(57)【要約】  本開示は、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡ分子、およびこの改変ＲＮＡを含む製剤に関する。本開示の態様は、さらに、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象の治療における、改変ＲＮＡを含む製剤の調製および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡと、緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液とを含む組成物。
【請求項２】
薬学的に許容し得る量の改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡと、緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液とを含む製剤。
【請求項３】
二価カチオンを実質的に含まない前記緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項３に記載の製剤。
【請求項６】
薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項２に記載の製剤。
【請求項７】
前記薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、請求項６に記載の製剤。
【請求項８】
ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療する方法であって、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤を対象に投与することを含む方法。
【請求項９】
前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤が、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血
管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が、心筋梗塞後の心機能不全である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が、虚血性心疾患である、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患が、外傷または手術による血管損傷である、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍である、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が、重症虚血肢である、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患が、肺高血圧症である、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が、末梢動脈疾患である、請求項８に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物または製剤が、筋肉内、皮内、皮下、心臓内、もしくは心外膜経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物または製剤が、前記対象に筋肉内に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物または製剤が、前記対象に皮内に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物または製剤が、前記対象に皮下に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、前記対象に、心臓内にまたは心外膜に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、門脈カテーテルを介して前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、冠静脈洞カテーテルを介して前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、治療される領域への直接的投与によって前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項３４】
クエン酸生理緩衝液を伴う前記組成物または製剤が、前記対象にとって、脂質ベースの組成物または製剤よりも毒性が低い、請求項９に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類の細胞、組織、または対象において、生理的プロセスを調節するための方法であって、前記哺乳類の細胞、組織、または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項３６】
前記調節することが、血管形成を誘導すること、血管細胞増殖を刺激すること、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更すること、内皮化を上方調節すること、心筋再生を誘導すること、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させること、血管機能を改善すること、組織灌流および新しい血管の形成を増大させること、瘢痕組織を減少させること、および心機能を改善することから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記調節することが、血管形成を誘導することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記調節することが、血管細胞増殖を刺激することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記調節することが、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記調節することが、内皮化を上方調節することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記調節することが、心筋再生を誘導することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記調節することが、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記調節することが、血管機能を改善することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記調節することが、組織灌流および新しい血管の形成を増大させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記調節することが、瘢痕組織を減少させることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記調節することが、心機能を改善することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０
μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法であって、前記哺乳類の細胞または組織を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項５４】
前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法であって、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤を、前記対象に投与することを含む方法。
【請求項６１】
前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記製剤が、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象が、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患っている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患が、心筋梗塞後の心機能不全である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患が、虚血性心疾患である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患が、外傷または手術による血管損傷である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾患が、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患が、重症虚血肢である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患が、肺高血圧症である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患が、末梢動脈疾患である、請求項６６に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物または製剤が、筋肉内、皮内、皮下、心臓内、もしくは心外膜経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、前記対象に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物または製剤が、前記対象に筋肉内に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項７８】
前記組成物または製剤が、前記対象に皮内に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項７９】
前記組成物または製剤が、前記対象に皮下に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８０】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、前記対象に、心臓内にまたは心外膜に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８１】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、門脈カテーテルを介して前記対象に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８２】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、冠静脈洞カテーテルを介して前記対象に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８３】
前記組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、治療される領域への直接的投与によって前記対象に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項８５】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項８６】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項８７】
組成物または製剤を調製するための方法であって、改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡを、緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液と組み合わせて、前記組成物または製剤にすることを含み、かつ前記組成物または製剤が、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療するのに有効である方法。
【請求項８８】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の前記改変ＲＮＡを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
クエン酸生理緩衝液を伴う前記組成物または製剤が、前記対象にとって、脂質ベースの組成物または製剤よりも毒性が低い、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
対象におけるＶＥＧＦ−Ａ治療の毒性を低下させるための方法であって、改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡを、緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液と共に配合して、組成物または製剤にすることを含む方法。
【請求項９５】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡの産生のためのインビトロ転写鋳型を含む核酸配列。
【請求項９８】
哺乳類組織または対象における創傷治癒を向上させるための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項９９】
哺乳類組織または対象における血管新生を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項１００】
哺乳類組織または対象における血管形成を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項１０１】
哺乳類組織または対象における血管拡張を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項１０２】
哺乳類組織または対象における血流上方調節を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項１０３】
哺乳類組織または対象における毛細血管および／または細動脈密度を増大させるための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項１０４】
哺乳類組織または対象における線維症を和らげるための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、請求項１に記載の組成物、および／または請求項２〜７のいずれか１項に記載の製剤と接触させることを含む方法。
【請求項１０５】
治療の方法に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物または製剤。
【請求項１０６】
ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を治療する方法に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物または製剤。
【請求項１０７】
前記疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される、請求項１０６に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１０８】
前記組成物または製剤が、筋肉内、皮内、皮下、心臓内、もしくは心外膜経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、前記対象に投与される、請求項１０６または１０７に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１０９】
前記治療法が、血管形成を誘導すること、血管細胞増殖を刺激すること、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更すること、内皮化を上方調節すること、心筋再生を誘導すること、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させること、血管機能を改善すること、組織灌流および新しい血管の形成を増大させること、瘢痕組織を減少させること、および／または心機能を改善することを含む、請求項１０５に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１０】
治療法が、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更することを含む、請求項１０５に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１１】
治療法が、内皮化を上方調節すること、および／または心筋再生を誘導することを含む、請求項１０５に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１２】
心筋梗塞（ＭＩ）後、心筋における心外膜由来細胞活性化のピーク時に投与される、請求項１０５、１１０、および１１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１３】
前記組成物または製剤が、ＭＩの約７日後、ＭＩの約１０日後、ＭＩの約２週後、ＭＩの約３週後、またはＭＩの約６週後、好ましくはＭＩの約７日後に投与される、請求項１０５、および１１０〜１１２のいずれか１項に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１４】
治療法が、駆出率が低下した心筋梗塞を治療する、または駆出率が保たれた心不全を治療することを含む、請求項１〜１１３のいずれか１項に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１５】
健康な組織と梗塞を起こした組織との間の境界域に注射される、請求項１１４に記載の使用のための組成物または製剤。
【請求項１１６】
ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を治療することに使用するための医薬品の製造における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物または製剤の使用。
【請求項１１７】
前記疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される、請求項１１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．分野
本開示は、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡ分子、およびその改変ＲＮＡを含む製剤に関する。本開示の態様は、さらに、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象の治療における、改変ＲＮＡを含む製剤の調製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）経路は、一般に心血管の生理機能、特に動脈形成の制御における中心的役割を果たす。ＶＥＧＦ−Ａの役割には、一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達、血管透過性、腫瘍血管形成、動脈形成、内皮複製、および多能性心血管前駆細胞のための細胞運命スイッチの活性化が含まれる。小分子と抗体の両方を介するＶＥＧＦ−Ａ経路の阻害は、選択された型の癌および黄斑変性症における治療の標準となってきているが、平滑筋を弛緩させること、新しい血管の形成を促進すること、および糖尿病性血管合併症を伴う血管反応の異常を潜在的に逆行させることを含めた、治療効果の可能性のためにＶＥＧＦ−Ａ経路を増強する可能性を切り開くことは、難しいままである。
【０００３】
したがって、標的組織におけるＶＥＧＦ−Ａの空間的および時間的発現を制御するための臨床的に扱いやすい手法を可能にするための、多くの多様な方法が試みられている。しかし、これらの手法はそれぞれ、重大な欠点を有する：全身的ＶＥＧＦ−Ａタンパク質手法は、重大な低血圧をもたらす可能性があり、かつＶＥＧＦ−Ａは急速に分解される；ウイルスカプセル化およびネイキッドＶＥＧＦ−Ａ  ＤＮＡプラスミドは、タンパク質発現の時間的制御が限定的であり、かつインビボ発現の効率は、非常に様々かつ非用量依存性であり得る；アデノウイルスベクターは、免疫系を活性化する可能性がある；また、ネイキッドＲＮＡは、不安定であり、トランスフェクションのレベルが低く、やはり免疫活性化を誘発する可能性がある。その結果、これらの制約が、治療プラットフォームとしてのＶＥＧＦ−Ａの適用可能性を制限している。
【０００４】
いくつかの以前の研究では、治療用ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡのインビボ使用は、ｍＲＮＡを分解から保護するための、また、効率的なトランスフェクションのための、脂質−ナノ粒子（ＬＮＰ）の利用に依存していた。さらに、肝臓以外の器官における治療レベルのＲＮＡｉ療法に到達しようとする試みは、注入に伴う過敏症反応、ならびに肝毒性、したがって他の器官系における疾患治療法のためのその使用の制限をもたらしている（Ｒｕｄｉｎ  Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（２００４）１０，７２４４−７２５１）。さらに、これらのＬＮＰの他のバリアントは、選択された場合における治療用途のために臨床的に使用されているが、用量依存性の組織損傷を引き起こす可能性がある（Ｃｏｅｌｈｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，（２０１３）３６９，８１９−８２９）。いくつかの脂質ベースの核酸医薬製剤のこうした用量依存的な毒性作用の例としては、呼吸困難、低酸素、悪寒、背部痛、低血圧、および肝損傷などの、注入に伴う反応が挙げられる。さらに、ＲＮＡ治療法（例えばｓｉＲＮＡ）の脂質製剤には、ＲＮＡの封入および安定性を向上させるために、典型的には、カチオン性脂質が含まれるが、いくつかのこうした脂質は、用量依存性の毒性、例えば、膜構造の完全性の破壊、細胞の溶解および壊死、および／または複数の遺伝子の発現の望ましくない様式の変更を呈する可能性がある（Ｘｕｅ  Ｈ．Ｙ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．（２０１５）２１（２２）：３１４０−７）。前臨床および臨床レベルでは、リポプレックスの用量依存性の全身毒性も、十分に裏付けられている。肝臓内のクッパー細胞によるリポプレックスの捕捉は、炎症反応を誘発する可能性があり、これは、肝臓に損傷を与え、主要肝機能指標のレベル上昇をもたらす可能性がある。白血球減少および血小板減少も起こる可能性がある（Ｚｈａｎｇ  Ｊ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．，（２００５）５７（５）：６８９−６９８）。さらに、リポフェクタミンは、免疫／炎症反応および細胞死を引き起こす。
【０００５】
したがって、ＲＮＡの免疫原性の可能性およびいくつかのＬＮＰに関連する用量依存性の毒性を避けるために、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象の治療において、治療的に適したレベルで改変ＲＮＡを送達するための、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡの代替の毒性の低い製剤の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
３．概要
本開示は、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡ分子、およびその改変ＲＮＡを含む製剤に関する。開示されるのはまた、タンパク質発現のためのこれらの製剤中のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの、結果として生じる利益、より低い毒性をもつ治療法をもたらすこと、および、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療するのに有用なツールを提供することである。
【０００７】
本開示のある種の実施態様を、以下の段落にまとめて示す。このリストは、例示的に過ぎず、この開示によって提供される実施態様のすべてを網羅しない。
【０００８】
実施態様１．改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡと、緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液とを含む組成物。
【０００９】
実施態様２．薬学的に許容し得る量の改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡと、緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液とを含む製剤。
【００１０】
実施態様３．二価カチオンを実質的に含まない前記緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、実施態様２の製剤。
【００１１】
実施態様４．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様３の製剤。
【００１２】
実施態様５．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様３の製剤。
【００１３】
実施態様６．薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、実施態様２の製剤。
【００１４】
実施態様７．薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、実施態様６の製剤。
【００１５】
実施態様８．ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療する方法であっ
て、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤を対象に投与することを含む方法。
【００１６】
実施態様９．前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、実施態様８の方法。
【００１７】
実施態様１０．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様９の方法。
【００１８】
実施態様１１．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様９の方法。
【００１９】
実施態様１２．製剤が、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、実施態様８の方法。
【００２０】
実施態様１３．薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、実施態様１２の方法。
【００２１】
実施態様１４．疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される、実施態様８の方法。
【００２２】
実施態様１５．疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全である、実施態様８の方法。
【００２３】
実施態様１６．疾患が、心筋梗塞後の心機能不全である、実施態様８の方法。
【００２４】
実施態様１７．疾患が、虚血性心疾患である、実施態様８の方法。
【００２５】
実施態様１８．疾患が、外傷または手術による血管損傷である、実施態様８の方法。
【００２６】
実施態様１９．疾患が、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍である、実施態様８の方法。
【００２７】
実施態様２０．疾患が、重症虚血肢である、実施態様８の方法。
【００２８】
実施態様２１．疾患が、肺高血圧症である、実施態様８の方法。
【００２９】
実施態様２２．疾患が、末梢動脈疾患である、実施態様８の方法。
【００３０】
実施態様２３．組成物または製剤が、筋肉内、皮内、皮下、心臓内、もしくは心外膜経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、対象に投与される、実施態様８の方法。
【００３１】
実施態様２４．組成物または製剤が、対象に筋肉内に投与される、実施態様８の方法。
【００３２】
実施態様２５．組成物または製剤が、対象に皮内に投与される、実施態様８の方法。
【００３３】
実施態様２６．組成物または製剤が、対象に皮下に投与される、実施態様８の方法。
【００３４】
実施態様２７．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、対象に、心臓内にまたは心外膜に投与される、実施態様８の方法。
【００３５】
実施態様２８．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、門脈カテーテルを介して対象に投与される、実施態様８の方法。
【００３６】
実施態様２９．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、冠静脈洞カテーテルを介して対象に投与される、実施態様８の方法。
【００３７】
実施態様３０．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、治療される領域への直接的投与によって対象に投与される、実施態様８の方法。
【００３８】
実施態様３１．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様８の方法。
【００３９】
実施態様３２．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様８の方法。
【００４０】
実施態様３３．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様８の方法。
【００４１】
実施態様３４．クエン酸生理緩衝液を伴う組成物または製剤が、対象にとって、脂質ベースの組成物または製剤よりも毒性が低い、実施態様９の方法。
【００４２】
実施態様３５．哺乳類の細胞、組織、または対象において、生理的プロセスを調節するための方法であって、前記哺乳類の細胞、組織、または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【００４３】
実施態様３６．調節することが、血管形成を誘導すること、血管細胞増殖を刺激すること、心外膜前駆細胞（ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更すること、内皮化を上方調節すること、心筋再生を誘導すること、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させること、血管機能を改善すること、組織灌流および新しい血管の形成を増大させること、瘢痕組織を減少させること、および心機能を改善することから選択される、実施態様３５の方法。
【００４４】
実施態様３７．調節することが、血管形成を誘導することを含む、実施態様３５の方法。
【００４５】
実施態様３８．調節することが、血管細胞増殖を刺激することを含む、実施態様３５の方法。
【００４６】
実施態様３９．調節することが、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更することを含む、実施態様３５の方法。
【００４７】
実施態様４０．調節することが、内皮化を上方調節することを含む、実施態様３５の方法。
【００４８】
実施態様４１．調節することが、心筋再生を誘導することを含む、実施態様３５の方法。
【００４９】
実施態様４２．調節することが、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させることを含む、実施態様３５の方法。
【００５０】
実施態様４３．調節することが、血管機能を改善することを含む、実施態様３５の方法。
【００５１】
実施態様４４．調節することが、組織灌流および新しい血管の形成を増大させることを含む、実施態様３５の方法。
【００５２】
実施態様４５．調節することが、瘢痕組織を減少させることを含む、実施態様３５の方法。
【００５３】
実施態様４６．調節することが、心機能を改善することを含む、実施態様３５の方法。
【００５４】
実施態様４７．前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、実施態様３５の方法。
【００５５】
実施態様４８．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様４７の方法。
【００５６】
実施態様４９．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様４７の方法。
【００５７】
実施態様５０．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様３５の方法。
【００５８】
実施態様５１．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様３５の方法。
【００５９】
実施態様５２．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様３５の方法。
【００６０】
実施態様５３．哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法であって、前記哺乳類の細胞または組織を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【００６１】
実施態様５４．前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、実施態様５３の方法。
【００６２】
実施態様５５．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様５４の方法。
【００６３】
実施態様５６．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様５４の方法。
【００６４】
実施態様５７．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様５３の方法。
【００６５】
実施態様５８．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様５３の方法。
【００６６】
実施態様５９．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様５３の方法。
【００６７】
実施態様６０．対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法であって、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤を、前記対象に投与することを含む方法。
【００６８】
実施態様６１．前記組成物または製剤中の二価カチオンを実質的に含まない緩衝液が、クエン酸生理緩衝液である、実施態様６０の方法。
【００６９】
実施態様６２．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様６１の方法。
【００７０】
実施態様６３．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様６１の方法。
【００７１】
実施態様６４．製剤が、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、実施態様６０の方法。
【００７２】
実施態様６５．薬学的に許容し得る賦形剤が、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、実施態様６４の方法。
【００７３】
実施態様６６．対象が、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患っている、実施態様６０の方法。
【００７４】
実施態様６７．疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される、実施態様６６の方法。
【００７５】
実施態様６８．疾患が、駆出率が低下したまたは保たれた心不全である、実施態様６６の方法。
【００７６】
実施態様６９．疾患が、心筋梗塞後の心機能不全である、実施態様６６の方法。
【００７７】
実施態様７０．疾患が、虚血性心疾患である、実施態様６６の方法。
【００７８】
実施態様７１．疾患が、外傷または手術による血管損傷である、実施態様６６の方法。
【００７９】
実施態様７２．疾患が、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍である、実施態様６６の方法。
【００８０】
実施態様７３．疾患が、重症虚血肢である、実施態様６６の方法。
【００８１】
実施態様７４．疾患が、肺高血圧症である、実施態様６６の方法。
【００８２】
実施態様７５．疾患が、末梢動脈疾患である、実施態様６６の方法。
【００８３】
実施態様７６．組成物または製剤が、筋肉内、皮内、皮下、心臓内、もしくは心外膜経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、対象に投与される、実施態様６０の方法。
【００８４】
実施態様７７．組成物または製剤が、対象に筋肉内に投与される、実施態様６０の方法。
【００８５】
実施態様７８．組成物または製剤が、対象に皮内に投与される、実施態様６０の方法。
【００８６】
実施態様７９．組成物または製剤が、対象に皮下に投与される、実施態様６０の方法。
【００８７】
実施態様８０．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、対象に、心臓内にまたは心外膜に投与される、実施態様６０の方法。
【００８８】
実施態様８１．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、門脈カテーテルを介して対象に投与される、実施態様６０の方法。
【００８９】
実施態様８２．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、冠静脈洞カテーテルを介して対象に投与される、実施態様６０の方法。
【００９０】
実施態様８３．組成物または製剤が、好ましくは複数回投与での固定投薬量で、治療される領域への直接的投与によって対象に投与される、実施態様６０の方法。
【００９１】
実施態様８４．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様６０の方法。
【００９２】
実施態様８５．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様６０の方法。
【００９３】
実施態様８６．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様６０の方法。
【００９４】
実施態様８７．組成物または製剤を調製するための方法であって、改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡを、緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液と組み合わせて、組成物または製剤にすることを含み、かつ前記組成物または製剤が、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療するのに有効である方法。
【００９５】
実施態様８８．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様８７の方法。
【００９６】
実施態様８９．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様８７の方法。
【００９７】
実施態様９０．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、０．１から１μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様８７の方法。
【００９８】
実施態様９１．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１から１０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様８７の方法。
【００９９】
実施態様９２．組成物または製剤が、好ましくはクエン酸生理緩衝液中に配合される、１０から５０μｇ／μＬの濃度の改変ＲＮＡを含む、実施態様８７の方法。
【０１００】
実施態様９３．クエン酸生理緩衝液を伴う組成物または製剤が、対象にとって、脂質ベースの組成物または製剤よりも毒性が低い、実施態様８７の方法。
【０１０１】
実施態様９４．対象におけるＶＥＧＦ−Ａ治療の毒性を低下させるための方法であって、改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡを、緩衝液であって、二価カチオンを実質的に含まない緩衝液、好ましくはクエン酸生理緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液、またはトロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液と共に配合して、組成物または製剤にすることを含む方法。
【０１０２】
実施態様９５．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない、実施態様９４の方法。
【０１０３】
実施態様９６．クエン酸生理緩衝液が、カルシウムもマグネシウムも含有しない、実施態様９４の方法。
【０１０４】
実施態様９７．改変ＲＮＡ、好ましくは配列番号２のＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする配列番号１の改変ＲＮＡの産生のためのインビトロ転写鋳型を含む核酸配列。
【０１０５】
実施態様９８．哺乳類組織または対象における創傷治癒を向上させるための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１０６】
実施態様９９．哺乳類組織または対象における血管新生を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１０７】
実施態様１００．哺乳類組織または対象における血管形成を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１０８】
実施態様１０１．哺乳類組織または対象における血管拡張を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１０９】
実施態様１０２．哺乳類組織または対象における血流上方調節を誘導するための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１１０】
実施態様１０３．哺乳類組織または対象における毛細血管および／または細動脈密度を増大させるための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１１１】
実施態様１０４．哺乳類組織または対象における線維症を和らげるための方法であって、前記哺乳類組織または対象を、実施態様１による組成物、および／または実施態様２〜７のいずれか１態様による製剤と接触させることを含む方法。
【０１１２】
４．図面の説明
当分野の技術者は、以下に記載される図面が、例示目的にすぎないことを理解するであろう。これらの図面は、本発明の教示の範囲を制限することを決して意図しない。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａ−１Ｂ：実施例で使用されるＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの構造（図１Ａ）および配列（配列番号１、図１Ｂ）。
【図２】図２Ａ−２Ｃ：より高い用量の改変ＲＮＡのトランスフェクションは、ヒト大動脈平滑筋細胞における、より多いＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生をもたらした（図２Ａ）。ヒト大動脈平滑筋細胞における改変ＲＮＡでのトランスフェクション後のＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の時間経過（図２Ｂ）。改変ＲＮＡでのトランスフェクション後の、マウス心臓線維芽細胞（図２Ｃ、左パネル）およびブタ内皮細胞（図２Ｃ、右パネル）におけるＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生。
【図３】図３Ａ−３Ｃ：ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡから産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、ヒト内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ２のリン酸化（図３Ａ）、およびヒト内皮細胞における下流シグナル伝達経路ｅＮＯＳの活性化（図３Ｂ）、およびマウス心臓線維芽細胞におけるＡｋｔ（図３Ｃ）を誘導した。
【図４】図４Ａ−４Ｃ：ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡから産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、血管形成プロセスにおけるいくつかの重要なステップに影響を与える。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、培養されたヒト内皮細胞の増殖（図４Ａ）および遊走（図４Ｂ）を増大させた。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、内皮細胞でコーティングしたビーズを用いる３Ｄ培養における血管形成性出芽形成を増大させた（図４Ｃ）。
【図５】図５Ａ−５Ｃ：内皮細胞でコーティングし、対照培地（図５Ａ）または改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａを含む馴化培地（図５Ｂ）で処理したビーズからの、血管形成性出芽形成の画像。内皮細胞でコーティングし、改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａで処理したビーズからの、血管形成性出芽形成の拡大図。
【図６】図６Ａ−６Ｃ：クエン酸生理食塩水（図６Ａ）、ＬａｃＺ改変ＲＮＡ（リポフェクタミン中に（１００μｇ、図６Ｂ）またはクエン酸生理緩衝液中に（１５０μｇ、図６Ｃ）配合されたもの）の、５０μＬ心臓内注射後にマウス心臓において産生されたβ−ガラクトシダーゼ酵素を示すＸ−ｇａｌ染色の比較。
【図７】リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｎ＝３）、クエン酸生理食塩水（Ｃ／Ｓ、ｎ＝６）、またはトロメタミンＡＫＡ  ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（ＴＨＡＭ、ｎ＝３）中に配合されたホタルルシフェラーゼ改変ＲＮＡの心臓内注射後にマウス心臓において産生されたルシフェラーゼタンパク質の評価。ＰＢＳ、Ｃ／Ｓ、およびＴＨＡＭ緩衝液（ｎ＝２／群）は、陰性対照として使用した。
【図８】図８Ａ−８Ｄ：未処置のラットにおける１５μｇ（円）、１５０μｇ（正方形）、または１８００μｇ（三角形）の、クエン酸生理食塩水に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後の異なる時点でのＶＥＧＦ−Ａタンパク質の心臓レベル（図８Ａ）。心筋梗塞を施された、クエン酸／生理食塩水またはＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１５０または１８００μｇ、クエン酸／生理食塩水中に配合）を心臓内に注射されたラットにおける、左室駆出率および（左室質量の％としての）梗塞サイズの比較。駆出率（図８Ｂ）および梗塞サイズ（図８Ｃ）は、梗塞の誘発および注射の８日後、心臓核磁気共鳴画像法によって評価した。心筋梗塞の誘発の１日後の、クエン酸／生理食塩水、またはクエン酸／生理食塩水中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを心臓内に注射したラットから採取した静脈血内の心筋トロポニンＩ（ＴｎＩ）のレベル（図８Ｄ）。
【図９】図９Ａ−９Ｂ：ＬａｃＺ改変ＲＮＡを心外膜に（３つの別の注射部位に１００μｇ）注射されたＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおける左室自由壁から回収した代表的な試料。組織は、注射の６時間後に回収して、１８時間Ｘ−ｇａｌ染色した。左の試料は、リポフェクタミン中に配合されたＬａｃＺ改変ＲＮＡを注射した組織（図９Ａ）、右の試料は、クエン酸／生理食塩水中に配合されたＬａｃＺ改変ＲＮＡを注射した組織（図９Ｂ）における染色をそれぞれ示す。
【図１０】Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおける様々な用量のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心外膜注射の６時間後の、ブタ左室組織試料におけるヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質。
【図１１−１】図１１Ａ−１１Ｇ：クエン酸生理緩衝液中のＬａｃＺおよびルシフェラーゼ改変ＲＮＡ心臓トランスフェクションおよび翻訳。７５μｇのＬａｃＺ改変ＲＮＡを、クエン酸生理緩衝液と共にマウス心臓に注射した。β−ガラクトシダーゼの産生は、心臓の左室のおよそ１０％に見られた（図１１Ａ、図１１Ｃ、および図１１Ｄに代表的な画像）。ＬａｃＺ改変ＲＮＡの注射後の心臓におけるβ−ガラクトシダーゼの産生を示すＸ−ｇａｌ染色の拡大図（図１１Ｂ）。ルシフェラーゼ改変ＲＮＡを心臓に注射した。ルシフェラーゼプローブを用いるＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションは、注射の部位の心筋におけるルシフェラーゼ改変ＲＮＡの存在を明らかにした（図１１Ｅ）。ルシフェラーゼ改変ＲＮＡの存在を示す、ルシフェラーゼプローブを用いるＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションの拡大図（図１１Ｆ）。免疫組織化学は、ルシフェラーゼ改変ＲＮＡの注射後の、注射の部位の心筋におけるルシフェラーゼタンパク質発現を明らかにした（図１１Ｇ）。
【図１１−２】図１１Ａ−１１Ｇ：クエン酸生理緩衝液中のＬａｃＺおよびルシフェラーゼ改変ＲＮＡ心臓トランスフェクションおよび翻訳。７５μｇのＬａｃＺ改変ＲＮＡを、クエン酸生理緩衝液と共にマウス心臓に注射した。β−ガラクトシダーゼの産生は、心臓の左室のおよそ１０％に見られた（図１１Ａ、図１１Ｃ、および図１１Ｄに代表的な画像）。ＬａｃＺ改変ＲＮＡの注射後の心臓におけるβ−ガラクトシダーゼの産生を示すＸ−ｇａｌ染色の拡大図（図１１Ｂ）。ルシフェラーゼ改変ＲＮＡを心臓に注射した。ルシフェラーゼプローブを用いるＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションは、注射の部位の心筋におけるルシフェラーゼ改変ＲＮＡの存在を明らかにした（図１１Ｅ）。ルシフェラーゼ改変ＲＮＡの存在を示す、ルシフェラーゼプローブを用いるＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションの拡大図（図１１Ｆ）。免疫組織化学は、ルシフェラーゼ改変ＲＮＡの注射後の、注射の部位の心筋におけるルシフェラーゼタンパク質発現を明らかにした（図１１Ｇ）。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｃ：クエン酸／生理緩衝液を用いる心臓への改変ＲＮＡ注射後のＶＥＧＦ−Ａタンパク質発現は、飽和性であり、複数の種にわたって同様の薬物動態を有する。７２時間にわたるマウスにおけるクエン酸生理緩衝液（ＮＴＢ）−対−リポフェクタミン（ＬＮＰ）中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの単回心臓注射後のＶＥＧＦ−Ａタンパク質薬物動態（図１２Ａ）。クエン酸生理食塩水中のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの漸増投与後のＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルの異種間の比較（図１２Ｂ）。漸増用量のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質のラット薬物動態。７２時間時点で産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質についての曲線下面積（ＡＵＣ）測定（図１２Ｃ）。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｂ：マウス、ラット、およびブタにおける、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の評価。クエン酸／生理食塩水中に配合された１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後に、マウス（塗りつぶされた正方形）、ラット（塗りつぶされた星）、およびブタ（塗りつぶされた円）心臓において産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質の大きさおよび時間プロフィール（図１３Ａでは０から７２時間；図１３Ｂ０から１９２時間）。示されるのは、幾何平均±ＳＤである。
【図１４】心筋梗塞を施されたミニブタにおける、左室駆出率（ＥＦ）に対する、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。左前下行枝の永久的閉塞の前（ＢＦ）および後（ＡＦ）に、ＥＦの連続的評価を実施した。別の群のブタに、冠動脈閉塞を伴わない偽処置を施した（塗りつぶされていない円、ｎ＝５）。次いで、閉塞の７日後の試験薬物注射の時点での（７Ｄ  ＡＦ）、およびもう一度、２か月後の（２ＭＯ  ＡＦ）、ＥＦのその後の評価を実施した。７Ｄ  ＡＦでは、ブタを、それぞれ、クエン酸／生理食塩水（塗りつぶされた正方形、ｎ＝８）、または１ｍｇ（塗りつぶされた円、ｎ＝８）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形、ｎ＝８）の総用量のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（塗りつぶされたひし形、ｎ＝５）、のいずれかの２０本の心外膜注射（各１００μＬ）を受けることに無作為に割り付けた。＊；２ＭＯ  ＡＦ時点でクエン酸／生理食塩水対照群に対してＰ＜０．０５、＊＊；２ＭＯ  ＡＦ時点でクエン酸／生理食塩水対照群に対してＰ＜０．０１、†；７Ｄ  ＡＦから２ＭＯ  ＡＦまでの変化を比較してＰ＜０．００１、††；７Ｄ  ＡＦから２ＭＯ  ＡＦまでの変化を比較してＰ＜０．０００１。
【図１５】心筋梗塞を施されたミニブタにおける、経時的最大左室圧発生（ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘ）に対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。ミニブタに、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的閉塞を施した。別の群のブタに、冠動脈閉塞を伴わない偽処置を施した（塗りつぶされていない円、ｎ＝５）。７日後、梗塞を起こしたブタを、クエン酸／生理食塩水ビヒクル（２ｍＬ、塗りつぶされた正方形）、１ｍｇ（塗りつぶされた円）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（２００ｎｇ）（塗りつぶされたひし形）の盲検化された心外膜注射に無作為に割り付けた。この用量／体積を、梗塞周囲領域に、２０本の別の注射（各１００μＬ）として投与した。注射の２か月後に、左室機能を、侵襲的に測定した。示されるのは、個々のデータおよび平均±ＳＥＭである。
【図１６】心筋梗塞を施されたミニブタにおける、経時的最小左室圧発生（ｄＰ／ｄｔ  ｍｉｎ）に対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。ミニブタに、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的閉塞を施した。別の群のブタに、冠動脈閉塞を伴わない偽処置を施した（塗りつぶされていない円、ｎ＝５）。７日後、梗塞を起こしたブタを、クエン酸／生理食塩水ビヒクル（２ｍＬ、塗りつぶされた正方形）、１ｍｇ（塗りつぶされた円）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（２００ｎｇ）（塗りつぶされたひし形）の盲検化された心外膜注射に無作為に割り付けた。この用量／体積を、梗塞周囲領域に、２０本の別の注射（各１００μＬ）として投与した。注射の２か月後に、左室機能を、侵襲的に測定した。示されるのは、個々のデータおよび平均±ＳＥＭである。
【図１７】心筋梗塞を施されたミニブタにおける、収縮機能（変力性、ＥＳＰＶＲ）に対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。ミニブタに、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的閉塞を施した。別の群のブタに、冠動脈閉塞を伴わない偽処置を施した（塗りつぶされていない円、ｎ＝５）。７日後、梗塞を起こしたブタを、クエン酸／生理食塩水ビヒクル（２ｍＬ、塗りつぶされた正方形）、１ｍｇ（塗りつぶされた円）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（２００ｎｇ）（塗りつぶされたひし形）の盲検化された心外膜注射に無作為に割り付けた。この用量／体積を、梗塞周囲領域に、２０本の別の注射（各１００μＬ）として投与した。注射の２か月後に、左室機能を、侵襲的に測定した。示されるのは、個々のデータおよび平均±ＳＥＭである。
【図１８】心筋梗塞を施されたミニブタにおける、拡張機能（コンプライアンス、ＥＤＰＶＲ）に対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。ミニブタに、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的閉塞を施した。別の群のブタに、冠動脈閉塞を伴わない偽処置を施した（塗りつぶされていない円、ｎ＝５）。７日後、梗塞を起こしたブタを、クエン酸／生理食塩水ビヒクル（２ｍＬ、塗りつぶされた正方形）、１ｍｇ（塗りつぶされた円）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（２００ｎｇ）（塗りつぶされたひし形）の盲検化された心外膜注射に無作為に割り付けた。この用量／体積を、梗塞周囲領域に、２０本の別の注射（各１００μＬ）として投与した。注射の２か月後に、左室機能を、侵襲的に測定した。示されるのは、個々のデータおよび平均±ＳＥＭである。
【図１９】心筋梗塞を施されたミニブタにおける、前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）に対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。ミニブタに、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的閉塞を施した。別の群のブタに、冠動脈閉塞を伴わない偽処置を施した（塗りつぶされていない円、ｎ＝５）。７日後、梗塞を起こしたブタを、クエン酸／生理食塩水ビヒクル（２ｍＬ、塗りつぶされた正方形）、１ｍｇ（塗りつぶされた円）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（２００ｎｇ）（塗りつぶされたひし形）の盲検化された心外膜注射に無作為に割り付けた。この用量／体積を、梗塞周囲領域に、２０本の別の注射（各１００μＬ）として投与した。注射の２か月後に、左室機能を、侵襲的に測定した。示されるのは、個々のデータおよび平均±ＳＥＭである。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｃ：心筋梗塞を施されたミニブタにおける、梗塞サイズに対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよび組換えヒトＶＥＧＦ−Ａの効果。梗塞サイズは、クエン酸／生理食塩水（塗りつぶされた正方形）、または１ｍｇ（塗りつぶされた円）もしくは１０ｍｇ（塗りつぶされた三角形）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（２００ｎｇ）（塗りつぶされたひし形）を心外膜に注射されたミニブタにおいて、左室全体の梗塞サイズ（切片２、３、４、および５、図２０Ａ）、左室中央の梗塞サイズ（切片３および４、図２０Ｂ）、および左室の最も中心部の梗塞サイズ（切片４、パネル  図２０Ｃ）として示した。注射は、左前下行枝の永久的閉塞を通した心筋梗塞の誘発の７日後に施した。注射の２か月後に、梗塞サイズを測定した。示されるのは、平均±ＳＥＭである。
【図２１】実施例１４における試験１中のマウスの体重。各マウスの体重は、各撮像時点で記録した。示されたデータは、平均±ＳＥＭ、黒色バー；単回注射されたビヒクル、斜線バー；２回注射されたビヒクル、灰色バー；単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、横線バー；２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、＊；ｐ＜０．０５（単回注射されたビヒクルに対する２回注射されたビヒクルに対して）である。
【図２２】実施例１４における試験１におけるマウスの空腹時および食後血糖測定。第０日に、４時間の絶食期間後に、血糖を測定した。第１８日に、食後血糖を測定した。示されたデータは、平均±ＳＥＭ、黒色バー；単回注射されたビヒクル、斜線バー；２回注射されたビヒクル、灰色バー；単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、横線バー；２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、＊；ｐ＜０．０５（単回注射されたビヒクルに対する単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡに対して）である。
【図２３】実施例１４における試験１についての創傷治癒曲線。３人の観察者からの中央値の平均の正規化された開放創面積を、手術後の日数に対してプロットする。示されたデータは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５（それぞれ第６日の単回（塗りつぶされた円）および２回（塗りつぶされていない円）注射されたビヒクルに対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射（塗りつぶされていない正方形）、および、それぞれ第１０日のビヒクル２回注射に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射に対して）である。塗りつぶされた正方形；単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図２４】実施例１４における試験１からの創傷治癒曲線の三次スプライン補間。２５％、５０％、および７５％閉鎖までのおよその時間に対して、水平な灰色の破線によって明らかにされる通りの三次スプライン補間を作成した。示されたデータは、３人の観察者からの中央値の正規化された開放創面積の平均である。Φ；ｐ＜０．０５（ビヒクル単回注射（塗りつぶされた円）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射（塗りつぶされていない正方形）に対して）。＃；ｐ＜０．０５（ビヒクル２回注射（塗りつぶされていない円）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射に対して）。塗りつぶされた正方形；単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図２５】実施例１４における試験１における時点間の創傷治癒（％）。各時点間の創傷閉鎖の平均パーセントを、正規化された創傷面積データを使用して算出した。示されたデータは、平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５（それぞれ第３から６日についての、ビヒクル２回（斜線バー）および単回注射（黒色バー）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射（横線バー）に対して、より高い平均パーセント創傷閉鎖について、およびそれぞれ第１０から１３日についての、ビヒクル２回および単回注射に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ単回注射（灰色バー）に対して、より低い平均創傷閉鎖について）である。
【図２６】実施例１４における試験１における創傷のヘマトキシリン−およびエオシン−染色された切片の代表的な画像。Ａ；単回注射されたビヒクル、Ｂ；２回注射されたビヒクル、Ｃ；単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、Ｄ；２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図２７】実施例１４における試験１における創傷のＣＤ３１染色された切片の代表的な画像。矢印は、強いＣＤ３１染色の領域を示す。Ａ）単回ビヒクル、Ｂ）２回ビヒクル、Ｃ）単回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、Ｄ）２回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図２８】実施例１４における試験１におけるＣＤ３１染色の定量化。パネルＡからＤは、得られた代表的な画像であり、パネルＥからＨは、ＣＤ３１陽性染色（ブラウンチャンネル）の代表的なしきい値処理された画像である。ＡおよびＥ；単回ビヒクル、ＢおよびＦ；２回ビヒクル、ＣおよびＧ；単回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、ＤおよびＨ；２回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、Ｉ；ＣＤ３１染色の面積（パーセント）（黒画素によってカバーされる面積）の定量化。黒色バー；単回注射されたビヒクル、斜線バー；２回注射されたビヒクル、灰色バー；単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、横線バー；２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図２９】実施例１４におけるウエスタンブロットを用いる下流ＶＥＧＦシグナル伝達分析（試験１）。上パネル；第０日でのビヒクルの単回投与、第０日および３日でのビヒクルの２回投与、第０日でのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの単回投与、および第０日および３日でのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの２回投与を受けたマウスからの第１８日試料のｐＡＫＴおよびＡＫＴブロット。下パネル；ｐＡＫＴ／ＡＫＴの定量化された比は、治療群間で統計的な差を示さない。左バー；単回ビヒクル注射、左内側バー；２回ビヒクル注射、右内側バー；単回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射、右バー；２回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射。
【図３０】実施例１４における試験１から第１８日に回収されたマウス創傷におけるｐＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦ−Ａのウエスタンブロット分析。上パネル；第０日でのビヒクルの単回投与、第０日および３日でのビヒクルの２回投与、第０日でのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの単回投与、および第０日および３日でのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの２回投与を受けたマウスからの第１８日試料のｐＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＡブロット。下パネル；ｐＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ２の定量化された比は、治療群間で統計的な差を示さない。左バー；単回ビヒクル注射、左内側バー；２回ビヒクル注射、右内側バー；単回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射、右バー；２回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射。
【図３１】実施例１４における試験２中のマウスの体重。各マウスの体重は、各撮像時点で記録した。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。左バー；２回注射されたビヒクル、右バー：２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図３２】実施例１４における試験２におけるマウスにおける空腹時および食後血糖。第０日に、４時間の絶食期間後に、血糖を測定した。第１８日に、食後血糖を測定した。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。左バー；２回注射されたビヒクル、右バー：２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ。
【図３３】酸素感受性ナノ粒子のインビボ適用の図。Ａ）全層皮膚創傷内のナノ粒子の適用。励起時に、ナノ粒子は、強い室温蛍光（Ｂ）および強い酸素依存性リン光（Ｃ）を放出した。創傷床内の酸素の相対レベルを報告するために、蛍光とリン光との間の比のレシオ測定画像を構築する（Ｄ）。
【図３４】実施例１４における試験２における創傷床内の相対的酸素化レベルのレシオ測定画像。各時点についての、２回ビヒクル（上半分）および２回ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（下半分）で治療された創傷についての、代表的な明視野およびレシオ測定画像。創傷境界は、黒で輪郭が描かれる。
【図３５】創傷床における酸素感受性ナノ粒子からの蛍光およびリン光の画像分析を介する酸素化の定量化。それぞれの未加工の蛍光対リン光画像の平均グレー値を、創傷床について算出した。示されたデータは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５（ビヒクル２回注射（左バー）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射（右バー）に対して、平均グレー値について）である。
【図３６】実施例１４における試験２における創傷治癒曲線。３人の独立した観察者からの中央値の平均の正規化された開放創面積を、手術後の日数に対してプロットする。示されたデータは、平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５（それぞれ第６日での、ビヒクル２回注射（塗りつぶされていない円）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射（塗りつぶされていない正方形）に対して、より小さい開放創面積について）である。曲線下面積は、それぞれ、ビヒクル２回注射について６４１．３１、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射について６０４．３５であった。
【図３７】実施例１４における試験２からの創傷治癒曲線の三次スプライン補間。２５％、５０％、および７５％閉鎖までのおよその時間に対して、灰色の破線によって明らかにされる通りの三次スプライン補間を作成した。示されたデータは、３人の観察者からの中央値の正規化された開放創面積の平均である。＃；ｐ＜０．０５（２回ビヒクル注射（塗りつぶされていない円）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射に対して）。
【図３８】実施例１４における試験２における時点間の創傷治癒（％）。各時点間の創傷閉鎖の平均パーセントを、正規化された創傷面積データを使用して算出した。示されたデータは、平均±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５（第３〜６日について、ビヒクル２回注射（左バー）に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射（右バー）に対して、より大きい創傷閉鎖の平均パーセントについて）である。
【図３９】マウスの耳における高用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡに対する血管反応の光音響顕微鏡分析。第１行；血管構造；第２行；ｓＯ２（％）；第３行；血流速度（ｍｍ／ｓ）。破線円；注射部位。第３行における矢印；血流が有意に上方調節された血管。第１行の上の表示は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射（１００μｇ）からの時間を示す。
【図４０】高用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを皮内注射されたマウスの耳における新生血管形成および血管形成。１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを皮内注射されたマウスの耳における新生血管（第２行、矢印によって標識）および血管形成の拡大画像。拡大された領域は、第１行における破線正方形によって示される。第１行の上の表示は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射（１００μｇ）からの時間を示す。
【図４１】マウスの耳における低用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡに対する血管反応の光音響顕微鏡分析。第１行；血管構造；第２行；ｓＯ２（％）；第３行；血流速度（ｍｍ／ｓ）。破線円；注射部位。第１行の上の表示は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射（１０μｇ）からの時間を示す。
【図４２】マウスの耳におけるヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質に対する血管反応の光音響顕微鏡分析。第１行；血管構造；第２行；ｓＯ２（％）；第３行；血流速度（ｍｍ／ｓ）。破線円；注射部位。第１行の上の表示は、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質の皮内注射（１μｇ）からの時間を示す。明白な血流上方調節を伴う血管は第３行において矢印で示す。
【図４３】マウスの耳におけるクエン酸／生理食塩水に対する血管反応の光音響顕微鏡分析。第１行；血管構造；第２行；ｓＯ２（％）；第３行；血流速度（ｍｍ／ｓ）。破線円；注射部位。第１行の上の表示は、クエン酸／生理食塩水の皮内注射（１０μｇ）からの時間を示す。
【図４４】マウスの耳における血管反応に対する、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質、およびクエン酸／生理食塩水の効果。マウスの耳におけるＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１００μｇ、塗りつぶされた正方形）、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質（１μｇ、塗りつぶされた三角形）、またはクエン酸／生理食塩水（１０μＬ、塗りつぶされた円）の皮内注射によって誘導される、短時間および長期の血管反応（血管径、左パネル、および容積測定的な血流、右パネル）の定量分析。示された値は、平均±ＳＤ、ｎ＝３／群である。
【図４５】マウスの耳におけるＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射後の、微小血管血流および酸素飽和度に対する影響。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１００μｇ）を、マウスの耳に皮内注射した。微小血管血流（パネルＡ）および酸素飽和度（パネルＢ）を、注射前（ベースライン）および７日後に評価した。
【図４６】マウスの耳における組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の注射後の、微小血管血流および酸素飽和度に対する影響。組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（１μｇ）を、マウスの耳に皮内注射した。微小血管血流（パネルＡ）および酸素飽和度（パネルＢ）を、注射前（ベースライン）および７日後に評価した。
【図４７】マウスの耳におけるクエン酸／生理食塩水ビヒクルの注射後の、微小血管血流および酸素飽和度に対する影響。クエン酸／生理食塩水ビヒクル（１０μＬ）を、マウスの耳に皮内注射した。微小血管血流（パネルＡ）および酸素飽和度（パネルＢ）を、注射前（ベースライン）および７日後に評価した。
【図４８】図４８Ａ−４８Ｂ：実施例１６についての実験設計を、図４８Ａに例示する。実施例１６についてのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射の位置を、図４８Ｂに例示する。
【図４９】ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを皮内注射されたウサギからの微小透析溶出液のヒトＶＥＧＦ−Ａ濃度。ウサギ後脚の皮内に挿入された１００ｋＤａ微小透析プローブからの溶出液のヒトＶＥＧＦ−Ａの濃度。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。ｔ＝０時間で微小透析を開始し、ｔ＝１時間でＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射（各５０μｇ）の４本の皮内注射を施した。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ、３３．４ｐｇ／ｍＬ）を示す。各ウサギ（ｎ＝４ウサギ）に２つのプローブを挿入した。
【図５０】図５０Ａ−５０Ｃ：インビボでの心筋梗塞を施されたブタにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後の、毛細血管密度（図５０Ａ）、細動脈密度（図５０Ｂ）、および線維症（図５０Ｃ）に対する効果。ミニブタに、左前下行枝の永久的結紮を施し、７日後、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１ｍｇ、塗りつぶされた灰色バー（ｎ＝８）、または１０ｍｇ、斜線バー（ｎ＝８））またはクエン酸／生理食塩水（塗りつぶされた黒色バー、ｎ＝８）を心外膜に注射した。別の群の動物は、偽処置を受け（冠動脈は結紮されず）、心外膜注射も施さなかった（白抜きバー、ｎ＝５）。結紮の２か月後、動物を生命終焉させ、梗塞周囲（境界）域における毛細血管密度（図５０Ａ）の評価のために心組織を回収した。示されるのは、平均±ＳＥＭである。＊；Ｐ＜０．０５および＊＊＊；Ｐ＜０．００１（クエン酸／生理食塩水治療された動物に対して）（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定）。図５０Ｂでは、結紮の２か月後、動物を生命終焉させ、梗塞周囲（境界）域における細動脈密度の評価のために心組織を回収した。示されるのは、平均±ＳＥＭである。＊＊；Ｐ＜０．０（クエン酸／生理食塩水治療された動物に対して）（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定）。図５０Ｃでは、結紮の２か月後、動物を生命終焉させ、梗塞を起こした領域から離れた線維症（コラーゲン沈着）の評価のために心組織を回収した。示されるのは、平均±ＳＥＭである。＊；Ｐ＜０．０５および＊＊；Ｐ＜０．０１（クエン酸／生理食塩水治療された動物に対して）（一元配置ＡＮＯＶＡおよびダネットの事後検定）。
【図５１】ヒト大動脈平滑筋細胞（ｈＡｏＳＭＣ、塗りつぶされていない円）における、および人工多能性細胞から誘導されたヒト心筋細胞（ｈｉＰＳ−ＣＭ、塗りつぶされた三角形）における、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡトランスフェクション後の、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の時間プロフィール。示されたデータは、平均±ＳＥＭである。
【図５２】図５２Ａ−５２Ｂ：図５２Ａは、組織回収前の、３、７、または１４日間の、梗塞を起こしていない正常なマウス心臓（対照）における、および左前下行枝の永久的閉塞を施された心臓における、心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）のマーカーとしてのウィルムス腫瘍１転写因子（Ｗｔ−１）の免疫組織化学を例示する。矢印は、Ｗｔ−１発現を示す。図５２Ｂは、組織回収前の、３、７、または１４日間の、梗塞を起こしていない正常なマウス心臓（対照）における、および左前下行枝の永久的閉塞を施された心臓における、Ｗｔ−１＋細胞の存在のスコアリングを例示する。ＭＩ；心筋梗塞。＊；Ｐ＜０．０５、＊＊＊；Ｐ＜０．００１（対照（各研究群内にｎ＝３〜５）に対して）。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
５．詳細な説明
言及したすべての参考文献の全体を、参照によって本明細書に組み込む。
【０１１５】
前述の説明および付随する図面において与えられる教示の利益を有する、本明細書で説明する本開示の多くの改変および他の実施態様は、これらの開示が属する分野の技術者に思い浮かぶであろう。したがって、本開示は、開示される具体的実施態様に限定されるべきではないこと、また、改変および他の実施態様が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることが理解されよう。本明細書では特定の用語が用いられるが、これらは、一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定の目的では使用されない。
【０１１６】
単位、接頭辞、および記号は、それらのＳＩ承認形で表示することができる。別に示されない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’方向に左から右に書かれ；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシ方向に左から右に書かれる。数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。アミノ酸は、本明細書では、その一般に知られている３文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている１文字記号によって称することができる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている１文字コードによって称することができる。下で定義する用語は、明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。
【０１１７】
５．１．定義
別に具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。別に言及しない限り、本明細書で用いられるまたは企図される技術は、当分野の技術者に周知の標準の方法論である。本開示の実施は、別に示されない限り、当分野の技術内である、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学、および組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いることとなる。材料、方法、および例は、例示に過ぎず、限定ではない。以下のものは、例示の目的で示され、本開示の範囲を限定することを意図しない。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、本明細書（それに特許請求の範囲全体が組み込まれる）に記述する数値パラメータは、概数であり、特定の実施態様によって得られることが求められる所望される特性に応じて変動し得る。いくつかの実施態様では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして、また、通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本開示の広範にわたるいくつかの実施態様を記述する数値範囲およびパラメータは概数であるが、具体的な例において記述される数値は、可能な限り正確に報告される。本開示のいくつかの実施態様において示される数値は、そのそれぞれの試験測定において見られる標準偏差に必然的に起因する、いくらかの誤差を含有する可能性がある。本明細書の値の範囲の記述は、単に、範囲内にあるそれぞれ別の値を個々に言及する簡便表記方法としての役割を果たすことを意図するに過ぎない。本明細書において別に示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
便宜のために、本出願全体（明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む）において用いられるある種の用語を、ここに集める。別に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「投与すること」は、所望される部位または組織位置での医薬組成物または医薬製剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、少なくとも１つの改変ＲＮＡを含む医薬組成物または医薬製剤の、対象への配置を指す。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡを含む医薬組成物または医薬製剤は、対象における有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。すなわち、投与は、対象における所望される位置または組織への送達をもたらし、ここでは、改変ＲＮＡによって発現される少なくとも１部分のタンパク質は、所望される標的組織または標的細胞位置に位置される。
【０１２１】
投与は、筋肉内、経動脈的、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、心室内、皮内、心臓内、心外膜投与、門脈カテーテルを介するもの、冠静脈洞カテーテルを介するもの、および／または治療される領域への直接的投与であり得る。医薬組成物は、各投与経路のために、特別に配合され、投与特異的な医薬製剤がもたらされる。
【０１２２】
本明細書で使用される用語「組成物」は、一般に、何かを構成する少なくとも２つの部分または要素の組み合わせを意味すると理解される。例えば、本明細書で使用される組成物は、通常、本開示による少なくとも１種のポリヌクレオチド、一次構築物、または改変ＲＮＡと、適切な担体または賦形剤とを含む。
【０１２３】
用語「含む」、「有する」、および「含まれる」は、制約のない連結動詞である。これらの動詞の１つ以上のあらゆる形態または時制、例えば、「含む（三人称単数現在形）」、「含むこと」、「有する（三人称単数現在形）」、「有すること」、「含まれる（三人称単数現在形）」、および「〜を含めて」なども、制約がない。例えば、１つ以上のステップ「を含む（三人称単数現在形）」、「を有する（三人称単数現在形）」、または「が含まれる（三人称単数現在形）」いずれかの方法は、それらの１つ以上のステップのみを有することに限定されず、他の列挙していないステップも包含することができる。同様に、１つ以上の特徴「を含む（三人称単数現在形）」、「を有する（三人称単数現在形）」、または「が含まれる（三人称単数現在形）」いずれかの組成物は、それらの１つ以上の特徴のみを有することに限定されず、他の列挙していない特徴も包含することができる。本明細書に記載したすべての方法は、本明細書に別に示されない、または文脈によって別に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。ある種の実施態様に関して提供される、ありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば「などの」）の使用は、本明細書では、本開示を、単に、より明らかにするためのものであり、別に主張される本開示の範囲に対する制限を与えない。本明細書中の言葉は、本開示の実施に不可欠であるものとしてのいずれかの主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１２４】
用語「本質的に〜からなるは、特許請求の範囲の範囲を、指定した材料またはステップおよび主張される発明の「基本のおよび新規の特性に実質的に影響を与えないもの」に限定する。ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  ＵＳＰＱ
４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（強調は原本によるもの）では、上訴人が主張した分散剤を必要とする従来の技術の作動流体は、ある種の構成要素「から本質的になる
」機能性流体に限定される特許請求の範囲から除外された。
【０１２５】
用語「からなる」は、実施態様の説明において列挙されていないあらゆる要素を除外する、本明細書に記載した通りの組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【０１２６】
用語「疾患」または「障害」は、本明細書では互換的に使用され、体のまたはいくつかの器官の状態の、いずれかの変化、機能の実行の中断または妨害、および／または悩んでいる人または人と接触するものに、不快、機能障害、苦痛、またはさらには死亡などの症状が起こることを指す。疾患または障害はまた、不健康（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、病的状態（ａｉｌｉｎｇ）、慢性的な軽い病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、慢性病（ｍａｌａｄｙ）、不調（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、疾病（ｉｌｌｎｅｓｓ）、愁訴（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、体調不良（ｉｎｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、または病気（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）に関連し得る。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、用語「ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患」は、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質または本明細書に開示する改変ＲＮＡなどのＶＥＧＦ−Ａタンパク質を産生する能力がある薬剤を含む医薬組成物または医薬製剤の投与後に、１つ以上の症状または臨床マーカーの改善を示す障害を指す。あるいは、疾患は、疾患の進行が、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質またはＶＥＧＦ−Ａタンパク質を産生する能力がある薬剤を含む医薬組成物または医薬製剤の投与と共に縮小または停止されるならば、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して「応答性」である。有益または所望される臨床結果としては、限定はされないが、１以上の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定（すなわち悪化せず）、疾患進行の遅れまたは緩徐化、疾患状態の回復または緩和、および寛解（部分か完全かにかかわらず）が挙げられる。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、用語「二価カチオン」は、２という正の原子価をもつイオン種を指す。例えば、マグネシウムイオンＭｇ２＋、およびカルシウムイオンＣａ２＋は、二価カチオンである。
【０１２９】
「剤形」は、錠剤（コート錠、遅延放出型錠剤、分散性錠剤など）、カプセル剤、軟膏、または注射剤（粉末、溶液）などの、薬物（例えば改変ＲＮＡ）が製造および分配される物理的形態である。
【０１３０】
語句「薬物製品」は、必ずしもというわけではないが一般に、不活性成分と共に、活性な薬物成分（例えば改変ＲＮＡ）を含有する、完成した剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤などを意味する。
【０１３１】
用語「有効量」は、本明細書で使用する場合、疾患または障害の少なくとも１つ以上の症状を軽減させるのに、または所望される効果を提供するのに十分な、治療薬（例えば改変ＲＮＡ）、医薬組成物、または医薬製剤の量を指す。例えば、これは、心血管状態、または他の疾患もしくは障害を有する典型的な対象に投与された場合に、心機能不全または他の障害と関連する症状または臨床マーカーの治療的または予防的に有意な低下をもたらす量であり得る。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象のうちの１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からの（例えば転写による）ＲＮＡ鋳型の産生；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０１３３】
用語「製剤」または「医薬製剤」は、本明細書で使用する場合、特定の投与経路を介して哺乳類（例えば、それを必要とするヒト）に投与するのに適した薬学的に許容し得る担体／希釈剤／賦形剤と共に、活性な医薬成分（例えば改変ＲＮＡ）を含有する医薬混合物または溶液を含む組成物の型を指す。例えば、「製剤」は、本明細書で使用する場合、いくつかの経路の１つ以上を介する、例えば筋肉内、皮内、皮下、または心臓内経路による、門脈カテーテルを介する、冠静脈洞カテーテルを介する、および／または治療される領域への直接的投与による投与に適した送達剤および／または他の薬学的に許容し得る担体を含むように、特別に配合することができる。したがって、「製剤」は、特定の投与経路のために特別に配合された組成物であると理解することができる。製剤は、特定の剤形で存在する組成物であり得る。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、用語「改変ＲＮＡ」は、アデノシン（Ａ）（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３，４−ジオール）、グアノシン（Ｇ）（２−アミノ−９−［３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−３Ｈ−プリン−６−オン）、シチジン（Ｃ）（４−アミノ−１−［３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン−２−イル］ピリミジン−２−オン）、およびウリジン（Ｕ）（１−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］ピリミジン−２，４−ジオン）と比較して、または、ＲＮＡ分子内のＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、およびＵＭＰと比較して、１つ、２つ、または２つよりも多いヌクレオシド改変を含有するＲＮＡ分子、またはその部分を指す。ヌクレオシド改変の非限定的な例は、本明細書内の他の場所に提供される。主張される特定のＲＮＡのヌクレオチド配列が、天然に存在するＲＮＡ分子の配列と他の点で同一である場合、改変ＲＮＡは、天然の対応物中に存在するものとは異なる少なくとも１つの改変を有するＲＮＡ分子であると理解されよう。相違は、ヌクレオシド／ヌクレオチドに対する化学変化、または配列内のその変化の位置であり得る。一実施態様では、改変ＲＮＡは、改変されたメッセンジャーＲＮＡ（または「改変されたｍＲＮＡ」）である。
【０１３５】
本明細書で使用する場合、用語「生理的プロセスを調節すること」は、生体、および細胞または組織などのその一部の、多様な機能および物理的または化学的作用の調節を指す。例えば、ＶＥＧＦ−Ａが中心的役割を果たす生理的プロセスについては、調節には、血管形成を誘導すること、血管細胞増殖を刺激すること、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更すること、内皮化を上方調節すること、心筋再生を誘導すること、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させること、血管機能を改善すること、組織灌流および新しい血管の形成を増大させること、瘢痕組織を減少させること、前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ）を増大させること、最大圧発生（ｍａｘｉｍａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を増大させること、変力作用を増大させること、左室駆出率（ＬＶＥＦ）を増大させること、心機能不全に関連するバイオマーカー（例えば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ｈｓＴｎＴ、およびｈｓＴｎＩ）のレベルを低下させること、梗塞サイズを低下させること、心組織の線維症を軽減させること、および／または心機能を改善することが含まれ得る。
【０１３６】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」には、その最も広い意味では、ホスホジエステル結合を介して連結されたヌクレオチドのポリマーを含む、あらゆる化合物および／または物質が含まれる。これらのポリマーは、しばしば、サイズに応じてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと称される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書では互換的に使用される。
【０１３７】
語句「薬学的に許容し得る」は、本明細書では、妥当なベネフィット／リスク比に相応する、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わない
、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に適した、適切な医学的判断の範囲内である、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。薬物承認機関（例えば、ＥＭＡ、ＵＳ−ＦＤＡ）は、ガイドラインを提供し、薬学的に許容し得る化合物、材料、組成物、および／または剤形を承認する。例は、薬局方に列挙され得る。
【０１３８】
語句「薬学的に許容し得る賦形剤」は、本明細書では、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、薬学的に許容し得る材料を指すために用いられる。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。
【０１３９】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって共に連結される、アミノ酸残基（天然または非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用する場合、あらゆるサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。ポリペプチドは、単一分子でもあり得るし、二量体、三量体、または四量体などの多分子複合体でもあり得る。これらは、抗体またはインスリンなどの単鎖または多連鎖ポリペプチドを含むこともでき、また、会合または連結され得る。最も一般的には、多連鎖ポリペプチド中に、ジスルフィド結合が見られる。用語ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用することができる。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」は、本質的に２０種のアミノ酸のいずれかからなるポリマーである。「ポリペプチド」は、多くの場合、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、「ペプチド」は、多くの場合、小さいポリペプチドに関して使用されるが、これらの用語の使用法は、当技術分野で重なり合っており、また、多様である。用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、本明細書では、時として互換的に使用される。
【０１４１】
用語「組換え」は、本明細書で使用する場合、タンパク質が、「異種核酸」の導入または天然の核酸の変更によって遺伝子操作されている核酸の使用を通じて原核または真核生物発現系に由来することを意味する。
【０１４２】
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計的有意性を指す。この用語は、差が存在するという統計的証拠を指す。これは、帰無仮説が実際には真である場合に帰無仮説を棄却することを決定する確率と定義することができる。この決定はしばしば、ｐ値を使用してなされる。当技術分野で周知である、有意性の他のあらゆる尺度を使用することができる。
【０１４３】
用語「対象」および「個人」は、本明細書では互換的に使用され、本明細書に記載した方法および組成物を用いた、予防的治療を含めた治療が提供される動物、例えばヒトを指す。ヒト対象などの特定の動物に対して特異的である状態または疾患状態の治療については、用語「対象」は、その特定の動物を指す。
【０１４４】
用語「を実質的に含まない」は、組成物または製剤が、意味がある量の特定の要素を有しない条件を指す。例えば、二価カチオン「を実質的に含まない」組成物または製剤は、二価カチオンをほとんどまたは全く含有しない。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、疾患、障害、および／または状態「を患う」対象または個人は、疾患、障害、および／または状態の１つ以上の症状と診断されているまたは呈する。いくつかの実施態様では、対象は、疾患、障害および／または状態を患うリスクがある可
能性がある。
【０１４６】
用語「組織」は、ある種の特別な機能を共に実施する、同様に特化された細胞の群または層を指す。用語「組織特異的な」は、特定の組織からの細胞の起源または決定的な特性を指す。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、用語「治療する」または「治療」または「治療すること」は、その目的が、疾患の発生を予防するまたは遅らせる、例えば、心機能障害の発生を減速させること、または、血管性の状態、疾患、または障害の少なくとも１つの有害作用または症状、例えば不十分なまたは望ましくない心機能を特徴とするいずれかの障害などを軽減させることである、治療的処置を指す。
【０１４８】
本開示が、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、したがって変わり得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語法は、特定の実施態様を説明する目的のためだけであり、本開示の範囲を限定することを意図せず、本開示は、もっぱら特許請求の範囲によって定義される。
【０１４９】
５．２．ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡ
インビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボにかかわらず、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）を、細胞に送達すること、例えば核酸の細胞内翻訳およびコードされた対象となるポリペプチドの産生を引き起こすことができることは、治療法、診断法、試薬の分野において、また、生物検定にとって非常に興味深い。
【０１５０】
天然に存在するＲＮＡは、４種の基本のリボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰから合成されるが、転写後に改変されたヌクレオチドも含有する可能性がある。さらに、ＲＮＡ内には、およそ１００種の異なるヌクレオシド改変が特定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ  ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．，Ｔｈｅ
ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９  ｕｐｄａｔｅ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，（１９９９）２７：１９６−１９７）。
【０１５１】
本開示によれば、これらのＲＮＡは、当分野の他のＲＮＡ分子の（例えば、投与時の自然免疫応答および急速分解を活性化する）欠点を回避するためのものとして改変されることが好ましい。したがって、これらのポリヌクレオチドは、改変ＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、対象への投与時の自然免疫応答を回避する。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡの半減期は、非改変ＲＮＡと比較して延長される。
【０１５２】
好ましい実施態様では、ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用する場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、対象となるポリペプチドをコードする、また、インビトロ、インビボ、インサイチュ、またはエクスビボで、翻訳されて、コードされた対象となるポリペプチドを産生する能力がある、あらゆるポリヌクレオチドを指す。
【０１５３】
図１Ａに表す通り、従来、ｍＲＮＡ分子の基本構成要素には、少なくとも、翻訳領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’キャップ、およびポリＡ鎖が含まれる。この野生型モジュール構造の構築に関して、本開示は、モジュール構造化を維持するが、ポリヌクレオチドに有用な特性（いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的誘発の欠如が含まれる）を付与する１つ以上の構造的および／または化学的改変もしくは変更を含む、ポリヌクレオチドまたは一次ＲＮＡ構築物を提供することによって、従来のｍＲＮＡ分子の機能性の範囲を拡大する。
【０１５４】
改変ＲＮＡは、例えば糖、核酸塩基（例えば、ピリミジン核酸塩基の原子を、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたチオール、任意に置換されたアルキル（例えば、メチルもしくはエチル）、またはハロ（例えば、クロロもしくはフルオロ）と置き換えるまたは置換することによるものなどの、核酸塩基の１つ以上の改変）、またはヌクレオシド間結合（例えば、ホスホジエステル骨格に対する１つ以上の改変）に対するものなどの、標準のＲＮＡヌクレオチド鎖と比較した場合の、いずれかの有用な改変を含むことができる。改変ＲＮＡは、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘発剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒活性ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどを任意に含むことができる。
【０１５５】
米国特許出願公開第２０１４／００７３６８７号明細書は、いくつかの有用な改変、例えば、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、シュードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ−２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ−２，２，７Ｇ）から選択される少なくとも１つ以上の改変ヌクレオシドを伴う例示的な改変ＲＮＡを開示している。追加の改変は、２０１４年１０月７日に出願された米国特許出願公開第２０１５／００５１２６８号明細書、および２０１４年２月３日に出願された米国特許第９，０６１，０５９号明細書に記載されている。したがって、これらの改変のすべての内容全体を、参照によって本明細書に組み込む。追加の改変は、本明細書に記載される。
【０１５６】
非限定的な例としては、いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、改変されてＮ１−メチル−シュード−ＵＭＰが形成される、少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）が含まれ得る。いくつかの実施態様では、Ｎ１−メチル−シュード−ＵＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％という、配列中のＵＭＰの割合で、ＵＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＵＭＰが、Ｎ１−メチル−シュード−ＵＭＰによって置き換えられている。
【０１５７】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、改変されてメチル−ＣＭＰが形成される、少なくとも１つのシチジン一リン酸（ＣＭＰ）が（さらに）含まれ得る。いくつかの実施態様では、メチル−ＣＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＣＭＰの割合で、ＣＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＣＭＰが、５−メチル−ＣＭＰによって置き換えられている。
【０１５８】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、改変されてＮ６−メチル−ＡＭＰが形成される、少なくとも１つのアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）が（さらに）含まれ得る。いくつかの実施態様では、Ｎ６−メチル−ＡＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＡＭＰの割合で、ＡＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＡＭＰが、Ｎ６−メチル−ＡＭＰによって置き換えられている。
【０１５９】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、改変されて７−メチル−ＧＭＰが形成される、少なくとも１つのグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）が（さらに）含まれ得る。いくつかの実施態様では、７−メチル−ＧＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＧＭＰの割合で、ＧＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＧＭＰが、７−メチル−ＧＭＰによって置き換えられている。
【０１６０】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、シュードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシンアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ−２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ−２，２，７Ｇ）、およびＮ１−メチル−シュードウリジン、またはこれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１つの改変ヌクレオシドが（さらに）含まれ得る。それぞれの可能性および組み合わせは、本開示の別々の実施態様に相当する。
【０１６１】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、５’ジグアノシンキャップなどの５’キャップに対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、翻訳領域に対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、５’ＵＴＲに対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、３’ＵＴＲに対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ポリＡ鎖に対する改変を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、翻訳領域、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはポリＡ鎖に対する改変のいずれかの組み合わせを含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、アルカリホスファターゼで任意に処理することができる。
【０１６２】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、一般に心血管の生理機能、特に動脈形成の制御における中心的役割を果たす、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチド、すなわち、ＶＥＧＦタンパク質の大きなファミリーのいずれか１つをコードする（Ｈｏｌｍｅｓ  Ｄ．Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，（２００５）６（２）：２０９）。ＶＥＧＦの役割には、一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達、血管透過性、発生上および出生後の血管形成、腫瘍血管形成、動脈形成、内皮複製、および多能性心血管前駆細胞のための細胞運命スイッチの活性化も含まれる。
【０１６３】
ある特定のＶＥＧＦ遺伝子について、１以上のバリアントまたはアイソフォームが存在し得ることが、当分野の技術者によって理解されよう。本開示によるＶＥＧＦ−Ａポリペプチドの非限定的な例を、表１に列挙する。表１に開示する配列が、隣接領域の可能性を含むことが、当分野の技術者によって理解されよう。これらは、オープンリーディングフレームの５’（上流）または３’（下流）のいずれかに対して各ヌクレオチド配列内にコードされる。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド参照配列を教示することによって明確かつ具体的に開示される。１つ以上の利用可能なデータベースまたはアルゴリズムを利用することによって、５’および３’隣接領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、ＮＣＢＩ配列の隣接領域に含まれる特徴に注釈を施しており、これらは、当技術分野で利用可能である。
【０１６４】
【表１−１】
2019521976.tif 000002
【０１６５】
【表１−２】
2019521976.tif 000003
【０１６６】
ＶＥＧＦ−Ａポリペプチド、例えばヒトＶＥＧＦ−ＡポリペプチドをコードするＲＮＡ分子が、表１に列挙したＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡアイソフォームにしたがって設計できることが、当分野の技術者によって理解されよう。当業者は、一般に、残りのＶＥＧＦファミリーメンバーの複数のアイソフォームを熟知している。
【０１６７】
一実施態様では、本開示は、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチド（例えば配列番号２）をコードする改変ＲＮＡを提供する。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードし、ここでは、改変ＲＮＡは、配列番号１を含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ鎖、またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施態様では、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリＡ鎖、またはこれらのいずれかの組み合わせは、１以上の改変されたヌクレオチドを含むことができる。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、配列番号１である、図１Ｂに表す通りの構造を有することができる。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦポリペプチドをコードし、ここでは、改変ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列内に、１つ以上の改変されたＵＭＰヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡには、例えば、改変されてＮ１−メチル−シュード−ＵＭＰが形成される少なくとも１つのＵＭＰが含まれ得る。いくつかの実施態様では、Ｎ１−メチル−シュード−ＵＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＵＭＰの割合で、ＵＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＵＭＰが、Ｎ１−メチル−シュード−ＵＭＰによって置き換えられている。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦポリペプチドをコードし、ここでは、改変ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列内に、１つ以上のＣＭＰ改変ヌクレオチドを（さらに）含む。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡには、例えば、改変されてメチル−ＣＭＰが形成される少なくとも１つのＵＭＰが含まれ得る。いくつかの実施態様では、メチル−ＣＭＰは、０．１％、２％、３％、４％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＣＭＰの割合で、ＣＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＣＭＰが、５−メチル−ＣＭＰによって置き換えられている。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦポリペプチドをコードし、ここでは、改変ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列内に、１つ以上のＡＭＰ改変ヌクレオチドを（さらに）含む。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡには、例えば、改変されてＮ６−メチル−ＡＭＰが形成される少なくとも１つのＡＭＰが含まれ得る。いくつかの実施態様では、Ｎ６−メチル−ＡＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＡＭＰの割合で、ＡＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＡＭＰが、Ｎ６−メチル−ＡＭＰによって置き換えられている。
【０１７２】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦポリペプチドをコードし、ここでは、改変ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列内に、１つ以上の改変されたＧＭＰヌクレオチドを（さらに）含む。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡには、例えば、改変されて７−メチル−ＧＭＰが形成される少なくとも１つのＧＭＰが含まれ得る。いくつかの実施態様では、７−メチル−ＧＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、および１００％から選択される、配列中のＧＭＰの割合で、ＧＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施態様では、すべてのＧＭＰが、７−メチル−ＧＭＰによって置き換えられている。
【０１７３】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦポリペプチドをコードし、ここでは、この改変ＲＮＡは、配列番号１の核酸配列内に、１つ以上の改変されたヌクレオチドを（さらに）含む。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡには、例えば、５−メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、シュードウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシ  ウリジン（２’  ｄＵ）、４−チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’−Ｏ−メチルシチジン（Ｃｍ）、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチルグアノシン（ｍ−２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン（ｍ−２，２，７Ｇ）、およびＮ１−メチル−シュードウリジン、またはこれらのいずれかの組み合わせから選択される、少なくとも１つ以上の改変ヌクレオシドが含まれ得る。それぞれの可能性および組み合わせは、本開示の別々の実施態様に相当する。
【０１７４】
５．３．改変ＲＮＡを含む組成物
いくつかの実施態様は、開示した改変ＲＮＡを含む特定の製剤を含めた組成物に関する。いくつかの実施態様では、製剤は、薬剤として有効な量の１つ以上の改変ＲＮＡを含む。
【０１７５】
いくつかの実施態様では、医薬組成物は、脂質ベースの複合体、リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子などの中に、少なくとも１つ以上の改変ＲＮＡを含むことができる。これらの製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、または改変ＲＮＡによる細胞トランスフェクションを増大させる；および／またはコードされたタンパク質の翻訳を増大させることができる可能性があるので、一般に、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を、ポリヌクレオチド、一次構築物、または改変ＲＮＡによって誘導されるタンパク質産生の有効性を向上させるために使用することができる。一つのこうした例には、ポリプレックスプラスミドＤＮＡの有効な全身送達を可能にするための脂質封入の使用が含まれる（Ｈｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．（２００７）１５：７１３−７２０；その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチド、一次構築物、または改変ＲＮＡの安定性を増大させるために使用することができる。
【０１７６】
したがって、いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡの医薬組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主として脂質二重層から構成することができ、かつ栄養および医薬製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用することができる、人工的に調製される小胞である。リポソームは、様々なサイズのもの、例えば、限定はされないが、多重層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＭＬＶ）（直径が数百ナノメートルであり得る、かつ狭い水性の区画によって隔てられている連続する同心性の二重層を含有することができる）、小型単層小胞（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＳＵＶ）（直径が５０ｎｍ未満であり得る）、および大型単層小胞（ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶ）（直径が５０から５００ｎｍであり得る）であり得る。リポソーム設計には、リポソームの不健康組織への接着を向上させる、または、限定はされないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化させるために、限定はされないが、オプソニンまたはリガンドを含めることができる。リポソームは、医薬組成物の送達を向上させるために、低ｐＨまたは高ｐＨを含有することができる。
【０１７７】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡの医薬組成物は、リポプレックス、例えば、限定はされないが、ＡＴＵＰＬＥＸ（商標）システム、ＤＡＣＣシステム、ＤＢＴＣシステム、およびＳｉｌｅｎｃｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）からの他のｓｉＲＮＡ−リポプレックス技術、ＳＴＥＭＧＥＮＴ（登録商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）からのＳＴＥＭＦＥＣＴ（商標）、および核酸のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはプロタミンに基づく標的化および非標的化送達を含む（Ａｌｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（２００８）６８：９７８８−９７９８；Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，（２０１２）５０：７６−７８；Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，（２００６）１３：１２２２−１２３４；Ｓａｎｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，（２００６）１３：１３６０−１３７０；Ｇｕｔｂｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，（２０１０）２３：３３４−３４４；Ｋａｕｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，（２０１０）８０：２８６−２９３；Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｈｅｒ．，（２００９）３２：４９８−５０７；Ｗｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｈｅｒ．，（２００８）３１：１８０−１８８；Ｐａｓｃｏｌｏ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１２８５−１２９４；Ｆｏｔｉｎ−Ｍｌｅｃｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，（２０１１）３４：１−１５；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００５）２３：７０９−７１７；Ｐｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，（２００７）６；１０４：４０９５−４１００；ｄｅＦｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，（２００８）１９：１２５−１３２；これらすべて、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。
【０１７８】
いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡの医薬組成物は、固体脂質ナノ粒子を含む。固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）は、１０から１０００ｎｍの平均直径を有する球状であり得る。ＳＬＮは、親油性分子を可溶化することができ、かつ界面活性剤および／または乳化剤で安定化させることができる、固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施態様では、脂質ナノ粒子は、自己組織化脂質−ポリマーナノ粒子であり得る（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，（２００８），２（８），ｐｐ１６９６−１７０２（その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０１７９】
追加の脂質ベースの組成物は、米国特許出願公開第２０１５／００５１２６８号明細書（その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）に論じられている。したがって、いくつかの実施態様では、本開示による改変ＲＮＡの医薬製剤は、米国特許出願公開第２０１５／００５１２６８号明細書に論じられている通りに、脂質ベースの製剤中に配合される。
【０１８０】
本開示のいくつかの実施態様では、改変ＲＮＡの医薬製剤は、いかなる脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子など）も含まず、本明細書ではネイキッドＲＮＡ製剤と呼ばれる。国際公開第ＷＯ２０１２／１０３９８５号パンフレットは、ネイキッドＲＮＡが、二価カチオン、好ましくはカルシウムの存在下で配合された場合にのみ、細胞を透過することができることを示唆している。さらに、他の研究は、ネイキッドＲＮＡ分子をインビボで動物組織に誘導させるためにはカルシウムが必要であることを示唆および示している（Ｗｏｌｆｆ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９９），２４７，１４６５−１４６８）。同様に、Ｐｒｏｂｓｔらは、インビボでのネイキッドＲＮＡの注射が、注射液内のカルシウムの存在に強く依存することを示した（Ｐｒｏｂｓｔ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，（２００７）１４，１１７５−１１８０）。したがって、ネイキッドＲＮＡの細胞および組織への送達に取り組んでいるこれらの研究は、製剤中のカルシウムの必要性を強く示唆している。
【０１８１】
さらに、本開示のいくつかの実施態様では、ネイキッド改変ＲＮＡは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液と共に配合される。例えば、改変ＲＮＡは、二価カチオンを実質的に含まないｐＨ７．４  ＰＢＳ緩衝液と共に配合することができる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、カルシウムまたはマグネシウムを実質的に含まないｐＨ７．４  ＰＢＳ緩衝液と共に配合することができる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、カルシウムもマグネシウムも含有しないｐＨ７．４  ＰＢＳ緩衝液と共に配合することができる。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、ネイキッド改変ＲＮＡは、クエン酸生理緩衝液と共に配合される。例えば、改変ＲＮＡは、二価カチオンを実質的に含まないｐＨ７．０クエン酸生理緩衝液と共に配合することができる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、カルシウムまたはマグネシウムを実質的に含まないｐＨ７．０クエン酸生理緩衝液と共に配合することができる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、カルシウムもマグネシウムも含有しないｐＨ７．０クエン酸生理緩衝液と共に配合することができる。例えば、改変ＲＮＡは、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）を含有するｐＨ７．０クエン酸生理緩衝液（ここでは、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない）と共に配合することができる。
【０１８３】
いくつかの実施態様では、ネイキッド改変ＲＮＡは、トロメタミン（ＴＨＡＭ）緩衝液と共に配合される。例えば、改変ＲＮＡは、二価カチオンを実質的に含まないｐＨ８．０
ＴＨＡＭ緩衝液と共に配合することができる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、カルシウムまたはマグネシウムを実質的に含まないＴＨＡＭ緩衝液と共に配合することができる。いくつかの実施態様では、改変ＲＮＡは、カルシウムもマグネシウムも含有しないｐＨ８．０  ＴＨＡＭ緩衝液と共に配合することができる。例えば、改変ＲＮＡは、ｐＨ８．０  ＴＨＡＭ緩衝液（トロメタミンＡＫＡ  ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ここでは、ＴＨＡＭ緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない）と共に配合することができる。
【０１８４】
いくつかの実施態様では、ネイキッドＲＮＡ医薬製剤は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができ、これには、本明細書で使用する場合、限定はされないが、所望される特定の剤形に適合された、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤などが含まれる。賦形剤はまた、限定はされないが、ポリマー、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、およびそれらの組み合わせを含むことができる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤、およびその組成物を調製するための技術は、当技術分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｌｌｅｎ，Ｌｏｙｄ  Ｖ．，Ｊｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと；その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体の使用は、いずれかの従来の賦形剤媒体が、いずれかの望ましくない生物学的影響をもたらすまたは別の方式で医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な方式で相互作用することによって物質またはその誘導体と適合しない可能性がある場合を除いて、本開示の範囲内であると考えることができる。
【０１８５】
いくつかの実施態様では、ネイキッドＲＮＡ製剤は、薬剤として有効な量の１つ以上の改変ＲＮＡを含み、ここでは、製剤は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液を含み、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。いくつかの実施態様では、溶媒は、非水性溶媒である。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、ネイキッドＲＮＡ製剤は、薬剤として有効な量の１つ以上の改変ＲＮＡを含み、ここでは、製剤は、ＴＨＡＭ緩衝液を含み、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、ネイキッドＲＮＡ製剤は、薬剤として有効な量の１つ以上の改変ＲＮＡを含み、ここでは、製剤は、クエン酸生理緩衝液を含み、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。
【０１８８】
ある種の実施態様では、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤は、脂質ベースの複合体（
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）、０．１から１μｇ／μＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中である。いくつかの実施態様では、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤は、脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）、１から１０μｇ／μＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。いくつかの実施態様では、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤は、脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）、１０から５０μｇ／μＬの濃度のリン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。
【０１８９】
好ましい実施態様では、本開示による改変ＲＮＡを含むネイキッドＲＮＡ製剤は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、この製剤は、０．１から１μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、この製剤は、１から１０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、この製剤は、１０から５０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。
【０１９０】
いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液中に配合される、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡを含むネイキッドＲＮＡ製剤は、脂質ベースの製剤よりも対象に対する毒性が低い。
【０１９１】
５．４．ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療すること
ＶＥＧＦ−Ａの発現が不十分である対象は、限定はされないが、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患を含めた、多くの血管疾患を患う可能性がある。ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１以上の改変ＲＮＡ分子の直接的投与によって、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療することが、本開示の目標である。いくつかの実施態様では、ネイキッドＶＥＧＦ−Ａ  ＲＮＡは、脂質およびカルシウムを含まないクエン酸生理緩衝液中で対象に投与される。
【０１９２】
一般に、細胞に導入された外来性の核酸は、自然免疫応答を誘発し、インターフェロン（ＩＦＮ）産生および細胞死をもたらす。しかし、改変ＲＮＡは、これらの問題の少なくともいくつかを克服しており、インビボまたはエクスビボで、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）を細胞の内側に送達するための、例えば、核酸の細胞内翻訳およびコードされたタンパク質の産生を引き起こすための、治療法、診断法、試薬にとって、また、生物検定にとって、非常に興味深いものである。
【０１９３】
本明細書に記載した改変ＲＮＡ、および改変ＲＮＡから翻訳されたタンパク質は、治療薬として使用することができる。例えば、本明細書に記載した改変ＲＮＡは、対象に投与することができ、ここでは、改変ＲＮＡは、対象において、翻訳されて、いずれかのＶＥＧＦファミリーメンバーの治療用タンパク質、またはその断片を生じる。提供されるのは、ヒトおよび他の哺乳類における疾患または状態の治療のための方法である。ＶＥＧＦ−Ａに関する本明細書に記載した製剤はすべて、いずれかの他のＶＥＧＦファミリーメンバーと共に快適に使用することができる。
【０１９４】
いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む組成物および特定の製剤を、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、裂傷などの創傷の治癒、
重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患などの疾患の治療のために使用することができる。
【０１９５】
いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、駆出率が低下したまたは保たれた心不全を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、心筋梗塞後の心機能不全を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、虚血性心疾患を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、外傷または手術による血管損傷を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、創傷治癒において、例えば、裂傷を治癒させることにおいて使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、重症虚血肢のために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、肺高血圧症を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、末梢動脈疾患を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、腎疾患を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする１つ以上の改変ＲＮＡを含む製剤を、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患を治療するために使用することができる。
【０１９６】
本開示の他の態様は、それを必要とする対象への、改変されたＲＮＡを含む製剤の投与に関する。製剤の投与は、筋肉内、経動脈的、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、心室内、皮内、心臓内、心外膜投与、門脈カテーテルを介するもの、冠静脈洞カテーテルを介するもの、および／または治療される領域への直接的投与であり得る。
【０１９７】
しかし、本開示は、薬物送達の科学の進歩の可能性を考慮に入れた、あらゆる適切な経路による、ネイキッド改変ＲＮＡ分子または改変ＲＮＡ複合体、および／またはその医薬用、予防用、または診断用製剤の送達も包含する。
【０１９８】
非限定的な例としては、いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、筋肉内、皮内、皮下、心臓内、もしくは心外膜経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に筋肉内に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に皮内に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に皮下に投与される。
【０１９９】
いくつかの実施態様では、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、対象に心臓内に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、門脈カテーテルを介して対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、冠静脈洞カテーテルを介して対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、治療される領域への直接的投与によって、対象に投与される。例えば、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、直視下心臓手術中の損傷領域への直接的注射によって、対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、対象に心外膜に投与される。例えば、冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）を受けている患者では、製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与での固定投薬量で、心臓の外側から、患者に投与される。この段落内のそれぞれの実施態様では、「複数回投与」は、互いに、短い（１〜５分）、中程度の（６〜３０分）、または長い（３０分よりも長い、数時間、さらには数日）時間間隔だけ離すことができる。
【０２００】
製剤は、疾患、障害、および／または状態を治療するのに有効な、いずれかの量の投与を使用して、対象に投与することができる。必要とされる厳密な量は、対象の人種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、個別の製剤、その投与様式、その活性様式などに応じて、対象ごとに変わることとなる。しかし、製剤の１日の総使用量は、正確な医学的判断の範囲内で主治医によって決定することができることが理解されよう。任意の特定の患者にとっての、薬剤として有効な具体的な投与レベルは、治療される疾患およびその疾患の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な製剤；患者の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事；用いられる具体的な化合物の投与時刻、投与経路、および排出速度；治療の期間；用いられる具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物（例えば改変ＲＮＡ）、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含めた、様々な要因に応じて決まることとなる。
【０２０１】
ある種の実施態様では、本開示による製剤が、対象に投与され、ここでは、製剤は、脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）を含む。他の実施態様では、ネイキッド改変ＲＮＡは、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中で投与される。他の実施態様では、ネイキッド改変ＲＮＡは、カルシウムを含めた二価カチオンの非存在下で投与される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む心臓内または皮内投与のための製剤は、カルシウムもマグネシウムも含有しないクエン酸生理緩衝液中に配合される。いくつかの実施態様では、製剤は、０．１から１μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、１から１０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、１０から５０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。
【０２０２】
ある種の実施態様では、所望の治療的または予防的効果を得るために、本開示による製剤を、１日あたり対象の体重あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの改変ＲＮＡを送達するのに十分な投薬量レベルで、１日１回以上投与することができる。所望される投薬量は、２４時間の期間内での秒、分、または時間という時間をかけてボーラス投与でもしくは複数回投与で、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに、３日に１回、毎週、２週ごとに、３週ごとに、４週ごとに、または単回投与として１回送達することができる。ある種の実施態様では、所望される投薬量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の投与）を使用して送達することができる。
【０２０３】
いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、固定投薬量レベルで投与することができる。例えば、本開示による製剤は、投与あたりまたは総用量あたり約０．１ｍｇから約１ｍｇの固定投薬量レベルで投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、投与あたりまたは総用量あたり約１ｍｇから約１０ｍｇの固定投薬量レベルで投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、投与あたりまたは総用量あたり約１０ｍｇから約２５ｍｇの固定投薬量レベルで投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、投与あたりまたは総用量あたり約２５ｍｇから約５０ｍｇの固定投薬量レベルで投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、投与あたりまたは総用量あたり約５０ｍｇから約１００ｍｇの固定投薬量レベルで投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、投与あたりまたは総用量あたり約０．１ｍｇから約２５ｍｇの固定投薬量レベルで投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、固定投薬量で投与することができる。例えば、いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、投与あたりまたは総用量あたり、０．１ｍｇ固定投薬量で投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、投与あたりまたは総用量あたり、１ｍｇ固定投薬量で投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、投与あたりまたは総用量あたり、１０ｍｇ固定投薬量で投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、投与あたりまたは総用量あたり、２５ｍｇ固定投薬量で投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、投与あたりまたは総用量あたり、５０ｍｇ固定投薬量で投与することができる。いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、投与あたりまたは総用量あたり、１００ｍｇ固定投薬量で投与することができる。
【０２０４】
いくつかの実施態様では、本開示による製剤は、対象に投与され、ここでは、クエン酸生理緩衝液中に配合されるＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードするネイキッド改変ＲＮＡを含む製剤は、脂質ベースの製剤よりも対象に対する毒性が低い。本開示による製剤におけるＲＮＡ送達が原因の毒性の評価は、当技術分野で周知の方法によって求めることができる。例えば、典型的には、カチオン性脂質が、ＲＮＡ封入および安定性を向上させるために、ＲＮＡ治療法の脂質製剤に含められる。しかし、いくつかのカチオン性脂質は、膜構造の完全性を用量依存的に破壊する、細胞の溶解および壊死を引き起こす、および／ま
たは複数の遺伝子の発現を望ましくない様式で変える可能性がある（Ｘｕｅ  Ｈ．Ｙ．，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．，（２０１５）２１（２２）：３１４０−７；その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。したがって、毒性の例は、本開示による製剤におけるＲＮＡ送達が原因の、細胞の溶解および壊死、および／または複数の遺伝子の発現の変更の程度を測定することによって評価することができる。前臨床および臨床レベルでは、いくつかのリポプレックスの用量依存性の全身毒性が、十分に裏付けられている。肝臓内のクッパー細胞によるいくつかのリポプレックスの捕捉は、炎症反応を誘発する可能性があり、これは、肝臓に損傷を与え、主要肝機能指標のレベル上昇をもたらす可能性がある。白血球減少および血小板減少も起こる可能性がある（Ｚｈａｎｇ  Ｊ．，Ａｄｖ
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．，（２００５）５７（５）：６８９−６９８；その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。したがって、毒性の例は、本開示による製剤におけるＲＮＡ送達が原因の炎症反応を測定することによって評価することができる。さらに、毒性の例は、呼吸困難、低酸素、悪寒、背部痛、低血圧、および肝損傷などの、注入に伴う反応を測定することによって評価することができる。
【０２０５】
血管疾患を患う対象は、１つ以上の症状または臨床マーカーが低減するならば、治療に対して「応答性」である。あるいは、治療は、疾患の進行が縮小または停止されるならば、機能している。例えば、心不全（ＨＦ）は、心臓が弱くなり血液が充満されない、または血液および酸素の身体の必要性を満たすのに十分な血液を送り出すことができない場合に起こる。同様に、虚血性心疾患（ＩＨＤ）を患う患者は、狭窄した心臓動脈によって引き起こされる心臓の問題を有する。動脈が狭窄すると、心筋に到達する血液および酸素が少なくなる。微小血管機能障害、機能血管の喪失、および／または心組織の喪失の結果として、患者は、通常、心筋梗塞後の心機能不全を発症する。さらに、血管構造は、最も一般的には、穿通性の外傷または手術によって損傷される。糖尿病は、創傷治癒の多数の要素を損ない、糖尿病性の創傷治癒を患う患者は一般に、血管機能障害が原因で、血流が変化している。したがって、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍を患う患者は、通常、創傷治癒の低下または遅延を有する。重症虚血肢（ＣＬＩ）は、動脈の重度の閉塞であり、これは、四肢（手、足、および脚）への血流を著しく低下させ、激痛点、およびさらには皮膚潰瘍、ただれ（ｓｏｒｅ）、または壊疽に進行する。肺高血圧症（ＰＨまたはＰＨＴＮ）は、息切れ、眩暈、失神、脚のむくみ、および他の症状をもたらす、肺血管系として共に公知である肺動脈、肺静脈、または肺毛細血管における血圧の増大である。末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、脚、胃、腕、および頭部への−最も一般的には脚の動脈における末梢動脈の狭窄である。これらの状態は、心エコー図法、血液検査、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、心電図記録法、および他の適切な試験による確認を伴う様々な理学的検査に基づいて、臨床的に診断されることが通例である。例えば、重大な血管損傷の診断は、綿密な理学的検査および画像検査に依存する。したがって、患者が、理学的検査による、より深刻ではない症状、および／または心エコー図法、血液検査、ＭＲＩ、心電図記録法、または任意の他の適切なおよび／または通例の試験からの試験結果の向上を示すならば、これらの状態のいずれか１つの治療は、機能している。
【０２０６】
いくつかの実施態様では、血管疾患を患う対象は、心筋梗塞を経験している。いくつかの実施態様では、対象は、本明細書に開示する製剤での治療前の約１か月以内に心筋梗塞を経験した。
【０２０７】
いくつかの実施態様では、心筋梗塞は、心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）の活性化を時間と共に誘発する。いくつかの実施態様では、心筋梗塞を経験している対象は、心筋梗塞の数日後、好ましくはＥＰＤＣ活性化のピーク時に、本明細書に開示する製剤で治療される。いくつかの実施態様では、心筋梗塞を経験している対象は、心筋梗塞の約７日後、本明細書に開示する製剤で治療される。いくつかの実施態様では、心筋梗塞を経験している対象は、心筋梗塞の約１０日後、心筋梗塞の約２週後、心筋梗塞の約３週後、または心筋梗塞
の約６週後に、本明細書に開示する製剤で治療される。
【０２０８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した組成物または製剤での治療法は、駆出率が低下した心筋梗塞を治療することを含む。他の実施態様では、治療法は、駆出率が保たれた心不全を治療することを含む。いくつかの実施態様では、組成物または製剤は、健康な組織と梗塞を起こした組織との間の境界域に注射される。
【０２０９】
いくつかの実施態様では、血管疾患を患う対象は、冠動脈疾患、高血圧、糖尿病、心房細動、心臓弁膜症、心筋症、または感染症も患う。
【０２１０】
いくつかの実施態様では、血管疾患を患う対象は、左室機能不全を患っている。いくつかの実施態様では、対象は、約４０％未満の左室駆出率（ＬＶＥＦ）を有する。いくつかの実施態様では、対象は、約４５％未満のＬＶＥＦを有する。
【０２１１】
いくつかの実施態様では、対象は、駆出率が低下したまたは保たれた心不全を患っている。いくつかの実施態様では、駆出率が低下したまたは保たれた心不全を患う対象は、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡＦＣ）ガイドラインのステージＩＩ〜ＩＶに分類される。
【０２１２】
いくつかの実施態様では、対象は、駆出率が低下したまたは保たれた心不全を示す１つ以上のバイオマーカー（例えば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ｈｓＴｎＴ、またはｈｓＴｎＩ）のレベルが上昇している。いくつかの実施態様では、対象は、ＢＮＰ（ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）レベルが上昇している。いくつかの実施態様では、対象は、約１００ｐｇ／ｍＬのＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、約１００〜３００ｐｇ／ｍＬのＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、約３００〜６００ｐｇ／ｍＬのＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、約６００ｐｇ／ｍＬのＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、約６００〜９００ｐｇ／ｍＬのＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ（ｎ末端プロｂ型ナトリウム利尿ペプチド）レベルが上昇している。いくつかの実施態様では、対象は、約４５０ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、５０歳未満であり、かつ約４５０ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルである。いくつかの実施態様では、対象は、約９００ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、約５０から７５歳であり、かつ約９００ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルである。いくつかの実施態様では、対象は、少なくとも１８００ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルを有する。いくつかの実施態様では、対象は、約７５歳であり、かつ約１８００ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏ  ＢＮＰレベルである。いくつかの実施態様では、対象は、ｈｓＴｎＴ（高感度トロポニンＴ）が上昇している。いくつかの実施態様では、対象は、ｈｓＴｎＩ（高感度トロポニンＩ）が上昇している。
【０２１３】
いくつかの実施態様では、対象は、本明細書の製剤での治療前の約１か月以内に、約４５％未満のＬＶＥＦを有する心筋梗塞を経験している。
【０２１４】
いくつかの実施態様では、対象は、約４０％未満のＬＶＥＦ、少なくとも約６００ｐｇ／ｍＬのＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルを有する、駆出率が低下したまたは保たれた慢性虚血性心不全を患っており、ＮＹＨＡＦＣガイドライン上でステージＩＩ〜ＩＶに分類される。
【０２１５】
さらに、血管機能についての分子測定を使用して、全身的病態生理の向上を評価するこ
とができる。これらの測定の例としては、一酸化窒素（ＮＯ）利用可能性の亢進、血管形成／動脈形成の増加、および幹細胞の心組織への動員が挙げられる。したがって、血管疾患を患う患者は、これらの測定において分子機能の向上を示すならば、治療に対して「応答性」である。
【０２１６】
５．５．哺乳類の細胞、組織、または対象における生理的プロセスを調節すること
本開示の別の態様は、哺乳類の細胞、組織、または対象において生理的プロセスを調節するための、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡを含む組成物または特定の製剤の投与に関する。いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象における生理的プロセスを調節するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。非限定的な例としては、生理的プロセスの調節には、血管形成を誘導すること、血管細胞増殖を刺激すること、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させることおよび／または運命を変更すること、内皮化を上方調節すること、心筋再生を誘導すること、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させること、血管機能を改善すること、組織灌流および新しい血管の形成を増大させること、瘢痕組織を減少させること、前負荷動員一回仕事量を増大させること、最大圧発生を増大させること、変力作用を増大させること、左室駆出率を（例えば、約５から１０％）増大させること、心機能不全に関連するバイオマーカー（例えば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ｈｓＴｎＴ、およびｈｓＴｎＩ）のレベルを低下させること、梗塞サイズを低下させること、心組織の線維症を軽減させること、および／または心機能を改善することが含まれ得る。
【０２１７】
用語「接触させること」または「接触」には、細胞、組織、または対象を、本明細書に開示した通りの改変ＲＮＡと接触させることに関連して本明細書で使用する場合、改変ＲＮＡを細胞、組織、または対象と触れさせることまたは極めて近接させることが含まれる。したがって、いくつかの実施態様では、語句「接触させること」は、直接的または間接的であり得る曝露の方法を指す。ある方法では、こうした接触は、当技術分野で周知の任意の手段を介する、組成物の、細胞、組織、または対象への直接的注射を含む。別の実施態様では、接触させることはまた、間接的接触、例えば、組織を囲む局所的な媒体を介するもの、または当技術分野で公知の任意の経路を介するものも包含する。それぞれの可能性は、本開示の別の実施態様に相当する。
【０２１８】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において血管形成を誘導するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。血管形成を誘導することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｌｏｐｅｚ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，（１９９８）４０，２７２−２８１；Ｇａｌｉａｎｏ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，（２００４）１６４，１９３５−１９４７；Ｌｉｎ  Ｙ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，（２０１２）４（１４６）：１４６ｒａ１０９；Ｚａｎｇｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１３）１０，８９８−９０７（これらすべてを参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２１９】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において血管細胞増殖を刺激するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含
む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。血管細胞増殖を刺激することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｇａｌｉａｎｏ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，（２００４）１６４，１９３５−１９４７（その全体を参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２０】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、心外膜前駆細胞の、増殖を増大させるおよび／または運命を変更するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。心外膜前駆細胞の、増殖を増大させるおよび／または運命を変更することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｚａｎｇｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１３）１０，８９８−９０７（その全体を参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２１】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、内皮化を上方調節するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。内皮化を上方調節することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｇａｌｉａｎｏ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，（２００４）１６４，１９３５−１９４７（その全体を参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２２】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、心筋再生を誘導するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。心筋再生を誘導することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｚａｎｇｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１３）１０，８９８−９０７；Ｌｉｎ  Ｙ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，（２０１２）４（１４６）：１４６ｒａ１０９（これらを両方とも参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２３】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を
、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。創傷治癒のために組織移植片の血行再建を増大させることに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｔｏｈｙａｍａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｍｅｄ  Ｊ，（２００９）３２，１３３−１３９；Ｃｈｅｎ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｄ，（２０１２）４，４３０−４３４（これらを両方とも参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２４】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、血管機能を改善するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。血管機能を改善することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｌｏｐｅｚ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，（１９９８）４０，２７２−２８１；Ｔｉｏ  Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，（１９９９）１０，２９５３−２９６０；Ｓａｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，（２００１）３７，６１６−２３（これらすべてを参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２５】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、組織灌流および新しい血管の形成を増大させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。組織灌流および新しい血管の形成を増大させることに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｃｈｉａｐｐｉｎｉ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ．，（２０１５）１４，５３２−５３９；Ｌｉｎ  Ｙ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，（２０１２）４（１４６）：１４６ｒａ１０９；Ｚａｎｇｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１３）１０，８９８−９０７（これらすべてを参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２６】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、瘢痕組織を減少させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。瘢痕組織を減少させることに対する改変ＲＮＡの効果は、当
技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｒｏｓａｎｏ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１２）３，２３７−２４７；Ｇａｌｉａｎｏ  Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，（２００４）１６４，１９３５−１９４７；Ｌｉｎ  Ｙ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，（２０１２）４（１４６）：１４６ｒａ１０９；Ｚａｎｇｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３）１０，８９８−９０７（これらすべてを参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２７】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、心機能を改善するための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。心機能を改善することに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｒｏｓａｎｏ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｅｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１２）３，２３７−２４７；Ｌｉｎ  Ｙ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．，（２０１２）４（１４６）：１４６ｒａ１０９；Ｚａｎｇｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２０１３）１０，８９８−９０７（これらすべてを参照によって本明細書に組み込む）を参照のこと）。
【０２２８】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、前負荷動員一回仕事量を増大させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。前負荷動員一回仕事量を増大させることに対する改変ＲＮＡの効果は、当技術分野で周知の方法によって評価することができる（例えば、Ｆｅｎｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＣ，（１９９２），１９（７）：１５２２−３０を参照のこと）。
【０２２９】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、最大圧発生を増大させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。最大圧発生を増大させることに対する改変ＲＮＡの効果は、左室造影、冠動脈造影、心エコー図法、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャン、心電図同期心筋ＳＰＥＣスキャン、または心電図同期心筋ＰＥＴスキャンなどの、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。
【０２３０】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、変力作用を増大させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝
生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。変力作用を増大させることに対する改変ＲＮＡの効果は、左室造影、冠動脈造影、心エコー図法、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャン、心電図同期心筋ＳＰＥＣスキャン、または心電図同期心筋ＰＥＴスキャンなどの、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。
【０２３１】
いくつかの実施態様では、哺乳類の心臓細胞、組織、または対象において、左室駆出率（ＬＶＥＦ）を増大させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。左室駆出率を増大させることに対する改変ＲＮＡの効果は、左室造影、冠動脈造影、心エコー図法、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャン、心電図同期心筋ＳＰＥＣスキャン、または心電図同期心筋ＰＥＴスキャンなどの、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。いくつかの実施態様では、ＬＶＥＦは、約４％から１０％増大する。いくつかの実施態様では、ＬＶＥＦは、約５％から８％増大する。
【０２３２】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、心機能不全に関連するバイオマーカー（例えば、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＢＮＰ、ｈｓＴｎＴ、およびｈｓＴｎＩ）を低下させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。
【０２３３】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、梗塞サイズを低下させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。いくつかの実施態様では、梗塞サイズが低下する。いくつかの実施態様では、梗塞が排除される。梗塞サイズに対する改変ＲＮＡの効果は、左室造影、冠動脈造影、心エコー図法、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャン、心電図同期心筋ＳＰＥＣスキャン、または心電図同期心筋ＰＥＴスキャンなどの、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。
【０２３４】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞、組織、または対象において、線維症を軽減させるための方法は、哺乳類の細胞、組織、または対象を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。いくつかの実施態様では、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい
実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。いくつかの実施態様では、線維症が軽減される。いくつかの実施態様では、線維症が排除される。線維症に対する改変ＲＮＡの効果は、左室造影、冠動脈造影、心エコー図法、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャン、心電図同期心筋ＳＰＥＣスキャン、または心電図同期心筋ＰＥＴスキャンなどの、当技術分野で周知の方法によって評価することができる。
【０２３５】
５．６．哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させること
本開示の別の態様は、哺乳類の細胞または組織におけるインビボ、インビトロ、インサイチュ、またはエクスビボタンパク質発現のための、ＶＥＧＦ−Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡを含む組成物または特定の製剤の投与に関する。
【０２３６】
いくつかの実施態様は、哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法であって、哺乳類の細胞または組織を、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで、改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む方法に関する。
【０２３７】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法は、哺乳類の細胞または組織を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含む。
【０２３８】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法は、哺乳類の細胞または組織を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含み、ここでは、この組成物は、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液中に配合される。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む組成物は、クエン酸生理緩衝液を含む。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。
【０２３９】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法は、哺乳類の細胞または組織を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含み、ここでは、この組成物は、０．１から１μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、組成物は、１から１０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、組成物は、１０から５０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。
【０２４０】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法は、哺乳類の細胞または組織を、本開示による改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含み、ここでは、この組成物は、脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）中に配合される。
【０２４１】
いくつかの実施態様では、哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させるための方法は、哺乳類の細胞または組織を、クエン酸生理緩衝液中に配合された改変ＲＮＡを含む組成物と接触させることを含み、ここでは、この組成物は、脂質ベースの製剤よりも対象に対する毒性が低い。
【０２４２】
５．７．対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生させる方法
いくつかの実施態様は、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生させる方法であって、本開示
による改変ＲＮＡを含む組成物または特定の製剤を、対象に投与することを含む方法に関する。
【０２４３】
非限定的な例としては、いくつかの実施態様では、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生させる方法は、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤を、対象に投与することを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、クエン酸生理緩衝液中に配合される。いくつかの実施態様では、製剤は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、製剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。
【０２４４】
いくつかの実施態様では、製剤は、脂質、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、およびそれらの混合物から選択される、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。
【０２４５】
いくつかの実施態様では、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法は、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤を対象に投与することを含み、ここでは、対象は、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患っている。いくつかの実施態様では、対象は、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される疾患を患っている。いくつかの実施態様では、疾患は、駆出率が低下したまたは保たれた心不全．である。いくつかの実施態様では、疾患は、心筋梗塞後の心機能不全である。いくつかの実施態様では、疾患は、虚血性心疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、外傷または手術による血管損傷である。いくつかの実施態様では、疾患は、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍である。いくつかの実施態様では、疾患は、重症虚血肢である。いくつかの実施態様では、疾患は、肺高血圧症である。いくつかの実施態様では、疾患は、末梢動脈疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、腎疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患である。
【０２４６】
いくつかの実施態様では、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法であって、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤を対象に投与することを含み、ここでは、製剤は、筋肉内、皮内、皮下、もしくは心臓内、経路によって、門脈カテーテルを介して、冠静脈洞カテーテルを介して、および／または治療される領域への直接的投与によって、対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に筋肉内に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に皮内に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に皮下に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に皮下に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、対象に、心臓内に、好ましくは複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上の）投与で、固定投薬量で投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、門脈カテーテルを介して対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、冠静脈洞カテーテルを介して対象に投与される。いくつかの実施態様では、製剤は、治療される領域への直接的投与によって、対象に投与される。
【０２４７】
いくつかの実施態様では、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法は、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤を対象に投与することを含み、ここでは、製剤は、脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液を含む。好ましい実施態様では、改変ＲＮＡを含む製剤は、クエン酸生理緩衝液中に配合される。いくつかの実施態様では、
クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。
【０２４８】
いくつかの実施態様では、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法は、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤を対象に投与することを含み、ここでは、この製剤は、０．１から１μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、１から１０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、１０から５０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。
【０２４９】
いくつかの実施態様では、対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生する方法は、本開示による改変ＲＮＡを含む製剤を対象に投与することを含み、ここでは、この製剤は、クエン酸生理緩衝液を含み、かつ脂質ベースの製剤よりも対象に対する毒性が低い。
【０２５０】
５．８．製剤を調製するための方法
いくつかの実施態様は、製剤を調製するための方法であって、本開示による改変ＲＮＡを、脂質ベースの複合体（リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子など）、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、ＴＨＡＭ緩衝液、またはクエン酸生理緩衝液と組み合わせることを含む方法に関する。
【０２５１】
いくつかの実施態様は、製剤を調製する方法であって、改変ＲＮＡを、クエン酸生理緩衝液と組み合わせることを含む方法に関し、ここでは、製剤は、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患う対象を治療する；哺乳類の細胞、組織、または対象において生理的プロセスを調節する；哺乳類の細胞または組織においてＶＥＧＦ−Ａを発現させる；および／または対象においてＶＥＧＦ−Ａを産生させるのに有効である。
【０２５２】
いくつかの実施態様では、製剤を調製するための方法は、本開示による改変ＲＮＡを、クエン酸生理緩衝液と組み合わせることを含み、ここでは、製剤は、０．１から１μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、１から１０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施態様では、製剤は、１０から５０μｇ／μＬのクエン酸生理緩衝液中に配合される、ある濃度の改変ＲＮＡを含む。
【０２５３】
いくつかの実施態様では、製剤を調製するための方法は、改変ＲＮＡを、本開示にしたがってクエン酸生理緩衝液と組み合わせることを含み、ここでは、この製剤は、クエン酸生理緩衝液を含み、かつ脂質ベースの製剤よりも対象に対する毒性が低い。
【０２５４】
いくつかの実施態様では、製剤を調製するための方法は、改変ＲＮＡを、本開示にしたがってクエン酸生理緩衝液と組み合わせることを含み、ここでは、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムおよびマグネシウムを含めた二価カチオンを実質的に含まない。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液は、カルシウムもマグネシウムも含有しない。
【０２５５】
いくつかの実施態様では、製剤を調製するための方法は、改変ＲＮＡを、本開示にしたがってクエン酸生理緩衝液と組み合わせることを含み、ここでは、この製剤は、クエン酸生理緩衝液を含み、かつ薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は水性溶媒、である。
【０２５６】
製剤は、本開示によるいくつかの経路を介して、対象に投与することができる。皮内、心臓内、皮下、および筋肉内注射に適した特定の製剤は、当技術分野で公知である。例えば、活性成分の効果を延長させるために、筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることがしばしば望ましい。筋肉内投与された薬物形態の吸収遅延は、薬物（例えば改変ＲＮＡ）をオイルビヒクルに溶解または懸濁させることによって実現される。注射可能デポー剤形は、ポリ乳酸−ポリグリコライドなどの生分解性ポリマー中に薬物（例えば改変ＲＮＡ）のマイクロカプセル化（ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌｅ）マトリックスを形成することによって作られる。薬物のポリマーに対する比、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。皮内および皮下注射については、製剤は、皮内区画に送達された場合に免疫応答を誘発しないように製剤化されることが好ましい。皮内注射のための製剤中に使用することができる添加剤としては、例えば、例えば、湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤が挙げられる。皮内注射のための製剤は、糖類およびポリオールなどの１以上の他の賦形剤も含有することができる。心臓内注射については、製剤は、注射針の使用後に心筋および冠動脈へのさらなる損傷を引き起こさないように製剤化されることが好ましい。心臓内注射に適した製剤を、本明細書に提供する。
【０２５７】
５．９．改変ＲＮＡ組成物の毒性を低下させる方法
いくつかの実施態様は、改変ＲＮＡをクエン酸生理緩衝液と共に配合することを含む、対象における改変ＲＮＡ治療の毒性を低下させる方法に関する。いくつかの実施態様では、クエン酸生理緩衝液を伴う改変ＲＮＡの製剤は、脂質ベースの製剤よりも対象に対する毒性が低い。いくつかの実施態様では、脂質ベースの製剤の毒性は、用量依存性の毒性である。いくつかの実施態様では、脂質ベースの製剤の毒性は、用量制限性の毒性である。
【０２５８】
いくつかの実施態様では、対象における治療の毒性を低下させる方法は、本開示による改変ＲＮＡをクエン酸生理緩衝液と共に配合することを含み、かつ薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、薬学的に許容し得る賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、コア−シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。いくつかの実施態様では、溶媒は、水性溶媒である。いくつかの実施態様では、溶媒は、非水性溶媒である。
【０２５９】
いくつかの実施態様では、対象における治療の毒性を低下させる方法は、本開示による改変ＲＮＡをクエン酸生理緩衝液と共に配合することを含み、ここでは、対象は、ＶＥＧＦ−Ａ療法に対して応答性の疾患を患っている。いくつかの実施態様では、対象は、駆出率が低下したまたは保たれた心不全、腎疾患、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患、心筋梗塞後の心機能不全、虚血性心疾患、外傷または手術による血管損傷、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍、重症虚血肢、肺高血圧症、および末梢動脈疾患から選択される疾患を患っている。いくつかの実施態様では、疾患は、駆出率が低下したまたは保たれた心不全である。いくつかの実施態様では、疾患は、心筋梗塞後の心機能不全である。いくつかの実施態様では、疾患は、虚血性心疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、外傷または手術による血管損傷である。いくつかの実施態様では、疾患は、糖尿病性潰瘍を含めた皮膚潰瘍である。いくつかの実施態様では、疾患は、重症虚血肢である。いくつかの実施態様では、疾患は、肺高血圧症である。いくつかの実施態様では、疾患は、末梢動脈疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、末梢動脈疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、腎疾患である。いくつかの実施態様では、疾患は、皮膚移植および組織移植を必要とする疾患である。
【０２６０】
５．１０．核酸配列
いくつかの実施態様は、改変ＲＮＡの産生のためのインビトロ転写鋳型を含む核酸配列に関する。いくつかの実施態様では、核酸配列は、本開示による改変ＲＮＡの産生のためのインビトロ転写鋳型を含む。
【０２６１】
改変ＲＮＡの産生のための転写鋳型が利用可能になれば、本開示による改変ＲＮＡを、市販品として利用可能な出発材料を使用して、当技術分野で周知の任意の利用可能な技術にしたがって調製することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１５／００５１２６８号明細書；米国特許第８，７１０，２００号明細書；米国特許出願公開第．２０１３／０２５９９２３号明細書；（これらすべてを参照によって組み込む）を参照のこと）。
【０２６２】
請求項リスト中の請求項はすべて、追加的実施態様として、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０２６３】
６．実施例
６．１．実施例１
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのトランスフェクションおよびＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのトランスフェクションの可能性を調べるために、１０，０００個の細胞を、９６ウェルプレート内の通常の培養培地に播種した。改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａを含有する馴化培地を調製するために、２５０，０００個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、６ウェルプレート内の内皮増殖培地（ＥＧＭ）培地（Ｌｏｎｚａ）に播種した。翌日、無血清内皮基本培地（ＥＢＭ）培地（Ｌｏｎｚａ）中で、トランスフェクションを行った。ＶＥＧＦ  Ａ改変ＲＮＡ（示された量）を、製造業者の指示書にしたがって、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合し、細胞に添加した。トランスフェクション対照として、水と混合したリポフェクタミン２０００を使用した。４時間後、トランスフェクション培地を除去し、新鮮な無血清ＥＢＭ培地に変え、指定した時点で培地を収集した。２４時間後に、馴化培地を収集し、−８０℃に維持した。下に記載する通りにＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＶＥＧＦ  Ａ濃度を測定した。
【０２６４】
トランスフェクション後の細胞培養培地中のヒトＶＥＧＦ−Ａの量を、製造業者の指示書にしたがってヒトＶＥＧＦ−Ａ  ＥＬＩＳＡキット（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘリーダーにおいて、４５０ｎｍで読み取り、試料中のＶＥＧＦ  Ａ濃度を算出した。
【０２６５】
インビトロでのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの細胞へのすべてのトランスフェクションについて、リポフェクタミン２０００が必要であった。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡは、複数のヒト心臓細胞型に遺伝子導入することができた。より高用量の改変ＲＮＡは、より多くのＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生をもたらした（図２Ａ）。改変ＲＮＡからのタンパク質産生は、トランスフェクションのおよそ８時間後に最大になり、その後、減少した（図２Ｂ）。さらに、改変ＲＮＡトランスフェクションおよびタンパク質産生は、種を越えて機能し、マウス心臓線維芽細胞とブタ内皮細胞はどちらも遺伝子導入することができ、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の翻訳をもたらした（図２Ｃ）。
【０２６６】
６．２．実施例２
組換えおよび改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−ＡによるＶＥＧＦ受容体２シグナル伝達の活性化
１０万個のＨＵＶＥＣを、１２ウェルプレート内のＥＧＭ培地に播種した。翌日、細胞を、ＥＢＭ中で２４時間飢餓させ、次いで、組換え（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）もしくは改変ＲＮＡによって産生された１００ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ−Ａ（馴化培地として添加）に、またはＶＥＧＦ−Ａを含まない培地に曝露させた。２、１０、および２０分後に、刺激を停止し、培地を除去した。プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含有する溶解緩衝液を含む培養細胞から、全タンパク質を調製した。製造業者のプロトコルにしたがってＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。
【０２６７】
１５マイクログラムのタンパク質を、４から１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓグラジエントゲルに装填し、ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して電気泳動を実施した。分画されたタンパク質を、ポリフッ化ビニル（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエレクトロブロットした。膜を、５％  ＢＳＡ（ＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ（０．１％）中）でブロッキングし、続いて、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。使用した一次抗体は、ＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、リン酸化されたＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２）、Ａｋｔ、リン酸化されたＡｋｔ（ｐ−Ａｋｔ）、ｅＮＯＳ（すべてＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡより）、およびリン酸化されたｅＮＯＳ（ｐ−ｅＮＯＳ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に対するものであった。膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された二次抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にインキュベートし、ＥＣＬウェスタンブロッティング基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して免疫反応を検出した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  Ｔｏｕｃｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、化学発光シグナルを可視化した。
【０２６８】
改変ＲＮＡから産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質が活性であることを検証するために、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを遺伝子導入した細胞による馴化培地を、培養細胞に添加した。これは、ヒト内皮細胞における、主要なＶＥＧＦ−Ａ受容体、ＶＥＧＦ受容体２のリン酸化をもたらした（図３Ａ）。さらに、馴化培地はまた、下流シグナル伝達経路ｅＮＯＳ（ヒト内皮細胞における）（図３Ｂ）およびＡｋｔ（マウス心臓線維芽細胞における）（図３Ｃ）のリン酸化もそれぞれ誘導した。
【０２６９】
６．３．実施例３
改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、血管形成プロセスにおけるいくつかの重要なステップを刺激した活性なタンパク質である
ＨＵＶＥＣを、９６ウェルプレート内、ＥＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ）に、ウェルあたり３０００細胞の密度で播種した。翌日、培地を、２％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と組換えＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とを添加した基本ＥＢＭ培地に、または、２％  ＦＢＳを添加した、改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａを含有する馴化培地に変え、ＶＥＧＦ−Ａ濃度は、それぞれ、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、および１００ｎｇ／ｍＬであった。ＶＥＧＦ−Ａを含まない培地を、対照として使用した。プレートを５％  ＣＯ２中、３７℃に維持し、２日後、４％緩衝ホルムアルデヒド（Ｈｉｓｔｏｌａｂ，Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）で固定し、核をＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１０分間染色した。Ｉｍａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍで、核の数を決定した。
【０２７０】
ＨＵＶＥＣを、製造業者の指示書にしたがって、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）で染色し、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）内、８μｍ孔径を有するＦｌｏｒｏＢｌｏｋメンブレンを備えたトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）インサート内の２％血清を添加したＥＢＭ培地に播種した。ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に２％血清を含むＥＢＭ、または２％血清と共に改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａを含有する馴化培地を、下側の容器に添加した。化学誘引物質としてのＶＥＧＦ−Ａを、１０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ研究した。ＶＥＧＦ−Ａを含まない培地を、対照として使用した。２４時間後、メンブレンの下側に遊走していた細胞を、Ｉｍａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて計数した。
【０２７１】
ＨＵＶＥＣを、ＥＢＭ中でＣｙｔｏｄｅｘ  ３マイクロキャリアビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）と混合し、管を３７℃に維持し、一定の間隔で軽くたたいて、均一なコーティングを可能にした。４時間後、内皮細胞でコーティングしたビーズを、フラスコに播種し、３７℃および５％  ＣＯ２で一晩維持した。ビーズを、５００ビーズ／ｍＬで、アプロチニン（０．１５単位／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するフィブリノゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）に懸濁させ、次いで、９６ウェルプレート内、トロンビン（０．６２５単位／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するウェルに添加した。１５分後、フィブリンゲルは、塊を形成しており、組換えＶＥＧＦ−Ａを含むＥＧＭ培地、または改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａを含有する馴化培地を添加した。対照として、ＶＥＧＦ−Ａを含まない培地を使用した。プレートを、３７℃および５％  ＣＯ２で２日間維持し、血管形成性出芽形成を評価した。細胞を、カルセインで３０分間染色し、Ｉｍａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍで、プレートを読み取り、出芽形成を決定した。
【０２７２】
表した通り、血管形成プロセスにおけるいくつかの重要なステップは、改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質によって影響を受けた。ＶＥＧＦ−Ａは、培養されたヒト内皮細胞の増殖（図４Ａ）および遊走（図４Ｂ）を増大させた。さらに、内皮細胞でコーティングしたビーズを用いる３Ｄ培養における血管形成性出芽形成は、改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａによって増大した（図４Ｃおよび図５）。重要なことには、内皮細胞では、改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質と比較して同様の反応を誘導し、これは、改変ＲＮＡによって産生されたＶＥＧＦ−Ａが、血管形成に影響を与えるその性質および能力を保持することを示す。
【０２７３】
６．４．実施例４
マウスにおけるＬａｃＺ改変ＲＮＡの単回心臓内注射後のβ−ガラクトシダーゼタンパク質の評価
雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（１０から１２週齢）を、イソフルランで麻酔した。左胸部領域を剃毛し、滅菌し、挿管後に、左開胸によって心臓を露出させた。クエン酸／生理食塩水（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、水酸化ナトリウムでおよそ７．５にｐＨ調整）、またはリポフェクタミン（登録商標）（ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．ＮＹ，ＵＳＡ）中に配合したＬａｃＺ改変ＲＮＡを、左室自由壁に、心尖から心臓の底部に向かって注射（５０μＬ）した。注射後、縫合することによって胸郭および皮膚を閉じ、軽い胸部圧迫によって、胸腔から余分な空気を取り除いた。続いて、正常な呼吸が確認されたら、マウスを人工呼吸器から外し、自分のケージに戻した。心臓注射後のあらかじめ決定した時点で、マウスを麻酔し、二度目の開胸を行った。心臓を切除し、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）染色によって、トランスフェクション効率およびレポーターβ−ガラクトシダーゼ酵素の存在を調べた。Ｘ−ｇａｌは、この酵素によって加水分解されて、活性なβ−ガラクトシダーゼの存在を示す濃い青色の不溶性生成物をもたらす。簡単に言うと、器官または組織を、リン酸緩衝液中ですすぎ、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．０１％デオキシコール酸ナトリウム、および０．０２％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含有する、０．１ｍｍｏｌ／Ｌリン酸（ｐＨ７．３）洗浄緩衝液で３回（２０から３０分）洗浄した。続いて、新たに調製したＸ−ｇａｌ溶液（５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｋ３Ｆｅ／ＣＮ）６、および１ｍｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌを含有する、リン酸洗浄緩衝液）を、検体に添加し、次いで、これをホイルで包んで、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、検体をリン酸洗浄緩衝液で３回洗浄し、撮影した。
【０２７４】
左開胸後、麻酔したマウスに、クエン酸／生理食塩水またはＬａｃＺ改変ＲＮＡの単回心臓内注射を施した。およそ２４時間後、マウスを屠殺し、心臓を切除した。次いで、心臓を、一晩、Ｘ−ｇａｌ染色にかけた。図６Ｂおよび６Ｃは、リポフェクタミン（図６Ｂ）またはクエン酸／生理緩衝液（図６Ｃ）中に配合された改変ＲＮＡを注射された心尖領域における、効率的な、かつ質的に同様のトランスフェクションおよびβガラクトシダーゼ酵素の産生を示す。クエン酸／生理食塩水のみを注射された心臓では、染色は観察されなかった（図６Ａ）。
【０２７５】
６．５．実施例５
未処置のマウスにおけるルシフェラーゼ改変ＲＮＡの心臓内注射後のルシフェラーゼタンパク質発現の評価
雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（１０から１２週齢）を、腹腔内注射を介して投与されるケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．５から４ｍｇ／ｋｇ）との混合物で麻酔した。左胸部領域を剃毛し、滅菌し、挿管後に、左開胸によって心臓を露出させた。
【０２７６】
ホタルルシフェラーゼ改変ＲＮＡを、以下の緩衝液と共に配合した：
１．ＰＢＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、カルシウムなし、マグネシウムなし、ｐＨ７．４）
２．クエン酸生理緩衝液（Ｃ／Ｓ、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、ｐＨ７．０）
３．ＴＨＡＭ緩衝液（トロメタミンＡＫＡ  ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）、３００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）
【０２７７】
合計２５μｇのルシフェラーゼ改変ＲＮＡを、左室自由壁に、心尖から心臓の底部に向かって注射（５０μＬ）した。注射後、縫合することによって胸郭および皮膚を閉じ、軽い胸部圧迫によって、胸腔から余分な空気を取り除いた。手術後、マウスは、塩酸アチパメゾール（１ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射および塩酸ブプレノルフィン（０．０２ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を受けた。続いて、正常な呼吸が確認されたら、マウスを人工呼吸器から外し、自分のケージに戻した。
【０２７８】
左開胸後、麻酔したマウスに、緩衝液のみ（ＰＢＳ、Ｃ／Ｓ、またはＴＨＡＭ対照）、またはＰＢＳ、Ｃ／Ｓ、もしくはＴＨＡＭ緩衝液中に配合されたホタルルシフェラーゼ改変ＲＮＡの、単回心臓内注射を施した。生物発光ＩＶＩＳイメージングを介するルシフェラーゼタンパク質発現評価のために、心臓を切除した。下に示す結果は、２つの時差的なマウス研究の組み合わせである。表２は、個々の生のＩＶＩＳ生物発光フラックス値を報告し、図７は、グラフ化された平均値を示す（それぞれ、すべての治療群について）。
【０２７９】
【表２】
2019521976.tif 000004
【０２８０】
図７に表す通り、ルシフェラーゼタンパク質発現は、ルシフェラーゼ改変ＲＮＡを注射されたすべての心臓において検出されたが、陰性対照（ＰＢＳ、Ｃ／Ｓ、およびＴＨＡＭ）は、シグナルをほとんどないし全く示さなかった。これらの対照におけるベースラインＩＶＩＳ生物発光シグナルは、約４から７．５＋Ｅ０３単位の生物発光フラックス（光子／秒として表される）まで変動した。ルシフェラーゼ改変ＲＮＡを注射されたすべての心臓において、３から４桁でルシフェラーゼシグナルが検出された。種々の緩衝液の間に、統計的な差は検出されなかった。
【０２８１】
６．６．実施例６
ラットにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の評価
雄のスプラーグドーリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ）（体重２５０から３００ｇ）を、イソフルランで麻酔し、鎮痛のためにマーカイン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。左胸部領域を剃毛し、滅菌し、挿管後に、第５肋間腔での左開胸によって心臓を露出させた。クエン酸生理食塩水（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、水酸化ナトリウムでおよそ７．５にｐＨ調整）中に配合したヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１８００、１５０、または１５μｇ）を、左室自由壁に沿って、６本の別の注射（各１５μＬ、総体積９０μＬ）として注射した。注射後、縫合することによって胸郭および皮膚を閉じ、軽い胸部圧迫によって、胸腔から余分な空気を取り除いた。続いて、正常な呼吸が確認されたら、ラットを人工呼吸器から外し、自分のケージに戻した。心臓注射後のあらかじめ決定した時点で、ラットを麻酔し、心臓組織採取のために、二度目の開胸を行った。心臓を切除し、右室ならびに左および右心房を切り落とした。注射部位を含む横軸切片を切り取り、２つの部分に分け、これを液体窒素中で瞬間凍結し、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質の分析まで−８０℃で保管した。陰性対照として、注射部位から離れた心尖から、別の組織試料を採取した。
【０２８２】
麻酔したラットに、クエン酸／生理食塩水中に配合された３つの異なる用量（１５、１５０、または１８００μｇ）のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを心臓内注射した。各用量は、ある単一の時点で、左室自由壁を横断する、６本の別の注射として投与した。注射後の異なる時点で、動物を屠殺し、心臓を切除し、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質含有量分析のために、心室組織を回収した。図８Ａは、注射された３つの用量のそれぞれについての、産生されたＶＥＧＦ−Ａタンパク質の時間プロフィールおよび大きさをまとめて示す。これからわかるように、タンパク質産生は、用量線形性ではなく１５、から１５０μｇまでの用量の１０倍の増大が、曲線下面積（ＡＵＣ）の１．６倍の増大しか引き起こさず、１５０および１８００μｇ用量群についても、同様のＡＵＣが観察された（１．１倍差）。
【０２８３】
６．７．実施例７
心筋梗塞を施されたラットにおける、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射の後の、左室機能および梗塞サイズに対する効果
雄のスプラーグドーリーラット（体重２５０から３００ｇ）を、上に記載した通りに、麻酔し、前処置し、開胸した。続いて、この動物に、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的結紮を施した。結紮に続いて、９０μＬのクエン酸／生理食塩水（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、水酸化ナトリウムでおよそ７．５にｐＨ調整）、またはクエン酸／生理食塩水中に配合した１５０もしくは１８００μｇヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのいずれかの心臓内注射を行った。全体積を、梗塞の境界域に沿った、６本の別の心外膜注射として送達した。注射後、縫合することによって胸郭および皮膚を閉じ、軽い胸部圧迫によって、胸腔から余分な空気を取り除いた。続いて、正常な呼吸が確認されたら、ラットを人工呼吸器から外し、自分のケージに戻した。
【０２８４】
動物の処置の１日および８日後に、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介する左室機能および梗塞サイズの評価のために、撮像設備に運んだ。さらに、処置の翌日、心臓障害のバイオマーカーとしての心筋トロポニンＩの分析（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）心筋トロポニンＩ診断検査，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ  ６００６４，ＵＳＡ）のために、尾静脈から血液試料を採取した。４．７Ｔの磁場強度で、特化した小動物ＭＲＩシステムを使用して、ＭＲＩスキャニングを行った。短軸方向の画像が得られ、左室をカバーする画像の積み重ねを得た。心周期における特定の期での撮像を誘発するために、心電図記録法を使用した。１回の心拍動中の左室壁の移動を示す画像系列から、心機能を評価した。この画像系列を得る時に使用される撮像シーケンスは、１０ｍｓの横断繰り返し時間と２５のフリップ角を用いるグラジエントエコーシーケンスであった。左室の体積を、特化した画像分析ソフトウェアを使用して、経験を積んだ読み手による、異なる時点での手書き描写を介して評価した。収縮末期容積（ＥＳＶ）および拡張末期容積（ＥＤＶ）を、最小および最大左室体積とみなした。心機能を反映する駆出率（ＥＦ）を、式ＥＦ＝（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶによって評価した。ガドジアミド、すなわちガドリニウムを含有する造影剤の投与後に、心筋梗塞の程度を示す画像を得た。画像獲得の１０分前に、０．３ｍｍｏｌ／ｋｇガドジアミドを、尾静脈カテーテルを介して注射した。グラジエントエコーシーケンスを使用して、撮像を実施し、ここでは、コントラスト・プリパレーションは、逆パルスの使用を含んでいた。繰り返し時間は最小９００ｍｓであり、フリップ角は、９０°であった。左室壁（ＬＶＶ）の、および梗塞（ＩＶ）の体積を、特化した画像分析ソフトウェアを使用して、手書き描写を介して、経験を積んだ読み手によって評価した。左室壁の梗塞を起こした割合として表される梗塞サイズ（ＩＳ）を、式ＩＳ＝ＩＶ／ＬＶＶによって決定した。
【０２８５】
２７匹のラットに、心筋梗塞を誘発するために、左前下行枝の永久的結紮、および、クエン酸／生理食塩水（ｎ＝８）または低（１５０μｇ、ｎ＝９）または高（１８００μｇ、ｎ＝１０）用量のクエン酸／生理食塩水中に配合したＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射を施した。これらの動物を８日間追跡し、梗塞の誘発後、第１日および第８日に、ＭＲＩによって、左室駆出率および梗塞サイズに対する効果を評価した。心臓ＴｎＩを、心筋細胞傷害のバイオマーカーとして、第１日に静脈血内で測定した。２つの用量のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡが、同様の量のＶＥＧＦ−Ａを産生させたので、両方の群からのデータを、有効性分析においてプールした。クエン酸／生理食塩水で治療されたラットと比較すると、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを投与された動物は、有意に高い左室駆出率（第８日）（図８Ｂ）および低いレベルの心臓ＴｎＩ（第１日）（図８Ｄ）を有していた。さらに、積極的に治療したラットは、ビヒクルで治療されたラットに対して、梗塞サイズが低下する傾向があった（図８Ｃ）。
【０２８６】
６．８．実施例８
ＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタにおけるＬａｃＺ改変ＲＮＡまたはヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後のβ−ガラクトシダーゼおよびヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の評価
一晩絶食させた雌のＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタ（体重約２５ｋｇ）を、ミダゾラムおよびケタミンの筋肉内注射を介して鎮静させた。鎮静後、プロポフォールによる麻酔の誘発のために、静脈ラインを耳翼辺縁静脈に設定し、このブタを、気管内に挿管した。次いで、このブタを、実験室に移し、人工呼吸器につないだ。周期的な動脈血ガスモニタリングを伴う精密な吸入器および循環吸収式呼吸装置を通して送達されるイソフルランによって、全身麻酔を維持した。バイタルサイン（心拍数、血圧、呼吸数、Ｏ２パルスオキシメーター、ＥＣＧ、および体温）を、実験全体を通して連続的に監視した。血液喪失を置き換えるように調節された速度で処置全体を通して、または、低い全身血圧の場合に、静脈内輸液療法を施した。心臓を露出させるための左開胸を実施し、（様々な体積および用量の）ＬａｃＺ改変ＲＮＡまたはＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを、心外膜表面からの深さおよそ５ｍｍで、左室自由壁に注射した。注射部位に、小さな縫い目で印を付け、６時間後、心臓を切除した。経壁的な組織の厚切りを、注射部位で回収し、上に記載した通りにβ−ガラクトシダーゼに対してＸ−ｇａｌ染色した。ＶＥＧＦ−Ａタンパク質分析については、それぞれの組織の厚切りを、心外膜から心内膜までの６つの別々の検体に分割した。これらの検体を、液体窒素中で瞬間凍結し、下に記載する通りのＶＥＧＦ−Ａ分析まで−８０℃で保管した。
【０２８７】
ＬａｃＺまたはＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを、左室自由壁に心外膜注射し、６時間後、Ｘ−ｇａｌ染色またはＶＥＧＦ−Ａタンパク質分析のために、組織を採取した。ＬａｃＺ改変ＲＮＡを投与されたブタでは、β−ガラクトシダーゼの産生は、トランスフェクション培地としてリポフェクタミンが使用された場合（図９Ａ）、クエン酸／生理食塩水が使用された場合（図９Ｂ）と質的に同様であった。
【０２８８】
６．９．実施例９
心組織におけるヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の定量化
ホスファターゼ阻害剤ＩおよびＩＩおよびプロテアーゼ阻害剤を含有するＴｒｉｓ溶解緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、凍結された組織生検材料に添加し、ホモジナイゼーションまでおよそ−２０℃で凍結した。次いで、セラミックビーズ（３ｍｍ）を添加し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザー装置を使用して試料をホモジナイズした。ホモジネートを遠心し、上清を分析まで−８０℃で保管した。
【０２８９】
電気化学発光検出を用いるサンドイッチ免疫測定法を使用して、ＶＥＧＦ−Ａ濃度を決定した。組織ホモジネート中のＶＥＧＦ−Ａ濃度を測定するために、ＭＳＤ  Ｖ−ＰＬＥＸサイトカインＰａｎｅｌ  １（ヒト）ＶＥＧＦ−Ａキットを使用した。このアッセイは、キット指示書の通りに実施した。スタンダードを、キット希釈剤で１対２で段階希釈し、各回分内に追加の対照を含めさせて、アッセイ性能を監視した。試料を、分析前に、キット希釈剤で最低１対１０で希釈し、プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６００装置で読み取った。
【０２９０】
図１０は、クエン酸／生理食塩水中に配合した、様々な用量（注射あたり５０から２０００μｇ）のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心外膜注射後６時間時点でのＶＥＧＦ−Ａの用量依存性の産生をまとめて示す。産生されたタンパク質のレベルは、低用量の注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡでの飽和を示し、これは、ラットにおける知見と一致している（図８Ａ）。
【０２９１】
６．１０．実施例１０
クエン酸生理緩衝液におけるＬａｃＺおよびルシフェラーゼ改変ＲＮＡの心臓トランスフェクションおよび翻訳
表した通り、心臓注射での７５μｇのＬａｃＺコード改変ＲＮＡは、左室のおよそ１０％において遺伝子導入および翻訳された（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ、および１１Ｄ）。ルシフェラーゼ改変ＲＮＡに対するＲＮＡインサイツハイブリダイゼーションは、注射の部位での心筋における染色発現（図１１Ｅおよび１１Ｆ）、ならびに連続切片における免疫組織化学的分析を介して示される相関するルシフェラーゼタンパク質発現（図１１Ｇ）を明らかにした。
【０２９２】
６．１１．実施例１１
クエン酸生理緩衝液を用いる心臓への改変ＲＮＡ注射後のＶＥＧＦ−Ａタンパク質発現は、飽和性であり、複数の種にわたって同様の薬物動態を有する
ＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生を比較するために、１５０μｇのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（クエン酸生理緩衝液中）、および１００μｇのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（送達担体としてＲＮＡｉＭａｘ（脂質ベースの製剤）を使用）を、ラット心臓に注射した。２４時間後、クエン酸生理緩衝液（ＮＴＢ）を用いたラットにおけるＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルは、ＲＮＡｉＭａｘを用いて注射したラットに匹敵するレベルであり、薬物動態プロフィールも同様であった（図１２Ａ）。タンパク質発現は、用量制限性かつ飽和性であり、これは、種を越えて見られた（図１２Ｂ）。用量が１０倍増大しても、曲線下面積は１．６倍しか増大しなかった（図１２Ｃ）。
【０２９３】
６．１２．実施例１２
マウス、ラット、およびブタにおける、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の評価
ＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生を比較するために、１５０μｇのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（クエン酸生理緩衝液中）、および１００μｇのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（送達担体としてＲＮＡｉＭａｘ（脂質ベースの製剤）を使用）を、ラット心臓に注射した。２４時間後、を有するラットにおけるＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルは、〜。雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（１０から１２週齢）を、イソフルランで麻酔した。左胸部領域を剃毛し、滅菌し、挿管後に、左開胸によって心臓を露出させた。クエン酸生理食塩水（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、水酸化ナトリウムでおよそ７．５にｐＨ調整）中に配合した１００μｇのヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（ＶＥＧＦ−Ａ）をコードする）を、左室自由壁に、心尖から心臓の底部に向かって注射（５０μＬ）した。注射後、縫合することによって胸郭および皮膚を閉じ、軽い胸部圧迫によって、胸腔から余分な空気を取り除いた。続いて、正常な呼吸が確認されたら、マウスを人工呼吸器から外し、自分のケージに戻した。心臓注射後のあらかじめ決定した時点で、マウスを麻酔し、心臓組織採取のために、二度目の開胸を行った。心臓を切除し、右室ならびに左および右心房を切り落とした。残存する心組織（すなわち、左室自由壁および心室中隔）を、液体窒素中で瞬間凍結し、下に記載する通りのＶＥＧＦ−Ａタンパク質の分析まで−８０℃で保管した。
【０２９４】
雄のスプラーグドーリーラット（体重２５０から３００ｇ）を、イソフルランで麻酔し、鎮痛のためにマーカイン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。左胸部領域を剃毛し、滅菌し、挿管後に、第５肋間腔での左開胸によって心臓を露出させた。クエン酸生理食塩水（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、水酸化ナトリウムでおよそ７．５にｐＨ調整）中に配合したヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１００μｇ）を、左室自由壁に沿って、３本の別の注射（各２０μＬ、総体積６０μＬ）として注射した。注射後、縫合することによって胸郭および皮膚を閉じ、軽い胸部圧迫によって、胸腔から余分な空気を取り除いた。続いて、正常な呼吸が確認されたら、ラットを人工呼吸器から外し、自分のケージに戻した。心臓注射後のあらかじめ決定した時点で、ラットを麻酔し、心臓組織採取のために、二度目の開胸を行った。心臓を切除し、右室ならびに左および右心房を切り落とした。注射部位を含む横軸切片を切り取り、２つの部分に分け、これを液体窒素中で瞬間凍結し、下に記載する通りのＶＥＧＦ−Ａタンパク質の分析まで−８０℃で保管した。
【０２９５】
一晩絶食させた雌のＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタ（体重約２５ｋｇ）を、ミダゾラムおよびケタミンの筋肉内注射を介して鎮静させた。鎮静後、プロポフォールによる麻酔の誘発のために、静脈ラインを耳翼辺縁静脈に設定し、このブタを、気管内に挿管した。次いで、このブタを、実験室に移し、人工呼吸器につないだ。周期的な動脈血ガスモニタリングを伴う精密な吸入器および循環吸収式呼吸装置を通して送達されるイソフルランによって、全身麻酔を維持した。バイタルサイン（心拍数、血圧、呼吸数、Ｏ２パルスオキシメーター、ＥＣＧ、および体温）を、実験全体を通して連続的に監視した。血液喪失を置き換えるように調節された速度で処置全体を通して、または、低い全身血圧の場合に、静脈内輸液療法を施した。心臓を露出させるための左開胸を実施し、クエン酸生理食塩水（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸塩、１３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム（Ｈｙｃｌｏｎｅ水中）、水酸化ナトリウムでおよそ７．５にｐＨ調整）中に配合したＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１００μｇ）を、心外膜表面からの深さおよそ５ｍｍで、左室自由壁に注射した。注射部位に、小さな縫い目で印を付け、６時間後、心臓を切除した。経壁的な組織の厚切りを回収した。ＶＥＧＦ−Ａタンパク質分析については、それぞれの組織の厚切りを、心外膜から心内膜までの６つの別々の検体に分割した。これらの検体を、液体窒素中で瞬間凍結し、下に記載する通りのＶＥＧＦ−Ａ分析まで−８０℃で保管した。
【０２９６】
図１３Ａおよび１３Ｂに示す通り、産生されたタンパク質の量は、注射のおよそ６から１２時間後に最大になり、産生されたＶＥＧＦ  Ａタンパク質の大きさおよび時間プロフィールは、種を越えて同様であった。ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、ラットでは、注射の１９２時間後でもまだ、心組織内に観察された（図１３Ｂ）。
【０２９７】
６．１３．実施例１３
心筋梗塞を施されたブタにおける、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射の後の、左室機能および梗塞サイズに対する効果
いずれかの性別の、３４匹の性的に成熟したＬａｎｙｕミニブタ（約５か月齢）を、一晩絶食させ、麻酔し、気管内に挿管し、酸素、空気、およびイソフルランの混合物を用いて、人工呼吸器を通して人工的に換気した。バイタルサイン（心拍数、血圧、呼吸数、Ｏ２パルスオキシメーター、ＥＣＧ、および体温）を、実験全体を通して連続的に監視した。血液喪失を置き換えるように調節された速度で処置全体を通して、または、低い全身血圧の場合に、静脈内輸液療法を施した。心臓を露出させるための左開胸を実施し、動脈を閉塞させない５匹（偽群）を除くすべてのブタにおいて、左前下行枝中央の永久的閉塞を行った。続いて、胸部を閉じ、ブタを、およそ２時間、集中治療室に移行させ、その後、その檻に戻した。痛みを軽減し、感染症を予防するために、手術の前後に鎮痛剤および抗生物質を投与した。
【０２９８】
これらのブタに、最初の手術の７日後、上に記載した通りに第２の手術の準備をし、手術室に戻した。準備の後、梗塞を起こしたブタを、クエン酸／生理食塩水（ｎ＝８）、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（低用量）（１ｍｇ、ｎ＝８）、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（高用量）（１０ｍｇ、ｎ＝８）、または自己組織化ナノファイバー中に配合された組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質（ｎ＝５）での盲検治療に無作為に割り付けた。臨床用途については認められていないが、ナノファイバー構築物は、陽性対照療法に含められた（Ｌｉｎ  Ｙ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，（２０１２）４：１４６ｒａ１０９；その内容全体を参照によって本明細書に組み込む）。左開胸後、試験薬物を、梗塞周囲／梗塞領域に配分される、各注入体積が１００μＬである２０本の心外膜注射として投与した。処置後、ブタを、上に記載した通りに治療し、２か月間回復させ、その後、最終実験を実施した。
【０２９９】
研究全体を通して、左室機能の連続測定値を、心エコー図法を用いて評価した。したがって、閉胸したブタにおいて、心筋梗塞の誘発の直前および直後に、試験薬物の心臓内注射の直前に、および屠殺の日に、麻酔下で測定を行った。心機能を、３．５ＭＨｚプローブを用いるＶｉｖｉｄ  Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｈｏｒｔｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、２Ｄ心エコー図法によって評価した。ブタを、左側臥位に置いた。Ｍモードによって、左室容積を測定して左室駆出率を得るための傍胸骨長軸視野を得た。研究の最後（すなわち、試験薬物投与の２か月後）に、上に記載した通りにブタを麻酔し、右頸動脈カテーテル法を介して左室内腔に配置した圧力−容積ループ記録カテーテル（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いる侵襲性の血行動態評価のために備えた。市販のソフトウェア（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、血行動態データを解析した。血行動態評価の後、ブタを屠殺し、心臓を回収した。心臓を３回洗浄し、心尖から乳頭筋レベルまでの５つの切片に加工した。各の切片の画像を撮影し、市販のソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を使用して梗塞サイズを推定した。梗塞サイズは、内部空間の面積を引いた全心室の面積の割合として算出した。
【０３００】
研究の過程中に、左室駆出率（ＥＦ）の連続的評価を実施した。図１４からわかるように、左前下行枝の永久的閉塞は、試験薬物が注射された場合、ＥＦの、およそ６５％から４５％未満までの即時的な減少を伴っており、減少は、閉塞の７日後まで保持された。こうした低下は、偽処置を施したブタでは見られなかった。注射の２か月後、自己組織化ナノファイバー中に配合されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたは組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質を投与されたブタは、クエン酸／生理食塩水を注射されたブタに対して、ＥＦの向上を有することが観察された。注射の日から研究終了までのＥＦの変化を比較すると、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群とＶＥＧＦ−Ａタンパク質群の両方について、統計的に有意な向上が見られたが、クエン酸／生理食塩水群については見られなかった。研究停止時に実施した左室機能の侵襲性の血行動態評価は、経時的最大左室圧発生（ｄＰ／ｄｔ  ｍａｘ、図１５）、経時的最小圧発生（ｄＰ／ｄｔ  ｍｉｎ、図１６）、収縮末期圧容積関係（ＥＳＰＶＲ、図１７）、拡張末期圧容積関係（ＥＤＰＶＲ、図１８）、および前負荷動員一回仕事量（ＰＲＳＷ、図１９）の差によってそれぞれ証明される通りの、同様の向上を示した。
【０３０１】
研究終了時に、組織回収後に梗塞サイズを測定し、左室全体の梗塞サイズ（切片２、３、４、および５、図２０Ａ）、左室中央の梗塞サイズ（切片３および４、図２０Ｂ）、および左室の最も中心部の梗塞サイズ（切片４、図２０Ｃ）として定量化した。図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃからわかるように、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡならびにＶＥＧＦ−Ａタンパク質／ナノファイバー治療は、クエン酸／生理食塩水で治療されたブタに対する、梗塞サイズの用量依存性の低下を伴っていた。
【０３０２】
６．１４．実施例１４
糖尿病マウスにおける創傷治癒モデルにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのインビボ効果
この実験の目的は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡが、皮膚創傷治癒遅延の糖尿病マウスモデルにおいて生理活性を呈するかどうかを決定することであった。点変異が原因でレプチン受容体発現の欠損を有し、健康な対照マウスと比較して皮膚創傷治癒の遅延を経験するｄｂ／ｄｂマウスを使用して、２つの試験を実施した。このｄｂ／ｄｂマウスは、創傷
治癒を促進することを目的とする様々な治療の治療有効性を試験するために、公開されている文献において広く使用されている。第１の試験、試験１は、３２匹の雄ｄｂ／ｄｂマウスを含んでおり、１）ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの、創傷治癒速度に対する効果を評価する、２）治療が肉芽組織形成の異常を引き起こすかどうかを決定する、および、３）ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの、肉芽組織における血管分布に対する効果を決定するために設計された。第２の試験、試験２は、７匹の雄ｄｂ／ｄｂマウスを含んでおり、ホウ素ベースの新規の酸素センシングナノ粒子のレシオ測定イメージングを使用して、経時的な創傷の酸素化を評価するために設計された。簡単に言うと、試験の１日目（第０日）に、各マウスの背側に、１ｃｍ直径の全層皮膚創傷を作り、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクル対照（ｎ＝８マウス／群）を、創傷の周囲に、直ちに皮内注射した。マウスの部分集合（ｎ＝８マウス／群）に、第３日に、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクル対照のいずれかをまた送達させた。創傷を、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）を使用して覆い、マウスを個々にケージに収容した。その後の時点で、創傷の連続的な写真を獲得し、最終エンドポイント（第１８日）で、創傷組織を回収し、免疫組織化学（内皮細胞のためのＣＤ３１＋染色、およびヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色）のために処理した。試験２では、第０日および３日での投与のみを行うこと以外は試験１と同様の実験処置の後、酸素センシングナノ粒子を創傷床に局所的に送達した後、蛍光およびリン光の連続的な画像を獲得した。試験１からの結果は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの連続的投与（第０日での１００μｇおよび第３日での１００μｇ）は、ビヒクル対照の連続的投与と比較して、第６日および第１０日での開放創面積を有意に（ｐ＜０．０５）低下させたが、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクル対照のいずれかの単回投与は低下させなかったことを示した。早期の時点（第３日から第６日）の間の創傷閉鎖の平均パーセントは、ビヒクル対照と比較して有意に増大した。肉芽組織におけるＣＤ３１＋染色も、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの連続的投与を受けたマウスにおいて増大した。試験２では、第６日での創傷における酸素レベルも、２回注射されたビヒクル群と比較して、１００μｇのヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの連続的２回の連続的投与を受けたマウスにおいて有意に（ｐ＜０．０５）増大した。この実験は、糖尿病マウスの背側における、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの連続的投与での皮膚創傷の治療が、創傷治癒の早期の、より臨床的に関連する時期の間の創傷治癒を有意に促進することを裏付けている。治癒の促進は、早期の時点での、肉芽組織の血管新生の増大および創傷床の酸素化の増大を伴う。
【０３０３】
【表３】
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【０３０４】
【表４】
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【０３０５】
【表５】
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【０３０６】
実験手順
実験は、２つの試験、試験１および試験２に分けた。試験１は、もっぱら、糖尿病性の創傷治癒という観点でのヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの生理活性を評価することにのみ焦
点を合わせた。試験２は、やはり、同じ創傷治癒モデルにおいてヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの生理活性を試験したが、創傷床内の酸素化を決定するために酸素感受性ナノ粒子の使用も用いた。以下に列挙した処置は、別に記述がない限り、両方の試験に共通である。
【０３０７】
全層皮膚創傷（第０日）：マウスを、２％吸入用イソフルラン／酸素混合物で麻酔し、次いで、除毛し、手術前に滅菌した。型紙を使用して、マウスの背側に直径１ｃｍの円の印を付けた。皮膚（真皮および表皮を含む）を、輪郭線領域から慎重に切除して、全層皮膚創傷を形成した。ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクルを、皮内注射した。手術後に鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与し、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）ドレッシング材および自着性ラップで創傷を覆った。
【０３０８】
皮内注射（第０日および３日）：１０μＬ×４のヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクル（上に概説）を、皮膚の切除の直後に注射した。第０日（創傷形成の日）に、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクルを、創傷の周囲に、０、９０、１８０、および２７０度の位置で、皮膚の真皮層に注射した。第３日に、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡまたはビヒクルを、同じ位置への２本の注射を避けるために、創傷の周囲に、４５、１３５、２２５、および３１５度の位置で、皮内注射した。
【０３０９】
撮像処置（第０、３、６、１０、１３、および１８日）：創傷を撮像する前に、自着性ラップおよびテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）ドレッシング材を取り除いた。撮像前に、毎日（第０、３、６、１０、１３、および１８日）、体重を記録した。１２００万画素のカメラでの創傷上からの固定距離の画像を獲得した一方で、マウスを２％吸入用イソフルラン／酸素混合物で麻酔した。撮像後、（ナノ粒子イメージングが実施されないならば）創傷を、新しいテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）ドレッシング材で覆い、既存の自着性ラップを巻いた。
【０３１０】
酸素感受性ナノ粒子を用いる撮像処置（第０、３、６、１０、１３、および１８日）：試験２では、酸素レベルに対する撮像のみを実施した。上に記載した通りの撮像後、マウスを麻酔し続け、カスタム設計された撮像プラットフォームを伴う温度制御された顕微鏡ステージに置いた。各創傷についてＵＶ照射下で、１）１０フレーム（ホウ素ベースのナノ粒子（ＢＮＰ）の適用前に創傷の３フレーム／秒で獲得される）、および２）６０フレーム（創傷床内に５０μＬのナノ粒子溶液を注いだ後に３フレーム／秒で獲得される）からなるＭ−ＪＰＥＧを獲得した。撮像後、創傷を、新しいテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）ドレッシング材で覆い、既存の自着性ラップを巻いた。
【０３１１】
創傷酸素化画像分析：試験２では、酸素レベルに対する撮像のみを実施した。ＵＶ照射された創傷画像（上に記載した通りにに獲得したもの）を、カスタム設定されたＭＡＴＬＡＢプログラムを使用して解析した。バックグラウンドシグナルを明らかにするために、創傷床内の選択された点を、ナノ粒子の添加の前に、赤および青チャンネル輝度について分析した。これらのバックグラウンド輝度値を、ナノ粒子の添加後に得られた赤および青輝度値から引いた。青チャンネル輝度と赤チャンネル輝度との比を、蛍光（ＢＮＰの存在下で一定）とリン光（酸素の存在下で消光される）との比を表すために、各画素についてコンピュータ算出した。次いで、レシオ測定画像を、蛍光−対−リン光比を時間空間的に解明するための比の範囲にスケール調整した２５６値のカラーマップを使用して、質的に表示した。創傷床内の酸素の量を定量化するために、生の青および赤チャンネル輝度値を使用して、グレースケール画像を作成した（低酸素；黒画素、高酸素；白画素）。創傷床を、対象となる領域として選択し、定量化し、平均の灰色画素値を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化した。
【０３１２】
組織の回収、組織学的切片作製、および染色（第１８日）：マウスを、ＣＯ２窒息によ
って安楽死させ、創傷の最終画像を獲得した。創傷中心を囲む１．５ｃｍ×１．５ｃｍ領域を切除し、３つの別々の分析のために、長軸方向の３分の１に分離した。組織の１つの３分の１は、液体窒素中で瞬間凍結し、下流ＶＥＧＦシグナル伝達タンパク質の評価に送った。組織の中間の３分の１は、１０％ホルマリン中で１週間固定し、パラフィン包埋のために処理した。５μｍ切片に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ならびにＣＤ３１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ−１５０６，ＰＥＣＡＭ−１（Ｍ−２０））で染色した。
【０３１３】
血糖測定（第０日および第１８日）：第０日での最初の創傷形成の前に、すべてのマウスを、食物無しの紙製床敷きケージ内で４時間絶食させた。創傷形成前に、最初の空腹時血糖測定を行った。第１８日に血液を回収しながら、非空腹時血糖測定を行い、血液の少量の試料を採取した。
【０３１４】
データ解析
創傷面積定量化：試験１および２の時点。ＩｍａｇｅＪを使用して、観察者らが、創傷周囲をトレースし、ＩｍａｇｅＪが、開放創傷の面積を算出した。観察者らの判断間の差を解決するために、各創傷について、３つの創傷面積の中央値を報告した。各時点での創傷面積を、最初の創傷面積（第０日）に対して正規化して、最初の創傷サイズのわずかな違いを解決した。ｐ＜０．０５で仮定される有意性を用いる反復測定二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、データを統計的に解析した。これらのデータの三次スプライン補間を実施して、創傷の２５％、５０％、および７５％閉鎖までの推定する時間を、それぞれ、コンピュータ算出した。各時点の間の治癒の平均パーセントを、残存する創傷面積のパーセントを以前の残存する創傷面積のパーセントから引くことによって算出した。ｐ＜０．０５で仮定される有意性を用いる反復測定二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、データを統計的に解析した。
【０３１５】
ＣＤ３１染色分析（試験１）：創傷組織の組織学的横断面を、ＣＤ３１に対して免疫染色し、４０×対物レンズを用いる透過型顕微鏡分析を使用して撮像した。ブラウンチャンネル（陽性ＣＤ３１標識）を、白および黒に二値化させて、バックグラウンドおよび非特異的標識を除去した。ＣＤ３１陽性染色の二値化された面積（パーセント）を、治療群（ｎ＝３）のそれぞれについて算出した。
【０３１６】
ヘマトキシリンおよびエオシン染色分析（試験１）：各創傷からのパラフィン切片を、Ｈ＆Ｅで染色し、４×対物レンズを使用する透過型顕微鏡分析を使用して撮像した。肉芽組織を視覚的に調べて、表皮の厚さおよび連続性、肉芽組織の断面積（幅および厚さ）、および血管腫などのいずれかの異常組織構造の存在または非存在を質的に評価した。
【０３１７】
下流ＶＥＧＦシグナル伝達分析（ウエスタンブロット）（試験１）：皮膚組織試料を、ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ｓｃ−２４９４８，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）と共にホモジナイズし、遠心し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（＃５０００１１２、Ｂｉｏ−Ｒｅｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって、上清のタンパク質濃度を決定した。総タンパク質３０μｇを、ポリアクリルアミドゲル（＃３４５０１２４，Ｂｉｏ−Ｒｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に装填し、膜に移した（＃１６２０２３２，Ｂｉｏ−Ｒｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。膜を、以下の抗体：抗ｐＡＫＴ抗体（Ｓ４７３，＃４０６０，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）および抗ＡＫＴ抗体（＃４６９１，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＩＲＤｙｅ
８００ＣＷ，ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）で探索した。ＩｍａｇｅＪプログラム２９を使用して、ｐＡＫＴおよびＡＫＴバンドの定量化を実施した。
【０３１８】
体重および血糖分析：体重および血糖値を、ｐ＜０．０５で仮定される有意性を用いる反復測定二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的に解析した。
【０３１９】
酸素定量化分析（試験２）：生のナノ粒子画像の平均グレー値を、ｐ＜０．０５で仮定される有意性を用いる反復測定二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、統計的に解析した。
【０３２０】
結果
創傷面積測定からの結果（試験１）
試験１に含まれるすべての群におけるｄｂ／ｄｂマウスの体重を、図２１に示す。体重は、第１３日時点で有意な（ｐ＜０．０５）差が存在していた単回注射されたビヒクル群と単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群を除いて、すべての時点ですべての群について同様であった。この差は、研究結果に影響を与えるとは考えられない。
【０３２１】
第０日でのおよび第１８日でのすべての群のｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時および食後血糖値を、図２２に示す。第０日時点で８５ｍｇ／ｄＬの有意な（ｐ＜０．０５）差が存在していた単回注射されたビヒクル群と単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群を除いて、すべての群が同様であった。この差は、研究結果に影響を与えるとは考えられない。
【０３２２】
１８日の観察期間中の創傷面積の測定からの結果を、図２３〜２５に示す。開放創面積の閉鎖に関しては、第０日での単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群の用量は、その単回注射されたビヒクルと比較して、同じ１８日の観察期間中、いずれの有意な効果も示さなかった。一方で、第０日および３日にＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを２回注射された群は、第６日に５５％の開放創面積および第１０日に２７％の開放創面積であり、それぞれ第６日の７１％の開放創面積および第１０日の４９％の開放創面積であったビヒクルを２回注射された群と比較して、有意に（ｐ＜０．０５）早い閉鎖を示さなかった（図２３）。曲線下面積は、それぞれ、ビヒクル単回注射について９６２．８３、ビヒクル２回注射について９９８．２１、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ単回注射について８９５．１２、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ２回注射について７９２．７９であった。２５％閉鎖までの時間は、それぞれ、単回注射されたビヒクルについて６．２日、２回注射されたビヒクルについて５．４日、単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて５．１日、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて４．２日であった（図２４）。５０％閉鎖までの時間は、それぞれ、単回注射されたビヒクルについて８．９日、２回注射されたビヒクルについて９．８日、単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて７．８日、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて６．３日であった（図２４）。７５％閉鎖までの時間は、それぞれ、単回注射されたビヒクルについて１２．３日、２回注射されたビヒクルについて１３．７日、単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて１２．５日、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて１０．４日であった（図２４）。各時点の間の創傷閉鎖の平均パーセントを比較すると、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群が、２０％の変化を伴う２回注射されたビヒクル群と比較して、第３日から第６日の間の４０％の変化を伴う有意な（ｐ＜０．０５）差を示したのに対して、単回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群は、単回注射されたビヒクル群と比較して、有意性を示さなかった（図２５）。
【０３２３】
組織学的評価からの結果（試験１）
第１８日での創傷領域のＨ＆Ｅ染色切片からの代表的な結果を、図２６に示す。この染色は、異常組織構造のいずれの徴候もない正常な肉芽組織を示した。図２７では、それぞれ、単回および２回注射されたビヒクルおよびＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ後の創傷領域切片について、代表的なＣＤ３１陽性染色が示される。図２８に示される創傷領域における内皮細胞に基づく血管の定量化は、それぞれ、単回（３．２±０．６）および２回（３．２
±０．６）注射されたビヒクルと比較して、単回（４．３±４．０、平均±ＳＤ）と２回（８．４±４．４）注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの両方について、ＣＤ３１陽性染色を用いてしきい値処理された面積（パーセント）の増大をもたらした。
【０３２４】
ウエスタンブロットを用いる下流ＶＥＧＦシグナル伝達分析（試験１）
ＡＫＴおよびＶＥＧＦＲ２を含む第１８日での下流ＶＥＧＦシグナル伝達の分析の結果を、図２９および図３０に示す。これらの結果は、第１８日（研究終了）時点でいかなる継続中の下流シグナル伝達も示さなかった。
【０３２５】
酸素センシングナノ粒子を用いる測定からの結果（試験２）
試験２における２つの群、すなわち２回注射されたビヒクルおよびＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡに含まれるｄｂ／ｄｂマウスの体重を、図３１に、時間の関数として示す。体重は、すべての時点でのすべての群について同様であった。試験２における２回注射されたビヒクルおよびＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのｄｂ／ｄｂマウスにおける第０日および第１８日での空腹時および食後血糖値を、それぞれ、図３２に示す。空腹時および食後血糖値は、両方の群において、同様であった。
【０３２６】
試験２では、酸素化を推定するために、酸素感受性ナノ粒子を創傷に乗せた。図３３には、ナノ粒子酸素定量化を手助けする技術の図を示す。室温で、励起後に、ナノ粒子は、青チャンネルシグナルによって捕捉される蛍光と、赤シグナルチャンネルによって捕捉される酸素依存性のリン光を放出する。これらのシグナルをまとめた場合、その結果は、創傷における相対的酸素化の画像である。図３４では、２回注射されたビヒクルマウスおよび２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡマウスについての代表的な画像を、時間の関数として示す。黄色および赤色は、第３日で既に、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡマウスの創傷面積では、２回注射されたビヒクルマウスと比較して、より突出している。第６日では、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群についての酸素化の、２回注射されたビヒクル群と比較した場合の有意な（ｐ＜０．０５）増大が存在する（図３５）。
【０３２７】
１８日の観察期間中の創傷面積の測定からの結果を、図３６〜３８に示す。第０日および３にＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを２回注射された群は、第６日に４５％の開放創面積であり、それぞれ、６２％の開放創面積であったビヒクルを２回注射された群と比較して、有意に（ｐ＜０．０５）早い閉鎖を示さなかった。２５％閉鎖までの時間は、それぞれ、２回注射されたビヒクルについて３．４日、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて３．８日であった。５０％閉鎖までの時間は、それぞれ、２回注射されたビヒクルについて７．１日、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて５．６日であった。７５％閉鎖までの時間は、それぞれ、２回注射されたビヒクルについて８．９日、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡについて７．８日であった。各時点の間の創傷閉鎖の平均パーセントを比較すると、２回注射されたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ群は、それぞれ、１４％の変化を伴う２回注射されたビヒクル群と比較して、第３日から第６日の間の４０％の変化を伴う有意な（ｐ＜０．０５）差を確かに示した。
【０３２８】
結論
受傷後第０日と第３日の両方での、創傷周囲の近くの４つの注射部位に分けた１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内投与は、第６日および第１０日時点でのｄｂ／ｄｂマウスにおける開放創面積を、ビヒクル対照と比較して有意に低下させた。
【０３２９】
受傷後第０日と第３日の両方での、創傷周囲の近くの４つの注射部位に分けた１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内投与は、早期の時点（第３日から第６日）の間の創傷閉鎖の平均パーセントを、ビヒクル対照と比較して有意に増大させた。
【０３３０】
受傷後第０日と第３日の両方での、創傷周囲の近くの４つの注射部位に分けた１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内投与は、第１８日での肉芽組織の組織学的横断面におけるＣＤ３１＋免疫染色の領域を、ビヒクル対照と比較して、また、最初の時点（第０日）でのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡのみでの投与と比較して増大させる。
【０３３１】
受傷後第０日と第３日の両方での、創傷周囲の近くの４つの注射部位に分けた１００μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内投与は、第６日での創傷内の酸素の量を、ビヒクル対照と比較して有意に増大させる。
【０３３２】
６．１５．実施例１５
インビボでのマウスの耳における血行動態および血管新生に対するヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの効果の光音響顕微鏡分析
この実験では、健康なマウスの耳において、ヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ）に対する急性および慢性の血管反応をインビボで監視した。血管直径、ヘモグロビンの酸素飽和度（ｓＯ２）、血流、および血管新生に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの効果を動的に特徴付けるために、多パラメータ光音響顕微鏡分析（ＰＡＭ）技術を適用した。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、組換えヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質、およびクエン酸／生理食塩水／ビヒクルに対する反応の、対照および定量比較を実施した。さらに、これらの反応の用量依存性を、高用量（１００μｇ／耳）および低用量（１０μｇ／耳）ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡによって誘導される結果を比較することによって探究した。これらの研究は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡが、注射後間もなく（３０分から６時間）、注射部位の近くの局所的血流の顕著な上方調節を誘導することを示した。さらに、高用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射の７から１４日後の、有意な毛細血管形成および血管新生が確認されたが、低用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質、またはクエン酸／生理食塩水を注射された耳では確認されなかった。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡは、注射部位の下流の微小血管血流の著しいかつ空間的に制限された上方調節を誘導し、これは、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質に対する高度に濃縮された反応と明確に異なっていた。
【０３３３】
本研究の目的は、インビボで、健康なマウスの耳において多パラメータ光音響顕微鏡分析（ＰＡＭ）技術を用いて、血管直径、ヘモグロビンの酸素飽和度（ｓＯ２）、血流、および血管新生に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの効果を動的に特徴付けることであった。
【０３３４】
【表６】
2019521976.tif 000008
【０３３５】
対照／参照化合物は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，６１４  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  ＮＥ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ  ５５４１３，ＵＳＡからの組換えヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５タンパク質である。
【０３３６】
【表７】
2019521976.tif 000009
【０３３７】
【表８】
2019521976.tif 000010
【０３３８】
実験手順
マウスの耳の撮像については、完全に非侵襲性であり、同じマウスを、血管直径、ｓＯ２、血流、血管形成、および血管新生に対する様々な薬物の効果の経時的モニタリングのために繰り返し撮像することができる。試験薬物の皮内注射の前に、マウスの耳のベースライン画像を獲得した。次いで、薬物治療された耳を、６時間監視して、急性的な血管反応を捉え、また、第７日に再撮像して、慢性的な血行動態反応および血管新生の可能性を記録した。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡによって誘導される血管リモデリングの持続性を調べるために、高用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡで治療されたマウスを、それぞれ、第１４、２１、および２８日に、さらに撮像した。
【０３３９】
詳細なＰＡＭイメージングプロトコルは、次の通りであった：マウスを、３％イソフルラン吸入ガス（典型的な流速１から１．５Ｌ／分、体重に依存）を満たした小さな容器内で麻酔した。実験全体を通して、１．５％イソフルランで、麻酔を維持した。正常な生理学的状態にマウスを維持するための吸入ガスとして、医療用空気を使用した。純粋な酸素は、静脈血酸素化を、正常な生理学的レベルよりも高く上昇させ、ＰＡＭ測定を偏らせる
ので、適切ではない。続いて、マウスを、麻酔容器から、すぐ近くの定位固定台に移した。マウスの体温を、加熱パッドを使用して３７℃に維持した。定位固定台に置いた後、超音波検査用ゲルの層を、撮像されることとなる耳の表面に適用した。ゲルの内側への気泡の閉じ込めを避けることに注意を払った。次いで、耳を、脱イオン水を満たした水槽の下方に入れ、超音波検査用ゲルが、水槽の底と穏やかに接触し、ポリエチレンの薄膜によって被覆されるまで、ゆっくりと引き上げた。乾燥および偶発的なレーザー損傷を予防するために、軟膏を眼に適用した。次いで、音響レンズが水槽に浸されるまで、撮像する頭部を下ろした。レンズ下に閉じ込められた気泡はいずれも除去した。したがって、この構成は、水面から底まで垂直に、音響レンズ、水槽、超音波検査用ゲル、およびマウスの耳を含んでいた。次いで、米国国家規格協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のレーザー安全標準（すなわち、２０ｍＪ／ｃｍ２）内で作動することを確実にするために、レーザーフルエンスを確認した。画像獲得後、マウスの耳を、脱イオン水で清浄し、自分のケージに戻した。
【０３４０】
多パラメータＰＡＭによって、３つの血管パラメータを同時に獲得した（Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎａｔｏｍｙ，  ｏｘｙｇｅｎ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ．Ｏｐｔ  Ｌｅｔｔ，２０１５，４０：９１０−９１３）。血管解剖学的構造は、各採取位置でのＰＡＭによって獲得された生の光音響シグナルのヒルベルト変換によって直接的にもたらされた。血管ｓＯ２は、その光吸収スペクトルを介して酸素化および脱酸素化ヘモグロビンを区別するために、２波長励起で獲得された。血流速度は、５３２ｎｍで得られた１００個の連続的なＡライン（Ａ−ｌｉｎｅ）を相関させることによって定量化した。相関分析についての時間窓を、１０ｍｓにセットした。コンピュータ算出された相関係数の時間経過は、二次指数的減衰に従い、血流定量化のために、血流速度と線形比例する減衰定数を抽出した。さらに、個々の血管の平均直径、ｓＯ２、および血流を、文書化された血管セグメンテーションアルゴリズム（Ｓｏｅｔｉｋｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｓｓｅｌ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ  ｉｍａｇｅｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ，２０１２，８２２３：８２２３４５）の助けを借りて抽出した。各群内の異なる動物の測定を、統計解析のために組み合わせた。
【０３４１】
データ分析
示された結果は、平均値±ＳＤである。クエン酸／生理食塩水、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、およびヒト組換えＶＥＧＦ−タンパク質で治療されたマウス間の量的差異を調べるために統計解析を実施するための反復測定のための混合モデルを使用した。共分散行列の自己回帰構造をもつ個々の切片モデルを、ベースラインからの直径または体積流量の差に適合させた。さらに、ベースライン血管直径または体積流量を、共変数として使用して、あらゆる差を補正した。
【０３４２】
結果
３匹の健康なマウスの耳に、高用量のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを皮内注射した。血管構造、ｓＯ２、および血流の、代表的な経時的ＰＡＭ画像を、図３９に示す。注射後間もなく（すなわち、最大６時間）、３匹すべてのマウスにおける注射部位の周囲で、血管ｓＯ２および血流の有意な上方調節が観察された。第７、１４、２１、および２８日に反復的に得られたＰＡＭ画像は、以前に上方調節されたｓＯ２が、徐々に退行するのに対して、血流はベースラインよりも上に維持されたことを示した。３つの高用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ注射された耳のうちの２つでは、血流の上方調節維持に加えて、著しい血管形成および血管新生が観察された（図４０）。ＰＡＭ画像におけるこれらの新生血管の強い対比は、これらが、赤血球で高度に覆われていることを暗示する。具体的には、図４０に見ら
れるように、新生血管は、の１４日後に現れ、第２１日に退行し、第２８日に「消失する」。同様に、第２の高用量マウスでは、新生血管は、第７日に現れ、注射の１４日後に「消失する」。新生血管の「退行／消失」は、血液灌流の喪失が原因である可能性が高かった。
【０３４３】
低下させたＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ投与量が、血流上方調節および血管新生を誘導することができるかどうかを探究するために、より低い用量のＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（３０μｇおよび１０μｇ）に対する血管反応を評価した。３０μｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを注射された１匹のマウスでは、ｓＯ２および血流の持続性がより低い上方調節が誘導され、これは、第１４日でのベースラインに戻っていた。注射部位の周囲に毛細血管形成をもたらす能力はあるが、顕著な血管新生は観察されなかった。２匹のマウスにおいてＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ投与量をさらに低く（１０μｇまで）低下させることは、さらに損なわれた血管反応をもたらした（図４１）。具体的には、血管ｓＯ２および血流の急性的な上方調節は、やや弱く、持続性がより低く（第７日でのベースラインに戻っていた）、注目すべき血管新生も血管形成も観察されなかった。これらの結果は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡに対する血管反応の用量依存性をさらに裏付ける。
【０３４４】
比較のために、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質に対する血管反応を、３匹のマウスにおいて研究した（図４２）。高および中用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡと同様、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、７日の監視期間全体を通して、局所的ｓＯ２および血流の上方調節維持を誘導した。しかし、非常に穏やかにすぎない毛細血管形成が、第７日の３匹のマウスのうちの２匹において観察され、新生血管は、すべての場合に観察されなかった。
【０３４５】
最後に、クエン酸／生理食塩水に対する血管反応を調べるために、３つの対照実験を実施した。図４３に示す通り、局所的ｓＯ２および血流は、注射後間もなく、おそらく間質液圧の上昇が原因で、わずかに上方調節され、第７日までにベースラインレベルに戻った。血管形成も、血管新生も、炎症反応も観察されなかった。
【０３４６】
血管セグメンテーションを使用して、高用量ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質、およびクエン酸／生理食塩水に対する血管反応を、さらに定量的に比較した。これを図４４に示す。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよびＶＥＧＦ−Ａタンパク質の注射後間もなく、急性的で顕著な血管拡張および血流上方調節が観察された。クエン酸／生理食塩水注射に応答して、おそらく間質液圧上昇の結果、血管径および血流における穏やかな反応も観察された。反応としての、ベースライン（注射前）からの血管径（４本の血管の平均）の変化を、治療、および対照とみなされるクエン酸／生理食塩水に対して、経時的に比較した。治療と時間との間の相互作用は、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）。すべての治療は、７日時点で互いに統計的に異なり（ｐ＝０．０００９）、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよびヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、６時間時点で生理食塩水とは異なっていた（ｐ＝０．００４）。ベースラインからの体積流量（４本の血管の平均）の変化について、同様の分析を実施した。体積流量の変化を、治療、および対照とみなされるクエン酸／生理食塩水に対して、経時的に比較した。治療と時間との間の相互作用は、統計的に有意であった（ｐ＝０．０２）。第７日で、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよびヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、クエン酸／生理食塩水とは異なっていた（ｐ＝０．００１５）。注射の７日後、クエン酸／生理食塩水群における血管径および血流は、ベースラインに戻り、これは、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡおよびヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質群における血管拡張維持および血流上方調節とは著しく対照的であった。
【０３４７】
局所注射に対する微小血管反応の空間依存性を、さらに探究した。この目的のために、５０μｍよりも大きい直径を有する主要なすべての血管を、血管セグメンテーションを使用して除去し、続いて、残った微小血管を、マイクロセグメント（ｍｉｃｒｏｓｅｇｍｅ
ｎｔ）に分けた。次いで、微小血管ｓＯ２および血流を、個々のマイクロセグメントの値を重ね合わせることによって、組織レベルに拡大した。重ね合わせにおける重み付け係数は、マイクロセグメントの重心と、対象となる組織の位置との間の距離の逆数と定義した。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射の前（すなわちベースライン）に得られた組織レベル血流およびｓＯ２マップを、第７日に得られたものから引くことによって、注射部位の下流の微小血管血流の、著しい（すなわち約４倍）かつ空間的に制限された上方調節が示された（図４５）のに対して、微小血管ｓＯ２の変化は穏やかであった（図４５）。対照的に、微小血管血流のＶＥＧＦ−Ａタンパク質によって誘導される上方調節は、あまり顕著ではなく、注射部位の周囲で、より濃縮されていた（図４６）が、微小血管ｓＯ２の増大は、より著しかった。予想通り、生理食塩水注射に対する微小血管反応は、第７日に消失した（図４７）。
【０３４８】
結論
多パラメータ光音響顕微鏡分析および血管セグメンテーションを使用して、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質、およびクエン酸／生理食塩水の皮内注射に対する時間空間的血管反応を監視および比較した。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡが、用量依存性の顕著かつ持続性の血管拡張、血流上方調節、毛細血管形成、および血管新生をインビボで誘導することができることが実証された。さらに、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡは、注射部位の下流の微小血管血流の、著しいかつ空間的に制限された上方調節を誘導し、これは、ヒト組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質に対する高度に濃縮された反応と明確に異なっていた。
【０３４９】
６．１６．実施例１６
ウサギにおけるインビボでのＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射後のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の発現および検出
この実験では、クエン酸／生理食塩水中に配合されたヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ）の皮内（ｉｄ）注射後のウサギ皮膚におけるＶＥＧＦ−Ａタンパク質の産生を、微小透析技術を用いて研究した。
【０３５０】
２種の微小透析プローブを、４匹の麻酔したウサギのそれぞれの左後脚に、皮内挿入した。ｔ＝０時間（ｈ）で、両方の微小透析プローブの回収時間を開始した。１時間後、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの４本の注射（各５０μＬおよび５０μｇ）を、各微小透析プローブの近くに施した。ｔ＝２ｈで開始して、ｔ＝６ｈまで、１ｈごとに、タンパク質含有溶出液を、氷上で収集した。最後の溶出液収集後、注射部位を取り囲む領域を切除した。
【０３５１】
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射の３時間後、検出可能なレベル（２１８±１５５、平均±ＳＥＭ）のヒトＶＥＧＦ−Ａが、８プローブのうちの３からの溶出液中に発見された。それに対応して、注射後４および５時間で、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質が、それぞれ、８プローブのうちの５、および８プローブのうちの５からの溶出液中に検出された。観察される濃度の大きな変動にもかかわらず；タンパク質レベルは、これらの時点でプラトー（それぞれ、３６９±２１７および３６０±２０３ｐｇ／ｍＬ）に達する傾向があった。
【０３５２】
ウサギ皮膚における微小透析技術を用いて、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射の３から５時間後に、ヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質を検出することができることが結論付けられる。
【０３５３】
【表９】
2019521976.tif 000011
【０３５４】
【表１０】
2019521976.tif 000012
【０３５５】
【表１１】
2019521976.tif 000013
【０３５６】
実験手順
麻酔および恒常性の維持：ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）雄ウサギを、静脈内急速静注として投与されるケタミン（５ｍｇ／ｋｇ，Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標），Ｐｆｉｚｅｒ  ＡＢ，Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびメデトミジン（０．１５ｍｇ／ｋｇ，Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標），Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で麻酔し、続いて、それぞれ維持注入（１１および０．３３ｍｇ／ｋｇ＊ｈ）を行った。これらのウサギに挿管し、Ｓｅｒｖｏ人工呼吸器（９００Ｄ，Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｅｌｅｍａ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、室内空気と１０％  Ｏ２との混合物で人工的に換気した。呼吸数を、３０サイクル／分で一定に維持した。実験前および実験中、血液ガス分析器（ＡＢＬ８００  Ｆｌｅｘ，Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって、動脈血中の血液ガスおよびｐＨを測定し、必要であれば、一回換気量を調整することによって、ウサギにとっての正常な生理的範囲内に入るように調整した。直腸内温度は、動物を覆うことによって、および外部加熱によって、３８から３９．５℃に維持した。
【０３５７】
動物準備：ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｃｓの投与のための経皮的ポリエチレンカテーテル（Ｖｅｎｆｌｏｎ  ０．８ｍｍ，Ｖｉｇｇｏ，Ｈｅｌｓｉｎｇｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、左耳の辺縁静脈に挿入した。ポリエチレンカテーテル（Ｉｎｔｒａｍｅｄｉｃ  ＰＥ−９０  Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、圧力トランスデューサ（Ｐｅｔｅｒ  ｖｏｎ  Ｂｅｒｇ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ  Ｇｍｂｈ，Ｋｉｒｃｈｓｅｅｏｎ／Ｅｎｇｌｈａｒｔｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる動脈圧記録のために、および血液採取のために、それぞれ右頸動脈に挿
入した。血圧測定からのシグナルを記録し、コンピュータおよびソフトウェア（ＰｈａｒｍＬａｂ  Ｖ６．６，ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｒ＆Ｄ  Ｍｏｅｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することによって採取した。左後脚の毛を、電気カミソリを用いて除去した。
【０３５８】
微小透析：２つの１００ｋＤａ線状（ｌｉｎｅａｒ）微小透析プローブ（各実験においてＡおよびＢと名付けられる）（６６線状カテーテルおよび６６高カットオフ線状カテーテル、Ｍ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  ＡＢ，Ｈａｍｍａｒｂｙ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を、製造業者によって提供される指示書にしたがって、ウサギの左後脚の上部に皮内挿入した。微小透析プローブを、０．５μＬ／分生理的食塩水（９ｍｇ／ｍＬ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ  ＡＧ，Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で灌流し、溶出液試料を、あらかじめ秤量した０．５ｍＬ管内で氷上で収集した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。透析膜と収集管出口との間のデッドスペースは、約１．５μＬであった。各溶出液の体積を決定し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ａ７９７９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、ｇｉｂｃｏ（登録商標）、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標），Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫによる）に入れたものを、１：１条件で添加した。試料を、分析するまで−８０℃で保管した。
【０３５９】
実験プロトコル：実験設計を、図４８Ａに例示する。ｔ＝０時間で、両方の微小透析プローブに対する回収期間を開始した。１時間後（すなわちｔ＝１時間）、回収溶出液を収集し、続いて、微小透析−プローブ部位での４本の注射を、図４８Ｂに表す通りに実施した。ｔ＝２ｈからｔ＝６ｈまで１ｈごとに、タンパク質含有溶出液を収集し、上に記載した通りに処理した。研究終了時に動物を、致死静脈内用量のペントバルビタールナトリウム（Ａｌｌｆａｔａｌ  ｖｅｔ，Ｏｍｎｉｄｅａ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって生命終焉させた。
【０３６０】
微小透析溶出液中のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の評価：微小透析溶出液試料における発現されたヒトＶＥＧＦ−Ａ濃度の決定のために、Ｇｙｒｏｌａｂプラットフォームを使用した。Ｇｙｒｏｌａｂは、微細構造ウェル（Ｇｙｒｏｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を伴うアフィニティフロースルーフォーマットを使用する。ストレプトアビジンコーティング材料（Ｇｙｒｏｓ）を用いるアフィニティ捕捉カラムを含有する９６微細構造ウェルからなるＧｙｒｏｌａｂ  ｂｉｏａｆｆｙ  １０００  ＣＤを使用した。最初に、ヒトＶＥＧＦ  Ａに対するビオチン標識された捕捉ポリクローナル抗体（ＡＦ−２９３−ＮＡ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）を、ストレプトアビジンカラム（ここでは、試料は回転重力によってフロースルーし、分析物は抗体上に捕捉される）に固定した。次いで、ヒトＶＥＧＦ−Ａに対するＡｌｅｘａ標識された検出抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、カラムをフロースルーさせ、リガンドの定量化のために蛍光強度を使用した。５パラメータ線形適合を使用して標準曲線を作成し、その吸光度にしたがって、標準曲線から試料濃度を算出した。１６．７ｐｇ／ｍＬから１２１７０ｐｇ／ｍＬの範囲の標準曲線は、ＭＳＤ希釈剤９（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）に入れたヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５（２９３−ＶＥ−０１０，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて準備した。品質管理は、ＭＳＤ希釈剤９に入れたヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のＷＨＯ標準から準備した。標準、ＱＣ、および試料はすべて、分析前にＲｅｘｘｉｐ  ＨＮ−ｍａｘ（Ｇｙｒｏｓ）と１：１混合した。
【０３６１】
データ分析：結果は、平均±ＳＥＭとして示す。
結果
４匹のウサギ（２つのプローブ、それぞれＡとＢを挿入）からの個々のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質レベルを、図４９に、平均±ＳＥＭとして示す。ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射の３時間後、検出可能なレベル（２１８±１５５、平均±ＳＥＭ）のヒトＶＥＧＦ−Ａが、８プローブのうちの３からの溶出液中に発見された。それに対応して、注射後４および５時間で、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質が、それぞれ、８プローブのうちの５、および８プローブのうちの５からの溶出液中に検出された。観察される濃度の大きな変動にもかかわらず、タンパク質レベルは、これらの時点でプラトー（それぞれ、３６９±２１７および３６０±２０３ｐｇ／ｍＬ）に達する傾向があった。
【０３６２】
結論
微小透析技術を用いて検出されるヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質は、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの皮内注射の３から５時間後のウサギ皮膚において発現される。
【０３６３】
６．１７．実施例１７
インビボでの、心筋梗塞を施されたブタにおけるヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの心臓内注射後の、毛細血管および細動脈密度および線維症に対する効果
毛細血管および細動脈密度および線維症に対する、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１もしくは１０ｍｇ）、クエン酸／生理食塩水（２ｍＬ）、または偽処置の効果の評価を、Ｌａｎｙｕミニブタにおいて行った。
【０３６４】
毛細血管および細動脈密度アッセイ：研究停止後、梗塞周囲領域からの組織試料を、４％パラホルムアルデヒド中で４℃で少なくとも２４時間固定し、次いで、パラフィン包埋した。切片作製、脱パラフィン、および再水和後、１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）中で１０分間煮沸することによって、抗原賦活化を実施した。次いで、切片を抗心筋トロポニンＩ（１：２００，ＤＳＨＢ，Ｉｏｗａ，ＩＡ，ＵＳＡ）、抗イソレクチン（１：１００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、およびＳＭ−２２α（１：２００，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）と共に一晩インキュベートした。３回洗浄した後、切片を、関連するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８または５６８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。核を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で染色した。マウントした後、毛細血管および細動脈密度を、梗塞周囲領域に沿う、ランダムに選択された３つの領域で撮影された画像（２００×倍率）から手作業で数えるおよび平均することによって算出した。
【０３６５】
線維症測定：梗塞／梗塞周囲領域から離れた試料を、梗塞周囲領域試料について上に記載した通りに処理した。線維症を、コラーゲン沈着の関数として、マッソントリクローム染色を使用して決定した。各切片に対して明視野顕微鏡法（２００×倍率）を使用して、ランダムに選択された３つの領域からの画像を撮影し、次いで定量化（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｚｅｉｓｓ，Ｍｕｎｉｃｈ  Ｇｅｒｍａｎｙ）し、平均した。
【０３６６】
結果
図５０Ａおよび図５０Ｂは、心筋梗塞の誘発の２か月後に評価される、梗塞周囲（境界）域における、毛細血管および細動脈密度に対する、偽処置、またはＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡ（１もしくは１０ｍｇ）またはクエン酸／生理食塩水（２ｍＬ）の注射の効果を示す。見てわかるように、ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射は、クエン酸／生理食塩水の注射に対して、用量依存性かつ統計的に有意な、毛細血管および細動脈密度の増大と関連していた。
【０３６７】
クエン酸／生理食塩水に対するＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡの注射は、梗塞を起こした領域から離れた、回収された組織試料におけるコラーゲン含有量（すなわち、線維症）を統計
的に有意に和らげることが実証された（図５０Ｃ）。
【０３６８】
６．１８．実施例１８
インビトロでのヒトＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡトランスフェクション後のＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の時間経過
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡトランスフェクション後のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質産生の時間プロフィールを調べるために、１０，０００個のヒト大動脈平滑筋細胞（ｈＡｏＳＭＣ、Ｌｏｎｚａ，Ｂａｚｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）または人工多能性細胞から誘導された、２０，０００個のヒト心筋細胞（ｈｉＰＳ−ＣＭ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、それぞれ、９６ウェルプレート内、増殖因子を添加した平滑筋細胞基本培地（ＳｍＧＭ−２，Ｌｏｎｚａ）または完全に添加された心筋細胞維持培地（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に播種した。翌日、無血清培地中でトランスフェクションを行い、２５０ｎｇ  ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡを、製造業者の指示書にしたがってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）と混合し、細胞に添加した。水と混合したリポフェクタミン２０００を、トランスフェクション対照として使用した。培地を、８時間ごとに新鮮な培地で置き換え、異なる時点でＥＬＩＳＡを用いて、上清中のヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質を測定した。
【０３６９】
ＶＥＧＦ−Ａ改変ＲＮＡから産生されたヒトＶＥＧＦ−Ａタンパク質の大きさは、ヒト大動脈平滑筋細胞とヒト心筋細胞の両方において、トランスフェクションのおよそ８時間後に最大になり、その後、低レベルに減少した（図５１）。トランスフェクション後３２時間では、まったくまたは非常に低レベルのタンパク質しか検出されなかった。
【０３７０】
６．１９．実施例１９
マウスにおける心筋梗塞後の心外膜由来細胞増殖の時間経過
雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを、イソフルランで麻酔し、挿管し、人工呼吸器につないで、空気および酸素（８０／２０％）を添加した２．５から３％イソフルランを用いて人工的に換気した。直腸内温度を、手術台の加熱および加熱灯によって、３７．５℃に維持した。続いて、胸部を剃毛し、心拍数およびＥＣＧの評価のために、ＥＣＧ針電極を足に挿入した。皮膚を切開し、胸部筋肉を注意深く切り離し、胸部開創器挿入のために第４肋間腔を開いた。心膜を優しく切開し、永久的閉塞のために、左心房のすぐ下の左前下行枝の周りに７−０絹糸結紮を行った。目視検査（糸の遠位の左室の蒼白）およびＥＣＧのＳＴ上昇を介して虚血を確認した。対照動物は、動脈閉塞を施さなかった。次いで、６−０吸収性縫合糸で肋骨および皮膚を閉じた。鎮痛剤（ブプレノルフィン、０．０５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍＬ／ｋｇ）を皮下に施し、マウスを、電気加温パッド上のそのケージ内で回復させた。マウスを、第３日、第７日に、および心筋梗塞（ＭＩ）後第１４日に屠殺した。心臓を切除し、次いで、生理食塩水中ですすいだ後、ホルマリン固定を行った。心外膜由来細胞（ＥＰＤＣ）活性化を、免疫組織化学を介してウィルムス腫瘍タンパク質１（Ｗｔ−１）発現によって評価した。
【０３７１】
ホルマリン固定された心臓を、心尖から心臓の底部まで、横方向に１ｍｍ切片に薄切りにした。これらの心臓切片を、エタノールおよびキシレン中で脱水し、パラフィンに包埋し、最後に４μｍ切片に切断した。ＥＰＤＣのマーカーとしてのＷｔ−１に対する免疫組織化学を、Ｗｔ−１に対するウサギポリクローナル抗体（希釈１：２００，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ自動染色装置（ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ）内で実施した。試薬はすべて、Ｖｅｎｔａｎａ製品（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）であった。Ｗｔ−１陽性（Ｗｔ−１＋）細胞を、盲検的に、手動スコアリングシステムを用いて評価した。スコアは、０；Ｗｔ−１＋細胞なし、１；極めて少ない数のＷｔ−１＋陽性細胞、２；心臓内に特定のレベルで位置する単一層の、少数のＷｔ−１＋陽性細胞、３；心臓内にいくらかのレベルで位置する中程度の数のＷｔ−１＋陽性細胞、および４；心臓内にいくらかのレベルで位置する厚い層の多数のＷｔ−１＋陽性細胞と定義した。
【０３７２】
対照、すなわち梗塞を起こしていない心臓の心外膜には、少数のＷｔ−１＋ＥＰＤＣが見られた（図５２Ａ）。ＭＩの誘発後、Ｗｔ−１＋ＥＰＤＣは、活性化されて、数が増え、ＭＩ後７日にピークに到達する（図５２Ｂ）。
【０３７３】
７．配列表
７．１．配列番号１：実施例内で使用されるＶＥＧＦ−Ａをコードする改変ＲＮＡ
【化１】
2019521976.tif 000014
ここでは：
Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ＝それぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＧＭＰ、およびＮ１−メチル−シュードＵＭＰ、
Ｍｅ＝メチル
ｐ＝無機リン酸塩
【０３７４】
７．１．配列番号２：ヒトＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ−１６５のアミノ酸配列
【化２】
2019521976.tif 000015
【０３７５】
【表１２】
2019521976.tif 000016
【０３７６】
【表１３】
2019521976.tif 000017
【０３７７】
【表１４】
2019521976.tif 000018
【０３７８】
【表１５】
2019521976.tif 000019
【０３７９】
【表１６】
2019521976.tif 000020
【０３８０】
【表１７】
2019521976.tif 000021
【０３８１】
【表１８】
2019521976.tif 000022
【０３８２】
【表１９】
2019521976.tif 000023
【図１】
2019521976.tif 000024
【図２】
2019521976.tif 000025
【図３】
2019521976.tif 000026
【図４】
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【図５】
2019521976.tif 000028
【図６】
2019521976.tif 000029
【図７】
2019521976.tif 000030
【図８】
2019521976.tif 000031
【図９】
2019521976.tif 000032
【図１０】
2019521976.tif 000033
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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