(57)【要約】    本発明は、楡根皮（Ulmus davidiana Planch）抽出物から分離したUldavioside A（Uldavioside A）の化合物を有効成分として含有する傷治療用の組成物に関するもので、上記のUldavioside Aの化合物が優れた傷の治療効果を示すので、傷の治療のための治療剤として有用に用いられる。【選択図】図９
2019525958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化1のUldavioside A（Uldavioside A）の化合物を有効成分として含有することを特徴とする傷治療用の組成物。
【化１】
2019525958.tif 000006
【請求項２】
上記傷は創傷、褥瘡、火傷、擦り傷、穿刺、潰瘍性創傷、刺傷、活性酸素による慢性皮膚創傷、打撲傷、切り傷、咽喉または口腔粘膜の創傷、裂傷、糖尿病性潰瘍、下肢潰瘍、高血圧虚血潰瘍、静脈潰瘍および足部潰瘍からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の傷治療用の組成物。 
【請求項３】
上記組成物は、Uldavioside Aの化合物が組成物の総重量に対して0.001〜50重量％で含有されていることを特定とする請求項１記載の傷治療用の組成物 。
【請求項４】
上記組成物は、経口用投与剤、スプレー剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤または外用剤で剤型化された薬学的な組成物であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の傷治療用の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、楡根皮(Ulmus davidiana Planch）抽出物から分離したUldavioside A（Uldavioside A）の化合物を有効成分として含有する傷治療用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体を外部の侵入者から守り、水分と体温を維持する皮膚組織が損傷されたのが傷(wound）であり、傷の治療(wound healing）は損傷された組織の機能と形態的な特性を再び正常化させるための必須的な反応である。傷ついたとき、適切に治療されないと、細菌感染などで体内臓器に致命的な損傷を引き起こしかねないので、傷の発生時は破損された皮膚部位ができるだけ早く、また、本来の皮膚構造と類似に復元されるように措置を取ることが重要である。
【０００３】
傷の治療は、止血(hemostasis）と炎症期(inflammation）の第1段階、増殖期（proliferation）の第2段階および成熟期（remodeling）の第3段階からなり、各段階は重畳されて連続的に進行される（Bello Y.M., et al., 2000; Midwood K.S., et al., 2004; Stadelmann W.K., et al., 1998）。
【０００４】
傷つくと、第1段階的である止血と炎症反応が起きるが、止血は数分内に血小板が傷部位に集合して繊維素性凝固（fibrin clot）を形成する反応で出血を防ぐ役割を果たす（Midwood K.S., et al., 2004; Sandeman S.R., et al., 2000）。
【０００５】
炎症反応はバクテリアや組織残骸らが食菌作用（phagocytosis）によって除去されながらマクロファージ（macrophage）から複数のサイトカイン（cytokine）が放出されて増殖期に分化（differentiation）される細胞の移住（migration）と分裂（mitosis）を助けるようになる。
【０００６】
第2段階である増殖期には新生血管の形成、コラーゲン蓄積、肉芽組織（granulation tissue）の形成、上皮化（epithelialization）、傷の収縮などが起こる（Midwood K.S., et al., 2004; Chang H.Y., et al., 2004）。この時期は傷の癒合と膠原繊維（collagenous fiber）の再配列のための初期段階として繊維芽細胞（fibroblast）らが傷の部位に出現するようになる（Byl N.N., et al., 1992）。
【０００７】
最終的に、成熟期には傷の空間が肉芽組織に完全に代替され血管生成が最高潮に達し、膠原繊維の量が豊かになって上皮細胞が段々通常の厚さを回復して傷の治療が完了する（Galeano M., et al., 2008; Garg H.G., et al., 2000）。
【０００８】
傷の治療の段階のうち、炎症期に破壊された組織、異物、壊死した組織の残骸などが炎症細胞によって除去されないと、次の段階である増殖期に移る時、傷の治療過程が遅延されるため、炎症期の役割が非常に重要である（Enoch P., et al., 2004）。
【０００９】
炎症期に起こる反応を詳細に見てみると、組織損傷の際、局所血管が収縮されたが、傷の部位からヒスタミン(histamine)、ブラディキニン(bradykinin)、プロスタグランジン(prostaglandin)、セロトニン(serotonin),ノルエピネフリン(norepinephrine)などが放出されることにより血管が拡張される。拡張された血管によって内皮細胞の間に透き間ができることになり、このような透き間から血漿と白血球がてんかん液に抜けるようになる。組織が損傷された後、数時間以内に多型核白血球(polymorphonuclear leukocyte)は、補体(complement)の影響を受けて、傷の部位に移動することになり、そこで損傷された組織の残骸と細菌を捕食する。傷の生成後、数時間が経過すると、マクロファージも損傷部位に到達して食菌作用をすることになるが、活性化されたマクロファージは、複数のサイトカインと活性酸素種(reactive oxygen species, ROS)を生成して、炎症反応の転写因子であるNF-κB(nuclear factor-κB)を活性化させ、その結果、iNOS(inducible nitric oxide synthase)とCOX-2(cycolooxygenase-2)の発現と活性を増加させて過量のNO(nitric oxide)とPGE2(prostaglandin E2)を生成することによって炎症反応を起こす。また、マクロファージから生成された活性酸素種は、傷の部位のバクテリアを除去して感染を予防し、細胞内の2次信号伝達物質(second messenger)として作用して、傷の治療段階で必須的な役割を果たす。しかし、活性酸素種が過剰に生成されると、傷の部位に酸化的ストレス(oxidative stress)を誘発して、炎症反応媒介物質の発現を調節することによって、傷の治療時の炎症反応に影響を及ぼして、傷の治療速度を遅らせることで知られており、過度の活性酸素種の生成を抑制する抗酸化物質を探そうとする試みが行われている(Park, Eungyo、2011)。
【００１０】
楡根皮はニレ科（Ulmaceae）に属するニレ（Ulmus davidiana Planch、Ulmus davidiana var.japonica Nakai）のコルク層をむいた樹皮及び根皮を乾燥したものである。韓方で楡根皮は味が甘く、無毒で、腫脹、関節炎、胃潰瘍、胃腸病などに使用され、去痰、抗がん、傷の治療薬及び炎症にも優れた効果があると報告されている(Duke J.A., 1985)。楡根皮中に存在する天然物としてβ-シトステロール（β-sitosterol）、フィトステロール（phytosterol）、スティグマステロール（stigmasterol）、タンニン（tannin）、でん粉（starch）、多糖類（polysaccharide）などが存在する。また、鎮痛作用を示す成分であるフリーデリン（friedelin）とEpifriendelalol(epifriendelalol）、タラクセロール（taraxerol）などの分離（Matsuzaki T., et al., 1985）と化学的な組成に関する研究（Duke J.A., 1985）などが多く行われているが、楡根皮の様々な生理活動を研究した試みは、これまでほとんど行われていなかった。
【００１１】
これに、本発明者は、楡根皮の抽出物を含有する傷治療用の組成物を研究する過程で、楡根皮抽出物から分離されたUldavioside Aの化合物が傷の治療効果に優れていることを確認することにより、本発明を完成することができた。
【００１２】
従来の先行技術として、韓国公開特許第2000-0041190号には、兪白皮を含む薬剤組成物の炎症、傷のような疾患の予防と治療が記載されており、韓国公開特許第2004-0050154号には、楡根皮抽出物を含有する傷治療用の組成物が記載されているが、Uldavioside Aの化合物が記載されたとこるがなくて、本発明の構成と違いがある。韓国登録特許第0893166号には、ニレ抽出物の繊維芽細胞の増殖及び抗酸化効果が記載されているが、Uldavioside Aの化合物及び傷の治療は、言及されたところはなくて、本発明の構成と違いがある。
【００１３】
また、非特許文献としてSon B.W.,et al.は、ニレから分離したUldavioside Aの化合物が記載されているが、傷の治療効果は記載されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、楡根皮（Ulmus davidiana Planch）抽出物から分離したUldavioside A（Uldavioside A）の化合物を有効成分として含有する傷治療用の組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、下記化1のUldavioside A（Uldavioside A）の化合物を有効成分として含有する傷治療用の組成物に関する
【００１６】
【化１】
2019525958.tif 000003
上記傷は、創傷、褥瘡、火傷、擦り傷、穿刺、潰瘍性創傷、刺傷、活性酸素による慢性皮膚創傷、打撲傷、切り傷、咽喉または口腔粘膜の創傷、裂傷、糖尿病性潰瘍、下肢潰瘍、高血圧虚血潰瘍、静脈潰瘍および足部潰瘍からなる群から選択されることができる。
【００１７】
上記組成物は、Uldavioside Aの化合物が組成物の総重量に対して0.001〜50重量％で含有されることができる。
【００１８】
上記組成物は、経口用投与剤、スプレー剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム製又は外用剤に剤形化された薬学的な組成物であることができる。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は、下記化1のUldavioside Aの化合物を有効成分として含有する傷治療用の組成物に関する
【００２１】
【化１】
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上記化1のUldavioside Aの化合物は、通常の方法によって合成することができ、薬学的に許容可能な塩で製造されることもあり、または楡根皮抽出物から分離、精製されることができる。
【００２２】
上記楡根皮はニレ科（Ulmaceae）に属するニレ（Ulmus davidiana var. japonica Nakai、Ulmus davidiana Planch）のコルク層をむいた樹皮及び根皮を乾燥したものである。
【００２３】
上記楡根皮抽出物は楡根皮を水、ClないしC4の低級アルコールまたはこれらの混合溶液を溶媒として抽出することができる。上記ClないしC4アルコールはメタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール及びイソブタノールからなる群から選択されることができる。好ましくは、水で抽出する。
【００２４】
上記楡根皮抽出物から分離された化合物は、カラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。上記クロマトグラフィーは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（silica gel column chromatography）、HP-20カラムクロマトグラフィー（HP-20 column chromatography）、RP-18カラムクロマトグラフィー（RP-18 column chromatography）、LH-20カラムクロマトグラフィー（LH-20 column chromatography）、高性能液体クロマトグラフィー（High-performance liquid chromatography）などから選択して使用することができる。
【００２５】
上記の傷治療用の組成物は、皮膚組織が損傷された傷を治療するためのもので、上記傷は創傷、褥瘡、火傷、擦り傷、穿刺、潰瘍性創傷、刺傷、活性酸素による慢性皮膚創傷、打撲傷、切り傷、咽喉または口腔粘膜の創傷、裂傷、糖尿病性潰瘍、下肢潰瘍、高血圧虚血潰瘍、静脈潰瘍および足部潰瘍からなる群から選択されることができる。
【００２６】
上記糖尿病性潰瘍は、糖尿病性足部潰瘍であることができる。
【００２７】
上記組成物は、上記化1のUldavioside Aの化合物と賦形剤を含む薬学的な組成物を提供する。上記Uldavioside Aの化合物は、組成物の総重量に対して0.001〜50重量％、好ましくは0.001〜40重量％、より好ましくは0.001〜30重量％として含有されることができる。
【００２８】
上記薬学的な組成物は、各々通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、スプレーなどの経口型製型、外用剤、座剤および滅菌注射溶液の形態で製型化して使用されることができる。上記薬学的な組成物に含まれることができる担体、賦形剤及び稀釈剤としては、ラクトース、デキストローズ、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には精製、環剤、酸剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は本発明のUldavioside A化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、でん粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単なる賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤らも使用される。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当されが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール (witepsol)、マクロゴール、ツイン(tween)-61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
【００２９】
上記傷治療用の組成物は、経口用投与剤、スプレー剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤または外用剤で剤型化された薬学的な組成物であることができるが、これに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の薬学的な組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重と、治療する特定疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路及び処方者の判断によって異なるようになる。このような因子に基づく投与量の決定は当業者の水準内にあり、一般に投与量は0.01mg/kg/日ないし大略2000mg/kg/日の範囲である。より望ましい投与量は1mg/kg/日ないし500mg/kg/日である。投与は一日に一度投与することも、数回に分けて投与することもできる。上記の投与量は、いかなる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３１】
本発明の薬学的な組成物は、ネズミ、家畜、人間などの哺乳動物に様々なルートで投与されることができる。投与のすべての方式は予想されることができるが、例えば経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射及び皮膚塗布によって投与されることができる。本発明の化合物は毒性及び副作用がほとんどないため、予防目的で長期間服用するときにも安心して使用できる薬剤である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、楡根皮(Ulmus davidiana Planch)抽出物から分離したUldavioside A(Uldavioside A)化合物を有効成分として含む傷治療用の組成物に関するもので、上記Uldavioside Aの化合物が傷の治療効能があることを確認した。
【００３３】
これを通じて、本発明のUldavioside A化合物が創傷、褥瘡、火傷、擦り傷、穿刺、潰瘍性創傷、刺傷、活性酸素による慢性皮膚創傷、打撲傷、切り傷、咽喉またはや口腔粘膜などの創傷、裂傷及び糖尿病性潰瘍、下肢潰瘍、高血圧虚血潰瘍、静脈潰瘍および足部潰瘍などのような傷の治療剤として容易に利用できると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のUldavioside A(Uldavioside A)化合物に対するlH1H COSY(bold lines)およびlH-13C HMBC相関関係(arrow)を示す図である。
【図２】本発明のUldavioside A化合物のC2C12(A)およびNIH3T3(B)細胞における細胞毒性結果を示している。
【図３】本発明のUldavioside A化合物の炎症ストレスに対するC2C12(A,B)およびNIH3T3(C,D)細胞における傷の治療効果を示している。
【図４】本発明のUldavioside A化合物の糖酸化的なストレスに対するC2C12(A,B)及びNIH3T3(C,D)細胞における傷の治療効果を示している。
【図５】本発明のUldavioside A化合物の動物モデルでの創傷治療の効果を示している。(A)は、Uldavioside A化合物の処理時間による傷部位のイメージを、(B)は傷部位を定量化したグラフを示している。
【図６】本発明のUldavioside A化合物の動物モデルにおける創傷治療による組織学的な変化を観察した結果を示している。(A)はH&E染色結果を、(B)はツリークロム染色結果を示している。
【図７】本発明のUldavioside A化合物の動物モデルでの創傷治療による血管生成関連タンパク質であるVEGFとCD31(A)および組織再生関連タンパク質であるbFGFと、β-カテニン(B)の発現程度を確認した結果を示している。
【図８】高糖環境での本発明のUldavioside A化合物の糖酸化的なストレスに対するHDF(A)およびC2C12(B)細胞保護効果を示している。
【図９】本発明のUldavioside A 化合物の糖尿病誘発動物モーテルにおける円形切傷治療による傷部位のイメージ(A)及び傷部位の大きさを定量化した結果(B)を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明の望ましい実施例を詳細に説明することにする。しかし、本発明はここで説明される実施例に限らず、別の形態で具体化されることもできる。むしろ、ここで紹介される内容が徹底かつ完全となり、当業者に本発明の思想を十分に伝えるために提供するものである。
【００３６】
<実施例1.Uldavioside A化合物の分離>
楡根皮(Ulmus davidiana Planch)は農家で乾燥した物を購入して使用した。乾燥した楡根皮lOgに精製水1lを添加した後、反連続式低温振空抽出器で25℃で12時間の間処理することを3回繰り返して楡根皮抽出物を抽出し、ろ過紙を利用して不純物を除去して楡根皮の水抽出物を得た。楡根皮の水抽出物を30%メタノール、50%メタノール、70%メタノール、100%メタノールの順で極性を高めながら、均一溶媒の溶出条件としてディアイオンHP-20カラムクロマトグラフィー(Diaion HP-20 column chromatography)を遂行して3つの分画物を得た(Fr.E-I〜E-3)。このうちFr. E-lを70%メタノール均一溶媒で均一溶媒の溶出条件によるセファデックスLH-20カラムクロマトグラフィー(sephadex LH-20 column chromatography)を遂行してUldavioside A化合物(9mg)を分離した。
【００３７】
<実施例2.Uldavioside A化合物の物理化学的な構造確認>
Uldavioside A;
薄茶色粉末;
lH NMR および13C NMRデータは以下の表1 参照;
ESI-MS[M+H]+m/z 423.1, C20H22O10
【００３８】
【表１】
2019525958.tif 000005
a 13C NMR(150 MHz in CD3OD) spectroscopy data
b 1H NMR(600 MHz in CD3OD) spectroscopy data 
＜実験例1.動物細胞の培養＞
本発明のUldavioside A化合物の活性を確認するため、動物細胞を培養した。その際、動物細胞は筋原細胞(myoblast)であるC2C12細胞および繊維芽細胞株(fibroblast)であるNIH3T3とHDF(human diploid fibroblast)細胞を用いた。各々の細胞は10%FBS(fetal bovine serum)、100U/mlのペニシリン(penicillin)及び100μg/mlのストレプトマイシン(streptomycin)が含まれているDMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培地を入れ、37℃、5%CO2培養器で培養した。
【００３９】
<実験例2.Uldavioside A化合物の細胞毒性確認>
本発明のUldavioside A化合物による細胞毒性の有無をMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)アッセイ方法を用いて確認した。
【００４０】
上記実験例1で培養したC2C12及びNIH3T3細胞を48ウェルプレートにウェル当たりに1×105個細胞になるよう分注して24時間の間培養した後、0.5% FBS、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンが含まれているDMEM培地を入れて18時間の間培養した。18時間培養後、Uldavioside Aの化合物を1μM及び10μMで処理し、24時間培養した。この際、何も処理しなかったC2C12およびNIH3T3細胞を対照群として利用した。24時間後に細胞に100μg/mlの濃度でMTT溶液を処理し、37℃で3時間反応させた後、培養液を除去して形成されたホルマザン(formazan)沈殿物をDMSO(dimethyl sulfoxide)200μlで溶かし、570nmで吸光度を測定し、その結果を図2に示した。
【００４１】
図2で示すように、Uldavioside A 化合物を処理したC2C12(2A)およびNIH3T3(2B)細胞の生存率が何も処理していない対照群に比べて増加した。
【００４２】
これを通じて、本発明のUldavioside A化合物が細胞毒性を示さないことが分かった。
【００４３】
<実験例3.Uldavioside A化合物の傷の治療効果の確認〉
本発明のUldavioside A 化合物の処理による傷の治療効果を確認するために、傷の治療アッセイ(Wound healing assay)を遂行した。
【００４４】
実験例3-1.炎症ストレスによる傷の治療効果の確認
上記実験例1で培養したC2C12およびNIH3T3細胞を12ウェルプレートにウェル当たりに1×106個細胞になるように分注して24時間の間培養して安定化させた後、0.5% FBS、100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンが含まれているDMEM培地を入れて18時間の間培養した。18時間培養後、細胞が育っているウェルの中央に0.9mm程度の傷(scratch)をつけ、10μMのUldavioside A化合物を処理して1時間の間、全反応させた。1時間後に炎症ストレス刺激を与えるため、10μg/mlのLPS(lipopolysaccharide)を処理し培養しながら細胞の移動を観察した。この際、0,12及び24時間ごとに細胞を固定液(2% Formaldehydeと0.2% glutaraldehyde)で固定し、0.3%クリスタルバイオレット(crystal violet)で染めた後、顕微鏡を利用して細胞の移動を確認し、傷をつけた部位への細胞移動による面積減少を分析して、その結果を図3に示した。この時、Uldavioside A化合物を全反応させずに、LPSで炎症ストレス刺激を与えたものを対照群として利用した。
【００４５】
図3で示すように、本発明のUldavioside A 化合物を処理した場合に、対照群に比べて炎症ストレスに対する細胞移動がC2C12(3A,3B)およびNIH3T3(3C,3D)細胞でいずれも増加しており、特にNIH3T3細胞移動の活性がより高く示された。
【００４６】
実験例3-2.糖酸化的なストレスによる傷の治療効果の確認
糖尿病は血液内の糖が分解される過程で酸化ストレスによって合併症が最も多く発生する疾患である。細胞内で糖が分解される過程でグルコース酸化酵素(glucose oxidase)は過酸化水素(H2O2)を生成し、糖酸化的なストレスを誘発する。したがって、本発明のUldavioside A化合物が糖酸化的なストレスによる傷の治療効果を確認した。
【００４７】
上記実験例3-1と同じ方法で実験を進行し、糖酸化的なストレス刺激を与えるために、LPSの代わりに7mU/mlのグルコース酸化酵素を処理し、その結果を図4に示した。
【００４８】
図4で示すように、本発明のUldavioside A 化合物を処理した場合、対照群に比べて糖酸化的なストレスに対する細胞移動がC2C12(4A,4B)およびNIH3T3(4C,4D)細胞でいずれも増加しており、特にNIH3T3細胞移動の活性がより高く示された。
【００４９】
上記図3及び図4の結果から、本発明のUldavioside A化合物が炎症ストレス及び糖酸化的なストレス等による傷の治療効果に優れていることが分かった。
【００５０】
<実験例4. Uldavioside A化合物の創傷の治療効果の確認>
実験例4-1. 肉眼観察による創傷の治療効果の確認
本発明のUldavioside A化合物による創傷治療の効果を確認するために動物実験を進めた。
【００５１】
7〜8週齢のSprague-Dawley白いネズミの後ろ足を除毛し、70%アルコールで消毒した後に、直径3cm円形の全層創傷をつけた。全層創傷をつけた後に、無作為に割り当てて、本発明のUldavioside Aの化合物を処理しなかった対照群と処理群とに分けた。処理群は、創傷を誘発した当日にUldavioside Aの化合物0.025重量%が含まれている軟膏(下記製剤例1-2)を処理し、滅菌した韓紙で傷を覆い、湿潤環境が維持されるようにバンドと絆創膏を利用して傷を固定し、対照群はUldavioside Aの化合物が含まれていない軟膏を処理した。以後、創傷誘発3日、7日、10日、14日目に傷部位を観察し、傷部位の大きさを定量化して、その結果を図5に示した。
【００５２】
図5の傷部位のイメージ(5A)及び傷部位を定量化したグラフ(5B)で示すように、対照群と対比してUldavioside A 化合物を処理した群では7日目から傷部位が回復する現象が現れ、14日目には傷がほとんど治療されたことを確認した。
【００５３】
これにより、本発明のUldavioside A化合物が創傷による傷の治療効果に優れていることが分かった。
【００５４】
実験例4-2.創傷治療による組織学的変化観察
本発明のUldavioside A化合物による創傷治療の効果を確認するため、創傷誘導動物の組織を利用して組織学的な変化を観察した。
【００５５】
上記実験例4-1で創傷の治療効果を観察した後、ネズミを犠牲にして創傷部位の筋組織を生検して組織を採取した。採取した組織を10%ホルマリン(formalin)に24時間処理して固定化した。固定された組織をパラフィン(paraffin)で包埋し、5μm厚さで切片化して組織切片を作った。
【００５６】
組織切片を脱パラフィン、関数、水洗過程を経た後、H&E染色(hematoxylin & eosin stain)またはトリクローム染色(Masson's trichrome stain)を行い、光学顕微鏡を用いて傷の回復に関わる組織学的な変化を分析し、その結果を図6に示した。
【００５７】
図6(A)のH&E染色結果で示すように、Uldavioside A 化合物を投与した群では、創傷誘発3日目に免疫細胞の流入が減少し、7日目からは新生血管生成と肉芽組織の形成が活発に進行され、10日目から繊維芽細胞の増殖が活発になった。一方、対照群の場合には、創傷誘発3日目にUldavioside A化合物処理群に比べて免疫細胞の流入が多く、これは7日目まで続いた。10日目に肉芽組織の形成が現れ、線維芽細胞の増殖は観察されなかった。
トリクローム染色の場合には、組織内のコラーゲンを確認するためのもので、コラーゲンの生成は真皮内の傷が回復されて皮膚組職の機能が回復されたことを意味する。
【００５８】
図6(B)のトリクローム染色結果からも分かるように、Uldavioside Aの化合物を投与した群では、創傷誘発7日目に染色されたコラーゲンの量が対照群に比べて著しく増加したことを観察し、14日目は組織の大部分でコラーゲンが生成されたことを確認した。
【００５９】
これを通じて、本発明のUldavioside A化合物が創傷による傷の治療効果に優れていることが分かった。
【００６０】
実験例4-3.創傷治療による血管生成及び組織再生関連タンパク質の変化確認
本発明のUldavioside A化合物による創傷治療の効果を確認するため、傷の治療過程で現れる血管生成および組織再生に関するタンパク質らの発現変化を観察した。
【００６１】
上記実験例4-2で製作した10日目の組織切片を脱パラピン、関数、水洗過程を経た後、組織内の血管生成関連タンパク質であるVEGF(vascular endothelial growth factor)とCD31、組織再生関連タンパク質であるbFGF(basic fibroblast growth factor)とβ-カテニン(β-catenin)の抗体を利用して免疫組織化学染色(immunohistochemistry,IHC)を行い、各々のタンパク質の発現を分析して、その結果を図7に示した。
【００６２】
図7の免疫組織化学染色結果で示すように、Uldavioside Aの化合物を投与した群の場合、血管生成関連タンパク質であるVEGFとCD31(7A)及び組織再生関連タンパク質であるbFGFとβ-カテニン(7B)の発現量が対照群に比べて増加されたことを確認した。
【００６３】
これを通じて、本発明のUldavioside A化合物が、傷の治療過程で現れる血管形成と組織再生を促進することで、優れた傷の治療効果を示すことがわかった。
【００６４】
<実験例5. Uldavioside A化合物の糖尿病性潰瘍の治療効果確認>
実験例5-1.Uldavioside A化合物の糖酸化的なストレスに対する細胞保護活性確認
本発明のUldavioside A化合物の糖酸化的なストレスに対する細胞保護の活性を確認した。
【００６５】
実験例1で培養したC2C12及びHDF細胞を48ウェルプレートにウェル当たりに1×105個細胞になるように各々分注して24時間の間培養した後、50mMのD-グルコース(D-glucose)を処理して高糖(high glucose)状態の環境を作ってあげた。以降、Uldavioside Aの化合物を10μM及び20μMで処理し、1時間後に7mU/mlのグルコース酸化酵素を処理し24時間培養した。
【００６６】
この際、何も処理しなかったC2C12またはHDF細胞を対照群1で、高糖状態の細胞を対照群2で、高糖状態のグルコース酸化酵素を処理した細胞を対照軍3として用いた。24時間後に各々の細胞に100μg/mlの濃度でMTT用液を処理し、37℃で3時間反応させた後、培養液を除去して形成されたホルマザン沈殿物をDMSO 200μlに溶かして570nmで吸光度を測定し、その結果を図8に示した。
【００６７】
図8で示すように、高糖環境でグルコース酸化酵素による糖酸化ストレス(大組群3)により、HDF(8A)及びC2C12(8B)細胞いずれも細胞生存率が減少した反面に、本発明のUldavioside A 化合物を処理した場合には、濃度依存的に糖酸化ストレスによる細胞生存率の減少が抑制されることを確認した。
【００６８】
これに通して、Uldavioside A化合物が高い糖数値の環境で糖酸化的なストレスに対する細胞保護効果があることがわかり、これは傷の治療速度が遅い糖尿病患者で本発明のUldavioside A化合物が効果的に傷を治療することができることが予測できる。
【００６９】
実験例5-2. Uldavioside A化合物の糖尿病性潰瘍の治療效果確認
本発明のUldavioside A化合物による糖尿病性潰瘍の治療を確認するために動物実験を行った。
【００７０】
7週齢の体重が約300gである雄Sprague-Dawley白ネズミにストレプトゾトシン(streptozotocin)を60mg/kgになるように腹腔注射して糖尿病を誘発した。3日後に尾静脈から静脈血を採取して血糖測定器で血糖を測定して、血糖が300mg/dl以上である白ネズミのみを選定した。選定した白ネズミの背部位を除毛した後、耳から4〜5cm程度離れた背部位をパンチを用いて直径が1cmまたは1.5cmになるように円形切傷を作った。円形切傷を作った後に、白ネズミを無作為で配定して本発明のUldavioside Aの化合物を処理しなかった対照群と処理群とに分けた。処理群は円形切傷を誘発した当日にUldaviosideA化合物0.025重量%が含まれている軟膏(下記製剤例1-2)を処理し、滅菌した韓紙で傷を覆い、湿潤環境が維持されるようにバンドと絆創膏を利用して傷を固定し、対照群はUldavioside A化合物が含まれていない軟膏を処理した。以後、円形切傷誘発後、2日間隔で8日間、傷部位を観察し、傷部位の大きさを定量化して、その結果を図9に示す。
【００７１】
図9の糖尿病誘発動物モデルにおける円形切傷の傷部位のイメージ(9A)及び傷部位の大きさを定量化したグラフ(9B)で示すように、対照群と対比してUldavioside A化合物を処理した群では、4日目から傷部位が回復されながら、傷の大きさが著しく減少することを確認した。
【００７２】
これを通じて、本発明のUldavioside A化合物が糖尿病の合併症である糖尿病性潰瘍の治療効果があることが分かった。
【００７３】
<製剤例1.薬学的製剤>
製剤例1-1.ゲル剤型薬学的製剤
調剤容器にプルロニックF-127(BASF Co.製品)15重量%をpH6.0の緩衝液に入れた後、ゆっくり攪拌した後、4℃で20時間放置して、清い粘潮性の液体を得た。
【００７４】
別途の容器にpH6.0の緩衝液に本発明のUldavioside A化合物0.0025重量%を入れた後、攪拌して溶解させた後、調剤容器に投入して攪拌した。また、別の容器にエタノール4重量%、パラオキシ安息香酸メチルエステル0.1重量%及びパラオキシ安息香酸プロピルエステル0.1重量%を投入した後、攪拌して溶解させた後、調剤容器に投入した。投入された混合物を20分間攪拌した後、冷蔵庫で4〜5時間放置することによって、浅黄の粘潮性液を得た。得られた粘潮性液からゲルが得られるまで徐々に加温した。
【００７５】
製剤例1-2.軟膏剤型の薬学的製剤
調剤容器に白色バセリン15重量%、セトステアリルアルコール10重量%、硬質流動パラフィン7重量%及びセトマクロゴール1.5重量%を約65℃に加温して溶融させた後、溶融された液を100メッシュふるいで濾過した。別途の容器に精製水を入れて本発明のUldavioside A化合物0.025重量%を入れて攪拌し溶解させた後、調剤容器に投入した。また、他の別の容器に95℃の熱湯精製水にパラオキシ安息香酸メチルエステル0.12重量%、パラオキシ安息香酸プロピルエステル0.08重量%を溶解させて調剤容器に投入した後、約20分間攪拌させた後、ホモジナイザーで約20分間、2500rpmの速度で乳化させた後、乳化が完了すると、ゆっくり攪拌しながら冷却した。
【００７６】
製剤例1-3.錠剤の製造
本発明のUldavioside A化合物200gをラクトース175.9g、ジャガイモでん粉180g及びコロイド性珪酸32gと混合した。この混合物に10%ゼラチン溶液を添加した後、粉砕して14メッシュふるいを通過させた。これを乾燥させ、これにジャガイモでん粉160g、活性50g及びステアリン酸マグネシウム5gを添加して得た混合物を錠剤に作った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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