(57)【要約】  哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に有用な細菌株は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力に関して細菌株をスクリーニングすることによって選択される。次に、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株を、アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するために選択する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための細菌株の選択方法であって、
ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力に関して細菌株をスクリーニングすること；並びに
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株を選択すること、
を含む前記方法。
【請求項２】
細菌株を選択することが、ＤａｇＫを産生する能力を有し、且つＤａｇＫを細胞外に放出可能である細菌株を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌株をスクリーニングすることが、ＤａｇＫを産生する能力に関して乳酸菌株をスクリーニングすることを含み；及び
前記細菌株を選択することが、ＤａｇＫを産生する能力を有する乳酸菌株を選択することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳酸菌株をスクリーニングすることが、ＤａｇＫを産生する能力に関してラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株をスクリーニングすることを含み；及び
前記乳酸菌株を選択することが、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株を選択することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｌ．ロイテリ株を選択することが、前記哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株を選択することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記乳酸菌株をスクリーニングすることが、ＤａｇＫを産生する能力に関してラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株をスクリーニングすることを含み；及び
前記乳酸菌株を選択することが、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株を選択することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ．ファーメンタム株を選択することが、前記哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株を選択することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌株をスクリーニングすることが、ｄａｇＫ遺伝子等のＤａｇＫをコードする遺伝子の存在に関して前記細菌株をスクリーニングすることを含み；及び
前記細菌株を選択することが、前記ｄａｇＫ遺伝子等のＤａｇＫをコードする前記遺伝子含む細菌株を選択することを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細菌株をスクリーニングすることが、前記細菌株の細胞質ゾル中のＤａｇＫの存在及び／又は前記細菌株を培養するそれぞれの培地中のＤａｇＫの存在に関して前記細菌株をスクリーニングすることを含み、及び
前記細菌株を選択することが、ｉ）細菌株の細胞質ゾル中にＤａｇＫを含む細菌株及び／又はｉｉ）前記細菌株を培養する培地がＤａｇＫを含む細菌株を選択することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ジアシルグリセロールの存在下で前記細菌株を培養することを更に含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力を有する細菌株であって、但し、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＬ．ロイテリ（Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない、上記細菌株。
【請求項１２】
前記アレルギーが、ピーナッツアレルギー等の食物アレルギー及び花粉アレルギーからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用のための細菌株。
【請求項１３】
前記細菌株が、ＤａｇＫを産生する能力を有し、且つＤａｇＫを細胞外に放出可能である細菌株である、請求項１１又は１２に記載の使用のための細菌株。
【請求項１４】
細菌株が、ＤａｇＫを産生する能力を有する乳酸菌株である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用のための細菌株。
【請求項１５】
前記乳酸菌株が、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カーノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、スポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、テトラジェノコッカス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、及びワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）からなる群から選択されるＤａｇＫを産生する能力を有する乳酸菌株であり、好ましくは、ラクトバチルス属、リューコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属及びストレプトコッカス属からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための細菌株。
【請求項１６】
前記乳酸菌株が、ＤａｇＫを産生する能力を有するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株である、請求項１４又は１５に記載の使用のための細菌株。
【請求項１７】
前記Ｌ．ロイテリ株が、前記哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためである、請求項１６に記載の使用のための細菌株。
【請求項１８】
前記乳酸菌株が、ＤａｇＫを産生する能力を有するラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株である、請求項１４又は１５に記載の使用のための細菌株。
【請求項１９】
前記Ｌ．ファーメンタム株が、前記哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためである、請求項１８に記載の使用のための細菌株。
【請求項２０】
前記乳酸菌株が、ＤａｇＫを産生する能力を有するストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）株又はストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株である、請求項１４又は１５に記載の使用のための細菌株。
【請求項２１】
前記Ｓ．サリバリウス株又は前記Ｓ．サーモフィルス株が、前記哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用されるためである、請求項２０に記載の使用のための細菌株。
【請求項２２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１１から２１のいずれか一項に記載の使用のための細菌株。
【請求項２３】
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療の方法であって、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力を有する細菌株であるが、但し、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない細菌株を、アレルギーに罹患しているか、又はアレルギーを発症するリスクを有する哺乳動物に投与することを含む、上記方法。
【請求項２４】
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＤＳＭ３２２７３。
【請求項２５】
前記哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための、請求項２４に記載のＬ．ロイテリ株。
【請求項２６】
哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのラクトバシルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５。
【請求項２７】
哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９。
【請求項２８】
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）株ＡＴＣＣ１４９３１。
【請求項２９】
前記哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための、請求項２８に記載のＬ．ファーメンタム株。
【請求項３０】
ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力を有する細菌株及びＨ１−抗ヒスタミン薬を含む抗アレルギー組成物。
【請求項３１】
前記Ｈ１−抗ヒスタミン薬が、セチリジン（ｃｅｔｉｒｉｚｉｎｅ）、エバスチン（ｅｂａｓｔｉｎｅ）、フェキソフェナジン（ｆｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅ）、ロラタジン（ｌｏｒａｔａｄｉｎｅ）及びデスロラタジン（ｄｅｓｌｏｒａｔａｄｉｎｅ）からなる群から選択される、請求項３０に記載の抗アレルギー組成物。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載の抗アレルギー組成物であって、但し、前記細菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５株及びＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９株からなる群からは選択されない、上記組成物。
【請求項３３】
医薬として使用するための請求項３０から３２のいずれか一項に記載の抗アレルギー組成物。
【請求項３４】
哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の抗アレルギー組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、一般的に、細菌株の選択、特に、アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に有用な細菌株の選択、並びにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー（アレルギー反応又はアレルギー疾患としても知られている）は、環境中のある物に対する免疫系の過敏症によって引き起こされる多くの症状である。アレルギーには、例えば、アレルギー性鼻炎（花粉症とも称される）；食物アレルギー；アトピー性皮膚炎（アトピー性湿疹とも称される）；アレルギー性喘息；及びアナフィラキシーが含まれる。症状は、一般的に、アレルギーの種類によって異なる。例えば、食物アレルギー（食品に対する異常な免疫反応である）は、軽度から重度の、かゆみ、舌の腫れ、嘔吐、下痢、息切れ、呼吸困難、又は低血圧に至る兆候及び症状を引き起こす可能性がある。これは通常、数分から数時間以内の曝露で生じる。それは、症状が重篤な場合には、アナフィラキシーとして知られている。
【０００３】
一般的な抗原、即ち、免疫系が認識した脅威（そうでなければ、体に無害であろうが）と戦う異常に激しい免疫応答を生じる抗原には、とりわけ、花粉及び食物が含まれる。基本的な機構には、免疫グロブリンＥ抗体（ＩｇＥ）が抗原に結合し、次に、肥満細胞又は好塩基球上の受容体に結合して、ヒスタミン等の炎症性化学物質の放出を誘発することが関わっている。
【０００４】
現在のアレルギー治療には、既知の抗原を避けること及び抗ヒスタミン薬等の薬剤を使用することが含まれる。抗ヒスタミン薬は、体内のヒスタミン受容体の活性に抵抗する薬剤である。抗ヒスタミン薬は、それらが作用するヒスタミン受容体に従ってサブクラスに分類される。抗ヒスタミン薬の２つの最も大きなクラスは、Ｈ１−抗ヒスタミン薬及びＨ２−抗ヒスタミン薬である。ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）を標的とする抗ヒスタミン薬は、主にアレルギー反応を治療するのに使用される。ヒスタミンＨ２受容体（Ｈ２Ｒ）を標的とする抗ヒスタミン薬は、胃腸系の症状を治療するのに使用される。
【０００５】
幾つかのより古いタイプの抗ヒスタミン薬は、眠気や調整機能の低下等の副作用によって役に立たなくなる。また、より新しいタイプの抗ヒスタミン薬は、口渇や頭痛等の望ましくない副作用を引き起こす可能性がある。従って、アレルギーを治療及び予防する新しい方法には、更なる改善の余地がある。
【０００６】
ヒト及び他の哺乳動物の体の様々な場所には、多くの異なる種の乳酸菌を含む、多くの異なる種の細菌が住み着いている。このような細菌は、長い間その宿主と共存し、様々な種類の相乗的な有益な効果をもたらしているが、今日では、それは、多様性を有し、現実に存在している細菌株に依存していることも知られている。米国の食糧農業機構（ＦＡＯ）と世界保健機構（ＷＨＯ）が現在採用している定義によれば、プロバイオティクスは「適正量投与すると宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」である。今日では、多くの異なる細菌、例えば、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の菌株等の乳酸産生細菌が、プロバイオティクスとして使用されている。
【０００７】
既知の乳酸菌の一例は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）（共生腸管ファーミキュート（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ））であり、多様な鳥類及び哺乳動物の種の胃腸管で広く分布しているプロバイオティックである。この生物は一般的に安全と認められており（ＧＲＡＳ）、且つ有益な微生物と認識されており、約２０年間、プロバイオティックとして世界的に使用されてきた。Ｌ．ロイテリは、腸上皮細胞、単球における炎症誘発性サイトカイン、及び異なるげっ歯類モデルにおける腸の炎症を抑制することが報告されている。
【０００８】
Ｌｅｅら（２００４年）は、乳酸菌を、ＩＬ−２等のＴｈ１細胞サイトカインの産生を促進しつつ、一方で、ＩＬ−４及びＩＬ−５等のＴｈ２細胞サイトカインの産生を抑制することを介する経口アレルギーの治療手段として使用することができることを開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に有用な細菌株を選択することが、一般的な目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
実施形態の態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための細菌株の選択方法に関する。この方法には、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力に関して細菌株をスクリーニングすることが含まれる。該方法には更に、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株を選択することが含まれる。
【００１１】
実施形態の別の態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株であって、但し、ラクトバチルス・ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  −６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない細菌株に関する。
【００１２】
実施形態の更なる態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療の方法に関する。この方法には、アレルギーに罹患しているか又はアレルギーを発症するリスクを有する哺乳動物に、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株を投与することが含まれるが、但し、該細菌株は、Ｌ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない。
【００１３】
実施形態の追加的な態様には、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＬ．ロイテリＤＳＭ３２２７３、哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９、及び哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）  ＡＴＣＣ１４９３１が含まれる。
【００１４】
実施形態の別の態様は、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株及びＨ１−抗ヒスタミン薬を含む抗アレルギー組成物に関する。
【００１５】
更なる態様は、医薬として使用するための、及び哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための、上記の抗アレルギー組成物に関する。
【００１６】
実施形態のＤａｇＫ産生細菌株により、Ｈ１Ｒシグナル伝達経路におけるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）シグナル伝達を終結させることができる。従って、アレルギー反応において放出されるヒスタミンは、Ｈ１Ｒシグナル伝達経路を介するその炎症誘発性作用の誘導を抑制するが、依然としてＨ２Ｒシグナル伝達経路を介するその抗炎症性作用の誘導は可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
実施形態並びに更なるその目的及び利点は、添付の図面と併せた以下の説明を参照することによって最も良く理解できる。
【００１８】
【図１】図１は、一実施形態に従う哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための細菌株の選択方法を示すフローチャートである。
【００１９】
【図２】図２は、Ｌ．ロイテリ野生型（ＷＴ）及びｈｄｃＡ突然変異体ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９がＤａｇＫを産生することを示す。ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＢに対して正規化された相対的なｍＲＮＡ標的遺伝子の発現レベルは、各細菌の３、６、２４及び４８時間の培養から示される。各細菌について３時間の培養から得られたｍＲＮＡを、１．０に設定して、相対的なｍＲＮＡの倍数における差を特定するためのキャリブレーターとして使用した。
【００２０】
【図３】図３は、Ｌ．ロイテリＤａｇＫのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。Ｌ．ロイテリＤａｇＫのアミノ酸配列は、トリプシン切断部位（縦線）と共に示されている。太字のアミノ酸は、このようなトリプシン処理の後に得られたペプチド配列を示す。黒いバーは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で見られたペプチド配列を示す。
【００２１】
【図４】図４は、Ｌ．ロイテリＤａｇＫのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。太字のアミノ酸は、得られたペプチド配列を示す。黒いバーは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験で見出されたペプチド配列を示す。
【００２２】
【図５】図５は、市販のＤａｇＫ阻害剤（ＤＧＫｉｎｈｉ）が、マウスエンテロイドにおけるＬ．ロイテリ由来ＤａｇＫが媒介するプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）のリン酸化を妨げることを示す。（ａ）は、哺乳動物のリン酸化ＰＫＣ（ｐＰＫＣ）を標的とする、培地コントロール（ＬＤＭ−４）のみと、ＷＴ  Ｌｒ（ＬＤＭ４中で増殖させたＷＴ  Ｌｒ）と、ＤａｇＫ阻害剤と、ＤａｇＫ阻害剤及びＷＴ  Ｌｒとを用いて４５分間処理した１０週齢の無菌（ＧＦ）雄マウスのマウス回腸エンテロイドから単離したタンパク質を示すウェスタンブロット分析を示す。１０μｇのタンパク質をＳＤＳゲルの各ウェルに入れた。ｐＰＫＣの合成比は、ＤａｇＫ阻害剤処理群のｐＰＫＣを１に設定し、ベースラインとして使用して、画像Ｊ分析によって得た。（ｂ）ｐＰＫＣタンパク質濃度（１０μｇ入れた）を示し、画像−ＪＧＦコントロール群を使用してデンシトメトリーによって定量したｎ＝３の平均値を、１に設定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。１群あたりｎ＝１０のマウス。ボンフェローニ補正による一元配置分散分析。
【００２３】
詳細な説明
本実施形態は、一般的に、細菌株の選択、特に、アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に有用な細菌株の選択、並びにその使用に関する。
【００２４】
本実施形態は、従来の抗ヒスタミン薬によるアプローチと比較した場合、アレルギーの予防及び治療の分野において根本的に異なるアプローチを採用している。先行技術との明らかな相違は、本実施形態では、アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に有益な細菌株を選択して使用することに基づいている。実施形態に従って選択され、そして使用される細菌株は、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤａｇＫ）を産生する能力を有する。
【００２５】
ＤａｇＫは、リン酸源としてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用して、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）からホスファチジン酸（ＰＡ）への転化を触媒する酵素である。非刺激細胞では、ＤａｇＫの活性は低いので、ＤＡＧをグリセロリン脂質の生合成に使用することができる。しかし、ホスホイノシチド経路の受容体が活性化されると、ＤａｇＫが活性化されて、ＤＡＧからＰＡへの転化への動きが高められる。ＤＡＧからＰＡへの転化により、ＤＡＧが減少するが、そうでなければ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化することができる。
【００２６】
ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１Ｒ）下流のシグナル伝達は、ＤａｇＫ合成によって、シグナル伝達に関与する脂質ＤＡＧを阻害することによって中断される。従って、本明細書に開示されるＤａｇＫ産生乳酸細菌株は、放出されたヒスタミンによる炎症誘発作用を抑制する。これにより、順に、アレルギー反応の結果として産生されたヒスタミンによるヒスタミンＨ２−受容体（Ｈ２Ｒ）の活性化のみが可能になる。そのようなＨ２Ｒの活性化により、抗炎症症状が促進される。
【００２７】
従って、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株は、Ｈ１Ｒ下流のシグナル伝達の抑制を引き起こすが、一方、アレルギー反応によって放出されたヒスタミンは、Ｈ２Ｒの活性化を誘導する。これらの組み合わせによって、ヒスタミンによる炎症誘発性作用を抑制し、且つ抗炎症性及び抗アレルギー症状を促進する。
細菌においては、酵素ＤａｇＫは、遺伝子ｄａｇＫによって発現される。
【００２８】
図１は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための細菌株の選択方法を示すフローチャートである。この方法には、ステップＳ１において、ＤａｇＫを産生する能力に関して細菌株をスクリーニングすることが含まれる。更に、この方法には、ステップＳ２において、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株を選択することが含まれる。
【００２９】
これにより、図１に示す方法を用いて、哺乳動物におけるアレルギーを回避、抑制及び／又は治療するのに有用な細菌株を同定し、且つ選択することができる。選択基準は、上記のように、アレルギー反応の結果として放出されるヒスタミンの炎症誘発性作用を抑制し、且つ放出されたヒスタミンの抗炎症作用を促進する、酵素ＤａｇＫを産生する能力である。
【００３０】
一実施形態では、図１のステップＳ２には、ＤａｇＫを産生する能力を有し、且つＤａｇＫを細胞外に放出可能である細菌株を選択することが含まれる。従って、この実施形態では、ステップＳ２で選択された細菌株は、ＤａｇＫを産生する能力を有するのみならず、可溶性のＤａｇＫにし、これにより、細胞外で、即ち、選択された細菌株の細胞の外でも利用可能になる。これは、細菌株が分泌することができ、或いはそうでなければＤａｇＫを細胞外に放出することができることを意味する。
【００３１】
一実施形態では、ＤａｇＫを産生する能力に関する細菌株のスクリーニングを、そのゲノム又はプラスミド等の発現カセットのいずれかにおいて、細菌株中のｄａｇＫ遺伝子等のジアシルグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の存在を検出することによって評価する。このような実施形態では、図１のステップＳ１には、ｄａｇＫ遺伝子等のＤａｇＫをコードする遺伝子の存在に関して細菌株をスクリーニングすることが含まれる。ステップＳ２には、この実施形態では、ｄａｇＫ遺伝子等のＤａｇＫをコードする遺伝子を含む細菌株を選択することが含まれる。
【００３２】
特定の実施形態では、細菌株には、ＤａｇＫをコードする活性遺伝子が含まれる。該遺伝子に関して活性とは、ＤａｇＫをコードする遺伝子が、細菌株中の構成的プロモーター又は細菌株中の誘導性プロモーターによって制御されること、即ち、プロモーターは、細菌株中で活性化又は誘導され得ることを意味する。
【００３３】
ＤａｇＫをコードする遺伝子の存在を検出するのに使用することができる様々な技術が利用可能である。非制限的且つ例示的な技術には、ＤａｇＫをコードする遺伝子の部分に相補的なプライマー又はＤａｇＫをコードする遺伝子のプロモーターに相補的なプライマーを使用して、ＤａｇＫをコードする遺伝子、その一部分、遺伝子のプロモーター、又はその一部分に対応する増幅されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列の存在を増幅及び検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。特に、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて、ＤａｇＫをコードする遺伝子の存在を検出することができる。他の技術には、種々のＤＮＡ配列決定技術が含まれる。
【００３４】
別の実施形態では、ＤａｇＫを産生する能力に関して細菌株をスクリーニングすることは、細菌細胞の細胞質ゾル中における、又は細菌株が追加的にＤａｇＫを分泌又は細胞外に放出することができる場合は、細菌株を培養している培地中等における、ＤａｇＫ酵素の存在を検出することによって評価される。この実施形態では、図１のステップＳ１には、細菌株の細胞質ゾル中のＤａｇＫの存在及び／又は細菌株を培養しているそれぞれの培地中のＤａｇＫの存在に関して細菌株をスクリーニングすることが含まれる。ステップＳ２には、この実施形態では、ｉ）その細胞質ゾル中にＤａｇＫを含む細菌株及び／又はｉｉ）細菌株が培養される培地にＤａｇＫを含む細菌株を選択するステップが含まれる。
【００３５】
細胞質ゾル及び／又は細菌細胞の培地中のＤａｇＫの存在を検出するのに使用することができる様々な技術が存在する。非限定的であるが例示的な技術には、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）；タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によって補完されるマトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）及びエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＴＯＦによるペプチド質量フィンガープリンティング等のタンパク質質量分析法；免疫電気泳動法において、抗ＤａｇＫ抗体を使用することが含まれる。
【００３６】
一実施形態では、図１の方法でスクリーニングされ、且つ選択された細菌株は、一般的に安全と認められる（ＧＲＡＳ）細菌株である。従って、アレルギーを予防、抑制及び／又は治療するために、哺乳動物に投与した場合、該細菌株は、好ましくは、いかなる疾患又は有害な症状も引き起こしてはいけない。従って、図１の方法に従って選択された細菌株は、好ましくは非病原性細菌株である。従って、このようなＧＲＡＳ細菌株は、好ましくは、いわゆる有益な微生物である。ＧＲＡＳである細菌株の特定の例は、非病原性プロバイオティック細菌等のプロバイオティック細菌である。従って、一実施形態では、図１のステップＳ１には、ＤａｇＫを生産する能力に関してプロバイオティク細菌株をスクリーニングすることが含まれ、ステップＳ２には、ＤａｇＫを産生する能力を有するプロバイオティック細菌株を選択することが含まれる。
【００３７】
一実施形態では、細菌株は乳酸菌株である。このような実施形態では、ステップＳ１には、ＤａｇＫを産生する能力に関して乳酸菌株をスクリーニングすることが含まれる。これに対応して、ステップＳ２には、ＤａｇＫを産生する能力を有する乳酸菌株を選択することが含まれる。
【００３８】
ラクトバチルス目(ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ)とも称される乳酸菌は、一般的な代謝及び生理学的特徴を共有する、グラム陽性、低ＧＣ、耐酸性、一般的に非胞子形成性、非呼吸性（ｎｏｎｒｅｓｐｉｒｉｎｇ）、桿菌又は球菌のいずれかのクレードである。これらの細菌は、炭水化物発酵の主要な代謝最終産物として乳酸を産生する。乳酸菌を含む属には、ラクトバチルス属、リューコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属及びストレプトコッカス属が含まれる。乳酸菌は更に、アエロコッカス属、カーノバクテリウム属、エンテロコッカス属、オエノコッカス属、スポロラクトバチルス属、テトラジェノコッカス属、バゴコッカス属、及びワイセラ属等の他の属にも見出すことができる。
【００３９】
ストレプトコッカス属の中の特定の好ましい細菌種には、ストレプトコッカス・サリバリウス及びストレプトコッカス・サーモフィルス（ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が含まれる。
【００４０】
特定の実施形態では、細菌株は、Ｓ．サリバリウス株又はＳ．サーモフィルス株である。この実施形態では、図１のステップＳ１には、ＤａｇＫを産生する能力に関してＳ．サリバリウス株又はＳ．サーモフィルス株をスクリーニングすることが含まれ、ステップＳ２には、これに対応して、ＤａｇＫを産生する能力を有するＳ．サリバリウス株又はＳ．サーモフィルス株を選択することが含まれる。
【００４１】
特定の実施形態では、ステップＳ２には、哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有するＳ．サリバリウス株又はＳ．サーモフィルス株を選択することが含まれる。
【００４２】
現在好ましい属は、ラクトバチルス属である。
ラクトバチルス属には、Ｌ．アセトトレランス（Ｌ．ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、Ｌ．アシジファリナエ（Ｌ．ａｃｉｄｉｆａｒｉｎａｅ）、Ｌ．アシジピスシス（Ｌ．ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ）、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アジリス（Ｌ．ａｇｉｌｉｓ）、Ｌ．アルギダス（Ｌ．ａｌｇｉｄｕｓ）、Ｌ．アリメンタリウス（Ｌ．ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．アミロリティクス（Ｌ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｌ．アミロフィルス（Ｌ．ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アミロトロピカス（Ｌ．ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、Ｌ．アミロボルス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、Ｌ．アニマリス（Ｌ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｌ．アントリ（Ｌ．ａｎｔｒｉ）、Ｌ．アポデミ（Ｌ．ａｐｏｄｅｍｉ）、Ｌ．アビアリエス（Ｌ．ａｖｉａｒｉｅｓ）、Ｌ．ビフェルメンタンス（Ｌ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．カメリアエ（Ｌ．ｃａｍｅｌｌｉａｅ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カテナフォルミス（Ｌ．ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ）、Ｌ．セチ（Ｌ．ｃｅｔｉ）、Ｌ．コレオホミニス（Ｌ．ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｌ．コリノイデス（Ｌ．ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、Ｌ．コンポスティ（Ｌ．ｃｏｍｐｏｓｔｉ）、Ｌ．コンカブス（Ｌ．ｃｏｎｃａｖｕｓ）、Ｌ．コリニフォルミス（Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｌ．クリスパタス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．クルストルム（Ｌ．ｃｒｕｓｔｏｒｕｍ）、Ｌ．クルバタスＬ．ｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｌ．デルブリュキイ亜種ブルガリクス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．デルブリュキイ亜種エルブリュキイ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．デルブリュキイ亜種ラクティス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．デキストリニクス（Ｌ．ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ）、Ｌ．ジオリボランス（Ｌ．ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、Ｌ．エクイ（Ｌ．ｅｑｕｉ）、Ｌ．エクイゲネロシ（Ｌ．ｅｑｕｉｇｅｎｅｒｏｓｉ）、Ｌ．ファラギニス（Ｌ．ｆａｒｒａｇｉｎｉｓ）、Ｌ．ファルシミニス（Ｌ．ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．フォルニカリス（Ｌ．ｆｏｒｎｉｃａｌｉｓ）、Ｌ．フルクチボランス（Ｌ．ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、Ｌ．フルメンティ（Ｌ．ｆｒｕｍｅｎｔｉ）、Ｌ．フルエンシス（Ｌ．ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ガリナルム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｌ．ガッセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ガストリクス（Ｌ．ｇａｓｔｒｉｃｕｓ）、Ｌ．ガネンシス（Ｌ．ｇｈａｎｅｎｓｉｓ）、Ｌ．グラミニス（Ｌ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、Ｌ．ハンメシイ（Ｌ．ｈａｍｍｅｓｉｉ）、Ｌ．ハムステル（Ｌ．ｈａｍｓｔｅｒ）、Ｌ．ハルビネンシス（Ｌ．ｈａｒｂｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ハヤキテンシス（Ｌ．ｈａｙａｋｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ヘルベティクス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．ヒルガルディイ（Ｌ．ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、Ｌ．ホモヒオチイ（Ｌ．ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ）、Ｌ．イネルス（Ｌ．ｉｎｅｒｓ）、Ｌ．イングルビエイ（Ｌ．ｉｎｇｌｕｖｉｅｉ）、Ｌ．インテスティナリス（Ｌ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、Ｌ．ジェンセニイ（Ｌ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．カリキセンシス（Ｌ．ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ケフィラノファシエンス（Ｌ．ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ）、Ｌ．ケフィリ（Ｌ．ｋｅｆｉｒｉ）、Ｌ．キムチ（Ｌ．ｋｉｍｃｈｉ）、Ｌ．キタサトニス（Ｌ．ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ）、Ｌ．クンケエイ（Ｌ．ｋｕｎｋｅｅｉ）、Ｌ．ライヒマンニイ（Ｌ．ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、Ｌ．リンドネリ（Ｌ．ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｌ．マレフェルメンタンス（Ｌ．ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｌ．マリ（Ｌ．ｍａｌｉ）、Ｌ．マニホチボランス（Ｌ．ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）、Ｌ．ミンデンシス（Ｌ．ｍｉｎｄｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ムコサエ（Ｌ．ｍｕｃｏｓａｅ）、Ｌ．ムリヌス（Ｌ．ｍｕｒｉｎｕｓ）、Ｌ．ナゲリイ（Ｌ．ｎａｇｅｌｉｉ）、Ｌ．ナムレンシス（Ｌ．ｎａｍｕｒｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ナンテンシス（Ｌ．ｎａｎｔｅｎｓｉｓ）、Ｌ．オリゴフェルメンタンス（Ｌ．ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｌ．オリス（Ｌ．ｏｒｉｓ）、Ｌ．パニス（Ｌ．ｐａｎｉｓ）、Ｌ．パンテリス（Ｌ．ｐａｎｔｈｅｒｉｓ）、Ｌ．パラブレビス（Ｌ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．パラブフネリ（Ｌ．ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．パラコリノイデス（Ｌ．ｐａｒａｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）、Ｌ．パラファラギニス（Ｌ．ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ）、Ｌ．パラケフィリ（Ｌ．ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ）、Ｌ．パラリメンタリウス（Ｌ．ｐａｒａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、Ｌ．パラプランタルム（Ｌ．ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ペントーサス（Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、Ｌ．ペロレンス（Ｌ．ｐｅｒｏｌｅｎｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ポンチス（Ｌ．ｐｏｎｔｉｓ）、Ｌ．プロテクツス（Ｌ．ｐｒｏｔｅｃｔｕｓ）、Ｌ．プシタシ（Ｌ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｌ．レンニニ（Ｌ．ｒｅｎｎｉｎｉ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ラムノーサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．リマエ（Ｌ．ｒｉｍａｅ）、Ｌ．ロゴサエ（Ｌ．ｒｏｇｏｓａｅ）、Ｌ．ロシアエ（Ｌ．ｒｏｓｓｉａｅ）、Ｌ．ルミニス（Ｌ．ｒｕｍｉｎｉｓ）、Ｌ．サエリムネリ（Ｌ．ｓａｅｒｉｍｎｅｒｉ）、Ｌ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．サンフランシスセンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）、Ｌ．サトスメンシス（Ｌ．ｓａｔｓｕｍｅｎｓｉｓ）、Ｌ．セカリフィルス（Ｌ．ｓｅｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．シャルペアエ（Ｌ．ｓｈａｒｐｅａｅ）、Ｌ．シリギニス（Ｌ．ｓｉｌｉｇｉｎｉｓ）、Ｌ．スピチェリ（Ｌ．ｓｐｉｃｈｅｒｉ）、Ｌ．スエビクス（Ｌ．ｓｕｅｂｉｃｕｓ）、Ｌ．タイランデンシス（Ｌ．ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ウルツネンシス（Ｌ．ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ）、Ｌ．バシノステルクス（Ｌ．ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ）、Ｌ．バギナリス（Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、Ｌ．ベルスモルデンシス（Ｌ．ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ）、Ｌ．ビニ（Ｌ．ｖｉｎｉ）、Ｌ．ビツリヌス（Ｌ．ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ）、Ｌ．ゼアエ（Ｌ．ｚｅａｅ）、及びＬ．ザイマエ（Ｌ．ｚｙｍａｅ）を含む幾つかの種が含まれる。一実施形態では、細菌株は、ＧＲＡＳ状態を有する乳酸菌株であり、非病原性であり、上記のラクトバチルス属の種の群から選択される。
【００４３】
特定の実施形態では、細菌株は、Ｌ．ロイテリ株である。この実施形態では、図１のステップＳ１には、ＤａｇＫを産生する能力に関してＬ．ロイテリ株をスクリーニングすることが含まれ、ステップＳ２には、これに対応して、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株を選択することが含まれる。
【００４４】
特定の実施形態では、ステップＳ２には、哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株を選択することが含まれる。
【００４５】
別の特定の実施形態では、細菌株は、Ｌ．ファーメンタム株である。この実施形態では、図１のステップＳ１には、ＤａｇＫを産生する能力に関してＬ．ファーメンタム株をスクリーニングすることが含まれ、ステップＳ２には、これに対応して、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株を選択することが含まれる。
【００４６】
特定の実施形態では、ステップＳ２には、哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株を選択することが含まれる。
【００４７】
一実施形態では、細菌の凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ又はｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）前に、既にＤａｇＫを発現している予め活性化している細菌株とするために、細菌株をＤＡＧの存在下で増殖させる。従って、この実施形態では、該方法は、更に、ＤＡＧの存在下で細菌株を培養することを含む。
【００４８】
実施形態の別の態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株であって、但し、Ｌ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない細菌株に関する。
【００４９】
一実施形態では、アレルギーは、食物アレルギー及び花粉アレルギーからなる群から選択される。特定の実施形態では、アレルギーは、食物アレルギーであり、好ましくは、ピーナッツアレルギー、乳（乳糖又は乳タンパク質）アレルギー、卵アレルギー、木の実アレルギー、魚アレルギー、貝アレルギー、大豆アレルギー、及び小麦（グルテン）アレルギーからなる群から選択される食物アレルギーである。
【００５０】
花粉アレルギーの非限定的な例には、マツ（Ｐｉｎｕｓ）、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ヒマラヤスギ（ｃｅｄａｒ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、ホーンビーム（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）、セイヨウトチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）、ポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、プラタナス（Ｐｌａｔａｎｕｓ）、シナノキ／ライム（Ｔｉｌｉａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヒノキ（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）、ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ  ｓｐ．）、チモシー（Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、プランテーン（Ｐｌａｎｔａｇｏ）、イラクサ／ヒカゲミズ（Ｕｒｔｉｃａｃｅａｅ）、オウシュウヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  Ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アカザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ）、及びスイバ／ドック（Ｒｕｍｅｘ）からの花粉に対抗するアレルギーが含まれる。
【００５１】
実施形態のＤａｇＫ産生細菌株は、哺乳動物におけるアレルギーを治療するのに使用することができる。本明細書で使用する治療は、哺乳動物に、実施形態の細菌株を投与した後、哺乳動物から、症状が１００％なくなることを必ずしも意味しない。更に、治療には、哺乳動物におけるアレルギーの症状を軽減することが包含される。従って、実施形態の細菌株は、哺乳動物におけるアレルギーを抑制する、或いは阻止するのに使用することができる。
【００５２】
更に、又は選択的に、実施形態の細菌株は、哺乳動物がアレルギーを発症するリスクを予防、即ち、回避、又は少なくとも軽減させるのに使用することができる。哺乳動物は、例えば、アレルギーへの遺伝子的又は遺伝的素因等の、アレルギーへの素因を持っている可能性がある。従って、実施形態の細菌株を、このような哺乳動物に、アレルギーに罹患しているか、又はアレルギー反応を発症する哺乳動物のリスクを回避するか、又は少なくとも軽減するのに投与することができる
【００５３】
特定の実施形態では、実施形態の細菌株を投与することができる哺乳動物は、好ましくはヒトである。実施形態の細菌株は更に、獣医学的用途に使用、即ち非ヒト哺乳動物に投与することができる。このような非ヒト哺乳動物の非限定的な例には、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが含まれる。
【００５４】
一実施形態では、細菌株は、ＤａｇＫを産生する能力があり、かつ、ＤａｇＫを分泌する等、細胞外に放出する能力がある細菌株である。
【００５５】
一実施形態では、細菌株は、ＤａｇＫを産生する能力がある乳酸菌株である。特定の実施形態では、乳酸菌株は、ラクトバチルス属、リューコノストック属、ペディオコッカス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、アエロコッカス属、カーノバクテリウム属、エンテロコッカス属、オエノコッカス属、スポロラクトバチルス属、テトラジェノコッカス属、バゴコッカス属、及びワイセラ属からなる群から選択されるＤａｇＫを産生する能力を有する乳酸菌株である。一実施形態では、ＤａｇＫを産生する能力を有する乳酸菌株は、ラクトバチルス、リューコノストック、ペディオコッカス、ラクトコッカス及びストレプトコッカスからなる群から選択される。
【００５６】
一実施形態では、細菌株は、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株である。特定の実施形態では、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株は、哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用される。
【００５７】
別の実施形態では、細菌株はＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株である。特定の実施形態では、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株は、哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用される。
【００５８】
更に別の実施形態では、細菌株は、ＤａｇＫを産生する能力を有するＳ．サリバリウス株又はＳ．サーモフィルス（ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株である。特定の実施形態では、ＤａｇＫを産生する能力を有するＳ．サリバリウス株又はＳ．サーモフィルス（ｔｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）株は、哺乳動物における花粉アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用される。
【００５９】
実施形態の更に別の態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療のための医薬の製造に、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株であって、但し、Ｌ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  −６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない細菌株の使用に関する。
【００６０】
実施形態の更なる態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療の方法に関する。該方法には、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株であるが、但し、Ｌ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ  −６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない細菌株を、アレルギーに罹患しているか、又はアレルギー反応を発症するリスクを有する哺乳動物に投与することが含まれる。
【００６１】
細菌株の投与及び配合の適切な方式は、ＤａｇＫの局所的な産生が望まれる部位に応じて選択される。投与の好ましい方式は経口である。投与の他の方式には、鼻の、眼内の、皮膚、直腸、鼻、目、膣若しくは歯肉への局所的な投与、又は静脈、皮下若しくは筋肉注射の局所的な或いは他の形式が含まれる。
【００６２】
実施形態の細菌株の経口投与は、哺乳動物における食物アレルギーを予防、抑制及び／又は治療するのに特に好ましい場合がある。このような場合、細菌株は、投与方式により、腸上皮の近くにあって、これにより、細菌株がＤａｇＫを産生し、脂質シグナル伝達を改変して、免疫バイオマーカーに変化を引き起こし、炎症又はアレルギー応答に局所的な影響を与える。
【００６３】
実施形態の細菌株の経鼻投与は、哺乳動物における花粉アレルギーを予防、抑制及び／又は治療するのに特に好ましい場合がある。このような場合、細菌株は、投与方式により呼吸器上皮の近くにあって、これにより、細菌株がＤａｇＫを産生し、脂質シグナル伝達を改変して、免疫バイオマーカーの変化を引き起こし、炎症応答又はアレルギー応答に局所的な影響を与える。
【００６４】
本明細書で定義される菌株の適切な投与量は、治療されるアレルギー、投与方式及び関連する配合に応じて容易に選択することができる。例えば、投与量及び投与計画は、本発明に従って対象者に投与される細菌が、所望の治療効果、予防効果又は健康上の利益をもたらすことができるように選択される。従って、好ましくは、投与量は、治療される哺乳動物及びアレルギーの種類に適した治療上又は予防上、有効な投与量である。例えば、１日の投与量としては、細菌の合計ＣＦＵで、１０４から１０１０、例えば１０５から１０９、又は１０６から１０８、又は１０８から１０１０を使用することができる。好ましい１日の投与量として、合計ＣＦＵで、約１０８、例えば１０７から１０９又は１０８から１０９である。
【００６５】
アレルギーは、一般的に、炎症誘発性症状を伴うヒスタミン放出の増加と相関する。従って、実施形態のＤａｇＫ産生細菌株は、アレルギー反応の間に放出されるヒスタミンによって引き起こされる炎症を、より自然な方法で抑制する優れた治療的アプローチであり得る。これは、ＤａｇＫを産生する能力を有する実施態様の細菌株が、抗ヒスタミン薬によって引き起こされる副作用を回避できることを意味する。
【００６６】
予防的又は治療的な抗アレルギー作用は、実施形態の細菌株のみによって、即ち、単一の抗アレルギー活性剤として得られる。しかしながら、実施形態の菌株は、抗ヒスタミン薬等の他の抗アレルギー薬と併用することにより、該菌株及び少なくとも１種の抗ヒスタミン薬を、任意選択的に薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は溶媒と共に含む組成物を形成することができる。更に、併用による治療は、実施形態の細菌株及び少なくとも１種の抗ヒスタミン薬を、アレルギーに罹患しているか又はアレルギーに罹患するリスクを有する哺乳動物に、別々に投与することによっても行なうことができる。
【００６７】
ＤａｇＫ産生細菌株を、少なくとも１種の抗ヒスタミン薬と併用する、併用による治療の利点は、少なくとも１種の抗ヒスタミン薬を単独で投与するのに比べて、該少なくとも１つの抗ヒスタミン薬の必要投与量を少なくできることである。これによって、このような抗ヒスタミン薬の投与量を減少させることによって、少なくとも１種の抗ヒスタミン薬を投与する場合に関連する副作用を回避するか、又は少なくとも最小限に抑えることができ、一方では、なお、十分な抗アレルギー作用を得ることができる。
【００６８】
従って、一実施形態では、組成物中の該少なくとも１種の抗ヒスタミン薬の量は、単一の抗アレルギー剤（複数可）として少なくとも１種の抗ヒスタミン薬を含む、即ち、実施形態の細菌株を欠いている組成物中の少なくとも１種の抗ヒスタミン薬の量と比較して、好ましくは、重量等で９０％未満である。種々の実施形態では、組成物中の少なくとも１種の抗ヒスタミン薬の量は、単一の抗アレルギー剤（複数可）として少なくとも１種の抗ヒスタミン薬を含む、即ち、実施形態の細菌株を欠いている組成物中の少なくとも１種の抗ヒスタミン薬の量と比較して、好ましくは、重量等で８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、又は１０％未満である。
【００６９】
併用による治療で、ＤａｇＫ産生細菌株と共に使用することができる抗ヒスタミン薬の、非限定的であるが、例示的な例には、Ｈ１Ｒアンタゴニスト及び／又はＨ１Ｒインバースアゴニスト等のＨ１−抗ヒスタミン薬が含まれる。
【００７０】
Ｈ１Ｒアンタゴニストの例示的な例には、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロモジフェンヒドラミン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、カルビノキサミン、セチリジン（例えば、ＺＹＲＬＥＸ（登録商標）、ＶＩＡＬＥＲＧ（登録商標）、ＡＣＵＲＡ（登録商標）の名称で販売されている）、クロロジフェンヒドラミン、クロルフェナミン、クロルプロマジン、クレマスチン、シクリジン、シプロヘプタジン、デクスブロムフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシラミン、エバスチン（例えば、ＫＥＳＴＩＮＥ（登録商標）の名称で販売されている）、エンブラミン、フェキソフェナジン（例えば、ＡＬＬＥＧＲＡ（登録商標）、ＡＬＴＩＦＥＸ（登録商標）の名称で販売されている）、ヒドロキシジン、ロラタジン（例えばＣＬＡＲＩＴＹＮ（登録商標）の名称で販売されている）、メクリジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、及びトリプロリジンが含まれる。
【００７１】
Ｈ１Ｒインバースアゴニストの例示的な例には、セチリジン、レボセチリジン、デスロラタジン（例えば、ＦＬＹＮＩＳＥ（登録商標）の名称で販売されている）及びピリラミンが含まれる。
【００７２】
従って、実施形態の態様は、ＤａｇＫを産生する能力を有する細菌株及びＨ１−抗ヒスタミン薬を含む抗アレルギー組成物に関する。
【００７３】
一実施形態では、Ｈ１−抗ヒスタミン薬は、セチリジン、エバスチン、フェキソフェナジン、ロラタジン及びデスロラタジンからなる群から選択される。
【００７４】
一実施形態では、細菌株は、Ｌ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９からなる群からは選択されない。
【００７５】
実施形態の更なる態様は、医薬として使用するための、且つ哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するための抗アレルギー組成物に関する。
【００７６】
併用による治療において本明細書で定義した菌株の適切な投与量は、治療されるアレルギー、投与方式、関連する配合及び併用による治療に使用される少なくとも１種の抗ヒスタミン薬に応じて、容易に選択することができる。例えば、投与量及び投与計画は、本発明に従って対象者に投与される細菌及び抗ヒスタミン薬（複数可）が、所望の治療効果、予防効果又は健康上の利益をもたらすことができるように選択される。従って、好ましくは、投与量は、治療される哺乳動物及びアレルギーの種類に適した治療上又は予防上、有効な投与量である。上記の細菌の１日の投与量は、併用による治療に使用することができる。更に、細菌は、少なくとも１種の抗ヒスタミン薬と併用されるので、併用による治療では、それより少ない１日の投与量を使用することも可能である。
【００７７】
更に、細菌株は、ピーナッツアレルギー等の食物アレルギーの治療のための経口免疫療法におけるアジュバントとしても使用することができる。
【００７８】
本明細書中に示した実験データから、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３（２０１６年３月８日に、ブダペスト条約下で、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ７Ｂ、Ｄ−３８１２４  ブラウンシュヴァイク、ドイツ）に寄託された）、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５（２００４年１２月２１日に、ブダペスト条約下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９、米国）に寄託された）、及びＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９（２００２年９月１１日に、ブダペスト条約下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、米国）に寄託された）は、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ロイテリ株であることが示される。従って、これらのＬ．ロイテリ株は、本明細書に開示した哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用することができる。特定の実施形態では、アレルギーは食物アレルギーである。
【００７９】
従って、実施形態の態様は、哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＬ．ロイテリ株ＤＳＭ  ３２２７３に関する。特定の実施形態では、アレルギーは食物アレルギーである。
【００８０】
実施形態の他の態様は、哺乳動物における食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するためのＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及び／又はＬ．ロイテリ株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９に関する。
【００８１】
Ｌ．ロイテリ株ＤＳＭ３２２７３、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９は、別々に使用することができ、或いは、少なくとも２種のＬ．ロイテリ株、例えば、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、又はＬ．ロイテリＤＳＭ３２２７３、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９の組成物として使用することができる。
【００８２】
一実施形態では、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１は、ＤａｇＫを産生する能力を有するＬ．ファーメンタム株である。従って、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１は、本明細書に開示する哺乳動物におけるアレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用することができる。特定の実施形態では、アレルギーは花粉アレルギーである。
【００８３】
Ｌ．ファーメンタム株ＡＴＣＣ１４９３１は、別々に、或いは上掲のＤａｇＫ産生Ｌ．ロイテリ株のうちの少なくとも１種の組成物として使用することができる。従って、このような組成物は、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１及びＬ．ロイテリＤＳＭ３２２７３、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１及びＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１及びＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９、Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、又はＬ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９を含むことができる。
【００８４】
特定の実施形態では、図１の方法には、ＤａｇＫを産生する能力に関して、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＬ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１以外の細菌株をスクリーニングすることが含まれる。更に、この方法には、哺乳動物におけるアレルギーを予防、抑制及び／又は治療するのに使用するための、ＤａｇＫを産生する能力を有する、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、及びＬ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１以外の細菌株を選択することが含まれる。
【実施例】
【００８５】
例１
ｑＲＴ−ＰＣＲによるｄａｇＫ  ｍＲＮＡ遺伝子発現の定量
野生型（ＷＴ）ラクトバチルス・ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、Ｌ．ロイテリ  ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のｈｄｃＡ突然変異体（２０１２年に、Ｔｈｏｍａｓらによって、前に記載されている）、ＷＴ  Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＷＴ  Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８（２００６年１月３０日にブダペスト条約下で、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｅｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に寄託された）を、ＭＲＳ培地中で一晩３７℃にて増殖させ、気相としてのＮ２／ＣＯ２（８０／２０；ｖ／ｖ）の厳密な無酸素条件下で培養した。１００μｌの新鮮な培養液を、１０ｍｌの乳酸菌限定培地４（ＬＤＭ４）中でインキュベートした。培養液を、ミニバイオリアクター中で、３７℃にて厳密な無酸素条件下に維持した。サンプルを３時間、６時間、２４時間及び４８時間にて収集した。細菌ペレットを、６０００×ｇで１０分間、４℃にて培養液を処理することによって得た。後に、ペレットをＲＮａｓｅで処理した。細菌細胞からのｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ分離キットによって抽出した。各群からの５００ｎｇのｍＲＮＡを使用して、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転化した。処理したｃＤＮＡを、１：２に希釈し、ｑＲＴ−ＰＣＲを実行するために使用した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００ｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ、米国）ｑＲＴ−ＰＣＲを、増幅及び蛍光データ収集に使用した。マスターミックスは、１２．５μｌのＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ２０００（ＡＢＩ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）、０．５μｌの各プライマー（ＤＡＧＫ−Ｌ．ｒ−Ｆ：ＧＣＧＴＧＡＧＴＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＣＴ（配列番号：９）及びＤＡＧＫ−Ｌｒ−Ｒ：ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＴ（配列番号：１０）、１０μＭ）、１μｌの試料からなり、水で調整して、最終的な体積を１ウェル当り２５μｌにした。ＰＣＲ増幅の後、プライマーの特異性を、融解曲線を検査し、アガロースゲル電気泳動（１％）によって、アンプリコンのサイズを決定することによって調べた。相対的なｍＲＮＡ標的遺伝子発現レベル（比＝［（Ｅｔａｒｇｅｔ）ｄＣＰｔａｒｇｅｔ（ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓａｍｐｌｅ）］／［（Ｅｒｅｆ．）ｄＣＰｒｅｆ．（ｃｏｎｔｐｏｌ−ｓａｍｐｌｅ）］）を、ハウスキーピング遺伝子ｒｐｏＢに対して正規化し、基準として使用した。続いて、各細菌の３時間の培養から得られたｍＲＮＡを、１．０に設定し、キャリブレーターとして使用して、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９及びＤＳＭ１７９３８の６時間、２４時間及び４８時間のような異なる時点での同じ細菌株における相対的なｍＲＮＡの倍数における差を特定した。
【００８６】
図２は、ｄａｇＫ遺伝子発現実験の結果を示す。この図は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４６５９と共に、ＷＴ及びｈｄｃＡ突然変異体Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５の両方によるｄａｇＫ発現の増加を示す。しかしながら、Ｌ．ロイテリＤＳＭ１７９３８には、ｄａｇＫ発現がなく、即ち、ＤａｇＫを産生する能力がなかった。興味深いことに、ｄａｇＫ  ｍＲＮＡ発現は、細菌の伸長期の間に非常に高く発現した。反復実験から、６時間と同様の発現を示したので、１２時間のインキュベーション時点を選択した。
【００８７】
例２
細菌培養上清中のＤａｇＫタンパク質を検出するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
文献によると、ＤａｇＫは、グラム陽性菌に可溶性のアイソフォームを有すると考えられている。本発明者らは、ＤａｇＫがＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５から放出され、それが宿主の腸上皮脂質シグナル伝達と相互作用し、アレルギー反応に起因して放出されたヒスタミンの炎症誘発性作用を抑制し、更に、抗炎症挙動を促進すると仮定した。本発明者らは、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５のｄａｇＫ遺伝子を突然変異させ（突然変異体は、Ｐｉｊｋｅｒｅｎ及びＢｒｉｔｔｏｎ（２０１２年）に記載されているように、ＲｅｃＴ媒介一本鎖組み換えによって作成され、オリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）標的ｄａｇＫを使用してｄａｇＫ遺伝子を突然変異させるように適合させた）、ＤａｇＫ突然変異体Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５を本発明者らの無菌（ＧＦ）マウスにコロニー形成させたが、本発明者らが、野生型Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５をコロニー形成させた無菌マウスにて観察したようなＩＬ−６及びＩＬ−１αの抑制は見られなかった。基礎的な炎症誘発性サイトカインレベルは顕著に抑制された。アレルギー反応に起因して放出されるヒスタミンは、Ｈ１Ｒ及びＨ２Ｒを活性化することができる。しかしながら、Ｈ１Ｒ下流のシグナル伝達は、Ｌ．ロイテリにおけるＤａｇＫ合成によって、シグナル伝達に関わる脂質ＤＡＧを阻害することによって中断され、それによって、ヒスタミンによる炎症誘発性作用が抑制される。これにより、Ｈ２Ｒ活性化のみが可能になり、該Ｈ２Ｒ活性化は、抗炎症性症状を促進することが知られている。
【００８８】
ｄａｇＫが宿主免疫応答に何らかのポジティブな効果を示すためには、宿主−ＤＡＧ脂質が発現されなければならない。ＤＡＧが活性化されるためには、Ｈ１Ｒシグナル伝達が活性化されなければならない。このことが、本発明者らが、Ｌ．ロイテリのｄａｇＫに突然変異を起こし、マウスにコロニー形成させた場合に、炎症誘発性サイトカイン抑制が見られなかったことの理由である。このことは、ＰＫＣ及びＰＫＡの活性化によって、追加的に確認された。
【００８９】
ＤａｇＫアイソフォームがＬ．ロイテリから分泌されているか否かを更に示すために、本発明者らは、細菌細胞培養実験を行った。１００μｌのＭＲＳ中で、３７℃にて無酸素条件下で、一晩増殖させたＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５を、ＤＡＧの存在下及び非存在下の、１０ｍｌのＬＤＭ４培地に加え、３７℃にて１２時間、無酸素条件下で放置した。細菌細胞を、４℃で１０分間、６０００×ｇの遠心分離によって除去した。１：１の比のプロテイナーゼ及びプロテインキナーゼ阻害剤を上清に添加した。上清を、０．２２μｍのフィルターによって濾過して、残存する微量の細菌を除去した。ＤａｇＫは１０から１３ｋＤａのタンパク質であるので、バックグラウンドを低減させる必要がある。従って、上清を５０ｋＤａの濾液で処理した。フロースルーを３ｋＤａの濾液に加え、５０００×ｇで３０分間回転させた。トリプシン分解後、上相の濃縮物を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実行した。図３は、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５からのＤａｇＫタンパク質のアミノ酸配列を、トリプシン分解或いは切断部位（Ｔｒｙｐｓ）と共に示す。図４は、ＤＡＧが細胞培地に存在する場合のＬ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５からのＤａｇＫタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００９０】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実験の結果を、表１及び表２並びに図３及び図４に示す。Ｌ．ロイテリＤａｇＫタンパク質と一致する配列が、上清中に見出された。従って、Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５は、ＤａｇＫタンパク質を産生し且つ分泌する能力があった。興味深いことに、Ｌ．ロイテリは、細胞培地中にＤＡＧが存在する場合に、それが存在しない場合と比較して、より高いレベルのＤａｇＫを分泌した。しかしながら、本発明者らは、ＤＡＧの存在下及び非存在下でも、ＤａｇＫの濃度は異なるが、ＤａｇＫを検出することができる。培地コントロールは陰性のままだった。
【表１】
2019520801.tif 000002
表１のペプチドＡ−Ｆ：
Ａ  ＥＥＲＮＭＲ                          配列番号１
Ｂ  ＤＶＡＡＧＧＶＬＩＳＡ                配列番号２
Ｃ  ＤＫＨＱＴＥＫ                        配列番号３
Ｄ  ＮＭＲＹＨＬＬＡＡＣＬＡＩ            配列番号４
Ｅ  ＥＥＲＮＭＲＹ                        配列番号５
Ｆ  ＫＡＫＤＶＡＡＧＧＶＬＩＳＡＩＦＳＶＬＶＧＬＩＩＦＩＰ      配列番号６
【表２】
2019520801.tif 000003
表２のペプチドＧ−Ｈ：
Ｇ  ＤＶＡＡＧＧＶＬ                    配列番号７
Ｈ  ＮＭＲＹＨＬＬＡＡＣＬＡＩＩＭＳＩＬＬＨＩＳＡＭＥＷＬＷＩＬＬＡＩＦＶＶＦＴＳ                                        配列番号８
【００９１】
例３
ＤａｇＫを産生する能力を有する菌株の同定
細菌を、ＭＲＳプレート上で１６時間３７℃にて嫌気性雰囲気で培養する。細菌のコロニーを滅菌プラスチックループを用いて集め、１００μｌの滅菌水（ＰＣＲ品質）中に懸濁する。或いは、ＤＮＡを、細菌培養物から任意の適切な方法を使用して調製することができる。例えば例１を参照されたい。
【００９２】
ｄａｇＫ遺伝子の存在は、ＰＣＲ、例えば、ＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）並びに各０．４ｍＭのプライマー対ｄａｇＫ＿ＬｒＦ（ＴＧＧＡＣＴＣＡＣＧＣＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＡ、配列番号１１）及びｄａｇＫ＿ＬｒＲ（ＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＧＣＴＴＣＧ、配列番号１２）を使用することによって調べられる。細菌懸濁液又はＤＮＡ調製物（０．５μｌ）を、ＰＣＲ混合物に添加し、ＰＣＲ反応を、９５℃で５分間；３０×（９５℃で３０秒；５８℃で３０秒；７２℃で３０秒）；７２℃で１０分のプログラムを実行することによって行った。ＰＣＲ生成物を、標準的なアガロースゲル電気泳動を使用して、分離し且つ可視化し、そして、該配列を、ＰＣＲに使用したフォワードプライマー（ｄａｇＫ＿ＬｒＦ）を使用して標準的なサンガー配列決定により決定する。
【００９３】
例４
ＤａｇＫを産生する能力を有するラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２２７３の分析
ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２２７３細菌を、一晩、ＭＲＳブロス中で３７℃にて増殖させた。細菌懸濁液を、３５００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、１μｌのペレットを、１００μｌのＰＢＳに懸濁させた。
【００９４】
Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３におけるｄａｇＫ遺伝子のＰＣＲ分析を、例３に記載したように行った。
【００９５】
その結果から、Ｌ．ロイテリＤＳＭ３２２７３は、ヒスチジンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子及びｄａｇＫ遺伝子に対して陽性であることが示された（表３参照）。細菌株Ｌ．ロイテリＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６４７５及びＤＳＭ１７９３８をコントロールとして含ませた。
【表３】
2019520801.tif 000004
【００９６】
例５
花粉アレルギーに使用するためのプロバイオティック製品の製造
この例では、花粉アレルギーに使用するためのプロバイオティック製品を製造する。Ｌ．ファーメンタムＡＴＣＣ１４９３１の菌株を、公開されているゲノム配列から分析されるＤａｇＫを産生するその能力に基づいて選択する。Ｌ．ファーメンタム株を、業界でラクトバチルスを増殖させるための標準的な方法を使用して、増殖し、凍結乾燥する。この製品は、良好な安定性及び貯蔵寿命のために作製された油基配合物である。製造プロセスの独特な特徴は、オイルを真空下に置いて、オイル中の水分の大部分を除去することによって、オイルを乾燥させ、配合物の安定性を高めるステップである。本明細書中の本発明で使用される油は、純粋な食用植物油、好ましくはヒマワリ油及び中鎖トリグリセリドである。
【００９７】
成分の混合。
１．中鎖トリグリセリド、例えば、Ａｋｏｍｅｄ  Ｒ（Ｋａｒｌｓｈａｍｎｓ  ＡＢ、スウェーデンのカースルハムン）及びひまわり油、例えば、Ａｋｏｓｕｍ（Ｋａｒｌｓｈａｍｎｓ  ＡＢ、スウェーデンのカースルハムン）を、二酸化ケイ素（Ｃａｂ−ｏ−ｓｉｌ  Ｍ５Ｐ、Ｍ５Ｐ、Ｃａｂｏｔ）と共に、Ｂｏｌｚ混合機／タンク（Ａｌｆｒｅｄ  ＢＯＬＺ  Ａｐｐａｒａｔｅｂａｕ  ＧｍｂＨ、ドイツのヴァンゲン・イム・アルゴイ）中で混合する。
【００９８】
２．均質化する。サインポンプ及び分散機（ｄｉｓｐａｘ）（Ｓｉｎｅ  Ｐｕｍｐ、コロラド州のアーバダ）をＢｏｌｚ混合機に接続し、混合物を均質化する。
【００９９】
３．真空乾燥する。混合物をＢｏｌｚタンク内で１０ミリバールの真空下で１２時間乾燥させる。
【０１００】
４．ラクトバチルス・ファーメンタムを添加する。約２０ｋｇの乾燥油混合物を、５０リットルのステンレス鋼容器に移す。Ｌ．ファーメンタム粉末、好ましくは凍結乾燥されたもの（使用するＬ．ファーメンタムの量は、該油中で求められる量に応じて変化するであろう、しかし、一例では、１ｇ当たり１０１１ＣＦＵを有する０．２ｋｇの培養物を添加するであろう。）を添加する。これを、均質になるまで、ゆっくりと混合する。
【０１０１】
５．混合する。Ｌ．ファーメンタムを含むプレミックスを、Ｂｏｌｚ混合機に戻す。
【０１０２】
６．排出する。懸濁液を、２００リットルのガラス容器に排出し、窒素で覆う。
【０１０３】
懸濁液は、花粉アレルギーの予防又は治療のためにヒトへの経鼻投与に使用されるスプレーボトルに充填されるまで、容器内で保管される。
【０１０４】
例６
食品アレルギーに使用するためのプロバイオティック製品の製造
この例では、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ３２２７３を、ヒトの食物アレルギーの予防、抑制及び／又は治療に使用するために錠剤にその菌株を添加するために、ＤａｇＫを産生するその能力に基づいて選択する。Ｌ．ロイテリ株を、業界で、ラクトバチルスを増殖させるための標準的な方法を使用して、増殖させ、凍結乾燥する。
【０１０５】
以下のステップでは、グルコースカプセル化を含む、選択された細菌株を含有する錠剤の製造プロセスの例を説明する。当該技術分野で知られている賦形剤、充填剤、着香剤、カプセル化物、潤滑剤、固化防止剤、甘味料及び錠剤製品の他の成分を、製品の有効性に影響を与えることなく使用することができることが理解される。
【０１０６】
１．融解させる。容器内のＳＯＦＴＩＳＡＮ（商標）１５４（ＳＡＳＯＬ  ＧＭＢＨ、ドイツのＢａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ）を融解させ、それを７０℃に加熱して、結晶構造を完全に破壊する。次に、それを５２から５５℃（硬化点（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）のすぐ上）に冷却する。
【０１０７】
２．造粒する。ラクトバチルス・ロイテリ凍結乾燥粉末をＤｉｏｓｎａ高せん断混合機／造粒機、又は同等物に移す。融解させたＳＯＦＴＩＳＡＮ（商標）１５４を、該Ｌ．ロイテリ粉末に約１分間、ゆっくりと添加する。添加中にチョッパーを使用する。
【０１０８】
３．湿式ふるい分けをする。造粒直後に、該顆粒を、Ｔｏｒｎａｄｏミルを使用することによって、１ｍｍのふるい網に通す。ふるい分けた顆粒を乾燥剤パウチと共に、アルパウチ（ＰＶＣ被覆アルミニウム箔から作製されたもの）に詰め、ヒートシーラーで封止して袋を形成し、混合まで、冷蔵保存する。顆粒化したバッチは、２つの錠剤バッチに分割される。
【０１０９】
４．当技術分野で知られている標準的なマイクロカプセル化法を使用してカプセル化したカプセル化Ｄ−グルコース（Ｇ８２７０、＞９９．５％グルコース、Ｓｉｇｍａ）を添加する。糖の量は、乾燥Ｌ．ロイテリの添加粉末の全ＣＦＵに依存し、標準レベルは、全菌株１０８ＣＦＵ当たり糖１グラムとすることができるが、更に、この糖の量は、下は０．１グラム又は０．０１グラムまで、上は１０グラムから更に１００グラムまで変化させることができる。
【０１１０】
５．混合する。混合機内の全ての成分を均質なブレンド物になるまで混合する。
【０１１１】
６．圧縮する。最終的なブレンド物をロータリー錠剤プレスのホッパーに移し、Ｋｉｌｉａｎコンプレッサーにて総重量７６５ｍｇで錠剤を圧縮する。
【０１１２】
７．大量包装する。錠剤を、分子ふるいの乾燥パウチと共に、アル−バッグに詰める。該アル−パウチを、プラスチックバケツに入れ、最終的な包装前の少なくとも１週間、冷所で保管する。ＳＯＦＴＩＳＡＮ（商標）（水添パーム油）を使用して、ラクトバチルス細胞を油脂中にカプセル化し、環境から保護することができる。
【０１１３】
上記のように、実施形態の製品は、錠剤以外の形態であってもよく、当該技術分野で知られている基本的な製品を調製する標準的な方法が、選択されたＬ．ロイテリ培養物を含む本発明の製品を調製するのに有益に使用される。
【０１１４】
例７
哺乳動物の腸上皮ＤＡＧ及びｐＰＫＣシグナル伝達を調べるためのマウスのエンテロイド実験
マウスのエンテロイド（腸上皮層のみを含む）は、１０週齢の無菌（ＧＦ）ＢＡＬＢ／ｃマウス由来であった。エンテロイドは、増殖して、単層を形成し、ＬＤＭ４培地（コントロール）、野生型Ｌ．ロイテリＰＴＡ−６４７５馴化培地（５０から３ｋＤａカットオフ）、ジアシルグリセロールキナーゼ（ＤＧＫ）阻害剤（２μＭ）のみ又はＤＧＫ阻害剤（２μＭ）及び野生型Ｌ．ロイテリＰＴＡ−６４７５馴化培地（ＣＭ；５０から３ｋＤａカットオフ）でインキュベートした。ＤＧＫ阻害剤（Ｒ５９−０２２；６−［２−（４−［（４−フルオロフェニル）フェニルメチレン］−１−ピペリジニル）エチル］−７−メチル−５Ｈ−チアゾロ−［３，２−ａ］ピリミジン−５−オン）を、哺乳動物のＤＧＫの活性化を止めるために、エンテロイドに馴化培地を添加する２時間前に添加し、２時間後、エンテロイドを洗浄し、それぞれ阻害剤を含むか又は含まない、馴化培地又はＬＤＭ４培地のみで処理した。４５分間のインキュベーション後に、タンパク質を集め、ウェスタンブロットを行った。
【０１１５】
得られたＤＧＫ阻害剤で処理したエンテロイドは、野生型Ｌ．ロイテリＰＴＡ−６４７５馴化培地の存在下でＰＫＣリン酸化を高め、一方、野生型Ｌ．ロイテリＰＴＡ−６４７５馴化培地の存在下でＤＧＫ阻害剤を欠いたエンテロイドからは、ＰＫＣリン酸化が増加した証拠は得られなかった。図５ａ及び図５ｂを参照されたい。
【０１１６】
上記の実施形態は、本発明の幾つかの例示的な例として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な改変、組み合わせ、及び変更を実施形態に加えることができることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分的な解決策を、技術的に可能な場合に他の構成に組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定される。
【０１１７】
参考文献
Ｔｈｏｍａｓら。（２０１２年）。プロバイオティックラクトバチルス・ロイテリ由来のヒスタミンは、ＰＫＡ及びＥＲＫシグナル伝達の調節を介してＴＮＦを抑制する。(Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ＴＮＦ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＫＡ  ａｎｄ  ＥＲＫ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．)ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（２）：ｅ３１９５１。
【０１１８】
ｖａｎ  ＰｉｊｋｅｒｅｎとＢｒｉｔｔｏｎ。（２０１２年）。乳酸菌における高効率組み換え。(Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ．)Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（１０）：ｅ７６。
【０１１９】
Ｌｅｅら。（２００４年）。種々の乳酸菌の食事摂取により、抗原刺激マウスの脾臓細胞における２型ヘルパーＴ細胞産生が抑制される。(Ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｙｐｅ  ２  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｉｍｅｄ  ｍｉｃｅ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ．)Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（１）：１６７−１７０。
【配列表フリーテキスト】
【０１２０】
配列番号９：＜２２３＞ｄａｇＫ遺伝子のフォワードｑＲＴ−ＰＣＲプライマー
配列番号１０：＜２２３＞ｄａｇＫ遺伝子のリバースｑＲＴ−ＰＣＲプライマー
配列番号１１：＜２２３＞ｄａｇＫ遺伝子のフォワードＰＣＲプライマー
配列番号１２：＜２２３＞ｄａｇＫ遺伝子のリバースＰＣＲプライマー
【図１】
2019520801.tif 000005
【図２】
2019520801.tif 000006
【図３】
2019520801.tif 000007
【図４】
2019520801.tif 000008
【図５ａ】
2019520801.tif 000009
【図５ｂ】
2019520801.tif 000010
【配列表】
2019520801000001.app
【国際調査報告】
2019520801.tif 000011
2019520801.tif 000012
2019520801.tif 000013