(57)【要約】本発明は下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）2019521152.tif 000022の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であって、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられるものに関する。
2019521152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる、下記一般式（Ｉ）の化合物：
2019521152.tif 000014
〔式中、Ｈｅｔは含窒素ヘテロシクロアルキル；
Ｘは単結合、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−６アルコキシ基、特に単結合、Ｃ１−３アルキル基またはＣ１−３アルコキシ基；
Ｙは−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１、Ｃ１−６アルキル、およびＣ１−６アルキル−アリール［Ｃ１−６アルキルは＝Ｏ、＝Ｓまたはフェニルで任意に置換され；アリールは水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２、および以下の［置換基群］から選択される置換基： 
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され、または、二つの隣接する置換基は、それらが結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよい：
から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよい。］からなる群より選択され；
Ｒ１からＲ４は互いに独立して、水素原子または（ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２９、およびＣ１−６アルキルから選択される置換基）であり、該Ｃ１−６アルキルは、ハロおよび−ＯＲ３０から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ１０からＲ３０は、互いに独立して、水素原子、ハロ、または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、該置換基はハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＦ３および−ＯＲ３１から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され；
Ｒ３１は、水素原子、ハロまたはＣ１−６アルキル基である。〕
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項２】
Ｙが、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、および（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）から選択される一つまたは数個の置換基、好ましくは一つから四つの置換基、特に一つまたは二つの置換基で任意に置換されるＣ１−６アルキル−フェニルである、請求項１に記載の用途に用いられる化合物。
【請求項３】
下式（Ｉａ）
2019521152.tif 000015
（式中、Ｈｅｔは含窒素ヘテロシクロアルキル；
Ｒ１からＲ９は請求項１に同じ。）
で表される、請求項１または２に記載の用途に用いられる化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項４】
Ｈｅｔがピペラジニルまたはピペリジニルである、請求項１から３のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項５】
下式（Ｉｂ）
2019521152.tif 000016
（式中、Ｒ１からＲ９は請求項１に同じ。）
で表される、請求項１から４のいずれかに記載の用途に用いられる化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項６】
Ｒ１からＲ４が、互いに独立して、水素原子、または（ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、およびＣ１−６アルキルから選択される置換基）；特に、Ｒ１からＲ４が、互いに独立して、水素原子、または（ハロ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、およびＣ１−６アルキルから選択される置換基）；さらに特別に、Ｒ１からＲ４が、互いに独立して、水素原子またはハロであり；
Ｒ２５からＲ２７が請求項１と同じである、請求項１から５のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項７】
Ｒ５からＲ９が、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり；好ましくは、Ｒ５からＲ９が、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、または（Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり；さらに特別に、Ｒ５からＲ９が、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ１３からＲ１９が請求項１と同じである、請求項３から６のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項８】
Ｒ１０からＲ３０が、互いに独立して、水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキルである、請求項１から７のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項９】
下式（Ｉｃ）：
2019521152.tif 000017
で表される、請求項１から８のいずれかに記載の用途に用いられる化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物、好ましくは化合物（Ｉｃ）の二塩酸塩。
【請求項１０】
アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる、下記一般式（II）の化合物：
2019521152.tif 000018
〔式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、互いに独立して、ＣＨ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＮであり；
Ｗ’は、ＣＨまたはＳＨであり；
Ｒ’１およびＲ’２は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＲ’７、−ＮＲ’８Ｒ’９またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏ、−ＯＲ’１０またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ’４およびＲ’５は、互いに独立して、水素原子、または〔ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキル基から選択される置換基〕であって、該Ｃ１−６アルキル基はハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され；
Ｒ’７からＲ’１６は、互いに独立して、水素原子または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であって、該置換基はハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＦ３および−ＯＲ１７から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され；
Ｒ’１７は水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキルである。〕
で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項１１】
アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる、下記一般式（IIａ）の化合物：
2019521152.tif 000019
〔式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、互いに独立して、ＣＨ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＮであり；
Ｒ’１およびＲ’２は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＲ’７、−ＮＲ’８Ｒ’９またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏ、−ＯＲ’１０またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ’４およびＲ’５は、互いに独立して、水素原子または〔ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキル基から選択される置換基〕であって、該Ｃ１−６アルキル基は（ハロおよび−ＯＲ’１６）から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され；
Ｒ’７からＲ’１６は、互いに独立して、水素原子または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、該置換基はハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＦ３および−ＯＲ１７から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され：
Ｒ’１７は水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキルである。〕
で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項１２】
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’が窒素原子である、請求項１０に記載の用途に用いられる化合物。
【請求項１３】
Ｒ’３が−ＣＮ、＝ＯまたはＯＨ、好ましくはＲ’３が−ＣＮである、請求項１０から１２のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項１４】
Ｒ’１およびＲ’２が、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨまたはＣ１−６アルキル基；好ましくは、Ｒ’１およびＲ’２が、互いに独立して、水素原子またはハロ；より好ましくは、Ｒ’１およびＲ’２が、互いに独立して、水素原子またはＣｌである、請求項１０から１３のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項１５】
Ｒ’５が水素原子、Ｒ’４が、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨおよびＣ１−６アルキル基からなる群から選択される置換基；好ましくは、Ｒ’５が水素原子、Ｒ’４が、水素原子またはハロ；より好ましくは、Ｒ’５が水素原子、Ｒ’４が、水素原子またはＣｌである、請求項１０から１４のいずれかに記載の用途に用いられる化合物。
【請求項１６】
下式（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）：
2019521152.tif 000020
で表される、請求項１０から１５のいずれかに記載の用途に用いられる化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項１７】
下式（ＩＩｄ）：
2019521152.tif 000021
で表される、請求項１０から１６のいずれかに記載の用途に用いられる化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれかに記載の少なくとも一つの化合物および／または請求項１０から１７のいずれかに記載の一つの化合物、および少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤を含み、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる、医薬組成物。
【請求項１９】
局所用の抗生物質（エリスロマイシンまたはダラシン）、局所用の抗炎症剤（ベンゾイルペルオキシド誘導体）、局所用の抗脂漏薬（イソトレチノイン、トレチノイン、アダパレン）、亜鉛誘導体（グルコン酸亜鉛）、サイクリン、またはイソトレチノインのような、さらに別の有効成分を含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は二つの化合物群、即ち、メクロジン誘導体とジクラズリル誘導体に関するもので、これらはアクネ菌による炎症関連疾患、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療のために用いられる。本発明はまた、該化合物を含む医薬組成物に関するもので、これら組成物は、アクネ菌による炎症関連疾患、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療のために用いられる。
【背景技術】
【０００２】
プロピオニバクテリウム属は、放線細菌門に属し、皮膚表面に多く見られる皮膚種を含む。最も重要な皮膚の共生種は、P.acnes、P.granulosum、P.lymphophilum、P.propionicumおよびP.avidumである。
プロピオニバクテリウム・アクネス（P.acnes）は、従来、コリネバクテリウム属として分類されていて、グラム陽性、耐気性嫌気性菌であり、胞子無形成の類ジフテリア菌または桿菌として記述された。アクネ菌の細胞壁と外殻が有する多くのユニークな特徴により他のグラム陽性菌と区別が可能である。アクネ菌は、通常、真核細胞に特有のホスファチジルイノシトールを合成する。また、アクネ菌のペプチドグリカンは多くのグラム陽性菌と異なり、L,L-ジアミノピメリン酸とD-アラニンのペプチド鎖の架橋領域を含み、その中で二つのグリシン残基が二つのL,L-ジアミノピメリン酸のアミノ基とカルボキシ基を結合している（Kamisango、1982年）。
【０００３】
アクネ菌は通常の皮膚微生物叢に属し、特に、皮脂の産生が重要な脂肪分泌性小胞に見られる（顔、胸、背中）。細菌密度は各個人および調査領域で異なるが、皮膚１cm２当たり細菌数１０７個に達する。アクネ菌は、成長に必要なエネルギーを与える皮脂の脂肪酸を触媒する能力において、この生態学的ニッチに順応している（BojarおよびHolland、2004年）。
ヒト共生細菌叢におけるアクネ菌の放棄された存在は、宿主と細菌が互いに利益を得る、長い共進化の現れを示唆している。しかし、もしもアクネ菌株が片利共生と考えるなら、いくつかの研究が洞察をもたらす。それに依れば、この細菌は口腔、気道、眼球粘膜、胃腸管内にも存在すると思われるので、日和見病原体と切り替えられる。また、より侵襲的な感染症または臨床状態に含まれると思われる（AchermannらのReview、2014年）。実際、アクネ菌は通常、皮膚の炎症性ニキビで単離される（Dessinioti、2010年）が、後期の人工関節感染症、心内膜炎、眼内炎、骨髄炎、シャント関連中枢神経系感染においても見られる（BrookおよびFrazier、1991年；Funke、1997年；Tunney、1999年）。さらに驚くべきことには、サルコイドーシスの原因論(Eishi、2002年)や前立腺癌(Fehri、2011年)における役割も疑われている。また、医療インプラントのバイオフィルム感染からの試料において、しばしばアクネ菌が単離される（Zedtwitz-Liebenstein、2003年）。
【０００４】
アクネ菌のゲノムは完全に解析されていて、2.5 Mbpの配列である。微好気性の条件で生存できる代謝酵素遺伝子を持っているが、また、毛嚢脂腺の小胞に含まれる脂質を分解して細菌に必要なエネルギーを与えるリパーゼも有している。またアクネ菌は、アンカー配列ＬＰＸＴＧを含む表面タンパクをコードする遺伝子を有していて、接着と同様、先天性免疫の活性化に関与している可能性がある(Brueggemann、2004年；Brzuszkiewicz、2011年)。最初に、アクネ菌は、細胞表面のガラクトシル残基の存在により、血清型ＩとＩＩに分けることができる(JohnsonおよびCummins、1972年)。ヌクレオチド配列とＭＬＳＴ分析に基づいて、六つのアクネ菌系統型、ＩＡ１、ＩＡ２、ＩＢ、ＩＣ、ＩＩおよびＩＩＩが同定された(McDowell、2013年)。これら系統型は、前炎症性分子の産生誘発能力、感染との関連、生化学的および形態学的特性、凝集能力に関係している(McDowell、2012年)。
【０００５】
アクネ菌の病原性は、免疫系に作用することができる多くの成分を環境中に分泌することで特徴付けられる。アクネ菌による毛嚢脂腺のコロニー化は炎症性応答で生じる最初の事象であり、細菌は、１）濾胞上皮の攻撃に寄与する溶解酵素及びリパーゼを分泌し、２）好中球を上皮膜に誘引する化学走化性因子を産生し(Jappe、2002年)、３）先天性免疫のＴＬＲ受容体を活性化する。実際、アクネ菌は、角化細胞、脂腺細胞および単球による前炎症性分子（インターロイキン類 ＩＬ−１α／β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２；ＴＮＦ−α、β−ディフェンシン）のインビトロ産生を誘引することができるが、座瘡のインビボ産生誘因はできない。従ってこの産生は、ＴＬＲ−２受容体を介し、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路を介するように、ＮＦ−κＢとＭＡＰＫシグナル経路を介する。アクネ菌はまた、角化細胞により活性酸素種の大量生産を誘起し、炎症反応の開始と増幅に寄与する（Graham、2004年; Grange、2009年a; Grange、2009年b; Kang、2005年; Nagy、2005年; Trivedi、2006年; Qin、2014年; Kistowska、2014年；Jugeau、2005年）。
【０００６】
２５〜３０年間、アクネ菌の処置は、分泌される皮脂の量に作用するか、および／または毛嚢脂腺の細菌密度の減少に作用するかであった。抗生物質処置に対するアクネ菌の応答は大変遅く、数ヶ月もかかった。さらにアクネ菌に対する抗生物質の使用が広がり、相当な選択圧がかかり、マクロライド系抗生剤やテトラシクリン等の耐性アクネ菌が出現し、今や４０％の耐性菌となっている。細菌耐性、特にアクネ菌の抗生剤耐性は地球規模の大きな問題であり、新たな治療方法の開発に向けていくつかの研究が動いている。従って、今日まで、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の治療および／または予防のための必要性が存在する。
本研究では、アクネ菌誘発の炎症を減少させ得る新しい分子を同定するため、化学ライブラリーをスクリーニングした。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の発明者らは、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療において、メクロジン誘導体およびジクラズリル誘導体という、二つの化合物群を発見した。
【０００８】
本発明の第一の目的は、下記一般式（Ｉ）の化合物：
2019521152.tif 000003
〔式中、Ｈｅｔは含窒素ヘテロシクロアルキル；
Ｘは単結合、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−６アルコキシ基、特に単結合、Ｃ１−３アルキル基またはＣ１−３アルコキシ基；
Ｙは−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１、Ｃ１−６アルキル、およびＣ１−６アルキル−アリール［Ｃ１−６アルキルは＝Ｏ、＝Ｓまたはフェニルで任意に置換され；アリールは水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２、および以下の［置換基群］から選択される置換基： 
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され、または、二つの隣接する置換基は、それらが結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよい：
から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよい。］からなる群より選択され；
【０００９】
Ｒ１からＲ４は互いに独立して、水素原子または（ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２９およびＣ１−６アルキルから選択される置換基）であり、該Ｃ１−６アルキルは、ハロおよび−ＯＲ３０から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ１０からＲ３０は、互いに独立して、水素原子、ハロ、または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であって、該置換基はハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＦ３および−ＯＲ３１から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され；
Ｒ３１は、水素原子、ハロまたはＣ１−６アルキル基である。〕
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であって、
アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる。
【００１０】
本発明の第二の目的は、下記一般式（II）の化合物：
2019521152.tif 000004
〔式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は互いに独立して、ＣＨ、ＣＨ２、ＮＨまたはＮであり；
Ｗ’はＣＨまたはＳＨであり；
Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＲ’７、−ＮＲ’８Ｒ’９またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏ、ＯＲ’１０またはＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ’４およびＲ’５は互いに独立して、水素原子、または〔ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキル〕から選択される置換基であって、該Ｃ１−６アルキルは、ハロおよび−ＯＲ１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され：
Ｒ’７からＲ’１６は、互いに独立して、水素原子、または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなる群から選択される置換基）であって、該置換基はハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＣＦ３および−ＯＲ’１７からなる群より選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され；
Ｒ’１７は水素原子、ハロまたはＣ１−６アルキルである。〕
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であって、
アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる。
【００１１】
本発明の第三の目的は、少なくとも一つの一般式（Ｉ）の化合物および／または一般式（II）の化合物と、少なくとも一つの医薬上許容される賦形剤を含み、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる医薬組成物に関連する。
【００１２】
＜定義＞
発明の目的から、「薬学上許容される」とは医薬組成物の調製に有用なもの、および薬学上の使用において一般に安全で非毒性のものを意味することを意図する。
「薬学上許容される塩または溶媒和物」とは、本発明の枠内において、上記で定義の如く、薬学上許容される、化合物の塩または溶媒和物であって、対応する化合物の薬学的活性を有するものを意味することを意図する。
薬学上許容される塩は、
１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、または酢酸、ベンゼンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシナフトエ酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、２−ナフタレンスルホン酸、プロピオン酸、コハク酸、ジベンゾイル−Ｌ−酒石酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリメチル酢酸、トリフルオロ酢酸等の有機酸と形成される酸付加塩；
２）該化合物中に酸性プロトンが存在する場合、金属イオン（例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン若しくはアルミニウム等）との置き換えか、または有機若しくは無機塩基の配位によって形成される塩基付加塩。許容される有機塩基には、ジエタノールアミン、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、トリエタノールアミン、トロメタミン等が含まれる。許容される無機塩基には、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムが含まれる。本発明化合物の治療用途で許容される溶媒和物には、従来型の溶媒和物、即ち、発明化合物の最終調製工程において、溶媒が存在する結果生成するような溶媒和物が含まれる。例えば、水（この溶媒和物は水和物とも呼ばれる。）またはエタノールの存在するため生成する溶媒和物が例示される。
【００１３】
本発明で使用される「Ｃ１−６アルキル」の語は、炭素数１から６を有する、直鎖または枝分かれした飽和炭化水素鎖をいい、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシル、sec-ヘキシル、tert-ヘキシルが含まれるが、限定はされない。同様に、本発明で使用される「Ｃ１−３アルキル」の語は、炭素数１から３の、直鎖または枝分かれした飽和炭化水素鎖をいい、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル等が含まれるが、限定はされない。
本発明で使用される「アリール」の語は、一つまたはそれ以上の、特に１または２の縮合環を含み、好ましくは炭素数６から１０の芳香族炭化水素いい、フェニルまたはナフチルが例示される。有利には、フェニルである。
本発明で使用される「Ｃ１−６アルキル−アリール」の語は、上記で定義したＣ１−６アルキルを介して該分子に結合する、上記で定義したアリールをいう。特に、Ｃ１−６アルキル−アリール基は、ベンジル基またはプロピルベンジル基である。
【００１４】
本発明で使用される「Ｃ１−６アルコキシ」の語は、酸素原子を介して該分子に結合する、上記で定義したＣ１−６アルキルをいい、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、t-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシが例示されるが。限定はされない。同様に、本発明で使用される「Ｃ１−３アルコキシ」の語は、酸素原子を介して該分子に結合する、上記で定義したＣ１−３アルキルをいい、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ等が例示されるが、限定はされない。特に、Ｃ１−６アルコキシはメトキシ基またはエトキシ基である。
本発明で使用される「Ｃ３−６シクロアルキル」の語は、炭素数３から６の、炭化水素環をいい、特にシクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルをいう。好ましくは、Ｃ３−６シクロアルキル基は、シクロプロピル基である。
【００１５】
本発明で使用される「ヘテロシクロ」の語は、飽和、不飽和または芳香族炭化水素であって、単環または多環（縮合環、架橋環またはスピロ環を含む。）、例えば二環性であり、一つまたはそれ以上の、有利的には１から４、より有利には１または２の炭素原子が、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子、特に窒素により置き換えられたものをいう。有利には、ヘテロ環は５から１５、特には５から１０の原子を環内に有する。ヘテロシクロの各環は、有利的には５または６の構成元素を有する。特定の態様に従えば、ヘテロシクロは飽和、不飽和または芳香族炭化水素であって、単環または二環性（縮合環、架橋環またはスピロ環、特には縮合環を含む。）であり、各環が５員環または６員環で、１から４、特には１または２の炭素原子が、窒素または酸素、特に窒素により置き換えられたものをいう。ヘテロシクロは、特に、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イソチアゾリジン、トリアゾール(1,2,3-トリアゾールおよび1,2,4-トリアゾール)、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチオフェン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、トリアジナン、モルホリン、ピロリジン、ジヒドロピリジン、ジヒドロピリミジン(特に1,2-ジヒドロピリミジン)、ジヒドロピリダジン、ジヒドロピラジン、ジヒドロトリアジン、テトラヒドロピリジン、テトラヒドロピリミジン、テトラヒドロピリダジン、テトラヒドロピラジン、テトラヒドロトリアジン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジオキサラン、等であり得る。特に、ヘテロシクロは、ピペリジンまたはピペラジンである。
【００１６】
本発明で使用される「含窒素ヘテロシクロ」の語は、少なくともひとつの窒素原子を含む、上記のヘテロシクロをいう。このような含窒素ヘテロシクロは、飽和、不飽和または芳香族炭化水素であって、単環または多環（縮合環、架橋環またはスピロ環を含む。）、例えば二環であり、一つまたはそれ以上の、有利的には１から４、より有利には１または２の炭素原子が、窒素、酸素、および硫黄から選択されるヘテロ原子で、少なくとも一つのヘテロ原子は窒素原子であり、特にすべてのヘテロ原子が窒素原子であるようなものである。有利的には、そのヘテロシクロは５から１５の、特に５から１０の原子を環内に有する。ヘテロシクロの各環は有利的には５員から６員である。
含窒素ヘテロシクロは、特に、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イソチアゾリジン、トリアゾール（1,2,3-トリアゾールまたは1,2,4-トリアゾール）、インドール、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズイソキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、ピペリジン、ピペラジン、トリアジナン、モルホリン、ピロリジン、ジヒドロピリジン、ジヒドロピリミジン（特に1,2-ジヒドロピリミジン）、ジヒドロピリダジン、ジヒドロピラジン、ジヒドロトリアジン、テトラヒドロピリジン、テトタヒドロピリミジン、テトラヒドロピリダジン、テトラヒドロピラジン、テトラヒドロトリアジン等である、特にこのヘテロ環はピペリジンまたはピペラジンである。
発明で使用される「Ｃ１−６アルキル-ヘテロシクロ」の語は、上記で定義したＣ１−６アルキル基を介して、該分子と結合した上記で定義したヘテロシクロ基をいう。特に、Ｃ１−６アルキル-ヘテロシクロ基はヘテロシクロ-メチル基である。
発明で使用される「ハロゲン」または「ハロ」の語は、フッ素、臭素、塩素またはヨウ素をいう。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜メクロジン誘導体＞
本発明の第一の目的の個別の態様に従えば、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる、一般式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物において、Ｘは単結合、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−６アルコキシ基であり、特に、単結合、Ｃ１−３アルキル基またはＣ１−３アルコキシ基である。さらに特別には、Ｘは単結合またはＣ１−３アルコキシ基であり、特に、Ｘは単結合またはプロポキシ基、また好ましくはプロポキシ基である。有利的には、Ｘは単結合である。
【００１８】
一般式（Ｉ）の化合物の好ましい態様では、Ｙは、−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１、Ｃ１−６アルキル、およびＣ１−６アルキル−アリール［Ｃ１−６アルキルは＝Ｏ、＝Ｓまたはフェニルで任意に置換され；アリールは水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２および以下の［置換基群］から選択される置換基： 
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され、または、二つの隣接する置換基は、それらが結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよい：
から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよい」からなる群より選択される。
【００１９】
特に、Ｙは、−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、−Ｒ１０Ｃ（Ｏ）ＮＲ１１、およびＣ１−６アルキル−アリール［Ｃ１−６アルキルは＝Ｏ、＝Ｓまたはフェニルで任意に置換され；アリールは、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２、および以下の［置換基群］から選択される置換基：
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され、または、二つの隣接する置換基は、それらが結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよい：
から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよい。］からなる群より選択される。
【００２０】
より特別には、ＹはＣ１−６アルキル−アリール［Ｃ１−６アルキルは＝Ｏ、＝Ｓまたはフェニルで任意に置換され；アリールは、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２および以下の［置換基群］から選択される置換基：
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され、または、二つの隣接する置換基は、それらが結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよい：
から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよい。］からなる群より選択される。
【００２１】
有利的には、ＹはＣ１−６アルキル−アリールであり、ここで該アリールは、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２および以下の［置換基群］から選択される置換基：
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換され、または、二つの隣接する置換基は、それらが結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよい：
から選択される一つまたは数個の置換基、好ましくは一つから四つの置換基、特に一つまたは二つの置換基で任意に置換されてもよい。
【００２２】
より有利的には、ＹはＣ１−６アルキル−アリールであり、ここで該アリールは、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、および（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）から選択される一つまたは数個の置換基、好ましくは一つから四つの置換基、特に一つまたは二つの置換基で任意に置換され、
好ましくは、これら該アリール置換基は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、または（Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、より特別には、該アリール置換基は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、またはＣ１−６アルキルである。有利には、該アリール置換基は、互いに独立して、水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキル、特にＣ１−３アルキルである。
上記のＹの定義において、Ｃ１−６アルキル−アリールは好ましくはＣ１−６アルキル−フェニルであり、より好ましくはＣ１−３アルキル−フェニルである。
【００２３】
本発明の第一の目的の個別の態様において、Ｘは単結合、Ｃ１−３アルキルまたはＣ１−３アルコキシ基、特に単結合、プロピル、またはエトキシ、好ましくはプロピルまたはエトキシ基であり；ＹはＣ１−６アルキル（特にメチル）およびＣ１−６アルコキシ（特にメトキシ）から選択される一つから四つの置換基で任意に置換されたＣ１−６アルキル−アリールであり、好ましくはＣ１−６アルキル（特にメチル）およびＣ１−６アルコキシ（特にメトキシ）から選択される一つから四つの置換基で任意に置換されたＣ１−６アルキル−フェニルである。この態様において、Ｘは好ましくはＣ１−３アルコキシ（特にエトキシ）であり、Ｙは好ましくはＣ１−６アルキル−フェニルである。
【００２４】
本発明の第一の目的の、もう一つの個別の態様において、Ｘは単結合で、Ｙは、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９および（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）から選択される一つまたは数個の置換基、好ましくは一つから四つの置換基、特に一つまたは二つの置換基で任意に置換されたＣ１−６アルキル−フェニルであり、好ましくは該Ｃ１−６アルキル−フェニルの置換基は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、または（Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、より特別には、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、またはＣ１−６アルキルである。有利的には、該Ｃ１−６アルキル−フェニルの置換基は、互いに独立して、水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキル、特にＣ１−３アルキルである
【００２５】
一般式（Ｉ）の化合物において、Ｈｅｔは含窒素ヘテロシクロアルキルまたは式（Ｉ’）の部分である。特に、Ｈｅｔは、特に一つ又は二つの窒素原子を含む、５員または６員の含窒素ヘテロシクロアルキルであり、より特別には、Ｈｅｔはピペラジニルまたはピペリジニルであり、好ましくは、Ｈｅｔはピペラジニルである。
【００２６】
有利的には、本発明の第一の目的の化合物は、下記一般式（Ｉａ）の化合物：
2019521152.tif 000005
（式中、Ｈｅｔは含窒素ヘテロシクロアルキルであり、特に一つ又は二つの窒素原子を含む、５員または６員の含窒素ヘテロシクロアルキルであり、より特別には、Ｈｅｔはピペラジニルまたはピペリジニルであり、好ましくはＨｅｔはピペラジニルである）
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物である。
【００２７】
有利的には、本発明の第一の目的の化合物は、下記一般式（Ｉｂ）の化合物：
2019521152.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物である。
【００２８】
一般式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物において、Ｒ１からＲ４は、互いに独立して、水素原子、またはハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ２８、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２９、およびハロおよび−ＯＲ３０から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されたＣ１−６アルキルから選択される置換基である。特に、Ｒ１からＲ４は、互いに独立して、水素原子、またはハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、より特別には、Ｒ１からＲ４は、互いに独立して、水素原子、またはハロ、−ＯＲ２５、−ＮＲ２６Ｒ２７、およびＣ１−６アルキルから選択される置換基である。好ましくは、Ｒ１からＲ４は、互いに独立して、水素原子、またはハロ、特にＨ、ＣｌまたはＦである。
【００２９】
一般式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物において、Ｒ５からＲ９は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１５、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２０、−ＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ２１、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２２、または下記の［置換基群］から選択される置換基：
［置換基群］Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキルアリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキルヘテロシクロからなり、これらはハロ、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ２３および−ＯＣ（Ｏ）Ｒ２４から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換される：
であって、Ｒ５−Ｒ６、Ｒ６−Ｒ７、Ｒ８−Ｒ８またはＲ８−Ｒ９の組み合わせは、それらが化学的に結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよく、その場合、他の置換基は水素原子である。
個別の態様において、Ｒ５−Ｒ６、Ｒ６−Ｒ７、Ｒ８−Ｒ８またはＲ８−Ｒ９の組み合わせは、それらが化学的に結合する炭素原子とともにヘテロ環を形成してもよく、その場合、他の置換基は水素原子であり、該ヘテロ環は、好ましくは、５員環または６員環であって、特に一つまたは二つの酸素原子又は窒素原子を含む。
【００３０】
もう一つの個別の態様では、Ｒ５からＲ９は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、好ましくは、Ｒ５からＲ９は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ１７、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ１８Ｒ１９、または（Ｃ１−６アルキル、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、より特別には、Ｒ５からＲ９は、互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＯＲ１２、−ＮＲ１３Ｒ１４またはＣ１−６アルキルである。有利的には、Ｒ５からＲ９は、互いに独立して、水素原子、ハロまたはＣ１−６アルキル、特にＣ１−３アルキルである。
【００３１】
本発明の第一の目的の個別の態様において、
Ｘは単結合、Ｃ１−３アルキルまたはＣ１−３アルコキシ基、特に単結合、プロピル好ましくはプロピルまたはエトキシ基であり；
Ｙは、Ｃ１−６アルキル−アリール、好ましくはＣ１−６アルキル−フェニルであって、該フェニルはＣ１−６アルキル（特にメチル）およびＣ１−６アルコキシ（特にメトキシ）から選択される一つ又は数個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ１からＲ４は、互いに独立して、Ｈ、またはハロ、−ＯＲ１３、−ＮＲ１４Ｒ１５およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、好ましくはＨまたはハロ、特にＨ、ＣｌまたはＦである。
【００３２】
本発明の第一の目的の、もうひとつの個別の態様において、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）中、
Ｒ１からＲ４は、互いに独立して、Ｈ、またはハロ、−ＯＲ１３、−ＮＲ１４Ｒ１５およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、好ましくはＨまたはハロ、特にＨ、ＣｌまたはＦであり；
Ｒ５からＲ９は、互いに独立して、Ｈ、またはハロ、−ＯＲ１９、−ＮＲ２０Ｒ２１およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、特にＨ、ハロ、またはＣ１−６アルキル、特にＣ１−３アルキルである。
【００３３】
上記のＹおよびＲ１からＲ９の定義中、Ｒ１０からＲ３０は、互いに独立して、水素原子、ハロ、または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であって、該置換基はハロ、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３および−ＯＲ３１から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく；Ｒ３１は水素原子、ハロまたはＣ１−６アルキルであって、特に、Ｒ１０からＲ３０は、互いに独立して、水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキルである。
【００３４】
本発明の第一の目的の個別の態様において、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物は塩の形態、特に塩酸塩、特に二塩酸塩である。
本発明の第一の目的の個別の態様において、一般式（Ｉ）の化合物は下式（Ｉｃ）の化合物：
2019521152.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であって、通称はメクロジンであり得、好ましくは化合物（Ｉｃ）の二塩酸塩、即ち、通称メクロジン二塩酸塩である。
【００３５】
一般式（Ｉ）の化合物としては、リドフラジン［式（Ｉｄ）］、ＧＢＲ１２９０９［式（Ｉｅ）］、クロルシクリジン［式（Ｉｆ）］およびロメリジン［式（Ｉｇ）］：
2019521152.tif 000008
または塩酸塩若しくは二塩酸塩のようなその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物を選択することができる。
【００３６】
一つの個別の態様に従えば、本発明は、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる、上記で定義された一般式（Ｉ）の化合物に向けられる。
本発明はまた、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療をする方法に関連し、上記で定義された式（Ｉ）の化合物の有効量を必要な患者に投与することが包含される。
本発明はまた、上記で定義された式（Ｉ）の化合物の使用に関連し、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる薬を製造するための使用に関連する。アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患としては、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎があり得る。
【００３７】
＜ジクラズリル誘導体＞
立体異性体またはあらゆる比率の立体異性体混合物は、エナンチオマー混合物、特にラセミ混合物を含み、また、本発明の第二の目的の一部である。
発明の意味内容において、「立体異性体」とはジアステレオマーまたはエナンチオマーを指摘することを意図する。従って、これらは光学異性体である。互いに鏡像関係にない立体異性体は「ジアステレオマー」、重ね合わすことができない鏡像関係にある立体異性体は「エナンチオマー」という。二つのエナンチオマーの等量混合物はラセミ混合物と呼ばれる。
【００３８】
特に、本発明の第二の目的は次の一般式（ＩＩａ）の化合物：
2019521152.tif 000009
〔式中、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は互いに独立して、ＣＨ、ＣＨ２、ＮＨまたはＮであり；
Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＲ’７、−ＮＲ’８Ｒ’９またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ’３は、Ｈ、−ＣＮ、＝Ｏ、ＯＲ’１０またはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ’４およびＲ’５は互いに独立して、水素原子または〔ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキルから選択される置換基〕であって、該Ｃ１−６アルキルはハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ’７からＲ’１６は互いに独立して、水素原子または（Ｃ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基）であり、これら置換基は、ハロ、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３および−ＯＲ’１７から選択される一つ又は数個の置換基で任意に置換されていてもよく；
Ｒ’１７は水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキルである。〕
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であって、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられ、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎の予防および／または治療に用いられる。
【００３９】
本発明の第二の目的の個別の態様に従うと、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる、一般式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物において、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の少なくとも二つはＮであり、その他はＣＨまたはＣＨ２、より特別にはＸ’、Ｙ’およびＺ’はＮである。
【００４０】
本発明の式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物において、Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＦ３、−ＯＲ’７、−ＮＲ’８Ｒ’９、またはＣ１−６アルキルであって、特に、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＲ’７、またはＣ１−６アルキルであり、より特別に水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルである。好ましくは、Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子またはハロ、特にＣｌである。
本発明の式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物において、Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏ、ＯＲ’１０またはＣ１−６アルキルであり、特に−ＣＮ、＝ＯまたはＯＲ’１０、より特別には−ＣＮ、＝ＯまたはＯＨである。好ましくは、Ｒ’３は−ＣＮである。
【００４１】
本発明の式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物において、Ｒ’４およびＲ’５は互いに独立して、水素原子、またはハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、該Ｃ１−６アルキルはハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく、特に、Ｒ’５は水素原子であり、Ｒ’４は水素原子、またはハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、該Ｃ１−６アルキルはハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく、より特別には、Ｒ’５は水素原子であり、Ｒ’４は水素原子、ハロ、−ＯＲ’１１およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、該Ｃ１−６アルキルはハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく、さらにより特別には、Ｒ’５は水素原子であり、Ｒ’４は水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨおよびＣ１−６アルキルから選択される置換基である。好ましくは、Ｒ’５は水素原子であり、Ｒ’４は水素原子またはハロ、より好ましくはＲ’５は水素原子であり、Ｒ’４は水素原子またはＣｌである。
【００４２】
上記のＲ’１からＲ’５の定義中、Ｒ’７からＲ’１６は、互いに独立して、水素原子、またはＣ１−６アルキル、アリール、Ｃ１−６アルキル−アリール、ヘテロシクロおよびＣ１−６アルキル−ヘテロシクロから選択される置換基であり、これら置換基は、ハロ、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３および−ＯＲ’１７から選択される一つ又は数個の置換基で任意に置換されていてもよく、Ｒ’１７は、水素原子、ハロ、またはＣ１−６アルキルである。
【００４３】
本発明の第二の目的の個別の態様において、一般式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物中、
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はＮであり；
Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであって、好ましくは水素原子またはハロ、特にＣｌである。
本発明の第二の目的の個別の態様において、一般式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物中、
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はＮであり；
Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであって、好ましくは水素原子またはハロ、特にＣｌであり；
Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏまたは−ＯＲ’１０で、好ましくは−ＣＮ、＝Ｏまたは−ＯＨ、より好ましくは−ＣＮである。
【００４４】
本発明の第二の目的の個別の態様において、一般式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物中、
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はＮであり；
Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであって、好ましくは水素原子またはハロ、特にＣｌであり；
Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏまたは−ＯＲ’１０で、好ましくは−ＣＮ、＝Ｏまたは−ＯＨ、より好ましくは−ＣＮであり；
Ｒ’５は水素原子；
Ｒ’４は水素原子、またはハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＯＲ’１１、−ＮＲ’１２Ｒ’１３、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’１４、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’１５およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、該Ｃ１−６アルキルはハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよく、特にＲ’４は、水素原子、ハロ、−ＯＲ’１１およびＣ１−６アルキルから選択される置換基であり、該Ｃ１−６アルキルはハロおよび−ＯＲ’１６から選択される一つまたは数個の置換基で任意に置換されていてもよい。
【００４５】
本発明の第一の目的の個別の態様において、一般式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物中、
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’はＮであり；
Ｒ’１およびＲ’２は互いに独立して、水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨまたはＣ１−６アルキルであって、好ましくは水素原子またはハロ、特にＣｌであり；
Ｒ’３はＨ、−ＣＮ、＝Ｏまたは−ＯＲ’１０で、好ましくは−ＣＮ、＝Ｏまたは−ＯＨ、より好ましくは−ＣＮであり；
Ｒ’５は水素原子；
Ｒ’４は水素原子、ハロ、−ＣＦ３、−ＯＨおよびＣ１−６アルキルから選択され、好ましくは水素原子またはハロ、特にＣｌである。
【００４６】
有利的には、本発明の第一の目的の化合物は次の一般式（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）の化合物：
2019521152.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物である。
【００４７】
本発明の第二の目的の個別の態様において、一般式（ＩＩ）の化合物は次式の化合物（ＩＩｄ）、通称ジクラズリル：
2019521152.tif 000011
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であり得る。
【００４８】
本発明の第二の目的の個別の態様において、一般式（ＩＩ）の化合物は次式の化合物（ＩＩｅ）、通称PH000645-PH：
2019521152.tif 000012
またはその薬学的に許容される塩および／または溶媒和物であり得る。
【００４９】
一つの個別の態様に従えば、本発明は、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる、上記で定義した一般式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物に向けられる。
本発明はまた、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療をする方法に関連し、上記で定義された式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物の有効量を必要な患者に投与することが包含される。
本発明はまた、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療をする方法に関連し、上記で定義された式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物の有効量を必要な患者に投与することが包含される。
本発明はまた、上記で定義された式（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物の使用に関連し、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる薬を製造するための使用に関連する。アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患としては、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎があり得る。
【００５０】
＜医薬組成物＞
本発明は、少なくともひとつの、上記で定義された式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物と、少なくともひとつの薬学上許容される賦形剤を含み、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる医薬組成物に関連する。本発明に従う医薬組成物は、特に、局所投与、経口投与または注射用に製剤化され、該組成物はヒトを含む哺乳類に投与される。その医薬組成物は錠剤またはゼラチンカプセルの手段により経口投与することができる。
固形組成物が錠剤の形態で調製される場合、主たる有効成分は、ゼラチン、デンプン、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアガム等の薬学的基剤と混合される。錠剤は蔗糖または他の適切な材料で被覆するか、または延長若しくは遅延活性を有するような、そして予め決定した量の成分が連続的に放出されるような方法で処置してもよい。
ゼラチンカプセルの調製は、有効成分を希釈剤と混合し、得られた該混合物をソフトまたはハードゼラチンカプセルに充填して得られる。
注射剤、水性懸濁剤、等張生理食塩水または無菌の注射液で、相溶性分散剤および／または湿潤剤を含むものが使用される。本発明の医薬組成物はまた、クリーム、ジェル、スティックまたは漿液のような手段で局所投与してもよい。
有効成分は、標準的な薬学的担体と混合し、単位投与量でヒトまたは動物に投与してもよい。
本発明の医薬組成物は、にきびの治療および／または治療に用いられる、少なくとも一つの他の有効成分、例えば局所用の抗生物質（エリスロマイシンまたはダラシン）、局所用の抗炎症剤（ベンゾイルペルオキシド誘導体）、局所用の抗脂漏薬（イソトレチノイン、トレチノイン、アダパレン）、亜鉛誘導体（グルコン酸亜鉛）、サイクリン、またはイソトレチノインをさらに含んでもよい。
【００５１】
本発明はまた、以下：
（１）少なくともひとつの、上記で定義された式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩａ）の化合物、および
（２）にきびの治療および／または治療に用いられる、少なくともひとつの、他の有効成分であって、例えば局所用の抗生物質（エリスロマイシンまたはダラシン）、局所用の抗炎症剤（ベンゾイルペルオキシド誘導体）、局所用の抗脂漏薬（イソトレチノイン、トレチノイン、アダパレン）、亜鉛誘導体（グルコン酸亜鉛）、サイクリン、またはイソトレチノイン、
を、同時使用、分離使用または連続的使用の組み合わせ製品として含む医薬組成物に関連する。
一つの個別の態様に従えば、本発明は、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる、上記で定義された医薬組成物に向けられる。
本発明はまた、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療をする方法に関連し、上記で定義された医薬組成物の有効量を必要な患者に投与することが包含される。
本発明はまた、上記で定義された医薬組成物の使用に関連し、アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患の予防および／または治療に用いられる薬を製造するための使用に関連する。アクネ菌誘発の炎症に関連する疾患としては、特に、ニキビ、乾癬、慢性蕁麻疹、色素性蕁麻疹、皮膚の自己炎症性疾患、汗腺炎、またはアトピー性皮膚炎があり得る。
続く実施例は本発明を説明するが、如何なる方向においてもその範囲を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】用量依存的なＩＬ−８産生の阻害およびジクラズリルとメクロジンで前処理した角化細胞による細胞生存率の評価。ＨａＣａＴ細胞をジクラズリル（Ａ、Ｃ）およびメクロジン（Ｂ、Ｄ）単独、濃度0.39から50μM（グレー棒）で２４時間培養し、アクネ菌で刺激した（黒棒）。対照実験は、未処理・非刺激（斜線棒）のＨａＣａＴ細胞、およびアクネ菌で刺激しただけ（横線棒）のＨａＣａＴ細胞で行った。ＩＬ−８産生の測定はＥＬＩＳＡで実施し、細胞毒性は材料と方法で記載のＭＴＴアッセイで決定した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００５３】
【図２】用量依存的なＩＬ−１β産生の阻害およびジクラズリルとメクロジンで前処理した単球による細胞生存率の評価。ＴｈＰ−１細胞をジクラズリル（Ａ、Ｃ）およびメクロジン（Ｂ、Ｄ）単独、濃度0.39から50μM（グレー棒）で２４時間培養し、アクネ菌で刺激した（黒棒）。対照実験は、未処理・非刺激（斜線棒）のＴｈＰ−１細胞、およびアクネ菌で刺激しただけ（横線棒）のＴｈＰ−１細胞で行った。ＩＬ−１β産生の測定はＥＬＩＳＡで実施し、細胞毒性は材料と方法で記載のＭＴＴアッセイで決定した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００５４】
【図３】ジクラズリルおよびメクロジンはアクネ菌誘発のＩＬ−８およびＩＬ−１βｍＲＮＡ産生を阻害する。ＨａＣａＴ細胞（Ａ）およびＴｈＰ−１細胞（Ｂ）をジクラズリル（明るいグレー棒）およびメクロジン（暗いグレー棒）１０μＭで２４時間前処理し、アクネ菌懸濁液（ＯＤ６００ｎｍ＝０．３）で５時間刺激した。対照実験は未前処理・非刺激の細胞（細胞単独）、およびアクネ菌で刺激しただけ（白棒）の細胞で行った。全ＲＮＡを抽出し、ＩＬ−８／ＩＬ−１βｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した。ＩＬ−８／ＩＬ−１βｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベル（対照として使用）と比較し、倍率変化として表現した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００５５】
【図４】ジクラズリルおよびメクロジンは炎症シグナル経路を阻害する。ＨａＣａＴ細胞をジクラズリルおよびメクロジン１０μＭで２４時間前処理し、アクネ菌で１５、３０、６０、１２０および１８０分間刺激した。各時間にＩＬ−８産生測定をＥＬＩＳＡ上清で実施し（Ａ）、全細胞溶解物を調製して適当な抗体を使用し、ＩκＢ（Ｂ）およびｐ−ＥＲＫ（Ｃ）のウェスタンブロット分析に用いた。
【００５６】
【図５】ジクラズリルまたはメクロジンで前処理しＰＧＮで刺激した角化細胞によるＩＬ−８産生の用量依存的阻害。ジクラズリルまたはメクロジンの濃度を０．３９から２５μMの範囲で添加してＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、それからＰＧＮ５（明るいグレー曲線）、１０（中央のグレー曲線）または２０μＭ／ｍｌ（暗いグレー曲線）で刺激した。対照実験は未処理のＨａＣａＴ細胞で行った。ＩＬ−８産生の測定は材料と方法で記載のとおり、ＥＬＩＳＡで実施した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。
【００５７】
【図６】ジクラズリルまたはメクロジンで前処理しＰＧＮまたはＬＴＡで刺激した単球によるＩＬ−１β産生の用量依存的阻害。ＴｈＰ−１細胞をジクラズリル（Ａ、Ｃ）またはメクロジン（Ｂ、Ｄ）、濃度０．３９から２５μＭで２４時間前処理し、それからＰＧＮ（Ａ、Ｂ）またはＬＴＡ（Ｃ、Ｄ）５（明るいグレー曲線）、１０（中央のグレー曲線）または２０μＭ／ｍｌ（暗いグレー曲線）で刺激した。対照実験は未処理のＴｈＰ−１細胞で行った。ＩＬ−１β産生の測定は材料と方法で記載のとおり、ＥＬＩＳＡで実施した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。
【００５８】
【図７】ジクラズリルまたはメクロジンの前処理による時間依存的効果。ＨａＣａＴ細胞に対し、ジクラズリル（Ａ、Ｃ）またはメクロジン（Ｂ、Ｄ）の濃度０．３９から１２．５μＭで１時間（明るいグレー曲線）、６時間（中央のグレー曲線）、２４時間（暗いグレー曲線）および４８時間（黒曲線）で前処理し、それからアクネ菌で１８時間刺激した。ＩＬ−８産生の測定はＥＬＩＳＡで実施し、細胞毒性は材料と方法で記載のＭＴＴアッセイで決定した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。
【００５９】
【図８】ジクラズリルおよびメクロジンとにきび治療に用いられる普段の市販分子との間のＩＬ−８産生比較効果。ＨａＣａＴ細胞をジクラズリル、メクロジン、エリスロマイシン、クリンダマイシン、ルペロックス（ベンゾイルパーオキシド）、イソトレチノイン、アダパレン、またはレチノイン酸６μＭ（Ａ）または１２．５μＭ（Ｂ）で２４時間前処理し、それからアクネ菌で１８時間刺激した。対照実験は前処理せずアクネ菌で刺激したＨａＣａＴ細胞で対応した（ＰＡ単独）。ＩＬ−８産生の測定はＥＬＩＳＡで実施し、細胞毒性は材料と方法で記載のＭＴＴアッセイで決定した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００６０】
【図９】アクネ菌誘発炎症に対するＶＮＰＡ−Ａ２ジェルの局所適用効果in vivo。マウスの耳にアクネ菌（ＯＤ620nm＝１．０、２．１０７ＣＦＵ／ＰＢＳ２０μｌに相当）を経皮注射して炎症を誘起した。続いて３日間、１．３％ジクラズリルジェルをマウス耳表面に毎日適用した。（Ａ）耳の厚さ、剥離および発赤に対応するスコアを９６時間、毎日測定した。データは１０の独立した実験の平均±ＳＤである。ＰＢＳは、ＰＢＳを投与した非処理群に対応する。ＰＡ＋基剤は、アクネ菌を耳に投与し、ワセリンのみで治療した群に対応する。ＰＡ＋ジクラズリルは、アクネ菌を耳に投与し、ワセリン混合の１．３％ジクラズリルで治療した群に対応する。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００６１】
【図１０】RCL PH000645-PHアナログで前処理し、アクネ菌で刺激した角化細胞によるＩＬ−８産生の用量依存性阻害。濃度２．５から６．２５μＭの範囲で（グレー棒）RCL PH000645-PH（Ａ）またはジクラズリル（Ｂ）とＨａＣａＴ細胞を２４時間培養し、アクネ菌で刺激した（暗い棒）。対照実験は非刺激ＨａＣａＴ細胞（斜線棒）とアクネ菌で刺激されたＨａＣａＴ細胞（横線棒）で行った。ＩＬ−８産生の測定は、材料と方法で記載のとおり、ＥＬＩＳＡで実施した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）、および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００６２】
【図１１】角化細胞をRCL PH000645-PHアナログで処理した後の生存率の評価。RCL PH000645-PH（Ａ）またはジクラズリル（Ｂ）を濃度２．５から６．２５μＭの範囲で（グレー棒）ＨａＣａＴ細胞と２４時間培養し、アクネ菌で刺激した（暗い棒）。対照実験は、非刺激ＨａＣａＴ細胞（斜線棒）およびアクネ菌刺激ＨａＣａＴ細胞（横線棒）で行った。細胞生存率の測定は材料と方法で記載のとおり、ＭＴＴアッセイにより行った。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。
【００６３】
【図１２】アクネ菌誘発炎症に対するメクロジンの効果in vivo。マウスの耳にアクネ菌（ＯＤ620nm＝１．０、２．１０７ＣＦＵ／ＰＢＳ２０μｌに相当）を経皮注射して炎症を誘起した。続いて３日間、１％メクロジンジェルをマウス耳表面に毎日適用した。耳の厚さ、剥離および発赤に対応するスコアを９６時間、毎日測定した。データは、八つの独立した実験の平均±ＳＤである。ＰＢＳは、ＰＢＳを注射した非処理群に対応する。ＰＡ＋基剤は、アクネ菌を耳に投与し、ＤＭＳＯ（１５０μｌ）およびソルトールHS153070／水（30:70、w/w）（３００μｌ）を含むワセリンで治療した群に対応する。ＰＡ＋メクロジンは、アクネ菌を耳に投与し、ＤＭＳＯ（１５０μｌ）およびソルトールHS153070／水（30:70、w/w）（３００μｌ）を含むワセリンと混合した1％メクロジンで治療した群に対応する。統計上の有意性は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、および＊＊（Ｐ＜０．０１）で示した。
【００６４】
【図１３】アクネ菌誘発炎症に対するメクロジンの局所適用の効果in vivo。マウスの耳にアクネ菌（ＯＤ620nm＝１．０、２．１０７ＣＦＵ／ＰＢＳ２０μｌに相当）を経皮注射して炎症を誘起した。続いて、３日間、１％メクロジンジェルをマウス耳表面に毎日適用した。ＰＢＳは、ＰＢＳを注射した非処理群に対応する。ＰＡ＋基剤は、アクネ菌を耳に投与し、ＤＭＳＯ（１５０μｌ）およびソルトールHS153070／水（30:70、w/w）（３００μｌ）を含むワセリンで治療した群に対応する。ＰＡ＋メクロジンは、アクネ菌を耳に投与し、ＤＭＳＯ（１５０μｌ）およびソルトールHS153070／水（30:70、w/w）（３００μｌ）を含むワセリンと混合した1％メクロジンで治療した群に対応する。
【００６５】
【図１４】マウス耳の病理組織学的解析。マウスの耳にアクネ菌（ＯＤ620nm＝１．０、２．１０７ＣＦＵ／ＰＢＳ２０μｌに相当）を経皮注射して炎症を誘起した。続いて、３日間、１％メクロジンジェルをマウス耳表面に毎日適用した。耳をホルマリン固定しパラフィンに埋め込んだ。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により細胞検出を行った。ＰＢＳは、ＰＢＳを注射した非処理群に対応する。ＰＡ＋基剤は、アクネ菌を耳に投与し、ＤＭＳＯ（１５０μｌ）およびソルトールHS153070／水（30:70、w/w）（３００μｌ）を含むワセリンで治療した群に対応する。。ＰＡ＋メクロジンは、アクネ菌を耳に投与し、ＤＭＳＯ（１５０μｌ）およびソルトールHS153070／水（30:70、w/w）（３００μｌ）を含むワセリンと混合した1％メクロジンで治療した群に対応する。
【００６６】
【図１５】ジクラズリルおよびメクロジンは炎症シグナル経路を阻害する。ＨａＣａＴ細胞をジクラズリルまたはメクロジン２５μＭで２４時間前処理し、アクネ菌で１５、３０、６０、１２０、１８０分間および１８、２４時間刺激した。各時間に全細胞溶解物を調製し、適当な抗体を使用して、ｐ−ＩκＢ／ＩκＢ、ｐ−ＥＲＫ／ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８／ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ／ＪＮＫ、ｐ−ＰＫＣ／ＰＫＣ、ｐ−Ａｋｔ／Ａｋｔ、ｐ−ｍＴＯＲ／ｍＴＯＲ、のウェスタンブロット分析に用いた。タンパク質負荷（２５μｇ／レーン）はβ−アクチンにより評価した。
【００６７】
【図１６】ジクラズリルおよびメクロジンは炎症シグナル経路を阻害する。ＨａＣａＴ細胞をジクラズリルまたはメクロジン２５μＭで２４時間前処理し、アクネ菌で１５、３０、６０、１２０、１８０分間および１８、２４時間刺激した。各時間に全細胞溶解物を調製し、適当な抗体を使用して、ｐ−ＰＩ３Ｋ／ＰＩ３Ｋ、ＩＣＡＭ−１、Ｃｏｘ２、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲβ、ＰＰＡＲγ、のウェスタンブロット分析に用いた。タンパク質負荷（２５μｇ／レーン）はβ−アクチンにより評価した。
【００６８】
【図１７】乾癬様モデル（in vitro）による、ジクラズリルまたはメクロジン処理後の角化細胞の生存率評価。ヒト皮膚の原始角化細胞（ＮＨＤＫ）をＭ５溶液〔ＩＬ−１７Ａ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２２、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ)〕で刺激し、ＪＡＫ阻害剤６．２５μＭ（陽性対照）または濃度範囲０．３９から１２．５μＭのメクロジン若しくはジクラズリルで４８時間処理を行った。対照実験は、未処理・刺激なしのＮＨＤＫ細胞（ＮＨＤＫ単独）および未処理のＮＨＤＫでＭ５による刺激を行ったもの（ＮＨＤＫ＋Ｍ５）で行った。細胞毒性の測定は、材料と方法で記載のとおり、ＭＴＴアッセイにより決定した。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性（ＮＨＤＫ単独に対する）は、それぞれ、＊（Ｐ＜０．０５）、＊＊（Ｐ＜０．０１）および＊＊＊（Ｐ＜０．００１）で示した。
【００６９】
【図１８】乾癬様モデル（in vitro）における、メクロジン処理した角化細胞のＩＬ−８産生ヒト皮膚の原始角化細胞（ＮＨＤＫ）をＭ５溶液〔ＩＬ−１７Ａ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２２、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ)〕で刺激し、ＪＡＫ阻害剤６．２５μＭ（陽性対照）または濃度範囲０．３９から１２．５μＭのメクロジン若しくはジクラズリルで４８時間処理を行った。対照実験は、未処理・刺激なしのＮＨＤＫ細胞（ＮＨＤＫ単独）および未処理のＮＨＤＫでＭ５による刺激を行ったもの（ＮＨＤＫ＋Ｍ５）で行った。ＩＬ−８の測定は材料と方法で記載のとおり、ＥＬＩＳＡで行った。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性（ＮＨＤＫ＋Ｍ５に対する）は、＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００７０】
【図１９】乾癬様モデル（in vitro）における、ジクラズリルによるＩＬ−８産生阻害ヒト皮膚の原始角化細胞（ＮＨＤＫ）をＭ５溶液〔ＩＬ−１７Ａ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２２、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ)〕で刺激し、ＪＡＫ阻害剤６．２５μＭ（陽性対照）または濃度範囲０．３９から１２．５μＭのメクロジン若しくはジクラズリルで４８時間処理を行った。対照実験は、未処理・刺激なしのＮＨＤＫ細胞（ＮＨＤＫ単独）および未処理のＮＨＤＫでＭ５による刺激を行ったもの（ＮＨＤＫ＋Ｍ５）で行った。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性（ＮＨＤＫ＋Ｍ５に対する）は、＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００７１】
【図２０】乾癬様モデル（in vitro）における、メクロジン処理した角化細胞のｈＢＤ−２産生ヒト皮膚の原始角化細胞（ＮＨＤＫ）をＭ５溶液〔ＩＬ−１７Ａ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２２、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ)〕で刺激し、ＪＡＫ阻害剤６．２５μＭ（陽性対照）または濃度範囲０．３９から１２．５μＭのメクロジンで４８時間処理を行った。対照実験は、未処理・刺激なしのＮＨＤＫ細胞（ＮＨＤＫ単独）および未処理のＮＨＤＫでＭ５による刺激を行ったもの（ＮＨＤＫ＋Ｍ５）で行った。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性（ＮＨＤＫ＋Ｍ５に対する）は、それぞれ、＊＊（Ｐ＜０．０１）、＊＊＊（Ｐ＜０．００１）および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【００７２】
【図２１】乾癬様モデル（in vitro）における、ジクラズリルによるｈＢＤ−２産生阻害ヒト皮膚の原始角化細胞（ＮＨＤＫ）をＭ５溶液〔ＩＬ−１７Ａ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２２、ＩＬ−１α（１０ｎｇ／ｍｌ)〕で刺激し、ＪＡＫ阻害剤６．２５μＭ（陽性対照）または濃度範囲０．３９から１２．５μＭのジクラズリルで４８時間処理を行った。対照実験は、未処理・刺激なしのＮＨＤＫ細胞（ＮＨＤＫ単独）および未処理のＮＨＤＫでＭ５による刺激を行ったもの（ＮＨＤＫ＋Ｍ５）で行った。データは三回の分離した実験の平均±ＳＤである。統計上の有意性は、それぞれ、＊＊（Ｐ＜０．０１）および＊＊＊＊（Ｐ＜０．０００１）で示した。
【実施例】
【００７３】
実施例１：本発明化合物の生物学的活性
＜材料と方法＞
菌株と成長条件
アクネ菌株６９１９はアメリカ培養細胞系統保存機関（バージニア州マナサス）から入手し、アクネ菌株ＲＯＮとＰＩＥは関節感染の患者から単離した。菌株はすべて嫌気性条件下、強化したクロストリジウム液と固体培地（ＲＣＭ）（ディフコ・ラボラトリーズ、ミシガン州デトロイト）の中で成長させた。アクネ菌は菌のストックからＲＣＭ寒天板に移動させ、嫌気性条件下でガスパック（商標）ＥＺ嫌気システム（ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニー、メリーランド州スパークス）を使用し５日間培養した。単一コロニーを１００ｍｌのＲＣＭに移して上記の通り成長させた。その後、菌懸濁液をグリセロールの最終濃度１０％の存在下−８０℃で冷凍保存した。該ストックは「スタートストック」と呼ばれ、全ての実験に用いた。日常の培養には、１００ｍｌのＲＣＭを用い、３７℃、５日後には、４℃、７０００Ｇで１０分間遠心分離を行い、菌を採取した。沈殿物を集めて無菌の冷ＰＢＳ〔１．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）〕３０ｍｌ中で洗浄し、再度、上記のとおり遠心分離した。最後に、菌の沈殿物を無菌のＰＢＳ（１：１０培養体積）中に懸濁した。
【００７４】
培養細胞、前処理と刺激
不死化ヒト角化細胞株ＨａＣａＴ、繊維芽細胞ＭＲＣ５を１ｍＭピルビン酸を含むダルベッコの修飾イーグル培地Glutamax-I（ＤＭＥＭ）中で成長させた。不死化ヒト単球細胞株ＴｈＰ−１は、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０Glutamax-I（ＲＰＭＩ）中で成長させた。ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩは、５％ＣＯ２を含む加湿した雰囲気下３７℃において、０．１％および１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（インビトロジェン）、および抗生剤／抗真菌剤溶液（１０Ｕ／ｍｌペニシリン、１０  ｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５  ｇ／ｍｌアムホテリン）を用いて記述のとおり補完した（ライフ・テクノロジー）。原始ヒト角化細胞（ＮＨＤＫ）および繊維芽細胞（ＨＤＦ）は、製造者（ロンザ）の記述に従い、それぞれＫＧＭ−ゴールドおよびＦＧＭ−２・ビュレットキット中で成長させた。不死化細胞株はマイコプラズマ感染の非存在を確認するため日常的に試験した。
６−または９６ウェルプレート上で培養した細胞は、適切な分子溶液で１〜４８時間、３７℃、暗所で、適切な濃度で前処理される。その後、細胞は刺激のため、適切な濃度に調節されたアクネ菌懸濁液で１５分から２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養される。例えば、乾癬のin vitroモデルでは、原始ヒト角化細胞（ＮＨＤＫ）を培地上で２４時間成長させた。それから培地を除去し、メクロジン、ジクラズリル、またはＪＡＫ阻害剤（陽性対照として使用）を、０．３９、１．５６、３．１２、６．２５、及び１２．５μＭの濃度で含む培地で置き換え、炎症性混合物Ｍ５（ＩＬ−１７Ａ、ＯＳＭ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２２、ＩＬ−１α  １０ｎｇ／ｍｌの組み合わせ）を加えて４８から７２時間培養した。
【００７５】
細胞生存率アッセイ
ＭＴＴアッセイを用いて細胞の生存率を評価した。ここでは、０．２％ＭＴＴを含む細胞培養培地中、３７℃で４時間細胞を培養した。その後、ＭＴＴ溶液を廃棄し、生存細胞中に産生したＭＴＴホルマザン結晶を溶解するためＤＭＳＯを加えた。混合の後、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
ＥＬＩＳＡ
刺激を受けた細胞の上清中のヒトＩＬ−１β、ＩＬ−８、ｈＢＤ−２およびＴＮＦ−αタンパク濃度を測定した。製造者の指示に従って、種々のＥＬＩＳＡセット〔すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のReady-Set-Go；但し、ｈＢＤ−２測定はＬＳＢｉｏ社のDEFB4A/BD-2 ELISAキット〕を用いた。標準曲線には、組み替えヒトＩＬ−１β、ＩＬ−８、ｈＢＤ−２およびＴＮＦ−αの連続希釈を用いた。５４０ｎｍの波長訂正において４５０ｎｍの光学密度を決定した。
【００７６】
ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ
６ウェルのポリスチレン板上で細胞を成長させ、前述の通り、ジクラズリルまたはメクロジン１０μＭで２４時間前処理し、アクネ菌で５時間刺激を行った。製造者の指示に従い、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡを用いて全ＲＮＡを単離し、ＤＮＡｓｅ Ｉで処理した（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌｓ社，ヘルト、フランス）。ＲＮＡ濃度はNanoDrop上（Labtech社、フランス）２６０ｎｍで決定した。全ての試料の比率は１．６から１．９の範囲であった。
１００ｎｇの全ＲＮＡから５０℃、１０分で相補的ＤＮＡを発生させ、定量的ＰＣＲ解析を実施した。LightCycler Nano（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてiTaq Universal SYBR Green One-Step kit（Bio-Rad Laboratories社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州，ＵＳＡ）を実施、２段階サイクル条件（９５℃、６０秒）、４０サイクル（９５℃、１５秒；６８℃、６０秒）、融解曲線（６５−９５℃、６０秒、０．１℃／秒）で終了した。増幅曲線から、閾値（Ｃｔ）を決定した。コントロール細胞に対する刺激細胞の相対的ＲＮＡ量は２ΔＣｔの方法から計算され、相対比発現、内在性コントロールの遺伝子発現に正常化された（ＧＡＰＤＨ）。ＩＬ−８プライマーは、センス：５’−ＴＣＴＴＧＧＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’、アンチセンス：５’−ＴＴＴＣＧＴＧＴＴＧＧＣＧＣＡＧＴＧＴ−３’を用いた。ＧＡＰＤＨプライマーは、センス：５’−ＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣ  ＡＣ−３’、アンチセンス：５’−ＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣ−３’を用いた。試料の定量化は三回繰り返した。
【００７７】
ウェスタンブロット解析
全細胞タンパク質抽出物（２５μｇ）を、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ ビストリスゲル（１ｍｍ、１２ウェル、インビトロジェン社、ＵＫ）の変性条件下、電気泳動（ＬＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。タンパクをニトロセルロース膜上に移し、２０ｍｌのＴＢＳ １Ｘ(トリス緩衝化生理食塩水)よりなる飽和緩衝液中で１時間飽和させた。該緩衝液は、２００ｍＭトリス、１．４Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、５％脱脂肪乳、０．１％トウィーン２０を含む。ＴＢＳ／Ｔ緩衝液〔１Ｘ  ＴＢＳ、０．１％トウィーン２０〕１５ｍｌで１５分間の洗浄を三回行ってから、４℃で静かに撹拌しながら、膜を終夜培養した。１０ｍｌのウサギポリクローナル一次抗体に対し、ヒトＩＣＡＭ−１（SC-7891、1:500）、ＰＰＡＲａ(SC-398394, 1 :250)、ＰＰＡＲｂ(SC-74517, 1 :200)、ＰＰＡＲｇ(SC-7196, 1:500)、ＩｋＢ(SC-371, 1:500)、ｐ−ＩｋＢ(SC-7977, 1:500)、Ｃｏｘ−２(SC-7951, 1:250)、ｐ−ｍＴＯＲ(CS, Ref 2974, 1:1000)、ｍＴＯＲ(CS, Ref 2972, 1:1000)、ｐ−ｐ３８(SC-17852, 1:500)、ｐ３８(SC-535, 1:250)、ＥＲＫ(SC-94, 1:500)、ＪＮＫ(SC-571, 1:500)；マウスモノクローナル一次抗体に対しヒトｐ−ＰＩ３キナーゼ(CS, Ref 4228, 1:250)、ＰＩ３キナーゼ(CS, Ref 4257, 1 :250)、ｐ−Ａｋｔ１／２／３(SC-81433, 1 :500)、ｐ−ＥＲＫ(SC-7383, 1:500)、ｐ−ＪＮＫ(SC-6254, 1:500)、ｂ−アクチン（ローディング・コントロール抗体）(SC-47778, 1:1000)（５％ＢＳＡで補完したＴＢＳ／Ｔで希釈）。抗体はサンタクルズ社（カルフォルニア州ＵＳＡ）およびセルシグナル社（ライデン、オランダ）から購入した（それぞれＳＣ、ＣＳと略した）。
非結合抗体を洗浄した後、ウサギおよびマウスＩｇＧに対する二次抗体を用いて１時間培養することにより、結合した一次抗体を検出した（それぞれSC-2357、1:5000およびSC-2005、1:5000）。非結合物質を洗浄で除去し、ペルオキシダーゼ活性を化学蛍光アッセイで検出した（アドバンスト社、メンロパーク、米国）。
統計的解析
実験群から得られたデータの違いの統計的有意性をペアのスチューデントテストで解析した。Ｐ≦０．０５のレベルを有意差ありとした。統計的有意性を＊（Ｐ≦０．０５）、＊＊（Ｐ≦０．０１）および＊＊＊（Ｐ≦０．００１）でそれぞれ表す。
【００７８】
＜結果＞
１．ジクラズリルとメクロジンは、角化細胞において、アクネ菌誘発ＩＬ−８産生を用量依存的に阻害する。
ジクラズリルとメクロジンの両分子は、別途Ｓｉｇｍａ社より購入し、不死化角化細胞ＨａＣａＴ細胞に対し、ＩＬ−８産生を用量依存的に阻害する効力を独立して試験した。ＨａＣａＴ細胞は、ジクラズリルまたはメクロジンにより、濃度範囲０．３９から５０μＭで２４時間前処理を行い、それから材料と方法に記載のとおり、アクネ菌懸濁液で刺激を行った。ＩＬ−８産生は、培養上清をＥＬＩＳＡで測定し細胞生存率をＭＴＴアッセイで評価した。ジクラズリルとメクロジンの両分子について、ＩＬ−８産生を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０がそれぞれ６μＭ（Ｐ＝０．０１１）、および３μＭ（Ｐ＝０．００２４）であることを確認した（図１Ａ、１Ｂ）。一方、前処理しても刺激しなかった細胞では変化がなかった。その上、ＩＣ５０濃度において細胞毒性は認められなかった（図１Ｃ、１Ｄ）。
他の二つのアクネ菌株（ＲＯＮ、ＰＩＥ）について、原始角化細胞ＮＨＤＫおよび繊維芽細胞（ＨＤＦ）細胞株に対する効果は同様であった。
【００７９】
２．ジクラズリルとメクロジンは、アクネ菌誘発ＩＬ−１β産生を用量依存的に阻害する。
両分子について、単球細胞株によるＩＬ−１β産生の阻害を試験した。ＴｈＰ−１細胞を、ジクラズリルまたはメクロジンにより、濃度範囲０．３９から５０μＭで２４時間前処理を行い、その後、材料と方法に記載のとおり、アクネ菌懸濁液で刺激した。先に述べたとおり、ＩＬ−１β産生は培養上清をＥＬＩＳＡで測定し、細胞生存率をＭＴＴアッセイで評価した（図２）。ジクラズリルとメクロジンは、ＩＬ−１β産生を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０がジクラズリルについて３μＭ（Ｐ＝５．８．１０−６）、メクロジンについて６μＭ（Ｐ＝６．９．１０−６）であり（図２Ａ、２Ｂ）、ジクラズリルには細胞毒性はなく（図２Ｃ）、メクロジンには少し細胞毒性が認められた（図２Ｄ）。
並行してジクラズリルまたはメクロジンの両分子につき、単球細胞株によるＴＮＦ−α産生の阻害能を試験したが、効果はなかった（結果は示さず）。
【００８０】
３．ジクラズリルとメクロジンは、アクネ菌誘発ＩＬ−８およびＩＬ−１βｍＲＮＡ産生を阻害する。
アクネ菌誘発ＩＬ−８およびＩＬ−１タンパク産生がジクラズリルとメクロジンにより阻害されることが示されたので、ＩＬ−８およびＩＬ−１の翻訳がｍＲＮＡレベルで規制されているのか調べた。ＲＴ−ｑＰＣＲ解析を用いて、アクネ菌で刺激されたＨａＣａＴ角化細胞およびＴｈＰ−１単球細胞株において、ジクラズリルとメクロジンがＩＬ−８およびＩＬ−１βのｍＲＮＡレベルに及ぼす効果につき、評価を行った（図３Ａ）。
両細胞株をジクラズリルまたはメクロジン１０μＭで２４時間前処理し、アクネ菌で５時間刺激を行った。対照実験は未処理／刺激なしの細胞およびアクネ菌刺激のみの細胞で行った。アクネ菌はＩＬ−８およびＩＬ−１βのｍＲＮＡ産生を強く誘発したが、ジクラズリルまたはメクロジンで前処理するとｍＲＮＡ産生が阻害され、ＨａＣａＴ細胞では最大９７％まで（Ｐ＝０．００２、Ｐ＝０．００２）（図３Ａ）、ＴｈＰ−１細胞では最大９１％と３８％まで（Ｐ＝０．００２、Ｐ＝０．０４７）（図３Ｂ）阻害を受けた。
【００８１】
４．ＭＡＰＫ経路のジクラズリルとメクロジン阻害
ジクラズリルとメクロジンによるＩＬ−８産生阻害の分子基礎を調べた、特に、角化細胞がアクネ菌で刺激された時に、活性化されることが知られているシグナル経路に干渉するのか、評価した。まず、細胞がアクネ菌で刺激されたらＩＬ−８産生が活性化されるが両者、即ち、ジクラズリルとメクロジンがその産生を阻害することを確認した（図４Ａ）。また、アクネ菌によるＴＬＲ−２活性化がＩκＢ分解に導かれることを確認し、ＨａＣａＴ細胞の応答における時間差としてのＨａＣａＴ細胞中のＭＡＰＫ経路の刺激をＩκＢおよびＥＲＫ経路の両方において確認した（図４Ｂ、４Ｃ、アクネ菌単独のパネル）。
アクネ菌刺激の前に、ＨａＣａＴ細胞角化細胞をジクラズリルで前処理してもＩκＢ分解は阻止されなかった（図４Ｂ）。しかしながら、両分子はアクネ菌誘発のＥＲＫリン酸化を阻止した（図４Ｃ、１０μＭジクラズリル、１０μＭメクロジンのパネル）。全ＥＲＫに対する抗体を用いたストリッピングと続くリプロービングによってもアクネ菌刺激後の全タンパク質レベルは変化しないことが示され、アクネ菌は前から存在するＥＲＫを活性化することが示唆された。これらのデータは、ジクラズリルとメクロジンによる、角化細胞におけるアクネ菌誘発ＩＬ−８産生阻害がＭＡＰＫ経路のダウンレギュレーションを含むことを示唆する。
【００８２】
５．ジクラズリルとメクロジンはＰＧＮ−およびＬＴＡ−誘発ＩＬ−８およびＩＬ−１β産生を阻害する。
先にジクラズリルとメクロジンは、前処理しアクネ菌で刺激した細胞において、ＩＬ−８およびＩＬ−１β産生を転写および翻訳のレベルで阻害できることを示した。ここでは、細胞刺激の性質がＩＬ−８およびＩＬ−１β産生に与える、ジクラズリルとメクロジンの効果に影響を及ぼすか調べる。
ＨａＣａＴとＴｈＰ−１の両細胞株を、ジクラズリルとメクロジンの濃度範囲０．３９から２５μＭのいくつかの濃度で２４時間前処理し、それからペプチドグリカン（ＰＧＮ）またはリポタイコ酸（ＬＴＡ）の三つの濃度、５、１０および２０μｇ／ｍｌで、３７℃、１８時間の刺激を行った。ＩＬ−８およびＩＬ−１β産生レベルを培養上清のＥＬＩＳＡで測定し、図５と６に示した。細胞が種々の濃度のＰＧＮ（５、１０および２０μｇ／ｍｌ）で刺激されるだけで、ＩＬ−８産生は用量依存的に増加し、７０ｐｇ／ｍｌから始めて最大１３０および１８０ｐｇ／ｍｌまで上昇した。ジクラズリルによる角化細胞の前処理によって、ＩＬ−８産生は、最初のＰＧＮ濃度にかかわらず、６．２５μＭで平均６５％減少した（図５Ａ）。同様の効果がメクロジンによっても得られ、６．２５μＭで６０％減少した（図５Ｂ）。
ＩＬ−１β産生に及ぼすジクラズリルとメクロジンの効果を評価するため、ＰＧＮおよびＬＴＡで刺激された単球およびＴｈＰ−１細胞株を用いた。ＩＬ−１β産生はＰＧＮ１７０から２１０ｐｇ／ｍｌ（図６Ａ、６Ｂ）またはＬＴＡ９から１２ｐｇ／ｍｌで誘発された（図６Ｃ、６Ｄ）。ジクラズリルまたはメクロジンによる前処理で、ＩＬ−１β産生は用量依存的に阻害された。ジクラズリル６．２５μＭの前処理で、ＩＬ−１β産生は平均６４％減少し（図６Ｃ、６Ｄ）、メクロジンでは平均３６％減少した（図６Ｂ、６Ｄ）。
【００８３】
６．角化細胞前処理による、角化細胞におけるＩＬ−８産生に対する時間依存的効果
本実験では、による角化細胞前処理の種々の時間が、ＩＬ−８産生に与える影響を評価した。角化細胞ＨａＣａＴ細胞株を、濃度範囲０．３９から１２．５μＭのジクラズリルまたはメクロジンで１、６、２４または４８時間前処理しアクネ菌で刺激した（図７）。１時間または６時間の前処理では、両分子はＩＬ−８産生を有意に減少させなかった（図７Ａ、７Ｂ）。２４時間の前処理では、ジクラズリルおよびメクロジンは、６．２５μＭにおいて、ＩＬ−８産生をそれぞれ３６％（Ｐ＝０．０３）および６３％（Ｐ＝０．００００４）抑制した。興味深いことに、細胞前処理を４８時間に引き上げるとＩＬ−８産生はジクラズリルで６５％（０．０００４）、メクロジンで７８％（０．０００２）にまで減少し（図７Ａ、７Ｂ）、細胞生存率には大きな影響はなかった（図７Ｃ、７Ｄ）。ここで、細胞前処理時間の増加がＩＬ−８産生を促すことが示された。
【００８４】
７．ジクラズリルおよびメクロジンと、にきび治療に用いられる分子との比較
本実験では、ＩＬ−８産生に与える効果につき、ジクラズリルおよびメクロジンと、にきび治療に通常用いられる分子（抗生剤、ベンゾイルパーオキシド、レチノイド）とを比較した。角化細胞ＨａＣａＴ細胞株を、すべての分子６．２５から１２．５μＭで２４時間前処理し、その後アクネ菌で刺激した（図８）。先に示したように、ジクラズリルおよびメクロジンは毒性を示すことなく、ＩＬ−８産生を＞６０％減少させることができた。これに対して、抗生剤のエリスロマイシンとクリンダマイシンは、ベンゾイルパーオキシドと同様、ＩＬ−８産生に影響しないか、極めて小さな有意差なしの影響を与えた。しかし、レチノイドはＩＬ−８産生をかなり抑制することができた。イソトレチノインおよびレチノイン酸はＩＬ−８産生を５％、アダパレンは２０％有意に抑制した。すべてのレチノイドは細胞毒性を示し、イソトレチノインとレチノイン酸で約２０％、アダパレンで約６０％であった（図８Ａ）。さらに、すべての分子の試験濃度を１２．５μＭに上げると、ジクラズリルおよびメクロジンは毒性を示すことなくＩＬ−８産生に大きな効果を与えることを確認した。しかしながら、他の分子は影響がなく、またアダパレンはＩＬ−８産生を９０％抑制したが７５％の細胞毒性が関係した。
【００８５】
８．炎症モデル（in vivo）においてアクネ菌誘発炎症を阻害する効力
抗炎症応答における両分子の効力（in vitro）を示す先の結果に従い、我々は炎症モデル（in vivo）においてアクネ菌様有髪の炎症反応を阻害する効力を試験した。このモデルは、アクネ菌を皮内注射したマウス耳の反応に対する効力に基づく。アクネ菌投与後４日間、落屑および／または小膿疱の存在とともに、耳の厚さ、発赤を測定して炎症反応を毎日評価する。試験終了時に炎症の最終測定を実施して耳の写真撮影を行った。その後、マウスを安楽死させて、耳を直ちに、ホルマリン含有緩衝液で固定し、将来の組織学的解析に備えた。
実験のデザインはそれぞれ１０匹のマウスを含む３群からなり、
１）ＰＢＳは、ＰＢＳを注入した未処理群に相当し、
２）ＰＡ＋基剤ＴＯＰＩＣは、アクネ菌を耳に注射し、ワセリンのみで処理したマウス群に相当し、
３）ＰＡ＋ジクラズリルは、アクネ菌を耳に皮内注射し、ワセリンと混合した１．３％ジクラズリルで処理した群に相当する。
１．３％ジクラズリル・ゲルの調製は、即席で６．５ｍｇのジクラズリルを０．５ｍｇのワセリンに室温で（２１℃）ゆっくりと加えて（１分）混合し、それからマウスの耳に直接適用した。
結果は図９に示した。ジクラズリル・ＶＮＰＡ−Ａ２は局所適用により耳の炎症を３７％減少させ得ることが示された（図９Ａ）。
【００８６】
９．ジクラズリル化学的アナログの試験の補足データ
ジクラズリルアナログ・RCL PH000645-PHは、角化細胞においてアクネ菌誘発ＩＬ−８産生を用量依存的に阻害する。
両分子、ジクラズリルとRCL PH000645-PH を、シグマ社より購入し、独立して、不死化ヒト角化細胞株ＨａＣａＴを用いてＩＬ−８産生の阻害効力を試験した。ＨａＣａＴ細胞をRCL PH000645-PHまたはジクラズリル（陽性対照として使用）により、０．３９から６．２５μＭの濃度範囲で２４時間前処理し、それから、材料と方法に記載の通り、アクネ菌懸濁液で刺激を行った。ＩＬ−８産生は培養上清をＥＬＩＳＡで測定し（図１０）、細胞生存率をＭＴＴアッセイで評価した（図１１）。
ジクラズリルによるＩＬ−８産生阻害が確認され、そのアナログ・RCL PH000645-PHが用量依存的に、ＩＣ５０が３μＭ（Ｐ＝０．００００６９）でＩＬ−８産生を阻害することが示された（図１０Ａ、Ｂ）。前処理のみで刺激なしの細胞では変化は観察されなかった。並行して細胞生存率を試験し、ＩＣ５０濃度で細胞毒性のないことが示された（図１１）。
【００８７】
１０．メクロジン化学的アナログの試験の補足データ
リドフラジン、ＧＢＲ１２９０９塩酸塩、クロロシクリジン塩酸塩およびロメリジンをＰｒｅｓｔｗｉｃｋ社より購入し、不死化ヒト角化細胞株ＨａＣａＴを用いてＩＬ−８産生の阻害効力を試験した。ＨａＣａＴ細胞をリドフラジン、ＧＢＲ１２９０９塩酸塩、クロロシクリジン塩酸塩またはロメリジン１０μＭで２４時間前処理し、それから、材料と方法に記載の通り、アクネ菌懸濁液で刺激を行った。ＩＬ−８産生は培養上清をＥＬＩＳＡで試験し、細胞生存率はＭＴＴアッセイで評価した。結果を表１に示す。
【表１】
2019521152.tif 000013
メクロジンのアナログであるリドフラジン、ＧＢＲ１２９０９塩酸塩、クロロシクリジン塩酸塩およびロメリジンがＩＬ−８産生を５４から７８％阻害できることが示された。並行して、細胞生存率の試験を行い、１０μＭで細胞毒性なし（９５または１０７％）または極めて弱い（７８，８１％）ことが示された（表１）。
【００８８】
１１．炎症モデル（in vivo）試験の補足データ
先に、両分子が抗炎症応答の有効性（in vitro）結果を示したので、炎症モデル（in vivo）において、アクネ菌誘発の炎症を抑制する効果があるか試験した。このモデルは、アクネ菌を皮内注射したマウス耳の反応に対する効力に基づく。アクネ菌投与後４日間、落屑および／または小膿疱の存在とともに、耳の厚さ、発赤を測定して炎症反応を毎日評価する。試験終了時に炎症の最終測定を実施して耳の写真撮影を行った。その後、マウスを安楽死させて、耳を直ちに、ホルマリン含有緩衝液で固定し、将来の組織学的解析に備えた。
実験のデザインはそれぞれ８匹のマウスを含む３群からなり、
１）ＰＢＳ：ＰＢＳを注入した未処理群に相当、
２）ＰＡ＋基剤：アクネ菌を耳に注射し、基剤のみで処理したマウス群に相当、
３）ＰＡ＋メクロジン：アクネ菌を耳に皮内注射し、基剤と混合した１％メクロジンで処理した群に相当。
１％メクロジンゲルの調製は、即席で５ｍｇのメクロジンを１５０μｌのＤＭＳＯと３００μｌのソルトールHS153070／水（３０：７０、W/W）に溶解し、最後に１．５ｇのワセリンに室温で（２１℃）ゆっくりと加えて（１分）行い、それからマウスの耳に直接適用した。
耳の写真（図１３）で示されるように、メクロジンは局所適用で耳の炎症を２９．５％減少（図１２）させ得ることが示された。組織学的解析により、アクネ菌注射の耳（図１４、パネルＰＡ＋基剤）には、陰性対照（図１４、パネルＰＢＳ）と比較して耳の厚さの増大と重大な白血球浸潤が明らかにされたが、メクロジンで処理した耳には、白血球浸潤と同様に耳の厚さが減少（図１４、パネルＰＡ＋メクロジン）した。
【００８９】
１２．シグナル経路解析についての補足データ
＜ジクラズリルとメクロジンによる炎症関連経路調節＞
ジクラズリルとメクロジンによるＩＬ−８産生阻害の分子的基盤、特に、両分子が、角化細胞がアクネ菌で刺激された時に活性化されることが知られている、細胞接着と脂質関連経路と同様に、炎症関連経路についても検討した。我々は、アクネ菌によるＨａＣａＴ角化細胞の活性化が、一過性のｐ−ＩκＢ分解をもたらす一方、ＩκＢは一定であることを示した。アクネ菌刺激の前にＨａＣａＴ角化細胞をジクラズリルまたはメクロジンで前処理しても、ｐ−ＩκＢ分解は変わらなかった。
我々はまた、アクネ菌によるＨａＣａＴ角化細胞の活性化がｐ−ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＰＫＣ、ｐ−Ａｋｔおよびｐ−ｍＴＯＲの活性化（図１５、パネル・アクネス菌単独）およびｐ−ＰＩ３Ｋの活性化（図１６、パネル・アクネス菌単独）をもたらすことを示した。しかしながら、両分子は、アクネ菌誘発のＥＲＫ−、ｐ３８−、ＰＫＣ−、Ａｋｔ−およびＰＩ３Ｋのリン酸化を妨げるが、アクネ菌誘発のＪＮＫ−およびｍＴＯＲのリン酸化は変化しない。（図１５および１６、パネル・ジクラズリルとメクロジン）。興味深いことに、ジクラズリルはＰＫＣおよびＰＩ３Ｋのリン酸化をメクロジンより強く阻害できたが、Ａｋｔのリン酸化阻害についてはメクロジンの方がより強い効力を有する。全ＩκＢ、ＥＲＫ、ｐ３８、ＪＮＫ、ＰＫＣ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲおよびＰＩ３Ｋに対する抗体を用いたストリッピングと続くリプロービングによってもアクネ菌刺激後の全タンパク質レベルは変化しないことが示され、アクネ菌刺激は前から存在するこれらタンパク質の全てを活性化することを示唆した（図１５、１６）。
これらのデータは、角化細胞における、ジクラズリルとメクロジンによるアクネ菌誘発のＩＬ−８産生阻害はＭＡＰＫ、ＰＫＣ、ＡｋｔおよびＰＩ３のダウンレギュレーションを含むことを示唆した。
【００９０】
＜ジクラズリルとメクロジンによる、接着分子と脂質関連経路調節＞
炎症反応において、皮膚に対する白血球浸潤の際に重要な役目を続いて担っている、角化細胞上の接着分子のアップレギュレーションを検討した。アクネ菌でＨａＣａＴ角化細胞を刺激すると、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現が上昇する。ＨａＣａＴ細胞をジクラズリルで前処理してもアクネ菌誘発ＩＣＡＭ−１の発現には影響がなかったが、メクロジンはその発現を減少させた（図１６）。炎症性にきびは毛嚢脂腺単位の多因子性疾患であるが、皮脂に存在する脂質と脂肪酸も同様に炎症反応を誘発する。にきびの成長には皮脂発現の増大が必須であるが、それはアクネ菌の栄養源にもなる。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）が、皮脂産生を増加させて、脂質の異化作用に影響すること、およびシクロオキシゲナーゼ（Ｃｏｘ−２）遺伝子発現の活性化により誘起されるプロスタグランディン（ＰＧ）と同様、これが炎症応答の重要なメディエーターであることが示された（Ｔｓａｉ、２０１３；Ｇｕｐｔａ、２０１５）。我々はその後、これらのマーカー（ＰＰＡＲおよびＣｏｘ−２）の発現を解析し、アクネ菌誘発角化細胞がＣｏｘ−２、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲβの発現を増加させること、そしてＰＰＡＲγの発現には有意な変化がないことを示した。ジクラズリルによるＨａＣａＴ細胞の前処理は、Ｃｏｘ−２の発現を減少させ、ＰＰＡＲの発現には変化がなかった。一方、メクロジン処理は、ＰＰＡＲαおよびＰＰＡＲβと同様にＣｏｘ−２発現を強く減少させた（図７）。
これらのデータは、ＩＣＡＭ−１やＣｏｘ−２／ＰＰＡＲ発現に対するジクラズリルの阻害は弱く、いっぽうメクロジンは強力な阻害能を有することが示唆された。
【００９１】
１３．乾癬試験の補足データ
ジクラズリルとメクロジンの乾癬に対する抗炎症作用を評価するため、乾癬様の表現型を模倣して、前炎症性混合物Ｍ５で刺激したヒトの通常表皮角化細胞（ＮＨＤＫ）のモデル（in vitro）を用いた。そこで我々は、この条件下で刺激された角化細胞のＩｌ−８およびβ−デフェンシン−２タンパク（ｈＢＤ−２）の放出（Ｒａｂｅｏｎｙら、２０１４）を阻害する、ジクラズリルとメクロジンの効力を評価した。
原始角化細胞に対するＭ５刺激は細胞生存率に有害な影響を与えなかった。細胞をＪＡＫ阻害剤で前処理すると細胞生存率の２４％減少が観察された。細胞をメクロジンで前処理すると細胞の生存率は０．１４から１５％減少し、一方、ジクラズリルの前処理では細胞生存率は２０から６２％減少した。
＜ＩＬ−８産生におけるジクラズリルとメクロジンの作用＞
基本条件下において、ヒトの通常表皮角化細胞（ＮＨＤＫ）は少量のＩＬ−８を産生した。五つのサイトカイン組み合わせによる刺激でＩＬ−８産生は大きく増加した。参照のＪａｋ阻害剤Ｉ（陽性対照）はこの関連の刺激効果を中程度に阻害した（４９％阻害）（図１８と１９）。この実験条件下で、メクロジンはＩＬ−８産生に影響しなかった（図１８）が、ジクラズリルは用量依存的にＩＬ−８産生を減少させ、ＩＣ５０は２−３μＭで、３．１２５μＭで６６％減少させた（図１９）。
＜ｈＢＤ−２産生におけるジクラズリルとメクロジンの作用＞
基本条件下において、ヒトの通常表皮角化細胞（ＮＨＤＫ）は極めて少量のβ−デフェンシン−２タンパク（ｈＢＤ−２）を産生した。Ｉｌ−１７、ＴＮＦ−αおよびＯＳＭの組み合わせによる処理で、ｈＢＤ−２は大きく増加した。参照のＪａｋ阻害剤Ｉ（陽性対照）はこの関連の刺激効果を阻害した（３８％阻害）（図２０と２１）。この実験条件下で、メクロジンはｈＢＤ−２産生に影響しなかった（図２０）が、ジクラズリルは用量依存的にｈＢＤ−２産生を減少させ、１２．５μＭで６８％減少させた（図２１）。
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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