(57)【要約】  改善された溶解性および安定性を有するが、グルカゴンアゴニスト活性を保持する改変グルカゴンペプチドが開示される。本グルカゴンペプチドは、自然のままのグルカゴンと比較して6、10または13位の1つ以上でピリジル-アラニンによる自然のままのアミノ酸の置換、および/または20または21位でD-配座のアミノ酸による置換によって改変された。
2019520336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然のままのグルカゴンと比較して強化された溶解性を有するグルカゴンペプチドであって、前記グルカゴンペプチドが、グルカゴンの自然のままの配列（配列番号:1）と比較して6、10または13位の1つ、2つまたは3つでピリジル-アラニンまたはヒスチジンアミノ酸置換を含む、前記グルカゴンペプチド。
【請求項２】
前記グルカゴンペプチドが、10および13位にピリジル-アラニンアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３】
前記グルカゴンペプチドが、6、10および13位にピリジル-アラニンアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項４】
前記ピリジル-アラニンアミノ酸が、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択される、請求項1〜3のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項５】
前記ピリジル-アラニンアミノ酸が、3-(4-ピリジル)-L-アラニンである、請求項4に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項６】
前記グルカゴンペプチドが、16位にAibを含む、請求項1〜5のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項７】
前記グルカゴンペプチドが、
i）20位にD-Gln、
ii）21位にD-Asp、または
iii）i）およびii）の組合せ
を含む、請求項1〜6のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項８】
前記グルカゴンペプチドが、配列X1X2X3GTX6TSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FVX24WLX27-Z（配列番号:934）を含み、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X3は、下記構造I,IIまたはIIIの側鎖を含むアミノ酸であり、
2019520336.tif 000026
構造Ｉ
2019520336.tif 000027
構造ＩＩ
2019520336.tif 000028
構造ＩＩＩ
（R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり；R2はNHR4またはC1-3アルキルであり；R3はC1-3アルキルであり；R4はHまたはC1-3アルキルであり；XはNH、O、またはSであり；YはNHR4、SR3またはOR3である）；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、His、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X12はLys、IleまたはArgであり；
X13はTyr、Hisまたはピリジル-アラニンであり；
X15は、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸であり；
X16は、Glu、Lys、Asp、Ser、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、ThrまたはAibであり；
X17はArgまたはGlnであり；
X18はAla、Argであり；
X20はGln、Glu、Ser、Thr、Ala、Lys、シトルリン、Arg、Orn、またはAibであり；
X21はGlu、Aib、Asp、Lys、Cys、Orn、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニンであり；
X24はAsn、Aib、Gln、GluまたはLysであり；
X27はMet、LeuまたはNleであり；
X28はAsn、AspまたはAlaであり；
X29はThr、GluまたはGlyであり；且つ
Zは、-COOH、-X28-COOH、X28-X29-COOH、およびX28-X29-GPSSGAPPPS（配列番号:953）から成る群から選択され、
ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つがピリジル-アラニンである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項９】
前記グルカゴンペプチドが、
（i）i位およびi+4位（iは12、16、20または24である）のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋を含むか、または
（ii）前記グルカゴンペプチドの16、20、21および24位のアミノ酸の1つ、2つ、3つ、または全てがα, α-二置換アミノ酸で置換されている、
請求項8に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１０】
前記16位のアミノ酸が、Aibである、請求項8に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１１】
X3がGlnであり；X15がAspであり；X17がArgであり；X18がArgであり；X20がGlnであり；X21がAspであり；且つX24がGlnである、請求項10に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１２】
Zが、X28-X29-COOHまたはX28-X29-GPSSGAPPPS（配列番号:953）である、請求項8〜11のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１３】
X3が、グルタミンである、請求項8〜10のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１４】
前記グルカゴンペプチドが、
配列X1X2QGTX6TSDX10SKX13LX15X16RRAX20DFVX24WLMX28T（配列番号:964）、または
7、11、14、17、18、19および27位から選択される1〜2個のアミノ酸改変によって配列番号:964と相違する配列番号:964のアナログ
を含み、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10はピリジル-アラニンであり；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X15はAsp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり；
X16はAibであり；
X20はD-Gln、GlnまたはLysであり；
X24はGlnまたはGluであり；
X28はAsn、AspまたはLysである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１５】
前記グルカゴンペプチドが、
配列X1X2X3GTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVX24WLMX28X29（配列番号:937）、または
配列番号:1の自然のままの配列と比較して10までのアミノ酸改変を含む、配列番号937のアナログ
を含み、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X3は下記構造Iの側鎖を含むアミノ酸であり
2019520336.tif 000029
構造Ｉ
（R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキル、R2はNHR4またはC1-3アルキル、R4はHまたはC1-3アルキル、XはNH、O、またはSである）；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はアミノイソ酪酸（Aib）であり；
X20はD-Gln、GlnまたはLysであり；
X24はGlnであり；
X28はAsnであり；且つ
X29はThr、GluまたはGlyであり、
ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つがピリジル-アラニンであり、
前記改変は、以下、
l．ヒドロキシル基を欠くアミノ酸、場合によってAbuまたはIleによる7位のThrの置換；
m．Argによる12位のLysの置換；
n．Gluによる15位のAspの置換；
o．Gluによる21位のAspの置換；
p．AlaまたはAibによる24位のGlnの置換；
q．LeuまたはNleによる27位のMetの置換；
r．Gluによる29位のThrの置換；
s．GPSSGAPPPS（配列番号:820）のアミノ酸配列のC-末端への付加（ここで29位のアミノ酸はThrまたはGlyである）；
t．天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではないアシルまたはアルキル基に共有結合している側鎖を含むアミノ酸の置換または付加；
u．荷電アミノ酸による28位のAsnの置換（場合によって、前記荷電アミノ酸はLys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸から成る群から選択される）；
v．29位の後ろに1〜3個の荷電アミノ酸の挿入（場合によって、前記挿入はGluまたはLysを含む）；又は
前記の組合せ
から成る群から選択され、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つがピリジル-アラニンである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１６】
前記グルカゴンペプチドが、配列HX2QGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAQDFVQWLMNT（配列番号:965）を含み、
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10はTyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はGluまたはAibであり、
ただしX6、X10またはX13の少なくとも2つがピリジル-アラニンである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１７】
X10が、ピリジル-アラニンである、請求項8〜16のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１８】
X2が、Aibである、請求項17に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項１９】
前記ピリジル-アラニンが、3-(3-ピリジル)-L-アラニンである、請求項8〜18のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２０】
前記グルカゴンペプチドが、配列HSQGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20X21FVQWLMX28X29（配列番号:966）を含み、
X6は、Phe、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X10は、Tyr、His、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X13は、Tyr、His、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X16はAibであり；
X20はdGlnおよびGlnから成る群から選択され；
X21はdAspおよびAspから成る群から選択され；
X28はAsn、AspまたはLysであり；且つ、
X29はThr、Gly、Asp、またはGluである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが、前記ペプチドの29位のアミノ酸に連結された配列番号:820（GPSSGAPPPS）のC-末端伸長をさらに含む、請求項20に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２２】
X6がPheであり；
X10が3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13がTyr、3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X16がAibであり；
X20がdGlnであり；
X21がAspであり；
X28がAsnであり；且つ
X29がThrである、
請求項20に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２３】
X6がPheであり；
X10が3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13がTyr、3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X16がAibであり；
X20がGlnであり；
X21がdAspであり；
X28がAsnであり；且つ
X29がThrである、
請求項20に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２４】
前記グルカゴンペプチドが、以下の配列
HSQGTFTSDX10SKYLDX16RRAX20DFVQWLMX28X29（配列番号:968）
HSQGTFTSDX10SKYLDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:967）
を含み、
X10は、Tyr、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X16はAibであり；
X20はdGlnであり；
X28はAspまたはLysであり；
X29はAspまたはGluであり、
場合によってX10はTyr、X28はAsp、およびX29はGluである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２５】
前記グルカゴンペプチドが、配列HSQGTFTSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:969）を含み、
X10は3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13は3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X16はAibであり；且つ
X20はdGlnであり、
場合によってX10およびX13がともに3-(3-ピリジル)-L-アラニンであるか、またはX10およびX13がともに3-(4-ピリジル)-L-アラニンである、
請求項24に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２６】
前記グルカゴンペプチドが、配列HSQGTFTSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:969）を含み、
X10は、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrであり；
X16はAibであり；且つ
X20はdGlnである、
請求項24に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２７】
前記グルカゴンペプチドが、以下、
X1X2QGTX6TSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:961）；
X1X2QGTFTSDX10SKYLDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:940）；
X1X2QGTFTSDYSKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:941）；
X1X2QGTFTSDX10SKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:962）；または
X1X2QGTX6TSDX10SKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:963）
から成る群から選択される配列を含み、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10 は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２８】
X1が、His、D-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）であり、
X2が、SerまたはAibであり、且つ
前記ピリジル-アラニンが、3-(3-ピリジル)-L-アラニンである、
請求項27に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項２９】
前記グルカゴンペプチドが、配列HSQGTFTSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:969）を含み、
X10は、His、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X13は、His、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X16はAibであり；且つ
X20はdGlnおよびGlnから成る群から選択される、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３０】
前記グルカゴンペプチドが、配列HSQGTFTSDX10SKYLDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:971）を含み、
X10は、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X16はAibであり；且つ
X20はdGlnである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３１】
前記グルカゴンペプチドが、配列HSQGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAQDFVQWLMNT（配列番号:950）を含み、
X6は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり;
X10は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；且つ
X16はAibである、
請求項1に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３２】
前記ピリジル-アラニンアミノ酸が、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択される、請求項8〜18のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３３】
前記グルカゴンペプチドが、親水性部分に共有結合れている、請求項1〜32のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３４】
前記親水性部分が、ポリエチレングリコール（PEG）である、請求項33に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３５】
前記グルカゴンペプチドが、自然のままではないアシルまたはアルキル基に共有結合している、請求項1〜34のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３６】
前記アシル基または前記アルキル基が、スペーサーを介してアミノ酸の側鎖に結合しており、前記アルキルまたはアシル基の遊離末端にカルボキシレートを含む、請求項35に記載のグルカゴンペプチド。
【請求項３７】
請求項1〜36のいずれか１項に記載のグルカゴンペプチドおよび医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
低血糖を治療または予防する必要がある患者で低血糖を治療または予防する方法であって、請求項37に記載の医薬組成物を前記患者の低血糖を治療または予防するのに有効な量で前記患者に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記グルカゴンペプチドがインスリンと共投与される、請求項38に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は米国仮特許出願No.62/344,672（2016年6月2日出願）の優先権を主張する（前記出願の開示内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
（電子提出資料の参照による取り込み）本明細書と同時に提出され下記のように認証されるコンピュータ読み出し可能ヌクレオチド/アミノ酸配列表は、参照によってその全体が本明細書に含まれる：2017年5月21日作成の“265440seqlist_st25.txt”と称する557キロバイトのascii（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００２】
プレ-プログルカゴンは158アミノ酸の前駆体ポリペプチドであり、前記は種々の組織でプロセッシングされて、多数の異なるプログルカゴン由来ペプチド（グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP-2）およびオキシントモジュリン（OXM）を含む）を形成し、それらは、多様な生理学的機能（グルコース恒常性、インスリン分泌、胃内容排出、および腸増殖を食物摂取の調節とともに含む）で必要とされる。グルカゴンは、プレ-プログルカゴンのアミノ酸33から61に対応する29アミノ酸ペプチドであり、一方、GLP-1は、プレ-プログルカゴンのアミノ酸72から108に対応する37アミノ酸ペプチドとして生成される。
低血糖は、血糖レベルが身体活動のために十分なエネルギーを提供するにはあまりに低く降下したときに発生する。成人または10歳以上の小児では、低血糖は糖尿病治療の副作用を除いて一般的ではないが、前記は、他の投薬処置若しくは疾患、ホルモン若しくは酵素欠損、または腫瘍により発生し得る。血糖が下降し始めるとき、グルカゴン（膵臓によって生成されるホルモン）は肝臓にグリコーゲンを分解してグルコースを放出するようにシグナルを発し、血糖レベルを正常レベルへ上昇させる。したがって、グルカゴンのもっとも認識されたグルコース調節における役割はインスリンの作用と反対に働き血糖レベルを維持することである。しかしながら糖尿病患者では、低血糖に対するこの応答が障害され、グルコースレベルが正常範囲に戻ることをより困難にする。
低血糖は即時的医療手当を必要とする生命を脅かす事象である。グルカゴンの投与は、急性低血糖の治療のために確立された投薬処置であり、投与数分以内にグルコースの正常レベルを回復させることができる。グルカゴンを低血糖の危機的医療処置で用いるときには、グルカゴンの結晶形が希酸緩衝液で溶解され当該溶液が筋肉内に注射される。この処置は有効であるが、その方法論は厄介であり、さらにある者（半ば意識不明状態の者）にとっては危険である。したがって、親分子の生物学的性能を維持するが対応する生理学的条件下で十分に溶解性で安定性であり、すぐに注射できる溶液として事前処方（pre-formulated）できるグルカゴンアナログが希求される。
【０００３】
自然のままのグルカゴンの溶解性処方を開発するために多数のアプローチが進歩してきた（水性および非水性処方の使用を含む）。加えて、凝集および化学的分解を低下させるために、一次配列の改変が報告されている。これらの改変には、自然のままのアミド側鎖の数の減少（酸感受性Gln3の化学的に安定な模倣物による置換を含む）が含まれる。付け加えれば、Ser16のアミノイソ酪酸（Aid）による置換は、物理的凝集傾向を最小限にすることによって示されるように生物物理的特性を改善するだけでなく、Asp15とSer16との間のイソアスパルチミドの形成による化学的分解の防止をもたらす。当該ペプチドの化学的および物理的安定化とは別に、その水溶性を強化するために2つのアプローチが採用された。これらには、エクセンジン由来9アミノ酸配列によるC-末端伸長、およびC-末端への陰イオン導入（中性pHでの溶解性を高める手段として等電点を低下させる）が含まれる。しかしながら、グルカゴン溶解性および安定性の更なる改善が所望される。
糖尿病患者は、正常血糖レベル近くを維持して微小血管合併症を遅らせるか予防するように督励される。この目標の達成は通常徹底的なインスリン療法を必要とする。この目標達成の奮闘で、医師は、彼らの糖尿病患者で低血糖の頻度および重篤度が実質的に増加することを目にしている。したがって、従来のインスリン療法より低血糖誘発の蓋然性が低い、改善された医薬および方法論が糖尿病治療に希求される。
本明細書に記載するように、強化された（enhanced）水溶性を示す、高効能のグルカゴンペプチドが提供される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明のある実施態様はグルカゴンペプチドを提供し、前記ペプチドは、グルカゴン受容体活性を保持し、かつ自然のままのグルカゴン（配列番号:1）と比較して改善された溶解性を示し、場合によって自然のままのグルカゴンと比較して当該アナログの等電点に影響を与えない。自然のままのグルカゴンは（特に生理学的pHの）水溶液中で貧弱な溶解性を示し、時間の経過で凝集および沈殿する傾向がある。対照的に、ある実施態様では、本明細書に開示するグルカゴンペプチドは、自然のままのグルカゴンと比較して6から7のpHで少なくとも2倍、5倍またはより高い溶解性すら示す。
本明細書で開示するようにグルカゴンペプチドが提供され、前記ペプチドは、自然のままのホルモンに匹敵する薬物動態プロフィールおよび薬力学プロフィールを有するが、いったん商品として処方されると、すぐに使える医薬を構成するために生理学的pHでの溶解性および化学的安定性を有する。ある実施態様では、強化された溶解性およびGLP-1またはGIP受容体での活性を有するグルカゴンペプチドもまた提供される。当該強化された溶解性は、グルカゴンのアミノ酸配列内の芳香族アミノ酸残基をピリジル-アラニンで入れ替えて、自然のままのホルモンに匹敵する薬物動態プロフィールおよび薬力学的プロフィールを有する構造的アナログを生成できるという発見に由来する。
ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該グルカゴンペプチドは自然のままのグルカゴンと比較して生理学的pHで強化された溶解性を有する。本明細書で開示されるように、ある実施態様では、強化された溶解性は、6、10または13位から選択される1つ以上のアミノ酸のピリジル-アラニンによる置換から生じる。
【０００５】
ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドの溶解性は、当該ペプチドのC-末端部分に、ある実施態様では配列番号:1のC-末端から27位までの位置に荷電アミノ酸を導入するアミノ酸置換および/または付加によってさらに改善される。場合によって、6、10または13位から選択されるアミノ酸位へのピリジル-アラニンの導入に加えて、1つ、2つ、または3つの荷電アミノ酸がC-末端部分に、ある実施態様ではC-末端から27位に導入される。ある実施態様にしたがえば、28位および/または29位の自然のままのアミノ酸は荷電アミノ酸により置換され、および/または1つから3つの荷電アミノ酸が29位の後ろで当該ペプチドのC-末端に付加される。例示的な実施態様では、荷電アミノ酸の1つ、2つまたは全ての荷電アミノ酸が陰性に荷電される。追加の改変、例えば保存的置換をグルカゴンペプチドに対して実施することができ、前記改変は当該ペプチドがグルカゴン活性をなお保持することを可能にする。
ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドの溶解性は、D-異性体配座のアミノ酸を導入するアミノ酸置換および/または付加によってさらに改善される。ある実施態様では、D-異性体配座のアミノ酸により20位または21位の天然のアミノ酸が置換される。ある実施態様では、20位にdGlnおよび/または21位にdAspを含むグルカゴンペプチドが提供される。ある実施態様では、6、10または13位から選択される位置にピリジル-アラニンによる1、2または3つの置換を、16位のAibおよび20位のdGlnおよび/または21位のdAspの置換と組合わせて含むグルカゴンペプチドが提供される。
本発明はさらに前記グルカゴンペプチドの医薬的に許容できる塩を包含する。
【０００６】
いくつかの実施態様では、1または2位の改変はジペプチジルペプチダーゼIV（DPP IV）切断に対する当該ペプチドの耐性を高める。例えば、2位のアミノ酸は、D-セリン、D-アラニン、バリン、グリシン、N-メチルセリン、N-メチルアラニン、またはアミノイソ酪酸で置換できる。また別には、或いは付け加えて、1位のアミノ酸は、D-ヒスチジン（D-His）、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル-ヒスチジン、アセチル-ヒスチジン、ホモ-ヒスチジン、N-メチルヒスチジン、アルファ-メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）で置換できる。
2位の改変（例えば2位のAib）およびいくつかの事例では1位の改変（例えば1位のDMIA）はグルカゴン活性を低下させること、時には顕著に低下させることが観察された。グルカゴン活性におけるこの低下は、グルカゴンのC-末端部分（アミノ酸12−19辺り）のアルファヘリックス構造の安定化によって回復させることができる。いくつかの実施態様では、安定化は、“i”および“i+4”位のアミノ酸の間の共有結合を介する（ここでiは12から25の任意の整数である）。いくつかの具体的な実施態様では、“i”および“i+4”は12および16、16および20、または20および24、または24および28である。いくつかの実施態様では、この共有結合は16位のグルタミン酸と20位のリジンとの間のラクタム架橋である。例示的な実施態様では、架橋またはリンカーは長さが約8（または約7−9）原子である。他の実施態様では、安定化は“j”および“j+3”のアミノ酸の間の共有結合を介する（ここでjは12から27の任意の整数である）。例示的な実施態様では、架橋またはリンカーは長さは約6（または約5−7）原子である。さらに他の実施態様では、安定化は“k”および“k+7”のアミノ酸の間の共有結合を介する（ここでkは12から22の任意の整数である）。いくつかの実施態様では、この共有結合はラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合方法（すなわち共有結合分子内架橋を形成する手段）には以下の任意の1つ以上が含まれる：オレフィンメタセシス、ランチオニンによる環化、ジスルフィド架橋または改変された硫黄含有架橋形成、α,ω-ジアミノアルカンテザーの使用、金属原子架橋の形成、および他のペプチド環化手段。
【０００７】
さらに他の実施態様では、ヘリックスは非共有結合（すなわち分子内非共有結合）によって安定化され、前記には水素結合、イオン相互反応および塩架橋が含まれる（ただしこれらに限定されない）。
本発明の他の実施態様では、グルカゴンペプチドのC-末端部分（アミノ酸12−29辺り）のアルファヘリックス構造の安定化は、所望の活性を保持する位置で1つ以上のα,α-二置換アミノ酸を意図的に導入することにより達成される。いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドの16、17、18、19、20、21、24または29位の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以上がα,α-二置換アミノ酸で置換される。例えば、グルカゴンペプチドの16位のアミノイソ酪酸（Aib）による置換は、塩架橋またはラクタムの非存在下で安定化されたアルファヘリックスを提供する。そのようなペプチドは、本明細書では分子内架橋を欠くペプチドとみなされる。具体的な特徴では、アルファヘリックスの安定化は、共有結合分子内架橋（例えばラクタム架橋、ジスルフィド架橋）を導入することなく、1つ以上のα,α-二置換アミノ酸を導入することによって達成される。そのようなペプチドは、本明細書では共有結合分子内架橋を欠くペプチドとみなされる。いくつかの実施態様では、16、20、21または24位の1つ、2つ、3つまたは4つ以上がAibで置換される。
【０００８】
したがっていくつかの実施態様では、本開示は、
アミノ酸配列X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z（配列番号:839）を含み、前記配列に対して1つから3つのアミノ酸改変を有するグルカゴンペプチドを提供し、
式中、
6、10または13位から選択される1つ以上のアミノ酸はピリジル-アラニンで置換され、さらに場合によって20および21位から選択される1つまたは2つのアミノ酸はD-異性体配座のアミノ酸で置換され、場合によって置換アミノ酸は当該位置の自然のままのアミノ酸のD-異性体であり；
X1および/またはX2は、ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低下させる（または耐性を高める）自然のままではないアミノ酸であり、場合によってX1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され、さらにX2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Valまたはアルファ-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され、
ここでZは、-COOH（天然に出現するC-末端カルボキシレート）、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH、およびY-COOHから成る群から選択され、式中Yは1つから2つのアミノ酸であり、場合によって分子内架橋（好ましくは共有結合）はi位のアミノ酸およびi+4位のアミノ酸の側鎖を結び付け、ここでiは12、16、20または24である。
【０００９】
いくつかの実施態様では、分子内架橋はラクタム架橋である。いくつかの実施態様では、配列番号:839のi位およびi+4位のアミノ酸は、LysおよびGlu、例えばGlu16およびLys20である。いくつかの実施態様では、X1は、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、およびアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択される。他の実施態様では、X2は、D-Ser、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Valおよびアルファ-アミノ-N-酪酸（Aib）から成る群から選択される。いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドは、アミノ酸16、17、20、21、24、29、40位のいずれかで、C-末端伸長内で、またはC-末端アミノ酸で親水性部分と共有結合的に連結される。例示的な実施態様では、この親水性部分は、これらの位置のいずれかでLys、Cys、Orn、ホモシステイン、またはアセチル-フェニルアラニン残基に共有結合的に連結される。例示的な親水性部分にはポリエチレングリコール（PEG）が含まれ、例えば約1,000ダルトンから約40,000ダルトン、または約20,000ダルトンから約40,000ダルトンの分子量のPEGである。
【００１０】
他の実施態様では、本発明は、アミノ酸配列X1-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Z（配列番号:839）を含む、グルカゴンアゴニスト活性を有するグルカゴンペプチドを提供する：
式中、
6、10または13位から選択される1つ以上のアミノ酸はピリジル-アラニンで置換され；
X1および/またはX2は、ジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低下させる（または耐性を高める）、自然のままではないアミノ酸であり、場合によってX1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され、さらにX2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Valまたはアルファ-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され、
グルカゴンペプチドの16、20、21、および24位の1つ、2つ、3つ、または4つはα,α-二置換アミノ酸で置換され、
Zは-COOH（天然に出現するC-末端カルボキシレート）、-Asn-COOH、Asn-Thr-COOH、およびY-COOHから成る群から選択され、式中Yは1つから2つのアミノ酸である。
【００１１】
前述のグルカゴンペプチドまたはアナログへの例示的な更なるアミノ酸改変には以下が含まれる：ヒドロキシル基を欠くアミノ酸（例えばアミノ酪酸）またはIleによる7位のThrの置換であって、前記は、場合によって、アシルまたはアルキル基（前記アシルまたはアルキル基は天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではない）と共有結合的に接着される側鎖を含むアミノ酸の置換または付加、12位のLysのArgによる置換と組み合わされる；15位のAspのGluによる置換；16位のSerのThrまたはアミノイソ酪酸（Aib）による置換；20位のGlnのdGln、Ser、Thr、AlaまたはAibによる置換;21位のAspのdAspまたはGluによる置換；24位のGlnのSer、Thr、AlaまたはAibによる置換；27位のMetのLeuまたはNleによる置換；28位のAsnの荷電アミノ酸による置換；28位のAsnのLys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸およびホモシステイン酸から成る群から選択される荷電アミノ酸による置換；Asn、Asp、またはGluによる28位の置換；Aspによる28位の置換；Gluによる28位の置換；29位のThrの荷電アミノ酸による置換；29位のThrのLys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸およびホモシステイン酸から成る群から選択される荷電アミノ酸による置換；29位のAsp、GluまたはLysによる置換；Gluによる29位の置換；29位の後ろへの1−3の荷電アミノ酸の挿入；GluまたはLysの30位（すなわち29位の後ろ）への挿入；場合によってLysの31位への挿入；配列番号:820のC-末端への付加、場合によって、29位のアミノ酸はThrまたはGly；親水性部分に共有結合的に接着されたアミノ酸の置換または付加；または前記の組合せ。
【００１２】
ある種の実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号:1の配列、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10のアミノ酸改変により配列番号:1と相違する配列を含み、ここで、グルカゴンペプチドはさらに改変されて、グルカゴンの自然のままの配列と比較して6、10または13位に1つ以上のピリジル-アラニンまたはヒスチジンアミノ酸置換を含む。さらに別の実施態様では、グルカゴンペプチドは、共有結合的に、場合によってスペーサーを介してアシル基またはアルキル基に接着される側鎖を有するアミノ酸を含み、当該アシル基またはアルキル基は天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではない。ある実施態様では、共有結合的に連結されるアシルまたはアルキル基はその遊離末端にカルボキシレートを有する。いくつかの実施態様のアシル基は、C4からC30の脂肪アシル基であり、場合によって各末端にカルボキシレート基を有する。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、共有結合的に連結されたC4からC30のアシル基を含み、前記は場合によってその遊離末端にカルボキシレートを有する。具体的な特徴では、アシル基またはアルキル基は10位のアミノ酸の側鎖に共有結合的に接着される。
さらにまた別の例示的な実施態様では、前述のペプチドのいずれかを、配列番号:1の15位のアミノ酸を改変して時間の経過におけるペプチドの分解（特に酸性またはアルカリ性緩衝液中での分解）を低下させることによってさらに改変し、安定性を改善することができる。例示的な実施態様では、15位のAspは、Glu、ホモ-Glu、システイン酸、またはホモシステイン酸で置換される。
また別に、本明細書に記載するグルカゴンペプチドのいずれかを、配列番号:1の16位のアミノ酸を改変することによってさらに改変し、安定性を改善することができる。例示的な実施態様では、16位のSerは、Thrにより置換されるか、またはグルカゴン受容体での能力を強化する上記に記載のミノ酸置換のいずれかで置換される。そのような改変はAsp15-Ser16間のペプチド結合の切断を低下させる。
【００１３】
グルカゴン受容体での活性の維持または活性の強化は、3位のGlnをグルタミンアナログで改変することによって達成できる。例えば、3位にグルタミンアナログを含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体で自然のままのグルカゴン（例えば配列番号:1）より約5％、約10％、約20％、約50％、若しくは約85％、または前記より高い活性を示すことができる。いくつかの実施態様では、当該グルカゴンアナログは、下記の構造I、IIまたはIIIの側鎖を含む、天然に出現するまたは天然には出現しないアミノ酸である：
2019520336.tif 000003
構造I
2019520336.tif 000004
構造II
2019520336.tif 000005
構造III
式中、R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり；R2はNHR4またはC1-3アルキルであり；R3はC1-3アルキルであり；R4はHまたはC1-3アルキルであり；XはNH、O、またはSであり；さらにYはNHR4、SR3、またはOR3である。いくつかの実施態様では、XはNHであるか、またはYはNHR4である。いくつかの実施態様では、R1はC0-2アルキルまたはC1ヘテロアルキルである。いくつかの実施態様では、R2はNHR4またはC1アルキルである。いくつかの実施態様では、R4はHまたはC1アルキルである。
【００１４】
グルカゴン受容体での活性強化はまた、アシルまたはアルキル基（例えば天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではないアシルまたはアルキル基（例えばC4からC30脂肪アシル基、C4からC30アルキル基））を当該グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖に共有結合的に接着することによって達成できる。いくつかの実施態様では、当該アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドは分子内架橋（例えば共有結合分子内架橋（例えばラクタム））を欠く。ある種の特徴では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー（例えば長さが3から10原子のスペーサー）を介してグルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖に接着される。いくつかの実施態様では、アシルまたはアルキル基は、スペーサーを介してグルカゴンペプチドの10位のアミノ酸の側鎖に接着される。具体的な実施態様では、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドはさらに改変を含み、前記改変はGLP-1受容体でのペプチドの活性を選択的に低下させる。例えば、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドは、C-末端アルファカルボキシレート、7位のThrのヒドロキシル基を欠くアミノ酸（例えばAbuまたはIle）による置換、C-末端から27または28位までのアミノ酸の欠失（27-または28-アミノ酸ペプチドを生じる）、または前記の組合せを含むことができる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載するグルカゴンペプチドのいずれかをさらに改変し、20、21、24または27位の任意の1つ、2つ、3つまたは4つ全てを改変することによって種々のアミノ酸の位置での分解を低下させることができる。例示的な実施態様は、20位のGlnのAlaまたはAibによる置換、21位のAspのGluによる置換、24位のGlnのAlaまたはAibによる置換、27位のMetのLeuまたはNleによる置換を含む。メチオニンの除去または置換はメチオニンの酸化による分解を低下させる。GlnまたはAsnの除去または置換はGlnまたはAsnの脱アミドによる分解を低下させる。Aspの除去または置換は、Aspが脱水されて環状スクシンイミド中間体を形成しその後に続くイソアスパルテートへの異性化により生じる分解を低下させる。
【００１５】
グルカゴンペプチドは、ダイマー、トリマー、またはリンカーを介する少なくとも2つ、3つまたは4つ以上のペプチドを含むより高次のマルチマーの部分であることができ、ここで、少なくとも1つまたは両方がグルカゴンペプチドである。ダイマーはホモダイマーまたはヘテロダイマーであり得る。いくつかの実施態様では、リンカーは、二官能性チオール架橋剤および二官能性アミン架橋剤から成る群から選択される。ある種の実施態様では、リンカーはPEG、例えば5kDa PEG、20kDa PEGである。いくつかの実施態様では、リンカーはジスルフィド結合である。例えば、ダイマーの各モノマーはCys残基（例えば末端または内部に位置するCys）を含み、各Cys残基の硫黄原子がジスルフィド結合の形成に参画する。本発明のいくつかの特徴では、モノマーは、末端アミノ酸（例えばN-末端またはC-末端）を介して、内部アミノ酸を介して、または少なくとも1つのモノマーの末端アミノ酸および少なくとも1つの他のモノマーの内部アミノ酸を介して結び付けられる。具体的な特徴では、モノマーはN-末端アミノ酸を介して結び付けられることはない。いくつかの特徴では、マルチマーのモノマーは“尾対尾”の向きで一緒に接着され、その場合各モノマーのC-末端アミノ酸が一緒に接着される。
共役部分は、本明細書に記載するグルカゴンペプチド（ダイマー、トリマーまたはより高次のマルチマーを含む）のいずれかに共有結合的に連結され得る。配列番号:820から822のいずれかのアミノ酸配列を含む融合ペプチドもまた意図される。
グルカゴン受容体活性を高め、部分的なグルカゴン受容体活性を保持し、溶解性を改善し、溶解性を高め、または分解を低下させる上記に記載する改変のいずれかを、グルカゴンペプチドに個々にまたは組合わせて適用することができる。
【００１６】
ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示する新規なグルカゴンペプチドのいずれか（好ましくは無菌的で、好ましくは少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の純度レベルである）、および医薬的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくともAの濃度でグルカゴンペプチドを含むことができ、ここでAは、0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、または前記より高い。他の実施態様では、そのような組成物は、多くてもBの濃度でグルカゴンペプチドを含むことができ、ここでBは、30mg/mL、25mg/mL、24mg/mL、23mg/mL、22mg/mL、21mg/mL、20mg/mL、19mg/mL、18mg/mL、17mg/mL、16mg/mL、15mg/mL、14mg/mL、13mg/mL、12mg/mL、11mg/mL、10mg/mL、9mg/mL、8mg/mL、7mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、または0.1mg/mLである。いくつかの実施態様では、組成物は、AからB mg/mLの範囲、例えば0.001から30.0mg/mLの濃度でグルカゴンペプチドを含むことができる。ある実施態様では、医薬組成物は水溶液を含み、前記は無菌的であり、場合によって種々の容器内で保存される。ある実施態様にしたがえば、そのような溶液を用いて、すぐに注射できる事前処方された溶液を調製できる。他の実施態様では、医薬組成物は凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物はさらにまた、患者に当該組成物を投与するための使い捨て装置を含むキットの部分として梱包され得る。装置は注射器および針、または予め充填された注射器を含むことができる。容器またはキットには、常温または冷蔵温度での保存のための標識を付すことができる。
【００１７】
ある実施態様にしたがえば、本発明のグルカゴンペプチドの事前処方された水性組成物を用いて迅速にグルコースレベルを高める方法、血糖レベルを正常化させる方法、血糖レベルを安定化させる方法、または低血糖を予防若しくは治療する方法が提供される。当該方法は、本開示の新規な改変グルカゴンペプチドを含む水溶液の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、水性組成物は、患者に当該組成物を投与するために用いられる装置に予めパッケージされる。べつの実施態様では、腸管の一過性麻痺を誘発する方法が提供される。当該方法は、その必要がある患者に本明細書に開示するグルカゴンペプチドの1つ以上を投与する工程を含む。
さらに別の実施態様では、インスリンおよび本開示のグルカゴンペプチドの共同投与を必要とする高血糖または糖尿病の治療方法が提供される。高血糖には、糖尿病、真性糖尿病I型、真性糖尿病II型、または妊娠性糖尿病（インスリン依存型またはインスリン非依存型）、および退縮糖尿病合併症（reducing complications of diabetes）（腎症、網膜症および血管の疾患を含む）が含まれる。インスリンおよび本発明のグルカゴンペプチドの共同投与は、夜間の低血糖を減少させ、および/またはインスリンの低血糖性作用をやわらげることができ、短時間作用性または長時間作用性インスリンの同じ用量またはより高い用量の投与を可能にし有害な低血糖性作用をより少なくする。本発明のグルカゴンペプチドと一緒にインスリンを含む組成物もまた提供される。
【００１８】
ある実施態様にしたがえば、インスリン依存患者の血糖レベルを調節する改善された方法が提供される。前記方法は、糖尿病の制御のために治療的に有効な量のインスリンを投与する工程、および本開示の新規な改変グルカゴンペプチドを低血糖の予防のために治療的に有効な量で投与する工程を含み、ここで、前記投与工程は互いに12時間以内に実施される。ある実施態様では、グルカゴンペプチドおよびインスリンは単一組成物として共同投与される。
本明細書に記載する全ての治療的方法、医薬組成物、キットおよび他の類似の実施態様で、グルカゴンペプチド、グルカゴンアゴニスト、またはグルカゴンアナログという用語を用いる場合、前記の全ての医薬的に許容できる塩およびエステルが含まれることが意図される。
前述の概要は本発明の全ての特徴を規定することを意図せず、他のセクション（例えば「詳細な説明」）で追加の実施態様が記載される。本文書全体を一元化された開示として記述することが意図され、たとえ複数の特色が本文書の同じ文章またはパラグラフまたはセクションで一緒に見いだされなくても、本明細書に記載する複数の特色の全ての可能な組合せを意図できることは理解されよう。
さらにまた、本発明は、本明細書の具体的なパラグラフによって規定される変型よりも多少なりとも範囲が狭い本発明の任意の1つのまたは全ての実施態様を含む。例えば、本発明のある種の特徴が1つの種類として記載されている場合、1つの種類の全てのメンバーはそれぞれ本発明の1つの実施態様であり、さらに当該種類の2つ以上のメンバーの組合せは本発明の複数の実施態様であることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】PBS中でi）最初に室温、ii）4℃48時間、またはiii）4℃7日間インキュベートした後のピリジル-アラニン改変グルカゴン（表1）の溶解性の変化を示す棒グラフである。黒い目印の線は注射可能な救急用グルカゴン処方物のための医薬的に対応する濃度を示す。
【図２】表1のグルカゴンペプチドのフィブリル化に対する耐性/安定性を示す棒グラフである。アナログ9（配列番号:950）は、実施例6に開示するチオフラビン-T蛍光アッセイによって測定されるフィブリル化に対し耐性を示した。自然のままのグルカゴン（1）及び陽性コントロールとしてインスリン（S1およびS2）を使用。
【図３】アナログ9の生物学的応答の持続性および化学的安定性を、4週間にわたるpH5、6および7でのin vitro効能により測定した。図3は、0時間、1週間および4週間におけるEC50のパーセント変化を示す。
【図４Ａ】図4Aは、時間経過における痩せラットの血糖レベルの変化のグラフである。当該ラットは、固定用量のインスリンとともに自然のままのグルカゴンが用量を増加させながら投与された。
【図４Ｂ】図4Bは、時間経過における痩せラットの血糖レベルの変化のグラフである。当該ラットは、固定用量のインスリンとともにアナログ9が用量を増加させながら投与された。
【図４Ｃ】固定用量のインスリンの共同投与下で、自然のままのグルカゴンに対してアナログ9の投与の効果を痩せラットで直接比較した、時間経過における血糖レベルの変化のグラフである。
【図４Ｄ】図4Dは、固定用量のインスリンの非存在下で、自然のままのグルカゴンに対してアナログ9の投与の効果を痩せラットで直接比較した、時間経過における血糖レベルの変化のグラフである。
【図５】糖尿病のブタでインスリン誘発低血糖を逆転させるアナログ9の能力を示すデータを提示するグラフである。糖尿病のブタ（4/グループ）をインスリンデテミル（Levemir）（長時間作用性インスリン）で処置した。4時間の時点で当該動物を1用量のアナログ9または自然のままのグルカゴン（1）でチャレンジした。
【図６Ａ−６Ｃ】図6A−6Cは一連のグルカゴンペプチドの能力を示す棒グラフである。前記グルカゴンペプチドの各々は、対応するD-異性体によるただ1つの自然のままのアミノ酸の置換を含む。図6Aは、各グルカゴンペプチドのPBS（pH7）および室温下での溶解性を示す。図6Bは、各グルカゴンペプチドの凝集に関するデータを提供する（実施例6で開示するチオフラビン-T蛍光アッセイによって測定）。図6Cは、実施例3で開示するcAMPアッセイを用いた各グルカゴンペプチドの活性に関するデータを提供する。
【図７Ａ−７Ｂ】図7Aおよび7Bは、種々のpH（pH4−8の範囲）下の室温（図7）または4℃（図7B）におけるグルカゴンペプチドの溶解性を示すグラフである。被検グルカゴンペプチドには以下が含まれる：Aib16、q20（配列番号:970）、3-Pal10、Aib16、q20（配列番号:971）、3-Pal13、Aib16、q20（配列番号:972）、3-Pal10&13、Aib16、q20（配列番号:973）。
【図８】実施例6に記載のチオフラビン-T蛍光（ThT）アッセイに基づくグルカゴンアナログの安定性を示すグラフである。当該グラフのために以下のナンバリングが用いられる：1はノボラピッド（NovoRapid）（インスリンアスパルト）；2はブランク；3は化合物9（6、10および13位に3-Pal、16位にAib（配列番号:950））；4は20位にdGln、16位にAibを有するペプチド（配列番号:974）；5は21位にdAsp、16位にAibを有するペプチド（配列番号:975）；6は16位にdSerを有するペプチド（配列番号:976）；7は20位にdGlnを有するペプチド（配列番号:977）；および8は21位にdAspを有するペプチド（配列番号:978）。3、4および5と番号を付されたグラフの線で表されるペプチド（すなわち、配列番号:950、974および975）は、リン酸緩衝液（pH7.0）中で37℃、45時間にわたって安定性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
定義
本発明の説明および特許請求の範囲で、以下の用語法が下記に示す定義にしたがって用いられるであろう。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容できる担体”という用語には、標準的な医薬担体のいずれか、例えばリン酸緩衝食塩水溶液、水、乳濁液（例えば油/水または水/油乳濁液）および多様なタイプの湿潤剤が含まれる。前記用語はまた、米国連邦政府の規制庁によって承認された、または動物（人を含む）で使用するために米国薬局方に列挙された任意の薬剤を包含する。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容できる塩”という用語は、親化合物の生物学的活性を保持する化合物の塩を指し、それらは生物学的にまたは他の態様において望ましくないものではない。本明細書に開示する化合物の多くは、アミノおよび/またはカルボキシル基または前記に類似する基の存在のために酸および/または塩基の塩を形成することができる。
医薬的に許容できる塩基付加塩は無機および有機塩基から調製できる。無機塩基から誘導される塩には、単に例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、第一、第二および第三アミンの塩が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
医薬的に許容できる酸付加塩は無機および有機酸から調製できる。無機酸から誘導できる塩は塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。有機酸から誘導される塩は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエン-スルホン酸、サリチル酸などを含む。
【００２１】
本明細書で用いられるように、“治療する”という用語は、具体的な異常または状態の予防、または具体的な異常または状態に密接に関係する症状の緩和、および/または前記症状の防止または排除を含む。例えば、本明細書で用いられるように、“糖尿病を治療する”という用語は、一般的にグルコースの血中レベルを正常レベルの方向に変化させることを指し、与えられた状況に応じて血糖レベルの増加または減少を含むことができる。
本明細書で用いられるように、グルカゴンペプチドの“有効な”量または“治療的に有効な量”は、所望の効果を提供するために当該ペプチドの無毒であるが十分な量を指す。例えば、所望される1つの効果は低血糖の予防または治療であり、前記は例えば血糖レベルの増加によって測定されよう。“有効な”量は、個体の年齢および一般的状態、投与態様などに応じて対象者毎に変動するであろう。したがって、正確な“有効量”を特定することが常に可能であるとは限らない。しかしながら、任意の個々の事例における適切な“有効”量を日常的な実験を用いて当業者は決定できる。
“非経口”という用語は、消化管を通らないいくつかの他の経路（例えば皮下、筋肉内、脊柱内または静脈内）によることを意味する。
本明細書で用いられるように、“精製される”という用語および同様な用語は、本来の環境または天然の環境にある分子または化合物に通常結合している夾雑物を実質的に含まない形態での当該分子または化合物の単離に関する。本明細書で用いられるように、“精製される”という用語は、絶対的な純度を要求するのではなく、相対的な定義として意図される。“精製されたポリペプチド”という用語は、他の化合物（核酸分子、脂質および炭水化物を含むが、ただしこれらに限定されない）から分離されてあるポリペプチドを指すために本明細書では用いられる。
【００２２】
“単離される”という用語は、言及された物質を本来の環境（例えば当該物質が天然に出現するならば天然の環境）から移動させることを必要とする。例えば、生きている動物に存在する天然に出現するポリヌクレオチドは単離されていないが、当該天然の系で一緒に存在するいくつかのもの又は全てのものから分離されている同じポリヌクレオチは単離されている。
本明細書で用いられるように、“自然のままのグルカゴン”という用語は、配列番号:1の配列から成るペプチドを指し、“自然のままのGLP-1”という用語は、GLP-1(7-36)アミド（配列番号:858の配列から成る）、GLP-1(7-37)酸（配列番号:857の配列から成る）またはそれら2つの化合物の混合物を呼ぶ包括的用語である。本明細書で用いられるように、何らかのさらに別の指示が無く“グルカゴン”または“GLP-1”と一般的に言及するときは、それぞれ自然のままのグルカゴンまたは自然のままのGLP-1を意味することが意図される。
本明細書で用いられる“グルカゴンペプチド”には、配列番号:１のアミノ酸配列または配列番号:1のアミノ酸配列の任意のアナログを含む任意のペプチドが含まれ、前記任意のアナログは、当該ペプチドのアミノ酸置換、付加若しくは欠失、または翻訳後改変（例えばメチル化、アシル化、ユビキチン化など）を含み、当該アナログは、例えば、実施例3に記載するアッセイを用いてcAMP生成によって測定されるようにグルカゴンまたはGLP-1受容体活性を刺激する。
“グルカゴンアゴニスト”という用語は、グルカゴン受容体活性を刺激するグルカゴンペプチドを含む複合体を指す（例えば、前記活性は実施例3に記載するアッセイを用いてcAMP生成によって測定される）。
【００２３】
本明細書で用いられるように、“アミノ酸”という用語は、アミノおよびカルボキシル官能基の両方を含む任意の分子を包含し、当該アミノおよびカルボキシレート基は同じ炭素（アルファ炭素）に接着される。アルファ炭素は、場合によって1つまたは2つの更なる有機置換基を有することができる。その立体化学を特定しないアミノ酸の呼称は、当該アミノ酸のL若しくはD型またはラセミ混合物を包含することを意図する。アミノ酸のD型は三文字コードの前に小文字のdを含むことによって特定される（例えばdLys）。
本明細書で用いられるように、アミノ酸“改変”はアミノ酸の置換、付加または欠失を指し、ヒトのタンパク質で一般的に見いだされる20アミノ酸と同様に非定型的なまたは天然には出現しないアミノ酸による置換または付加を含む。本出願を通して、数字による具体的なアミノ酸の位置（例えば28位）についての言及はいずれも、自然のままのグルカゴン（配列番号:1）の当該位置のアミノ酸またはその任意のアナログの対応するアミノ酸の位置を指す。例えば、本明細書で“28位”と言えば、配列番号:1の最初のアミノ酸が欠失しているグルカゴンアナログについては対応する27位を意味しよう。同様に、本明細書で“28位”と言えば、配列番号:1のN-末端の前に1つのアミノ酸が付加されているグルカゴンアナログについては対応する29位を意味しよう。
【００２４】
本明細書で用いられるように、アミノ酸“置換”は1つのアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による入替えを指す。
本明細書で用いられるように、“保存的アミノ酸置換”という用語は本明細書では下記の5つの群の1つの中での交換と定義される：
I．小さな脂肪族の非極性又はわずかに極性の残基：
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II．極性で陰性荷電残基およびそれらのアミド：
Asp、Asn、Glu、Gln、システイン酸およびホモシステイン酸；
III．極性で陽性荷電残基；
His、Arg、Lys、オルニチン（Orn）；
IV．大きな脂肪族の非極性残基：
Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン（Nle）、ホモシステイン；
V．大きな芳香族残基：
Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン。
【００２５】
本明細書で用いられるように、“ポリエチレングリコール”または“PEG”という一般用語は、エチレンオキシドと水の分枝または直鎖の縮合ポリマーの混合物を指し、式H(OCH2CH2)nOHで表される（式中nは少なくとも9である）。任意の更なる特徴づけが無ければ、当該用語は、500から40,000ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。“ポリエチレングリコール”または“PEG”は、その概算平均分子量を示すために数字の接尾辞と組み合わせて用いられる。例えば、PEG-5,000は、約5,000の総分子量を有するポリエチレングリコールを指す。
本明細書で用いられるように、“ペグ化”という用語および同様な用語は、ポリエチレングリコールポリマーをある化合物に連結させることによってその自然のままの状態から改変した化合物を指す。“ペグ化グルカゴンペプチド”は、グルカゴンペプチドにPEG鎖を共有結合させたグルカゴンペプチドである。
本明細書で用いられるように、一般的にペプチドと言えば、改変されたアミノおよびカルボキシ末端を有するペプチドを包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミド基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列によって包含されることが意図される。
本明細書で用いられるように、“リンカー”は、2つの無関係の実体を互いに結合させる、結合、分子または分子の基である。リンカーは、2つの実体の適切な間隙を提供することができ、或いは2つの実体を互いに引き離すことを可能にする柔軟な結合をさらにまた供給することができる。柔軟な結合には、光切断可能基、酸不安定性部分、塩基不安定性部分および酵素切断可能基が含まれる。
本明細書で用いられるように、“ダイマー”はリンカーを介して互いに共有結合された2つのサブユニットを含む複合体である。任意の限定語が無く用いられるときには、ダイマーという用語はホモダイマーヘテロダイマーの両方を包含する。ホモダイマーは2つの同一サブユニットを含むが、一方、ヘテロダイマーは異なる2つのサブユニットを含むが、ただし2つのサブユニットは実質的に互いに類似する。
【００２６】
本明細書で用いられるように、“pH安定化グルカゴンペプチド”という用語は、薬理学的目的のために用いられる最大のpH範囲の水性緩衝液中で、自然のままのグルカゴンと比較して優れた安定性及び溶解性を示すグルカゴンアナログを指す。
本明細書で用いられるように、“荷電アミノ酸”という用語は、生理学的pHの水溶液中で陰性に荷電される（すなわち、脱プロトン化される）または陽性に荷電される（すなわち、プロトン化される）側鎖を含むアミノ酸を指す。たとえば、陰性荷電アミノ酸にはアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、およびホモグルタミン酸が含まれ、一方、陽性荷電アミノ酸にはアルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、人間のタンパク質で一般的に見いだされる20アミノ酸の中の荷電アミノ酸と同様に非定型的なまたは天然には出現しないアミノ酸が含まれる。
天然には出現しないアミノ酸はin vivoでは天然に出現しないアミノ酸を指すが、それにもかかわらず、前記を本明細書に記載するペプチド構造に取り込むことができる。非定型的アミノ酸の市場の供給元には、シグマアルドリッチ社（Sigma-Aldrich；Milwaukee, WI）、ケムペプ社（ChemPep Inc.；Miami, FL）、およびゲンザイムファーマシューティカルズ社（Genzyme Pharmaceuticals；Cambridge, MA）が含まれる。非定型的アミノ酸は、市場の供給業者から購入するか、de novoに合成するか、または他のアミノ酸から改変若しくは誘導することができる。
本明細書で用いられるように、“酸性アミノ酸”という用語は、第二の酸性部分（例えばカルボン酸基またはスルホン酸基）を含むアミノ酸を指す。
【００２７】
“アルキル”は、指示された数の炭素原子を含む直鎖または分枝炭化水素を指さす。例示的なアルキルにはメチル、エチル、および直鎖プロピル基が含まれる。
“ヘテロアルキル”という用語は、指示された数の炭素原子及び構造骨格に少なくとも1つのヘテロ原子を含む直鎖または分枝炭化水素を指す。本明細書の目的に適切なヘテロ原子にはN、SおよびOが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるピリジル-アラニンは、3-(2-ピリジル)-L-アラニン（2-Pal）、3-(3-ピリジル)-L-アラニン（3-Pal）および3-(4-ピリジル)-L-アラニン（4-Pal）を包含する包括的用語である。ある実施態様では、本開示にしたがって用いられるピリジル-アラニンは下記の構造を有する：
2019520336.tif 000006
【００２８】
実施態様
本明細書で開示するように、自然のままのホルモンに匹敵する薬物動態プロフィールおよび薬力学プロフィールを有するが、いったん商品として処方されるとすぐに使える医薬を構成するために生理学的pHでの溶解性および化学的安定性を有する、グルカゴンペプチドが提供される。ある実施態様では、強化された溶解性およびGLP-1またはGIP受容体での活性を有するグルカゴンペプチドもまた提供される。当該強化された溶解性は、グルカゴンのアミノ酸配列に存在する芳香族アミノ酸をピリジル-アラニンで置換するか、またはカルボキシ末端のアミノ酸をD異性体配座のアミノ酸で置換して生理学的pHでの溶解性を強化し、一方、親ペプチドの活性は保持できるという発見から誘導される。
ある実施態様にしたがえば、6、10または13位から選択される位置でピリジル-アラニンによる1つ以上のアミノ酸置換を含む、溶解性が強化されたグルカゴンアナログが提供される。ある実施態様では、6、10または13位のアミノ酸から選択されるただ1つのアミノ酸がピリジル-アラニンで置換される。ある実施態様では、6および/または10位のアミノ酸から選択されるアミノ酸がピリジル-アラニンで置換される。ある実施態様では、10および/または13位のアミノ酸から選択されるアミノ酸がピリジル-アラニンで置換される。
【００２９】
ある実施態様にしたがえば、配列番号:1のグルカゴンアナログが提供され、前記は自然のままのグルカゴンの配列と比較して6、10または13位のピリジル-アラニンの1、2または3アミノ酸置換によって配列番号:1と相違する。ある実施態様では、自然のままのグルカゴンと比較して改善された溶解性を有するが、グルカゴン受容体での活性を保持するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該グルカゴンペプチドは、配列X1X2X3GTX6TSDX10SX12X13LX15X16X17X18AX20X21FVX24WLX27-Z（配列番号:934）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X3は、下記の構造I、IIまたはIIIの側鎖を含むアミノ酸であり；
2019520336.tif 000007
構造I
2019520336.tif 000008
構造II
2019520336.tif 000009
構造III
式中、R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり；R2はNHR4またはC1-3アルキルであり；R3はC1-3アルキルであり；R4はHまたはC1-3アルキルであり;XはNH、O、またはSであり；さらにYはNHR4、SR3、またはOR3であり；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され； 
X12はLys、IleまたはArgであり；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X15はAsp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸であり；
X16はGlu、Lys、Asp、Ser、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、ThrまたはAibであり；
X17はArgまたはGlnであり；
X18はAlaまたはArgであり；
X20は、Gln、Glu、Ser、Thr、Ala、Lys、シトルリン、Arg、OrnまたはAibであり；
X21は、Glu、Aib、Asp、Lys、Cys、Orn、ホモシステイン、またはアセチルフェニルアラニンであり；
X24は、Asn、Aib、Gln、GluまたはLysであり；
X27は、Met、LeuまたはNleであり；
X28はAsnまたはAlaであり；
X29はThrまたはGlyであり；さらに
Zは、-COOH、-X28-COOH、X28-X29-COOH、およびX28-X29-GPSSGAPPPS（配列番号:953）から成る群から選択されるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、X3はグルタミンである。さらに別の実施態様では、グルカゴンペプチドは配列番号:934の配列を有し、さらにまた以下を含む：
（i）iおよびi+4位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋（iは12、16、20または24である）、または
（ii）当該グルカゴンペプチドの16、20、21および24位のアミノ酸の1つ、2つ、3つまは全てがα,α-二置換アミノ酸で置換される。
【００３０】
ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列X1X2QGTX6TSDX10SX12X13LDX16RRAQDFVQWLX27NT（配列番号:979）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X12はLys、IleまたはArgであり；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はAibであり；さらに
X27はMet、LeuまたはNleであるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つがピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、X3はグルタミンである。ある実施態様では、配列番号:979を含むグルカゴンペプチドが提供され、ここで、X1はHisであり、X2はSer、D-SerまたはAibであり、X6はPheまたはピリジル-アラニンであり、X10はピリジル-アラニンであり、X12はLysであり、X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり、X16はAibであり、さらにX27はMet、LeuまたはNleである。
【００３１】
本明細書に開示するピリジル-アラニン置換グルカゴンペプチドは、そのカルボキシ末端に荷電を導入することによってさらに改変して当該ペプチドの溶解性を追加的に強化することができ、一方、当該ペプチドのアゴニスト特性は維持される。本アナログの強化された溶解性は、中性pH近くでのグルカゴン溶液の調製および保存を可能にする。比較的中性のpH（例えばpH約6.0から約8.0）でのグルカゴン溶液の処方は当該グルカゴンペプチドの長期安定性を改善する。
したがって、本発明のある実施態様は、水溶液中、特に約5.5から約8.0の範囲のpHでのペプチドの溶解性を改善し、一方、自然のままのペプチドの生物学的活性を維持するために、His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr（配列番号:1）の野生型ペプチドに対して改変されてあるグルカゴンペプチドに向けられる。ある実施態様は、6、10または13位の芳香族アミノ酸がピリジル-アラニンで置換され、場合によって、自然のままの非荷電アミノ酸の荷電アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択される）による置換によって、または当該ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加によって荷電が当該ペプチドに付加される。驚くべきことに、出願人らは、6、10または13位に通常出現するアミノ酸のピリジル-アラニンによる置換、および場合によって28および/または29位の荷電アミノ酸による置換、および/または当該グルカゴンペプチドのカルボキシ末端への1つまたは2つの荷電アミノ酸の付加は、生理学的に関連するpH（すなわち約6.5から約7.5のpH）の水溶液中でのグルカゴンペプチドの溶解性および安定性を少なくとも5倍および高ければ30倍強化することを見出した。
【００３２】
したがって、本発明のある実施態様のグルカゴンペプチドはグルカゴン活性を保持し、さらに25℃で24時間後に測定したとき、約5.5から8の間の与えられたpH（例えばｐH７）で、自然のままのグルカゴンと比較して少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、25倍、30倍、またはそれより高い溶解性を示す。本明細書に開示するグルカゴンペプチドのいずれかは、5.5から8の範囲内のpHで改善された安定性を追加的に示すことができ、例えば、25℃で24時間後に元々のペプチドの少なくとも75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％を保持する。いくつかの実施態様では、本発明のグルカゴンペプチドは改善された安定性を示し、当該ペプチドの濃度の少なくとも75％（例えば少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、95％より上、100％まで）または分解ペプチドの約25％未満（例えば20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、4％、3％、2％、1％、0％まで）が、少なくとも20℃（例えば21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、少なくとも27.5℃、少なくとも30℃、少なくとも35℃、少なくとも40℃、少なくとも50℃）および100℃未満、85℃未満、75℃未満、または70℃未満の温度の溶液で、約1週間以上（例えば約2週間、約4週間、約1箇月、約2箇月、約4箇月、約6箇月、約8箇月、約10箇月、約12箇月）後に紫外線（UV）検出装置によって280nmで検出できる。グルカゴンペプチドは追加の改変を含むことができ、前記改変は、その医薬特性を変更する（例えば、効能の増加、循環中の半減期の延長、保存期間の延長、沈殿又は凝集の減少、および/または分解の低下（例えば保存後の切断または化学的改変の発生の減少））。
【００３３】
さらに別の実施態様では、配列番号:935のアナログが提供され、ここで、28および/または29位のアミノ酸は荷電アミノ酸で置換され、および/または1つから2つの荷電アミノ酸が当該グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加される。ある実施態様では、荷電アミノ酸はAsp、Glu、およびLysから成る群から選択される。ある実施態様にしたがえば、配列番号:935のアナログはさらに、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のC-末端伸長を含む。
ある実施態様では、自然のままのグルカゴンと比較して改善された溶解性を有するが、グルカゴン受容体での活性は保持するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該グルカゴンペプチドは、配列X1X2QGTX6TSDX10SX12X13LDX16RRAX20X21FVQWLX27-Z（配列番号:954）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、His、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X12はLys、IleまたはArgであり；
X13はHis、Tyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はAibであり；
X20はdGln、Gln、GluまたはAibであり；
X21はdAsp、Glu、AibまたはAspであり；
X27はMet、LeuまたはNleであり；
X28はAsp、AsnまたはAlaであり；
X29はGlu、ThrまたはGlyであり；さらに
Zは、-COOH、-X28-COOH、X28-X29-COOH、およびX28-X29-GPSSGAPPPS（配列番号:953）から成る群から選択されるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つがピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、配列番号:954のペプチドが提供され、ここで、
X1はHisであり；
X2はAibまたはSerであり；
X6は、Phe、3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X10は、Tyr、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択され；
X12はLysであり；
X13は、Tyr、3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X16はAibであり；
X20はdGln、またはGlnであり；
X21はdAspまたはAspであり；
X27はMet、LeuまたはNleであり；
X28はAsp、AsnまたはAlaであり；
X29はGlu、ThrまたはGlyであり；さらに
Zは、X28-X29-COOH、およびX28-X29-GPSSGAPPPS（配列番号:953）から成る群から選択されるが、ただしX10またはX13の少なくとも1つが3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、X10なたはX13の少なくとも1つは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。
【００３４】
ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列X1X2QGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLX27NT（配列番号:955）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10はTyrおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はAibであり；
X20はdGlnまたはGlnであり；さらに
X27はMet、LeuまたはNleであるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。さらに別の実施態様では、配列番号:955のアナログが提供され、ここで、28および/または29位のアミノ酸は荷電アミノ酸で置換されるか、および/または1つから2つの荷電アミノ酸が当該グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加される。ある実施態様では、荷電アミノ酸はAsp、GluおよびLysから成る群から選択される。ある実施態様にしたがえば、配列番号:955のアナログはさらに、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結された配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のC-末端伸長を含む。
【００３５】
ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列X1X2QGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLX27NT（配列番号:955）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheであり；
X10はTyrおよびピリジル-アラニンであり；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はAibであり；
X20はdGlnであり；さらに
X27はMet、LeuまたはNleであり、場合によって、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、X1はHisであり、X2はAibである。ある実施態様では、X1はHisであり、X2はSerである。
【００３６】
ある実施態様では、自然のままのグルカゴンと比較して改善された溶解性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、配列X1X2QGTX6TSDX10SKX13LX15X16RRAX20DFVX24WLMX28T（配列番号:936）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され;
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13は、Tyrまたはピリジル-アラニンであり；
X15は、Asp、Glu、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり；
X16は、Glu、Lys、Asp、Ser、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、ThrまたはAibであり；
X20はGlnまたはLysであり；
X24はGlnまたはGluであり；
X28はAsn、AspまたはLysであるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つがピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、配列番号:936のアナログが提供され、前記は、7、11、14、17、18、19、21および27位から選択される1つから2つのアミノ酸改変によって配列番号:936と相違するが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、X1はHisであり、X2はAibである。ある実施態様では、当該グルカゴンペプチドの12および16位、16および20位、20および24位、または24および28位のアミノ酸の側鎖は共有結合によって連結される。別の実施態様では、16、20、21および24位の1つ、2つ、3つまたは全てがAibで置換される。
【００３７】
ある実施態様では、自然のままのグルカゴンと比較して改善された溶解性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、配列X1X2X3GTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVX24WLMX28X29（配列番号:937）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X3は下記構造Iの側鎖を含むアミノ酸であり：
2019520336.tif 000010
構造I
ここで、R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり；R2はNHR4またはC1-3アルキルであり；R4はHまたはC1-3アルキルであり；さらにXはNH、O、またはSであり；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はアミノイソ酪酸（Aib）であり；
X20はGlnまたはLysであり；
X24はGlnまたはGluであり；
X28はAsn、AspまたはLysであり；さらに
X29はThr、GluまたはGly、場合によってGluであるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とするか；
または当該アナログは、配列番号:937の配列と比較して10までのアミノ酸改変を含み、前記改変は、
a．ヒドロキシル基を欠くアミノ酸、場合によってAbuまたはIleによる7位のThrの置換；
b．PheまたはValによる10位のTyrの置換；
c．Argによる12位のLysの置換；
d．Gluによる15位のAspの置換；
e．AlaまたはAibによる20位のGlnの置換
f．Gluによる21位のAspの置換；
g．AlaまたはAibによる24位のGlnの置換；
h．LeuまたはNleによる27位のMetの置換；
i．GPSSGAPPPS（配列番号:820）のアミノ酸配列のC-末端への付加（ここで29位のアミノ酸はThrまたはGly）；
j．天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままでないアシルまたはアルキル基に共有結合的に接着される側鎖を含むアミノ酸の置換または付加；
k．29位の後ろに1−3つの荷電アミノ酸の挿入（場合によって、当該挿入はGluまたはLysを含む）；
または前記の組合せを含むが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンでる。ある実施態様では、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、X3はグルタミンである。ある実施態様では、配列番号:936または937の配列が提供され、ここで、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、配列番号:936または937が提供され、ここで、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、X3はグルタミンである。
【００３８】
ある実施態様にしたがえば、自然のままのグルカゴンと比較して溶解性が改善され、さらにグルカゴン受容体で活性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、配列X1X2QGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAQDFVQWLMNT（配列番号:935）を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、またはアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13は、Tyrまたはピリジル-アラニンであり；
X16はAibであるが、ただしX6、X10またはX13の少なくとも1つはピリジル-アラニンであることを条件とする。ある実施態様では、X1はDMIAであり、X2はセリンである。ある実施態様では、X1はHisであり、X2はD-セリンまたはAibである。ある実施態様では、X1はHisであり、X2はAibである。さらに別の実施態様では、グルカゴンペプチドはさらに、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のC-末端伸長を含む。ある実施態様では、当該ペプチドグリカンはさらに配列番号:820（GPSSGAPPPS）のC-末端伸長を含む。
【００３９】
ある実施態様にしたがえば、自然のままのグルカゴンと比較して溶解性が改善され、さらにグルカゴン受容体で活性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、配列HX2QGTX6TSDYSKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:938）を含み、
式中、
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；さらに
X13はTyrまたはピリジル-アラニンである。
ある実施態様では、改善された溶解性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該グルカゴンアナログは、配列HSQGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20X21FVQWLMX28X29（配列番号:957）を含み、
式中、
X6は、Phe、3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X10は、Tyr、His、3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X13は、Tyr、His、3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X16はAibであり；
X20はdGlnおよびGlnから成る群から選択され；
X21はdAspおよびAspから成る群から選択され；
X28はAsn、AspまたはLysであり；さらに
X29はThr、Gly、Asp、またはGluである。ある実施態では、グルカゴンペプチドは配列番号:957の配列を有し、さらに当該ペプチドの29位のアミノ酸に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）のC-末端伸長を含む。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは配列番号:957の配列を有し、ここで、X6はPheであり；X10は3-Palまたは4-Palであり；X13はTyr、3-Palまたは4-Palであり；X16はAibであり；X20はdGlnであり；X21はAspであり；X28はAsnであり；さらにX29はThrである。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは配列番号:957を有し、ここで、X6はPheであり；X10は3-Palまたは4-Palであり；X13はTyr、3-Palまたは4-Palであり；X16はAibであり；X20はGlnであり；X21はdAspであり；X28はAsnであり；さらにX29はThrである。
【００４０】
ある実施態様では、グルカゴンペプチドはHSQGTFTSDX10SKYLDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:959）の配列を有し、
式中、
X10は3-Palまたは4-Palであり；
X16はAibであり；さらに
X20はdGlnである。
ある実施態様では、グルカゴンペプチドはHSQGTFTSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:969）の配列を有し、
式中、
X10は3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X13は3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X16はAibであり；さらに
X20はdGlnであり、ここで、場合によってX10およびX11はともに3-Palであり、場合によってX10およびX11はともに4-Palである。
ある実施態様では、グルカゴンペプチドはHSQGTFTSDX10SKYLDX16RRAX20DFVQWLMNT（配列番号:959）の配列を有し、
式中、
X10は3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X16はAibであり；さらに
X20はdGlnであり、ここで場合によってX10は3-Palであり、場合によってX10は4-Palである。
ある実施態様では、グルカゴンペプチドはHSQGTX6TSDX10SKX13LDX16RRAX20DFVQWLMX28X29（配列番号:960）の配列を有し、
式中、
X6は3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X10は、His、3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X13は、His、3-Palおよび4-Palから成る群から選択され；
X16はAibであり；
X20はdGlnであり；
X28はAsn、AspまたはLysであり；さらに
X29はGly、Asp、またはGluである。
【００４１】
ある実施態様にしたがえば、自然のままのグルカゴンと比較して溶解性が改善され、さらにグルカゴン受容体で活性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、
X1X2QGTX6TSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:961）；
X1X2QGTFTSDX10SKYLDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:940）；
X1X2QGTFTSDYSKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:941）；
X1X2QGTFTSDX10SKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:962）；または
X1X2QGTX6TSDX10SKX13LDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号:963）
から成る群から選択される配列を含み、
式中、
X1は、His、D-His、N-メチル-His、アルファ-メチル-His、イミダゾール酢酸、des-アミノ-His、ヒドロキシル-His、アセチル-His、ホモ-His、およびアルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）から成る群から選択され；
X2は、Ser、D-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、Aib、Val、またはα-アミノ-N-酪酸から成る群から選択され；
X6はPheまたはピリジル-アラニンであり；
X10は、Tyr、Lysおよびピリジル-アラニンから成る群から選択され；
X13はTyrまたはピリジル-アラニンである。ある実施態様では、X1はDMIAであり、X2はセリンである。
ある実施態様では、X1はHisであり、X2はD-セリンまたはAibである。ある実施態様では、X1はHisであり、X2はAibである。さらに別の実施態様では、グルカゴンペプチドはさらに、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のC-末端伸長を含む。ある実施態様では、配列番号:938、939または940の配列が提供され、ここで、ピリジル-アラニンは3-(3-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、配列番号:936または937が提供され、ここで、ピリジル-アラニンは3-(4-ピリジル)-L-アラニンである。ある実施態様では、X3はグルタミンである。
【００４２】
更なる改変および組合せ
追加の改変をグルカゴンペプチドに対して実施でき、前記は溶解性および/または安定性および/またはグルカゴン活性をさらに高めることができる。グルカゴンペプチドは、また別に他の改変を含むことができ、それら改変は溶解性または安定性に実質的に影響を与えず、かつグルカゴン活性を実質的に低下させない。例示的な実施態様では、グルカゴンペプチドは、自然のままのグルカゴンに対して、合計して1つ、2つまで、3つまで、4つまで、5つまで、6つまで、7つまで、8つまで、9つまで、10まで、または11まで、または12まで、または13まで、または14までのアミノ酸改変を含むことができる。いくつかの実施態様では、そのようなグルカゴンアナログは、自然のままのグルカゴンの対応する位置に天然に出現するアミノ酸の少なくとも22、23、24、25、26、27または28を保持する（例えば、天然に出現するグルカゴンに対して1−7、1−5または1−3の改変を有する）。
いくつかの実施態様では、2、5、7、11、12、14、17、18、19、20、21、24、27、28または29位のいずれかで1、2、3、4または5つの非保存的置換が実施され、さらに自然のままのグルカゴンに対してこれらの位置のいずれかで5つまでの保存的置換がさらに実施される。いくつかの実施態様では、1−16位のアミノ酸内で1、2または3つのアミノ酸改変が実施され、さらに17−26位のアミノ酸内で1、2または3つのアミノ酸改変が実施される。
【００４３】
例示的な改変には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：
（a）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持したままで、非保存的置換、保存的置換、付加または欠失、例えば、2、5、7、11、12、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28または29位の1つ以上の保存的置換、10位のTyrのValまたはPheによる置換、12位のLysのArgによる置換、これらの位置の1つ以上のAlaによる置換；
（b）29および/または28位、場合によって27位のアミノ酸の欠失（前記は少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持する）；
（c）15位のアスパラギン酸の改変、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸またはホモシステイン酸による置換によって（前記は分解を低下させることができる）；または16位のセリンの改変、例えばスレオニン、Aib、グルタミン酸または別の4原子の長さを有する側鎖を持つ陰性荷電アミノ酸による置換によって、また別にはグルタミン、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸のいずれか1つによる置換によって（同様に前記はAsp15-Ser16の切断に起因する分解を低下させることができる）；
（d）例えば16、17、20、21、24，29、40位またはC-末端アミノ酸に、親水性部分、例えば本明細書に記載される水溶性ポリマーポリエチレングリコールの付加（前記は溶解性および/または半減期を増加させることができる）；
（e）7位のメチオニンの改変、例えばロイシンまたはノルロイシンによる置換によって（酸化的分解を低下させる）；
（f）20または24位のGlnの改変、例えばSer、Thr、AlaまたはAibによる置換によって（Glnの脱アミド化により生じる分解を低下させる）；
（g）21位のAspの改変、例えばGluによる置換によって（Aspが脱水されて環状スクシンイミド中間体を形成しその後に続くイソアスパルテートへの異性化により生じる分解を低下させる）；
（h）DPP-IV切断に対する耐性を改善する、本明細書に記載される1または2位の改変、場合によって分子内架橋（例えば“i”と“i+4”（iは12から25の整数、例えば12、16、20、24）との間のラクタム架橋）と組み合わされる；
（i）本明細書に記載されるグルカゴンペプチドのアシル化またはアルキル化（前記はグルカゴンおよびGLP-1受容体での活性を高め、循環中の半減期を延長し、および/または作用持続時間を延長し、および/または作用開始を遅らせることができる）、場合によって親水性部分の付加と組み合わされ、付け加えて或いはまた別に場合によって、GLP-1ペプチドでの活性を選択的に低下させる改変と組み合わされる、例えば7位のThrの改変（例えば7位のThrのヒドロキシル基を欠くアミノ酸（例えばAbuまたはIle）による置換）；C-末端から27位のアミノ酸までのアミノ酸欠失（例えば、28および29位のアミノ酸の一方または両方の欠失（長さが27または28アミノ酸を生じる））；または前記の組合せ；
（j）本明細書に記載されるC-末端伸長；
（k）本明細書に記載されるホモダイマー化またはヘテロダイマー化；
並びに上記の組合せ。
【００４４】
例示的な改変は、グループAから選択される少なくとも1つのアミノ酸改変およびグループBおよび/またはグループCから選択される1つ以上のアミノ酸改変を含み、
ここでグループAは、
28位のAsnの荷電アミノ酸による置換；
28位のAsnの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸から成る群から選択される荷電アミノ酸による置換；
28位のAsn、AspまたはGluによる置換；
28位のAspによる置換；
28位のGluによる置換；
29位のThrの荷電アミノ酸による置換：
29位のThrの、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸、およびホモシステイン酸から成る群から選択される荷電アミノ酸による置換；
29位のAsp、Glu、またはLysによる置換；
29位のGluにより置換；
29位の後に1−3つの荷電アミノ酸の挿入；
29位の後にGluまたはLysの挿入；
29位の後にGly-LysまたはLys-Lysの挿入；
または前記の組合せであり、
グループBは、
15位のAspのGluによる置換；
16位のSerのThrまたはAibによる置換であり、
さらにグループCは、
1位のHisの自然のままではないアミノ酸による置換（前記はジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）による切断に対して当該グルカゴンペプチドの感受性を低下させる）；
2位のSerの自然のままではないアミノ酸による置換（前記はジペプチジルペプチダーゼIV（DPP-IV）による切断に対して当該グルカゴンペプチドの感受性を低下させる）；
12位のLysのArgによる置換；
20位のGlnのAlaまたはAibによる置換；
21位のAspのGluによる置換；
24位のGlnのAlaまたはAibによる置換；
27位のMetのLeuまたはNleによる置換；
27−29位のアミノ酸の欠失；
28−29位のアミノ酸の欠失；
29位のアミノ酸の欠失；
または前記の組合せである。
【００４５】
3位の改変
グルカゴン受容体活性は、3位のアミノ酸改変（例えば3位の天然に出現するグルタミンの酸性、塩基性または疎水性アミノ酸による置換）によって低下させることができる。例えば、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンによる3位の置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低下または破壊する。
グルカゴン受容体における活性の維持または強化は、3位のGlnのグルタミンアナログによる改変によって達成できる。例えば、3位にグルタミンアナログを含むグルカゴンペプチドは、グルカゴン受容体で自然のままのグルカゴン（配列番号:1）の約5％、約10％、約20％、約50％、若しくは約85％またはそれより高い活性を示す。いくつかの実施態様では、3位にグルタミンアナログを含むグルカゴンペプチドは、3位の改変アミノ酸を除いて当該グルタミンアナログを含むペプチドと同じアミノ酸配列を有する対応するグルカゴンペプチド（例えば配列番号:877）の約20％、約50％、約75％、約100％、約200％、若しくは約500％、またはそれより高い活性を示すことができる。いくつかの実施態様では、3位にグルタミンアナログを含むグルカゴンペプチドはグルカゴン受容体で強化された活性を有するが、当該強化活性は、自然のままのグルカゴン、または3位の改変アミノ酸を除いて当該グルタミンアナログを含むペプチドと同じアミノ酸配列を有する対応するグルカゴンペプチドの活性の1000％、10，000％、100,000％、または1,000,000％を超えない。
【００４６】
いくつかの実施態様では、グルタミンアナログは、下記構造I、IIまたはIIIの側鎖を含む天然に出現するかまたは天然には出現しないアミノ酸である：
2019520336.tif 000011
構造I
2019520336.tif 000012
構造II
2019520336.tif 000013
構造III
式中、R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり；R2はNHR4またはC1-3アルキルであり；R3はC1-3アルキルであり；R4はHまたはC1-3アルキルであり；XはNH、O、またはSであり；さらにYはNHR4、SR3、またはOR3である。いくつかの実施態様では、XはNHであるか、またはYはNHR4である。いくつかの実施態様では、R1はC0-2アルキルまたはC1ヘテロアルキルである。いくつかの実施態様では、R2はNHR4またはC1アルキルである。いくつかの実施態様では、R4はHまたはC1アルキルである。例示的な実施態様では、構造Iの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、R1はCH2-Sであり、XはNHであり、さらにR2はCH3であるか（アセトアミドメチル-システイン、C(Acm)）；R1はCH2であり、XはNHであり、さらにR2はCH3であるか（アセチルジアミノブタン酸、Dab(Ac)）；R1はC0アルキルであり、XはNHであり、R2はNHR4であり、さらにR4はHであるか（カルバモイルジアミノプロパン酸、Dap(尿素)）；またはR1はCH2-CH2であり、XはNHであり、さらにR2はCH3 である(アセチルオルニチン、Orn(Ac))。例示的な実施態様では、構造IIの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、R1はCH2であり、YはNHR4であり、さらにR4はCH3である（メチルグルタミンQ(Me)）。例示的な実施態様では、構造IIIの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、R1はCH2であり、R4はHである（メチオニン-スルホキシド、M(O)）。具体的な実施態様では、3位のアミノ酸はDab(Ac)で置換される。例えば、3位（自然のままのグルカゴンに対して）に改変アミノ酸を含むグルカゴンペプチドは、配列番号:594、配列番号:595、配列番号:596、配列番号:597、配列番号:598、および配列番号:599のアミノ酸配列含むことができる。
GLP-1受容体における強化された活性は、C-末端アミノ酸のカルボン酸を中性荷電基、例えばアミドまたはエステルで入れ替えることによって提供される。反対に、当該ペプチドのC-末端に自然のままのカルボン酸を保持することによって、GLP-1受容体と対比してグルカゴン受容体に対する当該グルカゴンペプチドの相対的に強い選択性が維持される（例えば約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19また20倍より高い）。
【００４７】
DPP-IV耐性
いくつかの実施態様では、ジペプチジルペプチダーゼIVによる切断に対する感受性を低下させるために、本明細書に開示するグルカゴンペプチドは1または2位でさらに改変される。より具体的には、いくつかの実施態様では、アナログペプチドの1位は、D-ヒスチジン、アルファ,アルファ-ジメチルイミダゾール酢酸（DMIA）、N-メチルヒスチジン、アルファ-メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル-ヒスチジン、アセチル-ヒスチジンおよびホモ-ヒスチジンから成る群から選択されるアミノ酸で置換される。
より具体的には、いくつかの実施態様では、アナログペプチドの2位は、D-セリン、D-アラニン、バリン、アミノN-酪酸、グリシン、N-メチルセリンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選択されるアミノ酸で置換される。ある実施態様では、アナログペプチドの2位は、D-セリン、D-アラニン、グリシン、N-メチルセリンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選択されるアミノ酸で置換される。別の実施態様では、アナログペプチドの2位は、D-セリン、グリシンおよびアミノイソ酪酸から成る群から選択されるアミノ酸で置換される。
1または2位における置換または改変または誘導がグルカゴン受容体での活性を低下させる場合、当該ペプチドのC-末端部分（アミノ酸12−29）の分子内架橋（例えば“i”および“i+4”（iは12から25の整数）位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋）は、当該グルカゴン受容体におけるグルカゴン活性を改善することができる。
【００４８】
親水性部分の付加
親水性部分（例えばPEG基）は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために用いられる任意の適切な条件下でグルカゴンペプチドに付加することができる。以下を含む、当業界で公知の任意の手段を用いることができる：アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、またはPEG部分の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）を介する標的化合物の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基）との他の化学選択性共役/結合方法。水溶性ポリマーを1つ以上のタンパク質と連結するために用いることができる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジディリン、オキシラン、5-ピリジル、およびアルファ-ハロゲン化アシル基（例えばアルファ-ヨード酢酸、アルファ-ブロモ酢酸、アルファ-クロロ酢酸）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。還元的アルキル化によってペプチドに接着される場合、選択されるポリマーは、重合化度を制御できるようにただ1つの反応性アルデヒドを有するべきである。例えば以下を参照されたい：Kinstler et al., Adv.Drug.Delivery Rev.54: 477-485, 2002；Roberts et al., Adv.Drug Delivery Rev.54: 459-476, 2002；および and Zalipsky et al., Adv.Drug Delivery Rev.16: 157-182, 1995。
【００４９】
本発明の具体的な特徴では、チオールを有するグルカゴンペプチドのアミノ酸残基が親水性部分（例えばPEG）で改変される。いくつかの実施態様では、チオールは、マイケル付加反応でマレイミド活性化PEGで改変され、下記に示すチオエーテル結合を含むペグ化ペプチドを生じる：
【化１】
2019520336.tif 000014
【００５０】
いくつかの実施態様では、チオールは、求核置換反応でハロアセチル-活性化PEGにより改変されて、下記に示すチオールエーテル結合を含むペグ化ペプチドを生じる：
【化２】
2019520336.tif 000015
【００５１】
適切な親水性部分には以下が含まれる：ポリエチレングリコール（PEG）、プロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばPOG）、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（POG）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、モノ(C1-C10)アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(βアミノ酸)（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、ポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー（PPG）および他のポリアルキレンオキシド（polyakylene oxide）、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、コラン酸（colonic acids）または他の多糖類ポリマー、フィコールまたはデキストラン、および前記の混合物。
いくつかの実施態様にしたがえば、ポリエチレングリコール鎖は、約500から約40,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。ある実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、約500から約5,000ダルトン、または約1,000から約5,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、約10,000から約20,000ダルトンの分子量を有する。さらに別の他の例示的な実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、約20,000から約40,000ダルトンの分子量を有する。
デキストランは、もっぱらα1-6結合によって連結されるグルコースサブユニットの多糖類ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば約1kDから約100kD、または約5、10、15若しくは20kDから約20、30、40、50、60、70、80若しくは90kDで入手できる。
直鎖または分枝ポリマーが意図される。共役物の得られた調製物は本質的に単分散または多分散であり、ペプチド当たり約0.5、0.7、1、1.2、1.5または2ポリマーを有し得る。
【００５２】
アシル化
ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドは改変されて、アシル基、例えばアミノ酸で天然には出現しないアシル基（例えば天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではないアシル基）を含む。アシル基の付加は、循環中の半減期の延長、作用開始の遅延、作用持続時間の延長、プロテアーゼ（例えばDPP-IV）に対する耐性の改善、並びにGLP-1およびグルカゴン受容体における効能の増加の1つ以上を当該ペプチドにもたらす。本明細書に示すように、グルカゴンペプチドのアシル化は、グルカゴンおよびGLP-1受容体での活性の低下をもたらさない。それどころか、いくつかの例では、アシル化は実際にGLP-1およびグルカゴン受容体での活性を増加させる。したがって、アシル化アナログの効能は、強化されない場合でもグルカゴンコアゴニストアナログの非アシル化型に匹敵する。
ある実施態様にしたがえば、循環中での半減期の延長および/または作用の開始の遅延および/または作用持続時間の延長および/またはプロテアーゼ（例えばDPP-IV）に対する耐性の改善の目的のために、グルカゴンペプチドは改変されてアシル基を含み、前記アシル基は、エステル、チオエステル、またはアミド結合を介してグルカゴンペプチドに接着される。
アシル化はグルカゴンペプチド内の任意の位置で実施でき、当該位置には1−29位のいずれか、C-末端伸長内の位置、またはC-末端アミノ酸が含まれるが、ただしグルカゴンおよび/またはGLP-1活性が、強化されないとしても保持されることを条件とする。非限定的な例には、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、または29位が含まれる。具体的な実施態様では、アシル化はグルカゴンペプチドの10位で生じ、当該グルカゴンペプチドは、分子内架橋（例えば共有結合分子内架橋（例えばラクタム架橋））を欠く。分子内架橋を欠くそのようなアシル化ペプチドは、共有結合分子内架橋を欠く対応する非アシル化ペプチドと比較して、さらに10位以外の位置でアシル化された分子内架橋を欠く対応するペプチドと比較してGLP-1およびグルカゴン受容体で強化された活性を示す。本明細書に示すように、10位でのアシル化は、グルカゴン受容体でほとんど活性をもたないグルカゴンペプチドをグルカゴンおよびGLP-1受容体の両方で活性を有するグルカゴンペプチドに転換することさえできる。したがって、アシル化が生じる位置によってグルカゴンペプチドの全体的な活性プロフィルを変化させることができる。
【００５３】
グルカゴンペプチドは、親水性部分が結合されるアミノ酸と同じ位置で、または異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定的な例は、10位でのアシル化およびグルカゴンペプチドのC-末端部での、例えば24、28若しくは29位、C-末端伸長、またはC-末端での（例えばC-末端Cysの付加を介する）1つ以上の位置のペグ化を含む。
アシル基は、グルカゴンペプチドのアミノ酸に直接的に、またはグルカゴンペプチドのアミノ酸にスペーサーを介して間接的に共有結合で連結され、後者の場合、スペーサーはグルカゴンペプチドのアミノ酸とアシル基との間に配置される。
本発明の具体的な特徴では、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、またはチオールの直接的アシル化によってアシル基を含むように、グルカゴンペプチドは改変される。いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して直接的にアシル化される。いくつかの実施態様では、アシル化は10、20、24または29位に存在する。これに関しては、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列、または本明細書に記載のアミノ酸改変の1つ以上を含む配列番号:1の改変アミノ酸配列を含むことができ、10、20、24および29のアミノ酸の少なくとも1つは、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含む任意のアミノ酸に改変される。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、グルカゴンペプチドの直接的アシル化は、10位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して生じる。
【００５４】
いくつかの実施態様では、側鎖アミンを含むアミノ酸は下記式Iのアミノ酸である：
2019520336.tif 000016
式中、n＝1から4
[式I]
いくつかの実施態様では、式Iのアミノ酸は、nが4（Lys）またはnが3（Orn）のアミノ酸である。
【００５５】
他の実施態様では、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は下記式IIのアミノ酸である：
2019520336.tif 000017
式中、n＝1から4
[式II]
いくつかの実施態様では、式IIのアミノ酸は、nが1（Ser）のアミノ酸である。
【００５６】
さらに他の実施態様では、側鎖チオールを含むアミノ酸は下記式IIIのアミノ酸である：
2019520336.tif 000018
式中、n＝1から4
[式III]
いくつかの実施態様では、式IIIのアミノ酸は、nが1（Cys）のアミノ酸である。
【００５７】
さらに他の実施態様では、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含むアミノ酸は、式I、式IIまたは式IIIと同じ構造を含む二置換アミノ酸であるが、ただし式I、式IIまたは式IIIのアミノ酸のアルファ炭素と結合する水素は第二の側鎖で入れ替えられるという点を除く。
【００５８】
本発明のある実施態様では、アシル化グルカゴンペプチドは、当該ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドはスペーサーと共有結合され、当該スペーサーはアシル基と共有結合される。
スペーサーが接着されるアミノ酸は、スペーサーとの結合を許容する部分を含む、任意のアミノ酸（例えば一α置換アミノ酸またはα,α二置換アミノ酸）であり得る。例えば、側鎖NH2、-OH、または-COOHを含むアミノ酸（例えばLys、Orn、Ser、Asp、またはGlu）が適切である。これに関しては、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列、または本明細書に記載のアミノ酸改変の1つ以上を含む配列番号:1の改変アミノ酸配列を含むことができ、10、20、24および29のアミノ酸の少なくとも1つは、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸に改変される。
いくつかの実施態様では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸、または側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じるとき、アシル化はアミノ酸のアルファアミンまたは側鎖アミンを介して生じ得る。アルファアミンがアシル化される例では、スペーサーのアミノ酸は任意のアミノ酸であり得る。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばGly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸であり得る。また別には、スペーサーのアミノ酸は酸性残基、例えばAspおよびGluであり得る。
【００５９】
スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される例では、スペーサーのアミノ酸は側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Iのアミノ酸（例えばLysまたはOrn）である。この例では、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンおよび側鎖アミンの両方がアシル化されることが可能であり、グルカゴンペプチドは二アシル化される。本発明の実施態様はそのような二アシル化分子を含む。
アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じるとき、当該アミノ酸または当該ジペプチド若しくはトリペプチドの複数のアミノ酸の1つは式IIのアミノ酸であり得る。具体的な例示的実施態様では、アミノ酸はSerである。
アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じるとき、当該アミノ酸または当該ジペプチド若しくはトリペプチドの複数のアミノ酸の1つは式IIIのアミノ酸であり得る。具体的な例示的実施態様では、アミノ酸はCysである。
【００６０】
いくつかの実施態様では、スペーサーは親水性二官能性スペーサーである。ある種の実施態様では、親水性二官能性スペーサーは、2つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基または前記の任意の組合せを含む。ある種の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはアミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはチオール基およびカルボキシレートを含む。具体的な実施態様では、スペーサーはアミノポリ(アルキルオキシ)カルボキシレートを含む。これに関しては、スペーサーは、例えばNH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOHを含み、式中、mは1から6の任意の整数、nは2から12の任意の整数であり、例えば8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸である（前記はペプチドインターナショナル社（Peptides International, Inc.（Louisville, KY））から市場で入手できる）。
いくつかの実施態様では、スペーサーは疎水性二官能性スペーサーである。疎水性二官能性スペーサーは当業界で公知である。例えば以下を参照されたい：Bioconjugate Techniques, G.T.Hermanson（Academic Press, San Diego, CA, 1996）（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。ある種の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーは2つ以上の反応基を含む（例えばアミン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキシル基、または前記の任意の組合せ）。ある種の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーはアミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーはチオール基およびカルボキシレートを含む。カルボキシレートおよびヒドロキシル基またはチオール基を含む適切な疎水性二官能性スペーサーは当業界で公知であり、例えば8-ヒドロキシオクタン酸および8-メルカプトオクタン酸が含まれる。
【００６１】
いくつかの実施態様では、二官能性スペーサーは、カルボキシレート基の間に1−7つの炭素原子の非分枝メチレンを含むジカルボン酸ではない。いくつかの実施態様では、二官能性スペーサーは、カルボキシレート基の間に1−7つの炭素原子の非分枝メチレンを含むジカルボン酸である。
具体的な実施態様では、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能性スペーサー）は、長さが3から10原子である（例えば6から10原子（例えば6、7、8、9または10原子））。より具体的な実施態様では、スペーサーは長さが約3から10原子で（例えば6から10原子）、さらにアシル基はC12からC18脂肪アシル基（例えばC14脂肪アシル基、C16脂肪アシル基）であり、スペーサー及びアシル基の全長は14から28原子、例えば約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27または28原子である。いくつかの実施態様では、スペーサーおよびアシル基の長さは17から28（例えば19から26、19から21）原子である。
【００６２】
ある種の前述の実施態様にしたがえば、二官能性スペーサーには、合成または天然に出現するアミノ酸であることができ（本明細書に記載するアミノ酸のいずれかが含まれるが、ただしこれらに限定されない）、前記は、長さが3から10原子のアミノ酸骨格を含む（例えば6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノヘプタン酸、および8-アミノオクタン酸）。また別には、スペーサーは、長さが3から10原子（例えば6から10原子）のペプチド骨格を有するジペプチドまたはトリペプチドであり得る。ジペプチドまたはトリペプチドスペーサーの各アミノ酸は当該ジペプチドまたはトリペプチドの他のアミノ酸と同じでも異なっていてもよく、それぞれ別個に以下から成る群から選択できる：天然に出現するおよび/または天然に出現しないアミノ酸、例えば以下を含む天然に出現するアミノ酸のD若しくはL異性体のいずれか（Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、Tyr）、または以下から成る群から選択される天然には出現しないアミノ酸の任意のDまたはL異性体：β-アラニン（β-Ala）、N-α-メチル-アラニン（Me-Ala）、アミノ酪酸（Abu）、γ-アミノ酪酸（γ-Abu）、アミノヘキサン酸（ε-Ahx）、アミノイソ酪酸（Aib）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ams）、アミノテトラヒドロピラン-4-カルボン酸、アルギニンN-メトキシ-N-メチルアミド、β-アスパラギン酸（β-Asp）、アゼチジンカルボン酸、3-(2-ベンゾチアゾリル)アラニン、α-tert-ブチルグリシン、2-アミノ-5-ウレイド-n-吉草酸（シトルリン、Cit）、β-シクロヘキシルアラニン（Cha）、アセトアミドメチル-システイン、ジアミノブタン酸（Dab）、ジアミノプロピオン酸（Dpr）、ジヒドロキシフェニルアラニン（DOPA）、ジメチルチアゾリジン（DMTA）、γ-グルタミン酸（γ-Glu）、ホモセリン（Hse）、ヒドロキシプロリン（Hyp）、イソロイシンN-メトキシ-N-メチルアミド、メチル-イソロイシン（MeIle）、イソニペコチン酸（Isn）、メチル-ロイシン（MeLeu）、メチル-リジン、ジメチル-リジン、トリメチル-リジン、メタノプロリン、メチオニン-スルホキシド（Met(O)）、メチオニン-スルホン（Met(O2)）、ノルロイシン（Nle）、メチル-ノルロイシン（Me-Nle）、ノルバリン（Nva）、オルニチン（Orn）、パラ-アミノ安息香酸（PABA）、ペニシラミン（Pen）、メチルフェニルアラニン（MePhe）、4-クロロフェニルアラニン（Phe(4-Cl)）、4-フルオロフェニルアラニン（Phe(4-F)）、4-ニトロフェニルアラニン（Phe(4-NO2)）、4-シアノフェニルアラニン（Phe(4-CN)）、フェニルグリシン（Phg）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、3,4-デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Sar）、セレノシステイン（Sec）、O-ベンジル-ホスホセリン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸（Sta）、4-アミノ-5-シクロヘキシル-3-ヒドロキシペンタン酸（ACHPA）、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸（AHPPA）、1,2,3,4,-テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボン酸（Tic）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Thi）、O-ベンジル-ホスホチロシン、O-ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、O-(ビス-ジメチルアミノ-ホスホノ)-チロシン、チロシンスルフェートテトラブチルアミン、メチル-バリ���（MeVal）、およびアルキル化3-メルカプトプロピオン酸。
【００６３】
いくつかの実施態様では、スペーサーは全体的に陰性荷電を含み、例えば1つまたは2つの陰性荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、ジペプチドは、一般構造A-Bのジペプチドのいずれでもない（ここで、AはGly、Gln、Ala、Arg、Asp、Asn、Ile、Leu、Val、PheおよびProから成る群から選択され、BはLys、His、Trpから成る群から選択される）。いくつかの実施態様では、ジペプチドスペーサーは以下から成る群から選択される：Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-アミノ酪酸-γ-アミノ酪酸、およびγ-Glu-γ-Glu。
いくつかの例示的な実施態様では、グルカゴンペプチドは改変されてスペーサーのアミン、ヒドロキシルまたはチオールのアシル化によってアシル基を含み、前記スペーサーは、10、20、24または29位のアミノ酸の側鎖または当該グルカゴンペプチドのC-末端アミノ酸に接着される。
さらにまたより具体的な実施態様では、アシル基は、グルカゴンペプチドの10位のアミノ酸に接着され、スペーサーおよびアシル基の長さは14から28原子である。いくつかの特徴では、10位のアミノ酸は、式Iのアミノ酸（例えばLys）または式Iに関連する二置換アミノ酸である。より具体的な実施態様では、グルカゴンペプチドは分子内架橋、例えば共有結合分子内架橋を欠く。グルカゴンペプチドは、例えば1つ以上のアルファ,アルファ-二置換アミノ酸（例えばAib）を当該ペプチドのアルファヘリクスの安定化のために含むペプチドであり得る。本明細書に示すように、10位のアミノ酸の側鎖に共有結合的に接着されたアシル化スペーサーを含むそのようなペプチドは、GLP-1およびグルカゴン受容体の両方で強化された効能を示す。
【００６４】
アミン、ヒドロキシルおよびチオールを介するペプチドアシル化の適切な方法は当業界で公知である。例えば以下を参照されたい：（アミンを介するアシル化の方法）；Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382, 1996；Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62, 1982；およびPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13, 1972 ；(ヒドロキシルを介するアシル化の方法）；San and Silvius, J Pept Res 66: 169-180, 2005；（チオールを介するアシル化の方法）；Bioconjugate Chem."Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12, 1990；Hashimoto et al., Pharmacuetical Res."Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol.6, No: 2 pp.171-176, 1989。
アシル化グルカゴンペプチドのアシル基は任意のサイズでよく（例えば任意の長さの炭素鎖）、さらに直鎖でも分枝していてもよい。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、アシル基はC4からC30脂肪酸である。例えば、アシル基は、C4脂肪酸、C6脂肪酸、C8脂肪酸、C10脂肪酸、C12脂肪酸、C14脂肪酸、C16脂肪酸、C18脂肪酸、C20脂肪酸、C22脂肪酸、C24脂肪酸、C26脂肪酸、C28脂肪酸、またはC30脂肪酸のいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、アシル基はC8からC20脂肪酸、例えばC14脂肪酸またはC16脂肪酸である。
また別の実施態様では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は任意の適切な胆汁酸でよく、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸およびコレステロール酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のいくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドは改変され、グルカゴンペプチドによる長鎖アルカンのアシル化によってアシル基を含む。具体的な特徴では、長鎖アルカンはアミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含み（例えばオクタデシルアミン、テトラデカノールおよびヘキサデカンチオール）、前記は、グルカゴンペプチドのカルボキシル基またはその活性化型と反応する。グルカゴンペプチドのカルボキシル基またはその活性化型は、グルカゴンペプチドのアミノ酸（例えばグルタミン酸、アスパラギン酸）の側鎖の部分であってもよく、またはペプチド骨格の部分であってもよい。
【００６５】
ある種の実施態様では、グルカゴンペプチドは改変され、スペーサー（当該グルカゴンペプチドに接着される）による長鎖アルカンのアシル化によってアシル基を含む。具体的な特徴では、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含み、前記はスペーサーのカルボキシル基またはその活性化型と反応する。カルボキシル基またはその活性化型を含む適切なスペーサーは本明細書に記載され、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサーおよび疎水性二官能性スペーサーが含まれる。
本明細書で用いられるように、“カルボキシル基の活性化型”という用語は、一般式R(C=O)Xを有するカルボキシル基を指す（式中、Xは脱離基であり、Rはグルカゴンペプチドまたはスペーサーである）。例えば、カルボキシル基の活性化型には酸塩化物、酸無水物およびエステルが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、活性化カルボキシル基はN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）脱離基を有するエステルである。
長鎖アルカンがグルカゴンペプチドまたはスペーサーによってアシル化される、本発明のこれらの特徴に関して、長鎖アルカンは任意のサイズでよく、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは直鎖でも分枝していてもよい。ある種の特徴では、長鎖アルカンはC4からC30アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、C4アルカン、C6アルカン、C8アルカン、C10アルカン、C12アルカン、C14アルカン、C16アルカン、C18アルカン、C20アルカン、C22アルカン、C24アルカン、C26アルカン、C28アルカン、またはC30アルカンのいずれでもよい。いくつかの実施態様では、長鎖アルカンはC8からC20アルカン、例えばC14アルカン、C16アルカン、またはC18アルカンを含む。
【００６６】
さらにまた、いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドのアミン、ヒドロキシルまたはチオール基はコレステロール酸でアシル化される。具体的な実施態様では、グルカゴンペプチドは、アルキル化されたdes-アミノCysスペーサー（すなわちアルキル化3-メルカプトプロピオン酸スペーサー）を介してコレステロール酸と連結される。
本明細書に記載するアシル化グルカゴンペプチドはさらに改変され親水性部分を含む。いくつかの具体的な実施態様では、親水性部分はポリエチレングリコール（PEG）鎖を含むことができる。親水性部分の取り込みは、任意の適切な手段、例えば本明細書に記載する方法のいずれかにより達成できる。これに関しては、アシル化グルカゴンペプチドは、配列番号:1（本明細書に記載する改変のいずれかを含む）を含むことができ、前記では、10、20、24および29位のアミノ酸の少なくとも1つはアシル基を含み、さらに16、17、21、24または29位、C-末端伸長内の位置のアミノ酸またはC-末端アミノ酸の少なくとも1つは、Cys、Lys、Orn、ホモ-CysまたはAc-Pheに改変され、当該アミノ酸の側鎖は親水性部分（例えばPEG）に共有結合される。いくつかの実施態様では、アシル基は10位に場合によってスペーサー（Cys、Lys、Orn、ホモ-CysまたはAc-Pheを含む）を介して接着され、親水性部分は24位のCys残基に取り込まれる。
また別には、アシル化グルカゴンペプチドはスペーサーを含むことができ、ここで、スペーサーはアシル化されるだけでなく改変されて親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定的な例には、Cys、Lys、Orn、ホモ-CysまたはAc-Pheから成る群から選択される1つ以上のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。
【００６７】
アルキル化
いくつかの実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドは改変されてアルキル基を含む。例えば、アルキル基はアミノ酸で天然には出現しないものである（例えば天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではないアルキル基）。いずれの特定の理論にも拘束されないが、グルカゴンペプチドのアルキル化は、グルカゴンペプチドのアシル化と同じではないとしても同様な効果、例えば循環中での半減期の延長、作用開始の遅延、作用持続時間の延長、プロテアーゼ（例えばDPP-IV）に対する耐性の改善、GLP-1およびグルカゴン受容体における効能の増加を達成するであろうと考えられる。
アシル化はグルカゴンペプチド内の任意の位置で実施でき、当該位置には1−29位のいずれか、C-末端伸長内の位置、またはC-末端アミノ酸が含まれるが、ただしグルカゴン活性が保持されることを条件とする。非限定的な例には、5、7、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、24、27、28、または29位が含まれる。アルキル基は、グルカゴンペプチドのアミノ酸に直接的に、またはスペーサーを介してグルカゴンペプチドのアミノ酸に間接的に共有結合により連結され得る。後者では、スペーサーはグルカゴンペプチドのアミノ酸とアルキル基との間に配置される。グルカゴンペプチドは、親水性部分が連結される同じアミノ酸の位置で、または異なるアミノ酸の位置でアルキル化され得る。非限定的な例には以下が含まれる：10位でのアルキル化およびグルカゴンペプチドのC-末端部分（例えば24、28若しくは29位、C-末端伸長内、またはC-末端（例えばC-末端Cysの付加を介する））における1つ以上の位置でのペグ化。
本発明の具体的な特徴では、グルカゴンペプチドは改変され、グルカゴンペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシルまたはチオールの直接的アルキル化によってアルキル基を含む。いくつかの実施態様では、アルキル化は10、20、24または29位に存在する。これに関しては、アルキル化されるグルカゴンペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列、または本明細書に記載するアミノ酸改変の1つ以上を含む配列番号:1の改変アミノ酸配列を含み、10、20、24および29位のアミノ酸の少なくとも1つは、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含む任意のアミノ酸に改変される。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、グルカゴンペプチドの直接的アルキル化は、10位のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを介して生じる。
【００６８】
いくつかの実施態様では、側鎖アミンを含むアミノ酸は式Iのアミノ酸である。いくつかの例示的実施態様では、式Iのアミノ酸は、nが4（Lys）またはnが3（Orn）のアミノ酸である。
他の実施態様では、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は式IIのアミノ酸である。いくつかの例示的実施態様では、式IIのアミノ酸は、nが1（Ser）のアミノ酸である。
さらに他の実施態様では、側鎖チオールを含むアミノ酸は式IIIのアミノ酸である。いくつかの例示的実施態様では、式IIIのアミノ酸は、nが1（Cys）のアミノ酸である。
さらに他の実施態様では、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含むアミノ酸は、式I、式IIまたは式IIIと同じ構造を含む二置換アミノ酸であるが、ただし式I、式IIまたは式IIIのアミノ酸のアルファ炭素に結合する水素は第二の側鎖で入れ替えられるという点を除く。
本発明のある実施態様では、アルキル化グルカゴンペプチドは、当該ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドはスペーサーと共有結合され、当該スペーサーはアルキル基と共有結合される。いくつかの例示的実施態様では、グルカゴンペプチドは改変され、スペーサーのアミン、ヒドロキシルまたはチオールのアルキル化によってアルキル基を含む。当該スペーサーは、グルカゴンペプチドの10、20、24または29位のアミノ酸の側鎖に接着される。スペーサーが接着されるアミノ酸は、スペーサーとの結合を許容する部分を含む任意のアミノ酸でよい（例えば一α-置換アミノ酸またはα,α-二置換アミノ酸）。例えば、側鎖NH2、-OH、または-COOHを含むアミノ酸（例えばLys、Orn、Ser、Asp、またはGlu）が適切である。これに関しては、アルキル化されるグルカゴンペプチドは、配列番号:1のアミノ酸配列、または本明細書に記載するアミノ酸改変の1つ以上を含む配列番号:1の改変アミノ酸配列を含み、10、20、24および29位のアミノ酸の少なくとも1つは、側鎖アミン、ヒドロキシルまたはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸に改変される。
いくつかの実施態様では、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸、または側鎖アミン、ヒドロキシルまたはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
【００６９】
アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じるとき、アルキル化はアミノ酸のアルファアミンまたは側鎖アミンを介して生じ得る。アルファアミンがアルキル化される例では、スペーサーのアミノ酸は任意のアミノ酸でよい。例えば、スペーサーのアミノ酸は、疎水性アミノ酸（例えばGly、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Met、Phe、Tyr、6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸）でよい。また別には、スペーサーのアミノ酸は酸性残基（例えばAspおよびGlu）でよいが、ただしアルキル化が酸性残基のアルファアミンで生じることを条件とする。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される例では、スペーサーのアミノ酸は側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式Iのアミノ酸（例えばLysまたはOrn）である。この例では、スペーサーのアミノ酸のアルファアミンおよび側鎖アミンの両方がアルキル化されることが可能で、グルカゴンペプチドは二アルキル化される。本発明の実施態様はそのような二アルキル化分子を含む。
アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じるとき、当該アミノ酸または当該ジペプチド若しくはトリペプチドの複数のアミノ酸の1つは式IIのアミノ酸であり得る。具体的な例示的実施態様では、アミノ酸はSerである。
アルキル化がスペーサーのチオール基を介して生じるとき、当該アミノ酸または当該ジペプチド若しくはトリペプチドの複数のアミノ酸の1つは式IIIのアミノ酸であり得る。具体的な例示的実施態様では、アミノ酸はCysである。
【００７０】
いくつかの実施態様では、スペーサーは親水性二官能性スペーサーである。ある種の実施態様では、親水性二官能性スペーサーは、2つ以上の反応基、例えばアミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基または前記の任意の組合せを含む。ある種の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはアミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、親水性二官能性スペーサーはチオール基およびカルボキシレートを含む。具体的な実施態様では、スペーサーはアミノポリ(アルキルオキシ)カルボキシレートを含む。これに関しては、スペーサーは、例えばNH2(CH2CH2O)n(CH2)mCOOHを含み、式中、mは1から6の任意の整数、nは2から12の任意の整数であり、例えば8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸である（前記はペプチドインターナショナル社（Louisville, KY）から市場で入手できる）。
いくつかの実施態様では、スペーサーは疎水性二官能性スペーサーである。ある種の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーは2つ以上の反応基を含む（例えばアミン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキシル基、または前記の任意の組合せ）。ある種の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーはヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーはアミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施態様では、疎水性二官能性スペーサーはチオール基およびカルボキシレートを含む。カルボキシレートおよびヒドロキシル基またはチオール基を含む適切な疎水性二官能性スペーサーは当業界で公知であり、例えば8-ヒドロキシオクタン酸および8-メルカプトオクタン酸が含まれる。
【００７１】
具体的な実施態様では、スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性又は疎水性二官能性スペーサー）は、長さが3から10原子である（例えば6から10原子、例えば6、7、8、9または10原子）。より具体的な実施態様では、スペーサーは長さが約3から10原子で（例えば6から10原子）、さらにアルキルはC12からC18アルキル基（例えばC14アルキル基、C16アルキル基）であり、スペーサー及びアルキル基の全長は14から28原子、例えば約14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27または28原子である。いくつかの実施態様では、スペーサーおよびアルキル基の長さは17から28（例えば19から26、19から21）原子である。
ある種の前述の実施態様にしたがえば、二官能性スペーサーは、合成または天然に出現しないアミノ酸でよく、長さが3から10原子のアミノ酸骨格を含む（例えば6-アミノヘキサン酸、5-アミノ吉草酸、7-アミノヘプタン酸、および8-アミノオクタン酸）。また別には、スペーサーは、長さが3から10原子（例えば6から10原子）のペプチド骨格を有するジペプチドまたはトリペプチドスペーサーであり得る。ジペプチドまたはトリペプチドスペーサーは、天然に出現するおよび/または天然には出現しないアミノ酸で構成されることができ、例えば本明細書で教示するアミノ酸のいずれかが含まれる。いくつかの実施態様では、スペーサーは全体的に陰性荷電を含み、例えば1つまたは2つの陰性荷電アミノ酸を含む。いくつかの実施態様では、ジペプチドスペーサーは、Ala-Ala、β-Ala-β-Ala、Leu-Leu、Pro-Pro、γ-アミノ酪酸-γ-アミノ酪酸、およびγ-Glu-γ-Gluから成る群から選択される。
【００７２】
アミン、ヒドロキシル、およびチオールを介してペプチドをアルキル化する適切な方法は当業界で公知である。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を用いて、グルカゴンペプチドのヒドロキシル基とアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。または、ハロゲン化アルキルとの求核置換反応はエーテル、チオエーテルまたはアミノ結合のいずれかを生じることができる。
アルキル化グルカゴンペプチドのアルキル基は任意のサイズでよく（例えば任意の長さの炭素鎖）、さらに直鎖でも分枝していてもよい。本発明のいくつかの具体的な実施態様では、アルキル基はC4からC30アルキルである。例えば、アルキル基は、C4アルキル、C6アルキル、C8アルキル、C10アルキル、C12アルキル、C14アルキル、C16アルキル、C18アルキル、C20アルキル、C22アルキル、C24アルキル、C26アルキル、C28アルキル、またはC30アルキルのいずれかであり得る。いくつかの実施態様では、アルキル基はC8からC20アルキル、例えばC14アルキルまたはC16アルキルである。
いくつかの具体的な実施態様では、アルキル基は、胆汁酸、例えばコール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸およびコレステロール酸のステロイド部分を含む。
本発明のいくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドは改変され、求核性長鎖アルカンをグルカゴンペプチド（求核置換に適切な脱離基を含む）と反応させることによってアルキル基を含む。具体的な特徴では、長鎖アルカンの求核基は、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含む（例えばオクタデシルアミン、テトラデカノールおよびヘキサデカンチオール）。グルカゴンペプチドの脱離基はアミノ酸の側鎖の部分であってもよく、またはペプチド骨格の部分であってもよい。適切な脱離基には、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド、ハロゲンおよびスルホネートエステルが含まれる。
【００７３】
ある種の実施態様では、グルカゴンペプチドは改変され、求核性長鎖アルカンをスペーサー（当該グルカゴンペプチドに接着される）と反応させることによってアルキル基を含む（ここでスペーサーは脱離基を含む）。具体的な特徴では、長鎖アルカンは、アミン、ヒドロキシル、またはチオール基を含む。ある種の実施態様では、脱離基を含むスペーサーは、本明細書で考察される任意のスペーサー、例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサーおよび疎水性二官能性スペーサーでよく、前記はさらに適切な脱離基を含む。
長鎖アルカンがグルカゴンペプチドまたはスペーサーによってアルキル化される、本発明のこれらの特徴に関して、長鎖アルカンは任意のサイズでよく、任意の長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは直鎖でも分枝していてもよい。ある種の特徴では、長鎖アルカンはC4からC30アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、C4アルカン、C6アルカン、C8アルカン、C10アルカン、C12アルカン、C14アルカン、C16アルカン、C18アルカン、C20アルカン、C22アルカン、C24アルカン、C26アルカン、C28アルカン、またはC30アルカンのいずれでもよい。いくつかの実施態様では、長鎖アルカンはC8からC20アルカン、例えばC14アルカン、C16アルカン、またはC18アルカンを含む。
【００７４】
さらにまた、いくつかの実施態様では、アルキル化は、グルカゴンペプチドとコレステロール部分との間で生じ得る。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は長鎖アルカン上の脱離基を追い出し、コレステロール-グルカゴンペプチド生成物を形成する。
本明細書に記載するアルキル化グルカゴンペプチドはさらに改変されて、親水性部分を含むことができる。いくつかの具体的な実施態様では、親水性部分はポリエチレングリコール（PEG）鎖を含むことができる。親水性部分の取り込みは、任意の適切な手段、例えば本明細書に記載する方法のいずれかにより達成できる。これに関しては、アルキル化グルカゴンペプチドは、配列番号:1、または本明細書に記載のアミノ酸改変の1つ以上を含む配列番号:1の改変アミノ酸配列を含むことができ、前記では、10、20、24および29位のアミノ酸の少なくとも1つはアルキル基を含み、さらに16、17、21、24または29位、C-末端伸長内の位置のアミノ酸またはC-末端アミノ酸の少なくとも1つは、Cys、Lys、Orn、ホモ-CysまたはAc-Pheに改変され、当該アミノ酸の側鎖は親水性部分（例えばPEG）に共有結合される。いくつかの実施態様では、アルキル基は10位に場合によってスペーサー（Cys、Lys、Orn、ホモ-CysまたはAc-Pheを含む）を介して接着され、親水性部分は24位のCys残基に取り込まれる。
また別には、アルキル化グルカゴンペプチドはスペーサーを含むことができ、ここで、スペーサーはアルキル化されるだけでなく改変されて親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定的な例には、Cys、Lys、Orn、ホモ-CysまたはAc-Pheから成る群から選択される1つ以上のアミノ酸を含むスペーサーが含まれる。
【００７５】
GLP-1活性を低下させる改変
ある種の実施態様では、グルカゴンペプチドまたはそのアナログは、GLP-1活性を選択的に低下させるアミノ酸改変を含む。例えば、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドまたはそのアナログは、C-末端アルファカルボキシレート基；7位のThrのヒドロキシル基を欠くアミノ酸（例えばAbuまたはIle）による置換；C-末端アミノ酸から27または28位のアミノ酸を欠失させ（例えば28位のアミノ酸の欠失、28および29位のアミノ酸の欠失）、長さが27または28アミノ酸のペプチドの生成、または前記の組合せを含む。
【００７６】
共役物
本開示は他の共役物を包含し、前記共役物では、本発明のグルカゴンペプチドは、場合によって共有結合を介してさらに場合によってリンカーを介して共役部分に連結される。結合は、化学的共有結合、物理的力、例えば静電性、水素、イオン性、ファンデルワールスまたは疎水性若しくは親水性相互反応によって達成され得る。多様な非共有結合性カップリング系を用いることができ、前記にはビオチン-アビジン、リガンド/受容体、酵素/基質、核酸/核酸結合タンパク質、脂質/脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー、または互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントが含まれ得る。
ペプチドは、当該ペプチドの標的アミノ酸残基を有機誘導化剤（これら標的アミノ酸の選択側鎖またはN-若しくはC-末端残基と反応できる）と反応させることによって直接的共有結合を介して共役部分と連結できる。ペプチドまたは共役部分上の反応基には、例えばアルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α-ハロアセチル、マレイミドまたはヒドラジノ基が含まれる。誘導化剤には、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、N-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、または当業界で公知の他の薬剤が含まれる。また別には、共役部分は、中間担体（例えば多糖類またはポリペプチド担体）を介して間接的にペプチドと結合できる。多糖類担体の例にはアミノデキストランが含まれる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、前記のコポリマー、並びにこれらアミノ酸および他のもの（例えばセリン）の混合ポリマーが含まれ、得られたローディング担体に所望の溶解特性が付与される。
【００７７】
システイニル残基はもっとも一般的にはα-ハロアセテート（および対応するアミン）（例えばクロロ酢酸、クロロアセトアミド）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によって誘導される。
ヒスチジル残基は、pH5.5−7.0でジエチルピロカーボネートと反応させることによって誘導される（なぜならば、前記薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的だからである）。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である（当該反応は好ましくはpH6.0で0.1Mのカコジル酸ナトリウム中で実施される）。
リシニルおよびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応される。これら薬剤による誘導はリシニル残基の荷電を逆転させる効果を有する。アルファ-アミノ含有残基を誘導する他の適切な試薬には、イミドエステル、例えばメチルピコリニミデート（methyl picolinimidate）、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソウレア、2,4-ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
アルギニル残基は、1つまたはいくつかの通常的な試薬、とりわけフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって改変される。アルギニン残基の誘導は、グアニジン官能基の高いpKaのためにアルカリ条件下で反応が実施されることを要求する。さらにまた、これらの試薬は、アルギニンエプシロン-アミノ基と同様にリジンの基と反応することができる。
【００７８】
チロシン残基の特異的改変は、チロシル残基へのスペクトル標識導入への特別な関心により、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって実施され得る。もっとも一般的には、N-アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンが用いられ、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を生じる。
【００７９】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（R-N=C=N-R’）との反応によって選択的に改変される。式中、RおよびR'は、異なるアルキル基、例えば、1-シクロヘキシル-3-(2-モルフォリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドである。さらにまた、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
他の改変には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアルファ-アミノ基のメチル化（T.E.Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86, 1983）、アスパラギンまたはグルタミンの脱アミド化、N-末端アミンのアセチル化、および/またはC-末端カルボン酸基のアミド化またはエステル化が含まれる。
共有結合改変の別のタイプは、グリコシドのペプチドへの化学的または酵素的カップリングを必要とする。糖は、（a）アルギニンおよびヒスチジン、（b）遊離カルボキシル基、（c）遊離スルフヒドリル基（例えばシステインのもの）、（d）遊離ヒドロキシル基（例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのもの）、（e）芳香族残基（例えばチロシンまたはトリプトファンのもの）、または（f）グルタミンのアミド基へ接着され得る。これらの方法は以下に記載されている：WO87/05330（1987年9月11日公開）およびAplin and Wriston, CRC Crit.Rev.Biochem., pp.259-306, 1981。
【００８０】
本明細書に記載するグルカゴンペプチドのいずれかに連結することができる例示的な共役部分には、異種ペプチドまたはポリペプチド（例えば血漿タンパク質を含む）、標的誘導剤（targeting agent）、免疫グロブリンまたはその部分（例えば可変領域、CDRまたはFc領域）、診断標識（例えば放射性同位元素、蛍光色素または酵素標識）、ポリマー（水溶性ポリマーを含む）、または他の治療用若しくは診断用薬剤が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ある実施態様では、本発明のグルカゴンペプチドおよび血漿タンパク質を含む共役物が提供され、ここで、血漿タンパク質はアルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲンおよびグロブリンから成る群から選択される。ある実施態様では、共役物の血漿タンパク質部分はアルブミンまたはトランスフェリンである。いくつかの実施態様では、リンカーは、1から約60原子、または1から30原子以上、2から5原子、2から10原子、5から10原子、または10から20原子の長さの鎖を含む。いくつかの実施態様では、鎖原子は全て炭素原子である。いくつかの実施態様では、リンカーの骨格内の鎖原子は、C、O、NおよびSから成る群から選択される。鎖原子およびリンカーは、それらの期待される溶解性（親水性）に応じて選択でき、より高い溶解性の共役物を提供できる。いくつかの実施態様では、リンカーは官能基を提供し、当該官能基は、標的組織または器官または細胞で見いだされる酵素または他の触媒または加水分解条件による切断に付される。いくつかの実施態様では、リンカーの長さは、立体的障害に対する潜在性を低下させるために十分に長い。リンカーが共有結合またはペプチジル結合であり、さらに共役物がポリペプチドである場合、全共役物は融合タンパク質であり得る。例示的リンカーは、長さが約1から50アミノ酸、長さが5から50、3から5、5から10、5から15、または10から30アミノ酸である。そのような融合タンパク質は、また別には、当業者に知られている組換え遺伝子操作方法によって生成され得る。
【００８１】
上記に記載したように、いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドは共役物を形成し、例えば免疫グロブリンまたはその部分（例えば可変領域、CDRまたはFc領域）と融合される。免疫グロブリン（Ig）の公知のタイプには、IgA、IgE、IgD、またはIgMが含まれる。Fc領域はIg重鎖のC-末端領域である。前記はFc受容体との結合に必要であり、当該結合は、活性（例えばリサイクル（半減期の延長をもたらす）、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ADCC）、および補体依存細胞傷害（CDC））を実行する。
いくつかの定義にしたがえば、例えば、ヒトIgG重鎖Fc領域は重鎖のCys226からC-末端に広がる。“ヒンジ領域”は概ねヒトIgG1のGlu216からPro230ni及ぶ（他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に必要なシステインを一列に並べることによってIgG1配列とアラインメントすることができる）。IgGのFc領域は2つの定常ドメイン（CH2およびCH3）を含む。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメインは通常アミノ酸231からアミノ酸341に及ぶ。ヒトIgG Fc領域のCH3ドメインは通常アミノ酸342から447に及ぶ。免疫グロブリン若しくは免疫グロブリンフラグメント、または領域のアミノ酸の番号付けについての指示は、いずれもKabatらの論文に基づく（Kabat et al.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Public Health, Bethesda, Md.）。関連する実施態様では、Fc領域は、免疫グロブリン重鎖の1つ以上の自然のままのまたは改変されたCH1以外の定常領域、例えばIgGおよびIgAのCH2およびCH3領域、またはIgEのCH3およびCH4領域を含むことができる。
【００８２】
適切な共役部分は、FcRn結合部位を含む免疫グロブリン配列の部分を含む。FcRn（サルベージ受容体）は、免疫グロブリンをリサイクルしてそれらを血液循環に戻すために必要である。FcRn受容体と結合するIgGのFc部分の領域は、X-線結晶学に基づいて記載されている（Burmeister et al.1994, Nature 372:379）。FcのFcRnとの主要な接触領域はCH2とCH3の接合点に近い。Fc-FcRn接触はいずれも単一Ig重鎖内で生じる。主要な接触部位は、CH2ドメインのアミノ酸残基248、250−257、272、285、288、290−291、308−311、および314、並びにCH3ドメインのアミノ酸残基385−387、428および433−436を含む。
いくつかの共役部分はFcγR結合部位を含むことも含まないこともある。FcγRはADCCおよびCDCのために必要である。FcγRとの直接的接触を生じるFc領域内の位置の例は、アミノ酸234−239（下部ヒンジ領域）、アミノ酸265−269（B/Cループ）、アミノ酸297−299（C'/Eループ）、およびアミノ酸327−332（F/Gループ）である（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。IgEの下部ヒンジ領域もまたFcRI結合に関与していた（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。IgA受容体結合に密接に関係する残基はLewisらの論文に記載されている（Lewis et al., J Immunol.175:6694-701, 2005）。IgE受容体結合に密接に関係するアミノ酸残基はSayersらの論文に記載されている（Sayers et al., J Biol Chem.279(34):35320-5, 2004）。
【００８３】
アミノ酸改変を免疫グロブリンのFc領域に対して実施できる。そのような変種Fc領域は、Fc領域のCH3ドメイン（残基342−447）に少なくとも1つのアミノ酸改変、および/またはFc領域のCH2ドメイン（残基231−341）に少なくとも1つのアミノ酸を含む。FcRnに対する親和性増加を付与すると考えられる変異は、T256A、T307A、E380A、およびN434Aを含む（Shields et al.2001, J.Biol.Chem.276:6591）。他の変異は、FcRnに対する親和性を有意に低下させることなく、Fc領域のFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、および/またはFcγRIIIAとの結合を低下させることができる。例えば、Fc領域の297位のAsnのAlaまたは別のアミノ酸による置換は、高度に保存されたN-グリコシル化部位を除去して免疫原性低下をもたらすことができ、同時にFc領域の半減期を延長させるとともにFcγRとの結合を低下させる（Routledge et al.1995, Transplantation 60:847；Friend et al.1999, Transplantation 68:1632；Shields et al.1995, J.Biol.Chem.276:6591）。IgG1の233−236位のアミノ酸改変が実施され、前記はFcγRとの結合を低下させる（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al.1999, Eur.J.Immunol.29:2613）。いくつかの例示的なアミノ酸置換は米国特許7,355,008号および7,381,408号に記載されている（各々は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
本開示はまた、第二のペプチドまたはポリペプチドが末端に、例えばグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に融合されてあるグルカゴン融合ペプチドまたはタンパク質を包含する。C-末端融合のための例示的な候補物には、グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）、または配列番号:822（KRNR）が含まれる。
【００８４】
アルファヘリックス構造の安定化
グルカゴンペプチドの1位および/または2位のアミノ酸の改変に際してのグルカゴン活性の低下は、グルカゴンペプチドのC-末端部分（アミノ酸12−29辺り）のアルファヘリックス構造の安定化によって回復させることができる。アルファヘリックス構造は、例えば共有結合または非共有結合分子内架橋の形成、12−29位周辺のアミノ酸のアルファヘリックス安定化アミノ酸（例えばα,α-二置換アミノ酸）による置換または挿入によって安定化させることができる。
いくつかの実施態様では、分子内架橋は、2つのアミノ酸側鎖の間で形成され、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端部分（例えばアミノ酸12−29）の三次元構造を安定化させる。2つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、イオン相互作用（例えば塩架橋の形成）を介して、または共有結合によって互いに連結され得る。2つのアミノ酸側鎖が1つ以上の共有結合によって互いに連結されるとき、当該ペプチドは共有結合分子内架橋を含むと本明細書ではみなすことができる。2つのアミノ酸側鎖が互いに非共有結合（例えば水素結合、イオン相互作用）を介して連結されるとき、当該ペプチドは非共有結合分子内架橋を含むと本明細書ではみなすことができる。
いくつかの実施態様では、分子内架橋は、3アミノ酸離れた2つのアミノ酸間で、例えばiおよびi+4位のアミノ酸間で形成される（iは12から25の任意の整数、例えば12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24および25）。より具体的には、アミノ酸ペア12および16、16および20、20および24、または24および28（i＝12、16、20、または24のアミノ酸ペア）の側鎖が互いに連結され、グルカゴンアルファヘリックスを安定化させる。また別にはiは17でもよい。
iおよびi+4位のアミノ酸が分子内架橋によってつながれる、いくつかの具体的な実施態様では、リンカーのサイズは約8原子または約7−9原子である。
【００８５】
他の実施態様では、分子内架橋は、2アミノ酸離れた2つのアミノ酸間で、例えばjおよびj+3位のアミノ酸間で形成される（jは12から26の任意の整数、例えば12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25および26）。いくつかの具体的な実施態様では、jは17である。
jおよびj+3位のアミノ酸が分子内架橋によってつながれる、いくつかの具体的な実施態様では、リンカーのサイズは約6原子または約5から7原子である。
さらにまた他の実施態様では、分子内架橋は、6アミノ酸離れた2つのアミノ酸間で、例えばkおよびk+7位のアミノ酸間で形成される（kは12から22の任意の整数、例えば12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、および22）。いくつかの具体的な実施態様では、kは12、13、または17である。例示的な実施態様では、kは17である。
【００８６】
共有結合して6原子結合架橋を形成できるアミノ酸ペアの例には、OrnとAsp、Gluと式Iのアミノ酸（nは2）、およびホモグルタミン酸と式Iのアミノ酸（nは1）が含まれ、ここで式Iは下記である：
2019520336.tif 000019
式中、n＝1から4である。
[式I]
【００８７】
共有結合して7原子結合架橋を形成できるアミノ酸ペアの例には、Orn-Glu（ラクタム環）；Lys-Asp（ラクタム）；またはホモSer-ホモGlu（ラクトン）が含まれる。8原子リンカーを形成できるアミノ酸ペアの例には、Lys-Glu（ラクタム）；ホモLys-Asp（ラクタム）；Orn-ホモGlu（ラクタム）；4-アミノPhe-Asp（ラクタム）；またはTyr-Asp（ラクトン）が含まれる。9原子リンカーを形成できるアミノ酸ペアの例には、ホモLys-Glu（ラクタム）；Lys-ホモGlu（ラクタム）；4-アミノPhe-Glu（ラクタム）；またはTyr-Glu（ラクトン）が含まれる。これらアミノ酸の側鎖のいずれかを追加の化学基で追加的に置換できるが、ただしアルファヘリックスの三次元構造が破壊されない場合に限られる。当業者は、類似のサイズで所望の作用をもつ安定化構造を作り出すまた別のペア或いはまた別のアミノ酸アナログ（化学的に改変された誘導体を含む）を想定することができる。例えば、ホモシステイン-ホモシステインジスルフィド架橋は長さが6原子であり、さらにまた改変されて所望の作用を提供できる。共有結合がたとえ存在しなくても、上記に記載のアミノ酸ペアまたは当業者が想定し得る類似のペアは、非共有結合（例えば塩架橋の形成又は水素結合相互作用）を介してアルファヘリックスに対して付け足された安定性を提供できる。
ラクタム環のサイズはアミノ酸側鎖の長さに応じて変動可能であり、ある実施態様では、ラクタムは、リジンアミノ酸の側鎖をグルタミン酸側鎖に連結することによって形成される。さらに別の例示的な実施態様は、場合によってラクタム架橋を有する以下のペアを含む：12位のGluと16位のLysによるペア；12位の自然のままのLysと16位のGlu；16位のGluと20位のLys;16位のLysと20位のGlu；20位のGluと24位のLys；20位のLysと24位のGlu；24位のGluと28位のLys；24位のLysと28位のGlu。また別には、ラクタム環のアミド結合の順序は逆転させることができる（例えば、環はLys12とGlu16の側鎖間で、或いはGlu12とLys16間で形成され得る）。
【００８８】
、
ラクタム架橋以外の分子内架橋を用いて、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスを安定化できる。ある実施態様では、分子内架橋は疎水性架橋である。この例では、分子内架橋は場合によって、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスの疎水面の部分である2つのアミノ酸の側鎖間に存在する。例えば、疎水性架橋によって結び付けられるアミノ酸の一方は10、14および18位のアミノ酸であり得る。
ある具体的な特徴では、オレフィンメタセシス反応を用い、全炭化水素架橋系によりグルカゴンペプチドのアルファヘリックスの1つまたは2つのターンが架橋される。この例のグルカゴンペプチドは、種々の長さのオレフィン側鎖を保持し、iおよびi+4またはi+7位でRまたはS立体化学構造を有する、α-メチル化アミノ酸を含むことができる。例えば、オレフィン側鎖は(CH2)nを含むことができる（式中、nは1から6の任意の整数である）。ある実施態様では、架橋連結長が8原子の場合にはnは3である。そのような分子内架橋を形成する適切な方法は当業界で記載されている。例えば以下を参照されたい：Schafmeister et al., J.Am.Chem.Soc.122: 5891-5892, 2000；およびWalensky et al., Science 305: 1466-1470, 2004。また別には、グルカゴンペプチドは、隣接するヘリックスターン上に位置するO-アリルSer残基を含むことができ、前記は、ルテニウム触媒閉環メタセシス反応を介して一緒に架橋される。そのような架橋手順は、例えば以下に記載されている：Blackwell et al., Angew, Chem., Int.Ed.37: 3281-3284, 1998。
別の具体的な特徴では、非天然チオ-ジアラニンアミノ酸、ランチオニン（システインのペプチド模倣物として広く採用されている）の使用はα-ヘリックスの1つのターンを架橋するために用いられる。ランチオニンによる環化の適切な方法は当業界で公知である。例えば以下を参照されたい：Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401, 2004；Mayer et al., J.Peptide Res.51: 432-436, 1998；Polinsky et al., J.Med.Chem.35: 4185-4194, 1992；Osapay et al., J.Med.Chem.40: 2241-2251, 1997；Fukase et al.,  Bull.Chem.Soc.Jpn.65: 2227-2240, 1992；Harpp et al., J.Org.Chem.36: 73-80, 1971；Goodman and Shao, Pure Appl.Chem.68: 1303-1308, 1996；およびOsapay and Goodman, J.Chem.Soc.Chem.Commun.1599-1600, 1993。
【００８９】
いくつかの実施態様では、iおよびi+7位の2つのGlu残基の間でα, ω-ジアミノアルカンテザー（例えば1,4-ジアミノプロパンおよび1,5-ジアミノペンタン）を用いて、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスが安定化される。そのようなテザーは、ジアミノアルカンテザーの長さに応じて長さが9原子以上の架橋形成を生じる。
そのようなテザーで架橋されたペプチドを生成する適切な方法は当業界で記載されている。例えば以下を参照されたい：Phelan et al., J.Am.Chem.Soc.119: 455-460, 1997。
本発明のさらに別の実施態様では、ジスルフィド架橋を用いて、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスの1つまたは2つのターンが架橋される。また別には、一方または両方の硫黄原子がメチレン基で入れ替えられて立体異性大環状化を生じる改変ジスルフィド架橋を用いて、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスが安定化される。ジスルフィド架橋を有するペプチドの改変または硫黄系環状化の適切な方法は例えば以下に記載されている：Jackson et al., J.Am.Chem.Soc.113: 9391-9392, 1991；およびRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571, 1964。
さらに別の実施態様では、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスは、iおよびi+4位に位置する2つのHis残基またはHisとCysペアによる金属原子の結合を介して安定化される。金属原子は、例えばRu(III)、Cu(II)、Zn(II)、またはCd(II)である。そのような金属結合によるアルファヘリックス安定化の方法は当業界では公知である。例えば以下を参照されたい：Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743, 1999；Ghadiri et al., J.Am.Chem.Soc.112: 1630-1632, 1990；およびGhadiri et al., J.Am.Chem.Soc.119: 9063-9064, 1997。
【００９０】
グルカゴンペプチドのアルファヘリックスは、また別にはペプチド環化の他の手段を介して安定化される。前記手段は以下で概説されている：Davies, J.Peptide.Sci.9: 471-501, 2003。アルファヘリックスは、アミド架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋の形成などにより安定化され得る。例えば、チオエステル架橋は、C-末端とCys残基の側鎖との間で形成され得る。また別には、チオエステルは、チオールを有するアミノ酸（Cys）の側鎖とカルボン酸（例えばAsp、Glu）を介して形成され得る。別の方法では、架橋剤（例えばジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）など）が、アミノ酸側鎖の2つの官能基（例えば遊離アミノ、ヒドロキシル、チオール基および前記の組合せ）の間に結合を導入できる。
ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドのアルファヘリックスは、iおよびi+4位への疎水性アミノ酸の取り込みを介して安定化される。例えば、iはTyrでi+4はVal、またはLeuであることができ；iはPheでi+4はCysまたはMetであることができ；iはCysでi+4はMetであることができ；またはiはPheでi+4はIleであることができる。本明細書の目的のためには、上記のアミノ酸ペアを逆転できることは理解されよう。したがってi位に指定されたアミノ酸はまた別にi+4に配置することができ、一方i+4のアミノ酸はi位に配置できる。
本発明の他の実施態様にしたがえば、アルファヘリックスは、グルカゴンペプチドのC-末端部分（アミノ酸12−29辺り）への1つ以上のアルファヘリックス安定化アミノ酸の
取り込み（アミノ酸置換または挿入による）を介して安定化される。具体的な実施態様では、アルファヘリックス安定化アミノ酸は、以下のいずれかを含むα,α二置換アミノ酸である（ただしこれらに限定されない）：アミノイソ酪酸（Aib）；メチル、エチル、プロピル、およびブチルから選択される同じ若しくは異なる基で、またはシクロオクタン若しくはシクロヘプタンで二置換されたアミノ酸（例えば1-アミノシクロオクタン-1-カルボン酸）。いくつかの実施態様では、グルカゴンペプチドの16、17、18、19、20、21、24または29位の1つ、2つ、3つ、4つまたは5つ以上がα,α二置換アミノ酸で置換される。具体的な実施態様では、16、20、21および24位の1つ、2つ、3つまたは全てがAibで置換される。例えば、グルカゴンペプチドは、分子内架橋（例えば非共有結合分子内架橋（例えば塩架橋）または共有結合分子内架橋（例えばラクタム））の非存在下でAibによる16位の置換を含むことができる。分子内架橋を欠くそのようなペプチドは有利なことに調製が容易である。
【００９１】
いくつかの実施態様にしたがえば、分子内架橋を欠くグルカゴンペプチドは、アミノ酸12−29位内に、α,α二置換アミノ酸およびグルカゴンペプチドのアミノ酸（例えばグルカゴンペプチドの10位のアミノ酸）の側鎖に共有結合により接着されたアシルまたはアルキル基による1つ以上の置換を含む。具体的な実施態様では、アシルまたはアルキル基は、天然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではない。ある種の特徴では、アシルまたはアルキル基は10位のアミノ酸にとって自然のままではない。分子内架橋を欠くそのようなアシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドは、アシル化されていない対応するペプチドと比較して、GLP-1およびグルカゴン受容体で強化された活性を示す。GLP-1およびグルカゴン受容体における更なる活性の強化は、アシルまたはアルキル基とペプチドの10位のアミノ酸の側鎖との間にスペーサーを取り込むことにより、分子内架橋を欠くアシル化グルカゴンペプチドによって達成され得る。スペーサーを取り込むまたは取り込まないアシル化及びアルキル化もさらにまた本明細書に記載される。
具体的な実施態様では、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドまたはそのアナログは更なる改変を含み、前記改変はGLP-1受容体における活性を選択的に低下させる。例えば、アシル化またはアルキル化グルカゴンペプチドまたはそのアナログは以下の1つまたは組合せを含む：C-末端アルファカルボキシレート；C-末端アミノ酸から27または28位までのアミノ酸の欠失（例えばアミノ酸29位の欠失、28および29位のアミノ酸の欠失）；ヒドロキシル基を欠くアミノ酸（例えばAbuまたはIle）による7位Thrの置換。
【００９２】
実施態様の例
ある実施態様にしたがえば、配列番号:1の自然のままのグルカゴンペプチドは、6、10または13位の自然のままのアミノ酸のピリジルアラニンによる置換、および場合によって28および/または29位における陰性荷電アミノ酸（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）による置換、さらにまた場合によって当該ペプチドのカルボキシ末端への陰性荷電アミノ酸（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）の付加によって改変される。場合によってある実施態様では、本開示のピリジルアラニン置換アナログはさらにまた、29位の自然のままのアミノ酸の陽性荷電アミノ酸（例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン）による置換、および場合によって当該ぺプチドのカルボキシ末端への1つまたは2つの陽性荷電アミノ酸（例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン）の付加によって改変される。ある実施態様にしたがえば、改善された溶解性及び安定性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、配列番号:966のアミノ酸配列を有するが、ただし6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換されることを条件とする。さらに別の実施態様では、28または29は酸性アミノ酸で置換され、および/または追加の酸性アミノ酸が配列番号:966のカルボキシ末端に付加される。ある実施態様では、酸性アミノ酸は、Asp、Glu、システイン酸およびホモシステイン酸から成る群からそれぞれ別個に選択される。
【００９３】
ある実施態様にしたがえば、改善された溶解性及び安定性を有するグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アゴニストは配列番号:964のアミノ酸配列を含み、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、さらに場合によって27、28または29位のアミノ酸の少なくとも1つは自然のままではないアミノ酸残基で置換される（すなわち、当該アナログの27、28または29位に存在する少なくとも1つのアミノ酸は、配列番号:１の対応する位置に存在するアミノ酸とは異なる酸性アミノ酸である）。ある実施態様にしたがえば、配列番号:964を含むグルカゴンペプチドが提供され、前記は、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸がピリジルアラニンで置換され、28位のアミノ酸はアスパラギンであり、場合によって当該ペプチドはさらにまた1つから2つのアミノ酸を含み、前記はそれぞれ別個にLys、Arg、His、AspまたはGluから成る群から選択され、当該グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加される。
ある実施態様では、配列番号:964のグルカゴンペプチドが提供され、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、さらに当該アナログの5、7、11、12、14、17、18、19、21または24位から選択される1つから6つのアミノ酸は配列番号:１の対応するアミノ酸とは異なる。別の実施態様にしたがえば、配列番号:964のグルカゴンペプチドが提供され、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、さらに当該アナログの5、7、11、12、14、17、18、19、21または24位から選択される1つから3つのアミノ酸は配列番号:１の対応するアミノ酸とは異なる。別の実施態様では、配列番号:966のグルカゴンペプチドが提供され、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、さらに当該アナログの1、2、5、7、11、12、14、16、17、18、19、20、21または24位から選択される1つから2つのアミノ酸は配列番号:１の対応するアミノ酸とは異なり、さらにまた別の実施態様では、それら1つから2つの異なるアミノ酸は、自然のままの配列（配列番号:1）に存在するアミノ酸と比較して保存的アミノ酸置換を表す。ある実施態様では、配列番号:11または配列番号:13のグルカゴンペプチド誘導体が提供され、ここで、当該ペプチドは、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸がピリジルアラニンで置換され、場合によって当該グルカゴンペプチドはさらにまた、2、5、7、11、12、14、16、17、18、19、20、21、24、27または29位から選択される位置に1つ、2つまたは3つのアミノ酸置換を含むことによって配列番号:11または配列番号:13と異なる。ある実施態様では、2、5、7、11、12、14、16、17、18、19、20、27または29位の置換は保存的アミノ酸置換である。
【００９４】
ある実施態様では、配列番号:1のアナログを含むグルカゴンペプチドが提供され、ここで、当該アナログは、セリン以外の2位のアミノ酸、ピリジルアラニンで置換された6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸、および場合によって28または29位の自然のままのアミノ酸に代わり置換された酸性アミノ酸、または配列番号:1のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を有することによって配列番号:1と異なる。ある実施態様では、酸性アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。
ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドは、配列番号:9、配列番号:12、配列番号:13および配列番号:32から成る群から選択される配列と、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を有することによって相違する配列を含む。さらに別の実施態様では、配列番号:9、配列番号:12、配列番号:13および配列番号:32と以下によって相違する配列を含むグルカゴンペプチドが提供される：ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を有し、さらにまた1つまたは2つのアミノ酸を含み、前記は、配列番号:9、配列番号:12、配列番号:13および配列番号:32のC-末端に付加され、当該追加のアミノ酸はそれぞれ別個にLys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸またはホモシステイン酸から成る群から選択される。ある実施態様では、カルボキシ末端に付加される追加のアミノ酸は、Lys、Arg、His、AspまたはGluから成る群から選択されるか、或いはさらに別の実施態様では、追加のアミノ酸はAspまたはGluである。
【００９５】
本開示はまた、第二のペプチドがグルカゴンペプチドのC-末端に融合されて当該グルカゴンペプチドの安定性及び溶解性が強化されてあるグルカゴンペプチドを包含する。より具体的には、融合グルカゴンペプチドは、配列NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-X16-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-X27-X28-X29-R（配列番号:942）の誘導体を含むことができる。式中、X16はThrまたはAibであり、X27はMet、LeuまたはNleであり、X28はLys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸またはホモシステイン酸であり、X29はThr、Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸またはホモシステイン酸であり、さらに当該ペプチドは、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を有することによって配列番号:942と相違し、さらにRは、酸性アミノ酸、結合、または配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のアミノ酸配列であり、前記はグルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に連結される。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号:33、配列番号:7または配列番号:8から成る群から選択されるペプチドの誘導体であり、ここで、当該誘導体はさらにまた、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸、および当該グルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5および配列番号:6を含み、前記は、ピリジルアラニンまたはそのアナログで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸によって改変され、さらにまた、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のアミノ酸配列を含む。ある実施態様にしたがえば、融合ペプチドはさらにまたPEG鎖を含み、前記は、16、17、21、24、29位のアミノ酸、C-末端伸長内、またはC-末端アミノ酸に連結され、ここで、当該PEGは500から40,000ダルトンの範囲から選択される。ある実施態様では、配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（KRNR）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介して当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に結合される。
【００９６】
典型的には本発明の融合ペプチドは、標準的なカルボン酸基を有するC-末端アミノ酸を有するであろう。しかしながら、C-末端アミノ酸がカルボン酸の代わりに置換されたアミドを有する前記配列のアナログもまた実施態様として包含される。ある実施態様にしたがえば、融合グルカゴンペプチドは配列番号:10、配列番号:11および配列番号:13から成る群から選択される配列を含み、前記は、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸によって改変され、さらにまた当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:823（GPSSGAPPPS-CONH2）のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様にしたがえば、ペグ化グルカゴンペプチドは、当該グルカゴンペプチドに共有結合される2つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は約1,000から約5,000ダルトンである。ある実施態様では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号:6のペプチドを含み、前記はピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を有することによって改変され、ここで、PEG鎖は21位および24位のアミノ酸残基に共有結合的に連結され、2つのPEG鎖の一緒にした分子量は約1,000から約5,000ダルトン、または約5,000から約20,000ダルトンである。
ポリエチレングリコール鎖は直鎖形でもよく、或いは分枝していてもよい。ある実施態様にしたがえば、ポリエチレングリコール鎖は、約500から約40,000ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。ある実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は、約500から約5,000ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様では、ポリエチレングリコール鎖は約20,000から約40,000ダルトンの分子量を有する。
上記に記載するグルカゴンペプチドのいずれかはさらに改変されて、共有結合若しくは非共有結合分子内架橋またはアルファヘリックス安定化アミノ酸を当該グルカゴンペプチドのC-末端部分内（アミノ酸位12−29）に含むことができる。ある実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドは、16、20、21または24位（または前記の組合せ）におけるα,α二置換アミノ酸（例えばAib）によるアミノ酸置換に加えて、上記で考察した改変の任意の1つ以上を含む。別の実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドは、当該グルカゴンペプチドの16および20位のアミノ酸の側鎖間の分子内架橋（例えばラクタム）に加えて、上記に考察した任意の1つ以上の改変を含む。
【００９７】
いくつかの実施態様にしたがえば、グルカゴンペプチドは、下記構造I、IIまたはIIIの側鎖を含む3位のアミノ酸を含む：
2019520336.tif 000020
構造I
2019520336.tif 000021
構造II
2019520336.tif 000022
構造III
式中、R1はC0-3アルキルまたはC0-3ヘテロアルキルであり；R2はNHR4またはC1-3アルキルであり；R3はC1-3アルキルであり；R4はHまたはC1-3アルキルであり；XはNH、O、またはであり；YはNHR4、SR3、またはOR3である。いくつかの実施態様では、XはNHであるか、またはYはNHR4である。いくつかの実施態様では、R1はC0-2アルキルまたはC1ヘテロアルキルである。いくつかの実施態様では、R2はNHR4またはC1アルキルである。いくつかの実施態様では、R4はHまたはC1アルキルである。例示的な実施態様では、構造Iの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、R1はCH2-Sであり、XはNHであり、さらにR2はCH3（アセトアミドメチル-システイン、C(Acm)）であるか；R1はCH2であり、XはNHであり、さらにR2はCH3（アセチルジアミノブタン酸、Dab(Ac)）であるか；R1はC0アルキルであり、XはNHであり、R2はNHR4であり、さらにR4はH（カルバモイルジアミノプロパン酸、Dap(尿素)）であるか；またはR1はCH2-CH2であり、XはNHであり、さらにR2はCH3である（アセチルオルニチン、Orn(Ac)）。例示的な実施態様では、構造IIの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、R1はCH2であり、YはNHR4であり、さらにR4はCH3である（メチルグルタミン、Q(Me)）。例示的な実施態様では、構造IIIの側鎖を含むアミノ酸が提供され、ここで、R1はCH2であり、さらにR4はHである（メチオニン-スルホキシド、M(O)）。具体的な実施態様では、3位のアミノ酸はDab(Ac)で置換される。
【００９８】
具体的な特徴では、アナログは以下を含む（ただしこれらに限定されない）、本明細書に記載するアミノ酸改変のいずれかを含む：荷電アミノ酸による28位のAsnの置換；Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸およびホモシステイン酸から成る群から選択される荷電アミノ酸による28位のAsnの置換；Asn、AspまたはGluによる28位の置換；Aspによる28位の置換；Gluによる28位の置換；荷電アミノ酸による29位のThrの置換；Lys、Arg、His、Asp、Glu、システイン酸およびホモシステイン酸から成る群から選択される荷電アミノ酸による29位のThrの置換；Asp、GluまたはLysによる29位の置換；Gluによる29位の置換；29位の後ろへの1−3つの荷電アミノ酸の挿入；29位の後ろへのGluまたはLysの挿入；29位の後ろへのGly-LysまたはLys-Lysの挿入；および前記の組合せ；16、20、21および24位の1つ、2つ、3つまたは全てにα,α二置換アミノ酸（例えばAib）。
ある種の特徴では、配列番号:1のグルカゴンペプチドのアナログは以下の1つ以上を含む：ピリジルアラニンで置換される、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸；1位のHisの自然のままでないアミノ酸による置換（前記自然のままでないアミノ酸はジペプチジルペプチダーゼIV（例えばDPP-IV）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低下させる）；2位のSerの自然のままでないアミノ酸による置換（前記自然のままでないアミノ酸はジペプチジルペプチダーゼIV（例えばDPP-IV）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低下させる）；7位のThrのヒドロキシル基を欠くアミノ酸（例えばAbuまたはIle）による置換；10位のTyrのPheまたはValによる置換；12位のLysのArgによる置換；15位のAspのGluによる置換；16位のSerのThrまたはAibによる置換；20位のGlnのAlaまたはAibによる置換；21位のAspのGluによる置換；24位のGlnのAlaまたはAibによる置換；27位のMetのLeuまたはNleによる置換；27−29位のアミノ酸の欠失；28−29位のアミノ酸の欠失；29位のアミノ酸の欠失；配列番号:820のアミノ酸配列のC-末端への付加（ここで29位のアミノ酸はThrまたはGly）；または前記の組合せ。
ある種の実施態様では、配列番号:1を含むグルカゴンペプチドのアナログは、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を含み、アミノ酸は、アシル基またはアルキル基に場合によってリンカーを介して共有結合的に接着される側鎖を含み、当該アシル基またはアルキル基は自然に出現するアミノ酸と対比して自然のままではない。アシル基は、いくつかの実施態様ではC4からC30脂肪アシル基である。他の実施態様では、アルキル基はC4からC30アルキルである。具体的な特徴では、アシル基またはアルキル基は、10位のアミノ酸の側鎖に共有結合的に接着される。いくつかの実施態様では、7位のアミノ酸はIleまたはAbuである。
【００９９】
使用
本明細書に開示するグルカゴンペプチドは、強化された生物物理的安定性及び生理学的pHの溶液中での水溶性を有し、一方、自然のままのペプチドと比較して強化された生物活性を保持又は提示する。したがって、本発明のグルカゴンペプチドは、自然のままのグルカゴンペプチドについて以前に記載されたいずれかの使用のために適切であると考えられる。したがって、本明細書に記載する改変グルカゴンペプチドを用いて、低血糖を治療し、血糖レベルを高め、放射線学的使用のために一過性の腸管麻痺を誘発し、（インスリンとの補助療法として）体重を減少及び維持し、または低いグルカゴン血中レベルから生じる他の代謝疾患を治療することができる。
本明細書に記載するグルカゴンペプチドはまた、体重の減少若しくは維持、または高血糖の治療、または血糖レベルの低下、または血糖レベルの正常化、および/または血糖レベルの安定化のために用い得ることが期待される。血中レベルの“正常化”は、血糖レベルが正常に戻ることを意味する（例えば、血糖レベルが正常より高い場合に当該レベルを低下させ、低い場合に血糖レベルを上昇させる）。血糖レベルの“安定化”は、時間経過の間（例えば8時間、16時間、24時間、2日、3日、4日、5日、6日、または1週間）の血糖レベルの最大変動の縮小を意味する。例えば、グルカゴンペプチドの投与は、時間経過中の血糖レベルを、グルカゴンペプチドの投与がないときのグルコース値よりも正常グルコース値の範囲により近く維持する。
【０１００】
本発明のグルカゴンペプチドは、単独でまたは他の抗糖尿病薬剤または抗肥満薬剤と組合わせて投与できる。当業界で公知のまたは吟味中の抗糖尿病薬剤には以下が含まれる：インスリン、スルホニルウレア（例えばトルブタミド（オリナーゼ）、アセトヘキサミド（ダイメラー）、トラザミド（トリナーゼ)、クロルプロパミド（ダイアビニーズ）、グリピジド（グルコトロール）、グリブリド（ダイアベータ、ミクロナーゼ、グリナーゼ）、グリメピリド（アマリル）、またはグリクラジド（ダイアミクロン）；メグリチニド（例えばレパグリニド（プラジン）またはナテグリニド（スターリクス）；ビグアニド（例えばメトフォルミン（グルコファージ）またはフェンフォルミン；チアゾリジンジオン（例えばロシグリタゾン（アバンジア）、ピオグリタゾン（アクトス）、またはトログリタゾン（レズリン）、または他のPPARγ阻害剤；炭水化物消化を阻害するアルファグルコシダーゼ阻害剤（例えばミグリトール（グリセト）、アカルボース（プレコース/グルコベイ）；エクセナチド（バイエッタ）またはプラムリンチド；ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤（例えばビルダグリプチンまたはシタグリプチン）；SGLT（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター1）阻害剤；グルコキナーゼアクチベーター（GKA）；グルカゴン受容体アンタゴニスト（GRA）；またはFBPase（フルクトース1,6-ビスホスファターゼ）阻害剤。
当業界で公知のまたは吟味中の抗肥満薬剤は食欲抑制剤を含む。前記には以下が含まれる：フェネチルアミン型刺激剤、フェンテルミン（場合によってフェンフルラミンまたはデクスフェンフルラミンと一緒に）、ジエチルプロピオン（Tenuate(商標)）、フェンジメトラジン（Prelu-2(商標)、Bontril(商標)）、ベンズフェタミン（Didrex(商標)）、シブトラミン（Meridia(商標)、Reductil(商標)）、リモナバント（Acomplia(商標)）、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモデュリン；フルオキセチンヒドロクロリド（プロザク）；キネクサ（トピラメートおよびフェンテルミン）、エクスカリア（ブプロピオンおよびゾニサミド）またはコントレーブ（ブプロピオンおよびナルトレキソン）；またはリパーゼ阻害剤、キセニカル（オルリスタット）もしくはセチリスタット（ATL-962としても知られている）に類似、またはGT 389-255。
【０１０１】
本開示のある特徴は、低血糖治療で使用される、目下開示中のグルカゴンペプチドの事前処方水溶液に向けられる。本明細書に記載するグルカゴンペプチド組成物の改善された安定性および/または溶解性は、迅速投与および低血糖治療のためにグルカゴンの事前処方水溶液の調製を可能にする。したがって、ある実施態様では、本発明のグルカゴンペプチドを含む溶液が低血糖罹患患者への投与のために提供される。ある実施態様では、本明細書に開示するペグ化グルカゴンペプチドを含む溶液が低血糖罹患患者への投与のために提供され、ここで、ペグ化グルカゴンペプチドに連結されるPEG鎖の総分子量は約500から約5,000ダルトンである。
本発明に一致する治療方法（低血糖の治療を含むが、ただしこれに限定されない）は、任意の標準的投与経路を用いて目下開示中のグルカゴンペプチドを患者に投与する工程を含むことができる。当該投与経路には、非経口的（例えば静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内、髄腔内、経皮、直腸）、経口的、経鼻、または吸入が含まれる。ある実施態様では、組成物は皮下または筋肉内に投与される。ある実施態様では、組成物は非経口的に投与され、グルカゴン組成物は注射器に予めパッケージされる。
別の実施態様では、組成物は吸入器または他のエーロゾル化薬剤デリバリー装置に予めパッケージされる。有利には、本明細書に開示する水性状態で安定なグルカゴンペプチドは、薬理学的目的のために使用される最も広いpH範囲の水性緩衝液で、自然のままのグルカゴンと比較して優れた安定性及び溶解性を示す。本明細書に開示する安定化されたグルカゴンペプチドの使用は、生理学的pHのグルカゴン溶液の長期間の調製および保存を可能にする。
【０１０２】
改変されてPEG鎖（10,000ダルトンを超える分子量を有する）に共有結合されてあるグルカゴンペプチドをインスリンと一緒に投与して、インスリンの作用を減じ、さらに糖尿病患者で安定な血糖レベルの維持を助けることができる。本開示の改変されたグルカゴンペプチドは、単一組成物としてインスリンと共同投与するか、別々の溶液として同時に投与でき、また別には、インスリンおよび改変グルカゴンペプチドは互いに対して異なる時期に投与することもできる。ある実施態様では、インスリンを含む組成物および改変グルカゴンペプチドを含む組成物は互いに12時間以内に投与される。投与されるインスリンに対する改変グルカゴンペプチドの正確な比率は、部分的には患者のグルカゴンレベルの決定に左右され、前記は日常的な実験を介して決定できる。
ある実施態様にしたがえば、インスリンおよび改変グルカゴンペプチド（配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5およびそのグルカゴンアゴニストアナログから成る群から選択される）を含む組成物が提供され、ここで、当該改変グルカゴンペプチドはさらにまた、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸、および場合によって、16、17、24、29位、C-末端伸長内、またはC-末端アミノ酸のアミノ酸側鎖に共有結合されるポリエチレングリコール鎖を含む。ある実施態様では、組成物はインスリンおよびグルカゴンペプチドを含む水溶液である。グルカゴンペプチドが配列番号:11または配列番号:13の配列を含む実施態様では、当該ペプチドはさらにまた、16、17、24、29位、C-末端伸長内、またはC-末端アミノ酸のアミノ酸側鎖に共有結合されるポリエチレングリコール鎖を含むことができる。ある実施態様では、改変グルカゴンペプチドのPEG鎖の分子量は10,000ダルトンを超える。
【０１０３】
ある実施態様にしたがえば、本明細書に開示する改変グルカゴンペプチドを用いて、腸管の一過性麻痺を誘発することができる。この方法は放射線学的目的のために有用であり、前記方法は、ペグ化グルカゴンペプチドを含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含み、前記ペグ化グルカゴンペプチドはC-末端伸長またはそのようなペプチドのダイマーを含む。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12および配列番号:13から成る群から選択される配列を含み、ここで、当該ペプチドは改変されて、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を含む。ある実施態様では、グルカゴンペプチドはさらにまた約1,000から40,000ダルトンのPEG鎖を含み、21、24または29位、C-末端伸長内、またはC-末端アミノ酸のアミノ酸残基に共有結合される。
さらに別の実施態様では、腸管の一過性麻痺を誘発するために用いられる組成物は、第一の改変グルカゴンペプチドおよび第二の改変グルカゴンペプチドを含み、ここで、第一の改変グルカゴンペプチドは配列番号:10、配列番号:11および配列番号:13から成る群から選択される配列を含み、前記配列は場合によって約500から約5,000ダルトンのPEG鎖に連結され、さらに第二のペプチドは共有結合的に連結される約10,000から約40,000ダルトンのPEG鎖を含む。この実施態様では、各ペプチドのPEG鎖は、対応するペプチドおよびそれぞれから独立したペプチドの21、24または29位、C-末端伸長内、またはC-末端アミノ酸のアミノ酸残基に共有結合される。
【０１０４】
オキシントモデュリン（小腸で見いだされる天然に出現する消化ホルモン）は、ラットまたは人間に投与されるとき体重減少を引き起こすことが報告された（Diabetes 2005;54:2390-2395）。オキシントモデュリンは37アミノ酸ペプチドであり、前記は、グルカゴンの29アミノ酸配列（すなわち配列番号:1）とその後に続く配列番号:821の8アミノ酸カルボキシ末端伸長（KRNRNNIA）を含む。したがって、出願人らは、オキシントモデュリンのグルカゴンペプチド部分を本明細書に開示する改変グルカゴンペプチドで置換することによって、オキシントモデュリンの生物活性（すなわち食欲抑制および体重減少/体重維持）を保持し、一方、当該化合物の溶解性及び安定性を改善しさらに薬物動態を改善できると考える。加えて、出願人らはまた、本発明のグルカゴンペプチドを含む切端オキシントモデュリン分子（オキシントモデュリンの末端4アミノ酸が除去される）は食欲抑制および体重減少/体重維持の誘発でもまた有効であろうと考える。
したがって、本発明はまた、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822のカルボキシ末端伸長を有する本発明の改変グルカゴンペプチドを包含する。ある実施態様にしたがえば、配列番号:33のグルカゴンペプチドが個体に投与されて体重減少を誘発しまたは体重増加を防止する（前記配列番号:33のグルカゴンペプチドは改変されて、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位に少なくとも1つのアミノ酸を有し、さらにまた当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822のアミノ酸配列を含む）。ある実施態様にしたがえば、配列番号:11または配列番号:13のグルカゴンペプチドが個体に投与されて体重減少を誘発しまたは体重増加を防止する（前記配列番号:11または配列番号:13のグルカゴンペプチドは改変されて、ピリジルアラニンで置換される6、10または13位に少なくとも1つのアミノ酸を有し、さらにまた当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822のアミノ酸配列を含む）。別の実施態様では、個体で体重増加を低下させまたは体重減少を誘発する方法は、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4または配列番号:5から成る群から選択されるグルカゴンペプチドを含む組成物の有効量を投与する工程を含み、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29はペプチド結合を介して第二のペプチドに結合され、前記第二のペプチドは配列番号:824（KRNRNNIA）または配列番号:825を含み、ここで、約1,000から40,000ダルトンのPEG鎖が21および/または24いのアミノ酸残基に共有結合される。
【０１０５】
エクセンジン-4は39アミノ酸で構成されるペプチドである。前記はGLP-1として知られる受容体の強力な刺激物質である。このペプチドはまた、食欲を抑制しさらに体重減少を誘発すると報告されている。出願人らは、グルカゴンのカルボキシ末端に付加されるとき、エクセンジン-4はグルカゴンの溶解性および安定性を改善し、グルカゴンの生物活性は損なわないことを見出した。ある実施態様では、エクセンジン-4の末端の10アミノ酸（すなわち配列番号:820（GPSSGAPPPS）の配列）が、本開示のグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に連結される。具体的な特徴では、配列番号:820の配列（改変されてピリジルアラニンで置換された6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸を含む）は、グルカゴンペプチドのC-末端に連結され、29位のアミノ酸はThrまたはGlyである。これらの融合タンパク質は、食欲抑制および体重減少/体重維持のための薬理学的活性を有すると予想される。ある実施態様では、配列番号:820伸長部の末端アミノ酸はカルボキシ基の代わりにアミド基（すなわち配列番号:823）を含み、この配列は本開示のグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に連結される。
ある実施態様では、個体で体重増加を低下させまたは体重減少を誘発する方法は、配列番号:33のグルカゴンペプチドを含む組成物の有効量を投与する工程を含み、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29はペプチド結合を介して第二のペプチドに結合され、前記第二のペプチドは配列番号:820（GPSSGAPPPS）または配列番号:823を含む。ある実施態様では、グルカゴンペプチドは、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12および配列番号:13から成る群から選択され、ここで、6、10または13位の少なくとも1つのアミノ酸はピリジルアラニンで置換され、さらに場合によって当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29はペプチド結合を介して第二のペプチドに結合され、前記第二のペプチドは配列番号:820の配列（GPSSGAPPPS）または配列番号:823を含む。
別の実施態様では、医薬組成物の投与によって食欲を抑制し、体重増加を防ぎ、および/または体重減少を誘発するために、組成物が患者に投与される。前記組成物は、第一のペグ化グルカゴンペプチドおよび第二のペグ化グルカゴンペプチドを含み、ここで、第一および第二のペプチドは融合ペプチドであり、配列番号:820（GPSSGAPPPS）または配列番号:823を含むC-末端ペプチド伸長を含む。第一のペグ化グリコゲンペプチドは共有結合的に連結される約500から約10,000ダルトンのPEGを含み、第二のペグ化グルカゴンペプチドは共有結合的に連結される約10,000から約40,000ダルトンのPEG鎖を含む。
【０１０６】
本開示はまた、本明細書に開示する改変グルカゴンペプチドのマルチマーを包含する。標準的な連結剤および当業者に公知の手順を用いて、改変グルカゴンペプチドの2つ以上を一緒に連結することができる。例えば、ダイマーは、二官能性チオール架橋剤および二官能性アミン架橋剤の使用を介して（特にシスチン、リジン、オルニチン、ホモシステインまたはアセチルフェニルアラニン残基で置換されたグルカゴンペプチド（例えば配列番号:4および配列番号:5）用）、2つの改変グルカゴンペプチド間で形成され得る。ダイマーはホモダイマーであることができ、また別にはヘテロダイマーでもよい。ある実施態様では、ダイマーはあるグルカゴンペプチドのホモダイマーを含み、ここで、当該グルカゴンペプチド部分は、配列番号:11のアゴニストアナログおよび当該グルカゴンペプチドのアミノ酸29に連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）または配列番号:822（(KRNR）のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、ダイマーは配列番号:11のグルカゴンペプチドのホモダイマーを含み、ここで、当該グルカゴンペプチドはさらにまた、当該グルカゴンペプチドの21、24、29位、C-末端伸長内、またはC-末端アミノ酸に共有結合されるポリエチレングリコール鎖を含む。
【０１０７】
ある実施態様にしたがえば、医薬組成物が提供され、当該組成物は、本開示のグルカゴンペプチド、または医薬的に許容できるその塩、および医薬的に許容できる担体を含む。医薬組成物は、例えば以下を含む任意の医薬的に許容できる成分を含むことができる：酸性化剤、添加物、吸着剤、エーロゾル噴射剤、空気置換剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌性保存料、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、感染防止剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、保湿剤、乳化剤、軟化剤、乳化剤、エマルジョン安定化剤、充填剤、フィルム形成剤、フレーバー強化剤、流動強化剤、ゲル化剤、顆粒化剤、保湿剤、滑沢剤、粘膜接着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ベヒクル、有機基剤、トローチ基剤、色素、可塑剤、艶だし剤、保存料、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、座薬基剤、表面活性剤、界面活性剤、分散剤、甘味剤、治療薬、膨張剤、等張化剤、毒性物質、粘性増加剤、水分吸収剤、水混和性共溶媒、水軟化剤、または湿潤剤。
本明細書に開示する医薬処方物は、下記に記載するように、短時間作用性、迅速放出、長時間作用性又は持続放出であるように設計できる。医薬処方物はまた、即時放出、制御放出または緩慢放出のために処方することができる。本組成物はさらにまた、例えばミセル若しくはリポソームまたはいくつかの他の被包化形を含むことができ、或いは延長放出形で投与して長期貯蔵および/またはデリバリー効果を提供できる。開示の医薬処方物を任意のレジメンにしたがって、例えば、毎日（1日に1回、1日に2回、1日に3回、1日に4回、1日に5回、1日に6回）、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎、毎週、2週毎、3週毎、毎月、または2か月毎に投与できる。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、前述の成分は、医薬組成物中に任意の濃度で、例えば少なくともAで存在できる。ここで、Aは0.0001％w/v、0.001％w/v、0.01％w/v、0.1％w/v、1％w/v、2％w/v、5％w/v、10％w/v、20％w/v、30％w/v、40％w/v、50％w/v、60％w/v、70％w/v、80％w/v、または90％w/vである。いくつかの実施態様では、前述の成分は、医薬組成物中に任意の濃度で、例えば多くてもBで存在できる。ここで、Bは90％w/v、80％w/v、70％w/v、60％w/v、50％w/v、40％w/v、30％w/v、20％w/v、10％w/v、5％w/v、2％w/v、1％w/v、0.1％w/v、0.001％w/v、または0.0001％w/vである。他の実施態様では、前述の成分は、医薬組成物中に任意の濃度範囲で、例えば約Aから約Bで存在できる。いくつかの実施態様では、Aは0.0001％w/vでBは90％w/vである。
医薬組成物は生理学的に適合するpHを達成するように処方できる。いくつかの実施態様では、医薬組成物のpHは、少なくとも5、少なくとも5.5、少なくとも6、少なくとも6.5、少なくとも7、少なくとも7.5、少なくとも8、少なくとも8.5、少なくとも9、少なくとも9.5、少なくとも10、少なくとも10.5までであることができ、さらに処方物および投与経路に応じてpH11を含む。ある種の実施態様では、医薬組成物は1つ以上の緩衝剤を含み、生理学的に適合するpHを達成することができる。緩衝剤には、所望のpHで緩衝することができる任意の化合物（例えばリン酸緩衝液（例えばPBS）、トリエタノールアミン、トリス、ビシン、TAPS、トリシン、HEPES、TES、MOPS、PIPES、カコジレート、MES、および他のもの）が含まれ得る。ある種の実施態様では、緩衝液の強度は、少なくとも0.5mM、少なくとも1mM、少なくとも5mM、少なくとも10mM、少なくとも20mM、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも120mM、少なくとも150mM、または少なくとも200mMである。いくつかの実施態様では、緩衝液の強度は300mMを超えない（例えば、多くて200mM、多くて100mM、多くて90mM、多くて80mM、多くて70mM、多くて60mM、多くて50mM、多くて40mM、多くて30mM、多くて20mM、多くて10mM、多くて5mM、多くて1mM）。
【０１０９】
ある実施態様では、医薬組成物は、1mg/mL濃度のグルカゴンペプチドおよび10−50mMのトリエタノールアミン（pH7.0−8.5、または6−9．または7−9）を含む。ある実施態様では、医薬組成物は、1mg/mL濃度のグルカゴンペプチドおよび20mMのトリエタノールアミン（pH7.0−8.5）を含む。
本発明の改変グルカゴンペプチドは、ある実施態様にしたがってキットの部分として提供され得る。ある実施態様では、その必要がある患者にグルカゴンペプチドを投与するためのキットが提供され、当該キットは溶液中に本発明のグルカゴンペプチドのいずれかを含む。ある実施態様では、キットは、患者にグルカゴン組成物を投与するための装置、例えば注射針、ペン装置、ジェットインジェクターまたは他の無針インジェクターとともに提供される。キットは、また別に或いはさらに加えて、1つ以上の多様な容器を含むことができ、前記は、例えばバイアル、チューブ、ビン、一チャンバー若しくはマルチチャンバー付きの予め充填された注射器、カートリッジ、輸液ポンプ（外部ポンプ又は埋め込み可能ポンプ）、ジェットインジェクター、予め充填されたペン装置などであり、場合によって凍結乾燥形または水溶液のグルカゴンペプチドを含む。好ましくは、キットはまた使用のための指示を含むであろう。ある実施態様にしたがえば、キットの装置はエーロゾル調剤装置であり、ここで、組成物はエーロゾル装置内に予めパッケージされる。別の実施態様では、キットは注射器および針を含み、ある実施態様では、無菌的グルカゴン組成物が注射器内に予めパッケージされる。
本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えDNA技術、またはペプチドおよび融合タンパク質の任意の他の調製方法によって調製できる。ある種の非天然アミノ酸は標準的な組換えDNA技術によって発現させることはできないが、それらの調製技術は当業界で公知である。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物は、適用可能な時には標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によって合成できる。
【０１１０】
例示的実施態様
実施態様1:
溶解性が強化されたグルカゴンペプチド、前記ペプチドは、HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNT（配列番号:1）のアミノ酸配列を含み、ここで、6、10または13位の1つ、2つまたは3つはピリジルアラニンまたはヒスチジンで置換されてあり、場合によって10までのさらに別のアミノ酸改変を含む。
実施態様2：
6、10または13位の1つ、2つまたは3つがピリジルアラニンで置換されてある、実施態様1に記載のペプチド。
実施態様3：
6、10または13位の2つまたは3つがピリジルアラニンで置換されてある、実施態様1−2のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様4：
6、10および13位がピリジルアラニンで置換されてある、実施態様1−3のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様5：
当該ペプチドが9つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から4のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様6：
当該ペプチドが8つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から5のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様7：
当該ペプチドが7つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から6のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様8：
当該ペプチドが6つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から7のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様9：
当該ペプチドが5つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から8のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様10：
当該ペプチドが4つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から9のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様11：
当該ペプチドが3つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から10のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様12：
当該ペプチドが2つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から11のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様13：
当該ペプチドが1つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様1から12のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様14：
当該ペプチドが20位にd-Glnを含む、実施態様1から13のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様15：
当該ペプチドが21位にd-Aspを含む、実施態様1から14のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様16：
当該ペプチドが28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様1−12、14−15のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様17：
当該ペプチドが6位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から16のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様18：
当該ペプチドが10位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から17のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様19：
当該ペプチドが13位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から18のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様20：
当該ペプチドが6および10位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から19のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様21：
当該ペプチドが6および13位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から20のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様22：
当該ペプチドが10および13位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から21のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様23：
当該ペプチドが6、10および13位にピリジルアラニンまたはヒスチジンを含む、実施態様1から22のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様24：
当該ペプチドが6位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から23のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様25：
当該ペプチドが10位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から24のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様26：
当該ペプチドが13位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から25のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様27：
当該ペプチドが6および10位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から26のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様28：
当該ペプチドが6および13位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から27のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様29：
当該ペプチドが10および13位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から28のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様30：
当該ペプチドが6、10および13位にピリジルアラニンを含む、実施態様1から29のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様31：
当該ピリジルアラニンが、3-(3-ピリジル)-L-アラニンおよび3-(4-ピリジル)-L-アラニンから成る群から選択される、実施態様1から30のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様32：
当該ピリジルアラニンが3-(3-ピリジル)-L-アラニンである、実施態様1から31のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様33：
当該ピリジルアラニンが3-(4-ピリジル)-L-アラニンである、実施態様1−31のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様34：
当該ペプチドが6位にAibを含む、実施態様1から33のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様35：
配列HSQGT X6TSDX10 SKX13LD X16RRAQ DFVQW LMNT（配列番号:982）を含む、実施態様1から34のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6は3-(3-ピリジル)-L-アラニン、3-(4-ピリジル)-L-アラニン、およびPheから成る群から選択され；
X10は3-(3-ピリジル)-L-アラニン、3-(4-ピリジル)-L-アラニン、およびTyrから成る群から選択され；
X13は3-(3-ピリジル)-L-アラニン、3-(4-ピリジル)-L-アラニン、およびTyrから成る群から選択され；
X16はAibであり；
場合によって5つまでのさらに別のアミノ酸改変を含むが、ただし
X6、X10またはX13の少なくとも1つが3-(3-ピリジル)-L-アラニンまたは3-(4-ピリジル)-L-アラニンであることを条件とする。
実施態様36：
4つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様35に記載のペプチド。
実施態様37：
3つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様35−36のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様38：
2つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様35−37のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様39：
1つまでのさらに別のアミノ酸改変を含む、実施態様35−38のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様40：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり;
X10はTyrであり；
X13はTyrであり；さらに
X16はAibである。
実施態様41：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様40に記載のペプチド。
実施態様42：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様40に記載のペプチド。
実施態様43：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様40に記載のペプチド。
実施態様44：
配列番号:944の配列を含む、実施態様40に記載のペプチド。
実施態様45：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6はPheであり；
X10は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13はTyrであり；さらに
X16はAibである。
実施態様46：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様45に記載のペプチド。
実施態様47：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様45に記載のペプチド。
実施態様48：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様45に記載のペプチド。
実施態様49：
配列番号:945の配列を含む、実施態様45に記載のペプチド。
実施態様50：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6はPheであり；
X10はTyrであり；
X13は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；さらに
X16はAibである。
実施態様51：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様50に記載のペプチド。
実施態様52：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様50に記載のペプチド。
実施態様53：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様50に記載のペプチド。
実施態様54：
配列番号:946の配列を含む、実施態様50に記載のペプチド。
実施態様55：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6はPheであり；
X10はTyrであり；
X13は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；さらに
X16はAibである。
実施態様56：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様55に記載のペプチド。
実施態様57：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様55に記載のペプチド。
実施態様58：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様55に記載のペプチド。
実施態様59：
配列番号:947の配列を含む、実施態様55に記載のペプチド。
実施態様60：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6はPheであり；
X10は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；さらに
X16はAibである。
実施態様61：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様60に記載のペプチド。
実施態様62：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様60に記載のペプチド。
実施態様63：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様60に記載のペプチド。
実施態様64：
配列番号:948の配列を含む、実施態様60に記載のペプチド。
実施態様65：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6はPheであり；
X10は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；さらに
X16はAibである。
実施態様66：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様65に記載のペプチド。
実施態様67：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様65に記載のペプチド。
実施態様68：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様65に記載のペプチド。
実施態様69：
配列番号:949の配列を含む、実施態様65に記載のペプチド。
実施態様70：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；
X10は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13は3-(3-ピリジル)-L-アラニンであり；さらに
X16はAibである。
実施態様71：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様70に記載のペプチド。
実施態様72：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様70に記載のペプチド。
実施態様73：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様70に記載のペプチド。
実施態様74：
配列番号:950の配列を含む、実施態様70に記載のペプチド。
実施態様75：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X10は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；さらに
X16はAibである。
実施態様76：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様75に記載のペプチド。
実施態様77：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様75に記載のペプチド。
実施態様78：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様75に記載のペプチド。
実施態様79：
配列番号:951の配列を含む、実施態様75に記載のペプチド。
実施態様80：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X10はTyrであり；
X13はTyrであり；さらに
X16はAibである。
実施態様81：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様80に記載のペプチド。
実施態様82：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様80に記載のペプチド。
実施態様83：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様80に記載のペプチド。
実施態様84：
実施態様35−39のいずれか1つに記載のペプチド、
式中、
X6はPheであり；
X10は3-(4-ピリジル)-L-アラニンであり；
X13はTyrであり；さらに
X16はAibである。
実施態様85：
さらにまた20位にd-Glnを含む、実施態様84に記載のペプチド。
実施態様86：
さらにまた21位にd-Aspを含む、実施態様84に記載のペプチド。
実施態様87：
さらにまた28位にAspおよび29位にGluを含む、実施態様84に記載のペプチド。
実施態様88：
当該ペプチドがさらにまた、29位のアミノ酸にペプチド結合を介して連結される配列番号:820（GPSSGAPPPS）、配列番号:821（KRNRNNIA）、または配列番号:822（KRNR）のC-末端伸長を含む、実施態様1から87のいずれかに記載のペプチド。
実施態様89：
当該ペプチドが親水性部分に共有結合的に連結される、実施態様1から88のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様90：
当該親水性部分がポリエチレングリコール（PEG）である、実施態様89に記載のペプチド。
実施態様91：当該ペプチドがアシルまたはアルキル基に共有結合的に連結される、実施態様1から90のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様92：
当該アシル基またはアルキル基がアミノ酸の側鎖にスペーサーを介して接着される、実施態様91に記載のペプチド。
実施態様93：
当該アシル基またはアルキル基が、当該アシルまたはアルキル基の遊離末端にカルボキシレートを含む、実施態様91−92のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様94：
医薬として使用される、実施態様1から93のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様95：
低血糖治療で使用される、実施態様1から94のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様96：
当該ペプチドがインスリンと共同投与される、実施態様1から95のいずれか1つに記載のペプチド。
実施態様97：
実施態様1から96のいずれか1つに記載のペプチドおよび医薬的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物。
【実施例１】
【０１１１】
一般的合成プロトコル：
グルカゴンアナログは、改変したアプライドバイオシステム（Applied Biosystem）430Aペプチド合成装置で0.2ミリモルのBoc Thr(OBzl)Pam樹脂から開始しHBTU活性化“Fast Boc”単一カップリングを用いて合成された。Bocアミノ酸およびHBUTはミッドウェストバイオテク（Midwest Biotech, Fishers, IN）から入手した。用いられた側鎖保護基は以下であった：Arg(Tos)、Asn(Xan)、Asp(OcHex)、Cys(pMeBzl)、His(Bom)、Lys(2Cl-Z)、Ser(OBzl)、Thr(OBzl)、Tyr(2Br-Z)、およびTrp(CHO)。N-末端Hisの側鎖保護基はBocであった。
完成したペプチジル樹脂の各々をジメチルホルムアミド中の20％ピペルジン溶液で処理し、トリプトファンからホルミル基を除去した。p-クレゾールおよびジメチルスルフィドの存在下で、液体フッ化水素切断を実施した。切断はHF装置（Penninsula Labs）を用いて氷浴中で1時間実施した。HFの蒸発後に、樹脂をジエチルエーテル中に懸濁し、固体物質をろ過した。各ペプチドを30−70mLの酢酸水で抽出し、希釈したアリコットをHPLCで分析した[ベックマン系ゴールド、0.46ｘ5cm ゾルバックスC8（Zorbax C8）、1mL/分、45C、214nm、A緩衝液＝0.1％TFA、B＝0.1％TFA/90％アセトニトリル、10分かけて10％から80％のグラディエント]。
精製は2.2ｘ25cm クロマシル（Kromasil）C18カラムでのFPLCで実施し、その間214nmでUVをモニターし5分分画を収集した。均質な分画を一緒にして凍結乾燥し、＞95％の生成物純度を得た。厳密な分子量および純度をMALDI-質量スペクトル分析を用いて確認した。
一般的ペグ化プロトコル：（Cys-マレイミド）
典型的には、グルカゴンCysアナログをリン酸緩衝食塩水（5−10mg/mL）に溶解し、0.01Mのエチレンジアミン四酢酸を添加する（総体積の10−15％）。過剰な（2倍）マレイミドメトキシPEG（Nektar）を添加し、室温で反応物を攪拌し、その間HPLCで反応の進行をモニターする。8−24時間後、反応混合物を酸性化し、調製用逆相カラムにローディングし0.1％TFA/アセトニトリルグラディエントを用いて精製する。適切な分画を一緒にし、凍結乾燥して所望のペグ化アナログを得た。
【実施例２】
【０１１２】
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体に対するペプチドの親和性は、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競合結合アッセイで測定した。シンチレーション近接アッセイ緩衝液（0.05Mトリス-HCl（pH7.5）、0.15M NaCl、0.1％w/vウシ血清アルブミン）で作成した当該ペプチドの連続3倍希釈を、0.05nM（3-[125I]-ヨードチロシル）Tyr10グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）（1−6マイクログラム/ウェル）、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現する細胞から調製した形質膜、および1mg/ウェルのポリエチレンイミン処理コムギ胚芽アグルチニンタイプAシンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）とともに96ウェルの白色/透明底プレート（Corning Inc., Acton, MA）中で混合した。ロータリーシェーカー上で5分間800pmで振盪し、当該プレートを室温で12時間インキュベートし、続いてMicroBeta1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取った。非特異的結合（NSB）放射能活性は、試験サンプルの最高濃度より4倍高濃度の“コールド”の自然のままのリガンドを用いたウェルで測定し、総結合放射能活性は競合物質を含まないウェルで検出した。パーセント特異的結合は以下のように計算した：％特異的結合＝((結合−NSB)/(総結合−NSB))ｘ100。IC50値は、オリジン（Origin）ソフトウエア（OriginLab, Northampton, MA）を用いて決定した。
【実施例３】
【０１１３】
機能性アッセイ−cAPM合成
cANPを誘発するグルカゴンアナログの能力をホタルルシフェラーゼ系（luciferase-based）レポーターアッセイで測定した。グルカゴンまたはGLP-1受容体のどちらか及びcAMP応答エレメント連結ルシフェラーゼ遺伝子を共同トランスフェクトしたHEK293細胞を、0.25％のウシグロースシーラム（Bovine Growth Serum, HyClone, Logan, UT）補充DMEM（Invitrogen, Carlsbad, CA）で16時間培養することによって血清枯渇させ、続いてグルカゴン、GLP-1または新規なグルカゴンアナログの連続希釈と一緒に、96ウェルのポリ-D-L-リジン被覆“バイオコート（Biocoat）”プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）で、37℃、5時間、5％CO2でインキュベートした。インキュベーション終了時に、100マイクロリットルのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウェルに添加した。プレートを簡単に振盪し、暗所で10分インキュベートし、光の生成量をMicroBeta1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。ルミネセンス光の生成量はルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性化を示し、前記は引き続いて受容体の活性化の尺度である。50％有効濃度（“EC50”）は、オリジンソフトウエア（OriginLab, Northampton, MA）を用いることによって計算した。EC50は、該当受容体におけるペプチドの最大活性化応答の50％を生じるペプチド濃度である。相対的に低いEC50は、ペプチドが該当受容体で相対的に強力であることを示し、一方、高いEC50はペプチドの能力が低いことを示す。
【実施例４】
【０１１４】
グルカゴンラクタムの合成
285mg（0.2mmole）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Midwest Biotech）を60mLの反応容器に添加し、さらにBoc DEPBT活性化単一カップリングを用い改変アプライドバイオシステム430Aペプチド合成装置で以下の配列を組み立てた。
以下の側鎖保護基を用いた：Arg(Tos)、Asp(OcHx)、Asn(Xan)、Glu(OFm)、His(BOM)、Lys(Fmoc)、Ser(Bzl)、Thr(Bzl)、Trp(CHO)、Tyr(Br-Z)。例として、Lys(Cl-Z)を用い、ラクタムが16−20、20−24、または24−28から構築される場合は12位の自然のままのLysを保護した。完成したペプチジル樹脂を20％ピペリジン/ジメチルホルムアミドで1時間回転させながら処理し、Trpホルミル基をFmocおよびOFｍ保護と同様にLys12およびGlu16から除去した。陽性ニンヒドリン試験によって除去を確認したとき、当該樹脂をジメチルホルムアミドで、続いてジクロロメタンで、再び再度ジメチルホルムアミドで洗浄した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジイソプロピルエチルアミン（DIEA）中で520mg（1mmole）のベンゾトリアゾル-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（PyBOP）で処理した。反応を8−10時間進行させ、環化を陰性ニンヒドリン反応によって確認した。樹脂をジメチルホルムアミド、続いてジクロロメタンで洗浄し、引き続いてトリフルオロ酢酸で10分間処理した。Boc基の除去は陽性ニンヒドリン反応で確認した。樹脂をジメチルホルムアミドおよびジクロロメタンで洗浄し、フッ化水素酸（HF）反応容器に移す前に乾燥させた。500μLのp-クレゾールを磁気攪拌棒と一緒に添加した。容器をHF装置（Peninsula Labs）に繋ぎ、ドライアイス/メタノール浴中で冷却し排気して、約10mLの液体のフッ化水素酸が容器中に凝縮された。反応物を氷浴中で1時間攪拌し、引き続いてHFを真空下で除去した。残留物をエチルエーテルに懸濁し、固体をろ過しエーテルで洗浄し、ペプチドを150mLの20％アセトニトリル/1％酢酸で溶解させた。
粗溶解ペプチドの分析用HPLC分析を以下の条件下で実施した[4.6ｘ30mm Xterra C8、1.50mL/分、220nm、A緩衝液 0.1％ TFA/10％ CAN、B緩衝液 0.1％ TFA/100％ CAN、15分かけてグラディエント5−95％B]。抽出物を水で2倍に希釈し、2.2ｘ25cmのVydac C4調製用逆相カラムにローディングし、ウォーターズ（Waters）HPLC系でアセトニトリルグラディエントを用いて溶出させた（A緩衝液（0.1％ TFA/10％ CAN）、B緩衝液（0.1％ TFA/10％ CAN）、および流速15.00mL/分で120分かけて0−100％のBのグラディエント）。精製ペプチドのHPLC分析は95％を超える純度を示し、エレクトロスプレーイオン化質量分析は12−16ラクタムについて3506Daの質量を確認した。16−20、20−24および24−28のラクタムを同様にして調製した。
【実施例５】
【０１１５】
アシル化および/またはペグ化ペプチドの調製
アシル化および/またはペグ化ペプチドを以下のように調製した。ペプチドは、CS Bio 4886ペプチド合成装置またはアプライドバイオシステム430Aペプチド合成装置を用い固体支持体樹脂上で合成する。in situ中和化学を下記記載にしたがって用いる：Schnolzer et al., Int.J.Peptide Protein Res.40: 180-193, 1992。アシル化ペプチドのためには、アシル化されるべき標的アミノ酸（例えば10位）をNε-FMOCリジン残基で置換する。完成したN-末端BOC保護ペプチドのDMF中の20％ペピリジンによる30分間の処理はFMOC/ホルミル基を除去する。遊離ε-アミノLys残基のカップリングは、10倍モル過剰のFMOC保護スペーサーアミノ酸（例えばFMOC-(N-BOC)-トリプトファン-OH）またはアシル鎖（例えばC17-COOH）およびDMF/DIEA中のPyBOPまたはDEPBTDEPBTカップリング試薬をカップリングすることによって達成される。その後のスペーサーアミノ酸のFMOC基の除去に続いて、アシル鎖とのカップリングが繰り返される。100％TFAによる最終処理は、任意の側鎖保護基およびN-末端BOC基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を5％DIEA/DMFで中和し、乾燥させ、続いてHF/p-クレゾール（95：5）を0℃で1時間用いて支持体から切断する。エーテル抽出に続いて、5％のHOAcを用いて粗ペプチドを溶媒和する。続いて当該溶液のサンプルが正確な分子量ペプチドを含むことをESI-MSによって検証する。正確なペプチドを直線状グラディエント（10％ CH3CN/0.1％ TFAから100％ CH3CN/0.1％ TFA）を用いてRP-HPLCによって精製する。Vydac C18 22mmｘ250mmタンパク質カラムを精製に用いる。アシル化ペプチドアナログは緩衝液比20：80によって概ね溶出が完了する。複数の部分を一緒にプールし、分析用RP-HPLCで純度をチェックする。純粋な分画を凍結乾燥し、白色の固体ペプチドを得る。
ペプチドがラクタム架橋およびアシル化されるべき標的残基を含む場合、アシル化はペプチド骨格に当該アミノ酸を付加するときに上記に記載するように実施される。
ペプチドのペグ化については、40kDaのメトキシポリ(エチレングリコール)マレイミド-プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、7M尿素、50mMトリス-HCl緩衝液中の1モル当量のペプチドと反応させる。ペプチドおよびPEGの両方を透明な溶液に溶解させるために必要とされる最小量の溶媒を用いる（一般的には2−3mgのペプチドを用いる反応のために2mL未満）。4−6時間の室温での激しい攪拌を開始し、分析用RP-HPLCによって反応を分析する。ペグ化生成物は保持時間の低下により出発物質とは全く異なって見える。精製は、最初のペプチド精製に用いたものと同様な条件でVudac C4カラムで実施される。溶出は、典型的には緩衝液比50：50辺りで生じる。純粋なペグ化ペプチドの分画を収集し凍結乾燥する。
【実施例６】
【０１１６】
溶解性が強化されたグルカゴンペプチド
自然のままのグルカゴン1は29アミノ酸の膵臓ホルモンであり、その主要な生理学的役割は、グリコゲン分解の刺激、糖新生およびグリコゲン合成抑制を介して達成される、肝グルコースの動員である。完璧なグルカゴン応答（健康な個体の糖血制御の必須の成分）はしばしば糖尿病患者で損なわれる。この欠陥は、インスリン依存（1型）糖尿病患者（インスリン療法の過程で低血糖に見舞われる）について特に深刻なリスクを提示し得る。これらの事例では、患者はグルカゴンの非か投与の形で緊急介入を必要とすることがある。自然のままのグルカゴンは化学的分解を受け、さらに不溶性の原線維を形成する傾向があるために、前記は凍結乾燥粉末として供給される。当該粉末の使用は、その投与の直前に無菌的な酸性希釈液で再構成することを必要とする。不便であることおよびその調製と投与のために必要とされる時間的隔たりは更なるリスクを押し付ける。自然のままのグルカゴンの不利な生物物理学的特性はまた、多数の調査的設定（ミニドーシングプロトコルを含む）およびインスリン共同投与（二ホルモンポンプを介する）との併用におけるその使用を妨げる。
3-ピリジル-アラニン（3-Pal）の取り込みは、複数のタンパク質の溶解性特性を改善することが以前に観察されている（一連のCGRPアンタゴニストペプチドの溶解性を高め、一方でそれらの効力を維持する（Yan, et al., J.P.Discovery of potent, cyclic calcitonin gene-related peptide receptor antagonists.J.Pept.Sci.2011, 17, 383-386））。本研究における我々のアプローチは、グルカゴンの6、10および13位の単独または複数の3-ピリジル-アラニン（3-Pal）および4-ピリジル-アラニン（4-Pal）置換の系統的評価を含む（例えば表1を参照）。
【０１１７】
実験手順
化学
ピリジル-アラニンを含むグルカゴンペプチドを、予めローディングされたFmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂（Aapptec, Louisvile, KY）およびHCTU/DIPEA活性化で開始する自動化（CSBioモデルCS336X）Fmoc/tBu固相方法によって調製した。側鎖保護基のスキームは以下から成っていた：Arg(Pbf)、Asp(OtBu)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Tyr(tBu)、およびTrp(Boc)。略語：Fmoc＝フルオレニルメチルオキシカルボニル、Pbf＝2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル、OtBu＝tert-ブチルエステル、Trt＝トリチル、Boc＝tert-ブチルオキシカルボニル、およびtBu＝tert-ブチルエーテル、HCTU＝2-(6-クロロ-1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート、DIPEA＝N,N-ジイソプロピルエチルアミン。
Fmoc-(3-ピリジル)-L-アラニンおよびFmoc-(4-ピリジル)-L-アラニンは自動組み立て過程でカップリングされた。全ての通常の残基はミッドウェストバイオテク（Fisher, IN）から購入した。3-および4-ピリジル-L-アラニンはアパテック（Aapptec, Louisville, KY）から、HCTUはペプチドインターナショナル（Peptide International, Louisville, KY）から、DIPEAはシグマ-アルドリッチ（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO）から購入した。ペプチドは、以下を含むTFAで処理することによって樹脂から切断し脱保護した（2.5％トリス（トリイソプロピルシラン）、2.5％水、1.5％メタノール、2.5％フェノール、0.5％ DODT [2,2’-(エチレンジオキシ)-ジエテンチオール]および0.5％ Me2S（ジメチルスルフィド）。ペプチドは、アンバークロム-XT20（Amberchrom-XT20）（21.2ｘ250mm、DOW）および/またはカイネテックス（Kinetex）C8（AXIA充填、21.2ｘ250mm、5μm, Phenomenex）カラムで0.05％TFA/H2Oおよび0.05％TFA/CH3CNを溶出緩衝液として用い調製用RP-HPLCによって精製した。自然のままのグルカゴン（Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN）は、上記の条件下で再度精製し、同一の対イオン内容量を担保した。
精製ペプチドは、カイネテックス（Kinetex）C8（4.6ｘ75mm、2.6μm、Phenomenex）で0.05％TFA/H2Oおよび0.05％TFA/CH3CNを溶離液として用い（2.5分の遅れを有する5％Bから70％Bの15分グラディエントを利用する）、LC-MS（1260 Infinity-6120 Quadrupole LCMS、Agilent）によって分析および特徴づけした。ペプチド濃度はλ＝280nmでUV吸収を基準にして査定した（NanoDrop 1000分光光度計（Thermo Scientific, Wilmington, DE）で測定）。λ＝280nmの吸光係数はオンラインペプチドプロパティーカルキュレーター（Innovagen, PepCalc.com）を用いて計算した。
【０１１８】
溶解性アッセイ
2mLエッペンドルフ中の1または5mgの予め凍結乾燥されたペプチドを200−400μLのリン酸緩衝液（PBS：50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム（pH7.4））で処理した。続いて、サンプルをボルテックスし10分間音波処理してから室温（RT）で1時間平衡化し、続いて10krpmで10分間遠心分離した。得られた上清のペプチド濃度をλ＝280nmでUV吸収を測定することによって決定した。アナログ7−10の高度濃縮ストック溶液から、10、5および1mg/mLアリコットに希釈したものを作成し、その間に沈殿物の一切の外観を査定した。計算した濃度を基準にして、ペプチドペレットを含むサンプルを続いてリン酸緩衝液でさらに〜4−5mg/mLに希釈し、ボルテックスし、5分間音波処理し、続いて1時間平衡化して遠心分離し、当該ストックの濃度を同様な態様で査定した。かく乱されていないアリコットを続いて4℃で〜20時間平衡化し、再度遠心分離してペプチドの濃度を再評価した。アリコットにおける濃度は以前にUV吸収を用いて実施したように再査定した。ペプチド濃度の変化は、4℃で48時間および7日後に評価された。
チオフラビンT（ThT）分光光学アッセイ
原理：
チオフラビンT（ThT）は、塩酸の存在下でメタノールを用いてデヒドロチオトルイジンをメチル化することによって得られるベンゾチアゾール塩である。ThTは、間違って折り畳まれたタンパク質凝集物（またはアミロイド）の存在またはフィブリル化をin vitroおよびin vivoの両方で可視化および定量化するための染料として用いられる（例えばアルツハイマー病患者の脳で見いだされるアミロイドベータを含むプラーク；CGD患者の脳で見いだされるPrP原線維のプラーク）。
チオフラビンT（ThT）アッセイは、アミロイド原線維として結合したときのThTの蛍光強度の変化を測定する。蛍光の強化は、蛍光顕微鏡によってまたは蛍光顕微鏡法によって観察できる。分光光学アッセイは、時間経過時のフィブリル化をモニターするために一般的に用いられるが、しかしながら当該アッセイは厳密には定量的ではなく、凍結乾燥後のサンプルについて結合の相違は観察されなかった。
【０１１９】
チオフラビン-T蛍光アッセイプロトコル：
1．8mgのThTを10mLのリン酸緩衝液（10mMリン酸塩、150mM NaCl（pH 7.0））に添加することによってThTストック溶液を調製し、0.2μm注射器フィルターに通す。このストック溶液は暗所で保存されるべきであり、約1週間安定である。
2．分析の日に当該ストック溶液をリン酸緩衝液で希釈し（50mLの緩衝液に1mLのThTストック）、作業溶液を作成する。
3．1mLの作業溶液の蛍光強度を440nm励起（スリット幅5nm）および482nm発光（スリット幅10nm）、60秒間の平均化によって測定する。
4．無処理タンパク質溶液のアリコット（5−10μL）をキュベットに添加し、1分間攪拌し、60秒にわたって強度を測定する。これはコントロールサンプルとして機能する。
5．5−10μLの凝集タンパク質溶液を用いて工程3−4を繰り返す。上記コントロールサンプルの測定された強度はアミロイド原線維の指標である。
凝集
凍結乾燥ペプチドを適切な緩衝液に〜8−9mg/mLの濃度で溶解させた（1−5は0.1N塩酸；7、9および11は50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム（pH7.4））。正確な濃度はλ＝280でのUV吸収を基準にして計算し、全てのサンプルを等しい濃度（5mg/mL）までさらに溶解させた。続いてかく乱させないで全てを37℃で48時間、続いて磁気攪拌棒を用い300rpmで攪拌しながら40℃で48時間インキュベートした。改変チオフラビン-T蛍光アッセイプロトコルにしたがってフィブリル化を測定した。8mgのチオフラビン-T（ThT）を10mLのリン酸緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム（pH7.4））に溶解させた。溶液を0.22μm注射器フィルターでろ過し、4℃の暗所で保存した。実験の前に、ThTストック溶液の0.3mLをさらに15mLのリン酸緩衝液で希釈した。5mg/mLの精査されるペプチド溶液の5μLを400μLのThT作業溶液（リン酸緩衝液）に添加した。溶液を20から30分インキュベートした。続いて、蛍光強度をパーキンエルマーLS50B（Perkin-Elmer LS50B）ルミネセンス分光計（Perkin-Elmer, Waltham, MA）で以下の実験パラメーターを用いて測定した：サブマイクロ石英キュベットに350μLのペプチドThT（光路長＝10mm；12.5mmｘ12.5mmｘ45mm；ウインドウ2mmｘ8mm；Z＝15mm（Sterna Cells, Atascadero, CA））；励起λ＝450nm（スリット幅5nm）；発光λ＝482nm（スリット幅10nm）、インテグレーション10秒。シグナルは4つの連続点から平均化した。標準物質S1（リン酸緩衝液中に1mg/mLのインスリンバージン溶液、400μLのThT作業溶液に25μL）およびS2（以前に凝集したインスリン溶液（〜1mg/mL）、400μLのThT作業溶液に25μL）を精査されるグルカゴンペプチドと一緒にチェックした（図2参照）。
溶解性
pHを5、6および7に調整した0.5mLのリン酸緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム）にアナログ9の2.6mgを溶解させた。サンプルをボルテックスし、完全に溶解させた溶液を0.22μm注射器フィルターから無菌的エッペンドルフチューブへろ過した。濃度を以前に記載したように査定した。最終的に〜800μLの2.0mg/mLの溶液を、滅菌した磁性攪拌棒を備えた無菌的な2mLガラスバイアルに作成した。T＝0の参照サンプルを抜き取って-45℃で保存し、当該溶液の残りに蓋をし、パラフィンフィルムで密閉し、37℃でインキュベートし200rpmで攪拌した。試験サンプルを1および4週の時点で抜き取った。抜き取ったアリコットから、以前に記載したようにLC-MS分析を実施し、DMEM緩衝液中のサンプルをバイオアッセイのために調製した。グルカゴン受容体媒介cAMP蓄積アッセイを以前に記載したように実施した（実施例3参照）。4週間にわたる安定性は図3に示される。
in vivoラット
雄ウィスターラット（Harlan, IN（体重504±4g））を22℃および一定湿度の12：12時間明暗サイクル（8am−8pm照明）で収容し、標準固形飼料（chow, Teklad LM-485）および水に以下に記載する点を除いて自由にアクセスさせた。飼料は、照明相の開始時、化合物の腹腔投与の3時間前に除去された。血糖レベルを携帯用血糖計（Freestyle, Abbot）を用いて表示の時間間隔で決定した。全ての実験が、シンシナチ大学の学内動物管理及び使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Cincinnati）によって承認されかつそのガイドラインにしたがって実施された。in vivo実験で得られた結果の統計分析は、Prism 6.0h（GraphPad Software, CA）を用い一元配置分散分析とそれに続くDunnett検定を適用して実施され、コントロールとしてインスリングループが用いられた。0.05より低いP値は有意とみなされた（** P＜0.01；*** P＜0.001）。結果は、各グループにつき8レプリケートの平均±SEMとして提示される。全てのin vivo実験で、150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）がベヒクルとして用いられた（図4A−4D参照）。
ブタの試験
糖尿病の雄ユカタンミニチュアブタ（Yucatan miniature swine）（4動物/グループ）に給餌し、午前8時および試験の開始12時間前にNPHインスリンを投与し、続いて最後の血糖測定が完了するまで絶食させた。インスリンNPH用量はグルコースレベルを基準にして調整し、動物を任意抽出してグループ全体でグルコースレベルの均衡化を達成した。試験日に、動物に対し0.5U/kgのインスリンデテミルの皮下注射を0時点で、さらに10nmole/kgのアナログ9または自然のままのグルカゴン1を240分の時点で投与した。血糖を、-5、0（投与前）、30、60、120、240、245、250、260、280、300、330、360および480分に携帯用血糖計を用いて測定した。全動物に同じ装置を用い、各時点で2つの読みを採取し、一貫性を担保した。in vivo実験で得られた結果の統計分析は、Prism 6.0h（GraphPad Software, CA）を用い通常の二元配置分散分析とそれに続く2つの処置間のSidak多重比較検定を適用して実施された。0.05より低いP値は有意とみなされた（** P＜0.01；*** P＜0.001）。結果は、各グループにつき4レプリケートの平均±SEMとして提示される（図5参照）。
結果
表1の新規なグルカゴンペプチドが自動化Fmoc/tBu固相ペプチド合成によって合成され、表1に要約されている。我々の最初の選別基準は、pH7.0における水溶性及びルシフェラーゼ系グルカゴンアッセイによって査定されるin vitroの効能に重点を置いた（表2参照）。我々の構造-活性研究の出発点は[Aib16]Glc(1-29) 2であった（前記は、強化された生物物理学的安定性とともにAib16置換のためにAsp15-Ser16におけるアスパルチミド形成に対する耐性を示すアナログである）。Phe6、Tyr10およびTyr13の入れ替えの成功は、3-Palおよび4-Pal置換アナログの両方の溶解性の増加（溶解性における付加的作用）と相関関係を示す。単一置換は溶解性を＞1mg/mLに増加させ、一方、二重または三重置換は10mg/mLを超える溶解性増加をもたらす。これは当該ペプチドの疎水性低下の特性に帰属し、さらにまたより速いHPLC溶出時間の傾向の結果であった（表1）。
【０１２０】
表1：グルカゴンアナログ
2019520336.tif 000023
Z＝Aib；X＝3-Pal；U＝4-Pal
【０１２１】
表2：グルカゴンアナログの溶解性および生物活性
2019520336.tif 000024
【０１２２】
ルシフェラーゼ系グルカゴンアッセイを用いてin vitro有効性を査定した。前記有効性は、3−Palおよび4−Palシリーズでは、一、二置換アナログでおよび三置換アナログの場合ですら維持され、四置換アナログ11のみが低い効能を示した（表2参照）。十分に強力で高い溶解性（＞10mg/mL）のアナログ7および9をより厳密な溶解性および処方試験に付した。前記試験では、それらの最初の溶解性に対して4℃で48時間および7日間隔の溶解性が調べられた。アナログ9は、全ての条件下で完全な溶解性を維持し、一方、アナログ7は7日後に溶解性の低下を示した。アナログ9はまた、自然のままのグルカゴンおよびインスリンを陽性コントロールとして用いたチオフラビン-T蛍光法によって測定したときフィブリル化に対して耐性を示した（図2）。生物学的応答の持続性および化学的安定性を、4週間にわたるpH5、6および7でのin vitro効能により測定した（図3）。アナログ9の薬理学的性能の最も決定的な評価はラットおよびブタのパイロットin vivo試験を通して得られた。この最初の試験は痩せラットが関わっていた。痩せラットには、用量が段階的に増加する自然のままのグルカゴン（図4A）またはアナログ9（図4B）が固定用量のインスリンとともに投与された。アナログ9を自然のままのグルカゴンと同じ動物コホートで比較する同じプロトコルを繰り返した（図4C）。外因性インスリンの非存在下におけるアナログ9の低血糖に対するこの“スタンドアローン”効果は図4Dに示される（比較物質として自然のままのグルカゴンが再び用いられた）。最終的な検証は、糖尿病ブタでインスリン誘発低血糖を逆転させるアナログ9の能力によって提供された（図5）。この実験では、糖尿病ブタ（4/グループ）は、インスリンデテミル（Levemir）（長期作用性インスリン）で処置された。4時間時点で動物はアナログ9または自然のままのグルカゴン1の1用量でチャレンジされた。要約すれば、アナログ9は、すぐに使用できるグルカゴン治療薬であるために必須の生物物理学的、化学的、薬理学的特性を有するグルカゴンアナログの一実施態様である。
【実施例７】
【０１２３】
D-アミノ酸置換を含むグルカゴンアナログ
グルカゴンの溶解性に対するD-アミノ酸置換の影響を精査するために、単一改変を有する一連のグルカゴンアナログを調製した。単一改変では、自然のままのグルカゴン配列の各位置における自然のままのアミノ酸は系統的に対応するD-アミノ酸で置換される。続いて、29のアナログを溶解性、安定性（フィブリル化に対する耐性）およびグルカゴン受容体における活性についてそれぞれ試験した。図6Aは、pH７で室温のPBSにおける各アナログの溶解性を示す。図6Bは、各改変グルカゴンアナログの凝集/フィブリル化に関するデータを提供する（実施例6に開示するチオフラビン-T蛍光アッセイで測定）。図6Cは、実施例3で開示するアッセイを用いた各改変グルカゴンアナログ活性に関するデータを提供する。
表3は、種々のグルカゴンアナログのグルカゴンおよびGLP-1受容体における活性を提供し、前記アナログは、グルカゴン溶解性を改善するピリジルアラニンと組合わせてD-アミノ酸の置換を含む。
【０１２４】
表3：
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図7Aおよび7Bは、種々のpH（pH4−8の範囲）で室温（図7A）または4℃（図7B）における追加のグルカゴンアナログの溶解性を示すグラフである。全ての化合物は16位のAibの置換を含み、さらに20位のD-アミノ酸置換および場合によって10位および/または13位の3-Palのどちらかを含んでいる。これらの化合物の各々が、チオフラビン-T蛍光で測定したときフィブリル化に耐性であることが見いだされた（図8）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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