(57)【要約】  多層式ディスポーザブルカートリッジは、複数の試薬を保持する複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器と、生体標本を観察するための標本観察エリアとを有することができる。流体ウェル下方のフレキシブルエラストマー層に形成された特定のバルブを開放することにより、複数の試薬を順次連続して標本に適用することができる。試薬を標本に案内するために、第１のプラスチックリジッド層に流体通路を形成することができる。バルブに吸引力または圧力を印加するための空気圧通路を、第２のプラスチックリジッド層に形成することができる。
2019525159.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を分析するためのディスポーザブル品であって、
第１のリジッド層（２０）であって、分析エリア（２４）と、複数の流体貯蔵器（２２）と、該第１のリジッド層（２０）に形成された複数の流体通路とを有しており、該流体通路が前記流体貯蔵器との流体連通を提供する、第１のリジッド層（２０）と、
前記流体貯蔵器（２２）のうち少なくとも１つの流体貯蔵器と流体連通した複数の流体制御ポイント（３３）を有するフレキシブル層（３０）と、
第２のリジッド層（４０）であって、該第２のリジッド層（４０）に形成された複数の空気圧通路を有し、該空気圧通路が少なくとも１つの前記流体制御ポイントとの空気圧連通を提供する、第２のリジッド層（４０）と、を備え、
複数の前記流体貯蔵器（２２）のうち１つの流体貯蔵器だけから、前記流体通路への、または前記流体通路からの流れを生じさせるように、各流体制御ポイントを空気圧で制御可能である、生体試料を分析するためのディスポーザブル品。
【請求項２】
前記第２のリジッド層（４０）は、支持体（６０）を保持するための取り付け機構（４５）をさらに有しており、前記支持体（６０）と前記リジッド層（４６，２０）と前記フレキシブル層（３０）とによって、標本分析容積体（５００）が規定される、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項３】
前記流体制御ポイントは、前記第２のリジッド層の空気圧通路から前記フレキシブル層の裏面に向かって印加される吸引力によって、空気圧で制御され、前記フレキシブル層が第１の停止位置から第２の停止位置に向かって引っ張られて、前記標本分析容積体（５００）へ、および前記標本分析容積体（５００）から、流体を流すことができる、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項４】
前記流体制御ポイントは、前記第２のリジッド層の空気圧通路から前記フレキシブル層の裏面に向かって印加される吸引力によって、空気圧で制御され、前記フレキシブル層が第１の停止位置に当接して静止した位置におかれて、前記標本分析容積体（５００）への、および前記標本分析容積体（５００）からの、流体の流れが阻止される、請求項２記載のディスポーザブル品。
【請求項５】
前記流体制御ポイント（３３）は、前記フレキシブル層（３０）の薄膜化部分（１３３）を有する、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項６】
前記流体制御ポイントは、前記フレキシブル層（３０）の薄膜化部分（１３３）を有しており、該薄膜化部分（１３３）は、第１の停止位置（１２０）と第２の停止位置（４３）とに向かって撓まされる、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項７】
前記流体制御ポイントは、前記流体通路内に突入し前記フレキシブル層（３０）の前記薄膜化部分（１３３）のための第１の停止位置（１２０）を規定する、前記第１のリジッド層（２０）における突出構造要素（１２０）と、前記フレキシブル層（３０）の前記薄膜化部分（１３３）のための第２の停止位置（４３）である、前記第２のリジッド層（４０）の空気圧通路における開口部とを有しており、
前記薄膜化部分（１３３）によって、前記第１のリジッド層（２０）内の流体通路が開放および閉鎖される、請求項６記載のディスポーザブル品。
【請求項８】
前記第２のリジッド層（４０）は圧力ポイント（４３）を有しており、該圧力ポイント（４３）は、前記フレキシブル層（３０）の前記薄膜化部分（１３３）のための第２の停止位置として、前記フレキシブル層（３０）のキャビティに突入している、請求項６記載のディスポーザブル品。
【請求項９】
前記圧力ポイント（４３）が前記キャビティに突入することによって、前記フレキシブル層（３０）が前記リジッド層（４０）に対し、前記フレキシブル層（３０）の前記薄膜化部分（１３３）に形成されたボタンと隣接する場所で位置合わせされる、請求項８記載のディスポーザブル品。
【請求項１０】
前記フレキシブル層（３０）は、空気圧力によって作動するポンピング機構（２００）をさらに有する、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項１１】
前記ポンピング機構（２００）は、流体通路の容積を変化させるように構成された可動部分（２１０）を前記フレキシブル層（３０）内に有しており、
前記可動部分（２１０）は、第１の流体制御ポイント（１００）と第２の流体制御ポイント（３００）との間を流体連通させる、請求項１０記載のディスポーザブル品。
【請求項１２】
前記第２のリジッド層は、複数の流体制御ポイントから成る１つの行に対し吸引力を与える第１の空気圧通路と、複数の流体制御ポイントから成る１つの列に対し吸引力を与える第２の空気圧通路とを有しており、２つの前記空気圧通路が共働して、一度に複数の前記流体貯蔵器のうち１つの流体貯蔵器のみから流体が計量分配されるようになる、請求項２記載のディスポーザブル品。
【請求項１３】
前記第１のリジッド層は、前記分析容積体（５００）の少なくとも一方の側部に隣接したトレンチ（２２０）をさらに有しており、該トレンチによって、少なくとも１つの貯蔵器から流れる流体が、前記分析容積体（５００）の側部全体を介して受け入れられて分散される、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項１４】
前記トレンチ（２２０）は非対称の断面を有する、請求項１３記載のディスポーザブル品。
【請求項１５】
前記第１のリジッド層（２０）は、前記分析容積体（５００）の少なくとも一方の側部に隣接するバリア（２４０）をさらに有しており、該バリア（２４０）は、流体が前記バリア（２４０）と前記支持体（６０）との間を流れてから前記標本分析容積体（５００）に入るように、前記標本分析容積体（５００）に突入している、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項１６】
前記標本分析容積体（５００）は高さｈ１を、前記キャビティ（２４０）は深さｈ２を、前記バリア（２４０）は深さｈ３を、前記生体試料は高さｈ４を有しており、
ただしｈ１，ｈ２，ｈ３およびｈ４は、
（０．０５〜０．５）×ｈ３＝ｈ４、および／または
（０．１〜０．５）×ｈ２＝ｈ１、および／または
（０．１〜０．５）×ｈ１＝ｈ４
という比を有する、請求項１２記載のディスポーザブル品。
【請求項１７】
前記フレキシブル層（３０）は、前記第１のリジッド層（２０）を前記第２のリジッド層（４０）に対し封止し、かつ／または前記第２のリジッド層（４０）を前記支持体（６０）に対し封止する、請求項１記載のディスポーザブル品。
【請求項１８】
前記複数の流体貯蔵器（２２）は複数の試薬を含み、該複数の試薬のうちの少なくとも１つは、蛍光分子と共役された抗体である、請求項１記載のディスポーザブル品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料を分析するためのディスポーザブル品に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に免疫蛍光分析のために、１つまたは複数の抗体と共役された蛍光染料が使用される。標的細胞の特異的検出および隔離を行えるようにするため、抗体、蛍光染料、フローサイトメータ、フローソータおよび蛍光顕微鏡に関して、この２０年で膨大な数のバリエーションが開発されてきた。
【０００３】
組織の細胞構造を検出してイメージングするために、着目する抗原を標的とする蛍光色素共役体が使用される。このような技術において、蛍光シグナルの除去と再染色とを順次連続して行うことによって、標識付けと検出とを同時に用いる標準の手順よりも、高い多重化能力が得られるようになる。例えば、米国特許第７７４１０４５号明細書、欧州特許第０８１０４２８号明細書または独国特許出願公開第１０１４３７５７号明細書には、共役された蛍光部分の光化学的または化学的な破壊により、蛍光シグナルを除去することが開示されている。
【０００４】
上述の技術によれば、結果として生じた複数の蛍光シグナルが、１つのイメージとして収集される。蛍光シグナルの除去と種々の蛍光色素共役体による再染色とを順次連続して行うことにより、それぞれ異なる抗原が検出され、その結果、試料のそれぞれ異なる部分（抗原）を表す同じ試料の複数のイメージが得られる。これらの技術によって収集される情報の品質は、イメージの分解能と、処理ステップの精度と、標本を操作するために各ステップの合間に必要とされる時間とに大きく左右される。公知の技術によって得ることができるのは、処理ステップが厄介であることに起因して、一連の染色を通して１つの特定の生体標本のごく限られた個数のイメージである。このため、提案された分析のために、生体試料の染色、イメージングおよび染色除去のサイクルについて、自動化された手順に対するニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書では、生体標本の順次連続した分析をコンピュータ制御のもと、その場で行うことができるシステムについて説明する。本発明による装置によれば、複数の蛍光試薬を同じ生体標本に順次連続して適用することができ、イメージング機構または肉眼によって、透明な支持体を通して標本を観察することができる。イメージング機構を蛍光イメージングシステムとすることができ、このシステムは、データ収集コンピュータと組み合わせられて、一連の様々な試薬により染色された生体標本の視覚的イメージを生成することができる。
【０００６】
システムの中心にあるのは多層式ディスポーザブルカートリッジであり、これを複数の層から成る小さい低コストのプラスチックカートリッジとすることができる。１つの層において、複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器が複数の流体の試薬を保持することができる。ディスポーザブルカートリッジを、例えばスライドガラス上など透明な支持体上で生体標本を受け入れるように構成することもできる。
【０００７】
カートリッジは、２つのプラスチックリジッド層と、これら２つのリジッド層の間にある１つのフレキシブルエラストマー層とを含むことができる。これらのリジッド層は、その中に形成された小さい通路を有することができる。一方のリジッド層内の通路を、流体を搬送するように構成することができる。他方のリジッド層内の通路を、空気圧すなわち、エアプレッシャーまたは吸引力を搬送するように構成することができる。空気圧通路は、圧力または吸引力をエラストマー層の下面に供給することができ、その結果としてエラストマー層が撓まされる。この撓みによって流体バルブを開放または閉鎖することができ、これによって、流体を他方のリジッド層の流体通路へ流すことができる。特に、エラストマー層内のバルブによって、流体貯蔵器と生体標本との間の流体通路を開放して、特定の試薬をその標本に供給することができる。
【０００８】
これらの構造はすべて、小さいディスポーザブルカートリッジに含まれているので、流体容積が最小化される。容積が小さいことから高価な試薬が有効に使用され、洗浄ステップが最小限に抑えられ、データ収集に必要とされる時間が短くなる。カートリッジは使い捨てであり、流体経路はすべてその中に封じ込まれているので、殺菌の手順がなく、多層式ディスポーザブルカートリッジは単に廃棄されるだけである。
【０００９】
したがって、生体試料分析用のディスポーザブル品は第１のリジッド層（２０）を含むことができ、この層は、分析エリア（２４）と、複数の流体貯蔵器（２２）と、この層内に形成された複数の流体通路とを有しており、それらの通路が流体貯蔵器との流体連通を提供する。さらに、このディスポーザブル品はフレキシブル層（３０）も含むことができ、この層は、複数の流体貯蔵器（２２）のうち少なくとも１つの流体貯蔵器と流体連通した複数の流体制御ポイント（３３）を有する。このディスポーザブル品はさらに、内部に複数の空気圧通路が形成された第２のリジッド層（４０）を含むことができ、それらの通路が少なくとも１つの流体制御ポイントとの空気圧連通を提供し、この場合、複数の流体貯蔵器（２２）のうちただ１つの流体貯蔵器から流体通路への、および流体通路からの流れを生じさせるように、流体制御ポイント各々を空気圧で制御可能である。
【００１０】
フレキシブル層（３０）を、第１のリジッド層（２０）および第２のリジッド層（４０）とは別体で形成することができ、ディスポーザブルカートリッジは、以下の説明で詳しく説明するように、３つの別体の層から組み立てられる。本発明のこの実施形態によれば、フレキシブル層（３０）は、第１のリジッド層（２０）および第２のリジッド層（４０）とは別体で形成され、ディスポーザブルカートリッジは、各々別体の製品である第１のリジッド層（２０）とフレキシブル層（３０）と第２のリジッド層（４０）とから組み立てられる。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、フレキシブル層（３０）は、第１のリジッド層（２０）または第２のリジッド層（４０）のいずれかと共に形成される。この実施形態によれば、フレキシブル層（３０）は例えば、フレキシブル層（３０）の機能が依然として達成されるように、ただし別個の層としてではないように、他のリジッド層上にまたは他のリジッド層のところにフレキシブルな材料を取り付ける、配置する、または押し出し成形することによって形成される。この実施形態によれば、ディスポーザブルカートリッジは、第１のリジッド層（２０）に取り付けられたフレキシブル層（３０）と第２のリジッド層（４０）とから組み立てられ、または第２のリジッド層（４０）に取り付けられたフレキシブル層（３０）と第１のリジッド層（２０）とから組み立てられる。この実施形態の１つの変形例によれば、フレキシブル層（３０）は、例えば図１に示されているように連続的な層である。さらに別の変形例によれば、バルブまたはポンプの機能を提供するために、またはシーリング材料として、といったように、リジッド層のうちフレキシブルな材料の機能が必要とされる場所にだけ、フレキシブル材料が取り付けられ、配置され、または押し出し成形される。
【００１２】
以下の図面を参照しながら様々な例の詳細について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】多層式ディスポーザブルカートリッジの分解斜視図である。
【図２】多層式ディスポーザブルカートリッジの拡大斜視図である。
【図３】多層式ディスポーザブルカートリッジの上蓋および第１のリジッド層の拡大図である。
【図４】多層式ディスポーザブルカートリッジのエラストマー層の拡大図である。
【図５】多層式ディスポーザブルカートリッジの第２のリジッド層の拡大図である。
【図６】生体試料を保持するための粘着性フォイルバッキングおよび透明スライドガラスを示す図である。
【図７】複数の流体バルブのうちの１つの詳細断面図である。
【図８】１つのポンピングサイクルの１番目の部分における多層式ディスポーザブルカートリッジ内のポンピング機構の詳細図である。
【図９】１つのポンピングサイクルの２番目の部分における多層式ディスポーザブルカートリッジ内のポンピング機構の詳細図である。
【図１０】１つのポンピングサイクルの３番目の部分における多層式ディスポーザブルカートリッジ内のポンピング機構の詳細図である。
【図１１】多層式ディスポーザブルカートリッジのためのアレイの概略図である。
【図１２】多層式ディスポーザブルカートリッジのための流体流路を示す概略図であって、（Ａ）は平面図を示し（Ｂ）は断面図を示し、（Ｃ）は構造要素の詳細な寸法を示す。
【図１３】多層式ディスポーザブルカートリッジを機能化された表面と共に示す概略図である。
【００１４】
なお、これらの図面は必ずしも正確な縮尺で描かれているわけではなく、また、同じ構造要素には同じ参照符号が付されている場合もあることを理解されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
多層式ディスポーザブルカートリッジを用い自動化された手法で、複数の試薬を含む透明な表面上に配置された生体標本を分析するためのシステムおよび方法について説明する。複数の試薬を各々、このカートリッジ上の別個の流体ウェルに格納することができる。多層式ディスポーザブルカートリッジ内のエラストマー層を、流体バルブおよび流体ポンプとして構成することができ、これによって、試薬の流体をウェルから生体標本が配置された標本分析チャンバへと流すことができる。流体バルブおよび流体ポンプを、圧力源からの空気圧を用いて作動させることができ、これらの流体バルブおよびポンプはコンピュータ制御されている。したがって、生体標本を、複数の試薬を用いて自動化された手法で分析することができる。流体通路は著しく小さく、多層式ディスポーザブルカートリッジ内に含まれているので、デッドボリュームは小さく、短期間に連続的に試薬を適用することができる。容積が小さいことから高価な試薬が有効に使用され、洗浄ステップが最小限に抑えられ、かつデータ収集に必要とされる時間が短くなる。カートリッジは使い捨てであり、流体経路はすべてその中に封じ込まれているので、殺菌の手順がなく、多層式ディスポーザブルカートリッジは単に廃棄されるだけである。
【００１６】
図１は、多層式ディスポーザブルカートリッジ１の分解斜視図である。多層式ディスポーザブルカートリッジ１には複数の部品を含めることができ、これらの部品を組み立てて多層式ディスポーザブルカートリッジ１を形成することができる。カートリッジ１は、保護カバー１０または上蓋および第１のリジッド層２０を含むことができる。さらに、このカートリッジは、エラストマー層３０および第２のリジッド層４０を含むこともできる。最後に、このカートリッジは、フォイルカバー５０および試料支持体６０を含むことができる。これらの中でも主要な部品は、第１のリジッド層２０、エラストマー層３０および第２のリジッド層４０である。これら３つの部品の詳細については、図２〜図８を参照しながら後でさらに詳しく説明する。
【００１７】
第１のリジッド層２０および第２のリジッド層４０を、ポリカーボネートなどのポリマープラスチックから構成することができる。第１のリジッド層２０および第２のリジッド層４０を、射出成形することができる。エラストマー層３０を、シリコーンなどのようなゴム状の弾性材料から形成することができ、図示の構造となるようプレス加工することができ、または他の手法で成形することができる。これらの部品を互いに接着またはスナップフィットして、多層式ディスポーザブルカートリッジ１を形成することができる。
【００１８】
多層式ディスポーザブルカートリッジ１の全体の寸法を、奥行き約３０ｍｍ、高さ約１０ｍｍのときに１辺が約７５ｍｍとなるようにすることができる。自明のとおり、これらの寸法は多層式ディスポーザブルカートリッジ１において例示的なものにすぎず、用途に応じて都合のよい任意のサイズで形成することができる。
【００１９】
２つのリジッド層２０および４０を、エラストマー層３０によって分離することができる。第１のリジッド層２０は流体搬送部を支持することができ、第２のリジッド層４０は通路および孔といった空気圧構造を支持することができ、この空気圧構造によって、エラストマー層３０の可変部分に吸引力または真空を供給することができる。これらの可変部分は、後でさらに説明するように、ポンプおよびバルブといった流体制御要素を有することができる。保護カバーまたは上蓋１０、フォイル層５０および透明な試料支持体６０など残りの部品を、補助的なものまたはオプションとすることができる。一部の実施形態によれば、フォイル層５０は第２のリジッド層４０内の空気圧通路を覆うことができ、それによって通路内の気体を封止する。試料支持体６０はその表面で生体試料を担持することができ、この試料支持体６０をシールによって、好ましくはフレキシブルエラストマー層３０によって、第１のリジッド層２０に対して封止することができる。これについては後で説明する。
【００２０】
生体試料の分析を、光学顕微鏡法および／または任意の発光検出方法によって、例えばディジタルカメラを用いて、実施することができる。光源および検出手段の場所に応じて、（図３に示されているような）分析エリア２４および／または試料支持体６０を、２００〜１００ｎｍの波長を有する光に対し透過性とすることができる。図１に示されている実施形態によれば、分析エリア２４を第１のリジッド層２０の一体部分とすることができ、試料支持体６０を第２の層４０に取り付けられた別体部分とすることができる。自明のとおり、別の実施形態によれば、分析エリア２４を第１のリジッド層２０に取り付けられた別体部分とすることができ、支持体６０を第２のリジッド層４０の一体部分とすることができる。
【００２１】
したがって、生体試料分析用のディスポーザブル品は第１のリジッド層（２０）を含むことができ、この層は、分析エリア（２４）と、複数の流体貯蔵器（２２）と、この層内に形成された複数の流体通路とを有しており、それらの流体通路が流体貯蔵器との流体連通を提供する。さらに、このディスポーザブル品はフレキシブル層（３０）も含むことができ、この層は、複数の流体貯蔵器（２２）のうち少なくとも１つの流体貯蔵器と流体連通した複数の流体制御ポイント（３３）を有する。このディスポーザブル品はさらに、内部に複数の空気圧通路が形成された第２のリジッド層（４０）を含むことができ、それらの空気圧通路が少なくとも１つの流体制御ポイントとの空気圧連通を提供し、この場合、複数の流体貯蔵器（２２）のうちただ１つの流体貯蔵器から流体通路への、および流体通路からの流れを生じさせるように、流体制御ポイント各々を空気圧で制御可能である。
【００２２】
図２は、分解された多層式ディスポーザブルカートリッジ１の拡大図である。図１に示したものと同じ構成要素が、斜視図で示されている。これらの構成要素には、保護カバー１０、第１のリジッド層２０、エラストマー層３０、第２のリジッド層４０、フォイルカバー５０および支持体６０が含まれる。図３に示されているように、第１のリジッド層２０は複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２を含むことができる。これらのウェルまたは貯蔵器２２からの流体を、エラストマー層３０における複数のバルブを通して標本分析チャンバ５００へとポンピングすることができる。標本分析チャンバ５００において、流体を生体標本に適用することができる。標本分析チャンバ５００は、第１のリジッド層２０、フレキシブルエラストマー層３０および第２のリジッド層４０のうちの少なくとも一部分を含むことができる。試料支持体６０を、クリップセットなどのような取り付け機構によって、この標本分析チャンバ５００に対して保持することができる。これらの付加的な構造要素については、図３〜図６を参照しながら後で説明する。
【００２３】
図３には、第１のリジッド層２０および保護カバー１０の構造要素の一部がさらに詳しく示されている。保護カバー１０を、１枚のシーリングフィルムまたはプラスチック材料とすることができ、これを第１のリジッド層２０の突出部分を覆う形状にすることができる。これらの突出部分は、多数の小さい流体ウェルまたは流体貯蔵器２２を含むことができる。複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２を最上部の保護カバー１０によって覆うことができるように、それらを第１のリジッド層２０の一方の側で１つにまとめることができる。複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２各々を、それぞれ異なる化合物で満たすことができる。
【００２４】
複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２を、それぞれ異なる別個の生物学的反応性物質で満たすことができ、そのような物質とは試薬、検出成分を含む抗原認識成分、例えば蛍光染料を含む抗体、抗生物質、生物学的栄養素、毒素、染色剤、酸化剤などである。１つの実施形態によれば、流体ウェルまたは流体貯蔵器２２は、蛍光染料成分と共役された抗体を含むことができる。それらの試薬各々のための貯蔵器として、複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２を用いることができ、これによって、それらの試薬を生体試料に順次連続して適用することができる。これについては後でさらに詳しく説明する。流体ウェルまたは流体貯蔵器２２各々に、複数の流体制御ポイントから成るアレイによって別々にアクセスすることができ、このアレイを流体ウェルまたは流体貯蔵器２２の下に配置し、エラストマー層３０によって形成することができる。したがって、第１のリジッド層は複数の流体通路を含むことができ、これらの通路を介して、複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２から標本分析チャンバ５００へと流体を流すことができる。これらの流体通路を、第１のリジッド層２０の下面に配置することができ、したがって、これらは図３には示されていない。
【００２５】
第１のリジッド層２０の他方の側には分析エリアがあり、これは例えば、標本分析容積体５００の上に配置可能な凹部または分析エリア２４などである。凹部または分析エリア２４を、第１のリジッド層２０と同じポリカーボネート材料によって形成することができる。凹部または分析エリア２４を、第１のリジッド構造と同じ材料を用いて、第１のリジッド層２０に形成された透明な観察窓または観察面とすることができる。例えば、観察用の凹部または分析エリア２４は、透明なポリカーボネートプラスチックを有することができる。観察用の凹部または分析エリア２４を、リジッド層２０の一部分とすることができ、これを生体標本に向かって押圧することができ、さらに生体標本を載置可能な試料支持体６０に向かって押圧することができる。これらの構造要素については後でさらに説明する。第１のリジッド層２０を、非漏出流体シールを用いてエラストマー層３０に対して封止することができる。同様に、エラストマー層３０は、支持体６０に対する流体シールを成すこともできる。したがって、フレキシブルエラストマー層（３０）は、第１のリジッド層（２０）を第２のリジッド層（４０）に対し封止することができ、かつ／または第２のリジッド層（４０）を試料支持体（６０）に対し封止することができる。
【００２６】
図４には、エラストマー層３０のいくつかの詳細が示されている。エラストマー層３０は、入／出力ポート領域３２と複数の流体制御ポイント３３とを含むことができ、これらはすべてエラストマー層３０に形成されている。入／出力ポート３２により、圧力源または真空源と第２のリジッド層４０内の空気圧通路との間のゴム加工された非漏出シールを提供することができる。これらの空気圧によって、複数の流体制御ポイント３３の機能を駆動することができる。圧力および真空は、複数の流体制御ポイント３３を開放および閉鎖するための空気圧力を与えることになり、複数の入／出力ポート３２を通ってエラストマー層３０に入ることができる。流体制御ポイント３３を、例えば流体バルブまたはポンプの一部分とすることができる。
【００２７】
これらの機構すなわちバルブおよびポンプの双方は流体制御ポイントであり、これらについては後で詳しく説明する。図２において用いられた縮尺では、ポンプおよびバルブの細かい構造要素を描くのは難しい。よって、それらの詳細は図３〜図６に明確に示されている。
【００２８】
最後に、エラストマーシール３４はゴム加工シールを含むことができ、これによって、第１のリジッド層２０と第２のリジッド層４０と試料支持体６０との間の流体シールが提供される。
【００２９】
図５は、第２のリジッド層４０の詳細図である。図５には、入／出力ポート開口部４２と複数の突出した圧力ポイント４３とが示されている。さらに、開口部４４およびクランプ構造４５の様子も示されている。入／出力開口部４２によって、圧力または真空の空気圧源を多層式ディスポーザブルカートリッジ１に結合することができる。それらの空気圧源を、多層式ディスポーザブルカートリッジ１の外側に設けておくことができる。
【００３０】
複数の突出した圧力ポイント４３は、吸引源または圧力源から得られた吸引力または圧力を、エラストマー層３０の複数のバルブ３３に印加する。したがって、標本分析容積体（５００）に、および標本分析容積体（５００）から、流体を流すことができるようにするために、第２のリジッド層の空気圧通路からフレキシブルエラストマー層３０の裏面に向けて吸引力が印加されることによって、流体制御ポイントが空気圧で制御され、これによって、フレキシブルエラストマー層（３０）を、第１の停止位置から第２の停止位置に向けて引っ張ることができる。標本分析容積体（５００）に、および標本分析容積体（５００）から、流体が流れるのを阻止する目的で、第２のリジッド層４０の空気圧通路からフレキシブルエラストマー層３０の裏面に向かう吸引力が除かれることによって、流体制御ポイントを空気圧で制御することができ、これによって、フレキシブルエラストマー層３０が第１の停止位置に当接して静止した位置におかれる。圧力または吸引力に応答するバルブの機能については、図７〜図１０を参照しながら後で説明する。
【００３１】
観察開口部４４によって、第１のリジッド層２０に形成可能な凹部または分析エリア２４を、エラストマー層シール３４を通って、さらには第２のリジッド層４４を通って、透明な試料支持体６０に載置されている生体試料に向かって、突出させることができる。試料支持体６０を、クランプ４５によって第２のリジッド層４０に対し保持することができる。したがって、第２のリジッド層はさらに、試料支持体（６０）を保持するためにクランプのような取り付け機構（４５）を有しており、この場合、試料支持体（６０）とリジッド層（２０，４０）とフレキシブル膜（３０）とによって、標本分析容積体（５００）が規定される。
【００３２】
図６には、多層式ディスポーザブルカートリッジの残りの２つの構造が示されている。これら最後の構造を、フォイルカバー５０および透明スライドガラスなどの試料支持体６０とすることができる。フォイルカバー５０を、例えばアルミフォイルなどのような薄い金属シートとすることができ、粘着性バッキングを有することができる。このフォイルカバー５０を、第２のリジッド層４０の裏面に当接させることができる。第２のリジッド層４０の裏面は、この層の内部に形成された空気圧通路を有することができる。したがって、フォイル５０によって、第２のリジッド層４０における空気圧通路の露出部分を封止することができる。
【００３３】
試料支持体６０を、光学的に透明な標準スライドガラスとすることができ、その上に生体標本を載置することができる。生体標本を、例えばＴ細胞、幹細胞またはリンパ球といった細胞、または組織とすることができる。
【００３４】
図７には、個々のバルブ１００の機能がさらに詳しく説明されている。ディスポーザブルカートリッジ１の３つの層である第１のリジッド層２０、エラストマー層３０および第２のリジッド層４０の各々が、単一の個々の流体制御ポイント３３の機能に関与することができる。１つの好ましい実施形態によれば、流体制御ポイント（３３）を、フレキシブル層（３０）の薄膜化部分（１３３）とすることができる。薄膜化部分（１３３）は、フレキシブル層（３０）の厚さの１／５〜１／２０の厚さを有することができる。図７〜図１０に示されているように、流体制御ポイント３３は１つまたは複数のバルブ（１００，３００）を含むことができ、さらにオプションとしてポンピング機構（２００）を含むことができる。
【００３５】
図７には、第１のリジッド層２０、エラストマー層３０および第２のリジッド層４０各々のバルブ１００付近の断面図が含まれている。第１のリジッド層２０は、バルブの機能に関与する以下の構造要素すなわち開口部１１０および突出構造１２０を有することができる。図７に示されているように、個々の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２各々の下方に、個々のバルブ１００を配置することができる。開口部１１０によって、流体ウェルまたは流体貯蔵器２２から突出構造要素１２０を通過してフロー通路１２５へ向かう流路を提供することができる。したがって、流体制御ポイントは、フレキシブルエラストマー層（３０）内の薄膜化部分（１３３）として構成されており、この場合、フレキシブルエラストマー層の薄膜化部分（１３３）は、第１の停止位置（１２０）と第２の停止位置（４３）とに向かって撓まされる。一般的には、突出構造要素１２０付近にフレキシブルエラストマー層３０が存在することによって、流体貯蔵器２２から出口通路１２５への流れを阻止することができる。このバルブは、図７Ａに示されているように通常は閉鎖されている。
【００３６】
図７Ｂによれば、エラストマー層３０の下面に吸引力が印加され、これによって、エラストマー膜３０が引き下げられ、突出構造要素１２０から引き離される。その結果、吸引力によって、流体貯蔵器２２と出口通路１２５との間の流路が開かれる。エラストマー層３０は、第２のリジッド層４０における圧力ポイント４３に向かって引っ張られ、この場合、第２のリジッド層４０は、エラストマー層３０のための第２の停止位置４３としての役割を果たす。したがって、流体制御ポイントは、フレキシブル層（３０）の薄膜化部分（１３３）のための第１の停止位置である突出構造要素（１２０）として、第１のリジッド層（２０）の流体通路における突出構造要素１２０と、フレキシブル層（３０）の薄膜化部分（１３３）のための第２の停止位置（４３）として、第２のリジッド層（４０）の空気圧通路における開口部とを有しており、この場合、薄膜化部分（１３３）によって、第１のリジッド層の流体通路が開放および閉鎖される。
【００３７】
図７に示されているように、エラストマー層３０は、一層薄いエラストマー材料のセクションである撓みやすい薄膜化部分１３３を含むことができ、これによって、上述の運動を適度な量の圧力または真空を用いて生じさせることができる。これらの薄膜化部分１３３を例えば、少なくとも２５０μｍ〜約５ｍｍまでの厚さを有する可能性のあるエラストマー層の残りの部分と対比して、５０〜２００μｍの厚さとすることができる。第１のリジッド層２０における突出構造要素１２０を、フレキシブル層の薄膜化部分１３３のための第１の停止位置とすることができ、第２のリジッド層４０における圧力ポイントを第２の停止位置４３とすることができる。図７の断面図に示されているように、フレキシブルエラストマー層３０をこれらの構造要素の周囲に配置することができる。したがって、第２のリジッド層は圧力ポイント（４３）を有することができ、これはフレキシブル層（３０）の薄膜化部分（１３３）のための第２の停止位置（４３）として、フレキシブル層のキャビティに突入することができる。フレキシブル膜層３０の裏面に向かって第２のリジッド層の空気圧通路から吸引力が印加されると、このフレキシブル膜層３０を第１の停止位置である突出構造要素１２０から引き離して、第２の停止位置４３へ向けて引っ張ることができ、これによって、貯蔵器から第１のリジッド層２０の流体通路へ流体を流すことができる。フレキシブルエラストマー層３０の薄膜化部分１３３を、第１の停止位置である突出構造要素１２０と第２の停止位置４３とへ向けて撓ませることができる。
【００３８】
図７Ｃによれば、吸引力を取り除くことができ、これによって、エラストマー膜３０の位置を突出構造要素１２０に向かって再び戻すことができる。その結果、エラストマー膜３０によって、流体貯蔵器２２から出口通路１２５に入る流体を阻止することができる。したがって、図７Ｃによれば、第１のバルブ１００を閉鎖することができる。図７Ｃに示された第１のリジッド層２０のコンフィギュレーションを用いて、流体を貯蔵器２２から通路１２５を介して流れる別の流体へと向かわせることができる。この変形例によれば、図７Ａおよび図７Ｂに示されているようなバルブのオン／オフではなく、流体の２つの流れを混合することができる。圧力ポイントである第２の停止位置４３に形成された複数の小さい通路４６によって、フレキシブル膜３０の薄膜化部分１３３へ、およびこの薄膜化部分１３３から、空気圧を伝えることができる。
【００３９】
図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃを詳しく観察すれば、フレキシブル膜３０にさらに別の重要な構造要素があることがわかる。その構造要素を、フレキシブルエラストマー層３０の薄膜化部分１３３における小さい突出部または「ボタン」４８とすることができる。ボタン４８を、フレキシブル層３０の比較的厚い部分および／または比較的硬い部分とすることができ、この部分は、圧力ポイント４３における空気圧開口部を橋絡するのに十分な硬さである。このボタン４８は、上方および下方の停止位置すなわち突出構造要素１２０と圧力ポイントである第２の停止位置４３とに対する液密シールの形成を支援することができる。上方の停止位置１２０に対しボタン４８は、流れに対抗するバリアとしてエラストマーバリアの小さいセグメントを成すことができる。下方の停止位置である圧力ポイント４３に対しボタン４８は、第２の停止位置である圧力ポイント４３を適切に橋絡可能な硬化領域を成すことができる。自明のとおり、フレキシブル膜３０のキャビティに圧力ポイント４３を配置することは、フレキシブル膜３０の薄膜化部分１３３の真下の適切な空間に、圧力ポイント４３を配置または位置合わせするのに役立つ可能性もある。したがって、この多層式ディスポーザブルカートリッジによれば、圧力ポイント４３はキャビティに突入可能であり、その結果、フレキシブル膜３０がリジッド層４０に対し、フレキシブル層３０の薄膜化部分１３３に形成されたボタンと隣接する場所で位置合わせされる。
【００４０】
多層式ディスポーザブルカートリッジ１はさらに流体ポンプを有することができ、このポンプによって多層式ディスポーザブルカートリッジ１を通して流体がポンピングされる。この流体ポンプをフレキシブル層（３０）の一部分とすることができ、この場合、フレキシブル層（３０）はさらに、空気圧力によって作動するポンピング機構（２００）を有する。ポンピング機構（２００）は、流体通路の容積を変化させるように構成された可動部分（２１０）をフレキシブル層（３０）内に有することができ、この場合、上述の可動部分（２１０）は、第１のバルブ（１００）と第２のバルブ（３００）との間を流体連通させる。図８〜図１０には流体ポンプの機能が描かれており、このポンプはバルブ１００について図７に示したのと同様の構造を多数使用する。図８には、第１のバルブ１００、ポンピング機構２００および第２のバルブ３００が示されている。これら３つの構造が合わさって、流路１２５を介して流体をポンピングするように機能することができる。図８Ａに示されているように、当初、流体バルブ１００および流体バルブ３００は双方ともに閉鎖されている。圧力が第２のリジッド層４０を通して印加され、これによって、エラストマー層３０が、第１のリジッド層２０の突出構造要素１２０および第２の突出構造要素３２０に向かって上方に撓まされる。したがって、第１のバルブ１００および第２のバルブ３００は双方ともに閉鎖され、流体は流れない。
【００４１】
図８Ｂによれば、第２のリジッド層４０の突出圧力ポイント４３に向けて吸引圧力を印加することによって、第１のバルブ１００を開放することができる。吸引力によってエラストマー膜３０が下方に引っ張られ、突出構造要素１２０から反対に引き離されて、第１のバルブ１００を通過する流体通路が開放される。
【００４２】
ただし、ポンピング要素２００を、第２の停止位置である圧力ポイント４３とは反対に依然として閉鎖位置にしておくことができる。第２のバルブ３００も閉鎖位置にしておくことができる。したがって、この構造を通して流体が流れることはない。図９Ａによれば、ポンピング要素２００を駆動することができる。換言すれば、吸引圧力をポンピング要素２００のポートに印加することができ、これによって、エラストマー膜３０が下方に向かってポンピング要素２００内に引き寄せられる。これにより、流体のための流路が開放されて、第１のバルブ１００を通過してポンピング要素２００内に流体が流れる。ただし、第２のバルブ３００は依然として閉鎖されたままである。したがって、流体は、第２のバルブ３００を越えて流れない。図９Ｂによれば、第１のバルブはやはり閉鎖されていて、流体は第１のバルブ１００と第２のバルブ３００との間においてポンピング要素２００の空間内に閉じ込められている。
【００４３】
図１０Ａによれば、第２のリジッド層４０の対応する圧力ポイントである第２の停止位置４３に向けて吸引圧力を印加することによって、第２のバルブ３００が開放される。これによって、エラストマー層３０は突出構造要素１２０から離れて、下方に引き寄せられる。これによって、ポンピング要素２００から外界への流路が開放される。図１０Ｂによれば、ポンピング要素２００に圧力が印加されることによってポンピング要素が撓まされる。これによって、エラストマー膜が、第１のリジッド層２０の第１の停止位置１２０に向かって上方に撓む。エラストマー膜３０のこの運動によって、ポンピング機構２００から第２のバルブ３００を通りその向こうの空間へ流体が流れるようになる。
【００４４】
図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａおよび図１０Ｂが一緒にまとめられてこれらの図面によって描かれているのは、第１のバルブ１００、ポンピング要素２００および第２のバルブ３００の順次連続した駆動によるポンピング作用である。複数の構造のこのような組み合わせを用いることで、流体を任意の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２から、図２に示したような標本分析容積体５００（凹部または分析エリア２４、ゴム加工シール３４および開口部４４）内へポンピングすることができる。したがって、多層式ディスポーザブルカートリッジ１は、以下のようなポンピング機構を含むことができる。すなわち、このポンピング機構２００が空気圧力源と結合されているときに、このポンピング機構２００はポンピング源としてフレキシブルエラストマー膜層３０を用い、ディスポーザブルカートリッジを通して流体をポンピングする。
【００４５】
図１１は、多層式ディスポーザブルカートリッジ１のアレイアーキテクチャの概略図である。図１１からわかるように、このアーキテクチャは行列構造を有することができ、この場合、行と列の双方に対し吸引力または圧力を印加することによって、個々の流体容器各々にアクセスすることができる。図１１に示されているように、いずれかの任意の貯蔵器２２から流体を流すために、例えば空気圧通路の第３列２１’に吸引力または圧力を印加することができる。これによれば、貯蔵器２２および流体貯蔵器２２の上方および下方にあるすべての貯蔵器を含め、この列にある流体貯蔵器すべてにおけるバルブを駆動することができる。したがって、適切な流体貯蔵器２２から流体を流すために、空気圧通路２３’によって行バルブ２３も開放されることになる。図１１に示されているように、行バルブ２３が開放されると、流体は適切な流体貯蔵器２２だけからバルブ２３および２１を通って、標本分析チャンバを横切って流れるようになる。一層大きい貯蔵器２５のような図１１に示されている他の構造を用いて、一層大きい体積の流体を保持することができ、例えば緩衝液を保持することができる。このため、それらの一層大きい貯蔵器を用いて、一層多くの量の流体を貯蔵することができる。ポンピング機構によって、この流体を標本分析容積体５００へ、および標本分析容積体５００から、再循環させることができる。
【００４６】
このアレイアーキテクチャを用いることによって、最小数の空気圧管路を用いて流体ウェル各々をアドレス指定することができる。したがって、このシステムによれば、第２のリジッド層４０は、複数の流体制御ポイント３３から成る１つの行に対し吸引力を与える第１の空気圧通路と、複数の流体制御ポイント３３から成る１つの列に対し吸引力を与える第２の空気圧通路とを有することができ、これら２つの空気圧通路が共働して、複数の流体貯蔵器のうち一度に１つの流体貯蔵器のみから流体が計量分配されるようになる。
【００４７】
図１２には、多層式ディスポーザブルカートリッジ１内でどのように流体が流れるかが概略的に描かれている。図１２によれば、標本分析容積体５００の上方に流体貯蔵器２２が配置されて示されている。上述のように、第１のリジッド層２０内に配置された貯蔵器各々は、その真下に流体制御バルブを有しており、このバルブは、第２のリジッド層４０からの空気圧によって作動するエラストマー層３０から成る。これらの構造２０，３０および４０が共働して機能することにより、上述のようなエラストマーバルブが形成される。
【００４８】
いずれのケースであれ、流体は入口トレンチ２２０を通って標本分析容積体５００内に流れる。別の実施形態によれば、標本の一部分を避けて流れる可能性のある層流を回避するように、この流体は標本分析容積体５００に入る前に、少なくとも一方の側部と平行な流れを達成するために、この側部全体にわたって、さらには標本全体にわたって分散される。この目的で、第１のリジッド層２０はさらに、標本分析容積体（５００）の少なくとも一方の側部に隣接した少なくとも１つのキャビティまたはトレンチ（２２０，２２２）を有することができ、これによって、少なくとも１つの貯蔵器２２から流れる流体が、分析容積体（５００）の側部全体を介して受け入れられて分散される。図１２Ｂおよび図１２Ｃには、これらのトレンチが詳しく示されている。トレンチの形状は好ましくは、特定の方向において流体の流れに対し抵抗を最小限にするように選定されている。後でさらに説明するように、これによって、流体が標本を均一に覆うようにすることができる。好ましくは、入口トレンチ（２２０）は非対称の断面を有する。
【００４９】
例えば流体は、図１２（Ａ）に示されているように、左から右へと流れることができる。したがって、流体は、流体ウェルまたは流体貯蔵器２２から流体制御ポイント３３を介して、標本分析容積体５００の一方の側部に配置された、すなわち第１のリジッド層２０における凹部または分析エリア２４の一方の側部に配置された、入口トレンチ２２０へと流れる。流体はこのトレンチ２２０を満たすことができ、通路の入口だけでなく側部全体を介して、制御された流れで標本分析容積体５００に入ることができる。トレンチは、ｈ２（約３００μｍ）の深さ／高さ、および図１２の（Ｂ）および（Ｃ）に詳しく示した非対称の断面形状を有することができる。第１のリジッド層に少なくとも１つの出口トレンチ（図１２Ｂの２２２）を設けることができ、この出口トレンチは標本分析エリアの反対側に配置されており、そこにおいて入口トレンチ２２０によって提供されたすべての流体を収集する。出口トレンチ２２２は、必須ではないが、入口トレンチ２２０と同じ断面形状を有することができる。標本分析容積体５００における流体の流れをさらに制御する目的で、第１のリジッド層２０に、流れの方向に配置された１つまたは２つの側部キャビティを設けることができる。入口トレンチについて開示したすべての寸法を、必須ではないが、これらの他のキャビティに適用することができる。
【００５０】
標本分析容積体５００を通る流れのインピーダンスを制御する目的で、第１のリジッド層２０はさらに、分析容積体（５００）の少なくとも一方の側部に隣接するバリア（２４０）を有することができ、流体がバリア２４０と試料支持体６０との間を流れて標本分析容積体（５００）に入るように、このバリアは標本分析容積体（５００）に突入している。図１２Ｂおよび図１３には、バリア２４０がさらに詳しく示されている。バリア２４０は、約２００μｍの高さｈ３を有することができる。バリア２４０によって、標本分析容積体５００が浸水している間は入口トレンチ２２０が完全に満たされることを保証することができる。これによって、標本と流体とを均一に接触させることができるようになる。
【００５１】
第２のリジッド層４０は、標本分析容積体（５００）が第１の層２０の凹部または分析エリア２４に対し高さｈ１を有するレベルで、試料支持体６０を保持することができる。均一な流れおよび標本と流体との良好な接触を保証するために、生体標本を試料支持体６０に対しｈ４の高さにすることができる。よって、キャリッジが組み立てられたときに、標本分析チャンバ（５００）は高さｈ１を有することができ、トレンチ（２２０，２２２）は深さｈ２を、リムまたはバリア（２４０）は深さｈ３を、さらに生体試料は高さｈ４を有することができる。ただしｈ１，ｈ２，ｈ３およびｈ４は、（０．０５〜０．５）×ｈ３＝ｈ４および／または（０．１〜０．５）×ｈ２＝ｈ１および／または（０．１〜０．５）×ｈ１＝ｈ４という比を有する。図１２Ｃには、これらの寸法が概略的に示されている。
【００５２】
図１３は、多層式ディスポーザブルカートリッジ１のさらに別の実施例の概略図である。この実施形態によれば、試料支持体６０の表面は生物学的に活性の特定の化合物でコーティングされており、この化合物は生体試料と相互に作用し合うことができる。これらの化合物を、特定の領域においてスライドガラスの表面上に固定することができ、それによって表面が「機能化される」ようになる。機能化されセグメント化されたエリア各々は、付着されて生物学的に活性の構造を有することができ、このようにすれば、この構造は、抗原と抗体の相互作用の場合のように、試料と相互に作用し合う。かかる構造は例えば、検出成分を含む抗原認識成分、蛍光染料を含む抗体、抗生物質、生物学的栄養素、毒素、染色剤および酸化剤などを含むことができる。上述のように、試薬を適用してもよい。
【００５３】
多層式ディスポーザブルカートリッジ１を、以下のように構成することができる。すなわち、この多層式ディスポーザブルカートリッジ１のプラスチック部品は、第１のリジッド層２０と第２のリジッド層４０とを含む。これらの部品を例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンおよびＣＯＣから射出成形することができる。エラストマー層３０をポリシロキサンとすることができ、切削またはプレス加工することができる。次いで、これらの部品を、接着剤、各層のプラズマ活性化、または高周波溶接によって接合することができる。流体通路／空気圧通路などの精密な細部を、化学エッチングまたはレーザ除去または鋳造のパーツとして成形することができる。
【００５４】
動作中、複数の流体ウェルまたは流体貯蔵器２２各々を、所定量の試薬によってロボットまたはハンドピペットで充填することができる。次いで、生体標本を、標本の湿気を保持する所定量の緩衝液と共に、試料支持体６０上で標本分析容積体５００内に載置することができる。その後、支持体６０を、クランプ構造４５によって多層式ディスポーザブルカートリッジ１上の所定の場所にスナップフィットすることができる。次いで、多層式ディスポーザブルカートリッジ１を、第２のリジッド層４０における入／出力ポート４２のところで、圧力源および真空源と結合することができる。複数の流体貯蔵器は複数の試薬を含むことができ、それらの試薬のうちの少なくとも１つは、蛍光分子と共役された抗体である。その後、コントローラまたはコンピュータ（図示せず）は圧力源または真空源に指示を出し、入／出力ポート４２を介して、さらには図１１に示したアレイアーキテクチャを用いて、それらが特定のバルブに印加されるようにすることができる。標本分析チャンバ５００を、標本分析容積体５００の上方に位置決めされた対物レンズによって顕微鏡でイメージングすることができ、または単に肉眼で顕微鏡を用いて見ることができる。
【００５５】
これまで概略的に述べてきた例示的な具現化形態を参照しながら、種々の詳細な点について説明してきたけれども、既に知られたことであっても、または現時点では予見できないことあるいは予見できないであろうことであっても、既述の開示内容を参酌すれば、種々の代替案、修正、変更、改善、および／または実質的な等価物を明確に理解することができる。したがって、これまで述べてきた例示的な具現化形態は、例証することを意図したものであって、それらに限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７（Ａ）】
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【図７（Ｂ）】
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【図７（Ｃ）】
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【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図１０（Ａ）】
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【図１０（Ｂ）】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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