(57)【要約】  本発明に係る小豆は、筋肉の機能、筋肉量の増大又は筋肉細胞の分化に関与する遺伝子のmRNA又はタンパク質の発現及び活性を促進させる効果を通じて、筋肉量の増大、筋機能又は運動遂行能力の向上を可能にし、各種疾病により誘発される運動遂行能力低下、筋肉の機能低下、筋肉の損失などを予防、治療又は改善することができ、天然物質として体内の副作用がなく、医薬品又は食品などに効果的に使用することができる。
2019520319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項２】
前記抽出物は、水、C1乃至C6の有機溶媒、亜臨界流体及び超臨界流体からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で小豆を抽出して収得したことを特徴とする請求項１記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項３】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項４】
前記小豆由来のタンパク質は、下記i)乃至v)の段階からなる方法で収得し、前記小豆由来ペプチドは、下記i)乃至vii)段階からなる方法により収得することを特徴とする、請求項３記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物：
i)乾燥した小豆を粉砕してヘキサンを溶媒として抽出する段階;
ii）前記段階i)で抽出したヘキサン抽出物を除去して、残渣に水を加えてpH 7.0乃至10.0の条件で放置する段階、
iii)前記段階ii）で放置した溶液を遠心分離して、上澄み液を収得する段階;
iv）前記段階iii)で収得した上澄み液を、再びpH 2.0乃至6.0の条件で放置する段階、
v)前記段階iv）で放置した溶液を、再び遠心分離して、沈殿した沈殿体を小豆由来タンパク質として収得する段階;
vi）前記段階v)で収得した小豆由来のタンパク質に加水分解酵素を加えて酵素反応した後、濾過して沈殿物を除去する段階；及び
vii)前記段階vi）で沈殿物が除去された濾液を凍結乾燥してペプチドを収得する段階。
【請求項５】
前記段階vi）の加水分解酵素は、アルカラーゼ(Alcalase)、フレーバーザイム(Flavourzyme)、ニュートラーゼ(Neutrase)、プロタメックス(Protamex)及びプロテアーゼ-NP(Protease-NP)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質加水分解酵素からなることを特徴とする請求項４記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項６】
前記小豆は、小豆(V. angularis W.F.Wight)及び黒小豆(V. angularis var. angularis)からなる群から選ばれるいずれか一つ又は二つであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項７】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項８】
前記筋肉疾患は、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項７記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項９】
前記運動遂行能力向上は、退行性疾患、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などからなる群から選ばれる一つ以上の疾病を予防又は治療することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の筋肉疾患の治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項１０】
小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１１】
前記抽出物は、水、C1乃至C4の有機溶媒、亜臨界流体及び超臨界流体からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で小豆を抽出して収得したことを特徴とする請求項１０記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１２】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１３】
前記小豆由来のタンパク質は、下記i)乃至v)の段階からなる方法で収得して、前記小豆由来ペプチドは、下記i)乃至vii)段階からなる方法で収得することを特徴とする請求項１２記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物：
i)乾燥した小豆を粉砕してヘキサンを溶媒として抽出する段階;
ii）前記段階i)で抽出したヘキサン抽出物を除去し、残渣に水を加えてpH 7.0乃至10.0の条件で放置する段階；
iii)前記段階ii）で放置した溶液を遠心分離して、上澄み液を収得する段階;
iv）前記段階iii)で収得した上澄み液を、再びpH 2.0乃至6.0の条件で放置する段階；
v)前記段階iv）で放置した溶液を再び遠心分離して、沈殿した沈殿体を小豆由来タンパク質として収得する段階;
vi）前記段階v)で収得した小豆由来のタンパク質に加水分解酵素を加えて酵素反応した後、濾過して沈殿物を除去する段階；及び
vii)前記段階vi）で沈殿物が除去された濾液を凍結乾燥してペプチドを収得する段階。
【請求項１４】
前記段階vi）の加水分解酵素は、アルカラーゼ(Alcalase)、フレーバーザイム(Flavourzyme)、ニュートラーゼ(Neutrase)、プロタメックス(Protamex)及びプロテアーゼ-NP(Protease-NP)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質加水分解酵素からなることを特徴とする請求項１３記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１５】
前記小豆は、小豆(V. angularis W.F.Wight)及び黒小豆(V. angularis var. angularis)からなる群から選ばれるいずれか一つ又は二つであることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項１６】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１７】
前記筋肉疾患は、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１６記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１８】
前記運動遂行能力向上は、退行性疾患、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などからなる群から選ばれる一つ以上の疾病を予防又は治療することを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１９】
筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上のための、小豆抽出物を有効成分として含む薬学的組成物の使用。
【請求項２０】
筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上のための、小豆由来タンパク質又はペプチドを有効成分として含む薬学的組成物の使用。
【請求項２１】
筋機能改善又は運動遂行能力向上のための、小豆抽出物を有効成分として含む食品組成物の使用。
【請求項２２】
筋機能改善又は運動遂行能力向上のための、小豆由来タンパク質又はペプチドを有効成分として含む食品組成物の使用。
【請求項２３】
小豆(Vigna angularis)抽出物を、必要とする個体に投与する段階を含む筋肉疾患治療方法。
【請求項２４】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを、必要とする個体に投与する段階を含む筋肉疾患治療方法。
【請求項２５】
小豆(Vigna angularis)抽出物を、必要とする個体に投与する段階を含む運動遂行能力向上方法。
【請求項２６】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを、必要とする個体に投与する段階を含む運動遂行能力向上方法。
【請求項２７】
小豆(Vigna angularis)抽出物を、必要とする個体に投与する段階を含む筋機能改善方法。
【請求項２８】
小豆由来タンパク質又はペプチドを、必要とする個体に投与する段階を含む筋機能改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年5月2日に出願された韓国特許出願第10-2016-0054290号及び2017年5月2日に出願された韓国特許出願第10-2017-0056162号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は、参照により本出願に援用する。
【０００２】
本発明は、小豆抽出物、小豆由来のタンパク質及び小豆由来ペプチドを有効成分として含有する、筋機能改善又は運動遂行能力向上用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
筋萎縮（Muscle atrophy）とは、筋肉量の漸進的減少により発生するもので、筋肉の弱化及び退行を意味する(非特許文献１)。筋萎縮は、不活動、酸化的ストレス又は慢性炎症などにより促進され、筋肉の機能と運動能力を弱化させる(非特許文献２)。
【０００４】
これと関連して、筋肉の機能を決定する最も重要な要素は筋肉量であり、これは筋タンパク質合成と分解の均衡により維持される。筋萎縮症は、タンパク質分解が合成よりも多く起こるときに発生する（非特許文献３）。
【０００５】
筋肉の大きさは、筋肉内で起こる同化作用(anabolism)や異化作用(catabolism)を誘導する細胞内信号伝達経路(signaling pathways)によって調節され、筋タンパク質の分解より合成を誘導する信号伝達反応が多く起こる場合は筋タンパク質合成が増加されるが、これは筋タンパク質の増加に伴う筋肉の大きさの増加(hypertrophy、筋肥大)や筋線維数の増加(hyperplasia)で示される(非特許文献４)。
【０００６】
筋肥大誘導因子は、筋肉細胞内でホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）／Akt経路（phosphatidylinositol-3 kinase/Akt pathway）の刺激を起点に、ダウンストリームタンパク質（downstream proteins)をリン酸化させることにより、タンパク質の合成を誘導する。このうちPI3K/Akt信号伝達による哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mammalian target of rapamycin（mTOR））の活性は、細胞内で多様な成長信号を統合する主要な増殖信号伝達メカニズムとして認められている。mTORの活性化は、二つのダウンストリームターゲット（downstream targets）である4E結合タンパク質（4E-binding protein（4EBP1)）とリン酸化70kDaリボソームS6キナーゼ（phosphorylated 70-kDa ribosomal S6 kinase（p70S6K））を活性化させることにより、筋タンパク質合成を誘導して、筋肉量増加に寄与することができる（非特許文献４、非特許文献５）。
【０００７】
これとは逆に、転写因子(transcription factor)であるフォークヘッドボックス（forkhead box(FoxO)）が細胞質から核内に移動すると、タンパク質分解に関与するE3ユビキチンリガーゼ因子であるアトロジン-1(atrogin-1)とMuRF-1の発現を増加させる（非特許文献６）。これらの発現量が増加すると、筋肉内のタンパク質分解が促進されて、筋肉量が減ることになる。従って、mTORの活性促進と、アトロジン-1（atrogin-1）及びMuRF-1の発現抑制は、筋タンパク質の量を増加させることになる。
【０００８】
この他にも、筋肉細胞の分化と筋肉の形成は、多様な筋肉調節因子(muscle regulatory factors)によって調節される。その中で、MyoDは、myogeninの発現誘導を通じて、筋芽細胞（myoblast）が筋管細胞（myotube)になる過程を促進させる。このような過程を経て形成された筋繊維は、束をなして、最終的に筋肉を形成するようになる(非特許文献７)。
【０００９】
代表的な豆類の一つである小豆(Vigna angularis)は、双子葉植物であるマメ科（Fabaceae）のササゲ属（Vigna spp.）に属する一年草であって、代表的な豆類作物である。小豆はビタミンB1が豊富で、米と混合してご飯を炊けば、米飯に不足しがちなビタミンを供給してくれて、脚気だけでなく、疲労回復にも効果があることが知られている。小豆に含まれたサポニンは、繊維質と共に、便通を助け、毒を除き、排便を促進して腸をきれいにする効果があり、腎臓病や二日酔いの改善にも利用される（非特許文献８）。また、小豆は抗酸化（非特許文献９）、抗糖尿（非特許文献１０）、抗菌（非特許文献１１）、美白（非特許文献１２）などの活性が報告されているが、筋機能改善と関連した効能については報告されていない。
【００１０】
そこで、本発明者らは、植物抽出物由来の、筋萎縮などの筋肉の機能低下と関連した疾病の治療剤を開発するために努力した結果、小豆又はマメ科植物の抽出物が、筋肉細胞において、筋タンパク質合成、及び筋肉量増加と関連したタンパク質の発現、及びリン酸化水準を増加させることができ、本発明の小豆又は小豆抽出物は、筋肉疾患の予防及び治療用又は筋機能改善用組成物の有効成分として使用できることを確認して、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Cell, 119(7): 907-910, 2004
【非特許文献２】Clinical Nutrition, 26(5): 524-534, 2007
【非特許文献３】The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 37（10）：1985-1996, 2005
【非特許文献４】The Korea Journal of Sports Science, 20(3): 1551-1561, 2011
【非特許文献５】The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 43（9）：1267-1276, 2011
【非特許文献６】Disease Models＆Mechanisms, 6：25-39, 2013
【非特許文献７】Cellular and Molecular Life Sciences, 70: 4117-4130, 2013
【非特許文献８】Korean Journal of Food Science and Technology, 42（6)：693-698, 2010
【非特許文献９】Journal of Food Lipids 11（4)：278-286, 2004
【非特許文献１０】Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 68（12）：2421-2426, 2004
【非特許文献１１】Phytotherapy Research 20（2)：162-164, 2006
【非特許文献１２】International Journal of Molecular Sciences, 12（10）：7048-7058, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明者らは、筋機能改善又は運動遂行能力向上活性を有し、安全に適用することができる天然物質を探索した結果、小豆から筋機能改善又は運動遂行能力向上活性があることを確認して本発明を完成した。
【００１３】
従って、本発明の目的は、小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋肉疾患の治療又は運動遂行能力向上用組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、小豆抽出物を有効成分として含む、筋機能改善用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋機能改善用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
前記課題を解決するための手段として、本発明は、小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患の治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物を提供する。
前記課題を解決するためのさらに他の手段として、本発明は、小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋機能改善用組成物を提供する。
また、本発明は、小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋機能改善用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
従って、本発明は、小豆抽出物、小豆由来タンパク質又は小豆由来ペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患の予防及び治療用、筋機能改善用、又は運動遂行能力向上用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の小豆抽出物は、筋肉細胞において、筋肉の機能、筋肉量の調節又は筋肉細胞の分化に関与する因子のmRNA転写水準及びタンパク質活性を促進させ、筋肉量増大に起因する筋機能又は運動遂行能力の向上を可能にして、多様な疾病により誘発される運動遂行能力の低下、筋機能低下、筋肉損失などの予防、治療又は改善効果を示すことができる。また、本発明の小豆抽出物、小豆由来のタンパク質及び小豆由来ペプチドは、天然物質として体内の副作用がないため、医薬品又は食品などに効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、L6筋肉細胞において、小豆エタノール抽出物の処理によるmTORの活性を測定した結果を示す。
【図２】図2は、L6筋肉細胞において、小豆エタノール抽出物の処理によるmRNA翻訳関連バイオマーカーp-p70S6K及びp-4EBP1のタンパク質発現量を測定した結果を示す。
【図３】図3は、L6筋肉細胞において、小豆エタノール抽出物の処理による筋タンパク質の分解促進バイオマーカーMuRF-1及びアトロジン-1（atrogin-1）のmRNA発現量を測定した結果を示す。
【図４】図4は、L6筋肉細胞において、小豆エタノール抽出物の処理による筋肉分化バイオマーカーMyoD及びmyogeninのmRNA発現量を測定した結果を示す。
【図５】図5は、L6筋肉細胞において、小豆熱水抽出物の処理によるmTORの活性を測定した結果を示す。
【図６】図6は、L6筋肉細胞において、小豆亜臨界抽出物の処理によるmTORの発現水準を測定した結果を示す。
【図７】図7は、L6筋肉細胞において、小豆のタンパク質及び酵素反応による小豆ペプチドの処理によるmTORの発現水準を測定した結果を示す。
【図８】図8は、L6筋肉細胞において、小豆ペプチド処理によるmRNA翻訳関連バイオマーカーp-p70S6K及びp-4EBP1のタンパク質発現量を測定した結果を示す。
【図９】図9は、L6筋肉細胞において、小豆ペプチド処理による筋肉分化バイオマーカーMyoD及びmyoeninのmRNA発現量を測定した結果を示す。
【図１０】図10は、L6筋肉細胞において、黒小豆のエタノール抽出物の処理によるmTORの活性を測定した結果を示す。
【図１１】図11は、COS-7腎臓細胞において、小豆エタノール抽出物の処理によるPGC-1αの活性を測定した結果を示す。
【図１２】図12は、L6筋肉細胞において、小豆エタノール抽出物の処理によるミトコンドリア生合成バイオマーカーPGC-1α、ERRα、NRF-1、及びTfamのmRNA発現量を測定した結果を示す。
【図１３】図13は、L6筋肉細胞において、小豆のタンパク質及び酵素反応による小豆ペプチドの処理によるPGC-1αの活性を測定した結果を示す。
【図１４】図14は、L6筋肉細胞において、小豆ペプチド処理によるミトコンドリアの生合成バイオマーカーPGC-1α、ERRα、NRF-1、及びTfamのmRNA発現量を測定した結果を示す。
【図１５】図15は、COS-7腎臓細胞において、黒小豆エタノール抽出物の処理によるPGC-1αの活性を測定した結果を示す。
【図１６】図16は、筋萎縮誘導ラットにおいて、小豆エタノール抽出物の処理による筋力を測定した結果を示す。
【図１７】図17は、筋萎縮誘導ラットにおいて、小豆エタノール抽出物の処理による持久力を測定した結果を示す(ａ：運動時間、ｂ：運動の距離)。
【図１８】図18は、筋萎縮誘導ラットにおいて、小豆エタノール抽出物の処理による前脛骨筋の重量を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００２１】
本発明は、小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋肉疾患の治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物を提供する。
【００２２】
本明細書で「小豆(Vigna angularis)」とは、双子葉植物のマメ科(Fabaceae)のササゲ属（Vigna spp.)に属する、小豆（V. angularis W.F.Wight）、黒小豆（V. angularis var．angularis)又はその他の植物の種子を乾燥したもので、これらを単独で使用してもよく、混合して使用してもよい。
【００２３】
本明細書で“小豆抽出物”とは小豆を抽出して収得した抽出物を意味する。小豆抽出物の製造方法は、水、C1乃至C6の有機溶媒、亜臨界流体及び超臨界流体からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で、小豆を抽出して収得することができる。より具体的には、前記溶媒は、炭素数1乃至6のアルコール(alcohol)、アセトン(acetone)、エーテル(ether)、ベンゼン(benzene)、クロロホルム(chloroform)、エチルアセテート(ethyl acetate)、メチレンクロライド(methylene chloride)、ヘキサン(hexane)、シクロヘキサン(cyclohexane)及び石油エーテル(petroleum ether)からなる群から選ばれる一つ以上であってもよい。
【００２４】
より具体的には、前記抽出物は、下記の段階を含む製造方法により製造されることが好ましいものの、これに限定されない：
1)小豆に抽出溶媒を加えて抽出する段階;
2)段階1)の抽出物を濾過する段階；及び
3)段階2)の濾過した抽出物を減圧濃縮した後、乾燥する段階。
【００２５】
前記方法において、段階1)の小豆は栽培したもの、又は市販されているものなど制限なく使用することができる。
前記方法において、小豆抽出物の抽出方法としては、濾過法、熱水抽出、浸漬抽出、還流冷却抽出、超音波抽出、超高圧抽出及び亜臨界抽出など、当業界の一般的な方法を利用することができる。抽出方法と関連して、前記超高圧抽出を遂行する場合、100乃至500MPaの圧力で抽出することが望ましい。
【００２６】
前記方法において、段階3)の減圧濃縮は、真空減圧濃縮器又は真空回転蒸発器を利用することが好ましいものの、これに限定しない。また、乾燥は減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥することが好ましいが、これに限定しない。
【００２７】
また、本発明は、小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物を提供する。
【００２８】
本明細書で、「小豆由来のタンパク質」とは、下記のi)乃至v)段階からなる方法で収得することができる：
i)乾燥した小豆を粉砕してヘキサンを溶媒として抽出する段階;
ii）前記段階i)で抽出したヘキサン抽出物を除去し、残渣に水を加えてpH 7.0乃至10.0の条件で放置する段階；
iii)前記段階ii）で放置した溶液を遠心分離して、上澄み液を収得する段階;
iv）前記段階iii)で収得した上澄み液を、再びpH 2.0乃至6.0の条件で放置する段階；及び
v)前記段階iv）で放置した溶液を再び遠心分離して、沈殿した沈殿体を小豆由来のタンパク質として収得する段階。
【００２９】
本明細書で、「小豆由来ペプチド」とは、小豆から分離した小豆タンパク質に、タンパク質加水分解酵素を処理して収得したことを意味する。具体的には、小豆由来のペプチドは、下記i)乃至vii)段階からなる方法で収得することができる：
i)乾燥した小豆を粉砕してヘキサンを溶媒として抽出する段階;
ii）前記段階i)で抽出したヘキサン抽出物を除去し、残渣に水を加えてpH 7.0乃至10.0の条件で放置する段階；
iii)前記段階ii）で放置した溶液を遠心分離して、上澄み液を収得する段階;
iv）前記段階iii)で収得した上澄み液を、再びpH 2.0乃至6.0の条件で放置する段階；
v）前記段階iv）で放置した溶液を再び遠心分離して、沈殿した沈殿体を小豆由来のタンパク質として収得する段階;
vi）前記段階v)で収得した小豆由来のタンパク質に加水分解酵素を加えて酵素反応させた後、濾過して沈殿物を除去する段階；及び
vii)前記段階vi）で沈殿物が除去された濾過液を凍結乾燥してペプチドを収得する段階。
本明細書で、前記「加水分解酵素」とは、アルカラーゼ（Alcalase）、フレーバーザイム（Flavourzyme)、ニュートラーゼ（Neutrase）、プロタメックス（Protamex）及びプロテアーゼ-NP(Protease-NP)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質加水分解酵素であってよい。
【００３０】
本明細書で、筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患で、当業界で報告された疾病であることが望ましい。前記筋肉消耗又は筋肉退化は、遺伝的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋又は随意筋及び心筋の弱化及び退行を特徴とする。これと関連した疾患の例としては、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋肉退化、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)などを挙げることができる。本発明の組成物は、筋肉量の増大効果があり、筋肉はその種類を制限しない。
【００３１】
本明細書で、「筋」とは、テンドン(tendon)、筋肉、腱を包括的に指称し、「筋機能」又は「筋肉機能」とは、筋肉の収縮によって力を発揮できる能力を意味し、筋肉が抵抗に打ち克つために最大限の収縮力を発揮できる筋力；筋肉が与えられた重量にどれほど長く又はどれほどの回数の収縮と弛緩を繰り返すことができるかを示す能力である筋持久力；及び短時間に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。前記筋機能は、筋肉量に比例し、用語「筋機能改善」とは、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
【００３２】
本明細書で、「運動遂行能力」とは、日常生活やスポーツで見られる身体動作を、外形的にランニング、跳ぶこと、投げること、水泳などに区分すると、前記の動作を速く、強く、正確に、長い間、上手に遂行できる程度を示すもので、運動遂行能力は、筋力、敏捷性及び耐久力(持久力)などの因子で規定される。用語「運動遂行能力向上」とは、運動遂行能力を改善したり向上させたりすることを意味する。
【００３３】
本発明の組成物が、運動遂行能力向上用薬学的組成物である場合、運動能力の退化に因る疾患の予防又は治療に使用することができる。これと関連した疾患の例としては、退行性疾患、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などを挙げることができる。本発明の組成物は、運動遂行能力向上効果があって、運動の形態及び種類を制限しない。
【００３４】
本発明の筋機能改善用薬学的組成物の場合、筋肉消耗又は退化に因る筋肉疾患の予防又は治療に使用することができる。筋肉消耗及び退化は遺伝的要因、後天的要因、老化などを原因に発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋又は随意筋及び心筋の弱化及び退行を特徴とする。これと関連した疾患の例としては、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋肉退化、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)などを挙げることができる。本発明の組成物は筋肉量の増大効果があり、筋肉はその種類を制限しない。
【００３５】
本発明の運動遂行能力向上用薬学的組成物の場合、運動能力退化に因る疾患の予防又は治療に使用することができる。これと関連した疾患の例としては、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などを挙げることができる。本発明の組成物は、運動遂行能力向上効果があって運動の形態及び種類を制限しない。
【００３６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。薬学的に許容可能な担体には、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体をさらに含むことができる。経口投与用担体は、ラクトース、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などを含むことができる。また、非経口投与用担体は、水、適切な油、食塩水、水性グルコース及びグリコールなどを含むことができる。また、安定化剤及び保存剤をさらに含むことができる。適切な安定化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適切な保存剤には、塩化ベンザルコニウム、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体としては、次の文献に記載されていることを参考にすることができる（Remington's Pharmaceutical Sciences、19th ed.、Mack Publishing Company、Easton、PA、1995）。
【００３７】
本発明の薬学的組成物は、ヒトを初めとする哺乳動物にいかなる方法でも投与することができる。例えば、経口又は非経口投与することができ、非経口的な投与方法には、これに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与であってよい。
【００３８】
本発明の薬学的組成物は、上述したような投与経路により、経口投与用又は非経口投与用の製剤に製剤化することができる。製剤化する場合には、1つ以上の緩衝剤(例えば、生理食塩水またはPBS)、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤(例えば、EDTAまたはグルタチオン)、充填剤、増量剤、結合剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、懸濁剤、濃厚剤、湿潤剤、崩解剤又は界面活性剤、希釈剤、又は賦形剤を使用して調剤することができる。
【００３９】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液又はカプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、本発明の薬学的組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤の例を挙げれば、澱粉(コンスターチ、小麦澱粉、米澱粉、ジャガイモ澱粉などを含む)、炭酸カルシウム(calcium carbonate)、スクロース(sucrose)、ラクトース(lactose)、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロース又はゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。例えば、活性成分を固体賦形剤と配合し、これを粉砕して適切な補助剤を添加した後、顆粒混合物に処理することにより、錠剤又は糖衣錠剤を得ることができる。
【００４０】
単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤又はシロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤の水又は液体パラフィン以外に、多様な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、又は保存剤などが含まれる。また、場合によっては架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はアルギン酸ナトリウムなどを崩解剤に添加することができ、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、及び防腐剤などをさらに含むことができる。
【００４１】
非経口的に投与する場合、本発明の薬学的組成物は、適切な非経口用担体と共に注射剤、経皮投与剤及び鼻腔吸込剤の形で、当業界に公知された方法により剤形化することができる。前記注射剤の場合には必ず滅菌する必要があり、バクテリア及び真菌のような微生物の汚染から保護されるべきである。注射剤の場合、適切な担体の例としては、これに限定はされないが、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質であってよい。より好ましくは、適切な担体には、ハンクス溶液、リンゲル液、トリエタノールアミンが含有されたリン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline (PBS)）又は注射用滅菌水、10％エタノール、40％プロピレングリコール及び5％デキストロースのような等張溶液などを使用することができる。前記注射剤を微生物汚染から保護するためには、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような多様な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含むことができる。また、前記注射剤は、殆どの場合、糖又は塩化ナトリウムのような等張化剤をさらに含むことができる。
【００４２】
経皮投与剤の場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニメント剤、エアロゾルなどの形態が含まれる。前記「経皮投与」とは、薬学的組成物を局所的に皮膚に投与して、薬学的組成物に含有された有効な量の活性成分が皮膚内に送達されることを意味する。
【００４３】
吸込投与剤の場合、本発明に基づいて使用される化合物は、適切な推進剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用して、加圧パック又は煙霧器からエアロゾルスプレーの形態で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は計量された量を送達する弁を提供して決定することができる。例えば、吸込器又は取込器に使用されるゼラチンカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤の粉末混合物を含有するように製剤化することができる。非経口投与用剤形は、全ての製薬化学に一般的に公知された処方書の文献（Remington's Pharmaceutical Science、15th Edition、1975、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvania 18042、Chapter 87：Blaug、Seymour)に記載されている。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを有効量で含むとき、望ましい筋機能改善効果又は運動遂行能力向上効果を提供することができる。本明細書で「有効量」とは、陰性対照群に比べてそれ以上の反応を示す量を意味し、好ましくは筋機能を向上させるか又は、運動遂行能力を向上させるに十分な量を意味する。本発明の薬学的組成物には、小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドが0.01乃至99.99％含まれることができ、残量は薬学的に許容可能な担体が占めることができる。本発明の薬学的組成物に含まれる小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドの有効量は、組成物が製品化される形態などにより変わる。
【００４５】
本発明の薬学的組成物の総有効量は、単一投与量(single dose)で患者に投与することができ、多重投与量(multiple dose)で長期間投与される分割治療方法(fractionated treatment protocol)により投与することもできる。本発明の薬学的組成物は疾患の程度によって有効成分の含量を異にすることができる。非経口投与時には、前記小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを基準に１日に体重１kg当たり好ましくは0.01乃至50mg、より好ましくは0.1乃至30mgの量で投与するように、さらに、経口投与時には、小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを基準に１日に体重１kg当たり好ましくは0.01乃至100mg、より好ましくは0.01乃至10mgの量で投与するように、１乃至数回に分けて投与することができる。しかし、前記小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドの容量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患重症度、食餌及び排泄率など、多様な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらの点を考慮して、当分野の通常の知識を有する者であれば、小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを筋機能改善又は運動遂行能力増強のための特定の使用による適切な有効投与量を決定することができる。本発明に係る薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法は特に制限されない。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、単独で、もしくは手術、放射線治療、ホルモン療法、化学療法、又は生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００４７】
本発明の薬学的組成物は、小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを有効成分として含む外用剤の剤形で提供することができる。
【００４８】
本発明の薬学的組成物を皮膚外用剤として使用する場合、追加で脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤(foaming agent)、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型乳化剤、非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮蔽剤、湿潤化剤、エッセンシャルオイル、染料、顔料、親水性活性剤、親油性活性剤又は脂質小胞など、皮膚外用剤に一般的に使用される任意の他の成分など、皮膚科学分野で一般的に使用される補助剤を含有することができる。また、前記成分は、皮膚科学分野で一般的に使用される量で導入することができる。
【００４９】
本発明の薬学的組成物が皮膚外用剤として提供される場合、これに限定されるものではないが、軟膏、パッチ、ゲル、クリーム又はスプレーなどの剤形であってよい。
【００５０】
また、本発明の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物を提供する。
【００５１】
本発明の食品組成物が筋機能改善用食品組成物である場合、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患として当業界に報告された疾病の予防又は改善に使用することができる。前記筋肉消耗又は退化は遺伝的要因、後天的要因、老化などを原因として発生し、筋肉消耗は、筋肉量の漸進的損失、筋肉、特に骨格筋又は随意筋及び心臓の筋肉の弱化及び退行を特徴とする。これと関連した疾患の例には、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋肉退化、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)などを挙げることができる。本発明の組成物は、筋肉量の増大効果があって、筋肉はその種類を制限しない。前記筋機能は、筋肉量に比例しており、用語「筋機能改善」とは、筋機能をより肯定的な方向に向上させることを意味する。
【００５２】
本発明の食品組成物が運動遂行能力向上用食品組成物である場合、運動能力の退化に因る疾患の予防又は治療に使用することができる。これと関連した疾患の例には、退行性疾患、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などを挙げることができる。本発明の組成物は、運動遂行能力向上効果があって、運動の形態及び種類を制限しない。
【００５３】
本発明の食品組成物は、機能性食品(functional food)、栄養補助剤(nutritional supplement)、健康食品(health food)、食品添加剤(food additives)及び飼料などの全ての形態を含めて、ヒト又は家畜を初めとする動物を取食対象とする。前記類型の食品組成物は、当業界に公知された一般的な方法により、多様な形態で製造することができる。
【００５４】
前記類型の食品組成物は、当業界に公知された通常的な方法により、多様な形態で製造することができる。一般食品には、これに限定はされないが、飲料(アルコール性飲料を含む)、果実及びその加工食品(例：果物缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレードなど)、魚類、肉類及びその加工食品(例：ハム、ソーセージ、コンビーフなど)、パン類及び麺類(例：うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニなど)、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品(例：バター、チーズなど)、食用植物油脂、マーガリン、植物性タンパク質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料(例：味噌、醤油、ソースなど)などに前記小豆抽出物及び小豆ペプチドを添加して製造することができる。また、栄養補助剤としては、これに限定はされないが、カプセル、錠剤、丸剤などに小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを添加して製造することができる。また、健康機能食品としては、これに限定はされないが、例えば、前記小豆抽出物自体をお茶、ジュース及びドリンクの形態で製造して飲用(健康飲料)できるように液状化、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。また、前記小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを食品添加物の形態で使用するために、粉末又は濃縮液形態で製造して使用することができる。また、前記小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドと、筋機能改善又は運動遂行能力の向上効果があると知られている公知の活性成分とを一緒に混合して、組成物の形態で製造することができる。
【００５５】
本発明の筋機能改善又は運動遂行能力向上用組成物が健康飲料組成物として利用される場合、前記の健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースなどのジサッカリド；デキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類；キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールであってよい。甘味剤は、ソーマチン、ステビア抽出物などの天然甘味剤；サッカリン、アスパルテームなどの合成甘味剤などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物100 mL当たり、一般的に約0.01〜0.04 g、好ましくは約0.02〜0.03 gである。
【００５６】
小豆抽出物、小豆タンパク質又は小豆ペプチドを筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物の有効成分として含有することができるが、その量は筋機能改善又は運動遂行能力向上用作用達成に有効な量で、特に限定されるものではないが、全体組成物の総重量に対して、0.01乃至100重量％であることが望ましい。本発明の食品組成物は、小豆抽出物と共に筋機能改善又は運動遂行能力向上用組成物に効果があることが知られた他の活性成分と一緒に混合して製造することができる。
【００５７】
前記の他に本発明の健康食品は、種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、又は炭酸化剤などを含有することができる。その他に本発明の健康食品は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、又は野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は、単独で、又は混合して使用することができる。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物100重量部当たり0.01〜0.1重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例、実験例及び製造例を通じて、より詳細に説明する。
【００５９】
但し、下記の実施例、実験例及び製造例は本発明を例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例、実験例及び製造例に限定されるものではない。
【００６０】
［実施例１]小豆抽出物の製造
＜１−１＞小豆のメタノール抽出物製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕した後、粉砕した小豆の粉末100 gを100％メタノール1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン（Whatman)2番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した小豆メタノール抽出物を収得した。
【００６１】
＜１−２＞小豆のエタノール抽出物製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕し、粉砕した小豆の粉末100 gを100％、70％、50％又は30％エタノール1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した小豆エタノール抽出物を収得した。
【００６２】
＜１−３＞小豆のエチルアセテート抽出物製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕し、粉砕した小豆の粉末100 gを100％エチルアセテート1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した小豆エチルアセテート抽出物を収得した。
【００６３】
＜１−４＞小豆のヘキサン抽出物製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕し、粉砕した小豆の粉末100 gを100％ヘキサン1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した小豆ヘキサン抽出物を収得した。
【００６４】
＜１−５＞小豆の熱水抽出物製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕し、粉砕した小豆の粉末100 gを水1Lに入れて、80℃で2時間攪拌して抽出液を収得した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過し、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した小豆熱水抽出物を得た。
【００６５】
＜１−６＞小豆超高圧抽出物の製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕した後、18％エタノール76mLをポリエチレン(polyethylene)パックに入れて密封した後、超高圧抽出装置(Frescal MFP-7000; Mitsubishi Heavy Industries, Tokyo, Japan)を利用して抽出した。超高圧抽出条件として抽出圧力を320 MPa、抽出時間は5分に設定した。抽出された試料は、ワットマン２番濾紙で濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去することにより、小豆超高圧抽出物を得た。
【００６６】
＜１−７＞小豆亜臨界抽出物の製造
乾燥した小豆(Vigna angularis W.F.Wight)をミキサーで粉砕し、粉砕した小豆50 gを1Lの水と一緒に亜臨界抽出装置(Biovan, Gyeonggi, Korea)の亜臨界水反応器に入れて密閉した。密閉した後、反応器の温度を200℃まで上昇させ、反応器の温度が200℃に達したところで、前記温度を20分間維持して抽出を行った。20分後、抽出物を冷却水が供給される貯蔵タンクに移送して、30℃まで急速冷却した後、浮遊残渣を分離するために3,600 rpmで30分間遠心分離して上澄み液のみを得た。凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)を利用して溶媒を完全に除去することにより、小豆亜臨界抽出物を得た。
【００６７】
［実施例２］小豆由来タンパク質及びペプチドの分離
＜２−１＞小豆由来タンパク質の分離
乾燥した小豆(V. angularis W.F.Wight)を粉砕した後、粉砕した小豆試料1kgを1Lヘキサンに入れて常温で4時間攪拌しながら抽出した。ヘキサン抽出物を除去した後、残渣に水を入れて、pH 9で、25〜30分間放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して上澄み液を取り、上澄み液をpH 4.5で、25〜30分間再び放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して沈殿したタンパク質を収得し、沈殿したタンパク質を水に溶かして、中性化過程を経て、凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea) を利用して水を完全に除去することにより、分離した小豆タンパク質を収得した。
【００６８】
＜２−２＞アルカラーゼ（Alcalase）処理による小豆ペプチドの製造
実施例<2-1>で収得した小豆タンパク質に、タンパク質分解酵素である1％アルカラーゼ(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)を加えて、50℃で6時間酵素反応をさせた。6時間後に90℃で20分間酵素を不活性化させ、ワットマン２番濾紙で濾過して、沈殿物を除去した。濾過された液体を、凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea) を利用して水を完全に除去することにより、アルカラーゼ処理による小豆ペプチドを収得した。
【００６９】
＜２−３＞フレーバーザイム（Flavourzyme)処理による小豆ペプチドの製造
前記実施例<2-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにフレーバーザイム（Novozymes)を処理して、フレーバーザイム処理による小豆ペプチドを収得した。
【００７０】
＜２−４＞ニュートラーゼ（Neutrase）処理による小豆ペプチドの製造
前記実施例<2-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにニュートラーゼ(Novozymes)を処理して、ニュートラーゼ処理による小豆ペプチドを収得した。
【００７１】
＜２−５＞プロタメックス（Protamex）処理による小豆ペプチドの製造
前記実施例<2-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにプロタメックス (Novozymes)を処理して、プロタメックス処理による小豆ペプチドを収得した。
【００７２】
＜２−６＞プロテアーゼ-NP(Protease-NP)処理による小豆ペプチドの製造
前記実施例<2-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにプロテアーゼ-NP(Bioland, Asan, Korea)を処理して、プロテアーゼ-NP処理による小豆ペプチドを収得した。
【００７３】
［実施例３］黒小豆抽出物の製造
＜３−１＞黒小豆のメタノール抽出物製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕し、粉砕した黒小豆粉100 gを100％メタノール1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン(Whatman)2番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した黒小豆メタノール抽出物を収得した。
【００７４】
＜３−２＞黒小豆のエタノール抽出物製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕し、粉砕した黒小豆粉100 gを100％、70％、50％又は30％エタノール1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した黒小豆エタノール抽出物を収得した。
【００７５】
＜３−３＞黒小豆のエチルアセテート抽出物製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕し、粉砕した黒小豆粉100 gを100％エチルアセテート1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した黒小豆エチルアセテート抽出物を収得した。
【００７６】
＜３−４＞黒小豆のヘキサン抽出物製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕し、粉砕した黒小豆粉100 gを100％ヘキサン1Lに浸漬して24時間常温に放置した後、抽出液を収得する過程を3回繰り返した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した黒小豆ヘキサン抽出物を収得した。
【００７７】
＜３−５＞黒小豆の熱水抽出物製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕し、粉砕した黒小豆粉100 gを水1Lに入れ、80℃で2時間攪拌して抽出液を収得した。収得した抽出液をワットマン２番濾紙で減圧濾過して、濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去した黒小豆熱水抽出物を収得した。
【００７８】
＜３−６＞黒小豆超高圧抽出物の製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕した後、18％エタノール76mLをポリエチレン(polyethylene)パックに入れて密封した後、超高圧抽出装置(Frescal MFP-7000; Mitsubishi Heavy Industries, Tokyo, Japan)を利用して抽出した。超高圧抽出条件として抽出圧力を320 MPa、抽出時間は5分に設定した。抽出された試料は、ワットマン２番濾紙で濾過して濾過された抽出液を真空回転濃縮機で濃縮して、溶媒成分を除去することにより、黒小豆超高圧抽出物を収得した。
【００７９】
＜３−７＞黒小豆亜臨界抽出物の製造
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)をミキサーで粉砕し、粉砕した黒小豆50 gを1Lの水と一緒に亜臨界抽出装置(Biovan, Gyeonggi, Korea)の亜臨界水反応器に入れて密閉した。密閉した後、反応器の温度を200℃まで上昇させ、反応器の温度が200℃に達したところで、前記温度を20分間維持して抽出を行った。20分後、抽出物を冷却水が供給される貯蔵タンクに移送して、30℃まで急速冷却した後、浮遊残渣を分離するために3,600 rpmで30分間遠心分離して上澄み液のみを得た。凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)を利用して溶媒を完全に除去することにより、黒小豆亜臨界抽出物を収得した。
【００８０】
［実施例４］黒小豆由来タンパク質及びペプチドの分離
＜４−１＞黒小豆由来タンパク質の分離
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)を粉砕した後、粉砕した黒小豆試料1 kgを1Lヘキサンに入れて常温で4時間攪拌しながら抽出した。ヘキサン抽出物を除去した後、残渣を水を入れてpH 9で、25〜30分間放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して上澄み液を取り、上澄み液をpH 4.5で、25〜30分間再び放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して沈殿したタンパク質を収得し、沈殿したタンパク質を水に溶かして、中性化の過程を経て、凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)を利用して水を完全に除去することにより、分離した黒小豆タンパク質を収得した。
【００８１】
＜４−２＞アルカラ−ゼ(Alcalase)処理による黒小豆ペプチドの製造
実施例<4-1>で収得した黒小豆タンパク質に、タンパク質分解酵素である1％アルカラーゼ(Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)を加え、50℃で6時間酵素反応をさせた。6時間後に、90℃で20分間酵素を不活性化させて、ワットマン2番濾紙で濾過して沈殿物を除去した。濾過された液体を、凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)を利用して水を完全に除去することにより、アルカラーゼ処理による黒小豆ペプチドを収得した。
【００８２】
＜４−３＞フレーバーザイム（Flavourzyme)処理による黒小豆ペプチドの製造
前記実施例<4-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにフレーバーザイム(Novozymes)を処理して、フレーバーザイム処理による黒小豆ペプチドを収得した。
【００８３】
＜４−４＞ニュートラーゼ（Neutrase）処理による黒小豆ペプチドの製造
前記実施例<4-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりニュートラーゼを処理して、ニュートラーゼ処理による黒小豆ペプチドを収得した。
【００８４】
＜４−５＞プロタメックス（Protamex）処理による黒小豆ペプチドの製造
前記実施例<4-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにプロタメックスを処理して、プロタメックス処理による黒小豆ペプチドを収得した。
【００８５】
＜４−６＞プロテアーゼ-NP(Protease-NP)処理による黒小豆ペプチドの製造
前記実施例<4-2>と同じ方法で、アルカラーゼの代わりにプロテアーゼ-NPを処理して、プロテアーゼ-NP(Bioland, Chaonan, Korea)処理による黒小豆ペプチドを収得した。
【００８６】
［実験例１]小豆エタノール抽出物の筋肉生成活性確認
mTORタンパク質は、リン酸化して活性化されたとき、筋肉細胞内のPI3K/Akt信号伝達経路で筋タンパク質合成及び筋肉量増加に関与するタンパク質の活性化を誘導できることが知られている。そこで、小豆エタノール抽出物の筋肉生成誘導活性を確認するために、mTORサンドイッチELISAキット（Cell Signaling Technology、Beverly、MA、USA)を利用してmTORの活性を確認した。
【００８７】
筋肉母細胞株のL6細胞(ATCC; Manassas, VA, USA)を、10％ウシ胎児血清(FBS; Hyclone, Logan, UT, USA)が含まれたダルベッコ変形イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's media、DMEM; Hyclone)と一緒に、6ウェルプレートに 1×105 cell/mLになるように接種後、24時間培養した。培養後、ウェルにある培地を除去し、2％ウマ血清（HS; Hyclone)が含まれたDMEMと交換して、6日間追加培養し、L6細胞を筋管細胞(myotube)に分化させた。その後、前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を、40μg/mLの濃度で細胞に処理して、12時間培養した。培養後、細胞溶解緩衝液(cell lysis buffer)を処理して細胞を溶解させた。収得した細胞溶解物内のタンパク質をブラッドフォード(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)法で定量し、1 mg/mLの濃度に定量して、抗mTOR抗体が付着されたマイクロウェルに細胞溶解物を50μLずつ分注して、37℃で2時間培養した。培養後、洗浄緩衝液(Washing buffer)で計4回洗浄した後、確認用抗体(detection antibody)を処理して、37℃で1時間培養して、再び洗浄緩衝液で4回洗浄した後、ワサビ大根過酸化酵素（horseradish peroxidase、HRP)が接合された2次抗体を入れて、37℃で30分間培養した。最後に、洗浄緩衝液で4回洗浄した後、TMB基質を各ウェルに入れ、37℃で10分間培養して、停止緩衝液(stop solution)を加えてTMBの反応を止めた。2分後、450 nmの波長で吸光度を測定して、小豆エタノール抽出物を処理した筋管細胞内のmTOR水準を測定した。その結果を図1に示した。
【００８８】
その結果、図1に示した通り、小豆エタノール抽出物の処理により、L6筋肉細胞において、mTORの活性が有意(**p < 0.01)に増加したことを確認できた。これは、本発明の小豆エタノール抽出物が、筋肉細胞内で筋肉の生成を増加させる能力が優れていることを意味する。
【００８９】
［実験例２］小豆エタノール抽出物の筋タンパク質合成関与因子のmRNA転写水準確認
筋肉細胞株のL6細胞(ATCC)を、10％FBS(Hyclone)が含まれたDMEMと一緒に6ウェルプレートに2×105 cell/mLになるように接種後、培養した。細胞密度が約80乃至85％になったとき、ウェルにある培地を除去し、2％ HS(Hyclone)が含まれたDMEM(Hyclone)に交換して、L6細胞を筋管細胞(myotube)に分化させた。6日後、前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を25、50又は40μg/mLの濃度に溶かしたDMEM(Hyclone)で培地を交換して、24時間培養した。このとき、試料の代わりに0.01％DMSOを処理した群を対照群とした。24時間後、細胞を収得して、タンパク質加水分解酵素抑制剤カクテル(Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA)が含まれたNP-40緩衝液(ELPIS-Biotech, Daejeon, Korea)で溶解させて、細胞溶解物を収得した。収得した細胞溶解物は、13,000rpmで10分間遠心分離して上澄み液を収得した。上澄み液内のタンパク質濃度をブラッドフォード法で定量した後、一定濃度のタンパク質を5分間加熱して、10％SDS-PAGEゲルに展開してSDS-PAGE電気泳動で細胞内タンパク質を分離した。分離されたタンパク質はニトロセルロース膜にトランスファーした。その後、抗p-p70S6K抗体、抗t-p70S6K抗体、抗p-4EBP1抗体、抗t-4EBP1抗体又は抗α-tubulin抗体(Cell Signaling Technology)を、それぞれ2.5％牛血清アルブミン(BSA)に1:1000の比率で希釈して、１次抗体としてニトロセルロース膜にトランスファーされたタンパク質と20時間常温で反応させた。1次抗体を反応させた後、Tween20含有トリス緩衝生理食塩水（Tris-buffer Saline Tween20、TBST)を利用してニトロセルロース膜を10分間3回洗浄した。その後、1次抗体を認識するHRPが接合された2次抗体(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TA, USA)を、2.5％BSA(bioWORLD)に1：5000になるように希釈して、ニトロセルロース膜と2時間室温で反応させ、TBSTを利用して10分ずつ3回にわたって洗浄した。タンパク質バンドは、ECLウェスタンブロット検出試薬(Amersham, Tokyo, Japan)を使用して発色させ、G;BOX EFイメージングシステム(Syngene, Cambridge, UK)を利用して、発色されたタンパク質バンドを確認した。その結果を図2に示した。
【００９０】
その結果、図2に示した通り、小豆エタノール抽出物を処理することにより、L6筋肉細胞において、mRNA転写過程を通じて筋タンパク質合成に関与するp-p70S6K及びp-4EBP1のタンパク質発現水準が増加したことを確認できた。これは、本発明の小豆エタノール抽出物が、筋肉細胞内で筋タンパク質合成のための関連因子のmRNA翻訳過程を促進させることを意味する。
【００９１】
［実験例３］小豆エタノール抽出物の筋タンパク質分解抑制活性確認
筋肉母細胞株のL6細胞(ATCC)を、10％ FBS(Hyclone)が含まれたDMEM(Hyclone)と一緒に、6ウェルプレートに2×105 cell/mLになるように接種した後、培養した。細胞密度が約80乃至85％になったとき、ウェルにある培地を除去して、2％ HS(Hyclone)が含まれたDMEM(Hyclone)に交換して、L6細胞を筋管細胞(myotube)に分化させた。2日に1回ずつ新しい培地に交換して、合計6日間、分化を行った。分化後、50 ng/mLのTNF-αが含有されたDMEM培地に、前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を、20又は40μg/mLの濃度で溶解した後、細胞に処理した。6時間後、TRIzol試薬(Takara, Osaka, Japan)を使用して全RNAを分離した。分離した全RNAは、ナノドロップ(NanoDrop 1000; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)を利用して定量した。16μL RNAを定量し、逆転写酵素プレミックス（Reverse Transcriptase Premix、ELPIS-Biotech)と混合してPCR装置(Gene Amp PCR System 2700; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を利用して、42℃で55分、70℃で15分の条件でcDNAに合成した。合成されたcDNAのうち4μLのcDNA、下記[表1]に記載された配列の順方向及び逆方向プライマー対(Bioneer, Deajeon, Korea)及びPCRプレミックス(ELPIS-Biotech)を混合してPCR試料を製造した後、95℃で30秒、60℃で1分、72℃で1分を30回繰り返して、PCRを行った。
【００９２】
PCRの結果として増幅されたcDNAを、1.5％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離し、G;BOX EFイメージングシステム(Syngene)を利用してcDNAバンドを確認した。その結果を図3に示した。
【００９３】
【表１】
2019520319.tif 000003
【００９４】
その結果、図３に示した通り、小豆エタノール抽出物を処理することにより、L6筋肉細胞においてアトロジン-1（atrogin-1）及びMuRF-1のmRNA発現が減少したことが分かった。これは本発明の小豆エタノール抽出物が、筋肉細胞内において筋タンパク質を抑制する能力が優れていることを意味する。
【００９５】
［実験例４］小豆エタノール抽出物の筋肉分化促進活性確認
筋肉母細胞株のL6細胞(ATCC)を、10％FBS(Hyclone)が含まれたDMEMと一緒に、6ウェルプレートに2×105 cell/mLになるように接種した後、培養した。細胞密度が約80乃至85％になったとき、ウェルにある培地を除去し、2％HSが含まれたDMEM(Hyclone)に、前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を25、50又は40μg/mLの濃度で溶かした後、細胞に処理して筋管細胞への分化を誘導した。このとき、試料の代わりに0.01％DMSOを処理した群を対照群として使用した。この過程を2日間、3回繰り返し、合計6日間進行して分化させた後、TRIzol試薬を使用して全RNAを分離した。分離したRNAは、前記［実験例３］と同一な方法でcDNA合成及びPCRを行い、MyoD及びmyogeninのmRNA転写水準を確認した。PCRのために使用したプライマー(Bioneer)の配列は下記［表2]に示した通りである。PCRの結果として増幅されたcDNAを1.5％アガロースゲル電気泳動で分離し、G;BOX EFイメージングシステム(Syngene)を利用してcDNAバンドを確認した。その結果を図4に示した。
【００９６】
【表２】
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【００９７】
その結果、図４に示した通り、小豆エタノール抽出物を処理することにより、L6筋肉細胞においてMyoD及びMyogeninのmRNA発現が増加したことが分かった。これは本発明の小豆エタノール抽出物が、筋肉細胞内において筋肉分化を促進する能力が優れていることを意味する。
【００９８】
［実験例５］小豆熱水抽出物の筋肉生成活性
前記実験例１と同一な方法で、実施例<1-5>において製造した小豆熱水抽出物を40μg/mLで処理してmTOR活性を評価した。その結果を図５に示した。
【００９９】
図５に示した通り、小豆熱水抽出物の処理により、L6筋肉細胞においてmTORの活性が有意(**p < 0.01)に増加したことを確認した。これは本発明の小豆熱水抽出物が、筋肉細胞において筋肉生成を増加させる能力が優れていることを意味する。
【０１００】
［実験例６］小豆亜臨界抽出物の筋肉生成活性
前記実験例１と同一な方法で実施例<1-7>で製造した小豆亜臨界抽出物を5μg/mLで処理してmTOR活性を評価した。その結果を図６に示した。
【０１０１】
図６に示した通り、小豆亜臨界抽出物の処理によりL6筋肉細胞においてmTORの活性が有意(**p < 0.01)に増加したことを確認した。これは本発明の小豆亜臨界抽出物が筋肉細胞内で筋肉生成を増加させる能力が優れていることを意味する。
【０１０２】
［実験例７］小豆タンパク質及びペプチドの筋肉生成活性
前記実験例１と同一な方法で、実施例<2-1>、<2-4>、<2-5>、<2-6>で製造した小豆タンパク質と小豆ペプチドを、40μg/mLで処理して、mTOR活性を評価した。その結果を図７に示した。
【０１０３】
その結果、図７に示した通り、小豆タンパク質と小豆ペプチドの処理により、L6筋肉細胞においてmTORの活性が有意(**p < 0.01)に増加したことを確認した。これは本発明の小豆タンパク質と小豆ペプチドが、筋肉細胞内で筋肉生成を増加させる能力が優れていることを意味する。
【０１０４】
［実験例８］小豆ペプチドのmRNA転写促進活性
前記実験例２と同一な方法で、実施例<2-5>で製造した小豆ペプチドを50又は100μg/mLで処理してmTOR活性を評価した。その結果を図８に示した。
【０１０５】
その結果、図８に示した通り、小豆ペプチドを処理することにより、L6筋肉細胞においてmRNA転写過程を通じて筋タンパク質活性に関するp-p70S6K及びp-4EBP1のタンパク質の発現量が増加したことを確認することができた。これは本発明の小豆ペプチドが、筋肉細胞内で筋タンパク質活性のためのmRNA転写過程を促進させることを意味する。
【０１０６】
［実験例９］小豆ペプチドの筋肉分化促進活性
前記実験例４と同一な方法で実験を行った。小豆エタノール抽出物の代わりに前記実施例<2-5>で製造した小豆ペプチドを50又は100μg/mLの濃度で溶かした後、細胞に処理して筋肉細胞分化を誘導した。このとき、試料の代わりに0.01%DMSOを処理した群を対照群にした。その結果を図９に示した。
【０１０７】
その結果、図９に示した通り、小豆ペプチドを処理することにより、L6筋肉細胞においてMyoD及びmyogeninのmRNA発現が増加したことが分かった。これは本発明の小豆ペプチドが、筋肉細胞内で筋肉分化を促進する能力が優れていることを意味する。
【０１０８】
［実験例10］黒小豆エタノール抽出物の筋肉生成活性
前記実験例１と同一な方法で、実施例<3-2>において100％エタノールで製造した黒小豆エタノール抽出物を、40μg/mLで処理してmTOR活性を評価した。その結果を図10に示した。
【０１０９】
図10に示した通り、黒小豆エタノール抽出物の処理により、L6筋肉細胞においてmTORの活性が有意(**p < 0.01)に増加したことを確認することができた。これは本発明の黒小豆エタノール抽出物が、筋肉細胞内で筋肉生成を増加させる能力が優れていることを意味する。
【０１１０】
［実験例11］小豆エタノール抽出物の運動遂行能力向上活性
小豆エタノール抽出物の運動遂行能力を評価するために、PGC-1α活性のルシフェラーゼ分析を行った。COS7サル腎臓細胞(ATCC)を1.5μ105 cells／wellで、24ウェルプレートで培養した後、リポフェクター(Aptabio, Yongin, Korea)を利用して、pGL3-PGC-1α-Luc(Addgene, Cambridge, MA, USA)を細胞に形質注入した。４時間の形質注入後、細胞を24時間安定化させた。その後、前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を40μg／mLの濃度にDMEMで溶かした後、細胞に24時間処理した。最後の24時間の後、NP-40緩衝液(ELPIS-Biotech)で溶解させて細胞溶解を行い、細胞溶解物内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図11に示した。
【０１１１】
その結果、図11に示した通り、小豆エタノール抽出物が、運動遂行能力に関与する主な因子のPGC-1αの活性を有意(**p < 0.01)に増加させたことを確認した。
【０１１２】
［実験例12］小豆エタノール抽出物のミトコンドリア生合性促進活性
前記実験例４と同一な方法で実験を行った。前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を、25、50、40μg/mLの濃度に溶かして細胞に処理して、myotube分化を誘導した。この時、試料の代わりに0.01％DMSO処理した群を対照群にした。また、RT-PCRの際、下記の特異的プライマー(Bioneer)を使用してPCRを行った。その結果を図12に示した。
【０１１３】
【表３】
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【０１１４】
その結果、図12に示した通り、小豆エタノール抽出物を処理することにより、PGC-1α、ERRα、NRF-1、TfamのmRNA発現が増加したことを確認することができた。これは本発明の小豆エタノール抽出物が、運動遂行能力に深い関連性があるミトコンドリア生合成関連遺伝子発現を増加させる能力が優れていることを意味する。
【０１１５】
［実験例13］小豆タンパク質及びペプチドの運動遂行能力向上活性
前記実験例11と同一な方法で、実施例<2-1>、<2-2>、<2-3>、<2-4>、<2-5>及び<2-6>で製造した小豆タンパク質及び小豆ペプチドを、それぞれ40μg/mLで処理して、PGC-1α活性を評価した。その結果を図13に示した。
【０１１６】
その結果、図13に示した通り、小豆タンパク質及び小豆ペプチドが運動遂行能力に関与する主な因子のPGC-1αの活性を有意(**p < 0.01)に増加させることが分かった。従って、小豆タンパク質及び小豆ペプチドは運動遂行能力を増加させることを確認した。
【０１１７】
［実験例14］小豆ペプチドのミトコンドリア生合成促進活性
前記実験例４と同一な方法で、実施例<2-5>において製造した小豆ペプチドを50又は100μg／mLで処理して、小豆ペプチドのミトコンドリア生合成促進活性を評価した。その結果を図14に示した。
【０１１８】
その結果、図14に示した通り、小豆ペプチドを処理することにより、PGC-1α、ERRα、NRF-1、TfamのmRNA発現が増加したことを確認することができた。これは本発明の小豆ペプチドが、運動遂行能力に深い関連性があるミトコンドリア生合性関連遺伝子発現を増加させる能力が優れていることを意味する
【０１１９】
［実験例15］黒小豆エタノール抽出物の運動遂行能力向上活性
前記実験例11と同一な方法で、実施例<3-2>において100％エタノールで製造した黒小豆エタノール抽出物を40μg／mLで処理して、PGC-1α活性を評価した。その結果を図15に示した。
【０１２０】
その結果、図15に示した通り、黒小豆エタノール抽出物が、運動遂行能力に関与する主な因子であるPGC-1αの活性を有意(**p < 0.01)に増加させることが分かった。従って、黒小豆エタノール抽出物は、運動遂行能力を増進させることが確認できた。
【０１２１】
［実験例16］小豆ペプチドの筋萎縮抑制活性
＜16-1＞動物の飼育及び筋萎縮誘導
実験動物で生後７週の雄ラット(C57BL/6N; Young Bio)を購入して実験を行った。全ての動物の飼育は延世実験動物研究センター(Yonsei Laboratory Animal Reaserch Center; YLARC, Seoul, Korea)で行われ、飼育室環境は温度23±2℃、相対湿度55±10％に維持した。実験開始前に全20匹のラットを、無作為で、１群当たり５匹になるように、正常群、筋萎縮群、小豆300投与群、小豆600投与群に分けた。１週間適用させた後、325mg／kgのトリブロモメタノール(tribromoethanol, Sigma-aldrich)を腹腔注射して麻酔を誘導した。麻酔後、筋肉萎縮群と小豆投与群にいるラットの右後足(hindlimb)のふくらはぎの筋肉(gastrocnemius muscle)と右側の足裏を、皮膚スタプラー(skin stapler)(Unidus, Chungcheongbuk-do, Korea)を使用して、スタプラーの芯で筋肉を損傷させて、右側の後足が動けないようにしてこの状態を１週間維持させた。１週間後、ふくらはぎの筋肉と足裏に固定されていたスタプラーの芯を除去して、再び１週間、実施例<1-2>において50％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を、300mg／kg又は600mg／kgの濃度で毎日経口投与して、回復を誘導した。この時、正常群と筋萎縮群は、試料の代わりに食塩水を経口投与した。
【０１２２】
＜16-2＞筋力測定
経口投与期間が終わり、筋力測定器(Chatillon force measurement system; Columbus Instrument, Columbus, OH, USA)を利用して、ラットの筋力を測定した。ラットが筋力測定器の棒を放すまで、一定の力でラットの尾を引張り、一匹当たり合計5回、連続テストを実施した。
【０１２３】
その結果、図16に示した通り、正常群に比べて、筋萎縮群において筋力が有意(#p < 0.05)に減少したが、小豆エタノール抽出物を処理することにより、筋力が有意(*p < 0.05)に増加したことを確認した。これは、本発明の小豆エタノール抽出物が、筋萎縮により減少した筋力を増加させる効果が優れていることを意味する。
【０１２４】
＜16-3＞持久力測定
トレッドミル機器(LE8710MTS; Panlab, Barcelona, Spain)を利用して、実験動物の運動遂行能力を評価した。最初は8 m/minの速度で開始して、1分毎に1 m/minずつ速度を高めた。ラットがショックグリッド(shock grid)に触れたとき、0.2 mAの電気を与えるように設定して、ラットが電気ショックを10秒間受けてもそれ以上走らない時点で実験を停止して、時間と距離を測定した。
【０１２５】
その結果、図17に示した通り、正常群に比べて、筋萎縮群で運動距離及び運動時間が有意(#p < 0.05)に減少したが、小豆エタノール抽出物を処理することにより、運動距離及び時間が有意(*p < 0.05)に増加したことを確認した。これは、本発明の小豆エタノール抽出物が、筋萎縮により減少した運動遂行能力を向上させる効果が優れていることを意味する。
【０１２６】
＜16-4＞筋肉重量測定
筋力と運動遂行能力測定が終わった後、実験動物を、325 mg/kgのトリブロモメタノール(Sigma-aldrich)を腹腔注射して麻酔させ、心採血を通じて犠死させた。心臓拍動が止まったことを確認した後、右側の後足において損傷を受けていない前脛骨筋(tibialis anterior muscle)を摘出して重量を測定した。
【０１２７】
その結果、図18に示した通り、正常群に比べて、傷を受けていない筋萎縮群の前脛骨筋の重量が有意(#p < 0.05)に減少したが、小豆エタノール抽出物を処理することにより、重量が有意(*p < 0.05)に増加したことを確認した。これは、本発明の小豆エタノール抽出物が、筋萎縮により減少した筋肉の重量を増加させる効果が優れていることを意味する。
【０１２８】
以下、本発明に係る前記小豆を有効成分として含有する筋機能改善用又は運動遂行能力増強用食品類及び医薬品の製造例を説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、単に具体的に説明するものである。前記筋機能改善効果又は運動遂行能力増強効果が優れた小豆エタノール抽出物を有して、下記のような組成成分及び組成比によって製造例1乃至2の医薬品及び食品組成物を通常的な方法により製造した。
【０１２９】
［製造例１］医薬品
［製造例1-1]散剤
前記実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド50 mg、結晶セルロース2 gを混合した後、通常の散剤の製造方法により、機密包に充填して散剤を製造した。
【０１３０】
［製造例1-2]錠製
前記実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド50 mg、結晶セルロース400 mg、ステアリン酸マグネシウム5 mgを混合した後、通常の錠剤製造方法により打錠して、錠剤を製造した。
【０１３１】
［製造例1-3]カプセル剤
前記実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド30 mg、乳清タンパク質100 mg、結晶セルロース400 mg、ステアリン酸マグネシウム6 mgを混合した後、通常のカプセル剤製造方法により、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【０１３２】
［製造例２］食品
［製造例2-1]健康食品の製造
前記実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド1000 mg、ビタミンAアセテート70μg、ビタミンE 1.0 mg、ビタミンB1 0.13 mg、ビタミンB2 0.15 mg、ビタミンB6 0.5 mg、ビタミンB12 0.2μg、ビタミンC 10 mg、ビオチン10μg、ニコチン酸アミド1.7 mg、葉酸50μg、パントテン酸カルシウム0.5 mg、硫酸第一鉄1.75 mg、酸化亜鉛0.82 mg、炭酸マグネシウム25.3 mg、第1リン酸カリウム15 mg、第2リン酸カルシウム55 mg、クエン酸カリウム90 mg、炭酸カルシウム100 mg、塩化マグネシウム24.8 mgを混合して製造することができ、その配合比を任意に変えて実施しても良く、通常の健康食品の製造方法により前記の成分を混合した後、顆粒を製造して、通常の方法により健康食品組成物の製造に使用することができる。
【０１３３】
［製造例2-2]健康飲料の製造
前記実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド1000 mg、クエン酸1000 mg、オリゴ糖100 g、梅の実の濃縮液2 g、タウリン1 gに精剤水を加えて、全体900 mLとして、通常の健康飲料製造方法により、前記の成分を混合した後、約1時間85℃で攪拌加熱した後、作製された溶液を濾過して、滅菌された2 Lの容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管して健康飲料組成物製造に使用することができる。
【０１３４】
［製造例2-3]チューインガム
ガムベース20重量％、砂糖76.9重量％、香料1重量％及び水2重量％と前記実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド0.1重量％を配合して、通常の方法でチューインガムを製造した。
【０１３５】
［製造例2-4]キャンデー
砂糖60重量％、水飴39.8重量％及び香料0.1重量％と、実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド0.1重量％を配合して、通常の方法でキャンデーを製造した。
【０１３６】
［製造例2-5]ビスケット
薄力粉（メリケン粉）1級25.59重量％、中力粉1級22.22重量％、精白糖4.80重量％、食塩0.73重量％、グルコース0.78重量％、パームショートニング11.78重量％、アンモニウム1.54重量％、重曹0.17重量％、重亜硫酸ナトリウム0.16重量％、米粉1.45重量％、ビタミンB 0.0001重量％、ミルクフレーバー0.04重量％、水20.6999重量％、全脂粉乳1.16重量％、代用粉乳0.29重量％、第1リン酸カルシウム0.03重量％、スプレーソルト0.29重量％及びスプレーオイル7.27重量％と、実施例1乃至4の小豆抽出物、小豆ペプチド、黒小豆抽出物又は黒小豆ペプチド1.00重量％を配合して、通常の方法でビスケットを製造した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2019520319.tif 000023
【配列表】
2019520319000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月15日(2019.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項２】
前記抽出物は、水、C1乃至C6の有機溶媒、亜臨界流体及び超臨界流体からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で小豆を抽出して収得したことを特徴とする請求項１記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項３】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項４】
前記小豆由来のタンパク質は、下記i)乃至v)の段階からなる方法で収得し、前記小豆由来ペプチドは、下記i)乃至vii)段階からなる方法により収得することを特徴とする、請求項３記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物：
i)乾燥した小豆を粉砕してヘキサンを溶媒として抽出する段階;
ii）前記段階i)で抽出したヘキサン抽出物を除去して、残渣に水を加えてpH 7.0乃至10.0の条件で放置する段階、
iii)前記段階ii）で放置した溶液を遠心分離して、上澄み液を収得する段階;
iv）前記段階iii)で収得した上澄み液を、再びpH 2.0乃至6.0の条件で放置する段階、
v)前記段階iv）で放置した溶液を、再び遠心分離して、沈殿した沈殿体を小豆由来タンパク質として収得する段階;
vi）前記段階v)で収得した小豆由来のタンパク質に加水分解酵素を加えて酵素反応した後、濾過して沈殿物を除去する段階；及び
vii)前記段階vi）で沈殿物が除去された濾液を凍結乾燥してペプチドを収得する段階。
【請求項５】
前記段階vi）の加水分解酵素は、アルカラーゼ(Alcalase)、フレーバーザイム(Flavourzyme)、ニュートラーゼ(Neutrase)、プロタメックス(Protamex)及びプロテアーゼ-NP(Protease-NP)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質加水分解酵素からなることを特徴とする請求項４記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項６】
前記小豆は、小豆(V. angularis W.F.Wight)及び黒小豆(V. angularis var. angularis)からなる群から選ばれるいずれか一つ又は二つであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項７】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項８】
前記筋肉疾患は、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項７記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項９】
前記運動遂行能力向上は、退行性疾患、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などからなる群から選ばれる一つ以上の疾病を予防又は治療することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の筋肉疾患の治療又は運動遂行能力向上用薬学的組成物。
【請求項１０】
小豆(Vigna angularis)の抽出物を有効成分として含む、筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１１】
前記抽出物は、水、C1乃至C4の有機溶媒、亜臨界流体及び超臨界流体からなる群から選ばれる一つ以上の溶媒で小豆を抽出して収得したことを特徴とする請求項１０記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１２】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを有効成分として含む、筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１３】
前記小豆由来のタンパク質は、下記i)乃至v)の段階からなる方法で収得して、前記小豆由来ペプチドは、下記i)乃至vii)段階からなる方法で収得することを特徴とする請求項１２記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物：
i)乾燥した小豆を粉砕してヘキサンを溶媒として抽出する段階;
ii）前記段階i)で抽出したヘキサン抽出物を除去し、残渣に水を加えてpH 7.0乃至10.0の条件で放置する段階；
iii)前記段階ii）で放置した溶液を遠心分離して、上澄み液を収得する段階;
iv）前記段階iii)で収得した上澄み液を、再びpH 2.0乃至6.0の条件で放置する段階；
v)前記段階iv）で放置した溶液を再び遠心分離して、沈殿した沈殿体を小豆由来タンパク質として収得する段階;
vi）前記段階v)で収得した小豆由来のタンパク質に加水分解酵素を加えて酵素反応した後、濾過して沈殿物を除去する段階；及び
vii)前記段階vi）で沈殿物が除去された濾液を凍結乾燥してペプチドを収得する段階。
【請求項１４】
前記段階vi）の加水分解酵素は、アルカラーゼ(Alcalase)、フレーバーザイム(Flavourzyme)、ニュートラーゼ(Neutrase)、プロタメックス(Protamex)及びプロテアーゼ-NP(Protease-NP)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上のタンパク質加水分解酵素からなることを特徴とする請求項１３記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１５】
前記小豆は、小豆(V. angularis W.F.Wight)及び黒小豆(V. angularis var. angularis)からなる群から選ばれるいずれか一つ又は二つであることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１６】
前記筋肉疾患は、筋機能低下、筋肉消耗又は筋肉退化による筋肉疾患であることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１７】
前記筋肉疾患は、緊張減退症(atony)、筋萎縮症(muscular atrophy)、筋異栄養症(muscular dystrophy)、筋無力症、悪液質(cachexia)及び筋肉減少症(sarcopenia)からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１６記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１８】
前記運動遂行能力向上は、退行性疾患、ミトコンドリア異常疾患、持久力低下症、瞬発力低下症、無気力症、筋破壊及びうつ病などからなる群から選ばれる一つ以上の疾病を予防又は治療することを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の筋機能改善又は運動遂行能力向上用食品組成物。
【請求項１９】
筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上のための、小豆抽出物を有効成分として含む薬学的組成物の使用。
【請求項２０】
筋肉疾患治療又は運動遂行能力向上のための、小豆由来タンパク質又はペプチドを有効成分として含む薬学的組成物の使用。
【請求項２１】
筋機能改善又は運動遂行能力向上のための、小豆抽出物を有効成分として含む食品組成物の使用。
【請求項２２】
筋機能改善又は運動遂行能力向上のための、小豆由来タンパク質又はペプチドを有効成分として含む食品組成物の使用。
【請求項２３】
小豆(Vigna angularis)抽出物を、必要とする個体に投与する段階を含む筋肉疾患治療方法。
【請求項２４】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを、必要とする個体に投与する段階を含む筋肉疾患治療方法。
【請求項２５】
小豆(Vigna angularis)抽出物を、必要とする個体に投与する段階を含む運動遂行能力向上方法。
【請求項２６】
小豆由来のタンパク質又はペプチドを、必要とする個体に投与する段階を含む運動遂行能力向上方法。
【請求項２７】
小豆(Vigna angularis)抽出物を、必要とする個体に投与する段階を含む筋機能改善方法。
【請求項２８】
小豆由来タンパク質又はペプチドを、必要とする個体に投与する段階を含む筋機能改善方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
［実施例２］小豆由来タンパク質及びペプチドの分離
＜２−１＞小豆由来タンパク質の分離
乾燥した小豆(V. angularis W.F.Wight)を粉砕した後、粉砕した小豆試料1kgを1Lヘキサンに入れて常温で4時間攪拌しながら抽出した。ヘキサン抽出物を除去した後、残渣に水を入れて、pH 9で、25℃で30分間放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して上澄み液を取り、上澄み液をpH 4.5で、25℃で30分間再び放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して沈殿したタンパク質を収得し、沈殿したタンパク質を水に溶かして、中性化過程を経て、凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea) を利用して水を完全に除去することにより、分離した小豆タンパク質を収得した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
［実施例４］黒小豆由来タンパク質及びペプチドの分離
＜４−１＞黒小豆由来タンパク質の分離
乾燥した黒小豆(V. angularis var. angularis)を粉砕した後、粉砕した黒小豆試料1 kgを1Lヘキサンに入れて常温で4時間攪拌しながら抽出した。ヘキサン抽出物を除去した後、残渣を水を入れてpH 9で、25℃で30分間放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して上澄み液を取り、上澄み液をpH 4.5で、25℃で30分間再び放置した。6,000 rpmで30分間遠心分離して沈殿したタンパク質を収得し、沈殿したタンパク質を水に溶かして、中性化の過程を経て、凍結乾燥機(ilShin Lab Co. Ltd., Seoul, Korea)を利用して水を完全に除去することにより、分離した黒小豆タンパク質を収得した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
［実験例11］小豆エタノール抽出物の運動遂行能力向上活性
小豆エタノール抽出物の運動遂行能力を評価するために、PGC-1α活性のルシフェラーゼ分析を行った。COS7サル腎臓細胞(ATCC)を1.5×105 cells／wellで、24ウェルプレートで培養した後、リポフェクター(Aptabio, Yongin, Korea)を利用して、pGL3-PGC-1α-Luc(Addgene, Cambridge, MA, USA)を細胞に形質注入した。４時間の形質注入後、細胞を24時間安定化させた。その後、前記実施例<1-2>において100％エタノールで製造した小豆エタノール抽出物を40μg／mLの濃度にDMEMで溶かした後、細胞に24時間処理した。最後の24時間の後、NP-40緩衝液(ELPIS-Biotech)で溶解させて細胞溶解を行い、細胞溶解物内ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図11に示した。
【国際調査報告】
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