(57)【要約】  哺乳類又は哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、並びに細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法を提供する。この方法は、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子に対応するタンパク質の発現により、又はＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルを高めることができる物質を用いて哺乳類若しくは哺乳類由来細胞を処理し、それに作用することにより、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を上昇させるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類又は哺乳類由来細胞のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を上昇させることにより実現することを特徴とする、哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【請求項２】
前記哺乳類又は哺乳類由来細胞のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を上昇させることは、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子に対応するタンパク質の発現により実現することを特徴とする、請求項１に記載の哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【請求項３】
前記Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子に対応するタンパク質は、野生型Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質の１９４位セリンをアスパラギン酸又はグルタミン酸に変異させた後に得られるタンパク質である、請求項２に記載の哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【請求項４】
前記哺乳類若しくは哺乳類由来細胞のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を上昇させることは、哺乳類若しくは哺乳類由来細胞のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルを高めることができる物質を用いて哺乳類若しくは哺乳類由来細胞を処理し、それに作用することにより実現する、請求項１に記載の哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【請求項５】
前記哺乳類がマウス又はヒトである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、又は哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【請求項６】
前記脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素が、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ１、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、及び中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、又は哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【請求項７】
哺乳類若しくは哺乳類由来細胞が物質による作用を受けた後、ウェスタンブロット法でＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルの変化を測定し、リン酸化レベルが高くなった場合、前記物質は、哺乳類若しくは哺乳類由来細胞のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルを高める活性を有するか、又は哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する活性を有するか、又は哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる活性を有するか、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める活性を有する、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質をスクリーニングする方法、又は哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進することができる物質をスクリーニングする方法、又は哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させることができる物質をスクリーニングする方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性リパーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高めることができる物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルを高めることができる高分子物質（タンパク質、核酸、又は多糖）若しくは小分子（脂肪酸、ビタミン、天然産物、化学合成若しくは化学修飾による生成物、有機小分子、又は無機分子）、又はナノ分子を含む、哺乳類若しくは哺乳類由来細胞のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質。
【請求項９】
Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質又はＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子及びそれが発現したタンパク質の、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝レベルを高める薬物の製造における用途、哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる薬物の製造における用途、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める薬物の製造における使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、又は哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法を、従来の化学薬物で脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、漢方薬で脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、生物学的製品で脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、又は物理的に脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法と併用する、哺乳類若しくは哺乳類由来細胞の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝を促進する方法、又は哺乳類の体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法、又は細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強し、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高める方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ医薬品分野に属し、具体的には、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリグリセリド（ＴＧ）は、哺乳類の細胞エネルギー貯蔵の主な形式である。エネルギー摂取がエネルギー消費を超えると、余分なエネルギーがトリグリセリドの形式で脂肪細胞及び脂肪細胞を含有する組織や肝臓等の器官に貯蔵され、長期にわたり、最終的には脂肪細胞エネルギーとして蓄積され、肥満をもたらす。動物の脂肪細胞の分解は、複雑なプロセスであり、各種ホルモン及び生理シグナルにより共同で調整されており、こうした調整の失調により、肥満や関連疾患がもたらされることがある。脂肪細胞のうち、トリグリセリドの分解は、精巧な調節プロセスであり、細胞又は個体のエネルギーを維持するホメオスタシス及び代謝の健康と密接に関係している。脂肪分解の活性低下は、脂肪組織でのトリグリセリドの蓄積を促進し、過度の脂肪分解は、リポジストロフィー症候群をもたらす可能性があり、脂肪組織でのトリグリセリドの低下又は再分配は、循環脂肪酸濃度を高め、トリグリセリドの異所性の蓄積がもたらされる。トリグリセリドの脂肪分解作用は、少なくとも３種類の酵素によって触媒される。脂肪細胞特異的トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）は、主にトリグリセリドの１つ目のエステル結合の加水分解を触媒し、生成されたジアシルグリセロールは、ホルモン感受性エステラーゼ（ＨＳＬ）によって触媒され、モノアシルグリセロールを生成し、モノアシルグリセロールは、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＧＬ）によって触媒される（非特許文献１）。脂肪細胞において、ＡＴＧＬ及びＨＳＬが、最も重要な脂肪分解酵素であり、マウスの白色脂肪組織におけるトリグリセリドの９５％の加水分解活性を共同で制御する（非特許文献２）。脂肪分解によって生成された脂肪酸は、放出されて血中に入り、アルブミンと結合して脂肪酸アルブミンを形成し、他の組織まで運ばれて利用される。脂肪酸の分解は、酸化の形式で行なわれるが、酸化の方式には、α−酸化、β−酸化、及びω−酸化があり、そのうちβ−酸化が主な方式である。
【０００３】
ＨＳＬは、古典的な脂肪分解律速酵素であり、作用基質は、ほとんどが、リン脂質以外の大多数のエステルを含み、トリグリセリド、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、コレステロールエステル、及びレチニルエステルを含み、脂肪分解作用調整酵素と考えられている。トリグリセリドを加水分解してモノアシルグリセロールを生成し、モノアシルグリセロールは、その加水分解酵素の作用の下で、徹底的に加水分解される。リン酸化されたＨＳＬは、その活性形式であり、その活性化は、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路に依存する。ＨＳＬ遺伝子ノックアウトマウスには、肥満が発現しておらず、且つその脂肪組織は、トリグリセリド加水分解活性を有する（非特許文献３；Ｆｏｒｔｉｅｒ  Ｍら、２００４，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２８７：２８２−２８８；非特許文献４；Ｈａｅｍｍｅｒｌｅ  Ｇら、２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４８０６−４８１５）。加水分解生成物ジアシルグリセロールは、白色脂肪組織、褐色脂肪組織、筋肉、及び睾丸において蓄積される（非特許文献５；Ｈａｅｍｍｅｒｌｅ  Ｇら、２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４８０６−４８１５）。これらの結果、ＨＳＬは、脂肪組織及び筋肉におけるジアシルグリセロール加水分解の律速酵素であることが示される。脂肪分解反応発生時に、ＡＴＧＬが触媒する反応は、ＴＧの１つ目の脂肪酸の加水分解に対して特異性を有し、ＤＧを生成する。ＤＧの利用は、細胞の代謝状態に依存する（非特許文献６；Ｌａｓｓ  Ａら、２００６，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３（５）：３０９−３１）。エネルギーを必要とする状況において、カテコールアミンがβ−アドレナリン受容体と結合し、Ｇタンパク質が介するシグナルが、アデニル酸シクラーゼを活性化する。高濃度の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、ＰＫＡを活性化し、ＰＫＡは、更にＨＳＬ及びＰｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａをリン酸化する。リン酸化されたＰｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａは、構造を変えることにより、リン酸化されたＨＳＬが細胞質から脂肪滴表面への移行を促進し、リン酸化されたＨＳＬは、リン酸化されたＰｅｒｉｌｉｐｉｎ  Ａに近く、脂肪滴中のＴＧ及びＤＧの基質と結合することができる。ＤＧは、更にＨＳＬによってモノアシルグリセロール（ＭＧ）及び脂肪酸（ＦＡ）に加水分解され、ＭＧは、モノアシルグリセロールリパーゼの作用の下でグリセリン及びＦＡに加水分解され、脂肪酸及びグリセリンが脂肪細胞から離れ、循環に入る。大量の研究によって示されているように、栄養やホルモン等の要因が脂肪組織における脂肪の分解を調整している（非特許文献１及び５）。給餌状態で、インスリンは、ＨＳＬの脱リン酸化及びホスホジエステラーゼの活性化を引き起こし、ｃＡＭＰ濃度を低下させることにより、脂肪分解を抑制する（非特許文献６及び７）。
【０００４】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲｓ）は、核内受容体の一種として、多種の核内遺伝子の発現を調整することができ、コードするタンパク質及びその他の核内受容体は、相似した機能領域及び構造領域を有する。ＰＰＡＲｓには３種類の異なるサブタイプが存在することが既に分かっており、それぞれＰＰＡＲα、ＰＰＡＰβ、及びＰＰＡＲγと命名されている。この３種類のサブタイプは、構造が似ているが、組織分布が相違し、ＰＰＡＲαサブタイプは、脂肪酸酸化率が高い心臓、肝臓、腎臓、及び骨格筋細胞に主に分布している（非特許文献８）。ＰＰＡＲαは、脂肪酸代謝に対して重要な調整作用を有し、細胞による脂肪酸の摂取、輸送、活性化、及びβ酸化を促進することができる。ＰＰＡＲα及びそのアゴニストは、脂質代謝異常を治療し、インスリン抵抗を改善し、心肥大を逆転させる等の作用を有し、心血管を保護する作用を有する。活性化したＰＰＡＲαをＰＰＲＥと結合させると、アセチルＣｏＡ合成酵素及び脂肪酸輸送タンパク質の発現を活性化することができ、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ−１（ＣＰＴ−１）を活性化させ、脂肪酸の摂取、輸送、及び酸化などの面の効率を高めることにより、脂肪酸のβ酸化を促進し、脂質代謝を高め、個体により多くのエネルギーを提供することができる。ＰＰＡＲα遺伝子欠損マウスには、肥満及び脂肪細胞が大きくなる等の表現型が現れる（非特許文献９及び１０）。
【０００５】
細胞脂質代謝異常は、肥満、非アルコール性脂肪肝等のメタボリックシンドロームの主な病理的要因である。先進国であっても発展途上国であっても、肥満の流行は、世界中で急速に広がっている。そのため、脂質代謝プロセスにおける重要な転写因子又は触媒酵素は、トリグリセリドの脂肪分解プロセスを有効に促進し、脂肪酸の酸化速度を高め、肥満症及びその関連疾患を治療する重要な標的の１つであり、治療の鍵を握る難点となっている。
【０００６】
ＦＡＤＤ（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質）は、アポトーシスシグナル経路における重要なアダプタータンパク質であり、Ｆａｓ及びその他の細胞死受容体によるアポトーシスシグナル経路を媒介する。１９９５年に、ＤｉｘｉｔとＷａｌｌａｃｈの２つの研究班が、酵母ツーハイブリッド法を用いて、ヒトとマウスのＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１遺伝子をほぼ同時に発見した（非特許文献１１及び１２）。ヒトのＦＡＤＤ遺伝子は約３．６ｋｂで、２つのエクソン（それぞれ２８６ｂｐ及び３４１ｂｐ）とその間を隔てる２ｋｂのイントロンとを含む。この遺伝子は、１１番染色体の長腕上（１１ｑ１３．３）に位置し（非特許文献１３）、ＦＡＤＤは、同じく１１ｑ１３に位置する１型糖尿病感受性遺伝子座（ＩＤＤＭ４）と共局在する（非特許文献１４及び１５）ため、ＦＡＤＤ遺伝子の変異は、インスリン依存型糖尿病の発生に影響を及ぼす可能性がある。ヒトとマウスのＦＡＤＤ遺伝子は、それぞれ２０８個及び２０５個のアミノ酸からなるＦＡＤＤタンパク質をコードする。ヒトとマウスのＦＡＤＤタンパク質は、６８％のアミノ酸残基が完全に同じであり、タンパク質の一次構造における相同性は８０％にも達する。ヒトとマウスのＦＡＤＤタンパク質は、いずれも、それぞれデスドメイン（ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ，ＤＤ）、デスエフェクタードメイン（ｄｅａｔｈ  ｅｆｆｅｃｔ  ｄｏｍａｉｎ，ＤＥＤ）、及びＣ末端ドメイン（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，ＣＴＤ）の３つのドメインを含む。デスエフェクタードメインＤＥＤは、約７６個のアミノ酸残基からなり、Ｎ末端に近く、オリゴマー化が可能であり、疎水作用によりＤＥＤを含むタンパク質を集め、共同で細胞死誘導シグナル伝達複合体（ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＤＩＳＣ）を形成することにより、細胞死受容体が介するアポトーシスシグナルを下流に伝達する。デスドメインＤＤは、約７０個のアミノ酸残基からなり、Ｃ末端に近く、ＣＴＤドメインと部分的に重なり、ＦａｓのＤＤドメインと相互作用が可能であり、アポトーシスシグナルを受ける。Ｃ末端ドメインＣＴＤは、約２０個のアミノ酸残基からなり、リン酸化しやすいＳｅｒ及びＴｈｒ残基を含有し、ＦＡＤＤが媒介する細胞の非アポトーシス機能に関連する可能性がある（非特許文献１６）。
【０００７】
タンパク質においてリン酸化しやすいＳｅｒ及びＴｈｒ残基がアスパラギン酸又はグルタミン酸に変異することは、国際的に既に広く認められており使用されているタンパク質リン酸化の研究方法である。Ｋｉｍ  Ｙらは、その研究において、ＷＡＶＥ１タンパク質３１０位のセリンをアスパラギン酸に変異させることにより、そのリン酸化状態をシミュレートした（非特許文献１７）。Ｐａｒｏｏ  Ｚらは、その研究において、ＴＲＢＰタンパク質１４２、１５２、２８３、２８６位のセリンをアスパラギン酸に変異させることにより、そのリン酸化状態をシミュレートした（非特許文献１８）。Ｐａｐｉｎｓｋｉ  Ｄらは、その研究において、Ａｔｇ９タンパク質のセリン残基（Ｓ８０２、Ｓ８３１、Ｓ９４８、及びＳ９６９）をアスパラギン酸に変異させることにより、そのリン酸化状態をシミュレートした（非特許文献１９）。Ｂａｊｏｒｅｋ  Ｍらは、その研究において、ＲＳＶ基質タンパク質２２０位のセリンをアスパラギン酸に変異させることにより、そのリン酸化状態をシミュレートした（非特許文献２０）。Ｐｏｚｏ−Ｇｕｉｓａｄｏ  Ｅらは、その研究において、ＳＴＩＭ１タンパク質５７５、６０８、及び６２１位のセリンをグルタミン酸に入れ替え、そのリン酸化をシミュレートした（非特許文献２１）。Ｂｉｎ  Ｌらは、ＴｎＩタンパク質を研究した際に、１４４位のトレオニンをアスパラギン酸、グルタミン酸に変異させることにより、そのリン酸化をシミュレートした（非特許文献２２）。アスパラギン酸又はグルタミン酸を用いてセリンのリン酸化をシミュレートし、電荷の上でも、炭素鎖長の上でも、機能の上でも、多くの実験によって、アスパラギン酸又はグルタミン酸が完全にセリンのリン酸化と一致可能なことがすでに証明されている。そのため、ＦＡＤＤタンパク質１９１位のセリンをアスパラギン酸に変異させることにより、そのリン酸化機能を研究することは、通常の実行可能な方法である。
【０００８】
現時点で既に発見されているＦＡＤＤのリン酸化状態を調整することが可能なキナーゼとしては、３７ｋＤの大きさのＣＫＩαタンパク質（非特許文献２３）及び１３０ｋＤの大きさのＦＩＳＴ−ＨＩＰＫ３タンパク質（非特許文献２４）等があり、ホスファターゼとしては、ＡＫ２タンパク質（非特許文献２５）がある。これらのＦＡＤＤのリン酸化状態を調整する標的は、既に知られており、広く研究されているものであり、通常の分子デザイン方法を用いてこれらの酵素の基質類似物の分子デザイン、化学合成、及び活性評価を行い、上記酵素の活性を調節することにより、ＦＡＤＤのリン酸化状態を調整する機能を有する物質を容易に得ることができる。これらの理念に基づき、２０１０年には、国際的に、ＦＡＤＤのリン酸化を調整する化合物をハイスループットスクリーニングする方法が既にあり、これらの方法は、反復スクリーニングを大規模に行うことができる、通常の実行可能なものであることがすでに証明されている（非特許文献２６）。そのため、ＦＡＤＤのリン酸化状態を調整する物質をスクリーニングすることについて、対応する標的タンパク質においても、ハイスループットスクリーニング方法においても、これらの技術的方法は完全に実行可能なものであり、当業者が容易に熟練して把握できるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊａｗｏｒｓｋｉ  Ｋら、２００７，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９３：１−４
【非特許文献２】Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ  Ｍら、２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：４０２３６−４０２４１
【非特許文献３】Ｆｏｒｔｉｅｒ  Ｍら、２００４，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２８７：２８２−２８８
【非特許文献４】Ｈａｅｍｍｅｒｌｅ  Ｇら、２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４８０６−４８１５
【非特許文献５】Ｌａｓｓ  Ａら、２００６，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３（５）：３０９−３１
【非特許文献６】Ｃａｒｍｅｎ  ＧＹら、２００６，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １８：４０１−４０８
【非特許文献７】Ｌａｎｇｉｎ  Ｄら、２００６，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ  ５３（６）：４８２−４９１
【非特許文献８】Ｉｓｓｅｍａｎｎ  Ｉら、１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４７（６２９４）：６４５−６５０
【非特許文献９】Ｃｏｓｔｅｔ  Ｐら、１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（４５）：２９５７７−２９５８５
【非特許文献１０】Ｋｎａｕｆ  Ｃら、２００６，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４７：４０６７−４０７８
【非特許文献１１】Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ＡＭら、１９９５，Ｃｅｌｌ  ８１（４）：５０５−５１２
【非特許文献１２】Ｂｏｌｄｉｎ  ＭＰら、１９９５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（１４）：７７９５−７７９８
【非特許文献１３】Ｋｉｍ  ＰＫら、１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７（１２）：５４６１−５４６６
【非特許文献１４】Ｅｃｋｅｎｒｏｄｅ  Ｓら、２０００，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １０６（１）：１４−１８
【非特許文献１５】Ｎａｋａｇａｗａ  Ｙら、１９９８，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６３（２）：５４７−５５６
【非特許文献１６】Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：５１３−５２１）。
【非特許文献１７】Ｋｉｍ  Ｙら、２００６，Ｎａｔｕｒｅ  ４４２（７１０４）：８１４−８１７
【非特許文献１８】Ｐａｒｏｏ  Ｚら、２００９，Ｃｅｌｌ  １３９：１１２−１２２
【非特許文献１９】Ｐａｐｉｎｓｋｉ  Ｄら、２０１４，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５３（３）：４７１−４８３）。
【非特許文献２０】Ｂａｊｏｒｅｋ  Ｍら、２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８８（１１）：６３８０−６３９３
【非特許文献２１】Ｐｏｚｏ−Ｇｕｉｓａｄｏ  Ｅら、２０１３，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １２６（Ｐｔ  １４）：３１７０−３１８０
【非特許文献２２】Ｌｉｕ  Ｂら、２０１４，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（１）：ｅ８６２７９
【非特許文献２３】Ａｌａｐｐａｔ  ＥＣら、２００５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９：３２１−３３２
【非特許文献２４】Ｒｏｃｈａｔ−Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｖら、２０００，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１１６５−１１７４
【非特許文献２５】Ｋｉｍ  Ｈら、２０１４，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：３３５１
【非特許文献２６】Ｋｈａｎ  ＡＰら、２０１０，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ  １５（９）：１０６３−１０７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子を発現し、又はＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化程度を指標としてＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高める物質をスクリーニングすることを特徴とする、細胞脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法を提供することであり、上記方法の共通の目的は、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることである。
【００１１】
更に、細胞内ｃＡＭＰ濃度を調節して増加させ、ホルモン感受性エステラーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を調節し、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅｈｈａｄｈ）、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｖｌ）、長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｌ）、及び中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｍ）を含む、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高めることを特徴とする、細胞脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法を提供する。
【００１２】
更に、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法の、脂質代謝異常疾患治療薬の製造における用途を提供する。
【００１３】
更に、上記脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法の脂質代謝疾患治療薬の製造における用途と、従来の脂質代謝異常疾患治療薬及び技術との併用を提供する。
【００１４】
更に、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法を含み、薬学的に通常の担体又は賦形剤又は希釈剤を用いて配合を行うことを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００１５】
更に、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法の、脂質代謝異常疾患治療薬の製造における用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様において、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を調節することにより、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節を実現することを特徴とする、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法を提供する。
【００１７】
前記脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法は、ホルモン感受性リパーゼＨＳＬのリン酸化程度及び活性を高め、ＰＰＡＲα転写活性を増強することができるだけでなく、脂肪酸β酸化プロセスに関与する酵素の活性を高めることができる。
【００１８】
本発明の第２の態様において、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化程度の変化を指標としてＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質をスクリーニングすることにより、脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節を実現することを特徴とする、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質のスクリーニング方法を提供する。
【００１９】
前記Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質のスクリーニング方法は、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を調整する既知の調整タンパク質を標的として、デザイン、合成により、又は通常の方法により、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化程度を調整することができる物質をスクリーニングし、スクリーニングプロセスにおいて、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化程度の変化をスクリーニング指標とすることを特徴とする。
【００２０】
前記Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質は、例えば、タンパク質、核酸、多糖、脂肪酸、ビタミン、及びそのナノ分子等のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルを高めることができる高分子物質を含み、例えば、天然産物、化学合成又は化学修飾による生成物、有機小分子、無機分子等のＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化レベルを高めることができる小分子物質も含む。
【００２１】
本発明の第３の態様において、Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子を導入して発現を行うことによる脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法を提供する。
【００２２】
前記Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子は、ヒトＦａｓ関連デスドメインタンパク質の１９４位セリンをアスパラギン酸又はグルタミン酸に変異させるヒトＦａｓ関連デスドメインタンパク質変異遺伝子であることを特徴とする。上記Ｆａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子は、遺伝子治療に用いることができる。
【００２３】
本発明の第４の態様において、上記脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法の、脂質代謝異常疾患治療薬の製造における使用を提供する。前記使用は、スクリーニングにより得られたＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化を高めることができる物質若しくはＦａｓ関連デスドメインタンパク質のリン酸化をシミュレートする遺伝子を脂質代謝治療薬の製造に単独で用いること、又は従来の脂質代謝治療薬との組成物の生成、あるいは従来の化学薬物療法、漢方薬療法、生物学的療法、理学療法等の方法との脂質代謝治療における併用を含む。
【００２４】
本発明の第５の態様において、薬学的に許容される担体又は賦形剤又は希釈剤、並びに有効量の請求項１に記載の脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
本発明の第６の態様において、上記脂肪分解及び脂肪酸酸化代謝の調節方法の、脂質代謝異常疾患治療薬の製造における具体的な用途を提供する。
【００２６】
本発明の内容をより容易に明確に理解できるようにするため、次に具体的な実施例に基づき図面と合わせて本発明について更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＦＡＤＤをリン酸化したマウス胚線維芽細胞株における脂肪酸酸化代謝速度の上方制御。
【図１Ａ】ＦＡＤＤをリン酸化した細胞株における脂肪酸酸化速度増加。ｔ検定による有意差検定、＊Ｐ＜０．０５。
【図１Ｂ】ＦＡＤＤをリン酸化した細胞株におけるミトコンドリア数の増加。縮尺＝５００ｎｍ。
【図２】肥満者と健常者、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスと健常マウスの脂肪組織におけるＦＡＤＤリン酸化レベルの比較。
【図２Ａ】外科手術における健常者及び肥満者の白色脂肪組織から試料を作成してウェスタンブロットを行い、ＦＡＤＤリン酸化レベルを測定。
【図２Ｂ】標準飲食で飼育した２０週齢の大きさのｏｂ／ｏｂマウス及び健常対照マウスの白色脂肪組織から試料を作成してウェスタンブロットを行い、ＦＡＤＤリン酸化レベルを測定。
【図３】ｏｂ／ｏｂ肥満マウスの体重及び脂肪含有量に対するＦＡＤＤリン酸化の影響。
【図３Ａ】上：標準飲食で飼育した２０週齢の大きさのｏｂ／ｏｂマウス及びＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの写真。下：ｏｂ／ｏｂマウス及びＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの肝臓及び精巣上体の脂肪の写真。
【図３Ｂ】左：標準飲食で飼育したｏｂ／ｏｂマウス及びＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体重成長曲線。右：標準飲食で飼育したｏｂ／ｏｂマウス及びＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの１日あたりの摂食量。
【図３Ｃ】標準飲食で飼育したｏｂ／ｏｂマウス及びＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体内各組織の脂肪塊の重量：１．精巣上体；２．腎臓；３．鼠径部。ｔ検定による有意差検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４】健常マウスの体重及び脂肪含有量に対するＦＡＤＤリン酸化の影響。
【図４Ａ】左：標準飲食で飼育した１０週齢の大きさの健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの解剖写真。右：健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの白色脂肪組織及び肝臓組織の写真。
【図４Ｂ】左：標準飲食又は高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤリン酸化したマウスの体重成長曲線。右：健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの単位体重の１日あたりの摂食量：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。
【図４Ｃ】左：高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの体内各組織の脂肪塊の重量が体重に占める割合：１．精巣上体；２．腎臓；３．鼠径部。中：高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウス体内の褐色脂肪組織塊の重量が体重に占める割合：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤリン酸化したマウス。右：高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの体内肝臓重量が体重に占める割合：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。
【図４Ｄ】核磁気共鳴でスキャンした健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの体内脂肪の分布。
【図４Ｅ】マウスの白色脂肪組織、褐色脂肪組織切片後にＨＥ染色を行い各組織細胞の大きさ及び形態を観察。肝臓組織切片後にオイルレッドＯ染色を行い肝臓中のトリグリセリドの含有量を観察。ｔ検定による有意差検定、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図５】マウスの各組織及び血清トリグリセリド等の代謝指標に対するＦＡＤＤリン酸化の影響。
【図５Ａ】高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの肝臓及び筋肉におけるトリグリセリドの含有量：１．肝臓；２．筋肉。
【図５Ｂ】高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの血清中の遊離脂肪酸及びトリグリセリドの含有量：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。
【図５Ｃ】標準飲食又は高脂肪飲食で飼育した健常対照マウス及びＦＡＤＤをリン酸化したマウスの血清中のレプチンの含有量：１．標準飲食；２．高脂肪飲食。ｔ検定による有意差検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６】マウス体内トリグリセリドの脂肪分解速度に対するＦＡＤＤリン酸化の影響。
【図６Ａ】一晩絶食したマウスから精巣上体白色脂肪組織塊を取り、基礎条件又はイソプロテレノールの刺激下で２時間毎にグリセリン又は遊離脂肪酸の放出量を測定し、脂肪分解速度曲線図を作成。
【図６Ｂ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織におけるｃＡＭＰの含有量：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。
【図６Ｃ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織から試料を作成し、ウェスタンブロットを行い、ｐ−ＨＳＬ、ＨＳＬ及びα−ｔｕｂｕｌｉｎのタンパク質発現量を測定。右図は、ウェスタンブロットの結果に対する定量分析：１．ＨＳＬ；２．ｐ−ＨＳＬ。ｔ検定による有意差検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】マウス体内脂肪酸の酸化速度に対するＦＡＤＤリン酸化の影響。
【図７Ａ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織から白色脂肪細胞を分離し、脂肪酸β酸化速度比色法測定キットを用いてその脂肪酸酸化速度を測定：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。
【図７Ｂ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織から試料を作成し、ウェスタンブロットを行い、ＰＰＡＲαのタンパク質発現量を測定。下図は、ウェスタンブロットの結果に対する定量分析：１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。
【図７Ｃ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織を取り、パラフィン包埋切片を、ＰＰＡＲαの抗体を用いて免疫染色分析（各群マウス４匹）。縮尺＝５０μｍ。
【図７Ｄ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織を取り、脂質代謝関連遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを測定。１．ＰＰＡＲα；２．Ａｃｏｘ１；３．Ｅｈｈａｄｈ；４．Ａｃａｄｖｌ；５．Ａｃａｄｍ。図中、白は健常対照マウス、濃い灰色はＦＡＤＤをリン酸化したマウス。各群マウス４〜６匹とし、各試料で３個重複させ、ＧＡＰＤＨを内標準とした。
【図７Ｅ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪組織から試料を作成し、ウェスタンブロットを行い、ＶＬＣＡＤ、ＬＣＡＤ、ＭＣＡＤ、及びＰＴＬを含む脂質代謝関連タンパク質の発現レベルを測定し、α−ｔｕｂｕｌｉｎを内標準とした。１．健常対照マウス；２．ｏｂ／ｏｂマウス；３．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス；４．ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウス。
【図７Ｆ】高脂肪飲食で飼育したマウスの精巣上体白色脂肪細胞を取り、ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）試験を行い、ＰＰＡＲα（左）とＦＡＤＤ（右）とＰＰＲＥ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体応答配列）の調整領域の結合能力を測定した。１．健常対照マウス；２．ＦＡＤＤをリン酸化したマウス。ｔ検定による有意差検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
【実施例】
【００２９】
実施例１；ＦＡＤＤをリン酸化したマウス胚線維芽細胞株における脂肪酸酸化代謝速度の上方制御
【００３０】
ＦＡＤＤ永久リン酸化（ＦＡＤＤ−Ｄ、１９１位のセリンをアスパラギン酸に変異させた）及びＦＡＤＤ永久非リン酸化（ＦＡＤＤ−Ａ、１９１位のセリンをアラニンに変異させた）したマウス胚線維芽細胞株を作成した。細胞を培養し、脂肪酸β酸化速度比色法測定キット（上海宝曼生物科技有限公司）を用いてＦＡＤＤリン酸化細胞株、ＦＡＤＤ非リン酸化細胞株、野生型細胞株における脂肪酸酸化代謝速度を測定して比較し、電子顕微鏡を用いて３つの細胞株におけるミトコンドリアの形状及び数量を観察した。
【００３１】
脂肪酸酸化速度測定により、ＦＡＤＤリン酸化細胞株における脂肪酸の酸化代謝速度は、ＦＡＤＤ非リン酸化細胞株及び野生型細胞株よりも著しく高く、ＦＡＤＤ非リン酸化細胞株における脂肪酸酸化代謝速度は、野生型細胞株と有意差がないことがわかった（図１Ａ）。ミトコンドリアは、エネルギー代謝の主な場所であり、電子顕微鏡観察により、ＦＡＤＤをリン酸化した細胞株におけるミトコンドリアの数量も、ＦＡＤＤ非リン酸化細胞株及び野生型細胞株より高いことがわかり（図１Ｂ）、ＦＡＤＤリン酸化細胞株におけるエネルギー代謝がより活発であることを説明している。
【００３２】
実施例２；肥満者と健常者、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスと健常マウスの脂肪組織におけるＦＡＤＤリン酸化レベルの比較
【００３３】
ヒト組織試料の作成：病院の外科手術から体重健常者群及び肥満者群の白色脂肪組織試料を得て、試料を作成し、組織中のＦＡＤＤリン酸化のレベルについてウェスタンブロット分析を行った。
【００３４】
マウス組織試料の作成：全ての実験マウスは、通風無菌，恒温恒湿のＳＰＦクラス環境で飼育し繁殖させた。マウスは、水及び飼料を自由に摂取することができた。ｏｂ／ｏｂマウス及び健常対照マウスをそれぞれ４匹選び、標準飲食でマウスを飼育し、２０週齢の大きさに成長するまで待ち、マウスを安楽死させて解剖し、その白色脂肪組織を取り、試料を作成して、その組織中のＦＡＤＤリン酸化のレベルについてウェスタンブロット分析を行った。
【００３５】
ウェスタンブロット：組織を、細胞溶解液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのリン酸グリセリン、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％のＮＰ４０）中でホモジネートした後、１２，０００ｒｐｍで遠心し、上清を収集し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質濃度を測定した。等量（約５０μｇ）のタンパク質を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分離した後、ＰＶＤＦメンブレン中に移した。次いで、ＦＡＤＤの抗体を用いて検査を行った。
【００３６】
ＦＡＤＤは、細胞内で非リン酸化及びリン酸化の２種類の形式で存在し、ＦＡＤＤ抗体を用いて２本のバンドを測定することができ、そのうち上側のバンドはリン酸化形式のＦＡＤＤであり、下側のバンドは非リン酸化形式のＦＡＤＤである［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：，５１３−−５２１］。ウェスタンブロットの結果、肥満者の白色脂肪組織におけるリン酸化形式のＦＡＤＤバンドは、健常者よりも弱く（図２Ａ）、標準飲食で飼育した２０週齢のｏｂ／ｏｂマウスの白色脂肪組織におけるリン酸化形式のＦＡＤＤバンドは、健常対照マウスよりも著しく弱い（図２Ｂ）ことが分かった。これらの結果は、リン酸化形式のＦＡＤＤの発現レベルの低下は、マウス又はヒトの肥満をもたらす可能性があり、即ち、リン酸化形式のＦＡＤＤは、マウス又はヒトを痩せさせる可能性があることを説明している。
【００３７】
実施例３；ｏｂ／ｏｂ肥満マウスの体重及び体内脂肪含有量に対するＦａｓ関連デスドメインタンパク質（ＦＡＤＤ）リン酸化の影響
【００３８】
全ての実験マウスは、通風無菌、恒温恒湿のＳＰＦクラス環境で飼育し繁殖させた。マウスは、水及び飼料を自由に摂取することができた。ＦＡＤＤをリン酸化したマウスを、文献で報告されている方式で、ＯＢ／ｏｂマウスと交配させて繁殖させ［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：，５１３−−５２１］、ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスを得た。ＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。
【００３９】
遺伝子型ごとにマウスを６匹選び、標準飲食でマウスを飼育し、６週目から３５週目まで毎週マウスの体重を量り、マウスの体重成長曲線を作成し、代謝ケージを用いてマウスの１日あたりの摂食量を計算した。２０週齢の大きさのｏｂ／ｏｂマウスとＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体型、精巣上体白色脂肪組織、及び肝臓の大きさを比較した。マウスの精巣上体、腎臓、及び鼠径部の白色脂肪塊の重量を量り比較した。
【００４０】
健常状態でＦＡＤＤは非リン酸化を主とするため、リン酸化形式は特定の生理及び病理状態の下でのみ存在する。脂質代謝に対するＦＡＤＤリン酸化の影響を観察するため、本特許では、ＦＡＤＤリン酸化をシミュレーションする遺伝子組み換えマウスを構築し（マウスのＦＡＤＤ遺伝子１９１位のセリンをアスパラギン酸に変異させ、これによりリン酸化したＦＡＤＤをシミュレーションした。この種のモデルは既に国際的に認められている）［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：５１３−５２１］、このマウスをＯＢ／ｏｂマウスと交配させ繁殖させ、ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスを得た。標準飲食で飼育した２０週齢のＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体型は、ｏｂ／ｏｂマウスよりも著しく痩せており、その精巣上体白色脂肪含有量もｏｂ／ｏｂマウスよりも著しく少なく、肝臓の大きさはほとんど同じであったが、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓は、明らかな脂肪肝を呈し、ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの肝臓には脂肪肝現象がなかった（図３Ａ）。ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスとｏｂ／ｏｂマウスの体重成長曲線を比較し、ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体重成長は、ｏｂ／ｏｂマウスよりも著しく低く、かつ健常な野生型マウスに似ており、即ち、ＦＡＤＤリン酸化は、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満表現型を逆転させることができることがわかった（図３Ｂ、左）。代謝ケージ実験で、ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体重は、ｏｂ／ｏｂマウスよりも遥かに低かったが、１日あたりの摂食量はｏｂ／ｏｂマウスよりも略高かったことがわかり、体重の低下は摂食量の減少によって引き起こされたのではないことを説明している（図３Ｂ、右）。本特許は、精巣上体、腎臓、及び鼠径部を含むマウス体内の３つの組織の白色脂肪塊重量も測定し、その結果、ＦＡＤＤをリン酸化したｏｂ／ｏｂマウスの体内各組織の白色脂肪塊の重量もｏｂ／ｏｂマウスよりも著しく低いことがわかり（図３Ｃ）、ＦＡＤＤリン酸化はマウスの体内脂肪含有量の低下を促進してマウスの体重低下を引き起こすことができ、ｏｂ／ｏｂマウスの肥満表現型を逆転したことを説明している。
【００４１】
本実施例の結果に基づき、「ＦＡＤＤタンパク質の１９４位のセリンをアスパラギン酸に変異させる」タンパク質の発現を体内で実現することにより、肥満表現型を逆転させ、肥満症及び肥満に関連するメタボリックシンドロームを治療する目的を達成することができる。
【００４２】
世界的には、遺伝子治療は、既に急速な発展を遂げている。ウイルスベクターであっても、非ウイルスベクターであっても、外来遺伝子を導入する方法は既に非常に成熟しているため、遺伝子治療手段を用いて「ＦＡＤＤタンパク質の１９４位のセリンをアスパラギン酸に変異させる」タンパク質の発現を体内で行うことは非常に簡単で、便利で、経済的である。
【００４３】
また、ＦＡＤＤ遺伝子及びタンパク質は、哺乳類において高度に保守的であり、ヒト及びマウスのＦＡＤＤタンパク質は、６８％のアミノ酸残基が完全に同じであり、タンパク質の一次構造における相同性は８０％にも達し、その他の哺乳類（ヒトを含む）においてもＦＡＤＤは類似の機能を有する（Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ  ＡＭら、１９９５，Ｃｅｌｌ  ８１（４）：５０５−５１２；Ｂｏｌｄｉｎ  ＭＰら、１９９５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０（１４）：７７９５−７７９８）。かつ、実施例２の結果（図２Ａ及び２Ｂ）から、肥満者の白色脂肪組織におけるリン酸化形式のＦＡＤＤバンドは、健常者よりも弱く（図２Ａ）、標準飲食で飼育した２０週齢のｏｂ／ｏｂマウスの白色脂肪組織におけるリン酸化形式のＦＡＤＤバンドは、健常対照マウスよりも著しく弱い（図２Ｂ）ことがわかった。これらの結果は、リン酸化形式のＦＡＤＤの発現レベルの低下は、マウス又はヒトの肥満をもたらす可能性があり、即ち、リン酸化形式のＦＡＤＤは、マウス又はヒトを痩せさせる可能性があることを説明している。
【００４４】
そのため、本実施例の結果を更に結合し、ＦＡＤＤリン酸化を上昇させることにより、肥満マウス体内脂肪含有量及び体重を低下させる方法は、その他の哺乳類、特にヒトに同様に適用することができる。
【００４５】
実施例４；健常な遺伝子型マウスの体重及び体内脂肪含有量に対するＦＡＤＤリン酸化の影響
【００４６】
ｏｂ／ｏｂマウスの体重に対するＦＡＤＤリン酸化の影響を研究する以外に、本発明は、更に、健常な野生型マウスの体重及び体内脂肪含有量に対するＦＡＤＤリン酸化の影響を測定した。文献で報告されている方式［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：，５１３−−５２１］で、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスを得た。実験マウスを２群に分け、１群は同腹健常対照マウスとし、１群はＦＡＤＤをリン酸化したマウスとした。ＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。断乳したマウスを１０週齢の大きさまで標準飲食で飼育し、マウスを解剖し、撮影し、健常対照マウスとＦＡＤＤをリン酸化したマウスの体内精巣上体脂肪含有量及び肝臓の大きさを比較した。また、遺伝子型ごとにマウスを６匹選び、標準飲食又は高脂肪飲食でマウスを飼育し、５週目から２０週目まで毎週マウスの体重を量り、マウスの体重成長曲線を作成し、代謝ケージを用いてマウスの１日あたりの摂食量を計算した。高脂肪で飼育した２０週齢のマウスの精巣上体、腎臓、及び鼠径部の白色脂肪塊の重量及び褐色脂肪が体重に占める割合を測定し比較した。核磁気共鳴装置（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてマウス体内の脂肪分布をスキャンした。マウスの白色脂肪組織、褐色脂肪組織を取り、１０％のリン酸緩衝ホルマリンの中でパラフィン包埋した後、厚さ５μｍの薄片に切り、白色脂肪組織及び褐色脂肪組織切片に対してヘマトキシリン−エオシン染色法（ＨＥ）で染色し、各細胞の大きさ及び形態変化を顕微鏡で観察し比較した。マウスの肝臓組織を取り、切片を急速に凍結し、凍結切片に対してオイルレッドＯ染色を行い、肝臓組織中のトリグリセリドの含有量を比較した。
【００４７】
実施例３と同様に、ＦＡＤＤリン酸化は健常マウスを痩せさせることができた。健常マウスに比べ、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの精巣上体脂肪含有量は著しく減少し（図４Ａ）、体重成長速度も健常対照マウスよりも著しく低かった（図４Ｂ、左）。代謝ケージ実験で、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの体重は、健常対照マウスよりも遥かに低かったが、単位体重の１日あたりの摂食量は健常対照マウスよりも高く、体重の低下は摂食量の減少によって引き起こされたのではないことを説明している（図４Ｂ、右）。本特許では、精巣上体、腎臓、及び鼠径部を含むマウス体内の３つの組織の白色脂肪塊重量を同様に測定し、その結果、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの体内各組織の白色脂肪塊の重量も健常対照マウスより著しく低く（図４Ｃ、左）、褐色脂肪含有量も著しく低下した（図４Ｃ、中）が、肝臓の大きさの変化は大きくない（図４Ｃ、右）ことがわかった。核磁気共鳴スキャンにより、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスは、皮下脂肪であっても内臓脂肪であっても、健常対照マウスより著しく低いことがわかった（図４Ｄ）。組織切片ＨＥ染色の結果、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの白色脂肪細胞及び褐色脂肪細胞は、いずれも健常対照マウスよりも著しく小さいことがわかった。肝臓オイルレッドＯ染色の結果でも、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの肝臓中のトリグリセリドの含有量は、健常対照マウスよりも著しく低いことが示された（図４Ｅ）。これらの結果は、ＦＡＤＤリン酸化によって、高脂肪飲食又は年齢の増加により引き起こされるマウスの肥満を抑制することができることを説明している。
【００４８】
実施例３及び実施例４の結果、ＦＡＤＤリン酸化は、ｏｂ／ｏｂ肥満マウスを痩せさせることができるだけでなく、高脂肪飲食又は年齢の増加により引き起こされる健常な遺伝子型マウスの肥満を抑制することができることを説明しており、そのため、ＦＡＤＤリン酸化程度の変化を指標とし、ＦＡＤＤリン酸化を高めることができる物質をスクリーニングする方法により、肥満症及び関連するメタボリックシンドロームの治療を行うことができる。これらの物質は、主に、例えば、タンパク質、核酸、多糖、脂肪酸、ビタミン、及びそのナノ分子等のＦＡＤＤタンパク質のリン酸化レベルを高めることができる高分子物質を含み、例えば、天然産物、化学合成又は化学修飾による生成物、有機小分子、無機分子等のＦＡＤＤリン酸化レベルを高めることができる小分子物質も含む。実施例２の結果を更に結合し、以上の方法はヒトに同様に適用できる。
【００４９】
実施例５；マウスの各組織及び血清内トリグリセリド等の代謝指標に対するＦＡＤＤリン酸化の影響
【００５０】
文献で報告されている方式［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：，５１３−−５２１］で、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスを得た。実験マウスを２群に分け、１群は同腹健常対照マウスとし、１群はＦＡＤＤをリン酸化したマウスとした。ＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。マウスを高脂肪で飼育した。筋肉及び肝臓組織中のトリグリセリド及びコレステロール含有量を、それぞれトリグリセリド測定キット（上海盈公生物技術有限公司）、コレステロール測定キット（上海必優生物科技有限公司）で測定した。血清中の遊離脂肪酸含有量、トリグリセリド含有量を、それぞれ遊離脂肪酸測定キット及びトリグリセリド測定キット（いずれもＳｉｇｍａ社から購入）で測定した。血清中のレプチンレベルをサスペンションアレイによって測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００５１】
脂質代謝に対するＦＡＤＤリン酸化の影響を更に研究するため、本特許では、肝臓及び筋肉組織中のトリグリセリド含有量を更に測定し、その結果、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの肝臓及び筋肉組織中のトリグリセリドの含有量は、健常対照マウスよりも著しく小さく（図５Ａ、左）、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの肝臓中のコレステロール含有量は、健常対照マウスよりも略小さく、筋肉中のコレステロールの両者の含有量は同じである（図５Ａ、右）ことがわかった。高脂肪で飼育した後、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの血清中の遊離脂肪酸及びトリグリセリドの含有量は、健常対照マウスよりも著しく低く（図５Ｂ）、血清中のレプチンの含有量も健常対照マウスより著しく低かった（図５Ｃ）。これらの結果、ＦＡＤＤリン酸化はトリグリセリドの分解を促進することが示された。ＦＡＤＤリン酸化マウスは、血清中の遊離脂肪酸濃度も低下し、ＦＡＤＤリン酸化は、脂肪酸の酸化代謝も促進する可能性があることを説明している。
【００５２】
実施例６；マウス体内トリグリセリドの脂肪分解速度に対するＦＡＤＤリン酸化の影響
【００５３】
実験マウス：文献で報告されている方式［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：，５１３−−５２１］で、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスを得た。実験マウスを２群に分け、１群は同腹健常対照マウスとし、１群はＦＡＤＤをリン酸化したマウスとした。ＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。
【００５４】
脂肪分解速度測定：マウスの白色脂肪塊を取り、組織ホモジネートを作成し、遊離脂肪酸測定キット（Ｓｉｇｍａ）及びグリセリン測定キット（北京鴻躍創新科技有限公司）を用いて異なる時点（０時間、２時間、４時間、６時間、８時間）で基礎状態下又は刺激条件（１００ｎＭのイソプロテレノールを加えた）下で遊離脂肪酸、グリセリン濃度をそれぞれ測定した後、脂肪分解速度図を作成した。
【００５５】
ｃＡＭＰ含有量測定：ｃＡＭＰ含有量を競合免疫試験（Ｒ＆Ｄ）で測定した。
【００５６】
ウェスタンブロット：ウェスタンブロットの実験方法は、実施例２を参照し、それぞれＨＳＬ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＨＳＬの抗体を用いて検査した。ウェスタンブロット図に対して、Ｉｍａｇｅ  Ｊグレイスケールスキャンを行い、定量分析を行った。
【００５７】
データ解析：全てのデータの結果は、平均値±ＳＥＭで示した。Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）におけるｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて２種類の遺伝子型の間の差異分析を行った。Ｐ値が０．０５未満の場合、データに統計学的な有意差があるとした。
【００５８】
白色脂肪組織は、脂質代謝の主な場所である。トリグリセリドの代謝に対するＦＡＤＤリン酸化の影響を研究するため、本発明では、マウスの白色脂肪組織の脂肪分解速度を観察した。基礎状態下であってもイソプロテレノール刺激下であっても、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの白色脂肪組織におけるトリグリセリド分解速度は、いずれも健常対照マウスより著しく高かった（図６Ａ）。ｃＡＭＰは、脂肪分解シグナル経路における古典的な重要なシグナル分子であり、本発明では、白色脂肪組織中のｃＡＭＰ含有量を継続して測定し、その結果、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの白色脂肪組織中のｃＡＭＰ含有量は、健常対照マウスよりも著しく高いことが示された（図６Ｂ）。ｃＡＭＰは、下流のホルモン感受性リパーゼＨＳＬのリン酸化を促進し、リン酸化されたＨＳＬが活性化されることにより、トリグリセリドの分解を促進する。そのため、本特許では、ＨＳＬのリン酸化レベルがＦＡＤＤリン酸化の影響を受けるかどうかを継続して観察した。その結果、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの白色脂肪組織におけるＨＳＬのリン酸化レベルは、健常対照マウスよりも著しく高いことが示され（図６Ｃ）、ＨＳＬが活性化され、トリグリセリドの分解を促進したことを説明しており、これは、先に我々が観察したＦＡＤＤリン酸化によってトリグリセリドの分解が加速される現象と一致する。これらの結果、ＦＡＤＤリン酸化は、白色脂肪組織におけるｃＡＭＰ含有量を増加させ、脂肪分解シグナル経路を活性化し、トリグリセリドの分解を促進し、体内脂肪の含有量を低下させ、マウスの体重を低くすることが示され、これは、先に我々が観察した結果と一致する。
【００５９】
実施例７；マウス体内脂肪酸の酸化速度に対するＦＡＤＤリン酸化の影響
【００６０】
実験マウス：文献で報告されている方式［Ｈｕａ  ＺＣら、２００３，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：，５１３−−５２１］で、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスを得た。実験マウスを２群に分け、１群は同腹健常対照マウスとし、１群はＦＡＤＤをリン酸化したマウスとした。ＰＣＲ法により遺伝子型の同定を行った。
【００６１】
脂肪酸酸化速度測定：マウスを高脂肪飲食で飼育した。マウスの白色脂肪組織、コラゲナーゼ消化組織を取り、白色脂肪細胞を分離し、脂肪酸β酸化速度比色法測定キット（上海宝曼生物科技有限公司）を用いて、ＦＡＤＤリン酸化マウス及び健常対照マウスの脂肪酸酸化速度を測定し比較した。
【００６２】
ウェスタンブロット：測定方法は実施例２と同じである。
【００６３】
ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムＰＣＲ：ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて組織を処理した後、添付された説明書に基づきＲＮＡを抽出し、次いでＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写しｃＤＮＡを製造した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＡＢＩ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ．ＣＡ，ＵＳＡ）において行った。プライマーは次の通りである。ＰＰＡＲα：フォワードプライマー：５’−ＴＣＧＣＧＧＧＡＡＡＧＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡ−３’；リバースプライマー：５’−ＧＣＣＡＧＧＣＣＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＧＣ−３’；Ａｃｏｘ１：フォワードプライマー：５’−ＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＡＧＡＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＴＣＣＡＧＧＣＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＣ−３’；Ｅｈｈａｄｈ：フォワードプライマー：５’−ＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＣＧＣＣＡＣＡＧ−３’；リバースプライマー：５’−ＡＣＣＡＡＡＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧ−３’；Ａｃａｄｖｌ：フォワードプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡ−３’；リバースプライマー：５’−ＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＧＣＡＡＡＡＧＡＴ−３’；Ａｃａｄｍ：フォワードプライマー：５’−ＴＣＧＣＣＣＣＧＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡ−３’；リバースプライマー：５’−ＡＧＡＡＣＧＴＧＣＣＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＣＡ−３’；ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマー：５’−ＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣ−３’；リバースプライマー：５’−ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＴ  ＣＡＴＴＧ−３’。全ての結果は、３回の実験の平均値であり、ＧＡＰＤＨを内部基準とした。
【００６４】
ＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）実験：マウスを高脂肪で飼育し、マウスの白色脂肪組織、コラゲナーゼ消化組織を取り、白色脂肪細胞を分離し、１０センチメートル培養ディッシュを用いて培養した。
【００６５】
１日目：
【００６６】
１．培養液を捨てた後、壁に沿って３ｍＬの冷たいＰＢＳを加え、培養ディッシュをゆっくりと裏返し、ＰＢＳで細胞を充分に洗った後、ＰＢＳを捨て、ピペットできれいに吸い取った。
【００６７】
２．各ディッシュに４％のポリオキシメチレン４ｍＬを加え、均等に混ぜてディッシュ全体に敷いた後、シェーカーで揺らしながら１０分間固定した。
【００６８】
３．直接シェーカーで揺らしながら１．２５ＭのＧｌｙｃｉｎｅ溶液を滴下し、４５０μＬ／ディッシュとし、５分間揺らし続けた。
【００６９】
４．全ての液体を捨て、冷たいＰＢＳを用いて２回洗い、各回少なくとも３ｍＬとし、更に１ｍＬのＰＢＳを用いて細胞を削ぎ取った。３０００ｒｐｍで５分間遠心し細胞を収集した。ＰＢＳでもう一度洗い、上清を捨てた。
【００７０】
５．１管あたり１００μＬのＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩ  １：１００）を加え、細胞を吹き散らした後、１０分間氷冷した。
【００７１】
６．１管あたり９００μＬのＩＰ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＩ  １：１００）を加え、氷水混合物を用意し、超音波を開始した。
【００７２】
７．１２０００ｒｐｍで、４度で１０分間遠心し、上清を取り、抗体（ＰＰＡＲα抗体又はＦＡＤＤ抗体）を加え、抗体の用量は少なくとも２μｇ必要であり、４度で、縦型ローテーター上で混合し、一晩置いた。
【００７３】
２日目：
【００７４】
８．ｆｉｓｈ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡを用いてｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇをブロッキングし、４度で２時間培養した。
【００７５】
９．ブロッキングしたｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを試料に加えた後、４度で、縦型ローテーター上で２時間培養を継続した。
【００７６】
１０．５０００ｒｐｍで１分間遠心し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを収集した。各試料で４００の上清を保存した後、対照とし、上清を−２０度で一時的に保留した。
【００７７】
１１．残った上清を捨て、次のｂｕｆｆｅｒを用いてｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを順番に洗浄した。洗浄順序は次の通りである。
Ａ．Ｌｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄
Ｂ．Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄
Ｃ．ＬｉＣｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄
Ｄ．ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄
【００７８】
１２．新鮮なＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％のＳＤＳ、０．１ＭのＮａＨＣＯ３）を配合した
【００７９】
１３．１管ごとにＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬを加え、室温で、ボルテックスミキサー上で振動させながら１５分間混合し、１５分間溶出した後、５０００  ｒｐｍで１分間遠心し、上清を吸い取った。その後、再び２００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒでもう１度溶出し、同様に１５分間とし、再び上清を遠心し、２回の上清を１つに混合した後、合計４００μＬの溶出生成物を得た。
【００８０】
１４．このとき、各試料で４００μＬの溶出上清があり、更に以前に保留した４００μＬの対照上清があり、次いで２ロットの試料を同時に平行処理した。
【００８１】
１５．各試料に１６μＬの５ＭのＮａＣｌを加え、６５度で水浴し、４時間培養した後、−２０度で凍結させ、使用に備えた。
【００８２】
３日目：
【００８３】
１６．試料を解凍した後、各試料に８μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ、１６μＬの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＨ６．５、及び４μＬの１００倍のｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えてから、５０度で水浴し１時間培養した。
【００８４】
１７．４００μＬの試料ごとに２８０μＬの飽和ＮａＣｌを加え、７００μＬのクロロホルムと均等に混合した。
【００８５】
１８．１００００ｒｐｍで、４度で１０分間遠心し、２ｍＬの遠心管の中に上清を注意深く吸い取り、各試料に２０ｍｇの魚類精子ＤＮＡを加えてベクターＤＮＡとし、均等に混ぜた後、ゲノムの抽出を開始した。
【００８６】
１９．１．３ｍＬの無水エタノールを加え、１０分間氷冷した後、白色の混濁が微かに認められた。
【００８７】
２０．１２０００ｒｐｍで、４度で１０分間遠心し、上清を注意深く吸い取った後、沈降させ、７５％のエタノールを用いて試料を洗浄し、自然乾燥させた。
【００８８】
２１．２０μＬのＤＤＷを用いて溶解させ沈降させた後、ＰＣＲを行った。ＰＣＲプライマー：ＣＰＴ１ｂ，５’−ＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＡＣＴＣＡＣＡＧＣ−３’及び５’−ＣＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＴ−３’（２７９ｂｐ）。
【００８９】
血清中の遊離脂肪酸は、脂肪組織中に貯蔵されたトリグリセリドの分解に主に由来する。ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの脂肪分解速度が増加しても、血清中の遊離脂肪酸濃度は健常対照マウスよりも低いため、我々は、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの脂肪酸酸化速度も同様に増加すると推測した。我々の推測と同じく、本特許では、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの白色脂肪組織における脂肪酸の酸化速度は、健常対照マウスよりも著しく高い（図７Ａ）ことがわかり、これは、ＦＡＤＤをリン酸化したマウスの血清中の遊離脂肪酸含有量が健常対照マウスよりも低いという上述した結果と一致する。ＰＰＡＲαは、脂肪酸代謝に対して重要な調整作用を有し、細胞による脂肪酸の摂取、輸送、活性化、及びβ酸化を促進することができる。本発明は、更に脂肪組織における転写因子ＰＰＡＲαの発現を測定し、ウェスタンブロット及び免疫染色実験によって、いずれもＦＡＤＤをリン酸化したマウスの脂肪組織におけるＰＰＡＲαの発現が健常対照マウスよりも遥かに高いことが示された（図７Ｂ及び７Ｃ）。ＰＰＡＲαの発現増加によって、それが調整する脂肪酸酸化代謝に関与する標的遺伝子の発現を活性化させる。これと同じく、本特許では、ＦＡＤＤリン酸化マウスの白色脂肪組織におけるＰＰＡＲα、並びにペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅｈｈａｄｈ）、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｖｌ）、及び中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｍ）を含む脂肪酸酸化代謝に関与するいくつかの重要な酵素のｍＲＮＡレベルの発現が増加している（図７Ｄ）ことがわかった。Ａｃａｄｖｌ、Ａｃａｄｍ、長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｌ）、ペルオキシソーム３−ケトアシルＣｏＡチオラーゼ（ＰＴＬ）タンパク質の発現レベルも著しく上昇した（図７Ｅ）。これらの酵素の高発現は、脂肪酸酸化速度の上方制御を促進した。ＰＰＡＲαの転写活性及び脂肪酸酸化速度に対する調整を更に考察するため、本特許では、更にＣｈＩＰ実験を用いて脂肪酸代謝経路における重要な酵素の１つであるカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１ｂ（ＣＰＴ１ｂ）に対するＰＰＡＲαの転写調整作用を測定し、その結果、ＦＡＤＤリン酸化は、ＰＰＡＲαがＣＰＴ１ｂ遺伝子調整領域のＰＰＲＥ配列に結合することを促進することができ、ＣＰＴ１ｂ遺伝子の発現を増強し、脂肪酸の酸化代謝を促進した（図７Ｆ）ことがわかった。
【００９０】
ＦＡＤＤのリン酸化は、脂肪組織におけるｃＡＭＰの濃度を増加させることができ、古典的な脂肪分解経路を活性化させ、ＨＳＬのリン酸化レベルを増強し、トリグリセリドの遊離脂肪酸及びグリセリンへの分解を促進した。ＦＡＤＤリン酸化は、更にＰＰＡＲαの転写レベルを増強することができ、これにより、ＰＰＡＲαが調整する脂肪酸代謝に関与する酵素の発現を増加させ、脂肪酸の酸化代謝を促進した。そのため、本発明のＦＡＤＤリン酸化は、肥満を含む脂質代謝疾患の治療のために、新しい薬物標的を提供する。ＦＡＤＤリン酸化レベルをスクリーニングマーカーとすることにより、ＦＡＤＤリン酸化を調整することができる物質を得ることができ、これにより、脂質代謝を調節する薬物を見出すことができる。
【００９１】
本発明は、ＦＡＤＤリン酸化をシミュレーションするＦＡＤＤ変異遺伝子を導入することにより、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ１（Ａｃｏｘ１）、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ｅｈｈａｄｈ）、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｖｌ）、長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｌ）、及び中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（Ａｃａｄｍ）等の重要な転写因子又は酵素の発現の調整を直接実現し、これにより脂質代謝速度を有効に調節する。そのため、ＦＡＤＤリン酸化をシミュレーションするＦＡＤＤ変異遺伝子の遺伝子治療は、必然的に、脂質代謝疾患を調節する有効な手段となる。
【００９２】
そのため、ＦＡＤＤリン酸化により脂肪分解及び脂肪酸酸化速度を調節する方法は、脂質代謝疾患治療薬物の発見、製造、及び治療に直接応用することができる。この方法は、従来の化学薬物療法、漢方薬療法、生物学的療法、理学療法等の脂質代謝治療方法と併用し、より優れた治療効果を生み出すことができる。 
【図１】
2019520073.tif 000002
【図２】
2019520073.tif 000003
【図３】
2019520073.tif 000004
【図４−１】
2019520073.tif 000005
【図４−２】
2019520073.tif 000006
【図５】
2019520073.tif 000007
【図６−１】
2019520073.tif 000008
【図６−２】
2019520073.tif 000009
【図７−１】
2019520073.tif 000010
【図７−２】
2019520073.tif 000011
【図７−３】
2019520073.tif 000012
【国際調査報告】
2019520073.tif 000013
2019520073.tif 000014
2019520073.tif 000015
2019520073.tif 000016
2019520073.tif 000017
2019520073.tif 000018
2019520073.tif 000019
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