(57)【要約】  本開示は、アミロイドベータの蓄積に関連する疾患または障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、ＢＡＣＥ阻害剤およびアミロイドベータｎ−４２に結合する抗体または抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または障害は、アルツハイマー病である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβの蓄積に関連する疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、該対象に：
ａ）
【化１】
2019511500.tif 000068
またはその薬学的に許容される塩である、薬学的に有効な量のＢＡＣＥ阻害剤；および
ｂ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、薬学的に有効な量の抗体または抗原結合性断片
を投与するステップを含む前記方法。
【請求項２】
ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化２】
2019511500.tif 000069
またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化３】
2019511500.tif 000070
のカンシレート塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化４】
2019511500.tif 000071
である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の重鎖のＣＤＲを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の軽鎖のＣＤＲを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、ＶＨドメインは、配列番号５２４に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、ＶＬドメインは、配列番号５３３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＶＨドメインは、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０および配列番号５３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＶＨドメインは、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０および配列番号５３１のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＶＬドメインは、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９および配列番号５４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＶＬドメインは、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９および配列番号５４０のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＶＨドメインは、配列番号５２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＶＬドメインは、配列番号５３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＨドメインは、配列番号５２４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＶＬドメインは、配列番号５３３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＨドメインは、配列番号５２４のアミノ酸配列含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＶＬドメインは、配列番号５３３のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
抗体または抗原結合性断片は、抗原結合性断片である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗原結合性断片は、Ｆａｂ’である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
抗体または抗原結合性断片は、抗体である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
抗体は、モノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
抗体は、ＩｇＧ抗体である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体は、ヒトＩｇＧ１−ＴＭ、ＩｇＧ１−ＹＴＥまたはＩｇＧ１−ＴＭ−ＹＴＥである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体または抗原結合性断片は、ヒト化されている、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
抗体または抗原結合性断片は、ヒトのものである、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
抗体または抗原結合性断片は、５００ｐＭまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で単量体Ａβ１−４２に結合し、Ａβ１−４０に結合しないか、または１ｍＭより大きいＫＤでＡβ１−４０に結合するかのいずれかである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
抗体または抗原結合性断片は、アミロイドベータ１７−４２ペプチド（Ａβ１７−４２）およびアミロイドベータ２９−４２ペプチド（Ａβ２９−４２）に結合する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
抗体または抗原結合性断片は、３−ピロ−４２アミロイドベータペプチドおよび１１−ピロ−４２アミロイドベータペプチドに結合する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
抗体または抗原結合性断片は、アミロイドベータ１−４３ペプチド（Ａβ１−４３）に結合する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
疾患または障害は、アルツハイマー病、ダウン症、および／または黄斑変性症からなる群から選択される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
疾患または障害は、アルツハイマー病である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
疾患または障害は、ダウン症である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
疾患または障害は、黄斑変性症である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片は、対象に同時に投与される、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片は、別々に投与される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片は、同一の組成物中にある、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
ＢＡＣＥ阻害剤は、経口投与される、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
抗体または抗原結合性断片は、静脈内投与される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
抗体または抗原結合性断片は、皮下投与される、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
対象はヒトである、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
認知能力を改善するか、またはさらなる認知機能障害を予防する、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
記憶を改善するか、またはさらなる認知症を予防する、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
Ａβの蓄積に関連する疾患または障害を処置するための抗体または抗原結合性断片と組み合わせて使用するためのＢＡＣＥ阻害剤を含む組成物であって、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化５】
2019511500.tif 000072
またはその薬学的に許容される塩であり；抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む前記組成物。
【請求項５０】
Ａβの蓄積に関連する疾患または障害を処置するためのＢＡＣＥ阻害剤と組み合わせて使用するための抗体または抗原結合性断片を含む組成物であって、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化６】
2019511500.tif 000073
またはその薬学的に許容される塩であり；抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む前記組成物。
【請求項５１】
ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化７】
2019511500.tif 000074
のカンシレート塩である、請求項４９または５０に記載の組成物。
【請求項５２】
ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化８】
2019511500.tif 000075
である、請求項４９または５０に記載の組成物。
【請求項５３】
抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、該ＶＨドメインは、配列番号５２４に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、該ＶＬドメインは、配列番号５３３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項４９〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片を含むキットであって、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化９】
2019511500.tif 000076
またはその薬学的に許容される塩であり；抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む前記キット。
【請求項５８】
ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化１０】
2019511500.tif 000077
のカンシレート塩である、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化１１】
2019511500.tif 000078
である、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、該ＶＨドメインは、配列番号５２４に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６１】
抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、該ＶＬドメインは、配列番号５３３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６２】
ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６３】
ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１６年３月１５日に提出された米国仮特許出願第６２／３０８，６９８号の優先権の利益を主張する。前述の出願の明細書は、参照によってその全体を本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知機能および記憶を悪化させることによって特徴付けられ、患者の社会的および職業的機能を減退させる神経変性疾患である。この疾患は、脳内の神経細胞の損失を引き起こし、言語、ならびに判断、計画、秩序立ておよび論理的思考のような高次機能に認知的困難がもたらされ、最終的には人格変化を引き起こす可能性がある。この疾患の最終段階は、独立機能の完全な損失によって特徴付けられる。
【０００３】
組織学的には、ＡＤ（散発性および家族性）は、細胞内神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）および細胞外プラークの存在によって定義される。プラークは、脳内のニューロンおよび星状細胞に見られる膜貫通タンパク質である、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常な切断に由来するアミロイドβペプチド（Ａβ）の凝集物である。Ａβ沈着はまた、ＡＤ患者の血管内にも見られる。コリン作動性ニューロンは、ＡＤにおいて特に易損性であり、結果的な神経伝達物質の低下は、その他の神経伝達物質系に影響を及ぼす。この疾患の他の症状として、酸化的ストレス、炎症およびニューロンアポトーシス（プログラム細胞死）が挙げられる。ＡＤ患者では、広範な神経細胞死が、認知低下と、最終的な患者の死をもたらす（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。ＡＤは、一般集団よりもダウン症を有する人々の間で３〜５倍高い頻度で生じる。ダウン症を有する人々は、他の成人よりも若い年齢でＡＤを発症する傾向も高い。
【０００４】
現行の処置は対症療法に過ぎず、効果は最小限であり、限られた期間のみ症状が僅かに改善される。Ａβレベルにおける過剰生成または変化は、散発性および早発性ＡＤの発病において重要な事象であると考えられ、この理由から、Ａβは、ａ）その形成を低減するように（非特許文献４）、またはｂ）脳からのそのクリアランスを加速させる機構を活性化するように設計される薬物の開発の主要な標的となっている。
【０００５】
アミロイドカスケード仮説により、Ａβペプチドの生成がニューロンの機能に悪影響を及ぼし、それによって、ＡＤにおけるニューロン死および認知症が引き起こされることが提案される。Ａβは、セクレターゼによって順次切断されて異なる長さの種を生じるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から生成される。残基４２で終結するＡβは、ＡＰＰの処理によって生成されるＡβ種のマイナーな成分である。他の形態として、Ａβ１−４０およびＮ末端トランケートＡβｎ−４０が挙げられる。しかし、残基４２で終結するＡβは、最も凝集し易く、アミロイドプラークへの沈着を促進する。より凝集し易いことに加えて、Ａβ１−４２ペプチドは、培養中のニューロンに毒性であることが示されている可溶性の低分子ｎ−ポリマー（すなわち、オリゴマー）を形成する。より大きな目立つ原線維沈着とは異なり、オリゴマーは、典型的な病理学アッセイにおいて検出されない。同様の特性を有するオリゴマーはＡＤの脳から単離され、プラークよりも疾患進行により密接に関連する（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。Ａβ１−４２、ｐＧｌｕＡβ３−４２、Ａβ３−４２および４−４２を含むいくつかのＡβのアイソフォームが、ＡＤの脳で優勢であり、これらのうち、Ａβ１−４２とＡβ４−４２は、家族性および散発性ＡＤの海馬および大脳皮質の主要形態である（非特許文献８）。
【０００６】
以前に、いくつかの受動ワクチン接種ストラテジーが検討された。Ａβに対する抗体の末梢投与は、アミロイド負荷量を低減するのに十分であった（非特許文献９）。これらの実験では、比較的控えめな抗体血清レベルが達成されたにもかかわらず、受動的に投与された抗体は、血液脳関門を通過して中枢神経系に入り、プラークを修飾して、既存のアミロイドのクリアランスを誘導することができた。Ａβ１−４０特異的抗体、Ａβ１−４２特異的抗体およびＡβの残基１〜１６を対象とする抗体間の比較では、すべての抗体が、マウス脳内でＡβ蓄積が低減することを示した（非特許文献１０）。代表的な有用な抗Ａβ抗体の例として、特許文献１に記載されているものが挙げられる。
【０００７】
アルツハイマー病またはダウン症のような疾患を処置するためのさらなる興味深い治療標的はＢＡＣＥ阻害である。Ａβペプチドは、Ｃ末端における１種またはそれ以上のγセクレターゼによるＡＰＰの切断、およびβアミロイド形成経路の一部として、アスパルチルプロテアーゼまたはＡｓｐ２またはベータ部位ＡＰＰ切断酵素（ＢＡＣＥ）としても知られている、Ｎ末端におけるβセクレターゼ酵素によるＡＰＰの切断により生じる。ＢＡＣＥ活性は、ＡＰＰに由来するＡβペプチドの生成に直接相関し（非特許文献１１）、研究によって、ＢＡＣＥの阻害がＡβペプチドの生成を阻害することがさらに示されている（非特許文献１２）。ＢＡＣＥは、部分的に活性な酵素前駆体として合成される膜結合性１型タンパク質であり、脳組織中で豊富に発現される。ＢＡＣＥは、主要なβセクレターゼ活性を表すと思われ、Ａβの生成における律速ステップであると考えられる。したがって、ＢＡＣＥ活性を低減するか、またはブロックする薬物は、脳内、またはＡβもしくはその断片が沈着する他の場所におけるＡβレベルおよびＡβ断片のレベルを低減し、よって、アミロイドプラークの形成、およびＡＤまたはＡβもしくはその断片の沈着に関与する他の疾病の進行を遅延させるはずである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／０６０４４４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙｏｕｎｋｉｎ、Ｓ．Ｇ．（１９９５年）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．  ３７、２８７〜２８８頁
【非特許文献２】Ｂｏｒｃｈｅｌｔら（１９９６年）Ｎｅｕｒｏｎ  １７、１００５〜１０１３頁
【非特許文献３】Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９９、Ａ２３〜３１頁
【非特許文献４】Ｖａｓｓａｒ，Ｒ．ら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６、７３５〜７４１頁
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ｓ．Ｇ．（１９９８年）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ  ９２、２８９〜２９２頁
【非特許文献６】Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら（２００５年ａ）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．  ３３、１０８７〜１０９０頁
【非特許文献７】Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら（２００５年ｂ）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５、２４５５〜２４６２頁
【非特許文献８】Ｐｏｒｔｅｌｉｕｓ，Ｅ．ら（２０１０年）Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２０、１８５〜１９３頁
【非特許文献９】Ｂａｒｄ，Ｆら（２０００年）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、９１６〜９１９頁
【非特許文献１０】Ｌｅｖｉｔｅｓ，Ｙ．ら（２００６年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６、１９３〜２０１頁
【非特許文献１１】Ｓｉｎｈａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９年、４０２、５３７〜５４０頁
【非特許文献１２】Ｒｏｂｅｒｄｓ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００１年、１０、１３１７〜１３２４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ａβ形成を低減し（例えば、その形成を担う酵素を阻害することによって）、脳からのＡβクリアランスを加速するメカニズムを活性化する（例えば、既存のＡβと結合し、クリアランスのためにＡβを標的とすることによって）新規療法への必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一部の実施形態では、本開示は、Ａβの蓄積に関連する疾患または障害を有する対象を処置する方法であって、対象に：ａ）
【化１】
2019511500.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩である、薬学的に有効な量のＢＡＣＥ阻害剤、およびｂ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、薬学的に有効な量の抗体または抗原結合性断片を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化２】
2019511500.tif 000003
のカンシレート塩である。
【００１２】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化３】
2019511500.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１３】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は
【化４】
2019511500.tif 000005
のカンシレート塩である。
【００１４】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化５】
2019511500.tif 000006
である。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法のいずれかで使用するための抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の重鎖のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の軽鎖のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、ＶＨドメインは、配列番号５２４に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ここで、ＶＬドメインは、配列番号５３３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１、
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２、および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１、
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２、および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０および配列番号５３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０および配列番号５３１のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９および配列番号５４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９および配列番号５４０のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２４のアミノ酸配列含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３３のアミノ酸配列含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗原結合性断片である。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ’である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１−ＴＭ、ＩｇＧ１−ＹＴＥまたはＩｇＧ１−ＴＭ−ＹＴＥである。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトのものである。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、５００ｐＭまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）で単量体Ａβ１−４２に結合し、Ａβ１−４０に結合しないか、または１ｍＭより大きいＫＤでＡβ１−４０に結合するかのいずれかである。一部の実施形態では、抗体は、２つ以上のタイプの毒性または潜在的に毒性のＡβタンパク質（例えば、Ａβ１−４２および３−ピロ−４２アミロイドベータ）に結合するため有用である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、アミロイドベータ１７−４２ペプチド（Ａβ１７−４２）およびアミロイドベータ２９−４２ペプチド（Ａβ２９−４２）に結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、３−ピロ−４２アミロイドベータペプチドおよび１１−ピロ−４２アミロイドベータペプチドに結合する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、アミロイドベータ１−４３ペプチド（Ａβ１−４３）に結合する。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法のいずれかを使用して処置される疾患または障害は、アルツハイマー病、ダウン症、および／または黄斑変性症からなる群から選択される。一部の実施形態では、疾患または障害は、アルツハイマー病である。一部の実施形態では、疾患または障害は、ダウン症である。一部の実施形態では、疾患または障害は、黄斑変性症である。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片は、対象に同時に投与される。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片は、別々に投与される。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片は、同一の組成物中にある。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、経口投与される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、静脈内投与される。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、皮下投与される。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、本方法は、認知能力を改善するか、またはさらなる認知機能障害を予防する。一部の実施形態では、本方法は、記憶を改善するか、またはさらなる認知症を予防する。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、Ａβ蓄積に関連する疾患または障害を処置するための抗体または抗原結合性断片と組み合わせて使用するためのＢＡＣＥ阻害剤を含む組成物であって、ＢＡＣＥ阻害剤が：
【化６】
2019511500.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩であり、抗体または抗原結合性断片が、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、Ａβ蓄積に関連する疾患または障害を処置するためのＢＡＣＥ阻害剤と組み合わせて使用するための抗体または抗原結合性断片を含む組成物であって、ＢＡＣＥ阻害剤が：
【化７】
2019511500.tif 000008
またはその薬学的に許容される塩であり；抗体または抗原結合性断片が、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化８】
2019511500.tif 000009
またはその薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化９】
2019511500.tif 000010
のカンシレート塩である。
【００２０】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化１０】
2019511500.tif 000011
である。
【００２１】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号５２４に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＬドメインは、配列番号５３３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【００２２】
一部の実施形態では、ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、本開示は、ＢＡＣＥ阻害剤および抗体または抗原結合性断片を含むキットであって、ＢＡＣＥ阻害剤が：
【化１１】
2019511500.tif 000012
またはその薬学的に許容される塩であり；抗体または抗原結合性断片が、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７もしくはＡｂｅｔ０３８２またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つに由来する少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む、キットを提供する。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化１２】
2019511500.tif 000013
またはその薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化１３】
2019511500.tif 000014
のカンシレート塩である。
【００２４】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化１４】
2019511500.tif 000015
である。
【００２５】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＨドメインは、配列番号５２４に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインおよび重鎖可変（ＶＨ）ドメインを含み；ＶＬドメインは、配列番号５３３に示されるアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】精製した競合因子ｓｃＦｖの濃度（丸）を増加させることによる、ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドおよびＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ複合体形成の阻害を示すグラフである。最も有効なｓｃＦｖクローンのうちの４つ、Ａｂｅｔ０３６９（図１Ａ）、Ａｂｅｔ０３７７（図１Ｂ）、Ａｂｅｔ０３８０（図１Ｃ）およびＡｂｅｔ０３８２（図１Ｄ）はすべて、親であるＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ｓｃＦｖ配列（四角）に対して効力のかなりの改善を示している。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２】１０２４ｎＭ（上のトレース）から６３ｐＭ（下のトレース）までのペプチド濃度における、固定されたＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体に結合するヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドに対する表面プラズモン共鳴（ＢＩＡコア）トレースを示すグラフである。各トレースは、１：１のラングミュアモデルにフィッティングされている。
【図３】固定されたＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体に結合する一連のアミロイドベータペプチドに対する表面プラズモン共鳴（ＢＩＡコア）トレースを示すグラフである。ビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド（上のトレース）および標識されていないマウスアミロイドベータ１−４２ペプチド（２番目のトレース）への明らかな結合が存在する。ビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４０ペプチドまたは標識されていないマウスアミロイドベータ１−４０ペプチド（平らな線）には識別可能な結合が存在しない。
【図４−１】Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫組織化学染色からの試料画像を示す。（Ａ）陽性対照の抗体は、ヒトＡＤの脳切片に強力なプラークの認識（スコア＝４）を示す（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、ブラークステージ６；５μｇ／ｍｌの抗体）。（Ｂ）Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭを誘導したクローンは、隣接する脳切片に強力なプラークの認識（スコア＝３）を示す（１０μｇ／ｍｌ）。（Ｃ）同一の陽性対照抗体は、Ｔｇ２５７６マウス脳切片に強力なプラークの認識（スコア＝４）を示す（２２カ月齢のマウス；２０μｇ／ｍｌの抗体）。（Ｄ）Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭを誘導したクローンは、隣接するマウス脳切片に強力なプラークの認識（スコア＝４）を示す（２０μｇ／ｍｌ）。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】Ａベータ４２凝集調製物のウエスタンブロット解析およびＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１ＴＭを使用する検出を示す図である。（Ａ）非光架橋（ｎｏｎ  ＰＩＣＵＰ）Ａβ４２凝集物のＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１ＴＭ検出。（Ｂ）光架橋Ａβ４２凝集物（ＰＩＣＵＰ）のＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１ＴＭ検出。ここで、本発明者らは、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１ＴＭがＡβ１−４２単量体および五量体以下の低級ｎオリゴマー種を特異的に認識することを実証する。
【図６】１４日間にわたって週１回投与を繰り返し受けたスプラーグドーリーラットにおいて、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体の用量を増加させることによって、用量に依存した、ＣＳＦにおける遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドレベルの低減（Ａ）、脳組織における総アミロイドベータ１−４２ペプチドの増加（Ｂ）および影響を受けていない、脳組織における総アミロイドベータ１−４０ペプチドレベル（Ｃ）を示すグラフである。
【図７】老齢のＴｇ２５７６マウスへの末梢投与の１６８時間後の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、アミロイドベータプラークへのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの結合の免疫組織化学解析からの試料画像を示す。３０ｍｇ／ｋｇで与えた陽性対照の抗体は、強力なｉｎ  ｖｉｖｏでのプラーク認識を示し（Ａ）、一方、３０（Ｂ）または１０（Ｃ）ｍｇ／ｋｇで与えたＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭは、いかなるｉｎ  ｖｉｖｏでのプラーク修飾も示さない。
【図８】全長、トランケートおよびピロヒトＡベータペプチド（Ａベータ１−４２、Ａベータ１−４３、Ａベータ１−１６、Ａベータ１２−２８、Ａベータ１７−４２、Ａベータ  ピロ−３−４２、またはＡベータ  ピロ−１１−４２）のパネルの様々な濃度範囲（１０ｕＭを下回って０．１７ｎＭまで）での競合結合実験におけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの特異性を示すグラフである。記号解説：
【表１】
2019511500.tif 000016
ｘ軸は、ｌｏｇＭにおけるＡベータペプチドの濃度を示し、ｙ軸は特異的結合％を示す。Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの阻害：Ｎ末端でのビオチンＡベータ１−４２結合は、この群に対する１０−８〜１０−９モル濃度までの範囲のＩＣ５０値を有するＡベータ１−４２、Ａベータ１−４３、Ａベータ１７−４２、Ａベータ  ピロ−３−４２およびＡベータ  ピロ−１１−４２で観察された。Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの非阻害：Ｎ末端でのビオチンＡベータ１−４２結合は、Ａベータ１−１６またはＡベータ１２−２８で観察された。
【図９】正常なラットのＰＫ−ＰＤ研究における抗体Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬのアミロイドベータ１−４２を捕捉する能力を示すグラフである。ｘ軸は、ビヒクルまたはＡｂｅｔ０１４４−ＧＬの濃度（１０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇ）を示し、ｙ軸は、ＣＳＦ  ｐｇ／ｍｌ中の総アミロイドベータ１−４２の濃度を示す。ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２は、１０または４０ｍｇ／ｋｇのＡｂｅｔ０１１４−ＧＬのいずれによっても有意に変化しなかった（ビヒクルと比較した場合、それぞれ、５および１８％の増加）。ＣＳＦ中の総アミロイドベータ１−４２は、１０ｍｇ／ｋｇで３８％、４０ｍｇ／ｋｇで１３９％有意に増加した。脳組織中の総アミロイドベータ１−４２も、１０および４０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ、１６％および５０％有意に増加した。正常なラットにおけるこの研究のデータにより、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬが、ＣＳＦと脳の両方における総アミロイドベータ１−４２レベルを増加させる一方で、ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２レベルに有意な影響を与えなかったことが実証される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示は、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかと組み合わせて、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかで、それを必要とする対象を処置する方法を提供する。キットおよび組成物も提供される。
【００２８】
１．定義
本開示を説明する前に、この開示は、記載されている特定の方法および実験条件に限定されるのではなく、このような方法および条件は変更される場合があることを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるのであって、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図しないことも理解されたい。
【００２９】
他に定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００３０】
この明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、この文脈で他に明確に示されていなければ、複数の指示対象を含む。
【００３１】
アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される、それらの通常知られている３文字表記によって、または１文字表記によってのいずれかで言及されている。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常承認されている１文字コードによって言及されている。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「および／または」は、他のものの有無にかかわらず、２つの特定された構成または成分のそれぞれについての具体的な開示と解釈されるべきであると、ここで指摘するのが好都合である。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書において個々に述べられているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂおよび（ｉｉｉ）ＡおよびＢのいずれかについての具体的な開示と解釈されるべきである。
【００３３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用する。
【００３４】
この明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと」などの変化形は、述べられた整数または整数群を含むことを意味するが、他の整数または整数群を排除することを意味するものではないことが理解される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の記載された数値に関して使用される場合、その値が記載された値から１０％以下で変化してもよいことを意味する。
【００３６】
２．ＢＡＣＥ阻害剤
本開示は、それを必要とする対象を処置するための、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかと組み合わせた、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかの使用を提供する。
【００３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法のいずれかで使用するのに適するＢＡＣＥ阻害剤として、それぞれが参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許８，４１５，４８３号、同第８，８６５，９１１号、および同第９，２４８，１２９号、ならびに米国特許出願公開第２０１４／００３１３７９号に開示されているものが挙げられる。
【００３８】
一部の実施形態では、本開示で使用するのに適するＢＡＣＥ阻害剤は、４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン、またはその薬学的に許容される塩である。
【００３９】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、（１ｒ，４ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン：
【化１５】
2019511500.tif 000017
またはその薬学的に許容される塩である。
【００４０】
一部の実施形態では、本開示で使用するのに適するＢＡＣＥ阻害剤は、（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン：
【化１６】
2019511500.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示された化合物の誘導体であって、親化合物がその酸性または塩基性塩を作製することによって改変されている誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例として、これらに限定されないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩などが挙げられる。薬学的に許容される塩として、例えば、非毒性無機または有機酸から形成された親化合物の非毒性塩または第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、このような非毒性塩として、塩酸などの無機酸から誘導されるものが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から、従来の化学的方法によって合成することができる。一般的に、このような塩は、水中もしくは有機溶媒中、またはこの２つの混合物中で、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を化学量論量の適当な塩基または酸と反応させることによって製造することができ；一般的には、ジエチルエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が使用される。
【００４２】
一部の実施形態では、本開示で使用するのに適するＢＡＣＥ阻害剤は、化合物：４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩である。
【００４３】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、（１ｒ，４ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン：
【化１７】
2019511500.tif 000019
のカンシレート塩である。
【００４４】
一部の実施形態では、本開示で使用するのに適するＢＡＣＥ阻害剤は、（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン：
【化１８】
2019511500.tif 000020
のカンシレート塩である。
【００４５】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は：
【化１９】
2019511500.tif 000021
である。
【００４６】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、表Ａで示されるようなｄ−間隔値を有する、以下のピークを実質的に示す、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）パターンをもたらすことで特徴付けられる
【化２０】
2019511500.tif 000022
である。
【００４７】
【表２】
2019511500.tif 000023
【００４８】
【表３】
2019511500.tif 000024
【００４９】
一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、表Ｂで示されるようなｄ−間隔値を有する、以下の非常に強い、強いおよび中程度のピークを実質的に示す、Ｘ線粉末回折パターンをもたらすことで特徴付けられる
【化２１】
2019511500.tif 000025
である。
【００５０】
【表４】
2019511500.tif 000026
【００５１】
本明細書で使用される場合、用語カンシレート塩は、そのすべての溶媒和物および共結晶も包含する。
【００５２】
本明細書で使用するのに適するＢＡＣＥ阻害剤の代替塩として、コハク酸塩、塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩、フマル酸塩および１．５ナフタレンジスルホン酸塩が挙げられる。
【００５３】
本開示は、本開示の化合物のすべての互変異性形態をさらに含む。本明細書で使用される場合、「互変異性体」は、水素原子の転位から生じて平衡状態で存在する他の構造異性体を意味する。例えば、生じた化合物がケトンと不飽和アルコールの両方の特性を有するケト−エノール互変異性。互変異性の他の例として、２Ｈ−イミダゾール−４−アミンおよびその互変異性体である１，２−ジヒドロイミダゾール−５−イミン、ならびに２Ｈ−イミダゾール−４−チオールおよびその互変異性体である１，２−ジヒドロイミダゾール−５−チオンが挙げられる。この記載全体を通して、化合物の表現において、化合物の可能な互変異性体のうちの１つだけが描写されるかまたは示されている。
【００５４】
本開示の化合物は、水和物および溶媒和物をさらに含む。
【００５５】
（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩：
【化２２】
2019511500.tif 000027
化合物（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩は、（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンの適切な溶媒、例えば、２−プロパノール、アセトニトリル、もしくはアセトンまたはこれらの水との混合物中の溶液から出発して、その後、得られた溶液を、室温から８０℃の間の温度で、直接または適切な溶媒、例えば、２−プロパノールもしくは水に溶解した（１Ｓ）−（＋）−１０−カンファースルホン酸と混合することによって得られる。溶媒の蒸発によっておよび／もしくは溶液を冷却することによって、または塩反応による結晶化として直接、結晶を得ることができる。種結晶を使用して、結晶化を開始してもよい。少量の溶液をサンプリングし、次いで、これを急速に冷却して結晶化を誘導することによって、種をバッチ自体から製造してもよい。次いで、結晶を種としてバッチに添加する。
【００５６】
Ｘ線粉末回折解析（ＸＲＰＤ）は、標準的な方法、例えば、Ｇｉａｃｏｖａｚｚｏ，Ｃ．ら（１９９５年）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．およびＳｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｌ．（１９９６年）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｘ−Ｒａｙ  Ｐｏｗｄｅｒ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｕｎｎ，Ｃ．Ｗ．（１９４８年）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；またはＫｌｕｇ，Ｈ．Ｐ．およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ．（１９７４年），  Ｘ−ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されているものに従って調製された試料に関して実施してもよい。Ｘ線回折解析を、ＰＡＮａｎｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’Ｐｅｒｔ  ＰＲＯ  ＭＰＤ回折計を使用して、１〜６０°２θで９６分間実施した。ＸＲＰＤ距離の値は、最後の小数位の±２の範囲内で変化しうる。
【００５７】
相対強度は、可変スリットで測定されたディフラクトグラムから導出される。
【００５８】
最も強いピークに対する測定された相対強度は、５０％を超える相対ピーク高さで非常に強い（ｖｓ）、２５から５０％の間で強い（ｓ）、１０から２５％の間で中程度の（ｍ）、５から１０％の間で弱い（ｗ）、５％を下回ると非常に弱い（ｖｗ）とされる。ＸＲＰＤ強度は、好ましい配向を含む多様な理由で、様々な試料と様々な試料調製物の間で変化する場合があることが当業者に認識される。測定された角およびそれによるｄ−間隔におけるより小さなシフトは、回折計における試料表面レベルの変動を含む多様な理由で生じる場合があることもまた当業者に認識される。
【００５９】
３．抗Ａβ抗体または抗原結合性断片
本開示は、それを必要とする対象を処置するための、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせた、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの使用を提供する。
【００６０】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて使用するのに適する抗体または抗原結合性断片として、それぞれが参照によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１４／０６０４４４およびＵＳ２０１５／０２９９２９９に開示されているものが挙げられる。
【００６１】
本明細書で定義されているように、「抗体または抗原結合性断片」は、以下の抗体または抗原結合性断片：Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つまたはそれ以上の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、「抗体または抗原結合性断片」は、以下の抗体または抗原結合性断片：Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化変異体のうちのいずれか１つまたはそれ以上の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、「抗体または抗原結合性断片」は、Ａｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化変異体の少なくとも１、２、３、４、５または６つのＣＤＲを含む。本出願全体を通して、他に明示して述べられていなければ、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔおよび／またはＩＭＧＴシステムを使用して特定、または定義される。ＣＤＲが、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴシステムによって特定され、定義されたものとして存在することが示されている場合、ＣＤＲはそのシステムに従っていることを意味する（例えば、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ、ＫａｂａｔのＣＤＲまたはＩＭＧＴのＣＤＲ）。これらの用語はいずれも、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴのいずれのＣＤＲが参照されているかを示すために使用することができる。
【００６２】
血漿、脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）において、Ａβペプチド１−４２のアイソフォームとそのＮ末端トランケート（ｎ−４２）を結合することによって、本開示に記載の抗体または抗原結合性断片は、脳および脳血管系内でＡβｎ−４２（例えば、Ａβ１−４２、Ａβピロ３−４２、および／またはＡβ４−４２）アイソフォームの蓄積を防ぐかまたは沈着を元に戻す場合がある。本開示に記載の抗体または抗原結合性断片は、脳血漿中でおよび／または脳脊髄液（ＣＳＦ）中で可溶性Ａβ１−４２と結合し、沈殿し、それによって、それぞれ、血清および／またはＣＳＦ中で、Ａβ１−４２の濃度を低減する場合がある。これらの抗体または抗原結合性断片は、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて使用する場合、アルツハイマー病およびアミロイドーシスと関連する他の状態に対する治療アプローチを表す。
【００６３】
特定の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、Ａβ１７−４２内またはＡβ２９−４２内の標的エピトープに特異的であり、非標的エピトープ、例えば、Ａβ１−４０由来のエピトープに対して高い親和性でこの標的エピトープに結合し、それによって、アミロイドプラーク形成と関連する主要な毒性種を標的とする。例えば、抗体または抗原結合性断片は、Ａβ１−４０に対するよりも少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１０，０００倍高いＡβ１−４２に対する結合親和性を呈する場合がある。したがって、一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａβ１−４０よりもＡβ１−４２への結合に対して選択的である。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、５００ｐＭまたはそれ未満の解離定数（ＫＤ）でＡβ１−４２に結合する場合がある。特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａβ１−４０への有意な結合を示さない。一部の実施形態では、親和性および結合は、実施例で記載されているように、単量体Ａβペプチドを使用する表面プラズモン共鳴を使用して決定することができる。
【００６４】
Ａβへの結合は、抗体が、実施例に記載されているように、Ａβへの結合に対して、Ａβペプチドへの基準抗体分子と競合できるか否かを決定するために、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（商標））アッセイでも測定することができる。
【００６５】
ＨＴＲＦ（商標）アッセイは、極めて近接して存在するドナーとアクセプターフルオロフォアの間の蛍光共鳴エネルギー移動を利用するホモジニアスアッセイ技術である。このようなアッセイを使用して、目的の分子のうちの１つをドナーフルオロフォアであるユーロピウム（Ｅｕ３＋）クリプテートに直接的または間接的にカップリングする、および目的の他の分子をアクセプターフルオロフォアであるＸＬ６６５（安定な架橋アロフィコシアニン）にカップリングすることによって高分子相互作用を測定することができる。クリプテート分子の励起（３３７ｎｍにおける）は、６２０ｎｍにおける蛍光発光を生じる。この発光からのエネルギーは、クリプテートに極めて近接するＸＬ６６５に移行して、ＸＬ６６５からの特定の長寿命の蛍光（６６５ｎｍにおける）の発光を生じうる。ドナー（６２０ｎｍにおける）とアクセプター（６６５ｎｍにおける）の両方の特定のシグナルを測定し、アッセイにおける着色化合物の存在を補う６６５／６２０ｎｍの比の計算を可能にする。
【００６６】
一部の実施形態では、本開示に記載の抗体または抗原結合性断片は、Ａβ１−４２への結合に競合することができ、したがって、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイにおける基準抗体のＡβ１−４２との結合を阻害するが、Ａβ１−４０との結合は阻害しない。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＨＴＲＦ（商標）アッセイにおいて、Ａβ１−４２への結合に対するＡｂｅｔ０１４４ＧＬの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％の阻害を示す場合がある。
【００６７】
結合阻害の効力は、他に述べられていなければ、ＩＣ５０値（ｎＭ）として表現される。機能的アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大値の５０％低減する抗体分子の濃度である。リガンド結合研究では、ＩＣ５０は、受容体結合を特異的結合レベルの最大値の５０％低減する濃度である。ＩＣ５０は、抗体または抗原結合性断片濃度の対数の関数として生物学的応答の最大値の％をプロットすること、およびＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）またはＯｒｉｇｉｎ（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ）などのソフトウェアプログラムを使用して、Ｓ字型関数をＩＣ５０値を生じるためのデータにフィッティングすることによって計算することができる。効力を測定するかまたは決定するのに適するアッセイは当技術分野で周知である。
【００６８】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬおよびＡβ１−４２に関するＨＴＲＦ（商標）エピトープ競合アッセイにおいて、５ｎＭまたはそれ未満、例えば、２ｎＭまたはそれ未満、例えば、１ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０を有する場合がある。Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬは、ＶＨドメインである配列番号２０およびＶＬドメインである配列番号２９を有する抗体分子である。試験される抗体分子と同じフォーマット、例えば、ｓｃＦｖまたはＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１フォーマットのアッセイで使用される。したがって、本開示に記載のＩｇＧ抗体分子は、ＨＴＲＦエピトープ競合アッセイでヒトＡβ１−４２に結合するためのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧと競合する場合がある。このようなアッセイにおける効力は１ｎＭ未満である。
【００６９】
特定の実施形態では、本開示に記載の抗体または抗原結合性断片は、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイによって決定されるように、Ａβ１−４０よりもＡβ１−４２に特異的な結合を示す場合がある。このようなアッセイでは、Ａβ１−４０は、Ａβ１−４２ペプチドへの抗体または抗原結合性断片の結合についての有意な阻害を示さない場合があり、例えば、このようなアッセイにおいて、２０％未満、例えば、１０％未満または５％未満の阻害を示す場合があり、一部の実施形態では、このようなアッセイにおいて有意な阻害を示さない。
【００７０】
一部の実施形態では、本開示に記載の抗体または抗原結合性断片は、ヒトＡβ１７−４２内の、より具体的には、ヒトＡβ２９−４２内のエピトープを認識し、他の種、例えば、マウスまたはラット由来のＡβにおけるそれらの標的エピトープも認識する場合がある。第１の種（例えば、ヒト）由来のＡβ１−４２を使用するＨＴＲＦ（商標）競合アッセイにおいて計算された抗体または抗原結合性断片の効力は、２つの種のＡβ１−４２に対する抗体または抗原結合性断片の交差反応性の程度を評価するために、第２の種由来のＡβ１−４２（例えば、マウスのＡβ１−４２）を使用する同じアッセイにおける抗体または抗原結合性断片の効力と比較してもよい。ＩＣ５０測定によって決定される効力は、１０倍以内または１００倍以内であってもよい。上記のように、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬは、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイにおける基準抗体として使用される。本明細書に記載されている抗体または抗原結合性断片は、非ヒトＡβ１−４２アッセイにおいてよりもヒトＡβ１−４２アッセイにおいて大きな効力を有する場合がある。一部の実施形態では、抗体は、２種以上の毒性または潜在的に毒性のＡβタンパク質種（例えば、Ａβ１−４２および３−ピロ−４２アミロイドベータ）と結合するため有用である。
【００７１】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗体フレームワーク（すなわち、抗体抗原結合ドメイン）内に、１つまたはそれ以上のＣＤＲ、例えば、１セットのＣＤＲを有する抗体分子またはその抗原結合性断片を含む場合がある。例えば、抗体分子は、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含む場合がある。抗体分子のＶＨおよびＶＬドメインは、本開示の一部としても提供される。よく知られているように、ＶＨおよびＶＬドメインは、相補的決定領域（「ＣＤＲ」）、およびフレームワーク領域、（「ＦＷ］）を含む。ＶＨドメインは、１セットのＨＣＤＲを含み、ＶＬドメインは１セットのＬＣＤＲを含む。抗体分子またはその抗原結合性断片は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインならびに／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含む場合がある。ＶＨまたはＶＬドメインは、フレームワークをさらに含む場合がある。ＶＨまたはＶＬドメインフレームワークは、典型的に、以下の構造：ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＣＤＲ２−ＦＷ３−ＣＤＲ３−ＦＷ４において、ＣＤＲが散在する４つのフレームワーク領域、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４を含む。
【００７２】
６つの短いＣＤＲ配列の中で、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きな可変性（それを生じる遺伝子配列の機序に本質的に起因するより大きな多様性）を有する。重鎖の第３のＣＤＲは、最も長いサイズとして２６個のアミノ酸が知られているが、２つのアミノ酸程度の短さである場合がある。ＣＤＲの長さはまた、特定の基礎となるフレームワークによって収容することができる長さに従って変化する場合がある。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において部分的に役割を果たす（Ｓｅｇａｌら、ＰＮＡＳ、７１：４２９８〜４３０２頁、１９７４年；Ａｍｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７４７〜７５３頁、１９８６年；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７頁、１９８７年；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８８３頁、１９８９年；Ｃａｔｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４：１９６５〜１９６８頁、１９９；Ｓｈａｒｏｎら、ＰＮＡＳ、８７：４８１４〜４８１７頁、１９９０年；Ｓｈａｒｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４：４８６３〜４８６９頁、１９９０年；およびＫａｂａｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：１７０９〜１７１９頁、１９９１頁）。
【００７３】
本開示の態様による抗体ＶＨおよびＶＬドメイン、ＦＷならびにＣＤＲの例が、表３および４ならびに本開示の一部を形成する添付の配列表に列挙されている。ここで開示されているすべてのＶＨおよびＶＬ配列、ＣＤＲ配列、ＣＤＲのセット、ＨＣＤＲのセットおよびＬＣＤＲのセット、ならびにこれらの要素の組合せは、本開示の態様を表す。本明細書に記載されているように、「１セットのＣＤＲ」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、１セットのＨＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指し、１セットのＬＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指す。
【００７４】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は抗体である。一部の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００７５】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、抗原結合性断片である。抗原結合性断片として、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂおよびＦｄなどの分子が挙げられる。例えば、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびミニボディを含む、１つまたはそれ以上の抗体抗原結合部位を含む種々の他の抗体分子は操作されている。抗体分子ならびにそれらの構築および使用のための方法は、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１２６〜１１３６頁  ２００５年に記載されている。
【００７６】
実施例で記載されている多数のライブラリーのさらなる最適化および組み換えの広範囲に及ぶプロセスを通して、抗体クローンのパネルがＡｂｅｔ０１４４ＧＬから作成された。これらのさらに最適化されたクローンは、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３と称される。これらのＣＤＲ配列および可変ドメイン配列は、表３および４で言及され、配列表に示される。生殖系列化ＶＨおよびＶＬドメイン配列である、Ａｂｅｔ０３８０ＧＬ、Ａｂｅｔ０３７７ＧＬ、Ａｂｅｔ０３４３ＧＬ、Ａｂｅｔ０３６９ＧＬおよびＡｂｅｔ０３８２ＧＬは、表６および表７に示される。
【００７７】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０のＣＤＲの少なくとも１、２、３、４、５、または６つを含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０重鎖のＣＤＲの１、２、または３つを含む。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０軽鎖のＣＤＲの１、２、または３つを含む。表３および４は、Ａｂｅｔ０３８０が、ＨＣＤＲ１が配列番号５２５であり（Ｋａｂａｔ残基３１〜３５）、ＨＣＤＲ２が配列番号５２６であり（Ｋａｂａｔ残基５０〜６５）、ＨＣＤＲ３が配列番号５２７であり（Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２）、ＬＣＤＲ１が配列番号５３４であり（Ｋａｂａｔ残基２４〜３４）、ＬＣＤＲ２が配列番号５３５であり（Ｋａｂａｔ残基５０〜５６）およびＬＣＤＲ３が配列番号５３６である（Ｋａｂａｔ残基８９〜９７）Ｋａｂａｔシステムを使用して特定した１セットのＣＤＲを有することを示す。他の最適化された抗体クローンは、同様に表３および４に示され、本開示の態様としても提供される。
【００７８】
本開示に従って、ヒトＡβｎ−４２に対する抗体または抗原結合性断片は、本明細書に記載されている１つまたはそれ以上のＣＤＲ，例えば、１セットのＣＤＲを含む場合がある。ＣＤＲまたはＣＤＲのセットは、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３のＣＤＲのセット、またはその生殖系列化バージョンであるか、または本明細書に記載されているその変異体である場合がある。
【００７９】
一部の実施形態では；
ＨＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基３１〜３５からなる５アミノ酸長であってもよく；
ＨＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜６５からなる１７アミノ酸長であってもよく；
ＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基９５〜１０２からなる１６アミノ酸長であってもよく；
ＬＣＤＲ１は、Ｋａｂａｔ残基２４〜３４からなる１１アミノ酸長であってもよく；
ＬＣＤＲ２は、Ｋａｂａｔ残基５０〜５６からなる７アミノ酸長であってもよく；および／または
ＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ残基８９〜９７からなる９アミノ酸長であってもよい。
【００８０】
抗体または抗原結合性断片は、表３および４に列挙された抗体のいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／もしくはＨＣＤＲ３ならびに／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／もしくはＬＣＤＲ３、例えば、表３または４に列挙された抗体のいずれかの１セットのＣＤＲを含む場合がある。抗体または抗原結合性断片は、これらの抗体のいずれか１つの１セットのＶＨ  ＣＤＲを含む場合がある。場合により、抗体または抗原結合性断片は、これらの抗体のうちの１つの１セットのＶＬ  ＣＤＲを含む場合がある。ＶＬ  ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲと同一または異なる抗体に由来してもよい。表３に列挙された抗体のいずれかの１セットのＨＣＤＲを含むＶＨドメイン、および／または表４に列挙された抗体のいずれかの１セットのＬＣＤＲを含むＶＬドメインも本明細書において提供される。
【００８１】
抗体または抗原結合性断片は、Ｈおよび／またはＬ  ＣＤＲの開示されたセットの内、１つまたはそれ以上のアミノ酸変異、例えば、５、１０または１５個の変異を有する、表３および４に列挙された抗体のいずれかの１セットのＨおよび／またはＬ  ＣＤＲを含む場合がある。変異は、アミノ酸の置換、欠失または挿入であってもよい。例えば、本開示の抗体分子は、１つまたは２つのアミノ酸変異、例えば、置換を有する、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３、またはその生殖系列化バージョンのいずれかに由来するＨおよび／またはＬ  ＣＤＲのセットを含む場合がある。
【００８２】
例えば、抗体または抗原結合性断片は、
Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＨＣＤＲのアミノ酸配列が
ＨＣＤＲ１  配列番号５２５、
ＨＣＤＲ２  配列番号５２６、および
ＨＣＤＲ３  配列番号５２７
であるＡｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＨＣＤＲのセットを含むか、または１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＡｂｅｔ０３８０のＨＣＤＲのセットを含むＶＨドメインと、
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＬＣＤＲのアミノ酸配列が
ＬＣＤＲ１  配列番号５３４、
ＬＣＤＲ２  配列番号５３５、および
ＬＣＤＲ３  配列番号５３６
であるＡｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＬＣＤＲのセットを含むか、または１つまたは２つのアミノ酸変異を有するＡｂｅｔ０３８０またはＡｂｅｔ０３８０ＧＬのＬＣＤＲのセットを含むＶＬドメインとを含む場合がある。
【００８３】
変異は、ＣＤＲのセット内の任意の残基で潜在的になされる場合がある。一部の実施形態では、置換は、表３および４に示されるように、Ａｂｅｔ０１４４ＧＬと比較してＡｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３のいずれかにおいて、またはＡｂｅｔ０３８０、またはその生殖系列化バージョンと比較してＡｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３のいずれかにおいて置換された位置でなされる。
【００８４】
例えば、１つまたはそれ以上の置換は、以下のＫａｂａｔ残基：
ＶＨ  ＦＷ１における２６、２７、２８、２９または３０；
ＶＨ  ＣＤＲ１における３１、３２、３３、３４または３５；
ＶＨ  ＣＤＲ２における５２ａ、５３、５４、５５、５６、５７、５８または６２；
ＶＨ  ＣＤＲ３における９８、９９、１００ｈまたは１０２；
ＶＬ  ＣＤＲ１における２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４；
ＶＬ  ＣＤＲ３における８９、９０、９２、９３、９４または９７
の１つまたはそれ以上においてである場合がある。
【００８５】
特定のＫａｂａｔ残基の位置における可能なアミノ酸置換の例は、ＶＨドメインについて表１０および１２、ＶＬドメインについて表１１および１３に示される。
【００８６】
上述のように、抗体または抗原結合性断片は、抗体フレームワーク内に、１つまたはそれ以上のＣＤＲ、例えば、１セットのＣＤＲを有する抗体分子を含む場合がある。例えば、抗体の１つまたはそれ以上のＣＤＲまたは１セットのＣＤＲをフレームワーク（例えば、ヒトフレームワーク）に移植して、抗体分子をもたらすこともできる。フレームワーク領域はヒト生殖系列遺伝子セグメント配列のものである場合がある。したがって、フレームワークは生殖系列化されてもよく、それによって、フレームワーク内の１つまたはそれ以上の残基が、最も類似するヒト生殖系列フレームワークにおける等価の位置の残基に適合するように変化する。当業者は、生殖系列化前に、抗体のフレームワーク配列に対して配列中で最も近い生殖系列セグメントを選択し、抗体の親和性または活性を試験して、生殖系列となることによって、本明細書に記載されているアッセイにおいて、抗原結合または効力が有意に低減しないことを確認することができる。ヒト生殖系列遺伝子セグメント配列は当業者に公知であり、例えば、ＶＢＡＳＥ編集（ＶＢＡＳＥ、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＵＫ、１９９７年、ｈｔｔｐ／／ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）からアクセスすることができる。
【００８７】
本明細書に記載されている場合、抗体または抗原結合性断片は、ヒト生殖系列フレームワーク、例えば、Ｖｈ３−２３  ＤＰ−４７において、１セットのＨＣＤＲを含むＶＨドメインを有する単離されたヒト抗体分子である場合がある。したがって、ＶＨドメインフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＶｈ３−２３  ＤＰ−４７のフレームワーク領域を含む場合があり、および／またはこのヒト生殖系列遺伝子セグメントのフレームワーク残基に適合するフレームワーク残基を変異させることによって生殖系列化される場合がある。ＦＷ４は、ヒト生殖系列ｊセグメントのフレームワーク領域を含む場合がある。
【００８８】
ＶＨ  ＦＷ１のアミノ酸配列は配列番号５２８である場合がある。ＶＨ  ＦＷ１は、抗原結合および／またはＣＤＲ１ループの構造配置に重要となることに寄与する可能性のある、Ｋａｂａｔ位置２６〜３０の一連の残基を含有する。置換は、例えば、ＨＣＤＲ１の選択された配列と相乗効果を奏するために、配列番号５２８に含まれる。１つまたはそれ以上の置換は、場合により、表１０または表１２に示されているものから選択される。
【００８９】
ＶＨ  ＦＷ２のアミノ酸配列は配列番号５２９である場合がある。ＶＨ  ＦＷ３のアミノ酸配列は配列番号５３０である場合がある。ＶＨ  ＦＷ４のアミノ酸配列は配列番号５３１である場合がある。
【００９０】
通常、抗体または抗原結合性断片は、例えば、ヒト生殖系列フレームワーク、例えば、Ｖラムダ２３−３  ＤＰＬ−２３における１セットのＬＣＤＲを含むＶＬドメインも有する。したがって、ＶＬドメインフレームワーク領域は、ヒト生殖系列遺伝子セグメントＶラムダ２３−３  ＤＰＬ−２３のフレームワーク領域ＦＷ１、ＦＷ２および／またはＦＷ３を含む場合があり、および／またはこのヒト生殖系列遺伝子セグメントのフレームワーク残基に適合するフレームワーク残基を変異させることによって生殖系列化される場合がある。ＦＷ４は、ヒト生殖系列ｊセグメントのフレームワーク領域を含む場合がある。ＶＬ  ＦＷ１のアミノ酸配列は配列番号５３７である場合がある。ＶＬ  ＦＷ２のアミノ酸配列は配列番号５３８である場合がある。ＶＬ  ＦＷ３のアミノ酸配列は配列番号５３９である場合がある。ＶＬ  ＦＷ４のアミノ酸配列は配列番号５４０である場合がある。
【００９１】
生殖系列化ＶＨまたはＶＬドメインは、１つまたはそれ以上のＶｅｒｎｉｅｒ残基で生殖系列化されていてもよいし、または生殖系列化されていなくてもよいが、通常は生殖系列化されていない。
【００９２】
例えば、本明細書に記載されている抗体または抗原結合性断片は、重鎖フレームワーク領域の以下のセット：
ＦＷ１  配列番号５２８；
ＦＷ２  配列番号５２９；
ＦＷ３  配列番号５３０；
ＦＷ４  配列番号５３１
のうちのいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、
または、１、２、３、４、５、６または７個のアミノ酸変異、例えば、置換を有する重鎖フレームワーク領域の前記セットを含む場合がある。
【００９３】
本明細書に記載されている抗体または抗原結合性断片は、重鎖フレームワーク領域の以下のセット：
ＦＷ１  配列番号５３７；
ＦＷ２  配列番号５３８；
ＦＷ３  配列番号５３９；
ＦＷ４  配列番号５４０
のうちのいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、
または、１、２、３、４、５、または６個のアミノ酸変異、例えば、置換を有する軽鎖フレームワーク領域の前記セットを含む場合がある。
【００９４】
非生殖系列化抗体分子は、生殖系列化抗体分子と比較して、同一のＣＤＲを有するが、異なるフレームワークを有する。添付の配列表において、ここで示されている抗体配列のうち、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３７７−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３４３−ＧＬ、Ａｂｅｔ０３６９−ＧＬ、およびＡｂｅｔ０３８２−ＧＬの配列が生殖系列化されている。配列が本明細書で開示されている他の抗体分子の生殖系列化抗体は、それらのＶＨおよびＶＬドメイン配列のフレームワーク領域を、場合により、ＶＨドメインのＶｈ３−２３  ＤＰ−４７およびＶＬドメインのＶラムダ２３−３  ＤＰＬ−２３へと生殖系列化することによって産生される。
【００９５】
前述の通り、ＶＨまたはＶＬドメインは単独で使用され抗原に結合するが、典型的には、ＶＨドメインはＶＬドメインと対合して抗体抗原結合部位をもたらす。例えば、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＶＨドメイン（配列番号５２４）は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＶＬドメイン（配列番号５３３）と対合し、その結果、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＶＨとＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。本明細書で開示されている他の抗体のＶＨおよびＶＬドメインに対して類似の実施形態が提供される。他の実施形態では、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＶＨは、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＶＬ以外のＶＬドメインと対合する。軽鎖の交雑は当技術分野で十分に確立されている。また、類似の実施形態は、本明細書で開示されている他のＶＨおよびＶＬドメインに対して本開示によって提供される。したがって、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３のいずれかのＶＨ  ＣＤＲまたは生殖系列化ＶＨドメイン配列を含むＶＨドメインは、異なる抗体に由来するＶＬ  ＣＤＲまたは生殖系列化ＶＬドメインを含むＶＬドメインと対合する、例えば、ＶＨおよびＶＬドメインは、Ａｂｅｔ０３１９、Ａｂｅｔ０３２１ｂ、Ａｂｅｔ０３２２ｂ、Ａｂｅｔ０３２３ｂ、Ａｂｅｔ０３２８、Ａｂｅｔ０３２９、Ａｂｅｔ０３３２、Ａｂｅｔ０３４２、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７０、Ａｂｅｔ０３７１、Ａｂｅｔ０３７２、Ａｂｅｔ０３７３、Ａｂｅｔ０３７４、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３７８、Ａｂｅｔ０３７９、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３８１、Ａｂｅｔ０３８２およびＡｂｅｔ０３８３から選択される異なる抗体に由来する場合がある。
【００９６】
抗体または抗原結合性断片は、
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７およびＡｂｅｔ０３８２、もしくはその生殖系列化バージョンのいずれかに対して、表１４において、または添付の配列表において示されているＶＨドメインアミノ酸配列を含むか、
または１つまたは２つのアミノ酸変異を有するそのアミノ酸配列を含み；
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７およびＡｂｅｔ０３８２、もしくはその生殖系列化バージョンのいずれかに対して、表１４において、または添付の配列表において示されているＶＬアミノ酸配列を含むか、
または１つまたは２つのアミノ酸変異を有するそのアミノ酸配列を含む場合がある。
【００９７】
抗体分子は：
（ｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかに対して、表１４において示されているＶＨドメインアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を有するＶＨドメイン；および
（ｉｉ）Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかに対して、表１４において示されているＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％または９８％同一のアミノ酸配列を有するＶＬドメイン
を含む場合がある。
【００９８】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ａｂｅｔ０３８０、Ａｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７およびＡｂｅｔ０３８２、またはその生殖系列化バージョンのいずれかのＶＨドメインおよびＶＬドメインと、それぞれ、少なくとも９０％、９５％または９８％同一のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む場合がある。
【００９９】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＶＨドメインを含み、ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＶＬドメインを含み、ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインは：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；および
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３
を含み、ＶＬドメインは：
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２８、配列番号５２９、配列番号５３０および配列番号５３１のうちのいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３７、配列番号５３８、配列番号５３９および配列番号５４０のうちのいずれか１つまたはそれ以上のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるフレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号５２４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号５３３と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、抗体分子または抗原結合性断片は、抗体の定常領域を含む。抗体分子は、ＩｇＧのような全抗体、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４であるか、または以下に記載される抗体断片または誘導体であってもよい。抗体分子は、他のフォーマット、例えば、Ｆｃ領域において、ＹＴＥを有するＩｇＧ１（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６９：５１７１〜５１８０頁；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００６年）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（３３）：２３５１４〜２４頁）および／またはＴＭ変異（Ｏｇａｎｅｓｙａｎら（２００８年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ６４：７００〜４頁）を有することもできる。
【０１０４】
本開示は、変異体Ｆｃ領域を有する本開示の抗体または抗原結合性断片であって、変異体が、Ｋａｂａｔにおいて示され、ＥＵインデックスによって番号付けされた、２３４位におけるフェニルアラニン（Ｆ）残基、２３５位におけるフェニルアラニン（Ｆ）残基またはグルタミン酸（Ｅ）残基、および３３１位におけるセリン（Ｓ）残基を含む抗体または抗原結合性断片を提供する。このような変異の組合せは、以下、トリプレット変異（ＴＭ）と称される。
【０１０５】
本明細書に記載されている抗体または抗原結合性断片は：
（ｉ）寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８８９（Ａｂｅｔ０００７）；
（ｉｉ）寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８９０（Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ）；
（ｉｉｉ）寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８９１（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）；
（ｉｖ）寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８９２（Ａｂｅｔ０３７７−ＧＬ）
のうちのいずれかの核酸配列および／またはベクターによってコードされるＣＤＲ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、抗体抗原結合部位または抗体分子を含む場合がある。
【０１０６】
本明細書に記載されている抗体または抗原結合性断片は、寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の核酸、ベクターまたは細胞株から産生されるかまたは産生可能である。例えば、抗体または抗原結合性断片は、寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８９０の細胞株の核酸またはベクターの発現によって産生することができる。核酸またはベクターは、任意の従来の発現系を使用して発現される。あるいは、抗体または抗原結合性断片は、寄託受託番号ＮＣＩＭＢ  ４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞株によって発現される。
【０１０７】
本開示の態様は、受託番号４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞株に含有されるＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸；受託番号４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞株に含有される前記核酸を含むベクター；ならびに受託番号４１８８９、４１８９０、４１８９１または４１８９２の細胞または細胞株も提供する。
【０１０８】
本開示に記載の抗体または抗原結合性断片は、ヒトＡβ１−４２への結合について、受託番号４１８８９、４１８９０、４１８９１もしくは４１８９２の下で寄託された核酸によってコードされた任意の抗体分子、または添付の配列表において示されているＡｂｅｔ００７、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬまたはＡｂｅｔ０３７７−ＧＬのＶＨドメインおよびＶＬドメインアミノ酸配列を含む抗体分子と競合する抗体抗原結合部位または抗体分子を含む場合がある。
【０１０９】
抗体または抗原結合性断片は、通常、抗原結合部位を有する分子を含む。例えば、抗体または抗原結合性断片は、抗原結合部位を含む抗体分子または非抗体タンパク質であってもよい。
【０１１０】
モノクローナルおよび他の抗体を入手して、組み換えＤＮＡ技術の手法を使用し、標的抗原に結合する他の抗体またはキメラ分子を生成することが可能である。このような手法には、抗体の免疫グロブリン可変領域、またはＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域とフレームワーク領域へ導入することに関与する場合がある。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ  ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００、および以下の多くの文献を参照のこと。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、遺伝子変異または他の変化を受ける場合があり、このことが、産生される抗体の結合特異性を変化させる場合もあり、または変化させない場合もある。
【０１１１】
抗体の操作についての当技術分野に利用可能なさらなる技術により、ヒトおよびヒト化抗体を単離することが可能となっている。例えば、ヒトハイブリドーマは、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ［Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＲおよびＤｕｂｅｌ，Ｓ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＬＬＣ；２００１年、ＩＳＢＮ：３５４０４１３５４５」に記載されているように作製することができる。
【０１１２】
マウスの免疫系のインタクトな他の成分をそのままにして、ヒト抗体を単離するために、マウス抗体遺伝子を不活性化し、ヒト抗体遺伝子と機能的に置き換えたトランスジェニックマウスを使用することができる［Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．ら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ、１５（２）：１４６〜１５６頁］。ヒト化抗体を、例えば、ＷＯ９１／０９９６７、ＵＳ５，５８５，０８９、ＥＰ５９２１０６、ＵＳ５６５，３３２およびＷＯ９３／１７１０５に開示されているもののような当技術分野で公知の技術を使用して生成することができる。さらに、ＷＯ２００４／００６９５５には、非ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ配列の正準ＣＤＲ構造タイプをヒト抗体配列、例えば、生殖系列抗体遺伝子セグメントのライブラリーからの対応するＣＤＲの正準ＣＤＲ構造タイプと比較することによって、ヒト抗体遺伝子からの可変領域フレームワーク配列を選択することに基づき、抗体をヒト化するための方法が記載されている。非ヒトＣＤＲと類似する正準ＣＤＲ構造タイプを有するヒト抗体の可変領域は、ヒトフレームワーク配列を選択するためのメンバーヒト抗体配列の部分集合を形成する。部分集合のメンバーは、ヒトＣＤＲ配列と非ヒトＣＤＲ配列との間のアミノ酸類似性によって、さらに順位付けされる。ＷＯ２００４／００６９５５の方法では、上位の順位であるヒト配列が、機能的に、ヒトＣＤＲ配列を選択された部分集合のメンバーヒトフレームワークを使用する非ヒトＣＤＲ対応物と置き換えるキメラ抗体を構築するためのフレームワーク配列を提供するために選択され、それによって、非ヒトとヒト抗体の間のフレームワーク配列を比較する必要なく、親和性が高く、免疫原性の低いヒト化抗体が提供される。本方法に従って作製されたキメラ抗体も開示されている。
【０１１３】
合成抗体分子は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら［Ｋｎａｐｐｉｋら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）２９６、５７〜８６頁］またはＫｒｅｂｓら［Ｋｒｅｂｓら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５４  ２００１年  ６７〜８４頁］に記載されている適切な発現ベクター内で合成およびアセンブルされたオリゴヌクレオチドによって生成された遺伝子からの発現によって創出される。
【０１１４】
全抗体の断片（本明細書において、抗体断片または抗原結合性断片と称される場合もある）は、抗原と結合する機能を果たすことが示されてきた。抗原結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片［Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５４４〜５４６頁（１９８９年）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ、３４８、５５２〜５５４頁；Ｈｏｌｔら（２００３年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１、４８４〜４９０頁］；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結したＦａｂ断片を含む２価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片  （ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成できるようにするペプチドリンカーによって連結している単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）［Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５、５８７９〜５８８３頁、１９８８年］；（ｖｉｉｉ）二重特異性短鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多重特異性断片である、「ダイアボディ」（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０  ６４４４〜６４４８頁、１９９３年）である。Ｆｖ、ｓｃＦｖまたはダイアボディ分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組込みによって安定化される［Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１４、１２３９〜１２４５頁、１９９６年］。ＣＨ３ドメインに接続したｓｃＦｖを含むミニボディも作製される［Ｈｕ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６、３０５５〜３０６１頁、１９９６年］。結合性断片の他の例は、抗体ヒンジ領域に由来する１つまたはそれ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端のいくつかの残基の付加によるＦａｂ断片と異なるＦａｂ’、および定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を保有するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨである。
【０１１５】
本開示の抗原結合性断片は、酵素、例えば、ペプシンもしくはパパインによる消化のような方法によって、および／または化学的還元によるジスルフィド架橋の切断によって、本明細書に列挙した抗体のいずれかから出発して得ることができる。別の手法では、本開示に含まれる抗原結合性断片は、同様に当業者に周知の技術の遺伝子組み換え技術によって、または、そうでなければ、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社などによって供給されるもののような自動ペプチド合成装置によるペプチド合成、もしくは核酸の合成および発現によって得ることができる。
【０１１６】
本開示に記載の機能的抗体断片として、化学的改変によって、特に、ＰＥＧ化によって、またはリポソームへの組込みによって半減期が増加する任意の機能的断片が挙げられる。
【０１１７】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ｄＡｂである。ｄＡｂ（ドメイン抗体）は、抗体の小さな単量体抗原結合性断片、すなわち、抗体重鎖または軽鎖の可変領域である。ＶＨ  ｄＡｂは、ラクダ科（例えば、ラクダ、リャマ）では天然に存在し、標的抗原を有するラクダ科の動物を免疫化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、個々のＢ細胞からｄＡｂ遺伝子を直接クローニングすることによって生成される。ｄＡｂは、細胞培養物中でも生産可能である。
【０１１８】
種々の方法が、抗体を得るために当技術分野で利用可能である。抗体は、当業者に周知の標準方法に従って得ることのできる、特に、ヒト、マウス、キメラまたはヒト化起源のモノクローナル抗体であってもよい。
【０１１９】
一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的断片の調製について、特に、マニュアル「抗体」［ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．、７２６頁、１９８８年］またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ［ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７頁、１９７５年］に記載されている技法に言及することが可能である。
【０１２０】
一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、例えば、ヒトＡβ１−４２で免疫化された動物細胞、または前記モノクローナル抗体、例えば、Ａβ１７−４２によって認識されるエピトープを含有するその断片のうちの１つから得ることができる。
【０１２１】
ＷＯ２００６／０７２６２０には、免疫グロブリンドメインのベータ鎖間に伸長する構造（非ＣＤＲ）ループの抗原結合部位の操作について記載されている。抗原結合部位は、例えば、ＶＨまたはＶＬドメインのフレームワーク領域の、または抗体の定常ドメイン、例えば、ＣＨ１および／またはＣＨ３のＣＤＲの天然の位置から離れた抗体分子の領域において操作される。構造領域において操作された抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲのセットによって形成された抗原結合部位に追加されてもよく、またはその代わりであってもよい。多数の抗原結合部位が抗体分子中に存在する場合、これらは同一の抗原（標的抗原）に結合し、それによって、抗体または抗原結合性断片の価数を増加させる。あるいは、多数の抗原結合部位が異なる抗原（標的抗原と１つまたはそれ以上の別の抗原）に結合し、これを使用して抗体分子のエフェクター機能を追加するか、半減期を延長するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの送達を改善する場合がある。
【０１２２】
抗体分子を含む不均質調製物も本開示の一部を形成する。例えば、このような調製物は、全長重鎖およびＣ末端のリシンを欠く重鎖を有する、様々な度合いのグリコシル化を伴う、および／またはピログルタミン酸残基を形成するためのＮ末端グルタミン酸の環化のような誘導体化したアミノ酸を有する抗体の混合物であってもよい。
【０１２３】
上記のように、本開示に従う抗体または抗原結合性断片は、ヒトＡβ１−４２に結合する。本明細書に記載されているように、本開示の抗体または抗原結合性断片は、ＨＴＲＦ（商標）競合アッセイにおける親和性および／または阻害効力について最適化することができる。一般的に、効力の最適化は、選択された抗体または抗原結合性断片の配列（通常、抗体の可変ドメイン配列）を変異させて抗体または抗原結合性断片のライブラリーを作成し、次いで、これを効力についてアッセイし、より有効な抗体または抗原結合性断片を選択することに関与する。したがって、選択された「効力の最適化された」抗体または抗原結合性断片は、ライブラリーを作成した抗体または抗原結合性断片よりも高い効力を有する傾向がある。それにもかかわらず、高い効力を有する抗体または抗原結合性断片は最適化せずに得られる場合もあり、例えば、高い効力を有する抗体または抗原結合性断片は最初のスクリーニングから直接得られる場合もある。アッセイと効力については、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。したがって、当業者は、高い効力を有する抗体または抗原結合性断片を作成することができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、表３および４に列挙された抗体のいずれか、例えば、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１ＴＭまたはＩｇＧ１の親和性、またはより高い親和性で、ヒトＡβ１−４２と結合する場合がある。代表的な抗体結合親和性は表５に示されている。異なる抗体または抗原結合性断片の結合親和性および中和効力を適当な条件下で比較することができる。
【０１２５】
本明細書においてアミノ酸配列が示されているもの、およびＡβ１−４２に対する抗体または抗原結合性断片において用いることのできるものを含む、本明細書に記載されているＶＨおよびＶＬドメインならびにＣＤＲの変異体は、配列変化または変異の方法、および所望の特徴を有する抗原抗体または抗原結合性断片をスクリーニングすることによって、得ることができる。所望の特徴の例として、これらに限定されないが：抗原に特異的である公知の抗体と比較した抗原に対する結合親和性の増加、活性が、特定のモル比での抗原への公知の抗体またはリガンドとの公知の特定の競合能力である場合に、抗原に特異的である公知の抗体と比較した抗原活性の中和の増加、複合体を免疫沈降する能力、特異的エピトープ：直鎖状エピトープ、例えば、例えば直鎖状および／または制約されたコンフォメーション、または非連続残基によって形成された立体構造エピトープにおいてスクリーニングされたペプチド配列を使用して、本明細書に記載されているペプチド結合スキャンを使用して特定されたペプチド配列に結合する能力；ならびにヒトＡβ１−４２の新たな生物学的活性をモジュレートする能力が挙げられる。このような方法は本明細書においても提供される。
【０１２６】
本明細書で開示されている抗体分子の変異体は、本開示において生成および使用することができる。構造／特性−活性関係への多変量データ解析技術の適用におけるコンピューター化学の前例に従って［例えば、Ｗｏｌｄら、Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ−Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂ．Ｋｏｗａｌｓｋｉ編）；Ｄ．Ｒｅｉｄｅｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ドルドレヒト、オランダ国、１９８４年）（ＩＳＢＮ９０−２７７−１８４６−６）を参照のこと］、抗体の量的活性−特性関係を、周知の数学的技術、例えば統計回帰、パターン認識および分類法を使用して誘導することができる［例えば、Ｎｏｒｍａｎら  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；第３版（１９９８年４月）ＩＳＢＮ：０４７１１７０８２８；Ｋａｎｄｅｌ，Ａｂｒａｈａｍら  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅａｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ  ＰＴＲ、（１９９５年５月１１日）、ＩＳＢＮ：０１３３４１８８４７；Ｋｒｚａｎｏｗｓｋｉ，Ｗｏｊｔｅｋ．  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｎｏ  ２２（研究論文））。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；（２０００年１２月）、ＩＳＢＮ：０１９８５０７０８９；Ｗｉｔｔｅｎ，Ｉａｎ  Ｈ．ら  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｊａｖａ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ。Ｍｏｒｇａｎ  Ｋａｕｆｍａｎｎ；（１９９９年１０月１１日）、ＩＳＢＮ：１５５８６０５５２５；Ｄｅｎｉｓｏｎ  Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．（編）ら  Ｂａｙｅｓｉａｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）。Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；（２００２年７月）、ＩＳＢＮ：０４７１４９０３６９；Ｇｈｏｓｅ，Ａｒｕｐ  Ｋ．ら  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｏｏｌｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ。ＩＳＢＮ：０−８２４７−０４８７−８を参照のこと］。抗体の特性は、抗体配列、機能的および３次元構造の経験的および理論的モデル（例えば、可能性のある接触残基の分析または計算された物理化学特性）から演繹することができ、これらの特性は単独および組み合わせて考慮することができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、ＶＨドメインおよびＶＬドメインから構成される抗原結合部位は、典型的に、ポリペプチドの６つのループ：軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からの３つのループと重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からの３つのループによって形成される。原子構造が公知である抗体の解析により、抗体の結合部位の配列と３次元構造の間の関係が明らかにされた［Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ．ら  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９２年）２２７、７９９〜８１７頁；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９７年）２７３（４）、９２７〜９４８頁］。これらの関係は、ＶＨドメイン中の第３の領域（ループ）を除いて、結合部位ループが、少数の主鎖立体構造：すなわちカノニカルな構造のうちの１つを有することを意味する。特定のループにおいて形成されるカノニカルな構造は、そのサイズ、ならびにループおよびフレームワーク領域の両方の重要な部位におけるある特定の残基の存在によって決定されることが示された。
【０１２８】
配列と構造の関係についてのこの研究は、ＣＤＲループの３次元構造を維持し、ゆえに、結合特異性を維持する際に重要である、配列は公知であるが３次元構造は公知ではない抗体の残基を予測するために使用することができる。これらの予測は、リード最適化実験のアウトプットと予測を比較することによって確認することができる。構造的アプローチにおいて、ＷＡＭ［Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ，Ｎ．Ｒ．ｕ．およびＲｅｅｓ，Ａ．Ｒ（２０００年）。Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１２、８１５〜８２４頁］のような自由に利用可能であるか、または市販されている任意のパッケージを使用して、抗体分子のモデルを創出することができる［Ｃｈｏｔｈｉａら  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３、７５５〜７５８頁（１９８６年）］。次いで、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ［Ｇｕｅｘ，Ｎ．およびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９７年）１８、２７１４〜２７２３頁］のようなタンパク質可視化および解析用ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲ中の各位置において起こり得る置換を評価することができる。次いで、この情報を使用して、活性に最小限または有益な影響を与える可能性がある置換を起こすことができる。
【０１２９】
ＣＤＲ、抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインおよび抗体または抗原結合性断片のアミノ酸配列内に置換を起こすために必要とされる技術は、一般に、当技術分野において利用可能である。活性に最小限または有益な影響を与えることが予測されることもあればされないこともある置換により変異配列を作製し、Ａβ１−４２に結合する能力および／または任意の他の所望の特性に関して試験することができる。
【０１３０】
配列が本明細書に具体的に開示されているＶＨおよびＶＬドメインのいずれかの可変ドメインのアミノ酸配列変異体は、論じられるように、本開示に従って用いることができる。
【０１３１】
上述のように、本開示の態様は、ＶＨドメイン配列が以下の添付の配列表に示されている、表８に列挙された抗体のいずれかのＶＨドメインと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有するＶＨドメインを含み；および／またはＶＬドメイン配列が添付の配列表に示されている、表９に列挙された抗体のいずれかのＶＬドメインと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有するＶＬドメインを含む抗体分子のような抗体または抗原結合性断片を提供する。
【０１３２】
本開示の態様は、ＶＨ  ＣＤＲ配列が本明細書で示されている、本明細書で列挙された抗体のいずれかのＶＨ  ＣＤＲのセットと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有する１セットのＶＨ  ＣＤＲを有するＶＨドメインを含み；および／またはＶＬ  ＣＤＲ配列が本明細書で示されている、本明細書で列挙された抗体のいずれかのＶＬ  ＣＤＲのセットと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有する１セットのＶＬ  ＣＤＲを有するＶＬドメインを含む抗体分子のような抗体または抗原結合性断片を提供する。
【０１３３】
２つのアミノ酸配列の同一性％を計算するために使用することができるアルゴリズムとして、例えば、例えばデフォルトパラメータを用いる、ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０５〜４１０］、ＦＡＳＴＡ［ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８頁］、またはスミス−ウォーターマンアルゴリズム［ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５〜１９７］が挙げられる。
【０１３４】
特定の可変ドメインは、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列の変異（アミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入）、ならびに約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２つ未満の変異を含む場合がある。
【０１３５】
変異は、１つもしくはそれ以上のフレームワーク領域および／または１つもしくはそれ以上のＣＤＲにおいて起こる場合がある。通常、変異によって機能の喪失は生じないため、このように変化したアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合性断片は、ヒトＡβ１−４２に結合する能力を保持する場合がある。変化したアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合性断片は、例えば、本明細書に記載されているアッセイで測定された場合、変化が起こっていない抗体または抗原結合性断片と同量の結合および／または中和能力を保持する場合がある。このように変化したアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合性断片は、ヒトＡβ１−４２に結合する改善された能力を有する場合がある。
【０１３６】
変異は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を天然に存在しないかまたは非標準アミノ酸と置き換えること、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を天然に存在しないかもしくは非標準の形態に改変すること、または１つもしくはそれ以上の天然に存在しないかもしくは非標準アミノ酸を配列に挿入することを含む場合がある。本開示の配列の変化の数および位置の例は本明細書の他の箇所に記載されている。天然に存在するアミノ酸は、その標準の１文字コードでＧ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅと特定される２０種の「標準」Ｌ−アミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、ポリペプチド主鎖に組み込まれ、既存のアミノ酸残基の改変から生じる任意の他の残基を含む。非標準アミノ酸は、天然に存在する場合も天然に存在しない場合もある。４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなどのようないくつかの天然に存在する非標準アミノ酸が当技術分野で公知である［ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、（Ｗｉｌｅｙ）１９９５年］。Ｎ−アルファ位で誘導体化されるこれらのアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ末端にのみ位置づけられる。通常、本開示において、アミノ酸はＬ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。したがって、変化は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に改変すること、またはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置き換えることを含む。アミノ酸のメチル化、アセチル化および／またはリン酸化形態も知られており、本開示のアミノ酸はこのような改変を受ける場合もある。
【０１３７】
本開示の抗体ドメインおよび抗体または抗原結合性断片におけるアミノ酸配列は、上述の非天然または非標準アミノ酸を含む場合がある。非標準アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を合成の間に、またはアミノ酸配列の合成後に「オリジナルの」標準アミノ酸の改変もしくは置き換えによって、アミノ酸配列に組み込んでもよい。
【０１３８】
非標準および／または天然に存在しないアミノ酸の使用によって、本開示の抗体または抗原結合性断片における構造および機能の多様性が増し、したがって、所望の結合および中和特性を達成するための可能性も上昇する。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、標準のＬ−アミノ酸と比較して、異なる薬物動態プロファイルを有することが示され、これは、動物、例えば、ヒトへの投与後のＬ−アミノ酸を有するポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの分解に起因し、これは、Ｄ−アミノ酸が一部のｉｎ  ｖｉｖｏでの適用に有利であることを意味する。
【０１３９】
本開示のＣＤＲに由来する配列を保有する新規ＶＨまたはＶＬ領域は、可変ドメイン全体の中に変異を生じさせるために１つまたはそれ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を使用して作成される。このような技法は、エラープローンＰＣＲを使用したＧｒａｍら［Ｇｒａｍら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８９：３５７６〜３５８０頁］に記載されている。一部の実施形態では、可変ドメイン全体またはＣＤＲのセット内で１つまたは２つのアミノ酸置換が起こる。
【０１４０】
使用される別の方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対する突然変異誘発を対象とするものである。こうした技法は、Ｂａｒｂａｓら［Ｂａｒｂａｓら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３頁］およびＳｃｈｉｅｒら［Ｓｃｈｉｅｒら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２６３：５５１〜５６７頁］により開示されている。
【０１４１】
上述の技法はすべて、当技術分野においてそれ自体公知であり、当業者は、このような技法を使用して、当技術分野で常用の方法を使用して本開示の抗体または抗原結合性断片を提供することができる。
【０１４２】
本開示のさらなる態様は、ヒトＡβ１−４２に対する抗体抗原結合部位を得るための方法であって、本明細書で示されるＶＨドメインのアミノ酸配列における１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、または挿入によって、ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを準備するステップと、場合により、このように提供されたＶＨドメインを１つまたはそれ以上のＶＬドメインと組み合わせるステップと、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬの組合せを試験して、Ａβ１−４２に対するものであり、場合により、１つまたはそれ以上の所望の特性を有する抗体または抗原結合性断片または抗体抗原結合部位を特定するステップを含む方法を提供する。前記ＶＬドメインは、実質的に本明細書で示されているアミノ酸配列を有する場合がある。本明細書で開示されているＶＬドメインの１つまたはそれ以上の配列変異体を１つまたはそれ以上のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法が用いられてもよい。
【０１４３】
上記のように、本明細書で実質的に示されているＣＤＲアミノ酸配列は、ヒト抗体可変ドメインまたはその実質的部分にＣＤＲとして組み込まれる。本明細書で実質的に示されているＨＣＤＲ３配列は、本開示の実施形態を代表するものであり、これらのそれぞれは、ヒト重鎖可変ドメインまたはその実質的部分にＨＣＤＲ３として組み込まれる。
【０１４４】
本開示において用いられる可変ドメインは、任意の生殖系列もしくは再配列されたヒト可変ドメインから得られるかもしくはそれらに由来し、または、公知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列もしくは実際の配列に基づいた合成の可変ドメインでもよい。可変ドメインは、非ヒト抗体に由来する。本開示のＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技法を使用して、ＣＤＲ（例えばＣＤＲ３）を欠いている可変ドメインのレパートリー中に導入することができる。例えば、Ｍａｒｋｓら［Ｍａｒｋｓら  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０：７７９〜７８３頁］には、可変ドメイン領域の５’末端に向けられているか、または隣接しているコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと組み合わせて使用して、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する、抗体可変ドメインのレパートリーを生成する方法が記載されている。Ｍａｒｋｓらは、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３とどのように組み合わせるかについて、さらに記載している。類似の技法を使用して、本開示のＣＤＲ３に由来する配列を、ＣＤＲ３を欠いているＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルし、そのシャッフルされた完全なＶＨまたはＶＬドメインを同族のＶＬまたはＶＨドメインと組み合わせて、本開示の抗体または抗原結合性断片を提供することができる。次いで、適切な抗体または抗原結合性断片を選択することができるように、参照によってその全体が本明細書に組み入れられるＷＯ９２／０１０４７、またはＫａｙ、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ［Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．（１９９６年）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ］を含む、後続の多くの文献のいずれかのファージディスプレイ系のような適切な宿主系においてレパートリーを提示することができる。レパートリーは、１０４個より多い個々のメンバー、例えば、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９または少なくとも１０１０個またはそれ以上のメンバーのいずれかからなってもよい。他の適切な宿主系として、これらに限定されないが、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、Ｔ７ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、細胞ディスプレイ、リボソームディスプレイおよび共有結合ディスプレイが挙げられる。
【０１４５】
ヒトＡβ１−４２に対する抗体または抗原結合性断片を調製するための方法であって：
（ａ）置き換えられるＣＤＲ３を含むかまたはＣＤＲ３をコードする領域を欠くかのいずれかのＶＨドメインをコードする核酸の出発レパートリーを準備するステップと；
（ｂ）前記レパートリーをＶＨ  ＣＤＲ３、例えば、表９に示されるＶＨ  ＣＤＲ３として、本明細書で実質的に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸と組合せ、その結果、前記ドナー核酸がレパートリーのＣＤＲ３領域に挿入され、ＶＨドメインをコードする核酸の生成物レパートリーを提供するステップと；
（ｃ）前記生成物レパートリーの核酸を発現するステップと；
（ｄ）ヒトＡβ１−４２に対する抗体または抗原結合性断片を選択するステップと；
（ｅ）前記抗体もしくは抗原結合性断片またはそれをコードする核酸を回収するステップ
とを含む方法が提供される。
【０１４６】
また、本開示のＶＬ  ＣＤＲ３を、置き換えられるＣＤＲ３を含むかまたはＣＤＲ３をコードする領域を欠くかのいずれかのＶＬドメインをコードする核酸のレパートリーと組み合わせる類似の方法を用いる場合もある。
【０１４７】
同様に、１つもしくはそれ以上の、または３つのＣＤＲのすべてを、ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーに移植し、次いで、ヒトＡβ１−４２に対する抗体または抗原結合性断片に対してスクリーニングすることができる。
【０１４８】
例えば、表３もしくは表４に列挙される１つもしくはそれ以上の抗体に由来するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／もしくはＨＣＤＲ３、例えば、１セットのＨＣＤＲを用いることができ、ならびに／またはここで列挙される１つもしくはそれ以上の抗体に由来するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／もしくはＬＣＤＲ３、例えば、１セットのＬＣＤＲを用いることができる。
【０１４９】
同様に、本明細書で開示されている他のＶＨおよびＶＬドメイン、ＣＤＲのセットおよびＨＣＤＲのセットおよび／またはＬＣＤＲのセットを用いることができる。
【０１５０】
免疫グロブリン可変ドメインの実質的部分は、少なくとも３つのＣＤＲ領域を、介在するフレームワーク領域と共に含む場合がある。この部分は、第１および第４のフレームワーク領域のいずれかまたは両方の少なくとも約５０％を含む場合もあり、この５０％は、第１のフレームワーク領域のＣ末端の５０％および第４のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。可変ドメインの実質的部分のＮ末端またはＣ末端の付加的な残基は、天然に存在する可変ドメイン領域とは通常関連していないものでよい。例えば、組み換えＤＮＡ技術によって作製される本開示の抗体または抗原結合性断片の構築により、クローニングステップまたは他の操作ステップを容易にするために導入されるリンカーによってコードされたＮ末端またはＣ末端残基の導入がもたらされる場合がある。他の操作ステップには、リンカーを導入して、抗体の定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの生成における）、または本明細書の他の箇所でより詳細に論じられる検出可能な／機能的な標識を含むさらなるタンパク質配列に、本開示の可変ドメインを接続することが含まれる。
【０１５１】
本開示の一部の態様では、抗体または抗原結合性断片はＶＨおよびＶＬドメインの対を含み、ＶＨまたはＶＬドメイン配列のいずれかをベースとする単一の結合ドメインは、本開示のさらなる態様を形成する。単一の免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインが、特異的な方式で標的抗原に結合できることが公知である。例えば、上記ｄＡｂについての議論を参照のこと。
【０１５２】
単一の結合ドメインのいずれかの場合には、これらのドメインを使用して、Ａβ１−４２に結合できる、２ドメインの抗体または抗原結合性断片を形成することができる相補的ドメインについてスクリーニングすることができる。これは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられるＷＯ９２／０１０４７において開示されている、いわゆる階層的な二重組合せのアプローチを使用して、ファージディスプレイスクリーニング法によって達成されてよく、このアプローチでは、ＨまたはＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを使用して、他の鎖（ＬまたはＨ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させ、結果として生じる２種の鎖の抗体または抗原結合性断片を、この参考文献において記載されているもののようなファージディスプレイ技法に従って選択する。この技法は、Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０：７７９〜７８３頁においても開示されている。
【０１５３】
本開示の抗体または抗原結合性断片は、抗体の定常領域またはその一部分、例えばヒトの抗体の定常領域またはその一部分をさらに含んでよい。例えば、ＶＬドメインは、ヒトのＣκまたはＣλ鎖を含む、抗体軽鎖の定常ドメインに、Ｃ末端が結合されていてもよい。同様に、ＶＨドメインをベースとする抗体または抗原結合性断片は、任意の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭ、ならびにアイソタイプサブクラスのうちのいずれか、特にＩｇＧ２、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に由来する免疫グロブリン重鎖の全体または一部分（例えば、ＣＨ１ドメイン）に、Ｃ末端が結合されていてもよい。ＩｇＧ２は、エフェクター機能を欠くため、一部の実施形態では有利である場合がある。他の実施形態では、ＩｇＧ１は、そのエフェクター機能および製造しやすさにより有利である場合がある。これらの特性を有し、可変領域を安定させる、任意の合成または他の定常領域変異体もまた、本開示において有用な場合がある。
【０１５４】
本開示の態様は、本明細書で提供される抗体または抗原結合性断片のヒトＡβ１−４２への結合を引き起こすかまたは可能とすることを含む方法を提供する。記載のように、このような結合は、例えば、抗体もしくは抗原結合性断片、もしくは抗体もしくは抗原結合性断片をコードする核酸の投与後に、ｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、または、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、免疫細胞化学、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、および生化学もしくは細胞ベースのアッセイでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる場合がある。
【０１５５】
本開示は、競合アッセイにおいて抗原レベルを測定するための、上述の抗体または抗原結合性断片の使用、すなわち、競合アッセイにおいて、本開示によって提供される抗体または抗原結合性断片を用いることによって、サンプル中の抗原のレベルを測定する方法も提供する。これは、結合していない抗原から結合した抗原の物理的分離が必要とされない場合であってもよい。結合の際に物理的または光学的変化が生じるように抗体または抗原結合性断片にレポーター分子を連結することは、１つの実行可能な手段である。レポーター分子は、定量することができる、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じさせてもよい。レポーター分子の連結は、直接的もしくは間接的、共有結合的、例えばペプチド結合を介して、または非共有結合的であってもよい。ペプチド結合を介した連結は、抗体およびレポーター分子をコードする遺伝子融合体の組み換え発現の結果として存在してもよい。
【０１５６】
抗体または抗原結合性断片間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、および／または生化学的な競合アッセイによって、例えば、１つの抗体または抗原結合性断片に特異的なレポーター分子をタグ化し、１つまたはそれ以上の他のタグ無しの抗体または抗原結合性断片の存在下で検出することができるようにして、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する抗体または抗原結合性断片の特定を可能にすることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。このような方法は、当業者に容易に認識されるものであり、本明細書でより詳細に記載されている。
【０１５７】
本開示は、例えば、表３および４に列挙される抗体のいずれかの本明細書で定義される任意の抗体または抗原結合性断片と、ヒトＡβ１−４２に対する結合について競合する、例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１三重変異（「ＴＭ」；Ｏｇａｎｅｓｙａｎら（２００８年）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４（Ｐｔ  ６）：７００〜４頁）形態にある抗体または抗原結合性断片にまで及ぶ。抗体または抗原結合性断片間の競合は、例えば、１つの抗体または抗原結合性断片を特異的レポーター分子でタグ付けして、それがその他のタグ付けされていない抗体または抗原結合性断片の存在下で検出され、同一エピトープまたは重複エピトープと結合する抗体または抗原結合性断片を同定できるようにすることで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易にアッセイすることができる。競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して判定してもよく、その中では、Ａβ１−４２をプレートに固定化し、１つまたはそれ以上のその他のタグ付けされていないかまたは標識されていない抗体または抗原結合性断片と共に、第１のタグ付けされたかまたは標識された抗体または抗原結合性断片をプレートに添加する。タグ付けされた抗体または抗原結合性断片と競合するタグ付けされていない抗体または抗原結合性断片の存在は、タグ付けされた抗体または抗原結合性断片によって放出されるシグナルの低下によって観察される。
【０１５８】
競合アッセイは、エピトープマッピングでも使用することができる。一例では、エピトープマッピングを使用して、場合により、最適化された中和および／またはモジュレーション特性を有してもよい抗体または抗原結合性断片が結合するエピトープを同定してもよい。このようなエピトープは、直鎖状エピトープまたは構造エピトープであり得る。構造エピトープは、Ａβの少なくとも２つの異なる断片を含むことができ、Ａβペプチドがその三次または四次構造に折り畳まれて、Ａβ抗体または抗原結合性断片のようなＡβ阻害剤によって認識される構造エピトープを形成する場合、前記断片は互いに近接して配置される。競合に関する試験では、特に目的のエピトープを含むかまたはそれから本質的になるペプチドである、抗原のペプチド断片を用いてもよい。どちらかの末端に、エピトープ配列と１つまたはそれ以上のアミノ酸とを有するペプチドを使用してもよい。本開示による抗体または抗原結合性断片は、抗原に対するそれらの結合が、所与の配列を有するかまたはそれを含むペプチドによって阻害されるようであってもよい。
【０１５９】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、本開示の抗体もしくは抗原結合性断片、またはこのような抗体もしくは抗原結合性断片をコードする核酸が、全体として、本開示に従っている状態を指す。したがって、本発明による抗体もしくは抗原結合性断片、ＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然環境から単離および／もしくは精製されて、実質的に純粋もしくは均質形態で提供され、または核酸の場合は、必要な機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸もしくは遺伝子を含まず、もしくは実質的に含まずに提供される。単離されたメンバーおよび核酸は、天然環境内で、またはこのような調製物がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される組み換えＤＮＡ技術による場合は、その中でそれらが調製される環境（例えば、細胞培養物）内で、それらと共に見られる、他のポリペプチドまたは核酸などの、それらが天然に結合している物質を含まないか、または実質的に含まない。メンバーおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントと共に配合され、なおも実用的目的のために単離され、例えば、免疫アッセイで使用するためのマイクロタイタープレートの被覆に使用される場合、通常、メンバーは、ゼラチンもしくは他の担体と混合されるか、または診断もしくは治療で使用される場合は、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合されることになる。抗体または抗原結合性断片は、自然に、または異種真核生物細胞系（例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞）によってグリコシル化され、または（例えば、原核細胞中の発現によって生成される場合）それらはグリコシル化されない。
【０１６０】
４．核酸、細胞および生成方法
さらなる態様では、本開示は、本開示による抗体または抗原結合性断片、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインをコードする配列を含む単離された核酸、ならびに本開示の抗体または抗原結合性断片、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを調製する方法であって、前記抗体または抗原結合性断片、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの生成をもたらす条件下で前記核酸を発現するステップと、それを回収するステップとを含む方法を提供する。コード核酸配列の例は、表および添付の配列表に示されている。本開示による核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、完全にまたは部分的に合成であってもよい。本明細書で示されるヌクレオチド配列への言及は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、その中でＵがＴを置換する特定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１６１】
本開示は、例えば、調節エレメントに作動可能に連結する、上記のような少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、プラスミドまたはファージベクター、転写または発現カセットのようなプラスミド、ベクターの形態の構築物も提供する。
【０１６２】
さらなる態様は、本開示の核酸および／またはベクターを含有するか、またはそれによって形質転換された宿主細胞を提供する。本開示は、上記のような１つまたはそれ以上の構築物を含む、組み換え宿主細胞系も提供する。任意のＣＤＲまたはＣＤＲのセットまたはＶＨドメインまたはＶＬドメインまたは抗体抗原結合部位または抗体分子、例えば、提供されるようなｓｃＦｖまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１ＴＭ）をコードする核酸配列は、コードされた生成物を生成する方法と共に本開示の態様を形成し、その方法は、そのコード核酸配列からの発現を含む。発現は、適当な条件下で、核酸を含有する組み換え宿主細胞を培養することによって達成されるのが都合がよい場合がある。発現による生成の後、ＶＨもしくはＶＬドメイン、または抗体もしくは抗原結合性断片を任意の適切な技法を使用して単離および／または精製し、次いで、適宜使用してもよい。
【０１６３】
したがって、本開示の別の態様は、抗体ＶＨ可変ドメインの生成方法であって、コード核酸配列からの発現を引き起こすことを含む方法である。このような方法は、前記抗体ＶＨ可変ドメインの生成のための条件下で、宿主細胞を培養するステップを含む場合がある。
【０１６４】
ＶＨおよび／またはＶＬドメインを含むＶＬ可変ドメインおよび抗体または抗原結合性断片の生成のための類似の方法が、本開示のさらなる態様として提供される。
【０１６５】
生成方法は、生成物を単離および／または精製するステップを含んでもよい。生成方法は、生成物を、薬学的に許容される賦形剤のような少なくとも１つの追加の成分を含む組成物に配合するステップを含んでもよい。
【０１６６】
多様な異なる宿主細胞中でクローニングして、ポリペプチドを発現するシステムは、周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母およびバキュロウイルス系、ならびに遺伝子組換え植物および動物が挙げられる。原核生物細胞中の抗体および抗体断片の発現は、当技術分野で確立されている。再考するために、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ［Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５〜５５１頁（１９９１年）］を参照のこと。一般的な細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【０１６７】
当業者は、抗体または抗原結合性断片の生成の選択肢として、培養物中の真核生物細胞中における発現もまた利用できる［Ｃｈａｄｄ  ＨＥおよびＣｈａｍｏｗ  ＳＭ（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：１８８〜１９４頁；Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＤＣおよびＫｒｕｍｍｅｎ  Ｌ（２００２年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：１１７頁；Ｌａｒｒｉｃｋ  ＪＷおよびＴｈｏｍａｓ  ＤＷ（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：４１１〜４１８頁］。
【０１６８】
異種ポリペプチドの発現のために、当技術分野で利用できる哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、幼若ハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞、および他の多数が挙げられる。
【０１６９】
プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、増強剤配列、マーカー遺伝子および他の配列を含む適当な制御配列を含有する適切なベクターを、適宜、選択または構築することができる。ベクターは、適宜、プラスミド、例えば、ファージミド、またはウイルス、例えば、ファージであってよい［ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ］。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸操作のための多くの公知の技法およびプロトコルは、Ａｕｓｕｂｅｌら［Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第４版  １９９９年］で詳述される。
【０１７０】
本開示のさらなる態様は、本明細書で開示されている核酸を含有する宿主細胞を提供する。このような宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにあってもよく、培養物中にあってもよい。このような宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにあってもよい。ｉｎ  ｖｉｖｏでの宿主細胞の存在は、「細胞内抗体」または細胞内部抗体としての本開示の抗体または抗原結合性断片の細胞内発現を可能にする場合がある。細胞内抗体は、遺伝子治療のために使用することができる。
【０１７１】
別の態様は、本開示の核酸を宿主細胞に導入するステップを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技法を用いてもよい。真核細胞では、適切な技術として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクションおよびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、ワクシニアを使用する、または昆虫細胞ではバキュロウイルスを使用する形質導入が挙げられる。宿主細胞、特に、真核細胞内への核酸の導入には、ウイルスまたはプラスミドベースの系を使用してもよい。プラスミド系は、エピソームに維持してもよいし、または宿主細胞に、もしくは人工染色体に組み込んでもよい。組込みは、単一または複数遺伝子座における、１つまたはそれ以上のコピーの無作為または標的インテグレーションによるものでもよい。細菌細胞では、適切な技法として、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが挙げられる。
【０１７２】
導入の後には、例えば、遺伝子発現のための条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現が引き起こされるか、または可能となってもよい。発現生成物の精製は、当業者に公知の方法によって達成される。
【０１７３】
本開示の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）にインテグレーションされる。インテグレーションは、標準的技法に従って、ゲノムとの組み換えを促進する配列の包含によって促進される。
【０１７４】
本開示は、上記のような抗体または抗原結合性断片またはポリペプチドを発現するために、発現系において上述のような構築物を使用するステップを含む方法もまた提供する。
【０１７５】
５．処置方法
本開示は、本明細書で開示されている分子のいずれかの任意の組合せで、疾患または障害を有する対象を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ａ）本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれか、およびｂ）本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかで、疾患または障害を有する対象を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は：
配列番号５２５のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１；
配列番号５２６のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２；
配列番号５２７のアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３；
配列番号５３４のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１；
配列番号５３５のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２；および
配列番号５３６のアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３
を含む。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化２３】
2019511500.tif 000028
またはその薬学的に許容される塩である。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化２４】
2019511500.tif 000029
のカンシレート塩である。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、
【化２５】
2019511500.tif 000030
である。
【０１７６】
本明細書に記載されている方法のいずれかでは、本開示は、１つの方法の任意のステップの別の方法からの任意のステップとの組合せを意図する。これらの方法は、特定の疾患または障害に対して適当な本開示の化合物のいずれかの有効量を、それを必要とする個体に投与することに関する。具体的な実施形態では、これらの方法は、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかを本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて、それを必要とする対象へと送達することに関する。
【０１７７】
一部の実施形態では、疾患または障害は、Ａβの蓄積に関連する任意の疾患または障害である。一部の実施形態では、Ａβの蓄積は、Ａβの大脳および／または海馬への蓄積である。一部の実施形態では、Ａβの蓄積はニューロン内である。一部の実施形態では、Ａβの蓄積は細胞外である。一部の実施形態では、Ａβの蓄積は内皮細胞内である。一部の実施形態では、Ａβの蓄積は網膜内である。一部の実施形態では、Ａβの蓄積は脳血管系内である。一部の実施形態では、本明細書で開示されている処置方法のいずれかは、Ａβの蓄積を予防し、低減し、または元に戻す（例えば、除去する）のに有用である。
【０１７８】
一部の実施形態では、疾患または障害は神経変性疾患または障害である。特定の実施形態では、疾患または障害は、アルツハイマー病、ダウン症、黄斑変性症、または認知機能障害である。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対照はヒトである。
【０１７９】
一部の実施形態では、対象は、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかの治療有効用量を本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの治療有効用量と組み合わせて投与される。用語「治療有効用量」または「治療有効量」は、投与の目的となる所望の効果を生じる用量または量を意味する。正確な用量は、処置の目的に応じて変わり、当業者が公知の技法を使用して確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９年）Ｔｈｅ  Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照のこと）。
【０１８０】
本開示は、とりわけ、例えば、アミロイド形成疾患の予防または処置のために、患者において有益な治療応答（例えば、患者における、ＣＳＦのＡβ１−４２の低減、プラーク負荷量の低減、プラーク形成の阻害、神経炎性ジストロフィーの低減、認知機能の改善、および／または認知機能低下の回復、低減もしくは予防）を生じる条件下で、本開示の治療抗体の患者への投与によるアルツハイマー病および他のアミロイド形成疾患の処置を対象とする。
【０１８１】
用語「処置」、「処置すること」、「緩和」などは、一般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書で使用され、処置される状態の１つまたはそれ以上の症状の重症度を改善すること、緩和することおよび／または低下させることを指すためにも使用される場合がある。効果は、疾患、状態、もしくはその症状の発症もしくは再発を完全にもしくは部分的に遅延させるという点で予防的でもあり得、ならびに／または疾患もしくは状態および／もしくはその疾患もしくは状態を原因とする有害事象に対する部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の処置を網羅し：（ａ）疾患もしくは状態に罹患しやすい可能性があるが、それを有するとは未だ診断されていない対象において、疾患もしくは状態が生じるのを妨げること；（ｂ）疾患もしくは状態を阻害すること（例えば、その発生を阻止すること）；または（ｃ）疾患もしくは状態を軽減すること（例えば、疾患もしくは状態の退縮を引き起こし、１つまたはそれ以上の症状の改善をもたらすこと）のうちのいずれか１つまたはそれ以上を含む。例えば、アルツハイマー病の「処置」は、疾患の完全な逆転もしくは治癒、またはアルツハイマー病を原因とする状態および／もしくは有害事象の任意の範囲の改善を包含する。単なる例証として、アルツハイマー病の「処置」は、アルツハイマー病またはその合併症に伴う以下の事象のいずれかの改善を含む：精神的衰弱、精神撹乱、妄想、失見当識、健忘症、集中困難、新たな記憶形成ができないこと、攻撃性、激越、易刺激性、人格変化、抑制の欠如、怒り、無感動、一般的な不満、孤独、気分変動、うつ、幻覚、妄想、食欲不振、不穏状態、筋運動を連動できないこと、支離滅裂な発話、シナプス障害、ニューロンの損失、アミロイドベータの蓄積、タウリン酸化過剰、タウタンパク質の蓄積、アミロイドプラークの形成、および神経原線維変化の形成。これらの状態のいずれかの改善は、当技術分野で公知の標準方法および技法により容易に評価することができる。上記に列挙されていない他の症状を、アルツハイマー病のような神経変性疾患を処置することについての有効性を決定するためにモニタリングすることもできる。この疾患について、この方法で処置された対象の集団として、望ましくない状態または疾患に罹患している対象、およびこの状態または疾患の発生のリスクを有する対象が挙げられる。
【０１８２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている処置によって、脳におけるＡβｎ−４２種の生成および／または蓄積が予防される。一部の実施形態では、Ａβｎ−４２種は、Ａβ１−４２、Ａβピロ３−ピロ−４２、Ａβ４−４２、またはＡβ１１−ピロ−４２のうちの１種またはそれ以上である。一部の実施形態では、本明細書で開示されている処置によって、Ａβ１−４３の蓄積が予防される。一部の実施形態では、本明細書で開示されている処置によって、Ａβオリゴマーおよび／またはプラークの生成および／または蓄積が予防される。
【０１８３】
本開示は、患者の脳におけるＡβのアミロイド沈着に関連する疾患を予防または処置する方法を提供する。このような疾患として、アルツハイマー病、ダウン症、および認知機能障害が挙げられる。認知機能障害は、アミロイド形成疾患の他の特徴を有するか有さないかにかかわらず起こり得る。本開示は、Ａβに関連する状態である、黄斑変性症の処置の方法を提供する。本開示の方法は、患者に、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて、１−４２ＡβおよびそのＮ末端トランケートに特異的に結合する抗体の有効量を投与することに関する。
【０１８４】
本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかは、神経病理学、および一部の患者では、アルツハイマー病に伴う認知機能障害を予防または軽快させるための治療レジメンにおいて、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて使用される。
【０１８５】
処置を受けることができる患者として、症状を示している患者、また、症状を示していないが疾患のリスクを有する個体が挙げられる。アルツハイマー病では、十分に長い時間生きている場合、潜在的にリスクを有する者である。本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかは、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて使用され、対象患者のリスクについていかなる評価もせずに対象に予防的に投与される。処置を受けることができる患者として、アルツハイマー病の遺伝的リスクを有することが知られている個体、例えば、この疾患を有する血縁者を有する個体および遺伝的または生化学マーカーの解析によってリスクが判定された個体が挙げられる。アルツハイマー病に対する素因の遺伝的マーカーとして、ＡＰＰ遺伝子における変異、特に、それぞれ、ＨａｒｄｙおよびＳｗｅｄｉｓｈ変異と称される７１７位ならびに６７０および６７１位における変異が挙げられる。リスクについての他のマーカーは、プレセニリン遺伝子であるＰＳ１およびＰＳ２、ならびにＡｐｏＥ４における変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症である。アルツハイマー病に罹患している個体は、疾患に伴う特徴的な認知症によって、および上記リスク因子の存在によって診断することができる。いくつかの診断テストは、個体のアルツハイマー病の特定を補助するのに利用可能である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ１−４２レベルの測定が含まれる。タウレベルの上昇およびＡβ１−４２レベルの低下は、ＡＤの存在を表す場合がある。アルツハイマー病を患っている個体は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡまたはＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ基準によっても診断することができる。一部の実施形態では、処置されるアルツハイマー病は、軽度（初期段階）、中程度（中期段階）、または重度（後期段階）のアルツハイマー病である。
【０１８６】
無症候性の患者では、処置は任意の年齢（例えば、少なくとも１０、２０、３０歳）で開始することができる。一般的に、処置は、晩年、例えば、患者が４０代、５０代、６０代または７０代になった場合に開始される。処置は、患者の残りの人生の期間である、一定期間にわたる複数回用量を含む。反復用量投与の必要性は、経時的な抗体レベルの測定によってモニタリングすることができる。アルツハイマー病は、ダウン症の患者において早期に発症する場合があるので、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせた本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの投与は、ダウン症でない患者よりも人生の早い段階で（例えば、患者が、少なくとも１０、２０、３０歳である場合に）開始される。
【０１８７】
予防のために、医薬組成物または医薬は、アルツハイマー病の疑いのある、またはそうでなければアルツハイマー病のリスクを有する患者に、疾患の生化学的、組織学的、認知機能障害および／または行動症状、その合併症ならびに疾患の発生中に提示される中間病理学的表現型などの疾患のリスクを排除または低減する、重症度を和らげる、またはその発症を遅延させるのに十分な量で投与される。治療適用では、組成物または医薬は、このような疾患の疑いがあるか、または既に罹患している患者に、疾患の発生におけるその合併症および中間病理学的表現型を含む疾患の症状（生化学的、組織学的、認知機能障害および／または行動的な）を治癒させるか、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。
【０１８８】
処置方法は、（ｉ）本明細書で言及するように、アミロイドーシスに関連する状態を有する患者を特定するステップと、（ｉｉ）本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかの治療有効用量と組み合わせて、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの治療有効用量を投与するステップであって、血漿および／またはＣＳＦ中のＡβ１−４２レベルが低下し、アミロイドーシスが低減するステップとを含む。
【０１８９】
したがって、本開示のさらなる態様は、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせた本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの投与を含む処置方法、本明細書で開示されている抗体もしくは抗原結合性断片のいずれかを単独で、または本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて含む医薬組成物、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかを単独で、または本明細書で開示されている抗体もしくは抗原結合性断片のいずれかと組み合わせて含む医薬組成物、ならびに例えば、抗体もしくは抗原結合性断片および／またはＢＡＣＥ阻害剤と薬学的に許容される賦形剤とを配合するステップを含む医薬または医薬組成物を作製する方法において、投与用医薬の製造におけるこのような抗体もしくは抗原結合性断片および／またはＢＡＣＥ阻害剤の使用を提供する。薬学的に許容される賦形剤は、二次的反応を惹起せず、例えば、抗体もしくは抗原結合性断片の投与の促進、体内でのその寿命および／もしくは有効性の増加、溶液中での溶解度の上昇またはその他にその保存の改良を可能とする、医薬組成物の構成の一部となる化合物または化合物の組合せである。これらの薬学的に許容されるビヒクルは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与方式に関して当業者によって適合されることとなる。
【０１９０】
本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片は、通常、この抗体または抗原結合性断片に加えて少なくとも１種の成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本開示による、本開示に従う使用のための医薬組成物は、抗体または抗原結合性断片に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでもよい。このような材料は非毒性であり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存して変わる。
【０１９１】
本明細書に記載されているＢＡＣＥ阻害剤は、通常、抗体または抗原結合性断片に加えて少なくとも１種の成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、本開示による、本開示に従う使用のための医薬組成物は、抗体または抗原結合性断片に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでもよい。このような材料は非毒性であり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存して変わる。
【０１９２】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかおよび／または抗体もしくはその抗原結合性断片のいずれかは、対象に、以下の投与経路のうちのいずれか１つまたはそれ以上によって投与される：非経口、皮内、筋肉内、腹腔内、心筋内、静脈内、皮下、肺、経鼻、眼内、硬膜外、髄腔内、頭蓋内、心室内および経口経路。
【０１９３】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかは、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと同じ組成物中で投与される。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかは、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかを含む組成物と別の組成物中で投与される。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかを含む組成物が、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかを含む組成物と別に投与される場合、組成物は、対象に、同じ投与経路で投与される。一部の実施形態では、組成物は、対象に、異なる投与経路で投与される。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかを含む組成物は、対象に、注射により投与される。一部の実施形態では、注射は静脈内注射である。一部の実施形態では、注射は皮下注射である。一部の実施形態では、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかを含む組成物は、対象に、経口投与される。
【０１９４】
一部の実施形態では、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかの薬学的に有効な用量は、単独で投与される場合のＢＡＣＥ阻害剤の薬学的に有効な用量と比較して、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかと組み合わせて対象に投与される場合、より少ない。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの薬学的に有効な用量は、単独で投与される場合の抗体または抗原結合性断片の薬学的に有効な用量と比較して、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせて対象に投与される場合、より少ない。
【０１９５】
例えば、静脈内または皮下注射のための注射可能な製剤として、活性成分は、パイロジェンフリーであり、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。本明細書に記載されている抗体または抗原結合性断片は、分子の物理化学特性および送達経路に応じて、液体、半固体または固体形態で製剤化される。製剤は、賦形剤、または賦形剤の組合せ、例えば：糖、アミノ酸および界面活性剤を含んでもよい。液体製剤は、広い範囲の抗体濃度およびｐＨを含んでもよい。固体製剤は、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、または超臨界流体技術による乾燥によって製造される。処置は、注射で（例えば、皮下、または静脈内に）なされる。処置は、特に、抗体または抗原結合性断片の用量を減少させながら、パルス注入により投与される。投与経路は、処置の物理化学特性によって、疾患に対する具体的検討によって、または有効性を最適化するか、もしくは副作用を最小限にするための要件によって決定される。１つの特定の投与経路は静脈内である。本開示の医薬組成物を投与する別の経路は皮下である。針を用いないデバイスを使用する皮下注射も有利である。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかは、注射によって対象に投与される。
【０１９６】
本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかおよび本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかは、対象に、同時にまたは連続して投与される。一部の実施形態では、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片／ＢＡＣＥ阻害剤の併用療法はいずれも、さらなる処置とさらに組み合わされる。
【０１９７】
一部の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片のいずれかおよび本開示のＢＡＣＥ阻害剤のいずれかを医薬の製造に使用することができる。医薬は、個体に、別々に、または組み合わせて投与するためのものであってよく、したがって、組合せ調製物としてまたは別個の調製物として、抗体または抗原結合性断片およびＢＡＣＥ阻害剤を含む場合がある。別個の調製物を使用することにより、別々のおよび連続したまたは同時の投与を容易にし、異なる経路、例えば、経口および注射による（例えば静脈内および／または皮下）投与による成分の投与が可能となる。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている併用療法のいずれか（例えば本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかと組み合わせた、本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかの投与に関する療法のいずれか）をさらなる療法と組み合わせて、対象に投与してもよい。一部の実施形態では、さらなる療法として、これらに限定されないが、記憶訓練課題、記憶補助、認知訓練、食事療法、職業療法、理学療法、精神療法、マッサージ、鍼、指圧、運動補助、介助動物などが挙げられる。一部の実施形態では、さらなる療法は、対象へのさらなる薬剤成分の投与である。一部の実施形態では、さらなる薬剤成分を使用して、特に、抗体または抗原結合性断片と１つまたはそれ以上の他の薬物との組合せの、著しい相乗効果をもたらす場合がある。一部の実施形態では、さらなる薬剤成分は、本明細書に列挙した状態のうちの１つまたはそれ以上の処置のために、同時にもしくは連続して、または本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかとおよび／もしくは本明細書で開示されている抗体もしくは抗原結合性断片のいずれかとの組合せ調製物として投与される。一部の実施形態では、さらなる薬剤成分は、小分子、ポリペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および／またはｓｉＲＮＡ分子である。一部の実施形態では、さらなる薬剤成分は、以下のうちの任意の１つまたはそれ以上である：ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）、グランタミン（ｇｌａｎｔａｍｉｎｅ）（Ｒａｚａｄｙｎｅ）、メマンチン（Ｎａｍｅｎｄａ）、リバスチグミン（Ｅｘｅｌｏｎ）、またはタクリン（Ｃｏｇｎｅｘ）。一部の実施形態では、さらなる薬剤成分は、抗うつ剤、抗不安薬、向精神薬、または睡眠補助剤である。一部の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片のいずれかおよび１つまたはそれ以上の上記のさらなる薬剤成分を医薬の製造において使用することができる。医薬は、個体への別々のまたは組合せ投与のためのものであり、したがって、併用調製物としてまたは別個の調製物として、抗体または抗原結合性断片およびさらなる成分を含む場合がある。別個の調製物を使用して、別々のおよび連続したまたは同時の投与を容易にし、異なる経路、例えば、経口、静脈内および非経口投与による成分の投与が可能となる。
【０１９９】
一部の実施形態では、本開示のＢＡＣＥ阻害剤のいずれかおよび上記のさらなる薬剤成分のうちの１つまたはそれ以上を医薬の製造において使用することができる。医薬は、個体への別々のまたは組合せ投与のためのものであり、したがって、併用調製物としてまたは別個の調製物として、ＢＡＣＥ阻害剤およびさらなる成分を含む場合がある。別個の調製物を使用して、別々のおよび連続したまたは同時の投与を容易にし、異なる経路、例えば、経口および非経口投与による成分の投与が可能となる。
【０２００】
一部の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片のいずれかおよび上記のさらなる薬剤成分のうちの１つまたはそれ以上を医薬の製造において使用することができる。医薬は、個体への別々のまたは組合せ投与のためのものであり、したがって、併用調製物としてまたは別個の調製物として、抗体または抗原結合性断片およびさらなる成分を含む場合がある。別個の調製物を使用して、別々のおよび連続したまたは同時の投与を容易にし、異なる経路、例えば、経口および非経口投与による成分の投与が可能となる。
【０２０１】
提供される組成物は、哺乳動物に投与される場合がある。投与は、通常、治療有効量においてであり、これは、患者への利益を示すのに十分なものである。このような利益は、少なくとも１つの症状の少なくとも軽快でありうる。投与される実際の量、および投与の速度および時間経過は、処置されるものの性質および重症度、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床条件、障害の原因、組成物の送達部位、抗体もしくは抗原結合性断片および／またはＢＡＣＥ阻害剤のタイプ、投与方法、投与スケジュールならびに医師に知られている他の因子に応じて変わる。処置の処方、例えば、投薬量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、処置される疾患の症状および／または進行の重症度に応じて変わる。本開示の抗体もしくは抗原結合性断片および／または本開示のＢＡＣＥ阻害剤の治療有効量または適切な用量は、動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性およびｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を比較することによって決定することができる。試験動物の有効投薬量のヒトへの外挿のための方法は公知である。初期に高い負荷用量、その後に１回またはそれ以上の低い用量が投与される場合がある。処置は、医師の裁量で、１日１回、１週間に２回、週１回または月１回の間隔で反復される場合がある。処置は、２週から４週毎の皮下投与および４週から８週毎の静脈内投与であってもよい。処置は、周期的であってもよく、投与間の期間は、約２週間もしくはそれより長い期間、例えば、約３週間もしくはそれより長い期間、約４週間もしくはそれより長い期間、または約月に１回である。
【０２０２】
本開示の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示に関する当業者に明らかである。
【０２０３】
この明細書で言及した、データベースの参照および受入番号を含むすべての文書、特許、特許出願および特許公開は、参照によってその全体があらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【０２０４】
文脈が他に規定していなければ、上記に示されている構成についての記述および定義は、本開示のいずれかの特定の態様または実施形態に限定されるものではなく、記載されているすべての態様および実施形態に等しく適用されるものである。
【０２０５】
本開示のある特定の態様および実施形態は、実施例によって、ならびに添付の図面および表を参照してここで説明される。
【０２０６】
６．キット
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されているＢＡＣＥ阻害剤のいずれかおよび本明細書で開示されている抗体または抗原結合性断片のいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態では、ＢＡＣＥ阻害剤は、経口投与に適する組成物中にある。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は静脈内または皮下投与に適する組成物中にある。
【実施例】
【０２０７】
以下の配列を、ＮＣＩＭＢ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＡＢ２１  ９ＹＡ．Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫに寄託した：
大腸菌ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０００７＝ＮＣＩＭＢ  ４１８８９
大腸菌ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ＝ＮＣＩＭＢ  ４１８９０
大腸菌ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ＝ＮＣＩＭＢ  ４１８９１
大腸菌ＴＯＰ１０細胞Ａｂｅｔ０３７７−ＧＬ＝ＮＣＩＭＢ  ４１８９２
寄託日＝２０１１年１１月２日
【０２０８】
実施例１．側面に位置するＶｅｒｎｉｅｒ残基を含む６つすべてのＣＤＲの変異を介したＡｂｅｔ０１４４−ＧＬの抗体最適化
以下に提供するのは、特定の抗Ａβ抗体親クローンである、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬに由来する新たな抗Ａβ抗体の最適化および特徴付けについての説明である。
【０２０９】
１．１  リボソームディスプレイと適合性のｓｃＦｖフォーマットへのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ親クローンの変換
親和性最適化のための調製において、親クローンをＩｇＧ１−ＴＭフォーマットから一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）フォーマットに変換した。それらのそれぞれのＩｇＧベクターから、コドン最適化可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを別々に増幅して、特異的クローニング部位およびフレキシブルリンカー領域を付加した。次いで、再コンビナトリアルＰＣＲを実施して、完全なｓｃＦｖ構築物を生成し、それをリボソームディスプレイに必要な構造的特徴を含有する修飾ｐＵＣベクター（ｐＵＣ−ＲＤ）にクローニングした。これらの特徴としては、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡ転写物の分解を防止する５’および３’ステムループ、ｍＲＮＡ転写物へのリボソーム結合を促進するシャイン−ダルガノ配列、および翻訳ｓｃＦｖ分子がリボソームに結合したままで折り畳みできるようにする遺伝子ＩＩＩスペーサーが挙げられる（Ｇｒｏｖｅｓら、２００５年）。
【０２１０】
１．２  標的変異誘発によるＡｂｅｔ０１４４−ＧＬの最適化
親和性ベースのリボソームディスプレイ選択による標的変異誘発アプローチを使用して、ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドに対する改善された親和性のために、リード抗体（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）をさらに最適化した。ＣｌａｃｋｓｏｎおよびＬｏｗｍａｎ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、２００４年）によって記載されている標準分子生物学的技法を使用して６つすべての可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）相補性決定領域（ＣＤＲ）のオリゴヌクレオチドを対象とする変異誘発によって、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬに由来する大型ｓｃＦｖ−リボソームライブラリーを創出した。各ＣＤＲからの変異配列は、別個のライブラリーとして親和性最適化した。ＶＨＣＤＲ１（Ｋａｂａｔ残基２６〜３０）に先行する５個のＶｅｒｎｉｅｒ残基もまた、標的変異誘発を使用して無作為化し、これらの配列を残りのＶＨＣＤＲ１ライブラリーと組み合わせて成熟させた。ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドに対するより高い親和性を有する変異体を濃縮するために、親和性ベースのリボソームディスプレイ選択をすべてのライブラリーに実施した。選択は、本質的に、以前に記載されているようにして実施した（Ｈａｎｅｓら、２０００年）。
【０２１１】
簡潔には、各ＣＤＲを網羅するＡｂｅｔ０１４４−ＧＬリードクローンの６つの標的変異誘発ライブラリーを別々にｍＲＮＡに転写した。停止した翻訳プロセスを使用して、ｍＲＮＡ−リボソーム−ｓｃＦｖ三次複合体を形成した（Ｈａｎｅｓら、１９９７年）。次いで、これらの複合体に、合成ビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号：Ｈ−５６４２）の低下する濃度（１００ｎＭ〜１０ｎＭ）の存在下でインキュベートする４ラウンドの選択を実施して、ヒトアミロイドβ１−４２ペプチドに対するより高い親和性を有する変異体を選択した。次いで、抗原と結合するこれらの複合体をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：１１２−０５Ｄ）上に捕捉して、非特異的リボソーム複合体を洗い流した。次に、ｍＲＮＡを結合リボソーム複合体から単離して、ｃＤＮＡに逆転写し、次いで、ＰＣＲによって増幅した。このＤＮＡを次の選択ラウンドのために使用した。
【０２１２】
４ラウンドの親和性の成熟後、各選択のアウトプットをスクリーニング目的でクローニングした。本質的に、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９４年）によって記載されているようにして、リボソームディスプレイによって単離したＳｃＦｖをリボソームディスプレイ構築物（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ｒ０１８９Ｌ、Ｒ０１９３Ｌ）のＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ消化によって、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ６にクローニングし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ｍ０２０２Ｌ）を使用した、ＮｏｔＩ／ＮｃｏＩ消化ｐＣＡＮＴＡＢ６中へのライゲーションがそれに続いた。
【０２１３】
１．３  エピトープ競合アッセイを使用した改善クローンの同定
セクション１．２に記載されている標的変異誘発アプローチの選択ラウンド３および４から無作為に選択した２０２４個のｓｃＦｖを細菌中で発現させ、未精製ペリプラズムｓｃＦｖを生成した。ＨＴＲＦ（商標）プラットフォームを使用して、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭと同じエピトープを介して合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドと結合できるこれらのｓｃＦｖを、競合形式アッセイで解明した。具体的には、単一濃度の各未精製ペリプラズム試験ｓｃＦｖの存在下で、ストレプトアビジンクリプテート（ビオチン化アミロイドベータ１−４２ペプチドと会合する）および抗ヒトＦｃＸＬ６６５（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭと会合する）の間で、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定した。ｓｃＦｖによる、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭエピトープのペプチド上の成功した占有は、蛍光プレートリーダー上の評価でＦＲＥＴの低減をもたらした。
【０２１４】
競合因子ペプチドの非存在下における、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドへの結合を分析することで、「総合」結合シグナルを判定した。「試料」シグナルは、試験ｓｃＦｖ試料の存在下における、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドへの結合の分析から導出した。最後に、検出試薬カクテルのみによって媒介される蛍光を分析することで、「クリプテートブランク」シグナルを判定した。
【０２１５】
未精製ペリプラズムｓｃＦｖは、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５Ｍのスクロースからなる試料緩衝液中で供給した。プロファイリングのために、３８４ウェルＶ底プレート内で、５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．４Ｍのフッ化カリウム、０．１％の脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、および０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）からなるアッセイ緩衝液中で、ｓｃＦｖ試料を元の原液濃度の５０％に希釈した。液体取り扱いロボットを使用して、各新規希釈ｓｃＦｖ  ５μｌを黒色浅型中実底非結合３８４ウェルアッセイプレートの「試料」ウェルに移した。試料緩衝液５μｌ（「総合」および「クリプテートブランク」ウェル）、アッセイ緩衝液１０μｌ（「クリプテートブランク」ウェル）、２ｎＭ  Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ  ５μｌ（「試料」および「総合」ウェル）、５ｎＭのビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド５μｌ（「試料」および「総合」ウェル）、および６ｎＭのストレプトアビジンクリプテートおよび６０ｎＭの抗Ｈｉｓ６−ＸＬ６６５からなる検出カクテル５μｌ（すべてのウェルに）の順で、多重チャネルピペットによって、残りの試薬（アッセイ緩衝液中で調製した）をアッセイプレートに添加した。アッセイプレートを密封して、次いで、蛍光プレートリーダー上で６２０および６６５ｎｍ放射波長で時間分解蛍光を測定する前に、室温で３時間、暗所でインキュベートした。
【０２１６】
各試料について、％デルタＦ値を計算することによって、データを解析した。％デルタＦは、式１に従って決定した。
式１：
【数１】
2019511500.tif 000031
【０２１７】
次に、式２に記載されているように、デルタＦ値を使用して、正規化した結合値を計算した。
式２：
【数２】
2019511500.tif 000032
【０２１８】
アミロイドベータ１−４２ペプチドに対するＡｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ結合の有意な阻害を実証する未精製ペリプラズムｓｃＦｖを、ＤＮＡ配列決定に供した（Ｏｓｂｏｕｒｎら、１９９６年；Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年）。独自のタンパク質配列を有することが分かったｓｃＦｖを大腸菌中で発現させて、アフィニティクロマトグラフィーとそれに続く緩衝液交換によって精製した。
【０２１９】
各精製ｓｃＦｖの効力は、上述のエピトープ競合アッセイ中で、ｓｃＦｖの希釈系列（典型的には、４ｐＭ〜１２００ｎＭ）を試験することによって決定した。各試料について％デルタＦおよび％全結合値を計算することによって、データを再度解析した。さらに、式３に記載されているようにして、精製ｓｃＦｖの各濃度に対する％阻害値も計算した。式３：
％阻害＝１００−％全結合
【０２２０】
科学的グラフ化ソフトウェアを使用して、％阻害に対するＳｃＦｖ試料濃度をプロットし、任意の濃度依存性応答を非直線回帰曲線にフィッティングさせた。−１の値に制約されるＨｉｌｌ勾配に関するこれらの分析からＩＣ５０値を得た。この選択ラウンドからの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０２８６は、１．８ｎＭのＩＣ５０を有し、ＶＬＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリーに由来した。
【０２２１】
試薬／機器供給元：ＭＯＰＳ（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；カタログ番号：Ｍ９３８１）、フッ化カリウム（ＢＤＨ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ６００３）、脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；カタログ番号：Ａ６００３）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；カタログ番号：Ｐ２２８７）、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ（社内製造）、ビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド（ｒｐｅｐｔｉｄｅ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ１１１７）、ストレプトアビジンクリプテート（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ；カタログ番号：６１０ＳＡＫＬＢ）、抗Ｈｉｓ６−ＸＬ６６５（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ；カタログ番号：６１ＨＩＳＸＬＢ）、３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号：３６７６）、３８４ウェル希釈プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号：７８１２８０）、液体取り扱いロボット（ＭｉｎｉＴｒａｋ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）、蛍光プレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）、ＨＴＲＦ技術（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｒａｎｃｅ）、グラフ化／統計学的ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＵＳＡ）。
【０２２２】
１．４  「二成分」ライブラリーを作成するための成功した選択アウトプットの組み換え、およびそれに続くそれらの親和性最適化
セクション１．３に記載されているエピトープ競合アッセイを使用して、最初の４ラウンドの選択中に、特定のｓｃＦｖ−リボソームライブラリーが親和性成熟しているかどうかを判定した。ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ２標的変異誘発ライブラリーのうちの２つは、親Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬクローンに対して改善を示さず、さらに開発されなかった。
【０２２３】
残りの４つの標的変異誘発ライブラリー（ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ１およびＶＬＣＤＲ３を網羅する）は親和性改善を示し、ペアワイズ様式で組み換えして、その中で６つのＣＤＲのうちの２つが変異している６つの「二成分」組み換えライブラリーを作成した。例えば、ＶＨＣＤＲ１を網羅する親和性成熟ライブラリーを親和性成熟ＶＨＣＤＲ２ライブラリーと無作為に組み換えして、ＶＨ１：ＶＨ２ライブラリーを作成した。残りのライブラリーは：ＶＨ１：ＶＬ１、ＶＨ１：ＶＬ３、ＶＨ２：ＶＬ１、ＶＨ２：ＶＬ３およびＶＬ１：ＶＬ３として作成した。各組み換えライブラリーの部分集合を前述のように（セクション１．２）クローニングして、配列決定のために送付し、各ライブラリーの完全性を確認した。
【０２２４】
次いで、前述のように（セクション１．２）、低下するビオチン化合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド濃度（ラウンド５および６で、それぞれ５ｎＭおよび２ｎＭ）の存在下で、選択を継続した。前述したのと同様に、スクリーニング目的で、各選択アウトプットをクローニングした（セクション１．２）。
【０２２５】
セクション１．３に記載されているようなエピトープ競合アッセイ中で、選択ラウンド５および６から無作為に選択した１９３６個のｓｃＦｖをスクリーニングした。これらのクローンの効力の増大に起因して、未精製ｓｃＦｖをアッセイプレートへの添加前に、最初に、２５％に希釈した。以前のように、有意な阻害特性を示したクローンをＤＮＡ配列決定のために送付して、独自のクローンを生成し、精製ｓｃＦｖとして分析した（セクション１．３）。これらの選択からの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０３０３は、０．８４ｎＭの効力を有し、ＶＨ１：ＶＨ２組み換えライブラリーに由来した。
【０２２６】
１．５  「三成分」ライブラリーを作成するための二成分選択アウトプットの組み換え、およびそれに続くそれらの親和性最適化
セクション１．３に記載されているエピトープ競合アッセイを使用して、各二成分ライブラリーが、先の２ラウンドの選択（５および６）よりも親和性成熟しているかどうかを判定した。すべてのライブラリーは親和性改善を示し、したがって、さらに親和性成熟しているとみなした。
【０２２７】
６つの二成分ライブラリー（セクション１．４）を成功したラウンド４アウトプット（セクション１．２）でペアワイズ様式で組み換えし、その中で６つのＣＤＲのうちの３つが変異している、４つの「三成分」組み換えライブラリーを形成した。例えば、ＶＨ２：ＶＬ３二成分ライブラリー（ラウンド６アウトプット）をＶＨＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリー（ラウンド４アウトプット）で遺伝子組み換えして、ＶＨ１：ＶＨ２：ＶＬ３ライブラリーを作成した。同様の構築物はまた、ＶＨ１：ＶＨ２二成分ライブラリー（ラウンド６アウトプット）と、ＶＬＣＤＲ３標的変異誘発ライブラリー（ラウンド４アウトプット）を組み合わせることによっても創出した。これらの２つの個々のライブラリーをプールして、ＶＨ１：ＶＨ２：ＶＬ３三成分ライブラリーを創出した。
【０２２８】
同時に最適化されたＣＤＲ間の相乗作用を破壊しないように注意した。この操作が、同時に最適化されたＶＨＣＤＲ１配列とＶＬＣＤＲ３配列の間の相乗作用を破壊すると予想されたため、例えばＶＨ１：ＶＬ３二成分ライブラリーは、ＶＨＣＤＲ２標的変異誘発ライブラリーで組み換えしなかった。すべての三成分ライブラリーと、それらの派生物の完全な一覧を表１に記載する。各組み換えライブラリーの部分集合を前述のように（セクション１．２）クローニングして、配列決定のために送付して、各ライブラリーの完全性を確認した。
【０２２９】
【表５】
2019511500.tif 000033
【０２３０】
次いで、選択を前述のように（セクション１．２）、低下するビオチン化合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド濃度の存在下で継続した（ラウンド７および８で、それぞれ５００ｐＭおよび２００ｐＭ）。前述したのと同様に、スクリーニング目的で、各選択アウトプットをクローニングした（セクション１．２）。
【０２３１】
セクション１．３に記載されているようなエピトープ競合アッセイ中で、選択ラウンド７および８から無作為に選択した１４０８個のｓｃＦｖをスクリーニングした。「二成分」スクリーニングと同様に、アッセイプレートへの添加前に、未精製ｓｃＦｖを最初に、２５％に希釈した。以前のように、有意な阻害特性を示したクローンをＤＮＡ配列決定のために送付して、独自のクローンを生成し、精製ｓｃＦｖとして分析した（セクション１．３）。これらの選択からの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０３４３は、０．４８ｎＭの効力を有して、ＶＨ１：ＶＨ２：ＶＬ３組み換えライブラリーに由来した。
【０２３２】
３．６  「四成分」ライブラリーを作成するための三成分選択アウトプットの組み換え、およびそれに続くそれらの親和性最適化
セクション１．３に記載されているエピトープ競合アッセイを使用して、各三成分ライブラリーが、先の２ラウンドの選択（７および８）よりも親和性成熟しているかどうかを判定した。すべてのライブラリーは、親和性改善を示し、したがって、さらに親和性成熟しているとみなした。
【０２３３】
ＶＨ１：ＶＨ２：ＶＬ１三成分ライブラリー（ラウンド８アウトプット）をＶＬＣＤＲ３標的変異誘発ライブラリー（ラウンド４アウトプット）で組み換えし、ＶＨ２：ＶＬ１：ＶＬ３三成分ライブラリー（ラウンド８アウトプット）をＶＨＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリー（ラウンド４アウトプット）で組み換えた。別途、ＶＨ１：ＶＨ２二成分ライブラリー（ラウンド６アウトプット）をＶＬ１：ＶＬ３二成分ライブラリー（ラウンド６アウトプット）で組み換えた。次いで、これらの３つの個々のライブラリーをプールして、その中で６つのＣＤＲのうちの４つが変異している、単一「四成分」ライブラリーＶＨ１：ＶＨ２：ＶＬ１：ＶＬ３を創出した。
【０２３４】
同時に最適化されたＣＤＲ間の相乗作用を破壊しないように注意した。この操作が、同時に最適化されたＶＨＣＤＲ１／ＶＨＣＤＲ２配列とＶＬＣＤＲ３配列の間の相乗作用を破壊すると予想されたため、例えばＶＨ１：ＶＬ２：ＶＬ３三成分ライブラリーは、ＶＬＣＤＲ１標的変異誘発ライブラリーで遺伝子組み換えしなかった。各組み換えライブラリーの部分集合を前述のように（セクション１．２）クローニングして、配列決定のために送付して、各ライブラリーの完全性を確認した。
【０２３５】
次いで、選択を前述のように（セクション１．２）、低下するビオチン化合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド濃度（ラウンド９〜１１で５０ｐＭ〜１０ｐＭ）の存在下で継続した。前述したのと同様に、スクリーニング目的で、各選択アウトプットをクローニングした（セクション１．２）。
【０２３６】
セクション１．３に記載されているようなエピトープ競合アッセイ中で、選択ラウンド９〜１１から無作為に選択した１６７２個のｓｃＦｖをスクリーニングした。これらのクローンの効力の増大に起因して、未精製ｓｃＦｖをアッセイプレートへの添加前に、最初に、３．１３％に希釈した。以前のように、有意な阻害特性を示したクローンをＤＮＡ配列決定のために送付して、独自のクローンを生成し、精製ｓｃＦｖとして分析した（セクション１．３）。これらの選択からの最も強力なクローンであるＡｂｅｔ０３７７は、０．３２ｎＭの効力を有した（ｎ＝２のデータ）。試料阻害曲線は図１に示され、２４個の最大効力クローンのデータは表２に示されている。対応するタンパク質配列は、表３および４に列挙されている。
【０２３７】
【表６】
2019511500.tif 000034
【０２３８】
表３（以下を参照のこと）：本明細書に記載されている最適化非生殖系列化クローンのＶＨドメインの配列アラインメント。親配列（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）からの変化が強調されている。残基は、Ｋａｂａｔ番号付け体系に準じて命名される。
【０２３９】
表４（以下を参照のこと）：本明細書に記載されている最適化非生殖系列化クローンのＶＬドメインの配列アラインメント。親配列（Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ）からの変化が強調されている。残基は、Ｋａｂａｔ番号付け体系に準じて命名される。Ａｂｅｔ０３７８が、最適化中にグルタミンからの変化として導入されて、ＶＬ配列内の９１位に存在する、ａｍｂｅｒ停止コドン「Ｂ」を有することに留意されたい。抗体は、発現のために使用した大腸菌ＴＧ１株中でｓｃＦｖ断片として産生され、その中では、ａｍｂｅｒ停止コドンはグルタミンとして読み取られる。
【０２４０】
【表７】
2019511500.tif 000035
【０２４１】
【表８】
2019511500.tif 000036
【０２４２】
１．７  表面プラズモン共鳴による精製ｓｃＦｖフォーマットの親和性改善クローンの動態プロファイリング
ＨＴＲＦ（商標）エピトープ競合アッセイ（セクション１．３〜１．６）において、表面プラズモン共鳴を使用して、親配列であるＡｂｅｔ０１４４−ＧＬに対して、ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドへの結合親和性に有意な改善を示した精製ｓｃＦｖクローンを分析した。簡潔には、ＰｒｏｔｅＯｎタンパク質相互作用アレイシステム（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）を使用して、各精製ｓｃＦｖと、合成により生成したヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、本質的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９９１年）に記載されているようにして実施した。
【０２４３】
ビオチン化合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチド（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ１１１７）が、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を介して、独自仕様のストレプトアビジンチップ（ＮＴＡ１７６−５０２１）と５つの異なる表面密度で非共有結合するアッセイを使用して、各試験ｓｃＦｖとヒトアミロイドベータ１−４２の間の結合親和性を推定した。１０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．０の単回の６０秒間の注入によってペプチドに結合したｓｃＦｖを除去し、サイクル間にチップ表面を再生した。再生は、ｓｃＦｖ結合能力の顕著な損失をもたらさなかった。
【０２４４】
適切な結合モデルに信頼をもってフィッティングすることができるセンサーグラムを観察するのに十分な時間、１００〜２００ｎＭの各ｓｃＦｖをペプチド表面に順次通過させた。不適切なｓｃＦｖブランクを主要なデータセットから減算して、あらゆる緩衝液アーチファクトまたは非特異的結合効果の影響を低減した。次いで、適当な結合モデルをデータにフィッティングした。
【０２４５】
Ａｂｅｔ０３８０のｓｃＦｖでは、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）は、それぞれ１．９３×１０５Ｍ−１ｓ−１、２．８５×１０−５ｓ−１、および１４８ｐＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュアフィッティングから導出した。
【０２４６】
【表９】
2019511500.tif 000037
【０２４７】
１．８  親和性改善ｓｃＦｖのヒトＩｇＧ１−ＴＭへの再構成
それぞれヒト抗体重鎖および軽鎖全体を発現する、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをベクターにサブクローニングすることによって、ＳｃＦｖをＩｇＧ１−ＴＭに再構成した。ヒト重鎖定常ドメインと調節因子を含有する哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ１．４）に、可変重鎖をクローニングして、哺乳動物細胞内でＩｇＧ１−ＴＭ重鎖全体を発現させた。同様に、ヒトラムダ軽鎖定常ドメインおよび調節因子の発現のための哺乳動物発現ベクター（ｐＥＵ４．４）に、可変軽鎖ドメインをクローニングして、哺乳動物細胞内でＩｇＧ軽鎖全体を発現させた。
【０２４８】
抗体をＩｇＧとして得るために、重鎖および軽鎖ＩｇＧ発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ哺乳動物細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：Ｒ６２０−０７）に一過的にトランスフェクトして、ＩｇＧを発現させ培地中に分泌させた。採集物をプールして、精製前に濾過した。プロテインＡクロマトグラフィーを使用して、ＩｇＧを精製した。培養上清を適当なセラミックプロテインＡカラム（ＢｉｏＳｅｐｒａ−Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）に装填し、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄した。結合ＩｇＧは、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用してカラムから溶出し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）の添加によって中和した。溶出した物質は、ＮＡＰ−１０緩衝液交換カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ；カタログ番号：１７−０８５４−０２）を使用して、緩衝液をＰＢＳに交換して、精製ＩｇＧを０．２μｍフィルターに通過させた。ＩｇＧの濃度は、ＩｇＧのアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用して、分光光度法で決定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製ＩｇＧを凝集または分解について分析した。
【０２４９】
１．９  生殖系列化
それらの対応するｓｃＦｖの実験的特徴付けに基づいて、生殖系列化するために、最も強力なＩｇＧのうちの５つを選択した。クローンＡｂｅｔ０３４３、Ａｂｅｔ０３６９、Ａｂｅｔ０３７７、Ａｂｅｔ０３８０、およびＡｂｅｔ０３８２の精製ｓｃＦｖはすべて、エピトープ競合アッセイによる決定で、７５０ｐＭ未満のＩＣ５０値を示し（表２）、すべて、表面プラズモン共鳴による決定で２５０ｐＭ未満の実験的解離定数を有した（表５）。
【０２５０】
生殖系列化の過程は、ＶＨおよびＶＬドメイン内のフレームワーク残基を最も近い生殖系列配列に復帰させて、ヒト抗体に完全に同じように一致させることからなった。最適化抗体系統のＶＨドメインでは、これはＶｈ３−２３（ＤＰ−４７）であり、ＶＬドメインでは、これはＶλ３−３ｒ（ＤＰＬ−２３）であった。Ａｂｅｔ０３８０では、Ｋａｂａｔ位置４３において、ＶＨドメイン内の１つの残基の変更が必要であり（表６）、Ｋａｂａｔ位置８１において、ＶＬドメイン内の１つの残基の変更が必要であった（表７）。残りの４つの配列では、２〜５つの変更が必要であった（表６および７）。側面に位置する残基１および３と同時に生殖系列化されたＡｂｅｔ０３４３の軽鎖配列中の残基２を除いて、Ｖｅｒｎｉｅｒ残基（Ｆｏｏｔｅら、１９９２年）は生殖系列化されなかった。これらのアミノ酸残基の生殖系列化は、ＣｌａｃｋｓｏｎおよびＬｏｗｍａｎ（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、２００４年）によって記載されているような適当な変異原性プライマーを用いる標準部位特異的変異誘発技法を使用して行った。
【０２５１】
【表１０】
2019511500.tif 000038
【０２５２】
【表１１】
2019511500.tif 000039
【０２５３】
１．１０  表面プラズモン共鳴を使用する親和性最適化ＩｇＧの結合動態の判定
表面プラズモン共鳴を使用して、親和性最適化ＩｇＧ（セクション１．８）およびそれ
らの生殖系列化対応物（セクション１．９）の結合動態を解析した。簡潔には、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ−１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各試験ＩｇＧと、合成により生成したヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、本質的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９９１年）に記載されているようにして実施した。
【０２５４】
それ自体が独自仕様のＣＭ５チップとアミンにより連結するプロテインＧ表面によって、各抗体が非共有結合的に捕捉されるアッセイを使用して、各試験ＩｇＧとヒトアミロイドベータ１−４２の間の結合親和性を推定した。対の１０ｍＭグリシンｐＨ２．０の４０秒間注入によって、リガンドおよび結合抗体を除去し、サイクル間にチップ表面を再生した。次いで、各ペプチド注入毎に、試験抗体を再適用した。
【０２５５】
適当な結合モデルと信頼をもってフィッティングすることができるセンサーグラムの観察に十分な時間、合成ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドの一連の希釈液（０．０６３〜１０２４ｎＭ）を抗体表面に順次通過させた。ブランク基準フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度抗体のみの緩衝液ブランクを主要なデータセットから二重基準減算した。次いで、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、各検体滴定からのデータに、適当な結合モデルを同時にフィッティングした。
【０２５６】
２ＲＵ２未満を許容値として、計算したカイ二乗値を使用して、データの妥当性を評価した。２ＲＵ未満の偏差を許容可能として、残差を使用して、フィッティングの全体的な成功を推定した。
【０２５７】
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ（生殖系列化）ＩｇＧ１−ＴＭに対する例証的結果は、図２に示される。結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）は、それぞれ９．５２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３．０７×１０−４ｓ−１、および３２２ｐＭである。これらのパラメータは、データへの１：１ラングミュアフィッティングから導出した。
【０２５８】
１．１１  表面プラズモン共鳴を使用する親和性最適化ＩｇＧの特異性プロファイリング
表面プラズモン共鳴を使用して、ヒトアミロイドベータ１−４２ペプチドの親和性最適化ＩｇＧの特異性を確認した。簡潔には、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）バイオセンサー装置を使用して、各試験ＩｇＧと、合成により生成したヒトアミロイドベータ１−４２およびヒトアミロイドベータ１−４０を含む様々な小型ペプチドとの間の相互作用の動態学パラメータを評価した。これらの実験は、本質的に、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９９１年）に記載されているようにして実施した。
【０２５９】
それ自体が独自仕様のＣＭ５チップとアミンにより連結するプロテインＧ表面によって、抗体が非共有結合的に捕捉されるアッセイを使用して、各試験ＩｇＧと各ペプチドの間の相互作用を推定した。抗体とペプチドの間の相互作用は、５回適用の単一サイクルアプローチを使用して観察した。対の１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．０の４０秒間注入によって、リガンドおよび結合抗体を除去し、サイクル間にチップ表面を再生した。次いで、各ペプチド注入サイクル毎に、試験抗体を再適用した。
【０２６０】
結合を示さないか、または適当な結合モデルと信頼をもってフィッティングすることができるかのどちらかであるセンサーグラムを観察するのに十分な時間、各試験ペプチド（６４から１０２４ｎＭの間）を抗体表面に順次通過させた。ブランク基準フローセルデータを各ＩｇＧデータセットから減算し、ゼロ濃度抗体のみの緩衝液ブランクを主要データセットから二重基準減算した。
【０２６１】
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ（生殖系列化）ＩｇＧ１−ＴＭに関する例証的結果は、図３に示される。２つのペプチド（ビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４２、（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ１１１７）および標識されていないマウスアミロイドベータ１−４２（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ１００８）が抗体に対する強力な結合を示した一方で、２つのペプチドビオチン化ヒトアミロイドベータ１−４０（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ１１１１）および標識されていないマウスアミロイドベータ１−４０（ｒＰｅｐｔｉｄｅ、ＵＳＡ；カタログ番号：Ａ１００７）は、抗体への結合を示さなかった。
【０２６２】
１．１２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫組織化学試験を使用する天然アミロイドベータに対する最も強力なＩｇＧの親和性
アミロイドベータペプチドの天然形態に対するこれらのクローンの親和性を推定する目的で、最も強力なＩｇＧをアミロイドベータと結合するそれらの能力について試験した。簡潔には、ヒトアルツハイマー病の脳切片およびＴｇ２５７６マウスの脳切片上で、リード抗体をスクリーニングして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアミロイドプラークと結合する抗アミロイドベータ１−４２抗体を同定した。
【０２６３】
これらの実験では、２人の重度のアルツハイマー病を有する個体（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、ブラークステージ６；およびＡｐｏＥ遺伝子型４／３、ブラークステージ５）の前頭皮質からヒト脳組織を単離した。対照として、対応する組織を１人の非認知症個体（ＡｐｏＥ遺伝子型３／３、ブラークステージ１）から単離した。マウス脳組織は、１５ヶ月齢（２頭）および２２ヶ月齢（２頭）のＴｇ２５７６マウスから単離した。抗体は、２、５、１０および２０μｇ  ｍｌ−１の濃度で試験した。
【０２６４】
一実験では、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体は、Ｔｇ２５７６脳切片では４のスコアで、ヒトＡＤ脳切片では３のスコアで、コアプラーク（ＣＰ）を染色した。それはまた、びまん性プラーク（ＤＰ）および脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）プラークも染色したが、程度はより少なかった。対照的に、陽性対照抗体は、同一条件下において、隣接する切片上のすべてのプラーク（ＣＰ、ＤＰ、ＣＡＡ）上で、３〜４のスコアを生じた。典型的な画像は、図４に示される。
【０２６５】
１．１３  ウエスタンブロットによってＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭのＡベータ４２認識プロファイルを実証する
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にＡβ４２オリゴマーを架橋させるために、ＰＩＣＵＰ（ペプチドの光誘導架橋）を以下のように実施した。原液２μｌ（１０ｍＭ）を１×ＰＢＳ  １８μｌに添加して、１ｍＭのＲｕ（Ｂｐｙ）溶液を作成した。さらに、原液２μｌ（２００ｍＭで）を１×ＰＢＳ  １８μｌに添加して、２０ｍＭの過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）溶液を作成した。未使用原液は、ドライアイス上で即座にスナップ凍結し、−８０℃の冷凍庫に戻した。暗室で、Ｒｕ（Ｂｐｙ）５μｌを凝集体８０μｌ（無希釈の１０μＭ試料）に添加し、ＡＰＳ５μｌがそれに続いた。暗室内で、試料をランプで１０秒間照射した。（４×）ＬＤＳ試料緩衝液３０μｌを即座に添加した。
【０２６６】
次いで、架橋（ＰＩＣＵＰ）および架橋していないＡβ１−４２凝集体上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。溶液を７０℃の熱ブロック上で、１０分間インキュベートした。その間に、Ｍａｇｉｃ  Ｍａｒｋ  ＸＰ  Ｗｅｓｔｅｒｎタンパク質標準物質５μｌ、Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ染色済タンパク質標準物質５μｌを組み合わせて、マーカーを作成した。１０分間のインキュベーション後、マーカー添加試料をＭＥＳ泳動用緩衝液と共に、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（１．０ｍｍ、１５ウェル、ウェル当たり１５μｌ）に装填した。ゲルを２００Ｖで、３５分間泳動した。
【０２６７】
次いで、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｉＢｌｏｔ装置を使用して、ゲルをＰＶＤＦ膜上に、２０Ｖで７分間ブロットした（プログラムＰ３）。
【０２６８】
一旦ブロッティングが完了したら、ゲルスタックを分解し、次いで、室温で穏やかに回転させて、ＰＶＤＦ膜を４％のＭＰＢＳＴ５０ｍｌ（ＰＢＳＴ中４％のＭａｒｖｅｌ）中で１時間ブロックした。次いで、ブロットを外科用メスで切断して、個々の抗体を探索した。これを一次抗体溶液（３％のＭＰＢＳＴ１０ｍｌ中の２μｇ／ｍｌ）と共に、１時間インキュベーションした。
【０２６９】
次に、膜をそれぞれ５分間にわたりＰＢＳＴで５回洗浄し、次いで、二次抗体溶液（ＰＢＳＴ１０ｍｌ中の抗ヒトＦｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート１μｌ）中で、室温で１時間インキュベートした。膜をそれぞれ５分間にわたりＰＢＳＴで３回、およびＰＢＳで２回洗浄した。
【０２７０】
最後の洗浄中に、化学発光ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；３４０７５）が室温になるまで温めた。それぞれ６００μｌの２つの溶液を合わせた。ＰＢＳをＰＶＤＦ膜からデカントし、次いで、ピペットを使用して、混合硬膜試薬で膜を覆った。反応を約５分間進行させ（その間に、ＶｅｒｓｃＤｏｃ造影システムを準備した）、次いで、（変換フィルターを使用する増強と共に）３０秒間の露光で画像を撮影した。典型的な画像を図５に示す。
【０２７１】
実施例２．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体の特異的機能応答を実証する研究
２．１  ｉｎ  ｖｉｖｏでの遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドの低減によるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ機能の特徴付け
２５ｍＭのヒスチジン、７％のスクロース、０．０２％のｐ８０界面活性剤、ｐＨ６．０の投薬ビヒクルを用いた静脈内注射によって、８週齢の雄アルビノハーランスプラーグドーリーラット（ｎ＝８〜１２）に、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体を５ｍｌ／ｋｇで単回投与した。投与溶液は、投薬直前に作製した。示される時間に動物を麻酔して、大槽から脳脊髄液（ＣＳＦ）を吸引した。試料サンプリングの２０分間以内に、ＣＳＦ試料を４℃でおよそ３０００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞またはデブリを除去した。次いで、それに続く分析のために、試料をドライアイス上で凍結し、−７０℃で保存した。
【０２７２】
動物を断頭によって殺処分し、脳組織を解剖して、ジエチルアミン（ＤＥＡ；Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；カタログ番号：３１７２９）中で脳組織から、アミロイドベータペプチドを抽出した。簡潔には、凍結脳組織を０．２％のＤＥＡおよび５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ；カタログ番号：１．０６４０４．１０００）中で均質化した。脳ホモジネートを１３３，０００×ｇで１時間、超遠心分離した。回収した上清は、２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）塩酸塩；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；カタログ番号：９３３６３）でｐＨ８．０に中和して、分析するまで−７０℃で保存した。動物実験は、スウェーデン農業庁（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）によって提供される、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。倫理的認可は、動物実験専門の倫理委員会である：ストックホルム・セドラ動物実験倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｂｏａｒｄ）によって提供された。
【０２７３】
ラットＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドの測定は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ結合アミロイドベータ１−４２ペプチドを除去する免疫沈降法と、それに続くＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手される市販のＥＬＩＳＡキットによる分析を使用して行った。簡潔には、プロテインＡビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：１００−０２Ｄ）の溶液を９６ウェルノンスカートプレート（ポリプロピレン０．２ｍｌ；ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＫ；カタログ番号：１０７３２−４８２８）に添加して、磁石（ＤｙｎａＭａｇ（商標）９６面；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：１２３．３１Ｄ）を使用して、ＴＢＳＴ（５０ｍＭのＴＢＳ；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ；カタログ番号：Ｔ６６６４、０．１％のＴｗｅｅｎ２０添加）で２回洗浄し、溶液からビーズを分離した。解凍ラットＣＳＦ試料（４０μｌ）を各ウェルに添加して、４０℃で１時間、傾斜回転させてインキュベートした。次いで、磁石を使用してビーズをペレット化し、標準希釈緩衝液７０μｌ（プロテアーゼ阻害剤を補充；Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ；カタログ番号：１１８３６１５３００１）を既に添加した、ＥＬＩＳＡキット（マウスアミロイドベータ（１−４２）比色分析ＥＬＩＳＡキット；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：ＫＭＢ３４４１）からの９６ウェルプレートに、免疫沈降ＣＳＦ試料３０μｌを移した。較正基準試料を二連でプレートに添加して、プレートを室温で振盪しながら２時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液４００μｌで４回洗浄し、検出抗体溶液１００μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした。再度プレートを洗浄緩衝液４００μｌで４回洗浄し、二次抗体使用液を各１００μｌウェルに添加して、プレートを室温で振盪しながら３０分間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄緩衝液４００μｌで４回洗浄し、安定化色素原１００μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間、暗所でインキュベートした。反応を停止させるために停止液１００μｌを各ウェルに添加して、４５０ｎｍの吸光度で、プレートを２時間以内に読み取った。単一ＣＳＦ試料を分析して、多重比較のための調整なしの対数変換データ上の一方向ＡＮＯＶＡによるＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実施した。
【０２７４】
ラットの脳ホモジネート中の全（遊離およびＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ結合）アミロイドベータ１−４２ペプチドの測定は、マウスアミロイドベータ（１−４２）比色分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：ＫＭＢ３４４１）の修正法を使用して実施した。キットの検出抗体を過剰なＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体で置き換え、二次抗体を抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ；カタログ番号：１０９−０３５−０９８）で置き換えた。簡潔には、試料希釈剤（プロテアーゼ阻害剤を補充；Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ；カタログ番号：１１８３６１５３００１）で１：２に希釈した解凍脳ホモジネート５０μｌ、および標準試料を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに二連で添加した。過剰なＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体（５０μｌ、４μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加して、次いで、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液４００μｌで４回洗浄し、二次抗体使用液１００μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間インキュベートした。最後に、プレートを洗浄緩衝液４００μｌで４回洗浄し、安定化色素原１００μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で１５分間、暗所でインキュベートした。反応を停止させるために停止液１００μｌを各ウェルに添加して、４５０ｎｍの吸光度で、プレートを２時間以内に読み取った。多重比較のための調整なしの対数変換データ上の一方向ＡＮＯＶＡによるＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実施した。
【０２７５】
ラット脳ホモジネート中の全アミロイドベータ１−４０ペプチドの測定は、マウスアミロイドベータ（１−４０）比色分析ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ；カタログ番号：ＫＭＢ３４８１）を使用して実施した。簡潔には、試料希釈剤（プロテアーゼ阻害剤を補充；Ｒｏｃｈｅ、ＵＫ；カタログ番号：１１８３６１５３００１）で希釈した解凍脳ホモジネート５０μｌ、および標準試料を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに二連で添加した。検出抗体溶液５０μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で３時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液４００μｌで４回洗浄し、二次抗体使用液１００μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間インキュベートした。最後に、洗浄緩衝液４００μｌでプレートを４回洗浄し、安定化色素原１００μｌを各ウェルに添加して、プレートを室温で３０分間、暗所でインキュベートした。反応を停止させるために停止液１００μｌを各ウェルに添加して、４５０ｎｍの吸光度で、プレートを２時間以内に読み取った。多重比較のための調整なしの対数変換データ上の一方向ＡＮＯＶＡによるＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実施した。
【０２７６】
２．２  ｉｎ  ｖｉｖｏでの遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドの低減によるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの機能の特徴付け
２０ｍｇ／ｋｇでのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体の単回投与は、セクション２．１に記載されているアッセイにおける投与の７２または１６８時間後に、ラット中で、定量化限界まで、ＣＳＦの遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドレベルを低減した（データ示さず）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体の効果をさらに調べるために、０．２５、０．５、１、５または１０ｍｇ／ｋｇの週１回用量で、ラットに１４日間にわたり投与した。２回目の投与の１６８時間後に、動物を安楽死させて、ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２ペプチド、ならびに脳組織内の全アミロイドベータ１−４２または１−４０ペプチドのレベルを測定した。
【０２７７】
ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２の用量依存性低下が実証された（図６Ａ）。５および１０ｍｇ／ｋｇの２つの最大用量は、使用したアッセイの定量化限界までアミロイドベータ１−４２ペプチドを低減した一方で、０．５および１ｍｇ／ｋｇの用量は、ビヒクル対照と比較して、アミロイドベータ１−４２ペプチドをそれぞれ４７％および６１％に有意に低減した。最低用量である０．２５ｍｇ／ｋｇは、ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドに１４％の低減を与えたが、統計的有意性には到達できなかった。Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体によるアミロイドベータ１−４２ペプチド隔離のために、全アミロイドベータ１−４２ペプチドの用量依存的増大が、脳組織内で実証された（図６Ｂ）。しかし脳組織内の全アミロイドベータ１−４０ペプチドのレベルは影響を受けず（図６Ｃ）、したがってアミロイドベータ１−４２ペプチドに対するＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの特異性が実証された。要約すると、ラット研究からの上の結果は、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体が、０．５から１ｍｇ／ｋｇの間のＥＤ５０で、ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２ペプチドのレベルを低減することを示した。
【０２７８】
２．３  Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１ＴＭの機能の特徴付け−ｉｎ  ｖｉｖｏでの非プラーク結合の実証−老化Ｔｇ２５７６マウスへの末梢投与の１６８時間後にｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアミロイドベータプラークへのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの結合不在
単回末梢投与後に、老化Ｔｇ２５７６マウス中でアミロイドベータプラークと結合する能力について、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭを試験した。動物実験は、スウェーデン農業庁によって提供される、関連するガイドラインおよび規制に従って実施した。倫理的認可は、動物実験専門の倫理委員会である：ストックホルム・セドラ動物実験倫理委員会によって提供された。２５ｍＭのヒスチジン、７％のスクロース、０．０２％のｐ８０界面活性剤、ｐＨ６．０の投薬ビヒクルを用いた静脈注射によって、１７ヶ月齢の雌のＴｇ２５７６マウス（ｎ＝５）に、ビヒクル、３０ｍｇ／ｋｇの陽性対照抗体、または１０もしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ抗体を５ｍＬ／ｋｇで単回投与した。投与の１６８時間後に動物を深く麻酔して、室温のＰＢＳと、それに続く冷（４℃）リン酸緩衝４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。次いで、動物を断頭によって殺処分し、脳を解剖して、ＰＦＡ中において４℃で７２時間浸漬固定した。０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで固定液を交換し、さらに処理するまで組織を４℃で保存した。
【０２７９】
脳切片上で免疫組織化学的検査を実施して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアミロイドベータプラークへのＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの結合の度合いを評価した。簡潔には、パラフィン包埋した脳切片を免疫組織化学的検査のために調製した。脳実質内に沈着したＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭまたは陽性対照抗体の検出は、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓからのウサギ−抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２特異的二次抗体を使用して行った。ＯｍｎｉＭａｐ検出システム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して、Ｖｅｎｔａｎａロボット上で染色を実施した。ｅｘ  ｖｉｖｏでの添加では、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭまたは陽性対照抗体を過剰に注入して、連続組織切片をｉｎ  ｖｉｔｒｏで染色した。二次抗体および色素原は、上記と同一であった。
【０２８０】
染色の点数化は、１０倍の光学的倍率下で、盲検化様式で行った。修飾プラークの分布が認められた。０（プラークの染色なし）からの最大４（プラークの強い修飾）の相対的強度尺度に従って、プラーク標識の強度を点数化した。
【０２８１】
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、１０または３０ｍｇ／ｋｇの末梢投与の１６８時間後に、アミロイドベータプラークまたは脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を修飾しなかった。陽性対照抗体は、強から弱のｉｎ  ｖｉｖｏプラーク修飾を実証した。すべての動物において、コアプラーク、びまん性プラーク、およびＣＡＡで、部分的および限局性分散パターンが明白であった。典型的な画像は、図７に示される。同一動物からの脳組織への、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭおよび陽性対照抗体のｅｘ  ｖｉｖｏでの添加は、先に実証された、注射された抗体のｅｘ  ｖｉｖｏでのプラーク結合能力を確認した（図示せず）。
【０２８２】
実施例３．抗Ａβ１−４２配列
例証的抗体ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、個々のＣＤＲ配列、ＨＣＤＲのセット、ＬＣＤＲのセット、およびフレームワーク領域を含む抗体分子の配列例は、添付の配列表に列挙されている。
【０２８３】
表５に列挙される２４個の最適化クローンの配列を比較した。表８および９は、それぞれＶＨドメインとＶＬドメインの間の％配列同一性を示す。
【０２８４】
【表１２】
2019511500.tif 000040
【０２８５】
【表１３】
2019511500.tif 000041
【０２８６】
【表１４】
2019511500.tif 000042
【０２８７】
【表１５】
2019511500.tif 000043
【０２８８】
【表１６】
2019511500.tif 000044
【０２８９】
【表１７】
2019511500.tif 000045
【０２９０】
【表１８】
2019511500.tif 000046
【０２９１】
【表１９】
2019511500.tif 000047
【０２９２】
【表２０】
2019511500.tif 000048
【０２９３】
【表２１】
2019511500.tif 000049
【０２９４】
【表２２】
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【０２９５】
【表２３】
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【０２９６】
【表２４】
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【０２９７】
【表２５】
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【０２９８】
【表２６】
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【０２９９】
【表２７】
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【０３００】
【表２８】
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【０３０１】
【表２９】
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【０３０２】
【表３０】
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【０３０３】
実施例４：競合結合実験におけるＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの特異性
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの特異性を競合結合実験で検査した。簡潔には、異なる濃度範囲（１０μＭ〜０．１７ｎＭ）の完全長、トランケート、およびピロヒトＡベータペプチド（Ａベータ１−４２、Ａベータ１−４３、Ａベータ１−１６、Ａベータ１２−２８、Ａベータ１７−４２、Ａベータピロ−３−４２、またはＡベータピロ−１１−４２）のパネルを用いて、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ（０．５ｎＭ）を（室温で１時間）インキュベートした。
【０３０４】
Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭとＡベータペプチドＮ末端ビオチンの間のインキュベーションに続いて、Ａベータ１−４２（１．５ｎＭ）を添加し、ユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ抗体（０．８ｎＭ）（ＣｉｓＢｉｏ  カタログ番号：６１ＨＦＣＫＬＢ）およびストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔ！（５ｎＭ）（ＣｉｓＢｉｏ  カタログ番号：６１１ＳＡＸＬＢ）がそれに続いた。次に、標準均なホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）読み取りプロトコルを使用して、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で読み取る前に、アッセイを室温でさらに２時間インキュベートした。次に競合不在下で、ユウロピウムクリプテート供与体とＸＬ６６５受容体フルオロフォアの近接に起因する、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を通じて、（それぞれ、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔ！およびユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ抗体との複合体中の）Ｎ末端ビオチンＡベータ１−４２とＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭの相互作用を評価し得た。したがって、試験ペプチドによる、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡベータ１−４２相互作用の競合は、アッセイシグナルの低下をもたらした。結果は、％特異的結合として発現され、１００％特異的結合は、ストレプトアビジン−ＸＬｅｎｔ！（５ｎＭ）、Ｎ末端ビオチンＡベータ１−４２（１．５ｎＭ）、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ（０．５ｎＭ）およびユウロピウムクリプテート標識抗ヒトＦｃ抗体（０．８ｎＭ）を含有するウェルから得られた。０％特異的結合は、その中でＡｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭが省かれているウェルから得られた。
【０３０５】
最終アッセイ容積は２０μｌであり、すべての試薬は、ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４（５０ｍＭ）、フッ化カリウム（０．４Ｍ）、ツイーン２０（０．１％）、および脂肪酸非含有ＢＳＡ（０．１％）を含むアッセイ緩衝液中で調製した。アッセイは、低容量３８４ウェル黒色アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６７６）内で実施した。
【０３０６】
要約すると、１０−８〜１０−９のモル濃度範囲のＩＣ５０値のＡベータ１−４２、Ａベータ１−４３、Ａベータ１７−４２、Ａベータピロ−３−４２、およびＡベータピロ−１１−４２による、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡベータ１−４２結合の阻害が、このグループで観察された。Ａベータ１−１６またはＡベータ１２−２８による、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ  ＩｇＧ１−ＴＭ：Ｎ末端ビオチンＡベータ１−４２結合の阻害は観察されなかった（図８）。
【０３０７】
実施例５：正常ラットＰＫ−ＰＤ研究におけるアミロイドベータ１−４２を隔離する抗体Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬの能力
正常ラット中のＰＫ−ＰＤ研究において、アミロイドベータ１−４２を隔離する抗体Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬの能力を調べた。ラットに、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬ（１０または４０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクルを２週間にわたり毎週（０および７日目に）静脈内投与して、２回目の投与の１週間後に殺処分した。遊離および全アミロイドベータ１−４２の測定のためにＣＳＦをサンプリングし、全アミロイドベータ１−４２のために脳をサンプリングした。上述のアッセイを使用して、遊離および全アミロイドベータ１−４２レベルを評価した。
【０３０８】
図９に示されるように、ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２は、１０または４０ｍｇ／ｋｇのＡｂｅｔ０１４４−ＧＬのいずれも有意に変化させなかった（ビヒクルと比較してそれぞれ５および１８％の増大；図９）。ＣＳＦ中の全アミロイドベータ１−４２は、１０ｍｇ／ｋｇで３８％、４０ｍｇ／ｋｇで１３９％有意に増大した。脳組織内の全アミロイドベータ１−４２もまた、１０および４０ｍｇ／ｋｇで、それぞれ１６％および５０％有意に増大した。要約すると、正常ラットにおけるこの研究からのデータは、Ａｂｅｔ０１４４−ＧＬが、ＣＳＦ中の遊離アミロイドベータ１−４２レベルに対して有意な効果を有しない一方で、ＣＳＦおよび脳の双方において全アミロイドベータ１−４２レベルを増大させることを実証した。これは、標的に対する数１０ｎＭ範囲の親和性がある抗体について、予測されるプロファイルであった。
【０３０９】
実施例６：６’−ブロモスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１，４’（３’Ｈ）−ジオン
【化２６】
2019511500.tif 000059
カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２２３ｇ、１．９９ｍｏｌ）を、２０〜３０℃で、ＴＨＦ（１６．７５Ｌ）中６−ブロモ−１−インダノン（８．３８ｋｇ、３９．７ｍｏｌ）の撹拌混合物を含有する１００Ｌの反応器に投入した。次いで、メチルアクリレート（２．３３Ｌ、２５．８ｍｏｌ）を、２０〜３０℃の間の温度に保ちながら、１５分の間に、混合物に投入した。ＴＨＦ（４００ｍＬ）中に溶解したカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（８９．１ｇ、０．７９ｍｏｌ）の溶液を添加し、その後、メチルアクリレート（２．３３Ｌ、２５．８ｍｏｌ）を、２０〜３０℃で、２０分の間に添加した。次いで、ＴＨＦ（４００ｍＬ）中に溶解したカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（９０ｇ、０．８０ｍｏｌ）の第３の部分を添加し、その後、２０〜３０℃において、２０分の間に、メチルアクリレート（２．３３Ｌ、２５．８ｍｏｌ）の第３の添加を行った。ＴＨＦ（２１．９Ｌ）中に溶解したカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（４．８６ｋｇ、４３．３ｍｏｌ）を、２０〜３０℃で、１時間の間に、反応器に投入した。反応物をおよそ６５℃に加熱し、溶媒２３Ｌを留去した。反応温度を６０℃に低下させ、水（５１．１Ｌ）中に溶解した５０％の水酸化カリウム水溶液（２．４２Ｌ、３１．７ｍｏｌ）を、５５〜６０℃で、３０分の間に混合物に添加し、その後、混合物を６０℃で６時間撹拌し、２時間の間に２０℃に冷却した。２０℃で１２時間撹拌した後、固体物質を濾去し、水（８．４Ｌ）とＴＨＦ（４．２Ｌ）の混合物で２回洗浄し、次いで、５０℃で、真空下で乾燥させて、６’−ブロモスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’，４（３’Ｈ）−ジオン（７．７８ｋｇ；２６．６ｍｏｌ）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.78 - 1.84 (m, 2 H), 1.95 (td, 2 H), 2.32 - 2.38 (m, 2 H), 2.51 - 2.59 (m, 2 H), 3.27 (s, 2 H), 7.60 (d, 1 H), 7.81 (m, 1 H), 7.89 (m, 1 H).
【０３１０】
実施例７：（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’（３’Ｈ）−オン
【化２７】
2019511500.tif 000060
ＤＣＭ（３．８Ｌ）中に溶解したボランｔｅｒｔ−ブチルアミンコンプレックス（８４５ｇ、９．７ｍｏｌ）を、およそ０〜５℃で、およそ２５分かけて、ＤＣＭ（４２．４Ｌ）中６’−ブロモスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’，４（３’Ｈ）−ジオン（７．７ｋｇ、２６．３ｍｏｌ）のスラリーに投入した。０〜５℃で、撹拌しながら１時間反応させ、その後、分析により、変換が９８％を超えたことを確認した。塩化ナトリウム（２．７７ｋｇ）、水（１３．３Ｌ）および３７％の塩酸（２．６１Ｌ、３２ｍｏｌ）から調製した溶液を投入した。混合物をおよそ１５℃に加温し、層中への沈降後、相が分離した。有機相をメチルメタンスルホネート（２．６８Ｌ、３１．６ｍｏｌ）およびテトラブチルアンモニウムクロリド（１３１ｇ、０．４７ｍｏｌ）と一緒に反応器に戻し、混合物を２０℃で激しく撹拌した。次いで、５０％の水酸化ナトリウム（１２．５Ｌ、２３６ｍｏｌ）を、およそ１時間かけて、激しく撹拌した反応混合物に投入し、２０℃で、終夜、激しく撹拌しながら反応させた。水（１９Ｌ）を添加し、分離後に、水性相を捨てた。有機層をおよそ４０℃に加熱し、溶媒３３Ｌを留去した。エタノール（２１Ｌ）を投入し、温度を上昇させながら、蒸留を再開した（７９℃までで２２Ｌの留去）。エタノール（１３．９Ｌ）をおよそ７５℃で投入した。７２〜７５℃の間の温度で保ちながら、３０分かけて、水（１４．６Ｌ）を投入した。溶液およそ４００ｍＬが、５００ｍＬのポリテンボトルに回収され、試料は自然に結晶化した。バッチを５０℃に冷却し、結晶化したスラリー試料を溶液に戻して添加した。混合物を４０℃に冷却した。４時間の間に２０℃に冷却し、その後、混合物を終夜撹拌した。固体を濾去し、エタノール（６．６Ｌ）と水（５Ｌ）の混合物で洗浄し、５０℃で、真空下で乾燥させて、（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’（３’Ｈ）−オン（５．８３ｋｇ、１８．９ｍｏｌ）を得た1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 1.22-1.32 (m, 2 H), 1.41 - 1.48 (m, 2 H), 1.56 (td, 2 H), 1.99 - 2.07 (m, 2 H), 3.01 (s, 2 H), 3.16 - 3.23 (m, 1 H), 3.27 (s, 3 H), 7.56 (d, 1 H), 7.77 (d, 1 H), 7.86 (dd, 1 H).
【０３１１】
実施例８：（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’（３’Ｈ）−イミンヒドロクロリド
【化２８】
2019511500.tif 000061
（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’（３’Ｈ）−オン（５．８２ｋｇ；１７．７ｍｏｌ）を、周囲温度で、１００Ｌの反応器に投入し、続いて、チタン（ＩＶ）エトキシド（７．４Ｌ；３５．４ｍｏｌ）および２−メチルテトラヒドロフラン（１３．７Ｌ）中ｔｅｒｔ−ブチルスルフィンアミド（２．９４ｋｇ；２３．０ｍｏｌ）の溶液を投入した。混合物を撹拌し、８２℃に加熱した。８２℃で３０分の後、温度をさらに上昇させ（９７℃まで）、溶媒８Ｌを留去した。反応を８７℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（８．２Ｌ）を添加したところ、反応温度は８２℃となった。８２℃で、終夜、撹拌しながら反応させた。反応温度を上げ（９７℃まで）、溶媒８．５Ｌを留去した。反応を８７℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（８．２Ｌ）を添加したところ、反応温度は８２℃となった。３．５時間後、反応温度をさらに上昇させ（９７℃まで）、溶媒８Ｌを留去した。反応を８７℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（８．２Ｌ）を添加したところ、反応温度は８２℃となった。２時間後、反応温度をさらに上昇させ（９７℃まで）、溶媒８．２Ｌを留去した。反応を８７℃に冷却し、２−メチルテトラヒドロフラン（８．２Ｌ）を添加したところ、反応温度は８２℃となった。８２℃で、終夜、反応を撹拌した。反応温度をさらに上昇させ（９７℃まで）、溶媒８Ｌを留去した。反応を２５℃に冷却した。ジクロロメタン（１６．４Ｌ）を投入した。分離反応器に水（３０Ｌ）を添加し、激しく撹拌し、硫酸ナトリウム（７．５４ｋｇ）を添加し、得られた溶液を１０℃に冷却した。硫酸（２．３Ｌ、４２．４ｍｏｌ）を水溶液に添加し、温度を２０℃に調整した。酸性水溶液６Ｌを回収し、後のために保管した。よく撹拌しながら、有機反応混合物を酸性水溶液に５分かけて投入した。有機反応容器をジクロロメタン（１６．４Ｌ）で洗浄し、ジクロロメタン洗浄溶液も酸性水に添加した。混合物を１５分間撹拌し、次いで、２０分間沈降させた。下側の水性相を流出させ、保管した酸性のウォッシュ６Ｌを添加し、続いて、水（５．５Ｌ）を添加した。混合物を１５分間撹拌し、次いで、２０分間沈降させた。下側の有機層をカーボイに流出させ、上側の水層を捨てた。有機層を容器に戻して投入し、続いて、硫酸ナトリウム（２．７４ｋｇ）を投入し、混合物を３０分間撹拌した。硫酸ナトリウムを濾去し、ジクロロメタン（５．５Ｌ）で洗浄し、合わせた有機相を清浄な容器に投入した。バッチを蒸留するために加熱した（最大温度５７℃で３１Ｌ採取した）。バッチを４０℃に冷却し、ジクロロメタン（１６．４Ｌ）を添加した。バッチを蒸留するために加熱した（最大温度５４℃で１７Ｌ採取した）。バッチを２０℃に冷却し、ジクロロメタン（５．５Ｌ）およびエタノール（２．７Ｌ）を添加した。ジエチルエーテル（１０．６Ｌ；２１．２ｍｏｌ）中２Ｍの塩酸を、１６〜２３℃の間の温度を保ちながら、４５分かけて、反応に投入した。得られたスラリーを２０℃で１時間撹拌し、その後、固体を濾去し、ジクロロメタンとジエチルエーテルの１：１の混合物で３回洗浄した（３×５．５Ｌ）。固体を、５０℃で���真空下で乾燥させて、（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’（３’Ｈ）−イミンヒドロクロリドを得た（６．０ｋｇ；１４．３ｍｏｌ；１Ｈ  ＮＭＲによるアッセイ８２％ｗ／ｗ）1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 130 (m, 2 H), 1.70 (d, 2 H), 1.98 (m, 2 H), 2.10 (m, 2 H), 3.17 (s, 2 H), 3.23 (m, 1 H), 3.29 (s, 3 H), 7.61 (d, 1 H), 8.04 (dd, 1 H), 8.75 (d, 1 H), 12.90(br s,2H).
【０３１２】
実施例９：（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’（３’’Ｈ）−チオン
【化２９】
2019511500.tif 000062
トリメチルオルトホルメート（４．９５Ｌ；４５．２ｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（３．５Ｌ；２０．０ｍｏｌ）をイソプロパノール（５０．５Ｌ）中の（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン］−１’（３’Ｈ）−イミンヒドロクロリド（６．２５ｋｇ；１４．９ｍｏｌ）を含有する反応器に投入した。反応混合物を撹拌し、１時間の間に、７５℃に加熱し、その結果、清澄な溶液が得られた。温度を７０℃に設定し、イソプロパノール（１９．５ｋｇ；４０．６ｍｏｌ）中２−オキソプロパンチオアミドの２Ｍ溶液を１時間かけて投入し、その後、６９℃で、終夜、反応を撹拌した。バッチに（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’（３’’Ｈ）−チオン（３ｇ；７．６ｍｍｏｌ）を種として投入し、温度を６０℃に低下させ、１時間撹拌した。混合物を蒸留により濃縮した（蒸留温度はおよそ６０℃；３１Ｌを留去した）。水（３１Ｌ）を６０℃で１時間の間に添加し、温度を９０分の間に２５℃に低下させ、その後、混合物を３時間撹拌した。固体を濾去し、イソプロパノールで２回洗浄し（２×５．２Ｌ）、４０℃で、真空下で乾燥させて、（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’（３’’Ｈ）−チオンを得た（４．８７ｋｇ；１０．８ｍｏｌ；１Ｈ  ＮＭＲによる８７％ｗ／ｗのアッセイ）。
【０３１３】
実施例１０：（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン  Ｄ（＋）−１０−カンファースルホン酸塩
【化３０】
2019511500.tif 000063
メタノール（３２Ｌ；２２４ｍｏｌ）中７Ｍのアンモニアを（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’（３’’Ｈ）−チオン（５．１０ｋｇ；１１．４ｍｏｌ）および酢酸亜鉛二水和物（３．０２ｋｇ；１３．８ｍｏｌ）を含有する反応器に投入した。反応器を密封し、８０℃に加熱して、２４時間撹拌し、その後、混合物を３０℃に冷却した。１−ブタノール（５１Ｌ）を投入し、反応混合物を真空で濃縮し、およそ５０Ｌを留去した。１−ブタノール（２５Ｌ）を添加し、混合物を真空で濃縮し、２７Ｌを留去した。混合物を３０℃に冷却し、１Ｍの水酸化ナトリウム（３０Ｌ；３０ｍｏｌ）を投入した。二相性の混合物を１５分間撹拌した。下側の水性相を分離除去した。水（２０Ｌ）を投入し、混合物を３０分間撹拌した。下側の水性相を分離除去した。（１ｓ）−（＋）−１０−カンファースルホン酸（２．４ｋｇ；１０．３ｍｏｌ）を投入した後、有機相を７０℃に加熱した。混合物を７０℃で１時間撹拌し、次いで、３時間かけて２０℃に下降させた。固体を濾去し、エタノール（２０Ｌ）で洗浄し、５０℃で真空にて乾燥させて、（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン  （＋）−１０−カンファースルホン酸塩を得た（３．１２ｋｇ；５．１３ｍｏｌ；１Ｈ  ＮＭＲによるアッセイ１０２％ｗ／ｗ）。
【０３１４】
実施例１１：（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン
【化３１】
2019511500.tif 000064
水（０．１Ｌ）中に溶解したＮａ２ＰｄＣｌ４（１．４ｇ；４．７６ｍｍｏｌ）および３−（ジ−ｔｅｒｔ−ブチルホスホニウム）プロパンスルホネート（２．６ｇ；９．６９ｍｍｏｌ）を１−ブタノール（７．７Ｌ）と水（２．６Ｌ）の混合物中の（１ｒ，４ｒ）−６’−ブロモ−４−メトキシ−５’’−メチル−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン  （＋）−１０−カンファースルホン酸塩（１ｋｇ；１．５８ｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．７６３ｋｇ；５．５２ｍｏｌ）を含有する容器に投入した。混合物を注意深く窒素で不活性化し、その後、５−（プロパ−１−インイル）ピリジン−３−イル  ボロン酸（０．２９ｋｇ；１．６２ｍｏｌ）を投入し、混合物を再度注意深く窒素で不活性化した。分析により十分な変換が示された後、反応混合物を７５℃に加熱し、２時間撹拌した。温度を４５℃に調整した。撹拌を停止し、下側の水性相を分離除去した。有機層を水で３回洗浄した（３×４Ｌ）。反応温度を２２度に調整し、Ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃｓ  ＳＰＭ３２スカベンジャー（０．１９５ｋｇ）を投入し、混合物を終夜撹拌した。スカベンジャーを濾去し、１−ブタノール（１Ｌ）で洗浄した。減圧下で蒸留して、３Ｌまで、反応を濃縮した。酢酸ブチル（７．７Ｌ）を投入し、減圧下で蒸留して、３Ｌまで、混合物を再度濃縮した。酢酸ブチル（４．８Ｌ）を投入し、混合物を６０℃に加熱した。混合物を、減圧下で蒸留して、およそ４Ｌまで濃縮した後、１時間撹拌した。温度を６０℃に設定し、２０分かけて、ヘプタン（３．８Ｌ）を添加した。混合物を３時間かけて２０℃まで冷却し、次いで、終夜撹拌しながらそのままにした。固体を濾去し、酢酸ブチル：ヘプタンの１：１の混合物で２回洗浄した（２×２Ｌ）。生成物を、５０℃で、真空下で乾燥させて、（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン（０．５６２ｋｇ；１．３６ｍｏｌ；１Ｈ  ＮＭＲによるアッセイ１００％ｗ／ｗ）を得た。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.97 (d, 1 H), 1.12-1.30 (m, 2 H), 1.37-1.51 (m, 3 H), 1.83 (d, 2 H), 2.09 (s, 3 H), 2.17 (s, 2 H), 2.89-3.12 (m, 3 H), 3.20 (s, 3 H), 6.54 (s, 2 H), 6.83 (s, 1 H), 7.40 (d, 1 H), 7.54 (d, 1 H), 7.90(s,1H). 8.51(d,1H), 8.67(d,1H)
【０３１５】
実施例１２：（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩の調製
【化３２】
2019511500.tif 000065
（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミン  １．１０５ｋｇを、６０℃で、２−プロパノール  ８．１０Ｌおよび水４７５ｍＬに溶解した。次いで、１．０ｍｏｌ等量（６２２グラム）の（１Ｓ）−（＋）−１０  カンファースルホン酸を、６０℃で投入した。すべての（１Ｓ）−（＋）−１０  カンファースルホン酸が溶解するまで、スラリーを撹拌した。２−プロパノールの第２の部分を６０℃で添加し（６．０Ｌ）、次いで、蒸留物４．３Ｌを採取するまで内容物を蒸留した。次いで、ヘプタン９．１Ｌを６５℃で投入した。１時間遅れて、バッチは不透明になった。次いで、追加の蒸留を約７５℃で実施し、８．２Ｌの蒸留物を採取した。次いで、バッチを２時間かけて２０℃に冷却し、その温度で終夜保持した。次いで、バッチを濾過し、２−プロパノール  １．８Ｌとヘプタン２．７Ｌの混合物で洗浄した。最後に、減圧下、５０℃で、物質を乾燥させた。収量は１．４４ｋｇ（８３．６％ｗ／ｗ）であった。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.12 (1H, s), 9,70 (2H, d, J 40.2), 8.81 (1H, d, J 2.1), 8.55 (1H, d, J 1.7), 8.05 (1H, dd, J 2.1, 1.7), 7.77 (1H, dd, J 7.8, 1.2), 7.50 (2H, m), 3.22 (3H, s), 3.19 (1H, d, J 16.1), 3.10 (1H, d, J 16.1), 3.02 (1H, m), 2.90 (1H, d, J 14.7), 2.60 (1H, m), 2.41 (1H, d, J 14.7), 2.40 (3H, s), 2.22 (1H, m), 2.10 (3H, s), 1.91 (3H, m), 1.81 (1H, m), 1.77 (1H, d, J 18.1), 1.50 (2H, m), 1.25 (6H, m), 0.98 (3H, s), 0.69 (3H, s).
【０３１６】
実施例１３：（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンの活性の試験
（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンの活性レベルを以下の方法を使用して試験した：
【０３１７】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴで使用したβ−セクレターゼ酵素は以下のように調製した：
ヒトβ−セクレターゼ（ＡＡ１−ＡＡ４６０）の可溶性部分に関するｃＤＮＡを、ＡＳＰ２−Ｆｃ１０−１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ｎｅｏＫ哺乳動物発現ベクターを使用してクローニングした。遺伝子をＩｇＧ１のＦｃドメイン（親和性タグ）に融合して、ＨＥＫ２９３細胞に安定にクローニングした。精製したｓＢＡＣＥ−Ｆｃは、Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．２）中で、−８０℃にて保存し、４０％の純度を有した。
【０３１８】
酵素（トランケート形態）は、反応緩衝液（ＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｃｈａｐｓ、ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、ＥＤＴＡ  ｐＨ４．５）中で６μｇ／ｍＬに希釈し（１．３ｍｇ／ｍＬでストック）、基質（ユーロピウム）ＣＥＶＮＬＤＡＥＦＫ（Ｑｓｙ７）は、２００ｎＭに希釈した（１２０μＭでストック）。ロボットシステムＢｉｏｍｅｋ  ＦＸおよびＶｅｌｏｃｉｔｙ  １１を、すべての液体の取り扱いに使用し、酵素および基質溶液をロボットシステムに配置するまで氷上で維持した。酵素（９μｌ）をプレートに添加し、次いで、ジメチルスルホキシド中の化合物１μｌを添加し、混合して、１０分間プレインキュベートした。次いで、基質（１０μｌ）を添加し、混合して、反応を、室温で、１５分間進行させた。ストップ溶液（７μｌ、ＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｐＨ９）の添加により反応を停止させた。生成物の蛍光度を、３４０ｎｍの励起波長と６１５ｎｍの発光波長を有するＶｉｃｔｏｒ  ＩＩプレートリーダーで測定した。Ｃｏｓｔａｒの３８４ウェル丸底、低容量、非結合表面プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  番号３６７６）で、アッセイを実施した。酵素の最終濃度は２．７μｇ／ｍｌであり；基質の最終濃度は１００ｎＭ（約２５０ｎＭのＫｍ）であった。試験化合物の代わりに、ジメチルスルホキシド対照を１００％活性レベルと定義し、０％の活性は、酵素を欠く（反応緩衝液で置き換えた）ウェルで定義した。対照阻害剤は、用量応答アッセイでも使用し、約１５０ｎＭのＩＣ５０を有した。
【０３１９】
希釈ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
化合物を、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイに関して上記した条件での、ただし酵素を５０倍薄め、室温で、暗所にて、６．５時間長い反応時間での希釈ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイでさらに試験した。
【０３２０】
ｓＡＰＰβ放出アッセイ
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＣＳおよび１％の非必須アミノ酸を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２で培養し、１バイアル当たり７．５〜９．５×１０６個の細胞濃度で、−１４０℃にて凍結保存した。細胞を解凍し、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＣＳおよび１％の非必須アミノ酸を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２中、１ウェル当たりほぼ１００００個の細胞の濃度で、３８４ウェル組織培養処理プレートに、１ウェル当たり１００μＬの細胞懸濁液を播種した。次いで、細胞プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて、７〜２４時間インキュベートした。細胞培地を除去し、次に、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＣＳ、１％の非必須アミノ酸および１％のＰｅＳｔを有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２で１％ＤＭＳＯの最終濃度まで希釈した３０μＬの化合物を添加した。化合物を、３７℃、５％ＣＯ２にて、１７時間（終夜）、細胞と共にインキュベートした。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートを使用してｓＡＰＰβ放出を検出した。ＭＳＤ  ｓＡＰＰβプレートは、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（４０μＬ／ウェル）中１％のＢＳＡ中で、室温で１時間振盪してブロックし、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（４０μＬ／ウェル）中で１回洗浄した。培地２０μＬを、予めブロックし、洗浄したＭＳＤ  ｓＡＰＰβマイクロプレートに移し、この細胞プレートをＡＴＰアッセイでさらに使用して細胞毒性を測定した。ＭＳＤプレートは、室温で、２時間、振盪しながらインキュベートし、培地を捨てた。検出抗体１０μＬを１ウェル毎に添加し（１ｎＭ）、次に、室温で、２時間、振盪しながらインキュベートして、次いで、捨てた。Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ４０μＬをウェル毎に添加し、プレートをＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒで読み取った。
【０３２１】
ＡＴＰアッセイ
ｓＡＰＰβ放出アッセイで示したように、ｓＡＰＰβ検出のために細胞プレートから培地２０μＬを移した後、総細胞ＡＴＰを測定するＣａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅからのＶｉａＬｉｇｈｔ（商標）Ｐｌｕｓ細胞増殖／細胞毒性キットを使用して、プレートを使用して細胞毒性を分析した。製造業者のプロトコルに従ってアッセイを実施した。簡潔には、細胞溶解液試薬１０μＬをウェル毎に添加した。プレートを室温で１０分間インキュベートした。再構築したＶｉａＬｉｇｈｔ（商標）Ｐｌｕｓ  ＡＴＰ試薬２５μＬを添加した２分後に、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０  ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒで発光を測定した。Ｔｏｘ閾値は、対照の７５％未満のシグナルである。
【０３２２】
結果
（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンの異性体に関するＩＣ５０値を以下の表１５にまとめる。
【表３１】
2019511500.tif 000066
【０３２３】
実施例１４：（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩の活性
（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩の活性レベルは、以下の方法を使用して試験することができる：
【０３２４】
ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ
ＴＲ−ＦＲＥＴで使用したβ−セクレターゼ酵素は以下のように調製した：
ヒトβ−セクレターゼ（ＡＡ１−ＡＡ４６０）の可溶性部分に関するｃＤＮＡを、ＡＳＰ２−Ｆｃ１０−１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ｎｅｏＫ哺乳動物発現ベクターを使用してクローニングした。遺伝子をＩｇＧ１のＦｃドメイン（親和性タグ）に融合して、ＨＥＫ２９３細胞に安定にクローニングした。精製したｓＢＡＣＥ−Ｆｃは、１ＭのＴｒｉｓでｐＨ７．４に調整した５０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）中で、−８０℃にて保存し、４０％の純度を有した。
【０３２５】
酵素（トランケート形態）は、反応緩衝液（ＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｃｈａｐｓ、ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、ＥＤＴＡ  ｐＨ４．５）中で６μｇ／ｍＬに希釈し（１．３ｍｇ／ｍＬでストック）、ＴｒｕＰｏｉｎｔ  ＢＡＣＥ１基質は、２００ｎＭに希釈した（１２０μＭでストック）。酵素とジメチルスルホキシド中の化合物（ＤＭＳＯの最終濃度は５％）を混合して、室温で１０分間プレインキュベートした。次いで、基質を添加し、室温で１５分間反応をインキュベートした。ストップ溶液（ＮａＡｃｅｔａｔｅ、ｐＨ９）０．３５ｖｏｌを添加して反応を停止させた。生成物の蛍光度を、３４０〜４８５ｎｍの励起波長と５９０〜６１５ｎｍの発光波長を有するＶｉｃｔｏｒ  ＩＩプレートリーダーで測定した。酵素の最終濃度は２．７μｇ／ｍｌであり；基質の最終濃度は１００ｎＭ（約２５０ｎＭのＫｍ）であった。試験化合物の代わりに、ジメチルスルホキシド対照を１００％活性レベルと定義し、０％の活性は、酵素を欠く（反応緩衝液で置き換えた）ウェルで、または公知の阻害剤である２−アミノ−６−［３−（３−メトキシフェニル）フェニル］−３，６−ジメチル−５Ｈ−ピリミジン−４−オンの飽和用量で定義した。対照阻害剤は、用量応答アッセイでも使用し、約１５０ｎＭのＩＣ５０を有した。
【０３２６】
（１ｒ，１’Ｒ，４Ｒ）−４−メトキシ−５’’−メチル−６’−［５−（プロパ−１−イン−１−イル）ピリジン−３−イル］−３’Ｈ−ジスピロ［シクロヘキサン−１，２’−インデン−１’２’’−イミダゾール］−４’’−アミンのカンシレート塩は、このアッセイで、０．２ｎＭの平均ＩＣ５０を有した。
【０３２７】
ｓＡＰＰβ放出アッセイ
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＣＳおよび１％の非必須アミノ酸を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２で培養し、１バイアル当たり７．５〜９．５×１０６個の細胞濃度で、−１４０℃にて凍結し保存した。細胞を解凍し、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＣＳおよび１％の非必須アミノ酸を有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２中、１ウェル当たりほぼ１００００個の細胞の濃度で、３８４ウェル組織培養処理プレートに、１ウェル当たり１００μＬの細胞懸濁液を播種した。次いで、細胞プレートを、３７℃、５％ＣＯ２にて、７〜２４時間インキュベートした。細胞培地を除去し、次に、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％のＦＣＳ、１％の非必須アミノ酸および１％のＰｅＳｔを有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２で１％ＤＭＳＯの最終濃度まで希釈した３０μＬの化合物を添加した。化合物を、３７℃、５％ＣＯ２にて、１７時間（終夜）、細胞と共にインキュベートした。Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）プレートを使用してｓＡＰＰβ放出を検出した。ＭＳＤ  ｓＡＰＰβプレートは、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（４０μＬ／ウェル）中１％のＢＳＡ中で、室温で１時間振盪してブロックし、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（４０μＬ／ウェル）中で１回洗浄した。培地２０μＬを、予めブロックし、洗浄したＭＳＤ  ｓＡＰＰβマイクロプレートに移し、この細胞プレートをＡＴＰアッセイでさらに使用して細胞毒性を測定した。ＭＳＤプレートは、室温で、２時間、振盪しながらインキュベートし、培地を捨てた。検出抗体１０μＬを１ウェル毎に添加し（１ｎＭ）、次に、室温で、２時間、振盪しながらインキュベートして、次いで、捨てた。Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ４０μＬをウェル毎に添加し、プレートをＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒで読み取った。
【０３２８】
ＡＴＰアッセイ
ｓＡＰＰβ放出アッセイで示したように、ｓＡＰＰβ検出のために細胞プレートから培地２０μＬを移した後、総細胞ＡＴＰを測定するＣａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅからのＶｉａＬｉｇｈｔ（商標）Ｐｌｕｓ細胞増殖／細胞毒性キットを使用して、プレートを使用して細胞毒性を分析した。製造業者のプロトコルに従ってアッセイを実施した。簡潔には、細胞溶解液試薬１０μＬをウェル毎に添加した。プレートを室温で１０分間インキュベートした。再構築したＶｉａＬｉｇｈｔ（商標）Ｐｌｕｓ  ＡＴＰ試薬２５μＬを添加した２分後に、発光を測定した。Ｔｏｘ閾値は、対照の７５％未満のシグナルである。
【０３２９】
実施例１５：アルツハイマー病の動物モデルへの抗体または抗原結合性断片およびＢＡＣＥ阻害剤の投与
代表的な抗体または抗原結合性断片（例えば、Ａｂｅｔ０３８０−ＧＬ）および代表的なＢＡＣＥ阻害剤（例えば、
【化３３】
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のカンシレート塩）を、以下の代表的な動物モデルのうちのいずれか１種に、組み合わせて投与する：Ｇａｍｅｓら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ、３７３（６５１４）：５２３〜７頁に記載されているＰＤＡＰＰマウス；Ｅｋｅｔｊａｌｌら、２０１６年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、５０（４）：１１０９〜１１２３頁に記載されているＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＤｕｎｋｉｎ−Ｈａｒｔｌｅｙモルモット；上記実施例２に記載されているスプラーグドーリーラットまたはＴｇ２５７６マウス。対照動物モデルには、抗体もしくは抗原結合性断片単独、ＢＡＣＥ阻害剤単独の、またはビヒクル対照の対応する投薬量を投与する。抗体または抗原結合性断片は、実施例２に記載されているものと一致する方式で静脈内に投与される。ＢＡＣＥ阻害剤は、Ｅｋｅｔｊａｌｌらに記載されているものと同様の方式で経口投与される。マウスは、併用療法がマウスに対して毒性であるといういずれかの兆候についてモニタリングされ（例えば、衰弱、不活発、体重減少、死亡の兆候についてモニタリングされる）、したがって、各薬物の用量は、いずれの細胞毒性作用も最小限としながら最大の治療効果を達成するために調整される。脳、血漿およびＣＳＦ試料の生体分析（例えば、これらの試料のＡβレベルの生体分析）は、上記実施例２およびＥｋｅｔｊａｌｌらに記載されているものと同様の方式で、動物からモニタリングされる。異なる処置条件の効果も、当技術分野で公知の行動および／または認知アッセイを使用して、マウスで評価される。対照動物モデルにおけるよりも併用療法を投与した動物モデルで大きい、Ａβｎ−４２レベルのような試験したパラメータの改善（例えば、Ａβ１−４２レベルの大きな低減）は、そのパラメータを対象とする際に、ＢＡＣＥ阻害剤または抗体もしくは抗原結合性断片のいずれかを単独で用いる処置より、併用療法がより効果的であることを示唆する。当業者は、併用療法の効果を試験する他のモデル、および他のパラメータも認識している。例えば、Ｂｏｇｓｔｅｄｔら、２０１５年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、４６：１０９１〜１１０１頁を参照のこと。
【０３３０】
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他の参考文献は本文に含まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
2019511500.tif 000084
【図５】
2019511500.tif 000085
【図６】
2019511500.tif 000086
【図７】
2019511500.tif 000087
【図８】
2019511500.tif 000088
【図９】
2019511500.tif 000089
【配列表】
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【国際調査報告】
2019511500.tif 000090
2019511500.tif 000091