(57)【要約】  本発明は、Ｄ−キシロネートの製造方法およびコリネ型細菌に関する。本発明により、ミオイノシトール代謝レギュレーターをコードする遺伝子ＩｏｌＲ（以後、ＩｏｌＲ遺伝子と呼ぶ）の活性が低下もしくは消失しているか、またはＩｏｌＲ遺伝子が少なくとも部分的に欠失しているコリネ型細菌を用いて、基質としてのＤ−キシロネートから出発して、非常に高い収率の鏡像体純粋なＤ−キシロネートを獲得することができることが発見された。したがって本発明により、Ｄ−キシロネートの製造方法、および産生株におけるＩｏＩ−Ｒ遺伝子の活性が野生型もしくは野生型の変異体に比して低下もしくは消失しているか、またはＩｏｌＲ遺伝子が部分的もしくは完全に欠失している産生株としてのコリネ型細菌が、提供される。
2019518453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−キシロースからＤ−キシロネートを微生物で製造する方法であって、ＩｏｌＲ遺伝子の活性が野生型もしくは野生型の突然変異体と比較して低下しているかもしくは完全に消失しているか、またはＩｏｌＲ遺伝子が完全もしくは部分的に欠失しているコリネ型細菌によって、Ｄ−キシロースがＤ−キシロネートに変換されることを特徴とする方法。
【請求項２】
組換え改変されていないコリネ型細菌が使用されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはブレビバクテリウム・ジバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）の群からのコリネ型細菌が使用されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９
ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９および
ブレビバクテリウム・ジバリカタムＡＴＣＣ１４０２０
からなる群からのコリネ型細菌が使用されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＩｏｌＲ遺伝子の部分的なまたは完全な不活性化が、ＩｏｌＲの基質／誘導物質としてのミオイノシトールの使用、改変がＩｏｌＲ遺伝子の活性に影響を及ぼすＩｏｌＲ遺伝子の遺伝子領域へのベクターまたは別の遺伝子配列の挿入、リプレッサー遺伝子、アクティベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合部位、開始コドン、ターミネーターなどの遺伝子発現のシグナル構造の改変、トランジション、トランスバージョン、挿入または欠失の形態の突然変異によって行われることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
Ｄ−キシロネートの製造が、Ｄ−キシロース含有規定培地で実施されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
ＩｏｌＲ遺伝子の活性が野生型もしくは野生型の突然変異体と比較して低下しているかもしくは完全に消失しているか、またはＩｏｌＲ遺伝子が完全もしくは部分的に欠失していることを特徴とする、コリネ型細菌。
【請求項８】
組換え改変されていないことを特徴とする、請求項７に記載のコリネ型細菌。
【請求項９】
コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、特にコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムまたはブレビバクテリウム・ジバリカタムの群からの生物であることを特徴とする、請求項７または８に記載のコリネ型細菌。
【請求項１０】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラムＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９
ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９および
ブレビバクテリウム・ジバリカタムＡＴＣＣ１４０２０
からなる群からの生物であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一つに記載のコリネ型細菌。
【請求項１１】
コリネ型細菌において、ＩｏｌＲの基質／誘導物質としてのミオイノシトールの使用、ＩｏｌＲ遺伝子の遺伝子領域へのベクターまたは別の配列の挿入、リプレッサー遺伝子、アクティベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合部位、開始コドン、ターミネーターなどの遺伝子発現のシグナル構造の改変、トランジション、トランスバージョン、挿入または欠失の形態の突然変異による、ＩｏｌＲ遺伝子の部分的なまたは完全な不活性化が存在することを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一つに記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−キシロネートの製造方法およびコリネ型細菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−キシロン酸（Ｃ５Ｈ１０Ｏ６）は、ＴｏｉｖａｒｉらによってＡｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２、９６（１）：  １〜８（非特許文献１）に記載されたように、ポリアミド、ポリエステルおよび１，２，４−ブタントリオールの前駆体として役立つことができ、したがって、医薬品工業、食品工業および化学工業に広い使用潜在性を有する有機酸である。以下の説明は、Ｄ−キシロン酸の塩であるＤ−キシロネートに関するものである。Ｄ−キシロネートは、潜在的に高価値であって、第２世代の再生可能原料、例えばペントース含有ヘミセルロースに基づく前駆体化学物質の上位３０品目の１つに数えられる。Ｄ−キシロネートは、８０ｋｔ／年の世界市場をもつＤ−グルコネート（Ｃ６Ｈ１１Ｏ７）と類似性を有する。
【０００３】
Ｄ−キシロネートは、自然界では一部の細菌において二段階反応を経て生成される。最初の反応でＤ−キシロースがＤ−キシロノラクトンに酸化され、ここで、生物に応じて特異的デヒドロゲナーゼが触媒活性である。続いて、Ｄ−キシロノラクトンは、特異的ラクトナーゼにより、または酵素触媒なしに自然発生的に、Ｄ−キシロネートに変換し得る。例えば、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）種およびシュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ）種に関して高いＤ−キシロネート産物力価が報告されており、（Ｂｕｃｈｅｒｔら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７（４）：  ３３３〜３３６（非特許文献２）、Ｔｏｉｖａｒｉら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２、９６（１）：  １〜８（非特許文献１））が記載された。
【０００４】
加えて、（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２、１１５：  ２４４〜２４８（非特許文献３）、Ｒｉｃｈａｒｄら、２０１２年、ＵＳ２０１２０００５７８８Ａ１（ＵＳ１３／２５６，５５９）（特許文献１）、Ｔｏｉｖａｒｉら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ、２０１２、１４（４）：  ４２７〜４３６（非特許文献４））によって記載されたように、代替的なＤ−キシロネート産生株（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の酵母、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）種の細菌およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）種の真菌）が、例えばカウロバクター・クレセンタス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）由来のＤ−キシロースデヒドロゲナーゼの異種発現により生まれた。
【０００５】
微生物的産生以外に、Ｄ−キシロネートは、電気化学的に（Ｊｏｋｉｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１（４）：  ３２１〜３２６（非特許文献５））、酵素的に（Ｐｅｚｚｏｔｔｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ、２００６、３４１（１３）：  ２２９０〜２２９２（非特許文献６））または化学酸化により（Ｉｓｂｅｌｌら、Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９３２、８（３）：  ３２７〜３３８（非特許文献７））製造することができる。
【０００６】
有機酸またはその塩は、コリネ型細菌株、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の発酵により製造することができることは、公知である。
【０００７】
文書ＵＳ２０１３／０２９５６２１Ａ１（特許文献２）は、遺伝子工学的に改変された細菌によるＤ−キシロン酸の製造方法を開示している。
【０００８】
例えばグルコノバクター・オキシダンスのような、内因性Ｄ−キシロネート合成能を有する現状技術から公知の産生株は、その増殖のために非規定培地を必要とし、それによってＤ−キシロネートの産生は、明らかにより費用がかかり、より高価に、それに伴いより不経済になる。
【０００９】
今までに記載された全ての「非天然」Ｄ−キシロネート産生体は、遺伝子工学の規制に関する法律（ＧｅｎＴＧ）第３条の意味において遺伝子工学的に改変された生物であり、この法律によると、生物、とりわけ様々な酵母、真菌および細菌が異種発現能をもつか、またはこの生物にとって外来の遺伝子を含む、したがって組換え改変されている場合に、その生物が遺伝子工学的に改変されている。それにより、費用のかかる認可手続きの結果、例えば食品工業および医薬品工業のような特定の工業分野における使用にとっての欠点が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＵＳ２０１２０００５７８８Ａ１（ＵＳ１３／２５６，５５９）
【特許文献２】ＵＳ２０１３／０２９５６２１Ａ１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔｏｉｖａｒｉら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２、９６（１）：  １〜８
【非特許文献２】Ｂｕｃｈｅｒｔら、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２７（４）：  ３３３〜３３６
【非特許文献３】Ｌｉｕら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２、１１５：  ２４４〜２４８
【非特許文献４】Ｔｏｉｖａｒｉら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ、２０１２、１４（４）：  ４２７〜４３６
【非特許文献５】Ｊｏｋｉｃら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１（４）：  ３２１〜３２６
【非特許文献６】Ｐｅｚｚｏｔｔｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ、２００６、３４１（１３）：  ２２９０〜２２９２
【非特許文献７】Ｉｓｂｅｌｌら、Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９３２、８（３）：  ３２７〜３３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
Ｄ−キシロネートおよびそれと共にＤ−キシロン酸を高い鏡像体純度および高い回収率で製造することができる方法および微生物を提供する必要性がある。工業的利用に、特に食品工業、医薬品および化学工業に利用することができ、食品工業ならびに医薬品および化学工業における使用のための認可条件を容易に満たす微生物および方法を、特に提供すべきである。遺伝子工学の規制に関する法律第３条の意味における遺伝子改変生物に付随する欠点、特に組換え改変生物に付随する欠点を好ましくは回避すべきである。特に、割安で容易に使用可能な、簡単で低コストの培地を培養のために使用できるべきである。使用される微生物は、規定培地で高い増殖速度を有し、高いバイオマス収量を達成し、後続の産物の処理を簡単にするべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この課題は、本発明により、請求項１および並行請求項の前提部分から出発して、これらの請求項の特徴部分に示される特徴によって解決される。
【００１４】
本発明の微生物、そのゲノムおよび本発明の製造方法を用いて、今や、鏡像体純度１００％のＤ−キシロネートを高い収率で、例えば＞０．５のｇ  Ｄ−キシロネート／ｇ  Ｄ−キシロースで製造することが可能である。本発明の微生物は、工業的使用に十分に適しており、好ましい一実施形態では、食品工業、ならびに医薬品および化学工業における用途のための認可基準を満たし、特に、遺伝子工学法の下で組換え改変されていないと見なされる。本発明の微生物は、規定培地で高い増殖速度および高いバイオマス収率を達成し、簡単な産物処理を可能にする。現状技術の欠点が克服される。規定培地は、価格がより安く、使用があまり厄介でない。産生生物の増殖は、非規定培地の場合よりも再現性がある。培地の複雑さは小さく、それに伴い、産物処理のために必要な工程段階の数は減少する。
【００１５】
本発明の有利な変形形態を従属請求項に示す。
【００１６】
以下に本発明を、その全般的な形態で説明するが、これを限定的に解釈すべきではない。
【００１７】
驚くべきことに、ミオイノシトール代謝のレギュレーターをコードする遺伝子ＩｏｌＲ（以後、ＩｏｌＲ遺伝子と呼ぶ）の活性が低下もしくは消失している、またはＩｏｌＲ遺伝子が少なくとも部分的に欠失しているコリネ型細菌を用いて、基質としてのＤ−キシロネートから出発して、鏡像体純粋なＤ−キシロネートを非常に高い収率で獲得することができることが発見された。
【００１８】
したがって、本発明の主題は、ＩｏｌＲ遺伝子の活性が、野生型もしくは野生型の突然変異体、好ましくはこの遺伝子を含む非組換え型突然変異体に比して低下もしくは完全に消失しているか、またはＩｏｌＲ遺伝子が少なくとも部分的に欠失しているコリネ型細菌、およびＩｏｌＲ遺伝子の活性が低下もしくは完全に消失しているか、またはＩｏｌＲ遺伝子が少なくとも部分的に欠失しているコリネ型細菌を用いたＤ−キシロネートの製造方法である。
【００１９】
本発明による改変されたコリネ型細菌は、野生型、または野生型に対する遺伝子改変型であって好ましくは組換え改変されていない改変型に由来することができる。
【００２０】
野生型由来の株は、医薬品工業および食品工業に特に好ましい。それは、それらの株の製造許可を受けるのが特に容易であるからである。野生型は、本発明の方法の出発株として天然ＩｏｌＲ遺伝子を含む。
【００２１】
遺伝子改変された株も、同様に、その出発形態において天然ＩｏｌＲ遺伝子を含む。本発明の意味において、遺伝子改変株は、例えば、レギュレーターＩｏｌＲの標的または目標遺伝子の発現が増加するように遺伝子改変された株であると理解することができる。そのようにして、ミオイノシトール代謝酵素をコードするミオイノシトール代謝関連遺伝子の全てまたは一部が過剰発現され得る。このために、例えばこれらの酵素をコードし、これらの遺伝子の発現増加を可能にする遺伝子をゲノムに組み込むことができる。遺伝子は、染色体にも挿入することができる。ミオイノシトール代謝酵素の発現増加のための他の活性化メカニズム、例えばより強力なプロモーターの導入および翻訳効率のモジュレーションも起こり得る。加えて、ミオイノシトール代謝酵素の安定性を向上させることもできる。
【００２２】
特に、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、特にコリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）またはブレビバクテリウム・ジバリカタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）というコリネ型細菌を使用することができる。
【００２３】
本発明により野生型から出発して改変されたコリネ型細菌が好ましく、例えば、野生型の
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２
コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９
ブレビバクテリウム・フラバムＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９および
ブレビバクテリウム・ジバリカタムＡＴＣＣ１４０２０
が使用される。この列挙は、限定的ではなく、例示的である。
【００２４】
産生生物としてのコリネバクテリウム・グルタミカムの使用は、格別の利点を提供する。それは、
ｉ）全ての工業分野で使用することができる「一般に安全と認められる」（ＧＲＡＳ）生物であり、
ｉｉ）それを用いて規定培地で高い増殖速度およびバイオマス収量が達成され（Ｕｎｔｈａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０１４、１１１（２）：  ３５９〜３７１）、
ｉｉｉ）工業的に広い使用経験がある（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１２、２３（４）：  ６３１〜６４０）
からである。
【００２５】
コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２におけるミオイノシトール代謝レギュレーターＩｏｌＲ、特にＩｏｌＲ（ｃｇ０１９６）の部分不活性化、不活性化または部分欠失もしくは完全欠失は、Ｄ−キシロースからのＤ−キシロネートの生成を引き起こす。この好ましい実施形態は、本発明により改変された野生型であるとして、化学物質、医薬品または食品の製造許可に制限を受けないという利点を有する。
【００２６】
好ましい実施形態において、ＩｏｌＲ遺伝子は、完全に排除されている。
【００２７】
これは、好ましくはＩｏｌＲ遺伝子の完全欠失により起こり得る。ＩｏｌＲ遺伝子の不活性化が完全である限り、これは部分欠失によっても引き起こすことができる。
【００２８】
ＩｏｌＲ遺伝子の完全不活性化は、当業者に公知の他の手段によって行うこともできる。例えば、ＩｏｌＲの基質／誘導物質としてミオイノシトールを使用することによる適切な培養プロセス、ＩｏｌＲ遺伝子、特にＩｏｌＲ遺伝子ｃｇ０１９６の遺伝子領域への他のＤＮＡ配列の挿入を例示的に挙げることができる。本発明の意味における遺伝子領域は、改変がＩｏｌＲ遺伝子の活性になお影響を及ぼす領域と理解すべきである。この領域は、ＩｏｌＲ遺伝子のオープンリーディングフレームの前、後または中に位置する可能性がある。
【００２９】
完全不活性化は、遺伝子発現のシグナル構造の遺伝的改変（突然変異）によるＩｏｌＲの遺伝子発現の完全な排除によっても行うことができる。遺伝子発現のシグナル構造は、例えば、リプレッサー遺伝子、アクティベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合部位、開始コドンおよびターミネーターである。当業者は、これに関する記載を、例えば特許出願ＷＯ９６／１５２４６、ＢｏｙｄおよびＭｕｒｐｈｙ（Ｂｏｙｄら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９８８、１７０（１２）：  ５９４９〜５９５２）、ＶｏｓｋｕｉｌおよびＣｈａｍｂｌｉｓｓ（Ｖｏｓｋｕｉｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、２６（１５）：  ３５８４〜３５９０）、ＪｅｎｓｅｎおよびＨａｍｍｅｒ（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、１９９８、５８（２−３）：  １９１〜１９５）、Ｐａｔｅｋら（Ｐａｔｅｋら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６、１４２  （Ｐｔ  ５）：  １２９７〜１３０９）ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書、例えば、Ｋｎｉｐｐｅｒｓ（「Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ」、第８版、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、２００１）またはＷｉｎｎａｃｋｅｒ（「Ｇｅｎｅ  ｕｎｄ  Ｋｌｏｎｅ」、ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ、１９９０）の教科書に見出す。
【００３０】
ＩｏｌＲの機能的特性の改変、特に基質特異性の改変を生じる突然変異は、同様に、ＩｏｌＲ遺伝子の活性の完全な消失を生じることができる。突然変異として、トランジション、トランスバージョン、挿入および欠失、ならびに定向進化法が適切である。そのような突然変異およびタンパク質を生じるための手引きは、現状技術に属し、公知の教科書（Ｒ．  Ｋｎｉｐｐｅｒｓ「Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ」、第８版、２００１、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）、またはレビュー論文（Ｐｏｋａｌａら、Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ、２００１、１３４（２〜３）：  ２６９〜２８１、Ｊａｅｎｉｃｋｅら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ、２００３、４２（２）：  １４０〜１４２、Ｌｉｌｉｅ、ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ、２００３、４（４）：  ３４６〜３５１、Ｐｅｉら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、２００３、１００（２０）：  １１３６１〜１１３６６、Ｄｏｋｈｏｌｙａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２００４、５４（４）：  ６２２〜６２８、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ、２００４、４３（２５）：  ３２２２〜３２２３）から引用することができる。
【００３１】
このように生成したコリネ型細菌は、ＩｏｌＲ遺伝子活性を全く有さず、高い収率で鏡像体純粋なＤ−キシロネートの産生をもたらす。本発明の最良の実施形態に該当し、特に完全欠失が好ましい。
【００３２】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２  ΔＩｏｌＲの場合、ＩｏｌＲ遺伝子ｃｇ０１９６が完全に欠失している。
【００３３】
別の実施形態では、ＩｏｌＲ遺伝子の活性が低下されている。
【００３４】
これは、部分欠失によっても、活性が完全に消失しない場合引き起こすことができる。
【００３５】
ＩｏｌＲ遺伝子の部分不活性化は、当業者に公知の他の手段によっても行うことができる。例示的には、例えば、ＩｏｌＲの基質／誘導物質としてのミオイノシトールの使用による適切な培養プロセス、ＩｏｌＲ遺伝子、特にＩｏｌＲ遺伝子ｃｇ０１９６の遺伝子領域への別のＤＮＡ配列の挿入を挙げることができる。本発明の意味における遺伝子領域は、改変がＩｏｌＲ遺伝子の活性になお影響を及ぼす領域と理解すべきである。この領域は、ＩｏｌＲ遺伝子のオープンリーディングフレームの前、後または中に位置する可能性がある。
【００３６】
部分不活性化は、遺伝子発現のシグナル構造の遺伝的改変（突然変異）によるＩｏｌＲの遺伝子発現の部分的な排除によっても行うことができる。遺伝子発現のシグナル構造は、例えば、リプレッサー遺伝子、アクティベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合部位、開始コドンおよびターミネーターである。これに関して、完全欠失の場合と同じ方法を基本的に利用することができる。
【００３７】
ＩｏｌＲの機能的特性の改変、特に基質特異性の改変を生じる突然変異は、同様に、ＩｏｌＲ遺伝子の活性の部分的な消失を生じ得る。突然変異として、トランジション、トランスバージョン、挿入および欠失、ならびに定向進化法が適切である。この場合も、上記の方法を使用することができる。
【００３８】
記載した本発明による遺伝的改変は、本発明のコリネ型細菌を生じ、単離した際に本発明のゲノムを生じる。
【００３９】
ＩｏｌＲ遺伝子ｃｇ０１９６を、配列番号１に示す。
【００４０】
オープンリーディングフレームを有するコリネ型細菌ＡＴＣＣ１３０３２のＩｏｌＲ遺伝子を配列番号２に記載する。
【００４１】
驚くことに、ＩｏｌＲ遺伝子の不活性化は、増殖のための炭素源およびエネルギー源、例えばＤ−グルコース、ならびに他の炭素源およびエネルギー源としてのＤ−キシロースを有する規定培地にＤ−キシロネートの生成を引き起こす。Ｄ−キシロネートは、当然のことながらコリネ型細菌によって代謝されることができず、したがって培地中に蓄積され、続いてこれを培地から精製することができる。
【００４２】
本発明により改変されたコリネ型細菌という生物は、鏡像体純度１００％のＤ−キシロネートまたはＤ−キシロン酸を高い収率で産生する。この方法で生じた本発明のゲノムは、コリネ型細菌にＤ−キシロネートまたはＤ−キシロン酸を高い収率および鏡像体純度１００％で製造する能力を与える。
【００４３】
本発明のコリネ型細菌を用いたＤ−キシロネートの産生は、公知の、実験室または産生部門において通常の発酵法を用いて実施することができる。
【００４４】
本発明により製造された微生物は、Ｄ−キシロネートの産生を目的とするバッチ法（回分培養）またはフェッドバッチ（流加培養法）または反復フェッドバッチ（反復流加培養法）で連続的または断続的に培養することができる。公知の培養法に関する要約は、Ｃｈｍｉｅｌの教科書（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．  Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１）（非特許文献２２））またはＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４）（非特許文献２３））に記載されている。
【００４５】
使用すべき培地は、適切な方法でそれぞれの微生物の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培地の記載は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１）（非特許文献２４）のハンドブックに含まれている。
【００４６】
Ｄ−キシロネート生成の出発基質としてのＤ−キシロース以外に、増殖のための炭素源として、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロースなどの糖および炭水化物、例えばダイズ油、ヒマワリ種子油、ラッカセイ油およびヤシ油などの油脂、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸などの脂肪酸、例えばグリセリンおよびエタノールなどのアルコールならびに例えば酢酸などの有機酸を使用することができる。これらの物質は、個別にまたは混合物として使用することができる。
【００４７】
炭素源およびエネルギー源としてＤ−キシロースおよびＤ−グルコースを有するＣＧＸＩＩ培地（Ｕｎｔｈａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０１４、１１１（２）：  ３５９〜３７１（非特許文献８））が特に好ましい。それによってコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の最大０．６１ｈ−１という高い比増殖速度を達成することができる。加えて、ＣＧＸＩＩ培地の使用は、例えばエタノール沈殿に続く真空乾燥により（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２、１１５：  ２４４〜２４８（非特許文献３））、培養上清から目的産物Ｄ−キシロネートの容易な分離を保証する。単純な培地は、解決すべき課題の構成要素である。
【００４８】
窒素源として、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスチープリカー、ダイズ粉および尿素のような有機含有窒化合物または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムのような無機化合物を使用することができる。窒素源は、個別にまたは混合物として使用することができる。
【００４９】
リン源として、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【００５０】
さらに、培地は、例えば、増殖のために必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有するべきであろう。
【００５１】
最後に、上記物質に追加してアミノ酸およびビタミンなどの必須の増殖物質を使用することができる。
【００５２】
記載した原料を単回アプローチの形態で培養物に添加するか、または培養中に好都合な方法で供給することができる。
【００５３】
培養物のｐＨ制御のために、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物または塩酸、リン酸もしくは硫酸のような酸性化合物を適切な方法で使用することができる。細胞増殖のために好ましいｐＨ範囲は、６〜８の間である。
【００５４】
発泡の制御のために、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することができる。
【００５５】
好気的条件を維持するために、好ましくは酸素または例えば空気などの酸素含有混合気体を培養物中に供給することができる。
【００５６】
培養温度は、通常、２０℃〜４５℃であり、好ましくは２５℃〜４０℃である。
【００５７】
培養は、好ましくは最大のＤ−キシロネートが生成するまで継続することができる。この目標は、通常、１０時間〜１６０時間以内に達成される。
【００５８】
図面に、例からの実験結果を示すが、これらの結果は、本発明による利点を実証している。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】コリネバクテリウム・グルタミカムΔＩｏｌＲ株の培養過程を示す図である。
【図２】精製された沈殿のＧＣ−ＴｏＦ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
図１のＡ）およびＢ）欄にコリネバクテリウム・グルタミカムΔＩｏｌＲ株の培養過程を示す。その際、全ての欄におけるグラフの横座標は、時間（ｈ）単位の時間である。第１行の縦座標は、ミリモル［ｍＭ］でのＤ−キシロースおよびＤ−グルコースの量を意味する。
【００６１】
第２行の縦座標は、１リットルあたりのグラム［ｇ／Ｌ］でのバイオマスを意味し、第３行の縦座標は、ミリモル［ｍＭ］でのＤ−キシロネートの量を意味する。
【００６２】
１Ａ欄は、バッチ工程におけるＣ．グルタミカムΔＩｏｌＲ株の培養過程を示す。Ｄ−キシロネートの最終力価は、９．２±０．６ｇ／Ｌに達した。比産生率および産生速度は、ＹＰ／Ｓ＝０．４９±０．０１ｇ  Ｄ−キシロネート／ｇ  Ｄ−キシロースまたは０．３０±０．０２ｇ／（Ｌ・ｈ）である。１Ｂ欄に、フェッドバッチ工程におけるＣ．グルタミカムΔＩｏｌＲ株の培養過程を示す。Ｄ−キシロネートの最終力価は、２０．０±１．０ｇ／Ｌに達した。比産生率および産生速度は、ＹＰ／Ｓ＝０．５１±０．０２ｇ  Ｄ−キシロネート／ｇ  Ｄ−キシロースまたは０．４５±０．０２ｇ／（Ｌ・ｈ）である。
【００６３】
図２に、ＧＣ−ＴｏＦ−ＭＳ分析により得た、精製した沈殿のスペクトルを示す（Ｐａｃｚｉａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、２０１２、１１（非特許文献２５））。図中、横座標としてのクロマトグラフィー経過時間に対して縦座標に相対ピーク強度をプロットする。
【実施例】
【００６４】
例：
以下に実験的証拠を、限定的に解釈すべきでない例として挙げる。
【００６５】
Ｃ．グルタミカムΔＩｏｌＲ株の作製のために、下流に存在する遺伝子の発現をできるだけ損なわないように、遺伝子ＩｏｌＲをリーディングフレーム内（「イン・フレーム」）で欠失させた。そのために、まずクロスオーバーＰＣＲを実施した。２種の最初のＰＣＲでは、欠失させるべき遺伝子の下流および上流に位置するそれぞれ４００ｂｐ長の２つの隣接ＤＮＡ領域を別々に増幅させた。そのために使用したオリゴヌクレオチド（ｉｏｌＲ＿ＤＦ１＿ｆｏｒ  ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＴＡＣＴＴＧＣＣＧＡＡＡＧＡＴＴＧ（ＨｉｎｄＩＩＩ）、ｉｏｌＲ＿ＤＦ１＿ｒｅｖ  ＣＴＣＧＡＴＴＡＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧ、ｉｏｌＲ＿ＤＦ２＿ｆｏｒ  ＴＣＣＧＧＣＣＡＡＧＴＡＡＴＣＧＡＧ、ｉｏｌＲ＿ＤＦ２＿ｒｅｖ  ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＧＴＴＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣ（ＢａｍＨＩ））は、発生したＰＣＲ断片が５’末端でそれぞれ１８ヌクレオチド長の相同配列と結合しており、相同配列が断片毎に互いに相補的なように改変された。クロスオーバーＰＣＲのために最初のＰＣＲの産物をＤＮＡテンプレートとして使用したが、その際、相補的領域を介して反応中に付加（Ａｎｌａｇｅｒｕｎｇ）が起こった。このようにアウタープライマー（ａｅｕｓｓｅｒｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）の使用によって欠失構築物が生じ、この構築物をベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ中にクローニングした。自由に複製することができないこのベクターをＣ．グルタミカム中に形質転換し、続いてｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ−ΔｉｏｌＲ２によって媒介されるカナマイシン耐性で選択した後、プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれたクローンを単離した。カナマイシンを含まない完全培地（Ｖｏｌｌｍｅｄｉｕｍ）中でこれらの細胞を培養することによって、今や染色体中に２倍存在するＤＮＡ領域を介して第２の組換え事象を起こすことができた。細菌培養物を、１０％サッカロースを有するＬＢ培地で様々に希釈して播種した。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ−ΔｉｏｌＲ２上のｓａｃＢによりコードされるレバンスクラーゼのために、サッカロースがレバンに重合した。このポリマーは、さらにまた致死を誘導した。それで、第２の組換えによってプラスミドを失ったクローンだけが増殖することができた。さらに、サッカロース耐性でカナマイシン感受性のクローンの場合、遺伝的野生型状態が再形成されていたか、または目的遺伝子が欠失していたかのいずれかである。Ｃ．グルタミカムのゲノムにおける欠失の確認は、この遺伝子外の領域と相補的であったプライマーを用いたＰＣＲにより行った（Ｋ＿ＤｉｏｌＲ＿ｆｏｒ  ＧＣＡＣＧＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＡＡＣＴＣ、Ｋ＿ＤｉｏｌＲ＿ｒｅｖ  ＴＡＣＧＧＴＣＴＧＧＣＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＣ）。
【００６６】
このように生じたＣ．グルタミカムΔＩｏｌＲ株を、バッチおよびフェッドバッチ法により３０℃の１．５Ｌバイオリアクター（ＤＡＳＧＩＰ  ＡＧ、Ｊｕｅｌｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で通気速度を１ｖｖｍに一定にして培養した。連続好気条件（溶存酸素＞３０％）は、撹拌翼回転数（４００〜１２００ｒｐｍ）を調整して酸素を導入することによって達成した。５Ｍ  Ｈ３ＰＯ４および５Ｍ  ＮＨ４ＯＨを用いて培地中のｐＨ値をｐＨ７．１の一定に調節した。バッチ工程では、４０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースを有するＣＧＸＩＩ培地（Ｕｎｔｈａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０１４、１１１（２）：  ３５９〜３７１（非特許文献８））で一晩前培養したＯＤ＝１の培養物から、２つの独立したリアクター中の尿素不含で１０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースおよび３０ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロースを有するＣＧＸＩＩ培地に植菌した。フェッドバッチ工程では、４０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースを有するＣＧＸＩＩ培地で一晩前培養したＯＤ＝１の培養物から、２つの独立したリアクター中の尿素不含で２０ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースおよび４０ｇ／Ｌ  Ｄ−キシロースを有するＣＧＸＩＩ培地に植菌した。グルコース制限を用いた２０時間の工程後に、１００ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコースを速度２．５ｍＬ／ｈ（リアクター１）または５ｍＬ／ｈ（リアクター２）で連続供給し始めた。全ての培養を一定間隔で試験し、試料を遠心分離し、結果として得られた無細胞の上清を基質分析および産物分析のために使用した。基質分析（Ｄ−グルコースまたはＤ−キシロース）のために、２つの酵素アッセイを利用し（Ｕｎｔｈａｎら、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ、２０１５、１４：  ３２（非特許文献２６））、０．１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４による均一濃度溶離および流速０．６ｍＬ／ｍｉｎでＤＡＤ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いた８０℃のＨＰＬＣ（３００×８ｍｍ有機酸カラム、ＣＳ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅ、Ｌａｎｇｅｒｗｅｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により産物（Ｄ−キシロネート）を定量した。
【００６７】
フェッドバッチ培養の終わりに産物の精製および分析のためにリアクターから完全に回収した。産物の精製のために既存のプロトコール（Ｌｉｕら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１２、１１５：  ２４４〜２４８（非特許文献３））を以下のように利用した：１．  遠心分離による細胞分離（４５００ｒｐｍで１０分間、４℃）、２．  結果として生じた上清の活性炭（ＡＣ）による脱色、３．  ＡＣ処理後の上清のろ過（０．２２μｍ）および回転蒸発器（１００ｍｂａｒ、６０℃水浴）による濃縮、４．  濃縮液のろ過（０．２２μｍ）およびＥｔＯＨ（３：１、ｖ／ｖ）の添加によるＤ−キシロネートの沈殿、−１０℃で少なくとも１２時間の産物の真空乾燥。
【００６８】
オープンリーディングフレーム（太字）ならびに２５０ｂｐの上流および下流を有するＩｏｌＲの遺伝子配列。
【００６９】
【化１】
2019518453.tif 000003
【図１】
2019518453.tif 000004
【図２】
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【配列表】
2019518453000001.app
【国際調査報告】
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2019518453.tif 000007
2019518453.tif 000008
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