(57)【要約】試料中のインフルエンザＡ型ウイルスの阻害方法が提供される。方法の態様は、ＰＳＬ２モチーフを有するウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を、ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合してインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する有効量の薬剤と接触させることを含む。対象におけるインフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防方法も提供される。細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する能力についての候補薬剤のスクリーニング方法もまた提供され、この方法は、試料を候補薬剤と接触させることと、その候補薬剤がｖＲＮＡのＰＳＬ２モチーフに特異的に結合するかを決定することとを含む。主題の方法において用途を見出すＰＢ２  ｖＲＮＡ領域と相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む化合物及び薬学的組成物もまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＢ２  ｖＲＮＡ領域と相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド化合物であって、前記領域が、前記ＰＢ２  ｖＲＮＡの５’末端コード領域の（−）センス表記中のヌクレオチド３４〜８７を含む、オリゴヌクレオチド化合物、またはその塩。
【請求項２】
前記ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域のパッケージングステムループ２（ＰＳＬ２）モチーフの領域と相補的な少なくとも８個のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、及びチオホスホルアミデート結合から選択されるヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、
５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号４５）、
５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号４６）、
５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４７）、
５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号４８）、
５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４９）、
５’  ＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡ  ３’（配列番号５０）、
５’  ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＧＣＣ  ３’（配列番号５１）、
５’  ＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧ  ３’（配列番号５２）、
５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号５３）、
５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号５４）、
５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号５５）、
５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５６）、
５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５７）、
５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５８）、
５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５９）、
５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６０）、
５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６１）、
５’  ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡ  ３’（配列番号６２）、
５’  ＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＧＴＧ  ３’（配列番号６３）、
５’  ＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡ  ３’（配列番号６４）、
５’  ＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡ  ３’（配列番号６５）、及び
５’  ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡ  ３’（配列番号６６）から選択される配列を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、少なくとも５個のデオキシリボヌクレオチドユニットを含み、ＲＮａｓｅを動員することができる、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、
ＬＮＡ１：５’  ＡｃｃＡａａＡＧａａＴ  ３’（配列番号６７）、
ＬＮＡ２：５’  ＴｇｇＣｃＡＴｃａａＴ  ３’（配列番号６８）、
ＬＮＡ３：５’  ＴａｇＣＡｔＡｃｔｔＡ  ３’（配列番号６９）、
ＬＮＡ４：５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号７０）、
ＬＮＡ５：５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号７１）、
ＬＮＡ６：５’  ＣａｇａＣａＣＧａＣＣａａＡＡ  ３’（配列番号７２）、
ＬＮＡ７：５’  ＴＡｃＴｔａＣＴｇａＣａｇＣＣ  ３’（配列番号７３）、
ＬＮＡ８：５’  ＡＧＡＣａｃｇａｃｃａＡＡＡＧ  ３’（配列番号７４）、
ＬＮＡ９：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号７５）、
ＬＮＡ９．２：５’  ＴＡＣｔｔａｃｔｇａｃＡＧＣＣ  ３’（配列番号７６）、
ＬＮＡ１０：５’  ＡＣＣａａａａｇＡＡＴ  ３’（配列番号７７）、
ＬＮＡ１１：５’  ＴＧＧｃｃａｔｃＡＡＴ  ３’（配列番号７８）、
ＬＮＡ１２：５’  ＴＡＧｃａｔａｃＴＴＡ  ３’（配列番号７９）、
ＬＮＡ１３：５’  ＣｇａｃＣＡａａＡＧａａｔｔＣ  ３’（配列番号８０）、
ＬＮＡ１４：５’  ＣＧＡＣｃａａａａｇａＡＴＴＣ  ３’（配列番号８１）、
ＬＮＡ１５：５’  ＧａＴＧｇＣｃＡＴｃａＡｔｔＡ  ３’（配列番号８２）、
ＬＮＡ１６：５’  ＧＡＴＧｇｃｃａｔｃａＡＴＴＡ  ３’（配列番号８３）、
ＬＮＡ１７：５’  ＴｃＴＡｇＣａＴＡｃｔＴａｃＴ  ３’（配列番号８４）、
ＬＮＡ１８：５’  ＴＣＴＡｇｃａｔａｃｔＴＡＣＴ  ３’（配列番号８５）、
ＬＮＡ１９：５’  ＧＡＡｔｔｃｇｇａｔｇＧＣＣＡ  ３’（配列番号８６）、
ＬＮＡ２０：５’  ＧＧＣＣａｔｃａａｔｔａＧＴＧ  ３’（配列番号８７）、
ＬＮＡ２１：５’  ＴＴＣＧｇａｔｇｇｃｃａＴＣＡ  ３’（配列番号８８）、
ＬＮＡ２２：５’  ＡＧＣＣａｇａｃａｇＣＧＡ  ３’（配列番号８９）、
ＬＮＡ２３：５’  ＧＡＣＡｇｃｃａｇａｃａＧＣＡ  ３’（配列番号９０）、
ＬＮＡ９．Ｇ７４Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＴＣ  ３’（配列番号９１）、及び
ＬＮＡ９．Ｔ８０Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｃｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号９２）から選択される配列を含み、
大文字がＬＮＡヌクレオチドを示し、小文字がＤＮＡヌクレオチドを示す、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスの阻害方法であって、
ＰＳＬ２モチーフを有するウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を、前記ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合して前記インフルエンザＡ型ウイルスを阻害する有効量の薬剤と接触させることを含む、方法。
【請求項９】
前記薬剤が、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料を薬剤と接触させることが、前記ウイルスの少なくとも２ｌｏｇ１０の力価損失をもたらし、前記薬剤が、前記ｖＲＮＡの前記ＰＳＬ２モチーフの全体的な構造を破壊する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｖＲＮＡが、ビリオンまたは細胞から単離される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
対象におけるインフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防方法であって、
それを必要とする対象に、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のＰＳＬ２モチーフに特異的に結合する有効量の活性剤を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記活性剤が、ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域と相補的な少なくとも８個のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド配列を含む化合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、インフルエンザＡ型ウイルス感染の危険性があり、前記オリゴヌクレオチド化合物の前記投与が、前記対象を感染に対して１週間以上（例えば、２週間以上、３週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、等）保護する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、有効用量の前記オリゴヌクレオチド化合物の１週間に１回、２週間に１回、または１か月に１回の投与を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬学的組成物が、第２のオリゴヌクレオチド活性剤及び抗ウイルス薬から選択される追加の活性剤をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、インフルエンザＡ型ウイルス感染またはその疑いがあると診断される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、２０１６年３月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３０２，５４８号の利益を主張し、この出願は、その全体において本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）は、世界中で顕著な罹患及び死亡を引き起こすセグメント化ＲＮＡウイルスである。全ての現在承認されているＩＡＶ抗ウイルス薬は、ウイルスタンパク質に対して標的化され、サブタイプが限られ、全ての薬物クラスメンバーに対して上昇する抗ウイルス耐性が課題となっている。
【０００３】
ＩＡＶゲノムは、最小１４個の既知のウイルスタンパク質をコードする８個の一本鎖ネガティブセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）セグメントからなる。ｖＲＮＡは、核タンパク質（ＮＰ）ならびに、ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡタンパク質を含む、ヘテロトリマーポリメラーゼ複合体と共に、完全ウイルスリボ核タンパク質（ｖＲＮＰ）を形成する。完全に感染性となるには、ＩＡＶビリオンは、各セグメントのｖＲＮＰの少なくとも１つを組み込まなければならない。各ｖＲＮＰは、少なくとも１つの他のパートナーと相互作用し、パッケージングプロセスを誘導すると仮定されるセグメント間ＲＮＡ−ＲＮＡ及び／またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用により維持される可能性が高い超分子複合体を形成する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の態様は、ゲノムセグメントＰＢ２の５’パッケージングシグナル領域内で、パッケージングステムループ２（ＰＳＬ２）と呼ばれる、ＩＡＶのＲＮＡ構造要素を破壊するように設計された汎遺伝子型組成物を提供する。ＰＳＬ２構造の破壊は、ＩＡＶを劇的に阻害する。ＰＳＬ２は、全ての試験されたインフルエンザＡ型サブタイプにわたり保存される。
【０００５】
試料中のインフルエンザＡ型ウイルスの阻害方法が提供される。方法の態様は、ＰＳＬ２モチーフを有するウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を、ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合してインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する有効量の薬剤と接触させることを含む。いくつかの場合では、ｖＲＮＡは、ビリオンまたは細胞から単離される。いくつかの場合では、ｖＲＮＡは、ビリオン中にある。いくつかの場合では、ｖＲＮＡは、感染細胞中にある。対象におけるインフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防方法も提供される。細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する能力についての候補薬剤のスクリーニング方法もまた提供され、この方法は、試料を候補薬剤と接触させることと、その候補薬剤がｖＲＮＡのＰＳＬ２モチーフに特異的に結合するかを決定することとを含む。主題の方法において用途を見出すＰＢ２  ｖＲＮＡ領域と相補的なオリゴヌクレオチド配列を含む化合物及び薬学的組成物もまた提供される。
【０００６】
当業者であれば、下に記載される図面が例示目的のみのためのものであることを理解するであろう。図面は、本教示の範囲をいかなる方法でも限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】野生型ＰＢ２（配列番号１）、ならびにパッケージング変異体ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｍ７５７（配列番号２）、ｍ７４５（配列番号３）、１９１８パンデミック（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、高病原性鳥（Ｈ５Ｍ＝Ｎ１）（配列番号５）、及び２００９豚（Ｈ１Ｎ１）（配列番号６）のＲＮＡ二次構造を描写する。
【図１Ｂ】野生型ＰＢ２（配列番号１）、ならびにパッケージング変異体ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｍ７５７（配列番号２）、ｍ７４５（配列番号３）、１９１８パンデミック（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、高病原性鳥（Ｈ５Ｍ＝Ｎ１）（配列番号５）、及び２００９豚（Ｈ１Ｎ１）（配列番号６）のＲＮＡ二次構造を描写する。
【図１Ｃ】野生型ＰＢ２（配列番号１）、ならびにパッケージング変異体ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｍ７５７（配列番号２）、ｍ７４５（配列番号３）、１９１８パンデミック（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、高病原性鳥（Ｈ５Ｍ＝Ｎ１）（配列番号５）、及び２００９豚（Ｈ１Ｎ１）（配列番号６）のＲＮＡ二次構造を描写する。
【図１Ｄ】野生型ＰＢ２（配列番号１）、ならびにパッケージング変異体ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｍ７５７（配列番号２）、ｍ７４５（配列番号３）、１９１８パンデミック（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、高病原性鳥（Ｈ５Ｍ＝Ｎ１）（配列番号５）、及び２００９豚（Ｈ１Ｎ１）（配列番号６）のＲＮＡ二次構造を描写する。
【図１Ｅ】野生型ＰＢ２（配列番号１）、ならびにパッケージング変異体ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｍ７５７（配列番号２）、ｍ７４５（配列番号３）、１９１８パンデミック（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、高病原性鳥（Ｈ５Ｍ＝Ｎ１）（配列番号５）、及び２００９豚（Ｈ１Ｎ１）（配列番号６）のＲＮＡ二次構造を描写する。
【図１Ｆ】野生型ＰＢ２（配列番号１）、ならびにパッケージング変異体ｖＲＮＡ、ＰＢ２ｍ７５７（配列番号２）、ｍ７４５（配列番号３）、１９１８パンデミック（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、高病原性鳥（Ｈ５Ｍ＝Ｎ１）（配列番号５）、及び２００９豚（Ｈ１Ｎ１）（配列番号６）のＲＮＡ二次構造を描写する。
【図２】パネルＡ及びＢは、全長ＰＢ２  ｖＲＮＡの反応性を描写する。
【図３Ａ】パッケージング欠損変異、ＰＢ２ｍ７４４ｂ（配列番号８）、ＰＢ２ｍ７４５（配列番号９）、ＰＢ２ｍ５５ｃ（配列番号１０）、及びＰＢ２ｍ７５７（配列番号１１）による、野生型反応性（配列番号７）の破壊を描写する。
【図３Ｂ】パッケージング欠損変異、ＰＢ２ｍ７４４ｂ（配列番号８）、ＰＢ２ｍ７４５（配列番号９）、ＰＢ２ｍ５５ｃ（配列番号１０）、及びＰＢ２ｍ７５７（配列番号１１）による、野生型反応性（配列番号７）の破壊を描写する。
【図３Ｃ】パッケージング欠損変異、ＰＢ２ｍ７４４ｂ（配列番号８）、ＰＢ２ｍ７４５（配列番号９）、ＰＢ２ｍ５５ｃ（配列番号１０）、及びＰＢ２ｍ７５７（配列番号１１）による、野生型反応性（配列番号７）の破壊を描写する。
【図３Ｄ】パッケージング欠損変異、ＰＢ２ｍ７４４ｂ（配列番号８）、ＰＢ２ｍ７４５（配列番号９）、ＰＢ２ｍ５５ｃ（配列番号１０）、及びＰＢ２ｍ７５７（配列番号１１）による、野生型反応性（配列番号７）の破壊を描写する。
【図３Ｅ】パッケージング欠損変異、ＰＢ２ｍ７４４ｂ（配列番号８）、ＰＢ２ｍ７４５（配列番号９）、ＰＢ２ｍ５５ｃ（配列番号１０）、及びＰＢ２ｍ７５７（配列番号１１）による、野生型反応性（配列番号７）の破壊を描写する。
【図４】ＰＳＬ２構造を含有するヌクレオチド配列の保存を描写する。
【図５Ａ】ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造（図５Ｃ、配列番号１２）の２次元Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−Ｍａｐ分析を描写する。
【図５Ｂ】ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造（図５Ｃ、配列番号１２）の２次元Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−Ｍａｐ分析を描写する。
【図５Ｃ】ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造（図５Ｃ、配列番号１２）の２次元Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−Ｍａｐ分析を描写する。
【図５Ｄ】ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造（図５Ｃ、配列番号１２）の２次元Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−Ｍａｐ分析を描写する。
【図６】パネルＡ〜Ｂは、以前に記載されたＰＲ８ＰＢ２変異体（パネルＡ、配列番号１３）に対する補償的変異の設計を描写する。
【図７】パネルＡ〜Ｄは、ＰＲ８ＰＢ２  ｖＲＮＡの単一高度保存コドン（パネルＡ、配列番号１４〜１５、パネルＢ、配列番号１６〜２３、上から下）の同義的変異を描写する。
【図８】ＰＢ２パッケージング変異体用語体系及び対応する変異の部位を示す表を描写する。
【図９Ａ】ＰＳＬ２構造、ＰＢ２ｍ７３１（配列番号２４）、ＰＢ２ｍ７５１（配列番号２５）、及びＰＢ２ｍ７４８（配列番号２６）に対する同義的変異の効果を描写する。
【図９Ｂ】ＰＳＬ２構造、ＰＢ２ｍ７３１（配列番号２４）、ＰＢ２ｍ７５１（配列番号２５）、及びＰＢ２ｍ７４８（配列番号２６）に対する同義的変異の効果を描写する。
【図９Ｃ】ＰＳＬ２構造、ＰＢ２ｍ７３１（配列番号２４）、ＰＢ２ｍ７５１（配列番号２５）、及びＰＢ２ｍ７４８（配列番号２６）に対する同義的変異の効果を描写する。
【図１０】パネルＡ〜Ｉは、ウイルスパッケージング及び力価に対するＰＲ８ＰＢ２パッケージング欠損変異体における補償的変異の効果を描写する。
【図１１】パネルＡ〜Ｄは、ＰＢ２パッケージング欠損及び補償的変異体パートナー（パネルＢ、配列番号２７）の多次元化学マッピングを描写する。
【図１２】パネルａ〜ｔは、２次元Ｍｕｔａｔｅ−Ｍａｐ−Ｒｅｓｃｕｅ分析を描写する。
【図１３】２次元Ｍｕｔａｔｅ−Ｍａｐ−Ｒｅｓｃｕｅ変異体についてのプライマー配列の設計を描写する。配列は、配列番号２８〜４３、上から下に対応する。
【図１４】パネルＡ〜Ｂは、パッケージング欠損ウイルスがインビボで弱毒化されることを描写する。
【図１５】パネルＡ〜Ｄは、ＰＳＬ２ＲＮＡ構造（パネルＡ、配列番号４４）を標的とするロックド核酸の抗ウイルス活性を描写する。
【図１６Ａ】ＬＮＡ−ＲＮＡ結合についての分析を描写する。
【図１６Ｂ】ＬＮＡ−ＲＮＡ結合についての分析を描写する。
【図１７】パネルＡ〜Ｂは、単回用量の例示的な化合物ＬＮＡ９の鼻腔内投与後の時間に伴うマウスの生存及び体重減少パーセントを示す。
【図１８】パネルＡ〜Ｄは、薬物圧力下での連続継代後のオセルタミビルに対するインフルエンザウイルスの感受性を示す。
【図１９】パネルＡ〜Ｃは、薬物圧力下での連続継代後のウイルス及び薬物耐性ウイルスを含む、例示的な化合物ＬＮＡ９に対するインフルエンザウイルスの感受性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
例示的な実施形態についてより詳細に説明する前に、下記の定義を記載し、説明において使用される用語の意味及び範囲を例示及び定義する。
【０００９】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、当業者に、本明細書で使用される用語の多くの一般的な意味を提供する。それでも、特定の用語は、明瞭さ及び参照しやすさのために、下に定義する。
【００１０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で特に明記されない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。例えば、「プライマー（ａ  ｐｒｉｍｅｒ）」という用語は、１つ以上のプライマー、すなわち、単一のプライマー及び複数のプライマーを指す。請求項はいずれかの任意の要素を除外するように記載され得ることに、さらに留意されたい。このようなものとして、この記述は、請求項要素の列挙に関連した「単独で」、「のみ」、等のような排他的な用語の使用、または「消極的な」限定の使用ための先行詞として機能することが意図される。
【００１１】
本明細書で使用される「試料」という用語は、１つ以上の目的の成分を含有する、そうである必要はないが典型的には流体形態の、物質または物質の混合物に関する。
【００１２】
本明細書で使用されるとき、「有効量」という用語は、いくらかの所望の局所または全身効果をもたらす物質（例えば、目的の薬剤）の量を指す。目的の活性剤の有効量は、これらに限定されないが、対象の体重及び年齢、治療される状態、状態の重症度、投与の方法、等を含む、様々な因子に応じて変動し、容易に決定、例えば、下の実験セクションにおいて提供されるデータのようなデータを使用して経験的に決定することができる。
【００１３】
本明細書で使用される「試料」という用語は、１つ以上の目的の成分を含有する、そうである必要はないが典型的には流体、すなわち、水性形態の、物質または物質の混合物に関する。試料は、これらに限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、精液、リンパ液、皮膚の外部片、気道、腸管、及び泌尿生殖路、涙、唾液、乳、血球、腫瘍、臓器、及びまた（これらに限定されないが、細胞培地中の細胞、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、及び細胞成分の増殖からもたらされる馴化培地を含む）インビトロ細胞培養物構成要素の試料を含む、個体から単離された組織または流体のような、生体試料または固体のような様々な供給源に由来し得る。試料中の成分は、本明細書では「分析物」と称される。多くの実施形態では、試料は、少なくとも約１０２、５×１０２、１０３、５×１０３、１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２以上の種の分析物を含有する複合試料である。
【００１４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、例えば、インタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））、単鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々単一抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映する名称である、残留「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【００１５】
本明細書で相互互換的に使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、いずれかの長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コード化及び非コード化アミノ酸、化学または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、及び修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。「融合タンパク質」という用語またはその文法的同等物は、典型的にはそれらの天然状態では結合していないが、典型的には単一連続ポリペプチドを形成するペプチド結合を通したそれらの各アミノ及びカルボキシル末端により結合している、複数のポリペプチド成分からなるタンパク質を意味する。融合タンパク質は、２つ、３つ、またはさらに４つ以上の異なるタンパク質の組み合わせであり得る。ポリペプチドという用語は、これらに限定されないが、非相同アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を含むまたは含まない、非相同及び相同リーダー配列を有する融合体、免疫学的に標識されたタンパク質、検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、等を含む融合タンパク質、等を含む、融合タンパク質を含む。
【００１６】
一般に、ポリペプチドは、いずれかの長さ、例えば、２個超のアミノ酸、４個超のアミノ酸、約１０個超のアミノ酸、約２０個超のアミノ酸、約５０個超のアミノ酸、約１００個超のアミノ酸、約３００個超のアミノ酸、通常は最大約５００または１０００個以上のアミノ酸のものであり得る。「ペプチド」とは、一般的には、２個超のアミノ酸、４個超のアミノ酸、約１０個超のアミノ酸、約２０個超のアミノ酸、通常は最大約５０個のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５〜３０個のアミノ酸の長さである。
【００１７】
「特異的結合」という用語は、異なる分析物の均質な混合物中に存在する特定の標的（例えば、ＰＳＬ２）に優先的に結合する薬剤の能力を指す。いくつかの場合では、特異的相互作用は、試料中の望ましい分析物と望ましくない分析物とを、典型的には約１０〜１００倍以上（例えば、約１０００倍超）区別するであろう。いくつかの場合では、それらが捕捉剤／分析物複合体中で特異的に結合される場合、対象の薬剤と分析物（例えば、ＰＳＬ２）との間の親和性は、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、通常は最大約１０−１０Ｍである。特異的結合は、ハイブリダイゼーション、ポリペプチド−核酸相互作用、または小分子−核酸相互作用を含むことができる。
【００１８】
「オリゴヌクレオチド」とは、約２個及び約２００個の連続的なサブユニットを有するリボース及び／またはデオキシリボースヌクレオシドサブユニットポリマーを指す。ヌクレオシドサブユニットは、これらに限定されないが、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、Ｐ３’→Ｎ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート、及びホスホロチオエート結合を含む、様々なサブユニット間結合により結合することができる。さらに、「オリゴヌクレオチド」は、糖（例えば、２’置換）、塩基（下の「ヌクレオシド」の定義参照）、ならびに３’及び５’末端に対する、当業者に知られる修飾を含む。オリゴヌクレオチド部分が複数のサブユニット間結合を含む実施形態では、各結合は同じ化学を使用して形成され得るか、または結合化学の混合物が使用され得る。「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、「核酸配列もしくはセグメント」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、相互互換的に使用され、遺伝子、遺伝子によりコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡとも相互互換的に使用され得る。
【００１９】
「ロックド核酸」（ＬＮＡ）は、リボース部分が２’酸素及び４’炭素を結合する追加の架橋で修飾されている、修飾ＲＮＡヌクレオチドである。架橋は３’末端立体構造中でリボースを「ロック」し、これはＡ形態二本鎖中でよく見られる。ＬＮＡヌクレオチドは、所望に応じてオリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基のような、いずれかの便利なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と混合することができる。ＬＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成原理に従って、ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズする。こうしたオリゴマーは、化学的に合成することができる。一般に、ロックドリボース立体構造は、塩基スタッキング及び骨格予備組織化を向上させ、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融解温度）を増加させる。
【００２０】
開示は、単離または実質的に精製された核酸核酸分子、及びそれらの分子を含有する組成物を包含する。本開示の文脈では、「単離」または「精製」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その天然環境から離れて存在し、したがって自然の産物ではないＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製状態で存在し得るか、または、例えば、トランスジェニック宿主細胞のような、非天然環境中に存在し得る。例えば、「単離」もしくは「精製」核酸分子またはその生物学的に活性な部分は、組換え技法により産生される場合は他の細胞物質、もしくは培地を実質的には含まないか、または化学的に合成される場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的には含まない。１つの実施形態では、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、単離核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子に自然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。開示されるヌクレオチド配列の断片及び多様体も本開示により包含される。「断片」または「部分」とは、ヌクレオチド配列の全長または全長未満を意味する。本開示のｓｉＲＮＡは、当該技術分野において知られるいずれかの方法により、例えば、インビトロ転写により、組換えで、または合成手段により生成することができる。１つの例では、ｓｉＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートのような、組換え酵素を使用することにより、インビトロで生成することができる。
【００２１】
「小干渉」もしくは「短干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子に標的化されるヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」とは、ＲＮＡ分子の２つの領域間での相補的対形成により形成された構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的化遺伝子のヌクレオチド配列と相補的である遺伝子に「標的化」される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは、３０個未満のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、二本鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０個のヌクレオチドの長さであり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは、１９〜２５個のヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含有し得る。ループは長さが変動し得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造は、３’または５’オーバーハング部分も含有することができる。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、３’または５’オーバーハング０、１、２、３、４、または５個のヌクレオチドの長さである。
【００２２】
「脂質」という用語は、本明細書で広く使用され、有機溶媒には可溶性であるが、水には可溶性だとしても難溶性である物質を包含する。脂質という用語は、これらに限定されないが、炭水化物、油、（脂肪酸、グリセリドのような）脂肪、ステロール、ステロイド、及びこれらの化合物の誘導体形態が挙げられる。好ましい脂質は、脂肪酸及びそれらの誘導体、炭水化物及びそれらの誘導体、ならびにコレステロールのような、ステロールである。本明細書で使用されるとき、脂質という用語は、脂質及び親水性部分の両方を含有する両新媒性化合物も含む。脂肪酸は、通常は、直鎖中に偶数の炭素原子（一般的には１２〜２４個の炭素）を含有し、飽和または不飽和であってよく、様々な置換基を含有または含有するように修飾することができる。簡潔に、「脂肪酸」という用語は、例えば、オリゴヌクレオチドの修飾末端との、抱合反応により産生される脂肪アミドのような、脂肪酸誘導体も包含する。
【００２３】
用語の他の定義は、明細書全体を通して出現し得る。
（発明を実施するための形態）
【００２４】
様々な実施形態について説明する前に、本開示の教示が、記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、もちろん、変わり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語が、特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、本教示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定的であることが意図されないことも理解されたい。
【００２５】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、組織化目的のためのみのものであり、説明される主題をいかなる方法でも限定するものとは解釈されない。本教示は様々な実施形態と共に説明されるが、本教示がこうした実施形態に限定されることは意図されない。対照的に、本教示は、当業者により理解されるように、様々な代替物、変形、及び同等物を包含する。
【００２６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されるものと同様または同等のいずれかの方法及び材料も、本教示の実施または試験に使用することができるが、いくつかの例示的な方法及び材料についてここで説明する。
【００２７】
いずれかの刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、本特許請求の範囲が、先行発明によってこうした刊行物に先行する権利を有さないという認識として解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、独立して確認することができる実際の公開日とは異なり得る。
【００２８】
当業者には本開示を読むと明らかになるように、本明細書において記載及び例示される個別の実施形態の各々は、本教示の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に切り離す、またはこれと組み合わせることができる、別々の成分及び特徴を有する。いずれかの引用される方法は、引用される事象の順序または理論的に可能であるいずれかの他の順序で実施することができる。
【００２９】
本明細書で参照される、こうした特許及び刊行物内で開示される全ての配列を含む、全ての特許及び刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。
【００３０】
インフルエンザＡ型ウイルスを阻害するための方法
上で要約されるように、本開示の態様は、ゲノムセグメントＰＢ２の５’パッケージングシグナル領域内で、パッケージングステムループ２（ＰＳＬ２）と呼ばれる、ＩＡＶのＲＮＡ構造要素を破壊するように設計された汎遺伝子型組成物を含む。「汎遺伝子型」とは、組成物が、ＰＳＬ２構造要素が保存される、様々な異なるタイプのＩＡＶにわたり効果的であることを意味する。いくつかの場合では、主題の組成物は、広域スペクトルと称することができる。本明細書で使用されるとき、「広域スペクトル」という用語は、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、８個以上、１０個以上の異なるウイルスのような、２個以上の異なるウイルスに対して活性である単一部分の抗ウイルス活性を指す。２個以上の異なるウイルスは、異なるウイルスサブグループ（例えば、インフルエンザＡ型グループ１もしくはインフルエンザＡ型グループ２）から選択され得るか、または同じグループ内（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、及びＨ９グループ１インフルエンザＡ型ウイルスのうちの２個以上、もしくはＨ３、Ｈ４、Ｈ７、及びＨ１０グループ２インフルエンザＡ型ウイルスのうちの２個以上）から選択され得る。
【００３１】
ＰＳＬ２構造の破壊は、ＩＡＶを劇的に阻害する。ＰＳＬ２は、全ての試験されたインフルエンザＡ型サブタイプにわたり保存される。図１、パネルａは、主題の方法において標的化され得るＰＳＬ２構造の例を示す。図４は、ＰＳＬ２構造を含有する目的のヌクレオチド配列の保存について例示する。いくつかの場合では、主題の組成物は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＨ５Ｎから選択される２つ以上のＩＡＶに対する活性のような、ＩＡＶに対する広域スペクトル活性を有する。
【００３２】
本開示の態様は、試料中のインフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）を阻害するための方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＳＬ２モチーフを有するウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を、ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合してインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する有効量の薬剤と接触させることを含む。いくつかの場合では、試料は、インビトロである。特定の場合では、試料は、インビボである。試料中のｖＲＮＡは、ビリオン中に含まれ得る。いくつかの場合では、ｖＲＮＡは、ウイルス粒子に感染した細胞のような、細胞中に含まれる。
【００３３】
本開示の態様は、細胞中のインフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）を阻害するための方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＳＬ２モチーフを有するウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む細胞を、ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合してインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する有効量の薬剤と接触させることを含む。いくつかの場合では、細胞は、インビトロである。特定の場合では、細胞は、インビボである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、試料（例えば、細胞）中のｖＲＮＡは、ＰＢ２  ｖＲＮＡを含む。本明細書で使用されるとき、「ＰＢ２  ｖＲＮＡ」とは、パッケージングステムループ２（ＰＳＬ２）と呼ばれる保存されたＲＮＡ構造要素を含むウイルスＲＮＡ（例えば、ＩＡＶ  ＲＮＡ）を意味する。薬剤は、ＰＳＬ２モチーフの特定の部位に結合してｖＲＮＡの全体的な構造を破壊し、これによりウイルスを阻害することができる（例えば、図１４参照）。例えば、図１は、野生型ＰＢ２及びパッケージング変異体ｖＲＮＡのＲＮＡ二次構造を例示する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、試料（例えば、細胞）を薬剤と接触させることは、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０ｌｏｇ１０のウイルスの力価損失のような、少なくとも２ｌｏｇ１０のウイルスの力価損失をもたらす。いくつかの実施形態では、薬剤は、ｖＲＮＡのＰＳＬ２モチーフと相補的な配列を含む（例えば、本明細書に記載されるような）オリゴヌクレオチド化合物、またはその塩である。
【００３６】
方法のいくつかの例では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、上に記載された配列のうちの１つ）のＰＢ２  ｖＲＮＡの領域への（例えば、ハイブリダイゼーションを介した）結合は、ＰＢ２  ｖＲＮＡの全体的な二次ＲＮＡ構造を破壊する。いくつかの場合では、主題の化合物は、ＰＢ２  ｖＲＮＡの５’末端コード領域の（−）センス表記中のヌクレオチド３４〜８７により定義される領域の少なくとも一部を標的とする。いくつかの場合では、化合物は、ＰＢ２  ｖＲＮＡの５’末端コード領域の（−）センス表記中のヌクレオチド１〜１４により定義される領域の少なくとも一部を標的とする。方法のいくつかの例では、方法は、ＰＳＬ２をｖＲＮＡに分解するようにＲＮａｓｅを動員することをさらに含む。
【００３７】
本開示の態様は、対象におけるインフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、（例えば、本明細書に記載されるような）ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のＰＳＬ２モチーフに特異的に結合する有効量の活性剤を含む薬学的組成物を投与することを含む。このようなものとして、いくつかの場合では、対象は、ウイルスに感染しているものである。特定の場合では、対象は、ウイルスに感染する危険性があるか、または感染している疑いがあるものである。いくつかの実施形態では、ｖＲＮＡは、ＰＢ２  ｖＲＮＡである。
【００３８】
対象に薬剤を投与するためのいずれかの便利なプロトコルが使用され得る。使用される特定のプロトコルは、例えば、投与の部位及び薬剤が、例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、タンパク質、ペプチド、または小分子であるかに応じて、変動し得る。インビボプロトコルについて、いずれかの便利な投与プロトコルが使用され得る。薬剤の同一性及び結合親和性、所望の応答、投与方法、例えば局所または全身、眼内、眼周囲、眼球後方、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、結膜下、鼻腔内、局所、点眼剤、ｉ．ｖ．ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、経口、等、移植床または移植組織の半減期、細胞数、またはサイズに応じて、様々なプロトコルが使用され得る。
【００３９】
主題の薬剤を含む薬学的組成物も提供される。いずれかの便利な賦形剤、担体、等を、組成物中に使用することができる。組成物において用途を見出す薬学的に許容される担体は、無菌水性または非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液を含み得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体としては、食塩水及び緩衝化媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液、または懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、補液及び栄養補給剤、（リンゲルデキストロースをベースとするもののような）電解質補給剤、等が挙げられる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガス、等のような、防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。薬剤組成物はまた、その後の再構成及び使用のために、凍結乾燥され得る。組成物は、本明細書に記載されるような担体も含むことができる。使用され得る担体の例としては、これらに限定されないが、ミョウバン、ミクロ粒子、リポソーム、及びナノ粒子が挙げられる。いずれかの便利な添加剤は、主題の活性剤の送達を増強するように主題の組成物中に含めることができる。目的の添加剤としては、細胞取込み増強剤、担体タンパク質、脂質、デンドリマー担体、炭水化物、等が挙げられる。
【００４０】
いくつかの場合では、薬学部組成物は、１つ以上の追加の活性剤をさらに含む。目的の活性剤としては、本開示の追加のオリゴヌクレオチド化合物及びいずれかの便利な目的の抗ウイルス化合物または薬物が挙げられる。これらに限定されないが、アマンタジン、リマンタジン、ザナミビル、オセルタミビル、ぺラミビル、等を含む。
【００４１】
薬剤
いずれかの便利な薬剤は、主題の方法及び組成物において目的の標的（例えば、ＰＳＬ２）の薬剤として使用され得る。目的の薬剤としては、これらに限定されないが、ＰＳＬ−２の配位子、ＰＳＬ２結合抗体、ＰＳＬ２のスキャフォールド化タンパク質結合剤、オリゴヌクレオチド、小分子、及びペプチド、またはこれらの断片、多様体、もしくは誘導体、または前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。
【００４２】
本開示に関して薬剤として使用され得る抗体は、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異的抗体、Ｆａｂ抗体断片、Ｆ（ａｂ）２抗体断片、Ｆｖ抗体断片（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、単鎖Ｆｖ抗体断片、及びｄｓＦｖ抗体断片を包含することができる。さらに、抗体分子は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。本開示に関して使用され得る抗体は、いずれかの免疫グロブリン定常領域に結合した、成熟または未処理の、いずれかの抗体可変領域を含むことができる。アミノ酸配列中の変化が、配列の７５％以上、例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上を維持する場合、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中の微変化は、本開示により包含される。特に、保存的アミノ酸置換が考慮される。保存的置換は、それらの側鎖中で関連したアミノ酸のファミリー内で起こるものである。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性を分析することにより決定することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は、（例えば、本明細書に記載されるような）抗体断片である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、薬剤は、スキャフォールド化ポリペプチド結合剤である。スキャフォールドとは、そこからポリペプチド剤が生じる基礎的なペプチド性フレームワーク（例えば、コンセンサス配列または構造モチーフ）を指す。基礎的なスキャフォールド配列は、固定される残基及び、得られたポリペプチド剤に、標的受容体への特異的結合のような、異なる機能を与え得る多様体残基を含む。こうした構造モチーフは、特定の二次及び三次構造要素の組み合わせとして、またはあるいは、アミノ酸残基の同等の一次配列として、特徴分析され、構造的に比較され得る。いずれかの便利なスキャフォールド及びスキャフォールド化ポリペプチドは、主題の方法において薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、こうした薬剤は、ファージディスプレイスクリーニングのような組換えスクリーニング方法を使用して同定され得る。目的のスキャフォールド化ポリペプチド結合剤としては、これらに限定されないが、アフィボディのような合成小タンパク質及び組換え小タンパク質が挙げられる。
【００４４】
いくつかの場合では、薬剤は、ＰＳＬ２に結合する小分子である。目的の小分子としては、これらに限定されないが、５０超〜約１０００未満Ｄａ、または５０超〜約５００未満Ｄａのような、５０超〜約２，５００未満ダルトン（Ｄａ）の分子量（ＭＷ）を有する小有機または無機化合物が挙げられる。「小分子」は、合成、組換え、または自然発生ポリペプチド及び核酸を含む、合成、半合成、または自然発生無機もしくは有機分子を含む、多数の生物及び化学クラスを包含する。目的の小分子は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含むことができ、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含むことができ、官能化学基のうちの少なくとも２つを含有することができる。小分子は、上記官能基のうちの１つ以上で置換された環式炭素または複素環式構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。小分子は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体、またはこれらの組み合わせを含む、生体分子中でも見出される。
【００４５】
オリゴヌクレオチド化合物
いくつかの実施形態では、薬剤は、オリゴヌクレオチドもしくはその誘導体、またはその塩（例えば、薬学的に許容される塩）である。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドは、（例えば、本明細書に記載されるような）ＰＳＬ２モチーフの特定のセグメントと相補的である。主題の方法において用途を見出す相補的オリゴヌクレオチドは、いくつかの場合では、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、約１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、またはさらにこれを超えるような、少なくとも５個であろう。いくつかの場合では、相補的オリゴヌクレオチドは、２５個以下のヌクレオチドの長さ、２０個以下のヌクレオチドの長さ、または１５個以下のヌクレオチドの長さような、３０個以下のヌクレオチドの長さであり、長さは、阻害の効率、交差反応性の非存在を含む、特異性、等により決定される。本開示は、例えば、７または８〜１５個のヌクレオチドの長さの、ＰＳＬ２機能の強い選択的な阻害剤であり得る、短いオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、活性剤は、ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域と相補的な少なくとも８個のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド配列を含む化合物である。いくつかの実施形態では、活性剤は、ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域と相補的な少なくとも８個及び２０個以下（例えば、１５個以下）のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド配列を含む化合物である。
【００４６】
特異的領域または内在性鎖ＰＳＬ２配列の領域は、オリゴヌクレオチド剤により相補されるように選択される。オリゴヌクレオチドの特異的配列の選択は、（例えば、本明細書に記載されるような）構造分析に基づき、いくつかの候補配列がインビトロまたは動物モデルにおいて標的ＩＡＶの阻害について分析される、経験的方法を使用し得る。標的ＰＳＬ２のいくつかの領域がアンチセンス相補性について選択されるオリゴヌクレオチド及び配列の組み合わせも使用され得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、薬剤は、ｖＲＮＡのＰＳＬ２モチーフと相補的な少なくとも５個のヌクレオシドサブユニット（例えば、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個）を含むオリゴヌクレオチド化合物、またはその塩である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの結合のうちの１つ以上は、メチルホスホネート、Ｐ３’→Ｎ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデート、Ｎ３’→Ｐ５’チオホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、及びホスホロチオエート結合から選択される。特定の例では、オリゴヌクレオチド配列は、ロックド核酸である。特定の例では、オリゴヌクレオチド配列は、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、またはさらにこれを超えるような、１個以上のロックド核酸ヌクレオチドを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも５個のデオキシリボヌクレオチドユニット（例えば、ＰＳＬ２モチーフと相補的なユニット）（例えば、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個）を含み、ＲＮａｓｅを動員することができるオリゴヌクレオチドである。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドは、標的ｖＲＮＡのより小さな成分への分解を触媒するようにＲＮａｓｅを動員する。ＲＮａｓｅを動員するためのいずれかの便利な方法及び部分は、主題の薬剤（例えば、オリゴヌクレオチド）中に組み込むことができる。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド剤は、目的のＲＮａｓｅを動員する配列をさらに含む。特に指示されない限り、本明細書で描写されるようなオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列、（例えば、Ｕが任意でＴを置換することができる）ＲＮＡ配列、混合ＲＮＡ／ＤＮＡ配列、ならびに、ＬＮＡ類似体のような、配列の１つ以上のヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである類似体、及び／または１つ以上のヌクレオシド間結合が、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、もしくはチオホスホルアミデート結合のような非自然発生結合で置換される類似体を含む、これらの類似体を含むことを意味すると理解されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、
５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号４５）、
５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号４６）、
５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４７）、
５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号４８）、
５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４９）、
５’  ＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡ  ３’（配列番号５０）、
５’  ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＧＣＣ  ３’（配列番号５１）、
５’  ＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧ  ３’（配列番号５２）、
５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号５３）、
５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号５４）、
５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号５５）、
５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５６）、
５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５７）、
５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５８）、
５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５９）、
５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６０）、
５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６１）、
５’  ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡ  ３’（配列番号６２）、
５’  ＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＧＴＧ  ３’（配列番号６３）、
５’  ＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡ  ３’（配列番号６４）、
５’  ＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡ  ３’（配列番号６５）、及び
５’  ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡ  ３’（配列番号６６）から選択される配列を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号４５）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号４６）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４７）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号４８）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４９）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡ  ３’（配列番号５０）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＧＣＣ  ３’（配列番号５１）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧ  ３’（配列番号５２）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号５３）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号５４）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号５５）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５６）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５７）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５８）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５９）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６０）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６１）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡ  ３’（配列番号６２）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＧＴＧ  ３’（配列番号６３）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡ  ３’（配列番号６４）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡ  ３’（配列番号６５）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列：５’  ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡ  ３’（配列番号６６）を含む。
【００５１】
いくつかの例では、オリゴヌクレオチド化合物（例えば、上に記載された配列のうちの１つ）のＰＢ２  ｖＲＮＡ領域への（例えば、ハイブリダイゼーションを介した）結合は、ＰＢ２  ｖＲＮＡの全体的な二次ＲＮＡ構造を破壊する。
【００５２】
オリゴヌクレオチド配列は、いずれかの便利な数のＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＬＮＡヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド配列のいくつかの例では、配列は、混合ＲＮＡ／ＤＮＡ配列である。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド配列のいくつかの例では、配列は、混合ＬＮＡ／ＤＮＡ配列である。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド配列のいくつかの例では、配列は、混合ＬＮＡ／ＲＮＡ配列である。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド配列のいくつかの例では、配列は、ＬＮＡヌクレオチドのみを含む。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド配列のいくつかの例では、配列は、ＤＮＡヌクレオチドのみを含む。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド配列のいくつかの例では、配列は、ＲＮＡヌクレオチドのみを含む。
【００５３】
特定の例では、主題のオリゴヌクレオチドは、配列中のヌクレオチドのタイプの下記の配置のうちの１つ（例えば、配列番号４５〜６６のうちの１つ）を有する：
Ａが８個以上のＬＮＡヌクレオチドの配列である、Ａ、
Ｂが６〜８個のＤＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ａが３〜４個のＬＮＡヌクレオチドの配列である、Ａ−Ｂ−Ａ、
Ｂが７〜８個のＤＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ａが４個のＬＮＡヌクレオチドの配列である、Ａ−Ｂ−Ａ、
各Ｌが１〜２個のＬＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ｄが２個のＤＮＡヌクレオチドの配列である、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ、
各Ｌが１〜２個のＬＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ｄが１〜２個のＤＮＡヌクレオチドの配列である、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ、
各Ｌが１〜２個のＬＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ｄが１〜３個のＤＮＡヌクレオチドの配列である、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ、
各Ｌが１〜２個のＬＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ｄが１〜３個のＤＮＡヌクレオチドの配列である、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ、及び
各Ｌが１〜２個のＬＮＡヌクレオチドの配列であり、各Ｄが１〜２個のＤＮＡヌクレオチドの配列である、Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ。
【００５４】
主題のオリゴヌクレオチド配列は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、及び／またはチオホスホルアミデート結合のような、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合をさらに含み得る。非自然発生ヌクレオシド間結合は、主題のオリゴヌクレオチドの配列のいずれかの便利な位置で含まれ得る。
【００５５】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、大文字がＬＮＡヌクレオチドを示し、小文字がＤＮＡヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチドユニット）を示す、下記の配列のうちの１つを有する：
ＬＮＡ１：５’  ＡｃｃＡａａＡＧａａＴ  ３’（配列番号６７）、
ＬＮＡ２：５’  ＴｇｇＣｃＡＴｃａａＴ  ３’（配列番号６８）、
ＬＮＡ３：５’  ＴａｇＣＡｔＡｃｔｔＡ  ３’（配列番号６９）、
ＬＮＡ４：５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号７０）、
ＬＮＡ５：５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号７１）、
ＬＮＡ６：５’  ＣａｇａＣａＣＧａＣＣａａＡＡ  ３’（配列番号７２）、
ＬＮＡ７：５’  ＴＡｃＴｔａＣＴｇａＣａｇＣＣ  ３’（配列番号７３）、
ＬＮＡ８：５’  ＡＧＡＣａｃｇａｃｃａＡＡＡＧ  ３’（配列番号７４）、
ＬＮＡ９：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号７５）、
ＬＮＡ９．２：５’  ＴＡＣｔｔａｃｔｇａｃＡＧＣＣ  ３’（配列番号７６）、
ＬＮＡ１０：５’  ＡＣＣａａａａｇＡＡＴ  ３’（配列番号７７）、
ＬＮＡ１１：５’  ＴＧＧｃｃａｔｃＡＡＴ  ３’（配列番号７８）、
ＬＮＡ１２：５’  ＴＡＧｃａｔａｃＴＴＡ  ３’（配列番号７９）、
ＬＮＡ１３：５’  ＣｇａｃＣＡａａＡＧａａｔｔＣ  ３’（配列番号８０）、
ＬＮＡ１４：５’  ＣＧＡＣｃａａａａｇａＡＴＴＣ  ３’（配列番号８１）、
ＬＮＡ１５：５’  ＧａＴＧｇＣｃＡＴｃａＡｔｔＡ  ３’（配列番号８２）、
ＬＮＡ１６：５’  ＧＡＴＧｇｃｃａｔｃａＡＴＴＡ  ３’（配列番号８３）、
ＬＮＡ１７：５’  ＴｃＴＡｇＣａＴＡｃｔＴａｃＴ  ３’（配列番号８４）、
ＬＮＡ１８：５’  ＴＣＴＡｇｃａｔａｃｔＴＡＣＴ  ３’（配列番号８５）、
ＬＮＡ１９：５’  ＧＡＡｔｔｃｇｇａｔｇＧＣＣＡ  ３’（配列番号８６）、
ＬＮＡ２０：５’  ＧＧＣＣａｔｃａａｔｔａＧＴＧ  ３’（配列番号８７）、
ＬＮＡ２１：５’  ＴＴＣＧｇａｔｇｇｃｃａＴＣＡ  ３’（配列番号８８）、
ＬＮＡ２２：５’  ＡＧＣＣａｇａｃａｇＣＧＡ  ３’（配列番号８９）、及び
ＬＮＡ２３：５’  ＧＡＣＡｇｃｃａｇａｃａＧＣＡ  ３’（配列番号９０）。
【００５６】
上に記載されたオリゴヌクレオチド配列の配列変異体も、本開示により包含される。本明細書に記載される配列のいずれかでは、１、２、３、４個以上のヌクレオチドが、向上した阻害活性、修飾剤との複合、等のような、所望の特性を提供するように変異され得ることは、理解されている。
【００５７】
いくつかの場合では、本明細書に記載される配列のいずれか１つ（例えば、配列番号４５〜９６のうちの１つ）は、より長い配列中に含まれ、例えば、追加の５’及び／または３’ヌクレオチドを含む。特定の例では、主題のオリゴヌクレオチドは、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、または１０個以下のヌクレオチドの長さのような、３０個以下のヌクレオチドの長さである。
【００５８】
いくつかの場合では、主題のオリゴヌクレオチド化合物は、本明細書に記載される配列のうちの１つ（例えば、配列番号４５〜９６のうちの１つ）に対する欠失を有する配列を含む。例えば、１、２、または３個のヌクレオチドが、配列、例えば、配列番号４５〜９６のうちの１つの５’及び／または３’末端から欠失した配列である。いくつかの場合では、欠失配列は、配列番号４５〜９６のうちの１つの５’末端から１個のヌクレオチドが失われている。いくつかの場合では、欠失配列は、配列番号４５〜９６のうちの１つの３’末端から１個のヌクレオチドが失われている。いくつかの場合では、欠失配列は、配列番号４５〜９６のうちの１つの５’末端から２個のヌクレオチドが失われている。いくつかの場合では、欠失配列は、配列番号４５〜９６のうちの１つの３’末端から２個のヌクレオチドが失われている。
【００５９】
特定の場合では、オリゴヌクレオチド配列は、標的ＰＳＬ２配列中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）をカバーするように設計された変異を含むことができる。いくつかの場合では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ９標的配列でのヌクレオチド変化を含有するＰＬＳ２標的配列に対して保護する単一変異部位を含むＬＮＡ９の修飾バージョンである。目的のＳＮＰ変異は、本明細書に記載される配列のいずれかに適用することができると理解されている。目的の変異配列としては、これらに限定されないが、下記：
５’  ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＧＴＣ  ３’（配列番号９１）、
５’  ＴＡＣＴＴＡＣＣＧＡＣＡＧＣＣ  ３’（配列番号９２）、及び
５’  ＧＧＡＴＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡ  ３’（配列番号９３）が挙げられる。
【００６０】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、大文字がＬＮＡヌクレオチドを示し、小文字がＤＮＡヌクレオチドを示す、下記の配列のうちの１つを有する：
ＬＮＡ９．Ｇ７４Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＴＣ  ３’（配列番号９４）、
ＬＮＡ９．Ｔ８０Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｃｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号９５）、及び
ＬＮＡ１９．Ｕ５６Ｃ：５’  ＧＧＡＴｔｔｃｇｇａｔｇｇＣＣＡ  ３’（配列番号９６）。
【００６１】
特定の例では、オリゴヌクレオチドは、ＰＳＬ２構造の特定の領域（例えば、ヌクレオチド３４〜８７に対応するサブ領域）に対応する最大長さを有する。特定の例では、オリゴヌクレオチドの長さは、１５個以下のヌクレオチド、１４個以下のヌクレオチド、１３個以下のヌクレオチド、１２個以下のヌクレオチド、１１個以下のヌクレオチド、１０個以下のヌクレオチド、９個以下のヌクレオチド、８個以下のヌクレオチド、７個以下のヌクレオチド、またはさらにそれ未満のような、２０個以下のヌクレオチドである。
【００６２】
オリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られる方法（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、上記、及びＭｉｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記参照）により化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドは、それらの細胞内安定性及び結合親和性を増加させるために、天然ホスホジエステル構造から化学的に修飾され得る。骨格、糖、または複素環塩基の化学を変更する多数のこうした修飾については文献に記載されている。
【００６３】
骨格化学における有用な変化には、ホスホロチオエート、非架橋酸素の両方が硫黄で置換される、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステル、及びボラノホスフェートがある。アキラルホスフェート誘導体としては、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネート、３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデート、及びチオホスホルアミデートが挙げられる。ペプチド核酸は、ペプチド結合を含む全リボースホスホジエステル骨格を置換する。糖修飾も、安定性及び親和性を向上させるのに使用される。塩基が天然β−アノマーに対して反転される、デオキシリボースのα−アノマーが使用され得る。リボース糖の２’−ＯＨは、親和性を悪化させることなく耐分解性を提供する、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成するように変更され得る。複素環塩基の修飾は、適切な塩基対形成を維持しなければならない。いくつかの有用な置換としては、デオキシウリジンのデオキシチミジンでの、５−メチル−２’−デオキシシチジン及び５−ブロモ−２’−デオキシシチジンのデオキシシチジンでの置換が挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジン及び５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれ、デオキシチミジン及びデオキシシチジンで置換される場合、親和性及び生物活性を増加させることが示されている。
【００６４】
オリゴヌクレオチド剤は、いずれかの便利な修飾剤で、例えば、修飾剤の、オリゴヌクレオチド配列の５’−及び／または３’末端との複合により、誘導体化され得る。いくつかの場合では、修飾剤は、細胞取込みを増強する部分（例えば、脂質）である。いずれかの便利な脂質は、主題のオリゴヌクレオチドと複合され得る。いくつかの例では、修飾剤は、任意のリンカーを介して５’または３’末端に結合した脂肪酸である。脂質基は、これらに限定されないが、炭化水素及び脂肪酸の誘導体を含む、脂肪族炭化水素または脂肪酸とすることができ、例としては、ミリスチン（テトラデカン）酸、パルミチン（ヘキサデカン）酸、及びステアリン（オクタデカン）酸のような、１４〜２０個の炭素を有する飽和直鎖化合物、ならびにそれらの対応する脂肪族炭化水素形態、テトラデカン、ヘキサデカン、及びオクタデカンがある。使用され得る他の適切な脂質基の例としては、コレステロールのような、ステロール、置換脂肪酸、及び炭化水素、特にこれらの基の多フッ素化形態がある。脂質基の範囲は、アミン、アミド、エステル、及びカルバメート誘導体のような誘導体を含む。
【００６５】
いくつかの場合では、修飾剤は、所望の活性（例えば、本明細書に記載される、ＲＮａｓｅの動員）を有するさらなる核酸配列である。特定の例では、修飾剤は、細胞特異的タンパク質のような、特定の標的へのオリゴヌクレオチドの送達を提供する特異的な結合活性を有する。いくつかの場合では、修飾剤は、目的の細胞特異的標的に特異的に結合する、目的の抗体である。特定の例では、抗体修飾剤は、ヘマグルチニン（ＨＡ）標的に特異的に結合する。
【００６６】
オリゴヌクレオチド活性剤は、いずれかの便利な形態で使用することができる。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド活性剤は、一本鎖である。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド活性剤は、二本鎖である。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド活性剤は、ｓｉＲＮＡである。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド活性剤は、ｓｈＲＮＡである。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド活性剤は、ｓｓＲＮＡである。いくつかの例では、ｓｓＲＮＡの１個以上のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドで置換することができる。いくつかの例では、オリゴヌクレオチド活性剤は、ｓｓＤＮＡである。いくつかの例では、ｓｓＤＮＡの１個以上のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドで置換することができる。
【００６７】
治療方法
本開示の態様は、対象におけるインフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防方法を含む。主題のオリゴヌクレオチド化合物は、パッケージングを効率的に破壊し、そうでなければ致死的な疾患をインビボで完全に予防することができる、新たなクラスの抗ウイルス治療薬としての用途を見出す。実施例セクションにおいて示されるように、例示的なオリゴヌクレオチド化合物のインビボ鼻腔内投与は、強力な抗ウイルス有効性をもたらし、マウスにおける致死的ＩＡＶ感染を予防した。
【００６８】
方法の態様は、それを必要とする対象に、対象を感染症について治療または対象における感染を予防するために、治療有効量の主題の化合物を投与することを含む。「治療有効量」とは、所望の生物学的効果（例えば、状態または疾患、インフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防）を誘導するのに十分な化合物の濃度を意味する。「治療」とは、宿主に影響を及ぼす状態と関連した症状の少なくとも改善が達成されることを意味し、改善とは、パラメータ、例えば、治療されている状態と関連した症状の程度の少なくとも低減を指すように広範囲の意味で使用される。このようなものとして、治療は、病理学的状態、または少なくともそれと関連した症状が、宿主がその状態、または少なくともその状態を特徴付ける症状をこれ以上患っていないように、完全に阻害される、例えば、発生が予防される、または停止される、例えば、終了される状況も含む。よって治療は、（ｉ）予防、すなわち、臨床症状を発症させないことを含む、臨床症状の発症のリスクを低減すること、例えば、有害な状態までの疾患進行を予防すること、（ｉｉ）阻害、すなわち、臨床症状の発症もしくはさらなる進行を停止すること、例えば、活動性疾患（例えば、感染症）を緩和もしくは完全に阻害すること、及び／または（ｉｉｉ）軽減、すなわち、臨床症状の退縮を引き起こすことを含む。インフルエンザＡ型ウイルス感染の文脈では、「治療する」という用語は、患者試料中のウイルス細胞の数を低減すること、ウイルス細胞の複製を阻害すること、及び感染症と関連した１つ以上の症状を改善することのいずれかまたは全てを含む。
【００６９】
治療される対象は、治療される宿主が主題の化合物を使用する治療が可能なものである療法を必要とするものであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、インフルエンザＡ型ウイルス感染を有する疑いがあるものである。特定の実施形態では、対象は、インフルエンザＡ型ウイルス感染を有すると診断される。このようなものとして、いくつかの場合では、対象は、ウイルスに感染しているものである。
【００７０】
特定の場合では、対象は、ウイルスに感染する危険性があるか、または感染している疑いがあるものである。いくつかの実施形態では、ｖＲＮＡは、ＰＢ２  ｖＲＮＡである。主題の方法は、対象のインフルエンザＡ型ウイルス感染を予防するのに使用することができる。「予防」とは、インフルエンザＡ型ウイルス感染の危険性がある対象が、通常は感染を引き起こすであろう条件下でのウイルスへの曝露にかかわらず、感染していないことを意味する。いくつかの場合では、主題の活性剤（例えば、オリゴヌクレオチド化合物）の投与は、対象を感染に対して、２週間以上、３週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、等のように、１週間以上保護する。複数回用量の主題の化合物は、対象の感染からの長期間にわたる保護を提供する主題の方法に従って投与することができる。タイミング及び投与量は、従来の方法を使用して容易に決定することができる。
【００７１】
いくつかの場合では、主題の治療方法は、対象がインフルエンザＡ型ウイルス感染を有するかを決定または診断するステップを含む。決定ステップは、いずれかの便利な方法を使用して行うことができる。いくつかの場合では、決定ステップは、対象から生体試料を得ることと、試料をウイルス細胞の存在について分析することとを含む。試料は、細胞試料であり得る。決定ステップは、特定の変異を含むウイルス細胞の同定を含むことができる。
【００７２】
したがって、様々な対象は、本明細書に記載される主題の化合物及び薬学的組成物を使用する治療が可能であり得る。本明細書で使用されるとき、「対象」及び「宿主」という用語は、相互互換的に使用される。一般的に、こうした対象は「哺乳類」であり、ヒトが目的である。他の対象としては、家庭用ペット（例えば、イヌ及びネコ）、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、等）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、ラット、例えば、疾患の動物モデル）、及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー及びサル）を挙げることができる。
【００７３】
投与される主題の化合物の量は、いずれかの便利な方法を使用して、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと関連して所望の効果をもたらすのに十分な量となるように決定することができる。本開示の単位剤形についての仕様は、使用される特定の化合物及び達成される効果、ならびに宿主中の各化合物と関連した薬力学に依存するであろう。
【００７４】
いくつかの実施形態では、主題の化合物の有効量は、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約４０μｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約８００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約７００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約６００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ〜約８５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約９００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約８００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約７００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約６００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、または約２００ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌ）の範囲の量である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、主題の化合物の有効量は、約１０ｐｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約１０ｐｇ〜約５０ｐｇ、約５０ｐｇ〜約１５０ｐｇ、約１５０ｐｇ〜約２５０ｐｇ、約２５０ｐｇ〜約５００ｐｇ、約５００ｐｇ〜約７５０ｐｇ、約７５０ｐｇ〜約１ｎｇ、約１ｎｇ〜約１０ｎｇ、約１０ｎｇ〜約５０ｎｇ、約５０ｎｇ〜約１５０ｎｇ、約１５０ｎｇ〜約２５０ｎｇ、約２５０ｎｇ〜約５００ｎｇ、約５００ｎｇ〜約７５０ｎｇ、約７５０ｎｇ〜約１μｇ、約１μｇ〜約１０μｇ、約１０μｇ〜約５０μｇ、約５０μｇ〜約１５０μｇ、約１５０μｇ〜約２５０μｇ、約２５０μｇ〜約５００μｇ、約５００μｇ〜約７５０μｇ、約７５０μｇ〜約１ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約５０ｍｇ〜約１００ｍｇの範囲の量である。その量は、単回投与量または合計一日量であり得る。合計一日量は、１０ｐｇ〜１００ｍｇの範囲、または１００ｍｇ〜約５００ｍｇの範囲、または５００ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲であり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、単回用量の主題の化合物が投与される。他の実施形態では、複数回用量の主題の化合物が投与される。複数回用量がある期間にかけて投与される場合、主題の化合物は、１日２回（ｑｉｄ）、１日１回（ｑｄ）、１日おきに（ｑｏｄ）、２日おきに、週３回（ｔｉｗ）、または週２回（ｂｉｗ）、ある期間にかけて投与することができる。例えば、化合物は、１日２回、１日１回、１日おきに、週３回、または週２回、１日〜約２年以上の期間にかけて投与することができる。例えば、化合物は、前述の頻度のいずれかで、様々な要素に応じて、１週間、２週間、１か月、２か月、６か月、１年、または２年以上にわたり投与することができる。
【００７７】
様々な方法のいずれかを使用して、治療方法が効果的であるかを決定することができる。例えば、主題の方法で治療された個体から得られる生体試料は、ウイルス細胞の存在及び／またはレベルについて分析することができる。対象に対する治療方法の有効性の評価は、いずれかの便利な方法を使用して、治療前、その間、及び／またはその後の対象の評価を含むことができる。主題の方法の態様は、治療に対する対象の治療応答を評価するステップをさらに含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、方法は、治療されている目的の疾患または状態と関連した対象の１つ以上の症状を診断または評価することを含む、対象の状態を評価することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象から生体試料を得ることと、試料を、例えば、目的の（例えば、本明細書に記載される）疾患または状態と関連したウイルス細胞またはその成分の存在について分析することとを含む。試料は、細胞試料であり得る。主題の方法の評価ステップは、いずれかの便利な方法を使用して、主題の化合物の投与前、その間、及び／またはその後に１回以上で行うことができる。特定の場合では、評価ステップは、ウイルス細胞の同定及び／または定量を含む。特定の例では、対象を評価することは、対象がウイルス感染症またはその症状を有するかを診断することを含む。
【００７９】
スクリーニング方法
本開示の態様は、例えば、上で論評されるように、本発明の方法において用途を見出す薬剤を同定するように構成されたスクリーニングアッセイも含む。本開示の態様は、候補薬剤を細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する能力についてスクリーニングするための方法を含む。いくつかの例では、方法は、ＰＳＬ２モチーフを含むウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を候補薬剤と接触させることと、候補薬剤がＰＳＬ２モチーフに特異的に結合するかを決定することとを含む。いくつかの場合では、ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合する薬剤は、インフルエンザＡ型ウイルス感染を有する対象を治療するであろう。評価または決定とは、所定の試験化合物が、動物モデル及び／または臨床アッセイのような、追加のアッセイにおける化合物のさらなる試験が望ましいような、所望の活性を有することを少なくとも予測することを意味する。
【００８０】
候補薬剤は、小分子、オリゴヌクレオチド、抗体、及びポリペプチドから選択される。いくつかの例では、決定ステップは、細胞パラメータを検出することを含み、細胞中のパラメータの、候補薬剤と接触していない細胞中と比較した変化は、候補薬剤がＰＳＬ２モチーフに特異的に結合することを示す。いくつかの場合では、主題のスクリーニング方法は、ＳＨＡＰＥ分析（プライマー伸長により分析される選択的２’−ヒドロキシルアシル化）の方法である。特定の例では、候補薬剤は、オリゴヌクレオチドである。
【００８１】
薬物スクリーニングは、インビトロモデル、遺伝子改変細胞もしくは動物、または精製ＰＳＬ２タンパク質を使用して行われ得る。リード薬剤の作用と競合、これを調整、または模倣する配位子を同定することができる。薬物スクリーニングは、ＰＳＬ２モチーフの特定の部位に結合する薬剤を同定する。標識インビトロ結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合についての免疫アッセイ、等を含む、多種多様なアッセイがこの目的で使用され得る。本明細書に記載される構造研究から導かれるＰＳＬ２の３次元構造の知識は、ＩＡＶ活性を特異的に阻害する小薬物の合理的設計ももたらすことができる。
【００８２】
本明細書において使用される「薬剤」という用語は、ＰＳＬ２に結合してＩＡＶを阻害する能力を有する、いずれかの分子、例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、または医薬品を表す。一般的には、複数のアッセイ混合物は、異なる薬剤濃度で並行して分析され、様々な濃度に対する特異的応答が得られる。典型的には、これらの濃度のうちの１つは、陰性対照として、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル未満で作用する。
【００８３】
候補薬剤は、オリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、及び有機分子、例えば、５０超〜約２，５００未満ダルトンの分子量を有する小有機化合物のような、多数の化学クラスを包含する。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは官能化学基のうちの少なくとも２つを含む。候補薬剤は、多くの場合、上記官能基のうちの１つ以上で置換された環式炭素または複素環式構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体、またはこれらの組み合わせを含む、生体分子中でも見出される。
【００８４】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子のランダム及び指向性合成には多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、入手可能であるか、または容易に作製される。また、天然または合成的に作製されたライブラリー及び化合物は、従来の化学、物理、及び生化学的手段を通して容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作製するのに使用され得る。既知の薬理学的薬剤には、構造的類似体を作製するためのアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化、等のような、指向性またはランダム化学修飾が行われ得る。特定の実施形態における目的は、血液脳関門を通過する化合物である。
【００８５】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、分子のうちの１つ以上は、シグナル生成システムのメンバー、例えば、標識に結合され得、標識は検出可能なシグナルを直接的または間接的に提供することができる。様々な標識としては、これらに限定されないが、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁気粒子、等が挙げられる。特異的結合分子は、ビオチン及びストレプトアビジン、ジゴキシン及び抗ジゴキシン、等のような、ペアを含む。特異的結合メンバーについて、相補的メンバーは通常は、既知の手順に従って、検出をもたらす分子で標識されるであろう。
【００８６】
様々な他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれ得る。これらとしては、最適なタンパク質間結合を促進及び／または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用される、塩、中性タンパク質、例えば、アルブミン、洗浄剤、等のような試薬が挙げられる。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤、等のような、アッセイの効率を向上させる試薬が使用され得る。成分の混合物は、必要な結合をもたらすいずれかの順序で添加される。インキュベーションは、いずれかの適切な温度、典型的には４〜４０℃で行われる。インキュベーション期間は、最適活性について選択されるが、高速ハイスループットスクリーニングを促進するように最適化してもよい。典型的には、０．１〜１時間で十分であろう。
【実施例】
【００８７】
下記の実施例は、当業者に、本発明をどのように実施及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するために記載され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定することも意図せず、下の実験が全てまたは行われた実験のみであることを表すことも意図しない。使用される数値（例えば、量、温度、等）に関して精度を確保する努力がなされたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその近くである。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対、ｋｂ、キロベース、ｐｌ、ピコリットル、ｓまたはｓｅｃ、秒、ｍｉｎ、分、ｈまたはｈｒ、時間、ａａ、アミノ酸、ｋｂ、キロベース、ｂｐ、塩基対、ｎｔ、ヌクレオチド、ｉ．ｍ．、筋肉内、ｉ．ｐ．、腹腔内、ｓ．ｃ．、皮下、等が使用され得る。
【００８８】
材料及び方法
細胞及びウイルス：ＨＥＫ２９３Ｔ及びＭＤＣＫ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓａｓｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン−ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）において維持した。インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）Ｈ１Ｎ１ウイルスを、８プラスミド逆遺伝学システムを使用して作製した。組織培養された馴化インフルエンザＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（ＨＫ６８）Ｈ３Ｎ２ウイルスを、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ−ＶＲ−１６７９）から入手した。ウイルスは、１０日齢特定病原体不在ニワトリ胚において３５℃で増殖及び増幅させた（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＳＰＡＥＡＳ）。
【００８９】
プラスミド構成物及びクローニング：インフルエンザウイルスＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）［ＰＲ８］、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／４７０／２００４（Ｈ３Ｎ２）［ＮＹ４７０］、Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３１２／２００１（Ｈ１Ｎ１）［ＮＹ３１２］、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）［１９１８］、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）［ＣＡ０９］、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）［ＶＮ１２０３］、及びＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）からの野生型ＰＢ２セグメントを含有するプラスミドを使用した。ＰＲ８パッケージング変異体ｖＲＮＡの作製のために、我々は、ＰＲ８のＰＢ２遺伝子を含有するｐＤＺプラスミドの変異誘発のためのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ部位指向性変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。各変異構成物の配列を、自動化シーケンシングにより確認した。
【００９０】
逆遺伝学及びウイルス力価測定：インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８）ウイルスを、８プラスミド逆遺伝学システム（Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を使用して作製した。簡潔には、組換えＰＲ８ウイルスを作製するために、２９３Ｔ／ＭＤＣＫ共培養物の１０６細胞を、１ｕｇの、ゲノムｖＲＮＡ及びｍＲＮＡの同時合成のための双方向性二重ＰｏｌＩ／ＩＩプロモーターシステムを使用するプラスミド内に含有される８個のセグメントの各々のうちの１つで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの２４時間後に回収し、１０日齢ニワトリ胚（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、研究グレード特定病原体不在卵）の尿膜腔に接種した。組換えウイルスのレスキューは、赤血球凝集活性により評価した。各々の新たにレスキューされたウイルスをプラーク力価測定し、変異を変異遺伝子のシーケンシングにより確認した。プラークアッセイは、コンフルエントなＭＤＣＫ細胞に対して以前に記載されたように（Ｓｚｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）実施した。赤血球凝集（ＨＡ）アッセイは、９６ウェル丸底プレートにおいて室温で、５０ｕｌのウイルス希釈液及び５０ｕｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の七面鳥赤血球の０．５％懸濁液を使用して行った。
【００９１】
ウイルス増殖速度：ＰＲ８ウイルスについての増殖速度を、１０日齢ニワトリ卵の１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルス接種により決定した。接種の７２時間後、尿膜腔液中のウイルス力価を、ＭＤＣＫ細胞に対するプラークの力価測定により決定した。
【００９２】
パッケージ化ｖＲＮＡの単離：パッケージ化ｖＲＮＡをＰＲ８変異ウイルスについて分析するために、１０日齢卵に約１０００ＰＦＵの組換えウイルスを接種し、７２時間インキュベートした。尿膜腔液を採取し、上清を低速遠心分離により浄化した。浄化上清を次に、３０％スクロースクッション上に積層し、３０，０００ＲＰＭで２．５時間にわたって超遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｒｏｔｏｒ  ＳＷ４１）。ペレット化ウイルスを、ＰＢＳに再懸濁させ、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出した。沈降ｖＲＮＡを、２０ｕｌの最終体積の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁させ、−８０℃で保存した。
【００９３】
パッケージ化ｖＲＮＡのｑＰＣＲ分析：約２００ｎｇの抽出ｖＲＮＡを、ユニバーサル３’プライマー（５’−ＡＧＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＣＲＡＡＡＧＣＡＧＧ）（配列番号９７）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（ＲＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。ＲＴ産物を１０，０００倍希釈し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）のためのテンプレートとして使用した。別個のＰＣＲを次に、以前に記載されたように（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）セグメント特異的プライマーで実施した。１０ｕｌ反応混合物は、１ｕｌの希釈ＲＴ産物、０．５ｕＭのプライマー濃縮物、ならびにＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ色素、２００ｕＭのデオキシヌクレオシド三リン酸、熱不安定性ＵＤＧ、最適化ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂｕｆｆｅｒ、及びＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼＵＰ酵素を含んだＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含有した。相対ｖＲＮＡ濃度をサイクル閾値の分析により決定し、総ｖＲＮＡ量をＨＡｖＲＮＡのレベルの同等化により正規化した後、組込みの割合を野生型ｖＲＮＡパッケージングのレベルに対して計算した。ウイルスパッケージング結果は、３通り定量化されたｖＲＮＡレベルでの、２つの独立したウイルス精製から導かれたｖＲＮＡ組込み±標準偏差の平均レベル、ｎ＝６を表す。
【００９４】
マウス感染：６〜８週齢雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のグループに、イソフルランで浅く麻酔をかけ、５０ｕｌの１０００ＰＦＵの野生型マウス馴化ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）ウイルス（ＡＴＣＣ）、ＰＢ２変異ＰＲ８組換えウイルス、または無菌ＰＢＳで鼻腔内感染させた。体重を毎日測定し、動物を１０日目までまたは体重減少が２０％を超えた際に人道的に犠死させた。全ての動物飼育及び実験手順は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従い、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅにより承認される。
【００９５】
ロックド核酸（ＬＮＡ）設計及び調製：ロックド核酸（ＬＮＡ）を含有するオリゴヌクレオチドを、Ｅｘｉｑｏｎからカスタム合成した。大文字は、ＬＮＡを示す。小文字は、典型的な（非ロックド）ＤＮＡヌクレオチドを示す。全てのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有した。ＬＮＡは、セグメントＰＢ２のＰＳＬ２構造に含有される異なる配列と相補的となるように設計された。ＬＮＡ８及び９は、ＲＮＡｓｅ−Ｈ動員のための一続きの６〜８個のＤＮＡヌクレオチドを含有するように設計される。全てのＬＮＡの配列を下に示す。
ＬＮＡ１：５’  ＡｃｃＡａａＡＧａａＴ  ３’（配列番号６７）
ＬＮＡ２：５’  ＴｇｇＣｃＡＴｃａａＴ  ３’（配列番号６８）
ＬＮＡ３：５’  ＴａｇＣＡｔＡｃｔｔＡ  ３’（配列番号６９）
ＬＮＡ４：５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号７０）
ＬＮＡ５：５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号７１）
ＬＮＡ６：５’  ＣａｇａＣａＣＧａＣＣａａＡＡ  ３’（配列番号７２）
ＬＮＡ７：５’  ＴＡｃＴｔａＣＴｇａＣａｇＣＣ  ３’（配列番号７３）
ＬＮＡ８：５’  ＡＧＡＣａｃｇａｃｃａＡＡＡＧ  ３’−ＲＮａｓｅ−Ｈ活性を含む（配列番号７４）
ＬＮＡ９：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＣＣ  ３’−ＲＮａｓｅ−Ｈ活性を含む（配列番号７５）
ＬＮＡ９．２：５’  ＴＡＣｔｔａｃｔｇａｃＡＧＣＣ  ３’（配列番号７６）
ＬＮＡ１０：５’  ＡＣＣａａａａｇＡＡＴ  ３’（配列番号７７）
ＬＮＡ１１：５’  ＴＧＧｃｃａｔｃＡＡＴ  ３’（配列番号７８）
ＬＮＡ１２：５’  ＴＡＧｃａｔａｃＴＴＡ  ３’（配列番号７９）
ＬＮＡ１３：５’  ＣｇａｃＣＡａａＡＧａａｔｔＣ  ３’（配列番号８０）
ＬＮＡ１４：５’  ＣＧＡＣｃａａａａｇａＡＴＴＣ  ３’（配列番号８１）
ＬＮＡ１５：５’  ＧａＴＧｇＣｃＡＴｃａＡｔｔＡ  ３’（配列番号８２）
ＬＮＡ１６：５’  ＧＡＴＧｇｃｃａｔｃａＡＴＴＡ  ３’（配列番号８３）
ＬＮＡ１７：５’  ＴｃＴＡｇＣａＴＡｃｔＴａｃＴ  ３’（配列番号８４）
ＬＮＡ１８：５’  ＴＣＴＡｇｃａｔａｃｔＴＡＣＴ  ３’（配列番号８５）
ＬＮＡ１９：５’  ＧＡＡｔｔｃｇｇａｔｇＧＣＣＡ  ３’（配列番号８６）
ＬＮＡ２０：５’  ＧＧＣＣａｔｃａａｔｔａＧＴＧ  ３’（配列番号８７）
ＬＮＡ２１：５’  ＴＴＣＧｇａｔｇｇｃｃａＴＣＡ  ３’（配列番号８８）
ＬＮＡ２２：５’  ＡＧＣＣａｇａｃａｇＣＧＡ  ３’（配列番号８９）
ＬＮＡ２３：５’  ＧＡＣＡｇｃｃａｇａｃａＧＣＡ  ３’（配列番号９０）
【００９６】
下記のオリゴヌクレオチドは、ＰＳＬ２配列中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）をカバーするように設計された。下記の例示的な配列は、そのＰＬＳ２標的配列がＬＮＡ９標的配列でのヌクレオチド変化を含有するいくつかの鳥及びコウモリ株に対して保護する単一変異部位を含むＬＮＡ９の修飾バージョンである。同様の設計を本明細書に記載される配列のいずれかに適用することができることが理解されている。
【００９７】
ＬＮＡ９．Ｇ７４Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＴＣ  ３’（配列番号９４）
ＬＮＡ９．Ｔ８０Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｃｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号９５）
ＬＮＡ１９．Ｕ５６Ｃ：５’  ＧＧＡＴｔｔｃｇｇａｔｇｇＣＣＡ  ３’（配列番号９６）
【００９８】
抗ウイルスアッセイ：ＬＮＡを、ＲＮＡｓｅフリー水中で１００μＭで再構成し、分取し、単回使用前に−２０℃で貯蔵した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、ＬＮＡを細胞に、製造業者のプロトコルに従って１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、及び１ｎＭの最終濃度でトランスフェクトした。予防的抗ウイルスアッセイについて、１０６ＭＤＣＫ細胞を、指定ＬＮＡでトランスフェクトされる２４時間前に６ウェルプレートに播種した。細胞を次に、トランスフェクションの４時間、２時間、または１時間後、０．０１ＭＯＩのＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）またはＨＫ６８（Ｈ３Ｎ２）ウイルスで感染させた。感染後の治療抗ウイルス評価について、ＭＤＣＫ細胞を、記載されるようなＰＲ８またはＨＫ６８で感染させた。ＬＮＡを次に、感染の４時間、２時間、または１時間後にトランスフェクトした。感染の４８時間後、上清を回収し、ウイルス力価をプラークアッセイにより決定した。
【００９９】
ｖＲＮＡのインビトロ転写：各野生型単離物（ＰＲ８、１９１８、ＶＮ１２０３、ＮＹ４７０、ＮＹ３１２、ＣＡ０９、及びＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３  Ｈ７Ｎ９）及びＰＲ８パッケージング変異体クローンについて、ＰＢ２ｃＤＮＡを、Ｔ７プロモーター下でセグメント特異的プライマーを使用してプラスミドから増幅させた。増幅ｃＤＮＡを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＤＮＡゲルキットを使用してゲル精製した。ｖＲＮＡを次に、Ｔ７−ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔを使用して、インビトロ転写により作製した。ＳＨＡＰＥのためのｖＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ｃａｔ．ｎｏ．ＡＭ１９０８）により、キャピラリー電気泳動により確認された純度及び長さで精製した。
【０１００】
ｖＲＮＡのｓｆ−ＳＨＡＰＥ分析：ＰＢ２  ｖＲＮＡを、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝８中（１００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ、１分間６５℃、室温で５分冷却、２０〜３０分間３７℃）で折り畳んだ。ＮＭＩＡでの２分のアシル化（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）及び逆転写（ＲＴ）プライマー伸長を、１分間４５℃、２５分間５２℃、５分間６５℃で、以前に記載されたように（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｅｋｓ，２００９）行った。全ての標識化プライマーに６ＦＡＭを使用した。これらのプロトコルに対する例外は、下記の通りであった：（ｉ）アシル化後のＲＮＡ精製は、エタノール沈降ではなく、ＲＮＡ  Ｃ＆Ｃカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行い、（ｉｉ）ＳＨＡＰＥプライマー緩衝液の添加前及び後に、混合液は２〜５分間室温に置き、これはＲＴ転写収率を顕著に向上させ、（ｉｉｉ）ＤＮＡ精製は、９６ウェル形式のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０サイズ排除樹脂を使用して行い、次に真空遠心分離により濃縮し、プライマーのより顕著な除去をもたらし、（ｉｖ）ｄｄＧＴＰ  ＲＮＡシーケンシング反応では２ｐｍｏｌのＲＮＡを使用した。
【０１０１】
ＡＢＩ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＯＰ６マトリックスで充填した５０ｃｍキャピラリー）を、下記のパラメータに設定した：電圧１５ｋＶ、Ｔ＝６０℃、注入時間＝１５秒。ＧｅｎｅＳｃａｎプログラムを使用して、９．７５ｕｌのＨｉ−Ｄｉホルムアミドに再懸濁させた精製ＤＮＡからなり、０．２５ｕｌのＲＯＸ  ５００内部サイズ標準（ＡＢＩ  Ｃａｔ．６０２９１２）が添加された各試料についてのデータを取得した。ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒパラメータを、下記のパラメータに設定した：スムージング＝なし、ウィンドウサイズ＝２５、サイズコーリング＝ローカルサザン、ベースラインウィンドウ＝５１、ピーク閾値＝１５。断片２５０及び３４０を、ＲＯＸ５００標準から計算的に除外した（Ａｋｂａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒからのデータを次に、ＦＡＳＴ（ＳＨＡＰＥトレースの高速分析）、カスタムプログラムを使用することによりＳＨＡＰＥデータへと加工した（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＦＡＳＴは、外部サイジング標準としてｄｄＧＴＰラダー、及びローカルサザン方法を使用して、ハンドリングエラーによるシグナルの差について自動的に補正し、シグナルの減衰について調整し、断片長さをヌクレオチド位置に変換する（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１及びＰａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１０２】
ＲＮＡ構造パラメータ：２．６及び−０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌの勾配及び切片パラメータを提案されるように（Ｄｅｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）最初に試し、０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌに近い（例えば、〜−０．３）小さな切片は、（１０％の最大エネルギー差以内で）最適でない構造の生成が少ないことが見出された。このパラメータ微差は、自動化ＦＡＳＴアルゴリズムによる実験及び対照データセット間で達成される正確なフィッティングによるものであり得る。その現行の実施では、ＦＡＳＴは、ＲＮＡ構造に組み込まれ、ＭＦＣ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｅｓ）を必要とする。ＲＮＡ構造は、ＲＮＡＶｉｚ  ２（Ｄｅ  Ｒｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を使用して描画及び色付けし、Ａｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒで仕上げた。
【０１０３】
Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ実験のための構成物設計、ＲＮＡ合成、及び化学修飾：二本鎖ＤＮＡテンプレートを、以前記載されたような自動化ＭＡＴＬＡＢスクリプト（ＮＡ＿Ｔｈｅｒｍｏ、「ｈｔｔｐｓ：」続いて「／／ｇｉｔｈｕｂ．」続いて「ｃｏｍ／ＤａｓＬａｂ／ＮＡ＿ｔｈｅｒｍｏ」で入手可能）により設計されるＤＮＡオリゴマーのＰＣＲアセンブリにより調製した（Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ（Ｍ２）のための構成物は、ワトソン−クリック同等物に対する全ての単一変異体を含む。変異／レスキューのための補償的変異体は、提案された二次構造における塩基対形成に基づいて設計した（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。インビトロ転写反応、ＲＮＡ精製、及び定量化ステップは、以前に記載された通りとした（Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。１次元化学マッピング、ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ（Ｍ２）、及び変異／レスキューを、９６ウェル形式で、以前に記載されたように実施した（Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  ＶａｎＬａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。簡潔には、ＲＮＡを加熱及び冷却して二次構造不均質性を除去し、次に適切に折り畳んでＳＨＡＰＥ試薬（５ｍｇ／ｍＬの１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物（１Ｍ７））でインキュベートし（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｅｋｓ，２００７）、修飾反応物をクエンチし、ＲＮＡをポリ（ｄＴ）磁気ビーズ（Ａｍｂｉｏｎ）及びＦＡＭ標識化Ｔａｉｌ２−Ａ２０プライマーにより回収し、ＲＮＡを７０％エタノール（ＥｔＯＨ）により２回洗浄し、ｄｄＨ２Ｏに再懸濁させ、続いてｃＤＮＡへの逆転写及び加熱ＮａＯＨ処理を行ってＲＮＡを除去した。最終ｃＤＮＡライブラリーを磁気ビーズ分離により回収し、すすぎ、Ｈｉ−Ｄｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中でＲＯＸ−３５０ラダーで溶出し、キャピラリー電気泳動シーケンサー（ＡＢＩ３１００）に装填した。データ加工、構造モデリング、及びデータ蓄積：ＨｉＴＲＡＣＥソフトウェアパッケージバージョン２．０を使用し、ＣＥデータを分析した（ＭＡＴＬＡＢツールボックス及びウェブサーバーの両方が利用可能（Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３））。トレースアラインメント、ベースラインサブトラクション、配列割当て、プロファイルフィッティング、減弱補正、及び正規化を、以前に記載されたように達成した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｋｌａｄｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。配列割当ては、シーケンシングラダーからの照合で手動で達成した。データ駆動型二次構造モデルは、ＲＮＡ構造パッケージバージョン５．４（Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）のＦｏｌｄプログラムを使用して、２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び−０．８ｋｃａｌ／ｍｏｌの擬似エネルギー勾配及び切片パラメータで得た。Ｍ２データセットについての２次元Ｚスコアマトリックス、及び螺旋的ブートストラップ信頼度値を、以前に記載されたように計算した（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  ＶａｎＬａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｚスコアマトリックスを、１．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ及び０ｋｃａｌ／ｍｏｌの勾配及び切片での塩基対的な擬似自由エネルギーとして使用した。二次構造画像をＶＡＲＮＡにより生成した（Ｄａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。１次元マッピング、ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ、及び変異／レスキューを含む、全ての化学マッピングデータセットは、ＲＮＡ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｄａｔａｂａｓｅ（「ｈｔｔｐ：」続いて「／／ｒｍｄｂ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．」続いて「ｅｄｕ」）に蓄積されている（Ｃｏｒｄｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１０４】
ＬＮＡ標的化ｖＲＮＡのＳＨＡＰＥ分析：ＰＲ８セグメントＰＢ２のＤＮＡテンプレートを、ＤＮＡオリゴマーのＰＣＲアセンブリにより調製し、インビトロ転写反応、ＲＮＡ精製、及び定量化ステップは、以前に記載された通りとした（Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  ＶａｎＬａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。１次元ＳＨＡＰＥ化学マッピングを、９６ウェルプレート形式で、下記を例外として上で記載されたように行った：ＲＮＡを、記載されるように変性して再度折り畳んだ後、１００ｎＭの各々調製されたＬＮＡを、折り畳まれたＲＮＡに添加し、５ｍｇ／ｍＬのＳＨＡＰＥ試薬１Ｍ７（１−メチル−７−ニトロイサト酸無水物）でインキュベートした。修飾クエンチング、ＲＮＡ回収、再懸濁、逆転写、ｃＤＮＡシーケンシング、及びデータ加工を、記載されるように行った。Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  ＶａｎＬａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照されたい。
【０１０５】
実施例１：
ＩＡＶセグメントＰＢ２パッケージングシグナルのＳＨＡＰＥ特徴分析は保存構造を同定する
プライマー伸長により分析される選択的２’−ヒドロキシルアシル化（ＳＨＡＰＥ）及び計算的モデリングを、ＩＡＶセグメントＰＢ２ゲノムｖＲＮＡに適用し、構造化ＲＮＡドメインを検索した。株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）「ＰＲ８」からのインビトロ転写全長（−）センスＰＢ２  ｖＲＮＡを、溶液中で折り畳み（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、柔軟な一本鎖状態で存在するヌクレオチドと優先的に反応する求電子性ＳＨＡＰＥ試薬を使用して調査した（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）（図１）。この分析は、ＰＢ２を含む、全てのセグメントについての（−）センスＲＮＡに対して（＋）センスでのＲＮＡ二次構造保存について高い可能性を見出した最近の生物情報学研究（Ｐｒｉｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）と一貫して、２３４１ｎｔのｖＲＮＡのほとんどが広く構造化されていないことを明らかにした（図２）。これらの以前の研究は、末端コード領域（ＴＣＲ）を分析せず、代わりにＰＢ２  ５’ＴＣＲの末端の手前の８０個のヌクレオチドで止まっている。ＳＨＡＰＥ誘導モデリングは、ヌクレオチド３４〜８７（（−）センス表記）を含む、安定なＲＮＡ二次構造、最も注目すべきは、本明細書でパッケージングステムループ２（ＰＳＬ２）（図１Ａ）と称される、ステムループモチーフを含有するこの領域中のいくつかのエリアを示した。このセグメントは、未解明のメカニズムを介した変異分析を通したＰＢ２パッケージングにおいて以前に示されたヌクレオチドのセットを含んだ（図１Ａ〜１Ｂ、環状ヌクレオチド参照）（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｇｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これらの従来の変異がＰＳＬ２構造の破壊を通して作用するという仮説を支持し、変異体のＳＨＡＰＥ分析は、全てが野生型ＰＳＬ２構造を破棄した異なる立体構造をもたらした（図１Ｃ、図３）。ＰＳＬ２を包含する６０ヌクレオチド領域は、異なるサブタイプ及び種由来の季節性及びパンデミック株の間で単一ヌクレオチドレベルでの１００％近い配列保存を示し（図４）、インタクトなＰＳＬ２構造を維持するための厳しい生物学的要件の存在を示す。ＰＢ２  ｖＲＮＡ内の異なる下流配列はＰＳＬ２の二次構造を変え得るので、ＰＳＬ２の構造的保存は、高病原性鳥Ｈ５Ｎ１及びパンデミック１９１８Ｈ１Ｎ１株を含む、様々なＩＡＶ株及びサブタイプから単離される全長野生型ＰＢ２  ｖＲＮＡに対してＳＨＡＰＥ分析を行うことにより探究された。ステムループ内の２つの分岐するヌクレオチドの存在及び隣接する配列における顕著な分岐にかかわらず、ＰＳＬ２ステムループ構造は、これらの多様な種及びサブタイプにわたるＰＢ２ＲＮＡのＳＨＡＰＥ誘導モデリングにおいて回収された（図１Ｄ〜１Ｆ）。
【０１０６】
図１Ａ〜図１Ｆは、全長（−）センス野生型ＰＢ２  ｖＲＮＡについて行われたＳＨＡＰＥ化学マッピングを示す。色は、ＳＨＡＰＥ反応性を示し、ヌクレオチドが一本鎖である確率に比例する。全ての構造は、５’末端配列構造を強調するように切り取られる。エネルギー＝ＳＨＡＰＥ擬似自由エネルギーパラメータを使用してＲＮＡ構造モデリングアルゴリズムにより生成される決定構造のΔＧ自由エネルギー値。（図１Ａ）株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４「ＰＲ８」（Ｈ１Ｎ１）からの野生型ＰＢ２ＲＮＡ二次構造。色分けされた丸は、同義的変異がＰＢ２パッケージングに影響を及ぼすことが報告されたヌクレオチド部位に対応する（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。（図１Ｂ）ｑＰＣＲにより決定される、（図１ａ）における同義的変異体のパッケージング効率。３通り行われた結果。エラーバー＝±ＳＤ。下の枠は、変異体名及び対応する変異変化を示す。ゲノム（−）センス指向で示されるヌクレオチド番号付け。（図１Ｃ）ＰＢ２パッケージング欠損変異体ｖＲＮＡ、ｍ７５７（Ｇ４４Ｃ）及びｍ７４５（Ａ８０Ｕ）のＳＨＡＰＥ決定構造。黒色枠＝同義的変異の部位、（図１Ｄ〜図１Ｆ）異なるサブタイプを含む、パンデミック及び高病原性株からの野生型ＰＢ２のＳＨＡＰＥ決定構造：（図１Ｄ）１９１８パンデミック（Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１））、（図１Ｅ）高病原性鳥（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１））、（図１Ｆ）２００９パンデミック「豚」（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１））。
【０１０７】
図２、パネルＡ〜Ｂは、全長ＰＢ２  ｖＲＮＡのＳＨＡＰＥ反応性を示す。（図２、パネルＡ）ＩＡＶ株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）からの全長（−）センスＰＢ２  ｖＲＮＡについてのヌクレオチド位置の関数としての平均ＳＨＡＰＥ反応性（ウィンドウビンサイズ＝１００ｎｔ）。ＰＳＬ２領域（青色で強調される、ｎｔ３４〜８６）は、その第３の位置が保存され、ｖＲＮＡ内の最低ＳＨＡＰＥ反応性のうちの１つを有する、高密度のコドンを有する、５’パッケージングシグナルドメインを包含する。ＰＳＬ２後の領域は、比較的に構造化されていないが、ヌクレオチド１４００と１５００との間にＲＮＡ構造の存在について別の潜在的な部位を含有する。興味深いことに、この第２の内部領域は、２０１１年の生物情報学研究でも構造的要素を含有することが予測された（参考文献１９）。（図２、パネルＢ）（図２ａ）からのＰＳＬ２領域の拡大図。ウィンドウビンサイズ＝１０ｎｔ。
【０１０８】
図３Ａ〜図３Ｅは、パッケージング欠損変異が野生型ＳＨＡＰＥ反応性を破壊することを示す。左：ＷＴに対する変化としてプロットされた変異体ＳＨＡＰＥ反応性。ヌクレオチド番号付けは、（−）センスｖＲＮＡの５’末端から開始する。オレンジ色バーは変異の部位を示す。エネルギー値は、ＳＨＡＰＥ擬似自由エネルギーパラメータを使用してＲＮＡ構造モデリングアルゴリズムにより生成される予測構造のΔＧ自由エネルギーを表す。右：ＰＲ８株（Ｈ１Ｎ１）からの全長（−）センス変異体ＰＢ２  ｖＲＮＡのＳＨＡＰＥ決定構造。画像は、５’末端領域を強調するように切り取られる。（図３Ａ）野生型。パッケージング欠損変異体：（図３Ｂ）ｍ７４４ｂ（ＡＧ８３、８５ＵＡ）。（図３Ｃ）ｍ７４５（Ａ８０Ｕ）。（図３Ｄ）ｍ５５ｃ（ＣＵ３５、３６ＵＣ）。（図３Ｅ）ｍ７５７（Ｇ４４Ｃ）。
【０１０９】
図４は、ＰＳＬ２構造を含有するヌクレオチド配列の保存を示す。多様なインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ及び株にわたる核酸配列アラインメントのグラフ表示（「ｗｅｂｌｏｇｏ．」続いて「ｂｅｒｋｅｌｅｙ」続いて「．ｅｄｕ」）。全体的な高さは、そのヌクレオチド位置での配列保存を表し、各位置内の記号の高さは、その部位での各ヌクレオチドの相対度数を示す。黒色枠＝ＰＳＬ２領域。アラインメントに含まれる配列：高病原性Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）、パンデミック「豚インフルエンザ」Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、現代ヒトＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／４７０／２００４（Ｈ３Ｎ２）、ヒトＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、高病原性鳥Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、ヒトＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／１９６８（Ｈ３Ｎ２）、及びヒトＡ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／３１２／２００１（Ｈ１Ｎ１）。（−）センス指向で番号付けされたＲＮＡヌクレオチド。上記配列に対応するＰＢ２の末端５’領域の配列アラインメント。網掛け青色枠は、ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造要素を包含する。黒色斑点は、分岐ヌクレオチド部位を示す。
【０１１０】
Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−Ｍａｐ戦略は、ＰＳＬ２構造を検証し、新規パッケージング変異体を予測する。
ＰＳＬ２ＲＮＡ構造のＳＨＡＰＥ分析をさらに試験し、インビボ試験に必要な追加の情報を提供する変異を明らかにするために、多次元化学マッピング（Ｋｌａｄｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｄａｓ，２０１０）方法をＰＳＬ２セグメントに適用した。第一に、ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ（Ｍ２）測定は、ＰＢ２パッケージングにとって重要であることが以前に見出されているヌクレオチドでの変化を含む、各ステム残基の全体的変異後の化学反応性パターンの破壊を確認した（図５Ａ、備考欄参照）（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｇｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。これらのＭ２データに基づく自動化計算分析は、ＳＨＡＰＥ誘導ＰＳＬ２構造を高い信頼度で回収し（図１Ｃ、図３、図５Ｂ〜図５Ｄ）、構造モデルをさらに検証した。第二に、予測試験として、補償的変異は、初期パッケージング欠損変異により破壊された野生型ステムループ構造における塩基対を復元するように設計された（図６、パネルＡ〜Ｂ）。これらの変異−レスキュー多様体は、実際に、ＰＳＬ２ＳＨＡＰＥパターンを復元し、モデル化構造のインビトロ検証における塩基対解像を提供し、ＰＳＬ２構造の役割をインビボで試験するための配列多様体を提案した。
【０１１１】
図５Ａ〜図５Ｄは、ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造の２次元Ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−Ｍａｐ（Ｍ２）分析を示す。（図５Ａ）全体的単一ヌクレオチド変異及び得られる化学的アクセシビリティのマッピングは、ＲＮＡの３次元構造における相互作用を明らかにする。ＰＲ８株ＰＢ２からのＰＳＬ２要素の単一ヌクレオチド解像での８８個の単一変異にわたる、グレースケール（黒＝最高ＳＨＡＰＥ反応性）でプロットされた、化学的アクセシビリティ。反応性ピーク（左から右）は、ＰＢ２ＲＮＡの５’から３’末端までヌクレオチドに対応する。（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８により報告されるような）既知パッケージング変異に対応するヌクレオチド部位は、青色で右に示される。赤色矢印は、Ｍ２分析により予測される顕著なパッケージング欠損変異体部位を示す。（図５Ｂ）Ｚスコア分析（各残基での平均からの標準偏差の数値）より孤立したｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐデータの強い特徴。Ｚスコアは、各ヌクレオチド反応性について、全ての変異体にわたるこのヌクレオチドの平均反応性を引き、標準偏差で割ることにより計算した（ｏｕｔｐｕｔ＿Ｚｓｃｏｒｅ＿ｆｒｏｍ＿ｒｄａｔ  ｉｎ  ＨｉＴＲＡＣＥ）。四角は、ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐデータにより導かれる二次構造モデルを示す。濃色記号は、構造化ヌクレオチド対形成の証拠を強調する。（図５Ｃ）ＺスコアをＲＮＡ構造モデリングアルゴリズムに組み込むことから誘導される５’パッケージングシグナル領域（ｎｔ３０〜９３）についてのＲＮＡ二次構造：緑色パーセント値として与えられるブートストラップ信頼度推定値。ブートストラップ値は、構造的信頼度の数値的に正確な指標を提供する。低いブートストラップ信頼度値は、代替構造モデルの存在を示す。（図５Ｄ）ブートストラップは、グレースケール網掛けで示される各塩基対についての値を支持する。
【０１１２】
図６は、以前に記載されたＰＲ８ＰＢ２変異体に対する補償的変異の設計を示す。（図６、パネルＡ）以前に記載された同義的変異体（ｍ７５７、ｍ７４５、ｍ５５ｃ）は、ＰＳＬ２構造にマッピングされる。（図６、パネルＢ）補償的変異（ｍ５５ｃ−ｃｏｍｐ、ｍ７４５−ｃｏｍｐ、及びｍ７５７−ｃｏｍｐ）は、ＳＨＡＰＥ及びｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ化学分析に基づき野生型ＰＳＬ２構造を復元すると予測される部位で設計された。黒色枠内のヌクレオチドは、補償的変異の部位を示す。（−）センスｖＲＮＡ指向が示される。構造を復元するのに非同義的変化が必要とされた変異について、コード化タンパク質配列における変更が示される。
【０１１３】
溶液中で観察されるＰＳＬ２ステムループ構造が細胞環境中のウイルスパッケージングと関連していたかを試験するために、Ｇｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７及びＭａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８により報告された同じ９つの同義的変異（図１Ａ〜図１Ｂ、図７パネルＡ）ならびにＭ２分析により特徴付けられる４つの新たな同義的変異を（図７、パネルＢ）を、ＰＲ８ＰＢ２遺伝子を含有するｐＤＺプラスミドにクローニングした（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｇｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）（図８）。ここではＰＲ８バックグラウンド中の９つの以前から知られる変異体のパッケージング効率は、ＷＳＮ３３ウイルス１５において元々説明されたものと同等であった（図７、パネルＣ）。これらのうち、変異体ｍ５５ｃ、ｍ７５７、ｍ７４５、及びｍ７４４ｂは、ＰＳＬ２のステム領域内のそれらの位置に基づき、最も顕著な障害を示すことが予測された（図１Ｃ、図３Ａ〜図３Ｆ、図７）。対照的に、ＰＢ２パッケージングに対して影響がない公表された変異（例えば、ｍ７３１）は、構造化されていない頂点ループにマッピングしたか、またはＰＳＬ２の外に該当し、その構造的完全性を変更しなかった（図９Ａ）（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。Ｍ２分析によりインビトロＰＳＬ２構造に対して顕著な影響を有すると同定された３つの新規同義的変異体（ｍ７４−１、ｍ７４−２、及びｍ６８）（図５Ａ）は、ＰＢ２パッケージングの顕著な減少を示し、野生型ＰＳＬ２構造と比較してＳＨＡＰＥ反応性に無視してよい変化をもたらした変異部位は、野生型様パッケージング効率レベルをもたらした（例えば、ｍ５６）（図７、パネルＤ）。
【０１１４】
図７は、ＰＲ８ＰＢ２  ｖＲＮＡの単一高度保存コドンの同義的変異を示す。（図７、パネルＡ）ＰＢ２パッケージングに関与する以前に公表された同義的変異。上線は親ＰＲ８ｖＲＮＡ配列（（＋）センス指向）であり、変異単一ヌクレオチドは下線上の赤色の太文字である。導入された変異の番号付け及び用語体系は、Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８及びＧｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７による報告に基づく。黄色ハイライト領域は、ＰＳＬ２構造を含有する配列を示す。（図７、パネルＢ）Ｍ２分析から同定された同義的変異（補足図４ａ参照）のｐＤＺプラスミドへのクローニングのためのプライマー配列の設計。配列は（＋）センス指向である。強調されたヌクレオチド＝変異部位。（図７、パネルＣ〜Ｄ）（図７、パネルＣ）以前に公表された同義的変異体、及び（図７、パネルＤ）Ｍ２分析同定同義的変異体についての親野生型ＰＢ２に対する変異体ＰＢ２パッケージングの割合を表すパッケージング効率。２つの独立した実験からの結果、３通り行われたアッセイ（ｎ＝６）。エラーバーは±ＳＤを表す。
【０１１５】
図８は、ＰＢ２パッケージング変異体用語体系及び対応する変異の部位を示す。１）Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８及びＧｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７による報告に基づく、（青色で示される）ＰＢ２パッケージングに関与する以前に公表された同義的変異、ならびに２）（黒色で示される）ＰＳＬ２構造設計単一変異体及び（赤色で示される）二重補償的変異体からの変異の名称及び部位を示す変異用語体系チャート。導入された変異の番号付け及び用語体系は、ゲノム（−）センスｖＲＮＡに基づく。変異がタンパク質コードの変化をもたらす例は、同義的（ＳＹＮ）または非同義的（非ＳＹＮ）フィールドにより示される。
【０１１６】
図９Ａ〜図９Ｃは、ＰＳＬ２構造に対する同義的変異の効果を示す。左：ＰＲ８株からの全長（−）センスＰＢ２  ｖＲＮＡについてのｓｆ−ＳＨＡＰＥ分析により決定されるＰＢ２パッケージング変異体の予測ＲＮＡ二次構造。明瞭さのためのみに、野生型構造は、右上隅の枠に示される。右：野生型に対する変異体反応性の変化として示されるＳＨＡＰＥ反応性グラフ。図見出しの下に示されるエネルギー値及びパッケージング効率パーセント。変異体：（図９Ａ）ｍ７３１。（図９Ｂ）ｍ７５１。（図９Ｃ）ｍ７４８。以前に記載された変異体の各々についてのＰＢ２組込みのパッケージング効率パーセントを青色でハイライトする。
【０１１７】
補償的変異は、セグメントＰＢ２についてのウイルスパッケージング（図１０、パネルＡ〜Ｃ、図６、パネルＡ〜Ｂ）だけでなく、ＩＡＶパッケージングにおけるＰＢ２の提案された階層的役割（Ｍｕｒａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）と一貫して、有害変異により影響されることが以前に報告された他のセグメントもレスキューした（図１０、パネルＤ〜Ｆ）。ＰＢ２パッケージングの回収に加えて、補償的変異は、欠損変異により引き起こされるウイルス力価減少の完全またはほぼ完全レスキューをもたらした（図１０、パネルＧ〜Ｉ）。いくつかの非同義的補償的変異は、他より良好にＰＢ２パッケージングを復元することができ（ｍ７５７−ｃｏｍｐと比較して、ｍ７４５−ｃｏｍｐ及びｍ５５ｃ−ｃｏｍｐ）（図１０、パネルＡ〜Ｃ）、あるいは外因性付加を通したＰＢ２タンパク質機能の不完全な復元を反映した。こうした外因性付加は、いくつかの非同義的変異がＰＳＬ２構造及びタンパク質配列の両方に影響を及ぼしたので、必要であった。ＰＳＬ２構造の最も鋭敏な試験は、補足の野生型ＰＢ２タンパク質付加を必要としないパッケージング実験からのものであった。計算的列挙及び多次元変異−レスキュー実験（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）に基づき、共に同義的であり、野生型ＰＢ２タンパク質付加を不要にする、単一変異−レスキュー置換ペアが見出された（ｍ５２／ｍ６５、図１１、パネルＡ〜Ｂ、図１２、パネルｓ、図１３）。各変異を単独で行うこと（ｍ５２及びｍ６５）は、４％ＰＢ２組込み未満のパッケージング効率及び４ｌｏｇ１０を超える力価減少、パッケージング欠損ウイルスについて以前に報告されたもの（すなわち、２ｌｏｇ１０）を上回る重度の障害をもたらした（図１１、パネルＣ〜Ｄ、図７、パネルｃ、図１０）。変更された配列を有するにもかかわらず、ＰＳＬ２構造を復元した二重変異ｍ５２／６５−ｃｏｍｐ株に共に導入される場合、補償的変異は、パッケージング効率及びウイルス力価の両方を野生型レベルまで復元した。
【０１１８】
図１０、パネルＡ〜Ｉは、ウイルスパッケージング及び力価に対するＰＲ８ＰＢ２パッケージング欠損変異体における補償的変異の効果を示す。（図１０、パネルＡ〜Ｃ）パッケージング欠損及び補償的変異体ＰＢ２  ｖＲＮＡのパッケージング効率。非同義的変化が必要な補償的変異について、野生型ＰＢ２タンパク質発現プラスミドを、ウイルスレスキュー中にコトランスフェクトした。ｐＷＴ＝野生型ＰＲ８ＰＢ２タンパク質についてコードする発現プラスミド。ｗｔ親ＰＲ８ウイルスとの比較においてＰＢ２  ｖＲＮＡパッケージングの割合として与えられる値。２つの独立した実験からの結果、３通り行われたアッセイ（ｎ＝６）。（図パネルＤ〜Ｆ）パッケージング欠損及び補償的変異体ウイルスのパッケージング効率ならびに、他の相互作用セグメント、ＰＢ１、ＰＡ、ＮＰ、及びＭＸのパッケージングに対するそれらの効果。３通り行われたアッセイ（ｎ＝６）。（図１０、パネルＧ〜Ｉ）プラークアッセイによるウイルス力価。ＰＦＵ／ｍＬでの結果、３通り行われたアッセイ。
【０１１９】
図１１は、多次元化学マッピングが新規ＰＢ２パッケージング欠損及び補償的変異体パートナーを明らかにすることを示す。（図１１、パネルＡ）１Ｄデータ誘導モデルからの塩基対形成を試験ならびに予測される良好な同義的ＰＳＬ２欠損及び補償的変異体ペアを同定するための個別及び補償的二重変異のレスキュー（Ｍｕｔａｔｅ−Ｍａｐ−Ｒｅｓｃｕｅ）分析での全体的単一ヌクレオチド変異マッピングからの電気泳動図結果。ＰＲ８株ＰＢ２からのＰＳＬ２要素の単一ヌクレオチド解像での８８個の単一変異にわたる、グレースケール（黒＝最高ＳＨＡＰＥ反応性）でプロットされた、化学的アクセシビリティ。反応性ピーク（左から右）は、ＰＢ２ＲＮＡの５’から３’末端までヌクレオチドに対応する。Ｍｕｔａｔｅ−Ｒｅｓｃｕｅペアの完全なリストについては図１２を参照されたい。（図１１、パネルＢ）ＰＳＬ２構造上の単一変異体ｍ５２（Ｇ５２Ｕ）及びｍ６５（Ｃ６５Ａ）、ならびに二重ｍ５２／６５レスキューペアの変異設計。（図１１、パネルＣ）同義的単一及び二重変異体ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｒｅｓｃｕｅペアのパッケージング効率。ｗｔ親ＰＲ８ウイルスとの比較においてＰＢ２  ｖＲＮＡパッケージングの割合として与えられる値。２つの独立した実験からの結果、３通り行われたアッセイ（ｎ＝６）。（図１１、パネルＤ）ＰＦＵ／ｍＬでのウイルス力価、３通りの結果。エラーバーは±ＳＤを表す。
【０１２０】
図１２パネルａ〜ｔは、２次元Ｍｕｔａｔｅ−Ｍａｐ−Ｒｅｓｃｕｅ（Ｍ２Ｒ）分析を示す。変異／レスキュー結果は、ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造を検証する。１Ｄデータ誘導モデルからの塩基対形成を試験ならびに良好なＰＳＬ２欠損及び補償的変異体ペアを同定するための補償的二重変異でのＳＨＡＰＥ分析の電気泳動図。ＰＲ８株ＰＢ２からのＰＳＬ２要素の単一ヌクレオチド解像での８８個の単一変異にわたる、グレースケール（黒＝最高ＳＨＡＰＥ反応性）でプロットされた、化学的アクセシビリティ。各々の試験されたペアについて、野生型、単一変異体１、単一変異体２、及び補償的二重変異体の「カルテット」は、比較のためにグループ化される。（図１２、パネルａ〜ｒ）非同義的ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｒｅｓｃｕｅペア。全ての枠で囲まれていない電気泳動図は、破壊及び／またはレスキューが観察されなかったペアである。青色枠は、良好な欠損及びレスキュー変異を示す。（図１２、パネルｓ）二重同義的ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｒｅｓｃｕｅペア。緑色枠＝良好な同義的欠損及びレスキューペア。（図１２、パネルｔ）非同義的ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｒｅｓｃｕｅペアについてのパッケージング効率。ｗｔ親ＰＲ８ウイルスとの比較においてＰＢ２  ｖＲＮＡパッケージングの割合として与えられる値。２つの独立した実験からの結果、３通り行われたアッセイ（ｎ＝６）。エラーバーは±Ｓ．Ｄを表す。
【０１２１】
図１３は、２次元Ｍｕｔａｔｅ−Ｍａｐ−Ｒｅｓｃｕｅ（Ｍ２Ｒ）変異体についてのプライマー配列の設計を示す。配列番号（２８〜４３）上から下。Ｍ２Ｒ変異体のｐＤＺプラスミドへのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ変異クローニングに使用されるプライマー配列。配列は（＋）センス指向である。左フィールドは、同義的（Ｓｙｎ．）または非同義的（非ｓｙｎ．）変化を示す。強調されたヌクレオチド＝変異部位。枠内の変異体プライマーセットは、二重同義的変異体パートナー、ｍ５２及びｍ６５を示す。
【０１２２】
インビボモデルにおけるＰＳＬ２構造の関連性を試験するために、６〜８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、１０００ＰＦＵの野生型ＰＲ８ウイルスまたはＰＳＬ２構造を破壊もしくは復元することが予測される変異を有する株を鼻腔内接種した。ＰＳＬ２破壊変異−ｍ７４５変異体株（２０％パッケージング効率）または重度パッケージング欠損単一変異体ウイルス、ｍ５２（＜４％パッケージング効率）−に感染したマウスは、ＰＢＳ対照と比較して、それぞれ、体重減少または生存率のいずれかにおいて、低減した疾患の臨床的徴候を示すか、またはこれを示さなかった（図１４、パネルＡ〜Ｂ）。際立って、ＰＳＬ２構造を復元する補償的変異を含むことは、ウイルス病原性をレスキューした：ｍ５２／６５−ｃｏｍｐ及びｍ７４５−ｃｏｍｐに感染した動物は、野生型ＰＲ８に感染したマウスと同等の死亡プロファイル及び生存曲線を示した（図１４、パネルＡ〜Ｂ）。ＡＰＬＡＣガイドラインと一貫して、全てのマウスは、２０％超の体重減少に到達後に人道的に犠死させた。
【０１２３】
図１４パネルＡ〜Ｂは、パッケージング欠損ウイルスがインビボで弱毒化されることを示す。単一ＰＳＬ２破壊及び補償的ＰＳＬ２復元二重変異体ウイルスに感染したマウスの体重減少及び生存パーセント。６〜８週齢ＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスを、１０００ＰＦＵのＰＲ８野生型（ｗｔ）ウイルス、パッケージング欠損単一変異体ウイルス、ｍ５２及びｍ７４５、補償的二重変異体ウイルス、ｍ５２／６５及びｍ７４５−ｃｏｍｐ、またはＰＢＳ対照に鼻腔内感染させた。マウスを、０日目体重減少パーセント及び生存パーセントについて毎日モニタリングした。２つの独立した実験、条件当たり６匹のマウスの平均としての結果。（図１４、パネルＡ）体重減少パーセント。（図１４、パネルＢ）（図１４、パネルＡ）に描写される個別コホートのカプラン−マイヤー生存プロット。
【０１２４】
実施例２：
ＰＳＬ２構造の治療設計及び標的化は、ＩＡＶ感染をインビトロ及びインビボで阻害する
ＰＳＬ２媒介性ウイルスパッケージングを標的とする治療可能性を探究するために、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する９つのロックド核酸（ＬＮＡ）（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，２００４）を、要素の全体的なＲＮＡ二次構造を破壊し、これによりウイルス産生を阻害することが予測される主要残基に対して設計した（図１５、パネルＡ）。設計されたＬＮＡのうちの２つ、ＬＮＡ８及びＬＮＡ９は、配列において、それぞれ、ＬＮＡ６及びＬＮＡ７と同一であるが、ＲＮａｓｅ−Ｈ活性化に最適化された６〜７個の非修飾（非ロックド）ＤＮＡヌクレオチドを有する。第一に、ＰＳＬ２ＲＮＡ二次構造に対してＬＮＡ結合が有する影響を評価するために、トウプリンティング及びＳＨＡＰＥ化学マッピングを、ＬＮＡの存在下でＰＢ２  ｖＲＮＡについて行った。抗ウイルスアッセイ結果での実証では、ＬＮＡ６〜９にコードされる配列は、野生型ＰＳＬ２構造を結合及び破壊する最大の能力を示した（図１６）。
【０１２５】
図１５、パネルＡ〜Ｄは、ＰＳＬ２ＲＮＡ構造を標的とするロックド核酸が、インビトロ及びインビボで強力な抗ウイルス活性を示すことを示す。（図１５、パネルＡ）ＰＳＬ２構造の異なる領域に対して設計された補償的ロックド核酸（ＬＮＡ）の位置。（図１５、パネルＢ）ＬＮＡを抗ウイルス活性についてスクリーニングするために、ＭＤＣＫ細胞を、０．０１ＭＯＩのＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）ウイルスまたはＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（Ｈ３Ｎ２）ウイルスでの感染前の１時間にわたるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションにより、１００ｎＭの各指定ＬＮＡで予備処理した。感染の４８時間後、上清を回収し、ウイルス力価をプラークアッセイにより決定した。２つの独立した実験からの結果、３通り行われたアッセイ（ｎ＝６）。（図１５、パネルＣ）滴定濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ）のＬＮＡ９での予備処理（ＲＸ）対感染後処理の時間経過。ＷＴ＋Ｌｉｐｏ＝Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ対照での感染。予備処理：６ウェルプレート中のコンフルエントなＭＤＣＫ細胞を、感染の２時間前または４時間前のいずれかにＬＮＡ９で処理した。処理された上清を指定の時点で取り出し、細胞を０．０１ＭＯＩのｗｔＰＲ８ウイルスに１時間感染させた。感染後処理について：ＭＤＣＫ細胞を、０．０１ＭＯＩのＰＲ８ウイルスに１時間感染させ、その後、上清を取り換え、細胞を感染の２または４時間前のいずれかにＬＮＡ９で処理した。上清を４８時間後に回収し、ウイルス力価をプラークアッセイにより３通り決定した。図１５、パネルｄは、ウイルス感染マウスの生存に対する鼻腔内ＬＮＡ処理の効果を示す。マウスに、ＰＲ８ウイルス感染の１２時間前に、２０ｕｇのＬＮＡ９、スクランブルＬＮＡ、またはＰＢＳ（非感染対照）を鼻腔内投与した。全てのマウスは、８ｈｐｉ及び３６ｈｐｉで２つの追加の処理を受けた（条件当たりマウスｎ＝７）。
【０１２６】
図１６Ａ〜図１６Ｂは、ＬＮＡ−ＲＮＡ結合についてのＳＨＡＰＥ分析を示す。（図１６Ａ）ＰＲ８ＰＢ２  ｖＲＮＡの存在下でＬＮＡ１、２、４、５、６／８、及び７／９（１００ｎＭ）に行われたＳＨＡＰＥ分析の電気泳動プロファイル。Ｓ１、肝炎Ｃ型ウイルスＩＲＥＳ  ＲＮＡと相互作用する小分子を、ＲＮＡ結合の対照として追加した。左の欄、ＳＨＡＰＥ試薬、１Ｍ７なしでの非標識化反応。右：標識試薬あり。（図１６Ｂ）滴定濃度のＬＮＡにおけるＬＮＡ−ｖＲＮＡ組み合わせについて行われるＳＨＡＰＥの電気泳動プロファイル。各ＬＮＡについて、左セットの欄は、標識試薬なしである。
【０１２７】
次に、２つの異なるＩＡＶサブタイプにわたるＰＳＬ２のＬＮＡ媒介性標的化の抗ウイルス可能性を決定する第１のパイロット実験において、ＭＤＣＫ細胞を、１００ｎＭの各ＬＮＡで予備処理し、０．０１ＭＯＩの野生型ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）ウイルスまたは組織培養馴化Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８／６８（ＨＫ６８）（Ｈ３Ｎ２）ウイルスのいずれかでの感染前の１時間にわたるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクションにより送達した。感染の４８時間後、上清を回収し、ウイルス産生をプラークアッセイにより測定した（図１５、パネルＢ）。ＰＳＬ２の頂点ループのみに対して特異的なＬＮＡ（ＬＮＡ１、ＬＮＡ４）は、ウイルス力価に対する効果をほとんど〜全く有さなかった。同様に、ＰＳＬ２の３’塩基を標的とするＬＮＡ３及び５も、ウイルス産生を阻害しなかった。対照的に、ＬＮＡ６による頂点ループ及び中間バルジの両方のヌクレオチドカバレッジは、ＰＲ８について２ｌｏｇ１０超の力価損失をもたらした（図１５、パネルＡ〜Ｂ）。ＬＮＡ８、ＬＮＡ６のＲＮａｓｅ−Ｈ活性化コピーは、両方のウイルスに対する最大３ｌｏｇのさらにより大きな抗ウイルス活性をもたらした。最も驚くべきことには、ＬＮＡ９、ＬＮＡ７のＲＮａｓｅ−Ｈ活性化コピーは、最も強い抗ウイルス能力を有し、ウイルス産生を、ＰＲ８及びＨＫ６８に対して、それぞれ、５ｌｏｇ及び４ｌｏｇ近く低下させた。
【０１２８】
最適な候補ＬＮＡを特定したので、ＬＮＡ９の抗ウイルス活性の処理時間経過及び濃度パラメータをさらに調査した。ＭＤＣＫ細胞を、一回用量のＬＮＡ９の１０倍希釈物で、０．０１ＭＯＩの野生型ＰＲ８ウイルスでの感染の２または４時間前、あるいは、感染の２または４時間のいずれかに処理した。ＬＮＡで予め処理された細胞は、最も強力な抗ウイルス応答（４ｌｏｇ超）を有し、最も低い希釈（１ｎＭ）でも強いウイルス阻害（２ｌｏｇ超）を示した（図１５、パネルＣ）。感染後治療の時間が増加するにつれ、抗ウイルス活性が減少する傾向があったが、試験された最も遅い添加時点でも、ウイルス力価の３ｌｏｇ超抑制が達成された。
【０１２９】
実施例３：
インビボ有効性実験：長期単回用量予防
Ｂａｌｂ／Ｃ雌マウス（５マウス／グループ）を、致死用量の野生型ＰＲ８ウイルスでの感染の３日前（−３日目）または感染の１日前（−１日目）のいずれかに、単回用量の２０ｕｇＬＮＡ９で予め鼻腔内処理した。マウスを、体重減少、臨床スコア、及び生存について毎日モニタリングした。図１７、パネルＡは、時間に伴うマウスの生存パーセントを示す。図１７、パネルＢは、投与後の時間に伴う体重減少パーセントを示す。
【０１３０】
感染の３日前の２０ｕｇＬＮＡ９の単回投与は、致死的インフルエンザ疾患からマウスを完全に保護した。未処理対照マウスは、それらが２５％超の体重を失った場合、平均５．５日で、人道的に犠死させた。対照的に、予備処理グループは、最小の体重減少を示し、疾患の臨床的徴候がほとんど〜全くなく、感染前の体重までの完全に回復した。
【０１３１】
この結果は、感染の数日前に投与される単回の吸入可能な用量のＬＮＡ９が、致死的疾患に対する長期保護を提供することができることを示し、主題の化合物が、インフルエンザ蔓延及びパンデミック中の予防処置において用途を見出し得ることを示す。
【０１３２】
実施例４：
薬物の存在下での連続継代後の、オセルタミビル及びＬＮＡ９に対するインフルエンザウイルスの感受性：薬物選択実験
オセルタミビル（タミフル）は、市場で最も広く使用され、備蓄されるニューラミニダーゼ阻害剤（ＮＡＩ）である。全てのＮＡＩと同様に、オセルタミビルは、薬物を収容するウイルスニューラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質における立体的構造再配置を必要とする。この再配置に影響を及ぼすＮＡタンパク質にけるいずれかの変異は、オセルタミビルの結合親和性を低減し、よって薬物有効性を低減する。とりわけ、（用語体系に応じてＨ２７５Ｙ変異としても知られる）Ｈ２７４Ｙ変異体は、オセルタミビル耐性と最もよく関連付けられる。免疫低下患者におけるＨ２７４Ｙ変異の急速な選択は、最終手段のＮＡＩ薬、ぺラミビルの臨床的失敗をもたらし得、免疫低下宿主における多剤耐性ウイルスについての選択が、以前に考えられたよりも一般的であり得ることを示す。これは、最近のオセルタミビル耐性及びＮＡＩ耐性ウイルスの拡散と共に、一般的なＮＡＩの使用を再評価する必要性を示す。新たなクラスの抗ウイルスの開発は、ヒトの健康に及ぼし得る未来のインフルエンザパンデミックの有害な影響を低減するためには急務である。
【０１３３】
ＰＳＬ２ステムループを含有するセグメントＰＢ２中の配列領域は、広範囲の宿主種からのＩＡＶサブタイプ、株、及び単離物にわたり高度に保存され、その保存についての厳しい生物学的条件を反映する可能性が高い。この領域のＳＨＡＰＥ分析は、異なるサブタイプ及び宿主由来の季節性及びパンデミックウイルスの間でＰＳＬ２構造の維持を確認し、この構造要素が新規汎遺伝子型治療標的となり得る（よってＬＮＡ９がＩＡＶ単離物に対する広域スペクトルの可能性を有する）ことを強く示した。また、主題のＬＮＡが、その変異能力に対して強い制約を明確に有する、高度に保存されたウイルスゲノムＲＮＡ標的を対象とするので、ＰＳＬ２を標的とする主題のＬＮＡは、ＮＡＩと比較して耐性の発達に対するより高い障壁を有することが期待される。
【０１３４】
薬物圧力下での連続継代後のＬＮＡ９対オセルタミビルに対するインフルエンザウイルスの感受性を調査した。オセルタミビルは、プラーク低減アッセイにより決定されるように、薬物処理の継代１でＰＲ８に対して４１ｎＭの初期ＩＣ５０を有した。増加する量の薬物での６回のみのウイルス継代後、オセルタミビルのＩＣ５０は、５０ｕＭ−１０００倍の増加倍率まで急増した。図１８、パネルＡ〜Ｄを参照されたい。比較において、ＬＮＡ９の存在下でのウイルスの１０回継代後、ＩＣ５０は１８から１６ｐＭまで安定を保った。図１９、パネルＡ及びＢ。
【０１３５】
ＬＮＡ９はまた、薬物耐性ウイルスを治療するのに使用することができる。Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの薬物耐性変異体を、Ｈ２７４Ｙ耐性変異を含有するようにＮＡ遺伝子を変異させた逆遺伝学ウイルスレスキューシステムを使用して作製した。このウイルスに対して、オセルタミビルは５３ｕＭのＩＣ５０を有する。重要なことに、ＬＮＡ９は、ＷＳＮ  Ｈ２７４Ｙウイルスに対するその効力及び有効性をピコモル活性で維持した。図１９、パネルＣ。この結果は、ＰＳＬ２標的化ＬＮＡでのＮＡＩ耐性ウイルスの治療処置ための強力な証拠である。この結果はまた、異なるＩＡＶ単離物に対するＬＮＡ９の活性を強調する。
【０１３６】
参考文献
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１３．Ｇ．Ａ．Ｍａｒｓｈ，Ｒ．Ｒａｂａｄａｎ，Ａ．Ｊ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２，２２９５−２３０４（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ（１０．１１２８／ｊｖｉ．０２２６７−０７）。
１４．Ｅ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖ．Ｍｏｕｌｅｓ，Ｂ．Ｅｓｓｅｒｅ，Ｊ．Ｃ．Ｐａｉｌｌａｒｔ，Ｊ．Ｄ．Ｓｉｒｂａｔ，Ｃ．Ｉｓｅｌ，Ａ．Ｃａｖａｌｉｅｒ，Ｊ．Ｐ．Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｂ．Ｌｉｎａ，Ｒ．Ｍａｒｑｕｅｔ，Ａ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０，２１９７−２２０９（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ９８５）。
１５．Ｃ．Ｇａｖａｚｚｉ，Ｃ．Ｉｓｅｌ，Ｅ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｖ．Ｍｏｕｌｅｓ，Ａ．Ｃａｖａｌｉｅｒ，Ｄ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｂ．Ｌｉｎａ，Ｒ．Ｍａｒｑｕｅｔ，Ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｖｉａｎ  Ｈ５Ｎ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｕｍａｎ  Ｈ３Ｎ２  ｖｉｒｕｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１，１２４１−１２５４（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ１１８１）。
１６．Ｊ．Ｒ．Ｇｏｇ，Ｓ．Ａｆｏｎｓｏ  Ｅｄｏｓ，Ｒ．Ｍ．Ｄａｌｔｏｎ，Ｉ．Ｌｅｃｌｅｒｃｑ，Ｌ．Ｔｉｌｅｙ，Ｄ．Ｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ｖｏｎ  Ｋｉｒｃｈｂａｃｈ，Ｎ．Ｎａｆｆａｋｈ，Ｎ．Ｅｓｃｒｉｏｕ，Ｐ．Ｄｉｇａｒｄ，Ｃｏｄｏｎ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ＲＮＡ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５，１８９７−１９０７（２００７）１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ０８７）。
１７．Ｗ．Ｎ．Ｍｏｓｓ，Ｓ．Ｆ．Ｐｒｉｏｒｅ，Ｄ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｒｎａ  １７，９９１−１０１１（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｎ（１０．１２６１／ｒｎａ．２６１９５１１）。
１８．Ｙ．Ｌｉａｎｇ，Ｔ．Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｌｙ，Ｔ．Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ，Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＰＡ，ＰＢ１，ａｎｄ  ＰＢ２  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２，２２９−２３６（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ（１０．１１２８／ＪＶＩ．０１５４１−０７）。
１９．Ｋ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．Ｍｅｒｉｎｏ，Ｋ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ２’−ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＨＡＰＥ）：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １，１６１０−１６１６（２００６）１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００６．２４９）。
２０．Ｐ．Ｓ．Ｐａｎｇ，Ｍ．Ｅｌａｚａｒ，Ｅ．Ａ．Ｐｈａｍ，Ｊ．Ｓ．Ｇｌｅｎｎ，Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＨＡＰＥ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，ｅ１５１（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ７７３）。
２１．Ｓ．Ｆ．Ｐｒｉｏｒｅ，Ｗ．Ｎ．Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｈｏｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｌｏｂａｌ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３５９８９（２０１２）１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３５９８９）。
２２．Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｒ．Ｄａｓ，Ａ  ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｎ  ａ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ｈｅｌｉｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４９，７４１４−７４１６（２０１０）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＳｅｐ  ７（１０．１０２１／ｂｉ１０１１２３ｇ）。
２３．Ｓ．Ｔｉａｎ，Ｐ．Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｒ．Ｄａｓ，Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｔａｔｅ−ｍａｐ−ｒｅｓｃｕｅ  ｅｖａｌｕａｔｅｓ  ＳＨＡＰＥ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｕｎｃｏｖｅｒｓ  ｅｘｃｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅｓ．Ｒｎａ  ２０，１８１５−１８２６（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＮｏｖ（１０．１２６１／ｒｎａ．０４４３２１．１１４）。
２４．Ｂ．Ｖｅｓｔｅｒ，Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）：ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３，１３２３３−１３２４１（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＯｃｔ  ２６（１０．１０２１／ｂｉ０４８５７３２）。
２５．Ｋ．Ｋｌｕｍｐｐ，Ｒ．Ｗ．Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｆ．Ｂａｕｄｉｎ，Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＰ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６，１２４８−１２５７（１９９７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ  １７（１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／１６．６．１２４８）。
２６．Ｒ．Ｃｏｌｏｍａ，Ｊ．Ｍ．Ｖａｌｐｕｅｓｔａ，Ｒ．Ａｒｒａｎｚ，Ｊ．Ｌ．Ｃａｒｒａｓｃｏｓａ，Ｊ．Ｏｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｎｉｔｏ，Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ．ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ５，ｅ１０００４９１（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｎ（１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．１０００４９１）。
２７．Ｆ．Ｂａｕｄｉｎ，Ｃ．Ｂａｃｈ，Ｓ．Ｃｕｓａｃｋ，Ｒ．Ｗ．Ｒｕｉｇｒｏｋ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＲＮＰ．Ｉ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｌｔｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｎｈａｎｄｌｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ｅｘｐｏｓｅｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １３，３１５８−３１６５（１９９４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｌ  １（
２８．Ｔ．Ｃｏｅｌｈｏ，Ｄ．Ａｄａｍｓ，Ａ．Ｓｉｌｖａ，Ｐ．Ｌｏｚｅｒｏｎ，Ｐ．Ｎ．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｔ．Ｍａｎｔ，Ｊ．Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．Ｃｈｉｅｓａ，Ｓ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｅ．Ｔｒａｎｔｅｒ，Ｍ．Ｍｕｎｉｓａｍｙ，Ｒ．Ｆａｌｚｏｎｅ，Ｊ．Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ｃｅｈｅｌｓｋｙ，Ｂ．Ｒ．Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｍ．Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｂｕｔｌｅｒ，Ａ．Ｓｅｈｇａｌ，Ｒ．Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ，Ｑ．Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｂｏｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｖ．Ａ．Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｒ．Ａｌｖａｒｅｚ，Ｋ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｃ．Ｇａｍｂａ−Ｖｉｔａｌｏ，Ｓ．Ｖ．Ｎｏｃｈｕｒ，Ａ．Ｋ．Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ｄ．Ｗ．Ｓａｈ，Ｊ．Ａ．Ｇｏｌｌｏｂ，Ｏ．Ｂ．Ｓｕｈｒ，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９，８１９−８２９（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｕｇ  ２９（１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１２０８７６０）。
２９．Ｋ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｍ．Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｓ．Ｓｈｕｌｇａ−Ｍｏｒｓｋａｙａ，Ａ．Ｌｉｅｂｏｗ，Ｂ．Ｒ．Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｅ．Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｖ．Ａ．Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｖ．Ｋａｒｓｔｅｎ，Ｊ．Ｃｅｈｅｌｓｋｙ，Ｓ．Ｖ．Ｎｏｃｈｕｒ，Ｖ．Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｉ，Ｊ．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｔ．Ｍａｎｔ，Ｊ．Ｃｈｉｅｓａ，Ｊ．Ｒｉｔｔｅｒ，Ｍ．Ｍｕｎｉｓａｍｙ，Ａ．Ｋ．Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ｊ．Ａ．Ｇｏｌｌｏｂ，Ａ．Ｓｉｍｏｎ，Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｄｒｕｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ９（ＰＣＳＫ９）  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＬＤＬ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  ３８３，６０−６８（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ  ４（１０．１０１６／Ｓ０１４０−６７３６（１３）６１９１４−５）。
３０．Ｊ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ，Ｍ．Ｒ．Ｚａｍｏｒａ，Ｔ．Ｈｏｄｇｅｓ，Ａ．Ｗ．Ｍｕｓｋ，Ｕ．Ｓｏｍｍｅｒｗｅｒｋ，Ｄ．Ｄｉｌｌｉｎｇ，Ｓ．Ａｒｃａｓｏｙ，Ｊ．ＤｅＶｉｎｃｅｎｚｏ，Ｖ．Ｋａｒｓｔｅｎ，Ｓ．Ｓｈａｈ，Ｂ．Ｒ．Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｊ．Ｃｅｈｅｌｓｋｙ，Ｓ．Ｎｏｃｈｕｒ，Ｊ．Ｇｏｌｌｏｂ，Ａ．Ｖａｉｓｈｎａｗ，Ａ．Ｒ．Ｓｉｍｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ，ＡＬＮ−ＲＳＶ０１  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ  ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ３５，２１３−２２１（２０１６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＦｅｂ（１０．１０１６／ｊ．ｈｅａｌｕｎ．２０１５．０８．０１２）。
３１．Ｅ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｇ．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｙ．Ｋａｗａｏｋａ，Ｇ．Ｈｏｂｏｍ，Ｒ．Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ａ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ｅｉｇｈｔ  ｐｌａｓｍｉｄｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，６１０８−６１１３（２０００）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｙ  ２３（１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００１３３６９７）。
３２．Ｋ．Ｊ．Ｓｚｒｅｔｔｅｒ，Ａ．Ｌ．Ｂａｌｉｓｈ，Ｊ．Ｍ．Ｋａｔｚ，Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ：ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ｕｎｉｔ  １５Ｇ  １１（２００６）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１００２／０４７１７２９２５６．ｍｃ１５ｇ０１ｓ３）。
３３．Ｇ．Ａ．Ｍａｒｓｈ，Ｒ．Ｈａｔａｍｉ，Ｐ．Ｐａｌｅｓｅ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ａｒｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｖｉｒｉｏｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１，９７２７−９７３６（２００７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＳｅｐ（１０．１１２８／ｊｖｉ．０１１４４−０７）。
３４．Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ，Ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ＲＮＡ  ＳＨＡＰＥ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｏｎｅ−ｓｅｃｏｎｄ  ｓｎａｐｓｈｏｔｓ  ａｎｄ  ａｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４，１４１３−１４２１（２００９）１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．１２６）。
３５．Ａ．Ａｋｂａｒｉ，Ｇ．Ｍａｒｔｈｉｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．Ｌｉｆｊｅｌｄ，Ｆ．Ａｌｂｒｅｇｔｓｅｎ，Ｌ．Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｎ．Ｃ．Ｓｔｅｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．Ｊａｋｏｂｓｅｎ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２９，１２７３−１２８５（２００８）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ（１０．１００２／ｅｌｐｓ．２００７００５２３）。
３６．Ｐ．Ｓ．Ｐａｎｇ，Ｅ．Ａ．Ｐｈａｍ，Ｍ．Ｅｌａｚａｒ，Ｓ．Ｇ．Ｐａｔｅｌ，Ｍ．Ｒ．Ｅｃｋａｒｔ，Ｊ．Ｓ．Ｇｌｅｎｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍａｐ  ｏｆ  ａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６，１２５０−１２５４（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ（１０．１１２８／ＪＶＩ．０６３６７−１１）。
３７．Ｋ．Ｅ．Ｄｅｉｇａｎ，Ｔ．Ｗ．Ｌｉ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｋ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ，Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＳＨＡＰＥ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，９７−１０２（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ  ６（１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８０６９２９１０６）。
３８．Ｐ．Ｄｅ  Ｒｉｊｋ，Ｊ．Ｗｕｙｔｓ，Ｒ．Ｄｅ  Ｗａｃｈｔｅｒ，ＲｎａＶｉｚ  ２：ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９，２９９−３００（２００３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪａｎ  ２２。
３９．Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ＶａｎＬａｎｇ，Ｐ．Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｒ．Ｄａｓ，Ａ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３，９５４−９６２（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＤｅｃ（１０．１０３８／ｎｃｈｅｍ．１１７６）。
４０．Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｐ．Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｒ．Ｄａｓ，Ａ  ｍｕｔａｔｅ−ａｎｄ−ｍａｐ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  ｉｎｆｅｒｓ  ｔｈｅ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ  ｏｆ  ａ  ３５−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｏｄｅｌ  ＲＮＡ．Ｒｎａ  １７，５２２−５３４（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｒ（１０．１２６１／ｒｎａ．２５１６３１１）。
４１．Ｐ．Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ＶａｎＬａｎｇ，Ｒ．Ｄａｓ，ｉｎ  ＲＮＡ  Ｆｏｌｄｉｎｇ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｃ．Ｗａｌｄｓｉｃｈ，Ｅｄ．（２０１３），ｐｐ．ｉｎ  ｐｒｅｓｓ。
４２．Ｓ．Ａ．Ｍｏｒｔｉｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．Ｗｅｅｋｓ，Ａ  ｆａｓｔ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｄ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｂｙ  ＳＨＡＰＥ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２９，４１４４−４１４５（２００７）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｐｒ  １１（１０．１０２１／ｊａ０７０４０２８）。
４３．Ｓ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈｕｍ，Ｈ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｒ．Ｄａｓ，ＨｉＴＲＡＣＥ：ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｒｏｂｕｓｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２７，１７９８−１８０５（２０１１）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｌ  １（１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ２７７）。
４４．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｐ．Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｒ．Ｄａｓ，Ｓ．Ｙｏｏｎ，ＨｉＴＲＡＣＥ−Ｗｅｂ：ａｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｒｏｂｕｓｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１，Ｗ４９２−Ｗ４９８（２０１３）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＪｕｌｙ  １，２０１３（１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ５０１）。
４５．Ｊ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙｕ，Ｂ．Ｓｈｉｍ，Ｈ．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｍｉｎ，Ｅ．−Ｙ．Ｃｈｕｎｇ，Ｒ．Ｄａｓ，Ｓ．Ｙｏｏｎ，Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｐｅａｋ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｍａｐｐｉｎｇ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１１３７−１１４４（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｙ  １，２００９（１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ１１０）。
４６．Ｗ．Ｋｌａｄｗａｎｇ，Ｔ．Ｈ．Ｍａｎｎ，Ａ．Ｂｅｃｋａ，Ｓ．Ｔｉａｎ，Ｈ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙｏｏｎ，Ｒ．Ｄａｓ，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３，３０６３−３０６５（２０１４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｙ  ２０（１０．１０２１／ｂｉ５００３４２６）。
４７．Ｄ．Ｈ．Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｄ．Ｄｉｓｎｅｙ，Ｊ．Ｌ．Ｃｈｉｌｄｓ，Ｓ．Ｊ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，７２８７−７２９２（２００４）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＭａｙ  １１（１０．１０７３／ｐｎａｓ．０４０１７９９１０１）。
４８．Ｋ．Ｄａｒｔｙ，Ａ．Ｄｅｎｉｓｅ，Ｙ．Ｐｏｎｔｙ，ＶＡＲＮＡ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｄｒａｗｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１９７４−１９７５（２００９）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＡｕｇ  １（１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ２５０）。
４９．Ｐ．Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｊ．Ｂ．Ｌｕｃｋｓ，Ｒ．Ｄａｓ，Ａｎ  ＲＮＡ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ＤａｔａＢａｓｅ  ｆｏｒ  ｃｕｒａｔｉｎｇ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２８，３００６−３００８（２０１２）；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ＥｐｕｂＮｏｖ  １５（１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ５５４）．
【０１３７】
前述の発明は、理解の明瞭さの目的のための例証及び例示により、いくらか詳細に説明されたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、変更及び変形が行われ得ることは、当業者には容易に明らかとなる。
【０１３８】
したがって、前述は、本発明の原理を単に例証するものである。当業者は様々なアレンジを考案することができ、これは本明細書において明示的に説明または図示されていないが、本発明の原理を体現し、その精神及び範囲内に含まれることが明らかとなるであろう。さらに、本明細書に列挙される全ての例及び条件言語は、主に、読者が、本発明の原理及び当該技術分野を前進させるために発明者より与えられる概念を理解するのを助けることを意図し、こうした具体的に列挙される例及び条件に限定されないものと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、及び実施形態、ならびにこれらの具体例を列挙する本明細書の全ての記述は、これらの構造的及び機能的両方の同等物を包含することを意図している。加えて、こうした同等物は、現在知られている同等物及び将来開発される同等物の両方、すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を行うように開発されたいずれかの要素を含むことが意図される。本発明の範囲は、したがって、本明細書で図示及び説明される実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、添付の実施形態により体現される。
【０１３９】
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本明細書に記載される開示は、下記の項によっても説明される。
項１．ＰＢ２  ｖＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド配列を含み、その領域が、ＰＢ２  ｖＲＮＡの５’末端コード領域の（−）センス表記中のヌクレオチド３４〜８７を含む、オリゴヌクレオチド化合物、またはその塩。
項２．ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域と相補的な少なくとも８個のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド配列を含む、項１に記載の化合物。
項３．オリゴヌクレオチドが、ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域のパッケージングステムループ２（ＰＳＬ２）モチーフの領域と相補的である、項１〜２のいずれか１つに記載の化合物。
項４．オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、及びチオホスホルアミデート結合から選択されるヌクレオシド間結合を含む、項１〜３のいずれか１つに記載の化合物。
項５．オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合の全てが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、チオホスホルアミデート、及びホスホジエステル結合から選択される、項１〜４のいずれか１つに記載の化合物。
項６．オリゴヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む、項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
項７．オリゴヌクレオチドが、
５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号４５）、
５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号４６）、
５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４７）、
５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号４８）、
５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号４９）、
５’  ＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡ  ３’（配列番号５０）、
５’  ＴＡＣＴＴＡＣＴＧＡＣＡＧＣＣ  ３’（配列番号５１）、
５’  ＡＧＡＣＡＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧ  ３’（配列番号５２）、
５’  ＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴ  ３’（配列番号５３）、
５’  ＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴ  ３’（配列番号５４）、
５’  ＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号５５）、
５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５６）、
５’  ＣＧＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＣ  ３’（配列番号５７）、
５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５８）、
５’  ＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡ  ３’（配列番号５９）、
５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６０）、
５’  ＴＣＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＡＣＴ  ３’（配列番号６１）、
５’  ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡ  ３’（配列番号６２）、
５’  ＧＧＣＣＡＴＣＡＡＴＴＡＧＴＧ  ３’（配列番号６３）、
５’  ＴＴＣＧＧＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡ  ３’（配列番号６４）、
５’  ＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＧＡ  ３’（配列番号６５）、及び
５’  ＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡ  ３’（配列番号６６）から選択される配列を含む、項１〜６のいずれか１つに記載の化合物。
項８．オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドである、項７に記載の化合物。
項９．オリゴヌクレオチドが、
ＬＮＡ１：５’  ＡｃｃＡａａＡＧａａＴ  ３’（配列番号６７）、
ＬＮＡ２：５’  ＴｇｇＣｃＡＴｃａａＴ  ３’（配列番号６８）、
ＬＮＡ３：５’  ＴａｇＣＡｔＡｃｔｔＡ  ３’（配列番号６９）、
ＬＮＡ４：５’  ＣＣＡＡＡＡＧＡ  ３’（配列番号７０）、
ＬＮＡ５：５’  ＣＡＴＡＣＴＴＡ  ３’（配列番号７１）、
ＬＮＡ６：５’  ＣａｇａＣａＣＧａＣＣａａＡＡ  ３’（配列番号７２）、
ＬＮＡ７：５’  ＴＡｃＴｔａＣＴｇａＣａｇＣＣ  ３’（配列番号７３）、
ＬＮＡ８：５’  ＡＧＡＣａｃｇａｃｃａＡＡＡＧ  ３’（配列番号７４）、
ＬＮＡ９：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号７５）、
ＬＮＡ９．２：５’  ＴＡＣｔｔａｃｔｇａｃＡＧＣＣ  ３’（配列番号７６）、
ＬＮＡ１０：５’  ＡＣＣａａａａｇＡＡＴ  ３’（配列番号７７）、
ＬＮＡ１１：５’  ＴＧＧｃｃａｔｃＡＡＴ  ３’（配列番号７８）、
ＬＮＡ１２：５’  ＴＡＧｃａｔａｃＴＴＡ  ３’（配列番号７９）、
ＬＮＡ１３：５’  ＣｇａｃＣＡａａＡＧａａｔｔＣ  ３’（配列番号８０）、
ＬＮＡ１４：５’  ＣＧＡＣｃａａａａｇａＡＴＴＣ  ３’（配列番号８１）、
ＬＮＡ１５：５’  ＧａＴＧｇＣｃＡＴｃａＡｔｔＡ  ３’（配列番号８２）、
ＬＮＡ１６：５’  ＧＡＴＧｇｃｃａｔｃａＡＴＴＡ  ３’（配列番号８３）、
ＬＮＡ１７：５’  ＴｃＴＡｇＣａＴＡｃｔＴａｃＴ  ３’（配列番号８４）、
ＬＮＡ１８：５’  ＴＣＴＡｇｃａｔａｃｔＴＡＣＴ  ３’（配列番号８５）、
ＬＮＡ１９：５’  ＧＡＡｔｔｃｇｇａｔｇＧＣＣＡ  ３’（配列番号８６）、
ＬＮＡ２０：５’  ＧＧＣＣａｔｃａａｔｔａＧＴＧ  ３’（配列番号８７）、
ＬＮＡ２１：５’  ＴＴＣＧｇａｔｇｇｃｃａＴＣＡ  ３’（配列番号８８）、
ＬＮＡ２２：５’  ＡＧＣＣａｇａｃａｇＣＧＡ  ３’（配列番号８９）、
ＬＮＡ２３：５’  ＧＡＣＡｇｃｃａｇａｃａＧＣＡ  ３’（配列番号９０）、
ＬＮＡ９．Ｇ７４Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｔｇａｃａＧＴＣ  ３’（配列番号９１）、及び
ＬＮＡ９．Ｔ８０Ｃ：５’  ＴＡＣＴｔａｃｃｇａｃａＧＣＣ  ３’（配列番号９２）から選択される配列を含み、
大文字がＬＮＡヌクレオチドを示し、小文字がＤＮＡヌクレオチドを示す、項７に記載の化合物。
項１０．オリゴヌクレオチドが、少なくとも５個のデオキシリボヌクレオチドユニットを含み、ＲＮａｓｅを動員することができる、項１〜９のいずれか１つに記載の化合物。
項１１．化合物のＰＢ２  ｖＲＮＡの領域への結合が、ＰＢ２  ｖＲＮＡの全体的な二次ＲＮＡ構造を破壊する、項１〜１０のいずれか１つに記載の化合物。
項１２．化合物が、増強された細胞取込みを有するオリゴヌクレオチド複合体である、項１〜１１のいずれか１つに記載の化合物。
項１３．化合物が、オリゴヌクレオチド−脂質複合体である、項１２に記載の化合物。
項１４．化合物が、細胞特異的タンパク質を含むオリゴヌクレオチド複合体である、項１〜１２のいずれか１つに記載の化合物。
項１５．細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスの阻害方法であって、ＰＳＬ２モチーフを有するウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を、ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合してインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する有効量の薬剤と接触させることを含む、方法。
項１６．薬剤が、ｖＲＮＡのＰＳＬ２モチーフと相補的な少なくとも８個のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド化合物、またはその塩である、項１５に記載の方法。
項１７．薬剤が、項１〜１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド化合物である、項１５または１６に記載の方法。
項１８．試料中のｖＲＮＡが、ＰＢ２  ｖＲＮＡである、項１５〜１７のいずれか１つに記載の方法。
項１９．試料を薬剤と接触させることが、ウイルスの少なくとも２ｌｏｇ１０の力価損失をもたらす、項１５〜１８のいずれか１つに記載の方法。
項２０．薬剤が、ｖＲＮＡのＰＳＬ２モチーフの全体的な構造を破壊する、項１５〜１９のいずれか１つに記載の方法。
項２１．ｖＲＮＡが、ビリオンまたは細胞から単離される、項１５〜１９のいずれか１つに記載の方法。
項２２．ｖＲＮＡが、ビリオンまたは感染細胞中に含まれる、項１５〜１９のいずれか１つに記載の方法。
項２３．試料が、インビトロである、項１５〜２２のいずれか１つに記載の方法。
項２４．試料が、インビボである、項１５〜１９または２２のいずれか１つに記載の方法。
項２５．対象におけるインフルエンザＡ型ウイルス感染の治療または予防方法であって、それを必要とする対象に、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のＰＳＬ２モチーフに特異的に結合する有効量の活性剤を含む薬学的組成物を投与することを含む、方法。
項２６．ｖＲＮＡが、ＰＢ２  ｖＲＮＡである、項２５に記載の方法。
項２７．活性剤が、ＰＢ２  ｖＲＮＡの領域と相補的な少なくとも８個のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴヌクレオチド配列を含む化合物である、請求項２５〜２６のいずれか１つに記載の方法。
項２８．薬剤が、項１〜１４のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチド化合物である、項２５〜２７のいずれか１つに記載の方法。
項２９．対象が、インフルエンザＡ型ウイルス感染の危険性があり、オリゴヌクレオチド化合物の投与が、対象を感染に対して１週間以上（例えば、２週間以上、３週間以上、１か月以上、２か月以上、３か月以上、等）保護する、項２５〜２８のいずれか１つに記載の方法。
項３０  投与が、有効用量のオリゴヌクレオチド化合物の１週間に１回、２週間に１回、または１か月に１回の投与を含む、項２９に記載の方法。
項３１．投与が、対象の試料中のウイルスの少なくとも２ｌｏｇ１０の力価損失をもたらす、項２５〜３０のいずれか１つに記載の方法。
項３２．活性剤が、増強された細胞取込みを有するオリゴヌクレオチド複合体である、項２５〜３０のいずれか１つに記載の方法。
項３３．活性剤が、細胞特異的タンパク質を含むオリゴヌクレオチド複合体である、項２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
項３４．薬学的組成物が、細胞取込みの増強剤を含む、項２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
項３５．薬学的組成物が、第２のオリゴヌクレオチド活性剤及び抗ウイルス剤から選択される追加の活性剤をさらに含む、項２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
項３６．活性剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはアンチセンスＤＮＡである、項２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
項３７．対象が、インフルエンザＡ型ウイルス感染の危険性があり、方法が、感染を予防する、項２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
項３８．対象が、インフルエンザＡ型ウイルス感染またはその疑いがあると診断され、方法が、感染を治療する、項２５〜３１のいずれか１つに記載の方法。
項３９．細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する能力について候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、
ＰＳＬ２モチーフを含むウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を含む試料を候補薬剤と接触させることと、
候補薬剤がＰＳＬ２モチーフに特異的に結合するかを決定することと、を含み、
ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合する薬剤が、細胞中のインフルエンザＡ型ウイルスを阻害する、方法。
項４０．候補薬剤が、小分子、核酸、及びポリペプチドから選択される、項３９に記載の方法。
項４１．決定ステップが、細胞パラメータを検出することを含み、細胞中のパラメータの、候補薬剤と接触していない細胞中と比較した変化が、候補薬剤がＰＳＬ２モチーフに特異的に結合することを示す、項４０に記載の方法。
項４２．ＰＳＬ２モチーフに特異的に結合する薬剤が、インフルエンザＡ型ウイルス感染を有する対象を治療する、項３９〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【図１Ａ】
2019511471.tif 000002
【図１Ｂ】
2019511471.tif 000003
【図１Ｃ】
2019511471.tif 000004
【図１Ｄ】
2019511471.tif 000005
【図１Ｅ】
2019511471.tif 000006
【図１Ｆ】
2019511471.tif 000007
【図２】
2019511471.tif 000008
【図３Ａ】
2019511471.tif 000009
【図３Ｂ】
2019511471.tif 000010
【図３Ｃ】
2019511471.tif 000011
【図３Ｄ】
2019511471.tif 000012
【図３Ｅ】
2019511471.tif 000013
【図４】
2019511471.tif 000014
【図５Ａ】
2019511471.tif 000015
【図５Ｂ】
2019511471.tif 000016
【図５Ｃ】
2019511471.tif 000017
【図５Ｄ】
2019511471.tif 000018
【図６】
2019511471.tif 000019
【図７】
2019511471.tif 000020
【図８】
2019511471.tif 000021
【図９Ａ】
2019511471.tif 000022
【図９Ｂ】
2019511471.tif 000023
【図９Ｃ】
2019511471.tif 000024
【図１０】
2019511471.tif 000025
【図１１】
2019511471.tif 000026
【図１２】
2019511471.tif 000027
【図１３】
2019511471.tif 000028
【図１４】
2019511471.tif 000029
【図１５】
2019511471.tif 000030
【図１６Ａ】
2019511471.tif 000031
【図１６Ｂ】
2019511471.tif 000032
【図１７】
2019511471.tif 000033
【図１８】
2019511471.tif 000034
【図１９】
2019511471.tif 000035
【配列表】
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【国際調査報告】
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