(57)【要約】  本開示は、一般的に、妊娠女性が早産リスクがあるかどうかを判定する方法、組成物及びキットに関する。当該方法は、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のタンパク質発現レベルを測定する必要があり、それらのアップレギュレーションにより、当該女性が早産リスクにあると判定される。１６週目から２７週目までを含む、異なる妊娠段階にある女性に対して予測をすることができる。当該女性がリスクにあると予測する場合、適宜な治療処置を採用してリスクを低下することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）妊娠女性から単離された生物学的検体におけるアクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）遺伝子の発現表現を測定することと、
（ｂ）早産リスクがない対照の妊娠女性と比較してアクチビンＡの発現表現がアップレギュレートされている場合、前記女性において早産リスクがあると判定することと、
を含む早産リスクがある妊娠女性を判定する方法。
【請求項２】
さらに、
（ａ）前記女性から単離された生物学的検体におけるＡｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）からなる群より選ばれる少なくとも１種類の遺伝子の発現表現を測定することと、
（ｂ）早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡと、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のうちいずれか１つ又は２つの発現表現がアップレギュレートされている場合、前記女性において早産リスクがあると判定することと、を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記発現表現が、遺伝子がＲＮＡ又はタンパク質レベルでの発現レベルの表現である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記測定が、前記女性に対して、６種類以下の遺伝子について行われる、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記測定が、前記女性に対して、４種類以下の遺伝子について行われる、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記測定が、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のみについて行われる、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＦＮ１、ＰＥＧ１０又はＰＡＰＰＡ２のいずれかの発現レベルの測定を含まない、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＦＮ１、ＰＥＧ１０、ＰＡＰＰＡ２、ＥＰＡＳ１、Ｆ５、ＦＢＮ１、ＨＧＦ、ＩＧＦ２、ＡＧＯ２、ＡＴＦ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＤＰＫ１、Ｓ１００Ａ８、ＳＰＴＢＮ１、ＴＲＡ２Ｂ、ＢＭＰ７、ＣＧＢ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＤＬＸ４、ＥＬＯＶＬ２、ＥＺＲ、ＨＢＢ、ＩＬ６ＳＴ、ＭＦＳＤ２Ａ、ＰＥＧ３又はＳＶＥＰ１のいずれかの発現レベルの測定を含まない、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記女性が、妊娠１６〜２７週目にある、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記女性が、妊娠２８〜３１週目にある、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記女性が、妊娠３２〜３６週目にある、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定が、前記遺伝子から発現されたタンパク質に対する抗体で行われる、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定が、前記遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドで行われる、請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記女性が、
（ａ）喫煙又は飲酒、
（ｂ）１７歳未満又は３５歳超え、
（ｃ）早産経歴あり、又は
（ｄ）ストレスや不健康あり、である、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物検体が、血清である、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）妊娠３７週目未満にある女性から得られた血清検体から、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）を含む、６種類以下の遺伝子の発現表現を測定することと、
（ｂ）前記女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡの発現レベルがアップレギュレーションされることにより、早産リスクがあると判定される場合、前記女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を治療する方法。
【請求項１７】
さらに、
（ａ）妊娠３７週目未満にある前記女性から得られた血清検体から、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及び／又はｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）の発現表現を測定することと、
（ｂ）前記女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡと、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のうちいずれか１つ又は２つの発現表現がアップレギュレートされることにより、早産リスクがあると判定される場合、前記女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記処置が、コルチコステロイド、硫酸マグネシウム、抗生物質、又はプロゲスチンの投与、及び頚管縫縮術、及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項１９】
前記女性が、妊娠３５週目未満にある、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項２０】
前記測定が、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のみについて行われる、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項２１】
前記測定が、抗体又は核酸で行われる、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項２２】
前記測定が、ＦＮ１、ＰＥＧ１０及びＰＡＰＰＡ２からなる群より選ばれる遺伝子について行わらない、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）を含むタンパク質に対する抗体と
（ｂ）前記抗体によりタンパク質の発現を検出するための試薬と
（ｃ）対照抗体及び／又は対照検体と、を含む、キット又はパッケージ。
【請求項２４】
さらに、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は２つを含むタンパク質に対する抗体を含む、請求項２３記載のキット又はパッケージ。
【請求項２５】
対照抗体と別に、６種類以下のタンパク質に対する抗体を含む、請求項２３又は２４記載のキット又はパッケージ。
【請求項２６】
前記タンパク質が、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のみからなる、請求項２３又は２４記載のキット又はパッケージ。
【請求項２７】
（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにより核酸転写産物を検出するための試薬と、
（ｃ）対照核酸及び／又は対照検体と、を含む、キット又はパッケージ。
【請求項２８】
さらに、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は２つの遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２７記載のキット又はパッケージ。
【請求項２９】
対照核酸と別に、６種類以下の遺伝子に対するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２７又は２８記載のキット又はパッケージ。
【請求項３０】
前記遺伝子が、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のみからなる、請求項２７又は２８記載のキット又はパッケージ。
【請求項３１】
請求項２３〜３０のいずれか記載のキット又はパッケージの女性が早産リスクの有無を診断するための診断組成物の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、早産を予測する方法及びそのために使用される組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国のすべての妊娠のほぼ１１％が早産（３７週未満の妊娠）であり、周産期の罹患率及び死亡率に大きく寄与している（非特許文献１：Goldenberg,R.L.and Rouse,D.J. （1998）. Prevention of premature birth.N Engl J Med 339,313-20）。早産の病因はほとんど知られておらず、予測的なバイオマーカーはまだ十分に開発されていない。
【０００３】
ＦＤＣ−６モノクローナル抗体を含む酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定された頚腟部の胎児性フィブロネクチンの存在の増加は、早産の可能性の増加と相関することが報告されている。スワッブは、子宮頸部又は後膣円蓋から採取することができ、胎児性フィブロネクチンを検出するために使用することができる。しかし、このバイオマーカーの予測的ツールとしての感受性は漸近的妊娠女性において比較的低い：３４週未満出生、ＲＯＣ面積０．６１（９５％ＣＩ：０．５９〜０．６３）；３７週未満出生、ＲＯＣ面積０．６５（９５％ＣＩ：０．６３〜０．６６）（非特許文献２：Honest et al, BMJ.325:1-10）。また、臨床使用では、母体血液による検体の汚染、性交後２４時間以内のサンプリング、及び子癇前症などの要因により、測定の正確さを低下させ、偽陽性である結果を発生する可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Goldenberg,R.L.and Rouse,D.J. (1998). Prevention of premature birth.N Engl J Med 339,313-20
【非特許文献２】Honest et al, BMJ.325:1-10
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、このような早産を予測する方法を改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本開示は、一般的に、妊娠女性が早産リスクの有無を決定する方法、組成物及びキットに関する。この方法は、アクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）、及び任意的にＡｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のいずれか１種類のタンパク質の発現レベルを測定することを必要とし、それらのアップレギュレーションが、女性が早産リスクがあることを示す。予測は、１６〜２７週目、２８〜３１週目、及び３２〜３６週目を含む、妊娠の異なる段階にある女性に対して行われることができる。女性がリスクにあると予測される場合、リスクを低下するように適切な治療処置を適用することができる。
【０００７】
一実施形態において、本開示は、妊娠女性から単離された生物学的検体におけるアクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）の発現レベルを測定することと、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較してアクチビンＡの発現レベルがアップレギュレートされている場合、当該女性において早産リスクがあると判定することと、を含む早産リスクがある妊娠女性を判定する方法を提供する。
【０００８】
他の実施形態において、本開示は、妊娠女性から単離された生物学的検体におけるアクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）の発現表現、及びＡｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）の発現表現を測定することと、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡ及びＡｄａｍ１２の発現表現がアップレギュレートされている場合、当該女性において早産リスクがあると判定することと、を含む早産リスクがある妊娠女性を判定する方法を提供する。
【０００９】
他の実施形態において、本開示は、妊娠女性から単離された生物学的検体におけるアクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）の発現表現を測定することと、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡ及びｓＦｌｔ１の発現表現がアップレギュレートされている場合、当該女性において早産リスクがあると判定することと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を判定する方法を提供する。
【００１０】
他の実施形態において、本開示は、妊娠女性から単離された生物学的検体におけるアクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）の発現表現を測定することと、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１の発現表現がアップレギュレートされる場合、当該女性において早産リスクがあると判定することと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を判定する方法を提供する。
【００１１】
その他の遺伝子を測定することができるが、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１遺伝子の発現レベルは、早産の最も重要な指標であることが発見されている。驚くべきことに、早産リスクの強力な指標であると考えられるいくつかの遺伝子は、本開示において有用でなくなる。そのような例には、ＦＮ１、ＰＥＧ１０、及びＰＡＰＰＡ２が含まれる。
【００１２】
したがって、一実施形態において、本開示の方法は、ＦＮ１、ＰＥＧ１０及び／又はＰＡＰＰＡ２の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＦＮ１、ＰＥＧ１０、ＰＡＰＰＡ２、ＥＰＡＳ１、Ｆ５、ＦＢＮ１、ＨＧＦ、ＩＧＦ２、ＡＧＯ２、ＡＴＦ２、ＫＤＭ６Ａ、ＫＲＡＳ、ＭＥＣＯＭ、ＰＤＰＫ１、Ｓ１００Ａ８、ＳＰＴＢＮ１、ＴＲＡ２Ｂ、ＶＥＧＦＡ、ＷＮＫ１、ＡＣＳＳ１、ＢＭＰ７、ＣＧＢ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＤＬＸ４、ＥＬＯＶＬ２、ＥＺＲ、ＨＢＢ、ＩＬ６ＳＴ、ＭＦＳＤ２Ａ、ＰＥＧ３及び／又はＳＶＥＰ１の発現レベルの測定を含まない。
【００１３】
一実施形態において、本方法は、ＦＮ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＰＥＧ１０の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＰＡＰＰＡ２の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＥＰＡＳ１の発現レベルの測定を含まない。
【００１４】
一実施形態において、本方法は、Ｆ５の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＦＢＮ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＨＧＦの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＩＧＦ２の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＡＧＯ２の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＡＴＦ２の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、この方法は、ＫＤＭ６Ａの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＫＲＡＳの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＭＥＣＯＭの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＰＤＰＫ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、Ｓ１００Ａ８の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＳＰＴＢＮ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＴＲＡ２Ｂの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＶＥＧＦＡの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、この方法は、ＷＮＫ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＡＣＳＳ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＢＭＰ７の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＣＧＢの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＣＹＰ１９Ａ１の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＤＬＸ４の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＥＬＯＶＬ２の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＥＺＲの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、この方法は、ＨＢＢの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＩＬ６ＳＴの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＭＦＳＤ２Ａの発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＰＥＧ３の発現レベルの測定を含まない。一実施形態において、本方法は、ＳＶＥＰ１の発現レベルの測定を含まない。
【００１５】
一実施形態において、測定は、１０遺伝子以下、あるいは９遺伝子以下、８遺伝子以下、７遺伝子以下、６遺伝子以下、５遺伝子以下、４遺伝子以下又は３遺伝子以下に対して行われる。
【００１６】
本開示の方法は、妊娠の異なる段階にある女性に適する。これは、驚くべきことである理由として、そのような予測が一般的に妊娠３２週目超えの女性のみに対して行われるためである。一実施形態において、当該女性は、妊娠１６〜２７週目にある。一実施形態において、当該女性は、妊娠２８〜３１週目にある。一実施形態において、当該女性は、妊娠１６〜３１週目にある。一実施形態において、当該女性は、妊娠３２週目未満にある。一実施形態において、当該女性は、妊娠３２〜３６週目にある。
【００１７】
当該方法は、喫煙又は飲酒、１７歳未満又は３５歳超え、早産経歴及び／又はストレスや不健康などの特定の妊娠女性に特に適している可能性がある。
【００１８】
早産リスクが決定される場合、当該女性は、早産リスクを改善するに適する処置を受けることができる。そのような処置の例には、コルチコステロイド、硫酸マグネシウム、抗生物質、又はプロゲスチンの投与、ならびに頚管縫縮術、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
使用される生物学的検体は、血清、血液、尿、又は当該女性の細胞又は組織を含む任意の検体であってもよい。
【００２０】
一実施形態において、（ａ）妊娠３７週目未満にある女性から得られた血清検体から、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、及び任意にＡｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）とｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）からなる群より選ばれるいずれか１つ又は両方を含み、且つＦＮ１、ＰＥＧ１０、及びＰＡＰＰＡ２を除く６種類以下の遺伝子の発現レベルを測定することと、（ｂ）当該女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡの発現レベルがアップレギュレーションされることにより、早産リスクがあると判定される場合、当該女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を治療する方法を提供する。
【００２１】
一実施形態において、（ａ）妊娠３７週目未満にある女性から得られた血清検体から、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）を含み、且つＦＮ１、ＰＥＧ１０、及びＰＡＰＰＡ２を除く６種類以下の遺伝子の発現レベルを測定することと、（ｂ）当該女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡの発現レベルがアップレギュレーションされることにより、早産リスクがあると判定される場合、当該女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を治療する方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、（ａ）妊娠３７週目未満にある女性から得られた血清検体から、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、及びＡｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）を含み、且つＦＮ１、ＰＥＧ１０、及びＰＡＰＰＡ２を除く６種類以下の遺伝子の発現レベルを測定することと、（ｂ）当該女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡ及びＡｄａｍ１２の発現レベルがアップレギュレーションされることにより、早産リスクがあると判定される場合、当該女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を治療する方法を提供する。
【００２３】
一実施形態において、（ａ）妊娠３７週目未満にある女性から得られた血清検体から、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）を含み、且つＦＮ１、ＰＥＧ１０、及びＰＡＰＰＡ２を除く６種類以下の遺伝子の発現レベルを測定することと、（ｂ）当該女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡ及びｓＦｌｔ１の発現レベルがアップレギュレーションされることにより、早産リスクがあると判定される場合、当該女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を治療する方法を提供する。
【００２４】
一実施形態において、（ａ）妊娠３７週目未満にある女性から得られた血清検体から、アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）を含み、且つＦＮ１、ＰＥＧ１０、及びＰＡＰＰＡ２を除く６種類以下の遺伝子の発現レベルを測定することと、（ｂ）当該女性が、早産リスクがない対照の妊娠女性と比較して、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１の発現レベルがアップレギュレーションされることにより、早産リスクがあると判定される場合、当該女性に早産リスクを改善する処置を施すことと、を含む、早産リスクがある妊娠女性を治療する方法を提供する。
【００２５】
一実施形態において、前記処置は、コルチコステロイド、硫酸マグネシウム、抗生物質、又はプロゲスチンの投与、ならびに頚管縫縮術、及びそれらの組み合わせからなる群より選ばれる。
【００２６】
さらに、前記方法を実施するためのキット又はパッケージを提供する。一実施形態において、前記キット又はパッケージは、（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）を含むタンパク質に対する抗体；（ｂ）前記抗体によりタンパク質の発現を検出するための試薬；（ｃ）対照抗体及び／又は対照検体、を含む。他の実施形態において、前記キット又はパッケージは、さらに、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）とｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は両方を含むタンパク質に対する抗体、を含む。一実施形態において、キット又はパッケージは、（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）を含むタンパク質に対する抗体；（ｂ）前記抗体によりタンパク質の発現を検出するための試薬；（ｃ）対照抗体及び／又は対照検体、を含む。
【００２７】
一実施形態において、キット又はパッケージは、対照抗体と別に、６種類以下（又は５種類以下、４種類以下、又は３種類以下）のタンパク質に対する抗体のみを含む。いくつかの実施形態において、キット又はパッケージは、対照抗体と別に、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１に対する抗体のみを含む。
【００２８】
一実施形態において、キット又はパッケージは、（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチド；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにより核酸転写産物を検出するための試薬；（ｃ）対照核酸及び／又は対照検体、を含む。他の実施形態において、キット又はパッケージは、さらに、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は両方を含む遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチド、を含む。一実施形態において、キット又はパッケージは、（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）を含む遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチド；（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにより核酸転写産物を検出するための試薬；（ｃ）対照核酸及び／又は対照検体、を含む。
【００２９】
一実施形態において、キット又はパッケージは、対照核酸と別に、６種類以下（又は５種類以下、４種類以下又は３種類以下）の遺伝子に対するオリゴヌクレオチドのみを含む。いくつかの実施形態において、キット又はパッケージは、対照核酸と別に、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１に対するオリゴヌクレオチドのみを含む。
【００３０】
さらに、ここで定義されるキット又はパッケージの女性が早産リスクの有無を診断するための診断組成物の製造における使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ルチオミックスに基づく早産バイオマーカーの発見と検証に関する研究概要を示した図である。差異（早産と正常対照との比較）胎盤遺伝子発現解析、マウス胎盤遺伝学的機能喪失解析、及びヒト胎盤組織発現特異性解析（その後、失敗と検証された）のような発見解析により、候補分析物を取得し、灰色として標記する。赤い矢印と緑の矢印は、それぞれ、アップレギュレートとダウンレギュレートされる遺伝子発現を表す。上付き文字：タンパク質レベル（循環）；下付き文字：ＲＮＡレベル（マイクロアレイデータ）。
【図２】マルチオミックスに基づく発見解析からの候補物のベン図解析を示した図である：早産差異遺伝子：ｐ値＜０．０５、倍率変化＞１．２；胎盤遺伝子：３２の組織と比べて、胎盤に富む遺伝子、強化された遺伝子、及び最も発現された遺伝子、そのＦＰＫＭ＞１００（Mathias Uhlenら,2015,Science）；遺伝子異常のヒトオーソロガス遺伝子：異常な胚性−胚外境界形態ＭＰ：０００３８９０；異常な胚外組織形態学ＭＰ：０００２０８６（ｎ=５６７）；異常な胚外組織生理学ＭＰ：０００４２６４（ｎ=３４）。
【図３】早産候補遺伝子の転写解析を示した図である。左図：胎盤遺伝子発現（単位：ＦＰＫＭ）；中央図：胎盤と他の器官組織との間の遺伝子発現割合；右図：早産と正常対照との間の胎盤組織の遺伝子発現割合。
【図４Ａ】関心のある血清学タンパク質を、早産に予測的なバイオマーカー（アクチビンＡ）として、ＥＬＩＳＡによる検証の概要を提供する図である。血清検体は、妊娠の異なる在胎齢で収集され：ＧＡ＜２８、ＧＡが２８〜３１、ＧＡが３２〜３７であった。Ｐ値は、Mann Whiney Testを用いて算出した。Ａ．症例／対照及び異なる妊娠期間における収集時点での検体における血清ＥＬＩＳＡ濃度分布のボックスプロットである。
【図４Ｂ】関心のある血清学タンパク質を、早産に予測的なバイオマーカー（アクチビンＡ）として、ＥＬＩＳＡによる検証の概要を提供する図である。血清検体は、妊娠の異なる在胎齢で収集され：ＧＡ＜２８、ＧＡが２８〜３１、ＧＡが３２〜３７であった。Ｐ値は、Mann Whiney Testを用いて算出した。Ｂ．上図：対象の血清分析物濃度の分布と検体採取の在胎齢との関数関係；中央図：対象の血清分析物濃度の分布と検体採取から分娩までの妊娠日数との関数関係；下図：対象の血清分析物濃度の分布と分娩の妊娠日数との関数関係。
【図５Ａ】関心のある血清学タンパク質を、早産に予測的なバイオマーカー（Ａｄａｍ１２）として、ＥＬＩＳＡによる検証の概要を提供する図である。血清検体は、妊娠の異なる在胎齢で収集され：ＧＡ＜２８、ＧＡが２８〜３１、ＧＡが３２〜３７であった。Ｐ値は、Mann Whiney Testを用いて算出した。Ａ．症例／対照及び異なる妊娠期間における収集時点での検体における血清ＥＬＩＳＡ濃度分布のボックスプロットである。
【図５Ｂ】関心のある血清学タンパク質を、早産に予測的なバイオマーカー（Ａｄａｍ１２）として、ＥＬＩＳＡによる検証の概要を提供する図である。血清検体は、妊娠の異なる在胎齢で収集され：ＧＡ＜２８、ＧＡが２８〜３１、ＧＡが３２〜３７であった。Ｐ値は、Mann Whiney Testを用いて算出した。Ｂ．上図：対象の血清分析物濃度の分布と検体採取の在胎齢との関数関係；中央図：対象の血清分析物濃度の分布と検体採取から分娩までの妊娠日数との関数関係；下図：対象の血清分析物濃度の分布と分娩の妊娠日数との関数関係。
【図６Ａ】関心のある血清学タンパク質を、早産に予測的なバイオマーカー（ｓＦｌｔ１）として、ＥＬＩＳＡによる検証の概要を提供する図である。血清検体は、妊娠の異なる在胎齢で収集され：ＧＡ＜２８、ＧＡが２８〜３１、ＧＡが３２〜３７であった。Ｐ値は、Mann Whiney Testを用いて算出した。Ａ．症例／対照及び異なる妊娠期間における収集時点での検体における血清ＥＬＩＳＡ濃度分布のボックスプロットである。
【図６Ｂ】関心のある血清学タンパク質を、早産に予測的なバイオマーカー（ｓＦｌｔ１）として、ＥＬＩＳＡによる検証の概要を提供する図である。血清検体は、妊娠の異なる在胎齢で収集され：ＧＡ＜２８、ＧＡが２８〜３１、ＧＡが３２〜３７であった。Ｐ値は、Mann Whiney Testを用いて算出した。Ｂ．上図：対象の血清分析物濃度の分布と検体採取の在胎齢との関数関係；中央図：対象の血清分析物濃度の分布と検体採取から分娩までの妊娠日数との関数関係；下図：対象の血清分析物濃度の分布と分娩の妊娠日数との関数関係。
【図７】アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２、及びｓＦｌｔ−１を含むバイオマーカー群を使用することにより達成される早産を予測する能力を実証した図である。上図：対象のバイオマーカー群スコアの分布と、検体採取の在胎齢（週）との関数関係；下図：曲線下面積（ＡＵＣ）値を算出するようにバイオマーカー群のＲＯＣ曲線を解析した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
図面の一部又は全部は、説明のための概略図であることが認識される。
【００３３】
定義
以下の説明は、本技術の例示的な実施形態を記載する。しかしながら、そのような説明は、本開示の範囲を限定するものではなく、例示的な実施形態の説明として提供されることを認識すべきである。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、以下の単語、句及び記号は、それらが使用されている文脈が他の意味を示す限り、一般的に、以下に示す意味を有することが意図される。
【００３５】
本明細書における値又はパラメータの「約」への参照は、その値又はパラメータ自体に指す実施形態を含む（及び記述する）。特定の実施形態において、「約」という用語は、示された量±１０％を含む。他の実施形態において、「約」という用語は、示された量±５％を含む。いくつかの他の実施形態において、「約」という用語は、示された量±１％を含む。また、用語「約Ｘ」には、「Ｘ」の記載が含まれる。また、単数形「一」及び「当該」は、文脈に明確に説明されない限り、複数への参照を含む。したがって、例えば「化合物」への参照は複数のそのような化合物を含み、「測定」への参照は１種類又は複数種の測定及び当業者に公知の等価物への参照を含む。
【００３６】
早産を予測する方法
「早産」又は「自発性早産」とは早産を意味し、早産（premature birth）とも呼ばれ、即ち、在胎３７週未満での新生児の出生を意味する。これらの新生児は、早産児とも呼ばれる。早産の症状には、１０分ごとより頻繁に起こる子宮収縮又は膣からの液漏れが含まれる。早産児には、脳性麻痺、発達の遅延、聴力障害、及び視覚障害のリスクがより高い。新生児の出生が早ければなるほど、これらのリスクが大きくなる。早産の原因はよく知られていない。危険因子には、糖尿病、高血圧、一つを超える胎児の妊娠、肥満又は低体重、種々の膣感染、喫煙、及び心理的ストレスなどが含まれる。他の医学的理由で必要とされない限り、分娩は３９週前に医学的に誘導されないことが推奨される。同じ勧告は、帝王切開にも適用される。早産と分娩は現代産科を悩ませ続ける。早産率は、依然として分娩率の約１１％を占め、それにより新生児の罹患率と死亡率が高い。子宮収縮抑制薬、リスク評価と地域化などの策略に対して研究を行ったものの、依然として変わらない。新生児の生存率は、新生児集中治療室の進歩、及び結果（例えば、呼吸窮迫症候群及び脳室内出血）の発生率を低下させるための分娩前のステロイド投与によって改善されている。最近、分娩症状の発症前に早産リスクがある患者を特定することが強く求められている。種々のマーカーの使用、特に細菌性膣症の存在、頚腟部胎児性フィブロネクチンの評価、及び超音波スキャンによって決定される子宮頸部長さは、早産妊娠のリスクがある女性の標的とすることを目的として研究され、様々な方式（例えば、子宮収縮抑制薬、ステロイド、抗生物質、頚管縫縮術）で特定の患者を治療するように、臨床医の意思決定に寄与する。子宮頸部長さ、胎児性フィブロネクチン、及び細菌性膣症の状態が子宮頸部／膣の評価に関連するため、血清分子マーカーの方が、有利である。
【００３７】
本開示のそれぞれの態様では、早産の状態を予測する方法、キット及び試薬を提供する。ここで使用される「予測」は、一般的に、対象の疾患又は障害（即ち、早産）に対する感受性の予測；対象が現在疾患又は障害（即ち、早産）の影響を受けているかどうかについての決定又は診断；疾患又は障害の影響を受けている対象の予測（例えば、早産の重症度の判定、早産状況が早期分娩に進行する可能性）；対象の疾患又は障害の治療に対する応答性の予測；及び、治療の効果又は有効性に関する情報を提供するための対象の状態の観測、を含む。ここで使用される用語「治療」、「処理」などは、一般的に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防する点で予防的であってもよく、及び／又は、疾患及び／又は当該疾患に起因する副作用を部分的又は完全に治癒する点で治療的であってもよい。ここで使用される「治療」は、哺乳類の疾患に対するいずれの治療を含み、（ａ）疾患にかかりやすいが未だ診断されていない対象において疾患が発生することを予防すること；（ｂ）疾患を抑制する、即ち、その進行を阻止すること；又は（ｃ）疾患を緩和する、即ち、疾患の退行を引き起こすこと、を含む。治療剤は、疾患又は損傷の発症前、発症中又は発症後に投与されることができる。患者の望ましくない臨床症状を安定化又は減少させる進行中の疾患の治療は、特に重要である。このような治療は、影響を受けている組織における機能が完全に喪失する前に行われることが望ましい。本発明の療法は、疾患の症状段階の間に施すことが理想的であり、場合によって疾患の症状段階の後に施すことがある。用語「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」は、ここで互換的に使用され、診断、治療又は療法が需要される任意の哺乳動物対象、特にヒトを意味する。
【００３８】
本発明の方法を実施する際に、個体由来の検体、例えば細胞又はその液体（例えば、血液又は血清）を評価して、１つ又は複数の早産遺伝子の発現表現を得る。「発現表現（expression representation）」とは、ＲＮＡ又はタンパク質レベルでの１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの表現を意味する。「遺伝子」又は「組換え遺伝子」とは、遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味する。前記遺伝子産物は、例えばＲＮＡ又はポリペプチドであり、例えば早産に関連するＲＮＡ又はポリペプチドである。コード配列の境界は、５’（アミノ基）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ基）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の３’末端にあってもよい。また、遺伝子は、天然のプロモーター（即ち、非組換え細胞（即ち、天然に存在する細胞）において、遺伝子のエキソンとイントロンが作動可能に連結されているプロモーター）及び関連する調節配列を任意に含んでもよく、ＡＵＧ開始部位の上流にある配列を有しても有しなくてもよく、非翻訳のリーダー配列、シグナル配列、下流の非翻訳配列、転写開始及び停止配列、ポリアデニル化シグナル、翻訳開始及び停止配列、リボソーム結合部位などを含んでも含まなくてもよい。「早産遺伝子」とは、正常に分娩する個体と比較して、早産に進行する又は進行した個体において、差次的に発現される遺伝子又は差次的に存在するタンパク質補因子を意味する。言い換えれば、遺伝子産物、即ち遺伝子又はタンパク質補助因子から生成されたｍＲＮＡ又はタンパク質は、健康の個体と比較して早産に進行する又は進行した個体由来の検体において、異なるレベルで存在する。
【００３９】
以下の実施例で実証されるように、本発明者らは、本発明の方法において早産遺伝子として用いられる、複数の遺伝子及び１つのタンパク質補因子を特定した。これらは、インヒビンベータＡ（アクチビンＡ、GenBank登録番号ＮＭ＿００２１９２）；ＦＭＳ様チロシンキナーゼ１又はｓＦｌｔ−１、Genbank登録番号ＮＭ＿００１１５９９２０．１（アイソフォーム２）、ＮＭ＿００１１６００３０．１（アイソフォーム３）とＮＭ＿００１１６００３１．１（アイソフォーム４））；及び、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２（Ａｄａｍ１２、GenBank登録番号ＮＰ＿００１２７５９０３．１，ＮＭ＿００１２８８９７４．１［Ｏ４３１８４−４］；ＮＰ＿００１２７５９０４．１，ＮＭ＿００１２８８９７５．１．［Ｏ４３１８４−３］；ＮＰ＿００３４６５．３，ＮＭ＿００３４７４．５，［Ｏ４３１８４−１］；ＮＰ＿０６７６７３．２，ＮＭ＿０２１６４１．４．［Ｏ４３１８４−２］）を含む。本発明の方法において、早産にかかる患者においてここで開示される１種類又は複数種の早産遺伝子の差次的発現を実証するための、任意の便宜な組織検体を評価することができる。一般的に、適切な検体供給源は、対象となる早産遺伝子の産物が放出された液体から由来する。特に重要な検体源は、血液検体又はその製剤（例えば、全血）、又は血清もしくは血漿、及び尿を含む。約２μｌ〜約２，０００μｌの血液、血清、又は尿の検体容積は、早産遺伝子産物のレベルの決定に十分である。一般的に、検体容積は、約１０μｌ〜約１，７５０μｌ、約２０μｌ〜約１，５００μｌ、約４０μｌ〜約１，２５０μｌ、約６０μｌ〜約１，０００μｌ、約１００μｌ〜約９００μｌ、約２００μｌ〜約８００μｌ、約４００μｌ〜約６００μｌである。複数の実施形態において、ヒト検体の適切な初期供給源は、血液検体である。そのため、本発明の検定において用いられる検体は、一般的に血液由来の検体である。血液由来の検体は、全血又はその一部、例えば、血清や血漿などから由来することができ、いくつかの実施形態において、検体は、血液由来であり、凝固が許容され、血清が分離及び回収されて測定に使用される。
【００４０】
検体が血清又は血清由来の検体である実施形態において、検体は一般的に流体検体である。流体血清検体を生成するためのいずれの簡便な方法を用いることができる。複数の実施形態において、当該方法は、静脈血を皮膚穿刺（例えば、フィンガー・スティック、静脈穿刺）によって凝固又は血清分離管に抽出され、血液を凝固させ、凝固した血液から血清を分離するように遠心することを採用する。その後、血清を回収し、測定まで保存する。患者由来の検体を得ると、早産遺伝子産物のレベルを決定するように、検体を測定する。
【００４１】
対象検体は、早産遺伝子産物の検出を増強するために、様々な方法で処理することができる。例えば、検体が血液である場合、測定の前に赤血球を検体から除去（例えば、遠心分離によって）してもよい。このような処理は、親和性試薬を用いて早産遺伝子産物のレベルを検出する場合の非特異的バックグラウンドレベルを低下させるために使用されてもよい。当分野で周知の方法（例えば、酸沈殿、アルコール沈殿、塩沈殿、疎水性沈殿、濾過（３０ｋＤより大きい分子を保持できるフィルター、例えばCentrim３０ＴＭを使用する）、親和性精製）により検体を濃縮させ、早産遺伝子産物の検出を増強することもできる。いくつかの実施形態において、被験検体及び対照検体のｐＨは、中性に近いｐＨ（即ち、ｐＨ６．５〜８．０）に調整され、維持される。そのようなｐＨ調整は、早産遺伝子産物複合体形成を阻止し、それにより、検体における早産遺伝子産物のレベルのより正確な定量を提供する。検体が尿である実施形態において、早産遺伝子産物の検出を増強するために、検体のｐＨを調整し、検体を濃縮する。
【００４２】
対象検体は、一般的には、妊娠の第二期又は第三期において個体から取得する。「妊娠」とは、哺乳動物における妊娠の持続的期間、即ち、子宮における受胎から出生までの発育期間を意味する。妊娠の時間間隔に２週間（即ち最後の月経期間）を加えたものは、妊娠期間と呼ぶ。ヒトの妊娠期は、３つの段階に分け、それぞれの段階が３ヶ月である。妊娠第一期とは最後の月経から１３週目まで、妊娠第二期とは１４週目から２７週目まで、妊娠第三期とは２８週目から４２週目までである。対象検体は、妊娠第一期、例えば、妊娠３４週目又はそれ以前、妊娠２０〜３４週目、妊娠２４〜３４週目、妊娠３０〜３４週目で取得されることができる。対象検体は、妊娠第三期、例えば、妊娠３４週目以降、３５週目、３６週目、３７週目、３８週目、３９週目、４０週目、４１週目、又は４２週目で取得されることができる。
【００４３】
対象検体における１種類又は複数種の早産遺伝子の発現レベルは、任意の簡便な方法によって評価することができる。早産遺伝子発現レベルは、例えば、１種類又は複数種の早産遺伝子の核酸転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）（例えば、ＲＮＡ発現シグネチャー）を測定すること；又は、対象の１種類又は複数種の遺伝子の発現産物である１種類又は複数種の異なるタンパク質／ポリペプチドのレベル（例えば、プロテオーム発現シグネチャー）を測定することによって、検出することができる。用語「発現表現」及び「遺伝子発現表現」は、ＲＮＡレベル又はタンパク質レベルでの１種類又は複数種の遺伝子及び／又はタンパク質補因子の発現の決定を意味するために広く使用される。用語「評価」、「測定」、「計測」、「評価」、及び「決定」は、互換的に使用され、要素が存在するかどうかを決定すること、及び定量的及び定性的に測定することを含む任意の形態の測定を意味する。評価は、相対的でも絶対的でもよい。
【００４４】
例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子の発現は、核酸発現シグネチャーを取得することによって評価することができる。「核酸発現表現」とは、核酸レベルの測定を意味し、１種類又は複数種の核酸（例えば、１種類又は複数種の対象遺伝子の核酸転写産物）の量又はレベルを決定することを意味する。これらの実施形態において、発現表現を生成するために測定される検体は、核酸検体である。核酸検体は、診断される細胞又は組織の対象の表現型決定遺伝子の発現情報を含む、複数又は１つのグループの異なる核酸を含む。核酸は、検体から検体が得られる宿主細胞又は組織の発現情報を保持する限り、例えばｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのようなＲＮＡ又はＤＮＡ核酸を含んでもよい。当分野に周知のように、検体は、様々な異なる方式で、例えば、差次的発現の分野に知られるように、細胞からｍＲＮＡを単離することにより調製されることができ、単離されたｍＲＮＡがそのまま使用され、増幅され、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡなどを調製するために用いられる。上記のように、検体は、一般的に、標準プロトコールを用いて、診断しようとする対象から、例えば血液採取又は組織の生検により採取された細胞又は組織から調製され、そのような核酸を生成し得る細胞タイプ又は組織が、表現型の発現パターンが存在するかどうかを決定しようとするいずれの組織を含み、末梢血リンパ球細胞などを含むが、これに限定されるものではない。
【００４５】
発現表現は、任意の便宜なプロトコールを使用して初期核酸検体から生成することができる。様々な異なる核酸を検出する方式、例えば差次的遺伝子発現解析分野に使用される方法が知られるが、発現表現を生成するための１つの代表的で便利なタイプのプロトコールは、アレイベースの遺伝子発現プロファイリングプロトコルである。そのような応用は、使用される核酸が生成される発現表現における検定／プロファイリングされようとするそれぞれの遺伝子に関する「プローブ」核酸を示す、ハイブリダイゼーション検定である。これらの検定において、まず、検定される最初の核酸検体から標的核酸の検体を調製し、調製は、標的核酸の標識（例えば、シグナル生成系のメンバー）による標識を含んでもよい。標的核酸検体の調製後、検体をハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させることにより、アレイ表面に付着したプローブ配列に相補する標的核酸との間で複合体を形成する。その後、ハイブリダイズした複合体の存在を、定性的又は定量的に検出する。
【００４６】
本発明の方法で採用される発現表現を生成するために実施され得る特定のハイブリダイゼーション技術は、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，２８８，６４４号、第５，３２４，６３３号、第５，４３２，０４９号、第５，４７０，７１０号、第５，４９２，８０６号、第５，５０３，９８０号、第５，５１０，２７０号、第５，５２５，４６４号、第５，５４７，８３９号、第５，５８０，７３２号、第５，６６１，０２８号、第５，８００，９９２号；及びＷＯ９５／２１２６５、ＷＯ９６／３１６２２、ＷＯ９７／１０３６５、ＷＯ９７／２７３１７、ＥＰ３７３２０３、及びＥＰ７８５２８０に記載されるものを含み、これらの開示内容が、参照としてここで組み込まれる。それらの方法では、上記のように、発現が検定されているそれぞれの表現型決定遺伝子のプローブを含む「プローブ」核酸アレイを、標的核酸と接触させる。接触は、ハイブリダイゼーション条件、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われ、その後非結合核酸を除去する。ここで使用される用語「ストリンジェントな検定条件」とは、検定において所望の特異性レベルを提供するのに十分な相補性を持つ表面結合核酸及び溶液相核酸のような核酸の結合対の生成に適するが、所望の特異性を提供するのに十分でない相補性を持つ結合メンバー間の結合対の形成に適しない条件を意味する。ストリンジェントな検定条件は、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件の両方の合計又は組み合わせ（全体）である。
【００４７】
得られたハイブリダイゼーション核酸のパターンは、プローブされた各遺伝子の発現に関する情報を提供し、ここで発現情報は、遺伝子が発現されるかどうか、そして一般的にはどんなレベルで発現するかに関するものであり、発現データ、即ち発現表現（例えば、トランスクリプトームの形態）は、定性的でも定量的でもよい。
【００４８】
あるいは、検体における１種類又は複数種の核酸のレベルを定量するための非アレイベースの方法を用いることができ、定量的ＰＣＲ、逆転写ＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲなどを含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの検定のような増幅プロトコールに基づくものを含む。
【００４９】
別の例として、少なくとも１種類の早産遺伝子の発現は、検体における、対象の遺伝子によりコードされるタンパク質／ポリペプチドのような、１種類又は複数種のタンパク質／ポリペプチドの量又はレベルを決定するタンパク質レベルの測定により評価されることができる。本願で使用される用語「タンパク／タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換可能である。「ポリペプチド」とは、アミノ酸の重合体（アミノ酸配列）を意味し、分子の特定の長さを意味しない。したがって、ペプチド及びオリゴペプチドは、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、さらに、グリコシル化ポリペプチド、アセチル化ポリペプチド、リン酸化ポリペプチドなどのような翻訳後修飾ポリペプチドを意味するか、又はそれを含む。この定義には、例えば、アミノ酸の１種類又は複数種のアミノ酸アナログを含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、並びに当技術分野で知られている天然に存在する及び天然に存在しない他の修飾が含まれる。
【００５０】
発現表現がタンパク質レベルでの遺伝子発現（即ち、タンパク質発現表現）の決定である場合、検定された検体における１種類又は複数種のタンパク質のレベルが決定される、タンパク質レベルを評価するための任意の簡便なプロトコールを使用することができる。例えば、タンパク質レベルを検定するための代表的で便利なタイプのプロトコールの１つは、ＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ及びＥＬＩＳＡに基づく検定では、目的のタンパク質に特異的な１種類又は複数種の抗体を、選択された固体表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面に固定化することができる。不完全に吸着された物質を除去するように洗浄した後、検定プレートウェルを、試験検体に対して抗原的に中性であることが知られている非特異的「ブロッキング」タンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は粉末ミルクを塗布する。これは、固定化表面上の非特異吸着部位のブロッキングを可能にし、それにより表面上への抗原の非特異的結合によるバックグラウンドを減少させる。未結合のブロッキングタンパク質を除去するように洗浄した後、免疫複合体（抗原／抗体）の形成に適する条件下で、固定化表面を被験検体と接触させる。そのような条件は、非特異的バックグラウンドの減少に寄与する、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）／Tween又はPBS／Triton-X 100におけるＢＳＡ又はウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）のような希釈剤で検体を希釈することと、約２５〜２７℃の温度で約２〜４時間インキュベートする（他の温度を使用してもよい）ことと、を含む。インキュベーション後、抗血清接触表面を洗浄して、非免疫複合体を除去する。例示的な洗浄手順は、PBS／Tween、PBS／Triton-X 100、又はホウ酸塩緩衝液などの溶液による洗浄を含む。その後、免疫複合体形成の発生及び量は、結合した免疫複合体を、第１の抗体とは異なる標的に対する特異性を有する第２の抗体に付し、第２の抗体の結合を検出することによって決定する。特定の実施形態において、第２の抗体は、適切な発色基質と共にインキュベートすると着色沈殿を生じる、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、又はアルカリホスファターゼのような関連する酵素を有する。例えば、ウレアーゼ又はペルオキシダーゼ接合抗ヒトＩｇＧを、免疫複合体形成に有利の時間及び条件下で用いることができる（例えば、室温で、PBS／TweenのようなＰＢＳ含有溶液において２時間インキュベートする）。第２の抗体とインキュベーションし且つ未結合物質を除去するように洗浄した後、標識の量を、発色基質と共にインキュベートすることにより定量し、発色基質は、例えばウレアーゼ標識の場合に、尿素及びブロモクレゾールパープルであり、あるいはペルオキシダーゼ標識の場合に、２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）及びＨ２Ｏ２である。その後、定量は、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して、発色度を測定することにより達成される。
【００５１】
前記フォーマットは、まず、検体を検定プレートに結合させることによって変更することができる。その後、一次抗体を検定プレートとともにインキュベートし、続いて一次抗体に対する特異性を有する標識された二次抗体を用いて、結合された一次抗体を検出する。
【００５２】
上記１種類又は複数種の抗体が固定化された固体基材は、種々の材料から作製され、及び様々な形状を有してもよく、例えば、例えばマイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子などである。基板を選択することにより、信号対雑音比を最大化し、バックグラウンド結合を最小化し、分離及びコスト低下を容易にする。使用する基材に最も適切な方式で、例えば、リザーバーからビーズ又はディップスティックを除去すること、マイクロタイタープレートウェルなどのリザーバーを空にする又は希釈すること、あるいはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム又はフィルターを洗浄溶液又は溶媒ですすぐことによって、洗浄することができる。
【００５３】
あるいは、検体中の１種類又は複数種のタンパク質のレベルを測定するための非ＥＬＩＳＡベースの方法を使用することができる。代表的な例には、質量分析、プロテオームアレイ、ｘＭＡＰ（登録商標）マイクロスフェア技術、フローサイトメトリー、ウェスタンブロッティング、及び免疫組織化学が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrookら,HaRBor Laboratory Press 2001);Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubelら eds.,John Wiley & Sons 1999);Protein Methods (Bollagら,John Wiley & Sons 1996);Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagnerら eds.,Academic Press 1999);Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995);Immunology Methods Manual (I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997);及びCell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths,John Wiley & Sons 1998)のような標準的教科書に見出すことができ、それらの開示が参照としてここで組み込まれる。本開示において言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、及びキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich及びClonTechのようなメーカーから入手可能である。
【００５５】
得られたデータは、プロービングされた各遺伝子の発現に関する情報を提供し、ここで発現情報は、遺伝子が発現されているかどうか、そして一般的にはどのレベルで発現しているかに関するものであり、発現データは、定性的でも定量的でもよい。
【００５６】
１種類又は複数種の早産遺伝子の発現レベルが決定されると、その測定値を、複数の方法のいずれかで解析するにより、早産の発現表現を得ることができる。最も広い意味で、発現表現は定性的でも定量的でもよい。したがって、検出が定性的である場合、当該方法は、読み取り、又は標的分析物（例えば、核酸又は発現産物）が被験検体中に存在するか否かの評価（例えば、見積もり）を提供する。他の実施形態において、本方法は、被験検体中に標的分析物が存在するかどうかの定量的検出、即ち、標的分析物（例えば、核酸又はタンパク質）の実際量又は相対存在量の見積もり又は評価を提供する。このような実施形態において、定量的検出は絶対的であってもよく、あるいは、方法が検体中の２種類又はそれ以上の異なる分析物（例えば、標的核酸又はタンパク質）を検出する方法である場合、相対的であってもよい。したがって、検体中の標的分析物（例えば、核酸又はタンパク質）を定量するという文脈で使用される場合、用語「定量」とは、絶対的又は相対的定量を意味することができる。絶対的定量は、既知の濃度の１種類又は複数種の対照分析物を含み、既知の対照分析物による（例えば、検量線の作製による）標的分析物の検出レベルを参照することによって、達成されることができる。あるいは、相対的定量は、２種類又はそれ以上の異なる標的分析物間の検出レベル又は量の比較によって、２種類又はそれ以上の異なる分析物のそれぞれの相対的定量を提供することによって、達成されることができる。
【００５７】
例えば、早産発現測定値を解析して発現プロファイルを生成することができる。ここで使用される場合、発現プロファイルは、患者検体中の１種類又は複数種の早産遺伝子の発現の正規化レベルであり、例えば患者検体中の血清学タンパク質濃度の正規化レベルである。発現プロファイルは、当分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって作製されることができる。例えば、各遺伝子の発現レベルは、log2変換され、選択されたハウスキーピング遺伝子の発現（例えば、ＡＢＬ１、ＧＡＰＤＨ、又はＰＧＫ１）に対して、又はマイクロアレイ全体にわたるシグナルに対して、正規化されることができる。早産発現プロファイルは、早産表示の一例である。
【００５８】
別の例として、早産の測定値をバイオマーカーパネルとして解析することができる。バイオマーカーパネルの予測的メンバーは、統計的特徴選択プロセスによって選択することができる。例えば、分析物パネルは、遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）と、全部ペアリングされた（ＡＰ）サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）又はランダムフォレスト（ＲＦ）メソッドとを組み合わせることにより選択することができる。予測的特徴は、例えば、反復ＧＡ／（ＳＶＭ又はＲＦ）により、自動的に決定され、最適な分類性能を有する非常にコンパクトな非重複の早産関連分析物に導く。これらの異なる分類器セットは、適度な重合遺伝子特徴のみを有するが、類似のレベルの精度を有する可能性がある。
【００５９】
別の例として、早産発現の測定を解析することにより早産シグネチャーを生成することができる。早産シグネチャーは、患者検体中に検定された早産遺伝子（ここで開示される早産遺伝子又はそのサブセット）のパネルの、患者検体から得られたデータセットによって規定される加重発現レベル（例えば、血清学タンパク質濃度）を表す単一のメトリック値である。患者検体の早産シグネチャーは、遺伝子シグネチャーを算出するための当分野で公知の多数の方法のいずれかによって計算することができる。例えば、患者検体中の１種類又は複数種の早産遺伝子のそれぞれの発現レベルは、例えば、上記のように早産発現プロファイルを作成するために、log２変換及び正規化されることができる。その後、各遺伝子の正規化発現レベルは、正規化レベルに加重係数又は「重み」を乗算し、１種類又は複数種の遺伝子のそれぞれにおける加重発現レベルを得ることにより、加重化される。その後、加重発現レベルは合計され、場合によって、解析された１種類又は複数種の早産遺伝子のそれぞれの加重発現レベルを得るように、平均化される。加重係数又は重みは、例えば、検体のデータセットを得る主成分分析ＰＣＡ、線形回帰、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、及び／又はランダムフォレストなどのような、任意の統計的機械学習方法によって決定されることができる。例えば、各早産遺伝子の分析物レベルは、log2変換され、１（早産においてアップレギュレートされる遺伝子に対して）又は−１（早産においてダウンレギュレートされる遺伝子に対して）として加重され、ダウンレギュレートされた分析物と比較してアップレギュレートされた遺伝子の合計の間の比率を、早産シグネチャーとして取得されることが決定される。早産発現シグネチャー例は、早産発現表現の他の例である。
【００６０】
別の例として、早産発現の測定を解析して早産スコアを生成することができる。早産シグネチャーと同様に、早産スコアは、患者検体中の１種類又は複数種の早産遺伝子の加重発現レベルの合計を表す単一のメトリック値である。早産スコアは、上記早産シグネチャーと非常に類似する方法により、決定することができる。例えば、患者検体中の１種類又は複数種の早産遺伝子のそれぞれの発現レベルは、上記のように早産発現プロファイルを作成するために、log2変換及び正規化される；その後、各遺伝子の正規化発現レベルは、正規化レベルに加重係数又は「重み」を乗算し、１種類又は複数種の遺伝子のそれぞれにおける加重発現レベルを得ることにより、加重化される；その後、加重発現レベルは合計され、場合によって、解析された１種類又は複数種の早産遺伝子のそれぞれの加重発現レベルを得るように、平均化される。しかし、早産シグネチャーと逆に、加重発現レベルは、参照データセット又は「訓練データセット」によって定義される。従って、早産スコアは、参照データセットによって定義される。
【００６１】
当業者にとって、これらの解析方法は、コンピュータベースのシステムを使用することにより、例えば、当分野で知られているような任意のハードウェア、ソフトウェア及びデータ記憶媒体を使用し、そのような解析に適する任意のアルゴリズムを使用することによって、容易に実施され得る。例えば、「クラウドコンピューティング」、スマートフォンベース又はクライアントサーバベースのプラットフォームなどにより、データマイニングアルゴリズムを適用することができる。
【００６２】
特定の実施形態において、１種類の遺伝子のみの発現を評価して発現表現を生成する。他の実施形態において、２種類又はそれ以上、例えば約３種類又はそれ以上、約５種類又はそれ以上、約１０種類又はそれ以上、又は約１５種類又はそれ以上の遺伝子の発現が評価される。したがって、本発明の方法では、検体中の少なくとも１種類の遺伝子の発現が評価される。特定の実施形態において、行われる評価は、当分野で使用されているように、トランスクリプトームの評価と見なされることができる。
【００６３】
このようにして得られる発現表現は、早産の予測において多くの用途を見出す。例えば、発現表現は、妊娠女性が早産を発症するかどうかを予測するため、妊娠女性の早産を診断するため、診断された早産を特徴付けるため、又は妊娠女性の早産治療に対する応答性をモニターするために用いられる。いくつかの例では、ここで開示される早産マーカーの特定の組み合わせの測定値は、当分野で知られている標準的な方法（例えば、Hologicにより開発されたｆＦＮ（胎児性フィブロネクチン）試験）による早産の予測よりも、改善された精度を有する早産の予測を提供する。
【００６４】
いくつかの実施形態において、発現表現は、表現型決定要素（即ち、早産表現型決定要素）と比較することによって、表現型決定要素との類似性又は相違を判定するように使用され、判定された類似性又は相違が、妊娠女性が早産を発症するかどうかを予測するため、妊娠女性の早産を診断するため、診断された早産を特徴付けるため、又は妊娠女性の早産治療に対する応答性をモニターするなどのために用いられる。例えば、早産表現型決定要素は、所定の対象の発現表現の実験的決定における参照／対照として使用され得る、早産を患っている個体又は早産を患っていない個体由来の検体であってもよい。別の例として、早産表現型決定要素は、例えば早産状態を示し、所定の対象の発現表現を解釈するための参照／対照として使用され得る、発現プロファイル、発現シグネチャー又は発現スコアのような発現表現であってもよい。表現型決定要素は、陽性参照／対照であってもよく、例えば、早産を患っている妊娠女性、又は早産を発症する妊娠女性、又は既知の治療によって管理可能な早産を患っている妊娠女性、又は早産が新生児の分娩にのみ反応すると判断される妊娠女性からの検体又はその発現表現であってもよい。あるいは、表現型決定要素は、陰性参照／対照であってもよく、例えば、早産を発症していない妊娠女性、又は妊娠していない女性からの検体又はその発現表現であってもよい。表現型決定要素は、好ましくは、同じタイプの検体であるか、又は発現表現である場合、モニターされる個体の発現表現を生成するために使用された検体と同じタイプの検体から得られる。例えば、個体の血清が評価されている場合、参照／対照は好ましくは血清である。
【００６５】
特定の実施形態において、得られた発現表現を、単一の表現型決定要素と比較して、被験個体の早産に関する情報を得る。特定の実施形態において、得られた発現表現は、２種類又はそれ以上の表現型決定要素と比較する。例えば、得られた発現表現を、陰性対照と陽性対照と比較して、個体が早産を発症するかどうかに関する確認情報を得ることができる。別の例として、得られた発現表現は、治療に応答する早産を代表する参照と比較し、また、治療に応答しない早産を代表する参照と比較し、患者が治療に反応するかどうかに関する情報を得ることができる。
【００６６】
得られた発現表現と１種類又は複数種類の表現型決定要素との比較は、当業者にとって既知の任意の簡便な方法を使用することにより行われる。例えば、アレイ分野の当業者は、発現プロファイルのデジタル画像を比較すること、発現プロファイルのデータベースを比較することなどによって、アレイプロファイルを比較することができると理解する。発現プロファイルを比較する方法を記載している特許は、米国特許第６，３０８，１７０号及び第６，２２８，５７５号を含むが、これらに限定されるものではなく、それらの開示内容が参照としてここで組み込まれる。以上において、発現プロファイルを比較する方法も記載される。同じように、ＥＬＩＳＡの当業者は、ＥＬＩＳＡデータを、例えば、標準曲線の正規化、正規化値の比較などにより、比較することができると理解する。比較工程は、得られた発現プロファイルと対照／参照プロファイルとの間にどれほど類似しているか又は類似していないかに関する情報を生成し、類似性／非類似性情報が、早産の発症の予測、早産の診断、早産患者のモニタリングなどのような、早産を予測するために使用される。類似性は、相対的発現レベル、絶対的発現レベル又は両方の組み合わせに基づくことができる。特定の実施形態において、対象（例えば、ユーザ）から得られた遺伝子レベル発現結果の入力を受信し、１つ又は複数の参照プロファイルとの類似性を決定し、ユーザ（例えば、実験室技術者、医師、妊娠している個体など）に早産予測を戻すように設計される、プログラムを記憶したコンピュータを使用して類似性判定が行われる。本開示のコンピュータ実装の態様についてのさらなる説明は、以下に記載される。
【００６７】
得られた発現プロファイルと比較する参照／対照プロファイルの類型及び性質によって、上記比較工程は、検定される細胞／体液に関する様々な異なるタイプの情報を生成する。そのため、上記比較工程は、早産発症の陽性／陰性の予測を生成することができる。あるいは、そのような比較工程は、早産の陽性／陰性の診断を生成することができる。あるいは、このような比較工程は、早産の特徴付けを提供することができる。
【００６８】
他の実施形態において、発現表現は、予測、診断、又は特徴付けを行うために、直接的に、即ち表現型決定要素と比較せずに用いられる。例えば、患者の血清中のＡｄａｍ１２の濃度が妊娠２８週目未満で約２５．８６ｎｇ／ｍｌ以上、２８週目から３２週目までに１９．３７ｎｇ／ｍｌ以上、３２週目から３７週目までに４０．０３ｍｇ／ｍｌ以上である場合、患者に早産を発症すると予測することができる。他の例については、表１０を参照する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、他の分析は、個体の早産予測を提供するために、上記発現レベル表現と併用されることができる。そのような分析は、当分野において周知であり、例えば、血圧、体重増加、保水性及び血小板数の分析を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、早産を予測することは、早産の予測、診断、又は特徴付けを提供することを含む。そのような実施形態において、予測、診断、又は特徴付けは、当業者によるモニタリング評価の書面報告を提供（即ち、生成）することにより、提供されることができ、前記モニタリング評価が、即ち当業者による早産の発症に対する予測（「早産予測」）、当業者による対象早産に対する診断（「早産診断」）、又は当業者による対象早産に対する特徴付け（「早産特徴付け」）である。したがって、本発明の方法は、モニタリング評価の結果を提供する報告を生成又は出力する工程を含んでもよく、当該報告が、電子媒体（例えば、コンピュータモニタ上の電子表示）の形態で提供されてもよく、又は有形の媒体（例えば、紙又は他の有形の媒体に印刷された報告）の形態で提供されてもよい。
【００７１】
ここで説明するような「報告」は、対象監視評価及びその結果に関する関心の情報を提供する報告要素を含む、電子的又は有形の文書である。対象報告は、少なくとも、早産予測、早産診断、又は早産の特徴付けを含む。即ち、患者に対して、早産の発症の可能性、早産の診断、又は早産の特徴付けをそれぞれ予測する。対象報告は、完全に又は部分的に電子的に生成されることができる。対象報告は、１）試験施設に関する情報、２）サービスプロバイダ情報、３）患者データ、４）検体データ、５）ａ）使用される参照値と、ｂ）例えばタンパク質レベル決定を含む試験データを含む評価報告、６）他の特徴のうち、１つ又は複数を含む。
【００７２】
当該報告は、検体採取及び／又はデータ生成が行われた病院、診療所、又は実験室に関連する検査施設に関する情報を含むことができる。検体採取は、対象から、血液、唾液、尿などのような液体検体；組織生検などのような組織検体を得ることを含むことができる。データ生成は、早産患者と健康な個体（即ち、早産を患っていない及び／又は早産を発症しない個体）における差次的に発現したり、異なるレベルで存在したりする１種類又は複数種の遺伝子のポリペプチド濃度を測定すること含んでもよい。当該情報は、例えば、試験施設の名称及び位置、検定及び／又は入力データの登録を実施した実験室技師の身分証明、検定が実施／分析された日付と時間、検体及び／又は結果データを保存する場所、検定に使用される試薬（例えば、キットなど）のロット番号などを含んでもよい。当該情報を含む報告フィールドは、一般的にユーザが提供する情報を使用して入力されることができる。
【００７３】
当該報告は、ユーザ所在の医療施設の外又は内にあるサービスプロバイダに関する情報を含んでもよい。そのような情報の例は、サービスプロバイダの名称と場所、査読者の名前、及び必要又は希望に応じて検体採取及び／又はデータ生成を行った個ヒトの名前を含んでもよい。当該情報を含む報告フィールドは、一般的にユーザが提供する情報を使用して入力されることができ、当該データが、予め編集された選択肢から（例えば、ドロップダウンメニューを使用して）選択されることができる。報告中の他のサービスプロバイダ情報は、結果及び／又は解釈的報告に関する技術情報の連絡先情報を含むことができる。
【００７４】
当該報告は、患者の病歴（例えば、年齢、種族、血清型、早産出産エピソード、及びその他の妊娠に関するいずれの特徴を含んでもよい）と、患者を識別する情報（例えば、名前、患者の生年月日（ＤＯＢ）、性別、郵送先及び／又は住所、医療記録番号（ＭＲＮ）、医療施設における部屋及び／又はベッド番号、保険情報など）のような管理的患者データ、モニタリング評価を指令した患者の医師又は他の医療従事者の名前、及び指令医師と異なる場合、患者のケアを担当するスタッフ医師の名前（例えば、初級保健医）、を含む患者データ部を含んでもよい。
【００７５】
当該報告は、患者から得られた生物検体の供給源（例えば、血液、唾液、又は組織のタイプなど）、如何に検体を取り扱ったこと（例えば保存温度、準備プロトコール）、及び採取の日付と時間のような、モニタリング評価で解析された生物検体に関する情報を提供する、検体データ部を含んでもよい。当該情報を含む報告フィールドは、一般的にユーザが提供する情報を使用して入力されることができ、そのうちの一部が、予め編集された選択肢から（例えば、ドロップダウンメニューを使用して）提供されることができる。
【００７６】
当該報告は、ここで記載されているデータの処理後に生成される情報を含む、評価報告部を含んでもよい。解釈的報告は、対象が早産を発症する可能性の予測を含んでもよい。解釈的報告は、早産の診断を含んでもよい。解釈的報告は、早産の特徴付けを含んでもよい。解釈的報告は、例えば、タンパク質レベルで決定検定の結果（例えば、「血清中１．５ｎｍｏｌ／Ｌ ＡＤＡＭ１２」）；及び解釈、即ち予測、診断、又は特徴付けを含んでもよい。報告の評価部は、任意に、推奨事項を含んでもよい。例えば、結果が早産であり得ることを示す場合、推奨事項は、当分野で推奨されるように、食事の変更と、血圧治療薬の投与などを含んでもよい。
【００７７】
なお、報告は、少なくともユーザが要求する解析を提供するのに十分な要素（例えば、早産の予測、診断、又は特徴付け）を含む限り、上記の要素の全部又は一部を含むことができる。
【００７８】
上述のように、本発明の方法は、個体に早産の予測を提供するために用いられ、ここで「早産の予測を提供する」とは、個体が早産を発症するかどうかを予測すること、早産の有無を診断すること、及び／又は早産を特徴づけることを意味する。「個体が早産を発症するかどうかを予測する」とは、個体が翌週、次の３週間、次の５週間、次の２ヶ月、次の３か月、例えば妊娠の残り期間の間に早産を発症する可能性を決定することを意味する。「早産を診断する」とは、個人が早産を発症した、即ち妊娠による高血圧又は妊娠誘発性高血圧を発症したと判定することを意味する。「早産を特徴付ける」とは、個人における早産の程度を決定することにより、例えば、当分野に周知のように、個体をモニターし、治療案を決定することを意味する。
【００７９】
本発明の方法は、様々な異なるタイプの対象に適用することができる。複数の実施形態において、対象は、肉食動物（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット及びラット）、ウサギ目（例えば、ウサギ）及び霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー及びサルなど）を含む哺乳動物類に属する。特定の実施形態において、動物又は宿主（即ち、対象（ここで患者ともいう））はヒトである。
【００８０】
試薬、システム及びキット
さらに、上記の１種類又は複数種の方法を実施するための試薬、システム及びキットが提供される。本発明の試薬、システム及びそれらのキットは、大きく異なる場合がある。関心のある試薬は、タンパク質の検出のための抗体又はペプチド、核酸の検出のためのオリゴヌクレオチドなどのような、検体から早産遺伝子の上記発現表現を産生するために特別に設計される試薬、例えば、１種類又は複数種の遺伝子発現決定要素を含む。いくつかの例において、遺伝子発現決定要素は、抗体、ＰＣＲプライマーのセットなどのような、単一の早産遺伝子の発現を検出するための試薬を含む。他の例では、遺伝子発現決定要素は、核酸又はタンパク質アレイ、ＥＬＩＳＡプレート、マルチプレックスＰＣＲカクテルなどのような、それぞれが異なる早産遺伝子産物に特異的で、１種類以上の早産遺伝子の発現を同時に検出するために使用され得る、複数の試薬を含む。例えば、核酸又は抗体のぞれぞれに基づく検体核酸又はタンパク質の検出は、電気化学的バイオセンサープラットフォームと結合されることにより、個人化された早産救護のためのこれらのバイオマーカーの多重決定を可能にする。用語「システム」とは、試薬のコレクションを意味するが、例えば同じ又は異なる供給源から試薬のコレクションを購入することによって集められたものを意味する。用語「キット」とは、一緒に提供（例えば販売）される、試薬のコレクションを意味する。
【００８１】
そのような試薬の１つのタイプは、目的の表現型決定遺伝子を示すプローブ核酸のアレイである。当分野では、様々な異なるプローブ構造、基質組成及び付着技術（例えば、ドットブロットアレイ、マイクロアレイなど）を持つ、様々な異なるアレイフォーマットが知られる。代表的な目的のアレイ構造は、米国特許第５，１４３，８５４号、第５，２８８，６４４号、第５，３２４，６３３号、第５，４３２，０４９号、第５，４７０，７１０号、第５，４９２，８０６号、第５，５０３，９８０号、第５，５１０，２７０号、第５，５２５，４６４号、第５，５４７，８３９号、第５，５８０，７３２号、第５，６６１，０２８号、第５，８００，９９２号、ならびにＷＯ９５／２１２６５；ＷＯ９６／３１６２２；ＷＯ９７／１０３６５；ＷＯ９７／２７３１７、ＥＰ３７３２０３、及びＥＰ７８５２８０に記載されるものがあり、その開示内容が参照としてここで組み込まれる。
【００８２】
別のタイプの試薬は、表現型決定遺伝子（例えば、早産遺伝子）の発現表現を生成するために特別に調整され、これらの遺伝子を（例えば、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのようなＰＣＲベースの技術により）選択的に増幅するように設計された遺伝子特異的プライマーのコレクションである。遺伝子特異的プライマー及びそれを使用する方法は、米国特許第５，９９４，０７６号に記載され、その開示が参照としてここで組み込まれる。
【００８３】
さらに別のタイプの試薬は、表現型決定遺伝子（例えば、早産遺伝子）の発現プロファイルを生成するために特別に調整され、これらの遺伝子により、例えば、ＥＬＩＳＡフォーマットで、ｘＭＡＰ（登録商標）ミクロスフェアフォーマットで、プロテオームアレイで、フローサイトメトリーによる解析やウェスタンブロッティング及び免疫組織化学による解析のための懸濁液において、コードされるタンパク質に特異的に結合する抗体のコレクションである。代表的な抗体は、ＤＶＲ１００８（R&D Systems）、ＤＡＤ１２０（R&D Systems）、及びＤＡＣ００Ｂ（R&D Systems）を含む。これらを使用する方法は、当分野において十分に理解されている。これらの抗体は、溶液として提供されることができる。あるいは、それらは、予め固体マトリックス（例えば、マルチウェルディッシュのウェル又はｘＭＡＰマイクロスフェアの表面）に結合されて提供されることができる。
【００８４】
プローブアレイ、プライマー又は抗体のコレクションは、特に興味あるものであり、ＶＥＦＧＲ−１、Ａｄａｍ１２、及びインヒビンベータからなる群より選択される少なくとも１種類の遺伝子／タンパク質に、場合によってこれらの遺伝子のうちの複数（例えば、少なくとも２、３、４、８又はそれ以上）に特異的なプローブ、プライマー又は抗体（試薬とも呼ばれる）を含む。本発明のプローブ、プライマー、又は抗体のコレクション又は試薬は、以上に挙られた遺伝子／タンパク質／補因子のみに特異的な試薬を含んでもよく、あるいは、当分野で発現パターンが早産に関連することが知られている遺伝子／タンパク質／補因子に特異的なプローブ、プライマー、又は抗体のような、以上に挙られていない他の遺伝子／タンパク質／補因子に特異的な試薬を含んでもよい。
【００８５】
本発明で開示されるシステム及びキットは、上記アレイ、遺伝子特異的プライマーコレクション、又はタンパク質特異的抗体コレクションを含んでもよい。前記システム及びキットは、例えば、プレミックス又は単独としての標的核酸を生成するためのプライマー、ｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ；ビオチン化又はＣｙ３又はＣｙ５標識ｄＮＴＰのような、１種類又は複数種の一意的に標識されたｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ；異なる散乱スペクトルを有する金又は銀の粒子、又は蛍光染料の化学的活性な誘導体のような他の合成後標識試薬；逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼなどのような酵素；ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液のような種々の緩衝液；予め調製されたプローブアレイ、スピンカラムなどのような標識されたプローブ精製試薬及び部材；例えば、標識された二次抗体、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ接合体、化学蛍光又は化学発光基質などのようなシグナル生成及び検出試薬などのような、様々な方法で用いられる１種類又は複数種の他の試薬をさらに含んでもよい。
【００８６】
本発明のシステム及びキットは、表現型決定要素をさらに含んでもよく、複数の実施形態において、当該要素は、例えば、適切な実験又は計算手段によって発現プロファイル（例えば、上記遺伝子表現型決定要素により決定された発現プロファイル）の「入力」に基づいて早産を予測するために用いられる、参照又は対照の検体又は発現表現である。代表的な表現型決定要素は、早産を患っている又は患わないことが知られている個体由来の検体、上記のような参照又は対照発現プロファイルなどのような発現表現のデータベースを含む。
【００８７】
用語「システム」とは、試薬のコレクションを意味するが、例えば同じ又は異なる供給源から試薬のコレクションを購入することによって集められたものを意味する。用語「キット」とは、一緒に提供（例えば販売）される、試薬のコレクションを意味する。上記の成分に加えて、本発明のキットは、本方法を実施するための説明書をさらに含む。これらの説明書は、様々な形態で本発明のキット内に存在することができ、そのうちの１つ又は複数がキットにおいて存在することができる。これらの形態の一つは、キットの包装内に、添付文書において情報が印刷された１枚又は複数枚の紙などのような、適切な媒体又は基材に印刷された情報とする。別の形態は、磁気ディスク、ＣＤなどのような、情報が記録されたコンピュータ可読媒体である。存在し得る別の形態は、インターネットを介してリモートサイトの情報にアクセスするために使用されるウェブサイトアドレスである。キットには、任意の便利な形式で存在し得る。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、本開示の特定の実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施においてうまく機能する技術を表し、したがってその実施のために具体的なモデルを構成することが考えられると理解できる。しかし、当業者であれば、本開示に従って、本開示の趣旨及び範囲から逸脱しない限り、開示された具体的な実施形態において、同様の又は類似の結果が得られるように、多くの変更が可能であることを認識すべきである。
【００８９】
〔実施例１〕
早産リスクの血清学マーカーの同定
血清学バイオマーカーは、早産をより早くてより特異的に診断することを可能にするための診断ツールを作成するように、同定された。
【００９０】
研究デザイン。
全ての検体割り当て、早産バイオマーカー発見、検証、及び予測パネル構築工程を図１に示す。発明者らの研究は、（１）マイクロアレイデータセットのメタ解析（３つのデータセット、ｎ=２０の早産検体及びｎ=３８の対照胎盤検体）、タンパク質アトラスのデータベースからの胎盤特異的タンパク質の抽出及びＭＧＩデータベースからのマウスモデルにおける胎盤機能障害に関するヒトのオルソログ遺伝子の取得を含む、発見段階と；（２）独立した早産（ｎ=１０９）及び対照（ｎ=８９）コホートの解析を含む、検証段階、という二段階で行われた。さらなる検証の候補は、メタ解析における倍率変化＞１．２及びｐ値＜０．０５、又はＥＬＩＳＡ検定キットによって選択された。
【００９１】
臨床コホート設計と検体採取。
すべての血清検体は、中国の３つの教育病院から患者の同意と施設ＩＲＢの承認を得た上で調達された。前置胎盤、子宮頚管縫縮術及び外傷による患者の早産症状（定期的子宮収縮、低腹部痙攣、腰痛、骨盤圧症、膣出血、及び膣分泌物の増加）が疑われた患者を除外した。症例（早産）及び対照（正常妊娠）のコホートは、在胎齢、種族、及び出産回数に一致した（表１〜１１の詳細）。
【００９２】
ＰＥと対照の胎盤を比較する発現のマルチプレックスメタ解析。
以下の表１２に示すように、３つのＰＥ胎盤発現研究（ＰＭＩＤ：２２４９６７９０、２３２９０５０４、１８８１８２９６/１７１７００９５）を組み合わせ、これまでに開発した方法（Morganら Comparison of multiplex meta-analysis techniques for understanding the acute rejection of solid organ transplants.BMC bioinformatics 2010;11 Suppl 9:S6;Chenら Differentially expressed RNA from public microarray data identifies serum protein biomarkers for cross-organ transplant rejection and other conditions.PLoS computational biology 2010;6）により、マルチプレックスメタ解析を行った。被験の２２，３９４遺伝子のそれぞれについて、すべての研究にわたってメタ倍率変化を計算した。５つ又はそれ以上の研究で測定され、メタ効果ｐ値が０．０５未満であり、メタ倍率変化が１．２より高い場合に、有意な遺伝子として選択された。
【００９３】
タンパク質アトラス解析。
Uhlen Mら（Proteomics.Tissue-based map of the human proteome. Science.2015 Jan 23;347 (6220):1260419.）に従って、組織富化、群富化、組織増強、全部に表現ある（ＦＰＫＭ＞１００）、混合という５つの組織カテゴリーから胎盤遺伝子を抽出した。（ＦＰＫＭ＞１００）。
【００９４】
ＭＧＩデータベースからのマウスモデルが有する胎盤機能障害に対するヒトのオルソログ遺伝子。
妊娠障害における胎盤遺伝子の機能的意義を理解するために、ＭＧＩデータベースから、マウスオルソログ遺伝子が破壊される際に異常胎盤表現型に関連する、ヒトのオルソログ遺伝子を得た。異常胚外境界形態ＭＰ：０００３８３６、異常胚外組織生理学ＭＰ：０００４２６４及び異常胚外組織形態ＭＰ：０００２０８６という３つのＭＧＩ表現型が含まれた。
【００９５】
早産児のマーカー候補を確認するＥＬＩＳＡ検定。
すべての検定はＥＬＩＳＡ検定であり、メーカーの指示に従って市販のキットを用いて行った。全ての検定は、表１３における分析物についてのまとめのように（ＶＥＧＦＲ−１、Ａｄａｍ１２、インヒビンベータＡ、胎盤成長因子、フィブロネクチン、父親性発現を示すインプリンティング遺伝子１０（paternally expressed 10）、選択された分析物の血清レベルを測定するように実施された。
【００９６】
統計解析。
「疫学計算器」（R epicalcパッケージ）を用いて、患者の人口統計学的データ及び臨床データを解析した。連続変数のｐ値を計算するように、スチューデントｔ検定とマンホイットニーＵ検定を行い、フィッシャー確率検定とカイ二乗検定により、カテゴリー変数の比較解析を行った。早産の臨床リスク因子群は、文献レビューによって決定され、単変量解析及び多変量解析によって、それらの早産診断に対する影響を調査した。R rmetaパッケージによりフォレストプロットをし、胎盤発現メタ解析を表し、血清タンパク質ＥＬＩＳＡ結果を図式的にまとめるために用いられた。症例（早産）と対照検体はペアにならず、そのため、最初の血清タンパク質フォレストプロット解析を慎重に解釈する必要があった。ブートストラップ法により、症例群と対照群から「ペア」検体を作成し、その後のＥＬＩＳＡ結果のフォレストプロット解析のために用いられた。したがって、血清タンパク質フォレストプロット解析は、各分析物がＰＥと正常な妊娠対照対象を区別する能力の全体的な効果評価を提供した。スチューデントｔ検定（両側）とマンホイットニーＵ検定（両側）、及び局所ＦＤＲ（Efronら Empirical bayes analysis of microarray experiment.J Am Stat Assoc 2001;96:1151-60）により仮説検定を行い、多重仮説検定問題を修正した。遺伝的アルゴリズム（R genalgパッケージ）により、バイオマーカー特徴の選択及びパネル最適化を行った。各バイオマーカーパネル解析の予測性能は、ＲＯＣ曲線解析（Zweigら Receiver- operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine.Clinical chemistry 1993;39:561-77;Singら ROCR: visualizing classifier performance in R.Bioinformatics 2005;21:3940-1）により評価された。バイオマーカーパネルスコアは、母体循環中のそれぞれアップレギュレートとダウンレギュレートされたタンパク質バイオマーカーの幾何平均の間の比の自然対数として定義された。ランダムフォレストアルゴリズムにより、すべての有意義なバイオマーカーの複合パネルを開発し組み合わせ、ＲＯＣ ＡＵＣ性能によって評価した。
【００９７】
結論：メタ解析法は、いくつかの研究において、早産と正常妊娠との間で一貫して差次的に発現される、最適な候補バイオマーカーをロバスト同定することを可能にした。これらのタンパク質に対するさらなる研究は、早産の病態生理に対するよりよく理解し、患者検体中のこれらのタンパク質のレベルを検出するためのスクリーニング方法、試薬、及びキットは、早産のケア診察ツールとして役立った。
【００９８】
【表１】
2019518225.tif 000002
【００９９】
【表２】
2019518225.tif 000003
【０１００】
【表３】
2019518225.tif 000004
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
【表５】
2019518225.tif 000006
【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
【表８】
2019518225.tif 000009
【０１０６】
【表９】
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【０１０７】
【表１０】
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【０１０８】
【表１１】
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【０１０９】
【表１２】
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【０１１０】
【表１３】
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【０１１１】
【表１４−１】
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【０１１２】
【表１４−２】
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【０１１３】
【表１４−３】
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【０１１４】
【表１５】
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【０１１５】
【表１６】
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【０１１６】
【表１７】
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【０１１７】
【表１８】
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【０１１８】
【表１９】
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【０１１９】
【表２０】
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【０１２０】
【表２１】
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【０１２１】
【表２２】
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【０１２２】
【表２３】
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【０１２３】
【表２４】
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【０１２４】
結果
マルチ−オミックスベースの発見が早産マーカー候補を明らかにした。図１と２、及び表１２に示すように、多重メタ解析、及びタンパク質アトラス解析とヒトオルソロガス遺伝子解析に用いられるように、従来の胎盤発現研究と組み合わせて、正常対照と比較する早産を診断するバイオマーカー候補を発見した。この努力は、早産の差次的胎盤バイオマーカーとして、アクチビンＡ、胎盤成長因子、フィブロネクチン１、父親性発現を示すインプリンティング遺伝子１０、Ａｄａｍ１２、ｓＦｌｔ−１を同定した。
【０１２５】
検体の特性。
血清学タンパク質バイオマーカーの検証に用いられる早産症例と対照対象は、第一期（症例、ｎ=４；対照、妊娠期が２８週目未満、ｎ=１６）、２８〜３２週目（症例、ｎ=５６；対照、ｎ=３８）、及び３２〜３７週目（症例、ｎ=４２；対照、ｎ=３５）に分けた。表１〜１１にまとめられているように、患者の人口統計を示した。
【０１２６】
早産リスク要因の解析。
文献レビューにより、妊娠中のＢＭＩ、全血球数、教育レベル、及び好中球百分率を含むリスク因子群を選択した。第一期、第三期及び全段階での単変量及び多変量解析によって、血液検体採取時の妊娠期間を調整する場合と調整しない場合、これらのリスク因子の影響を調査した（表１〜１１）。単変量解析の結果として、教育レベル、全血球数、好中球差異的異常（ｐ＜０．０５）が早産の潜在的なリスク因子であることを示した。
【０１２７】
早産児及び対照母体血清検体を用いたバイオマーカーの検証。
早産血清学タンパク質パネルが、利用可能なＥＬＩＳＡ検定に基づいて即時実用的臨床ツールの開発を可能にするかどうかを判定するために、早産（ｎ=１０２）及び妊娠期間の一致した対照検体（ｎ=８９）を使用して、利用可能な血清検定により、発現メタ解析、プロテオミクス解析及びマウス遺伝学表現型解析からのバイオマーカー候補を検証した。図４〜６の箱ひげ図及び散布図を用いて詳細に説明するように、ＥＬＩＳＡ検定（マンホイットニーＵ検定）によって３つのタンパク質を検証した。図４〜６は、さらに、血液検体採取、分娩、及びその間の期間の妊娠期間（週）にわたる各検証済みのタンパク質の母体血清存在量の分布を実証した。早産と対照検体において、各検証済みのバイオマーカーの母体血清存在量の中央値、平均値及び標準偏差を表１４及び図４〜６にまとめた。
【０１２８】
検証済みの早産バイオマーカーの単変量及び多変量解析。
表１５〜２４には、妊娠第一期及び第三期母体の血清解析における早産と対照のハザード比、オッズ比、及び予測的性能をまとめた。
【０１２９】
早産バイオマーカーパネル構築。
ＥＬＩＳＡ検定からのデータを用いて、３つのタンパク質分析物パネル（アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１）のランダムフォレストアルゴリズムを構築した。小さいパネルサイズに対する需要、分類の正確さ、クラス分離の良さ（症例対対照）、及び十分な感度及び特異性のバランスをとって、最適な特徴数のバイオマーカーパネルを同定しようとした。
【０１３０】
疾患発症による早産疾患活性の分類器としてのバイオマーカーパネルの有効性を実証するために、妊娠期間の時間の関数としてバイオマーカーパネルスコアをプロットした（具体的に図７に示す）。
【０１３１】
早産児のバイオマーカーの経路解析。
発明者らは、PathVisioソフトウェア（バージョン３．２．１、オープンソース経路解析及び描画ソフトウェア）を用いて、早産において複合体として有意に差次的に発現した検証済のバイオマーカーを解析した（Martijnら Presenting and exploring biological pathways with PathVisio.BMC Bioinformatics 2008;9 (1): 399）。血管新生及び接着斑経路に関与する血管新生バイオマーカーＦＬＴ１に加えて、ここの経路解析は、早産の病態生理学において重要な役割を果たす以下の統計的に有意な古典的経路の判定に導いた：アクチビンＡは、２つのβＡサブユニットからなるホモ二量体タンパク質である。アクチビンＡは、トランスフォーミング成長因子−βファミリーのメンバーであり、インヒビンＡに関連する。これは、下垂体前葉における卵胞刺激ホルモンの放出の刺激、ニューロンの健康に対する作用、及び体軸の発展に対する影響を含む多面的作用を有し；脳幹、脳下垂体、生殖腺、骨髄、と胎盤などのような様々な組織で産生され；アクチビンが妊娠における作用をサポートする証拠がインビトロと臨床研究の両方から取得した。これらの全ては、早産が胎盤破片の脱落増加と関連し、炎症応答、ホルモン不均衡及び内皮機能障害に寄与することがあるバイオマーカータンパク質の血漿レベルの上昇に導く仮説をサポートした。
【０１３２】
発明者らは、「オミックス（omics）」法を適用することにより検証済みの早産バイオマーカーを開発し、胎盤ｍＲＮＡ発現メタ解析、プロテオミクス、及びマウス遺伝学表現型解析からの発見を統合した。早産と対照血清を市販のＥＬＩＳＡ検定と比較すると、発明者らは、アクチビンＡ、ｓＦｌｔ−１及びＡｄａｍ１２を含む３つのタンパク質マーカーの早産予測における作用を検証した。血清中のタンパク質バイオマーカーを同定するように、胎盤組織におけるトランスクリプトーム法とプロテオーム法と組み合わせ、マウス遺伝学表現型を統合する概念は、斬新的である。それは、病態生理学の焦点により近い組織研究の利点と、臨床的使用により適切な血清研究の利点とを組み合わせる。発見段階で発見／予測されたタンパク質を、ＥＬＩＳＡベースの検証段階に用いることにより、当該研究の見解を臨床実践に転換可能となる。
【０１３３】
他に定義されない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１３４】
本明細書に例示的に記載された開示は、本明細書に具体的に開示されていないいずれの１つ又は複数の要素や制限又は制限の非存在下で、適切に実施することができる。従って、例えば、「備える」、「含む」、「含有する」等の用語は、広義的かつ非限定的にみなされる。さらに、ここで使用される用語及び表現は、限定的ではなく、記載される用語として使用されており、そのような用語及び表現が表示及び記載された特徴のいずれの等価物又はその一部を除外する意図がないように用いられるが、請求の範囲内で様々な変更が可能であることを認識している。
【０１３５】
従って、本開示は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって具体的に開示されるが、ここで開示された開示の修正、改良、及び変形は、当業者によって採用されることができ、これらの改善及び変形は、本開示の範囲内にあるとみなされる。ここで提供される材料、方法及び実施例は、好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲を限定する意図がない。
【０１３６】
本開示は、ここで広く一般的に記載されている。包括的な開示に含まれるより狭い種及び亜属のグループの各々も、開示の一部を構成する。これは、除かれた材料が本明細書に具体的に記載されるか否かにかかわらず、当該属からのいずれかの主題の付加条件又は否定的制限を除く本開示の包括的な説明を含む。
【０１３７】
また、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループに準じて記載されている場合、当業者は、本開示がマーカッシュグループの任意の単独メンバー又はサブサブグループとして記載されることを認識する。
【０１３８】
本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それぞれ単独に参照として組み込まれる程度で、それぞれが明示的に参照として組み込まれ、その全体が参照により明示的に組み込まれる。衝突する場合、本明細書（定義を含む）が支配する。
【０１３９】
なお、本開示は、上記実施形態と合わせて記載されているが、前記説明及び実施例は説明的を意図するものであり、本開示の範囲を限定するものではないことが理解される。本開示の範囲内の他の態様、利点及び変更は、本開示が属する分野の当業者には明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月19日(2018.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
早産のリスクがある妊娠女性を同定するための医薬品の製造のためのキットまたはパッケージの使用であって、
前記キットまたはパッケージは、
（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）を含むタンパク質に対する抗体と
（ｂ）前記抗体によりタンパク質の発現を検出するための試薬と
（ｃ）対照抗体及び／又は対照検体と、を含む、キット又はパッケージの使用。
【請求項２】
さらに、前記キットまたはパッケージは、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は２つを含むタンパク質に対する抗体を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記キットまたはパッケージは、前記対照抗体と別に、６種類以下のタンパク質に対する抗体を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質が、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のみからなる、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記タンパク質が、ＦＮ１、ＰＥＧ１０又はＰＡＰＰＡ２のいずれかを含まない、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
早産のリスクがある妊娠女性を同定するための医薬品の製造のためのキットまたはパッケージの使用であって、
前記キットまたはパッケージは、
（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにより核酸転写産物を検出するための試薬と、
（ｃ）対照核酸及び／又は対照検体と、を含む、キット又はパッケージの使用。
【請求項７】
さらに、前記キットまたはパッケージは、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は２つの遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記キットまたはパッケージは、前記対照核酸と別に、６種類以下の核酸に対するオリゴヌクレオチドを含む、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記遺伝子が、アクチビンＡ、Ａｄａｍ１２及びｓＦｌｔ１のみからなる、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記遺伝子が、ＦＮ１、ＰＥＧ１０又はＰＡＰＰＡ２のいずれかを含まない、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）を含むタンパク質に対する抗体と、
（ｂ）前記抗体によりタンパク質の発現を検出するための試薬と、
（ｃ）対照抗体及び／又は対照検体と、を含む、キット又はパッケージ。
【請求項１２】
さらに、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は２つを含むタンパク質に対する抗体を含む、請求項１１に記載のキット又はパッケージ。
【請求項１３】
（ａ）アクチビンＡ（インヒビンベータＡ又はＩＮＨＢＡ）遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記オリゴヌクレオチドにより核酸転写産物を検出するための試薬と、
（ｃ）対照核酸及び／又は対照検体と、を含む、キット又はパッケージ。
【請求項１４】
さらに、Ａｄａｍ１２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１２）及びｓＦｌｔ１（ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１）のうちいずれか１つ又は２つの遺伝子の核酸転写産物に対するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のキット又はパッケージ。
【国際調査報告】
2019518225.tif 000038
2019518225.tif 000039
2019518225.tif 000040
2019518225.tif 000041