(57)【要約】  本発明により、フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）のＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物からＦＶＩＩＩタンパク質を分離するための方法であって、前記第１の組成物を、リガンド及びマトリックスを含むアフィニティ樹脂と接触させるステップであって、前記リガンドがＦＶＩＩＩの軽鎖に対して親和性を有する前記ステップ、及び、前記混合物から前記アフィニティ樹脂を分離して、改変された第１の組成物及び第２の組成物を得るステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップを含む方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）のＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物からＦＶＩＩＩタンパク質を分離するための方法であって、
前記第１の組成物を、リガンド及びマトリックスを含むアフィニティ樹脂と接触させるステップであって、前記リガンドがＦＶＩＩＩの軽鎖に対して親和性を有する前記ステップ、及び
前記混合物から前記アフィニティ樹脂を分離して、改変された第１の組成物及び第２の組成物を得るステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記ＦＶＩＩＩタンパク質が、ヒト血漿由来ＦＶＩＩＩ、ヒト血液中に天然に存在するＦＶＩＩＩ誘導体、組換えヒト完全長ＦＶＩＩＩ、及び組換えヒトＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｖＷＦタンパク質が、ヒト血漿由来ｖＷＦマルチマー、ヒト血漿由来ｖＷＦモノマー、及び組換えヒト完全長ｖＷＦから選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドがポリペプチドであり、好ましくは組換えポリペプチド、より好ましくは非動物供給源で産生される組換えポリペプチド、特に酵母細胞で産生される組換えポリペプチドである、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドが抗体Ｆａｂ断片、好ましくは１３ｋＤのＦａｂ断片である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記マトリックスが高度架橋アガロースから構成され、前記アフィニティ樹脂が好ましくはＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分離が充填カラムを通して連続的に行われ、前記第１の組成物及び／又は前記改変された第１の組成物の流速が３０ｃｍ／時以下、好ましくは１５ｃｍ／時以下、より好ましくは１０ｃｍ／時以下、特に７．５ｃｍ／時以下である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の組成物の総体積に対する前記第１の組成物中の前記ＦＶＩＩＩタンパク質の濃度が、１ＩＵ／ｍＬ以下、好ましくは０．７ＩＵ／ｍＬ以下、より好ましくは０．４ＩＵ／ｍＬ以下、最も好ましくは０．２ＩＵ／ｍＬ以下である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記樹脂の体積に対する前記第１の組成物の体積の比が、５：１〜１００：１の範囲内、好ましくは１０：１〜７０：１の範囲内、より好ましくは１０：１〜５０：１の範囲内、特に２０：１〜４０：１の範囲内である、請求項６〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の組成物が、血液製剤、好ましくはヒト血液製剤を含み、前記血液製剤が全血、血漿、及び血清から選択される、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記血液製剤が血漿、特に、クリオ上清などの前処理血漿又はＯｃｔａｐｌａｓ（商標）などの化学的にウイルスを不活性化した血漿である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＦＶＩＩＩタンパク質及び／又は前記ｖＷＦタンパク質、特に前記ＦＶＩＩＩタンパク質及び前記ｖＷＦタンパク質が、組換えにより発現されたタンパク質である、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
改変された血液製剤の生産法であって、
血液製剤、特に血漿を含む、第１の組成物を準備するステップ、
請求項２〜請求項１２のいずれか一項に記載のＦＶＩＩＩの分離を行うステップ、及び
改変された血液製剤、特に改変された血漿を含む、改変された第１の組成物を収集するステップ
を含む方法。
【請求項１４】
ＦＶＩＩＩを本質的に含まない外来性ｖＷＦタンパク質を前記血漿に添加することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＶＩＩＩの濃度が、健常ヒトドナーの血漿の平均ＦＶＩＩＩ濃度の４％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは２％未満、特に１％未満である、請求項１３又は請求項１４に記載の方法によって得られる改変された血漿。
【請求項１６】
ｖＷＦの濃度が、健常ヒトドナーの血漿の平均ｖＷＦ濃度の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも１００％である、請求項１３又は請求項１４に記載の方法によって得られる改変された血漿。
【請求項１７】
治療用の、特に凝固活性の低下を必要とする障害、好ましくは播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）又は敗血症の治療用の、請求項１５又は請求項１６のいずれかに記載の改変された血漿。
【請求項１８】
試料中のＦＶＩＩＩタンパク質の濃度及び／又は活性を試験するための、請求項１５又は請求項１６に記載の改変された血漿の用途。
【請求項１９】
ＦＶＩＩＩタンパク質、ｖＷＦタンパク質、又はＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を精製及び／又は濃縮するための方法であって、
ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物を準備するステップ、
請求項１〜請求項１２のいずれか一項に記載の分離方法を行うステップ、
所望により、前記第２の組成物に少なくとも１回の洗浄ステップを適用するステップ、及び
所望により、ｖＷＦを含む第３の組成物を溶出、特にＣａＣｌ２を含む溶出用緩衝液で溶出するステップ、並びに
ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体又はＦＶＩＩＩタンパク質を含む第４の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法によって得られる、ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体、又は精製されたＦＶＩＩＩタンパク質、又は精製されたｖＷＦタンパク質を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質及びフォン・ヴィルブランド因子タンパク質を含む第１の組成物、特に血漿から第ＶＩＩＩ因子を分離するための方法、及び前記方法の産物、すなわちＦＶＩＩＩ及び／又はＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の量が減少した血液製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血友病は、身体の血液凝固又は凝血を制御する能力が損なわれる、遺伝性の遺伝性疾患である。最も一般的な血友病Ａでは凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）が欠乏しており、血友病Ａはおよそ出生男児の５，０００〜１０，０００人に１人の割合で生じる。ＦＶＩＩＩタンパク質は血液凝固に必須な多機能性の補因子である。ＦＶＩＩＩの欠損は、血漿由来ＦＶＩＩＩ濃縮物又は組換え技術により産生されたＦＶＩＩＩで治療され得る。ＦＶＩＩＩ濃縮物による治療によって、血友病患者に正常な生活がもたらされている。歴史的に、血友病Ａはヒト血漿由来のＦＶＩＩＩで治療されてきた。血漿中、通常の条件下では、ＦＶＩＩＩ分子はその補因子であるフォン・ヴィルブランド因子（ｖＷＦ）と常に結合しており、この因子は様々な形態の変性からＦＶＩＩＩ分子を安定化させる。
【０００３】
フォン・ヴィルブランド因子を伴って、又は伴わずに、第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を組換えにより産生する、血漿又は培養物から第ＶＩＩＩ因子を精製するための方法が、多数報告されている。一般的に、少量のｖＷＦを含む精製されたＦＶＩＩＩ産物は、ＦＶＩＩＩ分子を安定化させるための、添加ヒトアルブミン、並びに／又は、カルシウムイオン及び塩濃度増加を含む他の安定化因子を含有する。
【０００４】
血漿からＦＶＩＩＩを精製するために使用される方法は、通常、クリオ沈殿、水酸化アルミニウム沈殿などの種々の沈殿法と、主にイオン交換クロマトグラフィーステップ、アフィニティクロマトグラフィーステップ、及びゲル濾過クロマトグラフィーステップであるクロマトグラフィーステップとを組み合わせたものであった。ＦＶＩＩＩ産物を改善するためにアフィニティクロマトグラフィーが利用され、これにより夾雑物が効果的に除去されて高純度のＦＶＩＩＩが得られたが、ｖＷＦも減少する可能性があった（Ｆａｒｒｕｇｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。９０年代に、最初の組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）産物が市販され、これらは血漿中のＦＶＩＩＩの主要な形態を模倣した完全長ｒＦＶＩＩＩ分子と、１つの不活性部分（Ｂドメイン）が除去されたＢドメイン欠失型ｒＦＶＩＩＩ分子（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）に分類され、共に高い純度を有していた（全てｖＷＦを含まない）。ｒＦＶＩＩＩは、国際公開第２００９／１５６４３０号及びＭｃＣｕｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９等に記載されるような、アフィニティクロマトグラフィーを含むいくつかの精製ステップによっても精製される。これらの文書には、１３ｋＤのリガンドが第ＶＩＩＩ因子の軽鎖に結合する、非動物由来Ｆａｂ断片をベースとするアフィニティ樹脂を用いた、（フォン・ヴィルブランド因子を含まない）組換えにより産生された第ＶＩＩＩ因子の精製のための、アフィニティクロマトグラフィーステップの使用が開示されている（Ｗｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１５を参照）。
【０００５】
生物活性のある第ＶＩＩＩ因子は、様々なインビトロ分析法（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）、例えば、ＦＶＩＩＩ発色アッセイ及び／又は１段階凝固アッセイ（Ｇｉｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を用いて測定可能である。この発色アッセイは、ＦＩＸａの補因子としての第ＶＩＩＩ因子の生物活性を測定する２段階測光法である。この方法では、カルシウムイオン及びリン脂質の存在下で、ＦＩＸａによって、ＦＸがＦＸａに活性化される。形成されたＦＸａは、発色基質（ｃｈｒｏｍｏｇｎｅｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を切断して、分光測定で定量可能な産物を生じる。１段階凝固アッセイは、リン脂質、接触活性化因子（ｃｏｎｔａｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、及びカルシウムイオンの存在下で、第ＶＩＩＩ因子を含有する試料が第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿の凝固時間を補正する能力に基づく。フィブリン凝塊が出現するまでの時間が１ステップで測定される。
【０００６】
ｒＦＶＩＩＩ試料又は精製ＦＶＩＩＩ試料の試験には、一般に、Ｈｅｌｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の内在「Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｌａｓｍａ  （Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）」などの、先天性ＦＶＩＩＩ欠乏血漿が使用される。しかし、これらの先天性血漿は、血友病Ａ患者由来であることにより量が限定されているため、有効性が限定されている。また、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿は、正常血漿からのＦＶＩＩＩの除去、すなわち、ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体に特異的な抗体、すなわち、多くの場合、ｖＷＦのＦＶＩＩＩへの結合によって妨害されないＦＶＩＩＩに対する親和性リガンドを用いる、正常血漿からのＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の除去によって、作製することもできる。一例として、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｏｇｉｃａｌｓ（商標）社製のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｐｌａｓｍａがある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は特に、ＦＶＩＩＩの軽鎖に特異的なリガンド、特にＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの名称で販売されているＦａｂ断片をベースとするアフィニティ樹脂が、一定条件下でＦＶＩＩＩとｖＷＦとの複合体に効率的に結合するという、驚くべき知見に基づいている。本発明者らは、その結合のための特定の至適条件を特定することができた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、第１の態様によれば、本発明は、ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物からＦＶＩＩＩタンパク質を分離するための方法であって、
前記第１の組成物を、リガンド及びマトリックスを含むアフィニティ樹脂と接触させるステップであって、前記リガンドがＦＶＩＩＩの軽鎖に対して親和性を有する前記ステップ、及び
前記混合物から前記アフィニティ樹脂を分離して、改変された第１の組成物及び第２の組成物を得るステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、ＦＶＩＩＩ、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ
を含む方法を提供する。
【０００９】
重要なことは、ＦＶＩＩＩ以外にも前記リガンドに結合するものがあるということである。本発明者らは、ｖＷＦと複合体化したＦＶＩＩＩと結合するための条件を特定することで、血液製剤、特に血漿からのＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の分離を可能にした。したがって、第２の態様によれば、本発明は、改変された血液製剤を作製するための方法であって、
血液製剤、特に血漿、を含む第１の組成物を準備するステップ、
本発明の第１の態様のＦＶＩＩＩの分離を行うステップ、及び
改変された血液製剤を収集するステップ
を含む方法を提供する。
【００１０】
したがって、第３の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩの濃度が健常ヒトドナーの血漿の平均ＦＶＩＩＩ濃度の４％未満である、第２の態様の方法によって得られる改変された血漿を提供する。
【００１１】
ＦＶＩＩＩ量が減少した改変された血漿、特にＦＶＩＩＩ欠乏血漿は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）又は敗血症などの疾患又は障害の治療において有用であり得る。すなわち、第４の態様によれば、本発明は、治療において使用される改変された血漿を提供し、改変された血漿は本発明の第３の態様に定義される。
【００１２】
しかし、第３の態様の改変された血液製剤の別の適用は、ＦＶＩＩＩ試料の分析的試験における適用である。これに関連して、第５の態様によれば、本発明は、試料中のＦＶＩＩＩの濃度及び／又は活性を試験するための、改変された血液製剤の用途、特に本発明の第３の態様の改変された血漿の用途を提供する。
【００１３】
第１の態様の分離方法は、血液製剤試料からの血液由来ＦＶＩＩＩの分離に有用なだけでなく、ＦＶＩＩＩ、ｖＷＦ、又はそれらの複合体の精製にも適用することができる。
【００１４】
したがって、第６の態様によれば、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ｖＷＦタンパク質、又はＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を精製又は濃縮するための方法であって、
ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物を準備するステップ、
第１の態様の分離方法を行うステップ、
所望により、前記第２の組成物に少なくとも１回の洗浄ステップを適用するステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ、及び、
所望により、ｖＷＦを含む第３の組成物を溶出、特にＣａＣｌ２を含む溶出用緩衝液で溶出するステップ、並びに
ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体又はＦＶＩＩＩタンパク質を含む第４の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ
を含む方法を提供する。
【００１５】
最後に、第７の態様によれば、本発明は、第６の態様の方法によって得られる、ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体、又は精製されたＦＶＩＩＩタンパク質、又は精製されたｖＷＦタンパク質を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アフィニティ樹脂ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを用いて様々な時間インキュベートされた後の血漿中のＦＶＩＩＩ濃度が測定される、バッチ吸着のグラフを示す。ＦＶＩＩＩ濃度がＹ軸に、時間がＸ軸に示される。血漿試料中のＦＶＩＩＩ濃度は、血漿とＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの混合の前、４時間後、及び２４時間後に測定された。グラフのレジェンドには、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ材料（グラム）及び血漿の体積（ｍｌ）の比が示されている。表示された温度（２０〜２５℃）はインキュベーション温度を示している。
【図２】ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ及びＯｃｔａｐｌａｓ（商標）を出発材料として用いたバッチ吸着試験のグラフを示す。血液製剤中のＦＶＩＩＩの濃度がＹ軸に、時間がＸ軸に示される。出発材料に対するカラム材料の種々の比が示されている。
【図３】ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ及び出発材料としてクリオ上清を用いたバッチ吸着試験のグラフを示す。血液製剤中のＦＶＩＩＩの濃度がＹ軸に、時間がＸ軸に示される。出発材料に対するカラム材料の種々の比が示されている。
【図４】直接的アミド分解活性の測定結果を示すグラフである。Ｙ軸には加水分解速度ΔＯＤ４０５ｎｍ／時が示され、Ｘ軸には種々の試験サンプルが示される。各試料の左側のバーはＳ−２３６６の加水分解速度を表し、右側のバーはＳ−２２８８の加水分解速度を表している。これらの試料は、実施例１及び実施例２に従って作製された血液製剤であり、Ｓｉｅｍｅｎｓ社製の市販製品ＤＰ、Ｈｅｌｅｎａ社製、及びＡｆｆｉｎｉｔｙ社製の市販製品と比較される。
【図５】実施例１及び実施例２に従って得られた選択された血液製剤中のｒｈＦＶＩＩＩの安定性試験の結果を示す。各試料のカラムは、異なる時点、すなわち、インキュベーションの前、３時間後、５時間後、及び８時間後の試料中のＦＶＩＩＩの濃度を表す。
【図６】実施例１及び実施例２で得られた３種の選択された血液製剤、並びに比較対象の市販ＦＶＩＩＩ欠乏血漿のｒｈＦＶＩＩＩの力価（ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）の結果を示している。
【図７】クリオ上清由来のＦＶＩＩＩの連続的なカラム分離における、流速試験の結果を示すグラフである。グラフにおいて、Ｙ軸はＦＶＩＩＩ活性（％）を示し、Ｘ軸は流速（ｃｍ／時）を示している。
【図８】種々の血漿の直接的アミド分解活性の測定結果を示している。この実験では、プロテアーゼ基質のＳ−２２８８及びＳ−２３６６が種々の血漿に添加され、すなわち、改変された血漿（プレパイロット１、プレパイロット２、及びプレパイロット３、全てＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーカラム上で精製）又は参照血漿、すなわち、Ｈｅｌｅｎａ社製の先天性（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ）市販品及びＳｉｅｍｅｎｓ社製の市販品が測定された。棒グラフにおいて、左側のバーはＳ−２２３８の加水分解速度を表し、右側のバーはＳ−２３６６の加水分解速度を表している。
【図９】本発明により作製されたＦＶＩＩＩ欠乏血漿、すなわち、プレパイロット１、プレパイロット２、及びプレパイロット３、並びに比較用血漿（Ｓｉｅｍｅｎｓ社製、Ｈｅｌｅｎａ社製）中に１ＩＵ／ｍｌに希釈されたｒｈＦＶＩＩＩの安定性測定の結果を示す。
【図１０】３種の改変された血漿であるプレパイロット３、プレパイロット２、及びプレパイロット１、並びに比較対象のＨｅｌｅｎａ社製先天性製品について、２５０ＩＵ／ｍｌの濃度のｒｈＦＶＩＩＩを用いたｒｈＦＶＩＩＩの力価（ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）の結果を示す。
【図１１】３種の改変された血漿であるプレパイロット３、プレパイロット２、及びプレパイロット１、並びに比較対象のＨｅｌｅｎａ社製先天性製品について、２０００ＩＵ／ｍｌの濃度のｒｈＦＶＩＩＩを用いたｒｈＦＶＩＩＩの力価（ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、ＦＶＩＩＩの軽鎖に特異的なリガンドを用いて、ｖＷＦの存在下でＦＶＩＩＩタンパク質を結合して、ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を分離するための新規の方法を開発した。ｖＷＦは、ＦＶＩＩＩの軽鎖に結合することが知られているため（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３、５頁、左カラム及びＣｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５を参照）、ｖＷＦと複合体の状態にある場合に、ＦＶＩＩＩへのＦＶＩＩＩ軽鎖特異的リガンドの結合を妨げるはずであるため、これは驚くべきことである。すなわち、本発明はＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体精製についての追加の選択肢を提供する。さらに、血漿由来ＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の結合のための任意の条件を決定することで、本発明はＦＶＩＩＩ欠乏血漿の作製に好適な方法を提供する。
【００１８】
第１の態様によれば、本発明は、ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物からＦＶＩＩＩタンパク質を分離するための方法であって、
前記第１の組成物を、リガンド及びマトリックスを含むアフィニティ樹脂と接触させるステップであって、前記リガンドがＦＶＩＩＩの軽鎖に対して親和性を有する前記ステップ、及び
前記混合物から前記アフィニティ樹脂を分離して、改変された第１の組成物及び第２の組成物を得るステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、ＦＶＩＩＩ、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ
を含む方法を提供する。
【００１９】
本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト又は動物の完全長第ＶＩＩＩ因子及び任意のその断片、変異体、又はバリアントであってもよい。ＦＶＩＩＩタンパク質は血漿由来であっても組換え型であってもよい。さらに、ＦＶＩＩＩタンパク質はグリコシル化ＦＶＩＩＩであっても非グリコシル化ＦＶＩＩＩであってもよい。第ＶＩＩＩ因子は、ヒトにおいて、６つのエクソン内の１８７，０００塩基対からなるＦ８遺伝子にコードされている。転写されたｍＲＮＡは、９，０２９塩基対長を有し、２，３５１個のアミノ酸を有するタンパク質に翻訳され、そこから、翻訳後修飾によって１９個のアミノ酸が除去される。ＦＶＩＩＩ分子は、ヒトにおいて、３１のアミノ酸側鎖でグリコシル化されている（２５のＮ−グリコシル化、６のＯ−グリコシル化）。
【００２０】
翻訳後、このアミノ酸鎖は、約２００ｋＤａの重鎖及び約８０ｋＤａの軽鎖の形成をもたらす位置において、特定のプロテアーゼによって切断される。ドメイン組成は、通常、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と特徴付けられる。軽鎖はドメインＡ３−Ｃ１−Ｃ２で構成される。重鎖は原則としてドメインＡ１−Ａ２−Ｂから構成される。血漿中に見られる重鎖は９０ｋＤａから２００ｋＤａまで様々な分子量を有する不均一な組成である。この理由としては、重鎖のグリコシル化の不均一性、スプライスバリアントの存在、及びＢドメイン欠失型重鎖Ａ１Ａ２などのタンパク質分解産物の存在がある。完全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、ＳｗｉｓＰｒｏｔ（１９８６年７月２１日）のＰ００４５１の２０〜２，３５１番目のアミノ酸によって特定される。ＦＶＩＩＩタンパク質は、特に、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（１９８６年７月２１日）のＰ００４５１の２０〜２３５１番目のアミノ酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。Ｐ００４５１の２０〜２３５１番目のアミノ酸によって定められるアミノ酸配列に対する配列相同性は、少なくとも９５％であることが好ましい。
【００２１】
重鎖及び軽鎖が結合する正確な条件は詳細には分かっていないが、疎水性相互作用と共に複合体を形成し結び付ける、金属イオン架橋の関与を示唆する論文がある。カルシウム、銅、亜鉛、マンガンなどを含む、様々な金属イオンが相互作用に関与することが示唆されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３）。近年開発されたＢドメイン欠失型組換え第ＶＩＩＩ因子産物は、３種の金属イオン（カルシウム、銅、及び亜鉛）を含有する分子であると報告された（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００２２】
本発明の分離方法により、第１の組成物からＦＶＩＩＩタンパク質が分離される。ｖＷＦタンパク質は試料中にも存在しており、ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを含むため、第１の組成物中に存在するＦＶＩＩＩタンパク質の少なくとも一部はｖＷＦタンパク質との複合体の形となる。
【００２３】
第１の態様のある実施形態によれば、第１の組成物は血液製剤を含む。本発明の方法を用いて、血液製剤中のＦＶＩＩＩの濃度を低下させるか、又は、血液製剤からＦＶＩＩＩを除去することができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「血液製剤」とは、哺乳動物の全血、又は全血の一部、特に血漿、血清、若しくは血漿及び血清のさらなる一部を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「改変された血液製剤」とは、沈殿ステップ、特に冷却沈殿ステップ、ウイルス不活性化、化学的処理若しくは加熱処理、及び／又は特定成分の除去などの、追加の処理ステップを経た血液製剤である。したがって、改変された血漿は血漿の処理によって得られる。改変された全血は、全血に対する追加の処理ステップによって得られる。
【００２６】
「血漿」は、本明細書で使用される場合、哺乳類の血漿を指す。血漿はペールホワイト、時に黄色の、血液の液体成分であり、通常、全血中の血液細胞を懸濁状態で保持している。血漿は大部分が水であり、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、電解質、ホルモン、及び二酸化炭素を含有している。血漿は血液から作製することができ、例えば、抗凝固剤を含有する新鮮血の遠心分離において血液細胞を遠心分離管の底に移行させることによって作製することができる。この処理の上清が血漿である。
【００２７】
「全血の一部」とは、本明細書で使用される場合、全血の成分の一部を含む、全血由来の懸濁液の溶液を指す。
【００２８】
「凝固因子」とは、本明細書で使用される場合、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、又は第ＶＩＩＩ因子などの凝固カスケードの一部である、血液中に天然に存在するタンパク質を指す。
【００２９】
「クリオ沈殿物」は、本明細書で使用される場合、血漿から作製される血液製剤である。クリオ沈殿物を得るためには、血漿、通常は凍結された血漿を、おおよそ０℃まで温めた後、遠心分離し、沈殿物を収集する。
【００３０】
用語「クリオ上清（ｃｒｙｏｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）」とは、本明細書で使用される場合、クリオ沈殿物（ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）が取り除かれた血漿を指す。得られる血漿は、低下はしているがかなりの量のＦＶＩＩＩ、ｖＷＦ、ＦＸＩＩＩ、フィブロネクチン、及びフィブリノーゲンを含む。
【００３１】
ある実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト血漿由来ＦＶＩＩＩ、血液中に天然に存在するＦＶＩＩＩ誘導体、特にヒト血液中に天然に存在するＦＶＩＩＩ誘導体、組換えヒト完全長ＦＶＩＩＩ、及び組換えヒトＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩから選択される。好ましい実施形態によれば、ＦＶＩＩＩタンパク質はヒト血漿由来ＦＶＩＩＩである。ヒト血漿由来ＦＶＩＩＩは、特に、全てのサブドメインであるＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、及びＣ２を含む、完全長ＦＶＩＩＩである。このことは、第１の態様の分離方法が第１の組成物としての血液製剤に対して使用される場合に、特に重要となる。したがって、ＦＶＩＩＩタンパク質は、血液中に天然に存在する任意のＦＶＩＩＩ誘導体であってもよく、特に、完全長ＦＶＩＩＩ及びヒトＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩが挙げられる。あるいは、前記ＦＶＩＩＩタンパク質の分離方法は、組換えにより産生されたＦＶＩＩＩタンパク質に対して用いることもできる。組換えにより産生されたＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト完全長ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列を有するＦＶＩＩＩであってもよい。あるいは、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、組換えヒトＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩであってもよい。
【００３２】
「ＦＶＩＩＩ軽鎖」とは、本明細書で使用される場合、第ＶＩＩＩ因子の一部を指す。ＦＶＩＩＩ軽鎖は、特に、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（１９８６年７月２１日）のＰ００４５１の１６６８〜２３５１番目のアミノ酸に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、Ｐ００４５１の１６６８〜２３５１番目のアミノ酸によって定められるアミノ酸配列に対する配列相同性は、少なくとも９５％である。
【００３３】
組換えＦＶＩＩＩタンパク質としては、Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に記載のＦＶＩＩＩアルブミン融合タンパク質及び／又はＦＶＩＩＩ  ＦＣ融合タンパク質などのＦＶＩＩＩ融合タンパク質が挙げられる。
【００３４】
本発明における組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、限定されないが、酵母発現系、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系、ＣＨＯ又はＢＨＫなどの哺乳類発現系、及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞などのヒト細胞株を含む、任意の公知の組換え発現系において産生可能である。ヒト細胞株内で発現された組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒトのグリコシル化パターンを模しているため、好ましい。
【００３５】
本発明におけるｖＷＦタンパク質は、ヒト又は動物の完全長ｖＷＦ、及び任意のその断片、変異体、又はバリアントであってもよい。ｖＷＦは、哺乳類の血漿中に存在する、多量体構造の接着性糖タンパク質であり、複数の生理機能を有している。一次止血において、ｖＷＦは、血小板表面上の特定の受容体とコラーゲンなどの細胞外マトリックス成分との間で、介在物質として働く。さらに、ｖＷＦは、凝血促進性の第ＶＩＩＩ因子の担体及び安定化タンパク質として働く。ＶＷＦは内皮細胞及び巨核球で２８１３個のアミノ酸からなる前駆体分子として合成される。この前駆体ポリペプチドであるプレプロｖＷＦは、２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド、及び成熟した血漿中のフォン・ヴィルブランド因子内に含まれる２０５０残基のポリペプチドからなる（Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。完全長ｖＷＦは、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０４２７５によって特定される。
【００３６】
血漿中に分泌されると、ｖＷＦは分子サイズが異なる様々な化学種の形で循環する。これらのｖＷＦ分子は、２０５０個のアミノ酸残基である成熟サブユニットのオリゴマー及びマルチマーからなる。ｖＷＦは、通常、サイズがおよそ５００〜２０，０００ｋＤａの範囲のサイズのマルチマーとして血漿中に存在し得る（Ｆｕｒｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。ある実施形態によれば、ｖＷＦタンパク質は血漿由来のｖＷＦマルチマーである。ある実施形態によれば、ｖＷＦタンパク質は血漿由来のｖＷＦモノマーである。ｖＷＦは、特に、アミノ酸配列、ＵｎｉｐｒｏｔエントリーＰ０４２７５の配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％のいずれかを有する。
【００３７】
本発明における組換えｖＷＦタンパク質は、限定されないが、酵母発現系、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系、ＣＨＯ又はＢＨＫなどの哺乳類発現系を含む任意の公知の組換え発現系において、及びＨＥＫ２９３Ｆ細胞などのヒト細胞株において、産生可能である。ヒト細胞株において発現された組換えｖＷＦタンパク質は、ヒトグリコシル化パターンを模しているため好ましい。
【００３８】
本発明におけるリガンドは、ＦＶＩＩＩの軽鎖に対して親和性を有するものであれば、いかなる分子又は実体であってもよい。本明細書で使用される場合、「親和性」は、標的、ここではＦＶＩＩＩの軽鎖、に特異的に結合する特性に関する。ＦＶＩＩＩへのリガンドの結合は、共有結合であっても非共有結合であってもよく、また、可逆的であっても非可逆的であってもよい。好ましくは、前記結合は非共有結合性であり、且つ可逆的である。ある実施形態によれば、前記リガンドはＦＶＩＩＩの軽鎖に対し親和性を有するポリペプチドである。
【００３９】
「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、好ましくはペプチド結合によって連結されている、任意の種類の任意の数のアミノ酸、好ましくは自然に存在するアミノ酸から構成され得る。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個、又は少なくとも１５個のアミノ酸を含む。さらに、ペプチドの長さに上限は無い。しかし、本発明におけるペプチドは、５００のアミノ酸長を超過しないことが好ましく、３００のアミノ酸長を超過しないことがより好ましく、２５０のアミノ酸長未満であることがさらにより好ましい。
【００４０】
したがって、用語「ペプチド」には、通常２〜１０のアミノ酸長を有するペプチドを指す「オリゴペプチド」、及び、通常１０より長いアミノ酸長を有するペプチドを指す「ポリペプチド」が包含される。
【００４１】
用語「タンパク質」は、少なくとも６０個、少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を有するペプチドを指す。
【００４２】
本発明における用語「融合タンパク質」は、元は別々のタンパク質／ペプチドをコードしていた２つ以上の遺伝子、ｃＤＮＡ、又は配列を連結することにより作製されたタンパク質に関する。前記遺伝子は、同一生物由来であっても異なる生物由来であってもよく、合成ポリヌクレオチドであってもよい。
【００４３】
２つのアミノ酸配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメーターによって説明される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度が、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ／．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにより実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意パラメーターは、ギャップ開始ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。「最長の同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅの結果（ｔｈｅｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性パーセントとして使用され、以下の通りに算出される。
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント内のギャップの総数）
【００４４】
「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である、移行語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的又はオープンエンドであり、追加の、記載されていない要素又は方法ステップを除外しない。移行句「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、通常それに付随する不純物を除いて、クレームに明記されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。句「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」が、プリアンブルの直後ではなく、クレームのボディの節中に見られる場合、この句はその節に記載された要素のみを限定し；他の要素は全体としてクレームから除外されない。移行句「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求の範囲に記載されている発明の、明記された材料又はステップ「及び基本的な新規の特徴に実質的に影響を与えないもの」にクレームの範囲を限定する。「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」クレームは、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」形式で記載される閉鎖クレームと、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」形式で作成される完全開放クレームの中間を占める。
【００４５】
「アフィニティ樹脂」とは、本明細書で使用される場合、特定のタンパク質に対して親和性を有するクロマトグラフィー媒体である。アフィニティ樹脂は、マトリックス及びあるタンパク質に親和性を有するリガンドを少なくとも含む。
【００４６】
「マトリックス」とは、本明細書で使用される場合、特異的なリガンドが共有結合により結合した、通常はビーズ形態の物質である。本発明におけるマトリックスは、以下のようなものでありはずである。
処理過程で使用される溶媒及び緩衝液に不溶性；
化学的及び機械的に安定；且つ、
リガンド又はリガンドが結合可能なスペーサーアームへの結合が容易。
さらに、本発明におけるマトリックスは、良好な流動性を示し、且つ、結合のための比較的大きな表面積を有するはずである。マトリックスはアガロース製、ガラス製、セルロース製、又はポリアクリルイミド製であることが好ましい。ある実施形態において、マトリックスは高度架橋アガロースである。
【００４７】
実施例で示されるように、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔにより、ｖＷＦタンパク質及び／又はＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の存在下での効率的なＦＶＩＩＩ結合が可能になる。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは高度架橋されたアガロース系マトリックスをベースとしている。このアガロース系マトリックスは、ＦＶＩＩＩの軽鎖に特異的に結合する１３ｋＤａのＦａｂ断片と結合する。この１３ｋＤａのＦａｂ断片は、親水性スペーサーを介してアガロース系マトリックスに連結されている。よって、本発明におけるリガンドは好ましくは組換えポリペプチドである。ある実施形態では、リガンドのサイズは２〜５０ｋＤａの範囲内である。ポリペプチドリガンドの分子量は、好ましくは５〜３０ｋＤａの範囲内であり、より好ましくは１０〜２０ｋＤａの範囲内である。３０ｋＤａを超えるサイズは、ＦＶＩＩＩ軽鎖上のｖＷＦの存在により、立体障害を引き起こす可能性がある。５ｋＤａ未満の分子量は、標的分子への結合特異性が低くなるという欠点があり得る。
【００４８】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは抗体Ｆａｂ断片である。Ｆａｂは抗体の抗原結合性断片である。抗体及び抗体断片はそれらの結合標的、すなわち抗原に対して、特に高い結合親和性を示す。したがって、Ｆａｂ断片はＦＶＩＩＩを分離するための好ましいリガンドである。ポリペプチド、特にＦａｂ断片は、非動物供給源において産生された組換えポリペプチドであることが好ましい。非動物供給源における産生には、患者にとって問題となり得るウイルス又は他の毒素の存在リスクを最小限にするという利点がある。好ましい実施形態では、リガンドは酵母細胞で産生された組換えポリペプチドである。
【００４９】
ある実施形態において、リガンドはスペーサーを介して樹脂に結合している。本発明におけるスペーサーアームは、リガンドがＦＶＩＩＩ軽鎖に結合する確率を向上させるように選択される。特に、このスペーサーは、マトリックスによるリガンドとＦＶＩＩＩ軽鎖との間の結合の立体障害を低減させる長さを有するべきである。好ましい実施形態では、スペーサーは以下の構造によって表される。
【００５０】
【化１】
2019511467.tif 000003
【００５１】
ある実施形態によれば、スペーサーは親水性化合物である。マトリックスは多孔質ビーズの形態であることが好ましい。好ましい実施形態では、樹脂に結合したリガンドはＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔと定義される。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販されているアフィニティ精製用樹脂である（データファイル２８−９６６２−３７ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。その容量は通常２００００ＩＵ／ｍｌゲルである。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの長期間のｐＨ安定性はｐＨ３〜１０で得られるが、ｐＨ２〜１２では短期間の安定性が得られ、この短期間の安定性は、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔアフィニティ樹脂上での反復的な精製の実行を可能にするためのアフィニティ樹脂の再生に使用され得る。
【００５２】
アフィニティ樹脂は、種々の緩衝液の適用により、第１の組成物を接触させる前に調製されることが好ましい。平衡のために、アフィニティ樹脂は、緩衝液再生用緩衝液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液、及び／又は平衡用緩衝液のうちの１種又は複数種で処理されることが好ましい。
【００５３】
アフィニティ樹脂は洗浄用緩衝液で処理された後に平衡用緩衝液で処理されてもよい。特に、未使用のアフィニティ樹脂をこのように処理してよい。使用済みのアフィニティ樹脂は、好ましくは、溶出用緩衝液、再生用緩衝液、及び平衡用緩衝液の順番で処理してもよい。
【００５４】
再生用緩衝液は、好ましくはＨＡｃを含み、より好ましくは０．１Ｍの濃度のＨＡｃを含む。洗浄用緩衝液は、好ましくはＮａＣｌを含み、より好ましくは０．５〜１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。洗浄用緩衝液中のＣａＣｌ２濃度は最大でも５０ｍＭであることが好ましい。洗浄用緩衝液は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を作製する際は、カルシウム、特にＣａＣｌ２を含有しないことがより好ましい。溶出用緩衝液は、５０％エチレングリコール又は５０％プロピレングリコール又は２Ｍ  ＭｇＣｌ２を含むことが好ましい。ｐＨは、好ましくは６．２〜６．８の範囲内であり、より好ましくは６．４〜６．６の範囲内である。溶出用緩衝液中のＣａＣｌ２濃度は最大でも５０ｍＭとすることが好ましい。平衡用緩衝液はＮａＣｌ及びクエン酸ナトリウムを含むことが好ましい。平衡用緩衝液中のＣａＣｌ２濃度は最大でも５０ｍＭであることが好ましい。平衡用緩衝液は、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿を作製する際は、カルシウム、特にＣａＣｌ２を含有しないことがより好ましい。全ての緩衝液は、イミダゾール、ヒスチジン、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、グリシン、ＮａＣｌ、及びＴｗｅｅｎ８０をさらに含有し得る。平衡用緩衝液は、３０ｇ／ｋｇのＮａＣｌ及び６．０ｇ／ｋｇのクエン酸ナトリウムを含み、ｐＨ６．４〜６．６であることがより好ましい。アフィニティ樹脂はエタノール、好ましくは２０％エタノール中で保存されることが好ましい。
【００５５】
本発明における分離ステップは、カラムで連続的に行ってもよく、又はバッチ形式で行ってもよい。実施例で示される通り、バッチ式分離及びアフィニティクロマトグラフィーの両方により、試料からＦＶＩＩＩが分離される。
【００５６】
しかしながら、連続的カラムクロマトグラフィを用いた場合、より短い時間で同等又はさらに良好な分離結果が得られた。したがって、好ましい実施形態では、分離は連続的に、すなわちカラムクロマトグラフィの形式で実行される。
【００５７】
ある実施形態では、樹脂に結合したリガンドがカラム内に設けられ、第１の組成物と接触させるための樹脂層（ｒｅｓｉｎ  ｂｅｄ）が形成される。ある実施形態では、樹脂層高（ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ）は少なくとも２ｃｍである。樹脂層高が２ｃｍ未満の場合、接触時間／流速が小さくなって処理時間が長くなり、その結果、時間単位当たりの樹脂に結合したリガンドの結合能が低くなり過ぎることがある。アフィニティ樹脂の樹脂層高は、好ましくは少なくとも５ｃｍ以上であり、又はより好ましくは少なくとも１０ｃｍ、特に少なくとも２０ｃｍである。樹脂層高が高くなるほど、同一流速での接触時間が長くなり、時間単位当たりの結合能が高くなる。しかし、このビーズ高さ（ｂｅａｄ  ｈｅｉｇｈｔ）では背圧も増加してしまう。したがって、ビーズ高さは背圧が最大でも０．３ＭＰａを超えないように選択されることが好ましい。背圧が０．３ＭＰａを超えるとカラム材の崩壊することがある。
【００５８】
一般的にアフィニティクロマトグラフィーには、処理ステップの時間が最小限となることから、速い流速が好ましい。しかし、実施例で示されるように、流速は分離効率に大きな影響を与える。カラムクロマトグラフィにおいて、第１の組成物の流速と改変された第１の組成物の流速は同一である。第１の組成物は出発材料であり、特にＦＶＩＩＩ及びｖＷＦを含む血液製剤を含む。改変された第１の組成物は、第１の組成物をアフィニティ樹脂と接触させた後に得られるアフィニティクロマトグラフィーのフロースルーである。
【００５９】
ある実施形態では、第１の組成物の流速は３０ｃｍ／時以下である。カラム内の流速は、カラム内の移動相の流速（ｃｍ／時）と等しい、体積流量（Ｌ／時）によって決定される。その関係は下記式により定義される。
体積流速（Ｌ／ｈ）＝流速（ｃｍ／ｈ）×カラム断面積（ｃｍ２）÷１０００
【００６０】
３０ｃｍ／時以下の流速により、第１の組成物からＦＶＩＩＩが分離される。１５ｃｍ／時以下の流速では、第３の組成物中のＦＶＩＩＩ濃度が強く減少する。したがって、ある実施形態では、流速は１５ｃｍ／時以下である。血漿からのＦＶＩＩＩの完全な除去のためには、実施例で示されるように、１０ｃｍ／時以下の流速が必要となる。このことから、ある実施形態では、流速は１０ｃｍ／時以下である。さらなる実施形態では、流速は７．５ｃｍ／時以下である。
【００６１】
ある実施形態では、第１の組成物中のＦＶＩＩＩタンパク質の濃度は１ＩＵ／ｍＬ以下である。実施例で示されるように、ＦＶＩＩＩ、特にＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の分離効率は、第１の組成物中、特に血液製剤中のＦＶＩＩＩの濃度に依存し得る。実験から、この組成物中のＦＶＩＩＩの濃度は１ＩＵ／ｍＬ以下であってもよいことが示されている。１ＩＵ／ｍＬの濃度は、健常人の正常な血液中ＦＶＩＩＩ濃度である。ある実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質及び第１の組成物の別の濃度は０．７ＩＵ／ｍＬ以下である。ある実施形態では、濃度は０．４ＩＵ／ｍＬ以下である。第１の組成物からのＦＶＩＩＩの完全な除去のためには、第１の組成物中のＦＶＩＩＩタンパク質の濃度は０．２ＩＵ／ｍＬ以下とすることが好ましい。完全な除去とは、０．０１ＩＵ／ｍＬ未満の濃度と定義される。濃度が０．０１ＩＵ／ｍＬ未満である血漿を「ＦＶＩＩＩ欠乏血漿」という。
【００６２】
試料中のＦＶＩＩＩタンパク質の濃度は、体積当たりのＦＶＩＩＩ活性として与えられる。
【００６３】
実施例で示されるように、アフィニティ樹脂の体積に対する第１の組成物の体積の比は、第１の組成物からのＦＶＩＩＩタンパク質の分離効率に影響する。アフィニティ樹脂の体積は、樹脂の液体環境を、例えば樹脂を保持する濾過膜を通じた吸引によって取り除き、残りの樹脂体積を測定することにより決定される。一般的に、特にアガロース系マトリックスをベースとした樹脂においては、アフィニティ樹脂の密度は約１ｇ／ｍｌある。したがって、アフィニティ樹脂の体積はアフィニティ樹脂中のマトリックスの量に比例し、すなわちマトリックスに結合したリガンドに比例する。ある実施形態では、アフィニティ樹脂の体積に対するは第１の組成物の体積は、５：１〜１００：１の範囲内である。濃度が１００：１であると、アフィニティ樹脂の最大充填量を超える可能性があり、それによって、第１の組成物からのＦＶＩＩＩタンパク質の分離効率が低減する。濃度が５：１を下回ると、アフィニティ樹脂の量に対してごく少量の産物しか一度に生産できないために、分離手順が時間的且つコスト的に非効率なものとなる。
【００６４】
アフィニティ樹脂の体積に対する第１の組成物の体積の比は、１０：１〜７０：１の範囲内であることが好ましい。このことから、ある実施形態では、アフィニティ樹脂の体積に対する第１の組成物の体積の比は、１０：１〜５０：１の範囲内である。実施例によれば、特に、第１の組成物において効率的なＦＶＩＩＩの減少を達成するためには、５０：１の所定の実験設定濃度を超えてはならないことが示されている。
【００６５】
実験で得られた実験データから、選択された実験設定において、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿の十分な収率を得るためには、アフィニティ樹脂の体積に対する第１の組成物の比は２０：１〜４０：１の範囲内であるべきことが示されている。したがって、好ましい実施形態では、アフィニティ樹脂の体積に対する第１の組成物の体積の比は、２０：１〜４０：１の範囲内である。
【００６６】
本発明者らはさらに、接触時間が分離方法の効率に対するパラメーターであることを特定した。このことは、バッチ式分離方法と連続式分離方法の両方において見出された。連続式分離において、接触時間は、流速、及びサイズ、特にカラムの長さ、カラムの直径、すなわちアフィニティ樹脂ビーズの体積に依存する。第１の組成物中のＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体の有意な減少を達成するためには、第１の組成物と親和性作用物質との接触時間は、少なくとも５分間である。ある実施形態では、第１の組成物と親和性作用物質との接触時間は少なくとも１０分間である。血漿からＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を除去、すなわち、０．０１ＩＵ／ｍＬ未満のＦＶＩＩＩ濃度を得るためには、接触時間は少なくとも２０分間であるべきである。好ましくは、接触時間は少なくとも３０分間ある。
【００６７】
例えば波板（ｗａｖｅ  ｂｏａｒｄ）を用いておよそ１０〜５０波／分の回数で、又は他の類似の混合用デバイスを用いて、連続的に穏やかに混合しながらバッチ式で分離実行される場合、少なくとも４時間の接触時間により、第１の組成物中のＦＶＩＩＩが有意に減少する。ある実施形態では、分離はバッチ式で実行され、第１の組成物とアフィニティ樹脂との接触時間は少なくとも１２時間である。より好ましくは、接触時間は少なくとも２４時間である。接触時間が２４時間であると、ＦＶＩＩＩ活性を０．０１ＩＵ／ｍＬ以下の濃度まで減少させることが可能であった。
【００６８】
ある実施形態では、第１の組成物中のｖＷＦタンパク質のモノマー／マルチマーの数は、ＦＶＩＩＩタンパク質のモノマーの数よりも多い。したがって、たとえＦＶＩＩＩが第１の組成物から完全に除去されたとしても、ＦＶＩＩＩ除去後もｖＷＦの主要部分が第１の組成物中に残ることになる。しかし、除去されたＦＶＩＩＩはいまだいくらかのｖＷＦ分子と結合するはずであるが、ＦＶＩＩＩとｖＷＦの初期濃度の差が大きい（通常、ヒト血液中ではＦＶＩＩＩに対するｖＷＦの比は約５０：１）ために、第１の組成物中のｖＷＦの減少はそれほど大きくはない。
【００６９】
ある実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するｖＷＦタンパク質の比は少なくとも１：５である。ＦＶＩＩＩタンパク質に対するｖＷＦタンパク質の比は少なくとも１０：１であることが好ましい。ＦＶＩＩＩタンパク質に対する第１の組成物中のｖＷＦタンパク質の比は少なくとも２０：１であることがより好ましい。ある実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するｖＷＦタンパク質モノマーの比は少なくとも５０：１である。ｖＷＦは通常、ヒト血液中ではマルチマーの形態で存在する。したがって、１つのＦＶＩＩＩタンパク質が２つ以上のｖＷＦに結合している場合がある。したがって、血液製剤からＦＶＩＩＩを除去しつつ十分な量のｖＷＦを維持するためには、ＦＶＩＩＩタンパク質に対するｖＷＦタンパク質の比を高くする必要がある。
【００７０】
実施例で示されるように、ＦＶＩＩＩに対するリガンドの結合効率、すなわち、アフィニティ精製後の改変された第１の組成物、すなわち改変された血漿中のＦＶＩＩＩ活性の低下は、より高い温度で向上する。したがって、第１の組成物及びアフィニティ樹脂の接触ステップの間の温度は４℃超であることが好ましい。温度は１５℃超であることがより好ましい。示されているように、第１の組成物からのＦＶＩＩＩの分離において、２０〜２５℃の範囲内の温度によって良好な結果が得られた。安定性を考慮して、温度は３７℃を超えないことが好ましい。本方法のある実施形態では、接触ステップにおける温度は２０℃超である。
【００７１】
ある実施形態では、第１の組成物は血液製剤を含む。第１の組成物は血液製剤からなっていてもよい。血液製剤は全血又は血液製剤、血漿又は血清から選択できる。好ましい実施形態では、血液製剤はヒト血液製剤である。ある実施形態では、第１の組成物は緩衝液をさらに含む。緩衝物質は、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、並びにヒスチジン、リジン、及びアルギニンから選択され得る。緩衝液は特に６〜８のｐＨ範囲内の緩衝液である。ある実施形態では、緩衝液はＨＥＰＥＳである。ＨＥＰＥＳは、例えば、第１の組成物中に、第１の組成物の総体積に対して、０．００１ｇ／ｍＬ〜０．１ｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは０．００５ｇ／ｍＬ〜０．０５ｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは約０．０１ｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ６．５〜７．５で、存在し得る。
【００７２】
ある実施形態では、血液製剤は血漿、特にヒトの血漿である。血漿は事前処理した血漿又はウイルスを不活性化した血漿であってもよい。事前処理した血漿としては、クリオ沈殿物及びクリオ上清が挙げられる。クリオ上清及びクリオ沈殿物は、好ましくは、新鮮血漿を凍結し、それを約０℃の温度で解凍して沈殿を引き起こすことによって得られる。沈殿物がクリオ沈殿物であり、上清がクリオ上清と称される。血漿はクリオ上清であることが最も好ましい。
【００７３】
ウイルス不活性化血漿は、特に、化学的にウイルスを不活性化した血漿である。ウイルス不活性化血漿の例としては、「Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）」の商品名で販売される血漿が挙げられる。
【００７４】
本発明による分離方法は、ヒト血液中又はヒト血漿中のＦＶＩＩＩの濃度を変化させるため、特に血漿からＦＶＩＩＩを除去するためだけではなく、組換え複合体の精製ステップとして使用されてもよい。したがって、別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質又はｖＷＦタンパク質は組換えにより発現されたタンパク質である。好ましい実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質及びｖＷＦタンパク質は共に組換えにより発現されたタンパク質である。組換え発現の場合、ｖＷＦタンパク質は特に、ヒトｖＷＦの特定のサブドメインであってもよい。ｖＷＦのサブドメインは、Ｐ０４２７５−１の７６４〜１０３５番目のアミノ酸によって定義されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列相同性は少なくとも９５％であることが好ましい。
【００７５】
第１の態様による分離方法は、特に、改変された血液製剤、特にＦＶＩＩＩ欠乏血液製剤を作製するために使用される。したがって、第２の態様において、本発明は、改変された血液製剤を作製するための方法であって、
血液製剤を含む第１の組成物を準備するステップ、
第１の態様の分離方法を実行するステップ、及び
改変された血液製剤を収集するステップ
を含む方法を提供する。
【００７６】
これに関して、血液製剤は血漿であることが好ましいため、改変された血液製剤は改変された血漿であることが好ましい。改変された血液製剤は、ＦＶＩＩＩ欠乏血液製剤、特にＦＶＩＩＩ欠乏血漿であることがより好ましい。
【００７７】
改変された血漿、特にＦＶＩＩＩ欠乏血漿を得るために、第２の態様による方法を、血漿の作製とそのまま組み合わせることができる。したがって、第２の態様のある実施形態は、本方法は、
全血試料を準備するステップ、
全血から血液細胞を遠心分離及び／又は濾過で除去して血漿を得るステップ、
血漿を凍結するステップ
所望により、凍結された血漿を貯蔵するステップ、
凍結された血漿を約０℃まで解凍してタンパク質沈殿を引き起こすステップ、
凍結された血漿からタンパク質沈殿物を遠心分離及び／又は濾過で除去して、クリオ沈殿血漿を得るステップ、及び、
所望により、本方法の次のステップの前に、クリオ上清を凍結、貯蔵、及び解凍するステップ
のうちの１つ又は複数を含む。
【００７８】
別の実施形態では、第２の態様の方法は、
全血試料を準備するステップ、
全血から血液細胞を遠心分離及び／又は濾過で除去して血漿を得るステップ、
血漿を凍結するステップ、
所望により、凍結された血漿を貯蔵するステップ、
凍結された血漿を約０℃まで解凍してタンパク質沈殿を引き起こすステップ、
凍結された血漿からタンパク質沈殿物を遠心分離及び／又は濾過で除去して、クリオ上清を得るステップ、及び、
所望により、本方法の次のステップの前に、クリオ上清を凍結、貯蔵、及び解凍するステップ
の全てをさらに含む。
【００７９】
ある実施形態では、前記方法は、
全血試料を準備するステップ、
全血から血液細胞を遠心分離及び／又は濾過で除去して血漿を得るステップ、
血漿を凍結するステップ、
所望により、凍結された血漿を貯蔵するステップ、
凍結された血漿を約１０〜２５℃の範囲内の温度まで解凍するステップ、
化学的処理を実行して化学的に処理された血漿を得るステップ、
特に油注出及び疎水性相互作用クロマトグラフィーによってウイルス不活性化化学物質を除去して、ウイルス不活性化血漿を得るステップ、及び、
所望により、本方法の次のステップの前に、ウイルス不活性化血漿を凍結、貯蔵、及び解凍するステップ
のうちの１つ又は複数を含む。
【００８０】
ある実施形態では、前記方法は、
全血試料を準備するステップ、
全血から血液細胞を遠心分離及び／又は濾過で除去して血漿を得るステップ、
血漿を凍結するステップ、
所望により、凍結された血漿を貯蔵するステップ、
凍結された血漿を約１０〜２５℃の範囲内の温度まで解凍するステップ、
化学的処理を実行して化学的に処理された血漿を得るステップ、
特に油注出及び疎水性相互作用クロマトグラフィーによってウイルス不活性化化学物質を除去して、ウイルス不活性化血漿を得るステップ、
所望により、本方法の次のステップの前に、ウイルス不活性化血漿を凍結、貯蔵、及び解凍するステップ
の全てを含む。
【００８１】
前記化学的処理は、好ましくは、１％ＴＮＢＰ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、少なくとも３０分間穏やかに撹拌することによって行われる。
【００８２】
ある特定の用途において、外来性ｖＷＦタンパク質を血液製剤、特に血漿に添加することは有益であり得る。本発明における外来性ｖＷＦは、血液製剤から得られたものではないｖＷＦである。外来性ｖＷＦは血漿由来ｖＷＦ又は組換えｖＷＦであり得る。ｖＷＦを血液製剤に添加するステップはスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）と呼ばれる。ｖＷＦのスパイキングは、改変された血漿中のｖＷＦ濃度を自然値に回復させるために必要となる場合があり、このステップにおいて、ＦＶＩＩＩは０．０１ＩＵ／ｍＬ未満の濃度にまで、そして血漿中のｖＷＦが、共に有意に除去される。
【００８３】
第２の態様による方法を用いて、ＦＶＩＩＩレベルが非常に低下した改変された血漿を作製することが可能である。ある実施形態では、第２の態様による方法で得られた改変された血漿は、健常ドナー血漿の平均ＦＶＩＩＩ濃度の４％未満のＦＶＩＩＩ濃度を有する。健常ドナー血漿は通常、約１ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩの濃度を有する。いくつかの適用では、ＦＶＩＩＩ濃度がさらに低い血漿を準備することが望ましい場合がある。したがって、ある実施形態では、ＦＶＩＩＩ濃度は健常ドナー血漿の平均ＦＶＩＩＩ濃度の３％未満である。さらなる実施形態では、ＦＶＩＩＩ濃度は健常ドナー血漿の平均ＦＶＩＩＩ濃度の２％未満である。上記で定義された通り、改変された血漿は、健常ドナーの濃度の１％未満、すなわち約０．０１ＩＵ／ｍＬ未満を含有する場合、ＦＶＩＩＩ欠乏と定義される。
【００８４】
血液、特にヒト血液、さらにはその血液から得られた血漿も、ＦＶＩＩＩより多くの量のｖＷＦを含有するため、ｖＷＦが完全に除去されることはない。例えば、改変された血漿は、血漿由来ＦＶＩＩＩ試料又は組換えＦＶＩＩＩ試料の試験に使用されてもよい。このために、血漿はＦＶＩＩＩに加えて全ての凝固因子を含有していなければならず、特に、改変された血液製剤には十分な濃度のｖＷＦが含有される。ｖＷＦの濃度は健常ヒトドナー血漿の平均ｖＷＦ濃度の少なくとも２０％であることが好ましい。ｖＷＦの濃度は健常ヒトドナー血漿の平均ｖＷＦ濃度の少なくとも３０％であることがより好ましい。改変された血漿中のｖＷＦ濃度は、健常ヒトドナー血漿の平均ｖＷＦ濃度の少なくとも４０％であってもよい。好ましい実施形態では、ｖＷＦの濃度は、健常ヒトドナー血漿の平均ｖＷＦ濃度の少なくとも５０％である。健常ヒトドナーの濃度の５０％の濃度であれば、ｖＷＦ濃度はＦＶＩＩＩ試験に十分であるはずである。
【００８５】
しかし、様々な理由により、例えば、ＦＶＩＩＩ解析時の、ＦＶＩＩＩ産物にとっての安定環境（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）の増大のために、及び／又は、より多量のｖＷＦを必要とする種々の特定療法での改変された血漿の使用のために、改変された血漿中においてより高濃度のｖＷＦが必要とされることがある。そのため、改変された血漿に、外来性ｖＷＦ、組換えｖＷＦ、又は血漿由来ｖＷＦをスパイクすることによって、ｖＷＦ濃度が健常ヒトドナー血漿の平均ｖＷＦ濃度の、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも約１００％までの、改変された血漿を得ることができる。血漿を、ＦＶＩＩＩを検出するための分析法で、及び特定療法のために使用するために、ＦＶＩＩＩ濃度は、特に、０．０１ＩＵ／ｍＬ未満、すなわち、健常ヒトドナー血漿のＦＶＩＩＩ濃度の１％未満であり、ｖＷＦ濃度は健常ヒトドナー血漿のｖＷＦ濃度の少なくとも９０％である。改変された血漿、特にＦＶＩＩＩの量が減少した血漿を作製するための第２の態様による方法は、改変された血漿中のフィブリノーゲンの有意な減少をもたらさないことが好ましい。
【００８６】
第３の態様による改変された血漿のある実施形態において、フィブリノーゲン濃度は、改変された血漿の体積に対して、少なくとも１ｇ／ｍｌであり、好ましくは少なくとも１．３ｇ／ｍｌ、より好ましくは１．５ｇ／ｍｌである。改変された血漿のＦＸ活性は、好ましくは少なくとも０．５ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは０．９〜１．１ＩＵ／ｍＬの範囲内である。好ましくは、改変された血漿は低いアミド分解活性を有するべきである。アミド分解活性は、例えば、プロテアーゼ基質Ｓ−２２８８又はＳ−２３６６に基づくものであり得る。Ｓ−２２８８基質に基づくアミド分解活性は、実施例４に示されるように測定される。実施例４に示される測定法に基づくと、Ｓ−２２８８に対するアミド分解活性は、好ましくは１ｍＯＤ／分以下、より好ましくは０．５ｍＯＤ／分以下、特に好ましくは０．２ｍＯＤ／分以下である。さらに、実施例４に示される測定法に基づくと、Ｓ−２３６６に対するアミド分解活性は、０．５ｍＯＤ／分以下、好ましくは０．２ｍＯＤ／分以下、より好ましくは０．１ｍＯＤ／分以下である。
【００８７】
前述の通り、第３の態様による改変された血漿にはいくつかの用途がある。特に、改変された血漿は治療に使用することができる。これより、第４の態様において、本発明は治療用の改変された血漿を提供する。改変された血漿の用途の例としては、凝固活性の低下を必要とする障害の治療が挙げられる。凝固活性の低下を必要とするのは、特に、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の場合の状況であり得る。ＤＩＣは、全身の小血管内での血餅形成をもたらす、広範な凝固カスケード活性化を特徴とする病的過程である。これは組織血流障害に繋がり、最終的には複数の臓器障害を引き起こし得る。ＦＶＩＩＩ欠乏血漿の投与によりＦＶＩＩＩが希釈され、アンチトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳなどのプロテアーゼ阻害剤が添加され、これらは抗炎症作用も有し得るため、凝固活性の低下と併せて、身体がより良好にＤＩＣ状態を制御可能となる。
【００８８】
敗血症は多くの場合、ＤＩＣの前段階である。すなわち、場合によっては、ＤＩＣを発症するリスクをさらに模倣（ｍｉｍｉｃ）するという予防的な理由で、敗血症の治療時に、ＦＶＩＩＩ濃度を希釈して、新たな量のプロテアーゼ阻害剤／抗炎症性物質を添加することが有益であり得る。
【００８９】
あるいは、ＦＶＩＩＩの濃度が減少した改変された血漿は、分析方法において、試料中のＦＶＩＩＩの濃度及び／又は活性を試験するために使用され得る。すなわち、第５の実施形態において、本発明は、試料中のＦＶＩＩＩの濃度及び／又は活性を試験するための、第３の実施形態による改変された血漿の使用を提供する。完全長ＦＶＩＩＩ及びその機能的誘導体において、活性は、濃度の直接的尺度であり、通常、濃度を決定するために一使用される。ＦＶＩＩＩの活性及び濃度は以下のように関連している：１ＩＵ／ｍＬは０．１μｇ／ｍＬのＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ濃度に相当し、完全長ＦＶＩＩＩに対しては約２倍高い。
【００９０】
本発明による方法は、試料中のＦＶＩＩＩを除去又はその濃度を減少させることが可能であるだけではない。示されているように、軽鎖に対するＦＶＩＩＩ親和性を用いる例は、ＦＶＩＩＩタンパク質及びｖＷＦタンパク質の複合体にも結合する。
【００９１】
すなわち、第６の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ｖＷＦタンパク質、又はＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を精製及び/又は濃縮する方法であって、
ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦ、及びタンパク質ＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物を準備するステップ、
第１の態様の分離方法を行うステップ、
所望により、前記第２の組成物に少なくとも１回の洗浄ステップを適用するステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ、及び、
所望により、ｖＷＦを含む第３組成物を溶出、特にＣａＣｌ２を含む溶出用緩衝液で溶出するステップ、並びに
ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体又はＦＶＩＩＩタンパク質のみを含む第４の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ
を含む方法を提供する。
【００９２】
したがって、第６の態様のある実施形態では、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を精製及び／又は濃縮する方法であって、
ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物を準備するステップ、
第１の態様の分離方法を行うステップ、
所望により、前記第２の組成物に少なくとも１回の洗浄ステップを適用するステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ、及び、
ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を含む第４の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ
を含む。
【００９３】
すなわち、第６の態様の実施形態では、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質を精製及び／又は濃縮する方法であって、
ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物を準備するステップ、
第１の態様の分離方法を行うステップ、
所望により、前記第２の組成物に少なくとも１回の洗浄ステップを適用するステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ、
ｖＷＦタンパク質を含む第４の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ、及び、
ＦＶＩＩＩタンパク質を含む第５の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ
を含む。
【００９４】
ある実施形態では、第１の組成物を平衡用緩衝液と接触させる前に、アフィニティ樹脂が平衡化される。平衡用緩衝液は、イミダゾール、ヒスチジン、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、グリシン、ＮａＣｌ、及びＴｗｅｅｎ８０から選択されることが好ましい。好ましくは、平衡用緩衝液のｐＨは６．９〜７．８の範囲内であり、好ましくは７．２〜７．６の範囲内である。ある実施形態では、イミダゾールの濃度は約１０ｍＭであり、グリシンの濃度は約０．５〜１％であり、ＮａＣｌの濃度は約０．１Ｍであり、Ｔｗｅｅｎの濃度は約０．０２％である。ｐＨは約７．４であることが好ましい。平衡用緩衝液中のＣａＣｌ２濃度は最大でも５０ｍＭとすることが好ましい。平衡用緩衝液はカルシウム、特にＣａＣｌ２を含有しないことがより好ましい。
【００９５】
洗浄ステップは洗浄用緩衝液を用いて実行されることが好ましい。洗浄用緩衝液は、イミダゾール、ヒスチジン、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、グリシン、ＮａＣｌ、及びＴｗｅｅｎ８０から選択されることが好ましい。好ましくは、平衡用緩衝液のｐＨは６．０〜７．５の範囲内であり、６．３〜６．７の範囲内であることが好ましい。ある実施形態では、イミダゾールの濃度は約１０〜２０ｍＭであり、グリシンの濃度は約０．５〜１％であり、ＮａＣｌの濃度は約０．４〜１．０Ｍであり、Ｔｗｅｅｎの濃度は約０．０２％である。ｐＨは約６．５であることが好ましい。洗浄用緩衝液中のＣａＣｌ２濃度は最大でも５０ｍＭとすることが好ましい。洗浄用緩衝液はカルシウム、特にＣａＣｌ２を含有しないことがより好ましい。
【００９６】
アフィニティ樹脂と結合した複合体からｖＷＦタンパク質を溶離させるためには、ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との結合を遮断する必要がある。この分離は、アフィニティ樹脂と結合した複合体を充填されたカラムを通して、アフィニティ樹脂と結合した複合体を、カルシウムイオンを含む溶液（例えば０〜０．５Ｍ  ＣａＣｌ２の勾配）と接触させ、カラムの出口において２８０ｎｍでの吸光度により検出されるｖＷＦタンパク質ピークを収集することによって行われることが好ましい。あるいは、アフィニティ樹脂からのｖＷＦタンパク質の溶出は、ＣａＣｌ２濃度の段階的な増加によって行うことができ、好ましくは０．１５Ｍ  ＣａＣｌ２、より好ましくは０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２でありおよそ０．５Ｍ  ＣａＣｌ２以下である。ｖＷＦ分離ステップのｐＨは６〜８の範囲内であり、好ましくは７．４である。
【００９７】
ある実施形態では、ｖＷＦはｖＷＦ溶出用緩衝液で溶出される。ｖＷＦ溶出用緩衝液は、イミダゾール、ヒスチジン、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、グリシン、ＮａＣｌ、及びＴｗｅｅｎ８０から選択されることが好ましい。溶出用緩衝液において、好ましくは、イミダゾールの濃度は約１０ｍＭであり、グリシンの濃度は約０．５〜１％であり、ＮａＣｌの濃度は約０．４Ｍであり、ＣａＣｌ２の濃度は約０．２５Ｍであり、Ｔｗｅｅｎの濃度は約０．０２％である。最初の簡易アプライの後にアフィニティ樹脂に結合していない画分をＦＶＩＩＩ欠乏血漿などとして使用することを意図していない場合、通常ｖＷＦ溶出用緩衝液に添加される０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２が、出発材料及び／又は平衡用緩衝液に添加されることで、ＦＶＩＩＩとｖＷＦとの間の相互作用が阻害され、それによって、ＦＶＩＩＩのみをアフィニティ樹脂に結合させることができる。
【００９８】
第２ステップでｖＷＦを除去及び溶出させた後に、ＦＶＩＩＩタンパク質を溶出してもよい。第６の態様の別の実施形態では、アルコール、特にエチレングリコールを、好ましくは濃度５０％、ｐＨ６〜８で含む、第２の溶出用緩衝液中でアフィニティ樹脂を接触させることで、ＦＶＩＩＩを含む第５の組成物が溶出される。これに関して、前記アフィニティ樹脂はＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔであることが好ましい。
【００９９】
ｖＷＦのみを濃縮／精製する場合、前記方法は、最後のＦＶＩＩＩの溶出無しで行われる。すなわち、第６の態様のある実施形態では、前記方法は、ＦＶＩＩＩタンパク質を精製及び／又は濃縮するための方法であって、
ｖＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを少なくとも含むｖＷＦタンパク質、及びＦＶＩＩＩの軽鎖を少なくとも含み、前記ｖＷＦタンパク質と複合体を形成し得るＦＶＩＩＩタンパク質を含む第１の組成物を準備するステップ、
第１の態様の分離方法を行うステップ、
所望により、前記第２の組成物に少なくとも１回の洗浄ステップを適用するステップであって、前記第２の組成物が、前記アフィニティ樹脂、及び前記ＦＶＩＩＩタンパク質と前記ｖＷＦタンパク質との複合体を含有する前記ステップ、及び、
ｖＷＦタンパク質を含む第４の組成物を前記アフィニティ樹脂から溶出するステップ
を含む。
【０１００】
第６の態様による精製法及び／又は濃縮法の使用によれば、ＦＶＩＩＩタンパク質、ｖＷＦタンパク質、又はＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体を含む組成物が得られる。すなわち、第７の態様によれば、本発明は、ＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体、又は精製されたＦＶＩＩＩタンパク質、又は精製されたｖＷＦタンパク質を含む組成物を提供する。すなわち、ある実施形態によれば、前記組成物は、ＦＶＩＩＩとＷＦタンパク質との複合体を含む。別の実施形態によれば、第６の態様の前記組成物は精製されたＦＶＩＩＩタンパク質を含む。他の実施形態によれば、第６の態様の前記組成物は精製されたｖＷＦタンパク質を含む。精製されたｖＷＦは、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿、特に本発明の方法によって得られるＦＶＩＩＩ欠乏血漿への添加に使用することができる
【０１０１】
前記精製されたＦＶＩＩＩタンパク質、又は精製されたｖＷＦタンパク質、又はＦＶＩＩＩタンパク質とｖＷＦタンパク質との複合体は、治療に使用されてもよい。
【０１０２】
すなわち、第７の態様によれば、本発明は、治療に使用される第６の態様の組成物を提供する。特に、前記組成物は、凝固活性の増大を必要とする出血性障害の治療用に提供される。そのような出血性障害の例には、血友病Ａ患者及び／又はｖＷＦ欠失患者の種々の症状がある。
【０１０３】
出血性障害の治療は、特に、前記組成物の皮下適用又は静脈内適用を含み得る。
【０１０４】
本発明は以下の実施例によってさらに明確となる。
【実施例】
【０１０５】
実施例で使用された材料
【０１０６】
【表１】
2019511467.tif 000004
【０１０７】
実施例１：ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を用いた種々の血液製剤からのＦＶＩＩＩのバッチ式分離
１．１．概要
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、少なくとも２５０００ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／ｍＬの期待結合能を有する市販のゲルである。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔは、組換えβドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子の精製用に設計されたアフィニティ樹脂である。
【０１０８】
３種の異なる出発材料である、血漿、Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）ＳＤ、及びクリオ上清を試験した。
【０１０９】
血漿及びクリオ上清は、血漿２５ｍＬ当たり０．２５ｇのＨＥＰＥＳを添加し、ｐＨを６．９〜７．５にすることで緩衝化した。製造ステップで既に緩衝化されているため、Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）にはＨｅｐｅｓを添加しなかった。Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）は、最終産物中で約２〜７．５ｍｍｏｌ／Ｌとなる血漿１ｋｇ当たり０．３９ｇのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び血漿１ｋｇ当たり５ｇのグリシンを含有し、ｐＨは６．９〜７．４である。
【０１１０】
１．２．バッチ吸着試験
下記の緩衝液を用いてＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を準備した：
【０１１１】
【表２】
2019511467.tif 000005
【０１１２】
未使用ゲルを緩衝液２で処理した後に、緩衝液４で処理した。使用済みゲルを、溶出用緩衝液、再生用緩衝液、洗浄用緩衝液、及び平衡用緩衝液（緩衝液３、１、２、及び４）で処理した後に使用した。ゲルは全て２０％エタノール中に保存した。
【０１１３】
５０ｍＬの各緩衝液で３回、２〜２０ｇのアフィニティ樹脂を処理した。各々の処理では、緩衝液を樹脂に添加し、穏やかに撹拌しながらアフィニティ樹脂と共に１時間インキュベートした。室温での遠心分離を用いて、血液製剤からアフィニティ樹脂を分離した。以下の組み合わせについて調べ、種々の時点で試料を採取してＦＶＩＩＩ結合を追跡した。
【０１１４】
【表３】
2019511467.tif 000006
【０１１５】
３種の血液製剤は全て、試料採取時に遠心分離を用いてゲルから分離された。
【０１１６】
全ての試料由来の材料を分注凍結の前に目視検査したところ、全て光学的に透明のようであり、血塊形成の傾向もなかった。
【０１１７】
１．３．ＦＶＩＩＩ濃度の測定
ＦＶＩＩＩ活性の解析は、Ｃｏａｔｅｓｔ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキット又はＣｏａｔｅｓｔ  ＳＰ４  ＦＶＩＩＩキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）を用い、低濃度のＦＶＩＩＩをより良好に検出可能とするためにＦＶＩＩＩ解析の低濃度域により多くの標準用希釈物を含めたこと以外は添付文書に従って、手動によるマイクロプレート上でのエンドポイント法を用いて行った。
【０１１８】
１．４．試料分析の結果
ゲル濃度、温度、及び時間の効果が調べられたいくつかの異なるバッチ吸着試験から、これら３つの変数のいずれかを増加させるとＦＶＩＩＩの結合能が向上することが分かった。
【０１１９】
結果を図１〜図３に示す。血漿２５ｍＬ当たり５ｇのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを用いた場合、２０〜２５℃、２４時間のインキュベーション後、血漿の残留ＦＶＩＩＩ活性は１．４％となり、Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）の残留ＦＶＩＩＩ活性は３％となった。このＯｃｔａｐｌａｓ（商標）の残留ＦＶＩＩＩ活性は、ゲル濃度をＯｃｔａｐｌａｓ（商標）２５ｍＬ当たり１５ｇのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔに増加させても、全て除去することはできなかった。血漿に対し使用されたＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔの最高濃度は５ｇ／２５ｍＬであった。
【０１２０】
一方、クリオ上清２５ｍＬあたり１ｇのゲル濃度でＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔゲルを用いた場合、クリオ上清中に存在する全てのＦＶＩＩＩを結合させることが可能であった。結合速度は温度の上昇に伴って増加した。
【０１２１】
実施例２：ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を用いたカラムクロマトグラフィＦＶＩＩＩ吸着試験
２．１．手順
実施例１と同様に、３種の異なる血液製剤を出発材料として用いた。各試験で、樹脂層高が５ｃｍとなる、樹脂１０ｍＬの最終カラム体積まで、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂をＸＫ１６カラム（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社）に充填した。試料は、２種類のポンプであるＰ−５０（０．５ｍＬ／分）及びＰ−１（０．０１〜０．０５ｍｌ／分）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）でカラムに添加した。安定な２８０ｎｍ吸光度が得られてからフロースルー物質を収集した。
【０１２２】
【表４】
2019511467.tif 000007
【０１２３】
２．２．結果
表４は結果をまとめたものである。これらのデータから、Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）中のＦＶＩＩＩのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔに対する結合が、使用された流量に強く依存したことは明らかである。したがって、流量を０．５ｍＬ／分から０．０５ｍＬ／分に減少させた場合、残留ＦＶＩＩＩ活性が０．１７ＩＵ／ｍＬから０．０３ＩＵ／ｍＬに低下した。しかし、０．０５ｍＬ／分（１．５ｃｍ／時）という流量は、試験的な大規模製造ステップで使用するには低過ぎるということには注意されたい。
【０１２４】
血漿をＦＶＩＩＩ源として用い、流量０．５ｍＬ／分のみを試験したところ、結果はバッチ吸着試験に類似したものとなり、すなわち、Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）と比べていくらか低い残留ＦＶＩＩＩ活性が得られた（０．１３ＩＵ／ｍＬ対０．１７ＩＵ／ｍＬ）。
【０１２５】
一方、流量０．５ｍＬ／分を同様に用いた場合、クリオ上清のＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーからは、ＦＶＩＩＩ活性が完全に除去された。
【０１２６】
流量０．５ｍＬ／分を用いる、０．１７Ｕ／ｍＬ  ＦＶＩＩＩを含有するＯｃｔａｐｌａｓ（商標）の空隙プール（ｖｏｉｄ  ｐｏｏｌ）の再クロマトグラフィー。再クロマトグラフィーで、Ｏｃｔａｐｌａｓ（商標）の残留ＦＶＩＩＩ活性は０．０８ＩＵ／ｍＬであり、一方、初期ＦＶＩＩＩ活性が０．２ＩＵ／ｍＬであったクリオ上清は、同一条件下でのクロマトグラフィー後にＦＶＩＩＩ活性が検出されなかった。
【０１２７】
【表５】
2019511467.tif 000008
【０１２８】
実施例３：実施例１及び実施例２から得られた血液製剤の詳細な分析
バッチ試験及びクロマトグラフィー試験から選択された製剤を、ｒｈＦＶＩＩＩ希釈剤としての適合性についてさらに試験した。
【０１２９】
３．１．ＦＶＩＩＩ濃度の測定
出発材料としての参照欠乏血漿及び選択された最終製剤に対して、より詳細なＦＶＩＩＩ分析を行った。このアッセイは、低濃度域用（ｌｏｗ  ｒａｎｇｅ）及び高濃度域用（ｈｉｇｈ  ｒａｎｇｅ）の両方を用いて、添付文書に従って行った。ＳＳＣ＃４を標準として使用し、希釈剤（高濃度域）及び一定レベル（１／８１）の先天性欠乏血漿を含む希釈剤（低濃度域）で希釈した。標準及び試料の両方に同量の血漿を含ませることでlike vs. like principleに従うために、且つ、試料中のＦＶＩＩＩ活性の過大推定を避けるために、先天性欠乏血漿中に希釈した標準に対する低濃度域試料の力価を決定した。試料は２つの独立したアッセイ系列で真の二連実験として分析した。
【０１３０】
３．２．ＦＶＩＩＩ活性測定の結果
３種の市販のＦＶＩＩＩ欠乏血漿を参照として使用した（Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｈｅｌｅｎａ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ）。３種全ての参照血漿が、検出不可又は０．００５ＩＵ／ｍＬ（０．５％）未満の残留ＦＶＩＩＩ活性を有していた。
【０１３１】
結果を表５にまとめる。
【０１３２】
バッチ吸着によりクリオ上清から調製された欠乏血漿は、検出不可又は０．００５ＩＵ／ｍＬ未満の残留ＦＶＩＩＩ活性を有していた。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔと室温で２４時間インキュベートされた血漿（５ｇ／２５ｍＬ血漿）、及びＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔとインキュベートされたＯｃｔａｐｌａｓ（商標）（１５ｇ／２５ｍＬ）は、０．０１２〜０．０１４ＩＵ／ｍＬの残留活性を有していた。クロマトグラフィーによるＯｃｔａｐｌａｓ（商標）からのＦＶＩＩＩの除去は、０．３〜１．５ｃｍ／時（０．０１〜０．０５ｍＬ／分）という非常に遅い流速を使用した場合にのみ可能であり、その場合でも、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを用いた際の残留活性は０．０４近くあった。
【０１３３】
【表６】
2019511467.tif 000009
【０１３４】
３．３．  ｖＷＦ濃度の測定
出発材料、参照欠乏血漿、並びにバッチ試験及びクロマトグラフィー試験から得られた選択された材料中のｖＷＦ濃度を、自動化されたラテックス増感イムノアッセイであるＶｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）又は同法の手動版を用いて測定した。この方法を、カイネティク読取りを含む手動の方法に対して採用し、標準としてはＳＳＣ＃４を使用した。標準は食塩水中に１：４〜１：２０に希釈し、試料は食塩水中に１：８に希釈した。各試料は、２つの独立したアッセイ系列の二連実験において、力価を決定した。
【０１３５】
【表７】
2019511467.tif 000010
【０１３６】
３．４．ｖＷＦ抗原測定の結果
表６はｖＷＦ濃度測定の結果を示している。
【０１３７】
【表８】
2019511467.tif 000011
【０１３８】
クリオ上清及びクリオ上清から得られた欠乏血漿は低濃度のｖＷＦ抗原を含んでいた。これは、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製の欠乏血漿も同様であった。
【０１３９】
バッチ吸着もカラムクロマトグラフィも、際立ったｖＷＦの減少を引き起こさない。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔとインキュベートされた血漿（５ｇ／２５ｍＬ）は、参照欠乏血漿と比較して、より多量のｖＷＦ抗原を含んでいた（１．６ＩＵ／ｍＬに対して１．２〜１．４ＩＵ／ｍＬ）。
【０１４０】
３．５．フィブリノーゲン濃度の測定
フィブリノーゲン含有量を、Ｃｌａｕｓｓ法に基づくＱ．Ｆ．Ａ．  Ｔｈｒｏｍｂｉｎキット（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。ＳＳＣ＃４を標準として使用した。最初の試験で、手動で実行する場合にはＣｌａｕｓｓ法を使用できないことが判明した。Ｃｌａｕｓｓ法は凝固時間の記録に基づく方法であるが、標準的なＣｌａｕｓｓ法を用いた凝固時間は１５秒に満たず、吸光度測定を開始するまでに凝固が完了してしまった。
【０１４１】
Ｃｌａｕｓｓアッセイ
試料を１：１０に希釈して体積を２００μＬにし、３７℃で３〜４分間インキュベートする。次に、１００μＬのトロンビン溶液（濃度１００ＩＵ／ｍＬ）を加え、３７℃でさらにインキュベートする。血塊形成までの時間を測定する。
【０１４２】
Ｃｌａｕｓｓアッセイの代わりに、血漿の完全凝固後の濁度又は光散乱の変化に基づく改変アッセイを使用した。
【０１４３】
試料を１：１０に希釈して体積を２５０μＬにする。４０５ｎｍでの吸収を測定する。５０ｕＬのトロンビン溶液（濃度２５ＩＵ／ｍＬ）を加える。吸光度がプラトーに達するまで４０５ｎｍでの吸収を測定する。
【０１４４】
前記アッセイを室温で行い、各試料について、２つの独立したアッセイ系列の二連実験において、力価を決定した。
【０１４５】
この改変アッセイは、プロトロンビン時間法（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｔｉｍｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）と称される場合もあり、通常、Ｃｌａｕｓｓ法と非常に良好な相関性を示す（ＥＣＡＴ  Ａｓｓａｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ２０１２，  Ｐａｌａｒｅｔｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９１，  Ｒｏｓｓｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １９８８を参照）。
【０１４６】
３．６．フィブリノーゲン測定の結果
フィブリノーゲンに関する結果を表７に示す。
【０１４７】
およそ同じ濃度のフィブリノーゲンがバッチ吸着前後に存在したことから、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを用いるバッチ吸着はフィブリノーゲンの減少を引き起こさないようだ。しかし、２５ｍＬのＯｃｔａｐｌａｓ（商標）当たり１５ｇのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔとインキュベートしたＯｃｔａｐｌａｓ（商標）においては、７０％超（２．８ｍｇ／ｍＬから０．８ｍｇ／ｍＬへの）減少した。これはおそらく、解凍された試料中に存在していた沈殿物／血塊によって説明される。
【０１４８】
得られた対照値、２．５ｍｇ／ｍＬ及び２．７ｍｇ／ｍＬは、２．３３〜３．１６ｍｇ／ｍＬの割当範囲ないであった。
【０１４９】
【表９】
2019511467.tif 000012
【０１５０】
３．７．第Ｘ因子濃度の測定
試料中ＦＸがヘビ毒ＲＶＶによってＦＸａへと活性化されるＲＶＶ発色法を用いて、第Ｘ因子活性を測定した。ＳＳＣ＃４を標準として使用した。標準は１：２０〜１：２００に希釈して解析し、試料は１：４０に希釈して解析した。希釈は全てＴｒｉｓ緩衝液で行った。
【０１５１】
以下のプロトコルに従って測定を行った。
【０１５２】
【表１０】
2019511467.tif 000013
【０１５３】
３．８．第Ｘ因子活性測定の結果
第Ｘ因子解析で得られた結果を表８にまとめる。
【０１５４】
表７は、ＦＶＩＩＩを欠乏させるステップがＦＸ活性に対して大きな影響を与えなかったことを示している。参照欠乏血漿を含む全ての試料が０．５ＩＵ／ｍＬを大きく超えるＦＸ活性を有した。ＦＸ活性は、２５ｍＬのＯｃｔａｐｌａｓ（商標）当たり１５ｇのＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔとインキュベートしたＯｃｔａｐｌａｓ（商標）で低く、この結果はｖＷＦ解析及びフィブリノーゲン解析の結果と一致している。
【０１５５】
【表１１】
2019511467.tif 000014
【０１５６】
実施例４：直接的アミド分解活性の測定
４．１．測定
予備活性化の有無を定性的に確認するために、出発材料、参照欠乏血漿、並びにバッチ式試験及びクロマトグラフ試験から得られた選択された材料を２種類の異なる発色基質、Ｓ−２２８８（一般的なセリンプロテアーゼの基質）及びＳ−２３６６（トロンビン、活性化第ＸＩ因子及びＡＰＣ）と共にインキュベートすることによって、ＳＳＣ＃４と比較した。全ての試料をＴｒｉｓ緩衝液（ＴＢ０３５、Ｒｏｓｓｉｘ社）中に１：５に希釈及び１：１０に希釈した。試料の加水分解速度をＳＳＣ＃４血漿の加水分解速度と比較した。異なる試料間の解析比較を最適化するために、場合によっては基質濃度及びインキュベーション温度に軽微な変更を加えて、以下の手順を実行した。
【０１５７】
【表１２】
2019511467.tif 000015
【０１５８】
４．２．直接的アミド分解活性の結果
結果を表９及び図４にまとめる。
【０１５９】
２種類の発色基質であるＳ−２２８８（一般的なセリンプロテアーゼ基質）及びＳ−２３６６（トロンビン、活性化第ＸＩ因子及びＡＰＣの高感度基質）とインキュベートすることによって、プロテアーゼの存在を定性的に試験した。全体として、表９の結果は、他の試料よりも明らかに高い加水分解速度を有していたＳｉｅｍｅｎｓ社製欠乏血漿を除いて、活性化プロテアーゼの存在が非常に限定されていたことを示している。
【０１６０】
【表１３】
2019511467.tif 000016
【０１６１】
４．３．ｒｈＦＶＩＩＩの安定性の確認
参照欠乏血漿、並びに実施例１及び実施例２のバッチ式試験及びクロマトグラフ試験から得られた選択された材料中に添加された純粋ｒｈＦＶＩＩＩの安定性を確認することによる逆向きの（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）安定性試験で、予備活性化の程度を潜在的に調べた。この実験計画は、予備活性化の増大がｒｈＦＶＩＩＩの活性化をもたらし、それに伴ってｒｈＦＶＩＩＩの安定性が減少するという仮説に基づくものであった。ｒｈＦＶＩＩＩを、各ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中に公称濃度（ｎｏｍｉｎａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）１ＩＵ／ｍＬまで希釈し、分注し、−７０℃以下で凍結した。試料を３時間、５時間、及び８時間の時点で解凍し、アッセイ開始直前に解凍された試料と比較する、逆向きの安定性試験を行った。
【０１６２】
ｒｈＦＶＩＩＩ活性は、高濃度域、及び手動によるマイクロプレート法を用いるＣｏａｔｅｓｔ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットで測定した。各試料は、独立して調製された二連実験にて分析した。標準は、Ｈｅｌｅｎａ社製先天性欠乏血漿中に１ＩＵ／ｍＬに希釈した。
【０１６３】
４．４．ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中に希釈されたｒｈＦＶＩＩＩの安定性試験の結果
結果を表１０及び図５にまとめる。
【０１６４】
種々の欠乏血漿中に１ＩＵ／ｍＬに希釈された場合、ｒｈＦＶＩＩＩの安定性に有意差はなかった。
【０１６５】
Ｈｅｌｅｎａ社製先天性欠乏血漿中に希釈された標準に対して力価が決定された場合、他の調製物におけるｔ＝０でのｒｈＦＶＩＩＩの回復はほぼ同一であり、アッセイ活性が全ての欠乏血漿において同一であるという実施例４．６における知見を裏付けるものである。
【０１６６】
【表１４】
2019511467.tif 000017
【０１６７】
４．５．希釈媒体として種々の欠乏血漿を用いたｒｈＦＶＩＩＩの力価決定
【０１６８】
ｒｈＦＶＩＩＩ濃縮溶液を７種の異なる欠乏血漿中に１ＩＵ／ｍＬに希釈し、同じ欠乏血漿中に希釈された標準に対する力価を決定した。
【０１６９】
これらの種々の欠乏血漿を希釈剤として用いた場合、力価に有意差は認められなかった（表１１、図６）。ｒｈＦＶＩＩＩ調製物の平均活性は４２１３ＩＵ／ｍＬであり、これらの種々の欠乏血漿の全ての平均値の結果は、その平均値から＋／−４％以内である、４０５８〜４３９４ＩＵ／ｍＬの範囲であった。
【０１７０】
標準の傾きは欠乏血漿に非依存的であった。これは、試料及び標準が同じ欠乏血漿中に希釈されたことにより、アッセイにおける活性がその両方で低下したためである。
【０１７１】
この実験設定では、標準及び試料が同じ欠乏血漿中に希釈されたために、ｒｈＦＶＩＩＩの力価は欠乏血漿中の残留ＦＶＩＩＩ活性の程度に依存しなかった。よって、残留ＦＶＩＩＩ活性からの潜在的な寄与は、試料及び標準の両方において同一である。全ての場合において、いかなる残留ＦＶＩＩＩ活性からの寄与も非常に小さいものであったため、検量線の傾きへの影響は有意ではなかった。
【０１７２】
【表１５】
2019511467.tif 000018
【０１７３】
実施例５：ＦＶＩＩＩ活性を含まないｖＷＦの精製
ｖＷＦ精製のための出発材料は、Ｗｉｌａｔｅ（登録商標）の名でＯｃｔａｐｈａｒｍａ社から販売されている、ヒトのＦＶＩＩＩとｖＷＦとの複合体であるＷｉｌａｔｅとした。
【０１７４】
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔをＸＫ１６／２０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に樹脂層高４．５ｃｍ（カラム体積９ｍＬに相当）まで充填した。実験中の流速は０．２５ｍＬ／分（７．５ｃｍ／時に相当）とした。カラムを以下の平衡用緩衝液で平衡化した。
【０１７５】
【表１６】
2019511467.tif 000019
【０１７６】
Ｗｉｌａｔｅ（登録商標）を、４ｍｌの０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２中で３０分間再構成し、ＦＶＩＩＩとｖＷＦとの間の相互作用を阻害した。再構成したＷｉｌａｔｅ（登録商標）を前記ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ  ＸＫ１６／２０カラムに０．２５ｍｌ／分の流速でアプライすることにより、ＦＶＩＩＩの大部分はアフィニティ樹脂に結合し、回収されたフロースルーにはｖＷＦと、フィブリノーゲンなどのいくらかの他のタンパク質とが含有された。
【０１７７】
【表１７】
2019511467.tif 000020
【０１７８】
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔカラムから得られたフロースルーの１体積当たり、その溶液に３．３４体積のフロースルー緩衝液及び３．１３ｇのＮａＣｌを添加した。高濃度グリシンによりｖＷＦ分子が沈殿する。この溶液を室温で３０分間撹拌した後、６００ｒｐｍで１０分間遠心して、ｖＷＦ含有ペレットを得た。
このペレットを再構成用緩衝液中に素早く再構成した。
【０１７９】
【表１８】
2019511467.tif 000021
【０１８０】
再構成後、２８〜３２℃で約１０時間保温して、全ての残留ＦＶＩＩＩ活性を取り除いた。
【０１８１】
最後に、ＨｉＰｒｅｐ脱塩カラム、並びに４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する平衡用緩衝液（ｐＨ７）を用いて、ＥＤＴＡを除去した。
【０１８２】
上記のプロトコルの結果、ｖＷＦの回収率は２０〜２５％となり、残留ＦＶＩＩＩ活性は０．０１ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／１００ＩＵ  ｖＷＦ抗原未満となった。
【０１８３】
実施例６：様々な流速の試験
６．１．手順
限定的な試験を行って、残留ＦＶＩＩＩ活性に対する流速の影響を調べた。クリオ上清を、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを充填したＸＫ１６カラム（樹脂層高４ｃｍ、カラム体積８ｍＬ）にアプライした。流速１２０〜７．５ｃｍ／時（１ｍＬ／分＝３０ｃｍ／時）を試験した。これらの結果に基づき、流速７．５ｃｍ／時（０．２５ｍＬ／分）をＦＶＩＩＩ欠乏血漿の精製用に選んだ。
【０１８４】
６．２．結果
結果を図７に示す。残留ＦＶＩＩＩ活性は流速に対し直線の関係であった。１時間当たり１０ｃｍ未満の流速により、ＦＶＩＩＩ活性が１％未満であるＦＶＩＩＩ欠乏血漿の信頼のおける産生がもたらされる。
【０１８５】
直径１．６ｃｍのＸＫ１６カラムに対する流速７．５ｃｍ／時（＝０．２５ｍＬ／分）の使用により、２００ｍＬの血漿をアプライした場合、１３時間の処理時間となった。２００ｍＬの血漿はカラム体積の２５倍に相当し、ＦＶＩＩＩの漏出の増加は処理中に見られなかった。全てのカラム精製を通じて圧力は安定であった。
【０１８６】
実施例７：ＦＶＩＩＩ欠乏血漿の作製
異なる２バッチのクリオ上清から異なる３バッチのＦＶＩＩＩ欠乏血漿を作製した。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓで緩衝化された１バッチ（プレパイロット３）以外は、クリオ上清を室温の水浴中で解凍し、０．２５ｇ  Ｈｅｐｅｓ／２５ｍＬ  血漿の添加により緩衝化して、４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓとした。
【０１８７】
ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔを充填したＸＫ１６カラム（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社）（樹脂層高４ｃｍ、カラム体積８ｍＬ）及びＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  １５０クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社）を用いて精製を行った。平衡用緩衝液として、２６ｇ／ｋｇ  ＮａＣｌ、６．０ｇ／ｋｇ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４〜６．６）１を用いた。流速７．５ｃｍ／時（０．２５ｍＬ／分）を使用し、２００〜２５０ｍＬのクリオ上清を各バッチの各カラムにアプライしたところ、１３〜１７時間の処理時間となった。
【０１８８】
プレパイロット３から得られたＦＶＩＩＩ欠乏血漿に、実施例５に従って作製されたｖＷＦを添加して、１ＩＵ／ｍｌ  ｖＷＦ抗原の公称濃度にした。この欠乏血漿を９６×１ｍＬラックに分注し、７０℃以下で凍結した。
【０１８９】
実施例８：ＦＶＩＩＩ欠乏血漿の特徴付け
８．１．残留ＦＶＩＩＩ活性の測定
Ｃｏａｔｅｓｔ  ＳＰ４  ＦＶＩＩＩキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社）を用いて残留ＦＶＩＩＩ活性を測定した。前記アッセイは、低濃度域用を用い、Ｃｏａｔｅｓｔ  ＳＰ４  ＦＶＩＩＩ添付文書に従って行った。ＳＳＣ＃４を標準として使用し、キットの緩衝液中に希釈した。実施例７で得た試料を１：８１に希釈して解析した。
【０１９０】
８．２．ｖＷＦ抗原濃度の測定
ｖＷＦ濃度を、Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。アッセイは凝固装置ＡＣＬ  ＴＯＰ  ７００を使用して、前記キット用の搭載アプリケーションを用いて行った。ＳＳＣ＃４を標準として使用した。
【０１９１】
８．３．フィブリノーゲン濃度の測定
フィブリノーゲン含有量を、Ｑ．Ｆ．Ａ．  Ｔｈｒｏｍｂｉｎキット（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて測定した。アッセイは凝固装置ＡＣＬ  ＴＯＰ  ７００を使用して、前記キット用の搭載アプリケーションを用いて行った。ＳＳＣ＃４を標準として用いた。
【０１９２】
８．４．第Ｘ因子濃度の測定
試料中ＦＸがヘビ毒酵素ＲＶＶ−ＸによってＦＸａへと活性化されるＲＶＶ発色法を用いて、第Ｘ因子活性を測定した。ＳＳＣ＃４を標準として使用した。標準は１：２０〜１：２００に希釈して解析し、試料は１：４０に希釈して解析した。希釈は全てＴｒｉｓ緩衝液で行った。
【０１９３】
ＦＸ濃度測定のためのプロトコルを表１２に要約する。
【０１９４】
【表１９】
2019511467.tif 000022
【０１９５】
８．５．吸光度測定
２８０ｎｍ及び６００ｎｍでの吸光度を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。
【０１９６】
８．６．結果
全試料の残留ＦＶＩＩＩ活性が１％未満であった。Ｒｏｓｓｉｘプレパイロット３に、約２０〜３０％から約１００％のｖＷＦレベルにまで、ｖＷＦを添加した。このｖＷＦ濃度は、試験されたＳｉｅｍｅｎｓ社製欠乏血漿と同等であり、Ｈｅｌｅｎａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製の先天性ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中のｖＷＦ抗原濃度と比較して約３０％高かった。プレパイロット１及びプレパイロット２は２０〜３０％のｖＷＦ濃度を有していた。
【０１９７】
プレパイロット血漿は参照血漿と比較してわずかに（約２０％）低いフィブリノーゲン濃度を有している。最も考えられる原因は、出発材料がクリオ上清血漿であることと、クリオ沈殿工程中にフィブリノーゲン分子の一部が共沈殿したことである。第Ｘ因子活性は全ての試験された欠乏血漿において正常である。
【０１９８】
目視で認められ、また予測できることであるが、参照血漿は、Ｒｏｓｓｉｘプレパイロットと比較して、より濁っており、１．５〜２倍高いＯＤ６００を有する。これは、これらのプレパイロットがクリオ沈殿反応後血漿に由来していること、及び、クリオ上清中の特定の物質を減少させる遠心分離工程によりクリオ沈殿物が除去されることと関連している。タンパク質濃度測定として使用できる２８０ｎｍでの吸光度は、Ｒｏｓｓｉｘプレパイロットにおいて同様であるか、わずかに高いが、これは異なる血漿ロット間のバッチ間変動によるものである可能性がある。
【０１９９】
【表２０】
2019511467.tif 000023
【０２００】
【表２１】
2019511467.tif 000024
【０２０１】
実施例９：予備活性化の試験
９．１．直接的アミド分解活性−実験プロトコル
欠乏血漿を２種の異なる発色基質である４ｍＭ  Ｓ−２２８８（一般的なセリンプロテアーゼ基質）及び２ｍＭ  Ｓ−２３６６（トロンビン、活性化第ＸＩ因子及びＡＰＣ）と共にインキュベートすることによって、予備活性化の有無を定性的に確認した。全ての試料をＴｒｉｓ緩衝液（ＴＢ０３５、Ｒｏｓｓｉｘ社）中に１：１０に希釈した。
【０２０２】
【表２２】
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【０２０３】
９．２．直接的アミド分解活性−結果
結果を図８に示す。２種類の発色基質（一般的なセリンプロテアーゼ基質であるＳ−２２８８、及びトロンビン、活性化第ＸＩ因子及びＡＰＣの高感度基質であるＳ−２３６６）とインキュベートすることによって、プロテアーゼの存在を定性的に調べた。全体として、結果は、他の試料よりも明らかに高い加水分解速度を有していたＳｉｅｍｅｎｓ社製欠乏血漿以外は、活性化プロテアーゼの存在が非常に限定されていたことを示している。
【０２０４】
９．３．ｒｈＦＶＩＩＩの安定性の確認
予備活性化の程度を、欠乏血漿に添加された純粋Ｂドメイン欠失型ｒｈＦＶＩＩＩの安定性を確認することによる逆向きの安定性試験で、潜在的に調べた。
【０２０５】
この実験計画は、予備活性化の増大がｒｈＦＶＩＩＩの活性化をもたらし、それに伴ってｒｈＦＶＩＩＩの安定性が減少するという仮説に基づくものであった。Ｎｕｗｉｑ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＢ社製、スウェーデン、２０００ＩＵ／バイアル）を、各ＦＶＩＩＩ欠乏血漿で公称濃度１ＩＵ／ｍＬまで希釈し、分注し、−７０℃以下で凍結した。試料を３時間及び６時間の時点で解凍し、アッセイ開始直前に解凍された試料と比較する、逆向きの安定性試験を行った。
【０２０６】
ｒｈＦＶＩＩＩ活性は、高濃度域、及び手動によるマイクロプレート法を用いるＣｏａｔｅｓｔ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩキットで測定した。各試料は、（独立して調製された）真の四連実験として解析し、ｔ＝０試料のプールから作製された標準に対する力価を決定した。
【０２０７】
９．４．ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中に希釈されたｒｈＦＶＩＩＩの安定性−結果
種々の欠乏血漿中に公称濃度１ＩＵ／ｍＬに希釈された場合、Ｎｕｗｉｑ（登録商標）２０００ＩＵ／バイアルの安定性に有意差はなかった。２０〜２５℃で６時間貯蔵した後の活性変化は−３〜＋２％の範囲内であった。
【０２０８】
【表２３】
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【０２０９】
９．５．種々の欠乏血漿中に１ＩＵ／ｍＬに希釈後のｒｈＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ（登録商標）２５０ＩＵバイアル及び２０００ＩＵバイアル）の力価の決定
力価決定の結果を、表１５及び表１６、並びに図１３及び図１４に示す。全てのアッセイ系列は、並列性、回帰性、及び線形性が認められた。種々の欠乏血漿の間で、２０００ＩＵ／バイアルの変動又は力価に有意差はなかった。２５０ＩＵ／バイアルは、プレパイロット１及びプレパイロット２中に事前希釈された場合、より大きな変動、及び２〜５％より低い力価を示した。これらはｖＷＦ抗原濃度が低い２つのプレパイロットである。このわずかに低い結果は、ｖＷＦ抗原の存在が少ないほど、ｒｈＦＶＩＩＩ希釈物はより不安定となることが説明となり得る。
【０２１０】
約２９０ＩＵ／バイアル及び２５５０ＩＵ／バイアルの得られた力価は、２５０ＩＵ／バイアル及び２０００ＩＵ／バイアルの公称活性と異なり、＋１６％及び＋２８％にそれぞれ相当する。
【０２１１】
標準及び試料の用量反応は、使用された全ての欠乏血漿において同様であった。
【０２１２】
【表２４】
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【０２１３】
【表２５】
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【０２１４】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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