(57)【要約】  本発明は、免疫原性剤としてのストレプトコッカス・ウベリスの抽出物に関する。本発明は、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株をインキュベートしてバイオフィルムを得て、得られたバイオフィルムを熱処理することを含む、免疫原性剤を得る方法にも関する。本発明はまた、ストレプトコッカス種によって又はバイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防炎及び／又は治療に使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、免疫原性剤を含むワクチン、並びにストレプトコッカス種によって引き起こされる感染症の予防及び／又は治療、特にＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するためのワクチン及び免疫原性剤に関する。本発明は、免疫原性剤又はワクチンを含むワクチン接種キットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）バイオフィルムを得るために、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス株をインキュベートする工程と、
ｂ）前記工程ａ）で得られた前記バイオフィルムに熱的加熱処理を施す工程と、
を含むことを特徴とする、免疫原性剤の調製方法。
【請求項２】
前記インキュベーションが１％〜１０％の二酸化炭素を含む雰囲気中で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｂ）において、前記熱処理が８０℃〜１３０℃の温度で行われることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）において、前記熱処理が５〜７５分の期間行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａ）の後、かつ前記工程ｂ）の前に、培地から前記バイオフィルムを回収する追加の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｂ）の前記熱処理後に得られた不溶性画分を廃棄し、可溶性抽出物を保存する工程を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株の培養物由来の熱的加熱処理されたバイオフィルムを含む、免疫原性剤。
【請求項８】
ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するための、請求項７に記載の免疫原性剤。
【請求項９】
前記ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するための、請求項８に記載の免疫原性剤。
【請求項１０】
免疫学的に有効な量の請求項７に記載の免疫原性剤を含む、ワクチン。
【請求項１１】
薬学的に許容されるビヒクル及び／又は薬学的に許容されるアジュバントを更に含むことを特徴とする、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、ビタミンＥ、スクワラン、スクワレン、チョウセンニンジン、ザイモサン、グルカン、ジメチルアミノエチル−デキストラン、デキストラン、非イオン性ブロックポリマー、モノホスホリルリピドＡ、サポニン、及びこれらの混合物から選択されるアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
モノホスホリルリピドＡを含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
【請求項１４】
皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は乳房的経路によって投与されることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１５】
２回以上投与されることを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１６】
ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１７】
バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】
免疫学的に有効な量の請求項７に記載の免疫原性剤又は請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のワクチンを含む容器を含むことを特徴とする、ワクチン接種キット。
【請求項１９】
ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療におけるワクチンとして使用するためのタイコ酸を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療におけるワクチンとして使用するためのタイコ酸を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１６年２月１５日に出願された欧州特許出願第１６３８２０６０．８号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ワクチンの分野に関し、具体的には、Ｓ．ウベリス（Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）細菌に基づく新規な免疫原性剤、並びに特に家畜のウシにおいて、ストレプトコッカス種によって及びバイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び感染症の予防及び／又は治療のためのワクチン組成物に使用するためのタイコ酸含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
乳腺炎は、乳腺の炎症を特徴とし、一般に家畜、特にウシ、ヒツジ、及びヤギに広く影響を及ぼす細菌感染症によって一般に引き起こされる病状であり、その発生は、世界的水準で乳業に重大な経済的損失を伴うため乳牛において特に重大である。
【０００４】
乳腺炎の臨床的徴候は、おそらくは乳腺の痛み及び炎症を伴うタンパク質凝集物又は凝固物等、乳中の何らかの目に見える異常の出現から、主としてタンパク質凝集物からなる分泌物の産生、菌血症、敗血症まで様々であり得、動物の死亡も発生し得る。乳腺炎はまた、乳腺の炎症が乳又は乳房に目に見える変化を生じない亜臨床形態で存在する場合もあり、亜臨床的に感染したウシは乳産生が減少し、品質が低下する。
【０００５】
乳腺炎は、異なる病原体によって引き起こされることがあり、顕著なものには、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、特にストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ；以下、Ｓ．ウベリスという。）が含まれる。Ｓ．ウベリスは、スタフィロコッカス種の細胞壁及びストレプトコッカス種の細胞壁と同様の細胞壁を有するグラム陽性菌であり、その中ではストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）及びストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）も顕著である。Ｓ．ウベリスは、ストレプトコッカス属の中で乳腺炎の臨床的及び亜臨床的症例からより一般的に単離された病原体である。近年、Ｓ．ウベリスは世界中のほとんどの地域で、臨床的及び亜臨床的乳腺炎の主な原因の１つとなっている。Ｓ．ウベリスは環境細菌であると考えられており、乳房の内部及び外部で生存及び複製が可能であり、家畜施設内の非常に広範囲に存在するため、闘うのが困難である。乳腺炎を引き起こす他の病原体は、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０００６】
現在、乳腺炎を予防するため、更にその発生率を減少させるため、又はその効果を緩和するために、様々な戦略が追求されている。主に、予防戦略は衛生学及び搾乳手順を改善することに焦点を当てているが、抗生物質による治療が治療アプローチの好ましい選択肢である。
【０００７】
更に近年では、ワクチンの投与に基づく予防戦略の開発に関心が高まっており、この意味で、Ｓ．ウベリスに基づく様々な免疫原性剤が乳腺炎、特にウシ乳腺炎の予防におけるその使用について最新技術に記載されている。
【０００８】
いくつかの文献は、例えば、乳腺炎の予防のための未精製の「粗」ワクチンの使用を記載しており、これらのワクチンは完全なＳ．ウベリス細菌又はそのタンパク質抽出物に基づく。
【０００９】
例えば、Ｆｉｎｃｈらによる論文では、死滅したＳ．ウベリスを用いた局所ワクチン接種は、同種株Ｉｎｆｅｃｔによる実験的な乳房内試行に対してウシ乳腺を保護する。非特許文献１に開示されている研究では、不活化Ｓ．ウベリス細菌を複数回乳房内投与する家畜のウシのワクチン接種によって、その後の同種株の感染症に対して動物内にある種の防御が得られる。
【００１０】
非特許文献２（Ｈｉｌｌらによる論文「乳牛におけるＳ．ウベリス乳腺炎の病因の免疫修飾（Ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ｍａｓｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗ）」）には、ウシの皮下ワクチン接種は、菌株０１４ＪのＳ．ウベリス生菌及び／又はムタノリシン及びＸヒアルロニダーゼで細菌を処理して、細胞壁及びカプセルを除去し、続いて遠心分離によってプロトプラストを除去して得られた同じ菌株に由来する可溶性抽出物が記載されている。Ｓ．ウベリスの可溶性抽出物のみでの処置は動物に免疫を与えないが、乳牛に生菌を皮下経路でワクチン接種した後、細菌性抽出物の乳房内注射と組み合わせると、乳腺炎の発生率低下を示すことが分かった。
【００１１】
Ｓ．ウベリスのワクチンに関するより最近の研究の大部分は、Ｓ．ウベリスに起因する感染症に対する防御を提供することができる特定の細菌サブユニットの探索に焦点を当てている。
【００１２】
従って、例えば、特許文献１では、泌乳牛にＳ．ウベリスによって誘発された乳腺炎の予防及び治療用ワクチンにおけるＳ．ウベリスのコヘモリジンポリペプチド（ＣＡＭＰ因子）の使用が開示されている。
【００１３】
非特許文献３（Ｌｅｉｇｈらによる論文「Ｓ．ウベリス由来のプラスミノーゲン活性剤を含むワクチン接種は阻害応答を誘発し乳牛を実験感染から防御する（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗ）」）では、プラスミノーゲン活性剤Ｓ．ウベリス含有粗タンパク質濃縮物（ＰａｕＡ）をアジュバントと組み合わせて皮下投与によりワクチン接種した乳牛が、その後のＳ．ウベリス病原性株の投与に対してどのように防御を備えたかが記載されている。
【００１４】
特許文献２には、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、ストレプトコッカス・アガラクティエ、Ｓ．ウベリス、ストレプトコッカス・パラウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ）、及びストレプトコッカス・イニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｉａｅ）のプラスミン結合ＧａｐＣタンパク質の組換え生成、並びに細菌感染症、特に乳腺炎の予防及び治療のためのワクチン組成物としてのそれらの使用が記載されている。
【００１５】
非特許文献４（Ｐｒａｄｏらによる論文「ウシ乳房上皮細胞へのＳ．ウベリスの付着及び内在化を低減する組換えＳ．ウベリス付着分子抗体を用いた乳牛の予防接種（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｄｕｃｅ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓ．  ｕｂｅｒｉｓ  ｉｎｔｏ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）」）では、インビトロで乳腺の上皮細胞へのバクテリアの付着を低減するように生成された抗体で観察される能力に基づく、乳腺炎に対する乳牛のワクチン接種について、組換えＳ．ウベリス付着分子（ＳＵＡＭ）の使用が示唆されている。
【００１６】
特許文献３では、Ｓ．ウベリス表面に固定されたソルターゼタンパク質に基づく免疫原性組成物、及びＳ．ウベリスによって引き起こされる感染症に対する予防的又は治療的ワクチンとしてのその使用が開示されている。
【００１７】
特許文献４には、ストレプトコッカスによって引き起こされる感染症に対するワクチンが、抗原としてのＳ．ウベリスの特定のタンパク質、具体的にはフェリクローム結合タンパク質、ＴＵ伸長因子、リポタンパク質、及びセリンプロテアーゼを含むと記載されている。
【００１８】
現在、Ｓ．ウベリスによって引き起こされたウシ乳腺炎における特定の適応症を有するワクチンはヨーロッパ市場には存在しない。米国市場には、「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  Ｂａｃｔｅｒｉｎ」（条件付きライセンスの下で販売されているＨｙｇｉｅｉａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）の製品コード２８５１．００）と呼ばれるワクチンが存在する。このワクチンは、Ｓ．ウベリスの不活化培養物から得られた古典的なバクテリンに基づくものであり、その分離株は臨床症例に由来し、Ｓ．ウベリスに起因するウシ乳腺炎に対する主張が有効性試験によって裏付けられるまで審議中である。
【００１９】
とりわけＳ．ウベリスによって引き起こされるウシ乳腺炎に対する残りの市販のワクチンは、多価ワクチンである。これらのワクチンは、古典的不活化バクテリンの混合物に基づく抗原組成物を含み、例えば、ＭＡＳＴＩＶＡＣ（登録商標）（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏｓ  Ｏｖｅｊｅｒｏ  Ｓ．Ａ．，（スペイン））が挙げられ、これはスペインで市販されているウシ乳腺炎に対する多価ワクチンであり、黄色ブドウ球菌、大腸菌Ｊ５、Ｓ．アガラクティエ、Ｓ．ディスガラクティエ、Ｓ．ウベリス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、及びアルカノバクテリウム・ピオゲネス（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のバクテリンを含む。別の例としては、Ｍａｓｔｉｐｌｕｓ（登録商標）ＢＲ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  Ｖｉｔａｆｏｒｔ  Ｉｎｄ．ｅ  Ｃｏｍ．ｄｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｏｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉｏｓ  Ｌｔｄａ．（ブラジル））が挙げられ、これはブラジルで市販されており、組成物はストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、Ｓ．ウベリス、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・アルバス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、大腸菌、アルカノバクテリウム（コリネバクテリウム）・ピオゲネス、サルモネラ種、シュードモナス種、クレブシエラ種、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アエロバクター・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、及びパスツレラ・ボビス（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｂｏｖｉｓ）のバクテリンである。これらのワクチンは、Ｓ．ウベリスに起因する臨床的及び亜臨床的乳腺炎の問題を解決しないため、ストレプトコッカス種属によって引き起こされる乳腺炎と戦い、特にＳ．ウベリスに対して特異的に戦うために新規な開発及び新しいワクチンが必要である。
【００２０】
従って、従来技術において利用可能な様々な提案にも関わらず、ストレプトコッカス種、特にＳ．ウベリスによって引き起こされる感染症を予防及び／又は治療するのに有効であり、特に一般に乳腺炎及び特にウシ乳腺炎の予防及び／又は治療に有効である新しい免疫原性産物を提供する必要がまだある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９６／４１８７９号公報
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ０１／９６３８１号公報
【特許文献３】国際特許出願ＷＯ２０１０／０４１０５６号公報
【特許文献４】国際特許出願ＷＯ２０１５／０４２４４９号公報
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｉｍｍｕｎ．，１９９４，６２，３５９９−６０３
【非特許文献２】ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，８，１０９−１１８
【非特許文献３】Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９９，１７，８５１−８５７
【非特許文献４】Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，２０１１，１４１，２０１−２０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、免疫原性剤の調製方法である。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の別の態様は、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス株の培養物からのバイオフィルムを含む免疫原性剤に関する。
【００２５】
本発明の別の態様は、この方法によって得ることができる免疫原性剤に関する。
【００２６】
本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するための免疫原性剤に関する。
【００２７】
本発明の別の態様は、この免疫原性剤を含むワクチンに関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのワクチンである。
【００２９】
本発明の別の態様は、バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのワクチンである。
【００３０】
本発明の別の態様は、本発明の免疫原性剤又はワクチンを含むワクチン接種キットに関する。
【００３１】
本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【００３２】
本発明の別の態様は、バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】横座標として示すワクチン接種群（ＧＶ）及び対照群（ＧＣ）における感染の２４時間後の体温上昇の平均（℃で表す）を縦座標として示す。ワクチン接種群は、より小さな体温上昇を示すことが観察される。
【図２】横座標として示すワクチン接種群（ＧＶ）及び対照群（ＧＣ）における感染の２４時間後の乳腺組織のｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇの平均値を縦座標として示す。Ｓ．ウベリス数が少ない群は本発明の免疫原性因子でワクチン接種した群に対応することが観察される。
【図３】横軸として示すワクチン接種群（ＧＶ）及び対照群（ＧＣ）における感染の２４時間後の感染腺の感受性パーセンテージの平均値を示す。低い感受性を有する群は本発明の免疫原性剤でワクチン接種した群に対応することが観察される。
【図４】直腸温度の平均値を縦座標として℃で示し、ワクチン接種群（■）及び対照群（◇）の感染後日数を横座標として示す（０日目を感染日とする）。実験感染後の日々の間にワクチン接種群において温度低下の明らかな傾向が観察された。
【図５】横座標として示すワクチン接種群（■）及び対照群（◇）について、感染後の日々における乳のｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌの平均値を縦座標として示す。Ｓ．ウベリス数が少ない群は本発明の免疫原性因子でワクチン接種した群に対応することが観察される。感染日は、横座標の０日に相当する。
【図６】ワクチン接種群（■）及び対照群（◇）について横座標として示す感染（０日）後のリットルで表した乳産生の平均値を縦座標として示す。感染後、本発明の免疫原性剤でワクチン接種した群は、ほぼ毎日、対照群よりも多い乳産生を示すことが明らかに観察される。
【図７】ワクチン接種群（■）及び対照群（◇）の横軸として示す感染後の日々における、乳１ｍｌ当たりの体細胞数（ＳＣ／ｍｌ）の平均値を縦座標として示す。感染日は０日に相当する。研究の２０日目に、本発明の免疫原性剤でワクチン接種した群では、対照群と比較して乳のＣＳ／ｍｌの数が明らかに少ないことが観察される。結果は、両方の群において体細胞の数が増加するという事実にも関わらず、ワクチン接種群は非ワクチン接種群よりも有意により迅速に正常値に戻ることを示している。
【図８】異なる濃度（１：１０及び１：２５希釈）のモノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在下及びその非存在下（対照群、ＧＣ）におけるＳ．ウベリスのインビトロ培養物に対応する５９５ｎｍでの光学密度が示されている。結果は、Ｓ．ウベリスのインビトロ培養物におけるこれらのモノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在が、このようなモノクローナル抗体を含まない培養物と比較して、バイオフィルムの形成を有意に阻害することを示す。
【図９】本発明の免疫原性剤でワクチン接種した動物の血清の存在下（ワクチン接種群、ＧＶ）及び非存在下（対照群、ＣＧ）における、Ｓ．ウベリスのインビトロ培養物に対応する５９５ｎｍでの光学密度が示されている。この結果は、本発明の免疫原性剤でワクチン接種した動物の血清の存在が、このような血清を含まない培養物と比較して、Ｓ．ウベリスによるインビトロ条件下でのバイオフィルムの形成を有意に阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の目的は、ａ）バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株をインキュベートしてバイオフィルムを得る工程と、ｂ）工程ａ）で得られたバイオフィルムに熱的加熱処理を施す工程と、を含む免疫原性剤の調製方法である。
【００３５】
本発明の発明者らは、Ｓ．ウベリスのバイオフィルム抽出物の調製方法を開発し、この方法は驚くべきことに、ストレプトコッカス種によって引き起こされる感染症に対する、特に、一般に動物、特に家畜のウシにＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎の予防のためのワクチン組成物に有効な免疫原性剤をもたらす。
【００３６】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、冠詞「ａ」又は「ｔｈｅ」によって先行される単数形の表現は、文脈が明らかに反対を示さない限り、広義には複数形への言及も含むと理解される。
【００３７】
本発明の文脈において、決定された値に言及する「おおよそ」という用語は、値の一定の変動が受け入れられ、一般に＋／−５％であることを示すことが理解される。
【００３８】
免疫原性剤の調製方法
【００３９】
本発明は、Ｓ．ウベリス細菌のバイオフィルムから得られ熱処理された免疫原性剤が、病原性ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリス、菌株、及びバイオフィルム産生細菌による感染に対して動物において免疫を誘導することができる優れた免疫原性を有するという驚くべき発見に基づいている。
【００４０】
バイオフィルムは、当業者に周知であるように、微生物、例えば細菌の凝集物であり、表面に付着して形成され、高分子化合物、主に多糖類の混合物から作られる細胞外マトリックスによって覆われて、一般に細胞外重合物質（ＥＰＳ）として知られている。
【００４１】
バイオフィルムの組成は、基本的には、他の細胞外生成物の中でも微生物細胞、多糖類、及び水を含み、Ｉ．  Ｗ．  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄによる「バイオフィルムマトリックス−固定化されているが動的である微生物環境（Ｔｈｅ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｍａｔｒｉｘ−ａｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｕｔ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）」，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１、９（５）、２２２−２２７に記載されているように、これらはマトリックスが多数の微小環境及び状況に適合することを可能にする。
【００４２】
本発明の方法では、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株を使用する。バイオフィルムを産生することができる任意のＳ．ウベリス菌株は、この方法で使用するのに適している。
【００４３】
バイオフィルム産生細菌を同定する方法は、当業者に周知である。例えば、マイクロプレート試験を使用することができ、Ｇ．Ｅ．ムーア、「乳房内感染症に関連するＳ．ウベリスによるバイオフィルム産生（Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」，２００９、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ  Ｈｏｎｏｒｓ  Ｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、又はＳｔｅｐａｎｏｖｉｃら、「マイクロタイタープレート内のバイオフィルムの定量：ブドウ球菌によるバイオフィルム生産の評価のための試験条件と実践的推奨の概説（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ：  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）」，ＡＰＭＩＳ、２００７，１１５，８９１−８９９に記載されている。
【００４４】
本発明の方法の工程ａ）では、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株をインキュベートしてバイオフィルムを得る。バイオフィルム産生菌株で起こるように、この菌株は、インキュベーション中にバイオフィルムを産生し、バイオフィルムは本発明の方法を実施する容器の表面に付着する。
【００４５】
細菌は、例えば、トリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）、トリプチカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）、とりわけミルク寒天、又はこれらの混合物（全て市販されており当業者には明らかである）から選択される通常の培地を用いてインキュベートすることができる。必要に応じて、培地には、例えば、血液、酵母エキス、グルコース若しくはカゼイン、又はそれらの混合物等の追加成分を補充することができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、培地は、トリプトン及びペプトン大豆を含有するトリプチカーゼ大豆ブロス（ＴＳＢ）を含む。ＴＳＢに酵母エキス（ＹＥ）を補充することが好ましく、より好ましくは０．１％〜２％、より好ましくは０．５％〜１．５％の酵母エキスを補充し、更に好ましくは１．２％の酵母エキスを補充したＴＳＢを使用し、パーセンテージはｗ／ｖで表される。
【００４７】
バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス細菌は、通常、慣習的な雰囲気でインキュベートされるが、好ましくは１％〜１０％の二酸化炭素、より好ましくは約５％の二酸化炭素を含む雰囲気中でインキュベーションを実施する。
【００４８】
インキュベーションは、一般に３０℃〜４５℃、好ましくは３５℃〜４０℃、更により好ましくは約３７℃を含む温度で行う。
【００４９】
Ｓ．ウベリス細菌を、バイオフィルムの発生に適した期間、一般に２４時間（１日）〜１６８時間（７日間）を含む、好ましくは３６時間（１．５日）〜１２０時間（５日）を含む、より好ましくは４８時間（２日）〜７２時間（３日間）を含む期間インキュベートする。
【００５０】
バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株は、当業者に周知のように、細胞培養に適した任意の支持体又は表面上でインキュベートすることができる。例えば、他の可能な支持体の中でも培養プレート、培養ボトル、ウェルプレート、又は培養チューブを使用することができる。支持体は、例えば、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）の名称でＣｏｒｎｉｎｇ又はＤＤＢｉｏｌａｂ社によって商業的に入手することができる。
【００５１】
本発明の方法は、工程ａ）の後に追加の工程を含むことができ、この工程は、懸濁液中に残っている細菌細胞を含む培地からバイオフィルムを回収することを含む。方法のこの任意選択的工程では、Ｓ．ウベリスのバイオフィルムの形成後、デカンテーションによって懸濁液中の細菌細胞と共に培地を除去し、廃棄する。形成されたバイオフィルムを回収し、次の工程のために保存する。
【００５２】
好ましい実施形態では、本発明の方法は工程ａ）の後、且つ工程ｂ）の前に追加の工程を含み、この工程は、媒質に懸濁液中の細菌細胞を含む培地からバイオフィルムを回収することを含む。
【００５３】
Ｓ．ウベリス細菌株によって産生されるバイオフィルムは、一般に、それが産生された表面に付着し、この表面から分離しなければならない。バイオフィルムを表面から分離することは、物理的手段、例えば、必要であればスパチュラ又はデフレーカーの助けを借りて簡単に行うことができる。
【００５４】
代替的に又は追加的に、物質を使用してバイオフィルムの分離を容易にすることができ、特にプロテアーゼを、典型的には同じ培養物支持体内でバイオフィルム上に水溶液の形態で添加し、これによりバイオフィルムが表面から分離し、水性懸濁液の形態で得られる。その後、例えば遠心分離によって分離することができる。
【００５５】
例えば、バイオフィルムを回収するために、バイオフィルムの分離を容易にする目的で、典型的には水溶液の形態でトリプシンを使用することもできる。このようにして、バイオフィルムは、溶液中にトリプシンを含有する水性懸濁液の形態で回収される。バイオフィルムによって形成された不溶性の沈降残留物を遠心分離によって分離し、トリプシン溶液を含有する上清を廃棄する。
【００５６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、工程ａ）の後、且つ工程ｂ）の前に追加の工程を含み、この工程は、トリプシンを使用して、工程ａ）で形成されたバイオフィルムを回収することを含む。場合により、バイオフィルムは、例えば遠心分離法により、典型的には１０，０００〜２０，０００ｇに相当する速度で５〜２５分間、トリプシン溶液から精製し、不溶性画分を保存することができる。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、回収されたバイオフィルムを水性溶液、典型的には注射用水に懸濁する工程を含むが、とりわけＰＢＳ又は類似の緩衝溶液も使用することができる。
【００５８】
続いて、本発明の方法の工程ｂ）では、好ましくは培地から分離され、より好ましくは水溶液中に懸濁された、前の工程ａ）で得られたバイオフィルムを、典型的には８０℃〜１３０℃を含む、好ましくは１００℃〜１２５℃を含む、より好ましくは約１２１℃である温度で熱処理に供する。熱処理は、一般に、５〜７５分を含む、好ましくは１５〜５０分を含む、より好ましくは約４５分の期間行われる。
【００５９】
工程ｂ）の後、本発明の方法は、不溶性画分を可溶性抽出物から分離する追加の工程を含み得る。不溶性画分は廃棄し、本発明の方法から得られた免疫原性剤を含む可溶性抽出物を保存し、これがストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の治療及び／又は予防に驚くほどに適している。
【００６０】
好ましい実施形態では、本方法は、工程ｂ）の熱処理後に得られた不溶性画分を廃棄し、本発明の免疫原性剤を含む可溶性抽出物を保存する工程を含む。
【００６１】
両方の画分の分離は、例えば、典型的には１０，０００ｇ〜２０，０００ｇに相当する速度で、５〜３０分、好ましくは１０〜２５分を含む期間遠心分離することによって実施することができる。
【００６２】
不溶性画分は、典型的には、不活化細菌及び細胞外マトリックスの不溶性成分を含有する。上清は、本発明の方法により得られた免疫原性剤を含む可溶性抽出物を含む。
【００６３】
この追加の工程は、不活化細菌及び細胞外マトリックスの不溶性成分を含まないためにより純粋な免疫原性剤を提供するのに寄与する。除去することができるこれらの成分を含む免疫原性剤の使用は、免疫防御応答も生じるが、その量は当業者に周知の方法で調整しなければならない。
【００６４】
必要に応じて、例えば凍結乾燥によって水分を除去することができ、これにより免疫原性剤は固体形態で乾燥抽出物として得られる。
【００６５】
免疫原性剤
【００６６】
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得ることができる免疫原性剤に関する。この免疫原性剤は、本発明の免疫原性剤と以下で言及される。
【００６７】
バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株の培養物由来の熱的加熱処理されたバイオフィルムを含む免疫原性剤も本発明の一部である。
【００６８】
免疫原性剤は、好ましくは、水性懸濁液、水溶液、又は凍結乾燥の形態である。
【００６９】
免疫原性生成物若しくは剤、又は抗原は、ワクチン又は医薬組成物の成分として理解され、動物に投与された場合に免疫応答を誘発することができ、病原体によるその後の感染及び／又はその感染に関連する病状から動物を保護する。免疫応答は、当業者に周知のように、細胞型であろうと体液型であろうと、任意のタイプの免疫を含むことが理解される。
【００７０】
本発明の枠組みにおいて、動物という用語は、ストレプトコッカス種によって、特にＳ．ウベリスによって引き起こされる感染症に対して感受性のある任意の動物を広く指し、より詳細には、ヒトを含む哺乳動物を指す。好ましくは、動物は反芻動物であり、より好ましくは乳牛（又はウシ）、ヒツジ（又はｏｖｉｎｅ）、ブタ（又はｐｏｒｃｉｎｅ）、あるいはヤギ（又はｃａｐｒｉｎｅ）である。特に好ましい実施形態では、本発明の免疫原性剤は、家畜のウシの免疫化に使用される。
【００７１】
防御免疫応答は、未処理の動物と比較して、処理動物のＳ．ウベリスによるその後の感染、特に免疫原性生成物の調製に使用されるものとは異なるＳ．ウベリス菌株及び／又はその関連病理、特に乳腺炎へのその後の感染に対する感受性の低さによって決定することができる。
【００７２】
実施例のセクションに開示されている有効性試験に示されているように、本剤がＳ．ウベリスによって引き起こされる感染症の予防に有効であることは、驚くほどに確認されている。
【００７３】
特に、実施例のセクションでは、出産前の乳牛に本発明の免疫原性剤でワクチン接種を行ったときに得られた結果が提供されている。感染２日後の体温の明確な低下、乳中のＣＦＵ／ｍｌの実質的な減少、対照群と比較した泌乳量の増加、及び研究の終了時に乳中の体細胞数（ＳＣ／ｍｌ）の低下が観察された。
【００７４】
従って、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療のための、好ましくはストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防のためのワクチンの調製のための本発明の免疫原性剤の使用も本発明の一態様である。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性剤は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療のための、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防のためのワクチンの調製に使用される。
【００７６】
別の好ましい実施形態において、本発明の免疫原性剤は、臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療のためのワクチンの調製に使用される。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、本発明の免疫原性剤は、亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療のためのワクチンの調製に使用される。
【００７８】
従って、本発明の一態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくは、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防のため、好ましくは、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくは、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防のため、好ましくは、臨床的乳腺炎及び／又は亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための本発明の免疫原性剤である。
【００７９】
臨床的乳腺炎の場合、ワクチン接種動物と比較した場合の非ワクチン接種動物において、以下の兆候、とりわけ乳腺の炎症又は直腸温度の上昇、乳中の目に見える異常の出現、例えば、痛み及び乳腺の炎症を伴う可能性のあるタンパク質凝集物又は凝固物、更には主としてタンパク質凝集物からなる分泌物産生を確認することができる。乳腺炎の亜臨床的徴候に関しては、とりわけ、乳又は乳房に目に見える変化を生じさせない乳腺の炎症、乳産生の低下及び乳品質の低下が示され得る。
【００８０】
タイコ酸によるバイオフィルム形成の阻害
【００８１】
本発明の免疫原性剤は、複合組成の生成物である。この組成物は、バイオフィルムを得るためのバイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株のインキュベーション及びＳ．ウベリス菌株によって産生されたバイオフィルムの熱処理を含む、その調製に使用される方法によって決定される。本発明の免疫原性剤は、莢膜多糖類を含み、また、成分の中にリポタイコ酸等のタイコ酸が同定されている。抗ＬＴＡ抗体の存在の実質的な増加が、血漿中及び本発明の免疫原性剤に基づくワクチンを受けた乳牛の乳中に検出されることも観察される。
【００８２】
Ｂｒｏｗｎら、「グラム陽性細菌の壁タイコ酸（Ｗａｌｌ  Ｔｅｉｃｈｏｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｏｆ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｉｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１３、６７、３１３−３３６に開示されているように、タイコ酸は、糖脂質を介して細菌膜に固定されるリポタイコ酸（ＬＴＡ）及びペプチドグリカンに共有結合する壁タイコ酸（ＷＴＡ）の両方を含む。
【００８３】
リポタイコ酸（ＬＴＡ）はグラム陽性細菌の細胞壁の構成成分であり、その構造は種の関数として変化し、一般に、細胞膜に結合する繰り返し単位として長いグリセロールリン酸鎖を含み、例えばＣｚａｂａｎｓｋａらによる論文、「ウシ乳腺炎ストレプトコッカス・ウベリス２３３、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ２０３３３、及びストレプトコッカス・アガラクティエ０２５０から単離したリポタイコ酸の構造解析（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｓｔｉｔｉｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ２３３，  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ  ２０３３３  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ０２５０）」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，２０１２，３６１，２００−２０５に記載されているように、糖及びアミノ酸、特にＤ−アラニンで更に置換することができる。
【００８４】
実施例に示すように、Ｓ．ウベリスによるインビトロでのバイオフィルムの形成は、モノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在下及び本発明の免疫原性剤でワクチン接種した動物由来の血清の存在下で有意に阻害されることが観察される。
【００８５】
従って、モノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在による、及び本発明の免疫原性剤でワクチン接種した動物由来の血清の存在下におけるバイオフィルム形成の阻害は、上皮細胞への微生物付着の阻害をもたらし、結果としてＳ．ウベリスによるコロニー形成／感染の可能性を減少させる。
【００８６】
従って、本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくは、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。本発明の一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクル及び／又は薬学的に許容されるアジュバントも含む。適切なビヒクル及びアジュバントは、ワクチンに対応する次のセクションに開示されている。
【００８７】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【００８８】
本発明の別の態様は、バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【００８９】
既に言及したように、バイオフィルム産生細菌を同定するための当業者に周知の方法がある。バイオフィルム産生細菌の例には、とりわけ、ストレプトコッカス・ウベリス、緑膿菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、アクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、肺炎桿菌、及びブルホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）等がある。
【００９０】
好ましい実施形態において、本発明は、臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【００９１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【００９２】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、ストプレトコッカスウベリス由来のリポタイコ酸を含む。より好ましい実施形態では、リポタイコ酸は、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株の培養物から熱処理されたバイオフィルムを含む免疫原性剤に由来する。
【００９３】
ワクチン
【００９４】
本発明の一態様は、本発明の免疫原性剤の免疫学的に有効な量を含むワクチンに関する。
【００９５】
このワクチンは、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる感染症に対する、及び／又はＳ．ウベリスによる感染に由来する病状、特に乳腺炎に対する免疫防御応答を提供するのに適している。
【００９６】
実施例で提供する実験結果に示されるように、このワクチンはまた、バイオフィルム産生細菌のバイオフィルム形成を阻害するのに適している。
【００９７】
「免疫学的に有効」という表現は、ワクチン接種手順において投与される免疫原性剤の量が、単回投与又は様々な投与に関わらず、ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスの病原性形態の感染に対してワクチン接種動物に有効な免疫防御応答を誘導するのに十分であることを意味する。
【００９８】
防御応答は、例えば、病原性細菌の不在又は排除によって、あるいは非ワクチン接種動物に対してワクチン接種動物における病原性細菌の数が減少することによって、あるいは感染の臨床徴候の不在、即ち、臨床的又は亜臨床的乳腺炎の兆候が現れていないことによって、あるいはワクチン接種動物においてこれらの徴候が弱化又は減少していることによって評価することができる。臨床的乳腺炎の場合、乳腺の炎症又は直腸温度の上昇、乳中の目に見える異常の出現、例えば、痛み及び乳腺の炎症を伴う可能性のあるタンパク質凝集物又は凝固物、更には主としてタンパク質凝集物からなる分泌物産生の兆候をとりわけ確認することができる。乳腺炎の亜臨床的徴候に関しては、とりわけ、乳又は乳房に目に見える変化を生じさせない乳腺の炎症、乳産生の低下及び乳品質の低下が示され得る。
【００９９】
一般に、ワクチンは、１用量当たり１〜５０ｍｇの乾燥抽出物、好ましくは１用量当たり２〜２５ｍｇ、より好ましくは１用量あたり４〜１２ｍｇを含む量の本発明の免疫原性剤を含む。
【０１００】
本発明の抗原の免疫学的に有効な量は、ワクチン接種動物の種、年齢、及び体重の関数として、またその健康状態及び身体状態並びに投与方法の関数として変わることがある。通常、免疫学的に有効な量は特定の範囲内で変動し、当業者が日常的な試験によって量を決定することに何ら困難はない。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、ワクチンはまた、薬学的に許容されるビヒクル及び／又は薬学的に許容されるアジュバントを含む。
【０１０２】
特にワクチンが水性相及び油性相を含みエマルジョンの形態である場合に、担体自体がアジュバントとして作用することもできる。
【０１０３】
ワクチンは、一般に液体の形態で、溶液、エマルジョン、又は懸濁液として投与され、好ましくはエマルジョンの形態である。また、ワクチンは、投与前に液体ビヒクル中に溶解、懸濁、又は乳化される固体形態であってもよい。
【０１０４】
液体形態のワクチンを調製するのに適したビヒクルには、水、又は等張性生理食塩溶液、即ち、生理学的細胞媒質の塩濃度に等しい塩濃度を有する溶液、又は脂、又は細菌が培養される培養液、あるいはこれらの混合物が含まれる。
【０１０５】
更に、所望に応じて、ビヒクルは他の補助物質又は薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、例えば、湿潤剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤（例えばリン酸緩衝剤）、安定剤、例えば炭水化物（例えばグルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、若しくはデキストラン）、又はタンパク質（例えば、アルブミン、カゼイン、ウシ血清、若しくは脱脂乳）が挙げられる。
【０１０６】
賦形剤の物理化学的特性及びそれらが市販されている市販製品の名称は、Ｒ．Ｃ．  Ｒｏｗｅら、「医薬品添加物ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）」、第４版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、２００３［ＩＳＢＮ：０−８５３６９−４７２−９］の本に見出すことができる。
【０１０７】
アジュバントは、当該技術分野において周知であるように、免疫系の非特異的な覚醒剤であり、抗原と共に投与され、免疫応答をより有効にする。アジュバントの例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、ビタミンＥ、スクワラン、スクワレン、チョウセンニンジン、ザイモサン、グルカン、ジメチルアミノエチル−デキストラン、デキストラン、非イオン性ブロックポリマー、モノホスホリルリピドＡ、植物油、サポニン、フロイント完全アジュバント、Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルジョン、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１０８】
エマルジョンは、分散相を作る液体の分散物として、第１の相が混和しない連続相である第２の液体中に定義され、特に相は水及び油である。エマルジョンは、乳化剤として使用される界面活性剤のタイプの関数として、また２つの相の間の関係の関数として、Ｗ／Ｏ、Ｏ／Ｗ、Ｗ／Ｏ／Ｗ型のものであり得る。
【０１０９】
本発明の一実施形態では、ワクチンは、水性相、油性相、及び乳化剤として作用する界面活性剤を含むようなエマルジョンの形態である。本発明の免疫原性剤は、典型的には、水性相に溶解される。
【０１１０】
特に好ましい実施形態では、ワクチンは、鉱油と、脂肪酸及び糖アルコールから得られた製品（例えば、ＳＥＰＰＩＣ社によって商品名Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）で市販されているもの）との組み合わせに基づくアジュバントを含む。このアジュバントを用いてＷ／Ｏ／Ｗ型のエマルジョンを調製することができる。
【０１１１】
また、ワクチンは、好ましくは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、ビタミンＥ、スクワラン、スクワレン、チョウセンニンジン、ザイモサン、グルカン、ジメチルアミノエチル−デキストラン、デキストラン、非イオン性ブロックポリマー、モノホスホリルリピドＡ、サポニン、及びこれらの混合物から選択される追加のアジュバントを含む。
【０１１２】
本発明のより好ましい態様において、ワクチンはモノホスホリルリピドＡを含む。
【０１１３】
モノホスホリルリピドａ（ＭＰＬＡ又はＭＰＬ）は、細菌リポ多糖、通常はサルモネラミネソタのリポ多糖から得られるワクチンを調製するための既知のアジュバントであり、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社から「リピドＡ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒｅ５９５（Ｒｅ変異体）由来のモノホスホリル」（製品Ｌ６８９５）で市販されているものなどがある。本発明の文脈において、モノホスホリルリピドＡはまた、アジュバントとしても適しているその誘導体及びその合成類似体を含む。アジュバントとして使用されるモノホスホリルリピドＡの誘導体の中で、誘導体３−脱アシル化（３Ｄ−ＭＰＬ又は３Ｄ−ＭＰＬＡ）が顕著であり、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）社からＭＰＬ（登録商標）の名称で市販されているものがある。モノホスホリルリピドＡの合成類似体も使用することができ、例えば国際特許出願第２００８／１５３５４１−Ａ１に記載されているもの、又はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（製品ＰＨＡＤ（登録商標））若しくはＡｄｉｐｏＧｅｎ社（製品ＡＧ−ＣＵ１−０００２）によって市販されているものが使用できる。
【０１１４】
ワクチンは、経口、局所、経皮、経粘膜、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は乳房内の経路によって投与することができ、好ましくは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内又は乳房内、より好ましくは、筋肉内経路によって投与される。
【０１１５】
このワクチンは、例えばレミントンのマニュアル「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２０００［ＩＳＢＮ：０−６８３−３０６４７２］に記載されているように、様々な投与形態に適した医薬製剤の調製のために当業者が使用する通常の方法に従って調製することができる。
【０１１６】
本発明のような注射用ワクチンの用量の通常量は、０．５ｍＬ〜５ｍＬ、好ましくは１ｍＬ〜３ｍＬ、より好ましくは１ｍＬ〜２ｍＬである。
【０１１７】
実施例の有効性試験に記載されているように、本発明によるワクチンは、Ｓ．ウベリス病原性株による感染から妊娠泌乳牛を防御するのに有効であり、このことは、感染の１４日後及び１９日後の乳中のバクテリア数の明らかな減少により、また乳腺炎の臨床的徴候の改善により確認されている。ワクチンはウサギの実験モデルにおいても有効であり、非ワクチン接種動物に対して、感染後２４時間又は４８時間に臨床的徴候の減少、及び乳房組織内のＳ．ウベリス数の顕著な減少が観察されている。
【０１１８】
乳房組織におけるＳ．ウベリス数の減少は、ホルムアルデヒド処理によって不活化したＳ．ウベリス菌株から得られた古典的なバクテリンでワクチン接種した動物と比較して、本発明のワクチンでワクチン接種した動物では感染後２４時間でも観察された。
【０１１９】
従って、本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくはストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するための、本発明の免疫原性剤を含むワクチンに関する。
【０１２０】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するためのワクチンに関する。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのワクチンに関する。
【０１２２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するためのワクチンに関する。
【０１２３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するためのワクチンに関する。
【０１２４】
本発明の枠組みにおいて、予防という用語は予防的又は予防的目的、即ち、ストレプトコッカス種、特にＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の出現を予防又は遅延させることを目的としたワクチンの投与に関する。「治療」という用語は、治療目的、即ち、ストレプトコッカス種、特にＳ．ウベリスによる乳腺炎及び／又は感染の症状を排除、軽減、改善、あるいは既にそれらを呈している場合には緩和することを目的としたワクチンの投与に関連する。
【０１２５】
本発明の枠組みにおいて、ストレプトコッカス種、特にＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症は、これまでに示したように、ストレプトコッカス種、特にＳ．ウベリスによって引き起こされる感染症に対して感受性の任意の動物、典型的には哺乳類、好ましくは反芻動物、より好ましくは乳牛（又はウシ）、ヒツジ（又はｏｖｉｎｅ）、ブタ（又はｐｏｒｃｉｎｅ）、あるいはヤギ（又はｃａｐｒｉｎｅ）に対するその一般的な影響に関する。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本発明の免疫原性剤を含むワクチンは、家畜のウシの乳腺炎（又はウシ乳腺炎）、より好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎の予防及び／又は治療に使用され、さらにより好ましくは、乳牛におけるウシ乳腺炎の予防及び／又は治療のために使用される。
【０１２７】
動物は任意の適切な時期にワクチン接種を受けることができる。従って、ワクチンは、ストレプトコッカス種、特にＳ．ウベリスに感染する危険性がある動物に予防的に投与することができる。
【０１２８】
特に好ましい実施形態では、本発明の免疫原性剤を含むワクチンは、乳腺炎の予防のために予防的に使用される。
【０１２９】
ワクチンは、１回以上投与することができる。当技術分野で周知であるように、複数回用量ワクチン接種は、第１の免疫化用量に続いて、ブースター量として作用する１回以上の追加用量を投与することから構成される。ワクチン接種に最も適した投与回数及びそれらの時間間隔は、日常的な試験に従って決定することができる。
【０１３０】
本発明の一実施形態では、ワクチンは単回投与である。
【０１３１】
本発明の別の実施形態では、ワクチンは２回以上、好ましくは２回又は３回、より好ましくは３回投与される。異なる用量が、好ましくは１０〜７０日、より好ましくは２０〜６０日を含む投与の時間間隔で投与される。
【０１３２】
ワクチンは、本発明の方法によって得られる免疫原性剤と１種以上の更なる免疫原性剤との組み合わせを更に含むことができる。
【０１３３】
本発明の免疫原性剤と組み合わせることができる免疫原性剤は、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ、大腸菌、クレブシエラ種、マイコプラズマ・ボビス、及び黄色ブドウ球菌、とりわけ、好ましくはストレプトコッカス・アガラクティエ、黄色ブドウ球菌及び／又は大腸菌を含む。
【０１３４】
本発明の別の態様は、ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するため、好ましくはストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防にワクチンとして使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【０１３５】
好ましい実施形態では、本発明は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するため、好ましくは、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防にワクチンとして使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【０１３６】
本発明の別の態様は、バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【０１３７】
好ましい実施形態において、本発明は、臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【０１３８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するためのタイコ酸、好ましくはリポタイコ酸を含む医薬組成物に関する。
【０１３９】
ワクチン接種キット
【０１４０】
本発明の別の態様は、Ｓ．ウベリスによる感染に対して動物にワクチン接種するための、特に乳腺炎に対して動物にワクチン接種するためのワクチン接種キットに関する。
【０１４１】
このワクチン接種キットは、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性剤又は本発明のワクチンを含む容器を含む。
【０１４２】
好ましい実施形態では、免疫原性剤又はワクチンは、すぐに使用できる単一の容器内にある。
【０１４３】
好ましい実施形態では、免疫原性剤は凍結乾燥形態である。
【０１４４】
別の好ましい実施形態では、キットはまた、薬学的に許容されるビヒクル又は希釈剤を含有する第２の容器を含む。この実施形態は、免疫原性剤を凍結乾燥形態で使用する場合に特に適切である。
【０１４５】
別の好ましい実施形態では、キットはまた、本発明の免疫原性剤又はワクチンの投与のための情報を含む有益なマニュアル又はリーフレットを含む。
【０１４６】
したがって、本発明の一態様は、ストレプトコッカス種又はバイオフィルム産生バクテリアによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくはストレプトコッカス種又はバイオフィルム産生バクテリアによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防のため、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防のため、好ましくは臨床的乳腺炎及び／又は亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するためのワクチンキットであり、好ましくは、本発明の免疫原性剤又はワクチンの投与のための情報を含む有益なマニュアル又はリーフレットを伴う。
【０１４７】
本発明は、以下の実施形態を含む。
【０１４８】
１．ａ）バイオフィルムを得るためにバイオフィルム産生Ｓ．ウベリス株をインキュベートする工程と、ｂ）工程ａ）で得られたバイオフィルムに熱的加熱処理を施す工程と、を含むことを特徴とする免疫原性剤の調製方法。
【０１４９】
２．インキュベーションが１％〜１０％の二酸化炭素を含む雰囲気中で行われることを特徴とする、実施形態１に記載の方法。
【０１５０】
３．工程ａ）において、培地が、０．１〜２％ｗ／ｖの酵母抽出物を補充したＴＳＢであることを特徴とする、実施形態１又は２に記載の方法。
【０１５１】
４．工程ａ）において、培養が３０℃〜４５℃間の温度で行われることを特徴とする、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
５．工程ａ）において、培養が２４時間〜１６８時間の期間行われることを特徴とする、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
６．工程ｂ）において、熱処理が８０℃〜１３０℃の温度で行われることを特徴とする、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
７．工程ｂ）において、熱処理が５〜７５分の期間行われることを特徴とする、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
８．工程ａ）の後、且つ工程ｂ）の前に、培地からバイオフィルムを回収する追加の工程を含むことを特徴とする、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
９．工程ａ）で形成されたバイオフィルムを回収するためにトリプシンを使用することを特徴とする、実施形態８に記載の方法。
【０１５７】
１０．回収したバイオフィルムを水溶液中に懸濁させることを特徴とする、実施形態８又は９に記載の方法。
【０１５８】
１１．工程ｂ）の熱処理後に得られた不溶性画分を廃棄し、可溶性抽出物を保存する工程を含むことを特徴とする、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
１２．実施形態１〜１１のいずれか１つの方法によって得ることができる免疫原性剤。
【０１６０】
１３．バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株の培養物由来の熱的加熱処理されたバイオフィルムを含む免疫原性剤。
【０１６１】
１４．水性懸濁液、水溶液又は凍結乾燥の形態であることを特徴とする、実施形態１２又は１３に記載の免疫原性剤。
【０１６２】
１５．ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態１２〜１４のいずれか１つに記載の免疫原性剤。
【０１６３】
１６．ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するための、実施形態１５に記載の免疫原性剤。
【０１６４】
１７．ストレプトコッカス種がＳ．ウベリスであることを特徴とする、実施形態１５又は１６に記載の免疫原性剤。
【０１６５】
１８．臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態１５又は１７に記載の免疫原性剤。
【０１６６】
１９．亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態１５又は１７に記載の免疫原性剤。
【０１６７】
２０．免疫学的に有効な量の実施形態１２〜１４のいずれかに記載の免疫原性剤を含むワクチン。
【０１６８】
２１．薬学的に許容されるビヒクル及び／又は薬学的に許容されるアジュバントも含むことを特徴とする、実施形態２０に記載のワクチン。
【０１６９】
２２．エマルジョン、懸濁液、又は溶液の形態であることを特徴とする、実施形態２０又は２１に記載のワクチン。
【０１７０】
２３．水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、ビタミンＥ、スクワラン、スクワレン、チョウセンニンジン、ザイモサン、グルカン、ジメチルアミノエチル−デキストラン、デキストラン、非イオン性ブロックポリマー、モノホスホリルリピドＡ、サポニン、及びこれらの混合物から選択されるアジュバントを含むことを特徴とする実施形態２１に記載のワクチン。
【０１７１】
２４．モノホスホリルリピドＡを含むことを特徴とする、実施形態２３に記載のワクチン。
【０１７２】
２５．追加の免疫原性剤を含むことを特徴とする、実施形態２０〜２４のいずれか１つに記載のワクチン。
【０１７３】
２６．ストレプトコッカス・アガラクティエ、黄色ブドウ球菌、クレブシエラ種、マイコプラズマ・ボビス、及び大腸菌で構成される群から選択される追加の免疫原性剤を含むことを特徴とする、実施形態２５に記載のワクチン。
【０１７４】
２７．皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は乳房的経路によって投与されることを特徴とする、実施形態２０〜２６のいずれか１つに記載のワクチン。
【０１７５】
２８．筋肉内経路によって投与されることを特徴とする、実施形態２７に記載のワクチン。
【０１７６】
２９．１回又は複数回で投与されることを特徴とする、実施形態２０〜２８のいずれかに記載のワクチン。
【０１７７】
３０．２回又は３回で投与されることを特徴とする、実施形態２９に記載のワクチン。
【０１７８】
３１．ストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するため、好ましくはストレプトコッカス種によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するための、実施形態２０〜３０のいずれか１つに記載のワクチン。
【０１７９】
３２．Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するための、実施形態３１に記載のワクチン。
【０１８０】
３３．バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態２０〜３０のいずれか１つに記載のワクチン。
【０１８１】
３４．臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載のワクチン。
【０１８２】
３５．亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態３１〜３３のいずれか１つに記載のワクチン。
【０１８３】
３６．免疫学的に有効な量の実施形態１２〜１４のいずれかに記載の免疫原性剤又は実施形態２０〜２６のいずれかに記載のワクチンを含む容器を含むことを特徴とする、ワクチン接種キット。
【０１８４】
３７．免疫原性剤又はワクチンがすぐに使用できる単一の容器内にあることを特徴とする、実施形態３６に記載のキット。
【０１８５】
３８．免疫原性剤が凍結乾燥形態であることを特徴とする、実施形態３６に記載のキット。
【０１８６】
３９．薬学的に許容されるビヒクル又は希釈剤を含有する第２の容器も含むことを特徴とする、実施形態３８に記載のキット。
【０１８７】
４０．実施形態１２〜１４のいずれかに記載の免疫原性剤又は実施形態２０〜２６のいずれかに記載のワクチンの投与のための情報を含む有益なマニュアル又はリーフレットも含むことを特徴とする、実施形態３６〜３９のいずれか１つに記載のキット。
【０１８８】
４１．ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸を含む医薬組成物。
【０１８９】
４２．ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防に使用するための、実施形態４１に記載の医薬組成物。
【０１９０】
４３．バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に使用するためのタイコ酸を含む医薬組成物。
【０１９１】
４４．臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態４１〜４３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１９２】
４５．亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療に使用するための、実施形態４１〜４３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１９３】
４６．タイコ酸がリポタイコ酸であることを特徴とする、実施形態４１〜４５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０１９４】
４７．リポタイコ酸がＳ．ウベリス由来であることを特徴とする、実施形態４６に記載の医薬組成物。
【０１９５】
４８．リポタイコ酸が、バイオフィルム産生Ｓ．ウベリス菌株の培養物由来の熱的加熱処理されたバイオフィルムを含む免疫原性剤に由来することを特徴とする、実施形態４７に記載の医薬組成物。
【０１９６】
４９．ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するためのタイコ酸を含む、医薬組成物。
【０１９７】
５０．ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防にワクチンとしての使用するための、実施形態４９に記載の医薬組成物。
【０１９８】
５１．バイオフィルム産生細菌によって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するためのタイコ酸を含む医薬組成物。
【０１９９】
５２．臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するための、実施形態４９〜５１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０２００】
５３．亜臨床的乳腺炎の予防及び／又は治療にワクチンとして使用するための、実施形態４９〜５１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０２０１】
５４．タイコ酸がリポタイコ酸であることを特徴とする、実施形態４９〜５３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【０２０２】
５５．リポタイコ酸がストレプトコッカス・ウベリス由来であることを特徴とする、実施形態５４に記載の医薬組成物。
【０２０３】
５６．リポタイコ酸が、バイオフィルム産生ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリス菌株の培養物由来の熱的加熱処理されたバイオフィルムを含む免疫原性剤に由来することを特徴とする、実施形態５５に記載の医薬組成物。
【実施例】
【０２０４】
実施例１  免疫原性剤の調製
【０２０５】
この方法ではＳ．ウベリスの菌株５６１６を使用して本発明の免疫原性剤を調製し、この菌株はスペインで臨床的ウシ乳腺炎の症例から得られたフィールド分離物である。この菌株は、Ｇ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ、「乳房内感染症に関連するＳ．ウベリスによるバイオフィルム産生（Ｂｉｏｆｉｌｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、２００９年、テネシー大学栄誉研究プロジェクトに記載されたマイクロプレート試験で確認したところ、バイオフィルム産生株であった。
【０２０６】
接種物は、最初に凍結乾燥細菌を水中に滅菌注射用に懸濁して１０９細菌／ｍｌの濃度が得られるまで培養し、続いてＴＳＢ＋０．５％ＹＥ培地を１／１００の割合でこの懸濁液に感染させ、１６時間３７℃でインキュベートして調製した。
【０２０７】
次いで２２５ｃｍ２のＦａｌｃｏｎ（登録商標）型細胞培養瓶（ＤＤＢｉｏｌａｂ）を、前もって調製した接種物とＴＳＢ＋０．５％ＹＥ培地とで調製した１：１００の割合の混合物１００ｍｌに感染させ、オーブン内で３７℃及び二酸化炭素含有量約５％の雰囲気下で４日間インキュベートした。
【０２０８】
培養の完了後、懸濁液中に細菌細胞を含む培養瓶から媒質を除去し、４０ｍｌのトリプシン水溶液（トリプシン溶液１ｘ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、温度３７℃で１５分間攪拌しながら維持した。
【０２０９】
瓶の内容物を空にし、得られた懸濁液を１５，３００ｇで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【０２１０】
沈降した残留物を０．５ｍｌの注射用水に再懸濁し、次いでこの懸濁液を１２１℃で４５分間加熱した。次いで１５，３００ｇで１５分間遠心分離し、上清を保存し、沈降した残渣を廃棄した。
【０２１１】
上清溶液を凍結乾燥して乾燥した免疫学的薬剤を得た。
【０２１２】
実施例２  妊娠泌乳ウサギにおけるワクチンの有効性試験
【０２１３】
２０匹の妊娠ウサギの群を、実施例１に記載の方法と類似の方法により得られた免疫原性剤の溶液を４ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するワクチン１ｍｌにＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）（ＳＥＰＰＩＣ）シリーズの油性アジュバントを水溶液とアジュバントの比率１：１で配合して、妊娠１３日及び２７日に皮下投与することにより免疫化した。２０匹のウサギ対照群と差異を比較した。感染は、最後のウサギの出産の１５〜２０日後に１０３ＣＦＵ／ｍｌの速度でＳ．ウベリス病原性株の懸濁液１００μｌを注射することにより、乳房内経路によって実施した。
【０２１４】
ワクチンの有効性を決定するために、非ワクチン接種感染対照群に対するワクチン接種感染群について、直腸温度、感染２４時間後の組織のＣＦＵ／ｇ及び感染した乳腺の局所臨床徴候のパラメータを決定した。
【０２１５】
実験データを、ＳＰＳＳ１４．０プログラムによって統計的に処理した。結果が正規分布に従う場合にはＡＮＯＶＡ分析を行い、そうでなければ、２群の場合のマンホイットニーＵ検定又はカイ二乗検定などのノンパラメトリック検定を用いた。
【０２１６】
・感染後２４時間の平均温度の低下（図１）、
・感染後２４時間の組織のＣＦＵ／ｇの減少（図２）、及び
・感染後の罹患腺の感受性の低下（図３）
が観察されたため、結果は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる感染症を予防するための本発明の免疫原性剤の有効性を明らかに示した。
【０２１７】
実施例３  妊娠泌乳牛におけるワクチンの有効性試験
【０２１８】
１０頭の妊娠牛の群を、実施例１に記載の方法と類似の方法により得られた免疫原性剤の溶液を４ｍｇ／ｍｌの濃度で含有するワクチン２ｍｌにＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）（ＳＥＰＰＩＣ）シリーズの油性アジュバントを水溶液とアジュバントの比率１：１で配合して、推定出産日の３１日前及び１０日前に筋肉内経路によって投与して免疫化した。１０頭の乳牛によって形成された対照群と差異を比較した。感染は、推定出産日の１６日後に１０２ＣＦＵ／ｍｌの割合でＳ．ウベリス病原性株の懸濁液５ｍｌを注射することにより、乳房内経路によって行った。
【０２１９】
ワクチンの有効性を決定するために、非ワクチン接種感染対照群に対するワクチン接種感染群について、直腸温度、感染後の乳中のＣＦＵ／ｍｌ及びＳＣ／ｍｌ（ＳＣ＝体細胞）の数、並びに感染した乳房の局所臨床徴候のパラメータを決定した。
【０２２０】
免疫化された乳牛において誘導された血清学的応答も、実験ワクチンを用いて分析した。血清をＥＬＩＳＡにより分析して、Ｓ．ウベリスに対する抗体の存在を検出した。
【０２２１】
ワクチン接種の安全性を確認するために、免疫化後に乳牛で観察される可能性のある臨床的徴候を評価した。動物に対するワクチン接種の可能性のある否定的効果を除外するために、出生後の臨床徴候及び子牛の死亡率も評価した。
【０２２２】
実験データを、ＳＰＳＳ１４．０プログラムによって統計的に処理した。結果が正規分布に従う場合にはＡＮＯＶＡ分析を行い、そうでなければ、２群の場合のマンホイットニーＵ検定又はカイ二乗検定などのノンパラメトリック検定を用いた。
【０２２３】
ワクチン接種中の直腸温度に関して、ワクチン接種の前日及び再ワクチン接種の前日も、温度を記録したその後の３日間も群間差は認められなかった。
【０２２４】
感染後に、対照群に対してワクチン接種群において、
・感染２日後の温度低下（図４）、
・乳中のＣＦＵ／ｍｌの減少（図５）、
・対照群と比較した乳産生量の増加（図６）、及び
・研究終了時の乳中の体細胞数（ＳＣ／ｍｌ）の減少（図７）
が観察されたことから、結果は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる感染症を予防するための本発明の免疫原性剤の有効性を明らかに示した。
【０２２５】
従って、本発明の免疫原性剤は、Ｓ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎の予防に有効であり、ストレプトコッカス種、好ましくはＳ．ウベリスによって引き起こされる乳腺炎及び／又は感染症の予防及び／又は治療に適していると結論することができる。
【０２２６】
実施例４  Ｓ．ウベリスの培養物中のモノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在によるインビトロでのバイオフィルム産生の阻害
【０２２７】
この試験では、Ｓ．ウベリス菌株を、Ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃら（前掲）に開示されている方法に実質的にしたがって、９６ウェルマイクロプレート中で４種の濃度のモノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在下で培養した。
【０２２８】
この研究では、５６１６と称されるＳ．ウベリス菌株を使用した。この菌株を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中で、ＴＳＢ＋０．５％ＹＥを使用してｐＨ７．５で２０時間及び２４時間繁殖させ培養した。
【０２２９】
モノクローナル抗体抗ＬＴＡは、０．０２％アジ化ナトリウムを含有する低エンドトキシンレベルを有する培地で＞２００μｇ／ｍｌの濃度を示すカタログＮｒ．ＨＭ２０４８をＨｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（オランダ）から購入した。
【０２３０】
この試験で使用したモノクローナル抗体希釈液は、１：１０、１：２５、１：５０、及び１：１００であった。
【０２３１】
モノクローナル抗体が存在しないＳ．ウベリスの対照培養物も調製した。
【０２３２】
菌株は振盪せずにウェル中でインキュベートした。各リファレンスについて８ウェルを使用した。
【０２３３】
インキュベーション後に、５５０ｎｍでの光学密度を記録して、微生物の増殖能力を確認した。グループ間に有意差は認められなかった。
【０２３４】
その後、ウェルをデカントし、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で洗浄し、３７℃で約１時間乾燥させた。乾燥させた管をクリスタルバイオレット（０．１％）で染色した。過剰の染色液を除去し、ウェルを滅菌水で洗浄した。
【０２３５】
色素を９５％エタノールで可溶化し、５９５ｎｍでの光学濃度を記録して、バイオフィルム産生の阻害を評価した。
【０２３６】
各群について得られた結果を表Ｉに示す。
【０２３７】
【表１】
2019504623.tif 000002
【０２３８】
＊は、ソフトウェアＳＰＳＳ  ｖ２２（ＩＢＭ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ）を用いた１因子ＡＮＯＶＡ分析により、対照群と比較して、結果がｐ値＜０．０５で統計的に有意であったことを示す。
【０２３９】
図８は、異なる濃度（１：１０希釈に対する１：２５希釈）のモノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在下及びその非存在下（対照群、ＧＣ）におけるＳ．ウベリスのインビトロ培養物に対応する５９５ｎｍでの光学密度を表す。
【０２４０】
結果は、１：１０及び１：２５希釈の培養物におけるこれらのモノクローナル抗体抗ＬＴＡの存在が、このようなモノクローナル抗体が存在しない培養物と比較して、インビトロ条件下でバイオフィルムの形成を有意に阻害することを示す。
【０２４１】
実施例５  Ｓ．ウベリス培養物中の実施例１の免疫原性剤でワクチン接種した動物由来の血清の存在によるインビトロでのバイオフィルム産生の阻害
【０２４２】
この試験では、実施例１の免疫原性剤でワクチン接種した動物由来の血清の存在下で、Ｓ．ウベリス株を培養した。この研究では、５６１６と称されるＳ．ウベリス菌株を使用した。この菌株を、３７℃及び５％ＣＯ２に設定したインキュベーター中で、ＴＳＢ＋０．５％ＹＥを使用してｐＨ７．５で２０時間及び２４時間繁殖させ培養した。
【０２４３】
実施例３に開示した手順に従って免疫原性剤でワクチン接種した動物由来の血清を、ワクチン接種グループ（ＧＶ）として指定したリファレンスに１：２０００の希釈で使用した。
【０２４４】
ワクチン接種動物由来の血清を含まないＳ．ウベリスの対照培養物（ＧＣ）も調製した。
【０２４５】
菌株は振盪せずにウェル中でインキュベートした。各リファレンスについて８ウェルを使用した。
【０２４６】
インキュベーション後に、５５０ｎｍでの光学密度を記録して、微生物の増殖能力を確認した。２群の間に有意差は見られなかった。
【０２４７】
その後、ウェルをデカントし、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）で洗浄し、３７℃で約１時間乾燥させた。乾燥させた管をクリスタルバイオレット（０．１％）で染色した。過剰の染色液を除去し、ウェルを滅菌水で洗浄した。
【０２４８】
色素を９５％エタノールで可溶化し、５９５ｎｍでの光学濃度を記録して、バイオフィルム産生の阻害を評価した。
【０２４９】
図９は、本発明の免疫原性剤でワクチン接種した動物の血清の存在下（ワクチン接種群、ＧＶ）及び非存在下（対照群、ＣＧ）における、Ｓ．ウベリスのインビトロ培養物に対応する５９５ｎｍでの光学密度を表す。
【０２５０】
結果は、本発明の免疫原性剤でワクチン接種した動物の血清の存在が、このような血清を含まない培養物と比較して、インビトロ条件下でバイオフィルムの形成を有意に阻害することを示す（ｐ値＜０．０５、ｔ−ステューデント検定）。
【図１】
2019504623.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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