(57)【要約】被験体における腫瘍の発生を阻害するための方法が開示されている。方法は、治療有効量のドミナントネガティブ腫瘍壊死因子（ＤＮ−ＴＮＦ）−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を被験体に投与することを含む。ＤＮ−ＴＮＦ−ａタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて投与することができる。一局面では、上記被験体が良性腫瘍を有し、上記腫瘍の発生を阻害することが、上記良性腫瘍の悪性腫瘍への変換を阻害することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における腫瘍の発生を阻害するまたは腫瘍を処置するための方法であって、治療有効量のドミナントネガティブ腫瘍壊死因子（ＤＮ−ＴＮＦ）−αタンパク質および／または前記ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を被験体に投与し、それにより、被験体における前記腫瘍の発生を阻害することを含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が良性腫瘍を有し、前記腫瘍の発生を阻害することが、前記良性腫瘍の悪性腫瘍への変換を阻害することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍の発生を阻害することが、前記被験体における前記腫瘍に対する免疫抑制応答を阻害することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫抑制応答を阻害することが、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数および／または機能を阻害することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫抑制応答を阻害することが、免疫抑制性サイトカインの産生を阻害することを含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サイトカインが、可溶性インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＴＧＦβまたはＩＬ−１０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫抑制応答を阻害することが、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の枯渇および／または消耗を阻害することを含む、請求項１から３までに記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍の発生を阻害することが、前記被験体における前記腫瘍に対する免疫応答を刺激することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫応答を刺激することが、Ｔｈ１免疫応答を刺激すること、Ｔｈ１７免疫応答を刺激すること、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／樹状細胞（ＤＣ）クロストークを促進すること、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の増大を促進すること、ならびに／または、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＦＮγおよび／もしくはＩＬ−１７の分泌を増加させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍の発生を阻害することが、腫瘍のサイズおよび数を対照と比較して低減させることを含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対照が、未処置の被験体または担体を用いて処置した被験体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮ−ＴＮＦ−αポリペプチドが、配列番号２と記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、結腸がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、カポジ肉腫、肝がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、腎がん、卵巣がん、膵がん、脳腫瘍、または黒色腫である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体に、前記腫瘍を処置するための追加的な薬剤を投与することをさらに含む、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記追加的な薬剤が、外科手術、放射線、または化学療法剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、ＭＵＣ−１または前立腺特異的抗原（ＰＣＡ）を含めた抗がんワクチンであり、前記腫瘍が、それぞれ結腸ポリープまたは前立腺前がん過形成性異形成である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加的な薬剤が、モノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記モノクローナル抗体が、抗プログラム死（ＰＤ）−１抗体、抗プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ）１抗体、抗プログラム死リガンドＰＤ−Ｌ２抗体、抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ）３抗体、抗Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンタンパク質（ＴＩＭ）−３抗体、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有する抗Ｔ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質（ＣＴＬＡ）−４抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記追加的な薬剤が、ワクチンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ワクチンが、樹状細胞−抗がんワクチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ワクチンが、ポックスウイルスワクチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ワクチンが、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲ−Ｌ）ワクチンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ワクチンが、ＭＵＣ−１タンパク質、ＭＵＣ−１タンパク質をコードする核酸、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、または前立腺特異的抗原をコードする核酸、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＡＦＰ、サバイビン、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１を含む、請求項１９、２０、２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加的な薬剤が、サイトカインである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記サイトカインが、インターフェロン（ＩＦＮ）α、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌｔ３−リガンドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記追加的な薬剤が、養子免疫療法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記養子免疫療法が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞および幹細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記追加的な薬剤が、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ４０またはＯＸ４０を模倣するものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
前記追加的な薬剤が、モノクローナル抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記追加的な薬剤が、リガンドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
これは、２０１５年１２月１８日に出願された米国仮出願第６２／２６９，８３９号（これは、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、がんの分野、詳細には、被験体におけるがん発生を阻害するために可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を排除することに関する。
【０００３】
政府支援の承認
本発明は、国立保健研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＮＩＨ）に認定された助成金番号ＤＥ０１７１５０の下で政府支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、膜貫通分子および可溶性分子として産生される（Ｗａｌｌａｃｈら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年；１７巻：３３１〜６７頁；Ｗａｊａｎｔら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ、２００３年；１０巻：４５〜６５頁）。膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）は、細胞膜上に、２６ｋＤａのＩＩ型プロトマーで構成される機能的なホモ三量体として発現する。可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）もホモ三量体であるが、ＴＮＦアルファ変換酵素（ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ−１７）シェディングによって産生される１７ｋＤａのｔｍＴＮＦ−プロトマー細胞外ドメイン残基で構成される。ＴＮＦは、活性化されたマクロファージによって主に産生される。ＴＮＦは、二次リンパ器官の構造的および機能的組織化、アポトーシスおよび抗腫瘍活性、ウイルス複製の阻害、免疫調節ならびに炎症を含めたいくつもの重要な生活機能を媒介する。ＴＮＦはまた、自己免疫疾患の病理発生、急性期反応、敗血症性ショック、発熱および悪液質においても重要な役割を果たす。これらの多様な機能は２つのＴＮＦの形態と２つの膜貫通型受容体、ＴＮＦ受容体１型（ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ｐ５５／６０、ＣＤ１２０ａ）およびＴＮＦ受容体２型（ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ｐ７５／８０、ＣＤ１２０ｂ）との間の同族相互作用を介して誘導される。受容体は、構造的に別個の細胞内ドメインを有し、異なるシグナル伝達経路を活性化する。ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２は、それぞれｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦによって優先的に活性化されることが示唆されている（Ｗａｌｌａｃｈら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９年；１７巻：３３１〜６７頁；Ｗａｊａｎｔら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ、２００３年；１０巻：４５〜６５頁）。
【０００５】
世界的に毎年数百万人ががんにより死亡している。がんは、米国における死亡率の第２の主な原因である。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙは、米国だけで、がんにより引き起こされる死亡が毎年５０万人をはるかに超え、１年に診断される新規の症例が１２０万件を超えると報告している。がんによる死亡は一般に増加しているので、がんが死亡の主な原因になることが予測されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗａｌｌａｃｈら、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９年）１７巻：３３１〜６７頁
【非特許文献２】Ｗａｊａｎｔら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ（２００３年）１０巻：４５〜６５頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
がんは、１つまたは複数の細胞集団の制御されていない増殖が正常な生物学的機能に干渉する、異常な状態である。増殖性変化は、通常、より分化していない状態への先祖返りおよび増殖能力の増大を含めた、細胞の性質の変化を伴う。がんのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相関するものは細胞形質転換と称される。形質転換された細胞は、一般に、以下の性質：球状の形態、胎児抗原の発現、増殖因子非依存性、接触阻止の欠如、足場非依存性、および高密度までの成長のうちのいくつかまたは全てを示す。がんを処置および予防するための方法が依然として必要とされている。
【０００８】
ドミナントネガティブ腫瘍壊死因子（ＤＮ−ＴＮＦ）−αにより、腫瘍の発生数および成長が低下し、腫瘍が発生するリスクがある被験体の生存が延長されることが本明細書に開示されている。さらに、被験体における腫瘍の発生を阻害するための方法が開示されている。方法は、腫瘍が発生するリスクがある被験体または腫瘍を有する被験体などの被験体に、ドミナントネガティブ腫瘍壊死因子（ＤＮ−ＴＮＦ）−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を治療有効量で投与することを含む。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０００９】
被験体は、良性腫瘍または悪性腫瘍を有し得る。一部の実施形態では、腫瘍は、結腸がん、肺がん、前立腺がん、乳がん  カポジ肉腫、肝がんまたは黒色腫である。
【００１０】
具体的な非限定例では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、配列番号２と記載されるアミノ酸配列を含む。他の非限定例では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質はペグ化されている。
【００１１】
本発明の前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進める以下の詳細な説明からより明白になろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦの隔離またはＴＮＦもしくはＴＮＦＲ１遺伝子の欠失によりマウスがＭＣＡ誘導性発癌現象から保護されることを示す。図１Ａ：実施例１に記載の通り、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡを皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ＭＣＡを注射したマウスを、１５匹のマウスの３つの群にランダム化した。対照群のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．５ｍＬ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。他の２つの群のマウスには、それぞれエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））またはＸＰＲＯ（商標）１５９５（ＤＮ−ＴＮＦ）のいずれかをｉ．ｐ．注射した（マウス１匹当たり２００μｇ／ＰＢＳ  ０．５ｍＬ）。ＰＢＳ、ＥＮＢＲＥＬおよびＤＮ−ＴＮＦの注射は、ＭＣＡを注射した日から開始して、週に２回、１２週間にわたって実施した。図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ：２０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１０匹のＴＮＦ欠損（ＴＮＦｋｏ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１０匹のＴＮＦＲ１欠損（ＴＮＦＲ１ｋｏ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび１０匹のＴＮＦＲ２欠損（ＴＮＦＲ２ｋｏ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＣＡを上記の通り注射した。ＭＣＡを注射した野生型マウスのうち１０匹にはＰＢＳもｉ．ｐ．注射し、他の１０匹のマウスにはＸＰＲＯ（商標）１５９５生物製剤を注射した。ＭＣＡを注射した遺伝子欠損マウスは未処置のままにした。ＭＣＡの注射および処置は図１Ａに記載されている通り実施した。図１Ａおよび１Ｂは、累積的な腫瘍発生数を表す。図１Ｃは、個々の腫瘍サイズおよびそれらの平均（太い線）を表す。図１Ｄは、累積的な生存を表す。分析は実施例１に記載の通り実施した。図１Ａにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ対ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬおよびＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ、ならびにＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦの差異は有意である（それぞれｐ＝０．００９、ｐ＜０．００００５、およびｐ＝０．０２７）。図１Ｂにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ、ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ；およびＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ、ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏの差異は有意である（それぞれｐ＝０．０００７、ｐ＝０．００１６およびｐ＝０．０３１；ｐ＝０．００１３、ｐ＝０．００２６、およびｐ＝０．０２９）。図１Ｃにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦおよびＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ；ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦおよびＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ；ならびにＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦおよびＭＣＡ／ＴＮＦｋｏの差異は有意である（それぞれｐ＝０．０１７、ｐ＝０．０２７；ｐ＝０．０２３、ｐ＝０．０３１；ｐ＝０．０２９およびｐ＝０．０３６）。図１Ｄにおいて、ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ対ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ、ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ；ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ対ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ、ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ；ならびにＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ対ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏの差異は有意である（それぞれｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００３、ｐ＜０．０００１；ｐ＜０．０００１、ｐ＜��．０００１、ｐ＜０．０００１；ｐ＝０．０３７、およびｐ＝０．０２９）。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｄは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦの隔離またはＴＮＦもしくはＴＮＦＲ１遺伝子の欠失によりマウスがＭＣＡ誘導性発癌現象から保護されることを示す。図１Ａ：実施例１に記載の通り、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＣＡを皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ＭＣＡを注射したマウスを、１５匹のマウスの３つの群にランダム化した。対照群のマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．５ｍＬ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。他の２つの群のマウスには、それぞれエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））またはＸＰＲＯ（商標）１５９５（ＤＮ−ＴＮＦ）のいずれかをｉ．ｐ．注射した（マウス１匹当たり２００μｇ／ＰＢＳ  ０．５ｍＬ）。ＰＢＳ、ＥＮＢＲＥＬおよびＤＮ−ＴＮＦの注射は、ＭＣＡを注射した日から開始して、週に２回、１２週間にわたって実施した。図１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ：２０匹の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１０匹のＴＮＦ欠損（ＴＮＦｋｏ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス、１０匹のＴＮＦＲ１欠損（ＴＮＦＲ１ｋｏ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび１０匹のＴＮＦＲ２欠損（ＴＮＦＲ２ｋｏ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＣＡを上記の通り注射した。ＭＣＡを注射した野生型マウスのうち１０匹にはＰＢＳもｉ．ｐ．注射し、他の１０匹のマウスにはＸＰＲＯ（商標）１５９５生物製剤を注射した。ＭＣＡを注射した遺伝子欠損マウスは未処置のままにした。ＭＣＡの注射および処置は図１Ａに記載されている通り実施した。図１Ａおよび１Ｂは、累積的な腫瘍発生数を表す。図１Ｃは、個々の腫瘍サイズおよびそれらの平均（太い線）を表す。図１Ｄは、累積的な生存を表す。分析は実施例１に記載の通り実施した。図１Ａにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ対ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬおよびＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ、ならびにＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦの差異は有意である（それぞれｐ＝０．００９、ｐ＜０．００００５、およびｐ＝０．０２７）。図１Ｂにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ、ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ；およびＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ、ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏの差異は有意である（それぞれｐ＝０．０００７、ｐ＝０．００１６およびｐ＝０．０３１；ｐ＝０．００１３、ｐ＝０．００２６、およびｐ＝０．０２９）。図１Ｃにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦおよびＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ；ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦおよびＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ；ならびにＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ対ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦおよびＭＣＡ／ＴＮＦｋｏの差異は有意である（それぞれｐ＝０．０１７、ｐ＝０．０２７；ｐ＝０．０２３、ｐ＝０．０３１；ｐ＝０．０２９およびｐ＝０．０３６）。図１Ｄにおいて、ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ対ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ、ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ；ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ対ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ、ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ；ならびにＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ対ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏの差異は有意である（それぞれｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０００３、ｐ＜０．０００１；ｐ＜０．０００１、ｐ＜��．０００１、ｐ＜０．０００１；ｐ＝０．０３７、およびｐ＝０．０２９）。
【００１３】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５  ＤＮ−ＴＮＦを用いたｓＴＮＦの隔離ならびにＴＮＦＲ２−ＦｃによるｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方の中和が、ＭＣＡを注射したマウスにおける免疫調節性サイトカインの分泌に影響を及ぼすことを示す。健康／未処置（対照）野生型マウス、ＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置した（ＭＣＡ）野生型マウス、ＭＣＡを注射した／ＴＮＦＲ２−Ｆｃで処置した（ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ）野生型マウスおよびＭＣＡを注射した／ＸＰＲＯ（商標）１５９５で処置した（ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ）野生型マウス（各群当たり３匹のマウス）を屠殺し、ＭＣＡ注射の１４日後にそれらの血清を得た。血清を、ＩＬ−１β（図２Ａ）、ＩＬ−１２ｐ４０／７０（図２Ｂ）、ＩＬ−１７（図２Ｃ）およびＩＬ−１α（図２Ｄ）の存在についてＬＵＭＩＮＥＸ（登録商標）アッセイを使用して調査した。データは、三連の平均値＋ＳＥを示す。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃにおいて、対照およびＭＣＡ／ＰＢＳで処置したマウスと比べて、ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスの血清中のサイトカインレベルの上昇は有意であった（それぞれｐ＝０．０２６、ｐ＝０．０５およびｐ＝０．０３９）。図２Ｄにおいて、対照およびＭＣＡ／ＰＢＳで処置したマウスに対して、ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）で処置したマウスおよびＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスの血清中のＩＬ−１αレベルの低下は有意である（それぞれｐ＝０．０１２およびｐ＝０．０２３）。
【００１４】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦ排除により、ＭＣＡ誘導性骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）増大が妨げられることを示す。図１の説明文に記載されているのと同様の実験群をセットアップした。健康／未処置対照マウス（対照）；ＭＣＡを注射した：ＰＢＳで処置したマウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＰＢＳ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ）、ＴＮＦＲ２−Ｆｃで処置したマウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）−Ｔ）、ＸＰＲＯ（商標）１５９５で処置したマウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ；ならびに／または腫瘍を有する、ＭＣＡを注射した／ＴＮＦｋｏマウス（ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ−Ｔ）、ＴＮＦＲ１ｋｏマウス（ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ−Ｔ）およびＴＮＦＲ２ｋｏ−Ｔマウス（ＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ−Ｔ）を含めた、腫瘍を有さない野生型マウスおよび腫瘍を有する（Ｔ）野生型マウスの両方を調査した。ＭＣＡ注射１４日後（図３Ａ、３Ｂ）および／または８４日後（図３Ｃ、３Ｄ）に、列挙されているマウスの群から脾細胞を得、蛍光色素とコンジュゲートした、ＣＤ１１ｂに対する抗体、Ｇｒ１に対する抗体、およびＬｙ６Ｃに対する抗体を用いて染色した。染色された脾細胞を３色フローサイトメトリーによって分析した。ゲーティング／分析戦略が図６に表される。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｌｏ／−Ｌｙ６Ｃ＋／ｈｉ単球性ＭＤＳＣ（図３Ａ、３Ｂ）、およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｈｉＬｙ６Ｃ＋顆粒球性ＭＤＳＣ（図３Ｃ、３Ｄ）をスコア化した。ドットプロットデータは、非顆粒Ｇｒ１−Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（図３Ａ）、および顆粒Ｇｒ１＋Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（図３Ｃ）を表す。ヒストグラムは、単球性ＭＤＳＣ（図３Ｂ）および顆粒球性ＭＤＳＣ（図３Ｄ）の個々の百分率および平均の百分率（２〜３回の反復±ＳＤ：対照、ＭＣＡ／ＰＢＳ−ＴおよびＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ）を示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｄは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦ排除により、ＭＣＡ誘導性骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）増大が妨げられることを示す。図１の説明文に記載されているのと同様の実験群をセットアップした。健康／未処置対照マウス（対照）；ＭＣＡを注射した：ＰＢＳで処置したマウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＰＢＳ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ）、ＴＮＦＲ２−Ｆｃで処置したマウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）−Ｔ）、ＸＰＲＯ（商標）１５９５で処置したマウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ；ならびに／または腫瘍を有する、ＭＣＡを注射した／ＴＮＦｋｏマウス（ＭＣＡ／ＴＮＦｋｏ−Ｔ）、ＴＮＦＲ１ｋｏマウス（ＭＣＡ／ＴＮＦＲ１ｋｏ−Ｔ）およびＴＮＦＲ２ｋｏ−Ｔマウス（ＭＣＡ／ＴＮＦＲ２ｋｏ−Ｔ）を含めた、腫瘍を有さない野生型マウスおよび腫瘍を有する（Ｔ）野生型マウスの両方を調査した。ＭＣＡ注射１４日後（図３Ａ、３Ｂ）および／または８４日後（図３Ｃ、３Ｄ）に、列挙されているマウスの群から脾細胞を得、蛍光色素とコンジュゲートした、ＣＤ１１ｂに対する抗体、Ｇｒ１に対する抗体、およびＬｙ６Ｃに対する抗体を用いて染色した。染色された脾細胞を３色フローサイトメトリーによって分析した。ゲーティング／分析戦略が図６に表される。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｌｏ／−Ｌｙ６Ｃ＋／ｈｉ単球性ＭＤＳＣ（図３Ａ、３Ｂ）、およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｈｉＬｙ６Ｃ＋顆粒球性ＭＤＳＣ（図３Ｃ、３Ｄ）をスコア化した。ドットプロットデータは、非顆粒Ｇｒ１−Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（図３Ａ）、および顆粒Ｇｒ１＋Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞（図３Ｃ）を表す。ヒストグラムは、単球性ＭＤＳＣ（図３Ｂ）および顆粒球性ＭＤＳＣ（図３Ｄ）の個々の百分率および平均の百分率（２〜３回の反復±ＳＤ：対照、ＭＣＡ／ＰＢＳ−ＴおよびＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ）を示す。
【００１５】
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦ隔離により、骨髄細胞におけるＳＴＡＴ３のＭＣＡにより誘導される活性化が予防されることを示す。健康／未処置対照野生型マウス（対照）およびＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置した野生型マウス（腫瘍を有する：ＭＣＡ−Ｔ）、ＴＮＦＲ２−Ｆｃで処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ；および腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ−Ｔ）、ならびにＸＰＲＯ（商標）１５９５で処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ；および腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ）の脾細胞をＭＣＡ注射の８４日後に得、リン酸化ＳＴＡＴ３  ｙ７０５（図４Ａ、４Ｂ）およびＳＴＡＴ３  ｓ７２７（図４Ｃ、４Ｄ）の細胞内の存在についてフローサイトメトリーによって調査した。ゲーティングされた大きな非顆粒単核細胞（単球）（図４Ａ、４Ｃ）および中間サイズの顆粒細胞（顆粒球）（図４Ｂ、４Ｄ）の分析を図８に示されている通り実施した。データは、染色された単球および顆粒球の総百分率を示す。
【００１６】
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、ｓＴＮＦ隔離により、ＮＫ細胞／ＤＣクロストークの細胞媒介性抑制のＭＣＡによる誘導が予防されることを示す。図３の説明文に記載されている通り、健康／未処置野生型マウス（対照）、ならびにＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＰＢＳ；および腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ）、ＴＮＦＲ２−Ｆｃで処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＥＮ；および腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＥＮ−Ｔ）ならびにＸＰＲＯ（商標）１５９５で処置した野生型マウス（腫瘍を有さないＭＣＡ／ＤＮ；および腫瘍を有するＭＣＡ／ＤＮ−Ｔ）の脾細胞を、ＭＣＡ注射後１４日目（図５Ａ、５Ｃ）および／または８４日目（図５Ｂ、５Ｄ）に得た。これらの脾細胞を、単独で（図５Ａ、５Ｂ）またはＳＣＩＤ脾細胞（ＳＣＩＤ）と１：１の比および３：１の比で混合して（図５Ｃ、５Ｄ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を用いて２４時間にわたって刺激した。この刺激後、細胞培養馴化培地を回収し、ＩＦＮβの存在についてＥＬＩＳＡを使用して調査した。図５Ａおよび図５Ｂにおいて、対照１および対照２は、それぞれ健康／未処置マウスの刺激していない脾細胞およびＩＬ−２／ＬＰＳで刺激した脾細胞を示す。データは、ＩＦＮγ  ｎｇ／ｍＬの三連の平均±ＳＤである。図５Ａにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳ、ＭＣＡ／ＥＮおよびＭＣＡ／ＤＮは、対照２よりも有意に低い（それぞれｐ＝０．０００４１、ｐ＝０．０００５７およびｐ＝０．００１６）。図５Ｂにおいて、ＭＣＡ／ＰＢＳおよびＭＣＡ／ＥＮは、対照２よりも有意に低い（それぞれｐ＝０．００４７、ｐ＝０．００１６）。図５Ｃにおいて、ＳＣＩＤ：対照（１．０：０．０）およびＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＰＢＳ（１．０：１．０〜１．０：３．０）は、ＳＣＩＤ：対照（１．０：１．０〜１．０：３．０）よりも有意に低く（それぞれｐ＝０．０２６、ｐ＝０．００１）；ＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＥＮ（１．０：１．０〜１．０：３．０）およびＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＤＮ（１．０：１．０〜１．０：３．０）は、ＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＰＢＳ（１．０：１．０〜１．０：３．０）よりも有意に高い（それぞれｐ＝０．０１９、およびｐ＝０．００１）。図５Ｄにおいて、ＳＣＩＤ：対照（１．０：０．０）およびＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ（１．０：１．０〜１．０：３．０）は、ＳＣＩＤ：対照（１．０：１．０〜１．０：３．０）よりも有意に低く（それぞれｐ＝０．００３４、ｐ＝０．００３３）；ＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＥＮ（１．０：３．０）、ＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＤＮ（１．０：１．０〜１．０：３．０）およびＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＤＮ−Ｔ（１．０：１．０〜１．０：３．０）は、ＳＣＩＤ：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ（１．０：１．０〜１．０：３．０）よりも有意に高い（それぞれｐ＝０．０２７、ｐ＝０．０２８、ｐ＝０．０４６）。
【００１７】
【図６】図６は、脾臓ＭＤＳＣの３色フローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。脾細胞を、抗ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ、抗Ｇｒ１−ＰＥおよび抗Ｌｙ６Ｃ−ＡＰＣ抗体を用いてまたは対応するアイソタイプ対照抗体を用いて同時に染色し、以下の通りフローサイトメトリーによって分析した。ゲーティング１：単一細胞をゲーティングし、細胞凝集体を排除した。ゲーティング２：前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）を使用して、非顆粒細胞、単核細胞、および顆粒細胞をゲーティングした。最後に、ＣＤ１１ｂ＋非顆粒単核細胞および顆粒細胞をゲーティングし（ゲーティング３）、Ｇｒ１発現およびＬｙ６発現について分析した。
【００１８】
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＭＣＡではマクロファージの頻度は影響を受けず、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦ排除ではマクロファージの頻度が低下することを示す。実験群を図３の説明文に記載されている通りセットアップした。脾細胞を、抗ＣＤ４５Ｒ−ＦＩＴＣおよび抗Ｆ４／８０−ＰＥ抗体を用いて同時に染色し、フローサイトメトリーによって調査した。単一の（図７Ａ）非顆粒（図７Ｂ）単核細胞をゲーティングし（図７Ｃ）、Ｂ細胞およびマクロファージのそれぞれをＣＤ４５ＲマーカーおよびＦ４／８０マーカーの細胞表面発現について２色フローサイトメトリーによって調査した。ＣＤ４５−Ｆ４／８０＋マクロファージが個々のおよび平均（２〜３回の反復）±ＳＤ値の陽性細胞の百分率のドットプロット（図７Ｃ）およびヒストグラム（図７Ｄ）として示されている。
【００１９】
【図８】図８は、脾臓の単球および顆粒球のＳＴＡＴ３単色フローサイトメトリー分析のためのゲーティング戦略を示す。脾細胞を固定し、透過処理し、ＩｇＧ対照または抗ｐＳＴＡＴ３抗体を用いて染色し、単一細胞に対しては図６のゲーティング１と同様にゲーティングし、大きな非顆粒（単球）および顆粒（顆粒球）脾細胞に対してはゲーティング２と同様にゲーティングした。したがってゲーティングされた白血球を、ｐＳＴＡＴ３  ｙ７０５およびｐＳＴＡＴ３  ｓ７２７の細胞内発現について単色フローサイトメトリーによって調査した。
【００２０】
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いたｓＴＮＦ隔離により、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞のＭＣＡ誘導性枯渇が予防され、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の増大が可能になることを示す。健康／未処置対照（対照）；ＭＣＡを注射した：ＰＢＳで処置した（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＰＢＳ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ）、ＴＮＦＲ２−Ｆｃで処置した（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）−Ｔ）、およびＸＰＲＯ（商標）１５９５で処置した（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ−Ｔを含めた、腫瘍を有さない野生型マウスおよび腫瘍を有する（Ｔ）野生型マウスの両方を調査した。脾細胞を、列挙されているマウスの群からＭＣＡ注射後１４日目および／または８４日目に得、蛍光色素とコンジュゲートした、ＣＤ３に対する抗体、ＮＫ１．１に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体およびＣＤ８に対する抗体を用いて染色した。染色された脾細胞を３色フローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＮＫ１．１−：ＣＤ３＋；図９Ａ）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋ＮＫ１．１−ＣＤ４＋：ＣＤ３＋ＣＤ４＋；図９Ｂ）およびＴ−細胞傷害性細胞（ＣＤ３＋ＮＫ１．１−ＣＤ８＋：ＣＤ３＋ＣＤ８＋；図９Ｃ）の個々の百分率および平均百分率（２〜３回の反復±ＳＤ：対照、ＭＣＡ／ＰＢＳ−ＴおよびＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ）を示す。
【００２１】
【図１０】図１０は、ＸＰＲＯ（商標）１５９５により、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有するヒト黒色腫細胞株におけるＢＲＡＦおよびＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤に対する、ｓＴＮＦにより誘導される抵抗性が有効に遮断されることを示す。ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を含有するヒト黒色腫細胞株であるＳＫ−Ｍｅｌ−３７を、組換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）またはＭ１マクロファージ（ＭΦ）により分泌されたｓＴＮＦに、ＸＰＲＯ（商標）１５９５またはＴＮＦ遮断抗体（それぞれＴＮＦ＋ＤＮ−ＴＮＦおよびＴＮＦ＋αＴＮＦ）の非存在下（ＴＮＦ）または存在下、３７℃で２０時間にわたって曝露させた。その後、ＢＲＡＦ（ＰＬＸ４７２０）およびＭＥＫ（セルメチニブ）阻害剤（それぞれＢＲＡＦｉおよびＭＥＫｉ）に対する細胞の感受性、ならびにそれらのＢＲＡＦｉおよびＭＥＫｉ抵抗性のｓＴＮＦ媒介性誘導を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）生存度アッセイを使用して試験した。試験は四連で実施した。各応答について平均値およびＳＤが示されている。＊ｐ≦０．０５。
【００２２】
【図１１】図１１は、可溶性ＴＮＦ（配列番号１）とＸＰＲＯ（商標）１５９５（配列番号２）のアミノ酸配列の比較を示す。可溶性ＴＮＦのアミノ酸配列（配列番号２）は下の行であり、下線が引かれている。２つの配列間の差異が太字で示され、強調表示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ、２０１６年１１月２０日、４，０９６バイト］として提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表において：
【００２４】
配列番号１は、ヒトＴＮＦ−αのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号２は、例示的なＤＮ−ＴＮＦ−α（ＸＰＲＯ（商標）１５９５）のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号３は、例示的なＤＮ−ＴＮＦ−α（ＸＰＲＯ（商標）１５９５）をコードする核酸配列である。
【００２７】
可溶性腫瘍壊死因子（ｓＴＮＦ）は、ＭＤＳＣの増大、免疫抑制の発生、ならびに、例えば、これだけに限定されないが、化学的に誘導された発癌現象において、発癌現象および腫瘍成長の促進において中心的な役割を有することが本明細書に開示されている。ＤＮ−ＴＮＦ−αの投与により、腫瘍免疫抑制および腫瘍発生が効率的に阻害される。
用語
【００２８】
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版、１９９４年（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により出版、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．により出版、１９９５年（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）において見いだすことができる。
【００２９】
本開示の種々の実施形態についての精査を容易にするために、以下の具体的な用語の説明を提示する：
【００３０】
動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物生物体。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物のどちらも含む。同様に、「被験体」という用語は、ヒト被験体および獣医学的被験体のどちらも含む。したがって、「被験体」という一般用語は、これだけに限定されないが、ヒト、または他の霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの獣医学的被験体を含めた全ての動物を含むものと理解される。
【００３１】
抗体：エピトープ（例えば、腫瘍もしくはウイルス抗原もしくはその断片、または、ＰＤ−１もしくはＣＴＬＡ−４などの別の目的のタンパク質などの抗原）を特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体とは、インタクトな免疫グロブリン、ならびに、当技術分野で周知のそれらのバリアントおよび部分、例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）などを含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域をリンカーによって結合させた融合タンパク質であり、一方、ｄｓＦｖは、鎖の会合を安定化するために、ジスルフィド結合が導入されるように鎖を変異させたものである。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの、遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  ＣａｔａｌｏｇおよびＨａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５年（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）；Ｋｕｂｙ、Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７年も参照されたい。
【００３２】
一般には、免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域（領域は、「ドメイン」としても公知である）を含有する。重鎖可変領域と軽鎖可変領域は組み合わさって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、３つの、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（これによって参照により組み込まれる、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９９１年を参照されたい）。Ｋａｂａｔデータベースは現在オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖の組み合わさったフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを３次元空間内に位置付け、アラインメントするように働く。
【００３３】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号を付して、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても特定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。
【００３４】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含め、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含め、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００３５】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合物からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。モノクローナル抗体とは、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００３６】
「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを供給する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを供給するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。一実施形態では、ＣＤＲの全てが、ヒト化免疫グロブリン内のドナー免疫グロブリンに由来するものである。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば、約９５％またはそれよりも高い割合で同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの、おそらくＣＤＲ以外の全ての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリンおよびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを供給するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから取得したアミノ酸による限られた数の置換を有する。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原への結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加的な保存的アミノ酸置換を有してよい。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【００３７】
「中和抗体」は、ＰＤ−１ポリペプチドなどのポリペプチドの任意の生物活性に干渉する抗体である。例えば、中和抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害性などの免疫応答を低減させるＰＤ−１ポリペプチドの能力に干渉し得る。いくつかの例では、中和抗体により、免疫応答を低減させるＰＤ−１ポリペプチドの能力が約５０％、約７０％、約９０％またはそれよりも高い割合で低下する。本明細書に記載のものを含めた免疫応答を測定するための任意の標準のアッセイを使用して潜在的な中和抗体を評価することができる。
【００３８】
ＢＲＡＦキナーゼ：ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関与する酵素。正常細胞では、細胞表面受容体チロシンキナーゼは、それらの細胞外領域に増殖因子が結合すると二量体を形成する。これにより、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードが開始され、それにより、細胞増殖、生存、浸潤、および血管新生が促進される（Ｃｈｅｎｇ、Ｙ．ら、２０１３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ、３２巻：５６７〜５８４頁）。ＢＲＡＦにおける体細胞変異により、前悪性メラニン細胞の再プログラミングが導かれる。変異型ＢＲＡＦシグナルにより、上流のキューとは独立して、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）および細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を介した過剰に活性な下流のシグナル伝達が導かれる。そのような調節不全シグナル伝達により、制御されていない細胞増殖および細胞生存の延長が引き起こされる。黒色腫のおよそ５０％が、タンパク質鎖のＶ６００位にＢＲＡＦ変異を有し、その大多数（＞９０％）がグルタミン酸（Ｅ）によるバリン（Ｖ；Ｖ６００Ｅ）の置換を伴い、その結果、上流のキューとは独立した、構成的に活性なＢＲＡＦがもたらされる（Ｃａｎｔｗｅｌｌ−Ｄｏｒｒｉｓ、Ｅ．  Ｒ．ら、２０１１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０巻：３８５〜３９４頁）。
【００３９】
乳がん：良性または悪性であり得る、乳房組織の新生物の状態。乳がんの最も一般的な型は、腺管癌である。上皮内腺管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）は、管の非侵襲的な新生物の状態である。小葉癌は、浸潤性疾患ではないが、癌腫が発生する可能性があることの指標である。浸潤性（悪性）乳癌は、ステージ（Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、およびＩＶ）に分けることができる。
【００４０】
乳癌では、正常な乳腺（ｂｒｅａｓｔ  ｇｌａｎｄ）の典型的な組織学およびアーキテクチャが失われる。一般に、癌腫細胞は、正常細胞よりも過成長し、腺様構造に分化する能力を失う。分化の喪失の程度は、一般には、腫瘍の攻撃性に関連する。例えば、「上皮内」癌は、定義によれば、基底膜はインタクトに保持されるが、「浸潤性」に進行するにつれ、腫瘍は基底膜の破壊を示す。したがって、乳癌内では、正常な乳房組織において見られるような基底細胞の明確な層の染色は見られないと予想される。正常な乳房および乳癌の生理学および組織学についての考察に関しては、Ｒｏｎｎｏｖ−Ｊｅｓｓｅｎ、Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｏ．  Ｗ．およびＢｉｓｓｅｌｌ、Ｍ．  Ｊ．、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｏ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」を参照されたい（例えば、Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｒｅｖ、７６巻、６９〜１２５頁、１９９６年を参照されたい）。
【００４１】
乳がんは、それらの遺伝子発現プロファイルに基づく群に分けることができる。基底細胞型癌は、通常、エストロゲン受容体（ＥＲ）の発現に関して陰性であり、ＨＥＲ２（ｅｒｂＢ２）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現に関しても陰性であり、したがって、「トリプルネガティブ乳がん」または「ＴＮＢＣ」と称される。この型の乳がんは、ＥＲ−／ＨＥＲ２−／ＰＲ−とも称され、全ての乳がんの約１５〜２０％であり、一般に、Ｈｅｒ２標的化療法またはエストロゲン標的化療法を使用して処置することができない。このがんの侵攻性は、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−／ｌｏ表現型のがん幹細胞（ＣＳＣ）の富化と相関すると考えられている。一部の実施形態では、基底細胞癌は、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現に関して陰性であり、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の発現に関して陽性であり、サイトケラチン５（ＣＫ５）の発現に関して陽性である。この表現型は、以下：ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−／ＣＫ５＋／ＥＧＦＲ＋の通り称される。
【００４２】
がん：分化の喪失、成長速度の上昇、周囲の組織への浸潤を伴う特徴的な退形成を受けており、また、転移可能である、悪性腫瘍。例えば、前立腺がんは、前立腺組織においてまたはそこから生じる悪性新生物であり、乳がんは、乳房組織においてまたはそこから生じる悪性新生物である（例えば、腺管癌など）。残存がんは、がんを低減させるまたは根絶するために被験体になされた任意の形態の処置後に被験体に残っているがんである。転移性がんは、転移性がんが由来する元の（原発）がん発生部位以外の、体の１つまたは複数の部位におけるがんである。がんとしては、これだけに限定されないが、固形腫瘍が挙げられる。
【００４３】
化学療法剤：異常な細胞増殖を特徴とする疾患の処置において治療的有用性がある薬剤（例えば、抗腫瘍剤）。一実施形態では、化学療法剤は、固形腫瘍などの新生物の処置において使用される薬剤である。化学療法剤は、タンパク質薬剤または非タンパク質薬剤、例えば、小分子薬物、抗体、ペプチド、タンパク質、およびイムノモジュレーターなどであり得る。一実施形態では、化学療法剤は、放射性分子である。当業者は、化学療法剤を容易に特定することができる（例えば、ＳｌａｐａｋおよびＫｕｆｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第８６章  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版；Ｐｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第１７章、Ａｂｅｌｏｆｆ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  第２番、（Ｃ）２０００  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｌ．、Ｂｅｒｋｅｒｙ  Ｒ．（編）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第２版、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９５年；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＤＳ、Ｋｎｏｂｆ  ＭＦ、Ｄｕｒｉｖａｇｅ  ＨＪ（編）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第４版、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ、１９９３年を参照されたい）。
【００４４】
結腸がん：結腸直腸がんは、大腸がんとも称され、結腸、直腸および虫垂内の癌性成長を含む。世界的に１年当たり６５５，０００件の死亡が伴う、３番目に多いがんの形態であり、西欧諸国におけるがん関連死亡の第２の主な原因である。多くの結腸直腸がんは、結腸内の腺腫様ポリープから生じると考えられている。これらのキノコ様の成長は通常は良性であるが、一部は、時間をかけてがんに発展する可能性がある。大半の時間、局在する結腸がんの診断は、結腸鏡検査によるものである。治療は、通常、外科手術によるものであり、多くの場合、その後に化学療法が続く。結腸がんの最初の症状は、通常、出血、体重減少、および疲労（倦怠）などの漠然としたものである。局所的な（腸）症状は腫瘍が大きなサイズに成長するまでは稀である。一般に、腫瘍が肛門に近いほど、より多くの腸症状が存在する。
【００４５】
接触させること：固体の形態および液体の形態のどちらも含めた、直接の物理的関連に置くこと。接触させることは、単離された細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または被験体に投与することによってｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【００４６】
サイトカイン：「サイトカイン」という用語は、ナノモル濃度〜ピコモル濃度で液性調節因子として働き、正常な状態または病的な状態のいずれにおいても個々の細胞および組織の機能活性をモジュレートする多様な群の可溶性タンパク質およびペプチドの一般的な名称として使用される。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外の環境において起こるプロセスを調節する。サイトカインの例としては、これだけに限定されないが、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１７が挙げられる。
【００４７】
低下させるまたは阻害する：数、量、サイズ、または強度をより低くまたは小さくすること。一例では、疾患（例えば、腫瘍形成など）のリスクの低下または阻害は、腫瘍が発生する可能性を少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低下させることを含む。別の例では、疾患のリスクの低下または阻害は、疾患の発生の遅延、例えば、少なくとも約６カ月、例えば約１年など、例えば約２年、約５年、または約１０年などの遅延を含む。
【００４８】
一例では、腫瘍の徴候および症状の低下または阻害は、腫瘍（例えば、結腸腫瘍もしくは乳腺腫瘍など）または転移のサイズ、体積、または数を、治療用組成物の不在下での応答と比較して、所望の量、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、またはさらには少なくとも９０％低下させることを含む。
【００４９】
樹状細胞ワクチン：骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）は、特定のタンパク質および糖脂質に対して反応性であるエフェクターＴ細胞のクロスプライミングを媒介する専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。がんの状況では、ＤＣクロスプライミングにより、防御免疫または治療免疫の増強が促進される。ＤＣは、まず、死滅したがん細胞またはタンパク質を捕捉し、消化する。次いで、ＤＣは、タンパク質をペプチドエピトープにプロセシングし、最終的に、これらのエピトープを、細胞表面に発現したＭＨＣ分子の状況で特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に提示する。結果としての抗腫瘍エフェクターＴ細胞の生成は、ＤＣにより寄与される共刺激分子およびサイトカインシグナルによって活発になり、また、調節される。樹状細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、末梢血単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で刺激することによって生成することができる。樹状細胞をＴｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲ−Ｌ）およびサイトカインを用いて成熟させて、それらの抗原提示活性を増大させることもできる。これらのＤＣにがん細胞溶解物、がん組換えタンパク質、合成ペプチドまたは核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を負荷させ、がん患者に抗がん免疫応答および腫瘍成長の制御を促進するためのワクチンとして注射することができる。
【００５０】
免疫応答：Ｂ細胞またはＴ細胞などの免疫系の細胞の、刺激に対する応答。一実施形態では、応答は、炎症反応である。
【００５１】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）：抗原性刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、およびヒトＢリンパ芽球様細胞によって天然に産生されるインターロイキン。ＩＬ−１２は、ナイーブなＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与する。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激し、また、ＩＦＮ−γのＩＬ−４媒介性抑制を低下させる。ＩＬ−１２は、４つのアルファヘリックスの束で構成される。ＩＬ−１２は、２つの別々の遺伝子、ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）によりコードされるヘテロ二量体サイトカインである。活性なヘテロ二量体（「ｐ７０」と称される）、およびｐ４０のホモ二量体は、タンパク質合成後に形成される。例示的なヒトＩＬ−１２Ａアミノ酸配列はＵＮＩＰＲＯＴ（登録商標）受託番号Ｐ２９２４６、２０１４年１２月２３日に示されている。
【００５２】
インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）：様々な組織のケモカイン産生を増大させて単球および好中球を炎症部位に動員することにより遅延型過敏症反応における強力なメディエーターとして作用するサイトカイン。ＩＬ−１７は、ヘルパーＴ細胞によって産生され、ＩＬ−２３によって誘導され、その結果、遅延型反応において破壊的な組織損傷がもたらされる。ＩＬ−１７は、ＩＬ−１７Ｒと称されるＩ型細胞表面受容体に結合し、ＩＬ−１７Ｒには少なくとも３つのバリアントＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、およびＩＬ１７ＲＣが存在する。例示的なヒトＩＬ−１７アミノ酸配列は、２０１４年１２月２３日に利用可能になったＵＮＩＰＲＯＴ（登録商標）受託番号Ｑ１５５５２に示されている。
【００５３】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質など）は、当該構成成分が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的構成成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡならびにタンパク質から実質的に分離されたもの、それらとは別に産生されたもの、またはそれらから精製されたものである。したがって、「単離された」核酸、ペプチドおよびタンパク質とは、標準の精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【００５４】
肺がん：肺がんの主要な型は、肺の癌腫であり、これは、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を含む。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、時には外科手術を用いて処置されるが、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、通常、化学療法および放射線に応答する。最も一般的な肺がんの原因は、タバコの煙への長期間の曝露である。
【００５５】
非小細胞肺癌は、予後および管理が類似しているので一緒に群分けされる。３つの主要なサブタイプ：肺扁平上皮癌、腺癌、および大細胞肺癌が存在する。扁平上皮細胞肺癌は、通常、中枢気管支の付近で始まる。がんの中心でのキャビテーションおよび壊死が一般的な所見である。高分化型肺扁平上皮細胞がんは、多くの場合、他のがん型よりもゆっくりと成長する。腺癌は、肺がんの２９．４％を占める。腺癌は、通常、末梢肺組織において生じる。腺癌の大半の症例は喫煙に関連するが、喫煙したことがない人の中でも腺癌が肺がんの最も一般的な形態である。腺癌のサブタイプである細気管支肺胞癌は、女性においてより一般的である。
【００５６】
小細胞肺がん（ＳＣＬＣ、「燕麦細胞癌」とも称される）は、あまり一般的でない。小細胞肺がんは、より大きな気道（主気管支および副次気管支（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｒｏｎｃｈｉ））において生じ、急速に成長し、かなり大きくなる傾向がある。「燕麦」細胞は、高密度の神経分泌顆粒（神経内分泌ホルモンを含有する小胞）を含有し、それにより、当該細胞に内分泌／腫瘍随伴症候群との関連性が生じる。最初は化学療法に対して感受性が高いが、最終的にはより悪い予後を有し、多くの場合、診察時には転移性である。小細胞肺がんは、限局期の疾患および進展期の疾患に分類される。この型の肺がんも喫煙に強力に関連する。
【００５７】
悪性細胞：退形成、浸潤および転移の性質を有する細胞。
【００５８】
骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）：Ｔ細胞の増殖および活性化を阻害する能力などの強力な免疫抑制活性を有する骨髄系列由来の免疫細胞の集団。ヒトでは、ＭＤＳＣは、高レベルのＣＤ３３、ＣＤ１１ｂおよび低レベルのＨＬＡ−ＤＲを発現する。慢性的な炎症性の状態（例えば、ウイルス感染および細菌感染など）またはがんでは、骨髄系分化は、ＭＤＳＣの増大に偏っている。ＭＤＳＣは、骨髄、末梢血ならびに脾臓およびリンパ節などの二次リンパ器官において増加し、炎症部位および腫瘍に浸潤し、そこでＴ細胞およびＮＫ細胞を阻害する。
【００５９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞／樹状細胞（ＤＣ）クロストーク：ＮＫ細胞およびＤＣは、微生物病原体および異常な細胞を急速に認識し、排除し、自然免疫機能および獲得免疫機能を誘導および調節する。ＮＫ細胞およびＤＣは、炎症を起こしたリンパ組織および末梢リンパ組織に共局在化し、そこで相互作用することができる。このクロストークは、通常、細胞間接触で起こり、膜貫通ＴＮＦ（ｔｍＴＮＦ）、トランス提示インターロイキン（ＩＬ）−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１８およびインターフェロン（ＩＦＮ）γを含めた膜結合サイトカインおよび分泌型サイトカインによって媒介される。相互作用により、相互作用する細胞の相反的な刺激および調節が導かれ、その結果、ＮＫ細胞活性化およびＤＣ成熟化がもたらされる。ＮＫ細胞は、ＤＣにおける成熟化マーカーの発現およびＩＬ−１２の分泌の増大を誘導する。相反的に、ＤＣは、ＮＫ細胞における活性化マーカーＣＤ６９の発現、細胞傷害性およびＩＦＮ−γ分泌の増殖および強化を誘導する。ＮＫ細胞およびＤＣ機能の共同した増大により、自然免疫系にウイルスが感染し形質転換した細胞を直接排除し、堅固なＴｈ１獲得免疫応答を誘導する増強された能力が付与され、それにより、ウイルス感染およびがんを効率的に制御することが可能になる。
【００６０】
正常細胞：非腫瘍、非悪性細胞などの非罹患（野生型）細胞。
【００６１】
核酸：ホスホジエステル結合によって連結した、ヌクレオチド単位（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、関連する天然に存在する構造バリアント、および合成の天然に存在しないその類似体）で構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造バリアント、ならびに合成の天然に存在しないその類似体。したがって、この用語は、ヌクレオチドおよびそれらの間の連結が、例えば、これだけに限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、天然に存在しない合成類似体を含むヌクレオチドポリマーを包含する。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して合成することができる。「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、一般に約５０ヌクレオチド以下の短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）で表されている場合、これは、「Ｕ」で「Ｔ」が置き換えられるＲＮＡ配列（すなわち、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含むことが理解されよう。
【００６２】
本明細書では、ヌクレオチド配列を記載するために従来の表示法が使用されている：一本鎖のヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり、二本鎖ヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物に対するヌクレオチドの５’から３’への付加方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と称され、そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、コードＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側に位置するＤＮＡ鎖上の配列は「下流の配列」と称される。
【００６３】
「ｃＤＮＡ」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、ｍＲＮＡと相補的または同一であるＤＮＡを指す。
【００６４】
「コードする」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列の、生物学的プロセスにおけるヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義された配列またはアミノ酸の定義された配列のいずれかおよびそれから生じる生物学的性質を有する他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する固有の性質を指す。したがって、遺伝子により産生されるｍＲＮＡの転写および翻訳によって細胞または他の生物系においてタンパク質が産生される場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常、配列表に提示されるヌクレオチド配列であるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖は、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称することができる。別段の指定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」とは、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。
【００６５】
「組換え核酸」とは、天然では一緒に接合していないヌクレオチド配列を有する核酸を指す。組換え核酸とは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる、増幅したまたは組み立てた核酸を含む核酸ベクターを包含する。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と称される。次いで、遺伝子を組換え宿主細胞において発現させて、「組換えポリペプチド」などを産生させる。組換え核酸は、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合性部位など）としての役割も果たし得る。
【００６６】
ポリヌクレオチドの配列が、配列が第２の配列であるポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする第１の配列である場合、第１の配列は、第２の配列に対して「アンチセンス」である。
【００６７】
２つまたはそれよりも多くのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の配列関係を説明するために使用される用語として、「参照配列」、「から選択される」、「比較ウインドウ」、「同一」、「配列同一性の百分率」、「実質的に同一」、「相補的」および「実質的に相補的」が挙げられる。
【００６８】
核酸配列の配列比較に関して、一般には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用する。比較のために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻：４８２頁、１９８１年の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁、１９７０年の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁、１９８８年の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または、手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編１９９５年、補遺）を参照されたい）によって、行うことができる。
【００６９】
有用なアルゴリズムの１つの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰでは、ＦｅｎｇおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、３５巻：３５１〜３６０頁、１９８７年の漸進的アラインメント法の単純化を使用する。使用される方法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１〜１５３頁、１９８９年と同様である。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列を他の試験配列と比較して、パーセント配列同一性関係を以下のパラメータ：デフォルトのギャップ重み（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォルトのギャップ長の重み（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）（０．１０）、および重み付けした末端ギャップを使用して決定する。ＰＩＬＥＵＰは、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻：３８７〜３９５頁、１９８４年）などのＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージから入手することができる。
【００７０】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９７７年に記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の関して）では、デフォルトとしてワード長（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）１１、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴＰプログラム（アミノ酸配列に関して）では、デフォルトとしてワード長（ｗｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）３、および期待値（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁、１９８９年）を使用する。
【００７１】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、ＣＭＶプロモーターなどのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、当該プロモーターは、当該コード配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は連続しており、必要であれば、２つのタンパク質コード領域が同じ読み枠内で接合している。
【００７２】
ＯＸ４０：ＯＸ−４０受容体（「ＯＸ−４０」）（Ｐａｔｅｒｓｏｎら（１９８７年）、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：１２８１〜１２９０頁；Ｃａｌｄｅｒｈｅａｄら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：５２６１〜５２７１頁）は、Ｔ細胞の多くのサブクラスの表面上に存在するＣＤ２８受容体とは異なり（活性化されているか否かに関係なく）、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗原により活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞上にのみ存在することが示されている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら（１９９４年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２巻：４７１２〜４７２１頁；Ｗｉｅｎｂｅｒｇら（１９９６年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２巻：１８３〜１８９頁）。例えば、ＯＸ−４０は、自己免疫疾患における炎症部位では自己抗原を認識する活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するが、末梢には存在しない。ＯＸ−４０は、頭頸部の扁平上皮細胞腫瘍および黒色腫を有する患者から取り出された腫瘍浸潤性リンパ球ならびに流入領域リンパ節細胞から単離された一定の百分率のＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上に存在することも示されている（Ｖｅｔｔｏら（１９９７年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．、１７４巻：２５８〜２６５頁）。ＯＸ−４０リガンドは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであり、抗ＣＤ３抗体で活性化されたＴ細胞を共刺激する（すなわち、非抗原特異的に）ことが示されている（Ｇｏｄｆｒｅｙら（１９９４年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１８０巻：７５７〜７６２頁）。ＯＸ−４０リガンドの共刺激特性の認識にもかかわらず、その利点は以前には抗原特異的免疫応答を増強するために十分に活用されていない。
【００７３】
非経口的：腸の外側の投与、例えば、消化管を介さない投与。一般に、非経口用製剤は、経口摂取以外の任意の可能性のある様式で投与されるものである。この用語は、特に、例えば、静脈内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、関節内、または皮下のいずれに投与するかにかかわらず注射、ならびに鼻腔内、皮内、および局部適用を含めた種々の表面適用を指す。
【００７４】
医薬品または薬物：被験体に適正に投与された場合に所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学化合物または組成物。医薬品としては、これだけに限定されないが、抗感染薬、抗炎症剤、気管支拡張薬、酵素、去痰薬、ロイコトリエンアンタゴニスト、ロイコトリエン形成阻害剤、および肥満細胞安定剤が挙げられる。
【００７５】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、第１５版（１９７５年）には、本明細書に開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および核酸の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００７６】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に左右される。例えば、非経口用製剤は、通常、例えば、水、生理的食塩水、平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの、薬学的におよび生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の無毒性固体担体として、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有し得る。
【００７７】
疾患を予防すること、処置すること、または好転させること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）：疾患を「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、良性腫瘍の悪性がんへの変換を予防することを含めた、腫瘍などの疾患の発生を阻害することを指す。一部の実施形態では、予防により、例えば、がんなどの疾患の素因を有することが分かっている人において腫瘍の完全な発生を阻害する。素因が分かっている人の例は、家族に乳がんの病歴がある人、または被験体に結腸がん、乳がん、肺がんまたは皮膚がんなどの状態の素因を与える因子に曝露されている人である。予防は、例えば、体液性応答、またはサイトカイン、ＮＫ細胞、活性化ＣＴＬ、例えばＣＤ９＋Ｔ細胞などを増大させること、または骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数および／または機能を低下させることなどにより、腫瘍に対する免疫応答を増大させることを含み得る。予防は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）などの免疫抑制性免疫応答を低下させること、または（ＰＤ）−１分子を遮断することを含み得る。「処置すること」は、疾患または病的な状態の徴候または症状を、それが発生し始めた後に好転させる治療介入を指す。例えば、腫瘍を「処置すること」とは、腫瘍体積を縮小させること、腫瘍の数を減少させることまたは腫瘍の転移を阻害することを含み得る。「好転させること」とは、がんなどの疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
【００７８】
本開示の一実施形態では、転移などの腫瘍の形成を遅延させる、予防する、または低下させる。別の態様では、腫瘍の数を減少させる。したがって、疾患の徴候および症状を低下させることができる。
【００７９】
プログラム死（ＰＤ）−１：ＰＤ−１分子は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインを含有する細胞外領域、膜貫通ドメイン、および免疫受容阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域を有する（（Ｉｓｈｉｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１巻：３８８７頁、１９９２年；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２３巻：７０４頁、１９９４年；米国特許第５，６９８，５２０号）。これらの特徴により、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、およびキラー阻害性受容体（ＫＩＲ）も含む、免疫阻害性受容体と称される、分子のより大きなファミリーも定義される（ＶｉｖｉｅｒおよびＤａｅｒｏｎ（１９９７年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、１８巻：２８６頁）。理論に束縛されることなく、これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフは、Ｓ１１２ドメインを含有するホスファターゼと相互作用し、それにより、阻害性シグナルがもたらされると考えられる。これらの免疫阻害性受容体のサブセットはＫＩＲなどの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）はＢ７−１およびＢ７−２に結合する。ヒトでは、ＰＤ−１は、活性化誘導性アポトーシスを受けているＴ細胞系において最初に特定された、５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通型受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ上に発現する。ＰＤ−１のリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーのＰＤリガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１としても公知）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても公知）である。
【００８０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＰＤ−１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、および単球上に発現する。実験データから、ＰＤ−１とそのリガンドの相互作用が中心および末梢の免疫応答の下方制御と関連付けられる。具体的には、ＰＤ−Ｌ１の存在下で、野生型Ｔ細胞の増殖は阻害されるが、ＰＤ−１欠損Ｔ細胞の増殖は阻害されない。さらに、ＰＤ−１欠損マウスは、自己免疫性表現型を示す。ヒトＰＤ−１の例示的なアミノ酸配列は、Ｉｓｈｉｄａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１１巻：３８８７頁、１９９２年；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２３巻：７０４頁、１９９４年；米国特許第５，６９８，５２０号）に記載されている。
【００８１】
ＰＤ−１の会合（例えば、架橋結合または凝集によるもの）により、免疫細胞における阻害性シグナルの伝達が導かれ、その結果、免疫細胞アネルギーが増大するのと同時に免疫応答が低減する。ＰＤ−１は、２種のリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合し、これらのリガンドは、どちらもポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーであるヒトＰＤ−１リガンドポリペプチドである。
【００８２】
ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）もしくはＰＤリガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の発現もしくは活性を低減させるまたはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２の相互作用を低減させる薬剤を含む。例示的な化合物としては、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体など）、ＲＮＡｉ分子（例えば、抗ＰＤ−１  ＲＮＡｉ分子、抗ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡｉ、および抗ＰＤ−Ｌ２  ＲＮＡｉなど）、アンチセンス分子（例えば、抗ＰＤ−１アンチセンスＲＮＡ、抗ＰＤ−Ｌ１アンチセンスＲＮＡ、および抗ＰＤ−Ｌ２アンチセンスＲＮＡなど）、ドミナントネガティブタンパク質（例えば、ドミナントネガティブＰＤ−１タンパク質、ドミナントネガティブＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびドミナントネガティブＰＤ−Ｌ２タンパク質など）が挙げられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２００８／０８３１７４号を参照されたい。
【００８３】
プロモーター：プロモーターは、核酸の転写を導く一連の核酸制御配列である。プロモーターは、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合（ＴＡＴＡエレメント）など、転写の開始部位の近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、場合により、転写の開始部位から数千塩基対ものところに位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターのどちらも含まれる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３巻：５１６〜５４４頁、１９８７年を参照されたい）。
【００８４】
プロモーターの特定の非限定例としては、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、レトロウイルスの長い末端反復；アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が挙げられる。組換えＤＮＡまたは合成技法によって作製されるプロモーターも使用することができる。宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含有する発現ベクターにポリヌクレオチドを挿入することができる。発現ベクターは、一般には、複製起点、プロモーター、ならびに形質転換された細胞の表現型による選択を可能にする特定の核酸配列を含有する。
【００８５】
肝細胞癌（ＨＣＣ）：世界的に３番目に多いがん関連死亡の原因であり、また、米国男性のがん関連死亡の最も増えている原因である、肝臓の悪性腫瘍。肝炎ウイルス、アルコール性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪肝疾患および自己免疫性肝炎は全てＨＣＣ発がんに関連付けられている。ＨＣＣの発生に関する主要な危険因子は、硬変症（その病因とは独立して、硬変患者における年間のＨＣＣ発生数は２〜６％である）およびＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスへの慢性感染である。
【００８６】
ＨＣＣは、一般に、疾患の後期に診断されるので、治癒の可能性がある外科手術（切除および肝移植）に適格な患者は２０％未満である。局所的な限局的療法は、主に待機的なものであり、それらとして、冷凍アブレーション（ｃｒｙｏａｂｌａｔｉｏｎ）、高周波アブレーション（ｒａｄｉｏｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｂｌａｔｉｏｎ）、および経動脈塞栓術が挙げられる。進行したＨＣＣの患者に対する標準治療は、生存を２．３〜２．８カ月改善するソラフェニブ（多標的化キナーゼ阻害剤）である。
【００８７】
前立腺がん：前立腺の、一般に腺起源の悪性腫瘍。前立腺がんは、腺癌および小細胞細胞癌を含む。多くの前立腺がん、特異的に腺癌は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を発現する。前立腺がんのリスクを上昇させる因子としては、高齢、疾患の家族歴、および人種が挙げられる。症例の約９９％が５０歳を超える人で生じる。第一度近親者が当該疾患を有する場合には、リスクが２〜３倍上昇する。症状としては、頻尿、夜間頻尿、尿の一定の流れを開始させ、維持することの困難、血尿、および排尿障害が挙げられる。
【００８８】
皮膚がん：皮膚がんは、多くの原因がある皮膚上の悪性増殖である。皮膚がんは、一般に、表皮（皮膚の最外側層）上に発生し、したがって、腫瘍は通常明白に目に見える。これにより、大多数の非黒色腫皮膚がんは初期に検出可能になる。皮膚がんは、最も一般的に診断される悪性疾患であり、肺がん、乳がん、結腸直腸がんおよび前立腺がんをしのぐ。
【００８９】
皮膚がんの最も一般的な型は、非黒色腫皮膚がんである。非黒色腫皮膚がんは、悪性黒色腫（皮膚の色素産生細胞であるメラニン細胞から発生するがん）以外の全ての皮膚がんを包含する。非黒色腫皮膚がんには多くの型が存在する。非黒色腫皮膚がんの２つの一般的な型は、基底細胞癌および扁平上皮癌である。これらの２つの型の皮膚がんは、ケラチノサイト癌としても公知である。
【００９０】
基底細胞癌は、基底細胞層と称される表皮の最下層において始まる。男性では全皮膚がんの約７０％〜８０％、女性では８０％〜９０％が基底細胞癌である。基底細胞癌は、通常、日光露光部、特に頭頸部において発生する。基底細胞癌は成長が遅い。基底細胞がんに関しては、リンパ節または体の遠位部位への拡散は極めてまれである。しかし、基底細胞がんを未処置のまま放置すると、近くの領域まで成長し、骨または皮膚の下の他の組織に浸潤する可能性がある。基底細胞癌は、処置後に皮膚の同じ場所に再発する可能性がある。また、新しい基底細胞がんが皮膚の他の箇所で始まる可能性がある。基底細胞がんと診断されてから５年以内に、３５％〜５０％の人で新しい皮膚がんが発生する。
【００９１】
扁平上皮癌は、全皮膚がんの約１０％〜３０％を占める。扁平上皮癌は、一般に、顔、耳、頸部、唇、および手の甲などの、体の日光露光部に出現する。扁平上皮癌はまた、瘢痕または皮膚潰瘍の箇所にも発生する可能性がある。これらの癌腫は、一般に、基底細胞がんよりも侵攻性である。扁平上皮癌は、時には、日光角化症から始まる。上皮内扁平上皮癌（ボーエン病とも称される）は、皮膚の扁平上皮細胞がんの最初期の形態であり、表皮内の細胞が関与し、真皮には浸潤しない。
【００９２】
非黒色腫皮膚がんのあまり一般的ではない型としては、カポジ肉腫、皮膚リンパ腫、皮膚付属器腫瘍および種々の型の肉腫およびメルケル細胞癌が挙げられる。まとめると、これらの型の非黒色腫皮膚がんは、非黒色腫皮膚がんの１％未満を占める。
【００９３】
皮膚がんの最も致死的な型は黒色腫である。黒色腫（悪性黒色腫または皮膚黒色腫としても公知）は、メラニン細胞において始まるがんである。大多数のメラノーマ細胞がなおメラニンを産生するので、黒色腫腫瘍は通常、褐色または黒色である。この形態の皮膚がんは、初期に処置しなければ致死的であり得る。
【００９４】
リスクがある被験体：腫瘍などのある特定の状態が発生しやすいヒトまたは獣医学的被験体などの個体。これは、年齢、遺伝子型に起因する場合もあり、環境曝露に起因する場合もある。例は、職業性曝露（すなわち、アスベスト、シリカ、電離放射線、芳香族アミン、重金属、殺虫剤、石油化学製品および燃焼副生成物）に起因して発がん物質に曝露しているヒト被験体、または、個人的喫煙によるものか副流煙への曝露に起因するものかいずれかのタバコの煙に曝露しているヒト被験体、または、例えば日焼けに起因して紫外線に曝露している被験体、または腫瘍が発生する遺伝的素因がある被験体である。
【００９５】
Ｔｈ１免疫応答：抗原特異的エフェクターＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞は、それらの一連のサイトカインに基づいて、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｒｅｇ細胞、およびＴｈ１７細胞にカテゴリー化することができる。Ｔｈ１細胞は、Ｔｈ１型サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＬＴαを分泌し、細胞内病原体、ウイルスおよびがんに対する免疫防御に寄与する獲得Ｔヘルパー−１（Ｔｈ１）免疫応答を媒介する。エフェクターＣＤ４＋Ｔｈ１細胞は、主要組織適合クラスＩＩ複合体（ＭＨＣ  ＩＩ）との関連で提示されるウイルス抗原またはがん抗原およびＤＣなどの抗原提示細胞から分泌されるＩＬ−１２、およびＮＫ細胞から分泌されるＩＦＮγによるＴｈ前駆（Ｔｈ０）細胞の刺激によって生成される。Ｔｈ１エフェクター細胞は、Ｔｈ２免疫応答を抑制し、ウイルスに感染した細胞およびがん細胞の死滅および排除において決定的な役割を有するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および遅延型過敏症（ＤＴＨ）およびＩｇＧ２ａの生成を補助する。
【００９６】
Ｔｈ２細胞：抗原特異的エフェクターＴｈ２細胞は、Ｂ細胞の増殖および分化を促進し、体液性免疫応答の特性である抗体の分泌を導くＴｈ２型サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−６を分泌する。Ｔｈ２免疫応答はアレルギー反応に寄与する。
【００９７】
Ｔｈ１７免疫応答：Ｔヘルパー１７（Ｔｈ１７）免疫応答には、上皮／粘膜バリアにおける抗微生物免疫の発生に役立つ生理的役割がある。Ｔｈ１７免疫応答はまた、多発性硬化症、若年性糖尿病、関節リウマチおよびクローン病などの自己免疫疾患における炎症および組織傷害にも関与する。さらに、Ｔｈ１７免疫応答は、アレルゲンに誘導される気道応答において役割を果たし得る。ＴＧＦｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３は、Ｔｈ０細胞からのＴｈ１７エフェクター細胞の生成を刺激する。Ｔｈ１７エフェクター細胞は、Ｔｈ１７免疫応答を媒介するＩＬ−１７、ＩＬ−２１およびＩＬ−２２を分泌する。
【００９８】
治療剤：一般的な意味で使用され、処置剤、予防剤、および補充剤を含む。治療剤は、外科手術、放射線および化学療法であり得る。抗体、化学化合物、細胞およびサイトカインが治療剤であり得る。
【００９９】
治療有効量：処置される被験体において所望の効果を達成するために十分な指定の化合物またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）の数量。例えば、治療有効量は、免疫抑制を低減させ、腫瘍に対する免疫応答を増大させる、腫瘍を予防する、腫瘍の発生を遅らせるおよび／または腫瘍が発生するリスクを低減させるために必要なＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）の量であり得る。一実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）の治療有効量は、単独で、または１つもしくは複数の追加的な治療剤（抗新生物剤もしくは免疫抑制剤など）と共に、予防、発生の遅延、または腫瘍数の減少などの所望の応答を誘導する量である。本明細書に開示されている調製物は、治療有効量で投与される。
【０１００】
一例では、所望の応答は、腫瘍の発生を予防することである。別の例では、所望の応答は、腫瘍の発生、進行、または転移を、例えば、少なくとも約３カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約５年、または少なくとも約１０年、遅延させることである。別の例では、所望の応答は、前立腺、結腸がん、乳がんまたは肺がんなどのがんの出現を減少させることである。例えば、一部の例では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）を含む組成物により、腫瘍（例えば、結腸直腸腫瘍など）のサイズ、体積、または数を、治療用組成物の不在下での応答と比較して、所望の量、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、またはさらには少なくとも９０％、低下させることができる。
【０１０１】
ヒトまたは獣医学的被験体に投与されるＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）の有効量は、その被験体に関連するいくつもの因子、例えば、被験体の全体的な健康に応じて変動する。薬剤の有効量は、製品の投与量を変動させ、腫瘍の数などの得られる治療応答を測定することによって決定することができる。有効量は、種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕにおけるイムノアッセイによって決定することもできる。開示される薬剤は、所望の応答を得るために必要に応じて単回用量または数回の用量で投与することができる。しかし、有効量は、適用される供給源、処置される被験体、処置される状態の重症度および型、ならびに投与の様式に依存する。
【０１０２】
治療有効量のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）は、全身的にまたは局所的に投与することができる。さらに、有効量のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）は、単回用量で、または数回の用量で、例えば、処置の経過中、毎日、週に２回および週に１回、投与することができる。しかし、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質（または当該タンパク質をコードする核酸）の有効量は、適用される調製物、処置される被験体、苦痛の重症度および型、ならびに化合物の投与の様式に依存する。
【０１０３】
Ｔｏｌｌ様受容体リガンド：Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（ＴＬＲ−Ｌ）は、微生物に由来する（病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ））または損傷を受けた細胞に由来する（損傷関連分子パターン（ＰＡＭＰ））、構造的に保存された分子であり、樹状細胞をそれらのＴＬＲを介して強力に活性化する能力を有する。したがって、活性化されたＤＣは、成熟化し、免疫調節性サイトカインの分泌を増強し、抗原の提示を増大させ、また、自然免疫応答および獲得免疫応答を促進する。この性質に起因して、ＴＬＲ−Ｌは、ワクチンにより誘導される免疫応答の質をモジュレートし、大きさおよび全体的な効果を増強するために、ワクチンと共に免疫アジュバントとして使用される。ＴＬＲ３−Ｌポリ（Ｉ：Ｃ）（ポリイノシン・ポリシチジル酸、二本鎖ＲＮＡの合成類似体）およびＴＬＲ９−Ｌ非メチル化ＣｐＧ（合成オリゴヌクレオチド）を含めたＴＬＲ−Ｌのいくつかが、抗がんワクチンと共に免疫アジュバントとして使用される。
【０１０４】
処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）：被験体にすでに存在する疾患または疾患（例えば、腫瘍など）に関連する病的な状態の徴候もしくは症状を好転させる治療介入を指す。処置はまた、そのような状態の寛解または治癒を誘導することができる。特定の例では、処置は、例えば、転移の発生もしくは原発腫瘍の発生を予防することなど、腫瘍の完全な発生を阻害することによって、腫瘍体積を縮小させることによって、または腫瘍の総数を低減させることによって腫瘍を阻害することを含む。阻害は、腫瘍が完全に存在しないことを必要としなくてよい。他の例では、処置は、皮膚がんを阻害すること、そのリスクを低減させること、またはその発生を遅延させることを含む。疾患（例えば、腫瘍、例えば、皮膚がん、肺がん、結腸がん、または乳がんなど）に関連する徴候または症状の低減または抑制は、例えば、影響を受けやすい被験体（例えば、まだ転移していない腫瘍を有する被験体など）における疾患の臨床症状の発症の遅延によって、疾患の臨床症状の一部もしくは全部の重症度の低下によって、より遅い疾患の進行によって（例えば、疾患を有する被験体の寿命の延長によって）、疾患の再発の数の減少によって、被験体の全体的な健康もしくは幸福（ｗｅｌｌ  ｂｅｉｎｇ）の改善によって、または特定の疾患に特異的な当技術分野で周知の他のパラメータによって証明することができる。
【０１０５】
Ｔｒｅｇ：調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）またはサプレッサーＴ細胞は、免疫系をモジュレートし、自己抗原に対する寛容性を維持し、過剰な免疫反応および自己免疫疾患を予防するＴ細胞の部分集団である。Ｔｒｅｇは、一般に、エフェクターＴｈ１細胞およびＴｈ２細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＦｏｘｐ３を発現する特徴的な表現型（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇＦｏｘｐ３＋）を有し、免疫抑制性サイトカインＴＧＦβおよびＩＬ−１０を分泌する。Ｔｒｅｇは、がんを有する被験体において増大し、がんが抗がん免疫機構を免れるのを補助する免疫抑制に寄与する。
【０１０６】
腫瘍：良性または悪性であり得る、細胞の異常な成長。がんは、悪性腫瘍であり、異常なまたは制御されていない細胞増殖を特徴とする。多くの場合に悪性疾患に関連する他の特徴としては、転移、近隣細胞の正常な機能への干渉、サイトカインまたは他の分泌産物の異常なレベルでの放出、および、炎症応答または免疫学的応答の抑制または増悪、リンパ節などの周囲または遠位組織もしくは器官への浸潤などが挙げられる。「転移性疾患」とは、元の腫瘍部位を離れ、例えば血流またはリンパ液系を介して体の他の部分に移動するがん細胞を指す。
【０１０７】
個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は「良性」と称される。周囲の組織に浸潤し、かつ／または転移する可能性がある腫瘍は「悪性」と称される。血液腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性白血病、前骨芽球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病など）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性で高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常症が挙げられる。
【０１０８】
肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性疾患、膵がん、乳がん（基底乳癌、腺管癌および小葉乳癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、唾液腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｒｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）が挙げられる。
【０１０９】
「確立された」または「既存の」腫瘍とは、診断検査によって見分けることができる既存の腫瘍である。一部の実施形態では、確立された腫瘍は、触診することができる。一部の実施形態では、「確立された腫瘍」は、少なくとも５００ｍｍ３、例えば、少なくとも６００ｍｍ３、少なくとも７００ｍｍ３、または少なくとも８００ｍｍ３などのサイズである。他の実施形態では、腫瘍は、少なくとも１ｃｍの長さである。固形腫瘍に関しては、確立された腫瘍は、一般に、堅固な血液供給を有し、誘導されたＴｒｅｇおよび骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。
【０１１０】
いくつかの例では、腫瘍は、乳がん、前立腺がん、結腸がん、肝がんまたは肺がんである。別の例では、腫瘍は、皮膚腫瘍である。
【０１１１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α：別個の膜ＴＮＦ−α受容体を通じて効果を発揮するサイトカイン。野生型ＴＮＦは、主に、安定なホモ三量体に配列された２１２アミノ酸のＩＩ型膜貫通タンパク質として産生される。可溶性ホモ三量体サイトカイン（ｓＴＮＦ）は、膜貫通形態からメタロプロテアーゼＴＮＦアルファ変換酵素（ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭ１７とも称される）によるタンパク質分解的切断によって放出される。分泌型および膜結合型の形態どちらも生物学的に活性であるが、異なる活性を有すると考えられている。ＴＮＦ、および構造的に関連するサイトカインであるリンホトキシン（ＬＴ）の結晶学的試験により、どちらのサイトカインもホモ三量体として存在し、サブユニットが３回対称で端から端にパッキングされていることが示されている。
【０１１２】
ＴＮＦは、２つの受容体、腫瘍壊死因子受容体１型（ＴＮＦＲ１、ＣＤ１２０ａおよびｐ５５／６０とも称される）ならびに腫瘍壊死因子受容体２型（ＴＮＦＲ２、ＣＤ１２０ｂ；ｐ７５／８０とも称される）に結合し得る。ＴＮＦＲ１は５５−ｋＤａのタンパク質であり、ＴＮＦＲ２は、７５−ｋＤａのタンパク質である。ＴＮＦＲ１は、大多数の組織において発現し、膜結合型のＴＮＦおよび可溶性三量体型のＴＮＦどちらによっても十分に活性化され、一方、ＴＮＦＲ２は、大部分が免疫系の細胞において見いだされ、膜結合型のＴＮＦホモ三量体に応答する。ＴＮＦは、活性化されたマクロファージによって主に産生される。ＴＮＦ−αのその受容体への結合により、二次リンパ器官の構造的および機能的組織化、アポトーシスおよび抗腫瘍活性、ウイルス複製の阻害、免疫調節ならびに炎症を含めた、いくつもの多様な重要機能が媒介される。ＴＮＦはまた、自己免疫疾患の病理発生、急性期反応、敗血症性ショック、発熱および悪液質においても重要な役割を果たす。これらの多様な機能は、２つのＴＮＦの形態と２つの膜貫通型受容体の間の同族相互作用を介して誘導される。
【０１１３】
ベクター：宿主細胞に導入されると、それにより、形質転換された宿主細胞を生じさせる核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターは、グラム陰性菌細胞およびグラム陽性菌細胞における発現のためのプラスミドを含めた、プラスミドベクターを含む。例示的なベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおける発現のためのベクターが挙げられる。ベクターとしては、これだけに限定されないが、レトロウイルス、オルソポックス、トリポックス（ａｖｉｐｏｘ）、鶏痘、カプリポックス、スイポックス（ｓｕｉｐｏｘ）などのポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターも挙げられる。ベクターとしては、酵母細胞における発現のためのベクターも挙げられる。
【０１１４】
特に説明がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明らかでない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、「または（ｏｒ）」という単語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、「および（ａｎｄ）」を含むものとする。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示されている全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子量または分子質量値はおおよそのものであり、説明のために提示されていることも理解される。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含め、本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
【０１１５】
ドミナントネガティブ腫瘍壊死因子タンパク質および核酸
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型ＴＮＦ−αと比較してモジュレートされた活性を有する。一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、これだけに限定されないが、野生型ＴＮＦ−αと比較した、受容体（ｐ５５、ｐ７５または両方）への結合の減少、活性化の低下および／または最終的に細胞傷害活性の喪失を含め、野生型ＴＮＦ−αと比較して生物活性（例えば、拮抗作用）がない程に低下している。「細胞傷害活性」とは、ＤＮ−ＴＮＦ−αポリペプチドの、細胞を選択的に死滅させるまたは阻害する能力を指す。ＤＮ−ＴＮＦは、野生型ＴＮＦ−αの生物活性の５０％未満、野生型ＴＮＦ−αの生物活性の２５％未満、１５％未満、または１０％未満を示す。ＴＮＦ−α活性についての適切なアッセイとしては、これだけに限定されないが、カスパーゼアッセイ、ＴＮＦ−α細胞傷害性アッセイ、ＤＮＡ結合アッセイ；転写アッセイ；サイズ排除クロマトグラフィーアッセイおよび放射性標識／免疫沈降；ならびに安定性アッセイ（当技術分野で公知の円偏光二色性（ＣＤ）アッセイおよび平衡試験の使用を含む）が挙げられる。追加的な実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質の結合親和性に関する重大な少なくとも１つの性質が、野生型ＴＮＦ−αの同じ性質と比較して変化しており、具体的には、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は受容体親和性が変化している。したがって、本明細書に開示されている方法において使用されるＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、結合親和性が変化しており、その結果、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質が可溶性野生型ＴＮＦ−αとは優先的にオリゴマー形成するが、野生型膜貫通ＴＮＦ−αとは実質的にオリゴマー形成しないまたは野生型ＴＮＦ−α受容体、すなわち、ｐ５５、ｐ７５とは相互作用しない。「野生型膜貫通ＴＮＦとは実質的にオリゴマー形成しない」とは、ＤＮ−ＴＮＦが膜貫通ＴＮＦを阻害することができないことを意味する。「ＴＮＦ受容体とは実質的に相互作用しない」とは、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質が、ｐ５５受容体またはｐ７５受容体のいずれに対しても、会合して、当該受容体を有意に活性化し、ＴＮＦシグナル伝達経路（複数可）開始させることができないことを意味する。一部の実施形態では、野生型ＴＮＦ−αの三量体と比較して、少なくとも５０％、５０％超、７６％超、８０％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、または９５％超の、受容体活性化の低下が見られる。ドミナントネガティブ腫瘍壊死因子α（ＤＮ−ＴＮＦ−α）タンパク質は、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０４００７６号；米国特許第７，４４６，１７４号；および米国特許第７，６６２，３６７号において開示されている。
【０１１６】
追加的な実施形態では、ＤＮ  ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型ＴＮＦ−αとのオリゴマー形成に関する親和性が変化している。したがって、一部の実施形態では、等量のドミナントネガティブバリアントＴＮＦ−α単量体および野生型ＴＮＦ−α単量体を考えると、得られる三量体の少なくとも２５％はバリアントＴＮＦ−αと野生型ＴＮＦ−αの混合型三量体であり、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％がバリアントＴＮＦ−αと野生型ＴＮＦ−αの混合物である。一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型ＴＮＦ−αタンパク質に対する親和性が、野生型ＴＮＦ−αタンパク質の親和性と比較して変化している。ヒトＴＮＦ−αの例示的なアミノ酸配列を以下に記載する：
【０１１７】
ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＥＧＡＥＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤＲＬＳＡＥＩＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶＹＦＧＩＩＡＬ（配列番号１、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６２，３６７号、および図１１も参照されたい）
【０１１８】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型ＴＮＦ−α配列と少なくとも１アミノ酸、例えば、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸および１０アミノ酸またはそれより多く異なるアミノ酸配列を有する。百分率として表すと、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型と９０％超同一、例えば、野生型ＴＮＦ−αと９５％超、９６％超、９７％超、９８％超および９９％超同一である。アミノ酸配列同一性値の百分率は、マッチする同一の残基の数を、アラインメントされた領域内の「より長い」配列の残基の総数で割ることによって決定することができる。「より長い」配列とは、アラインメントされた領域内で最多数の実際の残基を有するものである（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップは無視する）。同様に、「パーセント核酸配列同一性」とは、タンパク質をコードする核酸に関しては、ＴＮＦ−αのコード配列内のヌクレオチド残基と同一である、候補配列内のヌクレオチド残基の百分率であり得る。ある方法では、デフォルトパラメータに設定したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを、それぞれ１および０．１２５に設定したオーバーラップスパン（ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ）およびオーバーラップフラクション（ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）と共に利用する。百分率として表すと、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、野生型と９０％超同一、例えば、野生型ＴＮＦ−αをコードする野生型核酸配列と９５％超、９６％超、９７％超、９８％超および９９％超同一であり得る。
【０１１９】
一部の実施形態では、配列番号１のヒトＴＮＦ−α配列に基づいて、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、ヒト野生型ＴＮＦ−α配列とは異なるアミノ酸を少なくとも約１つ有する、例えば、異なるアミノ酸を少なくとも約２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ有する。一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、配列番号１または配列番号２とは異なるアミノ酸を３〜８つ有する。１つのＤＮ−ＴＮＦ−αと野生型ＴＮＦ−αの例示的なアラインメントが図１１に示されている。
【０１２０】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、治療または薬物動態上の目的で、例えば、他の治療用タンパク質またはＦｃもしくは血清アルブミンなどの他のタンパク質と融合することができる。この実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、別の部分に作動可能に連結している。一部の実施形態では、部分は、意図された治療または薬物動態的効果をもたらすものである。部分の例としては、これだけに限定されないが、ヒト血清アルブミン、治療剤、細胞傷害性または細胞傷害性分子、放射性ヌクレオチド、およびＦｃなどが挙げられる。本明細書で使用される場合、Ｆｃ融合物は、先行技術で使用される「イムノアドヘシン」、「Ｉｇ融合物」、「Ｉｇキメラ」、および「受容体グロブリン」という用語と同義である（Ｃｈａｍｏｗら、１９９６年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４巻：５２〜６０頁；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：１９５〜２００頁、どちらも参照により組み込まれる）。Ｆｃ融合物は、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域とＴＮＦ−αタンパク質の標的結合性領域が組み合わさったものである。例えば、どちらも参照により組み込まれる米国特許第５，７６６，８８３号および米国特許第５，８７６，９６９号を参照されたい。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、ペグ化することができる。
【０１２１】
一実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αは、以下の位置：アミノ酸２１、２３、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５７、６５、６６、６７、６９、７５、８４、８６、８７、９１、９７、１０１、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６、および１４７のうちの１つまたは複数にアミノ酸置換を含む。参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０４００７６号からの、ヒトＴＮＦ−α残基を含めた各位置についての例示的なアミノ酸置換を下記の表に示す。
【表１】
2019504008.tif 000002
【０１２２】
ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０４００７６号に開示されている通り、例えば、１４３位において、アミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、およびＬｙｓを利用することができる。このＰＣＴ公開には、アミノ酸置換が、Ｖ１Ｍ、Ｑ２１Ｃ、Ｑ２１Ｒ、Ｅ２３Ｃ、Ｒ３１Ｃ、Ｎ３４Ｅ、Ｖ９１Ｅ、Ｑ２１Ｒ、Ｎ３０Ｄ、Ｒ３１Ｃ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｒ３２Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｒ３２Ｓ、Ａ３３Ｅ、Ｎ３４Ｅ、Ｎ３４Ｖ、Ａ３５Ｓ、Ｄ４５Ｃ、Ｌ５７Ｆ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｋ６５Ｄ、Ｋ６５Ｅ、Ｋ６５Ｉ、Ｋ６５Ｍ、Ｋ６５Ｎ、Ｋ６５Ｑ、Ｋ６５Ｔ、Ｋ６５Ｓ、Ｋ６５Ｖ、Ｋ６５Ｗ、Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｑ、Ｑ６７Ｄ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｒ、Ｑ６７Ｓ、Ｑ６７Ｗ、Ｑ６７Ｙ、Ｃ６９Ｖ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｋ、Ｌ７５Ｑ、Ａ８４Ｖ、Ｓ８６Ｑ、Ｓ８６Ｒ、Ｙ８７Ｈ、Ｙ８７Ｒ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ｃ１０１Ａ、Ａ１１１Ｒ、Ａ１１１Ｅ、Ｋ１１２Ｄ、Ｋ１１２Ｅ、Ｙ１１５Ｄ、Ｙ１１５Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｙ１１５Ｈ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｌ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｎ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｒ、Ｙ１１５Ｓ、Ｙ１１５Ｔ、Ｙ１１５Ｗ、Ｄ１４０Ｋ、Ｄ１４０Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｌ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｓ、Ｆ１４４Ｎ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｙ、Ｅ１４６Ｋ、Ｅ１４６Ｌ、Ｅ１４６Ｍ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｒ、Ｅ１４６ＳおよびＳ１４７Ｒを含むことが開示されている。これらのアミノ酸置換は、個々に含まれていてもよく、任意の組合せで含まれてもいてもよい。一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質には少なくとも１〜８カ所のアミノ酸置換が含まれる。ＤＮ−ＴＮＦ−αは、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所、１１カ所、１２カ所、１３カ所、１４カ所、１５カ所、１６カ所、１７カ所、１８カ所、１９カ所または２０カ所のアミノ酸置換を含み得る。
【０１２３】
一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６２，３６７号の実施例３に概説されている通り、ＸＥＮＰ２６８  ＸＥＮＰ３４４、ＸＥＮＰ３４５、ＸＥＮＰ３４６、ＸＥＮＰ５５０、ＸＥＮＰ５５１、ＸＥＮＰ５５７、ＸＥＮＰ１５９３、ＸＥＮＰ１５９４、およびＸＥＮＰ１５９５であり得る。一実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αは、ＸＰＲＯ（商標）ｌ５９５であり、これは、野生型ヒト配列と比較してＶ１Ｍ、Ｒ３１Ｃ、Ｃ６９Ｖ、Ｙ８７Ｈ、Ｃ１０１Ａ、およびＡ１４５Ｒ（例えば、「＜００１＜−Ｖ００１Ｍ−Ｒ０３１Ｃ−μ０３１Ｐｅｇ１０−Ｃ０６９Ｖ−Ｙ０８７Ｈ−Ｃ１０１Ａ−Ａ０１４５Ｒ−＞１５７＞」）変異を含むペグ化されたタンパク質である。ＸＰＲＯ（商標）１５９５のアミノ酸配列は配列番号２に示されている。ＸＰＲＯ（商標）１５９５（配列番号２）をコードする核酸配列（配列番号３）を以下に示す：
【化１】
2019504008.tif 000003
【０１２４】
この配列は、ネイティブな可溶性ＴＮＦとは異なる、以下の特徴を有する：（１）Ｅ．ｃｏｌｉにおける均一な翻訳産物を容易にするための、Ｎ末端バリンのメチオニンでの置き換え；（２）ＴＮＦ受容体結合を予防するための、チロシン−８７のヒスチジンでの置き換えおよびアラニン−１４５のアルギニンでの置き換え；（３）特異的なペグ化部位として機能させるための、アルギニン−３１のシステインでの置き換え；および（４）混合ジスルフィド形成を回避し、不均一なペグ化部位を排除するための、システイン−６９のバリンでの置き換えおよびシステイン−１０１のアラニンでの置き換え。ＸＥＮＰ５５０の３つの単量体サブユニットはそれぞれ１７，３４０Ｄａの理論分子量、および、およそ６．９のｐＩを有する。ＸＰＲＯ（商標）１５９５は、ＸＥＮＰ５５０と、単量体サブユニット当たりおよそ１０ｋＤａのｍＰＥＧ−マレイミドの単一の直鎖との共有結合性コンジュゲーションによって作製される。安定なチオエーテル結合したコンジュゲートサブユニットは、およその分子量が２７ｋＤａである（活性なＸＰＲＯ（商標）１５９５の３つのサブユニットで８１ｋＤａ）。この分子は、ペグ化することができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型ＴＮＦ−αと相互作用して、受容体シグナル伝達を活性化することができない混合型三量体を形成する。一部の例では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、野生型ＴＮＦ−αタンパク質と比較して、１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所または８カ所のアミノ酸置換を有する。一部の実施形態では、これらのアミノ酸置換は、１位、２１位、２３位、３０位、３１位、３２位、３３位、３４位、３５位、５７位、６５位、６６位、６７位、６９位、７５位、８４位、８６位、８７位、９１位、９７位、１０１位、１１１位、１１２位、１１５位、１４０位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位および１４７位から選択される。追加的な実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｖ１Ｍ、Ｑ２１Ｃ、Ｑ２１Ｒ、Ｅ２３Ｃ、Ｎ３４Ｅ、Ｖ９１Ｅ、Ｑ２１Ｒ、Ｎ３０Ｄ、Ｒ３１Ｃ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｒ３２Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｒ３２Ｓ、Ａ３３Ｅ、Ｎ３４Ｅ、Ｎ３４Ｖ、Ａ３５Ｓ、Ｄ４５Ｃ、Ｌ５７Ｆ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｋ６５Ｄ、Ｋ６５Ｅ、Ｋ６５Ｉ、Ｋ６５Ｍ、Ｋ６５Ｎ、Ｋ６５Ｑ、Ｋ６５Ｔ、Ｋ６５Ｓ、Ｋ６５Ｖ、Ｋ６５Ｗ、Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｑ、Ｑ６７Ｄ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｒ、Ｑ６７Ｓ、Ｑ６７Ｗ、Ｑ６７Ｙ、Ｃ６９Ｖ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｋ、Ｌ７５Ｑ、Ａ８４Ｖ、Ｓ８６Ｑ、Ｓ８６Ｒ、Ｙ８７Ｈ、Ｙ８７Ｒ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ｃ１０１Ａ、Ａ１１１Ｒ、Ａ１１１Ｅ、Ｋ１１２Ｄ、Ｋ１１２Ｅ、Ｙ１１５Ｄ、Ｙ１１５Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｙ１１５Ｈ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｌ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｎ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｒ、Ｙ１１５Ｓ、Ｙ１１５Ｔ、Ｙ１１５Ｗ、Ｄ１４０Ｋ、Ｄ１４０Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｌ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｓ、Ｆ１４４Ｎ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｙ、Ｅ１４６Ｋ、Ｅ１４６Ｌ、Ｅ１４６Ｍ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｒ、Ｅ１４６ＳおよびＳ１４７Ｒのうちの１つまたは複数を有する。したがって、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、これらのアミノ酸置換のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つを有し得る。
【０１２６】
これらの置換は、個別に行うこともでき、組み合わせて行うこともでき、任意の組合せが可能である。一部の実施形態では、３１位、５７位、６９位、７５位、８６位、８７位、９７位、１０１位、１１５位、１４３位、１４５位、および１４６位における１つまたは複数の置換を利用して２重バリアントを形成することができる。さらに、３重、４重、５重などの点変異を生成することができる。したがって、一部の実施形態では、アミノ酸置換Ａ１４５Ｒ  Ｉ９７Ｔを含むＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質を本明細書に開示されている方法において利用する。他の実施形態では、アミノ酸置換Ｖ１Ｍ、Ｒ３１Ｃ、Ｃ６９Ｖ、Ｙ８７Ｈ、Ｃ１０１Ａ、およびＡ１４５Ｒを含むＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質を利用する。開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、ペグ化することができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、野生型ＴＮＦ−αタンパク質を改変し、改変領域は、大ドメイン（ＩＩとしても公知）、小ドメイン（Ｉとしても公知）、ＤＥループ、および三量体界面からなる群より選択される。大ドメイン、小ドメインおよびＤＥループは、受容体相互作用ドメインである。ＤＮ−ＴＮＦ−αは、これらの領域のうちの１つのみ、またはこれらの領域の任意の組合せにおいてアミノ酸置換を含み得る。大ドメインは、２１位、３０位、３１位、３２位、３３位、３５位、６５位、６６位、６７位、１１１位、１１２位、１１５位、１４０位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位および／または１４７位にアミノ酸置換を含み得る。小ドメインに関しては、ＤＮ−ＴＮＦ−αは、７５位および／または９７位にアミノ酸置換を含み得る。ＤＥループに関しては、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、８４位、８６位、８７位および／または９１位にアミノ酸置換を含み得る。三量体界面は、例えば３４位および９１位ならびに５７位に２重バリアントを含み得る。一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αにおいて複数の受容体相互作用および／または三量体形成ドメインにおける置換を組み合わせることができる。
【０１２８】
例としては、これだけに限定されないが、大ドメインおよび小ドメインのアミノ酸の同時置換（例えば、Ａ１４５ＲおよびＩ９７Ｔ）、大ドメインおよびＤＥループのアミノ酸の同時置換（例えば、Ａ１４５ＲおよびＹ８７Ｈ）ならびに大ドメインおよび三量体形成ドメインのアミノ酸の同時置換（例えば、Ａ１４５ＲおよびＬ５７Ｆ）が挙げられる。さらなる例としては、任意のかつ全ての組合せ、例えば、Ｉ９７ＴおよびＹ８７Ｈ（小ドメインおよびＤＥループ）が挙げられる。具体的な実施形態では、これらのアミノ酸の変化は、単一の点バリアントの形態、例えば、Ｋ１１２Ｄ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｔ、Ａ１４５ＥまたはＡ１４５Ｒであってよい。これらの単一の点バリアントは、例えば、Ｙ１１５ＩおよびＡ１４５Ｅ、またはＹ１１５ＩおよびＡ１４５Ｒ、またはＹ１１５ＴおよびＡ１４５ＲまたはＹ１１５１およびＡ１４５Ｅ；または任意の他の組合せなど、組み合わせることができる。
【０１２９】
ＤＮ−ＴＮＦ−αは、５７位、７５位、８６位、８７位、９７位、１１５位、１４３位、１４５位、および１４６位の任意の組合せにおいて２重点置換を含んでよい。さらに、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、Ｌ５７ＦおよびＹ１１５１、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｔ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｒ、Ｅ１４６ＫまたはＥ１４６Ｒのうちの１つなどの２重点変異を含んでよい。他の２重バリアントは、Ｙ１１５ＱおよびＤ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｒ、またはＥ１４６Ｋの少なくとも１つ；Ｙ１１５ＭおよびＤ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＲまたはＥ１４６Ｋの少なくとも１つ；ならびにＬ５７ＦおよびＡ１４５Ｅまたは１４６Ｒの少なくとも１つ；Ｋ６５ＤおよびＤ１４３ＫまたはＤ１４３Ｒのいずれか、Ｋ６５ＥおよびＤ１４３ＫまたはＤ１４３Ｒのいずれか、Ｙ１１５ＱおよびＬ７５Ｑ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｌ５７Ｆ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ｓ８６Ｑ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ１４６Ｋ、Ａ１４５ＲおよびＩ９７Ｔのいずれか、Ａ１４５ＲおよびＹ８７ＲまたはＹ８７Ｈのいずれか；Ｎ３４ＥおよびＶ９１Ｅ；Ｌ７５ＥおよびＹ１１５Ｑ；Ｌ７５ＱおよびＹ１１５Ｑ；Ｌ７５ＥおよびＡ１４５Ｒ；およびＬ７５ＱおよびＡ１４５Ｒである。
【０１３０】
さらに、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、３重点置換を含んでよい。一部の実施形態では、置換は、例えば、３４位、７５位、８７位、９１位、１１５位、１４３位、１４５位および１４６位が含まれるように行う。３重点バリアントの例としては、Ｖ９１Ｅ、Ｎ３４ＥならびにＹ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｔ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｒ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｅ、Ｅ１４６Ｋ、およびＥ１４６Ｒのうちの１つが挙げられる。他の３重点ＤＮ＿ＴＮＦ−αタンパク質としては、Ｌ７５ＥおよびＹ８７Ｈ、およびＹ１１５Ｑ、Ａ１４５Ｒの少なくとも１つが挙げられる。例示的なＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質としては、１）Ｌ７５Ｋ、Ｙ８７ＨおよびＹ１１５Ｑ；または２）Ｖ９１Ｅ、Ｎ３４ＥおよびＡ１４５ＲまたはＡ１４５Ｅのいずれかが挙げられる。
【０１３１】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、バリアントＴＮＦ−α核酸によりコードされるものとして特定することもできる。当業者には理解される通り、遺伝暗号の縮重に起因して、全て目的のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする非常に多数の核酸を作製することができる。したがって、特定のアミノ酸配列を特定すれば、当業者は、単に１つまたは複数のコドンの配列をＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質のアミノ酸配列が変化しないように改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。
【０１３２】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸も本明細書に開示されている方法において使用される。核酸分子はｃＤＮＡであってよい。開示されている抗体および抗原結合性断片をコードする組換え核酸分子は、当業者が、本明細書に提示されているアミノ酸配列、および遺伝暗号を使用して容易に作製することができる。さらに、当業者は、配列は異なるが同じタンパク質配列をコードする核酸などの、機能的に等価の核酸を含有する種々のクローンを容易に構築することができる。したがって、開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸分子が本明細書に提示される。
【０１３３】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸配列は、例えば、適切な配列のクローニング、または、Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８巻：９０〜９９頁、１９７９年のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８巻：１０９〜１５１頁、１９７９年のホスホジエステル法；  Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔ．、２２巻：１８５９〜１８６２頁、１９８１年のジエチルホスホラミダイト法；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａ．  Ｌｅｔｔｓ．、２２巻（２０号）：１８５９〜１８６２頁、１９８１年に記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法などの方法による直接化学合成によって、例えば、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２巻：６１５９〜６１６８頁、１９８４年に記載されている自動合成機を使用して；ならびに、米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法を含めた任意の適切な方法によって調製することができる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドを作製する。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または鋳型としてこの一本鎖を使用するＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡの化学合成は一般に約１００塩基の配列に限定されるが、短い配列をライゲートすることによってより長い配列を得ることができることが当業者には理解されよう。
【０１３４】
例示的なＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、クローニング技法によって調製することができる。適切なクローニングおよび配列決定技法の例、および当業者を多くのクローニング演習によって導くために十分な指示は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（編）、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌ、上記において見いだされる。生物学的試薬および実験設備の製造者からの製品情報からも有用な情報がもたらされる。そのような製造者としては、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的な供給源が挙げられる。
【０１３５】
核酸は、増幅方法によって調製することもできる。増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）が挙げられる。多種多様なクローニング方法、宿主細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅方法体系は当業者に周知である。
【０１３６】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、発現制御配列と作動可能に連結していてよい。例えば、これだけに限定されないが、抗原ポリペプチドなどの追加的なポリペプチドがコードされていてよい。コード配列と作動可能に連結した発現制御配列を、発現制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートする。発現制御配列としては、これだけに限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンに対するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするための、当該遺伝子の適正な読み枠の維持、および終止コドンが挙げられる。
【０１３７】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、これだけに限定されないが、配列の挿入または組み入れを可能にし、原核生物または真核生物のいずれかで発現させることができるように操作することができるプラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルを含めた発現ベクターに挿入することができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物生物体を挙げることができる。真核生物の配列またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物において発現させる方法は当技術分野で周知である。宿主において発現および複製することができる、生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で公知である。
【０１３８】
一実施形態では、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓなどの酵母における発現のためにベクターを使用する。構成的プロモーター原形質膜Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ１）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ−１（ＡＤＨ１）、および多面的薬剤耐性ポンプ（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｕｍｐ）（ＰＤＲ５）などのいくつかのプロモーターが酵母発現系において使用されることが公知である。さらに、ＧＡＬ１−１０（ガラクトースによって誘導される）、ＰＨＯ５（低細胞外無機ホスフェートによって誘導される）、およびタンデムな熱ショックＨＳＥエレメント（３７℃への温度上昇によって誘導される）などの、多くの誘導性プロモーターが使用される。滴定可能な誘導因子に応答して可変な発現を導くプロモーターとしては、メチオニン応答性ＭＥＴ３およびＭＥＴ２５プロモーターならびに銅依存性ＣＵＰ１プロモーターが挙げられる。これらのプロモーターのいずれかを、多コピー（２μ）または単一コピー（ＣＥＮ）プラスミドにクローニングして、追加的なレベルの発現レベルの制御をもたらすことができる。プラスミドは、酵母における選択のための栄養マーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＡＤＥ３、ＨＩＳ１、およびその他など）、ならびに細菌における繁殖のための抗生物質耐性（例えば、ＡＭＰなど）を含んでよい。Ｋ．ｌａｃｔｉｓにおける発現のためのプラスミドは、例えばｐＫＬＡＣ１など、公知である。したがって、一例では、細菌における増幅後、プラスミドを、対応する酵母栄養要求株に細菌形質転換と同様の方法によって導入することができる。
【０１３９】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、種々の酵母株において発現させることができる。例えば、７種の多面的薬剤耐性輸送体、ＹＯＲ１、ＳＮＱ２、ＰＤＲ５、ＹＣＦ１、ＰＤＲ１０、ＰＤＲ１１、およびＰＤＲ１５を、それらの活性化転写因子、ＰＤＲ１およびＰＤＲ３と共に、酵母宿主細胞において同時欠失させ、それにより、得られる株を薬物に対して感受性にする。エルゴステロール生合成に欠陥のあるｅｒｇ６変異体などの、原形質膜の脂質組成が変化している酵母株も利用することができる。他の液胞ヒドロラーゼの活性化を制御する主要液胞エンドペプチダーゼＰｅｐ４を欠く酵母株において、タンパク質分解に対する感受性が高いタンパク質を発現させることができる。対応するヌル変異体が生存不能である場合には、遺伝子の温度感受性（ｔｓ）対立遺伝子を有する株における異種発現を使用することができる。
【０１４０】
本明細書に開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードするウイルスベクターも調製することができる。ポリオーマ、ＳＶ４０（Ｍａｄｚａｋら、１９９２年、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、７３巻：１５３３〜１５３６頁）、アデノウイルス（Ｂｅｒｋｎｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：３９〜６頁；Ｂｅｒｌｉｎｅｒら、１９８８年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６１６〜６２９頁；Ｇｏｒｚｉｇｌｉａら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：４４０７〜４４１２頁；Ｑｕａｎｔｉｎら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：２５８１〜２５８４頁；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２年、Ｃｅｌｌ、６８巻：１４３〜１５５頁；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎら、１９９２年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０巻：２２３３〜２２３９頁；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１巻：２４１〜２５６頁）、ワクシニアウイルス（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２４巻：４９５〜４９９頁）、アデノ随伴ウイルス（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：９１〜１２３頁；Ｏｎら、１９９０年、Ｇｅｎｅ、８９巻：２７９〜２８２頁）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含めたヘルペスウイルス（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：６７〜９０頁；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２９５２〜２９６５頁；Ｆｉｎｋら、１９９２年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、３巻：１１〜１９頁；Ｂｒｅａｋｆｉｅｌｄら、１９８７年、Ｍｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１巻：３３７〜３７１頁；Ｆｒｅｓｓｅら、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４０巻：２１８９〜２１９９頁）、シンドビスウイルス（Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒら、１９９５年、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６巻：１１６１〜１１６７頁；米国特許第５，０９１，３０９号および同第５，２２１７，８７９号）、アルファウイルス（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、１９９３年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１１巻：１８〜２２頁；Ｆｒｏｌｏｖら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：１１３７１〜１１３７７頁）、ならびにトリ起源のレトロウイルス（Ｂｒａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙら、１９８４年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４巻：７４９〜７５４頁；Ｐｅｔｒｏｐｏｕｐｌｏｓら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：３３９１〜３３９７頁）、マウス起源のレトロウイルス（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２年、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８巻：１〜２４頁；Ｍｉｌｌｅｒら、１９８５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５巻：４３１〜４３７頁；Ｓｏｒｇｅら、１９８４年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４巻：１７３０〜１７３７頁；Ｍａｎｎら、１９８５年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、５４巻：４０１〜４０７頁）、およびヒト起源のレ��ロウイルス（Ｐａｇｅら、１９９０年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６４巻：５３７０〜５２７６頁；Ｂｕｃｈｓｃｈａｌｃｈｅｒら、１９９２年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、６６巻：２７３１〜２７３９頁）を含めた、いくつものウイルスベクターが構築されている。バキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ多核体病ウイルス；ＡｃＭＮＰＶ）ベクターも当技術分野で公知であり、商業的な供給源（例えば、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から得ることができる。
【０１４１】
したがって、一実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードするポリヌクレオチドをウイルスベクター中に含める。適切なベクターとしては、レトロウイルスベクター、オルソポックスベクター、トリポックスベクター、鶏痘ベクター、カプリポックスベクター、スイポックスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよびポリオウイルスベクターが挙げられる。特定の例示的なベクターは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）などのポックスウイルスベクター、アデノウイルス、バキュロウイルスなどである。
【０１４２】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードするポックスウイルスベクターなどのウイルスベクターは、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結した少なくとも１つの発現制御エレメントを含む。発現制御エレメントは、核酸配列の発現を制御および調節するためにウイルスベクターに挿入される。これらのベクターに使用される発現制御エレメントの例としては、これだけに限定されないが、ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーター領域およびプロモーター領域、酵母プロモーターならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０に由来するプロモーターが挙げられる。追加的な作動エレメントとしては、これだけに限定されないが、リーダー配列、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに、宿主系におけるＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸配列の適切な転写およびその後の翻訳に必要な任意の他の配列が挙げられる。発現ベクターは、宿主系における、核酸配列を含有する発現ベクターの移入およびその後の複製に必要な追加的なエレメントを含有してよい。そのようなエレメントの例としては、これだけに限定されないが、複製起点および選択マーカーが挙げられる。さらに、そのようなベクターは従来の方法を使用して容易に構築でき、（Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９８７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）また、市販されていることも当業者には理解されよう。
【０１４３】
１つまたは複数のタンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡウイルスを調製するための基本的技法は当技術分野で公知である。そのような技法は、例えば、ドナープラスミド中のＤＮＡ配列に隣接するウイルスＤＮＡ配列と親ウイルスに存在する相同な配列との間の相同組換えを伴う（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７９巻：７４１５〜７４１９頁）。特に、ポックスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを遺伝子の送達に使用することができる。ベクターは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，０９３，２５８号に記載されている、鶏痘ウイルスの合成組換え体を創出するための方法と類似したステップなどの当技術分野で公知のステップによって構築することができる。他の技法は、親ウイルスベクターに天然に存在するまたは人工的に挿入された独特の制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して異種ＤＮＡを挿入することを含む。
【０１４４】
組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技法によって行うことができる。宿主がＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数成長期後に回収し、その後、当技術分野で周知の手順を使用してＣａＣｌ２法によって処理した細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。形質転換は、所望であれば宿主細胞のプロトプラストを形成した後に、または電気穿孔によって実施することもできる。
【０１４５】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、微量注射などの従来の機械的手順、電気穿孔、リポソームまたはウイルスベクターに封入したプラスミドの挿入などのＤＮＡトランスフェクション方法を使用することができる。真核細胞はまた、抗体、標識した抗体またはその機能的（抗原結合性）断片をコードするポリヌクレオチド配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子を用いて同時形質転換することができる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して真核細胞を一過性に感染させるか形質転換し、タンパク質を発現させるものである（例えば、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ編、１９８２年を参照されたい）。当業者は、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株および骨髄腫細胞株などの高等真核細胞を含めた細胞におけるタンパク質の産生に使用されるプラスミドおよびベクターなどの発現系を容易に使用することができる。
【０１４６】
組換えにより発現させたポリペプチドの単離および精製は、調製的クロマトグラフィーおよび免疫学的分離を含めた従来の手段によって行うことができる。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質が発現したら、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含めた当技術分野の標準の手順に従って精製することができる（一般に、Ｒ．  Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．、１９８２年を参照されたい）。少なくとも約９０〜９５％の均質性である実質的に純粋な組成物が本明細書に開示されており、薬学的目的のためには９８〜９９％またはそれよりも高い均質性を使用することができる。ポリペプチドは、治療的に使用される場合、部分的にまたは所望の均質性まで精製されたら、内毒素を実質的に含まないことが必要である。
【０１４７】
組換え方法に加えて、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、全体的にまたは部分的に標準のペプチド合成を使用して構築することもできる。長さが約５０アミノ酸未満のポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、その後、残りのアミノ酸を配列内に逐次的に付加することによって達成することができる。固相合成のための技法は、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｂｉｏｌｏｇｙ．、２巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐａｒｔ  Ａ、３〜２８４頁；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、８５巻：２１４９〜２１５６頁、１９６３年、およびＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．、１９８４年に記載されている。より長いタンパク質は、より短い断片のアミノ末端とカルボキシル末端の縮合によって合成することができる。カルボキシル末端の活性化によってペプチド結合を形成する方法（例えば、カップリング試薬Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用することによってなど）は当技術分野で周知である。
【０１４８】
医薬組成物および使用方法
発癌現象を予防する、および／または腫瘍の形成を阻害する、腫瘍を処置する、もしくは腫瘍が発生するリスクを低減させるための方法が本明細書に開示されている。一部の実施形態では、良性病変から悪性病変への変換を予防する、または転移を予防するための方法が本明細書に開示されている。したがって、腫瘍は良性であっても悪性であってもよい。一部の実施形態では、腫瘍は、炎症性腫瘍である。腫瘍を有する被験体を処置するための方法が本明細書に開示されている。
【０１４９】
方法は、被験体にドミナントネガティブ腫瘍壊死因子（ＤＮ−ＴＮＦ）−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を治療有効量で投与することを含む。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、発現ベクターに含めることができる（上記を参照されたい）。方法は、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を投与することを含み得る。投与は、全身的なものであっても局所的なものであってもよい。上に開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質のいずれも開示されている方法において使用することができる。具体的な非限定的実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
【０１５０】
一部の実施形態では、腫瘍の発生を阻害するための方法が提供される。これらの方法は、被験体におけるがんに対する免疫抑制応答を阻害することを含み得る。免疫抑制応答は、免疫抑制性サイトカインの発現であり得る。サイトカインの発現は、例えば、対照と比較して２０％、３０％、０４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低減し得る。具体的な非限定例では、サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＴＧＦβおよびＩＬ−１０である。対照は、ＤＮ−ＴＮＦ−αを投与する前の被験体由来の試料におけるものなどの、ＤＮ−ＴＮＦ−αの投与の不在下でのサイトカインの発現であり得る。対照は、標準値であり得る。
【０１５１】
免疫抑制応答は、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含み得る。したがって、一部の実施形態では、開示されている方法により、ＭＤＳＣの数が減少する。ＭＤＳＣの数は、例えば、対照と比較して２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少し得る。対照は、ＤＮ−ＴＮＦ−αを投与する前の被験体由来の試料におけるものなどの、ＤＮ−ＴＮＦ−αの投与の不在下でのＭＤＳＣの数であり得る。対照は、標準値であり得る。
【０１５２】
免疫抑制応答は、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の枯渇または機能的消耗も含み得る。一部の実施形態では、開示されている方法により、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の数および／または機能が増大する。ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の数および／または機能（例えばサイトカイン分泌および／または腫瘍死滅によって測定される）は、例えば、対照と比較して２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増大する。対照は、ＤＮ−ＴＮＦ−αを投与する前の被験体由来の試料におけるものなどの、ＤＮ−ＴＮＦ−αの投与の不在下でのヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の数であり得る。対照は、標準値であり得る。
【０１５３】
追加的な実施形態では、前記腫瘍の発生を阻害することは、前記被験体における腫瘍に対する免疫応答を刺激することを含む。免疫応答は、Ｔｈ１応答および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と樹状細胞（ＤＣ）のクロストークを含み得る。一部の実施形態では、「クロストーク」とは、ＮＫ細胞とＤＣの間の、これらの自然免疫エフェクター細胞を相反的に刺激し活性化する、膜貫通ＴＮＦなどの膜結合リガンドおよびトランス提示ＩＬ−１５、ならびにＩＬ−１２およびＩＦＮγなどの分泌型サイトカインを介した相互作用である。免疫応答は、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７および／またはＩＦＮγなどのサイトカインの産生を含み得る。免疫応答は、抗がんＴ細胞応答またはＢ細胞応答の増大を含み得る。免疫応答は、例えば、対照と比較して２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増大し得る。対照は、ＤＮ−ＴＮＦ−αを投与する前の被験体由来の試料におけるものなどの、ＤＮ−ＴＮＦ−αの投与の不在下での、ＮＫ細胞／ＤＣクロストーク、サイトカイン産生またはＢ細胞およびＴ細胞の腫瘍抗原に対する特異的反応などの免疫応答であり得る。対照は、標準値であり得る。
【０１５４】
さらなる実施形態では、方法は、発癌現象および／もしくは腫瘍の発生を予防すること、または良性腫瘍もしくは悪性腫瘍などの腫瘍の発生を阻害することを含み得る。方法は、良性腫瘍の悪性腫瘍への変換を阻害することを含み得る。具体的な非限定例では、腫瘍のサイズおよび数を、被験体において対照と比較して減少させることができる。腫瘍は、原発腫瘍、および、これだけに限定されないが、微小転移を含めた転移であり得る。追加的な非限定例では、対照は、未処置の被験体または担体を用いて処置した被験体である。
【０１５５】
本明細書に開示されている方法は、状態に対する処置を必要とする被験体を選択することを含む。ある特定の実施形態では、被験体は、腫瘍が発生する素因を有するまたは腫瘍が発生するリスクがある。一部の実施形態では、被験体は、発がん物質に曝露している、被験体は放射線に曝露している、または被験体は前悪性状態を有する。被験体は、腫瘍を有している可能性があるもしくは以前に有していた、または、例えば病歴に起因して、腫瘍が発生する素因を有する。被験体は、腫瘍が発生する遺伝的素因を有し得る。一実施形態では、方法により、被験体における腫瘍の再発を予防するまたは遅延させる。場合により、追加的な薬剤を目的の被験体に投与することができる。いくつかの実施形態では、発がん物質に曝露している被験体において腫瘍が発生するリスクを低下させる、または腫瘍の発生を予防するもしくは遅延させるための方法が提供される。
【０１５６】
処置は、予防的なものであってもよく、あるいは、前がん性病変または非悪性腫瘍などの状態が発生した後に開始することもできる。予防的な処置は、例えば、被験体に状態の症状が顕在化した後に開始することができる。具体的な非限定例では、被験体は、結腸のポリープを有し得るが、結腸がんは有さない。皮膚がんに関してなどの一部の例では、処置は、例えば、発がん物質またはＵＶ光への曝露、酸化ストレス、アルキル化による損傷および脱アミノ化の結果など、ＤＮＡに損傷を与える作用因子に曝露する前または曝露中に開始することができる。一部の例では、処置は、ＤＮＡに損傷を与える作用因子、がんに関連するウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））に曝露した後であるが、腫瘍が出現する前に行うことができる。一部の例では、処置は、発がん物質への曝露、例えばアスベストおよび喫煙への職業性曝露など、または、例えば、それぞれ肺がん、肝がん、子宮頸がんおよび喉頭がんまたはカポジ肉腫のリスクがある被験体について、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶおよびＨＩＶなどへのウイルス感染への曝露の前またはその間に行うことができる。処置は、例えば、これだけに限定されないが、乳がんが発生するリスクがある、ＢＲＣＡ１および／またはＢＲＣＡ２変異を有する被験体など、状態が発生する前に行うことができる。状態が発生する前の処置は、本明細書では、状態が生じる「リスクがある」被験体の処置と称される。したがって、組成物の投与は、本明細書に記載の状態が出現する前、出現中、または出現した後に実施することができる。一部の実施形態では、開示されている方法により、腫瘍が発生するリスクを低減させる。
【０１５７】
ＤＮ−ＴＮＦ−αを受けるのに特に適した被験体の非限定例は、自然または人工的ＵＶ照射に曝露する可能性がある被験体、工業化学物質への職業性曝露に起因してまたは喫煙に起因して発がん物質に曝露している被験体である。被験体は、アスベストまたはシリカに曝露している、したがって、中皮腫のリスクがある被験体であり得る。一部の例では、これらの被験体では、腫瘍はまだ発生していない。処置に適した被験体の例は、肺がんが発生していない喫煙者である。大量のＵＶ光に曝露しているが、黒色腫または基底細胞癌などの皮膚がんがまだ発生していない被験体も処置に適した被験体の例である。処置に適した被験体のさらなる例は、アスベストなどの発がん物質への職業性曝露を有するまたはこれから有する被験体である。
【０１５８】
開示されている方法は、転移性がんを処置するため、例えば、転移を阻害するためまたは追加的な転移を予防するためなどに使用することができる。一部の実施形態では、開示されている方法は、被験体における腫瘍または追加的な腫瘍の発生を減少させるため、例えば、病変の体積および数を減少させるために使用することができる。当該方法は、転移の発生を阻害もしくは予防するため、または所属リンパ節への微小転移などの微小転移の数を減少させるために使用される（Ｇｏｔｏら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１４巻（１１号）：３４０１〜３４０７頁、２００８年を参照されたい）。最初の腫瘍状態が発生した後に開始した処置により、状態のうちの１つの症状の重症度が低下するまたは症状が完全に取り除かれる、または転移、腫瘍体積もしくは腫瘍の数が低減する可能性がある。一部の例では、これらの被験体は、悪性またはさらには転移性の病変に変換する可能性がある既存の良性腫瘍を有する。本開示のこの態様では、腫瘍の形成を遅延させる、予防する、または低下させる。一部の実施形態では、開示されている方法を使用して、転移性がんの発生を予防することができる。
【０１５９】
腫瘍は、固形腫瘍および血液腫瘍を含めた任意の目的の腫瘍であってよい。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性疾患、膵がん、乳がん（基底乳癌、腺管癌および小葉乳癌を含む）、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）が挙げられる。血液腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、１１ｑ２３陽性急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性白血病、前骨芽球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病など）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病など）などの白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性のおよび高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病ならびに脊髄形成異常症が挙げられる。具体的な非限定例では、腫瘍は、乳がん、前立腺がん、肺がん、肝がん、子宮頸がん、頭頸部がん、黒色腫、腎細胞癌、カポジ肉腫または結腸がんである。
【０１６０】
腫瘍の存在は、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、一般には、細胞学的評価および形態学的評価を含む。細胞は、生検から得られる細胞を含め、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるものであってもｅｘ  ｖｉｖｏにおけるものであってもよい。
【０１６１】
本明細書に開示されている任意のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αをコードする核酸を開示されている任意の方法において使用することができる。具体的な非限定例では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質は、配列番号２と記載されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、任意の目的の腫瘍を阻害する、予防する、それが発生するリスクを低下させるために、被験体に投与するための種々のやり方で製剤化することができる。本明細書に開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αをコードする核酸は、薬学的に許容される担体で投与することができる。
【０１６２】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、単独でまたは追加的な薬剤と併せて投与することができる。医薬組成物は、本明細書に開示されているＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を活性成分として含んでもよく、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸と、追加的な抗炎症性薬、抗免疫抑制剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体、Ｔｒｅｇを低減させるシクロホスファミドおよび／もしくは抗ＩＬ−２Ｒα抗体）、免疫賦活剤（例えば、抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体、ＯＸ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ワクチンおよび／またはＩＦＮα、ＩＬ−２などのサイトカイン）、免疫回復剤（例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ）３−リガンド、インターロイキン（ＩＬ）−７および／もしくは幹細胞）または化学療法剤などの追加的な薬剤の両方を含んでもよい。例示的な化学療法剤は、変異したＢＲＡＦＶ６００ＥまたはＭＥＫを標的とする小分子阻害剤または抗体である。しかし、化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、ダカルバジン、テモゾロミド、パクリタキセルおよびその他などの、任意の目的の化学療法剤であってよい。
【０１６３】
したがって、局所的使用（例えば、局部、腫瘍内、または吸入など）のための医薬組成物および全身的使用（例えば、経口または静脈内など）のための医薬組成物の両方が提供される。したがって、ヒト医学または獣医学において使用するための、製剤化された、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物が本開示の範囲内に含まれる。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、一般には、ヒト被験体を処置するために使用されるが、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの他の脊椎動物における同様または同一の疾患を処置するためにも使用することができる。適切な投与形式は、医療実践者が、各被験体について個別に決定することができる。種々の薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準の製剤の専門書、例えば、Ｅ．  Ｗ．  ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。Ｗａｎｇ、Ｙ．  Ｊ．およびＨａｎｓｏｎ、Ｍ．  Ａ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０、補遺、４２：２Ｓ、１９８８年。医薬組成物の剤形は、選択された投与形式によって決定される。
【０１６４】
一実施形態では、治療有効量のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を、皮膚への投与用に製剤化する。局部投与に適した製剤としては、活性化合物を皮膚細胞などの細胞に投与するための散布剤（ｄｕｓｔｉｎｇ  ｐｏｗｄｅｒ）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤または噴霧剤が挙げられる。そのような製剤は、場合により、無機色素、有機色素、無機散剤、有機散剤、炭化水素、シリコーン、エステル、トリグリセリド、ラノリン、蝋、蝋膜（ｃｅｒｅ）、動物油または植物油、界面活性物質、多価アルコール、糖、ビタミン、アミノ酸、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、紫外線遮断薬、日焼け止め、防腐剤、芳香剤、増粘剤、またはこれらの組合せを含んでよい。例えば、防腐剤、殺菌剤、香料、消泡剤、染料、着色作用を有する色素、界面活性物質、増粘剤、懸濁化剤、充填剤、保湿剤、保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、脂肪、油、ワックス、またはアルコール、ポリオール、ポリマー、泡安定剤、電解質、有機溶媒、またはシリコーン誘導体などの他の通例の化粧品製剤の構成要素などの添加剤を含めることができる。
【０１６５】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、例えば、これだけに限定されないが、肺がんまたは食道がんを処置するための製剤など、吸入による投与用に製剤化することができる。吸入用調製物としては、エアロゾル、微粒子物などが挙げられる。一般に、吸入のための粒子サイズの目標は、医薬を吸収のために肺の肺胞領域に到達させるために、約１μｍまたはそれ未満である。しかし、粒子サイズを調節して肺内の配置の領域を調整することができる。したがって、呼吸器細気管支および気腔（ａｉｒ  ｓｐａｃｅ）内への沈着を達成するために、より大きな粒子を利用することができる（例えば、直径約１〜約５μｍなど）。さらに、経口用製剤は、液体（例えば、シロップ剤、液剤、または懸濁剤）であっても固体（例えば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤）であってもよい。
【０１６６】
吸入による投与に関しては、化合物は、適切な噴霧体、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスを使用する、加圧されたパックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧提示の形態で都合よく送達することができる。加圧されたエアロゾルの場合では、投与量単位は、定量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。吸入器または吹き入れ器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）に使用するためのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有させて製剤化することができる。
【０１６７】
組成物または医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、髄腔内、もしくは関節内への注射もしくは注入によるもの、または舌下投与、経口投与、局部投与、鼻腔内投与、もしくは経粘膜投与によるものを含めた任意の経路によって投与することもできる。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を、例えば、注射または注入用の非経口用組成物として提供する場合、一般に、水性担体、例えば、ｐＨ約３．０〜約８．０、好ましくはｐＨ約３．５〜約７．４、３．５〜６．０、または３．５〜約５．０の等張緩衝溶液に懸濁させる。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸、およびリン酸ナトリウム−リン酸、および酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液が挙げられる。治療有効量の調製物が経皮注射または送達後に多くの時間または日数にわたって血流中に送達されるように、レポジトリまたは「デポー」緩慢放出調製物の形態を使用することができる。
【０１６８】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸はまた、持続放出系によっても適切に投与される。持続放出製剤の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、成形された物品、例えば、フィルム、もしくはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションなど）またはイオン交換樹脂、および、やや難溶性の誘導体（例えば、やや難溶性の塩など）が挙げられる。持続放出組成物は、経口投与、直腸投与、非経口投与、槽内投与、膣内投与、腹腔内投与、局部投与（散剤、軟膏剤、ゲル剤、滴剤（ｄｒｏｐ）もしくは経皮パッチとして）、頬側投与、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与することができる。
【０１６９】
投与するための調製物は、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸の制御放出が長期間にわたってもたらされるように適切に製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、生分解性ポリマーおよび／または多糖ゼリー化および／もしくは生体接着性ポリマー、両親媒性ポリマー、粒子の界面特性を調節する薬剤と、薬理活性のある物質とを含む粒子の形態であってよい。これらの組成物は、活性物質の制御放出を可能にするある特定の生体適合性の特徴を示す。米国特許第５，７００，４８６号を参照されたい。
【０１７０】
経口投与に関しては、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製された錠剤またはカプセル剤の形態をとってよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとってもよく、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥生成物として提供されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）；および防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤を用いて従来の手段によって調製することができる。調製物は、必要に応じて緩衝塩、矯味矯臭剤、着色剤、および甘味剤も含有してよい。固体組成物に関しては、従来の無毒性固体担体として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられる。そのような剤形の実際の調製方法は当業者には公知である、または明らかになる。
【０１７１】
使用される薬学的に許容される担体および賦形剤は、従来のものである。例えば、非経口用製剤は、通常、例えば、水、生理的食塩水、他の平衡化塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの、薬学的におよび生理的に許容される流体ビヒクルである注射用流体を含む。含めることができる賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質または血漿調製物である。所望であれば、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートも含有してよい。そのような剤形の実際の調製方法は、当業者には公知であるまたは明らかになる。
【０１７２】
一般に、製剤は、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方に均一かつ密接に接触させることによって調製される。次いで、必要であれば、産物を所望の製剤に形づくる。場合により、担体は、非経口用担体であり、一部の実施形態では、レシピエントの血液と等張性の溶液である。そのような担体ビヒクルの例としては、水、食塩水、リンゲル液、およびブドウ糖溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクル、ならびにリポソームも本発明において有用である。
【０１７３】
さらに、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、化合物をゆっくりと放出する固体または吸収性マトリックスを被験体の近接する周囲の組織に埋め込むこと（器官（例えば、腸もしくは肝臓）に直接または皮下に）によって投与することができる。例えば、胃腸の前がん性病変の処置に関しては、化合物は、全身的に（例えば、静脈内に、直腸にまたは経口的に）投与することもでき、局所的に（例えば、腫瘍に直接）投与することもできる。あるいは、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸をウェーハまたは吸収性海綿に含浸させ、胃の組織などの組織に直接接触させることができる。ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ウェーハからの拡散およびポリマーマトリックスの浸食によってゆっくりと放出する。別の例として、肝臓のウイルス感染（すなわち、肝炎）を、肝臓脈管構造に、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を含有する溶液を注入することによって処置する。
【０１７４】
治療用化合物がＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸である場合、核酸は、コードされるタンパク質の発現を促進するために、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、細胞内に入るように投与することによって、例えば、レトロウイルスベクターを使用することによって、直接注射することによって、微小粒子照射（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を使用することによって、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることによって、または核に進入することが公知であるホメオボックス様ペプチドと連結して投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：１８６４〜１８６８頁、１９９１年を参照されたい）などで、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与することができる。あるいは、核酸治療薬を細胞内に導入し、相同組換えによって発現のために宿主細胞ＤＮＡに組み入れる、またはエピソームとして残す。
【０１７５】
ＤＮＡの局所投与に関しては、標準の遺伝子療法ベクターを使用することができる。そのようなベクターとしては、複製欠損肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶおよびＨＣＶなど）、レトロウイルス（ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０７１３６号；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３２３巻（９号）：５７０〜５７８頁、１９９０年を参照されたい）、アデノウイルス（Ｍｏｒｓｅｙら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、補遺１７Ｅ、１９９３年を参照されたい）、アデノ関連ウイルス（Ｋｏｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻：２２１１〜２２１５頁、１９９０年）、複製欠損単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；Ｌｕら、Ａｂｓｔｒａｃｔ、６６頁、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｅｐｔ．  ２２−２６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年）に由来するものを含めたウイルスベクター、およびこれらのベクターの任意の改変バージョンが挙げられる。上に開示されているベクターのいずれか、または真核細胞への核酸のｉｎ  ｖｉｖｏ移入を達成する任意の他の送達系を利用することができる。例えば、核酸を、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）などのリポソーム、受容体媒介性送達系、非ウイルス核酸に基づくベクター、赤血球ゴースト、またはマイクロスフェア（例えば、微小粒子など；例えば、米国特許第４，７８９，７３４号；米国特許第４，９２５，６７３号；米国特許第３，６２５，２１４号を参照されたい）にパッケージングすることができる。裸のＤＮＡを投与することもできる。
【０１７６】
任意の所与の患者に対する投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全体的な健康、ならびに同時に投与される他の薬物を含めた多くの因子に依存する。投与量は変動し得るが、ＤＮＡの静脈内投与のために好ましい投与量は、ＤＮＡ分子およそ１０６〜１０２２コピーである。
【０１７７】
一般には、プラスミドは、哺乳動物に、ＤＮＡ約１ナノグラム〜約５０００マイクログラムの量で投与される。組成物は、ＤＮＡ５ナノグラム〜１０００マイクログラム、ＤＮＡ１０ナノグラム〜８００マイクログラム、ＤＮＡ０．１マイクログラム〜５００マイクログラム、ＤＮＡ１マイクログラム〜３５０マイクログラム、ＤＮＡ２５マイクログラム〜２５０マイクログラム、またはＤＮＡ１００マイクログラム〜２００マイクログラムを含有することが望ましい。あるいは、ＰＤ−１アンタゴニストをコードするアデノウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターの哺乳動物への投与は、少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１プラーク形成単位（ｐｆｕ）の濃度で施すことができる。
【０１７８】
一部の実施形態では、ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物は、正確な投与量の個々の投与に適した単位剤形に製剤化することができる。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置される被験体、苦痛の重症度、および投与の様式に依存し、処方する臨床医の判断に委ねるのが最良である。これらの範囲の中で、投与される製剤は、ある数量の活性構成成分（複数可）を、処置される被験体における所望の効果を達成するために有効な量で含有する。例えば、長期投与が達成されるように、規定された時間間隔にわたって、例えば、毎日、隔週、毎週、隔月または毎月など、複数回の処置が構想される。本明細書に開示されている通り、治療有効量のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、腫瘍の形成の予防、良性病変から悪性病変への変換の予防、腫瘍が発生するリスクの低減、または転移の予防に有用である。投与は、疾患の抑制または予防が望まれるときはいつでも、例えば、被験体のある特定の年齢で、または環境曝露の前に開始することができる。適切な用量は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６２，３６７号において開示されている。正確な用量は、特定の化合物（例えば、利用されるＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質など）の効力、被験体の年齢、体重、性別および生理的状態に基づいて、当業者により容易に決定される。
【０１７９】
本明細書に開示されている方法を使用した処置後の免疫応答を測定するための方法は当技術分野で周知である。免疫細胞の活性は、例えば、サイトカイン産生を検出するアッセイ；抗原で刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数、増殖、細胞傷害性およびサイトカイン産生を測定するアッセイ；ならびにＭＤＳＣの数および機能を測定するアッセイによって評価することができる。例示的なアッセイは、以下、および、例えば、米国特許第６，８０８，７１０号および米国特許出願公開第２００４／０１３７５７７号、同第２００３／０２３２３２３号、同第２００３／０１６６５３１号、同第２００３／００６４３８０号、同第２００３／００４４７６８号、同第２００３／００３９６５３号、同第２００２／０１６４６００号、同第２００２／０１６００００号、同第２００２／０１１０８３６号、同第２００／２０１０７３６３号、および同第２００２／０１０６７３０号において開示されている。
【０１８０】
治療有効量のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、治療有効量の別の薬剤と一緒に投与することができる。投与は、同時であっても逐次的であってもよい。以下の段落には、薬剤が個別に開示されているが、これらの薬剤の任意の組合せを利用することができることに留意するべきである。
【０１８１】
薬剤は、例えば、化学療法剤（例えば、これだけに限定されないが、ＢＲＡＦＶ６００Ｅおよび／もしくはマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）を標的とする阻害剤など）、放射線、サイトカイン、ケモカイン、抗体、細胞（活性化されたＮＫ細胞、樹状細胞、抗原特異的ＣＤ８もしくはＣＤ４Ｔ細胞、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ））または免疫賦活剤（ＯＸ４０アゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、または抗ＥＧＦＲ抗体）であってよい。一部の例では、薬剤は、外科的処置を伴ってよい。薬剤は、これだけに限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５を含めたサイトカイン、またはＩＦＮ−αもしくはＩＦＮ−γなどのインターフェロン（ＩＦＮ）であってよい。
【０１８２】
治療有効量のＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質および／またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、治療有効量の抗体、例えば、抗プログラム死（ＰＤ）−１抗体、抗プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ）１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ３）抗体、抗Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンタンパク質（ＴＩＭ）−３抗体、ＩｇドメインおよびＩＴＩＭドメインを有する抗Ｔ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）（参照により本明細書に組み込まれるＪｏｈｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．、２０１４年１２月８日；２６巻（６号）：９２３〜３７頁、ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１４．１０．０１８）、または抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）抗体などと一緒に投与することができる。抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体、および免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質を含む。
【０１８３】
ＰＤ−１に結合する抗体のアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２１０５６７号において開示されている。ＰＤ−１に結合する抗体は、同じく参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／００３４８２６号にも開示されている。抗体は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）である。抗体は、Ｏｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８）またはＯＰＤＩＶＯ（登録商標）などの抗ＰＤ−１抗体であってよい。いくつかの例では、抗体は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に少なくとも１０７Ｍ−１、例えば、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１または少なくとも１０９Ｍ−１などの親和性定数で特異的に結合する。抗体は、Ｉｐｉｌｍｕｍａｂ（ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１およびＹＥＲＶＯＹ（登録商標）としても公知）などの抗ＣＴＬＡ−４抗体であってよい。抗体は、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体または抗ＴＩＧＩＴ抗体であってよい。追加的な薬剤により、ＯＸ４０および／またはＣＤ４０を刺激することができる。追加的な薬剤は、抗ＯＸ４０抗体などの、ＯＸ４０を刺激する抗体であってよい。一例では、抗体は、ＡｇｏｎＯＸから入手可能である。薬剤は、ＣＰ−８７０またはＣＰ−８９３（Ｐｆｉｚｅｒ）などの、ＣＤ４０を刺激する抗体であってよい。抗体は、ＣＤ４０リガンドに特異的に結合する抗体であってよい。薬剤は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ；誘導性共刺激標的）に特異的に結合する抗体であってよい。
【０１８４】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質、またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、腫瘍ワクチンなどのワクチンと一緒に投与することができる。ワクチンは、合成ペプチドワクチン、組換えタンパク質ワクチン、腫瘍溶解物ワクチン、または核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）ワクチンであってよい。ワクチンは、細菌アジュバント、ウイルスアジュバントまたは細胞アジュバント（例えば、樹状細胞）を含んでよい。ワクチンは、例えば、全長ＭＵＣ−１タンパク質、ＭＵＣ−１を含有する、溶解させた腫瘍細胞、ＭＵＣ−１ポリペプチド、ＭＵＣ−１ポリペプチドをコードする核酸配列、または任意のＭＵＣ−１形式を負荷した樹状細胞を含んでよい。腫瘍ワクチンとしては、これだけに限定されないが、ＢＩＯＶＡＸＩＤ（登録商標）（前立腺、ｄａｓｉｐｒｏｔｉｍｕｔ−Ｔ）、ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセルＴ）、Ｏｎｃｏｐｈａｇｅ、ＰＲＯＳＴＶＡＣ（登録商標）（ＰＳＡ−ＴＲＩＣＯＭ（登録商標）、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ）、ＣＶ−３０１（結腸、膀胱および乳房、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ）、ＭＶＡ−ＢＮ  ＰＲＯ、ＭＶＡ−ＢＮ  ＨＥＲ２、またはＭＶＡ−ＢＮ  Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃウェブサイトを参照されたい）が挙げられる。腫瘍ワクチンとしては、：ａ）ＣＤＸ−１４０１（ＮＣＩ）（黒色腫；寛解の状態にある卵巣がん、卵管がんまたは原発性腹膜がん；骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病に対するＤＥＣ−２０５／ＮＹ−ＥＳＯ−１融合タンパク質ワクチン）；ｂ）ＰＡＮＶＡＣ（ＮＣＩ）（ＭＵＣ１およびＣＥＡワクチン；非筋肉浸潤性膀胱がん、膵がん、乳がん）；ｃ）ＭＡＧＥ−Ａ３（ＧＳＫ）（黒色腫および非小細胞肺癌）；ｄ）ＰＲＡＭＥ（ＧＳＫ）（非小細胞肺癌、転移性皮膚がん）；ｅ）ＩＳＡ１０１（ＩＳＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（子宮頸がんに対するＨＰＶ１６合成の長いペプチドワクチン）；ｆ）ＩＳＡ２０３（ＩＳＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）（ＰＲＡＭＥ（黒色腫において優先的に発現する抗原））も挙げられる。
【０１８５】
ワクチンは、ＭＵＣ−１（またはＭＵＣ−１をコードする核酸）を含んでよい。ＭＵＣ−１は、Ｏ結合炭水化物で高密度にグリコシル化された高分子量糖タンパク質である。ＭＵＣ−１は、膜貫通産物およびその切断により短縮された分泌型（可溶性）産物の両方を含めたいくつかのアイソフォームで産生される。ＭＵＣ−１は、通常、腺上皮細胞の頂端表面に極性化して低レベルで発現する。がんでは、ＭＵＣ−１は極性を失い、高度に増加し、そのグリコシル化が減少する。ＭＵＣ−１は、結腸がん、肺がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、腎がん、胃がんおよび頭頸部がんを含めた、固体上皮腫瘍がんならびに最も一般的な非固形腫瘍の９０％超で発現される。低グリコシル化に起因して、腫瘍ＭＵＣ−１は、免疫系によって認識され、免疫応答を誘導し、それにより、ＭＵＣ−１特異的抗体および細胞傷害性Ｔ細胞の産生が導かれる。ＭＵＣ−１の腫瘍バリアントおよびそのペプチドが抗原として抗がんワクチンに使用されている。ＫｉｍｕｒａおよびＦｉｎｎ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、１３巻（１号）：３５〜４９頁、２０１３年；Ｋｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．  Ｒｅｓ．（Ｐｈｉｌａ）、６巻（１号）：１８〜２６頁、Ｅｐｕｂ、２０１２年１２月１７日を参照されたい。追加的な適切な抗原を下記の表に開示する。
【０１８６】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質、またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、化学療法剤または放射線療法と一緒に投与することができる。化学療法剤の例は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、天然物、ホルモンおよびそれらのアンタゴニストまたはシグナル伝達分子の小分子阻害剤である。アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシルなど）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が挙げられる。代謝拮抗薬の例としては、葉酸類似体（例えば、メトトレキサートなど）、ピリミジン類似体（例えば、５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびメルカプトプリンまたはチオグアニンなどのプリン類似体が挙げられる。天然物の例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマシンＣ（ｍｉｔｏｃｙｃｉｎ  Ｃ）など）、および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼなど）が挙げられる。種々の薬剤の例としては、白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレアなど）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジンなど）、および副腎皮質抑制薬（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。ホルモンおよびアンタゴニストの例としては、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾンなど）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ  ａｃｅｔａｔｅ）など）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェンなど）、ならびにアンドロゲン（例えば、テストステロンプロピオネート（ｔｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）およびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。小分子阻害剤の例としては、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有するヒトがんの処置に関してＦＤＡに認可されている、ベムラフェニブ（ＺＥＬＢＯＲＡＦ（登録商標））、ダブラフェニブ（ＴＡＦＩＮＬＡＲ（登録商標））およびトラメチニブ（ＭＥＫＩＮＩＳＴ（登録商標））が挙げられる。最も一般的に使用される化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン、シスプラチン、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはドセタキセルなどの他のタキサン）、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられ、いくつかのよ��新しい薬物として、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、イリノテカン（カンプトサー（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ＣＰＴ−１１）、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標）、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）ＳＴＩ−５７１、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）（カペシタビン）、ＺＥＶＥＬＩＮ（登録商標）およびカルシトリオールが挙げられる。
【０１８７】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質、またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸は、ステロイド性抗炎症剤または非ステロイド性抗炎症剤と併せて投与することができる。ステロイド性抗炎症剤としては、グルココルチコイド、デキサメタゾン、プレドニゾン、およびヒドロコルチゾンが挙げられる。非ステロイド性抗炎症剤としては、サリチラート（例えば、アセチルサリチル酸（アスピリン）、アモキシピリン、ベノリラート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）／ベノリラート（ｂｅｎｏｒｉｌａｔｅ）、サリチル酸コリンマグネシウム（ｃｈｏｌｉｎｅ  ｍａｇｎｅｓｉｕ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、ジフルニサル、エテンザミド、ファイスラミン（ｆａｉｓｌａｍｉｎｅ）、サリチル酸メチル、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸サリチル、サリチルアミドなど）、アリールアルカン酸（例えば、ジクロフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナク、ブロムフェナク、エトドラク、インドメタシン、ナブメトン、オキサメタシン、プログルメタシン、スリンダク、トルメチンなど）、２−アリールプロピオン酸（例えば、イブプロフェン、アルミノプロフェン、カルプロフェン、デクスイブプロフェン、デクスケトプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトロラク、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸など）、Ｎ−アリールアントラニル酸（例えば、メフェナム酸、フルフェナム酸、メクロフェナム酸、トルフェナム酸など）、ピラゾリジン誘導体（例えば、フェニルブタゾン、アンピロン、アザプロパゾン、クロフェゾン、ケブゾン、メタミゾール、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェナゾン、スルフィンピラゾンなど）、オキシカム（例えば、ピロキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、メロキシカム、テノキシカム（ｔｅｎｏｘｉｃａｍｏ）など）またはＣＯＸ−２阻害剤が挙げられる。
【０１８８】
一部の実施形態では、方法は、腫瘍抗原などの目的の抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞などのＴ細胞を治療有効量で投与することを含む。一例では、方法は、ドナーからＴ細胞を含む細胞の集団（例えば、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはリンパ節など）を単離し、これらの細胞を、目的の抗原を提示しているドナー由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の集団を用いて刺激し、それにより、目的の腫瘍抗原を認識するアロ反応性Ｔ細胞が枯渇した活性化ドナーＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含むドナー細胞の集団を生じさせることを含む。ドナーの活性化ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞の集団を治療有効量で、場合によりＩＬ−２と一緒にレシピエントに注入し、それにより、目的の抗原に対する免疫応答を生じさせる。当該方法により、レシピエントにおける抗腫瘍反応を誘導することができる。したがって、レシピエントにおいて腫瘍抗原などの目的の抗原に対する免疫応答が生じる。
【０１８９】
目的の抗原に由来する任意の抗原性ペプチド（例えば、免疫原性断片など）を使用して、その目的の抗原に特異的なＴ細胞の集団を生成させることができる。多数のそのような抗原性ペプチドが当技術分野で公知であり、例えば、下記の表を参照されたい。本開示は特定の抗原の使用に限定されない。目的の抗原の特定の例としては、これだけに限定されないが、表に示されているものなどの、腫瘍抗原である抗原が挙げられる。追加的な抗原性タンパク質は当技術分野で公知である（例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５４巻（３号）：１８７〜２０７頁、２００５年、およびＣｈｅｎら、Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ、４巻：４１〜８頁、２００２年を参照されたい）。
【表２】
2019504008.tif 000004
【０１９０】
表には、全長の目的の抗原が開示されているが、断片または全長タンパク質も本明細書に開示されている方法において使用することができることが当業者には理解されよう。一例では、目的の抗原は、全長抗原配列の「免疫原性断片」である。「免疫原性断片」とは、ＭＨＣの分子に関連して細胞によって提示されると、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、当該タンパク質を発現している細胞に対してＴ細胞を活性化することができる、タンパク質の一部を指す。一般には、ＭＨＣクラスＩ分子に結合するそのような断片は、全長抗原のうちの８〜１２個の連続したアミノ酸であるが、より長い断片も当然使用することができる。一部の例では、免疫原性断片は、エピトープ配列のさらなるプロセシングを伴わずにＡＰＣの表面上のＭＨＣ分子に特異的に結合することができるものである。特定の例では、免疫原性断片は、全長抗原配列からの８〜５０個の連続したアミノ酸、例えば、全長抗原配列からの８〜２０個のアミノ酸、８〜１５個のアミノ酸、８〜１２個のアミノ酸、８〜１０個のアミノ酸、または８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個または２０個の連続したアミノ酸などである。一部の例では、ＡＰＣを免疫原性断片と一緒に、免疫原性断片が細胞内プロセシングを必要とせずにＡＰＣ表面上のＭＨＣ分子に特異的に結合するのに十分な条件下でインキュベートする。
【０１９１】
一般に、ＡＰＣおよびＴ細胞は自己由来のものである。具体的な非限定例では、ＡＰＣとレスポンダーＴ細胞は同じ個体に由来するものである。しかし、ＡＰＣおよびレスポンダーＴ細胞は、同系のものであってよい。ＡＰＣを使用して任意の抗原を自己由来Ｔ細胞の集団に提示することができる。ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する抗原性ペプチドをｅｘ  ｖｉｖｏにおいて生成し（例えば、細胞内で全長のタンパク質からプロセシングする代わりに）、細胞表面上のＭＨＣ  Ｉ分子およびＭＨＣ  ＩＩ分子と相互作用（例えば、結合）させることができることが当業者には理解されよう。一般に、ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのどちらにも関連して抗原を提示する。
【０１９２】
一例では、ＡＰＣと一緒にインキュベートした目的の抗原は、目的の抗原からのアミノ酸配列（例えば、目的の抗原からの８〜５０個の連続したアミノ酸、例えば、８〜１５個または８〜１２個の連続したアミノ酸など）を含む融合タンパク質である。したがって、一連のＭＨＣ結合性エピトープを単一の抗原性ポリペプチドに含めることもでき、単鎖三量体を利用することもでき、ここで、各三量体は、ＭＨＣクラスＩ分子、ｂ２ミクログロブリン、および目的の抗原性ペプチドを有する（Ｎａｔｕｒｅ、２００５年；４３６巻、５７８頁を参照されたい）。一部の例では単一の抗原のみを使用するが、他の実施形態では１種よりも多くの抗原、例えば、少なくとも２種の異なる抗原、少なくとも３種の異なる抗原、少なくとも４種の異なる抗原、少なくとも５種の異なる抗原、少なくとも１０種の異なる抗原、少なくとも１５種の異なる抗原、少なくとも２０種の異なる抗原、またはさらには少なくとも５０種の異なる抗原を使用する。
【０１９３】
ＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質またはＤＮ−ＴＮＦ−αタンパク質をコードする核酸に加えて、治療有効量の抗原特異的Ｔ細胞を被験体に投与することができる。治療有効量の精製された抗原特異的Ｔ細胞の特定の非限定例としては、被験体１キログラム当たり細胞約１×１０５個〜被験体１キログラム当たり細胞約１×１０９個、例えば、１キログラム当たり細胞約１×１０６個〜１キログラム当たり細胞約１×１０８個など、例えば、１キログラム当たり細胞約５×１０６個〜１キログラム当たり細胞約７５×１０６個など、例えば、１キログラム当たり細胞約２５×１０６個など、または１キログラム当たり細胞約５０×１０６個の用量で投与される精製された抗原特異的Ｔ細胞が挙げられる。精製された抗原特異的Ｔ細胞は、臨床医によって決定される通り単回用量によって投与することも複数回用量によって投与することもできる。例えば、細胞を、所望の応答および得られた応答に応じて、およそ２週間の間隔で投与することができる。投与は、局所的なものであっても全身的なものであってもよい。
【０１９４】
本開示を以下の非限定例によって例示する。
【実施例】
【０１９５】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、発癌現象の強力なプロモーターであり、がん予防のための潜在的に重要な標的である。ＴＮＦは、機能的に別個の膜貫通分子および可溶性分子（それぞれｔｍＴＮＦおよびｓＴＮＦ）として産生される。マウスにおける化学的に誘導される発癌現象へのｔｍＴＮＦおよびｓＴＮＦの関与が調査された（Ｓｏｂｏ−Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ，  Ａ．ら、２０１６年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．、４巻（５号）：４４１〜５１頁、参照により本明細書に組み込まれる）。ドミナントネガティブＴＮＦ生物製剤（ＤＮ−ＴＮＦ）およびｓＴＮＦの特異的なアンタゴニストであるＸＰＲＯ（商標）１５９５の腹腔内注射により、腫瘍の発生数および成長が著しく低下し、３−メチルコラントレン（ＭＣＡ）を注射したマウスの生存が延長されたことが決定された。両方のＴＮＦ形態をＴＮＦ受容体２−Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ２−Ｆｃ）処置またはＴＮＦ遺伝子欠失のいずれかによって排除した後にも同様の結果が得られた。さらに、ｓＴＮＦと優先的に相互作用するＴＮＦＲ１の遺伝子欠失ではＭＣＡ誘導性発癌現象が一時的に遮断されたが、ｔｍＴＮＦと優先的に相互作用するＴＮＦＲ２の遺伝子欠失ではＭＣＡ誘導性発癌現象が増強された。ＭＣＡにより、発癌現象の誘導と同時に、循環ＩＬ−１αレベル、ならびに、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の増大、ＳＴＡＴ３リン酸化および脾細胞の間での免疫抑制活性が増強された。著しく対照的に、ＤＮ−ＴＮＦによる処置により、ＭＣＡを注射したマウスの末梢血中において、ＩＬ−１αが劇的に減少し、中心的な免疫調節性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１７が劇的に増加した。さらに、ＤＮ−ＴＮＦによる処置、ＴＮＦＲ２−Ｆｃによる処置および／またはＴＮＦＲ２ではなくＴＮＦもしくはＴＮＦＲ１の遺伝子欠失により、ＭＣＡを注射したマウスにおけるＭＤＳＣ増大、ＳＴＡＴ３リン酸化および免疫抑制が予防された。ｓＴＮＦがＭＤＳＣの中心的な調節因子であり、かつ発癌現象の必須のプロモーターであることが決定され、それにより、ｓＴＮＦががん予防のための有意な標的になり得ることが示される。参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｊｕａｎｏｖｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、４巻：４４１〜４５１頁、２０１６年、ＤＯＩ：  １０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１５−０１０４も参照されたい。
【０１９６】
（実施例１）
材料および方法
マウス
８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）雌マウス、Ｔ細胞／Ｂ細胞欠損ＳＣＩＤ（Ｂ６；１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１ｍｏｍ／Ｊ）雌マウス、ＴＮＦ欠損（ＴＮＦｋｏ、Ｂ６；１２９Ｓ−Ｔｎｆｔｍ１Ｇｋｌ／Ｊ）雌マウス、ＴＮＦＲ１欠損（ＴＮＦＲ１ｋｏ、Ｂ６；１２９Ｓ−Ｔｎｆｒｓｆ１ａｔｍ１Ｉｍｘ  Ｉｌ１ｒ１ｔｍ１Ｉｍｘ／Ｊ）雌マウスおよびＴＮＦＲ２欠損（ＴＮＦＲ２ｋｏ、Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｔｎｆｒｓｆ１ｂｔｍ１Ｍｗｍ／Ｊ）雌マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。マウスを、国際的に認可された動物設備内に収容した。承認されたプロトコールに従って動物試験を実施した。
【０１９７】
試薬
以下の試薬、抗体およびキットを本試験に使用した：組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）；ＴＬＲ４リガンド、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）；ヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト、ＥＮＢＲＥＬ；Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）；ＸＰＲＯ（商標）１５９５ドミナントネガティブＴＮＦ構築物（ＤＮ−ＴＮＦ；Ｘｅｎｃｏｒ、Ｍｏｎｒｏｖｉａ、ＣＡ）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートした抗ＣＤ３モノクローナル抗体、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、抗ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体および抗ＣＤ４５Ｒモノクローナル抗体（ｍＡｂ）；フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートした抗ＣＤ３  ｍＡｂ、抗Ｇｒ１（Ｌｙ−６Ｇ）ｍＡｂ、抗ＣＤ２５  ｍＡｂ、抗ＮＫ１．１（Ｌｙ５５）ｍＡｂ、抗ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）ｍＡｂ、抗ＣＤ１１ｃ  ｍＡｂおよび抗Ｆ４／８０  ｍＡｂ；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートした抗Ｌｙ６Ｃ  ｍＡｂ、抗ＦｏｘＰ３  ｍＡｂおよび抗ＣＤ８  ｍＡｂ（すべてマウスＣＤに対するもの）；ならびに、対応する、蛍光色素とコンジュゲートしたアイソタイプ対照ｍＡｂ（全てｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡからのｍＡｂ）；リン酸化ｐＳＴＡＴ３に対するＰＥとコンジュゲートしたＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ（ＳＴＡＴ３  Ｔｙｒ７０５、ｐＳＴＡＴ３  Ｓｅｒ７２７）およびアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；マウスＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＩＦＮ−γ酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ならびにＭｉｌｌｉｐｏｒｅマウス３２プレックスサイトカインキット（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）。
【０１９８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける発癌現象の誘導、処置および測定
野生型Ｂ６マウスならびにＴＮＦ欠損Ｂ６マウス、ＴＮＦＲ１欠損Ｂ６マウスおよびＴＮＦＲ２欠損Ｂ６マウスの剃毛した背側領域に、ゴマ油０．１ｍＬに溶解させた３−メチルコラントレン（ＭＣＡ）０．１ｍｇ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。次いで、結果に記載の通り、野生型Ｂ６マウスをランダム化によって各々マウス１０〜１５匹の群に分けた。ＰＢＳ、ＸＰＲＯ（商標）１５９５−ＤＮ−ＴＮＦおよびＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ＥＮＢＲＥＬ（マウス１匹当たり２００μｇ／ＰＢＳ  ０．５ｍＬ）を、ＭＣＡを注射した日から開始して週に２回、１２週間にわたって腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。週２回、触診によって直径２ｍｍの腫瘍の出現を検出した。その後の腫瘍成長を、２つの垂直方向の腫瘍の直径を週２回カリパスで測定することによって決定した。データは、確立された個々の腫瘍の２つの腫瘍の直径の掛け算およびそれらの平均値として示されている。マウスの生存を毎日スコア化した。
【０１９９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＤＣ／ＮＫ細胞クロストーク抑制の評価
内在性ＤＣ／ＮＫ細胞クロストークを以下の通り評価した。未処置の野生型マウスおよび処置した野生型マウスの脾細胞（２×１０６個／ｍＬ）を、ＲＰＭＩ−１６４０培地、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および５０μＭの２−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）からなり、１μｇ／ｍＬのＬＰＳおよび６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充した完全細胞培養培地（ＣＭ）に再懸濁させた。細胞懸濁物（１００，０００細胞／２００μＬ／ウェル）を９６ウェル丸底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０２００】
ＤＣ／ＮＫ細胞クロストークの細胞媒介性抑制の評価を以下の通り実施した：ＳＣＩＤマウス脾細胞（１００，０００／ウェル、５０％ＮＫ１．１＋ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞および３０％ＣＤ１１ｃ＋ｉＤＣ、および２０％Ｆ４／８０＋単球／マクロファージの混合物）ならびに未処置の野生型マウスまたは処置した野生型マウスの脾細胞（１００，０００／ウェルおよび３００，０００／ウェル）の、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を補充したＣＭ中懸濁物を９６ウェル丸底プレートに混合して播種し、３７℃で２４時間（ｈ）インキュベートした。アッセイは三連で実施した。インキュベーション後、無細胞上清を回収し、ＩＦＮ−γの存在についてＥＬＩＳＡを使用して調査した。
【０２０１】
フローサイトメトリー
蛍光色素とコンジュゲートした抗体を用いた標準の細胞表面フローサイトメトリーを以前に記載されている通り実施した（１７）。Ｂ細胞（ＣＤ４５Ｒ＋Ｆ４／８０−）、マクロファージ（ＣＤ４５Ｒ−Ｆ４／８０＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ．１．１＋またはＣＤ３−ＮＫｐ４６＋）、ならびにＤＣ（ＣＤ１１ｂ±ＣＤ１１ｃ＋）、ＣＤ４（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−）およびＣＤ８（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８＋）Ｔ細胞、単球性（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒｌｏ／−Ｌｙ６Ｃ＋／ｈｉ）および顆粒球性（ＣＤ１１ｂ＋ＧｒｈｉＬｙ６Ｃ＋）ＭＤＳＣを、直接、多色細胞表面染色を使用して調査した。Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５ｈｉ）をＴｒｅｇキット製造者プロトコール（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って調査した。リン酸化ＳＴＡＴ３を以前に記載されている通り調査した（２１）。細胞をＣｙａｎ  Ｂｌｕｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）で分析した。フローサイトメトリーデータの解析をＳｕｍｍｉｔ  ４．３  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して実施した。
【０２０２】
サイトカインの定量化
末梢血血清中のサイトカインを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチプレックスマウス−サイトカインキットを使用し、この会社によって推奨されている通り定量化した。Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅマウス−ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ）を使用して細胞培養馴化培地中のＩＦＮ−γを測定した。血清または細胞培養馴化培地１ｍＬ中のサイトカインの量を決定した。
【０２０３】
統計学
データを、ＳＰＳＳ（バージョン１０．０  ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）およびＲ（バージョン３．０．２、Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇウェブサイトを参照されたい）プログラムパッケージを使用して統計学的に評価した。データは平均±ＳＤとして報告されている。データの統計的有意性を、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。さらに、カプラン・マイヤー方法を使用して、がんの出現までの時間（腫瘍発生に対する累積的ハザード）および生存を分析した。厳密なログランク検定を使用して、実験群と対照群のがんの出現までの時間および生存曲線を比較した。ｐ値≦０．０５を有意であるとみなした。
【０２０４】
（実施例２）
ＭＣＡ誘導性発癌現象は可溶性ＴＮＦの選択的な隔離によって予防される
ＤＮ−ＴＮＦにより、ｔｍＴＮＦに影響を及ぼすことなくｓＴＮＦが選択的に隔離され、細胞内病原体およびがんを制御する主要な免疫機構に影響を及ぼすことなく炎症性反応が阻害される（Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、２０１１年；５０巻：１５９〜７４頁；Ｖａｎ  Ｈａｕｗｅｒｍｅｉｒｅｎら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１１年；２２巻：３１１〜９頁）。対照的に、ＴＮＦＲ２−Ｆｃでは、ｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦがどちらも中和され、炎症性反応および主要な免疫機構の両方が阻害される（Ｘｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年；１０９巻：３３３３〜４１頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年；１１６巻：５７５〜５８３頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｓ．、２０１１年；５０巻：１５９〜７４頁；Ｖａｎ  Ｈａｕｗｅｒｍｅｉｒｅｎら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１１年；２２巻：３１１〜９頁）。ＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰＲＯ（商標）１５９５およびＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ＥＮＢＲＥＬの影響を、最初に、野生型Ｂ６マウスにおけるＭＣＡ誘導性発癌現象に関して調査した（図１Ａ）。処置にかかわらず全てのマウスにおいてＭＣＡ注射後第４週に小さな４ｍｍ２の腫瘍が出現し始めることが見いだされた。初発の腫瘍は、ＰＢＳで処置したマウスにおいて、ＥＮＢＲＥＬで処置したマウス、特に、ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスにおけるものよりも著しく頻度が高かった。ＰＢＳで処置したマウスとＥＮＢＲＥＬで処置したマウス、ＰＢＳで処置したマウスとＤＮ−ＴＮＦで処置したマウス、またはＥＮＢＲＥＬで処置したマウスとＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスの腫瘍頻度の差異は有意であった（それぞれｐ＝０．００９、ｐ＜０．００００５、およびｐ＝０．０２７）。
【０２０５】
最初の所見を確認するため、ならびに化学的に誘導された発癌現象におけるｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの役割をより深く評価するために、野生型マウスにおけるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による処置およびＤＮ−ＴＮＦによる処置（ｓＴＮＦ−隔離）の影響を、遺伝子欠損マウスにおけるＴＮＦ欠失、ＴＮＦＲ１欠失およびＴＮＦＲ２欠失（排除：ｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦ、それぞれｓＴＮＦ受容体およびｔｍＴＮＦ受容体）のＭＣＡ誘導性発癌現象に対する影響と共に調査した。本実験では、腫瘍発生数（図１Ｂ）、腫瘍サイズ（図１Ｃ）および生存（図１Ｄ）をモニターした。腫瘍出現の時間および発生数は実験群間で変動した（図１Ｂ）。ＰＢＳで処置した野生型および未処置のＴＮＦＲ２欠損マウスでは、初期に大多数の動物において４ｍｍ２の初発腫瘍が出現した（第４週：それぞれ６／１０および７／１０のマウス）。これらの試験群では、腫瘍発生数はそれぞれ第６週および第１０週に最大（８／１０のマウス）に達した。著しく対照的に、野生型マウスにおけるＤＮ−ＴＮＦによるｓＴＮＦの特異的隔離、ＴＮＦＲ１をノックアウトすることによるｓＴＮＦ活性の排除、またはＴＮＦをノックアウトすることによるｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方の排除により、腫瘍の出現の遅延（３〜４週間）および頻度の低下（それぞれ１／１０、２／１０および２／１０のマウス）が導かれた。ＭＣＡ注射後第９週において、低腫瘍発生数はＴＮＦ欠損マウスおよびＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスでは変化しないままであったが、ＴＮＦＲ１欠損マウスでは特に上昇した（２／１０のマウスから６／１０のマウスまで）。ＰＢＳで処置したマウスと、ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウス、ＴＮＦ欠損マウスまたはＴＮＦＲ１欠損マウスとの間の腫瘍頻度の差異は有意であった（それぞれｐ＝０．０００７、ｐ＝０．００１６、およびｐ＝０．０３１）。同様に、ＴＮＦＲ２欠損マウスと、ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウス、ＴＮＦ欠損マウスまたはＴＮＦＲ１欠損マウスとの間の腫瘍頻度の差異も有意であった（それぞれｐ＝０．００１３、ｐ＝０．００２６およびｐ＝０．０２９）。
【０２０６】
腫瘍は、マウスの全ての群において、ＭＣＡ注射後第１０週までゆっくりと成長したまたは休止状態のままであった。その後、腫瘍の頻度が高い試験群（ＰＢＳで処置した野生型マウスおよびＴＮＦＲ１欠損マウスおよびＴＮＦＲ２欠損マウス）では、腫瘍は、測定の全時点において、各群内で種々の速度で成長し、サイズは広範に異なった。著しく対照的に、ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスおよびＴＮＦ欠損マウスにおける頻度が低い腫瘍は小さく（４〜９ｍｍ２）、ＭＣＡ注射後第１２週まで休止状態のままであった。したがって、ＭＣＡ注射後第１０週と第１４週の間、腫瘍は、ＰＢＳで処置したマウス、ＴＮＦＲ１欠損マウスおよびＴＮＦＲ２欠損マウスにおいて、ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスおよびＴＮＦ欠損マウスよりも有意に大きかった（それぞれ、ＤＮ−ＴＮＦに対して：ｐ＝０．０１７、ｐ＝０．０２３およびｐ＝０．０２９；ＴＮＦノックアウトに対して：ｐ＝０．０２７、ｐ＝０．０３１およびｐ＝０．０３６）（図１Ｃ）。
【０２０７】
ＤＮ−ＴＮＦで処置した野生型およびＴＮＦ欠損マウスにおいて、ＰＢＳで処置した野生型マウス、ＴＮＦＲ１欠損マウスおよびＴＮＦＲ２欠損マウスよりも腫瘍頻度が著しく低いことおよび腫瘍成長が遅いことにより、マウス生存の有意な延長がもたらされた。実験のエンドポイントであるＭＣＡ注射後１１２日目（第１６週）において、９／１０のＤＮ−ＴＮＦで処置した野生型マウスおよび１０／１０のＴＮＦ欠損マウスが生存していた。著しく対照的に、ＴＮＦＲ１欠損マウスでは５／１０のみ（ＤＮ−ＴＮＦおよびＴＮＦｋｏに対して：それぞれｐ＝０．００１、ｐ＝０．００３）、ＰＢＳで処置したマウスでは４／１０のみ（ＤＮ−ＴＮＦおよびＴＮＦｋｏに対して：それぞれｐ＝０．００２６、ｐ＝０．００３７）およびＴＮＦＲ２欠損マウスでは１／１０のみ（ＤＮ−ＴＮＦおよびＴＮＦｋｏに対して：それぞれｐ＝０．０００３３、ｐ＝０．０００１２）が生存していた（図１Ｄ）。
【０２０８】
これらの所見から、ｓＴＮＦはＭＣＡ誘導性発癌現象に関して重要であるが、ｔｍＴＮＦはなくてもいいことが実証される。これらの所見から、ｔｍＴＮＦがｓＴＮＦとは対照的に、発癌現象において保護的な役割を有することも示される。
【０２０９】
（実施例３）
ｓＴＮＦの隔離により、ＭＣＡを注射したマウスにおける免疫調節性サイトカインがモジュレートされる
ＭＣＡ誘導性がんは、免疫原性である（Ｃｉｃｉｎｎａｔｉら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、２００５年；１３巻：９６１〜７０頁）。したがって、ｓＴＮＦ排除後、抗腫瘍免疫応答の改変および／または増強により、ＭＣＡ誘導性発癌現象に対する抵抗性の増大が引き起こされ得る。分泌型サイトカインの型および数量により、抗腫瘍免疫応答の型および効果が規定される。ＭＣＡ注射の２週間後に、健康／未処置（対照）マウスおよびＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置したマウス、ＥＮＢＲＥＬで処置したマウスまたはＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスの血清中のサイトカインのレベルを調査した（図２）。ＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置したマウスでは、それぞれ中心的な炎症促進性Ｔｈ１サイトカインおよびＴｈ１７サイトカインである、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０およびＩＬ−１７は、対照マウスと比べて変化しなかった（ＩＬ−１β、ＩＬ−１７；図２Ａ、２Ｃ）か、またはわずかに減少した（ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０、図２Ｂ）。著しく対照的に、ＭＣＡを注射した／ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウスではこれらのサイトカインのレベルが有意に上昇した（ＩＬ−１β：ｐ＝０．０２６；ＩＬ−１２ｐ４０／７０：ｐ＝０．０５；ＩＬ−１７；ｐ＝０．０３９）。ＭＣＡを注射した／ＥＮＢＲＥＬで処置したマウスではサイトカインは変化しなかった。対照的に、ＩＬ−１αレベルは、対照マウスにおいて高く、ＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置したマウスでは特に上昇したが、ＥＮＢＲＥＬ処置（ｐ＝０．０１２）またはＤＮ−ＴＮＦ処置（ｐ＝０．０２３）により、対照レベルを下回って強力に低下した。これらの所見から、ＭＣＡを注射したマウスにおけるインフラマソーム（ＩＬ−１β）応答、Ｔｈ１（ＩＬ−１２）応答およびＴｈ１７（ＩＬ−１７）応答がｓＴＮＦにより抑制され、ｓＴＮＦの隔離により可能になることが示される。これらの応答は健康／未処置対照およびＭＣＡを注射した／ＥＮＢＲＥＬで処置したマウス（ｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方が中和された）では異ならなかったので、ｓＴＮＦの隔離後の応答の増大は、ｔｍＴＮＦによって媒介される可能性がある。さらに、ＩＬ−１αの高いベースラインおよびＭＣＡにより誘導される強化はＥＮＢＲＥＬまたはＤＮ−ＴＮＦにより強力に抑制され、このことから、ｓＴＮＦによりＩＬ−１αが上方制御されることが示される。興味深いことに、この発癌現象の初期には、ｓＴＮＦはＭＣＡを注射した／未処置または処置したマウスの血清において検出可能でなかった。したがって、ｓＴＮＦは、最初は標的組織にのみ生物学的に有意な分量で存在する可能性がある。
【０２１０】
（実施例４）
ＭＤＳＣ増大はＭＣＡにより誘導され、ｓＴＮＦ隔離により妨げられる
発がん物質およびがんのどちらによっても強力な免疫抑制が誘導され、それにより、がんの発生および成長が可能になり得る（ＷｏｊｄａｎｉおよびＡｌｆｒｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９８４年；４４巻：９４２〜５頁；Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９年；５９巻：２９５０〜６頁；Ｂａｓｋｉｃら、Ｈｅａｄ  ＆  Ｎｅｃｋ、２０１３年；３５巻：３８８〜９８頁）。ＭＤＳＣは、主要な免疫機能を強力に抑制する未成熟骨髄細胞の不均一な集団である（ＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈおよびＮａｇａｒａｊ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年；９巻：１６２〜１７４頁；ＮａｇａｒａｊおよびＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ、２０１０年；１６巻：３４８〜５３頁）。ＭＤＳＣは健康な生物体では希少であるが、がん宿主骨髄、末梢リンパ組織および腫瘍ではそれらの頻度および活性が高度に増大する。ＭＤＳＣは、腫瘍の免疫エスケープおよび免疫療法の不首尾に寄与すると考えられている。しかし、化学的に誘導された発癌現象および免疫抑制におけるＭＤＳＣの存在および役割はまだ探求されていない（ＮａｇａｒａｊおよびＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ、２０１０年；１６巻：３４８〜５３頁）。ＭＣＡ注射による発癌現象の誘導ならびに／またはｓＴＮＦおよび／もしくはｔｍＴＮＦの排除による発癌現象の予防により、ＭＤＳＣ（図６、図３Ａ〜３Ｄ）および／またはマクロファージ（図７）の頻度の変化が導かれる。ＭＣＡにより、野生型マウスの脾臓における単球性ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｌｏ／−Ｌｙ６Ｃ＋／ｈｉ、図３Ａ、３Ｂ）および顆粒球性ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１ｈｉＬｙ６Ｃ＋、図３Ｃ、３Ｄ）の増加が誘導された。ＭＤＳＣの頻度の増大は、ＭＣＡ誘導性発癌現象の、がん開始段階で注目すべきものであり（１４日目：それぞれ１．４倍および１．３倍）、確立された腫瘍の段階で高度に強化された（８４日目：それぞれ６．７倍および６．８倍）。対照的に、脾臓Ｆ４／８０＋マクロファージの頻度はＭＣＡ注射後に有意に変化しなかった（図７Ｃ、７Ｄ）。しかし、ＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ＥＮＢＲＥＬによる両方のＴＮＦ型の中和により、腫瘍を有さない、ＭＣＡを注射したマウスおよび腫瘍を有する、ＭＣＡを注射したマウスにおいて両方の時点で、単球性ＭＤＳＣおよび顆粒球性ＭＤＳＣの両方ならびにマクロファージの頻度が低下した。驚くべきことに、腫瘍を有さない、ＭＣＡを注射したマウスおよび腫瘍を有する、ＭＣＡを注射したマウスにおいて、どちらの時点においても、ＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰＲＯ（商標）１５９５によるｓＴＮＦの隔離は、単球性ＭＤＳＣ、顆粒球性ＭＤＳＣおよびマクロファージの頻度が、それらの正常／未処置対照レベルまでまたはそれ未満に一定してかつ強力に低下した。ＭＤＳＣ頻度のＤＮ−ＴＮＦにより誘導される低下は、ＥＮＢＲＥＬによって誘導される低下よりも顕著であった。ＭＣＡを注射した、腫瘍を有する、両方のＴＮＦ型を欠くＴＮＦ欠損マウスおよびｓＴＮＦ受容体を欠くＴＮＦＲ１欠損マウスにおいても、ＭＤＳＣおよびマクロファージ頻度の同様の低下が観察された。ＭＣＡを注射した、ＤＮ−ＴＮＦで処置したまたはＥＮＢＲＥＬで処置した野生型マ��スおよびＴＮＦ欠損マウスまたはＴＮＦＲ１欠損マウスとは著しく対照的に、かつ、ＭＣＡを注射した、ＰＢＳで処置した野生型マウスと同様に、ＭＣＡを注射した、ｔｍＴＮＦ受容体を欠くＴＮＦＲ２欠損マウスでは、健康／未処置対照マウスと比較して、単球性ＭＤＳＣおよび顆粒球性ＭＤＳＣのどちらの頻度も高度に増大しており、マクロファージの頻度は変化していなかった。驚いたことに、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ頻度は、ＭＣＡを注射したマウスの群の全てにおいて変化しないことが見いだされた。これらのデータから、ＭＣＡにより、発癌現象中のＭＤＳＣ増大が誘導されることが示される。驚くべきことに、ＭＣＡ誘導性ＭＤＳＣの増大およびマクロファージ集団の維持にはｓＴＮＦが必要であるが、ｔｍＴＮＦは必要ではないこと、ならびに選択的なｓＴＮＦ阻害剤ＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰＲＯ（商標）１５９５を用いた処置によりＭＤＳＣ増大が効率的に予防されることも証明された。
【０２１１】
（実施例５）
ＭＣＡにより骨髄細胞におけるｓＴＮＦ依存性ＳＴＡＴ３活性化が誘導される
ＳＴＡＴ３は、ＭＤＳＣの発生および機能の調節において必須の役割を果たす転写因子である（ＮａｇａｒａｊおよびＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ、２０１０年；１６巻：３４８〜５３頁；Ｖａｓｑｕｅｚ−Ｄｕｎｄｄｅｌら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、２０１３年；１２３巻：１５８０〜９頁）。ＳＴＡＴ３のリン酸化された活性な形態（ｐＳＴＡＴ３）は、ＭＤＳＣの特質であると考えられる。発がん物質に誘導されるｓＴＮＦ依存性ＭＤＳＣの増大を検証するために、ＭＣＡにより骨髄細胞におけるｓＴＮＦ依存性ｐＳＴＡＴ３が誘導されるかどうかを調査した。健康／未処置対照およびＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置した野生型マウス、ＥＮＢＲＥＬで処置した野生型マウスまたはＤＮ−ＴＮＦで処置した野生型マウスの脾細胞をＭＣＡ注射の８４日後に回収し、フローサイトメトリーによってｐＳＴＡＴ３ｙ７０５残基およびｐＳＴＡＴ３ｓ７２７残基の存在について調査した（図４）。単球および顆粒球を、前方散乱（サイズ）および側方散乱（粒度）により、それぞれ非顆粒／大きな細胞および顆粒／中型の細胞として定義した（図８）。細胞集団の正体を、蛍光色素とコンジュゲートした、Ｇｒ−１に対する抗体、ＣＤ１１ｂに対する抗体、Ｌｙ６Ｃに対する抗体およびＦ４／８０に対する抗体を用いてそれらを標識することを使用して確認した（図６および７）。対照マウスでは、ｐＳＴＡＴ３を発現する脾臓の単球および顆粒球の頻度は低かった（図４）。著しく対照的に、ＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置したマウスでは、ＳＴＡＴ３ｙ７０５＋（図４Ａ、４Ｂ）およびｐＳＴＡＴ３ｓ７２７＋（図４Ｃ、４Ｄ）単球（図４Ａ、４Ｃ）および顆粒球（図４Ｂ、４Ｄ）の頻度が高度にかつ同様に上昇した。ｐＳＴＡＴ３＋細胞の頻度のＭＣＡにより誘導される増大は、腫瘍を有さないマウスおよび腫瘍を有するマウスのどちらにおいてもＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ＥＮＢＲＥＬまたはＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰＲＯ（商標）１５９５による処置により予防された。これらのデータから、ＭＣＡおよび／またはＭＣＡ誘導性腫瘍により、骨髄細胞における必須のＭＤＳＣ転写因子ＳＴＡＴ３が活性化することが示され、これは、ＭＤＳＣ増大と並行し、相関する。ｓＴＮＦが、ＭＣＡに誘導されるＭＤＳＣの増大に関して重要であるだけでなく、骨髄細胞におけるＳＴＡＴ３のＭＣＡにより誘導される活性化に関しても重要であることも示される。
【０２１２】
（実施例６）
ＮＫ細胞／ＤＣクロストークの細胞媒介性抑制はＭＣＡにより誘導され、ｓＴＮＦ阻害により妨げられる
ＮＫ細胞／ＤＣクロストークは、自然免疫応答および獲得免疫応答の型および程度を定義する中心的な免疫調節機構である（Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００２年；２巻：９５７〜６４頁；Ｃｏｏｐｅｒら、ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４年；２５巻：４７〜５２頁；Ｗａｌｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年；１０６巻：２２５２〜８頁）。がんの成長を効率的に制御する高いＴｈ１応答を導くクロストークは、主に細胞間接触およびｔｍＴＮＦによって媒介されることが以前に決定された（Ｘｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年；１０９巻：３３３３〜４１頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年；１１６巻：５７５〜５８３頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、２０１１年；５０巻：１５９〜７４頁、Ｍａｋａｒｅｎｋｏｖａら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ、２００５年；７７巻：４０８〜１３頁）。発がん物質および腫瘍により、ＮＫ細胞および／またはＤＣが抑制され（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９９年；５９巻：２９５０〜６頁．；Ｂａｓｋｉｃら、Ｈｅａｄ  ＆  Ｎｅｃｋ、２０１３年；３５巻：３８８〜９８頁；Ｇｏｒｅｌｉｋら、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ、１９８１年；６７巻：１３１７〜２２頁；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６年；１７０巻：１０１〜１０頁；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１９９７年；３巻：４８３〜９０頁）、それにより、ＮＫ細胞／ＤＣクロストークができなくなり、発癌現象および腫瘍成長が可能になる可能性がある。ＭＣＡにより、ｓＴＮＦ依存性発癌現象、ＮＫ細胞／ＤＣクロストークにおいて上方制御される中心的な免疫調節性サイトカインの抑制、およびＭＤＳＣの増大も同時に誘導されるので、ＮＫ細胞／ＤＣクロストークのＭＤＳＣ媒介性抑制がＭＣＡ誘導性免疫抑制機構であるかどうかを調査した（図５）。健康／未処置対照およびＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置した野生型マウス、ＥＮＢＲＥＬで処置した野生型マウスおよびＤＮ−ＴＮＦで処置した野生型マウスの脾細胞の間で内在性ＮＫ細胞／ＤＣクロストークを最初に評価した（図５Ａ、５Ｂ）。脾細胞を、ＩＬ−２およびＬＰＳを用いて刺激してそれぞれＮＫ細胞およびＤＣを活性化し、それらのクロストークおよびＩＦＮγ分泌を促進した（Ｘｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年；１０９巻：３３３３〜４１頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年；１１６巻：５７５〜５８３頁）。ＩＬ−２／ＬＰＳによる刺激により、対照脾細胞（対照２）において、それらの刺激していない対応物（対照１）と比べてＮＫ細胞／ＤＣクロストークおよびＩＦＮγ分泌の増強が誘導された。発がん物質注射の１４日後および８４日後のどちらにおいても、ＭＣＡの８４日後のＤＮ−ＴＮＦで処置した腫瘍を有さないマウス以外は、処置にかかわらず、ＭＣＡを注射したマウス全てのＩＬ−２／ＬＰＳで刺激した脾細胞で、Ｔｈ１応答の有意な低下が示された（図５Ａ、５Ｂ）。活性の低下は、ＥＮＢＲＥＬで処置したマウスの脾細胞において特に明白であった。これらの所見から、ＮＫ細胞／ＤＣクロストークがＭＣＡ誘導性発癌現象全体��通して抑制されることが示される。ＥＮＢＲＥＬで処置したマウス全てにおけるＮＫ細胞／ＤＣクロストークの抑制の増強、およびＭＣＡ後８４日目のＤＮ−ＴＮＦで処置した腫瘍を有さないマウスにおける抑制の欠如から、内在性ＮＫ細胞／ＤＣクロストークがｔｍＴＮＦによって媒介されることが確認され（Ｘｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年；１０９巻：３３３３〜４１頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年；１１６巻：５７５〜５８３頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、２０１１年；５０巻：１５９〜７４頁）、また、ＭＣＡ誘導性抑制におけるｓＴＮＦの潜在的な関与が示される。
【０２１３】
ＭＣＡ誘導性ＭＤＳＣによりＮＫ細胞／ＤＣクロストークを抑制することができるかどうかを直接評価した。これらの実験では、レスポンダー細胞（レスポンダー）は、５０％がＮＫ細胞、３０％がＤＣおよび２０％が単球／マクロファージで構成されるＳＣＩＤマウス脾細胞であった。刺激因子／サプレッサー細胞（刺激因子／サプレッサー）は、ＭＣＡ注射後１４日目および８４日目に得た、健康／未処置（対照）野生型マウス、ＭＣＡを注射した／ＰＢＳで処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＰＢＳ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＰＢＳ−Ｔ）、ＭＣＡを注射した／ＥＮＢＲＥＬで処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＥＮ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＥＮ−Ｔ）およびＭＣＡを注射した／ＤＮ−ＴＮＦで処置した野生型マウス（腫瘍を有さない：ＭＣＡ／ＤＮ；腫瘍を有する：ＭＣＡ／ＤＮ−Ｔ）の脾細胞であった。レスポンダーと刺激因子／サプレッサーを、単独でまたは１：１の比および１：３の比で混合して、ＩＬ−２／ＬＰＳの存在下、細胞間接触下で２４時間にわたってインキュベートした。ＭＣＡ注射後１４日目（図５Ｃ）および８４日目（図５Ｄ）に回収したマウスの脾細胞を使用して、極めて類似した結果が得られた。どちらの時点でも、ＳＣＩＤ  ＮＫ細胞とＤＣは強力に相互作用し、大量のＩＦＮγが分泌された（ＳＣＩＤ：対照、１．０：０．０）。反応は、ＳＣＩＤマウス脾細胞にＭＤＳＣの頻度が低い健康／未処置野生型マウス脾細胞を添加することにより、用量依存的に高度に増大した（図３および４）。重要なことに、観察されたＩＦＮγ分泌の増加は、対応する刺激因子／サプレッサー単独での応答の６〜１０倍であり（対照２、図５Ａ、５Ｂ）、これにより、ＳＣＩＤと健康／未処置野生型マウス脾細胞の相乗的な協同作用の可能性が示される。対照的に、ＭＤＳＣの大集団を含有したＭＣＡ／ＰＢＳマウス脾細胞（図３）では、ＳＣＩＤマウスＮＫ細胞／ＤＣクロストークが１４日目にはベースラインまで著しく低下し、８４日目までにベースライン未満に低下した。著しく対照的に、ＩＦＮγ分泌によって測定された通り、ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬマウス脾細胞では、および、ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦマウス脾細胞ではより顕著に、ＳＣＩＤ  ＮＫ細胞／ＤＣクロストークが刺激された。ＭＤＳＣを欠く、腫瘍を有さないＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦマウス脾細胞および腫瘍を有するＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦマウス脾細胞のどちらによっても、ＳＣＩＤ−ＮＫ細胞／ＤＣクロストークが、健康／未処置野生型脾細胞と同様に強力に刺激されたが（図３）、低〜中程度の量のＭＤＳＣを有するＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬで処置したマウス脾細胞では刺激されなかった（図３）。ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ脾細胞では、健康／未処置マウス碑細胞またはＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦで処置したマウス脾細胞と比べて、わずかに低下した（１４日目）および実質的に低下した（８４日目）ＳＣＩＤ−ＮＫ細胞／ＤＣクロストークの刺激が媒介された。これらの所見から、ＭＣＡおよびＭＣＡ誘導性腫瘍により、ＭＤＳＣの増大だけでなく、ＭＤＳＣの免疫抑制活性も強力に刺激され、それにより今度はＮＫ細胞／ＤＣクロストークが強力に阻害されることが示される。ＭＤＳＣの増大および免疫抑制��性がどちらもｓＴＮＦに依存し、ＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰＲＯ（商標）１５９５による処置によって効率的に予防することができることも示唆される。
【０２１４】
ＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰＲＯ（商標）１５９５による処置またはＴＮＦＲ１遺伝子欠失によるｓＴＮＦの選択的な排除、ならびにＥＮＢＲＥＬによる処置またはＴＮＦ遺伝子欠失によるｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方の排除により、発癌現象が著しく予防され、腫瘍成長が低下し、また、ＭＣＡを注射したマウスの生存が延長されたことが本明細書に開示されている。著しく対照的に、ＴＮＦＲ２遺伝子欠失によるｔｍＴＮＦの選択的な排除では、腫瘍成長の増大および生存の低下によって証明される通り、ＭＣＡ誘導性発癌現象が増強された。これらの所見から、化学的に（ＭＣＡにより）誘導される発癌現象にはｓＴＮＦは必須であるが、ｔｍＴＮＦはなくてもいいことが実証される。データから、ｔｍＴＮＦが、ｓＴＮＦとは対照的に、発癌現象における保護的な役割を有することも示唆される。
【０２１５】
特に、それぞれｓＴＮＦまたはｔｍＴＮＦおよびｓＴＮＦの両方を排除するＤＮ−ＴＮＦによる処置またはＴＮＦ遺伝子欠失では、発癌現象がほぼ完全に予防されたが、２つのＴＮＦの形態だけでなく、ＬＴαおよびＬＴα２β１も中和するＥＮＢＲＥＬによる処置では（Ｔｒａｃｅｙら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００８年；１１７巻：２４４〜７９頁）、発癌現象が部分的に予防された。これらの所見から、ｔｍＴＮＦだけでなく、ＬＴαおよび／またはＬＴα２β１も、ＥＮＢＲＥＬによって阻害される、ＭＣＡ誘導性発癌現象における保護的な役割を有する可能性があることが示される。
【０２１６】
理論に束縛されることなく、以下が、発癌現象の開始に関する可能性のある筋書きである。発がん物質により、標的組織における傷害および細胞壊死が誘導される。壊死細胞により、熱ショックタンパク質、高移動性群ボックス１（ＨＭＧＢ１）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｓ１００分子およびプリン代謝産物を含めた損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）が放出される（Ｔａｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、２０１３年；２４９巻：１５８〜７５頁）。ＤＡＭＰにより、マクロファージ、ＤＣおよびＮＫ細胞などの自然免疫エフェクター細胞の活性化が誘導される。これらの自然免疫エフェクターにより、ｓＴＮＦなどの炎症促進サイトカインが放出される。炎症促進サイトカインにより、発がん促進性炎症が誘導される。並行して、組織保護的／治癒的な抗炎症性および免疫抑制性フィードバック機構が生じる。本発明者らの試験では、活性化された自然免疫エフェクターによって産生され、有効なＴｈ１およびＴｈ１７抗がん免疫機構を媒介する免疫調節性サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−１２およびＩＬ−１７は、ＭＣＡ誘導性発癌現象の開始中は変化しないが、ＤＮ−ＴＮＦによってｓＴＮＦが排除された後に増強される。発癌現象に関しては、これらの所見から、抗がん免疫機構の活性化が、発癌現象中に誘導される可能性があるが、それらの発現は、ｓＴＮＦにより誘導される免疫抑制機構によって下方制御される。これは、潜在的に免疫抑制性のサイトカインである可溶性ＩＬ−１αが、健康なマウスにおいて分泌され、ＭＣＡ誘導性発癌現象の開始中に増大し、ＤＮ−ＴＮＦ−αによる選択的なｓＴＮＦの隔離によって健康なマウスにおけるレベル未満まで著しく低下するという事実によって裏付けられる。
【０２１７】
ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、同じ受容体に結合する（Ａｐｔｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．、２００６年；２５巻：３８７〜４０８頁）。どちらのサイトカインも、３１ｋＤの前駆体として産生され、それが、それぞれプロテアーゼカルパインおよびＩＬ−１変換酵素によってプロセシングされ、それにより、細胞外に放出される１７ｋＤの可溶性形態の生成が導かれる。可溶性ＩＬ−１βは、免疫学的に活性である。対照的に、可溶性ＩＬ−１αは、免疫学的に不活性である。１７ｋＤのＩＬ−１αの放出により、機能的な１４ｋＤのＩＬ−１α  Ｎ末端プロピース（ｐｒｏｐｉｅｃｅ）の生成も導かれる。ＩＬ−１αプロピースは、癌遺伝子を活性化し、腫瘍サプレッサー遺伝子を阻害する転写因子として機能する。分泌されたＩＬ−１αは、免疫学的に不活性であるが、癌腫、肉腫、ならびにＢ細胞白血病および骨髄系細胞白血病を含めた種々の悪性細胞型に対する増殖因子として機能し得る。理論に束縛されることなく、免疫学的に不活性な可溶性ＩＬ−１αは、ＩＬ−１受容体に結合することができ、ＩＬ−１受容体が免疫学的に活性な形態のＩＬ−１と相互作用し、したがって免疫応答の負の調節因子として機能することを遮断し、阻害することができる。
【０２１８】
ＩＬ−１αは、化学的な発がん物質に曝露した細胞において過剰発現するので（Ａｐｔｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ、２００６年；２５巻：３８７〜４０８頁）、ＭＣＡを注射したマウスにおける可溶性ＩＬ−１αレベルの上昇がＤＮ−ＴＮＦによる処置によって著しく低下するという、開示されている結果から、ｓＴＮＦにより、プロピースおよび可溶性ＩＬ−１αの生成の増強を誘導することができることが示される。結果として、２つの上方制御される形態のＩＬ−１αにより、それぞれ、標的細胞の悪性転換が促進され、新しく生成する悪性細胞の成長およびＩＬ−１誘導性疫応答の阻害が媒介される可能性がある。ＭＣＡ誘導性発癌現象により、骨髄細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化ならびに脾臓におけるＭＤＳＣの増大および蓄積も引き起こされ、これらは、腫瘍を有さないマウスおよび腫瘍を有するマウスのどちらにおいても、ＤＮ−ＴＮＦ−αもしくはＥＮＢＲＥＬによる処置および／またはＴＮＦもしくはＴＮＦＲ１遺伝子欠失によるｓＴＮＦの排除によって予防されたが、ＴＮＦＲ２遺伝子欠失によるｔｍＴＮＦの排除によっては予防されなかった。これらの所見から、ｓＴＮＦにより、ＭＣＡ誘導性発癌現象におけるＭＤＳＣ増大および蓄積が上方制御されることが実証される。骨髄細胞の成長およびホーミングを媒介し得る、分泌されたＩＬ−１α（Ａｐｔｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ、２００６年；２５巻：３８７〜４０８頁；Ｒｉｄｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１１年；１８７巻：４８３５〜４３頁）は、発癌現象中のＭＤＳＣの成長および調節に関与する可能性がある。本発明者らのデータから、ｓＴＮＦが、発癌現象におけるＭＤＳＣ増大において中心的な調節因子としての役割を有し、その役割が、ＩＬ−１αならびに／またはＶＥＧＦおよびＧＭ−ＣＳＦなどのＭＤＳＣ増殖因子の誘導を含み得ることが示唆される。ＭＣＡを注射したマウスの脾臓におけるＭＤＳＣのｓＴＮＦ依存性増大および蓄積と並行して、中心的な免疫調節機構であるＮＫ細胞／ＤＣクロストークを阻害する強力なｓＴＮＦ依存性免疫抑制性機構が見いだされた。ＭＤＳＣ増大と同様に、腫瘍を有さないマウスおよび腫瘍を有するマウスのどちらにおいても、ＤＮ−ＴＮＦによる処置を用いたｓＴＮＦ排除によって免疫抑制活性が完全に排除された。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇおよびＦ４／８０＋マクロファージを含めた他の潜在的な免疫抑制性細胞の頻度は、ＭＣＡ誘導性発癌現象の開始または腫瘍形成期の間には変化せず、ＭＤＳＣが、発癌現象中に進化する脾細胞免疫抑制の主要なメディエーターである可能性がある。ＭＤＳＣにより産生される免疫抑制性分子、特に、ＰＧＥ２、ＴＧＦβおよびＩＬ−１０は、ＮＫ細胞およびＤＣの強力な抑制薬および／またはモジュレーターとしても公知である（Ｈａｒｉｚｉ  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１３年；１０巻：２１３〜２１頁；Ｍｏら、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００６年；２４巻：９９〜１４６頁；Ｍｏｏｒｅ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年；１９巻：６８３〜７６５頁）。したがって、本発明者らの発見から、ＭＤＳＣによりＮＫ細胞および／またはＤＣが強力に抑制され、それにより、ＭＣＡ誘導性発癌現象におけるそれらのクロストークの抑止が導かれることが示され得る。ＮＫ細胞／ＤＣクロストークは、有効な抗がん免疫応答の質および程度を規定する中心的な免疫調節機構であるので、ＭＤＳＣ媒介性免疫抑制は、ＭＣＡ誘導性発癌現象におけるがん免疫エスケープの機構である可能性がある。本明細書に提示されているデータから、ＭＣＡにより、ＭＤＳＣの増大、自然免疫の抑制およびがんの発生が誘導され、これらは全てｓＴＮＦ隔離またはＴＮＦＲ１遮断によって予防することができることが実証される。これらの所見から、発癌現象におけるｓＴＮＦの中心的な役割が明らかになり、抗がん免疫機能を下方制御し、発癌現象を促進する、自然免疫ｓＴＮＦ−ＴＮＦＲ１軸の存在が示される。新しく定義された自然免疫の負の免疫調節軸は、獲得免疫ＣＴＬＡ４−Ｂ７−１／２およびＰＤ−１−Ｂ７−Ｈ１の免疫チェックポイントを補完するものであり、これを遮断することにより、進行がんを有する患者において高度に有望な有益な効果が導かれる（Ｐｏｓｔｏｗら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．、２０１２年；１８巻：１５３〜９頁；Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｃｕｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年；２４巻：２０７〜１２頁；Ｏｔｔら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１３年；１９巻：５３００〜９頁）。本発明者らの試験から、ｓＴＮＦ−ＴＮＦＲ１軸が追加的な免疫チェックポイントであり得、これの標的化をがん予防および免疫療法に活用できることが示される。臨床的適用は、ＤＮ−ＴＮＦ−ＸＰｒｏ１５９５生物製剤による処置を用いて、発がん物質に誘導される免疫抑制およびがん発生のどちらも効率的に予防されることによって裏付けられる。
【０２１９】
がん予防および療法のために、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１などの他の免疫チェックポイントの遮断をＤＮ−ＴＮＦ−αと組み合わせて使用することができる。
【０２２０】
開示されている発明の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に本発明の好ましい例であり、本発明の範囲を限定するものと考えるべきではないことが認識されるべきである。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、これらの特許請求の範囲の範囲および主旨に入る全てが本発明者らの発明であると主張する。
【０２２１】
（実施例７）
ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の枯渇が、ＭＣＡにより誘導され、ＥＮＢＲＥＬにより促進され、Ｘｐｒｏ１５９５  ＤＮ−ＴＮＦにより妨げられ、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の増大がＸｐｒｏ１５９５  ＤＮ−ＴＮＦにより可能になる。
【０２２２】
実施例４、５および６は、ＭＤＳＣ増大、および、がんを効率的に制御する強力なＴｈ１自然抗がん免疫応答およびＴ細胞獲得抗がん免疫応答の生成を導く中心的な免疫調節機構であるＮＫ細胞／ＤＣクロストークのＭＤＳＣ媒介性抑制が、ＭＣＡにより誘導され、ｓＴＮＦ隔離により妨げられることを実証するものである（Ｍｏｒｅｔｔａ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２年；２巻：９５７〜６４頁；Ｃｏｏｐｅｒら、ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４年；２５巻：４７〜５２頁；Ｗａｌｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、２００５年；１０６巻：２２５２〜８頁；Ｘｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年；１０９巻：３３３３〜４１頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０年；１１６巻：５７５〜５８３頁；Ｖｕｊａｎｏｖｉｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、２０１１年；５０巻：１５９〜７４頁、Ｍａｋａｒｅｎｋｏｖａら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ、２００５年；７７巻：４０８〜１３頁）。有効な抗がん応答を生成するためには、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞が豊富にあり、それらが機能的でなければならない。しかし、ＴＮＦにより、腫瘍特異的Ｔ細胞応答が阻害されることが示された（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１２年；４９０巻：４１２〜４１６頁；Ｄｏｎｉａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０１５年；７５巻：３７４７〜３７５９頁）。フローサイトメトリーを使用して、未処置（対照）野生型マウスまたはＭＣＡ／ＰＢＳ、ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ（ＥＮＢＲＥＬは、ｔｍＴＮＦおよびｓＴＮＦの両方とＬＴαとを中和する）、もしくはＤＮ−ＴＮＦ  Ｘｐｒｏ１５９５（ＤＮ−ＴＮＦはｓＴＮＦを特異的に隔離する）を用いて１４日間もしくは８４日間にわたって処置したマウスの脾臓におけるＣＤ３＋Ｔ細胞（図９Ａ）ならびにそれらのＣＤ３＋ＣＤ４＋ヘルパー部分集団（図９Ｂ）およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞傷害性部分集団（図９Ｃ）の頻度を調査した。ＭＣＡ注射の１４日後（発癌現象の初期）に、Ｔ細胞およびそれらの部分集団の頻度は、ＭＣＡを受けた全てのマウスにおいて増大したが、これらの増大は、ＥＮＢＲＥＬ処置（ＣＤ４＋細胞のみ）および特にＤＮ−ＴＮＦ処置（ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の両方）後により明白なものになる傾向があった。これらの所見から、ＭＣＡ（例えば、ＭＣＡ誘導性免疫原性悪性細胞）により最初にヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方の増大が誘導され、これがＴＮＦ中和によってさらに促進されたことが示された。ＭＣＡ注射の８４日後に、Ｔ細胞およびそれらの部分集団の頻度は、ＭＣＡ／ＰＢＳで処置したマウスでは強力に低下し、ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬで処置した腫瘍を有さない（ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ）マウスではわずかに低下し、ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬで処置した腫瘍を有する（ＭＣＡ／ＥＮＢＲＥＬ−Ｔ）マウスでは最も顕著に低下した。対照的に、ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦで処置した腫瘍を有さないマウス（ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ）では、未処置対照マウスのＴ細胞と同様の頻度が示された。ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦで処置した腫瘍を有するマウス（ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦ−Ｔ）では、Ｔ細胞およびそれらの部分集団の頻度は、ＭＣＡ／ＤＮ−ＴＮＦで処置した腫瘍を有さないまたは対照マウスにおけるものよりも特に高く、ＭＣＡ／ＰＢＳで処置したマウスにおけるものよりもよりも有意に高かった（ＣＤ３＋：ｐ＝０．００２０；ＣＤ３＋ＣＤ４＋：０．００３８；およびＣＤ３＋ＣＤ８＋、０．００７２）。
【０２２３】
これらの所見から、ＭＣＡにより誘導されたｓＴＮＦおよび腫瘍により誘導されたｓＴＮＦにより、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の両方の枯渇が導かれ、腫瘍を有するマウスにおいて、ｓＴＮＦは中和するがｔｍＴＮＦは保存するＤＮ−ＴＮＦによる処置により、これを予防することができるだけでなく、ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の増大を促進することができることが示された。腫瘍を有するマウスにおけるＴ細胞のＭＣＡ誘導性枯渇は、ＥＮＢＲＥＬにより深まるが、Ｘｐｒｏ１５９５  ＤＮ−ＴＮＦにより妨げられるので、ｔｍＴＮＦおよび／またはリンホトキシンにより、Ｔ細胞がｓＴＮＦ媒介性枯渇から保護される可能性がある。
【０２２４】
（実施例８）
ＤＮ−ＴＮＦにより、ＢＲＡＦ変異体黒色腫におけるｓＴＮＦにより誘導されるＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤抵抗性が遮断される
ＴＮＦは、ＭＡＰＫ経路阻害剤（ＭＡＰＫｉ）に対する獲得されたＢＲＡＦ変異体黒色腫抵抗性に関連する重要な因子であることが提唱されている（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．、２０１６年、４巻：１２１４〜１２２９頁；Ｌｅｈｒａｉｋｉ、Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖ、２０１５年、１巻：１５０３０頁）。例えば、ＭＡＰＫｉ療法により、試験したＢＲＡＦ阻害剤（ＢＲＡＦｉ）に抵抗性である黒色腫患者病変の全てにおいて腫瘍関連マクロファージの数の増加およびＴＮＦの発現の増大が導かれることが示され、マクロファージ由来（腫瘍由来ではない）ＴＮＦが、ＭＡＰＫｉに対する抵抗性に関連する重要な黒色腫増殖因子として関連付けられた。ＭＡＰＫｉに対するＴＮＦにより誘導される抵抗性を特異的に標的とし、遮断するための戦略が有益であると思われる。ＤＮ−ＴＮＦを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤（それぞれＢＲＡＦｉおよびＭＥＫｉ）に対するｓＴＮＦに誘導される黒色腫抵抗性を和らげる能力について試験した。組換えｓＴＮＦおよびマクロファージにより分泌されたｓＴＮＦは、ＢＲＡＦｉ（ＰＬＸ４７２０）に媒介される細胞傷害性およびＭＥＫｉ（セルメチニブ）に媒介される細胞傷害性に対する強力な阻害効果を一貫して示した。これらの効果は、ＤＮ−ＴＮＦ、ならびに、ｓＴＮＦおよびｔｍＴＮＦの両方を非特異的に遮断する抗ＴＮＦ抗体により有効に緩和された（図１０）。これらの試験により、選択的なｓＴＮＦアンタゴニストであるＤＮ−ＴＮＦをＢＲＡＦＶ６００ＥおよびＭＥＫの小分子阻害剤と組み合わせることが、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異体黒色腫を処置するための有効な戦略になり得ることが実証される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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