(57)【要約】  突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体、それをコードする配列、それを調製する方法、およびそれを含むウイルス様粒子が提供され、ここで、該タンパク質またはその改変体および該ウイルス様粒子は、少なくとも２種のＨＰＶ型に対する中和抗体の生成を可能にし、したがって、前記少なくとも２種のＨＰＶ型による感染および前記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌および尖圭コンジロームの予防に使用することができる。本発明はさらに、上記少なくとも２種のＨＰＶ型による感染、および上記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌および尖圭コンジローマを予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における上記タンパク質および上記ウイルス様粒子の使用に関する。
2019504110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体であって、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質と比較すると、突然変異したＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、以下の突然変異を有する：
（１）５〜７０アミノ酸、例えば５〜６０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４５または３５〜４０アミノ酸のＮ末端切断；そして
（２）（ａ）第２タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の置換；または
（ｂ）第２タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７６〜３８３位のアミノ酸残基の置換；そして
改変体は、１つまたはいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加または欠失のみによって突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質とは異なるが、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち、少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３、またはＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、（２）（ａ）で定義されるような突然変異を有し、場合によりさらに以下の突然変異を有する：
（３）第３タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７５〜３８３位のアミノ酸残基の置換；または
（４）第３タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の１４４〜１６８位のアミノ酸残基の置換；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質と比較してＮ末端で切断された５、１５、２７、３５、４０、６０または７０アミノ酸を有し；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された３５アミノ酸を有し；
好ましくは、前記第２タイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ３３であり；好ましくは、（２）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（２）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の３５０〜３５７位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記第３タイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ５２であり；好ましくは、（３）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の３８０〜３８８位のアミノ酸残基であり；好ましくは、（４）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、配列番号４、１０、１１および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、上記変異したＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその変異体。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体をコードする単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸および／または請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を含むまたはそれからなるＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項６】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体、または請求項２に記載の単離された核酸、または請求項３に記載のベクター、または請求項４に記載の宿主細胞、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子、及び場合により医薬として許容される担体及び／または賦形剤を含む医薬組成物またはワクチンであって、
好ましくは、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患の予防に有効な量で存在し；
好ましくは、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染および／またはＨＰＶ５２感染）による感染であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記医薬組成物またはワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を調製する方法であって、該方法は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を宿主細胞で発現させ、次に、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を宿主細胞の培養物から回収することを含み、
好ましくは宿主細胞は大腸菌であり；
好ましくは、該方法は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を大腸菌で発現させ、次に、大腸菌の溶解物上清を精製することによって突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を得て；好ましくは、クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を大腸菌の溶解物上清から回収することを含む、上記方法。
【請求項９】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を医薬として許容される担体および／または賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製する方法。
【請求項１０】
予防的有効量の請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子または請求項７に記載の医薬組成物もしくはワクチンを対象に投与することを含む、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防する方法であって、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染および／またはＨＰＶ５２感染）による感染であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質もしくはその改変体、または請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染および／またはＨＰＶ５２感染）による感染であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ウイルス学および免疫学の分野に関する。特に、本発明は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質（またはその改変体）、それをコードする配列、それを調製する方法、およびそれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、タンパク質（またはその改変体）、ウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３、またはＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）に対する中和抗体の生成を誘導することができ、したがって、少なくとも２つのＨＰＶタイプによる感染、及び該感染によって引き起こされる疾患、例えば、子宮頸癌および尖圭コンジロームを予防するために使用され得る。本発明はさらに、前記少なくとも2つのHPVタイプによる感染、および前記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌および尖圭コンジローマを予防するための医薬組成物またはワクチンの製造におけるタンパク質およびウイルス様粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（HPV）は、主に皮膚および粘膜にイボを引き起こす。ＨＰＶタイプは、腫瘍形成との関連性に応じて、高リスクタイプと低リスクタイプに分けられる。その中で、高リスクのＨＰＶタイプによる感染は、女性の子宮頸癌を含む生殖器癌の主要な原因であることが実証されている。低リスクのＨＰＶタイプは、主に尖圭コンジロームを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防および制御する最も効果的な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頸癌を引き起こす高リスクＨＰＶタイプに対するワクチンを投与することである。
【０００３】
ＨＰＶの主要キャプシドタンパク質Ｌ１は、中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己組織化の特徴を有する。ＨＰＶ  ＶＬＰは、主要キャプシドタンパク質Ｌ１の７２個の五量体で構成される対称二十面体構造を有する（Ｄｏｏｒｂａｒ、Ｊ．ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ、１９８７．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６１（９）：２７９３−９）。ＨＰＶ  ＶＬＰは、天然のＨＰＶと構造的に非常に類似しており、天然ウイルスの中和エピトープの大部分を保持し、高力価の中和抗体の生成を誘導することができる（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ、Ｒ．、Ｆ．Ｂｏｏｙら、１９９２  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２４）：１２１８０−４）。
【０００４】
しかしながら、既存の研究は、ＨＰＶ  ＶＬＰが、主に同じＨＰＶタイプに対する中和抗体の産生を誘導し、同じＨＰＶタイプに対して保護免疫を生成し、いくつかの高度に相同なＨＰＶタイプ間で低い交差防御効果しか示さないことを示す（Ｓａｒａ  Ｌ  Ｂｉｓｓｅｔｔ、Ｇｉａｄａ  Ｍａｔｔｉｕｚｚｏ、ｅｔ  ａｌ、２０１４  Ｖａｃｃｉｎｅ．３２：６５４８−６５５５）。したがって、既存のＨＰＶワクチンは、保護範囲が非常に限られている。一般に、１つのＨＰＶタイプのＶＬＰは、同じＨＰＶタイプによる感染を防ぐためにのみ使用できる。この場合、ＨＰＶワクチンの保護範囲を広げる必要がある場合、唯一の方法は、より多くのＨＰＶタイプのＶＬＰをワクチンに加えることである。現在、市販されているＨＰＶワクチン（Ｍｅｒｃｋ社のＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（ＨＰＶ１６、１８、６および１１に対する４価ワクチン）、ＧＳＫ社のＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（ＨＰＶ１６および１８に対する２価ワクチン）、およびＭｅｒｃｋ社のＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（９価ワクチン）は、複数のＨＰＶタイプのＶＬＰを組み合わせて調製されている。しかし、このような解決策は、ＨＰＶワクチンの製造コストを大幅に増加させ、免疫化用量の増加による安全性の問題を引き起こす可能性がある。
【０００５】
したがって、複数のＨＰＶタイプの感染、該感染によって引き起こされる疾患、例えば、子宮頸癌および尖圭コンジロームをより経済的にかつ効果的に予防するために、複数のＨＰＶタイプに対する防御的な中和抗体の生成を誘導することができるＨＰＶウイルス様粒子を開発することが当該技術分野における急務である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の内容
本発明は、少なくとも部分的には、本発明者らの驚くべき発見に基づいている：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ５８のＬ１タンパク質の特定のセグメントを第２のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ３３など）のＬ１タンパク質の対応するセグメントで置換した後、このようにして得られた突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、生物におけるＨＰＶ５８および第２のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ３３）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、ＨＰＶ５８  ＶＬＰおよび第２のＨＰＶ５８タイプのＶＬＰの混合物のものに匹敵し、ＨＰＶ５８に対するその保護効果は、ＨＰＶ５８  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、第２のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ３３など）に対するその保護効果は、第２のＨＰＶタイプ単独のＶＬＰのものに匹敵する。
【０００７】
さらに、上記の置換に基づいて、ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の別の特異的セグメントは、第３のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ５２など）のＬ１タンパク質の対応するセグメントでさらに置換することができ、こうして得られた二重置換を有する突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ５８、第２のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ３３など）および第３のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ５２など）に対する高力価中和抗体の生成を誘導し；その保護効果は、ＨＰＶ５８  ＶＬＰ、第２のＨＰＶタイプのＶＬＰ、および第３のＨＰＶタイプのＶＬＰの混合物のものに匹敵し、ＨＰＶ５８に対するその保護効果は、ＨＰＶ５８  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、第２のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ３３など）に対するその保護効果は、第２のＨＰＶタイプのみのＶＬＰのものに匹敵し、第３のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ５２など）に対するその保護効果は、第３のＨＰＶタイプ単独のＶＬＰのものに匹敵する。
【０００８】
したがって、一態様では、本発明は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を提供し、ここで、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質と比較して、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、以下の突然変異を有する：
（１）５〜７０アミノ酸、例えば５〜６０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４５または３５〜４０アミノ酸のＮ末端切断；及び
（２）（ａ）第２のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の置換；または
（ｂ）第２のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７６〜３８３位のアミノ酸残基の置換；
ならびに、改変体は、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加または欠失のみによる突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質とは異なるが、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３、またはＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する。
【０００９】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、（２）（ａ）で定義されるような突然変異を有し、場合によりさらに以下の突然変異を有する：
（３）第３のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７５〜３８３位のアミノ酸残基の置換；または
（４）第３のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の１４４〜１６８位のアミノ酸残基の置換。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された５、１５、２７、３５、４０、６０または７０個のアミノ酸を有する。
【００１１】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された３５個のアミノ酸を有する。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態では、前記第２のタイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ３３である。いくつかの好ましい実施形態では、（２）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態では、（２）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の３５０〜３５７位のアミノ酸残基である。
【００１３】
いくつかの好ましい実施形態では、前記第３のタイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ５２である。いくつかの好ましい実施形態では、（３）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の３８０〜３８８位のアミノ酸残基である。いくつかの好ましい実施形態では、（４）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基である。
【００１４】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基は、配列番号５９に記載の配列を有する。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の３５０〜３５７位のアミノ酸残基は、配列番号６０に記載の配列を有する。
【００１９】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基は、配列番号６１に記載の配列を有する。
【００２０】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の３８０〜３８８位のアミノ酸残基は、配列番号６２に記載の配列を有する。
【００２１】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、配列番号４、１０、１１および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、上記のような突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体をコードする単離された核酸を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による単離された核酸は、配列番号１８、２４、２５および２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
目的のポリヌクレオチドの挿入に有用なベクターは、当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、クローニングベクターおよび発現ベクターが挙げられる。一実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００２５】
別の態様では、本発明はさらに、単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞としては、限定されないが、原核細胞、例えば、大腸菌、ならびに真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）が含まれる。本発明に係る宿主細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞株であってもよい。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本発明に係る突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を含むかまたはそれからなるＨＰＶウイルス様粒子に関する。
【００２７】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌタンパク質と比較して、５〜７０アミノ酸、例えば、５〜６０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４５、３５〜４０アミノ酸、例えば、５、１５、２７、３５、４０、６０または７０アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の３５０〜３５７位のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７６〜３８３位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌタンパク質と比較して、５〜７０アミノ酸、例えば、５〜６０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４５、３５〜４０アミノ酸、例えば、５、１５、２７、３５、４０、６０または７０アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００２９】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌタンパク質と比較して、５〜７０アミノ酸、例えば、５〜６０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４５、３５〜４０アミノ酸、例えば、５、１５、２７、３５、４０、６０または７０アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の置換、ならびに野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の１４４〜１６８位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００３０】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌタンパク質と比較して、５〜７０アミノ酸、例えば、５〜６０、１５〜６０、２０〜５０、３０〜４５、３５〜４０アミノ酸、例えば、５、１５、２７、３５、４０、６０または７０アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の置換、ならびに野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の３８０〜３８８位のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７５〜３８３位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００３１】
特に好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号４、１０、１１または１４に記載の配列を有する突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３２】
別の態様において、本発明はさらに、突然変異ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、またはＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物に関する。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、本発明に係る突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明はさらに、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子、および場合により医薬として許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物またはワクチンに関する。本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、ＨＰＶ感染、またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患、例えば、子宮頸癌および尖圭コンジロームを予防するために使用することができる。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶタイプによる感染（例えば、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染および／またはＨＰＶ５２感染）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌および尖圭コンジロームからなる群より選択される。
【００３５】
本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、当該技術分野で周知の方法、例えば、限定されないが、経口的にまたは注射によって投与することができる。本発明において、特に好ましい投与経路は注射である。
【００３６】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物またはワクチンは、単位用量の形態で投与される。例えば、本発明を限定するものではないが、各単位用量は、５μｇ〜８０μｇ、好ましくは２０μｇ〜４０μｇのＨＰＶウイルス様粒子を含有する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を宿主細胞で発現させ、次に、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を宿主細胞の培養物から回収することを含む、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を調製する方法に関する。
【００３８】
いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
【００３９】
いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を大腸菌で発現させ、次に、大腸菌の溶解物上清を精製することによって突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体を得る工程を含む。いくつかの好ましい実施形態において、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質またはその改変体は、クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよび／または疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって大腸菌の溶解物上清から回収される。
【００４０】
別の態様では、本発明は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子を医薬として許容される担体および／または賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製する方法に関する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子または医薬組成物もしくはワクチンの予防有効量を対象に投与することを含む、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防する方法に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶタイプによる感染（例えば、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染および／またはＨＰＶ５２感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、限定されないが、子宮頸癌および尖圭コンジロームが含まれる。別の好ましい実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物である。
【００４２】
別の態様では、本発明はさらに、ＨＰＶ感染またはＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物またはワクチンの製造における、本発明の突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質もしくはその改変体またはＨＰＶウイルス様粒子の使用に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶタイプによる感染（例えば、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染および／またはＨＰＶ５２感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、限定されないが、子宮頸癌および尖圭コンジロームが含まれる。
【００４３】
本発明における用語の定義
本発明において、他に特定しない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されているルーチン操作である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義および説明は以下のように提供される。
【００４４】
本発明によれば、「第２のタイプの野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ５８以外の野生型ＨＰＶタイプを指す。本発明において、第２のタイプの野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ３３である。本発明によれば、用語「第３のタイプの野生型ＨＰＶ」は、ＨＰＶ５８および第２のタイプの野生型ＨＰＶ以外の野生型ＨＰＶタイプをいう。本発明において、第３のタイプの野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ５２である。
【００４５】
本発明によれば、表現「対応する位置」は、配列が最適に整列された場合に比較される配列の等価な位置を指す。すなわち、配列は最も高いパーセンテージの同一性を得るために整列される。
【００４６】
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルスタイプ５８（ＨＰＶ５８）における天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の配列は当該技術分野で周知であり、公的データベース（ＮＣＢＩデータベースのアクセション番号Ｐ２６５３５．１、ＡＣＪ１３４８０、ＡＣＸ３２３７６．１およびＡＣＫ３７６６３．１など）に見出すことができる。
【００４７】
本発明において、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは配列番号１に記載の配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のポリペプチドの８０〜８７位のアミノ酸残基をいう。しかしながら、当業者は、野生型ＨＰＶ５８は様々な分離株を含み得て、様々な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異があり得ることを理解する。さらに、当業者は、配列の相違があり得るが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、様々なＨＰＶ５８分離株の中で、非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解する。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質」という用語には、配列番号１に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ５８分離株のＬ１タンパク質（Ｐ２６５３５．１、ＡＣＪ１３４８０、ＡＣＸ３２３７６．１またはＡＣＫ３７６６３．１に記載のＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質など）も含まれる。さらに、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、配列番号１の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ５８分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基」は、配列番号１の８０〜８７位のアミノ酸残基および種々のＨＰＶ５８分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００４８】
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルス３３タイプ（ＨＰＶ３３）における天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の配列は、当該技術分野で周知であり、公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０６４１６．１、ＡＣＶ８４００８．１、ＡＣＶ８４０１１．１、ＡＣＶ８４０１２．１およびＡＣＬ１２３３３．１）に見出すことできる。
【００４９】
本発明において、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは配列番号２に記載の配列を参照して記載される。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基」とは、配列番号２に記載のポリペプチドの５４〜６１位のアミノ酸残基をいう。しかしながら、当業者は、野生型ＨＰＶ３３が、様々な分離株を含み得て、様々な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異があり得ることを理解するさらに、当業者は、配列の相違があり得るが、様々な分離株の中で、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解する。したがって、本発明において、用語「野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質」には、配列番号２に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ３３分離株のＬ１タンパク質（Ｐ０６４１６．１、ＡＣＶ８４００８．１、ＡＣＶ８４０１１．１、ＡＣＶ８４０１２．１またはＡＣＬ１２３３３．１に記載のＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質など）も含まれる。さらに、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、配列番号２の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ３３分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基」には、配列番号２の５４〜６１位のアミノ酸残基および種々のＨＰＶ３３分離株のＬ１タンパク質の対応する断片が含まれる。
【００５０】
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルス５２タイプ（ＨＰＶ５２）における天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の配列は当該技術分野で周知であり、公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＡＣＸ３２３６２．１、Ｑ０５１３８．２またはＡＢＵ５５７９０．１）に見出すことができる。
【００５１】
本発明において、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは配列番号３に示される配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基」とは、配列番号３に示されるポリペプチドの１４６〜１７０位のアミノ酸残基をいう。しかしながら、当業者は、野生型ＨＰＶ５２は様々な単離物を含み得て、種々の分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異があり得ることを理解する。さらに、当業者は、配列の相違があり得るが、様々なＨＰＶ５２分離株の中で、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、または９９％より高い）であり、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解する。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質」という用語には、配列番号３に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ５２分離株のＬ１タンパク質（例えば、ＡＣＸ３２３６２．１、Ｑ０５１３８．２またはＡＢＵ５５７９０．１に記載のＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質など）も含まれる。さらに、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、配列番号３の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ５２分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基」は、配列番号３の１４６〜１７０位のアミノ酸残基および様々なＨＰＶ５２分離株の対応するＬ１タンパク質断片を含む。
【００５２】
本発明によれば、表現「対応する配列断片」または「対応する断片」は、配列が最適に整列された場合に比較される配列の等価な位置に位置する断片を指す。すなわち、配列は、最大の同一性パーセンテージを得るために整列される。
【００５３】
本発明によれば、表現「Ｘアミノ酸のＮ末端切断」または「Ｎ末端で切断されたＸアミノ酸を有する」とは、（タンパク質翻訳を開始するための）開始コドンによってコードされるメチオニン残基による、タンパク質のＮ末端での１〜Ｘ位のアミノ酸残基の置換を指す。例えば、Ｎ末端で切断された３５アミノ酸を有するＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、開始コドンによってコードされるメチオニン残基による、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質のＮ末端での１〜３５位のアミノ酸残基の置換を指す。
【００５４】
本発明によれば、「改変体」という用語は、そのアミノ酸配列が１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９個お）アミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加または欠失を有し、又は本発明に係る突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号４、１０、１１及び１４に記載のタンパク質）と比較して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有し、本発明による突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の機能を保持しているタンパク質を指す。本発明において、「突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の機能」という用語は、少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３、またはＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を指す。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間の類似性の尺度を指す。一般に、配列は最大マッチングを得るために整列された。「同一性」は、当該技術分野で周知の意味を有し、公開されたアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）によって計算することができる。
【００５５】
本発明によれば、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸間の適合度を指す。比較のための２つの配列が、ある部位に塩基またはアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが特定の部位にアデニンを有するか、または２つのポリペプチドのそれぞれが特定の部位にリジンを有する）、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較のために部位の総数×１００に対して２つの配列によって共有される同一の部位数の関数である。例えば、２つの配列の１０部位のうちの６つが一致する場合、これら２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６つの部位のうち３つが一致する）。一般に、２つの配列の比較は、同一性を最大にするように行われる。このようなアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）らの方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することもでき、これは、ＰＡＭ１２０加重残基表を使用し、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムによって決定することができ、これは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用し、ギャップ加重は１６、１４、１２、１０、８、６または４であり、長さ加重が１、２、３、４、５または６である。
【００５６】
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不都合な影響を与えず、または変化させないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当該技術分野で公知の標準的技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば対応するアミノ酸残基に物理的または機能的に類似した残基（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性、例えば、共有結合又は水素結合等を形成する能力など）で置換さえる置換を含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、一般に、保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することをいう。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に援用されるＢｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
【００５７】
本発明によれば、用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）およびベクターからなる発現系を意味し、ここで、大腸菌は、限定されないが、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１、Ｂ８３４（ＤＥ３）、およびＢＬＲ（ＤＥ３）を含む市販の株に由来する。
【００５８】
本発明によれば、「ベクター」という用語は、その中に挿入されたポリヌクレオチドを有することができる核酸担体ツールを指す。ベクターが、そこに挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。
ベクターは、形質転換、形質導入、または宿主細胞へのトランスフェクションによって、宿主細胞において発現された担持遺伝物質を有することができる。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、限定されないが、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げられる。
【００５９】
本発明によれば、「医薬として許容される担体および／または賦形剤」という用語は、対象および活性成分に薬理学的および／または生理学的に適合する担体および／または賦形剤を指し、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ，１９ｔｈ  ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５参照）、例えば、限定されないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、およびイオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調節剤としては、限定されないが、リン酸緩衝液；界面活性剤としては、限定されないが、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、または非イオン界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０が含まれ；アジュバントには、限定されないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）およびフロイントアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）が含まれ；イオン強度増強剤としては、限定されないが、ＮａＣｌが挙げられる。
【００６０】
本発明によれば、「有効量」という用語は、意図された目的を効果的に達成することができる量を指す。例えば、疾患（ＨＰＶ感染など）を予防するのに有効な量は、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、または遅延させるのに有効な量を意味する。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００６１】
本発明によれば、用語「クロマトグラフィー」には、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、およびアフィニティークロマトグラフィーなどが含まれる。
【００６２】
本発明によれば、用語「溶解物上清」は、以下の工程によって生成された溶液を指す：宿主細胞（例えば、大腸菌）を溶解緩衝液中で破壊し、次に、不溶性物質が、破壊された宿主細胞を含む溶解された溶液から除去される。様々な溶解緩衝液が当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液などが挙げられる。さらに、宿主細胞の破壊は、当業者に周知の方法によって達成することができ、例えば、限定されないが、ホモジナイザー破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出、リゾチーム処理が挙げられる。当業者には、不溶性物質を除去する方法も周知であり、これに限定されないが、ろ過および遠心分離が挙げられる。
【００６３】
発明の有益な効果
研究は、ＨＰＶ５８と他のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２など）との間に一定の交差防御があるが、そのような交差防御は非常に低く、一般的に、同ＨＰＶタイプのＶＬＰの保護レベルの１％より低く、さらには１０００分の１、さらには１０００分の１であることを示す。したがって、ＨＰＶ５８ワクチンでワクチン接種された対象は、他のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２など）に感染するリスクがなおも高い。
【００６４】
本発明は、突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質およびそれによって形成されるＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明によるＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ５８および他のＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）に対して有意な交差防御を提供することができる。特に、同じ免疫化用量で、本発明によるＨＰＶウイルス様粒子は、生物中の少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３、またはＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その効果は、複数のＨＰＶタイプのＶＬＰの混合物（例えば、ＨＰＶ５８  ＶＬＰとＨＰＶ３３  ＶＬＰの混合物、またはＨＰＶ５８  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３  ＶＬＰとＨＰＶ５２  ＶＬＰとの混合物）の効果に匹敵する。したがって、本発明によるＨＰＶウイルス様粒子は、同時に少なくとも２種のＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３、またはＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２）による感染、ならびに該感染に関連する疾患を予防するために使用することができ、大幅に有益な技術的効果を有する。これは、ＨＰＶワクチンの保護範囲を拡大し、ＨＰＶワクチンの製造コストを削減するという点で特に重要な利点を有する。
【００６５】
本発明の実施形態は、図面および実施例を参照してさらに詳細に説明される。しかしながら、当業者であれば、以下の図面および実施例は、本発明の範囲を規定するのではなく、単に本発明を例示することを意図していることを理解する。以下の図面および好ましい実施形態の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的および利点は、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、実施例１における精製された変異変異型タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ５８Ｎ３５（Ｎ末端で切断された３５アミノ酸を有するＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質）；レーン２：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１；レーン３：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２；レーン４：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３；レーン５：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４；レーン６：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５；レーン７：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１；レーン８：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１；レーン９：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２；レーン１０：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３；レーン１１：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４。結果は、クロマトグラフィー精製後、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４タンパク質は９５％以上の純度に達したことを示した。
【図２】図２は、広域スペクトル抗体４Ｂ３を用いて測定した場合の、実施例１において調製されたＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４のウエスタンブロット結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ５８Ｎ３５；レーン２：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１；レーン３：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２；レーン４：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３；レーン５：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４；レーン６：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５；レーン７：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１；レーン８：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１；レーン９：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２；レーン１０：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３；レーン１１：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４。結果は、突然変異型タンパク質であるＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４が、広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得ることを示した。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｈは、分子篩クロマトグラフィーによって分析した場合、タンパク質ＨＰＶ５８Ｎ３５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、ＨＰＶ３３Ｎ９（Ｎ末端で切断された９個のアミノ酸を有するＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質）、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１を含む試料の結果を示す。結果は、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３またはＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４を含む試料の最初のタンパク質ピークが約１２分で現れ、これはＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰのそれに匹敵していることを示した。これは、これらの全てのタンパク質がＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。しかし、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２を含む試料の最初のタンパク質ピークは約１６分で現れ、これはＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の５量体の保持時間に匹敵し、タンパク質がＶＬＰにアセンブルできないことを示している。
【図３−２】図３Ｉ〜３Ｌは、分子篩クロマトグラフィーによって分析した場合、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４、およびＨＰＶ５２Ｎ４０（Ｎ末端で切断された４０個のアミノ酸を有するＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質）を含む試料の結果を示す。結果は、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３またはＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４を含む試料の最初のタンパク質ピークが約１２分で現れ、これはＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰのそれに匹敵していることを示した。これは、これらの全てのタンパク質がＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。しかし、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２を含む試料の最初のタンパク質ピークは約１６分で現れ、これはＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の５量体の保持時間に匹敵し、タンパク質がＶＬＰにアセンブルできないことを示している。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｆは、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図４Ａ、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ；図４Ｂ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ；図４Ｃ、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ；図４Ｄ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの沈降係数は、それぞれ１０９Ｓ、１１３Ｓおよび１０９Ｓであり、一方、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの沈降係数は、それぞれ１１８Ｓ、１３３Ｓおよび１３１Ｓであったことを示した。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４が、サイズおよび形態に関して野生型ＶＬＰに類似したウイルス様粒子にアセンブルできることを示した。
【図４−２】図４Ｅ及び４Ｆは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図４Ｅ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ；図４Ｆ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの沈降係数は、それぞれ１０９Ｓ、１１３Ｓおよび１０９Ｓであり、一方、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの沈降係数は、それぞれ１１８Ｓ、１３３Ｓおよび１３１Ｓであったことを示した。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４が、サイズおよび形態に関して野生型ＶＬＰに類似したウイルス様粒子にアセンブルできることを示した。
【図５】図５Ａ〜５Ｌは、様々なＶＬＰサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真（１００，０００倍、バー＝０．１μｍで撮影）を示す。図５Ａ、ＨＰＶ５８Ｎ３５によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｂ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２によって形成された五量体であり、ＶＬＰにさらにアセンブルされなかった；図５Ｄ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４によってアセンブルされた；図５Ｆ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｇ、ＨＰＶ３３Ｎ９によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｈ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１によってアセンブルされたＶＬＰ； 図５Ｉ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４によってアセンブルされたＶＬＰ；図５Ｌ、ＨＰＶ５２Ｎ４０によってアセンブルされたＶＬＰ。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４は、ＨＰＶ５８Ｎ３５、ＨＰＶ３３Ｎ９およびＨＰＶ５２Ｎ４０に類似し、約３０ｎｍの半径を有するＶＬＰにアセンブルすることができた。一方、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２は、約５ｎｍの半径を有する五量体を形成するだけであり、ＶＬＰにアセンブルすることはできなかった。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示す。図６Ａ、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ；図６Ｂ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ；図６Ｃ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰＰ。結果は、これらのタンパク質によって形成された全てのＶＬＰが非常に高い熱安定性を有することを示した。
【図６−２】図６Ｅ及び６Ｆは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３  ＶＬＰ、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示す。図６Ｅ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ。結果は、これらのタンパク質によって形成された全てのＶＬＰが非常に高い熱安定性を有することを示した。
【図７Ａ】図７Ａは、実験群のマウスにおけるＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ５  ＶＬＰの、ならびに対照群のマウスにおけるＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰおよびＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰの免疫保護の評価結果を示す。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ３３およびＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得た；それらのＨＰＶ５８に対する防御効果は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった；ＨＰＶ３３に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８感染およびＨＰＶ３３感染を予防するための有効なワクチンとして使用され得、ＨＰＶ５８  ＶＬＰおよびＨＰＶ３３  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用され得ることを示した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実験群のマウスにおけるＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４の、ならびに対照群のマウスにおけるＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ、および混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰの免疫保護の評価結果を示す。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得ることを示した；ＨＰＶ５８に対するそれらの保護効果は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものおよび混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった；それらのＨＰＶ３３に対する保護効果は、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものおよび混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった；それらのＨＰＶ５２に対する保護効果は、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものおよび混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものおよびＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染およびＨＰＶ５２感染を予防するための有効なワクチンとして使用可能であり、ＨＰＶ５８  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰをマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ａ：アルミニウムアジュバントグループ１（１０μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｂ：アルミニウムアジュバントグループ２（１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｃ：アルミニウムアジュバントグループ３（０．１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｄ：フロイントアジュバントグループ（１μｇの免疫用量で、フロイントアジュバントを使用）。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰは、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それは、マウスにおけるＨＰＶ３３に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、同じ用量のＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３に対する良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【図８−２】図８Ｅは、マウスをＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰまたはＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰでワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ｅ：アルミニウムアジュバントグループ１（１０μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰは、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のもの、またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ３３に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものよりわずかに弱く、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【図８−３】図８Ｆ及びＧは、マウスをＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰまたはＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰでワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ｆ：アルミニウムアジュバントグループ２（１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｇ：アルミニウムアジュバントグループ３（０．１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰは、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のもの、またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ３３に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものよりわずかに弱く、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【図９】図９は、カニクイザルをＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰでワクチン接種した後のカニクイザル血清中の中和抗体の評価結果を示す。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、カニクイザルにおけるＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、その保護効果が、同用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物に匹敵していることを示した。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差免疫原性を有し、霊長類におけるＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差防御を誘導し得ることを示した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、それぞれ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真および再構成された三次元構造を示す。図１０Ａは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真を示す。図１０Ｂは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰの再構築された三次元構造を示す。図１０Ｃは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真で示す。図１０Ｄは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの再構築された三次元構造を示す。再構成された三次元構造は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの両方が、７２個のキャプソマー（形態学的サブユニット、五量体）からなるＴ＝７二十面体構造（ｈ＝１、ｋ＝２）を有することを示した。準同値原理に一致する従来の二十面体ウイルスキャプシドとは異なり、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの構造における構成的サブユニットはすべて、六量体を含まない五量体であった。さらに、前記２つのＶＬＰは、約６０ｎｍの外径を有していた。これらは、以前報告された天然のＨＰＶウイルス粒子および真核生物発現系によって調製されたＨＰＶ  ＶＬＰ（例えば、ポックスウイルス発現系）の三次元構造と同様であった（Ｂａｋｅｒ  ＴＳ，Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＷＷ，Ｏｌｓｏｎ  ＮＨ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．（１９９１），６０（６）：１４４５−１４５６．Ｈａｇｅｎｓｅｅ  ＭＥ，Ｏｌｓｏｎ  ＮＨ，Ｂａｋｅｒ  ＴＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９４），６８（７）：４５０３−４５０５．Ｂｕｃｋ  ＣＢ，Ｃｈｅｎｇ  Ｎ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＤ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（２００８），８２（１１）：５１９０−７）。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
配列情報
本発明に関与する配列のいくつかを以下の表１に提供する。
【００６８】
【表１】
2019504110.tif 000003
【００６９】
配列１（配列番号１）：
MVLILCCTLAILFCVADVNVFHIFLQMSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７０】
配列２（配列番号２）：
MSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGHPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETGNKYPGQPGADNRECLSMDYKQTQLCLLGCKPPTGEHWGKGVACTNAAPANDCPPLELINTIIEDGDMVDTGFGCMDFKTLQANKSDVPIDICGSTCKYPDYLKMTSEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGTLGEAVPDDLYIKGSGTTASIQSSAFFPTPSGSMVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQVFVTVVDTTRSTNMTLCTQVTSDSTYKNENFKEYIRHVEEYDLQFVFQLCKVTLTAEVMTYIHAMNPDILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTVPPKEKEDPLGKYTFWEVDLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKLKRAAPTSTRTSSAKRKKVKK
【００７１】
配列３（配列番号３）：
MVQILFYILVIFYYVAGVNVFHIFLQMSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLTVGHPYFSIKNTSSGNGKKVLVPKVSGLQYRVFRIKLPDPNKFGFPDTSFYNPETQRLVWACTGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETSNKYAGKPGIDNRECLSMDYKQTQLCILGCKPPIGEHWGKGTPCNNNSGNPGDCPPLQLINSVIQDGDMVDTGFGCMDFNTLQASKSDVPIDICSSVCKYPDYLQMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGTLGDPVPGDLYIQGSNSGNTATVQSSAFFPTPSGSMVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCAEVKKESTYKNENFKEYLRHGEEFDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHKMDATILEDWQFGLTPPPSASLEDTYRFVTSTAITCQKNTPPKGKEDPLKDYMFWEVDLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLQARPKLKRPASSAPRTSTKKKKVKR
【００７２】
配列４（配列番号４）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７３】
配列５（配列番号５）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７４】
配列６（配列番号６）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETGNKYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７５】
配列７（配列番号７）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETGNKYPGQPGADNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７６】
配列８（配列番号８）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACTNAAPANDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７７】
配列９（配列番号９）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGTTASIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７８】
配列１０（配列番号１０）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTSDSTYKNENFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００７９】
配列１１（配列番号１１）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGISGHPLLNKFDDTETSNKYAGKPGIDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００８０】
配列１２（配列番号１２）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGTPCNNNSGNPGDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００８１】
配列１３（配列番号１３）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGTLGDPVPGDLYIQGSNSGNTATVQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００８２】
配列１４（配列番号１４）：
MTVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKNPTNAKKLLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVKKESTYKNENFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
【００８３】
配列１５（配列番号１５）：
ATGGTGCTGATCCTGTGCTGCACCCTGGCCATCCTGTTCTGCGTGGCCGACGTGAACGTGTTCCACATCTTCCTGCAGATGAGCGTGTGGAGGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTGA
【００８４】
配列１６（配列番号１６）：
ATGAGCGTGTGGAGGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTTCAGCATCAAGAACCCCACCAACGCCAAGAAGCTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCGGCAACAAGTACCCCGGCCAGCCCGGCGCCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGCTGGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCACCAACGCCGCCCCCGCCAACGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCAAGACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCGGCAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGACCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCACCCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCACCACCGCCAGCATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGGTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCCAGGTGACCAGCGACAGCACCTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAGTACATCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGGTGACCCTGACCGCCGAGGTGATGACCTACATCCACGCCATGAACCCCGACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGTGCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGGGCAAGTACACCTTCTGGGAGGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAAGCTGAAGAGGGCCGCCCCCACCAGCACCAGGACCAGCAGCGCCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTGA
【００８５】
配列１７（配列番号１７）：
ATGGTGCAGATCCTGTTCTACATCCTGGTGATCTTCTACTACGTGGCCGGCGTGAACGTGTTCCACATCTTCCTGCAGATGAGCGTGTGGAGGCCCAGCGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAGCATCAAGAACACCAGCAGCGGCAACGGCAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGATCAAGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCACCGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAAGTACGCCGGCAAGCCCGGCATCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCAAGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCACCCCCTGCAACAACAACAGCGGCAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGCAGCTGATCAACAGCGTGATCCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCAACACCCTGCAGGCCAGCAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAGCAGCGTGTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCACCCTGGGCGACCCCGTGCCCGGCGACCTGTACATCCAGGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCGTGCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATGGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCGCCGAGGTGAAGAAGGAGAGCACCTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTTCGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAAGATGGACGCCACCATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGGAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCACCGCCATCACCTGCCAGAAGAACACCCCCCCCAAGGGCAAGGAGGACCCCCTGAAGGACTACATGTTCTGGGAGGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGCAGGCCAGGCCCAAGCTGAAGAGGCCCGCCAGCAGCGCCCCCAGGACCAGCACCAAGAAGAAGAAGGTGAAGAGGTGA
【００８６】
配列１８（配列番号１８）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００８７】
配列１９（配列番号１９）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTCGGAATAAGCGGCCACCCCTTACTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTGA
【００８８】
配列２０（配列番号２０）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTCGGAATAAGCGGCCACCCCTTACTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCGGAAACAAGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTGA
【００８９】
配列２１（配列番号２１）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTCGGAATAAGCGGCCACCCCTTACTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCGGAAACAAGTACCCCGGACAGCCCGGCGCTGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９０】
配列２２（配列番号２２）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGTAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGAGTAGCATGTACAAACGCTGCACCTGCCAACGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９１】
配列２３（配列番号２３）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCACAACAGCAAGTATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGTTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９２】
配列２４（配列番号２４）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAGCGACAGCACGTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９３】
配列２５（配列番号２５）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAAGTACGCCGGCAAGCCCGGCATCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９４】
配列２６（配列番号２６）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCACCCCCTGCAACAACAACAGCGGCAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９５】
配列２７（配列番号２７）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCACCCTGGGCGACCCCGTGCCCGGCGACCTGTACATCCAGGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCGTGCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９６】
配列２８（配列番号２８）：
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGAAGAAGGAGAGCACCTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
【００９７】
配列５９（配列番号５９）：
NPTNAKKL
【００９８】
配列６０（配列番号６０）：
SDSTYKNE
【００９９】
配列６１（配列番号６１）：
ISGHPLLNKFDDTETSNKYAGKPGI
【０１００】
配列６２（配列番号６２）：
KKESTYKNE
【０１０１】
本発明を実施するための具体的な形態
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明されるが、これらの実施例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明する目的でのみ使用される。
【０１０２】
他に示されない限り、本発明において使用される分子生物学的実験方法および免疫学的アッセイは、実質的にＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５に記載される方法に従って実施される。制限酵素は、製造業者によって推奨される条件下で使用される。当業者であれば、これらの実施例は本発明を説明するために用いられているが、本発明の保護範囲を限定するものではないことを理解する。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の発現及び精製
発現ベクターの構築
ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質由来のセグメントを含む突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターは、マルチサイト突然変異誘発のためのＰＣＲによって構築した。使用した初期鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５８Ｌ１Ｎ３５Ｃ（Ｎ末端で切断された３５アミノ酸を有するＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質をコードする；表２に５８Ｌ１Ｎ３５と略記する）であった。各ＰＣＲの鋳型およびプライマーを表２に示し、ＰＣＲの増幅条件を以下のようにした：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７．５分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間伸長する。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に列挙した。
【０１０４】
増幅産物（５０μＬ）に２μＬの制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩを添加し、得られた混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。消化産物１０μＬを用いて、塩化カルシウム法により調製したコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換された大腸菌は、カナマイシンを含む固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の成分：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、以下同様）（最終濃度２５ｍｇ／ｍＬ、以下同様）に播種され、３７℃で１０〜１２時間静置培養し、単一のコロニーがはっきりと観察できるようにした。単一コロニーを採取し、４ｍＬ液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）を含むチューブに接種し、３７℃で２２０ｒｐｍで１０時間、振とう培養した後、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。
大腸菌からプラスミドを抽出し、Ｔ７プライマーを用いて、プラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４であり、それらのコードされたアミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、５、６、７、８、９及び１０である（それぞれ、対応するタンパク質をＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２−１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２−２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ５と記す）ことを示した。
【０１０５】
突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による置換によって、ＨＰＶ５８Ｎ３５と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の１４４〜１６８位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の１１８〜１４２位のアミノ酸残基による置換によって、ＨＰＶ５８Ｎ３５と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の２０３〜２０９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の１７７〜１８３位のアミノ酸残基による置換によって、ＨＰＶ５８Ｎ３５と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３０８〜３１１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の２８２〜２８５位のアミノ酸残基による置換によって、ＨＰＶ５８Ｎ３５と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７６〜３８３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の３５０〜３５７位のアミノ酸残基による置換によって、ＨＰＶ５８Ｎ３５と異なる。
【０１０６】
Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ＤＧ，Ｙｏｕｎｇ  Ｌ，Ｃｈｕａｎｇ  ＲＹ，Ｖｅｎｔｅｒ  ＪＣ，Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＣＡ，Ｓｍｉｔｈ  ＨＯ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３−５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１８）を使用して、二重置換を有する突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。この突然変異型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ３３  Ｌ１由来のセグメントおよびＨＰＶ５２Ｌ１由来のセグメントを含んでいた。要するに、突然変異を含む短い断片および突然変異を含まない長い断片がＰＣＲによって得られ、次に、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ系を用いて２つの断片を連結して環を形成させた。使用した初期鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１（突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１をコードする；表２ではＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１と略記する）およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５２Ｎ４０Ｃ（Ｎ末端で切断され、４０アミノ酸を有するＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質をコードする；表２では５２Ｌ１Ｎ４０と略記される）を含んでいた。各ＰＣＲの鋳型およびプライマーを表２に示し、短い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りである：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間伸長する。長い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りである：９４℃で１０分間の変性；  ２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７．５分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間伸長する。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。増幅産物を電気泳動に供し、次に、ＤＮＡ抽出キットを用いて目的の断片を回収し、その濃度を決定した。増幅により得られた短い断片と長い断片を２：１のモル比（総体積３μＬ）で混合し、次に、３μＬの２×Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢから購入、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、  Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを含有する）を添加し、５０℃で１時間反応させた。
【０１０７】
アセンブルされた生成物（６μＬ）を用いて、塩化カルシウム法により調製したコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換された大腸菌は、カナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に播種され、単一のコロニーがはっきりと観察されるまで、３７℃で１０〜１２時間静置培養された。単一コロニーを採取し、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを含むチューブに接種し、３７℃で２２０ｒｐｍで１０時間、振とう培養した後、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、Ｔ７プライマーを用いて、プラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号２５、２６、２７、および２８であり、それらのコードされたアミノ酸配列は配列番号１１、１２、１３、及び１４であったことを示した（対応するタンパク質はそれぞれ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４と命名された）。
【０１０８】
突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の１４４〜１６８位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の１４６〜１７０位のアミノ酸残基による置換によって異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の２００〜２０９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の２０２〜２１２位のアミノ酸残基による置換によって異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の２９２〜３１２位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の２９５〜３１７位のアミノ酸残基による置換によって異なる。突然変異型タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４は、野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の８０〜８７位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３３  Ｌ１タンパク質の５４〜６１位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の３７５〜３８３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５２  Ｌ１タンパク質の３８０〜３８８位のアミノ酸残基による置換によって異なる。
【０１０９】
【表２】
2019504110.tif 000004
【０１１０】
【表３】
2019504110.tif 000005
【０１１１】
ラージスケールでの突然変異型タンパク質の発現
組換えプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、及びｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４をそれぞれ含む大腸菌を−７０℃の冷蔵庫から取り出し、カナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ液体培地に播種し、２００ｒｐｍおよび３７℃で約８時間インキュベートした。次に、培養物をカナマイシンを含む５００ｍＬのＬＢ培地に移し（１ｍｌの細菌溶液を移した）、さらにインキュベートした。細菌の濃度が約０．６のＯＤ６００に達したとき、培養温度を２５℃に下げ、各培養ボトルに５００μＬのＩＰＴＧを添加した。インキュベーションをさらに８時間行った。インキュベーションが終了した後、細菌を遠心分離によって回収した。Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４タンパク質を発現する細菌をそれぞれ得た。
【０１１２】
突然変異型タンパク質を発現する細菌の破砕
得られた細菌は、１ｇの細菌１ｇ／１０ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の比で再懸濁された。細菌は、超音波装置を用いて３０分間破砕された。破砕された細菌を含む溶解溶液を１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で１５分間遠心分離し、上清（すなわち、破砕された細菌の上清）を得た。
【０１１３】
突然変異型タンパク質のクロマトグラフィー精製
装置：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（すなわち、元のＡｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏ．）によって製造されたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００分取液体クロマトグラフィーシステム；
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．）、ＣＨＴ−ＩＩ（Ｂｉｏ−ＲＡＤから購入）およびＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．）；
緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ；２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ；
試料：上記で得られたＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４を含む破砕された細菌の上清。
【０１１４】
溶出プロトコール：
（１）ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによる破砕した細菌の上清の陽イオン交換精製：試料をカラムに装填し、次に、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で不要なタンパク質を溶出し、続いて、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出した。８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出された画分を回収した。
（２）ＣＨＴＩＩ（ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）による、工程（１）で得られた溶出画分のクロマトグラフィーによる精製：工程（１）で得られた溶出画分は、ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるように希釈されるように希釈され；試料をカラムに装填し、５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した後、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した画分を回収した；
（３）ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）による、工程（２）で得られた溶出画分の精製：試料をカラムに装填し、次に、不要なタンパク質を１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した後、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出された画分を回収した。
【０１１５】
（３）で得られた１５０μＬの溶出画分を３０μＬの６×泳動緩衝液に加えた。得られた溶液を均一に混合し、８０℃の水浴中で１０分間インキュベートした。次に、得られた試料の１０μｌを１２０Ｖで１２０分間、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、電気泳動バンドをクーマシーブリリアントブルーで染色した。電気泳動結果を図１に示した。結果は、前記精製工程後、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４タンパク質が９５％以上の純度を有することを示した。
【０１１６】
同様の方法により、大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５８Ｌ１Ｎ３５Ｃを用いてＨＰＶ５８Ｎ３５タンパク質を調製し、精製した。大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ５２Ｎ４０Ｃを用いてＨＰＶ５２Ｎ４０タンパク質を調製し、精製した。大腸菌およびプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ３３Ｌ１Ｎ９Ｃ（ＨＰＶ３３Ｎ９タンパク質をコードする）を用いてＨＰＶ３３Ｎ９タンパク質を調製し、精製した。
【０１１７】
突然変異型タンパク質のウェスタンブロットアッセイ
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４は、上記の方法で精製し、電気泳動を行った。電気泳動後、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を用いてウェスタンブロットアッセイを行い、その結果を図２に示した。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４が、広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識され得ることを示した。
【０１１８】
実施例２：ＨＰＶウイルス様粒子のアセンブリと粒子の形態学的検出
ＨＰＢウイルス様粒子のアセンブリ
所定体積（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３またはＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４は、（１）２Ｌ保存緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；（２）２Ｌ再生緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；及び（３）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して連続的に透析した。透析は３つの緩衝液のそれぞれで１２時間行った。
【０１１９】
同様の方法により、ＨＰＶ５８Ｎ３５、ＨＰＶ３３Ｎ９およびＨＰＶ５２Ｎ４０タンパク質を、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰにそれぞれアセンブルした。
【０１２０】
モレキュラーシーブクロマトグラフィー分析
透析した試料を、１１２０コンパクトＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるモレキュラーシーブクロマトグラフィー分析に供し、分析カラムは、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ５０００ｘｌ  ７．８ｘ３００ｍｍであった。分析結果を図３Ａ〜３Ｌに示した。結果は、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４を含む試料の最初のタンパク質ピークは約１２分で現れ、これはＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰのそれに匹敵することを示した。これは、これらの全てのタンパク質がＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。しかし、タンパク質Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２を含む試料の最初のタンパク質ピークは約１６分で現れ、これはＨＰＶ５８  Ｌ１タンパク質の５量体の保持時間に匹敵し、タンパク質がＶＬＰにアセンブルできないことを示している。
【０１２１】
沈降速度分析
沈降速度分析のための装置は、光学検査システム及びＡｎ−５０Ｔｉ及びＡｎ−６０Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅであった。Ｈ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰの沈降係数を沈降速度法により分析した。結果を図４Ａ〜４Ｆに示す。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの沈降係数はそれぞれ１０９Ｓ、１１３Ｓおよび１０９Ｓであり、一方、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの沈降係数はそれぞれ１１８Ｓ、１３３Ｓおよび１３１Ｓであることを示した。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４が、サイズおよび形態に関して野生型ＶＬＰに類似したウイルス様粒子にアセンブルすることができることを示した。
【０１２２】
ウイルス様粒子の形態学的試験
ＶＬＰを含む試料１００μＬを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。使用した装置は、ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．によって供給された１００ｋＶ透過電子顕微鏡（倍率１００，０００倍）であった。要するに、１３．５μＬの試料を２％リンタングステン酸（ｐＨ７．０）で陰性に染色し、炭素被覆した銅グリッドに固定し、次いでＴＥＭで観察した。結果を図５Ａ〜５Ｌに示す。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４がウイルス様粒子にアセンブルし得ることを示した。さらに、これらの結果はまた、これらの突然変異型タンパク質によってアセンブルした粒子が約３０ｎｍの半径を有し、サイズが均一であることを示した。これは、これらの突然変異型タンパク質がＨＰＶ３３、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ５２のＬ１タンパク質に類似しており、均一なサイズのＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ２は五量体を形成し得ただけであるが、ウイルス様粒子にアセンブルすることはできなかった。
【０１２３】
実施例３：ウイルス様粒子の熱安定性の評価
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４により形成されたＶＬＰは、ＧＥ  Ｃｏｍｐａｎｙ（すなわち、ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｃｏ．）から購入した示差走査熱量計ＶＰキャピラリーＤＳＣを用いてそれらの熱安定性について評価した。タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質を１０℃〜９０℃の温度範囲内で１．５℃／分の加熱速度で走査した。
検出結果を図６Ａ〜６Ｆに示した。結果は、タンパク質によって形成されたこれらのＶＬＰのすべてが非常に高い熱安定性を有することを示した。
【０１２４】
実施例４：動物におけるウイルス様粒子の免疫防御の評価１
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３、およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４によって形成されたＶＬＰの免疫防御をマウスで評価した。ワクチン接種のための動物は、５〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（正常な等級）（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．ＬＴＤから購入）であった。
【０１２５】
上記で調製したＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰおよびＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰをそれぞれフロイントアジュバントに吸収させた。免疫原に応じてマウスを６群に分け、各群に３匹のマウスを含めた。ワクチン接種手順は以下の通りであった：第０週の最初のワクチン接種、ならびにそれぞれ第２週および第４週のブースターワクチン接種。マウスに皮下注射によりワクチン接種した。使用した免疫原およびその用量を表４に示した。最初のワクチン接種後の８週目に、眼球から静脈血を採取し、血清を分離した。血清中の中和抗体の力価を測定した。検出結果を図７Ａに示した。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ３３およびＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得ることを示した。ＨＰＶ５８に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものと同等であり、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。ＨＰＶ３３に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に高かった。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８感染およびＨＰＶ３３感染を予防するための有効なワクチンとして使用され得、ＨＰＶ５８  ＶＬＰおよびＨＰＶ３３  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用され得ることを示した。
【０１２６】
【表４】
2019504110.tif 000006
【０１２７】
さらに、上記のように調製したＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ、及び混合した混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物）をアルミニウムアジュバント上に吸収させた。免疫原に応じてマウスを８群に分け、各群に４匹のマウスを含めた。ワクチン接種手順は以下の通りであった：第０週の最初のワクチン接種、並びにそれぞれ第２週および第４週のブースターワクチン接種。マウスに腹腔内注射によりワクチン接種した。免疫原およびその用量を表５に示した。最初のワクチン接種後の８週目に、眼球から静脈血を採取し、血清を分離した。血清中の中和抗体の力価を測定した。検出結果を図７Ｂに示した。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得ることを示した。ＨＰＶ５８に対するそれらの保護効果は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独および混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。ＨＰＶ３３に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独および混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。ＨＰＶ５２に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独および混合ＨＰＶ５８／ＨＰＶ３３／ＨＰＶ５２  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のそれよりも有意に高かった。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８感染、ＨＰＶ３３感染およびＨＰＶ５２感染を予防するための有効なワクチンとして使用可能であり、ＨＰＶ５８  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
【０１２８】
【表５】
2019504110.tif 000007
【０１２９】
実施例５：動物におけるウイルス様粒子の免疫保護の評価２
Ｈ５８Ｎ３５−３５Ｔ１  ＶＬＰのＥＤ50
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌性マウス（８匹のマウス）に単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントを接種した。実験群にＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰを用い、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独を対照群に用いた。免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇまたは０．００４μｇであった。免疫容量は１ｍＬであった。ワクチン接種後の５週目に、眼球から静脈血を採取した。血液中のＨＰＶに対する抗体が検出され、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  ＭＨ、５０％終点を推定する簡単な方法、Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ．１９３８；２７：４９３−７）によって、セロコンバージョンを誘導する（すなわち、マウスにおける抗体の生成を誘導する）ためのＥＤ50を各試料について計算した。結果を表６〜８に示す。
【０１３０】
【表６】
2019504110.tif 000008
【０１３１】
【表７】
2019504110.tif 000009
【０１３２】
【表８】
2019504110.tif 000010
【０１３３】
結果は以下を示した：マウスのワクチン接種の５週間後、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する抗体の生成を誘導するためのＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰのＥＤ50は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。マウスにおけるＨＰＶ３３に対する抗体の生成を誘導するＥＤ50は、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３に対する良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【０１３４】
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−５８Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰのＥＤ50
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌性マウス（８匹のマウス）に、単回腹腔内注射によってアルミニウムアジュバントをワクチン接種し、ここで、実験的な群でＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰまたはＨ５８Ｎ３５−５８Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰを（０．９００μｇ、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇまたは０．００４μｇの免疫化用量で）使用した。ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独（０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇまたは０．００４μｇの免疫化用量で）、またはＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物（各ＶＬＰ、免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇまたは０．００４μｇであった）を対照群に用いた。免疫容量は１ｍＬであった。ワクチン接種後の５週目に、眼球から静脈血を採取した。血液中のＨＰＶに対する抗体が検出され、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  ＭＨ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ．１９３８；２７：４９３−７）によって、セロコンバージョンを誘導するためのＥＤ50（すなわち、マウスにおける抗体の生成）を各試料について計算した。結果を表９〜１４に示す。
【０１３５】
【表９】
2019504110.tif 000011
【０１３６】
【表１０】
2019504110.tif 000012
【０１３７】
【表１１】
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【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
【表１３】
2019504110.tif 000015
【０１４０】
【表１４】
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【０１４１】
結果は以下を示した：マウスのワクチン接種の５週間後、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する抗体の生成を誘導するためのＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰのＥＤ50は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のもの、並びにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。マウスにおけるＨＰＶ３３に対する抗体の生成を誘導するためのそれらのＥＤ50は、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のもの、並びにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。マウスにおけるＨＰＶ５２に対する抗体の生成を誘導するためのそれらのＥＤ50は、ＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のもの、並びにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ、およびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものおよびＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。これは、Ｈ３３Ｎ９−５８Ｔ５−５２Ｓ２  ＶＬＰおよびＨ３３Ｎ９−５８Ｔ５−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【０１４２】
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰでワクチン接種したマウスの血清中の和抗体力価の評価
この実験において、ワクチン接種スケジュールを表１５に示した。全てのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌性マウス）を４群に分けた：フロイントアジュバントグループ（フロイントアジュバントを用いて１μｇの免疫化用量で）、アルミニウムアジュバントグループ１（１０μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する）、アルミニウムアジュバントグループ２（１μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する）、アルミニウムアジュバントグループ３（０．１μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する）。各グループをさらに３つのサブグループに分けた。対照サブグループ１および２は、それぞれＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独でワクチン接種され、実験サブグループは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰでワクチン接種された。
【０１４３】
フロイントのアジュバントグループでは、６匹のマウス／サブグループに、１μｇの免疫化用量および２００μｌの注射容量で、皮下注射によりワクチン接種した。アルミニウムアジュバントグループ１〜３において、６匹のマウス／サブグループに、腹腔内注射により、それぞれ１０μｇ、１μｇ、および０．１μｇの免疫化用量および１ｍｌの注射容量でワクチン接種した。すべてのマウスを０週目に最初のワクチン接種に付し、次いで２週目および４週目に追加免疫ワクチン接種を行った。８週目に、眼窩出血により血液サンプルを採取し、血清中のＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３に対する抗体の力価を分析した。その分析結果を図８Ａ〜８Ｄに示した。
結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰが、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得、その保護効果が、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。マウスのＨＰＶ３３に対する高力価の中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は同じ用量のＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものに匹敵し得、同じ用量のＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に優れていた。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３３に対する良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【０１４４】
【表１５】
2019504110.tif 000017
【０１４５】
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰまたはＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰでワクチン接種したマウスの血清中和抗体力価の評価
この実験では、ワクチン接種スケジュールを表１６に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌性マウス）を３つのグループに分けた：アルミニウムアジュバントグループ１（１０μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを用いる）、アルミニウムアジュバントグループ２（１μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを用いる）、およびアルミニウムアジュバントグループ３（０．１μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを用いる）。各グループはさらに６つのサブグループに分けられた。対照サブグループ１、２および３は、それぞれＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独およびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独でワクチン接種された。対照サブグループ４は、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物をワクチン接種された。実験サブグループ１および２は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰ単独およびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ単独でワクチン接種された。
【０１４６】
アルミニウムアジュバントグループ１〜３において、６匹のマウス／サブグループに、それぞれ１０μｇ、１μｇおよび０．１μｇの免疫化用量および１ｍＬの注射容量で、腹腔内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスを０週目に最初のワクチン接種に付し、次いで２週目および４週目に追加免疫ワクチン接種を行った。８週目に、眼窩出血により血液サンプルを採取し、血清中のＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図８Ｅ〜８Ｇに示した。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰは、マウスにおけるＨＰＶ５８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰのものに匹敵し、同じ用量のＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ３３に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のもの、ならびにＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は、同じ用量でＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰ単独のものよりわずかに弱く、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものよりもわずかに弱かったが、同じ用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ単独またはＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰが、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差免疫原性および交差防御を有することを示した。
【０１４７】
【表１６】
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【０１４８】
実施例６：カニクイザルにおけるＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの免疫防御の評価
この実験は、霊長類生物医学研究の雲南研究室で行われた。ワクチン接種スケジュールを表１７に示した。１４匹のカニクリザルを無作為に２つの群に分けた：対照群は、各ＶＬＰについて５μｇの用量で、１ｍＬの注射容量で、ＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰおよびＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物でワクチン接種された。実験群は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ単独、５μｇの用量、および１ｍＬの注射容量でワクチン接種された。使用したアジュバントはアルミニウムアジュバントであり、カニクイザルは、筋肉内注射によりワクチン接種された。全てのカニクイザルを第０週に最初のワクチン接種し、次いで第８週に追加免疫を行った。第１０週にカニクイザルから血液を採取し、血清中のＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図３に示した。結果は以下を示した：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ単独では、カニクイザルにおけるＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対する高力価中和抗体の産生を誘導することができ、その保護効果は、同用量でＨＰＶ５８Ｎ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３３Ｎ９  ＶＬＰ及びＨＰＶ５２Ｎ４０  ＶＬＰの混合物のものに匹敵した。これは、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰがＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差免疫原性を有し、霊長類においてＨＰＶ５８、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ５２に対して良好な交差防御を誘導し得ることを示した。
【０１４９】
【表１７】
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【０１５０】
実施例７：Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ及びＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの３次元構造の再構築
Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの３次元構造は、低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＥＭ）（Ｗｏｌｆ  Ｍ，Ｇａｒｃｅａ  ＲＬ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｆｆ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（２０１０），１０７（１４）：６２９８−３０３）を用いた３次元構造再構成実験によって再構築された。簡単に述べると、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰ（図１０Ａ）の低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真では、コンピュータの重なりおよび構造の再構成のために、均一なサイズおよび５０ｎｍより大きい直径を有する５８１個の粒子を選択し、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰの三次元構造を得た。得られた三次元構造を図１０Ｂ（２２Åの解像度にて）に示した。さらに、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰ（図１０Ｃ）の低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真では、コンピュータの重なりおよび構造の再構築のために、均一なサイズおよび５０ｎｍより大きい直径を有する２２０個の粒子を選択したＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの三次元構造を得た。得られた三次元構造を図１０Ｄに示した（１８Åの分解能である）。結果は、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの両方が、７２個のキャプソマー（形態学的サブユニット、ペンタマー）からなるＴ＝７の二十面体構造（ｈ＝１、ｋ＝２）を有することを示した。準同値原理に一致する従来の二十面体ウイルスキャプシドとは異なり、Ｈ５８Ｎ３５−３３Ｔ１  ＶＬＰおよびＨ５８Ｎ３５−３３Ｔ１−５２Ｓ４  ＶＬＰの構造における構成的サブユニットはすべて、六量体を含まず、五量体であった。さらに、前記２つのＶＬＰは、約６０ｎｍの外径を有していた。これらは、以前報告された天然のＨＰＶウイルス粒子および真核生物発現系によって調製されたＨＰＶ  ＶＬＰ（例えば、ポックスウイルス発現系）の三次元構造と同様であった（Ｂａｋｅｒ  ＴＳ，Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＷＷ，Ｏｌｓｏｎ  ＮＨ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．（１９９１），６０（６）：１４４５−１４５６．Ｈａｇｅｎｓｅｅ  ＭＥ，Ｏｌｓｏｎ  ＮＨ，Ｂａｋｅｒ  ＴＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９４），６８（７）：４５０３−４５０５．Ｂｕｃｋ  ＣＢ，Ｃｈｅｎｇ  Ｎ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＣＤ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（２００８），８２（１１）：５１９０−７）。
【０１５１】
本発明の特定の実施形態について詳細に説明したが、当業者であれば、本明細書に開示された教示によれば、様々な修正および変更が可能であり、そのような修正および変更は、本発明の範囲内であることを理解する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその同等物によって与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図５Ｌ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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