(57)【要約】  本発明は、効率の高い形質転換技術、具体的には、藻類を形質転換するために用いられる高効率のプロモーター、当該プロモーターを含むベクター、および当該ベクターを用いる藻類の形質転換方法を提供することを目的とする。  本発明に係るプロモーターは、ＣｌｏｒＤＮＡウィルスの構造タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド等を有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）〜（３）の何れかの構造を有することを特徴とするプロモーター。
（１）  ＣｌｏｒＤＮＡウィルスの構造タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド
（２）  上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
（３）  上記ポリヌクレオチド（１）の配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
【請求項２】
上記ポリヌクレオチド（１）が配列番号１３の塩基配列を有するものである請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
上記ポリヌクレオチド（１）が配列番号１２の塩基配列を有するものである請求項１に記載のプロモーター。
【請求項４】
上記ポリヌクレオチド（１）が配列番号１１の塩基配列を有するものである請求項１に記載のプロモーター。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチド（１）が配列番号１の塩基配列を有するものである請求項１に記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のプロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを調製する工程；および
上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程；
を含むことを特徴とする藻類の形質転換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を形質転換するために用いられる新規のプロモーター、当該プロモーターを含むベクター、および当該ベクターを用いる藻類の形質転換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
恒久的かつ安定的なエネルギー源である太陽光を利用することは、エネルギー対策を考える上で非常に重要である。植物類による光合成は、太陽光エネルギーを最も効率的に化学エネルギーへ変換できる優れたシステムであり、環境中の二酸化炭素や過剰栄養塩を吸収同化する上に、酸素も放出する。よって植物を利用する技術の開発は、エネルギー問題を解決し得るものとして期待されているところである。【０００３】
植物類の中でも藻類は、多量に存在する海水および淡水中に生息することからその量は莫大なものであり、また、著しい光合成能を有する。さらに、藻類の中には不飽和脂肪酸や抗腫瘍化合物などの有用化合物を生産するものがある。また、珪藻類の中には有用な無機物を生産するものがあるので、珪藻類によるバイオミネラリゼーションという技術が注目されている。このように、藻類は有用資源として重要な生物といえる。【０００４】
一般的に、生物を産業で利用する場合には、有用な遺伝子を導入する形質転換技術が用いられる。この形質転換技術は、遺伝子の機能を解明すべく、特定遺伝子をノックアウトしたりその働きを抑制したりするためにも用いられる。【０００５】
これまでにも、珪藻や緑藻を中心として藻類の形質転換が行われている。しかし、かかる方法は内在性のプロモーターを分離し、それに遺伝子を結合させて藻類に導入するものであった。それでは、内在性プロモーターの分離に多大な労力と時間がかかるために、決して効率的なものではなかった。また、藻類、とりわけ海産藻類の形質転換効率自体が極めて低いという問題もある。【０００６】
一方、藻類以外の植物や動物の形質転換では、内在性のプロモーターではなく、ウィルス由来のプロモーターが汎用されている。例えば、アブラナ科植物に感染するカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）より分離されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターが、アブラナ科植物に限定されず幅広い植物の形質転換に利用されている。また、動物細胞の形質転換には、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）より分離されたＣＭＶプロモーターや、シアミンウィルス４０（ＳＶ４０）より分離されたＳＶ４０プロモーターが広く利用されている。【０００７】
それに対して、藻類の形質転換においては、外来性のウィルスプロモーターが用いられた例はほとんど知られていない。【０００８】
例えば非特許文献１には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いて珪藻Cycrotela crypticaを形質転換した実験例が記載されているが、形質転換体は得られなかったとされている。【０００９】
一方、非特許文献２には、ＣＭＶプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターを用いて珪藻Phaeodactylum tricornutumへＧＵＳ遺伝子を導入したところ、いずれの場合もＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）が発現したことが記載されている。【００１０】
さらに非特許文献３には、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いて渦鞭毛藻AmphidiniumとSymbiodiniumへＧＵＳ遺伝子を導入したところ、ＧＵＳが発現したことが記載されている。しかし他文献（非特許文献４）によれば、懸命の努力にもかかわらず、他のグループが渦鞭毛藻類の形質転換に成功したとの報告はされていないとのことである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Dunahay，T.G.ら，Journal of Phycology（ジャーナル・オブ・ファイコロジー），vol.31，pp.1004-1012（1995）
【非特許文献２】Sakaue，Kら，Physiologia plantarum（フィジオロジア・プランタラム），vol.133，pp.59-67（2008）
【非特許文献３】Lohuis，M.R.ら，The Plant Journal（ザ・プラント・ジャーナル），vol.13，pp.427-435（1998）
【非特許文献４】Walker，T.L.ら，Journal of Phycology（ジャーナル・オブ・ファイコロジー），vol.41，pp.1077-1093（2005）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、その数は極めて少ないものの、カリフラワーモザイクウィルスに由来するＣａＭＶ３５Ｓプロモーターなどのウィルスプロモーターを用いて藻類を形質転換した報告例はある。【００１３】
しかし、形質転換体が得られなかったり再現性が無いという報告もある。また、一般的に、藻類、とりわけ海産藻類の形質転換効率は非常に低いことから、高効率な形質転換技術の開発が切望されている。【００１４】
そこで本発明が解決すべき課題は、効率の高い形質転換技術、具体的には、藻類を形質転換するために用いられる高効率のプロモーター、当該プロモーターを含むベクター、および当該ベクターを用いる藻類の形質転換方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、Chaetoceros cf．lorenzianus ＤＮＡウィルス（ＣｌｏｒＤＮＡウィルス）の構造タンパク質をコードすると考えられる遺伝子の上流に位置するプロモーターが、藻類を極めて効率的に形質転換できることを見出して、本発明を完成した。【００１６】
本発明に係る新規プロモーターは、下記（１）〜（３）の何れかの塩基配列を有することを特徴とする。【００１７】
下記（１）〜（３）の何れかの構造を有することを特徴とするプロモーター。
（１）  ＣｌｏｒＤＮＡウィルスの構造タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド
（２）  上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド
（３）  上記ポリヌクレオチド（１）の配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド【００１８】
本発明に係るベクターは、上記新規プロモーター、および任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有することを特徴とする。【００１９】
また、本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程；および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るプロモーターを含むベクターを用いれば、藻類を効率的に形質転換し得る。よって、高い光合成能を有し、有用物質の産生能を示すなど優れた特性を有する上に、多量に存在するものでありながら、形質転換が難しくこれまで十分にその技術が検討されていなかった藻類を、本発明により形質転換することにより、有用物質の大量生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係るプロモーターを含むプラスミドベクターの構造の一例を示す図である。
【図２】本発明に係るプロモーターの比較対照であるプラスミドベクターの構造を示す図である。図２（１）はT．pseudonanaのｆｃｐプロモーターを含むプラスミドベクターの構造を示し、図２（２）はプロモーターを有さないプラスミドベクターの構造を示す。
【図３】本発明方法により形質転換された藻類細胞等に含まれる導入遺伝子の有無の確認実験の結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に係る第一のプロモーターは、（１）ＣｌｏｒＤＮＡウィルスの構造タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を構成するポリヌクレオチド、を有する。
【００２３】
ＣｌｏｒＤＮＡウィルスは、珪藻Chaetoceros cf．lorenzianusに感染するウィルスである。これまで藻類、とりわけ海産藻類に対して感染性を示すウィルスの報告例は少なかったが、近年、本発明者らは、ラフィド藻、渦鞭毛藻、珪藻などの藻類から様々なウィルスの分離に成功している。本発明に係るＣｌｏｒＤＮＡウィルスは、本発明者らにより分離された海産藻類感染性ウィルスの一つである。
【００２４】
構造タンパク質をコードする遺伝子は、ＣｌｏｒＤＮＡウィルスの構造タンパク質の複製に関与するものであり且つ活発に発現するものであれば特に制限されないものとする。
【００２５】
本発明において、コード領域とはｍＲＮＡを経てタンパク質に翻訳される部分をいい、非コード領域とはコード領域以外の部分をいう。即ち、非コード領域は、ＡＴＧなどの開始コドンの上流に位置する部分をいい、ｍＲＮＡに転写されない部分の他、ｍＲＮＡに転写はされるがタンパク質には翻訳されない部分を含むものとする。
【００２６】
一般的に、プロモーターは、転写の鍵を握るＣｏｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔと、転写を促進または抑制するＲｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔを有し、遺伝子を導入する際には、特にＣｏｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔを利用することが重要である。Ｃｏｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔとしては、ＴＡＴＡボックス、イニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）、ダウンストリートエレメントなどが知られており、Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔとしてはＣＡＡＴボックスやＧＡＴＡボックスなどが知られている。本発明者らがＣｌｏｒＤＮＡウィルスのＯＲＦ領域の上流の塩基配列を調べたところ、ＣＡＡＴボックスＩである５’−ＣＡＡＴ−３’、ＴＡＴＡボックスである５’−ＴＡＴＡＡＡ−３’、ＡＣＧＴＡボックスである５’−ＡＣＧＴＡ−３’および珪藻類のイニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）と思われる５’−ＴＣＡ+1ＴＡＡＡ−３’が見られた。これに関連して、本発明者らは、本発明に係るＣｌｏｒＤＮＡウィルスに近縁なウィルスの１種であるＣｓｅｔＤＮＡウィルスに由来する、上記Ｉｎｒを含むプロモーターが、中心目珪藻には働かないことを明らかにしている。この点を考慮すると、本発明に係るポリヌクレオチド（１）が高い形質転換能を発揮できる理由としては、上記イニシエーターエレメント等以外の未知の配列がＣｏｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔとして働いている可能性が高いといえる。
【００２７】
上記ポリヌクレオチド（１）としては、配列番号１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）、配列番号１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、配列番号１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）および配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の塩基配列を有するものを挙げることができる。
【００２８】
本発明に係る第二のプロモーターは、（２）上記ポリヌクレオチド（１）の１または複数のヌクレオチドが欠失、置換または付加されたポリヌクレオチドであり、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド、である。
【００２９】
上記ポリヌクレオチド（２）において、欠失、置換または付加されるヌクレオチドの数としては、１以上、２００以下が好ましく、１以上、１００以下がより好ましく、１以上、７０以下がさらに好ましく、１以上、３０以下がさらに好ましく、１以上、２０以下がさらに好ましく、１以上、１０以下がさらに好ましく、１以上、５以下が特に好ましい。
【００３０】
本発明に係る第三のプロモーターは、（３）上記ポリヌクレオチド（１）配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチド、である。
【００３１】
上記ポリヌクレオチド（３）において、ストリンジェントな条件とは、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで２回洗浄することをいう。
【００３２】
上記ポリヌクレオチド（２）および（３）において、任意のタンパク質をコードする遺伝子の発現を藻類細胞内で活性化するポリヌクレオチドとは、藻類細胞内に導入されることによって、その下流に結合された任意のタンパク質をコードする遺伝子を発現させることができるものをいう。
【００３３】
上記ポリヌクレオチド（２）および（３）において、上記ポリヌクレオチド（１）との相同性としては、５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、８０％以上がさらに好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上が特に好ましい。
【００３４】
上記ポリヌクレオチド（１）〜（３）は、ＣｌｏｒＤＮＡウィルスまたはその変異体の構造タンパク質をコードする遺伝子の上流から分離することができる。但し、化学的に合成してもよい。これらポリヌクレオチド（１）〜（３）は、鋳型からＰＣＲにより増幅して用いることができる。
【００３５】
本発明に係るベクターは、上記プロモーターと、任意のタンパク質をコードする遺伝子を含有する。
【００３６】
ベクターの種類は、藻類細胞へ導入され得るものであれば特に制限されず、プラスミドベクター、ウィルスベクターの何れも用いることができる。但し、藻類、とりわけ海産藻類に感染するウィルスの研究は十分に進んでいるとはいい難いので、好適にはプラスミドベクターを用いる。
【００３７】
ここで「任意のタンパク質」は特に限定されるものではなく、生産の望まれる有用なタンパク質であればよい。
【００３８】
本発明に係るベクターには、一般的なベクターに含まれるその他の配列を含んでいてもよい。かかる配列としては、例えば、本発明ベクターが導入された藻類を特定するための選択マーカー遺伝子や、藻類細胞で働くターミネーターを挙げることができる。
【００３９】
本発明ベクターの調製方法としては、常法を用いることができる。例えば、上記各配列とドナーベクターとを制限酵素で切断した後にアニーリングし、ＤＮＡリガーゼにより結合させればよい。或いは、クロナーゼ反応を利用した簡便な公知方法により、各配列をベクターにクローニングすることも可能である。
【００４０】
本発明に係る藻類の形質転換方法は、上記ベクターを調製する工程；および、上記ベクターを藻類細胞へ導入する工程を含むことを特徴とする。
【００４１】
本発明ベクターの調製方法は、上述したとおり、当業者公知の方法を用いることができる。
【００４２】
本発明ベクターの藻類細胞への導入方法としては、パーティクルガン法、ガラスビーズ攪拌法、マイクロインジェクション法、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法などの公知方法を用いることができる。但し、海産藻類の場合、塩濃度の高い培地で増殖せしめる必要があるので、エレクトロポーレーション法は適切でない。
【００４３】
本発明ベクターにより形質転換された藻類細胞は、導入されている選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することにより特定することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００４５】
実施例１  本発明に係るＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターの分離
（１）  海産藻類に感染するウィルスのゲノムＤＮＡの抽出
Tomaru，Y.ら，Aquatic Microbial Ecology，vol.50，pp.103-112（2008）に記載の方法に従って、中心目珪藻Chaetoceros cf. lorenzianusを宿主とするChaetoceros lorenzianus ＤＮＡウィルス（ＣｌｏｒＤＮＡウィルス）からゲノムを抽出した。【００４６】
具体的には、まず、ウィルス液（１０ｍＬ）を０．２２μｍフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製，Millex-GS，孔径：０．２２μｍ）で濾過することにより、藻細胞の破片などを除いた。得られた濾液に４０％ポリエチレングリコール６０００溶液（Ｗｏｋｏ社製）を最終濃度が１０ｗ／ｖ％となるように加え、４℃にて一晩静置した。当該液を遠心分離用チューブ（Ｎａｌｇｅｎ社製，UltraBottle Assemblies）に移し、超遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ社製，Ultracentrifuge L8-70M）を用いて５７，０００×ｇ、４℃で１．５時間遠心分離した後、その上清を除いた。得られた沈殿にリン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム，１０ｍＭリン酸水素ナトリウム，ｐＨ７．２，５ｍＬ)を加え混合することによりウィルス粒子を洗浄した。再度、２１７，０００×ｇ、４℃で４時間遠心分離し、同様に上清を除いた後、得られた沈殿を滅菌した精製水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，ｍｉｌｌｉＱ（登録商標），３００μＬ）に溶解した。当該溶液を１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移し、プロテイナーゼＫと１０％サルコシルを、それぞれ最終濃度が１ｍｇ／ｍＬおよび１ｗ／ｖ％となるように加え、５５℃にて１．５時間インキュベートした。その後、常法を用いてフェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理を行い、得られた上清に、その１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を加え、さらにその２．５倍量のエタノールを加えた。当該溶液を−８０℃にて１時間静置した。その後、微量高速遠心機（ＫＵＢＯＴＡ社製，KUBOTA3740）を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離を行い、得られた沈殿を７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させた。これを滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（２０μＬ）に溶解してＤＮＡ溶液を得た。【００４７】
（２）  ＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターの分離
上記（１）で得たＣｌｏｒＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡの配列情報を、ORF finder (NCBI)を用いて、それに含まれるＯＲＦを検索した後、Ｂｌａｓｔ(DDBJ)を用いてデータベースと比較し構造タンパク質のＯＲＦを検出した。当該ＯＲＦ配列の上流における塩基数５０７の配列を配列番号７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）に示す。配列番号７の３’末端のＡＴＧは、当該ＯＲＦの開始コドンである。この配列中の翻訳開始点と思われるＡＴＧ配列の２６塩基上流である第４８２番目の塩基から第９番目の塩基の領域を、ＣｌＰ２Ｌ／ａｔｔＢ１プライマー（配列番号２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびＣｌＰ２／ａｔｔＢ４プライマー（配列番号３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を用いたＰＣＲ反応により増幅させた。なお、配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）における５〜２９の塩基配列および配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）における５〜２８の塩基配列は、後述するプラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を示す。また、得られたＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターの塩基配列を配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に示す。なお、配列番号１の塩基配列における４６０番目のＴは、転写開始点であると考えられる。【００４８】
ＰＣＲ反応の条件を以下に示す。ＰＣＲ反応液として、５×バッファー（ＴａＫａＲａ社製，５μＬ）、ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社製，２μＬ）、Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ＨＳ（ＴａＫａＲａ社製，０．２５μＬ，５Ｕ／μＬ）、ＣｌｏｒＤＮＡウィルスのゲノムＤＮＡ（１μＬ）、および２種のプライマー（１０ｐｍｏｌ／μＬ，各１μＬ）を混合し、最後に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を全量が２５μＬとなるように添加混合した。次いで、９８．０℃で１０秒間、４０．０℃で３０秒間、７２．０℃で６０秒間のサイクルを３０回繰り返し、最後に７２．０℃で５分間反応させた。【００４９】
フラグメントの増幅を確認するために電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＡＥバッファー（トリス酢酸緩衝液）と、アガロースＳ（ニッポンジーン社製）１．５％ゲルを用いた。電気泳動用試料として、ＰＣＲ産物各９μＬに１０×ローディングバッファー（ＴａＫａＲａ社製）を１μＬずつ添加し、混合したものを用いた。また、ＤＮＡ分子量マーカーとして１００ｂｐラダー（ＴＯＹＯＢＯ社製，コードＮｏ．ＤＮＡ−０３０Ｘ，２μＬ）を用い、同時に泳動した。また、Ｍｕｐｉｄ電気泳動槽（ＡＤＶＡＮＣＥ社製）を用い、１００Ｖの条件下で約３０分間泳動した。泳動終了後、臭化エチヂウムを用い、定法（Sambrook and Russell 2001）により染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。【００５０】
実施例２  本発明に係るＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターを含むベクターの調製
（１）  各エントリークローンプラスミドの調製
上記実施例１で得たＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーター、導入遺伝子としてノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）(Poulsen, N. ら, Jornal of Phycology, 42, pp1059-1065. (2006) ) 、およびThlassiosira pseudonanaのｆｃｐターミネーター（Poulsen, N.ら, Jornal of Phycology, 42, pp1059-1065. (2006) ）がそれぞれ導入されたエントリークローンプラスミドベクターを、Multisite Gateway（登録商標） Pro Kit（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調製した。【００５１】
詳しくは、プラスミドの構築のためのクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有する、上記実施例１で得たＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーター溶液を、High pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche社製) を用いて、その取り扱い説明書に従って精製した。次に、当該溶液（５０ｆｍｏｌｅｓ）とドナーベクター（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ１−Ｐ４，１００ｎｇ／μＬ）を混合し、当該溶液へ滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を加えることにより計８μＬの混合液とした。なお、当該ドナーベクターは、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有する。当該混合液へ、さらにＢＰクロナーゼ（商標）II Enzyme Mix（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２μＬ）を加えて混合し、２５℃で１時間反応させた。その後、反応液にプロテイナーゼＫ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１μＬ）を加え、３７℃で１０分間処理した。当該反応液（２．５μＬ）を、One Shot Mach１ T1（登録商標）chemically competent cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。その後、４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移し、２分間静置した。次いで、ＳＯＣ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（２７５μＬ）を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン，０．５％イーストエクストラクト，１％ＮａＣｌ，１．５％アガー）に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン（タイテック社製）内で３７℃にて一晩（１０時間程度）倒置培養した。得られたコロニーは、白金耳を用いてＬＢ液体培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有するＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターが導入されたエントリークローンプラスミドを抽出した。【００５２】
また、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有するノールセオスリシン耐性遺伝子（ｎａｔ）を上記実施例１と同様に増幅し、上記と同様にしてＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ４ｒ−Ｐ３ｒへ導入し、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有する抗生物質耐性遺伝子が導入されたエントリークローンプラスミドを得た。【００５３】
さらに、プラスミドの構築のためのＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＢ配列を有するThalassiosira pseudonanaのｆｃｐターミネーターを上記実施例１と同様に増幅し、上記と同様にしてＢＰクロナーゼ反応に必要なａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２２１ Ｐ３−Ｐ２へ導入し、ＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＬ配列を有するターミネーターが導入されたエントリークローンプラスミドを得た。【００５４】
（２）  ディスティネーションプラスミドの調製
Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdB Survival（登録商標）Competent Cells（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、pBluescript SK-（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）へＬＲクロナーゼ反応に必要なａｔｔＲ配列を持つReading Frame Casetteを組み込むことにより、ディスティネーションプラスミドを調製した。【００５５】
まず、pBluescript SK-（２μｇ）に対し、制限酵素ＥｃｏＲＩ ２０Ｕ（ＴＯＹＯＢＯ社製，１０Ｕ／μＬ）を用いて、３７℃にて３時間消化した。当該反応液へ常法に従ってエタノールを添加することにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。次に、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端を平滑化した。即ち、回収したＤＮＡへ、１０×バッファー（５μＬ）、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴＡＫＡＲＡ社製，２μＬ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製，０．５Ｕ／μＬ，１μＬ）および滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（４２μＬ）を加え、計５０μＬとなるように反応液を調製した。この反応液を１２℃にて１５分間インキュベートした。この反応液に滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（３５０μＬ）を直ちに加え、常法に従ってフェノール／クロロホルム処理とクロロホルム処理をした後、続いてエタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収した。次に、制限酵素にて切断したプラスミドの再環状化を防ぐために、ＣＩＡＰ（ＴａＫａＲａ社製，Calf intestine Alkaline Phosphatase）を用いて、その切断断片の５’末端の脱リン酸処理を行った。平滑化処理を施したＤＮＡに１０×ＣＩＡＰバッファー（５μＬ）とＣＩＡＰ（０．１Ｕ／μＬ，１μＬ）を加え、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水により計５０μＬになるように反応液を調製した。当該反応液を３７℃にて１５分間、続いて５６℃にて１５分間インキュベートした後、ＣＩＡＰ（０．１Ｕ／μＬ，１μＬ）を再び加え、３７℃にて１５分間、続いて５６℃にて１５分間インキュベートした。当該反応液に、１０％ＳＤＳ溶液（２．５μＬ）、５００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（０．５μＬ）、プロテイナーゼＫ溶液(２０ｍｇ／μＬ，０．５μＬ）をそれぞれ加えた後、５６℃にて３０分間、続いて７５℃にて１０分間インキュベートした。その後、常法に従ってフェノール/クロロホルム処理とクロロホルム処理を施した。次に、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収し、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１０μＬ）に溶解した。【００５６】
得られた平滑末端を有するpBluescript SK-と、Reading Frame Casette A（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，ＲｆＡ）とを混合し、pGEM-T Vector Systems Kit（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）添付のＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。まず、オートクレーブ滅菌した０．２ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに、２×ラピッドライゲーションバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，５μＬ）、pBluescript SK-（１００ｎｇ／μＬ，０．５μＬ）、ＲｆＡ（５ｎｇ／μＬ，２μＬ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，３Ｕ／μＬ，１μＬ）および滅菌ｍｉｌｌｉＱ水（１．５μＬ）を加え、計１０μＬとなるように反応液を調製した。この反応液を室温にて１時間保存し、４℃にて一晩（１６時間以上）インキュベートした。このライゲーション溶液（５μＬ）をccdB Survival Competent Cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，５０μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。その後、４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移し、２分間静置した。次いでＳＯＣ（２５０ｍＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（３００μＬ）を、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン内で３７℃にて一晩倒置培養した。【００５７】
得られたコロニーは、白金耳を用いてＬＢ培地（１０ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。当該培養液（３ｍＬ）より、Pure Yield Plasmid Miniprep System （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ディスティネーションプラスミドを抽出した。【００５８】
（３）  エクスプレッションクローンプラスミドベクターの調製
Multisite Gateway Pro Kit（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、上記実施例２（１）で得たエントリークローンプラスミドと、上記実施例２（２）で得たディスティネーションプラスミドとの間でＬＲクロナーゼ反応を行うことにより、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターが連結されたエクスプレッションクローンプラスミドベクターを調製した。【００５９】
具体的には、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子、ターミネーターがそれぞれ組み込まれた３種のエントリークローンプラスミド（それぞれ１０ｆｍｏｌｅｓ）とディスティネーションベクター（２０ｆｍｏｌｅｓ）を混合し、さらに滅菌ｍｉｌｌｉＱ水を加えることにより計８μＬの混合液を調製した。当該液にLR Clonase II PLUS Enzyme Mix（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２μＬ）を加えて混合し、２５℃にて１６時間を反応させた。その後、当該反応液にプロテイナーゼＫ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，１μＬ）を加え、３７℃にて１０分間処理した。当該反応液（２．５μＬ）を、One Shot Mach1 T1（登録商標）chemically competent cells （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，２５μＬ）に混合し、氷上にて３０分間静置した。次いで４２℃にて３０秒間ヒートショック処理を行い、直ちに氷上に移して２分間静置した。その後、ＳＯＣ（２５０μＬ）を加え、３７℃にて１．５時間振とう培養した。培養した菌液（２７５μＬ）を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。当該培地をマルチシェーカーオーブン内で３７℃にて一晩倒置培養した。得られたコロニーを、白金耳を用いてＬＢ培地（２００ｍＬ）に植菌し、３７℃にて一晩振とう培養した。培養液より、NucleoBond（登録商標） Xtra Midi（MACHEREY-NAGEL社製）を用いて、その取り扱い説明書に従い、プラスミドDNAを抽出した。【００６０】
（４）  ＤＮＡ配列の確認
目的とするエクスプレッションクローンプラスミドベクターが作製されたことを確認するために、Ｄｉｄｅｏｘｙ法を用いて塩基配列を決定した。【００６１】
上記実施例２（３）にて調製したエクスプレッションクローンプラスミドベクター（２００ｎｇ）を鋳型として用いて、サイクルシークエンシングＰＣＲを行った。その反応条件を以下に示す。反応液（１０μＬ）は、鋳型ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ，２μＬ）、Big Dye Terminator Cycle Sequencing ver．3.1（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，０．５μＬ）、５×シークエンシングバッファー（２μＬ）、プライマー（１．６ｐｍｏｌ／μＬ，０．６６μＬ）、滅菌蒸留水（４．８４μＬ）からなる。プライマーは、Ｍ１３Ｍ３プライマー（配列番号４，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を用いた。反応条件としては、９５℃で５分間加熱した後、９６℃で１０秒、５０℃で５秒、６０℃で４分の反応を４０サイクル行った。反応後、反応液を１．５ｍＬ容のエッペンドルフチューブに移し、３Ｍ酢酸ナトリウム（１μＬ）、９９．５％エタノール（２５μＬ）および１２５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（１μＬ）を加え、指ではじきよく混合させた後、１５分間室温で放置した。１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離後、上清をイエローチップで丁寧に除き、７０％エタノール（３５μＬ）を加え、よく混合した。再び、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清をイエローチップで完全に取り除き、蓋を開けたまま室温で１０分間放置して沈殿を乾燥させた。【００６２】
乾燥させたペレットにホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製，１０μＬ）を加え、高知大学総合研究センター遺伝子実験施設内のABI PRISM（登録商標）3100-Avant Genetic Analyzer （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。あらかじめ、遺伝子解析ソフト Vector NTI Advance Ver10.0（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製，http://www.invitrogen.com/vntigateway）を用いて、ディスティネーションプラスミドの塩基配列に、プロモーター、抗生物質耐性遺伝子およびターミネーターの塩基配列を組み込むことにより、エクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列を作成した。次に、このコンピューター上にて作成したエクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列と、上記の方法により実験的に決定したエクスプレッションクローンプラスミドベクターの塩基配列とを、Vector NTI Advance Ver10.0のAlignXを用いてアライメントを行って比較することにより、上記実施例２（３）で調製したエクスプレッションクローンプラスミドベクターに目的遺伝子が導入されていることを確認した。【００６３】
得られたエクスプレッションクローンプラスミドベクターの構造を図１に示す。【００６４】
また、対照として、前述したプラスミドの構成要素のうち、ＣｌｏｒＤＮＡウィルスのプロモーターを中心目珪藻Thalassiosira pseudonanaのｆｃｐプロモーターに置き換えたプラスミド（pTpfcpPro/nat/TpfcpTer）と、さらにプロモーターを含まないプラスミド（pNat/TpfcpTer）も、同様に構築した。これらの構造を、それぞれ図２（１）と図２（２）に示す。【００６５】
実施例３  中心目珪藻の形質転換
上記実施例２の３種のプラスミドベクターを用い、中心目珪藻Chaetoceros sp．を形質転換した。【００６６】
具体的には、ＣｌｏｒＤＮＡウィルス（ＣｌｏｒＤＮＡＶ）のプロモーターまたはThalassiosira pseudonanaのｆｃｐプロモーターを有し、且つ抗生物質耐性遺伝子およびThalassiosira pseudonanaのｆｃｐターミネーターを組み込んだプラスミドベクターを平均粒子径１．１μｍのタングステン粒子Ｍ１７に付着させた。同時に、プロモーターを含まないプラスミドベクターも、タングステン粒子に付着させた。別途、中心目珪藻Chaetoceros sp.を１プレートあたり１×１０8ｃｅｌｌｓを固相培地に塗抹した。パーティクルガン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System）を用い、上記タングステン粒子を、ラプチャーディスク650psi (Bio-Rad社製) を２枚重ねることにより、Ｈｅガス圧１３５０ｐｓｉで細胞に打ち込んだ。次いで、ノールセオスリシン５００μｇ／ｍＬを含む０.３％アガロースＨＧＳ（高強度アガロース、和光純薬工業社製）ｆ／２培地にて当該細胞を培養し、全細胞数１×１０8当たりのコロニー数を計測した。結果を表１に示す。【００６７】
【表１】
2011102301.tif 000002
【００６８】
また、上記抗生物質含有培地で生育した細胞のコロニーが形質転換していることを、ＰＣＲにて確認した。生育した細胞のコロニーを１００ｍＬの培地を用いて培養し、藻類細胞を回収した後、ＤＮＡ抽出キット（Giagen社製，DNeasy（登録商標） Plant Mini Kit）を用い、ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｃ１Ｐ２プロモーターに特異的なプライマー（配列番号５，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）および導入した抗生物質遺伝子（ｎａｔ）に特異的なプライマー（配列番号６，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）と、Mighty Amp（商標） DNA Polymerase（Takara社製）を使ってＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応の条件は、基本的には上記実施例１（２）と同様とし、サイクル数は３０サイクル、アニーリング温度は５５℃とした。得られた増幅ＤＮＡを分析した電気泳動写真を図３に示す。【００６９】
図３中、「Ｍ」は分子量マーカーであり、「１〜４」は本発明に係るプロモーターと抗生物質遺伝子（ｎａｔ）を含むプラスミドベクターで形質転換した株のレーン、「５」は本発明に係るプロモーターと抗生物質遺伝子（ｎａｔ）を含むプラスミドベクターを用いた陽性対照のレーン、「６」はChaetoceros sp．の野生株を用いた陰性対照レーンである。【００７０】
実験結果の考察
（１）  形質転換能について
上記実施例３の結果のとおり、プロモーターを導入しない場合には形質転換体が得られず、また、従来型ウィルスプロモーターを用いた場合には、僅かに形質転換体が得られた。【００７１】
それに対して、本発明に係るプロモーターを用いた場合には、１０倍以上もの形質転換体を得ることができる。よって、本発明に係るプロモーターは、高効率に海産藻類を形質転換可能と考えられる。【００７２】
（２）  本発明プロモーターの塩基配列について
一般的に、真核生物のプロモーター領域には、転写を開始させる転写結合因子が結合するコアプロモーター領域と、その上流に位置する遺伝子転写調節領域が存在する。ウィルスプロモーターにおいても同様に、ＴＡＴＡボックス（５’−ＴＡＴＡＷＡＷ−３’（式中、ＷはＡまたはＴを表す））やイニシエーターエレメント（Ｉｎｒ）といった真核生物のコアプロモーター領域によく見られるモチーフ配列が存在することが知られている。このことを踏まえ、本発明プロモーターの配列１をPLACE Signal Scan Search（http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）を用いて解析し、比較した。【００７３】
その結果、配列番号１の本発明プロモーターに、ＴＡＴＡボックス（配列番号１中、２８５〜２８９）、ＡＣＧＴＡボックス（配列番号１中、３３７〜３４１）、および珪藻類のイニシエーターエレメントと考えられる５’−ＴＣＡＴ+1ＡＡＡ−３’（配列番号１中、４５７〜４６３）を見出した。このイニシエーターエレメントは、哺乳類の５’−ＹＹＡ+1ＮＷＹＹ−３’（式中、ＷはＡまたはＴを示し、ＹはＣまたはＴを示す。以下、同じ）（Javahery，R．ら，Molecular and Cellular Biology，14，pp．116-127（1994））、卵菌類の５’−ＹＣＡ+1ＴＴＹＹ−３’（Mcleod，Aら，Eukaryotic Cell，3，pp．91-99（2004））、ショウジョウバエの５’−ＴＣＡ+1ＫＴＹ−３’（式中、ＫはＧまたはＴを表す）（Purnell，B．A．ら，Genes & Development，8，pp．830-842（1994））、トリコモナスの５’−ＴＣＡ+1ＹＷ−３’（Liston，D．R．ら，Molecular and Cellular Biology，19，pp．2380-2388（1999））など、他の生物のＩｎｒ配列とはやや異なる。【００７４】
これに関連して、本発明者らは、本発明に用いたＣｌｏｒＤＮＡウィルスに極めて近縁なウィルスの１種であるＣｓｅｔＤＮＡウィルスに由来する、上記Ｉｎｒを含むプロモーターが、珪藻の中心目種には働かないことを明らかにしている。この点を考慮すると、本発明に係るポリヌクレオチド（１）が高い形質転換能を発揮できる理由として、イニシエーターエレメント以外の未知の配列が、Ｃｏｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔとして働いている可能性が高いと考えられる。【００７５】
以下、さらに実験を進めた。【００７６】
実施例４  プロモーターの重要部位の特定
（１）  ＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターの分離
上記実施例１（２）のＰＣＲにおいてプライマーを表２のものに変更した以外は同様にして、構造タンパク質のＯＲＦの上流配列中から長さの異なる３種の配列を調製した。なお、表２中のアニーリング部位は、ＯＲＦ配列の上流配列である配列番号７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）中における塩基番号を示す。【００７７】
【表２】
2011102301.tif 000003
【００７８】
具体的には、３’側のプライマーとしてＣｌＰ２Ｒ／２／ａｔｔＢ４を用い、５’側のプライマーとして表２中の１から３番目のプライマーを用い、長さの異なるＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターＤＮＡを得た。以下、得られたＤＮＡを、長いものからプロモーター１，２，３という。【００７９】
（２）  プラスミドベクターの調製
上記実施例２と同様にして、上記（１）で得られたＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターＤＮＡが導入されたプラスミドベクターを調製した。また、比較のため、中心目珪藻Thalassiosira pseudonanaの内在性プロモーターを含むベクターと、プロモーターを含まないベクターも同様に調製した。【００８０】
（３）  形質転換実験
上記（２）で得られたプラスミドベクターを用い、上記実施例３と同様にして中心目珪藻Chaetoceros sp.の形質転換実験を行い、全細胞数５×１０8当たりのコロニー数を計測した。実験は各３例行った。結果を表３に示す。【００８１】
【表３】
2011102301.tif 000004
【００８２】
表３に示す結果のとおり、上記（１）で調製したＣｌｏｒＤＮＡウィルスプロモーターＤＮＡのうち、中程度の長さのプロモーター２（配列番号１２；配列番号７中、第２８１から第５０７番目の塩基配列）で十分な形質転換効率が示された。一方、最も短いプロモーター３（配列番号７中、第４２４から第５０７番目の塩基配列；配列番号１２中、第１４４から第２３０番目の塩基配列）では、全く活性が見られなかった。従って、配列番号１２の第１から第１４３番の塩基配列（配列番号１３）の中に、藻類の形質転換に重要な配列が含まれていると考えられる。【００８３】
また、長いプロモーター１（配列番号１１；配列番号７中、第９から第５０７番目の塩基配列）では、さらに高い形質転換効率が得られた。従って、配列番号７中、第９から第２８０番目の塩基配列には、藻類の形質転換に補助的役割を示す配列が含まれていると考えられる。【００８４】
以上のとおり、配列番号１３のプロモーターには、藻類の形質転換を行う上で非常に重要な配列が含まれており、また、配列番号１２のプロモーターは、藻類の形質転換に非常に有用であり、配列番号１１のプロモーターは、さらに形質転換効率の高いものであることが明らかにされた。【００８５】
実施例５  プロモーターの重要部位の特定
配列番号１２のプロモーターを導入したプラスミドベクターを用い、中心目珪藻に加えて羽状目珪藻についても形質転換実験を行った。即ち、上記実施例３と同様にして、表４に示す珪藻を形質転換した。全細胞数１×１０8当たりのコロニー数を計測した。実験は各３例行った。また、陰性対照として、プロモーターを有さないプラスミドベクターを用い、同様に実験を行った。結果を表４に示す。【００８６】
【表４】
2011102301.tif 000005
【００８７】
表４の結果のとおり、珪藻は羽状目珪藻と中心目珪藻に大きく分類されるところ、従来のプロモーターの特異性が高いのに対して、本発明に係るプロモーターは特異性が低く、様々な珪藻の効率的な形質転換に幅広く用いられ得ることが示された。
【図１】
2011102301.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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