(57)【要約】微粒子を含有する流体のストリームを集束させるためのマイクロ流体チップは、微粒子を含有する流体のストリームを受けるように構成されたサンプルマイクロ流体チャネルと、多角形断面領域を有し、誘導流体のストリームを受けるように構成された誘導マイクロ流体チャネルと、誘導マイクロ流体チャネルの１つまたは複数の側面の一部のみに沿った斜角で、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導１０マイクロ流体チャネルを合流することによって形成された多角形断面部分、および１つまたは複数のセンサを有する、共通マイクロ流体チャネル内に配置された検出ゾーンを有する共通マイクロ流体チャネルとを備える。サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルの合流は、共通マイクロ流体チャネルの角または側面に隣接する共通マイクロ流体チャネル１５内に非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成され、１つまたは複数のセンサは、共通チャネル内の微粒子の集束されたビームの特性を感知するように構成される。
2019518971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を含有する流体のストリームを集束させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
前記微粒子を含有する流体のストリームを受けるように構成されたサンプルマイクロ流体チャネルと、
多角形断面領域を有し、誘導流体のストリームを受けるように構成された誘導マイクロ流体チャネルと、
前記誘導マイクロ流体チャネルの１つまたは複数の側面の一部のみに沿った斜角で、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルを合流することによって形成された多角形断面を有する共通マイクロ流体チャネルと、
１つまたは複数のセンサを有する、前記共通マイクロ流体チャネル内に配置された検出ゾーンと
を備え、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記共通マイクロ流体チャネルの角または側面に隣接する前記共有マイクロ流体チャネル内に非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成され、前記１つまたは複数のセンサが、前記共通チャネル内の前記微粒子の集束されたビームの特性を感知するように構成された、マイクロ流体チップ。
【請求項２】
前記サンプルマイクロ流体チャネルが、前記誘導マイクロ流体チャネルの１つまたは２つの隣接する側面の一部のみに沿って前記誘導マイクロ流体チャネルと合流する請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項３】
前記サンプルマイクロ流体チャネルが、前記誘導マイクロ流体チャネルの角に沿って前記誘導マイクロ流体チャネルと合流する請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項４】
前記サンプルチャネルが多角形断面領域を有する請求項１から３のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記サンプルチャネルが三角形または矩形の断面領域を有する請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項６】
前記サンプルチャネル、誘導チャネル、および共通チャネルが、矩形の断面領域を有する請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項７】
注入の点から前記検出ゾーンまでの前記共通チャネル内の流体のラインに従うことによって、前記共通チャネル内の流体力学的に有利な位置となる前記共通チャネルの前記断面内の点の近くに前記微粒子を含有する流体のストリームが注入されるようにマイクロ流体チャネルが構成された請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項８】
前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記共通マイクロ流体チャネルの角または側面に隣接し、その断面の中心から遠位の前記共有マイクロ流体チャネル内に配置された微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成された請求項１から７のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項９】
前記誘導マイクロ流体チャネルが前記サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも大きい断面積を有する請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１０】
前記誘導マイクロ流体チャネルおよびサンプルマイクロ流体チャネルが異なるアスペクト比を有する請求項１から９のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１１】
前記検出ゾーンの下流の前記共通マイクロ流体チャネル内に配置され、前記少なくとも１つのセンサによって検出された個々の微粒子に対応する前記微粒子の集束されたストリームの光学的特性または電気的特性の変化に応答して前記ストリーム内の前記個々の微粒子を変位させるために前記共通チャネル内の前記微粒子の集束されたビームに力を加えるように構成された力発生器を備える分離ゾーンを含む請求項１から１０のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１２】
前記１つまたは複数のセンサが、ＡＣインピーダンスまたはＤＣインピーダンスの変化を測定するように構成された少なくとも１対の電極を含む請求項１から１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１３】
前記少なくとも１対の電極が、励起電極と検出電極との間を通過する前記微粒子の集束されたビーム内の単一の粒子から生じる前記共通マイクロ流体チャネル内のＡＣ電気インピーダンスまたはＤＣ電気インピーダンスの変化を感知するように構成された前記励起電極と前記検出電極とを備える請求項１２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１４】
前記微粒子が異方性であり、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記異方性微粒子が優先的な共通の整列を有する異方性粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成された請求項１から１３のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１５】
前記異方性微粒子の整列の方向、すなわち円盤状微粒子の場合には短軸、細長い異方性微粒子の場合には長軸が、前記微粒子を含有する流体のストリームと前記誘導流体のストリームとを分離する濃度勾配の平面に沿って配置される請求項１４に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１６】
前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記１つまたは複数のセンサの検出の平面に沿って前記微粒子が整列する微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成された請求項１４または１５に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１７】
前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記微粒子が一列縦隊で前記検出ゾーンを通過する微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成された請求項１から１６のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のセンサが、前記微粒子の集束されたビームの前記位置に対応する前記共通チャネルの前記断面内の集束点において感知するように構成された請求項１から１７のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項１９】
前記マイクロ流体チャネルが、前記サンプルストリームと前記誘導ストリームの一方または両方が細長い断面を有する流体の複合ストリームを提供するように構成された請求項１から１８のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２０】
前記誘導マイクロ流体チャネルの断面積が前記サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも少なくとも２倍大きい請求項１から１９のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２１】
前記誘導マイクロ流体チャネルの断面積が前記サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも少なくとも３倍大きい請求項１から２０のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのセンサが光センサである請求項１から２１のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２３】
前記光センサが、光源に結合された導波路と、前記導波路間を通過する前記微粒子の集束されたビームに対応する光信号の変化を検出するように構成された光検出器に結合された導波路とを含む請求項２２に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のセンサが、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流される点から少なくとも１００μｍ遠位に配置された請求項１から２３のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２５】
前記１つまたは複数のセンサが、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流される点から少なくとも４００μｍ遠位に配置された請求項１から２４のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２６】
前記１つまたは複数のセンサが、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流される点から５０００μｍ未満遠位に配置された請求項１から２５のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２７】
前記１つまたは複数のセンサが、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流される点から３０００μｍ未満遠位に配置された請求項１から２６のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２８】
前記共通チャネル内の前記微粒子の集束されたビームが、前記共通チャネルの前記断面内の第１の流体力学的に有利な位置に向けて、前記共通チャネルの前記断面内の第２の流体力学的に有利な位置から離れるように誘導され、前記共通チャネルの前記断面内の前記第１の流体力学的に有利な位置が前記第２の流体力学的に有利な位置よりも前記励起電極に近い請求項１２から２７のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップ。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップと、サンプル流体供給モジュールおよび誘導流体供給モジュールとを備える装置。
【請求項３０】
前記流体供給モジュールが、前記サンプル流体の流量よりも大きい流量を有する誘導流体を提供するように構成された請求項２９に記載の装置。
【請求項３１】
毎分０．１〜１００μＬの前記微粒子流体のサンプルストリームの流量を提供するように構成された請求項３０に記載の装置。
【請求項３２】
毎分１〜１０００μＬの前記流体の誘導ストリームの流量を提供するように構成された請求項３０または３１に記載の装置。
【請求項３３】
前記流体供給モジュールが、層流において前記流体を供給するように構成された請求項２８から３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
電気供給モジュールを含む請求項２８から３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
前記１つまたは複数のセンサが、インピーダンスの変化を検出するように構成された少なくとも１対の電極を含み、前記電気供給モジュールが、前記少なくとも１対の電極の前記励起電極に、１００ｋＨｚから１００ＭＨｚの周波数範囲内のＡＣ電圧で付勢するように構成された請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
請求項１から２８のいずれか一項に記載のマイクロ流体チップを用いる微粒子を含有する流体のストリームを集束させるオンチップ方法であって、前記方法が、
前記サンプルマイクロ流体チャネルを介して微粒子を含有する流体をポンピングするステップと、
前記異方性の微粒子を含有する流体の流量よりも高い流量で誘導流体を前記誘導マイクロ流体チャネルに同時にポンピングするステップであって、それによって、前記異方性の微粒子を含有する流体および誘導流体が、前記共通マイクロ流体チャネルの中心から離れて配置された流体力学的に有利な位置において前記共通マイクロ流体チャネル内に配置された微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを形成するように合流する、ステップと、
前記１つまたは複数のセンサを用いて前記複合流体ストリーム内の前記粒子を分析するステップと
を備えるオンチップ方法。
【請求項３７】
前記分析ステップが、ＡＣインピーダンス分光法、蛍光検出、または光散乱を用いる請求項３６に記載のオンチップ方法。
【請求項３８】
前記分析ステップが、インピーダンス分光法を用いて、前記励起電極と前記検出電極との間を通過する前記微粒子の集束されたビーム内の単一の粒子から生じる前記共通マイクロ流体チャネル内の電気インピーダンスの変化を検出する請求項３７に記載のオンチップ方法。
【請求項３９】
前記マイクロ流体チップが、前記検出ゾーンの下流の前記共通マイクロ流体チャネル内に配置され、前記少なくとも１つのセンサによって検出された個々の微粒子に対応する前記微粒子の集束されたストリームの光学的特性または電気的特性の変化に応答して前記ストリーム内の前記個々の微粒子を変位させるために前記共通チャネル内の前記微粒子の集束されたビームに力を加えるように構成された力発生器を備える分離ゾーンを含み、前記方法が、前記力発生器を使用して、前記複合流体ストリーム内の異方性粒子を微粒子の２つの異なる集団へオンチップ分離するステップを含む請求項３６から３８のいずれか一項に記載のオンチップ方法。
【請求項４０】
前記微粒子が異方性である請求項３６から３９のいずれか一項に記載のオンチップ方法。
【請求項４１】
前記異方性微粒子が精子細胞であり、前記方法が、性別に従って精子細胞を分離する方法である請求項４０に記載のオンチップ方法。
【請求項４２】
０．１から２００ＭＨｚの範囲内の１つまたは複数の異なる周波数において前記励起電極を励起し、同じ周波数で前記検出電極において電気信号の変化を検出するステップを含む請求項３８から４１のいずれか一項に記載のオンチップ方法。
【請求項４３】
微粒子を含有する流体のストリームを集束させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
前記微粒子を含有する流体のストリームを受けるように構成されたサンプルマイクロ流体チャネルと、
誘導流体のストリームを受けるように構成された多角形断面領域を有する誘導マイクロ流体チャネルと、
斜角で前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルを合流することによって形成された多角形断面領域を有する共通マイクロ流体チャネルと、
１つまたは複数のセンサを有する前記共通マイクロ流体チャネル内に配置された検出ゾーンと
を備え、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記共通マイクロ流体チャネルの層流内の前記微粒子に作用する力のバランスによって前記微粒子が誘導される前記共通マイクロ流体チャネル内の流体力学的に有利な位置において非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含有する複合流体ストリームを提供するように構成された、マイクロ流体チップ。
【請求項４４】
微粒子を含有する流体のストリームを集束させるためのマイクロ流体チップであって、前記チップが、
前記微粒子を含有する流体のストリームを受けるように構成されたサンプルマイクロ流体チャネルと、
誘導流体のストリームを受けるように構成された多角形断面領域を有する誘導マイクロ流体チャネルと、
斜角で前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルを合流することによって形成された多角形断面領域を有する共通マイクロ流体チャネルであって、前記誘導マイクロ流体チャネルおよび前記サンプルマイクロ流体チャネルの前記合流が、前記誘導マイクロ流体チャネルの角のうちの１つの近く、または前記誘導流体を搬送する前記チャネルの１つの側面の中心の近くに前記微粒子を含有する流体を注入するように構成された、共通マイクロ流体チャネルと、
１つまたは複数のセンサを有する前記共通マイクロ流体チャネル内に配置された検出ゾーンと
を備え、前記サンプルマイクロ流体チャネルおよび前記誘導マイクロ流体チャネルの前記合流が、前記共通マイクロ流体チャネルの層流内の前記微粒子に作用する力のバランスによって前記微粒子が誘導される前記共通マイクロ流体チャネル内の流体力学的に有利な位置において非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含有する複合流体ストリームを提供するように構成された、マイクロ流体チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子を含有する流体のストリームを集束させ、オプションで、微粒子を含有する流体の集束されたストリームを分析するためのマイクロ流体チップおよび方法に関する。一態様では、マイクロ流体チップは、微粒子を含有する流体のインピーダンス分光法または光散乱に基づく分析、識別、または分離のためのものである。別の態様では、マイクロ流体チップは、細胞を含有する流体、特に細胞の異なる亜集団を含有する流体のインピーダンス分光法または光散乱または蛍光に基づく分析、識別、または分離のためのものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明の目的のために、「粒子」または「微粒子」という用語は、固体粒子、たとえば、金属、酸化物、窒化物、硫化物の粒子、ポリマー粒子、および多数の無機および有機材料の粒子、個々の粒子内の材料の混合物および複合物を含む混合粒子、ならびに様々なナノおよびマイクロ粒子およびクラスタ、ジェルのような半固体粒子を記述するために使用されることに留意されたい。この用語は、軟質粒子、たとえば、ポリスチレンビーズおよびアクリルビーズ、または実際に軟質粒子の混合物およびそれらの複合物、各粒子内にソフトマター材料および固体物質を含む混合物および複合物を説明するためにも使用される。用語は、細胞、たとえば、哺乳動物細胞および／または任意の他の細胞を記述するためにも使用される。本発明の目的のために、粒子は、その特性がそれを担持する流体の特性とは異なる含有される物体である。
【０００３】
従来のフローサイトメトリーは、トレイン内のサンプル流体内の細胞の整列と、細胞を１つずつ検出し、識別することに依存する。たとえば、細胞は、細胞が一度に１つ検出装置の集束されたビームに入るように光検出ビームを通過するトレイン内に整列され得、識別は、細胞によって変更された光信号、たとえば、光または蛍光信号の散乱に基づく。同じ手法は、粒子を含有する流体内の粒子の計数および識別の場合にも適用される。本開示では、細胞を含有する流体と粒子を含有する流体の両方を考慮し、簡潔にするために、それらを両方とも、微粒子を含有する流体と呼ぶものとする。本発明の注目の焦点は、マイクロ流体形式で測定を行うそのような検出および識別のための方法および装置である。
【０００４】
現在、従来のフローサイトメトリーでは、粒子または細胞のストリームは、検出器を１つずつ通過する細胞の均一な流れを達成するために、粒子を含有する流体のストリームを取り囲み、サンプル流を同軸に集束させるシース流体を適用することによって、ときには「フローセル」とも呼ばれる検出ゾーン内に配置される。典型的には、シースストリームの流速は、適切な集束比を達成し、光検出ベースのサイトメータに適切なサイズである直径３０〜７０マイクロメートルのサンプルストリームを得るために、サンプルストリームよりも１桁から２桁大きい。蛍光散乱フローサイトメトリーでは、流れる細胞または粒子は、検出チャネル内の集束されたレーザビームを通過し、レーザ光の散乱が測定される。光散乱の２つの方向、すなわち、粒子サイズに関する情報を含む前方光散乱、および、細胞または粒子の内部特性に関する情報を含む側方光散乱が独立して検出される。加えて、側方光散乱信号は、粒子または細胞の特定の蛍光発光帯域に関する情報を抽出するために、光フィルタリングを受ける場合がある。流体力学的集束は、すべての粒子または細胞が同じ強度のレーザ光を受け、集束されたレーザビームを均一に通過することを確実にすることによって、散乱された光信号の変動を低減するために必要であることに留意することが重要である。均一性は、集束されたレーザビーム中の細胞または粒子のトレースの均一性を意味し、これは、検出された信号の強度に影響を及ぼすからである。しばしばそうであるように粒子または細胞が円形ではない場合、均一性は、集束されたビーム方向に対するそれらの配向も指す。実際、細胞が、たとえば、円盤状である場合、光信号は、それらがより大きい領域の側（平坦面）またはより小さい領域の側（円盤の端）のどちらと対向する光ビームに面するのかに応じて変化する。
【０００５】
粒子または細胞は、次いで、特定の蛍光帯域におけるそれらのそれぞれの蛍光強度に基づいて亜集団に分割され得る。これらの亜集団は、特定の細胞受容体、細胞質、または細胞核のそれぞれの染色に対応することができる。特定の細胞特性の微小な変化によって異なる、粒子または細胞を区別することがますます重要になってきている。たとえば、細胞サイズの正確な測定は、健康な赤血球の中の異常な赤血球を検出することを可能にする。細胞の形状を区別する能力は、鎌状赤血球の検出を可能にし、異なるタイプの細菌、たとえば、棒状の大腸菌または円形のブドウ球菌の分化の検出を可能にする。細胞核の含有量の測定は、たとえば、精子細胞内のＸベアリング染色体およびＹベアリング染色体の分化を可能にする。これらのセル特性の微小な差異のそのような測定は、従来のフローサイトメトリーにおける現在の進歩を超えている。より正確な測定を妨げる主な制限は、現在の技術が、再現可能で正確な方法で検出器の前に微粒子流体内のすべての細胞または粒子を提示することができないことである。
【０００６】
近年、マイクロ流体形式で細胞フローサイトメトリーデバイスを実装することに関心が高まっている。マイクロ流体工学は、従来のフローサイトメトリー検出チャネルの構造および製造を単純で小型化して従来の散乱フローサイトメトリーを小型化し、同時にデバイス全体を使い捨てにする便利な技術プラットフォームを提供する。
【０００７】
細胞を計数し、細胞特性を評価するために、チップ上で蛍光およびインピーダンス検出を利用するマイクロ流体フローサイトメータのいくつかの例が存在する。非特許文献１［６］は、流体力学的集束を含むマイクロ流体チップ上の統合サイトメータのいくつかの構成を記載し、様々な蛍光強度を有する較正ビーズの蛍光検出を用いた実験も記載している。提供される方法は、従来のフローサイトメトリー測定値に相当する、約３％の粒子強度の測定値の低いＣＶを可能にする。さらに、著者は、従来のサイトメトリーの結果に相当する結果を有する、蛍光標識されたリンパ球亜集団の検出を実験している。
【０００８】
刊行物非特許文献２［１０］は、赤血球中の血小板の検出のための誘電体シースを用いた２次元流体力学的集束を含むインピーダンスベースのフローサイトメータを記載している。システムを較正するために、著者は、１０μｍおよび５μｍのポリスチレンビーズを使用し、サンプルおよびシース流体の様々な比率においてビーズによって生成されたインピーダンス信号を測定した。結果として、彼らは、誘電体シースを使用することによって、最初に使用された１４５μｍと比較して３３μｍのコアサンプルストリーム幅において、最良の信号と最小の変動とを達成している。著者はまた、健常ドナーからのＴＲＡＰ活性化血小板対非活性化血小板を用いて実験し、２つの集団間の差異を検出することができた。
【０００９】
本発明者らは、［１０］に記載の構成と同様に２対の電極が使用され、各対が励起電極および測定電極を有する、細胞検出のインピーダンスフロー分光法も調査した。１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの無線周波数におけるＡＣ電圧が励起電極に印加され、電流が測定電極によって測定される。測定される電流は、次いで、増幅され、出力電圧に変換される。出力信号は、次いで、励起周波数を除去し、インピーダンスの大きさおよび位相を回復させるために復調される。細胞が励起電極および測定電極の対を通過すると、インピーダンスの大きさおよび位相が変化し、したがって、細胞特性に関する情報を記録する。追加の電極の対は、測定が差動であることを保証し、したがって、寄生電磁ノイズを除去する。
【００１０】
典型的には、測定は、細胞サイズに関する情報を取得するために、２００ｋＨｚ〜５００ｋＨｚの低周波数でなされ、細胞質、および細胞の内部特性に関する情報を取得するために、２〜５０ＭＨｚの高周波数でなされる。
【００１１】
図１ａは、同一のポリスチレンビーズの集団に関するインピーダンスの大きさ対位相の密度プロットを示す。ビーズは、直径６μｍのポリスチレンビーズである。この実験では、チャネルは、正方形断面（３０μｍ×３０μｍ）であり、２０μｍ×０．２μｍのサイズを有するチャネル上に置かれた２つの電極が存在し、チャネルの上壁（チャネルの天井）上に置かれた上部電極は、励起電極であり、チャネルの下壁（チャネルの床）における電極は、検出電極である。粒子が励起電極と検出電極との間を通過するとき、それらは、インピーダンスの実部および虚部の変動に等しい、インピーダンスの大きさの変動およびインピーダンスの位相の変動からなるインピーダンスの複素数値の有意な変動を誘発する。図１ａは、ポリスチレンビーズを含有する流体に関するこのデータを、さらなる議論のために便利な大きさ対位相のフォーマットにおいてプロットしている。本発明者らは、低周波数において、インピーダンス信号が細胞のサイズと、マイクロ流体チャネル内の細胞の位置にも依存することを実験的に確認した。さらに、本発明者らは、チャネルの上部において励起電極の近くを流れる細胞対チャネルの下部において測定電極の近くを流れる細胞で信号が異なることを証明した。差異は、有限幅の２つの電極間の電場の不均一性に部分的に起因する。加えて、チャネルの上部および下部において電場勾配の差が存在し、特に、電場勾配は、測定電極におけるものと比較して励起電極においてより大きい。これは、高周波数において細胞位置に対するインピーダンス信号の感度にも寄与する。同様に、図１ｂは、インピーダンスの大きさ対インピーダンスの位相の同じフォーマットにおける赤血球の集団からのデータ点の散乱を示す。本発明者らは、このフォーマットのデータ提示をインピーダンス密度プロットと呼ぶ。ポリスチレンビーズ測定と赤血球測定の両方の場合において、本発明者らは、サンプルの流体力学的集束および位置決めを用いず、均質な集団のいくつかの異なる亜集団への分離を依然として達成したことに留意することが重要である。さらに、本発明者らは、この現象の説明を与え、それを本発明者らの利点に利用する方法を提供する。
【００１２】
矩形マイクロチャネルを横切って流れる粒子の分布が本質的に不均一である状況が存在することが従来技術の刊行物から知られている。さらに、粒子の速度およびサイズに依存して、粒子は、典型的には矩形マイクロチャネルの中心ではない好ましい安定した位置に配置される。これらの流体力学的に好ましい位置は、チャネルの幅と高さの比によって（正方形チャネル対矩形チャネル）、また粒子の速度およびサイズ、流体の粘度によって、ならびに粒子および粒子を動かす流体のレイノルズ数および密度によって影響され得る。粒子の自己集束は、しばしば、レイノルズ数が１（ストークス流）よりも大きく、１００よりも小さい流れにおいて生じる慣性粒子集束と呼ばれる。この順序付けは、矩形の壁で囲まれたチャネル内を流れる粒子に作用する４つの横力、すなわち、スリップ−回転によるマグヌス力、スリップ−剪断によるサフマン力、壁からの粒子周辺の流れ場の擾乱による壁揚力、および擾乱されていない速度プロファイルの放物線状湾曲による剪断勾配揚力によって生じる［２］。
【００１３】
刊行物非特許文献３［１］は、慣性集束における進歩の概説を提供し、安定した位置がチャネルの幾何学的形状によって影響を受ける状況を要約している。論文によれば、円形チャネル内を飛ばされる場合、ランダムに分散された粒子は、等距離に、円形チャネルの軸からチャネル半径の０．６倍に配置された安定した位置に向かって移動する。幅がチャネルの深さに等しい正方形の直線チャネルでは、粒子は、各壁の中心に面する４つの平衡位置に通常は集束する。チャネルが矩形で、アスペクト比が０．５未満（幅が深さの少なくとも２倍よりも大きい）場合、より長い壁の中心における２つの安定した位置のみが存在する。この現象は、Ｊｉａｎ  Ｚｈｏｕ  ｅｔ．ａｌ．［３］によって説明されており、それは、２段階慣性集束によるものである。さらに、Ｄｉｎｏ  Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  ｅｔ．ａｌ．［４］に記載された技法は、安定した位置における粒子の集束と、同時に非円形粒子の回転とを可能にし、回転整列は、チャネルの壁に平行な円盤状粒子の円盤で観察される。
【００１４】
慣性集束に加えて、検出チャネル内のサンプルストリームを位置決めするためにマイクロ流体チャネルが検出チャネルに追加されるチップ上で実施される多数の流体力学的サンプル集束技法が存在する。これらの追加のチャネルは、従来のフローサイトメトリーと同様にシース流体を搬送し、サンプルキャリア流体を包む。単一平面内に集束する多数の２Ｄ集束技法が存在する。
【００１５】
より最近、３Ｄ集束技法が、平面に垂直な追加の集束を伴って出現している。これらは、以下で説明され、参照される。
【００１６】
流体力学的集束は、何十年も知られている。現象は、１８８３年と同じくらい早く記述され［非特許文献４］、それはもともと、シース流ストリームによって両側に並べられたサンプル流の閉じ込めに関連していた。フローサイトメータ内のサンプル流体流の断面は、典型的には、０．００３〜０．０３ｍｍ2の範囲内である。
【００１７】
流体力学的集束は、インピーダンス測定を利用するチップ上の細胞および粒子の検出のために特に重要である。実際、細胞（または粒子）の識別のために、それらが検出システムの前を１つずつ通過するような流れにおいてこれらを配置することが必要である。この「１細胞ずつ」の原理は、成功した細胞識別のための基本的なものであり、識別を妨げる可能性があるので、複数の細胞が一度に検出システムを通過する状況を避ける必要がある。細胞（粒子）がチャネルの狭い断面によって１つずつ整列するようにチャネルを小さく形成することは、現実的ではなく、断面が単一のセルに相当するそのような小さいチャネルは、閉塞しやすく、チャネル断面積が減少するにつれて、壁に対する層流の摩擦が増加するので、大きな圧力差も必要とする。したがって、流体力学的集束を使用することが一般的である。流体力学的集束は、シース流体の層流へのサンプル流体の注入に基づく。２つの流れは、次いで、通常は縮小された断面の単一のチャネルに合併する。これは、流れのシース流体部分と、サンプル流体部分の両方の断面積を低減し、したがって、サンプル流体流の断面における所望の低減を達成する。サンプル流体の断面を制御するために、サンプル流体およびシース流体の流量を変更することができる。たとえば、シース流体の流量は、サンプル流体断面を低減するために増加され得る。シース流体の流れに隣接するサンプル流体のそのような小さい断面は、閉塞しないかなり大きい断面、すなわち、細胞サイズの複数倍のチャネルを通過する。マイクロ流体集束は、流体疑似壁のためのマイクロ流体チャネルの硬い壁を置き換え、これは、マイクロチャネルの閉塞のリスクを低減するということがいえる。電気インピーダンスに基づくサイトメトリーに関連して、流体力学的集束は、導電性サンプルストリームの幅を細胞の適切なサイズに減少させ、細胞が通過するときの導電性経路における抵抗変化率を増加させる。
【００１８】
近年、マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーは、異なる種類の細胞を計数し、区別するためにさらに開発されている。マイクロチップ内の単一の細胞の電気的特性を決定するために、多周波数インピーダンス測定が使用され得る［非特許文献５；非特許文献６］。これらの方法では、細胞は、それらにわたって印加されたＡＣ電場を有する小型電極間を流れる。細胞が電極間を通過すると、電流経路が擾乱され、電流の変化は、単一の細胞に関連するインピーダンス信号の変化を与える。通常、（１〜５ＭＨｚ）の周波数におけるインピーダンス測定は、細胞膜の静電容量における情報を与え、はるかにより高い周波数（＞１０ＭＨｚ）が細胞の内部特性を調べる。異なるタイプの細胞を区別するために、２つ以上の周波数が同時に用いられ得る。インピーダンスフローサイトメトリーは、細胞を容易に検出することができ、元の技法は、このためにＣｏｕｌｔｅｒによって開発された。サンプル流体内の細胞の亜集団を分離するより挑戦的なタスクについては、インピーダンスサイトメトリーの性能は、各細胞に対応するデータ点における大きい広がりのためにはるかに説得力がない。また、従来型のマイクロ流体チップを伴う３Ｄ流体力学的収束は、単純ではない。そのようなオンチップ３Ｄ集束の性能は、限定された能力を有する。
【００１９】
インピーダンスサイトメトリーのＣＶを低減するために、電極間における良好に規定された点、たとえば、チャネルの中心を通ってサンプル流体を導くことができることが望ましい。これは、流れの中の粒子のタイプの細胞の単一の集団からのデータ点における広がりを減少させる。電極によって作成された電場の方向に対してすべての細胞（粒子）を同じ方法で整列させることも望ましい場合がある。細胞は、しばしば、全体的に球形ではなく、むしろ、細長い、楕円状の、または円盤状の形状である。電気インピーダンスサイトメトリー装置内の細胞からの信号は、電極に対する細胞の長軸の配向に依存する。
【００２０】
近年、マイクロ流体チップおよびマイクロチャネルにおける流体力学的集束の使用に関する作業が増加している。たとえば、特許文献１は、「微粒子を含有する溶液を導入するためのチャネルと、導入チャネルの少なくとも１つの側面上に配置されたチャネルを形成するシース流とを有する分画マイクロチップ」を開示している。分画マイクロチップは、「導入された微粒子を測定するための微粒子測定部と、微粒子の分画捕集を実行するように微粒子測定部の下流側に配置された少なくとも２つの微粒子分画チャネルと、微粒子の移動方向を制御するように（略）開口するチャネルポートの近傍に配置された少なくとも２つの電極と」をさらに有する。特許文献１において開示された微粒子分画マイクロチップは、微粒子を含有する溶液を導入するためのチャネルと、２つのシース流形成チャネルとを有する「三分岐チャネル」によって流体層流が形成されるように設計される。本質的に、これは、チップ上に集束する２Ｄ流体力学的集束である。特許文献１において開示された微粒子分画マイクロチップでは、三分岐チャネルは、微粒子を含有する溶液が、左側および右側からのシース流体の流れによって挟まれ、微粒子は、微粒子測定部内のチャネルの中心を通って流れるようにされることを確実にする。結果として、微粒子を光学的に測定する場合には、たとえば、微粒子の各々は、測定光を正確に照射され得る。同様のアプローチは、［非特許文献７］および［非特許文献８］に記載されている。
【００２１】
２Ｄ流体力学的集束は、その本質的な限界を有する。これを踏まえて、サンプルを水平方向と垂直方向の両方において閉じ込めるために、マイクロ流体チップ上に３Ｄ流体力学的集束を導入するさらなる努力が存在する。そのような３Ｄ集束と従来のタイプのマイクロ流体チップとの統合のための１つの解決策が、［非特許文献９］において記載されている。集束は、２レベル設計を使用して達成され、シース流体は、サンプルストリームよりも広く、より高いチャネルからマイクロ流体チップに入る。
【００２２】
同様のアプローチが、［非特許文献１０］［Ｒｅｆ７］において記載されている。その研究は、サンプルチャネルと、サンプルチャネルよりも大きい高さを有する２つのシースチャネルが、シースチャネルと同じ高さを有する主チャネルの前の接合部において接合する３次元流体力学的集束を扱う。異なる高さのチャネルの合流は、横方向と縦方向の両方における流れの閉じ込めを生じ、結果として３Ｄ集束された流れを生じる。その刊行物では、３Ｄ集束は、従来のマイクロ流体平面チップのチャネルの中心における直線へのサンプル流の閉じ込めを指す。その刊行物の著者は、「粒子は、チャネルの中心から離れた位置に定着する傾向を有する。流れの集束は、そのような影響に対処する必要がある。」と述べている。したがって、マイクロ流体デバイスにおける傾向は、マイクロ流体チャネルの中心において粒子を配置することである。
【００２３】
特許文献２の特許では、Ｔｈｅｉｓｅｎ  Ｊａｎｋｏらは、マイクロ流体チャネル構造内の流体を集束させるための方法と、流体の流体力学的集束を達成するためのマイクロ流体構造の実装形態とを提供している。この特許では、サンプル搬送チャネルは、中心に位置し、２つのシース流チャネルが側面からサンプルチャネルに接合する。３次元集束を達成するために、第１のシース流チャネルは、下部層において、右手側から接合し、第２のシース流チャネルは、上部層において、左手側から接合する。この構成は、流体の旋回運動を作成し、シース流体流間にサンプルストリームを閉じ込める。特許は、チャネル内の粒子を集束させる方法を提供するが、旋回運動は、円盤状または非円形の粒子の配向を制御することができない。
【００２４】
特許文献３の特許では、Ｓｈｉｎｏｄａら［８］は、サンプル流を提供するためにマイクロチューブがマイクロチップに挿入される３次元流体力学的集束の方法を教示している。マイクロチップは、シース流体流がマイクロチューブを取り囲むように構成され、したがって、シース流体が粒子を含有するサンプルストリームを同軸に集束させる。これは、従来のフローサイトメトリー集束ノズルと非常に類似しており、巨大なフローサイトメトリー３次元流体力学的集束ノズルに対して、マイクロチップ構造にマイクロチューブを封入する方法が提供されることのみが異なる。
【００２５】
論文非特許文献１１［９］は、粒子が２段階において集束した集束の方法を記載している。最初に、粒子は、左手側および右手側からの２つのシースストリームによって横方向において集束される。これには、次いで、粒子をチャネルの底部と、電極が配置される場所とに向けて押しやる、いわゆる「チムニー」構造が続けられる。
【００２６】
３次元集束に対する別のアプローチは、非特許文献１２に記載されている。この方法は、シース搬送チャネルとサンプル搬送チャネルの２つのチャネルが主チャネルに接合する単純な平面マイクロ流体チップを利用する。交差の直後に、シースおよびサンプルストリームは、並んで流れ、サンプルストリームは、主チャネルの片側に押しつぶされている。主チャネルの内側に、シース流体ストリームを導き、それをサンプルストリームの周りにまとわせる一連の溝が配置される。さらに、論文は、サンプルストリームのいずれかの側から接合された２つのシースストリームが使用され、次いで、主チャネルがサンプルストリームの周囲にシースをまとわせるために一連のシェブロン溝を有する構成を提供する。非特許文献１３では、サンプルストリームを閉じ込めるためにシェブロンと同様の構成を使用した。彼らは、３つのシェブロンのみを使用して円形のサンプルストリームを得たが、７つのシェブロンを使用することによって、彼らは、サンプルの細長い狭い楕円形のストリームを達成することができた。この精密な集束は、Ｌｕｍｉｎｅｘからの従来のサイトメータによっては不可能であった複数のタイプの細菌の検出および分化のためにさらに使用された。非特許文献１４は、類似のシェブロンのアイデアを使用し、サブミクロンのサイズの粒子を検出するために、それをマイクロ流体チップ上の光ファイバの照明および検出と組み合わせた。
【００２７】
上記で説明した流体力学的集束方法は、従来のフローサイトメトリーにおける同軸集束と同様に対称的な集束を主に使用し、細胞を主チャネルの中心に配置する。さらに、方法は、流れる粒子の流体力学的に安定した位置と、中心が粒子を配置するには不安定な場所であるという事実とを考慮していない。これは、典型的には、シース流体がサンプルストリームと合流し、初期集束が生じる場所から数百マイクロメートル以内の正確な集束の損失をもたらす。それは、従来のサイトメトリーには適しているが、検出チャネルを流れる間にサンプルが数回取り調べられる差動測定はできない。加えて、粒子を安定した位置に集束させる能力にもかかわらず、慣性集束は、粒子の速度、粘度、および流体力学的特性に極めて依存し、粒子および細胞の位置決めの普遍的な方法を提供しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】特開２００３−１０７０９９号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１２５０８１号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０２８３１４８号明細書
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】”Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ”，  Ｍａｒｃｉｎ  Ｆｒａｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ．ａｌ．
【非特許文献２】”Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ”．  Ｍｉｋａｅｌ  Ｅｖａｎｄｅｒ  ｅｔ．ａｌ
【非特許文献３】”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｅｒｔｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”  Ｊｕｎｇ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ．
【非特許文献４】Ｏ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｐｒｏｃ．  Ｒ．Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄｏｎ，１８８３，３５  ８４−９９
【非特許文献５】Ｓ．Ｇａｗａｄ，Ｌ．Ｓｃｈｉｌｄ，Ｐ．Ｈ．Ｒｅｎａｕｄ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｄ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｉｎｇ，Ｌａｂ．Ｃｈｉｐ．２００１  １  ７６−８２
【非特許文献６】Ｔ．Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ．Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ，２０１０，８，４２３−４４３
【非特許文献７】Ｒ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｒｕｊｉｌｌｏ，Ｃ．Ｍｉｌｌｓ，Ｊ．Ｓａｍｉｔｉｅｒ，Ｇ．Ｇｏｍｉｌａ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ．Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ，３  １７１（２００７）
【非特許文献８】Ｐ．Ｗａｌｓｈ，Ｅ．Ｗａｌｓｈ，Ｍ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅａｔ  Ｆｌｕｉｄ  Ｆｌｏｗ２８  ４４（２００７）
【非特許文献９】”Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ”，Ｒ．Ｓｃｏｔｔ，Ｐ．Ｓｅｔｈｕ，Ｃ．Ｋ．Ｈａｒｎｅｔｔ，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ７９  ０４６１０４（２００８）
【非特許文献１０】”Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｓｉｎｇ”Ｙｕ−Ｊｕｉ  Ｃｈｉｕ，Ｓ．Ｈ．Ｃｈｏ，Ｚ．Ｍｅｉ，Ｖ．Ｌｉｅｎ，Ｔ．Ｆ．Ｗｕ，Ｙ．Ｈ．Ｌｏ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ  ２０１３  １３  １８０３
【非特許文献１１】”Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ３−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ”，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｗａｔｋｉｎｓ  ｅｔ．ａｌ．
【非特許文献１２】”Ｔｗｏ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒｕｇｇｅｄ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ”，Ｐｅｔｅｒ  Ｂ．Ｈｏｗｅｌｌ  Ｊｒ．  ｅｔ．ａｌ．
【非特許文献１３】”Ａ  ｈａｒｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｂｅａｄ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙｓ”．Ａｂｅｌ  Ｌ．Ｔｗａｎｇａｗｎｇ  ｅｔ．ａｌ．
【非特許文献１４】”Ｍｕｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ”，Ｊｏｅｌ  Ｐ．Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
現在の技術水準の再調査から、従来技術の解決策が、マイクロ流体チャネル内の粒子の位置決めおよび配向に起因する信号の変動の問題を完全には解決しないことは明らかである。本発明の目的は、上述した問題のうちの少なくとも１つを解消することである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
発明の説明
本発明は、光センサまたは電気センサによって、集束されたストリームの改善されたオンチップ解析を可能にする、微粒子を含有する流体ストリームのオンチップ流体力学的集束を提供するマイクロ流体チップおよび方法を記載する。本発明のマイクロ流体チップは、マイクロ流体チャネルの断面における非対称焦点に微粒子の集束されたビームを提供するように構成され、その焦点は、流体力学的に有利である（それが対称的な焦点よりも安定している）ことが見出されており、集束されたストリームの分析中の信号の変動も低減する。ストリーム中の微粒子の非対称な集束は、サンプルマイクロ流体チャネル内の微粒子を含むストリームを誘導マイクロ流体チャネル内の誘導ストリームと合流させ、共通マイクロ流体チャネルの断面に対して非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを含む共通マイクロ流体チャネルを形成することによって達成される。非対称な位置は、一般に、共通チャネルの断面の角または側面に向かって配置される。これを達成する１つの方法は、サンプルマイクロ流体チャネルと誘導マイクロ流体チャネルとを、誘導マイクロ流体チャネルの１つまたは複数の側面に沿って、たとえば、誘導チャネルの１つの側面の一部のみに沿って、または誘導チャネルの２つの隣接する側面の一部のみに沿って、斜角で合流させることによる。この幾何学的形状は、共通チャネル内の微粒子を共通チャネルの断面内の流体力学的に有利な焦点に集束させ、そこでは、集束されたビームは、安定し、集束ずれに耐性があり、そのため、微粒子から測定されたデータの統計的な広がりが低減される、集束ビーム内の検出ゾーンを微粒子が通過するようになる。適切なマイクロ流体チップのアーキテクチャの例が、図２〜図１９において提供されている。インピーダンス分光法を用いる性別に従ってウシ精子細胞を選別するための本発明のマイクロ流体チップの使用が、図２１〜図２５を参照して説明される。
【００３２】
第１の態様では、本発明は、微粒子を含有する流体のストリームを集束させるためのマイクロ流体チップを提供する。チップは、典型的には、微粒子を含有する流体のストリームを受け入れるように構成されたサンプルマイクロ流体チャネルと、誘導流体のストリームを受け入れるように構成された誘導マイクロ流体チャネルとを備える。チップは、典型的には、サンプルマイクロ流体チャネルと誘導マイクロ流体チャネルとを、一般に斜角で合流させることによって形成される共通マイクロ流体チャネルを備える。サンプルマイクロ流体チャネルと誘導マイクロ流体チャネルとの合流は、一般に、典型的には共通マイクロ流体チャネル内に非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成される。
【００３３】
一実施形態では、サンプルマイクロ流体チャネルと誘導マイクロ流体チャネルとの合流は、共通チャネルの角または側面に隣接して配置された粒子の集束されたビームを含む複合流体ストリームを提供するように構成される。
【００３４】
一実施形態では、チップは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが、誘導マイクロ流体チャネルの１つまたは複数の側面の一部のみに沿って、たとえば、誘導チャネルの１つの側面の一部のみに沿って、または誘導チャネルの２つの隣接する側面の一部のみに沿って、斜角で合流させられるように構成される。
【００３５】
一実施形態では、サンプルマイクロ流体チャネルは、多角形の断面、たとえば、矩形（正方形を含む）、三角形を有する。一実施形態では、多角形は、３〜６の側面、好ましくは３〜４の側面を有する。
【００３６】
一実施形態では、サンプルマイクロ流体チャネルは、矩形の断面を有する。
【００３７】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルは、多角形または矩形のサンプルマイクロ流体チャネルの３つ以下の側面に沿ってサンプルマイクロ流体チャネルと合流する。
【００３８】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルは、多角形矩形サンプルマイクロ流体チャネルの２つの側面に沿ってサンプルマイクロ流体チャネルと合流する。
【００３９】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルは、サンプルマイクロ流体チャネルの１つの側面に沿ってサンプルマイクロ流体チャネルと合流する。
【００４０】
一実施形態では、サンプルマイクロ流体チャネルは、実質的に正方形の断面を有する。
【００４１】
一実施形態では、サンプルマイクロ流体チャネルは、非多角形断面、たとえば、円形もしくは楕円形、または他の非多角形断面を有する。そのような場合、誘導マイクロ流体チャネルは、共通チャネル内の微粒子の集束されたビームが共通マイクロ流体チャネルの幾何学的中心から離れて配置されるように、たとえば、共通チャネルの側面に向けて配置されるように、サンプルマイクロ流体チャネルと合流する。
【００４２】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルは、多角形断面を有する。
【００４３】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルは、矩形断面を有する。
【００４４】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルは、実質的に正方形の断面を有する。
【００４５】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルの断面積は、サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも大きい。
【００４６】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルの断面積は、サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも少なくとも１．５倍大きい。
【００４７】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルの断面積は、サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも少なくとも２倍大きい。
【００４８】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルの断面積は、サンプルマイクロ流体チャネルの断面積よりも少なくとも３倍大きい。
【００４９】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルおよびサンプルマイクロ流体チャネルは、異なるアスペクト比を有する。これは、図２、図４、図６、図８、図１０、図１２、図１４、図１６、図１８、図１９、および図２０に示されている。
【００５０】
一実施形態では、合流ゾーンに近接するサンプルマイクロ流体チャネルの少なくとも一部、および共通マイクロ流体チャネルは、共通長手方向軸に沿って同一の広がりをもち、誘導マイクロ流体チャネルは、共通長手方向軸に対して斜めの長手方向軸を有する。
【００５１】
一実施形態では、誘導マイクロ流体チャネルおよびサンプルマイクロ流体チャネルは、１００μｍ〜５ｍｍ、１００μｍ〜４ｍｍ、１００μｍ〜３ｍｍ、５００μｍ〜５ｍｍ、５００μｍ〜４ｍｍ、５００μｍ〜３ｍｍ、または１〜５ｍｍ、１〜４ｍｍ、もしくは１〜３ｍｍの距離にわたって合流する。
【００５２】
一実施形態では、本発明のマイクロ流体チップは、微粒子を含有する流体の集束されたストリームの分析、たとえば、微粒子を含有する流体の定性的または定量的分析のために構成される。したがって、チップは、微粒子が均質または不均一な集団を含むかどうかを分析することができ、微粒子を別々の集団に分離することができる。
【００５３】
一実施形態では、マイクロ流体チップは、共通チャネル内の微粒子の集束されたストリームの特性を感知するように構成された１つまたは複数のセンサを備える検出ゾーンを含む。
【００５４】
一実施形態では、センサは、共通チャネル内の微粒子の集束されたストリームの光学的および／または電気的特性を感知するように構成される。一実施形態では、少なくとも１つのセンサは、光センサである。一実施形態では、少なくとも１つのセンサは、電気インピーダンスベースのセンサである。一実施形態では、少なくとも１つのセンサは、共通チャネル内の微粒子の集束されたストリームの特性を検出するように構成され、典型的には、インピーダンス分光法、蛍光検出、または光散乱によって微粒子を適切に識別または区別するように構成される。
【００５５】
一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、典型的には、光源に結合された導波路と、導波路間を通過する微粒子の集束されたストリームに対応する光信号の変化を検出するように構成された光検出器に結合された導波路とを含む、１つまたは少なくとも２つの光導波路を含む。
【００５６】
一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、インピーダンス変化を検出するように構成された少なくとも１対の電極を含む。一実施形態では、少なくとも１対の電極は、励起電極と、電極間を通過する微粒子の集束されたストリームに対応する共通チャネルにおけるＡＣインピーダンスの変化を検出するように構成された検出電極とを含む。
【００５７】
一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から少なくとも１００μｍ遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から少なくとも２００μｍ遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から少なくとも３００μｍ遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から少なくとも４００μｍ遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から少なくとも５００μｍ遠位に配置される。
【００５８】
一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から５０００μｍ未満遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から４０００μｍ未満遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から３０００μｍ未満遠位に配置される。一実施形態では、１つまたは複数のセンサは、サンプルマイクロ流体チャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルが完全に合流する点から２０００μｍ未満遠位に配置される。
【００５９】
一実施形態では、マイクロ流体チップは、微粒子を２つ以上の微粒子の亜集団、たとえば、３つ、４つ、または５つの亜集団に分離するように構成される。一実施形態では、マイクロ流体チップは、少なくとも１つのセンサによって検出された個々の微粒子に対応する微粒子の集束されたストリームの光学的特性または電気的特性の変化に応答してストリーム中の個々の微粒子を移動させるために、共通チャネル内の微粒子の集束されたビームに力を加えるように構成された力発生器を備える分離ゾーン（一般に検出ゾーンの遠位）を備える。
【００６０】
一実施形態では、共通マイクロ流体チャネルは、分離ゾーン内の２つ以上のチャネルに分岐する。一実施形態では、力発生器は、１つまたは複数の微粒子を１つのチャネルから異なるチャネルに移動させるように配置される。
【００６１】
一実施形態では、微粒子流体の微粒子が集束されたストリームの集束されたビームを含有する複合流体ストリームは、層流を有する。一実施形態では、複合流体ストリームは、１〜１０００のレイノルズ数を有する。一実施形態では、複合流体ストリームは、１０〜５００のレイノルズ数を有する。一実施形態では、複合流体ストリームは、５０〜２００のレイノルズ数を有する。様々な幾何学的形状のチャネル内の流体のストリームに関するレイノルズ数を計算する方法が、［１４］に記載されている。
【００６２】
一実施形態では、微粒子は、細胞である。本発明の装置および方法を使用して分析され得る他のタイプの粒子が以下に記載される。一実施形態では、装置は、粒子の不均一な集団を２つ以上の均質な集団に選別するためのものである。一実施形態では、装置は、表現型の違いに従って細胞を選別するためのものである。一実施形態では、表現型の違いは、細胞型、細胞性別、疾患状態、および細胞の健康状態から選択される。一実施形態では、本発明の装置および方法は、細胞の異なる集団の選別（たとえば、骨髄細胞から上皮細胞を選別すること）に関する。一実施形態では、本発明の装置および方法は、細胞の異なる亜集団の選別（たとえば、上皮細胞の異なる亜集団を選別すること）に関する。一実施形態では、本発明の装置および方法は、性別による精子細胞の選別（たとえば、ウシ精子細胞を精子細胞のＸ集団およびＹ集団に選別すること）に関する。一実施形態では、本発明の装置および方法は、細胞の集団の生きた細胞および死んだ細胞への選別に関する。一実施形態では、本発明の装置および方法は、細胞集団の癌細胞および非癌細胞への選別に関する。一実施形態では、本発明の装置および方法は、細胞集団の健康な細胞および不健康な細胞への選別に関する。
【００６３】
一実施形態では、マイクロ流体チップ内の誘導チャネルおよびサンプルチャネルの合流は、微粒子が一列縦隊内にある共通チャネル内の細胞（または微粒子）の集束されたビームを提供するように構成される。一実施形態では、マイクロ流体チップ内の誘導チャネルおよびサンプルチャネルの合流は、微粒子が同じ方向に整列された共通チャネル内の細胞（または微粒子）の集束されたビームを提供するように構成される。一実施形態では、誘導チャネルおよびサンプルチャネルの合流は、不均一な形状の粒子が検出の平面に沿って（すなわち、電極または光導波路センサの間に）整列されるように構成される。
【００６４】
一実施形態では、少なくとも１つのセンサは、微粒子の集束されたビームの位置に対応する共通チャネルの断面内の焦点において感知するように構成される。
【００６５】
一実施形態では、流体力学的集束装置は、異なる微粒子の光学的応答またはインピーダンス応答の差異が増幅されるように微粒子がセンサに対して優先的に整列されるように、複合ストリーム内の微粒子の異方性整列を提供するように構成される。
【００６６】
一実施形態では、検出ゾーンは、複数のセンサ、たとえば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、または１８のセンサを備える。一実施形態では、複数のセンサは、少なくとも１つの光センサと、少なくとも１つの電気ベースのセンサ（すなわち、インピーダンスセンサ）とを含む。
【００６７】
一実施形態では、検出ゾーンは、同じ検出平面内に（すなわち、チャネルに沿った同じ点において共通チャネルの周囲に配置された）複数のセンサを備える。
【００６８】
一実施形態では、検出ゾーンは、異なる検出平面内に（すなわち、チャネルに沿った異なる点において配置された）複数のセンサを備える。
【００６９】
一実施形態では、センサは、１つの検出平面内に配置された励起センサ（励起電極または導波路）と、第２の検出平面内に配置された検出センサ（検出電極または導波路）とを備える。
【００７０】
一実施形態では、マイクロ流体チップは、２つ以上の層を備え、マイクロ流体チャネルは、層に対して実質的に直交している（すなわち、２つ以上の層を通って延在する）。一実施形態では、検出ゾーンは、２つ以上の層にわたる。一実施形態では、検出ゾーンは、２、３、４、５、または６の層にわたる。一実施形態では、少なくとも２つの層が電極対を備える。一実施形態では、電極対の励起電極が１つの層において配置され、同じ電極対の検出電極が第２の層において配置される。
【００７１】
一実施形態では、本発明は、本発明によるマイクロ流体チップを備える装置を提供する。一実施形態では、装置は、電気供給モジュールを備える。一実施形態では、電気供給モジュールは、少なくとも１対の電極の励起電極に、１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの周波数範囲におけるＡＣ電圧で付勢するように構成される。一実施形態では、装置は、サンプル流体供給モジュールを備える。一実施形態では、装置は、微粒子を含有する流体の供給モジュールを備える。一実施形態では、流体供給モジュールは、層流で流体を供給するように構成される。一実施形態では、流体供給モジュールは、サンプル流体の流量よりも大きい流量を有する誘導流体を提供するように構成される。
【００７２】
一実施形態では、装置は、少なくとも１対の電極によって検出されたＡＣインピーダンスの変化が、検出電極において誘起されたＡＣ電圧の振幅および位相特性を含むように構成される。
【００７３】
一実施形態では、マイクロ流体チップのチャネルは、コアストリームおよび誘導ストリームの一方または両方が細長い断面を有する流体の複合ストリームを提供するように構成される。
【００７４】
一実施形態では、細長いストリームは、少なくとも１つのセンサの平面内で細長い。
【００７５】
一実施形態では、細長いストリームは、少なくとも１つのセンサの平面に垂直な平面内で細長い。
【００７６】
一実施形態では、マイクロ流体チップのチャネルは、微粒子（コア）ストリームの長手方向軸が誘導ストリームの長手方向に対してオフセットされた流体の複合ストリームを提供するように構成される。
【００７７】
一実施形態では、検出ゾーン内の共通マイクロ流体チャネルの断面積は、０．０００１〜０．０９ｍｍ2の範囲内にある。０．０００１〜０．００１の断面積は、小さいと考えられ、幅および深さが１０〜３０μｍのチャネルに対応する。０．００１〜０．０１の断面積は、中程度と考えられ、幅および深さが３０〜１００μｍのチャネルに対応する。０．０１〜０．９の断面積は、大きいと考えられ、幅および深さが１００〜３００μｍのチャネルに対応する。一実施形態では、共通マイクロ流体チャネルの断面は、チャネルの長さに沿って変化する。
【００７８】
一実施形態では、装置は、毎分０．１〜１００μＬの微粒子流体のサンプルストリームの流量を提供するように構成される。
【００７９】
一実施形態では、装置は、毎分１〜１０００μＬの流体の誘導ストリームの流量を提供するように構成される。
【００８０】
一実施形態では、マイクロ流体チップの検出ゾーンは、少なくとも２つの光導波路を備え、これらのうちの少なくとも１つは、光源に結合され（または結合されるように構成され）、他の１つは、微粒子から生じる光信号を検出するために光検出器に結合され（または結合されるように構成され）、そのような光信号は、微粒子の集団からのデータ点のＣＶを改善するために、検出電極において検出される電気信号に関連して測定される。
【００８１】
一実施形態では、本発明の装置は、ＡＣ信号が少なくとも２つの異なる周波数から構成され、励起電極に印加され、検出電極が、これらのまったく同じ周波数における単一の通過微粒子によって引き起こされるインピーダンス変化を検出し、微粒子が、これらの周波数の各々において検出電極で検出された振幅および位相信号に基づいてＸまたはＹ亜集団に属するように構成される。
【００８２】
一実施形態では、微粒子は、異なる表現型を有する細胞であり、装置は、表現型に従って細胞を選別するように構成される。
【００８３】
一実施形態では、微粒子は、少なくとも２つの異なる細胞タイプの細胞である。
【００８４】
一実施形態では、微粒子は、少なくとも２つの異なる表現型を有する同じタイプの細胞である。
【００８５】
一実施形態では、電極は０．１０〜３００μｍの厚さを有する。
【００８６】
本発明は、本発明のマイクロ流体チップまたは装置を用いる微粒子を含有する流体のストリームを集束させるオンチップ方法も提供する。一実施形態では、この方法は、
【００８７】
サンプルマイクロ流体チャネルを介して微粒子を含有する流体をポンピングするステップと、
誘導流体を誘導マイクロ流体チャネルに同時にポンピングするステップであって、それによって、流体が、共通マイクロ流体チャネル内に非対称に配置された微粒子の集束されたビームを含有する複合流体ストリームを形成するように合流する、ステップと
を備える。
【００８８】
一実施形態では、この方法は、共通マイクロ流体チャネルの検出ゾーンに配置された１つまたは複数のセンサ、たとえば、光学的および／または電気的感知方法（本明細書に記載されている）を使用する、共通マイクロ流体チャネル内の複合流体ストリームのオンチップ分析の追加のステップを含む。
【００８９】
一実施形態では、この方法は、適切な微粒子セパレータを使用する、共通マイクロ流体チャネル内の複合流体ストリーム内の微粒子のオンチップ分離の追加のステップを含む。したがって、複合ストリームは、微粒子含有量によって特徴付けられる（すなわち、微粒子の異なる集団を有する）２つ以上のストリームに分離され得る。典型的には、オンチップ分離ステップは、オンチップ分析ステップに結合され、それによって、微粒子の分離は、オンチップ分析に応答して実行される。一実施形態では、微粒子は、精子細胞であり、それによって、この方法は、性別に従って２つの集団への精子細胞の分離を実行する。
【００９０】
本発明の他の態様および好ましい実施形態は、下記の他の請求項で定義および説明される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１ａ】リン酸生理食塩水緩衝液中に懸濁された同一ポリスチレンビーズの集団に関するインピーダンスの大きさ対インピーダンスの位相の密度プロット。
【図１ｂ】リン酸生理食塩水緩衝液中に懸濁された赤血球の集団に関するインピーダンスの大きさ対インピーダンスの位相の密度プロット。
【図２ａ】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置における流体力学的集束マイクロ流体チップ８の断面Ａ−Ａ’。
【図２ｂ】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置の前の流体力学的集束マイクロ流体チップ８の断面Ｂ−Ｂ’。
【図２ｃ】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置の前の流体力学的集束マイクロ流体チップ８の断面Ｃ−Ｃ’。
【図２ｄ】共通チャネル８ａを表示する流体力学的集束マイクロ流体チップ８の断面Ｄ−Ｄ’。
【図２ｅ】共通チャネル８ａを表示する流体力学的集束マイクロ流体チップ８の断面Ｅ−Ｅ’。
【図２ｆ】検出ゾーンにおける共通チャネル８ａを表示する流体力学的集束マイクロ流体チップ８の断面Ｆ−Ｆ’。
【図３】実施例の流体力学的集束マイクロチップ８の上面図。
【図４】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の断面Ｋ−Ｋ’。
【図５】微粒子を含有する流体チャネル４ａが左上から接合している実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の上面図。
【図６】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の断面Ｋ−Ｋ’。
【図７】微粒子を含有する流体チャネル４ａが左上から接合し、誘導流体チャネルが右下から接合している実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の上面図。
【図８】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の断面Ｋ−Ｋ’、微粒子を含有する流体チャネル４ａが三角形状である。
【図９】三角形状の微粒子を含有する流体チャネル４ａを有する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の上面図。
【図１０】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面Ｋ−Ｋ’。
【図１１】微粒子を含有する流体チャネル４ａが左上から接合し、誘導流体チャネルが右下から接合している流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の上面図。
【図１２】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面Ｋ−Ｋ’。
【図１３】微粒子を含有する流体チャネル４ａが左上から接合し、誘導流体チャネルが下から接合している実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の上面図。
【図１４】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面Ｋ−Ｋ’。
【図１５】微粒子を含有する流体チャネル４ａが中央左から接合し、誘導流体チャネルが右から接合している実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の上面図。
【図１６】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面Ｋ−Ｋ’。
【図１７】微粒子を含有する流体チャネル４ａが中央左から接合し、誘導流体チャネルが上および右下から接合している実施形態の流体力学的集束マイクロチップ８の上面図。
【図１８ａ】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面。
【図１８ｂ】共通チャネル８ａと、細胞２０の位置および配向とを表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面。
【図１９ａ】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面。
【図１９ｂ】共通チャネル８ａと、細胞２０の位置および配向とを表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面。
【図２０ａ】微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面。
【図２０ｂ】共通チャネル８ａと、細胞２０の位置および配向とを表示する流体力学的集束マイクロチップ８の実施形態の断面。
【図２１ａ】微粒子を含有する流体／サンプル流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの合流の位置を表示する、精子細胞の配向に関する流体力学的集束マイクロチップの等角図ｏｆｔ。
【図２１ｂ】精子細胞の配向およびインピーダンス検出用に製造された流体力学的集束マイクロチップ。
【図２１ｃ】精子細胞の配向およびインピーダンス検出用の流体力学的集束マイクロチップの顕微鏡図。
【図２２】共通チャネルと、精子細胞の位置および配向とを表示する流体力学的集束マイクロチップの実施形態の断面。
【図２３ａ】１５ＭＨｚの励起周波数および３０μｌ／分のサンプル流量における未選別の精液ならびに停止した誘導流体流に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２３ｂ】１５ＭＨｚの励起周波数および１０μｌ／分のサンプル流量における未選別の精液ならびに２０μｌ／分の誘導流体流量に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２３ｃ】１５ＭＨｚの励起周波数および８μｌ／分のサンプル流量における未選別の精液ならびに２２μｌ／分の誘導流体流量に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２３ｄ】１５ＭＨｚの励起周波数および７μｌ／分のサンプル流量における未選別の精液ならびに２３μｌ／分の誘導流体流量に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２３ｅ】１５ＭＨｚの励起周波数および５μｌ／分のサンプル流量における未選別の精液ならびに２５μｌ／分の誘導流体流量に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２４ａ】１５ＭＨｚの励起周波数および８μｌ／分のサンプル流量における未選別の精液ならびに誘導流体流量２２μｌ／分に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２４ｂ】１５ＭＨｚの励起周波数および８μｌ／分のサンプル流量におけるＸ選別された精液ならびに誘導流体流量２２μｌ／分に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２４ｃ】１５ＭＨｚの励起周波数および８μｌ／分のサンプル流量におけるＹ選別された精液ならびに誘導流体流量２２μｌ／分に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２５ａ】１５ＭＨｚの励起周波数および８μｌ／分のサンプル流量のみにおけるＸ選別された精液および配向された細胞ならびに誘導流体流量２２μｌ／分に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【図２５ｂ】１５ＭＨｚの励起周波数および８μｌ／分のサンプル流量のみにおけるＹ選別された精液および配向された細胞ならびに誘導流体流量２２μｌ／分に関するインピーダンス位相対インピーダンス振幅のインピーダンス図。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
発明の詳細な説明
本明細書に記載されたすべての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示され、それらの内容が完全に援用されているかのように、すべての目的のためにそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００９３】
定義および全般の設定
本明細書で使用される場合、特に別途示されない限り、以下の用語は、用語が技術分野において享受し得るよりも任意に広い（または狭い）意味に加えて、以下の意味を有することが意図される。
【００９４】
文脈によって他に必要とされない限り、単数形の本明細書での使用は、複数形を含むように読まれるべきであり、逆もまた同様である。エンティティに関連して使用される「ａ」または「ａｎ」という用語は、そのエンティティの１つまたは複数を指すように読まれるべきである。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「備える（comprise）」という用語、または、「備える（comprises）」もしくは「備えている（comprising）」のようなその変形は、任意の列挙されたインテジャー（integer）（たとえば、特徴、要素、性質、特性、方法／プロセスステップ、または制限）またはインテジャー（integers）のグループ（たとえば、特徴（複数）、要素（複数）、性質（複数）、特性（複数）、方法／プロセスステップ（複数）、または制限（複数））を含むことを指すが、任意の他のインテジャー（integer）またはインテジャー（integer）のグループを除外しないように読まれるべきである。したがって、本明細書で使用される場合、「備えている（comprising）」という用語は、包括的または制限なしであり、追加の列挙されていないインテジャー（integers）または方法／プロセスステップ（複数）を排除しない。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、生理学的機能を損ない、特定の症状に関連する任意の異常状態を定義するために使用される。この用語は、生理学的機能が病因の性質（または、実際に疾患の病因学的根拠が確立されているかどうか）に関係なく損なわれている任意の障害、病気、異常、病理、病い、状態、または症候群を包含するように広く使用される。したがって、それは、感染、外傷、傷害、外科手術、放射線学的アブレーション、中毒、または栄養障害から生じる状態を包含する。
【００９７】
上記で定義された治療および有効量の文脈では、対象（文脈が許す場合、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳動物」を含むように読まれるべき）は、治療が必要とされる任意の対象、特に、哺乳動物の対象を定義する。哺乳動物の対象は、限定はしないが、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、運動動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌牛のようなペット動物、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーのような霊長類、イヌおよびオオカミのようなイヌ科の動物、ネコ、ライオン、およびトラのようなネコ科の動物、ウマ、ロバ、およびシマウマのようなウマ類、ウシ、ブタ、およびヒツジのような食用動物、シカおよびキリンのような有蹄類の動物、ならびに、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットのような齧歯動物を含む。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【００９８】
サンプルチャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルの合流に適用される「誘導マイクロ流体チャネルの１つまたは複数の側面の一部のみに沿って」は、サンプルチャネルが、誘導チャネルの１つまたは複数の側面の一部のみに沿って、誘導チャネルの全側面には沿わずに、たとえば、誘導チャネルの１つの側面の一部のみ、または誘導チャネルの２つの隣接する側面の一部のみに沿って合流することを意味する。これは、合流が誘導チャネルの１つの側面または２つの隣接する側面の一部のみに沿って生じる図の大部分において示されている。この幾何学的形状は、微粒子から測定されたデータの統計的な広がりが低減される集束ビーム内の検出ゾーンを微粒子が通過するように、共通チャネル内の微粒子を共通チャネルの断面内の流体力学的に有利な焦点で収束ビームに集束させ、その有利な焦点では、集束されたビームは、安定し、集束ずれに耐性がある。
【００９９】
サンプルチャネルおよび誘導マイクロ流体チャネルの合流に適用される「斜角」は、合流点の直近のサンプルチャネルの長手方向軸と誘導チャネルの長手方向軸との間の５°から６０°の角度を意味する。一実施形態では、斜角は、０５から４５°である。一実施形態では、斜角は、５°から３０°である。一実施形態では、斜角は、５°から２０°である。
【０１００】
微粒子を含有する流体に適用される「微粒子」は、流体中の固体、または半固体、すなわち、流体の特性とは異なる特性を有するボディを意味する。例は、金属の粒子、酸化物の粒子、窒化物の粒子、硫化物の粒子、ポリマー粒子、無機材料または有機材料の粒子、ゲルの粒子、複合粒子、および混合粒子、ナノ粒子、マイクロ粒子、微粒子複合体、細胞、細菌、真菌、ウイルスを含む。同様に、「微粒子を含有する流体」は、微粒子を含有する流体を意味する。例は、精子を含有する流体のような、細胞を含有する流体を含む。
【０１０１】
粒子の集束されたビームに適用される「共通チャネル内に非対称に配置された」は、集束されたビームが、共通チャネルの断面の幾何学的中心の外側、または共通チャネルの対称中心の外側に位置されることを意味する。集束されたビームは、一般に、共通チャネルの長手方向軸に平行な長手方向軸を有する。共通チャネルが矩形である場合、幾何学的中心は、各角から等距離にあるチャネルの断面内の点を意味する。共通チャネルの断面が矩形でない、すなわち、他の多角形である場合、幾何学的中心は、重心（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｃｅｎｔｒｏｉｄ）を指し、幾何学的中心は、代替的には、共通チャネルの断面を表す領域の質量の中心として解釈され得る。一実施形態では、「非対称に配置された」という用語は、チャネルの断面の角または側面に隣接して配置されることを意味する。
【０１０２】
共通マイクロ流体チャネル内に形成された微粒子の集束されたビームに適用される「流体力学的に有利な位置」は、集束されたビームが安定し、共通チャネルの長さに沿って集束されない可能性が低い共通チャネルの断面内の位置を意味し、代替的には、それは、流れの中の粒子に作用する力のバランスによって粒子が誘導される共通チャネルの断面内の位置として定義され得る。流れの中の粒子に作用する主要な力は、先にリスト化されている。本発明の重要な点は、チャネル内にいくつかの流体力学的に有利な位置が存在することである。流体力学的に有利な位置の例は、多角形断面のチャネルの角および側面に近い位置、共通チャネルの頂部に向かう位置（微粒子が粒子を含有する流体よりも密度が低い場合）、または共通チャネルの底部に向かう位置（微粒子が粒子を含有する流体よりも密度が高い場合）を含む。流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの断面形状、流体ストリームの流量、および、微粒子のタイプ、粒子の密度と流体の密度との間の差異を含む、いくつかの変数に依存してチップごとに異なる場合がある。
【０１０３】
「分析」は、流体中の微粒子の定性的または定量的特性を決定すること、たとえば、微粒子が均質な集団であるかもしくは不均一な集団であるかを決定すること、微粒子の量もしくは濃度を決定すること、または、差異に基づいて微粒子を区別もしくは選別することを意味する。したがって、この用語は、微粒子（即ち、細胞）の定性的もしくは定量的な分析、または、検出されたインピーダンス応答の差異に基づく微粒子の区別もしくは選別を広くカバーする。
【０１０４】
「細胞」は、精子、白血球、赤血球、骨髄細胞、免疫細胞、上皮細胞、神経細胞、胚細胞、血管細胞、肝細胞、腎臓細胞、皮膚細胞、幹細胞のような哺乳類細胞、または、細菌および真菌細胞、ならびにハイブリドーマを含む、任意のタイプの細胞を意味する。一般に、微粒子を含有する流体は、少なくとも２つの異なるタイプの微粒子、たとえば、異なる細胞タイプ、異なる性別の精子、同じ細胞タイプの亜集団、異なる表現型を有する同じ細胞タイプ、死んだ細胞および生きた細胞、羅患した細胞および羅患していない細胞、同じ種類の未熟な細胞および成熟した細胞を含む。本発明の装置および方法は、これらの異なるタイプまたは表現型の微粒子／細胞を分析および／または区別および／または分離するために用いられ得る。
【０１０５】
細胞に適用される「異なる表現型」は、細胞の異なる集団（すなわち、肝細胞および血管細胞）、同じ細胞タイプの異なる亜集団（すなわち、異なるタイプの軟骨細胞）、同じ細胞タイプの異なる表現型（すなわち、異なるマーカを発現する細胞、疾患細胞および健康細胞、トランスジェニック細胞および野生型細胞、分化の異なる段階における幹細胞）を意味する。
【０１０６】
精子細胞に適用される「ＸおよびＹ集団」は、雄精子細胞および雌精子細胞を意味する。
【０１０７】
「微粒子を含有する流体の集束されたストリーム」は、誘導ストリーム内に非対称に配置された微粒子の集束されたビームの形態における微粒子を含有する流体を意味する。一実施形態では、集束されたビーム中の微粒子は、単一の細胞ストリーム配置に集束される。微粒子が異方性形状を有する一実施形態では、集束されたビーム中の微粒子は、同じ方向に整列される。
【０１０８】
「マイクロ流体チップ」は、１ｍｍ2未満の断面積と少なくとも１ｍｍの長さとを有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有するチップを意味する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、０．２５ｍｍ2未満の断面積を有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、０．０１ｍｍ2未満の断面積を有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、０．００２５ｍｍ2未満の断面積を有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、複数のマイクロ流体チャネル、たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のマイクロ流体チャネルを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、少なくとも１．５００ｍｍの長さを有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、少なくとも２ｍｍの長さを有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、少なくとも３ｍｍの長さを有する。一実施形態では、マイクロ流体チップは、複数の層、たとえば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０層を備える。
【０１０９】
「実質的に直交するマイクロ流体チャネル」は、マイクロ流体チップが、チップの層に平行であるのとは対照的にチップを貫通することを意味する。チャネルは、チップの層に垂直であってもよく、または、チップの層の長手方向軸に対してある角度、たとえば、６０°または７０°の角度でチップの層を貫通してもよい。
【０１１０】
「ＡＣインピーダンスの変化」は、検出電極において検出されたインピーダンスの変化を意味すると理解されるべきである。変化は、信号の振幅、位相、または振幅および位相の変化を含むことができる。
【０１１１】
電極に適用される「マイクロ流体チャネルとの電気通信において」は、電極がマイクロ流体チャネルにおいて分析される流体と直接接触することを意味する。
【０１１２】
「検出平面」は、電極対が配置されるマイクロ流体チャネルの断面を意味する。本発明の装置は、（図７に示すように）複数の電極対が同じ検出平面において配置されることを可能にし、電極対は、同じ平面内でチャネルの周りに半径方向に離間される。それは、複数の電極対が異なる検出平面において設けられることも可能にし（たとえば、図８参照）、電極対は、チャネルに沿って軸方向に離間される。
【０１１３】
「分離ゾーン」は、検出ゾーンの遠位のマイクロ流体チップの一部であり、流体中の微粒子が、微粒子によって引き起こされたチャネルにおけるＡＣインピーダンス変化に基づいて、及び、検出ゾーン内の微粒子の特徴付けの結果に従って、分離され得る。分離ゾーンは、一般に、電極対に動作可能に接続され、流体のストリームから１つまたは複数の微粒子を分離するために、検出ゾーンからの信号に応答して微粒子に力を加えるように構成された力発生器を含む。細胞選別装置における使用に適した力発生器の例は、当技術分野において周知であり、たとえば、［１５］に記載されている。一実施形態では、装置は、典型的には、少なくとも１つの電極対および力発生器に動作可能に接続され、電極対から受信された信号に応答して力発生器を作動させるように構成されたプロセッサを含む。作動信号は、プロセッサに予めプログラムされてもよく、細胞タイプごとに変化してもよい。
【０１１４】
「異方性」という用語は、粒子の形状の全体的な対称性、または装置において使用される刺激に対するその応答が球形でないことを指す。最も単純な場合、これは、粒子（細胞）の全体的な形状を指す。たとえば、粒子が細長い、楕円形、棒状、または円盤形状、円盤状である場合、これは、等方性として記載されている球形形状の粒子とは対照的に、異方性として記載される。しかしながら、それ自体の全体的な形状は、等方性粒子と異方性粒子（細胞）とを区別するのに不十分である。たとえば、導電棒（ワイヤのセグメント）が絶縁球内に埋め込まれている場合、これは、粒子の全体的な形状が球形、すなわち、等方性であっても、異方性粒子を形成する。その理由は、粒子が電磁場に沿って棒の長さに向けられるか、または電磁場に垂直に向けられるかに応じて、そのような粒子が無線周波数（ＲＦ）電磁場に対して異なる応答を有するからである。ＲＦ場への主な応答は、この場合、金属棒からであり、この応答は、非常に異方性であり、絶縁球状エンベロープは、状況にほとんど影響を与えない。同じことが光学的応答にも当てはまり、それは、光の入射の方向と、棒の長軸に対する偏光とに依存して異なり、しかも、光学的応答に対する等方性誘電体エンベロープの影響は、導電棒からの異方性応答を変化させない。同じことが細胞にも当てはまる。細胞からのＲＦ信号応答への主な寄与は、細胞の外周から来るのではなく、その内部の特徴から来る可能性がある。これは、細胞の構造とＲＦ周波数とに依存する。
【０１１５】
層流様式に言及するとき、本発明者らは、ストークス様式（〜１＜Ｒｅ＜〜１０００）の下にある流れ条件を暗示するものとする。Ｒｅは、Ｒｅ＝ρＵＨ／μとして定義されるレイノルズ数であり、ここで、ρ、Ｕ、およびμは、それぞれ、流体密度、平均速度、および動的粘度であり，Ｈは、特徴的なチャネルの寸法である。場合によっては、レイノルズ数が１未満のとき、粒子集束の効果が依然として達成され得、したがって、本発明は、〜１＜Ｒｅ＜〜１０００の状況に限定されない。一般に、集束が達成されるＲｅ値の範囲は、液体の密度と粒子の密度との間の差にも依存する。差が大きいほど、たとえば、液体と比較して粒子が重いほど、流体力学的な力によって規定される位置から粒子を引き下げる有効重力（重力と浮力との間の差）が大きくなる。したがって、密度間の差が大きいほど、粒子の軌道の効果的な集束を達成するために、粒子を流体力学的に有利な位置に向ける力がより大きくなければならない。
【０１１６】
本発明は、マイクロ流体フローサイトメトリーの分野に関し、より一般的には、微粒子を含有する流体の分析のためのマイクロ流体技法に関する。それは、それらの特性によって異なる粒子のサブセットまたは細胞の亜集団を識別し、必要であれば、識別された細胞の亜集団または粒子のサブセットを分離するために、そのような技法の改善を扱う。特に、本発明は、マイクロ流体チップを扱い、それによって、検出された信号の変動を低減し、したがって、細胞または粒子のサブセット間の区別をより強固にするために、粒子または細胞のストリームは、制御された方法でマイクロ流体チャネルの断面内に配置される。本発明は、細胞または粒子のセットから測定されたデータの統計的広がりが適切な流体力学的条件下で低減される位置がマイクロ流体チップの検出ゾーンのチャネル内に存在することを教示する。この低減は、チャネル内の粒子（細胞）のより緊密に集束された流れによって、及び、チャネル内の粒子（細胞）のより均質な整列によって、達成される。後者は、粒子（細胞）が円形でない形状、たとえば、細長い、楕円形、または円盤状である場合、特に有用である。本発明はまた、細胞または粒子をそのような好ましい位置を介して導く方法と、粒子の集束が達成され得る流体力学的条件とを教示する。個々の細胞または粒子からの信号の広がりにおける変動が低減され、粒子（細胞）のサブセットの識別がより容易に達成されるチャネル内のそのような位置に微粒子を含有する流体を導くために誘導流体を使用するマイクロ流体チップのいくつかの幾何学的形状が示唆される。本発明者らは、粒子／細胞の識別がインピーダンス分光法を使用して行われる本発明の実施形態を記載する。細胞識別の他の方法、たとえば、蛍光検出または光散乱も、本発明とともに使用され得る。
【０１１７】
概して、本発明は、共通チャネルの検出ゾーン内の微粒子を含有する流体の軌道が共通チャネル内の粒子にとって流体力学的に好ましい位置を通過するように誘導チャネルによって誘導され、微粒子を含有する流体の流れとおよび誘導流体の流れとを単一の共通チャネルにおいて合流させるための手段を備える、微粒子を含有する流体の粒子の位置決めのためのマイクロ流体チップを提供し、そのような位置では、個々の粒子の軌道が共通チャネル内の層流中の粒子に作用する力によってほぼ直線の集束されたビームに束ねられる。
【０１１８】
典型的には、流体力学的に好ましい位置は、共通チャネルの幾何学的中心の実質的に外側に位置する。ふさわしくは、流体力学的に好ましい位置は、共通チャネルの１つまたはいくつかの角の近くにあり、共通チャネルは、矩形形状である。一実施形態では、流体力学的に好ましい位置は、共通チャネルのいくつかの側面の中点の近くにあり、共通チャネルは、実質的に矩形または正方形の断面である。一実施形態では、共通チャネルは、幅が高さよりも実質的に大きい矩形の断面であり、流体力学的に有利な位置は、共通チャネル断面の内部を形成する矩形の長辺の中心のうちの１つに近接して位置する。一実施形態では、微粒子を含有する流体および誘導流体は、微粒子を含有する流体が実質的に非対称なように誘導流体の流れに注入されるように、実質的に非対称なように合流される。一実施形態では、微粒子を含有する流体は、微粒子を含有する流体の注入点から共通チャネル内の検出ゾーンまでの共通チャネル内の流体流のラインに従うことによって、共通チャネル内の流体力学的に有利な位置となる共通チャネルの断面内のそのような点の近くに注入される。
【０１１９】
一実施形態では、微粒子を含有する流体流は、誘導流体を搬送するチャネルの断面の周辺点において微粒子を含有する流体を注入することによって、誘導流体と合流される。一実施形態では、流体力学的に有利な位置が、粒子（細胞）が微粒子を含有する流体の密度よりも大きい密度を有する限り、微粒子を含有する流体の分析のためのチャネルの下部に位置し、粒子（細胞）が微粒子を含有する流体の密度よりも小さい密度を有する限り、微粒子を含有する流体の分析のためのチャネルの上部に位置し、誘導流体流が、粒子（細胞）が選択された流体力学的に有利な位置に向かって誘導されるように配置されるように、流体力学的に有利な位置は、チャネルの断面内のいくつかのそのような可能な流体力学的に安定した位置から選択される。一実施形態では、誘導流体のチャネルは、矩形の断面を有する。一実施形態では、微粒子流体流は、誘導流体のチャネルの角のうちの１つの近くに注入される。一実施形態では、微粒子流体流は、誘導流体を搬送するチャネルの側面のうちの１つの中心の近くに注入される。一実施形態では、微粒子流体は、誘導流体を搬送するチャネルの中心から離れて注入される。一実施形態では、共通チャネル内の粒子について複数の流体力学的に有利な位置が存在し、誘導流体の流れは、粒子を共通チャネル内の流体力学的に有利な位置のサブセットに向けて、他のそのような流体力学的に有利な位置から離れるように導く。
【０１２０】
一実施形態では、チップは、インピーダンス分光法を使用する粒子（細胞）の識別のために使用され、粒子は、誘導流体によって誘導され、電極を有する検出ゾーンを通過し、これらの電極のうちの少なくとも１つは、励起電極であり、少なくとも１つは、検出電極である。
【０１２１】
一実施形態では、励起電極（電極）は、０．１から２００ＭＨｚの範囲内の少なくとも２つの異なる周波数において励起され、信号は、これらの周波数において検出電極において測定される。
【０１２２】
一実施形態では、検出電極において測定される信号は、検出信号の振幅と位相の特徴の両方を含む複素信号である。
【０１２３】
一実施形態では、誘導流体は、検出ゾーンの電極に対して均一なように粒子（細胞）を誘導する。
【０１２４】
一実施形態では、誘導流体は、粒子（細胞）が電極に平行に通過する共通チャネルの検出ゾーン内の軌道に粒子（細胞）を導き、これらの軌道における粒子から電極までの分離距離は、それらの軌道が共通チャネル内の粒子に関する流体力学的に有利な位置のライン上にあるので、すべての粒子についてほぼ同じに保たれる。
【０１２５】
一実施形態では、粒子は、形状が異方性であり、流体力学的に有利な位置は、壁および流体力学的な流れ力の効果が粒子を回転させて電極に対して同じ向きにそれらを整列させるように、チャネルの少なくとも１つの壁の近傍において選択される。
【０１２６】
一実施形態では、粒子（細胞）の分離は、検出ゾーンにおけるそれらの識別に続き、そのような分離は、検出ゾーンを出た後に細胞が到達する分離ゾーンにおいて起こる。
【０１２７】
一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの４つのうちの１つの近くに位置する。一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの４つの角のうちの１つの近くに位置する。
【０１２８】
一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの４つの側面のうちの１つの近くに位置し、共通チャネルは、実質的に矩形または正方形の断面である。
【０１２９】
一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、チャネルの幾何学的形状、それらの密度、サイズを含む粒子の流量および特性、ならびに、それらの密度および粘度を含む微粒子を含有する流体および誘導流体の特性によって定義される。
【０１３０】
本発明は、インピーダンス分光法を使用する微粒子を含有する流体の粒子の識別のためのマイクロ流体チップも提供し、そのようなチップは、電極を有する検出ゾーンに向けて共通チャネルを介して粒子を輸送し、これらの電極のうちの少なくとも１つは、励起電極であり、少なくとも１つは、検出電極であり、そのようなチップは、共通チャネルの検出ゾーン内の微粒子を含有する流体の軌道が共通チャネル内の粒子に関する流体力学的に有利な位置を通過するように誘導流体によって誘導されるように、微粒子を含有する流体の流れと誘導流体の流れとを単一の共通チャネルにおいて合流させるための手段をさらに備え、個々の粒子の軌道は、共通チャネル内の層流内の粒子に作用する力によってほぼ直線の集束されたビームに束ねられ、誘導流体の流れは、粒子を共通チャネル内の流体力学的に有利な位置のあるサブセットに向けて、他のそのような流体力学的に有利な位置から離れるように導き、粒子が導かれるそのような位置は、共通チャネル内の他の流体力学的に有利な位置よりも励起電極の近くに位置する。
【０１３１】
一実施形態では、励起電極（電極）は、０．１〜２００ＭＨｚの範囲内の２つ以上の異なる周波数において励起され、信号は、これらの周波数において検出電極において測定される。
【０１３２】
一実施形態では、検出電極において測定される信号は、検出信号の振幅と位相の特徴の両方を含む複素信号である。
【０１３３】
一実施形態では、粒子は、形状が異方性であり、流体力学的に有利な位置は、壁および流体力学的な流れの効果が、粒子を回転させて電極に対して同じ向きに優先的にこれらを整列させるように、チャネルの少なくとも１つの壁の近傍において選択される。
【０１３４】
本発明は、共通チャネルの検出ゾーン内の微粒子を含有する流体の軌道が共通チャネル内の粒子に関する流体力学的に有利な位置を通過するように誘導流体によって導かれるように、微粒子を含有する流体の流れと誘導流体の流れとを単一の共通チャネルにおいて合流させるための手段を備える、微粒子を含有する流体の粒子の位置決めのためのマイクロ流体チップも提供し、個々の粒子の軌道は、共通チャネル内の層流内の粒子に作用する力によってほぼ直線の集束されたビームに束ねられ、粒子の識別のために光検出が使用される。
【０１３５】
一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの幾何学的中心の実質的に外側に位置する。
【０１３６】
一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの角のうちの１つまたはいくつかの近傍にあり、共通チャネルは、矩形形状である。
【０１３７】
一実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネルのいくつかの側面の中点の近傍に位置し、共通チャネルは、矩形または正方形の断面である。
【０１３８】
一実施形態では、共通チャネルは、幅が高さよりも実質的に大きい矩形の断面であり、流体力学的に有利な位置は、共通チャネル断面の内部を形成する矩形の長辺の中心のうちの１つに近接して位置する。
【０１３９】
一実施形態では、微粒子を含有する流体および誘導流体は、微粒子を含有する流体が実質的に非対称なように誘導流体の流れに注入されるように、実質的に非対称なように合流される。
【０１４０】
一実施形態では、微粒子を含有する流体は、誘導流体を搬送するチャネルの断面の周辺点においてそれを注入することによって誘導流体と合流される。
【０１４１】
一実施形態では、微粒子を含有する流体は、微粒子を含有する流体の注入点から共通チャネル内の検出ゾーンまでの共通チャネル内の流体のラインに従うことによって、共通チャネル内の流体力学的に有利な位置となる共通チャネルの断面内のそのような点の近くに注入される。
【０１４２】
一実施形態では、粒子は、形状が異方性であり、流体力学的に有利な位置は、壁および流体力学的な流れ力の効果が、粒子を回転させて検出器の入ってくる光ビームに対して同じ向きにそれらを整列させるように、チャネルの少なくとも１つの壁の近傍において選択される。
【０１４３】
本発明は、微粒子を含有する流体の粒子の位置決めおよび整列のためのマイクロ流体チップも提供し、そのような粒子は、形状が異方性であり、マイクロ流体チップは、微粒子を含有する流体の流れと誘導流体の流れとを単一の共通チャネルにおいて合流させ、共通チャネル内の層流内の粒子に作用する力によって粒子軌道のラインの集束されたビームを形成するための手段を備え、円盤状粒子の場合は粒子の短軸、または細長い粒子の場合は長軸の整列の方向は、共通チャネル内の微粒子を含有する流体のボディを誘導流体のボディから分離する境界に沿う。
【０１４４】
一実施形態では、微粒子を含有する流体および誘導流体は、微粒子を含有する流体が実質的に非対称なように誘導流体の流れに注入されるように、実質的に非対称なように合流される。
【０１４５】
一実施形態では、微粒子を含有する流体流は、誘導流体を搬送するチャネルの断面の周辺点において微粒子を含有する流体を注入することによって、誘導流体と合流される。
【０１４６】
本発明は、マイクロ流体フローサイトメータまたは粒子分析器における信号の変動性の問題に取り組む。それは、信号変動性を低減するために検出チャネル内の粒子および細胞を流体力学的に集束させる方法を教示し、本発明を実施するための装置および方法を提供する。粒子の流れがチャネルの中心において集束されるマイクロ流体チップで使用される従来の３次元流体力学的集束とは対照的に、本発明は、粒子／細胞が検出チャネルの中心に集束されるべきではないことを示唆する。従来技術とは対照的に、本発明者らは、粒子を流れチャネルの角に集束させるためにシースストリームを使用し、そこでは、粒子の位置は、層流の正しく適切な条件下で安定している。本発明者らの装置および方法は、慣性揚力による粒子の安定した流体力学的位置を考慮し、したがって、従来技術で使用されるよりも安定した集束を提供する。
【０１４７】
本発明は、インピーダンス分光法を使用する微粒子を含有する流体の粒子の識別のためのマイクロ流体チップも提供し、そのようなチップは、電極を有する検出ゾーンに向けて共通チャネルを介して粒子を輸送し、これらの電極のうちの少なくとも１つは、励起電極であり、少なくとも１つは、検出電極であり、そのようなチップは、共通チャネルの検出ゾーン内の微粒子を含有する流体の軌道が共通チャネル内の粒子に関する流体力学的に有利な位置を通過するように誘導流体によって導かれるように、微粒子を含有する流体の流れと誘導流体の流れとを単一の共通チャネルにおいて合流させるための手段をさらに備え、個々の粒子の軌道は、共通チャネル内の層流内の粒子に作用する力によってほぼ直線の集束されたビームに束ねられ、誘導流体の流れは、粒子を共通チャネル内の流体力学的に有利な位置のあるサブセットに向けて、他のそのような流体力学的に有利な位置から離れるように導き、粒子が導かれるそのような位置は、共通チャネル内の他の流体力学的に有利な位置よりも励起電極の近くに位置する。
【０１４８】
一実施形態では、励起電極（電極）は、０．１から２００ＭＨｚの範囲内の２つ以上の異なる周波数において励起され、信号は、これらの周波数において検出電極において測定される。
【０１４９】
一実施形態では、検出電極において測定される信号は、検出信号の振幅と位相の特徴の両方を含む複素信号である。
【０１５０】
一実施形態では、粒子は、形状が異方性であり、流体力学的に有利な位置は、壁および流体力学的な流れの効果が、粒子を回転させて電極に対してそれらを同じ向きに優先的に整列させるように、チャネルの少なくとも１つの壁の近傍において選択される。
【０１５１】
粒子が異方性の形状である微粒子を含有する流体の粒子の位置決めおよび整列のためのマイクロ流体チップであって、チップは、微粒子を含有する流体の流れと誘導流体の流れとを単一の共通チャネルにおいて合流させ、共通チャネル内の層流内の粒子に作用する力によって粒子軌道のラインの集束されたビームを形成するための手段を備え、円盤状粒子の場合は粒子の短軸、または細長い粒子の場合は長軸の整列の方向は、共通チャネル内の微粒子を含有する流体のボディを誘導流体のボディから分離する境界に沿う。
例
【０１５２】
本発明を、特定の例を参照して以下に記載する。これらは、単に例示であり、説明の目的だけのためのものであり、それらは、特許請求された独占権の範囲にまたは記載された本発明に如何なる形式においても限定されることを意図されない。これらの例は、本発明を実施するために現在考えられる最良の形態を構成する。
【０１５３】
図２ａ、図２ｂ、および図２ｃは、２つのチャネルの断面を示し、より小さいチャネル４ａは、微粒子を含有する流体４ｂを搬送し、より大きいチャネル５ａは、誘導流体５ｂを搬送する。誘導流体は、図面を明瞭にするために示されていない。チャネルの全体的な断面５ａは、通常、誘導流体で満たされる。微粒子を含有する流体チャネル４ａは、幅および高さが０．００５〜１ｍｍの断面を有する。いくつかの特殊な場合、ミリメートル未満の範囲の小さい高さと組み合わされる場合、１０ｍｍまでの幅が考慮され得る。案内流体を搬送するチャネル５ａは、０．０５〜１０ｍｍ×０．０５〜１０ｍｍの範囲の断面を有する。チャネル４ａおよび５ａは、ＰＭＭＡのようなポリマー材料で作られるが、非ポリマー材料、たとえば、ガラスでも作られ得る。図２ａは、図３の断面Ａ−Ａ’における、２つのチャネル４ａおよび５ａが合流する点におけるチャネル４ａおよび５ａを示す。数字３によって示される２つのチャネルを分離する壁は、その点において消え、壁の位置は、破線で示される。図２ｃは、図３の断面Ｃ−Ｃ’における２つのチャネル４ａおよび５ａを示し、２つのチャネルを分離する壁３は、典型的には０．００５〜１ｍｍの範囲の有限の壁を有する。図２ｂは、図３の断面Ｂ−Ｂ’における２つのチャネル４ａおよび５ａを示す。その点において、壁３は、図２ｃにおけるよりも薄いが、まだ存在している。装置の断片の上面図が図３に示されている。２つのチャネル４ａおよび５ａは、単一の共通チャネル８ａを形成するように合流する。図２ｄ、図２ｅ、図２ｆは、それぞれ、断面Ｄ−Ｄ’、Ｅ−Ｅ’、およびＦ−Ｆ’における共通チャネル８ａの詳細を示す。共通チャネル８ａは、微粒子流体を搬送するチャネル４ａの寸法とは異なる寸法を有してもよい。粒子４ｂ（細胞）の位置は、各チャネルにおいて点の雲によって示されている。共通チャネル８ａは、典型的には、微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの累積的な断面よりも小さい断面を有する。共通チャネル８ａは、典型的には、０．００５〜１０ｍｍの範囲の内部の幅および高さを有する。３つのチャネルのすべては、数字８によって示される単一のマイクロ流体チップ上に製造され得る。図２ｆおよび図３に示されている実施形態は、インピーダンス分光装置の電極（励起電極６および測定電極７）も示す。この場合、粒子の検出および識別は、電極６と電極７との間を通過する粒子によるインピーダンスの変化の測定に基づく。実施形態は、４つの電極を有し、これらのうちの２つは、共通チャネル８ａの上に位置し（６および６‘によって示される）、２つの電極は、その下にある（７および７’によって示される）。チャネルの上壁および下壁は、０．１〜１０ｍｍの範囲内であるが、典型的には約０．５ｍｍであり得る。２つのチャネルが合流する点から電極の位置までの距離は、典型的には０．０５〜１ｍｍの範囲内であるが、この範囲外であってもよい。電極６、６‘、７、および７’が配置される場所は、検出ゾーンと呼ばれる。この実施形態では、流体力学的に有利な位置は、共通チャネル８ａの４つの角にある。それらは、数字９ａ、９ｂ、９ｃ、９ｄによってマークされている。これらの４���の流体力学的に有利な位置９ａ〜９ｄは、たとえば、０．５６ｍ／秒の流速と、３０マイクロメートル幅×３０マイクロメートル高さのサイズのチャネルとを有する、リン酸生理食塩水緩衝液中の赤血球の懸濁について達成される。流速を参照するとき、本発明者らは、共通チャネル８ａの中心における速度を指す。層流チャネルにおけるこの速度は、チャネルの中心において最大であり、チャネルの壁に近づくにつれて減少する。共通チャネル８ａの断面が微粒子を含有する流体４ａおよび誘導流体チャネル５ａの累積的な断面と比較して減少するので、共通チャネル８ａ内の流体の線速度は、誘導流体チャネル５ａ内の速度よりも大幅に大きい。誘導流体チャネル５ａの左上角への微粒子を含有する流体４ｂの注入は、他の３つの位置よりも位置９ａに有利である。細胞の有利な位置は、共通チャネルの壁から幾分離れて位置する。有利な位置の場所は、流体の密度および粘度によって定義されるレイノルズ数、流れの線速度、チャネルの寸法に依存する。それぞれ４０マイクロメートルおよび４０マイクロメートルの幅および高さを有するチャネル８ａ、０．３ｍ／秒の共通チャネル８ａの中央における線流速、ならびに共通チャネル内の水ベースの流体について、有利な位置は、角を形成する２つの壁のそれぞれから約０．００５ｍｍに位置する。これらの値は、共通チャネルの全体的な幅および高さならびに流れの条件とともに増加または減少する。矩形断面の共通チャネル内の流体力学的に有利な位置は、粒子分析器（細胞サイトメータ）に等しく適しているとは限らない。粒子（細胞）の密度が微粒子を含有する流体の密度よりも著しく大きい場合、共通チャネルの下部の角のうちの１つにおける位置を選択することが好ましい場合がある。粒子（細胞）の密度が微粒子を含有する流体の密度よりも著しく小さい反対の場合、共通チャネルの上部の角のうちの１つにおいて流体力学的に有利な位置を選択することが有利である場合がある。この選択は、粒子に作用する重力および浮力の影響と一致する。これらの２つの力の蓄積作用が粒子を引き下げている場合、チャネルの床に近い流体力学的に有利な位置を選択することは、力の集束ずれ効果を減少させる。同じ理論的根拠は、粒子（細胞）を搬送する流体よりも低い密度を有し、したがって、重力および浮力の蓄積作用として上向きの力を経験する粒子（細胞）の他の状況にも当てはまる。この場合、天井への流体力学的に有利な位置の近接は、そのような重力起源の力の集束ずれ効果を低減する。これらの考察は、チップが水平に配置されていることを仮定して当てはまる。選択された流体力学的に有利な位置が共通チャネルの床のより近くに位置する場合、励起電極７および７’がチャネル内の粒子（細胞）のより近くに位置するように、励起電極６および６’ならびに検出電極７および７’の位置を交換してサイトメータの感度を増加させることが有利である場合がある。誘導流体チャネルの断面に対する微粒子を含有するチャネルの相対位置は、選択された流体力学的に有利な位置によって与えられる。この場合、選択された流体力学的に有利な位置は、共通チャネルの左上の角にあり、これは、微粒子を含有する流体の注入が誘導流体チャネルの左上��角において行われることを決定する。細胞は、図２ｆに示されているように、軌道の緊密な束を形成する有利な位置を通って来る。検出ゾーン内の束の断面の寸法は、流速（流量）のような流れの条件、チャネルが合流する点から検出ゾーンまでの距離、および共通チャネルの寸法に依存する。しかしながら、この場合に重要なのは、粒子（細胞）が流体力学的に有利な位置のいずれにおいてもより緊密な束に束ねられ得ることである。
【０１５４】
以下では、本発明者らは、図２および図３に提示された実施形態よりも製造するのが容易ないくつかの実施形態を説明する。第１のそのような実施形態は、図４および図５に示されている。図４は、図５の断面Ｋ−Ｋ’に対応する。この場合、実施形態は、微粒子を含有する流体４ａのチャネルと同じ高さの共通チャネル８ａの高さを有し、それは、ＳＵ−８フォトポリマー材料を使用するポリマーフォトリソグラフィ法を使用してチップを製造することをより容易にする。共通チャネル８ａの幅は、微粒子を含有する流体チャネル４ａの幅と等しくても異なってもよい。図５における実施形態は、２つの幅が等しい状況を示す。このようにして、共通チャネル８ａは、その軸に沿った微粒子を含有する流体チャネル４ａの幾何学的連続である。共通チャネル８ａが微粒子を含有する流体４ａのチャネルの方向に対してある角度をなす、すなわち、共通チャネル８ａの長さに沿って曲がりが存在するデバイスの実施形態も可能である。誘導流体チャネル５ａは、微粒子を含有する流体チャネル４ａと３〜３０°の角度を形成するように配向される。この点で、図５に示されている実施形態は、誘導流体チャネル５ａが微粒子を含有する流体チャネル４ａとそれらの合流点において接する、すなわち、それらの間の角度がゼロである図３における実施形態と異なる。誘導流体チャネル５ａは、図５において文字Ａによってマークされた点において消滅する。誘導流体チャネル５ａ、微粒子を含有する流体チャネル４ａ、および共通チャネル８ａの幅および高さ、チャネルの床およびチャネルの天井の壁厚は、図２および図３ならびにチャネルにおける線流速を参照して示されているものの寸法と同様である。図２および図３のものと同様の４つの電極６、６’、７、および７’の配置が存在する。微粒子を含有する流体チャネル４ａは、誘導流体チャネル５ａのすぐ上に位置し、図２に示されている実施形態とは異なり、それらを分離する壁が存在せず、それは、図２に示されてるマイクロ流体チップと比較して製造をより容易にする。微粒子流体を含有するチャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａは、図５においてマークされている点Ｂと点Ａとの間で合流する。この場合、微粒子を含有する流体４ｂは、共通チャネル８ａの左上の角に近接して位置する４つの流体力学的に有利な位置のうちの１つに向けて誘導される。
【０１５５】
図６および図７は、微粒子を含有する流体チャネル４ａが誘導流体チャネル５ａにその右上の角において入る別の実施形態を示す。図６は、線Ｋ−Ｋ’に沿った図７に示されているチャネルの断面を示す。２つのチャネル４ａおよび５ａは、実線によって分離されているものとして図７において示されているが、その点において２つのチャネルを分離する壁は存在しない。図４および図５に関連して作られた、チャネルの寸法、流れの条件、電極、マイクロ流体チップの製造可能性などに関するすべての点は、図６および図７にも当てはまる。この場合、微粒子を含有する流体４ｂは、共通チャネルの左上の角の近位に位置する４つの流体力学的に有利な位置のうちの１つに向けて誘導される。
【０１５６】
微粒子流体を搬送するチャネル４ａおよび誘導チャネル５ａは、矩形または正方形の断面を有する必要はない。微粒子流体を搬送するチャネル４ａが三角形断面を有する実施形態が図８および図９に示されている。図４および図５に関連する図面の要素のすべての説明および意味は、図８および図９にも当てはまる。インピーダンス分光器の電極は、簡潔にするために示されていない。インピーダンス分光法は、粒子（細胞）の分析のために使用され得るいくつかの可能な手段のうちの１つに過ぎないので、この開示文書に示されている実施形態のいずれも、電極なしで使用され得ることが強調されるべきである。従来の細胞サイトメータまたは粒子分析器におけるものと同様の光散乱方法または光学的蛍光検出方法を使用することもできる。再び、図８において２つのチャネルを分離する壁は存在せず、チャネルを分離する図８における実線は、チャネルの幾何学的境界の輪郭を描くものである。図８は、図９の断面Ｋ−Ｋ’に対応する。この場合、微粒子を含有する流体４ａは、共通チャネルの左上の角に近位に位置する４つの流体力学的に有利な位置のうちの１つに向けて誘導される。
【０１５７】
別の実施形態が図１０および図１１において示されている。図４および図５に関連する図面の要素のすべての説明および意味は、図１０および図１１にも当てはまり、簡潔にするために繰り返されない。この場合、微粒子を含有する流体は、共通チャネルの左上の角に近接して位置する４つの流体力学的に有利な位置のうちの１つに向けて誘導される。
【０１５８】
別の実施形態が図１２および図１３において示されている。この場合、微粒子流体を含有するチャネル４ａは、誘導流体チャネル５ａの上に位置し、それは、図４および図５におけるのと同じである。しかしながら、図４および図５に示されてる実施形態とは異なり、２つのチャネルは、チャネルのいくらかの部分において壁（膜）３によって分離される。この部分は、図１３において破線の三角形によって示されている。図１２は、図１３の線Ｋ−Ｋ’に沿った断面に対応する。図１３の線Ｋ−Ｋ’の上の領域において、膜３は、消滅し、誘導流体チャネル５ａは、ゼロの幅に先細りにされる。誘導流体チャネル５ａは、図１３においてマークされている点Ｂと点Ａとの間の範囲内で共通チャネル８ａに沿って先細りにされる。これは、前の図に関するのと同じである。この場合、微粒子を含有する流体４ｂは、共通チャネルの２つの対向する側面、共通チャネルの上壁、その天井の中心の近位に位置する２つの流体力学的に有利な位置のうちの１つに向けて誘導される。他の同等の流体力学的に有利な位置は、共通チャネル８ａの床において位置する。
【０１５９】
図１４および図１５は、装置の別の実施形態を示す。表記は、前の図と同じである。誘導流体チャネル５ａは、共通チャネルに沿って点Ｂと点Ａとの間で先細りにされる。図１４は、図１５の線Ｋ−Ｋ’に沿った断面を表す。
【０１６０】
図１６および図１７は、装置の別の実施形態を示す。表記は、前の図と同じである。
【０１６１】
粒子（細胞）分析器の分解能を改善するために、検出システムに対して同じ方法で粒子を整列させることが重要であることが、文書において前に説明されている。粒子／細胞がそれらの応答において等方性である場合、この考慮は、無関係である。しかしながら、異方性粒子について、考慮は、有効である。本発明は、粒子または細胞を流体力学的に有利な位置に閉じ込めることに加えて、粒子または細胞のより良好な整列を達成することを可能にする。これは、図１８、１９、２０において説明される。粒子が、たとえば、細長いまたは円盤状の形状である場合、それらは、微粒子を含有する流体を誘導流体から分離する表面に平行にそれらの長軸を整列させる。図１８ａおよび図１９ａは、微粒子を含有する流体チャネル４ａおよび誘導流体チャネル５ａの、それらが合流する点における断面を示す。これらのチャネルの各々の断面積は、図１８ａおよび図１９ａにおけるのと同じである。しかしながら、誘導流体５ａのチャネルおよび微粒子を含有する流体４ａのチャネルのアスペクト比に差がある。図１８ａに示されている実施形態の場合、誘導流体チャネル５ａは、幅よりも大きい高さを有する。図１９ａに示されている実施形態の場合、状況は、逆である。図１８ｂおよび図１９ｂは、図１８ａおよび図１９ａのスケールの５倍のスケールを有する共通チャネル８ａの断面を示す（すなわち、共通チャネルが拡大されて示されている）。図１９ｂの実施形態の場合、粒子または細胞２０は、図１８ｂの実施形態と比較して垂直線の非常により近くに整列される。これは、影付きの楕円によって概略的に示されている。
【０１６２】
同様に、図２０ａおよび図２０ｂに示されている実施形態の場合。図１８、図１９におけるのと同様に、図２０ｂは、図２０ａに示されている断面から短い距離、約０．１ｍｍ下流の共通チャネル８ａの断面を示し、図２０ｂにおける断面は、図２０ａにおけるスケールよりも５倍大きいスケールで示されている（拡大されている）。この場合、微粒子を含有する流体４ｂを誘導流体５ｂから分離する線は、垂直であり、細胞または粒子２０は、垂直に配向された長軸と整列される。
【０１６３】
本発明者らは、ウシ精子細胞の整列、ならびにバルク精子サンプルからＸ  ＤＮＡ担持（メス）精子細胞およびＹ  ＤＮＡ担持（オス）精子細胞を分離するためのインピーダンス信号の改善について、上記で説明した構成を使用した。精子細胞は、非円形細胞の典型的な例であり、その正確なインピーダンス検出は、困難であり、検出電極の表面に対する細胞の配向および整列に依存する。本発明者らは、図２１ａにおいて示されているチャネル構成を有するインピーダンスチップを設計しており、そこでは、上および左から来るサンプル流チャネル４ａ内を流れる精子細胞は、下および右から来ている誘導流体チャネル５ａ内の誘導流体を受ける。本発明者らは、次いで、マイクロ流体チャネルを画定するためのＳＵ−８フォトリソグラフィプロセスと、電極構造を画定するための金電極堆積プロセスとを使用してＰＭＭＡプラスチック材料においてインピーダンスチップを製造した（図２１ｂおよび図２１ｃ）。誘導流体チャネルは、細胞を特定の角度に向けるのに適した幾何学的形状を有することが不可欠である。この調査のために、本発明者らは、誘導チャネル２００μｍ×２５０μｍおよびサンプルチャネル３０μｍ×３０μｍのケース１８ｂの寸法を選択した。
【０１６４】
製造されたチップが図２１ｂにおいて示されている。チャネル交差部および検出領域のクローズアップが図２１ｃに示されている。
【０１６５】
非対称集束チップがどれくらい良好に細胞を配向するのかを評価するために、本発明者らは、異なる３Ｄ集束比を用いていくつかの実験を行った。
【０１６６】
【表１】
2019518971.tif 000003
【０１６７】
条件３および４は、精子サイズを図２２によるサンプルストリームの寸法と一致させるための集束比を用いた。インピーダンス検出は、細胞の異なる亜集団を区別するために、０．５ＭＨｚの励起周波数でのインピーダンス信号の変化においてトリガし、１５ＭＨｚの励起周波数でのインピーダンス振幅およびインピーダンス位相の変化を検出することによって行われた。インピーダンス図（１５ＭＨｚにおけるＸ軸−インピーダンス振幅および１５ＭＨｚにおけるＹ軸インピーダンス位相）が図２３ａ〜図２３ｅに提示されている。図２３ａでは、本発明者らは、細胞の流体力学的集束を用いない実験の結果を示しており、そこでは、サンプル流量が３０μｌ／分であり、誘導流が停止されていた。インピーダンス図には細胞の１つの集団のみが存在し、大部分の細胞は、低インピーダンス信号を有している。これは、検出電極に垂直な細胞の向きに対応する。誘導流が導入されると（図２３ｂ）、より高いインピーダンス振幅、したがって検出電極に平行な向きに対応する第２の集団が現れる。２つの集団、赤色の配向されていない細胞、緑色の配向された細胞が見える。配向された細胞に対する配向されていない細胞の割合は、８５％〜１５％である。図２３ｃにおける条件３について、配向された細胞（赤色）の割合は、配向されていない（緑色）の７０％に対して３０％に増加した。図２３ｄにおける条件４についても、配向された細胞（赤色）の割合は、配向されていない（緑色）の６５％に対して３５％に増加した。本発明者らが誘導流体流を２５μｌ／分に増加させ続けると、細胞は、所望の配向を維持する余地がなく、したがって、整列外に回転され、割合は、５％の配向されたに対する９５％の配向されていないに減少した。
【０１６８】
２２μｌ／分の誘導に対する８μｌ／分のサンプルの比、および３０μｌ／分の組み合わされた流量が使用されたときに、最良の配向が達成されることが、図２３ａ〜図２３ｅから明らかであり、それは、マイクロチャネル比８／３０に対する精子のサイズに直接対応する。より高い絞り比が使用されると、それは、精子が特定の配向を失う原因になる。
【０１６９】
本発明者らは、３つの異なるサンプル、すなわち、Ｘ担持細胞およびＹ担持細胞を含むバルク（選別されていない精子）、予め選別されたＸ担持のみの精子細胞、ならびに予め選別されたＹ担持のみの精子細胞を用いて、条件３、ならびに対応する８μｌ／分のサンプル流量および２２μｌ／分の誘導流量の下での実験をさらに行った。結果が図２４ａ〜図２４ｃに示されている。バルクの選別されていないサンプルが導入されたとき、２つの異なる集団（Ｘ担持精子細胞およびＹ担持精子細胞）が見られることが、図２４ａから明らかである。選別されたサンプルのみが導入された場合、１の集団のみが見られ、この集団の中央値は、Ｙ選別された精子２４ｃの場合には左にシフトされ、Ｘ選別された精子２４ｂの場合には右にシフトされる。これは、Ｘ選別されたサンプルおよびＹ選別されたサンプルに対応する図２５ａおよび図２５ｂにおいて、配向された細胞のみが考慮される場合、さらに強化される。これらの実験の結果は、細胞の配向が細胞のインピーダンスにおける微小な差異の検出にとってきわめて重要である、重要な例を強調している。本発明の方法を使用することなく、本発明者らは、バルクの選別されていない精子中のいかなる亜集団も識別することができず、インピーダンス信号は、低かった（図２３ａ）。本発明を使用することによって、本発明者らは、検出電極に対して細胞を配向させることができ、Ｘ担持精子細胞およびＹ担持精子細胞の個々の亜集団の検出を可能にすることができた（図２４ａ〜図２４ｃ）。
【０１７０】
等価物
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの記述を考慮すると、その実際の多数の修正および変形が当業者に予想される。それらの修正および変形は、本明細書に添付された特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【０１７１】
参考文献
１．”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｅｒｔｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｊｕｎ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ．ａｌ，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１５
【０１７２】
２．”Ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｈｙｓｉｃｓ”，Ｈａｍｅｄ  Ａｍｉｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，Ｉｓｓｕｅ  １５，２０１４
【０１７３】
３．”Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ”，Ｊｉａｎ  Ｚｈｏｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，Ｉｓｓｕｅ  ６，  ２０１３
【０１７４】
４．”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ，ｏｒｄｅｒｉｎｇ，ａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌｓ”，Ｄｉｎｏ  Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  ｅｔ．ａｌ，ＰＮＡＳ，ｖｏｌｕｍｅ  １０４，Ｎｏ  ４８，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７
【０１７５】
５．ＷＯ２００８／１２５０８１Ａｌ，”Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ”Ｔｈｅｉｓｅｎ  Ｊａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，２３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８
【０１７６】
６．”Ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ”，Ｍａｒｃｉｎ  Ｆｒａｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２０１３，１３，４６７４−４６９３
【０１７７】
７．”Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ”，Ｙｕ−Ｊｕｉ  Ｃｈｉｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，１３，２０１３
【０１７８】
８．ＵＳ２００９／０２８３１４８Ａｌ，”Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  ａｎｄ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ”，Ｍａｓａｔａｋａ  Ｓｈｉｎｏｄａ，Ｍａｙ  ４  ２００９．
【０１７９】
９．”Ａ  ｒｏｂｕｓｔ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｗｉｔｈ  ３−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｙｄｒｏｆｏｃｕｓｉｎｇ”，Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｗａｔｋｉｎｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，ｖｏｌｕｍｅ  ９，ｎｏ  ２２，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９
【０１８０】
１０．”Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｍｉｋａｅｌ  Ｅｖａｎｄｅｒ  ｅｔ．ａｌ．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，ｖｏｌｕｍｅ１３，２０１３
【０１８１】
１１．”Ｍｕｌｔｉ−ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ”，Ｊｏｅｌ  Ｐ．Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，９，２００９
【０１８２】
１２．”Ｔｗｏ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒｕｇｇｅｄ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ”，Ｐｅｔｅｒ  Ｂ．Ｈｏｗｅｌｌ  Ｊｒ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ，８，２００８
【０１８３】
１３．”Ａ  ｈａｒｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｇｒｏｏｖｅ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｈｅａｔｈ  ｆｌｏｗ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｂｅａｄ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ａｓｓａｙｓ”，Ａｂｅｌ  Ｌ．Ｔｗａｎｇａｗｎｇ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９８：１８７１−１８８１，２０１０
【０１８４】
１４．”Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｆｌｕｉｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ”．Ｂａｔｃｈｅｌｏｒ  Ｇ．Ｋ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．２１１−２１５，１９６７
【０１８５】
１５．”Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ  ｔｏ  Ｒａｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ”，Ｃ．Ｗｙａｔｔ  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＩＶ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．２０１５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １６，１５（５）：１２３０−１２４９
【図１ａ】
2019518971.tif 000004
【図１ｂ】
2019518971.tif 000005
【図２ａ】
2019518971.tif 000006
【図２ｂ】
2019518971.tif 000007
【図２ｃ】
2019518971.tif 000008
【図２ｄ】
2019518971.tif 000009
【図２ｅ】
2019518971.tif 000010
【図２ｆ】
2019518971.tif 000011
【図３】
2019518971.tif 000012
【図４】
2019518971.tif 000013
【図５】
2019518971.tif 000014
【図６】
2019518971.tif 000015
【図７】
2019518971.tif 000016
【図８】
2019518971.tif 000017
【図９】
2019518971.tif 000018
【図１０】
2019518971.tif 000019
【図１１】
2019518971.tif 000020
【図１２】
2019518971.tif 000021
【図１３】
2019518971.tif 000022
【図１４】
2019518971.tif 000023
【図１５】
2019518971.tif 000024
【図１６】
2019518971.tif 000025
【図１７】
2019518971.tif 000026
【図１８ａ】
2019518971.tif 000027
【図１８ｂ】
2019518971.tif 000028
【図１９ａ】
2019518971.tif 000029
【図１９ｂ】
2019518971.tif 000030
【図２０ａ】
2019518971.tif 000031
【図２０ｂ】
2019518971.tif 000032
【図２１ａ】
2019518971.tif 000033
【図２１ｂ】
2019518971.tif 000034
【図２１ｃ】
2019518971.tif 000035
【図２２】
2019518971.tif 000036
【図２３ａ】
2019518971.tif 000037
【図２３ｂ】
2019518971.tif 000038
【図２３ｃ】
2019518971.tif 000039
【図２３ｄ】
2019518971.tif 000040
【図２３ｅ】
2019518971.tif 000041
【図２４ａ】
2019518971.tif 000042
【図２４ｂ】
2019518971.tif 000043
【図２４ｃ】
2019518971.tif 000044
【図２５ａ】
2019518971.tif 000045
【図２５ｂ】
2019518971.tif 000046
【国際調査報告】
2019518971.tif 000047
2019518971.tif 000048
2019518971.tif 000049