(57)【要約】本発明は、７−メチルグアノシンヌクレオシドの５’位に硫黄原子を含む、ヌクレオチド、ｍＲＮＡ ５’−末端（キャップ）の類似体に関する。開示された化合物は、ＤｃｐＳ酵素（デキャッピングスカベンジャー）によって認められ（結合、および非加水分解）、したがってその阻害剤としての治療用途が発見され得る。ＤｃｐＳはピロホスファターゼ活性を有するキャップ特異的な酵素であり、それは、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置における治療標的として特定された。開示された化合物のうちのいくつかは、リン酸塩鎖にさらなる修飾を有しており、それはＤｃｐＳ酵素に対する親和性を調整する。本発明さらに、５’末端において、５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ ５’−末端（キャップ）類似体で修飾されたｍＲＮＡに関し、ｍＲＮＡは細胞状態において安定性と翻訳活性が増加しており、および本発明はそれらの調製方法、それらの使用、およびそれらを含む医薬製剤に関する。【選択図】2019504837.tif 000088
2019504837.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１に記載の５’−ホスホロチオラートキャップ類似体であって、
【化１】
2019504837.tif 000050
式中、
Ｌ１とＬ２は、ＯとＳを含む基から独立して選択され、Ｌ１とＬ２の少なくとも１つはＯではなく；
ｎ＝０，１，ｌｕｂ２であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、ＮＨ、Ｏを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に係る基である、
５’−ホスホロチオラートキャップ類似体。
【化２】
2019504837.tif 000051
【化３】
2019504837.tif 000052
【化４】
2019504837.tif 000053
【化５】
2019504837.tif 000054
【化６】
2019504837.tif 000055
【請求項２】
次のものから成る基から選択される、請求項１に記載の化合物。
【表１−１】
2019504837.tif 000056
【表１−２】
2019504837.tif 000057
【請求項３】
次のものから成る基から選択される、請求項１−２に記載の化合物。
【表２−１】
2019504837.tif 000058
【表２−２】
2019504837.tif 000059
【請求項４】
式２に記載の５’−ホスホロチオラート類似体であって、
【化７】
2019504837.tif 000060
式中、
ｍ＝０，１であり；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｌ１はＳであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から独立して選択される、
５’−ホスホロチオラート類似体。
【請求項５】
式１３に記載の５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−７−メチルグアノシン  ５’−ジホスホロチオラートである、請求項４に記載の化合物。
【化８】
2019504837.tif 000061
【請求項６】
薬剤として使用される請求項１−５に記載の化合物。
【請求項７】
脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和において薬剤として使用される、請求項１−５に記載の化合物。
【請求項８】
薬剤の調製における、請求項１−５に記載の化合物の使用。
【請求項９】
上記化合物が、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和のための薬剤の調製において使用されることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
ＤｃｐＳ活性の調整剤としての、好ましくはＤｃｐＳ酵素活性の阻害剤としての、より好ましくはｈＤｃｐＳの阻害剤としての、請求項１−５に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
ｍＲＮＡ分解の調整および／またはｍＲＮＡスプライシングの調整における、請求項１−５に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
請求項１−５に記載の化合物、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤。
【請求項１３】
以下に示される式１０、１１および１２に係る構造を有する５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシン類似体。
【化９】
2019504837.tif 000062
【化１０】
2019504837.tif 000063
【化１１】
2019504837.tif 000064
【請求項１４】
式１に記載の化合物の調製方法であって、該方法は：
式８に示される５’−ヨードヌクレオシドであって、
【化１２】
2019504837.tif 000065
式中、
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に示される基である、５’−ヨードヌクレオシドが、
【化１３】
2019504837.tif 000066
【化１４】
2019504837.tif 000067
【化１５】
2019504837.tif 000068
【化１６】
2019504837.tif 000069
【化１７】
2019504837.tif 000070
末端チオリン酸部分を含む、式２に示される５’−ホスホロチオラート類似体に反応し、
【化１８】
2019504837.tif 000071
式中、
ｍ＝０，１であり；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｌ１はＯまたはＳであり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され、Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキルまたは置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から独立して選択され；
ここで、ｎ＝０およびｍ＝１ならば、すなわちＸ３はＳであり、およびＸ１はＯである；
ｎ＝１およびｍ＝０ならば、Ｘ２はＳである；およびＸ１はＯである；
ｎ＝１およびｍ＝１ならば、Ｘ３はＳである；およびＸ１、Ｘ２はＯである；
式１に示されるホスホロチオラートキャップ類似体を形成する工程であって、
【化１９】
2019504837.tif 000072
式中、
Ｌ１とＬ２は、ＯとＳを含む群から独立して選択され、Ｌ１とＬ２の少なくとも１つはＯではなく；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、ＮＨ、Ｏを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に示される基である；
【化２０】
2019504837.tif 000073
【化２１】
2019504837.tif 000074
【化２２】
2019504837.tif 000075
【化２３】
2019504837.tif 000076
【化２４】
2019504837.tif 000077
工程を含む方法。
【請求項１５】
等モル量の式２に示される化合物および式８に示される化合物、およびＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン）が塩基として使用されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法、
【請求項１６】
式２ａに示される５’−ホスホロチオラート類似体の調製方法であって、式９に示されるイミダゾリド誘導体は、
【化２５】
2019504837.tif 000078
式中、
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
式２ａに示される５’−ホスホロチオラート類似体を形成するために、リン酸トリエチルアンモニウムまたはチオリン酸ナトリウムと反応し、
【化２６】
2019504837.tif 000079
式中、
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｌ１はＯまたはＳであり、
Ｘ１とＸ２は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から選択される、
工程を含む方法。
【請求項１７】
反応が二価金属塩化物の存在下において行なわれることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記二価金属塩化物は塩化亜鉛ＺｎＣｌ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
リン酸塩基またはチオリン酸基の１．５倍過剰な、式９に示されるイミダゾリド誘導体を、８倍過剰な二価金属塩化物の存在下において使用することを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
式１に示される化合物の調製方法であって、該方法は：
式９に示されるイミダゾリド誘導体であって、
【化２７】
2019504837.tif 000080
式中、
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択される、イミダゾリド誘導体が、；
末端チオリン酸部分を含む、式２ａに示される５’−ホスホロチオラート類似体に反応し、
【化２８】
2019504837.tif 000081
式中、
Ｎ＝１であり、
Ｌ１はＯまたはＳであり；
Ｘ１とＸ２は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から独立して選択される；
式１に示される５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を形成し；
【化２９】
2019504837.tif 000082
式中、
Ｌ１とＬ２は、ＯとＳを含む群から独立して選択され、Ｌ１とＬ２の少なくとも１つはＯではなく；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、ＮＨ、Ｏを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に示される基である；
【化３０】
2019504837.tif 000083
【化３１】
2019504837.tif 000084
【化３２】
2019504837.tif 000085
【化３３】
2019504837.tif 000086
【化３４】
2019504837.tif 000087
工程を含む方法。
【請求項２１】
反応が二価金属塩化物の存在下において行なわれることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記二価金属塩化物が塩化亜鉛ＺｎＣｌ２であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
式２ａに示される化合物の１．５倍過剰な、式９に示されるイミダゾリド誘導体を、８倍過剰な二価金属塩化物の存在下において使用することを特徴とする、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
５’末端に、請求項１−３に記載の５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡ。
【請求項２５】
前記５’−ホスホロチオラートキャップ類似体は、ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（２４番）、ｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（３２番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１（３０番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３１番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１（３３番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）を含む基から選択され、より好ましくはｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）である、請求項２４に記載のｍＲＮＡ。
【請求項２６】
ｍＲＮＡ分子の５’末端に５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡの調製方法であって、請求項１−３に記載の５’−ホスホロチオラートキャップ類似体がｍＲＮＡ分子の合成中に組み込まれることを特徴とする方法。
【請求項２７】
５’−ホスホロチオラートキャップ類似体は、ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（２４番）、ｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（３２番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１（３０番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３１番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１（３３番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）を含む基から選択され、より好ましくはｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）であることを特徴とする、請求項２６に記載のｍＲＮＡの調製方法。
【請求項２８】
ｍＲＮＡの合成がインビトロ転写を介して進むことを特徴とする、請求項２６−２７に記載のｍＲＮＡの調製方法。
【請求項２９】
請求項２６−２８に記載の方法で調製されたｍＲＮＡ。
【請求項３０】
タンパク質の生成のための、５’−末端に請求項２４−２５および請求項２９に記載の５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡの使用。
【請求項３１】
タンパク質の生成が細胞系または非細胞系で行われたことを特徴とする、請求項３０に記載のｍＲＮＡの使用。
【請求項３２】
薬剤として使用される請求項２４−２５および請求項２９に記載のｍＲＮＡ。
【請求項３３】
脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置、および／またはＳＭＡの症状の緩和のための薬剤として使用される、請求項２４−２５および請求項２９に記載のｍＲＮＡ。
【請求項３４】
癌治療の薬剤として、より好ましくは抗癌免疫療法の薬剤として使用するための、請求項２４−２５および請求項２９に記載のｍＲＮＡ。
【請求項３５】
薬剤の生成のための、請求項２４−２５および請求項２９に記載のｍＲＮＡの使用。
【請求項３６】
癌治療の薬剤としての、より好ましくは抗癌免疫療法の薬剤としての、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和のための薬剤の調製にｍＲＮＡが使用されることを特徴とする、請求項３３に記載の使用。
【請求項３７】
請求項２４−２５および請求項２９に記載のｍＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ  ５’−末端（キャップ）の類似体、その調製方法、その中間体とその使用に関する。５’−ホスホロチオラートキャップ類似体は、特に脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）処置のための薬剤としての適用を可能にするＤｃｐＳ酵素抑制因子として使用される。本発明はさらに、本発明に係る５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ  ５’−末端（キャップ）類似体によって、５’末端において修飾されたｍＲＮＡに関し、当該修飾は、細胞状態下において安定性と翻訳活性が増加したｍＲＮＡ転写物を得ることを目的とする。そのような特性を有する転写物は、ｍＲＮＡに基づいた新規性のある遺伝子治療に適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
化学的に抽出されたｍＲＮＡ  ５’−末端類似体には様々な用途があり、また、その構造内で実施された修飾は、これらの化合物の生物学的特性を著しく修飾しうる（Ｚｉｅｍｎｉａｋ，Ｓｔｒｅｎｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。キャップ類似体の様々な用途の中でも、最も頻繁なものには、治療目的でのキャップ依存プロセスの低分子の阻害剤としての使用が含まれる（例えばＤｃｐＳ酵素抑制−脊髄筋萎縮症治療）。他方で、適切に修飾されたジヌクレオチドキャップ類似体は、細胞状態下において安定性と翻訳活性の改善された転写物を得るために、インビトロでの共転写によってメッセンジャーｍＲＮＡを修飾するために使用される。そのような特性を備えた転写物は、ｍＲＮＡに基づいた新規性のある遺伝子治療の文脈においてますます研究されている。後者の場合では、別のデキャッピング酵素であるＤｃｐ２に対するキャップ構造の耐性が主要問題である。
【０００３】
ＤｃｐＳ酵素（デキャッピングスカベンジャー）は真正核細胞中のｍＲＮＡ分解プロセスに関与する酵素である。真核細胞には、ｍＲＮＡ分解の主要な２つの経路、５’→３’分解および３’→５’分解がある（Ｒｙｄｚｉｋ，Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。両分解経路は脱アデニル化によって開始される。５’→３’方向の分解に続いて、αリン酸塩とβリン酸塩との間の結合の切断の結果としてのｍＲＮＡデキャッピング、および５’−エキソヌクレアーゼによる分解が起こる。３’→５’の分解は、３’−末端から始まるエキソソームによるｍＲＮＡ分解を含む。そのような分解は結果として、ジヌクレオチドキャップ残基またはキャップ末端の短いオリゴヌクレオチドの放出をもたらし、その後、それはＤｃｐＳ酵素によって分解される。ＤｃｐＳはＨＩＴファミリーピロホスファターゼに属し、７−メチルグアノシン  ５’−リン酸塩（ｍ７ＧＭＰ）および第二の生成物、従ってヌクレオシド５’−二リン酸塩または短いオリゴヌクレオチドを放出する、γリン酸塩とβリン酸塩との間のキャップを加水分解する。より長いキャップ末端のｍＲＮＡは、ＤｃｐＳの基質ではない。さらに、５’→３’ｍＲＮＡ分解の生成物である７−メチルグアノシン  ５’−二リン酸塩（ｍ７ＧＤＰ）は、ＤｃｐＳの基質ではない。３’→５’分解中にｍＲＮＡから放出された不要なキャップ残基が他のキャップ依存細胞プロセスに影響し得るため、ＤｃｐＳ酵素の活性は細胞恒常性にとって重要であると考えられる。ＤｃｐＳは細胞質と核の両方に位置し、そこでスプライシングの調整に関与しうる（Ｓｈｅｎ，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。したがって、細胞におけるＤｃｐＳの役割は、３’→５’ｍＲＮＡ分解におけるその十分に特徴づけられた機能を越えることが示唆された（Ｂａｉｌ  ａｎｄ  Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ  ２００８）。
【０００４】
２００８年には、ＤｃｐＳ抑制は脊髄筋萎縮症における治療効果を提供し得ると報告された。ＳＭＡは、平均で出生６０００人に対して１人に現われる一般的な神経変性疾患である（Ａｋａｇｉ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  １９６２）。それは、ＳＭＮ（運動神経細胞生存）遺伝子によってコードされた低レベルのＳＭＮタンパク質によって引き起こされる。ヒトには２つのＳＭＮ遺伝子、すなわちＳＭＮ１とＳＭＮ２が存在する。それらの主な違いは、エクソン７の配列の変化であり、それはｍＲＮＡ前躯体のスプライシングに影響する。その結果、ＳＭＮ１遺伝子の発現は、安定した機能タンパク質をもたらし、一方でＳＭＮ２から発現したタンパク質は短縮されている。両方のＳＭＮ１遺伝子コピーにおける、欠失、ＳＭＮ２などの遺伝子への転換、および点突然変異を含む突然変異は、結果としてＳＭＡ疾患をもたらす。不完全なＳＭＮ１コピーを１つだけ有する人々はＳＭＡ保有者であるが、疾病のいかなる症状も示さない。
【０００５】
同種のＳＭＮ２遺伝子は十分な量の機能性ＳＭＮタンパク質を提供することができないが、ＳＭＮ２遺伝子コピーの数が多いほど、疾病の経過はより良性であることが認められた。したがって、細胞のＳＭＮ２遺伝子によってコードされるタンパク質の量を増加させる化合物は、ＳＭＡに対する治療となり得ると信じられている。いくつかの５−置換されたキナゾリンはＳＭＮ２遺伝子発現を２倍にも増加させ得ることが発見された（Ａｋａｇｉ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，１９６２）。放射活性標識を使用した別の研究では、この活性化の基礎となる分子構造を解明すべく、著者は、タンパク質結合５−置換されたキナゾリンとしてＤｃｐＳを特定した。
【０００６】
これらの実験は、ＳＭＡ処置における治療の標的としてＤｃｐＳを特定することを可能にした。
【０００７】
さらなる研究により、様々なＣ５−置換されたキナゾリンがＤｃｐＳ酵素（既にナノモル濃度の）の有力な阻害剤であり、その阻害剤候補はＳＭＮ２遺伝子プロモーター活性化のレベルと関連していることが示された。その後、これらの化合物の治療上の潜在力は、マウスモデルのインビボで実証された（Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ，  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。最近では、ＤｃｐＳ阻害剤の１つであるＲＧ３０３９化合物は、ＳＭＡを有するマウスの運動機能を改善することが報告された。
【０００８】
進行中の前臨床試験と臨床試験にもかかわらず、ＳＭＡの有効な処置は依然としてなく、したがって、治療上の潜在力を有する新しい化合物が引き続き求められている。
【０００９】
三リン酸架橋および７−メチルグアノシンリボースにおける修飾を伴うジヌクレオチドキャップ類似体は、インビトロでのキャップＲＮＡ分子の合成に使用され得る。該方法は、改善された生物特性、とりわけ増加した翻訳活性と細胞内での延長された半減期を伴うＲＮＡ分子を得ることを可能にするため、有用である（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｋａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これらの両特徴によって、同量のｍＲＮＡを使用しながらも有意により多いタンパク質量が得られる。これには、研究および、例えば癌免疫療法などの治療用途を含むペプチドとタンパク質の商業生産の両方における、幅広い用途を見出すことができる（Ｓａｈｉｎ，Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００１０】
インビトロでキャップｍＲＮＡを得るために使用される最も一般的な方法は、（ｍ７ＧｐｐｐＧ）などの４つの全てのリボヌクレオシド三リン酸塩および１つのキャップジヌクレオチドの存在下において、バクテリアまたはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを使用した、ＤＮＡ鋳型によるｍＲＮＡの合成である。ポリメラーゼは、次に転写されるヌクレオシド三リン酸塩のαリン酸塩の、ｍ７ＧｐｐｐＧ内のＧｕｏ部分の３’−ＯＨの求核攻撃によって、転写を開始させ、結果として初期生成物としてのｍ７ＧｐｐｐＧｐＮをもたらす（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｆｉｅｒｓ  １９８１，Ｋｏｎａｒｓｋａ，Ｐａｄｇｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。
【００１１】
哺乳動物細胞の培養に導入された合成ｍＲＮＡによって生成されるタンパク質の量は、細胞状態のｍＲＮＡ分解によって制限される。インビボでのｍＲＮＡ分解は主として、αリン酸塩とβリン酸塩間の結合を切断する特定のピロホスファターゼＤｃｐ１／Ｄｃｐ２によって、ｍＲＮＡの５’末端から取り除かれたキャップによって開始される（Ｍｉｌｄｖａｎ，Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。調節タンパク質Ｄｃｐ１を有する複合体を形成するＤｃｐ２酵素は、完全長の転写物またはその少なくとも２０のヌクレオチド断片からの、キャップ構造の切断の原因である（Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ２００２）。Ｄｃｐ１／Ｄｃｐ２複合体は遺伝子発現の調整において重要な役割を果たす。この酵素活性に抵抗力のあるキャップ内のｍＲＮＡ転写物を作ることで、そのような修飾されたｍＲＮＡによってコードされたタンパク質発現の増加がもたらされる。修飾が同時に、翻訳開始因子との相互作用を損なわない場合、これはその後ｍＲＮＡの翻訳活性の増加をもたらす。そのような特性を有するｍＲＮＡは、癌免疫療法（Ｋｕｈｎ，Ｄｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、幹細胞リプログラミング（Ｗａｒｒｅｎ，Ｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、または細胞で形成された欠損のある形態の、または不十分な量のタンパク質の補充を含む治療用途に望まれる。キャップ構造の三リン酸架橋での修飾は、文献において知られており、Ｄｃｐ２酵素に対する抵抗を増大させる。これらはとりわけ、α−β架橋位置の酸素原子がメチレン基と置き換えられる類似体、β位置の非架橋酸素が硫黄原子またはボラノリン酸塩基と置き換えられる類似体を含む。メチレン類似体の場合、ｍＲＮＡの安定性の増加は、細胞内のタンパク質合成の効率を増加させることはなく、それは恐らくｅＩＦ４Ｅタンパク質への親和性の低下によるものであった（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｋａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。β位置の非架橋修飾の場合、Ｄｃｐ２に対する耐性の増加と、ｅＩＦ４Ｅに対する親和性の増加は、結果として、細胞内のそのような修飾されたｍＲＮＡの翻訳活性の増加をもたらした（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）（Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｗｙｐｉｊｅｗｓｋａ  ｄｅｌ  Ｎｏｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ｍＲＮＡへの取り込みに際して、Ｄｃｐ２による分解に対する感受性の減少を示した全てのキャップ類似体の一般的特徴は、酵素によるキャップ切断部位の近く、すなわち三リン酸架橋のαベータ位置における修飾の局在であった。
【発明の開示】
【００１２】
技術の記載された情勢を考慮し、本発明の目的は、指摘された不都合を克服し、およびＤｃｐＳ活性に影響を与える新しい種類のヌクレオチドｍＲＮＡ  ５’−末端類似体、ＳＭＡ処置における使用を含むその使用、さらにその合成方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、５’末端において、５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ  ５’−末端（キャップ）類似体で修飾されたｍＲＮＡを提供することであり、それによってｍＲＮＡの安定性、および細胞内におけるそのｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の生合成効率を増加させることである。本発明の別の目的は、５’末端において、５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ  ５’−末端（キャップ）類似体で修飾されたｍＲＮＡを提供することであり、転写物は、ｍＲＮＡに基づいた新規性のある遺伝子治療で使用するための使用を含む、薬剤としての使用を意図されている。
【００１４】
本発明は新規性のある種類のヌクレオチドｍＲＮＡ  ５’−末端類似体に関する。新しい類似体は、５’−ヌクレオシドの位置に硫黄原子を含み、つまり５’位の酸素原子の少なくとも１つが硫黄原子によって置換された。我々は意外にも、７−メチルグアノシンの側から５’位の硫黄原子による修飾を含んだ新しい類似体が、ＤｃｐＳ酵素の加水分解活性に対して抵抗力があり、およびＤｃｐＳ酵素の阻害剤であり、したがってＳＭＮタンパク質の発現に影響し、それはＳＭＡ処置において治療上適切であることを発見した。ＤｃｐＳ活性に対して安定しており、および／またはＤｃｐＳ活性に影響を与えるそのような化合物は、スプライシングの調節と調整に加えてｍＲＮＡ分解の調整においても使用されるだろう。以下の類似体が、阻害特性の観点から特に好ましいことが分かった：ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（２４番）、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（３２番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１（３０番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３１番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１（３３番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）、および最も好ましいのはｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）であった。同様に有用なものは、類似体ｍ７ＧＳｐｐ（１２番）、ｍ７ＧＳｐｐＧ（２３番）、ｍ７ＧＳｐｐＣＨ２ｐＧ（２５番）、ｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）、ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐＳＧ（３７番）であった。
【００１５】
本発明はさらに、５’末端において、５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ  ５’−末端（キャップ）類似体で修飾されたｍＲＮＡに関し、それによってｍＲＮＡの安定性、および細胞内におけるそのｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の生合成効率を増加させることに関する。本発明はさらに、５’末端において、５’−ホスホロチオラート部分を含むｍＲＮＡ  ５’−末端（キャップ）類似体で修飾されたｍＲＮＡに関し、修飾されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡに基づいた新規性のある遺伝子治療で使用するための使用を含む、薬剤としての使用を意図されている。
【００１６】
驚いたことに、インビトロ転写法によってｍＲＮＡへと取り込まれた後に、７−メチルグアノシンの側から５’位に硫黄原子での修飾を含む、本発明に係る新しい類似体が、酵素Ｄｃｐ１／２の加水分解活性に抵抗力を有するようになり、したがって、それらがｍＲＮＡの安定性、および、ヒーラー細胞株を含む細胞のこのｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の生合成の効率に影響することを、本発明者らは発見した。Ｄｃｐ１／２によってキャップの三リン酸架橋の切断部位から遠ざけられた修飾が、キャップ構造をその除去プロセスに抵抗力を有するようにし、ｍＲＮＡの半減期の増加がもたらされたのは、これが最初である。癌免疫療法における免疫系の特異的活性化の場合のように、供給された合成ｍＲＮＡに基づいた所望のタンパク質の発現を含む遺伝子治療において、この予期せぬ発見は治療上極めて重要である。したがって、例えば所与の癌タイプに特有のタンパク質をコードする修飾されたｍＲＮＡ転写物は、この特異性抗原を含む癌細胞に対して免疫系を活性化させるために使用され得る。以下の類似体が、修飾されたｍＲＮＡの翻訳特性の観点から特に好ましいことが分かった：ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（２４番）、ｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（３２番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１（３０番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３１番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１（３３番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）、および最も好ましいのはｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）であった。
【００１７】
本発明は、式１に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体に関し、
【００１８】
【化１】
2019504837.tif 000003
【００１９】
式中、
Ｌ１とＬ２は、ＯとＳを含む基から独立して選択され、Ｌ１とＬ２の少なくとも１つはＯではなく；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、ＮＨ、Ｏを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に係る基である。
【００２０】
【化２】
2019504837.tif 000004
【００２１】
【化３】
2019504837.tif 000005
【００２２】
【化４】
2019504837.tif 000006
【００２３】
【化５】
2019504837.tif 000007
【００２４】
【化６】
2019504837.tif 000008
【００２５】
好ましい５’−ホスホロチオラートキャップ類似体は、以下から成る基から選択される：
【００２６】
【表１−１】
2019504837.tif 000009
【００２７】
【表１−２】
2019504837.tif 000010
【００２８】
より好ましい５’−ホスホロチオラートキャップ類似体化合物は、以下から成る基から選択される：
【００２９】
【表２−１】
2019504837.tif 000011
【００３０】
【表２−２】
2019504837.tif 000012
【００３１】
本発明はさらに、式２に係る５’−ホスホロチオラート類似体に関し、
【００３２】
【化７】
2019504837.tif 000013
【００３３】
式中、
ｍ＝０，１であり；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｌ１はＳであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から独立して選択され；
好ましい５’−干すほろちおらーと類似体は、以下の式１３に係る７’−メチルグアノシン  ５’−デオキシ−５’−チオグアノシン  ５’−ジホスホロチオラートである。
【００３４】
【化８】
2019504837.tif 000014
【００３５】
本発明はさらに、薬剤として使用するための、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体に関する。
【００３６】
本発明はさらに、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和のための薬剤として使用するための、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体に関する。
【００３７】
本発明はさらに、薬剤の調製における、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体の使用に関する。
【００３８】
本発明はさらに、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和のための薬剤の調製における、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体の使用に関する。
【００３９】
本発明はさらに、ＤｃｐＳ活性の調整剤として、好ましくはＤｃｐＳ酵素活性の阻害剤として、より好ましくはｈＤｃｐＳの阻害剤としての、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体の使用に関する。
【００４０】
本発明はさらに、ｍＲＮＡ分解の調整および／またはｍＲＮＡスプライシングの調整における、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体の使用に関する。
【００４１】
本発明は加えて、以下に示される式１０、１１および１２に係る構造を有する５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシンの類似体に関する。
【００４２】
【化９】
2019504837.tif 000015
【００４３】
【化１０】
2019504837.tif 000016
【００４４】
【化１１】
2019504837.tif 000017
【００４５】
本発明はさらに、式１に係る化合物の調製方法に関し、該方法は：式８に係る５’−ヨードヌクレオシドであり、
【００４６】
【化１２】
2019504837.tif 000018
【００４７】
式中、Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に係る基である５’−ヨードヌクレオシドは、
【００４８】
【化１３】
2019504837.tif 000019
【００４９】
【化１４】
2019504837.tif 000020
【００５０】
【化１５】
2019504837.tif 000021
【００５１】
【化１６】
2019504837.tif 000022
【００５２】
【化１７】
2019504837.tif 000023
【００５３】
末端チオリン酸部分を含む、式２に係る５’−ホスホロチオラート類似体に反応し、
【００５４】
【化１８】
2019504837.tif 000024
【００５５】
式中、
ｍ＝０，１であり；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｌ１はＯまたはＳであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され、
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から独立して選択され；
ここで、ｎ＝０およびｍ＝１ならば、Ｘ３はＳであり、およびＸ１はＯであり；
ｎ＝１およびｍ＝０ならば、Ｘ２はＳである；およびＸ１はＯであり；
ｎ＝１およびｍ＝１ならば、Ｘ３はＳである；およびＸ１、Ｘ２はＯであり；
式１に示されるホスホロチオラートキャップ類似体を形成する工程であって、
【００５６】
【化１９】
2019504837.tif 000025
【００５７】
式中、
Ｌ１とＬ２は、ＯとＳを含む群から独立して選択され、Ｌ１とＬ２の少なくとも１つはＯではなく；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、ＮＨ、Ｏを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に示される基である；工程を含む。
【００５８】
【化２０】
2019504837.tif 000026
【００５９】
【化２１】
2019504837.tif 000027
【００６０】
【化２２】
2019504837.tif 000028
【００６１】
【化２３】
2019504837.tif 000029
【００６２】
【化２４】
2019504837.tif 000030
【００６３】
好ましくは、上述の合成法は、式２に係る化合物、式８に係る化合物、およびＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エンの等モル量を塩基として使用する工程を含む。
【００６４】
本発明はさらに、式２ａに係る５’−ホスホロチオラート類似体の調製方法に関し、式９に係るイミダゾリド誘導体は、
【００６５】
【化２５】
2019504837.tif 000031
【００６６】
式中、
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
式２ａに示される５’−ホスホロチオラート類似体を形成するために、リン酸トリエチルアンモニウムまたはチオリン酸ナトリウムと反応し、
【００６７】
【化２６】
2019504837.tif 000032
【００６８】
式中、
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｌ１はＯまたはＳであり、
Ｘ１とＸ２は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から選択される；工程を含む
【００６９】
本発明はさらに、式１に係る化合物の調製方法に関し、該方法は：式９に係るイミダゾリド誘導体であって
【００７０】
【化２７】
2019504837.tif 000033
【００７１】
式中、
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択される；
イミダゾリド誘導体が、末端チオリン酸部分を含む、式２ａに示される５’−ホスホロチオラート類似体に反応し、
【００７２】
【化２８】
2019504837.tif 000034
【００７３】
式中、
Ｎ＝１であり、
Ｌ１はＯまたはＳであり；
Ｘ１とＸ２は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルを含む基から選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、Ｎ３、アルキル、または置換アルキルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＨＦ、ＣＦ２、ＮＨおよびＯを含む基から独立して選択され、
式１に示される５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を形成し；
【００７４】
【化２９】
2019504837.tif 000035
【００７５】
式中、
Ｌ１とＬ２は、ＯとＳを含む群から独立して選択され、Ｌ１とＬ２の少なくとも１つはＯではなく；
ｎ＝０，１，または２であり；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３は、Ｏ、Ｓを含む基から独立して選択され；
Ｒ１は、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ｐｈ、アルキルまたは置換アルキルから独立して選択され；
Ｒ２とＲ３は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｒ４とＲ５は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、−ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＯＯＨ、Ｎ３、ＣＨ２Ｎ３、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを含む基から独立して選択され；
Ｙ１とＹ２は、ＣＨ２、ＣＨＣｌ、ＣＣｌ２、ＣＦ２、ＣＨＦ、ＮＨ、Ｏを含む基から独立して選択され；
およびＢは、以下の式３、４、５、６、または７に示される基である；工程を含む。
【００７６】
【化３０】
2019504837.tif 000036
【００７７】
【化３１】
2019504837.tif 000037
【００７８】
【化３２】
2019504837.tif 000038
【００７９】
【化３３】
2019504837.tif 000039
【００８０】
【化３４】
2019504837.tif 000040
【００８１】
好ましくは反応は二価金属塩化物の存在下において行なわれ、好ましい二価金属塩化物は塩化亜鉛ＺｎＣｌ２である。
【００８２】
イミダゾリド誘導体を用いた合成方法では、好ましくは、リン酸塩基、チオリン酸基、または式２ａに示される化合物の１．５倍過剰な、式９に示されるイミダゾリド誘導体を、８倍過剰な二価金属塩化物の存在下において使用する。
【００８３】
本発明はさらに、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含む医薬製剤および薬学的に許容可能な担体に関する。
【００８４】
本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含んだ、本発明に係る医薬製剤、および薬学的に許容可能な担体は、ｈＤｃｐＳ活性の阻害特性、好ましくはＤｃｐＳ活性の阻害特性を有し、およびＳＭＡ処置での使用を意図されている。
【００８５】
薬学的に許容可能な担体の選択は、医薬製剤の投与法、および本発明に係る５’−ホスホロチオラート類似体を細胞、組織または有機体に送達する前に分解の不活性化から保護する必要性に依存するだろう。薬学的に許容可能な担体は、溶媒、分散培地および補助的薬剤（被覆剤、界面活性剤、芳香および着香料、酸化防止剤など）を含む。本発明に係る医薬製剤は、注射、経口、局所的投与および直腸投与を含む種々の経路によって投与することができる。医薬製剤の用量は、投与経路、処置または予防薬を要する疾病、および他の関連する状況を考慮して設定される。
【００８６】
本発明はさらに、５’末端に、本発明に係る新規性のある５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡに関する。好ましいｍＲＮＡは、ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（２４番）、ｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（３２番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１（３０番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３１番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１（３３番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）を含む基から選択され、より好ましくはｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）である、５’−ホスホロチオラートキャップ類似体に特徴付けられる。
【００８７】
本発明はさらに、分子の５’−末端に５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡの調製方法に関し、該方法は：合成中に、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体をｍＲＮＡ分子に取り込む工程を含む。
【００８８】
ｍＲＮＡの好ましい調製方法では、５’−ホスホロチオラートキャップ類似体は、ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（２４番）、ｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（３２番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１（３０番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３１番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１（３３番）、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２（３４番）を含む基から選択され、より好ましくはｍ７，２’ＯＧＳｐｐｐＧ（２６番）である。
【００８９】
ｍＲＮＡの好ましい調製方法では、ｍＲＮＡの合成はインビトロ転写を通じて行われる。
【００９０】
本発明はさらに、分子の５’−末端に、本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡの調製方法によって調製されたｍＲＮＡに関する。
【００９１】
本発明はさらに、タンパク質産生のための、分子の５’−末端に本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡの使用に関する。タンパク質産生のためのｍＲＮＡの使用は、好ましくは細胞系または非細胞系で行われる。
【００９２】
本発明はさらに、薬剤として使用するための、本発明に係るｍＲＮＡ、および、分子の５’末端に本発明に係る５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を含むｍＲＮＡの調製方法に従って調製されたｍＲＮＡに関する。そのようなｍＲＮＡは好ましくは、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和のための薬剤として使用される。好ましくは、そのようなｍＲＮＡは、癌治療の薬剤として、より好ましくは抗癌免疫療法の薬剤として使用するために利用される。
【００９３】
本発明はさらに、薬剤の製造における、本発明に係るｍＲＮＡの使用、および分子の５’末端に本発明に係る５’−ホスホロチオラート類似体を含むｍＲＮＡの調製方法に従って調製されたｍＲＮＡの使用に関する。好ましい使用では、ｍＲＮＡは、脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置、および／またはＳＭＡの症状の緩和のための、癌治療の薬剤として、より好ましくは抗癌免疫療法の薬剤として、薬剤を調製するために使用される。
【００９４】
本発明はさらに、医薬製剤に関し、それは本発明に係るｍＲＮＡ、および、分子の５’末端に本発明に係る５’−ホスホロチオラート類似体を含むｍＲＮＡの調製方法に従って調製されたｍＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体を含む。
【００９５】
メチル化されていない化合物（ＧｐｐＳＧとＧｐｐｐＳＧ）は、生物学的研究のための対照として合成された。
【００９６】
表１は、発明者らによって初めて得られた、適切に修飾されたヌクレオチドの合成に使用されたアルキル化剤を表記する。表２と表３は、得られた後、生物物理的および生化学的な方法で特徴づけられた５’−ホスホロチオラートキャップ類似体を表記する。
【００９７】
表２および表３に表記された化合物のうち、ＳＭＡ処置に関して特に好ましいものは、７−メチルグアノシンの側から５’位に硫黄を含む５’−ホスホロチオラート類似体（化合物１２、２３、２４、２５、２６、３０、３１、３２、３３、３４および３７番）であり、それはＤｃｐＳ酵素の存在下における安定性が特徴である。
【００９８】
【表３】
2019504837.tif 000041
【００９９】
【表４】
2019504837.tif 000042
【０１００】
【表５】
2019504837.tif 000043
【０１０１】
本明細書に引用された文書、および本明細書で参照された文書もまた、引用によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
本発明のよりよい理解のために、本発明は実施例および添付の図により例示された。
【図１】５’−デオキシ−５’−ヨード−グアノシン類似体の合成を例示する。
【図２】５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−チオリン酸の合成を例示する。Ａ：グアノシン誘導体の合成、Ｂ：７−メチルグアノシン誘導体の合成。
【図３】Ｓ−アルキル化を介した５’−チオリン酸キャップ類似体の合成を例示する。Ａ：アルキル化反応で使用される末端チオリン酸、Ｂ：５’−デオキシ−５’−ヨード−グアノシン（図１）およびＡに示される末端チオリン酸を使用したアルキル化反応の体系。
【図４】イミダゾリドによる５’−チオリン酸キャップ類似体の合成を例示する。Ａ：該方法で使用される化合物、Ｂ：２つの異なる活性化誘導体９番および２９番を使用した最終化合物の合成。
【図５】ＤｃｐＳによる天然のジヌクレオチド基質の加水分解、および５’Ｓ修飾類似体の安定性試験を例示する。パネルＡ：ＤｃｐＳに対する天然のキャップ類似体ｍ７ＧｐｐｐＧの安定性試験、パネルＢ：ＤｃｐＳ酵素に対するキャップ類似体２０番の安定性試験（表３）、パネルＣ：ＤｃｐＳ酵素に対するキャップ類似体２１番の安定性試験（表３）。
【図６】化合物に関するＩＣ５０判定の結果を例示する。
【図７】ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２を有する複合体内の酵素ΔＮ３７ｈＤｃｐＳの活性部位の結晶構造を例示する。
【図８】ＳｐＤｃｐ１／２デキャッピング酵素でインキュベートされている、様々なキャップ類似体でキャップされた短い２６ｎｔのＲＮＡ（その５’末端にキャップのない転写物は２５ｎｔ長である）のＤｃｐ１／２酵素活性に対する感受性を例示する。反応は０、５、１５、３０分間行なわれ、その終了後に、反応混合物は１５％の変性のポリアクリルアミドゲル上で分解され、電気泳動の分離が完了した後、ゲルはＳＹＢＲ−Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。各パネルでは、左端のレーンが対照を指し、それはキャップされていないＲＮＡである。
【図９】図８のデータから判定されたＤｃｐ１／２酵素活性に対する相対的な感受性を例示する。Ｄｃｐ１／２活性に対する相対的な感受性は、５’末端でキャップされたＲＮＡに対応するバンドの強度と、キャップされたおよびキャップされていないＲＮＡに対応するバンドの強度の合計の比率として算出された。全ての数値は、個々のＲＮＡについて０分の時間に対して標準化された。
【図１０】ウサギの網状赤血球抽出物の５’末端の様々なキャップ類似体でキャップされたウミシイタケルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの翻訳効率の測定から得た、相対的な翻訳効率を例示する。
【図１１】選択された時点における、ルシフェラーゼ活性に基づいて判定されたヒーラー細胞の相対的な翻訳効率を例示する。結果は、５’末端のｍ２７，２’−ＯＧＳｐｐｐＧまたはｍ２７，２’−ＯＧｐｐｐＳＧでキャップされたｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の溶解産物に関して測定されたルシフェラーゼ活性と、ｍ７ＧｐｐｐＧでキャップされたｍＲＮＡでトランスフェクトされた細胞の溶解産物に関して測定されたルシフェラーゼ活性の比率として示される。ヒストグラムは、３つの生物学的反復からの平均値を表す。
【０１０３】
５’−チオリン酸キャップ類似体の化学合成は、以下の化学に基づいた３つのヌクレオチド合成方法の独創的な組み合わせである：
１）イミダゾリドヌクレオチド誘導体（（Ａｂｒａｍｓ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｆｆ  １９７３）；（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗａｌｄｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）；（Ｋａｌｅｋ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６）および（Ｋａｌｅｋ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５）を参照）
２）ヌクレオシド誘導体を含むハロゲンによるＳ−アルキル化（（Ａｒａｋａｗａ，Ｓｈｉｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）を参照）
３）末端ヌクレオシドβ−チオ−ジおよびγ−チオ−三リン酸塩の合成（（Ｚｕｂｅｒｅｋ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００３）を参照）
【０１０４】
５’位に硫黄含有キャップ類似体を合成するために、我々は２つの相補的なアプローチを開発し、それは全体として、ヌクレオシドおよびジヌクレオチドキャップ類似体のリン酸塩、二リン酸塩、および三リン酸塩の５’−ホスホロチオエート類似体の全種類の合成を可能にする（図２−４）。アプローチ１（図２、および図３の第１工程）は、β−またはγ−チオリン酸による、５’−デオキシ−５’−ヨードヌクレオシドの求核置換反応を使用するＳ−アルキル化の反応を含む。５’位に硫黄原子を有するジヌクレオチド化合物を産する第２のアプローチ（図４）は、適切なイミダゾリドヌクレオチドの事前に活性化された形態と二リン酸塩との間の、触媒としてのＺｎＣｌ２の存在下における共役反応を使用する（いずれの場合も、望まれた段階でＳ−アルキル化の反応が使用された）。
【０１０５】
第１のアプローチは、末端位置にホスホロチオエート部分を有する、対応するホスホロチオエート（モノ−、ジ―、トリ−）を使用する。この反応のための最適条件は、塩基として等モル量のホスホロチオエート、５’−ヨードヌクレオシドおよびＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン）を使用することである。現在までに、我々はこの方法を使用して、三リン酸架橋のα−βおよびβ−γ位にメチレン修飾を有する２つのユニットを含む、９つの異なるジヌクレオチドキャップ類似体を得た（図３）。
【０１０６】
効率的な産生のための第２の方法は、ＺｎＣｌ２などの二価金属塩化物の存在を必要としたが、それはさらに有機培地の溶解度を向上させ、イミダゾリド誘導体の加水分解から保護し、および、イミダゾール誘導体および互いに近接した他の分子のリン酸塩を得ることによって反応速度を加速する。この反応のための最適条件は、ＤＭＦにおける８倍過剰なＺｎＣｌ２の存在下における二リン酸塩に対して、イミダゾール誘導体の１．５等量の使用であった。第２の方法を使用して、我々はさらに、三リン酸鎖の５’位の２つの硫黄、およびβ−非架橋位置の硫黄を含む９つの５’−ホスホロチオエートキャップ類似体を得た（図４）。これまでに、この種の反応におけるヌクレオチドの５’−ホスホロチオエート類似体の使用が記述されたことはなかった。リン原子に位置する不斉中心の存在により、β−Ｓ−硫黄原子を含む各類似体は、ジアステレオマー混合物（ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからの溶離順序に従ってＤ１およびＤ２と呼ぶ）として得られた。個々のジアステレオマーはＲＰ−ＨＰＬＣによって分離された。
【０１０７】
得られたキャップ類似体は、イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５、および精製が十分でない場合は分取ＨＰＬＣによって精製された。その後、精製された化合物は、その生化学的および生物学的特性に関して試験された。
【０１０８】
５’位に硫黄原子を含むキャップ類似体をもたらす合成経路は、図１−４に示される。
【０１０９】
その後、得られたキャップ類似体は、ヒト酵素ＤｃｐＳ（ｈＤｃｐＳ）の基質として試験された。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ  ＨＰＬＣ）によって判定されるように、類似体のうち４つのみ：ｍ７ＧｐｐＳＧ（２１番）、ｍ７ＧｐｐｐＳＧ（２２番）、ｍ７，２’−ＯＧｐｐｐＳＧ（３８番）、およびｍ７ＧｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１／Ｄ２（３５−３６番）がＤｃｐＳによって加水分解される。７−メチル化されたグアノシンの側から５’位に硫黄原子を含む他の類似体は、ｈＤｃｐＳによる加水分解に抵抗力がある（２つの異なる類似体（２２番）と（２４番）の安定性の比較、図５、表４）。化合物２１、２２、３８番および３５−３６番とは対照的に、類似体３７（ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐＳＧ）は、メチレンビスホスホナート部分でさらに修飾され、さらに酵素ｈＤｃｐＳによる加水分解に抵抗力があった（表５）。その後、蛍光法および蛍光発生的なプローブは、酵素ｈＤｃｐＳを抑制するこれらの化合物の能力の判定のために使用され、同時に酵素活性パラメータＩＣ５０に対して抵抗力のある化合物を判定するためにも使用された（特許出願ＰＬ４０６８９３を参照）。試験後、結果として得た化合物がヒト酵素ＤｃｐＳの非常によい阻害剤であることが発見された。
【０１１０】
類似体３４番は試験されたすべてのキャップ類似体の中で、ｈＤｃｐＳ酵素に対する最良の阻害特性を示し、酵素の短縮版で共結晶化され（ΔＮ３７ｈＤｃｐＳ；完全長の酵素は結晶を形成しなかった）、および複合体の２．０５Å融解構造がＸ線結晶解析で判定された（図７）。複合体構造において観察された類似体３４番の構造は、触媒現象的に不活性のＨ２７７Ｎ  ｈＤｃｐＳ突然変異体を伴う複合体における非修飾キャップ類似体ｍ７ＧｐｐｐＧ（化合物０番）の構造とはかなり異なっている（Ｇｕ，Ｆａｂｒｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。それらの２つのリガンド間の特に実体的な相違は、三リン酸架橋の配列で観察され、結果として触媒中心からの類似体３４番のγリン酸塩の排除をもたらした。さらに、Ｃ末端領域との典型的なキャップ／ＤｃｐＳ酵素複合体の相互作用に加えて、類似体３４は水素結合を介してリジン１４２およびチロシン１４３残基と相互に作用する。それらのアミノ酸は、Ｃ−とＮ−末端領域が結合するいわゆるヒンジ領域に位置し、それは触媒回路中で互いに対して移動する。
【０１１１】
得られた化合物の構造および純度は質量分析法および１Ｈと３１Ｐ  ＮＭＲによって確認された。
【０１１２】
得られた化合物の加水分解が７−メチルグアノシンに隣接しているリン酸基に対する求核攻撃を通じて進むため、ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（化合物２４番）およびその類似体がｈＤｃｐＳに抵抗力があるという所見は予期しないものであり、これは天然の基質に関して確立された触媒のメカニズムと矛盾しない。
【０１１３】
まとめると、本発明は、５’−ホスホロチオエート部分を含むｍＲＮＡ（キャップ）の５’末端の様々な類似体の構造および合成方法を記載する。記載されるキャップ類似体、酵素ＤｃｐＳに対するそれらの特性、およびそれらの使用法、特に脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）の処置および／またはＳＭＡの症状の緩和のための使用のいずれも、これまでに文献に記載されたことはなかった。
【０１１４】
選択された類似体は、ＲＮＡ  ＳＰ６ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いたインビトロ転写法を用いたｍＲＮＡ合成に使用された。３５のヌクレオチドの長さを有する転写物のプールのどのパーセンテージがキャップ構造を有するのかを検査し、そして次に分裂酵母からの組換え酵素Ｄｃｐ１／２による分解に対するこれらの転写物の感受性を検査した（実施例２、試験４、図８、図９、表６）。ルシフェラーゼを（レポーター遺伝子として）コードする完全長の転写物は、ウサギ網状赤血球の溶解産物（図１０、実施例２、試験５）、および修飾されたｍＲＮＡでトランスフェクトされたヒーラー細胞（図１１、実施例２、試験６）における翻訳を受けた。いずれの場合も、双方の翻訳系統におけるｍＲＮＡ翻訳の効率は、合成されたタンパク質（ルシフェラーゼ）の活性を検査することによって判定された（表６）。
【０１１５】
本明細書で使用される用語は、以下の意味を持つ。本明細書に定義されない用語は、本開示および特許出願の明細書の文脈に照らして、当業者によって提示され、および理解される意味を持つ。他で指示されない限り、以下の約束事が本明細書において使用され、用語は以下の定義で示される意味を持つ。
【０１１６】
用語「アルキル」は、指示された数の炭素原子を有する、飽和した、または直鎖、または分岐したヒドロカルボニル置換基を指す。アルキル置換基の例は、−メチル、−エチル、−ｎプロピル、−ｎブチル、−ｎペンチル、−ｎヘキシル、−ｎヘプチル、−ｎオクチル、−ｎノニルおよび−ｎデシルである。代表的な分岐した−（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルは、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｒｔ−ブチル、−イソペンチル、−ネオペンチル、−１− −メチルブチル、−２−メチルブチル、−３−メチルブチル、−１，１−ジメチルプロピル、−１，２−ジメチルプロピル、−１−メチルペンチル、−２−メチルペンチル、−３−メチルペンチル、−４−メチルペンチル、−１−エチルブチル、−２−エチルブチル、−３−エチルブチル、−１，１−ジメチルブチル、−１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、−２，２−ジメチルブチル、−２，３−ジメチルブチル、−３，３−ジメチル−ブチル、−１−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、−３−メチルヘキシル、−４−メチルヘキシル、−５−メチルヘキシル、−１，２−ジメチルペンチル、−１，３−ジメチルペンチル、−１，２−ジメチルヘキシル、−１，３−ジメチルヘキシル、−３，３−ジメチルヘキシル、１，２−ジ−メチルヘプチル、−１，３−ジメチルヘプチル、および−３，３−ジメチルヘプチル、およびその他を含む。
【０１１７】
用語「アルケニル」は、飽和した、または直鎖、または分岐した非環式ヒドロカルビル置換基を指し、それは指示された数の炭素原子を有し、および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む。アルケニル置換基の例は、−ビニル、−アリル、−１−ブテニル、−２−ブテニル、−イソブチレニル、−１−ペンテニル、−２−ペンテニル、−３−メチル−１−ブテニル、−２−メチル−２−ブテニル、−２，３−ジメチル−２−ブテニル、−１−ヘキセニル、−２−ヘキセニル、−３−ヘキセニル、−１−ヘプテニル、−２−ヘプテニル、−３−ヘプテニル、−１−オクテニル、−２−オクテニル、−３−オクテニル、−１−ノネニル、−２−ノネニル、−３−ノネニル、−１−デケニル、−２−デケニル、−３−デケニル、およびその他である。
【０１１８】
用語「アルキニル」は、飽和した、または直鎖、または分岐した非環式ヒドロカルビル置換基を指し、それは指示された数の炭素原子を有し、および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む。アルキニル置換基の例は、アセチレニル、プロピニル、−１−ブチニル、−２−ブチニル、−１−ペンチニル、−２−ペンチニル、−３−メチル−１−ブチニル、４−ペンチニル、−１−ヘキシニル、−２−ヘキシニル、−５−ヘキシニル、およびその他である。
【０１１９】
用語「異種原子」は、酸素、硫黄、窒素、リン、およびその他の基から選択された原子を指す。
【０１２０】
用語「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを指し、および「ＨＰＬＣ」用の溶媒として指定された溶媒は、ＨＰＬＣ解析（高速液体クロマトグラフィー）に適した純度の溶媒を指す。
【０１２１】
用語「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を意味する。
【０１２２】
用語「細胞系」は、ＲＮＡ鋳型でタンパク質生合成プロセスを行なうことができる細胞を指す。
【０１２３】
用語「非細胞系」は、ＲＮＡ鋳型に基づいたタンパク質生合成に必要な全ての成分、通常は動物または植物の細胞の溶解産物を含む生物混合物を意味する。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
以下の実施例は、本発明を例示し、およびその様々な態様について説明するためだけに提供され、本発明を制限するためのものではなく、および添付された特許請求の範囲において定義されるその全ての範囲と同一視されるべきでない。以下の実施例は、他で指示されない限り、当分野で使用される標準的な物質および方法、または特定の物質と方法に関してメーカーによって推奨される手順の使用を含んだ。
【実施例】
【０１２５】
＜新たなキャップ類似体の合成、単離および特性評価に関する一般的な情報＞
中間物であるヌクレオチドは、脱イオン水中で重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）の直線勾配を使用し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５（ＨＣＯ３−ｆｏｒｍ）におけるイオン交換クロマトグラフィーによって精製された。減圧下での蒸発の間にＴＥＡＢ緩衝液を分解するために９６％のエタノールを数回添加し、その後に中間物はトリエチルアンモニウムの塩として単離された。最終的な生成物（キャップ類似体）は同じ方法で精製され、次にセミ分取ＨＰＬＣによって精製され、および凍結乾燥を数回受け、アンモニウム塩として単離された。分析逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ  ＨＰＬＣ）はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ  １２００の装置で、０．０５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．９）中の０％−２５％のメタノール（プログラムＡ）または０．０５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．９）中の０％−５０％のメタノール（プログラムＢ）の直線勾配を備える、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８  ＲＰＴカラム（４．６ラ２５０ｍｍ、フロー１．３ｍｌ／分）を用いて行われた。溶出された化合物は、ＵＶ−ＶＩＳ検出器（２６０ｎｍで）および蛍光検出器（励起２６０ｎｍ、放射３７０ｎｍ）を使用して検知された。分取ＲＰ  ＨＰＬＣは、移動相として０．０５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．９）中のアセトニトリルの直線勾配を使用し、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＲＰ  Ａｍｉｄｅ  Ｃ１６カラム（２１．２ｍｍ×２５０ｍｍ、フロー５．０ｍｌ／分）を使用して、同じ装置で行われた。１Ｈ  ＮＭＲおよび３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルはそれぞれ、３９９．９４ＭＨｚおよび１６１．９０ＭＨｚの周波数で、Ｖａｒｉａｎ  ＵＮＩＴＹ−ｐｌｕｓにおいて２５℃で記録された。１Ｈ  ＮＭＲ化学シフトは、Ｄ２Ｏ（内部標準）のＴＳＰ（３−トリメチルシリル［２，２，３，３−Ｄ４］プロピオン酸ナトリウム）に伝えられた。３１Ｐ  ＮＭＲ化学シフトは、Ｄ２Ｏ（外部標準）の２０％のリン酸塩に伝えられた。陰イオンモード［ＭＳ  ＥＳＩ（−）］または陽イオンモード［ＭＳ  ＥＳＩ  （＋）］における高解像度質量スペクトルを、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＱＴｏＦ  １  ＭＳに記録した。蛍光プレート読取り機の読取りを、４８０ｎｍの励起および５３５ｎｍの放射で、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔ  ２００（登録商標）ＰＲＯで行なった。サンプルは黒色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に置かれた。結晶は、分注ロボットＭｏｓｑｕｉｔｏ  Ｃｒｙｓｔａｌ（ＴＴｐ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を利用して、３つのレンズウェル（Ｓｗｉｓｓｃｉ）を備えた９６ウェルプレート上で行なわれた。溶媒および他の試薬はシグマ・オールドリッチから購入し、以下で指示されない限り、さらなる精製を行うことなく使用した。ＧＭＰとＧＤＰの市販されているナトリウム塩は、Ｄｏｗｅｘ  ５０  ＷＸ８で、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、トリエチルアンモニウム塩に変えられた。トリエチルアンモニウム塩、およびｍ７ＧＭＰとｍ７ＧＤＰのナトリウム塩、ｍ７ＧＭＰ−Ｉｍとｍ７ＧＤＰ−Ｉｍを、文献に記載のようにして得た（Ｋａｌｅｋ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５），（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。５’−デオキシ−５’−���ード−グアノシン、５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノチオホスファート、およびトリエチルアミンホスホロチオエートを、文献に記載のようにして得た（（Ａｒａｋａｗａ，Ｓｈｉｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００３），（Ｚｕｂｅｒｅｋ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００３））。ｍ７ＧｐＣＨ２ｐ  トリエチルアンモニウム塩を、文献に記載のように調製した（Ｋａｌｅｋ，Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＧｐＣＨ２ｐｐＳを、記載されているように調製した（Ｋｏｗａｌｓｋａ，Ｚｉｅｍｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０１２６】
以下の実施例において、特定の化合物に対する括弧内に、特定の置換基を示す図と数への参照が与えられ、それは特定のキャップ類似体に対する特定の数に一致する。
【０１２７】
＜実施例１＞
新しいキャップ類似体の合成および単離
５’−ヨードヌクレオシド誘導体（図１、３番、４番）の合成の一般的な方法
ヨウ素（３ｍｍｏｌ、Ｍ＝２５３．８１ｇ／ｍｏｌ）を、室温で、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ヌクレオシド０．２５ｍｏｌ／ｌ濃度まで）中の、対応するヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（３ｍｍｏｌ、Ｍ＝２６２．２９ｇ／ｍｏｌ）およびイミダゾール（６ｍｍｏｌ、Ｍ＝６８．０８ｇ／ｍｏｌ）の磁気的に撹拌された懸濁液に、５分以上加えた。その反応は３時間以上行なわれ、反応の進行はＲＰ  ＨＰＬＣを使用してモニタリングされた。次いで、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２：Ｈ２Ｏ（３：１、ｖ／ｖ）の溶液に注ぎ、反応混合物を１２回希釈した。白色の結晶性の沈殿物が、２つの層の界面で４℃で２４時間のあいだに形成された。沈殿物を減圧下で濾過し、塩化メチレンで洗浄し、Ｐ２Ｏ５上で真空中で乾燥した。
【０１２８】
５’−デオキシ−５’−ヨード−グアノシン（図１、３番）
グアノシン（図１、１番）（１０ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、５’−デオキシ−５’−ヨード−グアノシン（図１、３番）、（１０．４ｇ、２６．５ｍｍｏｌ、７５％）を得た。ｔＲ（Ｂ）＝１２．３６分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  １０．６５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−１）、７．８９（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８）、６．４７（ｂｓ、２Ｈ、ＮＨ２）、５．６８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６、Ｈｚ、Ｈ−１’）、５．５１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６  Ｈｚ、２’−ＯＨ）、５．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．７０Ｈｚ、３’−ＯＨ）、４．５９（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝５．４８  Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．０３（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝５．０９、３．１３  Ｈｚ、Ｈ−３’）、３．９０（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６、３．１３  Ｈｚ、Ｈ−４’）、３．５３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６、５．８７  Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．３９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．１７、６．６５  Ｈｚ、Ｈ−５’）；ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）ｃａｌｃｄ．ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１０Ｈ１１ＩＮ５Ｏ４−、（Ｍ−Ｈ）−；３９１．９８６１、ｆｏｕｎｄ  ３９１．９８６１０
【０１２９】
５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（図１、４番）
２’−Ｏ−メチルグアノシン（図１、２番）（３００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、２’−Ｏ−メチル−５’−デオキシ−５’−ヨード−グアノシン（図１、４番）、（３２８．８ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、８０％）を得た。ｔＲ（Ｂ）＝１４．４４分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ７．９５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８）、６．５０（ｂｓ、２Ｈ、ＮＨ２）、５．８１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４１  Ｈｚ、Ｈ−１’）、５．５０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．３４  Ｈｚ、３’−ＯＨ）、４．４１、４．４０（２ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６、６．４１  Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．２８−４．２５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’）、３．９７、３．９６（２ｔ、１Ｈ、Ｊ＝６．５６、３．０５  Ｈｚ、Ｈ−４’）、３．５６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．４１、１０．３８  Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．４３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．５３、６．８７、６．７１  Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．３０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１１Ｈ１３ＩＮ５Ｏ４−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ４０６．００９０、ｆｏｕｎｄ  ４０６．００２１．
【０１３０】
５’−デオキシ−５’−ヨード−７−メチルグアノシン（図１、５番）
５’−デオキシ−５’−ヨード−グアノシン（図１、３番）（２ｇ、５．０９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、Ｍｅｌ（２．５ｍＬ、４０．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温でマグネチックスターラーにて撹拌した。反応の進行をＲＰ  ＨＰＬＣによってモニタリングした。出発物質が観察されなかった場合、水（１０ｍＬ）を加えることにより反応を停止させ、過剰なヨウ化メチルを真空下で蒸発させ、反応混合物を減圧下で濃縮した。その後、残る粗生成物に、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）を加え、黄色の沈殿物を形成した。沈殿物を減圧下で濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×２０ｍＬ）で洗浄し、Ｐ４Ｏ１０上で真空中で２４時間乾燥した。収量１．６ｇ（７７．０％）。ｔＲ（Ｂ）＝１１．９４分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ５．９８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．９１  Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．８１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．７０  Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．３１（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．０９、Ｈ−３’）、４．１５（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝５．４８、Ｈ−４’）、４．０７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．５０−３．６２（ｍ、２Ｈ、Ｊ＝４．７０、５．８７  Ｈｚ、Ｈ−５’）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（＋）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ１５ＩＮ５Ｏ４＋  ［Ｍ＋Ｈ］＋：４０８．０１６８７、ｆｏｕｎｄ  ４０８．０１１６３．
【０１３１】
５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−Ｏ−メチル−７−メチルグアノシン（図１、６番）
５’−デオキシ−５’−ヨード−２’−Ｏ−メチルグアノシン（図１、４番）（２００．８ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（３．３ｍＬ）に溶解し、Ｍｅｌ（０．２５ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温でマグネチックスターラーにて撹拌した。反応の進行をＲＰ  ＨＰＬＣによってモニタリングした。出発物質が観察されなかった時、水（１０ｍＬ）を加えることにより反応をクエンチさせ、ｐＨをＮａＨＣＯ３を用いて中性に調整し、過剰なヨウ化メチルをジエチルエーテルで抽出し、水相をプールし（ｐｏｌｌｅｄ）、続いて混合物を濃縮し、分取ＨＰＬＣで精製して、４５．８ｍｇの化合物（７７％）を得た。ｔＲ（Ｂ）＝１１．９４分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）δｐｐｍ  ９．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８）、６．３９（ｂｓ、２Ｈ、ＮＨ２）、５．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．２７  Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．４０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝４．５８  Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．２４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝４．８８  Ｈｚ、Ｈ−３’）、４．０８−４．０６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’）、４．０２（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．５９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．１９、４．８８、１０．６８  Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．５０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．９３、７．６３、１０．６８  Ｈｚ、Ｈ−５’）、３．４１（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ１５ＩＮ５Ｏ４−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ４２０．０１７４１、ｆｏｕｎｄ：４２０．０１７５８．
【０１３２】
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノホスホロチオラート（図２、７番）
１００ｍＬのＤＭＦ：Ｈ２Ｏ混合物（１：１、ｖ／ｖ）中の５’−デオキシ−５’−ヨードグアノシン（図２、３番）（２．０ｇ、５．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、チオリン酸三ナトリウム（４．６ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。沈殿物を濾過によって除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残留物を５０ｍＬの水に溶解し、過剰なチオリン酸三ナトリウムを１００ｍＬのメタノールを追加することにより沈殿させた。分離後、粗生成物をＳｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物を凍結乾燥した。収量１．９ｇ（６４％）。ｔＲ（Ｂ）＝４．２４分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．０５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８）、５．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．７３  Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．８５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．４８  Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．５１（２ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．９８、４．２３  Ｈｚ、Ｈ−３’）、４．３３−４．３９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’）、３．１６−３．０８（ｍ、２Ｈ、Ｈｚ、Ｈ−５’）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  １５．４２（ｓ、１Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ１３Ｎ５Ｏ７ＰＳ−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ３７８．０２７８８、ｆｏｕｎｄ：  ３７８．０２８２８．
【０１３３】
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオ−７−メチルグアノシン−５’−モノホスホロチオラート（図２、８番）
１００ｍＬのＤＭＦ中の５’−デオキシ−５’−ヨード−７−メチルグアノシン（図２、６番）（２．０ｇ、４．９２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、チオリン酸三ナトリウム（４．４３ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。沈殿物を除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残留物を５０ｍＬの水に溶解し、過剰なチオリン酸三ナトリウムをメタノール（１００ｍＬ）を追加することにより沈殿させた。分離後、粗生成物をＳｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。生成物を凍結乾燥した。収量１．５５ｇ（５３％）。ｔＲ（Ｂ）＝４．６４分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．８５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８）、５．８９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．７４  Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．７８−４．７５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２’）、４．４３−４．３９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３’、Ｈ−４’）、４．０９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．０８−２．９４（ｍ、２Ｈ、Ｈｚ、Ｈ−５’）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  １４．４５（ｓ、１Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  Ｃ１１Ｈ１５Ｎ５Ｏ７ＰＳ−  ［Ｍ−Ｈ］−：３９２．０４３５３、ｆｏｕｎｄ：  ３９２．０４３７８．
【０１３４】
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノホスホロチオラートイミダゾリド（図２、９番、１０番）の合成の一般的な手順
適切な出発化合物（ヌクレオチドＴＥＡ塩）（１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（ヌクレオチド濃度０．１５Ｍまで）中のイミダゾール（１０ｍｍｏｌ）および２，２’−ジチオジピリジン（３ｍｍｏｌ）と混合した。次に、トリエチルアミン（３ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２４時間撹拌した。乾燥アセトン（〜添加したＤＭＦよりも１０倍大きい量）中のＮａＣｌＯ４の無水溶液（リン酸塩部分ごとに４ｍｍｏｌ）を添加した結果、反応混合物から生成物が沈殿した。４度まで冷却した後に、沈殿物を濾過し、冷たい乾燥アセトンで洗浄し、Ｐ４Ｏ１０上で真空中で乾燥させた。
【０１３５】
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノホスホロチオラートイミダゾリド（図２、９番）
５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノホスホロチオエート（図２、７番）（５００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、グアノシン５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノホスホロチオエートイミダゾリド（図２、９番）（３５２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、８９％）を得た。ｔＲ（Ｂ）＝８．２７分；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  １１．６９（ｍ、１Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１３Ｈ１５Ｎ７Ｏ６ＰＳ−  ［Ｍ−Ｈ］−：４２８．０５４７６、  ｆｏｕｎｄ  ４２８．０５４５２．
【０１３６】
５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−７−メチルグアノシン−５’−モノホスホロチオラートイミダゾリド（図２、１０番）
５’−デオキシ−５’−チオ−７−メチルグアノシン−５’−モノホスホロチオエート（図２、８番）（５００ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−７−メチルグアノシン−５’−モノホスホロチオエートイミダゾリド（図２、１０番）（３２１ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、８２％）を得た。ｔＲ（Ｂ）＝８．３９分；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１４Ｈ１７Ｎ７Ｏ６ＰＳ−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ４４２．０７０４１、ｆｏｕｎｄ  ４４２．０７０７０．
【０１３７】
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−ジホスホロチオラート（図２、１１番）
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−モノホスホロチオエートイミダゾリド（図２、９番）（１００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、トリス（トリエチルアンモニウム）リン酸塩（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、続いてＺｎＣｌ２（２３５．８４ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣで制御した。反応混合物を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。次いで、ＥＤＴＡの水溶液（５１３．９２ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、５０ｍＬ）を加えることにより反応を停止させ、１ＭのＮａＨＣＯ３で中和した。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＴＥＡ塩類として単離した。収量：１０８．５ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ、６５％）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｏ１０Ｐ２Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：４５７．９９４２１、  ｆｏｕｎｄ  ４５７．９９４８１．
【０１３８】
５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−７−メチルグアノシン−二リン酸塩（図２、１２番）
５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−７−メチルグアノシン−５’−モノホスホロチオエートイミダゾリド（図２、１０番）（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、トリス（トリエチルアンモニウム）−リン酸塩（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、続いてＺｎＣｌ２（２２４．５４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣで制御した。反応混合物を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。その後、その反応は、ＥＤＴＡ（４９０．５６ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、５０ｍＬ）の水溶液の追加によって止められ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３で中和された。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、ＴＥＡ塩類として単離した。収量：９１ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ、５４％）、ｔＲ（Ｂ）＝５．０７分、
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．１１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８  ゆっくりと交換可能）、５．９７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．９１  Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．５０、４．４９（２ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．０９  Ｈｚ、Ｈ−２’）、４．４１（ｑ、１Ｈ、Ｊ＝５．４８，５．０９  Ｈｚ、Ｈ−３’）、４．０７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３４−３．１３（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、Ｈ−５’）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ６．７１（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３０．８１  Ｈｚ）、８．２１（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３０．８１  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１１Ｈ１６Ｎ５Ｏ１０Ｐ２Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ４７２．００９８６、ｆｏｕｎｄ  ４７２．００９６７．
【０１３９】
グアノシン５’−デオキシ−５’−チオ−７−メチルグアノシン−２’−ジホスホロチオラート（図２、１３番）
５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−７−メチルグアノシン−５’−モノホスホロチオエートイミダゾリド（図２、１０番）（１００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、チオリン酸ナトリウム（４７ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加え、続いてＺｎＣｌ２（２２４．５４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣで制御した。反応混合物を、出発物質が消失するまで室温で撹拌した。その後、その反応は、ＥＤＴＡ（４９０．５６ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、５０ｍＬ）の水溶液の追加によって止められ、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３で中和された。粗生成物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、単離されたＴＥＡ塩類を直ちに共役反応に使用した。収量：１１０ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ、６４％）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ１１Ｈ１６Ｎ５Ｏ９Ｐ２Ｓ２−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ４８７．９８７０２、ｆｏｕｎｄ  ４８７．９８７２４．
【０１４０】
Ｓアルキル化による５’−Ｓキャップ類似体の合成
一般的な手順
ヌクレオシド末端のチオリン酸ＴＥＡ塩（１当量）をＤＭＳＯ（濃度約０．１−０．２Ｍまで）中で懸濁させた。次いで、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ（５．４．０）ウンデカ−７−エン）（１当量）および５’−ヨードグアノシン（１当量）の誘導体を加えた。反応の進行をＲＰ  ＨＰＬＣによってモニタリングした。１％酢酸をｐＨ＝７まで加えることによって末端チオリン酸塩からのシグナルがなくなった後に反応を停止させ、反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで洗浄した。生成物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘのイオン交換クロマトグラフィーによって精製し、トリエチルアンモニウム塩として単離した。生成物を半分取（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
【０１４１】
Ｐ１−（グアノシン−５’−イル）−Ｐ２−（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）二リン酸塩  −ＧｐｐＳＧ（図３、１９番）
ＧＤＰβＳ（図３、１４番）、（５０６ｍＯＤ、０．０４２ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ＧｐｐＳＧ（２０７ｍＯＤ、０．００９ｍｍｏｌ、２４％）を得た。ＲｐＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．９分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．９６（ｓ、１  Ｈ）、７．８１（ｓ、１  Ｈ）、５．７７（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝５．４８  Ｈｚ）、５．７０（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝５．８７  Ｈｚ）、４．８０−４．７０（ｍ、２Ｈ、水シグナルと重なる）、４．６４（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝５．４８  Ｈｚ）、４．４３（ｔ、１  Ｈ、ｔ、Ｊ＝３．９１  Ｈｚ）、４．３７（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝３．９１  Ｈｚ）、４．３０−４．１５（ｍ、４Ｈ）、３．３０−３．１３（ｍ、２  Ｈ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．６３（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３２．２８、１２．５  Ｈｚ）、−１２．０２（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３０．８１  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２０Ｈ２５Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：７２３．０７５３１、ｆｏｕｎｄ  ７２３．０７５４６．
【０１４２】
Ｐ１−（７−メチル−グアノシン−５’−イル）−Ｐ２−（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−二リン酸塩  −ｍ７ＧｐｐＳＧ（図３、２１番）
ｍ７ＧＤＰβＳ（図３、１７番）、（５８３０ｍＯＤ、０．５１ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ７ＧｐｐＳＧ（１０２８ｍＯＤ、０．０４５ｍｍｏｌ、９％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝５．９分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．９８（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  ｍ７Ｇ）、７，８７（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  Ｇ）、５．８８（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝２．０  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７３（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝５．７  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６９（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝５．５  Ｈｚ、Ｈ−２’  Ｇ）、４．５１（ｂｓ．、１  Ｈ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ）、４，３２  −  ４．４４（ｍ、５  Ｈ、Ｈ−３’  Ｇ、Ｈ−３’  ｍ７Ｇ、Ｈ−４’  Ｇ、Ｈ−４’  ｍ７Ｇ、Ｈ−５’  ｍ７Ｇ）、４．２４（ｄｄ、１  Ｈ、Ｊ＝１１．３、５．４  Ｈｚ、Ｈ５”  ｍ７Ｇ）、４．０４（ｓ、３  Ｈ、ＣＨ３）、３．２４  −  ３．４１（ｍ、２  Ｈ、Ｈ５’、５”  Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．３８（ｄｔ、１Ｐ、  Ｊ＝２９．０、１１．５  Ｈｚ）、−１２．００（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３２．２３  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（  ）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２７Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ７３７．０９０９６、ｆｏｕｎｄ  ７３７．０９０５２．
【０１４３】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ２−グアノシン−５’−イル−二リン酸塩  −ｍ７ＧＳｐｐＧ（図３、２３番）
ＧＤＰβＳ（図３、１４番；２５３２ｍＯＤ、０．２１ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ７ＧＳｐｐＧ（１６６０ｍＯＤ、０．０７３ｍｍｏｌ、３５％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝７．７５分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．９９（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  Ｇ）、５．８３（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝４，２  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．８０（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝６．０  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６５−４．７０（２  Ｈ、ｍ、Ｈ−２’  Ｇ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ）、４．４５（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝４．１  Ｈｚ、Ｈ−３’  Ｇ）、４．１９−４．４１（５  Ｈ、ｍ、Ｈ−３’  ｍ７Ｇ、Ｈ−４’  Ｇ、Ｈ−４’  ｍ７Ｇ、Ｈ５’、５”  Ｇ）、４．０５（ｓ、３  Ｈ、ＣＨ３）、３．３５−３．４３（ｍ、２  Ｈ、Ｈ５’、５”  ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．３２（ｄｔ、１Ｐ、Ｊ＝２９．０、１１．０  Ｈｚ）、−１１．８４（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２９．００  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２７Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：７３７．０９０９６、ｆｏｕｎｄ  ７３７．０９１４６．
【０１４４】
Ｐ１（グアノシン−５’−イル）−Ｐ３（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−三リン酸塩    −ＧｐｐｐＳＧ（図３、２０番）
ＧＴＰγＳ（図３、１５番；１２３３ｍＯＤ、０．１０ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ＧｐｐｐＳＧ（１１４９ｍＯＤ、０．０５１ｍｍｏｌ、５１％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝５．５０分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．０２（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  Ｇ）、７．９０（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  Ｇ）、５．８２（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝６．０  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、５．７８（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝６．２  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．８４（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝５．７  Ｈｚ、Ｈ−２’  Ｇ）、４．７４（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝５．７  Ｈｚ、Ｈ−２’  Ｇ）、４．５２（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝４．２  Ｈｚ、Ｈ−３’  Ｇ）、４．４７（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝４．３  Ｈｚ、Ｈ−３’  Ｇ）、４．３０−４．３８（ｍ、２  Ｈ、Ｈ−４’、５’  Ｇ）、４．２７（ｍ、２  Ｈ、Ｈ−４’、５”  Ｇ）、３．２５−３．３５（ｍ、２  Ｈ、Ｈ５’、５”  Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．２１（ｄｔ、１Ｐ、Ｊ＝２７．００、１３．３  Ｈｚ）、−１１．３４（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝１９．３０  Ｈｚ）、−２３．７８（ｄｄ、１Ｐ、Ｊ＝２７．００、１９．３０  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２０Ｈ２６Ｎ１０Ｏ１７Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：８０３．０４１６４、ｆｏｕｎｄ  ８０３．０４１３５．
【０１４５】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ３−グアノシン−５’−イル−三リン酸塩  −ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（図３、２４番）
ＧＴＰγＳ（図３、１５番；３０００ｍＯＤ、０．２５ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ７ＧＳｐｐｐＧ（７２９ｍＯＤ、０．０３２ｍｍｏｌ、１３％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝５．３６分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．９２（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  ｍ７Ｇ）、７．９６（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  Ｇ）、５．７８（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝４．３０  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５，７４（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝５．８７  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６３（ｍ、２  Ｈ、Ｈ−２’  Ｇ、Ｈ２’  ｍ７Ｇ）、４，４８（ｄｄ、１  Ｈ、Ｊ＝４．４３、３．５２  Ｈｚ、Ｈ−３’  ｍ７Ｇ）、４．３６−４．２６（ｍ、４  Ｈ、Ｈ−３’  Ｇ、Ｈ−４’  Ｇ、Ｈ−４’  ｍ７Ｇ、Ｈ−５’  Ｇ）、４．２４  −４．１９（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５”  Ｇ）、４．００（ｓ、３  Ｈ、ＣＨ３）、３．３３−３．２４（２  Ｈ、ｍ、Ｈ−５’、５”  ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．５７（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２７．８８  Ｈｚ）、−１１．６８（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２０．５４  Ｈｚ）、−２４．００（ｄｄ、１Ｐ、Ｊ＝２９．３５、２２．０１  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１７Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−  ８１７．０５７２９、ｆｏｕｎｄ  ８１７．０５４９４．
【０１４６】
Ｐ１−（７−メチル−グアノシン−５’−イル）−Ｐ３  −（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−三リン酸塩  −ｍ７ＧｐｐｐＳＧ（図３、２２番）
ｍ７ＧＴＰγＳ（図３、１８番；２６１６ｍＯＤ、０．２３ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ７ＧｐｐｐＳＧ（１５８２ｍＯＤ、０．０７ｍｍｏｌ、３２％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．０６分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．０２（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  ｍ７Ｇ）、７．８７（ｓ、１  Ｈ、Ｈ−８  Ｇ）、５．８４（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝３．５２  Ｈｚ、Ｈ１’  ｍ７Ｇ）、５．７０（ｄ、１  Ｈ、Ｊ＝６．６５  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．８０−４．６７（ｍ、１  Ｈ、Ｈ−２’  Ｇ）、４．５２（ｔ、１  Ｈ、Ｊ＝４．３０  Ｈｚ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ）、４．４１（ｄｄ、２  Ｈ、Ｊ＝４．７０、４．３０  Ｈｚ、Ｈ３’  Ｇ、Ｈ３’  ｍ７Ｇ）、４．３８−４．３０（ｍ、２  Ｈ、Ｈ−４’  Ｇ、Ｈ−４’  ｍ７Ｇ）、４．３６−４．３１  ｍ、２Ｈ、Ｈ５’  ｍ７Ｇ）、４．０２（ｓ、３  Ｈ、ＣＨ３）、３．３０−３．２０（ｍ、２  Ｈ、Ｊ＝１２．６、６．３  Ｈｚ、Ｈ５’、５”  Ｇ）；  ３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．６６（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２９．３５  Ｈｚ）、−１１．７３（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２２．０１  Ｈｚ）、−２３．９５（ｄｄ、１Ｐ、Ｊ＝２２．０１、２７．８８  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１７Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ８１７．０５７２９、ｆｏｕｎｄ  ８１７．０５７４８．
【０１４７】
Ｐ１  −（２’−Ｏ−メチル−７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ３−グアノシン−５’−イル  三リン酸塩ｍ２７，２’−ＯＧＳｐｐｐＧ（図３、２６番）
ＧＴＰγＳ（図３、１５番；１５００ｍＯＤ、０．１２ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ２７，２’−ＯＧＳｐｐｐＧ（１４０ｍＯＤ、０．００６ｍｍｏｌ、５％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝７．８９分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．９３（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．９１  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．４８  Ｈｚ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ）、４．４３−４．４０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−２’、Ｇ、Ｈ−３’  ｍ７Ｇ）、４．３２−４．１８（ｍ、６Ｈ、Ｈ−３’  Ｇ、Ｈ−４’、Ｈ−５’、Ｇ、ｍ７Ｇ）、４．０１（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．５２（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．３５（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２６．４１  Ｈｚ）、−１１．６８（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝１９．０７  Ｈｚ）、−２４．０２、−２４．１８（２ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２６．４１、１９．０７  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３０Ｎ１０Ｏ１７Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−  ８３１．０７２９４、ｆｏｕｎｄ  ８３１．０７４７７．
【０１４８】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ３−グアノシン−５’−イル−２，３メチレン三リン酸塩  −ｍ７ＧＳｐｐＣＨ２ｐＧ（図３、２５番）
ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐγＳ（図３、１６番；７１７ｍＯＤ、０．０６ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ７ＧＳｐｐＣＨ２ｐＧ（３５３ｍＯＤ、０．０１６ｍｍｏｌ、２７％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．３６分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、８．１７（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．３０  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．４８  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．７０−４．６６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ）、
４．４６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．９１、５．０９  Ｈｚ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．３８−４．３３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３２−４．２８（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ）、４．２６−４．２０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．１９−４．１３（ｍ、１Ｈ、Ｈ−５”  Ｇ）、４．０２（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３４−３．２２（ｍ、４Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  １７．０３（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝１０．２７  Ｈｚ）、７．４７−６．９７（ｍ、２Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３０Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−  ８１５．０７８０３、ｆｏｕｎｄ  ８１５．０７９２３．
【０１４９】
イミダゾリドを介する５’−Ｓ−キャップ類似体の合成
一般的な手順
５’Ｓ−ＧＭＰ−Ｉｍ（図２、９番）（Ｎａ塩、５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）、および適切な二リン酸塩（１ｍｍｏｌ）：
ｍ２７，２’−ＯＧＤＰ（図４、２８番）、ｍ７ＧｐＣＨ２ｐ（図４、２７番）、ｍ７−５’Ｓ  ＧＤＰ（図２、１２番）、ｍ７ＧＳｐｐβＳ（図２、１３番）、またはｍ７ＧＤＰβＳ（図３、１７番）を、無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中に懸濁させ、続いて、無水ＺｎＣｌ２（９５ｍｇ、１０ｅｑ、０．７ｍｍｏｌ）を追加した。試薬が溶解するまで、反応混合物を激しく振盪した。反応の進行をＲＰ  ＨＰＬＣによってモニタリングした。完了（２４時間）後、適切な量のＥＤＴＡ溶液（Ｎａ２ＥＤＴＡ、２３７ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加え、固体のＮａＨＣＯ３でｐＨを６に調節し、続いて、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘによるイオン交換クロマトグラフィーによる粗生成物を精製し、ＴＥＡ塩として単離した（または分取ＨＰＬＣにより直接精製した）。生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製した。
【０１５０】
Ｐ１−（２’−Ｏ−メチル−７−メチル−グアノシン−５’−イル）−Ｐ３−（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−三リン酸塩  −ｍ２７，２’−ＯＧｐｐｐＳＧ（図４、３８番）
ｍ２７，２’−ＯＧＤＰ（図４、２８番；９１２ｍＯＤ、０．０８ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従って、ｍ２７，２’−ＯＧｐｐｐＳＧ（１２２ｍＯＤ、０．００５ｍｍｏｌ、６％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．２９分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．００（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８  ｍ７Ｇ）、７．８８（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．７４  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．６５  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．４８  Ｈｚ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ）、４．４８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．４８  Ｈｚ、Ｈ−２’、Ｇ）、４．４３−４．３８（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３’，Ｇ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ）、４．３６−４．３２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３０−４．２６（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ）、４．２５−４．１６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．０３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．５３（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）、３．３０−３．２２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．６８（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２７．８８  Ｈｚ）、−１１．６８（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２０．５４  Ｈｚ）、−２３．７８、−２３．９４（２ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２７．８８、１９．０７Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３０Ｎ１０Ｏ１７Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−  ８３１．０７２９４、ｆｏｕｎｄ  ８３１．０７３５０．
【０１５１】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ３−グアノシン−５’−イル−１，２−メチレン三リン酸塩  −ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐＳＧ（図４、３７番）
ｍ７ＧｐＣＨ２ｐ（図４、２７番；２０５２ｍＯＤ、０．１８ｍｍｏｌ）および５’−Ｓ−ＧＭＰ−Ｉｍ（１２２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、ｍ７ＧｐＣＨ２ｐｐＳＧ（１００２ｍＯＤ，  ０．０４４ｍｍｏｌ、２５％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．２６分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．３１（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、８．０２（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．９０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．１３  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．８７  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．８０−４．７０（ｍ、２Ｈ、溶媒シグナルと重なる、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ）、４．５８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．９１、３．４８  Ｈｚ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．４８（ｔ、１Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ）、４．４０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．９１、４．０６、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３７−４．２９（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．１９−４．１３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．０３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３０−３．１９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ、ｍ７Ｇ）、２．４０（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝２０．３５  Ｈｚ、ＣＨ２）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  １７．１１（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝８．８０  Ｈｚ）、７．６４−６．７６（ｍ、２Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２２Ｈ３０Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ−  ［Ｍ−Ｈ］−  ８１５．０７８０３、ｆｏｕｎｄ  ８１５．０７９０６．
【０１５２】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノジ−５’−イル）−Ｐ３−（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−三リン酸塩  −ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（図４、３２番）
ｍ７−５’Ｓ−ＧＤＰ（５７ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）および５’Ｓ−ＧＭＰ−Ｉｍ（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、ｍ７ＧＳｐｐｐＳＧ（７６８  ｍＯＤ、３２ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、４０％）を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．８０分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．３８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８  ｍ７Ｇ  ゆっくりと交換可能）、７．８４（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．７０  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．６５  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝４．７０  Ｈｚ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ）、４．４０、４．３９（２ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２．７４、３．５２、４．４０  Ｈｚ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．３６−４．２９（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’  Ｇ、Ｈ−５’、Ｇ）、３．９９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、４．３７−４．２８（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、Ｈ−５’、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ７．７４（ｔ、２Ｐ、Ｊ＝２７．８８）、−２４．６１（ｔ、１Ｐ、Ｊ＝２９．３５  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ２−  ［Ｍ−Ｈ］−  ８３３．０３４４５、ｆｏｕｎｄ  ８３３．０３５５０．
【０１５３】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ３−グアノシン−５’−イル−２  チオ三リン酸塩  −ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ１／Ｄ２（図４、それぞれ３０番、３１番）
ｍ７ＧＳｐｐβＳ（５６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）および５’Ｓ−ＧＭＰ−Ｉｍ（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ（１０８０ｍＯＤ、４５ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、５６％）をジアステレオ異性体Ｄ１／Ｄ２の混合物として得た。ジアステレオ異性体をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離し、アンモニウム塩として単離した。Ｄ１（図４、３０番）：
（４３８ｍＯＤ、１８ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、２３％）ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．５６分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．９８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、８．０８（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．２７  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．８０  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６７−４．６５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ）、４．４９−４．４７（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．３９−４．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３３−４．２３（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．０２（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３８−３．２５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ２９．１８（ｄｄ、１Ｐ、Ｊ＝３４．８３、２７．３７  Ｈｚ）、６．９６（ｄｔ、１Ｐ、Ｊ＝３４．８３、１２．４４  Ｈｚ）、−１２．３７（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２７．３７  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ２−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ８３３．０３４４５、ｆｏｕｎｄ  ８３３．０３５４９；
Ｄ２（図４、３１番）：ｍ７ＧＳｐｐｓｐＧ  Ｄ２（３８０  ｍＯＤ，１６ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ，  ２０％）  ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝６．７１分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．９８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、８．１４（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．２７  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．４９  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．６９−４．６５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ），４．４９−４．４５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．４０−４．３５（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３４−４．２１（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．０３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３９−３．２４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ２９．４４−２８．６７（ｍ、１Ｐ）、７．１７−６．５４（ｍ、１Ｐ）、−１２．０９−（−１２．７２）（ｍ、１Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ２−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ８３３．０３４４５、ｆｏｕｎｄ  ８３３．０３６０６．
【０１５４】
Ｐ１−（７−メチル−５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）−Ｐ３−（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）  ２−チオ三リン酸塩    −ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１／Ｄ２（図４、それぞれ３３番、３４番）
ｍ７ＧＳｐｐβＳ（５６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）および５’Ｓ−ＧＭＰ−Ｉｍ（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ（９４２ｍＯＤ、３９ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ、４８％）をジアステレオ異性体Ｄ１／Ｄ２の混合物として得た。ジアステレオ異性体をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離し、アンモニウム塩として単離した。Ｄ１（図４、３３番）（５１０ｍＯＤ、２１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、２６％）ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝７．５３分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．００（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、７．９９（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．２７  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．１０  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．７９−４．６８（ｍ、２Ｈ、溶媒シグナルと重なる、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ）、４．４４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．５８  Ｈｚ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．４１−４．３３（ｍ、３Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ、Ｈ−４’、Ｇ、ｍ７Ｇ）、４．０３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３９−３．２６（ｍ、４Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ２８．２５（ｔ、１Ｐ、Ｊ＝３４．８３  Ｈｚ）、７．３１−６．７４（ｍ、２Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１５Ｐ３Ｓ３−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ８４９．０１１６１、ｆｏｕｎｄ  ８４９．０１２１３．
Ｄ２（図４、３４番）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（２７４  ｍＯＤ、１１ｍｇ、０．００９８ｍｍｏｌ、１４％）：ｔＲ（Ａ）＝７．６２分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ８．９９（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、８．０４（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．５８  Ｈｚ、Ｈ−１’ｍ７Ｇ）、５．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．１０  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．７８−４．６６（ｍ、２Ｈ、溶媒シグナルと重なる、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ）、４．４６−４．４２（ｍ、１Ｈ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．４１−４．３４（ｍ、３Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ、Ｈ−４’、Ｇ、ｍ７Ｇ）、４．０４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３９−３．２４（ｍ、４Ｈ、Ｈ−５’、Ｇ、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ２８．２９（ｔ、１Ｐ、Ｊ＝３４．８３  Ｈｚ）、７．３２−６．６８（ｍ、２Ｐ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１５Ｐ３Ｓ３−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ８４９．０１１６１、ｆｏｕｎｄ  ８４９．０１２１７．
【０１５５】
Ｐ１−（７−メチル−グアノシン−５’−イル）−Ｐ３−（５’−デオキシ−５’−チオグアノシン−５’−イル）２−チオ三リン酸塩  −ｍ７ＧｐｐｓｐＳＧ  Ｄ１／Ｄ２（図４、それぞれ３５番、３６番）
ｍ７ＧＤＰβＳ（３４９２ｍＯＤ、０．３１ｍｍｏｌ）および５’Ｓ−ＧＭＰ−Ｉｍ（５５５０ｍＯＤ、０．４６ｍｍｏｌ）から出発して、一般的な手順に従い、ｍ７ＧｐｐｓｐＳＧ  （１９４１ｍＯＤ、０．０８６ｍｍｏｌ、２８％）をジアステレオ異性体Ｄ１／Ｄ２の混合物として得た。ジアステレオ異性体をＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分離し、アンモニウム塩として単離した。
Ｄ１（図４、３５番）：（８８８  ｍＯＤ、０．０３９ｍｍｏｌ、１３％）ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝７．１２分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．０７（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、７．９５（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．５２  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．８０−４．７０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｇ  Ｄ２Ｏシグナルと重なる）、４．５６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．７０、３．５２  Ｈｚ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．４７−４．４０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３９−４．３３（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．０３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３５−３．２０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ２９．００（ｄｄ、１Ｐ、Ｊ＝３３．７５、２６．４１Ｈｚ）、６．９８（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３３．７５、Ｈｚ）、−１２．５６（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２４．９４  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ−［Ｍ−Ｈ］−：  ８３３．０３４４５、ｆｏｕｎｄ  ８３３．０３５１４．；
Ｄ２（図４、３６番）：ｍ７ＧｐｐｓｐＧ  Ｄ２（１０５３  ｍＯＤ、０．０４６ｍｍｏｌ、１５％）  ＲＰ−ＨＰＬＣ：ｔＲ（Ａ）＝７．４２分；
１Ｈ ＮＭＲ（４００  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ９．０４（ｓ、１Ｈ、Ｈ−８、ｍ７Ｇ）、７．９５（ｓ、１Ｈ、Ｇ）、５．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．５２  Ｈｚ、Ｈ−１’  ｍ７Ｇ）、５．７３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２６  Ｈｚ、Ｈ−１’  Ｇ）、４．８０−４．７０（ｍ、２Ｈ、Ｈ−２’  ｍ７Ｇ、Ｈ−２’、Ｄ２Ｏシグナルと重なるＧ）、４．５４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．３０、３．９１  Ｈｚ、Ｈ−３’、Ｇ）、４．４５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝５．０９  Ｈｚ、Ｈ−３’、ｍ７Ｇ）、４．４３−４．４０（ｍ、１Ｈ、Ｈ−４’、Ｇ）、４．３９−４．３２（ｍ、３Ｈ、Ｈ−４’、ｍ７Ｇ、Ｈ−５’、Ｇ）、４．０３（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３７−３．２１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’、ｍ７Ｇ）；
３１Ｐ ＮＭＲ（１６２  ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）δｐｐｍ  ２８．９９（ｄｄ、１Ｐ、Ｊ＝３３．７５、２６．  ４１、２４．９４Ｈｚ）、６．９４（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝３５．２１、Ｈｚ）、−１２．４８（ｄ、１Ｐ、Ｊ＝２４．９４  Ｈｚ）；
ＨＲＭＳ  ＥＳＩ（−）  ｃａｌｃｄ．  ｍ／ｚ  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ２８Ｎ１０Ｏ１６Ｐ３Ｓ２−  ［Ｍ−Ｈ］−：  ８３３．０３４４５、ｆｏｕｎｄ  ８３３．０３４９４．
【０１５６】
【表６−１】
2019504837.tif 000044
【０１５７】
【表６−２】
2019504837.tif 000045
【０１５８】
【表６−３】
2019504837.tif 000046
【０１５９】
【表６−４】
2019504837.tif 000047
【０１６０】
＜実施例２＞
新しいキャップ類似体の特性
試験１．ＤｃｐＳ酵素による分解に対する類似体の感受性試験
この試験の目標は、新しい５’−チオリン酸塩キャップ類似体が、ヒトＤｃｐＳ酵素（ｈＤｃｐＳ）によって加水分解されるかどうかを調べることであった。ＤｃｐＳ酵素をコードする組換えヒトタンパク質がかつて記述されたように発現された（Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｌｅｗｄｏｒｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。新しい類似体のｈＤｃｐＳ加水分解への感受性は、２００ｍＭ  ＫＣｌおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で試験される。反応混合物は、４００μｌの緩衝液中に、試験したキャップアナログ（２０μＭ）およびｈＤｃｐＳ酵素（１００ｎＭ）を含む。適切な間隔で、１００μｌのサンプルを反応混合物から集める。サンプルを２．５分の間９８度でインキュベートし、次いで０度まで冷却し、一般的な情報に記載される条件下でＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。試験では、商業的に入手可能なＤｃｐＳ阻害剤も試験し、化合物ＲＧ３０３９（０００番）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄａ．ｏｒｇ／ｑｕｅｓｔ／ｆｄａ−ａｐｐｒｏｖｅｓ−ｐｈａｓｅ−１−ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｔｒｉａｌ−ｒｇ３０３９−ｓｍａ）、ＧｐｐＳＧ（１９番）、ＧｐｐｐＳＧ（２０番）を試験し、その上、ｍ７ＧｐｐｐＧ（０番）およびｍ７Ｇｐｐ（００番）を対照として試験した。
得られた典型的な結果は、図５と表５に示される。
【０１６１】
試験２．選択された阻害剤についてのＩＣ５０判定
試験の目的は、所与の阻害剤が特定の条件下で最大値の５０％までＤｃｐＳ活性を阻害する濃度を判定することであった。この試験および試験１での緩衝液は同一である。同時に１０個の混合反応物を調製し、それらの各々は、ｍ７ＧＭＰＦ（６０μＭ）、ｈＤｃｐＳ酵素（５０ｎＭ）、および試験化合物を２００μｌの緩衝液中０〜５０μＭの範囲の濃度で含有していた。適切な時間の後、基質の３０％が阻害剤なしの生成物に変換されたとき、１００μｌのＡＣＮと混合することによって反応を停止させた。分析のために２５μｌのサンプルを採取し、続いてＤＭＳＯ中濃度２．５μＭのＴＢＤＳ−フルオレセイン溶液９０μｌと混合し、６０分間インキュベートした。次に、１００μｌの２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ＝７．０がサンプルに加えられ、一般的な情報に述べられるように蛍光を測定した。この結果に基づき、阻害剤濃度対蛍光の相関関係をプロットし、理論曲線をデータに当てはめることによってＩＣ５０値を決定した。得られた結果は、表５および図５に示される。
【０１６２】
【表７】
2019504837.tif 000048
【０１６３】
試験３．類似体３４番（ｍ７ＧＳｐｐｓｐＳＧ  Ｄ２）を備えた複合体中のヒトＤｃｐＳ酵素（ΔＮ３７ｈＤｃｐＳ）の構造の判定
この試験の目的は、ヒトＤｃｐＳ酵素を備えた類似体３４番の相互作用のメカニズムを検討することであった。先に記載したようにＮ末端で切断された組換えヒトＤｃｐＳ酵素（ΔＮ３７−残基Ａｌａ３８からＳｅｒ３３７）を得た（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。液滴蒸気拡散（ｄｒｏｐ  ｖａｐｏｒ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）による結晶化を、０．１Ｍ  類似体３４および７．３ｍｇ／ｍＬのＤｃｐＳ酵素（結晶化セットアップの前に氷上で１５分間インキュベートした）および０．２μＬのリザーバ溶液を含む０．２μＬのサンプルを用いて行った。約１週間後に、２９％ＰＥＧ４０００および０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６を含む混合物中に複合体の結晶が現れた。結晶を含む液滴に、リザーバ溶液とグリセロール（１：１  ｖ／ｖ）との混合物を加え、次いで結晶を採取し、液体窒素中で急速凍結させた。回折データ（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ）を、Ｄｅｃｔｒｉｓ  ＰＩＬＡＴＵＳ  ６Ｍ検出器を用いてシンクロトロンソース（Ｂｅａｍｌｉｎｅ  １４．１、Ｂｅｓｓｙ  ＩＩ、Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ−Ｚｅｎｔｒｕｍ  Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１００Ｋで収集し、ＸＤＳソフトウェア（Ｋａｂｓｃｈ  ２０１０）を用いてデータを処理した。構造を、検索モデルとして、ＤＧ１５７４９３阻害剤（ｐｄｂ：３ＢＬ９）（Ｓｉｎｇｈ、Ｓａｌｃｉｕｓら  ２００８）に結合したＤｃｐＳの構造を有するＰｈａｓｅｒソフトウェア（ＭｃＣｏｙ、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）を用いる分子交換（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によって解明した（ｓｏｌｖｅｄ）。リガンドモデルおよびディクショナリを、ＰｒｏＤＲＧ（Ｓｃｈｕｔｔｅｌｋｏｐｆ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ａａｌｔｅｎ  ２００４）を用いて生成した。モデル構築およびリガンド着装を、Ｃｏｏｔソフトウェア（Ｅｍｓｌｅｙ＆Ｃｏｗｔａｎ  ２００４）で行った。構造をｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ（Ａｄａｍｓ、Ａｆｏｎｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）を用いて精密化した。
【０１６４】
試験４．Ｄｃｐ１／２酵素による分解に対する、５’末端でキャップ類似体を含む短いＲＮＡ分子の感受性の試験
この試験の目的は、選択された５’−ホスホチオエートキャップ類似体の５’末端への取り込みが、Ｄｃｐ１／２デキャッピング酵素活性に対するこのように調製された転写物の感受性に影響を及ぼし得るかどうかを調べることであった。ヘテロ二量体Ｄｃｐ１／２の形態のシゾサッカロミセス・ポンベ組換えタンパク質を、以前に記載されたようにして得た（Ｆｌｏｏｒ、Ｊｏｎｅｓら、２０１０）。このアッセイで利用された転写物は、ＲＮＡ  ＳＰ６ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いるインビトロ転写により得られた。アニーリングされたオリゴヌクレオチド：ＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＴＡＧＣＣＧＡＴＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：１）およびＴＧＡＴＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＴＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）をインビトロ転写において鋳型として使用し、ＳＰ６ポリメラーゼ（ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３））についてのプロモーター配列を含むオリゴヌクレオチドは、ＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＧＣＡＵＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＡＵＡＧＣＣＧＡＵＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の配列を有する３５ｎｔ長のＲＮＡを得ることができるが、５’末端キャップＲＮＡ（５’  ｅｎｄ  ｃａｐｐｅｄ  ＲＮＡ）は３６ｎｔ長である。典型的なインビトロ転写反応を容量２０μｌで行い、４０℃で２時間インキュベートし、以下を含有した：１Ｕ  ＳＰ６ポリメラーゼ、１Ｕ  ＲｉｂｏＬｏｃｋ  ＲＮａｓｅ  ＩｎｈｉｂｉｔｏＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５ｍＭ  ＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ、０．１２５ｍＭ  ＧＴＰ、１．２５ｍＭジヌクレオチドキャップ類似体、および、０．１μＭ鋳型。２時間のインキュベーションに続き、１Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ）を反応混合物に加え、３７℃で３０分間インキュベーションを続け、その後、ＥＤＴＡを最終濃度２５ｍＭまで加えた。得られたＲＮＡを、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−２５（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製した。次いで、変性した１５％ポリアクリルアミドゲル上で合成ＲＮＡの品質を測定した。ＲＮＡの濃度を順に分光測光法で評価した。このようにして得られたＲＮＡは、３’末端が実質的に不均一であることを特徴とし、したがって、問題を排除するために、得られたＲＮＡを、ＤＮＡｚｙｍｅ  １０−２３（ＴＧＡＴＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＣＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５））でインキュベートし、これは２５ｎｔ長のＲＮＡを得ることにつながる。５’末端にキャップを有するＲＮＡは２６ｎｔ長であった。３’末端を切断する反応は以下の通りであった：１μＭのＲＮＡを、３７℃で１時間、５０ｍＭｍｇＣｌ２および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０を含む混合物中で１μＭのＤＮａｚｙｍｅ  １０−２３と共にインキュベートした（Ｃｏｌｅｍａｎら、２００４）。
【０１６５】
酵素試験のために、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、０．０１％のＮＰ−４０，１ｍＭのＤＴＴおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液中の３．５ｎＭのＤｃｐ１／２酵素でインキュベートした２０ｎｇの各ＲＮＡを使用した。反応は３７℃で最終容量２５μｌで行った。５Ｍの尿素、４４％のホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のブロモフェノールブルー、０．０３％のキシレンシアノ−ルの混合物を同量加えることにより、反応を０、５、１５および３０分後に停止させた。変性１５％ポリアクリルアミドゲル上で反応産物を分解し、電気泳動分離が完了した後、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｓｔｏｒｍ  ８６０  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。得られた結果の定量をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて行った。このアッセイの代表的な結果を図８、図９、および表６にも提示した。
【０１６６】
【表８】
2019504837.tif 000049
【０１６７】
試験５．ウサギ網状赤血球抽出液中のｍＲＮＡの翻訳効率に対する新しいキャップ類似体の存在の影響についての試験
この試験の目的は、翻訳効率に対するｍＲＮＡの５’末端における新規なキャップ類似体の導入の効果を調べることであった。この目的のために、ｍＲＮＡをコードし、５’末端におけるキャップ構造が異なる、一連のウミシイタケルシフェラーゼを調製した。この試験に使用した転写物を、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応によって得た。インビトロ転写のための鋳型として、ＰＣＲ生成物を使用し、プライマーＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）およびＧＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）  およびｈＲＬｕｃ−ｐＲＮＡ２（Ａ）１２８  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）を用いて調製した。このように行なわれたＰＣＲ反応は、ウミシイタケルシフェラーゼをコードする配列の上流のＳＰ６ポリメラーゼのためのプロモーター配列を導入することを可能にした。転写反応自体は、上記（試験４）の短いＲＮＡ合成と同様であった。反応は４０℃で２０μｌ中で２時間行われ、以下を含有した：１Ｕ  ＳＰ６ポリメラーゼ、１Ｕ  ＲｉｂｏＬｏｃｋ  ＲＮａｓｅ  ＩｎｈｉｂｉｔｏＲ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５ｍＭ  ＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ、０．１２５ｍＭ  ＧＴＰ、１．２５ｍＭジヌクレオチドキャップ類似体、および１００μｇの鋳型。２時間のインキュベーションに続き、１Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｂｉｏｎ）を加え、インキュベーションを３７℃で３０分間続け、その後ＥＤＴＡを最終濃度２５ｍＭまで加えた。得られたｍＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＸＳ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。合成されたＲＮＡの品質を、変性１５％ポリアクリルアミドゲルで調べた。ＲＮＡ濃度は分光測光法で決定された。
【０１６８】
インビトロ翻訳反応を、キャップ依存性翻訳のために決定された条件でウサギ網状赤血球抽出液（ＲＲＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ）において行なった（Ｒｙｄｚｉｋら、２００９年）。典型的な反応混合物（１０μｌ）は、４０％のＲＲＬ溶解物、０．０１ｍＭのアミノ酸の混合物（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１７０ｍＭの酢酸カリウム、５’末端に適切なキャップ類似体を有するｍＲＮＡをコードするウミシイタケルシフェラーゼを含み、混合物を３７℃で１時間インキュベートする。実験では、４種類の濃度のｍＲＮＡ：０．１ｎｇ／μｌ、０．２５ｎｇ／μｌ、０．５ｎｇ／μｌ、０．７５ｎｇ／μｌを使用した。合成したルシフェラーゼの活性を、マイクロプレートリーダーＳｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１（ＢｉｏＴｅｋ）中のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。得られた結果をＯｒｉｇｉｎ（Ｇａｍｂｉｔ）ソフトウェアで分析し、理論曲線を実験データに当てはめ、ここにおいて、得られた曲線の傾きは翻訳効率を表す。代表的なデータを図１０に示し、一方、生物学的な三通りについて得られた平均翻訳効率を表６に示す。
【０１６９】
試験６．ＨｅＬａ細胞におけるｍＲＮＡの翻訳効率に対する新しいキャップ類似体の存在の効果についての試験
ヒト子宮頚癌ＨｅＬａ細胞を、３７℃および５％ＣＯ２において、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）と、最終濃度２ｍＭのＬ−グルタミンと、を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。計画された実験の１日前に、抗生物質を含まない１００μｌの培地に懸濁した１０４個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞トランスフェクションは以下のとおりであり、０．３μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１μｇのｍＲＮＡおよび１０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を各ウェルに添加した。トランスフェクションをインキュベータ中で１時間行った。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、抗生物質のない新鮮な培地で補充した。トランスフェクションを始めてから２、３、４．５、６．５、１０．５および２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、溶解し、および、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１マイクロプレートリーダーを用いるルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。例示的なデータを図１１に示す。
【０１７０】
ホタルルシフェラーゼをコードし、β−グロビン３’ＵＴＲの２つの反復と３’末端に１２８つのアデニンのポリ（Ａ）尾部とを有する、ｍＲＮＡをトランスフェクションに用いた。５’末端に異なるキャップ類似体を含む、このｍＲＮＡは、インビトロ転写によって得られた。ＡａｒＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）で消化したｐＪＥＴ＿ｌｕｃ＿１２８Ａプラスミドを合成のための鋳型として用いた。典型的なインビトロ転写反応を、４０℃で２０μｌの容量で２時間実施し、以下を含有した：１ＵのＳＰ６ポリメラーゼ、１ＵのＲｉｂｏＬｏｃｋ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５ｍＭのＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ、０．１２５ｍＭのＧＴＰ、１．２５ｍＭのジヌクレオチドキャップ類似体、および０．１μｇの鋳型。ｍＲＮＡ調製の続きの工程は、ｍＲＮＡをコードするウミシイタケルシフェラーゼの場合の上記の通り（試験５）。さらに、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ＸＳカラムを使用してｍＲＮＡを精製した後、２μｇのグリコーゲンおよび酢酸ナトリウムの存在下で転写物をエタノール沈殿させ、次いで脱イオン水に溶解した。
【０１７１】
＜参考文献一覧＞
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Ａｄａｍｓ，  Ｐ．，  Ｐ．  Ａｆｏｎｉｎｅ，  Ｇ．  Ｂｕｎｋｏｃｚｉ，  Ｖ．  Ｃｈｅｎ，  Ｉ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｎ．  Ｅｃｈｏｌｓ，  Ｊ．  Ｈｅａｄｄ，  Ｌ．  Ｈｕｎｇ，  Ｇ．  Ｋａｐｒａｌ，  Ｒ．  Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，  Ａ．  ＭｃＣｏｙ，  Ｎ．  Ｍｏｒｉａｒｔｙ，  Ｒ．  Ｏｅｆｆｎｅｒ，  Ｒ．  Ｒｅａｄ，  Ｄ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｊ．  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｔ．  Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｚｗａｒｔ（２０１０）．  ”ＰＨＥＮＩＸ：  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．”  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６：  ２１３−２２１．
Ａｋａｇｉ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｌ．  Ｌ．  Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９６２）．  ”ＳＴＵＤＩＥＳ  ＯＮ  ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＩＣ  ＳＵＬＦＡＴＥ−ＲＥＤＵＣＩＮＧ  ＢＡＣＴＥＲＩＡ  ＩＩＩ．  ：  Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ．”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ８４（６）：  １１９４−１２０１．
Ａｒａｋａｗａ，  Ｈ．，  Ｍ．  Ｓｈｉｏｋａｗａ，  Ｏ．  Ｉｍａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｍａｅｄａ（２００３）．  ”Ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ−３’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−５’−ｐｈｏｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１４（２）：  ２０６−２１１．
Ｂａｉｌ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ（２００８）．  ”ＤｃｐＳ，  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｃａｐ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ？”  Ｒｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５（４）：  ２１６−２１９．
Ｂａｒｎｅｓ，  Ｓ．，  Ｒ．  Ｗａｌｄｒｏｐ  ａｎｄ  Ａ．  Ｓ．  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ（１９８３）．  ”Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｂｕｔａｎｏｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｅｓｔｅｒｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３３（２）：  ４７０−４７５．
Ｂｕｔｃｈｂａｃｈ，  Ｍ．  Ｅ．  Ｒ．，  Ｊ．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｍ．  ｐｏｒｓｔｅｉｎｓｄｏｔｔｉｒ，  Ｌ．  Ｓａｉｅｖａ，  Ｅ．  Ｓｌｏｍｉｎｓｋｉ，  Ｊ．  Ｔｈｕｒｍｏｎｄ，  Ｔ．  Ａｎｄｒｅｓｓｏｎ，  Ｊ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｄ．  Ｅｄｗａｒｄｓ，  Ｌ．  Ｒ．  Ｓｉｍａｒｄ，  Ｌ．  Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉ，  Ｊ．  Ｊａｒｅｃｋｉ，  Ａ．  Ｈ．  Ｍ．  Ｂｕｒｇｈｅｓ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｅ．  Ｇｕｒｎｅｙ（２０１０）．  ”Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ２，４−ｄｉａｍｉｎｏｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ＳＭＮ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ．”  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９（３）：  ４５４−４６７．
Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｗ．  Ｆｉｅｒｓ（１９８１）．  ”Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｒｎａ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ＩＩ  ｉｎ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ，  ＳＶ４０−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｏｒ  ｎｏｎｉｎｆｅｃｔｅｄ，  ＣＶ１  ｃｅｌｌｓ  −  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｏｆ  ＳＶ４０  ｌａｔｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９（２）：  ２１５−２３６．
Ｅｍｓｌｅｙ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｋ．  Ｃｏｗｔａｎ（２００４）．  ”Ｃｏｏｔ：  ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ．”  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６０：  ２１２６−２１３２．
Ｆｌｏｏｒ，  Ｓ．，  Ｂ．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｇ．  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｇｒｏｓｓ（２０１０）．  ”Ａ  ｓｐｌｉｔ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｃａｐ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄｃｐ２  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７（９）：  １０９６−Ｕ１０９９．
Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，  Ｅ．，  Ｍ．  Ｋａｌｅｋ，  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ（２００６）．  ”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１（４）：  １８５７−１８６７．
Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，  Ｅ．，  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ｊ．  Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ（２００７）．  ”Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｒｎａ−ａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｎａ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３（１０）：  １７４５−１７５５．
Ｇｕ，  Ｍ．  Ｇ．，  Ｃ．  Ｆａｂｒｅｇａ，  Ｓ．  Ｗ．  Ｌｉｕ，  Ｈ．  Ｄ．  Ｌｉｕ，  Ｍ．  Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｄ．  Ｌｉｍａ（２００４）．  ”Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １４（１）：  ６７−８０．
Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ｊ．，  Ｔ．  Ｆｏｗｌｅｒ，  Ｊ．  Ｚｕｂｅｒｅｋ，  Ｊ．  Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，  Ｍ．  Ｌｅｗｄｏｒｏｗｉｃｚ，  Ａ．  Ｎｉｅｄｚｗｉｅｃｋａ，  Ｒ．  Ｓｔｏｌａｒｓｋｉ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ（２００３）．  ”Ｎｏｖｅｌ  ”ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ”  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．”  Ｒｎａ−ａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｎａ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ９（９）：  １１０８−１１２２．
Ｋａｂｓｃｈ，  Ｗ．（２０１０）．  ”ＸＤＳ．”  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６：  １２５−１３２．
Ｋａｌｅｋ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ｚ．  Ｍ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｅ．  Ｂｏｊａｒｓｋａ，  Ｊ．  Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，  Ｒ．  Ｓｔｏｌａｒｓｋｉ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ（２００６）．  ”Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ５’  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ＤｃｐＳ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ．”  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４（９）：  ３２２３−３２３０．
Ｋａｌｅｋ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ｅ．  Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，  Ｊ．  Ｚｕｂｅｒｅｋ，  Ｅ．  Ｂｏｊａｒｓｋａ，  Ｌ．  Ｓ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｊ．  Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，  Ｒ．  Ｓｔｏｌａｒｓｋｉ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｄａｖｉｓ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ（２００５）．  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｍＲＮＡ  ５’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．”  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆ａｍｐ；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２４（５−７）：  ６１５−６２１．
Ｋｏｎａｒｓｋａ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｒ．  Ａ．  Ｐａｄｇｅｔｔ  ａｎｄ  Ｐ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ（１９８４）．  ”Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｓｐｌｉｃｉｎｇ  Ｉｎｖｉｔｒｏ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ−Ｒｎａ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．”  Ｃｅｌｌ  ３８（３）：  ７３１−７３６．
Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｌｅｗｄｏｒｏｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｚｕｂｅｒｅｋ，  Ｅ．  Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，  Ｅ．  Ｂｏｊａｒｓｋａ，  Ｊ．  Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ（２００８）．  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｉｇｈｔｌｙ  ｔｏ  ｅＩＦ４Ｅ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＤｃｐＳ．”  ＲＮＡ−ａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １４（６）：  １１１９−１１３１．
Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｊ．，  Ａ．  Ｗｙｐｉｊｅｗｓｋａ  ｄｅｌ  Ｎｏｇａｌ，  Ｚ．  Ｍ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｂｕｃｋ，  Ｃ．  Ｎｉｃｏｌａ，  Ａ．  Ｎ．  Ｋｕｈｎ，  Ｍ．  Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｚｕｂｅｒｅｋ，  Ｍ．  Ｓｔｒｅｎｋｏｗｓｋａ，  Ｍ．  Ｚｉｅｍｎｉａｋ，  Ｍ．  Ｍａｃｉｅｊｃｚｙｋ，  Ｅ．  Ｂｏｊａｒｓｋａ，  Ｒ．  Ｅ．  Ｒｈｏａｄｓ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｕ．  Ｓａｈｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ（２０１４）．  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ：  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２（１６）：  １０２４５−１０２６４．
Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｚｉｅｍｎｉａｋ，  Ｍ．  Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｚｕｂｅｒｋ，  Ｍ．  Ｓｔｒｅｎｋｏｗｓｋａ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ（２００８）．  ”Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｍ７ＧＴＰ：  Ｓｔｒｏｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．”  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  １０：  ４８７−４９０．
Ｋｕｈｎ，  Ａ．  Ｎ．，  Ｍ．  Ｄｉｋｅｎ，  Ｓ．  Ｋｒｅｉｔｅｒ，  Ａ．  Ｓｅｌｍｉ，  Ｊ．  Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｃ．  Ｈｕｂｅｒ，  Ｏ．  Ｔｕｒｅｃｉ  ａｎｄ  Ｕ．  Ｓａｈｉｎ（２０１０）．  ”Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７（８）：  ９６１−９７１．
Ｌｙｋｋｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｊ．（２００２）．  ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈＵｐｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｃａｙ．”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２（２３）：  ８１１４−８１２１．
Ｍｃｃｏｙ，  Ａ．，  Ｒ．  Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，  Ｐ．  Ａｄａｍｓ，  Ｍ．  Ｗｉｎｎ，  Ｌ．  Ｓｔｏｒｏｎｉ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｒｅａｄ（２００７）．  ”Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ４０：  ６５８−６７４．
Ｍｉｌｄｖａｎ，  Ａ．，  Ｚ．  Ｘｉａ，  Ｈ．  Ａｚｕｒｍｅｎｄｉ，  Ｖ．  Ｓａｒａｓｗａｔ，  Ｐ．  Ｌｅｇｌｅｒ，  Ｍ．  Ｍａｓｓｉａｈ，  Ｓ．  Ｇａｂｅｌｌｉ，  Ｍ．  Ｂｉａｎｃｈｅｔ，  Ｌ．  Ｋａｎｇ  ａｎｄ  Ｌ．  Ａｍｚｅｌ（２００５）．  ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｎｕｄｉｘ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．”  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ４３３（１）：  １２９−１４３．
Ｒｙｄｚｉｋ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｍ．  Ｌｕｋａｓｚｅｗｉｃｚ，  Ｊ．  Ｚｕｂｅｒｅｋ，  Ｊ．  Ｋｏｗａｌｓｋａ，  Ｚ．  Ｍ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ（２００９）．  ”Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５’，５’  ｂｒｉｄｇｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓ（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”  Ｏｒｇａｎｉｃ  ＆ａｍｐ；  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７（２２）：  ４７６３−４７７６．
Ｓａｈｉｎ，  Ｕ．，  Ｋ．  Ｋａｒｉｋｏ  ａｎｄ  Ｏ．  Ｔｕｒｅｃｉ（２０１４）．  ”ｍＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  −  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １３（１０）：  ７５９−７８０．
Ｓｃｈｕｔｔｅｌｋｏｐｆ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｄ．  ｖａｎ  Ａａｌｔｅｎ（２００４）．  ”ＰＲＯＤＲＧ：  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．”  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６０：  １３５５−１３６３．
Ｓｈｅｎ，  Ｖ．，  Ｈ．  Ｄ．  Ｌｉｕ，  Ｓ．  Ｗ．  Ｌｉｕ，  Ｘ．  Ｆ．  Ｊｉａｏ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ（２００８）．  ”ＤｃｐＳ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｄｅｃａｐｐｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃａｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．”  Ｒｎａ−ａ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｎａ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １４（６）：  １１３２−１１４２．
Ｓｉｎｇｈ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｓａｌｃｉｕｓ，  Ｓ．  Ｗ．  Ｌｉｕ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｓｔａｋｅｒ，  Ｒ．  Ｍｉｓｈｒａ，  Ｊ．  Ｔｈｕｒｍｏｎｄ，  Ｇ．  Ｍｉｃｈａｕｄ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｍａｔｔｏｏｎ，  Ｊ．  Ｐｒｉｎｔｅｎ，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｂｊｏｒｎｓｓｏｎ，  Ｂ．  Ａ．  Ｐｏｌｌｏｋ，  Ｍ．  Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ，  Ｌ．  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｊ．  Ｊａｒｅｃｋｉ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｅ．  Ｇｕｒｎｅｙ（２００８）．  ”ＤｃｐＳ  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ａｔｒｏｐｈｙ．”  Ａｃｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３（１１）：  ７１１−７２２．
Ｖａｎ  Ｍｅｅｒｂｅｋｅ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｒ．  Ｍ．  Ｇｉｂｂｓ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｐｌａｓｔｅｒｅｒ，  Ｗ．  Ｍｉａｏ，  Ｚ．  Ｆｅｎｇ，  Ｍ．−Ｙ．  Ｌｉｎ，  Ａ．  Ａ．  Ｒｕｃｋｉ，  Ｃ．  Ｄ．  Ｗｅｅ，  Ｂ．  Ｘｉａ，  Ｓ．  Ｓｈａｒｍａ，  Ｖ．  Ｊａｃｑｕｅｓ，  Ｄ．  Ｋ．  Ｌｉ，  Ｌ．  Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｒｕｓｃｈｅ，  Ｃ．−Ｐ．  Ｋｏ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｊ．  ＳｕｍｎｅＲ（２０１３）．  ”Ｔｈｅ  ＤｃｐＳ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＲＧ３０３９  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｏｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＳＭＡ  ｍｉｃｅ．”  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２（２０）：  ４０７４−４０８３．
Ｗａｒｒｅｎ，  Ｌ．，  Ｐ．  Ｄ．  Ｍａｎｏｓ，  Ｔ．  Ａｈｆｅｌｄｔ，  Ｙ．  Ｈ．  Ｌｏｈ，  Ｈ．  Ｌｉ，  Ｆ．  Ｌａｕ，  Ｗ．  Ｅｂｉｎａ，  Ｐ．  Ｋ．  Ｍａｎｄａｌ，  Ｚ．  Ｄ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ａ．  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，  Ｇ．  Ｑ．  Ｄａｌｅｙ，  Ａ．  Ｓ．  Ｂｒａｃｋ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｃ．  Ｃｏｗａｎ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｊ．  Ｒｏｓｓｉ（２０１０）．  ”Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ．”  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ７（５）：  ６１８−６３０．
Ｚｉｅｍｎｉａｋ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｓｔｒｅｎｋｏｗｓｋａ，  Ｊ．  Ｋｏｗａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ（２０１３）．  ”Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ．”  Ｆｕｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５（１０）：  １１４１−１１７２．
Ｚｕｂｅｒｅｋ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，  Ａ．  Ｎｉｅｄｚｗｉｅｃｋａ，  Ｊ．  Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，  Ａ．  Ｗｙｓｌｏｕｃｈ−Ｃｉｅｓｚｙｎｓｋａ，  Ｒ．  Ｓｔｏｌａｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ（２００３）．  ”Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｎ  ｍＲＮＡ  ５’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｎ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｅ．”  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆ａｍｐ；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２２（５−８）：  １７０７−１７１０．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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