(57)【要約】  本発明は、がん細胞を標的化するための腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、該物質を発現するＴ細胞、該物質を産生するための方法、および該物質を用いてがんを治療する方法に関する。特に、本明細書は、アミノ酸配列ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）を有するＭＡＧ−００３などのペプチドを有するＨＬＡクラスＩまたはＩＩ分子に結合する、ＴＣＲおよびそれらの変異型に関する。本明細書は、免疫療法で使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞にさらに関する。特に、本明細書は、がんの免疫療法に関する。本明細書は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激しまたは生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４４、５２、６０、６８、７６、および８４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなる抗原認識コンストラクト。
【請求項２】
前記抗原認識コンストラクトが、本発明の抗原ペプチドのＴＡＡに特異的におよび／または選択的に結合できる、請求項１に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項３】
前記抗原認識コンストラクトが、抗体、またはその誘導体もしくは断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体もしくは断片である、請求項１または２に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項４】
前記抗原認識コンストラクトがＴＡＡ抗原ペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合し、前記ＨＬＡが任意選択的にＡ*０２型である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。。
【請求項５】
前記コンストラクトが、配列番号１〜２５、好ましくは配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するエピトープに、特異的におよび／または選択的に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項６】
前記コンストラクトがα／β−ＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体であり、または前記コンストラクトがγ／δ−ＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項７】
前記コンストラクトがヒト起源であり、ＴＡＡ抗原ペプチドを特異的におよび／または選択的に認識することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項８】
前記抗原認識コンストラクトが、対象において免疫応答を誘導でき、任意選択的に、前記免疫応答がインターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項９】
前記ＴＣＲαまたはγ鎖が配列番号４４、６０、および７６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなり、および／または前記ＴＣＲβまたはδ鎖が配列番号５２、６８、および８４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含んでなる、ＴＣＲα鎖またはγ鎖および／またはＴＣＲβまたはδ鎖を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１０】
前記ＴＣＲαまたはγ鎖が、配列番号４２、５８、および７４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号４３、５９、および７５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項９に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１１】
前記ＴＣＲβまたはδ鎖が、配列番号５０、６６、および８２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ１；および／または配列番号５１、６７、および８３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項９または１０に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１２】
配列番号４１、４９、５７、６５、７３、および８１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するＴＣＲ可変鎖領域を含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１３】
前記コンストラクトが、ヒト化、キメラ化および／またはマウス化されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１４】
ＴＣＲ結合断片を含んでなり、前記結合断片が、任意選択的に、配列番号４２、４３、４４；または５０、５１、５２；または５８、５９、６０；または６６、６７、６８；または７４、７５、７６；または８２、８３、８４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列から選択されるＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１５】
前記コンストラクトが、少なくとも１つのＴＣＲα鎖および１つのＴＣＲβ鎖配列から構成されるＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号４２〜４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号５０〜５２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号５８〜６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号６６〜６８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり；または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号７４〜７６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号８２〜８４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１６】
前記コンストラクトが、少なくとも１つのＴＣＲα鎖および１つのＴＣＲβ鎖配列からなるＴＣＲまたはその断片であり、前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号４９のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号５７のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号６５のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、または前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号７３のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなり、前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号８１のアミノ酸配列を有する可変領域配列を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１７】
前記コンストラクトが、配列番号４６、５４、６２、７０、７８、および８６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＴＣＲ定常領域をさらに含んでなる、ＴＣＲまたはその断片であり；好ましくは前記ＴＣＲが、少なくとも、１つのＴＣＲαおよび１つのＴＣＲβ鎖配列から構成され、前記ＴＣＲα鎖配列が、配列番号４６、６２、および７８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する定常領域を含んでなり；前記ＴＣＲβ鎖配列が、配列番号５４、７０、および８６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する定常領域を含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１８】
配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項１９】
配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項２０】
配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第１のＴＣＲ鎖、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する第２のＴＣＲ鎖を含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項２１に記載の核酸、または請求項２２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、リンパ球、好ましくはＴリンパ球またはＴリンパ球前駆体、より好ましくはＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項２１に記載の核酸、または請求項２２に記載のベクター、または請求項２３または２４に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、安定剤および／または賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項２６】
医療で使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項２１に記載の核酸、または請求項２２に記載のベクター、または請求項２３または２４に記載の宿主細胞、または請求項２５に記載の医薬品組成物。
【請求項２７】
悪性または良性の腫瘍疾患を含んでなる増殖性疾患の診断、予防および／または治療における使用のための、請求項２６に記載の使用のための抗原認識コンストラクト、または核酸、またはベクター、または宿主細胞、または医薬組成物。
【請求項２８】
前記腫瘍疾患が、前記腫瘍疾患の腫瘍細胞内のＴＡＡの発現によって特徴付けられる、請求項２７に記載の使用のための抗原認識コンストラクト、または核酸、またはベクター、または宿主細胞、または医薬組成物。
【請求項２９】
医学における使用が、任意選択的に養子細胞移入を含んでなる免疫療法における使用であり、前記免疫療法が、養子自己または異種Ｔ細胞療法を含んでなる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の使用のための抗原認識コンストラクト、または核酸、またはベクター、または宿主細胞、または医薬組成物。
【請求項３０】
ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコードするコード配列を含んでなる遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記適切な宿主細胞に前記遺伝子コンストラクトを導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
を含んでなる、細胞株を発現するＴＡＡ特異的抗原認識コンストラクトを製造する方法。
【請求項３１】
前記抗原認識コンストラクトの細胞表面提示をさらに含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子コンストラクトが、前記コード配列と作動可能に連結されたプロモーター配列を含んでなる発現コンストラクトである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗原認識コンストラクトが哺乳類起源、好ましくはヒト起源である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記適切な宿主細胞が、任意選択的にヒト細胞またはヒトＴリンパ球から選択される哺乳類細胞である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗原認識コンストラクトが修飾ＴＣＲであり、前記修飾が、標識を含んでなる機能ドメインの付加、または膜アンカードメインを含んでなる代替ドメインの付加を含んでなる、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記抗原認識コンストラクトがα／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、または一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子コンストラクトが、レトロウイルス形質移入によって前記適切な宿主細胞に導入される、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記適切な宿主細胞からの前記抗原認識コンストラクトの単離および精製と、任意選択的に、Ｔ細胞内の前記抗原認識コンストラクトの再構成とをさらに含んでなる、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的化する。これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来するペプチドであり得て、それらは各腫瘍細胞内で発現され、同一起源の非改変細胞内と比較して、通常、上方制御される。
【０００２】
細胞性免疫応答の特異的要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
【背景技術】
【０００３】
ＭＡＧＥＡ４は、ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＭＡＧＥＡ４タンパク質およびｍＲＮＡの発現は、様々ながんの発症および予後と結びつけられている。ＭＡＧ−００３ペプチド、すなわち、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）は、ＭＡＧＥＡ４（アミノ酸２８６〜２９４）のＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープである。その内容全体が本明細書に参照により援用される（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。ＭＡＧ−００３は、生体外とＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋｂ遺伝子組換えマウスの双方において、ＨＬＡ−Ａ*０２０１−陽性ＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘発する。ＭＡＧ−００３誘導性ＣＴＬはＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束様式で標的細胞を溶解し、ＭＡＧ−００３がＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性ＣＴＬエピトープであることを実証する。
【０００４】
ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答が、抗腫瘍効果と共同して相乗的に寄与するので、腫瘍関連抗原および対応するＴ細胞受容体の同定と特性解析は、ワクチンおよび細胞療法などのがん免疫療法の開発において重要である。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応において、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンおよび細胞療法をはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。
【０００６】
本明細書に従って、特定のＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲまたは細胞表面ＴＣＲ）および抗体またはその他の結合分子（複合体）によって、ペプチド−ＭＨＣを標的化する場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
がん治療のための分子標的薬の開発が進歩しているものの、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的な分子を特異的に標的化する新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。本明細書は、新規ＭＡＧ−００３  ＴＣＲと、核酸と、ベクターと、ＭＡＧ−００３に特異的に結合する宿主細胞とを提供し、がんの治療におけるそのような分子の使用方法を提供することにより、その必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書は、α鎖および／またはβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。別の実施形態では、本明細書は、γ鎖および／またはδ鎖を含んでなるＴＣＲ（「γ／δＴＣＲ」）に関する。
【０００９】
本明細書は、ＴＣＲと、個々のＴＣＲサブユニット（単独または組み合わせ）およびそのサブドメインと、例えば、天然ＴＣＲには存在しない定常ドメイン残基の間に少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合を有する可溶性α／β二量体ＴＣＲなどの可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）と、クローン化ＴＣＲと、当該物質を生産する方法ならびに前記ＴＣＲを保有するその他の細胞を生産する方法とにさらに関し、前記ＴＣＲは、自己由来または同種異系Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体細胞に組み込まれる。
【００１０】
本明細書は、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合するＴＣＲにさらに関し、ＭＡＧ−００３ペプチドは、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）と、配列番号２〜配列番号２４に示されるものなどのその変異型とから選択される。一実施形態では、ＨＬＡ分子はＨＬＡ−Ａ*０２である。
【００１１】
本明細書は、表２に示されるＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性を有する、ＴＣＲα可変ドメインと；表２に示されるＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性、好ましくは９０％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインとを含んでなる、ＴＣＲにさらに関する。
【００１２】
一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表２に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有し；および／またはＴＣＲβ可変ドメインは、表２に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインおよび／またはＴＣＲβ可変ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲαドメインおよび／または非変異ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。
【００１３】
本明細書のＴＣＲα鎖は、表２に示されるＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＴＣＲα定常ドメインをさらに含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲβ鎖は、表２に示されるＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ＴＣＲβ定常ドメインをさらに含んでなってもよい。
【００１４】
本明細書のＴＣＲα鎖は、ＴＣＲα膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲα細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲβ鎖は、ＴＣＲβ膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲβ細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。
【００１５】
本明細書は、表２で開示される１つまたは複数のα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるＴＣＲα鎖、および表２に示されるＣＤＲに対して１つ、２つ、３つまたは４つの置換を有するその変異型にさらに関する。表２に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなるＴＣＲα鎖が、さらに記載される。表２に示されるα鎖ＣＤＲ３を含んでなるＴＣＲα鎖が、さらに記載される。
【００１６】
本明細書は、表２で開示される１つまたは複数のβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるＴＣＲβ鎖、および表２に示されるＣＤＲに対して１つ、２つ、３つまたは４つの置換を有するその変異型にさらに関する。表２に示されるβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含んでなるＴＣＲβ鎖が、さらに記載される。表２に示されるβ鎖ＣＤＲ３を含んでなるＴＣＲβ鎖が、さらに記載される。
【００１７】
本明細書は、本明細書のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離または組換え核酸にさらに関する。一実施形態では、本明細書の核酸は、表２に示されるように、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖をコードする。
【００１８】
本明細書はさらに、本明細書に記載のＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を含んでなる、組換え発現ベクターに関する。
【００１９】
本明細書は、本明細書に記載のＴＣＲα鎖、β鎖、またはその双方をコードする核酸を発現する組換え発現ベクターを含んでなる、単離された宿主細胞にさらに関する。
【００２０】
本明細書は、本明細書による組換え発現ベクター単離を含んでなるされた宿主細胞にさらに関し、好ましくはそ細胞は、ヒト細胞、好ましくは末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、より好ましくはＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔリンパ球である。
【００２１】
本明細書は、本明細書の組換え発現ベクターを含んでなる単離されたＰＢＬにさらに関し、ＰＢＬは、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００２２】
本明細書は、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含んでなる細胞の集団にさらに関する。
【００２３】
本明細は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどの増殖性疾患を治療するための、本明細書のＴＣＲおよび宿主細胞にさらに関する。
【００２４】
一態様では、宿主細胞は、本明細書による少なくとも１つのＴＣＲをコードする核酸で形質移入された、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞であり、ＴＣＲは、表２で開示される少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなる。別の態様では、このような宿主細胞は、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、好ましくは非小細胞肺がんの免疫療法で使用される。
【００２５】
本明細書は、がん細胞を本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクターまたは宿主細胞に接触させるステップを含んでなる、がん細胞を死滅させまたはその数を減少させる方法にさらに関する。本明細書に記載のＴＣＲ、核酸、ベクターまたは宿主細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法もまた提供される。
【００２６】
別の態様では、本明細書は、例えば、以下の一般式Ｉ、
Ｘ１Ｘ２ＬＥＨＶＶＲＸ３（配列番号２５）
式Ｉ
（式中、Ｘ１はアミノ酸ＫおよびＹから選択され、Ｘ２はアミノ酸Ｖ、ＬおよびＡから選択され、Ｘ３はＶ、Ｌ、Ａ、およびＩから選択され、前記ペプチドは、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合し、および／または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導する）に記載のアミノ酸配列を含んでなる単離ペプチドなどのＭＡＧ−００３ペプチド、またはその薬学的に許容可能な塩に関する。
一態様では、前記ペプチドは、その基礎となる全長ポリペプチドではない。
【００２７】
好ましいのは、配列番号１からなる群から選択される配列、または配列番号１と少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）それらの変異配列、またはその薬学的に許容可能な塩であり、前記変異型は、ＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合し、および／または前記ペプチドと交差反応するＴ細胞を誘導し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。
【００２８】
本明細書は、配列番号１、または配列番号１と少なくとも６６％、好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、本明細書のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８?１００、好ましくは８?３０、最も好ましくは８?１４アミノ酸の全長を有する。
【００２９】
以下の表は、本明細書による例示的ペプチド、およびそれらの各配列番号を示す。一態様では、表１のペプチドはＨＬＡ−Ａ*０２に結合してもよい。別の態様では、本明細書に記載のＴＣＲは、表１の１つまたは複数のペプチドに結合でき、または特異的に結合できる。
【００３０】
【表１】
2019511222.tif 000002
【００３１】
一態様では、本明細書は、本明細書に記載の１つまたは複数のペプチドを利用することによる、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどの増殖性疾患の治療に関する。
【００３２】
特に好ましいのは、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される、本明細書による単独のまたは組み合わされたペプチドである。より好ましいのは、配列番号１〜配列番号２４（表１を参照されたい）からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチドと、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、頭頸部がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、好ましくは非小細胞肺がんの免疫療法におけるそれらの使用である。
【００３３】
一態様では、本明細書は、ＨＬＡクラスＩまたは長さ変異型−ＨＬＡクラスＩＩなどのより長い形態の分子に結合する能力を有する、本明細書によるペプチドに関する。
【００３４】
一態様では、本明細書は、本明細書によるペプチドに関し、前記ペプチドは（それぞれ）配列番号１〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含んでなり、それからなり、またはそれから本質的になる。
【００３５】
本明細書は、本明細書によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む。
【００３６】
本明細書は、本明細書によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸、好ましくはその８０個のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体（またはその配列中）に融合した、融合タンパク質の一部である。
【００３７】
本明細書は、本明細書によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本明細書は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本明細書による核酸にさらに関する。
【００３８】
本明細書は、本明細書による核酸を発現でき、および／または発現する、発現ベクターにさらに関する。
【００３９】
本明細書は、疾患の治療および医療で、特にがんの治療で使用するための本明細書によるペプチド、本明細書による核酸、または本明細書による発現ベクターにさらに関する。
【００４０】
本明細書は、本明細書によるペプチドに、または本明細書による前記ペプチドとＭＨＣとの複合体に、特異的に結合する抗体と、このような抗体を生産する方法とにさらに関する。
【００４１】
本明細書は、前述のような本明細書による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。
【００４２】
本明細書は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本明細書による宿主細胞にさらに関する。
【００４３】
本明細書は、本明細書による宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本明細書によるペプチドを生産する方法にさらに関する。
【００４４】
本明細書は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ分子上に抗原が負荷され、または抗原／クラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ複合体モノマーを四量体化することで、クラスＩまたはＩＩ  ＭＨＣ四量体上に抗原が負荷される、本明細書による方法にさらに関する。
【００４５】
本明細書は、抗原提示細胞が、配列番号１〜配列番号２４を含有する、好ましくは配列番号１〜配列番号２４またはその変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現する能力がありおよび／または発現する、発現ベクターを含んでなる、本明細書による方法にさらに関する。
【００４６】
本明細書は、本明細書による方法によって生産される活性化Ｔリンパ球にさらに関し、Ｔ細胞は、本明細書によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。
【００４７】
本明細書は、患者においてがんを死滅させおよび／または細胞を抑制する方法にさらに関し、そのがん細胞は、本明細書による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現し、方法は、本明細書によって生産される有効数のＴ細胞を患者に投与するステップを含んでなる。
【００４８】
本明細書は、本明細書による薬剤としてのまたは薬剤の製造における、本明細書に記載の任意のペプチド、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載の発現ベクター、本明細書に記載の細胞、本明細書に記載の活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体、抗体、またはその他のペプチド−および／またはペプチド−ＭＨＣ−結合分子の使用にさらに関する。一態様では、薬剤はがんに対して有効である。
【００４９】
好ましくは、前記薬剤は、ＴＣＲ、可溶性ＴＣＲまたは抗体に基づく、細胞療法、ワクチンまたはタンパク質である。
【００５０】
本明細書はさらに、本明細書による使用に関し、がん細胞は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がん、好ましくは非小細胞肺がんである。
【００５１】
本明細書は、がん、好ましくは非小細胞肺がんの診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本明細書によるペプチドをベースとするバイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的化する免疫療法である、治療の成功確率を予測するために使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。任意選択的に、抗体または可溶性ＴＣＲは、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。
【００５２】
本明細書は、前記標的の少なくとも１つを認識するＴＣＲを同定するための、好ましくはＴ細胞を活性化する前記ＴＣＲを同定するための、これらの新規標的の使用にさらに関する。
【００５３】
本明細書はまた、がん治療の文脈におけるこれらの新規標的の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】健常組織およびがんにおける、ＭＡＧ−００３ペプチド提示を示す。
【図２】がんおよび健常組織における、ＭＡＧ−００３発現を示す。
【図３】同上
【図４】同上
【図５】ＭＡＧ−００３ペプチド（配列番号１）を負荷した標的細胞または相同的なとの同時インキュベーション後における、それぞれ、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２（表２）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を示すが、無関係のペプチドＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−００１（配列番号９１）、ＡＸＩＮ１−００１（配列番号９２）、ＡＮＯ５−００１（配列番号９３）、ＴＰＸ２−００１（配列番号９４）、ＳＹＮＥ３−００１（配列番号９５）、ＭＩＡ３−００１（配列番号９６）、ＨＥＲＣ４−００１（配列番号９７）、ＰＳＭＥ２−００１（配列番号９８）、ＨＥＡＴＲ５Ａ−００１（配列番号９９）またはＣＮＯＴ１−００３（配列番号１００）または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号１０１）との同時インキュベーションでは、放出はなかった。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なるドナー（ドナー１は右のＸ軸、ドナー２は左のＸ軸）に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞で得られた。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。
【図６】同上
【図７】同上
【図８】それぞれ、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２（表２）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＨＣ／ＭＡＧ−００３四量体またはＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体染色を示す。ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１複合体に特異的に結合する１Ｇ４ＴＣＲのＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞、および模擬電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、対照の役割を果たした。
【図９】配列番号１の１〜９位で、ＭＡＧ−００３ペプチド（配列番号１）または様々なＭＡＧ−００３アラニン置換変異型が負荷された標的細胞との同時インキュベーション後に、それぞれ、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２（表２）のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔された、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出を示す。ＲＮＡ電気穿孔ＣＤ８＋Ｔ細胞単独、または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１が負荷された標的細胞とのまたは未負荷標的細胞との同時インキュベーションが、対照の役割を果たした。ＩＦＮγ放出データは、２人の異なるドナー（ドナー１は右のＸ軸、ドナー２は左のＸ軸）に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞で得られた。
【図１０】同上
【図１１】同上
【図１２】それぞれ、Ａ−３７５黒色腫細胞株、Ｔ９８Ｇ神経膠芽腫細胞株、およびＳＫ−ＢＲ−３乳がん細胞株との同時インキュベーション後における、ＴＣＲ（Ａ）Ｒ７Ｐ１Ｄ５、（Ｂ）Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、および（Ｃ）Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２のαおよびβ鎖ＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞からの放出。  ＲＮＡ電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞単独が、対照の役割を果たした。
【図１３】ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、模擬または対照ＴＣＲ１Ｇ４（配列番号Ｘ）をコードするＲＮＡで形質移入されたＴ細胞は、異なる初代ヒト健常組織細胞（略号については表１３を参照されたい）、標的陰性腫瘍細胞株ＭＣＦ−７、およびＭＡＧＥＡ４−およびＮＹ−ＥＳＯ１−陽性細胞株Ａ−３７５およびＮＣＩ−Ｈ１７５５と共に同時培養された。Ｔ細胞内のＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、および１Ｇ４発現は、ＲＮＡベクターを用いた電気穿孔によって達成された。ヒト健常組織細胞培養物は、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２またはＲ２０Ｐ１Ｈ７に対する有意なＴＣＲ媒介認識およびＴ細胞活性化をもたらさなかった。Ｅ：Ｔ比１：１、各２０，０００個の細胞、反復から２０時間後のＩＦＮ−γ放出の平均が、ＥＬＩＳＡによって測定されるように示される。誤差棒は標準偏差を示す。結果は、ＴＣＲ形質移入Ｔ細胞単独からのＩＦＮ−γ放出、および標的細胞と目的のＴＣＲを発現しないＴ細胞との同時培養に起因するＩＦＮ−γ放出の減算によって正規化された。
【図１４】６つの異なるレンチウイルスコンストラクト（Ｒ７１−Ｒ７８）での形質導入後におけるＲ７Ｐ１Ｄ５ＴＣＲ導入遺伝子発現についてスクリーニングされた、４人のドナーからの累積データである。ＣＤ３＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞は、形質導入の９６時間後おける、ＭＨＣ／ＭＡＧ−００３四量体結合細胞の比率に関するフローサイトメトリーによって分析された。ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１四量体で染色された非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）、およびＭＨＣ／ＭＡＧ−００３四量体で染色された１Ｇ４（ＮＹ−ＥＳＯ１）ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞が、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用された。細胞は、生存ＣＤ３＋ＣＤ８＋集団上でゲートされた。
【図１５】ＭＡＧＥＡ４発現腫瘍細胞株Ａ３７５およびＭＡＧＥＡ４陰性腫瘍細胞株ＭＣＦ−７を同時培養した際のＩＦＮγ生成の手段によって測定される、Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞のエフェクター応答である。Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲをコードするＲ７３レンチウイルスの濃縮上清で形質導入されたＴ細胞は、４人の健常ドナーのＰＢＭＣに由来する非形質導入細胞（ＮＴ）と比較された。結果は、三連の平均±ＳＥＭとして提示される。    減少する濃度のＭＡＧ−００３ペプチドでパルス処理されたＴ２標的細胞との同時インキュベーション時における、２人の健常ドナー（ドナー６および７）のＰＢＭＣに由来する、Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲ形質導入（Ｒ７３レンチウイルス）Ｔ細胞のＩＦＮγ応答である。結果は、形質導入の９６時間後に測定された、三連の平均±ＳＥＭとして提示される。
【図１６】（Ａ、Ｂ）４ＨＣｒ５１放出アッセイにおいて、異なるＥ：Ｔ比で、ＭＡＧＥＡ４発現腫瘍細胞系Ａ３７５に対して測定された、Ｒ７Ｐ１Ｄ５ＴＣＲ（Ｒ７３レンチウイルス）形質導入および非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）の細胞毒性応答である。結果は、三連から四連の平均±ＳＥＭとして提示される。（Ｃ）４０：１のＥ：Ｔ比（ｒａｔｉｏｎ）で、ＭＡＧＥＡ４発現（Ａ３７５）およびＭＡＧＥＡ４−陰性（ＭＣＦ−７）腫瘍標的の抗原特異的死滅を示す５人のドナーから作製された、７つのＲ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲ（Ｒ７３レンチウイルス）形質導入Ｔ細胞産物からの合わせたデータである。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本明細書は、α鎖および／またはβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。ＭＨＣ分子によって提示されるとＴＣＲおよび抗体に結合できる、ＭＡＧ−００３ペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のＴＣＲおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞；そしてそれを使用する方法にも関する。
【００５６】
したがって、本発明の目的は、第１の態様において、配列番号４４、５２、６０、６８、７６、および８４から選択されるアミノ酸配列との少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）３を含んでなるコンストラクトを認識する抗原によって解決される。
【００５７】
本発明によるコンストラクトを認識する抗原は、好ましくは抗体、またはその誘導体もしくは断片、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体もしくは断片から選択される。本発明の抗体またはＴＣＲの誘導体または断片は、好ましくは、親分子の抗原結合／認識能力、特に上で説明したようなその特異性および／または選択性を保持しなければならない。そのような結合機能は、本明細書で定義されるＣＤＲ３領域の存在によって保持されてもよい。
【００５８】
本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ依存性様式でＴＡＡ抗原を認識できる。「ＭＨＣクラスＩ依存性様式」は、本明細書の用法では、ＴＣＲが、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈内で、ＴＡＡ抗原への結合時に免疫応答を誘発することを意味する。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ分子などの当該技術分野で公知の任意のＭＨＣクラスＩ分子であり得る。本発明の好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ*０２分子である。
【００５９】
本発明は、コンストラクトを認識する一本鎖抗原とコンストラクトを認識する二重鎖との双方を提供する。
【００６０】
一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表２に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有し；および／またはＴＣＲβ可変ドメインは、表２に示されるＴＣＲαドメインに対して少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインおよび／またはＴＣＲβ可変ドメインに少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＴＡＡペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲαドメインおよび／または非変異ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。
【００６１】
本明細書のＴＣＲα鎖は、ＴＣＲα膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲα細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。本（ｐｒｅ−ｓｅｎｔ）明細書のＴＣＲβ鎖は、ＴＣＲβ膜貫通ドメインおよび／またはＴＣＲβ細胞内ドメインをさらに含んでなってもよい。
【００６２】
本発明は、特に抗原認識コンストラクトとしてのＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体を提供する。ＴＣＲは、好ましくはヒトＴＣＲであり、ヒトＴＣＲ遺伝子座から生じ、したがってヒトＴＣＲ配列を含んでなるものとして理解される。さらに、本発明のＴＣＲは、それがヒト起源であり、表１で言及される本発明のＴＡＡ抗原を特異的に認識することを特徴としてもよい。
【００６３】
本発明の別の実施形態は、それに加えてまたは代案として、免疫応答を誘導する、上述の抗原認識コンストラクトを提供し、好ましくは免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。
【００６４】
本発明のＴＣＲは、一本鎖αまたはβ、またはγおよびδ、分子、または代案としては、αおよびβ鎖、またはγおよびδ鎖の双方から構成される、二重鎖コンストラクトとして提供されてもよい。
【００６５】
最も好ましくは、いくらかの追加的な実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＴＣＲ鎖の任意の１、２つまたは全てのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域を含んでなる、抗原認識コンストラクトに言及し（表１を参照されたい）、３つ以下、２つ、好ましくは唯一の修飾アミノ酸残基がある本発明の各ＣＤＲ配列を含んでなる、抗原認識コンストラクトが、好ましくあってもよい。修飾されたアミノ酸残基は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から選択されてもよい。最も好ましくは、３つ、２つ、好ましくは唯一の修飾アミノ酸残基は、それぞれのＣＤＲ配列の最初または最後のアミノ酸残基である。修飾が置換である場合、いくつかの実施形態では、置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。
【００６６】
本発明のＴＣＲは、例えば、ヒト、ラット、サル、ウサギ、ロバ、またはマウスなどの任意の哺乳類などの任意の適切な生物種に由来する、定常領域をさらに含んでなってもよい。本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、ヒト定常領域をさらに含んでなる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＴＣＲの定常領域は、例えば、好ましくはマウス配列である、ＴＣＲ発現および安定性を増加させてもよい異種配列の導入によって、わずかに修飾されてもよい。
【００６７】
本発明の一実施形態では、キメラＴＣＲが提供され、ＴＣＲ鎖は複数の生物種からの配列を含んでなる。好ましくは、本発明のＴＣＲは、α鎖のヒト可変領域と、例えば、マウスＴＣＲα鎖のマウス定常領域とを含んでなる、α鎖を含んでなってもよい。
【００６８】
一実施形態では、本発明のＴＣＲは、上記の実施形態に従ったヒト可変領域と、ヒト定常領域とを含んでなるヒトＴＣＲである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗原認識コンストラクトは、マウス化またはヒト化される。異種これらの用語は、異種由来のアミノ酸配列が本発明のコンストラクトに導入される場合に使用される。
【００７０】
本発明のＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として提供されてもよい。本発明によるｓｃＴＣＲは、１つのポリペプチド鎖中に、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される、完全なまたは部分的α鎖配列および完全なまたは部分的β鎖配列を含まなければならない。ｓｃＴＣＲは、第１のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖）の可変領域のポリペプチドと、全（完全長）第２のＴＣＲ鎖（例えば、β鎖）のポリペプチドとを含んでなり得て、または逆もまた然りである。さらに、ｓｃＴＣＲは、任意選択的に、２つ以上のポリペプチドを一緒に連結する、１つまたは複数のリンカーを含んでなり得る。リンカーは、例えば、本明細書に記載されるように、２つの一本鎖を一緒に結合するペプチドであり得る。また、ＩＬ−２、ＩＬ−７またはＩＬ−１５などのヒトサイトカインに融合された本発明のｓｃＴＣＲも提供される。
【００７１】
本発明による抗原認識コンストラクトはまた、少なくとも２つのｓｃＴＣＲ分子を含んでなる多量体複合体の形態で提供され得て、前記ｓｃＴＣＲ分子は、それぞれ、少なくとも１つのビオチン部分に、またはその他の相互接続分子／リンカーに融合され、前記ｓｃＴＣＲは、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって相互連結され前記多量体複合体が形成できるようにする。多量体ＴＣＲを生成するための当該技術分野で公知の同様のアプローチも可能であり、本開示に含まれる。本発明のｓｃＴＣＲを２つを超えて含んでなる、より高次の多量体複合体もまた提供される。
【００７２】
本発明の目的で、ＴＣＲは、少なくとも１つのＴＣＲαまたはγおよび／またはＴＣＲβまたはδ可変ドメインを有する部分である。一般に、それらは、ＴＣＲα可変ドメインおよびＴＣＲβ可変ドメインの双方を含んでなり、代案としては、ＴＣＲγ可変ドメインおよびＴＣＲδ可変ドメインの双方を含んでなる。それらは、αβ／γδヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖形態であってもよい。養子療法における使用のために、αβまたはγδヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの双方を有する完全長鎖として形質移入されてもよい。所望ならば、導入されたジスルフィド結合が、それぞれの定常ドメインの残基間に存在してもよい。
【００７３】
好ましい実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ヒトＴＣＲ、その断片もしくは誘導体である。ヒトＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体は、対応するヒトＴＣＲ配列の５０％超を含んでなるＴＣＲである。好ましくは、ＴＣＲ配列のごく一部のみが人工起源であり、またはその他の生物種に由来する。しかし、例えばヒト起源に由来して定常ドメインにマウス配列を有するものなどのキメラＴＣＲが有利であることが知られている。したがって、それらの定常ドメインの細胞外部分にマウス配列を含有する、本発明によるＴＣＲが特に好ましい。
【００７４】
したがって、本発明の抗原認識コンストラクトが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）依存的様式、好ましくはＨＬＡ−Ａ０２依存的様式で、その抗原を認識できることもまた好ましい。「ＨＬＡ依存的様式」という用語は、本発明の文脈では、抗原ペプチドが前記ＨＬＡによって提示される場合にのみ、抗原認識コンストラクトが抗原に結合することを意味する。
【００７５】
本発明による抗原認識コンストラクトは、一実施形態では好ましくは免疫応答を誘導し、好ましくは免疫応答は、インターフェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。
【００７６】
例えば、実施例セクションおよび表２に記載のＴＣＲの任意の１つなどの、本明細書に記載のＴＣＲ（またはその機能性変異型）のいずれかの機能性部分を含んでなるポリペプチドもまた、本発明によって提供される。「ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、オリゴペプチドを含み、１つまたは複数のペプチド結合によって連結されたアミノ酸の一本鎖を指す。本発明のポリペプチドに関して、機能性部分は、機能性部分が、好ましくは本明細書の表１で開示されるようなＴＡＡ抗原に特異的に結合するという条件で、それがその一部であるＴＣＲ（またはその機能性変異型）の連続アミノ酸を含んでなる任意の部分であり得る。「機能性部分」という用語は、ＴＣＲ（またはその機能性変異型）に関して使用される場合、本発明のＴＣＲ（またはその機能性変異型）の任意の部分または断片を指し、その部分または断片は、それがその一部である（親ＴＣＲまたはその親機能性変異型）、ＴＣＲ（またはその機能性変異型）の生物学的活性を保持する。機能性部分は、例えば、ＴＣＲ（またはその機能性変異型）の部分を包含する親ＴＣＲ（またはその機能性変異型）と同様の程度に、同じ程度に、またはより高い程度に、ＴＡＡ抗原に（ＨＬＡ依存的様式で）特異的に結合する能力を保持し、またはがんを検出し、治療し、または予防する。親ＴＣＲ（またはその機能性変異型）に関して、機能性部分は、例えば、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上の親ＴＣＲの可変配列（またはその機能性変異型）を含んでなり得る。
【００７７】
機能性部分は、部分のアミノまたはカルボキシ末端に、または双方の末端に、追加的なアミノ酸を含んでなり得て、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能性変異型のアミノ酸配列中に見いだされない。望ましくは、追加的なアミノ酸は、例えば、ＴＡＡ抗原に特異的に結合する；および／またはがん検出し、がんを治療または予防するなどの能力を有する、機能性部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能性変異型の生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。
【００７８】
場合によっては、本発明のコンストラクトは、配列番号３９〜８６のいずれかに記載の配列（ＣＤＲ配列、定常領域および可変領域、および完全長配列）、またはその機能性断片を含んでなる、１つまたは２つのポリペプチド鎖を含んでなってもよく、例えば、免疫グロブリンまたはその一部をコードするアミノ酸配列などのその他のアミノ酸配列をさらに含んでなり、本発明のタンパク質は融合タンパク質であり得る。この点において、本発明はまた、少なくとも１つの他のポリペプチドと共に、本明細書に記載される本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含んでなる融合タンパク質も提供する。もう１つのポリペプチドは、融合タンパク質の別個のポリペプチドとして存在し得るか、または本明細書に記載される本発明のポリペプチドの１つと共にフレーム（タンデム）で発現されるポリペプチドとして存在し得る。もう１つポリペプチドとしては、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなどのＣＤ１分子をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のペプチド分子またはタンパク分子、またはその一部が挙げられる。
【００７９】
融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１つまたは複数のコピーおよび／またはもう１つのポリペプチドの１つまたは複数のコピーを含んでなり得る。例えば、融合タンパク質は、本発明のポリペプチドおよび／またはもう１つのポリペプチドの１、２、３、４、５つ、またはそれ以上のコピーを含んでなり得る。融合タンパク質を作製する適切な方法は、当該分野で公知であり、例えば、組換え方法が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲ（およびその機能性部分および機能性変異型）、ポリペプチド、およびタンパク質は、α鎖およびβ鎖を連結し、γ鎖およびδ鎖を連結するリンカーペプチドを含んでなる、単一タンパク質として発現されてもよい。この点において、本発明のＴＣＲ（およびその機能性変異型および機能性部分）、ポリペプチド、およびタンパク質は、本発明のＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含んでなり、リンカーペプチドをさらに含んでなってもよい。リンカーペプチドは、宿主細胞内で、組換えＴＣＲ（その機能性部分および機能性変異型を含む）、ポリペプチド、および／またはタンパク質の発現を有利に促進してもよい。リンカーペプチドは、任意の適切なアミノ酸配列を含んでなってもよい。一本鎖ＴＣＲコンストラクトのためのリンカー配列は、当該技術分野で周知である。このような一本鎖コンストラクトは、１つまたは２つの定常ドメイン配列をさらに含んでなってもよい。リンカーペプチドを含むコンストラクトの宿主細胞による発現に際して、リンカーペプチドもまた切断されて、α鎖とβ鎖が分離され、γ鎖とδ鎖が分離されてもよい。
【００８０】
既に上述したように、本発明のＴＣＲの結合機能性は、抗体のフレームワークにおいて提供されてもよい。例えば、おそらく３、２または１つの追加的なＮおよび／またはＣ末端フレームワーク残基を含む、本発明のＴＣＲのＣＤＲ配列は、抗体可変重鎖／軽鎖配列に直接グラフトされてもよい。その様々な文法的形態における「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指すために、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部位またはパラトープを含有する分子を指すために、本明細書で使用される。このような分子は、免疫グロブリン分子の「抗原結合断片」とも称される。本発明は、本明細書に記載の抗原に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。抗体は、当該技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、鶏、ハムスター、ヒトなどの哺乳類から単離されたおよび／または精製された抗体などの天然抗体であり得る。代案としては、抗体は、例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体などの遺伝子改変抗体であり得る。抗体は、単量体または多量体の形態であり得る。
【００８１】
「抗体」という用語としては、細胞内抗体、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、「ＣＤＲ−グラフト」によって作製される）、抗体断片、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体など）などの遺伝子操作されまたは別の様式で修飾された形態の免疫グロブリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。「抗体」という用語は、ｃｙｓ−二特異性抗体およびミニ抗体を含む。したがって、本明細書で提供されるありとあらゆる実施形態は、「抗体」または「抗体様コンストラクト」に関して、他に明確に示されていない限り、二重特異性抗体、二特異性抗体、ｓｃＦｖ断片、キメラ抗体受容体（ＣＡＲ）コンストラクト、二特異性抗体および／または小型抗体実施形態とも想定される。「抗体」という用語は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを含み、または本明細書に開示されるように、好ましくは本発明のＴＡＡである対応する抗原に、非共有結合的、可逆的、および特異的様式で結合できる免疫グロブリンの断片を含んでなるポリペプチドを含む。例示的な抗体構造単位は、四量体を構成する。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成され得て、各対は、１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖（ジスルフィド結合を介して連結される）を有する。抗体の構造およびアイソタイプは、当業者に周知である（例えばＪａｎｅｗａｙ'ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１６）。
【００８２】
哺乳類の認識された免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。（免疫グロブリン遺伝子についてより詳しくは、国際Ｉｍ−ＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐｅｔａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｊａｎ；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４１３−２２；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／を参照されたい）完全長鎖では、軽鎖はκまたはλのどちらかに分類される。完全長鎖では、重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεに分類され、それは次に、それぞれ免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００?１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ軽鎖および重鎖のこれらの領域を指す。本発明における用法では、「抗体」は、抗体およびその断片の全ての変種を包含する。したがって、この概念の範囲内で、完全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、およびこれらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ'）２）は、本質的に同一または類似結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、本発明のペプチドＴＡＡに特異的に結合する。本発明による好ましい抗原認識コンストラクトとしては、抗体重鎖、好ましくはその可変ドメイン、またはその抗原結合断片、および／または抗体軽鎖、好ましくはその可変ドメイン、またはその抗原結合断片が挙げられる。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得るが、本発明の抗体断片は、これらの例示的なタイプの抗体断片に限定されない。また、抗体、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識を含んでなるように修飾され得る。場合によっては、ＴＣＲＣＤＲ３配列は、配列番号４４、５２、６０、６８、７６、および８４に提供されるＣＤＲ３配列と比較して、好ましくは３つ以下のアミノ酸残基で、好ましくは２つのみ、最も好ましくは１つのみのアミノ酸位置で、わずかに修飾されてもよい。好ましくは、抗体は、表２の本発明のＴＣＲについて示されるように、ＣＤＲ３、好ましくは全てのＣＤＲ１?ＣＤＲ３領域の組合せを含んでなり、いずれの場合にも独立して、これらの配列と比較して、任意選択的に、それぞれ３つまたは２つ以下、好ましくは１つのアミノ酸置換、挿入および／または欠失を有する。
【００８３】
抗体を作製する適切な方法は、当該技術分野で公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５，５１１−５１９（１９７６）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；およびＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，８  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０１１））に記載される。代案としては、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍ−ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１−６７（１９８４）、およびＲｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１，１４０−６７（１９８６））およびバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５−８１（１９８９）を参照されたい）などのその他の方法が、当該技術分野で公知である。さらに、非ヒト動物において抗体を生産する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、および米国特許第５，７１４，３５２号明細書、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書に記載される。
【００８４】
本発明のいくつかの実施形態はまた、可溶性ＴＣＲである、ＴＣＲまたはその機能性断片およびポリペプチドにも関する。本明細書の用法では、「可溶性Ｔ細胞レセプター」という用語は、天然ＴＣＲのヘテロ二量体切断変異型を指し、それは、例えばジスルフィド結合によって連結されているが、天然タンパク質の膜貫通および細胞質ゾルドメインを欠く、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の細胞外部分を含んでなる。「可溶性Ｔ細胞受容体α鎖配列および可溶性Ｔ細胞受容体β鎖配列」という用語は、膜貫通および細胞質ドメインを欠くＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を指す。可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の配列（アミノ酸または核酸）は、天然ＴＣＲ中の対応する配列と同一であってもよく、または対応する天然ＴＣＲ配列と比較して、変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を含んでなってもよい。「可溶性Ｔ細胞受容体」という用語は、本明細書の用法では、変異型または非変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列を有する、可溶性ＴＣＲを包含する。変異型は、可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖配列の可変領域または定常領域にあってもよく、アミノ酸欠失、挿入物、置換変異、ならびにアミノ酸配列を変化させない核酸配列変化が挙げられるが、これに限定されるものではない。いずれにしても、本発明の可溶性ＴＣＲは、それらの親分子の結合機能を保持する。
【００８５】
定義
本明細書の用法では、別段の記載がない限り、全ての用語は下述のとおり定義される。
【００８６】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲと略記される）という用語は、αポリペプチド鎖（α鎖）およびβポリペプチド鎖（β鎖）を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、ＨＬＡ分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。
【００８７】
「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞毒性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然にペプチドを提示する標的細胞の溶解；ペプチドによって誘導される好ましくはインターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−２であるサイトカインの分泌；ペプチドによって誘導される好ましくはグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。
【００８８】
「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短くあり得て、１０、１１、または１２以上に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本明細書のペプチドのより長い変異型）の場合、それらは１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上に長くあり得る。
【００８９】
さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内で塩ではないので、本明細書によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態がペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。
【００９０】
「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープ群が保持されれば、本明細書にとって重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。
【００９１】
「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本明細書にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。
【００９２】
ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本明細書における「免疫原」である）。本明細書では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本明細書では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。
【００９３】
クラスＩ  Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ  ＭＨＣ受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８〜１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。
【００９４】
特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本明細書のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡ断片と短いオリゴヌクレオチドリンカーとから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。
【００９５】
本明細書の用法では「ペプチドをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。
【００９６】
本明細書の用法では「ＴＣＲをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用なＴ細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むＴＣＲをコードする、１つまたは複数のヌクレオチド配列を指す。
【００９７】
本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。
【００９８】
「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。
【００９９】
コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。
【０１００】
「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。
【０１０１】
コード配列に言及する場合、「断片」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。
【０１０２】
「ＤＮＡセグメント」という用語は、別々の断片の形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、セグメントおよびその構成ヌクレオチド配列が、同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このようなセグメントは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。
【０１０３】
「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３'−ＯＨ末端を提供する。
【０１０４】
「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。
【０１０５】
「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。一態様では、このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、このようなベクターまたは組成物はその天然環境の一部ではないという点において、依然として単離されている。
【０１０６】
本明細書によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図され、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。
【０１０７】
本明細書によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本明細書を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性断片」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与されると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列の断片を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性断片」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。
【０１０８】
本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「セグメント」、および「断片」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列はより大型の配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、セグメントまたは断片に相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。
【０１０９】
本明細書によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１−（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
（ｉｖ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。
【０１１０】
比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。
【０１１１】
本明細書では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。
【０１１２】
当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ａｐｐａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１１３】
所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１〜配列番号２４からなる群から選択される所与のアミノ酸配列を有するペプチドと実質的に同様にＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ−Ａ*０２または−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化Ｔリンパ球のＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。同様に、ＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ*０２またはＨＬＡ−ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）複合体と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、Ｔ細胞を活性化する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。
【０１１４】
これらのＴ細胞は、本明細書の態様で定義されているように、引き続いて細胞と交差反応して、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）などの同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を死滅させ得る学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｏｄｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的にアンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。一態様では、当業者は、本明細書の教示を所与として、既知のアンカー残基を維持することによって、ＴＣＲのアミノ酸配列を修飾する能力を有し、このようなＴＣＲ変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）複合体に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本明細書のＴＣＲ変異型は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）複合体に結合する能力を維持する。本明細書のＴＣＲ変異型を発現するＴ細胞は、引き続いて、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）などの同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を死滅させ得る。
【０１１５】
一態様では、本明細書で開示されるペプチドまたはＴＣＲは、特に明記されない場合、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位での１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、前記ペプチドのアミノ酸鎖の末端に位置する。ＴＣＲでは、好ましくは、これらの置換は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の可変領域に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。
【０１１６】
保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１−小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２−極性の負に帯電した残基とそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３−極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４−大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５−大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
【０１１７】
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するが、サイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、過激な置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「過激な」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。
【０１１８】
一態様では、このような置換は、一般的なＬ−アミノ酸以外の構造を含んでもよい。したがってＤ−アミノ酸が、本明細書の抗原性ペプチドに通常見いだされるＬ−アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用されて、本明細書による免疫原および免疫原性ポリペプチドが生産されてもよい
【０１１９】
２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つを超える位置が、同時に置換されることはない。
【０１２０】
本明細書の用法では、「マウス」または「ヒト」という用語は、抗原認識コンストラクト、またはＴＣＲ、または本明細書に記載のＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定（ｄｅｔｅｒ−ｍｉｎｉｎｇ）領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖、および／またはβ鎖）に言及する場合、それぞれ、マウスまたはヒト非再構成型ＴＣＲ遺伝子座に由来するＴＣＲ（またはその構成要素）を意味する。
【０１２１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
好ましい実施形態では、本明細書は、表２に示されるＴＣＲα鎖およびその変異型と、表２に示されるＴＣＲβ鎖およびその変異型とを含んでなる、ＴＣＲに関する。一態様では、本明細書に記載のＴＣＲは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス−Ｉ／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）／複合体またはクラスＩＩ／ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）／複合体の分子に結合するまたは特異的に結合する能力を有する。
【０１２２】
【表２−１】
2019511222.tif 000003
【表２−２】
2019511222.tif 000004
【表２−３】
2019511222.tif 000005
【表２−４】
2019511222.tif 000006
【０１２３】
α／βＴＣＲのαおよびβ鎖、そしてγ／δＴＣＲのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ２つの「ドメイン」、すなわち可変および定常ドメインを有すると見なされる。可変ドメインは、可変領域（Ｖ）と接合領域（Ｊ）の連結からなる。可変ドメインはまた、リーダー領域（Ｌ）を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域（Ｄ）を含んでもよい。αおよびβ定常ドメインはまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるＣ末端膜貫通（ＴＭ）ドメインを含んでもよい。
【０１２４】
したがって本明細書では、「ＴＣＲα可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲαＶ（ＴＲＡＶ）領域とＴＣＲαＪ（ＴＲＡＪ）領域との連結を指し；「ＴＣＲα定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＡＣ領域、またはＣ末端切断型ＴＲＡＣ配列を指し、任意選択的にα膜貫通ドメイン（ＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬ（配列番号８７））を指す。
【０１２５】
同様に「ＴＣＲβ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲβＶ（ＴＲＢＶ）領域とＴＣＲβＤ／Ｊ（ＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ）領域との連結を指し；ＴＣＲβ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＢＣ領域、またはＣ末端切断型ＴＲＢＣ配列を指し、任意選択的にβ膜貫通ドメイン（ＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号８８））を指す。
【０１２６】
γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変領域」という用語は、本明細書の用法では、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常領域という用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域、またはＣ末端トランケート型ＴＲＧＣ配列を指す。同様に、「ＴＣＲδ可変領域」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し「ＴＣＲδ定常領域」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域、またはｔＣ末端トランケート型ＴＲＤＣ配列を指す。
【０１２７】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるＴＣＲα鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα鎖を含んでなり、またはそれからなる。表２に示されるＴＣＲα鎖は、表２で定義されるような、リーダー（Ｌ）セグメント；Ｖ鎖；３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）；接合領域（Ｊ）、および定常領域を含有する。
【０１２８】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【０１２９】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲα定常ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【０１３０】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表２に示されるα鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、表２に示されるα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１３１】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも９０％の配列同一性を有するＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、またはそれからなり、表２の同一α可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１３２】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるＴＣＲβ鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ鎖を含んでなり、またはそれからなる。表２に示されるＴＣＲβ鎖は、表２で定義されるような、リーダー（Ｌ）セグメント；Ｖ鎖；３つの相補性（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）；接合領域（Ｊ）、および定常領域を含有する。
【０１３３】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【０１３４】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲβ定常ドメインを含んでなり、またはそれからなる。
【０１３５】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２に示されるβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲβ鎖可変ドメインを含んでなり、またはそれからなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、表２に示されるβ鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、表２に示されるβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１３６】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、表２のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、またはそれからなり、表２の同一β可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１３７】
α鎖可変ドメインは、表２に示される対応するＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のαＣＤＲドメインを含んでなってもよい。同様に、β鎖可変ドメインは、表２に示される対応するβＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のβＣＤＲドメインを含んでなってもよい。
【０１３８】
ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、融合して一本鎖ＴＣＲを形成してもよい。代案としては、ＴＣＲα鎖およびβ鎖は、ヘテロ二量体に組み立てられ得る、別個のタンパク質として発現されてもよい。
【０１３９】
一実施形態では、表２の任意のＴＣＲα鎖は、表２の任意のＴＣＲβ鎖と対になって、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合するＴＣＲを生成する。
【０１４０】
ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、それぞれ配列番号３９および４７に対応する、ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７のα鎖および／またはβ鎖を含んでなり、またはそれからなる。
【０１４１】
ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７のＴＣＲα可変ドメインは、配列番号３９のアミノ酸２２〜１３３を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７のＴＣＲα定常ドメインは、配列番号３９のアミノ酸１３４〜２７５を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７のＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号４７のアミノ酸２０〜１３５を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲβ定常ドメインは、配列番号４７のアミノ酸１３６〜３１５を含んでなり、または代案としてはそれからなる。
【０１４２】
特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号３９のＴＣＲα鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα鎖を含んでなる。
【０１４３】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号３９のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。
【０１４４】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号３９のＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲα定常ドメインを含んでなる。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号３９のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号３９のα鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号３９のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１４６】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号３９のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、配列番号３９のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１４７】
別の特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号４７のＴＣＲβ鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ鎖を含んでなる。
【０１４８】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号４７のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。
【０１４９】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号４７のＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲβ定常ドメインを含んでなる。
【０１５０】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号４７のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号４７のβ鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号４７のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１５１】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号４７のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、配列番号４７のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１５２】
α鎖可変ドメインは、配列番号３９の対応するＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のαＣＤＲドメインを含んでなってもよい。同様に、β鎖可変ドメインは、配列番号４７の対応するβＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のβＣＤＲドメインを含んでなってもよい。
【０１５３】
ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、それぞれ配列番号５５および６３に対応する、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５のα鎖および／またはβ鎖を含んでなり、またはそれからなる。
【０１５４】
ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＴＣＲα可変ドメインは、配列番号５５のアミノ酸２２〜１３１を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＴＣＲα定常ドメインは、配列番号５５のアミノ酸１３２〜２７２を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５のＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号６３のアミノ酸２０〜１３１を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲβ定常ドメインは、配列番号６３のアミノ酸１３２〜３１０を含んでなり、または代案としてはそれからなる。
【０１５５】
特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号５５のＴＣＲα鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα鎖を含んでなる。
【０１５６】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号５５のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。
【０１５７】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号５５のＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲα定常ドメインを含んでなる。
【０１５８】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号５５のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号５５のα鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号５５のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１５９】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号５５のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、配列番号５５のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１６０】
別の特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号６３のＴＣＲβ鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％または９５％同一のＴＣＲβ鎖を含んでなる。
【０１６１】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号６３のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。
【０１６２】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号６３のＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲβ定常ドメインを含んでなる。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号６３のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号６３のβ鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号６３のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１６４】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号６３のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、配列番号６３のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１６５】
α鎖可変ドメインは、配列番号５５の対応するＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のαＣＤＲドメインを含んでなってもよい。同様に、β鎖可変ドメインは、配列番号６３の対応するβＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のβＣＤＲドメインを含んでなってもよい。
【０１６６】
ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、それぞれ配列番号７１および７９に対応する、ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２のα鎖および／またはβ鎖を含んでなり、またはそれからなる。
【０１６７】
ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２のＴＣＲα可変ドメインは、配列番号７１のアミノ酸２１〜１３６を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２のＴＣＲα定常ドメインは、配列番号７１のアミノ酸１３７〜２７７を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲ  Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２のＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号７９のアミノ酸２０〜１３４を含んでなり、または代案としてはそれからなり；ＴＣＲβ定常ドメインは、配列番号７９のアミノ酸１３５〜３１３を含んでなり、または代案としてはそれからなる。
【０１６８】
特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７１のＴＣＲα鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα鎖を含んでなる。
【０１６９】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７１のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。
【０１７０】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７１のＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲα定常ドメインを含んでなる。
【０１７１】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７１のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲα可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号７１のα鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号７１のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１７２】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７１のＴＣＲα可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲα可変ドメインを含んでなり、配列番号７１のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１７３】
別の特定の実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７９のＴＣＲβ鎖と少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ鎖を含んでなる。
【０１７４】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７９のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは９０％，９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。
【０１７５】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７９のＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の、好ましくは７５％同一のＴＣＲβ定常ドメインを含んでなる。
【０１７６】
一実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、ＴＣＲβ可変ドメインを含んでなる。好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ３を含んでなる。別の好ましい実施形態では、ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１７７】
特に好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、配列番号７９のＴＣＲβ可変ドメインと少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有するＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり、配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。
【０１７８】
α鎖可変ドメインは、配列番号７１の対応するＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のαＣＤＲドメインを含んでなってもよい。同様に、β鎖可変ドメインは、配列番号７９の対応するβＣＤＲ配列に対して、１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する１つまたは複数のβＣＤＲドメインを含んでなってもよい。
【０１７９】
さらに好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲは、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に特異的に結合し、ＭＡＧ−００３ペプチドは、配列番号２〜配列番号２４に示されるものなどの、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）およびその変異型から選択される。一実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ分子からなる群から選択される、クラスＩ  ＭＨＣ分子である。一実施形態では、ＨＬＡ分子はＨＬＡ−Ａ*０２である。別の実施形態では、ＨＬＡ分子は、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子である。
【０１８０】
本明細書のＴＣＲは、好ましくは、約１００μＭ以下、約５０μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に結合する。より好ましいのは、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下の結合親和性を有する、高親和性ＴＣＲである。本明細書のＴＣＲの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ；約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ；約２０ｎＭ〜約３０ｎＭ；約３０ｎＭ〜約４０ｎＭ；約４０ｎＭ〜約５０ｎＭ；約５０ｎＭ〜約６０ｎＭ；約６０ｎＭ〜約７０ｎＭ；約７０ｎＭ〜約８０ｎＭ；約８０ｎＭ〜約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ〜約１００ｎＭが挙げられる。
【０１８１】
本明細書の用法では、本明細書のＴＣＲとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、１００μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有するＴＣＲを意味するために使用される。
【０１８２】
本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、それらの定常ドメインの間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいＴＣＲとしては、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを有するものが挙げられるが、ただし、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７は、システイン残基によって置換されており、前記システインは、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。
【０１８３】
上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを有してもよく、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とが、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。
【０１８４】
本明細書のＴＣＲは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。
【０１８５】
一実施形態では、α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／またはβ鎖に少なくとも１つの変異を有する本明細書のＴＣＲは、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する。
【０１８６】
一実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖に少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲα鎖および／または非変異ＴＣＲβ鎖を含んでなるＴＣＲの少なくとも倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増強とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ−Ａ２拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく（Ａｌｅｋｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｋｕｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性であるＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られているプロセスにおいて胸腺内で負に選択され（Ｘｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｒｕｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｓｈａｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）、すなわち、自己抗原に対する低親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のみが残留する。したがって、ＭＡＧ−００３に対する本明細書のＴＣＲまたは変異型の親和性は、以下に記載されるように、当該技術分野で周知の方法によって増強された。
【０１８７】
ＭＡＧ−００３ペプチド
本明細書は、配列番号１〜配列番号２４、または配列番号１〜配列番号２４と８８％相同的であるその変異型、またはＴ細胞を本明細書に記載のペプチドと交差反応させるその変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。一態様では、本明細書のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に、または本明細書に記載のペプチドのより長いバージョンは、クラスＩＩに、結合する能力を有する。一態様では、本明細書に記載のＴＣＲは、本明細書に記載のペプチドに結合できまたはそれに特異的に結合できる。
【０１８８】
ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃがある。ＨＬＡ−Ａ*０１、ＨＬＡ−Ａ*０２、およびＨＬＡ−Ｂ*０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
【０１８９】
表３：ＨＬＡ−Ａ*０２およびＨＬＡ−Ａ*２４の発現頻度Ｆ、および最も高頻度のＨＬＡ−ＤＲ血清型。頻度は、ハーディ・ワインベルグの式Ｆ＝１−（２−Ｇｆ）?を用いて、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）から適応された米国人集団内のハプロタイプ頻度Ｇｆから推定された。連鎖不均衡のために、Ａ*０２またはＡ*２４と特定のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも、豊富でありまたは低頻度であるかもしれない。詳細については、Ｃｈａｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈａｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，２００４）を参照されたい。
【０１９０】
【表３−１】
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【表３−２】
2019511222.tif 000008
【０１９１】
ＭＡＧＥＡ４遺伝子
この遺伝子は、ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、互いに５０?８０％の配列同一性を有するタンパク質をコードする。ＭＡＧＥＡ遺伝子のプロモーターおよび第１のエクソンは、かなりの変動性を示し、この遺伝子ファミリーの存在が、異なる転写制御下で同じ機能を発現できるようにすることが示唆される。ＭＡＧＥＡ遺伝子は、染色体位置Ｘｑ２８でクラスター化する。それらは、先天性角化異常症などのいくつかの遺伝性疾患に関与するとされている。同一タンパク質をコードする少なくとも４つの変異型が、この遺伝子について判明している。（ＲｅｆＳｅｑ，Ｊｕｌ  ２００８によって提供される）。
【０１９２】
ＭＡＧＥＡ４の局在化は、細胞質性として記載されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかし、ＭＡＧＥＡ４染色はまた核内でも検出されており、高分化度がんと低分化型化ガンとの対比では、核と細胞質の間で示差的分布が示された。（Ｓａｒｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１９３】
ＭＡＧＥＡ４は、雄生殖細胞マーカーとして使用される。これは、精原細胞では発現されないが、前精原細胞および成熟胚細胞で発現される（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１９４】
【表４】
2019511222.tif 000009
【０１９５】
標的としてのｐＭＨＣ
第Ｉ相臨床試験では、食道がん患者において、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２に結合したＭＡＧＥＡ４（１４３−１５１）に対して反応性のＴＣＲ操作自己ＣＴＬの養子免疫伝達が調査された。患者には、予備調節治療なしでＴＣＲ形質導入リンパ球が１回投与され、それに続いて２週間および４週間後に、ＭＡＧＥＡ４ペプチドで皮下免疫化された。おそらくは、リンパ枯渇レジメンおよびＩＬ２の投与の欠如のために、客観的な腫瘍退縮は観察されなかった（Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。マウスにおける前臨床試験は、移入されたＴ細胞が、マウスに接種されたＭＡＧＥＡ４発現腫瘍細胞株の増殖を阻害し、さらなるペプチドワクチン接種がこの抗腫瘍活性を増強することを実証した（Ｓｈｉｒａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１９６】
ＥＢＶ陰性ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の治療選択肢として、養子ＣＴＬ移入を用いたＭＡＧＥＡ４の標的化が提案されている。ＥＢＶ由来ペプチドを標的化する注入ＣＴＬは、ＥＢＶ（＋）リンパ腫患者において完全な寛解を誘導すると記載されている。したがって、ＭＡＧＥＡ４をはじめとするリンパ腫によって発現されるその他の抗原を標的化することは、可能な治療選択肢として調査されている（Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１９７】
いくつかの研究は、重複ペプチド貯留でパルス処理された自己由来抗原提示細胞との培養後における、健常ドナーおよびがん患者からのＭＡＧＥＡ４特異的ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の生成を実証している（Ｃｅｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｇｅｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｏｈｋｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１９８】
ＭＡＧ−００３ペプチド、すなわち、ＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）は、ＭＡＧＥＡ４（アミノ酸２８６〜２９４）のＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープである。その内容全体が本明細書に参照により援用される（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。一態様では、ＭＡＧ−００３は、生体外とＨＬＡ−Ａ*０２０１／Ｋｂ遺伝子組換えマウスの双方において、ＨＬＡ−Ａ*０２０１−陽性ＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘発する。別の態様では、誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束様式で標的細胞を溶解し、ＭＡＧ−００３が、ＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性ＣＴＬエピトープであり、治療的抗腫瘍ワクチン接種の標的の役割を果たすことが実証され、配列番号３９のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでなる。その内容全体が参照により本明細書に援用される（Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。
【０１９９】
図１は健常組織およびがんにおける、ＭＡＧ−００３ペプチド提示を示す。結果は、表５に要約される。具体的には、卵巣がん（ＯＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）由来の腫瘍組織において、それぞれ１細胞あたり約４０００コピーおよび２，０００コピーの細胞が推定される。
【０２００】
【表５】
2019511222.tif 000010
【０２０１】
本明細書のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
健常細胞と比較した腫瘍細胞上のＴＡＡの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が健常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟ＴＣＲなどの安全性リスクが高い治療選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で健常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。
【０２０２】
ＲＮＡ起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された。腫瘍組織標本が手術直後にスナップ凍結され、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化された。ＴＲＩ試薬（独国ダルムシュタットのＡｍｂｉｏｎ）を使用して、これらのサンプルから全ＲＮＡが調製され、ＲＮｅａｓｙ（独国ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施された。
【０２０３】
ＲＮＡｓｅｑ実験
腫瘍および健常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、ＣｅＧａＴ（独国チュービンゲン）によって、次世代配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって実施された。配列決定ライブラリーは、ＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｖ４試薬キットを使用して、販売業者（米国カリフォルニア州サンディエゴのＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．）のプロトコルに従って作成される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、５０ｂｐのシングルエンドリードが生成される。処理された読み取りは、ＳＴＡＲソフトウェアを使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされる。発現データは、ｅｎｓｅｍｂｌ配列データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌ７７）の注釈に基づいて、ＲＰＫＭ（１００万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たり読み取り、ソフトウェアＣｕｆｆｌｉｎｋｓによって作成される）として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで（全読み取り、ソフトウェアＢｅｄｔｏｏｌｓによって作成される）提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、ＲＰＫＭ値が得られる。
【０２０４】
図２〜４に示されるように、ＭＡＧ−００３は、高リスクおよび中リスクの健常組織と比較して、がん組織と精巣などの低リスクの健常組織とにおいて、高度に発現される。
【０２０５】
表６〜８は、様々ながんにおけるＭＡＧ−００３発現のＲＮＡＳｅｑデータ（発現スコア）を示す。
【０２０６】
【表６】
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【０２０７】
【表７】
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【０２０８】
【表８】
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【０２０９】
一態様では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較して、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が、実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。
【０２１０】
ＴＣＲとの相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、その他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異型を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。
【０２１１】
【表９】
2019511222.tif 000014
【０２１２】
一態様では、より長いペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は実際のエピトープであるが、プロセシング中に実際のエピトープを曝露するのに必要なタンパク質分解性切断に実質的に影響を及ぼさない残基である可能性もある。
【０２１３】
一態様では、記載のペプチドは、１、２、３、または４つまでのアミノ酸によって伸長され得て、すなわち、１、２、３、または４つのアミノ酸が、８?１１個のアミノ酸の任意の組み合わせのペプチドのどちらかの末端に付加され得る。４：０?０：４の間の側面に位置する残基が好ましい。本明細書による伸長の組み合わせは、表１０にある。
【０２１４】
【表１０】
2019511222.tif 000015
【０２１５】
伸長／延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。
【０２１６】
したがって本明細書のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。
【０２１７】
代案の実施形態では、ペプチドは、４つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大３０アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。一態様では、この伸長は、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをもたらす。ＭＨＣクラスＩＩへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。
【０２１８】
したがって、本明細書は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、８〜１００、好ましくは８〜３０、最も好ましくは８〜１４、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、１４アミノ酸の全長を有し、より長いクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２アミノ酸であり得る。
【０２１９】
一態様では、本明細書によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異型のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。
【０２２０】
好ましくは、本明細書によるペプチドに特異的なＴ細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増加の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＴ細胞によって認識されることもまた好ましい。
【０２２１】
本明細書の用法では、「複合体」という用語は、（例えば、抗原性）決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、複合体はまた、それが付着する実体（例えば、（第２の）抗原結合部分）を例えば、抗原決定基（例えば本出願書に記載のペプチドとＭＨＣの複合体）を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、複合体は、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を通じて、シグナル伝達を活性化できる。複合体としては、抗体およびそれらの断片、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、（可溶性）ＴＣＲ、および同種または自己由来Ｔ細胞などの（改変）細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合する複合体であるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。
【０２２２】
「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を死滅させることができる活性分子を装備した複合体（例えば、ＴＣＲ）が、特異的標的は有しないがその他のペプチド−ＭＨＣ複合体を提示する別の細胞を死滅させることができない程度に、複合体がその他の天然ペプチド−ＭＨＣ−複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド−ＭＨＣ−複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド−ＭＨＣのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトＨＬＡ−ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド−ＭＨＣ提示を有する標的細胞（初代細胞または細胞株）、または天然に存在するペプチド−ＭＨＣレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。
【０２２３】
各複合体は標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合複合体が検出され得ることを提供する。例えば、複合体は、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。
【０２２４】
各複合体は、例えば、ＩＬ−２１、抗−ＣＤ３、および抗−ＣＤ２８などの第２の活性分子にコンジュゲートされ得る。
【０２２５】
ポリペプチド複合体に関するさらなる情報は、例えば、その内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１４／０７１９７８Ａ１号パンフレットの背景セクションに見いだされる。
【０２２６】
「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。
【０２２７】
本明細書の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体中に、少なくとも１つのＴＣＲ、可溶性ＴＣＲ、核酸、および／または本明細書のＴＣＲを発現する宿主細胞もまた含む。
【０２２８】
本明細書の医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤もまた含んでもよい。
【０２２９】
この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様（ａｄｅｎｏｍａｔｅｏｕｓ）またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。
【０２３０】
本明細書のさらなる態様は、本明細書のペプチド、ペプチド変異型、ＴＣＲ、およびＴＣＲ変異型をコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、一本鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本明細書のなおもさらなる態様は、本明細書によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。
【０２３１】
例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡセグメントが連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。
【０２３２】
１つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、米国コネチカット州ニューヘイブンのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．をはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。
【０２３３】
本明細書のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ  ＲＫ，ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限部位を遺伝子操作することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。
【０２３４】
一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、本明細書のＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）を形質導入し、それを患者への輸液前に増殖させる。
【０２３５】
別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ  ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＴＣＲ  ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖が再発現される。
【０２３６】
末梢Ｔ細胞に導入されたＴＣＲ鎖は、ＴＣＲ表面発現に必要であるＣＤ３複合体との結合について、内因性ＴＣＲ鎖と競合してもよい。高レベルのＴＣＲ表面発現は、標的腫瘍抗原を発現する細胞による始動のための適切な感受性を付与するのに必須であることから（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｌａｂｒｅｃｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現レベルを増強するストラテジーは、ＴＣＲ遺伝子治療における重要な考慮事項である。
【０２３７】
発現を増加させるために、本明細書のＴＣＲをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β−アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、伸長因子（ＥＦ）−１ａ（Ｔｓｕｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター（Ｊｏｓｅｐｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）などの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。
【０２３８】
強力なプロモーターに加えて、本明細書のＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。
【０２３９】
本発明のＴＣＲのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。
【０２４０】
高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方を高レベルで転写する必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の生成を確実にする単一転写物から生じるので、ＴＣＲ−α鎖とＴＣＲ−β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０２４１】
本明細書のＴＣＲをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増加されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β遺伝子発現を有意に高めることが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２４２】
さらに、導入ＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は、重大な自己免疫リスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能性結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２４３】
誤対合を減少させるために、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性ＴＣＲと対形成する能力が低下するように、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域を修飾してもよい。これらのストラテジーは、ヒトＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換すること；導入ＴＣＲのＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することによって、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を生成すること（システイン修飾）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖のＣ末端領域内の相互作用残基を交換すること（「ノブ・イン・ホール」）；ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させること（ＣＤ３ζ融合）を含んでもよい。（Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０２４４】
次に、ＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）が適切な宿主において発現され、本明細書のペプチドまたは変異型を含んでなるポリペプチドが生産されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本明細書のペプチドまたは変異型をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本明細書のポリペプチドの発現および生産のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。
【０２４５】
本発明明細書の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。
【０２４６】
一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。
【０２４７】
代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。
【０２４８】
次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。
【０２４９】
細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。
【０２５０】
一実施形態では、宿主細胞は、本細書のＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはＴ細胞前駆体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α／βＴＣＲを発現するように形質転換されたγ／δＴ細胞である。
【０２５１】
構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部を有するＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター、およびネオマイシンなどの耐性マーカーを含んでなる。一例は、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６であり、通常、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。
【０２５２】
強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内で、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。ＣＭＶベクターは、例えば、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのｂ−ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞と共に使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。
【０２５３】
別の実施形態では、本明細書の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトと同様）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ  ＩとＭＨＣ  ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。
【０２５４】
本明細書はまた、本明細書のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、米国メリーランド州ベセスダのＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒトの線維芽細胞株および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ−１細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  ＢａｌｂａｓおよびＡｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書、"Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，"Ｐａｒｔ  Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ９７８−１−５８８２９−２６２−９、および当業者に知られているその他の文献にある。
【０２５５】
本明細書のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに依存する周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、米国郵便番号２０８７７メリーランド州ゲイザースバーグのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，から入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。
【０２５６】
成功裏に形質転換細胞、すなわち本明細書のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。
【０２５７】
例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞が、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子中に負荷されてもよいように、本明細書のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本明細書は、本明細書による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。
【０２５８】
好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２５９】
本明細書のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、ペプチドまたはその変異型を生産する方法を提供する。
【０２６０】
別の実施形態では、本明細書のＴＣＲ、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ、ｉ．ｄ、ｉ．ｐ、ｉ．ｍ、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ、ｉ．ｍ、ｓ．ｃ、ｉ．ｐ、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ〜１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ〜５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２６１】
活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。
【０２６２】
本明細書は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレットおよびその中の引用文献を参照されたい）は、定義された三次元構造に折り畳まれて特異的標的構造を認識することができる、短い一本鎖核酸分子である。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。
【０２６３】
細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。
【０２６４】
ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。
【０２６５】
さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。
【０２６６】
アプタマーは、診断および治療目的で有用である。一態様では、少なくとも１つまたはそれ以上のアプタマーが腫瘍細胞に取り込まれ、したがってｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の腫瘍細胞への標的化送達のための分子ビヒクルとして機能し得る。
【０２６７】
アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本明細書による配列番号２５〜配列番号２６のいずれかに記載の配列とＭＨＣ分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体またはＴＣＲなどに対して、選択され得る。
【０２６８】
一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなＴＣＲを製造する方法を提供し、方法は、ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下でＴＣＲを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。
【０２６９】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ*０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ＭＡＧ−００３モノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２７０】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ*０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２７１】
本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ−Ａ*０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２７２】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する、遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをＭＡＧ−００３で免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２７３】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する、遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをｐ２８６−１Ｙ２Ｌで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２７４】
本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する、遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを培養するステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。
【０２７５】
本明細書は、Ｔ細胞が、本明細書によるＡ  ＴＣＲを発現できる発現ベクターを含んでなる、本明細書による方法にさらに関する。
【０２７６】
本明細書は、本明細書による有効数のＴＣＲ、可溶性ＴＣＲおよび／またはＴ細胞を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞がＭＡＧ−００３を異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。
【０２７７】
本明細書は、記載される任意のＴＣＲ、本明細書による核酸、本明細書による発現ベクター、本明細書による細胞、または本明細書による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本明細書は、薬剤ががんに対して有効である、本明細書による使用にさらに関する。
【０２７８】
本明細書はさらに、本明細書による使用に関し、前記がん細胞は、非小細胞肺がん細胞であり、または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどのその他の固形または血液学的腫瘍細胞である。
【０２７９】
本発明は、がん細胞を本明細書の宿主細胞と接触させるステップを含んでなる、がん細胞を死滅させる方法にさらに関する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書のＴＣＲを発現する。一実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。一実施形態では、好ましい実施形態では、がん細胞は、非小細胞肺がん細胞；または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどのその他の固形たは血液学的腫瘍細胞から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、治療効果のある薬剤にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、治療効果のある薬剤は、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される。
【０２８０】
本発明は、本発明の宿主細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にさらに関する。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書のＴＣＲを発現する。一実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。１つの実施形態では、宿主細胞は、治療される対象にとって自己由来である。別の実施形態では、宿主細胞は、処置される対象に対して同種異系である。好ましい実施形態では、がん細胞は、非小細胞肺がん細胞；または非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、および食道がんなどのその他の固形たは血液学的腫瘍細胞から選択される。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、治療効果のある薬剤にコンジュゲートされる。本明細書の用法では、「治療効果のある薬剤」という用語は、疾患または望ましくない医学的状態を治療または予防するために使用される化合物を意味する。一実施形態では、治療効果のある薬剤を使用して、がんが治療または予防される。特定の実施形態では、治療効果のある薬剤は、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される。
【０２８２】
本明細書のＴＣＲ、核酸、および宿主細胞、そしてその医薬組成物は、当該技術分野で公知であり、治療されるがん型次第で変動してもよい経路によって、それを必要とする対象に投与されてもよい。投与経路としては、例えば、局所投与（腫瘍内など）と、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、門脈内および肝臓内などの非経口投与とが挙げられる。好ましい実施形態では、本明細書のＴＣＲ、核酸または宿主細胞、またはその医薬組成物は、例えば、点滴ポンプおよび／またはカテーテル装置を用いた、固形腫瘍などの治療される部位への局所注入によって、対象に投与される。一実施形態では、本明細書の組成物は、固形腫瘍、固形腫瘍に供給する血管、および／または固形腫瘍を取り囲む領域に注入される。
【０２８３】
好ましい実施形態では、本明細書の組成物は、少なくとも２４時間隔てられた少なくとも２回の投与の投与レジメンを用いて対象に投与される。本明細書の組成物を投与するのに適した投与レジメンとしては、例えば、１日１回、２日に１回、３日に１回などが挙げられる。より好ましい投与レジメンとしては、週１回、週２回、隔週１回、月１回、および月２回が挙げられる。特定の実施形態では、用量漸増レジメンが使用され、一連の増加用量が、数日間、数週間または数ヶ月間に対象に投与される。
【０２８４】
本発明のＴＣＲを発現する宿主細胞の有効量としては、例えば、１用量当たり、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、および少なくとも１０１０個の宿主細胞量が挙げられる。一実施形態では、本明細書の宿主細胞は、１用量当たり約１０４〜約１０１０個の細胞の用量、好ましくは１量当たり１０５〜約１０９個の細胞の用量で投与される。好ましい実施形態では、用量は、少なくとも２回またはそれ以上の投与サイクルにわたって、投与レジメンで投与される。
【０２８５】
本発明はまた、少なくとも１つの化学療法剤および／または放射線療法と組み合わせて、本明細書のＴＣＲ、核酸、または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にも関する。
【０２８６】
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）本明細書のＴＣＲをコードする少なくとも１つのベクターで細胞を形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
【０２８７】
ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）本明細書のＴＣＲをコードするベクターで細胞を形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
【０２８８】
ａ）生物学的サンプルを本明細書のＴＣＲに接触させるステップと；
ｂ）生物学的サンプルへのＴＣＲの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプルにおいてがんを検出する方法もまた提供される。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、がんを検出する方法は、生体外、生体内または原位置で実施される。
【０２９０】
本明細書は、小細胞肺がんの診断および／または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本明細書によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本明細書はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。
【０２９１】
特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を生産する方法を提供することもまた、本明細書のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的化する変異誘発によって増加され得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。別の態様では、それは養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞内で発現される。例えば、その内容全体が参照により援用される、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレット、国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレット、および国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットを参照されたい。
【０２９２】
さらに本明細書のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。
【０２９３】
抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体またはＴＣＲは、腫瘍が位置確認され得るように、免疫シンチグラフィーを使用して、放射性ヌクレオチド（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらの断片は、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。
【０２９４】
診断用の抗体またはＴＣＲは、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の２つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体および／またはＴＣＲは、前記プローブで、直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体および／またはＴＣＲへの付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体またはＴＣＲへの組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。
【０２９５】
本発明は、以下の項目にさらに関する。
【０２９６】
項目１．
α鎖およびβ鎖を含んでなるＴＣＲであって、α鎖が配列番号３９、配列番号５５、および配列番号７１のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるＴＣＲα可変ドメインを含んでなり；β鎖が配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９のいずれかと少なくとも９０％同一であるＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり；ＭＡＧ−００３ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【０２９７】
項目２．
ＴＣＲα定常ドメインが配列番号３９、配列番号５５、および配列番号７１のいずれかのＴＣＲα定常ドメインと少なくとも７０％同一であり、β定常ドメインが配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９のいずれかのＴＣＲβ定常ドメインと少なくとも７０％同一である、ＴＣＲα定常ドメインおよびＴＣＲβ定常ドメインをさらに含んでなる、項目１に記載のＴＣＲ。
【０２９８】
項目３．
α定常ドメインがα膜貫通ドメインＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬ（配列番号９７）を含んでなり、β定常ドメインがβ膜貫通ドメインＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬ（配列番号８８）を含んでなる、項目１または２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０２９９】
項目４．
ＴＣＲα可変ドメインが配列番号３９のアミノ酸配列からなり；ＴＣＲβ可変ドメインが配列番号４７のアミノ酸配列からなる、項目１〜３のいずれかに記載のＴＣＲ。
【０３００】
項目５．
ＴＣＲα可変ドメインが配列番号５５のアミノ酸配列からなり；ＴＣＲβ可変ドメインが配列番号６３のアミノ酸配列からなる、項目１〜３のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０１】
項目６．
ＴＣＲα可変ドメインが配列番号７１のアミノ酸配列からなり；ＴＣＲβ可変ドメインが配列番号７９のアミノ酸配列からなる、項目１〜３のいずれかに記載のＴＣＲ。
【０３０２】
項目７．
ＴＣＲα定常ドメインが配列番号３９のＴＣＲα定常ドメインからなり、ＴＣＲβ定常ドメインが配列番号４７のＴＣＲβ定常ドメインからなる、項目１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０３】
項目８．
ＴＣＲα定常ドメインが配列番号５５のＴＣＲα定常ドメインからなり、ＴＣＲβ定常ドメインが配列番号６３のＴＣＲβ定常ドメインからなる、項目１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０４】
項目９．
ＴＣＲα定常ドメインが配列番号７１のＴＣＲα定常ドメインからなり、ＴＣＲβ定常ドメインが配列番号７９のＴＣＲβ定常ドメインからなる、項目１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０５】
項目１０．
配列番号３９からなるα鎖と、配列番号４７からなるβ鎖とを含んでなる、項目１〜９のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０６】
項目１１．
配列番号５５からなるα鎖と、配列番号６３からなるβ鎖とを含んでなる、項目１〜９のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０７】
項目１２．
配列番号７１からなるα鎖と、配列番号７９からなるβ鎖とを含んでなる、項目１〜９のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０８】
項目１３．
ＴＣＲα鎖が配列番号３９、配列番号５５、および配列番号７１のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される、少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり；および／またはＴＣＲβ鎖が配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される、少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、項目１〜１２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３０９】
項目１４．
ＴＣＲα鎖が、配列番号３９、配列番号５５または配列番号７１の全ての３つＣＤＲを含んでなる、項目１〜１３のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３１０】
項目１５．
ＴＣＲβ鎖が、配列番号４７、配列番号６３または配列番号７９の全ての３つＣＤＲを含んでなる、項目１〜１３のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３１１】
項目１６．
α鎖およびβ鎖が融合して一本鎖ＴＣＲを形成する、項目１〜１５のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３１２】
項目１７．
α鎖および／またはβ鎖が検出可能な標識を含んでなる、項目１〜１６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３１３】
項目１８．
検出可能な標識が、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、項目１７に記載のＴＣＲ。
【０３１４】
項目１９．
αおよび／またはβ鎖が治療効果のある薬剤にコンジュゲートされている、項目１〜１８のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３１５】
項目２０．
治療効果のある薬剤が、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される、項目１９に記載のＴＣＲ。
【０３１６】
項目２１．
γ鎖およびδ鎖を含んでなるＴＣＲであって、γ鎖が配列番号３９、配列番号５５、および配列番号７１のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり；および／またはＴＣＲδ鎖が配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり；ＭＡＧ−００３ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【０３１７】
項目２２．
ＭＡＧ−００３ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合し、ＭＡＧ−００３ペプチドが配列番号１〜２４からなる群から選択され、ＭＨＣ分子がＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ分子である、項目１〜２１のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３１８】
項目２３．
項目１〜２０のいずれか一項に記載のＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖、または項目２１に記載のＴＣＲのγ鎖および／またはδ鎖をコードする核酸。
【０３１９】
項目２４．
少なくとも１つのプロモーター配列に作動可能に連結された、項目２３に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【０３２０】
項目２５．
項目２４に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０３２１】
項目２６．
Ｔ細胞またはＴ細胞前駆細胞である、項目２５に記載の宿主細胞。
【０３２２】
項目２７．
Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体ががん患者から得られる、項目２６に記載の宿主細胞。
【０３２３】
項目２８．
Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が健常ドナーから得られる、項目２６に記載の宿主細胞。
【０３２４】
項目２９．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、および／または項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞と；薬学的に許容可能な担体と；任意選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤とを含んでなる医薬組成物。
【０３２５】
項目３０．
ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下で、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップを含んでなる、ＭＨＣ分子によって提示されると、配列番号１のペプチドに特異的に結合するＴＣＲを生成する方法。
【０３２６】
項目３１．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞および／または項目２９に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法。
【０３２７】
項目３２．
ＴＣＲが宿主細胞の表面で発現される、項目３１に記載の方法。
【０３２８】
項目３３．
宿主細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
【０３２９】
項目３４．
Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が自己由来である、項目３３に記載の方法。
【０３３０】
項目３５．
Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体が同種異系である、項目３３に記載の方法。
【０３３１】
項目３６．
ＴＣＲが治療効果のある薬剤にコンジュゲートされている、項目３１に記載の方法。
【０３３２】
項目３７．
治療効果のある薬剤が、放射性核種、化学療法剤、および毒素からなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
【０３３３】
項目３８．
がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、項目３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【０３３４】
項目３９．
少なくとも１つの化学療法剤を対象に投与することをさらに含んでなる、項目３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【０３３５】
項目４０．
放射線療法を対象に施すステップをさらに含んでなる、項目３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【０３３６】
項目４１．
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするベクターで細胞を形質転換し、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法。
【０３３７】
項目４２．
細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体から選択される、項目４１に記載の方法。
【０３３８】
項目４３．
ａ）細胞を健常ドナーから単離するステップと；
ｂ）項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするベクターで細胞を形質転換し、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法。
【０３３９】
項目４４．
細胞が、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体から選択される、項目４３に記載の方法。
【０３４０】
項目４５．
ａ）生物学的サンプルを項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲに接触させるステップと、
ｂ）生物学的サンプルへのＴＣＲの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプル中のがんを検出する方法。
【０３４１】
項目４６．
ＴＣＲが検出可能な標識を含んでなる、項目４５に記載の方法。
【０３４２】
項目４７．
検出可能な標識が、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
【０３４３】
項目４８．
検出が、生体外、生体内または原位置で実施される、項目４５〜４７のいずれかに記載の方法。
【０３４４】
項目４９．
前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞、脳がん、胃がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、膵臓がん、前立腺がん、白血病、乳がん、メルケル細胞がん、黒色腫、卵巣がん、膀胱がん、子宮がん、胆嚢および胆管がん、食道がん、またはそれらの組み合わせである、項目４５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【０３４５】
項目５０．
Ｔ細胞がγ／δＴ細胞である、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【０３４６】
項目５１．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲを発現する有効数のＴ細胞、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞、および／または項目２９に記載の医薬組成物を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞が異常にＭＡＧ−００３を発現する患者の標的細胞を死滅させる方法。
【０３４７】
項目５２．
可溶性ＴＣＲである、項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３４８】
項目５３．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲであって、α鎖が配列番号３９、配列番号５５、および配列番号７１のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるＴＣＲα可変ドメインを含んでなり；β鎖が配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９のいずれかと少なくとも９５％同一であるＴＣＲβ可変ドメインを含んでなり；ＭＡＧ−００３ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【０３４９】
項目５４．
配列番号３９、配列番号５５または配列番号７１に対してα鎖に少なくとも１つの変異を有し；および／または配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９に対してβ鎖に少なくとも１つの変異を有し；同一ペプチドの非変異ＴＣＲの少なくとも２倍である、ＭＡＧ−００３ペプチド−ＨＬＡ分子複合体に対する結合親和性および／または結合半減期を有する、項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３５０】
項目５５．
配列番号３９、配列番号５５または配列番号７１に対してα鎖に少なくとも１つの変異を有し；および／または配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９に対してβ鎖に少なくとも１つの変異を有し；非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する、項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【０３５１】
項目５６．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞または項目２９に記載の医薬組成物が、少なくとも２４時間隔てられた少なくとも２回の投与で投与される、項目３１〜４４または５１のいずれか一項に記載の方法。
【０３５２】
項目５７．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞または項目２９に記載の医薬組成物が、対象に、数日間、数週間または数ヶ月間にわたって投与される、項目５６に記載の方法。
【０３５３】
項目５８．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、項目２５２８のいずれか一項に記載の宿主細胞または項目２９に記載の医薬組成物が、局所注入によって投与される、項目５６または５７に記載の方法。
【０３５４】
項目５９．
局所注入が、注入ポンプおよび／またはカテーテル装置によって投与される、項目５８に記載のいずれかの方法。
【０３５５】
項目６０．
前記局所注入が、固形腫瘍、固形腫瘍に供給する血管、および／または固形腫瘍を取り囲む領域への注入である、項目５８または５９に記載の方法。
【０３５６】
項目６１．
項目１〜２２のいずれか一項に記載のＴＣＲ、項目２３に記載の核酸、項目２４に記載の発現ベクター、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞または項目２９に記載の医薬組成物が、１用量当たり約１０４〜約１０１０個の細胞の用量で投与される、項目３１〜４４、５１または５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【０３５７】
項目６２．
配列番号３９、配列番号５５、および配列番号７１のα鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）；および／または配列番号４７、配列番号６３、および配列番号７９のβ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群から選択される少なくとも１つのβ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなり；ＭＡＧ−００３ペプチド−ＭＨＣ分子複合体に特異的に結合する、ＴＣＲ。
【実施例】
【０３５８】
アロ反応性設定を使用して自己免疫寛容を回避し、自己由来設定、すなわち、患者に由来するＴ細胞と比較してより高い結合活性を有する、Ｔ細胞もをたらし得る。このような設定の例としては、アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｄｏｖｎｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｗｉｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、およびヒトＭＨＣまたはヒトＴＣＲについて遺伝子組換えであるマウスの免疫化（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）が挙げられる。
【０３５９】
実施例１：アロＨＬＡ反応性ペプチド特異的Ｔ細胞の生体外生成（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４）
告知に基づく同意を得た後、ＨＬＡ−Ａ*０２陽性およびＨＬＡ−Ａ*０２陰性の健常ドナーからのＰＢＭＣを使用した。組換えビオチン化ＨＬＡ−Ａ２クラスＩモノマーと、ＭＡＧ−００３を含有するＡ２蛍光性四量体をＭＢＬＩ（マサチューセッツ州ウーバン）から得た。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した抗ＣＤ２０ＳＡと共に、ＰＢＭＣを室温で１時間培養し、洗浄して、ビオチン化Ａ２／ＭＡＧ−００３モノマーと共に室温で３０分間培養し、洗浄して、２４ウェルプレート内の１０％ヒトＡＢ血清添加ＲＰＭＩに、３×１０６細胞／ウェルで播種した。インターロイキン７（ＩＬ−７；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を１日目に１０ｎｇ／ｍＬで添加し、ＩＬ−２（英国ヘアフィールドのＣｈｉｒｏｎ）を４日目に１０Ｕ／ｍＬで添加した。５週間にわたり、細胞を新鮮なＰＢＭＣで毎週再刺激し、応答性細胞と１：１の比で混合して、２４ウェルプレートに３×１０６／ウェルで播種した。
【０３６０】
高結合活性Ｔ細胞を得るために、およそ１０６のＰＢＭＣをＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧ−００３四量体フィコエリトリン（ＰＥ）（ＭＢＬＩから得た）と共に、３７°Ｃで３０分間培養し、それに続いて抗ＣＤ８イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）／アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と共に４°Ｃで２０分間培養し、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）−Ｃａｌｉｂｕｒ分析がそれに続いた。選別は、ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ（英国オックスフォード市カウリーのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。ウェル当たり、２×１０５の選別された細胞、フィーダーとしての２×１０６照射Ａ２陰性ＰＢＭＣ、２×１０４のＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ／ｍＬ（ノルウェイ国オスロのＤｙｎａｌ）、およびＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）を使用して、選別された四量体陽性細胞を２４ウェルプレート内で増殖させた。次に、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用して、単細胞５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）などの当該技術分野で公知の技術を用いてＴＣＲを同定し単離した。次に、非重複ＴＣＲ  ＤＮＡをアミノ酸／ＤＮＡ配列決定について分析し、当該技術分野で周知の方法を用いて発現ベクターにクローニングした。
【０３６１】
実施例２：ヒト−ＨＣまたはヒトＴＣＲについて遺伝子組換えであるマウスの免疫化
ＭＡＧ−００３を使用して、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補う多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）について遺伝子組換えであるマウスを免疫化する（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。高親和性Ｔ細胞を得るために、遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共に培養し、上記のような細胞選別がそれに続く。次に、当該技術分野で記載された方法を使用して、アミノ酸／ＤＮＡ配列決定および発現ベクターへのクローニングのために、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用してＴＣＲを同定し、単離する。
【０３６２】
一態様では、ＭＡＧ−００３およびその変異型、すなわち、ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ（２つのアミノ酸置換を有する、配列番号１３）およびｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌ（３つのアミノ酸置換を有する、配列番号１４）は、ＨＬＡ−Ａ*０２０１分子に対して強力な結合親和性および安定性を示す。特に、ｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌは、一態様では健常ドナーとＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂ遺伝子組換えマウスの双方のＰＢＭＣに由来する標的がん細胞を溶解する、特異的ＣＴＬを誘導する能力を示した。例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）を参照されたい。
【０３６３】
ＭＨＣＩまたはＩＩ／ｐ２８６−１Ｙ２Ｌまたはｐ２８６−１Ｙ２Ｌ９Ｌ複合体に対する高結合活性を得るために、これらのペプチドは、実施例１および２に記載される方法で使用され得る。次に、当該技術分野で記載された方法を使用して、アミノ酸／ＤＮＡ配列決定および発現ベクターへのクローニングのために、このようにして得られた高結合活性Ｔ細胞を使用してＴＣＲを同定し、単離する。
【０３６４】
実施例３：ＴＣＲのクローニング
ＴＣＲのクローニング法は、例えば、前記方法に関してその内容全体が参照により本  明細書に援用される、米国特許第８，５１９，１００号明細書に記載されるように、当該技術分野で公知である。制限部位ＮｄｅＩをコードするα鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドＡ１（ｇｇａａｔｔｃｃａｔａｔｇａｇｔｃａａｃａａｇｇａｇａａｇａａｇａｔｃｃ配列番号２６）、細菌における発現の効率的な開始のために導入されたメチオニン、および制限部位ＳａｌＩをコードするα鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドＡ２（ｔｔｇｔｃａｇｔｃｇａｃｔｔａｇａｇｔｃｔｃｔｃａｇｃｔｇｇｔａｃａｃｇ配列番号２７）を使用して、α鎖可変領域を増幅した。β鎖の場合、制限部位ＮｄｅＩをコードするβ鎖可変領域配列特異的オリゴヌクレオチドＢ１（ｔｃｔｃｔｃａｔａｔｇｇａｔｇｇｔｇｇａａｔｔａｃｔｃａａｔｃｃｃｃａａ配列番号２８）、細菌における発現の効率的な開始のために導入されたメチオニン、および制限部位ＡｇｅＩをコードするβ鎖定常領域配列特異的オリゴヌクレオチドＢ２（ｔａｇａａａｃｃｇｇｔｇｇｃｃａｇｇｃａｃａｃｃａｇｔｇｔｇｇｃ配列番号２９）を使用して、β鎖可変領域を増幅した。
【０３６５】
ＴＣＲα鎖をコードするＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＳａｌＩで切断し、ｐＧＭＴ７＋Ｃαベクターにライゲートし、それをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断した。ＴＣＲβ鎖をコードするＤＮＡ配列をＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで切断し、別個のｐＧＭＴ７＋Ｃβベクターにライゲートし、それもまたＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで切断した。ライゲートされたプラスミドをコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ／寒天プレート上に播種する。３７℃で一晩インキュベートした後、単一コロニーを選択し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬＢ中で一晩３７℃で振盪しながら増殖させる。クローン化プラスミドをＭｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、挿入断片を自動ＤＮＡ配列決定装置（Ｌａｒｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定する。
【０３６６】
それぞれ腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖をコードする３つのＴＣＲ（Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、Ｒ７Ｐ１Ｄ５、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２、表２を参照されたい）を健常ドナーのＴ細胞から単離し増幅した。健常ドナー由来の細胞は、Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．２００３に記載の方法に従って、生体外刺激した。標的特異的細胞は、引き続くＴＣＲ単離のために、標的特異的多量体を使用して単細胞ソートした。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されるように、標準法によって５’ＲＡＣＥを通じてＴＣＲ配列を単離した。３つのＴＣＲは全て、ＨＬＡ−Ａ２陽性ドナー由来であった。ＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、Ｒ７Ｐ１Ｄ５、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２のαおよびβ可変領域を配列決定した。
【０３６７】
Ｒ２０Ｐ１Ｈ７  ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号３９の残基２２〜１３３に対応するアミノ酸配列を有することが見いだされた。Ｒ２０Ｐ１Ｈ７  ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号４７の残基２０〜１３５に対応するアミノ酸配列を有することが見いだされた。
【０３６８】
Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号５５の残基２２〜１３１に対応するアミノ酸配列を有する。Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号６３の残基２０〜１３１に対応するアミノ酸配列を有する。
【０３６９】
Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２  ＴＣＲα可変ドメインは、配列番号７１の残基２１〜１３６に対応するアミノ酸配列を有する。Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２  ＴＣＲβ可変ドメインは、配列番号７９の残基２０〜１３４に対応するアミノ酸配列を有する。
【０３７０】
ファージディスプレイを用いてＴＣＲ変異型のライブラリーを作成し、高親和性変異体を同定し得た。表２に記載のＴＣＲから選択された参照ＴＣＲに、（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３（３）：３４９−３５４）に記載されるＴＣＲファージディスプレイおよびスクリーニングを適用し得る。
【０３７１】
例えば、配列番号３９、５５、および７１のα鎖配列の全ての３つのＣＤＲ領域；配列番号４７、５５、および７９のβ鎖配列の全ての３つのＣＤＲ領域を変異誘発によって標的化し得て、各ＣＤＲライブラリーは別々にパンニングおよびスリーニングする。
【０３７２】
したがって、参照ＴＣＲの少なくとも２倍の（したがって、天然ＴＣＲの少なくとも２倍であることが暗示される）親和性および／または結合半減期を有するＴＣＲが同定される。
【０３７３】
定常領域に導入されたシステインをはじめとする方法を用いて、ＴＣＲヘテロ二量体を再折りたたみし、人工鎖間ジスルフィド結合を提供する。このようにして、（ａ）変異α鎖と共に参照ＴＣＲβ鎖；（ｂ）変異β鎖と共に参照ＴＣＲα鎖；および（ｃ）変異可変ドメインを含むβ鎖およびα鎖の様々な組み合わせからなるＴＣＲを調製する。
【０３７４】
高親和性の可溶性ジスルフィド結合ＴＣＲと、ＴＣＲ変異型、および天然ペプチドＫＶＬＥＨＶＶＲＶ（配列番号１）ＨＬＡ−Ａ*０２複合体との間の相互作用は、ＢＩＡｃｏｒｅ法を用いて分析し得る。
【０３７５】
高親和性ＴＣＲ変異型はまた、酵母、またはＴ細胞ディスプレイによって、ＣＤＲ変異体のライブラリーから選択され得る（Ｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｃｈｅｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。したがって、候補ＴＣＲ変異型は、ＴＣＲのＣＤＲの変異をデザインして、高結合活性のＴＣＲ変異型を得るための指針を提供する（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｚｏｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０３７６】
実施例４：自己Ｔ細胞の遺伝子操作
Ｔ細胞は、高結合活性ＴＣＲ（いわゆるＴＣＲ療法）、またはＭＨＣＩ／ＭＡＧ−００３複合体またはＭＨＣＩＩ／ＭＡＧ−００３複合体に対する抗原特異性が増強されたタンパク質融合由来キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、遺伝子操作し得る。一態様では、このアプローチは、中枢および末梢寛容に関連するいくつかの制限を克服し、患者における新生Ｔ細胞活性化の必要なしに、腫瘍の標的化においてより効率的なＴ細胞を生じる。
【０３７７】
一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、実施例１〜３に記載されるように同定され単離された腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖をコードする核酸を、γ−レトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化する。組換えウイルスが生成され、次に、抗原特異性および機能性結合活性などの機能について試験される。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）を形質導入し、それを患者への輸液前に増殖させる。
【０３７８】
別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で記載される技術によって、ＴＣＲ  ＲＮＡが合成された。次に生体外で合成されたＴＣＲ  ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよび／またはＴＣＲ−β鎖が再発現された。
【０３７９】
ＴＣＲの特異性および親和性を判定するために、形質転換されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＡＧ−００３が負荷された標的細胞と、または同種であるが無関係なペプチドＲＡＢＧＡＰ１Ｌ−００１（配列番号９１）、ＡＸＩＮ１−００１（配列番号９２）、ＡＮＯ５−００１（配列番号９３）、ＴＰＸ２−００１（配列番号９４）、ＳＹＮＥ３−００１（配列番号９５）、ＭＩＡ３−００１（配列番号９６）、ＨＥＲＣ４−００１（配列番号９７）、ＰＳＭＥ２−００１（配列番号９８）、ＨＥＡＴＲ５Ａ−００１（配列番号９９）またはＣＮＯＴ１−００３（配列番号１００）または対照ペプチドＮＹＥＳＯ１−００１（配列番号１０１）が負荷された標的細胞と同時インキュベートし、ＩＦＮ−γ放出アッセイがそれに続いた。未負荷標的細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞単独が、対照の役割を果たした。ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌は、細胞毒性活性を有するＴ細胞活性化の指標となる。
【０３８０】
【表１１】
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【０３８１】
図５〜７に示されるように、本開示のＴＣＲで形質転換された全ての初代ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＡＧ−００３負荷標的細胞との同時インキュベーション後に、無関係のペプチドが負荷された標的細胞で刺激されたもの、および対照よりも、はるかに高レベルのＩＦＮ−γを放出した。標的ペプチド滴定分析は、約３ｎＭ〜約１０ｎＭの範囲のＥＣ５０を示した（表１１）。これらの結果は、本発明のＴＣＲが、ＭＨＣ／ＭＡＧ−００３複合体との特異的相互作用を通じて、例えばＩＦＮ−γ放出などの細胞毒性Ｔ細胞活性を活性化し得ることを示唆する。
【０３８２】
ＭＨＣ／ＭＡＧ−００３結合活性化細胞毒性Ｔ細胞を検出するための四量体染色技術を用いて、Ｔ細胞活性化をさらに確認した。図８および表１１に示されるように、ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１対照四量体または模擬対照よりも、蛍光標識ＭＨＣ／ＭＡＧ−００３四量体で、より高い百分率のＴＣＲ発現ＣＤ８＋Ｔ細胞が陽性に染色された。対照として、ＭＨＣ／ＮＹＥＳＯ１−００１複合体に特異的に結合することが知られている１Ｇ４  ＴＣＲなどのＴＣＲで形質転換された初代ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＮＹＥＳＯ１−００１を負荷した標的細胞によって容易に活性化された。ＴＣＲ１Ｇ４のα鎖およびβ鎖は、それぞれ配列番号８９および９０で示される。
１Ｇ４α鎖（配列番号８９）：METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
１Ｇ４β鎖（配列番号９０）：MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
ＭＡＧ−００３／ＭＨＣ複合体に対するＴＣＲの結合モチーフを判定するために、ＭＡＧ−００３ペプチドの９個のアミノ酸のそれぞれでポジショナルアラニンスキャニング分析を実施した。アラニン置換ＭＡＧ−００３ペプチドは、表１２に示される。
【０３８３】
【表１２】
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【０３８４】
目的のＴＣＲをコードするＲＮＡで電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＡＧ−００３、ＭＡＧ−００３−Ａ１〜ＭＡＧ−００３−Ａ９、または無関係のＮＹＥＳＯ１−００１ペプチドが負荷された標的細胞と共に同時インキュベートし、上記のようなＩＦＮγ放出アッセイがそれに続いた。
【０３８５】
ポジショナルアラニンスキャニング分析の結果は、図９〜１１に示され、表１３に要約される。
【０３８６】
【表１３】
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【０３８７】
同一モチーフを有するＡ*０２結合ペプチドのゲノムワイドスクリーニングは、それぞれＴＣＲ  Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、Ｒ７Ｐ１Ｄ５、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２に対して、潜在的に交差反応性のペプチドがないことを明らかにした。これらの結果は、本明細書に記載されるＴＣＲが、オフターゲット効果のリスクが低下した、非常に特異的な認識パターンを示すことを示唆する。
【０３８８】
本明細書に記載のＴＣＲを発現するＴ細胞の有効性を判定するために、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２のＲＮＡで電気穿孔された初代ＣＤ８＋Ｔ細胞を、例えばＡ−３７５（ＨＬＡ−Ａ２およびＭＡＧ−００３発現に対して陽性である黒色腫細胞株）、Ｔ９８Ｇ（ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＭＡＧ−００３陰性であるヒト神経膠芽腫）、およびＳＫ−ＢＲ−３（ＨＬＡ−Ａ２陰性およびＭＡＧ−００３陰性であるヒト乳がん細胞株）などの異なるヒトがん細胞株と共に同時インキュベートし、ＩＦＮγ放出アッセイがそれに続いた。
【０３８９】
図１２Ａ〜Ｃに示されるように、ＩＦＮγ放出は、ＨＬＡ−Ａ２陽性およびＭＡＧ−００３陽性のＡ−３７５細胞で観察されたが、エフェクター細胞単独対照と同等のＩＦＮγ放出の基礎レベルを有するＴ９８ＧおよびＳＫ−ＢＲ−３細胞では観察されなかった。さらに、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５で形質転換されたＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、ヒト非小細胞がん細胞株Ｈ１７５５と同時インキュベートするとＩＦＮγ放出が増加したが、対照では増加しなかった（データ未掲載）。これらの結果は、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、およびＲ１０Ｐ２Ｇ１２を発現するＴ細胞が、ＨＬＡ−Ａ２／ＭＡＧ−００３特異的様式でがん細胞を標的化する細胞毒性活性を特異的に誘導し得ることを示す。
【０３９０】
本発明は、がん／腫瘍、好ましくはＭＡＧ−００３を過剰にまたは排他的に提示する、黒色腫および非小細胞肺がんの治療に有用なＴＣＲを提供する。
【０３９１】
実施例５：同種異系Ｔ細胞の遺伝子操作
病原体に対する防御の第一線に関与する非従来的なＴリンパ球エフェクターであるガンマデルタ（γδ）Τ細胞は、受容体、特に、ＴＣＲ−γおよびＴＣＲ−δ鎖を活性化することで、ＭＨＣ非依存的様式で腫瘍細胞と相互作用して、腫瘍細胞を根絶し得る。これらのγδＴ細胞は、活性化に際して、迅速なサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）および強力な細胞毒性応答細胞傷害性応を可能にする前活性化表現型を示す。これらのＴ細胞は多くのがんに対して抗腫瘍活性を有し、γδＴ細胞媒介免疫療法が実行可能であり、客観的な腫瘍応答を誘導し得ることが示唆される。（Ｂｒａｚａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０３９２】
固定化抗原、作動性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、腫瘍由来人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）、または活性化ｍＡｂとａＡＰＣの組み合わせを用いる近年の進歩は、オリゴクローナルまたはポリクローナルＴＣＲレパートリーありまたはなしで、γδＴ細胞を増殖させるのに成功している。例えば、固定化主要組織適合性複合体クラスＩ鎖関連Ａは、ＴＣＲδ１アイソタイプを発現するγδＴ細胞に対する刺激であり、プレート結合活性化抗体は、生体外でＶδ１およびＶδ２細胞を増殖させた。臨床的に十分な量のＴＣＲδ１、ＴＣＲδ２、およびＴＣＲδ１ｎｅｇＴＣＲδ２ｎｅｇは、ａＡＰＣ上での同時培養に続いて生成し、これらのサブセットは、記憶表現型および生体外および生体内での腫瘍に対する反応性の差異を示した。（Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【０３９３】
さらに、γδＴ細胞は、ＴＣＲ−α鎖およびＴＣＲ−β鎖の導入によって証明されるように、遺伝子修飾に適している。（Ｈｉａｓａ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。本明細書の別の態様は、ＭＡＧ−００３に結合するＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−βを発現するγδＴ細胞の生成に関する。これを行うために、γδＴ細胞をＤｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４によって記載される方法によって増殖させ、（実施例３に記載されるような）ＭＡＧ−００３に結合するＴＣＲを発現する組換えウイルスを、増殖させたγδＴ細胞に形質導入することがそれに続いた。次に、ウイルス形質導入γδＴ細胞を患者に輸液する。
【０３９４】
実施例６：ＭＡＧ−００３特異的ＴＣＲの安全性
それぞれ腫瘍特異的ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β鎖をコードする３つのＭＡＧ−００３特異的ＴＣＲ（Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７、表２を参照されたい）を健常ドナーのＴ細胞から単離し増幅した。健常ドナーからの細胞を、以前記載された方法（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｎｏｖ  １５；１７１（１０）：４９７４−８）に従って生体外刺激し、ＨＬＡ−Ａ*０２多量体を用いて標的特異的細胞を単細胞ソートし、次に引き続くＴＣＲ単離のために使用した。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されるように、標準法によって５’ＲＡＣＥを通じてＴＣＲ配列を単離した。ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２、およびＲ２０Ｐ１Ｈ７のαおよびβ可変領域を配列決定し、さらなる機能特性解析のためにクローン化した。ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２  およびＲ２０Ｐ１Ｈ７は、ＨＬＡ−Ａ*０２陽性ドナーに由来する。
【０３９５】
【表１４】
2019511222.tif 000019
【０３９６】
目的のＴＣＲを、ＲＮＡ電気穿孔を通じてヒトＴ細胞内で発現させ、異なるペプチドを負荷したＴ２細胞、ならびに腫瘍細胞株および健常組織由来の初代細胞などの異なる標的細胞との同時培養の後に、Ｔ細胞をＩＦＮ−γ放出について評価した。Ｔ細胞活性化データは、以下に示すように絶対ＩＦＮ−γレベルでまたは正規化様式で示される。
【０３９７】
ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２およびＲ２０Ｐ１Ｈ７を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の有効性は、標的細胞として異なる腫瘍細胞株を用いるＴ細胞活性化試験（ＩＦＮ−γ放出）によって判定した。目的のＴＣＲの安全性プロファイルの特徴づけは、健常組織由来の単離された原発性細胞型およびＡ*０２陽性ドナー由来のＨＬＡ−Ｉ由来の多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）誘導性細胞型との同時培養における、ＴＣＲ発現Ｔ細胞の潜在的活性化を試験することによってアプローチした。（表１３）。細胞型は、例えば脳、心臓、および肝臓などの重要な器官の大部分と、上皮、内皮または平滑筋などの様々な細胞型とをカバーするように選択された。腫瘍細胞株を陽性および陰性対照と並べて分析した。
【０３９８】
ＩＦＮγ放出を正規化する方法：
Ｍｅａｎｎｏｒｍ（ＴＣＲｏｉ；ｃｏ）＝［平均（ＴＣＲｏｉ；ｃｏ）−平均（ＴＣＲｏｉ；エフェクター単独）］−［平均（模擬；ｃｏ）−平均（模擬；エフェクター単独）］
それぞれのＣＶｎｏｒｍを計算した：
ＣＶｎｏｒｍ（ＴＣＲｏｉ；ｃｏ）＝［ＣＶ（ＴＣＲｏｉ；ｃｏ）２＋ＣＶ（ＴＣＲｏｉ；エフェクター単独）２＋ＣＶ（模擬；ｃｏ）２＋ＣＶ（模擬；エフェクター単独）２］＾［１／２］
ＴＣＲｏｉ＝目的のＴＣＲを発現するエフェクター細胞
模擬＝外因性ＴＣＲ発現のないエフェクター細胞
Ｃｏ＝標的細胞と共培養されたエフェクター細胞
エフェクター単独＝共培養されないエフェクター細胞
平均（ｎｏｒｍ）＝平均ＩＦＮγ放出（正規化された）
ＣＶ（ｎｏｒｍ）＝変動係数（正規化された）
結果：
ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２またはＲ２０Ｐ１Ｈ７を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞では、健常組織由来のＨＬＡ−Ａ*０２陽性細胞型との共培養で時に活性化は観察されなかった（図１３を参照されたい）一方で、ＭＡＧ−００３ペプチドの供給源遺伝子としてＨＬＡ−Ａ*０２およびＭＡＧＥＡ４を発現する腫瘍細胞株Ａ−３７５およびＮＣＩ−Ｈ１７５５に対する活性があった。同様の反応性パターンがＮＹＥＳＯ１特異的ＴＣＲ  １Ｇ４を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞で観察され、これはＮＹＥＳＯ１発現ＨＬＡ−Ａ*０２陽性腫瘍細胞株に対して反応性であるが、健常組織細胞の示されたパネルには反応しないことが判明した。
【０３９９】
ＨＬＡ−Ａ*０２およびＭＡＧＥＡ４を発現する細胞株との同時培養時におけるＴ細胞活性化は、ＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２、およびＲ２０Ｐ１Ｈ７による内因性に発現されプロセスされた標的ｐＨＬＡの認識を反映する。
【０４００】
安全性分析は、健常組織初代細胞に対するＴＣＲ  Ｒ７Ｐ１Ｄ５、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２およびＲ２０Ｐ１Ｈ７の予期されない交差反応性または潜在的なアロ反応性の欠如を示唆する。これは、試験された初代細胞型が、ＨＬＡ−Ａ*０２の文脈で数千の正常なＨＬＡリガンドに相当し、正常細胞型毎に変動する追加的な同種異系ＨＬＡ対立遺伝子に相当する可能性が高いため、注目に値する。
【０４０１】
実施例７：本発明のＴＣＲのレンチウイルス発現
Ｔ細胞産物は、小規模なＡＣＴｅｎｇｉｎｅ製造プロセスに続いて、健常ドナーから単離されたバルク全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から出発して生成された。ＡＣＴｅｎｇｉｎｅＴ細胞を製造するための本発明のＲ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクター骨格は、以前の研究および複数の臨床試験に基づいてデザインされた（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；その他）。簡潔に述べると、解凍し休ませたＰＢＭＣをＣＤ３／ＣＤ２８抗体で活性化し、α鎖およびβ鎖の異なる配向を有するＲ７Ｐ１Ｄ５ＴＣＲ導入遺伝子と、プロモーターおよびエンハンサー配列の様々な組み合わせとを保有する種々のレンチウイルスベクターを用いて生成された濃縮ウイルス上清で、形質導入した（コンストラクトはＲ７１−Ｒ７８と表記される）。８つのコンストラクト（Ｒ７４、Ｒ７５）のうち２つは、低い力価および／または低い生産性のために排除された。残りの６つのウイルス上清で形質導入された細胞を増殖させ、フローサイトメトリーによって導入遺伝子発現について評価した。
【０４０２】
配向は以下のとおりであった：α−β：Ｒ７１、Ｒ７２、７５、７６；β−α：Ｒ７３、Ｒ７４、Ｒ７７、７８、ＩＧ４。
【０４０３】
全てのＴ細胞産物は、同等の生存度、リンパ球ならびにＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを示した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、ドナー間で異なった。６つのウイルス上清の全てにおいて、毒性に関して差は認められなかった。Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲレンチウイルスコンストラクトＲ７３は、四量体結合によって表面で検出される、より高いＴＣＲ発現を一貫して誘導した。導入遺伝子発現に基づいて、レンチウイルスコンストラクトは、次の順序に従う：Ｒ７３＞Ｒ７８＞Ｒ７７＞Ｒ７１＞Ｒ７６＞Ｒ７２（図１４）。
【０４０４】
Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲ  Ｒ７３ウイルスの形質導入性を確認するために、２人の新規ドナーを用いた追加的な実験を行った。全ての実験からの形質導入細胞を、サイトカイン放出および死滅アッセイにおける機能評価について試験した。試験された全てのドナーにおいて、４人のドナーの全ＰＢＭＣに由来するＲ７３形質導入Ｔ細胞は、非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原を発現するＡ３７５細胞と共培養すると有意に高いＩＦＮγ産生を示した（図１５Ａ）。ＩＦＮγ応答は、ＭＡＧＥ−Ａ４発現を欠くＭＣＦ−７細胞の存在下における誘導がバックグラウンドレベル未満であったため、厳密に抗原特異的であった。さらに、ＭＡＧ−００３ペプチドの濃度の減少に応答して検出されたＩＦＮγ量を表すＴ２滴定曲線に由来するＥＣ５０値は、双方のドナーにおいて１０．０ｎＭであった（図１５Ｂ）。
【０４０５】
サイトカイン放出に加えて、Ｒ７Ｐ１Ｄ５  ＴＣＲ（Ｒ７３ウイルス）形質導入Ｔ細胞産物を４時間Ｃｒ５１放出死滅アッセイで試験した。内因的にプロセスされたＭＡＧ−００３ペプチドを提示する、ＭＡＧＥ−Ａ４Ａ３７５腫瘍細胞の認識および溶解を評価した。Ｒ７３形質導入Ｔ細胞は、全てのＥ：Ｔ比で、非形質導入細胞よりも増加した殺傷率を示した（図１６Ａ、Ｂ）。ＭＡＧＥ−Ａ４標的で観察された溶解百分率は、ＭＡＧＥＡ−Ａ４陰性標的細胞で観察されたパーセンテージよりも有意に高かったので（図１６Ｃ）、Ｒ７３形質導入細胞で見られた細胞毒性効果は、抗原特異的様式で媒介された。
【０４０６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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