(57)【要約】本明細書では、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、修飾されていない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、１つ以上の型の網膜細胞の増加した感染性を付与する、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有する変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質が提供される。また、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンおよびその薬学的組成物、これらのｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンの作製方法、ならびにこれらのｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンを、研究および臨床診療、例えば、例えば網膜障害および疾患の治療のために網膜の１つ以上の細胞に核酸配列を送達することにおいて使用するための方法が提供される。【選択図】図１
2019518458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにペプチド挿入を含み、前記挿入が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体のキャプシド部分の対応する位置にあり、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【請求項２】
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２に対する１つ以上の点変異または他の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体に対する１つ以上の対応する点変異を含む、請求項１に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項３】
前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、請求項２に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項４】
前記ペプチド挿入が、ＡＡＶ２のＶＰ１の５７０〜６７１位のアミノ酸のうちのいずれか、または別の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体の対応する位置の後に挿入される、請求項１に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項５】
前記ペプチド挿入が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７、または別のＡＡＶ血清型の対応する位置の後に挿入される、請求項４に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項６】
（ａ）請求項１に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種核酸を含む、感染性組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項７】
前記異種核酸が、ＲＮＡ干渉剤またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
異種核酸を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を請求項７に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。
【請求項９】
前記標的細胞が網膜細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的細胞がインビトロである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的細胞がインビボである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにペプチド挿入を含み、前記挿入が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体のキャプシド部分の対応する位置にあり、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される、単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１４】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０と６１１との間の位置にある２つの隣接するアミノ酸に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入を含む変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記挿入が、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４を含み、Ｘ１が、Ｎ、Ａ、およびＨから選択され、Ｘ２が、Ｑ、Ｐ、およびＳから選択され、Ｘ３が、Ｔ、Ｙ、およびＳから選択され、Ｘ４が、Ｔ、Ｎ、およびＡから選択される、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【請求項１５】
前記ペプチド挿入が、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、およびＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）からなる群から選択される、請求項１４に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項１６】
前記ペプチド挿入が、Ｎ末端アミノ酸ＬＡおよびＣ末端アミノ酸Ａに隣接している、請求項１５に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項１７】
前記ペプチド挿入が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７と５８８との間、または別の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体の対応する位置にある、請求項１５に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項１８】
（ａ）請求項１５に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種核酸を含む、感染性組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項１９】
前記異種核酸が、ＲＮＡ干渉剤またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２０】
異種核酸を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を請求項１８に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。
【請求項２１】
前記標的細胞が網膜細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的細胞がインビトロまたはインビボである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０と６１１との間の位置にある２つの隣接するアミノ酸の間の親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入を含む変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記挿入が、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４を含み、Ｘ１が、Ｎ、Ａ、およびＨから選択され、Ｘ２が、Ｑ、Ｐ、およびＳから選択され、Ｘ３が、Ｔ、Ｙ、およびＳから選択され、Ｘ４が、Ｔ、Ｎ、およびＡから選択される、単離された核酸。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
【請求項２５】
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０と６１１との間の位置にある２つの隣接するアミノ酸に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入を含む変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記挿入が、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＰＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号６４）、およびＰＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号６３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【請求項２６】
ｉ）配列番号１〜１０および１１からなる群より選択される野生型ＡＡＶと少なくとも９０％同一であるＡＡＶアミノ酸配列と、（ｉｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｐ３４Ａ＋Ｒ４８４Ｓ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換と、を含み、前記１つ以上の置換が、ＡＡＶ２に対するものか、または他のＡＡＶ血清型に対する前記１つ以上の対応する置換である、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【請求項２７】
前記キャプシドタンパク質がペプチド挿入を含む、請求項２６に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項２８】
前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される、請求項２７に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項２９】
前記ＡＡＶアミノ酸配列が、前記野生型ＡＡＶと少なくとも９５％同一である、請求項２６に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項３０】
前記ＡＡＶアミノ酸配列が、前記野生型ＡＡＶと少なくとも９９％同一である、請求項２６に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項３１】
前記キャプシドタンパク質が祖先キャプシドタンパク質である、請求項２６に記載の変異ＡＡＶ。
【請求項３２】
（ａ）請求項２７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種核酸を含む、感染性組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
【請求項３３】
前記異種核酸が、ＲＮＡ干渉剤またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３４】
異種核酸を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を請求項３２に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。
【請求項３５】
前記標的細胞が網膜細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記網膜細胞が、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、および網膜色素上皮からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的細胞がインビトロである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的細胞がインビボである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号１〜１２からなる群から選択される野生型ＡＡＶまたはＡＡＶ変異体と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｐ３４Ａ＋Ｒ４８４Ｓ、Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｇ７２７Ｄ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換と、を含む、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項４０】
請求項３９に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
【請求項４１】
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｐ３４Ａである、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４２】
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４３】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）２つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４４】
前記２つ以上の点変異の少なくとも１つが、Ｖ７０８Ｉである、請求項４３に記載の変異ＡＡＶキャプシド。
【請求項４５】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）配列番号２のアミノ酸５８７と５８８との間のＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）ペプチド挿入と、ｂ）前記配列番号２のアミノ酸配列と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換と、を有し、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質の前記アミノ酸配列が、それ以外の点では配列番号２と同一である、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４６】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４７】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）２つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４８】
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｓ１０９ＴおよびＶ７０８Ｉからなる群から選択される、請求項４７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４９】
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも２つが、Ｓ１０９ＴおよびＶ７０８Ｉである、請求項４７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５０】
アミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５１】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）およびＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５２】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）２つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入または突然変異が、ＡＡＶ２、または前記ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分における対応する位置にあり、前記ペプチド挿入が、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）およびＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５３】
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｖ７０８Ｉである、請求項５２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５４】
アミノ酸配列ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５５】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）およびＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５６】
前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、請求項５５に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５７】
アミノ酸配列ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５８】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入が、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５９】
前記タンパク質が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分における対応する位置に対する、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される１つ以上の点変異をさらに含む、請求項５８に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６０】
前記タンパク質が、２つ以上の点変異をさらに含み、前記ペプチド挿入が、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）からなる群より選択される、請求項５８に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６１】
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｎ３１２Ｋである、請求項６０に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６２】
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入が、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）およびＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６３】
前記タンパク質が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分における対応する位置に対する、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される１つ以上の点変異をさらに含む、請求項６２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６４】
前記タンパク質が、２つ以上の点変異を含み、前記挿入または突然変異が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分の対応する位置にある、請求項６２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６５】
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｖ７０８Ｉである、請求項６４に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６６】
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、配列番号５８の配列と、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニン（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸残基と、を含む、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、本出願は、２０１６年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／３３６，４４１号、２０１６年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７８，１０６号、２０１６年９月７日に出願された米国仮特許出願第６２／３８４，５９０号、２０１７年２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４５４，６１２号の優先権を主張し、これらの全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表は、２０１７年５月１２日に作成された、サイズが１９８ＫＢのテキストファイル「４Ｄ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として本明細書と共に提供される。テキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
【０００３】
本明細書に開示される発明は、一般に、変異キャプシドタンパク質を含むアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ビリオン、および定向進化技術を使用したそのような変異キャプシドの生成の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝性網膜疾患は、およそ３０００人のうち１人（世界中で２００万人を超える人々）に影響を及ぼし、重度の視力喪失または失明の主要な原因である異種遺伝病の大きなグループを包含する。ウェット型加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）および糖尿病性網膜症（ＤＲ）などの複雑な多因子性網膜疾患は、さらに多くの個人に影響を与えており、現在１７０万人の米国人がｗＡＭＤに関連する重度の中心視力の低下を抱え、糖尿病を患っている４０歳超の成人のほぼ３分の１が視覚障害を起こしている。これらの疾患は、典型的には、網膜細胞の１つ以上の型の細胞の機能不全または死に関連し、いくつかの事例では、重要なタンパク質、例えば、ＬＣＡ２におけるＲＰＥ６５の発現または機能の欠如に起因し、他の場合には、毒性遺伝子産物を創出する遺伝子突然変異、例えば、ロドプシンタンパク質の折畳みに影響を及ぼす優性突然変異に起因し、あるいはさらに他の事例では、タンパク質、例えば、ｗＡＭＤにおけるＶＥＧＦの異所性発現によって誘導される網膜生理学の変化に起因する。
【０００５】
この大きな非医学的必要性に対処するための１つのアプローチは、例えば、欠損遺伝子の代置、優性欠損遺伝子の矯正、または連続タンパク質療法のための鋳型の提供のために、組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いて網膜細胞の１つ以上の型に遺伝子を送達する遺伝子ベースのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）による療法である。ＡＡＶベースの臨床遺伝子療法は次第に成功を収めるようになっているが、例えば、所望の網膜細胞を高い効率で標的化することを含む、ウイルスベクター特性に関する欠点を依然として伴う。例えば、複数の同種霊長類ＡＡＶ血清型および多数の非ヒト霊長類血清型が同定され、特性評価されており、ＡＡＶ２は、ＡＡＶ血清型の中で最もよく特性評価され、眼内の遺伝子送達ビヒクルとして採用される最初のものである。しかしながら、これらのＡＡＶ（ＡＡＶ２を含む）は、硝子体内投与によって送達される場合、より深い網膜細胞型を形質導入するのに有効であるとは報告されていない。したがって、眼疾患の治療のために網膜細胞へのより効果的な遺伝子ベースの送達を提供する、より優れた形質導入能力を有する新規のＡＡＶ変異体の必要性が当該技術分野に存在する。当該技術分野で既知である野生型ＡＡＶおよびＡＡＶ変異体と比較して、いくつかの事例では広範な、他の事例ではある特定の細胞型に優先的な強化された網膜形質導入プロファイルを示すＡＡＶ変異体の必要性が当該技術分野に存在する。
【０００６】
天然に存在するＡＡＶは、３つのオープンリーディングフレームｒｅｐ、ｃａｐ、およびａａｐを含む一本鎖ＤＮＡウイルスである。第１の遺伝子ｒｅｐは、ゲノム複製に必要な４つのタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードし、第２のｃａｐは、アセンブルしてウイルスキャプシドを形成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）を発現し、第３のものは、キャプシドのアセンブリに不可欠なアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を発現する。ＡＡＶは、能動的複製のためのアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在に依存する。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、そのゲノムがエピソームに維持されているか、またはＡＡＶＳ１座の宿主染色体に組み込まれる、潜伏状態を確立する。
【０００７】
現在のＡＡＶベースの遺伝子送達ベクターと比べて改善をもたらすＡＡＶ変異体を選択するために、インビトロおよびインビボ定向進化技法を使用してもよい。そのような定向進化技法は、当技術分野で公知であり、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１９４１３２号およびＫｏｔｔｅｒｍａｎ＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＯＰ，２０１４年５月２０日にオンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３７４２）で説明されている。定向進化は、遺伝的多様化および選択プロセスの反復ラウンドを介して自然進化を模倣し、それによってＡＡＶベースのビリオンなどの生体分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異の蓄積を可能にするキャプシド操作アプローチである。このアプローチでは、野生型ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子を多様化して、ウイルス粒子のライブラリーを生成するようにパッケージングされた大きな遺伝子ライブラリーを創出し、選択圧を適用して、遺伝子送達障壁を克服することができる優れた表現型を有する固有の変異体を単離する。
【０００８】
ＡＡＶ変異体は、例えば、米国特許第９，１９３，９５６号、同第９；１８６；４１９号、同第８，６３２，７６４号、同第８，６６３，６２４号、同第８，９２７，５１４号、同第８，６２８，９６６号、同第８，２６３，３９６号、同第８，７３４，８０９号、同第８，８８９，６４１号、同第８，６３２，７６４号、同第８，６９１，９４８号、同第８，２９９，２９５号、同第８，８０２，４４０号、同第８，４４５，２６７号、同第８，９０６，３０７号、同第８，５７４，５８３号、同第８，０６７，０１５号、同第７，５８８，７７２号、同第７，８６７，４８４号、同第８，１６３，５４３号、同第８，２８３，１５１号、同第８，９９９，６７８号、同第７，８９２，８０９号、同第７，９０６，１１１号、同第７，２５９，１５１号、同第７，６２９，３２２号、同第７，２２０，５７７号、同第８，８０２，０８０号、同第７，１９８，９５１号、同第８，３１８，４８０号、同第８，９６２，３３２号、同第７，７９０，４４９号、同第７，２８２，１９９号、同第８，９０６，６７５号、同第８，５２４，４４６号、同第７，７１２，８９３；６，４９１，９０７号、同第８，６３７，２５５号、同第７，１８６，５２２号、同第７，１０５，３４５号、同第６，７５９，２３７号、同第６，９８４，５１７号、同第６，９６２，８１５号、同第７，７４９，４９２号、同第７，２５９，１５１号、および同第６，１５６，３０３号、米国公開第２０１３／０２９５６１４号、同第２０１５／００６５５６２号、同第２０１４／０３６４３３８号、同第２０１３／０３２３２２６号、同第２０１４／０３５９７９９号、同第２０１３／００５９７３２号、同第２０１４／００３７５８５号、同第２０１４／００５６８５４号、同第２０１３／０２９６４０９号、同第２０１４／０３３５０５４号、同第２０１３／０１９５８０１号、同第２０１２／００７０８９９号、同第２０１１／０２７５５２９号、同第２０１１／０１７１２６２号、同第２００９／０２１５８７９号、同第２０１０／０２９７１７７号、同第２０１０／０２０３０８３号、同第２００９／０３１７４１７号、同第２００９／０２０２４９０号、同第２０１２／０２２０４９２号、同第２００６／０２９２１１７号、および同第２００４／０００２１５９号、欧州公開第２６９２７３１  Ａ１号、同第２３８３３４６  Ｂ１号、同第２３５９８６５  Ｂ１号、同第２３５９８６６  Ｂ１号、同第２３５９８６７  Ｂ１号、および同第２３５７０１０  Ｂ１号、同第１７９１８５８  Ｂ１号、同第１６６８１４３  Ｂ１号、同第１６６０６７８  Ｂ１号、同第１６６４３１４  Ｂ１号、同第１４９６９４４  Ｂ１号、同第１４５６３８３  Ｂ１号、同第２３４１０６８  Ｂ１号、同第２３３８９００  Ｂ１号、同第１４５６４１９  Ｂ１号、同第１３１０５７１  Ｂ１号、同第１４５６３８３  Ｂ１号、同第１６３３７７２  Ｂ１号、および同第１１３５４６８  Ｂ１号、ならびに国際（ＰＣＴ）公開第ＷＯ２０１４／１２４２８２号、同第ＷＯ２０１３／１７００７８号、同第ＷＯ２０１４／１６００９２号、同第ＷＯ２０１４／１０３９５７号、同第ＷＯ２０１４／０５２７８９号、同第ＷＯ２０１３／１７４７６０号、同第ＷＯ２０１３／１２���５０３号、同第ＷＯ２０１１／０３８１８７号、および同第ＷＯ２００８／１２４０１５号、同第ＷＯ２００３／０５４１９７に記載されているが、これらの参考文献のいずれも、本明細書に開示されるＡＡＶ変異体の物質構造の実施形態および／または特徴および／または組成物を開示していない。
本明細書および参照された特許文書に引用される全ての文書および参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＡＯＰ，２０１４年５月２０日にオンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｇ３７４２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書では、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、修飾されていない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、１つ以上の型の網膜細胞の増加した感染性を付与する、親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有する変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質が提供される。また、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンおよびその薬学的組成物、変異ｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンの作製方法、ならびにこれらのｒＡＡＶキャプシドタンパク質およびビリオンを、研究および臨床診療、例えば、網膜障害および疾患の治療のために網膜の１つ以上の細胞に核酸配列を送達することにおいて使用するための方法が提供される。
【００１１】
本開示のいくつかの態様では、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質が提供され、これらの変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、アミノ酸配列修飾を含まない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、１つ以上の型の網膜細胞（例えば、光受容細胞（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、グリア細胞（例えば、ミュラーグリア細胞、マイクログリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞）の増加した感染性を付与する、親ＡＡＶキャプシドに対してアミノ酸配列に１つ以上の修飾を有する。
【００１２】
本開示のいくつかの態様では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンが提供され、これらのｒＡＡＶビリオンは、本明細書に記載の変異キャプシドタンパク質を含み、このｒＡＡＶビリオンは、対応する修飾されていない親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性に対して、１つ以上の型の網膜細胞（例えば、光受容細胞（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、グリア細胞（例えば、ミュラーグリア細胞、マイクログリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞）の増加した感染性を呈する。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンに対して、全ての網膜細胞の増加した感染力を呈する。他の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンに対して、網膜のある特定の細胞型の増加した感染性を呈するが、他のものは増加しない。別の言い方をすれば、ｒＡＡＶビリオンは、網膜のある特定の細胞型に対して優先的な感染性を示すが、他のものではない。例えば、ｒＡＡＶは、光受容細胞、網膜神経節細胞、グリア細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞から選択される１つ以上の細胞型の優先的に増加した感染性を示すが、全ての細胞型の増加した感染性を示すわけではない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは異種核酸を含む。いくつかのこのような実施形態では、異種核酸は、ポリペプチドをコードするＲＮＡをコードする。他のこのような実施形態では、異種核酸配列は、ポリペプチドをコードしないＲＮＡ、例えば、異種核酸配列、ＲＮＡ干渉剤、ヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡなどをコードする。
【００１４】
本明細書では、主題の感染性ｒＡＡＶビリオンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物も提供される。
【００１５】
また、標的細胞をｒＡＡＶビリオンと接触させることによって異種核酸を標的細胞（網膜細胞など）に送達する方法における本明細書に記載の変異キャプシドタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンの使用が提供される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、眼疾患の治療を必要とする個体の眼などのインビボである。他の実施形態では、標的細胞はインビトロである。
【００１６】
また、本明細書に記載の変異キャプシドタンパク質を含む有効量のｒＡＡＶビリオンまたは有効量のｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物の投与を、そのような治療を必要とする対象に行うことによって、眼疾患を治療する方法が提供される。
【００１７】
また、本明細書に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸および単離された核酸を含む宿主細胞が提供される。さらに他の実施形態では、単離された核酸および／または単離された宿主細胞は、ｒＡＡＶを含む。
【００１８】
いくつかの態様では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のＧＨループに約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入（「異種ペプチド」または「ペプチド挿入」）を含み、この変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）から本質的になる群から選択される配列を含む。いくつかの態様では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸置換を含み、この変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
【００１９】
関連する態様では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入および１つ以上のアミノ酸置換を含み、この変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
【００２０】
本明細書では、ＡＡＶ２に対して異種ペプチドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）およびＰ３４Ａ置換を含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質も開示される。
【００２１】
本明細書では、ＡＡＶ２に対して異種ペプチドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）およびアミノ酸置換Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑを含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質も開示される。
【００２２】
本明細書では、変異ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶの製造および／または送達のための方法も開示される。加えて、本明細書では、本明細書に開示の変異ＡＡＶキャプシドを含むｒＡＡＶを含み、本明細書に記載の方法において使用するためのキットが提供される。
【００２３】
他の実施形態では、前段落における変異キャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンは、先行の実施形態または後続して開示される実施形態のうちのいずれを組み込んでもよい。実際に、明確にするために別個の実施形態の観点から記載されている本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の観点から記載されている本発明の様々な特徴は、別々にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。本発明に係る実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさにありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素の全ての部分的組み合わせも、本発明によって具体的に包含され、まさにありとあらゆるそのような部分的組み合わせが本明細書に個々にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。
【００２４】
本発明の要約は、特許請求の範囲を定義することを意図するものでも、いかなるようにも本発明の範囲を限定するものでもない。
【００２５】
本明細書に開示される発明の他の特徴および利点は、以下の図面、発明を実施するための形態、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明は、添付の図面と併せて読むと以下の詳細な説明から最もよく理解される。本特許または出願ファイルには、少なくとも１つのカラー図面が含まれる。カラー図面（複数可）を伴う本特許出願公開のコピーは、請求および必要な費用の支払いを受けて特許庁が提供する。一般的な慣行により、図面の様々な特徴は原寸ではないことが強調される。むしろ、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小される。図面には以下の図が含まれる。
【００２７】
【図１】定向進化法の実施形態を示す。ステップ（ａ）は、ＤＮＡ変異技法とキャプシド遺伝子との組み合わせを含むウイルスキャプシドライブラリーの生成を示す。ステップ（ｂ）は、各ウイルス粒子が、キャプシドをコードするキャプシド遺伝子を取り囲む変異キャプシドで構成され、精製されるような、ウイルスのパッケージングを示す。次いで、キャプシドライブラリーがインビトロまたはインビボで選択圧下に置かれる。定向進化技術のこの態様では、目的の組織または細胞物質は、その標的の感染に成功したＡＡＶ変異体の単離のために採取され、成功したウイルスが回収される。ステップ（ｃ）は、反復選択による成功したクローンの段階１の富化を示す。ステップ（ｄ）は、ウイルスの適合度を反復的に増加させるために再多様化およびさらなる選択ステップを経る選択されたキャプシド遺伝子の段階２の富化を示す。ステップ（ｅ）は、組換えＡＡＶベクターとして製造され、様々な細胞型および組織標的の形質導入レベルについて特性評価される、ベクター選択段階１および２の間にヒットとして同定された変異体を示す。ＡＡＶ定向進化プロセスの性質により、本明細書に開示される変異体は、選択プロセス中に網膜細胞を形質導入し、ゲノム（変異キャプシド遺伝子をコードするゲノム）を送達する能力を既に実証している。
【図２】ウイルスゲノムが増幅される試料が網膜の広い領域に渡って採取集される場所を示す、網膜フラットマウントの模式図を提供する。
【図３】選択の代表的なラウンドに由来する、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、光受容体／外顆粒層（ＯＮＬ）、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）層網膜組織からのウイルスゲノムのＰＣＲ増幅を示す。右目（上の画像）と左目（下の画像）との両方にライブラリーを注入した。内網膜（ｉｎ）、中間網膜（ｍｉｄ）、外／周辺網膜（ｏｕｔ）をサンプリングした。赤いボックス内のバンドは、ウイルスゲノムの増幅に成功したことを示す。
【図４】配列決定分析におけるモチーフの頻度を示す。図４Ａは、ラウンド３の配列決定分析を提供する。図４Ｂは、ラウンド４の配列決定分析を提供する。図４Ｃは、ラウンド５の配列決定分析を提供する。図４Ｄは、ラウンド６の配列決定分析を提供する。
【図５】アミノ酸５８７に続くランダムヘプタマーを含むＡＡＶ２の代表的な三次元モデルを提供する。
【図６−１】野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４−１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を示す野生型ＡＡＶ配列番号１〜１１のアラインメントを提供する。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【図６−５】同上。
【図６−６】同上。
【図６−７】同上。
【図６−８】同上。
【図６−９】同上。
【図６−１０】同上。
【図６−１１】同上。
【図６−１２】同上。
【図６−１３】同上。
【図６−１４】同上。
【図６−１５】同上。
【図６−１６】同上。
【図６−１７】同上。
【図６−１８】同上。
【図６−１９】同上。
【図６−２０】同上。
【図６−２１】同上。
【図６−２２】同上。
【図６−２３】同上。
【図７】ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達するＡＡＶ２（ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＧＦＰ）の２×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）の硝子体内投与後のアフリカミドリザルの網膜のＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）で撮影した眼底蛍光画像を提供する。画像は、ベースライン（Ａ）、ならびに注射から１４日目（Ｂ）、２８日目（Ｃ）、および４２日目（Ｄ）に撮影した。
【図８】ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＭＶ．ＧＦＰ）の２×１０１１ベクターゲノム（ｖｇ）の硝子体内投与後のアフリカミドリザルの網膜のＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）で撮影した眼底蛍光画像を提供する。画像は、ベースライン（Ａ）、ならびに注射から１４日目（Ｂ）、２８日目（Ｃ）、および４２日目（Ｄ）に撮影した。
【図９】ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ（ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰ）の硝子体内投与後のカニクイザルの網膜のＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）で撮影した眼底蛍光画像を提供する。（Ａ）注射後１４日目（Ａ１）、２１日目（Ａ２）、および２８日目（Ａ３）に撮像した２×１０１１ｖｇのベクターを硝子体内に注射したサルの網膜。（Ｂ）注射後１４日目（Ｂ１）および２１日目（Ｂ２）に撮像した１×１０１２ｖｇのベクターを硝子体内に注射したサルの網膜。
【図１０Ａ】注射の３週間後に分析した、ＣＡＧプロモーターの制御下でＧＦＰ導入遺伝子を送達する新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａの１×１０１２ｖｇを硝子体内に注射したサルの網膜の免疫組織化学分析の結果を提供する。全ての免疫組織化学は、対応する眼底蛍光画像とともに提供され、赤色のボックスは、網膜において分析が行われたおおよその場所を示す。図１０Ａ：強固な網膜色素上皮（ＲＰＥ）および光受容体形質導入が、ＧＦＰ特異的抗体（赤色）を用いて観察された。Ｍ／Ｌオプシン抗体を用いた錐体光受容体免疫染色を白色で示す。図１０Ｂおよび１０Ｃ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を用いた免疫組織化学によって、強固な桿体および錐体光受容体（図１０Ｂ）ならびにＲＰＥ（図１０Ｃ）の形質導入が観察された。ＲＰＥのメラノソームは画像中で黒く見える。図１０Ｄ：直接ＥＧＦＰ蛍光（緑色）、およびＧＦＰ特異的抗体（赤色）を用いた免疫組織化学によって、窩およびその周辺の錐体光受容体（Ｍ／Ｌオプシン、白色で識別）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入が観察された。中央のパネルの画像は、より高い倍率（６３倍）の左パネルの白色ボックスで示される領域である。図１０Ｅ：網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および網膜神経節細胞層の形質導入が直接ＥＧＦＰ蛍光によって観察された（右パネル、緑色；右下パネルは右上パネルの６３倍の倍率、左上パネルは明視野照明下の領域を示す）。
【図１０ＢＣ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０Ｅ】同上。
【図１１Ａ】新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４ＡキャプシドとＣＡＧプロモーターの制御下にあるＧＦＰ導入遺伝子とを含む組換えＡＡＶウイルスによるヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞のインビトロでの形質導入に関するデータを提供する。ヒト胚性幹細胞株（図１１Ａおよび１１Ｃ）またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（ＦＢ−ｉＰＳＣ）（図１１Ｂおよび１１Ｄ）からＲＰＥ細胞に分化した細胞を、新規のＡＡＶ変異体ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＧＦＰまたは野生型対照ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＧＦＰに感染させた。図１１Ａおよび１１Ｂ：５００のＭＯＩでの感染から７日後の細胞培養物の免疫蛍光撮像により、新規ＡＡＶ変異体キャプシド（左パネル）が野生型ＡＡＶ２キャプシド（右パネル）よりも優れてＲＰＥ細胞を形質導入することが示される。図１１Ｃおよび１１Ｄ：フローサイトメトリーによる各培養物中のＧＦＰ陽性ＲＰＥ細胞のパーセントの定量化により、新規のＡＡＶ変異体キャプシドが、細胞源にかかわらず、野生型ＡＡＶ２キャプシドと比べて形質導入された細胞数の有意な用量依存的改善を提供することが明らかとなる。図１１Ｅおよび１１Ｆ：ウエスタンブロットによる各培養物中のＧＦＰの量の定量化により、新規のＡＡＶ変異体が、細胞供給源にかかわらず野生型キャプシドよりも導入遺伝子の発現の有意な改善をもたらすことを明らかにする。細胞源にかかわらず、野生型キャプシドと比べて導入遺伝子の発現の有意な改善を提供することが明らかとなる。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１１Ｄ】同上。
【図１１Ｅ】同上。
【図１１Ｆ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の方法および組成物を記載する前に、本発明は記載される特定の方法または組成物に限定されず、そのため、変化し得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００２９】
本明細書に開示される発明は、図面および説明に例示されている。しかしながら、特定の実施形態が図面に例示されているものの、本発明を、例示および／または開示された特定の実施形態（単数または複数）に限定する意図はない。むしろ、本明細書で開示される発明は、本発明の趣旨および範囲内に入る全ての修正、代替構成、および均等物を網羅することが意図されている。このように、図面は例示的なものであり、限定的なものではない。
【００３０】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間に、文脈上明確に指示されない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値または介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値または介在値との間のより小さい各範囲は、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲内に含まれても除外されてもよく、より小さい範囲に限界のいずれかが含まれる、限界のいずれも含まれない、または限界の両方が含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界次第で、本発明に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界の一方または両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００３１】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、いくつかの可能性のあるかつ好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用される方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾が存在する限り、組み込まれた刊行物のいずれの開示にも優先することが理解される。
【００３２】
本開示を読むと当業者には明らかとなるように、本明細書に記載され図示される個々の実施形態の各々は、個別の構成要素および特徴を有し、これらは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴と容易に分離させるかまたは組み合わせてもよい。いずれの列挙される方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
【００３３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「組換えＡＡＶビリオン」への言及は、複数のそのようなビリオンを含み、「光受容細胞」への言及は、１つ以上の光受容細胞および当業者に既知のその等価物への言及を含む。特許請求の範囲は、いずれの任意選択の要素も排除するように作成され得ることにさらに留意されたい。このため、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連した「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「否定的」制限の使用に対する先行詞として機能することが意図される。
【００３４】
本明細書で考察される刊行物は、専ら本出願の出願日前のそれらの開示のために提供される。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格を有さないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は、実際の公開日とは異なってもよく、これは自主的に確認する必要があり得る。
【００３５】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、この技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３６】
アデノ関連ウイルスは、エンベロープを有しない２０面体キャプシド内の４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムからなる非病原性パルボウイルスである。このゲノムは、複製およびパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接する３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。ｒｅｐ  ＯＲＦは、ウイルス複製、転写調節、部位特異的組込み、およびビリオンアセンブリにおいて役割を果たす４つの非構造タンパク質をコードする。ｃａｐ  ＯＲＦは、アセンブルされて６０ｍｅｒのウイルスキャプシドを形成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）をコードする。最後に、ｃａｐ遺伝子内の代替リーディングフレームとして存在するＯＲＦは、ＡＡＶキャプシドタンパク質を核小体に局在させ、キャプシドアセンブリプロセスにおいて機能するウイルスタンパク質であるアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）を産生する。
【００３７】
天然に存在する（「野生型」）血清型はいくつかあり、ＡＡＶの既知の変異体は１００種類以上あり、それぞれ、アミノ酸配列、特にキャプシドタンパク質の超可変領域内、したがってその遺伝子送達特性が異なる。ＡＡＶはいずれのヒト疾患にも関連していないため、組換えＡＡＶは臨床用途に魅力的である。
【００３８】
本明細書の開示の目的のために、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ関連ウイルスの略称であり、限定されないが、ウイルス自体およびその誘導体を含む。別途明記されない限り、この用語は、全てのサブタイプまたは血清型ならびに複製可能型および組換え型の両方を指す。「ＡＡＶ」という用語には、限定されないが、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ−１またはＡＡＶ１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ−２またはＡＡＶ２）、３Ａ型ＡＡＶ（ＡＡＶ−３ＡまたはＡＡＶ３Ａ）、３Ｂ型ＡＡＶ（ＡＡＶ−３ＢまたはＡＡＶ３Ｂ）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ−４またはＡＡＶ４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ−５またはＡＡＶ５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ−６またはＡＡＶ６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ−７またはＡＡＶ７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ−８またはＡＡＶ８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ−９またはＡＡＶ９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ−１０またはＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」は霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は非霊長類哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」はウシ哺乳動物に感染するＡＡＶを指す。
【００３９】
ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。このような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースにおいて見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７．１（ＡＡＶ１）、ＡＦ０６３４９７．１（ＡＡＶ１）、ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＡＦ０４３３０３．１（ＡＡＶ２）、Ｊ０１９０１．１（ＡＡＶ２）、Ｕ４８７０４．１（ＡＡＶ３Ａ）、ＮＣ＿００１７２９．１（ＡＡＶ３Ａ）、ＡＦ０２８７０５．１（ＡＡＶ３Ｂ）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、Ｕ８９７９０．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡ５）、ＡＦ０８５７１６．１（ＡＡＶ−５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５１．１（ＡＡＶ７）、ＡＦ５１３８５２．１（ＡＡＶ８）ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ−８）、ＡＹ５３０５７９．１（ＡＡＶ９）、ＡＡＴ４６３３７（ＡＡＶ１０）、およびＡＡＯ８８２０８（ＡＡＶｒｈ１０）を参照されたい。これらの開示は、ＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：５５５、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６８２３、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：１３０９、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３９、Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：３９９４、Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８、Ｓｈａｄｅ  ｅｔ．ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４、Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：３７５−３８３、国際特許公開第ＷＯ００／２８０６１号、同第ＷＯ９９／６１６０１号、同第ＷＯ９８／１１２４４号、および米国特許第６，１５６，３０３号を参照されたい。
【００４０】
ＡＡＶ血清型に関連する天然に存在するｃａｐ（キャプシド）タンパク質の配列は、当該技術分野で既知であり、ＡＡＶ１（配列番号１）、ＡＡＶ２（配列番号２）、ＡＡＶ３Ａ（配列番号３）、ＡＡＶ３Ｂ（配列番号４）、ＡＡＶ４（配列番号５）、ＡＡＶ５（配列番号６）、ＡＡＶ６（配列番号７）、ＡＡＶ７（配列番号８）、ＡＡＶ８（配列番号９）、ＡＡＶ９（配列番号１０）、ＡＡＶ１０（配列番号１１）、およびＡＡＶｒｈ１０（配列番号１２）として本明細書で開示されるものを含む。「変異ＡＡＶキャプシドタンパク質」または「ＡＡＶ変異体」という用語は、天然に存在するまたは「野生型」ＡＡＶキャプシドタンパク質配列、例えば、本明細書において配列番号ｌ〜１２に示されるものに対して、少なくとも１つの修飾または置換（欠失、挿入、点変異などを含む）を含むアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して約８０％の同一性、例えば、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、または９５％以上の同一性、例えば、野生型キャプシドタンパク質に対して９８％または９９％の同一性を有し得る。変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質ではない場合がある。
【００４１】
本明細書の開示の目的のために、「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質およびキャプシド形成したＡＡＶポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。
【００４２】
本明細書の開示の目的のために、「ｒＡＡＶ」という用語は、組換えアデノ関連ウイルスを指す略称である。ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップ、および天然に見られるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を含む。
【００４３】
「ｒＡＡＶベクター」という用語は、定義上ｒＡＡＶポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶビリオン（すなわち、ｒＡＡＶウイルス粒子）（例えば、感染性ｒＡＡＶビリオン）を包含し、また、ｒＡＡＶをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｒＡＡＶをコードする一本鎖ポリヌクレオチド（ｓｓ−ｒＡＡＶ）、ｒＡＡＶをコードする二本鎖ポリヌクレオチド（ｄｓ−ｒＡＡＶ）、例えばｒＡＡＶをコードするプラスミドなど）も包含する。
【００４４】
ＡＡＶビリオンは、異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、標的細胞に送達される導入遺伝子、標的細胞に送達されるＲＮＡｉ剤またはＣＲＩＳＰＲ剤など）を含む場合、典型的には、「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオン」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」と称される。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般には２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。
【００４５】
「パッケージング」という用語は、ＡＡＶ粒子のアセンブリおよびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ関連ウイルスの複製およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
【００４６】
ＡＡＶに関する「ヘルパーウイルス」という用語は、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）の哺乳動物細胞による複製およびパッケージングを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアなどのポックスウイルスを含む、多様なＡＡＶに関するそのようなヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。サブグループＣのアデノウイルス５型が最も一般的に使用されるが、アデノウイルスはある数の異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物、およびトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣなどの預託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらもＡＴＣＣなどの預託機関から入手可能である。
【００４７】
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」という用語は、（本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて）ＡＡＶの複製およびパッケージングを可能にするヘルパーウイルスゲノムにコードされた機能（複数可）を指す。本明細書に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、トランスの産生細胞に、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば必要な機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含むある数の方法で提供され得る。例えば、１つ以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターを、ｒＡＡＶベクターとともに産生細胞にトランスフェクトする。
【００４８】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子という用語は、コンピテントにアセンブルされたキャプシドを含み、そのウイルス種が向性である細胞にポリヌクレオチド成分を送達することができるものである。この用語は、いずれかのウイルスの複製能力を必ずしも意味するものではない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の他箇所および当該技術分野において説明されている。ウイルス感染性は、感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比として表すことができる。感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比を決定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを説明する）、およびＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照されたい。実施例も参照されたい。
【００４９】
本明細書で使用される「向性」という用語は、特定の宿主種の細胞または宿主種内の特定の細胞型のウイルス（例えば、ＡＡＶ）による優先的な標的化を指す。例えば、心臓、肺、肝臓、および筋肉の細胞に感染することができるウイルスは、肺細胞および筋肉細胞のみに感染することができるウイルスと比較して、より広い（すなわち、増大した）向性を有する。向性はまた、宿主の特定の種類の細胞表面分子に対するウイルスの依存性を含み得る。例えば、いくつかのウイルスは表面グリコサミノグリカンを有する細胞のみに感染することができる一方、他のウイルスはシアル酸を有する細胞のみに感染することができる（そのような依存性はウイルス感染の可能性のある宿主細胞として特定のクラスの分子を欠く様々な細胞株を用いて試験することができる）。いくつかの事例では、ウイルスの向性は、ウイルスの相対的選好を示す。例えば、第１のウイルスは、全ての細胞型に感染することができてもよいが、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させる上ではるかに大きな成功を収める。第２のウイルスも同じ特徴を好む場合（例えば、第２のウイルスも、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させる上でより大きな成功を収める場合）、絶対的形質導入効率は類似していないとしても、第２のウイルスは第１のウイルスと類似の（または同一の）向性を有するとみなすことができる。例えば、第２のウイルスは、試験した全ての所定の細胞型を感染させる際に、第１のウイルスよりも効率的である可能性があるが、相対的選好が類似している（または同一である）場合、第２のウイルスは、依然として第１のウイルスと類似の（または同一の）向性を有するとみなすことができる。いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比べて改変されていない。いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比べて拡大されている（すなわち、広げられている）。いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比べて低下している。
【００５０】
「複製コンピテントな」ウイルス（例えば、複製コンピテントなＡＡＶ）という用語は、感染性であり、また感染した細胞中で（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることができる、表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合、複製能力は、一般に、機能的ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。一般に、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如のために、哺乳動物細胞（特にヒト細胞）において複製不能である。典型的には、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と移入されるｒＡＡＶベクターとの間の組換えによって複製コンピテントなＡＡＶが生成される可能性を最小限に抑えるために、一切のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠いている。多くの実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、あったとしてもわずかな複製コンピテントなＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、ＲＣＡとも称される）をほとんど含まないものである（例えば、ｒＡＡＶ粒子１０２個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０４個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子１０１２個当たり約１個未満のｒｃＡＡＶ、またはｒｃＡＡＶなし）。
【００５１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって妨害され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、二本鎖および一本鎖分子を同義に指す。別途指定されない限り、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドを含む本明細書の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが分かっているかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々との両方を包含する。
【００５２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の率の「配列同一性」を有する。すなわち、整列したときに、これらの２つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸の率が同じである。配列の類似性は、ある数の異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のウェブ上で入手可能なＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを使用して整列させることができる。他のアラインメントアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡであり、これは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社であるＭａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージにおいて利用可能である。アラインメントのための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡに記載されている。特に興味深いのは、配列中のギャップを許容するアライメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アライメントのギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を用いるＧＡＰプログラムを利用して配列のアラインメントを行うことができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
【００５３】
「遺伝子」という用語は、細胞内で何らかの機能を果たすポリヌクレオチドを指す。例えば、遺伝子は、遺伝子産物をコードすることができるオープンリーディングフレームを含み得る。遺伝子産物の一例は、遺伝子から転写され翻訳されるタンパク質である。遺伝子産物の別の例は、転写されているが翻訳されていないＲＮＡ、例えば、機能的ＲＮＡ産物、例えばアプタマー、干渉ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡなどである。
【００５４】
「遺伝子発現産物」または「遺伝子産物」という用語は、上で定義した特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子発現産物には、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）などが含まれる。
【００５５】
「ｓｉＲＮＡ剤」（「低分子干渉」または「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ））は、遺伝子関心対象（「標的遺伝子」）に標的化されるヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖である。「ＲＮＡ二重鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対形成によって形成され、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の領域を形成する構造を指す。ｓｉＲＮＡの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、ｓｉＲＮＡは遺伝子に「標的化」される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは、１９〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子標的化は、動物細胞の内因性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を活性化するためにＤＮＡ構築物を利用する遺伝子サイレンシング技術であるＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）の使用によって達成される。そのようなＤＮＡ構築物は、処理されると、標的遺伝子（単数または複数）のサイレンシングを引き起こす、自己相補的な二本鎖ＲＮＡ、典型的には短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するように設計される。内因性ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを含むいずれのＲＮＡも、所望のｍＲＮＡ標的に相補的な二本鎖ＲＮＡを発現する構築物を設計することによってサイレンシングされ得る。このように、ｓｉＲＮＡ剤のＲＮＡ二本鎖部分は、ｓｈＲＮＡと呼ばれる短鎖ヘアピン構造の一部であり得る。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。ループの長さは様々であり得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３’突出部または５’突出部も含み得る。いくつかの実施形態では、突出部は、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３’または５’突出である。一般に、標的遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ポリペプチドなど）のレベルは、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、標的遺伝子転写産物の少なくとも１９〜２５ヌクレオチド長のセグメント（例えば、２０〜２１ヌクレオチド配列）に相補的である特定の二本鎖ヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）によって低下する。いくつかの実施形態では、短鎖干渉ＲＮＡは、長さが約１９〜２５ｎｔである。例えば、ｓｉＲＮＡ技術の説明については、ＰＣＴ出願第ＷＯＯ／４４８９５号、同第Ｗ０９９／３２６１９号、同第ＷＯ０１／７５１６４号、同第ＷＯ０１／９２５１３号、同第ＷＯ０１／２９０５８号、同第ＷＯ０１／８９３０４号、ＷＯ０２／１６６２０号、および同第ＷＯ０２／２９８５８号、ならびに米国特許公開第２００４００２３３９０号を参照されたい。ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは核酸配列によってコードされ得、この核酸配列はプロモーターも含み得る。核酸配列はポリアデニル化シグナルも含み得る。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、合成最小ポリアデニル化シグナルである。
【００５６】
「アンチセンスＲＮＡ」という用語は、遺伝子発現産物に相補的なＲＮＡを包含する。例えば、特定のｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションがｍＲＮＡの発現を変化させる（例えば、ＲＮＡの安定性を改変すること、ＲＮＡの翻訳を改変することなどを介して）、ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡ系薬剤である（または修飾ＲＮＡであり得る）。「アンチセンスＲＮＡ」には、アンチセンスＲＮＡをコードする核酸も含まれる。
【００５７】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９剤」に関して、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を使用して侵入してくる核酸のサイレンシングを誘導することにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供するように進化した、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムを包含する。Ｃａｓ９タンパク質（またはその機能的同等物および／または変異体、すなわち、Ｃａｓ９様タンパク質）は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２つの天然に存在するまたは合成のＲＮＡ分子（ガイドＲＮＡとも呼ばれる）とのタンパク質の会合に依存するＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を天然に含む。いくつかの場合には、２つの分子が共有結合して、単一分子（単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）とも呼ばれる）を形成する。このため、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質を活性化し、タンパク質を標的核酸配列に誘導するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（本用語は、２分子ガイドＲＮＡ構成と単一分子ガイドＲＮＡ構成との両方を包含する）と会合する。
【００５８】
Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、その天然の酵素機能を保持する場合、標的ＤＮＡを切断して、ゲノムの改変（すなわち、編集：欠失、挿入（ドナーポリヌクレオチドが存在する場合）、置換など）をもたらすことができる二本鎖破断を創出し、それによって遺伝子発現を改変する。Ｃａｓ９のいくつかの変異体（変異体はＣａｓ９様の用語に包含される）は、ＤＮＡ切断活性が低下するように改変されている（いくつかの場合には、標的ＤＮＡの両方の鎖の代わりに単一の鎖を切断するが、他の場合には、ＤＮＡ切断活性がなくなるまでに著しく減少した）。ＤＮＡ切断活性が減少した（さらにはＤＮＡ切断活性がない）Ｃａｓ９様タンパク質は、それでも標的ＤＮＡに誘導されて、ＲＮＡポリメラーゼ活性を阻止し得る。あるいは、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質は、ＶＰ６４転写活性化ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合させ、融合タンパク質をテトラループおよびステムループでＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１ヘルパータンパク質およびＭＳ２  ＲＮＡアプタマーを含む単一ガイドＲＮＡと共に共同輸送して、転写を活性化する細胞内にＳｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｏｒ（Ｃａｓ９−ＳＡＭ）複合体を形成させることによって、修飾されてもよい。このため、酵素的に不活性なＣａｓ９様タンパク質は、標的ＤＮＡの転写を阻止または活性化するために、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって標的ＤＮＡ中の特定の場所を標的とすることができる。本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９剤」という用語は、上記のような、または当該技術分野で既知であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の全ての形態を包含する。
【００５９】
ＣＲＩＳＰＲ剤に関する詳細な情報は、例えば、（ａ）Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１：”Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”；（ｂ）Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３：”Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−  ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、ならびに（ｃ）米国特許出願第１３／８４２，８５９号およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／３２５８９に見い出すことができ、これらの全ては、全体が参照により本明細書に組み込まれる。このため、本明細書で使用される「ＣＲＩＳＰＲ剤」という用語は、Ｃａｓ９系システム（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９様タンパク質；ＤＮＡ標的化ＲＮＡの任意の成分、例えば、ｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ様ＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡなど；ドナーポリヌクレオチド；および同様のもの）において使用され得る、天然に存在するおよび／または合成の配列を含む任意の作用物質（またはそのような作用物質をコードする核酸）を包含する。
【００６０】
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼを意味する。ＺＦＮは、所望のＤＮＡ配列を標的とするように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが固有の標的配列を切断することが可能になる。細胞に導入された場合、ＺＦＮを用いて、二本鎖破断を誘導することにより、細胞（例えば、細胞のゲノム）中の標的ＤＮＡを編集することができる。ＺＦＮの使用に関するさらなる詳細については、例えば、Ａｓｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｆｅｂ；２０（２）：３２９−３８；Ｂｉｂｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３Ｍａｙ  ２；３００（５６２０）：７６４；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １５；３３３（６０４０）：３０７；Ｏｃｈｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２０１０  Ａｕｇ；１５（８）：８７５−８５；Ｔａｋａｓｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｏｃｔ；４０（１０）：７５９−６５；Ｅｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ２００８  Ｓｕｍｍｅｒ；５（２）：１２１−３；Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ａｐｒ  ２６；１０８（１７）：７０５２−７；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１０  Ｍａｒ  ５；１４０（５）：６７８−９１；Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９  Ｊｕｌ  ２４；３２５（５９３９）：４３３；Ｆｌｉｓｉｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（６）：ｅ２１０４５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１０４５．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊｕｎ  １３；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊｕｌ  １９；１０８（２９）：１２０１３−７；およびＹｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｎｏｖ；２１（ｌ  １）：１６３８−４０を参照されたい。これらの全ては、ＺＦＮに関連するこれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ＺＦＮ剤」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび／またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００６１】
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「ＴＡＬＥＮ」は、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工ＤＮＡエンドヌクレアーゼである転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を指す。ＴＡＬＥＮは、事実上いずれの所望のＤＮＡ配列にも結合するように迅速に操作することができ、細胞に導入した場合、ＴＡＬＥＮを使用して、二本鎖破断を誘導することによって細胞内の標的ＤＮＡ（例えば、細胞のゲノム）を編集することができる。ＴＡＬＥＮの使用に関するさらなる情報については、例えば、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ｊｕｌ  ７；２９（８）：７３１−４；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１  Ｊｕｌ  １５；３３３（６０４０）：３０７；Ｔｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ  ５；２９（８）：６９５−６；およびＨｕａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１  Ａｕｇ  ５；２９（８）：６９９−７００を参照されたい。これらの全ては、ＴＡＬＥＮに関連するこれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ＴＡＬＥＮ剤」という用語は、ＴＡＬＥＮおよび／またはＴＡＬＥＮをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００６２】
「制御要素」または「制御配列」という用語は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列を指す。この調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼし得、本来は増強性または阻害性であり得る。当該技術分野で既知の制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、ある特定の条件下では、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターは、普遍的作用性、すなわち、多くの細胞型、例えば、ＣＡＧまたはＣＭＶプロモーターにおいて活性であってもよく、または組織もしくは細胞特異性、例えば、桿体で活性なｒｈｏプロモーター、または錐体で活性なオプシンプロモーターであってもよい。
【００６３】
「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、遺伝的要素の並置を指し、要素は、それらが予想される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在し得る。
【００６４】
「発現ベクター」という用語は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含むベクターを包含し、意図された標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的中のタンパク質の発現を促進するために、コード領域に作動可能に連結された制御要素を含んでもよい。制御要素と、それらが発現のために作動可能に連結されている遺伝子（単数または複数）との組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、その多くは当該技術分野で公知であり入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
【００６５】
「異種」という用語は、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。天然コード配列から除去され、天然には結合していないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。このため、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸配列を含むｒＡＡＶは、天然に存在する野生型ＡＡＶに通常は含まれないポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。
【００６６】
「遺伝子改変」および「遺伝子修飾」（およびその文法上の変化）は、本明細書では同義に用いられ、遺伝子要素（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。要素は、細胞に対して異種であってもよく、または細胞に既に存在する要素の追加のコピーまたは改良版であってもよい。遺伝子改変は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体との接触など、当該技術分野で既知である任意のプロセスによって、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって行われ得る。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスまたはウイルスベクターを用いる形質導入または感染によって行われてもよい。一般に、遺伝子要素は、細胞内の染色体またはミニ染色体に導入されるが、この用語には、細胞およびその子孫の表現型および／または遺伝子型を変化させる任意の改変が含まれる。
【００６７】
細胞修飾に関して、外因性ＤＮＡによって（例えば、組換えウイルスを介して）「遺伝子修飾された」または「形質転換された」または「トランスフェクトされた」または「形質導入された」という用語は、そのようなＤＮＡが細胞の内部に導入されたときを指す。外因性ＤＮＡの存在により、永続的または一時的な遺伝的変化がもたらされる。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる（共有結合している）場合もそうでない場合もある。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定して増殖することができる初代細胞のクローンである。
【００６８】
本明細書で使用される場合、配列がインビトロでの延長した細胞培養中および／またはインビボでの長期間にその機能を果たすために利用可能である場合、細胞は遺伝子配列によって「安定して」改変、形質導入、遺伝子修飾、または形質転換されると言われる。一般に、そのような細胞は、遺伝子改変が導入され、改変された細胞の子孫によっても継承可能であるため、「遺伝的に」改変（遺伝子修飾）される。
【００６９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように本明細書では同義に使用される。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識化成分との抱合も包含する。哺乳動物対象に遺伝子産物を送達する状況において考察される場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチド、および同様のものなどのポリペプチド、ならびにそのための組成物は、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、および哺乳動物対象への遺伝子産物の送達に使用するための他のそのような核酸（レシピエント細胞に送達されることになる「導入遺伝子」と称されてもよい）への言及は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を保有する任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、タンパク質、または他の物質は、物質または類似の物質が自然発生するか、または最初に調製される、存在し得る他の構成成分の少なくともいくつかが欠如した物質の調製物を指す。このため、例えば、単離された物質は、精製技法を用いてそれを源混合物から濃縮することによって調製されてもよい。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定することができ、または源混合物中に存在する干渉する可能性のある第２の物質との関連で測定することができる。本開示の実施形態の増々の濃縮は、増々のさらなる単離である。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、いくつかの実施形態では、例えば、約８０％〜約９０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、または少なくとも約９９％以上純粋に精製される。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止するという点で予防的であり得、かつ／あるいは疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒という点で治療であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、（ａ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）が、疾患にかかりやすいかまたは疾患に罹患する危険性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において発生するのを防止すること、（ｂ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）を阻害すること、すなわち、その発展を阻害すること、ならびに（ｃ）疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）を軽減すること、すなわち、疾患（および／または疾患によって引き起こされる症状）の退行を引き起こすこと、すなわち、疾患および／または疾患の１以上の症状を緩和することを含む。例えば、主題の組成物および方法は、網膜疾患の治療を対象とし得る。網膜疾患およびその治療を評価するための非限定例には、網膜の機能およびその変化、例えば、視力（例えば、最良矯正視力［ＢＣＶＡ］、歩行、ナビゲーション、物体検知、および識別）の変化、視野（例えば、静的および動的視野計測）の変化、臨床検査（例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査）、明暗の全波長に対する電気生理学的応答（例えば、あらゆる形態の網膜電図写真（ＥＲＧ）［全視野、多焦点、およびパターン］、あらゆる形態の視覚誘発電位（ＶＥＰ）、電気眼球図記録（ＥＯＧ）、色覚、暗順応、および／または対比感度）の測定；解剖学的測定および／または写真による測定、例えば、光コンヘレンス断層撮影映像（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＯＣＴ）、眼底撮影、補償光学走査レーザー検眼鏡、蛍光法、および／または自己蛍光法を使用する生体構造または健康の変化の測定；眼球運動および眼の動き（例えば、眼振、凝視、選択、および安定性）の測定、報告された結果（患者報告による視覚および非視覚誘導挙動および活動の変化、患者報告結果［ＰＲＯ］、生活の質のアンケート評価、日常活動の測定、ならびに神経機能の測定（例えば、機能的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が挙げられる。
【００７２】
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では同義に使用され、ヒト；サルを含む非ヒト霊長類；哺乳動物の競技動物（例えば、ウマ）；哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）；哺乳動物の愛玩動物（イヌ、ネコなど）、および齧歯動物（例えば、マウス、ラットなど）を含むがこれらに限定されない、哺乳動物を指す。
【００７３】
いくつかの実施形態では、個体は、以前に自然にＡＡＶに曝露されており、その結果、抗ＡＡＶ抗体（すなわち、ＡＡＶ中和抗体）を有するヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、以前にＡＡＶベクターを投与されており（その結果、抗ＡＡＶ抗体を保有し得る）、異なる状態の治療または同じ状態のさらなる治療のためにベクターの再投与を必要とするヒトである。このビヒクルに対する中和抗体によって影響される全ての組織、例えば、肝臓、筋肉、および網膜へのＡＡＶ遺伝子送達を伴う臨床試験における陽性結果に基づいて、そのような治療的用途／疾患標的が多数存在する。
【００７４】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。本開示の目的のために、有効量の化合物（例えば、感染性ｒＡＡＶビリオン）は、特定の病態（例えば、網膜疾患）（および／またはその病態と関連付けられる症状の進行を、軽減、緩和、安定化、逆転、防止、減速、または遅延するのに十分な量である。したがって、有効量の感染性ｒＡＡＶビリオンは、異種核酸を個体の標的細胞（単数または複数）に効果的に送達することができる感染性ｒＡＡＶビリオンの量である。有効量は、当該技術分野において十分に理解されている技法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、蛍光法、または他のレポーター読出しなどを用いて異種核酸配列によってコードされる遺伝子産物（ＲＮＡ、タンパク質）を細胞または組織中で検出することによって、臨床前に決定され得る。有効量は、本明細書に記載されているようにまたは当該技術分野で既知であるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、眼底自己蛍光法、フルオレセイン血管造影法、ＯＣＴ、マイクロペリトリー、補償光学などを使用して、疾患の発症または進行の変化を検出することによって臨床的に決定されてもよい。
【００７５】
「網膜細胞」という用語は、網膜を構成する細胞型、例えば、限定するものではないが、網膜神経節（ＲＧ）細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）などの任意のものを指す。「光受容細胞」という用語は、本明細書では、限定するものではないが、桿体細胞または「桿体」および錐体細胞または「錐体」を指す。「ミュラー細胞」または「ミュラーグリア」という用語は、脊椎動物網膜のニューロンを支持するグリア細胞を指す。
【００７６】
「定向進化」という用語は、遺伝的多様化および選択プロセスの反復ラウンドを介して自然進化を模倣し、それによって生体分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異の蓄積する、インビトロおよび／またはインビボでのキャプシド操作方法論を指す。定向進化は、変異体が目的の細胞または組織型のより効率的なレベルの感染性を保有するライブラリーからＡＡＶ変異体を選択するための「バイオパニング」と呼ばれるインビボ法を伴うことが多い。
[発明を実施するための形態]
【００７７】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、エンベロープを有しないキャプシドの内部に含まれる４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有するパルボウイルスのファミリーである。天然に存在するＡＡＶのウイルスゲノムは、２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐ（ウイルス複製、転写制御、部位特異的組込み、およびビリオンアセンブリにおいて機能を果たすコードタンパク質）とｃａｐとに隣接する、複製およびパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有する。ｃａｐ  ＯＲＦは、アセンブルして６０ｍｅｒのウイルスキャプシドを形成する３つの構造タンパク質をコードする。多くの天然に存在するＡＡＶ変異体および血清型が単離されており、いずれもヒト疾患に関連付けられていない。
【００７８】
ＡＡＶの組換え型は遺伝子送達ベクターとして使用することができ、この場合、目的のマーカー遺伝子または治療用遺伝子をｒｅｐおよびｃａｐの代わりにＩＴＲの間に挿入する。これらのベクターは、インビトロおよびインビボで分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入することが示されており、有糸分裂後の組織において何年も安定した導入遺伝子発現をもたらすことができる。例えば、Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ．Ｆｉｅｌｄｓ’  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ，２００７；Ｇａｏ  Ｇ−Ｐ，Ａｌｖｉｒａ  ＭＲ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｃａｌｃｅｄｏ  Ｒ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｊ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭ．Ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２；９９：１１８５４−９；Ａｔｃｈｉｓｏｎ  ＲＷ，Ｃａｓｔｏ  ＢＣ，Ｈａｍｍｏｎ  ＷＭ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６５；１４９：７５４−６；Ｈｏｇｇａｎ  ＭＤ，Ｂｌａｃｋｌｏｗ  ＮＲ，Ｒｏｗｅ  ＷＰ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ：ｐｈｙｓｉｃａｌ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９６６；５５：１４６７−７４；Ｂｌａｃｋｌｏｗ  ＮＲ，Ｈｏｇｇａｎ  ＭＤ，Ｒｏｗｅ  ＷＰ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９６７；５８：１４１０−５；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  Ｕ，ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ  Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｓｉｔｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８４；１３４：５２−６３；Ｍａｙｏｒ  ＨＤ，Ｍｅｌｎｉｃｋ  ＪＬ．Ｓｍａｌｌ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ（ｐｉｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ  ｇｒｏｕｐ）．Ｎａｔｕｒｅ  １９６６；２１０：３３１−２；Ｍｏｒｉ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｔ，Ｋａｎｄａ  Ｔ．Ｔｗｏ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ：ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００４；３３０：３７５−８３；Ｆｌｏｔｔｅ  ＴＲ．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｒＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２００４；１１：８０５−１０を参照��れたい。
【００７９】
組換えＡＡＶ（本明細書では単に「ＡＡＶ」と呼ぶ）は、増加する臨床試験において有望な結果を示している。しかし、抗キャプシド免疫応答、ある特定の組織の形質導入の低下、特定の細胞型への標的送達不能、および比較的低い運搬能など、ＡＡＶの有用性を制限し得る遺伝子送達の障害が存在する。多くの状況において、ＡＡＶを改善する能力を有する合理的設計を効果的に力づけるためには、機構的知識が十分ではない。代替として、定向進化が、特定の生物医学的ニーズを満たす新規のＡＡＶ変異体を創出する戦略として出現している。定向進化戦略は、生物分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異の蓄積を可能にする遺伝的多様化および選択プロセスを利用する。このプロセスでは、野生型ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をいくつかのアプローチによって多様化して、ウイルス粒子のライブラリーを生成するようにパッケージングされた大きな遺伝子ライブラリーを創出し、次に、遺伝子送達障壁を克服することができる単離された新規の変異体に選択圧を適用する。重要なことに、機能の定向進化のために、遺伝子送達問題の根底にある機構的原理が知られている必要はないため、増強されたベクターの開発を加速することができる。
【００８０】
典型的には、本明細書に開示される変異体は、ＡＡＶライブラリー（単数および／または複数）の使用によって生成された。そのようなＡＡＶライブラリー（単数または複数）は、ＡＡＶキャプシドの構造タンパク質をコードする遺伝子であるｃａｐ遺伝子を、ウイルスゲノム操作の分野における当業者には既知であり容易に利用可能であるよって知られており容易に利用可能である様々な定向進化技術によって突然変異させることで生成される。例えば、Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒ．１５ｔｈＡｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．２０，Ｓ１４０（２０１２）；Ｂｏｗｌｅｓ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７，４２３−４３２（２００３）；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８，５７０−５７８（２０１０）；Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，５８８７−５９１１；Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１７０３−１７０９（２００８）；Ｌｉ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６，１２５２−１２６０（２００８）；Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３４，１６１−１７０（２００８）；Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８，３６７−３７８（２００７）；およびＫｏｅｒｂｅｒ，Ｊ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７，２０８８−２０９５（２００９）を参照されたい。そのような技法は、限定されるものではないが、以下の通りである：ｉ）ランダム点突然変異をＡＡＶ  ｃａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に所定の変更可能な速度で導入するためのエラープローンＰＣＲ；ｉｉ）複数のＡＡＶ血清型を有する遺伝子ライブラリーを得るために、ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子のランダムキメラを生成するためのインビトロまたはインビボウイルス組換えまたは「ＤＮＡシャッフリング」；ｉｉｉ）ｃａｐ  ＯＲＦ中の縮重オリゴヌクレオチドのライゲーションによるキャプシドの規定された部位におけるランダムペプチド挿入；ｉｖ）トランスポゾン突然変異誘発を用いたＡＡＶ  ｃａｐ  ＯＲＦのランダムな位置へのペプチドコード配列の定義された挿入；ｖ）「ループスワップ」ライブラリーを生成するための天然のＡＡＶ血清型および変異体の中の各アミノ酸位置の保存レベルに基づくバイオインフォマティクスによって設計されたペプチド配列のライブラリーによるＡＡＶキャプシドの表面ループの代置；ｖｉ）祖先変異体のライブラリーを生成するためのＡＡＶ血清型間の縮重の位置におけるランダムなアミノ酸置換（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚら、２０１５）、ならびにそのような技法の組み合わせ。
【００８１】
ＤＮＡシャフリングは、親の特性を、独自かつ多くの場合に有益な方法で組み合わせるキメラを生成する。しかし、パッケージングができないものもあり、これは事実上ライブラリーの多様性を減少させる。ライブラリーの多様性の集中は、限定されないが、上記のｉｉｉ）〜ｉｖ）のようなペプチド挿入技法によって達成される。ライブラリーの多様性も上記のｖ）のような技法に集中しており、このような集中は、ＡＡＶキャプシドの表面が露出したループ上にある複数の超可変領域に向けられる。多くの技法が、キャプシドの小さな領域のみが変異した変異キャプシドを生成するが、これらの技法は、完全なキャプシドを修飾するためのさらなる突然変異誘発戦略と対にされ得る。
【００８２】
ＡＡＶライブラリー（単数または複数）が生成されると、各ＡＡＶ粒子がキャプシドをコードするｃａｐ遺伝子を囲む突然変異キャプシドで構成され、精製されるように、ウイルスがパッケージされる。次いで、ライブラリーの変異体は、ＡＡＶの分野の当業者には既知であり、容易に入手可能であるインビトロおよび／またはインビボの選択圧技法に供される。例えば、Ｍａｈｅｓｈｒｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４，１９８−２０４（２００６）、Ｄａｌｋａｒａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．”Ｍｅｄ．”５，１８９ｒａ７６（２０１３）、Ｌｉｓｏｗｓｋｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．５０６，３８２−２８６（２０１３）、Ｙａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．１０６，３９４６−３９５１（２００９）、Ｇａｏ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，７７−８７（２００６）、およびＢｅｌｌ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．２２，９８５−９９７（２０１１）を参照されたい。例えば、限定されないが、ＡＡＶ変異体は、ｉ）異なる画分の溶出が変更された結合特性を有する変異体を生むアフィニティーカラム；ｉｉ）効率および／または組織特異性が増大したＡＡＶ変異体を生む、ヒト体内の細胞の挙動を模倣する組織試料または不死化細胞株から単離される一次細胞；ｉｉｉ）標的組織の感染に成功したＡＡＶ変異体を生む、臨床的遺伝子療法環境を模倣する動物モデル；ｉｖ）感染した移植されたヒト細胞を有するＡＡＶ変異体を生むヒト異種移植モデル；ならびに／またはそれらの選択技法の組み合わせを使用して選択され得る。
【００８３】
ウイルスが選択されると、それらは、限定されないが、アデノウイルス媒介性複製、ＰＣＲ増幅、次世代シークエンシングおよびクローニングなどのような既知の技法によって回収され得る。次いで、ウイルスクローンを選択技術の反復ラウンドにより濃縮し、ＡＡＶ  ＤＮＡを単離して、目的の選択された変異ｃａｐ遺伝子を回収する。そのような選択された変異体は、さらなる修飾または突然変異に供され得るため、ＡＡＶウイルス適合性を反復的に増加させるさらなる選択ステップのための新たな出発点として働く。しかし、ある特定の事例では、追加の突然変異なしにキャプシドの生成が成功している。
【００８４】
本明細書に開示されるＡＡＶ変異体は、少なくとも部分的に、硝子体内投与後の霊長類網膜スクリーンの使用を含む、上記の技法などのインビボ定向進化方法の使用によって生成された。このように、本明細書に開示されるＡＡＶ変異キャプシドは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質よりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入をもたらすアミノ酸配列における１つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質」は、対象の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質と同じ野生型または変異ＡＡＶ血清型であるが、対象の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質の１つ以上のアミノ酸配列修飾を含まない、ＡＡＶキャプシドタンパク質を指す。
【００８５】
いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶに共有結合によって挿入された約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の異種ペプチドを含む。ＡＡＶキャプシドタンパク質の「ＧＨループ」またはループＩＶは、当該技術分野では、ＡＡＶキャプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶと称される溶媒露出部分を意味する。ＡＡＶキャプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９；Ｐａｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７；およびＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照されたい。したがって、例えば、挿入部位は、ＡＡＶ  ＶＰ１キャプシドタンパク質のおよそアミノ酸４１１〜６５０内にあり得る。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ１  ＶＰ１のアミノ酸５７１〜６１２、ＡＡＶ２  ＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１１、ＡＡＶ３Ａ  ＶＰ１のアミノ酸内５７１〜６１２、ＡＡＶ３Ｂ  ＶＰ１のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ４  ＶＰ１のアミノ酸５６９〜６１０内、ＡＡＶ５  ＶＰ１のアミノ酸５６０〜６０１内、ＡＡＶ６  ＶＰ１のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ７  ＶＰ１のアミノ酸５７２〜６１３内、ＡＡＶ８  ＶＰ１のアミノ酸５７３〜６１４内、ＡＡＶ９  ＶＰ１のアミノ酸５７１〜６１２内、もしくはＡＡＶ１０  ＶＰ１のアミノ酸５７３〜６１４内、またはそれらの任意の変異体の対応するアミノ酸内にあり得る。当業者は、様々なＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「ＡＡＶ２のアミノ酸に対応する」挿入部位が任意の所与のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質に存在するであろうことを理解するであろう。野生型（天然に存在する）血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、およびＡＡＶ４−１０の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を提供する野生型ＡＡＶ配列番号１〜１１のアラインメントについては、図６も参照されたい。
【００８６】
ある特定の実施形態では、挿入部位は、任意の野生型ＡＡＶ血清型またはＡＡＶ変異体のＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１４の間に位置する２つの隣接アミノ酸間の単一の挿入部位であり、例えば、挿入部位は、任意のＡＡＶ血清型または変異体のＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１０、アミノ酸５８０〜６００、アミノ酸５７０〜５７５、アミノ酸５７５〜５８０、アミノ酸５８０〜５８５、アミノ酸５８５〜５９０、アミノ酸５９０〜６００、またはアミノ酸６００〜６１４に位置する２つの隣接アミノ酸間にある。例えば、挿入部位は、アミノ酸５８０と５８１、アミノ酸５８１と５８２、アミノ酸５８３と５８４、アミノ酸５８４と５８５、アミノ酸５８５と５８６、アミノ酸５８６と５８７、アミノ酸５８７と５８８、アミノ酸５８８と５８９、またはアミノ酸５８９と５９０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５７５と５７６、アミノ酸５７６と５７７、アミノ酸５７７と５７８、アミノ酸５７８と５７９、またはアミノ酸５７９と５８０との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸５９０と５９１、アミノ酸５９１と５９２、アミノ酸５９２と５９３、アミノ酸５９３と５９４、アミノ酸５９４と５９５、アミノ酸５９５と５９６、アミノ酸５９６と５９７、アミノ酸５９７と５９８、アミノ酸５９８と５９９、またはアミノ酸５９９と６００との間にあり得る。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ３Ａのアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ３Ｂのアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ４のアミノ酸５８４と５８５との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５と５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８と５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８と５８９との間にあり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチド挿入は、長さが、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸である。別の実施形態では、本明細書に開示されるペプチド挿入は、本明細書に開示されるペプチド挿入のうちのいずれか１つのアミノ末端（Ｎ末端）および／またはカルボキシル末端（Ｃ末端）に１〜４個のスペーサーアミノ酸を含む。例示的なスペーサーアミノ酸には、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびプロリン（Ｐ）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ペプチド挿入は、Ｎ末端に２個のスペーサーアミノ酸を含み、Ｃ末端に２個のスペーサーアミノ酸を含む。他の実施形態では、ペプチド挿入は、Ｎ末端に２個のスペーサーアミノ酸を含み、Ｃ末端に１個のスペーサーアミノ酸を含む。
【００８８】
本明細書に開示されるペプチド挿入は、以前に説明されておらず、かつ／またはＡＡＶキャプシドに挿入されていない。理論に束縛されることを意図するものではないが、開示されるペプチド挿入のうちのいずれかの存在は、霊長類網膜の前面の細胞外マトリックスへの結合を低下させる可能性のあるヘパリン硫酸に対する変異キャプシドの親和性を低下させるように作用し得る。加えて、本明細書に開示されるペプチド挿入モチーフは、細胞表面受容体結合ドメインの添加による霊長類網膜細胞の形質導入の増強をもたらし得る。
【００８９】
いくつかの好ましい実施形態では、挿入ペプチドは、以下の式のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００９０】
いくつかの態様では、挿入ペプチドは、式１ａの長さ７〜１０アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、およびＰｒｏから選択され、
Ｘ３は、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ４は、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、およびＡｌａから選択され、
Ｘ５は、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、およびＡｓｎから選択され、
Ｘ６は、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、およびＧｌｕから選択され、
Ｘ７は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、およびＡｌａから選択される。
【００９１】
ある特定の実施形態では、式１ａの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、およびＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
他の態様では、挿入ペプチドは、式１ｂの長さ７〜１０アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｙ３
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、およびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、およびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、ＡｓｐおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ４は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ５は、ＴｈｒおよびＬｙｓから選択され、
Ｘ６は、ＬｙｓおよびＡｓｎから選択され、
Ｘ７は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、およびＨｉｓから選択される。
【００９３】
ある特定の実施形態では、式１ｂの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、およびＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９４】
他の態様では、挿入ペプチドは、式１ｃの長さ７〜１０アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＡｓｐＸ３ＴｈｒＬｙｓＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、およびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｇｌｎ、およびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＧｌｎから選択され、
Ｘ４は、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、およびＨｉｓから選択される。
【００９５】
ある特定の実施形態では、式１ｃの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、およびＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９６】
他の態様では、挿入ペプチドは、式１ｄの長さ７〜１０アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＡｓｐＸ３ＴｈｒＴｈｒＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、ＧｌｎおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、ＴｈｒおよびＧｌｎから選択され、
Ｘ４は、ＡｓｎおよびＨｉｓから選択される。
【００９７】
ある特定の実施形態では、式１ｄの挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９８】
他の態様では、挿入ペプチドは、式Ｉｅの長さ７〜１１アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＡｓｎＸ３ＡｓｎＧｌｕＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、ＧｌｎおよびＩｌｅから選択され、
Ｘ２は、ＡｌａおよびＳｅｒから選択され、
Ｘ３は、ＧｌｕおよびＡｌａから選択され、
Ｘ４は、ＡｓｎおよびＨｉｓから選択される。
【００９９】
他の実施形態では、式１ｅの挿入ペプチドは、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）およびＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１００】
さらに別の実施形態では、挿入ペプチドは、式ＩＩａの長さ７〜１１アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４Ｙ３
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｑ、Ｎ、Ａ、Ｈ、およびＩから選択され、
Ｘ２は、Ｑ、Ａ、Ｐ、およびＳから選択され、
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、およびＱから選択され、
Ｘ４は、Ｔ、Ｎ、Ａ、およびＨから選択される。
【０１０１】
式Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４のアミノ酸配列のペプチド挿入のさらなる実施形態では、ペプチド挿入は、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、およびＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）からなる群から選択される。
【０１０２】
いくつかのそのような実施形態では、挿入ペプチドは、式ＩＩｂの長さ７〜１１アミノ酸のペプチドであり得、
Ｙ１Ｙ２Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４Ｙ３
【０１０３】
式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、存在する場合、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏから選択され、
Ｘ１は、Ｎ、Ａ、およびＨから選択され、
Ｘ２は、Ｑ、Ｐ、およびＳから選択され、
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、およびＳから選択され、
Ｘ４は、Ｔ、Ｎ、およびＡから選択される。
【０１０４】
式Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４のアミノ酸配列のペプチド挿入のさらなる実施形態では、ペプチド挿入は、ＡＳＤＳＴＫＡ、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、およびＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）からなる群から選択される。
【０１０５】
他の実施形態では、挿入ペプチドは、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、およびＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、挿入ペプチドは、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、およびＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
他の好ましい実施形態では、挿入ペプチドは、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、およびＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）から選択されるアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に１〜３個のスペーサーアミノ酸（Ｙ１〜Ｙ３）を有する。ある特定のそのような実施形態では、挿入ペプチドは、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＧＨループまたはループＩＶにおける約５アミノ酸〜約２０アミノ酸のペプチド挿入以外、いずれの他のアミノ酸配列修飾も含まない。例えば、いくつかの実施形態では、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド挿入を含み、いずれの他のアミノ酸置換、挿入、または欠失も含まない（すなわち、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、該挿入部を含み、他の点では対応するＡＡＶキャプシドタンパク質と同一である）。換言すれば、該挿入を含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、他の点では、ペプチドが挿入された親ＡＡＶキャプシドタンパク質と同一である。別の例として、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド挿入を含み、ペプチド挿入は、ＡＡＶ２キャプシドのＶＰ１のアミノ酸５８７と５８８との間または別の親ＡＡＶのＶＰ１の対応するアミノ酸間、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ４のＶＰ１のアミノ酸５８６と５８７との間、ＡＡＶ５のＶＰ１のアミノ酸５７７と５７８との間、ＡＡＶ７のＶＰ１のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８またはＡＡＶ１０のＶＰ１のアミノ酸５９０と５９１との間などに位置し、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質配列は、他の点では、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質配列、例えば配列番号１〜１２のうちのいずれかと同一である。
【０１０９】
他の実施形態では、本明細書に開示されているかまたは当該分野で既知であるようにペプチド挿入をＧＨループに含むことに加えて、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、親ＡＡＶキャプシドタンパク質と比較して、約１〜約１００個のアミノ酸置換または欠失、例えば、１〜約５、約２〜約４、約２〜約５、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、約２５〜５０、約５０〜１００個のアミノ酸置換または欠失を含む。したがって、いくつかの実施形態では、主題の変異キャプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶキャプシド、例えば、配列番号１〜１２に示される野生型キャプシドタンパク質に対して、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上、例えばまたは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
さらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ペプチドの挿入前の付番により、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基（複数可）１、１５、３４、５７、６６、８１、１０１、１０９、１４４、１６４、１７６、１８８、１９６、２２６、２３６、２４０、２５０、３１２、３６３、３６８、４４９、４５６、４６３、４７２、４８４、５２４、５３５、５５１、５９３、６９８、７０８、７１９、７２１、および／もしくは７３５、または別のＡＡＶキャプシドタンパク質の対応するアミノ酸残基（複数可）にある。いくつかのそのような実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、ペプチドの挿入前の付番により、ＡＡＶ２  ＶＰ１キャプシドタンパク質のＭ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑ、または別のＡＡＶキャプシドタンパク質の対応するアミノ酸残基（複数可）からなる群から選択される。
【０１１１】
好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号１４）、およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｍ１Ｌ＋Ｌ１５Ｐ＋Ｐ５３５Ｓ、Ｐ３４Ａ、Ｐ３４Ａ＋Ｓ７２１Ｌ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｑ１６４Ｋ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｎ３１２Ｋ、Ｎ３１２Ｋ＋Ｎ４４９Ｄ＋Ｄ４７２Ｎ＋Ｎ５５１Ｓ＋Ｉ６９８Ｖ＋Ｌ７３５Ｑ、Ｐ３６３Ｌ、Ｒ４８４Ｃ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｔ４５６Ｋ、およびＶ７０８Ｉからなる群から選択される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。
【０１１２】
特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７と５８８との間もしくは別のＡＡＶキャプシドの対応するアミノ酸間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれらからなるか、もしくはそれらからなる、ペプチド挿入物を含み、さらに、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）に対する残基３４または別のＡＡＶキャプシドの対応する残基にＰ３４Ａアミノ酸置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列または対応する親ＡＡＶキャプシドの全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＡＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４２）
【０１１３】
別の特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシド（配列番号２）のアミノ酸配列と比較したＮ３１２Ｋアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含み、任意選択で、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＮ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、および／またはＬ７３５Ｑアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換をさらに含む。別の特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）またはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれらからなる、ペプチド挿入物を含み、ＡＡＶ２キャプシド（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した、Ｎ３１２Ｋ、Ｎ４４９Ｄ、Ｄ４７２Ｎ、Ｎ５５１Ｓ、Ｉ６９８Ｖ、およびＬ７３５Ｑアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型の対応する残基における置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＫＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＤＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＮＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＳＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＶＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＱ（配列番号４３）
【０１１４】
別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換と、を含み、任意選択で、他の点では、配列番号１および３〜１２のうちのいずれか１つと同一である、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換と、を含み、２〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１１５】
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換と、を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【０１１６】
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）アミノ酸配列ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）もしくはＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４４）
【０１１７】
好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ、好ましくはＳ１０９Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ａ５２４Ｔ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、および／またはＶ７１９Ｍから選択される。ペプチド挿入部位は、好ましくは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＩ６９８Ｖアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含み、置換されたアミノ酸（複数可）は対応する位置において天然に存在しない。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、対応するアミノ酸置換は、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶ９キャプシドのアミノ酸配列と比較したＩ６９９Ｖアミノ酸置換、ＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列と比較したＩ６８７Ｖ置換、ＡＡＶ７のアミノ酸配列と比較したＩ７００Ｖ置換、ＡＡＶ８またはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較したＩ７０１Ｖ置換である。特に好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＶＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４５）
【０１１８】
他の好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７１９Ｍアミノ酸置換および任意選択のＶ７０８Ｉ置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含み、置換されたアミノ酸（複数可）は対応する位置において天然に存在しない。
【０１１９】
別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較して１０９位における、またはＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較して１０８位におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較した、アミノ酸１０９におけるセリンからトレオニンへの置換（Ｓ１０９Ｔ）またはアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換（Ｖ７０８Ｉ）を含み、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含み、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上アミノ酸配列同一性である。他の好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間、もしくは別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１０９でのセリンからトレオニンへの置換およびアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。
【０１２０】
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換と、を含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含まず、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１０９でのセリンからトレオニンへの置換を含まない。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【０１２２】
別の好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｒ３８９Ｓ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ３８９Ｓ、Ａ５９３Ｅ、および／またはＶ７０８Ｉから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。１つの好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）またはＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０１２３】
さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）を含むか、またはアミノ酸配列ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）もしくはＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４６）
【０１２４】
他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）少なくとも１つのアミノ酸置換と、を含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含まない。さらに他の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６１）を含むか、またはアミノ酸配列ＩＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号６０）もしくはＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉと、を含む。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）２つ以上のアミノ酸置換と、を含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。
【０１２５】
別の好ましい実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、Ｓ１０９Ｔ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｓ４６３Ｙ、Ｄ３６８Ｈ、およびＶ７０８Ｉから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。１つの好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４７）
【０１２６】
他の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）配列番号２の配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換、および任意選択のＳ４６３Ｙアミノ酸置換と、を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換と、を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【０１２７】
別の実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ１またはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較した３１３位もしくはＡＡＶ９のアミノ酸配列と比較した３１４位におけるアスパラギンからリジンへのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ３ＡもしくはＡＡＶ３Ｂの３１２位またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０の３１５位におけるセリンからリジンへの置換、あるいはＡＡＶ４もしくはＡＡＶ５の３０３位またはＡＡＶ７の３１４位におけるアルギニンからリジンへの置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）Ｎ３１２Ｋアミノ酸置換と、を含み、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１２８】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）およびＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。１つの好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４８）
【０１２９】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号６２）およびＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。１つの好ましい実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号６２）を含むか、またはＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＮ４４９Ｄアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型における対応する置換を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号６２）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４９）
【０１３０】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）およびＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。関連する実施形態では、ａ）ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９のＶＰ１のアミノ酸５８８と５８９、ＡＡＶ４のアミノ酸５８６と５８７、ＡＡＶ５のアミノ酸５７７と５７８、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９０と５９１との間に位置し、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）およびＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換と、を含み、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）を含むペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換と、を含む。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０１３１】
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５０）
【０１３２】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）およびＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、アミノ酸配列ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に位置するペプチド挿入を含み、他の点では配列番号２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、ａ）ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間のアミノ酸配列ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、かつ少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５１）
【０１３４】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）およびＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５２）
【０１３５】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）およびＬＡＫＤＲＡＰＴＳＡ（配列番号４１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＫＤＲＡＰＴＳＡ（配列番号４１）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５３）
【０１３６】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）およびＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置のうちの１つ以上において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５４）
【０１３７】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）およびＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置のうちの１つ以上において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５５）
【０１３８】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）およびＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５６）
【０１３９】
別の実施形態では、ａ）キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入であって、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）およびＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、ｂ）ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）における対応する置換であって、置換されたアミノ酸（複数可）が、対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供される：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびそれらの組み合わせ。好ましくは、ペプチド挿入部位は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異ＡＡＶキャプシドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸５８７と５８８との間に、アミノ酸配列ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）を含むか、またはアミノ酸配列ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％の配列同一性を有するか、またはそれと１００％同一である：
【０１４０】
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５７）。
【０１４１】
いくつかの態様では、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して１つ以上のアミノ酸置換を含む変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が提供され、本変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン中に存在する場合に、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換、またはＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列（配列番号６）と比較したＰ３３Ａアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２または配列番号６に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それぞれＡＡＶ２またはＡＡＶ５キャプシドのアミノ酸配列と比較したＰ３４ＡまたはＰ３３Ａアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１４３】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１６４、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１６４におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、もしくはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１６４、またはＡＡＶ７、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較したアミノ酸１６５におけるグルタミンからリジンへのアミノ酸置換を含むか、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸１６０におけるセリンからリジンへの置換を含むか、あるいはＡＡＶ９のアミノ酸１６４におけるアラニンからリジンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１６４におけるアミノ酸置換（例えば、Ｑ１６４Ｋ）を含み、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＱ１６４Ｋアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＱ１６４ＫおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）中の対応する置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性である。
【０１４４】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６９８、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６９８におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したアミノ酸６９８、またはＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、もしくはＡＡＶ９のアミノ酸配列と比較したアミノ酸６９９、またはＡＡＶ５のアミノ酸６８７、またはＡＡＶ７のアミノ酸７００、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７０１における、イソロイシンからバリンへのアミノ酸置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６９９におけるアミノ酸置換（例えば、Ｉ６９８Ｖ）を含み、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＩ６９８Ｖアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。
【０１４５】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１０９、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１０９におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸配列と比較した１０９位、またはＡＡＶ５もしくはＡＡＶ６のアミノ酸配列と比較した１０８位における、セリンからトレオニンへのアミノ酸置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列ＡＡＶ２と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換を含み、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。他の関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＳ１０９Ｔアミノ酸置換およびＡ５９３Ｅアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＳ１０９ＴおよびＡ４９３Ｖならびに任意選択のＡ５９３Ｅおよび／もしくはＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）中の対応する置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＳ１０９Ｔ、Ａ４９３Ｖ、Ａ５９３Ｅ、およびＶ７０８Ｉアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）中の対応する置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性である。他の好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＳ１０９ＴおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、他の点では、配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【０１４６】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸５９３、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸５９３におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ６、もしくはＡＡＶ９のアミノ酸配列と比較したアミノ酸５９４、またはＡＡＶ５のアミノ酸５８３、またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸５９６におけるグリシンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸５９４におけるアルギニンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ４のアミノ酸５９２におけるアスパラギン酸塩からグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ７の５９５位におけるグルタミンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３Ｅアミノ酸置換を含み、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含まない：Ｉ１９Ｖ、Ｖ３６９Ａ、Ｋ２６Ｒ、Ｎ２１５Ｄ、Ｇ３５５Ｓ、Ｖ４６Ａ、およびＳ１９６Ｐ。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＮ５９６Ｄアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＮ５９６Ｄアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有する。他の実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３ＥおよびＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。
【０１４７】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸７０８、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。好ましくは、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２と比較したアミノ酸２５０、または別のＡＡＶ親血清型中の対応するアミノ酸におけるプロリンからセリンへの置換を含まない。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸７０８におけるアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したアミノ酸７０８におけるバリンからイソロイシン（Ｖ７０８Ｉ）への置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一であり、Ｐ２５０Ｓアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸７０９におけるバリンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６の７０９位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、ＡＡＶ４のアミノ酸７０７またはＡＡＶ９のアミノ酸７０９におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ７のアミノ酸７１０またはＡＡＶ８もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸７１１におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはＡＡＶ５のアミノ酸６９７におけるグルタミンからイソロイシンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、２〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含み、Ｐ２５０Ｓアミノ酸置換を含まない。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、Ｖ７０８Ｉアミノ酸置換を含み、またＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＡ５９３Ｅおよび／またはＳ１０９Ｔアミノ酸置換も含む。他の関連する実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＡ５９３Ｅアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。他の関連する実施形態では、変異キャプシドは、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＳ１０９Ｔアミノ酸置換を含み、他の点では、ＡＡＶ２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＶ７１９Ｍアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＲ７３３Ｃアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列と比較したＶ７０８ＩおよびＧ７２７Ｄアミノ酸置換を含み、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【０１４８】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１９６、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在せず、任意選択でプロリン以外である。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１９６におけるアミノ酸置換を含み、任意選択でＳ１９６Ｐ置換以外である。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ９のアミノ酸１９６、またはＡＡＶ７、ＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ１０のアミノ酸１９７、またはＡＡＶ５のアミノ酸１８６におけるセリンからチロシンへのアミノ酸置換、あるいはＡＡＶ１またはＡＡＶ６のアミノ酸１９６におけるアラニンからチロシンへの置換、あるいはＡＡＶ４のアミノ酸１９１におけるメチオニンからチロシンへの置換、あるいはＡＡＶ３ＡまたはＡＡＶ３Ｂのアミノ酸１９６におけるトレオニンからチロシン置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と比較したＳ１９６Ｙアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したＳ１９６Ｐ置換以外のアミノ酸１９６におけるアミノ酸置換を含み（例えば、Ｓ１９６Ｙ置換を含み）、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１４９】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１７５、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１７５におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドは、配列番号２に示されるＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＱ１７５Ｈアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置におけるグルタミンからヒスチジンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸１７５におけるアミノ酸置換（例えば、Ｑ１７５Ｈ）を含み、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１５０】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６４、または別のＡＡＶ親血清型（すなわち、ＡＡＶ２以外）の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６４におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、配列番号２に示されるＡＡＶ２のアミノ酸配列と比較したＰ６４Ｓアミノ酸置換、または別のＡＡＶ親血清型の対応する位置におけるプロリンからセリンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドのアミノ酸配列（配列番号２）と比較したアミノ酸６４におけるアミノ酸置換（例えば、Ｐ６４Ｓ）を含み、配列番号２に示されるＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、１〜５個、５〜１０個、または１０〜１５個のアミノ酸置換を含む。
【０１５１】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、および１２からなる群から選択される野生型ＡＡＶキャプシド配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、かつｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｇ７２７Ｄ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびに／または（ｉｉ）ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７））、ＰＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号６３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＰＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号６４）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、ＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、およびＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）からなる群から選択されるペプチド挿入も含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、指定の１つ以上のアミノ酸置換および／またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号１〜１２からなる群から選択される配列と同一である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は祖先キャプシドタンパク質である。先祖キャプシドタンパク質とは、今日自然に見い出されるキャプシドタンパク質の進化的祖先、例えば、今日自然に見い出されるＡＡＶキャプシドタンパク質間の縮退の位置におけるランダムアミノ酸置換によってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成される、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３を意味する。祖先キャプシドの１つの非限定的な例が以下に提供され、ここで、縮退の位置（残基２６４、２６６、２６８、４４８、４５９、４６０、４６７、４７０、４７１、４７４、４９５、５１６、５３３、５４７、５５１、５５５、５５７、５６１、５６３、５７７、５８３、５９３、５９６、６６１、６６２、６６４、６６５、７１０、７１７、７１８、７１９、７２３）が「Ｘ」としてマークされる：
【０１５３】
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＸＳＸＧＸＴＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＶＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＳＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＸＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＸＸＥＬＬＦＳＱＸＧＰＸＸＭＳＸＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＬＸＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＸＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＸＲＦＦＰＳＳＧＶＬＩＦＧＫＸＧＡＧＸＮＮＴＸＬＸＮＶＭＸＴＸＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＸＹＧＶＶＡＸＮＬＱＳＳＮＴＡＰＸＴＧＸＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＸＸＦＸＸＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＡＫＳＸＮＶＤＦＡＶＸＸＸＧＶＹＸＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５８）
【０１５４】
いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、配列番号５８に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、例えば配列番号２に示されるＡＡＶ２のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、配列番号５８または配列番号２に開示される祖先配列のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニネト（Ａｌａｎｉｎｅｔ）（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、以下のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、いくつかの事例では１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニン（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含む：
【０１５５】
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＡＳＡＧＳＴＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＶＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＳＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＡＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＲＥＬＬＦＳＱＡＧＰＳＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＡＮＮＴＡＬＥＮＶＭＭＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＳＮＬＱＳＳＮＴＡＰＶＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＡＶＦＴＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＡＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＮＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５９）。
【０１５６】
他の実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質は、本明細書では配列番号５８として開示される祖先変異体からなる群から選択される野生型ＡＡＶキャプシド配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニン（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸残基を含み、かつｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｇ７２７Ｄ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換、ならびに／または（ｉｉ）ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＰＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号６３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＰＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号６４）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、ＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、およびＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）からなる群から選択されるペプチド挿入も含む。いくつかの実施形態では、変異ＡＡＶキャプシドは、指定の１つ以上のアミノ酸置換および／またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号５９と同一である。
【０１５７】
本明細書に開示されるＡＡＶ変異体は、硝子体内投与後の霊長類網膜スクリーンの使用を伴うインビボの定向進化の使用によって生成された。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶを含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の形質導入と比較して網膜細胞の形質導入の増加をもたらす。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンよりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入、例えば、親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶを含むＡＡＶビリオンよりも多い、主題の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの取り込みをもたらす。いくつかのそのような実施形態では、ＡＡＶ変異ビリオンまたは変異ｒＡＡＶは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む野生型ＡＡＶビリオンまたはｒＡＡＶによる網膜細胞の形質導入と比較して、網膜細胞の形質導入が、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増加している。ある特定のそのような実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオンに存在する場合、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質または野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンよりも広範な霊長類網膜細胞の形質導入をもたらす。換言すれば、変異ＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むビリオンによって形質導入されない細胞型、したがって、対応する親ＡＡＶビリオンよりも網膜におけるより多くの型の細胞を形質導入する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ変異ビリオンは、網膜細胞を優先的に形質導入し、例えば、主題のｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞を、別の網膜細胞または非網膜細胞、例えば、目の外側の細胞と比較して、２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で感染させる。いくつかの実施形態では、形質導入された網膜細胞は、光受容細胞（例えば、桿体、錐体）である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、網膜上皮細胞（ＲＰＥ細胞）である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ミュラーグリア細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ミクログリア細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、アマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、双極細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、水平細胞である。網膜細胞の形質導入の増加、例えば、形質導入の効率の上昇、より広い形質導入、より優先的な形質導入などは、遺伝子発現を測定するための当該技術分野における任意の数の方法によってインビトロまたはインビボで容易に評価され得る。例えば、ＡＡＶは、普遍的または組織特異的プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質を含む発現カセットを含むゲノムと共にパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、例えば蛍光顕微鏡法によって蛍光タンパク質を検出することによって評価される。別の例として、ＡＡＶは、バーコード核酸配列を含むゲノムと共にパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、例えばＰＣＲによって核酸配列を検出することによって評価される。別の例として、ＡＡＶは、網膜疾患の治療のための治療用遺伝子を含む発現カセットを含むゲノムと共にパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、ＡＡＶを投与された罹患患者における網膜疾患の治療を検出することによって評価される。
【０１５８】
本明細書に開示される変異ｒＡＡＶベクターもしくはビリオンおよび／または方法を使用して治療することができる眼疾患には、単一遺伝子疾患、複雑な遺伝病、後天性疾患、および外傷性損傷が挙げられるが、これらに限定されない。単一遺伝子疾患の例には、限定されないが、バルデー・ビードル症候；バッテン病；Ｂｉｅｔｔｉクリスタリン網膜症；先天性脈絡膜欠如；脈絡網膜萎縮；脈絡網膜変性；錐体または錐体桿体ジストロフィー（常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖）；先天性停止性夜盲（常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖）；色覚異常（ＡＣＨＭ２、ＡＣＨＭ３、ＡＣＨＭ４、およびＡＣＨＭ５を含む）、第一色覚異常、第二色覚異常、および第三色覚異常を含む色覚の障害；フリードライヒ運動失調症；ＬＣＡ１、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ４、ＬＣＡ６、ＬＣＡ７、ＬＣＡ８、ＬＣＡ１２、およびＬＣＡ１５を非限定的に含む、レーバー先天黒内障（常染色体優性および常染色体劣性）；レーバー遺伝性視神経萎縮症；急性黄斑変性、ベスト病、パターンジストロフィー、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、遺伝性ドルーゼン、ソースビー眼底変性症、Ｍａｌａｔｔｉａ  Ｌｅｖａｎｔａｎｅｓｅ、および遺伝子的に決定される未熟児網膜症を非限定的に含む、黄斑変性（常染色体優性および常染色体劣性）；眼網膜発達障害；眼白子症；視覚萎縮（常染色体優性、常染色体劣性、およびＸ連鎖）；網膜色素変性（常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ連鎖、およびミトコンドリアによって継承される特徴）（その例には、ＲＰ１、ＲＰ２、ＲＰ３、ＲＰ１０、ＲＰ２０、ＲＰ３８、ＲＰ４０、およびＲＰ４３；Ｘ連鎖網膜分離症が挙げられる）；シュタルガルト病；ならびにＵＳＨ１Ｂ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｄ、ＵＳＨ１Ｆ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｃ、ＵＳＨ２Ｄ、およびＵＳＨ３を非限定的に含む、アッシャー症候群が挙げられる。複雑な遺伝病の例には、限定されないが、緑内障（開放隅角、閉塞隅角、低眼圧、正常眼圧、先天性、血管新生、色素性、偽落屑）；急性黄斑変性、卵黄様黄斑変性などの滲出型および非滲出型（常染色体優性および常染色体劣性）両方の加齢性および他の型の黄斑変性；未熟児網膜症；フォークト・小柳・原田（ＶＫＨ）症候群が挙げられる。後天性疾患の例には、限定されないが、急性黄斑神経網膜症；前部虚血性視神経症および後部虚血性視神経症；ベーチェット病；膜静脈分枝閉塞；脈絡膜血管新生；増殖性糖尿病性網膜症および関連する合併症を含む糖尿病性網膜症；糖尿病性ブドウ膜炎；黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫；網膜上膜疾患；黄斑毛細血管拡張症；多巣性脈絡膜炎；非網膜症糖尿病性網膜機能障害；眼の腫瘍；視神経萎縮；網膜剥離；網膜中心静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈および静脈の閉塞性疾患、血管閉塞、ブドウ膜網膜疾患などの網膜障害；ブドウ膜浸出；網膜感染症および浸潤性疾患；後天性視神経萎縮などの視神経疾患が挙げられる。外傷性損傷の例には、ヒストプラスマ症；視神経外傷；後眼部または部位に影響を及ぼす眼の外傷；網膜外傷；目のウイルス感染；視神経のウイルス感染；眼科用レーザー治療によって引き起こされるか、またはそ���影響を受ける後眼病態；光線力学療法によって引き起こされるか、またはその影響を受ける後眼病態；光凝固、放射線網膜症；交感性眼炎が挙げられる。
【０１５９】
別の実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドは、遺伝子産物、例えば、限定するものではないが、干渉ＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、短鎖非コードＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、ポリペプチド、分泌型抗体、一本鎖抗体、ＶＨＨドメイン、可溶性受容体、アフィボディ、ノッチン、ＤＡＲＰｉｎ、センチュリン、シャペロン、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼ、または転写の遺伝子特異的活性化を提供する修飾された部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
【０１６０】
本明細書に開示されるｒＡＡＶ変異ビリオンは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、長鎖非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、短鎖非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、分泌型抗体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＶＨＨドメインである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はノッチン（ｋｎｏｔｔｉｎ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ＤＡＲＰｉｎである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、センチュリン（ｃｅｎｔｕｒｉｎ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、シャペロンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。
【０１６１】
遺伝子産物の使用には、細胞における因子のレベルの増強、因子の分泌による隣接細胞における因子のレベルの増強、細胞における因子のレベルの低下、または因子の分泌による隣接細胞における因子のレベルの低下が含まれる。遺伝子産物は、欠けている遺伝子産物の欠損のレベルの補充、欠けている遺伝子産物の欠損のレベルの低下、新しい支持遺伝子産物の導入、支持遺伝子産物のレベルの補充、妨げる遺伝子産物のレベルの低下、または妨げる遺伝子産物のレベルの低下と支持遺伝子産物のレベルの補充との両方を行うように設計され得る。
【０１６２】
主題のＡＡＶ変異体によって送達される遺伝子産物は、網膜疾患および外傷に直接的または間接的に関連する遺伝子産物または遺伝子産物活性のレベルを変化させるために使用され得る。遺伝子産物が遺伝的疾患に直接的または間接的に関連する遺伝子には、例えば、ＡＤＰ−リボシル化因子様６（ＡＲＬ６）；ＢＢＳｏｍｅ相互作用タンパク質１（ＢＢＩＰ１）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質１（ＢＢＳ１）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質２（ＢＢＳ２）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質４（ＢＢＳ４）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質５（ＢＢＳ５）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質７（ＢＢＳ７）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質９（ＢＢＳ９）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質１０（ＢＢＳ１０）；ＢＢＳｏｍｅタンパク質１２（ＢＢＳ１２）；中心体タンパク質２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）；鞭毛内輸送タンパク質１７２（ＩＦＴ１７２）；鞭毛内輸送タンパク質２７（ＩＦＴ２７）；イノシトールポリホスフェート−５−ホスファターゼＥ（ＩＮＰＰ５Ｅ）；内向き整流性カリウムチャネルサブファミリーＪメンバー１３（ＫＣＮＪ１３）；ロイシンジッパー転写因子様−１（ＬＺＴＦＬ１）；ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｋａｕｆｍａｎ症候群タンパク質（ＭＫＫＳ）；メッケル症候群１型タンパク質（ＭＫＳ１）；ネフロン癆３タンパク質（ＮＰＨＰ１）；血清学的に定義された結腸癌抗原８（ＳＤＣＣＡＧ８）；トリパタイトモチーフ含有タンパク質３２（ＴＲＩＭ３２）；テトラトリコペプチド反復ドメイン８（ＴＴＣ８）；バッテン病タンパク質（ＣＬＮ３）；シトクロムＰ４５０  ４Ｖ２（ＣＹＰ４Ｖ２）；Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＣＨＭ）；ＰＲ（正の調節）ドメイン含有１３タンパク質（ＰＲＤＭ１３）；ＲＰＥ−網膜Ｇタンパク質共役型受容体（ＲＧＲ）；ＴＥＡドメインファミリーメンバー１（ＴＥＡＤ１）；アリール炭化水素相互作用受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）；錐体桿体ｏｔｘ様光受容体ホメオボックス転写因子（ＣＲＸ）；グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質１Ａ（ＧＵＣＡ１Ａ）；網膜特異的グアニル酸シクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）；ホスファチジルイノシトール転写膜関連ファミリーメンバー３（ＰＩＴＰＮＭ３）；プロミニン１（ＰＲＯＭ１）；ペリフェリン（ＰＲＰＨ）；ペリフェリン２（ＰＲＰＨ２）；調節シナプス膜エキソサイトーシスタンパク質１（ＲＩＭＳ１）；セマフォリン４Ａ（ＳＥＭＡ４Ａ）；シー・エレガンスｕｎｃ１１９タンパク質（ＵＮＣ１１９）のヒト相同体；ＡＴＰ結合カセットトランスポーター−レチナール（ＡＢＣＡ４）；ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン９（ＡＤＡＭ９）；活性化転写因子６（ＡＴＦ６）；第２１染色体オープンリーディングフレーム２（Ｃ２１ｏｒｆ２）；第８染色体オープンリーディングフレーム３７（Ｃ８ｏｒｆ３７）；カルシウムチャネル；電圧依存性；アルファ２／デルタサブユニット４（ＣＡＣＮＡ２Ｄ４）；カドヘリン関連ファミリーメンバー１（プロトカドヘリン２１）（ＣＤＨＲ１）；セラミドキナーゼ様タンパク質（ＣＥＲＫＬ）；錐体光受容体ｃＧＭＰ依存性カチオンチャネルアルファサブユニット（ＣＮＧＡ３）；錐体環状ヌクレオチド依存性カチオンチャネルベータ３サブユニット（ＣＮＧＢ３）；サイクリンＭ４（ＣＮＮ���４）；グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）；アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）；カリウムチャネルサブファミリーＶメンバー２（ＫＣＮＶ２）；ホスホジエステラーゼ６Ｃ（ＰＤＥ６Ｃ）；ホスホジエステラーゼ６Ｈ（ＰＤＥ６Ｈ）；中心小体（ｃｅｎｔｒｉｏｌｅ）１中心子（ｃｅｎｔｒｉｏｌａｒ）タンパク質Ｂのプロテオーム（ＰＯＣ１Ｂ）；ＲＡＳ癌遺伝子ファミリーのＲＡＢ２８メンバー（ＲＡＢ２８）；網膜および前部神経ひだホメオボックス２転写因子（ＲＡＸ２）；１１−ｃｉｓレチノールデヒドロゲナーゼ５（ＲＤＨ５）；ＲＰ  ＧＴＰａｓｅ調節因子相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）；チューブリンチロシンリガーゼ様ファミリーメンバー５（ＴＴＬＬ５）；Ｌ型電位依存性カルシウムチャネルアルファ−１サブユニット（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）；網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子（ＲＰＧＲ）；桿体トランスデューシンアルファサブユニット（ＧＮＡＴ１）；桿体ロッドｃＧＭＰホスホジエステラーゼベータサブユニット（ＰＤＥ６Ｂ）；ロドプシン（ＲＨＯ）；カルシウム結合タンパク質４（ＣＡＢＰ４）；Ｇタンパク質共役型受容体１７９（ＧＰＲ１７９）；ロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）；代謝調節型グルタミン酸受容体６（ＧＲＭ６）；ロイシンリッチリピート免疫グロブリン様膜貫通ドメインタンパク質３（ＬＲＩＴ３）；アレスチン（ｓ−抗原）（ＳＡＧ）；溶質キャリアファミリー２４（ＳＬＣ２４Ａ１）；一時的受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー１（ＴＲＰＭ１）；ナイクタロピン（ＮＹＸ）；緑色錐体オプシン（ＯＰＮ１ＬＷ）；赤色錐体オプシン（ＯＰＮ１ＭＷ）；青色錐体オプシン（ＯＰＮ１ＳＷ）；フラタキシン（ＦＸＮ）；イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＭＰＤＨ１）；オルトデンティクル（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ）ホメオボックス２タンパク質（ＯＴＸ２）；クラムス（ｃｒｕｍｂｓ）相同体１（ＣＲＢ１）；タンパク質１を含むデスドメイン（ＤＴＨＤ１）；成長分化因子６（ＧＤＦ６）；鞭毛内輸送１４０クラミドモナス相同タンパク質（ＩＦＴ１４０）；Ｂ１タンパク質（ＩＱＣＢ１）を含むＩＱモチーフ；レベルシリン（ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ）（ＬＣＡ５）；レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）；ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１（ＮＭＮＡＴ１）；ＲＤ３タンパク質（ＲＤ３）；レチノールデヒドロゲナーゼ１２（ＲＤＨ１２）；網膜色素上皮特異的６５ｋＤタンパク質（ＲＰＥ６５）；精子形成関連タンパク質７（ＳＰＡＴＡ７）；タビー（ｔｕｂｂｙ）様タンパク質１（ＴＵＬＰ１）；ミトコンドリア遺伝子（ＫＳＳ、ＬＨＯＮ、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＴＨ、ＭＴ−ＴＬ１、ＭＴ−ＴＰ、ＭＴ−ＴＳ２、ミトコンドリアでコードされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ＭＴ−ＮＤ］）；ベストロフィン１（ＢＥＳＴ１）；Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死関連タンパク質５コラーゲン（Ｃ１ＱＴＮＦ５）；ＥＧＦ含有フィブリリン様細胞外マトリックスタンパク質１（ＥＦＥＭＰ１）；非常に長い脂肪酸タンパク質の伸長（ＥＬＯＶＬ４）；網膜ファスシン相同体２、アクチン束化タンパク質（ＦＳＣＮ２）；グアニル酸シク��ーゼ活性化タンパク質１Ｂ（ＧＵＣＡ１Ｂ）；ヘミセンチン１（ＨＭＣＮ１）；光受容体間マトリックスプロテオグリカン１（ＩＭＰＧ１）；網膜色素変性１様タンパク質１（ＲＰ１Ｌ１）；メタロプロテイナーゼ−３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ３）；補体因子Ｈ（ＣＦＨ）；補体因子Ｄ（ＣＦＤ）；補体成分２（Ｃ２）；補体成分３（Ｃ３）；補体因子Ｂ（ＣＦＢ）；ＤＮＡ損傷調節型オートファジーモジュレーター２（ＤＲＡＭ２）；コンドロイチン硫酸プロテオグリカン２（ＶＣＡＮ）；ミトフシン２（ＭＦＮ２）；核内受容体サブファミリー２グループＦメンバー１（ＮＲ２Ｆ１）；視神経萎縮１（ＯＰＡ１）；膜貫通タンパク質１２６Ａ（ＴＭＥＭ１２６Ａ）；内部ミトコンドリア膜トランスロカーゼ８相同体Ａ（ＴＩＭＭ８Ａ）；炭酸脱水酵素ＩＶ（ＣＡ４）；ヘキソキナーゼ１（ＨＫ１）；ケルチ様７タンパク質（ＫＬＨＬ７）；核内受容体サブファミリー２グループＥ３（ＮＲ２Ｅ３）；神経網膜ルシン（ｌｕｃｉｎｅ）ジッパー（ＮＲＬ）；嗅覚受容体ファミリー２サブファミリーＷメンバー３（ＯＲ２Ｗ３）；プレｍＲＮＡプロセシング因子３（ＰＲＰＦ３）；プレｍＲＮＡプロセシング因子４（ＰＲＰＦ４）；プレｍＲＮＡプロセシング因子６（ＰＲＰＦ６）；プレｍＲＮＡプロセシング因子８（ＰＲＰＦ８）；プレｍＲＮＡプロセシング因子３１（ＰＲＰＦ３１）；網膜外側セグメント膜タンパク質１（ＲＯＭ１）；網膜色素変性タンパク質１（ＲＰ１）；ＰＩＭ１−キナーゼ関連タンパク質１（ＲＰ９）；核内低分子リボ核タンパク質２００ｋＤａ（ＳＮＲＮＰ２００）；分泌型リンタンパク質２（ＳＰＰ２）；トポイソメラーゼＩ結合アルギニン／セリンリッチタンパク質（ＴＯＰＯＲＳ）；ＡＤＰ−リボシル化因子様２結合タンパク質（ＡＲＬ２ＢＰ）；第２染色体オープンリーディングフレーム７１（Ｃ２ｏｒｆ７１）；クラリン−１（ＣＬＲＮ１）；桿体ｃＧＭＰ依存性チャネルアルファサブユニット（ＣＮＧＡ１）；桿体ｃＧＭＰ依存性チャネルベータサブユニット（ＣＮＧＢ１）；シトクロムＰ４５０  ４Ｖ２（ＣＹＰ４Ｖ２）；デヒドロドキリルジホスフェートシンテターゼ（ＤＨＤＤＳ）；ＤＥＡＨボックスポリペプチド３８（ＤＨＸ３８）；ＥＲ膜タンパク質複合体サブユニット１（ＥＭＣ１）；アイシャット／スペースメーカー相同体（ＥＹＳ）；配列類似性を有するファミリー１６１メンバーＡ（ＦＡＭ１６１Ａ）；Ｇタンパク質共役型受容体１２５（ＧＰＲ１２５）；ヘパラン−アルファ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＨＧＳＮＡＴ）；ＮＡＤ（＋）特異的イソクエン酸デヒドロゲナーゼ３ベータ（ＩＤＨ３Ｂ）；光受容体間マトリックスプロテオグリカン２（ＩＭＰＧ２）；ＫＩＡＡ１５４９タンパク質（ＫＩＡＡ１５４９）；キズナ中心体タンパク質（ＫＩＺ）；雄性生殖細胞関連キナーゼ（ＭＡＫ）；ｃ−ｍｅｒプロトオンコジーン受容体チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）；メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；ＮＩＭＡ（ｎｅｖｅｒ  ｉｎ  ｍｉｔｏｓｉｓ  ｇｅｎｅ  Ａ）関連キナーゼ２（ＮＥＫ２）；ニューロン分化タンパク質１（ＮＥＵＲＯＤ１）；ｃＧＭＰホスホジエステラーゼアルファサブユニット（ＰＤＥ６Ａ）；ホスホジエステラーゼ６Ｇ  ��ＧＭＰ特異的桿体ガンマ（ＰＤＥ６Ｇ）；プログレッシブ桿体錐体変性タンパク質（ＰＲＣＤ）；レチノール結合タンパク質３（ＲＢＰ３）；レチニルアルデヒド結合タンパク質１（ＲＬＢＰ１）；溶質キャリアファミリー７メンバー１４（ＳＬＣ７Ａ１４）；ユーセリン（ｕｓｈｅｒｉｎ）（ＵＳＨ２Ａ）；ジンクフィンガータンパク質４０８（ＺＮＦ４０８）；ジンクフィンガータンパク質５１３（ＺＮＦ５１３）；口顔指症候群１タンパク質（ＯＦＤ１）；網膜色素変性２（ＲＰ２）；レチノスキシン（ＲＳ１）；アブヒドロラーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＢＨＤ１２）；カドヘリン様遺伝子２３（ＣＤＨ２３）；中心体タンパク質２５０ｋＤａ（ＣＥＰ２５０）；カルシウムおよびインテグリン結合ファミリーメンバー２（ＣＩＢ２）；ワーリン（ｗｈｉｒｌｉｎ）（ＤＦＮＢ３１）；単性聴覚原性痙攣感受性１相同体（ＧＰＲ９８）；ヒスチジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＨＡＲＳ）；ミオシンＶＩＩＡ（ＭＹＯ７Ａ）；プロトカドヘリン１５（ＰＣＤＨ１５）；ハーモニン（ＵＳＨ１Ｃ）；アンキリン反復およびＳＡＭドメインを含むマウス足場タンパク質のヒト相同体（ＵＳＨ１Ｇ）；ジストロフィン（ＤＭＤ）；ノルリン（ＮＤＰ）；ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）；カルパイン５（ＣＡＰＮ５）；フリッツルド４Ｗｎｔ受容体相同体（ＦＺＤ４）；内在性膜タンパク質２Ｂ（ＩＴＭ２Ｂ）；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）；マイクロＲＮＡ２０４（ＭＩＲ２０４）；網膜芽腫タンパク質１（ＲＢ１）；テトラスパニン１２（ＴＳＰＡＮ１２）；第１２染色体オープンリーディングフレーム６５（Ｃ１２ｏｒｆ６５）；カドヘリン３（ＣＤＨ３）；膜型フリッツルド関連タンパク質（ＭＦＲＰ）；オルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＯＡＴ）；ホスホリパーゼＡ２グループＶ（ＰＬＡ２Ｇ５）；レチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）；Ｇタンパク質シグナリング９の調節因子（ＲＧＳ９）；Ｇタンパク質シグナリング９結合タンパク質の調節因子（ＲＧＳ９ＢＰ）；ＡＲＭＳ２；除去修復交差相補性齧歯類修復欠乏相補グループ６タンパク質（ＥＲＣＣ６）；フィブリン５（ＦＢＬＮ５）；ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１）；トール様受容体３（ＴＬＲ３）；ならびにトール様受容体４（ＴＬＲ４）が挙げられる。
【０１６３】
遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は「アポトーシス促進遺伝子産物」と称される。プロアポトーシス標的には、例えば、Ｂａｘ遺伝子産物；Ｂｉｄ遺伝子産物；Ｂａｋ遺伝子産物；Ｂａｄ遺伝子産物；Ｂｃｌ−２；Ｂｃｌ−Ｘ１が含まれる。抗アポトーシス遺伝子産物には、アポトーシスのＸ連鎖阻害剤が含まれる。
【０１６４】
遺伝子産物が血管新生を誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「血管新生促進遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「血管新生促進遺伝子産物」と称される。血管新生促進標的には、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦａ、ＶＥＧＦｂ、ＶＥＧＦｃ、ＶＥＧＦｄ）；血管内皮成長因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）；血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１（Ｆｌｔ１）；胎盤成長因子（ＰＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；アンジオポエチン；ソニックヘッジホッグが含まれる。遺伝子産物が血管新生を阻害する遺伝子は、本明細書では「抗血管新生遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「抗血管新生遺伝子産物」と称される。抗血管新生遺伝子産物には、エンドスタチン；タムスタチン；アンジオスタチン；色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、ならびに血管新生促進標的および／またはそれらの受容体に特異的な融合タンパク質または抗体、例えば、抗ＶＥＧＦ融合タンパク質ｓＦＬＴ１またはＥｙｌｅａ、ＶＥＧＦ特異的抗体Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、およびＡｖａｓｔｉｎ（商標）などが含まれる。
【０１６５】
遺伝子産物が免疫モジュレーター、例えば、補体因子、トール様受容体として機能する遺伝子は、「免疫調節遺伝子」と称される。例示的な免疫調節遺伝子には、サイトカイン、ケモカイン、およびそれらおよび／またはそれらの受容体に特異的な融合タンパク質または抗体、例えば、抗ＩＬ−６融合タンパク質Ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ（商標）、補体因子Ｈ特異的抗体ランパミズマブ（ｌａｍｐａｍｉｚｕｍａｂ）などが含まれる。遺伝子産物が神経保護因子として機能する遺伝子には、例えば、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）；グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）；桿体由来錐体生存能力因子（ＲｄＣＶＦ）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；ニュールツリン（ＮＴＮ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；ニューロトロフィン−４（ＮＴ４）；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；表皮成長因子が含まれる。遺伝子産物が光応答性オプシンとして機能する遺伝子には、例えば、オプシン；ロドプシン；チャネルロドプシン；ハロロドプシンが含まれる。
【０１６６】
いくつかの場合には、目的の遺伝子産物は、例えば、エンドヌクレアーゼが網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする場合、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼである。例えば、優性対立遺伝子が、野生型の場合に網膜構造タンパク質であり、かつ／または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠損コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠損対立遺伝子を標的にし、欠損対立遺伝子をノックアウトすることができる。
【０１６７】
欠損対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを用いて、欠損対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡによる相同的組換えを刺激することもできる。このため、例えば、対象のｒＡＡＶビリオンは、欠損対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼの両方を送達するために使用することができ、また欠損対立遺伝子の機能的コピーを送達して、欠損対立遺伝子の修復を生じさせることで、機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリンなど）の産生をもたらすことができる。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：２１７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と、機能的コピーが機能的レチナールタンパク質をコードする場合、欠損対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列とを含む。機能的網膜タンパク質には、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅレギュレーター（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質−１、ペリフェリン、ペリフェリン−２などが含まれる。
【０１６８】
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、メガヌクレアーゼ；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；およびそのような部位特異的エンドヌクレアーゼが天然に存在せず、特定の遺伝子を標的とするように修飾されている場合には、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）が含まれる。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内のある特定の位置を切断するように操作することができ、その後、非相同末端接合により、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失させながら破断を修復することができる。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、その後、タンパク質を枠外に投げ出し、効果的に遺伝子をノックアウトする。例えば、米国特許崩壊第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
【０１６９】
本明細書に開示される変異ｒＡＡＶベクターのいくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。好適な構成的プロモーターには、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）（Ｓｔｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５（２）：４３１−４４１）、ＣＭＶ早期エンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター／ウサギβ−グロビンイントロン（ＣＡＧ）（Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７９（２）：２６９−２７７，ＣＢＳＢ（Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３（６）：１０７４−１０８４）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１α）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１（２）：２１７−２２３）、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）（Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｇｅｎｅ  ３２（３）：４０９−４１７）、ミトコンドリア重鎖プロモーター（Ｌｏｄｅｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＮＡＳ  １０９（１７）：６５１３−６５１８）、ユビキチンプロモーター（Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６１：１０１−１０５）が含まれる。他の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的調節要素に作動可能に連結される。例えば、いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的調節要素（例えば、光受容体特異的プロモーター）、例えば、光受容細胞における作動可能に連結された遺伝子の選択的発現をもたらす調節要素に作動可能に連結される。好適な光受容体特異的調節要素には、例えば、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、前出）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）、前出）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．５５：２２５）、オプシン遺伝子プロモーター（Ｔｕｃｋｅｒら（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：２６１１−２６１５）、レチノスキシン遺伝子プロモーター（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６（７）：９１６−９２６）、ＣＲＸホメオドメインタンパク質遺伝子プロモーター（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２２（５）：１６４０−１６４７）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質アルファ形質導入活性ポリペプチド１（ＧＮＡＴ１）遺伝子プロモーター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａ���．（２０１０）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：１３９０−１３９９）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）遺伝子プロモーター（Ａｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＰＮＡＳ  １０３（１０）：３８９０−３８９５）、ヒト錐体アレスチン（ｈＣＡＲ）プロモーター（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４３：１３７５−１３８３）、ならびにＰＲ２．１、ＰＲ１．７、ＰＲ１．５、およびＰＲ１．１プロモーター（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２７（１）：７２−８２））が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞特異的調節要素（例えば、ＲＰＥ特異的プロモーター）、例えば、ＲＰＥにおける作動可能に連結された遺伝子の選択的発現をもたらす調節要素に作動可能に連結される。好適なＲＰＥ特異的調節要素には、例えば、ＲＰＥ６５遺伝子プロモーター（Ｍｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １４：２９２−３０３）、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）遺伝子プロモーター（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３：５５９１−５５９８）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ、別名セルピンＦ１）遺伝子プロモーター（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９３（１−２）：６３−６９）、および卵黄様黄斑変性症（ＶＭＤ２）プロモーター（Ｅｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７９（１８）：１９０６４−１９０７３）が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、ミュラーグリア細胞特異的調節要素（例えば、グリア特異的プロモーター）、例えば、網膜グリア細胞における作動可能に連結された遺伝子の選択的発現をもたらす調節要素に作動可能に連結される。好適なグリア特異的調節要素には、例えば、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｂｅｓｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６６（２８）：１８８７７−１８８８３）が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、双極細胞特異的調節要素（例えば、双極特異的プロモーター）、例えば、双極細胞における作動可能に連結された遺伝子の選択的発現をもたらす調節要素に作動可能に連結される。好適な双極特異的調節要素には、例えば、ＧＲＭ６プロモーター（Ｃｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６（９）：１１７５−１１９０）が含まれる。
【０１７０】
本発明の目的のために、本明細書の開示は、上記の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。単離された核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。
【０１７１】
本明細書の開示はまた、網膜疾患を治療する方法を提供し、本方法は、上に記載されかつ本明細書に開示される目的の導入遺伝子を含む有効量のｒＡＡＶ変異ビリオンの投与を、それを必要とする個体に行うことを含む。当業者は、主題のｒＡＡＶビリオンの有効量と、１つ以上の機能的または解剖学的パラメータ、例えば、視力、視野、明暗に対する電気生理学的応答、色覚、対照感受性、生体構造、網膜の健康および脈管構造、眼球運動、凝視選択、ならびに安定性における変化について試験することによって疾患が治療されたこととを容易に決定することができる。
【０１７２】
網膜機能およびその変化を評価するための非限定的な方法には、視力（例えば、最良矯正視力［ＢＣＶＡ］、歩行、ナビゲーション、物体検知、および識別）の評価、視野（例えば、静的および動的視野計測）の評価、臨床検査（例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査）の実施、明暗の全波長に対する電気生理学的応答（例えば、あらゆる形態の網膜電図写真（ＥＲＧ）［全視野、多焦点、およびパターン］、あらゆる形態の視覚誘発電位（ＶＥＰ）、電気眼球図記録（ＥＯＧ）、色覚、暗順応、および／または対比感度）の評価が挙げられる。生体構造および網膜の健康ならびにその変化を評価するための非限定的な方法には、光コンヘレンス断層撮影映像（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＯＣＴ）、眼底撮影、補償光学走査レーザー検眼鏡（ＡＯ−ＳＬＯ）、蛍光法、および／または自己蛍光法を使用する生体構造または健康の変化の測定；眼球運動および眼の動き（例えば、眼振、凝視、選択、および安定性）の測定、報告された結果（患者報告による視覚および非視覚誘導挙動および活動の変化、患者報告結果［ＰＲＯ］、生活の質のアンケート評価、日常活動の測定、ならびに神経機能の測定（例えば、機能的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が挙げられる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンにより、網膜機能、解剖学的一体性、または網膜の健康の喪失率の低下、例えば、２倍、３倍、４倍、または５倍以上の損失率の低下、およびそれに従う疾患の進行の減少、例えば、損失率の１０倍以上の低下、およびそれに従う疾患の進行の減少が生じる。いくつかの実施形態では、有効量の主題のｒＡＡＶビリオンにより、視覚機能、網膜機能の増大、網膜の生体構造もしくは健康の改善、ならびに／または眼球運動の改善および／もしくは神経機能の改善、例えば、２倍、３倍、４倍、または５倍以上の網膜機能、網膜の生体構造もしくは健康の改善、および／または眼球運動の改善、例えば、１０倍以上の網膜機能、網膜の生体構造もしくは健康の改善、および／または眼球運動の改善が生じる。当業者によって容易に理解されるように、所望の治療効果を達成するのに必要な用量は、典型的には、１×１０８〜約１×１０１５の組換えビリオンとなり、これは、典型的には、１×１０８〜約１×１０１５の「ベクターゲノム」と当業者によって称される。
【０１７４】
主題のｒＡＡＶビリオンは、眼内注射、例えば、硝子体内注射、網膜下注射、脈絡膜上注射、またはｒＡＡＶビリオンの眼への送達をもたらす任意の他の簡便な投与様式または投与経路によって、投与することができる。他の簡便な投与マンセストード（ｍａｎｃｅｓｔｏｄｅ）または投与経路には、限定されないが、静脈内、動脈内、眼周囲、前房内、結膜下およびテノン下の注射、ならびに局所投与および鼻腔内が挙げられる。硝子体内注射によって投与される場合、主題のｒＡＡＶビリオンは、硝子体を通過して移動し、内境界膜（本明細書では内部境界膜、または「ＩＬＭ」とも称され、アストロサイトとミュラー細胞のエンドフィートとによって形成される、網膜と硝子体との間の境界を形成する網膜の表面にある薄く透明な無細胞性の膜）を横断し、かつ／あるいは対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの能力と比較してより効率的に網膜の層を通過して移動する。
【０１７５】
本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、単離、例えば、精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、ＡＡＶベクターまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンに含まれる。他の実施形態では、そのようなＡＡＶ変異体ベクターおよび／またはＡＡＶ変異体ビリオンは、霊長類網膜における眼疾患を治療するインビボまたはエクスビボの方法において使用される。
【０１７６】
本明細書の開示は、さらに、宿主細胞、例えば、限定するものではないが、主題の核酸を含む単離された（遺伝子修飾された）宿主細胞を提供する。本明細書に開示される本発明に従う宿主細胞は、インビトロ細胞培養由来の細胞などの単離された細胞であり得る。そのような宿主細胞は、本明細書に記載されるように、主題のｒＡＡＶ変異ビリオンを産生するために有用である。一実施形態では、そのような宿主細胞は、核酸によって安定に遺伝子修飾される。他の実施形態では、宿主細胞は、核酸によって一過性に遺伝子修飾される。そのような核酸は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介トランスフェクションなどを含むがこれらに限定されない確立された技術を用いて宿主細胞に安定にまたは一過性に導入される。安定な形質転換のために、核酸は、一般に、選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性などといったいくつかの周知の選択マーカーのいずれかをさらに含む。そのような宿主細胞は、多様な細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞および霊長類細胞（例えば、ヒト細胞）を含む）のいずれかに核酸を導入することによって生成される。例示的な哺乳動物細胞には、限定されないが、初代細胞および細胞株が挙げられ、例示的な細胞株には、限定されないが、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。例示的な宿主細胞には、限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶを産生するＳｆ９細胞などの昆虫細胞を感染させるためにバキュロウイルスを使用して作製することもできる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された宿主細胞は、上記のような変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つ以上のＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、ｒＡＡＶ変異ベクターをさらに含む。そのような宿主細胞を用いてｒＡＡＶ変異ビリオンを生成することができる。ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号および米国特許公開第２００９／０２０２４９０号に記載されている。
【０１７７】
本明細書の開示は、ａ）上に記載されかつ本明細書に開示されるｒＡＡＶ変異ビリオンと、ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤とを含む薬学的組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトまたは非ヒト患者における使用に好適である。そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬品が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれてもよい。加えて、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などが、そのようなビヒクル中に存在してもよい。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当該技術分野で既知であり、本明細書で詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、多様な刊行物、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃにおいて十分に説明されている。本発明のいくつかの態様では、本発明は、約１×１０８〜約１×１０１５の組換えウイルスまたは１×１０８〜約１×１０１５のベクターゲノムを含む薬学的組成物を提供し、該組換えウイルスの各々は、１つ以上の遺伝子産物をコードするゲノムを含む。
【０１７８】
以下の実施例は、本明細書に開示される変異ＡＡＶキャプシドをどのように作製および使用するかについての指導に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために示され、本明細書に開示される発明の範囲を限定することを意図するものではない。さらに、以下の実施例は、以下の実験が全てまたは唯一の実施された実験であることを示すことを意図するものではない。
【実施例】
【０１７９】
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者が発明と見なすものの範囲を制限することを意図せず、また以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験であると示すことを意図していない。使用される数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別途指示がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
【０１８０】
分子生物学および細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）などの標準的な教本に見い出すことができ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本開示において言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商用供給業者から入手可能である。
【０１８１】
実施例１
【０１８２】
硝子体内注射および組織採取。４〜１０歳で体重が少なくとも４ｋｇの単体の雄のカニクイザル（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、強膜を介した（ヒトの使用に適した手順および送達装置を用いて輪部の約３ｍｍ後ろの）硝子体内注射によって投薬した。動物を麻酔し、局所麻酔剤を与え、１００μＬのライブラリーを各眼に投与した。
【０１８３】
安楽死は、１４日目±３日に１００ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムの静脈内注射を用いて、訓練された獣医スタッフによって実施した。眼を核形成させ、解剖まで４℃で保存した。
【０１８４】
組織解剖。眼をメスで鋸状縁に沿って切断し、前部を除去した。網膜の平らな取付けを可能にするために、窩周囲の網膜にレリーフカットを作製し、硝子体を除去した。図２に示すように、各四半部（上側、下側、鼻側、および側頭側）から網膜の６つの試料を採取し、ＲＰＥ細胞、光受容体、バイオポーラー（ｂｉｏｐｏｌａｒ）細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または神経節細胞に対応する細胞物質を単離した。
【０１８５】
定向進化。定向進化過程を図１Ａ〜１Ｅに示す。端的には、ＤＮＡ突然変異技法とｃａｐ遺伝子との２０以上の独自の組み合わせを含むウイルスキャプシドライブラリーを創出する（図１Ａ）。次に、各粒子が、キャプシドをコードするｃａｐ遺伝子を取り囲む突然変異キャプシドから構成され、精製されるように、ウイルスをパッケージングする（図１Ｂ）。キャプシドライブラリーをインビボの選択圧下に置く。目的の組織または細胞物質を採取し、その標的の感染に成功したＡＡＶ変異体の単離し、成功したウイルスを回収する。成功したクローンを反復選択により富化する（ステージＩ−図１Ｄ）。次いで、選択されたｃａｐ遺伝子に独自の再多様化を行い、さらなる選択ステップによって富化して、反復的にウイルスの適合度を反復的に増加させる（ステージ２−図１Ｄ）。ベクター選択ステージ１および２の最中に同定された変異体は、霊長類網膜細胞を形質導入する能力を示す（図１Ｅ）。
【０１８６】
ＡＡＶキャプシドゲノムの回復の成功：ラウンド１〜６。各選択ラウンドから回収されたキャプシドを用いて、注入されたライブラリーをパッケージングして、その後の選択ラウンドを開始した。組織からのキャプシド遺伝子の回収は、目的の組織へのライブラリーベクターの内在化の成功を表す。ラウンド４に続いて、ラウンド５のライブラリーパッケージングおよび注入の前に、ライブラリーの追加の再多様化を組み込んだ。代表的な選択ラウンドからのＲＰＥ、ＰＲ、内顆粒層（ＩＮＬ）、および神経節細胞層（ＧＣＬ）網膜組織由来のウイルスゲノムの回収を図３に示す。ボックス内のバンドは、ウイルスゲノムの回収の成功を表す。
【０１８７】
シークエンシング分析：ラウンド３〜６。ラウンド３〜６では、ライブラリー内の個々のクローンについて配列決定を行い、集団内の変異体の頻度を決定した。変異体を、シークエンシングデータ内のモチーフの存在について評価した。変異体を、複数の配列で生じた統一的変異（例えば、キャプシド内の一貫した位置における特定の点突然変異または特異的なペプチド挿入配列）の存在に基づいてモチーフに分類した。２つ以上の選択ラウンドにおけるシークエンシングした集団の少なくとも５％、または１つ以上の選択ラウンドにおけるシークエンシングした集団の少なくとも１０％を表すモチーフを、図４Ａ（ラウンド３シークエンシング分析）、４Ｂ（ラウンド４シークエンシング分析）、４Ｃ（ラウンド５シークエンシング分析）、および４Ｄ（ラウンド６シークエンシング分析）に表す。
【０１８８】
網膜細胞の感染性の増加をもたらすと同定されたいくつかの代表的なクローンを以下の表１に列挙する（各クローンは同定された置換（複数可）および／またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号２と同一であり、各クローンについて、選択ラウンド、配列番号、および頻度（括弧内）が列挙される）。
表１。網膜の１つ以上の細胞の感染性の増加をもたらすＡＡＶ  ＶＰ１キャプシドタンパク質に対するアミノ酸配列修飾。第２欄に列挙される置換は、野生型ＡＡＶ２のアミノ酸配列、すなわち、挿入されたペプチドの非存在下のアミノ酸配列に基づく。
【表１−１】
2019518458.tif 000003
【表１−２】
2019518458.tif 000004
【表１−３】
2019518458.tif 000005
【表１−４】
2019518458.tif 000006
【表１−５】
2019518458.tif 000007
【表１−６】
2019518458.tif 000008
【表１−７】
2019518458.tif 000009
【表１−８】
2019518458.tif 000010
【０１８９】
網膜の１つ以上の細胞の感染性が増加したキャプシドとして、以下の祖先ＶＰ１キャプシド配列を有するクローンも同定された：
【０１９０】
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＡＳＡＧＳＴＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＶＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＳＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＡＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＲＥＬＬＦＳＱＡＧＰＳＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＡＮＮＴＡＬＥＮＶＭＭＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＳＮＬＱＳＳＮＴＡＰＶＴＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＡＶＦＴＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＡＫＳＴＮＶＤＦＡＶＤＮＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ。（配列番号５９）
【０１９１】
この祖先のキャプシド変異体は、祖先キャプシド配列番号５８から進化しており、ここでは、縮重の位置（残基２６４、２６６、２６８、４４８、４５９、４６０、４６７、４７０、４７１、４７４、４９５、５１６、５３３、５４７、５５１、５５５、５５７、５６１、５６３、５７７、５８３、５９３、５９６、６６１、６６２、６６４、６６５、７１０、７１７、７１８、７１９、７２３）が、２６４でアラニン（Ａ）、２６６でアラニン（Ａ）、２６８でセリン（Ｓ）、４４８でアラニン（Ａ）、４５９でトレオニン（Ｔ）、４６０でアルギニン（Ｒ）、４６７でアラニン（Ａ）、４７０でセリン（Ｓ）、４７１でアスパラギン（Ｎ）、４７４でアラニン（Ａ）、４９５でセリン（Ｓ）、５１６でアスパラギン（Ｄ）、５３３でアスパラギン（Ｄ）、５４７でグルタミン（Ｑ）、５５１でアラニン（Ａ）、５５５でアラニネト（Ａｌａｎｉｎｅｔ）（Ａ）、５５７でグルタミン酸（Ｅ）、５６１でメチオニン（Ｍ）、５６３でセリン（Ｓ）、５７７でグルタミン（Ｑ）、５８３でセリン（Ｓ）、５９３でバリン（Ｖ）、５９６でトレオニン（Ｔ）、６６１でアラニン（Ａ）、６６２でバリン（Ｖ）、６６４でトレオニン（Ｔ）、６６５でプロリン（Ｐ）、７１０でトレオニン（Ｔ）、７１７でアスパラギン酸（Ｄ）、７１８でアスパラギン（Ｎ）、７１９でグルタミン酸（Ｅ）、および７２３でセリン（Ｓ）を含むように進化した。
【０１９２】
本明細書に開示されるＡＡＶ変異ビリオンは、ＡＡＶウイルスベクター操作の技術分野の当業者には容易に明らかである、妥当な合理的設計パラメータ、特徴、修正、利点、および変形を組み込み得る。
【０１９３】
実施例２
【０１９４】
定向進化を用いて、ヒトの眼への遺伝子送達の他の方法（実施例１）よりも顕著な利点を有する投与経路である硝子体内（ＩＶＴ）投与後の網膜細胞への優れた遺伝子送達を有する新規のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）変異体を発見した。Ｐ３４Ａ置換とアミノ酸５８８に挿入されたペプチドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）とを含む新規のＡＡＶ変異体（ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ）の硝子体内投与後の細胞向性を、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）含有ＡＡＶ変異体が網膜細胞を形質導入する能力の代表例として、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてインビボで評価した。
【０１９５】
ＡＡＶ２キャプシドまたは新規の変異キャプシドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａのいずれかと、ＣＭＶプロモーター（それぞれ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ＧＦＰおよびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＭＶ．ＧＦＰ）またはＣＡＧプロモーター（それぞれ、ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＥＧＦＰおよびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰ）に作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）導入遺伝子を含むゲノムとを含む組換えＡＡＶビリオンを、標準的な方法を用いて製造した。アフリカミドリザル（図７、８）またはカニクイザル（図９）に、１眼当たり４×１０１０ｖｇ〜１×１０１２１ｅ１２  ｖｇの範囲の様々な用量のベクターを硝子体内注射し（詳細については図の凡例を参照）、網膜細胞の形質導入を、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ（商標）を用いた眼底蛍光撮像により生存中に評価した。
【０１９６】
新規の変異ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａを含むＡＡＶの硝子体内送達により、ＡＡＶ２と比べてより広範かつより強固なＮＨＰ網膜にわたる導入遺伝子発現がもたらされた（図７〜９）。画像により、新規のＡＡＶ変異キャプシドが、注射後２週間の早さで、中心窩の中央（錐体が豊富な領域）、傍中心窩リング（網膜神経節細胞が豊富な領域）、および末梢部（桿体、ミュラーグリア、アマクリン細胞、双極細胞を含む多くの細胞型が豊富な領域）の中で強固な発現をもたらすことが明らかとなる。対照的に、また他者によって報告された結果と一致して、野生型ＡＡＶ２は、主に傍中心窩リングで起き、後の時点でしか検出できないより弱い発現をもたらす。注射の３週間後に行われた網膜の様々な領域の免疫組織化学的分析により、網膜色素上皮細胞、桿体および錐体光受容体、ならびに網膜神経節細胞を含む多くの網膜細胞型が網膜全体に首尾よく形質導入されたことが確認された（図１０Ａ〜１０Ｅ）。
【０１９７】
この研究により、臨床的に意義のあるＡＡＶ２と比較して、臨床的に好ましい投与経路の後のＩＳＤＱＴＫＨ含有変異体による優れた遺伝子送達が示される。類似の効力は、このペプチド挿入モチーフを含む他の変異体で達成可能である。同様に、同じ定向進化アプローチを用いて同定された本明細書に開示される他の変異体でも類似の効力が達成可能である。
【０１９８】
実施例３
【０１９９】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞および光受容体（ＰＲ）細胞に対する新規のＡＡＶ変異ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａの細胞向性を、線維芽細胞由来ヒト誘導多能性幹細胞（ＦＢ−ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）から生成したＲＰＥ細胞およびＰＲ細胞を使用してインビトロで評価した。
【０２００】
ＡＡＶ２キャプシドまたは新規の変異キャプシドＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａのいずれかと、ＣＡＧプロモーター（それぞれ、ＡＡＶ２．ＣＡＧ．ＥＧＦＰおよびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰ）に作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）導入遺伝子を含むゲノムとを含む組換えＡＡＶビリオンを、標準的な方法を用いて製造した。４５日間の分化プロトコルを用いて、ヒト胚性幹細胞株ＥＳＩ−０１７またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞（「ＦＢ−ｉＰＳＣ」）からヒトＲＰＥ細胞培養を生成した。ＲＰＥ細胞への成熟は、ＲＰＥ６５およびＢＥＳＴ１を含む成熟ＲＰＥマーカーの発現、ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの合成、ならびに桿体の外側部を貪食する能力を検出することによって確認した。ＰＲ培養は、多段階の眼杯形成パラダイムによって生成し、培養の１７９日後にＲｅｃｏｖｅｒｉｎおよびＳ  Ｏｐｓｉｎの発現を検出することによってＰＲを含むことが確認された。
【０２０１】
ＡＡＶ２と比べて、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａは、免疫蛍光法（図１１Ａ〜Ｂ）、フローサイトメトリー（２．７倍の増加、図１１Ｃ〜Ｄ）、およびウエスタンブロット分析（図１１Ｅ〜Ｆ）によって決定して、感染後７日のヒトＲＰＥ培養における導入遺伝子発現の顕著に高い形質導入効率をもたらした。強固な形質導入および発現が、感染後３２日までに、ヒトＰＲ培養中のＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ＋Ｐ３４Ａ．ＣＡＧ．ＥＧＦＰを用いて同様に達成された。この研究により、網膜細胞に遺伝子を送達するＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）を含む変異体の優れた能力が示される。
【０２０２】
上記は、本発明の原理を例解するものでしかない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または図示されていないが、本発明の原理を具現化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に記載されている全ての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理および発明者らが当該技術を促進することに寄与する概念を理解する上で読者を助けることを意図しているものであり、そのような具体的に記載される例および条件に限定されないことが企図されるものである。
【０２０３】
さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの具体例を記載する本明細書における全ての記述は、その構造的等価物および機能的等価物の両方を包含するように意図されている。さらに、そのような等価物は、現在知られている等価物および今後開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす任意の開発されたいずれの要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲が、本明細書に図示および記載される例示的な実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１】
2019518458.tif 000011
【図２】
2019518458.tif 000012
【図３】
2019518458.tif 000013
【図４】
2019518458.tif 000014
【図５】
2019518458.tif 000015
【図６−１】
2019518458.tif 000016
【図６−２】
2019518458.tif 000017
【図６−３】
2019518458.tif 000018
【図６−４】
2019518458.tif 000019
【図６−５】
2019518458.tif 000020
【図６−６】
2019518458.tif 000021
【図６−７】
2019518458.tif 000022
【図６−８】
2019518458.tif 000023
【図６−９】
2019518458.tif 000024
【図６−１０】
2019518458.tif 000025
【図６−１１】
2019518458.tif 000026
【図６−１２】
2019518458.tif 000027
【図６−１３】
2019518458.tif 000028
【図６−１４】
2019518458.tif 000029
【図６−１５】
2019518458.tif 000030
【図６−１６】
2019518458.tif 000031
【図６−１７】
2019518458.tif 000032
【図６−１８】
2019518458.tif 000033
【図６−１９】
2019518458.tif 000034
【図６−２０】
2019518458.tif 000035
【図６−２１】
2019518458.tif 000036
【図６−２２】
2019518458.tif 000037
【図６−２３】
2019518458.tif 000038
【図７】
2019518458.tif 000039
【図８】
2019518458.tif 000040
【図９】
2019518458.tif 000041
【図１０Ａ】
2019518458.tif 000042
【図１０ＢＣ】
2019518458.tif 000043
【図１０Ｄ】
2019518458.tif 000044
【図１０Ｅ】
2019518458.tif 000045
【図１１Ａ】
2019518458.tif 000046
【図１１Ｂ】
2019518458.tif 000047
【図１１Ｃ】
2019518458.tif 000048
【図１１Ｄ】
2019518458.tif 000049
【図１１Ｅ】
2019518458.tif 000050
【図１１Ｆ】
2019518458.tif 000051
【配列表】
2019518458000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月7日(2018.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のＧＨループにペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項２】
前記ペプチド挿入は、アミノ酸配列Ｙ１Ｙ２ＩＳＤＱＴＫＨＹ３を含み、式中、Ｙ１〜Ｙ３の各々は、独立して、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＰｒｏから選択される、請求項１に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３】
前記ペプチド挿入は、アミノ酸配列ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）を含むか、またはそれからなる、請求項２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項４】
前記挿入の部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号２）のアミノ酸５８７および５８８に対応するアミノ酸の間に位置しているか、または別のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項５】
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号２）に対する１つ以上のアミノ酸置換または他のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質に対する１つ以上の対応する置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項６】
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号２）に対する以下のアミノ酸置換：Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑのうちの１つ以上、または他のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質に対する対応する置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項７】
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号２）に対するＰ３４Ａアミノ酸置換、または他のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質に対する対応する置換を含む、請求項６に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項８】
前記キャプシドタンパク質が、配列番号４２で示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項９】
前記キャプシドタンパク質が、配列番号４２で示されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項８に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項１０】
前記キャプシドタンパク質が、感染性組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンに、対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性、好ましくは、少なくとも２倍の増加した感染性を付与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、感染性ｒＡＡＶビリオン。
【請求項１３】
異種核酸、好ましくは遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸をさらに含み、好ましくは、前記遺伝子産物はタンパク質または短鎖干渉ＲＮＡである、請求項１２に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１４】
前記変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４２で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するか、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記異種核酸が、Ｒａｂエスコートタンパク質１タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１５】
前記変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなり、Ｒａｂエスコートタンパク質１タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結される、請求項１４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１６】
前記変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４２で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するか、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記異種核酸が、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、網膜色素変性ＧＴＰａｓｅ調節因子タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、ロドプシンキナーゼプロモーターに作動可能に連結される、請求項１３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１７】
前記変異ＡＡＶキャプシドタンパク質が、配列番号４２で示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するか、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記異種核酸が、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の活性を阻害するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、前記ポリペプチドは融合タンパク質または抗体である、請求項１３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
網膜細胞に、好ましくは、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、および網膜色素上皮からなる群から選択される網膜細胞に異種核酸を送達する方法において使用するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンを含む組成物、または請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
医薬として使用するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンを含む組成物、または請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
先天性脈絡膜欠如の処置において使用するための、請求項１４または１５に記載のｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物であって、好ましくは、前記薬学的組成物が硝子体内注射によって投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２２】
先天性脈絡膜欠如の処置のための医薬の製造のための、請求項１４または１５に記載のｒＡＡＶビリオンあるいは請求項１４または１５に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物の使用であって、好ましくは、前記ｒＡＡＶビリオンまたは薬学的組成物は硝子体内注射に適している、使用。
【請求項２３】
Ｘ連鎖網膜色素変性の処置において使用するための、請求項１６に記載のｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物であって、好ましくは、前記薬学的組成物が硝子体内注射によって投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２４】
Ｘ連鎖網膜色素変性の処置のための医薬の製造のための、請求項１６に記載のｒＡＡＶビリオンあるいは請求項１６に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物の使用であって、好ましくは、前記ｒＡＡＶビリオンまたは薬学的組成物は硝子体内注射に適している、使用。
【請求項２５】
ウェット型加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または脈絡膜血管新生の処置において使用するための、請求項１７に記載のｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物であって、好ましくは、前記薬学的組成物が硝子体内注射によって投与されることを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項２６】
ウェット型加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫または脈絡膜血管新生の処置のための医薬の製造のための、請求項１７に記載のｒＡＡＶビリオンあるいは請求項１７に記載のｒＡＡＶを含む薬学的組成物の使用であって、好ましくは、前記ｒＡＡＶビリオンまたは薬学的組成物は硝子体内注射によって投与されることを特徴とする、使用。
【請求項２７】
ヒト対象の処置において使用するための、請求項１９または２０に記載の組成物、あるいは請求項１９、２１、２３および２５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
配列番号２で示されるＡＡＶ２キャプシド配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そして、配列番号２に対してＰ３４Ａアミノ酸置換を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項２９】
配列番号２で示されるＡＡＶ２キャプシド配列に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項３１】
請求項２８または２９に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質を含む、ｒＡＡＶビリオン。
【請求項３２】
遺伝子産物をコードする異種核酸をさらに含む、請求項３１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項３３】
請求項３２に記載のｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの具体例を記載する本明細書における全ての記述は、その構造的等価物および機能的等価物の両方を包含するように意図されている。さらに、そのような等価物は、現在知られている等価物および今後開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす任意の開発されたいずれの要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲が、本明細書に図示および記載される例示的な実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにペプチド挿入を含み、前記挿入が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体のキャプシド部分の対応する位置にあり、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
（項目２）
前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ２に対する１つ以上の点変異または他の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体に対する１つ以上の対応する点変異を含む、項目１に記載の変異ＡＡＶ。
（項目３）
前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、項目２に記載の変異ＡＡＶ。
（項目４）
前記ペプチド挿入が、ＡＡＶ２のＶＰ１の５７０〜６７１位のアミノ酸のうちのいずれか、または別の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体の対応する位置の後に挿入される、項目１に記載の変異ＡＡＶ。
（項目５）
前記ペプチド挿入が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７、または別のＡＡＶ血清型の対応する位置の後に挿入される、項目４に記載の変異ＡＡＶ。
（項目６）
（ａ）項目１に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種核酸を含む、感染性組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
（項目７）
前記異種核酸が、ＲＮＡ干渉剤またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目６に記載のｒＡＡＶ。
（項目８）
異種核酸を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を項目７に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。
（項目９）
前記標的細胞が網膜細胞である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記標的細胞がインビトロである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記標的細胞がインビボである、項目８に記載の方法。
（項目１２）
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにペプチド挿入を含み、前記挿入が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体のキャプシド部分の対応する位置にあり、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される、単離された核酸。
（項目１３）
項目１２に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
（項目１４）
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０と６１１との間の位置にある２つの隣接するアミノ酸に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入を含む変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記挿入が、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４を含み、Ｘ１が、Ｎ、Ａ、およびＨから選択され、Ｘ２が、Ｑ、Ｐ、およびＳから選択され、Ｘ３が、Ｔ、Ｙ、およびＳから選択され、Ｘ４が、Ｔ、Ｎ、およびＡから選択される、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
（項目１５）
前記ペプチド挿入が、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、およびＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）からなる群から選択される、項目１４に記載の変異ＡＡＶ。
（項目１６）
前記ペプチド挿入が、Ｎ末端アミノ酸ＬＡおよびＣ末端アミノ酸Ａに隣接している、項目１５に記載の変異ＡＡＶ。
（項目１７）
前記ペプチド挿入が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７と５８８との間、または別の野生型ＡＡＶ血清型もしくはＡＡＶ変異体の対応する位置にある、項目１５に記載の変異ＡＡＶ。
（項目１８）
（ａ）項目１５に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種核酸を含む、感染性組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
（項目１９）
前記異種核酸が、ＲＮＡ干渉剤またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目１８に記載のｒＡＡＶ。
（項目２０）
異種核酸を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を項目１８に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。
（項目２１）
前記標的細胞が網膜細胞である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記標的細胞がインビトロまたはインビボである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０と６１１との間の位置にある２つの隣接するアミノ酸の間の親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入を含む変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記挿入が、アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＤＸ３ＴＫＸ４を含み、Ｘ１が、Ｎ、Ａ、およびＨから選択され、Ｘ２が、Ｑ、Ｐ、およびＳから選択され、Ｘ３が、Ｔ、Ｙ、およびＳから選択され、Ｘ４が、Ｔ、Ｎ、およびＡから選択される、単離された核酸。
（項目２４）
項目２３に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
（項目２５）
ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０と６１１との間の位置にある２つの隣接するアミノ酸に対応する親ＡＡＶキャプシドタンパク質に対してペプチド挿入を含む変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、前記挿入が、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＰＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号６４）、およびＰＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号６３）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
（項目２６）
ｉ）配列番号１〜１０および１１からなる群より選択される野生型ＡＡＶと少なくとも９０％同一であるＡＡＶアミノ酸配列と、（ｉｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｐ３４Ａ＋Ｒ４８４Ｓ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換と、を含み、前記１つ以上の置換が、ＡＡＶ２に対するものか、または他のＡＡＶ血清型に対する前記１つ以上の対応する置換である、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
（項目２７）
前記キャプシドタンパク質がペプチド挿入を含む、項目２６に記載の変異ＡＡＶ。
（項目２８）
前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）、ＡＳＤＳＴＫＡ（配列番号１５）、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）、ＨＰＤＴＴＫＮ（配列番号１８）、ＨＱＤＴＴＫＮ（配列番号１９）、ＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号２０）、ＩＳＮＥＮＥＨ（配列番号２１）、ＱＡＮＡＮＥＮ（配列番号２２）、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）、ＰＮＳＴＨＧＳ（配列番号２５）、ＫＤＲＡＰＳＴ（配列番号２６）、ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）、ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）、ＬＧＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２９）、ＬＡＡＳＤＳＴＫＡＡ（配列番号３０）、ＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）、ＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）、ＬＡＨＰＤＴＴＫＮＡ（配列番号３３）、ＬＡＨＱＤＴＴＫＮＡ（配列番号３４）、ＬＡＮＫＴＴＮＫＤＡ（配列番号３５）、ＬＰＩＳＮＥＮＥＨＡ（配列番号３６）、ＬＰＱＡＮＡＮＥＮＡ（配列番号３７）、ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）、ＬＡＰＮＳＴＨＧＳＡ（配列番号４０）、およびＬＡＫＤＲＡＰＳＴＡ（配列番号４１）からなる群から選択される、項目２７に記載の変異ＡＡＶ。
（項目２９）
前記ＡＡＶアミノ酸配列が、前記野生型ＡＡＶと少なくとも９５％同一である、項目２６に記載の変異ＡＡＶ。
（項目３０）
前記ＡＡＶアミノ酸配列が、前記野生型ＡＡＶと少なくとも９９％同一である、項目２６に記載の変異ＡＡＶ。
（項目３１）
前記キャプシドタンパク質が祖先キャプシドタンパク質である、項目２６に記載の変異ＡＡＶ。
（項目３２）
（ａ）項目２７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種核酸を含む、感染性組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン。
（項目３３）
前記異種核酸が、ＲＮＡ干渉剤またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目３２に記載のｒＡＡＶ。
（項目３４）
異種核酸を標的細胞に送達する方法であって、前記標的細胞を項目３２に記載のｒＡＡＶビリオンと接触させることを含む、方法。
（項目３５）
前記標的細胞が網膜細胞である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記網膜細胞が、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、および網膜色素上皮からなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記標的細胞がインビトロである、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記標的細胞がインビボである、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
配列番号１〜１２からなる群から選択される野生型ＡＡＶまたはＡＡＶ変異体と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と、（ｉｉ）Ｐ３４Ａ、Ｓ１０９Ｔ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｐ３４Ａ＋Ｒ４８４Ｓ、Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ａ５９３Ｅ＋Ｎ５９６Ｄ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｖ７１９Ｍ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｇ７２７Ｄ、Ｓ１０９Ｔ＋Ａ４９３Ｖ＋Ａ５９３Ｅ＋Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７０８Ｉ＋Ｒ７３３Ｃ、Ｑ１６４Ｋ、およびＩ６９８Ｖからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換と、を含む、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
（項目４０）
項目３９に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
（項目４１）
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｐ３４Ａである、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４２）
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４３）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）２つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＩＳＤＱＴＫＨ（配列番号１４）およびＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４４）
前記２つ以上の点変異の少なくとも１つが、Ｖ７０８Ｉである、項目４３に記載の変異ＡＡＶキャプシド。
（項目４５）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）配列番号２のアミノ酸５８７と５８８との間のＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ（配列番号２８）ペプチド挿入と、ｂ）前記配列番号２のアミノ酸配列と比較したＰ３４Ａアミノ酸置換と、を有し、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質の前記アミノ酸配列が、それ以外の点では配列番号２と同一である、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４６）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４７）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）２つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＱＡＤＴＴＫＮ（配列番号１３）およびＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４８）
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｓ１０９ＴおよびＶ７０８Ｉからなる群から選択される、項目４７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目４９）
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも２つが、Ｓ１０９ＴおよびＶ７０８Ｉである、項目４７に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５０）
アミノ酸配列ＬＡＱＡＤＴＴＫＮＡ（配列番号２７）を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５１）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）およびＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）からなる群から選択され、前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、Ｌ７３５Ｑ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５２）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）２つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入または突然変異が、ＡＡＶ２、または前記ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分における対応する位置にあり、前記ペプチド挿入が、ＴＮＲＴＳＰＤ（配列番号２４）およびＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５３）
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｖ７０８Ｉである、項目５２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５４）
アミノ酸配列ＬＡＴＮＲＴＳＰＤＡ（配列番号３９）を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５５）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、ａ）前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入と、ｂ）１つ以上の点変異と、を含み、前記ペプチド挿入が、ＧＫＳＫＶＩＤ（配列番号２３）およびＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５６）
前記１つ以上の点変異が、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｎ３１２Ｋ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される、項目５５に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５７）
アミノ酸配列ＬＡＧＫＳＫＶＩＤＡ（配列番号３８）を含む、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５８）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入が、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目５９）
前記タンパク質が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分における対応する位置に対する、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７０８Ｉ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される１つ以上の点変異をさらに含む、項目５８に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６０）
前記タンパク質が、２つ以上の点変異をさらに含み、前記ペプチド挿入が、ＮＱＤＹＴＫＴ（配列番号１６）およびＬＡＮＱＤＹＴＫＴＡ（配列番号３１）からなる群より選択される、項目５８に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６１）
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｎ３１２Ｋである、項目６０に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６２）
変異ＡＡＶキャプシドタンパク質であって、前記キャプシドタンパク質のＧＨループにおけるペプチド挿入を含み、前記ペプチド挿入が、ＨＤＩＴＫＮＩ（配列番号１７）およびＬＡＨＤＩＴＫＮＩＡ（配列番号３２）からなる群から選択される、変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６３）
前記タンパク質が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分における対応する位置に対する、Ｍ１Ｌ、Ｌ１５Ｐ、Ｐ３４Ａ、Ｎ５７Ｄ、Ｎ６６Ｋ、Ｒ８１Ｑ、Ｑ１０１Ｒ、Ｓ１０９Ｔ、Ｒ１４４Ｋ、Ｒ１４４Ｍ、Ｑ１６４Ｋ、Ｔ１７６Ｐ、Ｌ１８８Ｉ、Ｓ１９６Ｙ、Ｇ２２６Ｅ、Ｇ２３６Ｖ、Ｉ２４０Ｔ、Ｐ２５０Ｓ、Ｐ３６３Ｌ、Ｄ３６８Ｈ、Ｎ４４９Ｄ、Ｔ４５６Ｋ、Ｓ４６３Ｙ、Ｄ４７２Ｎ、Ｒ４８４Ｃ、Ａ５２４Ｔ、Ｐ５３５Ｓ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５９３Ｅ、Ｉ６９８Ｖ、Ｖ７１９Ｍ、Ｓ７２１Ｌ、およびＬ７３５Ｑからなる群から選択される１つ以上の点変異をさらに含む、項目６２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６４）
前記タンパク質が、２つ以上の点変異を含み、前記挿入または突然変異が、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型のキャプシド部分の対応する位置にある、項目６２に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６５）
前記２つ以上の点変異のうちの少なくとも１つが、Ｖ７０８Ｉである、項目６４に記載の変異ＡＡＶキャプシドタンパク質。
（項目６６）
変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、配列番号５８の配列と、２６４のアラニン（Ａ）、２６６のアラニン（Ａ）、２６８のセリン（Ｓ）、４４８のアラニン（Ａ）、４５９のトレオニン（Ｔ）、４６０のアルギニン（Ｒ）、４６７のアラニン（Ａ）、４７０のセリン（Ｓ）、４７１のアスパラギン（Ｎ）、４７４のアラニン（Ａ）、４９５のセリン（Ｓ）、５１６のアスパラギン（Ｄ）、５３３のアスパラギン（Ｄ）、５４７のグルタミン（Ｑ）、５５１のアラニン（Ａ）、５５５のアラニン（Ａ）、５５７のグルタミン酸（Ｅ）、５６１のメチオニン（Ｍ）、５６３のセリン（Ｓ）、５７７のグルタミン（Ｑ）、５８３のセリン（Ｓ）、５９３のバリン（Ｖ）、５９６のトレオニン（Ｔ）、６６１のアラニン（Ａ）、６６２のバリン（Ｖ）、６６４のトレオニン（Ｔ）、６６５のプロリン（Ｐ）、７１０のトレオニン（Ｔ）、７１７のアスパラギン酸（Ｄ）、７１８のアスパラギン（Ｎ）、７１９のグルタミン酸（Ｅ）、および７２３のセリン（Ｓ）からなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸残基と、を含む、変異アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質。
【国際調査報告】
2019518458.tif 000052
2019518458.tif 000053
2019518458.tif 000054
2019518458.tif 000055
2019518458.tif 000056