(57)【要約】  従来のレチノールおよびレチノール誘導体よりも優れたシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を持続的に奏する化合物、その製造方法ならびにそれを有効成分として配合する皮膚外用組成物およびシート状化粧料を提供する。コラーゲン中の少なくとも１つのヒドロキシル基にジカルボン酸が結合し、少なくとも１つの結合した該ジカルボン酸のカルボキシル基にレチノールが結合したレチノール修飾コラーゲン、その製造方法ならびにそれを有効成分として配合する皮膚外用組成物およびシート状化粧料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン中の少なくとも１つのヒドロキシル基にジカルボン酸が結合し、少なくとも１つの結合した該ジカルボン酸のカルボキシル基にレチノールが結合したレチノール修飾コラーゲン。
【請求項２】
該コラーゲンが、天然コラーゲン、または式（1）：
-（A1-A2-Gly）-                  （1）
（式中、Glyはグリシンを表し、A1およびA2はグリシン、プロリン（Pro）またはヒドロキシプロリン（Hyp）を表すが、但し、A1およびA2の少なくとも１つはHypである）
で表されるペプチドユニットを含むコラーゲン、ゼラチン、ならびに天然コラーゲンの加水分解物および式（1）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲンの加水分解物よりなる群から選択される１種以上である請求項１記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項３】
該ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸およびマレイン酸よりなる群から選択される１種以上である請求項１または２記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項４】
該ジカルボン酸がコハク酸である請求項３記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項５】
式（2）：
【化１】
2011158864.tif 000009
（2）
で表されるペプチドユニットからなる請求項１ないし４のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項６】
式（2）で表されるペプチドユニットと、式（3）：
【化２】
2011158864.tif 000010
（3）
で表されるペプチドユニット、および、式（4）：
【化３】
2011158864.tif 000011
（4）
で表されるペプチドユニットの少なくとも１種のペプチドユニットとからなる、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項７】
前記ペプチドユニット（2）と前記ペプチドユニット（3）および前記ペプチドユニット（4）との存在割合が、モル比にて(2)：((3)＋(4))＝1：99〜100：0の範囲にある請求項６記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項８】
分子量500〜1,000,000の範囲に分子量分布のピークを有する請求項１ないし７のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項９】
シワ形成防止剤である請求項１ないし８のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項１０】
ヒアルロン酸生成促進剤である請求項１ないし９のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項１１】
ヒアルロン酸合成酵素活性化剤である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項１２】
コラーゲン生成促進剤である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲン。
【請求項１３】
（１）コラーゲン中の少なくとも１つのヒドロキシル基にジカルボン酸またはその無水物を結合させてジカルボン酸付加コラーゲンを得、ついで
（２）該ジカルボン酸付加コラーゲンのジカルボン酸のカルボキシル基にレチノールを結合させることを含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲンの製造方法。
【請求項１４】
該コラーゲンが、天然コラーゲン、または式（1）：
-A1-A2-Gly-                  （1）
（式中、Glyはグリシンを表し、A1およびA2はグリシン、プロリン（Pro）またはヒドロキシプロリン（Hyp）を表すが、但し、A1およびA2の少なくとも１つはHypである）
で表されるペプチドユニットを含むコラーゲン、ゼラチンならびに天然コラーゲンの加水分解物および式（1）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲンの加水分解物よりなる群から選択される１種以上である請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
該ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸およびマレイン酸よりなる群から選択される１種以上である請求項１３または１４記載の製造方法。
【請求項１６】
該ジカルボン酸がコハク酸である請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
（２）の工程において、溶媒として第三級アミン類を用いる請求項１３ないし１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
第三級アミンがトリアルキルアミン類である請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
トリアルキルアミン類がジイソプロピルエチルアミンである請求項１８記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲンを有効成分として含む皮膚外用組成物。
【請求項２１】
組成物の全量に対して0.00001〜30質量％の請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲンを含む皮膚外用組成物。
【請求項２２】
シワ形成防止用である請求項２０または２１記載の皮膚外用組成物。
【請求項２３】
請求項１ないし１２のいずれか１項に記載のレチノール修飾コラーゲンを含むシート状化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚に適用して優れた皮膚老化防止効果を示すレチノール修飾コラーゲン、より詳しくは、細胞に対する毒性が低く、また、かゆみ等を引き起こすことなく安全性に優れるとともに、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を長時間にわたって高めてヒアルロン酸の生成を増大し、またコラーゲンの合成を高めることにより、優れたシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を奏し得るレチノール修飾コラーゲン、その製造方法ならびにそれを含む皮膚外用組成物およびシート状化粧料に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚老化に伴って肌にはシワが増える。シワには、眼の下に細く横に入り、深さが表皮レベルのシワ（表皮性シワ）から、目尻や額などの表情筋の方向と垂直の細かいひだとして現れ、シワの深さが真皮レベルのシワ（真皮性シワ）や、目や口の周り、顔の輪郭などの大きなひだとして現れるシワ（老人性シワ）などがあるが、表皮や真皮などの部位に総合的に作用してシワの形成防止や改善に多面的に作用する解決はなされていない。【０００３】
一方、コラーゲンまたはその誘導体は、あらゆる多細胞生物に見られる繊維状タンパク質であり、皮膚老化防止を目的として種々の化粧料に配合されている。
しかしながら、従来のコラーゲンやコラーゲン誘導体では満足のゆく優れた皮膚老化防止効果が得られないという問題があった。【０００４】
そこで、本発明者らは、コラーゲンが有する従来の問題点に鑑み、コラーゲン様構造を有するポリペプチドに関する発明を完成し、出願している（特許文献１）。【０００５】
一方、レチノールおよびその誘導体は、視覚をはじめとする生体機能の維持や、皮膚および粘膜などの正常上皮組織の再生機能などに関与することが知られているビタミンの一種であり、尋常性魚鱗癬などの角化異常皮膚疾患の外用医薬品として知られ、また、レチノール誘導体は、上皮組織の活性を維持し、紫外光線のシグナル透過を遮断することによって皮膚の老化を抑制することが知られており、皮膚老化防止用の化粧料などとして広く利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０３５０９２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来報告されているレチノールには細胞毒性があり、またレチノール誘導体による皮膚老化防止効果は長時間持続させることができず、シワの多面的な形成防止や改善ができなかったため、さらに有効なレチノール誘導体の開発やレチノールもしくはその誘導体に代わる有効成分の開発が望まれていた。【０００８】
したがって、本発明の目的は、従来のレチノールおよびレチノール誘導体よりも優れた安全性、シワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を長時間にわって持続し、シワの多面的な形成防止や改善を奏する化合物、その製造方法ならびにそれを有効成分として配合する皮膚外用組成物およびシート状化粧料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定のアミノ酸配列を有するペプチドユニットを縮合して得られるポリペプチド（繊維状集合体）にレチノールを結合した物質は細胞毒性が低く、炎症性サイトカインを生成することなく、表皮におけるヒアルロン酸産生を増大し、また、真皮におけるコラーゲンの合成を促進してかかる優れた効果を奏し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］  コラーゲン中の少なくとも１つのヒドロキシル基にジカルボン酸が結合し、少なくとも１つの結合した該ジカルボン酸のカルボキシル基にレチノールが結合したレチノール修飾コラーゲン；
［２］  該コラーゲンが、天然コラーゲン、または式（1）：
-（A1-A2-Gly）-                  （1）
（式中、Glyはグリシンを表し、A1およびA2はグリシン、プロリン（Pro）またはヒドロキシプロリン（Hyp）を表すが、但し、A1およびA2の少なくとも１つはHypである）
で表されるペプチドユニットを含むコラーゲン、ゼラチン、ならびに天然コラーゲンの加水分解物および式（1）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲンの加水分解物よりなる群から選択される１種以上である前記［１］記載のレチノール修飾コラーゲン；
［３］  該ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸およびマレイン酸よりなる群から選択される１種以上である前記［１］または［２］記載のレチノール修飾コラーゲン；
［４］  該ジカルボン酸がコハク酸である前記［３］記載のレチノール修飾コラーゲン；
［５］  式（2）：
【化１】
2011158864.tif 000002
（2）
で表されるペプチドユニットからなる前記［１］ないし［４］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［６］  式（2）で表されるペプチドユニットと、式（3）：
【化２】
2011158864.tif 000003
（3）
で表されるペプチドユニット、および、式（4）：
【化３】
2011158864.tif 000004
（4）
で表されるペプチドユニットの少なくとも１種のペプチドユニットとからなる、前記［１］ないし［４］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［７］  前記ペプチドユニット（2）と前記ペプチドユニット（3）および前記ペプチドユニット（4）との存在割合が、モル比にて(2)：((3)＋(4))＝1：99〜100：0の範囲にある前記［６］記載のレチノール修飾コラーゲン；
［８］  分子量500〜1,000,000の範囲に分子量分布のピークを有する前記［１］ないし［７］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［９］  シワ形成防止剤である前記［１］ないし［８］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［１０］  ヒアルロン酸生成促進剤である前記［１］ないし［９］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［１１］  ヒアルロン酸合成酵素活性化剤である前記［１］ないし［１０］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［１２］  コラーゲン生成促進剤である前記［１］ないし［１１］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲン；
［１３］  （１）コラーゲン中の少なくとも１つのヒドロキシル基にジカルボン酸またはその無水物を結合させてジカルボン酸付加コラーゲンを得、ついで
（２）該ジカルボン酸付加コラーゲンのジカルボン酸のカルボキシル基にレチノールを結合させることを含む、前記［１］に記載のレチノール修飾コラーゲンの製造方法；
［１４］  該コラーゲンが、天然コラーゲン、または式（1）：
-A1-A2-Gly-                  （1）
（式中、Glyはグリシンを表し、A1およびA2はグリシン、プロリン（Pro）またはヒドロキシプロリン（Hyp）を表すが、但し、A1およびA2の少なくとも１つはHypである）
で表されるペプチドユニットを含むコラーゲン、ゼラチンならびに天然コラーゲンの加水分解物および式（1）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲンの加水分解物よりなる群から選択される１種以上である前記［１３］記載の製造方法；
［１５］  該ジカルボン酸が、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸およびマレイン酸よりなる群から選択される１種以上である前記［１３］または［１４］記載の製造方法；
［１６］  該ジカルボン酸がコハク酸である前記［１５］記載の製造方法；
［１７］  （２）の工程において、溶媒として第三級アミン類を用いる前記［１３］ないし［１６］のいずれか１に記載の製造方法；
［１８］  第三級アミンがトリアルキルアミン類である前記［１７］記載の製造方法；
［１９］  トリアルキルアミン類がジイソプロピルエチルアミンである前記［１８］記載の製造方法；
［２０］  前記［１］ないし［１２］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲンを有効成分として含む皮膚外用組成物；
［２１］  組成物の全量に対して0.00001〜30質量％の前記［１］ないし［１２］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲンを含む皮膚外用組成物；
［２２］  シワ形成防止用である前記［２０］または［２１］記載の皮膚外用組成物；
［２３］  前記［１］ないし［１２］のいずれか１に記載のレチノール修飾コラーゲンを含むシート状化粧料
を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の新規なレチノール修飾コラーゲンは、安全性に優れ、皮膚に対する親和性に優れ、持続的に作用して優れて、多面的なシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を持続的に奏し得る。このようなレチノール修飾コラーゲンは、単一の化合物でシワ形成防止剤、シワ改善剤、美肌剤、肌質改善剤、ヒアルロン酸生成促進剤、ヒアルロン酸合成酵素活性化剤、コラーゲン生成促進剤として、また、皮膚外用組成物、例えば、シワ形成防止用、シワ改善用、美肌用、肌質改善用の皮膚外用組成物、シート状化粧料などの有効成分として適する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよび従来のレチノール誘導体による、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（HAS2）発現への影響を示す図である（試験例１）。
【図１Ｂ】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよび従来のレチノール誘導体による、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（HAS3）発現への影響を示す図である（試験例１）。
【図２】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよびレチノール／コラーゲン誘導体の混合物による、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子（HAS2およびHAS3）発現への影響を示す図である（試験例２）。
【図３】本発明に係るレチノール修飾コラーゲン、レチノール／コラーゲン混合物による、ヒト表皮角化細胞の生存性への影響を示す図である（試験例３）。
【図４】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよびコラーゲン誘導体による、ヒト表皮角化細胞単層細胞系におけるIL−8産生量への影響を示す図である（試験例４）。
【図５】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよびレチノールによる、ヒト三次元培養表皮におけるIL−8産生量への影響を示す図である（試験例５）。
【図６】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよびレチノールによる、ヒト三次元培養表皮におけるヒアルロン酸産生量への影響を示す図である（試験例６）。
【図７】本発明に係るレチノール修飾コラーゲンおよびレチノールによる、ヒト三次元真皮付き培養表皮におけるI型コラーゲン合成量への影響を示す図である（試験例７）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、第１の態様において、新規なレチノール修飾コラーゲンを提供する。
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、コラーゲンを構成するアミノ酸残基の少なくとも１つのヒドロキシル基にジカルボン酸を介してレチノールがエステル結合したものである。
ここで、本発明のレチノール修飾コラーゲンを構成するコラーゲンには、天然コラーゲン、または式（1）：【００１４】
2011158864.tif 000005
【００１５】
（式中、Glyはグリシンを表し、A1およびA2はグリシン、プロリン（Pro）またはヒドロキシプロリン（Hyp）を表すが、但し、A1およびA2の少なくとも１つはHypである）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲン、ゼラチン、ならびに天然コラーゲンの加水分解物および式（1）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲンの加水分解物が含まれる。【００１６】
これらのうち、式（1）で表されるペプチドユニットを含むコラーゲン（以下、「合成コラーゲン」という）については、Gly-Hyp-Gly-、Pro-Hyp-Gly-、Hyp-Gly-Gly-およびHyp-Pro-Gly-から選択される１種以上のペプチドユニットを適当な緩衝液に溶解し、それに、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）などの縮合助剤を加え、さらに冷却下にて1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩などの脱水縮合剤を加えた後、撹拌を続けて得られた反応溶液を水や適当な緩衝液に対して透析することにより得ることができる。【００１７】
本発明に使用し得る合成コラーゲンの縮合反応は、上記ペプチドユニットを溶解または懸濁（一部または全部を溶解）し得る溶媒中で行うことができ、通常、緩衝液を使用し得る。使用し得る緩衝液としては、例えば、リン酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液などが挙げられる。また、水を含まない非水系溶媒も使用し得る。【００１８】
また、合成コラーゲンの縮合反応に使用し得る縮合助剤としては、上記の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）などのN-ヒドロキシトリアゾール類の他に、例えば、N-ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類［例えば、N-ヒドロキシコハク酸イミド(HONSu)、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸イミド（HONB）などのN-ヒドロキシジカルボン酸イミド類］、3-ヒドロキシ-4-オキソ-3,4-ジヒドロ-1,2,3-ベンゾトリアジン(HOObt)などのトリアジン類、2-ヒドロキシイミノ-2-シアノ酢酸エチルエステルなどが含まれる。これらの縮合助剤は単独または二種以上を組み合わせて使用し得る。好ましい縮合助剤は、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）などのN-ヒドロキシベンゾトリアゾール類である。【００１９】
縮合助剤の使用量は、水系または非水系の溶媒の種類に関係なく、ペプチドユニット1モルに対して、例えば、約0.05〜5モル、好ましくは約0.1〜2モル、さらに好ましくは約0.15〜1モル程度である。【００２０】
また、合成コラーゲンの縮合反応に使用し得る脱水縮合剤としては、上記の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(WSCI・HCl)の他に、例えば、カルボジイミド系縮合剤［ジイソプロピルカルボジイミド(DIPC)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド（EDC=WSCI）、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)など］、フルオロホスフェート系縮合剤［O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、O-ベンゾトリアゾール-1-イル-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ-トリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール-1-イル-トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩(BOP)など］、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)などが含まれる。これらの脱水縮合剤は単独または二種以上を組み合わせて使用し得る。好ましい脱水縮合剤は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩などのカルボジイミド系縮合剤である。【００２１】
脱水縮合剤の使用量は、ペプチドユニット1モルに対して、水を含む水系溶媒を用いる場合には、水による脱水縮合剤の失活があるので、ペプチドユニット１モルに対して、通常、約2〜500モル（例えば、約2〜50モル）、好ましくは約5〜250モル（例えば、約5〜25モル）、さらに好ましくは約10〜125モル（例えば、約10〜20モル）程度である。一方、水を含まない非水系溶媒を用いる場合には約0.7〜5モル、好ましくは約0.8〜2.5モル、さらに好ましくは約0.9〜2.3モル（例えば約1〜2モル）程度である。【００２２】
また、合成コラーゲンを製造する際の縮合反応においては、反応系のpHを調節してもよく、また反応に関与しない塩基を添加してもよい。pHの調節は、通常、無機塩基［水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど］、有機塩基、無機酸［塩酸など］や有機酸を用いて行うことができ、通常、反応溶液を中性付近（pH＝約6〜8程度）に調節する。また、反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、N-メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などを用いることができる。このような塩基の使用量は、通常、ペプチドユニットの総モル数の約1〜2倍程度である。【００２３】
本発明のレチノール修飾コラーゲンを構成するジカルボン酸としては、２つのカルボキシル基を有する化合物であれば特に限定されないが、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、セバシン酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、フマル酸およびマレイン酸ならびにそれらの無水物などが含まれ、好ましくはマロン酸、コハク酸またはグルタル酸ならびにそれらの無水物であり、より好ましくはコハク酸およびその無水物である。【００２４】
本発明のレチノール修飾コラーゲンには、上記したようないずれか一種類のジカルボン酸がコラーゲンのヒドロキシル基に結合したもののみならず、二種類以上のジカルボン酸がコラーゲンの別のヒドロキシル基に各々結合したものも含まれる。
本発明のレチノール修飾コラーゲンでは、ジカルボン酸の２つのカルボキシル基のうちの１つのカルボキシル基がコラーゲンのヒドロキシル基にエステル結合する。
また、本発明のレチノール修飾コラーゲンには、コラーゲンのヒドロキシル基のうちの１つのヒドロキシル基にジカルボン酸が結合したものから全てのヒドロキシル基にジカルボン酸が結合したものが含まれる。【００２５】
本発明のレチノール修飾コラーゲンを構成するレチノールは、上記したようにコラーゲンにエステル結合したジカルボン酸のもう１つのカルボキシル基に、ヒドロキシル基を介してエステル結合したものである。
また、本発明のレチノール修飾コラーゲンには、コラーゲンに結合したジカルボン酸のうちの１つのジカルボン酸にレチノールが結合したものから全てのジカルボン酸にレチノールが結合したものが含まれる。【００２６】
好ましい形態において、本発明のレチノール修飾コラーゲンには、式（2）：
【化４】
2011158864.tif 000006
（2）
で表されるペプチドユニットからなるレチノール修飾コラーゲンが含まれる。【００２７】
もう１つの好ましい形態において、本発明のレチノール修飾コラーゲンには、式（2）で表されるペプチドユニットと、式（3）：
【化５】
2011158864.tif 000007
（3）
で表されるペプチドユニット、および、式（4）：
【化６】
2011158864.tif 000008
（4）
で表されるペプチドユニットの少なくとも１種のペプチドユニットとからなるレチノール修飾コラーゲンが含まれる。【００２８】
本発明のレチノール修飾コラーゲンを構成する式（2）で表されるペプチドユニットと、式（3）で表されるペプチドユニットおよび式（4）で表されるペプチドユニットの少なくとも１種のペプチドユニットとの存在割合は、(2)：(3)、(2)：(4)または(2)：（(3)＋(4)）として、モル比にて約0.1：99.9〜約100：0、約0.3：99.7〜約100：0、約0.5：99.5〜約100：0、約1.0：99.0〜約100：0、約3.0：97.0〜約100：0、約0.1：99.9〜約99.9：0.1、約0.3：99.7〜約99.9：0.1、約0.5：99.5〜約99.9：0.1、約1.0：99.0〜約99.9：0.1、約3.0：97.0〜約99.9：0.1、約0.1：99.9〜約99.7：0.3、約0.3：99.7〜約99.7：0.3、約0.5：99.5〜約99.7：0.3、約1.0：99.0〜約99.7：0.3、約3.0：97.0〜約99.7：0.3、約0.1：99.9〜約99.5：0.5、約0.3：99.7〜約99.5：0.5、約0.5：99.5〜約99.5：0.5、約1.0：99.0〜約99.5：0.5、約3.0：97.0〜約99.5：0.5、約0.1：99.9〜約99.0：1.0、約0.3：99.7〜約99.0：1.0、約0.5：99.5〜約99.0：1.0、約1.0：99.0〜約99.0：1.0、約3.0：97.0〜約99.0：1.0、約0.1：99.9〜約97.0：3.0、約0.3：99.7〜約97.0：3.0、約0.5：99.5〜約97.0：3.0、約1.0：99.0〜約97.0：3.0、約3.0：97.0〜約97.0：3.0であり、好ましくは約0.1：99.9〜約100：0、約0.3：99.7〜約100：0、約0.5：99.5〜約100：0、約1.0：99.0〜約100：0、約3.0：97.0〜約100：0であり、より好ましくは約0.5：99.5〜約100：0、約1.0：99.0〜約100：0、約3.0：97.0〜約100：0であり、最も好ましくは約1.0：99.0〜約100：0である。【００２９】
ペプチドユニット（3）、（4）または(3)＋(4)に対する(2)の存在割合がモル比にて約0.1：99.9未満である場合は有効なシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を発揮することができないため好ましくない。【００３０】
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、分子量として約500〜約3,000,000、約1,000〜約3,000,000、約3,000〜約3,000,000、約5,000〜約3,000,000、約10,000〜約3,000,000、約30,000〜約3,000,000、約500〜約2,000,000、約1,000〜約2,000,000、約3,000〜約2,000,000、約5,000〜約2,000,000、約10,000〜約2,000,000、約30,000〜約2,000,000、約500〜約1,000,000、約1,000〜約1,000,000、約3,000〜約1,000,000、約5,000〜約1,000,000、約10,000〜約1,000,000、約30,000〜約1,000,000、約500〜約700,000、約1,000〜約700,000、約3,000〜約700,000、約5,000〜約700,000、約10,000〜約700,000、約30,000〜約700,000、約500〜約500,000、約1,000〜約500,000、約3,000〜約500,000、約5,000〜約500,000、約10,000〜約500,000、約30,000〜約500,000、約500〜約100,000、約1,000〜約100,000、約3,000〜約100,000、約5,000〜約100,000、約10,000〜約100,000、約30,000〜約100,000の範囲に分子量のピークを有し、好ましくは約500〜約3,000,000、約500〜約2,000,000、約500〜約1,000,000、約500〜約700,000、約500〜約500,000、約500〜約100,000の範囲に分子量のピークを有し、最も好ましくは約500〜約1,000,000の範囲に分子量のピークを有する。
本発明のレチノール修飾コラーゲンの分子量は、例えばゲルパーミエーションクロマトグラフィーで測定することができる。【００３１】
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、好ましくはジカルボン酸エステル結合に由来する約1700〜1800cm-1の赤外スペクトル吸収、レチノールに由来する約300〜350nmのUV吸収、レチノールの環状構造に由来する1H-NMR  約1〜2ppm付近のピーク、レチノールのポリエン構造に由来する約5.5〜7ppm付近のピークを有するものである。この範囲の赤外スペクトル吸収ピークまたはUV吸収ピークが小さい場合は、コラーゲン主鎖に結合したジカルボン酸の量、またはジカルボン酸に結合したレチノールの量が少ないこととなる。赤外スペクトル吸収は、FT-IR（KBr法）で測定することができる。【００３２】
本発明のレチノール修飾コラーゲンにおけるジカルボン酸の結合量は、例えば、赤外スペクトル吸収におけるエステルとアミドのピーク強度比から測定することができる。また、より詳細には、ジカルボン酸の付加反応後、未反応のジカルボン酸の量（モル数）をHPLCで定量することにより測定することができる。すなわち、合成に用いたジカルボン酸全量より未反応のジカルボン酸量を減じた量がジカルボン酸の結合量となる。【００３３】
本発明のレチノール修飾コラーゲンにおけるレチノールの結合量は、例えば、レチノールの付加反応後、未反応のレチノールの量（モル数）をHPLCで定量することにより測定することができる。すなわち、合成に用いたレチノール全量より未反応のレチノール量を減じた量がレチノールの結合量となる。【００３４】
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、皮膚との親和性が高く、皮膚に適用すると強固に吸着して皮膚に浸透し、ヒアルロン酸合成経路の酵素遺伝子の発現を持続的に高めてヒアルロン酸の生成を増大し、また、コラーゲンの合成を促進することにより、優れた多面的なシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を持続的かつ累積的に発揮する。
したがって、本発明のレチノール修飾コラーゲンは、シワ形成防止剤、シワ改善剤、美肌剤、肌質改善剤、ヒアルロン酸生成促進剤、ヒアルロン酸合成酵素活性化剤、コラーゲン生成促進剤として有用である。【００３５】
本発明は、第２の態様において、上記のレチノール修飾コラーゲンの製造方法を提供する。
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、
（１）コラーゲン中のヒドロキシル基にジカルボン酸またはその無水物を結合させてジカルボン酸付加コラーゲンを得、ついで
（２）該ジカルボン酸付加コラーゲンのジカルボン酸のカルボキシル基にレチノールのヒドロキシル基をエステル結合させることを含む。【００３６】
本発明のレチノール修飾コラーゲンの製造方法には、レチノール修飾コラーゲンの説明において前記したコラーゲン、ジカルボン酸およびその無水物、およびレチノールを使用する。
また、コラーゲンに対するジカルボン酸またはその無水物の結合は、合成コラーゲンについて前記したような溶媒、脱水縮合剤、縮合助剤を用いて自体公知の方法で行うことができる。
ジカルボン酸付加コラーゲンに対する付加反応は、通常、DMF（ジメチルフォルムアミド）などに、ペプチドユニット1モルに対して1ないし2等量のDIPEAを添加する条件で行われる。そこで、ジカルボン酸付加コラーゲンへレチノールを結合させる反応をその条件を用いて行ったが、レチノールはほとんど付加しないことがわかった。驚くべきことには、レチノールをジカルボン酸基に結合させる工程において、溶媒として第三級アミン類を用いると、レチノールの付加量が増加することが判明した。かかる第三級アミン類としては、好ましくはトリアルキルアミン類、より好ましくはジイソプロピルエチルアミンが含まれる。【００３７】
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、従来のレチノールまたはその誘導体と比較して皮膚に対する親和性に優れ、持続的に作用して優れた多面的なシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果、肌質改善効果を発揮することができる。
したがって、本発明は、さらなる態様において、レチノール修飾コラーゲンを有効成分として含む皮膚外用組成物およびシート状化粧料を提供する。【００３８】
本発明の皮膚外用組成物に配合するレチノール修飾コラーゲンの量は、皮膚外用組成物に含浸する組成物の全量に対して、約1×10-6〜50質量％、約1×10-5〜50質量％、約5×10-4〜50質量％、約1×10-4〜50質量％、約5×10-3〜50質量％、約0.001〜50質量％、約1×10-6〜40質量％、約1×10-5〜40質量％、約5×10-4〜40質量％、約1×10-4〜40質量％、約5×10-3〜40質量％、約0.001〜40質量％、約1×10-6〜30質量％、約1×10-5〜30質量％、約5×10-4〜30質量％、約1×10-4〜30質量％、約5×10-3〜30質量％、約0.001〜30質量％、約1×10-6〜20質量％、約1×10-5〜20質量％、約5×10-4〜20質量％、約1×10-4〜20質量％、約5×10-3〜20質量％、約0.001〜20質量％、約1×10-6〜10質量％、約1×10-5〜10質量％、約5×10-4〜10質量％、約1×10-4〜10質量％、約5×10-3〜10質量％または約0.001〜10質量％であり、好ましくは約1×10-5〜30質量％である。約1×10-6質量％未満の配合量では、本発明の目的とする効果が十分得られない場合があり、一方、50質量％を超えて配合してもその増加分に見合った効果の向上が得られない。【００３９】
本発明の皮膚外用組成物は、例えば、軟膏剤、クリーム剤などの医薬、洗顔料、乳液、クリーム、ローション、ジェル、美容液などの基礎化粧料、ファンデーション、口紅などのメーキャップ化粧料などに処方化することができる。また、本発明のシート状化粧料は、レチノール修飾コラーゲンのみから構成される場合のほか、他の任意の成分を適宜配合して構成される場合があり、パックやマスクなどに処方化することができる。【００４０】
レチノール修飾コラーゲンを有効成分とする皮膚外用組成物やシート状化粧料を処方化する場合は、当該技術分野で公知の溶媒、界面活性剤、油剤、香料、色素、酸化防止剤、保存料、色素などを配合して、自体公知の方法によって処方化することができる。
【実施例】
【００４１】
つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これは説明することを目的とするものであって、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。なお、特に断らない限り％は質量％を示す。【００４２】
製造例
レチノール修飾コラーゲンの合成
（１）ポリ（Pro-Hyp-Gly）の合成反応
Pro-Hyp-Gly（PHG）トリペプチド（(株)ペプチド研究所）を10mMリン酸塩緩衝液（pH7.4）に溶解攪拌した後、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を加えて攪拌し、5℃以下に冷却した。1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添加し、90分間放置（反応）後、加温し、10mMリン酸塩緩衝生食液（PBS；pH7.4、0.15M  NaClを含む）を添加して反応を停止させた。反応物は透析の後に、凍結乾燥してスポンジ状の合成コラーゲンを得た。【００４３】
（２）ポリ（Pro-Hyp-Gly）合成物の評価
得られた合成コラーゲン（poly-PHG）について、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GEヘルスケアジャパン（株）、AKTApurifierシステム、column：Superdex  200HRGL、流速：0.5ml／分、溶離液：10mMリン酸塩緩衝生食液（PBS；pH7.4、0.15M  NaClを含む））を用いて分子量測定を行った。その結果、合成コラーゲンの分子量は2,000〜100,000に分布し、ピークトップは20,000付近に確認された。分子量はポリエチレングリコール（Fluka社）を標準物質として使用して算出した。
また、得られた合成コラーゲンの円二色性スペクトルを測定したところ、225nmに正のコットン効果、197nmに負のコットン効果が観察され、三重らせん構造を形成していることが確認された。【００４４】
（３）合成コラーゲン（poly-PHG）へのコハク酸の付加反応
乾燥した合成コラーゲンを細かく切断し、ジメチルホルムアミド（DMF)で洗浄した。DMFを添加し、攪拌しながら5℃以下に冷却した。再結晶により精製した無水コハク酸（和光純薬工業（株）、特級試薬）と、ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を添加した後に、2時間反応させた後に温度を20℃としてさらに一晩反応させた。反応は水で4倍に希釈することで停止させた。反応液は透析の後に、凍結乾燥してスポンジ状のコハク酸が付加した合成コラーゲンを得た。【００４５】
（４）コハク酸付加合成コラーゲンの評価
生成したコハク酸付加合成コラーゲンの赤外吸収スペクトルをFT-IR（KBr法）により測定した。その結果、1730cm-1付近にエステル結合由来の吸収が出現し、得られたコハク酸付加合成コラーゲンが、合成コラーゲンのヒドロキシル基にコハク酸がエステル結合した構造を有することが確認された。【００４６】
（５）コハク酸付加合成コラーゲンへのレチノールの付加反応
コハク酸付加合成コラーゲンにジメチルホルムアミドを添加して懸濁した。つづいて、N-ヒドロキシスクシンイミド（HOSu）および1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩を添加して攪拌し、20℃にて一晩反応させた。その反応物をメタノールおよびテトラヒドロフランで洗浄後、反応溶媒としてジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を添加し、つづいてレチノールを添加し、攪拌しつつ20℃にて一晩反応させた。その反応物をイソプロパノールおよびベンゼンで洗浄後、凍結乾燥して目的のレチノール修飾コラーゲンを得た。【００４７】
（６）レチノール修飾コラーゲンの評価
得られた反応物を重溶媒に溶解し、1H-NMRスペクトルを測定した（JOEL、JNM-ECP600 spectrometer）。その結果、1〜2ppmにレチノールの環状構造由来のピークが、5.5〜7ppmにレチノールのポリエン構造由来のピークが確認された。また、レチノールの15位由来の水素ピークがレチノール単体よりも低磁場側にシフトしていた。以上のことから、得られた反応物が、コハク酸付加合成コラーゲンにレチノールがエステル結合を介して付加した構造を有することが確認された。
また、得られた反応物について、レチノールに由来する325nmのUV吸収を測定してレチノールの付加を確認した。【００４８】
試験例１
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現に及ぼす効果の評価
ケラチノサイト単層培養系を用いたレチノール修飾コラーゲンの評価１（レチノールおよびレチノール誘導体との比較）
ヒト表皮角化細胞（Cell Application Inc.社）をヒト表皮角化細胞増殖培地（Cell Application Inc.社）を含む24ウェルマイクロタイタープレートに細胞数が1ウェル当たり1.5×105個になるよう播種し、5%CO2−95%Air中、37℃にてコンフルエントになるまで約2日間培養した。
つぎに、培地を棄て、レチノール濃度として10-6Mまたは10-5Mの最終濃度に調製した、製造例のレチノール修飾コラーゲン（REcol）、レチノール（Retinol）、パルミチン酸レチノール（PalRE）または酢酸レチノール（AceRE）を含有する培地、または培地のみ（対照区、V）を加えて、5%CO2−95%Air中、37℃にて6、24または48時間培養した。なお、各被験物質は少量のジメチルホルムアミドに溶解して培地に添加し、全ての実験区においてジメチルホルムアミドの濃度は0.1重量％に調整した。
所定の時間培養した後、ケラチノサイトを回収してRNAを抽出し、プライマー対(タカラバイオ(株))
HAS2：  Fwプライマー    agtcatgtacacagccttcagagca（配列番号：１）
Rvプライマー    cacctccaaccatgggatcttc（配列番号：２）
HAS3：  Fwプライマー    tcggcgattcggtggacta（配列番号：３）
Rvプライマー    cctccaggactcgaagcatctc（配列番号：４）
を用いたリアルタイムPCRによりヒアルロン酸合成酵素HAS2およびHAS3の遺伝子発現を評価した。その結果を図１に示す。
グラフは、培養6時間後の対照区（V）におけるペプチジルプロリルイソメラーゼA（PPIA）遺伝子に対するHAS2またはHAS3遺伝子の発現比を1とした場合の各被験物質による遺伝子発現の比を表す。【００４９】
その結果、レチノール修飾コラーゲンは、HAS2およびHAS3の両方の遺伝子について培養後48時間以上にわたって高い発現を維持することが判明した。また、遺伝子発現の程度はレチノール修飾コラーゲンの濃度に依存することが判明した。一方、従来のレチノール誘導体である酢酸レチノールおよびパルミチン酸レチノールは、レチノール修飾コラーゲンと比較して低い程度の遺伝子発現しか誘導し得ないことが判明した。【００５０】
試験例２
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現に及ぼす効果の評価
ケラチノサイト単層培養系を用いたレチノール修飾コラーゲンの評価１（レチノールおよびレチノール混合系との比較）
レチノール濃度として10-5Mの最終濃度に調製した、製造例のレチノール修飾コラーゲン（REcol）、レチノールおよび製造例のコハク酸付加合成コラーゲンの混合物（非付加物、MIX）ならびにレチノール（Retinol）を用いて、試験例1と同様の方法でヒアルロン酸合成酵素遺伝子HAS2およびHAS3の発現を評価した。その結果を図2に示す。【００５１】
その結果、レチノール修飾コラーゲンは、HAS2およびHAS3の両方の遺伝子について培養後48時間以降に、レチノールおよびコハク酸付加合成コラーゲンの混合物ならびにレチノールと比較して顕著に高い発現を誘導することが判明した。【００５２】
試験例３
レチノール修飾コラーゲンの細胞毒性の評価
レチノール修飾コラーゲンに対するケラチノサイトの細胞生存率を評価し、レチノール（Sigma  Aldrich社）、レチノールおよび合成コラーゲンの混合物、および汎用レチノール誘導体である酢酸レチノール（Sigma  Aldrich社）を用いた場合と比較した。
ヒト表皮角化細胞（Cell  Applications  Inc.）をヒト表皮角化細胞増殖培地（Cell  Applications  Inc.）を含む96ウェルプレートに細胞数が1ウェル当たり2.32×104個になるように播種し、5%CO2−95%Air中、37℃にてコンフルエントになるまで2日間培養した。
一方、各被験物質（レチノール（Retinol）、レチノール修飾コラーゲン（REcol）、酢酸レチノール（AceRE）、レチノールおよび合成コラーゲンの混合物（Retinol+pPHG））を、少量のジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、レチノール濃度として5〜200μMになるようにKBMで希釈し（培地におけるDMSO最終濃度が1%となるよう調製、対照区（Control）はDMSO最終濃度が1%となるようKBMで希釈）、これをヒト表皮角化細胞の培養に用いた培地と交換した。
培地交換後24時間のヒト表皮角化細胞の生存率を細胞増殖試薬WST−1（Roch  Diagnostics）を用いて評価した（N＝5）。その結果を図3に示す。【００５３】
その結果、レチノール修飾コラーゲンを適用した場合には、レチノールやレチノールおよびコラーゲン混合物を適用した場合と比較して細胞の生存率が高く、また酢酸レチノールを適用した場合と同等以上の細胞生存率を示した。したがって、レチノール修飾コラーゲンの細胞毒性が汎用されているレチノール誘導体と同等に低いことが判明した。【００５４】
試験例４
ケラチノサイト単層培養系を用いたレチノール修飾コラーゲンの炎症性サイトカイン産生の評価
ケラチノサイト単層培養系における、レチノール修飾コラーゲンによるかゆみ指標である炎症性サイトカインIL-8産生量を評価した。
ヒト表皮角化細胞（HEK）をヒト表皮角化細胞増殖培地を含む24ウェルプレートに播種し（1.0×105  cells/well）、コンフルエントになるよう、2日間培養した。
一方、各被験物質（レチノール（Retinol）、レチノール修飾コラーゲン（REcol）、コハク酸付加コラーゲン（Suc））を、少量のDMSO中に溶解させ、レチノール濃度として10-6Mまたは10-5Mの濃度になるようKBMで希釈し、（培地におけるDMSO最終濃度が1%となるよう調製、対照区（Control）はDMSO最終濃度が1%となるようKBMで希釈）、これをヒト表皮角化細胞の培養に用いた培地と交換した。
培地交換から24時間後に培養培地を回収し、ELISAキット（R&D  systems社）によってIL−8産生量を定量した（N＝4）。その結果を図4に示す。【００５５】
その結果、レチノール修飾コラーゲンを適用した場合には、レチノールやコハク酸付加コラーゲンを適用した場合と比較して、表皮の炎症の指標とされる炎症性サイトカインIL−8の産生が抑制され、レチノール使用時の副作用として生じるかゆみ等を引き起こすことなく、皮膚に適用できることが示された。【００５６】
試験例５
ヒト三次元培養表皮を用いたレチノール修飾コラーゲンの炎症性サイトカイン産生の評価
ケラチノサイト三次元培養表皮系における、レチノール修飾コラーゲンによるかゆみ指標である炎症性サイトカインIL-8産生量を評価した。
12ウェルマイクロプレートに付属のAssay培地を1ml添加し、ヒト三次元培養表皮（LabCyte  EPI−MODEL、（株）J−TEC社）を5%CO2−95%Air中、37℃にて2時間事前培養した。
ついで、事前培養した培養表皮に、オリーブ油（Control)、レチノール濃度として0.1%に調整したレチノール（Retinol）またはレチノール修飾コラーゲン（REcol）を80μl添加し、4日間培養した。レチノールおよびレチノール修飾コラーゲン溶液の調製にはオリーブ油を用いた。
添加後2日目および4日目に培地を回収し、ELISAキット（R&D  systems）によってIL−8産生量を定量した（2日目までN＝5、4日目までN＝3）。また、有意差はstudent−t検定により算出した。その結果を図5に示す。【００５７】
その結果、レチノール修飾コラーゲンを適用した場合には、同濃度のレチノールを適用した場合と比較して表皮の炎症の指標とされる炎症性サイトカインIL−8の産生が抑制され、レチノール使用時の副作用として生じるかゆみ等を引き起こすことなく、皮膚に適用できることが示された。
なお、試験例４ではレチノール修飾コラーゲンによるIL−8産生量が対照区よりも抑制され、また、試験例５の結果と傾向が異なる点については、三次元培養皮膚系を用いた場合（試験例５）には角質層上に物質が添加されるため物質と生細胞とが直接接する面積が少ないのに対し、単層培養系を用いた場合（試験例４）は生細胞と物質とが直接接するため、物質による効果が顕著に表れたものと考察した。【００５８】
試験例６
ヒト三次元培養表皮を用いたレチノール修飾コラーゲンによるヒアルロン酸産生の評価
試験例１および２では、ケラチノサイトのリアルタイムPCR評価により、レチノール修飾コラーゲンがヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を誘導することが示された。そこで、実使用する皮膚により近い条件として、ヒト三次元培養表皮（LabCyte、EPI−MODEL12）を用いてヒアルロン酸そのものの産生量を定量した。
12ウェルプレートに付属のAssay培地を1ml添加し、ヒト三次元培養表皮（LabCyte  EPI−MODEL、（株）J−TEC社）を5%CO2−95%Air中、37℃にて2時間事前培養した。
ついで、事前培養した培養皮膚に、オリーブ油（Control）、レチノール濃度として0.1%に調整したレチノール（Retinol）またはレチノール修飾コラーゲン（REcol）を80μl添加し、4日間培養した。レチノールおよびレチノール修飾コラーゲン溶液の調製にはオリーブ油を用いた。
添加後2日目および4日目に培養表皮を回収し、培養表皮内のヒアルロン酸量をヒアルロン酸測定キット（生化学バイオビジネス(株)社）によって定量した（2日目までN＝5、4日目までN＝3）。また、有意差はstudent−t検定により算出した。その結果を図6に示す。【００５９】
その結果、2日目ではレチノール修飾コラーゲンはレチノールと同等のヒアルロン酸産生量を示し、4日目ではレチノールよりも高いヒアルロン酸産生量を示した。【００６０】
試験例７
ヒト三次元培養皮膚を用いたレチノール修飾コラーゲンによるI型コラーゲン合成の評価
実使用する皮膚により近い条件として、ヒト三次元培養皮膚（EFT−412、倉敷紡績(株)社）を用いてI型コラーゲンの合成量を定量した。
6ウェルプレートに付属のAssay培地を2ml添加し、ヒト三次元培養皮膚（EFT−412、倉敷紡績(株)社）を5%CO2雰囲気のインキュベーター内、37℃にて一晩事前培養した。
ついで、事前培養した培養皮膚に、オリーブ油、0.5%レチノールまたは0.5%レチノール修飾コラーゲンを80μl添加し、2日間培養した。レチノールおよびレチノール修飾コラーゲン溶液の調製にはオリーブ油を用いた。
添加後1日目および2日目に培養培地を回収し、培地中のI型プロコラーゲン（PIP）量を、PIP  EIAキット（タカラバイオ（株）社）によって定量した（2日目までN＝6）。また、有意差はstudent−t検定により算出した。その結果を図7に示す。【００６１】
その結果、レチノール修飾コラーゲンはレチノールよりも高いPIP合成量を示し、レチノール修飾コラーゲンによる高いI型コラーゲン合成の促進効果が確認された。【００６２】
なお、本発明のレチノール修飾コラーゲンは、皮膚に適用すると強固に吸着し、また、皮膚の角質層まで比較的短時間のうちに浸透するため、皮膚を洗浄しても一定量が残存して効果が持続的かつ累積的に発揮される。
これらの試験から、本発明のレチノール修飾コラーゲンは、従来使用されていたレチノールやレチノール誘導体と比較して長時間にわたる高いヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現の維持、低い細胞毒性、炎症性サイトカイン産生抑制、高いヒアルロン酸産生およびコラーゲン産生効果を有することが判明し、皮膚に適用して優れたシワ形成防止効果、シワ改善効果、美肌効果および肌質改善効果を発揮することが示された。【００６３】
上記したように、本発明のレチノール修飾コラーゲンはヒト皮膚細胞に対してヒアルロン酸およびI型コラーゲン産生量を増大する効果を有することが示された。
ヒアルロン酸はその保水力による表皮保湿効果や、皮膚の乾燥により形成される小ジワを表皮の保湿により改善・予防する効果のほか、角層のヒアルロン酸がラジカルスカベンジャーとして作用するとの報告がある（Fragrance  Journal  2004，5，65−71）ことから、本発明のレチノール修飾コラーゲンは保湿効果、細胞増殖（ターンオーバー促進）および抗酸化効果を有する。また、創傷治癒の過程では真皮におけるヒアルロン酸量が増大して細胞の遊走や増殖、栄養素や酵素の供給などを行うため（Fragrance  Journal  2004，5，65−71）、本発明のレチノール修飾コラーゲンは表皮での創傷治癒にも効果を有する。また、角層のヒアルロン酸が細胞間の脂質ラメラ構造と相互作用することが報告されており（The  Journal  of  Investigative  Dermatology，2000，Vol.114，No.6，1184−1187）、培養皮膚にヒアルロン酸を添加すると表皮が厚くなり、ヒアルロン酸が表皮の脂質によるバリア機能を促進すると考えられる（Experimental  Dermatology，19，e336-e339）ことから、本発明のレチノール修飾コラーゲンは表皮バリア機能を促進する効果を有する。【００６４】
また、真皮コラーゲンが増加することにより、真皮構造に起因する肌弾力の改善効果が得られることから、本発明のレチノール修飾コラーゲンはたるみ予防・改善効果を有し、さらに、真皮性の深いシワおよび表皮性の浅いシワの両方に対してシワ形成防止効果およびシワ改善効果を有する。【００６５】
その他、本発明のレチノール修飾コラーゲンは、ハリ改善効果、光老化皮膚の改善効果、アンチエイジング効果や、肌を整える、肌のキメを整える、皮膚を健やかに保つ、肌荒れを防ぐ、皮膚に潤いを与える、皮膚の柔軟性を保つ、肌をひきしめる、皮膚の乾燥を防ぐ、肌をやわらげる、肌にはりを与える、肌につやを与える、肌をなめらかにする、皮膚を保護するなどの化粧品の効能効果を有する。【００６６】
処方例１：化粧水
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
エタノール                                          ５．０
濃グリセリン                                        ４．０
トレハロース                                        １．０
フェノキシエタノール                                ０．７
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60 E.O.)            ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム                              ０．１
パラベン                                            ０．１
クエン酸                                            ０．０８
クエン酸ナトリウム                                  ０．０８
香料                                                ０．０３
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００６７】
処方例２：美容液
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ５．０
エタノール                                        １０．０
濃グリセリン                                      １０．０
１，３−ブチレングリコール                          ６．０
フェノキシエタノール                                ０．８
ｄｌ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム                ０．５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60 E.O.)            ０．５
キサンタンガム                                      ０．４
ヒアルロン酸ナトリウム                              ０．１
香料                                                ０．１
パラベン                                            ０．１
クエン酸                                            ０．０８
クエン酸ナトリウム                                  ０．０８
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００６８】
処方例３：乳液
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ５．０
１，３−ブチレングリコール                        １２．０
オリーブ油                                          ８．０
エタノール                                          ３．０
メチルポリシロキサン                                ２．０
ステアリン酸                                        １．０
トリ（カプリル／カプリン酸）グリセリン              １．０
バチルアルコール                                    １．０
フェノキシエタノール                                ０．７
カルボキシビニルポリマー                            ０．２
水酸化カリウム                                      ０．２
レシチン                                            ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム（２）                        ０．１
香料                                                ０．１
パラベン                                            ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００６９】
処方例４：クリーム
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                          １０．０
濃グリセリン                                      １０．０
オリーブ油                                          ８．０
スクワラン                                          ６．０
モノステアリン酸ポリグリセリル                      ４．０
親油性モノステアリン酸グリセリル                    ４．０
ステアリン酸                                        ４．０
セタノール                                          ３．０
エタノール                                          ３．０
１，２−ヘキサンジオール                            １．０
フェノキシエタノール                                ０．９
メチルポリシロキサン                                ０．７
水酸化カリウム                                      ０．６
カルボキシビニルポリマー                            ０．２
香料                                                ０．１
ｄｌ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム                ０．１
パラベン                                            ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７０】
処方例５：クリーム
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ５．０
濃グリセリン                                      １０．０
オリーブ油                                          ８．０
スクワラン                                          ６．０
モノステアリン酸ポリグリセリル                      ４．０
親油性モノステアリン酸グリセリル                    ４．０
ステアリン酸                                        ４．０
セタノール                                          ３．０
エタノール                                          ３．０
フェノキシエタノール                                ０．９
メチルポリシロキサン                                ０．７
水酸化カリウム                                      ０．６
カルボキシビニルポリマー                            ０．２
香料                                                ０．１
ｄｌ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム                ０．１
パラベン                                            ０．１
１，２−ヘキサンジオール                            １．０
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７１】
処方例６：洗顔フォーム
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
ミリスチン酸                                      １５．０
パルミチン酸                                      １２．０
ステアリン酸                                      １０．０
水酸化カリウム                                      ８．０
濃グリセリン                                        ５．０
１，３−ブチレングリコール                          ４．０
ラウリン酸                                          ３．０
サラシミツロウ                                      ２．０
エタノール                                          ２．０
１，２−ヘキサンジオール                            １．０
フェノキシエタノール                                ０．９
香料                                                ０．６
エデト酸二ナトリウム                                ０．２
パラベン                                            ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７２】
処方例７：クレンジングジェル
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
濃グリセリン                                      １７．０
ジプロピレングリコール                            １７．０
ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸グリセリン（7 E.O.）１５．０
エタノール                                          ５．０
オリーブ油                                          ２．０
カルボキシビニルポリマー                            １．０
マカデミアナッツ油                                  １．０
フェノキシエタノール                                ０．９
水酸化ナトリウム                                    ０．５
パラベン                                            ０．１
香料                                                ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７３】
処方例８：化粧下地
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            １．０
デカメチルシクロペンタシロキサン                  ４５．０
酸化亜鉛                                          ２６．０
１，３−ブチレングリコール                          ５．０
オリーブ油                                          ３．０
酸化チタン                                          ２．０
モノイソステアリン酸ポリグリセリル                  ２．０
濃グリセリン                                        １．０
エタノール                                          １．０
フェノキシエタノール                                ０．８
ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体                      ０．５
塩化ナトリウム                                      ０．５
パラベン                                            ０．１
クエン酸                                            ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７４】
処方例９：パウダーファンデーション
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
セリサイト                                        １５．０
合成金雲母                                        １０．０
酸化チタン                                        １０．０
酸化亜鉛                                          １０．０
窒化ホウ素                                          ５．０
酸化鉄                                              ５．０
ベンガラ                                            ２．０
酸化アルミニウム                                    １．０
メチルポリシロキサン                                １．０
メチルハイドロジェンポリシロキサン                  １．０
２−エチルヘキサン酸セチル                          １．０
イソステアリン酸グリセリル                          ０．５
エタノール                                          ０．１
パラベン                                            ０．１
フェノキシエタノール                                ０．１
精製水                                              ０．１
ヒアルロン酸ナトリウム                              ０．０１
タルク                                              残部        
合計                                            １００．０【００７５】
処方例１０：リキッドファンデーション
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．５
デカメチルシクロペンタシロキサン                  ３０．０
酸化チタン                                          ８．０
酸化亜鉛                                            ５．０
トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル                  ５．０
１，３−ブチレングリコール                          ５．０
メチルポリシロキサン・セチルメチルポリシロキサン・
ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体                      ３．５
酸化鉄                                              ３．０
トリイソステアリン酸ポリグリセリル                  ３．０
１，２−ペンタンジオール                            ３．０
セリサイト                                          ３．０
オクチルドデカノール                                ２．０
ジイソステアリン酸ポリグリセリル                    ２．０
エタノール                                          １．０
塩化ナトリウム                                      ０．５
フェノキシエタノール                                ０．５
無水ケイ酸                                          ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７６】
処方例１１：シャンプー
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
ポリオキシエチレン（3 E.O.）
ラウリルエーテル硫酸ナトリウム                  １５．０
プロピレングリコール                                ８．０
ヤシ油脂肪アミドプロピルジメチルアミノ酢酸ベタイン  ５．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                      ３．０
フェノキシエタノール                                ０．８
香料                                                ０．７
パラベン                                            ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７７】
処方例１２：ヘアコンディショナー
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
トリカプリル酸グリセリル                            ５．０
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム                ４．０
プロピレングリコール                                ３．０
ポリオキシエチレン（5 E.O.）オレイルエーテル        ２．５
セタノール                                          ２．５
フェノキシエタノール                                ０．８
香料                                                ０．５
パラベン                                            ０．１
精製水                                              残部        
合計                                            １００．０【００７８】
処方例１３：入浴剤
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            ０．１
硫酸ナトリウム                                    ５０．０
酸化チタン                                          １．０
香料                                                ０．７
炭酸水素ナトリウム                                  残部        
合計                                            １００．０【００７９】
処方例１４：パック
成分                                        配合量（％）  
レチノール修飾コラーゲン                            残部
ヒアルロン酸ナトリウム（２）                      １０．０      
合計                                            １００．０
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明のレチノール修飾コラーゲンは、製薬および化粧品の分野において、皮膚外用組成物またはシート状化粧料として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号：１をヒアルロン酸合成酵素遺伝子HAS2につきリアルタイムPCRに付すためのフォワードプライマーとする。
配列番号：２をヒアルロン酸合成酵素遺伝子HAS2につきリアルタイムPCRに付すためのリバースプライマーとする。
配列番号：３をヒアルロン酸合成酵素遺伝子HAS3につきリアルタイムPCRに付すためのフォワードプライマーとする。
配列番号：４をヒアルロン酸合成酵素遺伝子HAS3につきリアルタイムPCRに付すためのリバースプライマーとする。
【図１Ａ】
2011158864.tif 000012
【図１Ｂ】
2011158864.tif 000013
【図２】
2011158864.tif 000014
【図３】
2011158864.tif 000015
【図４】
2011158864.tif 000016
【図５】
2011158864.tif 000017
【図６】
2011158864.tif 000018
【図７】
2011158864.tif 000019
【配列表】
2011158864000001.app
【国際調査報告】
2011158864.tif 000020
2011158864.tif 000021
2011158864.tif 000022
2011158864.tif 000023