(57)【要約】  本発明は、凍結保存生体サンプルを収容するように構成されたサンプル容器と、そのサンプル容器を製造するための方法とに関する。本発明は、凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法に更に関する。凍結保存生体サンプルを収容するように構成されたサンプル容器は、その外面に凍結した固体の指標物質を有し、指標物質の融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存生体サンプルを収容するように構成されたサンプル容器（１０、２０、３０、３０ａ、４０）であって、該サンプル容器の外面の領域（１１、３１、４１）に凍結した固体の指標物質（１２、２２、３２、４２ｂ）を有し、該指標物質の融点が−２０℃から−１４０℃の範囲内にある、サンプル容器。
【請求項２】
前記凍結した固体の指標物質（１２、２２、３２、４２ｂ）を有する領域（１１、２１、３１、４１）が、コーティングを備える、粗面化されている、及び／又は構造化されていることを特徴とする請求項１に記載のサンプル容器。
【請求項３】
前記凍結した固体の指標物質（１２、２２、３２、４２ｂ）を有する領域がミラー化（３５）されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のサンプル容器。
【請求項４】
前記凍結した固体の指標物質を有する領域が電極（３３、３４）を備えることを特徴とする請求項１又は２に記載のサンプル容器。
【請求項５】
前記指標物質が、前記サンプル容器（１０、２０、３０、３０ａ、４０）の外面に所定の配置で適用され、前記所定の配置が数字、文字（１２ｂ）、記号、マーカー、及び／又は構造（１２、１２ａ、２２）を表すことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のサンプル容器。
【請求項６】
前記外面に適用された指標物質（１２、１２ａ、１２ｂ）が、前記指標物質の凍結した固体の滴（８）で得られていることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のサンプル容器。
【請求項７】
−２０℃から−１４０℃の範囲内にそれぞれ異なる融点を有する複数の異なる指標物質（２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、３２ａ、３２ｂ）が前記サンプル容器（２０、３０ａ）の外面の異なる領域に適用されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のサンプル容器。
【請求項８】
前記サンプル容器（１０、２０、３０、３０ａ、４０）がクライオチューブであることを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載のサンプル容器。
【請求項９】
（ａ）融点が異なる複数の異なる指標物質の各々が、前記クライオチューブ（２０）の収容シリンダ上に凍結した固体の滴（２３ａ、２３ｂ、２３ｃ）の列、特に帯状、例えば環状に配置された滴の列として適用されていることと、
（ｂ）前記複数の異なる指標物質が前記クライオチューブ（２０）の軸方向（Ａ）に沿って互いにずれて位置していることとを特徴とする請求項８に記載のサンプル容器。
【請求項１０】
前記凍結した固体の指標物質が、前記サンプル容器の少なくとも部分的な領域にパターン又は表面構造を備えることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のサンプル容器。
【請求項１１】
前記パターン又は表面構造が刻印パターン（４３）であり、好ましくは液体状態の指標物質を型（４４）の中で成型し次いで成型された指標物質（４２ｂ）を凍結させることで得られていることを特徴とする請求項１０に記載のサンプル容器。
【請求項１２】
凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスであって、
請求項１から１１のいずれか一項に記載のサンプル容器（１０、２０、３０、３０ａ、４０）と、
前記凍結した固体の指標物質の形状構成変化、特に形状変化、配置変化、及び／又は位置変化を検出するように形成された測定装置とを備えるデバイス。
【請求項１３】
凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されるサンプル容器（１０、２０，３０、３０ａ、４０）を製造するための方法であって、
生体サンプルを収容するためのサンプル容器を提供することと、
前記サンプル容器の外面の領域に−２０℃から−１４０℃の範囲内の融点を有する指標物質を液体状態で適用することと、
適用された前記指標物質を凍結させることとを備える方法。
【請求項１４】
前記指標物質を液体状態で適用する前に、前記サンプル容器を前記指標物質の融点未満の温度に冷却することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
滴堆積デバイス（７）を用いて、前記サンプル容器の外面に前記指標物質を滴状に適用することを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）液体状態の指標物質（４２）で充填された容器（４６）に前記サンプル容器（１）を部分的に浸漬して、指標物質（４２ａ）が前記サンプル容器（１）の外面の一点に付着するようにすることと、
（ｂ）前記サンプル容器（１）を中空の型（４４）の上に配置して、前記サンプル容器（１）に付着している指標物質（４２ａ）が前記中空の型（４４）の内部空間のエンボス部を埋めるようにすることと、
（ｃ）指標物質の凍結後に、サンプル容器に対して凍結した固体の指標物質（４２ｂ）から前記中空の型（４４）を取り外すこととを備えることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法であって、
（ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載のサンプル容器（１０、２０、３０、３０ａ、４０）を提供するステップと、
（ｂ）前記指標物質の融点、又は融解した指標物質の粘度が所定の目標値を下回ることになる閾値温度を一時的に超えることによって前記指標物質の形状変化又は配置変化、特に位置変化が生じたかどうかを決定するステップとを備える方法。
【請求項１８】
前記指標物質が、１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択された少なくとも一種のアルコールと、任意で少なくとも一種の染料とを備えることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載のサンプル容器、請求項１２に記載のデバイス、又は請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記染料が、トリフェニルメタン染料、ローダミン染料、特にキサンテン、アゾ染料、フェナジン染料、及び、フェノチアジン染料から成る群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載のサンプル容器、デバイス、又は方法。
【請求項２０】
前記指標物質が、１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択された少なくとも二種のアルコール成分を備え、及び／又は、前記指標物質が、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、ローダミンＢ、ニュートラルレッド、メチレンブルー、及び細胞学において細胞を着色するのに用いられる他の染料から成る群から選択された少なくとも一種の染料を備えることを特徴とする請求項１８又は１９に記載のサンプル容器、デバイス、又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結保存生体サンプルを収容するように構成されたサンプル容器、及びそのサンプル容器を製造するための方法に関する。本発明は、更に、凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の低温保存（凍結保存）は、生理的温度に温めた後に再始動可能なように細胞レベルにおいて生命活動を可逆的に停止させる（生命力を維持する）ことができる現状で唯一の可能性である。凍結保存は、大型のバイオバンクによって最近数十年にわたって開発されてきて、病院、製薬会社、種の保存、環境保護、健康対策にとって重要な要素となっている。生体物質は、多様なサイズの低温適合性サンプル容器（クライオ容器）、例えば、チューブ、ストロー、バッグに保管される。凍結保存の場合、保管された生体物質は、そのサンプル物質の生命力を維持しながら凍結され、通常は−８０℃未満の温度で、生体収集用には−１４０℃未満から液体窒素の温度で凍結される。以下では、「低温サンプル（クライオサンプル）」との用語が、凍結保存されたサンプルや、凍結保存されるサンプルに対して使用される。
【０００３】
低温でのサンプル保管については、巨視的サンプル、例えば血液や組織用に多数の方法が開発されている。最近の医薬、遺伝子工学、生物学では、小型サンプルを凍結保存させることが益々多くなっている傾向にある。例えば、懸濁させた細胞や細胞集団を有する僅かな体積の懸濁液（ミリリットル単位以下）を凍結させる。ｉｎ‐ｖｉｔｒｏ（インビトロ，体外）培養の細胞の凍結保存は、主に懸濁液中において行われる。しかしながら、生物医学的に重要な細胞の多くは、その伝播及び適切な発達のために基質との接触を要する。従って、サンプルは、例えば培養後に、基質に結合された状態で凍結される。
【０００４】
サンプルは国家資源として病院での細胞治療や、製薬やバイオテクノロジー製品の開発、他の多数の事柄において使用されるものであるので、サンプルの質は極めて重要なものである。保管期間は数日から数十年と様々であるが、長期保管の傾向にある。サンプルは冷却容器に保管され、通常は金属の引き出しやラック内に置かれるが、これによって、新たに入れる際や取り出す際にサンプルが温度変動を受ける。生体保管（細胞、細胞懸濁液、組織片）の場合、途切れない連続的な冷却チェーンだけではなくて、深冷段階において大きな温度ジャンプを防止することが、極めて重要な役割を果たす。低温容器（クライオ容器）から取り出す間にサンプルが凍結したままではあるが、気付かぬままに−８０℃から−２０℃の温度に温められると、質の低下が気付かぬままに生じ、サンプルの価値を低下させるだけではなくて、臨床分野で用いられる際には生命を脅かす事態に繋がり得る。サンプルが短時間解けただけの場合であっても、その再凍結状態においてサンプルが元々の状態に最早一致していないかどうかを見て取ることはできない。生体物質の解凍を特定するだけではなくて、−１４０℃から−２０℃の間の範囲内の閾値温度を超えたことを記録実証することが特に重要である。各サンプルに対する温度の制御及び記録実証は、現状では満たされることが稀な要件であり、満たされるとしても高い技術的コストを伴う。また、解凍後の広範な臨床試験も、貴重なサンプル物質を使用するものであって、低温サンプルがその間に無用なものになった場合であってもコストを発生させることに留意されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の一つの目的は、凍結保存生体サンプルの温度監視に適している凍結保存サンプル用のサンプル容器を提供することである。更なる目的は、そのようなサンプル容器を製造するための方法を示すことである。更なる目的は、従来の方法の欠点を回避することができ単純に実行可能であることを特徴とする凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法を提供することである。
【０００６】
更なる目的は、低温サンプルが僅かな時間であっても所定の閾値温度を超えて温められたかどうかをマーカーから可能な限り単純に特定することができる可能性を提供することである。凍結に先立って−２０℃から−１４０℃までの間の範囲内で閾値温度を設定することができなければならない。これは、数百万個のサンプルに対し、その個別の低温サンプルにおいて素早く簡単に可能とされなければならず、生体物質を変化させてはならず、深冷状態において為されたものでなければならない。サンプルが保管場所から取り出され戻される度に一般的にはラック全体が引き出されるので、複数のサンプルにサンプル変化の危険性があるため、可能であれば、保管容器内においてもサンプルの状態を検出できることが望ましい。本デバイス及び方法は取り扱いが簡単で、低温耐性があり、調整可能であることが望ましい。冷却状態での生体サンプルの保管が総支出において数ユーロしか掛からないことが望ましいので、エネルギーがほとんど又は全く消費されず、コストを最小にしなければならない。また、使用される物質がこの要求を満たさなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的は、独立請求項に記載の特徴を有するデバイス及び方法によって達成される。本発明の有利な実施形態及び応用は従属請求項から明らかとなるものであり、図面を部分的に参照する以下の説明においてより詳細に説明されるものである。
【０００８】
本発明の第一態様によると、上記目的は、凍結保存生体サンプルを収容するように構成されたサンプル容器によって達成され、そのサンプル容器は、その外面の領域に凍結した固体の指標物質を有し、その指標物質の常圧（つまり１０１３．２５ｈＰａ）における融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。融点は−２０℃から−１００℃の範囲内にあってもよい。この結果として、凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されたサンプル容器が提供される。
【０００９】
サンプル容器は、凍結保存（低温保存）に適した容器、例えば、血液や幹細胞の保管用のバッグ（袋）、チューブ、ストロー（シードチューブとも称される）や、凍結保存に適した箱や他の容器である。そのため、このような容器は、低温チューブ（クライオチューブ）、低温ストロー（クライオストロー）、低温バッグ（クライオバッグ）、低温箱（クライオボックス）、まとめて低温容器（クライオ容器）とも称される。サンプル容器は、生体サンプルを収容するための収容空間を有する。収容キャビティが凍結保存サンプルを含み得る。
【００１０】
低温チューブ（クライオチューブ）はバイオバンクチューブや低温バンク（精子バンク）チューブとも称される。低温チューブは、生体サンプルを収容するための内部キャビティを形成する収容空間を有する。更に、低温チューブは、通常は、収容空間を閉じるためのカバーを有する。カバーは嵌め込み部を有することができて、ツールを用いその嵌め込み部を介してカバーを回転させることができる。また、低温チューブは、マーク、例えば機械可読コードを有する基部要素を有することもできる。
【００１１】
融点を超えると、凍結した固体の指標物質は液体になる。そして、サンプル容器の外面上の指標物質の形状構成状態が、例えば重力及び／又は表面張力の結果として変化する。例えば、指標物質は、その融点を超えると、サンプル容器上での位置及び／又はその表面形状を変化させて、これは目視でも測定装置によっても決定可能である。形状構成状態の変化は指標物質の再凍結の際にも保たれる。従って、好ましくは、サンプル容器の外面の領域で凍結した固体の指標物質は、その指標物質の融点を超えた際に形状及び／又は配置構成が変化するような構成を有する。
【００１２】
サンプル容器は、その外面の領域に凍結した固体の指標物質を有し、その指標物質の融点が−２０℃から−１４０℃の範囲内にあるものであって、凍結保存生体サンプルの温度監視用に有利に使用可能である。本発明に係るサンプル容器は、低コストで製造可能であり、従来のサンプル容器と比較して追加の設置スペースをあまり要さない。
【００１３】
指標物質は、サンプル容器の外面に直接適用可能である。指標物質は固体に凍結することのみによって、サンプル容器の外面に固定され得て、つまり、指標物質は、追加の固定要素、例えば追加の容器等によってサンプル容器に対して保持されるものではない。指標物質は容器上に露出されて固体に凍結し得る。
【００１４】
検出性能を改善するため、指標物質は、指標物質の物理的特性の検出性能を向上させる指標添加剤を含有することができる。例えば、指標添加剤は染料であり、指標物質が着色又は染色されて透明ではなくなり、その形状及び／又は位置が光学的により明らかになる。
【００１５】
原理的には、少なくとも以下の条件を満たすものが染料として可能である：
‐  少量低濃度であっても強力な染色性能（例えば、＜１体積％（一般的には１０００分の１又はそれ以下の範囲）の範囲で飽和染料溶液に追加することから始める）；
‐  不凍性；
‐  取り出し温度及び関連する低温における耐光性；
‐  指標物質の全成分における可溶性；
‐  凍結中に分離しないこと；
‐  指標物質と接触することになるプラスチック物質に反応しないこと。
【００１６】
好ましくは、染料は、トリフェニルメタン染料、ローダミン染料、特にキサンテン、アゾ染料、フェナジン染料、フェノチアジン染料から成る群から選択される。
【００１７】
より具体的な実施形態では、染料は、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、ローダミンＢ、ニュートラルレッド、メチレンブルー、及び細胞学において細胞を染色するのに用いられる他の染料から成る群から選択される。
【００１８】
指標添加剤は、指標物質に当たる電磁放射に対する指標物質の散乱作用及び／又は偏光作用を増大させる粒子、特にナノ粒子であり得る。結果として、光透過測定、散乱測定及び／又は偏光測定を用いて、指標物質の形状構成変化をより確実に検出することができる。指標添加剤は導電性粒子であり得る。指標物質の導電性又はインピーダンスは導電性粒子を加えることによって影響され得る。このようにして、指標物質の形状構成変化を導電性測定又はインピーダンス測定を用いて検出することができる。
【００１９】
指標物質として選択可能な物質は、その融点が所定の閾値温度に対応し、それを超過することを監視したいというものである。指標物質は一種の液体又は異なる液体の混合物であり、その融点が所望の閾値温度に対応する。単に例として、水（Ｈ２Ｏ）とエタノール（Ｃ２Ｈ６Ｏ）の混合物、水（Ｈ２Ｏ）と水酸化カリウム（ＫＯＨ）の混合物、又は、水と不凍剤の混合物が指標物質として選択可能である。混合比は、混合比の関数として融点のプロファイルを示す各場合の融点図に従って調整されて、液体混合物の融点が所望の値、つまりは監視される閾値温度を有するようにされる。
【００２０】
好ましい一実施形態によると、指標物質は、１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択された少なくとも一種のアルコールを備える。少なくとも一種のアルコールは、特に好ましくは、プロパン‐１，３‐ジオール、プロパン‐１，２‐ジオール、及び、２‐ブタノールから選択される。
【００２１】
好ましい他の実施形態によると、指標物質は、以下の少なくとも二種の異なるアルコール成分を備える：
（ａ）１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択されたアルコール；
（ｂ）１‐オクタノール、１‐ノナノール、プロパン‐１，２‐ジオール、プロパン‐１，３‐ジオール、ブタン‐１，２‐ジオール、ブタン‐１，３‐ジオール、２‐ブタノール、ペンタン‐１，５‐ジオール、１‐ペンタノール、シクロペンタノール、及びベンジルアルコールから成る群から選択され、（ａ）のアルコール成分よりも低い融点を有するアルコール；
ここで、（ａ）の成分と（ｂ）の成分の混合比は、混合物の融点が、−２０℃から−１６０℃、特に−２５℃から−１６０℃、又は−５０℃から−１５０℃の範囲内にあるように調整される。
【００２２】
より具体的な実施形態は、指標物質が（ａ）の成分と（ｂ）の成分の以下の組み合わせのうち一つを備えることを特徴とする：
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐オクタノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐オクタノールと１‐ペンタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐オクタノールとプロパン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ノナノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ノナノールとプロパン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ノナノールと１‐ペンタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールとプロパン‐１，３‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールとブタン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，３‐ジオールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のプロパン‐１，３‐ジオールとブタン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のペンタン‐１，５‐ジオールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のベンジルアルコールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ペンタノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比の１‐ペンタノールとメタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールと２‐ブタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールとプロパン‐１，２‐ジオール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールと１‐ペンタノール；
‐  ５体積％から９５体積％の混合比のシクロペンタノールとブタン‐１，２‐ジオール；
ここで、示されている混合比の値は、それぞれ、両成分の混合物中の前者の成分の比に関する。
【００２３】
特に好ましい実施形態によると、この指標混合物は、例えば、４０体積％から６０体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールと２‐ブタノール（略−９０℃の融点となる）、３０体積％から７０体積％の混合比のプロパン‐１，２‐ジオールとプロパン‐１，３‐ジオール、又は、３０体積％から７０体積％の混合比のプロパン‐１，３‐ジオールと２‐ブタノールを備える。
【００２４】
また、指標物質は、好ましくは、少なくとも一種のアルコールに加えて、上述のような少なくとも一種の染料も備える。この染料は、特に好ましくは、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、及びローダミンＢから成る群から選択される。
【００２５】
より具体的な実施形態では、指標物質が、プロパン‐１，３‐ジオール、プロパン‐１，２‐ジオール、及び２‐ブタノールから選択された二種のアルコール（ａ）及び（ｂ）を備え、好ましくは上述の混合比で備え、また、オイルレッド、メチルレッド、ブリリアントグリーン、及びローダミンＢから成る群から選択された染料を備えることを特徴とする。
【００２６】
アルコール成分中の染料の濃度は、染料とアルコールとに応じて、大きく異なり得る。
【００２７】
強力な着色の場合には、一般的に、濃度は可能な限り低く保たれることが望ましく、染料分子が、それが溶解されるアルコールの凝固及び融解の特性を変化させたり、粘度を増大させたりしないようにする。染料の濃度は、典型的には、＜１０体積％、特に＜１体積％又は＜０．１体積％の範囲、つまり、１０００分の１又はそれ以下の範囲内にある。
【００２８】
本発明の一変形例では、監視される閾値温度は、指標物質の融点に直接対応せず、融点を超える温度に対応し、その温度において、必要とされる液体の移動を可能とする程度にまで融解した物質の粘度が下がるものとする。
【００２９】
この温度も閾値温度と称され、典型的には、公称の融点より３〜３０℃、又は５〜３０℃、例えば３〜１０℃、３〜２０℃、５〜１０℃、又は５〜２０℃高い温度範囲にある。
【００３０】
従って、有利な一実施形態によると、指標物質は、その融点より３〜３０℃又は５〜３０℃高い温度範囲において液体混合物が、１０から１０６ｍＰａ×ｓ、好ましくは１０から１０４ｍＰａ×ｓの範囲内の粘度を有することを特徴とする。
【００３１】
好ましい一実施形態によると、凍結した固体の指標物質を有する領域は、コーティングを備えるもの、粗面化されたもの、及び／又は、構造化されたものである。例えば、凍結した固体の指標物質を有する領域は、付着性を向上させる構造のコーティングを備えてもよい。その結果として、凍結した固体の指標物質の付着性が改善される。
【００３２】
更なる態様によると、凍結した固体の指標物質を有する領域はミラー化されたものであり得る。この変形例によると、指標物質は、サンプル容器の外壁のミラー化された領域上で固体に凍結する。本実施形態の場合、特に確実に、測定装置によって又は単純に目視で指標物質の形状構成変化を検出することができる。
【００３３】
更なる態様によると、凍結した固体の指標物質を有する領域は電極配置構成体を有し得る。電極配置構成体は、例えば金又は白金の電極として実現され得る。この変形例によると、指標物質は電極配置構成体上で固体に凍結して、特に電極配置構成体を介して測定可能な抵抗又はインピーダンスが、指標物質が電極構成体上に位置しているか否かに依存するようにする。測定された抵抗に基づいて、指標物質が元々の適用箇所で電極配置構成体上で固体に凍結しているか、又は、指標物質が、その融点を超えて液体になった結果として電極配置構成体の領域から流れ出しているかを決定することができる。
【００３４】
サンプル容器に加えて、電極配置構成体の抵抗又はインピーダンスを検出するように形成された測定装置を更に提供し得る。
【００３５】
特に有利には、指標物質がサンプル容器の外面上に所定の配置構成で適用される。サンプル容器の外面の領域で固体に凍結する指標物質は、指標物質の融点を超えた際に、例えば重力の影響下で変化する特定の配置構成を有する。その配置構成は、数字、文字、記号、マーカー、及び／又は使用者が目視で簡単に見て取れる他の構造を示し得る。その配置構成が低温保管後に明らかに変化していないのであれば、低温保管中に指標物質の融点を超えていないことになる。配置構成が変化しているか失われているのであれば、これに基づいて、融点、つまりは臨界的な閾値温度を超えたと決定することができる。使用者は目視検査によって簡単に、融点又は監視される閾値温度を望ましくなく超えた温度上昇が生じたかどうかを確かめることができる。
【００３６】
更なる態様によると、外面に適用された指標物質は、指標物質の固体に凍結した滴（ドロップ）で得られ得る。これは、例えば、滴射出デバイスを用いて、適用される指標物質の正確な投与と、指標物質の適切な配置とを可能にする。
【００３７】
好ましい更なる実施形態によると、それぞれ−２０℃から−１４０℃の範囲内の異なる融点の複数の異なる指標物質を、サンプル容器の外面の異なる領域に適用し得る。これは、低温保管中に複数の温度閾値を監視することができるという利点や、サンプルが達した到達温度範囲をより正確に制限することができるという利点を有する。
【００３８】
この構成の有利な一変形例では、サンプル容器は低温チューブ（クライオチューブ）であり、融点に関して異なる複数種の異なる指標物質の各々が凍結した固体の滴の列として低温チューブの収容シリンダ上に適用される。異なる指標物質の各々は、帯状、例えば環状の列で配置された滴として、低温チューブの収容シリンダの外面上に配置され、複数種の指標物質は、低温チューブの軸方向に沿って互いにずらして配置される。この配置構成は、変化を目視で確認し易いものである。軸方向は低温チューブの長手方向に対応する。
【００３９】
例えば、指標物質を、軸方向に沿って深く又は高くなるにつれて、その融点が他の指標物質の融点と比較して低くなるように配置することができる。つまり、異なる種の指標物質を、それらの融点の昇順又は降順に従って分類して軸方向に沿って配置することができる。これは、サンプル容器に保管されたサンプルが達した温度範囲を目視で特に簡単に区別することを可能にする。
【００４０】
本発明の更なる実施形態によると、凍結した固体の指標物質は、その表面の少なくとも部分領域に、パターンや表面構造、例えば、成形又は刻印されたパターンを有する。パターンや表面構造は、指標物質が液状化すると失われるか、少なくとも変化し、その存在又は不存在に基づいて、サンプルが少なくとも一時的に融点を超えたかどうかを調べることができる。
【００４１】
本実施形態の有利な一変形例によると、透明又は半透明の保護カバーがパターン及び／又は表面構造の上に配置され得る。結果として、パターンを外部の機械的な損傷から保護することができる。
【００４２】
例えば、パターンや表面構造は刻印パターンであり得る。例えば、刻印パターンは、液体状態の指標物質を型の中で成型して、次いで成型された指標物質を凍結させることによって得られ得る。
【００４３】
本発明の更なる態様によると、凍結保存生体サンプルの温度監視用のデバイスが提供され、本デバイスは、上述のような本発明に係るサンプル容器と、測定装置とを備え、その測定装置は、凍結した固体の指標物質の形状構成変化、特に、形状変化、配置変化、及び／又は位置変化を検出するように形成される。
【００４４】
測定装置は、実施形態に応じて適切に実現され得る。凍結した固体の指標物質を有する領域が電極配置構成体を有する実施形態の場合には、測定装置は、上述のように、電極配置構成体の抵抗又はインピーダンスを測定するように形成され得る。
【００４５】
凍結した固体の指標物質を有する領域がミラー化されたものである実施形態の場合には、測定装置は、例えば、ミラーの上で固体に凍結した指標物質に測定ビーム、例えば電磁波ビームを向けて、ミラーで反射された場合には、反射された測定ビームを検出するように形成され得る。指標物質が融点を超えた場合には、液体状態でサンプル容器上を流れ落ちて、測定ビームがミラー化された表面（以前には凍結した固体の指標物質で覆われていた表面）に直接当たる。測定ビームがミラー化された表面で反射されることを測定装置によって検出することができる。測定装置が反射された測定ビームを検出すると直ぐに、少なくとも一時的に融点を超えたと結論付けることができる。凍結した固体の指標物質がパターンや表面構造を有する実施形態の場合には、測定装置は、例えば、パターンが依然として存在しているか否かを光学的に検出するように構成され得る。同様に、測定装置は、例えば、指標物質の配置構成が依然として存在している否か等を検出するように構成され得る。
【００４６】
サンプル容器との用語は、特に、凍結保存用に構成された容器のことを称する。好ましくは、サンプル容器は、−１４０℃未満の温度の低温適合性プラスチック物質を用いて製造される。プラスチック物質は、変化したり損傷したりせずに繰り返しの温度変化に耐えることができる。プラスチック物質は、好ましくは、正味質量の＜１％（１％未満）、特に正味質量の＜０．１％（０．１％未満）の吸水性能のものが使用される。本発明に係る低温保管要素は、例えば、ポリウレタンやポリエチレンに基づく。
【００４７】
「生体サンプル」との用語は、サンプル容器中で凍結保存され、適切な場合には、懸濁液中にあり及び／又は基質物質と組み合わせられる細胞、組織、細胞成分、生体高分子等の生体物質のことを称する。生体サンプルの一部である生体細胞に付着して受容するように構成されている基質を収容空間内に配置することができる。
【００４８】
本発明の更なる態様によると、凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されるサンプル容器を製造する方法が提供される。本方法は、生体サンプルを収容するように構成されるサンプル容器を提供することを備える。サンプル容器は、好ましくは低温（クライオ）サンプル容器である。
【００４９】
本方法は、サンプル容器の外面の領域に液体状態の指標物質を適用することと、適用された指標物質を凍結させることとを更に備え、その指標物質の融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。
【００５０】
本方法の第一の例示的な実施形態によると、液体状態の指標物質を適用することの前に、サンプル容器を指標物質の融点未満の温度に冷却する。結果として、放出された指標物質を急速に固定に凍結させることができる。
【００５１】
例えば、液体状態の指標物質は、滴堆積デバイス、例えば滴発射デバイスを用いて、深冷されたサンプル容器の外面に滴状に適用され得る。滴発射デバイスは、例えば、圧電性の圧力ノズルや圧電性の圧力ヘッドとして実現されるものであって、当該分野では従来技術において既知のものであるので、本願では詳述しない。
【００５２】
本方法の第二の例示的な実施形態によると、指標物質の適用及びその後の凍結は以下のステップで行われる：
【００５３】
まず、液体状態の指標物質で充填された容器にサンプル容器を部分的に浸漬するステップを行い、指標物質がサンプル容器の外面の一点に付着するようにする。次いで、中空の型の上にサンプル容器を配置するステップを行い、サンプル容器に付着している指標物質が、中空の型の内部空間のエンボス部を埋める。中空の型の中で指標物質が凍結すると、サンプル容器上で凍結した固体の指標物質から中空の型を取り外す。この結果として、中空の型によって指標物質の表面に形成されたエンボス部が露出される。
【００５４】
本発明の更なる態様によると、凍結保存生体サンプルの温度監視用の方法が提供される。本方法は、凍結保存生体サンプルを収容するように構成されるサンプル容器を提供することを備え、そのサンプル容器は、その外面の領域に凍結した固体の指標物質を有し、その指標物質の融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。更に、サンプル容器は、本願に記載されている実施形態及び変形例に従って実現され得る。繰り返しを避けるため、本デバイスに関してのみ開示されている特徴は、本方法に関しても開示されているとみなされるものであって、特許請求可能なものである。サンプル容器は、その収容空間内に凍結保存生体サンプルを有し得る。生体サンプルを凍結保存するために、サンプル容器は、指標物質の融点未満の保管温度で保管され得る。
【００５５】
本方法は、指標物質の融点を一時的に超えることによって指標物質の形状構成変化が生じたかどうか、特に指標物質の形状変化、配置変化、特に位置変化が生じたかどうかを決定することを更に備える。この変化に基づいて、目視検査で、又は技術的に自動化された方法においても、監視される閾値温度を超えたかどうかを決定することができる。
【００５６】
上記本発明の好ましい実施形態及び特徴は互いに組み合わせ可能である。以下、添付図面を参照して、本発明の更なる詳細及び利点について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されたサンプル容器の多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図２】凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されたサンプル容器の多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図３】凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されたサンプル容器の多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図４】凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されたサンプル容器の多様な例示的な実施形態の模式図を示す。
【図５Ａ】液体混合物の融点図を示す。
【図５Ｂ】液体混合物の融点図を示す。
【図６Ａ】液体混合物の融点図を示す。
【図６Ｂ】多種の純液体の融点の表を示す。
【図７】溶媒の混合可能性のマトリクスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
同一の要素や機能的に等価な要素は全図面において同じ参照番号で指称され、一部は個別に記載されていない。
【００５９】
図１Ａは、凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成されたサンプル容器１０の第一の例示的な実施形態を示す。図１Ａは、更に、そのようなサンプル容器１０の製造を極めて模式的に示す。
【００６０】
サンプル容器１０は低温チューブ（クライオチューブ）であり、図１Ａで完全にねじ込まれた状態で示されている。低温チューブは、収容空間２を形成するシリンダ状の収容部１を備え、その収容空間２の中に生体サンプル（バイオサンプル）６が保管される。生体サンプルは細胞懸濁液であり得る。シリンダ状の収容部１はカバー３で閉じられる。低温チューブは基部（底部）４を更に有する。
【００６１】
サンプル容器１０は、図１Ａでは、既に保管温度、例えば、−１４０℃にあるか、少なくとも指標物質８の融点未満の温度にあるものとなっている。低温チューブは、その外面の領域１１に凍結した固体の指標物質１２を有し、その指標物質の融点は−２０℃から−１４０℃の範囲内にある。
【００６２】
この場合、低温保管中に監視される温度閾値に応じて、適切な液体又は液体混合物が指標物質１２として選択される。
【００６３】
適切な液体と液体混合比との選択を介して、その融点は、所望の値、特に−２０℃から−１４０℃の範囲内の所望の値に設定可能である。
【００６４】
例えば、図５Ａは、アルコールと水との混合比の関数として融点のプロファイルを示し、温度低下と共に粘度が適度に増大し、０℃から−１１８℃までの温度範囲をカバーすることができる。例えば、−１１８℃の温度閾値を監視する場合、エタノール比が９３．５％に設定され得る。−６０℃を僅かに下回る値までの融点は、水に水酸化カリウム（ＫＯＨ）を加えることによっても設定可能である、その融点図は図５Ｂに示されている。また、水と不凍剤との混合物を指標物質として用いることもでき、これは図６Ａの融点図に示されている。図６Ｂの表は、単体で又は他の液体との混合物として指標物質に使用可能な更なる純液体の凝固点／融点を列挙している。指標物質に適した更なる液体混合物として、クロロホルム／シクロヘキサンの混合物や、例えば、図７の溶媒の混合可能性のマトリクスから推測可能な他の混合可能な液体が挙げられる
【００６５】
複数の温度閾値を低温保管中に監視したい場合や、サンプルが達する到達温度範囲をより正確に限定することが望まれる場合には、それに応じて、融点の異なる複数の異なる指標物質を用いることができ、これについては、以下で図２に基づいて説明する。
【００６６】
図１Ａに示される低温チューブの領域１１は、軸方向Ａ（図１に垂直矢印で示す）に列で配置されている凍結した固体の滴（ドロップ）１３の形態で指標物質１２を有する。
【００６７】
指標物質１２の滴１３は以下のようにして低温チューブに適用される。液体状態の温まった又は予冷された指標物質８を、滴射出デバイス７、例えば、圧電性の圧力ノズルを用いて低温チューブの領域１１の冷えた表面上に滴として射出する。滴８は極冷表面で凍結して、図１Ａに参照番号１３で示されるようになる。
【００６８】
付着性を改善するため、指標物質を保持する表面領域１１の特性を変更して、滴の優れた濡れ性及び付着性を与えることができるが、これは例えば、領域１１を粗面化することによって、及び／又は、領域１１上に構造や化学的コーティングを施すことによって行われる。
【００６９】
図１Ａに示されるように、滴１３は表面上で凝固する。低温サンプルが保管期間中のある時点で指標物質８の融点を超えると、凍結した滴１３が液状化して一緒になって完全に又は部分的に流れる。そして、図１Ｂに示されるのと同じ様な状態となる。
【００７０】
低温保管後に、指標物質１２が図１Ａに示される状態には最早なく、図１Ｂに模式的に示されるように滴が一緒になって少なくとも部分的に流れてしまっているのであれば、このことから、融点、つまりは臨界的な閾値温度を超えたと結論付けることができる。他方、低温保管後に、指標物質の配置構成が変化していないと分かれば、サンプル６は融点未満において常に適切に保管されていたことになる。
【００７１】
従って、使用者は、融点を超えて、又は監視される閾値温度を超えて望ましくなく温度が上昇したかどうかを目視検査で簡単に決定することができる。
【００７２】
圧電システムを用いて非常に細かい滴を発射することができる場合には、より大きな滴の領域や、文字や、パターンや、即座に認識可能な構造や、バーコードや、他のマーカーをサンプル容器の表面に生成することができる。こうした構造は、指標物質の臨界温度を超えると失われる。例示的な配置構成が図１Ｃ及び図１Ｄに示されている。
【００７３】
図１Ｃに示すサンプル容器１０ａは、その外面の領域１１に凍結した固体の指標物質１２ａを有し、指標物質１２ａは、大きな滴、又は互いに重なって隣同士に規則的に配置された指標物質の複数の凍結した滴１３ａから形成されている。図１Ｄに示すサンプル容器１０ｂは、その外面の領域１１に凍結した固体の指標物質１２ｂを有し、指標物質１２ｂは文字の形態で適用されている。指標物質１２ａ又は１２ｂの配置構成が低温保管中に失われている場合には、閾値温度を少なくとも一時的に超えたと結論付けることができる。
【００７４】
図２Ａも、保管温度にある低温チューブ（クライオチューブ）２０と滴射出デバイス７とを示す。
【００７５】
本例では、図２Ａに示されるように、低温チューブ１の極冷の外面の領域２１上に指標物質の滴８の列が環状の帯として適用されて、固体に凍結している。
【００７６】
図２の例示的な実施形態では、融点が異なる複数種の指標物質２３ａ、２３ｂ、２３ｃが用いられている。単に例として、指標物質２３ａは−６０℃の融点を有し、指標物質２３ｂは−７０℃の融点を有し、指標物質２３ｃは−８０℃の融点を有するものとすることができる。図２Ａに示されるような複数種の指標物質を、上から下の順に融点が下がるようにして低温チューブに適用する場合、それらのうち一つ以上の融点を超えると、その構造に基づいて、温度が許容不能に上昇したことを確認することができる。
【００７７】
図２Ｂは、例として、指標物質２３ａ（図２Ａの上部の滴の環）の融点を超えた場合を示し、図２Ｂでは上部の滴の環のみが下方に流れていて、これは、外部から極めて簡単に検出可能であり、また、生体サンプルの内部を汚染するものでもない。
【００７８】
図３Ａの左側は、図１及び図２と同様の低温チューブ（クライオチューブ）を示し、この場合、電極配置構成体３３、３４、例えば、小型の金又は白金の電極が外面の領域３１に配置され、その上に指標物質３２が適用される。
【００７９】
指標物質３２の融点を超えると、指標物質は電極領域から流れ出し、その結果として、抵抗又はインピーダンスが変化して、これを電極３３、３４の走査によって検出することができる。指標物質３２の融点を超えた場合の低温チューブ３０の状態が図３Ａの右側に示されている。
【００８０】
図３Ｂは一実施形態の低温チューブ３０ａを示し、この場合、ミラー化表面３５ａ、３５ｂが低温チューブの外面の二つの領域３１にそれぞれ配置され、ミラー化表面３５ａ、３５ｂの上に指標物質３２ａ、３２ｂが適用される。指標物質３２ａ、３２ｂがミラー化表面３５ａ、３５上の元々の位置領域に位置したままであるかどうかを、光学的に、目視で、又は測定ビーム１００を用いて確かめることができる。これが当てはまる場合には、指標物質の融点を超えていないことになる。対照的に、図３Ｂの右側は、指標物質３２ａ、３２ｂが融解及び流出の結果としてその領域から離れた状態を示す。従って、この場合、融点、つまりは監視される閾値温度をその監視中に超えたという結論を導き出すことができる。
【００８１】
更に、異なる指標物質を選択して、第一ミラー化表面３５ａ上の指標物質３２ａが監視される第一温度閾値に対応する融点を有し、第二ミラー化表面３５ｂ上の指標物質３２ｂが監視される第二温度閾値に対応する融点を有するようにすることができる。
【００８２】
図４は、図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄの時系列順において、凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成される更なる低温チューブ（クライオチューブ）４０の製造を概略的に示す。
【００８３】
低温バイオバンクで使用されるような典型的な閉じた低温チューブ（クライオチューブ）１の形態のサンプル容器が図４Ａに断面図で示されている。低温チューブは、一般的には、生体サンプル用の収容空間２を備え、その収容空間内に生体物質が入れられる。生体サンプルは、例えば、細胞懸濁液６である。低温チューブは、容器を閉じるカバー３を備え、カバー３は、その上部に嵌め込み部５を有し、自動化の場合には、その嵌め込み部５を介してツール（図示せず）を用いてカバー３を回転させることができる。低温チューブ１は基部（底部）４を有することもでき、その基部に任意でバーコードや他のマーカーが入れられる。この形態では通常は低温コンテナの格納部に垂直に立てて、低温チューブが保管される。
【００８４】
低温チューブは室温と指標物質４２の融点のちょうど上の温度との間の温度に在り得る。指標物質は液状で容器４６内に存在し、図４Ｂに示されるように、その容器に低温チューブの基部４が浸漬される。
【００８５】
この結果として、液状の指標物質４２の部分４２ａが基部４に存在する。或る量の指標物質４２ａを有する低温チューブを構造化された型４４に押し込んで、保管温度にする。結果として、指標物質４２ｂが、型４４の内部空間の表面構造及びエンボス部４５を凹凸逆で呈する。
【００８６】
図４Ｃに示される低温チューブ４０は、その下側に、凍結した固体指標物質を有し、その指標物質の表面の部分領域は、刻印パターン４３又は表面構造を有する。更なる保管中における保護のため、この凝固した構造を、例えば光学的に透明なものとして実現可能なキャップ４７で覆い、カメラシステムや光学的測定ビーム１０１を用いて、この構造を自動的に識別して調べることができるようにする。
【００８７】
指標物質４２ｂに刻印されたパターン４３又は含まれる構造が失われていたり変化している場合には、低温チューブは或る時点において指標物質４２ｂの融点を超えたことになる。このようにして、低温チューブ４０が、凍結保存生体サンプルの温度監視用に構成される。
【００８８】
その後、保管プロセス中の所望の時点において、凍結した固体の指標物質４２ｂを用いて、望ましくなく一時的であっても低温サンプルが温まったかどうかを調べることができる。このため、指標物質４２ｂに刻印されたパターン４３が失われていたり変化していたりするかどうかを調べる。これが当てはまる場合には、監視される閾値温度を超えたと結論付けることができる。
【００８９】
非常に細かい構造要素から粗い構造要素へと流れていくような又は移り変わっていく集団として実現される構造を生成すれば、その構造の変化によって、融点を僅かに超えたことさえも検出することができる。幾何学的に最小で最も細かな構造が最初に変化する。
【００９０】
具体的な例示的な実施形態に関して本発明を説明してきたが、当業者には、本発明の範囲を逸脱せずに多様な変更が可能であり、また等価物との置換が可能であることは明らかである。従って、本発明は開示されている例示的な実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に落とし込まれる全ての例示的な実施形態を含むものである。特に、本発明は、引用先の請求項に関係なく、従属請求項の特徴及び主題の保護も請求するものである。
【符号の説明】
【００９１】
１０、２０、３０、４０  サンプル容器
１１、３１、４１  領域
１２、２２、３２、４２  指標物質
【図１】
2019515284.tif 000003
【図２】
2019515284.tif 000004
【図３Ａ】
2019515284.tif 000005
【図３Ｂ】
2019515284.tif 000006
【図４Ａ】
2019515284.tif 000007
【図４Ｂ】
2019515284.tif 000008
【図４Ｃ】
2019515284.tif 000009
【図４Ｄ】
2019515284.tif 000010
【図５Ａ】
2019515284.tif 000011
【図５Ｂ】
2019515284.tif 000012
【図６Ａ】
2019515284.tif 000013
【図６Ｂ】
2019515284.tif 000014
【図７】
2019515284.tif 000015
【国際調査報告】
2019515284.tif 000016
2019515284.tif 000017
2019515284.tif 000018
2019515284.tif 000019
2019515284.tif 000020
2019515284.tif 000021