(57)【要約】  本開示は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び／又は網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）を治療する方法に関し、当該方法は、治療を必要とする患者の網膜に、有効量のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子を投与するステップを含む。カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、ペプチドカスパーゼ‐９阻害因子を含んでもよく、及び／又は、細胞膜透過性ペプチドに結合されてもよい。本開示は、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子を含む医薬組成物をさらに含む。本開示は、さらに、ＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療する方法におけるそのような組成物の使用に関する。
2019520414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び／又は網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）を治療する方法であって、該治療を必要とする患者の網膜に、有効量のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、ペプチドカスパーゼ‐９阻害因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドカスパーゼ‐９阻害因子は、ＸＢＩＲ３を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、細胞膜透過性ペプチドに結合される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞膜透過性ペプチドは、ペネトラチン１、トランスポータン、ｐＩＳｌ、Ｔａｔ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＡＰ、及びＭＴＳを含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子はＸＢＩＲ３を含み、前記ＸＢＩＲ３はペネトラチン１に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量は、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）によって検出される前記患者の網膜における浮腫を減少させることによってＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療する、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記有効量は、前記患者の網膜の網膜剥離を減少させることによってＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療する、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
投与は、点眼によるものである、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
有効量のカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、点眼による患者への投与用に製剤化される、医薬組成物。
【請求項１１】
前記カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、ペプチドカスパーゼ−９阻害因子を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドカスパーゼ‐９阻害因子は、ＸＢＩＲ３を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、細胞膜透過性ペプチドに結合される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞膜透過性ペプチドは、ペネトラチン１、トランスポータン、ｐＩＳｌ、Ｔａｔ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＡＰ、及びＭＴＳを含む群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子はＸＢＩＲ３を含み、前記ＸＢＩＲ３はペネトラチン１に結合される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記有効量は、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）によって検出される前記患者の網膜における浮腫を減少させることによって前記患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療する、請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記有効量は、前記患者の網膜の網膜剥離を減少させることによってＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療する、請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び／又は網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）を治療する方法において使用するための、請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益に関する記述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた認可番号ＮＳ０８１３３３の下、政府の支援の下に行われた。政府は、本発明においてある種の権利を有している。
【０００２】
本開示は、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）及び／又は網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）を抑制するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＭＥは、西欧諸国における新たな失明の主な原因である。糖尿病を患うアメリカ人は少なくとも２３００万人、世界的には３億８２００万人以上おり；８０％が網膜症にかかり、４０％もの人がＤＭＥにかかる。この問題をさらにひどくすると、糖尿病患者の約５０％のみが適切なアイケアを受けており、糖尿病の多くの症例は今のところ診断されていない。これら全てが、ＤＭＥ及びＲＶＯを含む糖尿病性網膜疾患の負荷を増大させている。現在のところ、唯一証明された薬理学的選択肢は、硝子体内注射によって送達される抗ＶＥＧＦ療法である。しかし、非遵守が問題であり；多くの患者は眼内注射を望んでおらず、処方された投与量を逃している。さらに、５０％ものＤＭＥ患者が抗ＶＥＧＦ療法に反応しないということが推定されている。他の治療は、レーザー凝固であり、視力喪失を５０％減らすことができ；目標は、病気の進行を減らすことであるが、視力の著しい改善はまれである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００６０５６４８７
【特許文献２】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，３４８，１８５
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２２；６５９−６６１（２００７）
【非特許文献２】Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｌｖｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３２６０８−３２６１３（１９９８）
【非特許文献３】Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８（２）：８４−８７，１９９８
【非特許文献４】Ｄｕｎｉｃａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，６０（１）：４５−６０，２００１
【非特許文献５】Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５１５（２）：１０１−０９，２００１
【非特許文献６】Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２（８）：２８４７−５５，２０００
【非特許文献７】Ｋｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１２（６）：９１１−１６，２００１
【非特許文献８】Ｂｅｌｌｅｔ−Ａｍａｌｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４６７（１）：１３１−４３，２０００
【非特許文献９】Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，５５（２）：１６３−７２，２０００
【非特許文献１０】Ｔｈｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４８２（３）：２６５−６８，２０００
【非特許文献１１】Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：５６３５−４０，１９９６
【非特許文献１２】Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：２５３−６１，１９９６
【非特許文献１３】Ｔｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：１９１１−１８，１９９７
【非特許文献１４】Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２００８  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；１７８０（７−８）：９４８−５９
【非特許文献１５】Ｐ．Ｋｕｍａｒ，Ｈ．Ｗｕ，Ｊ．Ｌ．ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｋ．Ｅ．Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｂ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．Ｌｅｅ，Ｐ．Ｓｈａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｍａｎｊｕｎａｔｈ，Ｔｒａｎｓｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８（２００７），ｐｐ．３９−４３
【非特許文献１６】Ｐｏｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１２（１）：６７−７７，１９９８
【非特許文献１７】Ｍａｇｚｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５１２（ｌ）：７７−８９，２００１
【非特許文献１８】Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（４）：２４３７−４３，２００２
【非特許文献１９】Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（８）：５８３６−４０，２００１
【非特許文献２０】Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（２５）：１６０１０−０１７，１９９７
【非特許文献２１】Ｅｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２６９（２）：２３７−４４，２００１
【非特許文献２２】Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１（３）：９９−１０３，２０００
【非特許文献２３】Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔ，１７８：２７７−３２８，１９９８
【非特許文献２４】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５４（１−２）：１３７−４５，２００１
【非特許文献２５】Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：２７３０−３６，１９９７
【非特許文献２６】Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５（４）：１８５−９４，１９９９
【非特許文献２７】Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９７５）
【非特許文献２８】Ｌｉｂｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８０）
【非特許文献２９】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １１７，１１２４−１１３３  ｅ１１２１（２０１０）
【非特許文献３０】Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １１７，１１０２−１１１２  ｅ１１０１（２０１０）
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、治療を必要とする患者の網膜に、有効量のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子を投与することによってＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療する方法を提供する。
【０００７】
本開示は、有効量のカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供し、当該医薬組成物は、点眼による患者への投与用に製剤化される。
【０００８】
本開示は、上記の方法において使用するための上記の医薬組成物をさらに提供する。
【０００９】
当該方法、医薬組成物、及び、当該方法において使用するための医薬組成物は、明らかに相互に排他的でない限り、以下の要素のいずれかを任意の組み合わせでさらに含んでもよい：ｉ）カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、ペプチドカスパーゼ−９阻害因子を含み得る；ｉｉ）ペプチドカスパーゼ−９阻害因子は、ＸＢＩＲ３を含み得る；ｉｉｉ）カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、細胞膜透過性ペプチドに結合され得る；ｉｖ）細胞膜透過性ペプチドは、ペネトラチン１、トランスポータン、ｐＩＳｌ、Ｔａｔ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＡＰ、及びＭＴＳを含む群から選択されてもよい；ｖ）カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子はＸＢＩＲ３を含んでもよく、ここでＸＢＩＲ３はペネトラチン１に結合される；ｖｉ）有効量は、ＯＣＴによって検出される患者の網膜における浮腫を減少させることによってＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療し得る；ｖｉｉ）有効量は、患者の網膜の網膜剥離を減少させることによってＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療し得る；ｖｉｉｉ）投与は、点眼によるものであってもよい。
【００１０】
本明細書は、本開示の様々な実施形態に言及し、様々な実施例を提供する。これらの実施形態及び実施例は全て、明確に除外されない限り、互いに、及び、上記の方法、医薬組成物、又は、上記の方法において使用するための医薬組成物のいずれかと組み合わせて使用することもできる。
【００１１】
本実施形態及びその利点のより完全な理解を、本開示の実施形態に関する付随の図面と併せて以下の説明を参照することによって得ることができる。これらの図及びその説明において使用される特定の略語は、本明細書の残りの箇所でさらに詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】例えばＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３によって遮断されない限り浮腫を引き起こすカスパーゼ‐９媒介シグナル伝達経路の概略図である。
【図２】マウス及びウサギにおける網膜によるＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３点眼剤の取り込みについての結果を表すブロット及び対応する棒グラフのセットを示した図である。
【図３】点眼処置後のウサギの血漿におけるＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の存在についての結果を表すブロットのセットを示した図である。
【図４】網膜浮腫に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果を示す一連の明視野及びＯＣＴ画像を示した図である。
【図５】カスパーゼ‐９のＲＶＯ活性化（左）、及び、カスパーゼ‐９のＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３結合（右）についてのアッセイの結果を表すブロットのセットを示した図である。
【図６】網膜浮腫に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３（カスパーゼ−９阻害因子）の効果を示す一連の明視野及びＯＣＴ画像並びにグラフを示した図である。
【図７】網膜剥離に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３（カスパーゼ‐９阻害因子）の効果を示す代表的なＯＣＴ画像及びグラフを示した図である。
【図８】内部網膜層に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３（カスパーゼ‐９阻害因子）の効果を示す代表的なＯＣＴ画像及び一連のグラフを示した図である。
【図９】網膜の外網状層に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３（カスパーゼ‐９阻害因子）の効果を示す代表的なＯＣＴ画像及びグラフを示した図である。
【図１０】網膜の視細胞層に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３（カスパーゼ‐９阻害因子）の効果を示す代表的なＯＣＴ画像及びグラフのセットを示した図である。
【図１１】網膜の内顆粒層の厚さに対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果のグラフを示した図である。
【図１２】網膜機能に関連するＢ波振幅に対するＲＶＯ、Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３、又は、ＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果のグラフを示した図である。
【図１３】ＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果を示すために、網膜血管における切断型カスパーゼ‐７の検出を可能にするように染色された一連の顕微鏡写真を示した図であり、スケールバーは２０μｍである。
【図１４】ＶＥＧＦ及びＥＲＫに対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果を示すブロット（左上）、ＶＥＧＦ発現に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果を示すグラフ（左下）、並びに、網膜におけるＨＩＦ‐１α発現に対するＲＶＯ又はＲＶＯ及びＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３の効果を示す一連の顕微鏡写真を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯを治療するための組成物及び方法に関する。例えば、限定としてではなく、本開示は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの誘導及び／又は悪化に関連しているカスパーゼ−９シグナル伝達活性を抑制するための方法及び組成物に関する。
【００１４】
本明細書において使用される場合、「ＤＭＥ」という用語は、臨床的に検出可能な糖尿病性黄斑浮腫を指す。ＤＭＥは、臨床的に検出可能な真性糖尿病（本明細書においては単に糖尿病とも呼ばれる）を有する患者、２型糖尿病が頻繁であるが、１型糖尿病においても発生する。ＤＭＥの臨床症状には、網膜浮腫、及び、黄斑浮腫を伴う糖尿病性網膜症が含まれる。ＤＭＥは、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）を使用して検出することができる。ＤＭＥは、労働年齢の成人（２０〜７０歳）における失明の主な原因である。
【００１５】
本明細書において使用される場合、「ＲＶＯ」という用語は、臨床的に検出可能な網膜静脈閉塞症を指す。ＲＶＯは、いかなる患者においても発生し得るが、臨床的に検出可能なアテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧、緑内障、黄斑浮腫、又は硝子体出血を有する患者においても発生するのがより一般的である。ＲＶＯは、高齢患者においてより一般的である。ＲＶＯは、緑内障及びＤＭＥを含む黄斑浮腫を引き起こし得る。ＲＶＯは、血管造影法及び／又はＯＣＴを使用して検出することができる。ＲＶＯは、労働年齢の成人における失明の第２の主な原因である。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「患者」という用語は、いかなる哺乳動物も含むいかなる動物も指し、ヒト、及び、（非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等を含むがそれらに限定されない）非ヒト動物を含むがそれらに限定されない。特に、患者はヒトである。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「有効量」は、患者において有益な又は所望の臨床結果を引き起こすのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で患者に投与することができ、典型的には患者の網膜に投与される。治療の点から、有効量は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの影響を寛解させる、及び／又は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの誘導及び／又は悪化を抑制するのに、又さもなければ、１つ又は複数の疾患の病理学的結果を減少させるのに十分な量である。有効量は、一般的に、ケースバイケースで医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際には、いくつかの要因が考慮され得る。これらの要因には、年齢、治療されている状態、状態の重症度、以前の反応、使用される阻害因子のタイプ、抑制されることになるカスパーゼ−９シグナル伝達経路のメンバー、標的を発現する細胞のタイプ、並びに、投与されている組成物（本明細書においては、「治療薬」、「阻害因子」又は「コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」とも呼ばれる）の形態及び有効濃度が含まれる。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療している」及び類似の動詞は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの影響を寛解させること、及び／又は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの誘導及び／又は悪化を抑制することを指す。
【００１９】
特定の作用様式に限定されることなく、本明細書において論じられるカスパーゼ−９シグナル伝達経路は、図１において示されている経路を含み得る。この経路において、ＲＶＯは血管内でカスパーゼ−９の活性化を誘導し、これは、カスパーゼ−７の活性化をもたらす。カスパーゼ−７は、コシャペロンタンパク質ｐ２３を切断する。ｐ２３はＨＩＦ−１αの負の制御因子であり、従って、ｐ２３の切断はＨＩＦ−１αの増加をもたらし、ＨＩＦ−１転写因子の形成における律速段階であり、ＶＥＧＦレベルを増加させ、浮腫をもたらす。例示的な例として図１においてＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３として示されているカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、カスパーゼ−７に対するカスパーゼ−９の作用を遮断することによって作用し得る。
【００２０】
ＤＭＥ及び／又はＲＶＯを抑制する方法
特定の実施形態において、本開示は、有効量のカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子又はそのコンジュゲートを投与することによる、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの影響を寛解させること、及び／又は、患者におけるＤＭＥ及び／又はＲＶＯの誘導及び／又は悪化を抑制することにおける本明細書において開示される治療の方法又は使用を対象にする。特定の実施形態において、本開示の方法は、ＤＭＥ及び／又はＲＶＯを抑制するための点眼によるカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子又はそのコンジュゲートの投与を対象にする。
【００２１】
治療薬は、ＤＭＥ及び／又はＲＶＯの影響を治療するために使用される場合、単一用量又は複数回用量として投与されてもよい。例えば、限定としてではないが、複数回用量が投与される場合、２４時間当たり６回、２４時間当たり４回、２４時間当たり３回、２４時間当たり２回、２４時間当たり１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、週に１回、週に２回、又は週に３回の間隔で投与されてもよい。特定の実施形態では、初回量はその後の用量より多くてもよく、又は、全ての用量が同じであってもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、本開示の方法及び使用と関連させて使用される阻害因子は、本明細書において開示されているＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３コンジュゲートである。特定の実施形態では、Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３コンジュゲートは、単一用量として又は複数回用量で、ＤＭＥ及び／又はＲＶＯを患っている患者に投与される。投与されるＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３組成物の濃度は、特定の実施形態では：０．１μＭから１，０００μＭ；１μＭから５００μＭ；１０μＭから１００μＭ；又は、２０μＭから６０μＭ；である。特定の実施形態において、特定のヒト等価用量は、非特許文献１において概説されているように、体表面積の比較を介して動物研究から計算することができる。特定の実施形態では、眼の大きさの比較を利用して、特定のヒト等価用量を計算することができる。
【００２３】
特定の実施形態では、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、単独で又は膜透過性コンジュゲートという面に関して、１つ又は複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与される。そのような実施形態のうちの特定の実施形態において、さらなる治療薬は、抗ＶＥＧＦ治療薬及び／又はステロイド系治療薬を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、当該方法は、単独で又は膜透過性コンジュゲートという面に関して、１つ又は複数のさらなるカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子の投与を含む。
【００２４】
組成物
カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子
特定の実施形態において、本開示のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、カスパーゼ‐９のペプチド阻害因子である。
【００２５】
特定の実施形態において、カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、アポトーシスの阻害因子（「ＩＡＰ」）として同定されるタンパク質阻害因子のクラスを含むが、これらに限定されない。ＩＡＰは、一般的に、それぞれ約７０のアミノ酸残基から成る１から３のＢＩＲ（バキュロウイルスＩＡＰ反復）ドメインを有する。加えて、特定のＩＡＰは、２つの亜鉛原子を配位させることができる７つのシステイン及び１つのヒスチジン（Ｃ３ＨＣ４）によって定義されるＲＩＮＧフィンガードメインも有する。
【００２６】
本明細書において使用するのに適した例証的な哺乳類のＩＡＰとしては、ｃ‐ＩＡＰ１（受入番号Ｑ１３４９０．２）、ｃＩＡＰ２（受入番号Ｑ１３４８９．２）及びＸＩＡＰ（受入番号Ｐ９８１７０．２）が含まれるが、これらに限定されない。上記のＩＡＰはそれぞれ、分子のＮ末端部分に３つのＢＩＲを有し、さらに、Ｃ末端にてＲＩＮＧフィンガーを有する。別の適した哺乳類のＩＡＰであるＮＡＩＰ（受入番号Ｑ１３０７５．３）は、ＲＩＮＧ無しで３つのＢＩＲを有し、さらに、２つのさらなる適したＩＡＰであるサバイビン（受入番号Ｏ１５３９２．２）及びＢＲＵＣＥ（受入番号Ｑ９Ｈ８Ｂ７）はどちらも、１つのＢＩＲのみを有する。
【００２７】
特定の実施形態では、カスパーゼ‐９のペプチド阻害因子は、配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＳＴＮＴＣＬＰＲＮＰＳＭＡＤＹＥＡＲＩＦＴＦＧＴＷＩＹＳＶＮＫＥＱＬＡＲＡＧＦＹＴＤＷＡＬＧＥＧＤＫＶＫＣＦＨＣＧＧＧＬＲＰＳＥＤＰＷＥＱＨＡＲＷＹＰＧＣＲＹＬＬＥＱＲＧＱＥＹＩＮＮＩＨＬＴＨＳ（配列番号１１）を有するＸＢＩＲ３である。
【００２８】
特定の実施形態では、カスパーゼ‐９のペプチド阻害因子は、配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＳＴＮＴＬＰＲＮＰＳＭＡＤＹＥＡＲＩＦＴＦＧＴＷＩＹＳＶＮＫＥＱＬＡＲＡＧＦＹＴＤＷＡＬＧＥＧＤＫＶＫＣＦＨＣＧＧＧＬＲＰＳＥＤＰＷＥＱＨＡＲＷＹＰＧＣＲＹＬＬＥＱＲＧＱＥＹＩＮＮＩＨＬＴＨＳ（配列番号１２）を有するＸＢＩＲ３である。
【００２９】
特定の実施形態では、カスパーゼ‐９のペプチド阻害因子には、ＥＧ  Ｚ‐ＶＥＩＤ‐ＦＭＫ（配列番号：１として開示されている「ＶＥＩＤ」）（特許文献１）；Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＣｒｍＡ、及びＺ−ＶＡＤ−（２，６−ジクロロベンゾイルオキソペンタン酸）（非特許文献２）；が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
カスパーゼ−９のペプチド阻害因子は、同定されるカスパーゼ−９阻害因子ペプチドの特定の構造的及び機能的特徴を保持しているが、１つ又は複数の位置にて同定される阻害因子のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。そのような変異体は、当技術分野において既知の方法を介して元の配列からアミノ酸残基を置換、欠失又は付加させることによって調製することができる。
【００３１】
特定の実施形態では、そのような実質的に類似の配列には、保存的アミノ酸置換を組み込んだ配列が含まれる。本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換を含むことを意図している。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており：塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等）；無電荷の極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン等）；非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等）；β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン等）；及び、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）；を含む。他の一般的に好ましい置換は、アラニン又はグリシン等の小さい側鎖を有する別の残基によるアミノ酸残基の置換を含む。アミノ酸置換ペプチドは、自動化学合成等の標準的な技術によって調製することができる。
【００３２】
特定の実施形態では、本開示のカスパーゼ‐９のペプチド阻害因子は、ＩＡＰ等の元のカスパーゼ−９のペプチド阻害因子のアミノ酸配列に少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同であり、カスパーゼ−９阻害の能力がある。本明細書において使用される場合、２つのアミノ酸配列間の相同性のパーセントは、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡ等の標準的なソフトウェアを使用して決定することができる。合成されたカスパーゼ‐９のペプチド阻害因子の、カスパーゼ‐９を抑制する能力に対するアミノ酸置換の効果は、以下の実施例の部分に開示されている方法を使用して試験することができる。
【００３３】
阻害因子−細胞膜透過性ペプチドのコンジュゲート
本開示の特定の実施形態において、カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子は、細胞膜透過性ペプチドに結合されて、阻害因子−細胞膜透過性ペプチドのコンジュゲートを形成する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「細胞膜透過性ペプチド」は、細胞の細胞膜及び／又は核膜を横切る膜透過性複合体の輸送に関連するエネルギー非依存的な（すなわち、非エンドサイトーシスの）移行特性を与える短い（約１２〜３０残基の）アミノ酸配列又は機能的モチーフを含むペプチドである。特定の実施形態において、本開示の膜透過性複合体に使用される細胞膜透過性ペプチドは、好ましくは、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子とジスルフィド結合を形成するために遊離であるか又は誘導体化された少なくとも１つの非機能性のシステイン残基を含み、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、そのような結合のために修飾されている。そのような特性を与える代表的なアミノ酸モチーフは、その内容を参照により本明細書において明示的に援用する特許文献２に列挙されている。本開示の細胞膜透過性ペプチドは、ペネトラチン１、トランスポータン、ｐＩｓｌ、ＴＡＴ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＴＳ、及びＭＡＰを含み得るが、これらに限定されない。
【００３５】
本開示の細胞膜透過性ペプチドは、同定される細胞膜透過性ペプチドの特定の構造的及び機能的特徴を保持しているが、１つ又は複数の位置にて同定されるペプチドのアミノ酸配列とは異なる配列を含む。そのようなポリペプチド変異体は、当技術分野において既知の方法を介して元の配列からアミノ酸残基を置換、欠失又は付加させることによって調製することができる。
【００３６】
特定の実施形態では、そのような実質的に類似の配列は、ペプチドカスパーゼ−９阻害因子と関連させて先に記載したように、保存的アミノ酸置換を組み込む配列を含む。特定の実施形態では、本開示の細胞膜透過性ペプチドは、同定されるペプチドのアミノ酸配列に少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同であり、細胞膜透過の媒介となる能力を有する。細胞膜透過の媒介となる合成されたペプチドの能力に対するアミノ酸置換の効果は、以下の実施例の部分に開示されている方法を使用して試験することができる。
【００３７】
本開示の特定の実施形態において、膜透過性複合体の細胞膜透過性ペプチドは、ペプチド配列Ｃ（ＮＰｙｓ）‐ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：２）を含むペネトラチン１又はその保存的変異体である。本明細書において使用される場合、「保存的変異体」は、１つ又は複数のアミノ酸置換を有するペプチドであり、この置換は、細胞膜透過性ペプチドの形状、又は、従って生物活性（すなわち輸送活性）若しくは膜毒性に悪影響を及ぼさない。
【００３８】
ペネトラチン１は、ショウジョウバエのアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）のホメオドメインの３番目のアルファ−ヘリックスに由来する１６アミノ酸ポリペプチドである。その構造及び機能は、よく研究され且つ特徴づけられている：非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０。
【００３９】
ペネトラチン１は、６３ｋＤａのタンパク質であるアビジンを、ヒトのＢｏｗｅｓメラノーマ細胞内に効率的に運ぶということが示されてきた（非特許文献７）。加えて、ペネトラチン１及びそのカーゴの輸送は、非エンドサイトーシス且つエネルギー非依存的であり、受容体分子又は輸送体分子には依存しないということが示されてきた。さらに、ペネトラチン１は、純粋な脂質二重層を通過することができるということが知られている（非特許文献１０）。この特徴は、ペネトラチン１が、細胞表面受容体／輸送体の利用可能性の制限はなく、そのカーゴを輸送するのを可能にする。送達ベクターは、全ての細胞タイプに入ること（非特許文献３）、及び、ペプチド（非特許文献１１）又はアンチセンスオリゴヌクレオチド（非特許文献１２；非特許文献１３）を効果的に送達することが以前に示されている。
【００４０】
本開示の他の非限定的な実施形態は、以下の例証的な細胞膜透過性分子：ＲＬ１６（Ｈ‐ＲＲＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＲＲ‐ＯＨ）（配列番号：３）、わずかに異なる物理的性質を有するペネトラチン１に由来する配列（非特許文献１４）；及び、ＲＶＧ‐ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号：４）、ニューロンを標的とする狂犬病ウイルス配列（非特許文献１５を参照）；の使用を含む。
【００４１】
本開示の特定の代替の非限定的な実施形態において、膜透過性複合体の細胞膜透過性ペプチドは：トランスポータン、ｐＩＳｌ、Ｔａｔ（４８−６０）、ｐＶＥＣ、ＭＡＰ及びＭＴＳを含む群から選択される細胞膜透過性ペプチドである。トランスポータンは、リジンによって接続されているニューロペプチドガラニンのアミノ末端からの１２の機能性アミノ酸、及び、カルボキシル末端における１４残基のマストパランの配列を有する２７アミノ酸長のペプチドであり（非特許文献１６）、アミノ酸配列ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号：５）又はその保存的変異体を含む。
【００４２】
ｐＩｓｌは、ラットのインスリン１遺伝子エンハンサータンパク質のホメオドメインの３番目のヘリックスに由来する（非特許文献１７；非特許文献７）。ｐＩｓｌは、アミノ酸配列ＰＶＩＲＶＷＦＱＮＫＲＣＫＤＫＫ（配列番号：６）又はその保存的変異体を含む。
【００４３】
Ｔａｔは、ＨＩＶ感染細胞の細胞膜を横切る移行がウイルスゲノムをトランス活性化するのを可能にする、８６〜１０２アミノ酸の転写活性化因子である（非特許文献５；非特許文献１８；非特許文献１９）。残基４８〜６０から延びる小さいＴａｔフラグメントは、核内移行の原因であると決定されており（非特許文献２０）、アミノ酸配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号：７）又はその保存的変異体を含む。
【００４４】
ｐＶＥＣは、マウスの細胞接着分子、血管内皮カドヘリンの配列に由来し、アミノ酸６１５〜６３２から延びる１８アミノ酸長のペプチドである（非特許文献２１）。ｐＶＥＣは、アミノ酸配列ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨ（配列番号：８）又はその保存的変異体を含む。
【００４５】
ＭＴＳ又は膜移行配列は、特定のペプチドのうち、発生過程の翻訳産物をさらなるプロセシングのために適切な細胞小器官内に向ける原因であるアクセプタータンパク質によって認識される部分である（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。特に関連性があるＭＴＳは、ＭＰＳペプチド、ウイルスｇｐ４１タンパク質の疎水性末端ドメインのキメラ、及び、シミアンウイルス４０ラージ抗原からの核局在化シグナルであり、核局在化シグナルと、温度とは無関係に内部移行し、オリゴヌクレオチドのための担体として機能する膜移行配列との１つの組み合わせを表している（非特許文献２２；非特許文献２５）。ＭＰＳは、アミノ酸配列ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号：９）又はその保存的変異体を含む。
【００４６】
モデル両親媒性ペプチド又はＭＡＰは、その本質的な特徴として、両親媒性へリックス及び少なくとも４つの完全なヘリックスターンの長さを有する一群のペプチドを形成する（非特許文献２６；非特許文献５）。例証的なＭＡＰは、アミノ酸配列ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ（配列番号：１０）−アミド又はその保存的変異体を含む。
【００４７】
特定の実施形態では、上記の細胞膜透過性ペプチド及びカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、共有結合してコンジュゲートを形成する。特定の実施形態では、細胞膜透過性ペプチドは、組換えＤＮＡ技術を介してペプチドカスパーゼ−９阻害因子に作動可能に連結される。例えば、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子がペプチドカスパーゼ−９阻害因子である実施形態では、そのペプチドカスパーゼ−９阻害因子をコードする核酸配列を、関心のあるペプチドカスパーゼ‐９阻害因子をコードする核酸配列の上流に（細胞膜透過性ペプチドのアミノ末端への連結のために）、若しくは、下流に（細胞膜透過性ペプチドのカルボキシ末端への連結のために）、又は、その両方に導入することができる。ペプチドカスパーゼ−９阻害因子をコードする核酸配列も、細胞膜透過性ペプチドをコードする核酸配列も含むそのような融合配列は、当技術分野において良く知られる技術を使用して発現させることができる。
【００４８】
特定の実施形態では、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、非共有結合を介して細胞膜透過性ペプチドに作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、そのような非共有結合は、イオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合、又はファンデルワールス力によって媒介される。
【００４９】
特定の実施形態では、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、化学リンカーを介して細胞膜透過性ペプチドに作動可能に連結される。そのような結合の例は、典型的には、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＰを含む群から選択される１〜３０の非水素原子を組み込む。例証的なリンカーには、置換アルキル又は置換シクロアルキルが含まれるが、これらに限定されない。或いは、異種部分は、（リンカーが単結合である場合）細胞膜透過性ペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に直接結合してもよい。リンカーが単共有結合ではない場合、リンカーは、任意選択で、一重、二重、三重又は芳香族の炭素−炭素結合だけでなく、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、硫黄−硫黄結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合、及び窒素−白金結合を含む安定した化学結合のいかなる組み合わせであってもよい。特定の実施形態では、リンカーは、２０未満の非水素原子を組み込み、エーテル、チオエーテル、尿素、チオ尿素、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミド、ヒドラジドの結合、及び、芳香族又はヘテロ芳香族の結合のいかなる組み合わせでも構成される。特定の実施形態では、リンカーは、一重炭素−炭素結合とカルボキサミド、スルホンアミド又はチオエーテルの結合との組み合わせである。
【００５０】
コンジュゲーションのための一般的な戦略は、細胞膜透過性ペプチド及びカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子の成分を別々に調製することを含み、それぞれが適切な反応基で修飾又は誘導体化されて、その２つの結合を可能にする。次に、修飾されたカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子は、細胞膜透過性ペプチドとカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子の分子との間で共有結合を生成するのに十分な時間（及び、温度、ｐＨ、モル比等のそのような適切な条件下で）、結合のために調製された細胞膜透過性ペプチドと共にインキュベートされる。
【００５１】
効率的なコンジュゲーションに要求される条件がそうであるように、多数のコンジュゲーションの方法及び戦略が、当業者には容易に明らかになる。単なる一例として、そのようなコンジュゲーションのための戦略の１つが以下に記載されるが、融合タンパク質の生成又は化学リンカーの使用等の他の技術も本開示の範囲内である。
【００５２】
特定の実施形態において、本開示のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子の分子と細胞膜透過性ペプチドとの間にジスルフィド結合を生成する場合、カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子の分子は、チオール基を有するように修飾させることができ、ニトロピリジン脱離基を、細胞膜透過性ペプチドのシステイン残基上に製造することができる。いかなる適した結合（例えば、チオエステル結合、チオエーテル結合、カルバメート結合等）も、一般的に且つ当技術分野において良く知られた方法に従って作製することができる。誘導体化又は修飾された細胞膜透過性ペプチドも、修飾されたカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子も、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ滅菌水において再構成され、次に、コンジュゲーションに適切な量（例えば、等モル量）で互いに添加される。コンジュゲーション混合物は、次に、３７℃で６０分間インキュベートされ、次に、４℃で保管される。結合は、ベクター結合型カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子の分子、及び、ＤＴＴで還元させたアリコートを１５％の非変性ＰＡＧＥ上で流すことによって確認することができる。次に、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子の分子を、適切な染色で可視化することができる。
【００５３】
特定の実施形態において、本開示は、ペネトラチン１１‐ＸＢＩＲ３（Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３）コンジュゲートを対象にしている。そのような特定の実施形態では、Ｐｅｎ−１−ＸＢＩＲ３の配列は：Ｃ（ＮＰｙｓ）−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ｓ−ｓ−ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＳＴＮＴＣＬＰＲＮＰＳＭＡＤＹＥＡＲＩＦＴＦＧＴＷＩＹＳＶＮＫＥＱＬＡＲＡＧＦＹＴＤＷＡＬＧＥＧＤＫＶＫＣＦＨＣＧＧＧＬＲＰＳＥＤＰＷＥＱＨＡＲＷＹＰＧＣＲＹＬＬＥＱＲＧＱＥＹＩＮＮＩＨＬＴＨＳ（それぞれ、ジスルフィド結合によって連結された配列番号２及び１１）である。他のそのような実施形態において、Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３の配列は：Ｃ（ＮＰｙｓ）−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ−ｓ−ｓ−ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭＳＴＮＴＬＰＲＮＰＳＭＡＤＹＥＡＲＩＦＴＦＧＴＷＩＹＳＶＮＫＥＱＬＡＲＡＧＦＹＴＤＷＡＬＧＥＧＤＫＶＫＣＦＨＣＧＧＧＬＲＰＳＥＤＰＷＥＱＨＡＲＷＹＰＧＣＲＹＬＬＥＱＲＧＱＥＹＩＮＮＩＨＬＴＨＳ（それぞれ、ジスルフィド結合によって連結された配列番号２及び１２）である。
【００５４】
医薬組成物
特定の実施形態において、本開示のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子又はコンジュゲートは、網膜投与用に製剤化される。点眼剤による投与のために、カスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子又はコンジュゲートを含有する溶液又は懸濁液を、従来の手段によって、例えば、点眼器、ピペット又はスプレーを用いて網膜に直接適用するために製剤化することができる。特定の実施形態において、本開示のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子又はコンジュゲートは、等張食塩水において製造化される。特定の実施形態では、本開示のカスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子又はコンジュゲートは、ｐＨ７．４の等張食塩水又はほぼｐＨ７．４の等張食塩水において製造化される。
【００５５】
細胞、組織又は対象への送達を促進するために、本開示のカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子又はそのコンジュゲートは、様々な組成物において、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に製剤化され得る。本明細書において使用される場合「薬学的に許容される」という用語は、選択される担体、賦形剤又は希釈剤が、カスパーゼ‐９シグナル伝達経路阻害因子又はコンジュゲートの生物活性、又は、その組成物のレシピエントの生物活性のいずれにも悪影響を及ぼさないということを意味する。本開示において使用するための適した医薬品の担体、賦形剤及び／又は希釈剤には、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、タルク粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム、アカシアゴム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ポリビニルピロリドン及び／又はポリビニルアルコール、生理食塩水、及び水が含まれるが、これらに限定されない。治療的処置のための化合物の具体的な製剤は、非特許文献２７及び非特許文献２８において論じられている。
【００５６】
本開示の方法によると、細胞、組織又は対象に投与されるカスパーゼ−９シグナル伝達経路阻害因子又はそのコンジュゲートの量は、有効量であるべきである。
【実施例１】
【００５７】
点眼剤によってマウス及びウサギの網膜にＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３が送達される。
【００５８】
マウス及びラットにＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３を送達する点眼剤の能力を試験した。結果が、図２及び図３において示されている。
【００５９】
マウスでは、Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３（１０μｇ）点眼剤を適用し、次に、その動物を指示された時間に屠殺した。ウサギでは、２００μｇのＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３点眼剤又は生理食塩水の溶媒を４．５日間ＢＩＤ投与した。最終用量を、網膜の回収の５ｈ前に与えた。ウサギから血漿を、ベースライン及び回収時に得た。
【００６０】
網膜ライセートをＸＩＡＰで免疫沈降させ、続いて抗Ｈｉｓについてウエスタンブロッティングを行った。ＸＢＩＲ３はＨｉｓタグを有するため、ＸＢＩＲ３の取り込みは、抗Ｈｉｓを使用して検出可能である。マウス及びウサギの試料に対するブロットが、結果を定量化するグラフと共に図２において示されている。ＸＢＩＴ３の取り込みを、マウスの試料においてもウサギの試料においても観察した。マウス試料における取り込みを、１ｈまでに検出し、２４時間にわたって維持した。ウサギでは、５ｄに網膜に有意なＸＢＩＲ３が見られた。
【００６１】
ウサギからのベースライン及び処置後の血漿を、ＸＩＡＰを用いた免疫沈降と、それに続く抗Ｈｉｓを用いたウエスタンブロットによって分析した。タンパク質投与量を示すために、ポンソータンパク質染色を使用した。ＸＢＩＲ３はウサギの血漿においては検出されず（図３）、これは眼内に局在したままであることを示している。
【実施例２】
【００６２】
ＲＶＯのマウスモデル
以下の実験では、再現性のある網膜浮腫を誘導するＲＶＯのマウスモデルを使用した。ＲＶＯは、ＤＭＥに対する抗ＶＥＧＦ療法を試験するために使用したモデルである。非特許文献２９；及び非特許文献３０。このモデルでは、ローズベンガル、光で活性化され得る色素が、成体Ｃ５７Ｂ１６マウスの尾静脈内に注入され、視神経乳頭周囲の網膜静脈のレーザーによって光活性化される。血餅が形成され、浮腫又は網膜厚の増加が急速に発生する。糖尿病においても見られる炎症も発生する。
【００６３】
Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶを使用して、それぞれ蛍光眼底造影及び光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって測定されるフルオレセイン漏出及び最大網膜浮腫が、ＲＶＯの２４ｈ後に観察される。網膜浮腫は、最初の３日間のＲＶＯにわたって維持される。４日目までに浮腫は減少し、網膜はその後薄くなる。浮腫の形成に加えて、ＲＶＯ後２日目までに視細胞層における細胞死の証拠がある。
【００６４】
この実施例では、ケタミン及びキシラジンの腹腔内（ＩＰ）注射でマウスを麻酔した。０．５％アルカインを１滴、局所麻酔薬として目に滴下した。Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶ画像誘導レーザーを使用したレーザーアブレーション用の静脈を選ぶために、網膜をＰｈｏｅｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｎ  ＩＶで画像化した。視神経乳頭周囲の１から４の静脈を、各静脈にレーザーパルス（出力５０ｍＷ、スポットサイズ５０μｍ、持続時間３秒）を送達することによって切除した。
【実施例３】
【００６５】
ターゲットアクティベーション及びエンゲージメント
Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３点眼剤を、ＲＶＯの直後及び２４ｈ後に送達した。４８ｈに、ＯＣＴを介して眼を画像化した。
【００６６】
図４は、個々の動物からの画像（２つの対照、２つのＲＶＯ、４つのＲＶＯ＋Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３）を示している。それぞれの動物に対して、３組のＯＣＴ及び明視野の画像がある。明視野画像は、ＯＣＴのレベルを示す水平線を有している。
【００６７】
ＲＶＯの４時間後、マウスの網膜をウエスタンブロットのために回収して、活性化されたカスパーゼ−９（ｃｌＣａｓｐ９）を検出した（図５、左のパネル）。ブロットは、ｃｌＣａｓｐ９の１０倍の誘導を示した。
【００６８】
ターゲットエンゲージメントを示すために、ＲＶＯ後、マウスにＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３点眼剤を与え、さらに、網膜を回収し、抗Ｈｉｓで免疫沈降させた後、ｃｌＣａｓｐ９についてウエスタンブロットを行った（図５、右のパネル）。４ｈまでにＸＢＩＲ３及びｃｌＣａｓｐ９の結合において２１倍の増加があり、２４ｈまでに４５倍の増加があった。
【実施例４】
【００６９】
Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３によってＲＶＯにおいて有意な保護が提供された
ＲＶＯにおけるＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３点眼剤の有効性を評価した。Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３点眼剤を、ＲＶＯの直後及び２４ｈに与えた。４８ｈに、ＯＣＴ画像は、網膜の厚さの増加が少なく、網膜剥離が抑止されたＲＶＯに対する有意な保護（＊＊Ｐ＜０．０１）を示した（図６）。
【００７０】
個々の網膜層も、ＲＶＯによって等しく影響されないため、調べた。網膜層は、神経節細胞層（ＧＣＬ）、内網状層（ＩＰＬ）、内顆粒層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、内節（ＩＳ）、外節（ＯＳ）、及び脈絡膜の隣に位置する網膜色素上皮（ＲＰＥ）を含む。Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３は、網膜剥離を減少させ（図７、＊＊Ｐ＜０．０１）、内側の網膜層を保護し（図８、＊＊Ｐ＜０．０１）、外網状層等の外側の網膜層の膨張を減少させ（図９、＊＊Ｐ＜０．０１）、さらに、視細胞を保護した（図１０、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【実施例５】
【００７１】
Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３によってＲＶＯ後の細胞死が阻止された
ＴＵＮＥＬ染色は細胞死のマーカーである。ＲＶＯは、ＩＮＬにおいて２４ｈまでにＴＵＮＥＬ染色を誘導する。網膜を、Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３で処置したマウス又は未処置のマウスから４８ｈにて回収し、次に、免疫組織化学的検査のために処理した。試料の分析によって、タネル陽性の細胞がＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３点眼剤により減少したということ、及び、点眼剤がＩＮＬの厚さを維持したということが示された（図１１）。
【実施例６】
【００７２】
Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３によってＲＶＯにおいて機能保護が提供された
ＲＶＯは、網膜電図（ＥＲＧ）上のＡ波及びＢ波の減少を誘導する。ＲＶＯの直後及び２４ｈ後のＰｅｎ１‐ＸＢＩＲ３を用いた処置は、ＲＶＯ後７ｄまでＥＲＧの改善（暗順応焦点（ｓｃｏｐｔｉｃ  ｆｏｃａｌ）ＥＲＧ、スポットサイズ１５００μｍ、フラッシュ強度‐２．３ｌｏｇ  ｃｄ／ｍ２）をもたらした（図１２）。
【実施例７】
【００７３】
Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３によってＲＶＯ後の切断型カスパーゼ−７の増加が防がれた
ＲＶＯは、血管において、活性型カスパーゼ−９の標的であるカスパーゼ−７の活性化を誘導する。Ｐｅｎ１‐ＸＢＩＲ３は、ＲＶＯの２４ｈ後に得られ且つ示されているように染色された網膜切片の比較によって示されるように、２４ｈにてこの増加を防ぐ（図１３）。
【実施例８】
【００７４】
Ｐｅｎ１−ＸＢＩＲ３によってＲＶＯによるＶＥＧＦ及びＨＩＦ−１αの誘導が防がれた
ＲＶＯは、ＲＶＯの誘導の４ｈ以内に血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び低酸素誘導因子１−アルファ（ＨＩＦ−１ａ）の誘導をもたらす。ＲＶＯ後のＰｅｎ１−ＸＢＩＲ３を用いた処置は、ＶＥＧＦ及びＨＩＦ−１αの増加を抑止した。網膜を、ＲＶＯの４ｈ後に回収し、ＶＥＧＦ発現についてウエスタンブロットによって分析し（図１４、左）、さらに、ＨＩＦ−１α発現について免疫組織化学的検査によって分析した（図１４、右）。
【００７５】
本開示は、本明細書において記載されている特定の実施形態によって範囲が限定されることはない。実際に、本明細書において記載されているものに加えて本開示の様々な修正が、上述の説明及び付随の図から当業者には明らかになる。そのような修正は、付随の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【００７６】
特許、特許出願、刊行物、手順等が本出願を通して引用されており、それらの開示はその全体が参照により本明細書において組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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