(57)【要約】  本発明は、グルコセレブロシダーゼ関連障害を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩（アリモクロモル）から選択される医薬品有効成分に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分。
【請求項２】
前記ＧＢＡ関連障害が、ゴーシェ病（ＧＤ）ではない、請求項１に記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ関連α−シヌクレイン病である、請求項１に記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項４】
前記ＧＢＡ関連α−シヌクレイン病がＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項５】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ関連パーキンソン症候群である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項６】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ関連パーキンソン病である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項７】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ酵素レベルの低下に関連する、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項８】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ酵素活性の減少に関連する、請求項１〜７のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項９】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ酵素活性および／またはレベルの低下に関連し、前記ＧＢＡ遺伝子が野生型であり、およびＧＢＡ活性の減少がタンパク質活性の抑制または遺伝子／タンパク質の転写もしくは翻訳の阻止に起因する、または特発性である、請求項１〜８のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１０】
前記ＧＢＡ関連障害が、１または複数の個別のＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜９のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１１】
前記ＧＢＡ関連障害を有する個体が、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１２】
前記ＧＢＡ関連障害が、１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１３】
前記ＧＢＡ関連障害が、ホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連し、前記ＧＢＡ関連障害が、ゴーシェ病ではない、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１４】
前記１または複数の個別のＧＢＡ遺伝子変異が、軽度（ＧＤＩ型に関連する）である、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１５】
前記１または複数の個別のＧＢＡ遺伝子変異が、重度（ＧＤＩＩ型およびＩＩＩ型に関連する）である、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１６】
前記ＧＢＡ遺伝子変異が、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１７】
前記ＧＢＡ遺伝子変異がＬ４４４Ｐである、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１８】
前記ＧＢＡ遺伝子変異がＥ３２６Ｋである、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項１９】
前記ＧＢＡ遺伝子変異がＮ３７０Ｓである、請求項１〜１８のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２０】
前記ＧＢＡ関連障害が、Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖのヘテロ接合体である、請求項１〜１９のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２１】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ変異保因者、例えば絶対保因者、例えばゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない保因者である、請求項１〜２０のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２２】
前記ＧＢＡ関連障害が、臨床的に影響を受けないゴーシェ病患者の親または同胞である、請求項１〜２１のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２３】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、ＧＢＡ酵素レベルの低下および／またはＧＢＡ酵素活性の減少に関連する、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２４】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、１または複数のＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜２３のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２５】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜２４のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２６】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、１または複数のホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異または複合ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜２５のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２７】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５ＲおよびＰ４１５Ｒからなる群から選択される１または複数のＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２８】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、ヘテロ接合またはホモ接合のＮ３７０Ｓ／Ｎ３７０ＳＧＢＡ遺伝子変異に関連する、請求項１〜２７のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項２９】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、遺伝的危険性の高いパーキンソン病ＧＢＡ遺伝子型に関連する、請求項１〜２８のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３０】
前記ＧＢＡ関連パーキンソン病が、同定されたＧＢＡ遺伝子変異を伴わない特発性ＧＢＡ酵素活性および／またはレベルの低下に関連する、請求項１〜２９のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３１】
前記医薬品有効成分が、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドのラセミ化合物である、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３２】
前記医薬品有効成分が、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの光学活性立体異性体である、請求項１〜３１のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３３】
前記医薬品有効成分が、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの鏡像異性体である、請求項１〜３２のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３４】
前記医薬品有効成分が、
（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、および
（−）−（Ｓ）−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド
からなる群から選択される、請求項１〜３３のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３５】
前記医薬品有効成分が、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの酸付加塩である、請求項１〜３４のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３６】
前記医薬品有効成分が、
Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート、および
Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアート
からなる群から選択される、請求項１〜３５のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３７】
前記医薬品有効成分が、
（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート、
（−）−（Ｓ）−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート、
（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアート、および
（−）−Ｓ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアート
からなる群から選択される、請求項１〜３６のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３８】
前記治療が予防、治癒または改善のためである、請求項１〜３７のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項３９】
個体においてゴーシェ病以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害を発症する危険性を減少させる方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分であって、前記個体がＧＢＡレベルの低下および／またはＧＢＡ活性の減少を有する、医薬品有効成分。
【請求項４０】
ＧＢＡレベルおよび／または活性が低下した前記個体が、ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異など、またはホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異などの１または複数のＧＢＡ遺伝子変異を有する、請求項３９に記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項４１】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ関連パーキンソン症候群、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群から選択されるＧＢＡ関連α−シヌクレイン病などのＧＢＡ関連α−シヌクレイン病である、請求項３９〜４０のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項４２】
前記ＧＢＡ関連障害が、ＧＢＡ関連パーキンソン病である、請求項４０に記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項４３】
前記個体が、仮想野生型活性および／またはレベルの約５〜９５％、例えば仮想野生型活性および／またはレベルの５〜１０％、例えば１０〜２０％、例えば２０〜３０％、例えば３０〜４０％、例えば４０〜５０％、例えば５０〜６０％、例えば６０〜７０％、例えば７０〜８０％、例えば８０〜９０％、例えば９０〜９５％のＧＢＡ活性および／またはレベルを有する、請求項３９〜４２のいずれかに記載の使用のための医薬品有効成分。
【請求項４４】
ａ．ＧＢＡ活性を増加させる、
ｂ．ＧＢＡレベル（または量）を増加させる、
ｃ．活性変異体ＧＢＡの量を増加させる、
ｄ．活性野生型ＧＢＡの量を増加させる、
ｅ．ＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みを増強する、
ｆ．処理／成熟したＧＢＡの量を増加させる、
ｇ．成熟（ポストＥＲ）ＧＢＡの量を増加させる、
ｈ．リソソームに到達する成熟ＧＢＡの量を増加させる、および／または
ｉ．α−シヌクレイン凝集を減少させる
方法のうちの１または複数で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩から選択される、医薬品有効成分。
【請求項４５】
医薬組成物などの組成物であって、ゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害、例えば、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）などのＧＢＡ関連α−シヌクレイン病の治療で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩（アリモクロモル）から選択される医薬品有効成分と、１種もしくは複数種のさらなる有効成分とを別々に、またはともに含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害、例えば、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）などのＧＢＡ関連α−シヌクレイン病を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩（アリモクロモル）から選択される医薬品有効成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゴーシェ病（ＧＤ）は、グルコセレブロシドの蓄積によって特徴づけられるリソソーム蓄積症の中で最も頻度が高い。ゴーシェ病は、スフィンゴ脂質の機能障害代謝を含むスフィンゴリピドーシスの種類である。現在まで、ＧＢＡ遺伝子において３００に及ぶ変異が知られており、ゴーシェ病に関連づけられている。ＧＢＡ変異は、軽度（ＧＤＩ型、非神経障害を引き起こす）または重度（ＧＤＩＩ型およびＩＩＩ型を引き起こす）に分類することができる。ホモ接合ＧＢＡ変異ならびに複合ヘテロ接合変異は、ＧＤを引き起こす。いくつかの共通変異が優位を占めており、ＧＤＩ型に対して最も有力な変異はアミノ酸残基３７０でアスパラギンをセリンで置換（Ｎ３７０Ｓ）するミスセンス変異であり、ＩＩ型およびＩＩＩ型に対して最も有力な変異はＬ４４４Ｐ（コドンは成熟タンパク質（すなわちシグナルペプチドがない）の第１のコドンから番号が付く）である。
【０００３】
これらの変異の多くは、パーキンソン病（ＰＤ）患者でも見られる。ＧＢＡ変異保因者（変異型ＧＢＡ遺伝子を１つ有する）で見られるヘテロ接合変異は、パーキンソン病の発症の素因になることがわかっている（Ｇａｎ−Ｏｒら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１５）。現在、ＧＢＡの変異は、パーキンソン病の主要な遺伝的危険因子の１つと考えられている。パーキンソン病患者の少なくとも８％は、ＧＢＡ遺伝子においてＬ４４４Ｐヘテロ接合体を含む軽度および重度の両ＧＢＡ変異があると推定されている。さらに、ＧＢＡ活性の二次欠損はパーキンソン病との関連があり得る。
【０００４】
ＧＢＡ欠損からパーキンソン病に至る主要病理は、明らかにされてないが、前臨床実験はα−シヌクレインに対する逆相関を示唆している。ＧＢＡ遺伝子変異の保因者は、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）と、おそらく多系統萎縮症（ＭＳＡ）とを発症する危険性が増しており、ＧＢＡ欠損とα−シヌクレイン病の少なくとも一部との間の関連をもたらす。
【０００５】
国際公開第２０１４／０７１２８２号は、ＰＤおよび関連するシヌクレイン病とタウオパチーのためのグルコセレブロシダーゼ増強療法を支持するためのモデルにおいてヒトグルコセレブロシダーゼをコードする組換え自己相補的アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ−ＧＢＡＩ）を開示する。
【０００６】
国際公開第２０１３／１４８３３３号は、ゴーシェ病を治療し、ＧＢＡ遺伝子変異を有する患者においてゴーシェ病症状の発症を阻害するため、およびパーキンソン病を治療するためにグルコセレブロシダーゼ活性剤としてサルチル酸誘導体を開示する。
【０００７】
国際公開第２００９／１５５９３６号は、ゴーシェ病を含むリソソーム蓄積症を治療するために、熱ショックタンパク質７０およびその誘導物質を開示する。
【０００８】
国際公開第２００５／０４１９６５号は、パーキンソン病を含む神経変性疾患において神経を保護するために、熱ショック誘導剤アリモクロモルの使用を開示する。
【発明の概要】
【０００９】
アリモクロモルは、現在、小児リソソーム蓄積障害および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療において評価が進行中の熱ショックタンパク質増幅因子である。
【００１０】
本発明者らは、現在、アリモクロモルがＧＢＡホモ接合体（ゴーシェ病を呈し、ＧＢＡ活性を著しく減少する）においてだけでなく変異体ＧＢＡヘテロ接合体（保因者）においてＧＢＡレベルを上昇させ、ＧＢＡ活性を高めることがわかった。具体的には、アリモクロモルは、ＧＢＡホモ接合体（ゴーシェ患者）において臨床的に影響を受けない活性レベルまでＧＢＡ活性を高める。さらに、アリモクロモルはＧＢＡヘテロ接合体（臨床的に影響を受けない）においてＧＢＡ活性を高め、およびＧＢＡ酵素量（総レベルおよび成熟／ポストＥＲ  ＧＢＡ）を増加させる。
【００１１】
本発明者らは、アリモクロモルがパーキンソン病患者において変異ＧＢＡ対立遺伝子（ヘテロ接合またはホモ接合、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない）によってＧＢＡ活性を増加させることも本明細書でさらに示す。
【００１２】
一態様は、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）−関連障害を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド（アリモクロモル）、その立体異性体、およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分を提供することである。
【００１３】
一実施形態において、上記ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ酵素レベルの低下および／またはＧＢＡ酵素活性の減少に関連する。一実施形態において、上記ＧＢＡ関連障害は、１または複数のＧＢＡ遺伝子変異、例えばヘテロ接合およびホモ接合のＧＢＡ遺伝子変異に関連する。
【００１４】
一実施形態において、上記ＧＢＡ関連障害は、例えば、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群から選択されるＧＢＡ関連α−シヌクレイン病である。
【００１５】
一実施形態において、上記ＧＢＡ関連パーキンソン病は、遺伝的危険性の高いパーキンソン病ＧＢＡ遺伝子型と関連している。
【００１６】
さらに、ＧＢＡレベルおよび／またはＧＢＡ活性を高める方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体、およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖのｃｉｓ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有する個体（保因者、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない）由来の一次細胞（ヒト線維芽細胞）におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示すグラフである。実施例１を参照されたい。
【図２】Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖのｃｉｓ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有する個体（保因者、ゴーシェ病に関して影響を受けない）由来の一次細胞（ヒト線維芽細胞）におけるＧＢＡ酵素量のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示すグラフである。実施例１を参照されたい。
【図３】Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０ＶゴーシェＩＩ型患者におけるＧＢＡ活性のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示すグラフである。レベルは、臨床的に影響を受けない活性レベル（破線）まで増加した。実施例２を参照されたい。
【図４】Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖヘテロ接合体（保因者、臨床的に影響を受けないゴーシェ病患者の親、遺伝的危険性の高いパーキンソン病遺伝子型）のＧＢＡ活性のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示すグラフである。レベルは、２倍以上増加した。実施例２を参照されたい。
【図５】Ｉ型（Ｎ３７０Ｓ／Ｖ３９４ＬおよびＮ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ）、ＩＩ型（Ｅ３２６Ｋ、Ｌ４４４Ｐ／Ｅ３２６Ｋ、Ｌ４４４ＰおよびＧ３２５Ｒ／Ｃ３４２ＧおよびＰ４１５Ｒ／Ｌ４４４Ｐ）またはＩＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＧＢＡ活性のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示すグラフである。実施例３を参照されたい。
【図６】Ｎ３７０Ｓ変異（Ｎ３７０Ｓ／＋）を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有するパーキンソン病患者由来の一次細胞におけるＧＢＡ活性のアリモクロモル誘導による用量依存的増加を示すグラフである。実施例４を参照されたい。
【図７】ＧＢＡ変異がない無症候の健常者由来（＋／＋）のヒト線維芽細胞におけるＧＢＡ活性のアリモクロモル誘導による用量依存増加をグラフである。実施例５を参照されたい。
【図８】Ｉ型（Ｎ３７０Ｓ／Ｖ３９４Ｌ）、ＩＩ型（Ｇ３２５Ｒ／Ｃ３４２Ｇ）およびＩＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＭＥ５６９による活性ＧＢＡの標識のアリモクロモル誘導による増加をグラフである。実施例６を参照されたい。
【図９】Ｉ型（Ｎ３７０Ｓ／Ｖ３９４Ｌ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。実施例７を参照されたい。
【図１０】Ｉ型（Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ＲＰＡをローディング対照として使用した。実施例７を参照されたい。
【図１１】Ｉ型（Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけＧＢＡタンパク質レベルのアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ＲＰＡをローディング対照として使用した。実施例７を参照されたい。
【図１２】ＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｐ４１５Ｒ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ＲＰＡをローディング対照として使用した。実施例８を参照されたい。
【図１３】ＩＩ型（Ｇ３２５Ｒ／Ｃ３４２Ｇ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。実施例８を参照されたい。
【図１４】ＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｐ４１５Ｒ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけＧＢＡタンパク質レベルのアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。実施例８を参照されたい。
【図１５】ＩＩ型（Ｇ３２５Ｒ／Ｃ３４２Ｇ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけＧＢＡタンパク質レベルのアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ＲＰＡをローディング対照として使用した。実施例８を参照されたい。
【図１６】ＩＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。実施例９を参照されたい。
【図１７】ＩＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）のゴーシェ病患者由来の一次細胞におけＧＢＡタンパク質レベルのアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ＲＰＡをローディング対照として使用した。実施例９を参照されたい。
【図１８】ＰＤ−ＧＢＡ（Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ）個体由来の一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）のアリモクロモル誘導による用量依存増加を示す。ビンキュリンをローディング対照として使用した。実施例１０を参照されたい。
【図１９Ａ】表示されたＧＢＡ変異を有するＧＤ個体由来のＭＡＳＣの神経分化にアリモクロモルが影響を及ぼさないことを示すグラフである。細胞を模擬（ＰＢＳ）または４００μＭのアリモクロモル（Ａｒｉ）のいずれかで９日間処置した。神経マーカーチューブリンβ３の発現を免疫染色によって評価した。実施例１１を参照されたい。
【図１９Ｂ】表示されたＧＢＡ変異を有するＧＤ個体由来のＭＡＳＣの神経分化にアリモクロモルが影響を及ぼさないことを示すグラフである。細胞を模擬（ＰＢＳ）または４００μＭのアリモクロモル（Ａｒｉ）のいずれかで９日間処置した。神経マーカーＮｅｕＮの発現を免疫染色によって評価した。実施例１１を参照されたい。
【図２０】表示されたＧＢＡ変異を有するＧＤ個体由来の一次神経様細胞におけるＧＢＡ活性のアリモクロモル誘導による増加を示すグラフである。ＧＤＩＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）を有する個体の皮膚由来線維芽細胞を対照として含んだ。細胞を模擬（ＰＢＳ）または４００μＭのアリモクロモル（Ａｒｉ）のいずれかで処置した。実施例１１を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
β−グルコセレブロシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ０４０６２、ＧＬＣＭ＿ＨＵＭＡＮ、さらにグルコシルセラミダーゼ、酸性β−グルコシダーゼ、Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシングルコヒドロラーゼ、ＧＣａｓｅまたはＧＢＡとも呼ばれる）は、グルコシルセラミダーゼ活性を有する酵素であり、加水分解によって、糖脂質代謝の中間体であるグルコセレブロシドのβ−グルコシド結合を切断する：
Ｄ−グルコシル−Ｎ−アシルスフィンゴシン＋Ｈ２Ｏ＝Ｄ−グルコース＋Ｎ−アシルスフィンゴシン。
【００１９】
ＧＢＡは、活性のためにサポシンＣと陰イオンリン脂質とを必要とする。ＧＢＡは、リソソームに局在する。それは、ＧＢＡ遺伝子（公定名：グルコシダーゼ、β、酸性；Ｇｅｎｅ／Ｌｏｃｕｓ  ＭＩＭ番号６０６４６３；ＥＣ３．２．１．４５）によってコードされる。選択的スプライシングは、複数の転写変異体をもたらす。
【００２０】
ゴーシェ病で欠損しているリソソーム酵素をコードするＧＢＡ遺伝子の変異は、パーキンソン病および関連した障害にとって重要で一般的な危険因子である。この関連は最初にクリニックで認識され、パーキンソン症候群がまれにではあるがゴーシェ病患者にみられ、絶対保因者（臨床的に影響を受けることはあり得ないが、家族歴の分析に基づいて遺伝子変異を保有しているに相違ない個体）である親族にみられる頻度が高いことが認められた。
【００２１】
ＧＢＡ遺伝子変異は、ＬＯＶＤ  ＣＣＨＭＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ，  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ；  ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，  ｂｅｔａ，  ａｃｉｄ（ＧＢＡ）ａｔ  ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｃｈｍｃ．ｏｒｇ／ＬＯＶＤ２／ｈｏｍｅ．ｐｈｐ？ｓｅｌｅｃｔ＿ｄｂ＝ＧＢＡに継続的に更新されている。
【００２２】
続いて、大規模な研究からの調査結果は、対照個体と比較すると、パーキンソン病および関連するレビー小体疾患の患者はＧＢＡ変異頻度が増加していたことを示した。ＧＢＡ関連パーキンソン症候群の患者は、様々なパーキンソン症候群表現型を示すが、ＧＢＡ変異がないパーキンソン症候群患者よりも、発病年齢が若く、認知変化と関連性が高い傾向がある。この関連を説明するために提案される仮説としては、α−シヌクレイン凝集を促進するグルコセレブロシダーゼにおける変異に起因する機能獲得、α−シヌクレインプロセシングおよびクリアランスに影響を及ぼす酵素の機能喪失に起因する基質蓄積、および双方向フィードバックループが挙げられる。
【００２３】
α−シュヌクレインは、主に神経組織で見つかるシヌクレインタンパク質であり、その機能は未知である。α−シュヌクレインは凝集して、レビー小体によって特徴づけられる病的状態、例えばパーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症で不溶性線維を形成することができる。α−シュヌクレインは、レビー小体線維の主要な構造成分である。
【００２４】
アリモクロモルは、Ｈｓｐ７０を含む熱ショックタンパク質の小分子誘導物質である。アリモクロモルは、現在、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびリソソーム蓄積疾患ニーマン・ピック病Ｃ型の治療について調査されている。Ｈｓｐ７０を含む熱ショックタンパク質が誘導されると、リソソーム膜が保護され、リソソーム基質の分解に関与するリソソーム酵素の活性が増加する。
【００２５】
アリモクロモルがゴーシェ病ＩＩＩ型（例えばＬ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）を有する患者由来の細胞において臨床的に影響を受けない活性レベル（場合によってはＧＢＡ変異の保因者と同じレベル）までＧＢＡ活性を増加させることを、本発明者らは本明細書に示す。驚くべきことに、アリモクロモルがＧＢＡ変異の保因者由来の細胞（例えばＬ４４４Ｐヘテロ接合）においてＧＢＡ活性を、臨床的に影響を受けない活性レベルの２倍以上増加させることも本明細書に示す。さらに、アリモクロモルはＰＤ患者由来の細胞においてＮ３７０Ｓ  ＧＢＡ活性を増加させる。このように、ＧＢＡ活性およびレベルは、変異体ＧＢＡヘテロ接合体（保因者）由来の細胞において、およびゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない変異体ＧＢＡホモ接合体由来の細胞においても増加することができる。
【００２６】
したがって、ＧＢＡレベルおよび／または活性のアリモクロモル誘導による増加は、ＧＢＡレベルおよび／または活性が損なわれている様々なタンパク質症の障害を治療するのに役立ち得る。
【００２７】
本明細書においてアリモクロモルは、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分として定義される。
【００２８】
ＧＢＡ欠損の治療で用いられるアリモクロモルが本明細書とともに提供される。一実施形態において上記ＧＢＡ欠損は、ゴーシェ病（ＧＤ）それ自体を含まない。
【００２９】
ゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害の治療で用いられるアリモクロモルが本明細書とともに提供される。
【００３０】
一実施形態において上記治療は予防、治癒または改善のためである。特定の一実施形態において、上記治療は予防のためである。別の実施形態において、上記治療は治癒のためである。さらなる実施形態において、上記治療は改善のためである。
【００３１】
さらに、ゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害の治療薬の製造で用いるアリモクロモルを本明細書とともに提供する。
【００３２】
さらに、ゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害を治療する方法であって、それを必要とする個体に有効量のアリモクロモルを投与することを含む方法を本明細書とともに提供する。
【００３３】
「個体」または「対象」という用語は、脊椎動物、具体的には哺乳類種のメンバー、好ましくはヒトを含む霊長類を指す。好適な実施形態において、本明細書で用いる場合、個体とは、あらゆる年齢の男性または女性のヒトである。
【００３４】
「それを必要とする個体」とは、本発明から利益を得ることができる個体を指す。一実施形態において、上記それを必要とする個体とは、病人であり、上記疾患はＧＢＡ関連障害である。
【００３５】
ＧＢＡ関連障害
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害の治療で用いられる、（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート；（−）−Ｓ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート；（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアート；および（−）−Ｓ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアートから選択される化合物が提供される。
【００３６】
本明細書に定義される、ＧＢＡ関連障害の治療で用いるアリモクロモルへの言及は以下の条件のいずれか１つを包含する。
【００３７】
本明細書に定義されるＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡレベルおよび／またはＧＢＡ活性との関連性を有するいずれかの障害を指し得る。したがってＧＢＡレベルの低下および／またはＧＢＡ活性の減少は、本明細書に定義されるＧＢＡ関連障害に関連する。一実施形態において関連するとは、発症を促す（または発症の危険性が増加する、または呈する）ことを意味する。
【００３８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病ではない。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病Ｉ型ではない。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病ＩＩ型ではない。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病ＩＩＩ型ではない。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病ＩＩ型またはＩＩＩ型ではない。
【００３９】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ酵素レベルの低下に関連する。
【００４０】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ酵素活性の減少に関連する。
【００４１】
ＧＢＡ酵素レベルの低下および／またはＧＢＡ活性の減少は、損なわれたＧＢＡ酵素レベルおよび／またはＧＢＡ活性、不十分なＧＢＡ酵素レベルおよび／またはＧＢＡ活性、または欠損したＧＢＡ酵素レベルおよび／またはＧＢＡ活性とも定義することができる。
【００４２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ欠損と呼ばれる。
【００４３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、低下しているがゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している（すなわち、ゴーシェ病を呈することはなく、ゴーシェ病と診断されていない）のに十分であるＧＢＡ活性および／または酵素レベルを有する。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、野生型活性レベルと比較して、低下しているＧＢＡ活性および／または酵素レベルを有する。
【００４４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、１または複数の別個のＧＢＡ遺伝子変異に関連している。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している、１または複数のＧＢＡ遺伝子変異を有する個体である。
【００４５】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、１または複数の軽度のＧＢＡ遺伝子変異（ＧＤＩ型（ＴＩ）に関連する）に関連している。
【００４６】
別の実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、１または複数の重度のＧＢＡ遺伝子変異（ＧＤＩＩ型（ＴＩＩ）およびＧＤＩＩＩ型（ＴＩＩＩ））に関連する）に関連している。
【００４７】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連しており、上記ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異がゴーシェ病を引き起こしていない、または発症をもたらしていない。
【００４８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している、１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する個体である。
【００４９】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、１または複数のホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異および／または複合ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連しており、上記ＧＢＡ遺伝子変異がゴーシェ病を引き起こしていない、または発症をもたらしていない。
【００５０】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している、１または複数のホモ接合および／または複合ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する個体である。
【００５１】
ＧＢＡタンパク質の活性に影響を及ぼすことができるＧＢＡ遺伝子の特異的変異としては、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓが挙げられる。
【００５２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択されるＧＢＡ遺伝子における１または複数の変異に関連している（または変異を含む、呈する）。ＧＢＡ遺伝子における上記１または複数の変異は、ヘテロ接合変異、複合ヘテロ接合変異またはホモ接合変異であり得る。
【００５３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択される１または複数のＧＢＡ遺伝子変異を有し、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している個体である。ＧＢＡ遺伝子における上記１または複数の変異は、ヘテロ接合変異、複合ヘテロ接合変異またはホモ接合変異であり得る。
【００５４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ  ＧＢＡ遺伝子変異（Ｌ４４４Ｐ／、Ｌ４４４Ｐ／＋またはＬ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）に関連している。Ｌ４４４Ｐ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子は、Ｌ４４４Ｐ／＋と呼んでもよい。
【００５５】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｄ４０９Ｈ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００５６】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｄ４０９Ｖ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００５７】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｅ２３５Ａ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００５８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｅ３４０Ａ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００５９】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｅ３２６Ｋ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６０】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｎ３７０Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。Ｎ３７０Ｓ変異を含有するホモ接合ＧＢＡ対立遺伝子は、Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓと呼んでもよい。Ｎ３７０Ｓ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子は、Ｎ３７０Ｓ／＋と呼んでもよい。
【００６１】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｖ３９４Ｌ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ａ４５６Ｐ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｖ４６０Ｖ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６５】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｃ３４２Ｇ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６６】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｇ３２５Ｒ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６７】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｐ４１５Ｒ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｙ１３３＊ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００６９】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｆ２１３Ｉ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００７０】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｎ１８８Ｓおよび／またはＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００７１】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ酵素活性の減少を伴うことなく、１または複数のＧＢＡ遺伝子変異に関連している。
【００７２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ酵素活性の減少に関連しており、上記ＧＢＡ遺伝子は野生型である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ酵素活性の特発性減少に関連している。野生型ＧＢＡ対立遺伝子は、（＋／＋）（ＧＢＡ変異がない）と呼んでもよい。
【００７３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、タンパク質活性の抑制に起因するＧＢＡ活性の減少に関連している。
【００７４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、遺伝子／タンパク質の転写または翻訳の阻止に起因するＧＢＡ活性の減少に関連している。
【００７５】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害はＧＢＡ活性の減少に関連し、上記ＧＢＡ遺伝子は野生型であり、およびＧＢＡ活性の減少はタンパク質活性の抑制および／または遺伝子／タンパク質の転写または翻訳の阻止に起因する。
【００７６】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択される１または複数の変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有する個体である。
【００７７】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖのｃｉｓ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有する個体である。
【００７８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖヘテロ接合体である。
【００７９】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、複合ＧＢＡ対立遺伝子Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖに対してヘテロ接合である。
【００８０】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ変異保因者である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、絶対保因者である。一実施形態において、ＧＢＡ変異保因者は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない。
【００８１】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病患者の臨床的に影響を受けない祖父母、親、同胞または子である。
【００８２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病患者の臨床的に影響を受けない親または同胞である。
【００８３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択される１または複数の変異を含有するホモ接合または複合ヘテロ接合のＧＢＡ対立遺伝子を有する個体であり、上記個体はゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している。
【００８４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ変異を含有するホモ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有する個体である。
【００８５】
一実施形態において、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害、例えばゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【００８６】
一実施形態において、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害は、ＧＢＡ関連パーキンソン症候群である。
【００８７】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ関連レビー小体疾患、例えばＧＢＡ関連パーキンソン病、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症およびＧＢＡ関連多系統萎縮症からなる群から選択されるＧＢＡ関連レビー小体疾患である。
【００８８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連α−シヌクレイン病を治療する方で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【００８９】
ＧＢＡ関連α−シヌクレイン病は、ＧＢＡ酵素のレベルおよび／または活性との関連性を有するα−シヌクレイン病として、本明細書に定義され得る。一実施形態において、α−シヌクレイン病は、α−シヌクレインの増加に関連するＧＢＡレベルおよび／または活性の減少を呈する。一実施形態において、アリモクロモルによる治療は、α−シヌクレイン凝集を減少させる。一実施形態において、アリモクロモルによる治療は、ＧＢＡ活性および／またはレベルを増加させる。
【００９０】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群から選択されるＧＢＡ関連α−シヌクレイン病を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【００９１】
一実施形態において、パーキンソン病、特にＧＢＡ関連パーキンソン病を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【００９２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ＧＢＡ酵素レベルおよび／または活性の減少に関連するパーキンソン病である。
【００９３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、１または複数のＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病を有する個体は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している。
【００９４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する個体である。
【００９５】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している１または複数のホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異および／または複合ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する個体である。
【００９６】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、遺伝的危険性の高いパーキンソン病ＧＢＡ遺伝子型である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ欠損パーキンソン病（ＰＤ−ＧＢＡ）である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有するパーキンソン病患者である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している、ホモ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有するパーキンソン病患者である。
【００９７】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択されるＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。上記ＧＢＡ遺伝子における１または複数の変異は、ヘテロ接合、複合ヘテロ接合またはホモ接合の変異であり得る。一実施形態において、ＧＢＡ遺伝子変異を呈する個体は、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない状態を存続している。
【００９８】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病を有する個体は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択されるＧＢＡ遺伝子変異を有する。
【００９９】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、Ｎ３７０Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。
【０１００】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ヘテロ接合Ｎ３７０Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異（Ｎ３７０Ｓ／＋）に関連するパーキンソン病である。
【０１０１】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ホモ接合Ｎ３７０Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異（Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ）に関連するパーキンソン病である。
【０１０２】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ヘテロ接合Ｌ４４４Ｐ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。
【０１０３】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ヘテロ接合Ａ４５６Ｐ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。
【０１０４】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ヘテロ接合Ｖ４６０Ｖ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。
【０１０５】
一実施形態において、ＧＢＡ関連パーキンソン病は、ヘテロ接合Ｅ３２６Ｋ  ＧＢＡ遺伝子変異に関連するパーキンソン病である。
【０１０６】
一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、特発性のＧＢＡ活性および／またはレベルの減少に関連するパーキンソン病である。一実施形態において、ＧＢＡ関連障害は、何のＧＢＡ遺伝子変異も同定されてない、特発性のＧＢＡ活性および／またはレベルの減少に関連するパーキンソン病である。
【０１０７】
以下の方法のうち１または複数で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分も、本明細書とともに提供される：
−ＧＢＡ活性を増加させる方法、
−ＧＢＡレベル（または量）を増加させる方法、
−活性変異体ＧＢＡの量を増加させる方法、
−活性野生型ＧＢＡの量を増加させる方法、
−ＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みを増強する方法、
−処理／成熟したＧＢＡの量を増加させる方法、
−成熟（ポストＥＲ）ＧＢＡの量を増加させる方法、および／または
−リソソームに到達する成熟ＧＢＡの量を増加させる方法。
【０１０８】
一実施形態において、アリモクロモルは、ＧＢＡ関連障害、例えばＧＢＡ関連α−シヌクレイン病、例えばＧＢＡ関連パーキンソン病を有する個体におけるＧＢＡレベルおよび／または活性を増加させる方法で用いる。
【０１０９】
一実施形態において、上記ＧＢＡ活性は、仮想野生型活性レベルの５０％以上まで、例えば仮想野生型活性レベルの５０〜６０％、例えば６０〜７０％、例えば７０〜８０％、例えば８０〜９０％、例えば９０〜１００％、例えば１００〜１１０％、例えば１１０〜１２０％、例えば１２０〜１３０％、例えば１３０〜１４０％、例えば１４０〜１５０％増加する。
【０１１０】
一実施形態において、上記ＧＢＡ活性は、仮想野生型活性レベル以上増加する。
【０１１１】
一実施形態において、上記ＧＢＡ活性は、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％、例えば少なくとも１１０％、例えば少なくとも１２０％、例えば少なくとも１３０％、例えば少なくとも１４０％、例えば少なくとも１５０％、例えば少なくとも１６０％、例えば少なくとも１７０％、例えば少なくとも１８０％、例えば少なくとも１９０％、例えば少なくとも２００％、例えば少なくとも２１０％、例えば少なくとも２２０％、例えば少なくとも２３０％、例えば少なくとも２４０％、例えば少なくとも２５０％、例えば少なくとも２６０％、例えば少なくとも２００％、例えば少なくとも２７０％、例えば少なくとも２８０％、例えば少なくとも２９０％、例えば少なくとも３００％増加する。
【０１１２】
一実施形態において、上記ＧＢＡレベル（または量）は、仮想野生型レベルの５０％以上まで、例えば仮想野生型レベルの５０〜６０％、例えば６０〜７０％、例えば７０〜８０％、例えば８０〜９０％、例えば９０％〜１００％、１００〜１１０％、例えば１１０〜１２０％、例えば１２０〜１３０％、例えば１３０〜１４０％、例えば１４０％〜１５０％増加する。
【０１１３】
一実施形態において、上記ＧＢＡレベルは、仮想野生型レベル以上増加する。
【０１１４】
一実施形態において上記ＧＢレベルおよび／または活性は、少なくとも１．５倍、例えば少なくとも２倍、たとえば少なくとも２．５倍、例えば少なくとも３倍増加する。
【０１１５】
一実施形態において、上記ＧＢＡレベル（または量）は、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも１００％、例えば少なくとも１１０％、例えば少なくとも１２０％、例えば少なくとも１３０％、例えば少なくとも１４０％、例えば少なくとも１５０％、例えば少なくとも１６０％、例えば少なくとも１７０％、例えば少なくとも１８０％、例えば少なくとも１９０％、例えば少なくとも２００％、例えば少なくとも２１０％、例えば少なくとも２２０％、例えば少なくとも２３０％、例えば少なくとも２４０％、例えば少なくとも２５０％、例えば少なくとも２６０、例えば少なくとも２００％、例えば少なくとも２７０％、例えば少なくとも２８０％、例えば少なくとも２９０％、例えば少なくとも３００％増加する。
【０１１６】
α−シヌクレイン凝集を減少させる方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分も本明細書とともに提供される。
【０１１７】
予防的使用：
別の態様において、ＧＢＡ酵素レベルおよび／または活性が低下している個体においてゴーシェ病以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害を発症する危険性を減少させる方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体とその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【０１１８】
一実施形態において、上記個体は、仮想野生型レベルよりもＧＢＡレベルおよび／または活性が低い。
【０１１９】
一実施形態において、上記個体は、仮想野生型レベルよりもＧＢＡレベル（または量）が低い。
【０１２０】
一実施形態において、上記個体は、仮想野生型活性レベルよりもＧＢＡ活性が低い。
【０１２１】
一実施形態において、上記個体は、ゴーシェ病患者における臨床的に影響を受けるレベルおよび／または活性よりもＧＢＡレベルおよび／または活性が高い。
【０１２２】
一実施形態において、上記個体は、仮想野生型レベルおよび／または活性よりもＧＢＡレベルおよび／または活性が低いが、ゴーシェ病患者における臨床的に影響を受けるレベルおよび／または活性よりも高い。
【０１２３】
一実施形態において、上記個体は、ＧＢＡ遺伝子変異（ヘテロ接合ＧＢＡ変異）保因者、例えば臨床的に影響を受けない保因者、例えば絶対保因者と同じ程度までＧＢＡ活性が減少している。
【０１２４】
一実施形態において、上記個体は、ＧＢＡ遺伝子変異（ヘテロ接合ＧＢＡ変異）保因者、例えば臨床的に影響を受けない保因者、例えば絶対保因者と同じ程度までＧＢＡレベルが減少している。
【０１２５】
一実施形態において、ＧＢＡレベルおよび／または活性が減少した上記個体は、１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する。
【０１２６】
一実施形態において、ＧＢＡレベルおよび／または活性が減少した上記個体は、１または複数のホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異または複合ヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する。
【０１２７】
一実施形態において、上記個体は、ＧＢＡ活性および／またはレベルがある程度の仮想野生型レベルまで減少している。
【０１２８】
一実施形態において、上記個体は、ＧＢＡ活性および／またはレベルの約５〜９５％または仮想野生型活性レベルの１０〜９０％、例えば仮想野生型活性および／またはレベルの５〜１０％、例えば１０〜２０％、例えば２０〜３０％、例えば３０〜４０％、例えば４０〜５０％、例えば５０〜６０％、例えば６０〜７０％、例えば７０〜８０％、例えば８０〜９０％、例えば９０〜９５％のＧＢＡ活性および／またはレベルを有する。
【０１２９】
一実施形態において、上記個体は仮想野生型レベルの約２５〜７５％のＧＢＡ活性および／またはレベルを有する。一実施形態において、上記個体は仮想野生型レベルの約５０％のＧＢＡ活性および／またはレベルを有する。
【０１３０】
一実施形態において、上記個体は、仮想野生型レベルおよび／または活性の約１０％のＧＢＡ活性および／またはレベル、例えば仮想野生型レベルおよび／または活性の２０％、例えば３０％、例えば４０％、例えば５０％、例えば６０％、例えば７０％、例えば８０％、例えば９０％を有する。
【０１３１】
一実施形態において、上記ＧＢＡ関連障害は、ＧＢＡ関連α−シヌクレイン病、例えば、ＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連レビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統萎縮症（ＭＳＡ）からなる群から選択されるＧＢＡ関連α−シヌクレイン病である。
【０１３２】
一実施形態において、ＧＢＡ酵素レベルおよび／または活性が低下している個体においてパーキンソン病、特にＧＢＡ関連パーキンソン病を発症する危険性を減少させる方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【０１３３】
一実施形態において、上記個体は、１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する。一実施形態において、上記個体は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択される１または複数のヘテロ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する。一実施形態において、上記個体はヘテロ接合Ｌ４４４Ｐ  ＧＢＡ遺伝子変異を有する。一実施形態において、上記個体はヘテロ接合Ｅ３２６Ｋ  ＧＢＡ遺伝子変異を有する。一実施形態において、上記個体はヘテロ接合Ｎ３７０Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異を有する。
【０１３４】
一実施形態において、上記個体は、１または複数のホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する。一実施形態において、上記個体は、Ｌ４４４Ｐ、Ｄ４０９Ｈ、Ｄ４０９Ｖ、Ｅ２３５Ａ、Ｅ３４０Ａ、Ｅ３２６Ｋ、Ｎ３７０Ｓ、Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ、Ｖ３９４Ｌ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ、Ｃ３４２Ｇ、Ｇ３２５Ｒ、Ｐ４１５Ｒ、Ｙ１３３＊、Ｆ２１３Ｉ、Ｎ１８８ＳおよびＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓからなる群から選択される１または複数のホモ接合ＧＢＡ遺伝子変異を有する。一実施形態において、上記個体は、ホモ接合Ｎ３７０Ｓ  ＧＢＡ遺伝子変異を有する。
【０１３５】
一実施形態において、ゴーシェ病Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型などのゴーシェ病患者である個体においてＧＢＡ関連パーキンソン病を発症する危険性を減少させる方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分が提供される。
【０１３６】
ＧＢＡ活性：
グルコセレブロシダーゼ活性は、当技術分野で既知の方法によって評価されることができる。例えば、グルコセレブロシダーゼ活性は、哺乳動物の脳脊髄液から測定することができる。一部の実施形態において、哺乳動物はＧＢＡ遺伝子の野生型である。「野生型」という用語は、タンパク質のレベルおよび／または酵素活性に影響を及ぼすことが知られている検出可能な変異を含まない遺伝子またはタンパク質を指す。
【０１３７】
遺伝子が野生型であることがわかるが、グルコセレブロシダーゼ活性の減少が観察されるとき、活性の減少は、タンパク質活性の抑制または遺伝子／タンパク質の転写もしくは翻訳の阻止に起因することがあり得る。これらの機構は当技術分野で周知である。例えば、タンパク質の産生は、異常な細胞機構によって阻止されることができる。あるいは、タンパク質は、酵素活性の減少または喪失を引き起こす細胞内で修飾されることができる。
【０１３８】
アリモクロモル
本明細書に参照するアリモクロモルは、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド（アリモクロモル）、その立体異性体およびその酸付加塩から選択される医薬品有効成分（ＡＰＩ）を包含する。アリモクロモルは、さらに、例えば国際公開第００／５０４０３号に記載されている。
【０１３９】
アリモクロモルは、塩基化合物Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その光学活性（＋）もしくは（−）鏡像異性体、任意の比率の鏡像異性体混合物、およびラセミ化合物を指し、さらに、ミネラルまたは有機酸とともに上記化合物のいずれかから形成される酸付加塩は本発明の目的を構成する。Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの幾何異性体の可能なすべての形態は、本発明の範囲に属する。「Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの立体異性体」という用語は、この化合物のすべての可能な光学異性体および幾何異性体を指す。
【０１４０】
必要に応じて、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドまたはその光学活性鏡像異性体の１種は、ミネラルまたは有機酸とともに、既知の方法で酸付加塩に変えることができる。
【０１４１】
一実施形態において、医薬品有効成分は、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドのラセミ化合物である。
【０１４２】
一実施形態において、医薬品有効成分は、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの光学活性立体異性体である。
【０１４３】
一実施形態において、医薬品有効成分は、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの鏡像異性体である。
【０１４４】
一実施形態において、医薬品有効成分は、（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、および（−）−（Ｓ）−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドからなる群から選択される。
【０１４５】
一実施形態において、医薬品有効成分は、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドの酸付加塩である。
【０１４６】
一実施形態において、医薬品有効成分は、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート（別名ＢＲＸ−３４５）およびＮ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアート（別名ＢＲＸ−２２０）からなる群から選択される。
【０１４７】
一実施形態において、医薬品有効成分は、（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート；（−）−Ｓ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドシトラート；（＋）−Ｒ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアート；および（−）−Ｓ−Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリドマレアートからなる群から選択される。
【０１４８】
組成物
医薬品有効成分を未加工化学物質として投与することは可能であるが、一部の実施形態において該成分を医薬製剤の形態で提供するのが好ましい。したがって、医薬組成物などの組成物、すなわち、本明細書で定義する医薬品有効成分を含む薬学的に安全な組成物を本明細書とともに提供する。一実施形態において、組成物は、薬学的および／または生理学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【０１４９】
本発明の生理活性剤を含有する医薬組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２０版，Ｇｅｎｎａｒｏ，編，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，２０００に記載の従来技術によって調製されることができる。
【０１５０】
したがって、一態様は、本明細書で定義するゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害の治療で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその（アリモクロモル）酸付加塩から選択される医薬品有効成分を含む医薬組成物などの組成物を提供することである。
【０１５１】
投与および投与量
本明細書で定義するものと同じものを含む医薬品有効成分または組成物は、一実施形態において、それを必要とする個体に薬学的有効用量または治療有効量で投与される。
【０１５２】
医薬品有効成分の治療有効量は、一実施形態において、所定の疾患または障害およびその合併症の臨床症状を治療する、防止する、その危険性を減少させる、軽減する、または部分的に抑えるのに十分な量である。特定の治療目的に効果がある量は、対象の障害の重症度と種類、ならびに体重と全身状態に依存する。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」と定義される。
【０１５３】
一実施形態において、組成物は、１日当たり１μｇ〜１００ｍｇの用量で、例えば１μｇ／日〜１０μｇ／日、例えば１０μｇ／日〜１００μｇ／日、例えば１００μｇ／日〜２５０μｇ／日、例えば２５０μｇ／日〜５００μｇ／日、例えば５００μｇ／日〜７５０μｇ／日、例えば７５０μｇ／日〜１ｍｇ／日、例えば１ｍｇ／日〜２ｍｇ／日、例えば２ｍｇ／日〜５ｍｇ／日、または例えば５ｍｇ／日〜１０ｍｇ／日、例えば１０ｍｇ／日〜２０ｍｇ／日、例えば２０ｍｇ／日〜３０ｍｇ／日、例えば３０ｍｇ／日〜４０ｍｇ／日、例えば４０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日、例えば５０ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日、例えば７５ｍｇ／日〜１００ｍｇ／日、例えば１００ｍｇ／日〜１５０ｍｇ／日、例えば１５０ｍｇ／日〜２００ｍｇ／日、例えば２００ｍｇ／日〜２５０ｍｇ／日、例えば２５０ｍｇ／日〜３００ｍｇ／日、例えば３００ｍｇ／日〜４００ｍｇ／日、例えば４００ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日、例えば５００ｍｇ／日〜６００ｍｇ／日、例えば６００ｍｇ／日〜７００ｍｇ／日、例えば７００ｍｇ／日〜８００ｍｇ／日、例えば８００ｍｇ／日〜９００ｍｇ／日、例えば９００ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日の用量で投与される。
【０１５４】
一実施形態において、医薬品有効成分または組成物は、１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１〜１０μｇ／ｋｇ体重、例えば１０〜１００μｇ／日、例えば１００〜２５０μｇ／ｋｇ体重、例えば２５０〜５００μｇ／ｋｇ体重、例えば５００〜７５０μｇ／ｋｇ体重、例えば７５０μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重、例えば２〜５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１０〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば２０〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば３０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば４０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば５０〜７５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば７５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。
【０１５５】
一実施形態において、用量は、１日当たり１または数回、例えば１〜６回／日、例えば１〜５回／日、例えば１〜４回／日、例えば１〜３回／日、例えば１〜２回／日、例えば２〜４回／日、例えば２〜３回／日投与される。一実施形態において、用量は、１日１回未満、例えば１日おきに１回、または週１回投与される。
【０１５６】
投与経路
好ましい投与経路は治療される対象の全身状態および年齢、治療される状態の性質、体内で治療される組織の位置および選択される活性成分に依存することを理解されたい。
【０１５７】
全身治療：
一実施形態において、投与経路により、最終的に望ましい作用の部位を標的とするために血流に生理活性剤を導入することが可能になる。
【０１５８】
一実施形態において、投与経路は、好適な任意の経路、例えば、経腸経路（経口、直腸、経鼻、肺、口腔内、舌下、経皮、大槽内および腹腔内の投与を含む）および／または非経口経路（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内および皮内の投与を含む）である。
【０１５９】
そのような投与のための適切な剤形は、従来の技術によって調製されることができる。
【０１６０】
非経口投与：
非経口投与は、経口／経腸経路ではない任意の投与経路であり、それによって生理活性剤が肝臓での初回通過分解を回避する。したがって、非経口投与としては、任意の注射および注入、例えば、ボラス注射または持続注入、例えば静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与が挙げられる。さらに、非経口投与としては、吸入法および局所投与が挙げられる。
【０１６１】
したがって、一実施形態において、医薬品有効成分または組成物は、動物のあらゆる粘膜、例えば、鼻、膣、眼、口、生殖器官、肺、消化管、または直腸、例えば鼻もしくは口の粘膜を通過するように局所的に投与され、したがって、非経口投与は、口腔内、舌下、経鼻、直腸、膣内および腹腔内の投与、ならびに吸入または装置による肺および気管支投与も含むことができる。一部の実施形態において、生理活性剤を局所的に投与して、皮膚を通過する。
【０１６２】
一実施形態において、静脈、皮下および筋肉内の非経口投与の形態が使用される。
【０１６３】
局所治療：
一実施形態において、医薬品有効成分または組成物を局所治療、すなわち作用部位（複数可）に直接導入する治療として使用する。したがって、医薬品有効成分は直接皮膚または粘膜に適用されてもよく、または作用部位に、例えば病変組織、もしくは直接病変組織につながる終動脈に注入されてもよい。
【０１６４】
併用治療：
一態様は、他の治療法と併せて、ゴーシェ病（ＧＤ）以外のグルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）関連障害を治療する方法で用いる、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその（アリモクロモル）酸付加塩から選択される医薬品有効成分を提供することである。
【０１６５】
このように、一実施形態において、医薬品有効成分は、それを必要とする個体に、少なくとも１種の他の治療法、例えば、ＧＢＡ関連α−シュヌクレイン病を含むＧＢＡ関連障害、例えばＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連ルビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統委縮症（ＭＳＡ）のための従来または既知の治療法と組み合わせて投与される。
【０１６６】
複数の治療法の組み合わせでの投与は、同時に、または連続してのいずれかで行ってよい。同時投与は、２種の化合物が同一組成物に、もしくは別々の組成物に含まれてもよく、または基本的に同時に行われる１種の組成物と、別の治療法とであってよい。連続投与とは、複数の治療法が異なる時点で投与される、例えば１つの治療法を最初に投与し、続いて第２の治療法を投与することを意味する。複数の治療法を連続して投与するための時間枠は、最適な効果をあげるために当業者が決定することができ、一実施形態において３０分〜７２時間の間であってよい。
【０１６７】
化合物の形態での治療法は、各々その最も有効な投与量で、一緒にまたは別々に投与されてもよい。複数の化合物を投与することによって、相乗効果を得ることができ、したがって各薬物の必要投与量を効果的に減少させる。
【０１６８】
一態様は、ＧＢＡ関連α−シュヌクレイン病を含むＧＢＡ関連障害、例えばＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連ルビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統委縮症（ＭＳＡ）の治療で用いる、ｉ）Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその（アリモクロモル）酸付加塩から選択される医薬品有効成分、およびｉｉ）他の治療法を別々に、またはともに含む組成物を提供することである。
【０１６９】
一実施形態において、他の治療法、すなわち従来または既知の治療法は、さらなる活性成分と呼ばれる。
【０１７０】
一実施形態において、Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）−プロポキシ］−ピリジン−１−オキシド−３−カルボキシイミドイルクロリド、その立体異性体およびその（アリモクロモル）酸付加塩から選択される医薬品有効成分は、１種または複数種のさらなる活性成分と組み合わせて投与される、および／または併用製品として調製される。
【０１７１】
一実施形態において、さらなる活性成分は、ＧＢＡ関連α−シュヌクレイン病を含むＧＢＡ関連障害、例えばＧＢＡ関連パーキンソン病（ＰＤ）、ＧＢＡ関連ルビー小体型認知症（ＤＬＢ）およびＧＢＡ関連多系統委縮症（ＭＳＡ）の治療において知られている、および／または使用されている１種または複数種の活性成分から選択される。
【０１７２】
一実施形態において、さらなる活性成分は、パーキンソン病の治療のために用いられる化合物である。一実施形態において、パーキンソン病の治療で用いられる上記化合物は、ドーパミン、Ｌ−ＤＯＰＡ、レボドパ、ドーパミン受容体アゴニスト、カルボキシラーゼ阻害剤（例えばカルビドパまたはベンセラジド）、ＮＭＤＡアンタゴニスト（例えばアマチジン（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ））、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤（例えばトルカポンおよびエンタカポン）、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤（例えばセレジリンおよびラサギリン）、カルビドパ−レボドパ、抗コリン薬およびアマンタジンからなる群から選択される。
【０１７３】
一実施形態において、さらなる活性成分は、ゴーシェ病の治療のために用いられる化合物である。一実施形態において、さらなる活性成分は、酵素補充療法、アロステリックシャペロン、薬理シャペロンおよび基質合成抑制療法からなる群から選択される。一実施形態において、上記さらなる活性成分は、ミグルスタット（Ｚａｖｅｓｃａ）、イミグルセラーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ）、エリグルスタット（Ｃｅｒｄｅｌｇａ）、ＶＰＲＩＶ、タリグルセラーゼアルファ（Ｅｌｅｌｙｓｏ）およびベラグルセラーゼアルファからなる群から選択される。
【０１７４】
実施例
実施例１：ゴーシェ病ＩＩ型ヘテロ接合体（パーキンソン病遺伝子型）における用量依存反応−ＢｉＰおよびＧＢＡ誘導
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０１７５】
【表１】
2019518725.tif 000002
【０１７６】
ウエスタンブロッティング：
細胞をＰＢＳに回収し、４℃で５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する１×抽出緩衝液（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に溶解し、超音波処理して、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離により清澄化させた。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。約１０〜２０μｇのタンパク質を含有する試料を糖タンパク質変性緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で希釈し、１００℃で１０分間のインキュベーションにより変性させた。試料を３７℃で１時間、ＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、またはＥｎｄｏＨなしでインキュベートし、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加え、次いで試料を、ＴＧＸゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した後に、この膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで短時間、染色し、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に５％脱脂乳を溶解した液でブロックした。パラフィルム被覆ガラスプレート上で一次抗体（１：５００から１：２０００に希釈）とともにインキュベーションを４℃で終夜行った。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに５％脱脂乳を溶解した液で１：１０，０００に希釈した二次抗体とともに１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットを展開し、次いでＧ−ｂｏｘシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して可視化した。
【０１７７】
結果
一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）の用量依存増加：
アリモクロモルは、ヒートショックタンパク質、例えばヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の発現レベルを上昇させることが報告されている（Ｋｉｅｒａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２００４）。
【０１７８】
一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）発現レベルに対するアリモクロモルの効果を評価するために、Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖのｃｉｓ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有する個体由来のヒト線維芽細胞（保因者、ゴーシェ病に関して臨床的に影響を受けない）を０、１０、５０または２００μＭのアリモクロモルで１４日間処置した。次いでウェスタンブロット解析のために細胞を回収した。無処置正常ヒト線維芽細胞からの可溶化液を対照として使用した。
【０１７９】
結果は、アリモクロモルが複合ＧＢＡ対立遺伝子Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖに対してヘテロ接合のヒト線維芽細胞株においてＢｉＰ発現レベルを用量依存的に上昇させることを実証する。これは、ＢｉＰ発現増加によってアリモクロモルがＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みの増強をもたらし得ることを示唆する。
【０１８０】
一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＧＢＡ酵素量の用量依存増加：
ＧＢＡタンパク質レベルに対するアリモクロモルの効果も、複合ＧＢＡ対立遺伝子Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖに対してヘテロ接合のヒト線維細胞株で評価した。ＥＲシャペロンＢｉＰの発現増加に一致して、アリモクロモルで処置した細胞においてＧＢＡの総レベルの用量依存増加が見られる。
【０１８１】
実施例２：ゴーシェＩＩ型ホモ接合体およびヘテロ接合体（ＧＴＩＩおよび危険性の高いパーキンソン病の遺伝子型）におけるＧＢＡ活性に対する用量依存反応
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０１８２】
ＧＢＡ活性アッセイ：
ＧＢＡ活性は、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）基質を用いる「無傷細胞」ＧＢＡアッセイ（Ｍｕら，Ｃｅｌｌ，２００８）を使用して測定した。手短に言うと、線維芽細胞を１２ウェルプレートに播種し、表示濃度のアリモクロモルを使用して４週間、生物学上の三つ組で処置した。培地は２〜３日ごとに新鮮な化合物を補充し、実験期間中、細胞を２回分割した。４週間の処置の後、細胞を９６ウェルプレートに移し、基質としてｐＨ４．０の４−ＭＵＧを用いてＧＢＡ活性を測定した。放出された４−ＭＵフルオロフォアを蛍光単位（ＦＬＵ）として定量化し、平行プレートのクリスタルバイオレット染色を用いて細胞密度に正規化した。正規化データは、任意単位（平均値±ＳＤ）として記録する。
【０１８３】
結果
ＧＢＡ変異を有する一次細胞においてＧＢＡ活性に対するアリモクロモルの効果を、遺伝子型Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖを有するゴーシェ病ＩＩ型患者由来の線維芽細胞において評価した。アリモクロモル処置は用量依存的にＧＢＡ活性を増加させることが観察された。注目すべきことに、５０μＭのアリモクロモルによって誘導されたＧＢＡ活性の増加は、無症候の個体由来のＬ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ対立遺伝子（図３において灰色の線で印がついている）に対するヘテロ接合細胞の活性レベルに対応する。
【０１８４】
重要なことに、アリモクロモルも、Ｌ４４４Ｐ、Ａ４５６Ｐ、Ｖ４６０Ｖ対立遺伝子に対してヘテロ接合である一次線維芽細胞においてＧＢＡ活性を増加させる。この結果は、ＧＢＡ活性が変異体ＧＢＡヘテロ接合体（保因者）由来の細胞においてさえ増加し得ることを示す。
【０１８５】
実施例３：ゴーシェ病Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩ型ホモ接合体におけるＧＢＡ活性に対する用量依存反応
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２
）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０１８６】
【表２】
2019518725.tif 000003
【０１８７】
ＧＢＡ活性アッセイ：
ＧＢＡ活性は、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）基質を用いる「無傷細胞」ＧＢＡアッセイ（Ｍｕら，Ｃｅｌｌ，２００８）を使用して測定した。手短に言うと、線維芽細胞を９６ウェルプレートに播種し、表示濃度のアリモクロモルを使用して５日間、生物学上の三つ組で処置した。培地は２〜３日ごとに新鮮な化合物を補充した。基質としてｐＨ４．０の４−ＭＵＧを用いてＧＢＡ活性を測定した。放出された４−ＭＵフルオロフォアを蛍光単位（ＦＬＵ）として定量化し、平行プレートのクリスタルバイオレット染色を用いて細胞密度に正規化した。正規化データは、模擬処置対照細胞と比較して倍率変化（平均値±ＳＤ）として記録する。
【０１８８】
結果
ＧＢＡのさらなる変異を有する一次細胞においてＧＢＡ活性に対するアリモクロモルの効果を、表示された遺伝子型の細胞をアリモクロモルで処置することによって評価した。Ｎ３７０Ｓ／Ｖ３９４ＬおよびＮ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇの２種類のＧＤＩ型細胞株においてアリモクロモルがＧＢＡ活性を用量依存的に増加させることを我々のデータは示している。重要なことに、１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇはヌル対立遺伝子であると考えられるので、アリモクロモルがＮ３７０Ｓ変異の活性を増加させることをこれらの結果は示している。
【０１８９】
アリモクロモルの用量依存効果は、Ｌ４４４Ｐ（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）に対するホモ接合体またはＧＢＡ変異Ｇ３２５Ｒ／Ｃ３４２ＧもしくはＰ４１５Ｒ／Ｌ４４４Ｐに対する複合ヘテロ接合体のいずれかであるＧＤＩＩ／ＩＩＩ型患者由来の一次細胞においてＧＢＡ活性がやはり見られる。Ｅ３２６Ｋ、Ｌ４４４Ｐ対立遺伝子に対してホモ接合のアリモクロモルで処置したＧＤＩＩ型細胞においてＧＢＡ活性の増加がそれほど明白でないことがわかった。
【０１９０】
実施例４：Ｎ３７０Ｓ変異を含有するヘテロ接合ＧＢＡ対立遺伝子を有するパーキンソン病患者由来の一次細胞におけるＧＢＡ活性に対する用量依存反応
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞を１：２の分割比で、１週間に１回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０１９１】
【表３】
2019518725.tif 000004
【０１９２】
ＧＢＡ活性アッセイ
ＧＢＡ活性は、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）基質を用いる「無傷細胞」ＧＢＡアッセイ（Ｍｕら，Ｃｅｌｌ，２００８）を使用して測定した。手短に言うと、線維芽細胞を９６ウェルプレートに播種し、表示濃度のアリモクロモルを使用して５日間、生物学上の三つ組で処置した。培地は２〜３日ごとに新鮮な化合物を補充した。基質としてｐＨ４．０の４−ＭＵＧを用いてＧＢＡ活性を測定した。放出された４−ＭＵフルオロフォアを蛍光単位（ＦＬＵ）として定量化し、平行プレートのクリスタルバイオレット染色を用いて細胞密度に正規化した。正規化データは、模擬処置対照細胞と比較して倍率変化（平均値±ＳＤ）として記録する。
【０１９３】
結果
パーキンソン病においてＮ３７０Ｓ変異に対するアリモクロモルの効果を調べるために、Ｎ３７０Ｓ変異を有するパーキンソン病患者由来の一次細胞をアリモクロモルで処置した。アリモクロモルがパーキンソン病患者由来の細胞においてＮ３７０Ｓ  ＧＢＡ活性を用量依存的に増加させることを我々のデータは示している。
【０１９４】
実施例５：ＧＢＡ変異を含まない健常者由来（＋／＋）の一次細胞におけるＧＢＡ活性に対する用量依存反応
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０１９５】
【表４】
2019518725.tif 000005
【０１９６】
ＧＢＡ活性アッセイ：
ＧＢＡ活性は、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（４−ＭＵＧ）基質を用いる「無傷細胞」ＧＢＡアッセイ（Ｍｕら，Ｃｅｌｌ，２００８）を使用して測定した。手短に言うと、線維芽細胞を９６ウェルプレートに播種し、表示濃度のアリモクロモルを使用して５日間、生物学上の三つ組で処置した。培地は２〜３日ごとに新鮮な化合物を補充した。基質としてｐＨ４．０の４−ＭＵＧを用いてＧＢＡ活性を測定した。放出された４−ＭＵフルオロフォアを蛍光単位（ＦＬＵ）として定量化し、平行プレートのクリスタルバイオレット染色を用いて細胞密度に正規化した。正規化データは、模擬処置対照細胞と比較して倍率変化（平均値±ＳＤ）として記録する。
【０１９７】
結果
野生型ＧＢＡタンパク質に対するアリモクロモルの効果を調べるために、ＧＢＡ変異のない健常者由来（＋／＋）の一次細胞をアリモクロモルで処置した。アリモクロモル処置によって、大きさが異なる３種類の細胞株すべてにおいて野生型ＧＢＡ活性が用量依存的に増加したことが観察された。
【０１９８】
実施例６：ゴーシェ病Ｉ型／ＩＩ型／ＩＩＩ型におけるアリモクロモル誘導による活性ＧＢＡの活性ベースプローブ標識の増加
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０１９９】
【表５】
2019518725.tif 000006
2019518725.tif 000007
【０２００】
ＭＥ５６９によるＧＢＡ標識：
活性ＧＢＡは、蛍光活性ベースのプローブ（ＡＢＰ）ＭＥ５６９によって選択的に標識されることが可能である（Ｗｉｔｔｅら，２０１０）。手短に言うと、線維芽細胞をシャーレに播種し、表示濃度のアリモクロモルを使用して５日間、生物学的二つ組で処置した。培地は２〜３日ごとに新鮮な化合物を補充した。細胞はＰＢＳで回収し、タンパク質を抽出し、次いでＢＣＡアッセイを用いて濃度を決定した。同量の総タンパク質をＭＥ５６９とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ローディング緩衝液を添加し、試料を９８℃で５分間インキュベートし、次いでＴＧＸゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル電気泳動の後、赤色ＬＥＤ／７０５Ｍフィルター（Ｇ−ｂｏｘ，Ｓｙｎｇｅｎｅ）を用いて蛍光を検出した。Ｓｙｎｇｅｎｅ製ソフトウェアＧｅｎｅＴｏｏｌｓ  ４．０３．０１．０版を使用して標識ＧＢＡの量を定量化した。正規化データは、模擬処置対照細胞と比較して倍率変化（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３〜４）として記録する。
【０２０１】
結果
蛍光ＡＢＰで標識したＧＢＡの量に対するアリモクロモルの効果を、表示された遺伝子型のゴーシェ病患者由来の一次細胞で評価した。アリモクロモルがＧＤＩ型細胞株（Ｎ３７０Ｓ／Ｖ３９４Ｌ）およびＧＤＩＩ型細胞株（Ｇ３２５Ｒ／Ｃ３４２Ｇ）においてＧＢＡ標識を用量依存的に増加させることを我々のデータは示している。高用量のアリモクロモルだけをＧＤＩＩ型細胞株（Ｌ４４４Ｐに対してホモ接合体）において評価した。さらに、アリモクロモルは、この細胞株において蛍光ＡＢＰで標識することができるＧＢＡの量を増加させる。
【０２０２】
総合すると、アリモクロモルが全３種類のゴーシェ病（
Ｔ１、Ｉ型、ＴＩＩ，ＩＩ型およびＴＩＩＩ，ＩＩＩ型）由来の一次細胞において、活性変異体ＧＢＡの量を増加させることをこれらのデータは示している。
【０２０３】
実施例７：ゴーシェ病Ｉ型における用量依存反応−ＢｉＰおよびＧＢＡ誘導
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０２０４】
【表６】
2019518725.tif 000008
【０２０５】
ウエスタンブロッティング：
細胞をＰＢＳに回収し、４℃で５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に溶解し、超音波処理して、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離により清澄化させた。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。約１０〜２０μｇのタンパク質を含有する試料を糖タンパク質変性緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で希釈し、１００℃で１０分間のインキュベーションにより変性させた。試料を３７℃で１時間、ＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、またはＥｎｄｏＨなしでインキュベートし、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加え、次いで試料を、ＴＧＸゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した後に、この膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで短時間、染色し、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に５％脱脂乳を溶解した液でブロックした。パラフィルム被覆ガラスプレート上で一次抗体（１：５００から１：２０００に希釈）とともにインキュベーションを４℃で終夜行った。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに５％脱脂乳を溶解した液で１：１０，０００に希釈した二次抗体とともに１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットを展開し、次いでＧ−ｂｏｘシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して可視化した。
【０２０６】
結果
ＧＤＩ型一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）の用量依存増加：
アリモクロモルは、ヒートショックタンパク質、例えば、ヒートショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）の発現レベルを増加させることが報告されている（Ｋｉｅｒａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４）。一次細胞においてＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）発現レベルに対するアリモクロモルの効果を評価するために、ＧＤＩ型患者由来のヒト線維芽細胞を０、２５、１００、２００もしくは４００μＭのアリモクロモル（Ｎ３７０Ｓ／Ｖ３９４Ｌ）または０、１００、２００もしくは４００μＭのアリモクロモル（Ｎ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ）を用いて５日間処置した。次いで細胞をウェスタンブロット解析のために回収した。結果は、アリモクロモルがゴーシェ病Ｉ型個体由来のヒト線維芽細胞株においてＢｉＰ発現レベルを用量依存的に増加させることを実証する。これは、ＢｉＰ発現増加によってアリモクロモルがＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みの増強をもたらし得ることを示唆する。
【０２０７】
ＧＤＩ型一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＧＢＡ酵素量の用量依存増加：
ＧＢＡタンパク質レベルに対するアリモクロモルの効果もＮ３７０Ｓ／１−ＢＰ  ｉｎｓ  ８４Ｇ遺伝子型を有するゴーシェＩ型患者由来のヒト線維芽細胞株で評価した。ＥＲシャペロンＢｉＰの発現増加に一致して、ＧＢＡの総レベルの用量依存的増加は、この個体由来のアリモクロモル処置細胞で見られる。さらに、ＥｎｄｏＨ耐性画分の増加は、アリモクロモルが細胞内の処理／成熟したＧＢＡの量を増加させることを示す。
【０２０８】
実施例８：ゴーシェ病ＩＩ型における用量依存反応−ＢｉＰおよびＧＢＡ誘導
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０２０９】
【表７】
2019518725.tif 000009
2019518725.tif 000010
【０２１０】
ウエスタンブロッティング：
細胞をＰＢＳに回収し、４℃で５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に溶解し、超音波処理して、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離により清澄化させた。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。約１０〜２０μｇのタンパク質を含有する試料を糖タンパク質変性緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で希釈し、１００℃で１０分間のインキュベーションにより変性させた。試料を３７℃で１時間、ＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、またはＥｎｄｏＨなしでインキュベートし、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加え、次いで試料を、ＴＧＸゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した後に、この膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで短時間、染色し、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に５％脱脂乳を溶解した液でブロックした。パラフィルム被覆ガラスプレート上で一次抗体（１：５００から１：２０００に希釈）とともにインキュベーションを４℃で終夜行った。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに５％脱脂乳を溶解した液で１：１０，０００に希釈した二次抗体とともに１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットを展開し、次いでＧ−ｂｏｘシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して可視化した。
【０２１１】
結果
ＧＤＩＩ型一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）の用量依存増加：
一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）発現レベルに対するアリモクロモルの効果を評価するために、ゴーシェ病ＩＩ型患者由来のヒト線維芽細胞を表示濃度のアリモクロモルで５日間処置した。次いで細胞をウェスタンブロット解析のために回収した。
【０２１２】
結果は、アリモクロモルがＬ４４４Ｐ／Ｐ４１５ＲまたはＧ３２５Ｒ／Ｃ３４２Ｇ遺伝子型を有するＧＤＩＩ型個体由来のヒト線維芽細胞株においてＢｉＰ発現レベルを用量依存的に増加させることを実証する。これは、ＢｉＰ発現増加によってアリモクロモルがＧＤＩＩ型細胞においてＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みの増強をもたらし得ることを示唆する。
【０２１３】
ＧＤＩＩ型一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＧＢＡ酵素量の用量依存増加：
ＧＢＡタンパク質レベルおよび成熟化に対するアリモクロモルの効果もＧＤＩＩ型一次細胞株において評価した。ＥＲシャペロンＢｉＰの発現増加に一致して、ＧＢＡの総レベルの用量依存的増加は、これらの個体由来のアリモクロモル処置細胞で見られる。さらに、ＥｎｄｏＨ耐性画分の増加は、アリモクロモルがＧＤＩＩ型細胞において成熟（ポストＥＲ）ＧＢＡの量を増加させることを示す。
【０２１４】
実施例９：ゴーシェ病ＩＩＩ型における用量依存反応−ＢｉＰおよびＧＢＡ誘導
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０２１５】
【表８】
2019518725.tif 000011
【０２１６】
ウエスタンブロッティング：
細胞をＰＢＳに回収し、４℃で５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に溶解し、超音波処理して、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離により清澄化させた。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定した。約１０〜２０μｇのタンパク質を含有する試料を糖タンパク質変性緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で希釈し、１００℃で１０分間のインキュベーションにより変性させた。試料を３７℃で１時間、ＥｎｄｏＨ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）とともに、またはＥｎｄｏＨなしでインキュベートし、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加え、次いで試料を、ＴＧＸゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した後に、この膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで短時間、染色し、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に５％脱脂乳を溶解した液でブロックした。パラフィルム被覆ガラスプレート上で一次抗体（１：５００から１：２０００に希釈）とともにインキュベーションを４℃で終夜行った。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに５％脱脂乳を溶解した液で１：１０，０００に希釈した二次抗体とともに１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットを展開し、次いでＧ−ｂｏｘシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して可視化した。
【０２１７】
結果
ＧＤＩＩＩ型一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）の用量依存増加：
一次細胞におけるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）発現レベルに対するアリモクロモルの効果を評価するために、ゴーシェ病ＩＩＩ型（Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ）を有する個体由来のヒト線維芽細胞を表示濃度のアリモクロモルで５日間処置した。次いで、細胞をウェスタンブロット解析のために回収した。
【０２１８】
結果は、アリモクロモルがＬ４４４Ｐに対してホモ接合のこの細胞株においてＢｉＰ発現レベルを用量依存的に増加させることを実証する。これは、ＢｉＰ発現増加によってアリモクロモルがＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みの増強をもたらし得ることを示唆する。
【０２１９】
ＧＤＩＩＩ型一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＧＢＡ酵素量の用量依存増加：
ＧＢＡタンパク質レベルおよび成熟化に対するアリモクロモルの効果もＬ４４４Ｐ／Ｌ４４４Ｐ  ＧＤＩＩＩ型一次細胞株において評価した。ＥＲシャペロンＢｉＰの発現増加に一致して、ＧＢＡの総レベルの用量依存的増加は、アリモクロモル処置細胞で見られる。
さらに、ＧＢＡのＥｎｄｏＨ耐性画分の増加は、アリモクロモルがＧＤＩＩＩ型細胞において成熟ＧＢＡの量を増加させることを示す。
【０２２０】
総合すると、より成熟したＧＢＡがリソソームに到達する可能性があるためにアリモクロモルがＧＢＡ活性を増加させることをこれらの結果は示している。
【０２２１】
実施例１０：ＧＢＡ欠損パーキンソン病におけるＢｉＰ発現の用量依存反応
材料および方法
細胞培養：
初代ヒト線維芽細胞株を、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１２％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ中で、標準細胞培養条件下（３７℃および５％ＣＯ２）で培養した。ヒト線維芽細胞株を１：２または１：３の分割比で、１週間に１〜２回継代した。１６〜２６継代頃に、複製老化の徴候が観察されない（目視検査）細胞を実験のために用いた。
【０２２２】
【表９】
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【０２２３】
ウエスタンブロッティング：
細胞をＰＢＳに回収し、４℃で５分間、３５００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解緩衝液（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に溶解し、超音波処理して、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離により清澄化させた。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイで測定し、次いで試料を、ＴＧＸゲルシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した後に、この膜をＰｏｎｃｅａｕ  Ｓで短時間、染色し、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎを加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）に５％脱脂乳を溶解した液でブロックした。パラフィルム被覆ガラスプレート上で一次抗体（１：５００から１：２０００に希釈）とともにインキュベーションを４℃で終夜行った。膜をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔに５％脱脂乳を溶解した液で１：１０，０００に希釈した二次抗体とともに１時間インキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してブロットを展開し、次いでＧ−ｂｏｘシステム（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して可視化した。
【０２２４】
結果
パーキンソン病ＧＢＡ一次細胞におけるアリモクロモル誘導によるＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）の用量依存増加：
ＧＢＡ欠損パーキンソン病（ＰＤ−ＧＢＡ）を有する個体由来の一次細胞においてＥＲ  Ｈｓｐ７０（ＢｉＰ）発現レベルに対するアリモクロモルの効果を評価するために、ＰＤ−ＧＢＡ（Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ）を有する個体由来のヒト線維芽細胞を表示濃度のアリモクロモルで５日間処置した。次いで細胞をウェスタンブロット解析のために回収した。
【０２２５】
結果は、アリモクロモルがＰＤ−ＧＢＡ（Ｎ３７０Ｓ／Ｎ３７０Ｓ）を有する個体由来の一次細胞におけるＢｉＰ発現レベルを用量依存的に増加させることを実証する。これは、ＢｉＰ発現増加によってアリモクロモルがＥＲ保持変異体ＧＢＡの折り畳みの増強をもたらすことを示唆する。
【０２２６】
実施例１１：ＧＤＩ型およびＧＤＩＩＩ型個体由来の一次神経様細胞におけるＧＢＡ活性に対するアリモクロモルの効果
材料および方法
細胞培養：
ヒト多分化能成体幹細胞（ＭＡＳＣ）を、ＧＤ個体由来の皮膚生検から単離した。ＭＡＳＣの遺伝子型を以下に示す。細胞は、Ｂｅｒｇａｍｉｎら．Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２０１３に記載のニューロン運命に沿って分化するよう誘導した。幹細胞の表面免疫表現型は、ＦＡＣＳによって分析した。幹細胞および神経マーカー発現を免疫蛍光法で評価した。
【０２２７】
【表１０】
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【０２２８】
０日目、ＭＡＳＣを神経系統に沿って分化するよう誘導した。１日目、細胞を模擬（ＰＢＳ）または４００μＭのアリモクロモルで処置した。計９日間、分化全体を通じて処置を持続した。９日目、神経マーカーの免疫蛍光によって分化を評価した。ＧＢＡ活性を蛍光発生基質４−ＭＵＧを使用して測定した。
【０２２９】
結果
アリモクロモルはＧＤＩ型およびＧＤＩＩＩ型の個体からの皮膚由来ヒト多分化能成体幹細胞の神経分化に影響を及ぼさない：
神経分化に対するアリモクロモルの効果を評価するために、模擬またはアリモクロモルで処置する一方で、ＧＤ個体由来のＭＡＳＣを分化するよう誘導した。結果は、神経マーカーのチューブリンβ３およびＮｅｕＮの発現がアリモクロモルに影響を受けなかったことを示す。
【０２３０】
ＧＤＩ型およびＧＤＩＩＩ型個体由来の神経におけるアリモクロモル誘導によるＧＢＡ活性の増加：
アリモクロモルがＧＤＩ型（Ｎ３７０Ｓ／Ｙ１３３＊）を有する個体由来の神経において、およびＧＤＩＩＩ型（Ｆ２１３Ｉ／Ｌ４４４Ｐ、Ｌ４４４Ｐ／Ｌ４４４ＰまたはＩＶＳ２＋１Ｇ＞Ａ／Ｎ１８８Ｓ）を有する３個体において変異体ＧＢＡ活性を増加させることを我々は見出した。
【０２３１】
総合すると、結果は、アリモクロモルが神経分化に影響を及ぼすことなくＧＤＩ型およびＧＤＩＩＩ型個体由来の神経において変異体ＧＢＡ活性を増加させることを実証する。
【０２３２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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