(57)【要約】  本発明は、免疫細胞において阻害活性を有するヒトＳｉｇｌｅｃに結合し、かつそのようなＳｉｇｌｅｃの阻害活性を中和する薬剤に関する。このような薬剤は、癌または感染性疾患の処置のために使用され得る。
2019511220.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合し、かつヒトＮＫ細胞によって発現されるＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和することができる単離抗体。
【請求項２】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに同等の結合親和性で特異的に結合する単離抗体。
【請求項３】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合について、細胞であって、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞への結合についてフローサイトメトリーによって決定されるときに１−ｌｏｇ以下だけ異なるＥＣ５０を有する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
（ａ）リンパ球によって発現されるＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和することができ、かつ（ｂ）リンパ球によって発現されるＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和することができる、請求項１〜３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５】
Ｓｉｇｌｅｃ−９を発現するＮＫ細胞がヒトドナーから精製され、かつＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する標的細胞と温置される標準的な４時間のインビトロ５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイにおいて、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強および／または回復させる、請求項１〜４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトｍｏＤＣであって、シアル酸とのシス相互作用に関与するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドをその表面に保有するヒトｍｏＤＣによって発現されるＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和することができる、請求項１〜５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ＣＤ１６ヒトＦｃγ受容体に結合する能力を欠く、請求項１〜６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ６４に結合する能力を欠く、請求項１〜７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止しない、請求項１〜８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記シアル酸リガンドは、Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂを含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止する、請求項１〜８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
（ａ）ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとＮｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂとの間の相互作用を実質的に阻止し、かつ（ｂ）ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドと６’−シアリルラクトースとの間の相互作用を実質的に阻止する、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止しない、請求項１〜１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止する、請求項１〜１２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記シアル酸リガンドは、６’−シアリルラクトースを含む、請求項１３または１４に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号２のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよび配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する、請求項１〜１５の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
さらなるヒトＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドに実質的に結合せず、任意選択により、第３のヒトＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドよりも少なくとも１００倍低いＫＤで前記Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９に結合し、任意選択により、前記第３のヒトＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃは、Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および−１２からなる群から選択される、請求項１〜１６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
前記第３のヒトＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドは、Ｓｉｇｌｅｃ−１２である、請求項１〜１７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドのＩｇ様Ｃ２型ドメイン上に存在する決定基に結合する抗体であって、前記Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を、前記ポリペプチドを発現する細胞において中和することができる抗体。
【請求項２０】
前記細胞は、好中球、マクロファージ、樹状細胞またはＮＫ細胞である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
ヒトドナーから精製されたＳｉｇｌｅｃ発現ＮＫ細胞において、前記ＮＫ細胞が、標的ヒト細胞であって、標的細胞表面上に前記Ｓｉｇｌｅｃのリガンドを保有する標的ヒト細胞と接触されると、細胞傷害性および／または細胞傷害性に関連するマーカーの上昇を引き起こす、請求項１〜２０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号２の野生型Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合と比較して、
−  残基Ｎ７８、Ｐ７９、Ａ８０、Ｒ８１、Ａ８２および／もしくはＶ８３における突然変異；残基Ｎ７７、Ｄ９６、Ｈ９８および／もしくはＴ９９における突然変異、ならびに／または残基Ｗ８４、Ｅ８５、Ｅ８６および／もしくはＲ８８における突然変異を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、
−  残基Ｓ４７、Ｈ４８、Ｇ４９、Ｗ５０、Ｉ５１、Ｙ５２、Ｐ５３および／またはＧ５４における突然変異を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、
−  残基Ｐ５５、Ｈ５８、Ｅ１２２、Ｇ１２４、Ｓ１２５および／またはＫ１２７における突然変異を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、
−  残基Ｋ１３１および／またはＨ１３２における突然変異を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、および／または
−  残基Ｒ６３、Ａ６６、Ｎ６７、Ｔ６８、Ｄ６９、Ｑ７０および／またはＤ７１における突然変異を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド
への減少した結合によって特徴付けられ、アミノ酸残基は、配列番号２の前記Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに関して示される、請求項１〜２１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
Ｓｉｇｌｅｃ−９への結合について、
（ａ）（ｉ）配列番号１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｂ）（ｉ）配列番号１７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｉ）配列番号１９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｄ）（ｉ）配列番号２１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｅ）（ｉ）配列番号２３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ｉ）配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗体と競合する、請求項１〜２２の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９への結合について、
（ａ）（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｂ）（ｉ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｉ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｄ）（ｉ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｅ）（ｉ）配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ｉ）配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗体と競合する、請求項１〜２３の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−９に結合する抗体であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｂ）（ｉ）配列番号１７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｉ）配列番号１９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｄ）（ｉ）配列番号２１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｅ）（ｉ）配列番号２３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ｉ）配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗体。
【請求項２６】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９に結合する抗体であって、
（ａ）（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｂ）（ｉ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｉ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｄ）（ｉ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｅ）（ｉ）配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ｉ）配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗体。
【請求項２７】
キメラ、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
Ｆｃドメインであって、前記ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の結合を減少させるために修飾されているＦｃドメインを有する抗体である、請求項１〜２７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
抗体断片、任意選択により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ、１本鎖抗体断片から選択される断片、または複数の異なる抗体断片を含む多特異性抗体である、請求項１〜２６の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
請求項２９に記載の抗体断片を含む単離されたＳｉｇｌｅｃ結合タンパク質。
【請求項３１】
検出可能部分と複合化されているかまたは共有結合されている、請求項１〜３０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
請求項１〜２７の何れか一項に記載の抗体をキメラ化またはヒト化することによって得られる抗体。
【請求項３３】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項３４】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体を含み、任意選択により、請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体を特異的に認識する標識化二次抗体をさらに含むキット。
【請求項３５】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸。
【請求項３６】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体を産生するハイブリドーマまたは組み換え宿主細胞。
【請求項３７】
疾患の処置または予防を、それを必要とする患者において行うための方法であって、有効量の請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体または請求項３３に記載の組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３８】
前記疾患は、癌であり、任意選択により、ＳＴ３ＧＡＬ１および／またはＳＴ３ＧＡＬ６酵素の発現によって特徴付けられる癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
対象において、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞、および／またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞、および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を調整するための方法であって、有効量の請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体または請求項３３に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項４０】
単球由来細胞および／またはリンパ球、任意選択により、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を調整するためのインビトロ方法であって、Ｓｉｇｌｅｃ７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現する単球由来細胞および／またはリンパ球を、請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体または請求項３３に記載の組成物と接触させることを含むインビトロ方法。
【請求項４１】
疾患を有する対象からのＮＫ細胞の活性を評価するためのインビトロ方法であって、ＮＫ細胞を含む対象からの生体試料を得ることと、前記細胞を請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体と接触させることと、前記抗体が前記ＮＫ細胞の前記活性を調整するか否かを評価することとを含むインビトロ方法。
【請求項４２】
リンパ球、任意選択により、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するための方法であって、細胞を含む対象からの生体試料を得ることと、前記細胞を請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体と接触させることと、前記抗体が前記細胞に結合するか否かを評価することとを含む方法。
【請求項４３】
前記細胞は、疾患、任意選択により、癌を有している対象から得られた生体試料中に存在する、請求項４０〜４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体または請求項３３に記載の組成物での処置に反応する癌を有している対象を選択するための方法であって、前記対象中の癌細胞がＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現するか否か、任意選択により、癌細胞が、上昇したレベルのＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現するか否かを判定することを含み、Ｓｉｇｌｅｃ−７もしくはＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドの発現またはＳｉｇｌｅｃ−７もしくはＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドの上昇したレベルは、反応者対象を示す、方法。
【請求項４５】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体または請求項３３に記載の組成物での処置に反応する癌を有している対象を選択するための方法であって、前記対象中の癌細胞は、ＳＴ３ＧＡＬ１および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ６酵素（またはＳＴ３ＧＡＬ１および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ６酵素活性）を発現するか否かを判定することを含み、ＳＴ３ＧＡＬ１および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ６酵素の発現あるいはＳＴ３ＧＡＬ１および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ６酵素（またはＳＴ３ＧＡＬ１および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ６酵素活性）の上昇したレベルは、反応者対象を示す、方法。
【請求項４６】
請求項１〜３２の何れか一項に記載の抗体または請求項３３に記載の組成物を反応者対象に投与することをさらに含む、請求項４３〜４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
複数のＳｉｇｌｅｃ遺伝子産物と交差反応し、かつ前記Ｓｉｇｌｅｃの阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）ヒトドナーから精製されたＮＫ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を選択するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体（例えば、ステップ（ａ）のもの）を選択するステップと、
（ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止しない抗体（例えば、ステップ（ｂ）のもの）を選択するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体（例えば、ステップ（ａ）のもの）を選択するステップと、
（ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止する抗体（例えば、ステップ（ｂ）のもの）を選択するステップと
を含む方法。
【請求項５０】
Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドの阻害活性を中和する能力を評価することは、Ｓｉｇｌｅｃ−９を発現するヒトドナーから精製されたＮＫ細胞において、前記ＮＫ細胞が、標的ヒト細胞であって、標的細胞表面上に前記Ｓｉｇｌｅｃのリガンドを保有する標的ヒト細胞と接触されると、細胞傷害性、任意選択により、細胞傷害性のマーカーの上昇を引き起こすことができる抗体を選択することを含む、請求項４７〜４９の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記シアル酸リガンドは、Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ構造を含む、請求項４８〜５０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、任意の図面および配列表を含む、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる２０１６年３月８日提出の米国仮特許出願第６２／３０４，９５７号明細書の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、２０１７年２月２２日作成の「Ｓｉｇ７９２ＰＣＴ＿ＳＴ２５ｔｘｔ」という名称で提供されており、サイズは１２４ｋＢである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、ＮＫおよび／または他の免疫細胞において阻害活性を有するヒトＳｉｇｌｅｃタンパク質に結合し、かつそのようなＳｉｇｌｅｃの阻害活性を中和する薬剤に関する。このような薬剤は、癌または感染性疾患の処置のために使用され得る。
【背景技術】
【０００４】
ＮＫ細胞は、リンパ球前駆細胞から骨髄で発生する単核細胞であり、形態学的特徴および生物学的特性としては、一般的に、クラスター決定基（ＣＤ）ＣＤ１６、ＣＤ５６および／またはＣＤ５７の発現；細胞表面上にアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体がないこと；「自己」主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）／ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タンパク質を発現できない標的細胞に結合し、これを死滅させる能力；およびＮＫ受容体を活性化するためにリガンドを発現する腫瘍細胞または他の病的細胞を死滅させる能力が挙げられる。ＮＫ細胞は、予め免疫付与または活性化する必要なく、一部のタイプの腫瘍細胞株に結合し、これを死滅させる能力によって特徴付けられる。ＮＫ細胞は、免疫系において制御効果を発揮する可溶性タンパク質およびサイトカインも放出し得、複数回の細胞分裂が起こり、親細胞と同様の生物学的特性を有する娘細胞を生成させ得る。正常で健康な細胞は、ＮＫ細胞による溶解から保護される。
【０００５】
それらの生物学的特性に基づいて、ＮＫ細胞の調整に依存する様々な治療およびワクチンストラテジーが当技術分野において提案されてきた。しかし、ＮＫ細胞活性は、刺激性および阻害シグナルの両方を含む複雑な機序により制御される。簡潔に述べると、ＮＫ細胞の溶解活性は、標的細胞上でのリガンドとの相互作用時に正または負の何れかの細胞内シグナルを伝達する様々な細胞表面受容体により制御される。これらの受容体を介して伝達される正および負のシグナル間のバランスは、ＮＫ細胞によって標的細胞が溶解（死滅）されるか否かを決定する。ＮＫ細胞刺激性シグナルには、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６などの天然細胞傷害誘発受容体（ＮＣＲ）；ならびにＮＫＧ２Ｃ受容体、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ある種の活性化キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）および他の活性化ＮＫ受容体が介在し得る（非特許文献１）。ＮＫ細胞阻害シグナルには、ＣＤ９４／ＮＫＧ２−Ａのような受容体ならびに主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を認識するある種の阻害性ＫＩＲが介在し得る（非特許文献２）。これらの阻害受容体は、他の細胞上に存在するＭＨＣクラスＩ分子の多型決定基（ＨＬＡクラスＩを含む）に結合し、ＮＫ細胞介在性の溶解を阻害する。
【０００６】
ＮＫ細胞の溶解活性は、ｓｉｇｌｅｃポリペプチドによっても制御され得る。Ｓｉｇｌｅｃ（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）は、シアログリカンに結合し、細胞型および分化依存性に造血系の細胞で主に発現される、Ｉ型レクチンのサブセットである。シアル酸が一般的には糖タンパク質および脂質の末端の位置でユビキタスに発現される一方で、非常に特異的な個別のシアログリカン構造のみが、末端近くの炭水化物部分に対する同一性および連結に依存して、個々のＳｉｇｌｅｃ受容体により認識される。Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）α２−６およびα２−３結合を含有する一般的な哺乳動物シアロシド構造に対するＳｉｇｌｅｃの一般的な親和性は低いものにすぎない。
【０００７】
Ｓｉｇｌｅｃは、一般に、Ｓｉｇｌｅｃ−１、−２、−４および−１５から構成される第１のサブセットと、Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１４および−１６を含むＳｉｇｌｅｃのＣＤ３３関連群との２つの群に分けられる。ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃは、とりわけ、進化的保存性が低いことおよび複数の機序による配列の急速な進化によって特徴付けられる。
【０００８】
イタリア、ジェノバのＭｏｒｅｔｔａグループにより１９９９年に最初にクローニングされ、特徴が調べられ、ヒトＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ受容体に属する、１型膜貫通タンパク質であるＳｉｇｌｅｃ−７（ＣＤ３２８）は、シアル酸結合Ｎ末端Ｖ−セットＩｇドメイン、２つのＣ２−セットＩｇドメインおよび１つの免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および１つのＩＴＩＭ様モチーフを含有する細胞質内領域によって特徴付けられる。Ｓｉｇｌｅｃ−７は、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球および好中球上で構成的に発現される。この受容体の細胞外ドメインは、（２，８）−結合ジシアル酸および分岐状α２，６−シアリル残基、例えばガングリオシドＧＤ３により提示されるものなどに選択的に結合する。
【０００９】
Ｓｉｇｌｅｃ−９（ＣＤ３２９）は、２０００年にＶａｒｋｉグループにより特徴が調べられ（例えば、（非特許文献３））、単球、好中球、樹状細胞、ＣＤ３４＋細胞およびＮＫ細胞上で発現される。Ｓｉｇｌｅｃ−９（ならびにＳｉｇｌｅｃ−８）は、シアル酸および硫酸の両方を含有するシアロシドリガンドに対して示差的な特異性を有し、硫酸の位置が特異性の重要な決定基であることが分かっている。Ｓｉｇｌｅｃ−９は、癌細胞上で過剰発現されるＭＵＣ１６に結合することが分かっている。Ｓｉｇｌｅｃ−７のように、Ｓｉｇｌｅｃ９もシアル酸結合Ｎ末端Ｖ−セットＩｇドメイン、２つのＣ２−セットＩｇドメイン、および１つの免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および１つのＩＴＩＭ様モチーフを含有する細胞質内領域を含有する。ヒトＳｉｇｌｅｃ−９のＮ末端Ｖ−セットＩｇドメインは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７のＮ末端Ｖ−セットＩｇドメインと約７７％の全体的なアミノ酸配列同一性を共有し、これらの２種類のｓｉｇｌｅｃは、異なるシアル酸結合特異性を示す。
【００１０】
結合アッセイは、Ｓｉｇｌｅｃ−７と同様に、Ｓｉｇｌｅｃ−９がガラクトースへのα２，３−またはα２，６−グリコシド結合の何れかにおいてシアル酸を認識することが報告されてきた。（非特許文献４）は、Ｓｉｇｌｅｃ−９特異的ｍＡｂを用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−９が、単球、好中球およびＣＤ１６＋、ＣＤ５６−細胞の少数集団によって高レベルまたは中レベルで発現することが見出されたことを報告した。しかし、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の約５０％ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の少数サブセットでは、より弱い発現が観察された。著者らは、高度の配列類似性にもかかわらず、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９が別個の発現プロファイルを有すると結論付けた。
【００１１】
ＮＫおよび他の免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃ−９の興味深い発現プロファイル、およびＳｉｇｌｅｃ−９を中和することへの潜在的な治療上の関心にもかかわらず、治療的使用について、Ｓｉｇｌｅｃ−９を特異的に中和する治療剤の候補は、今日まで進歩していないかまたは提案されていない。腫瘍関連シアル酸リガンドによる骨髄単球系統の細胞へのＳｉｇｌｅｃ−９の関与は、ＮＫ細胞ならびに好中球、微生物を認識し直接死滅させる特殊な顆粒球による免疫監視および腫瘍細胞の死滅を阻害することが報告されている（非特許文献５）。（非特許文献６）は、宿主シアル酸付加グリカンの模倣が、細菌病原体が好中球Ｓｉｇｌｅｃ−９に関与し、自然免疫応答を弱めることを可能にすると報告した。（非特許文献６）は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体１９１２４０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｉｎｃ．）をＳｉｇｌｅｃ−９上のシアル酸結合部位に結合し、シアル酸との相互作用を阻害するものとして記載した。（非特許文献６）は、非ブロッキング抗体（クローンＥ１０〜２８６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎｃ．）と異なり、クローン１９１２４０が好中球の細菌細胞への活性化を増強することをさらに報告した。同様に、前出の（非特許文献５）は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体クローン１９１２４０が、好中球による腫瘍細胞の死滅を増強しなかったクローンＥ１０−２８６と比較して、好中球による腫瘍細胞の死滅を増強できることを報告した。
【００１２】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体は、（特許文献１）（Ｍｏｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ）および（非特許文献７）に記載され、マウス抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体ＱＡ７９に言及しており、（非特許文献８）も抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体Ｚ１７６を報告している。
【００１３】
（非特許文献９）は、ブロッキング抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体が腫瘍標的細胞のＮＫ細胞による溶解からのＳｉｇｌｅｃ−７媒介性防御を阻害することを報告した。しかし、Ｓｉｇｌｅｃ−９に関して、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体（クローン１９１２４０が使用された）は、好中球による腫瘍細胞の死滅を増強する能力を有するにもかかわらず（（非特許文献５）を参照されたい、ヒトドナーから精製されたＮＫ細胞による溶解からの腫瘍標的細胞のＳｉｇｌｅｃ−９媒介性防御を阻害することができなかった（（非特許文献９）を参照されたい）。非ブロッキングおよび好中球による腫瘍細胞の死滅を促進しないとして（非特許文献５）に報告されている二価結合抗体クローンＥ１０−２８６も、初代ＮＫ細胞による溶解からの腫瘍標的細胞のＳｉｇｌｅｃ−９媒介性防御を阻害しなかった（非特許文献１０）。
【００１４】
Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９への関心にもかかわらず、これらの受容体を標的とする治療剤は開発されていない。したがって、癌などの疾患を処置することにおける使用のための、これらの受容体を標的とする薬剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許第１２３８２８２Ｂ１号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｌａｎｉｅｒ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００５；２３：２２５−７４
【非特許文献２】Ｗａｇｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：４３９−４４９
【非特許文献３】Ａｎｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００；２７５：２２１２７-２２１３５
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．２９：２２１２１-２２１２６）
【非特許文献５】Ｌａｕｂｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１１（３９）：１４２１１−１４２１６
【非特許文献６】Ｃａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１３：３３３３−３３３６）
【非特許文献７】Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（２６）：１５０９１−９６）
【非特許文献８】Ｆａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：７９３−８０１
【非特許文献９】Ｈｕｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１０：６９−７７
【非特許文献１０】Ｊａｎｄｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（４）：１８１０−１８０２０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ある態様において、本開示は、好中球および／または他の細胞と比較してより低いレベルの細胞表面Ｓｉｇｌｅｃを発現するヒト個体における、とりわけＮＫ細胞上のヒトＳｉｇｌｅｃの強力な中和剤として作用し、かつエフェクターリンパ球（Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９）における阻害性細胞表面受容体として作用する高親和性結合抗体を提供する。
【００１８】
ある実施形態において、本開示は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の競合および非競合阻害剤を含むＳｉｇｌｅｃ阻害剤（例えば、細胞の表面で発現されるＳｉｇｌｅｃ−９）を提供する。それぞれの阻害剤は、Ｓｉｇｌｅｃとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止するか否かにかかわらず、Ｓｉｇｌｅｃの阻害活性の中和において特に高い効力を有する。
【００１９】
ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質、例えば抗体もしくは抗体フラグメント、またはそれを含むタンパク質に特異的に結合する免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むタンパク質である。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤は、表１のヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／または他のヒトＳｉｇｌｅｃ（ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび−Ｆによって例示される）に結合することなく、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質に特異的に結合する。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質およびヒトＳｉｇｌｅｃ−７タンパク質に特異的に結合し、任意選択により、さらに表１の他のヒトＳｉｇｌｅｃ（ｍＡｂ４、−５、−６によって例示される）に結合しない。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７タンパク質およびヒトＳｉｇｌｅｃ−１２タンパク質に特異的に結合し、任意選択により、さらに表１の他のヒトＳｉｇｌｅｃ（ｍＡｂ１、−２および−３によって例示される）に結合しない抗体または抗体断片である。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ阻害剤は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質に二価結合することができる抗体または抗体フラグメントである（阻害剤は、それぞれヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質に結合することができる２つの抗原結合ドメインを含む）。
【００２０】
ある実施形態において、本発明は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに特異的に結合し、かつＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和する単離抗体を提供し、任意選択により、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止せず（ｍＡｂ１、２および３によって例示される、実施例１０を参照されたい）、任意選択により、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を阻止する（ｍＡｂＡ、ＢおよびＣによって例示される、実施例１０を参照されたい）。任意選択により、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドは、細胞の表面、例えばエフェクターリンパ球、ＮＫ細胞、例えば初代ＮＫ細胞、ヒト個体由来のＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞において発現される。ある実施形態において、抗体は、さらに、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに結合し、かつＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和し、任意選択により、抗体は、さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止しない。別の実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに結合しない。
【００２１】
ある態様において、本発明は、とりわけヒトＳｉｇｌｅｃ−９に特異的に結合し、かつＮＫ細胞（例えば、初代ＮＫ細胞）のシアル酸リガンド保有標的細胞に対する活性（例えば、細胞傷害性）を増強する抗体の発見から生じる。好中球、Ｓｉｇｌｅｃ遺伝子移入体、および／または細胞表面で高レベルのＳｉｇｌｅｃ−９を発現するかもしくは発現するように作成された他の細胞においてのみ細胞傷害性を増強することができる従来の抗体と異なり、本明細書に記載の抗体は、ヒトにおけるＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞）などの低レベルのＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞でも機能する。このようなＳｉｇｌｅｃ−９低発現ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する能力は、疾病標的細胞（例えば、腫瘍細胞および／または細菌細胞）に対するこの細胞集団をさらに動員できるという利点を有する。
【００２２】
ある実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９に特異的に結合し、かつＳｉｇｌｅｃ−９を発現するＮＫ細胞が、Ｓｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する標的細胞と共に温置される標準的な４時間のインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて、ＮＫ細胞（初代ＮＫ細胞）の細胞傷害性を増強および／または回復させる抗体または抗体フラグメント（またはそのようなフラグメントを含むタンパク質）が提供される。ある実施形態において、標的細胞は、ＮＫ細胞の添加前に５１Ｃｒで標識され、次いで、死滅（細胞傷害性）は、細胞から培地への５１Ｃｒの放出に比例するものとして推定される。任意選択により、本明細書の実施例の方法に従ってアッセイを実施することができる。例えば、実施例８を参照されたい。ある実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、Ｓｉｇｌｅｃ−９を発現するＮＫ細胞の細胞傷害性を、少なくともＳｉｇｌｅｃ−９を発現しないＮＫ細胞で観察されるレベル（例えば、本明細書の実施例の方法に従って決定されるレベル）まで回復させることができる。
【００２３】
本明細書中の何れかの態様において、ＮＫ細胞（例えば、初代ＮＫ細胞）は、ドナーから精製された新鮮なＮＫ細胞として特定され得、任意選択により、使用前に３７℃で一晩温置される。本明細書中の何れかの態様において、ＮＫ細胞または初代ＮＫ細胞は、例えば、フローサイトメトリーによってＳｉｇｌｅｃ−９上で細胞をゲートすることができるアッセイでの使用のために、Ｓｉｇｌｅｃ−９を発現するものとして特定され得る。例えば、本明細書の実施例８で記載されるＮＫ細胞を参照されたい。
【００２４】
別の実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９に特異的に結合し、かつ単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）におけるＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体または抗体フラグメント（またはそのようなフラグメントを含むタンパク質）が提供される。ある実施形態において、ｍｏＤＣは、その表面にＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを保有する。ある実施形態において、ｍｏＤＣは、その表面において、シアル酸とのシス相互作用に関与するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを保有する。ある実施形態において、抗体は、ｍｏＤＣにおける活性化またはシグナル伝達を増加させる。ある実施形態において、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを保有するｍｏＤＣにおいてＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和し、ここで、ｍｏＤＣは、シアル酸リガンドを除去するノイラミダーゼでｍｏＤＣを処理すると、ｍｏＤＣに結合する抗体のＥＣ５０がより低くなる細胞である。
【００２５】
別の態様において、本発明は、とりわけ同等の親和性でＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの両方に結合する抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の発見から生じる。そのような抗体は、有利な薬理学的特徴を有する。本明細書中に示されるように、ＮＫ細胞は、阻害Ｓｉｇｌｅｃ−７および阻害Ｓｉｇｌｅｃ−９タンパク質の両方を発現し得るが、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９は、異なる細胞集団にわたって異なる発現プロファイルを有し得る。さらに、腫瘍細胞がＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９に対する天然リガンド（グリカン）を発現し得ることが示されている。結果的に、一方のＳｉｇｌｅｃを阻害するが他方を阻害しない治療剤は、Ｓｉｇｌｅｃが介在するＮＫおよび／または他の免疫細胞集団の活性の制限を中和するのに最大限に有効でない可能性がある。したがって、Ｓｉｇｌｅｃ７および９の両方の阻害は有利であり得る。しかし、Ｓｉｇｌｅｃ−９がヒトＳｉｇｌｅｃ−７のＮ末端Ｖ−セットＩｇドメインと共有する全体的なアミノ酸配列同一性は、約７７％のみである。さらに、これらの２種類のＳｉｇｌｅｃは、異なるシアル酸結合特異性を示し、シアル酸リガンドが結合した領域における構造的差異を示唆する。
【００２６】
ある態様において、本開示は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９の阻害活性を中和し、かつ阻害性ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに同等の親和性で特異的に結合することができる高親和性結合抗体を提供する。Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９に同等の親和性で結合する抗体は、例えば、特定の実施形態において、各Ｓｉｇｌｅｃとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を阻止する向上した能力を有し得る（ｍＡｂ４、５および６によって例示される、実施例６を参照されたい）。Ｓｉｇｌｅｃ−９に結合する抗体は、他の実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−９とそのシアル酸リガンド、特にＮｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ構造を含むシアル酸との間の相互作用を実質的に阻止することなく、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻害活性を中和するものとして特徴付けられ得る（ｍＡｂ１、２および３によって例示される、実施例９を参照されたい）。
【００２７】
本明細書に示すように、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９は、Ｓｉａ１（Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ）およびＳｉａ２（６’−シアリルラクトース）の両方に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃ−７はＳｉａ２にのみ結合する。ある態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−９およびＳｉｇｌｅｃ−７の両方のシアル酸リガンド、例えばＳｉａ２シアル酸などのＳｉｇｌｅｃポリペプチドの相互作用を阻止することができる抗体が提供される。ある実施形態において、シアル酸は、シアル酸付加三糖である。ある実施形態において、シアル酸は、６’−シアリルラクトース構造を含む。
【００２８】
別の態様において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合し、かつその阻害活性を中和する抗体であって、Ｓｉａ１（Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ）およびＳｉａ２（６’−シアリルラクトース）の両方のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとの相互作用を阻止することができる抗体が提供される（ｍＡｂ１、２および３によって例示される、実施例９を参照されたい）。
【００２９】
ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９を結合することができる抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドへの結合について、細胞であって、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞（例えば、それぞれのＳｉｇｌｅｃの１つで遺伝子移入されたが、他のＳｉｇｌｅｃを発現しないＣＨＯ細胞）への結合についてフローサイトメトリーによって決定されるときに、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合についてのそのＥＣ５０と１−ｌｏｇ未満だけ異なるＥＣ５０を有する。ある実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合について、細胞であって、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞への結合についてフローサイトメトリーによって決定されるときに０．５ｌｏｇ、０．３ｌｏｇ、０．２ｌｏｇまたは０．１ｌｏｇ以下だけ異なるＥＣ５０を有する。細胞であって、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞は、それぞれのＳｉｇｌｅｃを同等の発現レベルで発現するものとして特徴付けられ得る。
【００３０】
ある実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／または−９と同等の親和性で非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃにさらに結合する。ある実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよび非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃへの結合について、細胞であって、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞（例えば、それぞれのＳｉｇｌｅｃで遺伝子移入されたＣＨＯ細胞）への結合についてフローサイトメトリーによって決定されるときに１−ｌｏｇ、０．５ｌｏｇ、０．３ｌｏｇ、０．２ｌｏｇまたは０．１ｌｏｇ以下だけ異なるＥＣ５０を有する。
【００３１】
ある実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９の活性を中和し、かつヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよび非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃへの結合について、細胞であって、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−９を発現する細胞（例えば、Ｓｉｇｌｅｃで遺伝子移入されたＣＨＯ細胞）への結合についてフローサイトメトリーによって決定されるときに１−ｌｏｇ、０．５ｌｏｇ、０．３ｌｏｇ、０．２ｌｏｇまたは０．１ｌｏｇ以下だけ異なるＥＣ５０を有する抗体が提供される。
【００３２】
ある実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド（および任意選択により、さらに非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ）への結合について、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析によるものなど）によって決定されるときに１０倍、５倍、３倍または２倍以下だけ異なる結合親和性のＫＤを有する。
【００３３】
ある実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド（および任意選択により、さらにヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよび／または非ヒト霊長類Ｓｉｇｌｅｃ）への結合について、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍまたは約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫＤを有する。ある実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合（例えば、一価親和性）について、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍまたは約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫＤを有し、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに対する実質的な結合を有しない。
【００３４】
ある実施形態において、本抗体は、さらに、ヒトＳｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および−１２の何れにも実質的に結合しない。ある実施形態において、本抗体は、さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−１４および−１６の何れにも実質的に結合しない。ある実施形態において、本抗体は、さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−６に実質的に結合しない。ある実施形態において、本抗体は、さらに、Ｓｉｇｌｅｃ−１２に実質的に結合しない。
【００３５】
本明細書中の実施形態の何れかにおいて、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現するように作製された細胞、例えば実施例に示すようにＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９をその表面に発現するように作製された組み換えＣＨＯ宿主細胞）の表面上に発現されるポリペプチドに結合することによって特徴付けられ得、および任意選択により、さらに、抗体は、フローサイトメトリーによって決定される高親和性で結合する。例えば、抗体は、初代ＮＫ細胞（例えば、ヒト個体またはドナー由来の生物学的試料から精製されたＮＫ細胞）、任意選択により、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞への結合について、５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により、１μｇ／ｍｌ以下、０．５μｇ／ｍｌ以下、０．２μｇ／ｍｌ以下、または０．１μｇ／ｍｌ以下の、フローサイトメトリーによって決定されるＥＣ５０によって特徴付けられ得る。ＥＣ５０は、例えば、実施例９の方法に従い、例えば４人以上の健常ヒトドナーで試験し、染色をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩによって得てＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析し、４パラメーターロジスティックフィットを用いてＥＣ５０を計算する方法で決定され得る。
【００３６】
別の態様において、本開示は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／または−９ポリペプチドに特異的に結合し、かつ免疫細胞におけるそのようなＳｉｇｌｅｃの阻害活性を中和することができ、そのようなＳｉｇｌｅｃポリペプチドのそのシアル酸リガンドとの相互作用を阻止することができる抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合ドメインまたはそれを含むタンパク質）を提供する。ある実施形態において、シアル酸は、シアル酸付加三糖である。ある実施形態において、シアル酸は、Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ構造を含む。ある実施形態において、シアル酸は、６’−シアリルラクトース構造を含む。ある実施形態において、抗体または抗体断片は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／または−９ポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトＮＫ細胞細胞（例えば、ヒト初代ＮＫ細胞；ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞）、ヒト単球、ヒト樹状細胞、ヒトマクロファージ（特に免疫抑制またはＭ２マクロファージ）、ＣＤ８  Ｔ細胞および／またはヒト好中球において、そのようなＳｉｇｌｅｃの阻害活性を中和することができる。ある実施形態において、抗体または抗体断片は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／または−９ポリペプチドに特異的に結合し、かつヒトドナーからの免疫抑制マクロファージ（例えば、Ｍ２マクロファージ）において、そのようなＳｉｇｌｅｃの阻害活性を中和することができ、ここで、抗体または抗体断片は、マクロファージの免疫抑制活性または能力を低下させる。
【００３７】
考察したように、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９は、Ｓｉａ１（Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ）およびＳｉａ２（６’−シアリルラクトース）の両方に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃ−７は、Ｓｉａ２にのみ結合する。特定の態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドと、Ｓｉｇｌｅｃ−９のリガンドであるがＳｉｇｌｅ−７のリガンドではないシアル酸、例えばＳｉａ１シアル酸との間の相互作用を阻止する抗体が提供される。ある実施形態において、シアル酸は、シアル酸付加三糖である。ある実施形態において、シアル酸は、Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ構造を含む。ある実施形態において、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−７のリガンドであるがＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドではないシアル酸、例えば６’−シアリルラクトース含有シアル酸とのＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの相互作用を実質的に阻止しない。
【００３８】
このような抗体の断片および誘導体も提供される。ある実施形態において、本抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドおよび／またはヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合可能である抗原結合ドメイン（例えば、単一抗原結合ドメイン、重鎖および軽鎖可変ドメインから構成されるドメインなど）を含む。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合し、かつヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに結合しない（ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび−Ｆによって例示される）。ある実施形態において、抗原結合ドメインは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド（ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５および−６によって例示される）の両方に結合する。ある実施形態において、そのような抗原結合ドメインをコードするタンパク質（例えば、抗体、多量体および／または多重特異性タンパク質）または核酸が提供される。
【００３９】
ある実施形態において、本開示の中和抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、免疫細胞においてＳｉｇｌｅｃ−７および／または−９によって発揮される阻害活性を緩和し、Ｓｉｇｌｅｃ−７のシアル酸リガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する癌細胞を効果的に認識しかつ／または排除するリンパ球の能力を促進する。中和抗体（または抗体断片）は、一方または他方のタイプのリガンドの発現のために、癌細胞が溶解から逃れる能力を低下させ、したがって、これらにより免疫系による腫瘍監視が促進される。ＮＫ区画において、Ｓｉｇｌｅｃ−９は、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞で主に発現される一方、ｓｉｇｌｅｃ−７は、ＣＤ５６ｄｉｍおよびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞上で発現される。ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞（ＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＫＩＲ＋）は、末梢血液および脾臓ＮＫ細胞の約９０％に相当し、パーフォリンおよびグランザイムを発現し、主要な細胞傷害性サブセットである一方、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｄｉｍ／−ＫＩＲ−）は、リンパ節および扁桃腺でＮＫ細胞の大多数を構成し、活性化時に主としてサイトカイン産生に反応する。ある実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９に特異的に結合し、かつヒトＮＫ細胞（例えば、ヒト初代ＮＫ細胞；ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞）におけるＳｉｇｌｅｃ−９によって発揮される阻害活性を緩和し、Ｓｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する癌細胞を効果的に認識しかつ／または排除するＮＫ細胞の能力を増強する抗体または抗体フラグメントが提供される。ある実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９に特異的に結合し、かつヒトＮＫ細胞（例えば、ヒト初代ＮＫ細胞；ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞）におけるＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９によって発揮される阻害活性を緩和し、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する癌細胞を効果的に認識しかつ／または排除するＮＫ細胞の能力を増強する抗体または抗体フラグメントが提供される。
【００４０】
ある実施形態において、本開示の抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の両方に結合し得、かつリンパ球（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）細胞傷害性のＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９介在性阻害の両方を中和し得る。ある態様において、本抗体は、標的細胞（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現する細胞、腫瘍細胞）の存在下でリンパ球活性化を向上させる。ある実施形態において、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９を発現するＮＫ細胞がヒトドナーから精製され、かつＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する標的細胞と温置される標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて評価されるＮＫ細胞の細胞傷害性を向上させる。ある実施形態において、細胞傷害性の阻害の活性化または中和の向上は、細胞傷害性／細胞傷害性の可能性のマーカー、例えばＣＤ１０７および／またはＣＤ１３７発現（動員）の上昇によって評価される。ある実施形態において、細胞傷害性の阻害の活性化または中和の向上は、５１Ｃｒ放出アッセイにおける５１Ｃｒ放出の増加によって評価される。Ｓｉｇｌｅｃ−７は、配列番号１のアミノ酸配列を含み得る。Ｓｉｇｌｅｃ−９は、配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−９は、配列番号１６０のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
ある実施形態において、本開示の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列（１００位にリジンを有し、集団の約４９％を表す）を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、および配列番号１６０のアミノ酸配列（配列番号２の残基１００に対応する位置にグルタミン酸を有する）、集団の約３６％を表す）を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの両方に結合することができる。何れかの実施形態において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、配列番号２のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを発現する（またはその細胞が発現する）個体において、および配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを発現する（またはその細胞が発現する）個体において、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻害活性を中和することができるものとして特定され得る。
【００４２】
ある実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合し、かつ配列番号２のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよび配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの両方の阻害活性を中和することができる抗体または抗体断片（またはそのような断片を含むタンパク質）が提供される。ある実施形態において、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合し、かつ配列番号２のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを発現するＮＫ細胞および配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを発現するＮＫ細胞において、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和することができる抗体または抗体フラグメント（またはそのようなフラグメントを含むタンパク質）が提供される。ある実施形態において、抗体は、特定のＳｉｇｌｅｃ−９を発現するＮＫ細胞がヒトドナーから精製され、かつそのＳｉｇｌｅｃ−９のシアル酸リガンドを発現する標的細胞と温置される標準的なインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて評価されるＮＫ細胞の細胞傷害性を向上させる。
【００４３】
本明細書中の実施形態の何れかのある態様において、本抗体は、Ｓｉｇｌｅｃの細胞外ドメイン上に存在するエピトープに２価方式で結合する四量体（例えば、全長、Ｆ（ａｂ）’２断片）抗体または抗体断片である。例えば、２価の様式でＳｉｇｌｅｃに結合する抗体または抗体断片は、それぞれがＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合することができるか、またはそれぞれがＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの両方に存在するエピトープに結合することができる２つの抗原結合ドメインを含み得る。本明細書中の実施形態の何れかの別の態様において、本抗体は、１価方式でＳｉｇｌｅｃに結合し、各Ｓｉｇｌｅｃ、例えばＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９でアゴニスト活性を欠く。ある実施形態において、１価方式でＳｉｇｌｅｃに結合する抗体は、Ｆａｂ断片である。本明細書中の実施形態の何れかにおいて、本抗体は、Ｓｉｇｌｅｃに１価または２価方式で結合し、Ｓｉｇｌｅｃ−９でアゴニスト活性がない。治療用途の場合、抗体は、好ましくは非枯渇抗体である。任意選択により、本抗体は、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって結合可能であるが、実質的にヒトＦｃγＲへのそのＦｃドメインを介した結合を欠くＦｃドメインを含む（例えば、ＣＤ１６’、任意選択により、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４ポリペプチドの１つ以上またはそれぞれ）。任意選択により、抗体は、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４ポリペプチドの１つ以上、またはそれぞれに対する、抗体の結合親和性を減少させるアミノ酸修飾（例えば、１つ以上の置換）を含むヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインを含む。
【００４４】
ある実施形態において、本抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９、任意選択により、さらにＳｉｇｌｅｃ−７に結合する１つ以上の（例えば、２つの）抗原結合ドメインを含む。ある具体的な実施形態において、本抗体は、四量体の、任意選択により、２つの同一の抗原結合ドメイン（任意選択により、２つの重鎖および軽鎖可変領域対）を含み、Ｓｉｇｌｅｃ−９、任意選択により、さらにＳｉｇｌｅｃ−７に結合し、その阻害活性を中和し、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって結合可能なＦｃドメインを含み、実質的にヒトＦｃγＲ（例えば、ＣＤ１６；任意選択により、ヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４ポリペプチドの１つ以上またはそのそれぞれ）への結合を欠く全長抗体である。
【００４５】
本明細書中の実施形態の何れかにおいて、ヒトリンパ球上でのＳｉｇｌｅｃへの結合時、モノクローナル抗体は、標的細胞表面上のＳｉｇｌｅｃのシアル酸リガンドを保有する標的ヒト細胞の溶解を促進または再構成する能力を有し、および／またはこの標的細胞が前記リンパ球、例えばエフェクターリンパ球、ヒト個体からのＮＫまたはＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞）と接触すると、（例えば、リンパ球上のＣＤ１０７および／またはＣＤ１３７発現の上昇によって決定した場合に）リンパ球活性化を向上させる能力を有する。ある実施形態において、リンパ球の第１のサブセットによって発現される第１のＳｉｇｌｅｃ（例えば、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞上に発現されるＳｉｇｌｅｃ−９）を中和する、およびリンパ球の第２のサブセットによって発現される第２のＳｉｇｌｅｃ（例えば、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞上に発現されるＳｉｇｌｅｃ−７）を中和する抗体が提供される。ヒトリンパ球の第１および第２のサブセット（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、免疫抑制またはＭ２マクロファージ）は、例えば、異なる細胞表面マーカー、または異なる機能的特性、または異なる標的細胞を溶解または認識する（例えば、これにより活性化される）能力によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、本抗体は、そのシアロシドリガンド（例えば、腫瘍細胞上に存在するリガンド）へのＳｉｇｌｅｃの結合を減少させる（阻止する）。
【００４６】
本明細書中の実施形態の何れかにおいて、Ｓｉｇｌｅｃのシアロシドまたはシアル酸リガンドは、天然リガンド、例えばシアル酸リガンド（シアル酸を含むリガンド）であり、抗体が結合するＳｉｇｌｅｃポリペプチドに結合することが知られている。９つの炭素の酸性単糖のファミリーであるシアル酸は、一般的にはＮ−グリカン、Ｏ−グリカンおよび糖脂質の終端分岐であることが分かっている。Ｓｉｇｌｅｃは、２位からの酸性シアル酸結合のようなシアル酸分子の多くの態様、シアル酸の配置およびそれらの提示法を認識すると考えられる。本明細書中の実施形態の何れかにおいて、Ｓｉｇｌｅｃのリガンドは、主に５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）誘導体を含み、５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）誘導体のような他のシアル酸誘導体を含み得る。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７のリガンドは、糖タンパク質（例えば、ムチン）または糖脂質上に存在するシアル酸である。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−７のリガンドは、ｂ−シリーズガングリオシド、例えばＧＤ２、ＧＤ３およびＧＴ１ｂ上で提示されるα２，８−結合ジシアル酸を含む。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−７のリガンドは、内部で分岐状であるα２，６−結合ジシアルガングリオシド、例えばＤＳＧｂ５を含む。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−９のリガンドは、ムチン、例えばＭＵＣ１上に存在するリガンドであるか、またはムチン、例えばＭＵＣ１を含む。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−９のリガンドは、シアル酸および硫酸の両方を含有するシアログリカンリガンドである。
【００４７】
ある態様において、抗体は、第１および第２のヒトＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃの細胞外ドメイン上に存在する共通の決定基に結合する。本明細書中の何れかの実施形態のある態様において、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９上に存在するがＳｉｇｌｅｃ−７上に存在しない決定基に結合する。本明細書中の何れかの実施形態のある態様において、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−７上およびＳｉｇｌｅｃ−９上に存在する共通の決定基に結合する。任意選択により、抗体が結合する決定基は、１つ以上の他のＳｉｇｌｅｃ、例えばＳｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および−１２の１つ以上（またはこれらの全て）上に存在しない。
【００４８】
本明細書中の実施形態の何れかにおいて、本抗体は、Ｓｉｇｌｅｃの細胞外ドメインに結合する。本明細書中の特定の実施形態において、特に抗体がＳｉｇｌｅｃとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を阻止する場合、抗体は、少なくとも部分的にＳｉｇｌｅｃのシアル酸結合ドメイン内またはその近くに結合し得る。本明細書中の他の実施形態において、特に抗体がＳｉｇｌｅｃとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を阻止しない場合、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃのシアル酸結合ドメインの外側に結合し得る。
【００４９】
本明細書中の実施形態の何れかにおいて、ヒトリンパ球（例えば、初代ＮＫ細胞）上のＳｉｇｌｅｃに結合すると、標的細胞がリンパ球と接触すると、モノクローナル抗体は、標的細胞表面上にＳｉｇｌｅｃのシアル酸リガンドを保有する標的ヒト細胞の溶解を再構成する能力を有する。
【００５０】
本明細書中の実施形態の何れかにおいて、本抗体は、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド（例えば、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／またはヒトＳｉｇｌｅｃ−９）のそれぞれへの結合に対して、１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍ未満の（例えば、一価結合について、本明細書中の実施例に開示される方法に従って判定される）ＫＤを有する。大量に発現される低親和性シアル酸とのシス相互作用のために細胞表面でＳｉｇｌｅｃ−７および−９結合部位が一般的に遮蔽されると考えられる限り、トランス相互作用は、シスと競合するリガンドよりも高い親和性を発現する抗体で起こり得る。ある実施形態において、中和抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９）へのシアロシドリガンドの結合に取って代わることが可能である。
【００５１】
本発明は、ヒトもしくはヒト化抗体またはその抗体断片もしくは誘導体も提供し、これは、単独でまたは何らかの適切な組み合わせで先述の特性の何れかを有する。
【００５２】
ある態様において、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび／または−Ｆが結合するＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープへの結合について競合する（例えば、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび／または−Ｆの何れかの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体との、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド上のエピトープへの結合について競合する）モノクローナル抗体が提供される。
【００５３】
ある態様において、ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５および／または−６が結合するＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープへの結合について競合する（例えば、ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５または−６の何れかの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたは可変領域を有する抗体との、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド上のエピトープへの結合について競合する）モノクローナル抗体が提供される。
【００５４】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｎ８２、Ｐ８３、Ａ８４、Ｒ８５、Ａ８６および／またはＶ８７における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドへの減少した結合を有する。ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体は、残基Ｎ８１、Ｄ１００、Ｈ１０２および／またはＴ１０３における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドへの減少した結合を有する。ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体は、残基Ｗ８８、Ｅ８９、Ｅ９０、Ｒ９２における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドへの減少した結合を有する。突然変異のための残基位置は、配列番号１のＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドを参照する。任意選択により、抗体は、表３の１つ以上の他の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド、例えば１つ以上の（または全ての）突然変異体Ｍ６、Ｍ８、Ｍ１５またはＭ１６に対する結合を失わない。
【００５５】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｎ７８、Ｐ７９、Ａ８０、Ｒ８１、Ａ８２および／またはＶ８３における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体は、残基Ｎ７７、Ｄ９６、Ｈ９８および／またはＴ９９における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体は、残基Ｗ８４、Ｅ８５、Ｅ８６および／またはＲ８８における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。突然変異のための残基位置は、配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを参照する。任意選択により、抗体は、表３の１つ以上の他の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、例えば１つ以上の（または全ての）突然変異体Ｍ６、Ｍ８、Ｍ１５またはＭ１６に対する結合を失わない。
【００５６】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｓ４７、Ｈ４８、Ｇ４９、Ｗ５０、Ｉ５１、Ｙ５２、Ｐ５３および／またはＧ５４における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。突然変異のための残基位置は、配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを参照する。任意選択により、抗体は、表３の１つ以上の他の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、例えば突然変異体９、１０および／もしくは１１、または１つ以上の（もしくは全ての）突然変異体Ｍ７もしくはＭ８に対する結合を失わない。
【００５７】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｐ５５、Ｈ５８、Ｅ１２２、Ｇ１２４、Ｓ１２５および／またはＫ１２７における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。突然変異のための残基位置は、配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを参照する。任意選択により、抗体は、表３の１つ以上の他の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、例えば突然変異体９、１０および／または１１に対する結合を失わない。
【００５８】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｋ１３１および／またはＨ１３２における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。突然変異のための残基位置は、配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを参照する。任意選択により、抗体は、表３の１つ以上の他の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、例えば突然変異体９、１０および／もしくは１１、または１つ以上の（もしくは全ての）突然変異体Ｍ８もしくはＭ１５に対する結合を失わない。
【００５９】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｒ６３、Ａ６６、Ｎ６７、Ｔ６８、Ｄ６９、Ｑ７０および／またはＤ７１における突然変異（例えば、表３に示す突然変異）を有するＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの減少した結合を有する。突然変異のための残基位置は、配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを参照する。任意選択により、抗体は、表３の１つ以上の他の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド、例えば突然変異体９、１０および／もしくは１１、または１つ以上の（もしくは全ての）突然変異体Ｍ６、Ｍ１５またはＭ１６に対する結合を失わない。
【００６０】
ある実施形態において、
（ａ）（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｂ）（ｉ）配列番号５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｃ）（ｉ）配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｄ）（ｉ）配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｅ）（ｉ）配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、および
（ｆ）（ｉ）配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｇ）（ｉ）配列番号１５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｈ）（ｉ）配列番号１７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｉ）（ｉ）配列番号１９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｊ）（ｉ）配列番号２１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、
（ｋ）（ｉ）配列番号２３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体、および
（ｌ）（ｉ）配列番号２５の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３を含む軽鎖とを含むモノクローナル抗体
からなる群から選択される抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、２および３を含むか、あるいはその抗体と同じエピトープに結合し、かつ／またはＳｉｇｌｅｃ−７および／もしくはＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合についてその抗体と競合する抗原結合化合物が提供される。
【００６１】
本発明の実施形態の何れかのある態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗体は、抗体ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、および−Ｆからなる群から選択される抗体の重鎖のＣＤＲを１つ、２つまたは３つ有する重鎖；および抗体ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび−Ｆからなる群から選択されるそれぞれの抗体の軽鎖のＣＤＲを１つ、２つまたは３つ有する軽鎖を含み得る。
【００６２】
ある態様において、アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号７５）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＥＩＮＰＳＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＥＳ（配列番号７８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＧＶＥＳＹＤＦＤＤＡＬＤＹ（配列番号８０）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号８３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号５７）を含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＦＴ（配列番号８６）を含む軽鎖ＣＤＲ３；およびヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列を含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００６３】
ある態様において、アミノ酸配列ＳＹＷＭＨ（配列番号７５）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＥＩＮＰＳＮＧＨＴＮＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号９０）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＧＶＥＴＹＤＦＤＤＡＭＤＹ（配列番号９２）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＮＮＹＬＮ（配列番号８３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＦＴＳＲＬＨＳ（配列番号９５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＱＱＧＤＴＦＰＦＴ（配列番号９６）を含む軽鎖ＣＤＲ３；およびヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列を含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００６４】
ある態様において、アミノ酸配列ＮＹＥＭＮ（配列番号９８）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＤＦＫ（配列番号１０１）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＤＤＹＧＲＳＹＧＦＡＹ（配列番号１０３）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ（配列番号１０６）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＬＡＳＫＬＥＳ（配列番号１０９）を含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＨＱＮＮＥＤＰＰＷＴ（配列番号１１０）を含む軽鎖ＣＤＲ３；およびヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列を含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００６５】
ある態様において、アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１１２）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＷＩＩＴＥＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＲＧ（配列番号１１５）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＤＦＤＧＹ（配列番号１１７）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ（配列番号１１９）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＮＡＫＴＬＴＥ（配列番号１２２）を含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＱＨＨＹＧＦＰＷＴ（配列番号１２３）を含む軽鎖ＣＤＲ３；およびヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列を含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００６６】
ある態様において、アミノ酸配列ＴＦＧＭＨ（配列番号１２５）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＳＳＧＳＮＡＩＹＹＡＤＴＶＫＧ（配列番号１２８）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＰＧＹＧＡＷＦＡＹ（配列番号１３０）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＳＳＶＳＳＡＹＬＨ（配列番号１３３）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１３６を含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＱＱＹＳＡＹＰＹＴ（配列番号１３７）を含む軽鎖ＣＤＲ３；およびヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列を含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００６７】
ある態様において、アミノ酸配列ＤＹＳＭＨ（配列番号１１２）を含む重鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＶＩＳＴＹＮＧＮＴＮＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１３９）を含む重鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＲＧＹＹＧＳＳＳＷＦＧＹ（配列番号１４１）を含む重鎖ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＫＡＳＱＮＶＧＴＤＶＡ（配列番号１４４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＡＳＹＲＹＳ（配列番号１４７を含む軽鎖ＣＤＲ２；アミノ酸配列ＱＱＹＮＳＦＰＹＴ（配列番号１４８を含む軽鎖ＣＤＲ３およびヒト重鎖および軽鎖フレームワーク配列を含む、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインまたは抗体が提供される。
【００６８】
本発明の実施形態の何れかのある態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する抗体は、抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５および−６からなる群から選択される抗体の個々の重および／または軽鎖の１、２または３つのＣＤＲを有する重および／または軽鎖を有し得る。
【００６９】
本発明の実施形態の何れかのある態様において、Ｓｉｇｌｅｃへの結合は、細胞性Ｓｉｇｌｅｃであるものとして特定され得、このＳｉｇｌｅｃは、細胞の表面で発現され、例えばネイティブまたは修飾型細胞性Ｓｉｇｌｅｃ、組み換え宿主細胞によって発現されるＳｉｇｌｅｃ、ＮＫ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞などによって発現されるＳｉｇｌｅｃである。
【００７０】
本発明は、先述の特性の何れかを有する、ヒトまたはヒト化抗体または抗体断片をコードする核酸、このような核酸を含むベクター、このようなベクターを含む細胞、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の発現に適切な条件下でこのような細胞を培養することを含むヒト抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体を産生させる方法も提供する。本発明は、このようなタンパク質、核酸、ベクターおよび／または細胞および一般的には活性成分または本組成物の処方、送達、安定性もしくは他の特徴を促進する不活性成分であり得る１つ以上のさらなる成分（例えば、様々な担体）を含む、組成物、例えば薬学的に許容可能な組成物およびキットにも関する。本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ介在性生物学的活性の調整などにおいて、例えばそれに関連する疾患、特に癌および感染性疾患の処置において、このような抗体、核酸、ベクター、細胞、生物および／または組成物を作製しかつ使用する、様々な新規のおよび有用な方法にさらに関する。
【００７１】
別の態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）（任意選択により、初代ヒトＮＫ細胞、例えばＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞における）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体（例えば、ステップ（ａ）のもの）を選択するステップと、
（ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止しない抗体（例えば、ステップ（ｂ）のもの）を選択するステップと
を含む方法が提供される。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドは、細胞、例えばＣＨＯ細胞、リンパ球、ＮＫ細胞の表面で発現される。
【００７２】
別の態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）（任意選択により、初代ヒトＮＫ細胞、例えばＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞における）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体（例えば、ステップ（ａ）のもの）を選択するステップと、
（ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止する抗体（例えば、ステップ（ｂ）のもの）を選択し、任意選択により、Ｎｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂおよびＳｉｇｌｅｃ−９の６’−シアリルラクトースシアル酸リガンドの両方を阻止する抗体を選択するステップと
を含む方法が提供される。
【００７３】
別の態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−７の阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体（例えば、ステップ（ａ）のもの）を選択するステップと、
（ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を実質的に阻止しない抗体（例えば、ステップ（ｂ）のもの）を選択するステップと
を含む方法が提供される。ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドは、細胞、例えばＣＨＯ細胞、リンパ球、ＮＫ細胞の表面で発現される。
【００７４】
当然のことながら、上記方法の何れかにおけるステップ（ｂ）および（ｃ）は、あらゆる所望の順序で行われ得る。
【００７５】
別の態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−９およびＳｉｇｌｅｃ−７の阻害活性を中和する抗体を作製する方法であって、
（ａ）Ｓｉｇｌｅｃ−９およびＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供するステップと、
（ｂ）（任意選択により、初代ヒトＮＫ細胞、例えばＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞における）Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよびＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの阻害活性を中和する抗体（例えば、ステップ（ａ）のもの）を選択するステップと
を含む方法が提供される。
【００７６】
ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃの阻害活性を中和する抗体を選択することは、初代ＮＫ細胞を増強する抗体を選択すること（例えば、ヒトドナーから得られた精製ＮＫ細胞として、例えば実施例１０の方法に従って）を含み得る。
【００７７】
ある実施形態において、抗体が２種類の異なるＳｉｇｌｅｃ遺伝子産物のうちの任意のものの阻害活性を中和するか否かを決定することは、その抗体が、Ｓｉｇｌｅｃを発現するリンパ球が（例えば、Ｓｉｇｌｅｃのリガンドを発現する）標的細胞と接触されると、細胞傷害性のマーカーの上昇（例えば、ＣＤ１０７および／またはＣＤ１３７の発現の上昇）を引き起こすか否かを評価することを含む。細胞傷害性のマーカー上昇（例えば、ＣＤ１０７および／またはＣＤ１３７の発現の上昇）は、その抗体がＳｉｇｌｅｃ遺伝子産物の阻害活性を中和可能であることを示す。
【００７８】
本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９発現リンパ球、任意選択により、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を調整するためのインビトロ方法も提供し、この方法は、表面にＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９を発現するリンパ球（例えば、初代ＮＫ細胞）を、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の阻害活性を中和する抗体と接触させることを含む。
【００７９】
本発明は、リンパ球の活性（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）活性の増強および／または調整を、それを必要とする対象において行う方法、例えばＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞（主要な細胞傷害性サブセット）と、任意選択により、さらなるＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞（リンパ節および扁桃腺のＮＫ細胞の大部分、活性化時に主にサイトカイン産生に反応する）とを調整することによってＮＫ細胞活性を増強する方法も提供し、この方法は、有効量の先述の組成物の何れかを対象に投与することを含む。ある実施形態において、対象は、癌に罹患している患者である。例えば、患者は、造血系の癌、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫または非ホジキンリンパ腫の罹患者であり得る。代替的に、患者は、固形腫瘍、例えば結直腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、乳癌または悪性メラノーマの罹患者であり得る。別の実施形態において、対象は、感染性疾患に罹患している患者である。
【００８０】
これらの態様をより詳細に記載し、本明細書中で提供される本発明の説明から、さらなる態様、特性および長所が明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＮＫ細胞への抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の結合を示す。Ｓｉｇｌｅｃ  ＭＦＩ：蛍光強度の平均。ＮＫ細胞のかなりの割合（約４４％）がＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の両方を発現し、このことから、例えば腫瘍細胞上に存在するグリカンリガンドの機能として、これらの受容体のそれぞれ（またはその両方）によってＮＫ細胞の大部分が阻害され得ることが示唆される。
【図２】Ｓｉｇｌｅｃ−７に結合するがＳｉｇｌｅｃ−９またはカニクイザルＳｉｇｌｅｃに結合しない抗体（右パネル）、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９およびカニクイザルＳｉｇｌｅｃのそれぞれに結合する抗体（中間パネル）、Ｓｉｇｌｅｃ−９に結合するがＳｉｇｌｅｃ−７またはカニクイザルＳｉｇｌｅｃに結合しない抗体（左パネル）の例について、フローサイトメトリーによる代表的な結果を示す。
【図３】抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤの、ｍｏＤＣ（左側パネル）およびノイラミダーゼ処理ｍｏＤＣ（右側パネル）への結合のフローサイトメトリーによる滴定を、それぞれのＥＣ５０値を伴って示す。ＥＣ５０は、ノイラミニダーゼ処理後に高度に増強され（１０倍）、これは、ｍｏＤＣ上に発現したＳｉｇｌｅｃ−９がノイラミニダーゼ処理前のシアル酸リガンドとのシス相互作用に関与していることを示唆する。しかし、プラトー相レベルは改変されておらず、抗体は、細胞表面上の全てのＳｉｇｌｅｃ−９（結合および非結合）立体構造に結合することができ、ｍｏｎｏＤＣならびに他の細胞型（例えば、単球ならびにマクロファージＭ１およびＭ２）におけるシス相互作用およびシグナル伝達を阻害することを示唆する。
【図４】Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９交差反応性抗体（図４Ｂ）およびＳｉｇｌｅｃ−９単一特異性（非Ｓｉｇｌｅｃ−７結合）抗体（図４Ａ）中でのＹＴＳ  Ｓｉｇｌｅｃ−９＊細胞傷害性の増加の用量依存的誘導を示す。
【図５】初代ＮＫ細胞（ドナーから精製された新鮮なＮＫ細胞として）およびＨＴ２９結腸直腸癌細胞を用いた古典的な５１Ｃｒ放出アッセイにおける、２人の異なるヒトドナー（ドナーＤ１（左側パネル）およびＤ２（右側パネル））における抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ、およびｍＡｂＦによって媒介される初代ＮＫ細胞の細胞傷害性の増加を示す。
【図６】ＨＴ２９腫瘍細胞の存在下において、１人のヒトドナーにおけるいくつかの抗Ｓｉｇｌｅｃ−９および抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＦ、ｍＡｂ６およびｍＡｂ４によって媒介されるＣＤ１３７を発現するＳｉｇｌｅｃ−９陽性ＮＫ細胞の％の増加を示す。抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９発現初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を、同一ドナー由来のＳｉｇｌｅｃ−９陰性初代ヒトＮＫ細胞で観察されたレベルまで完全に回復させた。
【図７】抗体ｍＡｂＡおよびｍＡｂ１がＳｉｇｌｅｃ−９陽性ＣＤ１３７＋ＮＫ細胞（％）（中央パネル）の増加を誘導するが、Ｓｉｇｌｅｃ−９陰性ＣＤ１３７＋ＮＫ細胞（％）（右側パネル）を誘導しないことを示す。抗体の非存在下でのＮＫ発現ＣＤ１３７の％を左側のパネルに示す。
【図８】Ｓｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のラモス細胞への抗体存在下での結合を示す（上のパネル）。抗Ｓｉｇｌｅｃ／９ｍＡｂ  ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤは、それぞれＳｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への結合を阻害し、ｍＡｂＥは部分的阻害を示し、ｍＡｂＦは結合を阻害しなかった。抗体の存在下でのＳｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＫ５６２細胞への結合を下のパネルに示す。抗Ｓｉｇｌｅｃ／９ｍＡｂ  ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤは、それぞれＳｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への結合を阻害し、ｍＡｂＥおよびｍＡｂＦの両方が部分的阻害を示した。
【図９】ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体によるＳｉｇｌｅｃ−７および−９とシアル酸付加リガンドとの間の相互作用の阻止の試験を示す。ｍＡｂ１、２、４、５および６がＳｉａ２とのＳｉｇｌｅｃ−７相互作用を阻止したが、ｍＡｂ３が阻止しなかったことを示す。
【図１０】ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体によるＳｉｇｌｅｃ−７および−９とシアル酸付加リガンドとの間の相互作用の阻止の試験を示す。全てのｍＡｂがＳｉａ２とのＳｉｇｌｅｃ−９相互作用を阻止するが、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３は、Ｓｉａ１とのＳｉｇｌｅｃ−９相互作用を阻害する能力が低く、したがってＳｉａ１相互作用を実質的に阻止しなかったことを示す。
【図１１】ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質を示す。Ｓｉｇｌｅｃ−９  Ｎ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインの構造を示し、Ｓｉｇｌｅｃ−９突然変異体Ｍ９、Ｍ１０およびＭ１１において置換された残基は陰影で示される。シアル酸リガンド結合部位は、薄い陰影で示されている。
【図１２】ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質を示す。Ｓｉｇｌｅｃ−９  Ｎ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインの構造を示し、Ｓｉｇｌｅｃ−９突然変異体Ｍ６およびＭ７において置換された残基は陰影で示される。シアル酸リガンド結合部位は、薄い陰影で示されている。
【図１３】ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質を示す。Ｓｉｇｌｅｃ−９  Ｎ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインの構造を示し、Ｓｉｇｌｅｃ−９突然変異体Ｍ１６において置換された残基は陰影で示される。シアル酸リガンド結合部位は、薄い陰影で示されている。
【図１４】ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質を示す。Ｓｉｇｌｅｃ−９  Ｎ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインの構造を示し、Ｓｉｇｌｅｃ−９突然変異体Ｍ８において置換された残基は陰影で示される。シアル酸リガンド結合部位は、薄い陰影で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項で使用される場合、「含む」という語と組み合わせて使用されるとき、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という語は、１つまたは２つ以上を意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれを超えるものを意味し得る。
【００８３】
「含む」が使用される場合、これは、任意選択により、「から基本的になる」または「からなる」により置き換えられ得る。
【００８４】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０５５２００．１で示され、この開示全体が参照により本明細書中に組み込まれる）は、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃファミリーのメンバーである（Ａｎｇａｔａ  ａｎｄ  Ｖａｒｋｉ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０（４），４３１−４３８（２０００））。ヒトＳｉｇｌｅｃ−７は、次のアミノ酸配列を有する４６７個のアミノ酸を含む。
【化１】
2019511220.tif 000003
【００８５】
ヒトＳｉｇｌｅｃ−９（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ０５５２５６．１で示され、この開示全体が参照により本明細書中に組み込まれる）は、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃファミリーのメンバーである（Ａｎｇａｔａ  ａｎｄ  Ｖａｒｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（２９），２２１２７−２２１３５（２０００））。ヒトＳｉｇｌｅｃ−９は、次のアミノ酸配列を有する４６３個のアミノ酸を含む。
【化２】
2019511220.tif 000004
【００８６】
本発明に関連して、「ＮＫ細胞の細胞傷害性のＳｉｇｌｅｃ介在性阻害を中和する」、「Ｔ細胞の細胞傷害性のＳｉｇｌｅｃ介在性阻害を中和する」または「Ｓｉｇｌｅｃの阻害活性を中和する」は、Ｓｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９）が、サイトカイン放出および細胞傷害性反応などのリンパ球反応につながる細胞内過程に負の影響を与えるその能力において阻害される過程を指す。これは、例えば標準的なＮＫまたはＴ細胞に基づく細胞傷害性アッセイにおいて測定され得、この場合、Ｓｉｇｌｅｃ陽性リンパ球によるシアル酸リガンド陽性細胞の死滅を刺激する治療用化合物の能力を測定する。ある実施形態において、抗体標品により、Ｓｉｇｌｅｃ限定リンパ球の細胞傷害性の少なくとも１０％の増強、任意選択により、リンパ球細胞傷害性の少なくとも４０％もしくは５０％の増強、または任意選択により、ＮＫ細胞傷害性の少なくとも７０％の増強が引き起こされ、これは記載される細胞傷害性アッセイに関するものである。ある実施形態において、抗体標品により、Ｓｉｇｌｅｃ限定リンパ球によるサイトカイン放出の少なくとも１０％の増強、任意選択により、サイトカイン放出の少なくとも４０％もしくは５０％の増強、または任意選択により、サイトカイン放出の少なくとも７０％の増強が引き起こされ、これは記載される細胞傷害性アッセイに関するものである。ある実施形態において、抗体標品により、Ｓｉｇｌｅｃ限定リンパ球による細胞傷害性のマーカー（例えば、ＣＤ１０７および／またはＣＤ１３７）の細胞表面発現の少なくとも１０％の増強、任意選択により、少なくとも４０％もしくは５０％の増強、または任意選択により、細胞傷害性のマーカー（例えば、ＣＤ１０７および／またはＣＤ１３７）の細胞表面発現の少なくとも７０％の増強が引き起こされる。
【００８７】
シアル酸リガンドへのＳｉｇｌｅｃ分子の結合を阻止する抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の能力は、可溶性または細胞表面連結Ｓｉｇｌｅｃおよびシアル酸分子を用いたアッセイにおいて、本抗体が、シアル酸分子に対するＳｉｇｌｅｃ分子の結合を用量依存的に検出可能に減少させ得、このＳｉｇｌｅｃ分子が本抗体の非存在下でシアル酸分子に検出可能に結合することを意味する。
【００８８】
本明細書全体において、「癌の処置」などが抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質（例えば、抗体）に関して言及される場合には常に、（ａ）癌の処置の方法であって、このような治療を必要とする個体、哺乳動物、特にヒトに、癌の処置を可能にする用量で（治療的有効量）、好ましくは本明細書中で指定されるような用量（量）で（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質中で）抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質を投与する（少なくとも１回の処置）ステップを含む方法；（ｂ）（特にヒトにおける）癌の処置のための抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質の使用またはその処置における使用のための抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質；（ｃ）癌の処置用の医薬品の製造のための抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質の使用、抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、癌の処置用の医薬品または有効用量の癌の処置に適切な抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質を含む医薬品の製造のために抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物質を使用する方法；または（ｄ）本願が提出される国で特許を得ることを可能とする主題に従う、ａ）、ｂ）およびｃ）の何れかの組み合わせを意味する。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、エピトープに免疫特異的に結合可能な三次元構造を含むドメインを指す。したがって、ある実施形態において、このドメインは、超可変領域、任意選択により、抗体鎖のＶＨおよび／またはＶＬドメイン、任意選択により、少なくともＶＨドメインを含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態において、結合ドメインは、非免疫グロブリン骨格からのポリペプチドドメインを含み得る。
【００９０】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される場合、全抗体およびその任意の抗原結合断片またはその単鎖を含む。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖および重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」および「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。これらの一部は、サブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などにさらに分類される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も共通する抗体であるため、および実験室で最も容易に作製されるため、本明細書中で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒトまたはそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」は、本明細書中に記載の抗体の何れかの何らかの断片または誘導体も含む。
【００９１】
「交差反応性」抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、特異性および／または親和性で、複数のＳｉｇｌｅｃ分子に結合する抗体である。例えば、モノクローナル抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９と交差反応性であり得る。
【００９２】
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープまたはネイティブタンパク質の何れかの組み換え形態を用いて評価した場合、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばＳｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイおよび特異的な結合を決定するための他の方法を以下でさらに記載し、これらは当技術分野で周知である。
【００９３】
抗体が特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組み換えＳｉｇｌｅｃ分子または表面発現Ｓｉｇｌｅｃ分子の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて参照抗体のＳｉｇｌｅｃポリペプチドまたはＳｉｇｌｅｃ発現細胞への結合を減少させる場合、本抗体は、参照抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【００９４】
「親和性」という用語は、本明細書中で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定められる解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）で見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析など）の使用である。
【００９５】
本明細書に関連して、「決定基」はポリペプチド上の相互作用または結合の部位を指す。
【００９６】
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリアまたは領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基ならびに特異的な抗原結合抗体またはペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば抗体または受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態または最小構造領域である。エピトープは、直鎖状または立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造または構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、したがって分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す（二次、三次および／または四次構造）アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは三次元構造に依存する。したがって、「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
【００９７】
「枯渇させる」または「枯渇させること」という用語は、Ｓｉｇｌｅｃ発現細胞（例えば、Ｓｉｇ−ｌｅｃ−７またはＳｉｇｌｅｃ−９発現リンパ球）に関して、結果として、試料または対象中に存在するこのようなＳｉｇｌｅｃ発現細胞の数に負の影響を与えるように、死滅させる、排除する、溶解する、またはこのような死滅、排除もしくは溶解の誘導を引き起こす過程、方法または化合物を意味する。過程、方法または化合物に関して、「非枯渇」という用語は、この過程、方法または化合物が枯渇させていないことを意味する。
【００９８】
「薬剤」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子または生体物質から作製される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
【００９９】
本明細書中での目的のために、「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合される抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するために設計される。このような抗体は、抗原負荷に反応して特異的なヒト抗体を作製させるために「操作」されている、トランスジェニックマウスまたは他の動物から入手し得る（例えば、全体的な教示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６：５７９を参照されたい）。全て当技術分野で公知である、遺伝学的または染色体導入法ならびにファージディスプレイ技術によって完全ヒト抗体も構築し得る（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３を参照されたい）。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても作製し得る（例えば、参照によりそれらの全体において組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）。
【０１００】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは改変されているクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域またはそれらの一部が改変され、置き換えられ、または交換されているか、または（ｂ）可変領域またはそれらの一部が、改変され、置き換えられ、または異なるかもしくは改変されている抗原特異性を有する可変領域と交換されている、抗体分子である。
【０１０１】
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の、残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の、３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の、残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメイン中の、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ１９８７；１９６：９０１−９１７）または抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、前出に記載の方法により行われる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」および「Ｋａｂａｔによる」などの句は、本明細書中で、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Ｋａｂａｔ付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはそれへの挿入に対応する少数のまたはさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後に残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列での抗体の配列の相動性の領域でのアライメントにより、特定の抗体に対して決定され得る。
【０１０２】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＲとして定められる領域を除く、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離される近接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）にさらに分けられ得る。
【０１０３】
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」および「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０からの、抗体重鎖のＣ末端断片、または他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、εおよびμ）におけるその対応配列またはその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるＫａｂａｔアミノ酸付番は、この開示を通じて使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ．  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい）。
【０１０４】
「単離」、「精製」または「生物学的に純粋」という用語は、実質的にまたは基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度および均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
【０１０５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然のアミノポリマーおよび非天然のアミノポリマーに適用される。
【０１０６】
「組み換え」という用語は、例えば細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の改変により修飾されているか、または細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組み換え細胞は、細胞のネイティブ（非組み換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないかまたは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【０１０７】
本明細書に関連して、ポリペプチドまたはエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性および／または親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
【０１０８】
「同一性」または「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上の一連のアミノ酸残基間の一致数により決定される場合の、ポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（もしあれば）を用いた２つ以上の配列のより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、公知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  ＤｅｖｅｒｅｕＸ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが限定されない。
【０１０９】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出）から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
【０１１０】
抗体の産生
疾患（例えば、癌、感染性疾患）の治療に有用な抗Ｓｉｇｌｅｃ剤は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９タンパク質の細胞外部分に結合し（および任意選択により、さらなるＳｉｇｌｅｃ−１２結合を伴うまたは伴わないヒトＳｉｇｌｅｃ−７タンパク質にさらに結合する）、Ｓｉｇｌｅｃ陽性免疫細胞の表面上に発現されたヒトＳｉｇｌｅｃの阻害活性を低下させる。ある実施形態において、本剤は、好中球、樹状細胞、マクロファージ、Ｍ２マクロファージ、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞において、シアル酸分子がＳｉｇｌｅｃによる阻害シグナル伝達を引き起こす能力を阻害する。
【０１１１】
ある実施形態において、本明細書中に記載される抗Ｓｉｇｌｅｃ剤は、Ｓｉｇｌｅｃのリガンドを有する標的細胞（例えば、癌細胞）への、ヒトまたはヒトドナーにおけるＮＫ細胞および／または好中球の細胞傷害性を増加させるために使用され得る。ＮＫ細胞および好中球は、微生物および癌細胞を認識し、直接死滅させる特殊化された顆粒球である。腫瘍細胞の表面で発現するシアル酸は、腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を低下させることが示されている。抗体は、例えば細胞傷害性のレベルを、特定のＳｉｇｌｅｃをその表面に発現しないＮＫ細胞または好中球において観察されるレベルに実質的に回復させるため、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するために使用され得る。
【０１１２】
シアル酸はまた、樹状細胞上で高度に発現され、ＴＬＲ刺激に対する応答性を含むいくつかのＤＣ機能を調整すると記載されてきた。シアル酸合成の阻止は、ＴＬＲ刺激のためのｍｏＤＣの活性化閾値を低下させ、およびＳｉｇｌｅｃ−Ｅ欠失増強樹状細胞は、いくつかの微生物ＴＬＲリガンドに対し応答する。Ｓｉｇｌｅｃ−９はマウスにおけるＳｉｇｌｅｃ−Ｅの最も近いヒトのオルソロガスなメンバーであり、ブロッキング抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体は樹状細胞の活性化を促進し、ＤＣ−Ｔ相互作用を調整することができる。シアル酸による抗原の改変は、抗原特異的調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の生成を調節し、樹状細胞によるエフェクターＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の形成を防止する。樹状細胞の貪食能力は、ａ２，６−シアル酸欠乏症によっても改善することができる。
【０１１３】
Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９の両方は、タイプＭ１およびＭ２マクロファージ上に発現され、Ｓｉｇｌｅｃ−９のノックダウンはＳｉｇｌｅｃ−９によるマクロファージ機能の調節を示唆する様々な表面発現マーカー（例えば、ＣＣＲ７およびＣＤ２００Ｒ）を調整すると記載されてきた。実際、様々なＳｉｇｌｅｃ−９突然変異体（ＩＴＩＭドメインにおける突然変異）をマクロファージ細胞株に遺伝子移入し、Ｓｉｇｌｅｃ−９が抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を増強することを実証した。Ｓｉｇｌｅｃ−９の可溶性リガンドとの結合はまた、マクロファージが腫瘍関連マクロファージ様表現型を示すように誘導することができ、チェックポイントリガンドＰＤ−Ｌ１の発現の増加を伴う。
【０１１４】
ある実施形態において、本剤は、Ｓｉｇｌｅｃへの結合においてシアル酸分子と競合し、すなわち、本剤は、Ｓｉｇｌｅｃとそのシアル酸リガンドとの間の相互作用を阻止する。
【０１１５】
本発明のある態様において、本剤は、全長抗体、抗体断片および合成または半合成抗体由来分子から選択される抗体である。
【０１１６】
本発明のある態様において、本剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体から選択される抗体である。
【０１１７】
本発明のある態様において、本剤は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭ抗体から選択される抗体の断片である。
【０１１８】
本発明のある態様において、本剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される定常ドメインを含む抗体の断片である。
【０１１９】
本発明のある態様において、本剤は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、重鎖Ｉｇ（ラマまたはラクダＩｇ）、ＶＨＨ断片、シングルドメインＦＶおよび１本鎖抗体断片から選択される抗体断片である。
【０１２０】
本発明のある態様において、本剤は、ｓｃＦＶ、ｄｓＦＶ、ミニボディー、ダイアボディ、トリアボディー、カッパボディー、ＩｇＮＡＲから選択される合成または半合成抗体由来分子および多特異性抗体である。
【０１２１】
したがって、本発明は、Ｓｉｇｌｅｃに結合する抗体および抗原結合ドメイン（および前述のものを含むポリペプチド）に関する。ある態様において、本抗体または抗原結合ドメインは、さらなるヒトＳｉｇｌｅｃ、例えばＳｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および／または−１２よりも少なくとも１００倍低い結合親和性（例えば、ＫＤ）でＳｉｇｌｅｃ−７および／または−９に結合する。ある態様において、抗体または抗原結合ドメインは、Ｓｉｇｌｅｃ−９に結合するが、Ｓｉｇｌｅｃ−７に結合せず、ある実施形態において、抗体は、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドに対し、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに対するよりも少なくとも１００倍低い結合親和性（例えば、ＫＤ）で結合する。別の態様において、抗体は、互いに１−ｌｏｇを超えて異ならない結合親和性（例えば、ＫＤ）を有するヒトＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの両方に結合し、前記Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の結合親和性は、さらなるヒトＳｉｇｌｅｃ、例えばＳｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および／または−１２に対するよりも少なくとも１００倍低い。親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴により、組み換えＳｉｇｌｅｃポリペプチドへの結合について決定することができる。
【０１２２】
本発明のある態様において、本抗体は、精製されたまたは少なくとも部分的に精製された形態である。本発明のある態様において、本抗体は、基本的に単離形態である。
【０１２３】
本抗体は、当技術分野で公知の様々な技術により作製し得る。一般的には、これらは、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド、好ましくはヒトＳｉｇｌｅｃポリペプチドを含む免疫原での非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫付与によって作製される。Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの全長配列またはその断片もしくは誘導体、一般的には免疫原性断片、すなわち、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドを発現する細胞の表面に露出したエピトープを含むポリペプチドの部分を含み得る。このような断片は、一般的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７連続アミノ酸、さらにより好ましくはその少なくとも約１０連続アミノ酸を含有する。断片は、一般的には、基本的に受容体の細胞外ドメイン由来である。ある実施形態において、免疫原は、脂質膜中、一般的には細胞の表面の、野生型ヒトＳｉｇｌｅｃポリペプチドを含む。具体的な実施形態において、免疫原は、任意選択により処理されるかまたは溶解されるインタクトな細胞、特にインタクトなヒト細胞を含む。他の実施形態において、本ポリペプチドは組み換えＳｉｇｌｅｃポリペプチドである。
【０１２４】
非ヒト哺乳動物に抗原で免疫付与するステップは、マウスにおいて抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の何らかの方式で行われ得る（例えば、その開示全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。任意選択により、完全または不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと共に免疫原を緩衝液中で懸濁するかまたは溶解させる。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための方法は、当業者にとって周知であり、何ら限定していない。これらのパラメーターは、異なる免疫原に対して異なり得るが、容易に明らかとなり得る。
【０１２５】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫付与の位置および頻度も当技術分野で周知である。典型的な免疫付与プロトコールにおいて、第１日に非ヒト動物に抗原を腹腔内注射し、約１週間後に再び注射する。この後、第２０日前後に、任意選択により、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと共に抗原のリコール注射を行う。リコール注射は、静脈内で行い、数日連続して反復し得る。この後、第４０日に、静脈内または腹腔内の何れかで、一般的にはアジュバントなしで、ブースター注射を行う。このプロトコールの結果、約４０日後、抗原特異的な抗体産生Ｂ細胞が生成する。結果として免疫付与で使用した抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の生成が起こる限り、他のプロトコールも使用し得る。
【０１２６】
代替的な実施形態において、非免疫付与非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、インビトロで増殖させ、次いで細胞培養中で免疫原に曝露する。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合ステップを行う。
【０１２７】
モノクローナル抗体の場合、次のステップは、免疫付与した非ヒト哺乳動物から脾臓細胞を分離し、続いて、抗体産生ハイブリドーマを形成させるために、不死化細胞とこれらの脾臓細胞を融合させることである。非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の分離は当技術分野で周知であり、一般的には、麻酔下の非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出し、それを切って小片にし、単一の細胞懸濁液を生成させるために、細胞ストレイナーのナイロンメッシュを通じて脾膜から脾臓細胞を適切な緩衝液中に圧搾することを含む。この細胞を洗浄し、遠心し、あらゆる赤血球細胞を溶解する緩衝液中で再懸濁する。溶液を再び遠心し、ペレット中の残留リンパ球を新鮮な緩衝液中で最終的に再懸濁する。
【０１２８】
分離し、単一細胞懸濁液中に入れたら、リンパ球を不死細胞株に融合させ得る。これは、一般的にはマウス骨髄腫細胞株であるが、ハイブリドーマを作製するのに有用な多くの他の不死細胞株が当技術分野で公知である。マウス骨髄腫株としては、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のもの、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ａから入手可能なＸ６３  Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞が挙げられるが限定されない。融合はポリエチレングリコールなどを使用して達成される。次いで、未融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する選択培地中で、得られたハイブリドーマを増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、一般的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【０１２９】
ハイブリドーマは、一般的にはマクロファージのフィーダー層上で増殖させる。マクロファージは、脾臓細胞を分離するために使用される、好ましくは非ヒト哺乳動物の同腹仔からのものであり、一般的にはハイブリドーマを播種する数日前に不完全フロインドアジュバントなどで刺激する。融合方法は、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｇｏｄｉｎｇ、“Ｍｏｎｏｃｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）に記載されている。
【０１３０】
コロニー形成および抗体産生のために十分な時間にわたり選択培地中で細胞を増殖させる。これは、通常、約７〜約１４日間である。
【０１３１】
次いで、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する抗体産生についてハイブリドーマコロニーをアッセイする。このアッセイは、一般的には、比色分析ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマを増殖させるウェルに適合させ得るあらゆるアッセイを使用し得る。他のアッセイとしては、ラジオイムノアッセイまたは蛍光励起細胞分取が挙げられる。１つ以上の別個のコロニーが存在するか否かを決定するために、所望の抗体産生について陽性であるウェルを調べる。複数のコロニーが存在する場合、単一細胞のみが所望の抗体を産生するコロニーを生じさせていることを確実にするために、細胞を再クローニングし、増殖させ得る。一般的には、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド、例えばＳｉｇｌｅｃ発現細胞に結合する能力についても試験され得る。
【０１３２】
モノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマをＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中でより大量に増殖させ得る。代替的に、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水癌としてインビボで増殖させ得る。
【０１３３】
所望のモノクローナル抗体を産生させるのに十分な増殖後、モノクローナル抗体を含有する増殖培地（または腹水）を細胞から分離して除き、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、一般に、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡもしくはプロテインＧ−セファロースを使用したクロマトグラフィーまたはアガロースもしくはセファロースビーズなどの固体支持体に連結される抗マウスＩｇによって達成される（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．１８−１０３７−４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＣに全て記載されている）。結合される抗体は、一般的には、抗体含有分画の即時の中和と共に低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシンまたは酢酸緩衝液）を使用することによってプロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出される。これらの分画をプールし、透析し、必要に応じて濃縮する。
【０１３４】
単一の明らかなコロニーがある陽性ウェルを一般的には再クローニングし、再アッセイして、１つのモノクローナル抗体のみが検出され、産生されていることを保証する。
【０１３５】
抗体は、例えば（その開示全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されるような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によっても作製され得る。
【０１３６】
抗体は、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドへの最大限の結合を達成するために必要な濃度についてＳｉｇｌｅｃで滴定することができる。Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド（またはそれを発現する細胞）への結合に関する「ＥＣ５０」は、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド（またはそれを発現する細胞）への結合に関して最大応答または効果の５０％を生じる抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の効果的な濃度を指す。
【０１３７】
Ｓｉｇｌｅｃに結合可能であり、かつ／または他の所望の特性を有することが可能な抗体が同定されたら、一般的には、他のＳｉｇｌｅｃポリペプチドおよび／または無関係なポリペプチドを含む他のポリペプチドへのこれらの結合能について、本明細書中に記載のものを含む標準的な方法を使用してこれらも評価する。理想的には、抗体はかなりの親和性でＳｉｇｌｅｃ、例えばヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／またはヒトＳｉｇｌｅｃ−９にのみ結合し、無関係のポリペプチド、とりわけＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ以外のポリペプチドまたは所望のＳｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９）以外のＳｉｇｌｅｃに対して顕著なレベルで結合しない。しかし、当然のことながら、Ｓｉｇｌｅｃに対する親和性が実質的に他のＳｉｇｌｅｃおよび／または他の無関係なポリペプチドに対する親和性よりも大きい限り（例えば、５×、１０×、５０×、１００×、５００×、１０００×、１０，０００×またはそれを超える）、抗体は、本方法での使用に適切である。
【０１３８】
抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、これらがヒトＦｃγ受容体への特異的な結合を減少させるかまたは実質的に欠くように、非枯渇抗体として調製され得る。このような抗体は、Ｆｃγ受容体に対して結合しないことまたはこれに対する結合親和性が低いことが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。あるこのような例は、ヒトＩｇＧ４定常領域である。代替的に、Ｆｃ受容体結合を回避するために、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片など、定常領域を含まない抗体断片を使用し得る。Ｆｃ受容体結合は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおけるＦｃ受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含め、当技術分野で公知の方法に従い評価し得る。また、Ｆｃ受容体への結合を最小化するかまたは除外するためにＦｃ部分が修飾される何らかの抗体アイソタイプを使用し得る（例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第０３１０１４８５号パンフレットを参照されたい）。例えばＦｃ受容体結合を評価するための細胞に基づくアッセイなどのアッセイは当技術分野で周知であり、例えば国際公開第０３１０１４８５号パンフレットに記載されている。
【０１３９】
Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主への遺伝子移入のために適切な発現ベクターに入れる。次いで、抗体またはそれらの変異体、例えばそのモノクローナル抗体のヒト化バージョン、抗体の活性断片、抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体または検出可能部分を含むバージョンの組み換え産生のために宿主を使用する。
【０１４０】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離し、配列決定し得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ得、次いで組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために、これを、そのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞に遺伝子移入する。本明細書中の他の箇所に記載されるように、多数の目的の何れかのために、例えば抗体をヒト化する断片もしくは誘導体を作製するために、または例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位において抗体の配列を修飾するために、このようなＤＮＡ配列を修飾し得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌中の組み換え発現は、当技術分野で周知である（例えば、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，ｐｐ．２５６（１９９３）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０，ｐ．１５１（１９９２）を参照されたい）。
【０１４１】
本発明に関連して、「共通の決定基」は、ヒト阻害Ｓｉｇｌｅｃ、特にＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃの受容体のいくつかの遺伝子産物によって共有される決定基またはエピトープを指す。抗体は、少なくともＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９によって共有される共通の決定基に結合し得る。ある実施形態において、この共通決定基は、任意選択により、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ、特にＳｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および−１２の１つ以上またはその全てにおいて存在し得ない。ある実施形態において、この共通決定基は、Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および−１２上に存在しない。
【０１４２】
ｓｉｇｌｅｃポリペプチド（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９、特に実質的にまたは基本的にモノクローナル抗体ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅもしくは−Ｆ（Ｓｉｇｌｅｃ−９特異的）またはｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５もしくは−６（Ｓｉｇｌｅｃ−７特異的）と同じエピトープに結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合が評価され得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイの何れか１つを用いて容易に決定し得る。多くのこのようなアッセイは、日常的に実施され、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照されたい）。本明細書中に記載の抗体が結合するエピトープを実際に決定することは、本明細書中に記載のモノクローナル抗体と同じまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定するのに何ら必要とされないことを理解されたい。
【０１４３】
例えば、調べようとする試験抗体は、異なるソースの動物から得られるか、または異なるＩｇアイソタイプのものでもあり、対照（例えば、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅもしくは−ＦまたはｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５もしくは−６）および試験抗体を混合し（または予め吸着させ）、Ｓｉｇｌｅｃポリペプチドを含有する試料に適用する、単純な競合アッセイを使用し得る。ウエスタンブロッティングおよびＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用に基づくプロトコールは、このような競合実験での使用に適切である。
【０１４４】
特定の実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ抗原試料に適用する前のある時間、対照抗体（例えば、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅもしくは−ＦまたはｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５もしくは−６）を様々な量の試験抗体（例えば、約１：１０または約１：１００）と予め混合する。他の実施形態において、対照および様々な量の試験抗体をＳｉｇｌｅｃ抗原試料への曝露中に単純に混合し得る。（例えば、未結合抗体を排除するための分離または洗浄技術を使用することによって）遊離抗体から結合抗体を、（例えば、種特異的なまたはアイソタイプ特異的な二次抗体を使用することにより、または検出可能標識でｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５、または−６を特異的に標識することにより）試験抗体からｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５、または−６を区別し得る限り、試験抗体がｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５、または−６の抗原への結合を減少させるか否かを判定し得、これは、試験抗体がｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５、または−６と結合について競合し、かつ／または共通のＳｉｇｌｅｃ上の結合部位を認識することを示す。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識化）対照抗体の結合は、対照高値となり得る。対照低値は、標識化（ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６）抗体を完全に同じタイプの（ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６）非標識抗体と温置することによって得られ得、ここで、競合が起こり、標識抗体の結合を減少させる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識化抗体の反応性の顕著な減少は、Ｓｉｇｌｅｃ上の実質的に同じ領域を認識し、標識化（ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６）抗体と「交差反応」または競合するエピトープを認識する試験抗体を示す。約１：１０〜約１：１００のｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６：試験抗体の何れかの比率でＳｉｇｌｅｃ抗原へのｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６の結合を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、またはより好ましくは少なくとも約８０％もしくは９０％（例えば、約６５〜１００％）だけ減少させる何らかの試験抗体は、それぞれｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６と競合する抗体であるとみなされる。好ましくは、このような試験抗体は、少なくとも約９０％（例えば、約９５％）だけＳｉｇｌｅｃ抗原へのそれぞれｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６の結合を減少させる。
【０１４５】
例えば、フローサイトメトリー試験により競合を評価することもできる。このような試験において、１種類以上のある種のＳｉｇｌｅｃポリペプチドを保有する細胞を最初に例えばｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６と温置し、次いで蛍光色素またはビオチンで標識される試験抗体と温置し得る。本抗体は、飽和量のｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６との予備温置時に得られる結合が、それぞれｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６との予備温置を行わずに抗体により得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）（蛍光手段により測定される場合）である場合、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６と競合すると言われる。代替的に、抗体は、飽和量の試験抗体と予備温置される細胞上で（蛍光色素またはビオチンにより）それぞれ標識化ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６抗体と共に得られる結合が、試験抗体との予備温置を行わずに得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％またはそれ未満（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６と競合すると言われる。
【０１４６】
試験抗体が予め吸着され、Ｓｉｇｌｅｃ抗原が固定化される表面に飽和濃度で適用される単純な競合アッセイも使用し得る。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に適切な他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６）をＳｉｇｌｅｃ飽和濃度で表面と接触させ、Ｓｉｇｌｅｃおよび対照抗体の表面結合を測定する。対照抗体のこの結合を試験抗体の非存在下でのＳｉｇｌｅｃ含有面への対照抗体の結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体によるＳｉｇｌｅｃ含有面の結合の顕著な減少は、試験抗体が結合について競合し、したがって対照抗体と同じＳｉｇｌｅｃ上の領域を認識し得、試験抗体が対照抗体と「交差反応」するようになることを示す。少なくとも約３０％またはそれを超えて、好ましくは約４０％だけＳｉｇｌｅｃ抗原への対照（ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６など）抗体の結合を減少させる何らかの試験抗体は、対照（例えば、ｍＡｂＡ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅ、−Ｆ、−１、−２、−３、−４、−５または−６）としてＳｉｇｌｅｃへの結合について競合する抗体であるとみなされ得る。好ましくは、このような試験抗体は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％またはそれを超える）だけＳｉｇｌｅｃ抗原への対照抗体（例えば、３Ａ１１、１Ｈ９または２Ｂ４）の結合を減少させる。当然のことながら、対照および試験抗体の順序は逆転し得、すなわち、対照抗体を最初に表面に結合させ得、試験抗体をその後に競合アッセイにおいて表面と接触させる。好ましくは、Ｓｉｇｌｅｃ抗原に対してより高い親和性を有する抗体は、（抗体が交差反応することが推測される）第２の抗体に対して見られる結合の減少がより大きい規模であると予想されるため、最初に表面に結合させる。このようなアッセイのさらなる例は、例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれるＳａｕｎａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３：３３−４１で提供される。
【０１４７】
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者にとって公知のように行い得る。このようなマッピング／特徴評価方法の一例として、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体に対するエピトープ領域は、Ｓｉｇｌｅｃタンパク質における露出アミン／カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術のある具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素−重水素交換）の使用であり、ここで受容体およびリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合および逆交換が起こり、タンパク質結合に加わる骨格アミド基は、逆交換から保護され、したがって重水素化されたままとなる。関連領域は、この点でペプシンのタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定され得る。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ  Ｈ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７（２）ｐｐ．２５２−２５９（１９９９）Ｅｎｇｅｎ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｌ．（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３，２５６Ａ−２６５Ａを参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、一般的には遊離抗原および抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成する抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、一般的には、１５Ｎで選択的に同位体標識され、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲ−スペクトルで見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないようになる。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは、一般に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定され得る。例えばＥｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｒｅｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．２００４；（４４）：１４９−６７；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８１（１）ｐｐ．６１−６７（１９９８）；およびＳａｉｔｏ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９６  Ｊｕｎ；９（３）：５１６−２４を参照されたい。
【０１４８】
エピトープマッピング／特徴評価は質量分析方法を用いて行うこともできる。例えば、Ｄｏｗｎａｒｄ，Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００  Ａｐｒ；３５（４）：４９３−５０３およびＫｉｓｅｌａｒ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎａｒｄ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｍａｙ  １；７１（９）：１７９２−１８０１を参照されたい。プロテアーゼ消化技術もエピトープマッピングおよび同定との関連で有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化によって、例えばＳｉｇｌｅｃに対して約１：５０の比率でトリプシンを使用することによってｐＨ７〜８でｏ／ｎ消化を使用することにより、続いてペプチド同定のために質量分析（ＭＳ）を行うことにより決定し得る。続いて、抗Ｓｉｇｌｅｃ結合物によりトリプシン切断から保護されるペプチドは、トリプシン消化に供した試料および抗体と温置し、続いて例えばトリプシン（それにより結合物に対するフットプリントが明らかになる）による消化に供した試料の比較により同定し得る。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素もまたは代替的に同様のエピトープ特徴評価方法で使用し得る。さらに、酵素性消化により、可能性のある抗原性決定基配列が表面に露出していない、したがっておそらく免疫原性／抗原性について関連がないと思われるＳｉｇｌｅｃポリペプチドの領域内にあるか否かを分析するための迅速な方法が提供され得る。
【０１４９】
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープを明らかにするのに有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性に対する結果を測定する。突然変異が結合親和性の顕著な低下につながる場合、結合に関与する可能性が高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち折り畳まれていないタンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響しないことを確認し得る。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５；２６７：３８３−３８６；およびＷｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６；９３：１−６を参照されたい。
【０１５０】
エピトープ「フットプリンティング」のために電子顕微鏡も使用し得る。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５５：２７５−２７８は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成およびＸ結晶学の同時適用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂ断片の物理学的フットプリントを決定した。
【０１５１】
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  １９９０；３：２０８−１４；Ｎｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３；６４６：１５９−１６８；Ｌｅｉｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８；３７：３３０８−３３１１；Ｋｒｏｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２００２；１７：９３７−９４４を参照されたい。
【０１５２】
本発明の抗体と同じであるかまたは実質的に同じであるエピトープへの抗体結合が本明細書中に記載の代表的な競合アッセイの１つ以上で同定され得ることも注意すべきである。
【０１５３】
試験抗体がヒトＳｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９）に対する天然または非天然シアル酸リガンドの結合に影響を及ぼすか否かを評価するために交差ブロッキングアッセイも使用し得る。例えば、ヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体標品がシアル酸とのＳｉｇｌｅｃ−７相互作用を減少させるかまたは阻止するか否かを判定するために次の試験を行い得る。用量範囲の抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−９  Ｆａｂを固定用量においてヒトＳｉｇｌｅｃ−Ｆｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７Ｆｃおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃ）と室温で３０分間共温置し、次いでシアル酸リガンド発現細胞株を１時間にわたり添加した。染色緩衝液で細胞を２回洗浄した後、染色緩衝液で希釈したＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント二次抗体を細胞に添加し、プレートを４℃でさらに３０分間温置する。細胞を２回洗浄し、ＨＴＦＣプレートリーダーを備えたＡｃｃｕｒｙ  Ｃ６フローサイトメーターで分析する。試験抗体の非存在下において、Ｓｉｇｌｅｃ−Ｆｃは細胞に結合する。シアル酸へのＳｉｇｌｅｃ結合を阻止するＳｉｇｌｅｃ−Ｆｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７Ｆｃおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃ）と予め温置した抗体標品の存在下において、細胞へのＳｉｇｌｅｃ−Ｆｃの結合が減少する。しかし、当然のことながら、シアル酸リガンド発現標的細胞に対するＮＫ細胞溶解活性の再構成は、Ｓｉｇｌｅｃ−シアル酸リガンド相互作用の阻止を評価する必要なく直接評価し得る。
【０１５４】
任意選択により、本開示の抗体は、Ｅ１０−２８６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、欧州特許第１２３８２８２Ｂ１号（Ｍｏｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ  ｄｅｇｌｉ  Ｓｔｕｄｉ  ｄｉ  Ｇｅｎｏｖａ）に開示された抗体ＱＡ７９、もしくはＦａｌｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：７９３−８０１に記載のＺ１７６の何れか１つ以上の抗体以外の抗体、または上記の誘導体、例えば抗原結合領域または重鎖および／もしくは軽鎖ＣＤＲの全体もしくは一部を含むものに特定され得る。任意選択により、本開示の抗体は、２０１５年９月９日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１５／０７０５５０号明細書（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）に開示されている抗体３Ａ１１、１Ｈ９および２Ｂ４の何れか１つ以上以外の抗体であるものに特定され得る。他の実施形態において、上記の抗体は、抗体の性質に応じて、本開示の抗体の特徴を有するように改変され得る。
【０１５５】
本明細書において、細胞外ドメイン、例えばヒトＳｉｇｌｅｃ−９のＮ末端Ｖ−セットドメインまたはＩｇ様Ｃ２型ドメイン１または２に結合する抗体、例えば本明細書の実施例に示されるエピトープに結合する抗体が提供される。
【０１５６】
ある態様において、抗体は、抗体ｍＡｂ１、２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆと実質的に同じエピトープに結合する。ある実施形態において、抗体は、抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆが結合するエピトープと少なくとも部分的に重複するか、または少なくとも１つの残基を含むＳｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７のエピトープに結合する。抗体が結合する残基は、Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドの表面、例えば細胞の表面上に発現したＳｉｇｌｅｃ−９またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド中に存在するものとして特定され得る。抗体が結合したＳｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７上のアミノ酸残基は、例えば、表３に列挙される残基からなる群から選択され得る。
【０１５７】
Ｓｉｇｌｅｃ−９突然変異体で遺伝子移入された細胞への抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の結合を測定し、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体が野生型Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド（例えば、配列番号２）に結合する能力と比較することができる。Ｓｉｇｌｅｃ−７にさらに結合する抗体について、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の結合は、追加的または代替的に、Ｓｉｇｌｅｃ−７突然変異体（例えば、表３の）で遺伝子移入した細胞を用いて行い、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体が野生型Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド（例えば、配列番号１）に結合する能力と比較することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体と突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド（例えば、表３の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９またはＳｉｇｌｅｃ−７）との間の結合の減少は、結合親和性の低下（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験などの公知の方法により、または突然変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ（商標）（ＳＰＲ）試験により測定される）および／または抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の全結合能力の低下（例えば、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少により証明される）があることを意味する。結合の有意な減少は、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体がＳｉｇｌｅｃ−９に結合している場合、突然変異した残基が抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体への結合に直接関与するか、または結合タンパク質に近接していることを示す。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、結合の有意な減少は、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体と突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとの間の結合親和性および／または能力が、抗体と野生型Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとの間の結合と比較して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超だけ減少することを意味する。特定の実施形態では、結合は検出可能限界以下に減少される。いくつかの実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の突然変異Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドへの結合が、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体と野生型Ｓｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドとの間に観察される結合の５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％または１０％未満）である場合、結合の有意な減少が証明される。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、突然変異体Ｓｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７ポリペプチドに対して有意に低い結合を示し、抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆが結合したアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸で置換された抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体が提供される。ある実施形態において、突然変異体は、野生型Ｓｉｇｌｅｃポリペプチド（例えば、配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチド）への結合と比較して、表３の突然変異体Ｍ６、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１５およびＭ１６から選択される突然変異体である。ある実施形態において、突然変異体は、野生型Ｓｉｇｌｅｃ−７ポリペプチド（例えば、配列番号１のポリペプチド）への結合と比較して、表３の突然変異体Ｍ６、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１５およびＭ１６から選択される突然変異体である。
【０１６０】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｎ７８、Ｐ７９、Ａ８０、Ｒ８１、Ａ８２および／またはＶ８３（配列番号２を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３、４、５または６つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６１】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｎ７７、Ｄ９６、Ｈ９８および／またはＴ９９（配列番号２を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３または４つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６２】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｗ８４、Ｅ８５、Ｅ８６および／またはＲ８８（配列番号２を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３または４つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６３】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｓ４７、Ｈ４８、Ｇ４９、Ｗ５０、Ｉ５１、Ｙ５２、Ｐ５３および／またはＧ５４（配列番号２を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７または８つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６４】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、残基Ｋ１３１および／またはＨ１３２（配列番号２を参照されたい）の一方または両方を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６５】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｒ６３、Ａ６６、Ｎ６７、Ｔ６８、Ｄ６９、Ｑ７０および／またはＤ７１（配列番号２を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３、４、５、６または７つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６６】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｐ５５、Ｈ５８、Ｅ１２２、Ｇ１２４、Ｓ１２５および／またはＫ１２７（配列番号２を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３、４、５または６つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−９上のエピトープに結合する。
【０１６７】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｎ８２、Ｐ８３、Ａ８４、Ｒ８５、Ａ８６および／またはＶ８７（配列番号１を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３、４、５または６つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−７上のエピトープに結合する。
【０１６８】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｎ８１、Ｄ１００、Ｈ１０２および／またはＴ１０３（配列番号１を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３または４つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−７上のエピトープに結合する。
【０１６９】
ある態様において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、Ｗ８８、Ｅ８９、Ｅ９０、Ｒ９２（配列番号１を参照されたい）からなる群から選択される１、２、３または４つの残基を含むヒトＳｉｇｌｅｃ−７上のエピトープに結合する。
【０１７０】
Ｓｉｇｌｅｃに対する所望の結合を有する抗原結合化合物が得られたら、そのＳｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９）阻害能についてこれを評価し得る。例えば、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体が（例えば、細胞上に存在するような）シアル酸リガンドにより誘導されるＳｉｇｌｅｃ活性化を低下させるかまたは阻止する場合、Ｓｉｇｌｅｃ限定リンパ球の細胞傷害性を向上させ得る。これは、典型的な細胞傷害性アッセイにより評価し得、その例を以下に記載する。
【０１７１】
抗体がＳｉｇｌｅｃ介在性シグナル伝達を低下させる能力は、例えばＳｉｇｌｅｃ−７またはＳｉｇ−ｌｅｃ−９を発現するＮＫ細胞および個々のＳｉｇｌｅｃのシアル酸リガンドを発現する標的細胞を使用して、標準的な４時間インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験し得る。Ｓｉｇｌｅｃ−７または−９がシアル酸リガンドを認識するため、このようなＮＫ細胞は、シアル酸リガンドを発現する標的を効果的に死滅させず、リンパ球介在性の細胞溶解を妨害する阻害シグナル伝達の開始および拡大につながる。任意選択により、本明細書の実施例の方法に従ってアッセイを実施することができる。例えば、ドナーから精製され、使用前に３７℃で一晩温置された新鮮なＮＫ細胞として初代ＮＫ細胞を用いた実施例８を参照されたい。このようなインビトロ細胞傷害性アッセイは、例えばＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒ−ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）に記載のように、当技術分野で周知である標準的方法により行われ得る。標的細胞をＮＫ細胞の添加前に５１Ｃｒで標識し、次いで死滅は、死滅の結果としての細胞から培地への５１Ｃｒの放出に比例するものとして推定する。Ｓｉｇｌｅｃ−７および／または−９がシアル酸リガンドに結合するのを妨害する抗体の添加の結果、Ｓｉｇｌｅｃを介した阻害シグナル伝達の開始および拡大が妨げられる。したがって、このような薬剤の添加の結果、標的細胞のリンパ球介在性の死滅が増加する。それにより、このステップは、例えばリガンド結合を阻止することによりＳｉｇｌｅｃ−７または−９誘導性の負のシグナル伝達を妨げる薬剤を同定する。特定の５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ−７または−９−発現ＮＫエフェクター細胞は、シアル酸リガンド陰性標的細胞（例えば、シアリダーゼで処理した細胞）を死滅させ得るが、シアル酸リガンド発現対照細胞はあまり死滅させない。このように、ＮＫエフェクター細胞は、特定のＳｉｇｌｅｃを介したシアル酸誘導性の阻害シグナル伝達のために、シアル酸リガンド陽性細胞をあまり効率的に死滅させない。このような５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイにおいてＮＫ細胞をブロッキング抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体と予め温置する場合、抗体濃度依存的にシアル酸リガンド発現細胞がより効率的に死滅される。本アッセイは、各Ｓｉｇｌｅｃ、例えばＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９に対して個別に行い得る。
【０１７２】
抗体の阻害活性（すなわち細胞傷害性促進能）は、多くの他の方法の何れかでも、例えばその開示が参照により本明細書中に組み込まれるＳｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１１２９−１１３６に記載されるような細胞内遊離カルシウムにおけるその効果により、または脱顆粒マーカーＣＤ１０７もしくはＣＤ１３７発現などのＮＫ細胞の細胞傷害性活性化のマーカーにおけるその影響により、評価し得る。何らかの細胞に基づく細胞傷害性アッセイを使用して、例えば、それぞれの開示全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｓｉｖｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１１２９−１１３６；Ｖｉｔａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８；１８７：２０６５−２０７２；Ｐｅｓｓｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９８；１８８：９５３−９６０；Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎ．２００１；８：１１３１−１１３５；Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９９；１９０：１５０５−１５１６において開示されるように、Ｐ８１５、Ｋ５６２細胞などの標的細胞または適切な腫瘍細胞を死滅させるためにＮＫ細胞を刺激する抗体の能力を評価するために何らかの他のパラメーターを測定することにより、ＮＫ、ＴまたはＮＫＴ細胞活性を評価することもできる。
【０１７３】
ある実施形態において、抗体標品は、Ｓｉｇｌｅｃ限定リンパ球の細胞傷害性の少なくとも１０％の増強、好ましくはＮＫ細胞傷害性の少なくとも４０％もしくは５０％の増強またはより好ましくはＮＫ細胞傷害性の少なくとも７０％の増強を引き起こす。
【０１７４】
ＮＫ細胞のサイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−ｙおよびＴＮＦ−α産生）を刺激するために抗体とＮＫ細胞を温置するサイトカイン放出アッセイを使用して、細胞傷害性リンパ球の活性にも対処し得る。代表的なプロトコールにおいて、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−ｙ産生は、培養４日後の、細胞表面および細胞質内染色およびフローサイトメトリーによる分析によって評価する。簡潔に述べると、ブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を培養の最後の４時間にわたり５μｇ／ｍＬの最終濃度で添加する。次いで細胞を透過処理（ＩｎｔｒａＰｒｅｐ（商標）；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＰＥ−抗ＩＦＮ−ｙまたはＰＥ−ＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）での染色前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ｍＡｂと温置する。ＥＬＩＳＡ（ＧＭ−ＣＳＦ：ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＩＦＮ−ｙ：ＯｐｔＥＩＡ  ｓｅｔ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、ポリクローナル活性化ＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ｙ産生を上清中で測定する。
【０１７５】
抗体の断片および誘導体（別段の指定がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、本願で使用される場合の１つまたは複数の「抗体」という用語に包含される）は、当技術分野で公知の技術により作製し得る。「断片」は、インタクト抗体の一部分、一般的には抗原結合部位または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；ダイアボディ；（１）１本鎖Ｆｖ分子、（２）会合する重鎖部分がなく、軽鎖可変ドメインを１つのみ含有する１本鎖ポリペプチドまたは軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそれらの断片、および（３）会合する軽鎖部分がなく、重鎖可変領域を１つのみ含有する１本鎖ポリペプチドまたは重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を含むが限定されない、近接アミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチド（本明細書中で「１本鎖抗体断片」または「１本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）である何らかの抗体断片；および抗体断片から形成される多特異性（例えば、二特異性）抗体が挙げられる。とりわけ、ナノボディ、ドメイン抗体、単ドメイン抗体または「ｄＡｂ」が挙げられる。
【０１７６】
特定の実施形態において、抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、例えば相同非ヒト配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインに対するコード配列を置換することによって（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ｐｐ．６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドに対するコード配列の全てまたは一部を共有結合により連結することにより、発現ベクターに挿入する前に修飾し得る。このようにして、オリジナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。一般的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドが抗体の定常ドメインに対して置換される。
【０１７７】
任意選択により、抗体はヒト化される。抗体の「ヒト化」型は、マウス免疫グロブリン由来の最小配列を含有する特異的なキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。殆どの部分に対して、ヒト化抗体は、オリジナル抗体の所望の特異性、親和性および能力を維持しながら、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基がオリジナル抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【０１７８】
一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列の何れでも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに高め、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てがオリジナル抗体のものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、通常はヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、その開示全体が参照により本明細書中に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；および米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。
【０１７９】
ヒト化抗体を作製することにおいて使用しようとするヒト可変ドメイン、軽鎖および重鎖の両方の選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」方法に従い、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対して抗体の可変ドメインの配列をスクリーニングする。次に、マウスのものに最も近いヒト配列が、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受容される（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．１９６，１９８７，ｐｐ．９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体のために同じフレームワークを使用し得る（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１，ｐ．２６２３（１９９３））。
【０１８０】
抗体がＳｉｇｌｅｃ受容体に対する高親和性および他の有利な生物学的特性を保有してヒト化されることはさらに重要である。この目的を達成するために、ある方法に従い、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析の過程によってヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元構造を例示し、表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンのその抗原への結合能に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基を選択し、コンセンサスおよび輸入配列から組み合わせ得、標的抗原に対する親和性向上などの所望の抗体特性が達成されるようになる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的に、および最も実質的に関与する。
【０１８１】
「ヒト化」モノクローナル抗体を作製する別の方法は、免疫付与のために使用されるマウスとして、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用することである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子により置換されているマウス宿主である。したがって、このマウスにより、またはこのマウスのＢ細胞から作製されるハイブリドーマにおいて産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその全体において本明細書中に組み込まれる、米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
【０１８２】
ヒト抗体は、免疫付与のためにヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用することによる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）２５５）かまたはファージディスプレイ法を用いた抗体レパートリーの選択によるなど、様々な他の技術によっても作製され得る。このような技術は、当業者にとって公知であり、本願で開示されるようにモノクローナル抗体から出発して実行され得る。
【０１８３】
ある実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、それらがヒトＦｃγ受容体、例えばＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ６４の何れか１つ以上に実質的な特異的結合を有しないように調製され得る。このような抗体は、Ｆｃγ受容体に対する結合を欠くことまたは低い結合性を有することが知られている様々な重鎖の定常領域を含み得る。代替的に、Ｆｃ受容体結合を回避するために、Ｆ（ａｂ’）２断片など、定常領域を含まない（または部分的に含む）抗体断片を使用し得る。Ｆｃ受容体結合は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイにおけるＦｃ受容体タンパク質への抗体の結合を試験することを含め、当技術分野で公知の方法に従い評価し得る。また、Ｆｃ受容体への結合を最小化または除外するためにＦｃ部分が修飾される（例えば、１、２、３、４、５つまたはそれを超えるアミノ酸置換を導入することによって）何らかの抗体ＩｇＧアイソタイプを一般に使用し得る（例えば、その開示が参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットを参照されたい）。Ｆｃ受容体結合を評価するための細胞に基づくアッセイなどのアッセイは、当技術分野で周知であり、例えば国際公開第０３／１０１４８５号パンフレットに記載されている。
【０１８４】
ある実施形態において、抗体は、エフェクター細胞との最小限の相互作用を有する「Ｆｃサイレント」抗体を生じるＦｃ領域における１つ以上の特異的突然変異を含み得る。サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域における突然変異によって得ることができ、当技術分野において記載されてきた。Ｎ２９７Ａ突然変異、ＬＡＬＡ突然変異（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ｖｏｌ．２０（６）：６８５−６９１）；Ｄ２６５Ａ（Ｂａｕｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：６６６４−６９）、およびＨｅｕｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２０１２／０６５９５０号パンフレットを参照されたい。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ある実施形態において、抗体は、ヒンジ領域に１、２、３つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２であり、残基２３３〜２３６、任意選択により、２３３〜２３８（ＥＵ付番）において１つ、２つまたは３つの置換を含む。一実施形態では、抗体はＩｇＧ４であり、残基３２７、３３０および／または３３１（ＥＵ付番）に１つ、２つまたは３つの置換を含む。サイレントＦｃ  ＩｇＧ１抗体の例は、ＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含むＬＡＬＡ突然変異体である。Ｆｃサイレント突然変異の別の例は、例えばＤＡＰＡ（Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ）突然変異（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）としてＩｇＧ１抗体において用いられる、残基Ｄ２６５、またはＤ２６５およびＰ３２９における突然変異である。別のサイレントＩｇＧ１抗体は、残基Ｎ２９７における突然変異（例えば、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｓ突然変異）を含み、その結果、グリコシル化／非グリコシル化抗体を生じる。他のサイレント突然変異は、残基Ｌ２３４およびＧ２３７における置換（Ｌ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ）；残基Ｓ２２８、Ｌ２３５およびＲ４０９における置換（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｒ４０９Ｋ、Ｔ、Ｍ、Ｌ）；残基Ｈ２６８、Ｖ３０９、Ａ３３０およびＡ３３１における置換（Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ）；残基Ｃ２２０、Ｃ２２６、Ｃ２２９およびＰ２３８における置換（Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ）；残基Ｃ２２６、Ｃ２２９、Ｅ２３３、Ｌ２３４およびＬ２３５における置換（Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ；残基Ｋ３２２、Ｌ２３５およびＬ２３５における置換（Ｋ３２２Ａ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）；残基Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３３１における置換（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ）；残基２３４、２３５および２９７における置換；残基Ｅ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２における置換（Ｌ２３５Ｅ／Ｅ３１８Ａ／Ｋ３２０Ａ／Ｋ３２２Ａ）；残基（Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ）における置換；残基２４３および２６４における置換；残基２９７および２９９における置換；ＥＵ付番系によって定義される残基２３３、２３４、２３５、２３７および２３８がＰＡＡＡＰ、ＰＡＡＡＳおよびＳＡＡＡＳから選択される配列を含む置換（国際公開第２０１１／０６６５０１号パンフレットを参照されたい）を含む。
【０１８５】
ある実施形態において、抗体は、Ｆｃ領域に１つ以上の特異的突然変異を含むことができ、その結果、本開示の抗体の改善された安定性がもたらされる、例えば複数の芳香族アミノ酸残基を含みかつ／または高い疎水性を有する。例えば、そのような抗体は、ヒトＩｇＧ１起源のＦｃドメインを含み、Ｋａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７、３３０および／または３３１における突然変異を含む。そのようなＦｃドメインの一例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓまたは（Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ））を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。このようなＦｃドメインの別の例は、Ｋａｂａｔ残基Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０およびＰ３３１における置換（例えば、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ）を含む。ある実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、およびＰ３３１Ｘ３置換を含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１はアラニンもしくはフェニルアラニンまたはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２はグルタミン酸またはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３はセリンまたはその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換、およびＰ３３１Ｘ４置換を含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ３はグリシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ４はプロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１はアラニンもしくはフェニルアラニンまたはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２はグルタミン酸またはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３はアラニンまたはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ４はセリンまたはその保存的置換である。別の実施形態において、抗体は、Ｆｃドメイン、任意選択により、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを含む抗体であり、Ｌ２３４Ｘ１置換、Ｌ２３５Ｘ２置換、Ｇ２３７Ｘ４置換、Ｇ３３０Ｘ４置換、およびＰ３３１Ｘ５置換を含み、Ｘ１はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ２はロイシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ３はグリシン以外の任意のアミノ酸残基、Ｘ４はアラニン以外のアミノ酸残基、Ｘ５はプロリン以外のアミノ酸残基であり、任意選択により、Ｘ１はアラニンもしくはフェニルアラニンまたはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ２はグルタミン酸またはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ３はアラニンまたはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ４はセリンまたはその保存的置換であり；任意選択により、Ｘ５はセリンまたはその保存的置換である。本明細書で使用されている略記法では、形式は、野生型残基：ポリペプチド中の位置：突然変異体残基であり、残基位置は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従って示される。
【０１８６】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはそれらと少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５および３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化３】
2019511220.tif 000005
【０１８７】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはそれらと少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５および３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化４】
2019511220.tif 000006
【０１８８】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはそれらと少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０および３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化５】
2019511220.tif 000007
【０１８９】
ある実施形態において、抗体は、以下のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはそれらと少なくとも９０％、９５％もしくは９９％同一の配列を含むが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７および３３１にアミノ酸残基を保持する（下線）。
【化６】
2019511220.tif 000008
【０１９０】
Ｆｃサイレント抗体は、ＡＤＣＣ活性を生じないかまたは低いＡＤＣＣ活性を生じ、すなわち、Ｆｃサイレント抗体は、５０％未満の特異的細胞溶解であるＡＤＣＣ活性を示す。好ましくは、抗体は、実質的にＡＤＣＣ活性を欠き、例えば、Ｆｃサイレント抗体は、５％未満または１％未満のＡＤＣＣ活性（特異的細胞溶解）を示す。Ｆｃサイレント抗体はまた、細胞表面（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ）でのＳｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−７のＦｃγＲ媒介性架橋の欠如を生じ得る。
【０１９１】
ある実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０、３３１および４０９（重鎖定常領域における残基の付番はＫａｂａｔによるＥＵ付番に従う）からなる群から選択される任意の１、２、３、４、５つまたはそれを超える残基において重鎖定常領域に置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５および３２２における置換を含む。ある実施形態において、抗体は残基２３４、２３５および３３１における置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７および３３１における置換を有する。ある実施形態において、抗体は、残基２３４、２３５、２３７、３３０および３３１における置換を有する。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１サブタイプのものである。アミノ酸残基は、ＫａｂａｔによるＥＵ付番に従って示される。
【０１９２】
抗体ＣＤＲ配列
抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅおよび−Ｆの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。具体的な実施形態において、モノクローナル抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆと同じエピトープまたは決定基と基本的に結合する抗体を提供し、任意選択により、本抗体は、抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆの超可変領域を含む。本明細書中の実施形態の何れかにおいて、抗体ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆは、アミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸配列によって特徴付けられ得る。ある実施形態において、モノクローナル抗体は、ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−ＦのＶＨおよび／もしくはＶＬ、またはＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２部分を含む。ｍＡｂ１の重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体も提供される。ある実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆの重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。ｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆの可変軽鎖可変領域またはｍＡｂ１、−２、−３、−４、−５、−６、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ、−Ｅまたは−Ｆの軽鎖可変領域のＣＤＲの１、２または３つをさらに含むモノクローナル抗体も提供される。任意選択により、前記軽鎖または重鎖ＣＤＲの何れか１つ以上は、１、２、３、４もしくは５つまたはそれを超えるアミノ酸修飾（例えば、置換、挿入または欠失）を含有し得る。任意選択により、抗体ｍＡｂ１の抗原結合領域の一部または全てを含む軽鎖および／または重鎖可変領域の何れかが、ヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域、任意選択により、ヒト定常領域、任意選択により、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプと融合され、任意選択により、エフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を低下させるためにアミノ酸置換をさらに含む抗体が提供される。
【０１９３】
別の態様において、表Ａ−１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ１のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ１のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ１のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ１のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ１のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ１のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体が提供される。
【０１９４】
【表１】
2019511220.tif 000009
【０１９５】
別の態様において、本発明は、表Ａ−３に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ３のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−３に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ３のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−３に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ３のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−３に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ３のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−３に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ３のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−３に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ３のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０１９６】
【表２】
2019511220.tif 000010
【０１９７】
別の態様において、本発明は、表Ａ−４に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ４のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−４に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ４のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−４に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ４のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−４に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ４のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−４に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ４のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−４に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ４のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０１９８】
【表３】
2019511220.tif 000011
【０１９９】
別の態様において、本発明は、表Ａ−５に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ５のＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−５に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ５のＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−５に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ５のＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−５に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ５のＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−５に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ５のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−５に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂ５のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２００】
【表４】
2019511220.tif 000012
【０２０１】
別の態様において、本発明は、表Ａ−７に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＡのＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−７に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＡのＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−７に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＡのＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−７に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＡのＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−７に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＡのＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−７に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＡのＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２０２】
【表５】
2019511220.tif 000013
【０２０３】
別の態様において、本発明は、表Ａ−８に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＢのＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−８に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＢのＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−８に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＢのＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−８に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＢのＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−８に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＢのＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−８に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＢのＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２０４】
【表６】
2019511220.tif 000014
【０２０５】
別の態様において、本発明は、表Ａ−９に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＣのＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−９に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＣのＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−９に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＣのＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−９に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＣのＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−９に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＣのＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−９に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＣのＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２０６】
【表７】
2019511220.tif 000015
【０２０７】
別の態様において、本発明は、表Ａ−１０に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＤのＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１０に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＤのＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１０に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＤのＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１０に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＤのＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１０に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＤのＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１０に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＤのＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２０８】
【表８】
2019511220.tif 000016
【０２０９】
別の態様において、本発明は、表Ａ−１１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＥのＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＥのＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＥのＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＥのＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＥのＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１１に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＥのＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２１０】
【表９】
2019511220.tif 000017
【０２１１】
別の態様において、本発明は、表Ａ−１２に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＦのＨＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１２に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＦのＨＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１２に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＦのＨＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１２に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＦのＬＣＤＲ１領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１２に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＦのＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得るもの；表Ａ−１２に規定のアミノ酸配列またはその少なくとも４、５、６、７、８、９もしくは１０個の近接アミノ酸の配列を含むｍＡｂＦのＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１つ以上が欠失し得るかまたは異なるアミノ酸により置換され得るものを含む抗体を提供する。
【０２１２】
【表１０】
2019511220.tif 000018
【０２１３】
本明細書中の実施形態の何れかの別の態様において、ＨＣＤＲ１、２、３およびＬＣＤＲ１、２、３配列の何れかは、任意選択により、全てが（またはそれぞれ独立に）Ｋａｂａｔ付番系（各ＣＤＲに対して表Ａ−１〜Ａ−１２に示されるとおり）のもの、Ｃｈｏｔｉａ付番系（各ＣＤＲに対して表Ａ−１〜Ａ−１２に示されるとおり）のもの、ＩＭＧＴ付番系（ＣＤＲに対して表Ａ−１〜Ａ−１２に示されるとおり）のものまたは何らかの他の適切な付番系のものとして特定され得る。
【０２１４】
本明細書中の実施形態の何れかの別の態様において、ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ、ｍＡｂＦ、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５またはｍＡｂ６の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３の何れも、その少なくとも４、５、６、７、８、９または１０個の近接アミノ酸の配列、および／または対応する配列番号で挙げられる特定のＣＤＲまたは一連のＣＤＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有するものとして特徴付けられ得る。
【０２１５】
本発明の抗体の何れかにおいて、例えばｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ、ｍＡｂＦ、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５またはｍＡｂ６において、特定される可変領域およびＣＤＲ配列は、配列修飾、例えば置換（１、２、３、４、５、６、７、８つまたはそれを超える配列修飾）を含み得る。ある実施形態において、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および／または３は、置換される残基が、ヒト起源の配列中に存在する残基である、１、２、３またはそれを超えるアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、置換は保存的修飾である。保存的配列修飾は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に顕著に影響しないかまたはこれを変化させないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的技術によって本発明の抗体に修飾を導入し得る。保存的アミノ酸置換は、一般的には、アミノ酸残基が同様の物理化学的特性の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。特定される可変領域およびＣＤＲ配列は、１、２、３、４またはそれを超えるアミノ挿入、欠失または置換を含み得る。置換が行われる場合、好ましい置換は保存的修飾である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定められている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐状側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）があるアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体は、本明細書中に記載のアッセイを用いて、保有される機能（すなわち本明細書中に記載の特性）について試験し得る。
【０２１６】
ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義系によるＣＤＲの配列を表Ａ−１〜Ａ−１２に要約する。本発明による抗体の可変領域の配列を以下の表Ｂに挙げる。本明細書中の何れかの実施形態において、シグナルペプチドまたはその何らかの部分をさらに含むかまたは欠くように、ＶＬまたはＶＨ配列を指定し、付番し得る。
【０２１７】
ある実施形態において、本発明の抗体は、それらの結合および／または機能的特性を保有する抗体断片である。
【０２１８】
【表１１】
2019511220.tif 000019
【０２１９】
【表１２】
2019511220.tif 000020
【０２２０】
抗体処方物
１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む医薬処方物中に抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体が組み込まれ得、前記処方物のｐＨは２．０〜１０．０である。本処方物は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤および界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬処方物は、水性処方物、すなわち水を含む処方物である。このような処方物は、一般に溶液または懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬処方物は水性溶液である。「水性処方物」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む処方物として定義される。同様に「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
【０２２１】
別の実施形態において、本医薬処方物は、凍結乾燥処方物であり、医師または患者が使用前にそれに溶媒および／または希釈剤を添加する。
【０２２２】
別の実施形態において、本医薬処方物は、事前に溶解する必要がない使用準備済みの乾燥処方物（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）である。
【０２２３】
さらなる態様において、本医薬処方物は、このような抗体の水溶液および緩衝液を含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬまたはそれを超える濃度で存在し、前記処方物のｐＨは約２．０〜約１０．０である。
【０２２４】
別の実施形態において、本処方物のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０および約５．５〜約７．５からなる一覧から選択される範囲である。
【０２２５】
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な各緩衝液は、本発明の代替的な実施形態を構成する。
【０２２６】
さらなる実施形態において、本処方物は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物はキレート剤も含む。本発明のさらなる実施形態において、本処方物は安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本処方物は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５を参照する。
【０２２７】
本発明のペプチド医薬処方物中に他の成分が存在し得る可能性がある。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたはタンパク質）および双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンおよびヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然ではあるが本発明の医薬処方物の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
【０２２８】
本発明による抗体を含有する医薬組成物は、いくつかの部位、例えば局所部位、例えば皮膚および粘膜部位、吸収を迂回する部位、例えば動脈における、静脈における、心臓における投与、および吸収を含む部位、例えば皮膚、皮下における、筋肉における、または腹部における投与において、このような処置を必要とする患者に投与し得る。本発明による医薬組成物の投与は、このような処置を必要とする患者への、いくつかの投与経路を通じて、例えば皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、舌、舌下、頬側、口腔における投与、経口、胃腸における投与、鼻腔、肺、例えば細気管支および肺胞またはそれらの組み合わせを通じた投与、上皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼、例えば結膜を通じた投与、ウレタル（ｕｒｅｔａｌ）および非経口投与であり得る。
【０２２９】
適切な抗体処方物は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体での経験を調べることによっても決定し得る。いくつかのモノクローナル抗体は、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾーレア（オマリズマブ）、ベクザー（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）など、臨床的状況で有効であることが示されており、本発明の抗体と共に同様の処方物を使用し得る。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の何れかの単回使用バイアルで、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０および注射用の滅菌水中でＩＶ投与用に処方された１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給され得る。ｐＨは６．５に調整する。別の実施形態において、本抗体は、ｐＨが６．０の約２０ｍＭクエン酸Ｎａ、約１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む処方物中で供給される。
【０２３０】
悪性腫瘍の診断および処置
本明細書中に記載のような抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体を使用して、個体、とりわけヒト患者を処置する方法も提供される。ある実施形態において、本発明は、ヒト患者への投与のための医薬組成物の調製における本明細書中で記載のような抗体の使用を提供する。一般的には、患者は、癌または感染性疾患、例えば細菌性またはウイルス性疾患に罹患しているか、またはそのリスクがある。
【０２３１】
例えば、ある態様において、本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／または−９限定免疫細胞、例えばリンパ球の活性の増強を、それを必要とする患者において行う方法を提供し、この方法は、中和抗Ｓｉｇｌｅｃ７および／または９抗体を前記患者に投与するステップを含む。本抗体は、例えばヒトまたはヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ−７および／または９抗体であり得、この抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／または−９受容体のシアル酸介在性活性化を低下させるかまたは妨害する。ある実施形態において、本方法は、リンパ球（例えば、ＮＫおよび／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）活性の向上が有益である疾患を有する患者においてこのようなリンパ球の活性を向上させることを対象とし、この疾患は、ＮＫもしくはＣＤ８＋Ｔ細胞による溶解の影響を受け易い細胞を含むか、このような細胞に影響を与えるか、またはこのような細胞により引き起こされ、または不十分なＮＫもしくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性により引き起こされるかまたは不十分なＮＫもしくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性によって特徴付けられ、例えば癌または感染性疾患である。例えば、ある態様において、本発明は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／または−９限定免疫細胞、例えばＮＫ細胞（例えば、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞）、Ｔ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ（例えば、免疫抑制またはＭ２マクロファージ）の活性（例えば、細胞活性化、抗腫瘍免疫または活性、サイトカイン産生、増殖）の増強を、それを必要とする患者において行う方法であって、本開示の中和抗Ｓｉｇｌｅｃ７および／または−９抗体を前記患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２３２】
ある実施形態において、本開示の抗体は、ＳＴ３ＧＡＬ６および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ１酵素（または例えば高レベルのＳＴ３ＧＡＬ６および／もしくはＳＴ３ＧＡＬ１酵素活性）の発現、任意選択により、ＳＴ３ＧＡＬ６酵素の過発現（健常個体における、例えば健常組織における発現と比較して）によって特徴付けられる腫瘍の処置において使用される。
【０２３３】
より具体的に、本明細書中における方法および組成物は、様々な癌および他の増殖性疾患の処置のために利用される。これらの方法は、リンパ球上の阻害受容体の阻止を介して免疫反応を促進することにより効果を発揮するため、これらは癌の非常に広い範囲に適用可能である。ある実施形態において、本開示の抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体で処置されるヒト患者は、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌（例えば、ＨＮＳＣＣ）、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）、メラノーマ、子宮癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、アスベストにより誘導されるものを含む環境誘導性の癌、例えば多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫／縦隔原発性Ｂ細胞性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞型リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫および前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫を含む血液系悪性腫瘍および前記癌の何れかの組み合わせを有する。本発明は転移性癌の処置にも適用可能である。患者は、処置前、処置中または処置後に、上記臨床特性の１つ以上に対して試験または選択され得る。
【０２３４】
抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体に基づく処置は、好ましくはウイルス、細菌、原生動物、カビまたは真菌による感染によって引き起こされる何らかの感染を含む感染性疾患を処置または予防するためにも使用され得る。このようなウイルス感染性生物としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペス（ＨＳＶ−２）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルスおよびＩ型または２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）が挙げられるが限定されない。細菌は、次のものを含むが限定されない感染生物の別の好ましいクラスを構成する：ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）；Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を含む連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｌ）；バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）；コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；Ｇ．バジナリス（Ｇ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）を含むガルドネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）；ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；サーモアクチノマイセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｒｎａ）；カンピロバクター（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）；Ｎ．ゴノローエ（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）およびＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）を含むナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）；Ｆ．メニンゴセプチクム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）およびＦ．オドラツルン（Ｆ．ｏｄｏｒａｔｕｒｎ）を含むフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）；Ｂ．ペルツッシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）およびＢ．ブロンキセプチカ（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）を含むボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）およびＳ．リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を含むセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）；エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）；Ｐ．ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）およびＰ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）を含むプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；Ｒ．フィケツフィ（Ｒ．ｆｉｃｋｅｔｔｓｆｉ）を含むリケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、Ｃ．シタッシ（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）およびＣ．トラコルナチス（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｒｎａｔｉｓ）を含むクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）；Ｍ．ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．ホルイツルン（Ｍ．ｆｏｌｌｕｉｔｕｒｎ）、Ｍ．ラプレ（Ｍ．ｌａｐｒａｅ）、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、Ｍ．カンサッシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）およびＭ．レプラエルヌリウム（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｒｎｕｒｉｕｍ）を含むマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；およびノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）。原生動物としては、リーシュマニア（ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、コクジディオア（ｋｏｋｚｉｄｉｏａ）およびトリパノソーマ（ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）が挙げられ得るが限定されない。寄生虫としては、クラミジア（ｃｈｌａｍｙｄｉａ）およびリケッチア（ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）が挙げられるが限定されない。
【０２３５】
抗体組成物は、個体が発現する対立遺伝子におけるＳｉｇｌｅｃ−９の１００位（配列番号２を参照されたい）またはＳｉｇｌｅｃ−７（配列番号１を参照されたい）の１０４位に存在する残基にかかわらず、個体を処置するために使用され得る。１００位にリシンを有するＳｉｇｌｅｃ−９（例えば、配列番号２）は集団の約４９％を表し）、１００位にグルタミン酸を有するＳｉｇｌｅｃ−９（例えば、配列番号１６０）は、集団の約３６％を表す。一実施形態において、抗体組成物は、Ｓｉｇｌｅｃ−９（配列番号２を参照されたい）の位置１００にリシンを有する個体およびＳｉｇｌｅｃ−９の位置１００にグルタミン酸を有する個体を処置するために使用される。ある実施形態において、その細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球など）がＳｉｇｌｅｃ−９の１００位（配列番号２を参照されたい）にリシンを発現する個体、およびその細胞がＳｉｇｌｅｃ−９の１００位にグルタミン酸を発現する個体を処置するために同一の投与計画が用いられる。ある実施形態において、投与計画は、個体において発現されるＭＩＣＡの特定の対立遺伝子に関係なく、同一の投与様式、同一の用量および同一の投与頻度を含む。
【０２３６】
本抗体組成物は、単剤療法において、またはその抗体が投与されている特定の治療目的のために通常利用される薬剤を含む１つ以上の他の治療剤との併用処置において使用され得る。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患または状態に対する単剤療法においてその薬剤に対して一般的に使用される量および治療計画で投与される。このような治療剤としては、抗癌剤および化学療法剤が挙げられるが限定されない。
【０２３７】
ある実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９および／または−７中和抗体は、ヒトＣＤ１６への結合を欠くが、ＣＤ１６発現エフェクター細胞（例えば、ＮＫまたはエフェクターＴ細胞）の活性を増強する。したがって、ある実施形態において、第２のまたはさらなる第２の治療薬は、（例えば、ＮＫ細胞によって発現されるＣＤ１６を介して）それが結合している細胞に対してＡＤＣＣを誘導することができる抗体または他のＦｃドメイン含有タンパク質である。一般的には、このような抗体または他のタンパク質は、目的の抗原、例えば腫瘍細胞上に存在する抗原（腫瘍抗原）、およびＦｃドメインまたはその一部に結合するドメインを含み、Ｆｃドメインを介した抗原結合ドメインおよびＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６）への結合を示す。ある実施形態において、そのＡＤＣＣ活性は、少なくとも部分的にＣＤ１６によって媒介される。ある実施形態において、さらなる治療薬は、天然または改変ヒトＦｃドメイン、例えばヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３抗体由来のＦｃドメインを有する抗体である。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」または「ＡＤＣＣ」という用語は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的細胞傷害性細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球および好酸球が含まれる。「ＡＤＣＣ誘導抗体」という用語は、当業者に公知のアッセイによって測定されるＡＤＣＣを示す抗体を指す。そのような活性は、典型的には、Ｆｃ領域の様々なＦｃＲとの結合によって特徴付けられる。いかなる特定の機構によっても限定されるものではないが、当業者は、抗体がＡＤＣＣを示す能力が、例えば、そのサブクラス（ＩｇＧ１またはＩｇＧ３など）による、Ｆｃ領域に導入された突然変異による、または抗体のＦｃ領域における糖パターンの改変によるものであり得ることを認識するであろう。ＡＤＣＣを誘発する抗体の例には、リツキシマブ（リンパ腫、ＣＬＬの処置用、トラスツズマブ（乳癌の処置用）、アレムツズマブ（慢性リンパ球性白血病の処置用）およびセツキシマブ（結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌の処置用）が挙げられる。ＡＤＣＣ増強抗体の例としては、ＧＡ−１０１（低フコシル化抗ＣＤ２０）、ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｆｃ増強抗ＨＥＲ２）、メポリズマブ、ＭＥＤＩ−５５１（Ｆｃ操作抗ＣＤ１９）、オビヌツズマブ（糖操作／低フコシル化抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（Ｆｃ操作抗ＣＤ２０）、ＸｍＡｂ（登録商標）５５７４／ＭＯＲ２０８（Ｆｃ操作抗ＣＤ１９）が挙げられるが限定されない。
【０２３８】
ある実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９および／または−７中和抗体は、ヒトＰＤ−１の阻害活性（例えば、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害する）を中和する薬剤の有効性を、とりわけヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤による処置に対する応答が弱い（または敏感でない）個人において増強する。抗Ｓｉｇｌｅｃ−９および／または−７中和抗体は、ＰＤ−１発現エフェクター細胞（例えば、ＮＫまたはエフェクターＴ細胞、例えばＳｉｇｌｅｃ−９発現ＮＫ細胞）の活性を増強するために有用であり得る。したがって、ある実施形態において、第２のまたはさらなる第２の治療剤は、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する抗体または他の薬剤である。
【０２３９】
プログラム死１（ＰＤ−１）（「プログラム細胞死１」とも呼ばれる）は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害性メンバーである。完全なヒトＰＤ−１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６４８６３に見出すことができる。ＰＤ−１の阻害活性の阻害または中和は、ＰＤ−Ｌ１誘導ＰＤ−１シグナル伝達を妨げるポリペプチド剤（例えば、抗体、Ｆｃドメインに融合したポリペプチド、イムノアドヘシンなど）の使用を含み得る。現在、市販または臨床評価中のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を阻止する少なくとも６つの薬剤が存在する。１つの薬剤は、ＢＭＳ−９３６５５８（ニボルマブ／ＯＮＯ−４５３８、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、以前はＭＤＸ−１１０６）である。ニボルマブ（商品名Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））は、ＰＤ−１およびＣＤ８０の両方へのＰＤ−Ｌ１リガンドの結合を阻害するＦＤＡ認可完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂであり、国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレットにおいて抗体５Ｃ４として記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。メラノーマ患者では、３ｍｇ／ｋｇの用量で最も有意なＯＲが観察されたが、他の癌のタイプでは１０ｍｇ／ｋｇであった。ニボルマブは、一般に癌の進行まで３週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇで投与される。「ヒトＰＤ−１の阻害活性を低下させる」、「ＰＤ−１を中和する」または「ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する」という用語と、ＰＤ−１が、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２などの１つ以上のその結合パートナーとの間の相互作用から生じるシグナル伝達能力において阻害される過程を指す。ＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤は、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２などのその結合パートナーの１つ以上との間の相互作用に起因するシグナル伝達を減少、阻止、阻害または抑制する。したがって、このような薬剤は、増殖、サイトカイン産生および／または細胞傷害性などのＴ細胞エフェクター機能を増強するように、Ｔリンパ球上に発現される細胞表面タンパク質によって媒介されるかまたはそれを介した負の共刺激シグナルを減少させることができる。
【０２４０】
ランブロリズマブまたはペンブロリズマブ（商品名Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））とも呼ばれるＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ社製ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ１ｍＡｂ）は、メラノーマの治療のためにＦＤＡによって承認され、他の癌において試験されている。ペンブロリズマブは、疾患の進行まで２週間または３週間ごとに２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで試験した。ヒト化抗体ｈ４０９の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ構築物である。全てがＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に寄託されている。ｈ４０９Ａ−ｌ  １の重鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドは２００８年６月９日に寄託され、０８１４６９＿ＳＰＤ−Ｈとして同定され、ｈ４０９Ａｌ  １の軽鎖をコードするＤＮＡを含むプラスミドは２００８年６月９日に寄託され、０８０１４７０＿ＳＰＤ−Ｌ−ｌ  １として同定された。Ｍｅｒｃｋ３７４５またはＳＣＨ−９００４７５としても知られているＭＫ−３４７５は、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットにも記載されている。
【０２４１】
ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製、抗ＰＤ−Ｌ１）は、ＦｃγＲ結合およびその結果としての抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を最小限に抑えることによって効力および安全性を最適化するように設計された、操作されたＦｃドメインを含むヒト抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂである。１、１０、１５、および２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量のＭＰＤＬ３２８０Ａを３週間ごとに最高１年間投与した。第３相試験では、ＭＰＤＬ３２８０ＡをＮＳＣＬＣにおいて３週間ごとに静脈内注入により１２００ｍｇで投与する。
【０２４２】
ＡＭＰ−２２４（ＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅおよびＧＳＫ）は、Ｆｃドメインに融合したＰＤ−Ｌ２細胞外ドメインを含むイムノアドヘシンである。ＰＤ−１を中和する薬剤の他の例は、ＰＤ−Ｌ２に結合する抗体（抗ＰＤ−Ｌ２抗体）を含み得、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との間の相互作用を阻止する。
【０２４３】
ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（ＣｕｒｅＴｅｃｈ／Ｔｅｖａ社製ヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤ１ｍＡｂ）、ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；  ＣｕｒｅＴｅｃｈ）（例えば、国際公開第２００９／１０１６１１号パンフレットを参照されたい）は別の例である。薬剤はリツキシマブ感受性再発性ＦＬを有する３０人の患者において試験され、患者は、４週間ごとの３ｍｇ／ｋｇでの静脈内ＣＴ−０１１の４回にわたる注入に、ＣＴ−０１１の最初の注入の２週間後に始まって毎週３７５ｍｇ／ｍ２で４週間にわたり投与されるリツキシマブを組み合わせて処置された。
【０２４４】
さらなる公知のＰＤ−１抗体および他のＰＤ−１阻害剤としては、ＡＭＰ−２２４（ＧＳＫにライセンスされたＢ７−ＤＣ／ＩｇＧ１融合タンパク質）、国際公開第２０１２／１４５４９３号パンフレットに記載のＡＭＰ−５１４、国際公開第２０１１／０６６３８９号パンフレットおよび米国特許出願公開第２０１３／０３４５５９号明細書に記載の抗体ＭＥＤＩ−４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅにより開発された抗ＰＤ−Ｌ１）、国際公開第２０１０／０７７６３４号パンフレットに記載の抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＢＭＳ−９３６５５９としても知られているＭＤＸ−１１０５は、国際公開第２００７／００５８７４号パンフレットに記載のＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂにより開発された抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および国際公開第２００６／１２１１６８号パンフレット、国際公開第２００９／０１４７０８号パンフレット、国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０１９９０６号パンフレットに記載の抗体および阻害剤が挙げられ、これらの開示は参照により本明細書中に組み込まれる。抗ＰＤ１抗体のさらなる例は、国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｈｅｎｇｒｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に開示されており、例えばそれぞれ配列番号６、配列番号７および／または配列番号８の軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、２および３、ならびにそれぞれ配列番号３、配列番号４または配列番号５の抗体重鎖可変ドメインＣＤＲ１、２および３を有する抗体であり、配列番号は国際公開第２０１５／０８５８４７号パンフレットに従った付番であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１への結合についてこれらの抗体の何れかと競合する抗体も使用することができる。
【０２４５】
代表的な抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブである（例えば、参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第２００９／１１４３３５号パンフレットを参照されたい）。抗ＰＤ−１抗体は、ＡＴＣＣに０８１４６９＿ＳＰＤ−Ｈとして寄託されたＤＮＡによってコードされる重鎖可変領域、およびＡＴＣＣに０８０１４７０＿ＳＰＤ−Ｌ１１として寄託されたＤＮＡによってコードされる軽鎖可変領域を含む、国際公開第２００８／１５６７１２号パンフレットの抗体ｈ４０９Ａ１であり得る。他の実施形態において、抗体は、ペンブロリズマブの重鎖および軽鎖のＣＤＲまたは可変領域を含む。したがって、ある実施形態において、抗体は、ＡＴＣＣに０８１４６９＿ＳＰＤ−Ｈとして寄託されたＤＮＡによってコードされるペンブロリズマブのＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにＡＴＣＣに０８０１４７０＿ＳＰＤ−Ｌ−ｌ  １として寄託されたＤＮＡによってコードされるペンブロリズマブのＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１中和剤は、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する抗ＰＤ−Ｌ１ｍＡｂである。いくつかの実施形態において、ＰＤ−１中和剤は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を阻害する抗ＰＤ１ｍＡｂである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１中和剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。
【０２４７】
処置方法において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体および第２の治療剤は、個別に、一緒に、または連続して、またはカクテルにして投与し得る。いくつかの実施形態において、本抗原結合化合物は、第２の治療剤の投与前に投与される。例えば、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、第２の治療剤の投与のおよそ０〜３０日前に投与し得る。いくつかの実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ結合化合物は、第２の治療剤の投与の、約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日または約１〜５日前に投与する。いくつかの実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、治療剤の投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、第２の治療剤の投与後に投与する。例えば、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、第２の治療剤の投与からおよそ０〜３０日後に投与し得る。いくつかの実施形態において、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体は、第２の治療剤の投与から、約３０分〜約２週間、約３０分〜約１週間、約１時間〜約２時間、約２時間〜約４時間、約４時間〜約６時間、約６時間〜約８時間、約８時間〜１日または約１〜５日後に投与する。
【０２４８】
他の態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−７＋および／またはＳｉｇｌｅｃ−９＋ＮＫ細胞および／またはＴ細胞、例えばＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞、ＣＤ５６ｄｉｍＮＫ細胞を同定するための方法が提供される。ＮＫ細胞および／またはＴ細胞上でのＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９の同時発現を評価することは、診断または予測法において使用し得る。例えば、生体試料は、個体から（例えば、血液試料から、癌患者から得られる癌または癌隣接組織から）得ることができ、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９＋ＮＫおよび／またはＴ細胞の存在について分析し得る。このような細胞上でのＳｉｇｌｅｃ−９の発現は、例えば、ＮＫおよび／またはＴ細胞、例えばＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドにより阻害される腫瘍浸潤性ＮＫおよび／またはＴ細胞を有する個体を同定するために使用し得る。このような細胞上でのＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の両方の発現は、例えば、ＮＫおよび／またはＴ細胞、例えばＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の両方のポリペプチドにより阻害される腫瘍浸潤性ＮＫおよび／またはＴ細胞を有する個体を同定するために使用し得る。本方法は、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９を中和する薬剤での処置に対する反応についての予測として有用であり得る。そのような細胞上のＳｉｇｌｅｃ−９（および任意選択により、さらなるＳｉｇｌｅｃ−７）の発現は、本開示の抗体での処置に適した個体を示し得る。
【０２４９】
特定の任意選択的な態様において、Ｓｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９に対する天然リガンドの腫瘍試料（例えば、腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織）中での存在を評価することにより、抗Ｓｉｇ−ｌｅｃ−７および／または−９抗体での処置について患者を同定し得る。本明細書中での治療用途または癌治療または予防方法の何れかのある実施形態において、個体における癌の処置または予防は、
ａ）癌を有する個体内の悪性細胞（例えば、腫瘍細胞）がＳｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現するか否かを決定することと、
ｂ）悪性細胞（例えば、腫瘍細胞）（の例えば表面上）によりＳｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドが顕著に発現されると判定されたら、それぞれの抗Ｓｉｇｌｅｃ７および／または−９抗体、例えば本開示の何れかの態様に従う抗体をその個体に投与することと
を含む。
【０２５０】
ある実施形態において、生体試料（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織および／または腫瘍隣接組織を含む試料）が主にＳｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現するという判定から、それぞれＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９ポリペプチドを阻害する抗体でその個体を処置し得る、および／またはそれにより利益を受け得る癌をその個体が有することが示される。
【０２５１】
ある実施形態において、Ｓｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドの顕著な発現は、特定の個体から採取される相当な数の腫瘍細胞において前記リガンドが発現されることを意味する。正確なパーセンテージ値により拘束されない一方で、一部の例において、患者から採取される腫瘍細胞（試料中）の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれを超えて存在する場合、リガンドが「顕著に発現される」と言われ得る。
【０２５２】
本方法の何れかのある実施形態において、癌を有する個体内の悪性細胞（例えば、腫瘍細胞）がＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現するか否かを判定することは、生体試料中の悪性細胞上でのＳｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドの発現レベルを決定することおよびそのレベルを参照レベル（例えば、値、弱いかまたは強い細胞表面染色など）と比較することを含む。参照レベルは、例えば、健常個体、抗Ｓｉｇｌｅｃでの処置から引き出せる臨床的便益がないかもしくは低い個体または抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体での処置から引き出せる臨床的便益がかなり大きい個体に対応し得る。生体試料が、上昇しているレベル（例えば、高値、強い表面染色、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体での処置から引き出せる臨床的利益が相当なものである個体のものに対応するレベル、抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体での処置から引き出せる臨床的便益がないか／低い個体のものに対応するものより高いレベルなど）でＳｉｇｌｅｃ−７のリガンドおよび／またはＳｉｇｌｅｃ−９のリガンドを発現するという判定は、その個体が抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体で処置し得る癌を有することを示す。
【実施例】
【０２５３】
実施例１：Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の両方を同時発現するヒトＮＫ細胞サブセット
ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃの中でも、Ｓｉｇｌｅｃ−７（ＣＤ３２８）およびＳｉｇｌｅｃ−９（ＣＤ３２９）は、癌細胞により過剰発現されるグリカンを含め、シアル酸に対する結合の特性を共有し、それらが発現される免疫細胞において阻害受容体として機能すると考えられる。リンパ球上でのＳｉｇｌｅｃの発現を調べるために、ヒトＮＫ細胞上でのＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の分布を調べた。
【０２５４】
ヒトドナーから精製された新鮮なＮＫ細胞上でのフローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞上でのＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９発現を判定した。ＮＫ集団は、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞と判定した（抗ＣＤ３  Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ−ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５８１２４；抗ＣＤ５６−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０−Ｍｉｌｔｅｎｙ  ＃１３０１００６７６）。抗Ｓｉｇｌｅｃ−７抗体（クローン１９４２１１−ＩｇＧ１  ＡＰＣ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＦＡＢ１１３８１Ａ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体（クローン  １９１２４０−ＩｇＧ２Ａ  ＰＥ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＦＡＢ１１３９Ｐ）およびアイソタイプ対照ＩｇＧ１  ＡＰＣおよびＩｇＧ２Ａ  ＡＰＣを使用した。５０μＬの染色Ａｂ混合液と共にＮＫ細胞を３０分間温置し、染色緩衝液で２回洗浄し、Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＨＴＳ）で蛍光を明らかにした。
【０２５５】
結果を図１に示す。代表的な結果を示す。ＭＦＩ：蛍光強度の平均。ＮＫ細胞のかなりの割合（約４４％）がＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９の両方を発現し、このことから、ＮＫ細胞の大部分が、例えば腫瘍細胞上に存在するグリカンリガンドの機能として、これらの受容体のそれぞれ（または両方）によって阻害され得ることが示唆される。
【０２５６】
実施例２：抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体の作製
抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９抗体を得るために、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７  ＦｃおよびヒトＳｉｇｌｅｃ−９  Ｆｃ細胞外ドメイン組み換えタンパク質を用いてＢａｌｂ／ｃマウスに免疫付与を行った。２つの異なる免疫化を行った。
【０２５７】
Ｓｉｇｌｅｃ−７ＦｃおよびＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃタンパク質を用いた第１回目の免疫化において、マウスに対して、３０μｇの各タンパク質および完全フロインドアジュバントの乳液の腹腔内への２回の注射を行った。次いで、７．５μｇの各タンパク質をマウスに静脈内投与した。２つの異なる融合（融合１および融合２）を行った。免疫促進注射から３日後に免疫脾臓細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、照射した脾臓細胞の存在下で培養した。ハイドリドーマを半固体メチルセルロース含有培地に播種し、ｃｌｏｎｅｐｉｘ２装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて増殖クローンを採取した。
【０２５８】
再びＳｉｇｌｅｃ−７ＦｃおよびＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃタンパク質を用いて２回目の免疫化を行った。マウスに対して、３０μｇの各タンパク質および完全フロインドアジュバントの乳液の腹腔内への３回の注射を行った。次いで、マウスに各タンパク質５μｇを静脈内投与した。３つの異なる融合（融合３、４および５）を行った。免疫促進注射から３日後に免疫脾臓細胞をＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、照射した脾臓細胞の存在下で培養した。Ｐ９６の培地にハイドリドーマを播種した。この免疫化において（および以下の実施例において）使用されたＳｉｇｌｅｃ−７ＦｃおよびＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞において産生された。Ｓｉｇｌｅｃ−７Ｆｃタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有していた。
【化７】
2019511220.tif 000021
【０２５９】
Ｓｉｇｌｅｃ−９Ｆｃタンパク質は、以下のアミノ酸配列を有していた。
【化８】
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【０２６０】
一次スクリーニング：親およびｈｕＳｉｇｌｅｃ−７、ｈｕＳｉｇｌｅｃ−９およびカニクイザルＳｉｇｌｅｃ−発現ＣＨＯ細胞株を用いて、フローサイトメトリーによって一次スクリーニングにおいて両方の免疫化の増殖クローンの上清（ＳＮ）を試験した。ヒトＳｉｇｌｅｃ−７およびカニクイザルＳｉｇｌｅｃ発現ＣＨＯをそれぞれ０．５μＭおよび０．０５μＭのＣＦＳＥで染色した。フローサイトメトリースクリーニングのために、全細胞を等しく混合し、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６４７で標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって上清中の反応抗体の存在を明らかにした。
【０２６１】
結果：それぞれ融合１、２および３／４／５における、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７および／またはＳｉｇｌｅｃ−９および／またはＳｉｇｌｅｃ−カニクイザルに結合するそれぞれの融合物において、２０、１９および８０を超える抗体が選択された。異なる交差反応性抗Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９およびＳｉｇｌｅｃ−カニクイザル抗体および異なる３種の融合物からの抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体（Ｓｉｇｌｅｃ−７に結合しなかったもの）をクローニングし、Ｎ結合グリコシル化の欠如およびＦｃγ受容体への結合の減少を生じる重鎖Ｎ２９７Ｑ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）突然変異を有するキメラヒトＩｇＧ１抗体として産生した。
【０２６２】
図２は、Ｓｉｇｌｅｃ−７に結合するがＳｉｇｌｅｃ−９またはカニクイザルＳｉｇｌｅｃに結合しない抗体（右パネル）、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９およびカニクイザルＳｉｇｌｅｃのそれぞれに結合する抗体（中間パネル）、Ｓｉｇｌｅｃ−９に結合するがＳｉｇｌｅｃ−７またはカニクイザルＳｉｇｌｅｃに結合しない抗体（左パネル）の例について、フローサイトメトリーによる代表的な結果を示す。
【０２６３】
【表１３】
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【０２６４】
【表１４】
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【０２６５】
【表１５】
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【０２６６】
【表１６】
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【０２６７】
実施例３：ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃへの結合
Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９と配列類似性を共有するＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃは、一般に、２つの群、Ｓｉｇｌｅｃ−１、−２、−４および−１５から構成される第１のサブセットと、Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１４および−１６を含むＳｉｇｌｅｃのＣＤ３３関連群とに分けられる。他のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃは異なる生物学的機能を有し、および／または腫瘍監視に関与しないと考えられるため、他のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに結合しない交差反応性Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体を得ることが可能か否かを評価するために抗体をさらにスクリーニングした。
【０２６８】
Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０、−１１および−１２を発現する細胞を作製し、細胞への結合についてフローサイトメトリーにより、交差反応性Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体の代表的なサブセットを試験した。本明細書中において使用される異なるＳｉｇｌｅｃに対するアミノ酸配列およびＧｅｎｂａｎｋ参照番号を上記の表１において以下に示す。
【０２６９】
簡潔に述べると、（Ｓｉｇｌｅｃの１つを発現する）ＨｕＳｉｇｌｅｃ発現ＣＨＯ細胞株を使用した。フローサイトメトリースクリーニングのために、各ＨｕＳｉｇｌｅｃ発現ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−３細胞株、ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−５細胞株、ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−６細胞株、ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−８細胞株、ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−１０細胞株、ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−１１細胞株、ＣＨＯ  ＨｕＳｉｇｌｅｃ−１２細胞株）と共に抗体を１時間温置し、染色緩衝液中で２回洗浄し、ＰＥで標識したヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により明らかにし、染色緩衝液で２回洗浄し、ＨＴＦＣサイトメーター上で染色を得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０２７０】
結果から、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥおよびｍＡｂＦのうち、Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−７、−８、−１０、−１１または−１２の何れかに結合したものはなかったことが示された。
【０２７１】
結果から、いくつかの交差反応性Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９に加えてＳｉｇｌｅｃ−１２またはＳｉｇｌｅｃ−６にも結合できることが示された。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９に加えてＳｉｇｌｅｃ−１２に結合し、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６は、Ｓｉｇｌｅｃ−１２に結合しなかった。代表的な抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５またはｍＡｂ６のうち、Ｓｉｇｌｅｃ−３、−５、−６、−８、−１０または−１１の何れかに結合したものはなかった。
【０２７２】
実施例４：Ｓｉｇｌｅｃへの結合のための抗体の滴定
ヒトＳｉｇｌｅｃ−７、ヒトＳｉｇｌｅｃ−９およびカニクイザルＳｉｇｌｅｃ−９における抗体の結合を、ヒトＳｉｇｌｅｃ−７およびヒトＳｉｇｌｅｃ−９およびカニクイザルＳｉｇｌｅｃ−９で遺伝子移入したＣＨＯ細胞でのフローサイトメトリーによる滴定実験によって試験した。細胞を、一次抗体を２０μｇ／ｍｌとし、かつ一連の希釈率１：５において染色緩衝液（ＳＢ）中で１時間温置した。それらをＳＢで３回洗浄し、次いでヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ＃ＩＭ０５５１０）で３０分間温置し、ＳＢで２回洗浄した。ＨＴＦＣ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔサイトメーターで蛍光を明らかにした。
【０２７３】
２回の免疫化における５つの融合体からの以下に示される６つの抗体は、細胞によって発現されるヒトＳｉｇｌｅｃ−７およびヒトＳｉｇｌｅｃ−９について、およびさらにカニクイザルＳｉｇｌｅｃについて同等の結合親和性を有することが見出された。各抗体の結合についてのＥＣ５０値（μｇ／ｍｌ）を以下に示す。
【０２７４】
【表１７】
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【０２７５】
実施例５：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＳｉｇｌｅｃ−９結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００の一般手順および試薬
ＳＰＲ測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃において行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ（商標）実験において、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＮａＯＨ  １０ｍＭは、ランニング緩衝液および再生緩衝液としてそれぞれ機能した。センサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて分析した。ヒトＳｉｇｌｅｃ−９および−７多量体タンパク質をＩｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａでクローニングし、産生させ、精製した。
【０２７６】
プロテイン−Ａの固定化
タンパク質をＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で活性化した。タンパク質を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４．２および５．０）中で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベルに達するまで（すなわち６００〜２０００ＲＵ）注入した。残りの活性化された基の失活は、１００ｍＭエタノールアミンｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。
【０２７７】
親和性研究
親和性研究は、製造業者（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｗｉｚａｒｄ）によって推奨される標準的なＫｉｎｅｔｉｃプロトコールに従って実施した。６００ｎＭ〜０．９７５ｎＭの範囲の抗Ｓｉｇｌｅｃ−９および−７／９抗体Ｆａｂ断片の連続的希釈物を固定化Ｓｉｇｌｅｃ−９ＦｃおよびＳｉｇｌｅｃ−７Ｆｃタンパク質上に順次注入し、再分化前に１０分間分離させた。センサーグラムセット全体を、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。一価の親和性および動態学的会合および解離速度定数を以下の表２に示す。
【０２７８】
【表１８】
2019511220.tif 000028
【０２７９】
実施例６：単球由来樹状細胞の滴定
単球由来樹状細胞（ｍｏＤＣ）の生成：
単球由来の樹状細胞は、末梢血単核球から生成した。健常ドナーから得られた軟膜からＰＢＭＣを単離した。単球をキットＭｏｎｏｃｙｔｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて精製し、１０％不活性化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（ＧＩＢＣＯ）、ピルビン酸ナトリウム（ＧＩＢＣＯ）、ＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびＧＭ−ＣＳＦ（４００ｎｇ／ｍｌ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を添加したＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）中で合計６日間にわたりｍｏＤＣ中で分化させた。細胞を３７℃の加湿ＣＯ２恒温器で培養し、サイトカインを４日目に更新した。
【０２８０】
２５ｍＵノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてｍｏＤＣを２時間脱シアル化した。脱シアル化は、ノイラミニダーゼ処理の前後で制御した：ｍｏＤＣ細胞を、マウスＳｉｇｌｅｃ−７Ｆｃ（ＩＰＨ）およびマウスＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃ組み換えタンパク質（ＩＰＨ）を含む染色緩衝液（ＳＢ）中において１０μｇ／ｍｌで１時間温置し、ＳＢで２回洗浄し、ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に３０分間温置し、ＳＢで２回洗浄し、蛍光をＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＨＴＳ）で明らかにした。
【０２８１】
滴定
ｍｏＤＣおよびノイラミニダーゼで処理したｍｏＤＣに対する結合をフローサイトメトリーによる滴定実験で試験した。細胞を、一次抗体を１０μｇ／ｍｌとし、かつおよび一連の希釈率１：１０で染色緩衝液（ＳＢ）中において１時間温置した。それらをＳＢで２回洗浄し、次いでヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で３０分間温置し、ＳＢで２回洗浄した。蛍光をＨＴＦＣ  Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔサイトメーターで明らかにした。
【０２８２】
結果
ＥＣ５０はノイラミニダーゼ処理後に高度に増強され（１０倍）、これは、ｍｏＤＣ上に発現したＳｉｇｌｅｃ−９がノイラミニダーゼ処理前のシアル酸リガンドとのシス相互作用に関与していることを示唆する。しかし、プラトー相レベルは改変されておらず、高親和性抗体は細胞表面上の全てのＳｉｇｌｅｃ−９（結合および非結合）立体構造に結合することができ、ｍｏｎｏＤＣならびに他の細胞型（例えば、ＮＫ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、単球ならびにマクロファージＭ１およびＭ２）におけるシス相互作用およびシグナル伝達を阻害することを示唆する。結果は、ｍｏＤＣ（左側パネル）およびノイラミダーゼ処理ｍｏＤＣ（右側パネル）における代表的な抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤについて、それぞれＥＣ５０値を伴って図３に示す。
【０２８３】
実施例７：ＮＫ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ活性を中和する抗体の能力の評価
初代ＮＫ細胞（ヒトドナーから精製され、使用前に３７℃で一晩温置した新鮮なＮＫ細胞）を用いたＮＫ細胞活性化アッセイにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ活性の阻止について、第１および第２の免疫付与において試験した抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体を試験した。２４時間でのＣＤ１３７発現上昇は、ＮＫ細胞を含む一部のリンパ球の活性化と相関する（Ｋｏｈｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１７（８）：２４２３−２４３２）。フローサイトメトリーによるＮＫ細胞上でのＣＤ１３７発現の分析により、ＮＫ細胞活性化における抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体の効果および標的細胞の脱シアル化を判定した。抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９ｍＡｂ  ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６は、それぞれ２４時間でＣＤ１３７発現の増加を誘導した。
【０２８４】
次に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体の効果を、ＹＴＳ  Ｓｉｇｌｅｃ−９＊エフェクター細胞株（ヒトＳｉｇｌｅｃ−９で遺伝子移入したヒトＮＫ細胞株ＹＴＳ）をエフェクターとし、Ｒａｍｏｓ細胞株を標的として用いた細胞傷害性アッセイ（Ｃｒ５１）で研究した。この試験は、５１Ｃｒ負荷標的細胞の溶解を直接定量することにより、ＹＴＳ  Ｓｉｇｌｅｃ−９＊細胞株の細胞傷害性を測定する。簡潔に述べると、標的細胞をまず放射性５１Ｃｒ同位体で標識し、次にエフェクター細胞と共に３７℃で４時間共温置する。この間に、ＹＴＳ細胞に感受性である標的細胞を溶解し、５１Ｃｒを培地に放出させる。回収された上清中の５１Ｃｒは、液体シンチレーション測定によって測定される。得られた結果は、ＮＫ細胞による標的細胞の溶解パーセントを評価することを可能にする。完全ＲＰＭＩ中、２００μＬ最終／ウェル、Ｅ：Ｔ比５／１で、９６Ｕウェルプレートでアッセイを行った。抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体およびアイソタイプ対照を１０μｇ／ｍｌおよび一連の希釈率１：１０で添加した。
【０２８５】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９ｍＡｂ  ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６は、それぞれ用量依存的にＹＴＳ  Ｓｉｇｌｅｃ−９＊細胞傷害性の増加を誘導した。対照として、この効果は野生型ＹＴＳ細胞株（Ｓｉｇｌｅｃ−９発現なし）では観察されなかった。同様に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９ｍＡｂ  ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥおよびｍＡｂＦは、それぞれ用量依存的にＹＴＳ  Ｓｉｇｌｅｃ−９＊細胞傷害性の増加を誘導する。図４は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９交差反応性抗体（図４Ｂ）およびＳｉｇｌｅｃ−９単一特異性（非Ｓｉｇｌｅｃ−７結合）抗体（図４Ａ）中でのＹＴＳ  Ｓｉｇｌｅｃ−９＊細胞傷害性の増加の用量依存的誘導を示す。
【０２８６】
実施例８：初代ヒトＮＫ細胞（低Ｓｉｇｌｅｃ−９発現）におけるＳｉｇｌｅｃ−９中和の詳細な研究
本発明者らは、以前の抗体がＮＫ細胞においてＳｉｇｌｅｃ−９を中和し得ないことが、例えば、その表面においてＳｉｇｌｅｃ−９をより高いレベルで発現する好中球および他の細胞と比較した、初代ＮＫ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ−９発現の差異および異なるＮＫ細胞サブセットで発現されるＳｉｇｌｅｃ−７に関連し得る可能性を考慮した。ＮＫ細胞においてＳｉｇｌｅｃ−９を中和する抗体を得ることができるかどうかを調べるために、本発明者らは、フローサイトメトリーによってＳｉｇｌｅｃ−９上でゲートされた多数のヒトドナー由来の初代ＮＫ細胞において抗体を研究および選択した。抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体の効果を、古典的５１Ｃｒ放出アッセイにおいて腫瘍細胞溶解を評価することにより、およびＮＫ細胞上のＣＤ１３７表面発現を評価することによる活性化アッセイにより、細胞傷害性によって研究した。それぞれの場合において、エフェクター細胞として初代ＮＫ細胞（ドナーから精製された新鮮なＮＫ細胞として）を使用し、ＨＴ２９結腸直腸癌細胞株を標的として使用した。
【０２８７】
パート１：細胞傷害性アッセイ：２人のヒトドナーにおける精製されたＮＫ対ＨＴ２９腫瘍細胞
細胞傷害性アッセイは、５１Ｃｒ負荷標的細胞の溶解を直接定量することによってＮＫ細胞の細胞傷害性を測定した。簡潔に述べると、標的細胞をまず放射性５１Ｃｒ同位体で標識し、次にエフェクター細胞と共に３７℃で４時間共温置した。この間に、ＮＫ細胞に感受性である標的細胞を溶解し、５１Ｃｒを培地に放出させた。回収された上清中の５１Ｃｒは、液体シンチレーション測定によって測定した。得られた結果は、ＮＫ細胞による標的細胞の溶解パーセントの評価を可能にする。完全ＲＰＭＩ中、２００μＬ最終／ウェル、Ｅ：Ｔ比８／１において９６Ｕウェルプレートでアッセイを行った。抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体およびアイソタイプ対照を１０μｇ／ｍｌで添加した。
【０２８８】
抗Ｓｉｇｌｅｃ９抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ、およびｍＡｂＦならびに抗Ｓｉｇｌｅｃ７／９抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６は、それぞれＮＫ細胞の細胞傷害性の増加を誘導した。図５は、２人の異なるヒトドナー（ドナーＤ１（左側パネル）およびＤ２（右側パネル））における抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＣ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ、およびｍＡｂＦによって媒介される初代ＮＫ細胞の細胞傷害性の増加を示す代表的な図である。
【０２８９】
パート２：活性化アッセイ（ＣＤ１３７）：精製されたＮＫ対ＨＴ２９、ｍＡｂの単一ヒトドナーにおける比較
フローサイトメトリーによるＳｉｇｌｅｃ−９陽性ＮＫ細胞上のＣＤ１３７発現の分析により、抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９および抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体のＮＫ細胞活性化における効果を決定した。エフェクター細胞は初代ＮＫ細胞（ドナーから精製された新鮮なＮＫ細胞、使用前に３７℃で一晩温置）であり、標的細胞（ＨＴ２９細胞株）は１：１の比率で混合した。完全ＲＰＭＩ中、２００μＬ最終／ウェルにおいて９６ＵウェルプレートでＣＤ１３７アッセイを行った。抗体をエフェクター細胞と共に３７℃で３０分間予備温置し、次いで標的細胞を３７℃で一晩共温置した。ステップは以下の通りである：５００ｇで３分間スピン；染色緩衝液（ＳＢ）で２回洗浄；５０μＬの染色Ａｂ混合液（抗ＣＤ３  パシフィックブルー−ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；抗ＣＤ５６−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）；抗ＣＤ１３７−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９  Ｋ８−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））の添加；４℃で３０分間の温置；ＳＢで２回洗浄；ＳＢでペレットを再懸濁；およびＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＨＴＳ）で明らかにした蛍光。
【０２９０】
陰性対照は、ＮＫ細胞対ＨＴ２９単独であり、アイソタイプ対照の存在下であった。図６は、１人のヒトドナーにおけるいくつかの抗Ｓｉｇｌｅｃ−９および抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＦ、ｍＡｂ６およびｍＡｂ４によって媒介されるＣＤ１３７を発現するＳｉｇｌｅｃ−９陽性ＮＫ細胞の％の増加を示す代表的な図である。対照として、ＣＤ１３７を発現するＳｉｇｌｅｃ−９陰性ＮＫ細胞の％は、これらの抗体に影響されなかった。図に見られるように、抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９発現初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性を、同一ドナー由来のＳｉｇｌｅｃ−９陰性初代ヒトＮＫ細胞で観察されたレベルまで完全に回復させた。
【０２９１】
パート３：活性化アッセイ（ＣＤ１３７）：６人のヒトドナーにおける精製されたＮＫ対ＨＴ２９、ｍＡｂＡおよびｍＡｂ１
１つの抗Ｓｉｇｌｅｃ−９（ｍＡｂ．Ａ）および１つの抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９（ｍＡｂ１）を用いて、６人のドナーで実験を再現した。抗体の非存在下において（「中」設定）、ＮＫ発現ＣＤ１３７の％は、ドナー間で６％〜２７％で変動した（（図７、左側パネル）を参照されたい）。データは、各実験からの対照中央値と比較して相対的な変化であるように標準化された：（（Ｘ−Ｘ中央値））／Ｘ中央値（％）。図７に示すように、ｍＡｂＡおよびｍＡｂ１は、Ｓｉｇｌｅｃ−９＋  ＣＤ１３７＋ＮＫ％の増加を誘導し（図７、中央パネル）、Ｓｉｇｌｅｃ−９−ＣＤ１３７＋ＮＫ％の増加を誘導しなかった（図７、右側パネル）。
【０２９２】
実施例９：初代ＮＫ細胞の滴定
新鮮な精製ヒトＮＫ細胞に対する抗体の結合をフローサイトメトリーによる滴定実験によって試験した。細胞を、一次抗体を１０μｇ／ｍｌとし、かつ一連の希釈率１：１０において染色緩衝液（ＳＢ）中で１時間温置した。それらをＳＢで３回洗浄し、次いでヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で３０分間温置した。染色はＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩで行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。以下の表にＥＣ５０値をμｇ／ｍｌで示す（４パラメーターロジスティックフィットを用いて計算した）。
【０２９３】
【表１９】
2019511220.tif 000029
【０２９４】
実施例１０：シアル酸リガンドへのＳｉｇｌｅｃ結合の阻止
パートＡ：フローサイトメトリーによるシアル酸発現腫瘍細胞へのＳｉｇｌｅｃ−９結合の阻止
用量範囲の抗ヒトＳｉｇｌｅｃ−９  Ｆａｂを室温で３０分にわたりヒトＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃ融合組み換えタンパク質と固定用量で共温置し、次いで様々なシアル酸発現細胞株Ｋ５６２  Ｅ６（ヒトＨＬＡ−Ｅで遺伝子移入したＫ５６２細胞株）およびＲａｍｏｓを１時間にわたり添加した。染色緩衝液で細胞を２回洗浄した後、染色緩衝液で希釈したＰＥ結合ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃフラグメント二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を細胞に添加し、プレートを４℃でさらに３０分間温置した。細胞を２回洗浄し、ＨＴＦＣプレートリーダーを備えたＡｃｃｕｒｙ  Ｃ６フローサイトメーターで分析した。蛍光強度の平均対ＦａｂとＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃ融合組み換えタンパク質の比をグラフにプロットした。
【０２９５】
結果を図８に示す。上のパネルにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への抗体存在下での結合を示す。抗Ｓｉｇｌｅｃ／９ｍＡｂ  ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤは、それぞれＳｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への結合を阻害し、ｍＡｂＥは、Ｓｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への結合阻害する部分的能力を示し、ｍＡｂＦは、Ｓｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への結合を有意に阻害しなかった。図８の下のパネルにおいて、Ｓｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＫ５６２細胞への抗体存在下での結合を示す。抗Ｓｉｇｌｅｃ／９ｍＡｂ  ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤは、それぞれＳｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＲａｍｏｓ細胞への結合を阻害し、ｍＡｂＥおよびｍＡｂＦの両方は、Ｓｉｇｌｅｃ−９−Ｆｃタンパク質のＫ５６２細胞への結合を、有意により高い抗体濃度においてのみ阻害する部分的能力を示した。結論として、抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤは、Ｓｉｇｌｅｃ−９の腫瘍細胞上のシアル酸リガンドへの結合を完全に阻止し、抗体ｍＡｂＥは、阻止はシアル酸発現細胞株に依存し、ｍＡｂＦは結合を阻止しない。
【０２９６】
パートＢ：ＥＬＩＳＡアッセイによるシアル酸付加リガンドへのＳｉｇｌｅｃ−７および−９結合の阻止
シアル酸は、グリコシル化タンパク質および形成脂質上の９炭素カルボキシル化単糖である。シアリルトランスフェラーゼ（それらの生合成を触媒する）およびノイラミニダーゼとも呼ばれるシアリダーゼ（それらの切断を触媒する）を含むいくつかの酵素は、哺乳動物系におけるそれらの発生を調整する。癌において、改変されたシアル酸プロファイルは、腫瘍成長、転移および免疫監視回避を増強し、癌細胞の生存につながる支配的な役割を果たす（Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００９  Ｏｃｔ；９８（１０）：３４９９−５０８）。増加したシアル酸付加は、シアル酸付加を制御する改変された酵素プロファイルと共にいくつかの癌において報告されている。ＳＴ３ＧＡＬ６酵素は、多発性骨髄腫細胞株および患者において過剰発現され、多発性骨髄腫細胞の表面上のα−２，３結合シアル酸の発現とインビトロで関連する。インビボでは、ＳＴ３ＧＡＬ６ノックダウンは、腫瘍負荷の減少および生存期間の延長に加えて、骨髄微小環境への多発性骨髄腫細胞のホーミングおよび生着の減少に関連する（Ｇｌａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４  Ｓｅｐ  １１；１２４（１１）：１７６５−７６）。グリオーマにおける高いＳＴ３ＧＡＬ１酵素発現は、間葉系分子分類のより高い腫瘍等級と関連している（Ｃｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２０１５  Ｎｏｖ  ７；１０８（２）。プロモーターのメチル化異常は、癌におけるいくつかのシアリルトランスフェラーゼ発現の調整において役割を果たす（Ｖｏｊｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１６  Ｊａｎ  １２）。膀胱癌では、ＳＴ６ＧＡＬ１プロモーターのメチル化異常がＳＴ６Ｇａｌ１の発現低下を誘導する（Ａｎｔｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１４  Ｄｅｃ  ２；１４：９０１）。
【０２９７】
Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９は、種々のシアル酸結合に結合する。チップ上にプリントされたシアロシドライブラリーにより、いくつかのＳｉｇｌｅｃおよび１つの選択的Ｓｉｇｌｅｃ−７リガンドに共通するシアロシドリガンドが同定された（Ｒｉｌｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ  １９；８（７）：１４１７−２２）。Ｓｉｇｌｅｃ−７およびＳｉｇｌｅｃ−９によるシアロシドの可能な差次的認識の観点から、免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃ−７および−９の両方を標的とすると、様々なシアリルトランスフェラーゼおよびシアル酸が与えられた場合、いくつかの癌型を標的とすることができる。
【０２９８】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−７／９抗体によるＳｉｇｌｅｃ−７および−９とシアル酸付加リガンドとの間の相互作用の阻止をＥＬＩＳＡアッセイで試験した。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、Ｓｉｇｌｅｃ−７ヒトＦｃおよびＳｉｇｌｅｃ−９ヒトＦｃ組み換えタンパク質であり、リガンドは、シアル酸付加三糖（「Ｓｉａ１」と称されるＮｅｕ５Ａｃａ２−３Ｇａｌｂ１−４ＧｌｃＮＡｃｂ−ＰＡＡ−ビオチン  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ＃０１−０７７、および６’−シアリルラクトース−ＰＡＡ−ビオチン  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ＃０１−０３９（「Ｓｉａ２」と称される）でビオチン化されたポリマーであった。簡潔に述べると、プロテインＡをＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。３回の洗浄および飽和後、Ｓｉｇｌｅｃ−７ＦｃおよびＳｉｇｌｅｃ−９Ｆｃを室温において１時間３０分にわたり０．８μｇ／ウェルで添加した。３回洗浄した後、ｍＡｂを２０μｇ／ｍｌおよび一連の希釈率１：５で添加した。３回洗浄した後、ビオチン化シアル酸付加ポリマーを室温で３時間にわたって添加した。３回洗浄した後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を１：１０００で添加した。最後に、Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９タンパク質におけるシアル酸付加ポリマーの結合は、暗所において室温でＴＭＢ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）を添加することによって明らかにし、反応はＨ２ＳＯ４の添加によって停止した。４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０２９９】
結果を図９および１０に示す。ｍＡｂ１、２、４、５および６はＳｉａ２とのＳｉｇｌｅｃ−７相互作用を阻止するが、ｍＡｂ３は阻止しなかった（図９）。全てのｍＡｂは、Ｓｉａ２とのＳｉｇｌｅｃ−９相互作用を阻止した（図１０）が、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３はＳｉａ１とのＳｉｇｌｅｃ−９相互作用を阻害する能力が低く（図１０）、したがってＳｉａ１相互作用を実質的に阻止しなかったことを示す。ｍＡｂ５およびｍＡｂ６はＳｉａ１とのＳｉｇｌｅｃ−９相互作用を阻止し、ｍＡｂ４はＳｉａ１とのＳｉｇｌｅｃ−９相互作用を阻止する中等度の能力を有していた。Ｓｉｇｌｅｃ−９に対するブロッキング効果は、シアル酸のタイプに依存する。全体として、Ｓｉｇｌｅｃ−９とシアル酸との間の相互作用の実質的な全阻害を達成した抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体ｍＡｂＡ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＣおよびｍＡｂＤで最も完全な阻害が観察された。
【０３００】
実施例１１：点突然変異体を用いた抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体のエピトープ
抗Ｓｉｇｌｅｃ−９抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、まずＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のタグＶ５を用いて各単一Ｓｉｇｌｅｃ−９ドメイン（Ｖ−セットＩｇ様ドメイン、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１、およびＩｇ様Ｃ２型ドメイン２）を発現させ、抗体の各タンパク質への結合を試験することによって本抗体の結合ドメインを同定した。
【０３０１】
本発明者らは、次いで、Ｎ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインの表面上の分子表面に露出したアミノ酸の置換によって定義されるＳｉｇｌｅｃ−９突然変異体を設計した。Ｓｉｇｌｅｃ−９の構造は依然として解明されておらず、入手可能なＳｉｇｌｅｃ構造内において、Ｓｉｇｌｅｃ−７は最も近いメンバーである（Ｓｉｇｌｅｃ−９アミノ酸配列と８０％以上の同一性）。結果的に、Ｓｉｇｌｅｃ−７構造を用いてＳｉｇｌｅｃ−９突然変異体を設計した。配列番号２のポリペプチドの天然Ｓｉｇｌｅｃ−９ペプチドリーダーを置換リーダー配列およびＶ５タグ（表１のＳｉｇｌｅｃ−９ドメインタンパク質Ｖ−セットＩｇ様ドメイン、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１、およびＩｇ様Ｃ２型ドメイン２で示される）、続いて表３に列挙されたアミノ酸置換が組み込まれた表１のＳｉｇｌｅｃ−９アミノ酸配列で置換した。タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株で発現された。
【０３０２】
全ての図（図１１〜１４）は、前出のＡｌｐｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ（２００３）に記載されるＳＩＧＬＥＣ−７構造１０７ＶのＮ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインに対応する。これらの図は、全てのＳｉｇｌｅｃで保存されている、末端シアル酸糖上のカルボキシル基との相互作用のための重要な残基である、アルギニン１２４、およびＳｉｇｌｅｃ−７とＳｉｇｌｅｃ−９との間で保存され、またシアル酸結合に必須であると記載される、周辺残基Ｗ１３２、Ｋ１３１、Ｋ１３５およびＮ１３３を含むリガンド結合領域を薄い陰影で示す。Ｗ１３２は、シアル酸のグリセロール部分との疎水性相互作用を提供する。表３の標的アミノ酸突然変異は、Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９の両方に存在する残基であり、Ｓｉｇｌｅｃ−７について配列番号１、またはＳｉｇｌｅｃ−９について配列番号２の付番を用いて示される（野生型Ｓｉｇｌｅｃ−９の残基／残基の位置／突然変異体の残基）。
【０３０３】
【表２０】
2019511220.tif 000030
【０３０４】
突然変異体の生成
Ｓｉｇｌｅｃ−９突然変異体をＰＣＲにより生成した。増幅した配列をアガロースゲル上に流し、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製した。各突然変異体について生成した精製ＰＣＲ産物を、ＣｌｏｎＴｅｃｈ  ＩｎＦｕｓｉｏｎ（商標）システムを用いて発現ベクターに連結した。突然変異した配列を含むベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、配列決定した。配列決定後、突然変異した配列を含むベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＭｉｄｉｐｒｅｐ（商標）として調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を用いてベクターで遺伝子移入し、導入遺伝子の発現を試験する前にＣＯ２恒温器中において３７℃で２４時間または４８時間温置した。
【０３０５】
ＨＥＫ２９３Ｔ遺伝子移入細胞への抗Ｓｉｇｌｅｃ−９結合のフローサイトメトリー分析
抗体ｍＡｂ４、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６はＩｇ様Ｃ２型ドメイン１に結合し、ｍＡｂ、ｍＡｂＢ、ｍＡｂＤ、ｍＡｂＥ  ｍＡｂＦ、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３はＮ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメインに結合した。Ｖ−セットＩｇ様ドメイン結合抗体をフローサイトメトリーによって突然変異体１〜１６のそれぞれへのそれらの結合について試験した。１つの濃度で１つまたは複数の突然変異体への結合を失う抗体を決定するために第１の実験を行った。結合の喪失を確認するために、結合がＳｉｇｌｅｃ−９突然変異によって影響を受けていると思われる抗体について抗体の滴定を行った。結果を以下の表４に示す。
【０３０６】
残基Ｋ１００（配列番号２のＳｉｇｌｅｃ−９に関して）またはＫ１０４（配列番号１のＳｉｇｌｅｃ−７に関して）における集団において異なる置換を含む突然変異体Ｍ２への結合を失った抗体はなく、したがって、抗体は、表１（配列番号１６０）に示されるＳｉｇｌｅｃ−９対立遺伝子に結合する。
【０３０７】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−７および−９特異的抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３、ならびにＳｉｇｌｅｃ−９特異的抗体ｍＡｂＥおよびｍＡｂＦは、全てＳｉｇｌｅｃ−９の突然変異体Ｍ９、Ｍ１０およびＭ１１への結合を失ったが、他の突然変異体への結合を失わなかった。突然変異体９は、残基Ｎ７８、Ｐ７９、Ａ８０、Ｒ８１、Ａ８２およびＶ８３（Ｓｉｇｌｅｃ−９への参照）におけるアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上または全てがこれらの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。突然変異体１０は残基Ｎ７７、Ｄ９６、Ｈ９８およびＴ９９におけるアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上または全てがこれらの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。突然変異体１１は、残基Ｗ８４、Ｅ８５、Ｅ８６およびＲ８８におけるアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上または全てがこれらの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。図１１に示すように、Ｍ９、Ｍ１０およびＭ１１において置換された残基は、シアル酸結合部位（薄い陰影）を含む面から離れたＮ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメイン（濃い陰影）の面に見られる。注目すべきことに、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃのシアル酸リガンド特異性を定義する（例えば、Ａｌｐｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３３７２−３３７７を参照されたい）Ｃ−Ｃ’ループドメインにおける突然変異を有するＭ８またはＭ１５への、部分的にリガンド結合領域をカバーするＭ１６の結合を失わなかった。したがって、抗体は、シアル酸接触領域もしくは結合部位またはＣ−Ｃ’ループに結合することなく、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻止において高い効力を達成する。
【０３０８】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−９特異的抗体ｍＡｂＤは、突然変異体Ｍ６への結合を失ったが、他の突然変異体への結合を失わなかった。突然変異体６は、残基Ｓ４７、Ｈ４８、Ｇ４９、Ｗ５０、Ｉ５１、Ｙ５２、Ｐ５３およびＧ５４（Ｓｉｇｌｅｃ−９への参照）におけるアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上または全てが抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。図１２に示すように、Ｍ１６（濃い陰影）において置換された残基は、シアル酸結合部位を含むＮ末端Ｖ−セットＩｇ様ドメイン面の上部であるが、リガンド結合部位（薄い陰影）の外側に見られる。ｍＡｂＤはＭ７への結合を失わなかったが、この変異体Ｍ７への結合の部分的な減少を示した。Ｍ７は、リガンド結合領域（薄い陰影）に部分的に重複し得る残基を含む。Ｍ７は、残基Ｐ５５、Ｈ５８、Ｅ１２２、Ｇ１２４、Ｓ１２５およびＫ１２７（Ｓｉｇｌｅｃ−９への参照）におけるアミノ酸置換を含んでいた。したがって、Ｍ７の残基は、抗体のコアエピトープにとって重要ではない。抗体は、Ｃ−Ｃ’ループドメインに突然変異を有するＭ８またはＭ１５への、部分的にリガンド結合領域をカバーするＭ１６の結合を失わなかった。したがって、抗体は、シアル酸接触領域もしくは結合部位またはＣ−Ｃ’ループに結合することなく、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻止において高い効力を達成する。
【０３０９】
抗Ｓｉｇｌｅｃ−９特異的抗体ｍＡｂＡおよびｍＡｂＢの両方は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の突然変異体Ｍ１６への結合を失ったが、他の突然変異体への結合を失わなかった。突然変異体１６は、残基Ｋ１３１およびＨ１３６（Ｓｉｇｌｅｃ−９への参照）におけるアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上または全てがこれらの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。興味深いことに、Ｍ１６は、Ｓｉｇｌｅｃ−９（図１３を参照されたい）のシアル酸リガンド接触部位の近位またはその中にあり、抗体は、Ｍ８（Ｃ−Ｃ’ループドメイン突然変異体への結合もＭ１５への結合も失わなかった。したがって、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−９の阻止において、さらにシアル酸接触領域内において、またＣ−Ｃ’ループに結合することなく高い効力を達成する。
【０３１０】
一方、抗体ｍＡｂＣは、Ｓｉｇｌｅｃ−９の突然変異体Ｍ８（すなわちＣ−Ｃ’ループ内）への結合を失ったが、Ｍ１５およびＭ１６への結合が部分的に減少したものの、Ｍ１５またはＭ１６への結合も、Ｍ６、Ｍ７またはＭ８への結合も、Ｍ９、Ｍ１０またはＭ１１への結合も（他の任意の突然変異体への結合も）失わなかった。Ｍ８で突然変異した残基を図１４に示す。突然変異体８は、残基Ｒ６３、Ａ６６、Ｎ６７、Ｔ６８、Ｄ６９、Ｑ７０およびＤ７１（Ｓｉｇｌｅｃ−９への参照）におけるアミノ酸置換を含み、突然変異体の残基の１つ以上または全てがこれらの抗体のコアエピトープにとって重要であることを示す。したがって、抗体は、Ｓｉｇｌｅｃのシアル酸特異性を定義するＣ−Ｃ’ループドメイン中の残基に結合する。
【０３１１】
【表２１】
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【０３１２】
本明細書中で引用される、刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、本明細書中の他の箇所でなされる特定の文献の何れかの個別に提供される組み込みにかかわらず、（法律によって許される最大の限度で）各参考文献が個々におよび具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書中でその全体において記載されているかのように、同定度に参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
【０３１３】
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という語および本発明を記載する文脈中の同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含するものと解釈すべきである。
【０３１４】
別段の指定がない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値または測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供するとみなされ得る）。
【０３１５】
１つまたは複数の要素に関する「含む」、「有する」、「包含する」または「含有する」などの語を使用した本発明の何らかの態様または実施形態の本明細書中の記述は、別段の指定がない限り、または内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の１つまたは複数の要素「からなる」、「から基本的になる」またはそれを「実質的に含む」本発明の同様の態様または実施形態に対する支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含む場合の本明細書中に記載の組成物は、別段の指定がない限り、または内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである）。
【０３１６】
本明細書中で提供されるあらゆる実施例または代表的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本明細書中のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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