(57)【要約】【解決手段】本発明は、ミトコンドリア機能を標的化し操作するのに有用な量子ドットナノ粒子と、そのような量子ドットナノ粒子を用いてミトコンドリア機能を標的化し操作する方法とに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コア半導体材料と、
外層と、
含む量子ドットを含んでおり、
外層は、ミトコンドリアの代謝活性を調節することを可能にする官能化リガンドに結合した官能化有機コーティングを含んでいる、ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２】
ミトコンドリアにおけるナノ粒子コンジュゲートの蓄積を増強するように表面修飾されている、請求項１に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項３】
ナノ粒子コンジュゲートがミトコンドリア指向性（mitochondriotopic）リガンドで被覆されている、請求項１に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項４】
ミトコンドリア指向性リガンドが、トリフェニルホスホニウム又はその誘導体である、請求項１に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項５】
ナノ粒子が、ＩＩ−ＶＩ族材料、ＩＩＩ−Ｖ族材料、Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料、又はそれらの任意の合金を含む、請求項４に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項６】
官能化リガンドがヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤である、請求項５に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項７】
ヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤が２−デオキシグルコース（２ＤＧ）である、請求項６に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項８】
細胞取込促進剤、組織浸透促進剤、又はそれらの組合せを更に含む、請求項７に記載のナノ粒子コンジュゲート。
【請求項９】
リガンドナノ粒子コンジュゲートを調製するための方法であって、
ミトコンドリアの代謝活性を調節することを可能にする官能化リガンドとナノ粒子とを結合させる工程を含んでおり、
ナノ粒子は、量子ドット、コア半導体材料、及び外層を含んでおり、外層はカルボキシル基を含んでいる、方法。
【請求項１０】
リガンドナノ粒子コンジュゲートを精製する工程を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
リガンドナノ粒子コンジュゲートを単離する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結合させる工程がカップリング剤の存在下で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
カップリング剤が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）請求項１に記載のリガンドナノ粒子コンジュゲートをミトコンドリアと接触させる工程と、
ｉｉ）光源を用いて量子ドットナノ粒子を励起する工程と、
を含むミトコンドリア機能を操作する方法。
【請求項１５】
ボルタ電流がシトクロムｃオキシダーゼの放出を刺激する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
発生した光子がシトクロムｃオキシダーゼの活性を光調節する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
シトクロムｃオキシダーゼの活性を調節する方法であって、
ｉ）請求項１に記載のリガンドナノ粒子コンジュゲートをミトコンドリアと接触させる工程と、
ｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起する工程と、
ｉｉｉ）量子ドットナノ粒子から光放射を発生させる工程と、
を含む方法。
【請求項１８】
ボルタ電流がチトクロムＣオキシダーゼの放出を刺激する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
シトクロムｃオキシダーゼの放出が細胞死を開始させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリア膜を脱分極する方法であって、
ｉ）請求項１に記載のリガンドナノ粒子コンジュゲートをミトコンドリアと接触させる工程と、
ｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起する工程と、
ｉｉｉ）量子ドットナノ粒子から光放射を発生させる工程と、
を含む方法。
【請求項２１】
アポトーシスを誘導する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ミトコンドリア膜が光起電力効果によって脱分極される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
糖分解を阻害する方法であって、
ｉ）請求項１に記載のリガンドナノ粒子コンジュゲートをミトコンドリアと接触させる工程と、
ｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起する工程と、
ｉｉｉ）量子ドットナノ粒子から光放射を発生させる工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示される実施形態は、ミトコンドリア機能を標的化して（targeting）、操作するのに有用な量子ドットナノ粒子と、そのような量子ドットナノ粒子を用いてミトコンドリア機能を標的化及び操作する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、多くの機能を有する細胞小器官であって、その機能には、エネルギー産生、発熱、ホルモン合成、代謝及びカルシウムの調節、標準酵素シトクロムｃオキシダーゼ（canonical enzyme cytochrome c oxidase）（ＣＯＸ）の放出、アポトーシス、活性酸素種（ＲＯＳ）ホメオスタシスの生成、並びに加齢がある。近年、ミトコンドリアの標的化は、敗血症、終末期の急性臓器不全、癌、アルツハイマー病、及び糖尿病を含む様々な疾患管理プロトコルについて検討されている。例えば、Karu et al., Life, 62(8), 607-610, 2010; Singer et al., Virulence, 5(1), 66-72, 2014; Wu et al., Antioxidants & Redox Signaling, 20(5), 733-745, 2014; Pathania et al., Adv. Drug Delivery Rev., 61, 1250-1275, 2009; and D’Souza et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1807, 689-696, 2011 を参照のこと。
【０００３】
最近の研究は、ナノ粒子が、細胞内小器官（subcellular organelles）、主にリソソームに特異的に蓄積する傾向があることを示唆している。例えば、Frohlich, International Journal of Nanomedicine, October 31, 2012, 5577-5591 を参照のこと。また、ミトコンドリアは、ナノ粒子を蓄積することが分かっている。例えば、D’Souza et al., Biochimica et Biophysica Acta 1807 (2011) 689−696 を参照のこと。
【０００４】
また、研究によって、酵素シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）が可視及び近赤外（ＮＩＲ）の領域における光アクセプタ（photo-acceptor）及び光信号トランスデューサとみなされることが分かっている。光放射は、一連の反応を導くＣＯＸ活性の増加を引き起こし、細胞のホメオスタシスを変化させ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、活性酸素種（ＲＯＳ）、一酸化窒素（ＮＯ）、及び細胞内カルシウム（ｉＣａ２＋）の生成が増加する。例えば、Karu et al., Multiple roles of cytochrome c oxidase in mammalian cells under action of red and IR-A radiation, Life, 62(8), 607-610, 2010 及び Tafur et al., Photomedicine and Laser Surgery, Volume 26, Number 4, 2008 323-28 を参照のこと。
【０００５】
量子ドット（ＱＤ）又はナノ結晶と呼ばれることが多い、例えば２乃至５０ｎｍの範囲の大きさを有する粒子の調製及び特徴付けに大きな関心が持たれてきた。これらの研究は、主として、これらの材料のサイズ調整可能な電子特性に起因して生じており、当該電子特性は、例えば、光学及び電子デバイス、太陽電池、触媒作用、発光ダイオード、一般的な空間照明において利用され得る。ＱＤは、量子閉じ込め効果から生じる、それらに独特の光学的、電子的及び化学的性質について、広く研究されてきた。半導体ナノ粒子の寸法がボーア半径の２倍より小さくなると、エネルギー準位が量子化されて、離散的なエネルギー準位が生じる。バンドギャップは、粒子サイズの減少と共に増加し、サイズ依存性フォトルミネッセンスなどのサイズ調整可能な光学的、電子的及び化学的特性がもたらされる。
【０００６】
明るくて吸収性の高い蛍光物質のような量子ドットの出現は、ミトコンドリア機能を標的化して操作する機会をもたらす。
【０００７】
ミトコンドリア機能を標的化して、これを操作するための新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
開示される実施形態は、ミトコンドリア機能を標的化するために使用できる量子ドットナノ粒子を含んでいる。そのような量子ドットナノ粒子の光学的及び／又は光起電特性を操作することによって、幾つかのミトコンドリア機能（例えば、ＣＯＸ活性又は膜電位など）が、検出及び標識化目的のために及び／又は治療目的のために調節される。
【０００９】
ある態様では、本発明は、ミトコンドリア機能を標的化するのに有用な量子ドットナノ粒子に関する。
【００１０】
ある実施形態では、本明細書に記載の量子ドットナノ粒子は、機能性リガンドにコンジュゲートして、ミトコンドリアの代謝活性を調節する（例えば、遅らせる又は止める）ことを可能にする。ある実施形態では、量子ドットナノ粒子は、コア半導体材料と外層とを含んでおり、外層は、ミトコンドリアの代謝活性を調節する（例えば、遅らせる又は止める）ことができるように機能性リガンドに結合した官能化有機コーティングを含む。
【００１１】
ある実施形態では、量子ドットナノ粒子は、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）などのヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤にコンジュゲートされている。酵素ＨＫは糖分解に関与しており、ミトコンドリア膜と結び付いている。糖分解は、癌細胞のエネルギーの主な供給源である。従って、量子ドットナノ粒子は、別々に又は組み合わせて、次の３つの機能を有することができる：ｉ）２−デオキシグルコース（２ＤＧ）などのヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤のような解糖阻害剤の送達；ｉｉ）ＣＯＸの活性化；及びｉｉｉ）標識化。
【００１２】
ある実施形態では、ナノ粒子は、量子ドットナノ粒子の無機表面上に、又は、ナノ粒子を水溶性及び生体適合性にするために使用される有機コロナ層上にあるアミド、エステル、チオエステル、又はチオール固定基（anchoring group）を介して、官能化リガンドと結合している（例えば、共有結合又は物理結合（電荷又はファンデルワールス））。幾つかの実施形態における水溶性ＱＤナノ粒子は、１つの半導体材料のコアと、異なる半導体分子の少なくとも１つのシェルとを含んでおり、他の実施形態では、水溶性ＱＤナノ粒子は、組成傾斜合金化（compositionally graded alloying）によって外向きに増加するバンドギャップ値を有する合金化半導体材料を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、光応答性（light responsive）量子ドット（ＱＤ）は、リガンド相互作用剤（ligand interactive agent）及び表面修飾リガンド（surface modifying ligand）を有する水溶性ＱＤナノ粒子を含む。水溶性ＱＤナノ粒子は、ヘキサメトキシメチルメラミンを含む溶液中のＱＤにリガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドを化学的添加することによって形成できる。幾つかの実施形態では、リガンド相互作用剤は、Ｃ８−２０脂肪酸及びそのエステルであり、表面修飾リガンドはモノメトキシポリエチレンオキシドである。
【００１４】
特定の実施形態では、水溶性ナノ粒子は、メチル化特異的結合リガンドに結合することができるキャッピングリガンドを含む。特定の実施形態では、キャッピングリガンドは、チオール基、カルボキシル基、アミン基、ホスフィン基、ホスフィンオキシド基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、イミダゾール基、ＯＨ基、チオエーテル基、及びカリックスアレーン基からなる群から選択される。
【００１５】
別の実施形態では、ナノ粒子は、イオン対化又はファンデルワールス相互作用によって機能性リガンドに結合している。ある実施形態では、ナノ粒子は、アミド結合を介して官能化リガンドに共有結合している。
【００１６】
ある実施形態では、量子ドットナノ粒子コンジュゲートは、コア半導体材料を含む量子ドットと、外層とを含んでおり、外層は、粒子を水溶性及び生体適合性にする有機コーティング（官能化有機コーティング）のコロナ（corona）と、ミトコンドリアの代謝活性を調節可能にする官能化リガンドとを含む。
【００１７】
ある実施形態では、本明細書に記載の量子ドットナノ粒子は、ミトコンドリア周辺又は内での量子ドットの蓄積を増強するために表面改質されている（例えば、物理的又は化学的にコーティング及び／又は荷電修飾されている）。適切なコーティングとしては、例えば、ミトコンドリアリガンドがあり、例えば、ミトコンドリアリガンドとしては、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売する抗ミトコンドリア抗体（カタログ番号：９０９−３０１−Ｄ７９）、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  ＨＳＰ６０（Ｔ５４７）（カタログ番号：ＢＳ１１７９−５０μｌ（５０μｌ）及びＢＳ１１７９−１００μｌ（１００μｌ））、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  ＳＯＤ１（カタログ番号：ＭＡＢ１０３９４）、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  Ｇｒｐ７５ ｃｌｏｎｅ Ｓ１９−２（カタログ番号：ＭＡＢ６６２９）、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  （Ｈ１９）（カタログ番号：ＢＳ１０８９−５０μｌ（５０μｌ）及びＢＳ１０８９−１００μｌ（ｌ００μｌ））、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）、それらの誘導体がある。これらのミトコンドリア特異的リガンドは、以下で説明されるコンジュゲーション化学を用いて量子ドットナノ粒子に結合すると、ミトコンドリアの付近又は内部における量子ドットナノ粒子のより特異的な蓄積を確実にする。
【００１８】
本明細書に記載の量子ドットナノ粒子のある実施形態では、ナノ粒子は、ＩＩ−ＶＩ族材料、ＩＩＩ−Ｖ族材料、Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料、又はそれらの任意の合金を含む。
【００１９】
更なる実施形態では、本明細書に記載の量子ドットナノ粒子は、細胞取込促進剤（cellular uptake enhancer）（細胞浸透性ペプチド（ＴＡＴ、ＲＧＤ、又はポリアルギニンのようなＣＰＰ））、組織浸透促進剤（例えば、サポニン、カチオン性脂質、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ））、又は、それらの組合せを更に含んでいる。細胞取込促進剤の例としては、例えば、トランス活性転写活性化因子（trans-activating transcriptional activators）（ＴＡＴ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド、又はポリアルギニンペプチドが挙げられる。リガンド−ナノ粒子コンジュゲートは、サポニン、カチオン性リポソーム又はストレプトリシンＯのような、細胞取込みを増強することができる既知の薬剤を更に含んでいてもよい。
【００２０】
別の態様は、本明細書に記載の実施形態に基づく量子ドットナノ粒子の調製方法である。ある実施形態では、その方法は、ｉ）ナノ粒子を官能化リガンドと結合させて官能化ナノ粒子コンジュゲートを得る工程を含んでおり、当該ナノ粒子は、コア半導体材料及び外層で構成される量子ドットを含んでおり、外層は、カルボキシル基を含んでいる。
【００２１】
ある実施形態では、結合工程は、カップリング剤の存在下で行われる。ある実施形態では、結合工程ｉ）は、（ａ）外層のカルボキシル基をカルボジイミドリンカー（linker）と反応させてカルボキシル基を活性化する工程と、（ｂ）活性化カルボキシル基を官能化リガンドと（例えば、リガンド上のアミン末端と）反応させる工程とを含んでいる。カップリング剤は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩であるのが好ましい。
【００２２】
更なる実施形態では、本発明の方法は、ｉｉ）量子ドットナノ粒子を精製する工程を更に含んでいる。更なる実施形態では、本発明の方法は、ｉｉｉ）特異的結合ナノ粒子コンジュゲートを単離する工程を含む。ある実施形態では、本発明の方法は、工程ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）を含む。
【００２３】
別の態様では、本発明は、ミトコンドリア機能を操作する方法をもたらす。ある実施形態では、本発明の方法は、ｉ）本明細書に記載の実施形態に基づく量子ドットナノ粒子をミトコンドリアと結び付ける工程と、任意選択的にｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起し、それによって光子及び／又はボルタ電流（voltaic current）（ボルタエネルギー）を生成する工程とを含む。ある実施形態において、光子及び／又はボルタ電流は、ミトコンドリア機能の反応性（例えば、ＣＯＸ活性又は膜電位など）を調節する。
【００２４】
ある実施形態では、発生したボルタ電流（例えば、微小電圧）は、チトクロムＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）の放出を刺激して、アポトーシスを誘導する。他の実施形態では、生成された光子は、例えば５８０乃至８６０ｎｍの光でＣＯＸの活性を光変調する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＣＯＸの、又は、そのサブユニット若しくは誘導体の活性を調節する（例えば、ＣＯＸ放出を刺激する）方法をもたらす。ある実施形態では、この方法は、ｉ）本明細書に記載の実施形態に基づく量子ドットナノ粒子をミトコンドリアと接触させる工程と、任意選択的にｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起する工程と、任意選択的にｉｉｉ）量子ドットナノ粒子から光放射を発生させる工程と、を含んでいる。ある実施形態では、ＣＯＸは、光起電力エネルギーを吸収することによって活性化される。別の実施形態では、ＣＯＸは、光エネルギーを吸収することによって活性化される。ある実施形態では、生成されたボルタ電流がＣＯＸの放出を刺激し、任意選択的にこれが細胞死を開始させる。
【００２６】
別の態様において、本発明は、ミトコンドリア膜を脱分極する（例えば、それによって、アポトーシスなどのシグナル伝達カスケードを誘導し、細胞死をもたらす）方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、ｉ）本明細書に記載の実施形態に基づく量子ドットナノ粒子をミトコンドリアと接触させる工程と、ｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起する工程と、任意選択的にｉｉｉ）量子ドットナノ粒子から光放射を発生させる工程とを含む。ある実施形態では、ミトコンドリア膜は、光起電力効果によって脱分極する。一実施形態において、これはアポトーシスを誘導する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、糖分解を阻害する方法をもたらす。ある実施形態では、本発明の方法は、ｉ）ヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤に結合した本明細書に記載の実施形態に基づく量子ドットナノ粒子を、ミトコンドリアと接触させる工程と、ｉｉ）量子ドットナノ粒子を光源で励起する工程と、任意選択的にｉｉｉ）量子ドットナノ粒子から光放射を発生させる工程とを含む。ある実施形態では、ＨＫ阻害剤は、２−デオキシグルコース（２ＤＧ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、５時間、２４時間及び４８時間後における、マウス胚性幹細胞での量子ドットナノ粒子の細胞質取込みを示す。核領域は、ＤＮＡ中のＡ−Ｔリッチ領域に強く結合する蛍光色素である４−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて、青／緑で対比染色されている。量子ドットで染色された細胞質の領域はＣで示されており、ＤＡＰＩで染色された核領域はＮで示されている。（注：複数の細胞を含む４８時間の図は、余す所なく標識化されてはいない。）
【００２９】
【図２】図２は、ミトコンドリアにおける量子ドットナノ粒子の相互作用について提唱されたメカニズムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
ミトコンドリアに結び付けることができ、特定のミトコンドリア経路を活性化するために光を放出できる量子ドット（ＱＤ）が、本明細書に開示される。ミトコンドリア機能を検出及び操作するのに十分なほどにミトコンドリアに接近する能力を有するミトコンドリア特異的結合リガンドとコンジュゲートするＱＤが、本明細書に開示される。
【００３１】
省略形：以下の省略形は、本願を通じて使用される。
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＨＭＭＭ：ヘキサメトキシメチルメラミン
Ｉｎ（ＭＡ）３：ミリスチン酸インジウム
ＱＤ：量子ドット
ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体
ＳＭＣＣ：スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＴＭＳ）３Ｐ：トリス（トリメチルシリル）ホスフィン
【００３２】
本発明の理解を容易にするために、そして、本明細書の特許請求の範囲の解釈における疑義を回避するために、幾つかの用語を以下に定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者が一般的に理解している意味を有する。本発明の特定の実施形態を説明するために使用される用語は、特許請求の範囲に述べられている場合を除いて、本発明を限定するものではない。
【００３３】
「ある」、「その」などの用語は、明示的に定義されていない限り、特異的な実体を示すことを意図したものではなく、一般的な種類を含んでおり、その種類の一般的な特定の例が、説明のために使用され得る。 特許請求の範囲及び／又は明細書中の「含む」と共に使用される場合における用語「ある」の使用は、１つを意味することもあるが、１つ以上、少なくとも１つ、及び／又は２つ以上と矛盾し得ない。
【００３４】
特許請求の範囲における用語「又は」使用は、相互に排他的であるとして選択肢を示すことを明示的に示されていない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。故に、特に明記されていない限り、一群の選択肢における用語「又は」は、その群のメンバーの任意の１つ又は任意の組合せを意味する。更に、相互に排他的であるとして選択肢を指すことが明示的に示されていない限り、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」なる言い回しは、要素Ａ単独、要素Ｂ単独、要素Ｃ単独、又はＡ、Ｂ及びＣの任意の組合せをまとめて含んだ実施形態を意味する。
【００３５】
同様に、疑義を避けるために、そして、別に相互排他的に選択肢に言及することを明示的に示さない限り、項目のリストと組み合わされた「少なくとも１つ」なる言い回しは、リストからの単一の項目、又はリスト内の項目の任意の組合せを意味する。例えば、そして別に定義されない限り、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」なる言い回しは、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＡ、Ｂ及びＣの任意の組合せからなる群からの少なくとも１つを意味する。従って、他に定義されない限り、この言い回しは、列挙された項目のうちの１又は複数を必要としているが、必ずしも全てではない。
【００３６】
「備えている」（及びその任意の形態、例えば「備える」）、「有している」（及びその任意の形態、例えば「有する」）、「含んでいる」（及びその任意の形態、例えば「含む」）、「含有している」（及びその任意の形態、例えば「含有する」）は、包括的又はオープンエンドであって、列挙されていない更なる要素又は工程を除外しない。
【００３７】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「有効な」という用語は、所望の、予想される、又は意図された結果をもたらす又は達成するのに適切なことを意味する。
【００３８】
「約」又は「ほぼ」なる用語は、当業者によって理解されるように「近い」と定義され、ある１つの非限定的な実施形態においては、この用語は、１０％以内、５％以内、１％以内、幾つかの態様では、０．５％以内と規定される。
【００３９】
幾つかの実施形態では、ミトコンドリア特異的結合リガンドは、ミトコンドリア特異的結合部位を認識する抗体である。本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子と、その部分、フラグメント、及び誘導体とを含んでおり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｓｃ、ＣＤＲ、又は、キメラ抗体を含む抗原又はエピトープに結合できる抗体の任意の部分が含まれ、キメラ抗体は、二重特異性であるか、又は、抗体に由来する抗原結合ドメインと、別のタイプのポリペプチドとを組み合わせる。用語「抗体」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、キメラ抗体と、ヒト化抗体と、公知技術によって提供されるそれらのフラグメント、部分、領域又は誘導体とを含んでおり、当該公知技術には、酵素的開裂及び組換え技術が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、用語「抗体」は、重鎖抗体の単一のモノマー可変抗体ドメイン（monomeric variable antibody domain）（ＶＨ）を有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びそのフラグメントも含んでいる。ｓｄＡｂは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを欠いており、ラクダ科動物（ＶＨＨ）及び軟骨魚類（ＶＮＡＲ）に天然に見られ、ラマでｓｄＡｂに結合する特異的抗原を開発した製薬会社Ａｂｌｙｎｘによって、時にナノボディ（Nanobody）と称される。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、特定の方法による抗体の生成を要するものと解釈されるべきではない。
【００４０】
他の実施形態では、ミトコンドリア特異的結合リガンドは、メチル化ＤＮＡ塩基を認識するアプタマーである。アプタマーは、構造的に異なるＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）であって、タンパク質結合分子を模倣することができ、ペアワイズな核酸結合によるのではなく、それらの独特の二次の三次元構造立体配座に基づいて、高い（ｎＭ）結合親和性を示すことができる。アプタマーは、ターゲット分子を結合するハイスループットインビトロ法によって選択することができる。アプタマーは通常、抗体の分子量の約１／１０であるが、それにも拘わらず、抗体に匹敵する十分な認識表面積を有する複雑な三次の折り畳み構造をもたらす。
【００４１】
ＱＤは、独特の光学特性を有する蛍光半導体ナノ粒子である。ＱＤは、サイズが非常に小さい特定の形態の半導体材料を意味しており、粒子のサイズ及び形状が光励起に対して量子力学的効果をもたらす。一般的に、半径が５乃至６ｎｍであるような大きいＱＤは、発光色がオレンジ色又は赤色であるより長い波長を放射し、半径が２乃至３ｎｍであるような小さいＱＤは、青色及び緑色で短い波長を放射するが、具体的な色及びサイズはＱＤの構成によって異なる。量子ドットは、従来の蛍光色素（インドシアニングリーン（ＩＣＧ）など）よりも約２０倍明るく輝き、光安定性が何倍も高い。重要なことであるが、ＱＤの滞留時間は、それらの化学的性質及びナノサイズに起因して長い。ＱＤは、遙かに強い光強度を吸収及び放出できる。幾つかの実施形態では、ＱＤは、２つ以上の結合タグを備えてよく、二重又は三重特異性ナノデバイスを形成する。ＱＤの独自の特性により、満たされていないニーズに応える幾つかの医療用途が可能になる。
【００４２】
本明細書に示される実施形態では、ＱＤは、親水性外層又はコロナを示すように機能化されており、例えば、生細胞におけるインビボ及びインビトロの用途のような水性環境でのＱＤの使用を可能にしている。このようなＱＤは、水溶性ＱＤと呼ばれる。
【００４３】
ある実施形態では、ＱＤは、コンジュゲーション可能な官能基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を表面に備えていてよい。例示的なある実施形態では、水溶性非毒性ＱＤは、カルボキシル官能化されているか又はカルボキシル官能化される。例えば、ＣＯＯＨ−ＱＤは、水溶性１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いるカルボジイミド連結技術を用いてターゲティング抗体のアミン末端に連結することができる。カルボキシル官能化ＱＤは、ＥＤＣと混合して、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成し、当該中間体は、その後、反応混合物中のモノクローナル抗体上の第一級アミノ基からの求核攻撃によって置換される。所望であれば、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（ｓｕｌｆｏ−ＨＳ）が、第一級アミン含有抗体との反応中に加えられる。ｓｕｌｆｏ−ＨＳの添加により、ＥＤＣは、ＮＨＳをカルボキシルに結合し、ＮＨＳエステルを形成する。当該ＮＨＳエステルは、Ｏ−アシルイソ尿素中間体よりも安定である一方で、生理学的ｐＨで第一級アミンへの効率的なコンジュゲーションを可能にする。何れの場合でも、結果は、ＱＤと抗体との間の共有結合である。鈴木−宮浦クロスカップリング、（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）のような他の化学反応、又はアルデヒドベースの反応が代わりに使用されてよい。
【００４４】
コア及びコア−シェルナノ粒子を合成する方法は、例えば、所有者を同じくする米国特許第７，８６７，５５６号、第７，８６７，５５７号、第７，８０３，４２３号、第７，５８８，８２８号、及び第６，３７９，６３５号に開示されている。前述の特許の各々の内容は、その全体が参照により本明細書の一部となる。米国特許第９，１１５，０９７号、第８，０６２，７０３号、第７，９８５，４４６号、第７，８０３，４２３号、及び第７，５８８，８２８号、並びに米国特許公開第２０１０／０２８３００５号、第２０１４／０２６４１９６号、第２０１４／０２７７２９７号、及び第２０１４／０３７０６９０号は、それらの各々の全体が本明細書の一部となる。これら引用文献には、大量の高品質単分散量子ドットを製造する方法が記載されている。
【００４５】
ある実施形態では、コア／シェル粒子が利用され、コア／シェル粒子は、少なくとも１つの半導体組成の中心領域又はコアを有しており、コアは、半導体組成が明確に異なる１又は複数の外層又はシェル内に埋め込まれて、又は覆われている。一例として、コアは、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳの合金で構成されてよく、例えば、ＺｎＳ分子クラスタ上へのＩｎ系ナノ粒子の分子シーディングとそれに続くＺｎＳのシェルの形成とを含む実施例１の説明に基づいて形成される。
【００４６】
更に別の実施形態では、使用される水溶性ＱＤナノ粒子は、コア／シェルＱＤを作製する代わりに、合金化半導体材料を含んでおり、当該合金化半導体材料は、傾斜合金化によって外向きに増加するバンドギャップ値又はエネルギー（Ｅｇ）を有する。バンドギャップエネルギー（Ｅｇ）は、基底状態の価電子エネルギーバンドから空いている伝導エネルギーバンドに電子を励起するのに要する最小エネルギーである。
【００４７】
傾斜合金ＱＤ組成は、別個のシェル層によって覆われた別個のコアとして形成されるのではなく、粒子の中心又はその近傍からＱＤの最外面まで元素組成が傾斜しているものと考えられる。１つの例は、ｘ及びｙがＱＤの中心から表面に向かって０から１まで次第に増加するＩｎ１-ｘＰ１-ｙＺｎｘＳｙ傾斜合金ＱＤであろう。そのような例では、ＱＤのバンドギャップは、中心近くの純粋なＩｎＰのバンドギャップから表面における純粋なＺｎＳのより大きいバンドギャップまで次第に変化するであろう。バンドギャップは粒子サイズに依存するが、ＺｎＳのバンドギャップはＩｎＰのバンドギャップよりも広いので、傾斜合金のバンドギャップは、ＱＤの内側から表面に向かって徐々に増加する。
【００４８】
本明細書の実施例１において説明されている分子シーディング法の変形として、ワンポット合成法が使用されてよい。これは、実施例１におけるコア粒子の生成について記載するように、プロセス中に量を増加しつつ亜鉛及び硫黄前駆体を添加しながら、粒子成長を維持するために反応溶液に添加されるミリスチン酸インジウム及び（ＴＭＳ）３Ｐの量を徐々に減少させることによって達成されてよい。故に、ある例では、ジブチルエステル及び飽和脂肪酸が反応フラスコに入れられて、加熱しながら脱気される。窒素が導入されて、昇温される。 例えば、ＺｎＳ分子クラスタ［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）１６］のような分子クラスタが、撹拌しながら加えられる。濃度を徐々に減少させた第１の半導体材料と濃度を徐々に減少させた第２の半導体材料の添加を含む傾斜プロトコルに従って傾斜合金前駆体溶液が加えられるにつれて、昇温される。例えば、ランピング（ramping）プロトコルは、ジカルボン酸エステル（例えば、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルなど）に溶解したミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）及びトリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐの添加で開始でき、添加されるＩｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの量は、経時的に徐々に減少して、徐々に濃度が増加する硫黄及び亜鉛化合物、例えば（ＴＭＳ）２Ｓ及び酢酸亜鉛で置き換えられる。Ｉｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの添加量が減少するにつれて、酢酸亜鉛と共に加えられる飽和脂肪酸（例えば、ミリスチン酸又はオレイン酸）及びジカルボン酸エステル（例えば、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステル）に溶解した（ＴＭＳ）２Ｓの量は徐々に増加する。次に続く反応は、ＺｎＳ化合物の生成を増加させるであろう。 添加が続くにつれて、所望のサイズのＱＤ粒子が形成され、発光極大波長は徐々に増加する。ＩｎＰ及びＺｎＳの濃度は傾斜しており、ＱＤ粒子の中心近くでＩｎＰの濃度が最も高く、ＱＤ粒子の外側で、ＺｎＳの濃度が最も高い。所望の発光極大が得られると、反応への更なる添加が停止され、得られた傾斜合金粒子をアニールした後、沈殿及び洗浄によって粒子の単離が行われる。
【００４９】
媒体に対するナノ粒子の適合性と、凝集、光酸化及び／又はクエンチングについてのナノ粒子の受け易さとは、主にナノ粒子の表面組成によって媒介される。任意のコア、コア−シェル又はコア−マルチシェルナノ粒子の最終的な無機表面原子の周りの配位は不完全なことがあり、表面に反応性が高いダングリングボンドを有し、これは粒子の凝集をもたらし得る。この問題は、本明細書でキャッピングリガンド又はキャッピング剤と呼ばれる保護有機基で、ベアな表面原子を不動態化する（キャッピングする）ことによって克服される。粒子のキャッピング又は不動態化は、粒子の凝集を防ぐだけでなく、周囲の化学的環境から粒子を保護し、コア材料の場合には、粒子に電子的安定化（不動態化）をもたらす。キャッピングリガンドは、粒子の最も外側の無機層の表面金属原子に結合したルイス塩基であってよいが、これに限定されない。キャッピングリガンドの性質は、特定の媒体に対するナノ粒子の適合性を大きく左右する。キャッピングリガンドは、所望の特性に応じて選択されてよい。使用可能なキャッピングリガンドの種類には、チオール基、カルボキシル基、アミン基、ホスフィン基、ホスフィンオキシド基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、イミダゾール基、ＯＨ基、チオエーテル基、及びカリックスアレーン基が挙げられる。カリックスアレーンを除いて、これらのキャッピングリガンドは全て、キャッピングリガンドのための固定中心を粒子の表面に形成できる頭部基を有する。キャッピングリガンドの本体は、直鎖であっても、環状であっても、芳香族であってよい。キャッピングリガンド自体は、大きく、小さく、オリゴマー状又は多座状であってよい。リガンドの本体の性質と、粒子に結合していない突出側部とは一緒になって、リガンドが親水性、疎水性、両親媒性、負性、陽性、又は双性イオン性であるか否かを決定する。
【００５０】
多くの量子ドット材料では、キャッピングリガンドは疎水性である（例えば、アルキルチオール、脂肪酸、アルキルホスフィンやアルキルホスフィンオキシドなど）。故に、ナノ粒子は通常、ナノ粒子の合成及び単離後に、トルエンなどの疎水性溶媒中に分散される。このようにキャッピングされたナノ粒子は通常、極性がより高い媒体には分散しない。ＱＤの表面修飾が望まれる場合に最も広く使用されている手法は、リガンド交換として知られている。親油性リガンド分子は、 コア合成及び／又はシェル形成手順中にナノ粒子の表面に配位し、続いて、極性／荷電リガンド化合物と交換されてよい。別の表面修飾ストラテジーは、極性／荷電分子又はポリマー分子を、ナノ粒子の表面に既に配位しているリガンド分子とインターカレートさせることである。しかしながら、ある種のリガンド交換及びインターカレーション手法は、水性媒体に対してナノ粒子をより相溶性にする一方で、対応する未修飾ナノ粒子よりも量子収率（ＱＹ）が低い、及び／又はサイズが実質的に大きい材料をもたらすことがある。
【００５１】
インビボ及びインビトロ用途においては、必要とされない場合には、低毒性プロフィールを有するＱＤが望ましい。故に、幾つかの用途では、量子ドットナノ粒子は、カドミウム、鉛やヒ素などの有毒な重金属を実質的に含まないこと（例えば、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属が５重量％未満、具体的には、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０１重量％未満）、或いは、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属を含まないことが好ましい。ある実施形態では、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属を含まない低毒性ＱＤがもたらされる。
【００５２】
ＱＤに特有の性質は、未だになされていない生細胞におけるインビトロ及びインビボ診断を含む幾つかの潜在的な医学的用途を可能にする。ＱＤの医療応用に関する大きな懸念の１つは、カドミウム、鉛、ヒ素などの有毒な重金属を含むＱＤに研究の大部分が集中しているということである。本明細書に記載の、生物学的に適合した重金属フリーの水溶性ＱＤは、インビトロ及びインビボの両方で医療用途に安全に使用することができる。幾つかの実施形態では、（完全ＩｇＧ２抗体の寸法サイズの範囲内である）１０乃至２０ｎｍの水力学的サイズを有する、インビボ適合性でカドミウムフリーな水分散性ＱＤがもたらされる。ある実施形態では、インビボ適合性でカドミウムフリーな水分散性ＱＤは、本明細書の実施例１及び実施例２に記載の手順に従って製造される。幾つかの実施形態では、インビボ適合性でカドミウムフリーな水分散性ＱＤは、カルボキシル官能化されており、更にリガンド結合部で誘導体化されている。
【００５３】
カドミウム、鉛及びヒ素を含まないナノ粒子の例には、例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＣｕＩｎＳ２、Ｓｉ、Ｇｅなどの半導体材料、それらの合金及びドープされた誘導体を含むナノ粒子、特に、これらの材料のうちの１つのコアと、これらの材料のうちの別の材料の１又は複数のシェルとを含むナノ粒子が挙げられる。
【００５４】
幾つかの実施形態では、非毒性ＱＤナノ粒子は表面修飾されて、水溶性にされて、且つ、それらをリガンド相互作用剤に曝すことによって誘導体化する表面部分を有しており、リガンド相互作用剤とＱＤの表面との会合をもたらすことを可能にする。リガンド相互作用剤は、以下に記載するように、鎖部分と、連結／架橋剤に対して特異的な親和性又はそれとの反応性を有する官能基とを含んでよい。鎖部分は、例えば、アルカン鎖であってよい。官能基の例には、チオ基、ヒドロキシル基、カルボキサミド基、エステル基やカルボキシル基などの求核基が挙げられる。リガンド相互作用剤はまた、ＱＤの表面に対して親和性を有する部分を含んでも含まなくてもよい。そのような部分の例には、チオール、アミン、カルボキシル基やホスフィンが挙げられる。リガンド相互作用基がそのような部分を含まない場合、リガンド相互作用基は、キャッピングリガンドとインターカレートすることによってナノ粒子の表面と会合してよい。リガンド相互作用剤の例には、例えばミリスチン酸イソプロピルのようなＣ８−２０脂肪酸及びそのエステルが含まれる。
【００５５】
リガンド相互作用剤は、単にナノ粒子の合成に使用されるプロセスの結果としてＱＤナノ粒子と会合してよく、ナノ粒子を更なる量のリガンド相互作用剤に曝す必要性を無くすことに留意のこと。このような場合、更なるリガンド相互作用剤をナノ粒子と会合させる必要はないかもしれない。代替的に又は追加で、ナノ粒子が合成及び単離された後に、ＱＤナノ粒子をリガンド相互作用剤に曝してもよい。例えば、ナノ粒子は、リガンド相互作用剤を含む溶液中にて、一定期間インキュベートされてよい。そのようなインキュベーション、又はインキュベーション期間の一部は、高温であってよく、リガンド相互作用剤とナノ粒子の表面との会合が促進する。リガンド相互作用剤をナノ粒子の表面と会合させた後に、ＱＤナノ粒子は、連結／架橋剤及び表面修飾リガンドに曝される。連結／架橋剤は、リガンド相互作用剤の基に対して、また、表面修飾リガンドに対して特異的な親和性を有する官能基を含む。リガンド相互作用剤−ナノ粒子会合複合体は、連結／架橋剤及び表面修飾リガンドに順次曝される。例えば、ナノ粒子は、架橋／架橋剤にある期間曝されて架橋をもたらし、その後、表面修飾リガンドに曝されて、それをナノ粒子のリガンドシェルへと組み込んでよい。或いは、ナノ粒子は、結合／架橋剤と表面修飾リガンドとの混合物に曝されてよく、よって、単一の工程で架橋されて、表面修飾リガンドが組み込まれる。
【００５６】
ある実施形態では、量子ドット前駆体は、分子クラスタ化合物の存在下で、分子クラスタの完全性が維持される条件下で与えられて、十分に分離した（well-defined）予め作製されたシード又はテンプレートとして作用し、化学前駆体と反応する核形成中心をもたらして、工業的用途に十分な規模で高品質のナノ粒子が生成される。
【００５７】
しかしながら、開示された方法は、分子クラスタ法に限定されない。量子ドットを調製するための更なる方法としては、例えば、二重注入法、水ベース法（aqueous based method）、ホットインジェクション法及びシーディング法が挙げられる。
【００５８】
本発明において有用な量子ドットナノ粒子の適切な種類には、以下の種類を含むコア材料（それらの任意の組合せ又は合金を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
周期律表の第２族からの第１元素と、周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるＩＩＡ−ＶＩＢ（２−１６）族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、及びＢａＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
周期律表の第１２族からの第１元素と周期律表の第１５族からの第２元素とを含んでいるＩＩ−Ｖ族材料であって、三元材料、四元材料、及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、Ｚｎ３Ｐ２、Ｚｎ３Ａｓ２、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、Ｃｄ３Ｎ２、及びＺｎ３Ｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
周期律表の第１２族からの第１元素と、周期律表の第１６族からの第２元素と含むＩＩ−ＶＩ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＺｎＯ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＣｄＳｅＳ、ＣｄＳｅＴｅ、ＣｄＳＴｅ、ＺｎＳｅＳ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＨｇＳｅＳ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＣｄＺｎＳ、ＣｄＺｎＳｅ、ＣｄＺｎＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＨｇＺｎＳ、ＨｇＺｎＳｅ、ＨｇＺｎＴｅ、ＣｄＺｎＳｅＳ、ＣｄＺｎＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳｅＳ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＴｅ、ＨｇＺｎＳｅＳ、ＨｇＺｎＳｅＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
周期律表の第１３族からの第１元素と周期律表の第１５族からの第２元素とを含んでいるＩＩＩ-Ｖ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、ＢＰ、ＡｌＰ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＮ、及びＢＮが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
周期律表の第１３族からの第１元素と周期律表の第１４族からの第２元素とを含んでいるＩＩＩ-Ｖ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、Ｂ４Ｃ、Ａ１４Ｃ３、Ｇａ４Ｃ、Ｓｉ、及びＳｉＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
周期律表の第１３族からの第１元素と周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるＩＩＩ−ＶＩ族材料であって、三元材料及び四元材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、Ａ１２Ｓ３、Ａｌ２Ｓｅ３、Ａｌ２Ｔｅ３、Ｇａ２Ｓ３、Ｇａ２Ｓｅ３、ＧｅＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｇａ２Ｔｅ３、Ｉｎ２Ｔｅ３、及びＩｎＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
周期律表の第１４族からの第１元素と周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるＩＶ−ＶＩ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、Ｓｂ２Ｔｅ３、ＳｎＳ、ＳｎＳｅ、及びＳｎＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
周期律表の遷移金属の任意の族からの第１元素と、周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるナノ粒子材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、ＮｉＳ、ＣｒＳ、ＡｇＳ、並びに、ＣｕＩｎＳｅ２、ＣｕＧａＳ２、ＣｕＧａＳ２、及びＡｇＩｎＳ２などのＩ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
好ましい実施形態では、ナノ粒子材料は、ＩＩ−ＩＶ族材料、ＩＩＩ−Ｖ族材料、Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料、それらの任意の合金又はドープされた誘導体を含む。
【００６８】
本明細書及び特許請求の範囲の意図するものとしては、「ドープされたナノ粒子」という用語は、上記と、大抵の場合には遷移金属又は希土類元素である１又は複数の主族元素又は希土類元素を含むドーパントとからなるナノ粒子を指しており、例えば、Ｍｎ＋でドープされたＺｎＳナノ粒子のようなマンガンを含む硫化亜鉛であるが、これに限定されない。
【００６９】
ある実施形態では、量子ドットナノ粒子は、カドミウムなどの重金属を実質的に含まない（例えば、カドミウムなどの重金属が５重量％未満、具体的には、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０１重量％未満）、或いは、カドミウムなどの重金属を含んでいない。
【００７０】
インビボ用途では、例えばＩｎＰ量子ドットであるＩｎ系量子ドットのような半導体ナノ粒子、それらの合金、ドープされた誘導体が好ましい。
【００７１】
ある実施形態では、本明細書に記載の量子ドットナノ粒子の何れも、ナノ粒子コア上に設けられた、第１の半導体材料を含む第１の層を含んでいる。第２の半導体材料を含む第２の層が、第１の層上に設けられてもよい。
【００７２】
［合成］
以下の合成工程が、コンジュゲーションに用いられてよい。リンカーが使用されて、ナノ粒子上のカルボキシル官能基とメチル化特異的結合リガンド上のアミン末端基との間にアミド基が形成されてよい。既知のリンカー、例えば、量子ドットナノ粒子の無機表面上に直接存在するチオール固定基などが使用できる。当業者には知られているであろう標準的なカップリング条件が用いられてよい。適切なカップリング剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミドが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、カップリング剤はＥＤＣである。
【００７３】
ある実施例では、カルボキシル末端基及び官能化リガンドを有する量子ドットナノ粒子が、溶媒に混合されてよい。ＥＤＣのようなカップリング剤が、混合物に添加されてよい。反応混合物は、インキュベートされてよい。粗の（crude）官能化リガンドナノ粒子コンジュゲートは、精製及び／又は単離されてよい。
【００７４】
一般的な固相精製法が使用されてよい。過剰な未反応の官能化リガンド及び／又はＥＤＣを除去するために、濾過及び適切な溶媒での洗浄が、数サイクル必要とされることがある。
【００７５】
以下の実施例は、開示を完全にするため、本発明の組成物及び複合物を製造する方法を説明するため、並びに組成物の特定の特徴を示すために記載されている。これらの実施例は、本発明の範囲又は教示を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７６】
［実施例１  無毒性量子ドットの合成］
分子シーディングプロセスを使用して、無毒性量子ドット（ＱＤ）を生成した。概要を説明すると、５００乃至７００ｎｍの範囲で発光する非官能化インジウム系量子ドットの調製を以下のようにして行った。ジブチルエステル（約１００ｍｌ）及びミリスチン酸（ＭＡ）（１０．０６ｇ）を三つ口フラスコに入れて、真空下で約７０℃で１時間脱気した。この期間の後、窒素を導入し、そして温度を約９０℃に上げた。約４．７ｇのＺｎＳ分子クラスタ［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）１６］を加え、混合物を約４５分間撹拌した。次に、温度を約１００℃に上げて、続いてＩｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴加し、続いてトリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴加した。反応混合物を撹拌しながら温度を約１４０℃に上げた。１４０℃で、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルに溶解させたミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）（１Ｍ、３５ｍｌ）（５分間撹拌したままにした）と、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルに溶解させた（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、３５ｍｌ）を更に滴加した。その後、温度をゆっくりと１８０℃に上げて、Ｉｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、５５ｍｌ）、続いて（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、４０ｍｌ）を更に滴加した。このようにして前駆体を添加することで、発光極大が５００ｎｍから７２０ｎｍまで徐々に増加するインジウム系粒子を作製した。所望の発光極大が得られた時点で反応を停止し、反応温度で半時間撹拌し続けた。この期間の後、混合物を約４日間（反応温度よりも約２０乃至４０℃低い温度で）アニールした。この段階でＵＶランプも使用して、アニーリングを促進した。
【００７７】
カニューレ法を用いて、乾燥脱気メタノール（約２００ｍｌ）の添加により粒子を単離した。沈殿物を沈殿させ、次に、フィルタスティックを用いてカニューレを介してメタノールを除去した。乾燥脱気クロロホルム（約１０ｍｌ）を加えて固体を洗浄した。真空下で１日間固体を乾燥させた。この手法により、ＺｎＳ分子クラスタにインジウム系ナノ粒子が形成された。更なる処理において、結果として得られたインジウム系ナノ粒子の量子収率は、希フッ酸（ＨＦ）中で洗浄することによって更に増加した。インジウム系コア材料の量子収率は、約２５％乃至５０％の範囲であった。この組成物は、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳを含む合金構造と考えられる。
【００７８】
ＺｎＳシェルの成長：ＨＦエッチングしたインジウム系コア粒子の２０ｍｌ部を三つ口フラスコ内で乾燥させた。１．３ｇのミリスチン酸及び２０ｍｌのジ-ｎ-ブチルセバケートエステルを添えて、３０分間脱気した。溶液を２００℃に加熱して、２ｍｌの１Ｍ  （ＴＭＳ）２Ｓを（７．９３ｍｌ／時の速度で）滴加した。この添加が完了した後、溶液を２分間放置し、次に１．２ｇの無水酢酸亜鉛を加えた。２００℃で１時間溶液を保持して、次に室温に冷却した。４０ｍｌの無水脱気メタノールを添加して遠心分離することで、得られた粒子を単離した。上澄み液を捨てて、残った固体に３０ｍｌの無水脱気ヘキサンを加えた。 溶液を５時間静置し、次に再度遠心分離した。上澄み液を集めて、残った固体を捨てた。最終的な非官能化インジウム系ナノ粒子材料の量子収率は、有機溶媒中で約６０％乃至９０％の範囲であった。
【００７９】
［実施例２  水溶性表面改質ＱＤ］
メラミンヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）修飾蛍光ナノ粒子を、薬物送達ビヒクルとして生成及び使用するための方法の一実施形態が、本実施例で提供される。独特なメラミンベースのコーティングは、優れた生体適合性と、低毒性と、非常に低い非特異的結合とを示す。これらの独特の作用により、インビトロとインビボの両方で幅広い生物医学的用途が可能になる。
【００８０】
適切な水溶性ナノ粒子の調製の一例を以下に示す。実施例１に記載されており、コア材料としてインジウム及びリンを含む合金と、Ｚｎ含有シェルとを有しており、６０８ｎｍで赤色発光する２００ｍｇのカドミウムフリー量子ドットナノ粒子を、ミリスチン酸イソプロピル（１００マイクロリットル）と共にトルエン（１ｍｌ）中に分散させた。ミリスチン酸イソプロピルは、リガンド相互作用剤として含まれる。５０℃で約１乃至２分間混合物を加熱し、次に室温で１５時間ゆっくりと振とうした。ヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）（ＣＹＭＥＬ  ３０３、Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ウェストパターソン）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）をナノ粒子分散系に加えた。サリチル酸は、官能化反応に用いられ、触媒、架橋剤、及びＣＯＯＨの供給源として３つの役割を果たす。ＯＨ基に関するＨＭＭＭの選好性に部分的に起因して、サリチル酸によって提供される多くのＣＯＯＨ基は、架橋後もＱＤ上で利用可能なままである。
【００８１】
ＨＭＭＭは、以下の構造を有するメラミンベースの連結／架橋剤である。
【化１】
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【００８２】
ＨＭＭＭは、酸触媒反応で反応して、アミド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、及びチオールなどの様々な官能基を架橋できる。
【００８３】
混合物を脱気し、電磁撹拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら、最初の１時間は１３０℃で、次に１４０℃で３時間還流した。最初の１時間の間、窒素流をフラスコに通過させて、ＨＭＭＭと求核基の反応によって発生した揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温に冷却して、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子は、未修飾ナノ粒子と比較して、蛍光量子収率がほとんど又は全く損なわれず、発光ピーク又は半値全幅（ＦＷＨＭ）値の変化がないことを示した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させて、脱イオン水を残留物に添加した。表面修飾ナノ粒子は、水性媒体によく分散し、常に分散したままであった。対照的に、未修飾ナノ粒子は水性媒体中に懸濁しなかった。上記手順による表面修飾ナノ粒子の蛍光量子収率は、４０乃至５０％である。典型的なバッチでは、４７％±５％の量子収率が得られる。
【００８４】
別の実施形態では、６０８ｎｍで赤色発光するカドミウムフリー量子ドットナノ粒子（２００ｍｇ）を、コレステロール（７１．５ｍｇ）と共にトルエン（１ｍｌ）に分散させた。５０℃で約１乃至２分間混合物を加熱し、次に室温で１５時間ゆっくりと振とうした。ＨＭＭＭ（Ｃｙｍｅｌ ３０３）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、グアイフェネシン（１００ｍｇ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）を、ナノ粒子分散系に加えた。
【００８５】
ここで用いられる化合物グアイフェネシンは、以下の化学構造を有する。
【化２】
2019521129.tif 000004
【００８６】
ここで用いられる化合物サリチル酸は、以下の化学構造を有する。
【化３】
2019521129.tif 000005
【００８７】
混合物を脱気して、磁気撹拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら、１４０℃で４時間還流した。先の手順と同様に、最初の１時間の間に窒素流をフラスコに通過させて、ＨＭＭＭと求核基の反応によって発生した揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温に冷却し、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させ、脱イオン水を残留物に加えた。１００ｍＭのＫＯＨ溶液を用いて、溶液のｐＨを６．５に調整し、Ａｍｉｃｏｎフィルタ（３０ｋＤ）を用いた３サイクルの限外濾過により、過剰な未反応物質を除去した。使用するまで最終水溶液を冷蔵保存した。
【００８８】
水溶性を増大させるようにナノ粒子を修飾する伝統的な方法（例えば、メルカプト官能化水溶性リガンドとのリガンド交換）は、ナノ粒子を水溶性にする温和な条件下では効果がないことに注目すべきである。熱及び超音波処理などの過酷な条件下では、フラクションは水溶性になり、非常に低い量子収率（ＱＹ＜２０％）を有する。対照的に、本方法は、高い量子収率を有する水溶性ナノ粒子を提供する。本明細書で規定されるように、高い量子収率は４０％以上である。幾つかの実施形態において、４５％以上の高い量子収率が得られる。この実施例のように調製された表面修飾ナノ粒子はまた、エタノール、プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、ブタノール、トリプロピルメチルメタクリレート、メチルメタクリレートを含む他の極性溶媒によく分散し、常に分散したままである。
【００８９】
［実施例３  標的化リガンドを含む水溶性ＱＤ］
特定の実施形態では、水溶性ＱＤは、ＱＤに付された標的化リガンドを含むように修飾される。故に、ある実施形態では、非毒性且つ水溶性（生体適合性）であり、コンジュゲーション可能な基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を表面に備えた量子ドットナノ粒子が合成される。例えば本明細書の実施例２で与えられたＣＯＯＨ官能基のような、ＱＤに付加できる官能基を用いて、サンプル、細胞及び組織中のミトコンドリアを選択的に同定することを可能にする標的化リガンドを含むように、ＱＤを修飾できる。標的化リガンド修飾ＱＤは、照射されると、検出用の光を発光する。
【００９０】
例示的なある実施形態では、水溶性の非毒性ＱＤはカルボキシル官能化されているか、カルボキシル官能化される。水溶性１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いるカルボジイミド結合法のような化学的方法を使用して、ＣＯＯＨ−ＱＤを、特異的抗体などのミトコンドリアの標的部のアミン末端に結合する。カルボキシル官能化ＱＤをＥＤＣと混合して、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成し、次に、当該中間体を、反応混合物中でモノクローナル抗体の第一級アミノ基からの求核攻撃によって置換する。必要であれば、第一級アミン含有抗体（primary amine bearing antibody）との反応中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（ｓｕｌｆｏ−ＨＳ）を加える。スルホ−ＮＨＳの添加により、ＥＤＣは、カルボキシルにＮＨＳを結合し、Ｏ−アシルイソ尿素中間体よりも安定なＮＨＳエステルを形成する一方で、生理学的ｐＨで第一級アミンへの効率的なコンジュゲーションを可能にする。何れの場合でも、結果は、ＱＤと抗体の間の共有結合となる。鈴木−宮浦クロスカップリング、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、又はアルデヒドを用いた反応のような他の化学反応が、代わりに用いられてもよい。
【００９１】
ある実施形態では、無毒性の水溶性量子ドットは、ミトコンドリア結合に対する抗体に化学的に結合している。適切なメチル化特異的結合リガンドとしては、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売する抗ミトコンドリア抗体（カタログ番号：９０９−３０１−Ｄ７９）、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  ＨＳＰ６０（カタログ番号：ＢＳ１１７９−５０μｌ（５０μｌ）及びＢＳ１１７９−１００μｌ（１００μｌ））、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＳＯＤ１（カタログ番号：ＭＡＢ１０３９４）、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  Ｇｒｐ７５  ｃｌｏｎｅ  Ｓ１９−２（カタログ番号：ＭＡＢ６６２９）、ｔｅｂｕ−ｂｉｏが販売するＡｎｔｉ  Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ（Ｈ１９）（カタログ番号：ＢＳ１０８９−５０μｌ（５０μｌ）及びＢＳ１０８９−１００μｌ（１００μｌ））、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）、それらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
ミトコンドリア特異的結合リガンドとのインビボ適合水分散性カドミウムフリーＱＤの共有結合コンジュゲーション：エッペンドルフ（Eppendorf）チューブにおいて、１ｍｇのカルボキシル官能化水溶性量子ドットを、１００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液と混合する（つまり、４０ｍｇ／ｍｌストックの２５μｌを１００μｌのＭＥＳに入れる）。ＭＥＳ緩衝液は、ｐＨ４．５の脱イオン（ＤＩ）水の２５ｍＭ溶液（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩（ＭＥＳ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として調製される。これに、３３μｌの新しいＥＤＣ溶液（脱イオン水の３０ｍｇ／ｍｌストック、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、その溶液を混合する。４μｌの新しいｓｕｌｆｏ−ＨＳ（１００ｍｇ／ｍｌストック、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＩ水中）を加えて、混合する。ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋフィルタ（ＰＡＬＬ  ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋ  Ｏｍｅｇａウルトラフィルタ）を、１００μｌのＭＥＳで予め湿らせる。ＭＥＳ／ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＨＳ／ＱＤ溶液を、ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋフィルタに添加し、十分なＭＥＳで満たす。５０００ｒｐｍ／１５分で、フィルタを遠心分離する。ドットを、５０μｌの活性化緩衝液に再度分注して、１０μｌのミトコンドリア特異的リガンドを含んでいるエッペンドルフチューブに移す。溶液をよく混ぜて、室温で一晩（約１６乃至１８時間）インキュベートする。１６μｌの６−アミノカプロン酸（６ＡＣ）（１９．７ｍｇ／１００ｍＭ）で、溶液をクエンチする。クエンチングは、第一級アミンを有する他の化合物を用いて代替的に行えるが、６ＡＣは、ＣＯＯＨを有しており、生成物のコロイド安定性を維持することができるので、６ＡＣがこの実施態様に対して選択されていることに留意のこと。予め濡らしたＮａｎｏｓｅｐ  ３００Ｋフィルタ（１００μｌ  １×ＰＢＳ）に溶液を移し、５００μｌのラインまで１×ＰＢＳで満たした。Ｎａｎｏｓｅｐ  ３００Ｋフィルタと１×ＰＢＳ緩衝液とを用いた３サイクルの限外濾過によって、過剰なＳＡＶを除去した。遠心分離の各サイクルは、５０００ｒｐｍで２０分間行われて、各サイクル後に約４００μｌの１×ＰＢＳを用いて再分散した。１００μｌのＰＢＳ中に最終濃縮物を再分散した。
【００９３】
［実施例４  インビトロ用途］
ＣＯＸ酵素は、６２０、６８０、７６０及び８２０ｎｍに光吸収ピークを有することから、ＣＯＸの吸収ピークのうちの１つに一致するように、量子ドット放射を調整することができる。この実施例では、６２０ｎｍ放射量子ドットナノ粒子を使用した。ある範囲の濃度（１乃至２０μｇ／ｍＬ）の水溶性６２０ｎｍ放射量子ドットナノ粒子と共に、培養癌細胞をインキュベートした。所定時間の後、蛍光顕微鏡画像を撮影してドットの内在化を検出した。図１から分かるように、量子ドットナノ粒子は、細胞質構造内に内在化されていた。次に、ＱＤに照射して続いて起こる、内在化されたＱＤからの放射を用いて、ＣＯＸを刺激し、培養癌細胞培養物のミトコンドリアのＣＯＸ活性又は放出を調節した。
【００９４】
研究によって、酵素シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）は、可視領域及び近赤外（ＮＩＲ）における光アクセプタ及び光信号トランスデューサと考えられることが分かっている。内在化した量子ドットによる光放射は、ＣＯＸ活性の増加を引き起こし、反応の連鎖を導いて、細胞のホメオスタシスを変化させ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、活性酸素種（ＲＯＳ）、一酸化窒素（ＮＯ）、及びカルシウム（ｉＣａ２＋）の細胞内産生を増加させる。光放射内在化量子ドットのインビトロでの応用は、細胞機能と疾患においてＣＯＸが果たす役割についてのより良い理解をもたらす。
【００９５】
［実施例５  インビボ用途−ホメオスタシス］
治療目的及び投与方法に応じて、量子ドットナノ粒子は、哺乳動物の関心のある領域（例えば、標的領域又は器官）に直接注射される単なる裸のドットとして使用することができる。ＣＯＸ活性を増加させるのに十分な内在化ＱＤによる光放射は、ホメオスタシスを調節することによる低強度光線療法（low-intensity light therapy）を果たし得ると考えられる（例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、活性酸素種（ＲＯＳ）、一酸化窒素（ＮＯ）及び／又は細胞内カルシウム（ｉＣａ２＋）の産生の増加）。Tafur et al., Low-Intensity Light Therapy: Exploring the Role of Redox Mechanisms, Photomed Laser Surg. 2008 Aug; 26(4): 323−328 を参照のこと。内在化量子ドットによる光放射は、他の領域を光放射することなく哺乳動物の関心領域を標的とするために使用される。ＱＤによる内部光放射は、炎症治療、創傷治癒、及び軟組織治療の過程を調節するために使用される。
【００９６】
ＱＤは、皮下、筋肉内、皮内、又は静脈内経路によって投与されてよい。（上記の実施例３に従って）組織特異的タグをＱＤに設けて、哺乳動物における特異的な送達を確実することで、ＱＤは、関心領域（例えば、哺乳動物の特定の臓器）を標的化する。
【００９７】
［実施例５  インビボ用途−アポトーシス］
治療目的及び投与方法に応じて、量子ドットナノ粒子は、哺乳動物の関心のある領域（例えば、標的領域又は器官）に直接注射される単なる裸のドットとして使用することができる。内在化量子ドットによる光放射は、ＣＯＸ活性の増加を引き起こす。ＣＯＸの過剰発現は、ミトコンドリアが存在する細胞の細胞質に到達することによってアポトーシスへの経路を誘発すると考えられている。Boehning D, et al., Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nature Cell Biology.5(12): 1051−61 (Dec 2003) を参照のこと。内在化量子ドットによる光放射は、他の領域を光放射することなく哺乳動物の関心領域を標的化するために使用される。ＱＤによる内部光放射は、腫瘍細胞のような望ましくない細胞の細胞死（アポトーシス）を開始させるために使用される。光放射は、ミトコンドリア膜の脱分極をもたらし、その結果、ミトコンドリアが中に存在する細胞の細胞質へのＣＯＸの放出をもたらす。
【００９８】
ＱＤは、皮下、筋肉内、皮内、又は静脈内経路によって投与されてよい。（上記の実施例３に従って）組織特異的タグをＱＤに設けて、哺乳動物における特異的な送達を確実することで、ＱＤは、関心領域（例えば、哺乳動物の特定の臓器）を標的にする。
【００９９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が本明細書に記載されているものとして、参照により本明細書の一部となる。本発明のこれら及び他の利点は、前述の明細書から当業者には明らかであろう。故に、本発明の広範な発明概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更又は修正を加えられ得ることを当業者は理解すべきである。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、本発明の範囲及び思想内にあるすべての変更及び修正を含むことを意図していることを理解のこと。
【図１】
2019521129.tif 000006
【図２】
2019521129.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月27日(2019.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内のミトコンドリア代謝活性を調節するように構成された複数の水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲートにおいて、
１０乃至２０ｎｍの流体力学的サイズを有する複数の水溶性量子ドットであって、各々が、６２０、６８０、７６０、又は８２０ｎｍのシトクロムｃ吸収ピークで発光するように寸法決めされたコア又はコア／シェル半導体材料を含む、複数の水溶性量子ドットと、
外層と、
を備えており、
外層は、Ｃ８−２０脂肪酸及びそのエステルを含む少なくとも１つのリガンド相互作用剤と、ミトコンドリアの代謝活性を調節することを可能にする少なくとも１つのミトコンドリア指向性（mitochondriotropic）リガンドに共有結合する少なくとも１つの表面修飾リガンドとを含む、複数の水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２】
ミトコンドリアの代謝活性を調節することを可能にする少なくとも１つのミトコンドリア指向性リガンドは、抗ミトコンドリア膜抗体、抗ミトコンドリアヘキソキナーゼ、抗ＨＳＰ６０、抗ＳＯＤ１、抗Ｇｒｐ７５、及び抗シトクロムｃからなる群から選択される、請求項１に記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項３】
量子ドットが、カドミウム、鉛及びヒ素を含む毒性重金属を実質的に含んでいない、請求項１に記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項４】
ミトコンドリア指向性リガンドが、トリフェニルホスホニウム又はその誘導体である、請求項１乃至請求項３の何れかに記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項５】
コア半導体材料が、ＩＩ−ＶＩ族材料、ＩＩＩ−Ｖ族材料、Ｉ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料、又はそれらの任意の合金若しくはドープされた誘導体を含む、請求項４に記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項６】
ミトコンドリア指向性リガンドがヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤である、請求項１に記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項７】
ヘキソキナーゼ（ＨＫ）阻害剤が２−デオキシグルコース（２ＤＧ）である、請求項６に記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項８】
細胞取込促進剤、組織浸透促進剤、又はそれらの組合せを更に含む、請求項７に記載の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項９】
水溶性量子ドットコンジュゲートを調製するための方法であって、
リガンド相互作用性Ｃ８-２０脂肪酸及びそのエステルを有する水溶性量子ドット（ＱＤ）を調製する工程と、
メラミン及びサリチル酸と混合することで、水溶性ＱＤを表面修飾する工程と、
ミトコンドリアにおける代謝活性を調節することを可能にする少なくとも１つのミトコンドリア指向性リガンドと表面修飾水溶性ＱＤとを共有結合させる工程と、
を含んでおり、
少なくとも１つのミトコンドリア指向性リガンドは、ミトコンドリア膜、ミトコンドリアヘキソキナーゼ、ＨＳＰ６０、ＳＯＤ１、Ｇｒｐ７５、及びシトクロムｃからなる群のうちの１つとの結合に特異的である、方法。
【請求項１０】
水溶性リガンド量子ドットコンジュゲートを精製する工程を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
水溶性リガンド量子ドットコンジュゲートを単離する工程を更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結合させる工程がカップリング剤の存在下で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
カップリング剤が１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）請求項１に記載の水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲートを細胞と接触させて、量子ドットナノ粒子コンジュゲートを細胞内に内在化させ、ミトコンドリア内又はその付近に蓄積させる工程と、
ｉｉ）光源及び／又はボルタ電流を用いて量子ドットナノ粒子を励起する工程と、
ｉｉｉ）内在化及び励起された量子ドットナノ粒子コンジュゲートから、細胞内で光放射を発生させる工程と、
を含む、ミトコンドリア機能を操作する方法。
【請求項１５】
ボルタ電流がシトクロムｃオキシダーゼの放出を刺激する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
光源が、シトクロムｃオキシダーゼの１又は複数の光吸収ピークで量子ドット発光を刺激し、それによって、シトクロムｃオキシダーゼの活性の増加を光調節する光子が生成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
シトクロムｃオキシダーゼの活性を調節する方法であって、
ｉ）請求項５に記載の水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲートを腫瘍細胞と接触させ、量子ドットナノ粒子コンジュゲートを腫瘍細胞内に内在化させ、腫瘍細胞内のミトコンドリア内又はその付近に蓄積させる工程と、
ｉｉ）量子ドットナノ粒子コンジュゲートを光源で励起する工程と、
ｉｉｉ）内在化量子ドットナノ粒子コンジュゲートから光放射を発生させて、腫瘍細胞内のチトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ）活性を調節する工程と、
を含む方法。
【請求項１８】
水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲートから生じた光放射が、腫瘍細胞の細胞質へのＣＯＸの放出を刺激する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＯＸの放出が腫瘍細胞死を開始させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞内のミトコンドリア膜を脱分極する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲートを腫瘍細胞と接触させ、量子ドットナノ粒子コンジュゲートを腫瘍細胞内に内在化させ、ミトコンドリア内又はその付近に蓄積させる工程と、
ｉｉ）量子ドットナノ粒子コンジュゲートを光源で励起する工程と、
ｉｉｉ）量子ドットナノ粒子コンジュゲートから、腫瘍細胞内で光放射を発生させる工程と、
を含む方法。
【請求項２１】
アポトーシスを誘導する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ミトコンドリア膜が光起電力効果によって脱分極される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細胞内の糖分解を阻害する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の水溶性量子ドットナノ粒子コンジュゲートを細胞と接触させて、量子ドットナノ粒子コンジュゲートを細胞内に内在化させ、ミトコンドリア内又はその付近に蓄積させる工程と、
ｉｉ）量子ドットナノ粒子コンジュゲートを光源で励起する工程と、
ｉｉｉ）内在化した量子ドットナノ粒子コンジュゲートから光放射を発生させる工程と、
を含む方法。
【国際調査報告】
2019521129.tif 000008
2019521129.tif 000009
2019521129.tif 000010
2019521129.tif 000011