(57)【要約】  本発明は、概して、核酸配列の増幅方法に関し、より具体的には、標的核酸配列の増幅及び識別方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物中の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法であって、ここで、２つ以上の標的核酸配列のそれぞれが第１のプライマー部位と第２のプライマー部位に隣接し、増幅が、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含み、前記方法は、第１プライマー部位のそれぞれに相補的な第１プライマー及び第２プライマー部位のそれぞれに相補的な第２プライマーを使用することを含み、第１プライマー及び第２プライマーが少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、アニーリング段階中、第１及び第２のプライマー部位のそれぞれに対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリング段階が実質的に存在しないように、熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用され、
ここで、以下：
ｉ）２つ以上の標的核酸配列が単一の熱サイクリング反応で増幅され；
ｉｉ）２つ以上の標的核酸配列が非生物学的情報をコードし；又は
ｉｉｉ）２つ以上の標的核酸のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接している、
の１つ以上又は全てが適用される方法。
【請求項２】
２つ以上の標的核酸のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位に隣接している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２つ以上の標的核酸のそれぞれが、共通の第２のプライマー部位に隣接している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
２つ以上の標的核酸配列のそれぞれが異なる核酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の標的核酸配列が単一の熱サイクリング反応で増幅される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１及び第２のプライマー部位とは異なる、第３のプライマー部位及び第４のプライマー部位により隣接された追加の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
増幅された２つ以上の標的核酸配列を配列決定によって識別する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上の標的核酸配列のそれぞれが異なる長さを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
サイズ分離によって増幅された２つ以上の標的核酸配列を識別する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
２つ以上の標的核酸配列が非生物学的情報をコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
２つ以上の標的核酸配列が、２つ以上の標的核酸配列が、銃器、弾薬、発射体、銃器残留物、ならびに銃器、弾薬及び／又は発射体と接触するようになる表面からなる群から選択される製造物から回収される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
２つ以上の標的核酸配列が、銃器から発射された発射体の進入点の表面から回収される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
２つ以上の標的核酸配列が医薬品又はその前駆体から回収される、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
製造物をその起源まで辿る方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つの核酸配列が組み込まれている製造物を用意し、ここで、少なくとも１つの核酸配列は、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位に隣接していて；
（ｂ）場合により、製造物から少なくとも１つの核酸配列を回収し；
（ｃ）第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを用いる熱サイクリングを含む高忠実度増幅によって少なくとも１つの核酸配列を増幅し、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、熱サイクリングは融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含み、及びアニーリング段階中に、第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的に存在しないように、熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用され、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された少なくとも１つの核酸配列を識別する、
ことを含み、ここで、工程（ｄ）において識別された少なくとも１つの核酸配列の配列及び／又は長さは製造物の起源を示す方法。
【請求項１５】
製造物が、銃器、弾薬、発射体及び銃器残留物からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
製造物が医薬品又はその前駆体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
２つ以上の核酸配列を増幅及び識別することを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位に隣接している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが、共通の第２のプライマー部位に隣接している、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが異なる核酸配列を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）が、増幅された少なくとも１つの核酸配列を配列決定によって識別することを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが異なる長さを有する、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）が、増幅された少なくとも１つの核酸配列をサイズ分離によって識別することを含む、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの核酸配列が非生物学的情報をコードする、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの核酸配列が、単一の熱サイクリング反応において増幅される、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以下の第１のプライマー及び１つの第２のプライマーが使用される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
第１及び第２のプライマーがそれぞれ８〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
第１及び第２のプライマーがそれぞれ１５〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
アニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度より少なくとも５℃高い、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
アニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度より少なくとも１０℃高い、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
アニーリング段階中に使用される温度が約５０℃〜７２℃である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
アニーリング段階中に使用される温度が約６７℃〜７２℃である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１及び第２のプライマーのそれぞれが１〜８個のＬＮＡを含む、請求項１〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
第１及び／又は第２のプライマーが、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
第１成分及び第２成分を含むキットであって、第１成分は２つ以上の核酸配列のライブラリーを含み、２つ以上の核酸配列のそれぞれが共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接し、第２の成分は、第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを含み、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むキット。
【請求項３６】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが非生物学的情報をコードする、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
第１及び第２のプライマーのそれぞれが１〜８個のＬＮＡを含む、請求項３５又は請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
ライブラリーが、配列番号１〜６０から選択される１つ以上の核酸配列を含む、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
第１及び／又は第２のプライマーが、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
ライブラリー由来の１つ以上の核酸配列が適用される銃器、弾薬及び発射体からなる群から選択される製造物をさらに含む、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４１】
２つ以上の核酸配列が適用される製造物又はその前駆体をさらに含む、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、核酸配列の増幅方法に関し、より具体的には、標的核酸配列の増幅及び識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年間で偽造品及び海賊版が大幅に増加しており、偽造品及び海賊版製品は世界中のほぼすべての国で、事実上すべての経済部門で発見されている。偽造レベルの見積もり及びそのような製品の価値は様々である。しかしながら、２０１３年の偽造品及び海賊版製品の世界貿易の価値は、４，６１０億ドルと推定されている（ＯＥＣＤ  ａｎｄ  ＥＵＩＰＯ，２０１６，Ｔｒａｄｅ  ｉｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒｆｅｉｔ  ａｎｄ  Ｐｉｒａｔｅｄ  Ｇｏｏｄｓ：Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｉｍｐａｃｔ）。偽造の影響を最小限に抑えるために、多くの製造業者が偽造防止対策を採用している。このような対策には、特殊な透かし、インクと染料、ホログラム、不正開封防止ラベル、レーザー表面認証、及び磁気及び無線周波数識別（ＲＦＩＤ）タグを使用したセキュリティ印刷が含まれる。これらの方法はすべて、ある程度効果的であるが、一般的には偽造防止策ではなく、偽造によって克服される可能性がある。対照的に、分子「タガント」とも呼ばれる核酸分子を用いた製品の分子タグ付けは、製品を認証し追跡するための事実上偽造防止手段であることが証明されている。典型的な例には、汚染物質追跡（例えば炭化水素）、製品認証（例えばアートワーク、電気製品）、及びセキュリティ用途（例えば紙幣及び文書認証）が含まれる。
【０００３】
核酸分子は、本質的に安定、情報密度が高く、非毒性であり、商業的に成熟した技術を用いて合成及び配列決定されるため、核酸分子は理想的な分子タグ（「タガント」とも呼ばれる）である。非生物学的情報は、核酸塩基対（ｂｐ）「アルファベット」を使用してＤＮＡのフラグメントにコード化することができ、この場合、利用可能な文字のセットは、ＤＮＡについてＳ＝｛Ａ（アデニン）、Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）及びＣ（シトシン）｝、ＲＮＡについて｛Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）及びＣ（シトシン）｝であり、セットサイズはｓ＝４（文字長＝１ｂｐの場合）である。この塩基−４システムでは、膨大な量の情報を比較的短いＤＮＡのフラグメントに格納することができ、列長ｎ記号（「文字」）を利用可能な固有のコードワード（タガント）の数はｗｎ＝ｓｎである。合成ヌクレオチドタグ付けシステムは新しいものではないが、タガント、又はタガントの混合セットを効率的に識別及びデコード化するための方法論はまだ不足している。認証とは異なり、識別とは、すべての可能なタガントのセットをスクリーニングして、未知のタガントのサブセットを決定することである（Ｗｕ⊆Ｗｎ）。これとは対照的に、認証とは、特定の１組又は複数組のプライマー「鍵」を使用して、既知のタガントのサブセットの存在を試験する（すなわち、Ｗｋ⊆Ｗｎ）ことである。識別能力を必要とする用途に関して、個々のタガントを回収するのに必要とされるプライマーに関する以前の知識は定義により欠如している。何百万ものプールから１つの対象物を識別するために従来の技術を使用することは、何百万対ものプライマーを用いてサンプルをスクリーニングすることを必要とするので明らかに実行不可能である。未知のタガントのサブセットを同時にデコード化する機能は、製造物の要素がマークされ、組み合わされ、その後、最終製品からデコード化されるというタガントな「階層化」機能をさらに提供する。
【０００４】
既存のタガントテクノロジーは認証アプリケーションにはかなり適しているが、識別及び階層化の目的には非常に非効率的である。「識別対認証」のこの問題に取り組む一つの方法は、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマー部位配列と、フラグメント長分離又は配列決定によって解読される可変コード領域とを有するタガントライブラリーを設計することである。しかしながら、ユニバーサルプライマー部位配列の使用は、回収及び増幅工程（通常はポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲを含む）の間にクロスフラグメントハイブリダイゼーションを必ずもたらす。タグ付きコードワードが一般的な文字シーケンスのライブラリーから生成される場合、これは特に難しい問題である。この場合、２つの異なるコードワードで使用されているのと同じ文字が、混合タガントの溶液中でヘテロ二量体を形成し、クロスハイブリダイズしたＰＣＲ産物を生成する可能性がある。この事実から多くの問題が生じる：（１）各タガントは回収及び増幅のための独特な組の識別プライマー対を含まなければならない、（２）ライブラリー中の各タガントは実質的に異なる配列を用いて、同じ記号をコード化しなければならない、（３）製造物中に存在するタガントについて従来の知識なしに（定義により、識別である）、ライブラリーＷｎ中の全ての可能なプライマー対についてサンプルをスクリーニングしなければならない、（４）ラージスケール（例えば、＞３００ＰＣＲ反応）は実用的ではなく、高価であり、低いフラグメントコピー数回復を助長しない、（５）これらの制約は現在の技術を実用的なタガントライブラリーサイズ限界ｗｎ＜３０００及び層状化限界２０タガントに制限する（ＵＳ８，７３５，３２７）。これは、既存のタガント技術の階層化能力、ひいては潜在的用途を厳しく制限してきた。
【０００５】
ＷＯ２００４／０６３８５６（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、２００４）は、結合した捕捉プローブを有する導電体を用いて標的核酸分子を検出するための装置を記載している。捕捉プローブは、標的核酸分子の１つに相補的であり、これはプローブ間で電気が伝導されたときに核酸分子の検出を可能にする。この方法は、既知の標的核酸分子の存在について試験するために（すなわち、認証のために）設計されており、したがって、未知の標的核酸分子又は１を超える標的核酸分子の混合物の識別には適していない。
【０００６】
分子タガントの増幅及び検出のための代替方法は、米国特許第８，７３５，３２７号によって提供され、これは、組み合わせ数学的アプローチを適用するプライマー部位コード化システムを使用して、増幅反応製造物をデコード化するタガント層及び識別の問題に対処することを試みるＤＮＡタガントシステムを記載する。したがって、プライマー部位は、ビット値及び列位置に対応するハイブリダイズしない配列のライブラリーから選択される。タガントはライブラリー中の全てのプライマー対の組み合わせでスクリーニングすることによりデコード化され、Ｗｕは、得られた陽性ＰＣＲ反応のネットワークグラフ（Ｇｕ）からデコード化される。しかしながら、サンプルは、Ｇｕが、サンプルに存在するタガントのセットＷｕに含まれていない重複するサブグラフクリークを含む場合、デコード不可能になる。
【０００７】
米国特許第８，７３５，３２７号では、情報をデコード化するためにプライマー部位の列を使用することは、コーディング列長に対する制約のために情報記憶容量を制限する。さらに、情報をコードするためのプライマー部位への依存は、多数の非ハイブリダイズプライマー配列が必要とされ、タガント内の情報をデコード化するために何百ものスクリーニング反応を行わなければならないことを意味する。例えば、長さｎ＝５のバイナリシステム（ｓ＝２）は、ライブラリーサイズがｓｎ＝２５＝３２であり、タガントは、デコードするのに（ｎ（ｎ−１）ｓ２）／２＝４０の反応を必要とする（すなわち、４０個のプライマー対の組み合わせ）。さらに、Ｍａｃｕｌａの方法はまた、混合して、後にデコード化することができるタガントの数に制限があるため、深層アプリケーションとの互換性がない。例えば、ｎ５−ｓ２バイナリシステムは、ｎｓ−ｎ＋１＝６の最大層状化深度を有する。層状化深度（すなわち、混合容量）は、複数のライブラリーの使用、又は３進若しくは４進コード化システムを介して増加し得る。しかしながら、これら両方のアプローチは、必要とされるスクリーニング反応の数を劇的に増加させる。例えば、ｎ５−ｓ５システムは、ライブラリーサイズが３，１２５タガントであるが、デコードには６２５反応が必要であり、最大混合限度は２１タガントである。そのため、既存のすべてのタガントシステムは、約２０タガントを超える混合制限を必要とする識別アプリケーションに到達しないままである。Ｍａｃｕｌａのアプローチで要求されるように、必要とされる多数のサンプルもまた法医学的及び微量ＤＮＡ回収用途と互換性がない。
【０００８】
分子タガントを用いて物質をタグ付けすることは比較的簡単であるが、タガントは、核酸配列を増幅し、続いてタガントを識別及び／又は認証するためにデコード化することができる場合にのみ価値がある。しかしながら、既存のヌクレオチドタガントシステムは、識別のために扱いにくく、実用的でなく、高価なままであり、未知のタガントのサブセットの識別（及びタガント層状化）を可能にする方法で効率的にデコード化されるようにはなっていない。製造物を識別するために必要とされる多数のサンプルはまた、低コピー数及び法医学的用途には役立たない。
【０００９】
したがって、分子タガントの識別及びタガント層状化を可能にする方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書に開示される一態様では、混合物中の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法が提供される。ここで、２つ以上の核酸配列の各々は第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位によって隣接され、増幅は、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含む。本方法は、第１のプライマー部位のそれぞれに相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位のそれぞれに相補的な第２のプライマーを用いることを含み、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように、高温が熱サイクリングのアニーリング段階中に使用される。
ここで、以下のうちの１つ以上又はすべてが適用される：
ｉ）２つ以上の標的核酸配列が単一の熱サイクリング反応で増幅される；
ｉｉ）２つ以上の標的核酸配列が非生物学的情報をコードする；又は
ｉｉｉ）２つ以上の標的核酸のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接している。
【００１１】
本明細書に開示される別の態様では、製造物をその起源まで追跡する方法が提供され、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの核酸配列が組み込まれている製造物を提供すること、ここで、少なくとも１つの核酸配列は、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位とに隣接している；
（ｂ）必要に応じて、製造物から少なくとも１つの核酸配列を回収すること；
（ｃ）第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを用いた熱サイクリングを含む高忠実度増幅によって、少なくとも１つの核酸配列を増幅すること、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、ここで、熱サイクリングは、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含み、ここで、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように、高温が熱サイクリングのアニーリング段階中に使用される；
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された少なくとも１つの核酸配列を識別すること
を含み、ここで、工程（ｄ）において識別された少なくとも１つの核酸配列の配列及び／又は長さは製造物の起源を示す。
【００１２】
本明細書に開示される別の態様では、第１の成分及び第２の成分を含むキットが提供され、ここで、第１の成分は、２つ以上の核酸配列のライブラリーを含み、ここで、２つ以上の核酸配列のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接し、ここで、第２の成分は、第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを含み、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。
【００１３】
本明細書に開示される別の局面において、第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位により隣接された標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法が提供され、ここで、増幅が、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含み、該方法は、第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを使用することを含み、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、ここで、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように、高温が熱サイクリングのアニーリング段階中に使用される。
【００１４】
本明細書に開示される別の態様では、混合物中の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法が提供され、ここで、２つ以上の標的核酸配列は、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位とに隣接していて、ここで、増幅は、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含み、該方法は、第１のプライマー部位のそれぞれに相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位のそれぞれに相補的な第２のプライマーを用いることを含み、第１及び第２のプライマーのそれぞれが少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、ここで、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように、高温が熱サイクリングのアニーリング段階中に使用される。
【００１５】
本明細書に開示される別の態様では、製造物をその起源まで追跡する方法が提供され、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも１つの核酸配列が組み込まれている製造物を提供すること、ここで、少なくとも１つの核酸配列は、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位とに隣接している；
（ｂ）製造物から少なくとも１つの核酸配列を回収すること；
（ｃ）第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを用いた熱サイクリングを含む高忠実度増幅によって、回収された少なくとも１つの核酸配列を増幅すること、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、ここで、熱サイクリングは、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含み、ここで、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように、高温が熱サイクリングのアニーリング段階中に使用される；
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された少なくとも１つの核酸配列を識別すること
を含み、ここで、工程（ｄ）において識別された少なくとも１つの核酸配列の配列及び／又は長さは製造物の起源を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、サプライチェーンのトレーシング及び製造物の識別のためのタガント層状化（混合）の使用例の概略図である。この例では、７つの製造物前駆体が７つのオリゴヌクレオチドタガント（１〜７）でマークされている。中間製品と最終製造物の組み合わせには、製造物の由来を示す複数のオリゴヌクレオチドタグが含まれている。本明細書に開示されているＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇの実施形態では、階層化深さ／混合制限（数百万）に本質的に制限はない。いずれのサンプルにおいても、アニーリング温度識別ポリメラーゼ連鎖反応（ＡＴＤ  ＰＣＲ）を用いた１回の反応で、全てのオリゴヌクレオチドタガントを回収及び増幅することができる。
【図２】図２は、オリゴヌクレオチドベースのアーカイブデータ保存システムにおけるランダムアクセス能力に使用されるＡＴＤ  ＰＣＲの実験手順の略図である。アーカイブデータは、３つの画像ファイル（ａ、ｂ、ｃ）をコードするオリゴヌクレオチドフラグメント（τ）のプール（Ｐ）で構成される。この例では、特定の画像ファイルをコード化するために使用される各組のフラグメントは、そのファイルに共通の一対のプライマー部位配列を含む。ランダムアクセスデータの回収は、興味のあるファイルを回収するためにＬＮＡプライマーのユニバーサルセットを使用して実施される。例えば、ＵＰＦｂ及びＵＰＲｂは画像（ｂ）を回収する。ＡＴＤ  ＰＣＲのより高い結合温度はまた、ヘテロ二量体形成及びクロスハイブリダイズしたＰＣＲ産物をもたらし得るワトソン−クリック結合の制約を減らすことによって可変領域におけるより大きなコード化柔軟性を可能にする。
【図３】図３は、プライマー部位コード化システム（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システム）において、どのようにＬＮＡ−プライマーを使用して文字長（ｌ）を減少させ、したがってコードワード列長（ｎ）を増加させることができるかを示す。プライマー部位コード化系において、ワトソン−クリックＤＮＡ結合生化学は典型的には（ａ）文字長が約２０〜３０ｂｐであり、これは１００ｂｐの可変コード領域について列長を最大ｎ＝５に制限する。ＬＮＡ−プライマーの高い結合親和性は、（ｂ）プライマー長、したがって文字長の減少を可能にし、それは任意の設定された可変領域長ｖに対して列長ｎの逆比例増加を可能にする。ｎの増加は、可変領域の情報記憶容量、及び利用可能なタガントライブラリーのサイズｗｎ（すなわち、利用可能なコードワードの数）を増加させる。
【図４Ａ】図４は、アニーリング温度識別ＰＣＲ（ＡＴＤ  ＰＣＲ）がクロスフラグメントハイブリダイゼーションをどのように最小化するかを示すグラフ図である。図は、従来のＰＣＲ及びＡＴＤ  ＰＣＲを用いた共通のプライマー部位配列を含むフラグメントの増幅反応生成物を示す。（ａ）において、共通のプライマー部位を有するが異なる可変領域（Ｖ １及びＶ ２）を有する変性された一本鎖フラグメントの混合物が示される。ＰＣＲ中、ｓｓＤＮＡフラグメントは冷却されてプライマーが曝露鎖に結合することを可能にする。
【図４Ｂ】従来のＰＣＲ（ｂ）において、プライマー−フラグメント及びフラグメント−フラグメントアニーリングは同様の温度で起こり、それは（ｂｉ）クロスフラグメントプライミング、（ｂｉｉ）クロスフラグメントハイブリダイゼーション、及び（ｂｉｉｉ）非特異的ハイブリッドフラグメントアニーリング及び伸長をもたらす。これらのプロセスは、最終的に、（ｂｉｖ）可変起源及び長さのフラグメントハイブリッドを含むＰＣＲ産物をもたらす。
【図４Ｃ】反対に、ＡＴＤ  ＰＣＲ（登録商標）では、増幅反応アニーリング温度は、ＬＮＡプライマー−フラグメント相互作用を許容するが、フラグメント−フラグメント相互作用を妨げるように設定される。ＬＮＡプライマー−フラグメント複合体は、フラグメント−フラグメント相補的プライマー部位相互作用よりも＞５℃高い温度でアニールするように理想的に設計されている。これはクロスタグハイブリダイゼーションを防ぐ。略語には、キャップ領域（Ｃｐ）、ユニバーサルフォワードプライマー配列（ＰＦ）、ユニバーサルフォワードプライマー相補配列（ＰＦｃ）、ユニバーサルリバースプライマー配列（ＰＲ）、ユニバーサルリバースプライマー相補配列（ＰＲｃ）、可変領域ｘ（Ｖ ｘ）、可変領域ｘ相補配列Ｖ ｘ（Ｖｃ ｘ）が含まれる。
【図５】図５は、異なるコードワードで使用される共通の記号配列が、従来のＰＣＲの間にどのようにヘテロ二量体形成及びクロスフラグメントハイブリダイゼーションをもたらし得るかを示す。（ａ）において、記号２７のためのクラム配列（２進バイトに等しい）は、２つの異なるコードワードにおいて使用され、それは（ｂ）においてクロスフラグメントプライミング及びハイブリダイゼーションを可能にする。ＡＴＤ  ＰＣＲは、これらの相互作用を区別するためにアニーリング温度を十分に高く設定することを可能にする。これにより、ワトソンクリックのＤＮＡ結合の制約が緩和され、ほぼすべてのコード化システムが共通の記号配列を使用するので、非生物学的情報をＤＮＡにコード化するのに特に有利であるより大きなコード化柔軟性が可能になる。
【図６】図６は、従来のＰＣＲ及びＡＴＤ  ＰＣＲの熱サイクルを示す。示されるＰＣＲ熱サイクル工程は、（ａ）ホットスタートポリメラーゼのための初期活性化工程、（ｂ）ｄｓＤＮＡ鎖変性、（ｃ１）ＡＴＤ  ＰＣＲにおいて使用される高温ＬＮＡ−プライマーフラグメントアニーリング、（ｃ２）低温従来プライマー（及びフラグメント−フラグメント）アニーリング、（ｄ）ポリメラーゼ媒介鎖伸長を含む。指数関数的増幅のために工程（ｂ）〜（ｄ）をｎ回繰り返し、工程（ｅ）は最終伸長期であり、工程（ｆ）ではＰＣＲ産物を貯蔵のために冷却する。ＬＮＡ含有プライマーは、クロスフラグメントハイブリダイゼーションを防ぐために、ＡＴＤ  ＰＣＲ実験において（ｃ１）と（ｃ２）との間の温度差（ΔＴＡ）が少なくとも５℃であるように設計された。
【図７】図７は、二本鎖タガントの一般的な設計である。この図は、鋳型と相補鎖からなる一般的なｄｓＤＮＡタガントを示す。鋳型鎖上にマークされた位置は（左から右へ）：オプションのキャッピング領域（Ｃｐ）、フォワードプライマー配列と同一の領域（ＰＦ）、可変コード領域（Ｖ ｘ）、リバースプライマーと相補的な領域（ＰＲｃ）、及び反対側の相補鎖上のキャッピング領域に相補的なオプション領域（Ｃｐｃ）である。下付き文字「ｃ」は「相補性」を示します。小文字で識別される領域は、塩基対（ｂｐ）の長さ単位を有し、以下を含む：フラグメント長（ｋ）、キャッピング長（ｊ）、プライマー部位長（ｐ）、可変領域長（ｖ）及び記号／文字長（ｌ）。可変領域列の文字数はｎであり、この場合、ｎ＝ｖ／ｌである。
【図８Ａ】図８は、（ａ）ヌクレオチド配列が起源を示す標的核酸配列（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ１システム）の概略図である。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ１システムでは、（ａ）、コードワード列ｎ中の各文字Ｌは１ヌクレオチド以上（ｌ≧１）でコード化され、ｎは配列決定によってデコード化される。コードワードｎは、ＡＴＤ  ＰＣＲ増幅及び産物長分離によってデコード化される。すべてのタガントタイプについて：ｋはオリゴヌクレオチドフラグメントの長さ（ｂｐ）、ｊは任意の３’及び５’キャップの長さ（ｂｐ）、ｐはフォワード及びリバースプライマーの長さ（ｂｐ）、ｖは可変領域の長さ（ｂｐ）、ｌはｎ文字のコードワード列内の各文字の長さ（ｂｐ）である。タガント内の領域は、キャッピング領域（Ｃｐ）、ユニバーサルフォワードプライマー部位（ＵＰＦ）、ユニバーサルリバースプライマー部位（ＵＰＲ）、及び可変領域（Ｖ ｘ）である。（ｂ）において、ＰＦ（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、文字Ａ、Ｂ、Ｃに特異的なプライマー部位である。下付き文字「ｃ」は、それに対して相補的であることを示す。
【図８Ｂ】図８は、（ｂ）標的配列の長さが起源を示す標的核酸（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システム）の概略図である。ｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システムでは、（ｂ）、各プライマー対は特定の文字ＬＡ、ＬＢ、ＬＣ（すなわちＰＦ（Ａ）、ＰＦ（Ｂ）、ＰＦ（Ｃ））をコードし、列ｎ中のＬの位置は可変長（ｖ）の長さによって決定される（／／）。コードワードｎは、ＡＴＤ  ＰＣＲ増幅及び産物長分離によってデコード化される。すべてのタガントタイプについて：ｋはオリゴヌクレオチドフラグメントの長さ（ｂｐ）、ｊは任意の３’及び５’キャップの長さ（ｂｐ）、ｐはフォワード及びリバースプライマーの長さ（ｂｐ）、ｖは可変領域の長さ（ｂｐ）、ｌはｎ文字のコードワード列内の各文字の長さ（ｂｐ）である。タガント内の領域は、キャッピング領域（Ｃｐ）、ユニバーサルフォワードプライマー部位（ＵＰＦ）、ユニバーサルリバースプライマー部位（ＵＰＲ）、及び可変領域（Ｖ ｘ）である。（ｂ）において、ＰＦ（Ａ、Ｂ、Ｃ）は、文字Ａ、Ｂ、Ｃに特異的なプライマー部位である。下付き文字「ｃ」は、それに対して相補的であることを示す。
【図９】図９は、合成による配列決定のためのＡＤＴ  ＰＣＲ産物調製を示す（イルミナプラットフォーム）。これらの図は、次世代シーケンスのためのサンプル調製ステップを示す。第１段階（ａ）において、ＡＴＤ  ＰＣＲからのＬＮＡを含むプライマー領域を用いてアダプター配列をオリゴヌクレオチドタグに連結する。鋳型と相補鎖が５’と３’の両方のアダプター配列を含むように、２番目のアダプター配列が各鎖（ｂ）の反対側の端に追加される。ＬＮＡ含有領域はライゲーション工程中に除去されるので、イルミナシークエンシング（ｃ）の最終産物は従来のヌクレオチドのみを含有する。これは、アダプター配列がＬＮＡを含まないために起こる。略語は以下の通りである：ｌｎ（ロックドヌクレオチド）、ｃｖ（従来のヌクレオチド）、ＵＰＦ（ユニバーサルフォワードプライマー）、ＵＰＲ（ユニバーサルリバースプライマー）、Ｖ １（可変領域１）、下付き文字「ｃ」は相補的領域を表し、Ｐ７とＰ５は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコルで与えられているアダプター配列である。
【００１７】
【図１０Ａ】図１０は、並列配列決定のために、どのようにして複数の試料をＬＮＡプライマー及びＡＴＤ  ＰＣＲでバーコード化することができるかを示す。この例では、サンプルを識別するためにＬＮＡプライマーの５’末端に固有なバーコード識別配列が追加されている（フォワード又はリバースプライマーのどちらでも使用可能である）。試料をＡＴＤ  ＰＣＲにより増幅し、一緒にプールし、並行して配列決定し、そして次にデコード化する。この例では、（ａ）サンプル１はバーコード１でラベル付けされ、可変領域１（Ｖ １）でコード化されたフラグメントを含み、（ｂ）において、サンプル２はバーコード２でラベル付けされ、可変領域２及び３（Ｖ ２、Ｖ ３）でコード化されたフラグメントを含む。
【図１０Ｂ】（ｃ）は、並行配列決定のために調製され、プールされたバーコードサンプルを示す。
【図１１Ａ】図１１は、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システムの別の例であり、（ａ）可変長の複数のタガントがコーディング列ｎ中の各文字Ｌをエンコードする。図（ａ）は、８個のｎ８−ｓ３オリゴヌクレオチドタガントのグループを示し、ここで、各タガントの長さは、列ｎ中の記号の位置をコードし、各プライマー対はセットＳ＝｛Ａ、Ｂ、Ｃ｝の文字Ｌをコードし、すなわちｓ＝３である。
【図１１Ｂ−Ｃ】図１１は、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システムの別の例であり、（ｂ）ゲル電気泳動フラグメント長分離によってデコードされた増幅産物の図である。最終の組み合わせ製造物（ｂ）は、個々のタガントτのレベル、各文字Ｌのタガントの組、及びアルファベットＳ内の文字の組で、２組以上の層状タガントを付けることができる。図（ｃ）は、ゲル電気泳動によって分離された（ｂ）の組み合わせ産物から生成される増幅産物を示す。フラグメントは、移動距離（フラグメント長に反比例する）及びゲルレーン（文字）に注目することによってデコード化される。これにより、ゲル上に効果的に二次元コードワードが形成され、ここで、各レーンは異なる文字（ｘ軸）を表し、ＤＮＡバンドの移動距離（ｙ軸）はコードワード中の文字の位置を表す。２つの異なる文字がコードワード内の同じ位置を占める可能性があることに留意されたい。セットＳ中の各ＬはＡＴＤ  ＰＣＲを用いて同時に復号されるので、この例では１１個のタガントについて３つのスクリーニング反応のみが必要とされる。
【図１２】図１２は、可変アニーリング温度範囲（設計温度より４、２、及び０℃下回る）で、（ａ）ＡＴＤ  ＰＣＲ、及び（ｂ）従来のプライマーＰＣＲの増幅産物を比較する電気泳動ゲルの写真を示す。両方のプロトコルについて、表１の２５μＭのＯｌｉｇｏＴａｇ １−４ Ｓｅｒ１タガントを含有する調製済み標準溶液で増幅を行った。これらのタガントは、７４ｂｐの同じポストＰＣＲ増幅長、ならびに同一のフォワード及びリバースプライマー部位を有する。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇプロトコル（ａ）は、クロスフラグメントハイブリダイゼーションの視覚的証拠を示さず、６５〜６９℃のアニーリング温度（ＡＴ）に対して単一の明確なバンドが存在する。対照的に、従来の回収及び増幅技術（ｂ）は、４９〜５３℃のアニーリング温度（ＡＴ）範囲にわたってスミアリング及びストライエーションを示し、これはクロスタガントプライミング及び増幅を示す。２０ｂｐのかすかなバンドは、ＰＣＲ産物に取り込まれていない過負荷プライマーである。（ａ）と（ｂ）の両方について、レーンは以下の通りである：（１）ハイパーラダー２５、（２）設計Ｔｍより４℃下のＡＴ、（３）設計Ｔｍより２℃下のＡＴ、及び（４）設計ＴｍのＡＴ。
【図１３】図１３は、サイクル時間が可変である、ＡＴＤ  ＰＣＲプロトコル（レーン３及び５）及び従来のＰＣＲ（レーン２及び４）を用いた、異なる長さのユニバーサルプライマー部位コード化  フラグメントの混合物の増幅産物を示す電気泳動ゲルの写真である。両方のプロトコルについて、２５μＭのＯｌｉｇｏＴａｇｓ １−４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇｓ ９−１２ Ｓｅｒ１、及びＯｌｉｇｏＴａｇｓ １７−２０ Ｓｅｒ１を含む調製済み標準溶液で増幅を実施した（配列を表１に提供する）。これらの  フラグメントは、それぞれ７４、６４、及び５４ｂｐの増幅後の長さを有する。レーン２及び３について、より長いアニーリング及び伸長時間（それぞれ１５秒及び２０秒）で増幅を行い、レーン４及び５では標準的な熱サイクルプロトコル（それぞれ５秒及び１０秒）を用いた。レーン１及び３はアニーリング温度（ＡＴ）＝５１℃での従来のＰＣＲの産物を示し、レーン３及び５は設計されたＡＴ＝６９℃（ΔＡＴ＝１８℃）でのＡＴＤ  ＰＣＲの産物を示す。レーン２及び４におけるスミア及びストライエーションは、従来のＰＣＲが使用されたときにクロスフラグメントハイブリダイゼーションが生じたことを示す。対照的に、レーン３及び５は３つの異なるバンドを示し、ＡＴＤがクロスフラグメントハイブリダイゼーションを妨げたことを示している。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇプロトコルのコントロールはレーン６に示されている。２０ｂｐのかすかなバンドは、ＰＣＲ産物に取り込まれなかった過剰のプライマーである。
【図１４】図１４は、ＡＴＤ  ＰＣＲ方法論を使用して焼成後に回収された弾丸から採取されたサンプルの増幅産物を示す電気泳動ゲルの写真である（実施例４）。弾薬カートリッジを３つのグループに分け、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇｓ：ＯｌｉｇｏＴａｇ ４、１２、及び２０ Ｓｅｒ１でマークした（例１を参照）。これらのタガントは、共通のフォワード及びリバースプライマー配列、ならびにそれぞれ７４、６４、又は５４ｂｐの増幅後の長さを有する。複数の定義されたバンドの存在は、（ａ）マガジンに装填された連続カートリッジへのタガントの移動、（ｂ）増幅中にクロスタグハイブリダイゼーションが起こらなかったこと、及び（ｃ）弾薬の追跡を目的として、現場でのＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ技術の実行可能性を示す。レーンは以下の通りである：（１）ハイパーラダー２５；以下（２）ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、（３）ＯｌｉｇｏＴａｇ １２ Ｓｅｒ１、（４）ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、（６）ＯｌｉｇｏＴａｇ １２ Ｓｅｒ１、（７）ＯｌｉｇｏＴａｇ ２０ Ｓｅｒ１、（８）ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１  、（１１）ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、（１２）ＯｌｉｇｏＴａｇ １２ Ｓｅｒ１、（１３）ＯｌｉｇｏＴａｇ ２０ Ｓｅｒ１、（１４）ＯｌｉｇｏＴａｇ ４ Ｓｅｒ１、及び（１５）ハイパーラダー２５でタグ付けされた回収銃弾。
【図１５】図１５は、シリーズ２の実験のためにハミング（８，４，４）コード化フラグメントがどのように調製されたかを示す図である。各Ｈａｍ（８，４，４）クラムは、データヌクレオチド（青のｄ０−ｄ３）とパリティヌクレオチド（黒のｐ０−ｐ３）で構成されている。ユニバーサルフォワード及びリバース相補的プライマー部位（それぞれＵＦＰＳ及びＵＲＣＰＳ）が隣接するピンク色のクラムライブラリー（表３）から長さｎ６のコードワードをアセンブルした（表４に提供される配列）。後生動物界に対する高い相補性（Ｅ≦０．１）及びＣＧに富む領域についてスクリーニングした後、候補コードワードを選択した。
【図１６】図１６は、５点タガント回収分析のための弾薬追跡実験配置の略図である。射手は、合板と土のうで裏打ちされた生物学的材料（スーパーマーケットの豚の脇腹肉）の部分からなる標的から１０ｍのところに配置された。ラベル付けされた５つのタガント回収ポイントは、（ａ）手；（ｂ）銃器；（ｃ）使用済みカートリッジケース；（ｄ）弾丸のエントリーポイント；及び（ｅ）土のうから回収された弾丸である。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システムについての組み合わせたシリーズ１実験（ａ及びｂ）の結果を示す（  フラグメント長分離結果）。ｙ軸の単位はパーセントで、ｎ＝７０である。
【図１７】図１７は、シリーズ１（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システム）弾薬追跡実験（ａ）及び（ｂ）についての組み合わせた結果のグラフ図である。ｙ軸は、ｘ軸にリストされている５つのリカバリーポイントのそれぞれについて、予想されるフラグメントが検出された頻度（％）を示す。
【図１８】図１８は、表１０に与えられたＤＮＡ−タガント固定溶液についての加速分解実験の結果を示す。
【図１９Ａ】図１９は、シリーズ１（９ｍｍ拳銃）及びシリーズ２（０．２２及び０．２０７口径の銃器）の弾薬追跡実験の結果を示し、ここで、サンプルは配列決定（すなわち、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ１システム）によってデコード化された。これには、（Ａ）すべてのサンプルで予想されるＤＮＡ追跡が検出された頻度が含まれる。
【図１９Ｂ−Ｃ】配列決定記録カウントに基づく、予想されるシグナル（ＥＳ）対ノイズ（Ｎ）比は、それぞれ（Ｂ）ケース、（Ｃ）エントリーポイントについて与えられる。左のｙ軸は平均ＥＳに正規化されたＥＳ及びＮの値を示し、右のｙ軸は平均ＥＳ／Ｎを示す。
【図１９Ｄ−Ｅ】配列決定記録カウントに基づく、予想されるシグナル（ＥＳ）対ノイズ（Ｎ）比は、（Ｄ）回収した弾丸サンプルについて与えられる。左のｙ軸は平均ＥＳに正規化されたＥＳ及びＮの値を示し、右のｙ軸は平均ＥＳ／Ｎを示す。レコードランクの関数としてのＥＳの確率を（Ｅ）に示す。ここで、ｎｓ＝サンプル数、ｎｒ＝配列決定記録数、ｎｔ＝追跡数。
【図２０】シリーズ１（ａ）実験ａ及び（ｂ）実験ｂ（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２）についての弾薬カートリッジケースからのＡＴＤ  ＰＣＲ産物を示す電気泳動ゲルの写真である。
【図２１】図２１は、シリーズ１（ａ）実験ａ及び（ｂ）実験ｂ（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２）についてのエントリー部位サンプルからのＡＴＤ  ＰＣＲ産物を示す電気泳動ゲルの写真である。
【図２２】図２２は、シリーズ１（ａ）実験ａ及び（ｂ）実験ｂ（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ）についての弾丸からのＡＴＤ  ＰＣＲ産物を示す電気泳動ゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
配列表の鍵
配列番号１  ＯｌｉｇｏＴａｇ １Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号２  ＯｌｉｇｏＴａｇ １Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号３  ＯｌｉｇｏＴａｇ ２Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号４  ＯｌｉｇｏＴａｇ ２Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号５  ＯｌｉｇｏＴａｇ ３Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号６  ＯｌｉｇｏＴａｇ ３Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号７  ＯｌｉｇｏＴａｇ ４Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号８  ＯｌｉｇｏＴａｇ ４Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号９  ＯｌｉｇｏＴａｇ ５Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号１０  ＯｌｉｇｏＴａｇ ５Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号１１  ＯｌｉｇｏＴａｇ ６Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号１２  ＯｌｉｇｏＴａｇ ６Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号１３  ＯｌｉｇｏＴａｇ ７Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号１４  ＯｌｉｇｏＴａｇ ７Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号１５  ＯｌｉｇｏＴａｇ ８Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号１６  ＯｌｉｇｏＴａｇ ８Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号１７  ＯｌｉｇｏＴａｇ ９Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号１８  ＯｌｉｇｏＴａｇ ９Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号１９  ＯｌｉｇｏＴａｇ １０Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号２０  ＯｌｉｇｏＴａｇ １０Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号２１  ＯｌｉｇｏＴａｇ １１Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号２２  ＯｌｉｇｏＴａｇ １１Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号２３  ＯｌｉｇｏＴａｇ １２Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号２４  ＯｌｉｇｏＴａｇ １２Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号２５  ＯｌｉｇｏＴａｇ １３Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号２６  ＯｌｉｇｏＴａｇ １３Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号２７  ＯｌｉｇｏＴａｇ １４Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号２８  ＯｌｉｇｏＴａｇ １４Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号２９  ＯｌｉｇｏＴａｇ １５Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号３０  ＯｌｉｇｏＴａｇ １５Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号３１  ＯｌｉｇｏＴａｇ １６Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号３２  ＯｌｉｇｏＴａｇ １６Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号３３  ＯｌｉｇｏＴａｇ １７Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号３４  ＯｌｉｇｏＴａｇ １７Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号３５  ＯｌｉｇｏＴａｇ １８Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号３６  ＯｌｉｇｏＴａｇ １８Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号３７  ＯｌｉｇｏＴａｇ １９Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号３８  ＯｌｉｇｏＴａｇ １９Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号３９  ＯｌｉｇｏＴａｇ ２０Ｔ Ｓｅｒ１
配列番号４０  ＯｌｉｇｏＴａｇ ２０Ｃ Ｓｅｒ１
配列番号４１  ＯｌｉｇｏＴａｇ １Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号４２  ＯｌｉｇｏＴａｇ １Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号４３  ＯｌｉｇｏＴａｇ ２Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号４４  ＯｌｉｇｏＴａｇ ２Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号４５  ＯｌｉｇｏＴａｇ ３Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号４６  ＯｌｉｇｏＴａｇ ３Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号４７  ＯｌｉｇｏＴａｇ ４Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号４８  ＯｌｉｇｏＴａｇ ４Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号４９  ＯｌｉｇｏＴａｇ ５Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号５０  ＯｌｉｇｏＴａｇ ５Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号５１  ＯｌｉｇｏＴａｇ ６Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号５２  ＯｌｉｇｏＴａｇ ６Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号５３  ＯｌｉｇｏＴａｇ ７Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号５４  ＯｌｉｇｏＴａｇ ７Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号５５  ＯｌｉｇｏＴａｇ ８Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号５６  ＯｌｉｇｏＴａｇ ８Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号５７  ＯｌｉｇｏＴａｇ ９Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号５８  ＯｌｉｇｏＴａｇ ９Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号５９  ＯｌｉｇｏＴａｇ １０Ｔ Ｓｅｒ２
配列番号６０  ＯｌｉｇｏＴａｇ １０Ｃ Ｓｅｒ２
配列番号６１  ＦｗｄＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ１
配列番号６２  ＲｅｖＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ１
配列番号６３  ＬＮＡ ＦｗｄＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ１
配列番号６４  ＬＮＡ ＲｅｖＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ１
配列番号６５  ＦｗｄＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ２
配列番号６６  ＲｅｖＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ２
配列番号６７  ＬＮＡ ＦｗｄＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ２
配列番号６８  ＬＮＡ ＲｅｖＰｒｉｍｅｒ Ｓｅｒ２
【００１９】
詳細な説明
本明細書を通じて、文脈上別段の要求がない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述された要素又は整数又は要素のグループ又は整数の包含を意味すると理解されるであろう。ただし、他の要素や整数、あるいは要素や整数のグループを除外するものではない。
【００２０】
本明細書における任意の先行刊行物（又はそれから派生する情報）、又は既知であるか、知られていない、またそのような先行刊行物についての承認又は承認と見なされるべきではないすべての事項への言及（又はそれから派生する情報）又は既知の事項は、本明細書が関連する努力の分野における共通の一般的な知識の一部を形成する。
【００２１】
本出願は、２０１６年７月２２日に出願されたＡＵ２０１６９０２８９２からの優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
特に断らない限り、本明細書に記載の分子生物学的技術は標準的な手順であり、当業者には周知である。このような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全てのアップデートを含む）などの供給源における文献を通じて記載され、説明されている。
【００２３】
本明細書で言及された全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の態様を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つのフラグメント」への言及は、単一のフラグメント、ならびに２つ以上のフラグメントを含む。
【００２５】
核酸は、それらの固有の安定性、情報密度及び合成の容易さのために理想的な分子タグである。非生物学的情報はまた、核酸配列にコード化され得、当該技術分野で公知の日常的な分子生物学技術を使用してデコードされ得る。核酸を含む分子タグは、製造物又はその包装の識別、認証及び追跡を可能にするために、製造物又はその包装に組み込まれてもよい。分子タガントによってコード化された情報は任意の適切な目的のために使用することができ、その例示的な例には原産地及び製造年月日が含まれる。
【００２６】
分子タグを用いて物質にタグを付けることは比較的簡単であるが、識別することができない限り、タグは限られた価値しかない。以前に開発された核酸タガントシステムは、タグのより大きなプールから未知のタグ又は未知のタグの混合された部分集合を効率的に検出及びデコード化することができない。これは、そのようなタグを認証するために独立した増幅反応を必要とする特定のプライマー−タグの組み合わせへの依存によるところが大きい。
【００２７】
本開示は、ＬＮＡ含有プライマーが、（ａ）共通のプライマー部位配列、及び／又は（ｂ）プライマー部位間の共通部分配列を有する複数の核酸の増幅中にフラグメント−フラグメント相互作用を区別し、したがってクロスフラグメントハイブリダイゼーションを防止するための選択的パラメーター「アニーリング温度」を導入するために使用され得るという本発明者の知見に基づいている。
【００２８】
ＬＮＡプライマーを使用することにより、熱サイクリング増幅反応のアニーリング温度を上昇させてＬＮＡプライマー−フラグメント複合体の形成を可能にするが、相補的な従来のヌクレオチド複合体（ユニバーサルプライマー部位又は共通の記号部分配列による）、及びそうでなければより低いアニーリング温度で生じるであろう非特異的複合体の形成に対して区別することができる。この方法は、望ましくない特異的及び非特異的なフラグメント−フラグメントクロスハイブリダイゼーションが問題となる、異なる核酸配列を含む複数のタグの同時増幅に特に有用である。例えば、核酸の標的プールが（ａ）共通のプライマー配列、又は（ｂ）プライマー部位間の共通の部分配列を含む場合、特異的クロスハイブリダイゼーションが問題となる（図４及び５も参照）。ここで、特定とは、望ましくない相互作用が実質的に相補的である２つの部分配列の間で起こることを意味する。
【００２９】
したがって、本明細書に開示される一態様では、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位とが隣接する標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法が提供され、ここで、増幅は、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含む。該方法は、第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを使用することを含み、ここで、第１及び第２のプライマーがそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、アニーリング段階中に、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列をそれぞれ第１及び第２のプライマー部位に実質的にアニーリングしないように、熱サイクリングのアニーリング段階中に高温を用いる。
【００３０】
標的核酸配列及びタグ
本明細書に開示される方法は、任意の標的核酸配列の高忠実度増幅に適していることを理解されたい。用語「標的核酸」、「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的核酸分子」、「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、「オリゴ」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸フラグメント」、「フラグメント」などは、１つのヌクレオチドのリン酸化五糖の３’位がホスホジエステル基によって、次のヌクレオチドの五糖の５’位に接続されている共有結合したヌクレオチドの配列を意味すると理解され、ここで、ヌクレオチド残基は、特定の配列、すなわち、ヌクレオチドの線形順序で連結されている。標的核酸は一本鎖又は二本鎖であり得る。
【００３１】
標的核酸配列は、天然に存在してもよく（例えば、天然又はトランスジェニック生物から単離されてもよく）、人工のもの（すなわち合成されたもの）であってもよい。標的核酸は、天然若しくは非天然ヌクレオチド、又は両方の組み合わせを含み得る。天然ヌクレオチドは、典型的には５つの天然に存在する塩基−アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルを指す。本明細書に開示される実施形態では、標的核酸配列は合成ヌクレオチドを含む。合成ヌクレオチドは、安定性、溶解性、及びヌクレアーゼ活性に対する耐性、熱及び／又は紫外線（ＵＶ）に対する耐性など、天然に存在するヌクレオチドを超えるいくつかの利点を有する。いくつかの実施形態において、非天然又は合成核酸は、イノシン塩基及び誘導体化ヌクレオチド、例えば７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、メチル−又はより長いアルキル−ホスホネートオリゴデオキシヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド、及びα−アノマーオリゴデオキシヌクレオチドを含むものを含む。
【００３２】
一実施形態では、１つ以上の標的核酸は、配列番号１〜６０から選択される核酸配列を含む。
【００３３】
本明細書の他の箇所で述べたように、核酸は、それらの固有の安定性、情報密度及び合成の容易さのために理想的な分子タグである。「タグ」及び「タガント」という用語は、本明細書において互換的に使用されて、タグが、それが付着され、適用され、若しくは他には組み込まれた製造物、又はタグ付き製造物が接触した表面（例えば、拳銃やライフルから発射された弾丸のようなタグ付き発射体のエントリーポイントの表面）上で検出されるかどうか、核酸のタグの検出によって製造物のその後の識別、認証及び／又は追跡を可能にするための、製造物に又はその上に付着、適用又は他には組み込まれ得る核酸分子を意味する。
【００３４】
したがって、「タグ」及び「タガント」という用語は、本明細書では「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、「標的核酸」、「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的核酸分子」、「オリゴ」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸フラグメント」、「フラグメント」などと互換的に使用される。これらの用語は、まとめて、上記の一本鎖（ｓｓ）及び二本鎖（ｄｓ）形態の両方を含むと理解されるべきである。
【００３５】
標的核酸配列が、製造物、物品又は物質に適用、付着又はその他の方法で組み込まれた核酸タグである場合、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によるその後の増幅のために少なくとも核酸のサンプルを回収する必要がある。いくつかの実施形態では、製造物からの核酸タグの回収は必要ではない。例えば、製造物が医薬品の場合、製造物は増幅反応混合物に直接溶解することができる。製造物又は物質から核酸タグを回収するための適切な方法は当業者によく知られており、その具体例は蒸留水又は緩衝溶液のいずれかを用いて製造物からタグを抽出することを含む。酸性又は塩基性のｐＨレベルが核酸タグを劣化させる可能性があるので、生理学的ｐＨが典型的には好ましい。核酸タグを荷電した製造物又は物質に付着、適用又はその他の方法で組み込む場合、静電的に結合した核酸タグとのイオン交換体として作用するために、製造物又は物質を高モル濃度の塩緩衝液中で洗浄する必要がある。イオン性又は非イオン性界面活性剤もまた、表面から又は複雑な混合物から核酸を除去するのに役立ち得る。フェノールベースの抽出又はフェノール／クロロホルム抽出もまた、複雑な生物学的物質又は油性物質から核酸を回収するために使用することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、回収された核酸タグは、アルコールによる沈殿、蒸発、又は精密濾過などの当業者に知られている標準的な技術によって濃縮することができる。
【００３７】
情報をコードした核酸配列
本明細書に記載の方法によれば、熱サイクル中のアニーリング温度の上昇は、混合物中のユニバーサルプライマー部位をコード化したタガント間の相互作用の発生を実質的に減少させる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列をそれぞれ第１及び第２のプライマー部位にアニーリングすることは実質的にない。したがって、高いアニーリング温度は、クロスタガントヘテロ二量体形成の可能性を減少させる。これは、本明細書に記載の用途に特有の３つの課題に対処するために特に重要である。（１）ユニバーサルプライマー部位をコードしたライブラリーの従来の伸長サイクルＰＣＲ増幅（＞２０サイクル）は、配列決定に十分な量の産物を産生するために必要であるがフラグメントハイブリッド形成をもたらす。（２）（図５のような）共通部分配列によってコードされた同じ記号を含む異なるタガントコードワードは、従来のＰＣＲが使用される場合、クロスハイブリダイズ産物を形成する可能性が高い。（３）従来のＰＣＲの低アニーリング温度は、非特異的ヘテロ二量体形成のために情報をコードするのに利用可能な配列に対してより厳密な生化学的制約を課す（例えば、ＧＣリッチ配列は問題が多い）。
【００３８】
本明細書に開示される実施形態では、標的核酸配列は非生物学的情報をコードする。句「非生物学的情報」は、典型的には、その配列が生細胞中で発現されたときに機能を果たすように設計されていないことを意味する。したがって、非生物学的情報をコードする核酸配列は、機能的ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含まない。したがって、いくつかの実施形態では、タグは、天然に存在する生物には存在しない核酸配列を含む、それからなる、又は本質的にそれからなる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、情報は、文字又は記号（すなわち、英数字、特殊文字など）又は２進コード（すなわち、１及び０）として、ヌクレオチド又はヌクレオチドの部分集合を用いて標的核酸配列にコード化され得る。例えば、ＤＮＡについては塩基性ヌクレオチドＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）及びＴ（チミン）（又はＲＮＡについてはＡ、Ｇ、Ｃ及びＵ（ウラシル））により、膨大な量の情報を得ることができる。ここで、各ヌクレオチド塩基、又はヌクレオチド塩基の列は、アルファベットの文字などの文字又は記号（すなわち、ｌ＝１ｂｐ）、又は２進コードの文脈では１及び０を表す。
【００４０】
本明細書に開示される実施形態では、標的核酸によってコードされた情報は、追加の情報が記憶されているディレクトリ（例えば、コンピュータデータベース）内のアドレスを提供する。別の実施形態では、情報は、使用されたコード化／暗号化の方法を知っている人なら誰でもデコード化／解読できるように標的核酸に直接コード化される。
【００４１】
一実施形態では、タガントは、各ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴ（又はＵ）が「０」又は「１」を表す２進コードをコードする。典型的な例では、ヌクレオチドＡ及びＧは「１」を表し、ヌクレオチドＣ、Ｔ及びＵは「０」を表す。したがって、２進コードは、ヌクレオチドの適切な配置によってタガントにコード化され得る。したがって、２進コード「０１００１１０１０」は、核酸配列「ＣＡＴＴＡＧＴＡＣ」、「ＴＧＣＣＧＧＣＡＴ」、「ＡＧＣＴＧＡＵＡＣ」などによってコードされ得る。逆に、ヌクレオチドＡ及びＧは「ゼロ」を表し、そしてヌクレオチドＣ、Ｔ及びＵは「１」を表す。
【００４２】
一実施形態では、一組のヌクレオチド｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ｝は、一組の２進数｛００、０１、１０、１１｝の任意の組み合わせにマッピングされる。例えば、｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ｝がそれぞれ｛００、０１、１０、１１｝にマッピングされている場合、ヌクレオチドの列ＧＡＴＴＡＣＡは２シン列１０００１１１１０００１００をコードする。
【００４３】
一実施形態では、２進数の短い列がバイトをコードし、各バイトは、コードワードを形成するために記号の列を構成するのに使用できる記号（「文字」とも呼ばれる）に対応する。コードワード内の記号には、ｊ＃ｎ５＠＄＄ｍｃ＊＆！ｍなどの英数字と特殊文字を含めることができる。
【００４４】
別の実施形態において、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵは、２つ以上のヌクレオチドの部分集合に配置され、各部分集合は文字又は記号を表す。したがって、単語は、ヌクレオチド部分集合の適切な配置によってタガントの核酸配列にコード化され得る。典型的な例では、部分集合「ＡＧＣ」は文字Ｔを表し、部分集合「ＧＣＴ」は文字Ａを表し、部分集合「ＣＴＵ」は文字Ｇを表し、そして部分集合「ＡＣＣ」は文字Ｎを表す。したがって、単語ＴＡＧＧＡＮＴは、核酸配列「ＡＧＣＧＣＴＣＴＵＣＴＵＧＣＴＡＣＣＡＧＣ」によってタガントにコードされ得る。
【００４５】
別の実施形態において、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ及びＵは、個々に又は２つ以上のヌクレオチドの部分集合において、記号中のｎ進ビットに対して２進、３進、４進などを表す。典型的な例では、４進コード化システムでは、部分集合「ＡＧＣ」は数０を表し、部分集合「ＧＣＴ」は数１を表し、部分集合「ＣＴＵ」は数２を表し、部分集合「ＡＣＣ」は数３を表す。したがって、数１２３０は核酸配列「ＧＣＴＣＴＵＡＣＣＧＣＴ」によってタガントにコード化することができ、数１３３１０２は核酸配列「ＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＧＣＣＴＵ」によってタガントにコード化することができ、以下同様である。４進コードの場合、２つ以上の４進数字の列、例えば１３３１０２は「クラム」を含むことができる。４進コードの「クラム」は、２進コードの「バイト」に相当する。クラムは、任意の文字又は記号（文字）をコードすることができるので、クラムの列はコードワード内の記号の列をコードする。当業者にはよく知られているように、各バイト、クラムなどをコード化するために使用されるｎ進数字の列は、指定された相互最小ハミング距離又はレーベンシュタイン距離で設計されるべきである。
【００４６】
本明細書に開示される一実施形態では、標的核酸配列は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルからなる群から選択されるヌクレオチドを含み、核酸配列は２進コードであり、各ヌクレオチドは、長さが≧１ｂｐである１’又は０’の列を表す。
【００４７】
本明細書に開示される実施形態では、標的核酸配列は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルからなる群から選択される部分集合ヌクレオチドを含み、部分集合は文字をコードする。
【００４８】
本明細書に開示される実施形態では、標的核酸コードワード配列は、長さ２ｂｐ以上（２進バイトに相当する）の一連の部分配列から組み立てられる。部分配列は、英数字又は特殊文字記号（例えば、ｊ＃ｎ５＠＄＄ｍｃ＊＆！ｍ）をコード化し、その結果、タガントの可変領域は、コードワードを形成する英数字及び／又は特殊文字の文字列をコード化する。次に、コードワードは、データベース上の商品、アイテム、又はオブジェクトに関連付けられている情報を検索するために使用することができる。
【００４９】
タガントにコード化することができる情報は、タガントのサイズ及びヌクレオチドの配置、又はヌクレオチドの部分集合によってのみ制限され、２進、３進、４進、…、ｎ進コードを表すことが理解されるべきである。いくつかの例では、冗長性を導入することは、配列決定及び合成エラーの観点から望ましいだろう。したがって、冗長性及びエラー検出及び訂正能力を組み込むことは、デコード化の信頼性を高めるためにコード化設計に組み込まれ得る。これらの場合、各クラムは、エラー検出及び訂正能力を与える記号及びパリティヌクレオチドをコードするデータヌクレオチドを含む。例えば、タガントコードワードは、４つのデータヌクレオチドと４つのパリティヌクレオチドとを含むハミング（８，４，４）コード化された≧ルから構成することができる。冗長性及び／又はエラー検出及び訂正能力を組み込んだコード化システムの他の例としては、ハフマンコード化、リードソロモンコード化、レーベンシュタインコード化、差分コード化、単一パリティ検査コード化、ゴールドマンコード化及びＸＯＲコード化がある１-８。
【００５０】
タガント中のヌクレオチドの列は、例えば、有効期限、製造者、製造施設、及び医薬品の各前駆体のバッチ番号などの情報を含むように細分することができる。最も単純な形では、直接コード化は各ヌクレオチドが文字をコード化することを必要とする（例えば、図８（ａ）参照、ここでｌ≧１ｂｐ）。
【００５１】
一実施形態では、タガントは、データベースに記憶されている製造物、物体、又は識別情報を指す固有の識別英数字及び／又は特殊記号コードでコード化される。例えば、タガントは、例えば、製造者、製造物タイプ、製造施設、製造物バッチ番号、製造日、及び有効期限を含むことができるデータベース内の情報を検索するために使用されるコードワード記号１３４−１２−１４５−８−２５５−８９でコード化することができる。
【００５２】
一実施形態では、タガントにコード化された情報は製造日を示す。例えば、製造者は、製造日の情報をコードする核酸配列を含む独自のタガントをその製造物に適用することができる。たとえば、「２０１６年６月１１日」である。次に、製造物の製造日は、タガントを取得するように（例えば、スワブを介して）製造物をサンプリングし、本明細書に開示されているタガントを増幅するために本明細書に開示される方法を実行することによって確かめられ得る。ここで、タガントによってコード化された情報が製造日を示す。
【００５３】
本明細書に開示される一実施形態では、タガントにコード化された情報は出所を示す。したがって、そのような方法は、製造物をそれらの場所又は起源まで追跡するために使用することができる。例えば、製造者は、製造者の名前、製造者の住所などの製造者を示す文字に対応する専有のｎ進コードをコード化する核酸配列を含む専有のタガントをその製造物に適用することができる。次に、タガントを得るように（例えば、スワブを介して）製造物をサンプリングし、本明細書に開示される方法を実行して専有のタガントを増幅することによって場所又は起源を確認することができる。ここで、タガントの存在は、製造業者を起源とする製造物を示し、一方、専有のタガントが存在しないことは偽造品を示している可能性がある。
【００５４】
標的核酸配列によってコードされる情報は、当業者に知られている日常的な方法を用いてデコード化することができる。本明細書中で使用される場合、用語「デコード化」又は「デコード化する」は、核酸配列の理解可能な形態（例えば、英数字及び／又は特殊文字記号からなるｎ長コードワード）への変換を意味する。
【００５５】
一実施形態では、標的配列はアーカイブデータ記憶のための手段を提供する。核酸は本質的に安定であるので、分子タグ付け剤はデータのアーカイブ保存に非常に適しており、ここで、データは、例えば、テキスト、画像、又はビデオファイルをコード化するために使用され得るｎ進コードの代表として、そこにヌクレオチドの配列又はヌクレオチドの部分集合によってコード化される。合成ＤＮＡ配列は、データを記憶するための有効な手段を提供することが実証されている。例えば、Ｂｏｒｎｈｏｌｔら（２０１６）は、キー・バリューストアとしてモデル化されているＤＮＡベースのアーカイブ記憶システムのためのアーキテクチャフレームワークを記載する。一実施形態では、ＤＮＡベースのアーカイブデータは配列決定によってデコード化される。例えば、図２は、特定のフラグメントのライブラリーによってコード化されている３つのイメージファイルを示す。各ライブラリーは、ファイルに普遍的な特定の組のフォワード及びリバースプライマー部位（例えば、ＵＰＦｂ、ＵＰＲｂ）によって定義される。ファイルは、標的配列内にコード化された３つすべての画像についてのデータを含むＤＮＡフラグメント（Ｐ）の混合プールとしてアーカイブされる。
【００５６】
本明細書に開示される方法はまた、ＤＮＡベースのアーカイブデータのデコード化を妨害する可能性があるフラグメント−フラグメントクロスフラグメントハイブリダイゼーションを最小化又は回避しながら、単一の増幅反応で特定のファイルにランダムにアクセスすることを可能にする。本明細書に開示された方法によって生成された増幅産物は、続いて配列決定され得て、そして得られた配列から画像がデコード化され得る。ファイルはまた、例えば、ファイルの特定の部分にアクセスするためのより大きなランダムアクセス機能を可能にするために、より小さなライブラリセットに分割することもできる。
【００５７】
本明細書の他の箇所で述べたように、タガントにコード化することができる情報は、２進、３進、４進、…、又はｎ進コードの代表としてタガントのサイズ及びヌクレオチドの配置、又はヌクレオチドの部分集合によってのみ制限される。
【００５８】
サンプルがフラグメント長分離及び／又はＰＣＲ産物の存在、及び非配列決定によってデコード化されるプライマー部位コード化システム（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２）の場合、ＬＮＡ含有プライマーを使用する利点は、タガント内のコード文字長が、結合親和性を犠牲にすることなく、約１０〜１５ｂｐの長さｌに圧縮することができる。したがって、ＬＮＡプライマーはタガントのデザインを変えることができる。このｌの減少は、以下の式１に従ってワードスティング長ｎの逆比例増加を可能にし、それは情報記憶容量及びタガントライブラリーサイズに対して重要な意味を有する。サイズｓ＝５のアルファベットを考慮すると、ｎが５から１０に倍増される場合、利用可能な固有のタガントの数は、式３に従って、ｗ５＝３，１２５からｗ１０≒９８０万まで増加する。ＬＮＡプライマーはまた、各ＬをＳにコード化するために、ユニバーサルフォワードプライマーと階層的なリバースプライマーセットの使用を介して、プライマー対に基づくシステムをより効率的にデコード化するために使用され得る。
【００５９】
コード化単位長圧縮はまた、文字長ｌ（ｂｐ）を減少させ、それによってタガントのコードワード列長ｎを増加させる。例えば、タガントの可変領域は、アルファベットの文字の組からの文字をコードする一連のヌクレオチド又はヌクレオチド部分集合の列から構成されてもよい。Ｓ．ワトソン−クリックＤＮＡ生化学は、結合させるための従来の核酸プライマーについてはｌ＝約２０〜３０ｂｐであり、同時に、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド合成制限は、約ｋ＝１００ｂｐに全フラグメント長を制限し得ることを示す。図３（ａ）は、これが最大コード化列長をｎ＝ｖ／ｌ＝１００／２０＝５文字（ここでｖ＝ｋ）に制限することを示し、次に、式ｗｎ＝ｓｎ（以下の式３も参照）にしたがって、利用可能なタガントライブラリーのサイズｗｎを厳しく制限する。現在のタガントコード化技術では、Ｗｎはまた、Ｗｎをスクリーニングするのに必要な増幅反応の数のためにｓによっても制限され、これはコスト及び低コピー数のサンプリングにとってフロー上の影響を有する。例えば、ｎ５−ｓ５システムのタガントライブラリーサイズは、ｗ５＝５５＝３，１２５であり、識別目的に必要な増幅スクリーニング反応の数は２５０である。
【００６０】
式１
コーディング列ｎの長さは、可変領域の長さｖ  ｂｐと文字の長さｌ  ｂｐの関数である。
【００６１】
【数１】
2019521713.tif 000002
【００６２】
式２
すべての記号の集合Ｓ上のすべてのコードワードの集合（単語列など）ｗのサイズは、文字列の長さｎと記号ｓの集合のサイズの関数である。
【００６３】
【数２】
2019521713.tif 000003
【００６４】
式３
定義された文字列長ｎに対するタグライブラリーサイズｗｎは、次のように与えられる。
【００６５】
御布施
【数３】
2019521713.tif 000004
【００６６】
本明細書の他の箇所で述べたように、標的核酸配列（タグ）は第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位を含む。いくつかの実施形態において、タグによってコードされる情報は、第１及び第２のプライマー部位の間の核酸配列中に見出され、したがって、第１及び第２のプライマー部位の核酸配列を除外する。他の例では、タグによってコードされた情報は、第１及び／又は第２のプライマー部位を含む核酸配列中に見出すことができる。一実施形態では、情報は第１のプライマー部位の核酸配列及び可変配列によってコードされている。別の実施形態では、情報は可変領域内の核酸配列及び第２のプライマー部位によってコードされる。さらに別の態様において、情報は第１のプライマー部位の核酸配列、可変配列及び第２のプライマー部位によりコードされる。
【００６７】
タグ付け
本明細書で使用される「タグ付け」という用語は、核酸タグの検出による製造物のその後の識別、認証及び／又は追跡を可能にする、製造物又は物品の中又は上に核酸タグを付着させる、適用する、又は組み込むプロセスを意味する。用語「製造物」及び「物品」は、本明細書において互換的に使用されて、核酸タグを適用、付着又は他の方法で組み込むことができる物質を意味する。核酸タグは、上記製造物又は物品の製造中に製造物に適用され、付着され、又はそうでなければ組み込まれることができる。あるいは、又はそれに加えて、核酸タグは、その製造後に製造物に適用する、付着させる、又はそうでなければ組み込むことができる。
【００６８】
製造物又は物品を核酸タグでタグ付けする適切な方法は当業者にはよく知られており、その具体例はＳｈｅｕらの米国特許第２００５／０００８７６２号に記載されている。一実施形態では、製造物が液体、気体又はエマルジョンである場合、タガントは単なる混合によって液体、気体又はエマルジョン全体に分布させることができる。別の実施形態では、製造物が固体である場合、タガントを溶液中で製造物又は物品に塗布し、続いてその上で乾燥させることができる。
【００６９】
核酸タガントを適用、付着又は他の方法で組み込むことができる製造物又は物品の他の典型的な例には、植物及び植物製造物（例えば、果物、野菜及び穀物）、動物及び動物製造物（例えば、肉、ミルク、チーズ）、爆薬（例：プラスチック爆薬及び火薬）、エアロゾル（例えば、自動車又は工業用汚染物質）、有機溶剤（例えば、化学処理工場由来）、紙製造物（例えば、新聞用紙、金銭、及び法的文書）、インク、香料、及び医薬品又はその前駆体が挙げられる。例えば、医薬品の前駆体は多成分医薬組成物の一成分であり得る。例えば、前駆体は、活性成分又は賦形剤であり得る。したがって、医薬品が２つ以上の活性成分及び／又は２つ以上の賦形剤を含む場合、最終医薬品を処方する前に、異なる核酸タグを各活性成分又は賦形剤に付けることができる。
【００７０】
本明細書の他の箇所で述べたように、核酸タグを適用、付着又は他の方法で組み込むことができる製造物は、不活性又は化学的活性を問わず、固体、液体又は気体とすることができる。不活性固体の典型的な例には、紙、医薬品又はそれらの前駆体、木材、食品及びポリマー化合物（例えばプラスチック）が含まれる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、核酸タグを固体製造物の表面に（例えば噴霧によって）付着させることができる。他の実施形態では、核酸タグを液体又は気体製造物と混合することができる。気体の場合、タグは単にガスと混合することができる。例えば、コンテナ化された気体はタグを容器に配置する。気体が大気中に放出される場合、タグは放出前又は放出時に混合され得る。例えば、産業界から放出された気体の拡散パターンを追跡するために、エアロゾル送出装置を排気口に取り付け、気体が放出されるときに計量された量のタグを導入することができる。別の実施形態では、核酸タグ又は複数のタグを微粒子又はナノ粒子に付着させ、続いて気体状又は液体状の物質全体に分散させることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、製造物は、ヌクレアーゼ活性、熱、圧力及びＵＶ光などの核酸タグを劣化させる可能性がある条件にさらされるか、又はさらされる危険性がある。したがって、製造物への適用中又はその後に、核酸タグに保護組成物をさらに提供することが有利であり得る。適切な保護組成物は当業者によく知られており、その具体例としては、酵素的又は化学的分解、ポリマー物質（例えばタンパク質）及び固定剤からそれらを保護するために核酸タグ（例えばリポソーム、ミセル本体、シリカ内）をカプセル化することが挙げられる。本明細書に開示される実施形態において、核酸タグは、固定剤（例えば、タグを製造物又は物品に固定することができ、及び／又は高温、高圧、紫外線及びヌクレアーゼ活性などの悪条件からタガントを保護することができる薬剤）を含む溶液とともに適用される。適切な固定剤は当業者によく知られているであろう。いくつかの実施形態では、固定剤は、ポリビニルアルコール、Ｄ−（＋）−トレハロース二水和物及びα，β−トレハロースからなる群から選択される。
【００７３】
核酸の増幅
本明細書で使用されるとき、語句「高忠実度増幅」は、典型的には、例えば、標的配列ヘテロ二量体形成を介して、非特異的フラグメント−フラグメントクロスハイブリダイゼーションによって形成され得る産物の増幅を最小化又は回避しながら、標的核酸配列の増幅を意味する。ここで、このような生成物は、そうでなければ標的核酸配列の増幅及び／又は識別に影響を与えるであろう。非特異的ハイブリッド増幅産物はまた、本明細書において「非特異的アンプリコン」とも呼ばれる。本明細書中で使用される場合、「クロスハイブリダイゼーション」とは、熱サイクリング中、特に熱サイクリングのアニーリング段階中の標的核酸フラグメントと他の標的核酸フラグメントとのハイブリダイゼーションをいい、混合起源及び長さのハイブリッドフラグメントを生じる。クロスハイブリダイゼーションは、増幅中のフラグメント−フラグメントプライミング及び鎖伸長の結果である。
【００７４】
クロス−ハイブリダイゼーションは、プライマー−フラグメントハイブリダイゼーションと同様のアニーリング温度で起こる、異なる標的配列にわたる相補鎖のクロス−ハイブリダイゼーションの可能性のために、異なる核酸配列を含む複数のタガントを増幅するときに特に問題である。クロス−ハイブリダイゼーションは、共通のフォワード及びリバースプライマー部位を有する異なる核酸配列を含む複数の核酸の増幅中に特に問題となる。相補鎖のクロス−ハイブリダイゼーションが起こると、得られたフラグメントは続いて増幅され、起源と長さが混在する増幅産物を生成し、それは不可能ではないにしても標的配列を識別することを困難にする。他に記載されているように、本明細書に開示されている方法は、それぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むフォワード及びリバースプライマーを使用することによってフラグメント−フラグメントクロスハイブリダイゼーションを最小化又は回避する。これにより、熱サイクリング増幅反応のアニーリング段階を、ＬＮＡプライマー−フラグメントハイブリダイゼーションの形成を可能にするより高い温度で実施することが可能になるが、そうでなければより低いアニーリング温度で起こるフラグメント−フラグメント複合体の形成とは区別される。
【００７５】
クロスフラグメントハイブリダイゼーションは、典型的には、フラグメント−フラグメント相互作用がプライマー−フラグメント相互作用と同じ又は類似の条件で起こるときの増幅反応中に起こる。これは、共通のフォワード及びリバースプライマー部位を有する標的核酸配列を増幅するとき（図４参照）及び／又はフラグメントがシンボルをコードする共通の部分配列を含むとき（図５参照）、大きな問題を提示する。本書の他の部分で説明されているように、一般的なプライマーを使用する利点は、ユニバーサルな一連のプライマー「キー」によって、サンプル数とサンプルのスクリーニングに必要な反応が劇的に減少することである。酵素フラグメントハイブリダイゼーションが起こり得るメカニズムの例は、図４及び図５のフラグメントプライミング図を参照して記載される。
【００７６】
図４は、異なる可変領域を有するが同じフォワード及びリバースプライマー部位を有するオリゴヌクレオチドフラグメントのプールを示す。ＰＣＲの最初のステップで、ｄｓＤＮＡフラグメントは高温で変性し（図６ａ）、露出した塩基対を持つｓｓＤＮＡフラグメントの混合物を形成する（図４ａ）。次に反応物を冷却してプライマーを露出した鎖に結合させ、ＤＮＡポリメラーゼ媒介鎖伸長のための二本鎖鋳型を提供する。プライマーが鋳型に結合する温度は、アニーリング温度と呼ばれる（図６；ｃ１とｃ２）。共通のプライマー部位を共有する異なるオリゴヌクレオチド間のクロスフラグメントハイブリダイゼーションは、これらの相補的部位間の相互作用がプライマー−フラグメント相互作用と同じ又は類似のアニーリング温度条件で起こるために生じる。
【００７７】
クロスフラグメントハイブリダイゼーションのメカニズムを図４（ｂ、ｉ〜ｉｖ）に示す。最初の（ｉ）クロスフラグメントプライミング及び伸長は、共通のプライマー部位間で起こり、それは（ｉｉ）ハイブリダイズした可変領域を有するフラグメントの最初の世代をもたらす。クロスプライミングの連続した世代は、各ＰＣＲ熱サイクルで継続し、さらに可変領域を「シャッフル」する。ハイブリッドフラグメント間の非特異的結合は、暴走的なプライミング及び伸長をもたらし（ｉｉｉ）、そして最終的には混合起源及び長さの産物を産生する（ｉｖ）。大部分の場合、クロスフラグメントハイブリダイゼーションは、元のフラグメント／タガントの配列を決定することを不可能にする。
【００７８】
図５は、異なるタガントコードワードにおける共通の記号配列間のクロスフラグメントハイブリダイゼーションのメカニズムを示す。クロス記号プライミングは、同じ記号配列（２進コードでは「バイト」、４進コードでは「クラム」と呼ばれます）が異なるコードワードで使用されている場合に特に問題になる。同じコード化化方式を使用して、後に混合されるタガントコードワードを生成すると、クロス記号プライミングが発生する可能性があある。同様に、クロスフラグメントハイブリダイゼーションは、ワトソンクリックＤＮＡ結合生化学によれば、ＧＣに富む可変領域間で起こりやすい。
【００７９】
標的核酸配列の熱サイクリング増幅のための適切な技術は、当業者に知られており、その例示的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ギャップフィリングＬＣＲ（ＧＬＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及びそれらの変法が含まれる。
【００８０】
一実施形態では、増幅はＰＣＲによって行われ、その具体例は米国特許第４，６８３，１９５号及び関連米国特許第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号及び第４，９６５，１８８号に記載されている。一実施形態において、ＰＣＲは、標的核酸配列（本明細書で核酸「鋳型」とも呼ばれる）を含むと疑われるサンプル、２つのプライマー配列（フォワード及びリバース）、ＰＣＲ緩衝液、遊離デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを合わせることによって開始される。その後、混合物を加熱して二本鎖ＤＮＡ鋳型を分離するか又は「融解」させる（本明細書では「融解段階」とも呼ぶ）。その後の「アニーリング段階」は、プライマーが、増幅されるべき一本鎖鋳型又は標的配列上の相補的配列にアニーリングすることを可能にする。標的配列の複製は「伸長段階」中で起こり、それによってＤＮＡポリメラーゼは鋳型に相補的なＤＮＡ鎖を生成する。このプロセスを繰り返すと、関心のある配列のコピー数が２倍になり、複数のサイクルでコピー数が指数関数的に増加する。一実施形態では、増幅は少なくとも１０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は少なくとも２０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は少なくとも３０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は少なくとも４０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は少なくとも５０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は１０〜５０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は２０〜５０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。一実施形態では、増幅は３０〜５０サイクルの融解、アニーリング及び伸長を含む。
【００８１】
本明細書に開示された方法は、有限サイズの標的核酸配列の増幅に限定されないことを理解すべきである。しかしながら、当業者は、増幅効率が少なくとも部分的には標的核酸配列のサイズに依存することを認識するであろう。一実施形態では、タガントは、長さが２０００塩基対（ｂｐ）以下である。一実施形態では、タガントは、長さが１０００塩基対（ｂｐ）以下である。一実施形態では、タガントは、長さが５００塩基対（ｂｐ）以下である。一実施形態では、タガントは、長さが３００塩基対（ｂｐ）以下である。一実施形態では、タガントは、長さが２００塩基対（ｂｐ）以下である。別の実施形態では、タガントは、長さが１００塩基対（ｂｐ）以下である。一実施形態では、タガントは、長さが５０塩基対（ｂｐ）以下である。本発明による増幅に適したタガントの典型的な例を図７及び図８に提供する。本発明による使用に適したタガントは、好適には第１のプライマー部位、第２のプライマー部位、及び第１と第２のプライマー部位の間の可変領域を含む。一実施形態では、タガントは、５’及び３’のキャッピング領域をさらに含む。
【００８２】
ＬＮＡプライマー
本明細書で使用されるとき、用語「プライマー」は、熱サイクリングによる増幅に適した条件下で目的の別の核酸にアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーがプライマー部位にアニールする能力は、少なくとも部分的には、プライマーのヌクレオチド配列とプライマー部位のヌクレオチド配列との間の相補性の程度に依存する。
【００８３】
プライマーは、典型的には、約８〜約６０塩基、好ましくは約８〜約３０ヌクレオチドの短い核酸配列である。いくつかの態様において、プライマーは１５〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のプライマー（フォワード及び／又はリバースプライマー）は、５’末端にさらなる核酸を含み得る。これは、標的核酸（タグ）の長さがそうでなければ検出には小さすぎる場合（例えば、配列決定プロトコルの最小読み取り長制限未満）に有利であり得る。したがって、フォワード及び／又はリバースプライマーの５’末端に追加の核酸を組み込むと、その後の検出に適したより大きなフラグメントが生成される可能性がある。フォワード及び／又はリバースプライマーの５’末端に追加の核酸を組み込むことが望ましい場合、ＬＮＡをフォワード及び／又はリバースプライマーの伸長部分（すなわち５’テール）に組み込むことは不要であることを理解されたい。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、用語「相補的」又は「相補性」は、ＡがＴ又はＵと対になり、ＣがＧと対になるという周知の塩基対合則によって関連する核酸（すなわちヌクレオチドの配列）を意味する。すなわち、配列５’−ＡＧＴ−３’は、ＤＮＡ中の配列３’−ＴＣＡ−５’、及びＲＮＡ中の３’−ＵＣＡ−５’に相補的である。相補性は、塩基対合則に従ってヌクレオチド塩基のいくつかのみが一致する「部分的」であり得る。他方、全ての塩基が塩基対合則に従って一致する場合、核酸鎖間に「完全」又は「全」相補性が存在し得る。核酸鎖間の相補性の程度は、当該技術分野において周知のように、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。これは、標的配列がタガントの可変コード領域に共通のプライマー部位及び／又は共通の記号配列を含む実施形態において特に重要である。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」は、リボース単糖の２’−Ｏ及び４’−Ｃ原子を連結するメチレン架橋を含む核酸類似体を意味する。
【００８６】
本明細書中に記載されるように、本発明者は、そうでなければより低いアニーリング温度で起こるであろうフラグメント−フラグメント複合体の形成に対して識別しながら、第１及び／又は第２のプライマーへの少なくとも１つのＬＮＡの組み込みが増幅反応のアニーリング温度を上昇させてＬＮＡプライマー−フラグメント複合体の形成を可能にすることを示した。本明細書で使用されるとき、用語「ＬＮＡプライマー」及び「ＬＮＡプライマー」は、少なくとも１つのＬＮＡを含むプライマーを指す。
【００８７】
本発明によって用いられる熱サイクリング増幅反応はまた、本明細書において「アニーリング温度識別ＰＣＲ」又は「ＡＴＤ  ＰＣＲ」とも呼ばれる。この方法は、（１）プライマー−フラグメント相互作用のアニーリング温度を人為的に上昇させ、（２）プライマー−フラグメント複合体の形成を促進するが（図６；ｃ１参照）、より低い温度で起こるフラグメント−フラグメント複合体に対して区別する（図６；ｃ２参照）ようにＰＣＲアニーリング温度を設定することによってクロスフラグメントハイブリダイゼーションを排除する。クロスハイブリダイゼーションに対して区別するために、プライマー−フラグメントアニーリング温度は、フラグメント−フラグメントアニーリング温度よりも高い（例えば、少なくとも５℃）（すなわち、ΔＡＴは少なくとも５℃である）。これは、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）モノマーをフォワード及び／又はリバースプライマー、好ましくはフォワード及びリバースプライマーの両方に組み込むことによって達成される。
【００８８】
したがって、アニーリング温度が上昇すると、標的フラグメント中の相補的又はほぼ相補的な配列間の相互作用（すなわち、フラグメント−フラグメント相互作用）の親和性が低下する。したがって、ＡＴＤ  ＰＣＲのより高いアニーリング温度は、（１）共通プライマー配列及び／又は（２）共通記号配列間のクロスフラグメント相互作用を排除するために熱サイクルアニーリング温度を十分に高く設定することを可能にする選択条件として使用できる。
【００８９】
したがって、ＡＴＤ  ＰＣＲは、少なくとも１つのＬＮＡを含む第１及び第２のプライマーの使用を含み、ここで、ＬＮＡプライマー−フラグメント複合体の形成を可能にするが、そうでなければより低いアニーリング温度で起こるであろうフラグメント−フラグメント複合体のその形成に対しては区別するようにアニーリン段階の温度が上昇する。熱サイクリング反応のアニーリング温度を上昇させることにより、ＡＴＤ  ＰＣＲは、少なくとも１つのＬＮＡを含まない核酸配列（例えば、フラグメント−フラグメント複合体）のアニーリングが実質的にないことを確実にしながら、ＬＮＡプライマー−  ラグメント複合体の形成を可能にする。一実施形態では、標的核酸配列の第１のプライマー部位と第２のプライマー部位との間に実質的に核酸のアニーリングが起こらないように、アニーリング段階の温度を上げる。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、語句「実質的にアニーリングしない」とは、例えばゲル電気泳動及び臭化エチジウムで標識することによって検出可能な増幅産物を生成するのに不十分であろうレベルのアニーリングをいう。したがって、「少なくとも１つのＬＮＡを含まない核酸配列の実質的にアニーリングしない」という句は、検出可能な増幅産物の少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は好ましくは少なくとも９９％が、少なくとも１つのＬＮＡを含む核酸配列アニーリングの結果であることを意味する。
【００９１】
第１及び第２のプライマーのそれぞれにおけるＬＮＡの数は、少なくとも１つのＬＮＡを含まない核酸配列のアニーリングが実質的に存在しない高温で（すなわち、フラグメント−フラグメントのクロスハイブリダイゼーションを区別する温度で）、標的核酸配列の対応するプライマー部位へのプライマーのアニーリングを可能にするようなものであるべきである。
【００９２】
本明細書に開示される実施形態では、第１又は第２のプライマー中のＬＮＡの数は、アニーリング段階の間に、ＬＮＡの非存在下で第１及び／又は第２のプライマーがそれらのそれぞれのプライマー部位にハイブリダイズするであろう温度よりも少なくとも５℃高い温度で（すなわち、少なくとも１つのＬＮＡを含まない核酸配列がアニーリングする温度よりも少なくとも５℃高い温度で）、プライマーがそれらのそれぞれのプライマー部位にハイブリダイズすることを可能にするように選択される。一実施形態では、アニーリング温度は、ＬＮＡの非存在下で第１及び／又は第２のプライマーがそれらのそれぞれのプライマー部位にハイブリダイズするであろう温度よりも少なくとも６℃高く、好ましくは少なくとも７℃高く、好ましくは少なくとも８℃高く、好ましくは少なくとも９℃高く、より好ましくは少なくとも１０℃高い、又は５℃〜１０℃高い。すなわち、少なくとも１つのＬＮＡを含まない核酸配列がアニーリングする温度よりも高い。
【００９３】
当業者は、ＰＣＲなどの熱環式増幅反応の最適又は最適に近いアニーリング温度がプライマーの長さ及び組成に大きく依存することを理解する。一実施形態では、アニーリング段階中に使用される温度は、約５０℃〜７２℃の間である。別の実施形態では、アニーリング段階中に使用される温度は、約６５℃〜７２℃の間である。他の実施形態では、アニーリング段階中に使用される温度は、約６７℃〜７２℃の間である。別の実施形態では、アニーリング段階中に使用される温度は、約６７℃〜６９℃の間である。
【００９４】
本明細書に開示される実施形態では、第１及び／又は第２のプライマーはそれぞれ１〜１４個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１のプライマーは１〜８個の間のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１のプライマーは２〜１０個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１のプライマーは２〜８個のＬＮＡを含む。好ましい態様において、第１のプライマーは３〜７個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１のプライマーは、少なくとも１個のＬＮＡ、少なくとも２個のＬＮＡ、少なくとも３個のＬＮＡ、少なくとも４個のＬＮＡ、少なくとも５個のＬＮＡ、少なくとも６個のＬＮＡ、少なくとも７個のＬＮＡ、少なくとも８個のＬＮＡ、少なくとも９個のＬＮＡ、少なくとも１０個のＬＮＡ、少なくとも１１個のＬＮＡ、少なくとも１２個のＬＮＡ、少なくとも１３個のＬＮＡ、又は少なくとも１４個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第２のプライマーは１〜８個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第２のプライマーは２〜１０個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第２のプライマーは２〜８個のＬＮＡを含む。好ましい態様において、第２のプライマーは３〜７個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第２のプライマーは、少なくとも１個のＬＮＡ、少なくとも２個のＬＮＡ、少なくとも３個のＬＮＡ、少なくとも４個のＬＮＡ、少なくとも５個のＬＮＡ、少なくとも６個のＬＮＡ、少なくとも７個のＬＮＡ、少なくとも８個のＬＮＡ、少なくとも９個のＬＮＡ、少なくとも１０個のＬＮＡ、少なくとも１１個のＬＮＡ、少なくとも１２個のＬＮＡ、少なくとも１３個のＬＮＡ、又は少なくとも１４個のＬＮＡを含む。
【００９５】
一実施形態では、第１及び第２のプライマーは同数のＬＮＡを含む。しかしながら、第１及び第２のプライマーが同数のＬＮＡを含むこと、及び第１及び第２のプライマーが異なる数のＬＮＡを含む場合に本明細書に開示された方法を実施できることの要件はないことを理解されたい。典型的な例として、第１のプライマーは１個のＬＮＡを含み、第２のプライマーは２個のＬＮＡを含み；第１のプライマーは２個のＬＮＡを含み、第２のプライマーは１個のＬＮＡを含み；第１のプライマーは１個のＬＮＡを含み、第２のプライマーは３個のＬＮＡを含み；第１のプライマーは３個のＬＮＡを含み、第２のプライマーは１個のＬＮＡを含み；第１のプライマーは４個のＬＮＡを含み、第２のプライマーは２個のＬＮＡを含み；第１のプライマーは４個のＬＮＡを含み、第２のプライマーは１個のＬＮＡを含む、などである。
【００９６】
ＬＮＡは、任意の適切な位置で第１及び第２のプライマーに組み込まれてもよい。一実施形態では、第１のプライマー及び／又は第２のプライマーは少なくとも１対の隣接するＬＮＡを含む。一実施形態では、ＬＮＡの少なくとも１対の隣接するＬＮＡはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）である。
【００９７】
第１のプライマー及び第２のプライマーへの少なくとも１つのＬＮＡの組み込みは、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に特異的にアニールするのに必要とされるプライマーの長さを減少させるというさらなる利点を有する。従来の核酸プライマーは、生化学的制限のため、一般的には２０〜３０ｂｐの間に制限される。しかしながら、ＬＮＡ−プライマーは、第１及び第２のプライマー部位の相補鎖にハイブリダイズする（すなわち、アニールする）それらの能力を実質的に減少させることなく、５〜１５ヌクレオチド長に減少させることができる。
【００９８】
一実施形態では、第１及び第２のプライマーはそれぞれ、５〜３０個のヌクレオチドを含む。他の実施形態では、第１及び第２のプライマーはそれぞれ、８〜２０個のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、第１及び第２のプライマーはそれぞれ、５〜１０個のヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１及び／又は第２のプライマーは、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む。
【００９９】
タガント層状化
本明細書の他の箇所で述べたように、本発明はタガント層状化に特に適している。すなわち、熱サイクリング増幅のアニーリング段階中の異なる標的配列間のフラグメント−フラグメントクロスハイブリダイゼーションの可能性を回避又は最小化するため、それらの混合物中の複数の標的核酸配列を識別することに適している。これは、コードワード中に共通の記号配列を含み得る可変領域に隣接する共通のプライマー配列を有する標的核酸配列の増幅に関する、本明細書中に開示される発明にとって特に重要である。
【０１００】
したがって、本明細書に開示される別の態様では、２つ以上の標的核酸配列のそれぞれが第１のプライマー及び第２のプライマー部位に隣接している、それらの混合物中の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅法が提供される。ここで、増幅は、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を伴う熱サイクリングを含み、この方法は、第１のプライマー部位のそれぞれに相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位のそれぞれに相補的な第２のプライマーを使用することを含む。ここで、第１及び第２のプライマーのそれぞれが少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマーのアニーリング以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用される。
【０１０１】
本明細書に開示される別の態様では、それらの混合物中の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法が提供され、ここで、増幅は、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含み、該方法は、第１のプライマー部位のそれぞれに相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位のそれぞれに相補的な第２のプライマーを用いることを含み、ここで、第１及び第２のプライマーのそれぞれが少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、アニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマーのアニーリング以外の核酸配列のアニーリングが実質的にないように熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用され、
ここで、以下のうちの１つ以上又はすべてが適用する：
ｉ）２つ以上の標的核酸配列が単一の熱サイクリング反応で増幅される；
ｉｉ）２つ以上の標的核酸配列が非生物学的情報をコードする；又は
ｉｉｉ）２つ以上の標的核酸のそれぞれは、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接している。
【０１０２】
一実施形態において、本明細書に記載の方法は、第１及び第２のプライマー部位とは異なる、第３のプライマー部位及び第４のプライマー部位に隣接するさらなる２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅をさらに含む。
【０１０３】
用語「タガント層状化」は、本明細書において、各エレメントの真正性又は同一性が、組み合わされた物質から確立され得るように、異なるタガントで物質のエレメント（すなわち生成物前駆体）を意図的にマーキングするプロセスを示すために使用される。例えば、医薬品の前駆体は、各前駆体の起源、製造日、製造者又は他の関連情報を識別するタガントでマークされてもよい。認証とは対照的に、識別は未知の物質の起源を確立することを目的とする。認証は、未知の物質が特定の原因であり、結果が「はい」又は「いいえ」であるという仮説を検証することを目的とする。例えば、認証では「この製造物はＸですか？」という質問が表示され、「はい」又は「いいえ」が表示される。識別は、「これはどんな製造物ですか？」という質問に対して、「これは、製造物Ｘ、Ｙ又はＺである」と答える。
【０１０４】
例えば、弾薬は、タガントサインがユーザー、銃、ケーシング、弾丸のエントリーポイント及び弾丸に残されるようにマークされてもよい。箇条書きに存在するタガントの従来の知識がなくても、部分集合を識別するために本明細書に開示される増幅方法を使用して、数百万又は数十億の可能な候補タガントのライブラリー全体を同時にスクリーニングすることができる。タガント階層化と識別の両方はともに、何十億ものタガントのライブラリーから未知のタガントの部分集合をスクリーニングしてデコードする能力を必要とする。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、用語「階層化深さ」は、混合されデコード化され得る、定義済みタガントライブラリー内のタガントの部分集合のサイズを意味する。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、用語「深層化」は、混合されデコード化され得る１００以上の要素事項のマーキングを意味する。
【０１０７】
本明細書中に開示された方法がタガント層化及び識別（すなわち、２つ以上の標的核酸配列の増幅）のために使用される場合、各タガントはそれ自体の一組の第１及び第２（フォワード及びリバース）のプライマー部位を含み得ることが理解される。したがって、一実施形態では、２つ以上の標的配列のうちの第１のものは第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位に隣接し、２つ以上の標的配列のうちの第２のものは第３のプライマー部位及び第４のプライマー部位に隣接する、などである。
【０１０８】
しかしながら、本明細書に開示されている方法は、クロスフラグメントハイブリダイゼーションを最小にするか、又は他の方法で回避しながら標的核酸配列の増幅を提供するため、ユニバーサルセットのプライマー（本明細書においてプライマー「キー」とも呼ぶ）を用いて、１回の増幅反応で数百万のフラグメントを「ロック解除」することができる。従来技術に対する利点は、情報記憶容量、情報デコード効率、及びタガントレイヤリング容量における桁違いの改善を含む。本明細書に開示された方法はまた、未知の部分集合のタグ付け対象を数十億のタグ付け対象の集団から識別することを可能にする。
【０１０９】
２つ以上の標的核酸配列のうちの少なくとも２つが共通のフォワード又はリバースプライマー部位を共有してもよいこともまた理解されるべきである。典型的な例として、２つ以上の標的配列のうちの第１のものは第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位に隣接し、２つ以上の標的配列のうちの第２のものは第１の標的配列の第１のプライマー部位及び第三のプライマー部位に隣接する。
【０１１０】
本明細書に開示される実施形態では、２つ以上の標的核酸配列は、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接している。「共通」という用語は、本明細書において「普遍的」という用語と互換的に使用され、２つ以上の標的配列にわたる第１のプライマー部位及び第２のプライマー部位が同じ又は実質的に同じ核酸配列を有することを意味する。理想的には、第１の標的核酸配列の第１のプライマー部位（例えばフォワードプライマー部位）の配列は、第２の標的核酸配列の第１のプライマー部位の配列と同一である。しかしながら、本明細書に開示された方法は、プライマー部位が完全に（すなわち１００％）同一ではなく、むしろ実質的に同一又は実質的に同一である場合にも実施できることを理解すべきである。用語「実質的に同じ」及び「実質的に同一」は、熱サイクリング反応のアニーリング段階の間、プライマーが第１及び第２の標的核酸配列の第１のプライマー部位にハイブリダイズすることを可能にする相補性の程度をなお保持しながら、第１の標的核酸配列の第１のプライマー部位（例えばフォワードプライマー部位）の配列は、第２の標的核酸配列の第１のプライマー部位の配列と１塩基以上（例えば１塩基、２塩基、3塩基、4塩基など）なることを意味する。
【０１１１】
用語「実質的に同じ」及び「実質的に同一」は、熱サイクリング反応のアニーリング段階の間、プライマーが第１及び第２の標的核酸配列の第２のプライマー部位にハイブリダイズすることを可能にする相補性の程度をなお保持しながら、第１の標的核酸配列の第２のプライマー部位（例えばリバースプライマー部位）の配列は、第２の標的核酸配列の第２のプライマー部位の配列と１塩基以上（例えば１塩基、２塩基、3塩基、4塩基など）なることを意味する。
【０１１２】
一実施形態において、２つ以上の標的核酸は共通の第１のプライマー部位に隣接される。一実施形態では、２つ以上の標的核酸は、共通の第２のプライマー部位に隣接している。好ましい実施形態では、２つ以上の標的核酸は、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接している。
【０１１３】
共通の第１及び第２のプライマー部位の使用は、単一の熱サイクリング反応における複数のタガントの増幅を可能にする。したがって、一実施形態では、２つ以上の標的核酸配列は単一の熱サイクリング反応で増幅される。一実施形態では、１つ以下の第１のプライマー及び１つの第２のプライマーが使用される。したがって、追加のプライマー、試薬、又は熱サイクル条件を必要とせずに、核酸の増幅を単一工程で達成することができる。これは、深層アプリケーション、たとえば医薬品や化粧品業界のサプライチェーンの追跡に特に役立つ。何十億ものタグ付け剤を同時にスクリーニングする能力は、タグ付けされた生成物前駆体を単一の反応で最終生成物から混合し、デコード化することを可能にする。タガント層状化／混合の図を図１に示す。図１は最終製造物に組み合わされる７つのタグ付き製造物前駆体を示すが、本発明において層状化／混合することができるタガントの数に実際的制限はない。一実施形態では、製造業者は、一組の共通プライマー部位を使用して医薬品のクラス又はバッチを定義することができる。あるいは、異なる医薬品にわたって使用され得る個々の前駆体を規定するために、複数組の共通のプライマー部位を使用することが可能であり得る。
【０１１４】
共通プライマー部位を使用することによって、本明細書に開示された方法は、各タガントライブラリーについて１対のプライマー「キー」を使用することによってタガント層形成及び識別の対決課題を解決する。これは、フラグメント−フラグメント相互作用を区別する新規な増幅プロトコルの開発、及び合成及びナノポア技術による配列決定の全能力を活用するタガントの設計を通して達成される。既存の技術に対して共通のプライマー部位及び１つのユニバーサルなプライマー「キー」のセット（本明細書ではＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステムとも呼ばれる）を使用する利点は、利用可能なタガントライブラリーのサイズ、階層化容量、及び（反応数の観点から）ライブラリーのスクリーニングに使用される効率における桁違いの改善を含む。例えば、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムは、何十億ものタガントのライブラリーをスクリーニングするためにただ１つの反応しか必要としないのに対し、現在の最先端技術は、わずか数千のライブラリーをスクリーニングするために数百の反応を必要とする（ＵＳ８，７３５，３２７）。
【０１１５】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステムが（数十億の）混合された不確実な起源の問題を追跡し識別するための能力は、例えば、違法及び偽造品、医薬品前駆体、バンクノート、化粧品、電気製品、食材、衣類を含む広範囲の新しい用途を開く。本明細書の他の箇所に記載されているように、追跡可能な化学的サインが使用者、銃、使用済みカートリッジケース、弾丸進入点及び発砲後の弾丸から回収可能であるように、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇｇａｎｔｓは弾薬をマークすることに成功した。本出願では、この技術は、違法で闇市場での武器譲渡を追跡し、武器禁輸違反を検出し、備蓄管理の弱点を露呈し、３Ｄプリントされたモジュール式の武器を追跡し、違法な野生生物取引に関与するグループを特定し、法医学的能力を高め、そして銃犯罪の抑止力としてび明確な利益をもたらす。
【０１１６】
タガントレイヤリングの目的は、タガントのライブラリー全体から未知のタガントの部分集合を識別することである。層を重ねる深さを増すことは、例えば、製造物前駆体追跡及び規制又は闇市場商品識別を含むように用途の範囲を拡大することができる。一実施形態では、２つ以上の標的核酸配列は医薬品又はその前駆体から回収される。一実施形態では、２つ以上の標的核酸配列は、銃器、弾薬、発射体、銃器の残留物、ならびに２つ以上の標的核酸配列が適用される銃器、弾薬及び／又は発射体と接触した表面からなる群から選択される製造物から回収される。
【０１１７】
識別
一実施形態において、本明細書に開示される方法は、増幅された標的核酸配列を検出又は識別する工程をさらに含む。増幅された標的核酸配列を検出又は識別する適切な方法は、当業者にはよく知られており、その具体例としては、配列決定（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １）及びフラグメントサイズ識別（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２）が挙げられる。増幅産物をアガロース又はポリアクリルアミドゲルに通し、アンプリコンを臭化エチジウムなどの適切な検出可能な標識で標識する。
【０１１８】
本明細書に開示されている方法が、２つ以上の標的核酸配列を識別するために、例えばそれらの混合物中で使用される場合、識別工程は２つ以上の標的配列を識別するのに十分である必要がある。例えば、２つ以上の標的核酸配列のそれぞれは異なる核酸配列を有してもよく、それによって増幅された標的を配列決定によって識別することが可能になる。したがって、一実施形態では、本明細書に開示される方法は、増幅された２つ以上の標的核酸配列を配列決定によって識別する工程をさらに含む。あるいは、又はさらに、２つ以上の標的核酸配列のそれぞれは異なる長さを有することができ、増幅された標的をサイズ識別によって識別することを可能にする。したがって、一実施形態では、２つ以上の標的核酸配列のそれぞれは異なる長さを有する。一実施形態において、本明細書に開示される方法は、サイズ分離によって増幅された２つ以上の標的核酸配列を識別する工程をさらに含む。
【０１１９】
本明細書で使用される「識別」という用語は、典型的には、本明細書で開示されている方法に従って配列の増幅後に標的核酸配列の同一性を決定することを意味する。これは、「認証」とは対照的であり、典型的には、既知のタガント又は一群の既知のタガントの存在について試験することを意味する。タガントは、スクリーニング及びデコード化前に既知の核酸配列を含む。
【０１２０】
増幅産物の識別は、当業者に公知の任意の適切な手段によって達成され得る。
実例として、検出可能な標識を含むヌクレオチドは、熱サイクリング反応の伸長段階の間にアンプリコンに組み込まれてもよく、その結果、検出可能な標識の存在に基づいてアンプリコンが検出され得る。適切な検出可能な標識は当業者によく知られており、その具体例には放射性同位体、フルオロフォア及びビオチンが含まれる。別の実施形態では、標的核酸配列はフラグメントの大きさに基づいて識別される。例えば、増幅後、反応混合物を、場合により既知のサイズ（塩基対）のヌクレオチドマーカーと一緒にアガロースゲル電気泳動にかける。ヌクレオチド長に基づいて所定のサイズを有する標的アンプリコン、及びマーカーはアガロースゲルを通って移動し、続いて臭化エチジウムなどの検出可能な試薬で染色される。次に、標的核酸配列の存在は、隣接するマーカーと比較して決定されるように、標的核酸配列の長さに対応するサイズを有するアンプリコンの存在によって確認される。
【０１２１】
あるいは、又はさらに、標的核酸配列の同一性は、増幅反応からのアンプリコンを配列決定し、標的配列と同じ配列を有するアンプリコンの存在を確認することによって決定される。アンプリコンを配列決定する適切な手段は当業者によく知られており、その具体例としては、サンガー配列決定、次世代の「合成による配列決定」及びナノ細孔配列決定が挙げられる。
【０１２２】
本明細書に開示されている方法が２つ以上の標的核酸配列を増幅するために使用される場合、２つ以上のアンプリコンは配列決定及び／又はサイズによって識別され得る。一実施形態において、本明細書に開示される方法が２つ以上の標的核酸配列を増幅するために使用される場合、各標的核酸配列は異なる長さを有する。したがって、２つ以上の標的配列の存在はサイズ（例えば、アガロースゲル電気泳動）によって決定され得る。別の実施形態において、本明細書に開示される方法が２つ以上の標的核酸配列を増幅するために使用される場合、各標的核酸配列は、各標的配列が同じ長さを有するか否かにかかわらず異なる配列を有する。したがって、２つ以上の標的配列の存在は、サイズ（例えば、アガロースゲル電気泳動）又は配列によって決定され得る。
【０１２３】
サイズによるフラグメント識別（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２）の場合、標的配列の存在及び長さは起源を示す（例えば、図１１参照）。例えば、ＡＴＤ  ＰＣＲ産物の存在は（特定のプライマー対についての）記号タイプを示し、サンプル中に観察されるフラグメント長はコードワードストリング中の記号の位置を示す。したがって、標的配列長によるタガントのデコード化に必要とされる増幅スクリーニング反応の数は、使用される文字セットのサイズｓ（すなわち、記号の数／アルファベット中の「文字」）に等しい。これは、アルファベットの各文字が、クロスフラグメントハイブリダイゼーションなしで単一の反応で増幅される固有のプライマーセットで識別されるためである。そのようにして、各追加文字は、１００ｂｐ未満のフラグメントに対するポリアクリルアミド又はアガロースゲルのフラグメント長分離分解能によって定義されるように、最大３０の増分で層の深さを増加させ、デコード化するための追加のスクリーニング反応を１回だけ必要とする。
【０１２４】
タガントライブラリー及びキット
本明細書の他の箇所で述べたように、本明細書に記載の核酸タグを用いた製造物のタグ付けは、タガントが適用、付着、又は他の方法で組み込まれている製造物を識別、認証、追跡及び追跡する有効な手段となり得る。核酸タグはその製造中に製造物に付着、適用又は他の方法で組み込むことができるが、製造後に製造物に核酸タグを付着、適用又はその他の方法で組み込むことがより便利であり得る。したがって、本開示は、その製造中又は製造後に製造物に付着、適用又は他の方法で組み込むことができる２つ以上の核酸タグのライブラリーに及ぶ。したがって、単一の核酸タグ又は複数の核酸タグをライブラリーから選択して適用するか、又は他の方法で製造物に組み込むことができる。
【０１２５】
したがって、本明細書に開示される別の態様では、２つ以上の核酸タグのそれぞれが共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接する、２つ以上の核酸タグのライブラリーが提供される。本明細書の他の箇所に記載されているように、共通の第１及び第２のプライマー部位の使用は、単一の熱サイクリング反応における複数のタガントの増幅を可能にする。一実施形態では、２つ以上の核酸タグのそれぞれは、ライブラリー中の他のタグと比べて異なる核酸配列を有する。
【０１２６】
本明細書に開示される別の態様において、第１の成分及び第２の成分を含むキットが提供され、ここで第１の成分は２つ以上の核酸タグのライブラリーを含み、２つ以上の核酸タグの各々は隣接する。第２の成分は、第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを含み、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。一実施形態では、２つ以上の核酸タグのそれぞれは、ライブラリー中の他のタグと比べて異なる核酸配列を有する。
【０１２７】
一実施形態では、ライブラリーは、配列番号１〜６０から選択される１つ又は複数の核酸配列を含む。
【０１２８】
一実施形態では、２つ以上の核酸配列は、本明細書に記載されるように非生物学的情報をコードする。別の実施形態では、本明細書に記載されるように、第１及び第２のプライマーのそれぞれは１から１４の間のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、１〜８個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、２〜１０個のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、２〜８個のＬＮＡを含む。好ましい態様において、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、３〜７のＬＮＡを含む。さらに別の態様において、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、アデニン及びチミンＬＮＡの少なくとも１つの隣接する対を含む。
【０１２９】
一実施形態では、第１及び／又は第２のプライマーは、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む。
【０１３０】
一実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法に従って２つ以上の核酸タグを高忠実度で増幅するための説明書をさらに含む。
【０１３１】
別の実施形態では、キットは、本明細書に記載の固定剤を含んでもよい、２つ以上の核酸タグのライブラリーで製造物をタグ付けするための試薬をさらに含む。
【０１３２】
一実施形態では、キットは、２つ以上の標的核酸配列が適用される銃器、弾薬及び発射体からなる群から選択される製造物をさらに含む。一実施形態では、キットは、２つ以上の標的核酸配列が適用される医薬品又はその前駆体をさらに含む。
【０１３３】
別の実施形態において、キットは、本明細書に記載される方法に従って２つ以上の核酸タグを高忠実度に増幅するための試薬、例えばＤＮＡ（例えば、Ｔａｑ）ポリメラーゼ、緩衝液及びヌクレオチド塩基をさらに含む。
【０１３４】
キットの第１及び第２の成分は、典型的には別々の容器又は包装で提供される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ライブラリーからの１つ又は複数の核酸タグはすでに適用されているか、付着しているか、そうでなければ製造物に組み込まれている。例えば、２つ以上の核酸タグのライブラリーは、銃器、弾薬及び発射体からなる群から選択される製造物に適用、付着又は他の方法で組み込まれる。
【０１３５】
追跡
本明細書の他の箇所で述べたように、本明細書に記載の核酸タグを用いた製造物又は物品の分子タグ付けは、タガントが適用、付着又は他の方法で組み込まれた製造物及び物品を識別、認証、追跡及び追跡する有効な手段であり得る。したがって、本明細書に開示されている別の態様では、製造物をその起源まで追跡する方法が提供される。該方法は、以下を含む：
（ａ）少なくとも１つの核酸配列が組み込まれている製造物を提供する。ここで、少なくとも１つの核酸配列は、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位に隣接している。
（ｂ）必要に応じて、製造物から少なくとも１つの核酸配列を回収する；
（ｃ）第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを用いた熱サイクリングを含む高忠実度増幅によって回収された少なくとも一つの核酸配列を増幅する。ここで、第１及び第２のプラモデルは各々、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、熱サイクリングは、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含み、高温が熱サイクリングのアニーリング段階の間に使用され、それにより、アニーリング段階の間に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に第１及び第２のプライマー以外に、核酸の実質的にアニーリングがない；
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された少なくとも１つの核酸配列を識別する。ここで、工程（ｄ）において識別された少なくとも１つの核酸配列の配列及び／又は長さは、製造物の起源を示す。
【０１３６】
一実施形態では、製造物は、銃器、弾薬、発射体及び銃器の残余からなる群から選択される。一実施形態では、製造物は医薬品又はその前駆体である。一実施形態では、製造物は化粧品又はその前駆体である。
【０１３７】
一実施形態では、少なくとも１つの核酸配列は製造物から回収される。したがって、一実施形態では、ステップ（ｂ）が実行される。
【０１３８】
一実施形態では、ステップ（ｃ）のアニーリング段階中に使用される温度は、少なくとも１つのＬＮＡを含まない核酸配列のアニーリングが実質的にないようなものである。別の実施形態では、工程（ｃ）のアニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度よりも少なくとも５℃高い。一実施形態では、工程（ｃ）のアニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度よりも少なくとも１０℃高い。一実施形態では、アニーリング段階中に使用される温度は、約５０℃から７２℃の間である。他の実施形態では、アニーリング段階中に使用される温度は、約６７℃〜７２℃の間である。
【０１３９】
一実施形態では、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、１〜８の間、又は１〜１４の間のＬＮＡを含む。好ましい態様において、第１及び第２のプライマーは３〜７のＬＮＡを含む。一実施形態では、第１及び第２のプライマーのそれぞれは、少なくとも１対の隣接するＬＮＡを含む。一実施形態では、ＬＮＡの隣接対の少なくとも１つはアデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）である。
【０１４０】
一実施形態では、この方法は、２つ以上の核酸配列を回収、増幅及び識別することを含む。一実施形態では、２つ以上の核酸配列のそれぞれは、共通の第１のプライマー部位に隣接している。一実施形態では、２つ以上の核酸配列のそれぞれは、共通の第２のプライマー部位に隣接している。一実施形態では、２つ以上のオリゴヌクレオチドタガントのそれぞれは異なる核酸配列を有する。一実施形態では、ステップ（ｄ）は、配列決定によって増幅された２つ以上の核酸配列を識別することを含む。
【０１４１】
別の実施形態では、２つ以上の核酸配列のそれぞれは異なる長さを有する。一実施形態では、ステップ（ｄ）は、サイズ分離によって増幅された２つ以上の核酸配列を識別することを含む。一実施形態では、２つ以上の核酸配列のそれぞれは、非生物学的情報をコードする。
【０１４２】
本明細書の他の場所に記載されるように、本明細書に開示される方法及び核酸タグは、違法銃器の追跡、武器禁輸違反の検出、備蓄管理の弱点の露出、３Ｄプリント及びモジュール式武器の追跡、及び違法野生生物取引に関与するグループの識別に使用できる。例えば、核酸タグを弾薬カートリッジの表面に適用、付着、又は他の方法で組み込んで、タグをユーザー、銃器、カートリッジケース、弾丸及び／又は弾丸エントリーポイントに結び付ける切れ目のない一連の識別を提供することができる。代表的な例は、本明細書に開示の実施例に示されている。例えば、１つ以上の核酸タグを弾薬又は銃器に適用して、例えばユーザー、銃、ケーシング、弾丸（発射体）、銃器の残余物及び／又は発射体のエントリーポイントにタガントサインを残すことができる。弾丸上に存在するタグについての従来の知識がなくても、可能性のある候補タグのライブラリー全体をスクリーニングして、存在するタグ又はタグの部分集合を識別することができる。共通のプライマー部位が使用される場合、可能性のある候補タガントの全ライブラリーは、本明細書中に開示される方法に従って、存在するタグ又はタグの部分集合を識別するためにフォワード及びリザーブプライマーの共通セットと同時にスクリーニングされ得る。
【０１４３】
したがって、本明細書に開示される方法の一実施形態では、標的核酸配列は、銃器、弾薬、発射体、銃器残渣、銃弾、及び標的核酸配列が適用される銃器、弾薬及び／又は発射体と接触されるようになる表面からなる群から選択される製造物から回収される。別の実施形態では、標的核酸配列は銃器から発射された発射体のエントリーポイントの表面から回収される。
【０１４４】
本明細書に開示されたタガント識別及びデコード化システムは、ライブラリーのサイズ、回復効率、及び階層化の深さに関して、既存の技術よりも桁違いに改善されている。既存のタガント識別及びデコード化システムと比較して、本明細書に開示された方法は、以下の分野のうちの１つ以上において重要な利点を提供する：
●範囲、タガントライブラリーの規模：数十億（無制限）対数千；
●範囲、タガントレイヤリング容量：数百万対約。２０；
●効率的なデコード反応が必要である：１対約３００；
●合成ＤＮＡタガントを使用してさらに効率を向上させることはできない：デコードする１つの反応、ＤＮＡの最小不可分単位であるヌクレオチド配列でエンコードされた情報；
●過去１０年間でムーアの法則をはるかに超えた、次世代シーケンシング技術の急速な学習曲線を活用する；
●アプリケーション：識別、深い階層化、認証。混合起源及び不確実起源の物質を追跡する能力；
●新規深層アプリケーション：サプライチェーンモニタリング（追跡）、製薬前駆体追跡、弾薬追跡、偽造品の識別。
【０１４５】
当業者は、本明細書に記載された発明が具体的に記載されたもの以外の変形及び修正を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、その精神及び範囲内にあるすべてのそのような変形形態及び修正形態を含むことも理解されたい。本発明はまた、本明細書において個々に又はまとめて参照又は示されるすべてのステップ、特徴、組成物及び化合物、ならびに任意の２つ以上の上記ステップ又は特徴の任意の又はすべての組合せを含む。
【０１４６】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態の態様は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに説明される。
【実施例】
【０１４８】
実施例１：シリーズ１実験（９ｍｍ拳銃）のための分子タガント設計及び調製
本明細書に記載のシリーズ１実験について、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。製造施設でのクロスコンタミネーションを防ぐために、製造は複数の異なる場所にまたがって数週間にわたって行われた。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、５’及び３’末端キャッピング領域（３ｂｐ）、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマー部位（２０ｂｐ）、ならびに可変長のコードワード領域（１４、２０、２４、２８、３２ｂｐ）を用いて設計された。
【０１４９】
合計で４０個の相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを発注し、続いてアニールして２０個のｄｓＤＮＡタガント二重鎖を形成した（表１のオリゴタグ １ Ｓｅｒ１からオリゴタグ ２０ Ｓｅｒ１）。これらの２０個のタガントは、以下の長さ：８０、７６、７０、６６及び６０ｂｐのそれぞれ４つを含み、そのため識別はフラグメント長分離によって実施することができた（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２）。シリーズ１の実験で使用されたタガントライブラリーは、各タガントの可変領域（表１のオリゴタグ １ Ｓｅｒ１からオリゴタグ ２０ Ｓｅｒ１）が、ライブラリーにおいて他のすべてのタガントから可変領域の長さの少なくとも５０％の相互距離で分離されるように設計された。
【０１５０】
シリーズ１の実験で使用したタガントの設計及び仕様を表１に示す。本明細書で使用した命名法は、オリゴタグ １（タグ １）Ｔ／Ｃ（それぞれ鋳型／相補鎖） Ｓｅｒ１（実験シリーズ）である。表１において、キャッピング領域をイタリック体で示し、プライマー部位を標準テキストで示し、コードワード配列を太字で角括弧で囲む。
【０１５１】
表１．シリーズ１の実験で使用されたフラグメント配列と仕様（９ｍｍ拳銃弾薬フィンガープリント）。
【表１−１】
2019521713.tif 000005
【０１５２】
【表１−２】
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【０１５３】
【表１−３】
2019521713.tif 000007
【０１５４】
【表１−４】
2019521713.tif 000008
【０１５５】
【表１−５】
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【０１５６】
【表１−６】
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【０１５７】
【表１−７】
2019521713.tif 000011
【０１５８】
【表１−８】
2019521713.tif 000012
【０１５９】
【表１−９】
2019521713.tif 000013
【０１６０】
【表１−１０】
2019521713.tif 000014
【０１６１】
【表１−１１】
2019521713.tif 000015
【０１６２】
【表１−１２】
2019521713.tif 000016
【０１６３】
【表１−１３】
2019521713.tif 000017
【０１６４】
【表１−１４】
2019521713.tif 000018
【０１６５】
【表１−１５】
2019521713.tif 000019
【０１６６】
【表１−１６】
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【０１６７】
【表１−１７】
2019521713.tif 000021
【０１６８】
【表１−１８】
2019521713.tif 000022
【０１６９】
【表１−１９】
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【０１７０】
【表１−２０】
2019521713.tif 000024
【０１７１】
表２は、表１中のすべてのシリーズ１タガントのテンプレート（Ｔ）と相補鎖（Ｃ）との間のフラグメント−フラグメント相互作用のギブス自由エネルギー（ΔＧ）マトリックスを組み合わせて示す。反応のギブス自由エネルギーは、エンタルピーの変化から温度とエントロピーの変化の積を引いたものである。ΔＧが負であるほど、クロスフラグメントハイブリダイゼーションへの傾向が大きくなり、アニーリング温度が高くなる。完全な相補性を有する長さ６０〜８０ｂｐのｄｓＤＮＡタガント二本鎖のΔＧは、−１０４．１〜−１４４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である（表２に太字で示す）。鋳型と同じタガントの相補鎖との間の結合はＰＣＲ効率を低下させるが、完全な相補性は鎖伸長をもたらさないため、これは問題ではない。
【０１７２】
表２はまた、２０個のタガントのクロスフラグメント相互作用のΔＧが−４４．５〜−３７．９ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であることを示している。この範囲は、共通のフォワード及びリバースプライマー部位を共有する６０〜８０ｂｐのオリゴヌクレオチドフラグメントに典型的であるが、従来のプライマー−タガント結合が−３２．７ｋｃａｌ／ｍｏｌのより少ない負のΔＧで生じるため、また問題がある。設計仕様は、一般的に、自己二量体、ヘアピン、及びヘテロ二量体形成は、−９ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも弱い（すなわち、より陰性が低い）ことを推奨している。ブラウン運動によるこれらの短い６０〜８０ｂｐフラグメントの拡散性もプライマーのそれと同様であり、これはクロスフラグメントプライミング及び溶液中でのハイブリダイゼーションの可能性を増大させる。表２に示されたΔＧ値に基づいて、表１の混合集団タガントの従来のＰＣＲ増幅中に広範囲のクロスフラグメントハイブリダイゼーションが予測され観察される。これは図１２及び図１３に示されている。共通のプライマー配列及びΔＧ≧−９ｋｃａｌ／ｍｏｌ（すなわち、より陰性が低い）を有する６０〜１００ｂｐのフラグメントを設計することは不可能であるため、本発明者は、ＬＮＡプライマー及びＡＴＤ  ＰＣＲを使用して、フラグメント−フラグメント相互作用と比較して、プライマー−フラグメント相互作用のΔＧを減少させた（すなわち、より陰性）。
【０１７３】
表２−一般的なフォワード及びリバースプライマー配列を有する一本鎖フラグメントの混合集団間の反応のギブス自由エネルギー（ΔＧ、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。
【０１７４】
【化１】
2019521713.tif 000025
【０１７５】
データは、一本鎖オリゴタグ １−２０ Ｓｅｒ１間のフラグメント−フラグメント相互作用のΔＧを示す。略語は、テンプレート鎖（Ｔ）、相補鎖（Ｃ）を含む。
【０１７６】
実施例２−シリーズ２実験用の分子タガント設計ン及び調製（０．２２口径ライフル、０．２０７口径ライフル、及び医薬品標識）。
シリーズ２実験（０．２２及び０．２０７口径ライフルの弾薬の追跡及び医薬品標識）において、タガントはＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ実施形態１に従って同様に設計された。具体的には、タガントは、エンドキャッピング領域なく（すなわち、０〜３ｂｐ）、ならびに長さ４６ｂｐの可変コード領域に隣接するユニバーサルフォワード及びリバースプライマー部位（２２ｂｐ）を有するように設計された。シリーズ１実験と比較して１つの違いはあるが、それでもＵｎｉＫｅｙ−タグの実施形態１と一致し、可変領域は６つのハミング（ｌ，ｄ，ｐ）コード化ブロック（略してＨａｍ（ｌ，ｄ，ｐ））から組み立てた。
【０１７７】
具体的には、シリーズ２実験におけるタガントの可変領域は、ｄ＝４データ及びｐ＝４パリティヌクレオチドを含む、記号長ｌ＝８の６つのハミング（ｌ，ｄ，ｐ）コード化クラム（バイナリバイトに相当）から構築された（すなわち、ハム（８，４，４）コード）。シリーズ２のコードワードを構成するために使用されたハム（８，４，４）クラムのライブラリーを表３に与え、コードワード集合のプロセスは図１５に示す。この場合、垂直ブロックは、ｎ長のコードワードを含むクラムストリングにおける各ｌ長の４次クラムにおけるデータ位置とパリティヌクレオチドを示す。ヌクレオチドセットＱｎ＝｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ｝は、数字セットＱｄ＝｛０、１、２、３｝にマッピングされ、その結果、例えば、ＤＮＡデータ四重項ＴＧＴＴは、四次数Ｘ４＝３２３３をコードし、これは、１０進数Ｘ１０＝２３９に等しい。Ｈａｍ（８，４，４）クラムは、表３に示される０から２５５まで（すなわち、｛０、１、２、…、２５５｝）の１０進数をコードした２５６のクラムのライブラリーから選択された。表３の各クラムは、４ヌクレオチドの相互距離で隔てられている。
【０１７８】
この設計では、可変領域は、別のデータベース上のコードワードに関連する情報を検索するために使用された６個の記号のストリングでコード化された。実際の状況では、この情報には、免許証番号、許可番号、購入場所の情報（弾薬指紋の場合）などの個人識別情報、又はバッチ番号、バーコード番号、製造日、有効期限、製造施設、製造業者、製品タイプなど（製品追跡用、すなわち医薬品）などがある。このｎ６−Ｈａｍ（８，４，４）コード化設計は、各ユニバーサルプライマー部位コード化ライブラリーについて２．８１×１０１４個の固有のタガント配列（ｓｎ＝２５６６）を可能にし、これはほとんどの実用的用途にとって本質的に無制限である。
【０１７９】
シリーズ２実験では、２５６個のクラムライブラリーから無作為に選択された６個のハム（８，４，４）クラムから１０個のｄｓＤＮＡタガントが構築された。これらのブロックは、表４に示される長さｎ＝６のコードワードにアセンブルされた。これは、各タガントのコード領域が４８ｂｐの長さであることを意味した（すなわち、６×８＝４８ｂｐ）。
【０１８０】
１０セットの相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち合計２０個）をアニールして、１０個のｄｓＤＮＡタガント二本鎖（オリゴタグ １ Ｓｅｒ２からオリゴタグ １０ Ｓｅｒ２）を形成した。ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。製造施設でのクロスコンタミネーションを防ぐために、製造はいくつかの異なる場所で行われ、数週間にわたって行われた。
【０１８１】
Ｈａｍ（８，４，４）クラムライブラリーを表３に示す。シリーズ２実験に使用したＨａｍ（８，４，４）にコードされたタガントの配列及び仕様を表４に示す。シリーズ２実験は、弾薬の追跡（口径０．２２及び０．２０７の銃器用）、及び医薬品の表示が含まれる。シリーズ２実験で使用したユニバーサルプライマー配列を表６に示す。
【０１８２】
表３．シリーズ２実験で使用されたタガントをエンコードするために使用されるハミング（８，４，４）クラムライブラリー
【０１８３】
【化２】
2019521713.tif 000026
【０１８４】
表４．シリーズ２実験において使用されるフラグメント配列及び仕様
【０１８５】
【表２−１】
2019521713.tif 000027
【０１８６】
【表２−２】
2019521713.tif 000028
【０１８７】
【表２−３】
2019521713.tif 000029
【０１８８】
【表２−４】
2019521713.tif 000030
【０１８９】
【表２−５】
2019521713.tif 000031
【０１９０】
【表２−６】
2019521713.tif 000032
【０１９１】
【表２−７】
2019521713.tif 000033
【０１９２】
【表２−８】
2019521713.tif 000034
【０１９３】
【表２−９】
2019521713.tif 000035
【０１９４】
【表２−１０】
2019521713.tif 000036
【０１９５】
実施例３−塩基対コード化タガント（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １）の設計
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムでは、記号のセット（Ｓ）における各記号（Ｌ）は、核酸配列によってエンコード化され、コードワードはＡＴＤ  ＰＣＲ及び配列決定によってデコードされる。
【０１９６】
図８（ａ）に示されるＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムでは、可変領域ｖ内のヌクレオチドの配列を用いて、配列決定によって解読されるストリングｎをコード化する。鋳型鎖について、フラグメント長ｋ＝１００ｂｐは、キャッピング領域ならびに５’及び３’末端（Ｃｐ、０〜３ｂｐ）、ユニバーサルフォワードプライマー部位（ＵＰＦ、１０〜３０ｂｐ）、相補的ユニバーサルリバースプライマー部位（ＵＰＲｃ、１０〜３０ｂｐ）、及び可変領域（Ｖ ｘ、２０〜１６０ｂｐ）で構成される。コードワード内の文字は、核酸の集合｛Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ｝からなるが、より一般的には、集合｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ｝が使用される（すなわち、ＤＮＡ中にＵは存在しない）。コードワード内の各記号の長さは、ｌ＝１からｖ  ｂｐであう。図８（ａ）に示す例では、ｖ＝２７ｂｐ及びｌ＝３ｂｐであり、長さｎ＝文字のコードワードを許容する。
【０１９７】
コードワードは、製品、アイテム、又はオブジェクトに関連付けられている情報を検索するために使用される英数字又は特殊文字の記号の文字列で構成され得る。この情報には、製品の種類、製造日、有効期限、製造施設、及びバッチ番号などが含まれ得る。使用されるコード化システムは、デコードの信頼性と情報密度との間の妥協点に依存している。最も単純な形では、各ヌクレオチドは、式：
ｎＵＫ１＝ｖ（ダイレクトエンコーディング用）
に従って、ｌ＝１ｂｐ及びｎ＝ｖであるＬの文字を直接コード化するために使用される。
【０１９８】
各プライマー対について可能性のある固有のコードワードの最大データセットは、式によって与えられる。
【０１９９】
【数４】
2019521713.tif 000037
【０２００】
これはすべての実用的な目的にとって本質的に無限である。例えば、ｓ＝４及びｎ＝４０の場合のみを考慮すると、Ｗ４０＝４４０≒１０２４個の固有のタガントワードである。文脈のために、この数は、世界中のすべての人に１０００億以上の固有のタガントを提供するのに十分である。「＊」は、可変領域長が異なる一連のタガントを表す。
【０２０１】
しかしながら、配列決定及び合成の誤りは、各文字を単一のヌクレオチドでコード化することが望ましくない場合があることを意味する。デコード化の信頼性を高めるためには、制御された冗長性及び誤り訂正能力を組み込むことが必要であり得る。前述のように、信頼性はデータ密度とトレードオフの関係にある。制御された冗長性を有するＤＮＡコード化システムの設計は、本発明の開示の範囲を超えているが、デジタルアーカイブ記憶用途のために異なるシステムが開発されてきた。これらのコードシステムは、情報をコード化するデータビットと、誤り検出及び訂正能力を可能にするパリティビットとを含む。冗長性が制御されたシステムの例には、ハミング、ハフマン、リードソロモン、レーベンシュタイン、差動、シングルパリティチェック、ゴールドマン、及びＸＯＲコード１〜８が含まれます。シリーズ２実験では、例えば、ハミング（８，４，４）コード化記号が使用された。これらの記号は、ｌ＝８のヌクレオチドを含み、これは、５０％の冗長度を与える、４つがデータビットであり、４つがパリティビットである。４値コードの４つのデータビットは、ｓ＝４４＝２５６の異なる記号の生成を可能にする。長さｎ＝６記号のコードワードの場合、Ｈａｍ（８，４，４）４値コードを用いて生成され得る異なるコードワードの総数（すなわち、タガントライブラリサイズ）は、ｗ＝２５６６＝２．８×１０１４である。
【０２０２】
コードワードの集合Ｗ＊に対するユニバーサルプライマーシーケンスの使用は、Ｗ＊内のフラグメントの任意の部分集合（Ｗｕ⊆Ｗ＊）が、式：
【０２０３】
【数５】
2019521713.tif 000038
【０２０４】
に従って、１つの反応でスクリーニングされることを意味する。
【０２０５】
そのため、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムでは、必要なスクリーニング反応の数はｎとｓの両方に依存しない。
【０２０６】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １について、ＡＴＤ  ＰＣＲ産物は、サンガー配列決定、次世代の「合成による配列決定」、又は携帯可能なナノポア技術によって配列決定され得る。短い増幅産物の配列決定は、イルミナのプラットフォームを用いて日常的に行われ、ナノポア技術を用いたシリーズ１及び２の実験（すなわちオックスフォードナノポアプラットフォーム）においても実証された。合成による配列決定の場合、ＰＣＲによるアダプター配列ライゲーション（合成技術による配列決定に必要とされる）の過程で、調製サンプルからこれらのＬＮＡが除去されるため、ＡＴＤ  ＰＣＲ中の増幅産物へのＬＮＡの取り込みは問題にならない（図９）。これは、配列決定用に調製された製造物中に従来のヌクレオチドのみを残す。したがって、ＵｎｉＫｅｙ−タグの回収及び増幅と既存のシーケンス技術との間に互換性の問題は予想されない。
【０２０７】
ナノポア配列決定の場合、ＡＴＤ  ＰＣＲ中のサンプルへのＬＮＡの組み込みは、本明細書に開示されるシリーズ１及びシリーズ２の研究における配列決定誤差に寄与することは観察されなかった。
【０２０８】
図１０は、ＡＴＤ  ＰＣＲにおいて使用されるＬＮＡプライマーの５’末端に特定のサンプルを識別するバーコード配列を組み込むことによって、多数のサンプルが一緒に配列決定及びデコード化され得ることを示す。これにより、複数のサンプルをまとめて並行して配列決定することが可能になり、それによってサンプリング、配列決定及びデコード効率が向上する。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムの場合、特定の産業（例えば、医薬）のために、固有の５’バーコード識別子配列を有するユニバーサルペアのプライマー対を使用して、複数の製品サンプルを並行して配列決定及びデコード化することができる。
【０２０９】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムのいくつかの利点は以下を含む。
１．識別と認証の両方の目的に適している；
２．各プライマー対に利用可能な何十億もの固有配列；
３．何十億という層になっている；及び
４．高いデコード効率。
【０２１０】
実施例４−フラグメントサイズコード化したタガント（ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２タガント）の設計
図８（ｂ）及び図１１のＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システム（フラグメント長コード化）では、集合Ｓ内の各Ｌは全長タガントによってコード化され、ｎはＡＴＤ  ＰＣＲ及びフラグメント長分離によってコード化される。
【０２１１】
図８（ｂ）及び図１１に示すＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムでは、各タガントは、記号とコードワード文字列内のその記号の位置をコード化する。記号タイプを識別するために使用される集合Ｓ内の各Ｌに固有のプライマー対が割り当てられ、各タガントτＳの長さがコードワード文字列内の記号の位置を決定する。集合Ｌのサイズはコードワード長であり、次式に従ってｖをゲル電気泳動の解像限界（ｆｒ）で割ったもので決定される。
【０２１２】
【数６】
2019521713.tif 000039
【０２１３】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動の最大フラグメントサイズ分解能が約２ｂｐであり、最大タガント長１００ｂｐ及び順方向及び逆方向プライマー長を２０ｂｐと仮定すると、ｎＵＫ２（最大）＝６０／２＝３０である。同様に、特定の記号が占めることができる様々な位置の最大数は３０である。
【０２１４】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムでは、コード化はフラグメントサイズ分離（例えばゲル電気泳動による）によって行われ、ここで特定のプライマー対についての産物の存在は記号タイプ、及び各産物バンドのサイズ（すなわち、移動距離）は次式に従って、コードワード内の各文字の位置を決定する。
【数７】
2019521713.tif 000040
【０２１５】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムに必要とされる増幅スクリーニング反応の数は、アルファベットサイズ、ｒＵＫ２＝ｓに等しい。これは、各セットＬが、その特定の文字に固有の一対のＬＮＡプライマーを用いて識別され、ＡＴＤ  ＰＣＲを用いた１つの反応においてクロスフラグメントハイブリダイゼーションなしに増幅されるためである。そのため、それぞれの追加の文字は３０の増分で階層化の深さを増やし、デコードに追加のスクリーニング反応を１つだけ必要する。
【０２１６】
図１１（ａ）に示されるｎ８−ｓ３  ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２の例では、Ｓ＝｛Ａ、Ｂ、Ｃ｝、ここで、ＬＡ＝｛τＡ１、τＡ２、τＡ３｝、ＬＢ＝｛τＢ１、τＢ２、τＢ３｝、及びＬＣ＝｛τＣ１、τＣ２、τＣ３、τＣ４、τＣ５｝である。図１１（ｂ）は、これらのタガントを使用して商品にマークを付ける方法を示す。まず、各前駆体は特定のタガントτで印を付けられ、中間産物は同じ文字セットＬの層状タガントを含む。間製品は組み合わされてアルファベットセットＳのメンバーである層状タガントを含む最終製品を形成する。この例では、タガント層化は２つのレベル、Ｌ及びＳで実行される。Ｓのセットは３つの異なる記号のみを含むため、すべてのタガント要素をデコード化するために３つの反応のみが必要とされる。
【０２１７】
図１１（ｃ）は、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２タガントが、電気泳動ゲル上の各バンドの列（文字）及び行（位置）を単に記録することによってデコード化されることを示す。例えば、図１１（ａ）の可変長タガントは、図１１（ｃ）の電気泳動ゲル図に示されるバンドを生成し、それはｎ８−ｓ３コードワードＬＡ＝｛１Ａ、６Ａ、７Ａ｝；ＬＢ＝｛２Ｂ、４Ｂ、６Ｂ｝；ＬＣ＝｛２Ｃ、３Ｃ、５Ｃ、６Ｃ、８Ｃ｝として容易にデコード化される。異なる文字の位置が重なること、すなわち｛６Ａ、６Ｂ、６Ｃ｝が許容されることに留意されたい。タガントシステム２は、低レベルのタガント階層化が必要であり、シーケンス処理が利用できない製品認証アプリケーションに最も適している。見当たらない文字は、特定の前駆物質が存在しないか、又は製品が偽造品であることを示唆する。次に、前駆体を直接再試験して真正性を判定することができる。
【０２１８】
また、図１１に示すＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムは、２次元コードワード（すなわち、２つの異なる文字がゲル上のサンプル位置を占めることができる）を効果的に生成し、それによって識別能力を大幅に拡大することができることに留意すべきである。例えば、サイズｓ＝３文字のアルファベットと、３０の異なるバンドを許容するゲル解像度限界とが、製造物を識別するために使用され得る３×２３０＝３．２×１０９の異なる２Ｄ電気泳動ゲル画像を生成し得る。
【０２１９】
米国特許第８，７３５，３２７号のような先行技術に対するＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムのいくつかの利点は、以下を含む：
１．低コピー数の回復に役立つ：必要なサンプル数＝ｓ。
２．深い階層化可能：アルファベットＳ内の各記号は、（バンドの有無に基づいて）長さｎ＝３０の一次元コードワードをコードする。他の文字と組み合わせると、２次元電気泳動ゲルは効果的に２Ｄの「コードワード」を形成し、大幅に拡張した階層化能を可能にする。
３．デコードに効率的である：各記号Ｌを増幅するのに１つのＡＴＤ  ＰＣＲ反応のみが必要であり、１記号当たり１つの電気泳動ゲルレーンのみが必要であり、二次元「コードワード」をデコードする。
【０２２０】
実施例５−アニーリング温度識別（ＡＴＤ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＡＴＤ  ＰＣＲプロトコルは、ロックド核酸（ＬＮＡ）モノマーをユニバーサルフォワード（ＵＦＰ）及びリバース（ＵＲＰ）プライマーに組み込むことによって、プライマーのアニーリング温度を人為的に上昇させることによりクロスハイブリダイゼーションを排除する。それ故、ＰＣＲアニーリング温度は、ＬＮＡプライマー−フラグメント複合体の形成を促進するが、より低い温度で起こり得るクロスハイブリダイゼーションに対して区別する温度に設定され得る。
【０２２１】
ＬＮＡプライマーのアニーリング温度が、ＬＮＡモノマーを含まない同じ従来のプライマー配列よりも少なくとも５℃高いように、Ｅｘｉｑｏｎによって提供されるオンラインツールを使用してＬＮＡプライマーを設計した。ＬＮＡプライマーの自己二量体（ＵＦＰ−ＵＦＰ及びＵＲＰ−ＵＲＰ）及びヘテロ二量体（ＵＦＰ−ＵＲＰ）融解温度は、ＬＮＡプライマーアニーリング温度より少なくとも３０℃低くなるように設計された。ここで、ＵＦＰ及びＵＲＰは、それぞれユニバーサルフォワードプライマー及びユニバーサルリバースプライマーである。
【０２２２】
増幅は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、ＬＮＡ−プライマー、低コピー数のタガント回収及び短いフラグメント長の可視化に適応するように最適化されたダイレクトＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｈｉｒｅ動物組織ダイレクトＰＣＲキット、Ｆ−１４０ＷＨ）によって実施した。
【０２２３】
表１のオリゴヌクレオチドタガントＯｌｉｇｏＴａｇ １−２０ Ｓｅｒ１を使用することによるＰＣＲアニーリング温度識別の有効性は、図１２〜１４に示されている。写真は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してフラグメントサイズによって分離されたＰＣＲ増幅産物を示す。明瞭な区別されるバンドは個々のフラグメントの複製を示し、ストライエーション及び塗抹標本は可変長産物の存在及びクロスフラグメントハイブリダイゼーションを示す。例えば、図１２（ａ）は、６５〜６９℃のアニーリング温度（ＡＴ）範囲にわたってクロスタガントハイブリダイゼーションの証拠を示さないが、図１２（ｂ）は、アニーリング温度範囲４９〜５３℃（デザインＡＴは５３℃）で従来のプライマーを使用した同等物実験についての広範なタガント−タガントハイブリダイゼーションを示す。図１３は、ＡＴＤ  ＰＣＲが可変長フラグメントのハイブリダイゼーションを、異なる熱サイクル時間間隔の下で妨げることを実証する。最後に、図１４は、弾薬追跡の適用フィールドにおけるＡＴＤ  ＰＣＲの有効性を確認する（実施例６も参照）。
【０２２４】
実施例６−弾薬散布タガントを介して銃器犯罪を追跡するためのＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ技術（識別）
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステムを使用して、識別情報を合成オリゴヌクレオチドにコード化し、続いてこれを固定溶液中に保存し、弾薬カートリッジの表面上に堆積させた。タガント増幅に必要な下流の酵素プロセスを阻害することなく、高温、高圧、紫外線（ＵＶ）及びヌクレアーゼ活性から保護するために固定剤をスクリーニングした。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステムは、０．２２口径の銃器（衝撃エネルギー、Ｅｉ＝４２０Ｊ）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ  ９ｍｍ拳銃（Ｅｉ＝４７０Ｊ）及び０．２７０口径の銃器（Ｅｉ＝３，６６０Ｊ）を用いて試験した。９ｍｍの拳銃が選択された。これは、２０１４年に米国で５，５６２件の殺人事件で同様の銃が使用されたため、それぞれ銃関連殺害の６８％、全殺人の４７％に相当するためである。０．２７０銃器は、軍事用途で使用される同等の高衝撃エネルギーアサルトライフルで本プロトコルを実証するために選ばれた。標識された弾薬は、ヒト組織の類似物として、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ（スーパーマーケットの豚の腹）の腹側部分からなる標的で発射され、破片の回収は５つのポイントでテストされた：射手の手、銃器、カートリッジケース、弾丸の入り口、そして弾丸を回収した。結果は、ラベル付き弾薬を射手、銃、ケース、回収された弾丸、及び弾丸のエントリーポイントに結びつけるすべての銃に対してほぼすべての試験で破壊のない一連の識別が確立されたことを示す（図１６、１７、１９〜２２参照）。これら５つの回収ポイントのうちいずれか１つは、疑わしい識別に十分なものである。この技術は、違法で闇市場での武器譲渡の追跡、武器禁輸違反の検出、備蓄管理の弱点の露出、３Ｄプリント及びモジュール式武器の追跡、そして違法な野生生物取引に関与する集団の特定に明確な応用がある。
【０２２５】
モジュール式、ポリマー製、及び３次元（３Ｄ）プリントガンの出現は、銃器の追跡及び登録に新たな課題をもたらした。完全なモジュール方式により、ユーザーは武器の口径の変更を含む、異なる運用上のニーズを満たすために、同じ又は関連するモデルのパーツから銃を再構成することができる。軽量のポリマーフレームの銃器は、改ざん防止用のシリアル番号や製造後の輸入スタンプでマーキングするのが難しく、従来のスクリーニング技術による検出を回避する可能性がある。３Ｄプリンティングの進歩はプロの銃器製造業者に明らかな利益をもたらすが、この技術はすぐに個人や犯罪組織が銃器を自宅で製造することを可能にするかもしれないというかなりの不安がある。一部の国では、３Ｄ銃の販売を制限又は禁止する法律が最近導入されたにもかかわらず、オンラインの違法市場及びファイル共有Ｗｅｂサイトでは、銃と計画の両方が自由に利用可能である。
【０２２６】
銃器の登録及び追跡能力が銃器技術の進歩に遅れを取っているという懸念は、多数の報告書及び国際武器及び弾薬取引を監視するイニシアチブによって強調されてきた。これらの課題に取り組む一つの方法は、弾薬を使用時に散在する識別可能な分子「バーコード」でマークすることである。そのようなシステムは、理想的には、銃器、使用者、弾丸及び犠牲者又は標的に壊れていない分子サインを残すだけでなく、銃器で以前に使用された弾薬の歴史を提供する。民間及び法執行機関の弾薬の登録は、法医学的調査を支援し、銃関連の犯罪に対する強力な抑止力を提供する可能性がある。タグ付き弾薬はまた、違法で闇市場での武器移転を追跡し、武器禁輸違反を検出し、備蓄管理の弱点を明らかにし、そして野生生物の違法取引に関与する集団を特定する能力を提供することができる。今までのところ、弾薬タギング技術への注意の欠如は、アプリケーションの欠如の認識不足（モジュール式及び３Ｄプリント銃器の出現前）、市場参入の障壁（最も顕著には政策介入の要件）、又は認識される技術的障壁によるものである（合成核酸技術とＤＮＡ配列決定における最近のいくつかの進歩の後に）ほとんどの部分がもはや存在しないということである。
【０２２７】
この実験では、タグ付き弾薬を使用して銃器及び銃器犯罪を追跡するためのＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ技術が実証される。弾薬フィンガープリンティングの基本的な概念は、弾薬が射手、銃器及び犠牲者と接触しているので、犯罪現場に情報を伝達するための最良の手段を提供するということである。各ＵｎｉＫｅｙタガントは、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマー配列に隣接する可変コード領域を含む。これにより、１回の増幅反応で基本的に無制限の数（１，０００億）のタガントをスクリーニングすることができる。既存のタガント技術は、弾薬追跡のような大規模な識別及び深層アプリケーションには適していない。
【０２２８】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステムはまた、消耗品の弾薬追跡及びサプライチェーンモニタリングに必要な他の設計基準を満たす。
●識別と認証の目的に適している（用語と略語で与えられている正確な定義を参照）；
●広範囲のもの：何十億もの固有の識別子配列を安価にかつ効率的に生成、回復、デコードする能力；
●高度に内密：「化学キー」（プライマー配列）に関する従来の知識がないと、見えず、検知されないものでなければならない；
●非毒性：ヒトの消費及び／又は血流への侵入に対して安全である（少量）；
●耐性：高温、高圧、紫外線、ヌクレアーゼ曝露、及び不正開封防止に耐性がある必要がある；
●接触によって分散される（タグ付き弾薬は、理想的には、銃、使用者、犠牲者／標的及び弾丸に追跡可能なサインを残さなければならない）；
●分散後の非常に少ないコピー数で回復可能；
●安価：製品の価値のごく一部（つまり、コストの１％未満）を占め、市場全体に浸透して効果的な抑止力として機能するのに十分なほど安価でなければならない；
●既存の弾薬製造プロセスに簡単に統合できる（理想的には製造後工程として）；
●ナノスケール：表面に付着したタグは、製造元によって定義された安全許容範囲内でなければならない；
●環境的に安全で無毒である。
【０２２９】
この実験の目的は、弾薬散布／移動タガントとしてＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ技術をこの分野でテストすることであった。本明細書に記載の方法論は、オリゴヌクレオチド分解を低減し、低コピー数のタグ回収を助けるように設計された新規プロトコルと組み合わせて、核酸技術におけるいくつかの最近の進歩を利用する。方法論は、銃関連の犯罪を追跡するためのより優れた法医学的能力を提供することを目的として、弾薬カートリッジから銃、使用者、標的又は犠牲者へのタガントな拡散のために最適化された。プロトコルは、０．２２口径のライフル銃（ＭＥ＝４２０Ｊ）、９ｍｍのブラウニング拳銃（ＭＥ＝４７０Ｊ）、及び０．２７０口径のライフル銃（ＭＥ＝３，６６０Ｊ）を含む低及び高マズルエネルギー（ＭＥ）銃器を使用してテストされたタガント回収は５つのポイントでテストされた：銃器、カートリッジケース、ユーザー、弾丸、及び侵入創傷（ブタ組織の切片が使われた）。
【０２３０】
方法論
この実験は２つの主要部分で構成された。第１に、高温、高圧、紫外線（ＵＶ）及びヌクレアーゼ活性からタガントを保護するための候補固定剤の能力を試験するために加速分解試験を行った。これらの固定剤はまた、タガント回収及び増幅に必要とされる下流の酵素プロセスに対する可能性のある阻害効果に対して確実にするためにスクリーニングされた。
【０２３１】
実験の第２部では、弾薬カートリッジに、選択された固定溶液中に懸濁されたタガントで印を付け、標的に向けて発砲した。タガントの回収は、射手の手、銃器、弾薬箱、弾丸のエントリーポイント、回収された弾丸の５点でテストされた。
【０２３２】
（Ａ）ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇの設計と調製
２つの異なるタガントコード化システムがシリーズ１及びシリーズ２実験で試験された。シリーズ１実験（９ｍｍ拳銃弾薬追跡）では、表１に与えられたタガントを使用した。これらのタガントは、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １及び２に従って設計された。具体的には、タガントは、５’及び３’末端キャッピング領域（０〜３ｂｐ）、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマー部位（２０ｂｐ）、ならびに可変長コードワード領域（１０〜４０ｂｐ）を用いて設計された。全部で４０個の相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを注文し、続いてアニールして２０個のｄｓＤＮＡタガント二本鎖を形成した。これらの２０個のタガントは、以下の長さ：８０、７６、７０、６６、及び６０ｂｐの各々の４つを含んだ。それにより、識別は、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ２システムによるフラグメント長分離、ならびにＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムによる配列決定により行うことができた。これら２０個のタガントの設計仕様及び配列を実施例１及び表１に示す。これらのタガントの全ては同一のフォワード及びリバースプライマー部位を用いて設計された。
【０２３３】
シリーズ２実験（０．２２及び０．２０７口径の銃器弾薬追跡及び医薬品標識）において、タガントは、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １に従って同様に設計された：タガントは５’及び３’末端キャッピング領域（０〜３ｂｐ）、ユニバーサルフォワード及びリバースプライマー部位（２２ｂｐ）、ならびに可変長の可変コード領域（４６ｂｐ）を用いて設計された。シリーズ１の実験と比較して１つの違いはあるが、それでもＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムと一致しているが、可変領域は２５６個のクラムのライブラリーから選択された６個のハミング（８，４，４）クラムでコード化された（表４及び図１５参照）。シリーズ２の実験では、デコード化は配列決定のみによって行われた。
【０２３４】
タガントをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈによって合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。クロス汚染を防ぐために、製造は複数の異なる場所で行われ、数週間にわたって行われました。
【０２３５】
（Ｂ）一本鎖二重鎖化
一本鎖オリゴヌクレオチド鋳型を４００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５〜８．０、Ｓｉｇｍａ  ９３２８４）に再懸濁し、場合により１０秒間ボルテックスし、１分間遠心分離した。再懸濁した鋳型鎖を、それぞれの相補的一本鎖タガントを含むチューブに移した。４００μＬ及び２００μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡアリコートについてこのプロセスをさらに２回繰り返し、合わせた鋳型−相補鎖鎖溶液を１０００μＬにした。溶液を９５℃のヒートブロック上に５分間置き、次いで１時間かけて２５℃までランプ冷却して二本鎖形成を促進した。ｄｓＤＮＡタガントをさらなる使用のために−２０℃で保存した。
【０２３６】
（Ｃ）ユニバーサルプライマー設計アニーリング温度識別（ＡＴＤ）ポリメラーゼ連鎖反応
これらの実験で行われたアニーリング温度識別（ＡＴＤ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法論は、プライマー−フラグメント相互作用が、フラグメント−フラグメント相互作用のアニーリング温度より少なくとも５℃高いアニーリング温度で起こるように設計された（例えば、ΔＡＴ≧５℃）。これは、タガント回収及び増幅に使用されるユニバーサルフォワード（ＵＦＰ）及びリバースプライマー（ＵＲＰ）にロックド核酸（ＬＮＡ）を組み込むことによって達成された。ＬＮＡ−プライマーは、Ｅｘｉｑｏｎによって提供されたオンラインツールを使用して、ΔＡＴ≧５℃となるように設計した。自己二量体（ＵＦＰ−ＵＦＰ及びＵＲＰ−ＵＲＰ）及びヘテロ二量体（ＵＦＰ−ＵＲＰ）融解温度は、ＬＮＡ−プライマー−フラグメント結合温度より少なくとも３０℃低い。
【０２３７】
シリーズ１及び２の実験で使用したユニバーサルセットのＬＮＡプライマーの設計仕様をそれぞれ表５及び６に示す。ロックドされた核酸の前には記号「＋」が付される。同等の従来のプライマーのアニーリング特性もまた比較のために与えられている。
【０２３８】
【表３】
2019521713.tif 000041
【０２３９】
【表４】
2019521713.tif 000042
【０２４０】
（Ｄ）アニーリング温度識別ＰＣＲプロトコル
ＬＮＡ含有プライマー、低コピー数タガント回収、及びポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた短いフラグメント長の視覚化に対応するためのさらなる改良を加えて、確立された直接ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法論（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｈｉｒｅ動物組織直接ＰＣＲキット、Ｆ−１４０ＷＨ）を用いてタガント増幅を行った。直接ＰＣＲを使用して、サンプルの損失を招く可能性がある追加の精製ステップを回避した。
【０２４１】
シリーズ１及び２の実験で使用したＰＣＲ試薬を表７に示し、熱サイクルプロトコルを表８及び９に示す。シリーズ１の実験では熱サイクルアニーリング温度を６７℃（ΔＡＴ≧１６℃）に設定し（表８）、クロスタガントプライミング及びハイブリダイゼーションに対して確実にするためのシリーズ２実験において７０℃（ΔＡＴ≧１６℃）（表９）に設定した。標準的なプロトコルと比較してより高濃度のプライマーとより多数の熱サイクルが、配列決定のための十分な長さの短い産物（増幅後の長さ５４〜８０ｂｐ）の生成とフラグメント長分離ゲル電気泳動によるバンドの識別とデコード化に必要であった。
【０２４２】
ＰＣＲ産物は、ポリアクリルアミドゲル（１２％）電気泳動を用いてフラグメントサイズによって分割された。ゲルを臭化エチジウムで染色し、高ＵＶ下で検査した。サンガー配列決定のために選択されたバンドを切り出した。
【０２４３】
【表５】
2019521713.tif 000043
【０２４４】
【表６】
2019521713.tif 000044
【０２４５】
【表７】
2019521713.tif 000045
【０２４６】
（Ｅ）固定液のスクリーニング：高温高紫外線下での促進劣化実験
候補固定液のリストを識別し、そして高温、高圧、紫外線（ＵＶ）及びヌクレアーゼ活性からタガントを保護するそれらの能力についてスクリーニングした。固定剤は、物理的接着剤として機能することも必要とされ、フラグメント回収及び直接ＡＴＤ  ＰＣＲを用いた増幅に必要とされる下流の酵素プロセスに対して全く又は低い阻害効果を有する。
【０２４７】
以下の表１０に示す固定液は、０．１、０．３及び０．６ＭのＤ−（＋）−トレハロース二水和物溶液（Ｓｉｇｍａ  ９０２１０）、０．１Ｍのα，β−トレハロース溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｔ０２９９）を含む。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  ９３２８４）に溶解したポリビニルアルコール（Ｓｉｇｍａ  ３６０６２７）の１％ｍ  ｍ溶液。各溶液は、ＯｌｉｇｏＴａｇ １  Ｓｅｒ１の０．８μＭ  ｄｓＤＮＡを含むように調製した（実施例１参照）。対照溶液は１００％１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡであった。
【０２４８】
【表８】
2019521713.tif 000046
【０２４９】
タガント溶液Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔａｂ、及びＰＶＡ（表１０）を、エアブラシガンを使用して８×１２ｍｍの真鍮プレート上に堆積させた。堆積層の厚さは５０μｍ未満であり、これは弾薬カートリッジの設計公差のかなり内側にある。弾薬カートリッジの表面をシミュレートするために真鍮板を使用した。固定されたタガントを４ヶ月間にわたって連続的な高光（ＵＶＡ及びＵＶＢ、１，０００μｍｏｌ  ｍ-２  ｓ-１）及び高温（５０℃）条件に曝露した。タガントを５、８、１３、２１、３４、５５日目にプレートから回収し（各固定溶液について回収サイクル当たりｎ＝３）、存在するｄｓＤＮＡの量及びタガント増幅生存率について試験した。
【０２５０】
タガントは、５００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に浸すことによって真鍮プレートから回収し、３〜４分間５０℃に加熱してボルテックスした。真鍮プレートを取り外す前に、この工程を３回繰り返した。残りの溶液の５μＬアリコートを予め調製した試薬を含むＰＣＲウェルに直接導入した。
【０２５１】
各時間間隔でプレート上に残っているｄｓＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｑ３２８５４）を用いて定量した。人為的な読み取りに対して確実にするために、各溶液の参照サンプルは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡに懸濁された固定剤のみを含んでいた。
【０２５２】
（Ｆ）銃器トレースのための弾薬タグ化
オリゴヌクレオチドタガントを固定液に懸濁し、０．２２口径、９ｍｍ及び０．２０７口径の弾薬カートリッジの表面に付着させた。シリーズ１の実験では、実施例１に示した２０個のタガントのそれぞれで４個のカートリッジに印を付けた。シリーズ２の実験では、５個の０．２２口径及び４個の０．２０７口径の弾薬カートリッジにそれぞれ表３に示す１０個のタガントで印を付けた。印を付された弾薬は１５ｍの距離からの豚組織（スーパーマーケットの豚の腹）の部分から成るターゲットで発射されました。ブタ組織は、ヒト組織のための類似体として、そしてヌクレアーゼ媒介タガント分解に寄与し得る条件をシミュレートするために使用された。弾丸の回収を容易にするために、標的を土のうの前に置いた。タガント回収は、図１６、１７、１９に示す５つのポイントでテストされました。これらの５つのポイントは、（ａ）射手の手、（ｂ）銃器、（ｃ）弾薬ケーシング、（ｄ）弾丸進入点、及び（ｅ）回収弾丸である。
【０２５３】
（Ｇ）タガント回収：
３つのタガント回収プロトコル、すなわち（１）軟組織、（２）硬表面と皮膚、及び（３）フラグメント化材料を開発した。これらのプロトコルは、過剰な取り扱い（低コピー数タグ回収用に最適化）を回避し、直接ＰＣＲ法と互換性があるように、５点回収場所からのタガント回収を最適化するように設計された。
【０２５４】
プロトコル１：軟組織：侵入創傷からのタグ回収
侵入創傷からのタグ回収の２つの方法を試験した：（１）Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０１３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４：４−６）及び（２）直接ＰＣＲプロトコルへの導入のための創傷からの組織の切除。
【０２５５】
第１の方法では、口腔スワブ（Ｉｓｏｈｅｌｉｘ、ＭＳ−００１：１）を０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡのエアロゾルで湿らせた。スワブは、スワブ頭の上部４分の１とのみ接触するように注意しながら、弾丸の進入場所を中心に回転させた。第２の乾いた口腔スワブを使用してその部位及び周囲の組織を再度スワブした。サンプルを直ちに氷上に置き、−２０℃で保存した。
【０２５６】
スワブからＤＮＡタガントを回収するために、スワブを０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡのエアロゾルで再び湿らせ、スワブ頭を１００μＬのピペットチップに挿入して液体を絞り出した。チップに集めた液体の５μＬアリコートを表３に示す直接ＰＣＲ試薬を含むウェルに導入した。ＰＣＲ増幅が失敗した場合、スワブチップを切り取り、直接ＰＣＲ試薬を含むウェルに直接「バックアップ」として導入した。両方の湿ったスワブが失敗した場合、乾いたスワブを試験した。
【０２５７】
第２のアプローチでは、少量の組織を弾丸エントリー部位から切除し、２ｍＬのエッペンドルフチューブに入れた。組織を６００μＬの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ溶液に懸濁し、２分間８２℃に加熱し、２回ボルテックスした。液体画分（上清）の５μＬアリコートを表２に示す直接ＰＣＲ試薬を含むウェルに導入した。
【０２５８】
プロトコル２：硬い表面と皮膚：銃器とユーザーからのタグ回収
ポリビニルアルコールベースのゲルを使用して、銃器及び射手の手からタガントを回収した。ゲルは、ＰＶＡ（１０％）をエタノール（１０％）及び水に７０℃で３〜４時間（又はすべてのＰＶＡ結晶が溶解するまで）溶解することによって調製した。  ゲルの薄いフィルムをサンプリング領域に適用し、硬化させ、次いで剥がし、−２０℃で保存した。
【０２５９】
ＰＶＡフィルムからタガントを回収するために、フィルムを０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡに６０℃で２分間溶解した。フィルムを溶解させるためには、典型的には約２００μＬ／ｃｍのトリスで十分であった。得られた溶液の５μＬアリコートをＰＣＲ試薬を含有するウェルに直接導入した。
【０２６０】
プロトコル３：弾薬ケーシングと弾丸
フラグメント化した材料（弾丸のフラグメント又はカートリッジのケーシングなど）からのタガント回収は、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に浸すことによって行った。浸漬した材料を２〜３分間５０℃に加熱し、短時間ボルテックスした。この加熱−ボルテックスサイクルを３回繰り返した後、ケーシング又は弾丸の破片を溶液から取り出し、−２０℃で保存した。溶解した金属イオンは下流ＰＣＲ反応を阻害する可能性があるため、金属フラグメントは３０分以上溶液中に放置しないように留意されたい。例えば、真鍮製カートリッジを一晩溶液中に放置した場合、懸濁液は青色に変わり、高濃度の溶解銅イオンを示した。
【０２６１】
（Ｈ）ナノ細孔配列決定プロトコル
ＰＶＡフィルムからタガントを回収するために、フィルムを０．１ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡに６０℃で２分間溶解した。フィルムを溶解させるためには、典型的には約２００μＬ／ｃｍのＴｒｉｓで十分であった。得られた溶液の５μＬアリコートをＰＣＲ試薬を含有するウェルに直接導入した。
【０２６２】
試料を調製し、アンプリコン用の１Ｄ、９６ＰＣＲバーコードプロトコル（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅプロトコル番号：ＳＱＫ−ＬＳＫ１０８）に従って配列決定した。Ｐｈｉｒｅ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＩＩポリメラーゼを用いて、このプロトコルに従ってＰＣＲバーコードを行った。すべてのＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １実験において、ＦＬＯ−ＭＩＮ１０６（Ｒ９．４）フローセルを用いて配列決定を行い、セミグローバル配列アラインメント用に修正したＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いてサンプルをデコード化した。
【０２６３】
結果
保存されたＤＮＡタガントの分解促進加速分解実験では、タガントを表１０の固定溶液中に懸濁させ、真鍮プレート上に堆積させた。プレートを５５日間にわたって持続的な高温（５０℃）及び電磁放射線条件（すなわち、ＵＶＡ及びＵＶＢを含む光、１，０００μｍｏｌ  ｍ-２  ｓ-１）に曝露した。ポリビニルアルコールは、以前はＤＮＡ保存プロトコルで使用されているので、候補固定剤として試験された。トレハロースはまた、乾燥する生物におけるＤＮＡ損傷から保護すると考えられており、また商業目的のためのＤＮＡ固定剤として以前に試験されたこともある。
【０２６４】
図１８に提示された結果は、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量化によって決定されるように、５５日間にわたって様々な時間間隔で回収されたＤＮＡの量を示す。回収されたｄｓＤＮＡの量は、約０．５〜３．０ｐｍｏｌ／プレートの範囲であり、全ての固定液について０．０３ｐｍｏｌ／ｄの同様の分解速度を示した。図１８によると、５５日目の固定化溶液の性能は、回収されたｄｓＤＮＡの大部分から最小の順にＴａｂ、Ｔ１、ＰＶＡ、Ｔ３、Ｔ２、及びＣ１であった。しかしながら、これらのデータは、フラグメントを保存するために試験された溶液の容量間に決定的な違いを示さない。詳細に調べると、Ｔａｂ及びＴ１溶液から回収されたｄｓＤＮＡの量は、１日目からのＰＶＡ、Ｔ３、Ｔ２、及びＣ１溶液よりも高く、実験期間にわたって、比例して高いままであったことがデータから示されている。ｄｂＤＮＡ回収率はＴａｂ及びＴ１溶液について一貫して最高であったが、Ｃ１を含む試験した全ての溶液間で分解の変化率の間に有意差は観察されなかった。
【０２６５】
ＰＣＲ産物は、各サンプリング時間間隔で、対照を含む全ての固定液から首尾よく得られた。それ故、ＤＮＡ保存及びＰＣＲ適合性に関して、試験した固定液と対照との間に有意差は観察されなかった。これらの結果はＤＮＡの耐久性を証明するものである。
【０２６６】
この加速分解実験の重要な知見は、トレハロースとポリビニルアルコールの両方がＰｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩポリメラーゼ活性に対して有意な阻害効果を示さないことである。ポリビニルアルコールは、Ｄ−（＋）−トレハロース脱水物が大気から湿気を吸収してプレート上に粘着層を形成するため、好ましい固定剤であり、α、β−トレハロースは実用的用途には高価すぎた（ＵＳＤ  １６，３００／ｇ）。
【０２６７】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システム（０．２２、０．２０７、９ｍｍ銃器）とＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システム（９ｍｍ銃器のみ）による弾薬のフィンガープリント：ｄｓＤＮＡタガントは発射後にユーザー、銃器、ケーシング、エントリーポイント及び弾丸に分散して回収できる
このセクションでは、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムを用いた弾薬追跡実験の結果を最初に提示する。これらの実験では、シリーズ１のタガント（表１）を使用して９ｍｍの弾薬カートリッジをマーキングし、シリーズ２のタガント（表４）を使用して０．２２と０．２０７の口径の弾薬カートリッジをマーキングした。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムに従って、試料をＡＴＤ  ＰＣＲによって増幅し、（ナノポア技術を使用して）配列決定し、デコード化した。
【０２６８】
第２に、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムを使用した弾薬追跡実験の結果が示されている。これらの実験は９ｍｍ銃器でのみ行われ、可変長のシリーズ１タガントのみを使用した（表１に示す）。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２に従って、サンプルをＡＴＤ  ＰＣＲによって増幅し、フラグメント長分離によってコード化した。
【０２６９】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １及び２実験の両方について、サンプルは手、銃器、使用ケース、弾丸エントリーポイント、及び回収された弾丸から採取された。
【０２７０】
（１）シリーズ１タガント（９ｍｍ拳銃）及びシリーズ２タガント（０．２２及び０．２０７口径の銃器）を用いたＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １弾薬フィンガープリント実験：配列決定によるデコード化
９ｍｍ拳銃（シリーズ１タガント）ならびに０．２２及び０．２０７口径の銃器（シリーズ２タガント）を用いたＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １実験の結果を図１９（ａ〜ｅ）に示す。ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムでは、ＤＮＡタガントはＡＤＴ  ＰＣＲによって増幅され、配列決定されてデコード化される。本明細書に記載の実験の場合、試料をＡＴＤ  ＰＣＲを使用して増幅し、試料識別配列でバーコード化し、一緒にプールし、携帯型ナノポア技術を使用して配列決定した。次に、セミグローバルシーケンスアラインメント用に修飾されたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、結果をデコード化した。
【０２７１】
弾薬追跡実験の結果を図１９（ａ〜ｅ）に示す。図１９（ａ）は、予想されるＤＮＡ追跡が検出された頻度を示し、（ｂ〜ｄ）は、ケース、エントリー及び弾丸試料についてそれぞれ予想されるシグナル（ＥＳ）及びノイズ（Ｎ）記録を示し、（ｅ）は、登録ランクの関数として正しい識別の確率を示す。ＥＳ及びＮメトリックは、ＥＳに対して正規化されたサンプルで検出された各フラグメントレコードの読み取り数である。ランクは、最高から最低までの各記録の読み取り数である。本発明者らはこのアプローチを選択した。それは、同じ銃をすべての試験で使用したためである。これにより、銃に連続的に装填されたラベル付き弾薬の異なるセット間でのフラグメント転送が可能になった。この実験計画は、民間銃の使用パターンを反映し、確率的にＥＳをランク付けすることができるかどうかをテストするために使用された。（Ｅ）に示したＰｒ（ランク＝ＥＳ）の結果には、集計されたケース、エントリー、及び銃弾サンプルに対する予測非線形回帰（ＮＬＲ）モデルが含まれる。例えば、ランク１（Ｒ１）の値は、複数の記録が検出されたサンプルで最もランクの高い記録が、その特定の試行で使用された弾薬を正しく識別しているという信頼度である。
【０２７２】
図１９（ａ）は、識別の破壊されていない鎖が、ほぼ全てのケース、エントリーポイント及び弾丸試料において検出されたことを示す。２つの例外は、０．２０７エントリポイント（９７％）と９ｍｍ弾丸サンプル（８５．２％）であった。実験の終わりに、射手と銃の手からサンプルを回収した。ほとんどすべての射手と銃のサンプルで、ラベル付き弾薬の各セットが検出されました。唯一の例外は９ｍｍ拳銃で、実験の終わりに２０セットのラベル付き弾薬のうち１９個が銃で検出さた（図１９（ａ）参照）。各試験のＥＳ及びＮ値を図１９（ｂ〜ｄ）に示す。
【０２７３】
登録ランクと予想されるシグナルの関係
記録ランクと予想されるシグナルの関係を図１９（ｅ）に示す。ケースサンプルの場合、ランク１（Ｒ１）の記録は、９ｍｍ及び０．２０７口径の銃器のそれぞれ９７％（ｎ＝６７試行）及び１００％（ｎ＝１００％試行）の特定の試行で使用された弾薬カートリッジを正しく識別した。ケースからのサンプルは、０．２２口径の銃器実験では採取されなかった。
【０２７４】
エントリーポイントのサンプルでは、Ｒ１記録が特定のトライアルで使用された弾薬カートリッジを正しく識別した確率は、０．２２銃器で０．９８（ｎｓ＝４６）、９ｍｍ拳銃で０．８６（ｎｓ＝６４）０．２０７銃器で０．７９（ｎｓ＝３８）であった。回収された弾丸のサンプルの場合、Ｒ１記録が特定の試験で使用された弾薬カートリッジを正しく識別した確率は０．１５、９ｍｍの拳銃、０．２０７銃器で０．１６であった。銃弾のサンプルは口径０．２２の銃器実験では採取されなかった。
【０２７５】
すべての銃器の種類にわたって集計した場合、正しいカートリッジがランク１〜３の記録（Ｒ１〜Ｒ３）で識別された確率は、ケースサンプルでは０．９９、エントリーポイントサンプルでは０．９６、回収弾丸サンプルでは０．４４であって。これらの実験は、合成ＤＮＡが、低及び高マズルエネルギー（ＭＥ）銃器の両方における弾薬のラベル付け及び銃犯罪の追跡に適した媒体であることを実証している。テストされた銃器のＭＥは４４０Ｊ（０．２２口径の銃器）から３，６６０Ｊ（０．２０７口径の銃器）の範囲であった。
【０２７６】
結果は、合成ＤＮＡで標識された弾薬が射手、銃、ケース、エントリーポイント、及びマークされた弾薬の起源を決定するのに十分なこれらのポイントのいずれかでの発砲後の回収された弾丸における識別の切れ目のない連鎖を残すことを示した。シグナル／ノイズアプローチは、以前の試験の銃器で異なるＤＮＡタガントでマークされた弾薬が使用された後でさえも、記録読み取りカウントを特定の試験で使用された正しい弾薬を確率的に識別するために使用できることを示した。これらの能力は、異なる組のラベル付き弾薬を同じ銃の中で使用することができる民間銃器の追跡及び弾薬備蓄管理にとって重要である。したがって、記録的ランクを使用される弾薬に確率的に関連付ける能力は、本明細書に開示される技術の特に重要な側面である。
【０２７７】
（２）シリーズ１のタガント（９ｍｍ拳銃）を用いたＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２弾薬フィンガープリンティング実験：フラグメント長分離によるデコード化
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２システムでは、試料をＡＴＤ  ＰＣＲによって増幅し、フラグメント長分離ゲル電気泳動によってデコード化した。ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真を図２０〜２２に示し、結果を表１１及び１２に要約する。弾薬追跡実験は、９ｍｍの拳銃を使用して２つの実験段階（Ｓｅｒ１ ａ及びＳｅｒ１ ｂ）にわたって行った。実験（ａ）では、２つの９ｍｍカートリッジに表１に示すｄｓＤＮＡタガントＯｌｉｇｏＴａｇｓ １−２０ Ｓｅｒ１のそれぞれを付けた。第２の実験（ｂ）では、１０個のカートリッジをＯｌｉｇｏＴａｇｓ ４，１２，２０ Ｓｅｒ１で付けた。シリーズ１（ａ）の実験では、増幅後の長さが７４、７０、６４、６０、５４ｂｐの５つのタガント基をポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離するのが困難なことがあった。これは、長さ７４、６４、及び５４の３つの異なるサイズのタガントグループがより優れた帯域分解能を提供するシリーズ１（ｂ）の実験で対処された。
【０２７８】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２（シリーズ１、９ｍｍ）実験の主な結果を以下に提示する。
【０２７９】
（Ａ）ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステム及びＡＴＤ  ＰＣＲの実現可能性がこの分野で実証された
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２の弾薬追跡実験の結果を表１１及び表１２にまとめ、図２０〜２２の電気泳動ゲルの写真に示す。電気泳動ゲルは、実験（ａ）及び（ｂ）の両方において、クロスフラグメントハイブリダイゼーションの証拠を伴わずに明瞭な区別されるバンドを示す。ｓｓＤＮＡタガント間のギブス自由エネルギー（ΔＧ）が、従来のプライマーアニーリング（−３２．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりもクロスフラグメントハイブリダイゼーション（ΔＧ＝−４４．５及び−３７．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を強く支持し、推奨設計限界である−９．０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも約４倍マイナスであることを考えると、これは特に好ましい結果である。ｓｓＤＮＡタガント間のギブス反応エネルギーを表２に示した。これらの結果は、この分野におけるＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇシステムの実行可能性を実証している。
【０２８０】
（Ｂ）合成ＤＮＡは弾薬の追跡に適した媒体である
図１９〜２２に提示された結果は、合成ＤＮＡが発砲後も弾丸上で無傷のままであること、合成ＤＮＡが弾薬をマーク及び追跡するための適切な媒体であることを示す。
【０２８１】
（Ｃ）発砲後、使用者、銃器、ケーシング、侵入口及び弾丸に標識剤が分散され、そこから回収可能−電気泳動ゲルの結果
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２の弾薬追跡実現可能性試験（Ｅｘｐ  Ｓｅｒ１ ａ、Ｓｅｒ１ ｂ）の総合結果を表１１及び１２に示し、図１６にまとめた。これらの結果は、ほぼすべての試験で切れ目のない一連の識別が確立されたことを示している。９ｍｍ拳銃（ｎ＝７０）の場合、タガントをユーザー（８０％）、銃（１００％）、ケーシング（１００％）、弾丸（９７％）、侵入傷（９９％）にリンクする。これらの復旧ポイントは、ユーザーの識別には十分である。合計で、１つの弾薬事件と８つの弾丸が回収されず、３つの弾丸のエントリー部位が以前のエントリー部位と重なった。
【０２８２】
表１１及び１２、ならびに図２０〜２２の結果は、それぞれ４３％、３３％、及び９２％の場合に、症例、侵入創傷、及び弾丸のサンプルで多重バンディングが発生したことを示している。多重バンディングは、マガジンをロードするときに他の弾丸にタガントを移動させることを示す。使用できる銃は１本だけであるため、ある程度の移動が生じたはずである。この移動は、これまで銃器で使用されていた弾薬の分子的な歴史を提供することによって法医学的調査を助けることができ、それ故にこの技術の悪い面とは見なされていない。
【０２８３】
弾薬事件のサンプルの複数のバンドは、マガジンをロードしている間の連絡先の移動に起因している。生物学的標的物質上の弾丸進入部位から回収されたサンプル（ブタの屠殺体の切片を用いてヒト組織をシミュレートした）については、スワブ回収技術を実験（ａ）で使用した場合にのみ多重バンディングが観察された。実験（ｂ）において、侵入創傷から少量の組織を切除し、緩衝液中でインキュベートし、そしてＰＣＲウェルに直接導入した。この第２の技術を使用して、各試験で観察された予想されるバンドのみを用いて１００％の回収率を達成した。これらの実験は、生物学的材料中に存在するヌクレアーゼがタガント回収及び増幅に悪影響を及ぼさないことを示した。銃器犯罪は常に何か又は誰かの弾痕を伴うため、エントリー部位でのタガント回復はこの研究の究極の目標であった。エントリー部位だけからユーザーを識別できることは、非常に有用な法医学的ツールになり得る。
【０２８４】
手と銃からのタガントの回復は、それぞれ８０％（ｎ＝５）と１００％（ｎ＝６）の試験で成功した。手と銃からの回復は１０ショット間隔で行われたことに注意されたい。このフィージビリティスタディは、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ技術が銃器の分野を追跡するための実行可能性を証明した。回収プロトコルのさらなる改良により、手と銃による明確な識別率は大幅に向上すると予想される。
【０２８５】
（Ｅ）ＰＶＡゲルリフトは従来のバッカルスワブ及びテープリフト技術よりも優れている
１つの重要な結果は、皮膚及び銃器の硬い表面からタガントを回収及び増幅するためのＰＶＡベースのゲルの使用が成功したことである。従来の法医学プロトコルは、犯罪現場からゲノムＤＮＡを回収するために口腔スワブを使用している。しかしながら、制御された実験室条件下で微量レベルのＤＮＡタガントを回収するためのこの技術の成功率は約５０％に過ぎないことが見出された。テープリフトもまた簡単に試験されたが、テープ接着剤からＤＮＡを精製するのに必要とされる追加の工程は、低コピー数回収には不適当であると考えられた。
【０２８６】
他の従来技術を超えるＰＶＡ−ゲルリフトの成功は、３つの主な要因に起因していた。第１に、液体ゲルの適用は、テープよりも表面の亀裂及び不規則性によく浸透すると考えられる。第２に、手や銃からＰＶＡの「皮膚」を引き裂くという機械的な動作は（テープリフトと同じように）回復結果を改善する場合がある。第三に、ＰＶＡリフトと直接ＰＣＲプロトコルとの互換性、及びポリメラーゼに対するＰＶＡの低い阻害効果（Ｐｈｉｒｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩのみを試験した）により、ＰＶＡ「スキンリフト」をＰＣＲウェルに直接添加することができた。これは必然的にサンプルの損失を招くいくつかの追加の精製工程の必要性を回避した。
【０２８７】
表１１−弾薬追跡実験（ａ）の結果、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２
【化３】
2019521713.tif 000047
【０２８８】
表１２−弾薬追跡実験（ｂ）の結果、ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  ２
【化４】
2019521713.tif 000048
【０２８９】
実施例７−偽造医薬品を追跡するための分子タガント技術
ＵｎｉＫｅｙタガント及びＬＮＡプライマーを用いたＡＴＤ  ＰＣＲは、製薬業界におけるサプライチェーンの追跡などの深層アプリケーションに適している。何十億ものタガントを同時にスクリーニングする能力は、タグ付けされた製造物前駆体を混合して、１つの反応で最終製造物から解読することを可能にする。この深層化能力は、本発明に特有のものであり、図１に示されている。すべての前駆体に対してタガントの部分集合が以下の情報を含むように、タガントは有効期限、製造者、製造施設、バッチ番号などの製品情報を含むことができる。あるいは、タガントは、中央化データベース上で製品情報を検索するために使用される固有のシリアル番号をコード化することができる。概念的には、業界全体が１セットのユニバーサルプライマー（すなわち同じライブラリー）を使用することができ、それによって医薬品のあらゆる混合物が１つの反応で解読され得る。しかしながら、安全上の理由から、複数組のユニバーサルプライマーを使用することが望ましい場合がある。
【０２９０】
ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １システムは、医薬品を標識する目的でさらに試験された。これらの実験では、シリーズ１Ｈｕｍ（８，４，４）コード化タガント（表４に示す）を使用して、５つの一般的に偽造された薬、すなわちリアメット（マラリア抗寄生虫）、イソニアジド（結核抗生物質）、アモキシシリン及びクラブラン酸（広域抗生物質）とシアリス（勃起不全）を標識した。０．００１、０．０１、０．１、１、及び１０ｎｇ／ｇの錠剤の濃度で異なるｄｓＤＮＡタガントを薬物に混合した（表１３参照）。図１に示すように、複数のタガントを使用してこれらの薬物を標識し、複数の前駆体ラベリングをシミュレートした。タガントを回収し、配列決定し、弾薬ＵｎｉＫｅｙ−Ｔａｇ  １追跡実験について前述した直接ＰＣＲプロトコルを使用してデコードした。
【０２９１】
医薬品標識実験の結果を表１３に示す。全ての薬物タイプについて、試験したほぼ全ての濃度にわたって、ＤＮＡタガントを首尾よく回収し、デコードした。
【０２９２】
【表９】
2019521713.tif 000049
【０２９３】
実施例８−ＤＮＡベースのアーカイブ記憶のための分子タガント技術
既存のデータ記憶媒体の容量は、新しいデータが生成される速度より遅れている。アーカイブデータ記録のためにＤＮＡを使用することは、情報密度が高く（１０９ＧＢ／ｍｍ３、テープよりも８桁大きい）、半減期が長い（ほとんどの条件下で１００ｂｐフラグメントで約５００年）ため魅力的であり、商業的に成熟した技術を用いて合成されそして配列決定される。一方、従来の光学、磁気及びフラッシュ技術は、５〜３０年の寿命を持ち、絶え間ない更新を必要とする。したがって、長期記憶媒体としてのＤＮＡは、従来のデータ記憶技術の限界に鑑みて大きな関心を集めている。
【０２９４】
ＤＮＡベースの保存はまた、永遠の関連性という利点がある：ＤＮＡベースの生活がある限り、ＤＮＡを読んで操作する強力な理由がある。ＤＮＡ記憶の書き込みプロセスでは、デジタルデータをＤＮＡヌクレオチド配列（ヌクレオチドはＤＮＡの基本的な構成要素である）にマッピングし、対応するＤＮＡ分子を合成（製造）して、それらを保存する。データを読み取ることは、ＤＮＡ分子を配列決定し、情報を元のデジタルデータにデコードすることを含む。合成から塩基配列決定まで、バイオテクノロジーの研究から診断、治療まで、標準的な方法である。
【０２９５】
ＤＮＡベースの保存が２３文字のメッセージをエンコードして回復していた１９９９年以来、ＤＮＡ保存の進歩は急速であった９。今日合成できるデータ量は、主に合成とシーケンシングのコストによって制限されているが、バイオテクノロジー業界の成長は、桁違いのコスト削減と効率の向上をもたらしている。
【０２９６】
Ｂｏｒｎｈｏｌｔらによる論文（２０１６年；ＤＮＡベースのアーカイブ保管システム、ＡＰＬＯＳ）は、キー・バリューストアとしてモデル化された、ＤＮＡで裏付けされたアーカイブ記憶システムのためのアーキテクチャを提示する。この論文は克服する必要があるいくつかの課題を強調している。第１に、ＤＮＡ合成と配列決定は完全に程遠いもので、エラー率は１％のオーダーである。配列はまた、記憶中に劣化する可能性もあり、データの整合性がさらに低下する。ＤＮＡ記憶の重要な側面は、冗長性を追加することでエラーを許容できる適切なエンコード方式を考案することである。既存のアプローチは冗長性に焦点を当てているが、密度の影響を無視している。この研究は、制御可能な冗長性を提供し、異なるタイプのデータ（例えば、テキスト及び画像）が異なるレベルの信頼性及び密度を有することを可能にする新しいコード化方式を提案する。識別された２番目の問題は、ＤＮＡベースの記憶内のデータにランダムにアクセスすることには問題があることである。その結果、全体の読み取り待ち時間が書き込み待ち時間よりはるかに長くなる。さらに、ファイルをコード化するために使用されるＤＮＡのフラグメントは溶液中に記憶されるため、従来の媒体内のデータにアクセスするために使用される座標系は使用することができない。既存の研究はラージブロックアクセスのみを提供してきた。記憶から１バイトでさえ読むためには、ＤＮＡプール全体を配列決定し、デコードしなければならない。
【０２９７】
ランダムアクセスアーカイブデータ回復のためのアニーリング温度識別ＰＣＲ
前述のように、アニーリング温度識別ＰＣＲ（ＡＴＤ  ＰＣＲ）は、クロスフラグメントハイブリダイゼーションの発生なしに、タガントの部分集合をタガントのプールから同時に選択し増幅することを可能にする。この能力は、ＤＮＡベースのアーカイブ記憶システムにおけるランダムアクセス又は小規模ブロックアクセスのデータ回復に完全に変換される。例えば、図２は、フラグメントの特定のライブラリー（Ｗａ、Ｗｂ、及びＷｃ）によってエンコードされている３つのイメージファイルを示す。各ライブラリーは、ファイルに普遍的な特定の組のフォワード及びリバースプライマー部位（例えば、ＵＰＦｂ、ＵＰＲｂ）によって定義される。これらのファイルは、３枚の写真すべてについて、ＤＮＡ形式のデータを含むＤＮＡフラグメント（Ｐ）の混合プールとしてアーカイブされる。ＡＴＤ  ＰＣＲは、クロスフラグメントハイブリダイゼーションなしに、１回の反応で特定の写真ファイルにランダムにアクセスすることを可能にする。ＡＴＤ  ＰＣＲはまた、可変領域ヘテロ二量体形成の発生率を低下させることによって、はるかに高いコード化柔軟性を可能にする。これは、２つの異なるＤＮＡフラグメントが前述のようにコードワード内に同じ記号部分配列を含む場合に特に問題となる（図５も参照）。次に、ＡＴＤ  ＰＣＲ増幅産物を配列決定のために送り、得られた配列から写真をデコードする。ファイルはまた、より高い解像度のアクセス機能を可能にするために、より小さなライブラリセットに分割することもできる。例えば、ファイルの特定の部分にアクセスする場合などである。各ライブラリー内のフラグメント（τ）は、ファイルを再構築できるように可変領域内にインデックスシーケンスを必要とすることに留意されたい。実際には、各画像ファイルは何千ものフラグメントでエンコードされ、何千もの画像ファイルが混在して一緒に記憶されることがある。
【０２９８】
このシステムは書き換え機能を持たないが、フラグメントを最新のバージョンとして識別する可変領域内の追加のコードと共にフラグメントの更新されたセットをプールに単に追加することによって、ファイルの特定の部分を変更することができる。いずれにせよ、書き換え能力はアーカイブデータストレージの重要な要素とは見なされない。
【０２９９】
参考文献
1. Bornholt, J. et al. A DNA-based archival storage system. ASPLOS ’16 - Proc. Twenty-First Int. Conf. Archit. Support Program. Lang. Oper. Syst. 637-649 (2016). doi:10.1145/2872362.2872397.
2. Bystrykh, L. V. Generalized DNA barcode design based on Hamming codes. PLoS One 7, 1-8 (2012).
3. Church, G. M., Gao, Y. & Kosuri, S. Next-Generation Digital Information Storage in DNA. Science (80-. ). 399, 533-534 (2013).
4. Goldman, N. et al. Toward practical high-capacity low-maintenance storage of digital information in synthesised DNA. Nature 494, 77-80 (2013).
5. Hamming, R. W. Error detecting and error correcting codes. Bell Syst. Tech. J. 29, (1950).
6. Levenshtein, V. I. Binary codes capable of correcting deletion, insertions and reversals. Sov. Physics-Doklady 10, 707-710 (1966).
7. Reed, I. S. & Solomon, G. Polynomial codes over certain finite fields. J. Soc. Ind. Appl. Math. 8.2 300-304 (1960).
8. Tabatabaei Yazdi, S. M. H., Yuan, Y., Ma, J., Zhao, H. & Milenkovic, O. A Rewritable, Random-Access DNA-Based Storage System. Nature 5, 14138 (2015).
9. Clelland, C. T., Risca, V. & Bancroft, C. Hiding messages in DNA microdots. Nature 399, 533-534 (1999).
【図１】
2019521713.tif 000050
【図２】
2019521713.tif 000051
【図３】
2019521713.tif 000052
【図４Ａ】
2019521713.tif 000053
【図４Ｂ】
2019521713.tif 000054
【図４Ｃ】
2019521713.tif 000055
【図５】
2019521713.tif 000056
【図６】
2019521713.tif 000057
【図７】
2019521713.tif 000058
【図８Ａ】
2019521713.tif 000059
【図８Ｂ】
2019521713.tif 000060
【図９】
2019521713.tif 000061
【図１０Ａ】
2019521713.tif 000062
【図１０Ｂ】
2019521713.tif 000063
【図１１Ａ】
2019521713.tif 000064
【図１１Ｂ−Ｃ】
2019521713.tif 000065
【図１２】
2019521713.tif 000066
【図１３】
2019521713.tif 000067
【図１４】
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【図１５】
2019521713.tif 000069
【図１６】
2019521713.tif 000070
【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
2019521713.tif 000073
【図１９Ｂ−Ｃ】
2019521713.tif 000074
【図１９Ｄ−Ｅ】
2019521713.tif 000075
【図２０（ａ）】
2019521713.tif 000076
【図２０（ｂ）】
2019521713.tif 000077
【図２１（ａ）】
2019521713.tif 000078
【図２１（ｂ）】
2019521713.tif 000079
【図２２（ａ）】
2019521713.tif 000080
【図２２（ｂ）】
2019521713.tif 000081
【配列表】
2019521713000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月5日(2019.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製造物をその起源まで辿る方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１つの核酸配列が組み込まれている製造物を用意し、ここで、少なくとも１つの核酸配列は、第１のプライマー部位と第２のプライマー部位に隣接していて；
（ｂ）場合により、製造物から少なくとも１つの核酸配列を回収し；
（ｃ）第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを用いる熱サイクリングを含む高忠実度増幅によって少なくとも１つの核酸配列を増幅し、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、熱サイクリングは融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含み、及びアニーリング段階中に、第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的に存在しないように、熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用され、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された少なくとも１つの核酸配列を識別する、
ことを含み、ここで、工程（ｄ）において識別された少なくとも１つの核酸配列の配列及び／又は長さは製造物の起源を示す方法。
【請求項２】
製造物が、銃器、弾薬、発射体及び銃器残留物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
製造物が医薬品又はその前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
２つ以上の核酸配列を増幅及び識別することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位に隣接している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが、共通の第２のプライマー部位に隣接している、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが異なる核酸配列を有する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｄ）が、増幅された少なくとも１つの核酸配列を配列決定によって識別することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが異なる長さを有する、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｄ）が、増幅された少なくとも１つの核酸配列をサイズ分離によって識別することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの核酸配列が非生物学的情報をコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの核酸配列が、単一の熱サイクリング反応において増幅される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以下の第１のプライマー及び１つの第２のプライマーが使用される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第１及び第２のプライマーがそれぞれ８〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
第１及び第２のプライマーがそれぞれ１５〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
アニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度より少なくとも５℃高い、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
アニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度より少なくとも１０℃高い、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アニーリング段階中に使用される温度が約５０℃〜７２℃である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
アニーリング段階中に使用される温度が約６７℃〜７２℃である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１及び第２のプライマーのそれぞれが１〜８個のＬＮＡを含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
第１及び／又は第２のプライマーが、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
第１成分及び第２成分を含むキットであって、第１成分は２つ以上の核酸配列のライブラリーを含み、２つ以上の核酸配列のそれぞれが共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接し、第２の成分は、第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー、及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを含み、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含むキット。
【請求項２３】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが非生物学的情報をコードする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
第１及び第２のプライマーのそれぞれが１〜８個のＬＮＡを含む、請求項２２又は請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
ライブラリーが、配列番号１〜６０から選択される１つ以上の核酸配列を含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
第１及び／又は第２のプライマーが、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
ライブラリー由来の１つ以上の核酸配列が適用される銃器、弾薬及び発射体からなる群から選択される製造物をさらに含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
２つ以上の核酸配列が適用される製造物又はその前駆体をさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２９】
製造物をその起源まで辿る方法であって、前記方法は、
（ａ）２つ以上の異なる核酸配列が組み込まれている製造物を用意し、ここで、２つ以上の核酸配列のそれぞれは、非生物学的情報をコードする一連の部分配列を含み、２つ以上の核酸配列のそれぞれは、共通の第１のプライマー部位と共通の第２のプライマー部位に隣接していて；
（ｂ）場合により、製造物から２つ以上の核酸配列を回収し；
（ｃ）第１のプライマー部位に相補的な第１のプライマー及び第２のプライマー部位に相補的な第２のプライマーを用いる単一の熱サイクリング反応における高忠実度増幅によって２つ以上の核酸配列を増幅し、ここで、第１及び第２のプライマーはそれぞれ少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、熱サイクリングは融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含み、及びアニーリング段階中に、それぞれ第１及び第２のプライマー部位に対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリングが実質的に存在しないように、熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用され、ならびに
（ｄ）工程（ｃ）で増幅された２つ以上の核酸配列を識別する、
ことを含み、ここで、工程（ｄ）において識別された２つ以上の核酸配列の配列及び／又は長さは製造物の起源を示す方法。
【請求項３０】
製造物が、銃器、弾薬、発射体及び銃器残留物からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
製造物が医薬品又はその前駆体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｄ）が、増幅された少なくとも１つの核酸配列を配列決定によって識別することを含む、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
２つ以上の核酸配列のそれぞれが異なる長さを有する、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｄ）が、増幅された少なくとも１つの核酸配列をサイズ分離によって識別することを含む、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
第１及び第２のプライマーがそれぞれ８〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項２９〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
第１及び第２のプライマーがそれぞれ１５〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
アニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度より少なくとも５℃高い、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
アニーリング段階中に使用される温度は、第１及び第２のプライマー以外の核酸配列がアニーリングする温度より少なくとも１０℃高い、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
アニーリング段階中に使用される温度が約５０℃〜７２℃である、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
アニーリング段階中に使用される温度が約６７℃〜７２℃である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１及び第２のプライマーのそれぞれが１〜８個のＬＮＡを含む、請求項２９〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
第１及び／又は第２のプライマーが、配列番号６１〜６８から選択される核酸配列を含む、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
混合物中の２つ以上の標的核酸配列の高忠実度増幅のための方法であって、ここで、２つ以上の標的核酸配列のそれぞれが第１のプライマー部位と第２のプライマー部位に隣接し、増幅が、融解段階、アニーリング段階及び伸長段階を含む熱サイクリングを含み、前記方法は、第１プライマー部位のそれぞれに相補的な第１プライマー及び第２プライマー部位のそれぞれに相補的な第２プライマーを使用することを含み、第１プライマー及び第２プライマーが少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、アニーリング段階中、第１及び第２のプライマー部位のそれぞれに対する第１及び第２のプライマー以外の核酸配列のアニーリング段階が実質的に存在しないように、熱サイクリングのアニーリング段階中に高温が使用され、
ここで、以下：
ｉ）２つ以上の標的核酸配列が単一の熱サイクリング反応で増幅され；
ｉｉ）２つ以上の標的核酸配列が非生物学的情報をコードし；又は
ｉｉｉ）２つ以上の標的核酸のそれぞれが、共通の第１のプライマー部位及び共通の第２のプライマー部位に隣接している、
の１つ以上又は全てが適用される方法。
【国際調査報告】
2019521713.tif 000082
2019521713.tif 000083
2019521713.tif 000084
2019521713.tif 000085
2019521713.tif 000086
2019521713.tif 000087
2019521713.tif 000088
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