(57)【要約】本開示は、Ｔｏｌｌ様レセプター９アゴニスト（ＴＬＲ９）および腫瘍抗原を含む粒子の腫瘍内送達によってがんを処置するための方法に関し、ここで、ＴＬＲ９アゴニストは、ポリヌクレオチドまたはそのキメラ化合物である。本開示の方法は、少なくとも１つの腫瘍にそれらの粒子を注射することを含み、哺乳動物被験体の注射された腫瘍と注射されていない腫瘍との両方の処置に有効である。さらに、本開示は、粒子を含む免疫原性組成物、ならびにそれを製造する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体におけるがんを処置する方法であって、該方法は、有効量の免疫原性組成物を腫瘍内送達によって該被験体に投与する工程を含み、ここで：
該免疫原性組成物は、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含み；
該多量体化剤は、約１０〜約２５，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有し；
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；
該腫瘍抗原は、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含み；
該ＴＬＲ９アゴニストおよび該腫瘍抗原は、各々、１つもしくはそれを超える共有結合によって該多量体化剤と会合しているか、または各々、吸着によって該多量体化剤と会合している、
方法。
【請求項２】
前記多量体化剤が、約０．５〜約２５マイクロメートルの直径を有する水酸化アルミニウム錯体を含み、前記ＴＬＲ９アゴニストおよび前記腫瘍抗原が、各々、吸着によって同じ錯体と会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水酸化アルミニウム錯体が、約０．５〜約５．０マイクロメートルの直径を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多量体化剤が、約１０〜約１，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖を含み、前記ＴＬＲ９アゴニストおよび前記腫瘍抗原が、各々、１つまたはそれを超える共有結合によって該多糖の同じ分子と会合している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多糖が、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、デキストラン、マンナン、キトサン、アガロースおよびデンプンからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記多糖が、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｉＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｊＮｖ−３’（配列番号２）
からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；
ｐ＝０または１であり；
ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；
ｖ＝０〜４１であり；
ｗ＝０、１または２であり；
ｉ＝１、２、３または４であり；
ｊ＝１、２、３または４であり；
Ｘ１とＸ１’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；
Ｘ２とＸ２’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；
該ポリヌクレオチドは、９〜５０ヌクレオチド長である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＮｑ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’ＣＧ）ｊＮｖ−３’（配列番号３）
からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；
ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；
ｖ＝１〜３９であり；
ｊ＝１、２、３または４であり；
Ｘ１とＸ１’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；
Ｘ２とＸ２’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；
該ポリヌクレオチドは、１２〜５０ヌクレオチド長である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）
からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）；
５’−ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  Ａ−３’（配列番号７）；
５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  Ｔ−３’（配列番号８）；
５’−ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＡ−３’（配列番号９）；および
５’−ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣ−３’（配列番号１０）
からなる群より選択される配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、
式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、
Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、
Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
のような、３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含むキメラ化合物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドもしくはキメラ化合物のヌクレオチド間および／または前記キメラ化合物の前記ヌクレオチドと前記スペーサーとの間の１つまたはそれを超える結合が、ホスホロチオエートエステル結合である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド間の結合および前記ヌクレオチドと前記スペーサーとの間の結合のすべてが、ホスホロチオエートエステル結合である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、前記多糖に対する前記ＴＬＲ９アゴニストの平均モル比および前記多糖に対する前記抗原の平均モル比が、各々、約１０〜約１２０の範囲内である不均一な粒子混合物を含む、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、前記水酸化アルミニウム錯体に対する前記ＴＬＲ９アゴニストの比および前記水酸化アルミニウム錯体に対する前記抗原の比が、各々、約０．１〜約１（重量／重量）の範囲内である、不均一な粒子混合物を含む、請求項２、３および７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍抗原が、約１０〜約１００アミノ酸長のポリペプチドを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍抗原が、２つまたはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原由来のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍抗原が、前記哺乳動物被験体に由来する正常細胞に存在する遺伝子と比べて変異を含む遺伝子によってコードされるネオ抗原を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍抗原が、前記腫瘍によって発現されるウイルス抗原を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍抗原が、ヒトがん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１）タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍抗原が、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記哺乳動物被験体が、ヒトである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍内送達が、少なくとも１つの腫瘍への前記免疫原性組成物の注射を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
がんを処置する工程が、前記注射された腫瘍において腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を誘導することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
がんを処置する工程が、全身性の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
がんを処置する工程が、前記注射された腫瘍においてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の数を減少させることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が、前記注射された腫瘍に加えて、１つまたはそれを超える注射されていない腫瘍を有し、がんを処置する工程が、以下：
（ａ）注射されていない腫瘍の数を減少させること；
（ｂ）注射されていない腫瘍の体積を減少させること；および
（ｃ）注射されていない腫瘍の成長を遅らせること
のうちの１つまたは複数を含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
がんを処置する工程が、以下：
（ｄ）前記被験体の生存時間を延長すること；
（ｅ）前記注射された腫瘍の体積を減少させること；および
（ｆ）前記注射された腫瘍の成長を遅らせること
のうちの１つまたは複数を含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍が、肉腫または癌腫である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記腫瘍が、リンパ腫である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、直腸結腸がん、子宮がん、膀胱がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、腎臓がんおよび甲状腺がんからなる群より選択される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記がんが、口腔、消化器系、呼吸器系、皮膚、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼球系、神経系、内分泌系およびリンパ腫からなる群より選択される部位の原発性がんである、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
有効量の第２の治療剤を前記被験体に投与する工程をさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の治療剤が、アクチノマイシン、アファチニブ、アレクチニブ、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カンプトテシン、カルボプラチン、カペシタビン、セリチニブ（ｃｅｒｔｉｎｉｂ）、シスプラチン、クロラムブシル、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エルロチニブ、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルダラビン、フルタミン（ｆｌｕｔａｍｉｎｅ）、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ラパチニブ、レトロゾール、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、ソラフェニブ、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される化学療法剤を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の治療剤が、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記阻害性免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記阻害性免疫チェックポイント分子が、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）またはトリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の治療剤が、免疫刺激分子のアゴニストである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫刺激分子が、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）からなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の治療剤が、抗体、そのフラグメントまたは誘導体を含む、請求項３６、３８、３９、４１および４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
放射線治療を行う工程をさらに含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記有効量の前記免疫原性組成物と前記有効量の前記第２の治療剤とが一緒になって、前記腫瘍に対して協同効果またはそれより良好な効果をもたらす、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記有効量の前記免疫原性組成物と前記有効量の前記第２の治療剤とが一緒になって、前記腫瘍に対して相加効果またはそれより良好な効果をもたらす、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記有効量の前記免疫原性組成物と前記有効量の前記第２の治療剤とが一緒になって、前記腫瘍に対して相乗効果をもたらす、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
がんを処置する工程が、前記免疫原性組成物の反復投与が禁忌となるような重症度のインフルエンザ様症状の発生をもたらさず、該インフルエンザ様症状は、発熱、頭痛、悪寒、筋痛および疲労からなる群のうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む、免疫原性組成物であって；
該多量体化剤は、１０〜１０，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有し；
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；
該腫瘍抗原は、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含み；
該ＴＬＲ９アゴニストおよび該腫瘍抗原は、各々、１つもしくはそれを超える共有結合によって該多量体化剤と会合しているか、または各々、吸着によって該多量体化剤と会合している、
組成物。
【請求項５０】
前記多量体化剤が、約５００〜約１０，０００マイクロメートルの直径を有する水酸化アルミニウム錯体であり、前記ＴＬＲ９アゴニストおよび前記腫瘍抗原が、各々、吸着によって同じ錯体と会合している、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記水酸化アルミニウム錯体が、約０．５〜約５．０マイクロメートルの直径を有する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記多量体化剤が多糖であり、前記ＴＬＲ９アゴニストおよび前記腫瘍抗原が、各々、１つまたはそれを超える共有結合によって該多糖の同じ分子と会合している、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５３】
前記多糖が、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、デキストラン、マンナン、キトサン、アガロースおよびデンプンからなる群より選択される、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記多糖が、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記粒子が、式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ−［Ｌ３−（ＰＥＧ）−Ｌ２−Ａ］ｔ      （Ｉ）
の化合物であり、式中：
Ｄは、前記ＴＬＲ９アゴニストであり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｔおよびｘは、独立して、３〜２００の整数であり；
Ａは、前記腫瘍抗原であり；
Ｆは、エーテル基を介してＬ３に接続されている前記多糖である、
請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）
からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である、
請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、
式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、
Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、
Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている、
請求項４９〜５５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
のような、３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含むキメラ化合物である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記腫瘍抗原が、約１０〜約１００アミノ酸長のポリペプチドを含む、請求項４９〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記腫瘍抗原が、２つまたはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原由来のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記融合タンパク質が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記腫瘍抗原が、前記哺乳動物被験体に由来する正常細胞に存在する遺伝子と比べて変異を含む遺伝子によってコードされるネオ抗原を含む、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記腫瘍抗原が、前記腫瘍によって発現されるウイルス抗原を含む、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記腫瘍抗原が、ヒトがん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１）タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６６】
前記腫瘍抗原が、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６７】
式（Ｉ）の化合物：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ−［Ｌ３−（ＰＥＧ）−Ｌ２−Ａ］ｔ      （Ｉ）
を調製するための方法であって、式中：
Ｄは、ＴＬＲ９アゴニストであり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｔおよびｘは、独立して、３〜２００の整数であり；
Ａは、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり；
Ｆは、約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖であり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎはヌクレオシドであり、該ヌクレオチド間および３’末端のヌクレオチドとＬ１との間の１つまたはそれを超える結合は、ホスホロチオエートエステル結合であり、
Ａは、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり、少なくとも１つのチオール基を含み、
該方法は、
式（ＩＩ）の化合物：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ      （ＩＩ）
（式中、Ｌ３、ＰＥＧおよびＦは、式（Ｉ）について定義されたとおりであり；
Ｌ２ａは、
【化４】
2019515900.tif 000054
であり；
ｙは、３〜３５０の整数であるが；但し、ｙは、ｔとｘとの合計以上である）と、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは、式（Ｉ）についして定義されたとおりであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を反応させる工程、および式Ａの化合物を反応させる工程を含む、方法。
【請求項６８】
前記方法が、前記式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を式（ＩＩ）の化合物と反応させて、中間体を形成する工程、および続いて、前記式Ａの化合物を該中間体と反応させる工程を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法が、前記式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物および前記式Ａの化合物を式（ＩＩ）の化合物と同時に反応させる工程を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記反応が、塩酸グアニジンを含む媒質中で行われる、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
Ｄが、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、
式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、
Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、
Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている、
請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
Ｎｕ２が、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｎｕ３が、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
Ｄが、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ポリペプチドが、少なくとも１つのシステイン残基を含む、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記少なくとも１つのシステイン残基が、前記ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記多糖が、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、デキストラン、マンナン、キトサン、アガロースおよびデンプンからなる群より選択される、請求項６７〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記多糖が、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
各々が吸着によって生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を調製するための方法であって、ここで、
該多量体化剤は、約０．５〜約２５マイクロメートルの直径を有する水酸化アルミニウム錯体であり、
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎは、ヌクレオシドであり、
該腫瘍抗原は、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含み、
該方法は、
緩衝液中に平衡化された該水酸化アルミニウム錯体に、約５％〜約３０％イソプロパノールを含む水溶液に溶解された該腫瘍抗原を加える工程、および該ＴＬＲ９アゴニストを加える工程
を含み、
該緩衝液は、約６〜約９のｐＨ範囲内であり、該緩衝液は、リン酸緩衝液ではない、
方法。
【請求項８０】
前記水酸化アルミニウム錯体が、約０．５〜約５．０マイクロメートルの直径を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記緩衝液が、約７〜約８のｐＨ範囲内である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記腫瘍抗原が、約１０％〜約２０％イソプロパノールを含む水溶液に溶解されている、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、約７のｐＨを有する酢酸緩衝液に溶解されている、請求項７９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記腫瘍抗原および前記ＴＬＲ９アゴニストが、同時に前記水酸化アルミニウム錯体に吸着される、請求項７９〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記腫瘍抗原が、まず、前記水酸化アルミニウム錯体に吸着された後、前記ＴＬＲ９アゴニストに吸着される、請求項７９〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、まず、前記水酸化アルミニウム錯体に吸着された後、前記腫瘍抗原に吸着される、請求項７９〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）
からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である、
請求項７９〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、
式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、
Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、
Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている、
請求項７９〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
Ｎｕ２が、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
Ｎｕ３が、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記腫瘍抗原が、約１０〜約１００アミノ酸長のポリペプチドを含む、請求項６７〜９２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記腫瘍抗原が、２つまたはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原由来のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記融合タンパク質が、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記腫瘍抗原が、前記哺乳動物被験体に由来する正常細胞に存在する遺伝子と比べて変異を含む遺伝子によってコードされるネオ抗原を含む、請求項９３〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記腫瘍抗原が、前記腫瘍によって発現されるウイルス抗原を含む、請求項９３〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記腫瘍抗原が、ヒトがん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１）タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記腫瘍抗原が、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群のうちの１つのアミノ酸配列を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
滅菌された免疫原性組成物を調製する方法であって、
（ａ）有機溶媒を含む水溶液に１つまたはそれを超えるペプチド抗原を溶解して、ペプチド水溶液を生成する工程；
（ｂ）水酸化アルミニウム錯体を含むスラリーと該ペプチド水溶液を接触させて、該水酸化アルミニウム錯体に吸着されたペプチド抗原を含む粒子を生成する工程；
（ｃ）該ペプチド−水酸化アルミニウム粒子を単離し、中性緩衝液で再構成して、ペプチド−水酸化アルミニウム粒子緩衝溶液を生成する工程；
（ｄ）該ペプチド−水酸化アルミニウム粒子緩衝溶液をオートクレーブして、滅菌された粒子溶液を生成する工程；
（ｅ）ＴＬＲ９アゴニストを中性緩衝液に溶解して、ＴＬＲ９アゴニスト緩衝溶液を生成する工程；
（ｆ）該ＴＬＲ９アゴニスト緩衝溶液を約０．２マイクロメートルのフィルターに通して、滅菌されたＴＬＲ９アゴニスト溶液を生成する工程；および
（ｇ）該滅菌された粒子溶液と該滅菌されたＴＬＲ９アゴニスト溶液とを接触させて、各々が該水酸化アルミニウム錯体に吸着されている該ＴＬＲ９アゴニストおよび該ペプチド抗原を含む粒子を含む滅菌された免疫原性溶液を生成する工程
を含み、
該１つまたはそれを超えるペプチド抗原は、各々が約９〜２０００アミノ酸長のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり、
該水酸化アルミニウム錯体は、約５００〜約５，０００ナノメートルの直径を有し、
該ＴＬＲ９アゴニストは、１２〜５０ヌクレオチド長のＣｐＧ含有ポリヌクレオチドを含む、
方法。
【請求項１０１】
前記有機溶媒が、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ギ酸、エタノール、２−ブタノール、アセトン、酢酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記腫瘍抗原が、各々、約８〜約６０アミノ酸長のポリペプチドを含む、請求項１００または請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記中性緩衝液が、約６〜約９のｐＨ範囲内であり、該緩衝液は、リン酸緩衝液ではない、請求項１００〜１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
工程（ａ）〜（ｄ）が、工程（ｅ）および（ｆ）の前または工程（ｅ）および（ｆ）と同時に行われる、請求項１００〜１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記滅菌された免疫原性組成物が、前記水酸化アルミニウム錯体に対する前記ペプチド抗原の各々の比および前記水酸化アルミニウム錯体に対する前記ＴＬＲ９アゴニストの比が、約０．１〜約５．０（重量／重量）［ペプチド：ａｌｕｍ：ＴＬＲ９＝０．１〜５．０：１：０：０．１〜５．０］の範囲内である不均一な粒子混合物を含む、請求項１００〜１０４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、配列
５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎは、ヌクレオシドである、請求項１００〜１０５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記滅菌された免疫原性組成物が、不均一な粒子混合物であって、前記ペプチド抗原の各々と前記水酸化アルミニウム錯体との比が、約０．６〜１．２：１．０（ｗ／ｗ）の範囲内であり、前記ＴＬＲ９アゴニストと該水酸化アルミニウム錯体との比が、約１．７〜３．４：１．０（ｗ／ｗ）の範囲内である、不均一な粒子混合物を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ペプチド抗原の各々と前記水酸化アルミニウム錯体との比が、約１．２：１．０（ｗ／ｗ）であり、前記ＴＬＲ９アゴニストと該水酸化アルミニウム錯体との比が、約３．４：１．０（ｗ／ｗ）である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、
式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、
Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、
Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている、
請求項１００〜１０５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＴＬＲ９アゴニストが、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
のような、３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含むキメラ化合物である、請求項１１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４３９，４３８号および２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，６２２号に対する利益を主張し、これらはその全体が参考として本明細書に援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
【０００２】
分野
【０００３】
本開示は、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子の腫瘍内送達によってがんを処置するための方法に関し、ここで、ＴＬＲ９アゴニストは、ポリヌクレオチドまたはそのキメラ化合物である。本開示の方法は、少なくとも１つの腫瘍にそれらの粒子を注射することを含み、哺乳動物被験体の注射された腫瘍と注射されていない腫瘍との両方の処置に有効である。さらに、本開示は、粒子を含む免疫原性組成物、ならびにそれを製造する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
背景
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙによると、毎年５０万人を超える米国人が、がんで死亡していると予想されており、およそ４人に１人の死因をがんが占めている。２０１５年には、１５０万例を超える新たながんの症例が診断されると予想されている。生存率は、次第に改善されてきているが、がん患者の３０％超が、なおも診断の５年以内に死亡する。
【０００５】
非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）を発現している細胞を活性化することによって自然免疫系を刺激する。いくつかのポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニストが、がんの免疫治療剤として試験されてきた。ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニストの前臨床試験および第ＩＩ相試験の結果は、有望であったが、ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニストの全身投与は、化学療法レジメンと合わせたとき、非小細胞肺がんを有する患者の生存時間を改善しなかった（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７，２５：８２５−８２６）。
その後、ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニストの投与経路が重要であると示され、腫瘍内注射が、静脈内注射よりも優れた抗腫瘍免疫応答をもたらした（Ｌｏｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１１，３４：２７９−２８８）。それでも、ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニスト含有がんワクチンの有効性を改善する必要性がまだ当該分野に残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００７，２５：８２５−８２６
【非特許文献２】Ｌｏｕら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１１，３４：２７９−２８８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本開示は、Ｔｏｌｌ様レセプター９アゴニスト（ＴＬＲ９）および腫瘍抗原を含む粒子の腫瘍内送達によってがんを処置するための方法に関し、ここで、ＴＬＲ９アゴニストは、ポリヌクレオチドまたはそのキメラ化合物である。本開示の方法は、少なくとも１つの腫瘍病変にそれらの粒子を注射することを含み、哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）における注射された腫瘍と注射されていない腫瘍との両方の処置に有効である。さらに、本開示は、粒子を含む免疫原性組成物、ならびにそれを製造する方法を提供する。
【０００８】
特に、本開示は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法を提供し、方法は、有効量の免疫原性組成物を腫瘍内送達によって被験体に投与する工程を含み、ここで：免疫原性組成物は、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含み；多量体化剤は、１０〜２５，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有し；ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；腫瘍抗原は、ポリペプチドを含み；ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、１つもしくはそれを超える共有結合によって多量体化剤と会合しているか、または各々、吸着によって多量体化剤と会合している。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、約９〜約２０００アミノ酸のポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、約９〜約６０アミノ酸のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、１０〜２５，０００ナノメートルの直径を有する。いくつかの好ましい実施形態において、多量体化剤は、５００〜５，０００ナノメートルの直径を有する。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、１０〜２５，０００ナノメートルの直径、および約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する。いくつかの好ましい実施形態において、多量体化剤は、５００〜５，０００ナノメートルの直径、および約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する。別段述べられない限り、ＴＬＲ９アゴニストと腫瘍抗原との両方は、各々、同じ多量体化剤と会合される（同じ錯体または分子）。
【０００９】
いくつかの態様において、本開示は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法を提供し、方法は、有効量の免疫原性組成物を腫瘍内送達によって被験体に投与する工程を含み、ここで：免疫原性組成物は、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含み；多量体化剤は、０．１〜２５マイクロメートル、０．５〜２５マイクロメートル、または１〜２５マイクロメートル、または０．５〜５マイクロメートルの直径を有するアルミニウム塩錯体を含み；ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；腫瘍抗原は、ポリペプチドを含み；ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、吸着によって同じ多量体化剤と会合している。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、８〜１８００アミノ酸、約９〜約１０００アミノ酸または約１０〜約１００アミノ酸である。同様に、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約９〜約２０００、約９〜約１０００、約９〜約１００または約９〜約６０アミノ酸長である。
【００１０】
別の態様において、本開示は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法を提供し、方法は、有効量の免疫原性組成物を腫瘍内送達によって被験体に投与する工程を含み、ここで：免疫原性組成物は、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含み；多量体化剤は、約１０〜１，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖を含み；ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；腫瘍抗原は、ポリペプチドを含み；ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、１つもしくはそれを超える共有結合によって多糖の同じ分子と会合している。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、約１０〜１，０００ナノメートルの直径を有する多糖を含む。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖を含む。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、約１０〜１，０００ナノメートルの直径、および約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖を含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、８〜１８００アミノ酸、約９〜約１０００アミノ酸または約１０〜約１００アミノ酸である。同様に、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、約９〜約２０００、約９〜約１０００、約９〜約１００または約９〜約６０アミノ酸長である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、多量体化剤は、０．１〜２５マイクロメートル、約０．５〜約２５マイクロメートル、約１〜約２５マイクロメートル、または０．５〜５マイクロメートルの直径を有するアルミニウム塩錯体を含み、ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、吸着によって同じ錯体と会合しており、粒子はマイクロ粒子である。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩錯体は水酸化アルミニウム錯体を含む。多量体化剤が、約１０〜約１，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖を含み、ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原が、各々、１つまたはそれを超える共有結合によって多糖の同じ分子と会合している、別の実施形態において、粒子はナノ粒子である。いくつかの実施形態において、多糖は、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、デキストラン、マンナン、キトサン、アガロースおよびデンプンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、多糖は、約１００，０００〜約７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである。いくつかの実施形態において、多糖は、約４００，０００±１００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって販売されているＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ  ４００）。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｉＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｊＮｖ−３’（配列番号２）からなるポリヌクレオチドであり、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｐ＝０または１であり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｖ＝０〜４１であり；ｗ＝０、１または２であり；ｉ＝１、２、３または４であり；ｊ＝１、２、３または４であり；Ｘ１とＸ１’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；Ｘ２とＸ２’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；ポリヌクレオチドは、９〜５０ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ｑ＝０、１または２である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ｐ＝０または１であり、ｑ＝０、１または２であり、ｖ＝０〜２０であり、ｗ＝０であり、ｉ＝１であり、ｊ＝１、２、３または４である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧＮｑ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’ＣＧ）ｊＮｖ−３’（配列番号３）からなるポリヌクレオチドであり、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｖ＝１〜３９であり；ｊ＝１、２、３または４であり；Ｘ１とＸ１’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；Ｘ２とＸ２’とは、自己相補的ヌクレオシドであり；ポリヌクレオチドは、１２〜５０ヌクレオチド長である。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）からなるポリヌクレオチドであり、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）；
５’−ＴＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  Ａ−３’（配列番号７）；
５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＴＴＴ  Ｔ−３’（配列番号８）；
５’−ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＡ−３’（配列番号９）；および
５’−ＴＣＧ  ＴＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣ−３’（配列番号１０）
からなる群より選択される配列からなるポリヌクレオチドである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ２は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ３は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ２およびＮｕ３は、独立して、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
のような、３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含むキメラ化合物である。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドもしくはキメラ化合物のヌクレオチド間および／またはキメラ化合物のヌクレオチドとスペーサーとの間の１つまたはそれを超える結合は、ホスホロチオエートエステル結合である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ヌクレオチド間の結合およびヌクレオチドとスペーサーとの間の結合のすべてが、ホスホロチオエートエステル結合である。
【００１９】
哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法であって、有効量の免疫原性組成物を腫瘍内送達によって被験体に投与する工程を含み、ここで：免疫原性組成物は、各々が、多糖を含む生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む、方法のいくつかの実施形態において、組成物は、多糖に対するＴＬＲ９アゴニストの平均モル比および多糖に対する抗原の平均モル比が、各々、約１０〜約１２０の範囲内である不均一な粒子混合物を含む。
【００２０】
哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法であって、有効量の免疫原性組成物を腫瘍内送達によって被験体に投与する工程を含み、ここで：免疫原性組成物は、各々が、アルミニウム塩錯体を含む生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む、方法のいくつかの実施形態において、組成物は、アルミニウム塩錯体に対するＴＬＲ９アゴニストの比およびアルミニウム塩錯体に対する抗原の比が、各々、約０．１〜約１（重量／重量）の範囲内である、不均一な粒子混合物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、アルミニウム塩錯体に対するＴＬＲ９アゴニストの比が約０．１〜約１（重量／重量）の範囲内である不均一な粒子混合物を含むが、アルミニウム塩錯体に対する抗原の比は、０．００５〜約１（重量／重量）というより広い範囲である。さらなる実施形態において、組成物は、アルミニウム塩錯体に対する共吸着された抗原およびＴＬＲ９アゴニストの比が、各々、約０．１〜約２．５（ｗ／ｗ）の範囲内または約０．１〜約５．０（ｗ／ｗ）の範囲内である粒子混合物を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、完全長タンパク質またはそのフラグメント（例えば、約１０〜約１００アミノ酸長のポリペプチド）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＣＴＡＧ１）、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１、Ｒａｓ、ｇｐ１００、プロテイナーゼ３、ｂｃｒ−ａｂｌｅ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント（ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＰ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７−Ａ、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲンレセプター、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＰｈｏＣ、ＴＲＰ−２、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＢＯＲＩＳ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７−Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＢＡＧＥ１、ＢＡＧＥ２、ＢＡＧＥ３、ＢＡＧＥ４、ＢＡＧＥ５、ＣＡＭＥＬ、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２およびＦｏｓ関連抗原１からなる群の１つまたは複数の完全長タンパク質またはポリペプチドフラグメントを含む。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、ｇｐ１００、ｈＴＥＲＴ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＭＡＧＥ  Ａ１０、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＡ、Ｒａｓ、サバイビン、ＴＲＰ１（ｇｐ７５）、ＴＲＰ２およびチロシナーゼからなる群の１つまたは複数由来のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。
【００２２】
これらの実施形態のいくつかにおいて、腫瘍抗原は、２つまたはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原由来のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む。１つのバリエーションにおいて、融合タンパク質は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、腫瘍抗原は、腫瘍の細胞によって発現される哺乳動物抗原を含む。１つのバリエーションにおいて、哺乳動物抗原は、ネオ抗原であるか、または哺乳動物被験体に由来する正常細胞に存在する遺伝子と比べて変異を含む遺伝子によってコードされる。これらの実施形態のいくつかにおいて、腫瘍抗原は、腫瘍によって発現されるウイルス抗原を含む。１つのバリエーションにおいて、ウイルス抗原は、ＨＰＶ  Ｅ６およびＨＰＶ  Ｅ７の一方または両方を含む。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、ヒトがん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１としても公知）タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む。いくつかのバリエーションにおいて、腫瘍抗原が、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群のうちの１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、哺乳動物被験体はヒトである。
【００２３】
方法の実施形態のいくつかにおいて、腫瘍内送達は、少なくとも１つの腫瘍への免疫原性組成物の注射を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、がんを処置する工程は、例えば、免疫原性組成物が腫瘍外部位に投与された場合の数より大きな、注射された腫瘍において腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を誘導することを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、がんを処置する工程は、全身性の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答、例えば、免疫原性組成物が腫瘍外部位に投与されたときよりも高度な全身性の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、がんを処置する工程は、全身性の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、がんを処置する工程は、注射された腫瘍においてＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の数を減少させることを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、被験体は、前記注射された腫瘍に加えて、１つまたはそれを超える注射されていない腫瘍を有し、がんを処置する工程は、以下：（ａ）注射されていない腫瘍の数を減少させること；（ｂ）注射されていない腫瘍の体積を減少させること；および（ｃ）注射されていない腫瘍の成長を遅らせることのうちの１つまたは複数を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、がんを処置する工程は、以下：（ｄ）被験体の生存時間を延長すること；（ｅ）注射された腫瘍の体積を減少させること；および（ｆ）注射された腫瘍の成長を遅らせることのうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態において、がんを処置する工程は、無進行生存を増大させることまたは進行までの時間を延長することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、腫瘍は、肉腫または癌腫である。いくつかの実施形態において、腫瘍が、リンパ腫である。いくつかの実施形態において、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、直腸結腸がん、子宮がん、膀胱がん、メラノーマ、頭頚部がん、非ホジキンリンパ腫、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がんおよび甲状腺がんからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、がんは、口腔、消化器系、呼吸器系、皮膚、胸部、生殖器系、泌尿器系、眼球系、神経系、内分泌系およびリンパ腫からなる群より選択される部位の原発性がんである。
【００２５】
いくつかの実施形態において、方法は、有効量の第２の治療剤を被験体に投与する工程をさらに含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、第２の治療剤は、アクチノマイシン、アファチニブ、アレクチニブ、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ビカルタミド、ビニメチニブ、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カンプトテシン、カルボプラチン、カペシタビン、カルムスチン、セリチニブ（ｃｅｒｔｉｎｉｂ）、シスプラチン、クロラムブシル、コビメチニブ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エンコラフェニブ、エルロチニブ、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルダラビン、フルタミン（ｆｌｕｔａｍｉｎｅ）、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、ラパチニブ、レトロゾール、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、ソラフェニブ、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トラメチニブ、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される化学療法剤を含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の一方または両方を含む。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ボリノスタット（ｖｏｒｏｎｉｓｔａｔ）［ＳＡＨＡ］、ロミデプシン、エンチノスタット、アベキシノスタット（ａｂｅｘｉｎｏｓｔａｔ）、エリノスタット（ｅｌｉｎｏｓｔａｔ）［ＣＨＲ−３９９６］、パノビノスタット、キシノスタット（ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ）［ＪＮＪ−２６４８１５８５］、４ＳＣ−２０２、レスミノスタット（ｒｅｓｍｉｎｏｓｔａｔ）［ＳＢ９３９］、プラシノスタット（ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ）［ＣＩ−９９４０］およびバルプロエート）およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、アザシチジン、デシタビン（ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゼブラリン、ＳＧＩ−１０２７、ＲＧ−１０８およびシネフンギン（ｓｉｎｆｕｎｇｉｎ）を参照のこと）を参照のこと）およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるエピジェニック調節剤を含む。
【００２６】
これらの実施形態のいくつかにおいて、第２の治療剤は、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、ＩＬ−１０、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、Ｐ−セレクチン糖たんぱく質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）およびＴＧＦ−ベータからなる群より選択される阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。これらの実施形態のいくつかにおいて、第２の治療剤は、免疫刺激分子のアゴニストである。これらの実施形態のいくつかにおいて、免疫刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ  ＣＤ１３７、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）からなる群より選択される。これらの実施形態のいくつかにおいて、第２の治療剤は、抗体、そのフラグメントまたは誘導体を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、第２の治療剤は、阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストであり、第２の治療剤は、抗体、そのフラグメントまたは誘導体を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記方法は、被験体に放射線治療を行う工程および／または有効量の第２の治療剤を投与する工程をさらに含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、有効量の免疫原性組成物と有効量の第２の治療剤とは一緒になって、腫瘍に対して協同効果またはそれより良好な効果をもたらす。これらの実施形態のいくつかにおいて、有効量の免疫原性組成物と有効量の第２の治療剤とは一緒になって、腫瘍に対して相加効果またはそれより良好な効果をもたらす。これらの実施形態のいくつかにおいて、有効量の免疫原性組成物と有効量の第２の治療剤とは一緒になって、腫瘍に対して相乗効果をもたらす
【００２８】
方法の実施形態のいくつかにおいて、がんを処置する工程は、免疫原性組成物の反復投与が禁忌となるような重症度のインフルエンザ様症状の発生をもたらさず、インフルエンザ様症状は、発熱、頭痛、悪寒、筋痛および疲労からなる群のうちの１つまたは複数を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、本開示は、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む、免疫原性組成物であって；多量体化剤は、１０〜１０，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有し；ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；腫瘍抗原は、８〜１８００アミノ酸、約９〜約１０００アミノ酸、または約１０〜約１００アミノ酸のポリペプチドを含み；ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、１つもしくはそれを超える共有結合によって多量体化剤と会合しているか、または各々、吸着によって多量体化剤と会合している、組成物を提供する。いくつかの実施形態において、多量体化剤は、アルミニウム塩錯体であり、ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原が、各々、吸着によって同じ錯体と会合している。一つのバリエーションにおいて、アルミニウム塩錯体は水酸化アルミニウム錯体を含む。いくつかの実施形態において、多量体化剤は多糖であり、ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、１つまたはそれを超える共有結合によって該多糖の同じ分子と会合している。一つのバリエーションにおいて、多糖は、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、デキストラン、マンナン、キトサン、アガロースおよびデンプンからなる群より選択される。さらなるバリエーションにおいて、多糖は、約１００，０００〜約７００，０００ダルトン、約３００，０００〜約５００，０００ダルトン、または約４００，０００±１００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって販売されているＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ  ４００）。
【００３０】
組成物のいくつかの実施形態において、粒子は、式（Ｉ）：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ−［Ｌ３−（ＰＥＧ）−Ｌ２−Ａ］ｔ      （Ｉ）
の化合物であり、式中：
Ｄは、前記ＴＬＲ９アゴニストであり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｔおよびｘは、独立して、３〜２００の整数であり；
Ａは、腫瘍抗原であり；
Ｆは、エーテル基を介してＬ３に接続されている多糖である。
【００３１】
組成物のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）
からなるポリヌクレオチドであり、
ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である。一つのバリエーションにおいて、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである。
【００３２】
組成物のいくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ２および／またはＮｕ３は、独立して、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
のような、３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含むキメラ化合物である。
【００３３】
ＴＬＲ９アゴニストが式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物である組成物のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドもしくはキメラ化合物のヌクレオチド間および／またはキメラ化合物のヌクレオチドとスペーサーとの間の１つまたはそれを超える結合は、ホスホロチオエートエステル結合である。１つのバリエーションにおいて、ヌクレオチド間およびヌクレオチドとスペーサーとの間の結合のすべては、ホスホロチオエートエステル結合である。
【００３４】
いくつかの態様において、式（Ｉ）の化合物：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ−［Ｌ３−（ＰＥＧ）−Ｌ２−Ａ］ｔ      （Ｉ）
を調製するための方法が提供され、式中：
Ｄは、ＴＬＲ９アゴニストであり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｔおよびｘは、独立して、３〜２００の整数であり；
Ａは、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり；
Ｆは、約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖であり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎはヌクレオシドであり、該ヌクレオチド間および３’末端のヌクレオチドとＬ１との間の１つまたはそれを超える結合は、ホスホロチオエートエステル結合であり、
Ａは、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり、少なくとも１つのチオール基を含み、
方法は、
式（ＩＩ）の化合物：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ      （ＩＩ）
（式中、Ｌ３、ＰＥＧおよびＦは、式（Ｉ）について定義されたとおりであり；
Ｌ２ａは、
【化１】
2019515900.tif 000003
であり；
ｙは、３〜３５０の整数であるが；但し、ｙは、ｔとｘとの合計以上である）と、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは、式（Ｉ）についして定義されたとおりであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を反応させる工程、および式Ａの化合物を反応させる工程を含む。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を式（ＩＩ）の化合物と反応させて、中間体を形成する工程、および続いて、式Ａの化合物を中間体と反応させる工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物および前記式Ａの化合物を式（ＩＩ）の化合物と同時に反応させる工程を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、反応は、塩酸グアニジンを含む媒質中で行われる。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、Ｄは、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ２は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ３は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ２およびＮｕ３は、独立して、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｄは、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
である。
【００３７】
式（Ｉ）の化合物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つのシステイン残基を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、少なくとも１つのシステイン残基は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置するか、またはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の５アミノ酸以内にある。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物を調製するための方法のいくつかの実施形態において、多糖は、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、デキストラン、マンナン、キトサン、アガロースおよびデンプンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、多糖は、約１００，０００〜約７００，０００ダルトン、約３００，０００〜約５００，０００ダルトンまたは約４００，０００±１００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである（例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって販売されているＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ  ４００）。
【００３９】
いくつかの態様において、各々が吸着によって生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む共吸着体粒子を調製するための方法であって、ここで、
多量体化剤は、０．１〜２５マイクロメートル、約０．５〜約２５マイクロメートル、約１〜約２５マイクロメートル、または約０．５〜約５マイクロメートルの直径を有するアルミニウム塩錯体であり、
ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎは、ヌクレオシドであり、
腫瘍抗原は、８〜１８００アミノ酸、約９〜約１０００アミノ酸、または約１０〜約１００アミノ酸のポリペプチドを含み、
方法は、
緩衝液中に平衡化されたアルミニウム塩錯体に、約５％〜約３０％イソプロパノールを含む水溶液に溶解された腫瘍抗原を加える工程、およびＴＬＲ９アゴニストを加える工程を含み、緩衝液は、約６〜約９のｐＨ範囲内であり、緩衝液は、リン酸緩衝液ではない、方法が提供される。
【００４０】
共吸着体粒子を調製するための方法のいくつかの実施形態において、アルミニウム塩錯体は水酸化アルミニウム錯体を含む。いくつかの実施形態において、緩衝液は、約７〜約８のｐＨ範囲内である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、約１０％〜約２０％の有機溶媒（例えば、イソプロパノール）を含む水溶液に溶解されている。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、約７のｐＨを有する酢酸緩衝液に溶解されている。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原および前記ＴＬＲ９アゴニストは、同時にアルミニウム塩錯体に吸着されるいくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、まず、アルミニウム塩錯体に吸着された後、ＴＬＲ９アゴニストに吸着される。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、まず、アルミニウム塩錯体に吸着された後、腫瘍抗原に吸着される。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）
からなるポリヌクレオチドであり、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である。１つのバリエーションにおいて、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｎｕ２および／またはＮｕ３は、独立して、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）である。本開示の好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、８〜１８００アミノ酸長、好ましくは９〜１０００アミノ酸長、より好ましくは１０〜１００アミノ酸長のポリペプチドを含む。いくつかのバリエーションにおいて、腫瘍抗原は、２つまたはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原由来のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む。いくつかのバリエーションにおいて、融合タンパク質は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む。いくつかのバリエーションにおいて、腫瘍抗原は、哺乳動物被験体に由来する正常細胞に存在する遺伝子と比べて変異を含む遺伝子によってコードされるネオ抗原を含む。別のバリエーションにおいて、腫瘍抗原は、腫瘍によって発現されるウイルス抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、ヒトがん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１としても公知）タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む。いくつかのバリエーションにおいて、腫瘍抗原は、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群のうちの１つのアミノ酸配列を含む。
【００４１】
本開示は、いくつかの好ましい実施形態において、各々が水酸化アルミニウム錯体と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む免疫原性組成物を提供し；ここで、水酸化アルミニウム錯体は、約０．１〜約２５マイクロメートル（好ましくは、約０．５〜約２５マイクロメートルまたは約０．５〜約２．５マイクロメートル）の直径を有し；ＴＬＲ９アゴニストは、配列番号６の配列を含むポリヌクレオチドを含み；腫瘍抗原は、配列番号６０のヒトがん／精巣抗原１のアミノ酸配列または少なくとも８アミノ酸長であるそのフラグメントを有するポリペプチドを含み；ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、吸着によって水酸化アルミニウム錯体と会合している。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群の１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、アルミニウム塩錯体に対するＴＬＲ９アゴニストの平均の比が約０．２〜約１．２（重量／重量）の範囲内であり、アルミニウム塩錯体に対する腫瘍抗原の平均の比が約０．００５〜約２．０（重量／重量）の範囲内であり、アルミニウム塩錯体の重量がアルミニウムの含有量に基づく、不均一な粒子混合物を含む。哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法も提供され、方法は、腫瘍内送達によって有効量の免疫原性組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４２】
さらに、本開示は、滅菌された免疫原性組成物を調製する方法であって、
（ａ）有機溶媒を含む水溶液に１つまたはそれを超えるペプチド抗原を溶解して、ペプチド水溶液を生成する工程；
（ｂ）水酸化アルミニウム錯体を含むスラリーとペプチド水溶液を接触させて、水酸化アルミニウム錯体に吸着されたペプチド抗原を含む粒子を生成する工程；
（ｃ）ペプチド−水酸化アルミニウム粒子を単離し、中性緩衝液で再構成して、ペプチド−水酸化アルミニウム粒子緩衝溶液を生成する工程；
（ｄ）ペプチド−水酸化アルミニウム粒子緩衝溶液をオートクレーブして、滅菌された粒子溶液を生成する工程；
（ｅ）ＴＬＲ９アゴニストを中性緩衝液に溶解して、ＴＬＲ９アゴニスト緩衝溶液を生成する工程；
（ｆ）ＴＬＲ９アゴニスト緩衝溶液を約０．２マイクロメートルのフィルターに通して、滅菌されたＴＬＲ９アゴニスト溶液を生成する工程；および
（ｇ）滅菌された粒子溶液と滅菌されたＴＬＲ９アゴニスト溶液とを接触させて、各々が水酸化アルミニウム錯体に吸着されているＴＬＲ９アゴニストおよびペプチド抗原を含む粒子を含む滅菌された免疫原性溶液を生成する工程
を含み、
１つまたはそれを超えるペプチド抗原は、各々が約９〜２０００アミノ酸長のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり、
水酸化アルミニウム錯体は、約５００〜約５，０００ナノメートルの直径を有し、
ＴＬＲ９アゴニストは、１２〜５０ヌクレオチド長のＣｐＧ含有ポリヌクレオチドを含む、
方法を提供する。いくつかの実施形態において、有機溶媒は、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ギ酸、エタノール、２−ブタノール、アセトン、酢酸およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、各々、約８〜約６０アミノ酸長のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、中性緩衝液は、約６〜約９のｐＨ範囲内であり、緩衝液は、リン酸緩衝液ではない。いくつかの実施形態において、工程（ａ）〜（ｄ）は、工程（ｅ）および（ｆ）の前または工程（ｅ）および（ｆ）と同時に行われる。いくつかの実施形態において、滅菌された免疫原性組成物は、水酸化アルミニウム錯体に対するペプチド抗原の各々の比および水酸化アルミニウム錯体に対するＴＬＲ９アゴニストの比は、約０．１〜約５．０（重量／重量）（例えば、ペプチド：ａｌｕｍ：ＴＬＲ９＝０．１〜５．０：１：０：０．１〜５．０）の範囲内である不均一な粒子混合物を含む。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎは、ヌクレオシドである。これらの実施形態のサブセットにおいて、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）からなるポリヌクレオチドであり、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり；ｑ＝０、１、２、３、４または５であり；ｒ＝０〜２９である。いくつかの好ましい実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、滅菌された免疫原性組成物は、不均一な粒子混合物であって、ペプチド抗原の各々と水酸化アルミニウム錯体との比が、約０．６〜１．２：１．０（ｗ／ｗ）の範囲内であり、ＴＬＲ９アゴニストと水酸化アルミニウム錯体との比は、約１．７〜３．４：１．０（ｗ／ｗ）の範囲内である、不均一な粒子混合物を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ペプチド抗原の各々と水酸化アルミニウム錯体との比は、約１．２：１．０（ｗ／ｗ）であり、ＴＬＲ９アゴニストと水酸化アルミニウム錯体との比は、約３．４：１．０（ｗ／ｗ）である。本明細書に記載される場合、水酸化アルミニウム錯体の重量は、アルミニウムの含有量に基づく。別の実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている。いくつかの好ましい実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
のような、３つの核酸部分および２つのヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサーを含むキメラ化合物である。いくつかの実施形態において、ペプチド抗原は腫瘍抗原である。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原の少なくとも１つは、配列番号６０のヒトがん／精巣抗原１のアミノ酸配列または少なくとも８アミノ酸長であるそのフラグメントを有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原の少なくとも１つは、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９およびそれらの組み合わせからなる群の１つのアミノ酸配列を含む。哺乳動物被験体（例えば、ヒト被験体）におけるがんを処置する方法も提供され、方法は、腫瘍内送達によって有効量の免疫原性組成物を被験体に投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、［ＣｐＧ−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬ−［（ＰＥＧ６−ペプチド］ｔのような、各々が多糖多量体化剤（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが販売するＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ブランドの多糖）に結合体化されているＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）および腫瘍抗原（ペプチド）を含む例示的な粒子（ナノ粒子）を調製するために用いられる製造スキームのフローチャートを提供している。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、［ＣｐＧ−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬ−［（ＰＥＧ６−ペプチド］ｔのような、各々が多糖多量体化剤（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが販売するＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ブランドの多糖）に結合体化されているＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）および腫瘍抗原（ペプチド）を含む例示的な粒子（ナノ粒子）を調製するために用いられる製造スキームのフローチャートを提供している。
【００４４】
【図２】図２は、［ＣｐＧ−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬ−［（ＰＥＧ６−ペプチド］ｔのような、各々が多糖多量体化剤（ＦＩＣＯＬＬ）に結合体化されているＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）および腫瘍抗原（ペプチド）を含む例示的な粒子（ナノ粒子）の調製を図示している。
【００４５】
【図３ＡＢ】図３Ａ〜Ｄは、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子の腫瘍内（ＩＴ）または皮下（ＳＣ）投与の後の、腫瘍を有するマウスの経時的な腫瘍体積の変化を表している成長曲線を、ワクチン接種されていないコントロールと比較して提供している。示されている平均腫瘍体積は、５〜６匹のマウスの群の２つの独立した実験の代表である。図３Ａでは、ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の４、７および１１日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミン（ＯＶＡ）タンパク質も含んだ。図３Ｂでは、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の１０、１４および１７日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミン（ＯＶＡ）タンパク質も含んだ。図３Ｃでは、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の８、１２および１６日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含んだ。図３Ｄでは、Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の８、１２および１６日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの群において、ナノ粒子は、３つのメラノーマ分化抗原のエピトープを含むポリペプチド（Ｔｒｉｐｌｅ）も含んだ。
【図３ＣＤ】同上。
【００４６】
【図４】図４は、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子の腫瘍内（ＩＴ）投与の後の、腫瘍を有するマウスの経時的な腫瘍体積の変化を表している成長曲線を、ワクチン接種されていないコントロールと比較して提供している。ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または０、３および７日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの独立した実験の代表であるデータが、４〜６匹のマウスの群の平均腫瘍体積として示されている。１つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含み、別の群では、別個のナノ粒子が、ＯＶＡｐｅｐを含んだ。この概略図において、灰色の円は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが販売するＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ブランドの多糖を表しており、黒っぽい波線は、Ｄ６１−０１  ＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）を表しており、黒っぽい卵形は、ＯＶＡｐｅｐ抗原を表している。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算し、０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
【００４７】
【図５】図５は、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子の腫瘍内（ＩＴ）または皮下（ＳＣ）投与後の、腫瘍を有するマウスのリンパ球による抗原特異的ＩＦＮ−γの分泌を示しているグラフを、ワクチン接種されていないコントロールと比較して提供している。確立されたＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫またはＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または０、７および１０日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含んだ。リンパ球を、１３日目に回収された腫瘍流入領域リンパ節から得て、様々な濃度のＯＶＡクラスＩペプチドで再刺激した。上清中のＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡによって評価した。２つの独立した実験の代表であるデータが、１群あたり２〜３個の複製物を作製するために２〜５匹のマウスからプールされたリンパ節から単離されたリンパ球の平均ＩＦＮ−γ濃度として示されている。
【００４８】
【図６Ａ】図６Ａは、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子の腫瘍内（ＩＴ）または皮下（ＳＣ）投与後の、腫瘍を有するマウスの脾細胞による抗原特異的ＩＦＮ−γの分泌を示しているグラフを、ワクチン接種されていないコントロールと比較して提供している。確立されたＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫またはＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または０、３および７日目にＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子を投与した。２つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含んだ。脾細胞を、１０日目に回収された脾臓から得て、様々な濃度のＯＶＡクラスＩペプチドで再刺激した。上清中のＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡによって評価した。２つの独立した実験の代表であるデータが、１群あたり２〜３個の複製物を作製するために２〜５匹のマウスからプールされた脾臓から単離されたリンパ球の平均ＩＦＮ−γ濃度として示されている。図６Ｂは、両側性のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を確立し、続いてＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子で処置するためのスケジュールの概略図を提供している。図６Ｃは、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子の腫瘍内（ＩＴ）または皮下（ＳＣ）投与後の、腫瘍を有するマウスのワクチン接種された腫瘍の体積およびワクチン接種されていない腫瘍の体積の経時的な変化を表している成長曲線を、ワクチン接種されていないコントロールと比較して提供している。２つの群において、ナノ粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含んだ。
【図６ＢＣ】同上。
【００４９】
【図７ＡＢ】図７Ａは、両側性のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を確立し、続いてＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ）で処置するためのスケジュールの概略図を提供している。腫瘍細胞接種後の１０、１３および１７日目に、マウスの右の腫瘍にＩＴでワクチン接種したか、または両方の腫瘍から遠位の部位にワクチン接種した（ＳＣ）。最後の免疫化の３日後に、腫瘍を回収して、ＲＮＡを抽出し、遺伝子発現解析を行い、左の腫瘍の体積を記録した。図７Ｂは、腫瘍内経路による免疫原性組成物（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ）の投与が、皮下注射を介する免疫原性組成物の腫瘍外投与と比べて、遠位の部位  注射されていない腫瘍において、より強い抗腫瘍応答を誘発したことを示している。図７Ｃは、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ遺伝子発現解析によって決定されたときの、腫瘍微小環境に存在する規定の免疫細胞タイプの規模を表しているグラフを提供している。ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性細胞、Ｔｈ１細胞およびＮＫ細胞の存在を特定するシグネチャは、ＳＣでワクチン接種されたマウスまたはアジュバントのみ（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ）を接種されたマウスと比較して、ＩＴでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍において有意にアップレギュレートされる。データは、１処置条件あたりｎ＝３を表している。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算し、０．０５未満の値を有意であるとみなした。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１および＊＊＊ｐ≦０．００１。
【図７Ｃ】同上。
【００５０】
【図８ＡＢ】図８Ａは、マウスの皮下腔と肺の両方におけるＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍の確立を示している模式図を提供している。皮下腫瘍と肺腫瘍を同時に有するマウスの皮下で成長している腫瘍（ＩＴ）または遠位の部位（ＳＣ）に、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐをワクチン接種した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃアジュバントのみを、コントロールとしてＩＴで投与した。静脈内経路によってＢ１６−０ＶＡ腫瘍細胞を注射することによって、肺腫瘍を確立した。皮下腫瘍の植え込み後の８、１２、１５および１８日目に、マウスにワクチン接種した。最後のワクチン接種の７日後に、マウスを屠殺し、肺を回収した。次いで、肺をホルマリンで固定し、肉眼で見える転移の数を数えた。図８Ｂは、注射された腫瘍の体積を示しているグラフを提供しており、これは、ワクチンを腫瘍に直接投与することによって、遠位部位の免疫化（ＳＣ）またはアジュバントのみと比べて優れた抗腫瘍活性がもたらされることを実証している。図８Ｃは、各研究群のマウスの肺の代表的な写真を示している。図８Ｄは、２つの独立した実験からの累積転移データのグラフを提供している。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算し、０．０５未満の値を有意であるとみなした。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１および＊＊＊ｐ≦０．００１。
【図８ＣＤ】同上。
【００５１】
【図９】図９は、各々が水酸化アルミニウム粒子に共吸着されたＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）および１つまたはそれを超える腫瘍抗原（ペプチド）を含む例示的な粒子（微小粒子）を調製するために用いられた製造スキームのフローチャートを提供している。
【００５２】
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ＴＬＲ９アゴニスト含有微小粒子の腫瘍内（ＩＴ）または皮下（ＳＣ）投与後の、腫瘍を有するマウスの経時的な腫瘍体積の変化を表している成長曲線を、ワクチン接種されていないコントロールと比較して提供している。示されている平均腫瘍体積は、５〜７匹のマウスの群の少なくとも２つの独立した実験の代表である。図１０Ａでは、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の８、１１および１５日目にＴＬＲ９アゴニスト含有微小粒子を投与した。２つの群において、微小粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含んだ。図１０Ｂでは、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の８、１１および１５日目にＴＬＲ９アゴニスト含有微小粒子を投与した。２つの群において、微小粒子は、３つのメラノーマ分化抗原のエピトープを含むポリペプチド（Ｔｒｉｐｌｅ）も含んだ。図１０Ｃでは、ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫腫瘍を有するマウスを、無処置で放置するか、または移植後の８、１１および１５日目にＴＬＲ９アゴニスト含有微小粒子を投与した。２つの群において、微小粒子は、オボアルブミンポリペプチド（ＯＶＡｐｅｐ）も含んだ。この実験において、Ａｌｕｍは、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓが販売する水酸化アルミニウム錯体であるＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５である。
【００５３】
【図１１】図１１Ａ〜Ｂは、腫瘍内経路による免疫原性組成物（ＤＶ６１−０４−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐ）の投与が、腫瘍から遠位の部位への皮下注射を介した腫瘍外投与と比べて、優れた抗腫瘍応答を誘発したことを実証している。皮下腫瘍と肺腫瘍を同時に有するマウスの皮下で成長している腫瘍（ＩＴワクチン）または遠位の部位（ＳＣワクチン）に、ＤＶ６１−０４−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐをワクチン接種した。ＩＴで投与したＤＶ６１−０４−Ａｌｕｍアジュバントのみを、コントロールとして使用した。静脈内経路によってＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注射することによって、肺腫瘍を確立した。皮下腫瘍の植え込み後の１１、１４、１８および２１日目に、マウスにワクチン接種した。最後のワクチン接種の４日後に、マウスを屠殺し、肺を回収した。次いで、肺をホルマリンで固定し、肉眼で見える転移の数を数えた。この実験において、Ａｌｕｍは、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓが販売する水酸化アルミニウム錯体であるＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な説明
本開示は、Ｔｏｌｌ様レセプター９アゴニスト（ＴＬＲ９）および腫瘍抗原を含む粒子の腫瘍内送達によってがんを処置するための方法に関し、ここで、ＴＬＲ９アゴニストは、ポリヌクレオチドまたはそのキメラ化合物である。本開示の方法は、少なくとも１つの腫瘍にそれらの粒子を注射することを含み、哺乳動物被験体の注射された腫瘍と注射されていない腫瘍との両方の処置に有効である。さらに、本開示は、粒子を含む免疫原性組成物、ならびにそれを製造する方法を提供する。
Ｉ．一般的な方法および定義
【００５５】
本開示の実施は、別段示されない限り、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学および免疫学の従来の手法を用いる。そのような技術は、文献中に完全に記載されており、例えば、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，第６版（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ２０１０）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２０１３）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第３版（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９６）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９６、２０１４までの補足も含め）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９１、２０１４までの補足も含め）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８７、２０１４までの補足も含め）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｅｇｌｉら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ２０００、２０１４までの補足も含め）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版（ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１２）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００４）；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３）；およびＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９８）を参照のこと。
【００５６】
本明細書中および添付の請求項において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段示されない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａｎ」賦形剤は、１つまたはそれを超える賦形剤を含む。
【００５７】
本明細書中で使用される句「含む」は、かかる実施形態がさらなるエレメントを含み得ることを示唆するオープンエンドである。対照的に、句「〜からなる」は、かかる実施形態がさらなるエレメント（微量の不純物を除く）を含まないことを示唆するクローズドである。句「〜から本質的になる」は、かかる実施形態が、かかる実施形態の基本的な特色を実質的に変化させないエレメントをさらに含み得ることを示唆する、部分的にクローズドである。「含む」として本明細書中に記載される態様および実施形態は、「〜からなる」および「〜から本質的になる」として記載される実施形態を含むと理解される。
【００５８】
ある値について本明細書中で使用される用語「約」は、その値の９０％〜１１０％を包含する（例えば、約２０μｇのサバイビン抗原とは、１８μｇ〜２２μｇのサバイビン抗原のことを指し、２０μｇのサバイビン抗原を含む）。
【００５９】
本明細書中で交換可能に使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、改変されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドまたはそれらの組み合わせを含む。ポリヌクレオチドは、一般にホスホジエステル結合を介してつながったヌクレオシドのポリマーであるが、代替の結合、例えば、ホスホロチオエートエステルも使用され得る。ヌクレオシドは、糖に結合された、プリン（アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）またはそれらの誘導体）またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）もしくはウラシル（Ｕ）またはそれらの誘導体）塩基からなる。ＤＮＡにおける４種のヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジンおよびデオキシシチジンと呼ばれる。ＲＮＡにおける４種のヌクレオシド単位（または塩基）は、アデノシン、グアノシン、ウリジンおよびシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００６０】
用語「パリンドローム配列」または「パリンドローム」とは、逆方向反復である核酸配列、例えば、ＡＢＣＤＤ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のことを指し、ここで、それらの塩基、例えば、ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’は、ワトソン−クリック塩基対を形成することができる。そのような配列は、一本鎖であり得るか、または二本鎖構造を形成し得るか、またはいくつかの条件下ではヘアピンループ構造を形成し得る。例えば、本明細書中で使用されるとき、「８塩基パリンドローム」とは、そのパリンドローム配列が８塩基長である核酸配列、例えば、ＡＢＣＤＤ’Ｃ’Ｂ’Ａ’のことを指す。パリンドローム配列は、非パリンドローム配列も含むポリヌクレオチドの一部であり得る。ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超えるパリンドローム配列部分および１つまたはそれを超える非パリンドローム配列部分を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、全体的にパリンドロームであり得る。１つより多いパリンドローム配列部分を有するポリヌクレオチドにおいて、それらのパリンドローム配列部分は、互いに重複してもよいし、重複しなくてもよい。
【００６１】
用語「個体」および「被験体」とは、哺乳動物のことを指す。「哺乳動物」としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、家畜、競技用動物、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）およびペット（例えば、イヌおよびネコ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
用語「抗原」とは、抗体またはＴ細胞抗原レセプターによって特異的に認識され、結合される物質のことを指す。抗原は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質およびリン脂質；それらの一部ならびにそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、本開示の組成物中に存在するとき、合成の抗原であり得るか、または天然から単離された抗原であり得る。本開示の方法における投与に適した抗原には、抗原特異的Ｂ細胞応答または抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発することができる任意の分子が含まれる。ハプテンは、「抗原」の範囲内に含められる。「ハプテン」は、単独では免疫原性ではないが、一般により大きい免疫原性分子（キャリア）に結合体化されたとき、免疫原性となる、低分子量化合物である。
【００６３】
「ポリペプチド抗原」は、精製された天然のペプチド、合成ペプチド、組換えペプチド、粗ペプチド抽出物、または部分的に精製されたもしくは未精製の活性な状態のペプチド（例えば、弱毒化または不活性化されたウイルス、微生物または細胞の一部であるペプチド）あるいはそのようなペプチドのフラグメントを含み得る。ポリペプチド抗原は、好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基長、好ましくは、８〜１８００アミノ酸長、より好ましくは、９〜１０００アミノ酸長または１０〜１００アミノ酸長である。同様に、いくつかの実施形態において、そのポリペプチドは、約９〜約２０００、約９〜約１０００、約９〜約１００または約９〜約６０アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドは、少なくとも（下限）９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０または９０アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、そのポリペプチドは、多くとも（上限）１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０または１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、ポリペプチド抗原は、１０〜１００アミノ酸長である。
【００６４】
本明細書中で使用されるとき、用語「免疫原性」とは、作用物質（例えば、ポリペプチド抗原）が、好適な条件下で哺乳動物被験体に投与されたとき適応免疫応答を誘発する能力のことを指す。その免疫応答は、Ｂ細胞（液性）応答および／またはＴ細胞（細胞性）応答であり得る。
【００６５】
「アジュバント」とは、抗原などの免疫原性の作用物質と混合されたとき、その混合物に曝露されたレシピエントにおいてその作用物質に対する免疫応答を非特異的に増大または増強する物質のことを指す。
【００６６】
用語「アゴニスト」は、最も広い意味において使用され、レセプターを介したシグナル伝達を活性化する任意の分子を含む。いくつかの実施形態において、アゴニストは、レセプターに結合する。例えば、ＴＬＲ９アゴニストは、ＴＬＲ９レセプターに結合し、ＴＬＲ９シグナル伝達経路を活性化する。別の例では、免疫刺激分子ＣＤ２７のアゴニストは、ＣＤ２７シグナル伝達経路に結合し、ＣＤ２７シグナル伝達経路を活性化する。
【００６７】
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味において使用され、アゴニストの生物学的活性を少なくとも部分的に阻止する任意の分子を含む。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、アゴニストに結合するが、他の実施形態では、アンタゴニストは、アゴニストのリガンドに結合する。例えば、阻害性免疫チェックポイント分子ＰＤ−１のアンタゴニストは、ＰＤ−１シグナル伝達経路に結合し、ＰＤ−１シグナル伝達経路を阻止する。
【００６８】
用語「免疫刺激性配列」および「ＩＳＳ」とは、計測可能な免疫応答（例えば、インビトロ、インビボおよび／またはエキソビボにおいて計測される）を刺激する核酸配列のことを指す。本開示の目的で、用語ＩＳＳとは、非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む核酸配列のことを指す。計測可能な免疫応答の例としては、抗原特異的抗体の産生、サイトカインの分泌、リンパ球の活性化およびリンパ球の増殖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６９】
用語「ＣｐＧ」および「ＣＧ」は、別段述べられない限り、ホスフェートによって分断されたシトシンおよびグアニンのことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、シトシンとグアニンとの塩基対形成とは対照的に、直鎖状の配列のことを指す。本開示のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。すなわち、ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンは、メチル化されていない（すなわち、５−メチルシトシンではない）。
【００７０】
本開示の「ＣｐＧ  ＰＮ」または「ＣｐＧポリヌクレオチド」は、１つまたはそれを超える非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含む７〜５０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態において、そのポリヌクレオチドは、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。いくつかの好ましい実施形態において、ＣｐＧ  ＰＮは、その５’末端に、Ｂ細胞を刺激する能力を付与するＴＣＧを含む。いくつかの実施形態において、ＣｐＧ  ＰＮは、ヒト形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）の成熟および高レベルのＩ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γなど）の分泌を誘導する能力を付与するＣＧ含有パリンドロームを含む。いくつかの実施形態において、ＣｐＧ  ＰＮは、好ましくは、１２〜５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＰＮは、少なくとも（下限）７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０または４５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ＰＮは、多くとも（上限）５０、４５、４０、３８、３６、３４、３２、３０、２８、２６、２４、２２または２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのパリンドローム配列は、少なくとも（下限）８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０塩基長である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのパリンドローム配列は、多くとも（上限）３２、３０、２８、２６、２４、２２、２０、１８、１６、１４、１２または１０塩基長である。すなわち、少なくとも１つのパリンドローム配列は、８〜３２塩基長であり得る。
【００７１】
本明細書中で使用される用語「アンチセンス」および「アンチセンス配列」とは、ｍＲＮＡのコード鎖に相補的な配列を有するポリヌクレオチドの非コード鎖のことを指す。好ましい実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、アンチセンス配列、すなわちＲＮＡｉ分子（ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）ではない。すなわち、好ましい実施形態において、本開示のポリヌクレオチドは、それらが使用される哺乳動物被験体の転写物（または遺伝子）に対して有意な相同性（または相補性）を有しない。例えば、ヒト被験体において免疫応答を調節するための本開示のポリヌクレオチドは、好ましくは、ヒトゲノムの核酸配列の長さにわたって８０％未満同一である（例えば、５０ヌクレオチド長のポリヌクレオチドは、ヒト転写物と５０塩基中４０塩基以下しか共有しない）。すなわち、好ましい実施形態において、本ポリヌクレオチドは、それらが使用される哺乳動物被験体（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなど）の核酸配列と８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％または２０％未満同一である。
【００７２】
応答またはパラメータの「刺激」は、目的のパラメータ以外、その他の点で同じ条件と比べたとき、あるいは、別の条件（例えば、ＴＬＲアゴニストの非存在下と比べたときのＴＬＲアゴニストの存在下におけるＴＬＲシグナル伝達の増大）と比べたとき、その応答またはパラメータを誘発および／または増大することを含む。例えば、免疫応答の「刺激」は、応答の増大を意味する。
【００７３】
応答またはパラメータの「阻害」は、目的のパラメータ以外、その他の点で同じ条件と比べたとき、あるいは、別の条件（例えば、ＰＤ−１アンタゴニストの非存在下におけるＰＤ−１リガンドの存在下と比べたときのＰＤ−１リガンドおよびＰＤ−１アンタゴニストの存在下におけるＰＤ−１シグナル伝達の低減）と比べたとき、その応答またはパラメータを阻止および／または抑制することを含む。例えば、免疫応答の「阻害」は、応答の低減を意味する。
【００７４】
本明細書中に開示される作用物質の「有効量」は、具体的に述べられる目的を果たすために十分な量である。「有効量」は、述べられる目的に対して経験的に決定され得る。作用物質の「有効量」または「十分な量」は、所望の生物学的効果（例えば、有益な臨床結果を含む有益な結果）をもたらすために充分な量である。用語「治療有効量」とは、被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）における疾患または障害を「処置する」のに有効な、作用物質（例えば、ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニスト）の量のことを指す。「有効量」または「十分な量」の作用物質が、１回またはそれを超える回数で投与され得る。
【００７５】
疾患を「処置する」または疾患の「処置」という用語は、その疾患の徴候または症状を軽減することを目指して個体（ヒトまたはそれ以外の個体）に１つまたはそれを超える薬物を投与することを含み得るプロトコルを実行することを指す。したがって、「処置する」または「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、かつ具体的には、個体に緩和効果を及ぼすだけのプロトコルを含む。本明細書中で使用されるとき、また、当該分野において十分に理解されているように、「処置」は、臨床結果を含む有益な結果または所望の結果を得るためのアプローチである。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、１つまたはそれを超える症状の軽減または回復、疾患の程度の低下、安定化された（すなわち、悪化していてない）疾患状態、疾患の広がりの防止、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の回復または緩和、および緩解（部分的であるか全体的であるかを問わない）が挙げられるがこれらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない個体の予想される生存時間と比べたときの、生存時間の延長も意味し得る。疾患または障害を「緩和する」は、予想される無処置の結果と比べて、疾患または障害の程度および／もしくは望ましくない臨床症状が和らぐこと、ならびに／または疾患もしくは障害の進行の時間経過が減速することを意味する。さらに、緩和および処置は、必ずしも１回の投与によって行われるわけではないが、連続した回数の投与において行われることが多い。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「アルミニウム塩」とは、ワクチン抗原に対する所望の免疫応答を高める（例えば、同時に投与される抗原に対する抗体の作製または細胞性免疫の誘導；例えば、Ｌｉｎｄｂｌａｄ，２００４  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：３６５８−３６６８を参照のこと）ためにワクチンアジュバントとして使用するのに適したアルミニウム含有無機化合物の１クラスのことを指す。アルミニウム塩は、ワクチンにおいて使用されるとき、通常、いくつかの多形のうちのいずれか１つの結晶構造を有する不規則な形状かつ大きさの粒子の湿潤ゲル懸濁液である。抗原は、静電相互作用、配位子交換および／または疎水性相互作用をはじめとしたいくつかの機序によってそれらの粒子に吸着する。ワクチンアジュバントとして通常使用されるアルミニウム塩としては、例えば、水酸化アルミニウム（例えば、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓが販売するＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）１．３％、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）２％およびＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５アジュバント）、水酸化酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（例えば、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓが販売するＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標））が挙げられる。ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５を例示的な方法において使用したが、本開示は、決してこの商標の水酸化アルミニウムアジュバントの使用に限定されない。他の商標およびノーブランドのアルミニウム含有アジュバントも、匹敵する生理化学的特性を有するならば、本明細書中に記載される方法および組成物における使用に適している。ヒト用ワクチンへの組み込みに適合するそのような特性としては、５００〜１０，０００ｎｍの直径サイズの範囲；多孔性の結晶構造；および正味の表面電荷が挙げられる（例えば、Ｈｅｍ  ａｎｄ  ＨｏｇｅｎＥｓｃｈ，２００７  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，６：６８５−６９８を参照のこと）。本開示の組成物および方法における使用に適したアルミニウム塩は、水酸化アルミニウム塩（本明細書中で「ａｌｕｍ」とも称される）であり、これは、全体として負電荷を有するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを吸着できる正味の正電荷を有する。
ＩＩ．Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子の組成物および合成
【００７７】
本開示の粒子は、ＴＬＲ９アゴニストを含み、そのＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）（ここで、各Ｎは、独立して選択されたヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７である）を含むポリヌクレオチドを含む。例示的なＴＬＲ９アゴニストは、表Ｓ１−１に提供され、ポリヌクレオチドまたはそのキメラ化合物として存在し得る。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号７３からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧＮｑＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＡＮｒ−３’（配列番号４）（ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｑ＝０、１、２、３、４または５であり、ｒ＝０〜２９である）からなるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）からなるポリヌクレオチドである。
【００７９】
別の実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、式Ｎｕ１−Ｓｐ１−Ｎｕ２−Ｓｐ２−Ｎｕ３のキメラ化合物であり、式中、Ｎｕ１、Ｎｕ２およびＮｕ３は、７〜５０ヌクレオチド長の独立して選択される核酸部分であり、Ｎｕ１は、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’からなり、ここで、ｓは４〜４７であり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、プロピル、ブチルおよびヘキシルからなる群の少なくとも１つのメンバーを含む同じまたは異なる非核酸スペーサー部分であり、Ｓｐ１は、Ｎｕ１およびＮｕ２に共有結合的に連結されており、Ｓｐ２は、Ｎｕ２およびＮｕ３に共有結合的に連結されている。いくつかの実施形態において、キメラ化合物のＮｕ２および／またはＮｕ３は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。いくつかの実施形態において、キメラ化合物のＮｕ２は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。いくつかの実施形態において、キメラ化合物のＮｕ３は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。いくつかの実施形態において、キメラ化合物のＮｕ２およびＮｕ３は、配列５’−ＡＡＣＧＴＴＮｍ−３’（ここで、ｍ＝１〜４４である）（配列番号７３）からなる。いくつかの実施形態において、Ｓｐ１およびＳｐ２は、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）である。
【００８０】
いくつかの好ましい実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、
５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）または
５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＣＣＧＧ−３’（配列番号７２）
である。
【００８１】
本開示の粒子は、腫瘍抗原も含み、腫瘍抗原は、８〜１８００アミノ酸、９〜１０００アミノ酸または１０〜１００アミノ酸のポリペプチドである。詳細には、腫瘍抗原は、少なくとも１つの完全長タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む。好適な腫瘍抗原は、当該分野で記載されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、２００９  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：５３２３−５３３７；およびＣａｂａｌｌｅｒｏ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１００：２０１４−２０２１を参照のこと）。例えば、好適な腫瘍抗原として、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１、Ｒａｓ、ｇｐ１００、プロテイナーゼ３、ｂｃｒ−ａｂｌｅ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント（ｓａｒｃｏｍａ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ）、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＰ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７−Ａ、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲンレセプター、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＰｈｏＣ、ＴＲＰ−２、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＢＯＲＩＳ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７−Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＡＰ、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＢＡＧＥ１、ＢＡＧＥ２、ＢＡＧＥ３、ＢＡＧＥ４、ＢＡＧＥ５、ＣＡＭＥＬ、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２およびＦｏｓ関連抗原１が挙げられるが、これらに限定されない。
代表的な腫瘍抗原のアミノ酸配列は、表Ｉに列挙されるアクセッション番号でＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースに収載されており、参照により本明細書中に援用される。
【表１−１】
2019515900.tif 000004
【表１−２】
2019515900.tif 000005
【表１−３】
2019515900.tif 000006
【００８２】
いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、ｇｐ１００、ｈＴＥＲＴ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ３、ＭＡＧＥ  Ａ１０、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ＰＳＡ、Ｒａｓ、サバイビン、ＴＲＰ１（ｇｐ７５）、ＴＲＰ２およびチロシナーゼからなる群の１つまたは複数由来のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍によって発現される哺乳動物抗原（例えば、Ｔｒｉｐｌｅペプチド）またはウイルス抗原（例えば、ＨＰＶ１  Ｅ６および／またはＨＰＶ  Ｅ７）を含む。いくつかの実施形態において、哺乳動物抗原は、ネオ抗原であるか、または哺乳動物被験体由来の正常な細胞に存在する遺伝子と比べて変異を含む遺伝子によってコードされる。ネオ抗原は、Ｔ細胞ががん細胞と非がん細胞とを区別できるようにする際に特に有用であると考えられている（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，２０１５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８：６９−７４；Ｄｅｓｒｉｃｈａｒｄら、２０１６  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２２：８０７−８１２；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，２０１７  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：１１−３７を参照のこと）。
【００８３】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、２つまたはそれを超えるポリペプチドを含む融合タンパク質であり、ここで、各ポリペプチドは、異なる腫瘍抗原のアミノ酸配列または同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、融合タンパク質は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、ここで、各ポリペプチドは、同じ腫瘍抗原由来の不連続なアミノ酸配列を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に単一のシステイン残基を含むように改変されて、そのシステインのチオール基を介して共有結合が可能になる。他の場合では、当該分野で公知のいくつかの生体結合体（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）化学によって、１〜３個のアミノ酸残基、または非天然のアミノ酸残基が、ポリペプチド抗原のＮ末端およびＣ末端の一方または両方に付加されて、改変されたポリペプチド抗原が形成されて、共有結合が可能になる。本開示は、本明細書中で詳述される任意の粒子、例えば、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む、免疫原性組成物を提供し、ここで、
多量体化剤は、１０〜１０，０００ナノメートルの直径および／または約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有し；
ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、各Ｎは、独立して選択されるヌクレオシドであり、ｓ＝４〜４７であり；
腫瘍抗原は、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含み；
ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原は、各々、１つもしくはそれを超える共有結合によって多量体化剤と会合しているか、または各々、吸着によって多量体化剤と会合している。
Ａ．ＴＬＲ９アゴニスト：アルミニウム塩錯体：腫瘍抗原共吸着体
【００８５】
本開示は、ＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を調製するための方法、ならびにそれにおいて有用な組成物および中間体を提供する。
【００８６】
１つの態様において、本開示は、各々が吸着によって生体適合性多量体化剤（例えば、アルミニウム塩錯体）と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を調製するための方法を提供し、その方法は、その腫瘍抗原およびＴＬＲ９アゴニストを、約６〜９、好ましくは、約７〜８のｐＨを有する緩衝液中に平衡化されたアルミニウム塩錯体と混合する工程を含む。溶解を増加させるために、腫瘍抗原は、５％〜３０％（好ましくは、１０％〜２０％）の有機溶媒を含む水または緩衝液に溶解される。好適な有機溶媒としては、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、酢酸プロピルおよびそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原は、５％〜３０％（好ましくは、１０％〜２０％）のイソプロパノールを含む水または緩衝液に溶解される。ＴＬＲ９アゴニストも、緩衝液に溶解され得る。効率的な吸着のために、リン酸緩衝液を避けるべきである。腫瘍抗原およびＴＬＲ９アゴニストは、多量体化剤（例えば、アルミニウム塩錯体）に同時に吸着されてもよいし、連続的に吸着されてもよい。例えば、腫瘍抗原の溶液が、ある時間にわたる吸着を可能にするために、緩衝液中の多量体化剤に加えられ得；次いで、ＴＬＲ９アゴニストが、吸着のためにその混合物に加えられるか；またはＴＬＲ９アゴニストの溶液が、ある時間にわたる吸着を可能にするために、緩衝液中の多量体化剤に加えられ得；次いで、腫瘍抗原が、吸着のためにその混合物に加えられる。あるいは、多量体化剤（例えば、アルミニウム塩錯体）への腫瘍抗原およびＴＬＲ９アゴニストの同時の吸着を可能にするために、腫瘍抗原およびＴＬＲ９アゴニストの溶液が、同時に加えられ得るか、または一方が、他方のすぐ後に加えられる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、各々が吸着によって生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を調製するための方法が提供され、ここで、
その多量体化剤は、１００〜２５，０００ナノメートル、５００〜２５，０００ナノメートルまたは１〜２５マイクロメートルの粒子直径を有するアルミニウム塩錯体（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））であり、
そのＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）（ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎは、ヌクレオシドである）を含むポリヌクレオチドを含み、
その腫瘍抗原は、約８〜１８００アミノ酸、９〜約１０００アミノ酸または約１０〜約１００アミノ酸のポリペプチドを含み、
その方法は、
約５％〜約３０％（好ましくは、約１０％〜約２０％）イソプロパノールまたは他の有機溶媒を含む水溶液に溶解された腫瘍抗原、およびＴＬＲ９アゴニストを、緩衝液中に平衡化されたアルミニウム塩錯体に加える工程を含み、
ここで、その緩衝液は、約６〜約９（好ましくは、約７〜約８）のｐＨ範囲内であり、その緩衝液は、リン酸緩衝液ではない。
【００８８】
いくつかの実施形態において、アルミニウム塩錯体は、水酸化アルミニウム錯体（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原およびＴＬＲ９アゴニストは、同時にアルミニウム塩錯体に吸着される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原が、まずアルミニウム塩錯体に吸着された後、ＴＬＲ９アゴニストが吸着される。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストが、まずアルミニウム塩錯体に吸着された後、腫瘍抗原が吸着される。
【００８９】
約６〜９のｐＨ範囲内の任意の好適な緩衝液、例えば、任意の非リン酸緩衝液を、上記方法におけるアルミニウム塩錯体の結合反応のために使用してよい。リン酸緩衝液は、アルミニウム塩錯体上の結合部位について競合して、ローディング能力を低下させ得るので、通常、避けられる。さらに、ホスフェートへの配位子：アルミニウム塩錯体の曝露は、配位子がホスフェートによって置換されるリン酸配位子交換を引き起こし得る。Ｌｉｎｄｂｌａｄ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００４，８２，４９７−５０５を参照のこと。いくつかの実施形態において、緩衝液は、酢酸緩衝液（例えば、ｐＨが約７の酢酸ナトリウム緩衝液）である。いくつかの実施形態において、緩衝液は、炭酸水素緩衝液（例えば、ｐＨが約８の炭酸水素ナトリウム緩衝液）である。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、非リン酸緩衝液に溶解される。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩錯体（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））は、非リン酸緩衝液中に平衡化される。好適な非リン酸緩衝液としては、酢酸緩衝液、炭酸水素緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、フタル酸緩衝液、四ホウ酸緩衝液およびＴＲＩＳ緩衝液が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
数多くのタンパク質抗原およびペプチド抗原が、アルミニウムアジュバントに効率的かつ安定に吸着されており、数十年間にわたって動物とヒトの両方においてワクチン用のアジュバントとして研究においておよび臨床応用のために使用されている。Ａｅｂｉｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７，３２３（２）：１３９−１４６を参照のこと。一般に、抗原とアルミニウムアジュバントとの会合は、主に静電力によって引き起こされると考えられている；しかしながら、水素結合、ファンデルワールス相互作用および疎水性−疎水性相互作用も、関与している可能性がある。ゆえに、結合能および結合効率は、各ペプチドのユニークな特性；例えば、配列、溶解度、構造、電荷および疎水性、ならびに緩衝液のタイプおよび組成、ペプチド濃度、イオン強度、ｐＨ、時間および温度をはじめとした結合条件に依存すると予想される。
【００９１】
ＣｐＧ−ＯＤＮとは異なり、目的の多くのペプチド抗原は、高度に疎水性であり、アルミニウム塩錯体との結合に通常使用される水性緩衝液に、有用な濃度で可溶でない。本開示は、水性緩衝液（例えば、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、エタノール、ギ酸、イソプロパノール、２−プロパノール、アセトニトリル、１，２−ジクロロエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、トリフルオロ酢酸およびそれらの組み合わせ）に加えられた１種またはそれを超える有機溶媒を使用した共溶媒系を提供し、この共溶媒系は、あらゆる水溶液系が使用されたときよりも高いペプチドの結合効率および結合能をもたらす。例示的な実施形態において、腫瘍抗原の溶解を増加させるため、ゆえに、多量体化剤への腫瘍抗原の吸着を促進するために、イソプロパノールが共溶媒として使用される。必要とされるイソプロパノールの量は、腫瘍抗原および多量体化剤の性質に依存し得る。例えば、より疎水性である腫瘍抗原ポリペプチドは、溶解および効率的な吸着のために、より疎水性でない腫瘍抗原ポリペプチドよりも多くのイソプロパノールを必要とする傾向がある。イソプロパノール共溶媒系の使用は、異なる疎水性を有する多くの異なるタイプのペプチドに適用することができる。有機溶媒の好ましい実施形態としては、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、エタノール、ギ酸および酢酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
ポリペプチドを溶解するために必要な量（最小量）とアルミニウム塩の脱水または溶解を引き起こし得る量（最大量）との間の任意の量のイソプロパノール（または他の好適な有機溶媒）を使用してよい。イソプロパノールの適切な代替物としては、酢酸、アセトン、アニソール、１−ブタノール、２−ブタノール、酢酸ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、クメン、ジメチルスルホキシド、エタノール、酢酸エチル、エチルエーテル、ギ酸エチル、ギ酸、ヘプタン、酢酸イソブチル、酢酸イソプロピル、酢酸メチル、３−メチル−１−ブタノール、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、２−メチル−１−プロパノール、ペンタン、１−ペンタノール、１−プロパノールおよび酢酸プロピルが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、約５％〜約３０％、約５％〜約２５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１５％、約５％〜約１０％、約１０％〜約３０％、約１０％〜約２５％、約１０％〜約２０％、約１０％〜約１５％、約１５％〜約２０％、約１５％〜約２５％、約１５％〜約３０％、約２０％〜約３０％または約１２％〜約１８％のイソプロパノールを含有する水溶液に溶解される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、約５％、約８％、約１０％、約１１％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％または約３０％のイソプロパノールを含有する水溶液に溶解される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、水または水性緩衝液中の約１０％〜約２０％のイソプロパノールに溶解される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、水中の約５％〜約３０％、好ましくは約１０％〜約２０％のイソプロパノールに溶解される。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、水性緩衝液中の約５％〜約３０％、好ましくは約１０％〜約２０％のイソプロパノール（例えば、８までのｐＨの炭酸水素ナトリウム緩衝液）に溶解される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、各々が吸着によって生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む微小粒子を調製するための方法は、以下の工程のうちの１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）をさらに含む：（ｉ）約５％〜約３０％（好ましくは、約１０％〜約２０％）のイソプロパノールを含む水溶液に腫瘍抗原を溶解する工程、（ｉｉ）水または非リン酸緩衝液にＴＬＲ９アゴニストを溶解する工程、および（ｉｉｉ）アルミニウム塩錯体（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））を非リン酸緩衝液中に予め平衡化する工程。
【００９４】
多量体化剤（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））の量に対する、使用されるＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ）および腫瘍抗原（例えば、ペプチド抗原）の量は、共吸着体においてＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム：腫瘍抗原の望ましい比が提供されるように調整され得る。いくつかの実施形態において、重量基準のＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ）と多量体化剤（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））との比は、約０．２：１〜約２：１、約０．４：１〜約２：１、約０．６：１〜約２：１、約０．８：１〜約２：１、約０．２：１〜約３：１、約０．２：１〜約４：１または約０．２：１〜約５：１である。いくつかの好ましい実施形態において、ＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、約０．２〜約１．２の範囲である。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、以下より大きい（下限）；約０．２：１、約０．３：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．７：１、約０．８：１、約０．９：１、約１：１、約１．２：１、約１．５：１、約２．０：１、約２．５：１、約３．０：１、約４：１または約５：１。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、以下より小さい（上限）；約５：１、約４：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．８：１、約１．５：１、約１．２：１、約１：１、約０．９：１、約０．８：１、約０．７：０または約０．６：１。すなわち、ＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、下限が上限未満である、約０．２：１〜約５：１の範囲である。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、約０．４：１、約０．６：１、約０．８：１、約１：１または約１．２：１である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、重量基準の、腫瘍抗原（例えば、ペプチド抗原）と多量体化剤（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＢＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））との比は、約０．０１：１〜約２：１、約０．０５：１〜約２：１、約０．１：１〜約２：１、約０．２：１〜約２：１、約０．４：１〜約２：１、または約０．６：１〜約２：１、約０．８：１〜約２：１、約１．０：１〜約２：１または約１．５：１〜約２：１である。いくつかの好ましい実施形態において、腫瘍抗原：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、約０．００５：１〜約２：１の範囲である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、以下より大きい（下限）；約０．００５：１、約０．０１：１、約０．０５：１、約０．１：１、約０．２：１、約０．４：１、約０．５：１、約０．６：１、約０．８：１、約１：１、約１．２：１または約１．５：１である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原の各々：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、以下より小さい（上限）；約２：１、約１．８：１、約１．５：１、約１．２：１、約１：１、約０．８：１または約．０．６：１である。すなわち、腫瘍抗原：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、下限が上限未満である、約０．２：１〜約２：１または約０．００５：１〜約２：１の範囲である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、約０．４：１、約０．６：１、約０．８：１、約１：１または約１．２：１である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、適切な量の、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧ−ＯＤＮ）、腫瘍抗原（例えば、ペプチド抗原）および多量体化剤（例えば、水酸化アルミニウム錯体またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））が混合されて、約０．４：１：０．４〜約２：１：２、好ましくは、約０．６：１：０．６〜約１．２：１：１．２というＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム：腫瘍抗原（ｗ／ｗ／ｗ）比を有する共吸着体が提供される。いくつかの実施形態において、共吸着体のＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム：腫瘍抗原（ｗ／ｗ／ｗ）比は、約０．２：１：０．０１〜約５：１：２、好ましくは、約１：１：０．０５〜約４：１：０．６である。吸着体におけるＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比および腫瘍抗原：水酸化アルミニウム（ｗ／ｗ）比は、異なってもよいし、同じであってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、吸着体におけるＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム：腫瘍抗原（ｗ／ｗ／ｗ）比は、約０．８：１：１．３である。いくつかの実施形態において、吸着体におけるＴＬＲ９アゴニスト：水酸化アルミニウム：腫瘍抗原（ｗ／ｗ／ｗ）比は、約１：１：１である。
Ｂ．ＴＬＲ９アゴニスト−多糖−腫瘍抗原共結合体
【００９７】
１つの態様において、本開示は、各々が生体適合性多量体化剤（例えば、多糖）に共有結合的に連結されているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を調製するための方法を提供し、方法は、マレイミド基によって官能化された多糖と、チオール基を含むかまたはチオール基によって官能化されたＴＬＲ９アゴニストを反応させ、そしてチオール基（例えば、システインチオールまたは腫瘍抗原ペプチドの官能化によるアルキル−チオール基）を含む腫瘍抗原を反応させる工程を含む。腫瘍抗原およびＴＬＲ９アゴニストは、多糖に同時にまたは連続的に共有結合的に連結され得る。例えば、チオール基を含むかまたはチオール基によって官能化されたＴＬＲ９アゴニストを、多糖に連結されたマレイミド基のいくつかと反応させてよく、次いで、腫瘍抗原を、多糖に連結された残りのマレイミド基と反応させる。まず、腫瘍抗原を、多糖におけるマレイミド基と反応させてもよく、次いで、ＴＬＲ９アゴニストを、多糖における残りのマレイミド基と反応させる。あるいは、マレイミド基によって官能化された多糖とチオール基を含む腫瘍抗原とを同時に、マレイミド基によって官能化された多糖と反応させてもよい。いくつかの場合において、反応は、反応混合物のｐＨを制御するために緩衝液中で行われる。緩衝液中に塩酸グアニジンを含めることによって、腫瘍抗原、特に、疎水性腫瘍抗原の溶解が促進される。
【００９８】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のＴＬＲ９アゴニスト−多糖−腫瘍抗原共結合体化合物：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ−［Ｌ３−（ＰＥＧ）−Ｌ２−Ａ］ｔ      （Ｉ）
を調製するための方法が提供され、式中：
Ｄは、ＴＬＲ９アゴニストであり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｔおよびｘは、独立して、３〜２００の整数であり；
Ａは、腫瘍抗原であり；
Ｆは、約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖であり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎはヌクレオシドであり、該ヌクレオチド間および３’末端のヌクレオチドとＬ１との間の１つまたはそれを超える結合は、ホスホロチオエートエステル結合であり、
Ａは、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり、少なくとも１つのチオール基を含み、
方法は、
式（ＩＩ）の化合物：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ      （ＩＩ）
（式中、Ｌ３、ＰＥＧおよびＦは、式（Ｉ）について定義されたとおりであり；
Ｌ２ａは、
【化２】
2019515900.tif 000007
であり；
ｙは、６〜３５０の整数であるが；但し、ｙは、ｔとｘとの合計以上である（ｙ≧ｔ＋ｘ））と、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物（式中、Ｄは、式（Ｉ）についして定義されたとおりであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を反応させる工程、および式Ａの化合物を反応させる工程を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を式（ＩＩ）の化合物と反応させて、中間体を形成する工程、および、式Ａの化合物を中間体と反応させる工程を含む。いくつかの実施形態において、方法は、式Ａの化合物を式（ＩＩ）の化合物と反応させて中間体を形成する工程、および式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を中間体と反応させる工程を含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、反応は、塩酸グアニジンを含む媒質（例えば、緩衝液）中で行われる。
【０１００】
式（Ｉ）のＴＬＲ９アゴニスト−多糖−腫瘍抗原共結合体化合物におけるＴＬＲ９アゴニストＤおよび腫瘍抗原Ａの数は、独立して、３〜約２００の範囲であり得る。すなわち、ｘおよびｔは、独立して、３〜２００の整数である。いくつかの実施形態において、ｘおよびｔは、独立して、３、６、９、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０より大きな（下限）整数である。いくつかの実施形態において、ｘおよびｔは、独立して、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５または４０未満（上限）の整数である。すなわち、ｘおよびｔは、独立して、下限が上限未満である、約３〜２００の範囲の整数であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ｘは、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１２０、１５〜１００、１５〜５０、２０〜１２０または２０〜４０である。いくつかの実施形態において、ｘは、約３０±１０である。好ましい実施形態において、ｘは、約３０である。いくつかの実施形態において、ｔは、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１２０、１２〜１００、１２〜８０、２０〜８０または３５〜７５である。いくつかの実施形態において、ｔは、約５５±２０である。好ましい実施形態において、ｔは、約５５である。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、少なくとも１つのシステイン残基を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの（ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）システイン残基は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍の細胞によって発現される哺乳動物抗原のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍によって発現されるウイルス抗原のアミノ酸配列を含む。
【０１０２】
いくつかの場合において、式（ＩＩ）の化合物におけるすべてのマレイミド基が、Ｄに連結されたチオールまたはＡのチオールと反応する。したがって、いくつかの実施形態において、ｙ＝ｔ＋ｘである。他の場合では、式（ＩＩ）の化合物における一部のマレイミド基だけが、Ｄに連結されたチオールまたはＡのチオールと反応し、一部は、Ｄに連結されたチオールまたはＡのチオールと反応しない。したがって、いくつかの実施形態において、ｙ＞ｔ＋ｘである。いくつかの実施形態において、ｙは、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１６５、１９０または２００より大きい（下限）整数である。いくつかの実施形態において、ｙは、３５０、３００、２７５、２５０、２２５、２１５、２１０、２０５、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０または５０より小さい（上限）整数である。すなわち、ｙは、下限が上限未満である、約６〜３５０の範囲の整数であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ｙは、２０〜３５０、３０〜３００、１５５〜２１５、１６５〜２０５、２０〜２５０、９０〜２５０、１２０〜２５０、１２０〜２２０、１６０〜２２０、２０〜２００、６０〜１８０、９０〜１５０、１００〜１４０または１１０〜１３０である。好ましい実施形態において、ｙは、約１９０、約１８５、約１５０または約１２０である。いくつかの実施形態において、ｙは、約１９０±３０または約１８５±３０である。ｙがｔとｘとの合計より大きい整数であるいくつかの実施形態において、核酸部分Ｄと反応していないマレイミド基は、キャッピングおよび／または加水分解される。ｙがｔとｘとの合計より大きい整数であるいくつかの実施形態において、核酸部分Ｄと反応していないマレイミド基は、システインでキャッピングされる、および／または水によって加水分解される。
【０１０３】
反応性チオール化合物Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨ、および式（ＩＩ）のマレイミドによって官能化された多糖は、本明細書中に記載される方法および当該分野で公知の方法、例えば、２０１６年１月２２日に出願され、ＷＯ２０１６／１１８９３２として公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４６３５（その内容が参照により本明細書中に援用される）に記載されている方法を用いて調製され得る。
【０１０４】
反応性チオール化合物Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨは、使用前に、より安定したジスルフィド化合物から生成されることが多い。いくつかの実施形態において、上記方法は、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨのジスルフィド化合物を還元剤（例えば、ホスフィン化合物）と反応させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｄは、式（Ｉ）に対して本明細書中で定義されたとおりであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍである（ここで、ｍは、２〜９の整数である）。それらの実施形態のいくつかにおいて、ｍは、２、３、４、５、６、７、８または９である。いくつかの実施形態において、ｍは、３〜６である。これらの実施形態のいくつかにおいて、ｍは、３または６である。１つの実施形態において、ｍは、６である。１つの実施形態において、ｍは、３である。還元剤の一例は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）である。
【０１０５】
式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物または式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＳ−Ｌ１ａ−ＯＨの化合物が、本明細書中に記載され、式中、Ｄは、本明細書中で詳述されるＴＬＲ９アゴニストであり、Ｌ１ａは、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である。これらの実施形態のいくつかにおいて、Ｄは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’（配列番号１）を含むポリヌクレオチドであり、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎは、ヌクレオシドである。それらの実施形態のいくつかにおいて、ｍは、２、３、４、５、６、７、８または９である。いくつかの実施形態において、ｍは、３〜６であるか、またはｍは、３もしくは６である。１つの実施形態において、ｍは、６である。１つの実施形態において、ｍは、３である。
【０１０６】
式（ＩＩ）の化合物におけるＰＥＧは、ＰＥＧを含む活性化エステル化合物と反応する多価多糖Ｆのアミン誘導体を介して導入され得る。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物を生成する方法は、式（ＩＩＩ）の化合物：
［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ      （ＩＩＩ）
（式中、Ｆは、式（Ｉ）について定義されたとおりであり、ｚは、６〜４００の整数である）を、
式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、Ｌ２ａおよびＰＥＧは、式（ＩＩ）について定義されたとおりであり；Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｌｖは、脱離基である）
と反応させて、式（ＩＩ）の化合物を形成する工程をさらに含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧを含む活性化エステル化合物は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳまたはＨＯＳｕ）エステルであり、Ｌｖは、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ（すなわち、ＯＳｕ）である。当該分野で公知の他の活性化カルボン酸または活性化エステルを用いて、式（ＩＩＩ）のアミンと反応させて、式（ＩＩ）の化合物を形成することができる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、Ｆは、約１００，０００〜７００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーである。いくつかの実施形態において、Ｆは、約４００，０００±１００，０００ダルトンの分子量を有する、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）ＰＭ４００）であり、式（ＩＩＩ）の化合物は、ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００の化合物である。使用される式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００の化合物）に対する活性化エステルＬ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖ（例えば、ＮＨＳエステルＬ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−ＯＳｕ）の相対量に応じて、式（ＩＩＩ）の化合物におけるアミノ基の一部または全部が、ＰＥＧ化され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｚは、ｙと等しい。いくつかの実施形態において、ｚは、ｙより大きい整数である。いくつかの実施形態において、ｚは、６、９、１２、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５５、１６５、１９０または２００より大きな（下限）整数である。いくつかの実施形態において、ｚは、４００、３５０、３００、２７５、２５０、２２５、２１５、２１０、２０５、２００、１９０、１８０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０または５０より小さな（上限）整数である。そのｚは、下限が上限未満である、約６〜４００の範囲の整数であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、ｚは、２０〜４００、５０〜３００、１９０〜２５０、２００〜２４０、２０〜３５０、３０〜３００、１５５〜２１５、１６５〜２０５、２０〜２５０、９０〜２５０、１２０〜２５０、１２０〜２２０、１６０〜２２０、２０〜２００、６０〜１８０、９０〜１５０、１００〜１４０または１１０〜１３０である。好ましい実施形態において、ｚは、約２２０、約１９０、約１５０または約１２０である。いくつかの実施形態において、ｚは、約２２０±３０または約２２０±２０である。ｚがｙより大きい整数であるいくつかの実施形態において、過剰なアミンは、キャッピングされる。ｚがｙより大きい整数であるいくつかの実施形態において、過剰なアミンは、スルホ−ＮＨＳ−アセテートまたはＮＨＳ−アセテートでキャッピングされる。
【０１０９】
ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）は、エピクロロヒドリンとスクロースを架橋することによって合成され、高度に分岐した構造をもたらす。アミノエチルカルボキシメチル−ＦＩＣＯＬＬ（ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標））は、Ｉｎｍａｎ，１９７５，Ｊ．Ｉｍｍ．１１４：７０４−７０９の方法によって調製され得る。次いで、ＡＥＣＭ−ＦＩＣＯＬＬは、６−マレイミドカプロン酸アシル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ  ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｙｌ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性架橋試薬と反応され、次いで、チオールによって誘導体化された核酸部分に結合体化され得る（Ｌｅｅら、１９８０，Ｍｏｌ．Ｉｍｍ．１７：７４９−５６を参照のこと）。他の多糖も同様に改変され得る。
【０１１０】
上記方法において使用されるＮＨＳエステル（Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−ＯＳｕ）は、商業的供給源から入手してもよいし、当該分野で公知の方法によって生成してもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物を調製するための方法は、
式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、
Ｌ２ａは、マレイミド基を含む部分であり、
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎ＝２〜８０である）であり、
Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｌｖは、脱離基（例えば、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）である））
を式（ＩＩＩ）の化合物：
［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ      （ＩＩＩ）
（式中、Ｆは、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続され、
ｚは、独立して、６〜４００の整数である）
と反応させて、式（ＩＩ）の化合物：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ      （ＩＩ）
（式中、ｙは、６〜３５０の整数である）を生成する工程
をさらに含む。
【０１１２】
本開示は、本明細書中に詳述される式（ＩＩ）の化合物の分布から式（Ｉ）の化合物の分布を含む組成物を調製するための方法も提供する。１つの態様において、式（Ｉ）の化合物を含む組成物：
［Ｄ−Ｌ１−Ｌ２−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｘ−Ｆ−［Ｌ３−（ＰＥＧ）−Ｌ２−Ａ］ｔ      （Ｉ）
を調製するための方法が提供され、式中：
Ｄは、ＴＬＲ９アゴニストであり；
Ｌ１は、アルキルチオ基を含む第１のリンカーであり；
Ｌ２は、スクシンイミド基を含む第２のリンカーであり；
Ｌ３は、アミド基を含む第３のリンカーであり；
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎは、２〜８０の整数である）であり；
ｔおよびｘは、独立して、３〜２００の整数であり；
Ａは、腫瘍抗原であり；
Ｆは、約１０，０００〜約１，０００，０００ダルトンの分子量を有する多糖であり、エーテル基を介してＬ３に接続されており、
該ＴＬＲ９アゴニストは、配列５’−ＴＣＧＮｓ−３’を含むポリヌクレオチドを含み、ここで、ｓ＝４〜４７であり、各Ｎはヌクレオシドであり、該ヌクレオチド間および３’末端のヌクレオチドとＬ１との間の１つまたはそれを超える結合は、ホスホロチオエートエステル結合であり、
Ａは、約９〜約１０００アミノ酸のポリペプチドを含む腫瘍抗原であり、少なくとも１つのチオール基を含み、
方法は、
式（ＩＩ）の化合物の分布を含む組成物：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ      （ＩＩ）
（式中、Ｌ３、ＰＥＧおよびＦは、式（Ｉ）について定義されたとおりであり；
Ｌ２ａは、
【化３】
2019515900.tif 000008
であり；
ｙは、６〜３５０の整数であるが；但し、ｔとｘとの合計以上である（ｙ≧ｔ＋ｘ））と、式Ｄ−Ｌ１ａ−ＳＨの化合物を含む組成物（式中、Ｄは、独立して、式（Ｉ）についして定義されたとおりであり、Ｌ１ａは、独立して、（ＣＨ２）ｍであり、ｍは、２〜９の整数である）を反応させる工程、および式Ａの化合物を含む組成物を反応させる工程を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物を含む組成物におけるＦ部分は、約２００，０００〜約６００，０００ダルトンの平均分子量を有し、組成物における式（ＩＩ）の化合物は、約６０〜約２５０の平均ローディング比（ｙ）を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物を含む組成物におけるＦ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、組成物における式（ＩＩ）の化合物は、約１２０±３０、約１５０±３０、約１８５±３０または約１９０±３０の平均ローディング比（ｙ）を有する。共結合体組成物におけるＴＬＲ９アゴニストの平均ローディング比（ｘ）と腫瘍抗原の平均ローディング比（ｒａｔｉｏｎ）（ｔ）は、同じであってもよいし、異なってもよい。いくつかの実施形態において、組成物における式（Ｉ）の共結合体化合物は、約１０〜約１２０、約１０〜約１００、約１０〜約８０、約１０〜約６０、約２０〜約４０または約３０±１０のＴＬＲ９アゴニスト（ｘ）の平均ローディング比、および／または約１０〜約１２０、約１０〜約１００、約２０〜約１００、約２５〜約１００、約３５〜約７５または約５５±２０の腫瘍抗原（ｔ）の平均ローディング比を有する。ＦＩＣＯＬＬ誘導体のローディング比は、モル濃度に基づく。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物を含む組成物を調製するための方法は、
式Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３ａ−Ｌｖの化合物（式中、
Ｌ２ａは、マレイミド基を含む部分であり、
ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（例えば、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であって、ここで、ｎ＝２〜８０である）であり、
Ｌ３ａは、−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｌｖは、脱離基（例えば、（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシである））
を、式（ＩＩＩ）の化合物を含む組成物：
［ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２］ｚ−Ｆ        （ＩＩＩ）
（式中、Ｆは、独立して、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであり、エーテル基を介してＬ３に接続され、
ｚは、独立して、６〜４００の整数であり；
式（ＩＩＩ）の化合物を含む組成物におけるＦ部分は、約２００，０００〜約６００，０００ダルトンの平均分子量を有し、式（ＩＩＩ）の化合物は、約６０〜約２８０の平均ローディング比（ｚ）を有する）
と反応させて、式（ＩＩ）の化合物：
［Ｌ２ａ−（ＰＥＧ）−Ｌ３］ｙ−Ｆ      （ＩＩ）
（式中、ｙは、独立して、６〜３５０の整数である）
を含む組成物を形成する工程をさらに含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物を含む組成物におけるＦ部分は、約３００，０００〜約５００，０００ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、Ｆ部分は、約４００，０００±１００，０００ダルトンの平均分子量を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、約５０〜約３５０、約５０〜約２８０、約６０〜約２５０、約６０〜約１８０、約６０〜約１５０、約９０〜約２８０、約９０〜約２５０、約９０〜約２００、約９０〜約１５０、約１２０〜約２８０、約１２０〜約２５０、約１５０〜約２８０、約１５０〜約２５０、約１８０〜約２８０、約１８０〜約２５０、約２００〜約２５０または約２１０〜約２３０の平均ローディング比（ｚ）を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物は、約１２０±３０、約１５０±３０、約１８０±３０、約２２０±３０または約２２０±２０の平均ローディング比（ｚ）を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）の化合物を含む組成物は、ＡＥＣＭ  ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００である。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物または式（Ｉ）の化合物を含む組成物を調製する方法は、式（Ｉ）の化合物、および／または中間体化合物のいずれか（例えば、式（ＩＩ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物）を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、その方法は、ダイアフィルトレーションによって式（Ｉ）の化合物を精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、その方法は、１００，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を使用するダイアフィルトレーションによって式（Ｉ）の化合物を精製する工程をさらに含む。
【０１１７】
本明細書中で詳述される方法のいずれかを用いて、各々が生体適合性多量体化剤と会合しているＴＬＲ９アゴニストおよび腫瘍抗原を含む粒子を含む免疫原性組成物のための、本明細書中に記載される方法を用いて調製される組成物または粒子がさらに提供される。
【０１１８】
本明細書中で詳述される粒子の粒径は、当該分野で公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計測され、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）が、粒径範囲および平均粒径を決定するために用いられ得る。Ｆｌｏｗ  Ｃａｍ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｌａｂ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）法も、粒子の平均直径およびサイズ分布を決定するために用いることができる。
【０１１９】
ＴＬＲ９アゴニスト−多糖−腫瘍抗原共結合体ポリマーの分子量は、当該分野で公知の（ｋｎｏｗ）方法、例えば、粘度に基づく流体力学的方法および光散乱に基づく方法を用いて、計測され得る。
ＩＩＩ．薬学的組成物
【０１２０】
本開示のいくつかの免疫原性組成物は、粒子および薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的組成物である。本開示の薬学的組成物は、溶液または懸濁液の形態で存在し得る。あるいは、薬学的組成物は、脱水された固体（例えば、フリーズドライまたは噴霧乾燥された固体）であり得る。本開示の薬学的組成物は、好ましくは、滅菌されており、好ましくは、本質的にエンドトキシンを含まない。用語「薬学的組成物」は、本明細書中で用語「医薬品」および「薬」と交換可能に使用される。
Ａ．賦形剤
【０１２１】
本開示の薬学的に許容され得る賦形剤としては、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、張度調整剤および保存剤が挙げられる。例えば、Ｐｒａｍａｎｉｃｋら、Ｐｈａｒｍａ  Ｔｉｍｅｓ，４５：６５−７７，２０１３を参照のこと。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、溶媒、増量剤、緩衝剤および張度調整剤のうちの１つまたは複数として機能する賦形剤を含み得る（例えば、食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクルと張度調整剤との両方として働き得る）。本開示の薬学的組成物は、非経口投与に適している。すなわち、本開示の薬学的組成物は、経腸投与を意図していない。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、溶媒として水性ビヒクルを含む。好適なビヒクルとしては、例えば、滅菌水、食塩水溶液、リン酸緩衝食塩水およびリンガー溶液が挙げられる。いくつかの実施形態において、組成物は、等張性である。
【０１２３】
薬学的組成物は、増量剤を含み得る。増量剤は、薬学的組成物が投与前に凍結乾燥されるとき、特に有用である。いくつかの実施形態において、増量剤は、フリーズドライ中もしくは噴霧乾燥中および／または貯蔵中の活性な作用物質の安定化および分解防止を助ける保護剤である。好適な増量剤は、糖類（単糖、二糖および多糖）、例えば、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔａｌ）、グルコースおよびラフィノースである。
【０１２４】
薬学的組成物は、緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、処理中、貯蔵中および必要に応じて再構成中の活性な作用物質の分解を阻害するようにｐＨを制御する。好適な緩衝剤としては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩を含む塩が挙げられる。他の好適な緩衝剤としては、例えば、アミノ酸（例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジンおよびリジン）が挙げられる。緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、組成物のｐＨを６〜９の範囲内で維持する。いくつかの実施形態において、そのｐＨは、６、７または８より高い（下限）。いくつかの実施形態において、そのｐＨは、９、８または７未満である（上限）。すなわち、そのｐＨは、下限が上限未満である、約６〜９の範囲内である。
【０１２５】
薬学的組成物は、張度調整剤を含み得る。好適な張度調整剤としては、例えば、デキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリンおよびマンニトールが挙げられる。
【０１２６】
薬学的組成物は、保存剤を含み得る。好適な保存剤としては、例えば、酸化防止剤および抗菌剤が挙げられる。しかしながら、好ましい実施形態において、薬学的組成物は、滅菌条件下で調製され、使い捨ての容器内に入れられるので、保存剤を含める必要がない。
Ｂ．キット
【０１２７】
さらに、本開示は、薬学的組成物などの免疫原性組成物および本明細書中に記載される方法のために組成物を使用することに関する指示書一式を含むキットを提供する。キットの薬学的組成物は、適切に包装される。例えば、薬学的組成物が、フリーズドライされた粉末である場合、その粉末が、弾力のある栓を通って流体を注入することによって容易に再懸濁され得るように、弾力のある栓を有するバイアルが、容器施栓系として通常使用される。薬学的組成物が、液体である場合、ゴム栓（例えば、Ｅｘｘｐｒｏハロブチルエラストマー）およびアルミニウム圧着トップを有する二酸化ケイ素バイアル（例えば、ＳＣＨＯＴＴ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｐｌｕｓ（登録商標））が、容器施栓系として通常使用される。ある特定の実施形態において、キットは、臨床試験における用量およびスケジュールの融通性を高めるために、２バイアル容器施栓系で構成されている薬学的組成物を含み、ここで、一方のバイアルは、多量体化剤（例えば、水酸化アルミニウム粒子）に吸着された腫瘍抗原を含み、第２のバイアルは、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、Ｄ６４−０４）を含み、処方された体積のそれらの２つの溶液が、投与前に混合される。他の好ましい実施形態において、キットは、「個別化医療」アプローチにおいて腫瘍ネオ抗原を使用することを容易にするために、２バイアル容器施栓系で構成されている薬学的組成物を含み、ここで、一方のバイアルは、多量体化剤（例えば、水酸化アルミニウム粒子）に吸着されたＴＬＲ９アゴニスト（例えば、Ｄ６４−０４）を含み、第２のバイアルは、１つまたはそれを超える腫瘍ネオ抗原を含む溶液を含み、処方された体積のそれらの２つの溶液が、投与前に混合される。腫瘍ネオ抗原は、通常、患者の腫瘍ゲノムを配列決定することによって特定される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、キットは、薬学的組成物を投与するためのデバイス（例えば、シリンジおよび針）をさらに含む。他の実施形態において、キットは、予め充填されたシリンジ／針システム、自動注入装置または無針デバイスをさらに含む。薬学的組成物の使用に関する指示書は、一般に、意図される使用方法に対する投与量、スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。
ＩＶ．使用方法
【０１２９】
本開示の薬学的組成物は、がんの処置を必要とする哺乳動物被験体におけるがんの処置に適している。哺乳動物被験体としては、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、ペットおよび家畜が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、特定の結果を達成するために有効な量で被験体に投与され得る。
Ａ．投与量および投与様式
【０１３０】
あらゆる薬学的組成物と同様に、有効量および投与様式は、当業者に明らかないくつかの因子に基づいて変化し得る。考慮されるべき重要な因子は、薬学的組成物が、単独の処置として投与されるのか、または治療剤の組み合わせの一部として投与されるのかである。他の考慮されるべき因子としては、達成されるべき結果および投与される回数が挙げられる。
【０１３１】
好適な投与量の範囲は、所望の効果を提供する範囲である。投与量は、被験体に投与されるべきポリヌクレオチドを含むＴＬＲ９アゴニストの量によって決定され得る。被験体の体重を基準として送達される量として与えられるポリヌクレオチドの例示的な投与量の範囲は、約５〜５０００ｍｃｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態において、投与量は、約５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０または１０００ｍｃｇ／ｋｇより大きい（下限）。いくつかの実施形態において、投与量は、約５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、７５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０または１００ｍｃｇ／ｋｇ未満（上限）である。すなわち、投与量は、下限が上限未満である、約５〜５０００ｍｃｇ／ｋｇの範囲内のどれでもよい。被験体に送達される量として与えられる例示的なポリヌクレオチドの投与量の範囲は約１００ｍｃｇ〜約１００ｍｇである。いくつかの実施形態において、投与量は、約１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００ｍｃｇより大きい（下限）。いくつかの実施形態において、投与量は、約１００、７５、５０、２５、２０、１５または１０ｍｇ未満（上限）である。すなわち、投与量は、下限が上限未満である、約１００〜１００，０００ｍｃｇの範囲内のどれでもよい。
【０１３２】
投与量は、被験体に投与されるべき抗原（例えば、ペプチド抗原）の量によって決定されてもよい。被験体に送達される量として与えられる例示的な投与量の範囲は、約１ｍｃｇ〜５０ｍｃｇである。いくつかの実施形態において、抗原投与量は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０、５０、１００、２５０、５００、７５０または１０００ｍｃｇより大きい（下限）。いくつかの実施形態において、抗原投与量は、約１０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０ｍｃｇ未満（上限）である。すなわち、各抗原の抗原投与量は、下限が上限未満である、約１〜１０００ｍｃｇの範囲内のどれでもよい。さらなる実施形態において、被験体に送達される量として与えられる例示的な投与量の範囲は、１ｍｃｇ〜１０００ｍｃｇの各抗原である。そのような実施形態において、抗原投与量は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２５０、５００または７５０ｍｃｇより大きい（下限）。そのような実施形態において、抗原投与量は、約１０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５または１０ｍｃｇ未満（上限）である。すなわち、各抗原の抗原投与量は、下限が上限未満である、約１〜１０００ｍｃｇの範囲内のどれでもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、本開示の薬学的組成物は、非経口投与（例えば、経口投与または直腸投与ではない）が意図されている。好適な投与経路としては、注射、局所および吸入が挙げられる。特に、本開示の薬学的組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、表皮（遺伝子銃）、経皮的および吸入などの経路によって投与され得る。しかしながら、好ましい投与経路は、腫瘍内送達である。
【０１３４】
好適な投薬レジメンは、予防的または治療的な状況において所望の効果をもたらす投薬レジメンである。選択された経路によって投与される回数は、１回または１回を超える回数であり得る。投薬頻度は、２、３、４、５もしくは６日ごと、毎週、隔週、毎月、隔月または３〜１２ヶ月の投与間隔の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、２回投与され、２回目の投与は、１回目の投与の１〜２ヶ月後に投与される。いくつかの実施形態では、３回投与され、２回目の投与は、１回目の投与の１〜２ヶ月後に投与され、３回目の投与は、２回目の投与の１〜５ヶ月後に投与される。他の実施形態では、隔週または毎月の基準で３回または４回投与され得る。他の実施形態では、それより短いまたは長い期間が、投与間に経過し得る。ある特定の実施形態では、連続する投与の間の間隔は、週数または月数で変動し得る。１つの実施形態において、１週間に２、３、４、５または６回（またはそれより高い頻度）というひと続きの投与が行われた後、その後の時点において、１週間に数回（またはそれより高い頻度）という第２のひと続きの投与が行われ得る。当業者は、実施例に例証されるような生物学的結果（例えば、抗原特異的抗体応答または腫瘍退縮）を計測することによって、投与レジメンを調整することができる。
Ｂ．免疫応答の刺激
【０１３５】
手短に言えば、本開示は、哺乳動物被験体において免疫応答を刺激する方法を提供し、その方法は、哺乳動物被験体に薬学的組成物を、その哺乳動物被験体において免疫応答を刺激するのに十分な量で投与する工程を含む。免疫応答を「刺激する」は、新規の免疫応答を誘発する（例えば、初回のワクチン接種レジメンの結果として）かまたは既存の免疫応答を増大する（例えば、追加免疫のワクチン接種レジメンの結果として）ことによって生じ得る、免疫応答の増大を意味する。いくつかの実施形態において、免疫応答を刺激することは、サイトカインの産生を刺激すること；Ｂリンパ球の増殖を刺激すること；インターフェロン経路に関連する遺伝子の発現を刺激すること；化学誘引物質に関連する遺伝子の発現を刺激すること；および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の成熟を刺激することからなる群のうちの１つまたは複数を含む。免疫応答の刺激を計測するための方法は、当該分野で公知であり、本開示の生物学的実施例に記載されている。
【０１３６】
例えば、本開示は、哺乳動物被験体に薬学的組成物を、その哺乳動物被験体において抗原特異的抗体応答を誘導するのに十分な量で投与することによって、その哺乳動物被験体において抗原特異的抗体応答を誘導する方法を提供する。抗原特異的抗体応答を「誘導する」は、抗原特異的抗体の力価を閾値レベル（例えば、投与前のベースライン力価または血清防御的レベル）より上に上昇させることを意味する。
【０１３７】
免疫応答の解析（定性的と定量的の両方）は、当該分野で公知の任意の方法による解析であってよく、それらの方法としては、抗原特異的抗体の産生の計測（特異的抗体サブクラスの計測を含む）、特定集団のリンパ球（例えば、Ｂ細胞およびヘルパーＴ細胞）の活性化の計測、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２）の産生の計測、および／またはヒスタミンの放出の計測が挙げられるがこれらに限定されない。抗原特異的抗体応答を計測するための方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。特定集団のリンパ球の活性化は、増殖アッセイおよび蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）によって計測され得る。サイトカインの産生も、ＥＬＩＳＡによって計測され得る。
【０１３８】
好ましくは、Ｔｈ１型免疫応答が、刺激される（すなわち、誘発または増大される）。本開示に関しては、Ｔｈ１型免疫応答の刺激は、本開示の活性な作用物質（ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニスト）で処置された細胞からのサイトカインの産生を、活性な作用物質で処置されていないコントロール細胞と比較して計測することによって、インビトロまたはエキソビボにおいて決定され得る。「Ｔｈ１型サイトカイン」の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマおよびＩＦＮ−アルファが挙げられるがこれらに限定されない。対照的に、「Ｔｈ２型サイトカイン」としては、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３が挙げられるがこれらに限定されない。免疫刺激活性の測定に有用な細胞としては、免疫系の細胞（例えば、抗原提示細胞であるリンパ球、好ましくは、マクロファージおよびＴ細胞）が挙げられる。好適な免疫細胞としては、哺乳動物被験体から単離された初代細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞およびＢ細胞を含む末梢血単核球、または脾細胞）が挙げられる。
【０１３９】
Ｔｈ１型免疫応答の刺激は、本開示の活性な作用物質（ポリヌクレオチドＴＬＲ９アゴニスト）で処置された哺乳動物被験体において、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびインターフェロンのレベルを、投与の前および後に、または活性な作用物質で処置されていないコントロール被験体と比較して、計測することによっても決定され得る。Ｔｈ１型免疫応答の刺激は、Ｔｈ１型抗体価とＴｈ２型抗体価との比を計測することによっても決定され得る。「Ｔｈ１型」抗体としては、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３ならびにマウスＩｇＧ２ａが挙げられる。対照的に、「Ｔｈ２型」抗体としては、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびＩｇＥならびにマウスＩｇＧ１およびＩｇＥが挙げられる。
Ｃ．がんを処置する工程
【０１４０】
本開示は、哺乳動物被験体におけるがんを処置する方法を提供し、その方法は、本開示の粒子を含む免疫原性組成物を、その哺乳動物被験体におけるがんを処置するのに十分な量で哺乳動物被験体に投与する工程を含む。がんを「処置する」は、有益な臨床結果（例えば、緩解を引き起こすこと、または、処置の非存在下において予想される生存時間と比べて生存時間を延長すること）を生じさせることを意味する。いくつかの実施形態において、がんを「処置する」は、腫瘍のサイズを縮小すること、または生存可能ながん細胞の数を減少させることを含む。他の実施形態において、がんを「処置する」は、腫瘍の成長を遅延させることを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本開示は、がんの処置を必要とする哺乳動物被験体におけるがんを処置する方法を提供し、その方法は、腫瘍内送達によって、有効量の、本開示の粒子を含む免疫原性組成物をその被験体に投与する工程を含む。
【０１４１】
いくつかの好ましい実施形態において、「がんを処置する」は、記載されているようなＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１）（例えば、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、２００９  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，４５：２２８−２４７を参照のこと）に従って、免疫原性組成物に対する患者の応答を評価することを含む。ＲＥＣＩＳＴに従って客観的な抗腫瘍応答を決定するための応答基準としては、完全奏効；部分奏効；進行性疾患；および安定疾患が挙げられる。
【実施例】
【０１４２】
省略形：Ａｂ（抗体）；Ａｇ（抗原）；Ａｌｕｍ（アルミニウム塩アジュバント、例えば、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ  Ａ／Ｓが販売するＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５）；Ａｌ（ＯＨ）３（水酸化アルミニウム）；ＡｌＰＯ４（リン酸アルミニウム）；ＢＭＤＣ（骨髄由来樹状細胞）；ＣＣ（キメラ化合物）；ＣｐＧ（非メチル化ＣＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはそのキメラ化合物）；ＣＴＡＧ１（がん／精巣抗原１）；ＣＴＲＬ（コントロール）；ＤＣ（樹状細胞）；ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）；ＥＣ５０（最大半量有効濃度）；ＦＡＣＳ（蛍光励起細胞分取）；ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）；Ｆｉｃ（高ＭＷの、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマー、例えば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅが販売するＦＩＣＯＬＬ（登録商標））；ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）；ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）；Ｈｙｐｂ（疎水性）；ＩＦＮ−γ（インターフェロン−ガンマ）；ＩＰＡ（イソプロパノール）；ＩＴ（腫瘍内）；ｍｃｇまたはμｇ（マイクログラム）；ＭＡＧＥＡ（メラノーマ抗原，ファミリーＡ）；ＭＷ（分子量）；ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）；ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＮＹＥＳＯ１（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ食道扁平上皮癌腫１）；Ｎｕ（核酸部分）；ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）；ＯＬＰ（重複長ペプチド）；ＯＶＡ（オボアルブミン）；ＰＡＤＲＥ（ＰＡｎ  ＨＬＡ  ＤＲ結合エピトープ）；ＰＢＭＣ（末梢血単核球）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＮ（ポリヌクレオチド）；ＳＣ（皮下）；ＳＣＣ（扁平上皮癌腫）；ＳＥＭ（平均値の標準誤差）；Ｓｐ（非核酸スペーサー部分）；ＴＦＦ（タンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）濾過）；ＴＩＬ（腫瘍浸潤白血球）；ＴＬＲ９（Ｔｏｌｌ様レセプター９）；ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−アルファ）；およびＷＴ（野生型）。
【０１４３】
本開示は、明確にする目的および理解させる目的で例証および例示としていくらか詳細に記載されてきたが、ある特定の変更および改変が行われ得ることが、当業者には明らかであろう。ゆえに、以下の合成実施例および生物学的実施例は、添付の請求項によって詳細に描写される本開示の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
実施例Ｓ１：ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物の構造
【０１４４】
表Ｓ１−１は、通常、本明細書中でＣｐＧまたはＣｐＧ−ＯＤＮと交換可能に称される、ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物の構造を示している。ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物におけるヌクレオチドは、２’−デオキシリボポリヌクレオチドである。ＨＥＧは、ヘキサエチレングリコールスペーサー部分であり、１８−Ｏ−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−（（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−イソプロピル））−ホスホルアミダイトを用いて組み込まれた。ヌクレオチド間の結合および核酸部分とスペーサー部分との間の結合のすべてが、ホスホロチオエートエステル結合である。
【表Ｓ１】
2019515900.tif 000009
【０１４５】
表Ｓ１−１は、これらの分子を分枝状のキャリア部分（例えば、［マレイミド−ＰＥＧｎ］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ）と共有結合的に連結して、分枝状のＣＣを作製するために使用される、末端の連結基（例えば、−（ＣＨ２）６−ＳＳ−（ＣＨ２）６−ＯＨ、−（ＣＨ２）６−ＳＨ）を有するＣＣ（例えば、Ｄ６１−０２、Ｄ６１−０３）も示している（実施例Ｓ９を参照のこと）。これらの連結基は、ホスホロチオエート結合によってスペーサー部分を介してポリヌクレオチドまたはＣＣに接続される。３’−Ｃ６−ジスルフィドリンカーは、１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド、１’−スクシニル−固体支持体を用いて組み込まれた。上記ポリヌクレオチドおよびキメラ化合物は、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＮｉｔｔｏ  Ｄｅｎｋｏ  Ａｖｅｃｉａ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって製造されたものであり、フリーズドライされた固体として受け取った。
実施例Ｓ２：ポリペプチド抗原の構造
【０１４６】
表Ｓ２−１は、本明細書中でポリペプチドまたはペプチドと交換可能に称されるポリペプチド抗原の１次構造を示している。これらのポリペプチドは、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）またはＣ  Ｓ  Ｂｉｏ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【表Ｓ２−１Ａ】
2019515900.tif 000010
【表Ｓ２−１Ｂ】
2019515900.tif 000011
【０１４７】
ＯＶＡｐｅｐ抗原は、オボアルブミン（ＯＶＡ）クラスＩエピトープ＋ペプチドの切り出しを容易にするためのＯＶＡ由来の７つのＮ末端アミノ酸（Ｃａｓｃｉｏら、２００１  ＥＭＢＯ  Ｊ，２０：２３５７−２３６６）、およびＯＶＡクラスＩＩエピトープ（Ｍａｅｃｋｅｒら、１９９８  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１：６５３２−６５３６）を含む。結合体化の目的で、そのＮ末端にシステイン残基を付加した。
【０１４８】
Ｔｒｉｐｌｅ抗原は、３つのクラスＩ拘束性メラノーマエピトープ（ｇｐ１００、Ｔｒｐ１およびＴｒｐ２）および人工の全クラスＩＩ  ＤＲ拘束性エピトープ（ＰＡＤＲＥ）を融合ポリペプチドとして、ならびにＰＥＧ２４基を含む。メラノーマエピトープ（ｇｐ１００、ｖａｎ  Ｓｔｉｐｄｏｎｋら、２００９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９：７７８４−７７９２；Ｔｒｐ１、Ｄｙａｌｌら、１９９８  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８８：１５５３−１５６１；およびＴｒｐ２、Ｌｉｕら、２００３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２６：３０１−３１２）および人工エピトープ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９９４  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：７５１−７６１）が、以前に報告されている。溶解性を高める目的で疎水性を低下させるために、ＰＥＧ２４基を、アミド結合を介してＮ末端に付着した。
【０１４９】
さらに、システインのチオール基を介した、マレイミドによって官能化された多糖への共有結合を可能にするために、Ｎ末端またはＣ末端に単一のシステイン残基を含むように上記ペプチドを改変した。上記ペプチドにおけるシステインは、アルミニウム塩錯体への非共有結合性の吸着のためにも存在してよいが、必要ない。
【０１５０】
表Ｓ２−２は、いくつかのＮｅｗ  Ｙｏｒｋ食道扁平上皮癌腫１（ＮＹ−ＥＳＯ−１またはＮＹＥＳＯ１）ポリペプチド抗原の１次構造を示している。ＮＹ−ＥＳＯ−１は、がん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１）としても知られる。表Ｓ２−２のいくつかの抗原は、ＣＴＡＧ１タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースアクセッション番号Ｐ７８３５８、配列番号６０として示される）の１つより多いエピトープのアミノ酸配列を含む重複長ペプチド（ＯＬＰ）抗原である。下記に列挙されるいくつかのＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原は、メラノーマワクチン候補のヒト臨床試験において使用された。ＣＴＡＧ１は、予後不良のメラノーマにおいて高度に発現され、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原は、抗原提示細胞による最小エピトープ配列の効率的なＭＨＣ提示を促進した（Ｓｌｉｎｇｌｕｆｆ，２０１１  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  １７：３４３；Ｔｓｕｊｉら、２０１３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １：３４０；Ｗａｄａら、２０１４  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７：８４；Ｓａｂｂａｔｉｎｉら、２０１２  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：６４９７を参照のこと）。
【０１５１】
配列番号５５〜５８のペプチド抗原を、固相ペプチド合成法を用いて化学的に合成し、次いで、公知の手法（Ｂｅｈｒｅｎｄｔら、２０１６  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ，２２：４を参照のこと）を用いて精製し、分析的に特徴づけた。配列番号５５〜５８のペプチド抗原は、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）またはＣ  Ｓ  Ｂｉｏ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。配列番号５９の９４アミノ酸ポリペプチドを、従来の組換え哺乳動物発現法を用いて発現させ、次いで、公知の手法（Ｆｉｓｃｈｅｒら、２０１５  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ，３３：１８７８を参照のこと）を用いて精製し、分析的に特徴づけた。
【表Ｓ２−２】
2019515900.tif 000012
【０１５２】
表Ｓ２−３は、いくつかのメラノーマ抗原ファミリーＡタンパク質（ＭＡＧＥＡ）の１次構造、ならびに対応するＭＡＧＥＡタンパク質由来の１つまたはそれを超える最小の９アミノ酸エピトープを含むいくつかのポリペプチドのアミノ酸配列を示している。これらのＭＡＧＥＡタンパク質は、非悪性組織において低発現であること、ならびに皮膚扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、食道ＳＣＣ、頭頸部ＳＣＣ、子宮頸部／肛門ＳＣＣ、肺ＳＣＣ、腺癌、膀胱尿路上皮癌腫、卵巣癌腫、子宮内膜癌腫、肺小細胞癌腫、粘液性乳癌腫、肝細胞癌腫、胸腺癌腫および中皮腫をはじめとした様々な腫瘍において高レベルで発現されることに起因して、免疫療法の有望な標的である（例えば、Ｋｅｒｋａｒら、２０１６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３９：１８１；Ｐａｒｋら、２０１６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３９：１を参照のこと）。ＭＡＧＥＡ３およびＭＡＧＥＡ１０を含むいくつかのＭＡＧＥＡタンパク質が、メラノーマワクチン候補のヒト臨床試験において抗原として使用された（例えば、Ｖａｎｓｔｅｅｎｋｉｓｔｅら、２０１６  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １６：８２２；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ  ＮＣＴ０２９８９０６４を参照のこと）。配列番号６１〜７１の完全長ＭＡＧＥＡタンパク質を、従来の組換え哺乳動物発現法を用いて発現させ、次いで、公知の手法（Ｆｉｓｃｈｅｒら、２０１５  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ，３３：１８７８を参照のこと）を用いて精製し、特徴づける。表Ｓ２−３に示されている完全長タンパク質（配列番号６７〜７１）の約９アミノ酸〜約６０アミノ酸の範囲のペプチド抗原（例えば、配列番号４６〜５０）は、本開示の組成物および方法においてペプチド抗原として使用するのに適している。それらのペプチド抗原を、固相ペプチド合成法を用いて化学的に合成し、次いで、公知の手法（Ｂｅｈｒｅｎｄｔら、２０１６  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ，２２：４を参照のこと）を用いて精製し、特徴づける。
【表Ｓ２−３Ａ】
2019515900.tif 000013
【表Ｓ２−３Ｂ】
2019515900.tif 000014
実施例Ｓ３：ＣｐＧ−ＯＤＮを水酸化アルミニウムに吸着させるための手順
【０１５３】
ワクチン用のアジュバントとして使用されるアルミニウム塩には、主要なタイプが２つある：水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）３］およびリン酸アルミニウム［ＡｌＰＯ４］（Ｌｉｎｄｂｌａｄら、２００４  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８２：４９７−５０５）。ワクチンの生成において通常のｐＨであるｐＨ６〜８では、水酸化アルミニウムは、正電荷を有するので、負に帯電したＣｐＧ−ＯＤＮならびに負に帯電したタンパク質およびペプチド（抗原）に対して静電引力を有する。逆に、リン酸アルミニウムは、ｐＨ６〜８において負電荷を有するので、負に帯電したＣｐＧ−ＯＤＮの吸着には適していない。
【０１５４】
水酸化アルミニウム、詳細には、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ  Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）がＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５として販売し、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ（Ｄｅｎｍａｒｋ）が製造し、Ｓｅｒｇｅａｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入される水酸化アルミニウム製剤を、すべての結合研究において使用した。ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５は、およそ１０±１ｍｇ／ｍｌというアルミニウム濃度で、精製水における懸濁液として供給され、実施例で述べられる量は、そのアルミニウムの含有量に基づく。ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５は、医薬品に対するＥＵ  ＧＭＰ  Ｐａｒｔ  Ｉに従って製造され、ヒトでの使用に適している。好ましい実施形態では、水酸化アルミニウム塩およびアルミニウム陽イオンへの哺乳動物被験体の曝露を最小限にするために、ＣｐＧおよび抗原と水酸化アルミニウムとの高ローディング比が用いられる。
【０１５５】
Ｆｌｏｗ  Ｃａｍ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｌａｂ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を用いたＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５水酸化アルミニウム製剤の解析は、粒子の大部分が、１ミクロン（μｍ）未満のサイズであり、０．８５μｍの平均直径および０．５μｍ〜２４μｍの範囲の粒子サイズ分布であることを示した。Ｆｌｏｗ  Ｃａｍ解析は、５０μｍの毛細管および２０×対物レンズを使用し、そのシステムは、２０μｍラテックスビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）で較正された。
【０１５６】
動的光散乱解析（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−Ｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、Ｄ６１−０４ポリヌクレオチドならびにＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原をＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５  ２％水酸化アルミニウム粒子に、ある範囲の質量比（実験Ｓ５−６を参照のこと）で共吸着した一連のワクチン構築物、ならびにＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５  ２％水酸化アルミニウム粒子のみで行った。ワクチンまたは水酸化アルミニウム粒子を１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で希釈することによって、各サンプルのスラリーを形成した。表Ｓ３−０は、集団分布曲線の幾何平均における粒子直径は、水酸化アルミニウム粒子の場合、１．３μｍであり、ワクチンの場合、ポリヌクレオチドと抗原とが共吸着した後の、予想されるより大きい質量と一致する１．７〜２．０μｍの範囲内であることを示している。このデータは、各１０回の測定を行う独立した５回のランから得られた平均である。改変されていない水酸化アルミニウム粒子の多分散指数は、中程度レベルの多分散性と一致する０．２であった。ワクチン粒子の多分散指数は、より分散した粒径を示唆する０．３９〜０．４６の範囲内であった。動的光散乱装置は、３μｍのポリスチレンジビニルベンゼンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で較正した。
【０１５７】
ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）８５を例示的な方法において使用したが、本開示は、決してこの商標の水酸化アルミニウムアジュバントの使用に限定されない。他の商標およびノーブランドの水酸化アルミニウムアジュバントも、本明細書中に記載される方法および組成物における使用に適しているので、この製剤は、本明細書中で「ａｌｕｍ」、「水酸化アルミニウム懸濁液」または「水酸化アルミニウム粒子」と広く称される。
【表Ｓ３】
2019515900.tif 000015
【０１５８】
ＣｐＧ−ＯＤＮと混合する前に、水酸化アルミニウム懸濁液を、室温（２０〜２５℃）における回転混合（約１００〜１５０ｒｐｍ）によって、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．０（平衡化緩衝液）で平衡化した。平衡化中の水酸化アルミニウム懸濁液（すなわち、１０±１ｍｇ／ｍｌというアルミニウムの含有量）と緩衝液との最小比は、１０ｍｌの平衡化緩衝液に対するおよそ１ｍｌの水酸化アルミニウム懸濁液であり、１０〜１５分間またはそれより長い時間（最大１〜２４時間）にわたって生じた。平衡化された水酸化アルミニウムを、遠心分離（スイングバケットローターが取り付けられた卓上遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ）を用いた２０〜２５℃での１５分間の約３２００ｒｐｍ）によってペレットにし、溶液をデカントし、貯蔵または結合実験での使用に向けて、水酸化アルミニウム錯体を湿潤ゲルペレットとして放置した。ほとんどの結合実験において、使用した水酸化アルミニウムの量は、１ｍｇ、５ｍｇまたは１０ｍｇのアルミニウムと等価な０．１ｍｌ、０．５ｍｌ、１．０ｍｌであり、それに様々な量のＣｐＧ−ＯＤＮが加えられた。
【０１５９】
固体の形態のＣｐＧ−ＯＤＮを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）緩衝液、ｐＨ７．０（これらの実施例における水酸化アルミニウムへの結合にとって好ましい緩衝液）に、約２〜５ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）という名目上の濃度で溶解した。固体のＣｐＧ−ＯＤＮは、かなりの量の会合した水を含むので、その溶液のＣｐＧ−ＯＤＮ濃度（ｍｇ／ｍＬ）は、各ＣｐＧ−ＯＤＮに対して、Ｂｅｅｒ法および２６０ｎｍにおける消衰係数を用いるＵＶ分光法によって決定された：Ｄ６１−０１の場合、２４．８４ｍｇ／ｍｌ−１ｃｍ−１；Ｄ６１−０２の場合、２２．６５ｍｇ／ｍｌ−１ｃｍ−１およびＤ６１−０４の場合、３０．０２ｍｇ／ｍｌ−１ｃｍ−１。規定量のＣｐＧ−ＯＤＮを、規定量の予め平衡化された水酸化アルミニウム（表Ｓ３−１および表Ｓ３−２）に加え、次いで、通常、さらなる緩衝液を加えることにより、アルミニウムの含有量に基づく約１ｍｇ／ｍＬという最終濃度を達成し（約０．７５〜２ｍｇ／ｍＬという濃度も許容され得ると示されたが）、得られた混合物を２０〜２５℃において約１００〜１５０ｒｐｍで約２時間、回転混合した。混合後、サンプルを、上に記載されたように遠心分離して、水酸化アルミニウムをペレットにした。この洗浄／遠心分離プロセスを、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液を用いてさらに２回繰り返し、上清をＵＶ分光光度法（実施例Ｓ４を参照のこと）によって解析して、ＣｐＧ−ＯＤＮ結合を評価した。水酸化アルミニウムに吸着されたＣｐＧを、最後の洗浄の後、湿ったペレットとして２〜８℃で貯蔵した。
実験Ｓ３−１：１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液における水酸化アルミニウムへのＤ６１−０１の結合
【０１６０】
Ｄ６１−０１を、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液において、一連のローディング（アルミニウムの含有量に基づいて１．０ｍｇの水酸化アルミニウムにつき、０．２ｍｇ〜０．９ｍｇのＤ６１−０１の投入量）にわたって３つの異なるスケール（１０ｍｇ、２０ｍｇおよび１００ｍｇのアルミニウム）で、上に記載されたように水酸化アルミニウムに吸着した（表Ｓ３−１）。これらのデータは、Ｄ６１−０１と水酸化アルミニウムとの非共有結合性の吸着が、生理学的塩濃度とほぼ等価な１５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でさえ、すべての条件に対して高効率（＞７１〜１００％）で成功したことを示している。
【表Ｓ３−１】
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実験Ｓ３−２：１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液における水酸化アルミニウムへのＤ６１−０１およびＤ６１−０４の結合能および結合効率の比較
【０１６１】
水酸化アルミニウムに対する２つの異なるＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｄ６１−０１およびＤ６１−０４）の結合能および結合効率を、上に記載されたような１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０において各ＣｐＧ−ＯＤＮの量を増加させながら（０．２５、０．５、１．０および１．５ｍｇ）、固定された量の水酸化アルミニウム（アルミニウムの含有量に基づいて１．０ｍｇ）と独立して混合することによって、比較した。Ｄ６１−０１とＤ６１−０４との両方に対して０．２５ｍｇ、０．５ｍｇおよび１ｍｇの投入量の場合、結合反応体積は、１．０ｍｌであった。Ｄ６１−０１に対する１．５ｍｇの投入条件の場合、結合反応体積は、１．１ｍｌであった。Ｄ６１−０４に対する１．５ｍｇの投入条件の場合、結合反応体積は、１．２ｍｌであった。これらの２つのＣｐＧ−ＯＤＮは、有意に異なる一次構造および二次構造を有するので、水酸化アルミニウムに対して異なる結合能を有すると考えられた。Ｄ６１−０１は、ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）スペーサーによって分断された核酸七量体を含むキメラ化合物（ＣＣ）であり、溶液中では一本鎖である。対照的に、Ｄ６１−０４は、長いパリンドローム配列を含むポリヌクレオチドであり、溶液中では主に二本鎖である。これらの条件下において、１ｍｇの水酸化アルミニウムは、１．０ｍｇおよび１．１ｍｇという最大量のそれぞれＤ６１−０１およびＤ６１−０４に結合すると示された（表Ｓ３−２）。これらのデータは、ＣｐＧ−ＯＤＮを水酸化アルミニウムに結合させるための一般的な方法が、異なる二次構造（一本鎖または二本鎖）を有する複数のタイプのＣｐＧ−ＯＤＮ配列（ポリヌクレオチドまたはキメラ化合物）に適用できることを示している。両方のタイプのＣｐＧ−ＯＤＮに対する結合能は、１ｍｇの水酸化アルミニウムにつき約１ｍｇのＣｐＧ−ＯＤＮにおいて似ており、その結合能に到達するまで、結合効率は、ほぼ１００％である。
【表Ｓ３−２】
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実施例Ｓ４：水酸化アルミニウムに吸着されたＣｐＧ−ＯＤＮおよびＣｐＧ−ＯＤＮ：水酸化アルミニウム比（ｗ／ｗ）を定量する手順
【０１６２】
水酸化アルミニウムに吸着されたＣｐＧ−ＯＤＮの比（結合効率％）を、方程式１および方程式２を用いて２６０ｎｍにおけるＵＶ吸光度（Ａ２６０）によって定量した。サンプルを、ＵＶ検出器の線形の範囲内に入るように、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７で希釈し、同じ緩衝液で分光光度計をブランク計測した。Ａ２６０投入およびＡ２６０上清を、Ａ２６０実測値と、希釈係数および希釈前の体積との乗法によって決定し、次いで、それを方程式１において使用した。ＣｐＧ−ＯＤＮと水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）３］との重量／重量（ｗ／ｗ）比を、方程式２を用いて計算した。
【数１】
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【数２】
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実験Ｓ４−１：水酸化アルミニウム粒子への様々な質量のＤ６１−０４の結合に対する緩衝液のｐＨの影響
【０１６３】
水酸化アルミニウム粒子への様々な質量のＤ６１−０４ポリヌクレオチドの結合に対する６．５〜７．５の緩衝液のｐＨの影響を評価した。３つの原液を、ｐＨ６．５、７．０または７．５である１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液において、５ｍｇ／ｍＬのＤ６１−０４ポリヌクレオチドで生成した。正確な濃度を、実施例Ｓ４に記載されたＵＶ吸光度法によって決定した。次いで、これらの原液を、必要に応じて、対応する緩衝液でさらに希釈して、適切な濃度の一連のＤ６１−０４ポリヌクレオチド使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を得た。次いで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、７．０または７．５中に１．０、１．５または２．０ｍｇのＤ６１−０４ポリヌクレオチド、および１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５、７．０または７．５中に１．０ｍｇの水酸化アルミニウム粒子を含む溶液を含む一連の１：１（ｖ／ｖ）スラリーを、回転混合機において約１５ｒｐｍで約３時間、２０〜２５℃において混合した。未結合のＤ６１−０４ポリヌクレオチドを、実験Ｓ５−３に記載されているような遠心分離によって水酸化アルミニウム粒子から分離した。この洗浄／遠心分離プロセスを、結合に使用された同じ緩衝液を用いてさらに２回繰り返し、プールされた上清を、ＵＶ吸光度法によって、未結合のＤ６１−０４ポリヌクレオチドについて解析した。Ａｌ（ＯＨ）３粒子に結合した、投入されたＤ６１−０４ポリヌクレオチドのパーセントは、Ａｌ（ＯＨ）３とともにインキュベートされたＤ６１−０４ポリヌクレオチドの１：１比において最大であった。この結合パーセントは、１．５：１比において約１５％低下し、２：１比においてさらに１０〜１５％低下した。これらの影響は、試験された範囲にわたってｐＨと無関係であった（表Ｓ４−１）。
【表Ｓ４−１】
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実施例Ｓ５：ペプチド抗原を水酸化アルミニウムに吸着させるための手順
【０１６４】
ＣｐＧ−ＯＤＮとは異なり、目的の多くのペプチド抗原は、高度に疎水性であり、Ａｌｕｍへの結合に通常使用される水性緩衝液に、有用な濃度では不溶性である。水酸化アルミニウムへの結合の最初の研究において、疎水性のレベルが異なる２つのペプチドを用いた：約３８％の疎水性を有するＯＶＡｐｅｐおよび約６０％の疎水性を有するＴｒｉｐｌｅメラノーマ（Ｔｒｉｐｌｅ）（表Ｓ２−１）。ＯＶＡｐｅｐは、水酸化アルミニウムへの吸着に好適な緩衝液である０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８緩衝液において約２〜４ｍｇ／ｍｌで可溶性であると見出されたが、水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液にはかなり可溶性ではなかった。対照的に、Ｔｒｉｐｌｅペプチドは、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８緩衝液、水、ＰＢＳ、炭酸水素ナトリウムまたはＮａＯＡｃ緩衝液においてかなり可溶性でなかった。Ｔｒｉｐｌｅペプチドは、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）／ｐＨ８．５または２０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／水（ｖ／ｖ）において約１〜５ｍｇ／ｍｌで可溶性であった。しかしながら、６Ｍ  ＧｕＨＣｌは、高イオン強度であることに起因して、水酸化アルミニウムへのペプチドの静電吸着にとって好適な溶液ではなく、水酸化アルミニウムへのペプチド結合に対するＩＰＡの効果は不明であった。
【０１６５】
水酸化アルミニウムを、実施例Ｓ３に記載されたように１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液中に平衡化した。固体ペプチドを、示される溶液に約２〜４ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）という名目上の濃度で溶解した。規定量のペプチドを、規定量の予め平衡化された水酸化アルミニウム（表Ｓ５−１および表Ｓ５−２）に加え、次いで、通常、同じ溶液をさらに加えることにより、アルミニウムの含有量に基づく約１ｍｇ／ｍＬという最終濃度を達成し、得られた混合物を２０〜２５℃において約１００〜１５０ｒｐｍで約２〜１８時間、回転混合した。混合後、サンプルを、上に記載されたように遠心分離して、水酸化アルミニウムをペレットにした。この洗浄／遠心分離プロセスを、結合に使用された同じ溶液を用いてさらに２回繰り返し、上清をＵＶ分光光度法および／またはアミノ酸分析によって解析して、ペプチドの結合を評価した（実施例Ｓ６を参照のこと）。水酸化アルミニウムに吸着されたペプチドを、最後の洗浄の後、湿ったゲルペレットとして２〜８℃で貯蔵した。
実験Ｓ５−１：０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０緩衝液における水酸化アルミニウムへのＯＶＡｐｅｐの結合
【０１６６】
ＯＶＡｐｅｐを、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０緩衝液において、２つのローディング（アルミニウムの含有量に基づいて水酸化アルミニウム１．０ｍｇあたり０．９８ｍｇおよび０．４４ｍｇの投入量）において２つの異なるスケール（水酸化アルミニウムにおける１０ｍｇおよび５０ｍｇのアルミニウム）で水酸化アルミニウム（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０中に平衡化した）に吸着させた（表Ｓ５−１）。これらのデータは、水酸化アルミニウムへのＯＶＡｐｅｐの非共有結合性の吸着の成功を示している。これらの条件下において、最大の結合能は、アルミニウムの含有量に基づいて水酸化アルミニウム１．０ｍｇあたり０．３ｍｇのＯＶＡｐｅｐであった。
【表Ｓ５−１】
2019515900.tif 000021
実験Ｓ５−２：イソプロピルアルコール／水における水酸化アルミニウムへのＴｒｉｐｌｅメラノーマ（Ｔｒｉｐｌｅ）ペプチドの結合
【０１６７】
Ｔｒｉｐｌｅペプチドを、アルミニウムの含有量に基づいて水酸化アルミニウム１．０ｍｇあたり０．８０ｍｇの投入量というローディングにおいて１０ｍｇスケールで水酸化アルミニウム（ＮａＯＡｃ緩衝液中に平衡化された）に吸着させた（表Ｓ５−２）。２０％ＩＰＡ／水（ｖ／ｖ）に溶解されたＴｒｉｐｌｅペプチドを、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液中の水酸化アルミニウムと１：１（ｖ／ｖ）混合し、５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液中の１０％ＩＰＡ（ｖ／ｖ）という最終組成を得た。これらのデータは、水酸化アルミニウムへのＴｒｉｐｌｅペプチドの非共有結合性の吸着の成功を示している。これらの条件下において、そのペプチドは、１００％の結合効率で水酸化アルミニウムに吸着した。
【表Ｓ５−２】
2019515900.tif 000022
実験Ｓ５−３：様々な質量の水酸化アルミニウム粒子に対する一定質量のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＯＬＰ抗原の結合
【０１６８】
固定された量のＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原の吸着に対する水酸化アルミニウムの質量を変化させることの影響を評価して、特定の量のＯＬＰ抗原を効率的に共吸着させるのに必要な最小質量の水酸化アルミニウム粒子を決定した。ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原を２０％イソプロパノール（ＩＰＡ）／水（ｖ／ｖ）に約１ｍｇ／ｍｌで溶解し、正確な濃度をアミノ酸分析によって決定した。次いで、適切な濃度の一連の使用溶液が得られるように、必要に応じて、この原液をさらに２０％（ｖ／ｖ）ＩＰＡ／水で希釈した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に０．２ｍｇの全ＯＬＰ抗原（０．１ｍｇの各ＯＬＰ抗原）および１．０、０．８、０．６、０．４または０．２ｍｇの水酸化アルミニウム粒子を含む１：１（ｖ／ｖ）溶液を混合して、１０％ＩＰＡ（ｖ／ｖ）を含む５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液という最終的な緩衝液組成物を得た。得られたスラリーを、２０〜２５℃において約１５ｒｐｍで約３時間、回転混合し、水酸化アルミニウムに結合したＯＬＰ抗原を、スイングバケットローターが取り付けられたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心機を用いて、２０〜２５℃、約３２００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によって未結合のペプチドから分離した。この洗浄／遠心分離プロセスを、結合に使用された同じ緩衝液を用いてさらに２回繰り返し、プールされた上清を、アミノ酸分析によってＯＬＰ抗原含有量について解析して、全体的なＯＬＰ抗原の結合を評価した（実施例Ｓ６を参照のこと）。これらの条件下において、０．２ｍｇのＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原は、１．０ｍｇ、０．８または０．６ｍｇの水酸化アルミニウム粒子を用いたときの条件下において、＞８５％結合という匹敵するレベルで結合した（表Ｓ５−３）。しかしながら、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原の結合は、０．４および０．２ｍｇの水酸化アルミニウム粒子を用いた条件では７３％に低下した。
【表Ｓ５−３】
2019515900.tif 000023
実験Ｓ５−４：２つの質量の水酸化アルミニウム粒子に対するＮＹ−ＥＳＯ−１  ＯＬＰ抗原の質量を増加させたときの結合
【０１６９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原の質量を増加させたときの水酸化アルミニウム粒子への吸着に対する影響を評価して、共吸着され得る抗原の最大質量を決定した。ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原を２０％ＩＰＡ／水（ｖ／ｖ）に約１ｍｇ／ｍｌで溶解し、正確な濃度をアミノ酸分析によって決定した。次いで、適切な濃度の一連の使用溶液が得られるように、必要に応じて、この原液をさらに２０％（ｖ／ｖ）ＩＰＡ／水で希釈した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に０．４、０．５および０．６ｍｇの全ＯＬＰ抗原（０．２、０．２５および０．３ｍｇの各ＯＬＰ抗原）ならびに０．５および１．０ｍｇの水酸化アルミニウム粒子を含む１：１（ｖ／ｖ）溶液を混合して、１０％ＩＰＡ（ｖ／ｖ）を含む５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液という最終的な緩衝液組成物を得た。得られたスラリーを、２０〜２５℃において約１５ｒｐｍで約３時間、回転混合し、次いで、水酸化アルミニウムに結合したＯＬＰ抗原を、実験Ｓ５−３に記載されたような遠心分離によって未結合のペプチドから分離した。この洗浄／遠心分離プロセスを、結合に使用された同じ緩衝液を用いてさらに２回繰り返し、プールされた上清を、アミノ酸分析によってＯＬＰ抗原含有量について解析して、全体的なＯＬＰ抗原の結合を評価した（実施例Ｓ６を参照のこと）。これらの条件下において、プールされたＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰの質量を増加させたとき、それらは、匹敵する約８５％の結合効率で０．５または１．０ｍｇの水酸化アルミニウム粒子に結合した（表Ｓ５−４）。
【表Ｓ５−４】
2019515900.tif 000024
実験Ｓ５−５（パート１）．水酸化アルミニウム粒子に対する等モル量の３つの異なるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原の結合
【０１７０】
等モル量の３つの異なるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８、ＮＹ−ＥＳＯ−１１２１−１５０およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３（それぞれ配列番号５５、５７および５８）を合わせることの、０．５ｍｇの水酸化アルミニウム粒子（元素アルミニウムとして表現される質量）への吸着に対する影響を評価して、それら３つのペプチドの各々の共吸着の効率を決定した。個々のペプチド抗原を、約１ｍｇ／ｍＬで２０％イソプロパノール（ＩＰＡ）／８０％水（ｖ／ｖ）に溶解し、次いで、その混合物の正確な濃度をアミノ酸分析によって決定した。この実施例の場合、規定量の各ペプチド溶液を混合して、ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原を基準として１．３４μｍｏｌの各ペプチドを達成した。それら３つのペプチドのこの混合物をサンプリングし、抗原の総濃度をアミノ酸分析によって決定した。およそ１２．６ｍｇ（投入量）の全ペプチド抗原（約４．０ｍｇの各ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原）を含む２０％ＩＰＡ／８０％水（ｖ／ｖ）を、１０ｍｇの水酸化アルミニウムを含む１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液と１：１混合して、１０％ＩＰＡ（ｖ／ｖ）を含む５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液という最終緩衝液組成物を得た。この溶液を、室温において約３時間、回転式スピナーを１５ｒｐｍで用いて混合して、水酸化アルミニウム粒子へのペプチドの吸着を可能にした。３時間後、水酸化アルミニウムに結合した抗原を、スイングバケットローターが取り付けられたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心機を用いた２０〜２５℃、約３２００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によって、吸着されていない抗原から分離した。未結合の抗原画分を含む上清をデカントし、アミノ酸分析に供した。水酸化アルミニウムに結合した抗原の湿潤ゲルペレットを、２０ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液で再構成し、短時間（１〜５分間）混合し、前述のように遠心分離し、上清をデカントし（洗浄）、アミノ酸分析に供した。最後に、抗原が結合した洗浄された水酸化アルミニウムもアミノ酸分析に供した。これらの条件下において、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８、ＮＹ−ＥＳＯ−１１２１−１５０およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原の混合物は、間接的（アミノ酸分析によって未結合画分および洗浄画分において観察された抗原の量から、投入された抗原の量を減算することによって）と直接的（水酸化アルミニウム粒子に結合した抗原のアミノ酸分析によって）の両方によって決定されたとき、９５〜９７％という効率で水酸化アルミニウム粒子に結合した（表Ｓ５−５ａ）。
【表Ｓ５−５ａ】
2019515900.tif 000025
実験Ｓ５−５（パート２）．水酸化アルミニウムに結合した固定された量のＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原に対する異なる量のＣｐＧ（Ｄ６１−０４）の共吸着
【０１７１】
３つの異なる質量のＤ６１−０４（配列番号６）を、固定された質量の、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原が結合した水酸化アルミニウム粒子に加えたときの影響（Ｓ５−５、パート１に記載されている）を評価して、ペプチド抗原が結合した水酸化アルミニウム粒子に対するＤ−６１−０４の結合能を決定した。４、２および１ｍｇ／ｍｌのＤ６１−０４溶液を、濃縮原液から１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７緩衝液で希釈することによって調製した。次に、０．５ｍｌの各Ｄ６１−０４溶液を、１ｍｇの水酸化アルミニウムにつき約１．２ｍｇの結合した全ペプチド抗原（約０．４ｍｇの各抗原）を含む、ペプチド抗原が結合した水酸化アルミニウムのスラリーと１：１（ｖ／ｖ）混合した。次いで、これらの３つの実験溶液（各約１．０ｍｌ）を、室温において約３時間、回転式スピナーを１５ｒｐｍで用いて混合して、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原が結合した水酸化アルミニウム粒子に対するＤ６１−０４の共吸着を促進した。未結合のＤ６１−０４を、スイングバケットローターが取り付けられたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心機を用いる、２０〜２５℃、約３２００ｒｐｍでの１５分間の遠心分離によって分離した。Ｄ６１−０４の未結合画分をＵＶ分光法によって解析し、水酸化アルミニウムに結合したＤ６１−０４の量を、投入した量から未結合の量を減算することによって推定した。次に、Ｄ６１−０４／ペプチド抗原に結合した水酸化アルミニウム粒子を、１０ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７緩衝液で再構成し、１〜５分間混合し、上記のように遠心分離して、未結合のＤ６１−０４および抗原を分離した（競合するホスフェート配位子交換の機序に起因して、Ｄ６１−０４によって置換されると考えられる）。未結合画分および洗浄画分を各々、ＵＶ分光法によって解析して、未結合のＤ６１−０４の総量を決定した。水酸化アルミニウムに結合した抗原に共吸着されたＤ６１−０４の量を、投入したＤ６１−０４と未結合のＤ６１−０４（未結合画分＋洗浄画分）との間の差として推定した。これらの条件下において、Ｄ６１−０４の結合能は、３つの異なる共吸着混合物に対して、抗原が結合した１ｍｇの水酸化アルミニウム粒子につき、それぞれ１．８、１．３および１．０ｍｇのＤ６１−０４であった（表Ｓ５−５ｂ）。これらの関連する粒子における様々な構成要素に対する最終的な量（ｍｇ）および結合比は、それらの抗原が、過剰なＤ６１−０４によって置換されなかったことを示唆している（すなわち、結合した抗原の量は、０．５ｍｇの水酸化アルミニウム粒子につき、およそ０．６ｍｇという全抗原で一定に保たれていた）。
【表Ｓ５−５ｂ】
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実験Ｓ５−６．水酸化アルミニウム粒子に対する、等モル量の２つのＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原＋ＭＡＧＥ  Ａ１０ペプチド抗原およびＤ６１−０４  ＣｐＧ（Ｄ６４−０１）の結合
【０１７２】
Ｓ５−５のパート１と同様の実験において、ＮＹ−ＥＳＯ−１１２１−１５０ペプチド抗原をＭＡＧＥ  Ａ１０２４５−２７４ペプチド抗原で置き換えた。その他の点では、このセットの３つの抗原を水酸化アルミニウム粒子に共吸着させるための他のすべての実験条件が同じであった。このこの実験のパート１において、約１４ｍｇの総抗原投入量に相当する、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８、ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３およびＭＡＧＥ  Ａ１０２４５−２７４ペプチド抗原（配列番号５５、５８および５０）を合わせたものは、アミノ酸分析によって決定されたとき、９３％という全結合効率で水酸化アルミニウム粒子に結合した（表Ｓ５−６ａ）。
【表Ｓ５−６ａ】
2019515900.tif 000027
この実験のパート２では、４、８および１２ｍｇ／ｍＬのＤ６１−０４  ＣｐＧを、３つの別個の共吸着反応物に加えて、ＣｐＧの結合、および水酸化アルミニウム粒子に結合したペプチド抗原をＤ６１−０４が置換する潜在能力（水酸化アルミニウム粒子に対する理論上の結合能を上回って）を評価した。他の実験条件は、Ｓ５−５、パート２に記載されたとおりであった。これらの条件下において、０．８、１．１および１．７ｍｇのＤ６１−０４を、水酸化アルミニウム粒子に結合したペプチド抗原に吸着させた（表Ｓ５−６ｂ）。さらに、未結合画分および洗浄画分をアミノ酸分析によってペプチド抗原の存在についてアッセイすることによって評価したとき、過剰なＤ６１−０４を加えても、水酸化アルミニウム粒子に結合した抗原の置換は、ほとんどまたはまったく生じなかった。
【表Ｓ５−６ｂ】
2019515900.tif 000028
実験Ｓ５−７：ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原は、オートクレーブによる最終的な滅菌の後、水酸化アルミニウム粒子に共吸着されたままである
【０１７３】
ＣｐＧ−Ａｌｕｍ−ペプチド結合体の製造スキームが、図９に提供されている。水酸化アルミニウム粒子（０．５〜３μｍの直径サイズ範囲）に共吸着されたタンパク質ベースの抗原から構成されるアルミニウム薬物製品は、製造における最後の処理工程（最終的な滅菌）として、０．２ミクロン（μｍ）濾過によって滅菌することができない。したがって、より煩雑な無菌的処理アプローチが必要である。ワクチンにおいて使用される水酸化アルミニウム粒子は、最後にオートクレーブによって滅菌されるので、オートクレーブによる最終的な滅菌の後に約２５〜３５アミノ酸長のペプチド抗原がその粒子に共吸着されたままであり得るか否かを評価した。実験Ｓ５−５パート１に記載されたように製造された、水酸化アルミニウム粒子に共吸着された３つのＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原のスラリー（ｌｏｔ＃ＢＭ−０１２５１７）を、１２１℃の高圧飽和水蒸気に１５〜２０分間曝露した（オートクレーブ）。動的光散乱によって評価されたそれらの粒子のサイズ分布および多分散指数は、オートクレーブの前後で同様であった。スラリー中の水酸化アルミニウム粒子を、オートクレーブの前および後に遠心分離によって除去し、その上清のペプチド抗原含有量を、２１５ｎｍにおいて吸光度検出を行う逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣと、２１５ｎｍにおける直接的な分光光度的計測との両方によって定量した。直接的な分光光度的解析は、ペプチド抗原の＜１％が、オートクレーブの後に水酸化アルミニウム粒子から解離したことを示唆した（表Ｓ５−７）。上記３つのペプチド抗原は、ユニークな保持時間を有するので、ＲＰ−ＨＰＬＣ解析は、上清中のそれらの３つのペプチド抗原の各々の量を評価する。この解析は、各ペプチドに対するピーク積分値が、このアッセイの定量下限（＞１０μｇ／ｍｌ）以下であったことを実証したことから、個別のペプチド抗原の各々の投入量の＜５％がオートクレーブによって脱着したことが示唆された。両方の方法が、水酸化アルミニウム粒子に共吸着されたＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原の、従来のオートクレーブ法を用いた最終的な滅菌が、粒径／サイズ分布を変化させず、かつ上記３つのＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド抗原を有意に脱着しないことを示唆する。
【表Ｓ５−７】
2019515900.tif 000029
実験Ｓ５−８．ヒトペプチド抗原の可溶化に対する、選択された有機溶媒の評価
【０１７４】
およそ１ｍｇの４つの異なるペプチド抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８、ＮＹ−ＥＳＯ−１１２１−１５０、ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３およびＭＡＧＥ  Ａ１０２４５−２７４を、別々に量り取り、ホウケイ酸ガラス試験管に入れた。ペプチド抗原の溶解度を、１ｍｌの６つの異なる有機溶媒、２０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／８０％水（ｖ／ｖ）、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、２０％ＤＭＳＯ／８０％水（ｖ／ｖ）、１００％ジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｆｏｒｍａｍｉｄｅ）（ＤＭＦ）、２０％ＤＭＦ／８０％水（ｖ／ｖ）および１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）を加えることによって評価した。溶媒を４つの抗原の各々に加えた後、それらを、室温での断続的なボルテックスによって３〜５秒間混合し、次いで、１〜２分以内に視覚的透明度について評価した。１００％および２０％ＤＭＳＯならびに２０％ＤＭＦの溶媒は、４つすべての抗原を容易に可溶化し、視覚的に透明な溶液をもたらした（表Ｓ５−８）。１００％ＤＭＦおよび２０％ＩＰＡ溶媒は、わずかに濁った溶液、またはいくつかの目に見える粒子もしくはフレーク材料を含む溶液をもたらした。１００％アセトニトリル溶媒は、４つのヒト腫瘍関連抗原のいずれも完全に可溶化せず、溶媒を加える前と質量が匹敵する溶解しなかった材料の視覚的に観察可能なフレークが残った。これらの溶解度の観察結果は、室温においてさらに１時間または２４時間静置した後も変化しなかった。
【表Ｓ５−８】
2019515900.tif 000030
実験Ｓ５−９．ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原の可溶化および水酸化アルミニウム粒子への結合を評価するための、選択されたクラス２および３溶媒の評価
【０１７５】
クラス３溶媒は、米国食品医薬品局および他の規制当局によって、それらの公知の安全性プロファイルに従って分類されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｑ３Ｃ−Ｔａｂｌｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｓｔ［Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１２，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ２］）。それらの毒性プロファイルに基づくと、クラス３溶媒は、ＧＭＰ条件下で製造されたヒト薬物製品において、５０００ｐｐｍ［０．５％ｗ／ｗ］以下という許容できる不純物限界を有する。１０個の水混和性クラス３溶媒を、ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原を効率的に可溶化する能力について（視覚的評価を用いる。表Ｓ５−９の脚注＊を参照のこと）および可溶化されたペプチド抗原がその後、水酸化アルミニウム粒子に吸着する能力について調査した。ギ酸、エタノール、アセトンおよび酢酸（各々１００％）は、ほぼすぐに視覚的に透明な溶液を示したので、それらを「１」とスコア付けした。イソプロピルアルコールおよび２−ブタノール（各々１００％）も、ほんのわずかな不溶性フレークが観察されただけで、ペプチド抗原の溶解に非常に有効であったので、それらを「１．５」とスコア付けした。さらに、上述の６つの溶媒が、さらに２０％溶媒／８０％水（ｖ／ｖ）に希釈されたとき、ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原は、視覚的に可溶性のままであった（データ示さず）。対照的に、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−ブチルおよびイソアミルアルコール（各々１００％）は、このペプチド抗原を可溶化しなかった。
【０１７６】
単一のペプチド抗原を用いたことを除いては実験Ｓ５−５（パート１）に記載された処理条件を用いたときの水酸化アルミニウム粒子へのＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原の結合を、２０％溶媒／８０％水（ｖ／ｖ）に可溶化されたペプチドで評価した；ここで、その溶媒は、ギ酸、イソプロピルアルコール、エタノール、アセトンおよび酢酸のいずれかであった。結合効率を、上清中の未結合のペプチド抗原のＲＰ−ＨＰＬＣ測定によって決定し、表Ｓ５−９に記載されるように計算した。ＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ペプチド抗原は、５つすべての溶媒において水酸化アルミニウム粒子に対して１００％結合効率を示した。
【表Ｓ５−９】
2019515900.tif 000031
実施例Ｓ６：水酸化アルミニウムに吸着されたペプチドおよびペプチド：水酸化アルミニウム比（ｗ／ｗ）を定量するための手順
【０１７７】
ＵＶ手順。水酸化アルミニウムに吸着されたペプチドの量（結合効率％）を、方程式３および方程式４を用いて、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸光度（Ａ２１５）および／または２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度（Ａ２８０）によって定量した。サンプルを、ＵＶ検出器の線形の範囲内に入るように、適切な希釈剤（ＯＶＡｐｅｐの場合は炭酸水素ＮａおよびＴｒｉｐｌｅペプチドの場合は１０ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で希釈し、分光光度計を、対応する希釈剤でブランク計測した。投入したときの吸光度（Ａ投入）および上清の吸光度（Ａ上清）（Ａ上清＝合わせたすべての洗浄液）を、Ａ２１５実測値と、希釈係数および希釈前の体積との乗法によって決定し、次いで、それを方程式３において使用した。ペプチドと水酸化アルミニウム［Ａｌ（ＯＨ）３］との重量／重量（ｗ／ｗ）比を、方程式４を用いて計算した。
【数３】
2019515900.tif 000032
【数４】
2019515900.tif 000033
【０１７８】
アミノ酸分析手順。投入したペプチドおよびペプチド上清溶液の濃度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＳＦ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓ，ＵＳＡ）が行うような標準的な手順を用いるアミノ酸分析（ＡＡＡ）によって決定した。簡潔には、サンプルを、真空下、１１０℃の６Ｎ  ＨＣｌ酸の中に２４時間置いた。次いで、それらのサンプルを真空乾燥させ、内部標準としてノルロイシン（ＮｏｒＬｅｕ）を含む正確な量の希釈剤に送り込み、Ｈｉｔａｃｈｉ  ８８００アミノ酸分析計に注入した。そのランの経過にわたってｐＨ、イオン強度および温度を上昇させる、ＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃカラムおよびＰｉｃｋｅｒｉｎｇ緩衝液を用いた強陽イオン交換によって、アミノ酸を分離する。アミノ酸は、検出のための二次反応においてニンヒドリンと可視波長において反応する。ピークを特定し、各アミノ酸の量を、それらのサンプルと同じ配列における検量線を用いて定量する。次いで、存在するアミノ酸の量および既知配列から、ペプチドの量を計算する。
【０１７９】
水酸化アルミニウムに吸着されたペプチド％（結合効率％）を、方程式５を用いて定量した。投入重量（Ｗ投入）および上清重量（Ｗ上清）を、濃度の実測値と、希釈係数および希釈前の体積との乗法によって決定し、次いで、それを方程式５において使用した。ペプチドと水酸化アルミニウムとの重量／重量（ｗ／ｗ）比を、上記の方程式４を用いて計算した。それらの溶液におけるペプチド濃度の実測値は、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸光度とも相関し、それらのペプチドに対する２１５ｎｍにおける消衰係数を決定した。
【数５】
2019515900.tif 000034
実施例Ｓ７：ＯＶＡｐｅｐ：水酸化アルミニウム：Ｄ６１−０１共吸着体の生成
【０１８０】
この実施例では、様々な緩衝液において水酸化アルミニウムにＣｐＧおよび抗原を吸着させる方法を説明する。
実験Ｓ７−１：水性緩衝液を用いた結合
【０１８１】
水酸化アルミニウムへのＯＶＡｐｅｐとＤ６１−０１との共吸着が、２工程で達成された。第１の工程では、０．１Ｍ炭酸水素Ｎａ、ｐＨ８．０に約１ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）の濃度で溶解されたＯＶＡｐｅｐ（５．４ｍｇ）を、１ｍｌ（アルミニウム基準で１０ｍｇ）の水酸化アルミニウム製剤（炭酸水素Ｎａ緩衝液中に平衡化された）と、転倒式回転（１００〜１５０ｒｐｍ）によってＲＴにおいて２時間混合した。ＯＶＡｐｅｐを、所定の吸着能のおよそ５０％のレベルで水酸化アルミニウムと混合し、それによって、水酸化アルミニウム上の残りの表面積の約５０％が、その後の工程におけるＤ６１−０１の吸着にとって利用可能になった。第２の工程では、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に約１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された約３．３ｍｇのＤ６１−０１を、すでに水酸化アルミニウムに吸着されたＯＶＡｐｅｐに加え、再度、転倒式回転（１００〜１５０ｒｐｍ）によってＲＴにおいて２時間混合した。混合された最終的な緩衝液は、およそ５０ｍＭ  炭酸水素Ｎａ、５ｍＭ  ＮａＯＡｃおよび７５ｍＭ  ＮａＣｌから構成された。過剰なまたは弱く吸着されたＯＶＡｐｅｐおよびＤ６１−０１を除去するために、０．１Ｍ炭酸水素Ｎａを用いた洗浄および水酸化アルミニウムの遠心分離を３サイクル行った後、水酸化アルミニウムに吸着されたＤ６１−０１およびＯＶＡｐｅｐの最終的な量を、それぞれ実施例Ｓ４および実施例Ｓ６（ＵＶ手順）に記載されたように決定した。この実験（Ｓ７−１）では、ＯＶＡｐｅｐの結合効率は、炭酸水素Ｎａにおいてわずか５４％であったが、提供されたＤ６１−０１の１００％が結合した（ｌｏｔ１１０４２０１５）。結合比の実測値は、０．３：１：０．３（ｗ／ｗ／ｗ）というＯＶＡｐｅｐ：水酸化アルミニウム：Ｄ６１−０１であった（表Ｓ７−１）。
実験Ｓ７−２：ＯＶＡｐｅｐ：水酸化アルミニウム：Ｄ６１−０１共吸着体の調製において水性緩衝液、またはイソプロピルアルコールと水性緩衝液との組み合わせを用いたＯＶＡｐｅｐ結合の比較
【０１８２】
炭酸水素Ｎａまたは２０％ＩＰＡ／水に溶解されたＯＶＡｐｅｐの、水酸化アルミニウムへの結合を比較した（表Ｓ７−１）。驚いたことに、２０％ＩＰＡ／水に溶解されたペプチドは、あらゆる水系を使用したときよりも高いペプチド結合効率および結合能を示す。詳細には、ＯＶＡｐｅｐを、炭酸水素Ｎａの代わりに２０％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）に溶解し（ｌｏｔ１１０４２１５−ＩＰＡ）、同様に処理したとき、ＯＶＡｐｅｐの結合能は、５４％から８８％に上昇した（かつ、提供されたＤ６１−０１の１００％が結合した）ことから、この条件が、水酸化アルミニウムへのペプチドの吸着に影響したことが示唆される。この条件の場合、結合比の実測値は、０．７：１：０．７（ｗ／ｗ／ｗ）というＯＶＡｐｅｐ：アルミニウム：Ｄ６１−０１であった。
【表Ｓ７−１】
2019515900.tif 000035
実験Ｓ７−３：単一工程における水酸化アルミニウムへのＯＶＡｐｅｐおよびＤ６１−０１の結合
【０１８３】
ＯＶＡｐｅｐは、２０％ＩＰＡ／水に溶解し、水酸化アルミニウムおよびＤ６１−０１は両方とも、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液中に存在した。すべての構成要素を表Ｓ７−２に示される比でＲＴにおいて１時間、共に加えた。それらの構成要素を合わせた後、その結合溶液の最終的な組成は、約１０％ＩＰＡを含む５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液となった。これらの条件下において、ペプチド結合効率は、この実験において、２つの異なるペプチド投入レベル（５および１０ｍｇ）における反応に対してそれぞれ８９％および９８％に上昇した（それらの２つの異なる投入ペプチドの各々は、１０ｍｇの水酸化アルミニウム（アルミニウムの含有量に基づく）と反応した）。驚いたことに、１ｍｇの水酸化アルミニウムにつき０．９ｍｇのＯＶＡｐｅｐの結合は、Ｄ６１−０１の結合能を有意に減少させず、Ｄ６１−０１も、１ｍｇの水酸化アルミニウムにつき０．９ｍｇという比で結合し、実施例Ｓ３、実験Ｓ３−２においてＤ６１−０１のみの場合に観察された結合能と似ていた。高レベルのペプチドとＣｐＧ−ＯＤＮとの両方が水酸化アルミニウムに結合できることによって、最少の水酸化アルミニウムをキャリアとして使用して最大量のペプチドおよびＣｐＧ−ＯＤＮの投与が可能になるので、そのように結合できることは、有益である。
【表Ｓ７−２】
2019515900.tif 000036
実験Ｓ７−４：生物学的研究において使用するためのさらなるＯＶＡｐｅｐ：水酸化アルミニウム：Ｄ６１−０１共吸着体の調製
【０１８４】
この２工程手順では、ＯＶＡｐｅｐ（２つの異なるサンプル）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０に溶解し（ｌｏｔ０９２９２１０５（３））、水酸化アルミニウムを炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．０緩衝液中に平衡化した。Ｄ６１−０１を１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶解した。ｌｏｔ０３３１−２０１５のために、水酸化アルミニウムを酢酸ナトリウム中に平衡化した。まず、１〜２ｍｇ／ｍＬのＯＶＡｐｅｐを水酸化アルミニウム（アルミニウムに基づいて１０ｍｇ）に加え、ＲＴにおいて２時間回転混合した。ＯＶＡｐｅｐに対する結合の結果は、表Ｓ７−３に示されているように、それぞれ５１％および５６％で中程度だった。次に、２〜４ｍｇ／ｍＬのＤ６１−０１を加え、ＲＴにおいて１時間混合した。両方のロットに対してペプチド吸着工程とＤ６１−０１吸着工程の両方の後に、水酸化アルミニウム錯体を炭酸水素ナトリウム緩衝液で十分に洗浄した。Ｄ６１−０１の結合効率は、表Ｓ７−３に示されているように、ｌｏｔ０３３１−２１０５に対して５３％であり、ｌｏｔ０９２９２１０５（３）に対して１００％であった。
【表Ｓ７−３】
2019515900.tif 000037
実施例Ｓ８：Ｔｒｉｐｌｅペプチド：水酸化アルミニウム：Ｄ６１−０１共吸着体の生成
【０１８５】
２工程手順を用いて、ＴｒｉｐｌｅペプチドおよびＤ６１−０１を水酸化アルミニウムに吸着させた。まず、Ｔｒｉｐｌｅペプチドを２０％ＩＰＡ／水に１〜２ｍｇ／ｍｌで溶解し、２０〜２５℃において２時間、１０％ＩＰＡ、５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液中の水酸化アルミニウムに吸着させた。次に、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液に２〜４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解されたＤ６１−０１を加え、２０〜２５℃において１時間混合した。
【０１８６】
ＴｒｉｐｌｅペプチドとＤ６１−０１との両方を、表Ｓ８−１に示されているように、ＩＰＡの存在下において２つの異なるスケールで水酸化アルミニウムに効率的に共吸着させた。両方のリガンドに対する結合効率は、高く、すなわち、＞８７％であった。両方の反応において、Ｔｒｉｐｌｅペプチド：水酸化アルミニウム（アルミニウムの含有量に基づく）：Ｄ６１−０１が１：１：１比（ｗ／ｗ／ｗ）に近いことが示され、このプロセスは再現性があると実証された。
【表Ｓ８−１】
2019515900.tif 000038
実験Ｓ８−２：様々な質量の共吸着されたＮＹ−ＥＳＯ−１ＯＬＰ抗原−水酸化アルミニウム粒子に対する一定質量のＤ６１−０４  ＯＤＮの結合、および共吸着されたＯＬＰ抗原の置換
【０１８７】
一定質量のＤ６１−０４ポリヌクレオチドが実験Ｓ５−３からの様々な共吸着されたＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原−水酸化アルミニウム粒子に結合する能力を評価して、１）Ｄ６１−０４の結合、ならびに２）ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原置換の程度を決定した。ニートのＤ６１−０４ポリヌクレオチドを、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に１ｍｇ／ｍＬで溶解し、正確な濃度を、実施例Ｓ４に記載されたＵＶ吸光度法によって決定した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に１ｍｇのＤ６１−０４ポリヌクレオチドを含む１：１（ｖ／ｖ）溶液、および１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に５つの異なるＯＬＰ抗原−水酸化アルミニウム粒子を含む溶液を、回転混合機において約１５ｒｐｍで約３時間、２０〜２５℃において混合した。次に、未結合のＤ６１−０４ポリヌクレオチドおよび置換されたＯＬＰ抗原を、実験Ｓ５−３に記載されたような遠心分離によって、共吸着されたＤ６１−０４ポリヌクレオチド−ＯＬＰ抗原−水酸化アルミニウム粒子から分離した。この洗浄／遠心分離プロセスを、結合に使用された同じ緩衝液を用いてさらに２回繰り返し、プールされた上清を、未結合のＤ６１−０４ポリヌクレオチドについてはＵＶ吸光度法によって、置換されたＯＬＰ抗原についてはアミノ酸分析（実施例Ｓ６を参照のこと）によって解析した。質量を増加させた共吸着されたＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原−水酸化アルミニウム粒子と、固定された投入質量のＤ６１−０４ポリヌクレオチドの結合％との間に直線関係が観察された（表Ｓ５−４）。対照的に、ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ抗原のさらなる置換は、０．６ｍｇの水酸化アルミニウム粒子条件における１０％というわずかな置換を除いては、観察されなかった。
【表Ｓ８−２】
2019515900.tif 000039
実験Ｓ８−３：ＯＬＰ質量を増加させたときの共吸着されたＮＹ−ＥＳＯ−１  ＯＬＰ抗原−水酸化アルミニウム粒子に対する一定質量のＤ６１−０４の結合、および共吸着されたＯＬＰ抗原の置換
【０１８８】
固定された量のＤ６１−０４ポリヌクレオチドが実験Ｓ５−５からの様々なＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ−水酸化アルミニウム粒子に結合する能力を評価して、１）Ｄ６１−０４の結合、ならびに２）ＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ置換の程度を決定した。ニートのＤ６１−０４ポリヌクレオチドを、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に溶解し、正確な濃度を、実施例Ｓ４に記載されたＵＶ吸光度法によって決定した。次いで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に１ｍｇのＤ６１−０４ポリヌクレオチドを含むスラリーと、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中の水酸化アルミニウム粒子上に６つの異なる比で共吸着されたＯＬＰを含む溶液とを、回転混合機において約１５ｒｐｍで約３時間、２０〜２５℃において１：１（ｖ／ｖ）比で混合した。次に、未結合のＤ６１−０４ポリヌクレオチド、および置換された水酸化アルミニウムに共吸着されたＯＬＰを、上に記載されたような遠心分離によって分離した。この洗浄／遠心分離プロセスを、結合に使用された同じ緩衝液を用いてさらに２回繰り返し、プールされた上清を、未結合のＤ６１−０４ポリヌクレオチドについてはＵＶ吸光度法によって、置換されたＯＬＰについてはアミノ酸分析（実施例Ｓ６を参照のこと）によって解析した。質量を増加させたＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰ−水酸化アルミニウム粒子と、量を増加させた共吸着されたＤ６１−０４質量との間に直線関係が観察された（表Ｓ５−３）。対照的に、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５または０．６ｍｇという総ＯＬＰ（０．１、０．１２５、０．１５、０．２、０．２５または０．３ｍｇの各ＯＬＰ）の組み合わされたＮＹ−ＥＳＯ−１７９−１０８およびＮＹ−ＥＳＯ−１１４２−１７３ＯＬＰの置換は、まったく観察されなかったか、または最小でしか観察されなかった。
【表Ｓ８−３】
2019515900.tif 000040
実施例Ｓ９：ＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド結合体の調製
【０１８９】
ＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド結合体に対する製造スキームは、図１Ａ〜Ｂに提供されている。この実施例において、多糖多量体化剤は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅがＦＩＣＯＬＬ（登録商標）として販売する高ＭＷの、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであった。しかしながら、ジェネリックバージョンまたはバイオシミラー（ノーブランドまたは他の商標）も、使用に適している。ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）に対する他のＣｐＧ−ＯＤＮまたはペプチド結合体は、ＣｐＧ−ＯＤＮおよび／もしくはペプチド配列、ＰＮもしくはＣＣ  ＣｐＧ−ＯＤＮに対するチオールリンカー、および／またはアミン架橋剤に対するチオールを変更することによって、同じ製造経路によって調製され得る。
【０１９０】
段階１では、ＦＩＣＯＬＬが、いくつかの工程において反応性マレイミド基を含むように改変されて、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｘ−ＦＩＣＯＬＬがもたらされる。段階２では、例示的なＣｐＧ−ＯＤＮにおけるジスルフィドであるＤ６１−０２（（Ｄ６１−０１）−３’−ＳＳとしても知られる）が、チオールに還元されて、Ｄ６１−０３（（Ｄ６１−０１）−３’−ＳＨとしても知られる）が形成される。段階３では、［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ、Ｄ６１−０３およびシステイン改変ペプチドが反応して、ＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド（この場合、Ｄ６１−０１−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド）が形成される。このプロセスの各工程において精製が行われる。最終的なＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド溶液は、濾過滅菌され、特徴づけられた後、＜−６０℃で貯蔵される。ＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド結合体について実施例の表に提供されるモル比の結果は、平均モル比（モルベースの平均ローディング比）である。
【０１９１】
図２は、ＦＩＣＯＬＬ中間体である、カルボキシメチル化された（ＣＭ）−ＦＩＣＯＬＬ、アミノエチルカルバミルメチル化された［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬおよび［マレイミド（Ｍａｌ）−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ、ならびに最終生成物（ＣｐＧ−ＯＤＮ−ＰＥＧ６）ｘ−ＦＩＣＯＬＬ−（ＰＥＧ６−ペプチド）ｔを製造するためのプロセスの概要を述べている。
Ａ．ＦＩＣＯＬＬ  ＰＭ４００の組成物
【０１９２】
ＦＩＣＯＬＬ  ＰＭ４００（ＦＩＣＯＬＬ４００）は、スクロースの高度に分岐した中性の合成ポリマーであり、４００，０００±１００，０００という分子量が報告されており、ナノ粒子の懸濁液として存在する。それは、スクロースとエピクロロヒドリンとの共重合によって形成される。ＦＩＣＯＬＬ  ＰＭ４００は、噴霧乾燥された粉末としてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。
Ｂ．［マレイミド（Ｍａｌ）−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬの調製  
【０１９３】
［マレイミド（Ｍａｌ）−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬは、図２に模式的に示されているように、および以前に報告されたように（２０１６年１月２２日に出願されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４６３５を参照のこと）調製した。
【０１９４】
簡潔には、ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬは、５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を用いた透析などを介する標準的な脱塩手順を使用する代わりに、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜によるタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）を用いる精製を行ったことを除いては、Ｉｎｍａｎの方法（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１４：７０４−７０９，１９７５）によって、塩基性条件下においてＦＩＣＯＬＬ  ＰＭ４００およびクロロ酢酸ナトリウムから調製した。そのＴＦＦ精製は、標準的な脱塩手順と同様に、分子および過剰な試薬を除去した。
【０１９５】
［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬは、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜によるタンジェンシャルフロー分画（ＴＦＦ）を使用する精製工程を用いるように改変されたＩｎｍａｎの方法（前出）によって、非常に過剰なエチレンジアミンおよび水溶性カルボジイミドを用いて、ＣＭ−ＦＩＣＯＬＬから調製した。
【０１９６】
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬは、［ＡＥＣＭ］ｚ−ＦＩＣＯＬＬ（１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液において２０ｍｇ／ｍＬ、アミンとＦＩＣＯＬＬとのモル比（ｚ）＝２１８〜２２４）をＳＭ−ＰＥＧ６（ジメチルスルホキシドにおいて１００ｍｇ／ｍＬ、アミン１つあたり５当量）とＲＴにおいて４０分間反応させることによって調製した。ＳＭ−ＰＥＧ６（スクシンイミジル−（（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ヘキサエチレングリコール（ｈｅｘｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ））エステル）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２２１０５）から入手した。ＦＩＣＯＬＬ上の未反応のアミンを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−アセテート（Ｓｕ−ＮＨＳ−Ａｃ）（ジメチルスルホキシドにおいて１００ｍｇ／ｍＬ、アミン１つあたり５当量）を用いてＲＴにおいて１５分間キャッピングした。このキャッピング反応によって、ＦＩＣＯＬＬ上の未反応のアミンが、得られるＦＩＣＯＬＬ生成物の物理化学的特性にとって重要であり得るアセトアミドに変換される。未反応のＳＭ−ＰＥＧ６およびＳｕ−ＮＨＳ−Ａｃを、グリシン（１００ｍＭリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の１００ｍｇ／ｍＬ、ＳＭ−ＰＥＧ６とＳｕ−ＮＨＳ−Ａｃとの合計につき１０当量）でＲＴにおいて１５分間クエンチした。粗［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、結合体化反応と同じ日に、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜を用いたＴＦＦによって精製した。粗［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液を用いて約５．８ｍｇ／ｍＬに希釈し、合計およそ２４〜２９体積の交換のために、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液でダイアフィルトレーションした。各透過物のダイアボリューム（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）の吸光度を２１５ｎｍにおいて計測し、透過物の吸光度が０．１ＡＵに達したら、ダイアフィルトレーションを終了した。精製された［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、滅菌されたポリプロピレンバイアルに等分し、−８０℃で貯蔵した。
【０１９７】
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬのマレイミドとＦＩＣＯＬＬとのモル比（ｙ）を、実施例Ｓ１０および実施例Ｓ１１で概要を述べる手順によって決定した。表Ｓ９−１は、生成された例示的なバッチの［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬおよびそれらから形成された結合体（セクションＤを参照のこと）を示している。
【表Ｓ９−１】
2019515900.tif 000041
Ｃ．Ｄ６１−０３（（Ｄ６１−０１）−３’−ＳＨとしても知られる）の調製
【０１９８】
Ｄ６１−０３を、先に記載されたように（２０１６年１月２２日に出願されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４６３５を参照のこと）調製した。簡潔には、Ｄ６１−０２（（Ｄ６１−０１）−３’−ＳＳとしても知られる。活性化緩衝液において５６ｍｇ／ｍＬ）を、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、活性化緩衝液において４８ｍｇ／ｍＬ、５当量）と約４０℃において約２時間反応させた。活性化緩衝液は、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５であった。粗Ｄ６１−０３（（Ｄ６１−０１）−３’−ＳＨとしても知られる）を、ＸＫ５０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に詰められたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｆｉｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いるゲル濾過によって、製造者が推奨する手順に従って、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液を移動相として使用して、精製した。溶離剤を２１５ｎｍおよび２６０ｎｍにおいてモニターし、精製された画分を合わせ、等分し、−８０℃において貯蔵した。
Ｄ．（Ｄ６１−０１）−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド共結合体の調製
【０１９９】
ＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチドの代表的な合成では、活性化されたＣｐＧ−ＯＤＮ（例えば、（Ｄ６１−０１）−３’−ＳＨとしても知られるＤ６１−０３）を加え、Ｍａｌ−ＦＩＣＯＬＬと約１５分間混合した後、ペプチドを加える。１５分後、固体の塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）をその混合物に加えることにより、約６Ｍという最終濃度を達成した後、固体のペプチドを加える。ＧｕＨＣｌは、ペプチドを可溶化するため、およびシステイン基（チオール）を介したＦＩＣＯＬＬ上の接近可能なマレイミドとの共有結合を可能にするために必要である。この手順の詳細な例は、以下の段落に提供され、他のＣｐＧ−ＯＤＮおよびペプチド配列にも適用できる。
【０２００】
Ｄ６１−０１−ＦＩＣＯＬＬ−Ｔｒｉｐｌｅメラノーマ（Ｔｒｉｐｌｅ）ペプチド共結合体、Ｌｏｔ０４１４２０１５を生成するための例示的な手順の詳細。１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５緩衝液中の５．４ｍｇ／ｍｌのＦＩＣＯＬＬ濃度（０．０００１１ｍｍｏｌのＦＩＣＯＬＬ、ＦＩＣＯＬＬ１つあたり０．０１７ｍｍｏｌのマレイミドまたは１５５マレイミド）のおよそ４４ミリグラム（ｍｇ）（８．１ｍｌ）のマレイミド−ＦＩＣＯＬＬ（ｌｏｔ０８２５２０１４）を、１５ｍｌチューブに加え、２５．７ｍｇ（２．１ｍｌ、ＦＩＣＯＬＬ１つあたり３０当量）の３’チオールＤ６１−０１（ｌｏｔ０２２６２０１４）と、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５緩衝液において１２．２ｍｇ／ｍｌの濃度で反応させた。この反応（約１０．３ｍｌ）を、２５℃恒温器において１５分間進めた。次に、およそ５．９グラムの固体のＧｕＨＣｌを溶液に加えて、およそ６ＭというＧｕＨＣｌ最終濃度を達成した。この溶液を、ＧｕＨＣｌが溶解するまで約１分間、ボルテックスすることによって混合し、次いで、２８ｍｇ（ＦＩＣＯＬＬ１つあたり４０当量）の固体のＴｒｉｐｌｅペプチド（Ｂｉｏ−ＳｙｎｔｈｅｓｉｓのロットＰ２３４５−１）を直ちに加え、溶解するまでボルテックスした。この混合物を２５℃において４５〜６０分間反応させた。この反応の後、潜在的な未反応のマレイミドをシステイン（Ｔｈｅｒｍｏ；Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４４８８９）でキャッピングした。簡潔には、約０．２１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌシステイン原液（２１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、マレイミド１つあたり１０当量）を加え、ＲＴ（２５℃）で２５分間維持した。最終的な粗共結合体（約１４．５ｍｌ）組成物は、およそ２．８ｍｇ／ｍｌのＦＩＣＯＬＬ、１．６ｍｇ／ｍｌの３’チオールＤ６１−０１、１．８ｍｇ／ｍｌのＴｒｉｐｌｅペプチドおよび１．３ｍｇ／ｍｌのシステインを含んでおり、それを２〜８℃で一晩貯蔵した後、精製した。得られた共結合体を、約１２０ｍｌのベッド体積を有するＨｉＬｏａｄ  １６／６００ｍｍ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００プレップグレードカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。このカラムを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４２ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２中に平衡化し、ＲＴにおいて１ｍｌ／分の流速にて定組成で流した。この精製は、Ａｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のクロマトグラフィーシステムを用いて制御した。およそ１４ｍｌの粗サンプルをこのカラムに適用し、総ラン時間は、１５０分であった。精製を、２１５、２６０および２８０ｎｍの吸光度におけるＵＶ検出によってモニターし、精製されたＤ６１−０１−ＦＩＣＯＬＬ−Ｔｒｉｐｌｅペプチド共結合体（ｌｏｔ０４１４２０１５）を約１８ｍｌの体積で単離し、続いて、特徴づけた（表Ｓ９−２）。Ｄ６１−０１−ＦＩＣＯＬＬ結合体は、ＧｕＨＣｌおよびペプチド溶液を加えなかったことを除いては、上に記載されたように調製した。
【表Ｓ９−２】
2019515900.tif 000042
【０２０１】
さらなる共結合体を、上に記載されたものと同様に調製し、それらの結果を表Ｓ９−３および表Ｓ９−４に提供する。
【表Ｓ９−３】
2019515900.tif 000043
【表Ｓ９−４】
2019515900.tif 000044
実施例Ｓ１０：ＦＩＣＯＬＬ含有中間体および生成物におけるＦＩＣＯＬＬ濃度を決定する手順
【０２０２】
このアッセイ用の検量線を作成するためにＦＩＣＯＬＬ  ＰＭ４００を使用したことを除いては、製造者のプロトコルに従って、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．２３２６０，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ＦＩＣＯＬＬ含有中間体および生成物のＦＩＣＯＬＬ濃度を決定した。
実施例Ｓ１１：［マレイミド］ｙ−ＦＩＣＯＬＬ溶液におけるマレイミド濃度およびマレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）を決定する手順
【０２０３】
［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬのマレイミド濃度を、エルマン試薬（５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．２２５８２，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。［マレイミド−ＰＥＧ６］ｙ−ＦＩＣＯＬＬを、製造者のプロトコルに従って過剰なシステインと反応させ、残りのシステインを、システイン検量線を用いて定量した。残りのシステイン濃度を最初のシステイン濃度から減算することによって、マレイミド濃度を決定した。そのマレイミド濃度をＦＩＣＯＬＬ濃度で除算することによって、マレイミド：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｙ）を計算し、ここで、ＦＩＣＯＬＬ濃度は、実施例Ｓ４に記載されたように決定され、それらの濃度は、モル濃度を単位とした。
実施例Ｓ１２：結合体におけるＣｐＧ濃度およびＣｐＧ：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を決定する手順
【０２０４】
（Ｄ６１−０１）−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチドのＤ６１−０１濃度を、紫外線分光光度法およびＢｅｅｒ法の方程式を用いて決定した。慣例により、ＦＩＣＯＬＬに付着された化合物は、この化合物を形成するために、リンカーを有するキメラ化合物Ｄ６１−０３が使用されたとしても、この段階では配列名Ｄ６１−０１と称される。２６０ｎｍにおける吸光度を決定し、Ｄ６１−０１に対して２２．６５ｍｇ／ｍｌ−１×ｃｍ−１という消衰係数を使用した。ＦＩＣＯＬＬ、リンカーおよびペプチドは、２６０ｎｍにおいて吸収しないので、その吸光度は、ＣｐＧ−ＯＤＮ、Ｄ６１−０１の吸光度にもっぱら起因する。ｍｇ／ｍＬを単位とするＤ６１−０１濃度を、Ｄ６１−０１に対する遊離酸の分子量を用いてモル濃度に変換した。ＣｐＧ：ＦＩＣＯＬＬモル比（ｘ）を、ＣｐＧ−ＯＤＮ濃度をＦＩＣＯＬＬ濃度で除算することによって決定し、ここで、ＦＩＣＯＬＬ濃度は、実施例Ｓ１０に記載されたように決定され、それらの濃度は、モル濃度を単位とした。他のＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ溶液に対する濃度は、必要に応じて、使用されたＣｐＧ−ＯＤＮに対する消衰係数および遊離酸の分子量を用いて決定される。
実施例Ｓ１３：粒径を決定する手順
【０２０５】
ＦＩＣＯＬＬサンプル（例えば、ＣｐＧ−ＦＩＣＯＬＬ−ペプチド）の粒径（Ｚ−平均）および標準偏差（ＳＤ）を、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ装置を用いる動的光散乱（ＤＬＳ）によって計測した。サンプルを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４２ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で０．５ｍｇ／ｍＬのＦＩＣＯＬＬ濃度に希釈し、定義された装置の設定の下で計測した。較正された５０ｎｍポリスチレンナノスフェアサンプル（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．３０５０Ａ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、システムの適格性コントロールとして解析に含め、それは、４９±６ｎｍの粒径を有した。
実施例Ｓ１４：ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって純度を決定する手順
【０２０６】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって純度パーセント（面積基準）を決定するためのＨＰＬＣパラメータを表Ｓ１４−１に提供する。
【表Ｓ１４−１】
2019515900.tif 000045
実施例Ｓ１５：水酸化アルミニウムへのＨＰＶ１６ペプチドおよびＤ６１−０１の結合
【０２０７】
ＨＰＶ１６ペプチド（配列番号１９）を、２０％ＩＰＡ／水に溶解し（約１〜２ｍｇ／ｍｌ）、水酸化アルミニウム（１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＬ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に平衡化した）と２時間反応させた。それらの構成要素を合わせた後、その結合溶液の最終的な組成は、約１０％ＩＰＡを含む５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。水酸化アルミニウム錯体にペプチドを吸着させた後、その錯体を１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で２回洗浄して、吸着されていないペプチドを除去し、湿ったゲルを２〜８℃で一晩保持した。翌日、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＬ  ＮａＣｌに溶解されたＤ６１−０１（約１〜２ｍｇ／ｍＬ）を、すでに水酸化アルミニウムに結合したＨＰＶ１６ペプチドに加え、回転混合（１００〜１５０ｒｐｍ）によって１時間反応させ、再度、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＬ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で２回洗浄した。各反応において使用されたＤ６１−０１、ＨＰＶ１６ペプチドおよび水酸化アルミニウムの量の詳細は、表Ｓ１５−１に結合効率とともに提供されている。これらの条件下において、ペプチドの結合効率は、２つの結合反応に対して９０％および８３％で高かった。Ｄ６１−０１の結合効率は、２つの反応に対して７４％および８０％であった。
【表Ｓ１５−１】
2019515900.tif 000046
実施例Ｓ１６：水酸化アルミニウムへのＡＨ１  ＣＩＩペプチドおよびＤ６１−０１の結合
【０２０８】
水酸化アルミニウムに対するＡＨ１  ＣＩＩペプチド（配列番号２６）およびＤ６１−０１の結合能を、表Ｓ１６−１に示されているように、提供されるＡＨ１  ＣＩＩペプチドおよびＤ６１−０１の量を一定に保持しつつ水酸化アルミニウムの量を変化させることによって評価した。ＡＨ１  ＣＩＩペプチドを２０％ＩＰＡ／水に溶解し（１〜２ｍｇ／ｍｌ）、水酸化アルミニウム（１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＬ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中に平衡化した）と２時間反応させた。それらの構成要素を合わせた後、その結合溶液の最終的な組成は、約１０％ＩＰＡを含む５ｍＭ  ＮａＯＡｃ、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０であった。水酸化アルミニウム錯体にペプチドを吸着させた後、その錯体を１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で２回洗浄して、吸着されていないペプチドを除去し、２〜８℃で一晩保持した。翌日、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＬ  ＮａＣｌに溶解されたＤ６１−０１（１〜２ｍｇ／ｍＬ）を、すでに水酸化アルミニウムに結合したＡＨ１  ＣＩＩペプチドに加え、回転混合（１００〜１５０ｒｐｍ）によって１時間反応させ、再度、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＬ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で２回洗浄した。表Ｓ１６−１に示されているように、これらの条件下において、ＡＨ１  ＣＩＩペプチドの結合効率は、８４％〜８９％の範囲で高く、Ｄ６１−０１の結合は、５つの条件のうち４つにおいて１００％であり、残りの条件（２．５ｍｇのアルミニウム）に対して８６％であった。これらのデータは、広範囲のリガンド結合分布（ペプチド：水酸化アルミニウム：Ｄ６１−０１比）が容易に生成され得ることを示している。
【表Ｓ１６−１】
2019515900.tif 000047
実施例Ｂ１：免疫原性組成物の腫瘍外投与と比較した腫瘍内投与の腫瘍サイズに対する影響
【０２０９】
この実施例では、多糖多量体化剤のみと会合したまたはさらに腫瘍抗原（Ａｇ）と会合したＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）を含む粒子を含む免疫原性組成物の投与による腫瘍成長の制御を説明する。この実施例において、多糖多量体化剤は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅがＦＩＣＯＬＬ（登録商標）として販売する高ＭＷの、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであった。しかしながら、ジェネリックバージョンまたはバイオシミラー（ノーブランドまたは他の商標）も使用に適しているので、この部分は、本明細書中で単にＦｉｃと称される。
【０２１０】
腫瘍モデル。免疫原性組成物を、３つの異なるマウス腫瘍モデルにおいて試験した。３つすべてのモデルが、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（現在のＥｎｖｉｇｏ）から購入した６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。
【０２１１】
ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫モデル。ＥＧ７−ＯＶＡ細胞株を、ＡＴＣＣ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＥＧ７−ＯＶＡ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２１１３ＴＭ）は、モデル抗原であるニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）を発現するように改変されたマウスリンパ腫細胞株ＥＬ４の誘導体である（Ｍｏｏｒｅら、Ｃｅｌｌ，５４：７７７−７８５，１９８８を参照のこと）。約１×１０６個のＥＧ７−ＯＶＡ細胞を、１００μｌのＰＢＳ中においてマウスの側腹部に皮下（ＳＣ）注射して、腫瘍形成を惹起した。腫瘍が、１０〜２０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ（アジュバントのみ）またはＤ６１−０１−Ｆｉｃ−Ａｇ（ワクチン）ナノ粒子を投与した。
【０２１２】
Ｂ１６−Ｆ１０およびＢ１６−ＯＶＡメラノーマモデル。Ｂ１６−Ｆ１０細胞株を、ＡＴＣＣ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｂ１６−Ｆ１０（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＣＲＬ−６４７５ＴＭ）は、マウスメラノーマ細胞株である（Ｆｉｄｌｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，３５：２１８−２２４，１９７５）。Ｂ１６−ＯＶＡ細胞株は、ＯＶＡを発現するように改変されたＢ１６−Ｆ１０の誘導体である。Ｂ１６−ＯＶＡおよびＢ１６−Ｆ１０に対しては、約１×１０５個の細胞を、１００μｌのＰＢＳ中においてマウスの側腹部にＳＣ注射して、腫瘍形成を惹起した。腫瘍が、直径４〜７ｍｍのサイズに達したら、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ（アジュバントのみ）、またはＡｇに共有結合的に連結されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ（ワクチン）ナノ粒子を投与した。
【０２１３】
免疫原性組成物および処置レジメン。３つの異なるタイプのＤ６１−０１−Ｆｉｃ−Ａｇ（ワクチン）ナノ粒子を試験した。Ｄ６１−０１は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）のような、３つの核酸部分および２つの非核酸部分を有する直鎖状のキメラ化合物である。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡ粒子は、オボアルブミンタンパク質を含む。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、オボアルブミンポリペプチド：ＣＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶ（配列番号１１）を含む。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｔｒｉｐｌｅ粒子は、３つのクラスＩ拘束性メラノーマエピトープ（Ｔｒｐ１、Ｔｒｐ２およびｇｐ１００）および人工ＰＡｎクラスＩＩ  ＤＲ拘束性エピトープ（ＰＡＤＲＥ）を融合ポリペプチドとして含む：ＶＧＡＬＥＧＰＲＮＱＤＷＬＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＴＡＹＲＹＨＬＬＳＳＶＹＤＦＦＶＷＬＳＣ（ここで、ＸはＬ−シクロヘキシルアラニンである）（配列番号１４）。免疫原性組成物を、腫瘍内注射（ＩＴ）または腫瘍外注射（この実施例では皮下（ＳＣ）注射を含んだ）によって投与した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および３９μｇのＯＶＡを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および５６μｇのＯＶＡｐｅｐを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｔｒｉｐｌｅ粒子は、１５０μｌの体積において５５μｇのＤ６１−０１および５０μｇのＴｒｉｐｌｅを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１を含む１用量として送達した。
【０２１４】
腫瘍成長の計測。腫瘍サイズを、３次元（長さ；Ｌ、幅；Ｗおよび深さ；Ｄ）のマイクロノギス計測によって決定し、以下の式：（Ｌ×Ｗ×Ｄ／２）を用いて体積を計算した。
【０２１５】
結果。図３Ａ〜Ｄの結果は、腫瘍内経路による免疫原性組成物の投与が、腫瘍から遠位の部位への皮下注射を介した腫瘍外投与と比べて、優れた抗腫瘍応答を誘発したことを実証している。さらに、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ粒子に共有結合的に付着した腫瘍抗原を含む免疫原性組成物の腫瘍内投与は、腫瘍抗原の非存在下のＤ６１−０１−Ｆｉｃ粒子（アジュバントのみ）の腫瘍内投与と比べて、優れた抗腫瘍応答を誘発した。起源の組織が異なる腫瘍モデル（ＥＧ７リンパ腫およびＢ１６メラノーマ）において成長の阻害が観察されたので、腫瘍内ワクチン接種の有効性は、腫瘍タイプによって影響されなかった。実際に、Ｂ１６メラノーマは、免疫原性の低い腫瘍であることが広く知られており（Ｃｅｌｉｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４３：３５０７−３５１０，１９８３；Ａｓｈｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，６５：２７１−７７，１９８７；およびＤｅｚｆｏｕｌｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８１：４５９−７１，２００３）、そのため、治療結果を評価するための理想的なモデルになっている。要約すると、例示的なＤ６１−０１−Ｆｉｃプラットフォームによって実証されたように、高分子量多糖（１０〜１０００ｋＤａ）を用いることにより、異なる生理化学的特性を有するホールタンパク質抗原（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡ）またはポリペプチド抗原（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐまたはＤ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｔｒｉｐｌｅ）を哺乳動物被験体に効果的に送達することができる。
実施例Ｂ２：同じまたは異なる粒子に結合体化されたＣｐＧおよび腫瘍抗原を含む免疫原性組成物の腫瘍内投与の腫瘍サイズに対する効果
【０２１６】
この実施例では、同じまたは異なる多糖分子に共有結合的に連結されたＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）および腫瘍抗原（Ａｇ）を含む免疫原性組成物による腫瘍成長の制御を説明する。この実施例において、多糖多量体化は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅがＦＩＣＯＬＬ（登録商標）として販売する高ＭＷの、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであった。しかしながら、ジェネリックバージョンまたはバイオシミラー（ノーブランドまたは他の商標）も使用に適しているので、この部分は、本明細書中で単にＦｉｃと称される。
【０２１７】
腫瘍モデル。免疫原性組成物を、実施例Ｂ１に記載されたＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫モデルにおいて試験した。
【０２１８】
免疫原性組成物および処置レジメン。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐおよびＤ６１−０１−Ｆｉｃ粒子は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）のような、３つの核酸部分および２つの非核酸部分を有する直鎖状のキメラ化合物を含む。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子およびＦｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、オボアルブミンポリペプチド：ＣＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶ（配列番号１１）を含む。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子、またはＤ６１−０１−ＦｉｃとＦｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子との組み合わせを、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および３９μｇのＯＶＡｐｅｐを含む１用量として腫瘍内（ＩＴ）注射によって送達した。
【０２１９】
腫瘍成長の計測。腫瘍サイズを、３次元（長さ；Ｌ、幅；Ｗおよび深さ；Ｄ）のマイクロノギス計測によって決定し、以下の式：（Ｌ×Ｗ×Ｄ／２）を用いて体積を計算した。
【０２２０】
結果。図４は、最大の治療効果には、同じ粒子へのＣｐＧおよび腫瘍抗原の共有結合が必要であることを実証している。詳細には、同じＦｉｃナノ粒子に共有結合的に付着されたＤ６１−０１およびＯＶＡｐｅｐの腫瘍内投与は、Ｄ６１−０１およびＯＶＡｐｅｐが異なるＦｉｃナノ粒子に結合体化された免疫原性組成物の投与と比べたとき、腫瘍成長を６８％減少させた（５６８対１８１ｍｍ３；ｐ＝０．０４）。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算し、０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
実施例Ｂ３：局所的な腫瘍抗原特異的免疫応答に対する免疫原性組成物の腫瘍内投与の効果
【０２２１】
この実施例では、多糖多量体化剤のみに会合したまたはさらに腫瘍抗原（Ａｇ）と会合したＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）を含む粒子を含む免疫原性組成物の投与による、腫瘍抗原特異的細胞性Ｔ細胞応答の誘発を説明する。この実施例において、多糖多量体化剤は、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅがＦＩＣＯＬＬ（登録商標）として販売する高ＭＷの、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであった。しかしながら、ジェネリックバージョンまたはバイオシミラー（ノーブランドまたは他の商標）も使用に適しているので、この部分は、本明細書中で単にＦｉｃと称される。
【０２２２】
腫瘍モデル。免疫原性組成物を、実施例Ｂ１に記載されたＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫およびＢ１６−ＯＶＡメラノーマモデルにおいて試験した。
【０２２３】
免疫原性組成物および処置レジメン。Ｄ６１−０１は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）のような、３つの核酸部分および２つの非核酸部分を有する直鎖状のキメラ化合物である。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、オボアルブミンポリペプチド：ＣＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶ（配列番号１１）を含む。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｔｒｉｐｌｅ粒子は、３つのエピトープを融合ポリペプチドとして含む：ＶＧＡＬＥＧＰＲＮＱＤＷＬＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＴＡＹＲＹＨＬＬＳＳＶＹＤＦＦＶＷＬＳＣ（ここで、Ｘは、Ｌ−シクロヘキシルアラニンである）（配列番号１４）。免疫原性組成物を、腫瘍内注射（ＩＴ）または腫瘍外注射（この実施例では皮下（ＳＣ）注射を含んだ）によって投与した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および５６μｇのＯＶＡｐｅｐを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｔｒｉｐｌｅ粒子は、１５０μｌの体積において５５μｇのＤ６１−０１および５０μｇのＴｒｉｐｌｅを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１を含む１用量として送達した。確立されたＥＧ７腫瘍またはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスに、０、７および１０日目に注射した。
【０２２４】
浸潤白血球を抽出するための腫瘍の処理。最後の注射の３日後に、腫瘍を回収した。腫瘍をメスの刃で小片に切断し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む１０ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０細胞培養液が入ったｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）に移した。５０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ５１３８−１００ＭＧコラゲナーゼ）および２ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ（ウシ膵臓由来のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＤＮ２５−１００ＭＧデオキシリボヌクレアーゼＩ）を含む１００マイクロリットルの１００×腫瘍消化酵素混合物を、腫瘍フラグメントを含むｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に加えた。腫瘍を、３７℃加熱アタッチメントを備えるｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭＯｃｔｏ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）においてｍ＿ＬＤＫ＿１プログラムを用いて単一細胞懸濁液に解離した。サンプルを７０μｍフィルターで濾過した。サンプルを、室温、１４００ｒｐｍで７分間遠心分離し、腫瘍サイズに応じて、１〜５体積の、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩに再懸濁した。
【０２２５】
腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）の単離。ＬＹＭＰＨＯＬＹＴＥ（登録商標）Ｍａｍｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を使用して、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）を腫瘍細胞から分離した。これらの腫瘍から得られた細胞懸濁液を、５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩを加えることによって７、１４または２１ｍＬという総体積にした。これは、ペレットサイズ、ならびにＴＩＬおよび腫瘍細胞の適切な分離を確保するためにその細胞懸濁液を複数のチューブに分けるための要件によって決定された。まず、１５ｍＬコニカルチューブを、７ｍＬのＬＹＭＰＨＯＬＹＴＥ（登録商標）−Ｍａｍｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＣＬ５１２０）で満たした後、その上に慎重に７ｍＬの細胞懸濁液を重ねた。細胞を、ブレーキなし、室温（ＲＴ）、８００×ｇで２０分間遠心分離した。分離培地と細胞培養液との間の界面に形成した層を５０ｍＬチューブに移し、それを、５０ｍＬという総体積になるように５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ培地で満たした。細胞を、最大加速度および最大ブレーキの下、ＲＴ、１８００ｒｐｍで７分間、ペレットにした。培地を吸引し、ＴＩＬ含有ペレットを１ｍＬの、５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に再懸濁した。
【０２２６】
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の作製。精製緩衝液（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ）で洗い流すことによって３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から骨髄を回収し、プールした。５ｍＬの赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｒ７７５７）を用いてＲＴにおいて５分間、赤血球を溶解し、１０ｍＬの精製緩衝液を加えることによって、その反応物を中和した。サンプルを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３１５−０３）および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２１４−１４）が補充された前駆細胞培地μ（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび５５μＭ  ２−β−メルカプトエタノール）に１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁した。組織培養無処理ペトリ皿（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３５１０２９）１枚につき１０ｍＬの細胞懸濁液を加え、プレートを５％ＣＯ２および３７℃でインキュベートした。培養の３日目に、５ｍＬの培地を除去し、４０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦおよび２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ４を含む５ｍＬの新鮮前駆細胞培地を加えることによって、サイトカインを各皿に補充した。培養物を、使用前にさらに３日間インキュベートした。
【０２２７】
ＢＭＤＣのペプチドパルス。ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）を、製造者の指示書に従って、ｐａｎ−ＤＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．１３０−１００−８７５）とのインキュベーションおよび磁気分離によって骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）培養物から濃縮した。単離されたら、ＢＭＤＣを１０×１０６細胞／ｍＬの濃度で前駆細胞培地に再懸濁した。１０μｇ／ｍＬの最終濃度のＯＶＡクラスＩ拘束性ペプチド（配列番号１２として示されるＳＩＩＮＦＥＫＬ）を加え、細胞を５％ＣＯ２の３７℃恒温器内に３０分間入れた。ペプチドをパルスしたＤＣを、１０ｍＬの前駆細胞培地で２回洗浄し、その後のアッセイに向けて１ｍＬの前駆細胞培地に再懸濁した。
【０２２８】
ペプチドをパルスした樹状細胞による腫瘍浸潤白血球のインビトロ刺激。ＬＹＭＰＨＯＬＹＴＥ（登録商標）Ｍａｍｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）を用いて単離されたおよそ２５０，０００個のＴＩＬを、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．３７９９）の１ウェルあたりに加え、ＲＴにおいて５分間、１６００ｒｐｍで遠心分離した。ペプチドをパルスしたＤＣを、３μｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を４００，０００細胞／ｍＬの濃度で含む前駆細胞培地に再懸濁した。次いで、２００μＬのＤＣ細胞懸濁液を、ペレットにしたＴＩＬを含む各ウェルに加え、上下にピペッティングすることによって細胞を懸濁した。ＴＩＬ−ＤＣ共培養物を１６００ｒｐｍで１分間遠心分離して、細胞と細胞との接触を確実に生じさせ、５％ＣＯ２、３７℃で４時間インキュベートした。細胞内染色およびフローサイトメトリーによって、サンプルをサイトカイン産生について解析した。
【０２２９】
フローサイトメトリーに向けた細胞内および細胞表面の染色。すべての試薬を４℃で維持し、すべての洗浄を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム）を加えた後、プレーティングされた細胞懸濁液を上下にピペッティングし、４℃、１６００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって行った。４時間のインキュベーションの後、ＴＩＬ−ＤＣ共培養物をペレットにし、５μＬのＨ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＡＰＣ（Ｉｍｍｕｄｅｘ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＪＤ２１６３）またはＨ−２Ｋｂ／ＴＡＹＲＹＨＬＬ−ＡＰＣ（Ｉｍｍｕｄｅｘ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＪＤ４１３８）デキストラマーを含む４５μＬの染色緩衝液に再懸濁した。ＳＩＩＮＦＥＫＬは、ＯＶＡクラスＩペプチド（配列番号１２）であり、ＴＡＹＲＹＨＬＬは、Ｔｒｐ１クラスＩペプチド（配列番号１５）である。染色緩衝液は、２μＬ／１００μＬのＦｃブロックが補充された、ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＢＲＩＬＬＩＡＮＴＴＭ  Ｖｉｏｌｅｔ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）とＦＡＣＳ緩衝液との１：１混合物であった。サンプルを４℃で１０分間インキュベートした後、細胞表面マーカーに対する抗体を含む５０μＬの染色緩衝液を加えた。サンプルを４℃でさらに２０分間インキュベートし、３回洗浄し、２００μＬの固定緩衝液（０．５％パラホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁した。サンプルを４℃で一晩固定し、光から保護した。
【０２３０】
細胞内のサイトカインを染色するために、４℃で一晩貯蔵されたサンプルを、ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮＴＭＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒセット（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５６２７２５）を製造者の指示書に従って使用して固定し、透過処理した。簡潔には、細胞をペレットにし、１００μＬの１×Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液に再懸濁し、４℃で４０分間インキュベートした。サンプルを、２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、２．５μＬの抗マウスＩＦＮ−γ−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５５４４１２）および１．５μＬの抗マウスＴＮＦ−α−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５６０６５８）を含む１００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁した。４℃でさらに４０分間インキュベーションした後、サンプルを２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、解析に向けて３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）製のＬＳＲＩＩフローサイトメーターを用いて直ちにデータを取得した。
【０２３１】
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γ計測のためのリンパ節の処理。最後の注射の３日後に、腫瘍流入領域リンパ節を回収した。５ｍＬの５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ中のリンパ節を７０μＭフィルターに通して、３ｍＬのシリンジプランジャーを用いて均質化することによって、単一細胞懸濁液を生成した。フィルター上に残ったいずれの組織も収集し、均質化されたリンパ節を含むチューブに加えた。組織解離酵素を加え、チューブを反転させることによって時々混合しながらサンプルを３７℃で２０分間インキュベートした。１０ｍＬの５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩを加えることによって、反応を中和した。サンプルを遠心分離し、その後のアッセイに向けて２ｍＬの前駆細胞培地に再懸濁した。
【０２３２】
約５００，０００個のリンパ節細胞を、１００μＬの前駆細胞培地が入った９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに加えた。２×濃度のペプチドの段階希釈を行い、１００μＬを各ウェルに加えた。商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＤＹ４８５）を製造者の指示書に従って使用して、組織培養上清中のＩＦＮ−γを計測した。サンプルの光学濃度が検量線の線形の範囲内に入った場合、このアッセイを妥当であるとみなした。自発的なサイトカイン産生のレベルを決定するためにペプチドの非存在下においてインキュベートされたコントロールを基準として決定されたバックグラウンド濃度レベルを減算することによって、値を計算した。
【０２３３】
結果。表Ｂ３−１およびＢ３−２は、ＩＴまたはＳＣ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐまたはＤ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｔｒｉｐｌｅで処置されたマウスのＴＩＬによる抗原特異的サイトカインの産生の大きさを示している。無処置で放置されたかまたはＩＴ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ（アジュバントのみ）で処置されたコントロールマウスのＴＩＬによる抗原特異的サイトカインの産生も示されている。データは、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γを同時に産生する抗原特異的ＴＩＬの平均パーセンテージ＋／−ＳＥＭを表している。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算した。０．０５未満の値を有意であるとみなした。
【表Ｂ３−１】
2019515900.tif 000048
【表Ｂ３−２】
2019515900.tif 000049
【０２３４】
図５は、ＩＴまたはＳＣ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐで処置されたマウスの腫瘍流入領域リンパ節のリンパ球による抗原特異的サイトカインの産生の大きさを示している。無処置で放置されたかまたはＩＴ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ（アジュバントのみ）で処置されたコントロールマウスのリンパ球による抗原特異的サイトカインの産生も示されている。
【０２３５】
優れた細胞傷害機能を有する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴は、複数のサイトカインを同時に分泌することである。この表現型の獲得は、腫瘍を拒絶する能力の増大と相関する（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０５：２０４１０−１５，２００８；Ａｒａｎｄａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７１：３２１４，２０１１；Ｍａｎｄｌら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ，２：３４，２０１４；Ｉｍａｉら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，３９：２４１−５３，２００９；およびＭａｒｓｈａｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，７２：５８１−９１，２０１２）。２つの原型的なＴｈ１サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの分泌を、同族ペプチドによる再刺激の後の細胞内ＦＡＣＳ解析によって評価した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ａｇの腫瘍内注射は、その両方のサイトカインを発現する抗原特異的細胞の割合を、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ａｇの皮下注射またはＤ６１−０１−Ｆｉｃのみの腫瘍内注射に対して観察された割合を超えて増加させた。
【０２３６】
樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍微小環境内で活性化されると、腫瘍流入領域リンパ節に移動し、そこでＣＤ８＋Ｔ細胞と相互作用して、腫瘍を破壊できる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）への成熟を促進する。その結果として、リンパ節細胞の腫瘍抗原特異的再刺激（ｒｅｃａｌｌ）応答の評価は、腫瘍微小環境が腫瘍抗原特異的ＣＴＬの拡大を促進する能力の読み取りを提供する。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−Ｏｖａｐｅｐの腫瘍内注射は、ＥＧ７−ＯＶＡモデルとＢ１６−ＯＶＡモデルの両方において腫瘍流入領域リンパ節細胞からのＩＦＮ−γの産生を大幅に増加させた。培養上清中で検出されたＩＦＮ−γの量が、刺激のために使用したＯＶＡクラスＩペプチドの量に正比例したので、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、このサイトカイン応答の主要な駆動物質であった。まとめると、これらの結果は、腫瘍内ワクチン接種が、遠位の部位における皮下ワクチン接種または抗原の非存在下の腫瘍内ワクチン接種と比べて、機能が高まった抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分化を促進することを実証している。
実施例Ｂ４：全身性の腫瘍抗原特異的免疫応答に対する免疫原性組成物の腫瘍内投与の効果
【０２３７】
この実施例では、多糖多量体化剤のみと会合したまたはさらに腫瘍抗原（Ａｇ）と会合したＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）を含む粒子を含む免疫原性組成物の投与による腫瘍抗原特異的細胞性Ｔ細胞応答の誘発を説明する。この実施例において、多糖多量体化剤は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ）がＦＩＣＯＬＬ（登録商標）として販売する高ＭＷの、スクロースとエピクロロヒドリンとの分枝状コポリマーであった。しかしながら、ジェネリックバージョンまたはバイオシミラー（ノーブランドまたは他の商標）も使用に適しているので、この部分は、本明細書中で単にＦｉｃと称される。
【０２３８】
腫瘍モデル。免疫原性組成物を、実施例Ｂ１に記載されたＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫モデルおよびＢ１６−ＯＶＡメラノーマモデルにおいて試験した。対側腫瘍におけるＴＩＬのエキソビボ解析のために、腫瘍細胞を同じ日に右側腹部と左側腹部の両方に接種した。転移に対する免疫原性組成物の効果を解析するために、静脈内経路によってＢ１６−ＯＶＡ細胞を注入することによって肺腫瘍を確立し、皮下経路によってＢ１６−ＯＶＡ細胞を注入することによって皮下腫瘍を確立した。
【０２３９】
免疫原性組成物および処置レジメン。Ｄ６１−０１は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）のような、３つの核酸部分および２つの非核酸部分を有する直鎖状のキメラ化合物である。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、オボアルブミンポリペプチド：ＣＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶ（配列番号１１）を含む。免疫原性組成物を、腫瘍内注射（ＩＴ）または腫瘍外注射（この実施例では皮下（ＳＣ）注射を含んだ）によって投与した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および５６μｇのＯＶＡｐｅｐを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１を含む１用量として送達した。脾臓リンパ球を解析するために、０、３および７日目に、確立されたＥＧ７腫瘍またはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウス（ｍｉｃｅ  ｂｉｃｅ）に対して注射を行った。反対側のＴＩＬを解析するために、１１、１４および１８日目（研究１）または１０、１３および１７日目（研究２）に、右側腹部と左側腹部の両方に確立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスに対して、右の腫瘍におけるＩＴ注射、または右と左の両方の腫瘍から遠位の部位におけるＳＣ注射を行った。転移に対する免疫原性組成物の効果を解析するために、皮下腫瘍と肺腫瘍とを同時（ｃｏｎｃｏｍｍｉｔａｎｔ）に有するマウスに対して、皮下腫瘍の植え込み後の８、１２、１５および１８日目に免疫原性組成物の注射を行った。
【０２４０】
脾臓の処理およびＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ。最後の免疫化の３日後に、脾臓を回収し、脾細胞を単離した。５ｍＬの５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ中の脾臓を７０μＭフィルターに通すことによって、単一細胞懸濁液を生成した。サンプルを遠心分離し、ＲＴにおいて５分間、５ｍＬの赤血球溶解緩衝液に再懸濁した。１０ｍＬの５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩを加えることによって反応を中和し、続いて、サンプルを遠心分離し、２ｍＬの前駆細胞培地に再懸濁した。約５００，０００個の脾細胞を、１００μＬの前駆細胞培地が入った９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに加えた。２×濃度のペプチドの段階希釈を行い、１ウェルあたり１００μＬを加えた。実施例Ｂ３に記載されたように、組織培養上清中のＩＦＮ−γを計測した。
【０２４１】
腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）の単離。実施例Ｂ３に記載されたように、腫瘍を回収し、ＴＩＬを単離し、刺激した。
【０２４２】
フローサイトメトリーに向けた細胞内および細胞表面の染色。ＴＩＬサンプルを、５μＬのＨ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＡＰＣ（Ｉｍｍｕｄｅｘ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．ＪＤ２１６３）デキストラマーを含む４５μＬのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。サンプルを４℃で１０分間インキュベートした後、ＣＤ１０７ａ−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．４６−１０７１−８２）などの細胞表面マーカーに対する抗体（５０μＬあたり１．５μＬ）を含む５０μＬの染色緩衝液を加えた。サンプルを４℃でさらに２０分間インキュベートし、３回洗浄し、２００μＬの固定緩衝液（０．５％パラホルムアルデヒドを含むＦＡＣＳ緩衝液）に再懸濁した。サンプルを、光から保護して４℃で一晩固定した。細胞内染色のために、４℃で一晩貯蔵されたサンプルを、ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮＴＭＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｕｆｆｅｒセット（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５６２７２５）を製造者の指示書に従って使用して固定し、透過処理した。簡潔には、細胞をペレットにし、１００μＬの１×Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液に再懸濁し、４℃で４０分間インキュベートした。サンプルを、２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、２μＬのグランザイムＢ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．５１５４０３）または１．５μＬのＫｉ６７−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．６５２４０４）を含む１００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁した。４℃でさらに４０分間インキュベーションした後、サンプルを２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、解析に向けて３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製のＬＳＲＩＩ）を用いて直ちにデータを取得した。すべての試薬を４℃で維持し、すべての洗浄を、２００μＬの緩衝液を加え、プレーティングされた細胞懸濁液を上下にピペッティングし、４℃、１６００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって行った。
【０２４３】
遺伝子発現。ＲＮＥａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用して、ＲＮＡを腫瘍から単離した。ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて、全腫瘍から抽出されたＲＮＡに対して遺伝子発現解析を行った。ｎＳｏｌｖｅｒＴＭ解析ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて、データ解析を行った。
【０２４４】
結果。図６Ａは、ＩＴまたはＳＣ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐで処置されたマウスの脾細胞による抗原特異的サイトカインの産生の大きさを示している。無処置で放置されたかまたはＩＴ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ（アジュバントのみ）で処置されたコントロールマウスの脾細胞による抗原特異的サイトカインの産生も示されている。
【０２４５】
図６Ｂは、両側性のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を確立し、その後、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子で処置するスケジュールの概略図を提供している。図６Ｃは、注射されずに放置された反対側の腫瘍および注射された右の腫瘍の腫瘍体積の変化を表している成長曲線を示している。
【０２４６】
表Ｂ４−１、Ｂ４−２およびＢ４−３は、ＩＴまたはＳＣ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐで処置されたマウスの反対側の（注射されていない）腫瘍のＴＩＬの特色を示している。無処置で放置されたかまたはＩＴ注射によって投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃ（アジュバントのみ）で処置されたコントロールマウスのＴＩＬの特色も示されている。データは、２〜４つの独立した腫瘍のプールからなる群１つあたり２または３つの生物学的反復のパーセンテージ＋／−を表している。統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて計算し、０．０５未満の値を有意であるとみなした。
【表Ｂ４−１】
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【表Ｂ４−２】
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【表Ｂ４−３】
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【０２４７】
反対側の腫瘍由来のＴＩＬの免疫表現型を決定した。表Ｂ４−１は、ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇナノ粒子の腫瘍内注射が、反対側の腫瘍への腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の優れた輸送を促進することを示している。ＯＶＡクラスＩペプチドへの結合を計測することによって、抗原特異性を評価した。表Ｂ４−２は、ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇナノ粒子の腫瘍内注射が、反対側の腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を高めることを示している。グランザイムＢセリンプロテアーゼおよび脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）の発現について染色することによって、細胞傷害性を評価した。表Ｂ４−３は、ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇナノ粒子の腫瘍内注射が、反対側の腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能を高めることを示している。Ｋｉ６７＋発現について染色することによって、増殖能を評価した。
【０２４８】
図７Ａは、両側性のＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を確立し、その後、ＴＬＲ９アゴニスト含有ナノ粒子で処置するスケジュールの概略図を提供している。図７Ｂは、腫瘍内経路による免疫原性組成物（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ）の投与が、皮下注射を介する腫瘍外投与と比べて、遠位の部位／注射されていない腫瘍（対側）において、より強い腫瘍成長の抑制を誘発したことを示している。図７Ｃは、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性細胞、Ｔｈ１細胞およびＮＫ細胞のシグネチャが、ＳＣでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍、ＩＴ経路によってＤ６１−０１−Ｆｉｃのみを注射されたマウス由来の注射されていない腫瘍（ＩＴコントロール）またはワクチン接種されていないマウス由来の腫瘍と比べて、ＩＴでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍において、有意にアップレギュレートされることを示している。
【０２４９】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）のｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ＰａｎｅｌおよびｎＳｏｌｖｅｒＴＭ解析ソフトウェアを用いて、腫瘍組織において遺伝子発現解析を行った。多数の免疫応答関連遺伝子のセットの差次的発現の累積尺度である方向付けグローバル有意性スコア（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｓｃｏｒｅ）を決定した。免疫応答のアップレギュレーションを示唆する高い方向付けグローバル有意性スコアは、１．０超である。免疫応答のダウンレギュレーションを示唆する低い方向付けグローバル有意性スコアは、１．０未満である。
【０２５０】
表Ｂ４−４は、ワクチン接種されていないマウス由来の腫瘍を基準として、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐをＳＣでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍と比較して、またはＩＴ経路によってＤ６１−０１−Ｆｉｃのみを投与されたマウス由来の注射されていない腫瘍（ＩＴコントロール）と比較して、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐをＩＴでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍において方向付けグローバル有意性スコアが上昇したことを示している。これらのデータは、ＩＴでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍の免疫機能シグネチャのすべてが、ワクチン接種されていないマウス由来の腫瘍と比較してアップレギュレートされることを示している。さらに、ＩＴでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍の免疫機能シグネチャのすべてが、ＳＣでワクチン接種されたマウス由来の注射されていない腫瘍またはＩＴ経路によってＤ６１−０１−Ｆｉｃのみを投与されたマウス由来の腫瘍（ＩＴコントロール）と比べて、より強くアップレギュレートされる。
【表Ｂ４−４】
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【０２５１】
図８Ａは、マウスの皮下腔と肺の両方におけるＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍の確立を示している模式図を提供している。皮下腫瘍と肺腫瘍を同時に有するマウスの皮下で成長している腫瘍（ＩＴ）または遠位の部位（ＳＣ）に、Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐをワクチン接種した。ＩＴで投与されたＤ６１−０１−Ｆｉｃアジュバントのみをコントロールとして使用した。
【０２５２】
図８Ｂ〜８Ｄは、腫瘍内経路による免疫原性組成物（Ｄ６１−０１−Ｆｉｃ−ＯＶＡｐｅｐ）の投与が、腫瘍から遠位の部位への皮下注射を介した腫瘍外投与と比べて、遠位部位の肺転移において優れた抗腫瘍応答を誘発したことを実証している。
【０２５３】
がんによる死亡は、常に、原発腫瘍細胞が体内の遠位部位に転移して広がることが原因である。がんに対するワクチン接種の主な目標は、原発腫瘍を根絶できるだけでなく、散在した疾患（遠位部位の腫瘍）を除去することもできる免疫応答を誘発することである。腫瘍流入領域リンパ節は、腫瘍から直接、細胞輸送を受け取るのに対して、脾臓は、末梢循環を通って全身に輸送する細胞の貯蔵所を提供する。全身性の抗原特異的免疫の発生を、ＥＧ７モデルとＢ１６−ＯＶＡモデルの両方においてワクチン接種されたすべての群から単離された脾細胞からのＩＦＮ−γの用量依存的誘導によって確認した。最もロバストな誘導が、ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇをワクチン接種された腫瘍内の群において観察されたことから、腫瘍内ワクチン接種が、優れた全身性の腫瘍抗原特異的免疫応答を誘導することが実証された。
【０２５４】
ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇを腫瘍内にワクチン接種されたマウスにおける反対側の腫瘍は、皮下にワクチン接種されたマウスまたはＣｐＧ−Ｆｉｃのみを腫瘍内にワクチン接種されたマウスと比べて、より遅い速度で成長した。したがって、より高い割合の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇを腫瘍内にワクチン接種されたマウスの反対側の腫瘍に見られた（表Ｂ４−１）。
【０２５５】
ＣｐＧの腫瘍内投与によってもたらされたＴｈ１に偏った微小環境内でＩＦＮ−γに曝露された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、溶解酵素グランザイムＢの発現をアップレギュレートする。グランザイムＢを発現する細胞は、ＭＨＣクラスＩの状況において同族ペプチドを提示する細胞を認識できる用意が整っている。このペプチドが認識されると、活性化によって誘導される、ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒が生じ、これは、細胞溶解の必要な前駆体である。脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの細胞表面露出は、このプロセスを特定するための、十分に確立された方法である。高度に細胞傷害性のグランザイムＢ＋ＣＤ１０７ａ＋抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を反対側の腫瘍においてモニターした。ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇを腫瘍内にワクチン接種されたマウス由来のより高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞が、この高度に細胞傷害性の表現型を獲得したことが観察された（表Ｂ４−２）。さらに、より高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞が、増殖マーカーＫｉ６７を発現したので、増殖能が高まっていた（表Ｂ４−３）。
【０２５６】
ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇの腫瘍内投与は、原発腫瘍の成長を有意に阻害するように機能するだけでなく、ＣｐＧ−Ｆｉｃ−Ａｇの皮下投与またはＡｇの非存在下のＣｐＧ−Ｆｉｃの腫瘍内投与によって誘発される免疫応答よりも優れた全身性の免疫応答も誘導する。その全身性の免疫応答は、高い細胞傷害性および増殖能を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発によって特徴づけられ、この２つの特色は、遠位の部位における腫瘍成長を効果的に制御するのに必要である。
実施例Ｂ５：腫瘍のサイズおよび転移に対する、免疫原性組成物の腫瘍外投与と比較したときの腫瘍内投与の効果
【０２５７】
この実施例では、アルミニウム塩多量体化剤のみと会合したまたはさらに腫瘍抗原（Ａｇ）と会合したＴＬＲ９アゴニスト（ＣｐＧ）を含む粒子を含む免疫原性組成物の投与による腫瘍成長の制御を説明する。この実施例において、アルミニウム塩多量体化剤は、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｎｏｒｄｉｃ  Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）がＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）として販売する水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）製剤であった。しかしながら、ジェネリックバージョンまたはバイオシミラー（ノーブランドまたは他の商標）も使用に適しているので、この製剤は、本明細書中でＡｌｕｍと称される。
【０２５８】
腫瘍モデル。免疫原性組成物を、実施例Ｂ１に記載されたＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫モデルおよびＢ１６−ＯＶＡメラノーマモデルにおいて試験した。転移に対する免疫原性組成物の効果を解析するために、静脈内経路によってＢ１６−ＯＶＡ細胞を注射することによって肺腫瘍を確立し、皮下経路によってＢ１６−ＯＶＡ細胞を注射することによって皮下腫瘍を確立した。
【０２５９】
免疫原性組成物および処置レジメン。Ｄ６１−０１は、５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＡＡＣＧＴＴＣ−３’−ＨＥＧ−５’−ＴＣＧＧＣＧＣ−３’（配列番号５）のような、３つの核酸部分および２つの非核酸部分を有する直鎖状のキメラ化合物である。Ｄ６１−０４は、ポリヌクレオチド：５’−ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＧＴＴ  ＣＧＡ  ＡＣＧ  ＴＴＣ  ＧＡＡ  ＣＧＴ  ＴＣＧ  ＡＡＴ−３’（配列番号６）である。Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐおよびＤ６１−０４−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、オボアルブミンポリペプチド：ＣＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫＩＫＶ（配列番号１１）を含む。Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ−Ｔｒｉｐｌｅ粒子は、３つのエピトープを融合ポリペプチドとして含む：ＶＧＡＬＥＧＰＲＮＱＤＷＬＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＴＡＹＲＹＨＬＬＳＳＶＹＤＦＦＶＷＬＳＣ（ここで、Ｘは、Ｌ−シクロヘキシルアラニンである）（配列番号１４）。免疫原性組成物を、腫瘍内注射（ＩＴ）または腫瘍外注射（この実施例では皮下（ＳＣ）注射を含んだ）によって投与した。Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および３５μｇのＯＶＡｐｅｐを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ−Ｔｒｉｐｌｅ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１および３５μｇのＴｒｉｐｌｅを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ粒子は、１５０μｌの体積において５０μｇのＤ６１−０１を含む１用量として送達した。Ｄ６１−０４−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐ粒子は、１５０μｌの体積において４５μｇのＤ６１−０１および４５．６μｇのＯＶＡｐｅｐを含む１用量として送達した。Ｄ６１−０１研究では、確立されたＢ１６−ＯＶＡメラノーマまたはＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫腫瘍を有するマウスに対して、８、１１および１５日目に注射を行った。Ｄ６１−０４研究では、確立されたＢ１６−ＯＶＡメラノーマ腫瘍を有するマウスに対して、皮下腫瘍の植え込みの後、１１、１４、１８および２１日目に注射を行った。
【０２６０】
腫瘍成長の計測。腫瘍サイズを、３次元（長さ；Ｌ、幅；Ｗおよび深さ；Ｄ）のマイクロノギス計測によって決定し、以下の式：（Ｌ×Ｗ×Ｄ／２）を用いて体積を計算した。
【０２６１】
結果。図１０Ａ〜Ｃの結果は、腫瘍内経路による免疫原性組成物の投与が、腫瘍から遠位の部位への皮下注射を介した腫瘍外投与と比べて、優れた抗腫瘍応答を誘発したことを実証している。
【０２６２】
ハイスループット配列決定技術の進歩は、ＣＤ８＋Ｔ細胞による認識に対する新規エピトープを生成し得る患者特異的腫瘍点変異を特定することへの関心を促した。抗原の起源としてこれらの患者特異的新規エピトープを探究する理論的根拠は、これらのエピトープが新規に生じたものであるので、それらはＣＴＬ応答の強さを弱める免疫調節機構を受けていないからというものである。がんワクチンの個人化には、アジュバントと患者特異的ネオ抗原を同じ細胞に同時に送達する迅速かつ効率的な方法が必要である。
【０２６３】
Ａｌｕｍ粒子製剤の調製は、ＣｐＧおよび／または腫瘍抗原を付着するために多段階の化学的結合体化を必要としないので、Ｆｉｃプラットフォームの代替物として、Ａｌｕｍを使用することが探索された。ＣｐＧ−Ｆｉｃプラットフォームで観察されたものと同様に、Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐまたはＤ６１−０１−Ａｌｕｍ−Ｔｒｉｐｌｅ微小粒子の腫瘍内投与は、Ａｇの非存在下のＤ６１−０１−Ａｌｕｍの皮下投与または腫瘍内投与と比べて、優れた抗腫瘍応答をもたらした（図１０Ａ〜Ｂ）。Ａｌｕｍのみの腫瘍内投与は、抗腫瘍効果をもたらさず、ワクチン接種されていないコントロールと同じ速度で腫瘍が成長した。Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐまたはＤ６１−０１−Ａｌｕｍは、腫瘍内に投与されたとき、Ｄ６１−０１−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐ共吸着体と同じ腫瘍成長の減少を達成しなかった（図１０Ｃ）。このことは、最大の抗腫瘍活性のためにはＣｐＧと抗原の両方がＡｌｕｍに同時吸収することが要求されることを確かめ、これは、Ｆｉｃプラットフォームを用いて観察されたものを再現している。まとめると、これらの結果は、粒子製剤としてのＡｌｕｍが、腫瘍内にＣｐＧアジュバントおよび抗原と同時に送達されたとき、優れた抗腫瘍応答を達成できることを実証している。
【０２６４】
図１１Ａ〜Ｂの結果は、腫瘍内経路による免疫原性組成物（Ｄ６１−０４−Ａｌｕｍ−ＯＶＡｐｅｐ）の投与が、腫瘍から遠位の部位への皮下注射を介した腫瘍外投与と比べて、遠位部位の肺転移の腫瘍の体積と数の両方に関して、優れた抗腫瘍応答を誘発したことを実証している。すなわち、ＴＬＲ９−ａｌｕｍ−腫瘍抗原粒子を含む例示的な免疫原性組成物の投与は、腫瘍の体積を減少させることおよび高悪性度の遠位部位の肺転移を排除することができる全身性の免疫応答を誘導する際に有効である。さらに、この抗腫瘍応答の有効性は、組成物が腫瘍内経路によって投与されたとき、有意に高まる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
2019515900.tif 000057
【図３ＡＢ】
2019515900.tif 000058
【図３ＣＤ】
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【図４】
2019515900.tif 000060
【図５】
2019515900.tif 000061
【図６Ａ】
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【図６ＢＣ】
2019515900.tif 000063
【図７ＡＢ】
2019515900.tif 000064
【図７Ｃ】
2019515900.tif 000065
【図８ＡＢ】
2019515900.tif 000066
【図８ＣＤ】
2019515900.tif 000067
【図９】
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【図１０】
2019515900.tif 000069
【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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