【手続補正書】
【提出日】令和3年11月29日(2021.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた試料中における乳癌のスクリーニング方法であって、
１）メチル化特異的手法でＤＮＡを修飾する試薬を用いて、ヒト個体の生体試料中のゲノムＤＮＡを処理し；
選択された４〜１４個の遺伝子それぞれに対する特異的なプライマーのセットを使用して、処理されたゲノムＤＮＡを増幅し；
ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、及び標的捕捉からなる群から選択される技術によって、１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを決定する；
ことにより、ヒト個体の生体試料中における前記４〜１４個の遺伝子のメチル化レベルをアッセイすること：
ここで、前記４〜１４個の遺伝子は、ＣＤ１Ｄ、ＩＴＰＲＩＰＬ１、ＦＡＭ５９Ｂ、Ｃ１０ｏｒｆ１２５、ＴＲＩＭ６７、ＳＰＨＫ２、ＣＡＬＮ１＿Ｂ、ＣＨＳＴ２＿Ｂ、ＭＰＺ、ＣＸＣＬ１２＿Ｂ、ＯＤＣ１＿Ｂ、ＯＳＲ２＿Ａ、ＴＲＨ＿Ａ、及びＣ１７ｏｒｆ６４＿Ｂから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む、
ならびに、
２）前記マーカーの前記メチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされたマーカーのメチル化状態とは異なる場合に、前記対象を、乳癌を有すると同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが、メチル化特異的手法でＤＮＡを修飾する試薬で処理され、前記試薬が、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、亜硫酸水素塩、のうち１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子量を測定することが、多重増幅、メチル化特異的ＰＣＲ、定量メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲフラップアッセイ、及び亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択された４〜１４個の遺伝子それぞれに対する特異的なプライマーの前記セットが、
ＴＲＨ＿Ａについては、配列番号：２４５及び２４６からなるプライマーのセット、
ＭＰＺについては、配列番号：１７５及び１７６ならびに配列番号：４３９及び４４０からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＩＴＰＲＩＰＬ１については、配列番号：９７及び９８、配列番号：９９及び１００ならびに配列番号：４２５及び４２６からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＯＳＲ２＿Ａについては、配列番号：１８７及び１８８からなるプライマーのセット、
ＣＨＳＴ２＿Ｂについては、配列番号：３９及び４０からなるプライマーのセット、
Ｃ１７ｏｒｆ６４＿Ｂは、配列番号：２６９及び２７０ならびに配列番号：４４９及び４５０からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＣＸＣＬ１２＿Ｂは、配列番号：２８９及び２９０ならびに配列番号：４４１及び４４２からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＯＤＣ１＿Ｂについては、配列番号：３４１及び３４２ならびに配列番号：４４３及び４４４からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＣＤ１Ｄについては、配列番号：４２３及び４２４からなるプライマーのセット、
ＦＡＭ５９Ｂについては、配列番号：４２７及び４２８からなるプライマーのセット、
Ｃ１０ｏｒｆ１２５については、配列番号：４２９及び４３０からなるプライマーのセット、
ＴＲＩＭ６７については、配列番号：４３１及び４３２からなるプライマーのセット、
ＳＰＨＫ２については、配列番号：４３３及び４３４からなるプライマーのセット、ならびに
ＣＡＬＮ１＿Ｂについては、配列番号：２７３及び２７４からなるプライマーのセットからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が、乳房組織である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、血液、血清、または血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象から得られた試料中におけるトリプルネガティブ乳癌のスクリーニング方法であって、
１）メチル化特異的手法でＤＮＡを修飾する試薬を用いて、ヒト個体の生体試料中のゲノムＤＮＡを処理し；
選択された４〜１４個の遺伝子それぞれに対する特異的なプライマーのセットを使用して、処理されたゲノムＤＮＡを増幅し；
ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シーケンシング、質量分析、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量に基づく分離、及び標的捕捉によって、１つ以上の遺伝子のメチル化レベルを決定する；
ことにより、ヒト個体の生体試料中における前記４〜１４個の遺伝子のメチル化レベルをアッセイすること：
ここで、前記４〜１４個の遺伝子は、ＢＨＬＨＥ２３＿Ｃ、ＮＡＣＡＤ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＡＮＫ１、ＤＬＸ４、ＦＯＸＰ４、ＧＰ５、ＬＭＸ１Ｂ＿Ａ、ＳＴＸ１６＿Ｂ、ＡＢＬＩＭ１、ＺＳＣＡＮ１２、ＣＸＣＬ１２、ＯＴＸ１、ＭＡＸ．ｃｈｒ１７．７３０７３６８２−７３０７３８１４、ＭＡＸ．ｃｈｒ２０．１７８４２０９−１７８４４６１、ＬＯＣ１００１３２８９１、ＰＲＫＣＢ、ＴＲＩＭ６７、ＢＨＬＨＥ２３＿Ｄ、ＴＲＨ＿Ａ、ＤＮＭ３＿Ａ、ＰＬＸＮＣ１＿Ａ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．４２７３９０６−４２７４０１２、ＣＡＬＮ１＿Ａ、ＡＬＯＸ５、ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４６３７９９０３−４６３８０１９７、ＯＤＣ１、ＣＨＳＴ２＿Ａ、ＣＨＳＴ２＿Ｂ、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．７７２６８６７２−７７２６８７２５、ＤＳＣＲ６、ＩＴＰＲＩＰＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ３＿Ｂ、ＧＲＡＳＰ、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＭＡＸ．ｃｈｒ１１．１４９２６６０２−１４９２７１４８、ＵＢＴＦ、ＭＰＺ、ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．４２７３９０６−４２７４０１２、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．７７２６８６７２−７７２６８７２５、Ｃ１７ｏｒｆ６４、ＥＭＸ１＿Ａ、ＣＤＨ４＿Ｅ、ＳＬＣ３０Ａ１０、Ｃ１０ｏｒｆ１２５、ＧＹＰＣ＿Ｂ、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９９４８６６−４２９９４９３６、ＯＳＲ２＿Ａ、ＳＣＲＴ２＿Ｂ、ＭＡＸ．ｃｈｒ５．１４５７２５４１０−１４５７２５４５９、ＭＡＸ．ｃｈｒ１１．６８６２２８６９−６８６２２９６８、ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４１７３０３０−１２４１７３３９５、ＫＨＬＤＣ７Ｂ、ＴＢＸ１、及びＭＡＳＴ１から選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む、
ならびに、
２）前記マーカーの前記メチル化状態が、乳癌を有しない対象でアッセイされたマーカーのメチル化状態とは異なる場合に、前記対象を、トリプルネガティブ乳癌を有すると同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡが、メチル化特異的手法でＤＮＡを修飾する試薬で処理され、前記試薬が、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素、亜硫酸水素塩、のうち１つ以上を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子量を測定することが、多重増幅、メチル化特異的ＰＣＲ、定量メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化特異的ＤＮＡ制限酵素分析、定量亜硫酸水素塩パイロシーケンシング、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ、ＰＣＲフラップアッセイ、及び亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記選択された４〜１４個の遺伝子それぞれに対する特異的なプライマーの前記セットが、
ＢＨＬＨＥ２３＿Ｃについては、配列番号：１９及び２０からなるプライマーのセット、
ＮＡＣＡＤについては、配列番号：１７９及び１８０からなるプライマーのセット、
ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１については、配列番号：１３及び１４からなるプライマーのセット、
ＢＡＮＫ１については、配列番号：１５及び１６からなるプライマーのセット、
ＤＬＸ４については、配列番号：５１及び５２からなるプライマーのセット、
ＦＯＸＰ４については、配列番号：７３及び７４からなるプライマーのセット、
ＧＰ５については、配列番号：７７及び７８からなるプライマーのセット、
ＬＭＸ１Ｂ＿Ａについては、配列番号：１１５及び１１６からなるプライマーのセット、
ＳＴＸ１６＿Ｂについては、配列番号：２３３及び２３４または配列番号：２３５及び２３６からなるプライマーのセット、
ＡＢＬＩＭ１については、配列番号：３及び４からなるプライマーのセット、
ＺＳＣＡＮ１２については、配列番号：２５１及び２５２からなるプライマーのセット、
ＣＸＣＬ１２については、配列番号：４７及び４８からなるプライマーのセット、
ＯＴＸ１については、配列番号：１８９及び１９０からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ１７．７３０７３６８２−７３０７３８１４については、配列番号：１４１及び１４２からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ２０．１７８４２０９−１７８４４６１については、配列番号：１５１及び１５２ならびに配列番号：１５３及び１５４からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＬＯＣ１００１３２８９１については、配列番号：１１７及び１１８または配列番号：１１９及び１２０からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＰＲＫＣＢについては、配列番号：２０１及び２０２からなるプライマーのセット、
ＴＲＩＭ６７については、配列番号：２４７及び２４８からなるプライマーのセット、
ＢＨＬＨＥ２３＿Ｄについては、配列番号：２１及び２２からなるプライマーのセット、
ＴＲＨ＿Ａについては、配列番号：２４５及び２４６からなるプライマーのセット、
ＤＮＭ３＿Ａについては、配列番号：５５及び５６からなるプライマーのセット、
ＰＬＸＮＣ１＿Ａについては、配列番号：１９３及び１９４からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．４２７３９０６−４２７４０１２については、配列番号：１３３及び１３４ならびに配列番号：１３５及び１３６からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＣＡＬＮ１＿Ａについては、配列番号：２９及び３０からなるプライマーのセット、
ＡＬＯＸ５については、配列番号：９及び１０からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ１９．４６３７９９０３−４６３８０１９７については、配列番号：１４５及び１４６ならびに配列番号：１４７及び１４８からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＯＤＣ１については、配列番号：１８１及び１８２、配列番号：１８３及び１８４、ならびに配列番号：１８５及び１８６からなるプライマーのセット、
ＣＨＳＴ２＿Ａについては、配列番号：３７及び３８からなるプライマーのセット、
ＣＨＳＴ２＿Ｂについては、配列番号：３９及び４０からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ５．７７２６８６７２−７７２６８７２５については、配列番号：１６１及び１６２からなるプライマーのセット、
ＤＳＣＲ６については、配列番号：５７及び５８からなるプライマーのセット、
ＩＴＰＲＩＰＬ１については、配列番号：９７及び９８、ならびに配列番号：９９及び１００からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＩＧＦ２ＢＰ３＿Ｂについては、配列番号：９３及び９４からなるプライマーのセット、
ＧＲＡＳＰについては、配列番号：２５３及び２５４からなるプライマーのセット、
ＳＴ８ＳＩＡ４については、配列番号：２２７及び２２８からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ１１．１４９２６６０２−１４９２７１４８については、配列番号：１２９及び１３０からなるプライマーのセット、
ＵＢＴＦについては、配列番号：２４９及び２５０からなるプライマーのセット、
ＭＰＺについては、配列番号：１７５及び１７６からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ１２．４２７３９０６−４２７４０１２については、配列番号：１３３及び１３４ならびに配列番号：１３５及び１３６からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ５．７７２６８６７２−７７２６８７２５については、配列番号：１６１及び１６２からなるプライマーのセット、
Ｃ１７ｏｒｆ６４については、配列番号：２５及び２６からなるプライマーのセット、
ＥＭＸ１＿Ａについては、配列番号：６１及び６２からなるプライマーのセット、
ＣＤＨ４＿Ｅについては、配列番号：３５及び３６からなる群から選択されるプライマーのセット、
ＳＬＣ３０Ａ１０については、配列番号：２１９及び２２０からなるプライマーのセット、
Ｃ１０ｏｒｆ１２５については、配列番号：２３及び２４からなるプライマーのセット、
ＧＹＰＣ＿Ｂについては、配列番号：８１及び８２からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ５．４２９９４８６６−４２９９４９３６については、配列番号：１５９及び１６０からなるプライマーのセット、
ＯＳＲ２＿Ａについては、配列番号：１８７及び１８８からなるプライマーのセット、
ＳＣＲＴ２＿Ｂについては、配列番号：２１１及び２１２からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ５．１４５７２５４１０−１４５７２５４５９については、配列番号：１５７及び１５８からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ１１．６８６２２８６９−６８６２２９６８については、配列番号：１３１及び１３２からなるプライマーのセット、
ＭＡＸ．ｃｈｒ８．１２４１７３０３０−１２４１７３３９５については、配列番号：１６５及び１６６からなるプライマーのセット、
ＫＨＬＤＣ７Ｂについては、配列番号：１０９及び１１０からなるプライマーのセット、
ＴＢＸ１については、配列番号：２３９及び２４０からなるプライマーのセット、ならびに
ＭＡＳＴ１については、配列番号：１２５及び１２６からなるプライマーのセットからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、組織を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が、乳房組織である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、血液、血清、または血漿である、請求項８に記載の方法。