(57)【要約】  ハイブリッドナノ粒子により長期寛容を誘導するための方法および組成物が提供される。自然免疫細胞に対する固有の親和性を有するハイブリッドナノ粒子を含む組成物および処方が提供される。【選択図】図１Ｇ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物、および任意に（ｉｉ）ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物
の有効量を患者に投与することを含む免疫寛容を誘導する方法。
【請求項２】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグであり、およびＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与が、Ｌｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦ発達を促進する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
患者が、セリアック病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、甲状腺炎、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、強皮症、乾癬、関節炎、関節リウマチ、脱毛症、強直性脊椎炎、チャーグ・ストラウス症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、皮膚筋炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、重症筋無力症、心筋炎、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症から成る群より選択される自己免疫状態を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
患者が、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全およびそれらの組み合わせなどの、冠動脈アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症の続発症を含むアテローム性動脈硬化状態になりやすいまたはそれを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症を治療する方法。
【請求項７】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することをさらに含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＤＬが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含みおよびＡｐｏＡ−１をさらに含む、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アテローム性動脈硬化症が、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全およびそれらの組み合わせなどの、冠動脈アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症の続発症を含む、請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む、プラークまたは血管炎症部位においてマクロファージおよび／または単球を標的化する方法。
【請求項１３】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することをさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＤＬが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含みおよびＡｐｏＡ−１をさらに含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、器官または組織拒絶の予防のための方法。
【請求項１８】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＤＬが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含みおよびＡｐｏＡ−１をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者が、器官または組織移植を経験したことがありおよび移植組織が、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
組成物が、静脈内または動脈内に投与される、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
１以上の免疫抑制剤を患者に投与することをさらに含む、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、アテローム性動脈硬化症の進行を遅くするための方法。
【請求項２４】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＤＬが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含みおよびＡｐｏＡ−１をさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物。
【請求項２７】
ＨＤＬが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含みおよびＡｐｏＡ−１をさらに含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
ＭＨＰＣに対するＤＭＰＣの重量比が、約３：１である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬまたはラパマイシン−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
ａ）請求項２６に記載の組成物の薬学的有効量およびｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む薬学的組成物。
【請求項３１】
１以上の免疫抑制剤または抗炎症剤をさらに含む、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
免疫抑制剤が、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６である、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物。
【請求項３４】
ＨＤＬが、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含みおよびＡｐｏＡ−１をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
ＭＨＰＣに対するＤＭＰＣの重量比が、約８：１〜約９：１の範囲である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
ａ）請求項３３に記載の組成物の薬学的有効量、およびｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む薬学的組成物。
【請求項３８】
請求項３０に記載の薬学的組成物および請求項３７に記載の薬学的組成物を含む薬学的組成物。
【請求項３９】
請求項２６、３０、３３、３７、または３８に記載の組成物を含むキット。
【請求項４０】
前記ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンである、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
１以上の免疫抑制剤をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４２】
免疫抑制剤が、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６またはラパマイシンである、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、６８７７００２である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４４】
それを必要とする患者に請求項２９、３４、または３６に記載の薬学的組成物の有効量を投与することを含む、患者において同種移植片生着を延長するための方法。
【請求項４５】
それを必要とする患者に請求項３０、３７、または３８に記載の組成物の有効量を投与することを含む、患者において樹状細胞刺激能力を減少させるための方法。
【請求項４６】
それを必要とする患者に請求項３０、３７、または３８に記載の組成物の有効量を投与することを含む、患者において調節性マクロファージの発達を促進するための方法。
【請求項４７】
それを必要とする患者に請求項３０、３７、または３８に記載の組成物の有効量を投与することを含む患者において移植寛容を誘導する方法。
【請求項４８】
それを必要とする患者に請求項３０または３８に記載の組成物の有効量を投与することを含む患者において骨髄細胞を標的化する方法であって、ｍＴＯＲ−ＨＤＬが、患者の血液循環中のＭｏ／ＭΦ数を減少させる、方法。
【請求項４９】
組成物が、骨髄細胞を特異的に標的とする、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
患者が、移植を経験したことがありおよび移植組織が、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
移植組織が、インタクトな器官である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
患者が、同種組織または器官移植を受けたことがある、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
方法が、同種組織または器官移植の実行の前に行われる、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
方法が、同種組織または器官移植と同時に行われる、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
方法が、同種組織または器官移植後の少なくとも２週間以内に行われる、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
対象が、ヒトである、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
組成物が、静脈内または動脈内に投与される、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
１以上の免疫抑制薬学的剤を患者に投与することをさらに含む、請求項４４から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
免疫抑制剤が、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６である、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３２９，６７６号の優先権を主張し、それは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
政府のサポート
この発明は、国立衛生研究所により贈られた助成金Ｒ０１ＨＬ１１８４４０、Ｒ０１ＨＬ１２５７０３、Ｒ０１ＣＡ１５５４３２、Ｒ０１ＥＢ００９６３８、Ｋ２５ＥＢ０１６６７３およびＰ３０ＣＡ００８７４８の下、政府のサポートを受けた。政府は、本発明において、いくらかの権利を有する。
【０００３】
発明の属する技術分野
ハイブリッドナノ粒子により長期寛容を誘導するための方法および組成物が提供される。自然免疫細胞に対する固有の親和性を有するハイブリッドナノ粒子を含む組成物および処方が提供される。
【背景技術】
【０００４】
背景
無期限の同種移植片生着は、器官移植において、捉えどころがないゴールのままである移植は、器官拒絶を防ぐために免疫システムの抑制を必要とする。器官移植を経験する患者は通常、コルチコステロイド、タクロリムス、シクロスポリンおよびシロリムス（ラパマイシン）１〜３を含むがこれらに限定されない免疫抑制薬物混合物を受ける。かかる免疫抑制療法は、器官移植の短期間結果を劇的に改善した。しかしながら、全ての免疫抑制剤は、感染およびかなりの代謝毒性などの深刻な有害な影響を有する４。従って、習慣的な免疫抑制治療由来の毒性を減少させ、その延長で、長期生着を改善するための継続的な必要性がある。現在利用可能な免疫抑制剤をより毒性の少ない方法で使用する努力にも関わらず、これらの薬物のほぼ普遍的な使用に真剣に挑戦する代替レジメンはない。
【０００５】
歴史的に、移植免疫学者は、適応免疫応答メカニズムを標的とすることにより、新規の寛容原性のプロトコルを開発することを試みてきた。かかる仕事は、Ｔ細胞が、同種移植片拒絶を誘導するのに、必要不可欠でありおよび十分であるという観察に基づいてきた。しかしながら、マウスモデルにおいて達成される移植寛容の誘導は、活性化Ｔ細胞の欠失などの、適応免疫のみを標的とするメカニズムにより完全に説明することができない５〜７。どのくらい多数の非特異的な応答が免疫活性に影響を与えるかについての我々の理解における近年の進歩は、どのように自然免疫システムが、（ａ）器官移植に反応するか、および（ｂ）同種移植片寛容の誘導に対し適応免疫応答に決定的に影響を与えるかを明らかにした８〜１４。しかしながら、自然免疫システムは、器官移植において成功裏に探索されていない、可能性のあるインビボ治療標的である。
【０００６】
ラパマイシンは、移植において最も広く用いられる免疫抑制薬物の一つである。この薬物は、ｍＴＯＲ阻害を介してＴおよびＢリンパ球活性化をブロックし、およびＴ細胞増殖を効率的に阻害する１８。しかしながら、この薬物の使用は、感染のしやすさの増加を含む、深刻な副作用と関連している１９、２０。
【０００７】
現在の治療において、同種移植片生着は、免疫抑制薬物のカクテルを必要とする。自然免疫システムを標的とする実験的抗体は、深刻な副作用を有する長期寛容を誘導することが示されてきた。
【０００８】
従って、自然免疫システムを調節でき、副作用をほとんど伴わずに長期寛容を誘導できる治療に対するニーズが存在する。
【０００９】
アテローム性動脈硬化症は、世界での主要な死因および身体障害の原因の一つである。アテローム性動脈硬化症は、動脈内腔表面上での脂肪プラークの堆積に関与し、それは次に狭窄、すなわち、動脈を狭くすることを引き起こす。最終的に、この堆積は、虚血損傷を引き起こす病変に対して遠位の血流をブロックする。
【００１０】
アテローム性動脈硬化症のためのより有効な治療法およびプラーク炎症を標的とする新規のものを開発する必要性が未だ存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−Ｇ】図１Ａ〜Ｇは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ免疫療法、同種移植片モデル、生体分布および免疫細胞標的化の概要を示す略図である。図１Ａは、リン脂質、ヒトＡＰＯＡ１およびラパマイシンから合成されたｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子が透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により評価された円盤状形状を有したこと、およびそれらが８９Ｚｒで放射線標識され得ることを示す略図である。図１Ｂは、ＰＥＴイメージングおよび生体分布のために放射線標識されるか、または自然および適応免疫システムの細胞サブセット中での分布のために蛍光標識される、ｍＴＯＲナノ免疫療法を受ける完全同種異系Ｃ５７ＢＬ／６レシピエント（Ｈ２ｂ）に移植されるＢＡＬＢ／ｃドナー心臓（Ｈ２ｄ）を示す概略図である。図１Ｃは、８９Ｚｒ（８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）で放射線標識されたｍＴＯＲ−ＨＤＬの静脈内投与の２４時間後のマウスの代表的なｍｉｃｒｏ−ＰＥＴ／ＣＴ３Ｄ融合画像である。ＣＴ画像を、関心領域を作成するための解剖学的参照として用いて移植された心臓における放射能濃度を決定した（３Ｄ−動画をＳ２Ａとして提供する。）。図１Ｄは、関心のある組織（腎臓、肝臓、脾臓、血液、骨、皮膚および筋肉）における、注入２４時間後の８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬの生体分布を示す放射能数のグラフである。放射能含有量を、組織のグラムあたりの注入された投与量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表した。エラーバーは、平均（ＳＥＭ）の標準誤差である、ｎ＝３。図１Ｅは、同一のレシピエント中の、８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬの静脈内投与後２４時間の、天然の（Ｎ）ｖｓ．移植された心臓（Ｔｘ）における放射性追跡子分布を決定したオートラジオグラフィーである。定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）である、ｎ＝３。図１Ｆは、血液、脾臓および移植された心臓における骨髄細胞を区別するためのフローサイトメトリーゲーティングストラテジーのグラフ表現である。灰色のヒストグラムは、対照（黒ヒストグラム）と比較した、ＤｉＯ−標識したｍＴＯＲ−ＨＤＬを注入されたマウスにおける免疫細胞分布を示す。図１Ｇは、血液、脾臓および移植される心臓における好中球、単球／マクロファージ、Ｌｙ−６ＣｌｏおよびＬｙ−６Ｃｈｉ単球／マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。エラーバーは、平均（ＳＥＭ）の標準誤差である、ｎ＝４；ＡＮＯＶＡ＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ免疫療法が、自然免疫システムのバランスを取り戻すことを示す画像およびグラフである。図２Ａは、移植に浸潤する白血球、好中球、マクロファージおよび樹状細胞の合計数を示すグラフである。移植６日後でのプラセボ、経口−ＲａおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置を受けたレシピエントの移植心臓における異なる細胞サブセットのフローサイトメトリー解析を示す（ＡＮＯＶＡ＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１）。図２Ｂは、プラセボ、経口−ＲａおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置を受けたレシピエントの移植された心臓におけるＬｙ−６Ｃｈｉ対Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージの頻度を示すグラフ表現である。データは平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝４；ＡＮＯＶＡ＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１を表す。図２Ｃは、ＧＳＥＡ遺伝子アレイ解析の画像を提示する。結果は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントからのＬｙ−６Ｃｌｏ移植片内マクロファージにおいて、ｍＴＯＲパスウェイが下方制御されることを示す。移植６日後でのｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントの同種移植片からのＬｙ−６Ｃｌｏマクロファージにおいてｐ＜０．０５を達成する選択された遺伝子のＧＳＥＡデータ由来のヒートマップを示す（群あたりｎ＝３の平均）。
【図３Ａ−Ｇ】図３Ａ〜Ｇは、ＨＤＬナノ免疫療法が調節性マクロファージの蓄積を誘導し、および移植片受容を促進することを示す略図およびグラフである。図３Ａは、移植６日後のプラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したマウスからの移植浸潤Ｌｙ−６ＣｌｏおよびＬｙ−６ＣｈｉＭΦおよびＬｙ−６Ｇ好中球の画像機能的特徴を示す。プラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置した同種移植片レシピエントからの、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋同種移植片、骨髄細胞サブセットにおける、Ｌｙ−６ＣおよびＬｙ−６Ｇ発現についての代表的かつ定量的なフローサイトメトリー結果（上）。プラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置したマウスからの移植浸潤Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦのインビトロ抑制能力を測定した。７２時間後のＣＳＦＥ希釈により測定される細胞増殖パーセンテージを用いた、ＣＦＳＥ  ＣＤ８＋Ｔ細胞についての定量的なフローサイトメトリー結果を示す（中）。プラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置したマウスからの移植浸潤Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦのインビトロＴ−ｒｅｇ増殖能力を評価した。フローサイトメトリー解析は、７２時間の共培養後のＣＤ４＋Ｔ細胞についてのＦｏｘｐ３発現のパーセンテージを示す（下）。データを平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝４；ｔ−検定＊＊Ｐ≦０．０１として示す。図３Ｂは、プラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置した同種移植片レシピエントからの、移植浸潤ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ｖｓ．ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ−細胞のパーセンテージを示す画像である。データを、平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝４；ｔ−検定＊＊Ｐ≦０．０１として示す。図３Ｃは、移植６日後での、Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦ枯渇に次いでｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置したマウスからの、移植片に浸潤するＬｙ−６ＣｌｏおよびＬｙ−６ＣｈｉＭΦおよびＬｙ−６Ｇ好中球の表現型特徴を示す散布図およびグラフである。Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦ枯渇のためにＤＴを受けたｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置したＣＤ１６９−ＤＴＲレシピエントの移植浸潤ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞サブセットの代表的なおよび定量的なフローサイトメトリー結果。データを、平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝４；ｔ−検定＊＊Ｐ≦０．０１として示す。図３Ｄは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントにおける、Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージ枯渇に次ぐ移植片生着を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。結果は、野生型単球の養子移入が、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したマクロファージ枯渇レシピエントにおいて寛容を回復することを示す（各群においてｎ＝４マウス；Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ＊＊Ｐ≦０．０１）。図３Ｅは、プラセボ対ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエント同種移植片から得たＬｙ−６Ｃｌｏマクロファージにおける、ＣＤ４０の発現についての遺伝子アレイののボックスプロットである（群あたりｎ＝３の平均；ｔ−検定＊＊Ｐ≦０．０１）。図３Ｆは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ免疫療法を伴ってまたは伴わずにインビボでアゴニスト刺激性ＣＤ４０ｍＡｂを受けたｍＴＯＲ−ＨＤＬレシピエントの移植片生着を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である（各群においてｎ＝５マウス；Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ＊＊Ｐ≦０．０１）。図３Ｇは、プラセボ、経口−Ｒａ、ｍＴＯＲ−ＨＤＬおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ���ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ組み合わせ療法の移植片生着曲線を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である（各群においてｎ＝８マウス、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生着解析；Ｐ≦０．００１プラセボｖｓ．ｍＴＯＲ−ＨＤＬ、Ｐ≦０．０１経口−Ｒａ  ｖｓ．ｍＴＯＲ−ＨＤＬ、Ｐ≦０．０１  ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ  ｖｓ．ｍＴＯＲ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ、Ｐ≦０．０１  ｍＴＯＲ−ＨＤＬ  ｖｓ．ｍＴＯＲ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）。
【図４】図４は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬの円盤形態を示す透過型電子顕微鏡写真である。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ〜Ｃは、Ｃ５７／Ｂｌ６野生型マウスにおける生理学的生体分布およびｍＴＯＲ−ＨＤＬ標的化を示すグラフおよび画像である。図５Ａは、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および筋肉における蓄積を示す、移植２４時間前のＰＢＳ対照（器官の最初の行）またはＤｉＲ−標識したｍＴＯＲ−ＨＤＬのいずれかを注入された器官の代表的な近赤外蛍光画像（ＮＩＲＦ）を示す。右パネルは、対照およびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−ＤｉＲ群において、各器官の合計シグナルを割ることにより計算した、各器官における対照対ｍＴＯＲ−ＨＤＬ−ＤｉＲ蓄積割合を表すバーを伴うグラフである。エラーバーは、平均（ＳＥＭ．）の標準誤差、ｎ＝４；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１である。図５Ｂは、血液および脾臓における骨髄細胞分布を示すグラフである。灰色のヒストグラム（右）は、対照動物における分布（黒ヒストグラム）と比較した、ＤｉＯ−標識したｍＴＯＲ−ＨＤＬを注入されたマウスにおける分布を示す。図５Ｃは、血液および脾臓における好中球、単球／マクロファージプール、Ｌｙ−６Ｃｌｏ／Ｌｙ−６Ｃｈｉ単球および樹状細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。エラーバーは、平均（ＳＥＭ．）の標準誤差、ｎ＝４；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１である。
【図６】図６は、移植心臓、腎臓、肝臓および脾臓における平均％ＩＤ／ｇによる、ＰＥＴ−定量化された取り込み値を示すグラフである、ｎ＝３。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ免疫療法がＴリンパ球を標的としないことを示すグラフおよびフローサイトメトリー画像である。図７Ａは、血液および移植心臓において、Ｔ細胞を区別するためのフローサイトメトリーゲーティングストラテジーを示す散布図である。灰色のヒストグラム（右）は、対照動物における分布（黒ヒストグラム）と比較した、ＤｉＯ−標識したｍＴＯＲ−ＨＤＬを注入されたマウスにおけるＴ細胞分布を示す。図７Ｂは、血液および移植心臓における単球／マクロファージ、ＣＤ３＋Ｔ、ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ−細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである。エラーバーは、平均（ＳＥＭ．）の標準誤差、ｎ＝４；＊＊Ｐ≦０．０１；＊＊＊Ｐ≦０．００１である。
【図８】図８は、移植後６日での、プラセボ、経口−ＲａおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置した同種移植片レシピエントの血液および脾臓から回収した細胞懸濁液のフローサイトメトリー解析を示すグラフである。データを、平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝４；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１として示す。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜Ｂは、プラセボ、経口−ＲａおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置した同種移植片レシピエントからの血液および脾臓におけるＬｙ−６Ｃｈｉ対Ｌｙ−６Ｃｌｏ単球の頻度と関連する略図およびグラフである。図９Ｂは、プラセボ、経口−ＲａおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置した同種移植片レシピエントの血液、脾臓および移植心臓における、Ｌｙ−６Ｃｌｏ単球に対するＬｙ−６Ｃｈｉ単球の割合を示すグラフである。データを、平均±ＳＥＭ；群あたりｎ＝４；＊Ｐ≦０．０５；＊＊Ｐ≦０．０１として示す。
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡにより分析した、プラセボ、経口−ＲａおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置した同種移植片レシピエントからの血清における、移植後６日のＴＮＦ−α分泌を示すグラフである。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ〜Ｂは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの円盤形態を示す透過型電子顕微鏡写真である。ナノ粒子は、それぞれＤＬＳおよびＨＰＬＣにより決定される、１９．２±３．１ｎｍの平均流体力学的半径および８４．６±８．６％の薬物取り込み効率を有した。図１１Ｂは、粒子が積層構造である場合にＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ粒子の円盤形態を評価でき、一方でトップダウンの視点から粒子を観察する場合にナノ粒子のサイズを評価できることを示す。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜Ｂは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ免疫療法が、皮膚同種移植片生着を劇的に延長することを示す画像およびＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。図１２Ａは、デジタルカメラを有する顕微鏡により確認された、移植後の異なる時点での対照およびｍＴＯＲ−ＨＤＬ−処置したマウスにおける皮膚同種移植片拒絶を示す画像である。図１２Ｂは、皮膚同種移植片のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である（各群においてｎ＝４マウス、プラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬ間Ｐ≦０．０１）。
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ〜Ｂは、毒性評価についての、腎臓および肝臓画像（図１３Ａ）および心臓免疫組織化学（ＩＨＣ）（図１３Ｂ）を示すグラフである。ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）およびマッソントリクローム（マッソン）についてのＩＨＣの腎臓および肝臓の代表的な画像は、毒性の兆候を示さない。ｍＴｏｒ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したレシピエントからの腎臓および肝臓を、移植１００日後で採取した（ｎ＝４；倍率Ｘ２００）。図１３Ｂにおいて、Ｈ＆ＥおよびシリウスレッドについてのＩＨＣの代表的な画像は、慢性同種移植脈管症（ＣＡＶ）の兆候を示さない。ｍＴｏｒ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦｉ−ＨＤＬ処置したレシピエントからの心臓同種移植片を、移植後１００日（ｄａｔ）で回収した（ｎ＝４；倍率Ｘ２００）。慢性同種移植脈管症解析である、図１３Ｂでは、切片は、動脈炎を伴わない軽度の粘膜炎症を示し、内膜肥厚の兆候は示さない。マウス大動脈セグメントは、内膜肥厚を伴わずに組織学的変化を示さず、およびＣＡＶの兆候を示さなかった。
【図１４Ａ−Ｇ】図１４Ａ〜Ｇは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子生体分布および取り込みを示す画像、概略図およびグラフである。８週齢Ａｐｏｅ−／−マウスに、１２週間高コレステロール食を給餌し、その後８９Ｚｒ−、ＤｉＲ−またはＤｉＯ−標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子のいずれかでのＩＶ注入を受けさせた。２４時間後、マウスを、ＰＥＴ／ＣＴイメージングに用いたか、生体外ＮＩＲＦイメージングまたはフローサイトメトリー解析のために犠牲にした。図１４Ａは、ヒトａｐｏＡ−Ｉ、脂質（ＤＭＰＣおよびＭＨＰＣ）およびＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の低分子阻害剤を組み合わせることにより作成した、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの略図である。図１４Ｂは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを調査するためにとられた次の工程を示す研究概要である。図１４Ｃは、肝臓、脾臓および腎臓において最も高い取り込みを示す、血液減衰曲線（左パネル）および投与後２４時間での全身３Ｄ−レンダリングＰＥＴ／ＣＴ融合画像（右パネル）を示す、Ａｐｏｅ−＼−マウスにおける８９Ｚｒ−標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの薬物動態を示すグラフである。図１４Ｄは、投与後２４時間での８９Ｚｒ−標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの分布のガンマカウントのグラフである。大動脈のオートラジオグラフィーは、マウスモデルにおいてアテローム性動脈硬化症発生の起こりやすい場所である、大動脈基部における可視性のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ蓄積を示す。図１４Ｅは、マウス大動脈におけるＤｉＲ−標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ分布のＮＩＲＦイメージング（ｎ＝２）、および大動脈基部面積におけるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの蓄積を示す対応するグラフを示す。図１４Ｆは、ＤｉＯ−標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを用いたマウス大動脈全体のデータのフローサイトメトリー（ｎ＝８）であり、マクロファージおよびＬｙ６Ｃｈｉ単球の高い標的化効率を示し、一方で系列陽性のＣＤ１１ｂ陰性細胞はナノ粒子を取り込まなかった。＊＊＊ｐ＜０．００１。図１４Ｇは、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球およびマクロファージがＤｉＯ標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを取り込んだことを示す、骨髄、血液、脾臓および大動脈細胞のフローサイトメトリー解析の画像である。好中球、Ｌｙ６Ｃｌｏ単球および樹状細胞もＤｉＯ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを取り込んだが、系列陽性の細胞（全ての非骨髄細胞）は取り込まなかった。バーは平均の標準誤差を表す。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａ〜Ｂは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法が組織学により評価されるプラークマクロファージ含有量を減少させたことを説明する、画像およびグラフである。８週齢Ａｐｏｅ−／−マウスに高コレステロール食を１２週間給餌し、続いて７日にわたり、ＰＢＳ（ｎ＝１０）、ｒＨＤＬ（ｎ＝１０）またはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝１０）のいずれかの４回のｉ．ｖ．注入処置を受けさせた。最後の注入の２４時間後に、大動脈基部を切片（４μＭ）にし、免疫組織化学方法で染色した。図１５Ａは、処置群間でプラークサイズ（Ｈ＆Ｅ）、コラーゲン含有量（シリウスレッド）または増殖細胞の数（Ｋｉ６７染色）に差がないことを示す大動脈基部の画像およびグラフである。図１５Ｂは、大動脈基部のＭａｃ３染色を示しマクロファージ陽性の面積の著しい減少およびコラーゲンに対するマクロファージのより低い割合を説明する画像およびグラフである。＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１６Ａ−Ｅ】図１６Ａ〜Ｅは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬが、損なわれたＬｙ６Ｃｈｉ単球リクルートメントのために、プラーク炎症を減少させることを示す画像およびグラフである。１２週間の高コレステロール食での８週齢Ａｐｏｅ−／−マウスを、単一週以内にプラセボ（ＰＢＳ）、ｒＨＤＬまたはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬのいずれかの４回のｉ．ｖ．注入で処置した。図１６Ａは、プラセボ（ｎ＝８）処置群と比較した、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝７）における大動脈基部での著しく減少したプロテアーゼ活性を示す、ＦＭＴ／ＣＴイメージングの画像およびグラフである。図１６Ｂは、プラセボ（ｎ＝２７）およびｒＨＤＬ（ｎ＝２６）と比較した、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝２７）処置群におけるマクロファージの数における有意な減少を示す、大動脈全体のフローサイトメトリー解析の画像である。Ｌｙ６Ｃｈｉ単球もまた著しくＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ群において減少したという事実は、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球リクルートメントの減損を示す。図１６Ｃは、プラークＬｙ６Ｃｈｉ単球含有量の減少が、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の全身性減少に起因したと考えられなかったことを示した、骨髄、血液および脾臓のフローサイトメトリー解析の画像およびグラフである。（図１６Ｄは、プラークマクロファージ増殖に対しるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの効果がないことを示す、インビボＢｒｄＵ取り込み実験の画像である。図１６Ｅは、マクロファージ増殖への効果がないことを示した、プラセボ、ｒＨＤＬ、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ、ｂａｒｅＣＤ４０−ＴＲＡＦ６低分子阻害剤またはｒＨＤＬ＋ｂａｒｅＣＤ４０−ＴＲＡＦ６低分子阻害剤の組み合わせで、２４時間処理したＲＡＷ２６４．７マクロファージにおける、ＢｒｄＵ取り込みのインビトロ実験（ｎ＝３）からのグラフである。＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１７Ａ−Ｄ】図１７Ａ〜Ｄは、影響される過程の中で特に、細胞移動に対するＴＲＡＦ６ｉ処置の効果を説明する、プラーク単球／マクロファージの全トランスクリプトーム解析からのデータを反映するグラフおよび略図である。８週齢ＡｐｏＥ−／−マウスに高コレステロール食を１２週間給餌し、その後プラセボ（ｎ＝１０）またはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝１０）のいずれかの４回のｉ．ｖ．注入で７日にわたり処置した。最後の注入の２４時間後に、マウスを犠牲にしおよび大動脈基部の凍結切片をレーザー捕捉顕微解剖によるプラークマクロファージの単離に用い、続いてＲＮＡの単離および配列解析を行った。図１７Ａは、プラーク単球／マクロファージにおいて差次的に発現される（ＤＥ）遺伝子の分布を示す、Ｖｏｌｃａｎｏプロットである。図１７Ｂは、０．２のＦＤＲ閾値のカットオフ値による、有意に上方および下方制御された遺伝子の合計数を示すグラフである。ＦＤＲ＜０．２は、ｐ−値＜０．００９に対応する。（図１７Ｃは、遺伝子オントロジー（ＧＯ）データベース中のＤＥ遺伝子セットの遺伝子濃縮解析であり、ＤＥ遺伝子が著しく濃縮された１５のＧＯタームを示す。図１７Ｄは、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）パスウェイツールを用いて４１６ＤＥ遺伝子をマッピングすることにより同定された、２つの有意に変化したパスウェイ（接着斑およびエンドサイトーシス）を示すマクロファージの略図である。ＦＤＲ＜０．０５を有する８つの最も有意なＤＥ遺伝子およびそれらの細胞内での位置も示す（より濃い黒の遺伝子は上方制御され、より明るい灰色の遺伝子は下方制御され、遺伝子を図２３〜２４でリストにした）。
【図１８Ａ−Ｃ】図１８Ａ〜Ｃは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法が、非ヒト霊長類において毒性効果を示さないことを説明するグラフおよび画像である。６匹の非ヒト霊長類にプラセボ（ｎ＝３）または１．２５ｍｇ／ｋｇＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝３）のいずれかを注入した。血液を複数の時点で採取し、および動物を注入の７２時間後に犠牲にした。図１８Ａは、リンパ球、赤血球および血小板へのＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法の影響がないことを示す全血球数のグラフである。図１８Ｂは、肝臓、腎臓、膵臓または筋肉細胞バイオマーカーへのＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ注入の毒性効果がないことを示す大規模血液化学解析のグラフである。脂質、グルコース、タンパク質（アルブミンおよびグロブリン）および電解質も影響されなかった。図１８Ｃは、組織学的解析のため切片にされおよび染色され（Ｈ＆Ｅ）、病理学者により評価された肝臓、腎臓および脾臓からの検体の画像である。組織損傷または組織構造におけるかく乱の兆候は、いずれの組織においても認められなかった。
【図１９Ａ−Ｄ】図１９Ａ〜Ｄは、非ヒト霊長類におけるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ生体分布を示す画像およびグラフである。６匹の非ヒト霊長類に８９Ｚｒ−標識したＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを注入した。注入の６０分以内に動的ＰＥＴ画像を獲得した。静的ＰＥＴ／ＭＲＩスキャンを２４、４８および７２時間で行った。ＮＨＰを７２時間後に犠牲にした。器官を生体外解析のために採取した。図１９Ａは、１、５、１５、３０および６０分での動的ＰＥＴ画像である。画像を、肝臓および他の器官を別々に可視化するため分割した。グラフは、異なる時点での表示された器官における定量化された取り込みを示す。右の回転画像は、６０分での分布の３Ｄ表現を示す。図１９Ｂは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの分布および蓄積を示す、２４、４８および７２時間での追加の静的ＰＥＴ／ＭＲ画像である。グラフは、異なる時点での代表的な器官における定量化された取り込みを示す。図１９Ｃは、８９Ｚｒ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの投与後２４および７２時間での、ＮＨＰにおける分布のガンマカウントを反映するグラフおよび画像を含む。図１９Ｄは、ＮＨＰにおける８９Ｚｒ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬについての血液時間活性曲線を示すグラフである。
【図２０】図２０は、プラセボ、ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したＡｐｏｅ−／−マウスの全血球数値を示す表である。Ｐ−値を、ＫｒｕｓｋａｌＷａｌｌｉｓ検定を用いて計算した。
【図２１】図２１は、プラセボおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したＡｐｏｅ−／−マウスの血液化学値を示す表である。Ｐ−値を、マンホイットニーＵ検定により計算した。アルカリホスファターゼのわずかな増加を除いて、群のいずれの間にも有意な差は観察されなかった。
【図２２】図２２は、遺伝子オントロジータームにおける遺伝子の差次的発現変動を示す表である。Ａｐｏｅ−／−マウスの大動脈洞プラークからのＣＤ６８陽性の細胞を、レーザー捕捉顕微解剖により単離した。１５のＧＯタームは、差次的に発現された遺伝子の濃縮を示した。Ｐ−値を、調整したｐ−値として示した。
【図２３】図２３は、２つの主な同定されたＫＥＧＧパスウェイにおける、遺伝子の差次的発現変動を示す表である。Ａｐｏｅ−／−マウスの大動脈洞プラークからのＣＤ６８陽性の細胞を、レーザー捕捉顕微解剖により単離した。プラセボおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したＡｐｏｅ−／−マウス間での、２つの顕著なＫＥＧＧパスウェイである、接着斑およびエンドサイトーシスにおける遺伝子の差次的発現変動。Ｐ−値を、調整していないｐ−値として示す。
【図２４】図２４は、ＦＤＲ＜０．０５を有する遺伝子の差次的発現変動を示す表である。Ａｐｏｅ−／−マウスの大動脈洞プラークからのＣＤ６８陽性の細胞を、レーザー捕捉顕微解剖により単離した。プラセボおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したＡｐｏｅ−／−マウス間での遺伝子の差次的発現変動を示す。Ｐ−値を、調整したｐ−値として示す。
【図２５】図２５は、増殖、アポトーシスおよび移動性退出に関与する遺伝子の差次的発現変動を示す表である。Ａｐｏｅ−／−マウスの大動脈洞プラークからのＣＤ６８陽性の細胞を、レーザー捕捉顕微解剖により単離した。プラセボおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したＡｐｏｅ−／−マウス間での遺伝子の差次的発現変動を示す。調整していないＰ値を示す。
【発明の概要】
【００１２】
概要
患者において同種移植片生着を延長するための方法が本開示に包含され、この方法はそれを必要とする患者に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。
【００１３】
本開示は、それを必要とする患者に本発明の組成物の有効量を投与することを含む、患者において樹状細胞刺激能力を減少させるための方法を提供する。
【００１４】
本開示は、それを必要とする患者に本発明の組成物の有効量を投与することを含む、患者において調節性マクロファージの発達を促進するための方法を提供する。
【００１５】
本開示は、それを必要とする患者に本発明の組成物の有効量を投与することを含む、患者において移植寛容を誘導する方法を提供する。
【００１６】
本開示は、それを必要とする患者に本発明の組成物の有効量を投与することを含む、患者において骨髄細胞を標的とする方法であって、ｍＴＯＲ−ＨＤＬが患者の血液循環においてＭｏ／ＭΦ数を減少させる、方法を提供する。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、骨髄細胞を特異的に標的とする。
【００１８】
特定の実施形態において、患者は移植を経験したことがあり、移植組織は肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である。特定の実施形態において、移植組織は、インタクトな器官である。
【００１９】
特定の実施形態において、患者は同種組織または器官移植を受けたことがある。特定の実施形態において、本方法は、同種組織または器官移植の実行の前に行われる。特定の実施形態において、方法は、同種組織または器官移植と同時に行われる。特定の実施形態において、方法は、同種組織または器官移植後の少なくとも２週間以内に行われる。
【００２０】
特定の実施形態において、対象または患者はヒトである。
【００２１】
特定の実施形態において、組成物は、静脈内または動脈内に投与される。
【００２２】
特定の実施形態において、本方法は、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６などの、１以上の免疫抑制剤を患者に投与することをさらに含む。
【００２３】
本開示は、（ｉ）ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物、および任意に（ｉｉ）ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む、免疫寛容を誘導する方法を提供する。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。特定の実施形態において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。
【００２４】
特定の実施形態において、投与は、Ｌｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦ発達を促進する。
【００２５】
特定の実施形態において、患者は、セリアック病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、甲状腺炎、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、強皮症、乾癬、関節炎、関節リウマチ、脱毛症、強直性脊椎炎、チャーグ・ストラウス症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、皮膚筋炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、重症筋無力症、心筋炎、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症から成る群より選択される自己免疫状態を有する。
【００２６】
特定の実施形態において、患者は、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全およびそれらの組み合わせなどの、冠動脈アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症の続発症を含むアテローム性動脈硬化状態になりやすいまたはそれを有している。
【００２７】
本開示は、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む、アテローム性動脈硬化症を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。
【００２８】
特定の実施形態において、本方法は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。特定の実施形態において、ＨＤＬは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含み、およびＡｐｏＡ−１をさらに含む。
【００２９】
特定の実施形態において、アテローム性動脈硬化症は、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全およびそれらの組み合わせなどの、冠動脈アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症の続発症を含む。
【００３０】
本開示は、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することを含む、プラークまたは血管炎症部位においてマクロファージおよび／または単球を標的化する方法を提供する。特定の実施形態において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。
【００３１】
特定の実施形態において、本方法は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量を患者に投与することをさらに含む。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。特定の実施形態において、ＨＤＬは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含み、およびＡｐｏＡ−１をさらに含む。
【００３２】
本開示は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、器官または組織拒絶の予防ための方法を提供する。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。特定の実施形態において、ＨＤＬは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含み、およびＡｐｏＡ−１をさらに含む。
【００３３】
特定の実施形態において、患者は器官または組織移植を経験したことがあり、および移植組織は肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である。
【００３４】
特定の実施形態において、組成物は、静脈内または動脈内に投与される。
【００３５】
特定の実施形態において、本方法は、１以上の免疫抑制剤を患者に投与することをさらに含む。
【００３６】
アテローム性動脈硬化症の進行を遅くするための方法も本開示に包含され、この方法はＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物の有効量をそれを必要とする患者に投与する工程を含む。特定の実施形態において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。特定の実施形態において、ＨＤＬは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含み、およびＡｐｏＡ−１をさらに含む。
【００３７】
本開示は、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む、高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、ＨＤＬは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含み、およびＡｐｏＡ−１をさらに含む。特定の実施形態において、ＭＨＰＣに対するＤＭＰＣの重量比は約３：１である。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬまたはラパマイシン−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。
【００３８】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、１以上の免疫抑制剤または抗炎症剤をさらに含む。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６である。
【００３９】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物も、本開示に包含される。特定の実施形態において、ＨＤＬは、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含み、およびＡｐｏＡ−１をさらに含む。特定の実施形態において、ＭＨＰＣに対するＤＭＰＣの重量比は、約８：１〜約９：１の範囲である。特定の実施形態において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。
【００４０】
本開示は、ａ）本発明の組成物の薬学的有効量、およびｂ）薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む薬学的組成物も提供する。
【００４１】
本開示は、ａ）ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物、およびｂ）ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を含む組成物を含む薬学的組成物を提供する。
【００４２】
本開示は、本発明の組成物を含むキットを提供する。特定の実施形態において、ｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンである。特定の実施形態において、キットは、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６またはラパマイシンなどの、１以上の免疫抑制剤をさらに含む。特定の実施形態において、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤は６８７７００２である。
【００４３】
本開示は、免疫寛容を誘導するための組成物の調製における、ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）、および任意に（ｉｉ）ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の使用を提供する。
【００４４】
本開示は、アテローム性動脈硬化症を治療するための組成物の調製における、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の使用を提供する。
【００４５】
本開示は、プラークまたは血管炎症部位においてマクロファージおよび／または単球を標的とするための組成物の調製における、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の使用を提供する。
【００４６】
本開示は、器官または組織拒絶の予防のための組成物の調製における、ｍＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の使用を提供する。
【００４７】
本開示は、アテローム性動脈硬化症の進行を遅くするための組成物の調製における、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の使用を提供する。
【００４８】
本開示は、それを必要とする患者において同種移植片生着を延長するための組成物の調製における、本発明のナノ粒子の使用を提供する。
【００４９】
本開示は、それを必要とする患者において樹状細胞刺激能力を減少させるための組成物の調製における、本発明のナノ粒子の使用を提供する。
【００５０】
本開示は、それを必要とする患者において調節性マクロファージの発達を促進するための組成物の調製における、本発明のナノ粒子の使用を提供する。
【００５１】
本開示は、それを必要とする患者において移植寛容を誘導するための組成物の調製における、本発明のナノ粒子の使用を提供する。
【００５２】
本開示は、それを必要とする患者において骨髄細胞を標的化するための組成物の調製における、本発明のナノ粒子の使用を提供する。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、患者の血液循環においてＭｏ／ＭΦ数を減少させる。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
詳細な説明
ラパマイシンを自然免疫細胞に送達するために高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）を開発した。天然リン脂質およびアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（ＡＰＯＡ１）のコロナ中にラパマイシンをカプセル化する、ラパマイシン−ＨＤＬ（典型的にはｍＴＯＲ−ＨＤＬ）と名付けられたハイブリッドＨＤＬナノ粒子を、同種移植片生着を延長するために開発した。ＨＤＬ−ナノ粒子はＡＰＯＡ１を含有し、それはスカベンジャー受容体タイプＢ−１（ｓｒ−ｂ１）およびアデノシン三リン酸−結合カセットトランスポーターＡ１（ＡＢＣＡ１）を介して効率的にマクロファージ細胞に結合する２１、２２。結果として、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子は、インビボでラパマイシンを特異的に自然免疫細胞に送達する。直径〜１５ｎｍであるｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子は、〜６５％の高いカプセル充填効率を有する。放射線標識したｍＴＯＲ−ＨＤＬは、移植された心臓において特異的に蓄積することおよび主に骨髄細胞と関連していることが観察された。結果は、移植された心臓における、Ｌｙ−６Ｃｈｉ／Ｌｙ−６ＣｌｏｗおよびＣＤ２５−／ＣＤ２５＋細胞の有意な減少を実証する。この処置は、同種移植片生着の劇的な増強ももたらした。
【００５４】
その上、本発明者らは、低分子阻害剤（ＴＲＡＦ−ＳＴＯＰ）を取り込む、ＴＲＡＦ６上のＣＤ４０の結合ドメインに対するＨＤＬナノ生物製剤を開発した（以下、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬと称する）。６８７７００２阻害剤をこのＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの開発のために用いた（６８７７００２阻害剤は、他の阻害剤と同様に、Ｃｈａｔｚｉｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔａｌ、２０１４に記載されおよび米国特許第９，４０８，８２９号にも記載される）。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子は、１９．２±３．１ｎｍの平均流体力学的半径および８４．６±８．６％の薬物取り込み効率を有した。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子は、単独で、または本明細書中に記載されるｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子（ｎａｎｏｐｒａｔｉｃｌｅｓ）と組み合わせて用いられ得る。
【００５５】
代替の実施形態において、ＳＭＩ６８６０７６６（ＶａｎｄｅｒＢｅｒｇｅｔａｌ、２０１５に記載される）などの他のＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を用いて、代替のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを形成できる。これらの阻害剤は、単独で、または本明細書中に記載される他のナノ生物製剤のいずれかと組み合わせて用いることができる。ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用をブロックするための追加の適した化合物は、米国特許第９，４０８，８２９号に記載される。
【００５６】
分子イメージングおよび免疫学的技術と組み合わせた心臓移植実験モデルを用いて、本データは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬが、樹状細胞の強力な刺激能力を制限し、調節性マクロファージの発生を促進し、および心臓同種移植片生着を無期限に延長することを実証する。レジメンは、移植後第一週の間の５ｍｇ／ｋｇ当量のラパマイシンの３回の静脈尾静脈内注入のみを含んだ。コンピュータ断層撮影によるインビボ陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ−ＣＴ）イメージングおよび免疫学的アッセイのアレイの組み合わせを用いて、本発明者らは、心臓同種移植片の標的化および細胞特異性を評価した。本発明者らは続いて広範囲に、自然免疫応答、同種移植片生着および治療メカニズムを研究した。我々のデータは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子処置が無期限の心臓同種移植片生着を促進することを実証する。その上、本発明者らは、皮膚移植モデルにおいて、これらの結果を拡張できた。これらの結果は、臨床においてドナー−特異的な非応答を誘導するための免疫応答をどのように操作するかおよびヒトにおいて同種移植片拒絶を防ぐかもしれない新規の治療上の標的をどのように同定するかについてのクリティカルな情報を提供する。
【００５７】
さらに、本データは、抑制性ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６特異的なナノ免疫療法（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）と組み合わせてｍＴＯＲ−ＨＤＬを用いる短期間の治療的処理置が無期限の同種移植片生着を引き起こす器官移植受容を相乗的に促進することを実証する。
【００５８】
合わせて、結果は、ＨＤＬ−ベースのナノ療法が移植寛容の誘導のための有効な治療パラダイムを表すことを実証する。本研究は、寛容誘導する免疫調節性マクロファージを生み出す新規の治療的ナノ医薬化合物および治療を開発するための基礎を提供する。その上、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置は、アテローム性動脈硬化症においてマクロファージ蓄積を解決しおよび非ヒト霊長類において望ましい安全性および有効性プロファイルを示すことが示された。
【００５９】
定義および方法
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）（ｍＴＯＲ−阻害剤−ＨＤＬとして示される）を含み、ｍ−ＴＯＲ阻害剤などの例は、ラパマイシンナノ粒子として処方される（典型的にはｍＴＯＲ−ＨＤＬ）、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。代替の実施形態において、組成物は、１以上のラパマイシン派生物およびラパマイシンシグナリングカスケード（Ｓ６Ｋ）の可能性のある標的を含んでもよい。
【００６０】
特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントをさらに含んでもよい。
【００６１】
特定の実施形態において、ＨＤＬ組成物は、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、またはアザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル、およびそれらのアナログ（例えば、エベロリムス、ＡＢＴ−５７８、ＣＣＩ−７７９、およびＡＰ２３５７３）などの１以上の追加の免疫抑制と組み合わせて投与できる。
【００６２】
一実施形態において、「患者」または「対象」は、哺乳動物を指し、およびヒトおよび獣医対象を含む。一実施形態において、対象は、哺乳類である。
【００６３】
一実施形態において、化合物は、薬学的に許容可能な担体を含む組成物で投与される。
【００６４】
特定の実施形態において、発明は、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の治療上有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、同種移植片拒絶が介在する障害または疾患の治療または予防の方法であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグ、またはそれらの薬学的組成物である、方法に関連する。一実施形態において、対象は同種移植片拒絶のリスクがあり、方法は同種移植片拒絶を防ぐ（すなわち、予防）または阻害するためである。
【００６５】
その上、どんな移植も拒絶のリスクがあるため、実施形態は、移植拒絶を防ぐために本明細書中に記載される方法または組成物のいずれかを用いるアジュバント療法を含む。
【００６６】
同種移植片拒絶に介在される疾患は、心臓移植、皮膚移植、肝臓移植、肺移植、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、腎臓移植、膵臓移植、膵島移植、腸移植、骨移植、網膜移植、骨髄移植、膵島移植および角膜移植を含むがこれらに限定されない。特定の実施形態において、治療は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬを投与することにより容易化される。他の実施形態において、治療は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの組み合わせを、単一のＨＤＬでまたは２つの別々のＨＤＬ組成物でのいずれかで投与することにより容易化される。
【００６７】
特定の実施形態において、発明は、同種移植片拒絶に介在される障害または疾患の治療または予防の方法に関連し、（ｉ）ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグ、またはその薬学的組成物である、ナノ粒子および任意に（ｉｉ）ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含むＴＲＡＦｉ−ＨＤＬナノ粒子であって、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＨＤＬナノ粒子（ＴＲＡＦｉ−ＨＤＬ）として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグまたはその薬学的組成物である、ナノ粒子の治療上有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む。特定の実施形態において、ｍＴＯＲ−ＨＤＬおよびＴＲＡＦｉ−ＨＤＬナノ粒子は、それを必要とする患者に、組み合わせて、または順番に投与される。一実施形態において、対象は同種移植片拒絶のリスクがあり、方法は同種移植片拒絶を防ぐ（すなわち、予防）または阻害するためである。同種移植片拒絶に介在される疾患は、心臓移植、皮膚移植、肝臓移植、肺移植、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、腎臓移植、膵臓移植、膵島移植、腸移植、骨移植、網膜移植、および角膜移植を含むがこれらに限定されない。
【００６８】
さらなる実施形態において、発明は、自己免疫疾患の治療または予防の方法に関連する。自己免疫疾患の例としては、セリアック病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、甲状腺炎、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、強皮症、乾癬、関節炎、関節リウマチ、脱毛症、強直性脊椎炎、チャーグ・ストラウス症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、皮膚筋炎、糸球体腎炎、ギラン・バレー症候群、ＩＢＤ、ループス腎炎、重症筋無力症、心筋炎、動脈炎天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【００６９】
本発明の組成物および方法を用いて治療されるかもしれない状態は、増加した炎症と関連する疾患を含む。Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２００２；  １０１（１−２）：１２−２２。
【００７０】
本発明の組成物および方法は、アテローム性動脈硬化症、狭窄、再狭窄、高血圧、心不全、左心室の肥大（ＬＶＨ）、心筋梗塞、急性冠動脈症候群、脳卒中、一過性虚血性発作、損なわれた血液循環、心臓疾患、コレステロールおよびプラーク形成、虚血、虚血再灌流傷害、末梢血管疾患、心筋感染、心臓病（例えば、胸痛および介入処置のリスク層別化）、心肺機能蘇生、腎不全、血栓症（例えば、静脈血栓症、深部静脈血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、動脈血栓症など）、血栓形成、血栓症または合併症、バッド・キアリ症候群、Ｐａｇｅｔ−Ｓｃｈｒｏｅｔｔｅｒ病、冠状動脈性心疾患、冠状動脈疾患、冠動脈再建術の必要性、末梢動脈疾患、肺循環疾患、肺塞栓症、脳血管疾患、細胞増殖および内皮機能不全、移植片閉塞または不全、末梢バイパス移植手術の必要性または有害な臨床転帰、冠動脈バイパス（ＣＡＢＧ）手術後の必要性または有害な臨床転帰、血管形成術後の不全または有害転帰、内胸動脈移植片不全、静脈移植片不全、自己静脈移植片、静脈移植片閉塞、虚血性疾患、血管内凝固、脳血管疾患、あるいは肥満または過体重状態に関係する任意の他の心臓血管疾患などの、心臓血管疾患を治療するまたは防ぐために用いられ得る。
【００７１】
冠動脈アテローム性動脈硬化症、糖尿病性アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症およびその後遺症（例えば、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全など）などの、任意のタイプのアテローム性動脈硬化病変が、治療され得る。
【００７２】
特定の実施形態において、化合物（例えば、ラパマイシン、または本明細書中に記載される任意の化合物）の疎水性は、分子に長いアルキル鎖を付加することにより変更され得る。
【００７３】
本発明の方法において用いられる化合物は、本発明により用いられる化合物の、すべての水和物、溶媒和物、および複合体を含む。キラル中心または異性体中心の別の形態が本発明の化合物に存在する場合、そのような異性体または異性体（エナンチオマーおよびジアステレオマーを含む）のすべての形態は、本明細書に包含されることが意図される。キラル中心を含む化合物は、ラセミ混合物、鏡像異性的に富化された混合物として使用されてよく、またはラセミ混合物が周知の技術を用いて分離されてよく、および個々のエナンチオマーが単独で使用されてよい。本発明に記載の化合物は、ラセミ形態または個々のエナンチオマーである。エナンチオマーは、Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９，  １４６９−１４７４，  （１９９７）  ＩＵＰＡＣに記載されているものなどの公知の技術を用いて分離できる。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）異性体およびトランス（Ｅ）異性体の両方が本発明の範囲内である。化合物がケト−エノール互変異性体などの互変異性体で存在し得る場合、各互変異性体形態は、平衡状態で存在するか主として１つの形態で存在するかに関係なく、本発明に含まれるものと考えられる。
【００７４】
本発明で使用される化合物の構造が不斉炭素原子を含む場合、かかる化合物はラセミ化合物、ラセミ混合物、および単離された単一エナンチオマーとして存在し得る。これらの化合物の全てのそのような異性体は、本発明に明示的に含まれる。各立体形成炭素は、ＲまたはＳ立体配置であってよい。したがって、そうでないことが示されない限り、かかる非対称性から生じる異性体（例えば、すべてのエナンチオマーおよびジアステレオマー）は本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。かかる異性体は、古典的分離技術によりおよびＪ．Ｊａｃｑｕｅｓ，Ａ．ＣｏｌｌｅｔおよびＳ．Ｗｉｌｅｎによる“Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｐｕｂ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９８１に記載されるものなどの、立体化学的に制御された合成により実質的に純粋な形態で得ることができる。例えば、分割は、キラルカラムでの分取クロマトグラフィーによって行うことができる。
【００７５】
対象の発明は、また、本明細書に開示される化合物上に存在する原子の全ての同位体の使用を含むことが意図される。同位体は、原子番号は同じであるが質量数が異なる原子を含む。一般的な例として、限定するものではないが、水素の同位体はトリチウムおよび重水素を含む。炭素の同位体は、炭素−１３および炭素−１４を含む。
【００７６】
本出願を通して構造中の炭素の記法は、さらなる表記なしで使用される場合、１２Ｃ、１３Ｃまたは１４Ｃなどの炭素の全ての同位体を表すことを意図していることに留意されたい。さらに、１３Ｃまたは１４Ｃを含む任意の化合物は、本明細書に開示される化合物のいずれかの構造を具体的に有し得る。
【００７７】
また、本出願を通しての構造中の水素の記法は、それ以上の表記なしで使用される場合、１Ｈ、２Ｈ、または３Ｈなどの、水素のすべての同位体を表すと意図されることにも留意されたい。さらに、２Ｈまたは３Ｈを含む任意の化合物は、本明細書に開示される化合物のいずれかの構造を具体的に有し得る。
【００７８】
同位体標識された化合物は一般に、当業者に知られている慣用の技術により、または使用される非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を用いる本明細書に開示される実施例において記載されるものと類似の方法により調整することができる。
【００７９】
本発明の化合物は、塩の形態であってよい。本明細書で使用される「塩」は、本発明の化合物の酸または塩基塩を製造することによって修飾された本化合物の塩である。癌の治療のために使用される化合物の場合、塩は薬学的に許容される。薬学的に許容可能な塩の例は、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；フェノールなどの酸性残基のアルカリまたは有機塩を含むがこれらに限定されない。塩は有機酸または無機酸を用いて製造できる。かかる酸塩は、塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩などである。フェノラート塩は、アルカリ土類金属塩、ナトリウム、カリウムまたはリチウムである。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、この点において、本発明の化合物の、比較的非毒性の無機および有機酸または塩基付加塩を指す。これらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にｉｎ  ｓｉｔｕで、またはその遊離塩基または遊離酸形態での本発明の精製化合物を、適切な有機または無機の酸または塩基と別々に処理し、このように形成される塩を単離することにより調製される。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。
【００８０】
本明細書で使用される「アルキル」は、特定数の炭素原子を有する分枝鎖および直鎖飽和脂肪族炭化水素基の両方を含み、非置換であるまたは置換されていてよい。アルキルはＣ１〜Ｃ１０アルキル、またはそのサブセットもしくは個別のものである。非限定的な例において、アルキルが「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」でのようにＣ１〜Ｃ５である場合、それは直鎖または分枝配置で１、２、３、４または５個の炭素を有する基を含むと定義され、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、およびペンチルを含む。アルキルは任意に、フェニルまたは置換フェニルで置換されて置換または非置換ベンジルを提供し得る。
【００８１】
ヘテロシクリルは、炭素または窒素から選択される３〜８個の環原子、好ましくは５〜６個の環原子を含有するがピロリジンに限定されない飽和または部分不飽和単環式基を意味する。
【００８２】
本明細書で使用する「アリール」という用語は、５〜１５個の炭素原子を含む芳香族単環式または多環式基を指す。アリール基としては、非置換または置換フェニルなどの基が挙げられるが、これらに限定されない。上記アリールが置換されていることを指す場合、上記置換は、本発明の化合物の他の環系への結合点以外の、環上の任意の位置であってよい。したがって、アリール環上の任意の水素原子は、本発明によって定義される置換基で置換されていてよい。アリールがフェニル環である実施形態では、上記置換基は、結合点に対してメタ位および／またはオルト位および／またはパラ位であり得る。アリールは任意に、ピロリジニル−Ｃ（Ｏ）−部分を含むヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−部分で置換されていてよい。
【００８３】
本明細書で使用される用語「ヘテロアリール」は、各環中に最大で１０個の原子の安定な単環式、二環式または多環式環を表し、少なくとも１つの環が芳香族であり、１〜４個のヘテロ原子、または特にＯ、ＮおよびＳから成る群より選択される１〜２個のヘテロ原子を含む。二環式芳香族ヘテロアリール基としては、（ａ）１個の窒素原子を有する６員の芳香族（不飽和）複素環に縮合した；（ｂ）２個の窒素原子を有する５員または６員の芳香族（不飽和）複素環に縮合した；（ｃ）１個の酸素原子または１個の硫黄原子と共に１個の窒素原子を有する５員の芳香族（不飽和）複素環に縮合した；または（ｄ）Ｏ、ＮまたはＳから選択される１個のヘテロ原子を有する５員芳香族（不飽和）複素環に縮合した、フェニル、ピリジン、ピリミジンまたはピリダジン環が挙げられる。この定義の範囲内のヘテロアリール基は、：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、１，４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリイニジニルジヒドロピロリル、、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンを含むがこれらに限定されない。ヘテロアリール置換基が二環式であり、かつ一つの環が非芳香族であるかまたはヘテロ原子を含まない場合、結合はそれぞれ、芳香族環を介するまたはヘテロ原子含有環を介すると理解される。ヘテロアリールが窒素原子を含む場合、その対応するＮ−オキシドもこの定義に包含されると理解される。
【００８４】
本発明の化合物において、アルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基は、代替の非水素基で１つ以上の水素原子を置換することによってさらに置換され得る。これらは、アルキル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、シアノおよびカルバモイルから選択される１〜４個の基を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
「置換された」という用語は、通常の原子価が維持され置換により安定な化合物が生じることを条件として、その中に含まれる水素原子への１つ以上の結合が、非水素原子または非炭素原子への結合によって置換される上記の官能基を指す。置換基は、炭素原子または水素原子への１つ以上の結合が、二重または三重結合を含む１つ以上の結合によってヘテロ原子に置き換えられた基も含む。置換基の例としては、上記の官能基、特にハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）；メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、およびトリフルオロメチル基などのアルキル基；ヒドロキシル；メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、およびイソプロポキシなどのアルコキシ基；フェノキシなどのアリールオキシ基；ベンジルオキシ（フェニルメトキシ）およびｐ−トリフルオロメチルベンジルオキシ（４−トリフルオロメチルフェニルメトキシ）などのアリールアルキルオキシ；ヘテロアリールオキシ基；トリフルオロメタンスルホニル基、メタンスルホニル基、およびｐ−トルエンスルホニル基などのスルホニル基；ニトロ、ニトロシル；メルカプト；メチルスルファニル、エチルスルファニルおよびプロピルスルファニルなどのスルファニル基；シアノ；ヘテロシクリル−Ｃ（Ｏ）−部分；アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、およびジエチルアミノなどのアミノ基；およびカルボキシルが挙げられる。複数の置換基部分が開示または特許請求される場合、置換された化合物は、開示されたまたは特許請求される置換基部分の１つまたは複数によって、単独または複数で独立して置換され得る。独立して置換されるとは、（２以上の）置換基が同一であっても異なっていてもよいことを意味する。
【００８６】
本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定であり、かつ容易に入手可能な出発物質から、当該分野で公知の技術および以下に示す方法によって容易に合成され得る化合物を提供するために当業者によって選択され得ることが理解される。置換基自体が複数の基で置換される場合、これらの複数の基は、安定な構造が生じる限り、同じ炭素上または異なる炭素上にあってよいことが理解される。
【００８７】
本発明の化合物の選択において、当業者は、様々な置換基、すなわちＲ１、Ｒ２などが、周知の化学構造連結の原理に従って選択されることを認識するであろう。さらに、本明細書中の炭素ベースの構造に水素が示されていない場合、暗黙の水素は必要に応じて価数を満たすと理解される。
【００８８】
本発明の化合物は、塩の形態であってよい。本明細書で使用される「塩」は、本発明の化合物の酸または塩基塩を製造することによって修飾された本化合物の塩である。癌の治療のために使用される化合物の場合、塩は薬学的に許容可能である。薬学的に許容可能な塩の例は、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；フェノールなどの酸性残基のアルカリまたは有機塩を含むがこれらに限定されない。塩は有機酸または無機酸を用いて製造できる。かかる酸塩は、塩化物、臭化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、スルホン酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、アスコルビン酸塩などである。フェノラート塩は、アルカリ土類金属塩、ナトリウム、カリウムまたはリチウムである。「薬学的に許容可能な塩」という用語は、この点において、本発明の化合物の、比較的非毒性の無機および有機酸または塩基付加塩を指す。これらの塩は、本発明の化合物の最終的な単離および精製の間にｉｎ  ｓｉｔｕで、またはその遊離塩基または遊離酸形態での本発明の精製化合物を、適切な有機または無機の酸または塩基と別々に反応させ、このように形成される塩を単離することにより調製される。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート（ｎａｐｔｈｙｌａｔｅ）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。
【００８９】
数値範囲が任意のパラメータについて本明細書に提供される場合、その数値範囲のすべての数値サブセット、およびそこに含まれるすべての個々の整数値が本発明の一部として提供されることが理解される。従って、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルは、１〜３個の炭素原子であるアルキルのサブセット、２〜５個の炭素原子であるアルキルのサブセットなど、および１個の炭素原子を有するアルキル、３個の炭素原子を有するアルキル、１０個の炭素原子を有するアルキル等を含む。
【００９０】
一実施形態において、本明細書で論じられるプリンは、アデノシン、イノシン、ヒポキサンチン、またはアデニンの１つ以上である。一実施形態において、本明細書で使用される「決定する」は、実験的に決定することを意味する。
【００９１】
医薬組成物においてのように、用語「組成物」は、活性成分、および担体を構成する不活性成分（薬学的に許容可能な賦形剤）を含む製品、ならびに任意の２つ以上の成分の組み合わせ、複合体化または凝集から直接または間接的に生じる任意の製品、または１以上の成分の分離から直接または間接的に生じる任意の製品、または１以上の成分の他のタイプの反応または相互作用から直接または間接的に生じる任意の製品を包含すると意図される。従って、本発明の薬学的組成物は、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）化合物の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、および薬学的に許容可能な賦形剤を混合することにより製造される任意の組成物を包含する。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「任意に」は、後に記載される事象が発生しても発生しなくてもよいことを意味し、発生する事象、および発生しない事象の両方を含む。
【００９３】
本明細書で使用される、用語「１つ以上の基で置換された」は、置換基の数が明示されていない限り許容される、最大ですべての水素原子を同一のまたは異なる置換基で置換する、指定された１つまたは複数の置換基での置換、複数の置換を指す。置換基の数が明示的に記載されない場合、１つ以上が意図される。
【００９４】
本明細書で使用する「本発明の化合物」は、式Ｉの化合物、またはその塩、溶媒和物もしくは生理学的に機能的なその派生物を意味する。
【００９５】
本明細書で使用される「溶媒和物」という用語は、溶質（例えば、式Ｉの化合物、またはその塩）および溶媒によって形成される可変化学量論の複合体を指す。本発明の目的のためのかかる溶媒は、溶質の生物学的活性を妨害しないであろう。適切な溶媒の例としては、水、アセトン、メタノール、エタノールおよび酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは使用される溶媒は、薬学的に許容可能な溶媒である。適切な薬学的に許容可能な溶媒の例としては、水、エタノールおよび酢酸が挙げられる。最も好ましくは、溶媒は水である。
【００９６】
特定の実施形態において、用語「生理学的に機能的な派生物」は、インビボで形質転換されて、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグ、または薬学的に許容可能な塩、化合物の水和物または溶媒和物である、化合物、を生じる化合物（例えば、薬物前駆体）を指す。形質転換は、例えば、血液中での加水分解を介するなどの、さまざまなメカニズム（例えば、代謝的または化学的過程による）により起こり得る。プロドラッグは、かかる派生物であり、およびプロドラッグの使用の議論は、Ｔ．  ＨｉｇｕｃｈｉおよびＷ．  Ｓｔｅｌｌａ、“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，”  Ｖｏｌ．  １４  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，およびＢｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ（編）  Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７により提供される。その上、用語は、インビボで形質転換されてＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を包含するＨＤＬの化合物、例えばＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを生じ得る化合物（例えば、薬物前駆体）を包含し得る。
【００９７】
本明細書に記載される様々な要素の全ての組み合わせは、本明細書中で別途指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内である。各変形の実施形態は、一般に、各変形について別個に上に列挙されているが、本発明はまた、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、上に列挙された各実施形態から選択され、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである化合物、のいくつかのまたは各実施形態を含む。従って、本発明は、各変形の実施形態の全ての組み合わせを含むと意図される。
【００９８】
特定の実施形態において、本発明は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤とも称される）をさらに含む化合物も含み、ここで阻害剤は、上に列挙された実施形態のいずれかから選択され、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）として処方される、６８７７００２（Ｚａｒｚｙｃｋａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｍｏｄｅｌ．  ５５：２９４−３０７  （２０１５）に記載される）またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。従って、各変形の実施形態の全ての組み合わせが本明細書で検討される。
【００９９】
ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、およびそれらの塩、溶媒和物および生理学的に機能的な派生物は、同種移植片拒絶のリスクのある対象を治療するために有用であると信じられる。および方法は、同種移植片拒絶を防ぐ（すなわち、予防）または阻害するためである。いかなる移植も同種移植片拒絶のリスクがあり、および従って本明細書中に記載される組成物および方法は任意の移植状態のための治療的使用のために考えられることに留意されたい。さらに、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ組成物をｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置レジメンと組み合わせることは、同種移植片拒絶を防ぐ（すなわち、予防）または阻害することにおいて、相乗的効果を提供する。
【０１００】
さらなる実施形態において、本発明は、免疫不寛容の可能性を示すあるレベルの免疫反応物により介在される障害の治療のための医薬の調製における、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物の使用を提供し、ここでｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩または溶媒和物、またはそれらの生理学的に機能的な派生物である。
【０１０１】
従って、本発明は、薬学的組成物をさらに提供し、それはｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、およびそれらの塩、溶媒和物および生理学的機能的派生物、および１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、およびそれらの塩、溶媒和物および生理学的機能的派生物は、上に記載される。担体、希釈剤または賦形剤は、製剤の他の成分と適合性があり、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で許容可能でなければならない。本発明の別の観点によれば、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、またはそれらの塩、溶媒和物および生理学的機能的派生物を、１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物の調製のための方法が提供される。
【０１０２】
本発明は、薬学的組成物をさらに提供し、それはＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６ナノ粒子（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）として処方される、６８７７００２、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、およびそれらの塩溶媒和物および生理学的機能的派生物、および１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６ナノ粒子（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、およびそれらの塩、溶媒和物および生理学的機能的派生物は、上に記載される。担体、希釈剤または賦形剤は、製剤の他の成分と適合性があり、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で許容可能でなければならない。本発明のもう一つの観点により、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６ナノ粒子（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）として処方される、６８７７００２またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、またはそれらの塩、溶媒和物および生理学的機能的派生物を、１以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む薬学的組成物の調製のための過程も提供される。
【０１０３】
その上、特定の実施形態において、組み合わされたＨＤＬナノ粒子処方として処方される、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤およびｍ−ＴＯＲ阻害剤の両方を含む組み合わせ組成物が企図される。かかる組み合わせ組成物において、活性剤／化合物は、上記の通りであり得るが、任意の適切に荷電されたＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤またはｍ−ＴＯＲ阻害剤が、組み合わされたＨＤＬナノ粒子処方として処方され得る。
【０１０４】
本発明の薬学的組成物は、単位用量当たりあらかじめ決定された量の活性成分を含有する単位用量形態で提供され得る。かかる単位は、治療条件、投与経路、患者の年齢、体重および状態に応じて、例えば、５μｇ〜１ｇ、好ましくは１ｍｇ〜７００ｍｇ、より好ましくは５ｍｇ〜１００ｍｇの、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物を含んでよく、ここでｍ−ＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである。このような単位用量はしたがって、１日に１回より多く投与され得る。好ましい単位投与組成物は、活性成分の、上記のような１日用量または部分用量（１日に１回以上の投与のため）、またはその適切な画分を含有するものである。さらに、かかる薬学的組成物は、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製できる。例示的な投与量は、マウスでの５ｍｇ／ｋｇを含む。
【０１０５】
本発明の薬学的組成物は、経口（頬側または舌下を含む）、吸入、鼻内、眼内、または非経口（静脈内および筋肉内を含む）経路などの、任意の適切な経路による投与に適合されてよい。かかる組成物は、例えば、活性成分を担体または賦形剤と会合させることによって、薬学の分野で公知の任意の方法によって調製できる。
【０１０６】
本発明の化合物の治療上有効量は、例えば、動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な状態およびその重症度、製剤の性質および投与経路を含む多くの因子に依存し、最終的に医師または獣医師の裁量に任されるであろう。しかしながら、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、心臓移植、皮膚移植、肝臓移植、肺移植、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、腎臓移植、膵臓移植、膵島移植、腸移植、骨移植、網膜移植、および角膜移植を含む同種移植片拒絶と関連する疾患または状態の治療のためのラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物の有効量は一般に、１日あたり５μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇレシピエント（哺乳類）体重の範囲であり、より一般的には１日あたり５μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にあるであろう。この量は、１日当たり１回の用量で、またはより一般的には、１日あたりの総用量が同じであるように、１日当たり複数（２、３、４、５または６など）の小用量で与えられ得る。それらの塩または溶媒和物の有効量は、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、それ自体がラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物の有効量の比率として決定され得る。
【０１０７】
本発明の化合物およびそれらの塩および溶媒和物、およびその生理学的に機能的な派生物は、単独でまたは心臓移植、皮膚移植、肝臓移植、肺移植、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、腎臓移植、膵臓移植、膵島移植、腸移植、骨移植、網膜移植、および角膜移植を含む、同種移植片拒絶に関係する疾患および状態の治療のための他の治療剤と組み合わせて用いられ得る。
【０１０８】
本発明による組合せ療法は従って、ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の少なくとも一の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグある、化合物、またはそれらの薬学的に許容可能な塩または溶媒和物、またはその生理学的に機能的な派生物の投与、および少なくとも一の他の薬学的活性剤の使用を含む。ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物、および他の薬学的活性剤は、一緒にまたは別々に投与されてよく、別々に投与される場合、これは任意の順序で同時にまたは逐次的に起こり得る。ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）の化合物であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、化合物（複数）および他の薬学的活性剤（複数）の量および投与の相対的なタイミングは、望ましい組み合わせられた治療効果を達成するために選択される。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明による組合せ療法は従って、（ｉ）ｍ−ＴＯＲ阻害剤を含む高密度リポタンパク質由来ナノ粒子（ＨＤＬ）であって、ｍ−ＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシンナノ粒子（ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）として処方される、ラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグである、ナノ粒子、またはその薬学的組成物、および（ｉｉ）ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤を含むｓＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子であって、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子として処方される、６８７７００２、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、ポリモルフ、互変異性体またはプロドラッグ（一般にＣＤ４０−ＨＤＬと称される）である、ナノ粒子、またはその薬学的組成物の投与を含む。
【０１１０】
適切な場合には、他の治療的成分が、治療的成分の活性および／または安定性および／または溶解性などの物理的特性を最適化するために、塩の形態で、例えばアルカリ金属塩またはアミン塩または酸付加塩として、またはプロドラッグ、またはエステル、例えば低級アルキルエステルとして、または溶媒和物、例えば水和物として、使用できることは、当業者には明らかであろう。必要に応じて、治療的成分が光学的に純粋な形態で使用できることも、明らかであろう。
【０１１１】
上で言及した組み合わせは、薬学的組成物の形態での使用のために好都合に存在してよく、従って、薬学的に許容可能な希釈剤または担体と一緒に上で定義した組み合わせ含む薬学的組成物は、本発明のさらなる観点を表す。
【０１１２】
かかる組み合わせの個々の化合物は、別々のまたは組み合わせた医薬組成物中で連続的にまたは同時に投与されてよい。好ましくは、個々の化合物は、組み合わせた医薬組成物中で同時に投与される。既知の治療剤の適切な用量は、当業者には容易に理解されるであろう。
【０１１３】
本発明の化合物は、標準化学を含む、様々な方法によって製造できる。以前に定義された任意の可変物は、特に明記しない限り、以前に定義された意味を持ち続ける。例示的な一般的な合成方法を以下に記載し、次に本発明の特定の化合物を実施例で調製する。
【０１１４】
本発明の化合物は、部分的に以下の合成スキームで示されるような有機合成の分野で知られている方法によって調製されてよい。以下に記載するスキームの全てにおいて、化学の一般原則に従って、必要に応じて、感受性基または反応性基に対する保護基が使用されることは十分に理解される。保護基は、有機合成の標準的な方法に従って操作される（（Ｔ．  Ｗ．  Ｇｒｅｅｎ  および  Ｐ．  Ｇ．  Ｍ．  Ｗｕｔｓ  （１９９１）  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。これらの基は、当業者に容易に明らかである方法を用いて、化合物合成の都合のよい段階で除去される。保護基の選択ならびに反応条件および反応工程の順序は、本発明の化合物の調製と矛盾しないものであるべきである。当業者は、立体中心が本発明の化合物に存在するかどうかを認識するであろう。したがって、本発明は、すべての可能な立体異性体を含み、立体異性体の混合物（ラセミ化合物など）だけでなく個々の立体異性体も含む。化合物が単一のエナンチオマーとして所望される場合、それは立体特異的合成によって、または最終生成物または任意の都合のよい中間体の分割によって得ることができる。最終生成物、中間体、または出発物質の分割は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって行うことができる。例えば、Ｅ．  Ｌ．  Ｅｌｉｅｌ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｗｉｌｅｎ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｎ．  Ｍａｎｄｅｒ  によるＳｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９４））を参照のこと。
【０１１５】
「移植可能な移植片」は、対象に投与できる細胞、組織および器官（全体または一部）などの、生物学的物質を指す。移植可能な移植片は、例えば、器官、組織、皮膚、骨、神経、腱、ニューロン、血管、脂肪、角膜、多能性細胞、分化細胞（インビボまたはインビトロで得られたまたは誘導された）などの生物学的材料の自家移植片、同種移植片、または異種移植片であってよい。いくつかの実施形態において、移植可能な移植片は、例えば、軟骨、骨、細胞外マトリックス、またはコラーゲンマトリックスから形成される。移植可能な移植片は、単細胞、細胞の懸濁液、および移植可能な組織および器官中の細胞であってよい。移植可能な細胞は典型的には、治療的機能、例えば、レシピエント対象において欠損または減少している機能、を有する。Ｔ移植可能な細胞のいくつかの非限定的な例は、島細胞、ベータ細胞、肝細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ニューロン、グリア細胞、またはミエリン化細胞である。移植可能な細胞は、未修飾の細胞、例えば、ドナー対象から得られる細胞であり、遺伝的または後成的改変を伴わずに移植で使用可能な細胞であり得る。他の実施形態において、移植可能な細胞は、改変された細胞、例えば、遺伝子欠損を有し当該遺伝子欠損が矯正されている対象から得られる細胞、または再プログラミングされた細胞に由来する細胞、例えば、対象から得られる細胞に由来する分化細胞であり得る。
【０１１６】
「移植」とは、レシピエント対象中に（例えば、ドナー対象から、インビトロ供給源（例えば、分化した自己または異種の天然のまたは誘導された多能性細胞）から）および／または同じ対象において１つの身体位置から別の身体位置に移植可能な移植片を移す（移動させる）過程を指す。
【０１１７】
「望ましくない免疫応答」は、抗原への曝露から生じ、本明細書に提供される疾患、障害または状態（またはその症状）を促進または悪化させる、または本明細書で提供される疾患、障害または状態の症候である、任意の望ましくない免疫応答を指す。そのような免疫応答は一般に、対象の健康に悪影響を及ぼし、または対象の健康に対する悪影響の兆候を示す。
【０１１８】
一実施形態において、移植組織は、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、または血管組織である。
【０１１９】
一実施形態において、移植組織は、インタクトな器官として移植される。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「レシピエント対象」は、別の対象からの移植される細胞、組織または器官を受け取る、または受け取った対象である。
【０１２１】
本明細書中で使用される場合、「ドナー対象」は、移植される細胞、組織または器官が、レシピエント対象へのその細胞、組織または器官の移植前にそれから除去される対象である。
【０１２２】
一実施形態では、ドナー対象は霊長類である。さらなる一実施形態において、ドナー対象はヒトである。一実施形態では、レシピエント対象は霊長類である。一実施形態では、レシピエント対象はヒトである。一実施形態では、ドナーおよびレシピエント対象の両方はヒトである。したがって、本発明は、異種移植の実施形態を含む。
【０１２３】
本明細書中で使用される、「免疫系による拒絶」は、ドナーからの移植された細胞、組織または器官を非自己として認識するレシピエント対象の免疫系の超急性、急性および／または慢性の応答の事象およびそれに続く免疫反応を説明する。
【０１２４】
用語「同種異系」は、その物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質を指す。１以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は互いに同種異系であると言われる。
【０１２５】
「自己」という用語は、それが後に同じ個体中に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指す。
【０１２６】
本明細書中で使用される場合、「免疫抑制薬」は、レシピエント対象の免疫応答を抑制するために使用される薬学的に許容される薬物である。非限定的な例としては、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６およびラパマイシンが挙げられる。
【０１２７】
本明細書中で使用される「予防的に有効な」量は、物質が投与される対象における所定の病理学的状態の発症を防ぐまたは遅延させるのに有効な物質の量である。予防的に有効な量は、所望の予防結果を達成するための、必要な用量でおよび期間の間、有効な量を指す。典型的には、予防的な用量は疾患の前にまたは初期で対象において使用されるので、予防的に有効な量は、治療的に有効な量より少ないであろう。
【０１２８】
本明細書中で使用される「治療的に有効な」量は、それに対し物質が投与されそれを患う対象における所定の病的状態の症状または原因を治療、改善または軽減するために有効な物質の量である。
【０１２９】
一実施形態では、治療的にまたは予防的に有効な量は、投与当たり約１ｍｇの薬剤／ｋｇ対象〜約１ｇの薬剤／ｋｇ対象である。別の実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、約１０ｍｇの剤／ｋｇ対象〜５００ｍｇの剤／対象である。さらなる実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、約５０ｍｇの剤／ｋｇ対象〜２００ｍｇの剤／対象である。さらなる実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、約１００ｍｇの剤／ｋｇ対象である。なおさらなる実施形態において、治療的にまたは予防的に有効な量は、５０ｍｇの剤／ｋｇ対象、１００ｍｇの剤／ｋｇ対象、１５０ｍｇの剤／ｋｇ対象、２００ｍｇの剤／ｋｇ対象、２５０ｍｇの剤／ｋｇ対象、３００ｍｇの剤／ｋｇ対象、４００ｍｇの剤／ｋｇ対象および５００ｍｇの剤／ｋｇ対象から選択される。
【０１３０】
状態、障害または状態の「治療する」または「治療」は、
（１）状態、障害または状態に罹患しているかまたは罹患している可能性があるが、状態、障害または状態の臨床症状をまだ経験していないか表示していない人で発達する状態、障害、または状態の臨床症状の出現を防ぐことまたは遅延させること；または
（２）状態、障害または状態を阻害すること、すなわち、疾患の発症またはその再発（維持療法の場合）または少なくとも１つのその臨床症状、兆候、または試験を、停止すること、低減することまたは遅延すること；または
（３）病気を和らげること、すなわち、状態、障害または状態またはその臨床的または潜在的な症状または徴候の少なくとも１つの退行を引き起こすこと
を含む。
【０１３１】
治療される対象への利益は、統計的に有意であるか、または少なくとも患者または医師に知覚可能である。
【０１３２】
「予防的に有効な量」は、所望の予防結果を達成するための、必要な用量でおよび期間の間、有効な量を指す。典型的には、予防的な用量は疾患の前にまたは初期で対象において使用されるので、予防的に有効な量は、治療的に有効な量より少ないであろう。
【０１３３】
治療的使用のための許容可能な賦形剤、希釈剤、および担体は、医薬品分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  （Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．  ２００５）などに記載されている。薬学的賦形剤、希釈剤、および担体の選択は、意図される投与経路および標準的な製薬実務に関して選択できる。
【０１３４】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という語句は、「一般的に安全とみなされる」、例えば、生理学的に寛容であり、かつ典型的には、ヒトに投与された場合に、胃の不調和、めまいなどのアレルギー反応または同様の不都合な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、動物での、特にヒトでの使用のために連邦または州政府の規制機関によって承認されるか、または米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。
【０１３５】
「患者」または「対象」は哺乳動物を指し、ヒトおよび獣医学の対象を含む。特定の獣医学的対象は鳥類を含み得る。
【０１３６】
本発明は、以下の実験詳細からよりよく理解されるであろう。しかしながら、当業者は、議論される特定の方法および結果は、本発明の単なる例示であり、その後に続く請求項においてより十分に記載されることを容易に理解するであろう。
【０１３７】
一般的な方法
分子生物学における標準的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  （１９８２  ＆  １９８９  第２版，  ２００１  第３版  Ｅｄｉｔｉｏｎ）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第３版、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  Ｗｕ  （１９９３）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，  Ｖｏｌ．  ２１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）に記載される。標準的な方法は、Ａｕｓｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．１−４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  および  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹにも出現し、それは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）について記載する。
【０１３８】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製方法が記載される（Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化が記載される（例えばＣｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．  ２，  Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ３，  Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  ＮＹ，  ｐｐ．  １６．０．５−１６．２２．１７；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃｏ．  （２００１）  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ；  ｐｐ．  ４５−８９；  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （２００１）  ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．，  ｐｐ．  ３８４−３９１を参照のこと）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生、精製および断片化が記載される（（Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９）  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ；  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  ｓｕｐｒａ）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１３９】
ラパマイシンは、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）によって産生される既知のマクロライド抗生物質である。ラパマイシンの適切な派生物は、例えば、式Ｉの化合物を含み、ここでＲ１は、Ｒ．ｓｕｂ．１はＣＨ．ｓｕｂ．３またはＣ．ｓｕｂ．３〜６アルキニルであり、Ｒ．ｓｕｂ．２はＨまたは−−ＣＨ．ｓｕｂ．２−−ＣＨ．ｓｕｂ．２−−ＯＨであり、Ｘは、Ｘが．ｄｂｄ．ＯでありＲ．ｓｕｂ．１がＣＨ．ｓｕｂ．３である場合Ｒ．ｓｕｂ．２がＨ以外であることを条件として、ｄｂｄ．Ｏ，（Ｈ，Ｈ）または（Ｈ，ＯＨ）である。ラパマイシンの構造を下に示す：
【化１】
2019515926.tif 000003
【０１４０】
式Ｉの化合物は、例えば、米国特許５，６６５，７７２；６，４４０，９９０；５，９８５，８９０；および６，２００，９８５に開示されており、それは参照により本明細書中に組み込まれる。それらは、開示されるように、またはこれらの参考文献に記載された手順と同様にして調製され得る。
【０１４１】
好ましい化合物は、３２−デオキソラパマイシン、１６−ペンタ−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパンビシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２（Ｓ）−ジヒドロ−４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシンであり、より好ましくは、米国特許第５，６６５，７７２および６，４４０，９９０の実施例８において開示される、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン（以後、化合物Ａと称される）である。
【０１４２】
式Ｉの化合物は、観察された活性、例えばＷＯ９４／０９０１０、ＷＯ９５／１６６９１またはＷＯ９６／４１８０７に記載される、例えばマクロフィリン−１２（ＦＫ−５０６結合タンパク質またはＦＫＢＰ−１２としても知られる）への結合、に基づいて、例えば急性同種移植片拒絶の治療において、例えば免疫抑制として有用であることが見出された。
【０１４３】
実施形態は、改善された疎水性および／または混和性を有するラパマイシン誘導体を含むナノ粒子も含む。例えば、ラパマイシンは、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ  ｄｒｕｇ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｕｍｏｕｒ  ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ７，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  １１２２１  （２０１６）  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１１２２１に記載されるようにアルキル鎖とコンジュゲートできる。
【０１４４】
特定の実施形態では、コレステロールの添加は、配合物を安定化させ、かつ捕捉効率を改善した。特定の実施形態において、コレステロールの重量パーセントは、ナノ粒の子、脂質の、または組成物の、約０％〜約１０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約６％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約７％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約８％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）〜約９％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）〜約８％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）〜約７％（ｗ／ｗ）、または約１％（ｗ／ｗ）〜約６％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【０１４５】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達媒体は、例えばマクロファージを標的にして移植寛容を誘導する、自然免疫系を標的にする本発明の組成物の導入のために使用されてよい。マクロファージを標的とする化合物は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬとしてナノ療法として製剤化されることに加えて、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などに封入されたいずれかを含む、多数の異なる形態および方法での送達のために処方され得る。
【０１４６】
リポソームの形成および使用は一般に、当業者に公知である。近年、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６）。さらに、可能性のある薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４；５，５５２，１５７；５，５６５，２１３；５，７３８，８６８および５，７９５，５８７）。
【０１４７】
リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに対し通常は耐性がある多数の細胞タイプでうまく使用されてきた。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達システムに典型的なＤＮＡ長の制約がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを様々な培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソーム媒介薬物送達の有効性を調べるいくつかの成功した臨床試験が完了している。
【０１４８】
リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、自発的にマルチラメラ同心二重層小胞（マルチラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する、直径２００〜５００Åの小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
【０１４９】
あるいは、自然免疫系を標的とする本発明の組成物のナノカプセル製剤を使用してもよい。ナノカプセルは通常、安定な再現性のある方法で物質を閉じ込めることができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、かかる超微粒子（約０．１μｍの大きさ）は、インビボで分解できるポリマーを用いて設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために考えられる。
【０１５０】
「合成ナノキャリア」は、自然界には存在せず、かつサイズが５ミクロン以下の少なくとも１つの寸法を有する、個別の物体を意味する。アルブミンナノ粒子は一般に、合成ナノキャリアとして含まれるが、特定の実施形態では、合成ナノキャリアは、アルブミンナノ粒子を含まない。特定の実施形態では、合成ナノキャリアはキトサンを含まない。他の実施形態において、本発明の合成ナノキャリアは、脂質ベースのナノ粒子ではない。さらなる実施形態では、合成ナノキャリアはリン脂質を含まない。
【０１５１】
合成ナノキャリアは、限定されるものではないが、１つまたは複数の脂質ベースのナノ粒子、（本明細書中脂質ナノ粒子とも呼ばれ、すなわち、それらの構造を構成する材料の大部分が脂質であるナノ粒子）、ポリマーナノ粒子、金属ナノ粒子、界面活性剤ベースのエマルジョン、デンドリマー、バッキーボール、ナノワイヤ、ウイルス様粒子（すなわち、ウイルス構造タンパク質で主に構成されているが、感染性ではないか、または感染性が低い粒子）、ペプチドまたはタンパク質ベースの粒子（本明細書ではタンパク質粒子、すなわち、それらの構造を構成する材料の大部分がペプチドまたはタンパク質である粒子とも呼ばれる）（アルブミンナノ粒子など）および／または脂質−ポリマーナノ粒子などのナノ材料の組み合わせを用いて開発されたナノ粒子であってよい。合成ナノキャリアは、回転楕円体、直方体、ピラミッド形、長円形、円筒形、トロイダル形などを含むが、これらに限定されない様々な異なる形状であってよい。本発明による合成ナノキャリアは、１つ以上の表面を含む。本発明の実施における使用のために適合できる例示的な合成ナノキャリアは、：（１）Ｇｒｅｆらへの米国特許第米国特許第５，５４３，１５８号に開示される生分解性ナノ粒子（２）Ｓａｌｔｚｍａｎらへの公開された米国特許出願第２００６０００２８５２号のポリマーナノ粒子（３）リソグラフィーで構築された、Ｄｅ  Ｓｉｍｏｎｅらへの公開米国特許出願第２００９００２８９１０号のナノ粒子（４）ｖｏｎ  ＡｎｄｒｉａｎらへのＷＯ２００９／０５１８３７の開示、（５）Ｐｅｎａｄｅｓらへの米国特許出願公開第２００８／０１４５４４１号に開示されているナノ粒子、（６）ｄｅ  ｌｏｓ  Ｒｉｏｓらへの公開された米国特許出願第２００９０２２６５２５号に開示されるタンパク質ナノ粒子、（７）Ｓｅｂｂｅｌ  らへの公開された米国特許出願第２００６０２２２６５２号に開示されるウイルス様粒子、（８）Ｂａｃｈｍａｎｎらへの公開された米国特許出願公開第２００６０２５１６７７号に開示される核酸結合ウイルス様粒子、（９）ＷＯ２０１００４７８３９Ａ１またはＷＯ２００９１０６９９９Ａ２に開示されるウイルス様粒子、（１０）Ｐ．Ｐａｏｌｉｃｅｌｌｉら、“Ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＰＬＧＡ−ｂａｓｅｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ５（６）：８４３−８５３  （２０１０）に開示されるナノ沈降ナノ粒子、または（１１）米国特許出願公開第２００２／００８６０４９号に開示されるアポトーシス細胞、アポトーシス小体または合成または半合成模倣物を含む。実施形態において、合成ナノキャリアは、１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７、または１：１０超のアスペクト比を有してよい。
【０１５２】
合成ナノキャリアは、約１００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の最小寸法を有してよく、補体を活性化するヒドロキシル基を有する表面を含まないか、あるいは補体を活性化するヒドロキシル基ではない部分から本質的になる表面を含む。特定の実施形態において、合成ナノキャリアは、約１００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の最小寸法を有してよく、実質的に補体を活性化する表面を含まないか、または補体を実質的に活性化しない部分から本質的になる表面を含む。いくつかの実施形態における合成ナノキャリアは、約１００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下の最小寸法を有し、補体を活性化する表面を含まないか、または補体を活性化しない部分から本質的になる表面を含む。実施形態において、合成ナノキャリアは、ウイルス様粒子を排除する。実施形態において、合成ナノキャリアは、１：１１：１、１：１．２、１：１．５、１：２、１：３、１：５、１：７、または１：１０．を超えるアスペクト比を有し得る。
【０１５３】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、１種類以上のリン脂質を含む（本質的にそれからなるか、またはそれからなる）。
【０１５４】
適したリン脂質の例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたは他のセラミド、ならびにレシチン油などのリン脂質含有油が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の組合せ、またはリン脂質と他の物質との混合物を使用することができる。
【０１５５】
本発明の組成物において使用され得るリン脂質の非限定的な例としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、大豆レシチン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジラウリルオリホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジラウリルオリルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、ジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明の組成物が２以上のタイプのリン脂質を含む（本質的にそれからなる、またはそれらからなる）場合、２種のリン脂質の重量比は約１：１０〜約１０：１、約２：１〜約４：１、約１：１〜約５：１、約２：１〜約５：１、約６：１〜約１０：１、約７：１〜約１０：１、約８：１〜約１０：１、約７：１〜約９：１、または約８：１〜約９：１の範囲であり得る。例えば、２種類のリン脂質の重量比は、約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１であり得る。
【０１５７】
一実施形態では、本発明の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）由来ナノ粒子は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）を含む（本質的にそれからなるか、またはそれからなる）。ＭＨＰＣに対するＤＭＰＣの重量比は、約１：１０〜約１０：１、約２：１〜約４：１、約１：１〜約５：１、約２：１〜約５：１、約６：１〜約１０：１、約７：１〜約１０：１、約８：１〜約１０：１、約７：１〜約９：１、または約８：１〜約９：１の範囲であり得る。ＭＨＰＣに対するＤＭＰＣの重量比は約１：１０、約１：９、約１：８、約１：７、約１：６、約１：５、約１：４、約１：３、約１：２、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１であり得る。
【０１５８】
ｍＴｏｒ阻害剤および他の薬学的活性成分との組み合わせ
ｍＴＯＲ阻害剤の例としては、ラパマイシンおよびその類似体（例えば、ＣＣＬ−７７９、ＲＡＤ００１、ＡＰ２３５７３、Ｃ２０−メタリルラパマイシン（Ｃ２０−Ｍａｒａｐ）、Ｃ１６−（Ｓ）−ブチルスルホンアミドラパマイシン（Ｃ１６−ＢＳｒａｐ）、Ｃ１６−（Ｓ）−３−メチルインドールラパマイシン（Ｃ１６−ｉＲａｐ）（Ｂａｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６、１３：９９−１０７））、ＡＺＤ８０５５、ＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、クリソファン酸（クリソファノール）、デホロリムス（ＭＫ−８６６９）、エベロリムス、（ＲＡＤ０００１）、ＫＵ−００６３７９４、ＰＩ−１０３、ＰＰ２４２、ｔｅｍシロリムス、およびＷＹＥ−３５４（Ｓｅｌｌｅｃｋ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。
【０１５９】
特定の実施形態において、ＰＩＲｂ＋マクロファージを標的とし、同種移植片の生着を促進する１以上の追加のまたは代替の活性成分を、組み合わせて使用してよい。これらの活性成分のいずれか１つ以上は、１つの投与単位で、またはｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子などの形態の組み合わせで製剤化されてよく、脂質粒子、リポソーム、小胞、第２または第３の活性成分を含むナノスフェアと組み合わせて投与されてよい。他の適切な活性薬剤は、１つ以上の免疫抑制剤を含む。
【０１６０】
治療レジメン／オプション
ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、Ｔ細胞枯渇およびＢ細胞枯渇などの適応免疫応答を標的とする他の誘導療法と併用できる。例えば、腎臓生着ドナーについて、移植レシピエントは、移植の前および直後に処置されてよい。現行の免疫抑制療法を受けている患者は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ療法またはｍＴＯＲ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ組合せ療法に切り替えられてよい。追加のシナリオでは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置は、移植前および移植直後に患者に投与され、それは６ヶ月または１２ヶ月ごとに繰り返されてよく、免疫抑制治療を排除することまたは大幅に減少させることをゴールとする。追加のシナリオでは、患者は、追加の免疫抑制療法を行わずに、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ療法、またはｍＴＯＲ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ組合せ療法を投与される。
【０１６１】
例示的な免疫抑制剤としては、スタチン；ラパマイシンまたはラパマイシン類似体などの、ｍＴＯＲ阻害剤；ＴＧＦ−βシグナリング剤；ＴＧＦ−β受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；コルチコステロイド；ロテノンなどの、ミトコンドリア機能の阻害剤；Ｐ３８阻害剤；ＮＦ−κβ阻害剤；アデノシン受容体アゴニスト；プロスタグランジンＥ２アゴニスト；ホスホジエステラーゼ４阻害剤などの、ホスホジエステラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；キナーゼ阻害剤；Ｇタンパク質共役受容体アゴニスト；Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニスト；グルココルチコイド；レチノイド；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体阻害剤；サイトカイン受容体活性化剤；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アンタゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；カルシニューリン阻害剤；ホスファターゼ阻害剤および酸化型ＡＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤としてはまた、ＩＤＯビタミンＤ３、シクロスポリンＡ、アリール炭化水素受容体阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アスピリン、ニフルム酸、エストリオール、トリポリド、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１０）、シクロスポリンＡ、サイトカインまたはサイトカイン受容体を標的とするｓｉＲＮＡなどが挙げられる。スタチンの例としては、アトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）、ＴＯＲＶＡＳＴ（登録商標））、セリバスタチン、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）、ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）ＸＬ）、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）、ＡＬＴＯＣＯＲ（登録商標）、ＡＬＴＯＰＲＥＶ（登録商標））、メバスタチン（ＣＯＭＰＡＣＴＩＮ（登録商標））、ピタバスタチン（ＬＩＶＡＬＯ（登録商標）、ＰＩＡＶＡ（登録商標））、ロスバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）、ＳＥＬＥＫＴＩＮＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＳＴＡＴ（登録商標））、ロスバスタチン（ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標））、およびシンバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標）、ＬＩＰＥＸ（登録商標））が挙げられる。
【０１６２】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法を、同種異系心臓移植マウスモデルで試験した。このレジメンは、移植後最初の週の間に５ｍｇ／ｋｇ相当のラパマイシンの３回の静脈内尾静脈注射のみを含んだ。コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ−ＣＴ）イメージングによるインビボでの陽電子放出断層撮影と免疫学的アッセイのアレイの組み合わせを用いて、心臓同種移植標的化および細胞特異性を評価した。続いて、自然免疫応答を、同種移植片の生着および治療メカニズムとともに分析した。これらの結果は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子処置が不定心臓同種移植片の生着を促進することを実証する。さらに、同様の結果が皮膚移植モデルについても観察された。これらの結果は、診療所でドナー特異的非応答を誘導するための免疫応答をどのように操作し、かつヒトにおける同種移植拒絶反応を防止し得る新たな治療的標的を同定するかを実証する。
【０１６３】
実施例
実施例１
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子の開発
ＰＢＳ中でＡＰＯＡ１と、ラパマイシンおよびリン脂質を含む脂質フィルムを水和させることによりｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子（図１Ａを参照のこと）を合成した。続いて、および激しいホモジナイゼーション後に、試料を超音波分解して、高速液体クロマトグラフィーおよび動的光散乱によりそれぞれ決定される、６２±１１％ラパマイシンカプセル充填効率および１２．７±４．４ｎｍの平均流体力学的直径を有するｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子を作成した。ナノ粒子のサイズは様々であるが、典型的には約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍである。
【０１６４】
透過電子顕微鏡法によって明らかにされるように（図４）、ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、ＨＤＬベースのナノ粒子１６に典型的な円盤状構造を有していた。生体外近赤外蛍光（ＮＩＲＦ））イメージングおよびフローサイトメトリーを用いてＣ５７Ｂｌ／６野生型マウスにおいて、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＲ）標識ｍＴＯＲ−ＨＤＬの生体内分布および細胞特異性を評価した。ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、主に肝臓、脾臓および腎臓に蓄積することが示され（図５Ａ）、一方で血液および脾臓中で樹状細胞（ＤＣ）または好中球のいずれかよりも単球に対し高い親和性を示した（図５Ｂ、Ｃ）（それぞれ、Ｐ≦０．００１、Ｐ≦０．０１およびＰ≦０．０１、Ｐ≦０．０１）。
【０１６５】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置を、心臓移植マウスモデルで利用した（図１Ｂ）。ｍＴＯＲ−ＨＤＬの生体分布、同種移植片標的化、および細胞特異性を、インビボＰＥＴ−ＣＴイメージング（図１Ｂ）および生体外技術を用いて決定した。続いて、フローサイトメトリー、酵素結合イムノソルベントアッセイおよび混合リンパ球反応を含む、免疫学的読み出しのアレイを利用して、短期間のｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ治療レジメンの効果を評価した（図１Ｂ）。
【０１６６】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法は自然免疫系を標的とする
組織の標的化および特異性を定量的に研究するために、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子を８９Ｚｒで放射線標識した（８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬ）。心臓が腹部に移植されてから６日後に、マウスは８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬを静脈内に受けた。ナノ粒子は、マウスがインビボＰＥＴ−ＣＴイメージングを受ける前に２４時間循環および分配された。顕著な８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬの存在が、心臓同種移植片で観察された（図１Ｃ）。イメージング後、マウスを犠牲にし、器官を、生体外オートラジオグラフィーによる８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬ定量のために収集した。同種移植片心臓（Ｔｘ）活性（２５．２±２．４ｘ１０３数／単位面積）は、天然心臓（Ｎ）（１１．１±１．９×１０３カウント／単位面積）より２．３倍高いと決定された（１１．１±１．９ｘ１０３数／単位面積）（図１Ｆ）。ガンマカウントは、８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬの完全な生体内分布を評価した。生体外オートラジオグラフィーは、８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬが多くの組織を標的とすることを示し（図１Ｄ）、薬物を負荷したＨＤＬナノ粒子の典型的な分布パターンと一致して、薬物の全身的な生体分布を示唆する１７。
【０１６７】
好ましい器官分布パターンおよび心臓同種移植取り込みは、発明者を、心臓同種移植片、血液、脾臓および骨髄における細胞レベルでのｍＴＯＲ−ＨＤＬ標的化および特異性を評価するように導いた。ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子を、蛍光色素３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸（ＤｉＯ）で標識し、静脈内投与し、２４時間循環させた。いくつかの組織タイプを利用して、好中球が抽出され、フローサイトメトリーによる分析のための骨髄細胞；Ｌｙ−６ＣｌｏおよびＬｙ−６Ｃｈｉ単球を含む、単球／マクロファージ（Ｍｏ／ＭΦ）プール、ＤＣ、およびＴ細胞を含んだ。
【０１６８】
骨髄細胞標的化が、心臓同種移植片、血液および脾臓において観察された（図１Ｆおよび１Ｇ）。重要なことに、本発明者らは、Ｍｏ／ＭΦプールおよび好中球に対する細胞特異性を観察し、心臓、血液および脾臓中のＭｏ／ＭΦプールによるｍＴＯＲ−ＨＤＬ取り込みはＤＣまたは好中球のいずれかよりも有意に高かった（それぞれ：Ｐ≦０．０１、Ｐ≦０．０１、Ｐ≦０．０５およびＰ≦０．０１、Ｐ≦０．０１、Ｐ≦０．０５）。対照的に、Ｔ細胞によるＤｉＯ標識ｍＴＯＲ−ＨＤＬ取り込みは実質的に存在せず（図１Ｆ、１Ｇ）、ナノセラピーの自然免疫細胞特異性を示した。全体として、データは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬが心臓同種移植片などの炎症部位に対して高い特異性を示し、かつ単球、ＤＣおよび好中球を含む骨髄細胞によって活発に取りこまれることを実証する。
【０１６９】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、骨髄細胞区画を有意に減少させる
白血球集団をプロファイルし、より広範囲に、プラセボ、経口ラパマイシン（経口−ＲＡ）およびｍＴＯＲの−ＨＤＬ処置であって、治療レジメンが移植当日ならびに２日後および５日後に、３回の静脈内ｍＴＯＲ−ＨＤＬ注射を含んだ処置、を受けたマウスの血液、脾臓および同種移植片中の、好中球、Ｍｏ／ＭΦおよびＤＣを含む、骨髄細胞コンパートメントをプロファイルした。標的化データと一致して、有意に減少した合計白血球が、プラセボ（Ｐ≦０．０５およびＰ≦０．０１）または経口−Ｒａ−治療したレシピエントのいずれかと比較して、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置レシピエントの血液、脾臓および同種移植片中で観察された（図２Ａおよび図８）。その上、これらのデータは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が、プラセボ（Ｐ≦０．０５、Ｐ≦０．０５およびＰ≦０．０５）および経口−Ｒａ−治療したレシピエント（Ｐ≦０．０５）の両方と比較して、血液、脾臓および同種移植片中の好中球レベルを低下させたことを示す。さらに、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置は、プラセボ（Ｐ≦０．０５、Ｐ≦０．０１およびＰ≦０．０５）または経口−Ｒａ治療したレシピエント（Ｐ≦０．０５）と比較して、血液循環、脾臓および心臓同種移植片中のＭｏ／ＭΦ数を劇的に減少させた。最終的に、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置は、プラセボ（Ｐ≦０．０５、Ｐ≦０．０１およびＰ≦０．０５）または経口−Ｒａ治療したレシピエント（Ｐ≦０．０５）と比較して、血液循環、脾臓および同種移植片中のＤＣを劇的に減少させた。まとめて、これらの結果は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が、移植された同種移植片中の骨髄細胞の蓄積を妨害することによって、アロ反応性免疫応答を制限することを実証する。
【０１７０】
これらの骨髄細胞の調査の後、Ｍｏ／ＭΦ組織分布に対するｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法の効果を評価した。Ｍｏ／ＭΦは、区域移動特性を有する２つの異なるサブセット（Ｌｙ−６ＣｈｉおよびＬｙ−６Ｃｌｏ）を含む２３。移植６日後に、未治療マウスおよび経口−Ｒａ治療したマウスは、それらの血液、脾臓および心臓同種移植片中で増加した数の蓄積された骨髄細胞を有した（図２Ｂおよび図９Ａ）。さらに、増加したＭｏ／ＭΦ集団は、高いパーセンテージの炎症性Ｌｙ−６Ｃｈｉ単球を含んだ（図９Ａおよび２Ｂ）。対照的に、ｍＴＯＲ−ＨＤＬレシピエントは、プラセボおよび経口Ｒａ−治療した動物よりも、血液（６０％ｖｓ１２％および１３％）、脾臓（５５％ｖｓ２９％および４４％）および心臓同種移植片（５６％ｖｓ２０％および１８％）において、有意に多くのＬｙ−６Ｃｌｏ単球を蓄積した（図２Ｂ、図９Ａ）。従って、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置した群において、プラセボまたは経口−Ｒａ−投与されたレシピエントのいずれかよりも、顕著に少ない循環Ｌｙ−６Ｃｈｉ単球が同定された（それぞれＰ≦０．０５およびＰ≦０．０５）。脾臓および移植器官中のＭｏ／ＭΦサブセットの割合は、末梢血中のレベルを反映した（図１Ｅ）。データは、Ｌｙ−６Ｃｈｉ単球が移植拒絶における骨髄応答を支配する一方で、Ｌｙ−６Ｃｌｏ単球が寛容の間に骨髄応答を支配することを示す。これは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が調節性Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦの蓄積を促進し、恒常性に有利に骨髄球区画のバランスを取り戻すことができることを示唆する。
【０１７１】
ｍＴＯＲパスウェイは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬにより負に調節される
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ免疫療法により標的とされる分子パスウェイを、プラセボまたはｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントの同種移植片からフロー選別されたＭΦから単離されたｍＲＮＡのＧｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＳＥＡ）を用いて研究した。遺伝子アレイ結果は、ｍＴＯＲ（図２Ｃ）経路がｍＴＯＲ−ＨＤＬによって負に調節されることを示した。
【０１７２】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置は、調節性Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦの発達を促進することにより移植寛容の誘導を優先する
次に、移植片浸潤Ｌｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦ同種移植片の抑制的機能をインビトロで評価した。Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦの調節性の抑制的機能を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロ増殖を阻害する能力により評価した。本発明の結果は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントマウスの同種移植片から得られた調節性Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦが、インビトロでＴ細胞増殖を防ぐことを示す。（図３Ａ）。本発明者らはまた、プラセボレシピエントマウスの同種移植片から得られたＬｙ−６ＣｌｏＭΦとは異なり、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントの同種移植片から得られたＬｙ−６ＣｌｏＭΦは免疫抑制性Ｆｏｘｐ３発現Ｔｒｅｇを増殖することを観察した（図３Ａ）。これらのデータと一致して、本発明者らは、同種移植片ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数の有意な増加を観察した（図３Ｂ；図１０）。これは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が、調節性Ｌｙ−６ＣｌｏＭΦの発達を促進することにより移植寛容の誘導を優先するかもしれないことを示唆する。
【０１７３】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法は、樹状細胞による強力なＴ細胞刺激を防ぐ
樹状細胞（ＤＣ）はｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子を取り込むので（図１Ｆ〜Ｇ）、ｍＴＯＲ−ＨＤＬの免疫細胞活性化、抗原提示およびＤＣ介在性Ｔ細胞刺激に対する効果を調査した。まず、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を利用して腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現を評価した。これらのデータは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が、プラセボおよび経口−Ｒａと比較して、血清ＴＮＦ−αレベルを有意に減少させることを示す（図１０；Ｐ≦０．０５およびＰ≦０．０１）。次に、急性拒絶２５、２６の間に上方制御される共刺激性分子および接着分子の発現を調べた。フローサイトメトリーは、ＣＤ４０およびＣＤ５４分子の両方が、プラセボおよび経口−Ｒａ治療されたレシピエントと比較して、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントからの白血球中で有意に減少されることを示す（図１０）。レシピエントＭＨＣクラスＩＩＩ−Ａｂ分子により提示されるドナー由来のＩ−Ｅｄペプチドを認識するＹ−Ａｅモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて、抗原提示に対するｍＴＯＲ−ＨＤＬの効果を評価した。プラセボまたは経口−Ｒａのいずれかからのものよりも有意に少ない抗原提示Ｙ−Ａｅ＋細胞が、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントの大動脈リンパ節および脾臓で観察された。次に、ｍＴＯＲ−ＨＤＬレシピエントから得られたＤＣの能力を評価して、インビトロで抗原特異的Ｔ細胞を刺激した。プラセボおよびｍＴＯＲ−ＨＤＬで処置したマウスの脾臓から抽出したＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋ＤＣを、インビトロで混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を刺激するための開始剤として用いた。抗原特異的なＴＥａＣＤ４＋Ｔ細胞を、これらのＴ細胞がＹ−Ａｅ  ｍＡｂと同様にペプチドとＭＨＣの同じＩ−Ｅｄ−Ｉ−Ａｂ複合体を認識するので、レスポンダーとして単離し、以前に記載されたように細胞をカルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識しＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋脾臓ＤＣと共に培養した２７。ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ＋脾臓ＤＣの刺激特性を、フローサイトメトリーによるＴ細胞中のＣＦＳＥ希釈を測定することにより試験した。これらのデータは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬレシピエントからのＤＣが、対照マウスから得られたＤＣよりも、インビトロでナイーブＴ細胞増殖を刺激する有意に低い能力を有することを示す。次に、移植マウスから得られたＴ細胞の増殖能力を試験した。これらのデータは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬレシピエントからのＴ細胞が、プラセボ拒絶マウスから得られたＴ細胞と同様のインビトロ免疫応答を備えることができることを示す。全体として、これらの結果は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子処置がＤＣ介在性の移植片反応性Ｔ細胞免疫応答を防ぐことを説明する。
【０１７４】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法は、抑制性マクロファージの発達を促進する
ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子がＭｏ／ＭΦを標的とし（図１Ｆおよび１Ｇ）かつそれらの組織分布に影響を及ぼすことを決定した後で、寛容誘導中の同種移植片に蓄積するＬｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦの機能特性を試験した。ドナー心臓同種移植片を移植６日後に回収し、骨髄球コンパートメントをフローサイトメトリーにより分析した。生きたＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋レシピエント移植片浸潤骨髄細胞に焦点を当てることにより、本発明者らはＬｙ−６ＣｈｉＭｏ／ＭΦ、Ｌｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦおよびＬｙ−６Ｇ好中球の差次的発現変動パターンに基づいて３つの主要な集団を見出した（図１Ｄ）。フローサイトメトリー分析は、プラセボレシピエントと比較して、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したマウスの同種移植片中でＬｙ−６ＣｈｉＭｏ／ＭΦより多くのＬｙ−６Ｃｌｏの存在を確認した（図１Ｄ）。群間でＬｙ−６Ｇ好中球頻度に差はなかった。
【０１７５】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントの同種移植片に蓄積するＬｙ−６Ｃｌｏマクロファージの遺伝子アレイの特徴付けは、ｍＴＯＲＣ１パスウェイがこれらのマウスにおいて負に調節されることを明らかにした。これは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が移植片浸潤マクロファージを標的とすることを確認する。
【０１７６】
器官移植の成功を防ぐ共刺激性分子の包括的な分析は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置がＣＤ４０発現を増加させることを明らかにした。この観察と一致して、本発明者らは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントにおける長期同種移植片生着延長を無効にするアゴニスト的ＣＤ４０ｍＡｂ治療を見出した図３Ｆ）。これは、ＣＤ４０Ｌ発現Ｔ細胞がレシピエントＭΦ中でＣＤ４０シグナル伝達を刺激し、最終的な移植片喪失をもたらし得ることを示唆する。有害なＣＤ４０シグナリングを抑制するために、本発明者らは、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害性ＨＤＬ（ＣＤ４０−ＨＤＬまたはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬと呼ばれる；図１１Ａ−Ｂ）からなる第２のナノ免疫療法治療を開発した。低分子阻害剤ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６は、ＴＲＡＦ６上のＣＤ４０の結合ドメインに向けられ、ＣＤ４０シグナリングをブロックし、Ｌｙ６Ｃｈｉ炎症性マクロファージの抗炎症表現型への分極をもたらす。
【０１７７】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬは同種移植片生着を無期限に延長する
最後に、器官拒絶を防ぎ同種移植片生着を延長するナノ免疫療法治療の能力を評価した。Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ２ｄ）ドナー心臓同種移植片を（１）プラセボ、（２）経口−Ｒａ、（３）ｍＴＯＲ−ＨＤＬ、（４）ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ、または（４）ｍＴＯＲ−ＨＤＬ＋ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬで処置した完全同種異系Ｃ５７Ｂｌ／６（Ｈ２ｂ）レシピエントに移植した。移植片生着を評価するために、レシピエントは、心臓収縮が完全に止まるまで腹部触診を受けた。本データは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法が、５０日間にわたる８５％を超える同種移植生着率で移植片の生着を劇的に延長することを示す（図３Ｇ）。対照的に、経口ラパマイシン治療は、同じ期間に同種移植の生着を３５％延長させただけであった（Ｐ≦０．０１、Ｐ≦０．０１）。これは、レジメンが移植後最初の１週間での３回の投与のみを含むことを特に考慮すると、顕著な結果である。
【０１７８】
二次エンドポイントとして、本発明者らは、組合せ治療１００日後の同種移植片の組織学を評価した（図１３Ａ〜Ｂ）。図１３Ｂは、動脈炎を伴わない軽度の末梢炎症を示し内膜肥厚の徴候を示さない。マウス大動脈セグメントは、組織学的変化を示さず内膜肥厚および慢性同種移植脈管症（ＣＡＶ）の徴候はなかった。さらに、本発明者らは、心臓同種移植片モデルを使用して移植後最初の５日以内にｍＴＯＲ−ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの３回の注入を含む組合せ治療レジメンを評価した。図３Ｇに示すように、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ組み合わせ療法は器官移植を相乗的に促進し、移植後１００日間にわたり７０％を超える生着をもたらし、ｍＴＯＲ−ＨＤＬおよびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ単剤療法よりも著しく優れている。
【０１７９】
治療のタイミングは様々であり、移植前に、移植と同時に、または移植後のいずれかで開始できる。一実施形態において、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置またはｍＴＯＲ−ＨＤＬ／ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ組み合わせ処置は、器官移植の１〜２日前に開始される。
【０１８０】
インビトロで抑制性のＬｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦがｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントにおける延長された移植片生着を媒介するかどうかを試験するために、本発明者らは、最近記載されたように、インビボでＬｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦを枯渇させた９。簡単に、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ２ｄ）ドナー心臓同種移植片を、移植当日に完全同種異系ＣＤ１６９ジフテリア毒素（ＤＴ）受容体（ＤＴＲ）（Ｈ２ｂ）レシピエントマウスに移植して、レシピエントＬｙ−６Ｃｌｏマクロファージを枯渇させた。移植片浸潤白血球を移植６日後にフローサイトメトリーにより調べて、インビトロ抑制性マクロファージのＬｙ−６Ｃｌｏの特異的枯渇を確認した（図３Ｂ）。それに続く移植片生着実験は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置にもかかわらず、Ｌｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦ枯渇が１５日目（１２．３±１．８）までに移植片拒絶をもたらしたことを示した（図３Ｄ）。野生型単球の養子移入は同種移植生着率を回復させ、ナノ免疫療法が調節性ＭΦを介してその効果を発揮することを実証した。これらの実験は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が、Ｔ細胞介在性免疫応答を防ぎそれにより同種移植生着延長を促進する、調節性Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージのインビボ発生を刺激することを示唆する。
【０１８１】
ｍＴＯＲ−ＨＤＬの一般的な治療適用性をさらに調査するために、本明細書に記載のｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法を、拒絶反応が巨視的にモニタリングされた完全同種異型皮膚移植モデルに適用した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。同じ３回投与レジメンを用いて、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ医薬処置は、移植片生着を劇的に増強した。平均生着時間は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したレシピエントにおいて有意に増加し、５０日目に７５％を超える生着であった；一方、プラセボ群は、１００％の拒絶率（Ｐ≦０．０１）（１０．５±２．９日）を有した。全体として、これらの実験および結果は、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法がＤＣ介在性Ｔ細胞刺激を防ぎ、Ｌｙ−６ＣｌｏＭｏ／ＭΦ発生を促進し、かつ同種移植片生着を劇的に延長することを示す。
【０１８２】
図１３Ａ〜Ｂは、ｍＴＯＲ−ＨＤ処置と比較した、経口−Ｒａと関連する毒性を示すグラフである。レシピエントマウスは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ治療レジメンを受けたか、または同じ治療的結果を達成するために投与量が増加された経口−Ｒａ治療を受けた（ｎ＝４、灰色）または（ｎ＝４、黒）。ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、血液尿素窒素（ＢＵＮ、図１３Ａに示す）または血清クレアチニン（図１３Ｂに示す）に対して有意な効果を有さないが、腎臓毒性パラメータは、経口−ＲａとｍＴＯＲ−ＨＤＬとの間に統計的差異を示し、一方で注入３０日後に同系およびｍＴＯＲ−ＨＤＬレシピエント間の差異は観察されなかった（ＡＮＯＶＡ＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１）。
【０１８３】
Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳおよびＭａｓｓｏｎ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍによって染色され腎臓の病理学者によって検査された、腎臓からの組織学的切片は、腎実質の３つの区画で有意な変化を示さない（図１３Ａ）。正常に見える糸球体が存在し、糸球体硬化症の兆候はない。細管は、空胞化、刷子縁の喪失または有糸分裂を含む顕著な萎縮または上皮細胞損傷のいかなる証拠も示さない。動脈および細動脈は、それぞれ内膜線維症または細動脈ヒアリノシスの証拠を示さない。Ｈ＆Ｅ、ＰＡＳ、Ｍａｓｓｏｎ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍで染色され肝臓病理学者によって検査された肝臓切片は、正常な腺房および小葉構造を示す。門脈管および肝実質に炎症または線維化の証拠はない。肝細胞は正常であり、胆汁うっ滞、封入体またはアポトーシスの徴候はない（図１３Ａ）。図１３Ｂにおいて、切片は、動脈炎のない軽度の末梢炎症を示しおよび内膜肥厚の徴候はない。マウス大動脈セグメントは、内膜肥厚を伴わずに組織学的変化を示さず、慢性同種移植脈管症（ＣＡＶ）の徴候はない。
【０１８４】
議論
移植患者は、器官拒絶を避けるために免疫抑制薬で治療される３０。免疫抑制剤は、適応免疫システムを標的とし、深刻な副作用を有する３１、３２。現在の移植免疫学の研究は、異なる実験移植モデルを用いて新規寛容原性プロトコルを開発することを目指している。基本的な免疫学と革新的なナノ医学を組み合わせることは、免疫寛容を促進する有望な新しいアプローチである。動物モデルの使用は、この研究において重要な役割を果たす。残念ながら、いくつかの実験的寛容原プロトコルがマウスおよび霊長類において無期限の同種移植片生着を誘導し得る一方３３、３４、血栓塞栓性合併症が、これらの方法が臨床的治療に変換されることを妨げている３５。その結果、移植拒絶反応を防ぐために、自然免疫系を標的とするなどの、免疫調節に対する代替アプローチの継続的な必要性がある１１、１２、３６。
【０１８５】
本研究では、データは、保存的に投与されたＨＤＬカプセル化ラパマイシンが移植片生着を延長することを実証する。これは、最近記載されたように、カプセル化されたラパマイシン（すなわち、遊離形態ではない）のみが、免疫学的寛容を誘導するために使用され得ることを示す３７。データはまた、ｍＴＯＲ−ＨＤＬが血液、脾臓および同種移植片中の白血球を減少させることを機構的に示す。白血球の接着および移動の減少は、以前の研究と一致して、より良好な移植片生着と関連している３８〜４１。より具体的には、同種移植片中のより少ない骨髄性細胞浸潤が付随する有意に低いＭｏ／ＭΦおよび好中球数が観察された。ミエロイド区画を標的とするこのｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ治療アプローチとは対照的に、吸収された経口ラパマイシンの９５％が赤血球に結合する４２。したがって、本ナノ療法送達ストラテジーは、薬物の生物学的利用能を劇的に高めるための革新的な方法を提示する。
【０１８６】
移植器官における細胞浸潤を減少させるその能力と関連して、インビボでのｍＴＯＲ−ＨＤＬ投与は、炎症促進性分子の産生を著しく減少させ、Ｔ細胞増殖を誘発するＤＣの能力を減少させる。これらの結果は、インビトロでラパマイシンで条件付けられたＤＣが炎症促進性メディエーターを減少させ同種移植片生着を延長することを示す、以前の報告と一致する４３。その上、これらのデータは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ療法が、それらの刺激性機能を阻害することによってＤＣにさらに影響を及ぼすことを示し、それによって同種抗原特異的Ｔ細胞活性化が治療的に調節され得ることを示唆している。本データは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置がＣＤ４＋Ｔ細胞への同種抗原の提示を減少させることも実証する。これらの免疫調節効果は、抗原提示細胞が移植される器官に対する特異的なアロ反応性を媒介する、移植の間に極めて重要である４４。
【０１８７】
本データは、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置が、細胞傷害性Ｔ細胞応答を阻害する抑制性マクロファージの蓄積を媒介することを示す。さらに、ＨＤＬ処置したレシピエント由来のＬｙ−６Ｃｌｏマクロファージは、インビトロでＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを増殖し、インビボでの移植片内Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ蓄積と相関する。Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージを枯渇させることはｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置にもかかわらず寛容誘導を防ぐため、移植器官中の調節性Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージの蓄積は、ＴＯＲ−ＨＤＬに媒介される同種移植片生着延長にとって重要であると思われる。これらの結果は、Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージが細胞傷害性Ｔ細胞増殖を阻害し、Ｔｒｅｇ増殖を媒介し、かつ移植寛容を促進することを示す研究と一致する９。結果は、ＨＤＬベースのナノ粒子が、インビボでマクロファージを標的とする薬物送達系を開発するための新規な治療的アプローチであることを実証する。
【０１８８】
まとめると、これらのデータは、ＨＤＬナノ粒子技術が自然免疫システムに免疫抑制薬を効果的に送達することを示す。ｍＴＯＲ−ＨＤＬは、ＤＣ活性化を防ぎ、調節性マクロファージの発生を促進し、かつ無期限の同種移植片生着を誘導する。ｍＴＯＲ−ＨＤＬ技術は、自然免疫細胞を標的にして長期同種移植片生着を誘導する、革新的で、効果的で、かつ潜在的に橋渡し的な治療アプローチである。最適化されたＧＭＰプロトコルの臨床試験および実施は、長期間の安全性および有効性を確認するであろう。ｍＴＯＲ−ＨＤＬは既存のＦＤＡ承認剤を組み合わせるため、その開発−または他のＦＤＡ承認された免疫抑制剤を放出するＨＤＬナノ粒子システムの開発−は、即座に移行につながる可能性がある。
【０１８９】
材料および方法
ナノ粒子合成
本標的アプローチは、新規の合成高密度リポタンパク質ナノ粒子プラットフォームを用いて薬物ラパマイシンを送達する。ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子を、改質脂質膜水和法を用いて合成した。簡潔には、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）（いずれもＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した）およびラパマイシン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を３：１：０．５の重量比でクロロホルム／メタノール（１０：１  ｖ／ｖ）混合物中に溶解した。溶媒を蒸発させた後、ＰＢＳ中のヒトＡＰＯＡ１を添加して、リン脂質対ＡＰＯＡ１の重量比５：１で、脂質膜を水和させ、氷浴中で２０分間インキュベートした。得られた混合物を氷浴中でプローブソニケーターを用いて１５分間ホモジナイズして、ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子を得た。ｍＴＯＲ−ＨＤＬを洗浄し、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターチューブを用いて遠心濾過により濃縮した。凝集物を、遠心分離および濾過（０．２２μｍ）を用いて除去した。経口ラパマイシン溶液（経口−Ｒａ）はＰＢＳ中の４％エタノール、５％ＰＥＧ３００および５％ＴＷＥＥＮ８０からなり、一方で静脈内ラパマイシン溶液（ｉ．ｖ．−Ｒａ）はＰＢＳ中の４％エタノールおよび５％ＴＷＥＥＮ８０を含んだ。動物は、移植の日ならびに移植後２日および５日にラパマイシン用量５ｍｇ／ｋｇで、経口投与または静脈内尾部注入（ｍＴＯＲ−ＨＤＬまたはｉ．ｖ．−Ｒａとして）を受けた。
【０１９０】
ＣＤ４０−ＨＤＬナノ粒子を、上記と同様の手順に従って合成した。ＤＭＰＣ、ＭＨＰＣおよびＴＲＡＦ６−阻害剤（２Ｅ）−１−フェニル−３−（２，５−ジメチルアニリノ）−２−プロペン−１−オン１を、クロロホルム／メタノール混合物（１０：１ｖ／ｖ）中に８．７：１：０．６の重量比で混合し、次いで真空下で乾燥させて、薄い脂質フィルムを作製した。ＡＰＯＡ１を含むＰＢＳを、リン脂質対ＡＰＯＡ１９．５：１重量比の脂質膜に添加し、膜が水和し均一な溶液が形成されるまで３時間氷上でインキュベートした。この溶液を次いで１時間超音波処理してＣＤ４０−ＨＤＬナノ粒子を形成させた。続いて、溶液を複数の遠心分離および濾過工程によって精製した。
【０１９１】
マウス
雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６ＷＴ、Ｈ−２ｂ）、ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｆｏｘｐ３ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ）マウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＣＤ１６９ＤＴＲマウスは、Ｍａｓａｔｏ  Ｔａｎａｋａ（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）からのものであった。クラスＩＩのＩ−Ａｂ分子に結合するＩ−Ｅα鎖（Ｅαペプチド）の残基５２〜６８を表すペプチドを認識するＣ５７ＢＬ／６ＪＣＤ４＋トランスジェニックＴＥａマウスは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）からのものであった。動物を、８〜１０週齢（体重、２０〜２５ｇ）で登録した。すべての実験を、施設動物実験および利用委員会によって承認されたプロトコルに従って、８〜１２週齢の雌適合マウスで行った。
【０１９２】
血管化心臓移植
ＢＡＬＢ／ｃ心臓を、以前に記載されたように４５、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中に完全に血管新生した異所移植片として移植した。心臓を、ドナーとレシピエントの大動脈の間のエンド・トゥ・サイド吻合と、ドナーの肺幹とレシピエントの下大静脈との間のエンド・トゥ・サイド吻合を確立することによって、レシピエントの腹膜腔に移植した。心臓同種移植片生着を続いて、毎日の触診によって評価した。拒絶を、心臓収縮の完全な停止として定義し、開腹術での直接視覚化によって確認した。移植片生着を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を用いて群間で比較した。
【０１９３】
マイクロＰＥＴ／ＣＴイメージングおよび生体分布研究
マウス（ｎ＝６、心臓移植３例、皮膚移植３例）［重量：１８．８±１．０ｇ］に、０．２ｍＬＰＢＳ溶液中の８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬ（０．１７±０．０１ｍＣｉ、〜０．２５ｍｇＡＰＯＡ１）をそれらの外側の尾の静脈を介して注入した。２４時間で、動物をイソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）／酸素ガス混合物（誘導については２％、維持については１％）で麻酔し、スキャンを次に、Ｉｎｖｅｏｎ  ＰＥＴ／ＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｇｌｏｂａｌ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。３０００万回の同時発生事象を記録する全身ＰＥＴ静的スキャンを、１５分間行った。エネルギーおよび一致タイミングウィンドウは、それぞれ３５０〜７００ｋｅＶおよび６ｎｓであった。画像データを、ＰＥＴ応答不均一性、デッドタイムカウント損失、陽電子分岐比および注入時間に対する物理的減衰を補正するために正規化したが、減衰、散乱または部分体積平均補正は適用されなかった。再構成画像における計数率を、８９Ｚｒを含むマウスサイズの水分等価ファントムを画像化して得られたシステム較正係数を用いて、活性濃度（組織１ｇ当たりの投与量％［％ＩＤ］％）に変換した。画像を、ＡＳＩＰｒｏＶＭＴＭソフトウェア（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ，ＵＳＡ）を用いて分析した。全身標準低倍率ＣＴスキャンを、電圧８０ｋＶおよび電流５００μＡでのＸ線管設置で行った。ＣＴスキャンを、で１２０秒の推定スキャン時間と１フレーム当たり１４５ミリ秒の露出をもたらす合計２２０度について１２０回の回転ステップを使用して得た。ＰＥＴ／ＣＴスキャンの直後に、動物を犠牲にし、関心のある組織−腎臓、心臓、肝臓、脾臓、血液、骨、皮膚、および筋肉−を収集し、秤量し、Ｗｉｚａｒｄ２２４８０自動ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でカウントして、放射活性含有量を決定した。値を減衰補正し、１グラム当たりの注射された用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）に変換した。移植された心臓内の放射能分布を決定するために、天然および移植した標本を、リン酸イメージングプレート（ＢＡＳＭＳ−２３２５、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｖａｌｈａｌｌａ、ＮＹ）に対するフィルムカセット中に−２０℃で４時間置いた。プレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ７０００ＩＰプレートリーダー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いて２５μｍのピクセル解像度で読み取った。画像を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して分析した。
【０１９４】
グラフト浸潤白血球の単離
マウス心臓を、１％ヘパリンを含むＨＢＳＳでその場ですすいだ。取り出した心臓を、小片に切断し、ＨＢＳＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中の４００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）および０．０１％ＤＮａｓｅＩ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて３７℃で４０分間消化した。消化した懸濁液を、ナイロンメッシュに通し遠心分離し、細胞ペレットを、完全なＨＢＳＳ中に再懸濁し、染色し、フローサイトメトリー（ＢＤＬＳＲ−ＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１９５】
フローサイトメトリーおよび細胞選別
骨髄細胞染色のために、マウスＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、Ｆ４／８０（クローンＣＩ：Ａ３．１）、Ｌｙ−６ＣクローンＨＫ１．４）および対応するアイソタイプ対照に特異的な蛍光色素複合ｍＡｂを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。Ｌｙ−６Ｇ（クローン１Ａ８）ｍＡｂを、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。Ｆ４／８０（クローンＣＩ：Ａ３．１）を、ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃから購入した。Ｔ細胞染色のために、ＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）、ＣＤ３（クローン２Ｃ１１）、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８（クローン５３−６．７）、ＣＤ２５（クローンＰＣ６１．５）、ＣＤ４０（クローン１Ｃ１０）およびＣＤ５４（クローンＹＮ１／１．７．４）に対する抗体を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。絶対細胞計数を、ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。抗原提示を検出するために、Ｙ−Ａｅ  ｍＡｂを、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。フローサイトメトリー分析を、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）で分析した。結果を、染色された細胞またはバックグラウンドを超える細胞数（１ミリリットルあたりの細胞）のパーセンテージとして表す。ｍＡｂを、これらの研究の過程で一定の間隔で滴定して飽和濃度の使用を確実にした。移植片浸潤骨髄細胞を精製するために、ドナー心臓単細胞懸濁液を、フローサイトメトリー共有資源施設（Ｍｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉのＩｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）にてＩｎＦｌｕｘセルソーター（ＢＤ）で選別して＞９６％の純度を達成した。
【０１９６】
混合リンパ球反応
抗原特異的ＴＥａ（Ｈ−２ｂ）マウスの脾臓を、単細胞懸濁液へと穏やかに解離し、赤血球を、低血圧ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて除去した。脾細胞を５μＭ濃度でＣＦＳＥ細胞増殖マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの分子プローブ）で標識し、続いて氷上にて３０分間抗ＣＤ４ｍＡｂで染色した。レスポンダーＣＦＳＥ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、＞９８％の純度でＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。ｍＴＯＲ−ＨＤＬ−およびプラセボ処置したレシピエント由来の脾細胞を、ＥａｓｙＳｅｐマウスＣＤ１１ｃ陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を用いてＣＤ１１ｃ＋細胞について濃縮した。濃縮したＣＤ１１ｃ＋脾細胞を、氷上にて３０分間抗マウスＣＤ１１ｃ  ｍＡｂで染色した。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別し、次いでレスポンダー細胞ＣＦＳＥ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために使用した。細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて４日間培養し、ＣＦＳＥ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を、ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー分析によって測定した。
【０１９７】
インビトロ抑制アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスの脾臓を、単細胞懸濁液へと穏やかに解離し、赤血球を、低血圧ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて除去した。脾細胞を５μＭ濃度でＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの分子プローブ）で標識し、続いて氷上にて３０分間抗ＣＤ８ｍＡｂで染色した。レスポンダーＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、純度＞９８％のＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。ＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、刺激剤として抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズと共に使用した。刺激されたＣＦＳＥ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、グラフト浸潤Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージ、ｍＴＯＲ−ＨＤＬまたはプラセボと共に、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて７２時間培養した。Ｔ細胞増殖を、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー分析によって測定した。
【０１９８】
Ｔｒｅｇ増殖アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６−Ｆｏｘｐ３ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ（Ｈ−２ｂ）マウスの脾臓を、単細胞懸濁液へと穏やかに解離し、赤血球を、低血圧ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて除去した。脾細胞を、氷上にて抗ＣＤ４ｍＡｂで３０分間染色した。レスポンダーＣＤ４＋を、＞９８％の純度でＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、刺激剤として抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズと一緒に使用した。刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて７２時間、移植片浸潤Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージ、ｍＴＯＲ−ＨＤＬまたはプラセボと共に培養した。Ｔｒｅｇの増殖を、ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＦｏｘｐ３−ＲＦＰのフローサイトメトリー分析によって測定した。
【０１９９】
マイクロアレイ
移植片浸潤レシピエントＬｙ−６Ｃｌｏマクロファージを、移植後６日目にｍＴＯＲ−ＨＤＬ処置したおよびプラセボ拒絶レシピエントから選別した。細胞をＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回選別して＞９８％の純度を達成した。選別された細胞のマイクロアレイ分析を、合計６個のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｘｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ２．０アレイを目的のサンプルを用いて３回繰り返して行い、実施た。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＣｏｎｓｏｌｅからのＲａｗＣＥＬファイルデータを、バックグラウンド修正し、正規化し、ＲＭＡを使用して要約した。サマリー発現スコアを、製造業者によって供給された注釈ファイルを使用して、転写物メタプローブセットレベルで計算した。遺伝子発現を、遺伝子フィルターパッケージを用いるＩＱＲ（０．２５）フィルターに基づいてフィルターにかけた。ｌｏｇ２正規化およびフィルタリングされたデータ（調整されたＰ＜０．０５）を、さらなる解析に使用した。遺伝子シグネチャーの比較を、ｍＴＯＲ−ＨＤＬ由来の移植片内Ｌｙ６Ｃｌｏマクロファージとプラセボ処置したレシピエントとの間で行った。ＧＳＥＡを、Ｇｅｎｅ  ｐａｔｔｅｒｎバージョン３．９．６からのＧＳＥＡバージョン１７を用いて実施した。分析に用いたパラメータは以下の通りであった。Ｇｅｎｅ  ｓｅｔｓ  ｃ２．ｃｐ．ｂｉｏｃａｒｔａ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ；ｃ２．ｃｐ．ｋｅｇｇ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ；ｃ２．ｃｐ．ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ；ｃ６．ａｌｌ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ），ｃ７．ａｌｌ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）；およびｈ．ａｌｌ．ｖ５．１．ｓｙｍｂｏｌｓ．ｇｍｔ（Ｈａｌｌｍａｒｋｓ）を用いてＧＳＥＡを実行し、１０００個の置換を用いてｐ値を計算し、置換型を遺伝子セットに設定した。各遺伝子セットを別々に実行した。基本フィールドと詳細フィールドを、すべてデフォルトに設定した。各遺伝子セット結果から有意な経路を選択するために、０．２５のｆｄｒ  ｑ−値をカットオフとして設定した。コア濃縮に寄与した遺伝子のみを考慮した。
【０２００】
インビボマクロファージ枯渇
ＣＤ１６９発現Ｌｙ−６Ｃｌｏマクロファージを枯渇させるために、ヘテロ接合体ＣＤ１６９−ＤＴＲレシピエントに、移植の２４、４８および７２時間後に１０ｎｇ／ｇ体重のＤＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射した４６。
【０２０１】
統計的解析
結果を、平均±ＳＥＭとして表す。２つの群間の統計的比較を、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて評価した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存グラフを実施し、群の対数順位比較によりＰ値を算出した。Ｐ≦０．０５の値を統計的に有意とみなした。ＩＢＭ  ＳＰＳＳ統計２２を統計分析に利用した。
【０２０２】
近赤外蛍光イメージング
Ｃ５７／Ｂ６野生型マウスは、ＤｉＲ色素またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかで標識された５ｍｇ／ｋｇのｍＴＯＲ−ＨＤＬの単回静脈内注射を受けた。２４時間後に、マウスを屠殺し、ＰＢＳで灌流した。肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および筋肉組織を、ＮＩＲＦイメージング用に収集した。蛍光画像を、７４５ｎｍ励起フィルターおよび８２０ｎｍ発光フィルターを用いて、２秒の曝露時間でＩＶＩＳ  ２００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で取得した。各組織内の平均放射効率および対照に対する比の両方を、定量化した。
【０２０３】
放射性標識ｍＴＯＲ−ＨＤＬナノ粒子
８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬを、以前に記載された手順［１５］に従って調製した。簡潔には、初期製剤中で１モル％のリン脂質キレート剤１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−１，８−ジアザフルレン−９−オン（ＤＳＰＥ−ＤＦＯ）［４４］を１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）の代償に添加することにより、即座に標識されるｍＴＯＲ−ＨＤＬを得た。８９Ｚｒでの放射性標識を、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．１）中で３７℃にて１時間ＤＦＯ含有ナノ粒子を８９Ｚｒ−シュウ酸塩と反応させることによりが達成した。８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬを、１０ｋＤａの分子量カットオフチューブを用いる遠心濾過によって単離した。放射化学的収率は７５±２％（ｎ＝２）であった。
【０２０４】
８９Ｚｒ−ｍＴＯＲ−ＨＤＬの生体分布
ＰＥＴ／ＣＴスキャンの直後に、マウスを屠殺し、興味のある組織（血液、心臓、腎臓、肺、肝臓、脾臓、骨、皮膚、筋肉および移植片）を採取し、ブロットし、秤量してから、Ｗｉｚａｒｄ２  ２４８０自動ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で放射能を計数した。放射能含量を次いで、放射能濃度に変換し、組織１グラム当たりの注射された用量の百分率（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【０２０５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
血液を、移植後６日目に採集し、血清を、室温でのインキュベーションおよび短い遠心分離後に１．１ｍｌのＺ−Ｇｅｌマイクロチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を用いて精製した。血清中のＴＮＦ−α分泌を、製造者のプロトコルに従いＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した（各群でｎ＝４）。アログラフトサイトカイン産生を、製造者のガイドライン（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）に従いＩＬ−６およびＴＮＦαの市販のＥＬＩＳＡキットを用いて上清中で測定した。
【０２０６】
超音波イメージング
心臓同種移植移植速度（１分当たりの拍動数、ＢＰＭ）を、その最大寸法にわたるＭモードカーソルラインおよび左心室壁のトレースで、移植された心臓の短軸横断面Ｂモード画像を用いて、モニタリングした。
【０２０７】
皮膚移植
全層幹皮膚同種移植片を、先に記載したように配置した［４２］。皮膚をＢＡＬＢ／Ｃから回収し、０．５ｃｍ片に切断し、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントに置いた。皮膚同種移植片を、レシピエントの胸部を覆って準備したやや大きな移植床に置き、ワセリン、ガーゼおよび包帯を用いて固定した。移植片を、拒絶反応の証拠のために視覚的に毎日評価した。皮膚同種移植拒絶反応を、デジタル顕微鏡写真撮影によってモニターし、それが＞９０％の壊死であった場合、完全に拒絶されたとみなした。移植片生存率を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存分析を用いて群間で比較した。
【０２０８】
参照
１．  Ｄｅｍｉｒｋｉｒａｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｏ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｔｈｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８７，  １０６２−１０６８  （２００９）．
２．  Ｇａｒｄｉｎｅｒ，  Ｋ．Ｍ．，  Ｔｅｔｔ，  Ｓ．Ｅ．  ＆  Ｓｔａａｔｚ，  Ｃ．Ｅ．  Ｍｕｌｔｉｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ，  Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ，  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ，  Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ，  ａｎｄ  Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２１，  １−１１  （２０１６）．
３．  Ｌｉｅｎ，  Ｙ．Ｈ．  Ｔｏｐ  １０  ｔｈｉｎｇｓ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｒｅ  ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  ｓｈｏｕｌｄ  ｋｎｏｗ  ａｂｏｕｔ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （２０１５）．
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２１．  Ｃｈａｍｂｅｎｏｉｔ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＡＢＣＡ１  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６，  ９９５５−９９６０  （２００１）．
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２３．  Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ，  Ｆ．，  Ｊｕｎｇ，  Ｓ．  ＆  Ｌｉｔｔｍａｎ，  Ｄ．Ｒ．  Ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｉｎｃｉｐａｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９，  ７１−８２  （２００３）．
２４．  Ｍａｕｒｙ，  Ｃ．Ｐ．  ＆  Ｔｅｐｐｏ，  Ａ．Ｍ．  Ｒａｉｓｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃａｃｈｅｃｔｉｎ／ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６６，  １１３２−１１３７  （１９８７）．
２５．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｋ．，  Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ，  Ｕ．，  Ｍａｃｈ，  Ｆ．，  Ｌｉｂｂｙ，  Ｐ．  ＆  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｒ．Ｎ．  Ｈｏｓｔ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｒａｆｔ  ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５，  ３５０６−３５１８  （２０００）．
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２８．  Ｅｎｄｏ，  Ｓ．，  Ｓａｋａｍｏｔｏ，  Ｙ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｅ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ａ．  ＆  Ｔａｋａｉ，  Ｔ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ＰＩＲ−Ｂ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０５，  １４５１５−１４５２０  （２００８）．
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３６．  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｏ，  Ｔ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ｎ．  ＆  Ａｓｈｉｈａｒａ，  Ｅ．  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  Ｐｒｏｌｏｎｇｓ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ａｌｌｏｇｒａｆｔ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｂｙ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｍｙｅｌｏｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｅｌｌｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５，  ２３６４−２３７７  （２０１５）．
３７．  Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，  Ｒ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１２，  Ｅ１５６−１６５  （２０１５）．
３８．  Ｓｗｉｒｓｋｉ，  Ｆ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｒｉｃｈ  Ｌｙ−６Ｃ＋  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｏｒｇａｎ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２０，  ２６２７−２６３４  （２０１０）．
３９．  Ｇａｒｃｉａ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２０，  ２４８６−２４９６  （２０１０）．
４０．  Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｗｏ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０４，  ３０３７−３０４７  （２００７）．
４１．  Ｓｈｉ，  Ｃ．  ＆  Ｐａｍｅｒ，  Ｅ．Ｇ．  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  １１，  ７６２−７７４  （２０１１）．
４２．  Ｇａｒｒｏｄ，  Ｋ．  Ｒ．  ＆  Ｃａｈａｌａｎ，  Ｍ．  Ｄ．  Ｍｕｒｉｎｅ  ｓｋｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，  ｄｏｉ：１０．３７９１／６３４  （２００８）．
４３．  Ｈａｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＩＬ−４−−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｌｏｏｄ  １０１，  ４４５７−４４６３  （２００３）．
４４．  Ｈｅｒｒｅｒａ，  Ｏ．Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３，  ４８２８−４８３７  （２００４）．
４５．  Ｃｏｒｒｙ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｗｉｎｎ，  Ｈ．Ｊ．  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｐ．Ｓ．  Ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｈ−２Ｄ，  Ｈ−２Ｋ，  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｈ−２  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １６，  ３４３−３５０  （１９７３）．
４６．  Ｍｉｙａｋｅ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１７，  ２２６８−２２７８  （２００７）．
４７．  Ｚａｒｚｙｃｋａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｃｅ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｍｏｄｅｌ．  ５５：２９４−３０７  （２０１５）．
４８．    Ｃｈａｔｚｉｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１４  Ｆｅｂ．  １８；１１１（７）：２６８６−９１．
４９．      Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５；  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ６８６０７６６  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  （Ｌｏｎｄ）．  ２０１５  Ｍａｙ；３９（５）：７８２−９０．
【０２０９】
実施例２
標的化されたＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害は、アテローム性動脈硬化症におけるマクロファージの蓄積を解消する
アテローム性動脈硬化症において、マクロファージの蓄積は、プラークの不安定化および破裂に直接関連し、急性アテローム血栓症事象を引き起こす。循環単球はプラークに入りマクロファージへと分化し、ここでそれらはＣＤ４０＋ＣＤ４０リガンドシグナル伝達を介してＣＤ４＋Ｔリンパ球により活性化される。ここで、本発明者らは、単球／マクロファージにおけるこのシグナリングパスウェイの中断が、アテローム性動脈硬化症のＡｐｏＥ−／−マウスモデルにおいて迅速な抗炎症効果を発揮することを示す。この目的のために、本発明者らは、ＣＤ４０と腫瘍壊死因子受容体関連因子６との相互作用の小分子阻害剤を担持する注入可能な再構成高密度リポタンパク質ナノ粒子を開発した。本発明者らは、それらの移動能力を損なう、本ナノ免疫療法の単球／マクロファージ特異的標的化を示す。この療法によるプラーク炎症の急速な減少は、非ヒト霊長類における好都合な毒性プロファイルによって示されるように、臨床的移行の可能性が高い、アテローム性動脈硬化症の治療における新規な戦略である。
【０２１０】
マクロファージへと分化する循環単球の補充は、アテローム性動脈硬化性プラーク炎症を悪化させる重要な寄与過程である［１］。プラーク中のこの動的マクロファージの蓄積は、アテローム血栓症の発生と直接関連する［１］。
【０２１１】
ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ）シグナリングを介するＣＤ４＋Ｔリンパ球によるプラークマクロファージの活性化がプラーク炎症を惹起する際に中心的な役割を果たすことが、１９９０年代に早くも認められた［２］。アポリポタンパク質ｅノックアウト（Ａｐｏｅ−／−）マウスにおけるＣＤ４０Ｌの遺伝的破壊は、アテローム硬化性病変の発達を劇的に減少させ、プラークのＴリンパ球およびマクロファージの含量を減少させる［３］。抗マウスＣＤ４０Ｌ抗体による低密度リポタンパク質レセプターノックアウト（ＬＤＬｒ−／−）マウスおよびＡｐｏｅ−／−の処置は、同様のアテローム保護効果を有した［４〜６］。さらなる研究は、腫瘍壊死因子レセプター関連因子６（ＴＲＡＦ６）がマクロファージ内部のＣＤ４０シグナル伝達カスケードを推進する上で特に重要であることを明らかにした［７］。ＴＲＡＦは、ＣＤ４０の細胞質ドメインを結合でき、受容体複合体をいくつかの異なるシグナル伝達パスウェイに結合させることができるアダプタータンパク質である［８］。実際に、骨髄細胞におけるＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の欠損は、単球のプラークへのリクルートメントを減少させ、Ａｐｏｅ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化プラーク形成を消失させることが示されている［７］。
【０２１２】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用は有望な治療的標的を提供するが、主な制限はその阻害と関連する。骨髄細胞におけるＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の役割に加えて、それはＢリンパ球の成熟および長期生存形質細胞の生成を部分的に制御する［９］。したがって、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の長期間の阻害は、おそらく免疫不全を引き起こし、それをアテローム性動脈硬化症に対する実現不可能な治療的アプローチにするであろう。
【０２１３】
この問題に対処するために、我々は、単球／マクロファージにおいてＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用を特異的にブロックする能力を有する標的化免疫療法を開発した。この目的のために、本発明者らは、再構成高密度リポタンパク質（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）中に、最近開発されたＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の小分子阻害剤を組み込んだ［１０、１１］。我々は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬが単球／マクロファージを標的とし一方でリンパ球はナノ粒子を取り込まないことを、アテローム性動脈硬化症のＡｐｏｅ−／−マウスモデルにおいて示す。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ免疫療法の１週間後に、プラーク炎症の急速な減少および単球のリクルートメントの減少が観察された。これらの発見と一致して、トランスクリプトーム分析全体は、細胞移動が、影響される細胞過程の中にあることを示した。最後に、その移行能力を評価するために、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの薬物動態、生体内分布および安全性を評価した。
【０２１４】
結果
ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの特性。
この研究の目的は、標的化されたナノ免疫療法（ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ）を介して単球／マクロファージにおけるＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用を特異的に阻害することによってプラークの炎症を減少させることであった。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子は、ヒトアポリポタンパク質ＡＩ（ａｐｏＡ−Ｉ）、およびリン脂質１−ミリストイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＭＨＰＣ）ならびに１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から構築され、その中にＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の親油性小分子阻害剤（ＳＭＩ６８７７００２）がカプセル化された［８、１１］。ａｐｏＡ−Ｉはそれ自身で調節効果を有することができるので、ナノ免疫療法は、低いａｐｏＡ−Ｉ対薬物比で設計された。得られたＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子（図１４Ａに模式的に示される）は、動的光散乱および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって決定される、直径が２２．６±１２ｎｍ（ＰＤＩ＝０．３）であった。蛍光技術、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、ガンマ計数およびオートラジオグラフィーによる検出を可能にするために、蛍光色素（ＤｉＯまたはＤｉＲ）またはジルコニウム−８９（８９Ｚｒ）放射性標識リン脂質を組み込んだ、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ変異体を合成した。
【０２１５】
概略
研究設計の概略図が図１４Ｂに示される。研究の最初の部分は、アテローム性動脈硬化症マウス（高コレステロール食のＡｐｏｅ−／−マウス）で行われた。これらのマウスで、最初にＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの毒性、薬物動態、生体内分布、およびアテローム性動脈硬化プラーク単球／マクロファージ標的効率を研究した。続いて、４回の静脈内注入を含む１週間のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬレジメンのプラーク回帰効果を評価した。次に、全トランスクリプトーム解析を用いて、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬがプラーク単球／マクロファージに作用するメカニズムを調べた。この研究の第２の部分は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ免疫療法の移行可能性に焦点を当てた。この目的のために我々は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの毒性および薬物動態を調べ、一方で非ヒト霊長類における体内分布と血管壁の標的化を長期にわたり研究するために、磁気共鳴（ＰＥＴ／ＭＲＩ）を用いてインビボ陽電子放出断層撮影法を実施した。
【０２１６】
Ａｐｏｅ−／−マウスにおける毒性、薬物動態、および生体分布研究。
１週間のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置は、赤血球、血小板または白血球レベルに影響を与えなかった（図２０）。網状赤血球およびリンパ球の数は、プラセボと比較して幾分増加した。骨髄血液および脾臓におけるＴ細胞およびＢ細胞の数は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法の影響を受けなかった。アルカリホスファターゼはいくらか増加したが、腎臓および肝臓の機能への毒性作用は観察されなかった（図２１）。脂質、グルコース、タンパク質および電解質は影響を受けなかった。
【０２１７】
その薬物動態および生体内分布を調べるために、Ａｐｏｅ−／−マウスは８９Ｚｒ−放射性標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの単回注入を受けた。８９Ｚｒ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの血液放射能クリアランスを２４時間にわたって測定し、データを２相減衰非線形回帰を用いて適合させた。加重血液半減期（ｔ１／２）は最終的に、１３．７分のｔ１／２−時間および１９５分のｔ１／２−時間に基づいて１２４．４分と計算された（図１４Ｃ）。生体内分布を、インビボＰＥＴ／ＣＴイメージングによって評価し（図１４Ｃ）生体外ガンマ計数によって検証し、後者を、１ｇ組織あたりの注射された用量のパーセンテージとして表した（％ＩＤ／ｇ；図１４Ｄ）。予想通り、ＰＥＴ／ＣＴイメージングは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬが、ＨＤＬを吸収して代謝することが知られている器官である、肝臓、脾臓および腎臓に主に蓄積したことを示した。ガンマカウンティングデータは、これらの結果を確認し、肝臓で１２．８％ＩＤ／ｇ、脾臓で８．９％ＩＤ／ｇ、腎臓で７．９％ＩＤ／ｇのナノ粒子取り込みを示した。比較すると、同様の大きさの器官である心臓は、１．１％ＩＤ／ｇしか含まなかった（図１４Ｄ）。注入２４時間後の生体外の近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングは、ＰＥＴ／ＣＴおよびガンマ計数の観察結果を裏付け、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬが肝臓、脾臓および腎臓に主に蓄積することを示した。
【０２１８】
フローサイトメトリー分析は、血液、骨髄、および脾臓中のＬｙ６Ｃｈｉ単球およびマクロファージがＤｉＯ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを取り込んだことを明らかにした。好中球、Ｌｙ６Ｃｌｏ単球および樹状細胞もＤｉＯ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを取り込み、一方で系統的陽性ＣＤ１１ｂ陰性細胞（すべての非骨髄性細胞）は取り込まず、骨髄性細胞の特異性を示した（図１４Ｇ）。
【０２１９】
アテローム硬化性病変におけるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの蓄積。
全大動脈の生体外ガンマカウンティングは、８９Ｚｒ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの１．３％ＩＤ／ｇが注入後２４時間に蓄積したことを示した（図１４Ｄ）。大動脈全体のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子分布を特異的に見ると、取り込みは大動脈洞領域で最も高く、それはこのマウスモデルにおけるプラーク発生の優勢部位である。総面積の６．４％に過ぎないが、大動脈洞領域は信号の約２９％を生成し、５．９％ＩＤ／ｇに相当する（図１ｄ）。ＮＩＲＦイメージングは、大動脈洞領域におけるＤｉＲ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの同様の優先的蓄積を示した（図１４Ｅ）。大動脈プラークにおけるＤｉＯ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ摂取の細胞特異性を、フローサイトメトリーによって評価した。マクロファージの８６％およびＬｙ６Ｃｈｉ単球の８１％がＤｉＯ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを取り込み、一方で系統陽性細胞（非骨髄性細胞）は実質的に全く取り込まなかったことがわかった（図１４Ｆ）。さらに、大動脈斑で大部分の好中球（６４％）および樹状細胞（６１％）が、標識されたナノ粒子を含むことが分かった（図１４Ｇ）。これらの結果は、血液、骨髄および脾臓における我々の知見を反映し、骨髄系細胞、特にＬｙ６Ｃｈｉ単球サブセットおよびマクロファージの細胞が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子によって優先的に標的化されることを示す。
【０２２０】
プラーク炎症に対するＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬのインビボ効果。
ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの治療的有効性を評価するために、高コレステロール飼料を１２週間投与した２０週齢のＡｐｏｅ−／−マウスを使用して、アテローム性動脈硬化症の病変を発症させた。すべてのマウスは高コレステロール食を維持する一方で、７日間にわたってプラセボ、ペイロードのないＨＤＬナノ粒子のコントロール、またはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの静脈内注入を４回受けた。注入１回当たりに投与されたＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤の用量は５ｍｇ／ｋｇであった。アポＡ−Ｉ自体の支配的な治療的効果を制限するために、９ｍｇ／ｋｇの低アポＡ−Ｉ用量を使用した。全てのマウスを、最終注入の２４時間後に犠牲にした。
【０２２１】
最初の実験では、プラセボ、ＨＤＬまたはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬで処置したマウス（群あたりｎ＝１０）の大動脈洞領域におけるプラークの定量的組織学的分析を行った。横断切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにシリウスレッド（コラーゲン）で染色し、Ｍａｃ３（マクロファージ）およびＫｉ６７（増殖細胞）について免疫染色した。プラークサイズまたはコラーゲン含有量において有意差は、群全体で観察されなかった（図１５Ａ）。しかし、Ｍａｃ３陽性領域のパーセンテージは、プラセボ群およびＨＤＬ群と比較して、それぞれ３６％（ｐ＝０．００１）および３７％（ｐ＜０．００１）著しく減少した（図１５Ｂ）。その結果として、プラセボ群とＨＤＬ群との比が３１％（ｐ＜０．００１）および３６％（ｐ＝０．００４）減少した際、プラーク中のＭａｃ３対コラーゲン比もＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ群においてより安定なプラーク表現型へ優位に影響された（図１５Ｂ）。増殖マクロファージの数は全ての群で同様であり（図１５Ａ）、プラークマクロファージで観察された減少は、マクロファージの局所増殖の減少に起因しないことを示した。以前の研究は、単球リクルートメントに加えて、局所マクロファージの増殖がプラークの炎症を促進する中枢的役割を果たすことを示した［１２］。
【０２２２】
続いて、我々は、大動脈洞領域におけるプロテアーゼ活性を視覚化するために、コンピュータ断層撮影（ＦＭＴ／ＣＴ）イメージングと融合した蛍光分子トモグラフィを行った。プラセボ（ｎ＝８）およびＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝７）処置Ａｐｏｅ−／−マウスはすべて、画像化の２４時間前に活性化可能なパン−カテプシンプロテアーゼセンサーの１回の注射を受けた。プロテアーゼセンサーは、活性化されたマクロファージによって取り込まれ、続いてエンドリソソーム内のプロテアーゼセンサーが切断され、酵素活性の関数として蛍光を生じる。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法は、プロテアーゼ活性を６０％低下させた（ｐ＝０．００２、図１６Ａ）。次に、全大動脈のフローサイトメトリーによる大動脈マクロファージ含有量の定量に焦点を当てた。再度、高コレステロール食で２０週齢のＡｐｏｅ−／−をプラセボ（ｎ＝２７）、ＨＤＬ（ｎ＝２７）またはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（ｎ＝２７）のいずれかで処置した。大動脈マクロファージの含量は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置群において、プラセボ群およびＨＤＬ群と比較して、６６％および６７％（両方の比較でｐ＜０．００１）、著しく減少した（図１６Ｂ）。これらの結果は、組織学的分析およびＦＭＴ−ＣＴによる観察結果を裏付けている。さらに、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置した群では、大動脈のＴリンパ球含量は、プラセボおよびＨＤＬと比較してそれぞれ６５％および４９％減少した。全体として、これらのデータは、療法のわずか１週間後のアテローム硬化性プラークにおけるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの強力な抗炎症効果を示す。
【０２２３】
増殖するＫｉ６７＋マクロファージの数が療法によって影響されないことをすでに観察していたので、プラークマクロファージの含有量および炎症の減少は、むしろ単球のリクルートメントの減少によって引き起こされる可能性があると仮説を立てた［１３、１４］。これをさらに調べるために、我々は最初に、大食細胞Ｌｙ６Ｃｈｉ単球を、マクロファージ含有量を測定したものと同じフローサイトメトリー実験で定量した。我々は、マクロファージの減少が、プラセボ群およびＨＤＬ群と比較してそれぞれ、大動脈におけるＬｙ６Ｃｈｉ単球の４９％および５２％（両方の比較についてｐ＜０．００１）の減少と並行することを観察した（図１６Ｂ）。興味深いことに、大動脈のＬｙ６Ｃｈｉ単球の含有量の減少は、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球の全身的な減少によって説明できなかった（図１６Ｃ）。
【０２２４】
次に、我々は、チミジン類似体５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、マウスを犠牲にする２時間前に腹腔内に注射する実験を行った。ＢｒｄＵは新たに合成されたＤＮＡに取り込まれるため、増殖のマーカーとして使用できる。図１６Ｄは、ＢｒｄＵを取り込んだプラークマクロファージの割合がＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法によって減少しなかったことを示す。この結果は、Ｋｉ６７発現に関する組織学的観察と一致する。高い増殖速度を特徴とするマウスマクロファージのＲＡＷ２６４．７細胞系を用いたインビトロ実験では［１５］、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害化合物またはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬとのインキュベーションは、増殖速度に影響しなかった（図１６Ｅ）。
【０２２５】
まとめると、これらのデータは、プラークマクロファージ含量およびプロテアーゼ活性が、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法によって減少したことを示す。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬがプラーク炎症を減少させる作用機序は、単球リクルートメントの軽減により媒介される可能性が高く、一方で局所マクロファージの増殖は影響されない。
【０２２６】
プラーク単球／マクロファージの全トランスクリプトーム比較解析。
プラーク単球／マクロファージの遺伝子発現に対するＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの影響についての洞察を得るために、我々はプラセボまたはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬで処置したマウスのレーザー捕獲顕微解剖によって、大動脈洞プラークからＣＤ６８陽性細胞を単離した。これらの細胞の全ＲＮＡを配列決定のために単離した。
【０２２７】
本発明者らは、プラセボとＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したマウスとの間で差次的に発現される遺伝子（ＤＥ）を同定した。誤検出率（ＦＤＲ）＜０．２を用いて複数の試験の修正を行った（図１７Ａ）。計４１６のＤＥ遺伝子が同定され、そのうち２０９の遺伝子が下方制御され、２０７が上方制御された（図１７Ｂ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）機能を用いてＤＥ遺伝子に注釈をつけ、ＤＥ遺伝子で有意に富化された細胞成分を見出した（図１７Ｃ）。ＤＥ遺伝子が有意に濃縮された１５の濃縮されたＧＯタームにおいて、「接着斑」が最も興味深い。「細胞−基質接着接合」、「細胞−基質接合」、「接着結合」、および「固定結合」などの他の濃縮されたＧＯタームは、「接着斑」に密接に関連し、これらのＧＯタームの遺伝子は高度に重なっていた（図２２）。接着斑は、タンパク質複合体が細胞外マトリックスに結合する動的過程であり、単球／マクロファージの移動に中心的役割を果たす［１６］。その後の分析で、同じ４１６ＤＥ遺伝子を、「京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）」パスウェイツールでマッピングし、これにより２つの有意に改変されたパスウェイ、すなわち「接着斑」および「エンドサイトーシス」を同定した（図１７Ｄ、図２３）。
【０２２８】
最も重要なＤＥ遺伝子は、すべてＦＤＲ＜０．０５を有し（図１７Ｄ、図２４）、Ａｄｃｙ３、Ｌｇａｌｓ３ｂｐ、ＰｌｔｐおよびＳｔａｂ１（上方制御）およびＩｍｐａｄ１、Ｓｅｐｔ２、Ｓｌｃ４ａ７およびＳｐｃｓ２（下方制御）であった。これらの遺伝子のうち、マクロファージ由来のＰＬＴＰは抗アテローム性動脈硬化作用を示すことが知られており［１７］、Ｓｔａｂ１（Ｓｔａｂｉｌｉｎ−１をコードする）はリンパ球ホーミングおよび細胞接着において機能を有し、アテローム保護性マクロファージ表現型と関連している［１８、１９］。Ｓｅｐｔ２（Ｓｅｐｔｉｎ２をコードする）はマクロファージで豊富に発現することが知られており、ファゴソーム形成に必要である［２０］。まとめると、トランスクリプトームデータ分析は、様々な影響されるプロセスの中で、接着斑がＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法によって有意に影響されることを示している。細胞接着に関与するプロセスである接着斑が重要な影響を受けるという事実は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置したマウスにおける低下したＬｙ６Ｃｈｉ単球のリクルートメントの前述の観察と一致する。我々は、マクロファージの増殖、アポトーシスまたは移動性退出に関連する遺伝子発現に対する影響を観察しなかった（図２５）。
【０２２９】
非ヒト霊長類におけるＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの毒性、薬物動態、および生体内分布の研究。
ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法の移行可能性を評価するために、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における包括的な血液検査、組織学的分析、および高度薬物動態学ならびに生体分布研究を行った。６匹のＮＨＰを、完全な血液学的分析および死後の組織学的分析に使用し、別の６匹を、生体分布イメージング（ＰＥＴ／ＭＲＩ）および血液化学分析に使用した。ＮＨＰにプラセボまたは単回投与のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを注入し、７２時間後に犠牲にするか、または複数の時点で画像化し次いで犠牲にした。
【０２３０】
注射後７２時間以内の７時点からの完全な血球カウントデータは、白血球、単球、好中球、リンパ球、赤血球、血小板または他の指標のいずれにおいてもプラセボとＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置した動物との間に差異がないことを示した（図１８Ａ）。さらに、血液化学分析は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ処置した群において、プラセボ群と比較して、肝臓、腎臓、膵臓または筋細胞毒性の兆候を示さなかった（図１８Ｂ）。さらに、脂質、グルコース、およびタンパク質（アルブミンおよびグロブリン）レベルは両群で同等であった（図１８Ｂ）。電解質にも影響はなかった。肝臓、腎臓および脾臓からの標本を切片化し、組織学のために染色し（Ｈ＆Ｅ）、病理学者によって評価した。組織損傷の兆候も組織構造での障害も見られなかった（図１８Ｃ）。
【０２３１】
生体内分布を評価するために、６匹のＮＨＰを８９Ｚｒ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの静脈内投与後に全身ＰＥＴ／ＭＲイメージングに供した。動物は、投与後１時間の経過に亘って動的に画像化され、その後の静的スキャンは１、２４、４８および７２時間に実行された。動的ＰＥＴイメージングは、肝臓、脾臓および腎臓における急速な放射能蓄積を示し、続いて骨髄における有意な取り込みを示した（図１９Ａ）。注入１時間後に、ＰＥＴ画像は、腎臓からの強いシグナルに支配され、続いて１時間の時点で肝臓および脾臓に支配された（図１９Ａ）。２４、４８および７２時間で、放射能は主に肝臓および脾臓に蓄積した（図１９Ｂ）。７２時間の時点で動物を犠牲にした後、組織ガンマカウンティングは、注射された用量（ＩＤ／ｇ％）の最大量が肝臓および脾臓に、続いて腎臓に遡ることができることを示し、これはＰＥＴ／ＭＲＩイメージングの知見を裏付ける（図１９Ｃ）。異なる時点で血液を採取し、データを２相減衰非線形回帰を用いて当てはめた。ｔ１／２速（ｆａｓｔ）は１４．２分であり、ｔ１／２遅行（ｓｌｏｗ）は５１３分であり、２７２分の加重血液半減期（ｔ１／２）をもたらした（図１９Ｄ）。
【０２３２】
議論
この研究で、単球／マクロファージにおけるＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用を標的とするＨＤＬベースのナノ免疫療法の開発について記載する。我々のデータは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬがアテローム硬化性病変に蓄積し、単球／マクロファージに強い親和性を有することを示す。一週間の療法は、プラークマクロファージの含有量を急速に減少させ、これは部分的には単球リクルートメントの阻害に起因する可能性がある。ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬが非ヒト霊長類において安全であると証明されたという事実は、この療法の移行的可能性を示している。
【０２３３】
ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌシグナリング軸は、アテローム性動脈硬化症における免疫応答を誘発するために不可欠な役割を果たすことが長い間認識されている［２〜５］。その同定は高い期待をもたらしたが、この共刺激受容体−リガンド対の治療的標的化は厄介であることが判明した。抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、マウスのアテローム性動脈硬化症の発症を減少させるのに有効であった［３〜５］が、血小板上に発現したＣＤ４０による血栓塞栓合併症はヒトへのその適用を妨げた［２１、２２］。さらに、ＣＤ４０はＢリンパ球上で発現され、長期間のブロッキングは、それらの成熟を損ない免疫不全を引き起こすであろう［９］。本研究では、特に単球／マクロファージにおいてＣＤ４０の細胞質ドメインとのＴＲＡＦ６の相互作用を標的とすることによって、これらの問題に取り組んだ。これは、ＨＤＬを、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の小分子阻害剤を負荷したナノ粒子担体として使用することによって達成された。これらのデータは、本発明者らのＨＤＬベースのナノ粒子が、単球およびマクロファージの８０％以上にその負荷物を曝露した一方で、リンパ球はいずれのナノ粒子も取り込まなかったことを示す。
【０２３４】
ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤の送達を単球／マクロファージ集団に制限することに加えて、わずか１週間の短い療法の期間を使用することによって、全身免疫抑制効果を最小化することも目的とした。ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌシグナリング軸を標的にしたこれまでの治療的研究は、延長された治療時間を用いた［３〜５］。１週間以内にプラークＬｙ６Ｃｈｉ単球およびマクロファージ含量が４９％および６６％減少することを発見したという事実は、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ療法の高い効力を示す。注目すべきことに、本発明者らは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの治療的効果に対するａｐｏＡ−Ｉの寄与が軽微であることを証明した。我々は、ａｐｏＡ−Ｉ  ９ｍｇ／ｋｇの４回の注入を使用したが、これは以前に発表された研究と比較して比較的低く［２４］、空のＨＤＬが、プラセボと比較してプラーク単球／マクロファージ含量に影響を及ぼさないことを見出した。
【０２３５】
このような短い時間スケールでＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬがプラークの炎症を減少させるメカニズムは、減少された単球のリクルートメントによって部分的に説明できる。一般に、プラークマクロファージ含有量は、単球の補充のバランスならびにマクロファージの増殖、アポトーシスおよび移動性退出によって決定される。最初の２つのプロセスは、最も重要な決定要因と考えられる［２５〜２８］。我々のデータは、マクロファージの増殖、アポトーシスまたは移動性退出に及ぼす影響を明らかにしなかったが、プラークＬｙ６Ｃｈｉ単球含有量の減少を観察し、それは単球リクルートメントの減少を示唆した。さらに、本発明者らは、プラーク中の単球数の減少を説明し得る血液単球の減少を見出さなかった。以前の研究は、単球の高い動力学を示し［１３、１４、２６〜２８］、減少されたリクルートは、４週間以内にプラークマクロファージ含有量の７０％を超える減少を引き起こすことを示した［２６］。逆に、心筋梗塞によって誘発された単球リクルートメントの突然の増加は、１〜３週間以内にプラークマクロファージ含有量の顕著な増加を引き起こした［２７］。これらの所見は、１週間以内にプラークマクロファージ含量の６６％の減少を引き起こす低下した単球リクルートメントの結果と一致する。
【０２３６】
我々のトランスクリプトーム解析データは、単球動員が影響を受けることを支持する。この分析は、ケモカイン受容体またはリガンドの明確な役割を示さなかった。しかし、ＧＯファンクション分析は、細胞移動における中心的プロセスである「接着斑」が、ＤＥ遺伝子で有意に富化されたことを示した。ＫＥＧＧパスウェイ解析もまた、「接着斑」についての濃縮を示した。特に興味深い「接着斑」パスウェイにおける遺伝子はＲｈｏａ、Ｒａｐ１ｂおよびＲａｐ１ｂであり、これらはインテグリンを活性化することによって単球移動の調節において中心的役割を果たす［１６］。それらはすべて顕著に下方制御された。これは、欠損ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６シグナリングを有するノックアウトマウスモデルにおける以前の観察と一致し、そこでは生体内顕微鏡検査によって評価された際に頸動脈への循環単球の管腔内接着がインビボで損なわれた［７］。また、マクロファージの移動能力が著しく影響された［７］。
【０２３７】
ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの効果は、影響を受けることが示された他の様々な遺伝子発現によって証明されるように、「接着斑」に限定されない。合わせて、本データは、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬが、単球／マクロファージの移動の障害を含む、プラーク単球／マクロファージにおける様々な生物学的プロセスに影響を及ぼすことを示す。非ヒト霊長類（Ｎｈｐ）における薬物動態、生体内分布および安全性に関する広範な実験は、この治療の移行能力を示す。再構成されたＨＤＬの使用は、ヒトでは４０ｍｇ／ＫｇのａｐｏＡ−Ｉ投与量で安全であることが以前に判明している［２４］。我々は９ｍｇ／ＫｇのａｐｏＡ−Ｉを使用したため、安全性の問題はない。最近開発された低分子のＣＤ４０−ＴＲＡＦ６相互作用の阻害剤は、現在までヒトにおいて評価されていない。８９ｚｒ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの生体内分布は、ネズミ、ウサギ、およびブタのアテローム性動脈硬化症モデルにおける８９Ｚｒ標識ＨＤＬによる以前の観察［２９］と同様であった。肝臓、脾臓および腎臓において最も高い蓄積を観察した。肝臓および腎臓はａｐｏＡ−ＩおよびＨＤＬ異化の主要な部位であり、脾臓は、血液循環からナノ粒子を除去する多くの骨髄細胞を含む主要な二次リンパ器官である。肝臓、腎臓または脾臓での毒性作用の兆候はなく、すべての組織は組織学的分析で正常組織構造を示した。さらに、完全血球算定は、血小板、リンパ球、単球、好中球または赤血球の数に対する何らの影響も示さなかった。安全性データを、投与後７２日まで評価した。長期間の安全性は、本研究では評価されなかった。
【０２３８】
抗インターロイキン−１β抗体および低用量メトトレキセートを用いる慢性的な療法が現在、大規模な第ｉｉｉ相臨床試験で研究されている［３０〜３２］が、プラークの炎症に対処する特定の療法は現在存在しない。アテローム性動脈硬化症などの慢性疾患における免疫抑制の課題は、利益とリスクとのバランスをとることである。前述の慢性免疫抑制戦略とは対照的に、我々は、免疫調節特性を有する短期誘導ナノ療法が、心血管イベントのリスクが高い患者におけるプラーク炎症を迅速に抑制するために使用できると考える。標的送達が薬物の局所有効性を高める一方、その短期間の適用は、長期にわたる免疫抑制に伴うリスクを最小限に抑える。急性冠動脈症候群のため運び込まれた患者は、最初の１年以内に最大で１７．４％の再発性心筋梗塞の著しく高いリスクを有するため、そのような炎症の誘導療法のための適切な集団であり得る［３３］。最近の研究は、初期心筋梗塞そのものがアテローム性動脈硬化プラークへの単球動員を誘発し、それらに炎症を起こさせプラーク破裂を起こし易くすることを提案している［２７］。この病態生理学的背景において、脆弱な段階での単球リクルートメントの急速な抑制の概念は重要であると予想される。この研究は、単球／マクロファージにおけるＣＤ４０−ＴＲＡＦ６シグナル伝達を標的とすることにより、アテローム性動脈硬化症における炎症を治療するための迅速な誘導療法の革新的な治療的アプローチを提供する。注入可能なＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ免疫療法は、非ヒト霊長類における好ましい安全性データによって証明されるように、有望な移行の可能性を有する。
【０２３９】
これらの結果を考慮すると、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子は、肥満およびインスリン抵抗性に関連するか、または関連する状態においても有用であることが予想される。このような状態および合併症は、インスリン抵抗性、２型真性糖尿病および心臓血管疾患を含む。ＣＤ４０−ＴＲＡＦ経路を遮断することは、食餌誘発性肥満、ならびに同様の状態におけるインスリン抵抗性の低下、および脂肪組織（ＡＴ）炎症および肝浸潤の両方の減少をもたらすと予想される。本発明のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子は、ＡＴ炎症および肥満に関連する代謝合併症を防御することがさらに予想される。したがって、ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子を単独でまたは他の標準のケア治療と組み合わせて投与することは、患者の転帰を改善し、これらの状態に関連する損傷を防止または逆転させることができる。
【０２４０】
方法
ｒＨＤＬベースのナノ粒子の合成
ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの合成は、以前に発表された方法に基づいた［３４、２３］。要するに、クロロホルム／メタノール混合物（容積で９：１）中で、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤６８７７００２［１０］を１−ミリストイル−２−ヒドロキシｓｎ−グリセロ−リン酸化コリン（ＭＨＰＣ）および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）と組み合わせ、次に真空中で乾燥させ、薄い脂質フィルムを生成した。ヒトのアポリポタンパク質Ａ１（ａｐｏＡ−Ｉ）のＰＢＳ溶液を脂質膜に添加した。混合物を氷上で１時間、またはフィルムが水和され均質な溶液が形成されるまで、インキュベートした。溶液を次いで、２０分間超音波処理してＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子を形成させた。続いて、溶液を複数の遠心濾過工程によって精製した。標的化、イメージングおよび生体内分布実験のために、蛍光色素ＤｉＲまたはＤｉＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または８９Ｚｒで放射標識できる、リン脂質キレート剤ＤＳＰＥ−ＤＦＯ（ＤＭＰＣの代償に１ｍｏｌ％）の組み込みによってＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬの類似体を調製した［３５］。
【０２４１】
マウス研究のための動物および食事。
この研究には、雌Ａｐｏｅ−／−マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ａｐｏｅｔｍ１Ｕｎｃ、ｎ＝１０３）を用いた。全ての動物のケアと処置は、Ｍｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉのＩｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから承認された施設のプロトコルに基づいた。８週齢のＡｐｏｅ−／−マウスを、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全てのマウスに高コレステロール食（ＨＣＤ）（０．２％重量コレステロール；１５．２％ｋｃａｌタンパク質、４２．７％ｋｃａｌ炭水化物、４２．０％ｋｃａｌ脂肪；Ｈａｒｌａｎ  ＴＤ、８８１３７）を１２週間与えた。
【０２４２】
各実験での処置プロトコルは同一であった：２０週齢のＡｐｏｅ−／−マウスを無作為に、プラセボ（生理食塩水）、空のｒＨＤＬまたはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ）群に割り当てた。マウスを７日間にわたり４回の静脈内注射で処置し、処置中はＨＣＤを維持した。最後の注射の２４時間後に動物を犠牲にした。
【０２４３】
フローサイトメトリー。
Ａｐｏｅ−／−マウスを安楽死させ、ＰＢＳで灌流した後、大動脈根から腸骨枝への大動脈を、脂肪から静かに浄化し、採取した。全大動脈を、リベラーゼＴＨ（４Ｕ／ｍＬ）（Ｒｏｃｈｅ）、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）Ｉ（４０Ｕ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびヒアルロニダーゼ（６０Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む酵素消化溶液中に入れ、細かく刻み、３７℃のインキュベーターに６０分間置いた。細胞を７０μｍのストレーナーに通し、２回スピンダウンし、血清含有培地中に再懸濁した。脾臓を秤量し、７０μｍの細胞ストレーナーに押し通し、スピンダウンし、赤血球溶解緩衝液中に４分間再懸濁し、次いで血清を含有する培地を用いて不活性化し、スピンダウンし、１００ｍｇの脾臓組織あたり１０００μｌの血清含有培地中に再懸濁した。ＥＤＴＡ処理した血液をスピンダウンし、赤血球溶解緩衝液中に４分間再懸濁し、次いで血清含有培地を用いて不活性化し、スピンダウンし、１００μｌの血清含有培地中に再懸濁した。骨髄を、単一の大腿骨から得た。無傷の大腿骨を７０％エタノールですすぎ、続いて氷冷した滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。骨端を切断し、骨髄をＰＢＳで洗い流した。細胞を７０μｍのストレーナーに通し、スピンダウンし、赤血球溶解緩衝液中に３０秒間再懸濁し、次いで血清含有培地を用いて不活性化し、スピンダウンし、１０００μＬの血清含有培地に再懸濁した。以下の抗体を使用した：Ｆ４／８０−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＢＭ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＣＤ１１ｂ−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローンＭ１／７０，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ（クローンＮ４１８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；ＣＤ４５−ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ５１０（クローン３０−Ｆ１１，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；Ｌｙ−６Ｃ−ＰＥ（クローンＡＬ−２１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｌｙ６ＣＦＩＴＣ（クローンＡＬ−２１），ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ９０．２−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローン５３−２．１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ＣＤ９０．２−ＰＥ（クローン５３−２．１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｔｅｒ１１９−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローンＴＥＲ−１１９，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ＮＫ１．１−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローンＰＫ１３６，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ＮＫ１．１−ＰＥ（クローンＰＫ１３６，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ４９ｂ−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローンＤＸ５，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ＣＤ４５Ｒ−ｅＦｌｕｏｒ４５０（クローンＲＡ３−６Ｂ２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；Ｌｙ−６Ｇ−ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ（クローン１Ａ８，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；Ｌｙ−６Ｇ−ＰＥ（クローン１Ａ８，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ３−ＰＥ（クローン１７Ａ２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；ＣＤ１９−ＰＥ（クローン１Ｄ３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０２４４】
抗体希釈液は、１：２００〜１：１００の範囲であった。異なる集団への新たに作られた細胞の寄与を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）でのインビボ標識により決定した。取り込みを、製造業者のプロトコルに従ってＡＰＣ結合抗ＢｒｄＵ抗体を使用して測定した（ＢＤＡＰＣ−ＢｒｄＵキット，５５２５９８）。単球およびマクロファージを、以前に記載された方法［２８］と同様の方法を用いて同定した。具体的には、Ｌｙ６Ｃｈｉ単球を、Ｌｙ−６ＣｈｉであったＣＤ１１ｂｈｉ、ＣＤ１１ｃｌｏｗ、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ（ＬｉｎはＣＤ９０．２＋、ＣＤ４５Ｒ＋、ＣＤ４９ｂ＋、ＮＫ１．１＋、Ｌｙ−６Ｇ＋、Ｔｅｒ１１９＋またはＣＤ９０．２＋、ＮＫ１．１＋、Ｌｙ−６Ｇ＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ３＋として定義される）Ｆ４／８０ｌｏｗとして同定した。マクロファージを、ＣＤ１１ｂｈｉ、ＣＤ１１ｃｌｏｗ、Ｌｉｎ−／ｌｏｗ、Ｆ４／８０ｈｉ、ＣＤ１１−／ｌｏｗと同定した。データをＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．０．７（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）で分析した。
【０２４５】
組織学および免疫組織化学。
組織学的分析のための組織を収集し、ホルマリン中で一晩固定し、パラフィン中に包埋した。大動脈の根を４μｍスライスに切断し、１本のルートにつき合計９０〜１００の断面を生成した。８つの横断切片をヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）で染色し、アテローム性動脈硬化性プラークサイズ測定に使用した。他の切片を脱パラフィンし、ブロックし、９５℃の抗原回収溶液（ＤＡＫＯ）中でインキュベートし、ＭＡＣ−３ラットモノクローナル抗体（１：３０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または抗Ｋｉ６７ウサギポリクローナル抗体（１：２００、Ａｂｃａｍ）のいずれかで免疫標識した。シリウスレッド染色をコラーゲン含量の分析に用いた。抗体染色を、Ｉｍｍｐａｃｔ  ＡＭＥＣ  ｒｅｄ（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ）またはジアミノベンジジン（ＤＡＢ）のいずれかによって可視化した。切片を、ＬｅｉｃａＤＭ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＶＥＮＴＡＮＡ  ｉＳｃａｎ  ＨＴスライドスキャナ（Ｖｅｎｔａｎａ）を用いて分析した。
【０２４６】
レーザー捕捉顕微解剖およびＲＮＡ配列解析。
ＬＣＭを、以前に記載されたように２４の大動脈根切片（６μｍ）に対して行った（２０）。要するに、凍結切片をエタノール溶液中で段階的に脱水し（７０％２回、９５％２回、１００％１回）、ＤＥＰＣ処理水で洗浄し、メイヤーのヘマトキシリン、エオシンで染色し、キシレン中で洗浄した。８つの切片ごとに１切片を、ＬＣＭを誘導するために使用されたＣＤ６８染色（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、１：２５０希釈）に用いた。プラーク内のＣＤ６８の豊富な領域を同定し、ＡｒｃｔｕｒｕｓＸＴ  ＬＣＭシステムを使用して切り出した。収集したＣＤ６８陽性細胞を、ＲＮＡ単離（（ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ａｒｃｔｕｒｕｓ）およびその後の製造業者のプロトコルに従うＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ調製（Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｐｉｃｏ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＮｕＧＥＮ）に用いた。収集したサンプルの品質と濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
【０２４７】
ＲＮＡ配列解析。ペアエンドライブラリを調製し、検証した。純度、フラグメントサイズ、収量および濃度を決定した。クラスター生成中に、ライブラリー分子をＩｌｌｕｍｉｎａフローセルにハイブリダイズさせた。続いて、ハイブリダイズした分子を、ブリッジ増幅を用いて増幅し、クラスターの異種集団を生じた。データセットを、ｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００シーケンサーを用いて得た。
【０２４８】
差次的発現および機能注釈分析。
ペアエンドのシークエンシングリードを、トゥファットアライナー（ｂｏｗｔｉｅ２）を用いてヒトゲノムｈｇ１９に対しアライメントした［３６］。リードアライメントに続き、ＨＴＳｅｑ［３７］を用いて、ＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子モデルリリース２２［３８］に基づいて遺伝子レベルで遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の生の読み取りカウントを、Ｍ値正規化法のトリミングされた平均を用いて百万分の一として正規化して、サンプル間のシーケンシングライブラリサイズの差を調整した［３９］。薬物治療とプラセボの間の差次的発現遺伝子を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージｌｉｍｍａ［４０］を用いて同定した。複数の検査問題を修正するために、ｌｉｍｍａを使用して、ラベルの置換後のランダムサンプルの統計値およびｐ−値を計算した。この操作を１０００回繰り返して、全ての遺伝子の誤発見率（ＦＤＲ）を推定するためのヌルｔ−統計量およびｐ−値分布を得た。差次的に発現された（ＤＥ）遺伝子を、０．２未満の補正されたｐ−値のカットオフによって同定した。ＧＯ遺伝子［４１］を用いてＤＥ遺伝子に注釈を付け、ＤＥ遺伝子が有意に濃縮された細胞成分を見いだした。ＤＥ遺伝子をまた、ＫＥＧＧ  Ｍａｐｐｅｒ［４２］を用いて、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）パスウェイにマッピングした。
【０２４９】
ＣＴによる蛍光分子断層撮影。
高脂肪食を雌１２週間与えたＡｐｏｅ−／−マウスを、７日間にわたり４回のＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ注入（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）または生理食塩水（ｎ＝８）のいずれかで処理した。５ナノモルのパン−カテプシンプロテアーゼセンサー（ＰｒｏＳｅｎｓｅ６８０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＮＥＶ１０００３）を、イメージングの２４時間前に静脈内投与した。ＦＭＴ／ＣＴイメージングのために、動物を、イメージング中のイソフルラン投与用に備えた特注のイメージングカートリッジに入れた。動物を最初に、ＣＴ造影剤（ｉｓｏｖｕｅ−３７０、Ｂｒａｃｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を尾静脈を通して５５μＬ／分の速度で連続注入しながら、高分解能コンピュータ断層撮影（ＣＴ；ＩｎｖｅｏｎＰＥＴ−ＣＴ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いてスキャンした。動物を続いて、同じカートリッジ中でＦＭＴスキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によりスキャンした。３７０〜４００ｍｓの露光時間でＣＴＸ線源を、８０ｋＶｐおよび５００ｍＡにて操作した。コントラスト増強された高分解能ＣＴ画像を用いて大動脈根の位置を特定し、それを定量的ＦＭＴプロテアーゼ活性マップの関心体積の配置を誘導するために使用した。画像融合は、基準マーカーに依存した。画像の融合および分析を、ＯｓｉｒｉＸｖ．６．５．２（Ｔｈｅ  Ｏｓｉｒｉｘ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｇｅｎｅｖａ）を用いて行った。
【０２５０】
ＨＤＬナノ粒子の放射性標識。
即時標識されるＨＤＬナノ粒子を、ＤＭＰＣを代償に製剤混合物中に１ｍｏｌ％のリン脂質キレート剤またはＤＳＰＥ−ＤＦＯを含めることにより（３５）調製した。ＤＦＯ含有ナノ粒子を次いで、先に記載したようにジルコニウム−８９（８９Ｚｒ）で標識した（３５）。簡潔に述べると、ナノ粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．１）中の８９Ｚｒ−シュウ酸塩と３７℃で１時間反応させた。精製を、１０ｋＤａの分子量カットオフフィルターチューブを用いる遠心濾過によって行い、新鮮な滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。放射化学的収率は、サイズ排除クロマトグラフィーで測定して、９０±４％（ｎ＝３）および放射化学的純度＞９７％であった。
【０２５１】
マウスにおける薬物動態学、生体内分布およびＰＥＴ／ＣＴイメージング研究。
１２週間高脂肪食を与えた雌Ａｐｏｅ−／−マウス（ｎ＝４、２５．５±２．６ｇ体重）に、８９Ｚｒ−ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬナノ粒子（１８３±１６μＣｉ、５ｍｇＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ／ｋｇ）を注入した。所定の時点（２、１５および３０分、ならびに１、４、８および２４時間）で、血液サンプルを採取し、秤量し、２４７０Ｗｉｚａｒｄ自動ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して放射能含有量について測定した。データを、組織１ｇ当たり注入された投与量の百分率［％ＩＤ／ｇ］に変換し、時間−活動曲線にプロットし、Ｐｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄの非線形２相減衰回帰を用いてフィッティングした。加重血液放射能半減期（ｔ１／２）を、最後に計算した。
【０２５２】
注射の２４時間後に、動物を、イソフルラン／酸素ガス混合物麻酔下（誘導については２％、維持については１％）で、Ｉｎｖｅｏｎ  ＰＥＴ／ＣＴスキャナ（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｇｌｏｂａｌ）上で走査した。ＰＥＴ静的スキャンは、少なくとも２５００万回の同時発生イベントを記録し、１０分間持続した。エネルギーおよび一致タイミングウィンドウは、それぞれ３５０〜７００ｋｅＶおよび６ｎｓであった。画像データを正規化して、ＰＥＴの応答の不均一性、デッドタイムカウント損失、陽電子分岐比、および注入時間に対する物理的減衰を補正したが、減衰、散乱、または部分体積平均補正は適用されなかった。再構成画像中の計数率を、８９Ｚｒを含むマウスサイズの水等価ファントムのイメージングから得られたシステム較正係数を用いて、活性濃度（％ＩＤ／ｇ）に変換した。画像を、ＡＳＩＰｒｏ  ＶＭＴＭ（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩｎｖｅｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈソフトウェア（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｇｌｏｂａｌ）を用いて分析した。活性濃度の定量化を、関心組織の隣接するスライス上に描かれた少なくとも５つのＲＯＩの最大値を平均することによって行った。全身標準低倍率ＣＴスキャンを、電圧８０ｋＶ、電流５００μＡにてＸ線管設置で行った。ＣＴスキャンを、フレーム当たり１４５ミリ秒の露出を伴う１２０秒のスキャン時間をもたらし推定される合計２２０度について１２０回の回転ステップを使用して取得した。ＰＥＴ／ＣＴスキャンの直後に、動物を犠牲にし、ＰＢＳで灌流した。関心のある組織（肝臓、腎臓、脾臓、肺、筋肉、心臓、大動脈、骨および脳）を収集し、ブロットして、秤量した。放射能をガンマ計数によって測定し、放射能濃度を１グラムあたり注射された投与量の百分率［％ＩＤ／ｇ］として表した。
【０２５３】
オートラジオグラフィー。
放射能計数の後、大動脈を、−２０℃で２４時間リン光イメージングプレート（ＢＡＳＭＳ−２３２５、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、Ｖａｌｈａｌｌａ、ＮＹ）に対するフィルムカセット中に置き、放射能分布を決定した。プレートを、Ｔｙｐｈｏｏｎ７０００ＩＰプレートリーダー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を用いて２５μｍのピクセル解像度で読み取った。
【０２５４】
生体外近赤外蛍光イメージング（ＮＩＲＦ）。
高脂肪食を１２週間与えた雌Ａｐｏｅ−／−マウスに、ＤｉＲ標識した（０．５ｍｇ／ｋｇ）ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝２）または生理食塩水（ｎ＝１）の単回のＩＶ注入を行った。マウスを、注射の２４時間後に犠牲にし、６０ｍＬのＰＢＳで灌流した。肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および筋肉組織を、ＮＩＲＦイメージングのために収集した。蛍光画像を、７４５ｎｍ励起フィルターおよび８２０ｎｍ発光フィルターを用いて、２秒の曝露時間で、ＩＶＩＳ２００システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ）により獲得した。ＲＯＩを、ベンダーが提供するソフトウェアを使用して各組織について作成し、その後定量分析を、これらのＲＯＩ内の平均放射効率で行った。
【０２５５】
血液試験。
マウスでは、血液を、屠殺時に心臓穿刺により採取した。血清をＩＤＥＸＸ研究所（Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）に送り、オリンパスＡＵ４００化学分析装置で分析した。全血をＥＤＴＡ含有管に集め、全血球数解析のためにＩＤＥＸＸ  ｐｒｏｃｙｔｅ  ＤＸ血液分析器で分析した。非ヒト霊長類では、注入後０、１５分および６、１２、２４、２８、４８および７２時間に血液を採取した。血清をオリンパスＡＵ４００化学分析装置で分析した。全血試料をＩＤＥＸＸ  ｐｒｏｃｙｔｅ  ＤＸ血液分析装置で分析した。
【０２５６】
非ヒト霊長類研究
雄成体カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、ケンタッキー大学およびＭｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉのＩｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅで実施された非ヒト霊長類研究に使用した。動物は平均７．３歳であり、体重は７．３±１．９８ｋｇであった（平均±ＳＤ）。すべての動物のケア、手順および実験は、Ｍｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉのＩｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅとケンタッキー大学の動物実験および使用委員会から承認された施設のプロトコルに基づいた。サルは、１２時間の明／暗サイクルで気候制御された条件で、可能な場合対で収容された。サルに水を自由に与え、Ｔｅｋｌａｄ  Ｇｌｏｂａｌ  ２０％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｄｉｅｔを与えた。ケンタッキー大学での実験では、６匹の雄サルを用いた。一晩絶食させた後、サルをケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）およびデクスメデトミジン（０．００７５〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、血液を大腿静脈から採取した。サルを次いで、伏在静脈を介してビヒクル（ＰＢＳ、ＵＳＰグレード）またはＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬのいずれかで、ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６阻害剤６８７７００２の投与量が２５ｍｇ／ｋｇであるように、ＩＶ注射した。血液を、注入後１５分、６、１２、２４、２８、および４８時間に収集した。採血後、アチパメゾール（０．０７５〜０．１５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔を逆転させた。７２時間後に、絶食したサルをケタミン（２５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、最終的に出血させ、イソフルランで麻酔しながら（３〜５％誘導、１〜２％維持）全身生理食塩水灌流での瀉血により安楽死させた。組織を速やかに取り出し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。血液を全血液計数（ＣＢＣ）試験に供した。
【０２５７】
Ｍｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉのＩｃａｈｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅでの実験のため、６匹の雌サルを用いた。８９Ｚｒ−ＰＥＴ／ＭＲＩイメージングのために、動物に５８．９±１７．９ＭＢｑの８９Ｚｒ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）を注入し、異なる時点でＰＥＴ／ＭＲＩにより画像化した。動的ＰＥＴイメージングを、注入後最初の６０分間に実施した。追加のＰＥＴ／ＭＲＩスキャンを２４時間、４８時間および７２時間で行った。ＰＥＴおよびＭＲ画像を、組み合わせた３Ｔ  ＰＥＴ／ＭＲＩシステム（Ｂｉｏｇｒａｐｈ  ｍＭＲ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｉｎｅｅｒｓ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得した。１日目に、動的ＰＥＴイメージングを、８９Ｚｒ標識ＴＲＡＦ６ｉ−ＨＤＬを注射した直後に、胸部および腹部を覆う１つのベッドポジションを用いて６０分間行った。同時に、解剖学的血管壁ＭＲ画像を、プロトン密度（ＰＤ）加重した様々なフリップ角エボリューションを使用するアプリケーション最適化コントラストを有するサンプリング完全性（Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｃｏｎｔｒａｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｌｉｐ  ａｎｇｌｅ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＳＰＡＣＥ）シーケンスを使用して取得した。ＭＲ画像化パラメータは：捕捉面、コロナル；繰り返し時間（ＴＲ）、１０００ｍｓ；エコー時間（ＴＥ）、７９ｍｓ；視野（ＦＯＶ）、３００×１８７ｍｍ２；スライス数、１４４；平均数、４；帯域幅、６０１Ｈｚ／ピクセル；ターボファクター（ＴＦ）、５１；スライスごとのエコートレイン、４；エコートレインの長さ、１９２ｍｓ；エコー間隔３．７ｍｓ；取得時間３３分３６秒であった。動的ＰＥＴ取得後、静的全身ＰＥＴイメージングを、１０分ずつ３連続のベッドポジションを使用して、頭蓋骨から骨盤で取得した。各ベッドと同時に、ＭＲ画像を、１．４シグナル平均（取得時間、１ベッドあたり１１分４４秒）のみを用いることを除いて、上記のように取得した。全身ＰＥＴおよびＭＲイメージングも、３ベッドポジション（ベッド当たりのＰＥＴ期間、３０分；１ベッド当たりのＭＲ期間、３３分および３６秒）を用いて、注入後２４、４８、および７２時間に行った。各ベッドからの全身ＭＲ画像を、スキャナによって自動的に照合した。取得後、各ベッドからのＰＥＴ生データを再構成し、ポイントスプレッドファンクション（ＰＳＦ）補正を用いるオーダーサブセット期待値最大化（ＯＳＥＭ）アルゴリズムによりシーメンス独自のｅ７ツールを使用してオフラインでまとめて照合した。二重区画（軟組織および空気）減衰マップを、減衰補正に使用した。
【０２５８】
統計的解析。
連続変数は、他に言及しない限り、平均±標準偏差として表される。差の有意性を、ノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定およびＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の使用により計算した。Ｐ＜０．０５の確率値を有意とみなした。統計分析を、社会科学用統計パッケージ（ＳＰＳＳ）バージョン２２．０．０．０を使用して行った。
【０２５９】
参照
１．  Ｆ．  Ｋ．  Ｓｗｉｒｓｋｉ，  Ｍ．  Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，  １６１−１６６  （２０１３）．
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７．  Ｅ．  Ｌｕｔｇｅｎｓ，  Ｄ．  Ｌｉｅｖｅｎｓ，  Ｌ．  Ｂｅｃｋｅｒｓ，  Ｅ．  Ｗｉｊｎａｎｄｓ，  Ｏ．  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ，  Ａ．  Ｚｅｒｎｅｃｋｅ，  Ｔ．  Ｓｅｉｊｋｅｎｓ，  Ｄ．  Ｅｎｇｅｌ，  Ｊ．  Ｃｌｅｕｔｊｅｎｓ，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｎａｉｋ，  Ｌ．  Ｂｏｏｎ，  Ｈ．  Ａ．  Ｏｕｆｅｌｌａ，  Ｚ．  Ｍａｌｌａｔ，  Ｃ．  Ｌ．  Ａｈｏｎｅｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｎｏｅｌｌｅ，  Ｍ．  Ｐ．  ｄｅ  Ｗｉｎｔｈｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｄａｅｍｅｎ，  Ｅ．  Ａ．  Ｂｉｅｓｓｅｎ，  Ｃ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｓｋｅｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏｗａｒｄ  ａｎ  ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０７，  ３９１−４０４  （２０１０）．
８．  Ｓ．  Ｓ．  Ｐｕｌｌｅｎ，  Ｈ．  Ｇ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｄ．  Ｓ．  Ｅｖｅｒｄｅｅｎ，  Ｔ．  Ｔ．  Ｄａｎｇ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｃｒｕｔｅ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｋｅｈｒｙ，  ＣＤ４０−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  （ＴＲＡＦ）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４０  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＴＲＡＦ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  ＴＲＡＦ  ｈｅｔｅｒｏ−ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，  １１８３６−１１８４５  （１９９８）．
９．  Ｃ．  Ａｈｏｎｅｎ，  Ｅ．  Ｍａｎｎｉｎｇ，  Ｌ．  Ｄ．  Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｂ．  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｌｉｎｄ，  Ｓ．  Ｓ．  Ｐｕｌｌｅｎ，  Ｍ．  Ｒ．  Ｋｅｈｒｙ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｎｏｅｌｌｅ，  Ｔｈｅ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ａｘｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３，  ４５１−４５６  （２００２）．
１０．Ｂ．  Ｚａｒｚｙｃｋａ，  Ｔ．  Ｓｅｉｊｋｅｎｓ，  Ｓ．  Ｂ．  Ｎａｂｕｕｒｓ，  Ｔ．  Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，  Ｊ．  Ｇｒｏｍｍｅｓ，  Ｏ．  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ，  Ｒ．  Ｓｃｈｒｉｊｖｅｒ，  Ｃ．  Ｍ．  ｖａｎ  Ｔｉｅｌ，  Ｔ．  Ｍ．  Ｈａｃｋｅｎｇ，  Ｃ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｆ．  Ｇｉｅｈｌｅｒ，  Ａ．  Ｋｉｅｓｅｒ，  Ｅ．  Ｌｕｔｇｅｎｓ，  Ｇ．  Ｖｒｉｅｎｄ，  Ｇ．  Ａ．  Ｎｉｃｏｌａｅｓ，  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｆ．  Ｍｏｄｅｌ．  ５５，  ２９４−３０７  （２０１５）．
１１．Ａ．  Ｃｈａｔｚｉｇｅｏｒｇｉｏｕ，  Ｔ．  Ｓｅｉｊｋｅｎｓ，  Ｂ．  Ｚａｒｚｙｃｋａ，  Ｄ．  Ｅｎｇｅｌ，  Ｍ．  Ｐｏｇｇｉ，  Ｓ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，  Ｓ．  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，  Ｏ．  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ，  Ｈ．  Ｗｉｎｋｅｌｓ，  Ｌ．  Ｂｅｃｋｅｒｓ，  Ｄ．  Ｌｉｅｖｅｎｓ，  Ａ．  Ｄｒｉｅｓｓｅｎ，  Ｐ．  Ｋｕｓｔｅｒｓ，  Ｅ．  Ｂｉｅｓｓｅｎ，  Ｒ．  Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ａ．  Ｋｌｏｔｚｓｃｈｅ−ｖｏｎ  Ａｍｅｌｎ，  Ｍ．  Ｇｉｊｂｅｌｓ，  Ｒ．  Ｎｏｅｌｌｅ，  Ｌ．  Ｂｏｏｎ，  Ｔ．  Ｈａｃｋｅｎｇ，  Ｋ．Ｍ．  Ｓｃｈｕｌｔｅ，  Ａ．  Ｘｕ，  Ｇ．  Ｖｒｉｅｎｄ，  Ｓ．  Ｎａｂｕｕｒｓ，  Ｋ．Ｊ．  Ｃｈｕｎｇ，  Ｋ．  Ｗｉｌｌｅｍｓ  ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，  Ｐ．Ｃ．  Ｒｅｎｓｅｎ，  Ｎ．  Ｇｅｒｄｅｓ，  Ｍ．  ｄｅ  Ｗｉｎｔｈｅｒ，  Ｎ．Ｌ．  Ｂｌｏｃｋ，  Ａ．Ｖ．  Ｓｃｈａｌｌｙ，  Ｃ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｓ．Ｒ．  Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｇ．  Ｎｉｃｏｌａｅｓ，  Ｔ．  Ｃｈａｖａｋｉｓ，  Ｅ．  Ｌｕｔｇｅｎｓ．  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ＣＤ４０−ＴＲＡＦ６  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １１１，  ２６８６−２６９１  （２０１４）．
１２．Ｃ．  Ｓ．  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｉ．  Ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆ，  Ｇ．  Ｆ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｉ．  Ｔｈｅｕｒｌ，  Ｙ．  Ｉｗａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ，  Ｒ．  Ｇｏｒｂａｔｏｖ，  Ｇ．  Ｋ．  Ｓｕｋｈｏｖａ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｄ．  Ｓｍｙｔｈ，  Ｃ．  Ｃ．  Ｚａｖｉｔｚ，  Ｅ．  Ａ．  Ｓｈｉｋａｔａｎｉ，  Ｍ．  Ｐａｒｓｏｎｓ，  Ｎ．  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ，  Ｈ．  Ｙ．  Ｌｉｎ，  Ｍ．  Ｈｕｓａｉｎ，  Ｐ．  Ｌｉｂｂｙ，  Ｍ．  Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｒ．  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｆ．  Ｋ．  Ｓｗｉｒｓｋｉ，  Ｌｏｃａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｏｍｉｎａｔｅｓ  ｌｅｓｉｏｎａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １９，  １１６６−１１７２  （２０１３）．
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１４．Ｆ．  ＫＳ．  ｗｉｒｓｋｉ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｐｉｔｔｅｔ，  Ｍ．  Ｆ．  Ｋｉｒｃｈｅｒ，  Ｅ．  Ａｉｋａｗａ，  Ｆ．  Ａ．  Ｊａｆｆｅｒ，  Ｐ．  Ｌｉｂｂｙ，  Ｒ．  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ．  Ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０３，  １０３４０−１０３４５  （２００６）．
１５．  Ｓ．  Ｂ．  Ｉｌｏｋｉ  Ａｓｓａｎｇａ，  Ａ  Ａ．  Ｇｉｌ−Ｓａｌｉｄｏ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｌｅｗｉｓ  Ｌｕｊａｎ，  Ａ．  Ｒｏｓａｓ−Ｄｕｒａｚｏ，  Ａ．  Ｌ．．  Ａｃｏｓｔａ−Ｓｉｌｖａ，  Ｅ．  Ｇ．  Ｒｉｖｅｒａ−Ｃａｓｔａｎｅｄａ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｒｕｂｉｏ−Ｐｉｎｏ，  Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｕｒｖｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓ．  ４，  ６０−７０  （２０１３）．
１６．Ｂ．  Ａ．  Ｉｍｈｏｆ，  Ｍ．  Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓ，  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４，  ４３２−４４４  （２００４）．
１７．Ｄ．  Ｔ．  Ｖａｌｅｎｔａ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｂｕｌｇｒｉｅｎ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｂｏｎｎｅｔ，  Ｌ．  Ｋ．  Ｃｕｒｔｉｓｓ，  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ＰＬＴＰ  ｉｓ  ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ＬＤＬｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＰＬＴＰ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ．  Ｒｅｓ．  ４９，  ２４−３２  （２００８）．
１８．Ｇ．  Ｄ．  Ｗｅｎｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．  Ｏ’Ｄｏｒｉｓｉｏ，  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３４，  １８３６−１８４３  （１９８５）．
１９．Ｇ．  Ｃｈｉｎｅｔｔｉ−Ｇｂａｇｕｉｄｉ，  Ｓ．  Ｃｏｌｉｎ，  Ｂ．  Ｓｔａｅｌｓ，  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １２，  １０−１７  （２０１５）．
２０．Ｙ．  Ｗ．  Ｈｕａｎｇ，  Ｍ．  Ｙａｎ，  Ｒ．  Ｆ．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｄｉｃｉｃｃｉｏ，  Ｓ．  Ｇｒｉｎｓｔｅｉｎ，  Ｗ．  Ｓ．  Ｔｒｉｍｂｌｅ，  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｅｐｔｉｎｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｈａｇｏｓｏｍｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  １９，  １７１７−１７２６  （２００８）．
２１．Ｔ．  Ｋａｗａｉ，  Ｄ．  Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｒ．  Ｂ．  Ｃｏｌｖｉｎ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｓａｃｈｓ，  Ａ．  Ｂ．  Ｃｏｓｉｍｉ，  Ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−  ｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ６，  １１４  （２０００）．
２２．Ｐ．  Ａｎｄｒｅ，  Ｋ．  Ｓ．  Ｐｒａｓａｄ，  Ｃ．  Ｖ．  Ｄｅｎｉｓ，  Ｍ．  Ｈｅ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｐａｐａｌｉａ，  Ｒ．  Ｏ．  Ｈｙｎｅｓ，  Ｄ．  Ｒ．  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｗａｇｎｅｒ，  ＣＤ４０Ｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｉｂｙａｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８，  ２４７−２５２  （２００２）．
２３．  Ｒ．  Ｄｕｉｖｅｎｖｏｏｒｄｅｎ，  Ｊ．  Ｔａｎｇ，  Ｄ．  Ｐ．  Ｃｏｒｍｏｄｅ，  Ａ．  Ｊ．  Ｍｉｅｓｚａｗｓｋａ，  Ｄ．  Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ−Ｇａｒｃｉａ，  Ｃ．  Ｏｚｃａｎ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｏｔｔｅｎ，  Ｎ．  Ｚａｉｄｉ，  Ｍ．  Ｅ．  Ｌｏｂａｔｔｏ，  Ｓ．  Ｍ．  ｖａｎ  Ｒｉｊｓ，  Ｂ．  Ｐｒｉｅｍ，  Ｅ．  Ｌ．  Ｋｕａｎ，  Ｃ．  Ｍａｒｔｅｌ，  Ｂ．  Ｈｅｗｉｎｇ，  Ｈ．  Ｓａｇｅｒ，  Ｍ．  Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｒａｎｄｏｌｐｈ，  Ｅ．  Ｓ．  Ｓｔｒｏｅｓ，  Ｖ．  Ｆｕｓｔｅｒ，  Ｅ．  Ａ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｚ．  Ａ．  Ｆａｙａｄ，  Ｗ．  Ｊ．  Ｍｕｌｄｅｒ，  Ａ  ｓｔａｔｉｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５，  ３０６５  （２０１４）．
２４．Ｐ．  Ｋ．  Ｓｈａｈ，  Ｊ．  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｓ．  Ｋａｕｌ，  Ｍ．  Ｃ．  Ｆｉｓｈｂｅｉｎ，  Ｈ．  Ａｇｅｌａｎｄ，  Ａ．  Ｈａｍｓｔｅｎ，  Ｊ．  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｆ．  Ｋａｒｐｅ，  Ｂ．  Ｃｅｒｃｅｋ，  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ（Ｍｉｌａｎｏ）  ｏｎ  ａｏｒｔｉｃ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７，  ７８０−７８５  （１９９８）．
２５．Ｋ．  Ｊ．  Ｍｏｏｒｅ，  Ｆ．  Ｊ．  Ｓｈｅｅｄｙ，  Ｅ．  Ａ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｂａｌａｎｃｅ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３，  ７０９−７２１  （２０１３）．
２６．  Ｓ．  Ｐｏｔｔｅａｕｘ，  Ｅ．  Ｌ．  Ｇａｕｔｉｅｒ，  Ｓ．  Ｂ．  Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ，  Ｎ．  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｒａｄｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｔｈｏｍａｓ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｓｏｒｃｉ−Ｔｈｏｍａｓ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｒａｎｄｏｌｐｈ，  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｒｉｖｅｓ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｏｆ  Ａｐｏｅ−／−  ｍｉｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １２１，  ２０２５−２０３６  （２０１１）．
２７．Ｐ．  Ｄｕｔｔａ，  Ｇ．  Ｃｏｕｒｔｉｅｓ，  Ｙ．  Ｗｅｉ，  Ｆ．  Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒ，  Ｒ．  Ｇｏｒｂａｔｏｖ，  Ｃ．  Ｓ．  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｙ．  Ｉｗａｍｏｔｏ，  Ｂ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ａ．  Ｌ．  Ｃａｒｌｓｏｎ，  Ｔ．  Ｈｅｉｄｔ，  Ｍ．  Ｄ．  Ｍａｊｍｕｄａｒ，  Ｆ．  Ｌａｓｉｔｓｃｈｋａ，  Ｍ．  Ｅｔｚｒｏｄｔ，  Ｐ．  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ｍ．  Ｔ．  Ｗａｒｉｎｇ，  Ａ．  Ｔ．  Ｃｈｉｃｏｉｎｅ，  Ａ．  Ｍ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ，  Ｈ．  Ｗ．  Ｎｉｅｓｓｅｎ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｐｉｅｋ，  Ｂ．  Ｂ．  Ｒｕｂｉｎ，  Ｊ．  Ｂｕｔａｎｙ，  Ｊ．  Ｒ．  Ｓｔｏｎｅ，  Ｈ．  Ａ．  Ｋａｔｕｓ，  Ｓ．  Ａ．  Ｍｕｒｐｈｙ，
Ｄ．  Ａ．  Ｍｏｒｒｏｗ，  Ｍ．  Ｓ．  Ｓａｂａｔｉｎｅ，  Ｃ．  Ｖｉｎｅｇｏｎｉ，  Ｍ．  Ａ．  Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｐｉｔｔｅｔ，  Ｐ．  Ｌｉｂｂｙ，  Ｃ．  Ｐ．  Ｌｉｎ，  Ｆ．  Ｋ．  Ｓｗｉｒｓｋｉ，  Ｒ．  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｍ．  Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４８７，  ３２５−３２９  （２０１２）．
２８．Ｃ．  Ｓ．  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｉ．  Ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆ，  Ｇ．  Ｆ．  Ｗｅｂｅｒ，  Ｉ．  Ｔｈｅｕｒｌ，  Ｙ．  Ｉｗａｍｏｔｏ，  Ｊ．  Ｌ．  Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ，  Ｒ．  Ｇｏｒｂａｔｏｖ，  Ｇ．  Ｋ．  Ｓｕｋｈｏｖａ，  Ｌ．  Ｍ．  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，  Ｄ．  Ｓｍｙｔｈ，  Ｃ．  Ｃ．  Ｚａｖｉｔｚ，  Ｅ．  Ａ．  Ｓｈｉｋａｔａｎｉ，  Ｍ．  Ｐａｒｓｏｎｓ，  Ｎ．  ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ，  Ｈ．  Ｙ．  Ｌｉｎ，  Ｍ．  Ｈｕｓａｉｎ，  Ｐ．  Ｌｉｂｂｙ，  Ｍ．  Ｎａｈｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｒ．  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，  Ｆ．  Ｋ．  Ｓｗｉｒｓｋｉ，  Ｌｏｃａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｏｍｉｎａｔｅｓ  ｌｅｓｉｏｎａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  １９，  １１６６−１１７２  （２０１３）．
２９．Ｃ．  Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｄｉｎａ，  Ｔ．  Ｂｉｎｄｅｒｕｐ，  Ｍ．  Ｅ．  Ｌｏｂａｔｔｏ，  Ｊ．  Ｔａｎｇ，  Ｃ．  Ｃａｌｃａｇｎｏ，  Ｌ．  Ｇｉｅｓｅｎ，  Ｃ．  Ｈ．  Ｗｅｓｓｅｌ，  Ｊ．  Ｗｉｔｊｅｓ，  Ｓ．  Ｉｓｈｉｎｏ，  Ｓ．  Ｂａｘｔｅｒ，  Ｙ．  Ｚｈａｏ，  Ｓ．  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，  Ｍ．  Ｅｌｄｉｂ，  Ｂ．  Ｌ．  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｙｔａｎ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｒｏｂｓｏｎ，  Ｊ．  Ｂｉｎｉ，  Ｊ．  Ｆ．  Ｇｒａｎａｄａ，  Ｋ．  Ｍ．  Ｆｉｓｈ，  Ｅ．  Ｓ．  Ｓｔｒｏｅｓ，  Ｒ．  Ｄｕｉｖｅｎｖｏｏｒｄｅｎ，  Ｓ．  Ｔｓｉｍｉｋａｓ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｔ．  Ｒｅｉｎｅｒ，  Ｖ．  Ｆｕｓｔｅｒ，  Ａ．  Ｋｊａｅｒ，  Ｅ．  Ａ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｚ．  Ａ．  Ｆａｙａｄ，  Ｗ．  Ｊ．  Ｍｕｌｄｅｒ，  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ＰＥＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ＨＤＬ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．  ＪＡＣＣ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ９，  ９５０−９６１  （２０１６）．
３０．Ｐ．  Ｍ．  Ｒｉｄｋｅｒ，  Ｔ．  Ｔｈｕｒｅｎ，  Ａ．  Ｚａｌｅｗｓｋｉ，  Ｐ．  Ｌｉｂｂｙ，  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｖｅｎｔｓ：  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｓｔｕｄｙ  （ＣＡＮＴＯＳ）．  Ａｍ．  Ｈｅａｒｔ．  Ｊ．  １６２，  ５９７−６０５  （２０１１）．
３１．Ｂ．  Ｍ．  Ｅｖｅｒｅｔｔ，  Ａ．  Ｄ．  Ｐｒａｄｈａｎ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｓｏｌｏｍｏｎ，  Ｎ．  Ｐａｙｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍａｃｆａｄｙｅｎ，  Ｅ．  Ｚａｈａｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｇｕｐｔａ，  Ｍ．  Ｃｌｅａｒｆｉｅｌｄ，  Ｐ．  Ｌｉｂｂｙ，  Ａ．  Ａ．  Ｈａｓａｎ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｇｌｙｎｎ，  Ｐ．  Ｍ．  Ｒｉｄｋｅｒ，  Ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ：  ａ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  １６６，  １９９−２０７  （２０１３）．
３２．  Ｍ．  Ｂａｃｋ，  Ｇ．  Ｋ．  Ｈａｎｓｓｏｎ，  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  １２，  １９９−２１１  （２０１５）．
３３．Ｇ．  Ｗ．  Ｓｔｏｎｅ，  Ａ．  Ｍａｅｈａｒａ，  Ａ．  Ｊ．  Ｌａｎｓｋｙ，  Ｂ．  ｄｅ  Ｂｒｕｙｎｅ，  Ｅ．  Ｃｒｉｓｔｅａ，  Ｇ．  Ｓ．  Ｍｉｎｔｚ，  Ｒ．  Ｍｅｈｒａｎ，  Ｊ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｎ．  Ｆａｒｈａｔ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｍａｒｓｏ，  Ｈ．  Ｐａｒｉｓｅ，  Ｂ．  Ｔｅｍｐｌｉｎ，  Ｒ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ｚ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｐ．  Ｗ．  Ｓｅｒｒｕｙｓ，  Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｎａｔｕｒａｌ−ｈｉｓｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３６４，  ２２６−２３５  （２０１１）．
３４．  Ｊｏｎａｓ  Ａ．  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２８，  ５５３−５８２  （１９８６）．
３５．Ｃ．  Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｄｉｎａ，  Ｊ．  Ｔａｎｇ，  Ｄ．  Ａｂｄｅｌ−Ａｔｔｉ，  Ｂ．  Ｈｏｇｓｔａｄ，  Ｍ．  Ｍｅｒａｄ，  Ｅ．  Ａ．  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｚ．  Ａ．  Ｆａｙａｄ，  Ｊ．  Ｓ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｗ．  Ｊ．  Ｍｕｌｄｅｒ，  Ｔ．  Ｒｅｉｎｅｒ，  ＰＥＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｗｉｔｈ  ８９Ｚｒ−Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ５６，  １２７２−１２７７  （２０１５）．
３６．Ｂ．  Ｌａｎｇｍｅａｄ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｓａｌｚｂｅｒｇ．  Ｆａｓｔ  ｇａｐｐｅｄ−ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｗｔｉｅ  ２．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ３５７−３５９  （２０１２）．
３７．  Ｓ．  Ａｎｄｅｒｓ，  Ｐ．Ｔ．  Ｐｙｌ，  Ｗ．  Ｈｕｂｅｒ．  ＨＴＳｅｑ  −  ａ  Ｐｙｔｈｏｎ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｔｏ  ｗｏｒｋ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１，  １６６−１６９  （２０１５）．
３８．  Ｊ．  Ｍ．  Ｍｕｄｇｅ，  Ｊ．  Ｈａｒｒｏｗ．  Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．  Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ．  ２６，  ３６６−３７８  （２０１５）．
３９．Ｍ．  Ｅ．  Ｒｉｔｃｈｉｅ，  Ｂ．  Ｐｈｉｐｓｏｎ，  Ｄ．  Ｗｕ，  Ｙ．  Ｈｕ，  Ｃ．  Ｗ．  Ｌａｗ，  ＳＷ．  Ｓｈｉ，  Ｇ．  Ｋ．  Ｓｍｙｔｈ．  Ｌｉｍｍａ  ｐｏｗｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ４３，  ｅ４７  （２０１５）．
４０．  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｘ．  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．  Ｚｈｕ，  Ｙ．  Ｇｕ，  Ｗ．  Ｚｈａｏ，  Ｊ．  Ｚｏｕ，  Ｚ．  Ｇｕｏ．  ＧＯ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ：  ｄｅｒｉｖｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．  Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ  １３，  ２１６−２２７  （２０１２）．
４１．Ｍ．  Ｋａｎｅｈｉｓａ，  Ｓ．  Ｇｏｔｏ，  Ｙ．  Ｓａｔｏ，  Ｍ．  Ｆｕｒｕｍｉｃｈｉ，  Ｍ．  Ｔａｎａｂｅ．  ＫＥＧＧ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４０，  Ｄ１０９−１１４  （２０１２）．
【０２６０】
本明細書中に引用された全ての参考文献は、個々の刊行物と同じ程度に参照により組み込まれ、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、と特許出願または特許は、具体的かつ個々に、参照により組み入れられることが示された。参照による組込みのこの声明は、個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許に関連すると、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に準じて、出願人によって意図され、これらの各々は、そのような引用が参照による組込みの組込みの声明に直接隣接していなくても、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に応じて明確に識別される。参照による組込みの組込みの声明の包含は、もしあれば、本明細書中の中で、この一般的な参照による組込みの声明を決して弱めるものではない。本明細書中の参の引用は参考文献が関連する先行技術であることの認定を意図するものではなく、これらの刊行物または文書の内容または日付に関する認定を構成するものでもない。
【０２６１】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
【０２６２】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。本明細書に示され記述されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の記載から当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲に含まれるであろう。
【図１Ａ】
2019515926.tif 000004
【図１Ｂ】
2019515926.tif 000005
【図１Ｃ】
2019515926.tif 000006
【図１Ｄ】
2019515926.tif 000007
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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