣ等のカルボジイミド；ＤＭＴ−ＭＭ等のトリアジン系縮合などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記縮合剤は、ＤＭＴ−ＭＭが、短い反応時間でシアリルオリゴ糖脂肪酸アミドを得ることができ、反応効率がよい点で好ましい。
【００４１】
なお、前記工程（ＩＩ）において、前記工程（Ｉ）で得られた反応物と、脂肪酸とを反応させた際に、副生成物として、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されたシアリルオリゴ糖脂肪酸アミドを得ることができる。
シアル酸のカルボキシル基がアミド化されたシアリルオリゴ糖脂肪酸アミドと、シアル酸のカルボキシル基がアミド化さていないシアリルオリゴ糖脂肪酸アミドとは、陰イオン交換クロマトグラフィーや、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどで、公知の方法により分離することができる。
【００４２】
−精製工程−
前記シアリルオリゴ糖脂肪酸アミドは、更に精製されることが好ましい。前記シアリルオリゴ糖脂肪酸アミドを精製する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０（ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス株式会社）、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ−２（日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）、シリカゲル（例えば、Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ  ６ＲＳ  ８０６０（株式会社  三菱化学ヤトロン））、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ１８  Ｂｕｌｋ  Ｐａｃｋｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ウォーターズ社製））等を担体として用いた、各種カラムクロマトグラフィーを行う方法などが挙げられる。
なお、前記精製を行う前に、前記工程（ＩＩ）で得られた反応液中の溶媒を除去し、前記反応液と等量のヘキサンを加えて混合した後、遠心分離し、上清を除去する洗浄を行うことが、未反応の脂肪酸を除去できる点で好ましい。
前記洗浄回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２回以上が好ましく、２回〜３回がより好ましい。
【００４３】
＜製造されたシアル酸含有糖鎖複合体の確認方法＞
前記製造方法により得られたシアル酸含有糖鎖複合体を確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、質量分析計、プロトンＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳ（液体クロマトグラフィー／質量分析）等の分析方法などが挙げられる。
【００４４】
＜用途＞
前記製造方法は、本発明の前記シアル酸含有糖鎖複合体を好適に製造できるため、後述する本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分の製造方法として、好適に利用可能である。
【００４５】
（抗インフルエンザウイルス剤）
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、本発明の前記シアル酸含有糖鎖複合体を少なくとも含有し、必要に応じて、更にその他の成分を含有する。
【００４６】
＜シアル酸含有糖鎖複合体＞
前記抗インフルエンザウイルス剤に含有される前記シアル酸含有糖鎖複合体は、好ましくは、そのシアル酸含有糖鎖部分に、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）認識部位を有する。前記ヘマグルチニンは、インフルエンザウイルスのエンベロープに存在するスパイクタンパク質の１種であり、標的細胞の膜表面に存在する複合糖質のシアル酸を含む糖鎖を認識し、結合して、感染を成立させることが知られている。前記シアル酸含有糖鎖複合体は、このヘマグルチニン認識部位を有していることから、インフルエンザウイルスと結合可能であり、そのため、インフルエンザウイルスの本来の標的細胞への結合を阻害することができると考えられる。
前記シアル酸含有糖鎖の前記ヘマグルチニン認識部位としては、具体的には、３’−シアリルガラクトース鎖（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ）、及び、６’−シアリルガラクトース鎖（６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ）のいずれかが好ましく挙げられる。
【００４７】
前記抗インフルエンザウイルス剤における前記シアル酸含有糖鎖複合体（有効成分）の含有量としては、特に制限はなく、前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型などに応じて、適宜選択することができるが、６０質量％〜７０質量％が好ましい。また、前記抗インフルエンザウイルス剤は、前記シアル酸含有糖鎖複合体そのものであってもよい。
【００４８】
＜その他の成分＞
前記抗インフルエンザウイルス剤に含有され得る、前記シアル酸含有糖鎖複合体以外のその他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記薬学的に許容され得る担体としても、特に制限はなく、前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型などに応じて、適宜選択することができる。
また、前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤における前記シアル酸含有糖鎖複合体（有効成分）の含有量が所望の範囲内となるように、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４９】
＜剤型＞
前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤の投与方法などに応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤、経口液剤、注射剤、点鼻剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００５０】
−経口固形剤−
前記経口固形剤としては、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などが挙げられる。
前記経口固形剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記シアル酸含有糖鎖複合体に、賦形剤、及び必要に応じて各種添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記賦形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。また、前記添加剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味／矯臭剤などが挙げられる。
【００５１】
前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
前記崩壊剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。
前記滑沢剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００５２】
−経口液剤−
前記経口液剤としては、例えば、内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などが挙げられる。
前記経口液剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記シアル酸含有糖鎖複合体に添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、矯味／矯臭剤、緩衝剤、安定化剤などが挙げられる。
【００５３】
前記矯味／矯臭剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００５４】
−注射剤−
前記注射剤としては、例えば、溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤などが挙げられる。
前記注射剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記シアル酸含有糖鎖複合体に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加することにより、製造することができる。ここで、前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。また、前記安定化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００５５】
−点鼻剤−
前記点鼻剤としては、例えば、液剤、スプレー剤、軟膏剤などが挙げられる。
前記点鼻剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、前記シアル酸含有糖鎖複合体に添加剤を加えることにより、製造することができる。ここで、前記添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、クエン酸、Ｄ−ソルビトール、グリセリン、エデト酸ナトリウム、結晶セルロース、ポリソルベート８０、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、ｐＨ調節剤などが挙げられる。
【００５６】
−スプレー剤−
前記スプレー剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エアゾール剤、粉剤、乳剤、液剤、水和剤などが挙げられる。
スプレー剤の製造方法としては、特に制限はなく、常法を使用することができ、例えば、米国特許第２，８６８，６９１号明細書及び米国特許第３，０９５，３５５号明細書に記載の方法などを使用して製造することができる。
【００５７】
＜使用＞
前記抗インフルエンザウイルス剤は、１種単独で使用されてもよく、他の成分を有効性とする薬剤と併用してもよく、また他の成分を有効性とする薬剤に配合されてもよい。
前記他の薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、オセルタミビル（タミフル（登録商標））、ザナミビル（リレンザ（登録商標））、アマンタジン（シンメトレル（登録商標））等の既存の抗インフルエンザウイルス薬が好ましく、タミフルがより好ましい。
前記抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルス感染時及び感染後のいずれの時期においても好適に抗インフルエンザウイルス活性を有するが、前記薬剤は、主に感染初期に抗インフルエンザウイルス活性を有し、前記抗インフルエンザウイルス剤とは作用機序が異なることから、これらを併用することにより、相乗効果を有する点で有利である。また、例えば、併用する薬剤の有効濃度を単独使用の約１／１０レベルまで低下させても十分な抗インフルエンザウイルス活性を得ることができ、使用に起因する副作用を軽減できる安全性の高いインフルエンザの感染予防又は治療薬となる。
【００５８】
＜投与＞
前記抗インフルエンザウイルス剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、経口又は非経口で投与することができる。
【００５９】
前記抗インフルエンザウイルス剤の投与量としても、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の薬剤の投与有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。
【００６０】
また、個体への投与時期にも、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、インフルエンザウイルスの感染前に投与してもよく、感染後に投与してもよい。前記抗インフルエンザウイルス剤は、投与時期に制限がないため、既存の薬剤と比べて有利である。
【００６１】
＜対象＞
前記抗インフルエンザウイルス剤の投与対象となる動物種としては、インフルエンザウイルスに感染する可能性のある動物種であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、トリ、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどが挙げられる。
【００６２】
また、前記抗インフルエンザウイルス剤の適用対象となるインフルエンザウイルスの種類としても、特に制限されるものではない。前記抗インフルエンザウイルス剤は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型全てのインフルエンザウイルスについて、感染抑制効果が期待でき、また、Ａ型インフルエンザウイルスについては、その由来を問わず、全ての亜型（Ｈ１Ｎ１〜Ｈ１５Ｎ９）のインフルエンザウイルスについて、感染抑制効果が期待できる。
【００６３】
＜用途＞
前記抗インフルエンザウイルス剤は、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、投与時期や投与対象の年齢などに制限がなく、かつ副作用がなく安全性が高いため、インフルエンザウイルスの予防又は治療に好適に利用可能である。
また、前記抗インフルエンザウイルス剤は、基材に担持することもでき、後述する本発明のフィルターなどに担持させて利用することもできる。
【００６４】
（フィルター）
本発明のフィルターは、前記抗インフルエンザウイルス剤を担持し、必要に応じて、更にその他の構成を有する。
【００６５】
前記フィルターにおいて、前記抗インフルエンザウイルス剤を担持させる量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記フィルターに、前記抗インフルエンザウイルス剤を担持させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記抗インフルエンザウイルス剤をそのまま、あるいは水やアルコール等で希釈した状態の抗インフルエンザウイルス剤を、噴霧する方法、被覆する方法、浸漬する方法などが挙げられる。
【００６６】
前記フィルターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マスク用フィルター、エアコン用フィルター、空気清浄機用フィルター、掃除機用フィルター、介護用フィルター、ベットマット用フィルター、壁乃至天井用フィルターなどが挙げられる。
【００６７】
前記フィルターに用いられる材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリアクリル、ポリプロピレン、ナイロン、ポリカーボネート、レーヨン、ビスマイレイミドトリアジン等のプラスチック材；紙、綿、麻、絹等の天然繊維；ガラス繊維等の無機材料などが挙げられる。
【００６８】
前記フィルターの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記フィルターが、マスク用フィルターである場合、ガーゼ、不織布、布が好ましい。
【００６９】
前記フィルターの目の粗さや厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記フィルターは、単層構造及び多層構造のいずれの構造であってもよい。多層構造の場合、前記抗インフルエンザウイルス剤は、少なくとも１層に担持されていればよい。
【００７０】
本発明のフィルターは、前記抗インフルエンザウイルス剤を担持しているため、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、安全性が高く、安価に製造可能であるため、空気中に浮遊するインフルエンザウイルスの吸入を効率よく防ぐことができる。
【００７１】
（効果）
本発明のシアル酸含有糖鎖複合体は、抗インフルエンザウイルス活性を有しており、本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として、好ましく利用可能である。また、前記シアル酸含有糖鎖複合体は、本発明のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法により効率的に得ることができる。
更に、本発明のシアル酸含有糖鎖複合体は、規定の分子量の範囲内で、シアル酸含有糖鎖と規定の炭素数を有する脂肪酸とを任意に組み合わせて設計及び製造することができるため、様々な型の複合体を提供することが可能であり、したがって、様々な効果を有する抗インフルエンザウイルス剤の提供が期待される。
【００７２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、好ましい抗インフルエンザウイルス活性を有し、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型を問わず、全てのインフルエンザウイルスに対して感染抑制効果が期待でき、また、Ａ型インフルエンザウイルスについては、全ての亜型について、その動物種由来を問わず、感染抑制効果が期待できることから、現在抗インフルエンザ薬として使用認可されているアマンタジンやタミフルに次ぐ新たな抗インフルエンザ薬として、臨床応用の可能性が期待される。
【００７３】
また、インフルエンザウイルスは、膜表面のタンパク質を僅かに変異させることで、抗体という生体防御機能を免れる能力を持つ。それに比べ、インフルエンザウイルスの、レセプターを認識し結合する部位はよく保存されており、レセプターに対する高い特異性はよく保持されている。本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、このウイルス−レセプター結合の選択的特異性による感染の、競争的阻害効果を利用することに着目したものである。したがって、本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、単独で使用する場合だけでなく、インフルエンザワクチンや、作用機構の異なる既存薬との併用においても、インフルエンザに対する感染予防と治療に対する大きな効果が期待される。
【実施例】
【００７４】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００７５】
（試験例１：製造方法の検討）
＜従来法による３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２の製造＞
特開２００７−３０８４４４号公報に開示された方法で、下記構造式で表される３’−シアリルラクトシルラウリン酸アミド（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１２、分子量：８１４）を、以下のようにして製造した。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
【化１】
2011158388.tif 000003
【００７６】
３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）（ウシ初乳由来、シグマアルドリッチ社製、分子量：６３３）を、過飽和炭酸水素アンモニウム水溶液に溶解し、室温で４日間、撹拌を行った。途中、反応の進行度合いを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて、水分と共に炭酸水素アンモニウムを、反応物から除去した。
次いで、得られた反応物を、０℃条件下、炭酸ナトリウム存在下で、塩化ラウリン酸と反応させた。ここで、塩化ラウリン酸は、３’−ＳＬの使用量に対し、モル比で５倍となるような量で使用した。また、炭酸ナトリウムは、塩化ラウリン酸の使用量に対し、モル比で等量となるような量で使用した。
反応の進行状況は、開始から約３０分間間隔で、サンプリングを行い、ＴＬＣにより確認し、反応の進行が飽和に達した時点で反応を終了した。反応液に等量のクロロホルムを加え、未反応の塩化ラウリン酸を抽出し除去した。ＴＬＣは、テトラヒドロフラン／アセトニトリル／１−プロパノール／０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液／２８体積％アンモニア水（５：１０：５０：３５：０．３（体積比））で展開した。
得られた３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２、及び、出発物質の３’−ＳＬのシアル酸量を、レゾシノール−塩酸法、及び、呈色後にデンシトメーター（株式会社島津製作所製）で定量したところ、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２の収率は、１０質量％以下であった。また、反応開始２４時間後のＴＬＣの結果を図１に示す。【００７７】
＜本発明の方法による３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２の製造＞
前記従来法において、塩化ラウリン酸に代えてラウリン酸を用い、また炭酸ナトリウムに代えて縮合剤（ＤＭＴ−ＭＭ：４−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ、国産化学株式会社製）を用い、反応を０℃に変えて室温で行ったこと以外は、従来法と同様の方法で３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２を製造した。
反応の進行状況は、開始から約３０分間間隔で、サンプリングを行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により確認し、反応の進行が飽和に達した時点で反応を終了した。
反応液の溶媒を除去した後、前記反応液と等量のヘキサンを加え、十分に攪拌した後、遠心分離して上清を除去した。この操作を、更に２度行うことで、未反応のラウリン酸を除去した。次いで、反応物を水で溶解し、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ１８  Ｂｕｌｋ  Ｐａｃｋｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ウォーターズ社製））に負荷し、メタノール：水（５：５（体積比））、次いで、メタノール：水（８：２（体積比））の順で溶出し、目的物を含む画分を回収した。ＴＬＣは、テトラヒドロフラン／アセトニトリル／１−プロパノール／０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液／２８体積％アンモニア水（５：１０：５０：３５：０．３（体積比））で展開した。
３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１２の収率を前記同様の方法で求めたところ、５０質量％であった。また、反応開始３０分間後と、２４時間後のＴＬＣの結果を図１に、反応開始３０分間後のＴＬＣの結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。【００７８】
試験例１の結果、本発明の製造方法は、従来法と比較して、短時間でシアル酸含有糖鎖複合体を得ることができ、更に収率が高いことがわかった。【００７９】
（製造例１：３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４の製造）
３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）（ウシ初乳由来、シグマアルドリッチ社製、分子量：６３３）を、過飽和炭酸水素アンモニウム水溶液に溶解し、室温で４日間、撹拌を行った。途中、反応の進行度合いを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で確認した。反応終了後、ロータリーエバポレーターを用いて、水分と共に炭酸水素アンモニウムを、反応物から除去した。
次いで、得られた反応物を、室温条件下、ＤＭＴ−ＭＭ存在下で、ミリスチン酸（Ｃ１４）と反応させた。ここで、ミリスチン酸（Ｃ１４）は、３’−ＳＬの使用量に対し、モル比で５倍となるような量で使用した。また、ＤＭＴ−ＭＭは、ミリスチン酸（Ｃ１４）の使用量に対し、モル比で等量となるような量で使用した。
反応の進行状況は、開始から約３０分間間隔で、サンプリングを行い、ＴＬＣ（展開溶媒：テトラヒドロフラン／アセトニトリル／１−プロパノール／０．６Ｍ酢酸アンモニウム水溶液／２８体積％アンモニア水（５：１０：５０：３５：０．３（体積比））により確認し、反応の進行が飽和に達した時点で反応を終了した。ＴＬＣで確認した結果を図２に示す。反応開始３０分間で、高い収率が得られた。【００８０】
３０分間反応させた反応液の溶媒を除去した後、前記反応液と等量のヘキサンを加え、十分に攪拌した後、遠心分離して上清を除去した。この操作を、更に２度行うことで、未反応のミリスチン酸を除去した。次いで、反応物を水で溶解し、Ｃ１８逆相カラム（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃ１８  Ｂｕｌｋ  Ｐａｃｋｉｎｇ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ウォーターズ社製））に負荷し、メタノール：水（５：５（体積比））、次いで、メタノール：水（８：２（体積比））の順で溶出し、目的物を含む画分を回収した。
これにより、下記構造式で表される３’−シアリルラクトシルミリスチン酸アミド（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：８４２）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
精製後の３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４について、前記同様の方法でＴＬＣにより確認した結果を図３Ｃ及び図４に示す。なお、図３Ａ〜Ｃ及び図４において、「Ｍ」は、マーカーとして使用したクジラ脳ガングリオシド混合液（ＧＭ４、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、及びＧＴ１ｂ）を示す。
【化２】
2011158388.tif 000004
【００８１】
なお、前記クジラ脳ガングリオシド混合液は、以下の方法で調製した。
ミンククジラの脳（日本鯨類研究所より譲渡）に、脳組織重量に対して５倍容量のクロロホルム／メタノール混合溶液（２：１（体積比））を添加して抽出した後、この抽出物を更に前記脳組織重量に対して５倍容量のクロロホルム／メタノール混合溶液（１：２（体積比））を添加して抽出し、総脂質画分を得た。得られた総脂質画分をクロロホルム／メタノール／水混合溶液（約３０：６０：８（体積比））に調製し、陰イオン交換（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（ＧＥヘルスケア社製））カラムに吸着させた。前記総脂質画分の５倍容量のクロロホルム／メタノール／水混合溶液（３０：６０：８（体積比））、次いでメタノールで中性成分及び塩基性成分を洗浄後、前記総脂質画分の５倍容量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム／メタノール混合溶液にて吸着成分を溶出した。溶出された溶液に１Ｍ  ＮａＯＨ／メタノール混合溶液を必要量加え、０．０５Ｍ濃度とし、室温にて３０分間放置し、エステル結合を含むリン脂質類を分解した（以下、「弱アルカリ処理」と称することがある。）。弱アルカリ処理後、酢酸の添加量が、前記ＮａＯＨと等量になるように酢酸／メタノール混合溶液を添加して中和し、窒素気流下でメタノールを蒸発させて濃縮した。次いで、乾燥物を少量の水に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１０  カラム（ＧＥヘルスケア社製）で脱塩を行い、ガングリオシド画分を凍結乾燥した。この凍結乾燥物を、クロロホルム／メタノール溶液（２：１（体積比））で溶解し、ＴＬＣの標準試料として使用した。【００８２】
なお、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４の製造原料として使用した３’−ＳＬについて、プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、アセトンを内部標準とし、４００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図５に示す通りである。シアル酸含有物質に認められるピークとして、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）のＣ３ａｘのピークが１．８ｐｐｍ付近に、Ｃ３ｅｑのピークが２．７５付近に認められた。また、ガラクトース（Ｇａｌ）のＣ１のアノマープロトンのピークが４．５ｐｐｍ付近に、糖鎖還元末端のグルコース（Ｇｌｃ）のアノマープロトンのピークが、αとβとに分かれ、それぞれ４．６５ｐｐｍ付近、及び５．２ｐｐｍ付近に認められた。更に、ガラクトース（Ｇａｌ）のＣ３のプロトンのピークが４．１ｐｐｍ付近に認められた。なお、４．７ｐｐｍ付近のピークは水由来のシグナルであり、２．２２５ｐｐｍ付近のピークはアセトン由来のシグナルである。【００８３】
（製造例２：３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６の製造）
製造例１において、ラウリン酸に代えて、パルミチン酸（Ｃ１６）を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、下記構造式で表される３’−シアリルラクトシルパルミチン酸アミド（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１６、分子量：８７０）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６を精製した。更に、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６を製造例１と同様の方法でＴＬＣにより確認を行った。結果を図３Ｂに示す。
【化３】
2011158388.tif 000005
【００８４】
（製造例３：３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８の製造）
製造例１において、ラウリン酸に代えて、ステアリン酸（Ｃ１８）を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、下記構造式で表される３’−シアリルラクトシルステアリン酸アミド（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８、分子量：８９８）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８を精製した。
更に、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８を製造例１と同様の方法でＴＬＣにより確認を行った。結果を図３Ｃに示す。また、プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、ＴＭＳ（テトラメチルシラン）を内部標準とし、６００ＭＨｚにおいて２質量％重水（Ｄ２Ｏ）を含有する重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図６に示す通りである。３’−ＳＬと比較して、ステアリン酸が導入されたことにより、メチルプロトンのピークが０．９ｐｐｍ付近に認められた。また、メチレンプロトンのピークが１．３ｐｐｍ付近に認められ、更にα炭素のプロトンのピークが２．１ｐｐｍ付近に、β炭素のプロトンのピークが１．５ｐｐｍ付近に低磁場シフトして認められた。このメチレンプロトンのシグナルの総和と、メチルプロトンのシグナルとから、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８であることが確認された。なお、３．４ｐｐｍ付近のピークは重水（ＤＨＯ）由来のシグナルである。
【化４】
2011158388.tif 000006
【００８５】
（製造例４：３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４の製造）
製造例１において、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）に代えて、３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（３’−ＳＬＮ）（シグマアルドリッチ社製、分子量：６７４）を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、下記構造式で表される３’−シアリルラクトサミニルミリスチン酸アミド（３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４：３’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：８８３）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４を精製した。
プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、ＴＭＳを内部標準とし、６００ＭＨｚにおいて２質量％重水（Ｄ２Ｏ）を含有する重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４のプロトンＮＭＲスペクトルは図７に示す通りである。
【化５】
2011158388.tif 000007
【００８６】
（製造例５：６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４の製造）
製造例１において、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）に代えて、６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（６’−ＳＬＮ）（シグマアルドリッチ社製、分子量：６７４）を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、下記構造式で表される６’−シアリルラクトサミニルミリスチン酸アミド（６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：８８３）、及び６’−シアリルアミドラクトサミニルミリスチン酸アミド（６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：８８２）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４を精製した。更に、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４を製造例１と同様の方法でＴＬＣにより確認を行った。結果を図４に示す。図４より、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されると、極性が低くなるため、移動度が大きくなった。
また、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４について、下記条件にてＬＣ／ＭＳの測定を行った。６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４のスペクトルは図８Ａに、６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４のスペクトルは図８Ｂに示す。ＬＣ／ＭＳの分析により、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されると、分子量が１小さくなることが確認された。また、ＬＣ／ＭＳの分析（逆相クロマトグラフィー）では、前記ＴＬＣ（順相クロマトグラフィー）の結果と、移動度が逆転した。
［ＬＣ／ＭＳ分析条件］
カラム：１．０ｍｍ×１０ｍｍ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８、Ｉｍｔａｋｔ社製）
溶媒：Ａ液：０．０５体積％  ギ酸水
Ｂ液：アセトニトリル／ギ酸水（９０／１０（体積比））（含０．０５体積％  ギ酸）
（０分間〜５分間：０体積％Ｂ液（一定）、５分間〜１０分間：０体積％Ｂ液〜１００体積％Ｂ液（濃度勾配）、１０分間〜２０分間：１００体積％Ｂ液（一定））
流速：０．２  ｍＬ／分間
質量分析範囲：ｍ／ｚ  ３４０〜２，０００
【化６】
2011158388.tif 000008
【化７】
2011158388.tif 000009
【００８７】
また、プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、ＴＭＳを内部標準とし、６００ＭＨｚにおいて２質量％重水（Ｄ２Ｏ）を含有する重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４のプロトンＮＭＲスペクトルは図８Ｃに、６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４のプロトンＮＭＲスペクトルは図８Ｄに示す通りである。【００８８】
なお、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４の製造原料として使用した６’−ＳＬＮについて、プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、アセトンを内部標準とし、４００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図９に示す通りである。【００８９】
（製造例６：６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４の製造）
製造例１において、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）に代えて、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）（ウシ初乳由来、シグマアルドリッチ社製、分子量：６５５）を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、下記構造式で表される６’−シアリルラクトシルミリスチン酸アミド（６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：８４２）、及び６’−シアリルアミドラクトシルミリスチン酸アミド（６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：８４１）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４を精製した。
６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を、製造例１と同様の方法でＴＬＣにより確認を行った。結果を図４に示す。また、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４について製造例５と同じ条件でＬＣ／ＭＳ分析を行ったところ、製造例５と同様に、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されると、分子量が１小さくなることが確認された。
更に、プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、ＴＭＳを内部標準とし、６００ＭＨｚにおいて２質量％重水（Ｄ２Ｏ）を含有する重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４のプロトンＮＭＲスペクトルは図１０Ａに、６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４のプロトンＮＭＲスペクトルは図１０Ｂに示す通りである。
【化８】
2011158388.tif 000010
【化９】
2011158388.tif 000011
【００９０】
なお、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４の製造原料として使用した６’−ＳＬについて、プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、アセトンを内部標準とし、４００ＭＨｚにおいて重水（Ｄ２Ｏ）中で測定したプロトンＮＭＲスペクトルは、図１１に示す通りである。【００９１】
（製造例７：６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８の製造）
製造例３において、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）に代えて、６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）（ウシ初乳由来、シグマアルドリッチ社製、分子量：６５５）を用いたこと以外は製造例３と同様の方法で、下記構造式で表される６’−シアリルラクトシルステアリン酸アミド（６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８、分子量：８９８）、及び６’−シアリルアミドラクトシルステアリン酸アミド（６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８、分子量：８９７）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８を精製した。
プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、ＴＭＳを内部標準とし、６００ＭＨｚにおいて２質量％重水（Ｄ２Ｏ）を含有する重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８のプロトンＮＭＲスペクトルは図１２に示す通りである。
また、６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１８について製造例５と同じ条件でＬＣ／ＭＳ分析を行ったところ、製造例５と同様に、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されると、分子量が１小さくなることが確認された。
【化１０】
2011158388.tif 000012
【化１１】
2011158388.tif 000013
【００９２】
（製造例８：６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８の製造）
製造例３において、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）に代えて、６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（６’−ＳＬＮ）（シグマアルドリッチ社製、分子量：６７４）を用いたこと以外は製造例３と同様の方法で、下記構造式で表される６’−シアリルラクトサミニルステアリン酸アミド（６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８、分子量：９３９）及び６’−シアリルアミドラクトサミニルステアリン酸アミド（６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８：６’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−６）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１８）、分子量：９３８）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８を精製した。
プロトン核磁気共鳴スペクトルとして、ＴＭＳを内部標準とし、６００ＭＨｚにおいて２質量％重水（Ｄ２Ｏ）を含有する重ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）中で測定した。６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８のプロトンＮＭＲスペクトルは図１３Ａに、６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８のプロトンＮＭＲスペクトルは図１３Ｂに示す通りである。図１３Ｂより、８ｐｐｍ付近（約７．０ｐｐｍ〜８．１ｐｐｍ）に糖鎖還元末端のアミン化によるアミドプロトンが確認された。
また、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８について製造例５と同じ条件でＬＣ／ＭＳ分析を行ったところ、製造例５と同様に、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されると、分子量が１小さくなることが確認された。
【化１２】
2011158388.tif 000014
【化１３】
2011158388.tif 000015
【００９３】
（比較製造例１：ＬＮ−Ｃ１４の製造）
製造例１において、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）に代えて、ラクトサミン（ＬＮ）（ナカライテスク株式会社製、分子量：３８４）を用いたこと以外は製造例１と同様の方法で、下記構造式で表されるラクトサミニルミリスチン酸アミド（ＬＮ−Ｃ１４：Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｎ−Ｃ１４、分子量：５９１）を得た。下記構造式において「Ａｃ」は、アセチル基を表す。
製造例１において、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４を含む反応液に代えて、ＬＮ−Ｃ１４を含む反応液を用いたこと以外は、製造例１と同様の方法で、ＬＮ−Ｃ１４を精製した。
【化１４】
2011158388.tif 000016
【００９４】
下記に、製造例１〜８及び比較製造例１で合成したシアル酸含有糖鎖複合体を、まとめて示す。【００９５】
【表１】
2011158388.tif 000017
【００９６】
なお、製造例１〜４において、本実施例においては、プロトン核磁気共鳴スペクトル、ＬＣ／ＭＳ分析、ＴＬＣ等で確認を行っていないが、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されたシアル酸含有アミド糖鎖複合体は、シアリルオリゴ糖をアシルアミド化の際に副生成物として合成されるため、製造例１においては、３’−シアリルアミドラクトシルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１４）、製造例２においては、３’−シアリルアミドラクトシルパルミチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１６）、製造例３においては、３’−シアリルアミドラクトシルステアリン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ−Ｎ−Ｃ１８）、製造例４においては、３’−シアリルアミドラクトサミニルミリスチン酸アミド（３’−Ｎｅｕ５Ａｃ１ＮＨ２（α２−３）Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮａｃ−Ｎ−Ｃ１４）が合成されているものと推察される。【００９７】
（試験例２：シアル酸含有糖鎖複合体による抗インフルエンザウイルス活性の検討（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ））
＜シアル酸含有糖鎖複合体の感染後の作用＞
表２に示す各シアル酸含有糖鎖複合体の抗インフルエンザウイルス活性を、以下のようにしてプラック測定（ＰＦＵ  Ａｓｓａｙ）により評価した。
ＭＤＣＫ細胞（ＮＢＬ−２細胞、イヌ腎細胞）（大日本住友製薬株式会社製）を、１０体積％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有Ｅ−ＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ；インビトロジェン株式会社製）を添加したマイクロプレートで、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。モノレーヤーになったＭＤＣＫ細胞に、１００ＰＦＵ／ｍＬとなるようにインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９５）（Ｈ１Ｎ１型）を加え、３７℃にて１時間インキュベートして感染させた。感染後、感染に使用したインフルエンザウイルスを含む培養液を除去し、表２に示す各シアル酸含有糖鎖複合体、並びに、既存薬として、オセルタミビル（タミフル（登録商標）、ロッシュ社製）、ザナミビル（リレンザ（登録商標）、グラクソ・スミス・クライン社製）、及びアマンタジン塩酸塩（シグマアルドリッチ社製）をそれぞれ０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲で加えたアガロース液を前記マイクロプレートに重層し、完全に凝固した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養した。
各シアル酸含有糖鎖複合体を添加していない細胞を対照とし、次式により、各シアル酸含有糖鎖複合体を添加した場合のインフルエンザウイルス増殖抑制率を算出し、ＩＣ５０値（対照の５０％までインフルエンザウイルスの増殖を抑制する濃度）を算出した。結果を下記表２に示す。なお、表２は、前記試験を１回〜３回行った平均値を示す。
インフルエンザウイルス増殖抑制率（％）＝１００−（シアル酸含有糖鎖複合体添加時のプラック数／対照のプラック数）×１００【００９８】
【表２】
2011158388.tif 000018
【００９９】
表２より、シアル酸含有糖鎖複合体の抗インフルエンザウイルス活性は、炭素数が多くなる程強くなることがわかった。
既存薬であるオセルタミフル及びリレンザに比べると、シアル酸含有糖鎖複合体のＩＣ５０値は、５０倍〜１００倍濃度での抗インフルエンザウイルス活性であり、アマンタジン塩酸塩とは同等の濃度であった。【０１００】
＜シアル酸含有糖鎖複合体の感染時及び感染後の作用＞
ＭＤＣＫ細胞は、前記同様の方法でモノレーヤーに調製した。このＭＤＣＫ細胞に、１００ＰＦＵ／ｍＬとなるようにインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９５）（Ｈ１Ｎ１型）を加え、同時に、表３に示す各シアル酸含有糖鎖複合体及び既存薬、並びに、シアル酸含有糖鎖複合体の対照として比較製造例１で得られたＬＮ−Ｃ１４をそれぞれ０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬの範囲で加え、３７℃にて１時間インキュベートして感染させた。感染後、感染に使用したインフルエンザウイルスを含む培養液を除去し、表３に示す各シアル酸含有糖鎖複合体及び既存薬を、前記感染時と同様の濃度で加えたアガロース液を前記マイクロプレートに重層し、完全に凝固した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養した。培養後、前記同様の方法で、ＩＣ５０値を算出した。結果を下記表３に示す。なお、表３は、前記試験を１回〜３回行った平均値を示す。【０１０１】
【表３】
2011158388.tif 000019
【０１０２】
表３の結果より、カルボキシル基をアミド化したシアル酸含有糖鎖複合体は、カルボキシル基がアミド化されていないシアル酸含有糖鎖複合体と同等の強い抗インフルエンザウイルス活性が認められた。シアル酸を有さないラクトースにミリスチン酸を導入したオリゴ糖誘導体（ＬＮ−Ｃ１４）では抗インフルエンザウイルス活性が全く確認されなかった。したがって、これらのシアル酸含有糖鎖複合体の抗インフルエンザウイルス活性は、界面活性作用ではなく、シアル酸を介した特異的な抗インフルエンザウイルス活性であることが示唆された。【０１０３】
（試験例３：シアル酸含有糖鎖複合体の保存安定性の検討）
前記表３に示す各シアル酸含有糖鎖複合体を４℃にて１．５年間保存した。長期保存後の各シアル酸含有糖鎖複合体について、試験例２と同様にしてプラック測定（ＰＦＵ  Ａｓｓａｙ）により抗インフルエンザウイルス活性を評価することで、その安定性について試験した。その結果、１．５年間保存後においても抗インフルエンザウイルス活性は安定に維持されていることが確認された。【０１０４】
（試験例４：シアル酸含有糖鎖複合体の毒性試験）
＜単回投与試験＞
ＩＣＲマウス（雌雄、６週齢ＳＰＦ、ｎ＝６、日本チャールス・リバー株式会社）に、シアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）を１．５ｍｇ／ｋｇの用量で単回静脈内投与し、７日間飼育した。シアル酸含有糖鎖複合体に代えて、ＰＢＳを投与した動物を対照とした。飼育期間中、体重測定、血液学的検査、血液化学的検査等により一般症状の観察を行った。
その結果、死亡例はなく、対照動物と比較して前記一般症状への影響は認められず、毒性は認められなかった。シアル酸含有糖鎖複合体は、天然の材料で構築した物質であるため、高濃度でも安全性が高いことが示唆された。【０１０５】
＜反復投与試験＞
ＩＣＲマウス（雌雄、６週齢ＳＰＦ、ｎ＝６、日本チャールス・リバー株式会社）に、シアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）を１．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、７日間反復静脈内投与し、合計７日間飼育した。シアル酸含有糖鎖複合体に代えて、ＰＢＳを投与した動物を対照とした。飼育期間中、体重測定、血液学的検査、血液化学的検査等により一般症状の観察を行った。
その結果、死亡例はなく、対照動物と比較して前記一般症状への影響は認められず、毒性は認められなかった。【０１０６】
（試験例５：シアル酸含有糖鎖複合体の抗インフルエンザウイルス活性の検討（ｉｎ  ｖｉｖｏ））
＜投与方法の検討＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６週齢、日本クレア株式会社）に、製造例１で得られたシアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４）を１ｍｇ／ｋｇの用量で、１日２回（計３日間）、経鼻投与（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経鼻投与群、ｎ＝５）又は経口投与（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群、ｎ＝５）した。
最初にシアル酸含有糖鎖複合体を投与してから４時間後にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ＝１０−６／ｍＬ）を１０μＬ（致死量７５％〜１００％）経鼻接種した。
なお、シアル酸含有糖鎖複合体及びインフルエンザウイルスを投与しなかった動物を対照群（ｎ＝５）、シアル酸含有糖鎖複合体を投与せず、前記同様の方法でインフルエンザウイルスのみを経鼻接種させた動物をウイルス投与群（ｎ＝５）とした。また、シアル酸含有糖鎖複合体を経口投与し、インフルエンザウイルスを投与しなかった動物を経口投与対照群（ｎ＝５）とした。
前記各群について、以下の方法で、体重変動及び生存率の観察を行った。また、シアル酸含有糖鎖複合体の経鼻投与群及び経口投与群、並びに、ウイルス投与群について、以下の方法で、血清中の炎症性サイトカインの測定、及び肺組織中のウイルス力価の測定を行った。【０１０７】
−体重変動、生存率−
インフルエンザウイルスを接種してから、１日１回、７日間、生存の確認及び体重測定を行った。なお、体重変動を観察した動物は、各群ｎ＝５である。
体重測定の結果を図１４Ａに示す。この結果より、ウイルス投与群と比較して、シアル酸含有糖鎖複合体の経口投与群（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群）において有意な体重減少抑制が認められた。また、シアル酸含有糖鎖複合体のみを経口投与した対照群（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与対照群）は、何も投与しなかった対象群と同様体重変動がなく、シアル酸含有糖鎖複合体は毒性がないことがわかった。
生存率の結果を図１４Ｂに示す。この結果、シアル酸含有糖鎖複合体の経口投与群（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群）は、ウイルス投与群に対して有意な延命効果が認められた。また、シアル酸含有糖鎖複合体の経鼻投与群（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経鼻投与群）は、体重減少の抑制は認められなかったものの、生存率は、ウイルス投与群と比較して、延命効果が認められた。【０１０８】
−炎症性サイトカインの測定−
ウイルス投与群（ｎ＝５）、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経鼻投与群（ｎ＝５）、及び３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群（ｎ＝５）について、炎症性サイトカインとして、ＩＬ−６及びＩＮＦ−γの濃度を以下の方法で測定した。
インフルエンザウイルスを接種してから３日目に各動物の血液を採取し、４℃にて３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより血清を得た。この血清を用い、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いてＩＬ−６の濃度を測定した。また、前記血清を用い、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｒ＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）を用いてＩＮＦ−γの濃度を測定した。ＩＬ−６の測定結果を図１４Ｃに、ＩＮＦ−γの測定結果を図１４Ｄに示す。この結果より、インフルエンザウイルス感染によって誘導される炎症性サイトカイン産生の、シアル酸含有糖鎖複合体による抑制が認められた。特に、炎症性サイトカイン産生の抑制作用は、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群において有意であった。なお、統計解析は、ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）で行った（ｐ＜０．０５）。【０１０９】
−肺組織中のウイルス力価の測定−
ウイルス投与群、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経鼻投与群、及び３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群について、インフルエンザウイルスを接種してから２日目（ｎ＝５／群）及び３日目（ｎ＝５／群）に解剖を行い、肺を摘出した。各群の肺組織をホモジナイズすることにより、肺組織中のインフルエンザウイルスを抽出し、プラック測定（ＰＦＵ  Ａｓｓａｙ）によりウイルス力価を測定した。
即ち、試験例２と同様の方法で調製したＭＤＣＫ細胞に、各群の肺組織中のインフルエンザウイルスの希釈系列液を接種し、３７℃にて１時間インキュベートして感染させた。培養後、アガロース液を重層し、完全に凝固した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養し、各群のウイルス力価を測定した。
結果を図１４Ｅに示す。この結果より、肺組織中のウイルス力価は、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経口投与群及び３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４経鼻投与群共に、感染２日目で明らかな減少が認められた。なお、統計解析は、ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）で行った（ｐ＜０．０５）。【０１１０】
＜既存薬との比較検討＞
製造例１で得られた３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４、製造例３で得られた３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１８、製造例４で得られた３’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４、製造例５で得られた６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１４及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１４、製造例６で得られた６’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４と、既存薬剤タミフルとの比較検討を以下の方法で行った。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢、日本クレア株式会社）に、前記各シアル酸含有糖鎖複合体を１ｍｇ／ｋｇ、及びタミフルを１ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与し（ｎ＝５／群）、これを１日２回、３日間行った。
最初にシアル酸含有糖鎖複合体を投与してから４時間後にインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株を１００ＰＦＵ／マウスを経口投与した。
シアル酸含有糖鎖複合体及びタミフルに代えて、ＰＢＳを投与した動物を対照群（ｎ＝５）とした。また、インフルエンザウイルスのみを投与した群をウイルス投与群（ｎ＝５）とした。【０１１１】
−生存率の評価−
シアル酸含有糖鎖複合体の投与終了後、更に６日間飼育し、合計９日間生存を観察し、生存率を算出した。結果を図１５Ａに示す。この結果より、３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４がタミフルと同様に１００％の生存率であった。【０１１２】
−炎症性サイトカインの測定−
炎症性サイトカインとして、ＩＬ−６の濃度を前記同様の方法で測定した。ＩＬ−６の測定結果を図１５Ｂに示す。この結果より、ＩＬ−６の産生の抑制は、特に３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１４、６’−Ｓ（１ＮＨ２）Ｌ−Ｎ−Ｃ１４に強く認められ、これらは抗ウイルス活性が強いシアル酸含有糖鎖複合体であることがわかった。【０１１３】
−肺組織中のウイルス力価の測定−
インフルエンザウイルスを接種してから２日目（ｎ＝５／群）に解剖を行い、肺を摘出し、肺組織中のウイルス力価を前記同様の方法で測定した。結果を図１５Ｃに示す。この結果より、シアル酸含有糖鎖複合体は、タミフルと同等のウイルス力価であり、明らかにインフルエンザウイルス感染を抑制していることが確認された。【０１１４】
（試験例６：インフルエンザウイルス感染の生活環での作用効果）
＜シアル酸含有糖鎖複合体添加時期の検討＞
各シアル酸含有糖鎖複合体の抗ウイルス活性の作用機序を解析するために、インフルエンザウイルスの感染過程、即ち、インフルエンザウイルス感染時又は感染後に各シアル酸含有糖鎖複合体を作用させてインフルエンザウイルスの感染抑制効果についてプラック測定（ＰＦＵ  Ａｓｓａｙ）により評価した。【０１１５】
試験例２において、シアル酸含有糖鎖複合体を表４に示す各シアル酸含有糖鎖複合体に代え、この各シアル酸含有糖鎖複合体の添加時期を表４に示す時期に従ったこと以外は、試験例２と同様の方法でＩＣ５０値を算出した。結果を表４に併せて示す。なお、表４は、前記試験を１回〜３回行った平均値を示す。【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
シアル酸含有糖鎖複合体は、いずれのシアル酸含有糖鎖複合体も、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに作用することから感染時又は感染後に作用し、特にインフルエンザウイルス感染時及び感染後の両方の時期で作用させることにより抗インフルエンザウイルス活性が増強されることがわかった。また、カルボキシル基をアミド化したシアル酸含有糖鎖複合体は、アミド化することで抗インフルエンザウイルス活性が強まる傾向にあった。【０１１８】
＜インフルエンザウイルスの種類の検討＞
シアル酸含有糖鎖複合体の、Ａ／ＰＲ／８／３４以外のインフルエンザウイルス株に対する効果について検討した。
試験例２において、シアル酸含有糖鎖複合体を表５に示す各シアル酸含有糖鎖複合体に代え、この各シアル酸含有糖鎖複合体の添加時期を表５に示す時期に従い、インフルエンザウイルスをＡ／ＰＲ／８／３４に代えて、インフルエンザウイルスＡ型でありＨ１Ｎ１タイプのＡ／山形／３２／８９、Ａ／山形／１２０／８６、Ａ／北九州／１５９／９３、又はインフルエンザウイルスＢ型のＢ／三重／１／９３を用いたこと以外は、試験例２と同様の方法でＩＣ５０値を算出した。結果を表５に併せて示す。なお、表５は、前記試験を１回行った平均値を示す。【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
表５より、いずれの分離株もＡ／ＰＲ／８／３４と同様にインフルエンザウイルス感染時及び感染後のいずれであっても抗インフルエンザウイルス活性が認められた。【０１２１】
（試験例７：シアル酸含有糖鎖複合体添加時間と抗インフルエンザウイルス活性の検討）
シアル酸含有糖鎖複合体（３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６）及びタミフルの作用時間による、ＭＤＣＫ細胞に接種したインフルエンザウイルスの遊離に対する影響を検討した。【０１２２】
試験例２と同様の方法でＭＤＣＫ細胞を培養し、モノレーヤーになったＭＤＣＫ細胞に、試験例２と同様の方法でインフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４株に感染させた。３７℃にて１時間インキュベートした後、インフルエンザウイルスを含む培養液を除去し、下記表６に示す各時間（１時間から２８時間）後に３’−ＳＬ−Ｎ−Ｃ１６（５０μｇ／ｍＬ）又はタミフル（１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ加えたアガロース液を前記マイクロプレートに重層し、完全に凝固した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養した。ＭＤＣＫ細胞に形成されたプラーク数から、各時間での遊離ウイルス量（ＰＦＵ／ｍＬ）を算出した。結果を下記表６に示す。【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
表６より、シアル酸含有糖鎖複合体は、感染時及び感染後共に添加することで強い抗インフルエンザウイルス活性を示し、特に１６時間以降に添加すると、明らかに作用が強くなる傾向が確認され、その作用は既存薬のタミフルよりも強かった。
インフルエンザウイルスが細胞に感染して６時間以降から成熟インフルエンザウイルスが出現し、約１５時間頃までにほぼ終了することが報告されている（タミフル（医薬品インタビューフォーム：中外製薬株式会社）、リレンザ（医薬品インタビューフォーム：グラクソ・スミスクライン株式会社）参照）ことから、シアル酸含有糖鎖複合体は、成熟インフルエンザウイルスの増殖を抑制し、再感染を防ぐ作用を有することが示唆される。
タミフル及びリレンザは、選択的ノイラミニダーゼ阻害剤であることから、成熟インフルエンザウイルスが感染細胞から遊離し、増殖の最後の過程に作用すると考えられている（タミフル（医薬品インタビューフォーム：中外製薬株式会社）、リレンザ（医薬品インタビューフォーム：グラクソ・スミスクライン株式会社）参照）。したがって、シアル酸含有糖鎖複合体は、タミフル及びリレンザよりも前の段階でインフルエンザウイルス活性を抑制できる点で有利である。【０１２５】
（試験例８：シアル酸含有糖鎖複合体を含浸させた不織布の抗インフルエンザウイルス効果）
下記表７に示すマスクに使用されている一般的な６種類の不織布に、下記表７に示すシアル酸含有糖鎖複合体をそれぞれ５０μｇ／ｃｍ２含浸させ、乾燥させた後、該不織布にインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）を１．０×１０６ＰＦＵ／ｍＬ作用させた。室温にて１時間、安全キャビネット内に静置した後、各不織布にＰＢＳを加えて該不織布からインフルエンザウイルスを回収した。このウイルス溶液を用い、不織布に残存したウイルス量を、プラック法（ＰＦＵ  Ａｓｓａｙ）により測定した。
即ち、試験例２と同様の方法で調製したＭＤＣＫ細胞に、前記ウイルス溶液の希釈系列液を接種し、３７℃にて１時間インキュベートして感染させた。培養後、アガロース液を重層し、完全に凝固した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養し、各含浸不織布のインフルエンザウイルスの増殖抑制率を測定した。なお、対照としては、シアル酸含有糖鎖複合体を含浸させなかった各種不織布を用いた。結果を表７に示す。【０１２６】
【表７】
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（＊１）ＬＰＯ  ２５２Ｄ  ＰＰ  スパンボンド  ２５ｇ／ｍ２（株式会社ツジトミ製）
（＊２）３２０１Ａ  スパンボンド  ＰＰＴ  １００％  ２０ｇ／ｍ２（東洋紡績株式会社製）
（＊３）３３０１Ａ  スパンボンド  ＰＰＴ  １００％  ３０ｇ／ｍ２（東洋紡績株式会社製）
（＊４）ＧＣ−２５  サーマルボンド  ＰＰ／ＰＥ  ２５ｇ／ｍ２（三幸毛糸紡績株式会社製）
（＊５）ＧＣ−３０  サーマルボンド  ＰＰ／ＰＥ  ３０ｇ／ｍ２（三幸毛糸紡績株式会社製）
（＊６）ＢＴ−０６０５Ｗ  ３０ｇ／ｍ２（ユニセル株式会社製）【０１２７】
表７の結果より、いずれの不織布もインフルエンザウイルスの増殖抑制率が８０％以上を示し、シアル酸含有糖鎖複合体を不織布に固定することが可能であることが確認された。【０１２８】
（試験例９：シアル酸含有糖鎖複合体のインフルエンザウイルスへの作用の検討）
インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）と、下記表８に示すシアル酸含有糖鎖複合体とを、それぞれ表８の容量に従い混合し、室温にて１０分間又は６０分間静置した。これらのインフルエンザウイルスの増殖について、プラック法（ＰＦＵ  Ａｓｓａｙ）により測定した。
即ち、試験例２と同様の方法で調製したＭＤＣＫ細胞に、前記インフルエンザウイルスを１００ＰＦＵ／ｍＬ添加し、３７℃にて１時間インキュベートして感染させた。培養後、アガロース液を重層し、完全に凝固した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日間培養し、それぞれインフルエンザウイルスの増殖抑制率を測定した。結果を表８に示す。【０１２９】
【表８】
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【０１３０】
表８の結果、感染前に、シアル酸含有糖鎖複合体とインフルエンザウイルスとを予め接触させることで、インフルエンザウイルスの細胞への感染能力が低下することがわかった。また、この作用は、１０分間接触させたインフルエンザウイルスより、６０分間作用させたインフルエンザウイルスの感染力が低下していた。これは、シアル酸含有糖鎖複合体が、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに吸着したことからウイルスの感染能力が低下したものと推察される。
この結果から、シアル酸含有糖鎖複合体をフィルターなどに担持させることにより、インフルエンザウイルスへの感染の予防に好適にできることが示唆される。【０１３１】
（試験例１０：シアル酸含有糖鎖複合体のシアリダーゼ抵抗性の検討）
製造例８で得られた６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８及び６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８、並びに、下記方法で合成した２−（２−ピリジルアミノ）エチルアミン・２塩酸−３’−シアリルラクトース（ＰＡＥＡ−３’−ＳＬ）、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ、シグマアルドリッチ社製）をそれぞれ０．０１ｍｇ用い、０．１Ｍ  酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に懸濁し、シアリダーゼ（別名ノイラミニダーゼ；ＥＣ３．２．１．１８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓ由来、シグマアルドリッチ社製）を１０ｍＵ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で３０分間反応させた。【０１３２】
ＰＡＥＡ−３’−ＳＬは、以下の方法で３’−シアリルラクトース以下のＰＡＥＡ化反応を行うことにより合成した。
３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）（シグマアルドリッチ社製）１５ｍｇ（２４μｍｏｌ）と、ＰＡＥＡ（和光純薬工業株式会社製）５．５ｍｇ（２６μｍｏｌ）に、６００μＬのエタノール／０．３２Ｍ  水酸化ナトリウム（９：１（体積比））を加え、更にＤＭＴ−ＭＭ（国産化学株式会社製）（１２．９０％水分）８．３ｍｇ（２６μｍｏｌ）を加えた後、室温で３時間放置することにより、３’−ＳＬ誘導体（ＰＡＥＡ−３’−ＳＬ）を得た。【０１３３】
シアリダーゼ処理により得られた各反応物と、製造例１で用いたクジラ脳ガングリオシド混合液とを用い、ＴＬＣにより、クロロホルム／メタノール／０．２質量％塩化カルシウム水溶液（６０：４０：１０（体積比））で展開した。結果を図１６に示す。【０１３４】
図１６において、「−」は、シアリダーゼ処理を行っていないもの、「＋」は、シアリダーゼ処理を行ったものを示す。また、「Ｍ」は、マーカーとして使用したクジラ脳ガングリオシド混合液（ＧＭ４、ＧＭ３、ＧＭ２、ＧＭ１、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、及びＧＴ１ｂ）を示す。
図１６の結果より、シアル酸のカルボキシル基がアミド化された６’−Ｓ（１ＮＨ２）ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８は、シアリダーゼ処理の有無により移動度に変化はなく、シアリダーゼ抵抗性を示すことがわかった。また、上記方法でシアル酸のカルボキシル基をアミド化反応で修飾したＰＡＥＡ−３’−ＳＬも同様にシアリダーゼに対する抵抗性が認められた。
一方、シアル酸のカルボキシル基がアミド化されていない６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８は、シアリダーゼ処理により分解され、ＧＴ１ｂ付近と、ＧＭ４よりわずかに移動度が大きい位置にバンドが検出された。ＧＴ１ｂ付近のバンドは、６’−ＳＬＮ−Ｎ−Ｃ１８から切り離された遊離Ｎｅｕ５Ａｃであり、ＧＭ４よりわずかに移動度の大きいバンドは、ラクトサミニルステアリン酸アミド（ＬＮ−Ｎ−Ｃ１８）である。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明のシアル酸含有糖鎖複合体は、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有するため、抗インフルエンザウイルス剤に好適に利用可能である。
また、本発明のシアル酸含有糖鎖複合体の製造方法は、短い反応時間で、かつ、反応効率がよいため、前記シアル酸含有糖鎖複合体を効率よく製造することができる。
更に、本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、前記シアル酸含有糖鎖複合体を含有するため、優れた抗インフルエンザウイルス活性を有し、投与時期や投与対象の年齢などに制限がなく、かつ副作用がなく安全性の高い、インフルエンザの予防又は治療に好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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