(57)【要約】  操作されたＴ細胞を用いて癌を治療する改善された方法が記載される。【選択図】  図２５Ｉ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、前記患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に有効量のＴ細胞を含む組成物を導入することを含む方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞が自己又は同種異系Ｔ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が、組換え核酸分子による増殖、分画、又はトランスフェクションの１つ以上によってｅｘ  ｖｉｖｏで操作されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞が、腫瘍細胞抗原に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドがキメラ抗原レセプターである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が脳室内に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が脊髄の中心管に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記投与が、左脳室(ventrical)又は右脳室(ventrical)への投与である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が少なくとも１×１０６個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞を含む組成物が少なくとも２回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与が、投与されたＴ細胞の総数が異なる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与が用量を段階的に増大する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与が用量を段階的に縮小する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、キメラ抗原レセプターを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｔ細胞が自己腫瘍浸潤リンパ球を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞がＴＣＲ操作されたＴ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記悪性腫瘍が、びまん性の浸潤性腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記悪性腫瘍が原発性脳腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の腫瘍病巣のサイズが少なくとも２５％減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記悪性腫瘍が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、及び黒色腫から選択される原発癌から生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
当該方法が腫瘍切除後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
Ｔ細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記悪性腫瘍が続発性脳腫瘍である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
グリア芽細胞腫細胞の表面上に発現されるタンパク質に結合するキメラ抗原レセプターを発現する治療用Ｔ細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、以前に腫瘍病変の切除を受けている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍抗原が、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、及びＣＤ１９からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖を受けた、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞が少なくとも１０％のＴｃｍ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞がＩＬ１３Ｒα２を標的とし、且つ、
ヒトＩＬ−１３又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体を含むキメラ抗原レセプターをコードする核酸分子；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
少なくとも１つの共刺激ドメイン；及び
１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒトＩＬ−１３の前記変異体が、ＩＬ１３Ｒα２対ＩＬ１３Ｒα１の結合特異性を増加させる１〜１０個のアミノ酸改変を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトＩＬ−１３又はその変異体が、１〜５個のアミノ酸改変を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３変異体であり、但し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の１１位はＥ以外である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメインを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメインを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記キメラ抗原レセプターが、
ヒトＩＬ−１３又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記キメラ抗原レセプターが、前記ＩＬ−１３又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記スペーサー領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，１４〜２０，５０及び５２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記キメラ抗原レセプターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記キメラ抗原レセプターがＨＥＲ２に結合し、且つ、
前記セントラルメモリーＴ細胞が、
ＨＥＲ２標的化ドメインを含むキメラ抗原レセプターをコードする核酸分子；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ｓの膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン；及び
１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ｓシグナル伝達ドメイン；
を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＥＲ２標的化ドメインがＨＥＲ２  ｓｃＦｖである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＥＲ２  ｓｃＦｖはアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記キメラ抗原レセプターが、
ＨＥＲ２標的化配列；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ｓの膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン；及び
１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ｓシグナル伝達ドメイン；
を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体を含むポリペプチドを発現する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、有効量のＴ細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の解剖学的コンパートメントに注入することを含み、前記解剖学的コンパートメントは脳脊髄液（ＣＳＦ）を収容する、方法。
【請求項４６】
前記解剖学的コンパートメントが脳室系の一部を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記解剖学的コンパートメントが脊髄の中心管の一部を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記中枢神経系の悪性腫瘍が脳腫瘍を包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記中枢神経系の悪性腫瘍が転移した腫瘍を包含する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約５０ｍＬの連続体積を収容する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約１００ｍＬの連続体積を収容する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約１５０ｍＬの連続体積を収容する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記悪性腫瘍が、
原発性ＣＮＳ悪性腫瘍及び他の場所にある癌に起因する続発性悪性腫瘍、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形性／ラブドイド腫瘍、中枢神経系、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（ＣＬＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胎児腫瘍、中枢神経系、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、骨の繊維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃(ｇａｓｔｒｉｃ，  ｓｔｏｍａｃｈ)癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）−軟部組織肉腫を参照、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛状細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌（原発）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子を伴う不顕性原発性ミッドライン管癌腫を有する転移性扁平上皮頸部癌(Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｉｄｌｉｎｅ  Ｔｒａｃｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ＮＵＴ  Ｇｅｎｅ)、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成の／骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔(oral)癌、口腔(oral  cavity)癌、中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、中間分化の松果体実質腫瘍、松果体芽腫及び小脳テント上方の(supratentorial)原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞(腎臓)癌、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平細胞癌、扁平上皮頸部癌、胃(stamach,  gastric)癌、小脳テント上方の(supratentorial)原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫(thymoma)及び胸腺癌(thymic  carcinoma)、甲状腺癌、前記腎盂及び尿管の移行上皮癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂癌、尿道(urethral)癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍、
からなる群から選択される癌から生じる、請求項１又は請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記悪性腫瘍が腫瘍を含む、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項５５】
治療が、腫瘍体積の少なくとも５０％の減少をもたらす、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
治  療が、腫瘍体積の少なくとも６０％の減少をもたらす、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
治療が、腫瘍体積の少なくとも７０％の減少をもたらす、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
治療が、腫瘍体積の少なくとも８０％の減少をもたらす、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
治療が、腫瘍体積の少なくとも９０％の減少をもたらす、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
治療が前記悪性腫瘍の排除をもたらす、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者がグレード３以上の毒性を経験しない、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６２】
有効量のＴ細胞を含む前記組成物で処置する前に、前記患者にステロイドのレジメンを投与した、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記ステロイドのレジメンが、前記治療の後により低い用量に低減される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記患者が少なくとも５０％の１年生存率を有する、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６５】
前記患者が少なくとも５０％の２年生存率を有する、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６６】
前記患者が少なくとも５０％の５年生存率を有する、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が、放射線療法、小分子薬物療法、抗体療法、又はそれらの組み合わせを包含する、標準治療（ＳＯＣ）処理を受けている患者と比較して増大した平均余命を有する、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、ＳＯＣ処理を受けている前記患者は、初期診断から約１５ヶ月生存することを期待することができる（全生存期間又はＯＳ）のに対し、前記請求された治療を受けた患者は２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６カ月以上のＯＳを期待できる、方法。
【請求項６９】
前記請求された治療を受ける患者は、４２，４８，５４，６０，６６，７２，７８，８４，９０カ月以上のＯＳを期待できる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物が少なくとも２×１０６個のＴ細胞を含む、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物が、少なくとも１０×１０６個のＴ細胞を含む、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項７２】
当該方法は前記組成物の投与を少なくとも５回繰り返すことを含む、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項７３】
当該方法は前記組成物の投与を少なくとも１０回繰り返すことを含む、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項７４】
当該方法は前記組成物の反復投与を含む、請求項１又は４５に記載の方法。
【請求項７５】
前記患者が、少なくとも９０×１０６個のＴ細胞の総用量を受ける、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
投与が週に１回繰り返される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
投与が２週間に１回繰り返される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記反復投与を１５週間の期間にわたって受ける、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）における少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルを増加させる方法であって、
有効量のＴ細胞を含む組成物を中枢神経系の悪性腫瘍を有する患者の前記ＣＳＦに投与することを含み、
前記ＣＳＦ中の少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のＴ細胞を含む前記組成物の投与後に増加する、方法。
【請求項８０】
投与後の前記ＣＳＦ中の前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルが、前記ベースラインレベルと比較して１０倍増加する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
投与後の前記ＣＳＦ中の少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルが、前記ベースラインレベルと比較して５倍増加する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも５つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも５つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のＴ細胞を含む前記組成物の投与後に増加する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも１０のサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも１０のサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のＴ細胞を含む前記組成物の投与後に増加する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインがＥＧＦ、エオタキシン、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、又はＶＥＧＦを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＣＲ２／ＭＣＰ−１、又はＩＬ−１Ｒαを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８６】
前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインが、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＣＲ２／ＭＣＰ−１、ＩＬ−１Ｒα、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ２−Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、又はＭＩＰ−１ｂを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも１つのサイトカインの前記増加レベルは、前記少なくとも１つのサイトカインのレベルの局所的増加を包含する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８８】
前記組成物が脳室内に投与される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｔ細胞が、自己又は同種異系Ｔ細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｔ細胞が、組換え核酸分子による増殖、分画、又はトランスフェクションの１つ以上によってｅｘ  ｖｉｖｏで操作されている、請求項７９に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｔ細胞が、腫瘍細胞抗原に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ポリペプチドがキメラ抗原レセプターである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記キメラ抗原レセプターがＩＬ−１３Ｒに特異的である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において観察されるベースライン数と比較して、少なくとも約５日間、Ｔ細胞数の増加した数を持続させる方法であって、
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者のＣＳＦへの有効量のＴ細胞を注入するステップを含み、
前記注入ステップの前に観察されたベースライン数と比較して観察されたＴ細胞数の増加数が少なくとも約５日間持続する、方法。
【請求項９５】
有効量のＴ細胞が、約１×１０６個の細胞から約１００×１０６個の細胞の範囲である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
有効量のＴ細胞が、約２×１０６個の細胞から約５０×１０６個の細胞の範囲である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
観察されたＴ細胞数の前記増加数が、少なくとも約６日間持続する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
観察されたＴ細胞数が約７日間、前記ベースライン数に戻らない、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記観察されたＴ細胞が、注入されたＴ細胞を包含する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１００】
前記観察されたＴ細胞が内因性Ｔ細胞を包含する、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＴ細胞の数を増加させる方法であって、
有効量のＴ細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍を有する患者の前記ＣＳＦに投与するステップを含み、
前記ＣＳＦ中で検出可能なＴ細胞の数は、前投与(pre-administration)レベルと比較して増加する、方法。
【請求項１０２】
前記ＣＳＦ中で検出可能なＴ細胞の数が、投与後７日間までの間、前投与(pre-administration)レベルと比較して増加している、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞が、内因性Ｔ細胞及びＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞は、内因性１型Ｔ細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞は、内因性２型Ｔ細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞は、ＣＤ１４＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＨＬＡ−ＤＲ＋成熟骨髄集団を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
ＣＤ１９＋  Ｂ細胞及びＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１５＋顆粒球が、前記組成物の投与後に前記ＣＳＦにおいて検出可能である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
反応性リンパ球、単球、及びマクロファージが、前記組成物の投与後に前記ＣＳＦにおいて検出可能である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記少なくとも１つのサイトカインのレベルの局所的増加が観察される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記組成物が脳室内に注入される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｔ細胞が自己又は同種異系Ｔ細胞である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記Ｔ細胞が、組換え核酸分子による増殖、分画、又はトランスフェクションの１つ以上によってｅｘ  ｖｉｖｏで操作されている、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記Ｔ細胞が、腫瘍細胞抗原に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ポリペプチドがキメラ抗原レセプターである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記キメラ抗原レセプターがＩＬ１３Ｒに特異的である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞での治療のための悪性腫瘍と診断された患者の適合性を決定する方法であって、前記患者からのサンプルに起因するスコアが所定の閾値を上回るＩＬ−１３Ｒα２発現を示すかどうかを決定することを含む方法。
【請求項１１８】
請求項１１７に記載の方法であって、
前記ＩＬ−１３Ｒα２のマーカーで免疫組織化学的に染色し、前記染色強度を分析し、及び、前記染色強度に基づくスコアを計算することにより、悪性腫瘍と診断された患者からの切除腫瘍サンプルの免疫反応性を決定することにより、前記サンプルに起因する前記スコアが計算され、
前記サンプル中の中程度から強い染色強度に対応するスコアは、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞での治療が前記患者に適していることを示す、方法。
【請求項１１９】
前記スコアが、弱い、中程度の、又は強い染色強度を有する細胞の数をカウントすること、各強度に重みを割り当てることを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記サンプル中のＫｉ６７の発現がまた、免疫組織化学染色によって決定される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
悪性腫瘍と診断された患者に、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効量を含む組成物を投与することを含む、悪性腫瘍患者を治療する方法であって、前記患者が所定の閾値を上回るＩＬ−１３Ｒα２を発現する工程を含む方法。
【請求項１２２】
ＩＬ−１３Ｒα２発現の前記所定の閾値が、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を含む治療に好適であるとして以前に同定された、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記患者が多巣性グリア芽細胞腫に罹患している、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記治療が、脳脊髄液中のＣＸＣＬ９又はＣＸＣＬ１０又はその両方のレベルを増加させる、請求項１又は請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
バックグラウンド
操作されたＴ細胞及びｅｘ  ｖｉｖｏで増殖(expanded)又は選択されたＴ細胞を用いる療法を包含する、腫瘍特異的Ｔ細胞に基づく免疫療法が、抗腫瘍治療について研究されている。いくつかの場合において、このような療法に使用されるＴ細胞は、十分長い期間、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性を維持しない。いくつかの場合において、Ｔ細胞の腫瘍特異性は比較的低い。いくつかの場合において、操作されたＴ細胞は腫瘍へのアクセスが不十分である。従って、より効果的な抗腫瘍機能を有する腫瘍特異的癌治療のための当該分野での必要性が存在する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の癌の治療は、特に難題で(challenging)あり得る。例えば、未分化星状細胞腫（ＡＡ−グレードＩＩＩ）及び多形グリア芽腫（ＧＢＭグレードＩＶ）を包含する高グレードの悪性グリオーマ(malignant  glioma)（ＭＧ）の治療は、依然として重要な治療上の難題である。現在利用可能な治療選択肢は治癒能力が限られており、最初の診断後５年を超える患者の５％未満しか生存しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
概要
本明細書に記載されるのは、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（tumor  infiltrating  lymphocytes）（「ＴＩＬ」）、ＴＣＲ操作されたＴ細胞、又はＴ細胞クローン）を含む組成物を患者の脳脊髄液（「ＣＳＦ」）に投与することによって中枢神経系の悪性腫瘍を治療する方法である。Ｔ細胞には、例えば、所望のレセプターを発現する核酸分子の導入により、単離されたもしくは遺伝子改変されたＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖(expansion)により、又は患者もしくはドナーから得られたＴ細胞のサブセットのｅｘ  ｖｉｖｏ選択により、又はこれらの技術の２つ以上の組み合わせにより、操作されたＴ細胞が含まれる。ＣＮＳへの投与は、例えば、脳室系(ventricular  system)又は脊柱の中心空洞への投与によって達成することができる。当該用語が本明細書中で使用される場合、ＣＮＳへの投与は、腫瘍内投与（腫瘍自体への注射又は注入）及び腫瘍の切除によって作製された空腔への投与の両方とは異なる。しかし、本明細書に記載のＣＮＳ投与方法は、腫瘍内(intraturmoral)投与及び／又は切除後の腔内投与と組み合わせることができる。
【０００４】
本明細書に記載のＣＮＳ投与は、Ｔ細胞を含む比較的大容積の組成物、例えば、１回の注入で１ｍｌ〜２ｍｌ以上の注入を可能にする。したがって、数百万のＴ細胞を一回の注入で投与することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、有効量のＴ細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の解剖学的コンパートメントに注入することを含み、前記解剖学的コンパートメントは脳脊髄液（ＣＳＦ）を収容する、方法が開示される。当該方法は、例えば、組成物を脳室系又は脊髄の中心管の一部に注入することを包含する。開示された方法の一実施形態では、中枢神経系の悪性腫瘍は、脳、脊柱などの一部を包含する、中枢神経系のどこかに見られる原発腫瘍又は転移腫瘍を包含する。好ましくは、前記解剖学的コンパートメントは、少なくとも約５０，１００、又は１５０ｍＬの脳脊髄液の連続した容積を収容する。
【０００６】
本明細書に記載の方法で注入された操作されたＴ細胞は、腫瘍抗原、例えば表面タンパク質及び細胞内タンパク質を標的とする。治療される悪性腫瘍は、原発腫瘍又は身体の他の場所から発症する癌に起因する続発性腫瘍であり得る。脳脊髄液への投与は、局所的な注射部位を越えた領域へのＴ細胞のアクセスを可能にするので、本明細書に記載の方法は、注射部位から離れているが、ＣＮＳ内である腫瘍の大きさを攻撃し、縮小させるために使用することができる。ＴＣＲ操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞へのＴＣＲαβ遺伝子の導入（例えば自己Ｔ細胞）、続いてＴ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖によって調製される；及び患者へのＴ細胞の注入。ＴＣＲ操作されたＴ細胞の注入は、腫瘍が適切な抗原及びＨＬＡ制限エレメントを発現する患者に、腫瘍反応性を付与する。ＴＣＲは、例えば、Ｔ細胞１（ＭＡＲＴ−１）、によって認識されるメラノーマ関連抗原、糖タンパク質（ｇｐ）１００、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｐ５３、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ−Ａ３）、及びニューヨーク式食道扁平上皮癌抗原（New  York  esophageal  squamous  cell  carcinoma  antigen）（ＮＹＥＳＯ）を包含する種々の腫瘍抗原のいずれかを標的とすることができる。
【０００７】
本明細書に記載されるのは、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、前記患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に有効量のＴ細胞を含む組成物を導入することを含む方法である。
【０００８】
種々の実施形態において、：
前記Ｔ細胞は自己又は同種異系Ｔ細胞である；
前記Ｔ細胞が、組換え核酸分子による増殖(expansion)、分画(fractionation)、又はトランスフェクションの１つ以上によってｅｘ  ｖｉｖｏで操作されている；
前記Ｔ細胞が、腫瘍細胞抗原に結合するポリペプチドをコードする組換え核酸分子でトランスフェクトされた細胞を含む；
前記ポリペプチドがキメラ抗原レセプターである；
前記組成物が脳室内に(intraventricularly)投与される；
前記組成物が脊髄の中心管に投与される；
前記投与が、左脳室(ventrical)又は右脳室(ventrical)への投与である；
前記組成物が少なくとも１×１０６個の細胞を含む；
Ｔ細胞を含む前記組成物が少なくとも２回投与される；
前記投与が、投与されたＴ細胞の総数が異なる；
前記投与が用量を段階的に増大する(escalate)；
前記投与が用量を段階的に縮小する(de-escalate)；
前記Ｔ細胞がＣＡＲ  Ｔ細胞を含む；
前記Ｔ細胞が自己腫瘍浸潤リンパ球を含む；
前記Ｔ細胞がＴＣＲ操作されたＴ細胞を含む；
前記悪性腫瘍が、びまん性の浸潤性腫瘍である；
前記悪性腫瘍が原発性脳腫瘍である；
１つ以上の腫瘍病巣のサイズが少なくとも２５％減少する；
前記悪性腫瘍が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、及び黒色腫から選択される原発癌から生じる；
当該方法が腫瘍切除後に行われる；
Ｔ細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む；
前記悪性腫瘍が続発性脳腫瘍である；
グリア芽細胞腫細胞の表面上に発現されるタンパク質に結合するキメラ抗原レセプターを発現する治療用Ｔ細胞を含む組成物の腫瘍内投与をさらに含む；
前記患者が、以前に腫瘍病変の切除を受けている；
前記腫瘍抗原が、ＩＬ１３Ｒα２、ＨＥＲ２、ＰＳＣＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、及びＣＤ１９からなる群から選択される；
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方を含む；
前記Ｔ細胞がｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖を受けた；
前記Ｔ細胞が少なくとも１０％のＴＣＭ細胞を含む；
前記注入された細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上がＣＤ４＋である；
前記注入された細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％又はそれ以上が前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現する（例えばＩＬ１３Ｒα２）；及び、
細胞の用量は、前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現する注入された細胞の数に基づく（例えばＩＬ１３Ｒα２）。
【０００９】
いくつかの実施形態では、
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞がＩＬ１３Ｒα２を標的とし、且つ、
ヒトＩＬ−１３又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体を含むキメラ抗原レセプターをコードする核酸分子；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
少なくとも１つの共刺激(costimulatory)ドメイン；及び
１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む。いくつかの実施形態では、
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される；
ヒトＩＬ−１３の前記変異体が、ＩＬ１３Ｒα２対ＩＬ１３Ｒα１の結合特異性を増加させる１〜１０個のアミノ酸改変を有する；
前記ヒトＩＬ−１３又はその変異体が、１〜５個のアミノ酸改変を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３変異体であり、但し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の１１位はＥ以外である；
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメインを含む；
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメインを含む；
前記キメラ抗原レセプターが、
ヒトＩＬ−１３又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む；
前記ＣＡＲが、前記ＩＬ−１３又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を含む；
前記スペーサー領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，１４〜２０，５０及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
前記キメラ抗原レセプターが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＨＥＲ２に結合するキメラ抗原レセプターを発現し、
ＨＥＲ２標的化ドメインを含むキメラ抗原レセプターをコードする核酸分子；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ｓの膜貫通ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン；及び
１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ｓシグナル伝達ドメイン；
を含む。特定の実施形態において、
前記ＨＥＲ２標的化ドメインがＨＥＲ２  ｓｃＦｖである；
前記ＨＥＲ２  ｓｃＦｖはアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）
又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体を含む；
前記キメラ抗原レセプターが、
ＨＥＲ２標的化配列；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ｓの膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体及び４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体から選択される共刺激ドメイン；及び
１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ｓシグナル伝達ドメイン；
前記核酸分子が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６及び２７から選択されるアミノ酸配列又は１〜５個のアミノ酸改変を有するその変異体を含むポリペプチドを発現する。
【００１１】
また本明細書に記載されるのは、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者を治療する方法であって、有効量のＴ細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の解剖学的コンパートメントに注入することを含み、前記解剖学的コンパートメントは脳脊髄液（ＣＳＦ）を収容する、方法である。様々な実施形態において、
前記解剖学的コンパートメントが脳室系の一部を含む；
前記解剖学的コンパートメントが脊髄の中心管の一部を含む；
前記中枢神経系の前記悪性腫瘍が脳腫瘍を包含する；
前記中枢神経系の前記悪性腫瘍が転移した腫瘍を包含する；
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約５０ｍＬの連続体積を収容する；
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約１００ｍＬの連続体積を収容する；
前記解剖学的コンパートメントが、脳脊髄液の少なくとも約１５０ｍＬの連続体積を収容する。
【００１２】
本明細書に記載の方法によって治療することができる癌の中には、
原発性ＣＮＳ悪性腫瘍及び他の場所にある癌に起因する続発性悪性腫瘍、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形性／ラブドイド腫瘍、中枢神経系、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳幹神グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（ＣＬＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胎児腫瘍、中枢神経系、子宮内膜癌、上衣芽細胞腫、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、腫瘍のユーイング肉腫ファミリー、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、骨の繊維性組織球腫、悪性、及び骨肉腫、胆嚢癌、胃(gastric,  stomach)癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）−軟部組織肉腫を参照、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫、有毛状細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌（原発）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、男性乳癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、ＮＵＴ遺伝子を伴う不顕性原発性ミッドライン管癌腫を有する転移性扁平上皮頸部癌(Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｎｅｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｏｃｃｕｌｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｍｉｄｌｉｎｅ  Ｔｒａｃｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ＮＵＴ  Ｇｅｎｅ)、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成の／骨髄増殖性腫瘍、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔(oral)癌、口腔(oral  cavity)癌、中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫、傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、中間分化の松果体実質腫瘍、松果体芽腫及び小脳テント上方の(supratentorial)原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞(腎臓)癌、腎盂及び尿管、移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、セザリー症候群、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平細胞癌、扁平上皮頸部癌、胃(stamach,  gastric)癌、小脳テント上方の(supratentorial)原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫(thymoma)及び胸腺癌(thymic  carcinoma)、甲状腺癌、前記腎盂及び尿管の移行上皮癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂癌、尿道(urethral)癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍、
がある。
【００１３】
いくつかの実施形態では、開示された方法に従って治療される前記悪性腫瘍が腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、治療が、腫瘍体積の少なくとも５０％の減少、腫瘍体積の少なくとも６０％の減少、腫瘍体積の少なくとも７０％の減少、腫瘍体積の少なくとも８０％の減少、腫瘍体積の少なくとも９０％の減少をもたらす。及びいくつかの実施形態では、前記治療が前記悪性腫瘍の排除をもたらす。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記患者がグレード３以上の毒性を経験しない。
【００１５】
いくつかの実施形態では、有効量のＴ細胞を含む前記組成物で処置する前に、前記患者にステロイドのレジメン(regimen)を投与した。及びいくつかの実施形態では、前記ステロイドのレジメンが、前記治療の後により低い用量に低減される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記患者が、放射線療法、小分子薬物療法、抗体療法、又はそれらの組み合わせを包含する、標準治療処理を受けている患者と比較して増大した平均余命を有する。及びいくつかの実施形態では、標準治療（standard  of  care）（「ＳＯＣ」）処理を受けている前記患者は、初期診断から約１５ヶ月生存することを期待することができ（全生存期間又はＯＳ）、前記開示された治療を受けた患者は１５，２０,２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６カ月又はそれ以上のＯＳを期待できる。いくつかの実施形態では、前記請求された治療を受ける患者は、４２，４８，５４，６０，６６，７２，７８，８４，９０カ月以上のＯＳを期待できる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも２×１０６個のＴ細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現する２×１０６個のＴ細胞を含む一方、いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも１×１０６個のＴ細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現する１×１０６個のＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも５×１０６個のＴ細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現する５×１０６個のＴ細胞を含む一方、いくつかの実施形態では、前記組成物は少なくとも１０×１０６個のＴ細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現する１０×１０６個のＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記開示された方法は、前記組成物の反復投与、例えば、前記組成物の少なくとも５回投与を反復すること、前記組成物の少なくとも１０回投与を反復すること、又は前記患者が少なくとも９０×１０６個のＴ細胞又は腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現するＴ細胞の全用量を受けるまでの投与を反復すること、を含んだ。いくつかの実施形態では、前記投与は１週間に１回又は２週間に１回繰り返される。いくつかの実施形態では、前記反復投与は１５週間にわたって継続される。
【００１８】
また本明細書に開示されるのは、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）における少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルを増加させる方法であって、
有効量のＴ細胞を含む組成物を中枢神経系の悪性腫瘍を有する患者の前記ＣＳＦに投与することを含み、
前記ＣＳＦ中の少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のＴ細胞を含む前記組成物の投与後に増加する、方法である。
【００１９】
開示された方法のいくつかの実施形態において、前記投与後の前記ＣＳＦ中の前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインのレベルが、前記ベースラインレベルと比較して１０倍又は５倍増加する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、少なくとも５つのサイトカイン又はケモカインのレベルは、投与前の前記少なくとも５つのサイトカイン又はケモカインのベースラインレベルと比較して、有効量のＴ細胞を含む前記組成物の投与後に増加する。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインがＥＧＦ、エオタキシン、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、又はＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態において、サイトカインもしくはケモカイン発現における増加は局所的増加である（即ち、前記ＣＳＦに特異的）。
【００２１】
また本明細書に開示されるのは、中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）において観察されるベースライン数と比較して、少なくとも約５日間、Ｔ細胞数の増加した数を持続させる方法であって、
中枢神経系の悪性腫瘍と診断された患者のＣＳＦへの有効量のＴ細胞を注入するステップを含み、
前記注入ステップの前に観察されたベースライン数と比較して観察されたＴ細胞数の増加数が少なくとも約５日間持続する、方法である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、有効量のＴ細胞（又は前記腫瘍抗原を標的とする細胞表面レセプターを発現するＴ細胞）が、約１×１０６個の細胞から約１００×１０６個の細胞の範囲である。及びいくつかの実施形態において、有効量のＴ細胞が、約２×１０６個の細胞から約５０×１０６個の細胞の範囲である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、観察されたＴ細胞数の前記増加数が、少なくとも約６日間持続する、又は観察されたＴ細胞数が約７日間、前記ベースライン数に戻らない。
【００２４】
いくつかの実施形態において、前記観察されたＴ細胞が、注入された(infused)Ｔ細胞（例えばＣＡＲ発現Ｔ細胞）を包含する。及びいくつかの実施形態において、前記観察されたＴ細胞が内因性Ｔ細胞を包含する。
【００２５】
また本明細書に開示されるのは、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＴ細胞の数を増加させる方法であって、
有効量のＴ細胞を含む組成物を、中枢神経系の悪性腫瘍を有する患者の前記ＣＳＦに投与するステップを含み、
前記ＣＳＦ中で検出可能なＴ細胞の数は、前投与(pre-administration)レベルと比較して増加する、方法である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記ＣＳＦ中で検出可能なＴ細胞の数が、投与後７日間までの間、前投与(pre-administration)レベルと比較して増加している。いくつかの実施形態において、前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞が、内因性Ｔ細胞及びＣＡＲ発現Ｔ細胞、及び／又は１型Ｔ細胞、及び／又は２型Ｔ細胞を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を含む。及びいくつかの実施形態において、前記ＣＳＦにおいて検出可能な前記Ｔ細胞は、ＣＤ１４＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＨＬＡ−ＤＲ＋成熟骨髄集団を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞及びＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１５＋顆粒球が、前記組成物の投与後に前記ＣＳＦにおいて検出可能である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、反応性リンパ球、単球、及びマクロファージが、前記組成物の投与後に前記ＣＳＦにおいて検出可能である。
【００２９】
また本明細書に開示されるのは、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞での治療のための悪性腫瘍と診断された患者の適合性を決定する方法であって、前記患者からのサンプルに起因するスコアが所定の閾値を上回るＩＬ−１３Ｒα２発現を示すかどうかを決定することを含む方法である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、前記ＩＬ−１３Ｒα２のマーカーで免疫組織化学的に染色し、前記染色強度を分析し、及び、前記染色強度に基づくスコアを計算することにより、悪性腫瘍と診断された患者からの切除腫瘍サンプルの免疫反応性を決定することにより、前記サンプルに起因する前記スコアが計算され、
前記サンプル中の中程度から強い染色強度に対応するスコアは、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞での治療が前記患者に適していることを示す。いくつかの実施形態において、前記スコアが、弱い、中程度の、又は強い染色強度を有する細胞の数をカウントすること、各強度に重みを割り当てることを含む（Ｈスコア、免疫組織化学的結果を定量する方法は、以下の式：
（３×強い染色の細胞のパーセンテージ）＋（２×中程度の染色の細胞のパーセンテージ）＋（１×弱い染色の細胞のパーセンテージ）、
に基づき、０〜３００の範囲になる）。いくつかの場合において、前記患者は、関連する腫瘍関連抗原について、５０を超える，５０〜１００、１００を超える，１００〜２００、２００を超える，１００〜３００、又は２５０を超えるＨスコアを有する。いくつかの実施形態では、サンプル中のＫｉ６７の発現も、免疫組織化学染色によって決定される。
【００３１】
また本明細書に開示されるのは、悪性腫瘍と診断された患者に、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効量を含む組成物を投与することを含む、悪性腫瘍患者を治療する方法であって、前記患者が所定の閾値を上回るＩＬ−１３Ｒα２を発現する工程を含む方法である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３Ｒα２発現の前記所定の閾値が、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を含む治療に好適であるとして以前に同定された。
【００３３】
ＴＩＬは、患者又はドナーから単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、それを必要とする患者に再注入することができる腫瘍浸潤リンパ球である。
【００３４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞外ドメイン、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラＴ細胞レセプターを発現する。前記細胞外ドメインは、標的細胞に結合する部分、及び場合により例えばヒトＦｃドメインの一部を含むスペーサーを包含する。前記膜貫通部分は、適切な膜貫通ドメイン、例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ３膜貫通ドメイン又は４ＩＢＢ膜貫通ドメインを包含する。前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメイン（ＣＤ３ζ）及び１つ以上の共刺激(costimulatory)ドメイン、例えば、４−１ＢＢ共刺激ドメインを包含する。細胞外ドメインの前記標的細胞結合部分（例えば、ｓｃＦｖ又はリガンド）は、前記ＣＡＲが、Ｔ細胞の表面上に発現された場合、標的細胞表面分子を発現する細胞、例えばＨＥＲ２又はＩＬ１３Ｒα２、悪性神経膠腫細胞を包含する腫瘍細胞の表面に発現するレセプター、にＴ細胞活性を向けることを可能にする。
【００３５】
種々の異なるＴ細胞、例えば患者特異的な自己Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように操作することができる。様々なＴ細胞サブセットを使用することができる。さらに、ＣＡＲは、ＮＫ細胞などの他の免疫細胞で発現され得る。患者がＣＡＲ又はＴＣＲを発現する免疫細胞で治療される場合、その細胞は自己又は同種異系Ｔ細胞であり得る。いくつかの場合、使用される細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋  ＣＤ６２Ｌ＋であるＣＤ４＋及びＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）であり、そのような細胞の使用は、他のタイプの患者特異的Ｔ細胞の使用と比較して、養子移植後の当該細胞の長期持続性を改善することができる。前記ＴＣＭ細胞は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を包含することができる。
【００３６】
本明細書に記載の方法において有用なＣＡＲの中には、ＩＬ１３Ｒα２を標的とするものがある。そのようなＣＡＲは、結合特異性を増加させるアミノ酸改変（例えば、Ｅ１３Ｙ突然変異）を有するＩＬ１３を包含し得る。
【００３７】
本明細書に記載の方法で使用されるＴ細胞は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含有することができる。その場合、前記キメラ抗原レセプターは、
ヒトＩＬ−１３又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む。
【００３８】
共刺激ドメインの包含(the  inclusion)、例えば細胞内領域のＣＤ３ζと直列の４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）又はＣＤ２８補助刺激ドメインは、Ｔ細胞が共刺激シグナルを受け取ることを可能にする。したがって、様々な実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、４―ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体が存在する。
【００３９】
本方法のさらなる実施形態では、
前記Ｔ細胞によって発現される前記ＣＡＲは、ＩＬ１３Ｒα２対ＩＬ１３Ｒα１の結合特異性を増加させる１〜１０個のアミノ酸改変を有するヒトＩＬ−１３の変異体を含む；
前記ヒトＩＬ−１３又はその変異体が、１〜５個のアミノ酸改変を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＩＬ−１３変異体であり、但し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の１１位はＥ以外である；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；
前記キメラ抗原レセプターが、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；
ヒトＩＬ−１３又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
前記ＩＬ−１３又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（前記スペーサー領域が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，１４〜２０，５０及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）；
前記スペーサーはＩｇＧヒンジ領域を含む；
前記スペーサー領域は１０〜１５０個のアミノ酸を含む；
前記４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む；
前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む；及び
前記共刺激ドメインとＣ前記Ｄ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する３〜１５個のアミノ酸のリンカー。２つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は４−ＩＢＢ共刺激ドメインであり、他方はＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。
【００４０】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、
Ｔ細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する核酸分子を内部に持つ(harbor)；
前記キメラ抗原レセプターは、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１のアミノ酸を含むＩＬ−１３／ＩｇＧ４／ＣＤ４ｔ／４１−ＢＢ領域と、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む；
前記キメラ抗原レセプターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
また開示されるのは、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団の脳室内投与を含む方法である。キメラ抗原レセプターが、
ヒトＩＬ−１３又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む。様々な実施形態において、ヒトＴ細胞の前記集団は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む；
ヒトＴ細胞の前記集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）を含む（例えば、前記細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり；前記Ｔ細胞又は前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又は３５％がＣＤ４＋であり、前記Ｔ細胞又は前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％又は３５％がＣＤ８＋細胞である）。
【００４２】
また記載されるのは、キメラ抗原受容体をコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団（例えば、ＴＣＭ細胞を含む自己又は同種異系Ｔ細胞；前記細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞である；前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）のＣＮＳ投与を含む患者の癌を治療する方法であって、キメラ抗原受容体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択される選択されたアミノ酸配列を含む、方法である。様々な実施形態において、
ヒトＴ細胞の前記集団はセントラルメモリーＴ細胞を含む；
前記癌はグリア芽腫である；及び
前記患者からＴ細胞を取得すること、セントラルメモリーＴ細胞を単離するため前記Ｔ細胞を処理すること、及び、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むウイルスベクターを、前記セントラルメモリー細胞の少なくとも一部に形質導入すること、を含む方法であって、キメラ抗原受レセプターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列を含む、方法によって調製される場合、前記形質導入されたヒトＴ細胞。
【００４３】
また記載されるのは方法である。前記患者に投与された前記Ｔ細胞が、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
５個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
５個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び
２個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０及び３１〜４８から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
を内部に持つ(harbor)。
【００４４】
本明細書に記載されるのは、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を内部に持つＴ細胞のＣＳＦ投与によって患者を治療する方法である。前記キメラ抗原レセプターは、
ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ（例えば、アミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＧＳＴＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９を含む）又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体；
スペーサ領域；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む。
【００４５】
種々の実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、４−ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される。特定の実施形態では、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体が存在する。
【００４６】
追加の実施形態では、患者に投与されたＴ細胞は、ＣＡＲを発現し、前記ＣＡＲは、
ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ（例えば、ヒト化ｓｃＦｖ）；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜１０（例えば、１又は２）個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；
ＣＤ２８共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、４ＩＢＢ共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＯＸ４０共刺激ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体からなる群から選択される２つの異なる共刺激ドメイン；
ヒトＩＬ−１３又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
共刺激ドメイン；及び
１〜２個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
前記ＩＬ−１３又はその変異体と前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域（例えば、前記スペーサー領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，１４〜２０，５０及び５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）；
前記スペーサーはＩｇＧヒンジ領域を含む；
前記スペーサー領域は１０〜１５０個のアミノ酸を含む；
前記４−１ＢＢシグナル伝達ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む；
前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む；
前記共刺激ドメインと前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン又はその変異体との間に位置する３〜１５個のアミノ酸のリンカー；
を含む。２つの共刺激ドメインが存在する特定の実施形態では、一方は４−ＩＢＢ共刺激ドメインであり、他方はＣＤ２８及びＣＤ２８ｇｇから選択される共刺激ドメインである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、患者に投与されたＴ細胞は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する核酸分子を内部に持つ。
【００４８】
また開示されるのは、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入されたヒトＴ細胞の集団の脳室内投与を含む方法であり、
ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；
ＣＤ４の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、及びＣＤ３ζの膜貫通ドメイン又は１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体、から選択される膜貫通ドメイン；
補助刺激ドメイン；及び
１〜１０個のアミノ酸改変を有するその変異体のＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン；
を含む。様々な実施形態において、ヒトＴ細胞の前記集団は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列を含むキメラ抗原レセプターを発現するベクターを含む；
ヒトＴ細胞の前記集団は、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）を含む（例えば、前記細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％がＴＣＭ細胞であり；前記Ｔ細胞又は前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、及び／又は前記Ｔ細胞又は前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）。
【００４９】
また記載されるのは、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むベクターによって形質導入された自己または同種異系のヒトＴ細胞の集団（例えば、ＴＣＭ細胞を含む自己または同種異系Ｔ細胞；例えば、前記細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％はＴＣＭ細胞である；前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ４＋であり、および／または前記ＴＣＭ細胞の少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％がＣＤ８＋細胞である）の脳室内投与を含む患者の癌を治療する方法であって、キメラ抗原レセプターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されたアミノ酸配列を含む、方法である。様々な実施形態において、
ヒトＴ細胞の前記集団はセントラルメモリーＴ細胞を含む；
前記癌はグリア芽腫である；及び
前記患者からＴ細胞を取得すること、セントラルメモリーＴ細胞を単離するため前記Ｔ細胞を処理すること、及び、キメラ抗原レセプターをコードする発現カセットを含むウイルスベクターを、前記セントラルメモリー細胞の少なくとも一部に形質導入すること、を含む方法であって、キメラ抗原受レセプターがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列を含む、方法によって調製される場合、前記形質導入されたヒトＴ細胞。
【００５０】
また記載されるのは、自己又は同種異系のヒトＴ細胞の集団の脳死内投与を含む患者の癌を治療する方法である。（例えば、ＴＣＭ細胞を含む自己又は同種異系Ｔ細胞は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
５個以下のアミノ酸置換、欠失又は挿入の存在を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
５個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；及び
２個以下のアミノ酸置換の存在を除いて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３〜５６から選択されるアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
を内部に持つ(harboring)。
【００５１】
本明細書中に記載される特定のＣＡＲ、例えばＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ及びＩＬ１３（ＥＱ）ＣＤ２８−ＢＢζＣＡＲは、特定の他のＩＬ１３標的化ＣＡＲと比較してある有益な特徴を有する。例えば、それらはＩＬ１３Ｒαに対する改善された選択性を有し、低いＴｈ２サイトカイン産生、特にＩ低いＬ１３産生を誘発する(elicit)。
【００５２】
ＩＬ１３Ｒα２を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、膠芽腫などの癌、並びにＩＬ１３Ｒα２を発現する他の癌の治療に有用であり得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いて癌を治療するための方法を包含する。
【００５３】
ＨＥＲ２を標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞は、膠芽腫などの癌、並びにＨＥＲ２を発現する他の癌、例えば中枢神経系に広がっている乳癌の治療に有用であり得る。したがって、本開示は、本明細書に記載のＣＡＲを発現するＴ細胞を用いて癌を治療するための方法を包含する。
【００５４】
本明細書に記載のＣＡＲは、前記標的化ドメインと前記膜貫通ドメインとの間に位置するスペーサー領域を包含することができる。様々な異なるスペーサーを使用することができる。それらのいくつかは、ヒトＦｃ領域の少なくとも一部、例えばヒトＦｃ領域のヒンジ部分又はＣＨ３ドメイン又はその変異体を包含する。以下の表１は、本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用され得る様々なスペーサーを提供する。
【００５５】
表１：  スペーサーの例
【表１】
2019504105.tif 000003
【００５６】
いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域の全部又は一部、すなわち免疫グロブリンのＣＨ１及びＣＨ２ドメイン間に該当する配列、例えばＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ又はＣＤ８ヒンジ、を包含する。いくつかのスペーサー領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメイン又はＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を包含する。免疫グロブリン由来の配列は、１つ以上のアミノ酸改変、例えば１，２，３，４又は５個の置換、例えばオフターゲット結合を減少させる置換を包含することができる。
【００５７】
「アミノ酸改変」とは、アミノ酸置換、挿入、及び/又は欠失をいう。「アミノ酸置換」又は「置換」とは、特定の位置でのアミノ酸の置換を指し、「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ペプチド又はタンパク質配列中の特定の一におけるアミノ酸を、別のアミノ酸で置き換えることをいう。得られたタンパク質のアミノ酸を非保存的に（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸にコドンを変化させることによって）、又は保存的に（すなわち、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸にコドンを変更することによって）変化させるために置換を行うことができる。このような保存的変化は、一般に、得られるタンパク質の構造及び機能の変化をより少なくする。以下は、アミノ酸の様々なグループの例である：
１）非極性Ｒ基を有するアミノ酸：  アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン；
２）非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸：  グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；
３）荷電した極性Ｒ基を有するアミノ酸（ｐＨ６．０で負に荷電した）：アスパラギン酸、グルタミン酸；  ４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：  アスパラギン酸、グルタミン酸；
４）塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０で正に帯電）：  リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０で）。
別のグループは、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：  フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン。
【００５８】
種々の膜貫通ドメインが、本明細書に記載の方法で使用される細胞によって発現されるＣＡＲにおいて使用され得る。表２は、適切な膜貫通ドメインの例を包含する。スペーサー領域が存在する場合、前記膜貫通領域は前記スペーサー領域のカルボキシ末端に位置する。
【００５９】
表２：  膜貫通ドメインの例
【表２】
2019504105.tif 000004
【００６０】
本明細書に記載の方法で使用される細胞によって発現されるＣＡＲの多くは、１つ以上（例えば、２つ）の共刺激ドメインを含む。前記共刺激ドメイン（複数可）は、前記膜貫通ドメインと前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとの間に位置する。表３は、前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの配列と共に適切な共刺激ドメインの例を包含する。
【００６１】
表３：  共刺激ドメインの例
【表３】
2019504105.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６２】
図面の説明
【図１】図１は、示されるようなＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＩＬ−１３変異体（ｈｕＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ））、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー（ｈｕγ４Ｆｃ）、ヒトＣＤ４膜貫通(transmembrane)（ｈｕＣＤ４  ｔｍ）及びヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質（ｈｕＣＤ３ζｃｙｔ）タンパク質から構成されるＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカイン(zetakine)ＣＡＲ（左）の模式図である。前記ＩｇＧ４スペーサーの前記ＣＨ２ドメインに位置する２つの点突然変異、赤で示されたＬ２３５ＥおよびＮ２９７Ｑ、及び共刺激４−１ＢＢ細胞質ドメイン（４−１ＢＢｃｙｔ）の添加を除き、前記ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカインと同一である、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲも示されている。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、特定のベクター及びオープンリーディングフレームを示す。  図２Ａは２６７０ヌクレオチドＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物のｃＤＮＡオープンリーディングフレームの図であり、そこでは、前記ＩＬ１３Ｒα２特異的リガンドＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩｇＧ４（ＥＱ）Ｆｃヒンジ、ＣＤ４膜貫通、４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達、３−グリシンリンカー、及び前記ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲのＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び短縮型ＣＤ１９配列が示されている。Ｌ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの表面発現を駆動するヒトＧＭ−ＣＳＦレセプターα及びＣＤ１９シグナル配列も示される。  図２Ｂは、宿主ゲノムに組み込まれるであろう長い末端反復（「Ｒ」で示される）が隣接する(flanked)配列の図である。  図２ＣはＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミドのマップである。
【図３】図３は、ｐＨＩＶ７の構築を示す。
【図４】図４は、ｐＨＩＶ７の要素を示す。
【図５】図５は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭの生産計画を示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、表面導入遺伝子及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。  ＩＬ−１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１は、ＣＤ８＋  ＣＡＲ＋及びＣＤ４＋（すなわちＣＤ８陰性）ＣＡＲ＋細胞を検出するため、抗ＩＬ−１３−ＰＥ及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣで共染色した（Ａ）か、又はＣＤ４＋  ＣＤ１９ｔ＋及びＣＤ８＋（すなわちＣＤ４陰性）ＣＡＲ＋細胞を検出するため、抗ＣＤ１９−ＰＥ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで共染色した（Ｂ）。  蛍光色素結合抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８で染色した（グレーヒストグラム）、又はアイソタイプ対照(controls)で染色した（黒色ヒストグラム）ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１（Ｃ）。全ての場合において、パーセンテージは、上記アイソタイプで染色された生存リンパ球（ＤＡＰＩ陰性）に基づく。
【図７Ａ−Ｄ】図７Ａ〜図７Ｄは、大きな確立された腫瘍に対するＣＡＲ＋  Ｔ細胞送達の経路を比較する（ｉ．ｃ．対ｉ．ｖ．）実験の結果を示す。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２  ＴＳ（１×１０５個）をＮＳＧマウスの右前脳内に移植した。１９日目及び２６日目に、マウスに５×１０６  ＣＡＲ＋  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  ＴＣＭ（１１．８×１０６  合計細胞；ｎ＝４）、又はモック(mock)ＴＣＭ（１１．８×１０６  細胞；ｎ＝４）のいずれかを、尾静脈を介してｉ．ｖ．注射した。あるいは、１９日目、２２日目、２６日目及び２９日目に、マウスに、１×１０６個のＣＡＲ＋  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  ＴＣＭ（２．４×１０６個の合計細胞；ｎ＝４）又はモックＴＣＭ（２．４×１０６の細胞；ｎ＝５）のいずれかをｉ．ｃ．注射した。経時的な平均ｆｆＬｕｃフラックス（光子／秒）は、ｉ．ｃ．送達されたＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ  ＴＣＭが、１９日目の腫瘍の腫瘍退縮を媒介することを示す。これと比較して、ｉ．ｖ．送達されたＴ細胞は、未処理又はモックＴＣＭ対照と比較して、腫瘍負荷の減少を示さなかった（Ａ）。Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線は、i.v.投与ＣＡＲ＋  ＴＣＭで処置したマウスと比較して、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ  ＴＣＭをｉ．ｃ．処置したマウスの場合の生存率の改善を示す（ｐ＝０．０００３ログランク検定）（Ｂ）。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ＋  ＴＣＭでｉ．ｖ．処置したマウス（Ｃ）対ｉ．ｃ．処置したマウス（Ｄ）の代表的なＨ＆Ｅ及びＣＤ３  ＩＨＣ。ＣＤ３＋  Ｔ細胞は、ｉ．ｖ．処置されたマウスの腫瘍または周囲の脳実質においてＣＤ３＋細胞が検出されず、ｉ．ｃ．処置された群においてのみ検出された。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、腫瘍内（ｉ．ｃ．ｔ）または脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．）のいずれかの頭蓋内に注入されたＣＡＲ＋  Ｔ細胞が、反対側の半球上の腫瘍に通行する（traffic）ことができることを示す研究結果を示す図である。ＥＧＦＰ−ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２  ＴＳ（１×１０５）をＮＳＧマウスの左右の前脳部に定位移植した。６日目に、１．０×１０６  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  ＴＣＭ（１．６×１０６合計細胞；６３％ＣＡＲ；ｎ＝４）をマウスに、右の腫瘍部位にｉ．ｃ．注射した。  多巣性神経膠腫実験モデルの模式図（Ａ）。  左右の腫瘍部位の両方に浸潤するＴ細胞を示すＣＤ３  ＩＨＣ（Ｂ）。
【図９】図９は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋のアミノ酸配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）。
【図１０】図１０は、ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ［ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ  Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；  ｐＦ０２６３０］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びＣＤ１９Ｒｏｐ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０１６８３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の配列比較を示す。
【図１１】図１１は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＣＤ８ｈ３−ＣＤ８ｔｍ２−４１ＢＢゼータ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１；ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＣＤ８ｈ３−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２；ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まない配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ４ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３；ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）のアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４；ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）のアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−リンカー−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５；ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）のアミノ酸配列を示す。
【図１６】ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＨＬ−ＣＤ２８ｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６；ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のアミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＩｇＧ４（ＨＬ−ＣＨ３）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ（ＧＭＳＣＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７；  ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）のアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−４１ＢＢ−ゼータ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８；ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）のアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９は、ＩＬ１３（ＥｍＹ）−ＣＤ８ｈ３−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢゼータ（ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７；ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチドを含まないＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）のアミノ酸配列を示す。
【図２０】図２０は、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列を示す。種々のドメインは、配列の下に順番に列挙され、交互の下線及び非下線によって示される。成熟ＣＡＲ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又はトランケートされたＣＤ１９を包含しない。
【図２１】図２１は、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ８ｔｍ−４１ＢＢ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列を示す。種々のドメインは、配列の下に順番に列挙され、交互の下線及び非下線によって示される。成熟ＣＡＲ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）は、ＧＭＣＳＦＲａシグナルペプチド、Ｔ２Ａスキップ配列又はトランケートされたＣＤ１９を包含しない。
【図２２Ａ−Ｄ】図２２Ａ〜Ｄは、ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ構築物及びＣＡＲ  Ｔ細胞増殖(expansion)データを示す。
【図２３Ａ−Ｄ】図２３Ａ〜Ｄは、乳癌細胞株に対するＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けを示す。
【図２４Ａ−Ｆ】図２４Ａ〜Ｆは、ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍活性に関する研究の結果を示す。
【図２５Ａ−Ｉ】図２５Ａ〜図２５Ｉは、局所腫瘍内送達ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関する研究の結果を示す。
【図２６Ａ−Ｄ】図２６Ａ〜Ｄは、ヒト正常位の(orthotopic)ＢＢＭ異種移植モデルにおけるＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の局所送達に関する研究の結果を示す。
【図２７Ａ−Ｄ】図２７Ａ〜Ｄは、ＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の脳室内送達に関する研究の結果を示す。
【図２８】図２８は、神経膠芽腫のネズミモデルにおけるＩＬ１３α２Ｒを標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍内及び脳室内注射の研究のための腫瘍細胞注入及びＣＡＲ  Ｔ細胞注入の位置を概略的に示す。
【図２９Ａ−Ｃ】図２９Ａ〜Ｃは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭの投与後の確立された神経膠腫腫瘍異種移植片の退縮を実証する研究の結果を示す。ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞（１×１０５）をＮＳＧマウスの左右の前脳部に定位的に移植した。６日目に、上記の図４．１に記載されているように、１×１０６個のＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ（１．６×１０６個の合計細胞；６３％のＣＡＲ＋）をマウスにｉ．ｃ．ｔ．又はｉ．ｃ．ｖ．注射した。  Ａ，Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅを用いて相対的な腫瘍負荷を示す各群からの代表的なマウス。  Ｂ，各群のマウス（ｎ＝４〜５）からの左脳半球及び右脳半球（関心領域、ＲＯＩ）の平均Ｘｅｎｏｇｅｎフラックス。各連続バーはそれぞれ５，９，１２，１５及び１９日を表す。＊，対応のない(unpaired)Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、未処置のＰＢＴ０３０−２群のそれぞれのＲＯＩ及び日／バーと比較した場合、ｐ＜０．０５。  Ｃ，Ｔ細胞注入１３日後の全脳の平均Ｘｅｎｏｇｅｎフラックス。＊，ｉｃｖ群と未処理のＰＢＴ０３０−２群とを対応のない(unpaired)Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて比較した場合、ｐ＝０．０４０７。これらのデータは、３つの別々の多巣性ＧＢＭ実験の代表である。
【図３０】図３０は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭのｉｃｔ及びｉｃｖ投与後、ｈｕＣＤ３＋細胞が左右の脳腫瘍／半球において検出されることを実証する研究の結果を示す。ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞（１×１０５）をＮＳＧマウスの左右の前脳部に定位的に移植した。６日目に、マウスは、１×１０６  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  Ｔｃｍ（１．６×１０６合計細胞；６３％ＣＡＲ＋）をｉｃｔ）注射されたか（左画像）、又はｉｃｖ注射されたか（右画像）のいずれかであった。Ｔ細胞投与後１週間（最上部画像）及び２週間（最下部画像）、各群から２〜３匹のマウスを安楽死させ、脳を採取し、パラフィンに包埋し、Ｔ細胞を検出するために抗ヒトＣＤ３抗体を用いてＩＨＣを行った。各群（ｉｃｔ：  ｍ４０６及びｍ４１０；ｉｃｖ：  ｍ４１４及びｍ４１５）のマウスの左及び右の腫瘍部位の代表的なＩＨＣ画像が示されている。はめ込み画像(inlays)は、安楽死及び脳収穫の日におけるマウスのｘｅｎｏｇｅｎフラックス画像を示す。
【図３１】図３１は、神経膠芽細胞腫の処置のためのＣＡＲ  Ｔ細胞の臨床試験のためのＣＡＲ  Ｔ細胞の調製及びの処置の時間経過を概略的に示し（Ａ）、いくつかの投与計画を提供する（Ｂ）。
【図３２】図３２は、ＣＤ１９によってモニターされるＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性の分析を提示し（Ａ）、ＩＬ１３Ｒα２発現によってモニターされるＧＢＭ細胞の存在を示す（Ｂ）。
【図３３】図３３は、腫瘍内投与のために使用されるカテーテルの領域における患者ＵＰＮ０９７の画像化結果を示す。
【図３４】図３４は、１人の患者の治療経過中の様々なサイトカインのレベルを示す一連のグラフである。
【図３５Ａ−Ｃ】図３５Ａ〜Ｃは、ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の脳室内送達後の、脊髄転移を包含する再発性多巣性膠芽細胞腫の退行(egression)を示す画像である。脊髄に１つの転移部位を含む再発性多巣性ＧＢＭ及び広範な軟髄膜疾患を呈する患者を、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの６回の局所注入を用いて、最も大きな再発腫瘍病巣(focus)の切除腔に処置した（２Ｍの１サイクル及び１０Ｍ  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の５サイクル）。ＣＡＲ  Ｔ細胞注射部位は、７週間以上にわたり疾患再発の証拠なしに安定したままであったが、ＣＡＲ  Ｔ細胞注射部位から離れた他の病巣は進行し続けた（データは示さず）。次いで、この患者は、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの５回の毎週(five  weekly)脳室内（ｉｃｖ）注入を受けた（２Ｍの１サイクル及び１０Ｍ  ＣＡＲ  ＋  Ｔ細胞の４サイクル）。（Ａ）横断脳切片の、（Ｂ）矢状面(saggital)脳切片の、及び（Ｃ）ｉ．ｃ．ｖ．療法の前（左）及び一週間後（右）の脊柱の横（最上部）及び前（最低部）のセクションの、ＭＲＩ及び／又はＰＥＴ画像が示されている。ここで、腫瘍病変部位は各画像に赤い矢印で示されている。
【図３６Ａ−Ｂ】図３６Ａ〜Ｂは、ＮＣＴ０２２０８３６２への登録及び特例(compassionate)使用プロトコルを用いた処置レジメンを示す。ＮＣＴ０２２０８３６２への登録は、０日目に設定された（Ａ）。１０７日目には、特例使用プロトコルが開始された（Ｂ）。ＮｏｖｏＴＴＦ−１００Ａ，非侵襲性の使い捨ての頭皮電極によって、低強度、中間周波数、交番電界を提供するポータブル医療機器；  ＦＧＦＲ，線維芽細胞増殖因子レセプター；  ＭＲＩ，磁気共鳴イメージングであり、これらの全ては、特に指示がない限り、脳で行われた；  ＩＣＴ，腔内の(intracavitary)；  ＰＥＴ，指定部位で実施された、陽電子放出断層撮影；  ＩＣＶ，脳室内の(intracerebroventricular)。
【図３７Ａ−Ｃ】図３７Ａ〜Ｃは、原発腫瘍及び再発腫瘍の免疫組織化学を示す。初期診断時に切除された腫瘍（Ａ）、及びＮＣＴ０２２０８３６２の下でのＲｉｃｋｈａｍ配置時に切除された再発腫瘍（Ｔ１）（Ｂ、Ｃ）。ヘマトキシリン対比染色を用いたＩＬ１３Ｒα２特異的又はＫｉ６７特異的ＤＡＢのいずれかを用いた免疫化学的染色が描かれている。左から右に向かう連続する拡大画像の輪郭を赤い四角で示している。
【図３８Ａ−Ｂ】図３８Ａ〜Ｂは、腫瘍病変の同定を示す。（Ａ）ＧＢＭ病変Ｔ１〜Ｔ８の特徴を同定する。（Ｂ）Ｔ１〜Ｔ７の部位を描写する脳ＭＲＩスキャン。
【図３９Ａ−Ｃ】図３９Ａ〜Ｃは、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの腔内送達後の疾患の進行／再発の証拠なしに、切除された腫瘍領域が安定していることを示す図である。  （Ａ）ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ細胞産物のフローサイトメトリー分析。一番上の行、示された構築物による形質導入は、ＩＬ１３ＢＢζＣＡＲ（抗ＩＬ１３で検出された）及びＣＤ１９ｔマーカー（抗ＣＤ１９で検出された）のＴ２Ａリボソームスキップ配列を介した同調(coordinate)表面発現を駆動した。Ｔ細胞マーカーＴＣＲ−α／β、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８並びに疲弊(exhaustion)マーカーＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＫＬＲＧ１及びＰＤ−１の染色プロファイルは、中央の列に描かれている。メモリーマーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７及びＣＤ２８並びにナイーブＴ細胞マーカーＣＤ４５ＲＡの染色プロファイルが、最下段に示されている。  （Ｂ）ＮＣＴ０２２０８３６２の治療スキーム。患者は再発を経験し、腔内（ＩＣＴ）Ｒｉｃｋｈａｍカテーテルの配置により腫瘍切除を受けた後、ＩＣＴ細胞用量の６サイクル（２×１０６の１サイクル及び１０×１０６  ＣＡＲ＋細胞の５サイクル）を投与された。サイクル３とサイクル４の間に１週間休憩がある。赤い矢印、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ送達部位。  （Ｃ）脳のＭＲＩスキャンの黄色の円は、カテーテルが配置された切除された腫瘍の部位（Ｔ１）、並びに前頭葉の切除しただけの腫瘍部位（Ｔ２、Ｔ３）、及び５１日間のＩＣＴ治療期間にわたって新たに生じる腫瘍部位（Ｔ６  、Ｔ７）を、示す。
【図４０Ａ−Ｅ】図４０Ａ〜Ｅは、ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の脳室内送達後の、脊髄転移を包含する再発性多巣性膠芽細胞腫の退行(regression)を示す。  （Ａ）特例使用プロトコルの下での治療スキーマ。患者は、脳室内（ＩＣＶ）Ｒｉｃｋｈａｍカテーテルの配置を受けた後、５サイクルのＩＣＶ細胞投与量（１サイクルの２×１０６及び４サイクルの１０×１０６  ＣＡＲ＋細胞、サイクル７〜１１として示される）が投与された。サイクル９とサイクル１０の間に１週間の休憩がある。赤い矢印、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ送達部位。ＩＣＶ療法の前（左）及び１週間後（右）に、（Ｂ）横断脳切片、（Ｃ）矢状面脳切片、及び（Ｄ）脊柱の横（最上部）および前（最低部）切片のＭＲＩ及び／又はＰＥＴ画像。腫瘍病変部位は各画像に黄色の丸で示されている。（Ｅ）非切除腫瘍Ｔ４−Ｔ８の最大病変面積は、ＩＣＶ療法の経時的なそれぞれの減少を示す。
【図４１】図４１は、ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＣＶ送達後の再発性多巣性ＧＢＭの退行を示す。切除されていない腫瘍Ｔ４〜Ｔ７の最大病変面積が示されている。
【図４２Ａ−Ｃ】図４２Ａ〜Ｃは、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルからの細胞浸潤及びサイトカインの分析を示す。  （Ａ）ＣＤ１９＋  Ｂ細胞の、ＣＡＲ＋（すなわち、ＣＤ１９ｔ＋）及び非操作ＣＤ３＋  Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１５＋顆粒球及びＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１４＋  ＨＬＡ−ＤＲ＋単球の両方の、フローサイトメトリーエビデンスにより、ＩＣＶサイクル９，１０及び１１の後にスパイクされたＣＳＦ細胞浸潤数。  （Ｂ）遺伝子改変（すなわちＣＤ１９ｔ＋）Ｔ細胞の存在についてＣＳＦ中のＣＤ３＋  Ｔ細胞集団の評価。サイクル９，１０及び１１の示された日に回収されたＣＳＦ由来のＣＤ３ゲーテッド(gated)細胞を、ＣＤ１９及びＣＤ８について共染色した（最上部ヒストグラム）。次いで、各時点でのＣＳＦ液１ｍＬ当たりの総ＣＤ３＋  Ｔ細胞数及びＣＤ１９＋  ＣＤ３＋（ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ）細胞数を算出するため、免疫反応性細胞のパーセンテージを用いた。  （Ｃ）ＩＣＶ処理サイクル７〜１１でのサイトカインレベルのｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ。  前処置レベルと比較して１０倍又はそれ以上の変化を示す３０−ｐｌｅｘ分析からのこれらサイトカインのみが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
詳細な説明
以下に、種々のＣＡＲ  Ｔ細胞の構造、構築及び特徴付け、及び中枢神経系の癌の治療におけるそれらの使用について説明する。キメラ抗原（ＣＡＲ）は、最低でも、細胞外認識ドメイン、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する組換え生体分子である。したがって、用語「抗原」は、抗体に結合する分子に限定されずに、標的に特異的に結合することができるいずれの分子に限定される(but  to)。例えば、ＣＡＲは、細胞表面レセプターに特異的に結合するリガンドを包含することができる。細胞外認識ドメイン（細胞外ドメイン又は単にそれが含有する認識要素とも呼ばれる）は、標的細胞の細胞表面上に存在する分子に特異的に結合する認識要素を含む。膜貫通領域は膜中にＣＡＲを固定する。細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３複合体のζ鎖由来のシグナル伝達ドメインを含み、必要に応じて１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲは、ＭＨＣ制限とは両方とも無関係に、抗原に結合し、且つ、Ｔ細胞活性化を形質導入することができる。したがって、ＣＡＲは、そのＨＬＡ遺伝子型にかかわらず、抗原陽性腫瘍を有する患者集団を治療することができる「普遍的な(universal)」免疫レセプターである。腫瘍特異的ＣＡＲを発現するＴリンパ球を用いた養子免疫療法は、癌治療のための強力な治療戦略となり得る。
【００６４】
いくつかの場合において、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＡＲオープンリーディングフレームの後、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列及び細胞質シグナル伝達尾部を欠く（アミノ酸３２３で切断された）トランケート型ＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）が続く、ベクターを用いて作製することができる。この装置(arrangement)では、ＣＤ１９ｔの同時発現は、遺伝子改変細胞の正確な測定を可能にし、且つ、遺伝子改変細胞のポジティブな選択を可能にする不活性で非免疫原性の表面マーカーを、並びに、養子移植後の、効率的な細胞追跡及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏでの治療用Ｔ細胞のイメージングを提供する。ＣＤ１９ｔの同時発現は、治療細胞を選択的に除去するため、臨床的に利用可能な抗体及び／又は免疫毒素試薬をｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、形質導入細胞の免疫学的標的化のための、及びそれによって自殺スイッチとして機能するのマーカーを提供する。
【００６５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた開示された治療方法は、様々な用量で、そして様々な時間枠にわたって実施することができる。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ＩＬ−１３Ｒα２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞）の注入、投与又は注射を受けている患者は、１×１０６〜１５×１０６個の細胞を含む単一用量を受け得る。言い換えれば、開示された方法で使用するための単一用量は、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、１０×１０６、１１×１０６、１２×１０６、１３×１０６、１４×１０６、又は１５×１０６個の細胞を含むことができる。全治療期間にわたって、患者は、２０×１０６〜１５０×１０６個のＴ細胞の累積又は総用量の細胞を受け取ることができる。例えば、前記患者は、治療期間にわたって、約２０×１０６、約２５×１０６、約３０×１０６、約３５×１０６、約４０×１０６、約４５×１０６、約５０×１０６、約５５×１０６、約６０×１０６、約６５×１０６、約７０×１０６、約７５×１０６、約８０×１０６、約８５×１０６、約９０×１０６、約９５×１０６、約１００×１０６、約１０５×１０６、約１１０×１０６、約１１５×１０６、約１２０×１０６、約１２５×１０６、約１３０×１０６、約１４０×１０６、約１４５×１０６、又は約１５０×１０６個以上のＴ細胞を受けることができる。いくつかの実施形態では、患者は、少なくとも９０×１０６個のＴ細胞の総用量を受け取ることができる。一実施形態において、患者は、９４×１０６個のＴ細胞の総用量を受けることができる。
【００６６】
さらに、用量は、異なるレジメン及び時間表に従って投与され得る。例えば、開示された方法は、注入、投与、又は注射を、１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、隔月に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回、含むことができる。いくつかの実施形態では、開示された方法は、例えば着用可能なポンプからの連続注入を含むことができる。同様に、治療の全時間経過は、約５週間、約１０週間、約１５週間、約２０週間、約２５週間、約３０週間、約３５週間、約４０週間、約４５週間、約５０週間、約５５週間、約６０週間、約６５週間、約７０週間、約７５週間、又はそれ以上であり得る。前記患者は、開示された方法による処置の過程にわたるＴ細胞の注入、投与、又は注射投与を、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９、又は２０回以上受けてもよい。例えば、一実施形態では、患者は１５週間にわたって１１回のＴ細胞注入を受けることができる。
【００６７】
開示された方法に従って、癌、より具体的には神経膠芽腫のような神経膠腫を治療することは、多数の治療効果をもたらし得る。例えば、開示されたＣＡＲ  Ｔ細胞による治療は、開示された方法に従って治療される患者のＣＳＦ中のサイトカイン及びケモカインのレベルを増加させることができる。サイトカイン及び／又はケモカインの発現は、サイトカイン及び／又はケモカインの発現が、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％だけ増加し得るか、又はサイトカイン及び／又はケモカイン発現は、ＣＡＲを含む組成物での処置前に測定したベースラインレベルと比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、又は少なくとも１０倍だけ増加し得る。この発現の増加は、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４、又は１５以上のサイトカイン又はケモカインで観察され得る。
【００６８】
特に、ＥＧＦ、エオタキシン、ＦＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１Ｒα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つの発現は、本明細書に開示するＣＡＲ  Ｔ細胞での処置の結果として増加し得る。さらに、サイトカイン及び／又はケモカイン発現の増加は局所的であり得る（すなわち、ＣＮＳ及びＣＦＳにおいて増加が観察されるに過ぎず、サイトカイン及びケモカインの血清レベルは不変のままである）。
【００６９】
開示された方法による治療はまた、ＣＳＦにおいて検出可能なＴ細胞の増加をもたらし得る。治療後にＣＳＦ中で検出可能なＴ細胞の少なくともいくつかはＣＡＲ発現Ｔ細胞である可能性が高いが、ＣＳＦに動員される(recruited)内因性Ｔ細胞の増加もありうる。理論に縛られることは望まないが、内因性Ｔ細胞の増加は、局所サイトカインレベルの増加に起因する１型及び２型Ｔヘルパー細胞の動員の結果であり得る。さらに、検出可能なＴ細胞は、ＣＤ３＋  Ｔ細胞、並びにＣＤ１４＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＨＬＡ−ＤＲ＋成熟骨髄集団、ＣＤ１９＋  Ｂ細胞及びＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１５＋顆粒球、及び／又は反応性リンパ球、単球及びマクロファージを含むことができる。
【００７０】
ＣＳＦ中のＴ細胞の数の増加は、開示された方法による処置後の特定の期間、検出可能であり得る。ＣＳＦ中のＴ細胞の検出可能な増加は、Ｔ細胞を含む組成物の投与後、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９、又は３０日以上の間、持続するか、又は持続し得る。例えば、ＣＳＦ中に観察されるＴ細胞の数の増加は、約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９、又は３０日の間、ベースラインレベル（すなわち、治療前に検出可能なＴ細胞の数）に戻らない可能性がある。ＣＳＦ中で検出可能なＴ細胞の数は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％だけ、又は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む組成物での処理前に測定した、ベースラインレベルと比較して少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、もしくは少なくとも１５倍だけ、増加し得る。
【００７１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製及び処置の時間経過を図３１に示す。製造プロセスと同時に、研究参加者は腫瘍の切除を受け、続いてＲｉｃｋｈａｍカテーテルの配置及びベースラインイメージングを受けた。
【００７２】
患者ＵＰＮ０９７は腫瘍切除を受け、サイクル１において２×１０６個の細胞で、サイクル２において１０×１０６個の細胞で処理された。サイクル１及びサイクル２の両方において、細胞を切除によって残された腔に投与した。第２のサイクル後、急速な腫瘍進行のために患者ＵＰＮ０９７が研究から離脱した。
【００７３】
患者ＵＰＮ１０９を、サイクル１において２×１０６個の細胞で、サイクル２及び３において１０×１０６個の細胞で処理した。休息期間後、患者ＵＰＮ１０９をサイクル４，５及び６において１０×１０６個の細胞で処置した。サイクル１〜６では、細胞を腫瘍内に投与した。サイクル７では、前記患者を２×１０６個の細胞で処置した。サイクル８及び９では、前記患者を１０×１０６個の細胞で処置した。サイクル７〜１０では、投与は脳室内で行った。
【００７４】
本明細書で使用する「脳室内」という用語は、脳室系の内部の空間、具体的に脳室を指す。したがって、用語「脳室内(intraventricular)」及び「脳室内(intracerebroventiricular)」は、本開示を通じて交換可能に使用され得る。したがって、「脳室内投与」又は「脳室内注射」は、脳の脳室（ventricals）（すなわち、脳室（cerebral  ventricles））への組成物の送達を指す。脳室は、前脳及び脳幹の中核に位置する一連の相互接続された流体充填空間である。このシステムは、４つの脳室、すなわち左右の側脳室（そのうちの１つは脳の各半球に見られる）、第３の脳室及び第４の脳室、を含む。
【００７５】
開示される方法は、Ｔ細胞を含む組成物を投与する様々な経路を含む。例えば、いくつかの実施形態では、開示された組成物は、脳室内に送達又は投与され得る。いくつかの実施形態において、開示された組成物は、脊柱管内に送達又は投与され得る（すなわち、髄腔内送達）。いくつかの実施形態において、開示された組成物は、脊髄硬膜外腔内に送達又は投与され得る（すなわち、硬膜外送達）。いくつかの実施形態では、開示された組成物を腫瘍に直接送達又は投与することができる（すなわち、腫瘍内送達）。いくつかの実施形態では、開示される組成物は、腫瘍組織の切除によって形成された空洞に送達又は投与され得る（すなわち、空洞内送達）。さらに、いくつかの実施形態では、開示される方法は、前述の投与経路の組み合わせを含み得る。例えば、患者は、腔内送達を介してＴ細胞を含む組成物の少なくとも１回の投与を受け、続いて脳室内送達を介して組成物の少なくとも１回の投与量を受け得る。
【００７６】
図３２Ａは、ＣＤ１９によってモニターされるＣＡＲ  Ｔ細胞持続性の分析を示す。この分析は、サイクル２の８日後に良好なＴ細胞持続性を示す。図３２Ｂは、ＩＬ１３Ｒα２発現によってモニターされるＧＢＭ細胞の減少した存在を示す。
【００７７】
図３３Ａ及び図３３Ｂは、腫瘍内投与のために使用されるカテーテルの領域における患者ＵＰＮ０９７の画像化結果を示す。図３３Ａでは、ＣＤ３＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞のほとんどが前処理に存在しない(few)ことが分かる。左前頭腫瘍腔壁から採取した治療後１６日目のサンプルである図３３Ｂは、壊死性腫瘍の大きな領域及びＣＤ３＋及びＣＤ８＋細胞の有意な存在を示す。
【００７８】
神経膠腫(gliomas，グリオーマ)は、ＩＬ１３レセプター、及び特に高親和性ＩＬ１３レセプターを発現する。しかしながら、ＩＬ１３レセプターとは異なり、神経膠腫細胞は、ＩＬ４Ｒβ又はγｃ４４の必要条件とは無関係にＩＬ１３に結合することができるユニークなＩＬ１３Ｒα２鎖を過剰発現する。そのホモログＩＬ４と同様に、ＩＬ１３はＣＮＳの外側に多面的な免疫調節活性を有する。ＩＬ１３及びＩＬ４の両方は、Ｂリンパ球によるＩｇＥ産生を刺激し、マクロファージによる炎症促進性のサイトカイン産生を抑制する。放射線標識されたＩＬ１３によるオートラジオグラフィーを用いた詳細な研究は、研究されたほとんどすべての悪性神経膠腫組織に豊富なＩＬ１３結合を示した。この結合は、腫瘍切片内で及び単一細胞分析において非常に均一である。しかしながら、ＩＬ１３Ｒα２ｍＲＮＡに特異的な分子プローブ分析は、正常な脳要素による神経膠腫特異的レセプターの発現を検出せず、且つ、放射性標識ＩＬ１３によるオートラジオグラフィーも、正常なＣＮＳにおける特異的ＩＬ１３結合を検出できなかった。これらの研究は、共有されたＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃレセプターが正常なＣＮＳにおいて検出可能に発現されないことを示唆している。したがって、ＩＬ１３Ｒα２は神経膠腫に対して高度に特異的な細胞表面標的であり、神経膠腫の治療のために設計されたＣＡＲに対して好適な標的である。
【００７９】
開示された治療方法を受けるためには、特定の患者が他の患者よりも適切であり得る。例えば、ＩＬ−１３Ｒα２を高度に発現する悪性腫瘍を有する患者は、開示されたＣＡＲ  Ｔ細胞による治療から特に利益を得ることができる。患者の適合性は、ＩＬ−１３Ｒα２の発現量を決定するために患者から切除された腫瘍サンプルを染色することによって決定することができる。前記サンプルは、弱い、中程度の、又は強い染色強度を示す細胞の数に基づいてスコアリングすることができる。Ｋｉ６７の発現レベルを決定することはまた、疾患の攻撃性を決定するために有益であり得る。患者が開示されたＣＡＲ  Ｔ細胞を受けるのに適していると決定されると、開示された方法に従って前記患者を治療することができる。
【００８０】
しかしながら、広く発現されるＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃレセプター複合体へのＩＬ１３ベースの治療分子の結合は、ＣＮＳ外の正常組織への望ましくない毒性を媒介する可能性を有し、及びしたがって、これらの薬剤(agents)の全身投与を制限する。ネイティブの(native)グルタミン酸に対するチロシンのアミノ酸１３におけるＩＬ１３アルファヘリックスＡにおけるアミノ酸置換は、ＩＬ１３Ｒα１／ＩＬ４β／γｃレセプターに対するＩＬ１３の親和性を選択的に減少させる。しかしながら、この突然変異体（ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）と称される）のＩＬ１３Ｒα２への結合は、野生型ＩＬ１３と比較して増加した。したがって、この最小限に改変されたＩＬ１３類似体は、グリオーマ細胞に対するＩＬ１３の特異性及び親和性を同時に増加させる。従って、本明細書に記載されるＣＡＲは、アミノ酸１３（Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：３１４３ｓのナンバリングによる）において突然変異（ＥからＹ、又はＥから他のアミノ酸、例えばＫもしくはＲもしくはＬもしくはＶ）を含有するＩＬ１３を包含する。しかしながら、天然の配列を有するＩＬ１３も使用することができ、特に、改変Ｔ細胞を腫瘍塊に直接注射するなどの局所的に投与する場合に有用であり得る。
【００８１】
さらに、神経膠腫は、一般に不良な患者予後を有することが知られている。例えば、多形性グリア芽細胞腫（ＧＢＭ）は、ＣＮＳの一般的な悪性癌である。ＧＢＭに対する１年及び２年の相対生存率は、それぞれ２９．６％及び９．０％である。ＧＢＭ診断を受けた患者のわずか３．４％が５年以上生存する。さらに、外科的切除及び／又は他の従来の治療法による処置後の再発が一般的である。現行の従来の治療には、放射線療法、小分子（例えば、テモゾロミド、イリノテカン、メシル酸イマチニブ、エルロチニブ、及びヒドロキシ尿素）、及び抗体（例えば、ベバシズマブ）などの生物製剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
開示された治療方法は、現行の基準と比較して患者における臨床予後を改善する。例えば、開示された方法は、１年、２年及び５年の生存率を高めることができる。いくつかの実施形態では、開示された方法に従って治療される患者の１年生存率は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であり得る。いくつかの実施形態では、開示される方法に従って治療される患者の２年生存率は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であり得る。いくつかの実施形態では、開示される方法に従って治療される患者の５年生存率は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％であり得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、開示された方法はまた、放射線療法、小分子薬物療法、治療抗体のような治療用生物製剤、又はそれらの組み合わせを包含する、従来の治療又はＳＯＣ治療を受けている別の患者と比較して患者の平均余命を増加させる。ＳＯＣ治療を受けている患者が初期診断から約１５ヶ月生存することを期待できるいくつかの実施形態では（全生存(overall  survival)即ちＯＳ）、開示された治療を受けた患者は、２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６カ月又はそれ以上のＯＳを期待することができる。いくつかの実施形態では、特許請求された治療を受けている患者は、４２，４８，５４，６０，６６，７２，７８，８４，９０カ月以上のＯＳを期待することができる。
【００８４】
開示された方法は、様々な臨床成績を通じて患者の予後を改善することができる。例えば、開示された方法は、Ｔ細胞を含む組成物で処置されている患者における腫瘍体積の減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、開示された治療方法は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の腫瘍体積の減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、患者の腫瘍を完全に排除することができ、且つ、患者は悪性腫瘍を治癒することができる。
【００８５】
さらに、開示された方法は安全であり、十分に耐えられる。開示された方法に従って治療されている患者は、重大な副作用を経験しない可能性があり、及びさらに、補助薬剤の投与を中止することができる可能性がある。例えば、いくつかの実施形態において、開示された方法は、ＮＣＩ共通毒性基準（Common  Toxicity  Criteria）（ＣＴＣ）に従うグレード３以上の毒性をもたらさない。ＣＴＣは０〜５の定量可能な尺度を提供する。０は有害事象なしを意味し、１は軽度を意味し、２は中等度を意味し、３は重度及び望ましくないを意味し、４は生命の脅威又は無能力を意味し、５は死亡を意味する。したがって、副作用及び／又は毒性には、軽度又は中程度の頭痛、疲労、筋肉痛及び嗅覚性前兆のような軽度の神経系障害が含まれ得るが、高悪性度の毒性は回避される。
【００８６】
デキサメタゾンのようなステロイドは、脳浮腫のような神経学的副作用を予防するために、神経膠腫の臨床管理において一般に使用されている。開示された治療方法は、そのような補助治療の必要性を減少させることができる。例えば、開示された方法による治療の前に患者がステロイド（例えば、デキサメタゾン）のレジメンを受けている場合、前記患者は、臨床的に有害な効果を経験することなくステロイドレジメンの用量を減らすか、ステロイドレジメンを完全に中止することができる。
【００８７】
乳癌の脳転移は、ＨＥＲ２を発現することができる。悪性神経膠腫の治療に有用な本明細書に記載のＣＡＲの特定のものは、ＨＥＲ２を標的とする。
【００８８】
本明細書中に記載されるＣＡＲは、当技術分野で公知のいずれの手段によって製造することができるが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いて製造される。キメラレセプターのいくつかの領域をコードする核酸は、当該分野で公知の、手頃な(as  is  convenient)標準的な分子クローニング技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマーアシストライゲーション、部位特異的突然変異誘発など）によって完全なコード配列に調製され、組み立てられ得る。得られたコード領域は、好ましくは発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主細胞株、好ましくはＴリンパ球細胞株、最も好ましくは自己Ｔリンパ球細胞株を形質転換するために使用される。
【００８９】
選択されていないＰＢＭＣ又は富化ＣＤ３  Ｔ細胞又は豊富なＣＤ３又はメモリーＴ細胞サブセットを包含する、患者から単離された様々なＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ発現のためのベクターで形質導入され得る。セントラルメモリーＴ細胞は、１つの有用なＴ細胞サブセットである。セントラルメモリーＴ細胞は、所望のレセプターを発現する細胞を免疫学的に選択するために、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を使用して、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋細胞を選択することにより末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。セントラルメモリーＴ細胞が富化された細胞は、例えばＣＡＲの発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクター、並びに短縮型ヒトＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）、ｉｎ  ｖｉｖｏ検出及び潜在的なｅｘ  ｖｉｖｏ選択の両方のための非免疫原性表面マーカーで形質導入された抗ＣＤ３／ＣＤ２８で活性化することができる。活性化／遺伝子改変されたセントラルメモリーＴ細胞は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、次いで凍結保存され得る。
【実施例】
【００９０】
実施例１：  ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの構築及び構造
有用なＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの構造を以下に記載する。コドン最適化ＣＡＲ配列は、ＩＬ１３Ｒα１、Ｆｃレセプター媒介認識モデルを大きく減少させる２つの突然変異（Ｌ２３５Ｅ；  Ｎ２９７Ｑ）を含有するＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー、ＣＤ４膜貫通ドメイン、共刺激４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、への潜在的結合を低減するために、単一部位（Ｅ１３Ｙ）で突然変異した膜テザード(tethered)ＩＬ−１３リガンド、を含有する。Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、このＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ配列を、不活性で非免疫原性の細胞表面検出／選択マーカーであるＣＤ１９ｔから分離する。このＴ２Ａ結合は、単一の転写産物からのＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ及びＣＤ１９ｔの両方の同調発現をもたらす。図１Ａは、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物をコードする２６７０ヌクレオチドのオープンリーディングフレームの概略図である。この図において、前記ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ  ＣＡＲの、ＩＬ１３Ｒα２特異的リガンドＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）、ＩｇＧ４（ＥＱ）Ｆｃ、ＣＤ４膜貫通、４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達、３−グリシンリンカー、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン、並びにＴ２Ａリボソームスキップ及び短縮型ＣＤ１９配列はすべて示されている。ヒトＧＭ−ＣＳＦレセプターα、及びＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ  ＣＡＲ及びＣＤ１９ｔの表面発現を駆動するＣＤ１９シグナル配列も示される。従って、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ構築物は、ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒンジ最適化共刺激キメラ免疫レセプター配列（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺと呼ばれる）、リボソームスキップＴ２Ａ配列及びＣＤ１９ｔ配列を包含する。
【００９１】
ヒトＧＭ−ＣＳＦレセプターαリーダーペプチドと、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）リガンド５Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ｑ改変ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ（二重突然変異がＦｃＲ認識を妨害する）、ＣＤ４膜貫通、４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメイン配列との融合によりＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ配列を生成した。この配列は、コドン最適化後に新規に（de  novo）合成された。Ｔ２Ａ配列は、Ｔ２Ａ含有プラスミドの消化から得た。ＣＤ１９ｔ配列は、ＣＤ１９含有プラスミドの膜貫通成分（すなわち、塩基対１−９７２）までリーダーペプチド配列にまたがるもの(spanning)から得られた。全部で３つの断片、１）ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ、２）Ｔ２Ａ、及び３）ＣＤ１９ｔを、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターの多重クローニング部位にクローニングした。適切な細胞にトランスフェクトされると、ベクターは図１Ｂに模式的に示された配列を宿主細胞ゲノムに組み込む。図１Ｃは、９５１５塩基対ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミドそれ自体の模式図を提供する。
【００９２】
図２に模式的に示すように、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ  ＣＡＲは、ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカインと呼ばれる前述のＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲといくつかの重要な点で異なる（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：２１９９）。ＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）−ゼータカインは、示されるように、ＩＬ１３Ｒα２特異的ヒトＩＬ−１３ムテイン（ｈｕＩＬ−１３（Ｅ１３Ｙ））、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー（ｈｕγ４Ｆｃ）、ヒトＣＤ４膜貫通（ｈｕＣＤ４  ｔｍ）及びヒトＣＤ３ζ鎖細胞質（ｈｕＣＤ３ζ  ｃｙｔ）部分から構成される。対照的に、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ）は、ＩｇＧ４スペーサーのＣＨ２ドメインに位置する２つの点突然変異、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ、及び共刺激４−１ＢＢ細胞質ドメイン（４−１ＢＢ  ｃｙｔ）を有する。
【００９３】
実施例２：  ＩＬ１３Ｒα２特異的ＣＡＲの発現に使用されるｅｐＨＩＶ７の構築及び構造
ｐＨＩＶ７プラスミドは親プラスミドである。当該親プラスミドから、臨床ベクターＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７がＣｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ（ＣＯＨ）のＴ細胞治療研究研究所（ＴＣＴＲＬ）において得られたＣＡＲの発現に用いたｅｐＨＩＶ７ベクターは、ｐＨＩＶ７ベクターから作製した。重要なことに、このベクターは、ＣＡＲの発現を駆動するためヒトＥＦ１プロモーターを使用する。ベクターの５’及び３’配列は、以前はＨＸＢｃ２プロウイルス由来のｐｖ６５３ＲＳＮ由来であった。ポリプリントラクトＤＮＡフラップ配列（ｃＰＰＴ）は、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙからのＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３株由来であった。ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列は以前に記載されている。
【００９４】
ｐＨＩＶ７の構築を図３に概略的に示す。簡単に説明すると、介在するＳＬ３−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）を有するｇａｇ−ｐｏｌプラス５’及び３’長末端反復配列（ＬＴＲ）由来の６５３ｂｐを含有するｐｖ６５３ＲＳＮは、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングされた。：
ステップ１では、５’ＬＴＲからｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）までの配列がｐ５’ＨＩＶ−１  ５１を作成し、次いで前記５’ＬＴＲが、ＴＡＴＡボックスの上流の配列を除去することによって改変され、及び最初にＣＭＶエンハンサーに、次いでＳＶ４０複製起点にライゲーションした（ｐ５’ＨＩＶ−２）。ステップ２では、ｐ３’ＨＩＶ−１を作製するため３’ＬＴＲをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングした後、ＨＩＶ  Ｕ３中のcis調節エレメントを除去し、ｐ３’ＨＩＶ−２を形成するため、３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターにおける４００ｂｐの欠失を行った。ステップ３では、ｐＨＩＶ−３を作成するため、ｐ５’ＨＩＶ−３及びｐ３’ＨＩＶ−２から単離された断片をライゲーションした。ステップ４では、前記ｐ３’ＨＩＶ−３を生成するために、余分な上流のＨＩＶ配列を除去することによりｐ３’ＨＩＶ−２をさらに改変し、ｐ３’ＨＩＶ−４を作成するため、ＷＰＲＥを含有する６００ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントをｐ３’−３に添加した。ステップ５では、ｐＨＩＶ−３ＲＲＥをＰＣＲによりサイズを減少させ、及び、ｐＨＩＶ−６を作製するため、ｐＨＩＶ−３由来の５’断片に（図示せず）、及びｐ３’ＨＩＶ−４にライゲーションした。ステップ６では、ＨＩＶ−１  ｐＮＬ４−３（５５）由来のｃＰＰＴ  ＤＮＡフラップ配列を含有する１９０ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＮＬ４−３から増幅し、ｐＨＩＶ−７を作製するため、ｐＨＩＶ６におけるＲＲＥ配列とＷＰＲＥ配列との間に配置した。この親プラスミドｐＨＩＶ７−ＧＦＰ（ＧＦＰ、グリーン蛍光タンパク質（green  fluorescent  protein））は４−プラスミド系を用いて親ベクターをパッケージングするのに使用された。
【００９５】
ウイルスゲノムをベクターに効率的にパッケージングするためには、パッケージングシグナルｐｓｉΨが必要とされる。ＲＲＥ及びＷＰＲＥは、ＲＮＡ転写物の輸送及び導入遺伝子の発現を増強する。フラップ配列は、ＷＰＲＥと組み合わせて、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクターの形質導入効率を高めることが実証されている。
【００９６】
組換えによる複製コンピテントレンチウイルスの生成の可能性を減少させるため、ウイルスベクターの産生に必要なヘルパー機能を３つの別々のプラスミドに分けた。：
１）ｐＣｇｐはウイルスベクター構築に必要なｇａｇ／ｐｏｌタンパク質をコードする；
２）ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２は、効率的なパッケージングのためにウイルスゲノムの輸送を助けるためにＲＲＥ配列に作用するＲｅｖタンパク質をコードする；
３）ｐＣＭＶ−Ｇは、ウイルスベクターの感染性のために必要とされる水疱性口内炎ウイルス(vesiculo-stomatitis  virus)（ＶＳＶ）の糖タンパク質をコードする。
【００９７】
ｐＨＩＶ７にコードされたベクターゲノムとヘルパープラスミドとの間に最小のＤＮＡ配列相同性が存在する。相同性領域は、
ｐＣｇｐヘルパープラスミドのｇａｇ／ｐｏｌ配列中に位置する約６００ヌクレオチドのパッケージングシグナル領域；
全部で３つのヘルパープラスミド中のＣＭＶプロモーター配列；及び
ヘルパープラスミドｐＣｇｐ中のＲＲＥ配列；
を包含する。複数の組換え事象を必要とするため、これらの領域における相同性に起因して複製能力のある組換えウイルスが生成される可能性は極めて低い。さらに、得られたいずれの組換え体は、レンチウイルス複製に必要な機能的ＬＴＲ及びｔａｔ配列を欠いているであろう。
【００９８】
ＣＭＶプロモーターをＥＦ１α−ＨＴＬＶプロモーター（ＥＦ１ｐ）で置き換え、その新しいプラスミドをｅｐＨＩＶ７と命名した（図４）。ＥＦ１ｐは５６３ｂｐを有する。そして、前記ＥＦ１ｐは、ＣＭＶプロモーターを切除した後、ＮｒｕＩ及びＮｈｅＩを用いてｅｐＨＩＶ７に導入した。
【００９９】
野生型ウイルスの病原性に必要であり、標的細胞の増殖性感染に必要とされるｇａｇ／ｐｏｌ及びｒｅｖを除くレンチウイルスゲノムは、この系から除かれている。さらに、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクター構築物はインタクトな３’ＬＴＲプロモーターを含有しないので、結果として生じる、標的細胞における発現および逆転写ＤＮＡプロウイルスゲノムは、不活性ＬＴＲを有するであろう。この設計の結果、ＨＩＶ−１由来配列はプロウイルスから転写されず、治療配列のみがそれぞれのプロモーターから発現される。ＳＩＮベクターにおけるＬＴＲプロモーター活性の除去は、宿主遺伝子の意図しない活性化の可能性を有意に減少させることが期待される。表４は、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２ＡＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７に存在する種々のレギュレーター要素をまとめたものである。
【０１００】
表４：  ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７の機能要素
【表４】
2019504105.tif 000006
【０１０１】
実施例３：患者Ｔ細胞の形質導入のためのベクターの作製
各プラスミド（ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＣｇｐ；ｐＣＭＶ−Ｇ；及びｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２）について、十分な量のプラスミドＤＮＡを産生するために発酵槽に接種するために使用されるシードバンクが生成される。プラスミドＤＮＡは、レンチウイルスベクターの産生に使用する前に、同一性、無菌性及びエンドトキシンについて試験される。
【０１０２】
簡潔には、無菌性及びウイルス汚染の存在を確認するために試験された２９３Ｔ作業細胞（ＷＣＢ）から細胞を増殖させた。２９３Ｔ  ＷＣＢ由来の２９３Ｔ細胞のバイアルを解凍した。ベクター産生及び細胞列(cell  train)の維持のために１０層細胞工場（cell  factories）（ＣＦ）の適切な数をプレートするため、十分な数の細胞が存在するまで、細胞を成長させ、増殖させた。細胞の単一列を生産に使用することができる。
【０１０３】
レンチウイルスベクターは、１０ＣＦまでのサブバッチで産生された。同じ週に２つのサブバッチを作製することができ、１週間に約２０Ｌのレンチウイルス上清の産生をもたらす。１つのロットの製品を製造するために、すべてのサブバッチから製造された材料を下流の処理段階でプールした。２９３Ｔ細胞を２９３Ｔ培地中でＣＦ中に播種した（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）。ファクトリーを３７℃のインキュベーターに置き、ＣＦの全層に細胞を均一に分布させるため水平にレベリングした(leveled)。２日後、Ｔｒｉｓ：ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＣａＣｌ２、２Ｘ  ＨＢＳ、及び４つのＤＮＡプラスミドの混合物を含むＣａＰＯ４法を用いて、上記の４つのレンチウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、分泌されたレンチウイルスベクターを含有する上清を回収し、精製し、濃縮した。上清をＣＦから除去した後、各ＣＦから生産終了細胞を回収した。細胞を各工場からトリプシン処理し、遠心分離により回収した。細胞を凍結培地に再懸濁し、凍結保存した。これらの細胞は、その後、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）試験に使用された。
【０１０４】
ベクターを精製及び製剤化するために、細胞の破片を除去するために膜濾過によって粗上清を清澄化した。宿主細胞ＤＮＡ及び残留プラスミドＤＮＡは、エンドヌクレアーゼ消化（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））によって分解された。ウイルス上清を０．４５μｍのフィルターを用いて細胞破片から清澄化した。清澄化した上清を予め秤量した容器に採取し、その中にＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を加えた（最終濃度５０Ｕ／ｍＬ）。残留プラスミドＤＮＡ及び宿主ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ消化は、３７℃で６時間行った。エンドヌクレアーゼ処理した上清の最初の接線流限外濾過（ＴＦＦ）濃度を、ウイルスを約２０倍濃縮しながら、粗上清から残留低分子量成分を除去するのに使用した。清澄化したエンドヌクレアーゼ処理したウイルス上清を、流速を最大にしながら、せん断速度を約４，０００秒−１以下に維持するように設計された流速で、５００ｋＤのＮＭＷＣＯを有する中空繊維カートリッジに循環させた。ヌクレアーゼ処理された上清のダイアフィルトレーションは、カートリッジの性能を維持するために濃縮プロセスの間に開始された。ダイアフィルトレーション緩衝液としてＰＢＳ中に４％ラクトースを使用して、８０％透過物置換率を確立した。ウイルス上清を標的体積にもたらした。これは粗上清の２０倍の濃度に相当する。透析液交換率を１００％として４回の追加交換容量についてダイアフィルトレーションを続けた。
【０１０５】
ウイルス産物のさらなる濃縮は、高速遠心分離技術を使用することによって達成された。レンチウイルスの各サブバッチを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−２６プラス６０００ＲＰＭ（６，０８８ＲＣＦ）、６℃、１６〜２０時間の遠心分離を使用してペレット化した。次いで、各サブバッチからのウイルスペレットをＰＢＳ中の４％ラクトースを含む５０ｍＬ容積に再構成した。この緩衝液中の再構成されたペレットは、ウイルス調製のための最終製剤を表す。ベクター濃縮プロセス全体は約２００倍の体積減少をもたらした。全てのサブバッチの完了後、各部分バッチからのサンプルを無菌性について試験しながら、材料を次に−８０℃に置いた。サンプルの無菌性を確認した後、サブバッチを、頻繁に撹拌しながら３７℃で急速に解凍した。次いで、この物質をプールし、クラスＩＩタイプＡ／Ｂ３バイオセーフティーキャビネットでウイルスベクターセット(suite)に手動で分注した。滅菌ＵＳＰクラス６、雄ネジ(externally  threaded)Ｏリングクリオバイアル中の濃縮レンチウイルス１ｍＬの充填構成を使用した。ＣＯＨの応用技術開発センター（ＣＡＴＳ）の品質システム（ＱＳ）は、ＣＢＧのためのポリシーと標準的な運用手順に従い、現在のグッド・マニュファクチャリング・プラクティス（ｃＧＭＰｓ）に従ってすべての資料をリリースした。
【０１０６】
レンチウイルスベクター調製物の純度を保証するために、残留宿主ＤＮＡ混入物、及び残留宿主及びプラスミドＤＮＡの移入について試験した。他の試験の中でも、正しいベクターが存在することを確実にするために、ＲＴ−ＰＣＲによってベクター同一性を評価した。すべての放出基準は、この研究での使用を意図したベクターについて満たされた。
【０１０７】
実施例４：  ＡＣＴでの使用に適したＴ細胞の調製
Ｔリンパ球は、白血球フェレーシス(leukopheresis)によって患者から得られる。適切な同種異系又は自己Ｔ細胞サブセット、例えばセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）は、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変され、次いで、抗癌治療を達成するために、臨床上許容されるいずれ手段により前記患者に戻るように投与される。
【０１０８】
適切なＴＣＭは以下のように調製することができる。合意された研究参加者から得られたアフェレーシス生成物を、フィコール処理し（ｆｉｃｏｌｌｅｄ）、洗浄し、一晩インキュベートする。ＧＭＰグレードの抗ＣＤ１４、抗ＣＤ２５及び抗ＣＤ４５ＲＡ試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置を用いて、単球、調節性Ｔ細胞及びナイーブＴ細胞集団を細胞から除去する。枯渇後、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）分離装置でＤＲＥＧ５６−ビオチン（ＣＯＨ臨床グレード）及び抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ６２Ｌ＋  ＴＣＭ細胞について陰性画分細胞を濃縮する。
【０１０９】
富化後、ＴＣＭ細胞を、完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５プラス５０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１５中に配合し、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）細胞培養バッグに移す。前記ＴＣＭ細胞(they)はＤｙｎａｌ  ＣｌｉｎＥｘ（登録商標）Ｖｉｖｏ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激される。刺激後の５日までに、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターを用いて感染多重度（ＭＯＩ）１．０〜０．３で細胞に形質導入する。細胞増殖のために必要な完全なＸ−Ｖｉｖｏ１５及びＩＬ−２及びＩＬ−１５サイトカインを添加して培養物を４２日までの間維持する（細胞密度を３×１０５〜２×１０６生存細胞／ｍＬに、及びサイトカイン補充を培養の月曜日、水曜日、金曜日毎に維持する）。細胞は、典型的には、２１日以内にこれらの条件下で約１０９細胞に増殖する。培養期間の終わりに、細胞を採取し、２回洗浄し、臨床グレードの凍結保存培地中に配合する（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ  ＣＳ５、ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）。
【０１１０】
Ｔ細胞注入の日（複数可）に、低温保存及び放出された生成物を解凍し、洗浄し、再注入のために配合される。放出された細胞産物を含有する低温保存バイアルを液体窒素貯蔵から取り出し、解凍し、冷却し、ＰＢＳ／２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）洗浄緩衝液で洗浄する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を保存料なし遊離生理食塩水（ＰＦＮＳ）／２％ＨＳＡ輸液希釈液に再懸濁する。品質管理試験のためにサンプルを取り除く。
【０１１１】
健康なドナーから調達された細胞に対する２回の適格性評価試験（qualification  runs）を、上記の製造プラットフォームを使用して行った。各前臨床適格性評価試験製品には、ヒトドナー（ＨＤ）番号ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１が割り当てられた。重要なことに、表５に示すように、これらの適格性評価試験は２８日以内に＞８０倍に増殖し、増殖した細胞はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ導入遺伝子を発現した。
【０１１２】
表５：  前臨床適格性評価試験製品からの発現データの要約
【表５】
2019504105.tif 000007
【０１１３】
実施例５：  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭにおける表面導入遺伝子及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析
実施例４に記載されている２つの前臨床的適格性評価試験製品は、以下に記載するように、前臨床研究において用いられた。図６Ａ〜Ｃは、表面導入遺伝子及びＴ細胞マーカー発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＩＬ−１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を、ＣＤ８＋  ＣＡＲ＋及びＣＤ４＋（すなわちＣＤ８陰性）ＣＡＲ＋細胞を検出するため、抗ＩＬ−１３−ＰＥ及び抗ＣＤ８−ＦＩＴＣで同時染色した（図６Ａ）。又はＣＤ４＋  ＣＤ１９ｔ＋及びＣＤ８＋（すなわち、ＣＤ４陰性）ＣＡＲ＋細胞を検出するため、抗ＣＤ１９−ＰＥ及び抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで同時染色した（図６Ｂ）。ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢγ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ  ＨＤ００６．５及びＨＤ１８７．１を、蛍光色素結合抗ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２８（グレーのヒストグラム）又はアイソタイプ対照(controls)（黒いヒストグラム）で染色した。（図６Ｃ）。図６Ａ〜Ｃのそれぞれにおいて、示されたパーセンテージは、アイソタイプ上に染色された生存リンパ球（ＤＡＰＩ陰性）に基づく。
【０１１４】
実施例６：  大きなＴＳ開始ＰＢＴ腫瘍の治療のためのＣＡＲ  Ｔ細胞送達経路の比較
以下は、侵襲性原発性ＰＢＴ系に対する抗腫瘍活性について、送達経路、静脈内（ｉ．ｖ．）又は頭蓋内（ｉ．ｃ．）、を比較する調査である。パイロット研究（データは示されていない）において、意外にも、ｉ．ｖ．投与されたＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  ＴＣＭは、小さい（５日目の）ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ腫瘍の治療のためにＰＢＳと比較して治療上の有益性をもたらさなかったことが観察された。これは、ｉ．ｃ．投与ＣＡＲ＋  Ｔ細胞で観察された頑健な治療効果とは対照的である。ＰＢＴ０３０−２腫瘍は５日目に末梢から治療用Ｔ細胞を動員するには小さすぎる可能性があると推測し、大きな１９日目のＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ腫瘍に対するｉ．ｖ．送達とｉ．ｃ．送達との比較を行った。これらの研究のために、ＰＢＴ０３０−２移植マウスを、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ＋  ＴＣＭの又は模擬ＴＣＭ（ＣＡＲなし）の、２回のｉ．ｖ．注入（５×１０６  ＣＡＲ＋  ＴＣＭ；１９日目及び２６日目）又は４回のｉ．ｃ．注入（１×１０６  ＣＡＲ＋  ＴＣＭ；１９日目、２２日目、２６日目及び２９日目）のいずれかで処理した。ここでも、ｉ．ｖ．投与されたＣＡＲ＋  Ｔ細胞についてのＸｅｎｏｇｅｎイメージング又はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析によって、治療上の利益はモニタリングされない（図７Ａおよび７Ｂ）。対照的に、強力な抗腫瘍活性が、ｉ．ｃ．投与されたＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ＋  ＴＣＭについて観察された（図７Ａ〜Ｂ）。次に、Ｔ細胞注射の７日後のマウスコホートからの脳を採取し、ＩＨＣによってＣＤ３＋ヒトＴ細胞について評価した。驚くべきことに、モックＴＣＭ又はＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ  ＴＣＭのいずれかでｉ．ｖ．処置したマウスでは、腫瘍において、又はヒトＴ細胞が典型的に存在する、他のマウス脳領域において（すなわち軟髄膜）、検出可能なＣＤ３＋ヒトＴ細胞はなかった（図７Ｃ）。腫瘍指向性の欠損を示唆している。これは、ｉ．ｃ．治療マウスで検出された有意な数のＴ細胞とは対照的である（図７Ｄ）。
【０１１５】
腫瘍由来サイトカイン、特にＭＣＰ−１／ＣＣＬ２は、Ｔ細胞を腫瘍に動員する際に重要である。従って、ＰＢＴ０３０−２腫瘍細胞を評価したところ、この系統は、ｉ．ｃ．移植腫瘍にｉ．ｖ．投与されたエフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘引することが以前に示された神経膠腫株であるＵ２５１Ｔ細胞に匹敵する高レベルのＭＣＰ−１／ＣＣＬ２を産生することが分かった（データは示していない）。悪性グリオーマは高度に浸潤性の腫瘍であり、しばしば提示において多巣性である。上記の研究は、ＩＬ１３ＢＢＺ  ＴＣＭが浸潤した腫瘍、例えばＰＢＴ０３０−２などを排除し、長期耐久性抗腫瘍活性を媒介することができることを確立している。多巣性疾患への通行(traffic)への頭蓋内送達ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力もまた調べた。この研究のために、ＰＢＴ０３０−２  ＥＧＦＰ：ｆｆＬｕｃ  ＴＳを、左半球及び右半球の両方に移植し（図８Ａ）、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞を右の腫瘍部位にのみ注射した。励ますように、私たちは、評価した全てのマウス（ｎ＝３）について、注射部位（すなわち右腫瘍）、さらに左半球の腫瘍内の両方においてＴ細胞注入後７日目のＣＤ３  ＩＨＣによってＴ細胞を検出した（図８Ｂ）。これらの知見は、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞が遠隔部位で腫瘍病巣に辿り着き、且つ、浸潤することができるという証拠を提供する。Ｕ２５１Ｔ神経膠腫細胞株を用いた第２の腫瘍モデルにおいても同様の発見が観察された（データは示されていない）。
【０１１６】
実施例７：  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔのアミノ酸配列
ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔの完全アミノ酸配列を図９に示す。全配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、
２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、
１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（太字のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
２２アミノ酸のＣＤ４膜貫通配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；
４２アミノ酸の４−１ＢＢ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
２４アミノ酸のＴ２Ａ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；及び
３２３アミノ酸のＣＤ１９ｔ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
を包含する。
【０１１７】
成熟キメラ抗原レセプター配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）は、
１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（太字で示すアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
２２アミノ酸のＣＤ４配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；
４２アミノ酸の４−１ＢＢ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；及び
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
を包含する。このＣＡＲ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）内には、ＩＬ−１３／ＩｇＧ４／ＣＤ４ｔ／４１−ＢＢ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）が存在し、これは、
１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（太字のアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
２２アミノ酸のＣＤ４配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；及び
４２アミノ酸の４−１ＢＢ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
を包含する。ＩＬ１３／ＩｇＧ４／ＣＤ４ｔ／４−１ＢＢ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙリンカーなどのリンカーによって１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に連結することができる。ＣＡＲ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の前に２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を配置することができる。
【０１１８】
図１０は、ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ［ＩＬ１３（ＥＱ）４１ＢＢζ  Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７；ｐＦ０２６３０］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びＣＤ１９Ｒｏｐ＿ｅｐＨＩＶ７（ｐＪ０１６８３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）の配列の比較を示す。
【０１１９】
実施例８：  ＩＬ１３Ｒα２を標的とする追加のＣＡＲのアミノ酸配列
図１１〜１８は、ＩＬ１３Ｒα２に対して向けられた追加のＣＡＲのアミノ酸配列を示す。各場合において、種々のドメインは、特定の細胞内ドメインの間に位置するＧｌｙＧｌｙＧｌｙスペーサーを除いて標識される。それぞれは、ヒトＩＬ１３及びＧｌｕからＴｙｒまでを包含する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；強調されたアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）。これらのＣＡＲを発現するために使用される発現ベクターにおいて、発現されるアミノ酸配列は、
２４アミノ酸のＴ２Ａ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；及び
ＣＡＲ発現細胞の表面上の短縮型ＣＤ１９配列の協調発現を可能にする３２３アミノ酸のＣＤ１９ｔ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
を包含することができる。
【０１２０】
ヒトＩＬ１３（Ｅ１３Ｙ）ドメイン、ＣＤ２８ｔｍドメイン、ＣＤ２８ｇｇ共刺激ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζドメインＣＡＲ骨格を含み、且つ、ＨＬ（２２アミノ酸）スペーサー、ＣＤ８ヒンジ（４８アミノ酸）スペーサー、ＩｇＧ４−ＨＬ−ＣＨ３（１２９アミノ酸）スペーサー又はＩｇＧ４（ＥＱ）（２２９アミノ酸）スペーサーのいずれかを包含するＣＡＲのパネルを、７２時間共培養アッセイで評価したＩＬ１３Ｒａ２特異的死滅を媒介するそれらの能力について試験した。この系においてＣＡＲ発現が低いと思われるＨＬ（２２アミノ酸）を除いて、全てが活性であった。
【０１２１】
実施例９：  ２つのＨＥＲ２−ＣＡＲの構造
本明細書に記載のＨＥＲ２  ｓｃＦｖを含む１つのＣＡＲは、Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ４（Ｌ２３５Ｅ，Ｎ２９７Ｑ）−ＣＤ２８ｔｍ−ＣＤ２８ｇｇ−Ｚｅｔａ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔと呼ばれる。このＣＡＲは、以下のもの：
ＨＥＲ２を標的とするｓｃＦｖ；
Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）による結合を減少させる様式でＣＨ２領域（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）内の２つの部位で突然変異されたＩｇＧ４  Ｆｃ領域；
ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、及びＣＤ３ζ活性化ドメイン；
を包含する様々な重要な特徴を包含する。図２０は、ＣＡＲ発現をモニターするために使用されるトランケートされたＣＤ１９配列の配列及びトランケートされたＣＤ１９配列の融合なしでＣＡＲが産生されることを可能にするＴ２Ａリボソームスキップ配列を包含する、このＣＡＲのアミノ酸配列を示す。図２１に示すように、未成熟ＣＡＲは、ＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ、スペーサーとして作用するＩｇＧ４、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＬＬ−ＧＧ配列改変を包含する４−ＩＢＢ共刺激ドメイン、３つのＧｌｙ配列、ＣＤ３ゼータ刺激ドメイン、を包含する。転写物はまた、ＣＡＲタンパク質配列の一部ではないＴ２Ａリボソーム配列及びトランケートされたＣＤ１９配列をコードする。成熟ＣＡＲは、未成熟ＣＡＲと同一であるが、ＧＭＣＳＦシグナルペプチドを欠いている。
【０１２２】
実施例１０：  ＨＥＲ２を標的とするＣＡＲの発現
図２２Ａは、図２０及び図２１に示される２つのＨＥＲ２特異的ＣＡＲ構築物の概略図である。ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζにおいて、ｓｃＦｖは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び細胞溶解性ＣＤ３ζドメインを含有する改変ＩｇＧ４  Ｆｃリンカー（二重変異体、Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）によって膜に繋がれている。Ｔ２Ａスキップ配列は、細胞トラッキングのために使用される切断されたＣＤ１９（ＣＤ１９ｔ）タンパク質からＣＡＲを分離する。ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζは、共刺激ドメインがＣＤ２８ではなく４−１ＢＢであり、且つ、膜貫通ドメインがＣＤ２８膜貫通ドメインではなくＣＤ８膜貫通ドメインであることを除いて同様である。ヒトセントラルメモリー（ＴＣＭ）細胞を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζのいずれかを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。図２２Ｂは、ヒトＴＣＭ表面表現型の代表的なＦＡＣＳデータを示す。図２２Ｃは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζのいずれかを発現するレンチウイルスベクターでトランスフェクトしたＴＣＭにおけるＣＤ１９及びプロテインＬ発現についてのアッセイの結果を示す。これらの結果からわかるように、ＣＤ１９発現によって評価したトランスフェクション効率は、両方のＣＡＲについて同様であった。しかし、タンパク質Ｌ発現は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζのほうがＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζより低かったが、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲはＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζより安定性が低いことが示唆された。細胞増殖の分析（図２２Ｄ）は、ＣＡＲはどちらもＴ細胞増殖を妨害しないことを示す。
【０１２３】
実施例１１：  ＨＥＲ２標的化ＣＡＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定
ＨＥＲ２陰性系統（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現系統（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１，２３１ＢＲ）及び高ＨＥＲ２発現系統（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）を包含する様々な乳癌細胞株が、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζの特徴付けに使用された。図２３Ａは、これらの系統の各々のＨＥＲ２発現レベルを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍細胞（低ＨＥＲ２発現）又はＢＢＭ１腫瘍細胞（高ＨＥＲ２発現）のいずれかと５時間の同時培養後に、フローサイトメトリー（ゲートオンした(gated  on)ＣＡＲ＋  Ｔ細胞）を、Ｍｏｃｋ（非形質導入）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ１０７ａ脱顆粒及びＩＦＮγ産生を特徴付けるために用いた。この分析の結果を図２３Ｂに示す。他の乳癌細胞株についても同様の研究を行い、その結果を図２３Ｃに要約する。組換えＨＥＲ２タンパク質又は腫瘍標的による２４時間培養後のＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生の産生をＥＬＩＳＡによって測定し、この分析の結果を図２３Ｄに示す。
【０１２４】
実施例１２：  ＨＥＲ２標的化ＣＡＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
Ｍｏｃｋ（非形質導入）、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞を腫瘍標的と７２時間共培養した後の腫瘍細胞死滅を評価するのに、フローサイトメトリーを用いた。この分析の結果を図２４Ａに示す。ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＨＥＲ２陽性ＢＢＭ１細胞との７２時間の同時培養後、総ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１及びＬＡＧ−３誘導を測定した。この分析の結果を図２４Ｂに示す。ＨＥＲ２陰性（ＬＣＬリンパ腫、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、Ｕ８７グリオーマ）、低ＨＥＲ２発現（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１，２３１ＢＲ）又は高ＨＥＲ２発現（ＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、ＢＢＭ１）である腫瘍標的との７２時間の共培養後のＣＤ８＋  ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＰＤ−１誘導を測定した。この分析の結果を図２４Ｃに示す。これらの研究は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζが、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζを起こすよりも低いＰＤ−１誘導を生じることを示唆している。エフェクター：腫瘍（Ｅ：Ｔ）比が０．２５：１〜２：１の範囲の腫瘍細胞死滅を、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞について測定した。この分析の結果は、図２４Ｄに示されている。図２４Ｄは、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζの両方がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞死滅に有効であることを示す。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８又はＢＢＭ１細胞との７２時間の同時培養後のＨＥＲ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＦＳＥ増殖を、フローサイトメトリーによって測定した。この分析の結果は、図２４Ｅに示されている。図２４Ｅは、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞がＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζＣＡＲ  Ｔ細胞よりも増殖することを示す。
【０１２５】
実施例１３：  ＨＥＲ２標的化ＣＡＲのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
腫瘍内に送達されたＨＥＲ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性を、患者由来の乳房から脳への転移モデルで評価した。図２５Ａ〜２５Ｃは、腫瘍のＨ＆Ｅ染色である。Ｍｏｃｋ（非形質導入）又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて腫瘍に直接注射してマウスを処置した。図２５Ｄ〜２５Ｆは、腫瘍の光学イメージングの結果を示し、図２５Ｇ〜２５Ｉは、腫瘍注射後３日目、８日目又は１４日目のいずれかで局所的に処置したマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。これらの研究は、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞が、腫瘍に直接注射された場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍効果を有することを示している。
【０１２６】
乳房−脳転移のヒト異種移植モデルにおける抗腫瘍効果を評価するために、ＢＢＭ１細胞（０．２Ｍ）又はＢＴ４７４（０．１５Ｍ）をＮＳＧマウスに頭蓋内注射した。腫瘍注射後８日目に、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ又はＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζ、又はＭｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞（１Ｍ）を腫瘍内に注射した。ＢＢＭ１（図２６Ａ）及びＢＴ４７４（図２６Ｂ）腫瘍を、ルシフェラーゼベースの光学イメージングによってモニターした。Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ曲線を図２６Ｃ及び図２６Ｄに示す。
【０１２７】
ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ及びＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞を評価するために、胸部−脳転移のヒト患者由来正常位の異種移植モデルも使用した。図２７Ａは、ＢＢＭ１細胞（０．２Ｍ）の定位的注入による腫瘍移植の領域、及び脳室内Ｔ細胞送達を示す。腫瘍の染色を図２７Ｂに示す。腫瘍注射後１４日目に、ＨＥＲ２（ＥＱ）２８ζ、ＨＥＲ２（ＥＱ）ＢＢζ、又はＭｏｃｋ（非形質導入）Ｔ細胞（０．５Ｍ）を腫瘍内に注射した。腫瘍増殖は、ルシフェラーゼベースの光学イメージングによってモニターした。図２７Ｃは、各治療群についてのフラックス平均を示し、図２７Ｄは、各治療群についてのＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。
【０１２８】
実施例１４：  ＩＬ１３Ｒａ２を標的とするＣＡＲを発現するＴＣＭの頭蓋内及び腫瘍内投与の比較
２つの異なる頭蓋内（ｉｃ）送達経路、即ち腫瘍内（ｉｃｔ）及び脳室内（ｉｃｖ）を、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターで形質導入され、且つ、グリア芽腫（ＧＢＭ）の臨床的処置のために提案されたようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖された、ＴＣＭに富んだ細胞株から生成されたＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性、輸送(trafficking)及び有効性のための神経膠芽腫のネズミモデルで評価した。ｉｃｔ又はｉｃｖのいずれかで投与されたこれらの細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および機能的効力を、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）レポーター遺伝子を発現するように操作された、ＩＬ１３Ｒα２＋原発性低継代(low-passage)ＧＢＭの腫瘍様塊(tumor  sphere)系統ＰＢＴ０３０−２を用いて、免疫不全ＮＳＧマウスにおいて調べた。
【０１２９】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）／ＡｕｔｏＭＡＣＳ選択によってＰＢＭＣから富化されたＴＣＭ細胞株を、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスでレンチ形質導入し、増殖させ、次いで上記と同様の方法を用いて凍結保存した。次に、ｉｃｔ又は脳内ｉｃｖのいずれかで投与された新鮮解凍ＣＡＲ  Ｔ細胞を、潜在的な毒性、多巣性ＧＢＭ腫瘍へのそれらの輸送能、及びｉｃ移植ＩＬ１３Ｒα２＋  ＧＢＭ系ＰＢＴ０３０−２細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を制御する能力について評価した。一般的な毒性を評価するために、体重及び機敏性(alertness)を包含する全般的な健康状態についてマウスを毎日観察した。Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングによって測定した腫瘍負荷を調べた。腫瘍のＴ細胞動員／浸潤を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）も、マウスのサブセットに対し実施した。
【０１３０】
雄ＮＳＧマウス（１０〜１２週齢）に、０日目に左右の対側半球の両方に１×１０５  ｆｆＬｕｃ＋  ＰＢＴ０３０−２細胞を、定位的にｉｃ注射し、６日間生着させた。次いで、マウス１匹につき等しい腫瘍サイズ分布について、Ｘｅｎｏｇｅｎイメージングによって決定した腫瘍サイズに基づいてグループ分けした。次いで、マウス群を未処置（ｎ＝４）のままにするか、又は、１×１０６ＣＡＲ＋  ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭでｉｃｔ（右半球、ｎ＝８）もしくはｉｃｖ（ｎ＝８）のいずれかで処置した（図２８）。ＰＢＴ０３０−２腫瘍増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎイメージング及びｆｆＬｕｃフラックス(flux)（光子／秒）の定量化によって経時的にモニターした。異なる時点で、各群のマウスを安楽死させ、それらの脳を採取し、パラフィンに包埋し、ヒトＣＤ３発現細胞（すなわち、ヒトＴ細胞）の存在を評価するために免疫組織化学（ＩＨＣ）を行った。具体的には、Ｔ細胞投与の１週間後、各ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群から３匹のマウスを安楽死させたので（実験の１３日目）、これらのマウスは図２９のＸｅｎｏｇｅｎイメージング分析に含まれなかった。次いで、Ｔ細胞投与の２週間後に、マウス群の各々において２匹のマウスを安楽死させた（実験の２１日目）。
【０１３１】
これは生存研究ではなかったので、及びしたがって、脳のＴ細胞輸送を評価するため、マウスは特定の時点ですべて安楽死させた（後述）。苦痛又は一般毒性の明白な徴候について前記マウスを毎日モニターした。ｉｃｔ又はｉｃｖレジメンのいずれかで処置したマウスは、体重減少を示さず、実験を通して聡明で(bright)、注意深く、反応性であった。したがって、Ｔ細胞投与の経路にかかわらず、治療に関連した副作用の兆候はなかった。したがって、Ｔ細胞投与の経路にかかわらず、いずれの治療に関連した副作用の兆候はなかった。
【０１３２】
図２９Ａ〜Ｃに示すように、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭのｉｃｔ送達は、予想通り、ＰＢＴ０３０−２腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示した。しかし、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭのｉｃｖ送達は、ｉｃ移植ＰＢＴ０３０−２腫瘍に対して、特に対側（左）半球における腫瘍病変に対して、ｉｃｔ投与で観察されるものよりも、大きな治療効果を提供するようであった。
【０１３３】
投与経路が腫瘍部位に移動するＴ細胞の能力に影響を及ぼすかどうかを決定するために、Ｔ細胞投与の１週間後及び２週間後に各群からのマウスの脳に対してＣＤ３＋  Ｔ細胞のＩＨＣ分析を行った。図３０に示すように、ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞は、ｉｃｔ又はｉｃｖ投与Ｔ細胞のいずれかを受けたマウスの左右の腫瘍部位の両方に見出された。これらのデータは、Ｔ細胞投与後１週間で各群３匹のマウスを代表し、Ｔ細胞投与２週間後で各群２匹を代表する。
【０１３４】
この研究は、Ｔ細胞の腫瘍内及び脳室内投与の両方がこのＮＳＧマウスモデルにおいて耐容性が高かった(well-tolerated)ことを実証している。さらに、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢＺ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７ベクターで形質導入されたＴＣＭ適格性評価試験細胞のｉｃｔ送達およびｉｃｖ送達の両方で、腫瘍部位におけるＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ多巣性抗腫瘍効果及びＩＨＣ検出を観察することができる。この研究はさらに、ｉｃｖ送達されたＴ細胞が、ｉｃｔ送達されたＴ細胞よりも高い有効性を有し得ることを示唆する。
【０１３５】
実施例１５：  グリア芽細胞腫の治療のためのＩＬ−１３Ｒα２ＣＡＲ  Ｔ細胞を評価する第１相臨床試験
この実施例は、再発性ＩＬ１３Ｒα２＋  ＧＢＭを有する患者における自己ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの毎週の頭蓋内注入の安全性、実現可能性及び生物活性を評価する臨床試験の初期知見を記載する。以下にさらに詳細に説明するように、登録患者は自己ＰＢＭＣを採取するために白血球アフェレーシス(leukapheresis)を受け、且つ、ＩＬ１３ＢＢζ＋  Ｔｃｍの製造と同時に、リザーバ／カテーテル装置を配置して腫瘍生検又は切除を行う。ベースラインのＭＲ及びＰＥＴイメージング及び手術からの回復に続いて、患者は、ＩＬ１３ＢＢζ＋  Ｔｃｍの３週間の頭蓋内注入、続いて毒性及び疾患評価のための１週間の休憩からなる４週間の治療レジメンで治療される。現在までの、３名の切除患者のこの第１の低用量コホートについての結果は、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの外科的切除後の局所的送達は安全であり、且つ、観察された治療に起因するグレード３以上の毒性がなく耐容性が高いことを示唆し、且つ、重要なことに、ＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の抗腫瘍活性の早期証拠を示す。サンプルが入手可能であった全ての患者について、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、処置後少なくとも７日間、フローサイトメトリーによって腫瘍嚢胞液または脳脊髄液（ＣＳＦ）中に検出された。特に興味深い１人の患者は、再発性多巣性ＧＢＭ（脊椎の１つの転移部位及び広範な軟膜疾患を包含する）を呈した。この患者は、最初にプロトコルごとに、後頭側頭−後頭部領域における最も大きな再発性腫瘍病巣(focus)の切除腔内への、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの６回の局所注入をによって、治療された。促進するように(Encouragingly)、このＣＡＲ  Ｔ細胞注射部位は、７週間以上にわたり疾患再発の証拠なしで安定したままであったが、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞注射部位から離れた他の病巣は進行し続けた。次いでこの患者を、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの５週間の(five  weekly)脳室内注入を用いて、他の治療的介入なしに特例使用プロトコルで処置した。最終的な脳室内ＣＡＲ  Ｔ細胞注入の１週間後、全ての頭蓋内腫瘍および脊髄腫瘍は退縮し、大部分が７５体積％を超えて減少し、この患者はＣＡＲ  Ｔ細胞治療の開始後４ヶ月で臨床的に安定したままであった。
【０１３６】
この研究で使用されるＣＡＲ、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζは、上記に記載されている。ＣＤ１９ｔマーカーを包含する未成熟ＣＡＲの配列を図９に示す。未成熟配列全体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、
２２アミノ酸のＧＭＣＳＦシグナルペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、１１２アミノ酸のＩＬ−１３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；太字で示すアミノ酸置換Ｅ１３Ｙ）；
２２９アミノ酸のＩｇＧ４配列（太字で示すアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑを有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；
２２アミノ酸のＣＤ４膜貫通配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）；
４２アミノ酸の４−１ＢＢ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；
３アミノ酸のＧｌｙリンカー；
１１２アミノ酸のＣＤ３ζ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）；
２４アミノ酸のＴ２Ａ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）；及び
３２３アミノ酸のＣＤ１９ｔ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）；
を包含する。
【０１３７】
ＣＤ８＋  ＣＤ４＋  ＴＣＭ細胞を調製するため、各患者由来の自己細胞を使用した。次いでＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζを発現する上記のレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。簡潔に述べると、ＴＣＭは、ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋  ＴＣＭを免疫学的に選択するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）装置を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から富化された。これらの細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｌビーズで活性化し、ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζＣＡＲの発現を指示するＳＩＮレンチウイルスベクターで形質導入した。活性化／遺伝子改変ＩＬ１３（ＥＱ）ＢＢζ／ＣＤ１９ｔ＋  ＴＣＭ細胞をＩＬ−２／ＩＬ−１５でｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させ、次いで凍結保存した。
【０１３８】
療法とも再発性／難治性ＧＢＭに罹患している２人の患者の治療は、以下に記載されている。ＣＡＲ  Ｔ細胞の腔内投与は、Ｒｉｃｋｈａｍカテーテルを介して約５〜１０分かけて手作業で行い、対流増強送達（ＣＥＤ）により０．５ｍｌ／時間で送達された保存料を含まない正常生理食塩水（ＰＦＮＳ）フラッシュを１．０ｍＬまで行った。ＣＡＲ  Ｔ細胞の脳室内投与は、側脳室内に配置されたＲｉｃｋｈａｍカテーテルを通して手動で約５〜１０分かけて実施した。これに続いて、手動のプッシュ技術により５−１０分間にわたって送達された防腐剤を含まない正常生理食塩水（ＰＦＮＳ）フラッシュ０．５ｍＬまでが続いた。ＰＦＮＳフラッシュは、投与ラインをクリアすること、及び残りのＣＡＲ  Ｔ細胞をカテーテルを通してプッシュすることを意味する。
【０１３９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製及び処置の時間経過を図３１に示す。製造プロセスと同時に、研究参加者は彼らの腫瘍の切除を受け、続いてＲｉｃｋｈａｍカテーテル及びベースライン画像の配置を受けた。
【０１４０】
患者ＵＰＮ０９７は腫瘍切除を受け、サイクル１において２×１０６個の細胞で処理され、サイクル２において１０×１０６個の細胞で処理された。サイクル１及びサイクル２の両方において、細胞を切除残存腔に投与した。２回目のサイクル後、急速な腫瘍進行のために患者ＵＰＮ０９７が研究から外された。
【０１４１】
患者ＵＰＮ１０９をサイクル１において２×１０６個の細胞で、サイクル２及び３において１０×１０６個の細胞で処理した。休息期間後、患者ＵＰＮ１０９をサイクル４，５及び６において１０×１０６個の細胞で処置した。サイクル１〜６において、細胞を投与した。サイクル７において、患者を２×１０６個の細胞で処置した。サイクル８及び９において、患者を１０×１０６個の細胞で処置した。サイクル７〜１０において、投与は脳室内で行った。
【０１４２】
図３２Ａは、ＣＤ１９によってモニターされるＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性の分析を示す。この分析は、サイクル２の８日後に良好なＴ細胞持続性を示す。図３２Ｂは、細胞上のＩＬ１３Ｒα２発現によってモニターされるＧＢＭ細胞の存在の減少を示す。
【０１４３】
図３３Ａ及び図３３Ｂは、腫瘍内投与のために使用されるカテーテルの領域における患者ＵＰＮ０９７のイメージング結果を示す。図３３Ａでは、前処置においてＣＤ３＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞がほとんど存在しないことが分かる。左前頭腫瘍腔壁から採取した治療後１６日目のサンプルである図３３Ｂは、壊死性腫瘍の大きな領域及びＣＤ３＋及びＣＤ８＋細胞の有意な存在を示す。
【０１４４】
図３４Ａ〜Ｄに示すように、ＩＬ−１３のレベルは有意に変化しなかった（Ｔｈ２サイトカイン）が、処置の２つのサイクルにわたってＩＦＮ−γの増加があった（Ｔｈ１サイトカイン）（図３４Ａ及び図３４Ｂ）。腫瘍関連サイトカインであるＩＬ−６は、サイクル１の間に減少し、サイクル２の間、より低いレベルにとどまった（図３４Ｃ）。別の腫瘍関連サイトカインであるＩＬ−８は、サイクル１の間に減少したが、サイクル２の間、その前サイクル１レベルに向かって増加した（図３４Ｄ）。
【０１４５】
患者ＵＰＮ１０９は、脊髄に１つの転移部位及び広範な軟膜疾患を包含する再発性多巣性ＧＢＭを提示した。上記のように、この患者は、最も大きな再発腫瘍病巣焦点の切除腔内への、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの６回の局所注入により、治療された。ＣＡＲ  Ｔ細胞注射部位は、７週間以上にわたり疾患再発の証拠なしに安定したままであったが、ＣＡＲ  Ｔ細胞注射部位から離れた他の病巣は進行し続けた（データは示さず）。次いで、この患者は、上記のように、ＩＬ１３ＢＢζ  Ｔｃｍの５週間の
(five  weekly)の脳室内注入を受けた。図３５Ａ〜Ｂは、横断脳切片（図３５Ａ）及び矢状脳切片（図３５Ｂ）のＭＲＩ及び／又はＰＥＴ画像を示す。図３５Ｃは、脳室内治療の前（左）及び１週間後（右）の脊柱の横（最上部）及び前頭（最低部）断面を示す。腫瘍病変部位は各画像において赤い矢印で示されている。
【０１４６】
実施例１６：  脳室内投与の症例報告
５０歳の男性は、最初に大発作を呈した後、右頭葉に低悪性度脳腫瘍と診断された。４カ月間のモニタリング後、この右側頭腫瘍はＭＲＩによる増強を示した。前記患者は腫瘍切除を受け、ＷＨＯグレードＩＶ神経膠腫（ＧＢＭ）の診断を確定した。次いで前記患者は、同時のテモゾロミド（毎日１４０ｍｇ）と合わせて５９．４コバルトＧｙ相当量の総線量まで、標準治療アジュバント陽子線照射を、続いて、Ｎｏｖｏｃｕｒｅ装置（ＮｏｖｏＴＴＦ−１００Ａ）を併用してテモゾロミド４サイクルを３ヶ月間受けた。原発腫瘍切除術後６ヵ月後、ＰＥＴ及びＭＲＩ画像は疾患の進行の証拠を示した。
【０１４７】
次に、ＩＨＣによる原発性右側頭葉腫瘍におけるＩＬ１３Ｒα２発現の確認後に、自己ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞で患者を処置し（図３６）、Ｈスコア１００を得た（図３７）。次いで、白血球アフェレーシス（leukapheresis）により、続いて、前述のように、２ステップデプレッション(depletion)選択法を介したＣＤ４＋  ＣＤ８＋  ＴＣＭの濃縮により、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が回収された。ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの製造中、前記患者は線維芽細胞成長因子阻害剤（ＮＣＴ０１９７５７０１）を評価する別の臨床プロトコルで治療され、頭痛、混乱及び増大する見当識障害の症状を伴う治療によって進行した。さらに、前記患者はＴ細胞注射の前に先細(tapered  off)ステロイドであった。
【０１４８】
原発腫瘍切除後１０ヶ月後、前記患者は、リザーバ／カテーテル装置が配置された右後頭側−後頭部領域（Ｔ１）における最大病変部を包含する５つの同定された進行性ＧＢＭ病変のうちの３つ（図）３８、及び右前頭葉における２つの病変（Ｔ２、Ｔ３）について、別の外科的切除を受けた。左の側頭領域における２つのさらなる腫瘍は外科的に除去されなかった（Ｔ４、Ｔ５）。外科的切除後６日目、患者は、２回の４週間の治療レジメンを受けた。各レジメンは、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの３週間の(three  weekly)腔内（ＩＣＴ）注入、続いて、毒性評価及び疾患評価のための１週間からなる。この患者を低用量の２×１０６  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞から開始し、続いて１０×１０６  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の５回の注入で治療した（図３９）。これらの６回のＩＣＴ注入の後、特例使用プロトコルの下で、前記患者がＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの追加の５回の脳室内（ＩＣＶ）治療サイクルを受けることを可能にし、再び、２×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の低用量で開始し、１０×１０６  ＣＡＲ  Ｔ細胞の４回の注入が続く、第２のカテーテルを右側脳室内に配置した（図４０）。
【０１４９】
限定された治療用生成物に起因して、わずか５回のＩＣＶ注入サイクルが実現可能であった。全体的に、患者は９４×１０６のＣＡＲ＋  Ｔ細胞の総用量について１１回の細胞注入を受けた。治療コースは、３回目のサイクルごとに、及び最後の２回のＩＣＶ注入後に、毒性および疾患評価（すなわち、ＭＲＩおよびＰＥＴイメージング）が行われるための評価週を含む、１５週を包含した。前記患者はこのＣＡＲ  Ｔ細胞治療コース中に他の治療的介入を受けなかった。１１回の注入サイクルを包含する１９０日間の評価期間までの所見がここに報告される。続いて、第２のＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ産物が製造された。１９２日目に開始して、この患者はこの第２の産物のＩＣＶ注入を約３週間おきに続けた。
【０１５０】
実施例１７：  研究デザイン
特例使用プロトコルを包含するこれらの研究は、施設の審査委員会によって承認された。患者は書面によるインフォームドコンセントを提供した。適格性は、現在再発しているＩＬ１３Ｒα２＋グレードＩＶ神経膠腫の組織学的に確認された診断、カルノフスキーのパフォーマンスステータス（ＫＰＳ）＞６０を有する年齢＞１８歳、適切な心肺機能、及び生存期待＞４週間、を包含した。患者は、参加前少なくとも１２週間に初期放射線治療を完了していなければならず、いずれの他の活動性悪性腫瘍、感染症又は間接性疾患を有してはならない。又は、他の治験薬を受けていなければならず、又は、Ｔ細胞療法中に２ｍｇ  ＴＩＤ（３ｘ／ｄａｙ）より多いデキサメタゾンを必要とする。
【０１５１】
この患者は、再発性／難治性ＩＬ１３Ｒα２＋高悪性度(high-grade)グリオーマ（ＷＨＯグレードＩＩＩ及びＩＶ）と診断された患者における自己ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ）の毎週の頭蓋内注入の安全性及び実行可能性を評価するために、我々の進行中の第Ｉ相試験（ＮＣＴ０２２０８３６２）の下、最初に治療された。これは、Ｔ細胞を腫瘍内に直接的に（層１＝腫瘍内）又は腫瘍切除腔内に（層２＝腔内に）のいずれかで投与した２アーム研究である。６つの腔内（ＩＣＴ）注入サイクルを完了した後、この患者を次に、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの脳室内（ＩＣＶ）送達を可能にする別々の特例使用プロトコルの下で治療した。
【０１５２】
実施例１８：  細胞製品の製造及び注入
４−１ＢＢ共刺激性、ＩＬ１３Ｒα２標的化ＣＡＲ、ＩＬ１３ＢＢζをコードするレンチウイルスベクターは本明細書に詳述されている。簡潔には、コドン最適化されたＣＡＲ配列は、ＩＬ１３Ｒα１、Ｆｃレセプター仲介認識を妨げる２つの突然変異（Ｌ２３５Ｅ；Ｎ２９７Ｑ）を含有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃスペーサー、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒト共刺激４−１ＢＢ細胞質シグナル伝達ドメイン、及びヒトＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達への潜在的結合を減少させるため、単一部位（Ｅ１３Ｙ）で突然変異した膜係留ヒトＩＬ−１３リガンドを含有する。次いで、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列は、このＩＬ１３ＢＢζＣＡＲ配列を、不活性非免疫原性細胞表面マーカーである短縮型ヒトＣＤ１９配列（ＣＤ１９ｔ）から分離する。
【０１５３】
白血球搬出の日にＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭを製造するために、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上での密度勾配遠心分離、続いてＰＢＳ／ＥＤＴＡ中での２回の洗浄によって単離された。次いで、ＰＢＭＣをＰＢＳ中で１回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含有するＸ  Ｖｉｖｏ１５培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）に再懸濁し、３００ｃｃのトランスファーバッグに移し、室温で（ＲＴ）一晩３−Ｄローテーター上に保存した。翌日、５ｘ１０９  ＰＢＭＣを、臨床グレードの抗ＣＤ１４（１．２５ｍＬ）、抗ＣＤ２５（２．５ｍＬ）及び抗ＣＤ４５ＲＡ（２．５ｍＬ）マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を含む３００ｃｃトランスファーバッグ中でＲＴで３０分間、１０％ＦＣＳを含有するＸ  Ｖｉｖｏ１５中でインキュベートした。ＣＤ１４＋、ＣＤ２５＋、及びＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、製造元の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従ってＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）デプレッション(depletion)を用いて直ちに枯渇させた。遠心分離後、細胞の非標識陰性画分を０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）を含有するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に再懸濁し、次いで、臨床グレードのビオチン化ＤＲＥＧ５６ｍＡｂ（ＣＯＨＮＭＣ  ＣＢＧ）で、ＲＴで３０分間、０．６ｍＬにおいて標識化した。次いで、細胞を洗浄し、０．５％ＨＳＡを含有する１００ｍＬのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡの最終容量中に再懸濁し、新しい３００ｃｃのトランスファーバッグに移した。１．２５ｍＬの抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）と３０分間インキュベーションした後、ＣＤ６２Ｌ＋画分（ＴＣＭ）をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）でのポジティブ選択により、製造者の指示に従って精製し、１０％ＦＣＳを含有するＸ  Ｖｉｖｏ１５中に再懸濁した。
【０１５４】
濃縮２時間以内に、１：３の比（Ｔ細胞：ビーズ）でＧＭＰ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴエキスパンダＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２６．９×１０６  ＴＣＭを刺激した。そして、３７℃、５％ＣＯ２において培養ラック上の水平位置に置かれた３２個のＶｕｅｌｉｆｅ組織培養バッグ（ＡＦＣ）中に、５μｇ／ｍＬの硫酸プロタミン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、５０Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−１５と共に１０％ＦＣＳを含有する５．５ｍＬのＸ  Ｖｉｖｏ１５中の０．３のＭＯＩで臨床グレードのＩＬ１３ＢＢζ−Ｔ２Ａ−ＣＤ１９ｔ＿ｅｐＨＩＶ７で形質導入した。次いで、細胞密度を４×１０５〜２×１０６生存細胞／ｍＬに維持するために、必要に応じてＸ−Ｖｉｖｏ１５  １０％ＦＣＳを加えることにより、培養の月曜日、水曜日、及び金曜日ごとに、サイトカイン補充（５０Ｕ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２及び０．５ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−１５の最終濃度）により、培養物を維持した。培養物体積に基づいて、Ｔ細胞を７３０個のＶｕｅｌｉｆｅバッグ（ＡＦＣ）に移した。レンチウイルス形質導入の７日後、ＣＤ３／ＣＤ２８  ＤｙｎａｂｅａｄｓをＤｙｎａｌ  ＣｌｉｎＥｘ  Ｖｉｖｏ磁性粒子濃縮器バッグ磁石を用いて除去した。ビーズを含まないＴ細胞を新しい７３０  Ｖｕｅｌｉｆｅバッグ内に排出した。培養物をＧｕａｖａ  ＰＣＡによって決定されるように約４．５３×１０８個の細胞が生成するまで増殖させた。その時点で培養物を回収し、２％ＨＳＡを含むＩｓｏｌｙｔｅ（Ｂｒａｕｎ）中で洗浄し、次いでＭｒ．  Ｆｒｏｓｔｙ（Ｎａｌｇｅｎｅ）及びポータブル制御速度フリーザーシステム（Ｃｕｓｔｏｍ  Ｂｉｏｇｅｎｉｃｓ）を使用した凍結保存のため、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中に約１．３×１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。品質管理試験は、生存能力、効力（ＣＤ１９ｔ発現）、同一性（ＣＤ３発現）、トランスジーンコピー数（ＷＰＲＥ  ｑＰＣＲ）、複製能力のあるウイルス試験（ＶＳＶ−Ｇ  ｑＰＣＲ及びインディアナ大学での正式ＲＣＬ試験）、残存ビーズカウント、及び無菌状態(sterility)を包含した。
【０１５５】
上記のように、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列１２は、このＩＬ１３ＢＢζ配列をＣＤ１９ｔ、細胞形質導入をマーキングする不活性非免疫原性細胞表面マーカーから分離する（図３９Ａ）。このＴ２Ａ結合は、単一の転写産物からのＩＬ１３ＢＢζ及びＣＤ１９ｔの両方の同調発現をもたらす。
【０１５６】
ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋  ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、レンチウイルス形質導入及びｅｘ  ｖｉｖｏ増殖の免疫原性富化のための製造方法もここに詳述する。エンドオブプロセス(end-of-process)（ＥＯＰ）凍結保存された(cryopreserved)ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭ製品は、臨床プロトコルに従って、品質管理放出試験を受けた。各注入について、２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む医薬保存料を含まない生理食塩水（ＰＦＮＳ）中で、Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、最終容量０．５ｍＬに再定式化した。５〜１０分間かけて０．５ｍＬ容積、続いて１時間当たり０．５ｍＬの対流増強送達（ＣＥＤ）により送達される最大１ｍＬのＰＦＮＳフラッシュを送達するため、細胞を２１ゲージのバタフライ針を用いてＲｉｃｋｈａｍリザーバに手動で注入した。
【０１５７】
実施例１９：  臨床イメージング
脳及び脊椎のポストガドリニウムＴ１加重ＭＲＩ配列を、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｖｉｒｏ  ３  Ｔｅｓｌａスキャナー上で獲得した。Ｍｕｌｔｉｈａｎｃｅ（登録商標）の投与後に得られたアキシャルＴ１  のＭＰＲ加重画像上で病変を測定した。ＧＥ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＤＳＴ  ＨＰ６０  ＰＥＴ−ＣＴスキャナー（７０ｃｍアキシャル視野、スライス厚３．７５ｍｍ）を用いて、１８−Ｆ−フルオロデオキシグルコース（１８−Ｆ−ＦＤＧ）による画像化を行った。最大標準取込値（ＳＵＶ）は、Ｖｉｔａｌ  Ｉｍａｇｅｓ  Ｖｉｔｒｅａバージョン６．７．２ソフトウェアを利用して得た。造影増強腫瘍病巣の領域を、最大腫瘍面積（ｍｍ２）の測定のための放射線科医によって概説した。及び腫瘍容積（ｃｍ３）を計算した。
【０１５８】
品質管理放出された自己ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの凍結保存された細胞バンクを解凍した。そして、２％ＨＳＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、及び２％ＨＳＡを含む医薬保存料を含まない生理食塩水中に再懸濁することにより、再構築された。神経膠腫切除腔（ＩＣＴ）又は側脳室（ＩＣＶ）いずれかへの治療用ＣＡＲ  Ｔ細胞の送達は、脳室カテーテル（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｐｕｄｅｎｚ）及びスタイレットを備えたＨｏｌｔｅｒ（商標）Ｒｉｃｋｈａｍ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｓｔｏｍｙ  Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ（Ｃｏｄｍａｎ）を用いて達成された。ＩＣＴ送達のために、腫瘍切除の時点でリザーバ／カテーテルシステムを挿入した。内及び腫瘍周囲脳組織内の両方への細胞送達を可能にするため、カテーテルの先端を切除壁に部分的に埋め込んだ。カテーテルの位置及び腫瘍切除の程度を確認するために術後イメージング（ＣＴ及びＭＲＩ）を得た。
【０１５９】
実施例２０：  ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭは、セントラルメモリー様のＴ細胞表現型を示す
濃縮ＴＣＭ（３６×１０６）をｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、レンチウィルスで形質導入し、そして１７日間で６３８×１０６個の全細胞を得るため増殖した。最終的なＴ細胞の生成物（ＣＤ３＋及びＴＣＲ＋）は、ＣＤ４（７４％）及びＣＤ８（１６％）Ｔ細胞サブセットからなり、両方の細胞表面タンパク質についての遺伝子改変共染色と共にＩＬ１３ＢＢζとＣＤ１９ｔを発現した（図３９Ａ）。ＣＡＲ  Ｔ細胞生成物は、ＣＤ４５ＲＯ（９７％）、ＣＤ６２Ｌ（５７％）、ＣＣＲ７（２８％）、ＣＤ２８（９７％）及びＣＤ２７（５９％）を発現する、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を示した（図３９Ａ）。この製品はまた、ＴＩＭ−３（６５％）及びＬＡＧ−３（４９％）を包含するが、ＰＤ−１及びＫＬＲＧ１の有意なレベルを包含しない、いくつかの疲弊(exhaustion)マーカーを示した（図３９Ａ）。
【０１６０】
実施例２１：  ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの反復的頭蓋内注入（infustions)）の安全性及び耐性
患者は、２つの異なる頭蓋内送達経路、即ち腫瘍切除後の腔内（ＩＣＴ）送達（サイクル１〜６）及び脳脊髄液（ＣＳＦ）への脳室内（ＩＣＶ）送達（サイクル７〜１１）である、を介してリザーバ／カテーテル装置を介して投与されたＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの毎週の注入によって治療された。１０×１０６  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞の最大細胞用量での１１回の頭蓋内注入は、観察された治療に対する可能性又はそれ以上の帰属を伴う、グレード３以上の毒性（ＮＣＩ共通毒性基準）なしで良好に耐容された。ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後に認められる軽度の事象には、以下が含まれる。
【０１６１】
表６：  安全性及び耐性
【表６】
2019504105.tif 000008
【０１６２】
＊  Ｔ細胞投与に対する可能性のある又はより高い帰属を有する事象のみが報告される；全てが一度発生し、ＮＣＩ共通毒性基準に従ってグレード１−２であり、グレード３以上の事象は観察されなかった。
【０１６３】
実施例２２：  臨床応答
治療の時点で、患者の腫瘍は、不良な予後特徴を有する非常に攻撃的な再発性ＧＢＭの特徴を示した。これには、標準治療後の治療から６ヶ月以内の一次診断からの再発の証拠、脊髄病変及び広範囲の軟部腫瘍疾患を包含する、多病巣性腫瘍病変の提示（図３８）、脱分化型ＧＢＭの組織学的特徴、及び６０％を超える細胞がＫｉ６７陽性に染色された高い腫瘍増殖率（図３７Ｂ）が含まれた。切除された腫瘍組織のＦＦＰＥに対するＩＨＣによって評価されたＩＬ１３Ｒα２の腫瘍発現は、それぞれ１００及び８０のＨスコアを有する原発腫瘍と再発腫瘍との間で類似していた（図３７）。再発腫瘍の腫瘍内ＩＬ１３Ｒα２発現は不均一であった。細胞の１０％が高い染色強度（２−３＋）を示し、６０％が低発現（１＋）を示し、細胞の３０％がバックグラウンド（０＋）よりも染色されなかった。潜在的な関心事の中で、最も高いレベルのＩＬ１３Ｒα２発現は、他のＧＢＭ腫瘍について言及された発現パターンである、偽柵構造（pseudopalisading）壊死の腫瘍領域においてしばしば観察された（図３７Ａ）。
【０１６４】
臨床プロトコルへの登録後、この患者は、５つの再発病変のうちの３つについて外科的切除を受けた（図３８）。リザーバ／カテーテル装置は、右後頭側−後頭部領域における最も大きな再発巣（Ｔ１）の切除された腔に配置した。この患者は、最初に、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞（２×１０６  サイクル１；１０×１０６  サイクル２〜６）の６週間(six  weekly)の腔内（ＩＣＴ）注入によりプロトコールごとに治療された（図１Ｂ）。この期間中、側頭−後頭部腫瘍病変（Ｔ１）は、進行性疾患の証拠なしに、手術後４５日以上にわたって安定したままであった（図３９Ｃ）。しかし、ＭＲＩは、左側頭葉における他の非切除腫瘍病巣（Ｔ４及びＴ５）並びに腫瘍３に隣接する新たな再発病変（Ｔ６）及び嗅覚溝における病変（Ｔ７）がこの同じ期間にわたって進行したことを明らかにした（図３９Ｃ）。さらに、１つの大きな腫瘍（２７０ｍｍ２）及び１より多くの小さな腫瘍病巣（＜１ｃｍ２）を包含する、脊柱の転移性病変も検出された。これらの結果は、混合しているが、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭが切除された後頭側頭−後頭部領域での疾患再発を予防した可能性があることを示唆していることから、奨励された。しかし、これらはまた、局所ＩＣＴ送達は、注入部位から離れた遠隔地における腫瘍の進行を効果的に制御するのには不十分であったことを示唆した。
【０１６５】
これらの知見に基づいて、及び、ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＣＶ送達がＮＳＧマウスモデルにおいて多巣性ＧＢＭに輸送され得ることを示す前臨床試験によって支持され（データは示さず）、この患者は、特例使用プロトコルに登録され、且つ、いずれの他の治療的介入なしで、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭの５週間(five  weekly)のＩＣＶ注入で治療した（２×１０６  サイクル７；１０×１０６  サイクル８−１１）（図４０Ａ）。３回のＩＣＶ注入の１週間後に（サイクル９；１３３日目）、すべての腫瘍病変が劇的な退行を示した。最終的なＩＣＶ注入の後（サイクル１１；１５６日目）、大部分の頭蓋内及び脊髄腫瘍は、最大面積および体積測定の両方によって７０％を超えて退縮していた（図４０Ｂ〜Ｅ、以下の表７、及び図４１）。患者が他の治療的介入を受けなかった最後のＩＣＶ注入の６週間後の追跡ＭＲ及びＰＥＴイメージングは（１９０日目）、疾患の退行を継続して示した。最大面積および体積の両方の測定によって腫瘍が≧７８％減少した（図４０Ｂ〜Ｅ、以下の表７及び図４１）。この１９０日目の時点で、疾患対炎症、瘢痕(scaring)及び／又は硬膜増強の残存Ｘ線写真の証拠を区別することはできなかった。ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭのＩＣＶ送達は、脊柱内のすべての転移性腫瘍のほぼ完全な排除を誘発した。最大の病変の最大面積が９７％減少した。ＩＣＶ治療の前に存在する１０以上のうちわずか1つの小さな腫瘍病巣が見える。ＩＣＶ治療の時間経過及び腫瘍退縮と同時に、システムデキサメタゾン(dexamethosome)を２ｍｇ  ｂｉｄから０．５ｍｇ  ｑｄに減らすことができた。この患者は臨床的に安定したままであり、正常な生活と仕事の活動に戻った。従って、このＣＡＲ  Ｔ細胞媒介性抗腫瘍応答の持続性を支持する。これらの結果は、ＩＬ１３ＢＢζ  ＴＣＭによる処理が、厳しいＲＡＮＯ基準に基づいてほぼ完全な応答を媒介することを示している。
【０１６６】
表７:  非切除病変のＭＲＩ評価（容積  ｃｍ３、面積  ｍｍ２）
【表７】
2019504105.tif 000009
【０１６７】
＊、  サイクル１−６で発生した新しい病変
太字、  最大％減少と比較した値
ＮＡ、  病変は特定できなかった
０、  病変は視覚的に特定されるかもしれないが、値は分析ソフトウェアパラメータの値よりも低かった
ＮＤ、  イメージングが行われていない
【０１６８】
実施例２３：  ＣＡＲ  Ｔ細胞の持続性及びＣＮＳ炎症反応
ＩＬ３ＢＢζ  ＴＣＭのＩＣＶ注入（サイクル６〜１１）後に観察された抗腫瘍応答に関連する免疫学的変化を解明するために、ＣＳＦを細胞浸潤、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞持続性、及びサイトカインレベルについて評価した。各ＩＣＶ注入の直後に（すなわち、サイクル６〜１１の第１−２日目）、ＣＳＦのｍＬ当たりの細胞数は、プレ注入レベル（各サイクルの０日目）と比較して７．０±３．６倍増加し、且つ、プレＩＣＶ（Ｃ７Ｄ０）レベルと比較して１５３±１２８倍増加した（図４２）。ＣＳＦ中の総細胞数は、典型的には、７日間の治療サイクルにわたって減少した。Ｃ９Ｄ２について評価したところ、細胞浸潤物は、ＣＤ１４＋  ＣＤ１１ｂ＋  ＨＬＡ−ＤＲ＋成熟骨髄集団と同様に、内因性及びＣＡＲ発現性の両方の、ＣＤ３＋  Ｔ細胞の大部分を包含した（図４２Ａ）。まれなＣＤ１９＋  Ｂ細胞及びＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１５＋顆粒球のみが検出された（図４２Ａ）。フローサイトメトリーデータと一致して、Ｃ１１Ｄ１についてのＣＳＦ細胞病理学は、反応性リンパ球、単球及びマクロファージの存在を報告した。
【０１６９】
ＣＡＲ−Ｔ持続性もまた、ＩＣＶ処置コースにわたってモニターされた。サイクル７及び８のＣＳＦにおける細胞回収率が低いため、分析はサイクル９、並びにサイクル１０及び１１の直後の時点を評価することに焦点を当てた。重要なことに、ＣＡＲ＋  Ｔ細胞は、サイクル８の７日後に対応するＣ９Ｄ０を含めて、評価された全時点で検出された（図４２Ｂ）。したがって注入後少なくとも７〜８日間治療細胞の持続性を実証する。しかし、注入後のＣＳＦにおけるＣＡＲ  Ｔの数は、腫瘍負荷が有意に減少した後のサイクルで減少した（Ｃ１０Ｄ１及びＣ１１Ｄ１）（図４０Ｂ）。注目すべきことに、サイクル９でのＣＳＦにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞の有意な増殖は検出されなかった。ＣＡＲ＋細胞数は、、注入前（Ｃ９Ｄ０）から２日後に（Ｃ９Ｄ２）１．６倍に増加し、その後、８日目には（Ｃ９Ｄ８）２．３倍減少した。
【０１７０】
各注入後のＣＡＲ＋  Ｔ細胞を包含する免疫細胞の存在は、ＣＳＦにおけるサイトカインレベルの有意な上昇に対応した。測定されたレベル及び測定された３０−サイトカインについてのベースラインを超える計算されたｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅを以下の表９及び表１０に示す。特に、１１個のサイトカインがＩＬ３ＢＢζＴＣＭ注入の直後、プレＩＣＶベースライン（Ｃ７Ｄ０）から１０倍以上増加した。サイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−８及びケモカインＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、及びＣＣＲ２／ＭＣＰ−１及び可溶性サイトカインレセプターＩＬ−１Ｒαを包含する（図３Ｃ）。７つの他のサイトカインは、ベースライン（Ｃ７Ｄ０）から５倍以上の増加を示した。Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２−Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、及びＭＩＰ−１ｂを包含する。プレＩＣＶ（Ｃ７Ｄ０）と比較してＩＬ３ＢＢζ  ＴＣＭ注入直後に最も高い倍数増加を示した炎症性サイトカインは、ＩＬ−２（Ｃ９Ｄ２について＞９０倍）及びＩＦＮ−γ誘導性ケモカインＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０（Ｃ８Ｄ１、Ｃ９Ｄ２、Ｃ１０Ｄ１及びＣ１１Ｄ２について＞４０倍）であった。これらのサイトカインは、治療サイクルの間に７日間以内にほぼベースラインレベルに戻った。ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後に有意な増加を示さなかったサイトカインには、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳ及びＶＥＧＦが含まれる（表９及び表１０）。
【０１７１】
表９：  ＵＰＮ  １０９  ＣＳＦサイトカイン分析（ｐｇ／ｍＬ）、ＩＣＶサイクル７〜１１
【表８】
2019504105.tif 000010
【０１７２】
ＯＯＲ＜、  範囲外（Ｏｕｔ  ｏｆ  Ｒａｎｇｅ）（未満）
＊、  標準範囲を超えて外挿した値
【０１７３】
表１０：  ＵＰＮ  １０９  ＣＳＦサイトカインｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ分析、ＩＣＶサイクル７〜１１
【表９】
2019504105.tif 000011
【０１７４】
表１０からの太字の値、「ＯＯＲ＜」値は、fold  changeの計算を可能にするために、そのサイトカインについての測定可能な最低値で置き換えた。
＊、  ＞１０倍以上の増加が少なくとも１回観察されたサイトカイン。
【０１７５】
ＣＳＦにおけるこれらの免疫学的変化は局所的であった。サイトカインレベルの有意な変化がなく（表１１）、ｑＰＣＲによる検出可能なＣＡＲ＋  Ｔ細胞及び末梢血中のフローサイトメトリー（データ示さず）は観察されなかったためである。ＣＳＦにおける変化は、ＩＣＴ治療コース中に腔から嚢胞液を得ることができないため、腫瘍病変１（Ｔ１）の切除された腔における変化と比較することができなかった。
【０１７６】
表１１：  ＵＰＮ  １０９血清サイトカイン分析（ｐｇ／ｍＬ）、ＩＣＶサイクル７〜１１
【表１０】
2019504105.tif 000012
【０１７７】
ＯＯＲ＜、  範囲外（Ｏｕｔ  ｏｆ  Ｒａｎｇｅ）（未満）
＊、  標準範囲を超えて外挿した値
【０１７８】
実施例２４：  患者のサンプル処理及び分析
腫瘍切除材料を、臨床プロトコルに従って病理学のＣＯＨ部門を介して収集した。
【０１７９】
ＩＬ−１３Ｒα２免疫組織化学（ＩＨＣ）は、前述のようにホルマリン固定パラフィン包埋標本の５μｍ切片について実施した。Ｋｉ６７  ＩＨＣは、ｐＨ８．０での加熱による抗原回収、及び抗Ｋ１６７（Ｄａｋｏ  Ｃｏｒｐ）の１：７５希釈を除いて同様に実施した。ＩＬ−１３Ｒα２免疫反応性を臨床的神経病理学者によってスコアリングし、弱い（１＋）、中程度（２＋）、又は強い（３＋）強度の細胞質及びゴルジ様染色を示す腫瘍細胞のパーセンテージに基づいて定量した。Ｈスコアは、式：
（３×強く染色する細胞のパーセンテージ）＋（２×中程度に染色する細胞のパーセンテージ）＋弱い染色する細胞のパーセンテージ
によって得られ、０〜３００の範囲を与える。Ｈスコアは、以下のように、登録基準に記載された強度スコアリングシステムに翻訳することができる。０は負（Ｈスコア０）を表し、１＋は低い（Ｈスコア１〜１００）を表し、２＋は中程度（Ｈスコア１０１〜２００）を表し、３＋は高い（Ｈスコア２０１〜３００）を表す。包含基準は、１＋染色強度（＞２０％、１＋）をスコアリングする細胞の少なくとも２０％であり、Ｈスコア２０を表した。適切な陽性（精巣）及び陰性（前立腺）対照をＩＬ−１３Ｒα２ＩＨＣ染色に用いた。「＋」記号は、膜状染色の存在を反映する。この試験は、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの病理学科で行われ、研究のための治験とみなされている。この検査室は、複雑な臨床検査室の検査を実施する資格を有するとして、１９８８年の臨床検査室改良改正（ＣＬＩＡ）の認定を受けている。
【０１８０】
末梢血サンプルをバキュテナーチューブ±ＥＤＴＡ中に集めた。ＥＤＴＡを含むサンプルは、受領後直ちにフィコール化された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を−８０℃でＣｒｙｓｔｏｒ  ＣＳ５中で凍結し、次いで長期保存のために液体窒素に移した。ＥＤＴＡを含まないサンプルを室温で２〜３時間凝固させた。遠心分離によって血清を回収し、１００〜２００μＬの単回使用でアリコートに分け、−８０℃で保存した。脳脊髄液（ＣＳＦ）をＩＣＶリザーバから３ｃｃシリンジで回収し、スピンダウンし、上清をアリコートに分けて−８０℃で保存した。ＣＳＦ細胞を、直ちにフローサイトメトリー分析のために２％ＦＣＳ及びアジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳ−／−（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＧｒｏ）に再懸濁した。残りの細胞を再懸濁し、−８０℃でＣｒｙｏｓｔｏｒ  ＣＳ４中で凍結し、及び次いで、長期保存のために液体窒素に移した。
【０１８１】
免疫細胞の細胞表面表現型決定は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＩＬ−１３、ＴＣＲ−α／β（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＫＬＲＧ１、ＣＤ１５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＤ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＡＧ−３（Ｌｉｆｅｓｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＣＲ７、又はＴＩＭ−３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に特異的な蛍光色素結合体及びそれらのそれぞれのアイソタイプ対照を用いたフローサイトメトリーによって行った。
【０１８２】
研究参加者血清及びＣＳＦサンプルを、サイトカインビーズアレイによって分析した。アッセイは、ヒトサイトカイン３０−Ｐｌｅｘパネルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＦＬＥＸＭＡＰ  ３Ｄ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を用いて行った。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１０−１０】
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【図１０−１１】
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【図１０−１２】
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【図１０−１３】
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【図１０−１４】
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【図１０−１５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ−２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ−２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２５Ｉ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４０Ｅ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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