(57)【要約】本発明は、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療、予防、若しくは改善するためのポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤及び／又はテトラサイクリンの使用、並びにＰＡＲＰ阻害剤又はテトラサイクリンを含む医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善における使用のための、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物。
【請求項２】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものである、請求項１に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項３】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、メンケベルグ動脈硬化症又は尿毒症性細小動脈石灰化症（ＣＵＡ）の治療、予防、又は改善における使用のためのものである、請求項２に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項４】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、慢性腎疾患、糖尿病、老化、副甲状腺機能亢進症、高リン酸血症、ビタミンＤ障害、ビタミンＫ障害、骨粗鬆症、川崎病、ＣＤ７３の欠乏による動脈石灰化（ＡＣＤＣ）、乳児全身性動脈石灰化症（ＧＡＣＩ）、特発性基底核石灰化症（ＩＢＧＣ）、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、関節リウマチ、シングルトン−マーテン症候群、及び／又はβ−サラセミアに罹患している対象における血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものである、請求項２又は３に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項５】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、内膜アテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものである、請求項１に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項６】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、又は少なくとも１００のＡｇａｔｓｔｏｎスコアを有する患者におけるアテローム硬化性石灰化の治療における使用のためのものである、請求項５に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項７】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、ＰＡＲＰ阻害剤であり、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、タラゾパリブ、ミノサイクリン、シロスタゾール、Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロフェナントリジン−２−イル）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）アセトアミド塩酸塩（ＰＪ３４）、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）、及び３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシル］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）若しくはそれらの誘導体、又はそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項８】
前記ＰＡＲＰ阻害剤が、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、タラゾパリブ、ミノサイクリン、及びシロスタゾール、又はそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項７に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項９】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、テトラサイクリンであり、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、ドキシサイクリン、チゲサイクリン、クロモサイクリン、及びピパサイクリンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項１０】
前記テトラサイクリンが、ミノサイクリンである、請求項９に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項１１】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、１ｍｇ〜１００００ｍｇ若しくは２ｍｇ〜２０００ｍｇ、５ｍｇ〜１０００ｍｇ、１０ｍｇ〜２００ｍｇ、１５ｍｇ〜１００ｍｇ、又は２０ｍｇ〜５０ｍｇの１日用量として投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項１２】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、１日２回の用量として投与され、各用量が、１ｍｇ〜５０００ｍｇ、２ｍｇ〜１０００ｍｇ、３ｍｇ〜５００ｍｇ、４ｍｇ〜１００ｍｇ、５ｍｇ〜５０ｍｇ、又は１０ｍｇ〜２５ｍｇである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項１３】
各用量が、１０ｍｇ〜２５ｍｇである、請求項１２に記載の使用のためのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン。
【請求項１４】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物、並びに薬学的に許容されるビヒクルを含む、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療、予防、又は改善するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のものである、請求項１４又は１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
治療有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物と、薬学的に許容されるビヒクルとを接触させることを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物を製造するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管石灰化に関し、特に、過剰及び／又は不適切な血管石灰化に関連する疾患の治療に有用な化合物に関する。本発明は、特に、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療することに関する。本発明は、過剰な及び／又は不適切な（すなわち中膜）血管石灰化を治療する医薬組成物及び方法に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
血管石灰化は、様々な疾患に関連し、３つの異なる種類、すなわち（ｌ）内膜の石灰化であり、アテローム性動脈硬化症及び関連する炎症を含む、内膜アテローム硬化性石灰化、（２）大動脈弁の石灰化である弁石灰化大動脈弁狭窄症、及び（３）中膜の石灰化である動脈中膜石灰化に大きく分類され、Ｄｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｎｔｕｔ  “Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００８；１１７，２９３８−２９４８を参照のこと。
【０００３】
中膜は、動脈又は静脈の中間層であり、平滑筋細胞及び弾性組織からなる。
【０００４】
図２８Ａに示すように、アテローム硬化性石灰化は偏心状であり、内腔の変形をもたらす。内腔の変形は、線維性内膜キャップ４によって覆われている、コレステロールを担持した白血球（泡沫細胞）に起因するリポタンパク質沈着３によって引き起こされる。石灰化１は、キャップ４を含むアテローム性動脈硬化病変の全体にわたって起こり、病巣の弾力線維分解２は、リポタンパク質沈着３に隣接する中膜において生じる。血管硬化は、アテローム硬化性石灰化によって引き起こされる。
【０００５】
逆に、図２８Ｂに示すように、中膜石灰化は同心円状である。従って、石灰化１及び弾力線維分解は、中膜全体にわたって生じる。血管硬化はまた、中膜石灰化によって引き起こされる。
【０００６】
分子レベルでは、石灰化は、鉱物粒子の形成及び細胞外マトリックスへの結合である。過去２０年間にわたる研究により、血管石灰化が発達中の骨／軟骨形成と類似した細胞媒介プロセスであることが実証されている。石灰化は、骨に必要不可欠であるマトリックスの硬化をもたらすが、血管組織の機械的特性に有害な結果をもたらす。
【０００７】
メンケベルグ動脈硬化症は、中膜石灰化硬化症としても知られており、中膜石灰化の最も典型的な種類である。さらに、尿毒症性細小動脈石灰化症（ＣＵＡ）は、カルシフィラキシスとしても知られており、皮膚壊死及び脂肪織炎を生じさせる重度の病的で生命を脅かす血管中膜石灰化形態である。
【０００８】
血管石灰化によって引き起こされる大動脈及び動脈の弾力性の減少は、心血管の血行動態を損なう。これは、高血圧、大動脈弁狭窄症、心臓肥大、心筋及び下肢虚血、並びにうっ血性心不全をもたらし得る。特に、血管石灰化は、心血管疾患の主要な危険因子である。
【０００９】
血管石灰化はまた、典型的には、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、慢性腎疾患、老化、副甲状腺機能亢進症、ビタミンＤ障害、ビタミンＫ欠乏症、骨粗鬆症、川崎病、ＣＤ７３の欠乏による動脈石灰化（ＡＣＤＣ）、乳児全身性動脈石灰化症（ＧＡＣＩ）、特発性基底核石灰化症（ＩＢＧＣ）、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、関節リウマチ、シングルトン−マーテン症候群、β−サラセミア、及びワルファリンの使用に関連する。
【００１０】
従って、過度及び／若しくは不適切な血管石灰化、並びに特に血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化に関連する疾患を治療、予防、又は改善するために使用することができる化合物が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
実施例に記載されているように、本発明者らは、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤として作用する様々な化合物及びテトラサイクリン類の抗生物質を使用して、血管中膜石灰化を減少させることができることを実証した。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】細胞溶解及び洗浄後のインビトロヒトＶＳＭＣ細胞外マトリックスの２次元１３Ｃ−１３Ｃ相関ＮＭＲスペクトルを示す図である。グルコースから生合成された糖成分は、グリシン及びプロリン／ヒドロキシプロリン（主としてコラーゲンタンパク質に存在する）と同様に、１３Ｃ標識されている。コラーゲングリシン、プロリン、及びヒドロキシプロリン、並びにコラーゲングリコシル化（主として、Ｏ−結合型α−グルコシル−β−ガラクトシル及びβ−ガラクトシル）からの予想されるアミノ酸シグナルに加えて、ポリ（ＡＤＰリボース）からの明確なシグナルがある。イタリック体の表示は、ポリ（ＡＤＰリボース）シグナルと重複する他の分子種からのシグナルがあることを示す。
【図１Ｂ】図１Ａで使用されるポリ（ＡＤＰリボース）の原子番号付けスキームを示す図である。
【図２】ヒト頸動脈病変におけるポリ（ＡＤＰリボース）（ＰＡＲ）／ＤＮＡ損傷の発現を示す図である。低倍率でのヒト頸動脈病変の位相差画像（Ａ）及び蛍光画像（Ｂ）（スケールバーは１５０μｍである）。画像の左上には、内膜肥厚領域（ｉＴ）と境を接して病変部の無細胞核（ＡＣ）があり、培地（右下）の隣には石灰化（ＣａＰ）がある。病変石灰化は、（Ａ）では暗い沈着物として、（Ｂ）ではカルセイン染色後に緑色蛍光として明瞭に見える。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色され、青色に見える。培地中のＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸ抗体、赤色）及びＰＡＲ（クローン１０Ｈ抗体、緑色）の免疫染色（Ｃ及びＤ、スケールバーは１８μＭである）は、主に、核の近くの位置での染色を示し、対照的に、内膜肥厚／石灰化領域（Ｅ及びＦ、スケールバーは１６μｍである）では、染色はより広範であり、核並びに細胞質及び／又は細胞外領域に関連して位置する。
【図３】胎児ヒツジ骨成長板におけるポリ（ＡＤＰリボース）（ＰＡＲ）／ＤＮＡ損傷の発現を示す図である。低倍率での胎児ヒツジ成長板の位相差画像（Ａ）及び蛍光画像（Ｂ）（スケールバーは１５０μｍである）。画像の左上には、成長板の肥大軟骨（ＨＣ）のゾーンがあり、鉱物が形成し始める石灰化ゾーン（ＣＦ）（右下）に接している。鉱物は、（Ｂ）においてカルセイン染色後の緑色蛍光によって明瞭に見える。細胞核はＨｏｅｃｈｓｔ色素で染色され、青色に見える。鉱化が起こる境界近くのＨＣゾーンにおけるＰＡＲ（クローン１０Ｈ抗体、緑色）及びＤＮＡ損傷（Ｈ２Ａ．Ｘ抗体、赤色）に対する免疫染色（Ｃ及びＤ、スケールバーは１０μｍである）は、主に、核の近くの位置での染色を示しているが（矢印）、核ＤＮＡから離れても弱い染色が見える（アスタリスク）。骨梁を取り囲むＣＦゾーン（Ｅ及びＦ、スケールバーは１０μｍである）では、ＰＡＲ及びＤＮＡ損傷染色は、核（矢印）並びに細胞質及び／又は細胞外領域（アスタリスク）に関連して位置している。
【図４Ａ】０〜１００μＭの濃度でのＮ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロフェナントリジン−２−イル）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）アセトアミド塩酸塩（ＰＪ３４）、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）、及び３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシル］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）、並びに対応する希釈でのＤＭＳＯビヒクルの、７日間にわたるウシ血管平滑筋細胞（ｂＶＳＭＣ）に対する毒性を示すグラフである。
【図４Ｂ】０〜１００μＭの濃度でのＮ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロフェナントリジン−２−イル）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）アセトアミド塩酸塩（ＰＪ３４）、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）、及び３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシル］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）、並びに対応する希釈でのＤＭＳＯビヒクルの、７日間にわたるウシ血管平滑筋細胞（ｂＶＳＭＣ）に対する毒性を示すグラフである。
【図５Ａ】０〜１００μＭの濃度でのＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、３−ＡＢ、及びＤＰＱ、並びに対応する希釈でのＤＭＳＯビヒクルの、７日間にわたるヒト単球マクロファージ（ＨＭＭ）に対する毒性を示すグラフである。
【図５Ｂ】０〜１００μＭの濃度でのＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、３−ＡＢ、及びＤＰＱ、並びに対応する希釈でのＤＭＳＯビヒクルの、７日間にわたるヒト単球マクロファージ（ＨＭＭ）に対する毒性を示すグラフである。
【図６】ｂＶＳＭＣを培地のみ（ＮＡ）又はＧＡＤ培地で増殖し、阻害剤を添加しなかったか又は１０μＭの濃度のＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、又は３−ＡＢを添加したときのアリザリンレッドＳ染色を用いて得られた結果を示す写真である。
【図７Ａ】ｂＶＳＭＣを培地のみ（ＮＡ）で増殖させ、阻害剤を添加しなかったか又は１０μＭの濃度のＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、又は３−ＡＢを添加したときのプレートから得られたカルシウムの質量を示すグラフである。
【図７Ｂ】ｂＶＳＭＣをＧＡＤ培地で増殖させ、阻害剤を添加しなかったか又は１０μＭの濃度のＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、ジピリダモール（ＤＰ）、又は３−ＡＢを添加したときのプレートから得られたカルシウムの質量を示すグラフである。
【図８】図７Ａ及び図７Ｂにカルシウム含有量が示されている各プレートのタンパク質含有量を示すグラフである。
【図９Ａ】それぞれ図７Ａ及び図７Ｂに示される結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を示すグラフである。
【図９Ｂ】それぞれ図７Ａ及び図７Ｂに示される結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を示すグラフである。
【図１０】潜在的阻害剤の非存在下（ＮＡ）又は１０μＭ、１μＭ、若しくは０．１μＭの濃度のＰＪ３４（ＰＪ）若しくはミノサイクリン（ＭＣ）の存在下において、対照培地（ＧＡＤなし）又はβ−ＧＡＤ培地（ＧＡＤあり）で７日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの細胞生存率の結果を示すグラフである。
【図１１】潜在的阻害剤の非存在下（ＮＡ）又は１０μＭ、１μＭ、若しくは０．１μＭの濃度のＰＪ３４（ＰＪ）若しくはミノサイクリン（ＭＣ）の存在下において、対照培地（ＧＡＤなし）又はβ−ＧＡＤ培地（ＧＡＤあり）で９日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの細胞生存率の結果を示すグラフである。
【図１２】潜在的阻害剤の非存在下（ＮＡ）又は１０μＭ、１μＭ、若しくは０．１μＭの濃度のＰＪ３４若しくはミノサイクリン（ＭＣ）の存在下において、対照培地（ＧＡＤなし）又はβ−ＧＡＤ培地（ＧＡＤあり）で７日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの試料中のＣａ２＋濃度を示すグラフである。
【図１３】潜在的阻害剤の非存在下（ＮＡ）又は１０μＭ、１μＭ、若しくは０．１μＭの濃度のＰＪ３４若しくはミノサイクリン（ＭＣ）の存在下において、対照培地（ＧＡＤなし）又はβ−ＧＡＤ培地（ＧＡＤあり）で９日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの試料中のＣａ２＋濃度を示すグラフである。
【図１４】潜在的阻害剤の非存在下（ＮＡ）又は１０μＭ、１μＭ、若しくは０．１μＭの濃度のＰＪ３４若しくはミノサイクリン（ＭＣ）の存在下において、対照培地のみ（−）又はβ−ＧＡＤ培地（＋）で７日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの試料中のタンパク質の総質量を示すグラフである。
【図１５】潜在的阻害剤の非存在下において（ＮＡ）又は１０μＭ、１μＭ、若しくは０．１μＭの濃度のＰＪ３４若しくはミノサイクリン（ＭＣ）の存在下において、対照培地のみ（−）又はβ−ＧＡＤ培地（＋）で９日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの試料中のタンパク質の総質量を示すグラフである。
【図１６】潜在的阻害剤なし（ＮＡ）で９日間にわたりＧＡＤ培地で増殖させたｂＶＳＭＣと比較した、潜在的阻害剤の有無において９日間にわたりＧＡＤ培地で増殖させたｂＶＳＭＣの試料中のＣａ２＋濃度をパーセンテージで示すグラフである。
【図１７】ＤＭＳＯのみ（陰性対照）、ＤＭＳＯ＋Ｃａ／Ｐ（鉱化の陽性対照）の存在下において、又は様々な濃度のＰＡＲＰ阻害剤（ＰＪ−３４、ミノサイクリン、又はシロスタゾール）存在下での鉱化条件下で、ヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）を増殖させたときのプレートから得られたカルシウムの質量を示すグラフである。
【図１８】図１７にカルシウム含有量が示されている各プレートのタンパク質含有量を示すグラフである。
【図１９】図１７に示される結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を示したグラフである。
【図２０】ＤＭＳＯのみ（陰性対照）、ＤＭＳＯ＋Ｃａ／Ｐ（鉱化の陽性対照）の存在下において、又は３μＭの濃度のＰＡＲＰ阻害剤（ミノサイクリン、シロスタゾール、オラパリブ、タラゾパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、又はＰＪ−３４）の存在下での鉱化条件下で、ヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）を増殖させたときのプレートから得られたカルシウムの質量を示すグラフである。
【図２１】図２０にカルシウム含有量が示されている各プレートのタンパク質含有量を示すグラフである。
【図２２】図２０に示される結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を示すグラフである。
【図２３】図２０にカルシウム含有量が示されている各プレートのアリザリンレッドＳ染色を用いて得られた結果を示す写真である。
【図２４】図２０にカルシウム含有量が示されている各プレートの近接写真である。
【図２５】ＤＭＳＯのみ（陰性対照）、ＤＭＳＯ＋Ｃａ／Ｐ（鉱化の陽性対照）の存在下において、又はグラフ上に示される種々の濃度のＰＡＲＰ阻害剤（ベリパリブ、ミノサイクリン、若しくはシロスタゾール）又は別の薬物（ボセンタン、ペントキシフィリン、ロサルタン、アムロジピン、若しくはアトルバスタチン）の存在下での鉱化条件下で、ヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）を増殖させたときのプレートから得られたカルシウムの質量を示すグラフである。
【図２６】図２５にカルシウム含有量が示されている各プレートのタンパク質含有量を示すグラフである。
【図２７】図２５に示される結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を示すグラフである。
【図２８Ａ】アテローム硬化性石灰化を示す図である。
【図２８Ｂ】中膜石灰化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
従って、本発明の第１の態様によれば、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善における使用のための、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物を提供する。
【００１４】
本発明の第２の態様によれば、対象における血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療、予防、又は改善する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量のポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物を投与することを含む、方法を提供する。
【００１５】
有利なことに、実施例は、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが用量依存的な様式で石灰化を阻害することを示している。さらに、実施例は、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンが、中膜中に存在する平滑筋細胞の石灰化を阻害することを示す。従って、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、中膜に存在する平滑筋細胞の石灰化を阻害することが好ましい。ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、動脈中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものであることが好ましい。
【００１６】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものであることが好ましい。
【００１７】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、メンケベルグ動脈硬化症及び尿毒症性細小動脈石灰化症（ＣＵＡ）からなる群から選択される疾患の治療、予防、又は改善における使用のためのものであることが好ましい。
【００１８】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、慢性腎疾患、糖尿病、老化、副甲状腺機能亢進症、高リン酸血症、ビタミンＤ障害、ビタミンＫ障害、骨粗鬆症、川崎病、ＣＤ７３の欠乏による動脈石灰化（ＡＣＤＣ）、乳児全身性動脈石灰化症（ＧＡＣＩ）、特発性基底核石灰化症（ＩＢＧＣ）、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、関節リウマチ、シングルトン−マーテン症候群、及び／又はβ−サラセミアに罹患している対象における血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものであることが好ましい。慢性腎疾患は、末期腎疾患であることが好ましい。糖尿病は、Ｉ型糖尿病であり得る。糖尿病は、ＩＩ型糖尿病であることが好ましい。ビタミンＤ障害は、ビタミンＤ毒性であることが好ましい。ビタミンＫ障害は、ビタミンＫ欠乏症であることが好ましい。
【００１９】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、ワルファリンを処方されている対象における血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものであることが好ましい。
【００２０】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、大動脈弁の石灰化などの弁石灰化大動脈弁狭窄症の治療、予防、又は改善における使用のためのものではないことが好ましい。或いは、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、内膜アテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものであり得る。
【００２１】
本発明者らが留意したことは、アテローム硬化性石灰化は、血管平滑筋細胞の骨形成分化、換言すれば、石灰化が起こる前に血管細胞の特異的な変質を必要とすることである。この理由から、どれほど悪いものであっても決して石灰化しないアテローム性動脈硬化性プラークが存在し、血管損傷の初期段階において石灰化する他のものも同様に存在する。従って、石灰化は、アテローム性動脈硬化症の不可避の部分ではなく、選ばれた患者群のみが罹患することとなるであろう。アテローム硬化性石灰化を引き起こす細胞変質を誘発するものは明確には知られていないが、一般に、アテローム性動脈硬化症における石灰化を防止する制御機構が一部の患者において機能しなくなり、アテローム硬化性石灰化を生じさせ得ると考えられている。
【００２２】
アテローム硬化性石灰化に罹患している患者は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いて同定することができる。ＣＴスキャンを使用して、患者の全ての冠動脈におけるプラーク密度及びその面積から導き出される疑似連続変数であるＡｇａｔｓｔｏｎスコアを計算することができる。従って、Ａｇａｔｓｔｏｎスコアが０の対象は、冠動脈石灰化を有しないであろう。ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、Ａｇａｔｓｔｏｎスコアが少なくとも２０、より好ましくは少なくとも４０、少なくとも６０、又は少なくとも８０、及び最も好ましくは少なくとも１００である患者のアテローム硬化性石灰化の治療における使用のためのものであることが好ましい。
【００２３】
プラークの構造的ストレスは、初期のプラーク石灰化に伴って最初は増加し、プラークの破裂を生じさせ、これが今度は心臓発作を引き起こし得る。従って、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、アテローム性動脈硬化症の初期の石灰化を示す患者のアテローム硬化性石灰化の治療における使用のためのものである。患者の血管系の画像は仮想組織学的血管内超音波法（ＶＨ−ＩＶＵＳ）を用いて得ることができ、初期の石灰化を示す患者をその画像から同定することができるであろう。
【００２４】
従って、本発明者らは、新規の患者群、すなわちＰＡＲＰ阻害剤を用いて成功裏に治療し得るアテローム硬化性石灰化に罹患している患者を同定した。本発明者らが留意したのは、スタチンは、通常、アテローム性動脈硬化症を治療するために使用されることである。しかしながら、実施例９に示すように、スタチンは石灰化自体を治療しないので、スタチンを用いてもアテローム硬化性石灰化は治療されないであろう。実際、スタチンの使用により内膜石灰化が増加するという証拠がいくつかある。従って、本発明は、ＰＡＲＰ阻害剤を用いて特異的かつ意図的に新規の患者群を治療することを可能にする。
【００２５】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、高血圧、大動脈弁狭窄症、心臓肥大、心筋及び下肢虚血、並びにうっ血性心不全に罹患している対象におけるアテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのものであることが好ましい。
【００２６】
ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、タラゾパリブ、ミノサイクリン、シロスタゾール、Ｎ−（６−オキソ−５，６−ジヒドロフェナントリジン−２−イル）−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）アセトアミド塩酸塩（ＰＪ３４）、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢ）、及び３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシル］−１（２Ｈ）−イソキノリノン（ＤＰＱ）又はそれらの誘導体からなる群から選択され得る。
【００２７】
ＰＡＲＰ阻害剤は、哺乳動物細胞によって産生されるＰＡＲＰを阻害できることが好ましい。
【００２８】
ＰＡＲＰ阻害剤は、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、タラゾパリブ、ミノサイクリン、若しくはシロスタゾール、又はそれらの誘導体を含むことが好ましい。或いは、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＪ３４、ミノサイクリン、３−ＡＢ、又はＤＰＱを含む。
【００２９】
ミノサイクリンの誘導体は、一般式［ＩＩ］を有することができる：
【化１】
2019518030.tif 000002
式［ＩＩ］
（式中、各Ｒ３は、Ｃ１〜３アルキルである）。
【００３０】
ベリパリブの誘導体は、一般式［ＩＩＩ］を有することができる：
【化２】
2019518030.tif 000003
式［ＩＩＩ］
（式中、Ｒ４はＣ１〜３アルキルであり、Ｒ５及びＲ６は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、５員又は６員のヘテロシクリル基を形成する）。
【００３１】
Ｒ４は、メチルであることが好ましい。Ｒ５及びＲ６は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、５員のヘテロシクリル基を形成することが好ましい。ヘテロシクリル基は、ピロリジン又はテトラヒドロフランであることがより好ましい。
【００３２】
ニラパリブの誘導体は、一般式［ＩＶ］を有することができる：
【化３】
2019518030.tif 000004
式［ＩＶ］
（式中、Ｌ１は、６員のアリール又はヘテロアリール基であり、Ｒ７及びＲ８は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、５員又は６員のヘテロシクリル基を形成する）。
【００３３】
Ｌ１は、フェニル基であることが好ましい。Ｌ１は、パラ位で置換されていることが好ましい。Ｒ７及びＲ８は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、６員のヘテロシクリル基を形成することが好ましい。ヘテロシクリル基は、ピペリジン、テトラヒドロピラン、又はチアンであることがより好ましい。
【００３４】
ルカパリブの誘導体は、一般式［Ｖ］を有することができる：
【化４】
2019518030.tif 000005
式［Ｖ］
（式中、Ｘ６はハロゲンであり、Ｌ２は、６員のアリール又はヘテロアリール基であり、Ｒ９はＣ１〜３アルキルである）。
【００３５】
Ｘ６は、フッ素、塩素、又は臭素であることが好ましく、フッ素又は塩素であることがより好ましく、フッ素であることが最も好ましい。Ｌ２は、フェニル基であることが好ましい。Ｌ２は、パラ位で置換されていることが好ましい。Ｒ９は、メチルであることが好ましい。
【００３６】
オラパリブの誘導体は、一般式［ＶＩ］を有することができる：
【化５】
2019518030.tif 000006
式［ＶＩ］
（式中、Ｘ７は、ハロゲンであり、Ｌ３は、６員のシクロアルキル又はヘテロシクリル基であり、Ｒ１０及びＲ１１は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、３〜６員のシクロアルキル基を形成する）。
【００３７】
Ｘ７は、フッ素、塩素、又は臭素であることが好ましく、フッ素又は塩素であることがより好ましく、フッ素であることが最も好ましい。Ｌ３は、６員のヘテロシクリル基であることが好ましい。Ｌ３は、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサン、又はジチアンであることがより好ましい。Ｌ３は、
【化６】
2019518030.tif 000007
であることがより好ましい。Ｒ１０及びＲ１１は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロプロピル、シクロブチル、又はシクロペンチルを形成することが好ましく、シクロプロピル又はシクロブチルを形成することがより好ましく、シクロプロピルを形成することが最も好ましい。
【００３８】
タラゾパリブの誘導体は、一般式［ＶＩＩ］を有することができる：
【化７】
2019518030.tif 000008
式［ＶＩＩ］
（式中、Ｘ８はハロゲンであり、Ｘ９はハロゲンであり、Ｒ１２はＣ１〜３アルキルである）。
【００３９】
Ｘ８は、フッ素、塩素、又は臭素であることが好ましく、フッ素又は塩素であることがより好ましく、フッ素であることが最も好ましい。Ｘ９は、フッ素、塩素、又は臭素であることが好ましく、フッ素又は塩素であることがより好ましく、フッ素であることが最も好ましい。Ｒ１２は、メチルであることが好ましい。
【００４０】
図９Ｂ、図１３、及び図１６に示すように、ミノサイクリンは用量依存的な様式で石灰化を阻害する。
【００４１】
テトラサイクリンは、以下の式Ｉの構造を有する広域スペクトル抗生物質群である：
【化８】
2019518030.tif 000009
式［Ｉ］
（式中、Ｘ１は、Ｈ、Ｃｌ、又はＮ（ＣＨ３）２であり、Ｒ１はＨ若しくはＣＨ３であり、かつＸ２はＨ若しくはＯＨであるか、又はＲ１はＣＨ２であり、かつＸ１は存在せず、Ｘ３は、ＯＨ又はＨであり、Ｘ４は、ＯＨであり、Ｒ２は、Ｈ、
【化９】
2019518030.tif 000010
、
【化１０】
2019518030.tif 000011
、
【化１１】
2019518030.tif 000012
又は
【化１２】
2019518030.tif 000013
であり、Ｘ５は、Ｈ又は
【化１３】
2019518030.tif 000014
である）。
【００４２】
血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善における使用のためのテトラサイクリンは、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物であることが好ましい。
【００４３】
テトラサイクリンは、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、ドキシサイクリン、チゲサイクリン、クロモサイクリン、及びピパサイクリンからなる群から選択され得る。図９Ｂ、図１３、及び図１６に示すように、ミノサイクリンは、用量依存的な様式で石灰化を阻害する。従って、テトラサイクリンは、ミノサイクリンであることが最も好ましい。ミノサイクリンは、ＰＡＲＰ阻害剤及びテトラサイクリンのいずれでもあることは理解されよう。
【００４４】
薬学的に許容される塩には、その生物学的特性を保持し、毒性でないか、そうでなければ薬学的使用に望ましくないものではない、本明細書で提供されるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの任意の塩が含まれる。薬学的に許容される塩は、当技術分野で周知の様々な有機及び無機対イオンから誘導することができる。
【００４５】
薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンチルプロピオン酸、グリコール酸、グルタル酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マイレン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ピクリン酸、桂皮酸、マンデル酸、フタル酸、ラウリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、樟脳酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、安息香酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸、ムコン酸などの有機酸又は無機酸で形成される酸付加塩を含むことができる。或いは、薬学的に許容される塩は、親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、アルミニウムイオン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化亜鉛、及び水酸化バリウムなどのアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属水酸化物、又はアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、Ｎ−メチルグルカミンピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、水酸化テトラメチルアンモニウムなどの脂肪族、脂環式、若しくは芳香族有機アミンなどの有機塩基との配位物（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）のいずれかによって置き換えられる場合に形成される塩基付加塩を含むことができる。
【００４６】
例えば、ピパサイクリンの薬学的に許容される塩は、ペニメピサイクリンであってもよい。
【００４７】
薬学的に許容される溶媒和物は、非共有結合分子間力によって結合された化学量論量又は非化学量論量の溶媒をさらに含む、本明細書で提供されるＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン又はそれらの塩を指す。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。
【００４８】
本明細書に記載のＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物は、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化の治療、改善、又は予防のための単独療法（すなわち、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンのみ使用）で使用し得る医薬に使用し得ることが理解されるであろう。或いは、ＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物は、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療、改善、又は予防するための公知の治療剤の補助剤として、又はその治療剤と組み合わせて使用することができる。
【００４９】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、特に組成物が使用される様式に依存したいくつかの異なる形態の組成物で組み合わせることができる。従って、例えば、組成物は、散剤、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、又は治療を必要とする人又は動物に投与することができる任意の他の好適な形態であってもよい。本発明による医薬のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に忍容されるものでなければならないことは理解されよう。
【００５０】
本明細書に記載のＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンを含む医薬は、いくつかの方法で使用することができる。本発明のＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンを含む組成物は、吸入（例えば鼻腔内）によって投与することができる。組成物はまた、局所的使用のために製剤化することができる。例えば、クリーム又は軟膏を皮膚に適用することができる。
【００５１】
本発明によるＰＡＲＰ及び／又はテトラサイクリン阻害剤はまた、遅延放出又は徐放デバイス内に組み込むことができる。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上又は下にインサートする（ｉｎｓｅｒｔ）ことができ、医薬が数週間又は数カ月にわたって放出され得る。デバイスは、治療部位に少なくとも隣接して配置することができる。そのようなデバイスは、本発明に従って使用されるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンによる長期治療が必要であって、頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を通常必要とする場合に特に有利であり得る。
【００５２】
本発明によるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン並びに組成物は、血流への注射によって、又は治療を必要とする部位、例えば石灰化に罹患している特定の血管（静脈又は動脈）に直接注射することによって対象に投与することができる。注射は、静脈内（ボーラス若しくは輸液）、若しくは皮下（ボーラス若しくは輸液）、又は皮内（ボーラス若しくは輸液）であり得る。
【００５３】
好ましい実施形態において、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは経口投与される。従って、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、例えば、錠剤、カプセル、又は液体の形態で経口的に摂取することができる組成物内に含有することができる。
【００５４】
必要とされるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの量は、その生物活性及びバイオアベイラビリティによって決定され、これらは今度は投与形式、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの物理化学的特性、並びにそれが単独療法として使用されるのか、又は併用療法で使用されるのかに依存することが理解されよう。投与頻度はまた、治療される対象内でのＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの半減期によって影響を受けるであろう。投与される最適な投薬量は、当業者が決定することができ、使用される特定のＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン、医薬組成物の強さ、投与形式、並びに血管中膜石灰化の進行度によって変わるであろう。対象の年齢、体重、性別、食事、及び投与時間を含む、治療される特定の対象に依存したさらなる要因により、投薬量を調整する必要が生じるであろう。
【００５５】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、治療される血管中膜石灰化の発症前、発症中、又は発症後に投与することができる。１日用量を単回投与として与えることができる。しかしながら、ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、１日に２回以上与えることが好ましく、１日に２回与えることが最も好ましい。
【００５６】
投与されるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの１日用量は、１ｍｇ〜１００００ｍｇ若しくは２ｍｇ〜２０００ｍｇであり、より好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇ若しくは１０ｍｇ〜２００ｍｇであり、最も好ましくは１５ｍｇ〜１００ｍｇ又は２０ｍｇ〜５０ｍｇであってもよい。
【００５７】
最も好ましい実施形態において、本発明によるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、１日２回の用量として投与することができ、各用量は、１ｍｇ〜５０００ｍｇ若しくは２ｍｇ〜１０００ｍｇであり、より好ましくは３ｍｇ〜５００ｍｇ若しくは４ｍｇ〜１００ｍｇであり、最も好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇ又は１０ｍｇ〜２５ｍｇである。最も好ましい投薬量には、１０〜２５ｍｇの２回の投与が含まれる。
【００５８】
治療を受けている対象は、起床時には第１の用量を摂取し、その後、（２回の投与計画の場合には）夕方に第２の用量を摂取するか、又は３又は４時間間隔で摂取することができる。或いは、遅延放出デバイスを用いて、反復投与する必要なく、本発明によるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの最適な用量を患者に提供することができる。
【００５９】
公知の方法、例えば製薬業界によって用いられる慣用的な方法（インビボ実験、臨床試験など）を用いて、本発明によるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンを含む特定の製剤、及び正確な治療計画（ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの１日用量及び投与頻度など）を作成することができる。本発明者らは、それらが、本発明のＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの使用に基づく血管中膜石灰化を治療するための医薬組成物を記述する最初のものであると考える。
【００６０】
従って、本発明の第３の態様において、ＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物、並びに薬学的に許容されるビヒクルを含む、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化を治療するための医薬組成物が提供される。
【００６１】
本医薬組成物は、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化の対象における治療学的な改善、予防、又は治療に使用することができる。
【００６２】
本発明はまた、第４の態様において、第３の態様による組成物を製造するための方法であって、治療有効量の第１の態様のＰＡＲＰ阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物と、薬学的に許容されるビヒクルとを接触させることを含む、方法を提供する。
【００６３】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、又は家畜であってもよい。従って、本発明によるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン、組成物、並びに医薬は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えばウマ）、ペットを治療するために使用することができ、又は他の獣医学用途に使用することができる。しかしながら、対象はヒトであることが最も好ましい。
【００６４】
ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの「治療有効量」は、対象に投与されたときに、血管中膜石灰化を治療するために必要とされる薬物の量である任意の量である。
【００６５】
例えば、使用されるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンの治療上有効な１日量は、１ｍｇ〜１００００ｍｇ若しくは２ｍｇ〜２０００ｍｇであってもよく、より好ましくは５ｍｇ〜１０００ｍｇ若しくは１０ｍｇ〜２００ｍｇであり、最も好ましくは１５ｍｇ〜１００ｍｇ又は２０ｍｇ〜５０ｍｇである。１０〜２５ｍｇの１日２回の用量が好ましい。
【００６６】
本明細書で言及する「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に公知である任意の公知の化合物又は公知の化合物の組み合わせである。
【００６７】
一実施形態において、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよい、組成物は散剤又は錠剤の形態であってもよい。薬学的に許容される固体ビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、充填剤、流動化剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、染料、コーティング剤、又は錠剤崩壊剤としても作用することができる１つ又は複数の物質を含むことができる。ビヒクルはまた、カプセル化材料であってもよい。散剤では、ビヒクルは、微粉化された本発明による活性剤（すなわちＰＡＲＰ阻害剤又はテトラサイクリン）と混合された微粉化固体である。錠剤では、活性ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンを必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合し、所望の形状及びサイズに圧縮することができる。散剤及び錠剤は、最大９９％の活性ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンを含有することが好ましい。好適な固体ビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、及びイオン交換樹脂が含まれる。別の実施形態において、薬学的ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【００６８】
しかしながら、薬学的ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態であってもよい。液体ビヒクルは、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び加圧組成物の調製に使用される。本発明によるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、水、有機溶媒、両方の混合物、又は薬学的に許容される油若しくは油脂などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解又は懸濁することができる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤、又は浸透圧調節剤などの他の好適な医薬添加物を含有することができる。経口及び非経口投与用の液体ビヒクルの好適な例には、水（上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を一部含有する）、アルコール（一価アルコール及び多価アルコール、例えばグリコールを含む）及びそれらの誘導体、並びに油（例えば、分画ココナッツ油及び落花生油）が含まれる。非経口投与のため、ビヒクルは、オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容される噴射剤であってもよい。
【００６９】
滅菌溶液又は懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、及び特に皮下注射によって利用することができる。ＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンは、滅菌水、生理食塩水、又は他の適切な滅菌注入用媒体を用いて投与時に溶解又は懸濁することができる、滅菌固体組成物として調製することができる。
【００７０】
本発明のＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリン及び組成物は、他の溶質又は懸濁化剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水又はグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合したソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステル）などを含有する滅菌溶液又は懸濁液の形態で投与することができる。本発明に従って使用されるＰＡＲＰ阻害剤及び／又はテトラサイクリンはまた、液体又は固体組成物形態のいずれかで経口投与することができる。経口投与に好適な組成物には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、及び散剤などの固体形態、並びに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌液剤、乳剤、及び懸濁剤が含まれる。
【００７１】
本発明のさらなる態様によれば、不適切な血管石灰化によって特徴付けられる疾患の治療、予防、又は改善における使用のためのテトラサイクリン及び／若しくはポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物が提供される。
【００７２】
本発明のなおさらなる態様によれば、対象における不適切な血管石灰化を特徴とする疾患を治療、予防、又は改善する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量のテトラサイクリン及び／又はポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物を投与することを含む、方法を提供する。
【００７３】
なおさらなる態様によれば、対象における血管石灰化を減少させる方法であって、そのような治療を必要とする対象に、治療有効量のポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤及び／若しくはテトラサイクリン、又は薬学的に許容されるそれらの塩若しくは溶媒和物を投与することを含む、方法を提供する。
【００７４】
血管石灰化は、アテローム硬化性石灰化を含むことができる。或いは、血管石灰化は、中膜石灰化を含むことができる
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書、及び図面のいずれも含む）に記載された全ての特徴及び／又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの全ての工程は、そのような特徴及び／又は工程の少なくともいくつかが互いに排他的である組み合わせを除いて、上記の任意の態様のいずれとの組み合わせで組み合わせることができる。
【００７５】
本発明をよりよく理解するため、及び本発明の実施形態がどのように実施されるかを示すために、ここで、例として添付した図面を参照する。
【００７６】
本発明者らは、以下のようにまとめることができる様々な実験を行った：
実施例１：ポリ（ＡＤＰリボース）（ＰＡＲ）と血管石灰化との間の生理学的関連の提示；
実施例２：ＰＡＲＰ阻害剤／テトラサイクリンのウシ血管平滑筋細胞に対する毒性の検討；
実施例３：ＰＡＲＰ阻害剤／テトラサイクリンのヒト単球マクロファージに対する毒性の検討；
実施例４：インビトロウシ血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるＰＡＲＰ阻害剤／テトラサイクリンの初期試験；
実施例５：インビトロウシ血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおける石灰化レベルに対する被験阻害剤の用量依存性；
実施例６：ｐｋ濃度相関を用いた被験阻害剤の例示用量の提示；
実施例７：インビトロヒト血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるＰＡＲＰ阻害剤／テトラサイクリンの初期試験；
実施例８：試験化合物リスト中のオラパリブ、ルカパリブ、ニラパリプ、ベリパリブ、及びタラゾパリブを含む、インビトロヒト血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるＰＡＲＰ阻害剤／テトラサイクリンのさらなる試験；
実施例９：試験化合物リスト中のロサルタン、アムロジピン、及びアトルバスタチンを含む、インビトロヒト血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるＰＡＲＰ阻害剤／テトラサイクリン及び他の一般的な心血管薬のさらなる試験。
【００７７】
実施例１：ポリ（ＡＤＰリボース）（ＰＡＲ）と血管石灰化との間の生理学的関連の提示
血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）は、ストレス下にあるとき、その周囲の細胞外マトリックスを石灰化する。ＶＳＭＣ組織のインビトロモデルを用いて、ストレス下のＶＳＭＣが、ポリ（ＡＤＰリボース）（ＰＡＲ）を任意の認識できる量で産生するかどうかを決定した。
【００７８】
このモデルでは、細胞内に酸化ストレスを誘導する高濃度のグルコース中でＶＳＭＣを増殖させた。細胞は細胞外マトリックスを合成し、マトリックスを鉱化し、その後、細胞壊死に似た細胞溶解によりマトリックスから細胞が除去される。細胞溶解後にマトリックスをリン酸緩衝液で少なくとも６回洗浄し、マトリックスに強く結合していない任意の分子成分を除去した。
【００７９】
これらの実験における細胞培養培地には、Ｕ−１３Ｃ−グルコース、並びにＵ−１３Ｃ，１５Ｎ−グリシン及びプロリンが含有しており、細胞がグルコースから合成する糖種の全てが、コラーゲン（組成中に約３３％のグリシン及び２２％のプロリン／ヒドロキシプロリンを含有する）と同様に、１３Ｃ標識されるようにした。次いで、得られたマトリックスのコラーゲン及び糖含有量を、コラーゲンに関するマトリックスの糖組成の詳細な特徴付けを可能にする２次元１３Ｃ−１３Ｃ相関スペクトルによって調べることができた。
【００８０】
図１Ａは、この実験から得られた一般的な２次元１３Ｃ−１３Ｃ相関スペクトルを示す。全てのスペクトルは、ＰＡＲに予想されるシグナルを明確に示した。マトリックスを洗浄した後に１３Ｃ  ＮＭＲシグナルがＰＡＲから観察されたという事実は、マトリックス中のＰＡＲの強い結合又は捕捉を示している。
【００８１】
次いで、本発明者らは、石灰化沈着物並びにＰＡＲ及びＤＮＡ損傷の存在についてエクスビボでヒト頸動脈病変を画像化した（赤色はＨ２Ａ．Ｘ抗体である）。位相差画像化及びカルセイン染色を用いて、鉱物沈着物を画像化した。隣接する部位において、間接的免疫組織化学染色を用いてＰＡＲ（モノクローナル抗ポリ（ＡＤＰリボース）抗体クローン１０Ｈを使用、緑色蛍光）及びＤＮＡ損傷（Ｈ２Ａ．Ｘに対するモノクローナル抗体を使用、赤色蛍光）を画像化した。
【００８２】
図２は、病変の隣接する部位からの位相差画像及び蛍光画像化を示す。位相差画像及びカルセイン染色の蛍光画像の両方は、病変の壊死性無細胞核に隣接する病変の内膜肥厚領域における鉱物沈着物の存在を明確に示している。隣接する部位（部位の厚さ５μｍ）では、細胞核領域並びに細胞質及び／又は細胞外マトリックス領域の両方で、ポリ（ＡＤＰリボース）に対する有意な染色が存在する。エキソビボ冠動脈アテローム性動脈硬化病変でも同様のパターンのポリ（ＡＤＰリボース）染色が見られる。
【００８３】
重要な論点は、発達中の骨及び酸化ストレスを受けた血管組織でのポリ（ＡＤＰリボース）の合成を何が駆動するかであった。ポリ（ＡＤＰリボース）は、細胞死（ＡＩＦのミトコンドリア放出によるアポトーシス、又はＤＮＡ損傷により過剰なＰＡＲＰ発現が駆動されて解糖機能障害を引き起こす場合のパータナトス）及びＤＮＡ修復において十分証明された役割を有する。マトリックス石灰化に関連する細胞死に関して、骨芽細胞の６０〜８０％が骨石灰化の間に死滅する。同様に、細胞死（アポトーシス及び壊死）は、石灰化がアテローム性動脈硬化症又は中膜石灰化と関連しているかどうかに関わらず、血管石灰化に常に先行する。ＤＮＡ損傷が血管石灰化と関連する可能性は高く、活性酸素／窒素種から酸化的ストレスを受けた血管平滑筋細胞でのＤＮＡ損傷が見込まれるシナリオである。おそらくあまり直感的ではなく、従ってさらにより興味深いことには、骨芽細胞株であるＳＡＯＳ−２細胞は骨形成マーカーを発現するときに過酸化水素を放出し、過酸化水素の放出はポリ（ＡＤＰリボース）合成と密接な関係があるが、このことは骨の発達におけるポリ（ＡＤＰリボース）合成のＤＮＡ損傷依存性機構があり得ることも示唆している。
【００８４】
従って、本発明者らは、細胞外マトリックスにおけるポリ（ＡＤＰリボース）の出現はＤＮＡ損傷依存性の細胞死に由来し得ると仮定し、従って、石灰化領域内での場所的に（ｓｐａｔｉａｌｌｙ）関連する細胞のＤＮＡ損傷の存在について、発達中の骨及びヒト血管石灰化沈着物の両方を調べた。図２（右側の列）は、血管石灰化において、核及び細胞外ポリ（ＡＤＰリボース）染色の両方がＤＮＡ損傷のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ２Ａ．Ｘと共局在化していることを示している。
【００８５】
図３は、胎児骨成長板におけるポリ（ＡＤＰリボース）とＨ２Ａ．Ｘとの間の非常に類似した関係−細胞核及び細胞外マトリックスの両方におけるポリ（ＡＤＰリボース）及びＨ２Ａ．Ｘの共局在化を示している。
【００８６】
ポリ（ＡＤＰリボース）と骨及び血管鉱物沈着物との直接的な関連は、ポリ（ＡＤＰリボース）の細胞外沈着と鉱物形成の誘発との間の機構的関連性を示唆している。
【００８７】
実施例２：ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤の７日間にわたるウシ血管平滑筋細胞（ｂＶＳＭＣ）に対する毒性
ＰＡＲの細胞外沈着と鉱物形成の誘発との間の機構的関連性を考慮して、ＰＡＲＰ阻害剤が血管石灰化を阻害するかどうかを試験することを決定した。
【００８８】
ＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、及び３−ＡＢは、哺乳動物細胞によって産生されるＰＡＲＰを阻害することが示されている。従って、これらの化合物を試験するものと同定した。
【００８９】
さらに、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（ＢｏｓＭＨ）、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、及びジピリダモール（ＤＰ）は全て、組換えＰＡＲＰを阻害することが示されている。従って、これらの化合物が真のＰＡＲＰ阻害剤であるかどうかははっきり分からないが、それらも試験すべきであると決定された。
【００９０】
同定された化合物のウシＶＳＭＣに対する毒性を、生細胞のデヒドロゲナーゼ酵素活性を測定するＭＴＴアッセイを用いて測定した。このアッセイは、細胞死及び増殖の両方を捕捉することができる。
【００９１】
方法
ウシＶＳＭＣを９６ウェルプレートに播種し、Ｍ１９９／２０％ＦＣＳ中で１日培養した。次いで、細胞を０．５〜１００μＭの阻害剤濃度でインキュベートした（Ｍ１９９培地＋５％ＦＢＳ中）。細胞を阻害剤とともに７日間インキュベートし、２〜３日ごとに培地−／＋阻害剤を交換した。次いで、ＭＴＴアッセイを行った。ストックビヒクルＤＭＳＯは、０．１％以下のＤＭＳＯで、阻害剤に対応する濃度で試験した。
【００９２】
結果
結果を以下の表１に示し、図４Ａ及び図４Ｂにグラフで示す。示された値は、各々２連で、３回の実験の平均を表す。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、エラーバーは、３回の実験の標準誤差（ＳＥ）を表す。以下の表の網掛けされた値は、ＮＡ対照（阻害剤なし）と比較して統計学的に有意であると判断される；ｐ≦０．０１（ＡＮＯＶＡ＋ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ試験）。
【００９３】
【表１】
2019518030.tif 000015
【００９４】
ＭＴＴアッセイの結果は、ペントキシフィリン（ＰＦ）、３ＡＢ、ＤＰＱ、及びＤＭＳＯビヒクルが、試験濃度では実質的に非毒性であることを示している。ボセンタン一水和物（Ｂｏｓ）はまた、毒性がわずかであることを示している。ＰＪ３４、ジピリダモール（ＤＰ）、及びシロスタゾール（ＣＳ）は、５０μＭ及び１００μＭで毒性である。ミノサイクリン（ＭＣ）及びジルチアゼムは両方とも非毒性であり、さらに２０μＭ超では細胞に対する刺激効果を示す。従って、全ての阻害剤は、石灰化モデルで使用される可能性のある濃度において、ｂＶＳＭＣに十分な忍容性を示す。
【００９５】
実施例３：潜在的阻害剤のヒト単球−マクロファージ（ＨＭＭ）に対する毒性
ヒト単球−マクロファージ（ＨＭＭ）で同様の設定の毒性実験を行った。ＨＭＭは培養では増殖しないので、分裂細胞（ｂＶＳＭＣ）と非分裂細胞（ＨＭＭ）との間の比較は、毒性に起因する効果と増殖に起因する効果とを区別するのに時として役立ち得る。さらに、化合物の意図される使用のために、それらがヒトマクロファージに毒性ではないことを確立することが重要である。
【００９６】
ＨＭＭをＭｏ−ＳＦＭ培地（無血清培地）で通常の培養及び毒性アッセイのために培養した以外、方法は実施例２に記載した通りとした。
【００９７】
結果
結果を以下の表２に示し、図５Ａ及び図５Ｂにグラフで示す。前述のように、示された値は、各々２連で、３回の実験の平均を表す。図５Ａ及び図５Ｂにおいて、エラーバーは、３回の実験の標準誤差（ＳＥ）を表す。以下の表の網掛けされた値は、ＮＡ対照（阻害剤なし）と比較して統計学的に有意であると判断される；ｐ≦０．０１（ＡＮＯＶＡ＋ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ＬＳＤ試験）。
【００９８】
【表２】
2019518030.tif 000016
【００９９】
毒性アッセイの結果は、１００μＭの濃度では、ＨＭＭに対して、ＭＣ、ＰＪ３４、ＤＺ、及びＢＯＳが阻害剤のうちで最も毒性であるが、ＣＳ、ＤＰ、ＰＦ、ＤＰＱ、及び３ＡＢは比較的無毒であることを示している。
【０１００】
実施例２及び３の結果により、次の実施例において血管石灰化を阻害するのに必要な化合物の濃度の毒性を判断することができる。
【０１０１】
実施例４：ＰＪ３４、ミノサイクリン（ＭＣ）、シロスタゾール（ＣＳ）、ボセンタンＭＨ（Ｂｏｓ）、３−ＡＢ、ペントキシフィリン（ＰＦ）、ジルチアゼム（ＤＺ）、及びジピリダモール（ＤＰ）による血管石灰化の初期試験
方法
ｂＶＳＭＣに関し、ＧＡＤ培地（１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩／０．１ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩／１０ｎＭデキサメタゾン）モデルを用いて、ｂＶＳＭＣにおいて鉱化を誘発した。それ故、Ｍ１９９／２０％ＦＣＳ培養培地を用いた組織培養プレートに細胞を播種し、一晩培養した。翌日、細胞を培地（Ｍ１９９／５％ＦＢＳ）のみ＋／−阻害剤、又はＧＡＤ培地（１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩／０．１ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸塩／１０ｎＭデキサメタゾン）＋／−阻害剤のいずれかで処置した。
【０１０２】
全ての阻害剤は１０μＭの濃度で使用したが、それは、実施例２及び３により、全ての化合物がこの濃度で非毒性であり、さらに、化合物が、それらが示し得る任意の石灰化阻害効果の評価を複雑化する可能性のある有意な増殖などの他の効果を誘発しないようであることが示されたからである。培地＋／−阻害剤は２〜３日ごとに交換した。評価前に、ウシＶＳＭＣを７日間インキュベートした。
【０１０３】
アリザリンレッドＳ染色
アリザリンレッドＳ染色は、組織カルシウム沈着物に対する視覚的／組織学的染色である。細胞を４％パラホルムアルデヒド／ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で簡単に固定し、続いてアリザリンレッドＳ（２％アリザリンレッドＳ／ＤＩＷ  ｐＨ４．２）で５分間染色する。ＤＩＷ中で洗浄することによって、余分な染色を除去する。カルシウム鉱物沈着物は、明るい赤橙色に染色される。
【０１０４】
ｏ−クレゾールフタレインアッセイ
ｏ−クレゾールフタレインアッセイは、細胞／組織溶解物中のＣａ２＋濃度を測定するための分光光度法である。石灰化実験の後、細胞を簡単に洗浄して培地を除去し、１００  ｌの０．１Ｎ  ＨＣｌを各ウェルに添加して任意の鉱物沈着物を溶解する。次いで、試料中のＣａ２＋濃度を、約０．０２〜２７０ｇＣａ２＋／ｍｌの濃度範囲のＣａＣｌ２標準曲線を用いて、ｏ−クレゾールフタレインアッセイで分光光度的に（５７０ｎｍで）測定する。
【０１０５】
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ
市販のＢｉｏＲａｄ  ＤＣタンパク質アッセイは、タンパク質と銅−酒石酸塩複合体との反応及びその後のフォリン試薬との反応としても公知であるＬｏｗｒｙ法に基づく。石灰化実験の後、細胞を簡単に洗浄して培地を除去し、１００  ｌの可溶化溶液（０．１Ｍ  ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ／ＤＩＷ）を各ウェルに添加して細胞を溶解する。続いて、溶解物のタンパク質濃度を、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準として用いて、供給者の指示に従ってＢｉｏＲａｄ  ＤＣアッセイで決定する。
【０１０６】
結果
アリザリンレッドＳ染色で処置したプレートの写真を図６に示す。培地のみ（ＮＡ）で処置した細胞では、アリザリンによる赤色染色は見られなかったことは明らかである。これは、培養物の石灰化がほとんど又は全く起こらなかったことを示している。
【０１０７】
対照的に、ＧＡＤ処置した細胞はアリザリンで陽性に染色され、培養物の石灰化が示された。眼で判断すると、鉱化の程度は、ミノサイクリン（ＭＣ）試料ではわずかに少なく、ＰＪ３４及びジピリダモール（ＤＰ）試料ではわずかに悪化していた。
【０１０８】
図７Ａ及び図７Ｂに示すように、本発明者らは、ｏ−クレゾールフタレインアッセイにより、Ｃａ２＋沈着物を定量することができた。
【０１０９】
図７Ａに示されるように、クレゾールフタレインアッセイは、ＮＡ処置群のカルシウム含有量が非常に低かった（基本的にアッセイの検出限界であった）ことを示した。図７Ｂに示されるＧＡＤ処置群では、カルシウムレベルは、未処置細胞のカルシウムレベルの約５０〜６０倍に上昇する。
【０１１０】
図７Ｂに示されるように、ＣＳ、Ｂｏｓ、３ＡＢ、及びＰＦはカルシウムレベルに影響を及ぼさないようであったが、ＰＪ３４及びＤＰはカルシウムレベルを上昇させるようであった。しかしながら、ＤＺ及び特にＭＣは、阻害剤を添加していない試料と比較して、カルシウムレベルを低下させるようであった。
【０１１１】
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイの結果を図８に示す。化合物が石灰化を阻害する程度を評価する場合、試料中のタンパク質の質量（ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイによって決定される）当たりの試料中のカルシウムの質量（クレゾールフタレインアッセイによって決定される）として阻害度を定量するのが通常である。これは、実験を行う期間中、この場合は７日間、添加された化合物によって誘発された細胞成長、増殖、又はマトリックスの細胞合成が原因で、試料中のタンパク質の総質量が増加し得るからである。これらの標準化した結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。
【０１１２】
図９Ｂに示されるように、結果を標準化した場合、ＣＳは依然としてカルシウムレベルに影響を及ぼさないようであり、ＰＪ３４及びＤＰは依然としてカルシウムレベルを上昇させるようである。しかしながら、Ｂｏｓ、３ＡＢ、ＰＦ、及びＤＺは全て、カルシウムレベルをわずかに低下させるようであり、ＭＣはカルシウムレベルを有意に低下させるようである。
【０１１３】
実施例５：インビトロ血管石灰化モデルにおける石灰化に対する被験阻害剤の用量依存性
方法
インビトロモデルは、実施例４で使用したモデルと同じである：ＧＡＤ培地（１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩／０．１ｍＭ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸／１０ｎＭデキサメタゾン）を添加して、細胞外マトリックスを産生するようにウシ血管平滑筋細胞（ｂＶＳＭＣ）を培養する。
【０１１４】
上記のように、細胞を培地のみ（「無添加」；ＮＡ）＋／−阻害剤又はＧＡＤ培地＋／−阻害剤のいずれかで処置した。使用した阻害剤は、１０μＭ、１μＭ、及び０．１μＭのＰＪ３４及びミノサイクリン（ＭＣ）とした。鉱化について細胞培養物を目視で検査し、石灰化の程度を７日目のＧＡＤ処置で評価したが、これが最初のデータポイントとして予め計画されていたからである。ＧＡＤ処置細胞における鉱化がかなり急速に進行するようであったので、石灰化の程度を評価する第２の時点は９日目とした。細胞がウェルから剥がれやすくなり、その後完全に失われる可能性があるので、より長い処置期間は危険であると考えられた。
【０１１５】
実施例４と同様に、Ｃａ２＋沈着物の定量のためのｏ−クレゾールフタレインアッセイ及びタンパク質含有量に関してＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを実施した。方法は実施例４に記載したものと同じであった。
【０１１６】
さらに、細胞生存率／増殖の尺度としてＭＴＴアッセイを行った。ウシＶＳＭＣを９６ウェルプレートに播種し、Ｍ１９９／２０％ＦＣＳ中で１日培養した。次いで、細胞を１０μＭ、１μＭ、及び０．１μＭの阻害剤濃度でインキュベートした（Ｍ１９９培地＋５％ＦＢＳ中）。細胞を阻害剤とともに７又は９日間インキュベートし、２〜３日ごとに培地−／＋阻害剤を交換した。次いで、ＭＴＴアッセイを行った。
【０１１７】
結果
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ
７日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの細胞生存率の結果は以下の表３に示され、図１０にグラフで示されている。同様に、９日間インキュベートしたｂＶＳＭＣの細胞生存率の結果は表４に示され、図１１にグラフで示されている。各場合において、示された値は３回の実験の平均を表す。図１０及び図１１において、エラーバーは、３回の実験の標準偏差（ＳＤ）を表す。
【０１１８】
【表３】
2019518030.tif 000017
【０１１９】
【表４】
2019518030.tif 000018
【０１２０】
ＮＡ処置もＧＡＤ処置も、７日後にｂＶＳＭＣに対して毒性ではなかった。
【０１２１】
９日後、ＧＡＤ培地で処置したマトリックス／細胞は、ウェル内でわずかに丸まり始めた。ＭＴＴアッセイにより、ＮＡ処置群と比較した場合、ＧＡＤ処置群では約２７％のホルマザン産生の低下が示された。これは、細胞生存率の低下を表しているのではなく、ウェル中の細胞の丸まり及び細胞のＭＴＴへの接近／曝露の減少に起因する可能性が最も高い。この考えは、１０μＭのＭＣ試料細胞は丸まりがかなり少なく、この処置群におけるホルマザン産生の低下は観察されなかったとの事実によって裏付けられる。
【０１２２】
クレゾールフタレインアッセイ
７日間インキュベートしたｂＶＳＭＣについてのＣａ２＋濃度結果は以下の表５に示され、図１２にグラフで示されている。同様に、９日間インキュベートしたｂＶＳＭＣのＣａ２＋濃度結果は以下の表６に示され、図１３にグラフで示されている。各場合において、示された値は３連での実験の平均を表す。図１２及び図１３において、エラーバーは３連での実験の標準偏差（ＳＤ）を表す。
【０１２３】
【表５】
2019518030.tif 000019
【０１２４】
【表６】
2019518030.tif 000020
【０１２５】
ＧＡＤ培地で処置していないプレート（図１２及び図１３において「ＮＡ処置」として同定される）において、Ｃａ２＋含有量は、予想されたように７日間及び９日間の両方で非常に低かった。
【０１２６】
プレートをＧＡＤ培地で処置した場合、７日間の処置後、阻害剤が存在しない場合に、ＧＡＤ培地で処置していないプレートのＣａ２＋濃度よりＣａ２＋濃度は約３倍高いだけであった（図１２の最初の２つのバーを参照されたい）。しかしながら、９日後、阻害剤が存在しない場合に、ＧＡＤ培地で処置していないプレートで観察されたものよりもＣａ２＋濃度が約２５倍に劇的に増加した（図１３の最初の２つのバーを参照されたい）。
【０１２７】
実施例４で考察したように、化合物が石灰化を阻害する程度を評価するとき、試料中のタンパク質の質量当たりの試料中のカルシウムの質量として石灰化の阻害度を定量するのが文献においては通常である。試料中のタンパク質の総質量はＢｉｏＲａｄアッセイによって決定され、図１４及び図１５に示されている。これらの図において、「＋」でラベル付けされた試料はＧＡＤ培地で処置されており、「−」とラベル付けされた試料はＧＡＤ培地で処置されていない。
【０１２８】
従って、タンパク質の総質量は、ＧＡＤ培地で処置した細胞培養物では、ＧＡＤ培地で処置しなかった細胞培養物と比較して大きいことが明らかである。しかしながら、ＭＴＴアッセイによって決定されるように、ＧＡＤ処置は、試料中の細胞数のいずれの明らかな変化も引き起こさない。ＧＡＤ処置していない場合と比較したＧＡＤ処置下でのタンパク質の増加は、細胞外マトリックス又は他のタンパク質産生の刺激に起因する可能性が最も高い。
【０１２９】
従って、本発明者らは、タンパク質１ミリグラム当たりの石灰化の程度を表すことは、被験阻害剤による任意の阻害効果を過大評価することとなると考える。この問題を克服するために、潜在的阻害剤ありのＧＡＤ培地で処置したプレートの石灰化の程度を、阻害剤なしのＧＡＤ培地で処置したプレートと比較し、パーセンテージとして計算した。これらの値は表７に示され、図１６にグラフで示されている。
【０１３０】
【表７】
2019518030.tif 000021
【０１３１】
実施例４に示したように、ＰＪ−３４は、１０μＭの濃度でＣａ２＋沈着物を増加させた。この効果はまた、１μＭの濃度で観察される。
【０１３２】
ミノサイクリンは、潜在的阻害剤が存在しない場合と比較して、１０μＭの濃度でＣａ２＋沈着物を約１９％にまで減少させた。すなわち、約８１％の減少であった。同様に、ミノサイクリンは、潜在的阻害剤が存在しない場合と比較して、０．１μＭの濃度でＣａ２＋沈着物を約６２％にまで減少させた。すなわち、約３８％の減少であった。しかしながら、ミノサイクリンは、０．１μＭの濃度ではＣａ２＋濃度に影響を及ぼさないようであった。
【０１３３】
考察
ミノサイクリンは石灰化に対して用量依存性の効果を示し、この薬物が血管石灰化プロセスに直接的な効果を有することと一致している。従って、ミノサイクリンは、血管石灰化の阻害剤として有望である。
【０１３４】
有利なことに、ミノサイクリンは、許容される安全なレベル内の比較的低い濃度において血管石灰化の阻害剤として使用することができると考えられる。
【０１３５】
一方、ＰＪ−３４は、石灰化を促進するようである。しかしながら、ＰＪ−３４はまた、図４Ａ及び実施例２を参照して、ｂＶＳＭＣにおいていくらかの細胞死を誘発するようである。従って、観察された石灰化を引き起こすのは細胞死であり得る。
【０１３６】
死滅した細胞は、鉱物／石灰化の沈殿の発生場所として作用し得る（通常はそうである）。インビボにおいて死滅した細胞の周囲で同様のプロセスが起こるかどうかは不明である。しかしながら、インビトロ実験では、上記で考察したものなど、死滅した細胞は石灰化が起こることを意味する。従って、ＰＪ−３４が、依然として残りの生細胞の石灰化を阻害する可能性がある。
【０１３７】
実施例６：用量の提示
実施例５において実施された実験により、ミノサイクリンは１μＭの低い濃度で石灰化を阻害することができ、より低濃度でも有効である可能性があることが示された。ミノサイクリンの分子量は４５７ｇ／ｍｏｌであるので、１μＭの濃度は０．４６μｇ／ｍＬに等しい。
【０１３８】
５０ｍｇのミノサイクリン経口用量での患者血流中の最大濃度（Ｃｍａｘ）は、投与の２時間後に到達する０．６５μｇ／ｍＬ（Ｔｍａｘ）である。
【０１３９】
ミノサイクリンは、典型的には１日２回服用され、体内のミノサイクリンの半減期は約１２時間である。従って、１２時間ごとの５０ｍｇの継続用量での定常状態濃度は、１．３μｇ／ｍＬである。
【０１４０】
従って、０．４６μｇ／ｍＬの濃度に到達するのに必要な投薬量は、約２０ｍｇのミノサイクリンを１日２回であろう。
【０１４１】
ミノサイクリンの副作用は用量依存性であると思われ、従って、これらの低用量でも克服すべきである。
【０１４２】
座瘡を治療するための（主用途）ミノサイクリンの成人投薬量は、５０〜１００ｍｇを１日２回あり、その後、毎日５０〜１００ｍｇの維持用量に移行することに留意すべきである。従って、示唆した投薬量は許容される安全なレベル内である。
【０１４３】
実施例７：ヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）を用いたＰＪ３４、ミノサイクリン、及びシロスタゾールによる血管石灰化の初期試験
方法
インビトロウシ血管平滑筋細胞モデルにおける血管石灰化の阻害に関して陽性の結果及び結論を考慮して、本発明者らは、インビトロヒト血管平滑筋細胞モデルで実験を続けた。
【０１４４】
初代ｈＶＳＭＣを、ＦＢＳ（Ｍ１９９／５％ＦＢＳ）を含有するＭ１９９培地で培養した。それらを公知の細胞密度で播種し、２４時間増殖させた後、対照（ＤＭＳＯのみ）又は石灰化培地（２．７ｍＭカルシウム＋２．５ｍＭリン酸塩を含有するＤＭＳＯ）＋／−阻害剤で処置した。６日後、Ｃａ２＋沈着物の定量のためのｏ−クレゾールフタレインアッセイ及びタンパク質含有量のためのＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて、石灰化を評価した。
【０１４５】
ＰＪ３４を１０μＭの濃度で使用した一方、ミノサイクリン及びシロスタゾールを両方とも０．５μＭ、１μＭ、及び２μＭの濃度で使用した。培地＋／−阻害剤を２〜３日ごとに交換した。
【０１４６】
各実験を３連で実施し、図１７〜図１９は平均値＋平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【０１４７】
結果
図１７に示すように、本発明者らは、ｏ−クレゾールフタレインアッセイにより、Ｃａ２＋沈着物を定量することができた。これは、ＤＭＳＯ群（陰性対照）のカルシウム含有量が非常に低かったことを示している。逆に、ＤＭＳＯ  Ｃａ＋Ｐ群（陽性対照）では、カルシウムレベルが大きく上昇した。ＰＪ３４、ミノサイクリン、及びシロスタゾールは全て、カルシウムレベルを低下させるようであった。
【０１４８】
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイの結果を図１８に示す。これから得られたデータによって、ｏ−クレゾールフタレインアッセイから得られた結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を得ることができた。これらの標準化した結果を図１９に示す。
【０１４９】
図１９に示されるように、結果を標準化したとき、ＰＪ３４、ミノサイクリン、及びシロスタゾールの各々はカルシウムレベルを有意に低下させる。さらに、ミノサイクリンは、用量依存的な様式でカルシウムレベルを低下させるようである。
【０１５０】
実施例８：ヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）を用いたＰＡＲＰ阻害剤による血管石灰化のさらなる試験
方法
初代ｈＶＳＭＣを、ＦＢＳ（Ｍ１９９／５％ＦＢＳ）を含有するＭ１９９培地で培養した。それらを公知の細胞密度で播種し、２４時間増殖させた後、対照（ＤＭＳＯのみ）又は石灰化培地（２．７ｍＭカルシウム＋２．５ｍＭリン酸塩を含有するＤＭＳＯ）＋／−阻害剤で処置した。８日後、Ｃａ２＋沈着物の定量のためのｏ−クレゾールフタレインアッセイ及びタンパク質含有量のためのＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて、石灰化を評価した。
【０１５１】
試験したＰＡＲＰ阻害剤には、ミノサイクリン及びシロスタゾールとともに、オラパリブ（別々に試験した２つの供給源）、タラゾパリブ、ニラパリプ、ルカパリブ、及びベリパリブを含めた。試験した全ての化合物を３μＭの濃度で使用した。培地＋／−阻害剤を２〜３日ごとに交換した。
【０１５２】
各実験は６回実施し、図２０及び図２２は平均値＋平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【０１５３】
結果
プレートの近接写真を図２４に示し、アリザリンレッドＳ染色で処置したプレートの写真を図２３に示す。図２３では、ＤＭＳＯ群（陰性対照）の細胞では、石灰化が最小限であり、アリザリンに起因する赤色染色が最小限しか見られないことが明らかである。これは、培養物の石灰化がほとんど又は全く起こらなかったことを示している。
【０１５４】
対照的に、画像は、ＤＭＳＯ  Ｃａ＋Ｐ群（陽性対照）の細胞では多量の石灰化が生じたことを示している。ＰＡＲＰ阻害剤で処置された細胞培養物の全てである程度の石灰化が生じたが、これはＤＭＳＯ  Ｃａ＋Ｐ群の細胞よりも有意に少ないことが明らかである。
【０１５５】
図２０に示されるように、本発明者らは、ｏ−クレゾールフタレインアッセイにより、Ｃａ２＋沈着物を定量することができた。実施例７と同様に、ＤＭＳＯ群（陰性対照）のカルシウム含有量は非常に低く、ＤＭＳＯ  Ｃａ＋Ｐ群（陽性対照）のカルシウム含有量は大きく上昇した。全てのＰＡＲＰ阻害剤は、カルシウムレベルを低下させるようであった。
【０１５６】
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイの結果を図２１に示す。これから得られたデータによって、ｏ−クレゾールフタレインアッセイから得られた結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を得ることができた。これらの標準化した結果を図２２に示す。
【０１５７】
図２２に示されるように、結果を標準化したとき、ＰＡＲＰ阻害剤の全てがカルシウムレベルを有意に低下させる。ミノサイクリン、シロスタゾール、ルカパリブ、ニラパリプ、及びベリパリブは、カルシウムレベルを低下させるのに特に有効であった。
【０１５８】
実施例９：ヒト血管平滑筋細胞（ｈＶＳＭＣ）を用いたＰＡＲＰ阻害剤による血管石灰化のさらなる試験
方法
初代ｈＶＳＭＣを、ＦＢＳ（Ｍ１９９／５％ＦＢＳ）を含有するＭ１９９培地中で培養した。それらを公知の細胞密度で播種し、２４時間増殖させた後、対照（ＤＭＳＯのみ）又は石灰化培地（２．７ｍＭカルシウム＋２．５ｍＭリン酸塩を含有するＤＭＳＯ）＋／−化合物で処置した。８日後、Ｃａ２＋沈着物の定量のためのｏ−クレゾールフタレインアッセイ及びタンパク質含有量のためのＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて、石灰化を評価した。
【０１５９】
ＤＭＳＯ陰性対照及びＤＭＳＯ  Ｃａ＋Ｐ陽性対照とともに、以下の化合物をこの実験で試験した：ボセンタン一水和物、ペントキシフィリン、ロサルタン、アムロジピン、アトルバスタチン、ベリパリブ、ミノサイクリン、及びシロスタゾール。
【０１６０】
ボセンタン一水和物及びペントキシフィリンは、陰性の結果（実施例４）であったウシＶＳＭＣモデルにおけるＰＡＲＰ阻害剤の特性を調べるために、最初に検査する既存の薬物の例として含めた。ロサルタン、アムロジピン、及びアトルバスタチンは、血管中膜石灰化を阻害するかどうかを調べるために、一般的な心血管薬（それぞれ、アンジオテンシンＩＩ拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、及びスタチン）の例として含めた。ベリパリブは、石灰化を阻害するために、実施例８に示す公知のＰＡＲＰ阻害剤の例として含めた。ウシＶＳＭＣモデル及びヒトＶＳＭＣモデル研究の全体にわたる陽性の実験結果（実施例４〜８に示される）を考慮して、ミノサイクリンを含めた。ヒトＶＳＭＣ研究における陽性の実験結果（実施例７及び８に示される）を考慮して、シロスタゾールを含めた。
【０１６１】
図に示されているように、化合物を０．０５μＭ〜３μＭの濃度で使用した。これらの濃度は、各薬物の処方情報での投与スケジュールに従って患者へ投与した後にこれらの薬物の全身濃度を模倣するように選択された。培地＋／−阻害剤を２〜３日ごとに交換した。
【０１６２】
各実験は３回実施され、図２５〜図２７は平均値＋平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【０１６３】
結果
図２５に示されるように、本発明者らは、ｏ−クレゾールフタレインアッセイにより、Ｃａ２＋沈着物を定量することができた。これは、ＤＭＳＯ群（陰性対照）のカルシウム含有量が非常に低かったことを示している。逆に、ＤＭＳＯ  Ｃａ＋Ｐ群（陽性対照）では、カルシウムレベルが大きく上昇した。
【０１６４】
ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイの結果を図２６に示す。これから得られたデータによって、ｏ−クレゾールフタレインアッセイから得られた結果を標準化し、タンパク質の質量当たりのカルシウムの質量を得ることができた。これらの標準化した結果を図２７に示す。
【０１６５】
図２７は標準化した結果を示している。ベリパリブ、ミノサイクリン、及びシロスタゾールは各々、石灰化を有意かつ反復的に阻害する（狭いエラーバー）。その結果により、ボセンタン一水和物及びペントキシフィリンは石灰化を阻害しないことが確認される。重要なことに、結果により、例示的な一般的な心血管薬（ロサルタン、アムロジピン、及びアトルバスタチン）は血管中膜石灰化を阻害しないこともまた確認される。エラーバーは、ボセンタン一水和物、ペントキシフィリン、ロサルタン、アムロジピン、及びアトルバスタチンで見られる結果の変動が広範であることを示している。
【０１６６】
要約
結果により、発達中の骨及び病的血管石灰化の両方において、細胞外ポリ（ＡＤＰリボース）と細胞外マトリックスの石灰化領域との間に強い場所的相関があることが示され、このことは、ポリ（ＡＤＰリボース）と細胞外マトリックス内の石灰化沈着物の構築との間に直接的な機構的関係が存在する可能性があることを示唆している。
【０１６７】
血管平滑筋細胞は、そのマトリックスを石灰化するときに、骨シアロタンパク質、オステオポンチン、及びオステオカルシンを含む、多くの骨形成タンパク質を発現するので、血管石灰化でも同様のポリ（ＡＤＰリボース）媒介構築プロセスが起こり得る。
【０１６８】
本発明者らは、ミノサイクリン及びシロスタゾールとともに、試験した全ての公知のＰＡＲＰ阻害剤（オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリプ、ベリパリブ、及びタラゾパリブ）が、ウシ細胞及びヒト細胞インビトロ血管石灰化モデルで細胞外マトリックス石灰化を有意に減少させることを示した。これは、インビボでの血管中膜石灰化を減少させる潜在的経路を示唆している。他の心血管薬（特にスタチンを含む）の試験例で得られた陰性の結果により、本発明者らは、患者は他の一般的に処方されている心血管薬から血管中膜石灰化の阻害効果を既に受けている可能性を排除した。
【０１６９】
上記の化合物は、インビトロにおいて低濃度で石灰化を阻害することができたので、このことは、血管中膜石灰化を阻害する薬物が低投薬量において有用であり、副作用が克服されるべきことを保証するものであることを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【国際調査報告】
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