(57)【要約】  細胞集団を含む組成物であって、前記集団が必要とする対象への移植に適し、複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする、組成物。さらに、必要とする対象への移植に適した細胞集団を同定するための方法およびキット。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照発現レベルに比較した複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする細胞集団を含む組成物であって、前記複数の遺伝子が、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される、組成物。
【請求項２】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１に列挙された前記遺伝子の少なくとも５０％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１から選択される表に列挙された遺伝子から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記細胞集団が、エクスビボで生育された細胞に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞集団が、三次元培養で生育された細胞に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
鉱物粒子をさらに含み、前記細胞集団の少なくとも一部が前記鉱物粒子と接触（例えば、付着）している、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記鉱物粒子が、サンゴの鉱物粒子、海綿骨および皮質骨からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞集団が、ヒト脂肪組織由来細胞（ＨＡＴＤＣ）に由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細胞集団が、骨形成系細胞分化に供されたＨＡＴＤＣに由来する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記対照発現レベルが、二次元培養物中で生育された細胞に由来する第二の細胞集団に対応する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第二の細胞集団が、骨形成誘導に供された細胞集団である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
前記骨形成系細胞分化が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７からなる群から選択される骨形成誘導因子により誘導される、請求項１０または１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
必要とする対象への移植における使用のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞集団において複数の遺伝子の発現レベルを計測することを含む、必要とする対象への移植に適した細胞集団を同定するための方法であって、対照発現レベルに比較した、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される前記遺伝子から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差が、前記細胞集団が移植に適することを示す、方法。
【請求項１６】
発現レベルの前記差が、各遺伝子で独立して、上方制御および下方制御から選択される、請求項１に記載の組成物、または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１から選択される表に列挙された前記遺伝子から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１に列挙された前記遺伝子の少なくとも５０％を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記計測ステップが、前記細胞集団から核酸分子を得るステップを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｃＤＮＡ分子が、前記ｍＲＮＡ分子を逆転写することにより得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記計測が、前記核酸分子を複数のリガンドとハイブリダイズするステップをさらに含み、各リガンドが、表１〜１１に列挙された前記遺伝子から選択される単一遺伝子と特異的に複合体形成すること、結合すること、ハイブリダイズすること、または前記単一遺伝子を定量的に検出もしくは同定することが可能である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
複数のリガンドを含むキットであって、各リガンドが、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される複数から選択される単一遺伝子と特異的に複合体形成すること、結合すること、ハイブリダイズすること、または前記単一遺伝子を定量的に検出もしくは同定することが可能である、キット。
【請求項２５】
対象への移植に適した細胞集団を同定するための、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記差が、上方制御、下方制御、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１から選択される表に列挙された前記遺伝子から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２９】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される、請求項２４に記載のキット。
【請求項３０】
前記複数の遺伝子が、表１〜１１に列挙された前記遺伝子の少なくとも５０％を含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、２０１６年７月１１日出願の米国特許仮出願第６２／３６０，５００号の優先権の利益を主張するものである。上記文書の内容は、本明細書に全て示されたのと同様に、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、一般に、組織エンジニアリングの分野におけるもので、詳細には組織再生、ならびに骨の欠損および障害の処置のための細胞組成物の使用のためのものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
組織エンジニアリングおよび再生医療は、損傷を受けた臓器および組織の治癒を支援するための興味深い新規処置を提供する。組織エンジニアリングの１つの重要な側面は、ヒトの自身の細胞を使用してそのヒトを処置する能力である。自家細胞を使用することにより、組織拒絶または移植片拒絶のリスクが、排除される。
【０００４】
組織エンジニアリングの急速に成長する部門の１つは、骨の障害および疾患の処置にある。骨は、傷害に応答して自ら修復する能力を有する。しかし、複雑な臨床状態では、正常な骨の再生が害される。これらの例には、外傷、感染、腫瘍摘出、および骨格異常により生じた大きな骨欠損、または無血管壊死および骨粗鬆症をはじめとする再生過程が損なわれた例がある。骨修復の治療的アプローチには、代用骨移植片および治療分子が含まれる。
【０００５】
骨再生市場、および詳細には骨移植片は、成長する市場である。この市場の成長は、整形外科手術の増加、高齢者人口の増加、自家移植片手術の代用または補助としての代用骨移植片の好適性の向上、整形外科手術のための代用骨移植片の採用増加、および整形外科手術のための医療費償還の増加など、複数の側面が追い風となっている。
【０００６】
骨移植は、失った骨を置換する外科手術である。骨移植は、自家移植片（即ち、患者の身体の別の部分からの組織を使用する）、または同種移植片（即ち、生存するヒトドナーまたは死体からの組織を使用する）のいずれかの使用を含む。それゆえ、患者またはドナーからの組織採取の期間が必要となる。
【０００７】
典型的には組織採取は、通常は腸骨稜、遠位大腿骨、近位脛骨、腓骨、または他の小骨から組織を採取することを含む外科手術により遂行される。採取された組織は、再構成されて、損傷部位に移植される。
【０００８】
しかし、移植片採取手順は、少なからぬ罹患率と実質的な疼痛を伴う。自家移植片の組織回収、または同種移植片のための生存するドナーからの組織回収は、炎症、感染、または死亡などの合併症をもたらす場合もある。
【０００９】
限定される供給量および遺伝的な回収困難により、大きな骨欠損の修復のための別の方策の開発が奨励されてきた。
【００１０】
インプラントとしての骨抽出物、ポリマーまたはミネラルスキャフォールドなどの三次元（３Ｄ）代用骨の使用が研究され、多孔質生体適合性スキャフォールドが、骨組織の修復および再生に用いられてきた。
【００１１】
組織修復の際の早期試みは、主に、骨の大きな空隙を充填する多孔質プラグとしての非晶質生体適合性フォームの使用に集中した。米国特許第４，１８６，４４８号には、骨空隙を治癒するためのポリラクチドなどのポリヒドロキシ酸ポリマーで構成された多孔質メッシュプラグの使用が記載されている。他のスキャフォールドを作製するための複数の異なる方法も、記載された（例えば、米国特許第５，１３３，７５５号；同第５，５１４，３７８号；同第５，５２２，８９５号；同第５，６０７，４７４号；同第５，６７７，３５５号；同第５，６８６，０９１号；同第５，７１６，４１３号；同第５，７５５，７９２号；同第５，７６９，８９９号；同第５，７７０，１９３号；同第６，３３３，０２９号；同第６，３６５，１４９号および同第６，５３４，０８４号）。
【００１２】
骨髄（ＢＭ）は、骨形成能を有する細胞の集団を含むことが示されている。そのため、スキャフォールド−骨誘導アプローチの代替法は、この能力を有する生存細胞を患者に移植することである。サイトカインで操作されたナイーブ自家および同種ＢＭ細胞が、実験モデルおよびヒト患者における回折された（ｄｉｆｆｒａｃｔｅｄ）または再吸収された骨の治癒に成功した。骨形成系列の前駆細胞を、成長促進因子の存在下または非存在下で生体適合性（生分解性または非生分解性）スキャフォールドの上に播種する（例えば、米国特許第６，５４１，０２４号；同第６，５４４，２９０号；同第６，８５２，３３０号）。罹患した患者への移植を、所与のスキャフォールド上での細胞のエクスビボ増複（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）期に続いて実施する。このアプローチを利用すれば、セラミックスキャフォールドに積層された初代骨形成細胞または増幅された間葉系間葉細胞（ＭＳＣ）は、骨組織を再生することができた。
【００１３】
生存する骨は、連続で進化する臓器であり、正常な骨維持過程においては、一定のリモデリング工程が利用されている。これらの手順では、古い骨が新しい骨に交換され、臓器は、環境により変化する強度および弾性のための要件に応答する。それゆえ正常なリモデリングの進行には、骨再吸収手順と骨形成手順の機械的負荷工程を緊密に調和させることが求められる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
細胞については、正常なリモデリングの進行は、破骨細胞（骨再吸収細胞）および骨芽細胞（骨形成細胞）の連続機能に依存する。加えて、内皮細胞および内皮細胞前駆体（血管芽細胞）が、発達した骨組織中で新しい血管を形成するのに必要となる。しかし、骨形成にかかわる様々な細胞型は、異なる系列である。現在、骨芽細胞が間葉系幹細胞から生じ、破骨細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）から直接発生する）および内皮細胞が共通するコロニー形成芽細胞の子孫であることが、知られている。そのため、専門的細胞成分としての骨芽細胞に依存する、骨様材料のエクスビボ生成のための方法論は、生来の欠点に悩まされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
第一の態様によれば、本発明は、対照発現レベルに比較した複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする細胞集団を含む組成物であって、前記複数の遺伝子が、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される、組成物を提供する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、該組成物は、鉱物粒子をさらに含み、前記細胞集団の少なくとも一部が、該鉱物粒子と接触（例えば、付着）している。幾つかの実施形態において、該鉱物粒子は、サンゴの鉱物粒子、海綿骨および皮質骨からなる群から選択される。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、細胞集団において複数の遺伝子の発現レベルを計測することを含む、細胞集団を同定するための方法であって、対照発現レベルに比較した、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される遺伝子から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差が、前記細胞集団の同定を示す、方法を提供する。
【００１８】
別の態様によれば、本発明は、細胞集団において複数の遺伝子の発現レベルを計測することを含む、必要とする対象への移植に適した細胞集団を同定するための方法であって、対照発現レベルに比較した、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される遺伝子から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差が、前記細胞集団が移植に適することを示す、方法を提供する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された遺伝子の少なくとも５０％を含む。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１から選択された表に列挙された遺伝子から選択される。
【００２０】
幾つかの実施形態において、該細胞集団は、エクスビボで生育された細胞に由来する。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、三次元培養で生育された細胞に由来する。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、ヒト脂肪組織由来細胞（ＨＡＴＤＣ）に由来する。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、骨形成系細胞分化に供されたＨＡＴＤＣに由来する。
【００２１】
幾つかの実施形態において、該対照発現レベルは、二次元培養で生育された細胞に由来する第二の細胞集団に対応する。幾つかの実施形態において、該第二の細胞集団は、骨形成系細胞分化に供された細胞集団である。
【００２２】
幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７からなる群から選択される１種または複数の骨形成誘導因子により誘導される。
【００２３】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、必要とする対象への移植に使用するためのものである。
【００２４】
幾つかの実施形態において、該発現レベルの差は、独立して、上方制御、および下方制御から選択される各遺伝子についてのものである。
【００２５】
幾つかの実施形態において、本発明の方法の計測ステップは、前記細胞集団から核酸分子を得るステップを含む。幾つかの実施形態において、該核酸分子は、ｍＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子から選択される。幾つかの実施形態において、該ｃＤＮＡ分子は、前記ｍＲＮＡ分子を逆転写することにより得られる。
【００２６】
幾つかの実施形態において、本発明の方法の計測ステップは、前記核酸分子を複数のリガンドとハイブリダイズするステップをさらに含み、各リガンドは、表１〜１１に列挙された遺伝子から選択される単一遺伝子と特異的に複合体形成すること、結合すること、ハイブリダイズすること、または該単一遺伝子を定量的に検出もしくは同定することが可能である。
【００２７】
別の態様によれば、本発明は、複数のリガンドを含むキットであって、各リガンドが、表１〜１１から選択される少なくとも２つの表から選択される複数から選択される単一遺伝子と特異的に複合体形成すること、結合すること、ハイブリダイズすること、または該単一遺伝子を定量的に検出もしくは同定することが可能である、キットを提供する。幾つかの実施形態において、該キットは、対象への移植に適した細胞集団を同定するためのものである。幾つかの実施形態において、該差は、上方制御、下方制御、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１から選択される表に列挙された遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１の各１つの１つまたは複数の遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された遺伝子の少なくとも５０％を含む。
【００２８】
先に記載された例示的態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態が、図の参照により、そして以下の詳細な記載の学習により明白となろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図１Ｂ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図１Ｃ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図２Ａ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図２Ｂ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図２Ｃ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図３Ａ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図３Ｂ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図３Ｃ】２Ｄ系で培養された非処置ＨＡＤＴＣに比較した、骨形成誘導の０、１、２、３、または４日後の２Ｄおよび鉱物粒子上の３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣにおいて発現された、（Ａ）ＢＭＰ−２、（Ｂ）ＳＰ７、および（Ｃ）ＡＬＰのｑＰＣＲ分析を示した棒グラフである。
【図４】分散成分の割合を示した棒グラフ解析である。
【図５】対照（ＢＬ）に対比させた各処置群（Ａ、Ｂ、またはＣ）をもたらした複数の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を示したベン図である。
【図６Ａ】対照（ＢＬ）に対比させた、各処置群の（Ａ）群Ａ、（Ｂ）群Ｂ、および（Ｃ）群Ｃのための遺伝子発現の差の有意性を示したグラフである。各グラフのｙ軸は、ｐ値の負のｌｏｇ１０を表し、このためｐ値０．０１は、ｙ軸上の２の値により表され、ｐ値０．００１は、ｙ軸上の３の値により表される。
【図６Ｂ】対照（ＢＬ）に対比させた、各処置群の（Ａ）群Ａ、（Ｂ）群Ｂ、および（Ｃ）群Ｃのための遺伝子発現の差の有意性を示したグラフである。各グラフのｙ軸は、ｐ値の負のｌｏｇ１０を表し、このためｐ値０．０１は、ｙ軸上の２の値により表され、ｐ値０．００１は、ｙ軸上の３の値により表される。
【図６Ｃ】対照（ＢＬ）に対比させた、各処置群の（Ａ）群Ａ、（Ｂ）群Ｂ、および（Ｃ）群Ｃのための遺伝子発現の差の有意性を示したグラフである。各グラフのｙ軸は、ｐ値の負のｌｏｇ１０を表し、このためｐ値０．０１は、ｙ軸上の２の値により表され、ｐ値０．００１は、ｙ軸上の３の値により表される。
【図７】処置群Ａ、Ｂ、ＣおよびＢＬのための階層クラスタリング（ヒートマップ）である。
【図８】対照（ＢＬ）に対比された処置群Ａ、ＢおよびＣにおける遺伝子発現レベルの差の比較分析を示す。
【図９】対照（ＢＬ）に対比された処置群Ａ、ＢおよびＣについての骨芽細胞分化に関する遺伝子発現レベルの差の分析を示す。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｂ。対照（ＢＬ）に対比された処置群（Ａ）Ａならびに（Ｂ）ＢおよびＣについての血管新生および脈管形成経路に関する遺伝子発現レベルの差の分析を示す。
【図１１】２Ｄ系に比較した、３Ｄ系で培養されたＨＡＤＴＣの例示的な発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を列挙した表（表１１）である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な記載
本発明は、幾つかの実施形態において、表１〜１１に示された遺伝子発現プロファイルを特徴とする細胞集団を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、必要とする患者における移植、埋め込み、投与、および／または注射のためのものである。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、エクスビボで生育された細胞に由来する。
【００３１】
幾つかの実施形態において、本発明は、組成物が必要とする患者における移植に適するか否かを決定するための方法を提供する。追加の実施形態において、本発明は、組成物が必要とする患者における移植に適するか否かを決定するのに有用な遺伝子パネルを提供する。
【００３２】
本発明は、一部として、本発明の細胞集団が複数の遺伝子の遺伝子発現シグネイチャを特徴とし得るという発見に基づく。本明細書の以下に例示される通り、表１〜１１から選択される遺伝子発現レベルは、三次元（３Ｄ）培養で育成された細胞（例えば、ヒト脂肪組織由来細胞またはＨＡＴＤＣ）、および／または他の細胞（例えば、二次元（２Ｄ）培養で育成されたＨＡＴＤＣ）への骨形成誘導を受けた細胞の間で区別するために用いられてもよい。
【００３３】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された細胞集団を含む組成物は、鉱物粒子をさらに含む。幾つかの実施形態において、該組成物は、骨移植に有用な埋め込み可能な三次元（３Ｄ）組成物である。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する。幾つかの実施形態において、該３Ｄ培養で育成された細胞を、さらに骨形成誘導に供した。幾つかの実施形態において、骨形成系細胞分化は、骨形成誘導因子（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、Ｂ，Ｐ−６またはＢＭＰ−７）により誘導される。幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、ＢＭＰ−２により誘導される。幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、ＢＭＰ−３により誘導される。幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、ＢＭＰ−４により誘導される。幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、ＢＭＰ−５により誘導される。幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、ＢＭＰ−６により誘導される。幾つかの実施形態において、該骨形成系細胞分化は、ＢＭＰ−７により誘導される。
【００３４】
幾つかの実施形態において、該細胞集団は、ミネラルスキャフォールド上で３Ｄ培養により育成されて、骨形成誘導に供されたＨＡＴＤＣに由来する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、異種細胞集団である。幾つかの実施形態において、該異種細胞集団は、関節の欠損のための骨・軟骨混合移植片（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｇｒａｆｔ）、および／または血管柄付き骨移植片への適合を含む様々な適用が可能である。幾つかの実施形態において、該細胞集団を含む組成物は、必要とする患者における移植に用いられる。別の実施形態において、該組成物は、骨の中の空隙を充填するのに用いられる。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、有利な移植特性を有する。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、改善された移植片転帰を有する。幾つかの実施形態において、前記改善された移植片転帰は、確率が５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９７％を超える、９８％を超える、または９９％を超える実現に成功した移植（例えば、前記対象における移植された細胞集団の融合）である。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本発明は、細胞組成物が６０％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、または９５％を超える確率である実行に成功した移植（例えば、前記対象における移植された細胞集団の融合）を有するか否かを決定するための方法を提供する。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「対象」は、動物、例えば非ヒト哺乳動物またはヒトを指す。非ヒト動物対象は、例えば胚または胎児などの動物の出生前形態を包含してもよい。非ヒト動物の非限定的例としては、ウマ、ウシ、ラクダ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモットおよびブタが挙げられる。一実施形態において、該対象は、ヒトである。ヒト対象は、胎児を包含してもよい。一実施形態において、必要とする対象は、骨折、骨傷害、骨重量減少および／または骨異常に見舞われた対象である。
【００３９】
本明細書で用いられる用語：埋め込むことまたは埋め込み、移植することまたは移植、投与することまたは投与、注射することまたは注射、送達することまたは送達は全て、本明細書で開示された組成物を処置部位に提供する工程を指し、部位への組織の送達を実行するために用いられる組成物の特性および手順にもよるが、同じ意味を有することは、当業者に理解されよう。これらの用語は、互換的に用いることができ、決して本発明の方法に限定されない。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「遺伝子発現プロファイル」、「遺伝子発現シグネイチャ」または「遺伝子発現フィンガープリント」は、互換性がある、対照細胞（例えば、２Ｄ培養で育成されて、骨形成誘導に供された、または供されていない細胞）に由来する集団に比較した、本発明の異種細胞集団により呈された発現の増加または減少をはじめとする遺伝子発現の変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）／差のパターンを指す。該プロファイルまたはフィンガープリントは、対照に比較した「発現変動遺伝子」（ＤＥＧ）の発現の増加または減少の相対的度合いを含む。
【００４１】
用語「発現変動遺伝子」、「ＤＥＧ」、「変動する遺伝子発現」およびそれらの同義語は、互換的に用いられ、対照に比較した、選択された細胞集団において発現がより高レベルまたはより低レベルに上方制御または下方制御された遺伝子を指す。発現変動遺伝子が核酸レベルもしくはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害される場合があること、または選択的スプライシングを受けて異なるポリペプチド生成物をもたらす場合があることも、理解されたい。そのような差は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変動、表面発現、分泌または他のポリペプチド分配により立証されてもよい。
【００４２】
本明細書で用いられる「発現レベルの差」および「発現レベルの変調」、ならびにそれらの同義語は、互換的に用いられ、遺伝子発現における有意差を指す。該用語は、遺伝子発現の増加および／または遺伝子発現の減少を包含する。
【００４３】
測定された発現レベルに関連する用語「有意差」は、検査された遺伝子の上方制御／増加／誘導および／もしくは下方制御／減少／低下、またはそれらの組み合わせを包含する（検査された発現プロファイルの第一の遺伝子が上方制御され得るが、発現プロファイルの第二の遺伝子が、下方制御され得る、など）。
【００４４】
幾つかの実施形態において、具体的遺伝子の上方制御または下方制御が、テストされた集団が移植に適していることを示すか否かの決定は、表１〜１１（「＋」または「−」を用いて示す）に列挙されたデータに基づく。幾つかの実施形態において、前記有意差は、当業者により認識される通り、平均発現レベルなどにおける統計学的有意差である。例えば非限定的に、対照値に比較して少なくとも約２倍の、あるいは少なくとも約３倍の増加または減少が、細胞の特定の分化段階に関連する。
【００４５】
用語「減少」、「下方制御」、および「低下」は、本明細書では互換的に用いられ、遺伝子発現における統計学的に有意な減少を指す。幾つかの実施形態において、減少は、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または１０倍の減少を指す。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「増加」、「上方制御」、および「誘導」は、本明細書では互換的に用いられ、遺伝子発現における統計学的に有意な増加を指す。幾つかの実施形態において、増加は、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または１０倍の増加を指す。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００４７】
組成物
一態様によれば、該組成物が表１〜１１のいずれか１つに示される遺伝子発現プロファイルを特徴とする、細胞集団を含む組成物が提供される。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１〜１０から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１〜１１から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１１から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００４８】
幾つかの実施形態において、該発現レベルの差は、対照集団に比較して計測される。幾つかの実施形態において、該対照集団は、二次元（２Ｄ）培養で育成された細胞に由来する集団である。幾つかの実施形態において、該対照集団は、２Ｄ培養で育成され、骨形成誘導に供された細胞に由来する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表２から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表３から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表４から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表５から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表６から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表７から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表８から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表９から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表１０から選択される１つもしくは複数の遺伝子、および／または表１１から選択される１つもしくは複数の遺伝子、あるいはそれらの組み合わせから選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１の各１つからの１つまたは複数の遺伝子を含む。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１から選択される表に列挙された遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、１つまたは複数の遺伝子は、少なくとも２つの遺伝子、または少なくとも３つの遺伝子、または少なくとも４つの遺伝子である。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５０】
幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表２から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表３から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表４から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表５から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表６から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表７から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表８から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表９から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１０から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該細胞集団は、表１１から選択される複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００５１】
幾つかの実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５の異なる遺伝子を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５２】
幾つかの実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くともｔ  ２０、多くとも２１、多くとも２２、多くとも２３、多くとも２４、多くとも２５、多くとも２６、多くとも２７、多くとも２８、多くとも２９、多くとも３０、多くとも３１、多くとも３２、多くとも３３、多くとも３４、多くとも３５、多くとも３６、多くとも３７、多くとも３８、多くとも３９、多くとも４０、多くとも４１、多くとも４２、多くとも４３、多くとも４４、多くとも４５、多くとも４６、多くとも４７、多くとも４８、多くとも４９、多くとも５０、多くとも５５、多くとも６０、多くとも６５、多くとも７０、多くとも７５、多くとも８０、多くとも８５、多くとも９０、多くとも９５の異なる遺伝子を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５３】
幾つかの実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１１に列挙された、多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くともｔ  ２０、多くとも２１、多くとも２２、多くとも２３、多くとも２４、多くとも２５、多くとも２６、多くとも２７、多くとも２８、多くとも２９、多くとも３０、多くとも３１、多くとも３２、多くとも３３、多くとも３４、多くとも３５、多くとも３６、多くとも３７、多くとも３８、多くとも３９、多くとも４０、多くとも４１、多くとも４２、多くとも４３、多くとも４４、多くとも４５、多くとも４６、多くとも４７、多くとも４８、多くとも４９、多くとも５０、多くとも５５、多くとも６０、多くとも６５の遺伝子を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５４】
幾つかの実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された遺伝子の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００５５】
別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表２に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表３に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表４に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表５に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表６に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表７に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表８に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表９に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１０に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。別の実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１１に列挙された遺伝子全てを含む、またはそれからなる。
【００５６】
本発明の細胞集団の遺伝子発現
ＭＳＣマーカーの下方制御
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）、ＴＨＹ１（ＣＤ９０）、およびＫＬＦ４（表１ｂに示される）から選択される幹細胞関連遺伝子の減少を特徴とする。
【００５７】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）、ＴＨＹ１（ＣＤ９０）、およびＫＬＦ４を含む、表１に列挙された１つまたは複数のＭＳＣマーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）、ＴＨＹ１（ＣＤ９０）、およびＫＬＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）、ＴＨＹ１（ＣＤ９０）、およびＫＬＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下を特徴とする。
【００５８】
幾つかの実施形態において、対照集団に比較した、ＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）、ＴＨＹ１（ＣＤ９０）、およびＫＬＦ４からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下は、該細胞集団が必要とする対象への移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団に対比された、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）の発現レベルの低下は、該細胞集団が必要とする対象への移植に適することを示す。
【表１】
2019521708.tif 000003
【００５９】
増殖および分化調節遺伝子の発現
以下の実施例の節に例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、表２ｂに示された遺伝子発現レベルの差を特徴とする。さらに、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１、およびＡＮＸＡ２から選択される増殖調節遺伝子の発現減少を特徴とする。さらに、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、ＳＦＲＰ２、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣから選択される分化調節遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。実施例の節にさらに例示される通り、骨形成誘導に供された２Ｄまたは３Ｄ培養で生育されたＨＡＴＤＣは両者とも、ＩＤ１、ＩＤ２、およびＩＤ３からなる群から選択される増殖調節遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００６０】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１、ＡＮＸＡ２、ＳＦＲＰ２、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣを含む、表２に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞は、対照と比較した、ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１、ＡＮＸＡ２、ＳＦＲＰ２、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞は、対照と比較した、ＡＵＲＫＡ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＡＮＸＡ２、およびＳＦＲＰ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００６１】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１、およびＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＡＵＲＫＡ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、およびＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＳＦＲＰ２、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＳＦＲＰ２の発現レベルの上昇を特徴とする。
【００６２】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１、ＡＮＸＡ２、ＳＦＲＰ２、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＳＦＲＰ２、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１およびＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＳＦＲＰ２の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表２】
2019521708.tif 000004
【００６３】
ＭＨＣ  Ｉ遺伝子の発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表３ｂに示される）に比較したＭＨＣＩ遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００６４】
本明細書で用いられる用語「ＭＨＣ」は、免疫系への外来抗原の提示に関与する主要組織適合性複合体を指す。本明細書で用いられる「ＨＬＡ」は、「ＭＨＣ」のヒト形態である。典型的にはＭＨＣＩ遺伝子は、ほとんど全ての分化された細胞で発現される。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、低レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現することが知られている。
【００６５】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ｈを含む、表３に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照細胞集団と比較した１種または複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、該１種または複数の遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ｈからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、該１種または複数の遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ｈからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ｈからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ｈからなる群から選択される複数の遺伝子の発現レベルの上昇は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、およびＨＬＡ−Ｈからなる群から選択される複数の遺伝子の発現レベルの上昇は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表３】
2019521708.tif 000005
【００６６】
脂肪細胞マーカーの発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表４ｂに示される）に比較した複数の脂肪細胞マーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００６７】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＰＰＡＲＧ、ＤＬＫ１、ＡＣＳＬ１、ＡＥＢＰ１、およびＳｏｘ９を含む、表４に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＰＰＡＲＧ、ＤＬＫ１、ＡＣＳＬ１、ＡＥＢＰ１、およびＳｏｘ９からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＥＢＰ１の発現レベルの差を特徴とする。
【００６８】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＰＰＡＲＧおよびＡＣＳＬ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較したＰＰＡＲＧおよびＡＣＳＬ１の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＤＬＫ１、ＡＥＢＰ１、およびＳｏｘ９からなる群から選択される複数の脂肪細胞遺伝子マーカーの発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＥＢＰ１の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００６９】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＰＰＡＲＧ、ＤＬＫ１、ＡＣＳＬ１、ＡＥＢＰ１、およびＳｏｘ９からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較したＤＬＫ１、ＡＥＢＰ１、およびＳｏｘ９からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較したＡＥＢＰ１の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較したＰＰＡＲＧ、およびＡＣＳＬ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表４】
2019521708.tif 000006
【００７０】
骨芽細胞マーカーの発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表５ｂに示される）に比較した複数の骨芽細胞マーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００７１】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ２、ＳＰ７、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、ＦＧＦＲ３、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＤＬＸ５、ＫＡＺＡＬＤ１、ＣＡ１２、ＢＭＰＥＲ、およびＦＢＮ２を含む、表５に列挙された１つまたは複数の骨芽細胞マーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ２、ＳＰ７、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、ＦＧＦＲ３、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＤＬＸ５、ＫＡＺＡＬＤ１、ＣＡ１２、ＢＭＰＥＲ、およびＦＢＮ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰ２、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＣＡ１２、ＢＭＰＥＲ、およびＦＢＮ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００７２】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰＥＲおよびＦＢＮ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰＥＲおよびＦＢＮ２の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＦＢＮ２の発現レベルの低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ２、ＳＰ７、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、ＦＧＦＲ３、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＤＬＸ５、ＫＡＺＡＬＤ１、およびＣＡ１２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰ２、ＡＬＰ、ＰＯＳＴＮ、ＭＳＸ１、ＭＳＸ２、およびＣＡ１２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＭＰ２、ＳＰ７、およびＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００７３】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ２、ＳＰ７、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、ＦＧＦＲ３、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＤＬＸ５、ＫＡＺＡＬＤ１、ＣＡ１２、ＢＭＰＥＲ、およびＦＢＮ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＭＰ２、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＣＡ１２、およびＦＢＮ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＭＰ２、ＢＭＰＲ２、ＳＰ７、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、ＦＧＦＲ３、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、ＤＬＸ５、ＫＡＺＡＬＤ１、ＣＡ１２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【００７４】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＭＰ２、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＰＯＳＴＮ、Ｍｓｘ１（Ｈｏｘ７）、Ｍｓｘ２（Ｈｏｘ８）、およびＣＡ１２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＭＰＥＲおよびＦＢＮ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの低下は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＦＢ２の発現レベルの低下は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表５】
2019521708.tif 000007
【００７５】
骨軟骨前駆体および肥大軟骨細胞遺伝子マーカーの発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表６ｂに示される）に比較した複数の骨軟骨前駆体および／または肥大軟骨細胞遺伝子マーカーの発現レベルの差を特徴とする。
【００７６】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、Ｓｏｘ９、ＭＧＰ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＭＭＰ１３、ＧＳＮ、ＣＢＦＢ、ＢＡＰＸ１（ＮＫＸ３−２）、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＣＯＭＰを含む、表６に列挙された１つまたは複数の骨軟骨前駆体および／または肥大軟骨細胞遺伝子マーカーの発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、Ｓｏｘ９、ＭＧＰ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＭＭＰ１３、ＧＳＮ、ＣＢＦＢ、ＢＡＰＸ１（ＮＫＸ３−２）、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＣＯＭＰからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＭＭＰ１３、ＲＵＮＸ１、およびＲＵＮＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００７７】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、Ｓｏｘ９、ＭＧＰ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＭＭＰ１３、ＧＳＮ、ＣＢＦＢ、ＢＡＰＸ１（ＮＫＸ３−２）、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＣＯＭＰからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＭＭＰ１３、ＲＵＮＸ１、およびＲＵＮＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００７８】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、Ｓｏｘ９、ＭＧＰ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＭＭＰ１３、ＧＳＮ、ＣＢＦＢ、ＢＡＰＸ１（ＮＫＸ３−２）、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＣＯＭＰからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、Ｓｏｘ９、ＭＧＰ、ＣＯＬ１０Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＭＭＰ１３、ＧＳＮ、ＣＢＦＢ、ＢＡＰＸ１（ＮＫＸ３−２）、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、およびＣＯＭＰからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＭＭＰ１３、ＲＵＮＸ１、およびＲＵＮＸ２からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表６】
2019521708.tif 000008
【００７９】
ＥＣＭ遺伝子マーカーの発現
以下の実施例の節で例示される通り、本発明の細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表７ｂに示される）に比較した複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）マーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００８０】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＬＴＢＰ３、ＤＰＴ、ＥＦＥＭＰ２、ＰＬＯＤ１、ＴＮＣ、ＤＣＮ、ＦＢＬＮ２、ＮＤＮＦ、およびＳＵＬＦ１を含む、表７に列挙された１つまたは複数のＥＣＭマーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＬＴＢＰ３、ＤＰＴ、ＥＦＥＭＰ２、ＰＬＯＤ１、ＴＮＣ、ＤＣＮ、ＦＢＬＮ２、ＮＤＮＦ、およびＳＵＬＦ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＤＰＴ、ＰＬＯＤ１、ＤＣＮ、およびＮＤＮＦからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００８１】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＬＴＢＰ３、ＤＰＴ、ＥＦＥＭＰ２、ＰＬＯＤ１、ＴＮＣ、ＤＣＮ、ＦＢＬＮ２、ＮＤＮＦ、およびＳＵＬＦ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＤＰＴ、ＰＬＯＤ１、ＤＣＮ、およびＮＤＮＦからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００８２】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＬＴＢＰ３、ＤＰＴ、ＥＦＥＭＰ２、ＰＬＯＤ１、ＴＮＣ、ＤＣＮ、ＦＢＬＮ２、ＮＤＮＦ、およびＳＵＬＦ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＬＴＢＰ３、ＤＰＴ、ＥＦＥＭＰ２、ＰＬＯＤ１、ＴＮＣ、ＤＣＮ、ＦＢＬＮ２、ＮＤＮＦ、およびＳＵＬＦ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＢＧＮ、ＬＡＭＡ４、ＬＡＭＡ２、ＤＰＴ、ＰＬＯＤ１、ＤＣＮ、およびＮＤＮＦからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表７】
2019521708.tif 000009
【００８３】
遺伝子をコードする構造タンパク質の発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表８ｂに示される）に比較した１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００８４】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ２、およびＰＣＯＬＣＥを含む、表８に列挙された１つまたは複数の構造遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００８５】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００８６】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２４Ａ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ２、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ３、ＣＯＬ６Ａ２、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ８Ａ２、およびＰＣＯＬＣＥからなる群から選択される１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表８】
2019521708.tif 000010
【００８７】
血管新生および脈管形成に関連する遺伝子の発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表９ｂに示される）に比較した１つまたは複数の血管関連マーカー遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００８８】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＥＤＮＲＡ、ＥＰＨＡ２、Ｆ２Ｒ、ＰＧＦ、ＣＴＨＲＣ１、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、ＩＬ１１、ＨＥＹ１、ＥＣＭ１、ＭＦＧＥ８、ＳＲＰＸ２、およびＵＮＣ５Ｂを含む、表９に列挙された１つまたは複数の血管新生および脈管形成に関連する遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＥＤＮＲＡ、ＥＰＨＡ２、Ｆ２Ｒ、ＰＧＦ、ＣＴＨＲＣ１、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、ＩＬ１１、ＨＥＹ１、ＥＣＭ１、ＭＦＧＥ８、ＳＲＰＸ２、およびＵＮＣ５Ｂからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、およびＥＣＭ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００８９】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＥＤＮＲＡ、ＥＰＨＡ２、Ｆ２Ｒ、ＰＧＦ、ＣＴＨＲＣ１、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、ＩＬ１１、ＨＥＹ１、ＥＣＭ１、ＭＦＧＥ８、ＳＲＰＸ２、およびＵＮＣ５Ｂからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、およびＥＣＭ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００９０】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＥＤＮＲＡ、ＥＰＨＡ２、Ｆ２Ｒ、ＰＧＦ、ＣＴＨＲＣ１、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、ＩＬ１１、ＨＥＹ１、ＥＣＭ１、ＭＦＧＥ８、ＳＲＰＸ２、およびＵＮＣ５Ｂからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＴＢＸ２、ＴＢＸ３、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＥＤＮＲＡ、ＥＰＨＡ２、Ｆ２Ｒ、ＰＧＦ、ＣＴＨＲＣ１、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、ＩＬ１１、ＨＥＹ１、ＥＣＭ１、ＭＦＧＥ８、ＳＲＰＸ２、およびＵＮＣ５Ｂからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ２、ＴＲＯ、ＰＴＧＤＳ、ＡＥＢＰ１、ＩＬ８（Ｃｘｃｌ８）、およびＥＣＭ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表９】
2019521708.tif 000011
【００９１】
特異的な上流調節因子の発現
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表１０ｂに示される）に比較した１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００９２】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＴＧＦＢ３、ＢＡＭＢＩ、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５を含む、表１０に列挙された１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＴＧＦＢ３、ＢＡＭＢＩ、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＴＧＦＢ３、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００９３】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＴＧＦＢ３、ＢＡＭＢＩ、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、対照と比較した、ＴＧＦＢ３、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの誘導を特徴とする。
【００９４】
幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＴＧＦＢ３、ＢＡＭＢＩ、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの差は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＴＧＦＢ３、ＢＡＭＢＩ、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。幾つかの実施形態において、対照集団と比較した、ＴＧＦＢ３、ＩＧＦＢＰ２、およびＩＧＦＢＰ５からなる群から選択される１つまたは複数の上流調節因子遺伝子の発現レベルの誘導は、該細胞集団が必要とする対象における移植に適することを示す。
【表１０】
2019521708.tif 000012
【００９５】
以下の実施例の節で例示される通り、３Ｄ培養で育成された細胞に由来する細胞集団は、２Ｄ培養で培養された対照集団（表１１に示される）に比較した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。
【００９６】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、表１１に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも２倍の変化を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、表１１に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも３倍の変化を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＣＬＤＮ１、ＳＦＲＰ１、ＢＣＹＲＮ、ＣＤＣＡ７、ＦＬＪ２１９８６、ＯＤＣ１、ＯＳＲ１、ＬＯＣ１００１３０５１６、およびＲＯＲ１を含む、表１１に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも３倍の低下を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＣＬＤＮ１、ＳＦＲＰ１、ＢＣＹＲＮ、ＣＤＣＡ７、ＦＬＪ２１９８６、ＯＤＣ１、ＯＳＲ１、ＬＯＣ１００１３０５１６、およびＲＯＲ１からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも３倍の低下を特徴とする。
【００９７】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＥＰＨ、ＦＮＤＣ１、Ｃ１４ＯＲＦ１３２、ＰＦＫＦＢ４、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＣＲＩＳＰＬＤ２、Ｃ１３ＯＲＦ１５、ＳＬＣ６Ａ１０Ｐ、ＪＡＭ２、ＮＢＬ１、ＯＧＮ、ＡＳＳ１、ＳＳＰＮ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＴＭＥＭ９０Ｂ、ＦＬＪ３５２５８、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＣＲＬＦ１、ＣＤ２４、ＣＭＴＭ８、ＡＲＨＧＥＦ１９、ＯＭＤ、ＢＴＢＤ１１ＣＹＧＢ、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＩＮＳＣ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＣＰＥ、ＮＢＬ１、ＥＮＣ１、ＡＰＣＤＤ１Ｌ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＬＣ７Ａ８、ＩＳＬＲ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＴＳＰＡＮ７、ＳＡＭＤ１１、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＬＤＯＣ、ＲＧＳ２、ＤＹＮＣ１Ｉ１、ＲＡＳＬ１１Ｂ、ＥＹＡ２、ＤＩＯ２、ＣＲＹＡＢ、ＫＬＫ４、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８を含む、表１１に列挙された１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも３倍の上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＨＥＰＨ、ＦＮＤＣ１、Ｃ１４ＯＲＦ１３２、ＰＦＫＦＢ４、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＣＲＩＳＰＬＤ２、Ｃ１３ＯＲＦ１５、ＳＬＣ６Ａ１０Ｐ、ＪＡＭ２、ＮＢＬ１、ＯＧＮ、ＡＳＳ１、ＳＳＰＮ、ＡＬＯＸ１５Ｂ、ＴＭＥＭ９０Ｂ、ＦＬＪ３５２５８、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＣＲＬＦ１、ＣＤ２４、ＣＭＴＭ８、ＡＲＨＧＥＦ１９、ＯＭＤ、ＢＴＢＤ１１ＣＹＧＢ、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＩＮＳＣ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＣＰＥ、ＮＢＬ１、ＥＮＣ１、ＡＰＣＤＤ１Ｌ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＬＣ７Ａ８、ＩＳＬＲ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＴＳＰＡＮ７、ＳＡＭＤ１１、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＬＤＯＣ、ＲＧＳ２、ＤＹＮＣ１Ｉ１、ＲＡＳＬ１１Ｂ、ＥＹＡ２、ＤＩＯ２、ＣＲＹＡＢ、ＫＬＫ４、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも３倍の上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＦＬＪ３５２５８、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＣＲＬＦ１、ＣＤ２４、ＣＭＴＭ８、ＡＲＨＧＥＦ１９、ＯＭＤ、ＢＴＢＤ１１ＣＹＧＢ、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＩＮＳＣ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＣＰＥ、ＮＢＬ１、ＥＮＣ１、ＡＰＣＤＤ１Ｌ、ＳＥＺ６Ｌ２、ＳＬＣ７Ａ８、ＩＳＬＲ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＴＳＰＡＮ７、ＳＡＭＤ１１、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＬＤＯＣ、ＲＧＳ２、ＤＹＮＣ１Ｉ１、ＲＡＳＬ１１Ｂ、ＥＹＡ２、ＤＩＯ２、ＣＲＹＡＢ、ＫＬＫ４、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも４倍の上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＳＬＣ７Ａ８、ＩＳＬＲ、ＡＴＰ１Ｂ１、ＴＳＰＡＮ７、ＳＡＭＤ１１、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＬＤＯＣ、ＲＧＳ２、ＤＹＮＣ１Ｉ１、ＲＡＳＬ１１Ｂ、ＥＹＡ２、ＤＩＯ２、ＣＲＹＡＢ、ＫＬＫ４、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも５倍の上昇を特徴とする。
【００９８】
幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＡＴＰ１Ｂ１、ＴＳＰＡＮ７、ＳＡＭＤ１１、ＡＴＰ１Ｂ１、ＡＬＤＯＣ、ＲＧＳ２、ＤＹＮＣ１Ｉ１、ＲＡＳＬ１１Ｂ、ＥＹＡ２、ＤＩＯ２、ＣＲＹＡＢ、ＫＬＫ４、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも６倍の上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＤＩＯ２、ＣＲＹＡＢ、ＫＬＫ４、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも７倍の上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＭＸＲＡ５、ＣＡ９、Ｈ１９、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも８倍の上昇を特徴とする。幾つかの実施形態において、本発明の細胞集団は、ＰＥＮＫ、ＲＡＲＲＥＳ２、ＫＡＮＫ４、ＰＴＧＥＳ、およびＡＮＫＲＤ３８からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの少なくとも１０倍の上昇を特徴とする。
【表１１】
2019521708.tif 000013
【００９９】
骨形成誘導に続く発現の変調
以下の実施例の節（表１２）に例示される通り、骨形成誘導に供されたＨＡＴＤＣは、遺伝子ＡＴＯＨ８、ＣＧＢ１、ＣＭＴＭ４、ＦＯＸＯ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＮＥＢＬ、ＯＳＲ１、ＰＲＲＸ２、ＳＡＭＤ１１、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＳＭＡＤ９の発現レベルにおいて変調を呈することが見出された。
【０１００】
幾つかの実施形態において、骨形成誘導に供された細胞に由来する細胞集団は、ＡＴＯＨ８、ＣＧＢ１、ＣＭＴＭ４、ＦＯＸＯ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＮＥＢＬ、ＯＳＲ１、ＰＲＲＸ２、ＳＡＭＤ１１、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＳＭＡＤ９からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルの差を特徴とする。幾つかの実施形態において、骨形成誘導に供された細胞に由来する細胞集団は、ＡＴＯＨ８、ＣＧＢ１、ＣＭＴＭ４、ＦＯＸＯ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＮＥＢＬ、ＰＲＲＸ２、ＳＡＭＤ１１、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＳＭＡＤ９からなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の誘導を特徴とする。幾つかの実施形態において、骨形成誘導に供された細胞に由来する異種細胞集団は、ＯＳＲ１遺伝子の発現レベルの低下を特徴とする。
【０１０１】
移植に適した組成物を同定するための方法
一態様によれば、移植のための細胞組成物の適切性を計測するための方法であって、前記組成物の、複数の遺伝子またはその産物の発現レベルを計測することを含み、対照に比較した、前記複数の遺伝子の発現レベルの有意差が、移植に適した組成物の指標となる、方法が提供される。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数は、表１〜１１の各１つの１つ以上の遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数は、表１〜１１から選択される表に列挙された遺伝子から選択される。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１〜１１の任意の１つに列挙された遺伝子から選択される。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、該対照集団は、二次元（２Ｄ）培養で育成された細胞に由来する集団である。幾つかの実施形態において、該対照集団は、２Ｄ培養で育成され、骨形成誘導に供された細胞に由来する。
【０１０４】
用語「計測すること」、「測定すること」、「評定すること」、および「アッセイすること」は、互換的に用いられ、定量的および定性的の両方の計測を包含する。これらの用語は、任意の形態の測定を指し、特徴、特性、または特色が存在するか否かを決定することを包含する。評定することは、相対的または絶対的であってもよい。
【０１０５】
幾つかの実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１〜１０に列挙された少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５の異なる遺伝子を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。幾つかの実施形態によれば、該複数の遺伝子は、表１〜１１に列挙された多くとも２、多くとも３、多くとも４、多くとも５、多くとも６、多くとも７、多くとも８、多くとも９、多くとも１０、多くとも１１、多くとも１２、多くとも１３、多くとも１４、多くとも１５、多くとも１６、多くとも１７、多くとも１８、多くとも１９、多くともｔ  ２０、多くとも２１、多くとも２２、多くとも２３、多くとも２４、多くとも２５、多くとも２６、多くとも２７、多くとも２８、多くとも２９、多くとも３０、多くとも３１、多くとも３２、多くとも３３、多くとも３４、多くとも３５、多くとも３６、多くとも３７、多くとも３８、多くとも３９、多くとも４０、多くとも４１、多くとも４２、多くとも４３、多くとも４４、多くとも４５、多くとも４６、多くとも４７、多くとも４８、多くとも４９、多くとも５０、多くとも５５、多くとも６０、多くとも６５、多くとも７０、多くとも７５、多くとも８０、多くとも８５、多くとも９０、多くとも９５の異なる遺伝子を含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１０６】
本明細書に記載された複数の遺伝子は、少なくとも１種の他のマーカー、例えば他の公知の遺伝子を特色とする任意の部分的組み合わせおよび／または組み合わせを場合により包含する。
【０１０７】
遺伝子発現の計測
遺伝子発現は、ＲＮＡポリメラーゼによるメッセンジャーＲＮＡへのＤＮＡの転写である。本明細書で用いられる用語「発現」は、前記遺伝子産物の転写および／または翻訳をはじめとする遺伝子産物の生合成を指す。したがって核酸分子の発現は、核酸断片の転写（例えば、ｍＲＮＡまたは他の機能的ＲＮＡをもたらす転写）および／または前駆体もしくは成熟タンパク質（ポリペプチド）へのＲＮＡの翻訳を指すことができる。
【０１０８】
上方制御は、ある試料（例えば、移植に適した試料）において、別のもの（例えば、対照試料）と比較してより高い発現（例えば、より高いｍＲＮＡレベル）を有することが観察された遺伝子を記載している。下方制御は、ある試料（例えば、移植に適した試料）において、別のもの（例えば、対照試料）と比較してより低い発現（例えば、より低いｍＲＮＡレベル）を有することが観察された遺伝子を記載している。
【０１０９】
一実施形態において、該遺伝子発現は、タンパク質レベルで測定される。試料中のタンパク質の量／レベルを測定するための方法の例としては、ウェスタンブロット、免疫ブロット、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫沈降法、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、化学発光、蛍光偏光法、リン光、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、抗体アレイ、顕微鏡測定（例えば、電子顕微鏡測定）、フローサイトメトリー、およびプロテオミクスに基づくアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
別の実施形態において、該遺伝子発現は、核酸（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）レベルで測定される。
【０１１１】
用語「核酸」は、当該技術分野で周知である。本明細書で用いられる「核酸」は、一般に、ヌクレオ塩基を含むＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくは類似体の分子（即ち、ストランド）を指す。ヌクレオ塩基としては、例えばＤＮＡ中で見出される天然由来プリンまたはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミジン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」またはＣ）が挙げられる。用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「核酸分子」は、本明細書では互換的に用いられる。
【０１１２】
数多くの検出および定量技術が、非限定的にＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＲＴ−ｑＰＣＲ；ＮＡＳＢＡ；ノーザンブロット技術；ハイブリダイゼーションアレイ；分枝状核酸増幅／技術；ＴＭＡ；ＬＣＲ；ＲＮＡ−ｓｅｑ、インサイチュハイブリダイゼーション技術などのハイスループットシーケンシングまたは次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法；および増幅工程と、それに続くＨＰＬＣ検出またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析など、複数の核酸の発現レベルを計測するために用いられてもよい。
【０１１３】
本発明の実施形態において、核酸の全てまたは一部が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその変形法、例えば非限定的に、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、およびリアルタイムＰＣＲ（試料中の各配列のためのｍＲＮＡコピーの初期量を測定する手段として）などの方法により増幅および検出されてもよい。そのような方法は、核酸の一部に相補的な１つまたは２つのプライマーを用いており、該プライマーは、核酸合成をプライミングするために用いられる。新規に合成された核酸は、場合により標識されて、直接、または本発明のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより検出されてもよい。新規に合成された核酸は、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でポリヌクレオチド（配列を含有する）と接触させてもよい。発現された核酸の発現を検出するための追加の方法としては、液相ハイブリダイゼーションなどのＲＮＡｓｅ保護アッセイ、および細胞のインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０１１４】
当業者に理解されるであろうが、核酸の発現の検出は、これらの核酸の任意の適当な部分もしくは断片、または核酸全体の発現の検出により実施されてもよい。好ましくは該部分は、試料中で発現される他の配列に対比して独特の配列を含有するのに充分大きい。その上、核酸のいずれかのストランドが核酸の発現の指示物質として検出され得ることを、当業者は認識するであろう。これは、該核酸が細胞内でＲＮＡ分子として発現されるが、操作および検出の容易さからｃＤＮＡ分子に変換される場合があるためである。得られたｃＤＮＡ分子は、発現されたＲＮＡの配列と、その相補鎖の配列を有していてもよい。したがってＲＮＡ配列鎖または相補鎖のいずれかが、検出されてもよい。もちろん、ｃＤＮＡへ変換せずに発現されたＲＮＡを検出することも可能である。
【０１１５】
一実施形態において、該方法は、試料中に存在するｍＲＮＡ分子の逆転写を実施すること；ならびにｃＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて目的のｃＤＮＡおよび１種または複数の対照ｃＤＮＡを増幅すること、を含む。
【０１１６】
ＲＮＡ存在量を測定するために用いられる一般的技術は、逆転写（ＲＴ）の後にリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行うＲＴ−ｑＰＣＲである。定量ＰＣＲのための市販されるシステム、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）の「Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ」、ＲｏｃｈｅのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）のｉＣｙｃｌｅｒ（登録商標）その他が、用いられてもよい。逆転写は最初、ＲＮＡからＤＮＡ鋳型を作製する。この一本鎖鋳型は、ｃＤＮＡと呼ばれる。該ｃＤＮＡ鋳型はその後、定量ステップで増幅され、その際、ＤＮＡ増幅工程が進行すると、標識ハイブリダイゼーションプローブが発した蛍光またはインターカレーティング色素が変化する。定量ＰＣＲは、本来のＲＮＡのコピーの増加または減少の尺度を生成し、同等な健常組織に比較した癌組織での遺伝子発現の変化を定義するための試みに用いられてきた（Ｎｏｌａｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １：１５５９−１５８２，２００６；Ｐａｉｋ  Ｓ．Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １２：６３１−６３５，２００７；Ｃｏｓｔａ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：８７−９１，２０１３）。
【０１１７】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術により可能になった大規模並列シーケンシングは、組織試料中のＲＮＡ転写産物の一覧に近づく別の方法であり、ＲＮＡ−ｓｅｑは、これを用いる方法である。それは、異なる生理学的条件の間の遺伝子発現レベルの差、または発達の間もしくは疾患進行の途中で生じる変化をはじめとする、トランスクリプトーム分析に用いられる現在最も強力な分析ツールである。具体的には、ＲＮＡ−ｓｅｑは、遺伝子融合事象、新規転写産物、およびＲＮＡ編集をはじめとする遺伝子発現の変化、選択的スプライシングの事象、対立遺伝子特異性遺伝子発現、およびキメラ転写産物などの現象を試験するために用いることができる。
【０１１８】
本明細書で用いられる用語「増幅」または「増幅する」は、標的核酸、例えば表１〜１１に列挙された遺伝子をコピーし、それにより選択された核酸配列のコピー数を増加させるための当該技術分野で公知の１つまたは複数の方法を意味する。増幅は、指数関数的または直線的であってもよい。詳細な実施形態において、該標的核酸は、ＲＮＡである。
【０１１９】
本明細書で用いられる「核酸」は、広義では染色体の区分、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／またはＲＮＡの区分または一部を指す。核酸は、元々、任意の供給源から単離された（例えば、試料のＤＮＡまたはＲＮＡからの単離、精製、増幅、クローニングまたは逆転写された）核酸試料に由来しても、またはそれから得られてもよい。
【０１２０】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせで構成された短いポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、一般には約１０〜約１００の間のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、典型的には１５〜７０ヌクレオチド長であり、２０〜２６ヌクレオチドが最も一般的である。オリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして用いられてもよい。オリゴヌクレオチドおよび核酸がアライメントされた時に、該オリゴヌクレオチドが、該核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有する場合、該オリゴヌクレオチドは、該核酸に「特異性がある」。核酸に特異性があるオリゴヌクレオチドは、適当なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で該当する標的とハイブリダイズが可能で、該当しない核酸と実質的にハイブリダイズが可能でないものである。高レベルの配列同一性が好ましく、それには少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性が包含される。
【０１２１】
核酸に関連して本明細書で用いられる「断片」は、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約７ヌクレオチド、少なくとも約９ヌクレオチド、少なくとも約１１ヌクレオチド、または少なくとも約１７ヌクレオチドを有する（ｈａｒｅ）ヌクレオチド残基の配列を指す。断片は、典型的には約３００ヌクレオチド未満、約１００ヌクレオチド未満、約７５ヌクレオチド未満、約５０ヌクレオチド未満、または約３０ヌクレオチド未満である。特定の実施形態において、該断片は、同一または関連のＤＮＡ分子を同定または増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または様々なハイブリダイゼーション手順で用いられ得る。
【０１２２】
本明細書で用いられる、増幅のための「プライマー」は、標的またはマーカーヌクレオチド配列に特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドである。プライマーの３’ヌクレオチドは、ポリメラーゼによる最適なプライマー伸長のために対応するヌクレオチド位置にある標的またはマーカー配列と同一でなければならない。本明細書で用いられる「フォワードプライマー」は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のアンチセンス鎖にアニーリングするプライマーである。「リバースプライマー」は、ｄｓＤＮＡのセンス鎖にアニーリングする。
【０１２３】
本明細書で用いられる「標的核酸」は、染色体の区分、遺伝子間配列を有する、もしくは有さない完全な遺伝子、遺伝子間配列を有する、もしくは有さない遺伝子の区分もしくは部分、またはプローブもしくはプライマーが設計された核酸の配列を指す。標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡに由来してもよい。本明細書で用いられる標的核酸は、ネイティブＤＮＡまたはＰＣＲ増幅産物であってもよい。
【０１２４】
先に記載された検出方法は、本発明が実践され得る方法を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するためのものではない。対象試料中の核酸の存在を検出するための他の配列に基づく方法論を、本発明により用い得ることが企図される。
【０１２５】
遺伝子発現を計測するためのキット
幾つかの態様によれば、該キット、パネル、またはマイクロアレイは、細胞集団を含む組成物が必要とする対象への移植に適するか否かを決定するためのものである。幾つかの実施形態において、複数のリガンドを含むキット、パネル、またはマイクロアレイが提供され、各リガンドは、表１〜１１に列挙された遺伝子から選択される単一遺伝子と特異的に複合体形成すること、結合すること、ハイブリダイズすること、または該単一遺伝子を定量的に検出もしくは同定することが可能である。幾つかの実施形態において、該複数のリガンドは、独立して、表１〜１１に列挙された遺伝子から選択される複数の遺伝子を検出または同定することが可能である。幾つかの実施形態において、該複数のリガンドは、独立して、表１〜１１から選択される表に列挙された遺伝子から選択される複数の遺伝子を検出または同定することが可能である。本明細書に記載された複数の遺伝子は、少なくとも１つの他のマーカー、例えば他の公知の遺伝子を特色とする任意の部分的組み合わせおよび／または組み合わせを場合により包含する。幾つかの実施形態において、該複数の遺伝子は、表１から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表２から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表３から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表４から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表５から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表６から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表７から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表８から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表９から選択される１つもしくは複数の遺伝子、表１０から選択される１つもしくは複数の遺伝子、および／または表１１から選択される１つもしくは複数の遺伝子、あるいはそれらの組み合わせから選択される。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、該キット、パネルまたはマイクロアレイは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００の異なるリガンドを含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。幾つかの実施形態において、該キット、パネルまたはマイクロアレイは、多くとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０または１０００の異なるリガンドを含む。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【０１２７】
用語「マイクロアレイ」は、基質上のハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチドプローブの規則正しい配列を指す。
【０１２８】
特定の実施形態において、１つまたは複数のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムが、試験試料中の各遺伝子の定量された発現レベルを所定のカットオフと（または複数の所定のカットオフと）比較するために用いられてもよい。あるいは、必要なステップをヒトにより用手法で実施するための１つまたは複数の使用説明書を、提供することができる。パターン分析を決定および比較するためのアルゴリズムとしては、主成分分析、フィッシャー線形分析、ニューラルネットワークアルゴリズム、遺伝子アルゴリズム、ファジー論理パターン認識などが挙げられるが、これらに限定されない。分析が完了した後、得られた情報を、例えば次の検索のために、ディスプレーに表示すること、ホストコンピューターに伝送すること、または保存デバイスに保存することができる。
【０１２９】
異種細胞集団
幾つかの実施形態によれば、本発明の細胞集団は、異種細胞集団である。
【０１３０】
本明細書で用いられる用語「細胞集団」は、類似の、または異なる表現型を発現する少なくとも２つの細胞の群を指す。非限定的例として、細胞集団は、類似の、または異なる表現型を発現する少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００の細胞を含み得る。本明細書で用いられる用語「異種細胞集団」は、細胞の少なくとも一部が異なる表現型を発現する少なくとも２つの細胞の群を指す。
【０１３１】
本明細書で用いられる用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、複数の間葉系系列の分化細胞を、具体的には骨芽細胞、脂肪細胞、筋芽細胞および軟骨芽細胞を生じることが可能な細胞を指す。一般には間葉系幹細胞はまた、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：非同時性または対称的な複製を受ける能力、即ち分裂後の２つの娘細胞が異なる表現型を有し得る能力；大規模な自己再生能力；および該幹細胞が存在する組織、例えば骨髄の非造血細胞のクローン再生。「前駆細胞」は、典型的には大規模な自己再生能力を有さない点が幹細胞と異なる。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、該細胞集団は、異種細胞集団である。幾つかの実施形態において、該異種細胞集団は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の、本明細書に記載された前記発現プロファイルを有する細胞を含む。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、該異種細胞集団は、間葉系幹細胞、骨前駆細胞および骨形成細胞からなる群から選択される２つ以上の細胞型を含む。幾つかの実施形態において、該異種細胞集団の細胞の３０〜７０％は、骨前駆細胞である。幾つかの実施形態において、該異種細胞集団の細胞の４０〜６０％は、骨前駆細胞である。幾つかの実施形態において、該異種細胞集団の細胞の５０〜６０％は、骨前駆細胞である。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、該異種細胞集団は、骨形成誘導に供された細胞に由来する。
【０１３５】
用語「骨形成の」または「骨形成」は、未分化の間葉系幹細胞および骨芽細胞系列の細胞からの骨細胞の増殖および骨組織の生育（即ち、新しい骨基質の合成および堆積）を指す。骨形成はまた、骨細胞（即ち、骨芽細胞）への前駆体または前駆細胞の分化または分化転換を指す。前駆体または前駆細胞は、例えば間葉系幹細胞をはじめとする、多能性幹細胞であり得る。前駆体または前駆細胞は、骨芽細胞系列にプレコミットされた細胞（例えば、前骨芽細胞）、または骨芽細胞系列にプレコミットされていない細胞（例えば、前脂肪細胞または筋芽細胞）であり得る。
【０１３６】
本明細書で用いられる用語「分化」は、原始的段階から、細胞表面抗原マーカーの特徴的組み合わせの発現に関連する成熟形態への、細胞の発達を指す。分化は、細胞が特定の表現型を引き受ける、例えば他の細胞型と異なる１つまたは複数の特徴または機能を獲得する、発達工程である。幾つかの例において、該分化された表現型は、幾つかの発達経路における成熟のエンドポイントにある細胞表現型（「高分化型細胞」）を指す。
【０１３７】
用語「骨形成誘導」は、骨形成系細胞分化の上方制御または刺激を指す。
【０１３８】
一実施形態において、該異種細胞集団は、少なくとも２４時間の骨形成プライミング期間を受けた細胞に由来する。別の実施形態において、該異種細胞集団は、少なくとも４８時間の骨形成プライミング期間を受けた細胞に由来する。別の実施形態において、該異種細胞集団は、少なくとも７２時間の骨形成プライミング期間を受けた細胞に由来する。別の実施形態において、該異種細胞集団は、少なくとも９６時間の骨形成プライミング期間を受けた細胞に由来する。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、細胞の骨形成系細胞分化の誘導は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７からなる群から選択される１つまたは複数の骨形成誘導因子により実現される。
【０１４０】
幾つかの実施形態において、該細胞を１つまたは複数の骨形成誘導因子の少なくとも２５ナノグラム／ミリリットルで処理して、異種細胞集団を得る。別の実施形態において、該細胞を１つまたは複数の骨形成誘導因子の少なくとも５０ナノグラム／ミリリットルで処理して、異種細胞集団を得る。別の実施形態において、該細胞を１つまたは複数の骨形成誘導因子の少なくとも７５ナノグラム／ミリリットルで処理して、異種細胞集団を得る。別の実施形態において、該細胞を１つまたは複数の骨形成誘導因子の少なくとも１００ナノグラム／ミリリットルで処理して、異種細胞集団を得る。別の実施形態において、該細胞を１つまたは複数の骨形成誘導因子の少なくとも１５０ナノグラム／ミリリットルで処理して、異種細胞集団を得る。
【０１４１】
非限定的例として、該異種細胞集団は、好ましい濃度の以下の分子：デキサメタゾン（１０〜２００ｎＭ）、ベータグリセロリン酸ナトリウム（５〜２５ｍＭ）、１，２５ジヒドロキシコレカルシフェロール（カルシトリオール：１〜５０ｎＭ）、Ｌ−アスコルビン酸−２−ホスファート（０．０５〜５００ｍＭ）および骨形成誘導因子（１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）、の１種または複数で構成された骨形成培養分化培地を含む骨形成培養分化条件に細胞を供することに由来する。
【０１４２】
別の実施形態において、該細胞を１つまたは複数の骨形成誘導因子の１５０ナノグラム／ミリリットルで４８時間処理して、異種細胞集団を得る。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、該細胞は、幹細胞に由来する。幾つかの実施形態において、該幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。幾つかの実施形態において、該ＭＳＣは、自家ＭＳＣである。幾つかの実施形態において、該ＭＳＣは、同種ＭＳＣである。幾つかの実施形態において、該自家ＭＳＣは、自家ヒト脂肪組織に由来し、ヒト脂肪組織由来細胞（ＨＡＴＤＣ）と称される。別の実施形態において、ヒト脂肪組織由来細胞（ＨＡＴＤＣ）は、脂肪吸引手順により脂肪組織から得られた細胞である。
【０１４４】
本明細書で用いられる用語「ヒト脂肪組織由来細胞（ＨＡＴＤＣ）」は、多くの異なる細胞治療のための代わりの細胞供給源として用いられ得る脂肪組織の血管間質コンパートメントから発生した細胞の異種集団を指す。本明細書で用いられるＨＡＴＤＣは、骨前駆体、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞および破骨細胞、ならびに内皮前駆細胞（ＥＰＣ）（ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ１４４＋ＣＤ１４６＋ＣＤ１０２）、造血前駆細胞（ＨＰＣ−ＣＤ３４＋）および成熟ＥＣ（ＣＤ３１＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ９０−ＣＤ１４４＋ＣＤ１４６＋ＣＤ１０５＋）の任意の組み合わせの中に、複数の脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）（ＣＤ３４−ＣＤ４５−ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１９、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１０５＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋）、間葉系細胞、間葉系幹細胞、血管平滑筋細胞（平滑筋アルファアクチン陽性、デスミン陽性、ｈ−カルデスモン陽性、平滑筋ミオシン、重鎖陽性）、脂肪生成、軟骨形成、および骨形成細胞を含む、細胞の異種集団を含む。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、該細胞は、骨形成誘導の前に三次元（３Ｄ）培養で育成される。幾つかの実施形態において、該細胞は、ミネラルスキャフォールド上での３Ｄ培養で育成される。幾つかの実施形態において、該細胞は、バイオリアクターまたは力学的生育システムでの３Ｄ培養で育成される。別の実施形態において、本発明の細胞は、５％ＣＯ２を含む加湿条件下の組織培養インキュベータ中、３７℃で維持および生育される。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、該異種細胞集団を含む組成物が、必要とする患者に移植される。幾つかの実施形態において、エクスビボに由来した移植組成物の異種細胞集団の細胞が、移植部位（例えば、骨）で利用可能なインビボ骨形成誘導因子に暴露される。幾つかの実施形態において、該異種細胞集団の細胞は、インビボで成熟骨芽細胞にさらに分化される。
【０１４７】
本明細書で用いられる用語「エクスビボ」は、細胞を生存する生物体から取り出して該生物体の体外で繁殖する工程を指す。本明細書で用いられる用語「インビボ」は、生存する生物体の体内で行われる任意の工程を指す。
【０１４８】
別の実施形態において、本発明は、取り付けられた３Ｄ細胞培養物を含む鉱物粒子と、提供された該３Ｄ細胞培養物から本発明の異種細胞集団を作製するための使用説明書と、を含むキットを提供する。別の実施形態において、該３Ｄ細胞培養物は、ＨＡＴＤＣを含む。別の実施形態において、該使用説明書は、本発明の組成物を得るために、ミネラルスキャフォールド上で３Ｄ培養物で育成されたＨＡＴＤＣの骨形成誘導のための推奨される条件を含む。別の実施形態において、該キットは、少なくとも１種の骨形成誘導因子および／または骨形成培養分化培地をさらに提供する。
【０１４９】
多層細胞培養物
幾つかの実施形態において、多層細胞培養物は、少なくとも２種の細胞型で構成された異種細胞培養物である。別の実施形態において、多層細胞培養物は、少なくとも３種の細胞型で構成された異種細胞培養物である。別の実施形態において、多層細胞培養物は、少なくとも４種の細胞型で構成された異種細胞培養物である。別の実施形態において、多層細胞培養物は、骨形成プライミング期間に続く４８時間のヒト脂肪組織由来細胞（ＨＡＴＤＣ）を含む。
【０１５０】
別の実施形態において、多層細胞培養物は、下層の細胞と上層の細胞とを含む。別の実施形態において、多層細胞培養物は、下層の細胞と、中層の細胞と、上層の細胞とを含む。別の実施形態において、多層細胞培養物は、３Ｄ（三次元）細胞培養物である（２Ｄ（二次元）細胞培養物と呼ばれる単層の細胞とは異なる）。別の実施形態において、３Ｄ細胞培養物は、細胞と、細胞外マトリックスと、からなる。別の実施形態において、３Ｄ細胞培養物は、本明細書に記載された鉱物粒子の表面で生育される。別の実施形態において、３Ｄ細胞培養物は、生体物質からなる。別の実施形態において、２細胞層以上の３Ｄ細胞培養物が、鉱物粒子に付着されている。別の実施形態において、２細胞層以上の３Ｄ細胞培養物が、鉱物粒子に操作可能に付着されている。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物は、少なくとも二層の細胞を含み、一層中の細胞の少なくとも１０％は、別の層の細胞の少なくとも１０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物は、少なくとも３層の細胞を含む。
【０１５２】
幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の１層中の細胞の少なくとも１０％は、同じ多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の別の層の細胞の少なくとも１０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の１層中の細胞の少なくとも２０％は、同じ多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の別の層の細胞の少なくとも２０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の１層中の細胞の少なくとも３０％は、同じ多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の別の層の細胞の少なくとも３０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の１層中の細胞の少なくとも４０％は、同じ多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の別の層の細胞の少なくとも４０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の１層中の細胞の少なくとも５０％は、同じ多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の別の層の細胞の少なくとも５０％と接触している。幾つかの実施形態において、多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の１層中の細胞の少なくとも６０％は、同じ多層細胞培養物または３Ｄ細胞培養物中の別の層の細胞の少なくとも６０％と接触している。別の実施形態において、熟語「接触している」は、物理的接触状態にある。別の実施形態において、熟語「接触している」は、細胞−細胞相互作用の状態にある。
【０１５３】
別の実施形態において、熟語「３Ｄ細胞培養物」または「３Ｄ培養物」は、細胞を細胞生育に適合性があり、細胞を１層より多く生育させる条件に配置する培養物を指す。別の実施形態において、３Ｄ細胞培養物中の細胞は、様々な局所微細環境の確立を可能にする細胞外マトリックスナノスケール線維の複雑なネットワークに保持されている。別の実施形態において、該ＥＣＭ中の細胞外リガンドは、基底膜への付着のみならず、種々の血管およびリンパ管へのアクセスも媒介する。別の実施形態において、３Ｄ細胞培養物中の細胞は、酸素、ホルモンおよび栄養素に暴露される。別の実施形態において、３Ｄ細胞培養物は、細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ相互作用を特徴とする。
【０１５４】
スキャフォールド
別の実施形態において、該組成物は、骨伝導性粒子をさらに含む。本明細書で用いられる「骨伝導性」は、適当な鋳型として働く物質、または骨を生育させ得る物質の能力を指す。非限定的例として、該骨伝導性粒子の１つまたは複数の型は、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、脱灰骨材料、粉砕骨移植片、皮質海綿状同種移植片、皮質海綿状自家移植片、皮質海綿状異種移植片、リン酸三カルシウム、ウミヒバ鉱物および硫酸カルシウムからなる群から選択される骨伝導性セラミック粒子である。
【０１５５】
別の実施形態において、該組成物は、鉱物粒子をさらに含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、３Ｄ細胞培養物を担うスキャフォールドである。別の実施形態において、鉱物粒子は、生体適合性である。別の実施形態において、細胞は、鉱物粒子に付着してもよい。別の実施形態において、該鉱物粒子は、付着された細胞の増複を容易にする。別の実施形態において、鉱物粒子は、粉砕組成物の形態である。別の実施形態において、鉱物粒子は、微粉砕組成物の形態である。別の実施形態において、鉱物粒子は、縁部と、より多くの細胞付着部位を提供する溝と、を含む。本明細書で用いられる「増複」または「増複すること」は、細胞分化が実質的に欠如した細胞増殖の工程を指す。したがって増複を受けた細胞は、細胞再生特性、即ち細胞集団の増加を維持し（例えば、少なくとも２倍）、そのような増加に伴う分化を行わない。
【０１５６】
別の実施形態において、鉱物粒子は、骨線維である。別の実施形態において、本発明の骨線維は、増強された細胞結合表面を有する。別の実施形態において、本発明の骨線維は、
骨組織に由来する。別の実施形態において、骨組織は、骨組織の長さに沿って、またはきめの方向に沿って切断されて、骨線維を形成する。
【０１５７】
別の実施形態において、鉱物粒子は、３Ｄ細胞培養物を担う骨のスキャフォールドである。別の実施形態において、鉱物粒子は、骨鉱物粒子である。別の実施形態において、鉱物粒子は、摩砕された鉱物化皮質骨である。別の実施形態において、鉱物粒子は、摩砕された鉱物化海綿骨である。別の実施形態において、鉱物粒子は、鉱物化海綿粒子である。別の実施形態において、鉱物粒子は、鉱物化皮質粒子である。別の実施形態において、鉱物粒子は、サンゴの鉱物粒子である。別の実施形態において、鉱物粒子は、鉱物からなる。別の実施形態において、鉱物粒子は、リン酸カルシウムを含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、リン酸カルシウム誘導体を含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、硫酸カルシウムを含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、硫酸カルシウム誘導体を含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、カルシウムヒドロキシアパタイトを含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、ケイ酸塩を含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、硫酸カルシウム誘導体を含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、ケイ酸塩鉱物ヒドロキシアパタイトを含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、ベータ３リン酸カルシウムを含む。別の実施形態において、鉱物粒子は、当業者に公知の鉱物の任意の組み合わせを含む。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、該スキャフォールドは、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノーゲンおよびコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質をさらに含む。幾つかの実施形態において、該鉱物粒子は、細胞外マトリックスタンパク質にコーティングされている。
【０１５９】
別の実施形態において、鉱物粒子は、少なくとも５０ミクロンの径を有する。別の実施形態において、鉱物粒子は、少なくとも１００ミクロンの径を有する。別の実施形態において、鉱物粒子は、５０ミクロン〜２０００ミクロンの範囲内の径を有する。別の実施形態において、鉱物粒子は、１００ミクロン〜１０００ミクロンの範囲内の径を有する。別の実施形態において、鉱物粒子は、２００ミクロン〜２０００ミクロンの範囲内の径を有する。幾つかの実施形態において、該鉱物粒子は、１センチメートル〜１５センチメートル（ｃｍ）長のサイズを有する。幾つかの実施形態において、該鉱物粒子は、５ｃｍ〜１５センチメートル（ｃｍ）長のサイズを有する。幾つかの実施形態において、該鉱物粒子は、最大１５センチメートル長のサイズを有する。
【０１６０】
別の実施形態において、鉱物粒子に付着された３Ｄ細胞培養物は、骨形成系細胞分化の誘導前の５日間に、細胞培地で生育および／または維持される。別の実施形態において、鉱物粒子に付着された３Ｄ細胞培養物は、骨形成系細胞分化の誘導前の４〜６日間に、細胞培地で生育および／または維持される。別の実施形態において、鉱物粒子に付着された３Ｄ細胞培養物は、骨形成系細胞分化の誘導前の２〜２１日間、あるいは４〜２１日間、あるいは２〜１６日間、あるいは３〜１６日間、あるいは４〜１６日間、あるいは１〜１０日間、あるいは２〜１０日間、あるいは３〜１０日間、あるいは４〜１０日間、あるいは１〜６日間、あるいは２〜６日間、あるいは３〜５日間、あるいは３〜６日間、あるいは４〜６日間、細胞培地で生育および／または維持される。
【０１６１】
細胞の播種
組織から遊走した細胞の播種
幾つかの実施形態において、細胞の播種は、鉱物粒子への細胞の遊走および付着を可能にする所定の期間に、鉱物粒子に対する組織の特異的比率で脂肪組織と鉱物粒子との接触を維持することにより実行される。幾つかの実施形態において、該脂肪組織は、無傷のままであるか、あるいは機械的に解離される（例えば、小さな組織断片に細断される）。
【０１６２】
幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、脂肪組織からスキャフォールド上へのＨＡＴＤＣの遊走および該スキャフォールドの表面での密集を容易にするために必要となる期間、接触を維持される。幾つかの実施形態において、接触での少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、または少なくとも１０日間のインキュベーションが、ＨＡＴＤＣの遊走およびミネラルスキャフォールドの表面での密集を容易にするのに必要となる。幾つかの実施形態において、該播種期間は、少なくとも３日間である。別の実施形態において、該播種期間は、少なくとも４日間である。別の実施形態において、該播種期間は、少なくとも５日間である。別の実施形態において、該播種期間は、少なくとも６日間である。別の実施形態において、該播種期間は、少なくとも７日間である。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、３〜７日間、接触を維持される。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、３〜１０日間、接触を維持される。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、５〜１０日間、接触を維持される。
【０１６３】
幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、１ミリグラムスキャフォールドあたり１マイクロリットル組織の比率を有し、それは本明細書では以後、１：１の比率と称する。幾つかの実施形態において、該比率は、それぞれ１０：１〜１：１０、９：１〜１：９、８：１〜１：８、７：１〜１：７、６：１〜１：６、ｅ５ｅ５、４：１〜１：４、３：１〜１：３、または２：１〜１：２の範囲内である。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、それぞれ３：１〜１：２の範囲内の比率を有する。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、それぞれ２：１〜１：４の範囲内の比率を有する。幾つかの実施形態において、該比率は、それぞれ２：１〜１：３、２：１〜１：２、３：１〜１：４、１：１〜１：４、１：１〜１：２または２：１〜１：１の範囲内である。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。幾つかの実施形態において、該脂肪組織とスキャフォールドの間の比率は、１：１である。非限定的例としては、１ミリリットルの脂肪組織を、１グラムのミネラルスキャフォールドと接触させる。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、該脂肪組織と該スキャフォールドの接触を実現するために、該脂肪組織および該スキャフォールドは最初、培地（例えば、ゼノフリー培地）の存在下で混合される。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドは、培地と酸素に暴露しながら、接触状態で配置させる。幾つかの実施形態において、該脂肪組織および該スキャフォールドの接触により、該脂肪組織の少なくとも一部とスキャフォールドの少なくとも一部との物理的接触が可能になる。非限定的例として、接触は、容器、バイオリアクター、プレート内で実施されてもよい。幾つかの実施形態において、鉱物粒子と接触した脂肪組織との合わせた厚さが、部分的に培地で覆われている。非限定的例として、１〜２ミリメートルの合わせた厚さが、１〜２ミリメートルの培地レベルで維持される。幾つかの実施形態において、該培地は、ゼノフリー生育培地である。本明細書で用いられる「ゼノフリー」は、培養された細胞以外の種の任意の細胞または細胞生成物を含まない細胞培養条件を意味する。他の実施形態において、該培地は、血清が補充されている。血清の非限定的例としては、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ヒトＡＢ血清、および自家血清または血小板溶解物が挙げられる。
【０１６５】
最初に組織から得られた細胞の播種
他の実施形態において、細胞の播種が、鉱物粒子への細胞の付着を可能にする所定の期間、鉱物粒子に対する細胞の特異的比率で鉱物粒子の存在下、細胞の特異的濃度を維持することにより実行される。
【０１６６】
幾つかの実施形態において、該付着期間は、少なくとも１時間である。別の実施形態において、該付着期間は、少なくとも２時間である。別の実施形態において、該付着期間は、少なくとも３時間である。別の実施形態において、該付着期間は、少なくとも４時間である。別の実施形態において、該付着期間は、少なくとも５時間である。別の実施形態において、該播種期間は、少なくとも１０時間である。別の実施形態において、該播種期間は、最大７日間である。
【０１６７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１×１０２個の細胞が、鉱物粒子１ミリグラム（ｍｇ）あたりに播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１×１０３個の細胞が、鉱物粒子１ｍｇあたりに播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１×１０２〜１×１０６個の細胞が、鉱物粒子１ｍｇあたりに播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも１×１０２〜１×１０４個の細胞が、鉱物粒子１ｍｇあたりに播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも５×１０２〜５×１０４個の細胞が、鉱物粒子１ｍｇあたりに播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された少なくとも３．５×１０３個の細胞が、鉱物粒子１ｍｇあたりに播種される。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された細胞は、培地１ミリリットルあたり少なくとも１×１０３細胞の濃度で播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された細胞は、培地１ミリリットルあたり少なくとも１０×１０３細胞の濃度で播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された細胞は、培地１ミリリットルあたり少なくとも５０×１０３細胞の濃度で播種される。別の実施形態において、本明細書に記載された細胞は、培地１ミリリットルあたり少なくとも１００×１０３細胞の濃度で播種される。幾つかの実施形態において、該培地は、ゼノフリー生育培地である。他の実施形態において、該培地は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ヒトＡＢ血清、および自家血清などの血清または血小板溶解物が補充される。
【０１６９】
生体成分
別の実施形態において、本発明は、該組成物がアルブミンをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質をさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がフィブリンをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がフィブロネクチンをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がコラーゲンＩ型をさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がラミニンをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がビトロネクチンをさらに含むことを提供する。
【０１７０】
別の実施形態において、本発明は、該組成物が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がインスリン様成長因子をさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がインターロイキン−１、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＲＡＮＫＬ、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、組成物は、培地を含有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）中に懸濁された自家多細胞３Ｄ細胞培養物を含む。別の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、抗炎症剤をさらに含む。別の実施形態において、本明細書に記載された組成物は、抗生物質をさらに含む。
【０１７１】
別の実施形態において、本発明は、該組成物が生体適合性結合剤をさらに含むことを提供する。別の実施形態において、該生体適合性結合剤は、フィブリン接着剤、フィブリノーゲン、トロンビン、イガイ接着タンパク質、シルク、エラスチン、コラーゲン、カゼイン、ゼラチン、アルブミン、ケラチン、キチンおよびキトサンからなる群から選択される１種または複数である。別の実施形態において、該生体適合性結合剤は、デンプン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリカルボナート、ポリオキソエステル、ポリアミノ酸、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシブチラート、ポリヒドロキシバレラート、ポリ（プロピレングリコール−ｃｏ−フマル酸）、チロシンに基づくポリカルボナート、ポリビニルピロリドン、セルロース、エチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される１種または複数である。
【０１７２】
別の実施形態において、本発明は、該組成物がビタミンをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がグルコサミンをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物がサイトカインをさらに含むことを提供する。別の実施形態において、本発明は、該組成物が成長因子をさらに含むことを提供する。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明は、該組成物がヒアルロン酸をさらに含むことを提供する。別の実施形態において、用語「ヒアルロン酸（ＨＡ）」は、ヒアルロナンまたはヒアルロン酸ナトリウムと同義である。別の実施形態において、ヒアルロン酸は、生理学的緩衝剤を含む組成物中に存在する。別の実施形態において、ヒアルロン酸は、２００，０００〜８５０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０１７４】
別の実施形態において、ヒアルロン酸は、鉱物粒子に堆積または付着された異種細胞集団を懸濁させるための組成物である。別の実施形態において、ヒアルロン酸は、溶液（緩衝剤を含む）１ｍＬあたりヒアルロン酸０．５ｍｇ〜５０ｍｇを含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、溶液（緩衝剤を含む）１ｍＬあたりヒアルロン酸０．５ｍｇ〜５ｍｇを含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、溶液（緩衝剤を含む）１ｍＬあたりヒアルロン酸５ｍｇ〜２０ｍｇを含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、溶液（緩衝剤を含む）１ｍＬあたりヒアルロン酸１０ｍｇ〜３０ｍｇを含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、溶液（緩衝剤を含む）１ｍＬあたりヒアルロン酸１０ｍｇ〜２５ｍｇを含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、０．０５〜５重量％のヒアルロン酸を含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、０．１〜１重量％のヒアルロン酸を含む組成物である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、０．１〜０．５重量％のヒアルロン酸を含む組成物である。
【０１７５】
別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、溶液である。別の実施形態において、鉱物粒子に堆積または付着された細胞を懸濁させるためのヒアルロン酸組成物は、ゲルである。
【０１７６】
骨修復組成物を作製する工程
本発明の組成物は、複数の代替的工程により製造されてもよい。幾つかの実施形態において、該工程は、該細胞を３Ｄ培養で培養することを含む。幾つかの実施形態において、該工程は、該細胞を３Ｄ培養で培養する前に、２Ｄ培養で培養することを含む。
【０１７７】
幾つかの実施形態において、細胞は最初、組織試料から単離される。幾つかの実施形態において、単離は、血漿の除去、遠心分離および／またはコラーゲナーゼインキュベーションを含む。他の実施形態において、細胞は、組織からスキャフォールドに直接遊走する。幾つかの実施形態において、該組織は、脂肪組織である。幾つかの実施形態において、該細胞は、幹細胞である。幾つかの実施形態において、該幹細胞は、ヒト脂肪組織由来細胞である。
【０１７８】
幾つかの実施形態において、単離された細胞は最初、２Ｄ系（例えば、フラスコ）で育成および拡大される。次に、２Ｄ系で生育された細胞は、接着細胞の付着および生育を可能にする培地を用いて、鉱物粒子上で滅菌条件下、エクスビボで育成および増複される。幾つかの実施形態において、該培地は、ゼノフリー培地である。他の実施形態において、該培地は、血清が補充される。幾つかの実施形態において、これらの細胞の初期生育および拡大期を支援した培地は、場合によりこれらの細胞の分化および骨形成を支援する別の細胞培養形式で交換されてもよい。
【０１７９】
幾つかの実施形態において、組織およびスキャフォールドを接触させるが、該接触は、脂肪組織からスキャフォールド上への細胞遊走、および細胞の付着を容易にし、それにより細胞が密集したスキャフォールドを提供する。幾つかの実施形態において、該方法は、細胞の拡大を可能にするために、細胞が密集されたスキャフォールドを培養および増複するステップをさらに含む。幾つかの実施形態において、該方法は、赤血球などの他の細胞から脂肪組織を分離する予備的ステップを含む。本明細書で用いられる用語「予備的」は、組織およびスキャフォールドの接触の前に行われるステップを指す。幾つかの実施形態において、分離は、脂肪組織を生理食塩水（例えば、通常の生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、または細胞生育培地）などでの洗浄に供した後、遠心分離して、赤血球、細胞片などを含有するペレットをもたらすことにより利用される。幾つかの実施形態において、該方法は、スキャフォールドおよびそれに付着したＨＡＴＤＣから脂肪組織を分離するステップをさらに含む。幾つかの実施形態において、脂肪組織とＨＡＴＤＣが密集したスキャフォールドとの該接触は、混合してＨＡＴＤＣが密集した沈殿スキャフォールドをもたらし、脂肪組織を浮遊させることなどにより、脱離させてもよい。幾つかの実施形態において、分離は、脂肪組織を除去することにより実現される。幾つかの実施形態において、該浮遊する脂肪組織は、洗浄（例えば、培地で）により除去される。非限定的例として、分離は、液体を吸引すること（例えば、ピペッティングにより）、脂肪組織およびスキャフォールドを混合して（例えば、ボルテックス処理により）、ＨＡＴＤＣが密集した沈殿スキャフォールドと、容易に除去され得る浮遊する脂肪組織をもたらすこと、により実行されてもよい。
【０１８０】
別の実施形態において、該鉱物粒子に付着された３Ｄ異種細胞集団は、フロースルーバイオリアクターシステムに供された鉱物粒子に付着された３Ｄ細胞培養物に由来する。別の実施形態において、該鉱物粒子に付着された３Ｄ異種細胞集団は、該３Ｄ細胞培養物を骨形成系細胞分化にさらに供することに由来する。別の実施形態において、該３Ｄ細胞培養物は、骨形成系細胞分化に４８時間、あるいは少なくとも２４時間、、あるいは少なくとも４８時間、あるいは少なくとも７２時間、あるいは少なくとも９６時間、供される。
【０１８１】
別の実施形態において、該生育培地（細胞培地）は、成長因子およびサイトカイン、例えばトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦベータ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のメンバー、例えばＦＧＦ−２、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−１０など、ならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のメンバー、例えばＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７のうちの１つまたは複数などが補充される。
【０１８２】
別の実施形態において、該異種細胞集団の３Ｄ培養物に覆われた鉱物粒子は、必要とする対象に移植される。別の実施形態において、該異種細胞集団の３Ｄ培養物に覆われた鉱物粒子は、骨の欠損または空隙の所定部位に移植される。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明の移植可能な組成物は、シリンジで提供される。別の実施形態において、本明細書において、シリンジと、鉱物粒子に堆積または付着された本発明の３Ｄ異種細胞集団と、半固形培地（例えば、ヒアルロン酸）と、が提供される。別の実施形態において、本明細書で提供されるのは、シリンジと、半固形培地に懸濁された鉱物粒子に堆積または付着された３Ｄ異種細胞集団を含む懸濁液と、を含むキットである。
【０１８４】
別の実施形態において、骨の内部の空隙を充填するための医薬組成物が、半固形培地（例えば、ヒアルロン酸）と、本発明の鉱物粒子に付着された３Ｄ異種細胞集団と、を簡単に混合することにより生成される。別の実施形態において、骨の内部の空隙を充填するための医薬組成物は、半固形培地と、細胞培地に懸濁された鉱物粒子に堆積または付着された３Ｄ異種細胞集団を含む懸濁液と、を簡単に混合することにより生成される。
【０１８５】
別の実施形態において、骨の内部の空隙を充填するためのキットは、半固形培地の有効量を含有する第一の部分と、細胞培地に懸濁された鉱物粒子に堆積または付着された３Ｄ異種細胞集団を含む懸濁液の有効量を含有する第二の部分と、を含む。別の実施形態において、該キットは、注射用であり、第一および第二の部分は、溶液形態であり得、独立したパック（プラスチック瓶またはアンプルのようなガラス瓶など）に別個に入れられている。別の実施形態において、各パックは、第一または第二の部分の複数の投与量を含むことができるが、好ましくは単一投与量を含むことができる。別の実施形態において、注射前に該２つの部分は、該配合剤を適用するための使用説明書（キットの操作方法、溶液の混合比などの情報を含む）の情報に従って注射用シリンジに入れられる。別の実施形態において、注射の前に該２つの部分は、シリンジの内部または外部の混合手段に投入される。別の実施形態において、注射の前に該２つの部分は、シリンジの内部または外部の混合手段により混合される。
【０１８６】
半固形という用語は、非限定的例として室温で実質的に寸法が安定しているが、典型的には残留溶媒量により、特定の弾性および可撓性を有するなど、ゲル様の稠度を有する材料を指す。
【０１８７】
本発明の様々な実施形態の記載は、例示の目的で示されているが、開示された実施形態に網羅または限定する意図はない。多くの改変および変更が、記載された実施形態の範囲および主旨から逸脱することなく、当業者に明白となろう。本明細書で用いられる用語法は、実施形態の主旨、実践的適用、もしくは市場で見出される技術を超える技術的改善を最良に説明するため、または本明細書に開示された実施形態を当業者に理解させるために、選択されている。
【０１８８】
議論において、他に断りがなければ、本発明の実施形態の特色または複数の特色の条件または関連性の特徴を改変する「実質的に」および「約」などの形容詞は、該条件または特徴が意図する適用のための実施形態の操作に容認できる耐容誤差内で定義されることを意味するものと理解されたい。他に断りがなければ、本明細書および特許請求の範囲内の言語「または」は、排他的なまたはというよりむしろ包括的な「または」であると見なされ、連結する項目の少なくとも１つまたは任意の組み合わせを示す。
【０１８９】
本明細書の前述で、そして他の箇所で用いられた用語「ａ」および「ａｎ」は、挙げられた構成要素の「１つまたは複数」を指すものと理解されなければならない。単数形の使用が、他に具体的に断りがない限り複数を含むことは、当業者に明らかであろう。
【０１９０】
本発明の教示をよりよく理解し、教示の範囲を限定しないことを目的として、他に断りがなければ、本明細書および特許請求の範囲で用いられた量、百分率または割合を表す全ての数、および他の数値が、用語「約」により全ての例で改変されるものと理解されなければならない。したがって、反することが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に示された数字のパラメータは、得られるよう模索された所望の特性に応じて変動し得る近似値である。いずれにしても各数字パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、そして通常の丸め技術を適用することにより、見積もられなければならない。
【０１９１】
本出願の説明および特許請求の範囲において、動詞「含む」、「包含する」および「有する」のそれぞれ、ならびにそれらの組み合わせは、その動詞の目的または複数の目的が、必ずしもその動詞の対象または複数の対象の成分、要素または一部の完全な列挙でないことを示すために用いられている。本明細書で用いられる他の用語は当該技術分野でのそれらの周知の意味によって定義されることが意図される。
【０１９２】
明瞭にするために別の実施形態に関連して記載された本発明の特定の特色が、単一の実施形態において組み合わせて提供される場合もあることを理解されたい。反対に、簡潔にするために単一の実施形態に関連して記載された本発明の様々な特色が、別個に、または任意の適切な部分的組み合わせで、または本発明の任意の他の記載された実施形態に適するように、提供される場合もある。様々な実施形態に関連して記載された特定の特色が、該実施形態がそれらの要素を用いずに実施できない場合を除き、それらの実施形態の本質的特色と見なされるべきではない。
【０１９３】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特色が、限定を意図しない以下の実施例の検査の際に当業者に明白となろう。加えて、本明細書の先に描写された、そして以下の特許請求の範囲の節で請求された、本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれが、以下の実施例において実験的支援を見出す。
【０１９４】
実施例
一般に、本明細書で用いられる専門語および本発明で利用される検査手順は、分子、生化学、微生物および組換えＤＮＡの技術を包含する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示された方法論；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ―ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ―ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に詳細に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ���ｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）ａｎｄ“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい（それらの全てが、参照により組み入れられる）。他の一般的参照は、本文書全体で提供されている。
【０１９５】
材料と方法：
実験計画
細胞を４つの異なる条件下（処置群ＢＬ、Ａ、Ｂ、およびＣで表す）で育成させており、これらの異なる条件を表１３に要約する。各実験を３回繰り返した。
【０１９６】
群ＢＬは、最大４継代で維持された２Ｄ培養物を表し、この群の遺伝子の発現レベルを、遺伝子発現のベースラインレベルとして用いた。ＨＡＴＤＣを、２〜４継代の間、ゼノフリー培地により２Ｄ系で培養した。ＢＭＰ２は、培地に補充されなかった。本明細書で用いられる用語「継代」は、組織培養容器内でコンフルエンスに達した、またはコンフルエンスに近い、培養で生育している細胞を、容器から取り出し、新鮮な培地で希釈して（即ち、１：５希釈）、新しい組織培養容器に入れて、連続での生育および生存性を可能にする細胞培養技術を指す。
【０１９７】
群Ａ．  ＨＡＴＤＣをゼノフリー培地により２Ｄ系で培養した。１〜３継代に続いて、細胞を２Ｄ系に再度播種し、播種（０日目）の１〜２日後、培地に１種または複数の骨形成誘導因子を補充し、細胞をさらに２日間培養した（２日目、群Ａ）。
【０１９８】
群Ｂ．  ＨＡＴＤＣを１〜２継代の間、ゼノフリー培地によりフラスコ（２Ｄ）で培養した。次に、ゼノフリー培地を用いて、細胞を皮質スキャフォールド上、３Ｄ系に播種した。３Ｄでの播種から４〜５日後に、細胞に１種または複数の骨形成誘導因子を補充して、骨形成系細胞分化を誘導し、回収までさらに２日間培養した（２日目、系Ｂ）。
【０１９９】
群Ｃ．  脂肪組織をゼノフリー培地中、ミネラルスキャフォールド上に配置し、ＨＡＴＤＣをスキャフォールド分子に遊走させる。播種から１０〜１２日後に、細胞に１種または複数の骨形成誘導因子を補充して骨形成系細胞分化を誘導し、さらに２日間培養した。
【０２００】
２Ｄで培養されたＨＡＤＴＣを０日目（ＢＭＰ２誘導の前）および骨形成誘導後２日目（２日目）に回収した。３Ｄで培養されたＨＡＤＴＣ（群ＢおよびＣ）を、骨形成誘導後２日目（２日目）に回収した。
【０２０１】
骨形成誘導を、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７などの１種または複数の骨形成誘導因子により誘導する。
【表１２】
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【０２０２】
ＲＮＡ試料の調製：
ＱｉａｃｕｂｅロボットをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）と共に用いて、ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡ試料の全ての品質を、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて評価した。全試料のＲＮＡ値が、＞９．５であった。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐｓ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）のためのＴａｒｇｅｔＡｍｐ  Ｎａｎｏ標識キットを用いたインビトロ転写により、ＲＮＡをビオチン化ｃＲＮＡに増幅した。ビオチン化ｃＲＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎアッセイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐにハイブリダイズした。ハイブリダイズされたチップを、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてストレプトアビジンで染色し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｃａｎでスキャンし、品質管理（ＱＣ）のために画像をＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にインポートした。その後、データを、統計解析のためにＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＳＡＳ）に、そしてネットワークエンリッチメント解析のためにＩＰＡにインポートした。
【０２０３】
マイクロアレイ
マイクロアレイ解析のために、４７，０００より多くのプローブを標的とするＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ  Ｋｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いた。得られた生データは、４７，０００より多くのプローブを含んだ。ｌｏｇ２変換、低発現のふるい分け、試料間の低分散のふるい分けに続いて、約９，０００のプローブが統計解析に残った。
【０２０４】
統計解析：
遺伝子発現の生データを、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏからエクスポートし、ＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｖ７ソフトウエア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ、ノースカロライナ州ケーリー所在）にインポートした。試料での非発現遺伝子（検出ｐ値＜０．０１）および低分散の転写産物（分散＜５％）についてのふるい分けの後、ＪＭＰ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓでの品質管理および解析を、ｌｏｇ２変換データで実施した。データ分布は類似の発現を示し、それゆえデータを正規化しなかった。一元配置分散分析を用いてデータを解析した。発現変動遺伝子（ＤＥＧ）を、少なくとも２倍の変動差を有する偽陽性率（ＦＤＲ）を利用して、補正ｐ値≦０．０５で統計学的に有意であった転写産物と定義した。以下のソフトウエアを用いて、データ解析を実施した：（１）ＧｅｎｅＡｎａｌｙｔｉｃｓ，ＬｉｆｅＭａｐ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（２）Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ  ８．０）、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ，Ｑｉａｇｅｎ。
【０２０５】
実施例１
ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析された内在性ＢＭＰ−２、ＳＰ７、ＡＬＰの発現
３Ｄ系（群ＣおよびＤ）および２Ｄ系（群Ａ）の骨形成能を評価するために、早期骨形成マーカー（内在性骨形成タンパク質（ＢＭＰ２）、Ｏｓｔｒｉｘ（ＳＰ７）、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ））の発現レベルを検査した。最初に、群Ａ、ＢおよびＣの骨形成系細胞分化を、１５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ２を補充したゼノフリー培地により２日間、誘導した。次に、系Ａ、Ｂ、およびＣから得られたＲＮＡ試料を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。発現レベルを、対照群（群ＢＬ）のレベルに対比して分析した。実験は、異なる生物学的供給源からの３種のリプリケート（ＡＤ１５３、ＡＤ１５４、およびＡＤ１６０で表す）を利用して実施し、結果をそれぞれ図１、２、および３に表す。
【０２０６】
早期骨形成マーカー：ＢＭＰ−２（図１Ａ、２Ａおよび３Ａ）、ＳＰ７  ２（図１Ｂ、２Ｂおよび３Ｂ）およびＡＬＰ  ２（図１Ｃ、２Ｃおよび３Ｃ）の発現レベルを、骨形成誘導に続いて評価した。
【０２０７】
これまでの試験から、外来性ＢＭＰ２に加えて、ＢＭＰ２の内在性発現が骨形成系細胞分化に重要な役割を担い、肝要であることが実証された。結果から、外来性ＢＭＰ２により誘導された３Ｄ−ＨＡＤＴＣにおける内在性ＢＭＰ２の上昇が実証された（図１Ｃ、２Ｃおよび３Ｃ）。内在性ＢＭＰ２は、分化の３日目に平均で（用いられた３つのバッチの）３．０２±０．７６倍上昇した。
【０２０８】
とりわけ、テストされた全ての遺伝子：ＢＭＰ２、ＳＰ７、ＡＬＰの発現は、ＢＭＰ２を含む、または含まない２Ｄに比較して、ＢＭＰ２処置後の３Ｄで高くなった（図１Ａ〜Ｃ、２Ａ〜Ｃおよび３Ａ〜Ｃ）。これらの結果から、３Ｄ系で生育されたＨＡＤＴＣでは２Ｄ系で生育されたＨＡＤＴＣに対比して骨芽細胞に分化する能力が高いことが示される。
【０２０９】
実施例２
マイクロアレイ分析
最初に、異なる処置群（系）の間、および異なるバイオロジカルリプリケート（ＡＤ１５３、ＡＤ１５４、およびＡＤ１６０）の間の差を分析することにより、分散成分を確定した。
【０２１０】
結果から、全分散の約６６％が処置群間の差により、分散のさらなる約１８％がバイオロジカルリプリケート間の差によることが実証される（図４）。
【０２１１】
各処置群（Ａ、Ｂ、Ｃ）について、遺伝子発現レベルを、ベースラインレベル（ＢＬ）と比較して分析し、発現変動遺伝子（ＤＥＧ）をベン図で表している（図５）。発現変動遺伝子は、ベースラインレベルに比較して少なくとも２倍の変動（ＦＣ＞＝２）を示した遺伝子である。図５で実証された通り、３１種の遺伝子が、ベースラインレベル（ＢＬ）に比較して群Ａにおいて発現が変動している。加えて、５００より多くの遺伝子が、ベースラインレベル（ＢＬ）に比較して群ＢまたはＣで発現が変動している。とりわけ３７６のＤＥＧが、ベースラインレベル（ＢＬ）に比較して群ＢとＣの間で共通している。３７６のＤＥＧのうち３６２が、群ＢとＣの間のみで共通し、１４種のＤＥＧは、ベースラインレベル（ＢＬ）に比較して処置群Ａ、ＢおよびＣで共通している。これらの結果から、３Ｄ系での細胞生育が骨形成誘導（２日間で１種またはより多くの骨形成誘導因子）よりも細胞に影響を及ぼすことが実証された。さらに、ベースラインレベル（ＢＬ）と比較したＤＥＧの誘導および減少は、群Ａよりも群ＢおよびＣで有意である（図６）。
【０２１２】
その上、図７に示されたヒートマップから、処置群ＡおよびＢＬが類似していて、類似する群ＢおよびＣと有意に異なることが実証される。
【０２１３】
マイクロアレイ分析から、ＨＡＴＤＣを３Ｄで増複された場合に、遺伝子発現プロファイルにおける有意な改変が生じることが実証される。これに反し、同一細胞を、同じ培地および骨形成誘導条件（ＢＭＰ２、２ｄ）で２Ｄ条件において生育すると、遺伝子発現プロファイルが、ベースライン対照（２Ｄ、ＢＭＰ２条件を含まない）と非常に類似し、３Ｄ条件（群ＢおよびＣ）で得られた遺伝子発現プロファイルと非常に異なる。
【０２１４】
実施例３
マイクロアレイ分析の結果
マイクロアレイの結果を分析して、ＤＥＧを異なるクラスターにグループ分けした。結果から、１４のＤＥＧのみが、ベースラインレベル（ＢＬ）に比較して１種または複数の骨形成誘導因子での骨形成誘導を受けた処置群（群Ａ、Ｂ、およびＣ）で共通することが実証された（表１２）。
【０２１５】
４８時間の骨形成誘導を受けたＨＡＴＤＣが、遺伝子ＡＴＯＨ８、ＣＧＢ１、ＣＭＴＭ４、ＦＯＸＯ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＮＥＢＬ、ＯＳＲ１、ＰＲＲＸ２、ＳＡＭＤ１１、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＳＭＡＤ９の発現レベルにおいて変調を呈することが見出された。具体的には、骨形成誘導（群Ａ、ＢおよびＣ）に続いて、遺伝子：ＡＴＯＨ８、ＣＧＢ１、ＣＭＴＭ４、ＦＯＸＯ、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＮＥＢＬ、ＰＲＲＸ２、ＳＡＭＤ１１、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＳＭＡＤ９の発現レベルが、骨形成処置に供されなかったＨＡＴＤＣ（ＢＬ）に比較して誘導された。骨形成誘導に供されたＨＡＴＤＣ（群Ａ、Ｂ、およびＣ）において、遺伝子ＯＳＲ１の発現レベルが、骨形成誘導に供されなかったＨＡＴＤＣ（ＢＬ）に比較して低下した。
【表１３】
2019521708.tif 000015
【０２１６】
図８は、異なるテスト生育条件において誘導または低下された、古典的経路（左）、上流調節因子（中）および機能分析に関連する記述子の比較を実証している。３つの処置の比較を、ＩＰＡ分析ツールにより実施した。ここに示された各記述子は、ベースライン（ＢＬ）処置に比較して誘導または低下された多くの関連するＤＥＧを表す。記述子あたりの全ての関連するＤＥＧの全体的効果を、これらのヒートマップに要約および実証している。結果から、２つの３Ｄ生育条件（ＢおよびＣ処置）が上述の記述子に有意な影響を及ぼすが、２Ｄ生育条件（処置Ａ）がベースライン（ＢＬ）に対比してわずかな影響を有することが示される。
【０２１７】
幹細胞マーカー
ＣＤ１３、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＫＬＦ４をはじめとする多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）／複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞マーカーの発現レベルは、対照（ＢＬ）に比較して３Ｄ系（群ＢおよびＣ）で生育されたＨＡＴＤＣで低下している（表１および１ｂ）。これらの結果から、３Ｄ系で生育されたＨＡＴＤＣが分化の増進を受けたことが示される。
【表１４】
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【０２１８】
増殖分化およびアポトーシスマーカー
３Ｄ系で生育されたＨＡＴＤＣは、増殖の減少および分化の増進を呈している。マイクロアレイの結果から、３Ｄ系で生育されたＨＡＴＤＣが細胞マーカー：ＡＵＲＫＡ、ＦＯＳ、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＢＣＬ２Ｌ１、ＤＤＸ２１、ＲＲＡＳ２、ＳＴＡＴ１、およびＡＮＸＡ２の発現増加を呈することが実証される。加えて、３Ｄ系で生育されたＨＡＴＤＣは、ＳＦＲＰ２、ＩＤ１、ＩＤ２、ＩＤ３、ＭＲＡＳ、ＮＯＸ４、ＮＯＴＣＨ３、およびＲＧＣＣをはじめとする細胞マーカーの発現増加を呈する（表２および２ｂ）。
【表１５】
2019521708.tif 000017
【０２１９】
ＭＨＣ  Ｉタンパク質
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原は、ほとんど全ての分化細胞で発現される。これらのタンパク質は、免疫系への外来抗原の提示に関与する。ＭＳＣは、低レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現することが知られている。
【０２２０】
ＭＨＣ  Ｉ遺伝子は、２Ｄ系で生育されたＨＡＴＤＣに対比して３Ｄ系で生育されたＨＡＴＤＣで誘導され、３Ｄ系での細胞の分化増進が示される（表３、３ｂ）。
【表１６】
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【０２２１】
脂肪細胞マーカー
成熟した脂肪細胞は、骨の分化が既にコミットされているため、該細胞の遺伝子マーカー（例えば、ＰＰＡＲＧ）は減少した（表４、４ｂ）。しかし、早期脂肪細胞マーカーは、３Ｄで誘導される（例えば、ＤＬＫ１、ＳＯＸ９）（表４、４ｂ）。これらの結果は、適切な生育条件下では、３Ｄ系で生育された細胞が脂肪細胞に加え骨にも分化する能力を有することを示唆する可能性がある。
【表１７】
2019521708.tif 000019
【０２２２】
骨芽細胞マーカー
これらのクラスターの遺伝子マーカーは、２Ｄ条件に対比して３Ｄ条件で増進する骨芽細胞分化（例えば、内在性ＢＭＰ２、ＳＰ７、およびＡＬＰ）にとって不可欠である。
【０２２３】
結果から、ＢＭＰ２、ＳＰ７およびＡＬＰなどのマーカーの誘導が実証され、これらの結果は、ｑＲＴ−ＰＣＲによりさらに裏づけられる（図１Ａ〜Ｃ、２Ａ〜Ｃおよび３Ａ〜Ｃ）。３Ｄで得られた骨分化の他の重要なマーカーは、ＰＯＳＴＮ、ＦＧＦＲ３およびＤＬＸ５である。Ｍｓｘ１およびＭｓｘ２の誘導が、発達工程で示され、骨分化のメカニズムでも、神経堤細胞で起こる（表５、５ｂ）。
【０２２４】
ＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  −  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｐａ参照）分析に続いて得られた結果は、３Ｄ生育条件（群ＢおよびＣ）が骨芽細胞分化に関与する３０より多くのＤＥＧをもたらすが、群Ａ（２Ｄ系で生育され骨形成誘導に供された）がこの経路に関与するＤＥＧをもたらさないことが実証される。
【表１８】
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【０２２５】
骨軟骨前駆体および／または肥大軟骨細胞の遺伝子マーカー
破骨細胞マーカーは、軟骨発達、軟骨細胞、骨軟骨前駆体および肥大軟骨細胞に特異性がある。これらの遺伝子マーカーから、骨分化メカニズムが軟骨内骨化に関与することが示される（表６、６ｂ）。特異的マーカーは、ＣＯＬ１０Ａ１、ＭＭＰ１３およびＣＯＭＰである。
【表１９】
2019521708.tif 000021
【０２２６】
ＥＣＭマーカーおよび構造タンパク質
ＥＣＭ（表７、７ｂ）および構造タンパク質（表８、８ｂ）の遺伝子マーカーは、３Ｄにおける細胞の分化増進を示す。その上、複数のＥＣＭタンパク質は、軟骨内骨化工程で肥大軟骨細胞から作製される。主なＥＣＭマーカーは、ＴＮＣおよびＤＰＴ遺伝子である。
【表２０】
2019521708.tif 000022
【表２１】
2019521708.tif 000023
【０２２７】
血管新生および脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｏｇｅｎｉｃ）遺伝子
血管新生および脈管形成（ｖａｓｃｌｏｒｏｇｅｎｉｃ）遺伝子マーカーは、血管新生および脈管形成工程に寄与する。一部は、ＰＧＦおよびＩＬ８などの成長因子またはサイトカインである。その他は、ＡＮＧ、ＡＮＧＰＴ２およびＡＮＧＰＴＬ２などの血管形成の特異的メディエータである。典型的には、大規模な骨形成の際に、主に軟骨内骨化工程を介して、血管新生が増進される。
【０２２８】
結果から、多くの血管新生因子が２Ｄ生育条件に比較して３Ｄで誘導されることが実証される（表９、９ｂ）。その上、ＩＰＡ分析の結果から、血管新生および脈管形成経路が有意に誘導され（図８右、破線の矢印で表示）、関連するＤＥＧの９６（群９６）および１０５（群Ｃ）に関与したことが実証される（図１０Ｂ）。反対に２Ｄ生育条件では（群Ａ）、これらの工程は、誘導されない（図８右の破線の矢印で表示、および図１０Ａ）。
【表２２】
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【０２２９】
上流調節因子の発現
結果から、上流調節因子が２Ｄ生育条件に比較して３Ｄで誘導されることが実証される（表１０、１０ｂ）。
【表２３】
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【０２３０】
発現レベルの有意な変調を有するさらなるＤＥＧ
表１１ｂから、ＤＥＧが少なくとも３倍の変動を有することが実証される（図１１参照）。
【０２３１】
本発明を具体的な実施形態と併せて記載したが、多くの代替、改変および変更が当業者に自明となることは、明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の主旨および広い範囲に含まれるそのような代替、改変および変更の全てを包含するものとする。
【図１Ａ】
2019521708.tif 000026
【図１Ｂ】
2019521708.tif 000027
【図１Ｃ】
2019521708.tif 000028
【図２Ａ】
2019521708.tif 000029
【図２Ｂ】
2019521708.tif 000030
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2019521708.tif 000032
【図３Ｂ】
2019521708.tif 000033
【図３Ｃ】
2019521708.tif 000034
【図４】
2019521708.tif 000035
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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