(57)【要約】  本発明は、抽出物の総重量に対して、少なくとも５ｗｔ％のタンパク質を含有し、分子量が１０ｋＤａ未満である分子を本質的に含まない、タバコ葉抽出物に関する。本発明は、また、かかる抽出物を含有する医薬組成物に、及びタバコ中毒の治療におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥抽出物の総重量に基づき少なくとも５重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質を含有し、分子量が１０ｋＤａ未満である分子を本質的に含まない、タバコ葉抽出物であって、前記タンパク質が、以下のタンパク質ファミリー：リグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ、グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼ、エンドキチナーゼ、病態形成関連タンパク質、オスモチン、及びプロテイナーゼ阻害剤、並びにそれらの混合物からなる群から好ましくは選ばれる、タバコ葉抽出物。
【請求項２】
高分子量タンパク質を本質的に含まないことを特徴とする、請求項１に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項３】
その分子量が５００ｋＤａより大きい、好ましくはその分子量が４００ｋＤａより大きい、より好ましくはその分子量が３００ｋＤａより大きい、優先的にはその分子量が２００ｋＤａより大きい、より優先的にはその分子量が１５０ｋＤａより大きい、さらにより優先的にはその分子量が１００ｋＤａより大きい、さらに良好にはその分子量が５０ｋＤａより大きいタンパク質を本質的に含まないことを特徴とする、請求項１又は２に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項４】
分子量が１０ｋＤａ未満である分子の含有量が、前記抽出物の総重量に基づき、５重量％未満、好ましくは２．５重量％未満、さらに良好には１重量％未満であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項５】
粉砕した乾燥させたタバコ葉の溶媒抽出プロセス、例えば水性溶媒、その後、粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液からの固体残渣の分離、その後、前記抽出物の体積に基づき、体積で２〜１２倍、好ましくは体積で３〜１０倍、好ましくは体積で４〜８倍の範囲、好ましくは体積で６倍の量の水性溶媒を用いる、及び、１０ｋＤａカットオフ膜を用いる、固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液の定積透析ろ過によって取得可能であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項６】
グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼのファミリーに属し、ベータ−１，３−エンドグルカナーゼ酸性アイソフォームＰＲ−Ｑ’（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、ＰＲ３６４０１）、ベータ−１，３−エンドグルカナーゼ塩基性液胞型アイソフォームＧＬＢ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ２７６６６）、及びそれらの混合物から好ましくは選択される、少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項７】
エンドキチナーゼのファミリーに属し、酸性エンドキチナーゼＰ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１７５１３）、酸性エンドキチナーゼＱ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１７５１４）、エンドキチナーゼＢ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ２４０９１）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項８】
少なくともオスモチン（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１４１７０）を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項９】
少なくとも１つのリグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１１９６５）を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項１０】
病態形成関連タンパク質Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１３０４６）、病態形成関連タンパク質ＰＲ−４Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、ＰＲ２９０６２）、病態形成関連タンパク質ＰＲ−４Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、ＰＲ２９０６３）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つの病態形成関連タンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項１１】
プロテイナーゼ阻害剤のファミリーに属し、プロテイナーゼ阻害剤Ｉ−Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｑ０３１９９）、プロテイナーゼ阻害剤Ｉ−Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｑ０３１９８）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項１２】
乾燥抽出物中のタンパク質含有量が、前記乾燥抽出物の総重量に基づき、少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも１５重量％、好ましくは少なくとも２０重量％であることを特徴とする、請求項１〜１１の少なくともいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物。
【請求項１３】
活性成分としての請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
前記タバコ葉抽出物に存在するタンパク質が、１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜３００μｇ／ｍＬ、好ましくは６０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは８０〜１５０μｇ／ｍＬの範囲の量で存在することを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
カンナビスから抽出されるタンパク質をさらに含有することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
皮下注射による投与に好適な形態で提供されることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
タバコ中毒の治療における使用のための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
タバコ及びカンナビス中毒の連結治療における使用のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記医薬組成物が、０．０３ｍＬ〜１０ｍＬの、好ましくは０．１ｍＬ〜５ｍＬの、好ましくは０．５〜２ｍＬの投与形態で提供されることを特徴とする、請求項１７に記載のタバコ中毒の治療における、又は請求項１８に記載のタバコ及びカンナビス中毒の連結治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２０】
以下の工程：
ａ．  タバコ葉の乾燥、
ｂ．  粉砕した乾燥させたタバコ葉を取得するための、乾燥させたタバコ葉の粉砕、
ｃ．  溶媒、例えば水性溶媒、好ましくは６．０〜８．５のｐＨを有する水性緩衝剤溶液を用いる、機械的撹拌下での、前記粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出、
ｄ．  固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液を取得するための、ろ過又は遠心分離による、前記粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液からの固体残渣の分離、
ｅ．  前記抽出物の体積に基づき、体積で２〜１２倍、好ましくは体積で３〜１０倍、好ましくは体積で４〜８倍の範囲、好ましくは体積で６倍の量の溶媒、好ましくは水性溶媒を用いる、及び、１０ｋＤａカットオフ膜を用いる、工程ｃにおいて取得される溶液の定積ろ過、
ｆ．  任意で、工程ｄにおいて取得されるタンパク質溶液の凍結乾燥
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタバコ葉抽出物を調製するためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タバコ（tobacco）葉抽出物、及びこのタバコ葉抽出物を含有する医薬組成物、並びにタバコ中毒の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
概して、依存性又は中毒は、世界保健機関によって、「症候群であって、そのために、或る物質の使用が、かつてはより大きな価値を有していた他の行動よりもはるかに高い優先順位を持つようになる、症候群」と定義されている。その極端な形態では、依存性の状態が、この依存性を患っている個体がこの物質を衝動的に探すことを余儀なくさせる、物質に対する抵抗することができない必要性によって特徴づけられる。
【０００３】
タバコ依存性は、多数の喫煙関連疾患、例えばがん（肺、咽喉、口、唇等）、循環器疾患、慢性気管支炎等を伴う、主要な公衆衛生の問題を引き起こす。疾患それ自体に加えて、喫煙は、多くの副作用（受胎能の減少、表皮の変化、口腔及び鼻粘膜の変化、脳動脈の変化、食道及び胃に対する損傷、ビタミンＢ及びＣ欠乏症等）を有する。
【０００４】
同時に作用する３種類のタバコ依存性が存在する：タバコ中のニコチンの存在に本質的に起因し、渇望の感情（喫煙への強い衝動、易刺激性、神経過敏、焦燥感、不安、睡眠障害等）として表現される身体的依存性；喜び、弛緩、知的刺激、抗不安、抗うつ及び食欲抑制作用をもたらすニコチンの向精神効果と関連する心理的依存性；並びに、社会的及び交友的圧力に依存する環境又は行動依存性。身体的依存性は、平均して数週間で消失する。禁断症状は、喫煙をやめておよそ３〜４日後にピークに達し、数週間続くことがある。心理的依存性は、減少するのにより長い時間がかかり、数ヵ月続くことがある。
【０００５】
タバコ依存性は、正及び負の強化を通じて、維持される。ニコチンは、報酬回路における神経伝達物質であるドーパミンの放出に関与する。喫煙者は、ドーパミンの放出によって引き起こされる喜びの感情を再現すること（これは、シガレットの正の強化である。）、及び、彼のドーパミンレベルが低過ぎるときの禁断症状を回避すること（これは、シガレットの負の強化である。）の両方のために、喫煙する。
【０００６】
タバコ依存性の薬理学的治療の３つの主な方法が存在する。１つ目は、最初に設定された標的禁煙日の時点での即時の中止を目指し、ニコチン代用物の場合においてはこの標的禁煙日の後に、ブプロピオン又はバレニクリンの場合においては１週間前に（標的禁煙日の時点で十分な血漿濃度に到達するように）、薬理学的治療が施される。２つ目は、中断しようと試みる前に彼の消費を低減することにあり、当該低減段階は、その間に薬理学的治療が施される前治療に該当する。３つ目は、中止の成功の後の再発防止である。これらの３つの方法に、中断しようと試みることなく減煙すること（cutting down）を追加することができる。
【０００７】
これらの方法の各々の有効性は、喫煙を中断する必要性及びそうすることの彼の動機づけを強化する必要性を自分に納得させなければならない喫煙者に対する準備段階によって強化される。したがって、タバコ依存性のための薬理学的治療に係る処方情報は、喫煙をやめるように動機づけられている患者においては喫煙中止治療が成功する可能性がより高いことを示す。
【０００８】
現在、タバコ依存性に対する４つの主要な種類の治療（行動心理療法、鍼治療及び催眠術には言及しない）、すなわちニコチン代用物、ブプロピオン、バレニクリン及びホメオパシーが存在する。これらの４つの方法の各々の作用の原理は、ニコチンがタバコ依存性のメカニズムに関与する分子であるという事実に基づく。
【０００９】
ニコチン代用物は、以下のような様々な方法で、投与することができる：パッチの形態で経皮的に、チューインガム、ロゼンジ若しくは舌下錠剤の形態で経口的に、又は、吸入剤の形態で肺経路を介して。ニコチン代用物の投与は主に、当該代用物によってもたらされるニコチンがシガレットのそれを補い、喫煙者が中止に関連する禁断症状を感じることをできる限り防止することによるシガレットの負の強化の低減を可能とする。ニコチン代用物の有効性は、使用される方法によって変化し、中止率は概して１５〜２０％の範囲である。ニコチン代用物は、即時の中止を試みているときに、及びまた、段階的な中止の一部として、喫煙者がそのシガレット消費を低減することを助けるための中止の試みの前の前治療（やめるための減煙）としても、使用される。それらは、タバコ消費を低減するという唯一の目的のために使用することもできる。再発を防止する上でのそれらの有効性は、未だ実証されていない。
【００１０】
ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ研究所によって（Ｚｙｂａｎ（登録商標）というブランド名で）上市されるブプロピオンは、或る特定の脳神経伝達物質、例えばカテコールアミン、ノルアドレナリン及びドーパミンに作用する。ブプロピオンは、それに抗うつ特性を与える選択的カテコールアミン再取り込み阻害剤である。その有効性は、ニコチンパッチの使用後に得られるそれと同等である（およそ２０％の中止率）。それは、ニコチン代用物より少なく処方されるが、これは、それが、同等の有効性に対して、より低い利益／リスク比を有するためである。実際に、それは、自殺企図を引き起こすことがある。
【００１１】
Ｐｆｉｚｅｒ研究所によって（Ｃｈａｎｔｉｘ（登録商標）又はＣｈａｍｐｉｘ（登録商標）というブランド名で）上市されるバレニクリンは、ニコチン性アセチルコリン受容体の部分アゴニストである。バレニクリンは、以下の二重の作用によって、これらの受容体を標的とする：α４β２受容体部分アゴニスト、それは、より低い強度で、ニコチンによって誘導されるものと類似の反応をもたらす（したがって、離脱時の渇望効果を低減する）；及び、治療の開始時に、喫煙者が時々喫煙しながら治療されるとき、それは、ニコチンの存在下で神経化学的刺激を弱める（α４β２受容体部分アンタゴニスト）。したがって、バレニクリンは、シガレットの負の強化（離脱効果）及び正の強化（喫煙への衝動）を低減する。実際に、バレニクリンは、喫煙の喜びを低減し、このことは、喫煙をやめる上での将来の成功に係る基準であろう。その有効性は、ニコチン代用物のそれより大きい（約２８％の中止率）。バレニクリンは、即時の中止の試みのために、及びまた、段階的な中止の一部として、喫煙者がそのシガレット消費を低減することを助けるための中止の試みの前の数週間の前治療（やめるための減煙）としても、使用される。第１の研究（ＮＣＴ００７８９０７４）においては、３５％の喫煙者が、バレニクリンでの３週間の前治療の後になされたポイントに従い、そのシガレット消費を少なくとも５０％低減することができた。第２の研究（ＮＣＴ００８３５９００）においては、バレニクリンでの４週間の前治療でなされたポイントに従い、喫煙されたシガレットの数における低減率は、４２％であった。第３の研究（ＮＣＴ０１３７０３５６）においては、４７％の喫煙者が、レニクリンでの４週間の前治療の後になされたポイントに従い、そのシガレット消費を少なくとも５０％低減することができた。再発を防止する上でのその有効性は、未だ実証されていない。しかしながら、バレニクリンは、頻繁な副作用（吐き気）を誘発し、心臓の問題又は自殺企図の原因であり得る。これらの副作用は、コチン代用物よりも優れた有効性に関わらず、多くの場合、ニコチン代用物での失敗の後の第２選択肢の治療法としてのみ、バレニクリンが処方されることを意味する。
【００１２】
第４の中止経路は、ホメオパシーであり、これは、制御することが望まれる症状を引き起こす物質の微小用量の使用に基づく。「タバコ（tabacum）」の抽出物が、多くの場合、喫煙の中止において使用される。アイルランド特許出願ＩＥ９６０５１１は、特に、神経機能の回復及びニコチン禁断症状の軽減を対象とする医薬品の製造のためのタバコ抽出物のホメオパシー希釈物の使用を記載する。他の非通常の中止技法と同様に、その有効性は、重度の喫煙者においては不十分である。
【００１３】
この領域における多くの研究に関わらず、新たな治療を見出す必要性、又はタバコ依存性に対する既存の治療を改善する必要性が依然として存在する。
【００１４】
出願ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７８６において、出願人は、タバコ葉の抽出物の水溶液の注射を喫煙者に与えることが、前記喫煙者のタバコ依存性を治療することを可能とすることを発見した。この発見は、真に予期せぬことであった。なぜなら、出願人は、前記水性タバコ葉抽出物が小量のニコチンを含有することを決定することができたからである。したがって、この水性タバコ葉抽出物を使用するタバコ依存性の治療に関与する作用のメカニズムは、喫煙者に対するニコチンの供給ではない。
【００１５】
しかしながら、前記水性タバコ葉抽出物が小量のニコチンを含有するという事実は、その組成及びその製造の方法についての情報を提供しなかった。水性タバコ葉抽出物のニコチン含有量は、実際上、多くの因子に依存してかなり変化し得る。
【００１６】
タバコ葉中のニコチン含有量は、成長したタバコの主な種類について、０．５％から８％まで変化し得る（Davis et al., “Production, Chemistry, and Technology”, ISBN-13: 978-0632047918, Chapter 8, page 275）。
【００１７】
バーリー（Burley）タバコは、マリーランド（Maryland）タバコの約２倍の量のニコチン、及びオリエンタル（Oriental）タバコの３倍の量のニコチンを含有する（Leffingwell, “Chemical constituents of tobacco leaf and differences among tobacco types”, Leffingwell Reports, Vol. 1 (No. 2), February, 2001）。
【００１８】
窒素肥料の使用は、タバコ葉のニコチン含有量に影響を及ぼし、ニコチン含有量は、下葉よりも高い中葉よりも上葉において高い（Xiao-Tang et al., “Yield and nicotine content of flue-cured tobacco as affected by soil nitrogen mineralization”, Pedosphere 18(2): 227-235, 2008, ISSN 1002-0160/CN 32-1315/P）。
【００１９】
輪作は、タバコ葉のニコチン含有量に影響を及ぼす（Butorac et al., “The Effect of Tobacco Monoculture and Crop Rotations on Tobacco Leaf Composition”, Agriculturae Conspectus Scientificus, Vol. 69 (2004) No. 4 (95-101)）。
【００２０】
タバコ葉の化学組成及びニコチン含有量は、紫外線照射及び光強度によって影響を受ける（Andersen et al., “Chemical composition of tobacco leaves altered by near-ultraviolet and intensity of visible light”, Plant Physiol. (1973) 51, 723-726）。
【００２１】
抽出物調製方法、特に浸漬時間及び条件、滅菌方法、並びに物理的分離及び化学的分離も、ニコチン含有量に影響を及ぼす。
【００２２】
タバコ抽出物、例えば出願ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７８６に記載されるものは、低分子量の、すなわち１０ｋＤａ未満の分子を含む。これらの低分子量の分子は、例えば、不揮発性アルカロイド由来のタバコ特異的Ｎ−ニトロソアミン（ＴＳＮＡ）及びＮ−ニトロソアミノ酸、揮発性アルデヒド、多環芳香族炭化水素（例えば、ベンゾ［ａ］ピレン）、ラクトン、ウレタン、又は金属、例えばカドミウムを含む（Wagner et al., Plant Physiol. 1986, 82, 274-279、及びIARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human, vol. 49）。これらの化合物は、発癌性、変異原性又は毒性を有することがあり、がん並びに腎臓及び骨の問題を引き起こすことがある。したがって、これらの化合物は、前記化合物を含有する組成物が投与された患者の健康に有害である。
【００２３】
このようなタバコ抽出物は、あらゆる分子量を有する多くのタンパク質を含む。例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースは、７５９のタバコタンパク質を特定する。ＲｕＢｉｓＣＯタンパク質は、単独で、可溶性タンパク質の３０〜５０％を占め得る。完全なＲｕＢｉｓＣＯタンパク質は、典型的には、約５４０ｋＤａのタンパク質複合体を形成する８のサブユニットを有する。それらの全て又は幾つかがいずれかの治療効果に関与し得るという表示は存在しないけれども、溶液で皮下投与されたこれらのタンパク質の毒性は未知である。
【００２４】
本発明の目的は、タバコ中毒に対する効果的な治療を提供することである。有利には、この治療は、治療効果を原則として有しない未知の毒性を有する分子の投与をできる限り低減することによって、非毒性であり、患者による十分な耐容性を示し、限定的なリスクを提示する。
【００２５】
タバコ抽出物は数千の化合物を含有するけれども、出願人は、驚くべきことに、タバコ葉抽出物由来のタンパク質が、喫煙の中止を促進する特異的なＩｇＧ免疫応答を誘導することを発見した。したがって、高タンパク質含有量及び特定のタンパク質組成を含む本発明によるタバコ葉抽出物は、喫煙の中止を促進する特異的なＩｇＧ免疫応答を誘導する。
【００２６】
この発見は、いっそう驚くべきことである。なぜなら、水性タバコ葉抽出物は、数千の化合物を含有し、タンパク質は、数ある中で化合物の１つのファミリーを構成するにすぎないからである。タバコタンパク質がタバコ中毒において或る役割を果たすことは知られておらず、したがって、喫煙の中止においてそれらを使用する誘因は存在しない。
【００２７】
出願人は、特に、本発明によるタバコ葉抽出物が、高タンパク質含有量及び特定のタンパク質組成を有することを示す。この特定のタンパク質組成は、とりわけ、乾燥させた（cured）タバコ葉を使用したときに、取得することができる。乾燥させること（Curing）は、例えば加水分解メカニズムを通じて、タンパク質の分解を、及び、タバコ葉における遊離アミノ酸の増大を促進する（Hamilton & Lowe, 1978；Long & Weybrew, 1981；Burton, et al., 1983）。
【００２８】
出願人は、驚くべきことに、本発明によるタバコ葉抽出物由来のタンパク質が、喫煙の中止を促進する特異的なＩｇＧ抗体の生成を誘導することを発見した。出願人は、本発明によるタバコ葉抽出物の投与が、特異的なＩｇＧ免疫応答を誘導し、免疫応答を促進することができる補助剤を抽出物に添加せずとも、タバコ中毒に対する効果的な治療を取得することを可能とすることを示す。出願人は、乾燥させたタバコ葉の抽出物を使用したときに、特異的なＩｇＧ免疫応答、タバコ中毒の治療、及び喫煙の中止が、特に効果的であることを示す。
【００２９】
この発見は、いっそう驚くべきことである。なぜなら、タバコ葉抽出物タンパク質に特異的なＩｇＧ抗体が、喫煙者が喫煙を低減又は中断することを助ける可能性が高いことを示すものは、先行技術には何も存在しないからである。タバコ抽出物の投与の後における特異的なＩｇＧ免疫応答の活性化、及び、喫煙の中止におけるタバコ抽出物の役割は、今まで決して記載されていない。喫煙の中止を促進することができる、免疫系（とりわけ、特異的なＩｇＧ抗体の産生に関与する）と神経系（とりわけ、喫煙の行為及び行動の知覚に関与する）との間のこのような関連は、今まで決して記載されていない。
【００３０】
有利には、本発明によるタバコ中毒の治療は、数回のみの本発明による医薬組成物の投与、有利には１回のみの投与を必要とし、その結果、シガレットの強化の効果は、患者によって、もはや感じられないか、又は、顕著に弱く感じられ、特に、喫煙への衝動（正の強化）及びシガレットの嗜好性が、低減される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】アイルランド特許出願ＩＥ９６０５１１
【特許文献２】ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００７８６
【非特許文献】
【００３２】
【非特許文献１】Davis et al., “Production, Chemistry, and Technology”, ISBN-13: 978-0632047918, Chapter 8, page 275
【非特許文献２】Leffingwell, “Chemical constituents of tobacco leaf and differences among tobacco types”, Leffingwell Reports, Vol. 1 (No. 2), February, 2001
【非特許文献３】Xiao-Tang et al., “Yield and nicotine content of flue-cured tobacco as affected by soil nitrogen mineralization”, Pedosphere 18(2): 227-235, 2008, ISSN 1002-0160/CN 32-1315/P
【非特許文献４】Butorac et al., “The Effect of Tobacco Monoculture and Crop Rotations on Tobacco Leaf Composition”, Agriculturae Conspectus Scientificus, Vol. 69 (2004) No. 4 (95-101)
【非特許文献５】Andersen et al., “Chemical composition of tobacco leaves altered by near-ultraviolet and intensity of visible light”, Plant Physiol. (1973) 51, 723-726
【非特許文献６】Wagner et al., Plant Physiol. 1986, 82, 274-279
【非特許文献７】IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Human, vol. 49
【非特許文献８】Hamilton & Lowe, 1978
【非特許文献９】Long & Weybrew, 1981
【非特許文献１０】Burton, et al., 1983
【発明の概要】
【００３３】
第１の態様では、本発明は、乾燥抽出物の総重量に基づき少なくとも５重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質を含有し、分子量が１０ｋＤａ未満である分子を本質的に含まない、タバコ葉抽出物に関する。好ましくは、前記タンパク質は、以下のタンパク質ファミリー：リグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ、グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼ、エンドキチナーゼ、病態形成関連タンパク質、オスモチン、及びプロテイナーゼ阻害剤、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００３４】
本発明は、さらに、前記タバコ葉抽出物を含む医薬組成物、及びタバコ中毒の治療におけるその使用に関する。
【００３５】
本発明は、さらに、前記タバコ葉抽出物を含む医薬組成物、及び喫煙の中止におけるその使用に関する。
【００３６】
本発明は、さらに、タバコ中毒を治療するための方法であって、タバコ中毒又は依存性に罹患している対象に前記タバコ葉抽出物を投与することを含む、方法に関する。
【００３７】
本発明は、さらに、タバコ中毒を治療するための方法であって、タバコ中毒に罹患している対象に前記前記タバコ葉抽出物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００３８】
本発明との関連では、タバコ依存性又は中毒の治療は、タバコの消費の全ての形態、すなわち、製造されたシガレット又は巻きシガレット、シガリロ又はシガー、パイプタバコ、さらには無煙タバコ、例えば嗅ぎタバコ（snuff）、噛みタバコ又はスナス（snus）の形態でのタバコの喫煙を包含する。
【００３９】
本発明は、乾燥抽出物の総重量に基づき少なくとも５重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質を含有し、分子量が１０ｋＤａ未満である分子を本質的に含まない、前記タバコ葉抽出物を調製するためのプロセスであって、以下の工程：
ａ．  タバコ葉の乾燥（Curing）、
ｂ．  粉砕した乾燥させたタバコ葉を取得するための、乾燥させたタバコ葉の粉砕、
ｃ．  溶媒、例えば水性溶媒、好ましくは６．０〜８．５のｐＨを有する水性緩衝剤溶液を用いる、機械的撹拌下での、粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出、
ｄ．  固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液を取得するための、ろ過又は遠心分離による、粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液からの固体残渣の分離、
ｅ．  抽出物の体積に基づき、体積で２〜１２倍、好ましくは体積で３〜１０倍、好ましくは体積で４〜８倍の範囲、好ましくは体積で６倍の量の溶媒、好ましくは水性溶媒を用いる、及び、１０ｋＤａカットオフ膜を用いる、工程ｄにおいて取得される溶液の定積ろ過、
ｆ．  任意で、工程ｅにおいて取得されるタンパク質溶液の凍結乾燥
を含む、プロセスにも関する。
【００４０】
本発明は、乾燥抽出物の総重量に基づき少なくとも５重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質を含有し、分子量が１０ｋＤａ未満である分子を本質的に含まない、前記タバコ葉抽出物を含む医薬組成物を含むキットにも関する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１によるタバコ葉抽出物の電気泳動プロファイルを例示する図である。ＭＥＳ緩衝剤中の４％〜１２％ＮｕＰａｇｅゲル上での、及び還元剤の存在下での分画。
【図２】マウスにおける実施例１によるタバコ葉抽出物の注射後のＩｇＧ誘導を示す図である。
【図３】活性化した免疫細胞の特徴づけのための免疫表現型検査を例示する図である。
【図４】実施例１によるタバコ葉抽出物によるナチュラルキラー細胞の活性化を示す図である。
【図５】Ｔ及びＢリンパ球に対する実施例１によるタバコ葉抽出物の活性を示す図である。
【図６】実施例１によるタバコ葉抽出物による炎症促進性サイトカインの、及びＩＦＮγの誘導を示す図である。
【図７】実施例１によるタバコ葉抽出物によるＴＨ２サイトカインの、並びにケモカイン及び造血成長因子の誘導を示す図である。
【図８】実施例１によるタバコ葉抽出物の投与によって治療された患者におけるタバコ消費の変化を示す図である。
【図９】実施例１によるタバコ葉抽出物の投与によって治療された患者におけるタバコ消費の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
タバコ葉抽出物
本発明は、乾燥抽出物の総重量に基づき少なくとも５重量％、好ましくは少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも１５重量％、好ましくは約２０重量％の、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質を含有し、分子量が１０ｋＤａ未満である分子を本質的に含まない、タバコ葉抽出物に関する。
【００４３】
乾燥抽出物は、有利には、本発明によるタバコ葉抽出物の凍結乾燥の前に取得され、その後、一定量の抽出物が取得されるまで、好ましくはＰ２Ｏ５の存在下で、真空ベル・ジャー下に置かれる。
【００４４】
有利には、分子量が１０ｋＤａ未満である分子の含有量は、抽出物の総重量に基づき重量％未満、好ましくは２．５重量％未満、さらに良好には１重量％未満である。
【００４５】
本発明の目的では、「約」は、測定の不確実性に起因するプラスマイナス１％を意味する。
【００４６】
タバコ葉抽出物において通常測定される、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質の含有量は、約１％である。したがって、本発明によるタバコ葉抽出物は、過去に知られるよりもはるかに高い含有量の、分子量が１０ｋＤａより大きいタンパク質を有する。
【００４７】
好ましくは、本発明による抽出物に存在するタンパク質は、以下のタンパク質ファミリー：リグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ、グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼ、エンドキチナーゼ、病態形成関連タンパク質、オスモチン、及びプロテイナーゼ阻害剤、並びにそれらの混合物からなる群から選ばれる。
【００４８】
本発明による抽出物に存在するタンパク質について示される名称は、タンパク質配列を列挙する生物学的データベースであるＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースにおいて示される名称に対応する。
【００４９】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼのファミリーに属し、ベータ−１，３−エンドグルカナーゼ酸性アイソフォームＰＲ−Ｑ’（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、ＰＲ３６４０１）、ベータ−１，３−エンドグルカナーゼ塩基性液胞型アイソフォームＧＬＢ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ２７６６６）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００５０】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、エンドキチナーゼのファミリーに属し、酸性エンドキチナーゼＰ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１７５１３）、酸性エンドキチナーゼＱ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１７５１４）、エンドキチナーゼＢ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ２４０９１）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００５１】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、少なくともオスモチン（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１４１７０）を含む。
【００５２】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、少なくとも１つのリグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ （ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１１９６５）を含む。
【００５３】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、病態形成関連タンパク質Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｐ１３０４６）、病態形成関連タンパク質ＰＲ−４Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、ＰＲ２９０６２）、病態形成関連タンパク質ＰＲ−４Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、ＰＲ２９０６３）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つの病態形成関連タンパク質を含む。
【００５４】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、プロテイナーゼ阻害剤のファミリーに属し、プロテイナーゼ阻害剤Ｉ−Ｂ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｑ０３１９９）、プロテイナーゼ阻害剤Ｉ−Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースによれば、Ｑ０３１９８）、及びそれらの混合物から好ましくは選ばれる、少なくとも１つのタンパク質を含む。
【００５５】
１つの実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、１０ｋＤａより大きい分子量を有し、好ましくは水溶性である、多糖も含む。
【００５６】
好ましくは、本発明によるタバコ葉抽出物は、乾燥抽出物の総重量に基づき少なくとも５重量％、好ましくは少なくとも１０重量％、好ましくは少なくとも１５重量％、好ましくは約２０重量％の、以下のタンパク質ファミリー：リグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ、グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼ、エンドキチナーゼ、病態形成関連タンパク質、オスモチン、及びプロテイナーゼ阻害剤、並びにそれらの混合物からなる群から選択されるタンパク質を含む。
【００５７】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、高分子量タンパク質を本質的に含まない。
【００５８】
本発明の目的では、「高分子量タンパク質」は、その分子量が５００ｋＤａより大きい、好ましくはその分子量が４００ｋＤａより大きい、より好ましくはその分子量が３００ｋＤａより大きい、優先的にはその分子量が２００ｋＤａより大きい、さらにより優先的にはその分子量が１５０ｋＤａより大きい、さらに良好にはその分子量が１００ｋＤａより大きい、タンパク質を意味する。
【００５９】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、その分子量が５０ｋＤａより大きいタンパク質を本質的に含まない。
【００６０】
本発明の目的では、「実質的に含まない」は、抽出物の総タンパク質重量に基づき１５重量％未満の分子の含有量、好ましくは、抽出物の総タンパク質重量に基づき１０重量％未満、より好ましくは抽出物の総タンパク質重量に基づき７．５重量％未満、より好ましくは抽出物の総タンパク質重量に基づき５重量％未満、優先的には抽出物の総タンパク質重量に基づき２．５重量％未満、より優先的には抽出物の総タンパク質重量に基づき１重量％未満、さらに良好には抽出物の総タンパク質重量に基づき０．５重量％未満の分子の含有量を意味する。
【００６１】
有利には、高分子量タンパク質の含有量は、抽出物の総タンパク質重量に基づき１５重量％未満、好ましくは抽出物の総タンパク質重量に基づき１０重量％未満、より好ましくは抽出物の総タンパク質重量に基づき７．５重量％未満、より好ましくは抽出物の総タンパク質重量に基づき５重量％未満、優先的には抽出物の総タンパク質重量に基づき２．５重量％未満、より優先的には抽出物の総タンパク質重量に基づき１重量％未満、さらに良好には抽出物の総タンパク質重量に基づき０．５重量％未満である。
【００６２】
１つの実施形態によれば、本発明によるタバコ葉抽出物は、ＲｕＢｉｓＣＯタンパク質を本質的に含まない。
【００６３】
１つの実施形態によれば、タバコ葉は、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana Tabacum）種又はニコチアナ・ルスティカ（Nicotiana Rustica）種のものである。タバコ葉は、ブラウン又はブロンドタバコ由来のものの場合があり、バージニアタバコ、バーリータバコ、オリエンタルタバコ、ラタキアタバコ、ペリクタバコ、マリーランドタバコ、ケンタッキータバコ、カリフォルニアタバコ、テックスメックスタバコ、及びそれらの混合物から選択され得る。
【００６４】
無論、抽出物は、必ずしも、タバコ葉の純粋な抽出物からならない。カンナビスから抽出されるタンパク質が、タバコ及びカンナビス依存性の両方を治療するために、添加されてもよい。
【００６５】
或る特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、ブラウンタバコ、バージニアタバコ及びバーリータバコの１／１／１ブレンドから取得される。
【００６６】
或る特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、バーリータバコから取得される。
【００６７】
１つの実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、乾燥させたタバコ葉から取得される。
【００６８】
或る特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、空気乾燥させたタバコ葉から取得される。
【００６９】
或る特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、その地域の気候条件に適合させた期間、好ましくは１月という最小期間、空気乾燥させたタバコ葉から取得される。
【００７０】
本発明の目的では、「空気乾燥」又は「自然乾燥」は、自然の屋外又は屋内の空気の存在下で実施される乾燥を意味する。空気乾燥は、開かれ又は閉じられ、覆われた又は覆われない構造において、実施され得る。空気乾燥は、例えば、自然乾燥室において、実施され得る。この場合、新たに収穫された又は予め乾燥させたタバコ葉が、解放空気の効果で自然に乾燥するように、放置される。タバコ葉は、例えば、加熱されず換気された部屋において、吊るしてもよい。タバコ葉は、例えば、それらが褐色になるまで、自然に乾燥するように、放置してもよい。この段階では、葉に残された糖は、実質的に存在しない。有利には、乾燥は、その地域の気候条件に適合させた期間、好ましくは１月という最小期間、実施される。例として、乾燥は、中央フランスにおける収穫のための９月と１２月との間に、実施してもよい。タバコ葉は、均一な乾燥を可能とし、葉の圧縮（condensation）の形成及び腐敗（rotting）又は分解を回避するように、乾燥中に１回又は複数回かき混ぜる（turned）か又は通気してもよい。空気乾燥方法は、例えばバーリー種のタバコに対して、使用され得る。
【００７１】
或る特定の実施形態によれば、タバコ葉の抽出物は、自然乾燥室において乾燥させたタバコ葉から取得される。
【００７２】
別の特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、加熱した乾燥室において乾燥させたタバコ葉から取得される。この場合、乾燥は、好適な温度まで加熱された部屋又は構造において、実施され得る。
【００７３】
別の特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、煙道乾燥させたタバコ葉から取得される。この場合において、乾燥は、好適な温度まで加熱された構造又は部屋において、実施され得る。熱が、外部の熱供給源に接続されたダクトを通じて構造又は部屋中に導入され得る。このを制御された加熱が、黄色〜橙色の葉をもたらす。したがって、これらの葉は、高い糖含有量を有する。バージニアタバコは、例えば、この方法に従って、乾燥してもよい。
【００７４】
別の特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、日光で乾燥させたタバコ葉から取得される。この場合、タバコ葉は、ラック上に広げて、１２〜３０日間、日光に曝してもよい。太陽からの直接の光及び熱の下で、葉は、黄色又は橙色となり、高い糖含有量を保持する。オリエンタルタバコは、概して、この方法を使用して、乾燥させる。
【００７５】
別の特定の実施形態によれば、タバコ葉抽出物は、火で乾燥させたタバコ葉から取得される。この場合、木の小さい片を、タバコ葉の下で燃やしてもよく、タバコ葉が、「スモーキー」なアロマを吸収しながら乾燥する。
【００７６】
本発明によるタバコ葉抽出物は、有利には、水性抽出物である。
【００７７】
本発明によるタバコ葉抽出物は、有利には、褐色の色を有する水性抽出物である。
【００７８】
好ましくは、タバコ葉抽出物は、粉砕した乾燥させたタバコ葉の、例えば水性溶媒による、溶媒抽出プロセス、その後、粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液からの固体残渣の分離、その後、抽出物の体積に基づき、体積で２〜１２倍、好ましくは体積で３〜１０倍、好ましくは体積で４〜８倍の範囲、好ましくは体積で６倍の量の水性溶媒を用いる、及び、１０ｋＤａカットオフ膜を用いる、固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液の定積透析ろ過によって、取得可能である。
【００７９】
無論、他の種類の溶媒を、タバコ葉抽出物の抽出プロセスを実施するために、使用してもよい。工程ｃの抽出は、有機若しくは無機溶媒を用いて、又は有機及び／若しくは無機溶媒の混合物を用いて、実施され得る。
【００８０】
良好な抽出効率及び収率を確保するために、並びに所望の純度特性及び組成を有する良好な質の抽出物を取得するために、当業者は、以下の基準に従って、適切な溶媒をどのようにして選択するかを容易に知る：
−  溶媒又は溶媒混合物の極性（極性又は非極性）；
−  溶媒又は溶媒混合物の物理的状態（例えば、液体、固体、超臨界状態又は気体）；
−  溶媒又は溶媒混合物の化学的性質（例えば、有機又は無機）；
−  溶媒又は溶媒混合物の電荷（例えば、イオン性又は非イオン性）；
−  溶媒又は溶媒混合物の起源；
−  溶媒又は溶媒混合物の混和性；
−  溶媒又は溶媒混合物の溶解性。
【００８１】
当業者は、所望の抽出収率並びに抽出物の純度及び組成に基づき、彼の基準に対応する溶媒を選択するためにどの技法を使用すべきかを知る。
【００８２】
有利には、本発明によるタバコ葉抽出物は、以下に記載されるタバコ葉調製プロセスによって取得される。
【００８３】
医薬組成物
第２の態様では、本発明は、上で記載されるようなタバコ葉抽出物を活性成分として含む医薬組成物に関する。
【００８４】
本発明による医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、例えば薬学的に許容可能な溶媒、例えば水をさらに含む。
【００８５】
有利には、医薬組成物は、１〜１０００μｇ／ｍＬ、好ましくは １０〜５００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜３００μｇ／ｍＬ、好ましくは６０〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは８０〜１５０μｇ／ｍＬの範囲の含有量で、本発明によるタバコ葉抽出物に存在するタンパク質を含む。
【００８６】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、水性組成物である。
【００８７】
或る特定の実施形態によれば、医薬組成物は、負の強化に作用する活性剤、例えばニコチン代用物、バレニクリン又はブプロピオンをさらに含んでもよい。
【００８８】
或る実施形態によれば、医薬組成物は、補助剤をさらに含む。補助剤の例は、膨潤剤、例えば糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、グルコース、ラフィノース、マンニトール、好ましくはラクトース、スクロース、トレハロース、グルコース、若しくはマンニトール、アミノ酸、例えばアルギニン、グリシン若しくはヒスチジン、好ましくはグリシン、又はデキストラン若しくはポリエチレングリコールタイプのポリマー、又はそれらの混合物を含む。この実施形態によれば、医薬組成物は、医薬組成物の総重量に基づき、５０〜９９重量％、好ましくは８０〜９７重量％の補助剤を含む。
【００８９】
或る特定の実施形態によれば、医薬組成物は、カンナビスから抽出されるタンパク質をさらに含んでもよい。
【００９０】
１つの実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、皮下投与に好適な形態で提供される。
【００９１】
別の実施形態によれば、医薬組成物は、接着性（adhesive）経皮的治療システムを用いる投与に好適な形態で提供される。有利には、医薬組成物は、パッチ形態で提供される。
【００９２】
別の実施形態によれば、医薬組成物は、噴霧による又は気化による投与に好適な形態で提供される。有利には、医薬組成物は、噴霧器、気化器又はエアロゾル形態で提供される。
【００９３】
本発明による医薬組成物は、好ましくは、以下に記載されるタバコ葉抽出物を含む医薬組成物を調製するためのプロセスに従って調製される。
【００９４】
医薬組成物の使用
第３の態様では、本発明は、タバコ中毒の治療のための医薬組成物の使用に関する。
【００９５】
本発明の目的では、「タバコ中毒の治療」又は「タバコ依存性の治療」は、より正確には、シガレットの習慣性の（addictive）強化の低減を意味する。本発明による医薬組成物の投与は、とりわけ、シガレットの正の強化、特に喫煙への衝動を低減する。
【００９６】
本発明は、タバコ中毒の治療における使用のための、上で定義されるようなタバコ葉抽出物を含む組成物にも関する。
【００９７】
換言すれば、本発明は、タバコ中毒又は依存性を治療するための方法であって、上で定義されるようなタバコ葉抽出物を含む組成物を投与することを含む、方法にも関する。
【００９８】
有利には、本発明による組成物の投与は、タバコの正の強化、とりわけ喫煙への衝動を減弱させ、したがって喫煙の中止を促進することによって、患者が、喫煙を中断すること、彼の消費を減少させること、又は中断後における彼の再発を防止することを可能とする。有利には、組成物の投与は、いずれかの種類の喫煙者、すなわち重度の喫煙者を含む喫煙者が、喫煙を中断すること、及びやめた後の再発を減少させること又はこれを回避することを助ける。
【００９９】
有利には、カンナビスから抽出されるタンパク質をさらに含む本発明による組成物の投与は、タバコ及びカンナビスに対する依存性又は中毒を同時に治療することを可能とする。
【０１００】
１つの実施形態によれば、本発明による組成物は、皮下注射によって投与される。この実施形態によれば、医薬組成物は、皮下投与に好適な形態で提供される。
【０１０１】
１つの実施形態によれば、医薬組成物は、０．０３ｍＬ〜１０ｍＬ、好ましくは０．１ｍＬ〜５ｍＬ、好ましくは０．５〜２ｍＬという投与形態で提供される。したがって、医薬組成物は、好ましくは、皮下注射によって、０．０３ｍＬ〜１０ｍＬ、好ましくは０．１〜５ｍＬ、好ましくは０．５ｍＬ〜２ｍＬという量で投与される。
【０１０２】
１つの実施形態によれば、本発明による組成物は、上で定義されるようなタバコ葉抽出物を含有する接着性経皮的治療システムを用いて、投与される。この実施形態によれば、医薬組成物は、接着性経皮的治療システムを用いる投与に好適な形態で提供される。有利には、医薬組成物は、パッチ形態で提供される。
【０１０３】
パッチは、１つ又は複数のコンパートメントを有するリザーバ型パッチ、又はマトリクス型パッチの形態であり得る。パッチの実際の実行は、パッチの適用の全期間、例えば約２ｈ〜２４ｈの期間にわたってタバコ葉抽出物の制御及び延長された全身投与を得るための対象の彼の一般知識に基づき、当業者によって決定される。
【０１０４】
リザーバ型パッチは、活性成分の放出の速度を調整する半透性ポリマー膜を介して皮膚と接触する、溶液中に又はポリマーマトリクスに懸濁される（タバコ葉抽出物を含む）活性成分を含有する１つ又は複数の別々のリザーバを含む。
【０１０５】
マトリクス型パッチは、その内部に適切な割合で活性成分が溶解又は分散する、ポリマー性物質を含む。これらの活性成分は、前記マトリクスのポリマー鎖を通じた拡散によって放出される。
【０１０６】
このタイプのパッチの或る特定の実施形態によれば、接着剤が、マトリクスの全放出表面を覆い、後者の不可欠な部分となる。したがって、これは、簡単なつくりの、患者の皮膚上での快適な適用を可能とする薄く、好適には柔軟なパッチの創出を可能とする、当業者に周知の活性接着型パッチである。
【０１０７】
皮下における又は血流における、適切な用量での、適切な拡散速度での、及び適切な期間での、これらの活性成分の良好な注入を確実とするために、当業者は、以下のパラメータを容易に設定することができる：
−  パッチの各コンパートメントの表面積と体積との比；
−  １つ又は複数の親水性添加剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の拡散活性化剤又は阻害剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の可溶化剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の安定化剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の吸収促進剤の任意の添加；並びに
−  より一般的に、タバコ葉抽出物の流れ及び安定性の良好な制御を可能とする、当業者に周知の全ての種類の添加剤。
【０１０８】
当業者は、所望の溶解性及び安定性に基づき、上で列挙されるパラメータを設定するためにどの技法を使用すべきかを知る。
【０１０９】
パッチの様々な製造パラメータが、所望の投与に到達するために、当業者によって容易に適合させられる。
【０１１０】
それ自体が既知のように、このようなパッチは、パッチが製造された後に、及び、その貯蔵期間全体を通じて、皮膚に適用される接着側を保存することが意図される除去可能な保護フィルムを含む。それ自体が既知のように、当業者は、例えば、その一方側を抗接着シリコーンで処理することができるポリエステルフィルムを使用する。
【０１１１】
別の実施形態によれば、本発明による組成物は、上で定義されるようなタバコ葉抽出物を含有する噴霧又は気化システムを用いて、投与される。この実施形態によれば、医薬組成物は、噴霧又は気化による投与に好適な形態で提供される。有利には、医薬組成物は、噴霧器、気化器又はエアロゾル形態で提供される。
【０１１２】
噴霧器、気化器又はエアロゾルは、１つ又は複数のコンパートメントを有するリザーバを有する噴霧器、気化器又はエアロゾルの形態であり得る。噴霧器、気化器又はエアロゾルの実際の実行は、タバコ葉抽出物の制御及び延長された全身投与を得るための対象の彼の一般知識に基づき、当業者によって決定される。
【０１１３】
噴霧器、気化器又はエアロゾルは、溶液又は懸濁液中に活性成分（タバコ葉抽出物を含む）を含有する１つ又は複数の別々のリザーバを有する。活性成分は、その後、治療対象の身体の領域上に、噴霧又は気化によって投与される。噴霧又は気化は、例えば、皮膚上に実施することができる。活性成分は、粘膜中に噴霧又は気化によって投与され得る。
【０１１４】
皮下における又は血流における、適切な用量での、適切な拡散速度での、及び適切な期間での、これらの活性成分の良好な注入を確実とするために、当業者は、以下のパラメータを容易に設定することができる：
−  噴霧器、気化器又はエアロゾルの各コンパートメント又はリザーバの表面積と体積との比；
−  １つ又は複数の親水性添加剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の拡散活性化剤又は阻害剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の可溶化剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の安定化剤の任意の添加；
−  １つ又は複数の吸収促進剤の任意の添加；並びに
−  より一般的に、タバコ葉抽出物の流れ及び安定性の良好な制御を可能とする、当業者に周知の全ての種類の添加剤。
【０１１５】
当業者は、所望の溶解性及び安定性に基づき、上で列挙されるパラメータを設定するためにどの技法を使用すべきかを知る。
【０１１６】
噴霧器、気化器又はエアロゾルの様々な製造パラメータが、所望の投与に到達するために、当業者によって容易に適合させられる。
【０１１７】
第１の実施形態によれば、医薬組成物は、１回だけ投与されることが意図される形態で提供される。この実施形態によれば、医薬組成物は、１回だけ投与され、したがって、タバコの正の強化、とりわけ喫煙への衝動の低減又は抑制を可能とする。
【０１１８】
別の実施形態によれば、医薬組成物は、複数回、好ましくは２回又は３回投与されることが意図される形態で提供される。この実施形態によれば、医薬組成物は、好ましくは、０日及び１０日に、又は０日、１０日及び３０日に投与され、タバコの正の強化、とりわけ喫煙への衝動を低減又は抑制する。この実施形態においては、２回目及び任意で３回目に注射される用量は、１回目に注射される用量と同一である。
【０１１９】
或る特定の実施形態によれば、本発明による医薬組成物は、負の強化に作用する活性剤、例えばニコチン代用物、バレニクリン、ブプロピオン又はそれらの混合物を含む組成物とともに、投与され得る。この実施形態によれば、複数の具体的な投与の様式が想定され得る：
（ｉ）シガレット消費を低減するための、本発明による医薬組成物の、喫煙を中断する試みの前における、投与、その後、負の強化の効果、特に離脱の感覚を限定するための、負の強化に作用する活性剤の投与；
（ｉｉ）即時の中止を目的とする、喫煙を中断する試みの時点での、本発明による医薬組成物の、及び負の強化に作用する活性剤の同時投与；
（ｉｉｉ）再発の防止を目的とする、例えば中断する試みの後１２週間にわたる、負の強化に作用する活性剤の、喫煙を中断する試みの時点での、投与、その後、例えば負の強化に作用する活性剤の投与の終了後２週間にわたる、本発明による医薬組成物の投与。
【０１２０】
タバコ葉抽出物の調製
第４の態様においては、本発明は、本発明によるタバコ葉抽出物の調製に関する。
【０１２１】
有利には、本発明によるタバコ葉抽出物を調製するためのプロセスは、以下の工程を含む：
ａ．  タバコ葉の乾燥、
ｂ．  粉砕した乾燥させたタバコ葉を取得するための、乾燥させたタバコ葉の粉砕、
ｃ．  溶媒、例えば水性溶媒、好ましくは６．０〜８．５のｐＨを有する水性緩衝剤溶液を用いる、機械的撹拌下での、粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出、
ｄ．  固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液を取得するための、ろ過又は遠心分離による、粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物の溶液からの固体残渣の分離、
ｅ．  抽出物の体積に基づき、体積で２〜１２倍、好ましくは体積で３〜１０倍、好ましくは体積で４〜８倍の範囲、好ましくは体積で６倍の量の溶媒、好ましくは水性溶媒を用いる、及び、１０ｋＤａカットオフ膜を用いる、工程ｄにおいて取得される溶液の定積ろ過、
ｆ．  任意で、工程ｅにおいて取得されるタンパク質溶液の凍結乾燥。
【０１２２】
或る特定の実施形態によれば、工程ａの乾燥は、解放空気中で実施され、これは自然乾燥と称される。この場合、乾燥は、屋外又は屋内で、自然の解放空気の存在下で実施される。乾燥は、開かれ又は閉じられ、覆われた又は覆われない構造において、実施され得る。空気乾燥は、例えば、自然乾燥室において、実施され得る。この場合、新たに収穫された又は予め乾燥させたタバコ葉が、解放空気の効果で自然に乾燥するように、放置される。タバコ葉は、例えば、加熱されず換気された部屋において、吊るしてもよい。タバコ葉は、例えば、それらが褐色になるまで、自然に乾燥するように、放置してもよい。この段階では、葉に残された糖は、実質的に存在しない。有利には、乾燥は、その地域の気候条件に適合させた期間、好ましくは１月という最小期間、実施される。例として、乾燥は、中央フランスにおける収穫のための９月と１２月との間に、実施してもよい。タバコ葉は、均一な乾燥を可能とし、葉の圧縮の形成及び腐敗又は分解を回避するように、乾燥中に１回又は複数回かき混ぜてもよい。空気乾燥方法は、例えばバーリー種のタバコに対して、使用され得る。或る特定の実施形態によれば、工程ａの乾燥は、自然乾燥室において、実施される。
【０１２３】
別の特定の実施形態によれば、工程ａの乾燥は、加熱された乾燥室において、実施される。この場合、乾燥は、好適な温度まで加熱された部屋又は構造において、実施され得る。
【０１２４】
別の特定の実施形態によれば、工程ａの乾燥は、煙道乾燥によって、実施される。この場合、乾燥は、好適な温度まで加熱された構造又は部屋において、実施され得る。熱は、外部の熱供給源に接続されるダクトを通じて、構造又は部屋中に、導入され得る。この制御された加熱は、黄色〜橙色の葉をもたらす。したがって、これらの葉は、高い糖含有量を含有する。バージニアタバコは、例えば、この方法を使用して、乾燥させてもよい。
【０１２５】
別の特定の実施形態によれば、工程ａの乾燥は、日光乾燥によって、実施される。この場合、タバコ葉は、ラック上に広げて、１２〜３０日間、日光に曝してもよい。太陽からの直接の光及び熱の下で、葉は、黄色又は橙色となり、高い糖含有量を保持する。オリエンタルタバコは、概して、この方法を使用して、乾燥させる。
【０１２６】
別の特定の実施形態によれば、工程ａの乾燥は、火炎乾燥によって、実施される。この場合、木の小さい片を、タバコ葉の下で燃やしてもよく、タバコ葉が、「スモーキー」なアロマを吸収しながら乾燥する。
【０１２７】
有利には、工程ａの乾燥は、例えば加水分解メカニズムによって、高分子量タバコタンパク質、例えばＲｕＢｉｓＣＯの分解を促進する。
【０１２８】
工程ｃ〜ｅは、特許ＵＳ５，７７０，６９８（第６列、第４７行〜第７列、第７行）及び特許出願ＵＳ２００９／０１６２４０３（［００３２］〜［００４０］段落）に記載される種類の抽出、ろ過及び透析ろ過工程に相当する。
【０１２９】
好ましくは、工程ｃにおける抽出は、４〜２０℃、好ましくは４〜１０℃の温度で、実施される。
【０１３０】
好ましくは、工程ｃにおける抽出は、１２〜３６ｈ、好ましくは２２〜２６ｈ、好ましくは２４ｈ、実施される。
【０１３１】
或る特定の実施形態によれば、工程ｃにおいて使用される溶媒は、水性溶媒である。好ましくは、工程ｃにおいて使用される水性溶媒は、好ましくは２〜６ｇ／Ｌ、好ましくは４ｇ／Ｌの濃度の、重炭酸アンモニウムの水性緩衝剤溶液である。
【０１３２】
無論、他の種類の溶媒を使用して、工程ｃの抽出を実施してもよい。工程ｃの抽出は、有機若しくは無機溶媒を用いて、又は、有機及び／若しくは無機溶媒の混合物を用いて、実施され得る。
【０１３３】
良好な抽出効率及び収率を確保するために、並びに所望の純度特性及び組成を有する良好な質の抽出物を取得するために、当業者は、以下の基準に従って、適切な溶媒をどのようにして選択するかを容易に知る：
−  溶媒又は溶媒混合物の極性（極性又は非極性）；
−  溶媒又は溶媒混合物の物理的状態（例えば、液体、固体、超臨界状態又は気体）；
−  溶媒又は溶媒混合物の化学的性質（例えば、有機又は無機）；
−  溶媒又は溶媒混合物の電荷（例えば、イオン性又は非イオン性）；
−  溶媒又は溶媒混合物の起源；
−  溶媒又は溶媒混合物の混和性；
−  溶媒又は溶媒混合物の溶解性。
【０１３４】
当業者は、所望の抽出収率並びに抽出物の純度及び組成に基づき、これらの基準に対応する溶媒を選択するためにどの技法を使用すべきかを知る。
【０１３５】
好ましくは、工程ｃにおける抽出は、好ましくは３０〜７０ｇ／Ｌ、好ましくは４０〜６０ｇ／Ｌ、より優先的には５０ｇ／Ｌという緩衝剤溶液中における粉砕した乾燥させたタバコ葉の濃度で、緩衝剤溶液中に粉砕した乾燥させたタバコ葉を懸濁することによって、実施される。懸濁された固体残渣は、その後、固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉を取得するために、ろ過によって、例えばブフナーろ過（工程ｄ）によって、除去される。
【０１３６】
好ましくは、工程ｄにおいて使用される水性溶媒は、注射用水（ＷＦＩ）である。
【０１３７】
有利には、工程ｅは、分子量が１０ｋＤａ未満である分子、とりわけ、１０ｋＤａ未満の分子量の遊離アミノ酸、タンパク質及びペプチド、並びに、工程ａのタンパク質の分解から生じる１０ｋＤａ未満の分子量のタンパク質残渣の９９％超を除去する。
【０１３８】
好ましくは、工程ｅにおいて取得されるタンパク質溶液は、工程ｆの前に、滅菌ろ過の工程ｅ’に供される。
【０１３９】
上で記載されるプロセスの終了時に取得される本発明によるタバコ葉抽出物は、滅菌ろ過の工程ｄ’の終了時に取得されたままの状態で貯蔵してもよく、又は、工程ｆの終了時に取得されたままの状態で凍結乾燥してもよい。
【０１４０】
タバコ葉抽出物を含む医薬組成物の調製
第５の態様では、本発明は、本発明によるタバコ葉抽出物を含む医薬組成物の調製に関する。
【０１４１】
医薬組成物は、以下の工程を含むプロセスによって調製され得る：
ａ．  上で定義されるようなタバコ葉抽出物の調製、
ｂ．  １００〜２００μｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度を取得するための、タンパク質濃度の調整、
ｃ．  薬学的に許容可能な賦形剤の添加、及び
ｄ．  任意で、この抽出物への補助剤の添加、好ましくは、マンニトールの添加。
【０１４２】
工程ｂにおいて使用されるタバコ葉抽出物は、１０ｋＤａカットオフ膜での透析ろ過の工程の後に直接的に取得されるもの、若しくは、滅菌透析ろ過の工程の後に取得されるもののいずれか、又は、凍結乾燥され、その後、例えば生理食塩水若しくは水中で、再構成されるタバコ葉抽出物であり得る。
【０１４３】
有利には、工程ｂにおける濃度は、以下のいずれかによって、調整され得る：
−  タンパク質濃度をより低くするための、水での希釈、又は
−  タンパク質濃度を増大させるための、透析ろ過。
【０１４４】
工程ｃにおいて特に好まれる、薬学的に許容可能な賦形剤は、水である。
【０１４５】
工程ｄにおいて添加することができる補助剤は、とりわけ、膨潤剤、例えば糖、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、ソルビトール、グルコース、ラフィノース、マンニトール、好ましくはラクトース、スクロース、トレハロース、グルコース、若しくはマンニトール、アミノ酸、例えばアルギニン、グリシン若しくはヒスチジン、好ましくはグリシン、又はデキストラン若しくはポリエチレングリコール型のポリマー；又は、これらの混合物であり得る。
【０１４６】
或る特定の実施形態によれば、工程ｄは、少なくともマンニトールの添加を含む。
【０１４７】
タバコ葉抽出物を含む医薬組成物を含むキット
第６の態様では、本発明は、複数用量のタバコ葉抽出物又は本発明による医薬組成物を含むキットに関する。
【０１４８】
第１の実施形態によれば、キットは、好ましくは凍結乾燥形態の、１つ又は複数の用量のタバコ葉抽出物、及び、投与直前に本発明による医薬組成物を調製するための、１つ又は複数の用量の生理食塩水又はＷＦＩを含む。
【０１４９】
別の実施形態によれば、キットは、患者に直ぐに投与することができる、１つ又は複数の用量の医薬組成物を含む。
【０１５０】
キットは、任意で、皮下注射によって医薬組成物を投与するための、１つ又は複数のシリンジを含み得る。
【０１５１】
キットは、任意で、経皮的に医薬組成物を投与するための、１つ又は複数のパッチを含み得る。
【０１５２】
以下の実施例は、本発明を例証することを目的とする。
【０１５３】
実施例
実施例１：本発明によるタバコ葉抽出物の調製
バーリータバコ葉を使用して、抽出物を調製する。
【０１５４】
約３月間（中央フランスにおいて、９月〜１２月）自然乾燥させた１００ｇのバーリータバコ葉を、粉砕する。粉砕した葉を、８ｇの重炭酸アンモニウムが添加された１８９２ｇのＷＦＩ中、２４ｈ、４〜１０℃の温度で懸濁する。懸濁された固体残渣を、その後、ブフナーろ過によって除去する。
【０１５５】
抽出物の０．２μｍ清澄ろ過を、その後、実施する。取得された抽出物は、褐色である。抽出物を、その後、秤量して、定積透析ろ過工程において使用されるべきＷＦＩの体積を決定する。この場合において、液体抽出物の質量は、１６８０ｇである。
【０１５６】
この固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物のタンパク質の抽出を、その後、行う。１００８０ｇのＷＦＩを、その後、固体残渣を含まない粉砕した乾燥させたタバコ葉の抽出物に添加する。そのようにして取得された１１７６０ｇの溶液を、１０ｋＤａカットオフ（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて体積の６倍に対して定積で透析ろ過し、残余分の質量を１６８０ｇまで低減する。
【０１５７】
透析ろ過の後に取得された残余分は、それらの最初の濃度より９９％低い濃度を有する１０ｋＤａ未満の分子量のタンパク質が検出されるタンパク質混合物である。取得された残余分の色は、欧州薬局方５．０、２．２．２、液体の着色の程度において定義される測定スケールに従うと、Ｂ２とＢ３との間である。
【０１５８】
この透析ろ過物は、凍結乾燥したタバコ葉抽出物を取得するために、マンニトールの添加の後で、例えばＳＭＨ１５０凍結乾燥器を使用して、凍結乾燥してもよい。
【０１５９】
実施例２：実施例１によって調製されたタバコ葉抽出物のタンパク質組成の決定
実施例１のタバコ葉抽出物のタンパク質を、先ず、ポリアクリルアミドゲルで分離する。このために、分析対象の抽出物を、ＮｕＰａｇｅ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（４〜１２％）に添加し、電気泳動を、２００Ｖで３５分間実施し、その後、２０ｍＬのＩｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅと１ｈ接触させ、その後、水で終夜リンスする。選択されたポリアクリルアミドゲルのバンドを、切り出し（６つのバンド）、その後、５０ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３／ＣＨ３ＣＮ（５０／５０）緩衝剤で脱染する。ジスルフィド架橋を、その後、１０ｍＭ  ジチオスレイトール／５０ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３溶液を用いて、５５℃で４０分間還元する。還元されたシステインを、その後、１００ｍＭ  ヨードアセトアミド／５０ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３溶液を用いて、３０分間室温、暗所でアルキル化する。
【０１６０】
そのようにして取得されたタンパク質溶液を、酵素を用いて消化して、タンパク質又はペプチド断片を取得する。消化は、５０ｍＭ  ＮＨ４ＣＯ３液中で、３７℃で終夜、ポリアクリルアミドゲルバンドの染色に適合させた量でトリプシン（トリプシンＶ５１１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて実施される。
【０１６１】
ペプチド消化物（digestate）のペプチドを、その後、ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８マイクロプレカラム（５μｍ；１００Å；３００μｍ×５ｍＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での予備濃縮、その後、線形勾配モード（緩衝剤Ａ：Ｈ２Ｏ中０．１％  ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ（９５／５）、緩衝剤Ｂ：Ｈ２Ｏ中０．１％  ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ（２０／８０）、勾配０→６０％  Ｂ（６０分で）、流速３００μＬ／分）のＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８ナノカラム（３μｍ；１００Å；７５μｍ×２５０ｍＭ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での溶出を用いる、液体ナノクロマトグラフィ（Ｕ３０００ナノＬＣシステム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分離する。
【０１６２】
ペプチドを、その後、ナノスプレー源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備え、Ｕ３０００ナノＬＣ装置と連結されたＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ機器（二重圧力線形イオントラップ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での質量分析によって分析する。データを、「Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ」モードでのｍ／ｚ４００から１６００までのＭＳスキャン、その後、衝突エネルギー３５ｅＶのヘリウム下のＣＩＤモードでの２０の最強ＭＳイオン（電荷：２以上）での「Ｎｏｒｍａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」モードでのＭＳＭＳスキャンのサイクルによる、ポジティブモードのＥｘｃａｌｉｂｕｒ２．１ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて取得する。左記に断片化したＭＳイオンを、５０ｍｍｕのマストレランスで３０秒間、動的に排除する。
【０１６３】
ペプチド及びそれらの断片の質量を、同定の目的で、データベース中の既存のデータと比較する。このために、ＭＳ及びＭＳＭＳデータを、ＭＡＳＣＯT検索アルゴリズム（２．４版）によるＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．４ソフトウェアを用いて加工し、ＴＯＢＡＣ種まで低減されたＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（２０１５年４月リリース）を検索する。
【０１６４】
タンパク質の同定を、０．０５未満の信頼値ｐによって、確認する。最大信頼の少なくとも２つのペプチドで同定されたタンパク質のみが、保持される。
【０１６５】
そのようにして同定された各タンパク質のスコアは、それらの間のタンパク質の相対的な分類のみを可能とし、この分類は、これらのタンパク質の濃度と相関する。これらのスコアの絶対値は、操作条件、試験試料及び付着した量に依存する。
【０１６６】
それらのスコアの降順（最も多く存在するものから、最も少なく存在するものまで）での、そのようにして同定及び分類された１２のタンパク質のリストは、以下の通りである：
−  Ｐ３６４０１；Ｅ１３Ｈ＿ＴＯＢＡＣ；グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼ、酸性アイソフォームＰＲ−Ｑ’（ＥＣ３．２．１．３９）（（１−＞３）−ベータ−グルカンエンドヒドロラーゼ）（（１−＞３）−ベータ−グルカナーゼ）（ベータ−１，３−エンドグルカナーゼ）（ＰＲ−３５）；ＭＭ：３６９９５Ｄａ；
−  Ｐ１７５１３；ＣＨIＰ＿ＴＯＢＡＣ；酸性エンドキチナーゼＰ（ＥＣ３．２．１．１４）（病態形成関連タンパク質Ｐ）（ＰＲ−Ｐ）；ＭＭ：２７４６９Ｄａ；
−  Ｐ１７５１４；ＣＨＩＱ＿ＴＯＢＡＣ；酸性エンドキチナーゼＱ（ＥＣ３．２．１．１４）（病態形成関連タンパク質Ｑ）（ＰＲ−Ｑ）；ＭＭ：２７６３３Ｄａ；
−  Ｐ２７６６６；Ｅ１３Ｆ＿ＴＯＢＡＣ；グルカンエンド−１，３−ベータ−グルコシダーゼ、塩基性液胞型アイソフォームＧＬＢ（ＥＣ３．２．１．３９）（（１−＞３）−ベータ−グルカンエンドヒドロラーゼ）（（１−＞３）−ベータ−グルカナーゼ）（ベータ−１，３−エンドグルカナーゼ、塩基性）（グルカナーゼ  ＧＬＢ）；ＭＭ：４０４４３Ｄａ；
−  Ｐ１４１７０；ＯＳＭＯ＿ＴＯＢＡＣ；オスモチン；ＭＭ：２６６８１Ｄａ
−  Ｐ２４０９１；ＣＨＩ２＿ＴＯＢＡＣ；エンドキチナーゼＢ（ＣＨＮ−Ｂ）（ＥＣ３．２．１．１４）；ＭＭ：３４７２１Ｄａ；
−  Ｐ１１９６５；ＰＥＲＸ＿ＴＯＢＡＣ；リグニン形成性アニオン性ペルオキシダーゼ （ＥＣ１．１１．１．７）（ＴＯＰＡ）；ＭＭ：３４６７４Ｄａ；
−  Ｐ１３０４６；ＰＲＲ１＿ＴＯＢＡＣ；病態形成関連タンパク質Ｒ主要形態（タウマチン様タンパク質Ｅ２２）；ＭＭ：２４６６７Ｄａ；
−  Ｐ２９０６２；ＰＲ４Ａ＿ＴＯＢＡＣ；病態形成関連タンパク質ＰＲ−４Ａ；ＭＭ：１６２２１Ｄａ；
−  Ｑ０３１９９；ＩＰＩＢ＿ＴＯＢＡＣ；プロテイナーゼ阻害剤Ｉ−Ｂ（ＰＩ−ＩＢ）（微生物セリンプロテイナーゼ主要アイソフォームの阻害剤）；ＭＭ：１１９１６Ｄａ；
−  Ｑ０３１９８；ＩＰＩＡ＿ＴＯＢＡＣ；プロテイナーゼ阻害剤Ｉ−Ａ（ＰＩ−ＩＡ）（微生物セリンプロテイナーゼ主要アイソフォームの阻害剤）；ＭＭ：１１８８０Ｄａ；
−  Ｐ２９０６３；ＰＲ４Ｂ＿ＴＯＢＡＣ；病態形成関連タンパク質ＰＲ−４Ｂ；ＭＭ：１６２３５Ｄａ。
【０１６７】
したがって、タバコ葉抽出物の調製プロセスは、或る特定のタンパク質を濃縮すること、及び他のものを除去することを可能とする。したがって、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔに列挙される７５９のニコチアナ・タバカムタンパク質のうち、６のファミリー及び１２のタンパク質のみが、実施例１によって調製されたタバコ葉抽出物に主に存在する。実施例１によって調製されたタバコ葉抽出物に主に存在する１２のタンパク質は、１０〜５０ｋＤａの間の分子量を有する。
【０１６８】
実施例３：タンパク質含有量の決定
実施例１によるタバコ葉抽出物中の（透析ろ過工程の前及び後の）タンパク質含有量を、ブラッドフォード法に従って決定した。
【０１６９】
実施例１の抽出物を、生理食塩水に溶解させる。
【０１７０】
３の標準タンパク質溶液を、調製した：５０μＬの２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｐ０８３４）を、正確に１００μｇ／ｍＬの標準化溶液を取得するために、９５０μＬの生理食塩水を用いて、２０倍希釈する。
【０１７１】
試験された各チューブは、８０μｌのタンパク質試料及び９２０μＬのブラッドフォード試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｂ６９１６）を含有する。各チューブにブラッドフォード試薬を添加した後、チューブを、穏やかに振とうして渦を作り出し、その後、室温で５分間インキュベートする。試料を、１．５ｍＬキュベットに移し、その吸光度を、５９５ｎｍで１ｈ測定する。
【０１７２】
タンパク質濃度を、調製された標準タンパク質溶液との比較によって、決定した。
【０１７３】
測定されたタンパク質量は、以下である：
−  透析ろ過前：２９５．４５  ＋／−  ９．９１μｇ／ｍＬ；
−  透析ろ過後：１６０．６１  ＋／−  １．３１μｇ／ｍＬ。
【０１７４】
実施例１によるタバコ葉抽出物の電気泳動プロファイルを、透析ろ過工程の後で、決定した。２、５、１０及び１５μｇの量のタンパク質を、ＮｕＰａｇｅゲルに装荷した。
【０１７５】
４％〜１２％Ｎｕｐａｇｅゲルを、３５分間調製し、その後、２０ｍｌのクマシーブルー中に１ｈ置き、水で終夜リンスした。ゲルを、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（商標）ソフトウェアを用いるＢｉｏｒａｄのＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳシステムを使用して、分析した。
【０１７６】
３の主要なバンドを、１５ｋＤａ及び３０ｋＤａの周りに検出する（図１）。２の他のバンドも、約４０ｋＤａに認識可能である。
【０１７７】
結果は、このタバコ葉抽出物においては、検出された１００ｋＤａより大きい分子量のタンパク質の量が、１０〜５０ｋＤａの間の分子量のタンパク質の量と比較して小さいことを示す。
【０１７８】
実施例４：本発明によるタバコ葉抽出物における分子量が１０ｋＤａ未満である分子の除去に対する透析ろ過体積の影響
実施例１によるタバコ葉抽出物における、分子量が１０ｋＤａ未満である分子の除去を、使用された透析ろ過体積に従って、透析ろ過工程中に、モニタリングした。モニタリングを、１０ｋＤａ未満の分子量の分析トレーサー（ニコチン）のガスクロマトグラフィアッセイによって行う。
【０１７９】
結果を、以下の表に示す：
【０１８０】
【表１】
2019511516.tif 000002
【０１８１】
分子量が１０ｋＤａ未満である分子の除去は、透析ろ過体積が増大するとますます効果的であり、この透析ろ過体積が最初の体積の６倍であるときに完全となる。
【０１８２】
実施例５：ヒト単核細胞に対するインビトロでの、及びマウスに対するインビボでの実施例１の抽出物の生物学的活性
材料及び方法：
−  使用された製品
ＰＭＡ／イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  製品番号Ｐ８１３９／Ｉ０６３４）
ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  製品番号Ａ７０２０）
ＰＢＳ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  製品番号Ｈ１５−００２）
Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  製品番号Ｐ１３７９）
ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇ鎖特異的）−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  製品番号１０３０−０４）
ビオチン−抗マウスＩｇＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  製品番号ＢＬＥ４０６９０４）
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  製品番号７１００−０４）
【０１８３】
−  細胞調製及び刺激様式
種々の健康なドナー由来の末梢血単核細胞を、密度勾配上の遠心分離によって単離した（分離培地：ＬＭＳ １０７７ ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。取得した単核細胞を、種々の希釈率で実施例１による抽出物を用いて２４ｈ又は４８ｈ刺激した。上清を、取り出し、Ｌｕｍｉｎｅｘ法を使用するサイトカインプロファイル分析のために、２４ｈ又は４８ｈの刺激の後で−８０℃で貯蔵した。２４ｈの刺激の後、細胞を、フローサイトメトリーによる表現型分析のために採取した。
【０１８４】
サイトメトリー表現型分析
細胞を、最初に、生存度マーカー（Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ４５０（６５−０８６３−１４  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で、その後、種々の膜マーカーの検出のための蛍光色素に直接結合した抗体で、染色した。Ｔ及びＢリンパ球集団を、マーカーＣＤ３及びＣＤ１９を用いて同定した。ＮＫ細胞を、マーカーＮＫｐ４６若しくはマーカーＣＤ５６及びＣＤ１６の組合せのいずれかを用いて、又はＣＤ３の不存在下におけるＣＤ５６発現を介して、検出した。これらの細胞集団から、種々の活性化マーカー（ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ）のための「ゲート」が設定された。
【０１８５】
表現型サイトメトリー分析のために使用された抗体のリストが、以下の表に示される：
【０１８６】
【表２】
2019511516.tif 000003
【０１８７】
アイソタイプ対照を、各実験において使用し、補償マトリクスを、この多パラメータ表現型分析のために作り出した。
【０１８８】
染色した試料を、チューブ１つ当たり１０００００事象の最小取得で、Ｎａｖｉｏｓサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  １０色）で分析した。取得したデータを、その後、Ｋａｌｕｚａソフトウェアで分析した。
【０１８９】
−  Ｌｕｍｉｎｅｘ及びＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌プロファイルの分析
ＥＬＩＳＡ及びサイトメトリー原理に基づくこの技術は、複数の分析物を同時にアッセイすることを可能とする。
【０１９０】
特有の色コードマイクロビーズを、各分析物に特異的な捕捉抗体と結合する。アッセイされる試料を伴うインキュベーションの後、蛍光色素に結合した検出抗体が、二重レーザー光学システム（Ｂｉｏ−ｐｌｅｘ２００システム  Ｂｉｏ−ｒａｄ）による分析を可能とする。第１のレーザーは、マイクロビーズを特定し、第２のものは、蛍光色素に結合した検出抗体を定量する。１７の分析物を、細胞に対して行われた様々な刺激実験時に採取された試料に対してＢｉｏ−Ｐｌｅｘ ＰｒｏヒトサイトカインＧｒｐ１パネル１７ｐｌｅｘキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて、アッセイすることができる。実施例１によるタバコ葉抽出物を含まない培養培地によって刺激された細胞が、各サイトカインについての基礎レベルを取得することを可能とする。
【０１９１】
ＩＬ−８ＥＬＩＳＡは、従来の免疫酵素的サンドイッチ法に基づく。使用した市販のキットを、Ｅｕｒｏｂｉｏ−Ｄｉａｃｌｏｎｅ（Ｂｅｓａｎｃｏｎ）から購入した。
【０１９２】
−  実施例１によるタバコ葉抽出物によるマウスの免疫化
７週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、フランス）から購入した。マウスを、０及び２１日目に、凍結乾燥し５ｍＬの生理食塩水で再構成した、２００μＬの実施例１によるタバコ葉抽出物を用いて、腹腔内に免疫化した。血液を、免疫化前及び後の全てのマウスから回収した。遠心分離後、血清を、−２０℃で凍結した。
【０１９３】
−  ＩｇＧ及びＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ実験のために、製品の１つのバイアルを、２．５ｍＬの炭酸塩−重炭酸塩緩衝剤（０．１Ｍ、ｐＨ９）を用いて再構成した。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ９６Ｗプレートを、実施例１に従って凍結乾燥した後再構成し１８ｈインキュベートした、１００μＬのタバコ葉抽出物とともに、インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ緩衝剤でプレートを洗浄した後、プレートを、２００μＬのＰＢＳ−１％ＢＳＡ緩衝剤を用いて、室温で１時間飽和させる。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ緩衝剤でプレートを洗浄した後、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで１／２０に希釈した１００μＬのマウス血清を、室温で２時間インキュベートする。
【０１９４】
Ｅｌｉｓａ ＩｇＧ：
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０緩衝剤での洗浄後、１００μＬの、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで希釈した、アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 製品番号１０３０−０４）を、温度で１時間インキュベートする。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎでの洗浄後、１００μＬの、アルカリホスファターゼのｐ−ニトロフェニルホスフェート基質（Ｓｉｇｍａ  ｐＮＰＰ）を添加し、室温で１５分間、暗所で放置する。反応を、その後、５０μＬの３Ｍ  ＮａＯＨを添加することによって中断し、光学密度（ＯＤ）を、４０５ｎｍで読み取る。
【０１９５】
Ｅｌｉｓａ  ＩｇＥ
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０緩衝剤での洗浄後、１００μＬの、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで希釈した、ビオチンに結合したラット抗マウスＩｇＥ二次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製品番号ＢＬＥ４０６９０４）を、室温で１時間インキュベートする。ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎでの洗浄後、１００μＬの、アルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  製品番号７１００−０４）を添加し、室温で１時間インキュベートする（供給業者の推奨に従い、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで１１２０００倍希釈）。ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎでのさらなる洗浄の後、１００μＬの、アルカリホスファターゼのｐＮＰＰ基質を添加し、室温で１５分間、暗所で放置する。反応を、その後、５０μＬの３Ｍ  ＮａＯＨを添加することによって中断し、光学密度（ＯＤ）を、４０５ｎｍで読み取る。
【０１９６】
結果：
−  実施例１によるタバコ葉抽出物は、マウスにおいて特異的なＩｇＧ体液性応答を引き起こす。
実施例１に従って凍結乾燥し５ｍＬの生理食塩水で再構成した、タバコ葉抽出物によるマウスの２回の免疫化の後、製品の成分に対するＩｇＧ誘導が観察された。したがって、４／５のＣ５７ＢＬ／６マウス及び４／５のＢａｌｂ／ｃマウスが、２８日目に、すなわち、２回目のワクチン投与の７日後に、タバコ葉抽出物に対して、それらのＩｇＧの増大を示した（図２）。応答しなかった各群における唯一のマウスは、基礎ＩｇＧ抗体レベルを有していた。抗体力価は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスよりもＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、より低いようである（図２）。
【０１９７】
しかしながら、ＩｇＥ体液性応答は、タバコ葉抽出物でのマウスの２回のワクチン投与後には、検出されなかった。光学密度（ＯＤ）は、種々の血清について行われた全てのアッセイにおいて、０．０５未満であった。
【０１９８】
−  タバコ葉抽出物は、末梢血ナチュラルキラー細胞を優先的に活性化する
密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ）による末梢血からの単核細胞の単離の後、種々の細胞集団（Ｔ及びＢリンパ球、ＮＫ細胞等）を、特徴づけることができる（図３）。したがって、ＮＫ細胞を、ＣＤ３ネガティブ集団においてはマーカーＣＤ５６及びＣＤ１６によって、又は、マーカーＮＫｐ４６によって、同定した。実施例１によるタバコ葉抽出物での単核細胞のインキュベーション後、活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ２５及びＨＬＡ−ＤＲの発現の増大が、マーカーＣＤI６＋ＣＤ５６＋（ＣＤ３−）（図４Ａ）及びマーカーＮＫｐ４６の両方によって特定される、ＮＫ細胞において観察された（図４Ｂ）。結果は、１／２に希釈したタバコ葉抽出物を用いた場合、及びＣＤ６９発現について、より明瞭である。したがって、６０％を超えるＮＫ細胞が、タバコ葉抽出物との接触の２４時間後に、マーカーＣＤ６９を発現する（図４Ａ−Ｂ）。静止時には、５％未満の血液ＮＫ細胞が、ＣＤ６９を発現する。
【０１９９】
末梢血リンパ球の活性化に対するタバコ葉抽出物の効果は、はるかに弱い。したがって、静止時には、２％のＴリンパ球が、ＣＤ６９を発現し、この発現は、タバコ葉抽出物での２４時間の培養後に６％まで増大する（図５Ａ）。ＣＤ２５の発現は、タバコ葉抽出物で感作したＴリンパ球においては増大しない（図５Ａ）。同様に、末梢血Ｂリンパ球においては、３％未満のＢリンパ球が、この抽出物との２４時間の共培養後にＣＤ６９を発現するため、タバコ葉抽出物は、顕著な活性を有しない（図５Ｂ）。
【０２００】
−  ヒト血液単核細胞において実施例１によるタバコ葉抽出物によって誘導されるサイトカインのプロファイル
末梢血単核細胞を、実施例１に従って凍結乾燥し異なる希釈率（１／２又は１／２０）で５ｍＬのＰＢＳで再構成した、タバコ葉抽出物と、２４時間接触させ、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子のアッセイを、上清におけるＬｕｍｉｎｅｘによって行った。
【０２０１】
図６は、タバコ葉抽出物による炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１７）の強い誘導を示す。例えば、単核細胞がタバコ葉抽出物の存在下に置かれないときのこれらのサイトカインの基礎レベルは、１０ｐｇ／ｍＬ未満である（図６Ａ）。
【０２０２】
サイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαの濃度を、１／２に希釈したタバコ葉抽出物とのインキュベーション後に、１０００ｐｇ／ｍＬ超で測定する（図６Ａ）。この明確な炎症促進性サイトカインの誘導は、タバコ葉抽出物を１／２０に希釈したときにも観察される（図６Ａ）。結果は、試験した種々のドナーの間で、かなり均一である。細胞媒介性免疫を促進するＴＨ１サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）のうち、ＩＦＮγのみが、１／２及び１／２０に希釈したタバコ葉抽出物によって顕著に刺激される（図６Ｂ）。タバコ葉抽出物は、数ｐｇ／ｍＬオーダーという非常に低い濃度のＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）を誘導する（図７Ａ）。対照的に、タバコ葉抽出物は、１／２に希釈したタバコ葉抽出物と接触させた細胞の上清において見出される、７５０ｐｇ／ｍＬのレベルで単核細胞によるＩＬ−１０産生を刺激する（図７Ａ）。ＩＬ−１０は、元々、ＴＨ２サイトカインであると考えられたが、Ｔｒ１と称される調節性Ｔリンパ球によっても産生され得る。
【０２０３】
我々は、タバコ葉抽出物が、造血成長因子、例えば、好中球の増殖及び動員を促進するＧ−ＣＳＦ、及び、ケモカイン、例えば、マクロファージに対する走化効果を発揮することが知られるＭＣＰ−１の産生も誘導することができることを示した（図７Ｂ）。しかしながら、タバコ葉抽出物は、他の成長因子、例えばＩＬ−７又はＧＭ−ＣＳＦを顕著には刺激しないようである（図７Ｂ）。同じサイトカイン／ケモカインプロファイルが、タバコ葉抽出物との培養の４８時間後に回収した上清に対してアッセイを行ったときに、見出された。
【０２０４】
結論
実施例１によるタバコ葉抽出物は、異なる遺伝的背景を有する２つのマウス系列において、製品に存在するタンパク質を対象とする特異的なＩｇＧ体液性応答を誘導することが可能である。
【０２０５】
ＩｇＥ体液性応答は、これらの同じマウスにおける物質の２回の投与の後に、観察されなかった。
【０２０６】
インビトロでは、実施例１によるタバコ葉抽出物は、末梢血単核細胞のうち、ＮＫ細胞の活性化を優先的に誘導する。この活性化は、ＣＤ６９、ＣＤ２５及びＨＬＡ−ＤＲ分子の発現の増大によって反映される。
【０２０７】
実施例１によるタバコ葉抽出物は、炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ６、ＩＬ−１７、ＩＬ−８及びＴＮＦαをインビトロで誘導する。これらのサイトカインは、刺激の２４時間後に回収した培養上清中に高い濃度で存在する。
【０２０８】
実施例１によるタバコ葉抽出物は、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦ及びＭＣＰ−１も誘導する。しかしながら、この抽出物は、ＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の産生を顕著には誘導しない。
【０２０９】
実施例６：実施例１によるタバコ葉抽出物の毒性学的研究
材料及び方法：
以下の全ての研究が、実施例１によるタバコ葉抽出物を用いて行われた。
【０２１０】
投与の経路は、全ての事例において皮下である。毒性学的研究を、げっ歯類（Ｈａｎ  Ｗｉｓｔａｒラット）について行った。毒性学的研究を、良好な研究室実務のＯＥＣＤ原理（データの評価におけるデータの相互アクセプタンス（ＭＡＤ）、１９９７年１１月２６日（Ｃ（９７）１８６最終）に従って、及び、フランス雇用連帯省によって発行された良好な研究実実務（ＧＬＰ）（第２０００／５の２、２０００年３月１４日、ＪＯ２３／０３／２０００）に従って、実施した。
【０２１１】
−  １４日目における皮下毒性の研究
この研究の目的は、皮下投与（１週間に１回、２週間）の後のラットにおける実施例１によるタバコ葉抽出物の毒性を決定することであった。
【０２１２】
研究を、以下のように行った：
【０２１３】
【表３】
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【０２１４】
研究の結果は、以下のことを示した：
−  いずれの用量でも、死亡は、観察されない；
−  治療に関連する臨床徴候は、観察されず、皮下投与は、局所的に十分な耐容性を示す（臨床徴候及び局所の耐容性が、注射の前及び後に、また、治療を行わないときには１日１回、観察された）；
−  （対照と比較して）体重及び食品消費に対する効果は、有害ではない；
−  治療されたげっ歯類と治療されないげっ歯類と間に、白血球計測数において生物学的に顕著な差異が存在するが、これらの差異は、毒性効果を有しない；
−  変動が、タンパク質及びコレステロール濃度に関して、治療群と非治療群との間に、観察されたが、これらの変動は、対照群の変動の範囲内であるか又は対照群の変動に近い。これらの効果は、有害ではない；
−  変化は、治療群と対照群との間における臓器重量において、観察されなかった。
【０２１５】
したがって、１１．２及び５６μｇタンパク質／ｋｇ／ａｄｍの用量での、１週間に１回、２週間の、実施例１によるタバコ葉抽出物のＷｉｓｔａｒラットに対する皮下投与は、十分な耐容性を示した。
【０２１６】
−  皮下毒性の４週間研究
目的は、 Ｗｉｓｔａｒラットに対する１週間に１回の皮下投与の後における実施例１によるタバコ葉抽出物の毒性を決定すること、及び、治療を行わない場合の４週間の期間にわたる、毒性のいずれかの徴候の退行を決定することであった。
【０２１７】
潜在的な免疫学的現象には、特に注意を払った。
【０２１８】
研究を、以下のように行った：
【０２１９】
【表４】
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【０２２０】
治療期間中、ラットを、投与前、及び、投与後少なくとも３回、観察した。観察期間中、ラットを、１日１回観察した。
【０２２１】
一式の臨床検査を、１週間に１回行った。局所の耐容性を、各注射の前及び後に、最初の１週間の間は１日１回、及びその後、観察期間の終了までは１週間に２回記録した。
【０２２２】
身体温度を、各投与の翌日（１日目、８日目、１５日目及び２２日目）に測定した。
【０２２３】
眼科的検査を、試験前に、並びに、投与の最初の日及び最後の日の１日後（１日目及び２２日目）に、行った。
【０２２４】
個体の体重及び食品消費を、１週間に２回測定した。
【０２２５】
血液学的、凝固、血清臨床化学パラメータ及びリンパ球分析を、２３日目及び４９／４８日目（それぞれ、雄／雌）に、行った。尿試験を、２３日目に行った。
【０２２６】
全ての動物を、最後の投与の２日後に、又は４週間の観察期間後に、屠殺し、死体解剖した。或る特定の臓器を、秤量し、組織病理学的検査に使用した。
【０２２７】
研究の結果は、以下のことを示した：
−  いずれの用量でも、死亡は、観察されない；
−  １６．８、３３．６及び１１２．０μｇ／ｋｇ／ａｄｍの、タンパク質として発現された用量での皮下投与は、局所的に十分な耐容性を示した；
−  治療に関連する臨床徴候は、観察されない；
−  体温は、影響を受けない；
−  治療に関連する眼科的効果は、観察されなかった；
−  体重及び食品消費は、影響を受けない；
−  血液学、凝固及び尿に関して、顕著な差異は、観察されなかった；
−  クレアチンキナーゼ酵素活性は、雌群３及び４において、治療期間の終了時に、減少した（中間用量及び高用量；それぞれ、３３．６及び１１２μｇ／ｋｇ／ａｄｍ）。これらの変動は、それらが組織病理学的特徴と関連しない限りにおいて、有害ではないと考えられた；
−  治療された雌における、並びに中間用量及び高用量で治療された雄（群３及び４）における、循環ＮＫ細胞の数の僅かな減少；
−  観察期間の終了時に、高用量で治療された雄（群４）における循環ＮＫ細胞の平均数は、より低かった；
−  臓器重量の変化は、観察されなかった；
−  暗色のスポットが、注射部位で、観察され、これは、組織病理学的評価中の皮下出血に該当する。この観察は、投与手順に関連しないと考えられる。
【０２２８】
治療の終了時に、最小の又は僅かな炎症性の皮膚の変化が、群３及び４注射部位で観察されたが、群１及び２については、炎症性の変化はほとんど観察されなかった。
【０２２９】
観察期間の終了時に、群４について過去に観察された炎症性の変化は、ほとんど完全な回復を示した。
【０２３０】
１１２μｇ／ｋｇ／ａｄｍの用量までの実施例１によるタバコ葉抽出物の４つの皮下注射は、十分な耐用性を示し、極小で回復可能な炎症性の変化のみが、治療されないラットと比較して、治療されたラットにおいて、生じた。
【０２３１】
結論として、上で定義される実験条件下で、１６．８、３３．６及び１１２μｇ／ｋｇ／ａｄｍの用量での、１週間に１回、４週間の、実施例１によるタバコ葉抽出物のＷｉｓｔａｒラットにおける皮下投与は、十分な耐用性を示し、いずれかの副作用と関連しなかった。
【０２３２】
実施例７：実施例１によるタバコ葉抽出物の投与後における、臨床研究
１００μｇ又は２００μｇのタンパク質及びマンニトールを含有する、実施例１によるタバコ葉抽出物を含む医薬組成物を、２４人の喫煙者に、１回目は０日目に、及び２回目は２９日目に（各回各腕に１ｍＬ）、皮下注射によって投与した。組み入れ（Inclusions）を、コホート拡張の原理に従って行い、６人の最初の患者が、最初に含まれる１００μｇを受け、その後、６人の最初の患者が、２００μｇを受け、その後、６人の追加の患者の組み入れが、１００μｇを受けた。治療された対象の集団は、３０歳と６５歳の間の、２４人の人々、すなわち１４人の男性及び１０人の女性からなるものであり、年齢の中央値は４４．５歳であった。
【０２３３】
試験した用量のいずれも、国立がん研究所の有害事象の一般的用語基準（ＣＴＣＡＥ）第４．０版の毒性グレードに従ってレベル３〜４の毒性を生じなかったことに留意すべきである。
【０２３４】
タバコ消費に関する対象の最初の特徴が、以下の表に提示される。
【０２３５】
【表５】
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【０２３６】
図８及び９は、タバコ消費の進化を示す。
【０２３７】
シガレットの数の減少を算出するための式は、以下の通りである：
（シガレット訪問ｎ（cigarettes visit n）の数  −  組み入れ時のシガレットの数） ／ 組み入れ時のシガレットの数。
【０２３８】
４週目で作られた点は、１６人の喫煙者（６７％の喫煙者）が、喫煙をやめたか、又はその毎日のシガレット消費を少なくとも５０％低減したこと、及び、２４人の喫煙者の毎日のシガレット消費が、６０％減少したことを示した。
【０２３９】
１２週目で作られた点は、１５人の喫煙者（６３％の喫煙者）が、喫煙をやめたか、又はその毎日のシガレット消費を少なくとも５０％低減したこと、及び、２４人の喫煙者の毎日のシガレット消費が、６０％減少したことを示した。
【０２４０】
最後の１２人の喫煙者（２４人のうち１２人）は、臨床研究センターとのその最初の接触と、実施例１によるタバコ抽出物の注射との間に、より長い遅延から（１月以上の間に時々）利益を得たが、最初の１２人の喫煙者は、より短い遅延を有した（わずか数日の間に頻繁に）ことに留意することは興味深い。より長い遅延から利益を得たこれらの１２人の喫煙者について、その消費を少なくとも５０％低減した又は３及び４週目で喫煙を中断した喫煙者の百分率は、８３％であるが（１２人のうち１０人の喫煙者）、より短い遅延から利益を得た１２人の喫煙者については、それは、５０％である（１２人のうち６人の喫煙者）。この優れた有効性は、実施例１によるタバコ抽出物の注射を受ける前にその動機づけを強化するためにより多くの時間を有したこれらの喫煙者の良好な準備によって説明される。最後の１２人の喫煙者のうち、５人は、治療の終了の１週間後から、１２週目（経過観察の終了時）まで、連続的に禁煙し、８人は、１２週目の最後の７日にわたって、連続的に禁煙した。
【０２４１】
治療された喫煙者は、シガレットに対するその関心及びその喫煙への衝動の低減、並びにシガレットに対するある一定の無関心の確立を述べる。彼らは、シガレットの嗜好性の低減に気付く。シガレットの風味の変化を語る者もいる。禁煙についての彼らの動機づけが、強化される。
【０２４２】
医薬組成物の投与前に、医薬組成物を対象とするＩｇＧ抗体が、全ての患者において検出された。治療前に、医薬組成物を対象とするＩｇＧの平均濃度は、６．０７マイクロｇ／ｍｌ（標準偏差：２．９８マイクロｇ／ｍｌ）であった。
【０２４３】
医薬組成物の投与後に、抗医薬組成物ＩｇＧの濃度の顕著な増大が、観察された。したがって、医薬組成物の投与の２９日後に測定されたＩｇＧ濃度は、７．１９マイクロｇ／ｍｌ（標準偏差：４．０４マイクロｇ／ｍｌ）であり、これらの濃度は、医薬組成物の最初の投与の８週間後に測定すると、７．５マイクロｇ／ｍｌ（標準偏差：４．２８マイクロｇ／ｍｌ）に増大した。ＩｇＧ濃度の変動は、２９日目と０日目の間において（ｐ＝０．０２）、及び、８週目と０日目の測定の間において（ｐ＝０．００６）、顕著であった（ｔ検定の有意性の閾値ｐ＜０．０５）。顕著な差異が、８週目及び２９日目の抗医薬組成物ＩｇＧの濃度の間においても観察された（ｐ＝０．０２９）。
【０２４４】
医薬組成物を対象とするＩｇＧの濃度と喫煙の中止とに対する（crossing）統計解析は、より高いレベルの、医薬組成物を対象とするＩｇＧと、喫煙の中止との間における相関関係を示した（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、有意性の閾値ｐ＜０．０５）。
【０２４５】
医薬組成物の最初の投与の１週間後にその消費を少なくとも５０％低減した患者は、２９日目に（ｐ＝０．０３４）及び８週目に（ｐ＝０．０４４）、より高いレベルの、医薬組成物を対象とするＩｇＧを有した。
【０２４６】
３６日目に連続する７日間禁煙した（優位な禁煙（prevalent abstinence））患者は、２９日目に（ｐ＜０．００１）及び８週目に（ｐ＜０．００１）、より高いレベルの、医薬組成物を対象とするＩｇＧを有した。
【０２４７】
１２週目に連続する７日間禁煙した患者（優位な禁煙）は、２９日目に（ｐ＝０．０１３）及び８週目に（ｐ＝０．０１６）、より高いレベルの、医薬組成物を対象とするＩｇＧを有した。
【０２４８】
１２週目まで連続的に禁煙した患者は、２９日目に（ｐ＝０．００７）及び８週目に（ｐ＝０．００９）、より高いレベルの、医薬組成物を対象とするＩｇＧを有した
【０２４９】
ＩｇＥ抗体は、医薬組成物の投与の後に、検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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