(57)【要約】【課題】研究調査に必要とされる時間を最小限に抑えてできる限り早く治療を始められるように、対象の患者に最大の利益を提供する抗体を同定する解決策を提供する。【解決手段】  （ａ）患者から得られた少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから解離細胞サンプルを提供することと、（ｂ）フロー領域とフロー領域に流体接続された少なくとも１つの分離領域とを有するマイクロ流体デバイスに解離細胞サンプルをロードすることと、（ｃ）少なくとも１つのＢ細胞を解離細胞サンプルからマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域に移動させることにより少なくとも１つの単離されたＢ細胞を得ることと、（ｄ）癌細胞に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つのＢ細胞を同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することとを含む、抗体治療剤の調製方法が提供される。癌細胞は患者自身の癌細胞であり得る。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．患者から得られた少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから解離細胞サンプルを提供することと、
ｂ．少なくとも１つのフロー領域と前記フロー領域に流体接続された少なくとも１つの分離領域とを有するマイクロ流体デバイスに前記解離細胞サンプルをロードすることと、
ｃ．少なくとも１つのＢ細胞を前記解離細胞サンプルから前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域に移動させることにより少なくとも１つの単離されたＢ細胞を得ることと、
ｄ．癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定することと、
を含む、抗体治療剤の調製方法。
【請求項２】
前記分離領域が、Ｂ細胞リンパ球生存能を向上させる少なくとも１つの調整された表面を含み、前記調整された表面が、共有結合された分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離領域が、Ｂ細胞リンパ球生存能を向上させる複数の調整された表面を含み、各調整された表面が、共有結合された分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの調整された表面又は前記複数の各調整された表面が、共有結合された親水性分子の層を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記親水性分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せの群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記分離領域が、Ｂ細胞生存能を向上させるコーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記分離領域が、Ｂ細胞生存能を向上させるコーティング材料でそれぞれコーティングされた複数の表面を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コーティング材料が親水性分子を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記親水性分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せの群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、前記マイクロ流体デバイス内でデッドエンドを形成し、前記フロー領域が流動する第１の流体培地で実質的に充填されると共に前記分離領域が第２の流体培地で実質的に充填される場合、
ａ．前記第２の培地の成分が前記第１の培地中に拡散可能であると共に前記第１の培地の成分が前記第２の培地中に拡散可能であり、
ｂ．前記フロー領域から前記分離領域内への前記第１の培地のフローが実質的にノーフローである、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域がマイクロ流体チャネルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、対応する隔離チャンバの一部であり、且つ各隔離チャンバが、対応する分離領域を前記マイクロ流体チャネルに流体接続する接続領域を更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接続領域が約２０ミクロン〜約６０ミクロンの幅Ｗｃｏｎを有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、前記対応する接続領域の幅Ｗｃｏｎよりも大きい幅Ｗｉｓｏを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、約５０ミクロン〜約２５０ミクロンの幅Ｗｉｓｏを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記隔離チャンバのそれぞれが、約０．５ｎｌ〜約２．５ｎｌの容積を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロ流体デバイスが、ＤＥＰ構成を有する基板を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＢ細胞を前記少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、ＤＥＰ力を用いて前記少なくとも１つのＢ細胞を移動させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＢ細胞が、重力及び／又は局在化流体フローを用いて前記少なくとも１つの分離領域内に移動される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
前記解離細胞サンプルをロードする前に、前記解離細胞サンプル中のＢ細胞を検出可能マーカーで標識することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＢ細胞を前記少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、移動させる少なくとも１つのＢ細胞を前記検出可能マーカーの検出に基づいて選択することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つのＢ細胞を少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、複数の個別Ｂ細胞を対応する複数の個別分離領域内に移動させることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＢ細胞とＢ細胞活性化を刺激する刺激剤とを接触させること
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
前記刺激剤がＣＤ４０アゴニストを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＤ４０アゴニストがＣＤ４０Ｌ、その誘導体、又は抗ＣＤ４０抗体を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記刺激剤が１つ以上のＣＤ４０Ｌ＋支持細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上のＣＤ４０Ｌ＋支持細胞がＴ細胞又はその誘導体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記刺激剤がトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＴＬＲアゴニストがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのＢ細胞が１〜１０日間にわたり前記刺激剤に接触される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのＢ細胞が１〜１０日間にわたり前記刺激剤に実質的に連続的に接触される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
培養培地を前記少なくとも１つのＢ細胞に提供すること
を更に含み、前記培養培地が、Ｂ細胞増殖を促進する１つ以上の成長誘導剤を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上の成長誘導剤が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、及びＢＡＦＦの群から選択される少なくとも１つの作用剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記提供された培養培地が前記刺激剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つのＢ細胞に１〜１０日間にわたり培養培地が提供される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのＢ細胞の各Ｂ細胞が、約８〜２０細胞の細胞数まで前記マイクロ流体デバイスの分離領域で培養される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのＢ細胞と前記刺激剤とを接触させるステップ及び培養培地を前記少なくとも１つのＢ細胞に提供するステップが、実質的に同一の時間にわたり行われる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つのＢ細胞と前記刺激剤とを接触させることが、前記解離細胞サンプルを前記マイクロ流体デバイス内にロードする少なくとも前に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つのＢ細胞と前記刺激剤とを接触させることが、前記少なくとも１つのＢ細胞を前記少なくとも１つの分離領域内に移動させた少なくとも後に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つのＢ細胞と前記刺激剤とを接触させることが、前記癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する前記少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定する少なくともステップ時に行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する前記少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定することが、前記癌細胞関連抗原を前記マイクロ流体デバイス内に導入することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌細胞関連抗原を前記マイクロ流体デバイス内に導入することが、前記癌細胞関連抗原を含む流体培地を前記マイクロ流体デバイス内に導入することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌細胞関連抗原が前記流体培地中に可溶化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌細胞関連抗原を前記マイクロ流体デバイス内に導入することが、前記癌細胞関連抗原を含む微小物体を前記マイクロ流体デバイス内に導入することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記微小物体が、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、及びビーズから選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記微小物体がビーズであり、且つ前記癌細胞関連抗原が前記ビーズにコンジュゲートされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌細胞関連抗原が、前記少なくとも１つの腫瘍サンプル中に存在する癌細胞の細胞表面上に存在する膜関連抗原である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ビーズにコンジュゲートされた前記癌細胞関連抗原が、前記少なくとも１つの腫瘍サンプルから単離された癌細胞から得られる細胞膜調製物に由来する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記微小物体が癌細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記癌細胞が、前記患者の少なくとも１つの腫瘍サンプルの癌細胞により提示されるマーカーを呈する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記癌細胞が前記少なくとも１つの腫瘍サンプルから単離される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌細胞が、異なる患者から得られた１つ以上の腫瘍サンプルから単離される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの固形腫瘍サンプルが得られた前記患者及び前記異なる患者が、同一のタイプの癌と診断されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌細胞が癌細胞系に由来する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌細胞関連抗原を前記マイクロ流体デバイス内に導入することが、
前記癌細胞関連抗原を含む微小物体を含有する流体培地を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に通して流動させることと、
前記培地中の前記微小物体の少なくとも幾つかが、前記少なくとも１つの分離領域に近接する前記フロー領域の一部に位置決めされたとき、前記流体培地のフローを停止することと、
を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記癌細胞関連抗原を前記マイクロ流体デバイス内に導入することが、前記微小物体の少なくとも１つを前記マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域内に移動させることを更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの微小物体を前記マイクロ流体デバイスの前記少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、少なくとも１つの微小物体を複数の分離領域に移動させることを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記少なくとも１つの微小物体を、少なくとも１つのＢ細胞を含有する少なくとも１つの分離領域内に移動させることにより、少なくとも１つの微小物体と少なくとも１つのＢ細胞とを有する少なくとも１つの分離領域を生成する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも１つ微小物体及び前記少なくとも１つのＢ細胞が、異なる分離領域内に移動される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記異なる分離領域が前記マイクロ流体デバイス内で互いに隣接する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する前記少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定するこが、
標識された抗体結合剤を含有する流体培地を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域に通して流動させることと、
前記流体培地中の前記標識された抗体結合剤の少なくとも幾つかが、前記少なくとも１つの分離領域に近接する前記フロー領域の一部に位置決めされたとき、前記流体培地のフローを停止することと、
前記癌細胞関連抗原への前記標識された抗体結合剤の結合を監視することと、
を更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６２】
前記標識された抗体結合剤が、標識された抗ＩｇＧ抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記標識された抗体結合剤が蛍光標識に共有結合されている、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記標識された抗体結合剤が前記癌細胞関連抗原との混合物で提供される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記標識された抗体結合剤が、前記癌細胞関連抗原を提供した後に提供される請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記癌細胞関連抗原への前記標識された抗体結合剤の結合を監視することが、前記マイクロ流体デバイスの撮像を行うことを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
前記撮像が蛍光撮像を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記撮像が複数の像を取り込むことを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記複数の像が一定の時間間隔で取り込まれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記解離細胞サンプルが１つの固形腫瘍サンプルから得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７１】
前記解離細胞サンプルが複数の固形腫瘍サンプルから得られる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７２】
解離細胞サンプルを提供することが、前記少なくとも１つの固形腫瘍サンプルを得ることと、前記少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから単一細胞を解離することとを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７３】
前記解離細胞サンプルの個別細胞が、
ａ．コラゲナーゼ＋DNase消化、及び／又は
ｂ．細胞ディソシエータ装置
により前記少なくとも１つの腫瘍サンプルから解離される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７４】
前記解離細胞サンプルをロードする前に、
前記解離細胞サンプルを分画して元の解離サンプルよりも大きい濃度のＢ細胞を有するＢ細胞富化画分を単離することと、
前記Ｂ細胞富化画分を前記マイクロ流体デバイス内にロードすることと、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７５】
前記分画することが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１３８、ＰＮＡ、及びＧＬ７から選択される少なくとも１つのマーカーを用いて前記解離細胞サンプルからＢ細胞を選択することを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記解離細胞サンプル又は前記Ｂ細胞富化画分を前記マイクロ流体デバイス内にロードする前に、前記解離細胞サンプル中の癌細胞を検出可能マーカーで標識することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７７】
前記解離細胞サンプルをロードする前に、
前記解離細胞サンプルを分画して元の解離サンプルよりも大きい濃度の癌細胞を有する癌細胞富化画分を単離することと、
前記癌細胞富化画分を前記マイクロ流体デバイス内にロードすることと、
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７８】
少なくとも１つの分離領域内に移動させる少なくとも１つの癌細胞を選択することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも１つの分離領域内に移動させる少なくとも１つの癌細胞を選択することを更に含み、且つ前記少なくとも１つの癌細胞が、前記検出可能マーカーの検出に基づいて選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｂ細胞を前記マイクロ流体デバイス内にロードし、前記分離領域内に移動させる前に、前記少なくとも１つの癌細胞を前記マイクロ流体デバイス内にロードし、前記マイクロ流体デバイスの前記分離領域内に移動させる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記Ｂ細胞を前記マイクロ流体デバイス内にロードし、前記分離領域内に移動させた後、前記癌細胞富化画分を前記マイクロ流体デバイスの前記フロー領域内にロードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記癌細胞が前記分離領域に進入しない、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記癌細胞が前記癌に特異的な少なくとも１つのマーカーを用いて富化される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記癌細胞が形態学的差を用いて富化される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
前記癌細胞が、前記癌細胞から正常細胞を単離するために癌細胞でダウンレギュレートされる少なくとも１つのマーカーを用いて富化される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
前記Ｂ細胞が、ＦＡＣＳを用いて前記解離細胞サンプルを処理することにより富化される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｂ細胞が、磁気ビーズベースの選別を用いて前記解離細胞サンプルを処理することにより富化される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８８】
前記固形腫瘍サンプルが腫瘍生検物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８９】
前記少なくとも１つの腫瘍サンプルを生成した腫瘍が三次リンパ様構造を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９０】
前記少なくとも１つの腫瘍サンプルを生成した腫瘍が、乳癌、泌尿生殖器癌、腎細胞癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮癌、頸癌、神経系癌、神経芽腫、腸癌、結腸直腸癌、肺癌、又は黒色腫である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９１】
前記少なくとも１つの腫瘍サンプルを生成した前記腫瘍が髄様乳癌である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記少なくとも１つの腫瘍サンプルを生成した前記腫瘍が中皮腫である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記マイクロ流体デバイスから前記少なくとも１つの同定されたＢ細胞又はそれに由来するクローンＢ細胞集団を搬出すること
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９４】
各同定されたＢ細胞又はそれに由来するクローンＢ細胞集団が個別に搬出される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記少なくとも１つの同定されたＢ細胞又はそれに由来するＢ細胞のクローン集団の一部若しくは全部で抗体シーケンシングを行うこと
を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９６】
抗体シーケンシングを行うことが、前記少なくとも１つの同定されたＢ細胞又はそれに由来するＢ細胞の前記クローン集団の一部若しくは全部から対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの抗体配列を決定することを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記少なくとも１つの同定されたＢ細胞から対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列の一部又は全部を含む抗体治療剤を生成することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９８】
Ｔ細胞又はＮＫ細胞が前記解離細胞サンプル中に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９９】
元の解離サンプルよりも大きい濃度のＴ細胞又はＮＫ細胞を有する画分を単離するように前記解離細胞サンプルで選択を行うことを更に含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が同一の患者の固形腫瘍サンプルから得られる、請求項９８に記載の方法
【請求項１０１】
ａ．前記Ｔ細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、及びＣＤ３から選択される少なくとも１つのマーカーを用いて前記解離細胞サンプルから分離されるか、又は
ｂ．前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６をマーカーとして用いて前記解離細胞サンプルから分離される、
請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
個別のＴ細胞又はＮＫ細胞が前記患者から選択及びクローニングされる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記患者の癌細胞及び他の供給源由来の癌細胞の両方に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つのＢ細胞を同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記Ｂ細胞により産生された抗体が非癌細胞に結合可能であるかを同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記非癌細胞及び前記癌細胞が、前記少なくとも１つの腫瘍サンプルを提供した前記患者に由来する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
癌細胞及び非癌細胞への前記抗体の結合を同定するために同一のマイクロ流体デバイスが使用される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記癌細胞及び非癌細胞が同一の流路に逐次的にロードされる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
癌を有する患者の治療方法であって、請求項１又は２に記載の方法により産生された抗体又はそのフラグメントを用いて前記患者を治療することを含む方法。
【請求項１０９】
腫瘍サンプルが、治療される同一の患者から採取される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記腫瘍サンプルの取得から治療までの時間が多くとも約２ヵ月である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記抗体又はそのフラグメントが一本鎖抗体である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記抗体又はそのフラグメントが２本の重鎖と２本の軽鎖とを有する、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記抗体が工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞上に提示される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１４】
前記工学操作Ｔ細胞がキメラ抗原受容体Ｔ細胞であるか、又は前記工学操作ＮＫ細胞がキメラ抗原受容体ＮＫ細胞である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が、前記抗体を提示するように工学操作される前に同一の患者から得られたものである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が前記患者の腫瘍サンプルから得られたものである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記抗体又はそのフラグメントが他の療法と組み合わせて投与される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１８】
前記組合せ療法が、手術、放射線療法、化学療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法、Ｔ細胞療法、他の免疫療法、又は免疫刺激分子若しくは腫瘍特異的ウイルスの投与である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
患者において癌を標識又は検出する方法であって、検出可能標識にコンジュゲートされた抗体又はそのフラグメントを投与することを含み、前記抗体又はそのフラグメントが請求項１又は２に記載の方法により産生される、方法。
【請求項１２０】
ａ．請求項１又は２に記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖ＣＤＲ、
ｂ．請求項１又は２に記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、
ｃ．請求項１又は２に記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖可変領域、又は
ｄ．請求項１又は２に記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域、
を含む、工学操作抗体構築物。
【請求項１２１】
請求項１又は２に記載の方法により同定された抗体の変異体である、工学操作抗体構築物。
【請求項１２２】
前記構築物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’（２）、ｓｃＦｖ、多価ｓｃＦｖ、ミニボディー、二重特異的抗体、又はラクダ機能性重鎖可変ドメインである、請求項１２０に記載の工学操作抗体構築物。
【請求項１２３】
外面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞であって、前記抗体又はそのフラグメントが請求項１又は２に記載の方法により同定される、工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞。
【請求項１２４】
前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞及び前記抗体又はそのフラグメントが同一の患者から得られたものである、請求項１２３に記載の工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞。
【請求項１２５】
外面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作Ｔ細胞の調製方法であって、
ａ．腫瘍サンプルに結合する抗体を請求項１又は２に記載の方法により同定することと、
ｂ．前記抗体又はそのフラグメントを発現するようにＴ細胞を遺伝子工学操作することと、
を含む方法。
【請求項１２６】
前記Ｔ細胞、前記抗体を発現するＢ細胞、及び前記腫瘍サンプルが同一の患者から得られたものである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
外面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作ＮＫ細胞の調製方法であって、
ａ．腫瘍サンプルに結合する抗体を請求項１又は２に記載の方法により同定することと、
ｂ．前記抗体又はそのフラグメントを発現するようにＮＫ細胞を遺伝子工学操作することと、
を含む方法。
【請求項１２８】
前記ＮＫ細胞、前記抗体を発現するＢ細胞、及び前記腫瘍サンプルが同一の患者から得られたものである、請求項１２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の規定により２０１６年１月１５日出願の米国仮特許出願第６２／２７９，３４１号、２０１６年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６２／４１１，６９０号、及び２０１６年１０月２４日出願の米国仮特許出願第６２／４１２，０９２号（それらの開示はそれぞれその全体が参照により本明細書に援用される）に基づく利益を主張する非仮出願である。
【０００２】
分野
癌特異的抗体を産生するＢ細胞の単離方法更にはそうした抗体及び／又はその誘導体を用いた治療方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
免疫療法は、患者自身の免疫系を用いて癌との闘いを支援する急成長中の分野である。患者自身の免疫系の刺激による癌細胞の攻撃又は外部源からの免疫系成分の投与をはじめとする様々な免疫療法ストラテジーが評価されてきた。例えば、生体内で癌細胞を攻撃するように設計されたモノクローナル抗体は、単独で又は遺伝子工学操作構築物として投与されてきた。そのほか、ＣＡＲ−Ｔ（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）療法が研究されてきた。この治療方法では、遺伝子工学操作Ｔ細胞は、その表面上に抗体含有融合タンパク質を発現することにより、Ｔ細胞が対象の癌を標的としてＴ細胞が癌細胞を死滅させる。ＣＡＲ−Ｔ細胞は患者の体内に永久移植された状態になり得るので、この方法は特に有望と思われる。しかし、これらの方法は依然として更なる改善を必要とする。
【０００４】
モノクローナル抗体療法又はＣＡＲ−Ｔ療法の主要な問題の１つは、治療が開始可能になる前又は有意な罹患及び死亡の回避が治療の成功に必要とされる前に患者が非常に短い時間ウィンドウを有する可能性があることに留意して、対象の患者に最大の利益を提供する抗体を同定又は設計することである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本実施形態は、研究調査に必要とされる時間を最小限に抑えてできる限り早く治療を始められるように、対象の患者に最大の利益を提供する抗体を同定する解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本明細書によれば、抗体治療剤の調製方法は、
ａ）患者から得られた少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから解離細胞サンプルを提供することと、
ｂ）少なくとも１つの分離領域を有するマイクロ流体デバイスに解離細胞サンプルをロードすることと、
ｃ）少なくとも１つのＢ細胞を解離細胞サンプルからマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域に移動させることにより少なくとも１つの単離されたＢ細胞を得ることと、
ｄ）癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定することと、
を含む。
【０００７】
本方法及び本明細書に記載の他の方法は、幾つかの実施形態では患者が罹患しているタイプの癌を標的とするために患者自身の生体が産生したＢ細胞を同定する利点を提供する。マイクロ流体デバイスを用いてこうした抗体を単離することにより、複数のＢ細胞を比較的迅速なアッセイ方式で並行して検査可能であると共に対象の特定のＢ細胞の同定、培養、及びシーケンシングが可能である（又はハイブリドーマの産生に使用可能である）。これにより研究者による患者特異的抗癌抗体の産生が可能になり、こうした抗体をモノクローナル抗体若しくはそのフラグメント又は遺伝子工学操作構築物として、例えば、融合タンパク質又はＣＡＲ−Ｔ治療剤として投与したり検出方法等に使用したりすることが可能になる。
【０００８】
そのほかの実施形態は、本明細書の方法により産生された抗体又はそのフラグメントを用いて患者を治療することを含む癌を有する患者の治療方法を含む。検出可能な標識にコンジュゲートされた抗体又はそのフラグメントを用いて患者の癌を標識又は検出することも可能である。治療用組成物として、表面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作Ｔ細胞、更には本明細書に明記された抗体の少なくとも重鎖ＣＤＲ、少なくとも重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、少なくとも重鎖可変領域、又は少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含む工学操作抗体構築物を提供し得る。
【０００９】
そのほかの目的及び利点は、部分的には以下の説明に示され、部分的にはその説明から明らかであろう。又は、実施すれば分かり得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘された要素及び組合せにより実現及び達成されるであろう。
【００１０】
以上の一般的な説明及び以下の詳細な説明は両方とも、例示的且つ解説的なものにすぎず、特許請求の範囲を制限するものではないことを理解すべきである。
【００１１】
本明細書に組み込まれてその一部を構成する添付の図面は、１つ（幾つか）の実施形態を例示し、本記載内容と合わせて本明細書に記載の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】幾つかの実施形態による関連する制御機器を含めてマイクロ流体デバイス及びマイクロ流体デバイス用システムの例を示す。
【図１Ｂ】幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの垂直断面図を示す。
【図１Ｃ】幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの水平断面図を示す。
【図２Ａ】幾つかの実施形態による分離ペンを有するマイクロ流体デバイスの垂直断面図を示す。
【図２Ｂ】幾つかの実施形態による分離ペンを有するマイクロ流体デバイスの水平断面図を示す。
【図２Ｃ】幾つかの実施形態による隔離チャンバの詳細水平断面図を示す。
【図２Ｄ】幾つかの実施形態による分離ペンを有するマイクロ流体デバイスの部分水平断面図を示す。
【図２Ｅ】幾つかの実施形態による隔離チャンバの詳細水平断面図を示す。
【図２Ｆ】幾つかの実施形態による隔離チャンバの詳細水平断面図を示す。
【図２Ｇ】実施形態による各フローチャネルが複数の隔離チャンバに流体接続された複数のフローチャネルを含有するフロー領域を有するマイクロ流体デバイスを示す。
【図２Ｈ】幾つかの実施形態による基部の内向き表面及びカバーの内向き表面が調整された表面であるマイクロ流体デバイスの部分垂直断面図を示す。
【図３Ａ】幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスに作動結合するように構成されたシステムネスト及び関連する制御機器の具体例を示す。
【図３Ｂ】幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを制御するためのシステムの光学縦列を示す。
【図４】幾つかの実施形態による癌細胞関連抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞リンパ球を同定するための例示的なワークフローのステップを示す。
【図５Ａ】複数の隔離チャンバにそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイスを示す。各隔離チャンバは、複数のマウス脾細胞を含有する。マイクロチャネルデバイスの一部の明視野像である。
【図５Ｂ】複数の隔離チャンバにそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイスを示す。各隔離チャンバは、複数のマウス脾細胞を含有する。テキサスレッドフィルターを用いて得られた蛍光像である。像は、実施例１に記載の抗原特異性アッセイの開始５分後に得た。
【図５Ｃ】複数の隔離チャンバにそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイスを示す。各隔離チャンバは、複数のマウス脾細胞を含有する。テキサスレッドフィルターを用いて得られた蛍光像である。像は、実施例１に記載の抗原特異性アッセイの開始２０分後に得た。白矢印は、アッセイで陽性シグナルを生成した隔離チャンバを指している。
【図６】ジャーカット細胞の各種画分のウェスタンブロットを示す。
【図７】抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４５抗体、又は抗Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ抗体で染色されたジャーカット細胞膜画分でコーティングされたビーズを示す。
【図８】図７と同一の抗体で染色されたＨＥＫ２９３細胞でコーティングされたビーズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
実施形態の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書には、本発明の例示的な実施形態及び適用が記載されている。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び適用にも、例示的な実施形態及び適用を行う方式やそれについての本明細書に記載の方式にも、限定されるものではない。更に、図は、簡略図又は部分図を示し得ると共に、図中の要素の寸法は、誇張されたりさもなければ比例していなかったりし得る。そのほか、「〜上」、「〜に付着される」、「〜に接続される」、「〜に結合される」という用語又は類似語が本明細書で使用される場合、一方の要素が直接他方の要素上にあるか、それに付着されるか、それに接続されるか、若しくはそれに結合されるか、又は一方の要素と他方の要素との間に１つ以上の介在要素があるかにかかわらず、一方の要素（例えば、材料、層、基板等）は、他方の要素「上」にあるか、それ「に付着される」か、それ「に接続される」か、又はそれ「に結合される」。また、文脈上特に規定されない限り、方向（例えば、上、下、頂、底、側、上向き、下向き、下方、上方、上側、下側、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供された場合、相対的なものであり、単なる例として説明及び考察が容易になるように提供されたものであり、限定を目的としたものではない。そのほか、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照された場合、かかる参照は、列挙された要素のいずれか１つだけ、列挙された要素の全てに満たない任意の組合せ、及び／又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的としたものであり、考察される要素のいずれの組合せにも限定されるものではない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「実質的に」とは、意図された目的で機能するのに十分であることを意味する。そのため、「実質的に」という用語は、当業者により予想されるような、ただし、全体性能にそれほど影響を及ぼさない、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からのわずかな有意でない変動を許容する。数値又は数値として表現可能なパラメータ若しくは特性に対して用いられる場合、「実質的に」とは１０パーセント以内を意味する。
【００１５】
「ones（もの）」という用語は２つ以上を意味する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上であり得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「位置決めされる」を包含する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」とは、流体を保持するように構成された１つ以上の離散マイクロ流体回路（各マイクロ流体回路は、限定されるものではないが、領域、流路、チャネル、チャンバ、及び／又はペンをはじめとする相互接続回路要素を含む）と、マイクロ流体デバイスに対して流体（及び任意選択的に流体中に懸濁された微小物体）の流入及び／又は流出を可能にするように構成された少なくとも２つのポートとを含むデバイスのことである。典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルと少なくとも１つのチャンバとを含み、約１ｍＬ未満、例えば、約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満、又は約２μＬ未満の体積の流体を保持するであろう。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１〜２μＬ、約１〜３μＬ、約１〜４μＬ、約１〜５μＬ、約２〜５μＬ、約２〜８μＬ、約２〜１０μＬ、約２〜１２μＬ、約２〜１５μＬ、約２〜２０μＬ、約５〜２０μＬ、約５〜３０μＬ、約５〜４０μＬ、約５〜５０μＬ、約１０〜５０μＬ、約１０〜７５μＬ、約１０〜１００μＬ、約２０〜１００μＬ、約２０〜１５０μＬ、約２０〜２００μＬ、約５０〜２００μＬ、約５０〜２５０μＬ、又は約５０〜３００μＬを保持する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」とは、約１μＬ未満、例えば、約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ以下の体積の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路要素を含有するマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスのことである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個、又はそれ以上）を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００ｐＬ〜１ｎＬ、約１００ｐＬ〜２ｎＬ、約１００ｐＬ〜５ｎＬ、約２５０ｐＬ〜２ｎＬ、約２５０ｐＬ〜５ｎＬ、約２５０ｐＬ〜１０ｎＬ、約５００ｐＬ〜５ｎＬ、約５００ｐＬ〜１０ｎＬ、約５００ｐＬ〜１５ｎＬ、約７５０ｐＬ〜１０ｎＬ、約７５０ｐＬ〜１５ｎＬ、約７５０ｐＬ〜２０ｎＬ、約１〜１０ｎＬ、約１〜１５ｎＬ、約１〜２０ｎＬ、約１〜２５ｎＬ、又は約１〜５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約２０ｎＬ〜２００ｎＬ、約１００〜２００ｎＬ、約１００〜３００ｎＬ、約１００〜４００ｎＬ、約１００〜５００ｎＬ、約２００〜３００ｎＬ、約２００〜４００ｎＬ、約２００〜５００ｎＬ、約２００〜６００ｎＬ、約２００〜７００ｎＬ、約２５０〜４００ｎＬ、約２５０〜５００ｎＬ、約２５０〜６００ｎＬ、又は約２５０〜７５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成される。
【００２０】
本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」とは、水平寸法及び垂直寸法の両寸法よりも有意に長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えば、その長さの少なくとも１０倍、その長さの少なくとも２５倍、その長さの少なくとも１００倍、その長さの少なくとも２００倍、その長さの少なくとも５００倍、その長さの少なくとも１，０００倍、その長さの少なくとも５，０００倍、又はそれ以上であり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、介在する任意の範囲を含めて約５０，０００ミクロン〜約５００，０００ミクロンの範囲内である。幾つかの実施形態では、水平寸法は、約１００ミクロン〜約１０００ミクロン（例えば、約１５０〜約５００ミクロン）の範囲内であり、且つ垂直寸法は、約２５ミクロン〜約２００ミクロン、例えば、約４０〜約１５０ミクロンの範囲内である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多種多様な空間構成を有し得るので、完全に線状の要素に制限されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、次の構成、すなわち、カーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク（例えば、複数の異なる流路）、及びそれらの任意の組合せのいずれかを有する１つ以上のセクションを含み得る。そのほか、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅、及び狭窄を有し得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの２つの異なる領域間又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分な大きさのバンプ又は類似のタイプの構造物を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離チャンバ及びマイクロ流体チャネル、又はマイクロ流体隔離チャンバの接続領域及び分離領域であり得る。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの回路要素（又は２つの回路要素間のインターフェース）の幅の狭小化を指す。狭窄は、例えば、マイクロ流体隔離チャンバとマイクロ流体チャネルとの間のインタフェース又はマイクロ流体隔離チャンバの分離領域と接続領域との間のインタフェースに位置決めし得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、透過の際に光を実質的に変化させることなく可視光を透過させる材料を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本発明に従って単離及び収集し得る任意の微視的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、無生物微小物体、例えば、マイクロ粒子、マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）、磁気ビーズ、マイクロロッド、マイクロワイヤ、量子ドット等、生物学的微小物体、例えば、細胞（例えば、胚、卵母細胞、卵細胞、精子細胞、組織解離細胞、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞系由来細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／若しくはトランスフォーム細胞、レポーター細胞、原核細胞等）、生物学的オルガネラ、ベシクル若しくは複合体、合成ベシクル、リポソーム（例えば、合成若しくは膜調製物由来）、脂質ナノラフト（Ritchie et al. (2009) “Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,” Methods Enzymol., 464:211-231に記載）等、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞付着マイクロビーズ、リポソームコーティングマイクロビーズ、リポソームコーティング磁気ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、共有結合又は非共有結合された他の部分／分子、例えば、蛍光標識、タンパク質、低分子シグナリング部分、抗原、又はアッセイで使用可能な化学的／生物学的種を更に有し得る。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、植物細胞、動物細胞（例えば哺乳動物細胞）、細菌細胞、菌類細胞等であり得る生体細胞を指す。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長動物等に由来し得る。
【００２６】
コロニー中の複製可能な生細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞である場合、生体細胞のコロニーは「クローン」である。「クローン細胞」という用語は、同一のクローンコロニーの細胞を指す。
【００２７】
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」とは、２細胞以上（例えば、２〜２０、４〜４０、６〜６０、８〜８０、１０〜１００、２０〜２００、４０〜４００、６０〜６００、８０〜８００、１００〜１０００細胞、又は１０００細胞超）を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞の生存及び／又は増殖を続けるのに必要な条件を提供する、流体及び気体の両成分と任意選択的に表面とを含む環境を提供することを指す。
【００２９】
流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、低分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物等をはじめとする培地中に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。
【００３０】
流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」又は「拡散」とは、流体培地の成分が濃度勾配の下方に熱力学的に移動することを指す。
【００３１】
「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、点間の圧力差に起因する一方の点から他方の点への流体培地の移動を含み得る。かかるフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期フロー、ランダムフロー、間欠フロー、若しくは往復フロー、又はそれらの任意の組合せを含み得る。一方の流体培地が他方の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合を生じ得る。
【００３２】
「実質的にノーフロー」という語句は、時間平均で流体培地中への又は流体培地中での材料の成分（例えば、対象のアナライト）の拡散速度未満の流体培地の流速を指す。かかる材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ、及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に依存し得る。
【００３３】
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填されたときに各領域内の流体が単一体の流体を形成するように接続されることを意味する。このことは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも同一の組成であることを意味するものではない。より正確には、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、溶質がそのそれぞれの濃度勾配の下方に移動するときに及び／又は流体がデバイスを貫流するときに流束内で異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、他の分子等の溶質の濃度が異なる）を有し得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「流路」とは、培地のフローの軌道を規定する且つその対象となる１つ以上の流体接続回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を意味する。そのため、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路の培地のフローの対象とならない流路を含む回路要素に流体接続し得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、μｍとはマイクロメートルを意味し、μｍ３とは立方マイクロメートルを意味し、ｐＬとはピコリットルを意味し、ｎＬとはナノリットルを意味し、且つμＬ（又はｕＬ）とはマイクロリットルを意味する。
【００３６】
本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的としたものであり、考察される要素のいずれの組合せにも限定されるものではない。
【００３７】
ＩＩ．抗体治療剤の調製方法
抗体治療剤は、以下のステップ、すなわち、
ａ）患者から得られた少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから解離細胞サンプルを提供するステップと、
ｂ）フロー領域とフロー領域に流体接続された少なくとも１つの分離領域とを有するマイクロ流体デバイスに解離細胞サンプルをロードするステップと、
ｃ）少なくとも１つのＢ細胞を解離細胞サンプルからマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域に移動させることにより少なくとも１つの単離されたＢ細胞を得るステップと、
ｄ）癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定するステップと、
を含む方法を用いて調製し得る。
【００３８】
抗体を同定する本方法は、抗体を産生するＢ細胞と治療剤が望まれる患者に問題を引き起こしている癌細胞との関係を有するという１つの潜在的目標を念頭において、多種多様な形態で実施し得る。特定の一方法４００は、図４に概説される。
【００３９】
特定の場合には、本方法は、同定されたＢ細胞から対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの抗体配列を決定することを更に含む。例えば、癌細胞に結合する抗体を産生する少なくとも１つのＢ細胞をマイクロ流体デバイスから搬出した後、シーケンシングを行い得る。他の場合には、本方法は、少なくとも１つの単離されたＢ細胞からハイブリドーマを生成することを含む。抗体配列が決定された場合、本方法はまた、少なくとも１つの同定されたＢ細胞から対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列の一部又は全部を含む抗体治療剤を生成することを含み得る。例えば、方法は、少なくとも１つの同定されたＢ細胞から重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列の６個のＣＤＲを全て含む抗体又はその機能部分を調製することを含み得る。
【００４０】
Ａ．解離細胞サンプルの調製
特定の場合には、本方法は、固形腫瘍からサンプルを得るステップを含む。例えば、図４の方法４００のステップ４１０に示される通り。固形腫瘍サンプルは、外科切除生検物や細針吸引物（ＦＮＡ）等の腫瘍生検物であり得る。幾つかの場合には、腫瘍は、増殖性Ｂ細胞及び／又はＢ細胞濾胞を含み得る三次リンパ様構造を有する。腫瘍は、乳癌、泌尿生殖器癌、神経系癌、腸癌、肺癌、黒色腫、又は他のタイプの癌であり得る。幾つかの実施形態では、乳癌は髄様乳癌であり得る。幾つかの実施形態では、泌尿生殖器癌は、腎臓（例えば、腎細胞癌）、尿管、膀胱、尿道等の尿路に発生する癌であり得る。幾つかの実施形態では、泌尿生殖器癌は、男性生殖管の癌（例えば、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管、若しくは陰茎の癌）或いは女性生殖管の癌（例えば、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、又は卵管癌）であり得る。幾つかの実施形態では、神経系癌は神経芽腫であり得る。幾つかの実施形態では、腸癌は結腸直腸癌であり得る。幾つかの実施形態では、肺癌は中皮腫であり得る。
【００４１】
幾つかの場合には、単一の腫瘍サンプルが得られる。他の場合には、多発性腫瘍サンプルが得られる。一例では、全ての腫瘍サンプルが同一の患者に由来する。例えば、患者に由来する１つの腫瘍サンプル（例えば、単一の生検物）を使用し得るか、又は同一の患者に由来する複数の腫瘍サンプル（例えば、患者の同一の腫瘍又は異なる腫瘍に由来する複数の生検物）を使用し得る。
【００４２】
他の場合には、異なる患者に由来する腫瘍サンプルを使用し得る。例えば、Ｂ細胞は第１の患者に由来し得ると共に、癌細胞（例えば、癌細胞関連抗原源として使用される癌細胞）は第２の患者に由来する。こうした形態の幾つかでは、Ｂ細胞は治療を望む患者に由来する。こうした形態の幾つかでは、癌細胞は癌細胞系に由来する。また、サンプルが異なる患者に由来する場合、抗体を産生するＢ細胞と癌細胞関連抗原との何らかの関係を保持し得る。例えば、癌細胞関連抗原が同一の患者の癌細胞に由来するものでない場合、幾つかの実施形態では、それは同一のタイプの癌に由来し得る。特定の場合には、マイクロ流体デバイスで使用されるさもなければ癌関連抗原を提供するために使用される癌細胞は、患者が罹患している腫瘍のタイプに特徴的である１種以上のマーカーを呈する。例えば、癌細胞は、患者の腫瘍サンプルにも存在する１つ以上のかかるマーカーを有し得る。
【００４３】
特定の場合には、本方法は、解離細胞サンプルを生成するように腫瘍サンプルを処理するステップを含む。例えば、図４の方法４００のステップ４２０に示される通り。解離細胞サンプルは、腫瘍（例えば、腫瘍生検物又はＦＮＡ）から解離させた少なくとも１つの単一細胞を含み得る。幾つかの場合には、細胞は全て単一細胞形態である。他の場合には、細胞の一部は単一細胞形態ではなく、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の細胞の集塊として残留し、更に他の細胞は単一細胞形態である。解離細胞サンプルは、解離形態で培養下で成長させた癌細胞系を含む。そのため、細胞は、能動的に解離させ得るか（少なくとも１つの固形腫瘍サンプルを得て少なくとも１つの単一細胞を解離させることにより）、又は受動的に解離させ得る（予め解離させた又は解離形態で成長させたサンプルを得ることにより）。
【００４４】
解離は、幾つかの方法で行い得る。例えば、腫瘍サンプルは、コラゲナーゼ＋DNase消化を用いて解離させ得る。腫瘍サンプルはまた、Miltenyi Biotec製gentleMACS（商標）装置等の細胞ディソシエータ装置を用いて解離させ得る。
【００４５】
幾つかの場合には、本方法は、元の解離サンプルよりも大きいパーセント及び／又は濃度のＢ細胞を有する画分を単離するために、ローディング前に解離細胞サンプルの選択を行うことを更に含む。例えば、図４の方法４００のステップ４３０に示される通り。所望により、Ｂ細胞は、少なくとも１つのマーカー、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１３８、ＰＮＡ、及びＧＬ７から選択されるマーカーを用いて、解離細胞サンプルから選択し得る。代替的又は追加的に、非Ｂ細胞を除去するためにネガティブ選択を行い得る（例えば、Ｂ細胞上に発現されない少なくとも１つのマーカーを用いて）。例えば、解離細胞サンプルから癌細胞（例えば、癌細胞特異的マーカーを用いて）及び／又はＴ細胞（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８等のＴ細胞特異的マーカーを用いて）を枯渇させ得る。更に他の場合には、解離細胞サンプルは、Ｂ細胞の富化処理を行うことなくマイクロ流体デバイスにロードされる。
【００４６】
解離細胞サンプルでＢ細胞の富化処理を行うかどうかにかかわらず、解離細胞サンプルはマイクロ流体デバイスにロードされる。例えば、図４の方法４００のステップ４４０を参照されたい。幾つかの場合には、単一の解離細胞サンプルをマイクロ流体デバイスにロードし得る。単一の解離細胞サンプルは、Ｂ細胞及び他のタイプの細胞（例えば、癌細胞）の両方を含み得る。他の場合には、（ｉ）単一の解離細胞サンプル又は（ｉｉ）異なる解離細胞サンプルの個別画分（例えば、それぞれ個別に及び／又は異なる方式で分画されたもの）を異なる時点でロードし得る。幾つかの場合には、解離細胞サンプルは、最初のサンプルよりも大きいパーセント及び／又は濃度の癌細胞を有する画分を生成するように処理し得る。癌細胞画分は、Ｂ細胞の選択後に残留する画分であり得るか、又はその逆であり得る。
【００４７】
所望により、癌に特有の少なくとも１つのマーカーを用いて、癌細胞を解離細胞サンプルから選択し得る。幾つかの場合には、形態学的差を用いて細胞を分離し得る。癌細胞は、多くの場合、不規則な細胞サイズ（例えば、より大きな細胞サイズ若しくはより小さな細胞細胞）、より大きな核を呈するか、より多くのＤＮＡを含有するか、又は核構造変化を含有する。多くの場合、これらの差は、視覚により及び／又は自動化し得る画像解析により識別可能である。かかる解析を容易にするために又は促進するために、解離細胞サンプルの核酸を染色し得るか（例えば、核酸結合染料で染色した場合、癌細胞は、多くの場合、正常細胞よりも明るく染色される）、又は核膜、核小体、及び／若しくは核マトリックスに関連するマーカーを染色し得る。かかるマーカーの例としては、ラミン（例えば、Ａ型又はＢ型ラミン）、核膜タンパク質（例えば、エメリン等の核ラミナ関連タンパク質）、フィブリラリン、核孔タンパク質（ＮＵＰ、例えば、Ｎｕｐ１５３、Ｎｕｐ２１０等）、ヒストンタンパク質、及び核マトリックスタンパク質（例えば、ｐ８４））が挙げられる。これらはいずれも、核構造の差を強調し得る。
【００４８】
形態学的差以外に、特定のタイプの癌細胞を同定するのに有用な様々なマーカーが当技術分野で知られている。例えば、限定されるものではないが、以下の通りである。
【００４９】
乳癌では、ＣＤ４４、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｋｉ−６７（又はＭＫ１６７）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）、及びガングリオシドＧＤ２は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、一方、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ヒト表皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、及びＣＤ２４は、癌細胞に存在しない又は少ない傾向があり、髄様乳癌を同定するために、ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−／ＨＬＡ−ＤＲ＋を使用可能であり、且つ乳癌幹細胞を同定するために、ＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ２４ｌｏ／ＡＬＤＨ１ｈｉ又はＣＤ４４ｈｉ／ＣＤ２４ｌｏ／ＧＤ２ｈｉを使用可能である。
【００５０】
腎臓癌では、Ｃ反応性タンパク質、アクアポリン−１（ＡＱＰ１）、アディポフィリン（ＡＤＦＰ）、インスリン様成長因子ＩＩｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３又はＩＭＰ３）、Ｂ７−Ｈ１（又はＰＤ−Ｌ１）、及びＫｉ−６７（ＭＫ１６７）は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向がある。
【００５１】
膀胱癌では、核分裂装置タンパク質（ＮＭＰ２２）、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、及びフィブリン／フィブリノーゲン分解産物は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、一方、脂肪細胞脂肪酸結合タンパク質（Ａ−ＦＡＢＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼμ（ＧＳＴ−μ）、プロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（ＰＧＤＨ）、及びケラチン１３は、存在しない又は正常細胞と比べて少ない傾向があり、遺伝子レベルで、ｐ１６腫瘍サプレッサー遺伝子又は９ｐ２１遺伝子座は、癌細胞に欠失し得る。
【００５２】
尿路上皮癌では、補体因子Ｈ関連タンパク質（ＣＦＨｒｐ）は、癌細胞でレベルの増加及び／又は分泌を呈し得ると共に、核レベルで、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）は、癌細胞でｍＲＮＡ発現の増加を呈する傾向がある。
【００５３】
子宮内膜癌では、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、癌抗原１９．９（ＣＡ１９．９）、癌抗原７２．４（ＣＡ７２．４）、及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向がある。
【００５４】
卵巣癌では、腫瘍関連トリプシン阻害剤（ＴＡＴＩ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、クローディン５、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＶＣＡＭ−１、及びｍｉＲ−１８１ａは、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、ＴＡＴＩ、ＣＡ１２５、及びクローディン５は、卵巣癌を診断するために組み合わせて使用されており、ＨＥ４及びＣＡ１２５も同様であり、任意選択的にＣＥＡ及びＶＣＡＭ−１が併用され、ＳＴＡＴ１は、化学療法に反応する卵巣癌とそうでない卵巣癌とを識別するために使用可能である。
【００５５】
頸癌では、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（例えば、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、６、１１、４２、４３、及び４４型）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、及びインスリン様成長因子ＩＩｍＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３又はＩＭＰ３）は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向がある。
【００５６】
前立腺癌では、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、サルコシン（代謝物）、前立腺癌遺伝子３（ＰＣＡ３）、及びＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ融合産物は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、一方、前立腺性酸性ホスファターゼ、フィブリノーゲンα鎖前駆体、コラーゲンα−１（ＩＩＩ）、コラーゲンα−１（Ｉ）、乾癬感受性１候補遺伝子２タンパク質、肝細胞癌関連タンパク質ＴＢ６、ヒストンＨ２ＢＢ、オステオポンチン、高分子Ｉｇ受容体、Ｎａ／Ｋ輸送ＡＴＰアーゼγ、膜貫通分泌成分、及びセメノゲリン１は、存在しない又は正常細胞と比べて少ない傾向がある。
【００５７】
神経芽腫では、バニリルマンデリン酸（ＶＭＡ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）、及びフェリチンのレベルの増加及び／又は分泌は、癌細胞に関連付けられ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、及びガングリオシドＧＤ２は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、ゲノムレベルで、染色体１ｐ及び１１ｑの部分欠失並びに１７ｑの部分重複は、癌細胞に関連付けられる。
【００５８】
結腸直腸癌では、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、結腸癌特異的抗原３（ＣＣＳＡ−３）、結腸癌特異的抗原４（ＣＣＳＡ−４）、及びＢ−Ｒａｆ突然変異Ｖ６００Ｅは、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、遺伝子レベルで、結腸直腸癌細胞は、マイクロサテライト不安定性及び各種Ｋ−Ｒａｓ突然変異を呈する。
【００５９】
小細胞肺癌では、ガングリオシドＧＤ２は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、非小細胞肺癌では、Ｂ−Ｒａｆ突然変異Ｖ６００Ｅは、癌細胞に存在する傾向があり、中皮腫では、カルレチニン、サイトケラチン５／６、及びＷＴ１は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、一方、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）（例えば、ＭＯＣ−３１又はＢｅｒ−ＥＰ４抗体により検出される）、ルイスＹ血液型（例えば、ＢＧ−８抗体により検出される）、及びＢ７２．３抗体により検出される腫瘍関連糖タンパク質は、存在しない又は少ない傾向があり、それとは逆に、経肺腺癌では、ＣＥＡ、Ｅｐ−ＣＡＭ（例えば、ＭＯＣ−３１又はＢｅｒ−ＥＰ４抗体により検出される）、ルイスＹ血液型（例えば、ＢＧ−８抗体により検出される）、及びＢ７２．３抗体により検出される腫瘍関連糖タンパク質は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、一方、カルレチニン、サイトケラチン５／６、及びＷＴ１は、存在しない又は少ない傾向がある。
【００６０】
黒色腫では、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ−Ｋ）、ガングリオシドＧＤ２、Ｂ−Ｒａｆ突然変異Ｖ６００Ｅ、Ｈｓｐ９０、Ｇタンパク質シグナリング１レギュレーター（ＲＧＳ１）、オステオポンチン、ヒト表皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、核受容体コアクチベーター３（ＮＣＯＡ３）、ミニ染色体維持複合体成分４及び６（それぞれ、ＭＣＭ４及びＭＣＭ６）は、癌細胞に存在する及び／又は多い傾向があり、一方、阻害剤又は成長タンパク質３及び４（それぞれ、ＩＮＧ３及びＩＮＧ４）は、存在しない又は正常細胞と比べて少ない傾向がある。
【００６１】
幾つかの場合には、癌細胞は、癌に特有の少なくとも２つのマーカーを用いて解離細胞サンプルから選択し得る。例えば、２つ以上のマーカーは、形態学的マーカー、少なくとも１つの陽性マーカー（例えば、癌細胞に存在する及び／又は多いマーカー）、及び／又は少なくとも１つの陰性マーカー（例えば、存在しない又は正常細胞と比べて少ないマーカー）、又はそれらの任意の組合せを含み得る。特定の形態では、Ｂ細胞（例えば、メモリＢ細胞、血漿Ｂ細胞等、及びそれらの組合せ）及び／又は癌細胞は、ＦＡＣＳにより解離細胞サンプルから選択し得る。代替的又は追加的に、Ｂ細胞（例えば、メモリＢ細胞、血漿Ｂ細胞等、及びそれらの組合せ）及び／又は癌細胞はまた、磁気ビーズベース選別を用いて解離サンプルから選択し得る。選択は、サンプルにおいてＣＤ２７（又は幾つかの他のメモリＢ細胞マーカー）を発現するＢ細胞又はＣＤ１３８（又は幾つかの他の形質細胞マーカー）を発現するＢ細胞を富化し得る。選択はポジティブであり得る（例えば、Ｂ細胞特異的マーカー又は癌細胞特異的マーカーに基づく）。代替的に、選択はネガティブであり得る。例えば、非Ｂ細胞細胞型は、DYNABEADS（商標）UntouchedヒトＢ細胞試薬（Thermo Fisher）、Ｂ細胞単離キット（Miltenyi）、RosetteSepヒトＢ細胞富化カクテル（Stem Cell Technologies）等でサンプルを処理する等の当技術分野で周知の技術を用いて、解離細胞サンプルから枯渇させ得る。他の例として、選択は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＧ抗体、又はそれらの任意の組合せを発現するＢ細胞をサンプルから枯渇させ得る。代替的又は追加的に、Ｂ細胞及び／又は癌細胞は、以下で更に考察されるようにマイクロ流体デバイスを用いて選択し得る。
【００６２】
Ｂ．マイクロ流体デバイス内へのＢ細胞のローディング及びマイクロ流体デバイス内でのＢ細胞の移動
解離細胞サンプル（以上で考察したように任意選択的に分画されたもの）は、デバイスの流入口を介してフロー領域内にサンプル細胞を流入させることによりマイクロ流体デバイス内にロードすることが可能である。例えば、図４に示される方法４００のステップ４４０は、マイクロ流体デバイス内への解離細胞サンプルのローディングを提供する。幾つかの実施形態では、フロー領域はフローチャネル（又はマイクロ流体チャネル）を含み、且つ解離細胞サンプルのローディングはフローチャネル内に細胞を流入させることを含む。
【００６３】
解離細胞サンプルをマイクロ流体デバイスのフロー領域（又はフローチャネル）内にロードした後、サンプル中のＢ細胞をマイクロ流体デバイスの分離領域内に移動させることが可能である。例えば、方法４００のステップ４５０に例示されるように（図４）、フロー領域（又はフローチャネル）に流体接続された且つそれから開口した分離チャンバ内に位置決めし得る１つ以上の分離領域内にフロー領域（又はフローチャネル）からＢ細胞を移動させることが可能である。Ｂ細胞は、例えば、ＣＤ２７＋Ｂ細胞又はＣＤ１３８＋Ｂ細胞であり得る。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞はメモリＢ細胞である。他の実施形態では、Ｂ細胞は形質細胞である。Ｂ細胞の移動は、本明細書で一般的に考察されるように、重力の利用（例えば、マイクロ流体デバイスを傾けることにより）、局在化流体フローの誘導（例えば、分離領域に隣接又は近接して位置決めされたマイクロ流体デバイスの変形可能表面を押圧又は牽引することにより）、誘電泳動（ＤＥＰ）力の適用（例えば、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により）、又はそれらの任意の組合せを含めて、様々な手段により達成し得る。
【００６４】
幾つかの場合には、解離細胞サンプルをロードする前に、本方法は、少なくとも１つの検出可能マーカーで解離細胞サンプル中のＢ細胞を標識することを更に含む。マーカーは、Ｂ細胞特異的マーカー、例えば、本明細書に開示されるＢ細胞マーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１３８、ＰＮＡ、ＧＬ７等）のいずれか１つであり得る。例えば、ＤＥＰ力を適用することによりＢ細胞を移動させる実施形態では、マーカーは、検出可能マーカーの検出に基づいて移動するＢ細胞の選択を支援し得る。代替的に、検出可能マーカーは、Ｔ細胞マーカーや癌細胞関連マーカー等の非Ｂ細胞マーカーに結合させ得る。かかる場合には、検出可能マーカーの欠如に基づいて移動するＢ細胞を選択し得る。
【００６５】
マイクロ流体デバイスの分離領域にロードされるＢ細胞は、メモリＢ細胞、形質細胞等の異なるＢ細胞型の混合物を含み得る。幾つかの実施形態では、分離領域内に移動させる形質細胞を選択することが望まれ得る。幾つかの実施形態では、分離領域内に移動させるＩｇＧ型抗体を発現するＢ細胞を選択することが望まれ得る。
【００６６】
幾つかの場合には、分離領域の全てにロードするか否かにかかわらず、１つのＢ細胞のみを各分離領域内に移動させる。他の場合には、最初に１つ以上の分離領域内にＢ細胞をプールし、後で個別分離領域内に分離し得る（すなわち、１つの分離領域当たり１つのＢ細胞）。癌細胞に結合する抗体を産生するＢ細胞をスクリーニングする場合、後者の実施形態ではより大きいスループットが可能である。各分離領域内に１つのＢ細胞のみを配置することによりＢ細胞のクローン増殖が可能になるので、対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列の同定を容易にし得る。
【００６７】
特定の実施形態では、癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイスにロードする前、Ｂ細胞をマイクロ流体デバイスにロードして分離領域内に移動させる。他の実施形態では、癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイスにロードして分離領域内に移動させた後、Ｂ細胞をマイクロ流体デバイスにロードして分離領域内に移動させる。更に他の実施形態では、Ｂ細胞及び癌細胞関連抗原を同時にマイクロ流体デバイスにロードする（例えば、Ｂ細胞及び癌細胞の両方を含む解離細胞サンプルの一部として）。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞を分離領域にロードした後、Ｂ細胞は、癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つのＢ細胞の同定後までそこに残留する。
【００６８】
Ｃ．抗体を産生するＢ細胞と癌細胞関連抗原との接触
開示された方法は、癌細胞関連抗原に特異的に結合する抗体をＢ細胞が発現しているかを検出するステップを含む。例えば、図４の方法４００のステップ４７０を参照されたい。かかる発現を検出するために、発現された抗体を癌細胞関連抗原と相互作用させなければならない。
【００６９】
癌細胞関連抗原は単純型又は複合型であり得る。また、抗原は、タンパク質、炭水化物基若しくは炭水化物鎖、タンパク質や炭水化物以外の生物学剤若しくは化学剤、又はそれらの任意の組合せ上のエピトープであり得ると共に、エピトープは、リニア又はコンフォメーショナルであり得る。癌細胞関連抗原は、癌細胞（例えば、１つ以上の特定のタイプの癌細胞）を一義的に同定する又は正常細胞での発現と比較して癌細胞でアップレギュレートされる抗原であり得る。典型的には、癌細胞関連抗原は、癌細胞の表面上に存在するので、抗体により確実に認識可能である。抗原は、当技術分野で公知の又は本明細書に記載の腫瘍に見いだし得る任意のタイプの癌細胞を含めて、任意のタイプの癌細胞に関連付け可能である。特に、抗原は、肺癌、乳癌、黒色腫等に関連付け可能である。本明細書で使用される場合、「癌細胞に関連付けられる」という用語は、抗原に関連して使用されるとき、抗原が癌細胞により直接産生されること又は癌細胞と正常細胞との間の相互作用により生じることを意味する。
【００７０】
Ｂ細胞発現抗体が癌細胞関連抗原に特異的に結合するかの検出は、本明細書に記載のマイクロ流体デバイスで行い得る。特に、マイクロ流体デバイスは、フロー領域（例えば、マイクロ流体チャネル）と隔離チャンバとを有するエンクロージャを含み得る。隔離チャンバは、分離領域と接続領域とを含み得ると共に、接続領域は、分離領域とフロー領域との間に流体接続を提供する。隔離チャンバは、約０．５ｎＬ〜約５．０ｎｌ又はその中の任意の範囲（例えば、約０．５ｎｌ〜約１．０ｎｌ、約０．５ｎｌ〜約１．５ｎｌ、約０．５ｎｌ〜約２．０ｎｌ、約１．０ｎｌ〜約１．５ｎｌ、約１．０ｎｌ〜約２．０ｎｌ、約１．０ｎｌ〜約２．５ｎｌ、約１．５ｎｌ〜約２．０ｎｌ、約１．５ｎｌ〜約２．５ｎｌ、約１．５ｎｌ〜約３．０ｎｌ、約２．０ｎｌ〜約２．５ｎｌ、約２．０ｎｌ〜約３．０ｎｌ、約２．０ｎｌ〜約３．５ｎｌ、約２．５ｎｌ〜約３．０ｎｌ、約２．５ｎｌ〜約３．５ｎｌ、約２．５ｎｌ〜約４．０ｎｌ、約３．０ｎｌ〜約３．５ｎｌ、約３．０ｎｌ〜約４．０ｎｌ、約３．０ｎｌ〜約４．５ｎｌ、約３．５ｎｌ〜約４．０ｎｌ、約３．５ｎｌ〜約４．５ｎｌ、約３．５ｎｌ〜約５．０ｎｌ、約４．０ｎｌ〜約４．５ｎｌ、約４．０ｎｌ〜約５．０ｎｌ、約４．５ｎｌ〜約５．０ｎｌ、又は上記の端点の１つにより規定される任意の範囲）の容積を有し得る。接続領域は、本明細書に一般的に記載される幅Ｗｃｏｎ（例えば、約２０ミクロン〜約１００ミクロン又は約３０ミクロン〜約６０ミクロン）を有し得る。分離領域も同様に、本明細書に一般的に記載される幅Ｗｉｓｏを有し得る（例えば、分離領域は、接続領域の幅Ｗｃｏｎよりも大きい幅Ｗｉｓｏを有し得る）。特定の実施形態では、分離領域は、約５０ミクロン〜約２５０ミクロンの幅Ｗｉｓｏを有する。
【００７１】
フロー領域、隔離チャンバ、及び／又は隔離チャンバの分離領域は、抗体発現Ｂ細胞（例えば、メモリーＢ細胞又は形質細胞）の生存能を向上させるコーティング材料を用いてコーティングされた少なくとも１つの表面を含み得る。これとの関連で用いられる場合、「生存能を向上させる」とは、コーティングされていない等価な表面と比較してコーティングされた表面でＢ細胞の生存能がより良好であることを意味する。特定の実施形態では、フロー領域、隔離チャンバ、及び／又は分離領域は、Ｂ細胞の生存能を向上させるコーティング材料でそれぞれコーティングされた複数の表面を有する。コーティング材料は、当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載の任意の好適なコーティング材料であり得る。コーティング材料は、例えば、親水性分子を含み得る。親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、炭水化物基を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せからなる群から選択可能である。
【００７２】
フロー領域、隔離チャンバ、及び又は隔離チャンバの分離領域は、Ｂ細胞（例えば、メモリーＢ細胞又は形質細胞）の生存能を向上させる少なくとも１つの調整された表面を含み得る。これとの関連で用いられる場合、「生存能を向上させる」とは、調整されていない等価な表面と比較して調整された表面でＢ細胞の生存能がより良好であることを意味する。特定の実施形態では、フロー領域、隔離チャンバ、及び／又は分離領域は、Ｂ細胞の生存能をそれぞれ向上させ得る複数の調整された表面を有する。調整された表面は、共有結合された分子を含み得る。共有結合された分子は、例えば、共有結合された親水性分子を含めて、当技術分野で公知である及び／又は本明細書に開示される任意の好適な分子であり得る。親水性分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、炭水化物基を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せからなる群から選択可能である。親水性分子は、本明細書に記載されるように、共有結合された親水性分子の層を形成可能である。
【００７３】
癌細胞関連抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞の検出は、抗原がＢ細胞に近接して位置決めされた状態になるように癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイスに導入することを含み得る。マイクロ流体デバイスへの癌細胞関連抗原の導入は、例えば、癌細胞関連抗原を含有する流体培地をマイクロ流体デバイスのフロー領域に流入させることと、癌細胞関連抗原がＢ細胞に近接して位置決めされたときに流体培地のフローを停止することとを含み得る。Ｂ細胞に「近接する」位置は、Ｂ細胞から１ミリメートル（ｍｍ）以内（例えば、Ｂ細胞から７５０ミクロン以内、６００ミクロン以内、５００ミクロン以内、４００ミクロン以内、３００ミクロン以内、２００ミクロン以内、１００ミクロン以内、又は５０ミクロン以内）であり得る。
【００７４】
癌細胞関連抗原は、当技術分野で公知の及び／又は本明細書に記載の任意の好適な微小物体（例えば、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、又はビーズ）であり得る微小物体の一部として提供可能である。そのため、マイクロ流体デバイスへの癌細胞関連抗原の導入は、Ｂ細胞が位置決めされる隔離チャンバの接続領域に隣接して又は接続領域内にかかる微小物体を配置することを含み得る。代替的に、癌細胞関連抗原の導入は、Ｂ細胞が位置決めされる隔離チャンバの分離領域内にかかる微小物体を移動させることを含み得る。
【００７５】
微小物体は、癌細胞から分画された抗原、例えば、癌細胞膜調製物に見いだされる膜関連抗原を含み得る。開示された方法に使用される微小物体を生成するために、かかる単離された膜関連抗原はビーズにコンジュゲートし得る。代替的に、微小物体は、実質的に純粋な抗原（例えば、精製されたタンパク質）を含み得る。抗原分子、例えば、精製されたタンパク質、細胞膜調製物等をビーズにコンジュゲートする方法は、当技術分野で公知である及び／又は本明細書の実施例に記載される。同様に、癌細胞から抗原を単離する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Bachleitner-Hoffmann et al. (2002), J. Clin. Endocrin. & Metab. 87(3): 1098-1104; and He et al. (2016), Oncology Letters 12:1101-06を参照されたい）。そのため、癌細胞関連抗原の単離は、当技術分野で公知の様々な方法により行い得る。他の実施形態では、微小物体は、癌細胞（例えば、患者のサンプルから単離されたもの）や癌細胞系細胞等の細胞であり得る。
【００７６】
上述したように、微小物体（例えば、癌細胞又は抗原コンジュゲートビーズ）は、デバイスの流入口を介してフロー領域内に微小物体を流入させることによりマイクロ流体デバイスにロードし得る（抗体結合を検出するために）。幾つかの実施形態では、フロー領域はフローチャネルを含み、且つ微小物体のローディングはフローチャネル内に微小物体を流入させることを含む。
【００７７】
幾つかの実施形態では、微小物体は、マイクロ流体デバイスのフロー領域（又はフローチャネル）にロードされ、マイクロ流体デバイスから搬出されるまでフロー領域（又はフローチャネル）内に残留する。幾つかの実施形態では、微小物体は分離領域に入らない。幾つかの実施形態では、微小物体は、フロー領域（又はフローチャネル）に存在する以外に分離チャンバの接続領域内に浸入する。これらの実施形態のいずれかでは、微小物体（例えば、癌細胞又は抗原コンジュゲートビーズ）は、少なくとも約１×１０７、２．５×１０７、５×１０７、７．５×１０７、又は１×１０８個の微小物体／ｍｌの濃度でフロー領域（又はフローチャネル）にロードし得る。
【００７８】
幾つかの実施形態では、微小物体は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域内に移動される。Ｂ細胞と同様に、微小物体（例えば、癌細胞又は抗原コンジュゲートビーズ）の移動は、重力の利用（例えば、マイクロ流体デバイスを傾けることにより）、局在化流体フローの誘導（例えば、分離領域に隣接又は近接して位置決めされたマイクロ流体デバイスの変形可能表面を押圧又は牽引することにより）、誘電泳動（ＤＥＰ）力の適用（例えば、光電子ピンセット（ＯＥＴ）により）、又はそれらの任意の組合せを含めて、様々な手段により達成し得る。かかる実施形態では、１個以上（例えば、１個のみ、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、若しくはそれ以上、又は約１〜２０、１〜１０、１〜５、１〜３、１〜２個）の微小物体をマイクロ流体デバイスの個別分離領域内に移動させ得るので、単離された微小物体又は一群の単離された微小物体を有する少なくとも１つの分離領域が得られる。単離された微小物体及びＢ細胞は、同一の分離領域内に配置し得る。代替的に、単離された微小物体及びＢ細胞は、異なる分離領域（例えば、隣接分離領域）内に配置し得る。
【００７９】
マイクロ流体デバイス内の微小物体の所望の位置に関係なく、癌細胞をマイクロ流体デバイスにロードする前に、癌細胞である微小物体を１つ以上の検出可能マーカーで標識し得る。所望の形態が少なくとも１つの分離領域内への少なくとも１つの癌細胞の移動を含む場合、移動する少なくとも１つの癌細胞を選択するために検出可能マーカーを使用し得る。代替的又は追加的に、移動する少なくとも１つの癌細胞を選択するために、細胞サイズ、細胞形状、核サイズ、又は核構造の形態学的評価を使用し得る。癌細胞はまた、形態学的評価と任意選択的に組み合わせて細胞マーカーの不在により選択し得る。
【００８０】
特定の実施形態では、癌細胞は、患者から採取された１つ以上の固形腫瘍サンプルから得られる解離細胞サンプルに由来するので、患者自身の癌細胞である。以上で考察したように、癌細胞は、解離細胞サンプルから選択（又は分画）し得る、及び／又は癌細胞は、Ｂ細胞を含有する同一の解離細胞サンプルの一部としてマイクロ流体デバイスにロードし得る。特定の実施形態では、癌細胞は、癌細胞に結合可能な抗体を産生するＢ細胞をアッセイする前に、培養及び／又はクローニングされる。かかる培養及び／又はクローニングは、マイクロ流体デバイス内で又はマイクロ流体デバイスに癌細胞をロードする前に行い得る（例えば、腫瘍サンプルに由来する癌細胞を選択、培養、及び／又はクローニングする従来技術を用いて）。それにもかかわらず、癌細胞を選択、培養、及び／又はクローニングして少なくとも約１×１０７、２．５×１０７、５×１０７、７．５×１０７、又は１×１０８細胞／ｍｌの濃度にし得る。
【００８１】
当技術分野で周知のように、腫瘍に由来する癌細胞集団は、集団を構成する個別細胞の形態学的及び遺伝的特性に関して比較的不均一であり得る。例えば、集団は、癌幹細胞（徐々に分裂し得る）及びより分化した癌細胞（より迅速に分裂し得ると共に癌促進突然変異の様々なサブセットを含有し得る）を含有し得る。癌細胞のマーカーベースの選択及び／又はクローニングを用いることにより、より均一な細胞集団を提供することが可能である。したがって、特定の実施形態では、幾つかの実施形態で、複数の不均一な癌細胞をマイクロ流体デバイスにロードし得る。代替的に、マイクロ流体デバイスにロードする前に個別癌細胞を選択してクローニングし得る。そのため、他の実施形態では、実質的に均一な癌細胞集団をマイクロ流体デバイスにロードして、癌細胞に結合可能な抗体を産生するＢ細胞を同定するために使用し得る。実質的に均一な集団は、少なくとも１つの腫瘍を提供する患者又は異なる患者に由来する癌細胞系であり得る。
【００８２】
更に他の実施形態では、癌細胞関連抗原の提供は、可溶性抗原を含む溶液をマイクロ流体デバイスのフロー領域に通して流動させることと、Ｂ細胞が位置決めされる隔離チャンバに可溶性抗原を拡散導入可能にすることとを含み得る。かかる可溶性抗原は、検出可能標識（例えば、蛍光標識）に共有結合させ得る。
【００８３】
Ｄ．結合の検出及びＢ細胞の処理
癌細胞関連抗原へのＢ細胞により産生された抗体の結合は、様々な方法で検出し得る。例えば、癌細胞をマイクロ流体デバイスに導入する場合、凝集アッセイで生じ得るような細胞集塊を検出し得る。代替的に、結合された抗体を有する微小物体（例えば、癌細胞又は抗原コンジュゲートビーズ）を標識するために、標識（例えば、蛍光標識）にコンジュゲートされた抗ヒト抗体等の二次抗体を添加し得る。そのため、幾つかの実施形態では、本方法は、標識された抗体結合剤を癌細胞関連抗原の前又はそれと同時に提供することを更に含む。かかる実施形態では、Ｂ細胞により発現された抗体への抗原の結合の監視は、癌細胞関連抗原への標識された抗体結合剤の間接結合を検出することを含み得る。標識された抗体結合剤は、蛍光標識されたものであり得る標識された抗ＩｇＧ抗体であり得る。特定の実施形態では、標識された抗体結合剤は、癌細胞関連抗原との混合物で提供される。他の実施形態では、標識された抗体結合剤は、癌細胞関連抗原の提供後に提供される。
【００８４】
特定の実施形態では、本方法は、癌細胞関連抗原に特異的に結合する抗体を発現する少なくとも１つの抗体発現Ｂ細胞（例えば、形質細胞又はメモリーＢ細胞）を同定することを更に含み得る。以下でより詳細に考察されるように、マイクロ流体デバイスは、シグナル（例えば、癌細胞集塊又は微小物体の表面への標識の蓄積）の可視化を可能にする撮像デバイスを含み得る。例えば、撮像デバイスは、マイクロ流体デバイスの撮像を周期的に行うことが可能であり、経時的にかかるシグナルのいかなる増加も検出可能である。像は、例えば、数秒ごとに（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０秒ごとに、若しくはそれ以上の間隔で）又は数分ごとに（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０分ごとに、若しくはそれ以上の間隔で）取得可能である。幾つかの実施形態では、複数の像を互いに重ねてオーバーレイすることにより「合わせた」像を形成することが可能であり、これはバックグラウンドシグナルを平均化する一般的効果を有し、真のシグナルとバックグラウンドシグナルとのより良好なコントラストを形成する。シグナルの検出は、人が像を精査するときに行われるように手動であり得るか又は自動であり得る（例えば、適切な画像解析ソフトウェアを用いる）。
【００８５】
癌細胞関連抗原とＢ細胞により産生された抗体との結合を検出した後、かかる抗体を産生するＢ細胞を同定することが可能であり、且つその位置（例えば、位置決めされる分離領域又は分離チャンバ）を確認及び／又は記録することが可能である。例えば、図４の方法４００のステップ４８０を参照されたい。任意選択的に、癌細胞への抗体結合を検出した後、フロー領域（又はフローチャネル）をフラッシュし得る。かかるフラッシングは、癌細胞関連抗原（例えば、癌細胞又は抗原コンジュゲートビーズ）に結合する抗体を産生するＢ細胞の同定前又は同定後に行い得る。他の任意選択的なステップとして、癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生しなかったＢ細胞は、マイクロ流体デバイスから廃棄し得る。
【００８６】
特定の実施形態では、癌細胞関連抗原に結合する抗体を産生するとして同定されるＢ細胞は、マイクロ流体デバイスから搬出可能である。例えば、（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の）シーケンシング又はハイブリドーマの調製のいずれかの目的でＢ細胞を単離するために、癌細胞に結合する抗体を産生するＢ細胞をマイクロ流体デバイスから搬出し得る。幾つかの場合には、各細胞又はクローン細胞集団は個別に搬出される。
【００８７】
Ｅ．Ｂ細胞活性化の刺激
以上の実施形態のいずれかでは、マイクロ流体デバイスの分離領域内に移動させたＢ細胞は、抗体の産生を助長する条件下でインキュベート可能である。幾つかの場合には、そうした抗体は、マイクロ流体デバイス内の培地を介して癌細胞関連抗原（癌細胞若しくは抗原コンジュゲートビーズに含まれるか又は溶液中にあるかにかかわらず、且つ同一の分離領域内、主要フローチャネル内、又は隣接分離領域内にあるかにかかわらず）の位置に拡散可能である。隣接分離領域の例として、幾つかのマイクロ流体デバイスでは、２つの隣接する分離領域間の薄壁に小さなギャップが存在し、一方の分離領域から他方の分離領域に抗体を直接拡散させることが可能であるので、必ずしも主要フローチャネルに進入させて隣接分離領域内に拡散させる必要はない。かかる小さなギャップは、抗体の拡散を可能にするが、癌細胞もＢ細胞も分離領域を離れることが許されない。
【００８８】
幾つかの場合には、癌細胞関連抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞の検出は、Ｂ細胞活性化を刺激する刺激剤にＢ細胞を接触させるステップを含み得る。例えば、図４の方法４００のステップ４６０を参照されたい。刺激剤は、ＣＤ４０アゴニスト、例えば、ＣＤ４０Ｌ、その誘導体、又は抗ＣＤ４０抗体であり得る。そのため、刺激剤は、ＣＤ４０Ｌ＋支持細胞を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。ＣＤ４０Ｌ＋支持細胞は、Ｔ細胞（例えば、ジャーカットＤ１．１細胞）又はその派生物であり得る。代替的に、支持細胞は、ＣＤ４０Ｌ発現構築物でトランスフェクト／トランスフォームされた細胞系（例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）であり得る。刺激剤は、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ９アゴニスト）を更に含む。ＴＬＲアゴニストは、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ２００６）であり得る。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、約１マイクログラム／ｍＬ〜約２０マイクログラム／ｍＬ（例えば、約１．５〜約１５マイクログラム／ｍＬ、約２．０〜約１０マイクログラム／ｍＬ、又は約２．５〜約５．０マイクログラム／ｍＬ）の濃度で使用可能である。Ｂ細胞は、１〜１０日間（例えば、２〜８日間、３〜７日間、又は４〜６日間）にわたり刺激剤に接触させることが可能である（例えば、実質的に連続的に又は周期的／間欠的に）。
【００８９】
癌細胞関連抗原に特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞の検出は、Ｂ細胞増殖を促進する１種以上の成長誘導剤を含む培養培地にＢ細胞を提供するステップを更に含み得る。１種以上の成長誘導剤は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、及びＢＡＦＦの群から選択される少なくとも１種の作用剤を含み得る。ＩＬ−２及び／又はＩＬ−４は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１マイクログラム／ｍＬの濃度で提供可能である。ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及び／又はＩＬ−２１は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で提供可能である。ＢＡＦＦは、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供可能である。特定の実施形態では、培養培地は、１〜１０日間（例えば、２〜８日間、３〜７日間、又は４〜６日間）にわたりＢ細胞に提供される。培養培地は、刺激剤（例えば、ＣＤ４０アゴニスト及び／又はＴＬＲアゴニスト）を含み得る。そのため、例えば、Ｂ細胞への培養培地の提供は、Ｂ細胞と活性化剤との接触と同時に行い得る。特定の実施形態では、Ｂ細胞リンパ球と刺激剤とを接触させるステップ及びＢ細胞リンパ球に培養培地を提供するステップは、時間をオーバーラップさせて（例えば、実質的に同一の時間にわたり）行われる。そのほか、他の任意選択的なステップとして、マイクロ流体デバイス内でＢ細胞を培養してクローン集団にし得る。かかる培養は、例えば、約２〜３日間にわたり及び／又は細胞数が約８〜２０細胞になるまで行い得る。
【００９０】
ＩＩＩ．マイクロ流体デバイス
Ａ．マイクロ流体デバイス用語
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、「掃引」領域及び「非掃引」領域を含み得る。拡散を可能とするが掃引領域と非掃引領域との間で培地が実質的にノーフローとなるように流体接続が構造化される限り、非掃引領域は掃引領域に流体接続可能である。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化可能である。
【００９１】
特定の生体物質（例えば、抗体等のタンパク質）を産生する生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の能力は、かかるマイクロ流体デバイスでアッセイ可能である。例えば、対象のアナライト（抗体等）の産生に関してアッセイされる生物学的微小物体（Ｂ細胞等）を含むサンプル材料は、マイクロ流体デバイスの掃引領域内にロードし得る。生物学的微小物体のうち特定の特徴を有するものを選択し、非掃引領域内に配置することが可能である。次いで、残留サンプル材料を掃引領域から流出させ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることが可能である。選択された生物学的微小物体は非掃引領域内にあるので、選択された生物学的微小物体は、残留サンプル材料の流出やアッセイ材料の流入の影響を実質的に受けない。選択された生物学的微小物体は、対象のアナライトの産生を可能にし得る。この場合、対象のアナライトは、非掃引領域から掃引領域内に拡散可能であり、掃引領域では、対象のアナライトは、アッセイ材料と反応して局在化された検出可能な反応を引き起こすことが可能であり、各反応は、特定の非掃引領域に関連付け可能である。検出された反応に関連付けられる任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域内のどの生物学的微小物体（もしあれば）が対象のアナライトの十分なプロデューサーであるかを決定することが可能である。
【００９２】
Ｂ．マイクロ流体デバイスを含むシステム
図１Ａは、インビトロで癌由来Ｂ細胞を単離又はスクリーニングすることに使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示す。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得、ここで、各隔離チャンバは、流路１０６に流体接続する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離チャンバは、流路１０６と流通する１つのみの開口部を有し得る。更に以下で考察するように、マイクロ流体隔離チャンバは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
【００９３】
図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
【００９４】
図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
【００９５】
支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
【００９６】
マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フロー領域（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
【００９７】
マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料  −  したがって、マイクロ流体回路材料１１６  −  は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
【００９８】
カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
【００９９】
幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極を更に含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
【０１００】
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１Ａに示されていない）を含む。
【０１０１】
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイスは、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイスは、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイスは顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【０１０２】
システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）を更に含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
【０１０３】
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離チャンバの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離チャンバよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離チャンバ内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離チャンバよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離チャンバ内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
【０１０４】
幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離チャンバの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離チャンバの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
【０１０５】
システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
【０１０６】
図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。
【０１０７】
マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
【０１０８】
培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
【０１０９】
原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
【０１１０】
撮像モジュール１６４は撮像デバイスを制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイスから画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイスからの画像データは、撮像デバイスにより捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイスにより捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。
【０１１１】
傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離チャンバへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
【０１１２】
図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離チャンバの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離チャンバは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
【０１１３】
マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離チャンバを含み得る。５つの隔離チャンバが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離チャンバを有し得る。ここで、「隔離チャンバ」及び「隔離ペン」は、互換可能に使用される。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、及び１３０は、隣接Ｂ細胞からあるＢ細胞を単離するように、細胞特異的な抗体分泌を検出するに当たり有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離チャンバを含む。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離チャンバを含み、その場合、隔離チャンバの２つ以上は、細胞の異なる種類の維持おいて異なる利点を提供する異なる構造及び／又は特徴を含む。非限定的な一例として、あるタイプのペン内にＢ細胞を維持しながら、異なるタイプのペン内に癌細胞を維持することを挙げることができる。
【０１１５】
図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
【０１１６】
幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離チャンバは、隔離チャンバが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
【０１１８】
トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離チャンバの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離チャンバの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離チャンバにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離チャンバに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離チャンバ（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離チャンバから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
【０１２０】
他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離チャンバの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離チャンバに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離チャンバ（例えば、隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離チャンバから選択的に取り出す。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離チャンバの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をチャンバ内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
【０１２２】
図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ〜図２Ｈは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
【０１２３】
Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は癌細胞のような癌由来細胞を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスを更に記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
【０１２４】
Ｃ．原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
【０１２５】
ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
【０１２６】
図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
【０１２７】
特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
【０１２８】
電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
【０１２９】
図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１３１】
他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
【０１３２】
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、及び米国特許出願公開第２０１６／０１８４８２１号（Hobbsら）（例えば、その図面全体を通して示されるデバイス２００、５０２、５０４、６００及び７００、並びにその説明を参照されたい）に記載されており、このそれぞれの内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１３３】
ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
【０１３４】
ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
【０１３５】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１３６】
更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
【０１３７】
誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）を有する。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
【０１４１】
したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
【０１４２】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
【０１４３】
マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
【０１４４】
Ｄ．隔離チャンバ
一般的な隔離チャンバ２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ〜図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離チャンバ２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離チャンバ２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離チャンバ２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
【０１４５】
図２Ａ〜図２Ｃの隔離チャンバ２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離チャンバの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離チャンバのフロアを形成する、隔離チャンバのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離チャンバの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離チャンバの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００にも当てはまる。
【０１４６】
したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離チャンバ２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ〜図２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
【０１４７】
図２Ｃは、本開示による隔離チャンバ２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
【０１４８】
既知のように、隔離チャンバ２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離チャンバ２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離チャンバ２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離チャンバ２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離チャンバ２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
【０１４９】
更に、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離チャンバ２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離チャンバ２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離チャンバ（例えば、図２Ｄの隔離チャンバ２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
【０１５０】
マイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離チャンバ２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離チャンバの分離領域とフロー領域との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
【０１５１】
マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
【０１５２】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
【０１５３】
図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
【０１５４】
図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
【０１５５】
図２Ｄ〜図２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離チャンバ２６６も有する。特に、図２Ｄ〜図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離チャンバ２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００での上述した隔離チャンバ１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
【０１５６】
図２Ｄ〜図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離チャンバ２６６が流体接続される。
【０１５７】
各隔離チャンバ２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離チャンバ２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
【０１５８】
図２Ｅに示されるように、各隔離チャンバ２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離チャンバ２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離チャンバ２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離チャンバ２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離チャンバ２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
【０１５９】
図２Ｅに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む：約３０°〜約９０°、約４５°〜約９０°、約６０°〜約９０°等。
【０１６０】
隔離チャンバの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
【０１６１】
隔離チャンバの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：約５０〜１０００μｍ、約５０〜５００μｍ、約５０〜４００μｍ、約５０〜３００μｍ、約５０〜２５０μｍ、約５０〜２００μｍ、約５０〜１５０μｍ、約５０〜１００μｍ、約７０〜５００μｍ、約７０〜４００μｍ、約７０〜３００μｍ、約７０〜２５０μｍ、約７０〜２００μｍ、約７０〜１５０μｍ、約９０〜４００μｍ、９０〜３００μｍ、約９０〜２５０μｍ、約９０〜２００μｍ、約９０〜１５０μｍ、約１００〜３００μｍ、約１００〜２５０μｍ、約１００〜２００μｍ、約１００〜１５０μｍ、及び約１００〜１２０μｍ。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００〜８００μｍ、約２００〜７００μｍ、又は約２００〜６００μｍの範囲であり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。更に、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離チャンバの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
【０１６２】
幾つかの実施形態では、隔離チャンバは、約３０〜約２００μｍ又は約５０〜約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離チャンバは、約１×１０４〜約３×１０６平方μｍ、約２×１０４〜約２×１０６平方μｍ、約４×１０４〜約１×１０６平方μｍ、約２×１０４〜約５×１０５平方μｍ、約２×１０４〜約１×１０５平方μｍ、又は約２×１０５〜約２×１０６平方μｍの断面積を有する。
【０１６３】
隔離チャンバの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜１００μｍ、２０〜９０μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜７０μｍ、２０〜６０μｍ、２０〜５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜９０μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜７０μｍ、３０〜６０μｍ、３０〜５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜９０μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜７０μｍ、４０〜６０μｍ、又は４０〜５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離チャンバの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。
【０１６４】
隔離チャンバの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００〜５０，０００平方μｍ、５００〜４０，０００平方μｍ、５００〜３０，０００平方μｍ、５００〜２５，０００平方μｍ、５００〜２０，０００平方μｍ、５００〜１５，０００平方μｍ、５００〜１０，０００平方μｍ、５００〜７，５００平方μｍ、５００〜５，０００平方μｍ、１，０００〜２５，０００平方μｍ、１，０００〜２０，０００平方μｍ、１，０００〜１５，０００平方μｍ、１，０００〜１０，０００平方μｍ、１，０００〜７，５００平方μｍ、１，０００〜５，０００平方μｍ、２，０００〜２０，０００平方μｍ、２，０００〜１５，０００平方μｍ、２，０００〜１０，０００平方μｍ、２，０００〜７，５００平方μｍ、２，０００〜６，０００平方μｍ、３，０００〜２０，０００平方μｍ、３，０００〜１５，０００平方μｍ、３，０００〜１０，０００平方μｍ、３，０００〜７，５００平方μｍ、又は３，０００〜６，０００平方μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。
【０１６５】
隔離チャンバの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約１〜６００μｍ、５〜５５０μｍ、１０〜５００μｍ、１５〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜５００μｍ、４０〜４００μｍ、６０〜３００μｍ、８０〜２００μｍ、又は約１００〜１５０μｍ。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。
【０１６６】
隔離チャンバの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２０〜５００μｍ、２０〜４００μｍ、２０〜３００μｍ、２０〜２００μｍ、２０〜１５０μｍ、２０〜１００μｍ、２０〜８０μｍ、２０〜６０μｍ、３０〜４００μｍ、３０〜３００μｍ、３０〜２００μｍ、３０〜１５０μｍ、３０〜１００μｍ、３０〜８０μｍ、３０〜６０μｍ、４０〜３００μｍ、４０〜２００μｍ、４０〜１５０μｍ、４０〜１００μｍ、４０〜８０μｍ、４０〜６０μｍ、５０〜２５０μｍ、５０〜２００μｍ、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、５０〜８０μｍ、６０〜２００μｍ、６０〜１５０μｍ、６０〜１００μｍ、６０〜８０μｍ、７０〜１５０μｍ、７０〜１００μｍ、及び８０〜１００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。
【０１６７】
隔離チャンバの様々な実施形態において、接続領域の基端開口部の幅Ｗｐｒは、隔離チャンバが意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、幅Ｗｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、又は約５０〜３００μｍ、約５０〜２００μｍ、約５０〜１００μｍ、約７５〜１５０μｍ、約７５〜１００μｍ、又は約２００〜３００μｍの範囲であり得る。
【０１６８】
隔離チャンバの様々な実施形態において、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記例と異なってもよい。
【０１６９】
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３００において、Ｖｍａｘは、約０．２マイクロリッター／秒、約０．３マイクロリッター／秒、約０．４マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．６マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約０．８マイクロリッター／秒、約０．９マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．１マイクロリッター／秒、約１．２マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．４マイクロリッター／秒、又は約１．５マイクロリッター／秒に設定することができる。
【０１７０】
隔離チャンバを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離チャンバの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも５×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、少なくとも５×１０８立方μｍ、少なくとも８×１０８立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。隔離チャンバを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離チャンバの容積は、約５×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、又は約８×１０７立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離チャンバの容積は、約１ナノリットル〜約５０ナノリットル、２ナノリットル〜約２５ナノリットル、２ナノリットル〜約２０ナノリットル、約２ナノリットル〜約１５ナノリットル、又は約２ナノリットル〜約１０ナノリットルであり得る。
【０１７１】
様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離チャンバを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約５〜約１０個の隔離チャンバ、約１０〜約５０個の隔離チャンバ、約１００〜約５００個の隔離チャンバ、約２００〜約１０００個の隔離チャンバ、約５００〜約１５００個の隔離チャンバ、約１０００〜約２０００個の隔離チャンバ、又は約１０００〜約３５００個の隔離チャンバを有する。隔離チャンバは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離チャンバ内の異なる特徴を含み得る。
【０１７２】
図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。マイクロ流体デバイス２８０は図２Ｇに示され、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離チャンバ１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離チャンバを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離チャンバは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
【０１７３】
Ｅ．システムネスト
図３Ａ〜図３Ｂは、本開示によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
【０１７４】
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
【０１７５】
通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
【０１７６】
特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ−ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
【０１７８】
図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
【０１８０】
ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェースを介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
【０１８１】
Ｆ．システム撮像デバイス
上述したように、システム１５０は撮像デバイスを含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイスは光変調サブシステム３３０（図３Ｂ参照）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。適する光変調サブシステム４２２の一例は、Andor Technologies（商標）のMosaic（商標）システムである。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
【０１８２】
特定の実施形態では、撮像デバイスは顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
【０１８３】
特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
【０１８４】
特定の実施形態では、撮像デバイスは、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は、構造化光（例えば、光変調サブシステム３３０を介する）を生成するために使用可能であり、第２の光源３３４は、非構造化光を提供するために使用可能である。第１の光源３３２は、光学作動動電性及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成可能であり、第２の光源３３４は、明視野照明を提供するために使用可能である。これらの実施形態では、原動モジュール１６４は、第１の光源３３２を制御するために使用可能であり、撮像モジュール１６４は、第２の光源３３４を制御するために使用可能である。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されたとき、光変調サブシステム３３０から構造化光を受け取ってマイクロ流体デバイスの少なくとも第１の領域、例えば、光学作動動電デバイスに構造化光を集束させるように、且つ（２）マイクロ流体デバイスから反射光及び／又は発光光を受け取ってかかる反射光及び／又は発光光の少なくとも一部を検出器３４８に集束させるように、構成可能である。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されたとき、第２の光源から非構造化光を受け取って、マイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域に非構造化光を集束させるように、更に構成可能である。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域はオーバーラップ領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、追加的又は代替的に、任意の好適な波長の光を有し得るレーザーを含み得る。図３Ｂに示される光学システムの図は模式図にすぎず、光学システムは、追加のフィルタ、ノッチフィルター、レンズ等を含み得る。第２の光源３３４が明視野及び／又は蛍光励起更にはレーザー照明のための１つ以上の光源を含む場合、光源の物理的構成は、図３Ｂに示されるものと異なり得ると共に、レーザー照明は、光学システム内の任意の好適な物理的位置に導入し得る。光源４３２及び光源４０２／光変調サブシステム４０４の模式的位置は、同様に交換し得る。
【０１８５】
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
【０１８７】
Ｇ．被覆溶液及び被覆剤
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
【０１８８】
被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
【０１８９】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、フロー領域（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離チャンバの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離チャンバのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離チャンバのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。
【０１９０】
被覆剤／溶液
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
【０１９１】
ポリマーベースの被覆材料
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
【０１９２】
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
【０１９３】
他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
【０１９４】
他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
【０１９５】
他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
【０１９６】
更に他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びに／或いはアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％ｖ／ｖの範囲で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
【０１９８】
共有結合される被覆材料
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
【０１９９】
共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
【０２００】
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
【０２０１】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。
【０２０２】
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得、ここで、アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
【０２０３】
他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
【０２０４】
他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、又は約２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
【０２０５】
共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
【０２０６】
共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離チャンバ及び／又はフロー領域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。
【０２０７】
調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は２つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子を更に含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第１の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。
【０２０８】
調整面特性
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がＤＥＰ力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式（例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング）等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１ｎｍ〜約７ｎｍ、約１ｎｍ〜約５ｎｍ、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成基板表面）に共有結合した場合、単層を形成し得、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５ｎｍ〜３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、約３０ｎｍの範囲の厚さを有するＣＹＴＯＰ（登録商標）（Asahi Glass Co., Ltd.、日本）フルオロポリマースピンコーティングの厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
【０２０９】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場）を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造（例えば、高密度単層構造）を有することができる。
【０２１０】
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
【０２１１】
単一又は複数パートの調整面
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、２部シーケンスで形成し得る。
【０２１２】
共有結合された被覆材料を準備する方法
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離チャンバ及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合した被覆材料は、式１又は式２の構造を有する。被覆材料は、表面に１ステップで導入される場合、式１の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式２の構造を有する。
【化１】
2019511454.tif 000002
【０２１３】
被覆材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。ＤＥＰ又はＥＷ構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。
【０２１４】
被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に結合し得、ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１〜２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基の群から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０〜２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子〜約２００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式２の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘとペアとなる反応部分Ｒｐｘ（すなわち、反応部分Ｒｘと反応するように構成される部分）との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な１つの結合基ＣＧはカルボキサミジル（carboxamidyl）基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）基、カルボキサミジル（carboxamidyl）、チオアミジル、オキシム、メルカプチル（mercaptyl）、二硫化物、エーテル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部）に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。結合基ＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、更に置換し得る（例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン（triazolylene）基）。
【０２１７】
幾つかの実施形態では、被覆材料（又は表面修飾リガンド）は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電層）を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る）を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１〜約７：１であり得るピラニア溶液）等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。
【０２１８】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス２００の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路１２０に堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６の誘電層及び／又はカバー１１０との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。２ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。
【０２１９】
図２Ｈは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、ＤＥＰ基板であり得る基板２８６の内面２９４と、マイクロ流体デバイス２９０のカバー２８８の内面２９２と、の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近くエンクロージャ２８４に向かって内側に面する略全ての内面２９４、２９２に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかに配置することができる。
【０２２０】
図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。上記の被覆材料２９８のいずれかを使用することができ（例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分）、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される（すなわち、内面２９２、２９４に結合されず、エンクロージャ２８４に近い被覆材料２９８の単層の部分）。
【０２２１】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は両性イオン部分をマイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）中に存在する非共有結合被覆剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とイオン結合を形成することができる。
【０２２２】
更に他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分（例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分）のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。
【０２２３】
適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
【０２２４】
マイクロ流体デバイスの隔離チャンバ内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
【０２２５】
ＩＶ．そのほかの実施形態
Ａ．Ｔ細胞又はＮＫ細胞を用いた実施形態
特定の場合には、解離細胞サンプル中にＴ細胞が存在し得る。かかる場合には、本方法は、元の解離サンプルよりも大きいパーセント又は濃度のＴ細胞を有する画分を単離するように解離細胞サンプルで選択を行うことを更に含み得る。このようにして、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を同一の患者の腫瘍サンプルから得ることができる。他の場合には、Ｔ細胞を同一の患者の血液から得ることができる。例えば、同一の患者から得られる血液サンプル（又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプル）からＴ細胞を選択できる。更に他の場合には、少なくとも１つの固形腫瘍を提供する患者でない被験者（例えば、血液ドナー又は組織ドナーである被験者）からＴ細胞を得ることができる。Ｔ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、及びＣＤ３から選択される少なくとも１つのＴ細胞マーカーを用いて解離細胞サンプル又は血液／ＰＢＭＣサンプルの他の細胞から分離し得る。Ｔ細胞源又は使用される選択手順（もしあれば）にかかわらず、得られたＴ細胞は、クローニングし得る及び／又は本明細書に開示される方法に使用し得る。例えば、Ｔ細胞（患者特異的又はドナー由来にかかわらず）は、ＣＡＲ−Ｔ治療剤を調製するために使用し得るか、又は他のタイプの免疫療法、例えば、ＴＩＬと他の治療剤（例えば、本明細書に開示される方法に従って調製される抗体）とを含む組合せ療法に使用し得る。
【０２２６】
Ｔ細胞と同様に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を本明細書に開示される方法に使用可能である。例えば、Topfer et al. (2015), J. Immunol. 194(7):3201-3212に記載されるように、ＣＡＲ治療剤を調製するためにＮＫ細胞を使用可能である。ＮＫ細胞は、例えば、血液サンプル又は組織サンプル（例えば、腫瘍から得られる解離細胞サンプル）から得ることができる。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６等の少なくとも１つのＮＫマーカーを用いてサンプル中の他の細胞から単離可能である。
【０２２７】
Ｂ．外部細胞源に依拠する実施形態
幾つかの実施形態では、細胞源は全て、単一の患者に由来する。他の実施形態では、このサブセクションで考察されるように、細胞源は、異なる患者又は異なる供給源に由来し得る。一態様では、本方法は、患者の癌細胞及び他の供給源の癌細胞の両方に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つのＢ細胞を同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することを含む（例えば、２ステッププロセスで）。一実施形態では、Ｂ細胞は、患者自身の癌細胞の調製時及び／又は培養時（例えば、患者の癌細胞をマイクロ流体デバイスにロードする前）に癌細胞系に対して試験される。Ｔ細胞又はＮＫ細胞はまた、同一の患者又は異なる供給源から得られ得る。
【０２２８】
Ｃ．正常細胞を利用した実施形態
所望により、Ｂ細胞により産生された抗体の特異性は、癌細胞及び非癌細胞（すなわち、正常細胞）の両方に結合する能力を比較することにより評価可能である。このため、任意選択的に、本方法は、Ｂ細胞により産生された抗体が非癌細胞に結合可能であるかを同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することを更に含み得る。非癌細胞及び癌細胞は、同一の腫瘍サンプルから解離し得る。代替的に、非癌細胞及び／又は癌細胞は、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルを提供する患者以外の被験者に由来し得る。
【０２２９】
癌細胞及び非癌細胞への抗体の結合を同定するために同一のマイクロ流体デバイスを使用し得る。癌細胞及び非癌細胞は、マイクロ流体デバイスの異なる部分にロードし得る。例えば、癌細胞（又は非癌細胞）は、Ｂ細胞と同一の分離チャンバ内に配置可能であり、且つ非癌細胞（又は癌細胞）は、分離チャンバがフローチャネル内に開口する場所に近接するフローチャネル内の位置に流入可能である。他の例では、癌細胞（又は非癌細胞）は、Ｂ細胞を含有する分離チャンバに隣接する分離チャンバ内に配置可能であり、且つ非癌細胞（又は癌細胞）は、Ｂ細胞を含有する分離チャンバがフローチャネル内に開口する場所に近接するフローチャネル内の位置に流入可能である。更に他の例では、癌細胞（又は非癌細胞）は、Ｂ細胞と共に分離チャンバ内に配置可能であり、且つ非癌細胞（又は癌細胞）は、Ｂ細胞を含有する分離チャンバに隣接する分離チャンバ内に配置可能である。癌細胞及び／又は非癌細胞の配置にかかわらず、同一のマイクロ流体デバイスを用いて抗体（例えば、Ｂ細胞により産生されたもの）が癌細胞及び／又は非癌細胞に結合するかを同時に評価することが可能である。他の実施形態では、癌細胞及び非癌細胞は、同一の流路（又は同一の分離領域）内に逐次的にロードして、（１）抗体と癌細胞との間及び（２）抗体と非癌細胞との間の結合の逐次検出を可能にし得る。
【０２３０】
Ｖ．治療方法及び治療用組成物
癌を有する患者は、本明細書に記載の方法により産生された抗体又はそのフラグメントにより治療し得る。一例では、腫瘍サンプルは、治療される同一患者から採取される。この方法の利点の１つは、所与の患者に対する個別化治療を設計可能であり、幾つかの場合には、比較的短い時間ウィンドウで個別化治療を施し得るので、患者の疾患状態に必要とされる時間で治療有効性が得られることである。例えば、幾つかの実施形態では、腫瘍サンプルを得てから治療に至るまでの時間は多くとも約２ヶ月であり得る。
【０２３１】
Ｂ細胞により産生された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を決定した後、可変配列の全部又は一部のいずれかを含有する多種多様な抗体又は抗体フラグメントの構築物を調製し得る。幾つかの場合には、患者は一本鎖抗体により治療し得る。他の場合には、患者は、２本の重鎖と２本の軽鎖とを有する抗体又はそのフラグメントにより治療し得る。幾つかの実施形態では、工学操作抗体構築物は、Ｆａｂ又はＦａｂ’（２）フラグメント、ｓｃＦｖ、多価ｓｃＦｖ（例えば、ダイアボディー又はトリボディー）、ミニボディー（例えば、ｓｃＦｖ−ＣＨ３ダイマー）、二重特異的Ａｂ、又はラクダ機能性重鎖可変ドメインを含む。他の実施形態では、工学操作抗体構築物は、本明細書の方法により同定された抗体の任意の変異体を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はフラグメントは、単離された形態で投与し得る。
【０２３２】
例えば、工学操作抗体構築物は、（ａ）本明細書の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖ＣＤＲ、（ｂ）本明細書の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、（ｃ）本明細書の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖可変領域、又は（ｄ）本明細書の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含み得る。
【０２３３】
他の場合には、抗体又はフラグメントを用いて各種構築物を調製し得る。例えば、工学操作Ｔ細胞又は工学操作ＮＫ細胞上に抗体を提示し得る。幾つかの実施形態では、工学操作Ｔ細胞はキメラ抗原受容体Ｔ細胞である。Ｔ細胞は、抗体を提示するように工学操作される前に、同一の患者から、例えば、患者の腫瘍サンプル又は患者から得られた血液サンプルから、得られ得る。かかるＴ細胞は、抗体又はそのフラグメントを発現するように遺伝子工学操作し得る。同様に、他の実施形態では、工学操作ＮＫ細胞はキメラ抗原受容体ＮＫ細胞である。ＮＫ細胞は、抗体を提示するように工学操作される前に、同一の患者から、例えば、患者の腫瘍サンプル又は患者から得られた血液サンプルから、得られ得る。かかるＮＫ細胞は、抗体又はそのフラグメントを発現するように遺伝子工学操作し得る。
【０２３４】
幾つかの形態では、抗体又はそのフラグメントは、他の療法と組み合わせて投与し得る。かかる場合には、組合せ療法は、手術、放射線療法、化学療法、ＣＡＲ−Ｔ療法、Ｔ細胞療法（例えば、ＴＩＬ等の患者自身のＴ細胞を単に増幅してそれを再導入することにより）、他の免疫療法（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、又はそれらの任意の組合せに対する阻害抗体等の機能阻止抗体を用いて、Ｔ細胞機能を阻害する既知の抗原を標的とすることにより）、又はＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、抗腫瘍ワクチン、サイトカイン、腫瘍特異的ウイルス等の免疫刺激剤の投与であり得る。
【０２３５】
ＶＩ．標識方法及び検出方法
本明細書の方法に従って産生された抗体はまた、検出方法に使用し得る。例えば、抗体を検出可能標識で標識して、癌細胞（患者自身の腫瘍細胞を含む）を検出又は標識するために生体内又は生体外で使用し得る。例えば、腫瘍の強調、外科切除の向上、及び生存率の増加のために、フルオロフォアコンジュゲート抗体を用いて蛍光ガイド下手術を行い得る。Alexa Fluor 488等のフルオロフォアを使用し得る。抗体−フルオロフォアコンジュゲートは、静脈内に注射し得るか又は手術時に切除表面に適用し得る。本明細書で産生される抗体はまた、他の検出方法又は標識方法にも使用し得る。
【実施例】
【０２３６】
実施例
実施例１．腫瘍生検物の処理及び解離細胞サンプルの断片化
Ａ．腫瘍サンプルの解離
腫瘍サンプルは、自身の腫瘍の外科切除を受けた患者から得られる。腫瘍切除の当日、手順の直後に実験室で検体を受け取る。検体は、無菌容器に入った無菌生理食塩水に浸漬する。スカルペル及び無菌フォーセプスを用いてラミナーフローフード内で生存可能腫瘍組織を生存不能組織及び健常（非癌）組織から切除する。生存可能腫瘍組織の他のサンプルを他の評価のために得てもよい。少量の無菌ＨＢＳＳを含有する５０ｍｌ遠心分離管に解離用腫瘍サンプルを秤取して保持する。細胞培養用の培地は、１０％ヒト血清（５６℃で３０分間熱不活性化）と、最終濃度のペニシリンＧ（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Hepes（２５ｍＭ）、及び２−メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）とをRPMI1640に追加することにより調製される。
【０２３７】
組織試料は、無菌カッティング表面（裁断板又はオープンペトリ皿）上に配置される。無菌スカルペル及びフォーセプスを用いて、検体を小さな（３〜５ｍｍ）断片にカットする。カットされた断片は、gentleMACS（登録商標）Ｃ管に移される。酵素培地（ＥＭ）を管に添加し（０．２〜２ｇの組織に対して５ｍｌ及び２〜５ｇに対して１０ｍｌ）、かすかなクリック音が聞かれるまでキャップを回すことにより管を確実に密閉する。ＥＭは、gentleMACS（登録商標）プログラムラン間の短いインキュベーション時間の間、外科試料からの細胞の分散を支援するために使用される。酵素含有培地RPMI1640は血清を含有しないが、ペニシリンＧ（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、Fungizone（登録商標）（１．２５μｇ／ｍｌ）、コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）、及びPulmozyme（登録商標）（約３０単位／ｍｌ）を含有する。酵素ストックは−２０℃で貯蔵された乾燥粉末である。
【０２３８】
gentleMACs Sleeve内にキャップ側を下向きにしてＣ管を鉛直に設置する。適正に設置することにより回転力及び軸方向力に対してＣ管を確実に適所に保持する。内部gentleMACS（登録商標）ディソシエータメモリーにより所定のプログラムが提供される。プログラムは強度がさまざまであるので、処理される組織のテクスチャーに依存して適切なプログラムを選択する。より軟質の組織は、より緩速の回転（より低速）を必要とし、より硬質の組織は、より激しいより長時間の回転を必要とする。ラン間で行われる解離状態の評価により、複数の解離ランを行い得る。解離組織は、２５０ｍｌ遠心分離管の頂部のオートクレーブ処理された漏斗内に配置されたオートクレーブ処理されたワイヤメッシュに通して濾過される。無菌ＨＢＳＳでワイヤメッシュを濯ぎ、追加の無菌ＨＢＳＳを管に充填する。次いで、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより解離組織を１回洗浄する。上清を吸引し、ペレットを既知量のＨＢＳＳ中に再懸濁する。
【０２３９】
Ｂ．腫瘍解離の代替手順
gentleMACS（登録商標）装置を用いて腫瘍解離を行う代替法として、消化緩衝液を使用し得る。腫瘍組織は、フォーセプスを用いて引き裂くか、又は小片（２〜５ｍｍ）にカットする。組織は、解離緩衝液（ＲＰＭＩ及び１０％ヒト血清中の１００単位／ｍｌのコラゲナーゼ及び１００μｇ／ｍｌのDNase（５６℃で３０分間熱不活性化））中に配置される。消化は、３７℃のインキュベーター中で３０分間進行させる。インキュベーション後、ピペットを用いてサンプルを上下にピペッティングし、易流動性単一細胞懸濁液を得る。
【０２４０】
懸濁液を７０ミクロンフィルターに通して濾過し、１０％ヒト血清が追加されたＭＡＣｓ分離緩衝液（５６℃で３０分間熱不活性化）で２回洗浄する。細胞懸濁液を４００×ｇで１０分間遠心分離する。ペレットを１０ｍｌのＭＡＣｓ緩衝液で濯ぎ、同一設定では再び遠心分離する。次いで、解離細胞を１００μｌのＭＡＣｓ緩衝液中に再懸濁させる。
【０２４１】
Ｃ．解離細胞サンプルからの細胞型の細分
以上のプロトコルのいずれかを用いて単一細胞を含む解離細胞サンプルを調製した後、解離細胞サンプルからＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び癌細胞を細分し得る。抗ＣＤ２０磁気ビーズを用いてＢ細胞を選択し得る。抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８磁気ビーズを用いてＴ細胞を選択し得る。抗ＣＤ５６磁気ビーズを用いてＮＫ細胞を選択し得る。癌細胞に特異的な抗体に付着された磁気ビーズを用いて、癌細胞を選択し得るか、又は形態学的評価を用いて癌細胞を手動で除去し得る。
【０２４２】
細分される第１の細胞型を標的とする抗体標識マイクロビーズ（１０８細胞当たり約１０μｌ）を解離細胞サンプルに添加する。管を軽くフリッキングし、光を遮蔽して４〜８℃で１５分間インキュベートすることにより、管を十分に混合する。１０ｍｌのＭＡＣｓ緩衝液を添加して４００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞を洗浄する。上清を注加（又は吸引）により除去し、細胞を５００μｌのＭＡＣｓ緩衝液中に再懸濁させる。新しいカラムをマグネットセパレーターに適用する。選択されたカラムに適切な量のＭＡＣｓ緩衝液で濯ぐことによりカラムをプライミングする。カラムのプライミング後、１×１０８細胞ごとに１つのカラムを使用して細胞懸濁液をカラムの頂部に適用する。いずれの非標識細胞（通過）も収集し、異なる細胞型の単離のために保存する。第１の洗浄では、合計で１．５〜２．５ｍｌの流体洗浄液となるように５００μｌ量でカラムを最小で３回且つ最大で５回洗浄する。純度に影響を及ぼし得ると共に細胞生存能の損失をもたらし得る枯渇が起こらないように、カラム中の流体フローを維持する）。
【０２４３】
第２の洗浄では、死滅又は瀕死の腫瘍細胞に由来する固着性デブリを洗い流すために、コラゲナーゼとDNaseとを含む解離緩衝液ミックスでカラムを洗浄する（ＲＰＭＩ及び１０％ヒト血清中の１００単位／ｍｌのコレゲナーゼ及び１００μｇ／ｍｌのDNase（５６℃で３０分間熱不活性化））。第３の洗浄では、洗浄液が完全に透明に見えるまで、再びＭＡＣｓ緩衝液を使用する。
【０２４４】
カラムを磁気分離器から取り出し、好適な収集管上に配置する。２ｍｌの緩衝液をカラム上に配置し、カラムに付属するプランジャーをしっかりと適用することにより磁気標識細胞を収集する。
【０２４５】
代替的に、AutoMACS（登録商標）により磁気分離を行い得る。
【０２４６】
Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び癌細胞のそれぞれを単離するために、追加の分離ステップを行う。所望により磁気ビーズを細胞から除去する。
【０２４７】
実施例２．マイクロ流体デバイスにおけるＩｇＧ抗体を分泌するマウス脾細胞のスクリーニング
ヒトＣＤ４５に結合するＩｇＧ型抗体を分泌するマウス脾細胞を同定するために、スクリーニングを行った。実験設計は、次のステップ、すなわち、
１．ＣＤ４５抗原コーティングビーズの生成、
２．マウス脾細胞の採取、
３．マイクロ流体デバイスへの細胞のローディング、及び
４．抗原特異性のアッセイ、
を含んでいた。
【０２４８】
実験に使用した試薬は、表１に示されるものを含んでいた。
【０２４９】
【表１】
2019511454.tif 000003
【０２５０】
ＣＤ４５抗原コーティングビーズの生成
ＣＤ４５抗原コーティングマイクロビーズを以下のように生成した。
・５０μｇの担体フリーＣＤ４５を５００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に再懸濁させた。
・slide-a-lyzer miniカップを５００μＬのＰＢＳで濯ぎ、次いで、遠心分離管に入れた。
・濯いだslide-a-lyzer miniカップに５０μＬの０．１μｇ／μＬ  ＣＤ４５溶液を添加した。
・１７０μＬのＰＢＳを２ｍｇのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンに添加した後、４．１μＬのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンをＣＤ４５抗原の入ったslide-a-lyzer miniカップに添加した。
・ＮＧＳ−ＰＥＧ４−ビオチンをＣＤ４５抗原と共に室温で１時間インキュベートした。
・インキュベーション後、slide-a-lyser miniカップを遠心分離管から取り出して第２の遠心分離管内の１．３ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に配置し、揺動させながら第１の１時間にわたり４℃でインキュベートした。続いて、slide-a-lyser miniカップを１．３ｍｌの新鮮なＰＢＳ（ｐＨ７．２）の入った第３の遠心分離管に導入し、揺動させながら第２の１時間にわたり４℃でインキュベートした。この最終ステップを更に３回繰り返し、１時間のインキュベーションを合計で５回行った。
・１００μＬのビオチン化ＣＤ４５溶液（約５０ｎｇ／μＬ）をピペッティングにより標識管に入れた。
・５００μＬのSpherotechストレプトアビジンコーティングビーズをピペッティングにより遠心分離管に入れ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し（１０００μＬ／洗浄）、次いで、３０００ＲＣＦで５分間遠心分離した。
・ビーズを５００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、５ｍｇ／ｍｌのビーズ濃度を得た。
・５０μＬのビオチン化タンパク質と再懸濁させたSpherotechストレプトアビジンコーティングビーズとを混合した。揺動させながら２時間にわたり混合物を４℃でインキュベートし、次いで、４°、３０００ＲＣＦで５分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、ＣＤ４５コーティングビーズを１ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。次いで、４℃、３０００ＲＣＦでビーズを更に５分間遠心分離した。最後に、ＣＤ４５ビーズを５００μＬのＰＢＳ  ｐＨ７．４中に再懸濁させ、４℃で貯蔵した。
【０２５１】
マウス脾細胞の採取
ＣＤ４５で免疫されたマウスから脾臓を採取し、ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ中に配置した。ハサミを用いて脾臓をミンスした。
【０２５２】
ミンスした脾臓を４０μｍ細胞ストレーナー中に配置した。１０ｍｌピペットを用いて単一細胞を細胞ストレーナーに通して洗浄した。ガラス棒を用いて脾臓を更に破壊し、単一細胞を押圧して細胞ストレーナーに通し、その後、１０ｍｌピペットを用いて単一細胞を再び細胞ストレーナーに通して洗浄した。
【０２５３】
市販のキットを用いて赤血球を溶解させた。
【０２５４】
細胞を２００×Ｇで遠心沈降させ、１０ｍｌのピペットを用いて生の脾細胞をＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ中に２ｅ８細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
【０２５５】
マイクロ流体デバイス内の細胞のローディング
脾細胞をマイクロ流体チップ内に取り込み、２０〜３０細胞／ペンを含有するようにペン内にロードした。１００マイクロリットルの培地を１μＬ／ｓでデバイスに通して流動させ、望ましくない細胞を除去した。温度を３６℃に設定し、培養培地を０．１μＬ／ｓｅｃで３０分間かん流させた。
【０２５６】
抗原特異性アッセイ
１：２５００ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２−Alexa 568を含有する細胞培地を調製した。
【０２５７】
１：２５００希釈のヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２−Alexa 568を含有する２２μＬの細胞培地中に１００μＬのＣＤ４５ビーズを再懸濁させた。
【０２５８】
次いで、脾細胞を含有するペンに隣接して、ただし、そのすぐ外側に位置決めされるまで、再懸濁させたＣＤ４５ビーズを１μＬ／ｓｅｃの速度でマイクロ流体チップのメインチャネルに流入させた。次いで、流体フローを停止させた。
【０２５９】
次いで、明視野でマイクロ流体チップの撮像を行ってビーズの位置を決定した。
【０２６０】
次いで、テキサスレッドフィルターを用いて細胞及びビーズの像をキャプチャーした。５分ごとに１時間にわたりそれぞれ露光持続時間１０００ｍｓ及びゲイン５で像を取り込んだ。
【０２６１】
結果
特定のペンからメインチャネル内に拡散してＣＤ４５コーティングビーズに結合可能なＩｇＧアイソタイプ抗体の拡散を反映して、ビーズ上に発生する陽性シグナルが観測された。ビーズに抗ＣＤ４５抗体が結合することにより、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ−５６８がビーズと一体化して検出可能なシグナルを生成した。図５Ｃの白矢印を参照されたい。
【０２６２】
本明細書に開示される方法を用いて、陽性シグナルに関連付けられた各脾細胞群を分離し、単一細胞として新しいペン内に移動させ、再分析することが可能であった。このようにして、抗ＣＤ４５ＩｇＧ抗体を発現する単一細胞を検出することが可能であった。
【０２６３】
実施例３．膜の調製及びビーズへの膜抗原のコンジュゲーション
次のプロトコルにより、対象のサンプル細胞からタンパク質（及び他のバイオ分子）、特に膜結合タンパク質又は膜関連タンパク質を含有するサンプルを得ることが可能であることを実証する。このプロトコルをジャーカット細胞で行うことにより、かかる細胞に存在することが知られるタンパク質に関して得られたサンプルを試験することが可能である。このプロトコルは、腫瘍生検物から単離された癌細胞を含めて他の細胞型に容易に拡張可能であるので、抗原への反応性を示す免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）をスクリーニングするのに有用な腫瘍細胞特異的（又は他の細胞型に特異的な）抗原を含有するサンプルが得られる。
【０２６４】
材料：
・ジャーカット細胞（ATCC TIB-152）
・ＬｉＤＳ−サンプル緩衝液：０．０２ｇ／ｍＬ  ＬｉＤＳ、１０％グリセロール、０．５１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２４７ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５（ThermoFisher B0008）
・Qiashredder（Qiagen 79654）
・ＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含有、ThermoFisher 14040-182）
・超純水（ThermoFisher 10977-015）
・EZ-Linkスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（ThermoFisher 21328）：−２０℃で貯蔵し、使用約３０分前に取り出して室温で加温する。短時間の遠心沈降を行って管の底にあるもの全てを収集する。使用直前に、１ｍｇのスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンの入った１つの管に１６４μＬの超純水を添加し、上下に数回ピペッティングして溶解させる（１０ｍＭ溶液が得られる）。
・Complete Ultra mini（Sigma 5892791001）：２０×溶液を調製する。ボルテックスすることにより５００μＬの水に１つの錠剤を溶解させる（４℃又は−２０℃で４週間安定）。
・Minute形質膜タンパク質単離キット（Invent Biotechnologies SM-005）：使用前に、溶液Ａ及びＢを解凍し、以下のようにプロテアーゼ阻害剤を添加する。
・各サンプルに対して５００μＬの緩衝液Ａ＋２５μＬの２０×プロテアーゼ阻害剤（氷上で貯蔵）
・各サンプルに対して２００μＬの緩衝液Ｂ＋１０μＬの２０×プロテアーゼ阻害剤（氷上で貯蔵）
・各サンプルに対して１つのフィルターカートリッジを氷上に準備する。
・ＢＳＡ：Chromatopurウシアルブミン（MP Biomedicals 02180561）
・ストレプトアビジンコーティング磁気マイクロスフェア（Bangs Laboratories CM01N Lot# 11806）、使用前に以下のように洗浄しブロックする。
・ビーズをボルテックスし、３００μＬ／サンプルを取り出し、１．５ｍＬ管に移す。
・ＰＢＳで洗浄する。
・０．５％ＢＳＡ中に再懸濁し、４℃で（回転しながら）少なくとも１時間インキュベートする。
・ＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＤＰＢＳ（＋プロテアーゼ阻害剤）／サンプル中に再懸濁する。
・抗α１ナトリウムカリウムＡＴＰアーゼ（Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰアーゼ）抗体（Abcam ab7671）
・抗ヒトＣＤ３抗体、クローンＳＫ７（BioLegend 344802）
・抗ヒトＣＤ４５抗体、クローンＨＩ３０（BioLegend 304002）
・Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Alexa Fluor 488（ThermoFisher A-11017）
【０２６５】
膜タンパク質のビオチン化：
・ジャーカット細胞数をカウントする。
・ウェスタンブロット分析用のアリコートの準備：
・２×１０６細胞を遠心分離する。
・ＰＢＳで洗浄する。
・ＬｉＤＳ−サンプル緩衝液に溶解させ、Qiashredderカラムを介して遠心分離し、ＤＮＡを剪断する。
・数日であれば４℃で、より長期間であれば−８０℃で貯蔵する。
・ＤＰＢＳを用いて遠心分離により複数組の１５×１０６細胞を３回洗浄する。
・各ペレットを５００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁し、１．５ｍＬ管に移し、１０μＬの新たに調製した１０ｍＭスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンを添加する。
・室温で３０分間回転させる。
・冷ＤＰＢＳで３回洗浄し、続いて細胞ペレットの膜画分の富化を進める。
・ウェスタンブロット分析用に１つのサンプルを処理する（上記参照）。
【０２６６】
図６は、形質膜中に存在するタンパク質Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ及びサイトゾルタンパク質ＧＡＰＤＨを染色した例示的なウェスタンブロットを示す。
【０２６７】
Minute形質膜単離キットを用いた膜画分の富化：
・全てのステップを氷上で行い、４℃で遠心分離する。
・緩衝液Ａ：＜５×１０６細胞の場合は２００μｌ及び＞５×１０６細胞の場合は５００μｌ中にペレットを再懸濁する。
・氷上で１０分間インキュベートする。
・１０〜３０秒間激しくボルテックスし、ただちに、氷上のフィルターカートリッジに移す。
・フィルターカートリッジにキャップをし、１６，０００ｇで３０秒間遠心分離する（細胞ライセートが通り抜けない場合、２分間まで延長する）。
・収集管内でペレットを再懸濁し、同一のフィルタに移し、再び遠心分離する。
・フィルタを廃棄し、激しく１０秒間ボルテックスすることによりペレットを再懸濁する。
・７００ｇで１分間遠心分離する（インタクト核をペレット化する）。
・新しい１．５ｍｌ管で上清を１６，０００ｇ／４℃で３０分間遠心分離する（→上清はサイトゾルを含有し、ペレット＝全膜タンパク質画分である）。
・ボルテックスすることにより又は上下にピペッティングすることにより２００μｌの緩衝液Ｂ中にペレットを再懸濁する。
・７，８００ｇ／４℃で２０分間遠心分離する→ペレットはオルガネラ膜タンパク質を含有する。
・新しい２．０ｍｌ管に上清（膜画分）を注意深く移す。
【０２６８】
ストレプトアビジンコーティング磁気マイクロスフェアへの膜画分の結合：
・８０μＬの各膜画分を５００μＬのビーズに添加する。
・４℃で一晩回転させる。
・ウェスタンブロット分析用に非結合画分を保存する。
・０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤中で３０分間回転させる。
・ＰＢＳで洗浄する。
・２５０μＬの０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤中に再懸濁する。
・ビーズからの膜画分の放出（ＤＴＴを用いてＳ−Ｓ結合を切断する）：
・５０μＬのビーズのアリコートを取り出す。
・磁石を作動し、溶液を除去する。
・５０ｍＭ  ＤＴＴ（１×還元剤、ThermoFisher B0009）を含有する５０μＬのＬｉＤＳ−サンプル緩衝液中にビーズを再懸濁する。
・室温で２時間インキュベートする（約３０分ごとに混合する）。
【０２６９】
抗体染色：
・各抗体に対して以下の希釈率でビーズの５０μＬのアリコートを取り出す（ステップ２４から）。
・ＣＤ３（１：２００）
・ＣＤ４５（１：１００）
・Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ（１：１００）
・一次抗体なし
・４℃で３０分間回転させる。
・８００μＬのＰＢＳを添加して洗浄し、ＰＢＳでもう１回洗浄する。
・二次抗体（Alexa 488コンジュゲートヤギ抗マウス）中、４℃、１：３００で３０分間インキュベートする（回転させながら、体積：２００μＬ、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤中）。
・８００μＬのＰＢＳを添加して洗浄し、ＰＢＳでもう１回洗浄する。
・２０μＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤中に再懸濁する。
・蛍光顕微鏡の撮像を行う。
【０２７０】
図７は、ＣＤ３、ＣＤ４５、又はＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを染色してジャーカット細胞膜画分でコーティングされたビーズを示す。よりかすかなスポットとして現れるＮＡ／Ｋ−ＡＴＰアーゼと比較して、ＣＤ３及びＣＤ４５は両方とも強く現われる。図８は、ＨＥＫ２９３細胞との比較を示す。ここでは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは同じに染色されるが、ＣＤ３及びＣＤ４５は不在である。
【０２７１】
細胞膜調製物から単離されたタンパク質は、ビーズにうまく結合可能であることが、結果から実証される。かかるビーズを免疫細胞と混合して、どの細胞が細胞膜調製物中に存在する抗原（タンパク質であるか否かにかかわらず）に反応するかを決定することが可能であった。
【０２７２】
実施例４．ビーズコンジュゲート癌細胞由来抗原に結合する抗体を発現するＢ細胞の同定
患者自身の髄様乳癌細胞に結合する抗体を発現する患者特異的Ｂ細胞を同定するために、スクリーニングを行うことが可能である。実験設計は、以下のステップ、すなわち、
・Ｂ細胞及び癌細胞の採取及び選択を行うステップと、
・癌細胞から細胞膜調製物を得て膜抗原をビーズにコンジュゲートするステップと、
・Ｂ細胞をマイクロ流体デバイス内にロードするステップと、
・癌細胞由来膜抗原にコンジュゲートされたビーズをマイクロ流体デバイス内にロードするステップと、
・Ｂ細胞により産生された抗体とビーズとの結合をアッセイするステップと、
を含み得る。
【０２７３】
Ａ．細胞の採取及び選択
髄様乳癌腫瘍の生検物は患者から得られ、生検物の細胞は実施例１（上記）に記載したように解離される。Ｂ細胞は、得られた解離細胞サンプルから抗ＣＤ−２０磁気ビーズを用いて選択されるので、Ｂ細胞富化細胞サンプルが生成される。次いで、抗ＥＲ（エストロゲン受容体）磁気ビーズと抗ＰＲ（プロゲステロン受容体）磁気ビーズと抗ＨＥＲ２磁気ビーズとの混合物を用いて、Ｂ細胞枯渇解離細胞サンプル中に残留する細胞から非髄様乳癌細胞を枯渇させると、三重陰性乳癌細胞富化サンプルが生成される。
【０２７４】
Ｂ．乳癌細胞からの細胞膜の調製及びビーズへの膜抗原のコンジュゲーション
パートＡで得られた三重陰性乳癌細胞富化サンプルから出発して、癌細胞由来の細胞膜を調製し、以上の３に記載されるように、ビーズにコンジュゲートすることが可能である。
【０２７５】
Ｃ．マイクロ流体デバイス内への細胞のローディング
次いで、Ｂ細胞富化細胞サンプルは、０．１〜１．０マイクロリットル／ｓｅｃの速度で１〜３マイクロリットルのサンプルをフローチャネルに流入させることによりマイクロ流体チップにロードされる。次いで、サンプルのフローは停止されるが、サンプル中の細胞はフローチャネル内に位置決めされ、Ｂ細胞はＤＥＰ力（例えば、ＯＥＴ）を用いて選択的に捕捉され、フローチャネルに接続された分離チャンバの分離領域内に移動される。単一のＢ細胞は、複数の分離チャンバのそれぞれに配置される。使用されるマイクロ流体チップのサイズに依存して、３０００細胞以上のＢ細胞は、単一のチップで個別に単離可能である。一般に、より少数のＢ細胞がサンプル中に存在すると予想される。結果として、サンプル中のＢ細胞は全て、単離可能である。Ｂ細胞を分離チャンバ内に移動させた後、フローチャネルから望ましくない細胞及びデブリを排除するために、フローチャネルは、新鮮培地を用いてフラッシュされる。
【０２７６】
フローチャネルを清浄化した後、三重陰性乳癌細胞富化サンプルがチップにロードされる。Ｂ細胞富化サンプルと同様に、１〜３マイクロリットルの癌細胞富化サンプルが、０．１〜１．０マイクロリットル／ｓｅｃの速度でフローチャネルに流入され、次いで、フローが停止される。形態学的形質を用いて、複数の癌細胞（例えば、３〜６個）がＤＥＰ力（例えば、ＯＥＴ）を用いて選択され、Ｂ細胞を含有する各分離チャンバ内に移動される。癌細胞を分離チャンバ内に移動させた後、フローチャネルから望ましくない細胞及びデブリを排除するために、フローチャネルは、新鮮培地を用いてフラッシュされる。このようにして、マイクロ流体チップの複数の分離チャンバ内に単一のＢ細胞及び複数の髄様乳癌細胞がロードされる。
【０２７７】
Ｄ．マイクロ流体デバイス内へのビーズのローディング
フローチャネルを清浄化した後、三重陰性乳癌細胞富化サンプルから得られた膜抗原にコンジュゲートされたビーズがチップにロードされる。Ｂ細胞富化サンプルと同様に、１〜３マイクロリットルの癌細胞関連抗原コンジュゲートビーズが、０．１〜１．０マイクロリットル／ｓｅｃの速度でフローチャネルに流入され、次いで、フローが停止される。ビーズは、Ｂ細胞を含有する各分離チャンバ内に移動される。ビーズを分離チャンバ内に移動させた後、フローチャネルから望ましくないビーズ及びデブリを排除するために、続いて、フローチャネルは、新鮮培地を用いてフラッシュされる。このようにして、マイクロ流体チップの複数の分離チャンバ内に単一のＢ細胞及び複数の癌細胞関連抗原コンジュゲートビーズがロードされる。代替的に、ビーズは、以上の実施例２に記載されるように、チャネルに残存させ得る。
【０２７８】
Ｅ．抗体結合アッセイ
単離されたＢ細胞のいずれかが、癌細胞関連抗原に結合する抗体を産生するかを決定するために、マイクロ流体チップ内のＢ細胞は、抗体発現を助長する条件下でインキュベートされる。かかるインキュベーションの後、ヒト抗体の定常領域に結合する二次抗体の混合物を含有する培地をマイクロ流体チップに流入させ、次いで、停止させる。蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、及び任意選択的にヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、及び／又はＩｇＤに対する抗体を含有し得る抗体混合物中の抗体は、分離チャンバ内を拡散可能であり、且つＢ細胞により産生された抗体に結合可能である。Ｂ細胞により産生された抗体が、対応する分離チャンバ内のビーズにコンジュゲートされた癌細胞関連抗原の１つ以上に結合する場合、抗ヒト二次抗体（及びその標識）は、ビーズの表面に検出可能に結合された状態になるであろう。ビーズがチャネルに残留する場合、蛍光標識二次抗体は、ビーズをマイクロ流体デバイスに流入させる前にビーズと混合可能である。
【０２７９】
二次抗体のインキュベーションステップ時、蛍光シグナル検出用フィルター（例えば、テキサスレッドフィルター）を用いてマイクロ流体チップの撮像が周期的に行われる。５分ごとに１時間にわたりそれぞれ露光持続時間１０００ｍｓで像を取り込むことが可能である。
【０２８０】
Ｆ．結果
陽性シグナルは、癌細胞関連抗原に結合する抗体を発現するＢ細胞を含有する任意の分離チャンバ内の（又はそれに近接する）ビーズの表面に発生して観測可能である。本方法を用いて、対象の抗体を発現する個別Ｂ細胞を特異的に同定することが可能である。興味深い抗体を何ら産生しないＢ細胞は、その分離チャンバから移動させてマイクロ流体チップから搬出し廃棄可能である。患者の髄様乳癌細胞由来の抗原に結合する抗体を発現するとして同定されたＢ細胞は、分離チャンバから移動させて（例えば、ＯＥＴ等のＤＥＰ力を用いて）、発現された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の増幅及びシーケンシングのために搬出可能である。抗体の発現を誘導しつつＢ細胞を増殖させた場合、Ｂ細胞のクローン集団は、発現された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の増幅及びシーケンシングのために搬出可能である。
【０２８１】
実施例５．癌細胞に結合する抗体を発現するＢ細胞の同定
代替的に、患者自身の髄様乳癌細胞に結合する抗体を発現する患者特異的Ｂ細胞を同定するために、スクリーニングを行うことが可能である。実験設計は、以下のステップ、すなわち、
・Ｂ細胞及び癌細胞の採取及び選択を行うステップと、
・マイクロ流体デバイスに細胞をロードするステップと、
・Ｂ細胞により産生された抗体と癌細胞との結合をアッセイするステップと、
を含み得る。
【０２８２】
Ａ．細胞の採取及び選択
髄様乳癌腫瘍の生検物は患者から得られ、生検物の細胞は実施例１（上記）に記載したように解離される。Ｂ細胞は、得られた解離細胞サンプルから抗ＣＤ−２０磁気ビーズを用いて選択されるので、Ｂ細胞富化細胞サンプルが生成される。次いで、抗ＥＲ（エストロゲン受容体）磁気ビーズと抗ＰＲ（プロゲステロン受容体）磁気ビーズと抗ＨＥＲ２磁気ビーズとの混合物を用いて、Ｂ細胞枯渇解離細胞サンプル中に残留する細胞から非髄様乳癌細胞を枯渇させると、三重陰性乳癌細胞富化サンプルが生成される。
【０２８３】
Ｂ．マイクロ流体デバイス内への細胞のローディング
次いで、Ｂ細胞富化細胞サンプルは、０．１〜１．０マイクロリットル／ｓｅｃの速度で１〜３マイクロリットルのサンプルをフローチャネルに流入させることによりマイクロ流体チップにロードされる。次いで、サンプルのフローは停止されるが、サンプル中の細胞はフローチャネル内に位置決めされ、Ｂ細胞はＤＥＰ力（例えば、ＯＥＴ）を用いて選択的に捕捉され、フローチャネルに接続された分離チャンバの分離領域内に移動される。単一のＢ細胞は、複数の分離チャンバのそれぞれに配置される。使用されるマイクロ流体チップのサイズに依存して、３０００細胞以上のＢ細胞は、単一のチップで個別に単離可能である。一般に、より少数のＢ細胞がサンプル中に存在すると予想される。結果として、サンプル中のＢ細胞は全て、単離可能である。Ｂ細胞を分離チャンバ内に移動させた後、フローチャネルから望ましくない細胞及びデブリを排除するために、フローチャネルは、新鮮培地を用いてフラッシュされる。
【０２８４】
フローチャネルを清浄化した後、三重陰性乳癌細胞富化サンプルがチップにロードされる。Ｂ細胞富化サンプルと同様に、１〜３マイクロリットルの癌細胞富化サンプルが、０．１〜１．０マイクロリットル／ｓｅｃの速度でフローチャネルに流入され、次いで、フローが停止される。形態学的形質を用いて、複数の癌細胞（例えば、３〜６個）がＤＥＰ力（例えば、ＯＥＴ）を用いて選択され、Ｂ細胞を含有する各分離チャンバ内に移動される。癌細胞を分離チャンバ内に移動させた後、フローチャネルから望ましくない細胞及びデブリを排除するために、フローチャネルは、新鮮培地を用いてフラッシュされる。このようにして、マイクロ流体チップの複数の分離チャンバ内に単一のＢ細胞及び複数の髄様乳癌細胞がロードされる。
【０２８５】
Ｃ．抗体結合アッセイ
単離されたＢ細胞のいずれかが、癌細胞に結合する抗体を産生するかを決定するために、マイクロ流体チップ内のＢ細胞は、抗体発現を助長する条件下でインキュベートされる。かかるインキュベーションの後、ヒト抗体の定常領域に結合する二次抗体の混合物を含有する培地をマイクロ流体チップに流入させ、次いで、停止させる。蛍光標識された抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、及び任意選択的にヒトＩｇＡ、ＩｇＥ、及び／又はＩｇＤに対する抗体を含有し得る抗体混合物中の抗体は、分離チャンバ内を拡散可能であり、且つＢ細胞により産生された抗体に結合可能である。Ｂ細胞により産生された抗体が、対応する分離チャンバ内の癌細胞の１つ以上に結合する場合、抗ヒト二次抗体（及びその標識）は、髄様乳癌細胞の表面に検出可能に結合された状態になるであろう。
【０２８６】
二次抗体のインキュベーションステップ時、蛍光シグナル検出用フィルター（例えば、テキサスレッドフィルター）を用いてマイクロ流体チップの撮像が周期的に行われる。像は、５分ごとに１時間にわたりそれぞれ露光持続時間１０００ｍｓで取り込まれる。
【０２８７】
Ｄ．結果
陽性シグナルは、癌細胞に結合する抗体を発現するＢ細胞を含有する任意の分離チャンバ内の癌細胞の表面に発生して観測可能である。本方法を用いて、対象の抗体を発現する個別Ｂ細胞を特異的に同定することが可能である。興味深い抗体を何ら産生しないＢ細胞は、その分離チャンバから移動させてマイクロ流体チップから搬出し廃棄可能である。患者の髄様乳癌細胞に結合する抗体を発現するとして同定された各Ｂ細胞は、分離チャンバから移動させて（例えば、ＯＥＴ等のＤＥＰ力を用いて）、発現された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の増幅及びシーケンシングのために搬出可能である。抗体の発現を誘導しつつＢ細胞を増殖させた場合、Ｂ細胞のクローン集団は、発現された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の増幅及びシーケンシングのために搬出可能である。
【０２８８】
実施例６．ＣＡＲ−Ｔと腫瘍崩壊ウイルスとを用いた組合せ療法
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）リダイレクトＴ細胞は、癌治療で大きな利益を提供する可能性を有する。神経芽腫等の癌を有する患者は、生検又は外科切除を受け、癌に結合する抗体を産生するＢ細胞は、上記の実施例を用いて同定される。ＣＡＲ−Ｔ細胞系は、同定されたＢ細胞により産生される抗体に対応する抗体又はそのフラグメントを発現するように工学操作される（対応するとは、少なくとも同一の重鎖ＣＤＲ、少なくとも同一の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、少なくとも可変重鎖、又は少なくとも可変重鎖及び可変軽鎖を有することを意味する）。この患者では、ＣＡＲ−Ｔ細胞系は、ｓｃＦｖを発現するように工学操作され、重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされる。コンビナトリアルｓｃＦｖ遺伝子は、スプライシングバイオーバーラップＰＣＲにより生成され、次いで、ベクターファージＤＮＡの制限部位内にライゲートされる。
【０２８９】
ｓｃＦｖ配列は、ＳＦＧレトロウイルス骨格等のレトロウイルス骨格内にインフレームでクローニングされる。レトロウイルス上清は、２３９Ｔ細胞を用いて調製される。レトロウイルスを含有する上清は、４８及び７２時間後に収集される。トランスダクションでは、ＯＫＴ３抗体（Ortho Biotech, Bridgewater, NJ）及びＣＤ２８抗体（Becton Dickinson, Mountain View, CA）並びに組換えヒトＩＬ−１２（１００単位／ｍｌ、Proleukin, Chiron, Emeryville, CA）で活性化された０．５×１０６／ｍｌ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、組換えフィブロネクチン断片（FN CH-296、レトロネクチン、宝酒造株式会社、日本国大津市）でプレコートされた２４ウェルプレート中の完全培地（RPMI 1640  ４５％、クリック培地４５％、並びに１０％熱滅菌ヒト血清及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）にプレーティングされる。ウイルス上清の添加後、細胞をスピン処理し、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートする。Ｔリンパ球上のＣＡＲ発現は、７２時間後に測定され、細胞は、３日ごとにｒＩＬ−２（５０単位／ｍｌ）が追加される完全培地中、培養下で維持される。
【０２９０】
かかるＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍崩壊アデノウイルス等の腫瘍崩壊ウイルスの投与と共に患者に養子導入される。腫瘍崩壊アデノウイルスはＡｄ５Ｄ２４であり得ると共に、任意選択的に組換えＩＬ１５、ＲＡＮＴＥＳ、又はそれらの組合せを発現する。患者は有意な臨床改善を有すると予想される。
【０２９１】
例示的な実施形態のリスト
１．抗体治療剤の調製方法であって、
患者から得られた少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから解離細胞サンプルを提供することと、
少なくとも１つのフロー領域とフロー領域に流体接続された少なくとも１つの分離領域とを有するマイクロ流体デバイスに解離細胞サンプルをロードすることと、
少なくとも１つのＢ細胞を解離細胞サンプルからマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域に移動させることにより少なくとも１つの単離されたＢ細胞を得ることと、
癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定することと、
を含む方法。
【０２９２】
２．前記分離領域が、Ｂ細胞リンパ球生存能を向上させる少なくとも１つの調整された表面を含み、前記調整された表面が、共有結合された分子を含む、実施形態１に記載の方法。
【０２９３】
３．前記分離領域が、Ｂ細胞リンパ球生存能を向上させる複数の調整された表面を含み、各調整された表面が、共有結合された分子を含む、実施形態１に記載の方法。
【０２９４】
４．前記少なくとも１つの調整された表面又は前記複数の各調整された表面が、共有結合された親水性分子の層を含む、実施形態２又は３に記載の方法。
【０２９５】
５．前記親水性分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態４に記載の方法。
【０２９６】
６．前記分離領域が、Ｂ細胞生存能を向上させるコーティング材料でコーティングされた少なくとも１つの表面を含む、実施形態１に記載の方法。
【０２９７】
７．前記分離領域が、Ｂ細胞生存能を向上させるコーティング材料でそれぞれコーティングされた複数の表面を含む、実施形態１に記載の方法。
【０２９８】
８．前記コーティング材料が親水性分子を含む、実施形態６又は７に記載の方法。
【０２９９】
９．前記親水性分子が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むポリマー、アミノ酸を含むポリマー、及びそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態８に記載の方法。
【０３００】
１０．少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、マイクロ流体デバイス内でデッドエンドを形成し、且つフロー領域が流動する第１の流体培地で実質的に充填されると共に分離領域が第２の流体培地で実質的に充填される場合、第２の培地の成分が第１の培地中に拡散可能であると共に第１の培地の成分が第２の培地中に拡散可能であり、且つフロー領域から分離領域内への第１の培地のフローが実質的にノーフローである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０３０１】
１１．マイクロ流体デバイスのフロー領域がマイクロ流体チャネルを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０３０２】
１２．少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、対応する隔離チャンバの一部であり、且つ各隔離チャンバが、対応する分離領域をマイクロ流体チャネルに流体接続する接続領域を更に含む、実施形態１１に記載の方法。
【０３０３】
１３．接続領域が約２０ミクロン〜約６０ミクロンの幅Ｗｃｏｎを有する、実施形態１２に記載の方法。
【０３０４】
１４．少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、対応する接続領域の幅Ｗｃｏｎよりも大きい幅Ｗｉｓｏを有する、実施形態１２又は１３に記載の方法。
【０３０５】
１５．少なくとも１つの分離領域のそれぞれが、約５０ミクロン〜約２５０ミクロンの幅Ｗｉｓｏを有する、実施形態１４に記載の方法。
【０３０６】
１６．隔離チャンバのそれぞれが、約０．５ｎｌ〜約２．５ｎｌの容積を含む、実施形態１２〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０３０７】
１７．少なくとも１つのＢ細胞が、重力及び／又は局在化流体フローを用いて少なくとも１つの分離領域内に移動される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０３０８】
１８．マイクロ流体デバイスが、ＤＥＰ構成を有する基板を含む、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０３０９】
１９．少なくとも１つのＢ細胞を少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、ＤＥＰ力を用いて少なくとも１つのＢ細胞を移動させることを含む、実施形態１８に記載の方法。
【０３１０】
２０．解離細胞サンプルをロードする前に、方法が、解離細胞サンプル中のＢ細胞を検出可能マーカーで標識することを更に含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【０３１１】
２１．少なくとも１つのＢ細胞を少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、移動させる少なくとも１つのＢ細胞を検出可能マーカーの検出に基づいて選択することを含む、実施形態２０に記載の方法。
【０３１２】
２２．少なくとも１つのＢ細胞を少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、複数の個別Ｂ細胞を対応する複数の個別分離領域内に移動させることを含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０３１３】
２３．少なくとも１つのＢ細胞とＢ細胞活性化を刺激する刺激剤とを接触させることを更に含む、実施形態１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０３１４】
２４．刺激剤がＣＤ４０アゴニストを含む、実施形態２３に記載の方法。
【０３１５】
２５．ＣＤ４０アゴニストがＣＤ４０Ｌ、その誘導体、又は抗ＣＤ４０抗体を含む、実施形態２４に記載の方法。
【０３１６】
２６．刺激剤が１つ以上のＣＤ４０Ｌ＋支持細胞を含む、実施形態２３に記載の方法。
【０３１７】
２７．１つ以上のＣＤ４０Ｌ＋支持細胞がＴ細胞又はその誘導体である、実施形態２６に記載の方法。
【０３１８】
２８．刺激剤がトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む、実施形態２３〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０３１９】
２９．ＴＬＲアゴニストがＣｐＧオリゴヌクレオチドである、実施形態２８に記載の方法。
【０３２０】
３０．少なくとも１つのＢ細胞が１〜１０日間にわたり刺激剤に接触される、実施形態２３〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０３２１】
３１．少なくとも１つのＢ細胞が前記１〜１０日間にわたり実質的に連続的に刺激剤に接触される、実施形態３０に記載の方法。
【０３２２】
３２．培養培地を少なくとも１つのＢ細胞に提供することを更に含み、培養培地が、Ｂ細胞増殖を促進する１つ以上の成長誘導剤を含む、実施形態２３〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０３２３】
３３．１つ以上の成長誘導剤が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−２１、及びＢＡＦＦの群から選択される少なくとも１つの作用剤を含む、実施形態３２に記載の方法。
【０３２４】
３４．提供される培養培地が刺激剤を含む、実施形態３２又は３３に記載の方法。
【０３２５】
３５．少なくとも１つのＢ細胞に１〜１０日間にわたり培養培地が提供される、実施形態３２〜３４のいずれか１つに記載の方法。
【０３２６】
３６．少なくとも１つの単離されたＢ細胞の各Ｂ細胞が、約８〜２０細胞の細胞数までマイクロ流体デバイスの分離領域で培養される、実施形態３２〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【０３２７】
３７．少なくとも１つのＢ細胞と刺激剤とを接触させるステップ及び培養培地を少なくとも１つのＢ細胞に提供するステップが、実質的に同一の時間にわたり行われる、実施形態３２〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【０３２８】
３８．少なくとも１つのＢ細胞と刺激剤とを接触させることが、解離細胞サンプルをマイクロ流体デバイス内にロードする前に行われる、実施形態２３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０３２９】
３９．少なくとも１つのＢ細胞と刺激剤とを接触させることが、少なくとも１つのＢ細胞を少なくとも１つの分離領域内に移動させた後に行われる、実施形態２３〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０３３０】
４０．少なくとも１つのＢ細胞と刺激剤とを接触させることが、癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定するステップ時に行われる、実施形態２３〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０３３１】
４１．癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定することが、癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイス内に導入することを含む、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０３３２】
４２．癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイス内に導入することが、癌細胞関連抗原を含む流体培地をマイクロ流体デバイス内に導入することを含む、実施形態４１に記載の方法。
【０３３３】
４３．癌細胞関連抗原が流体培地中に可溶化される、実施形態４２に記載の方法。
【０３３４】
４４．癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイス内に導入することが、微小物体をマイクロ流体デバイス内に導入することを含み、微小物体が癌細胞関連抗原を含む、実施形態４１に記載の方法。
【０３３５】
４５．微小物体が、細胞、リポソーム、脂質ナノラフト、及びビーズから選択される、実施形態４４に記載の方法。
【０３３６】
４６．微小物体がビーズであり、且つ癌細胞関連抗原がビーズにコンジュゲートされる、実施形態４５に記載の方法。
【０３３７】
４７．癌細胞関連抗原が、少なくとも１つの腫瘍サンプル中に存在する癌細胞の細胞表面上に存在する膜関連抗原である、実施形態４５又は４６に記載の方法。
【０３３８】
４８．ビーズにコンジュゲートされた癌細胞関連抗原が、少なくとも１つの腫瘍サンプルから単離された癌細胞から得られる細胞膜調製物に由来する、実施形態４７に記載の方法。
【０３３９】
４９．微小物体が癌細胞である、実施形態４５に記載の方法。
【０３４０】
５０．癌細胞が、患者から得られた少なくとも１つの腫瘍サンプルの癌細胞により提示されるマーカーを呈する、実施形態４９に記載の方法。
【０３４１】
５１．癌細胞が少なくとも１つの腫瘍サンプルから単離される、実施形態４９に記載の方法。
【０３４２】
５２．癌細胞が、異なる患者から得られた１つ以上の腫瘍サンプルから単離される、実施形態４９又は５０に記載の方法。
【０３４３】
５３．少なくとも１つの固形腫瘍サンプルが得られた患者及び異なる患者が、同一のタイプの癌と診断されている、実施形態５２に記載の方法。
【０３４４】
５４．癌細胞が癌細胞系に由来する、実施形態４９又は５０に記載の方法。
【０３４５】
５５．癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイス内に導入することが、癌細胞関連抗原を含む微小物体を含有する流体培地をマイクロ流体デバイスのフロー領域に通して流動させることと、培地中の微小物体の少なくとも幾つかが、少なくとも１つの分離領域に近接するフロー領域の一部に位置決めされたとき、流体培地のフローを停止することとを含む、実施形態４１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０３４６】
５６．癌細胞関連抗原をマイクロ流体デバイス内に導入することが、微小物体の少なくとも１つをマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域内に移動させることを更に含む、実施形態５４に記載の方法。
【０３４７】
５７．少なくとも１つの微小物体をマイクロ流体デバイスの少なくとも１つの分離領域内に移動させることが、少なくとも１つの微小物体を複数の分離領域のそれぞれに移動させることを含む、実施形態５６に記載の方法。
【０３４８】
５８．少なくとも１つの微小物体を、少なくとも１つのＢ細胞を含有する少なくとも１つの分離領域内に移動させることにより、少なくとも１つの微小物体と少なくとも１つのＢ細胞とを有する少なくとも１つの分離領域を生成する、実施形態５６又は５７に記載の方法。
【０３４９】
５９．少なくとも１つの微小物体及び少なくとも１つのＢ細胞が、異なる分離領域内に移動される、実施形態５６に記載の方法。
【０３５０】
６０．異なる分離領域がマイクロ流体デバイス内で互いに隣接する、実施形態５９に記載の方法。
【０３５１】
６１．癌細胞関連抗原に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つの単離されたＢ細胞を同定することが、標識された抗体結合剤を含有する流体培地をマイクロ流体デバイスのフロー領域に通して流動させることと、流体培地中の標識された抗体結合剤の少なくとも幾つかが、少なくとも１つの分離領域に近接するフロー領域の一部に位置決めされたとき、流体培地のフローを停止することと、癌細胞関連抗原への標識された抗体結合剤の結合を監視することとを更に含む、実施形態４１〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０３５２】
６２．標識された抗体結合剤が、標識された抗ＩｇＧ抗体である、実施形態６１に記載の方法。
【０３５３】
６３．標識された抗体結合剤が蛍光標識に共有結合されている、実施形態６１又は６２に記載の方法。
【０３５４】
６４．標識された抗体結合剤が癌細胞関連抗原との混合物で提供される、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０３５５】
６５．標識された抗体結合剤が、癌細胞関連抗原を提供した後に提供される、実施形態６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０３５６】
６６．癌細胞関連抗原への標識された抗体結合剤の結合を監視することが、マイクロ流体デバイスの撮像を行うことを含む、実施形態６１〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【０３５７】
６７．撮像が蛍光撮像を含む、実施形態６６に記載の方法。
【０３５８】
６８．撮像が複数の像を取り込むことを含む、実施形態６６又は６７に記載の方法。
【０３５９】
６９．複数の像が一定の時間間隔で取り込まれる、実施形態６８に記載の方法。
【０３６０】
７０．解離細胞サンプルが１つの固形腫瘍サンプルから得られる、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０３６１】
７１．解離細胞サンプルが複数の固形腫瘍サンプルから得られる、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
【０３６２】
７２．解離細胞サンプルを提供することが、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルを得ることと、少なくとも１つの固形腫瘍サンプルから単一細胞を解離することとを含む、実施形態１〜７１のいずれか１つに記載の方法。
【０３６３】
７３．解離細胞サンプルの個別細胞が、コラゲナーゼ＋DNase消化及び／又は細胞ディソシエータ装置により少なくとも１つの腫瘍サンプルから解離される、実施形態１〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０３６４】
７４．解離細胞サンプルをロードするステップが、解離細胞サンプルを分画して元の解離サンプルよりも大きい濃度のＢ細胞を有するＢ細胞富化画分を単離することと、Ｂ細胞富化画分をマイクロ流体デバイス内にロードすることとを含む、実施形態１〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【０３６５】
７５．分画することが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１３８、ＰＮＡ、及びＧＬ７から選択される少なくとも１つのマーカーを用いて解離細胞サンプルからＢ細胞を選択することを含む、実施形態７４に記載の方法。
【０３６６】
７６．解離細胞サンプル又はＢ細胞富化画分をマイクロ流体デバイス内にロードする前に、方法が、解離細胞サンプル中の癌細胞を検出可能マーカーで標識することを更に含む、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０３６７】
７７．解離細胞サンプルをロードするステップが、解離細胞サンプルを分画して元の解離サンプルよりも大きい濃度の癌細胞を有する癌細胞富化画分を単離することと、癌細胞富化画分をマイクロ流体デバイス内にロードすることとを更に含む、実施形態１〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０３６８】
７８．方法が、少なくとも１つの分離領域内に移動させる少なくとも１つの癌細胞を選択することを更に含む、実施形態７６に記載の方法。
【０３６９】
７９．方法が、少なくとも１つの分離領域内に移動させる少なくとも１つの癌細胞を選択することを更に含み、且つ少なくとも１つの癌細胞が、検出可能マーカーの検出に基づいて選択される、実施形態７７に記載の方法。
【０３７０】
８０．Ｂ細胞をマイクロ流体デバイス内にロードして分離領域内に移動させる前、少なくとも１つの癌細胞をマイクロ流体デバイス内にロードしてマイクロ流体デバイスの分離領域内に移動させる、実施形態７９に記載の方法。
【０３７１】
８１．Ｂ細胞をマイクロ流体デバイス内にロードして分離領域内に移動させた後、癌細胞富化画分をマイクロ流体デバイスのフロー領域内にロードする、実施形態７７に記載の方法。
【０３７２】
８２．癌細胞が分離領域に進入しない、実施形態７７に記載の方法。
【０３７３】
８３．癌細胞が、解離細胞サンプルから選択されるか、又は癌に特異的な少なくとも１つのマーカー（例えば、本明細書に開示される癌関連マーカーのいずれか）を用いて富化される、実施形態７６〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０３７４】
８４．癌細胞が、解離細胞サンプルから分離されるか、又は形態学的差を用いて富化される、実施形態７６〜８３のいずれか１つに記載の方法。
【０３７５】
８５．癌細胞が、癌細胞から正常細胞を単離するために癌細胞でダウンレギュレートされる少なくとも１つのマーカーを用いて解離細胞サンプルから選択される、実施形態７６〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０３７６】
８６．Ｂ細胞及び／又は癌細胞が、ＦＡＣＳにより解離細胞サンプルから選択される、実施形態７４〜８５のいずれか１つに記載の方法。
【０３７７】
８７．Ｂ細胞及び／又は癌細胞が、磁気ビーズベースの選別により解離細胞サンプルから選択される、実施形態７４〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０３７８】
８８．固形腫瘍サンプルが腫瘍生検物である、実施形態１〜８７のいずれか１つに記載の方法。
【０３７９】
８９．少なくとも１つの腫瘍サンプルを生成した腫瘍が三次リンパ様構造を有する、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の方法。
【０３８０】
９０．少なくとも１つの腫瘍サンプルを生成した腫瘍が、乳癌、泌尿生殖器癌（例えば、腎臓（例えば、腎細胞癌）、尿管、膀胱、尿道等の尿路に発生する癌、男性生殖管の癌（例えば、精巣癌、前立腺癌、又は精嚢、精管、若しくは陰茎の癌）、又は女性生殖管の癌（例えば、卵巣癌、子宮癌、頸癌、腟癌、若しくは卵管癌））、神経系癌（例えば、神経芽腫）、腸癌（例えば、結腸直腸癌）、肺癌、黒色腫、又は他のタイプの癌である、実施形態１〜８９のいずれか１つに記載の方法。
【０３８１】
９１．腫瘍が髄様乳癌である、実施形態９０に記載の方法。
【０３８２】
９２．腫瘍が中皮腫である、実施形態９０に記載の方法。
【０３８３】
９３．方法が、マイクロ流体デバイスから少なくとも１つの同定されたＢ細胞又はそれに由来するクローンＢ細胞集団を搬出することを更に含む、実施形態１〜９２のいずれか１つに記載の方法。
【０３８４】
９４．各同定されたＢ細胞又はそれに由来するクローンＢ細胞集団が個別に搬出される、実施形態９３に記載の方法。
【０３８５】
９５．少なくとも１つの同定されたＢ細胞又はそれに由来するＢ細胞のクローン集団の一部若しくは全部で抗体シーケンシングを行うことを更に含む、実施形態１〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０３８６】
９６．抗体シーケンシングを行うことが、少なくとも１つの同定されたＢ細胞又はそれに由来するＢ細胞のクローン集団の一部若しくは全部から対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの抗体配列を決定することを含む、実施形態９５に記載の方法。
【０３８７】
９７．方法が、少なくとも１つの同定されたＢ細胞から対をなす重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列の一部又は全部を含む抗体治療剤を生成することを更に含む、実施形態１〜９６のいずれか１つに記載の方法。
【０３８８】
９８．Ｔ細胞又はＮＫ細胞が解離細胞サンプル中に存在する、実施形態１〜９７のいずれか１つに記載の方法。
【０３８９】
９９．方法が、元の解離サンプルよりも大きい濃度のＴ細胞又はＮＫ細胞を有する画分を単離するように解離細胞サンプルで選択を行うことを更に含む、実施形態９８に記載の方法。
【０３９０】
１００．Ｔ細胞又はＮＫ細胞が同一の患者の固形腫瘍サンプルから得られる、実施形態９８又は９９に記載の方法。
【０３９１】
１０１．Ｔ細胞が、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、及びＣＤ３から選択される少なくとも１つのマーカーを用いて解離細胞サンプルから分離されるか、又はＮＫ細胞が、ＣＤ５６をマーカーとして用いて解離細胞サンプルから分離される、実施形態９８〜１００のいずれか１つに記載の方法。
【０３９２】
１０２．個別のＴ細胞又はＮＫ細胞が患者から選択及びクローニングされる、実施形態９８〜１０１のいずれか１つに記載の方法。
【０３９３】
１０３．方法が、患者の癌細胞及び他の供給源由来の癌細胞の両方に結合可能な抗体を産生する少なくとも１つのＢ細胞を同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することを含む、実施形態１〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
【０３９４】
１０４．方法が、Ｂ細胞により産生された抗体が非癌細胞に結合可能であるかを同定するためにマイクロ流体デバイスを使用することを更に含む、実施形態１〜１０３のいずれか１つに記載の方法。
【０３９５】
１０５．非癌細胞及び癌細胞が、少なくとも１つの腫瘍サンプルを提供した患者に由来する、実施形態１０４に記載の方法。
【０３９６】
１０６．癌細胞及び非癌細胞への抗体の結合を同定するために同一のマイクロ流体デバイスが使用される、実施形態１０４又は１０５に記載の方法。
【０３９７】
１０７．癌細胞及び非癌細胞が同一の流路に逐次的にロードされる、実施形態１０６に記載の方法。
【０３９８】
１０８．癌を有する患者の治療方法であって、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により産生された抗体又はそのフラグメントを用いて患者を治療することを含む方法。
【０３９９】
１０９．腫瘍サンプルが、治療される同一の患者から採取される、実施形態１０８に記載の方法。
【０４００】
１１０．腫瘍サンプルの取得から治療までの時間が多くとも約２ヵ月である、実施形態１０８又は１０９に記載の方法。
【０４０１】
１１１．抗体又はそのフラグメントが一本鎖抗体である、実施形態１０８〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０２】
１１２．抗体又はそのフラグメントが２本の重鎖と２本の軽鎖とを有する、実施形態１０８〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０４０３】
１１３．抗体が工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞上に提示される、実施形態１０８〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０４０４】
１１４．工学操作Ｔ細胞がキメラ抗原受容体Ｔ細胞であるか、又は工学操作ＮＫ細胞がキメラ抗原受容体ＮＫ細胞である、実施形態１１３に記載の方法。
【０４０５】
１１５．Ｔ細胞又はＮＫ細胞が、抗体を提示するように工学操作される前に同一の患者から得られたものである、実施形態１１３又は１１４に記載の方法。
【０４０６】
１１６．Ｔ細胞又はＮＫ細胞が患者の腫瘍サンプルから得られたものである、実施形態１１５に記載の方法。
【０４０７】
１１７．抗体又はそのフラグメントが他の療法と組み合わせて投与される、実施形態１０８〜１１６のいずれか１つに記載の方法。
【０４０８】
１１８．組合せ療法が、手術、放射線療法、化学療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法、Ｔ細胞療法、他の免疫療法、又は免疫刺激分子若しくは腫瘍特異的ウイルスの投与である、請求項１１７に記載の方法。
【０４０９】
１１９．患者において癌を標識又は検出する方法であって、検出可能標識にコンジュゲートされた抗体又はそのフラグメントを投与することを含み、抗体又はそのフラグメントが実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により産生される、方法。
【０４１０】
１２０．実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖ＣＤＲ、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の少なくとも軽鎖ＣＤＲ、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖及び軽鎖のＣＤＲ、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖可変領域、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の少なくとも軽鎖可変領域、又は実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含む、工学操作抗体構築物。
【０４１１】
１２１．工学操作抗体構築物であって、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定された抗体の変異体（例えば、同定された抗体の軽鎖及び／又は重鎖の可変領域に１〜２０、１〜１５、１〜１０、又は１〜５アミノ酸の置換、付加、又は欠失を有する変異体）である工学操作抗体構築物。
【０４１２】
１２２．構築物が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’（２）、ｓｃＦｖ、多価ｓｃＦｖ、ミニボディー、二重特異的抗体、又はラクダ機能性重鎖可変ドメインである、実施形態１２０又は１２１に記載の工学操作抗体構築物。
【０４１３】
１２３．外面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞であって、抗体又はそのフラグメントが実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定される、工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞。
【０４１４】
１２４．Ｔ細胞又はＮＫ細胞及び抗体又はそのフラグメントが同一の患者から得られる、実施形態１２３に記載の工学操作Ｔ細胞又はＮＫ細胞。
【０４１５】
１２５．外面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作Ｔ細胞の調製方法であって、腫瘍サンプルに結合する抗体を実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定することと、抗体又はそのフラグメントを発現するようにＴ細胞を遺伝子工学操作することとを含む方法。
【０４１６】
１２６．Ｔ細胞、抗体を発現するＢ細胞、及び腫瘍サンプルが同一の患者から得られたものである、実施形態１２５に記載の方法。
【０４１７】
１２７．外面上に提示された抗体又はそのフラグメントを含む工学操作ＮＫ細胞の調製方法であって、腫瘍サンプルに結合する抗体を実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の方法により同定することと、抗体又はそのフラグメントを発現するようにＮＫ細胞を遺伝子工学操作することとを含む方法。
【０４１８】
１２８．ＮＫ細胞、抗体を発現するＢ細胞、及び腫瘍サンプルが同一の患者から得られたものである、実施形態１２７に記載の方法。
【０４１９】
均等物
上記の書面の明細書は、当業者による実施形態の実施を可能とするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、企図される最良形態を記述する。しかし、以上の内容が本文でいかに詳細に見えても、実施形態は多くの方法で実施し得、且つ添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈すべきであることは分かるであろう。
【図１Ａ】
2019511454.tif 000004
【図１Ｂ】
2019511454.tif 000005
【図１Ｃ】
2019511454.tif 000006
【図２Ａ】
2019511454.tif 000007
【図２Ｂ】
2019511454.tif 000008
【図２Ｃ】
2019511454.tif 000009
【図２Ｄ】
2019511454.tif 000010
【図２Ｅ】
2019511454.tif 000011
【図２Ｆ】
2019511454.tif 000012
【図２Ｇ】
2019511454.tif 000013
【図２Ｈ】
2019511454.tif 000014
【図３Ａ】
2019511454.tif 000015
【図３Ｂ】
2019511454.tif 000016
【図４】
2019511454.tif 000017
【図５Ａ】
2019511454.tif 000018
【図５Ｂ】
2019511454.tif 000019
【図５Ｃ】
2019511454.tif 000020
【図６】
2019511454.tif 000021
【図７】
2019511454.tif 000022
【図８】
2019511454.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月20日(2018.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれる）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１Ａに示されていない）を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイスは、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイスは顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターンは、正方形光パターン２２０等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
図２Ａ〜図２Ｃの隔離チャンバ２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離チャンバの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離チャンバ２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離チャンバのフロアを形成する、隔離チャンバのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離チャンバの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離チャンバの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０にも当てはまる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００において、Ｖｍａｘは、約０．２マイクロリッター／秒、約０．３マイクロリッター／秒、約０．４マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．６マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約０．８マイクロリッター／秒、約０．９マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．１マイクロリッター／秒、約１．２マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．４マイクロリッター／秒、又は約１．５マイクロリッター／秒に設定することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光を撮像デバイス１９４の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３４０を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2019511454.tif 000024
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｂ】
2019511454.tif 000025
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｃ】
2019511454.tif 000026
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ａ】
2019511454.tif 000027
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２Ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２Ｈ】
2019511454.tif 000028
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ａ】
2019511454.tif 000029
【国際調査報告】
2019511454.tif 000030
2019511454.tif 000031
2019511454.tif 000032
2019511454.tif 000033