(57)【要約】  本発明は、肝細胞癌の治療のためのウットロシドＢ組成物及び方法を含む。肝臓がんの化学療法の選択肢は限られており、ＨＣＣ患者の予後は、低迷したままである。ソラフェニブが、現在のところ肝細胞癌の治療に利用できる唯一の薬物である。
2019520425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞癌の治療のための組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記組成物。
【請求項２】
ウットロシドＢ組成物の安定性を増加させる方法であって、前記ウットロシドＢ組成物に、プロリンを添加するステップを含む、前記方法。
【請求項３】
腫瘍の増殖を阻害するための組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記組成物。
【請求項４】
アポトーシス、オートファジー、ＭＡＰＫ経路の下方調節、ｍＴＯＲ経路の下方調節、又はこれらの組合せを誘導することによる肝臓がんの治療のためのウットロシドＢ組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記ウットロシドＢ組成物。
【請求項５】
肝臓疾患の治療のための組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記組成物。
【請求項６】
肝臓疾患の治療のための医薬品として使用するためのウットロシドＢ組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記ウットロシドＢ組成物。
【請求項７】
肝臓疾患が、肝臓がん、肝臓硬化症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝硬変、又は原発性胆汁性胆管炎である、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
肝臓がんが、肝細胞癌（ＨＣＣ）、線維層板肝細胞癌、胆管細胞癌（胆管がん）、血管肉腫、又は肝芽腫である、請求項４又は７に記載の組成物。
【請求項９】
ウットロシドＢが、およその範囲で体重１ｋｇあたり０．０５〜１５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり５〜８０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり１０〜５０ｍｇ、及び最も好ましくは体重１ｋｇあたり約１０ｍｇの濃度を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的担体中に含有されるソラフェニブをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
薬学的担体中に含有されるクロロキンをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的担体中に含有されるオートファジーの阻害剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
プロリン、好ましくはプロリンオリゴマー、及び最も好ましくは遊離プロリンをさらに含む、請求項１及び３〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
１又は２以上のグルタチオン、任意でグルタチオンの１又は２以上のオリゴマーをさらに含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
フィトケラチンをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
ウットロシドＢが、０．６６μＭ〜２ｍＭ、好ましくは０．０６６〜１．３２ｍＭ、及び最も好ましくは０．１３２〜１．０５ｍＭの濃度を有する、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、医薬品として、特にがんの治療において使用される、新規なサポニン及びその誘導体、それらの調製の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定するものではないが、その背景は、サポニン及びサポニン誘導体と関連して記載される。主として、植物界から単離される、広くはサポニンと称されるトリテルペン及びステロイドグリコシドは、それらの広い構造的多様性に起因して、広範な薬理学的特性を発揮する（Vincken, J.-P.; Heng, L.; de Groot, A.; Gruppen, H. Phytochemistry. 2007, 68, 275-297）。サポニンは、相当な構造的多様性を有する天然に存在する複合糖質化合物の大きなファミリーを形成している。これらの化合物中のステロイド、トリテルペノイド、又はステロイダルアルカロイドアグリコンには、様々な数の糖が、グリコシド結合によって結合している。サポニンは、広範な生物学的活性及び実用的な適用を呈する。
【０００３】
「Saponin Compounds, Methods of Preparation Thereof, Use Thereof and Pharmaceutical Compositions（サポニン化合物、その調整方法、その使用及び医薬組成物）」と題される米国特許第８，５５２，１６１号明細書は、ｐ−メトキシベンゾイル置換並びにＣ６−１０アリール、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−４アルキル−、Ｃ１−１８アルカノイル、Ｃ３−１８アルケニル、Ｃ６−１０アリール−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−４アルキル−Ｃ（Ｏ）−との置換を有するサポニン化合物を開示しており、ここで、これらの基のそれぞれは、任意で置換されていてもよい。これらの化合物は、例えば、増殖性疾患の治療において有用な、選択的細胞増殖抑制活性を有する。
【０００４】
「Water Soluble Extract From Plant of Solanum Genus and the Preparation Process Thereof, and Pharmaceutical Composition Containing the Water Soluble Extract（なす属植物由来の水溶性抽出物及びその調製方法、並びに当該水溶性抽出物を含む医薬組成物）」と題される米国特許第７，０７８，０６３号明細書は、少なくとも６０％〜９０％のソラマルジン及びソラソニンから本質的になる、ナス属（Solanum Genus）の植物に由来する水溶性抽出物を開示している。ナス属の植物から水溶性抽出物を調製するためのプロセスは、酸による加水分解、塩基による沈殿、並びにクロロホルム、アルコール、及び水を抽出溶媒として使用する分離処置のステップを伴う。このプロセスにより調製された水溶性抽出物を、純水又は中性ｐＨの水に直接的に溶解して、２〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲又はそれよりも高い水溶性を有する黄色がかった澄んだ透明の水溶液を得ることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，５５２，１６１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０７８，０６３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vincken, J.-P.; Heng, L.; de Groot, A.; Gruppen, H. Phytochemistry. 2007, 68, 275-297
【発明の概要】
【０００７】
現在のところ、肝細胞癌を治療するための組成物はほとんど存在しない。肝臓がんの化学療法の選択肢は限られており、ＨＣＣ患者の予後は、低迷したままである。高スループットのスクリーニングによるデノボコンビナトリアルアプローチから導出され、２００７年にＵＳ−ＦＤＡによって承認されたソラフェニブが、現在のところ肝細胞癌の治療に利用できる唯一の薬物である。ウットロシドＢは、イヌホオズキ（Solanum nigrum）の葉から単離され、肝臓がん細胞（ＨｅｐＧ２）に対して、０．５μＭのＩＣ５０値で選択的かつ有意な細胞毒性を呈しており、これは、肝臓がんの唯一のＦＤＡ承認薬であるソラフェニブ（ＩＣ５０が５．８μＭ）よりも、１１．６倍を上回って低い。肝臓がん細胞（ＨｅｐＧ２）に対するこのような並外れた選択的かつ有意な細胞毒性は、驚くべきことであり、予想外なことでもある。ウットロシドＢ（Uttroside B）は、ＨｅｐＧ２細胞においてアポトーシスを誘導し、評価されている様々な細胞生存性シグナル伝達経路の中でもとりわけ、ＭＡＰＫ及びｍＴＯＲ経路を下方調節する。この化合物の生物学的安全性は、正常不死化肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓細胞）においてインビトロで、並びにスイスアルビノマウスにおける急性及び慢性の両方の毒性モデルを使用してインビボで、評価されている。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいてＨｅｐＧ２異種移植片モデルを使用したインビボでの研究では、肝臓がんに対するこの分子の抗がん有効性も確立される。これらの結果は、ウットロシドＢが、化学療法による手段では現在のところ打つ手がほとんどない腫瘍である肝臓がんに対するさらなる臨床上の検証を保証する薬理学的に安全な薬物であると示している。
【０００８】
本発明は、肝細胞癌の治療のための組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記組成物を提供する。本発明は、ウットロシドＢ組成物の安定性を増加させる方法であって、ウットロシドＢ組成物に、プロリンを添加するステップを含む、方法を提供する。本発明は、腫瘍の増殖を阻害するための組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記組成物を提供する。本発明は、アポトーシスの誘導、ＭＡＰＫ経路の下方調節、ｍＴＯＲ経路の下方調節、又はこれらの組合せによる肝臓がんの治療のためのウットロシドＢ組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記ウットロシドＢ組成物を提供する。本発明は、肝臓疾患の治療のための組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記組成物を提供する。本発明は、肝臓疾患の治療のための医薬品として使用するためのウットロシドＢ組成物であって、薬学的担体中に含有される薬学的に有効な量のウットロシドＢを含む、前記ウットロシドＢ組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、任意の形態又は状態の肝臓疾患を治療するために使用され、これには、肝臓硬化症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ，Nonalcoholic Steatohepatitis）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ，non-alcoholic fatty liver disease）、肝硬変、又は原発性胆汁性胆管炎が含まれるが、これらに限定されない。同様に、本発明は、任意の形態又は状態の肝臓がんを治療するために使用され、これは、肝細胞癌（ＨＣＣ，hepatocellular carcinoma）、線維層板肝細胞癌、胆管細胞癌（胆管がん）、血管肉腫、又は肝芽腫を含むがこれらに限定されない。
【００１０】
組成物又は医薬品のいずれも、プロリン、好ましくはプロリンオリゴマー、及び最も好ましくは遊離プロリンを含む安定剤をさらに含み得る。組成物又は医薬品のいずれも、１又は２以上のグルタチオン、任意でグルタチオンの１又は２以上のオリゴマー、又はフィトケラチンをさらに含み得る。
【００１１】
本発明は、単回用量、複数回用量、逐次用量として他の処置と、１又は２以上の活性薬剤、例えば、薬学的担体中に含有されるソラフェニブと、組み合わせることができる。
【００１２】
同様に、ウットロシドＢは、およその範囲で体重１ｋｇあたり０．０５〜１５０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり５〜８０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり１０〜５０ｍｇ、及び最も好ましくは体重１ｋｇあたり約１０ｍｇの濃度を有する。ウットロシドＢの濃度は、安定性を増加させるために薬剤が薬学的担体に添加され、ウットロシドＢの活性が低減される場合には、増加させてもよい。一部の事例において、濃度は、１ｋｇあたり７５〜１２５ｍｇであり得る。ウットロシドＢは、およその範囲で０．６６μＭ〜２ｍＭ、好ましくは０．０６６〜１．３２ｍＭ、及び最も好ましくは０．１３２〜１．０５ｍＭの濃度を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、これより、本発明の詳細な説明への参照は、添付の図面と併せてなされる。
【図１】ウットロシドＢの構造を示す図である。
【図２Ａ−２Ｆ】ウットロシドＢが、肝臓がん細胞に対して最大の感受性を示すことを示す図である。
【図３Ａ−３Ｅ】ＨｅｐＧ２細胞におけるカスパーゼ活性化を示すウエスタンブロットの図である。
【図３Ｆ】ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞において細胞周期のいずれの段階にも影響を及ぼさないことを示す図である。
【図４Ａ−４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、ウットロシドＢが、肝臓がんにおける極めて重要な生存性シグナルの一部であるＭＡＰＫ及びｍＴＯＲシグナル伝達を阻害することを示す図である。
【図５Ａ−５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは、スイスアルビノマウスにおけるウットロシドＢの毒物学的評価を示す図である。
【図６Ａ】抗腫瘍研究を示す、絵で表した図である。
【図６Ｂ】ウットロシドＢ処置あり又はなしの４週間後のＨｅｐＧ２異種移植片腫瘍を有するマウスの代表的な写真である。
【図６Ｃ】ウットロシドＢが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、腫瘍体積を効果的に阻害することを示すグラフである。
【図６Ｄ】対照及びウットロシドＢで処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの群から単離した腫瘍組織の組織病理学的評価の画像である。
【図６Ｅ】ウットロシドＢが、ウットロシドで処置した腫瘍切片においてアポトーシスを誘導するという画像である。
【図７Ａ】５つのがん細胞株のパネルにおけるイヌホオズキの有機抽出物の細胞毒性のグラフである。
【図７Ｂ】ＨｅｐＧ２細胞におけるイヌホオズキから単離したカラム画分によって誘導される細胞毒性のグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を、示されるように異なる濃度のカラム画分で処置し、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
【図８Ａ】ＨｅｐＧ２細胞におけるサポニン及びプロリンの混合物（ＳＰ）によって誘導される用量依存性細胞毒性のグラフである。
【図８Ｂ】プロリン及びサポニンの混合物である淡黄色の泡沫固体の画像である。
【図８Ｃ】用量依存性様式での単離したサポニン及びプロリンの細胞毒性のグラフである。
【図８Ｄ】白色固体であるウットロシドＢ（１）の画像である。
【図９】ウットロシドＢ（１）のＨＲＥＳＩＭＳの図である。
【図１０】ウットロシドＢ（１）の負モードでのＭＳ−ＭＳ分析の図である。
【図１１】ウットロシドＢ（１）の正モードでのＭＳ−ＭＳ分析の図である。
【図１２】ウットロシドＢ（１）からのペルアセチル化（peracetylated）化合物（２）の合成の図である。
【図１３】ウットロシドＢの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【図１４】ウットロシドＢの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【図１５】化合物２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【図１６】化合物２の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【図１７】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導される形質学的変化及び液胞の形成を示す代表的な画像である。
【図１８】アクリジンオレンジ染色により、ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞において酸性液胞の形成を誘導することを示す、代表的な画像である。
【図１９】ウットロシドＢによって誘導されるｍＴＯＲ下流標的であるホスホ−４Ｅ−ＢＰ１及びホスホ−ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化の動態を示す、ウエスタンブロットの図である。
【図２０】ウットロシドＢが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｐＧ２異種移植片腫瘍において、ホスホ−４ＥＢＰ１及びホスホ−ｐ７０Ｓ６キナーゼの発現を有意に下方調節することを示す、代表的なＨ＆Ｅ画像である。
【図２１】ＨｅｐＧ２細胞において、ＬＣ３  ＩからＬＣ３  II（微小管関連タンパク質１、軽鎖３）への内因性変換に対するウットロシドＢの時間依存性効果を示す図である。
【図２２】ＬＣ３の有意な下方調節を示す、ウットロシドＢで処置したＨｅｐＧ２異種移植片を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色を示す図である。
【図２３】ＨｅｐＧ２細胞における様々なオートファジー関連タンパク質ベクリン−１、Ａｔｇ  ７、Ａｔｇ  ５に対するウットロシドＢの時間依存性効果を示す図である。
【図２４】別の肝臓がん細胞であるＨｅｐ３Ｂ細胞における様々なオートファジー関連タンパク質ベクリン−１、Ａｔｇ  ７、Ａｔｇ  ５、Ａｔｇ  ３、Ａｔｇ  １２に対するウットロシドＢの時間依存性効果を示す図である。
【図２５】ウットロシドＢが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｐＧ２異種移植片において、ベクリン−１の発現を有意に上方調節することを示す図である。
【図２６】オートファゴソーム−リソソーム遮断を飽和するためのバフィロマイシンＡ１の濃度の標準化を示す図である。
【図２７】ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞におけるオートファジー誘導剤であることを示す図である。細胞を、ＬＣ３  ＩからＬＣ３  IIへの内因性変換に関して、ウットロシドＢ（５００ｎＭ）及び／又はバフィロマイシンＡ１（１０ｎＭ）で２４時間処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＬＣ３抗体に対して免疫ブロッティングを行った。
【図２８】ＰｔｆＬＣ３レポータータンパク質を使用したオートファジーフラックスアッセイを示す図である。
【図２９】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるオートファジーの定量的分析を示す棒グラフである。
【図３０】３−ＭＡによるオートファジーの阻害が、ウットロシドＢによって誘導される細胞毒性を有意に強化したことを示す棒グラフである。
【図３１】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断が、オートファジー阻害剤である３−ＭＡによって強化されることを示す、ウエスタンブロットの図である。
【図３２】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断が、オートファジー阻害剤であるバフィロマイシンＡ１によって強化されることを示す、ウエスタンブロットの図である。
【図３３】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるカスパーゼ９の切断の活性化が、オートファジー阻害剤である３−ＭＡによって強化されることを示す、ウエスタンブロットの図である。
【図３４】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるカスパーゼ９の活性化が、オートファジー阻害剤であるバフィロマイシンＡ１によって強化されることを示す、ウエスタンブロットの図である。
【図３５】ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断が、ベクリン−１の遺伝子的サイレンシングによって強化されることを示す、ウエスタンブロットの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用が、以下に詳細に考察されるが、本発明は、様々な具体的な状況において具現化することができる多数の適用可能な発明的概念を提供することが、理解されるべきである。本明細書において考察される特定の実施形態は、本発明を作製及び使用するための特定の手段の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を定めるものではない。
【００１５】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が、以下に定義される。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって広く理解されている意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」などの用語は、単数形の実体のみを指すことを意図するものではなく、特定の実施例が例示のために使用され得る一般的なクラスを含むものである。本明細書における用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説される場合を除き、本発明を定義するものではない。
【００１６】
本技術は、肝細胞癌の治療としてのウットロシドＢ（イヌホオズキ植物から単離される）の使用に関連する。肝細胞癌の現在の治療としては、放射線（内部又は外部）、化学塞栓療法、アルコール注射、アブレーション（ablation）（凍結（cryo）又はラジオ波（ＲＦ））、及び外科手術／移植が挙げられる。現在利用できる唯一の経口による治療的処置は、Bayer & Onyx Pharmaceuticals社によって製造されているＮＥＸＡＶＡＲ（商標）（ソラフェニブ）であり、これは、チロシンタンパク質キナーゼ阻害剤である。
【００１７】
非常に多くのサポニン類が、広範ながん細胞パネルに対して、抗腫瘍効果を呈することが報告されている（Man, S.; Gao, W.; Zhang. Y.; Huang, L.; Liu, C. Fitoterapia. 2010, 81, 703-714、Podolak, I.; Galanty, A.; Sobolewska, D. Phytochem. Rev. 2010, 9, 425-474）。天然物の研究において、様々ながん細胞に対するサポニン類の化学療法上の有効性は、インビトロでのデータに限定されており、それらの構造解明が特に強調されている（Podolak, I.; Galanty, A.; Sobolewska, D. Phytochem. Rev. 2010, 9, 425-474）。ナス属の様々な植物種は、相当な量のサポニン類を有することがわかっており、これらのサポニン類は、様々ながん細胞株に対して強力な抗がん活性を呈する（Nohara, T.; Ikeda, T.; Fujiwara, Y.; Matsushita, S.; Noguchi, E.; Yoshimitsu, H.; Ono, M.J. Nat. Med. 2007, 61, 1-13、Milner, S. E.; Brunton, N. P.; Jones, P. W.; O' Brien, N. M.; Collins, S.G.; Maguire, A. R.J. Agric. Food. Chem. 2011, 59, 3454-3484）。ブラック・ナイトシェイド（black nightshade）として広く知られているイヌホオズキは、多くの伝統的な医薬系において広く使用されている医薬植物であるナス科のメンバーである（Jain, R.; Sharma, A.; Gupta, S.; Sarethy, I. P.; Gabrani, R. J. Clin. Ther. 2011, 16, 78-85）。植物全体のアルコール抽出物は、様々なステロイダルサポニンを含有することが報告されており、これは、様々ながん細胞株において細胞毒性を誘導する（Hu, K.; Kobayashi, H.; Dong, A.; Jing, Y.; Iwasaki, S.; Yao, X. Planta Med. 1999, 65, 35-38、Ikeda, T.; Tsumagari, H.; Nohara, T. Chem. Pharm. Bull. 2000, 48, 1062-1064、Zhou, X.; He, X.; Wang, G.; Gao, H.; Zhou, G.; Ye, W.; Yao, X. J. Nat. Prod. 2006, 69,1158-1163）。Ｓｈａｒｍａらは、イヌホオズキの茎及び根のメタノール抽出物に由来する、ウットロシドＡ及びＢという２つのフロスタノールサポニンを報告している（Sharma, S. C.; Chand, R.; Sati, O. P.; Sharma, A. K. Phytochemistry. 1983, 22, 1241-1244）。
【００１８】
図１は、ウットロシドＢの構造を示す図である。ウットロシドＢは、フロスタノールのＣ−２６におけるβ−Ｄ−グルコピラノシル単位の存在及びＣ−３におけるβ−リコテトラオシル（lycotetraosyl）単位の存在を特徴とする。本化合物はまた、トリビュラス・テレストリス（Tribulus terrestris）（Wu, K.-L.; Kang, L.-P.; Xiong, C.-Q.; Zhao, Y.; Yu, H.-S.; Zhang, J.; Ma, B-P. J. TianjinUniv. Trad. Chin. Med. 2012, 31, 225-228）及びポリアンテス・チューベローズ（Polianthes tuberosa）（Jin, J.-M.; Zhang, Y.-J.; Yang, C.-R. J. Nat. Prod. 2004, 67, 5-9）からも単離されており、ＰＣ−１２（ＩＣ５０が１．２０μＭ）及びＨＣＴ−１１６（ＩＣ５０が２．３３μＭ）細胞に対する有意な細胞毒性（Ikeda, T.; Tsumagari, H.; Honbu, T.; Nohara, T. Chem. Pharm. Bull. 2003, 26, 1198-1201）並びにＨｅＬａ細胞に対する中等度の細胞毒性（ＩＣ５０が１５．４３μＭ）（Jin, J.-M.; Zhang, Y.-J.; Yang, C.-R. J. Nat. Prod. 2004, 67, 5-9）が示されている。トリビュラス・パルビスピヌス（Tribulusparvispinus）から単離される別のサポニンであり、リコテトラオシル単位における１つの糖だけがウットロシドＢとは構造的に異なる、パルビスピノシドＢ（Parvispinoside B）は、Ｕ９３７白血病細胞株に対して強力な細胞毒性を呈するが（ＩＣ５０が０．５μＭ）、ＨｅｐＧ２細胞に対しては有効ではない（ＩＣ５０が１００μＭを超える）（Perrone, A.; Plaza, A.; Bloise, E.; Nigro, P.; Hamed, A. I.; Belisario, M. A.; Pizza, C.;Piacente, S. J. Nat. Prod. 2005, 68, 1549-1553）。しかしながら、本研究において、ウットロシドＢは、ＨｅｐＧ２細胞に対して最大の細胞毒性を呈し（ＩＣ５０が０．５μＭ）、これは、肝臓がんのための唯一のＦＤＡ承認薬であるソラフェニブ（ＩＣ５０が５．８μＭ）よりも１０倍を上回って効果的である。ＨｅｐＧ２細胞におけるウットロシドＢの細胞毒性は、アポトーシスの誘導を通じたものであり、インビトロ（正常Ｃｈａｎｇ肝臓細胞）及びインビボの両方での研究によって、その生物学的安全性が確認されている。この分子の抗がん効力は、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて、ＨｅｐＧ２−異種移植片モデルを使用してインビボでさらに証明された。
【００１９】
図２Ａ〜２Ｆは、ウットロシドＢが、肝臓がん細胞に対して最大の感受性を示すことを図示する。図２Ａは、起源が異なるがん細胞のパネルにおけるウットロシドＢのＩＣ５０の比較のグラフである。がん細胞株ＨｅＬａ、Ａ３７５、ＨｅｐＧ２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＬ  ６０、Ａ５４９、及びＨＣＴ１１６を、示されるようにウットロシドＢで処置し、７２時間インキュベートし、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。図２Ｂは、肝臓がん細胞株及び正常不死化肝細胞におけるウットロシドＢの用量依存性効果を示すグラフである。肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＫＨＥＰ−１、Ｈｕｈ−７、及び正常肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓）を、ウットロシドＢで処置し、７２時間インキュベートし、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。図２Ｃは、ウットロシドＢとソラフェニブとのＩＣ５０の比較のグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を、示されるようにウットロシドＢで処置し、７２時間インキュベートし、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。図２Ｄは、ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導される形質学的変化の画像である。ＨｅｐＧ２細胞を、示されるようにウットロシドＢで処置し、７２時間インキュベートした。図２Ｅは、ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞のクローン原性能力を阻害することを示す画像である。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる濃度のウットロシドＢで７２時間処置し、クローン原性アッセイを行った。図２Ｆは、ＨｅｐＧ２細胞のクローン原性能力の阻害におけるウットロシドＢの有効性の比較のグラフである。発生したクローンを計数し、グラフとしてプロットした。４個を上回る細胞を含有するコロニーを、１つのクローンとして計数した。
【００２０】
ＨｅｐＧ２（肝臓がん）細胞が、０．５μＭのＩＣ５０でこの化合物に対して最大の感受性を示し、続いて、Ａ５４９（１μＭ）、ＨｅＬａ（１．５μＭ）、Ａ３７５（１．６μＭ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（１．６μＭ）、ＨＬ６０（２．５μＭ）、及びＨＣＴ−１１６（６μＭ）であったことに留意することは、非常に興味深いことであった［図２Ａ）］。次に、異なる肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＫＨｅｐ１、及びＨｕｈ−７）並びに正常不死化肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓）におけるウットロシドＢの効果を、ＭＴＴアッセイを使用して比較することを試みた。ウットロシドＢに対する肝臓がん細胞の感受性に関して、肝臓がん細胞のいずれにおいても劇的な差異は観察されなかったが（ＩＣ５０：４００〜６００ｎＭ）、正常不死化肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓）のうちの７０％が、１２５０ｎＭですら生存していた［図２Ｂ］。合わせると、ウットロシドＢは、ナノモル濃度で肝臓がん細胞に対して有効であり、同時に、正常不死化肝細胞に対して非毒性であることが明らかとなった。細胞株のパネルの中で最も感受性であったＨｅｐＧ２を、さらなる研究に選択した。ウットロシドＢの細胞毒性を、肝臓がんに対する唯一のＦＤＡ承認薬であるソラフェニブのものと比較した。驚くべきことに、ウットロシドＢは、肝臓がん細胞の殺滅において、ソラフェニブよりも１０倍を上回って強力であった［図２Ｃ］。ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢでの処置の７２時間後に、位相差顕微鏡によって、形質学的変化に関して調べた。アポトーシスの特徴である核凝縮、膜小疱形成、及びアポトーシス小体の形成が、未処置対照と比較して、ウットロシドＢで処置したＨｅｐＧ２細胞においては、用量依存性様式で観察された［図２Ｄ］。ウットロシドＢを、濃度依存性様式で、ＨｅｐＧ２細胞における抗クローン原性能力に関しても研究した。クローン原性アッセイは、細胞の生存及び増殖に対する特定の薬剤の有効性を研究するための技法として日常的に使用されているインビトロでのアッセイである（Pittelkow, M. R.; Scott, R. E. Mayo Clin Proc. 1986, 61, 771-777、Franken, N. A. P.; Rodermond, H. M.; Stap, J.; Haveman, J.; van Bree, C. Nat. Protoc.2006, 1, 2315-2319）。形成されるクローンの数及びサイズの両方における劇的な用量依存性低減により、ウットロシドＢの抗クローン原性能力が実証される［図２Ｅ〜２Ｆ］。
【００２１】
図３Ａ〜３Ｆは、ウットロシドＢが、細胞周期とは独立していながら、ＨｅｐＧ２細胞においてＰＡＲＰ切断をもたらす、カスパーゼ依存性アポトーシスを誘導することを示す。図３Ａ〜３Ｅは、ＨｅｐＧ２細胞におけるカスパーゼ活性化を示すウエスタンブロットの図である。ＨｅｐＧ２細胞を、示される濃度のウットロシドＢで４８時間処置した後に、全細胞抽出物を調製し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、カスパーゼ８、９、及び７に対する抗体を使用して、ウエスタンブロットに供し、ＥＣＬによって検出した。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる濃度のウットロシドＢで４８時間処置し、全細胞ライセートを、１０％ゲルで分解し、抗ＰＡＲＰに対して免疫ブロッティングを行い、ＥＣＬによって検出した。図３Ｆは、ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞において細胞周期のいずれの段階にも影響を及ぼさないことを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢで４８時間処置し、ヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期分析を、蛍光活性化細胞分取装置を使用して行った。クルクミン２５μＭ（２４時間）を、陽性対照として使用した。
【００２２】
ウットロシドＢは、ＨｅｐＧ２細胞においてアポトーシスを誘導するが、細胞周期のいずれの段階にも影響を及ぼさない。ウエスタンブロット法を使用して、アポトーシス分析を行った。ウットロシドＢは、イニシエーターカスパーゼであるプロカスパーゼ９からその活性なフラグメント（ｐ３５／３７及びｐ１７）への切断の、時間依存性かつ濃度依存性の増加を呈することが見出された［図３Ａ］。カスパーゼ活性化の強力な誘導は、２４時間後に現れ、４８時間でピークに達する。残りのカスパーゼ及びそれらの下流標的の分析を、濃度依存性様式で、４８時間後に行った。これまでに観察されていたように、イニシエーターカスパーゼであるプロカスパーゼ９からその活性なフラグメント（ｐ３５／３７及びｐ１７）への切断の増加［図３Ｂ］、プロカスパーゼ８からその活性なフラグメント（ｐ４３／４１）への切断の増加［図３Ｃ］、及びプロカスパーゼ７からその活性なフラグメント（ｐ−２０）もまた、ウットロシドＢ処置によって、濃度依存性様式で、４８時間後に強化された［図３Ｄ］。予測したとおり、ウットロシドＢは、カスパーゼ活性化の下流事象であるＰＡＲＰの切断を誘導した。ウットロシドＢで処置した細胞において、母バンドからその娘バンドへの強力な切断があり、ここで、８９ｋＤａの娘バンドは、完全に分解されて２５ｋＤａとなったが、対照細胞では、母バンドの１１６ｋＤａのＰＡＲＰは、インタクトな（intact）ままであった［図３Ｅ］。所与の細胞集団の、細胞周期の異なる段階への分布は、フローサイトメトリー分析による核ＤＮＡ含量の定量的測定によって、評価することができる。ウットロシドＢでのＨｅｐＧ２細胞の処置は、４８時間後でさえも、研究した濃度のいずれにおいても、細胞周期にいずれの有意な影響を示さなかったが、陽性対照の（２５μＭ）クルクミンでは、２４時間後に、Ｇ２／Ｍでの細胞周期停止が容易に誘導された［図３Ｆ］。
【００２３】
図４Ａ〜４Ｅは、ウットロシドＢが、肝臓がんにおける極めて重要な生存性シグナルの一部であるＭＡＰＫ及びｍＴＯＲシグナル伝達を阻害することを示す画像である。図４Ａは、ウットロシドＢが、ＮＦ−кＢの核転位にいずれの役割も有さないことを示す。図４Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＡｋｔのリン酸化の動態を示す。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる時間間隔（０〜２４０分間）で、ウットロシドＢで処置し、全細胞ライセートを、１０％ゲルで分解し、ホスホ−ＥＲＫ１／２抗体及びホスホ−Ａｋｔ抗体に対して免疫ブロッティングを行った。タキソールを、陽性対照として使用した。図４Ｃは、ウットロシドＢが、Ｐ−ＪＮＫ、Ｐ３８、及びＥＲＫ１／２の構成的リン酸化及びＰＭＡによって誘導されるリン酸化を下方調節することを示す。図４Ｄは、ウットロシドＢが、ＡＰ−１の核転位を有意に下方調節することを示す。図４Ｅは、ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導される、ウットロシドＢによって誘導されるｍＴＯＲのリン酸化の動態を示す。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる時間間隔で、ウットロシドＢで処置し、全細胞ライセートを、８％ゲルで分解し、ホスホ−ｍＴＯＲ（２４４８）及びホスホ−ｍＴＯＲ（２４８１）抗体に対して免疫ブロッティングを行った。
【００２４】
がんの進行に広く認められる様々な生存性シグナルの調節におけるウットロシドＢの効果。がんの進行に関連する主要なシグナル伝達事象のうちのいくつかと関連する調節性分子を見出すために、ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢで処置し、核抽出物及び全細胞抽出物を、調製した。ＨｅｐＧ２細胞におけるＮＦ−κＢの構成的活性化が存在したが、ウットロシドＢは、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ，electrophoretic mobility shift assay、図４Ａ）によって評価した場合に、そのいずれの有意な下方調節ももたらすことはできなかった。Ａｋｔの活性化状態もまた、ウエスタンブロットによってこれらの細胞において評価した。しかしながら、Ａｋｔの基礎活性化はＨｅｐＧ２において観察されず、したがって、ウットロシドＢは、Ａｋｔ経路の活性化において有意な役割を有さない（図４Ｂ）。興味深いことに、ＭＡＰＫ経路の基礎活性化、特に、ｐ−４２／４４及びｐ−ＪＮＫシグナル伝達は、これらの細胞において顕著であり、これが、ウットロシドＢによって、有意に下方調節された。さらに、ＰＭＡによって誘導されるｐ−ＪＮＫ、ｐ−３８、及びｐ−４２／４４の活性化もまた、ウットロシドＢによって下方調節され、肝臓がんに対するウットロシドＢの抗がん能力の調節におけるこの経路の重要な役割を示す［図４Ｃ］。この観察を裏付け、ＭＡＰＫシグナル伝達の下流標的であるＡＰ−１もまた、電気泳動移動度シフトアッセイによって評価した場合に、ウットロシドＢによって下方調節された［図４Ｄ］。ｍＴＯＲ経路は、主要な生存性シグナルであり、これは、細胞の増殖及び代謝において中枢的な役割を果たし、肝臓がんの５０％近くにおいて、上方調節されている。この経路の強力な基礎活性化が、ＨｅｐＧ２細胞において観察された。本発明者らは、ウットロシドＢが、この活性化されたｍＴＯＲを下方調節できるかどうかを、ウエスタンブロットアッセイによって調べた。ウットロシドＢ曝露の際に、ｐ−ｍＴＯＲ活性化を表す２４４８及び２４８１リン酸化部位におけるｍ−ＴＯＲのリン酸化の時間依存性減少が確認されたことは、非常に興味深かった［図４Ｅ］。
【００２５】
図５Ａ〜５Ｅは、スイスアルビノマウスにおけるウットロシドＢの毒物学的評価を示す。図５Ａは、スイスアルビノマウスにおけるウットロシドＢを使用した毒性研究の概略図である。図５Ｂ〜５Ｄは、（Ｂ〜Ｄ）急性及び慢性の毒性研究によって評価した場合に、ウットロシドＢの血清生物化学的分析は、ウットロシドＢがいずれの肝臓毒性、血液毒性、及び腎臓毒性も誘導しないことを表すことを示す。ウットロシドＢは、図５Ｅに見られるように、肝臓の組織病理学的分析によって評価した場合に、肝臓毒性を誘導しない。対照及びウットロシドＢで処置したスイスアルビノマウスの群から単離した腫瘍組織の組織病理学的評価。ホルマリンで固定した凍結切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００２６】
ウットロシドＢは、急性及び慢性の毒性モデルによって評価した場合に、薬理学的に安全である。ウットロシドＢに起因するあらゆる毒性副作用の可能性を排除するために、化合物の詳細な毒物学的評価を、図５Ａに示されるように、スイスアルビノマウスにおいて行った。１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの用量（dose）のウットロシドＢを受容したマウスの群は、いずれの異常な挙動も呈さず、また肝臓機能における異常性の明確なマーカーであるＡＳＴ［（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＳＧＯＴ）］、ＡＬＴ［（アラニントランスフェラーゼ、ＳＧＰＴ）］、及びＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）の血清レベルにいずれの逸脱も示されなかった［図５Ｂ］。３カ月間の慢性細胞毒性研究において、それぞれ、対照マウス及び処置マウスにおいて、ＷＢＣの全計数及び差次的計数のレベル、並びにＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＰ、及びＢＵＮ（blood urea nitrogen、血中尿素窒素）の血清レベルを分析することによって、ウットロシドＢに起因する血液毒性、肝臓毒性、及び腎臓毒性をアッセイした［図５Ｃ〜５Ｄ］。結果は、これらのパラメーターのいずれにも、正常な値の範囲との有意な差がなかったことを示し、ウットロシドＢが、薬理学的に安全かつ非毒性であることを実証する。腫瘍低減研究に使用したウットロシドＢの用量と同じものを使用した、急性（１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ）並びに慢性毒性研究（１０ｍｇ／ｋｇ）におけるマウスから単離した肝臓組織の組織病理学的分析は、毒性のいずれの形質学的変化の特徴も示さなかった。急性毒性研究の肝臓組織においては、処置用量（５０ｍｇ／ｋｇ）の５倍高い量で、微胞性脂肪の変化が現れたが、これは、いずれの化学療法にも付随する可逆的変化である。これらの観察により、ウットロシドＢが、前臨床試験を通じて検証される化学療法薬として安全に使用できることが確認される［図５Ｅ］。
【００２７】
図６：ウットロシドＢは、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて、肝臓異種移植片腫瘍の発達を阻害する。図６Ａは、抗腫瘍研究を示す、絵で表した図である。図６Ｂは、ウットロシドＢ処置あり又はなしの４週間後のＨｅｐＧ２異種移植片腫瘍を有するマウスの代表的な写真である。図６Ｃは、ウットロシドＢが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、腫瘍体積を効果的に阻害することを示すグラフである。対照及びウットロシドＢで処置した群の間のＨｅｐＧ２異種移植片腫瘍の平均体積を、示す。データは、１群当たり９匹の動物を用いた３回の独立した研究セットの平均を示す（Ｐ値は、０．００５未満）。図６Ｄは、対照及びウットロシドＢで処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの群から単離した腫瘍組織の組織病理学的評価の画像である。ホルマリンで固定した凍結切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。図６Ｅは、ウットロシドＢが、ウットロシドで処置した腫瘍切片においてアポトーシスを誘導する画像である：切断型ＰＡＲＰ抗体を使用した、対照及びウットロシドＢで処置したマウスの腫瘍凍結切片のＩＨＣ分析であり、切断型ＰＡＲＰの発現が、ウットロシドＢで処置したマウスに由来する腫瘍組織切片において検出され、アポトーシスが示される。
【００２８】
続いて、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいてインビボＨｅｐＧ２異種移植片モデルを使用して、肝臓がんに対するウットロシドＢの抗がん能力を検証することを試みた。マトリゲルに懸濁したＨｅｐＧ２細胞を、マウスの側腹部領域に皮下注射した。研究は、図６Ａに概略的に示されている。ＰＢＳ（Phosphate Buffered Salts：リン酸緩衝生理食塩水）中に溶解したウットロシドＢを、１５日間の腫瘍細胞の移植後に投与したが、この時点で、腫瘍は、およそ５０〜１００ｍｍ３のサイズになっていた。ウットロシドＢ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）を、週３回で４週間、腹腔内注射した。群１は、対照動物から構成され、これらは、いずれの処置も受けなかった。腫瘍のサイズは、ノギスを使用して毎週測定し、対応する腫瘍体積を計算した。ウットロシドＢを受容した動物において発達した腫瘍の体積は、ビヒクルを注射した対照マウスのものと比較して、有意に低かった。処置期間の終わりの時点で、ウットロシドＢを受容したマウスの群では、外から確認できる腫瘍はなかったが、対照群では、測定できるほどの腫瘍が発達した。しかしながら、殺処分の時に、ウットロシドＢで処置した動物の皮膚の下にも、非常に小さな腫瘍が観察されたが、このサイズは、対照動物のものと比較して劇的に小さかった［図６Ｂ〜６Ｃ］。発達した腫瘍量を、Ｈ＆Ｅ染色を使用して組織病理学的に分析し、これによっても、ウットロシドＢで処置した腫瘍組織において、細胞の著しい破壊が示され、これは、劇的な腫瘍の縮小と相関性がある［図６Ｄ］。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて異所的に移植したヒト肝臓異種移植片のホルマリンで固定した凍結切片の、切断型ＰＡＲＰ特異的抗体に対するＩＨＣ染色により、ウットロシドＢのインビボでのアポトーシス応答が明らかとなった。切断型ＰＡＲＰの発現における有意な上方調節が、ウットロシドＢで処置したマウスに由来する腫瘍切片において観察された［図６Ｅ］。この研究は、マウスにおけるものであったが、当業者であれば、用量を、単純な計算によってヒトに相当する投薬量に変換することができることを知っている。例えば、マウスの１０ｍｇ／ｋｇ体重は、ヒトでは０．８ｍｇ／ｋｇ体重に変換され、結果として、０．０５〜１．２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲となる。
【００２９】
いくつかの研究により、植物由来の生体活性物質を含有する多数の伝統的な医薬が、抗腫瘍効果を呈し、様々な種類のがんの治療に使用されていることを実証している（Antony, J.; Saikia, M.; Vinod, V.; Nath, L. R.; Katiki, M. R.; Murty, M. S.; Paul, A.;Shabna, A.; Chandran, H.; Joseph, S. M.; Nishanth, K. S.; Panakkal, E. J.; Sriramya, I.;Sridivya, I.; Ran, S.; Sankar, S.; Rajan, E.; Anto, R. J. Sci. Rep. 2015, 5, 11107、da Rocha, A. B.; Lopes, R. M.; Schwartsmann, G. Curr. Opin. Pharmacol. 2001, 1, 364-369、Itokawa, H.; Wang, X.; Lee K. H. Brunner-Routledge Psychology Press, Taylor &Francis Group, Boca Raton. 2005, 4, 47、Laladhas, K. P.; Cheriyan, V. T.; Puliappadamba, V. T.; Bava, S. V.; Unnithan, R. G.;Vijayammal, P. L.; Anto, R. J. J. Cell. Mol. Med. 2011, 14, 636-646）。抗がん剤としてのサポニンの使用を示す文書が存在する（Podolak, I.; Galanty, A.; Sobolewska, D. Phytochem. Rev. 2010, 9, 425-474、Raju, J.; Mehta, R.; Nutr. Cancer. 2009, 61, 27-35）。ライネッケ・カネア（Reineckiacarnea）から単離されるスピロスタノールサポニン誘導体であるＲＣＥ−４、（１β，３β，５β，２５Ｓ）−スピロスタン−１，３−ジオール１−［α−Ｌ−ラムノピラノシル−（１→２）−β−Ｄキシロピラノシド］は、ヒトがん細胞において増殖の阻害及びアポトーシスを誘導することが示されている（Wang, G.; Huang, W.; He, H.; Fu, X.; Wang, J.; Zou, K.; Chen, J. Int J Mol Med. 2013,31, 219-224）。デガラクトチゴニン（Degalactotigonin）（１０５９Ｄａ）は、イヌホオズキに由来する公知の高度に細胞毒性（０．２５μＭ）のサポニンである（Zhou, X.; He, X.; Wang, G.; Gao, H.; Zhou, G.; Ye, W.; Yao, X. J. Nat. Prod. 2006, 69,1158-1163）。文書はほとんど存在せず、子宮頸がん細胞及び結腸がん細胞に対するウットロシドＢの細胞毒性の可能性に関する文献中に、比較的高いＩＣ５０値（それぞれ、１５．４３μＭ及び２．３３μＭ）で記載があるが（Jin, J.-M.; Zhang, Y.-J.; Yang, C.-R. J. Nat. Prod. 2004, 67, 5-9、Ikeda, T.; Tsumagari, H.; Honbu, T.; Nohara, T. Chem. Pharm. Bull. 2003, 26, 1198-1201）、その生物学的安全性に関しても作用機序に関しても、さらなる情報は報告されていない。知り得る限り、本発明が、正常肝臓細胞に対して薬理学的に安全かつ非毒性でありながら、肝細胞癌に対するウットロシドＢの並外れた抗がん能力を報告した最初の研究である。理想的な化学防御剤は、非毒性であり、低用量で有効であり、経済的であり、容易に入手可能であるべきである（Amin, A. R.; Kucuk, O.; Khuri, F. R.; Shin, D. M. J. Clin. Oncol. 2009, 27, 2712-2725）。イヌホオズキは、インディアンの伝統的な医薬系において使用される重要なハーブであり、そこから単離されたいくつかの分子が、抗がん能力に関して広く研究されているが、この植物から単離される１２１５．１２ＤａのサポニンであるウットロシドＢの抗がん能力は、それほど研究されていなかった。本発明者らの観察によると、ウットロシドＢは、肝臓がん細胞に対して最も細胞毒性が高いが、他のがん細胞においても細胞毒性を誘導する。本研究によって、ウットロシドＢが、肝臓がん細胞株であるＨｅｐＧ２のクローン原性能力を阻害することも明らかとなった。化学療法剤のほとんどは、主として、がん細胞においてアポトーシスを誘導することによって作用する。化学療法薬の効率は、アポトーシスの誘導の成功に依存するが、これは、アポトーシスシグナル伝達における欠陥が、薬物耐性の主な原因であるためである（Melet, A.; Song, K.; Bucur, O.; Jagani, Z.; Grassian, A. R.; Khosravi-Far, R. Adv. Exp.Med. Biol. 2008, 615, 47-79）。アポトーシスは、カスパーゼの活性化を特徴とする分子事象のカスケードであり、カスパーゼは、酵素前駆体（プロカスパーゼ）として合成され、化学療法剤に応答したそれらのタンパク質分解切断により、活性化がもたらされる。アポトーシスプログラムは、イニシエーターカスパーゼの活性化で開始し、次にエグゼクターカスパーゼが活性化され、これが、続いて逐次的な順序でＰＡＲＰなどの機能性酵素の切断を引き起こし、それによって、周囲組織に毒性又は炎症を引き起こすことなく、腫瘍細胞の体系的な破壊が補助される。アポトーシスに関する現在許容されている教理と一致して、ウットロシドＢは、肝臓がん細胞においてそのような特徴的な分子事象を誘導することが見出され、イニシエーターカスパーゼであるカスパーゼ９のその活性なフラグメントへの時間依存性切断をもたらし、切断されたフラグメントは、２４時間で現れ、４８時間でピークに達したため、本発明者らは、残りのカスパーゼ及びその下流標的を４８時間で分析することにした。活性化されると、イニシエーターカスパーゼであるカスパーゼ−９／８は、エフェクターカスパーゼであるカスパーゼ−３／７を活性化し、それによって、アポトーシス細胞死の実行を促進する。アポトーシスの際、ＤＮＡ修復酵素ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ，Poly(ADPRibose) polymerase）は、ほとんどの場合、カスパーゼ−３又はカスパーゼ−７によるタンパク質切断を受けることが多く、本来の１１６ｋＤａが、ＣＯＯＨ末端側の触媒ドメインを含む８９ｋＤａのフラグメント及び短縮されたＮＨ２末端側のＤＮＡ結合ドメインを含む２５ｋＤａのフラグメントに切断される。ＰＡＲＰ切断は、カスパーゼ活性化の重要なマーカーのうちの１つと考えられる。ウットロシドＢは、アポトーシス小体の存在、カスパーゼ及びＰＡＲＰの切断によって証明されるように、カスパーゼ依存性アポトーシスのすべての古典的なマーカーを誘導した。細胞周期停止の誘導は、化学療法薬ががん細胞において細胞毒性を誘導する別の機序である。ジオスゲニンなどの一部のステロイダルサポニン及びスミラゲニンは、Ｇ０／Ｇ１期で細胞周期を遮断し、一方でチゴゲニンなどのその他のものは、細胞周期に対して全く影響を有さないことを示す文書があるが、これにより、Ａ−環及びＢ−環の空間配置並びに５，６−二重結合の存在又は欠如における相違が、細胞周期に対するサポニンの作用様式の決定因子ではないことが示される（Podolak, I.; Galanty, A.; Sobolewska, D. Phytochem. Rev. 2010, 9, 425-474、Trouillas, P.; Corbiere, C.; Liagre, B.; Duroux, J. L.; Beneytout, J. L. Bioorg. Med. Chem.2005, 13, 1141-1149）。本発明者らの研究の結果により、ウットロシドＢが、チゴゲニンと同様に、細胞周期に対していずれの作用も有さないことが確認される。ＨＣＣにおける腫瘍生存の機序は、その増殖を調節する複数のシグナル伝達機序が関与し、高度に複雑である。ＮＦ−κＢ、Ａｋｔ、ＭＡＰＫ、及びｍＴＯＲは、肝臓がんの進行を促進する最も広く認められている生存性シグナルであり、肝臓がんを標的とする薬物のほとんどが、これらの経路の阻害剤である（Sun, B. Karin, M. Oncogene. 2008, 27, 6228-6244、Wu, X.; Li, Y. InTech, Prof. Alexander Juliano (Ed.), 2012, ISBN: 978-953-51-0036-2）。ウットロシドＢは、ＨｅｐＧ２細胞においてＮＦ−κＢの構成的活性化にいずれの有意な下方調節ももたらすことができなかった。別の興味深い観察としては、ＨｅｐＧ２細胞における活性化Ａｋｔの非存在があったが、これにより、本発明者らは、ウットロシドＢの抗がん能力を調節している可能性のある経路の一覧から、Ａｋｔも排除することとなった。しかしながら、これらの細胞において構成的に活性化されているＭＡＰＫ及びｍＴＯＲの両方のリン酸化の基礎レベルは、ウットロシドＢによって完全に破壊され、ＨｅｐＧ２においてウットロシドＢによって誘導される細胞毒性の調節におけるこれらの両方の経路の強力な役割を示した。ウットロシドＢはまた、ＰＭＡによって誘導されるＭＡＰＫ経路のすべてのメンバー（ＪＮＫ、ｐ３８、及びｐ４２／４４）のリン酸化も下方調節した。ラパマイシンの哺乳動物標的である（ｍＴＯＲ）経路が、ある割合のＨＣＣ患者において異常に活性化されており、ｍＴＯＲの阻害により、肝臓腫瘍の増殖及び転移を抑制することができることが示されている文書がある（Guertin, D. A.; Sabatini, D. M. Cancer Cell, 2007, 12, 9-22、Wang, C.; Wang, X.; Su, Z.; Fei, H.; Liu, X.; Pan, Q. Oncol. Rep. 2015, 34, 1708-1716）。さらに、ｍＴＯＲの上方調節は、２番目に最も多い肝臓の原発性がんである胆管細胞癌において頻繁に観察されている（Matter, M. S.; Decaens, T.; Andersen, J. B.; Thorgeirsson, S. S. J. Hepatol. 2014, 60,855-865）。ｍＴＯＲ経路とＭＡＰＫ経路との間の複雑な相互作用もまた、肝臓癌形成（hepatocarcinogenesis）の際に実証されている（Wang, C.; Cigliano, A.; Delogu, S.; Armbruster, J.; Dombrowski, F.; Evert, M.; Chen, X.; Diego F. Cell. Cycle. 2013, 12, 1999-2010）。しかしながら、これらの経路の両方が、ウットロシドＢの抗がん能力の調節において互いに依存性であるか非依存性であるかを確認するには、さらなる研究が必要である。ウットロシドＢの生物学的安全性は、短期間（７日間）及び長期間（３カ月間）の毒性研究を使用して、スイスアルビノマウスにおいて行った。がんの治療に現在利用可能な化学療法スキームのほとんどには、相当な毒性が付随し、そのため、患者にとって最適な臨床利益には至っていない。化学療法に付随する主要な問題は、リンパ球、好中球、及び単球などの血液学的パラメーターの計数の低減である。ウットロシドＢは、血液学的パラメーターにいずれの有意な相違ももたらさなかったため、動物においていずれの毒性も免疫抑制も引き起こさないことが示される。肝臓損傷の発生後には、ＡＬＰ（ＳＧＰＴ）、ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）、及びＡＬＴが、損傷した細胞から放出され、血清中のそれらのレベルが上昇する。急性及び慢性の両方の毒性研究において、動物の血清中の肝臓機能酵素のレベルは、正常範囲内であったため、ウットロシドＢが、インビボで非毒性であり、薬理学的に安全であることが示唆される。正常レベルの血中尿素窒素（ＢＵＮ）によっても、ウットロシドＢが、腎臓にいずれの重度の毒物学的兆候ももたらさないことが示された。ウットロシドＢは、体重の減少、毛並みの乱れ、並びに挙動及び食物摂取における変化などの全体的な尺度から結論付けると、最大で５倍の用量まで、研究動物において蓄積による有害な応答のいずれの兆���も示すことはなく、ウットロシドＢが、インビボでの投与に関して薬理学的に安全であることが示された。ヒト肝臓がん異種移植片を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいてウットロシドＢによってもたらされた腫瘍増殖の劇的な阻害により、ウットロシドＢの化学療法上の有効性が示され、また強調されるが、これは、その有意な存在がアポトーシスの明確なマーカーである切断型ＰＡＲＰの発現に関する腫瘍切片の免疫組織化学的分析によって、さらに確認された。
【００３０】
肝臓がんの化学療法の選択肢は限られており、ＨＣＣ患者の予後は、低迷したままである。高スループットのスクリーニングによるデノボコンビナトリアルアプローチから導出され、２００７年にＵＳ−ＦＤＡによって承認されたソラフェニブが、現在のところ肝細胞癌の治療に利用できる唯一の薬物である。ソラフェニブは、多重キナーゼ阻害剤であり、生存率を最大で２０％延長することができ、２つのフェーズIII臨床試験に基づいて、進行した切除不能なＨＣＣの治療に承認されている唯一の全身的薬剤であるが、重度の副作用を有することが報告されている。本研究において、ウットロシドＢをイヌホオズキから単離し、ウットロシドＢが、ソラフェニブよりも強力であることが見出された。これらの結果により、肝臓がんに対するウットロシドＢのさらなる臨床上の評価が保証される。
【００３１】
一般的な研究手順：シリカゲル６０  Ｆ２５４アルミニウムＴＬＣプレートを使用して、短波長の紫外線による反応をモニタリングし、１５％硫酸をスプレーした後に、ＴＬＣプレートを炭化させて、スポットを可視化した。カラムクロマトグラフィーを、シリカゲル６０〜１２０及び２３０〜４００メッシュにおいて行った。Ｃ１８−ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ逆相カラム（２５０×２１．２０ｍｍ、１５μ）を備えるShimadzu社のＨＰＬＣ機器を、勾配グレードのＣＨ３ＯＨ及びＨ２Ｏを使用した半精製メタノール抽出物の精製に使用した。１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、それぞれ、５００ＭＨｚ、７００ＭＨｚ、及び１２５ＭＨｚ、１７６ＭＨｚで記録した。すべてのスペクトルは、メタノール−ｄ４及びＣＤＣｌ３中で記録した。化学シフトは百万分率で表し、結合定数はＨｚで表す。ＨＲＥＳＩＭＳ分析を、Thermo Scientific Exactive質量分析計で行い、イオンはｍ／ｚで表す。
【００３２】
イヌホオズキ（Ｌｉｎｎ．）の葉の材料を、室温で乾燥させた後、すり砕いて粗い粉末にし、１００ｇの材料を得た。粉末にした材料を、勾配溶媒系：ヘキサン（５００ｍＬ）、ジクロロメタン（５００ｍＬ）、酢酸エチル（５００ｍＬ）、及びメタノール（５００ｍＬ）を使用して、振盪インキュベーターにおいて１５０ＲＰＭで浸軟に供し、これを濾過し、濃縮した後に、それぞれ、１．７ｇ、２．５ｇ、４．２ｇ、及び６．３ｇが得られた。メタノール抽出物が、肝臓がん細胞株に対して最も活性であることが見出された。
【００３３】
図７Ａは、５つのがん細胞株のパネルにおけるイヌホオズキの有機抽出物の細胞毒性のグラフである。がん細胞を、示される濃度のヘキサン抽出物、ジクロロメタン抽出物、酢酸エチル抽出物、及びメタノール抽出物で処置し、示されるように７２時間インキュベートし、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。図７Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞におけるイヌホオズキから単離したカラム画分によって誘導される細胞毒性のグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を、示されるように異なる濃度のカラム画分で処置し、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。データは、３つの独立した研究セットを表す。エラーバーは、±標準偏差を表す。
【００３４】
ウットロシドＢ（１）の単離及び精製：メタノール抽出物（６．３ｇ）を、カラムクロマトグラフィーによる分画に供した。カラムに、ヘキサンを充填し（シリカゲル６０〜１２０メッシュ、４５ｃｍ×３ｃｍ）、化合物をロードし、勾配溶媒系：ヘキサン／クロロホルム（それぞれ５００ｍＬ、１００／０、８０／２０、６０／４０、５０／５０、４０／６０、２０／８０、０／１００）から、クロロホルム／メタノール（それぞれ５００ｍＬ、１００／０、９５／５、９０／１０、８５／１５、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０、５０／５０）を使用して、溶出した。クロロホルム／メタノール（６０／４０）溶出中に溶出された画分の濃縮により、主要な極性画分（１．１２５ｇ）が得られ、これが、最も活性な画分であることが見出された。極性の活性画分（１．１２５ｇ）を、さらに、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２３０〜４００メッシュ、３０ｃｍ×２ｃｍ）による精製に供した。カラムに、クロロホルムを充填し、化合物をロードし、勾配溶媒系：クロロホルム（１００ｍＬ）からクロロホルム／メタノール（それぞれ３００ｍＬ、９０／１０、８０／２０、７０／３０）を使用して溶出した。クロロホルム／メタノール（７０／３０）での溶出中に得られた画分は、淡黄色の泡沫固体（７００ｍｇ）を含むことが見出され、これは、１Ｈ−ＮＭＲにおいて観察すると、プロリン及びサポニンの混合物であることがわかった。プロリン及びサポニンの混合物（７００ｍｇ）を、Ｈ２Ｏ（６ｍＬ）中に再度溶解し、次いで、以下の勾配プログラムを使用して逆相分取ＨＰＬＣによる精製に供した：溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ）及び溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）、０分で０％Ｂ、５分で１０％Ｂ、１０分で２０％Ｂ、１５分で３０％Ｂ（プロリン１３０ｍｇを単離、１０〜１５分）、２０分で５０％Ｂ、３０分で６０％Ｂ、６０分で８０％Ｂ、６５分で９０％Ｂ、７０分で１００％Ｂの線形勾配。サポニンは、６５％〜８０％Ｂで溶出され、これを、溶出した画分をＴＬＣプレートに収集し、エタノール中１５％硫酸を用いて炭化させることによって、モニタリングした。濃縮した後に凍結乾燥することによって、白色固体のウットロシドＢ（１、１２０ｍｇ）を得た。
【００３５】
図８Ａは、ＨｅｐＧ２細胞におけるサポニン及びプロリンの混合物（ＳＰ）によって誘導される用量依存性細胞毒性のグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる濃度の活性なカラム画分で処置し、細胞生存率を、ＭＴＴによって評価した。図８Ｂは、プロリン及びサポニンの混合物である淡黄色の泡沫固体の画像である。イヌホオズキのメタノール抽出物から単離した活性なカラム混合物及びこれの画分を、真空条件に供した。図８Ｃは、用量依存性様式での単離したサポニン及びプロリンの細胞毒性のグラフである。ＨｅｐＧ２細胞を、示される濃度のプロリン及びウットロシドＢで処置し、示されるように７２時間インキュベートし、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。データは、３つの独立した研究セットを表す。エラーバーは、±標準偏差を表す。図８Ｄは、白色固体であるウットロシドＢ（１）の画像である。イヌホオズキのメタノール抽出物の活性なカラム画分及び純粋な画分から単離した活性化合物を、真空条件に供した。
【００３６】
図９は、ウットロシドＢ（１）のＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳの図である。負モードで分析したウットロシドＢ（１）のＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳデータは、ｍ／ｚ１２１３．６１４５の（Ｍ−Ｈ）イオンを示し、分子式Ｃ５６Ｈ９３Ｏ２８が示された。ＭＳ−ＭＳの負モードでのフラグメンテーションにより、ｍ／ｚ１０８１．５（Ｍ−ｘｙｌ−Ｈ）、９１９．５（Ｍ−ｈｅｘ−Ｈ）、７５７．４（Ｍ−ｈｅｘ−ｈｅｘ−Ｈ）のイオンが得られた。正モードのフラグメンテーションにより、ｍ／ｚ１２３５．５（Ｍ−Ｈ２Ｏ＋Ｋ）、１１９７．５（Ｍ−Ｈ２Ｏ）、１０７３．４（Ｍ−Ｈ２Ｏ−ｈｅｘｏｓｅ＋Ｋ）、７４１．４（Ｍ−Ｈ２Ｏ−ｈｅｘ−ｈｅｘ−ｘｙｌ＋Ｈ）、５７９．３（Ｍ−Ｈ２Ｏ−ｈｅｘ−ｈｅｘ−ｘｙｌ−ｈｅｘ＋Ｈ）、４１７．３（Ｍ−Ｈ２Ｏ−ｈｅｘ−ｈｅｘ−ｘｙｌ−ｈｅｘ−ｈｅｘ＋Ｈ）、１６３．０６（Ｍ−ｈｅｘ−ｈｅｘ−ｘｙｌ−ｈｅｘ−ｈｅｘ−ｆｕｒｏｓｔａｎｏｌ＋Ｈ）のイオンが得られた。
【００３７】
図１０は、ウットロシドＢ（１）の負モードでのＭＳ−ＭＳ分析の図である。重要な構造的特徴付け：ウットロシドＢの１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲ研究を、まず、ＣＤ３ＯＤ溶媒で行った。ステロイダルフラノース環に関係する重要な情報としては、δＨ０．９９におけるＨ−２１メチル基（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝７）及びδＣ１１２．５におけるヘミケタール炭素Ｃ−２２が挙げられる。３〜４ｐｐｍの領域において糖に起因して生じるシグナルの複雑なパターンのため、ウットロシドＢが、アセチル化されて、ペルアセチル化化合物（２）が得られた。ペルアセチル化化合物（２）の１Ｈ及び１３Ｃ−ＮＭＲ研究を、ＣＤＣｌ３溶媒で行った。驚くべきことに、アセチル化の後に、Ｈ−２１メチル基は、δＨ１．５７（３Ｈ、ｓ）で低磁場シフトを示し、Ｈ−１７はδＨ２．４５［１Ｈ、ｄ、Ｊ＝９．８］で示した。１３Ｃ−ＮＭＲでは、ヘミケタール炭素のピークが消失し、それぞれ、炭素Ｃ−２０及びＣ−２２を示す２つの追加のピークがδＣ１０３．７及び１５１．７に現れた。ＮＭＲによる前述の観察により、本発明者らは、アセチル化の際の水分子の消失に起因したフラノース環に新しいオレフィン結合が出現したと考えるに至った。
【００３８】
図１１は、ウットロシドＢ（１）の正モードでのＭＳ−ＭＳ分析の図である。ウットロシドＢ（１）のペルアセチル化：ウットロシドＢ（１、２０ｍｇ）を、３ｍＬのピリジン：Ａｃ２Ｏ（２：１）中に溶解した後、Ｎ２雰囲気下において室温で撹拌した。２４時間後に、反応混合物に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２５ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（２５ｍＬ×２）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４下において乾燥させ、濃縮した。ヘキサン／酢酸エチル６０／４０から４０／６０を使用したカラムクロマトグラフィーによる精製によって、ペルアセチル化化合物２（１０ｍｇ）を白色固体として得、これを、ＣＤＣｌ３でのＮＭＲによって特徴付けた。化合物２のＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋Ｃ８８Ｈ１２４Ｏ４３Ｎａ、計算値ｍ／ｚ１８９１．７４１４、実測値１８９１．７３８２。
【００３９】
図１２は、ウットロシドＢ（１）からのペルアセチル化化合物（２）の合成の図である。本発明には、ペルアセチル化化合物（２）において示される「Ｒ」基の１又は２以上の置換を含み得る、ウットロシドＢ誘導体化合物が含まれる。加えて、「ＯＲ」基全体の置換による他の誘導体が含まれる。置換は、活性、特異性、可溶性、又は他の物理的若しくは化学的特性をモジュレートするために行われ得る。置換としては、アリール、アルキルアリール、アリールアルコキシ、シクロアルキル、架橋シクロアルキル、シクロアルコキシ、アリールチオ、アルキルスルフィニル、カルボキサミド、カルバモイル、アリールチオ、アルキルスルフィニル、カルボキサミド、カルバモイル、カルボキシル、カルボニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアリール、ヘテロ環式環、アリールヘテロ環式環、ヘテロ環式化合物、アミド、アルキルアミド  カルボン酸エステル、カルボン酸、ホスホリル、ハロゲン、又は水素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
図１３は、ウットロシドＢの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【００４１】
図１４は、ウットロシドＢの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【００４２】
図１５は、ペルアセチル化化合物２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【００４３】
図１６は、ペルアセチル化化合物２の１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルの図である。
【００４４】
植物は、２００９年８月に、ケーララ州のティルヴァナンタプラムの地方域から新しく採取し、Dr. G. Valsaladevi、Curator、Dept of Botany、University of Kerala、Indiaによって識別し、証拠標本を、Rajiv Gandhi Centre Biotechnology, Division of Cancer Research研究室（証拠番号：ＣＲＰ  ０５）に寄託された。
【００４５】
子宮頸がん細胞株（ＨｅＬａ）、乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、肺がん細胞株（Ａ５４９）、結腸がん細胞株（ＨＣＴ−１１６）、皮膚がん細胞株（Ａ３７５）、肝臓がん細胞株（ＨｅｐＧ２、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、Ｈｅｐ３Ｂ、及びＨｕｈ−７）、白血病細胞株（ＨＬ６０）、並びに正常肝細胞（Ｃｈａｎｇ肝臓）を、National Centre for Cell Sciences（Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａ）から入手した。
【００４６】
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Dulbecco's Modified Eagle Medium）及びストレプトマイシン硫酸塩などの重要な細胞培養試薬を、Invitrogen Corporation社（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）から入手した。SUPERSENSITIVE（商標）ポリマー−ＨＲＰ  ＩＨＣ検出系キットを、Biogenex Laboratories Inc社（Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ、ＵＳＡ）から入手し、免疫組織化学研究に使用した。ＭＴＴ試薬及びAmershamECL PLUS（商標）ウエスタンブロッティング試薬を、GE Healthcare Life Sciences社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）から購入した。カスパーゼ、β−アクチン、ｐ−ｐ４２／４４、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ｐ３８、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−ｍＴＯＲ、及びビンクリンに対する抗体を、Cell Signaling Technologies社（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手し、ＰＡＲＰに対する抗体を、Santa Cruz Biotechnology社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。抽出、カラムクロマトグラフィー、及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に使用したすべての化学物質は、分析グレードのものであり、Merck Ltd社、Ｍｕｍｂａｉ、Ｉｎｄｉａから入手した。カラムクロマトグラフィーに使用したシリカゲル（６０〜１２０及び２３０〜４００メッシュ）及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に使用した事前コーティングシリカゲル６０  ＧＦ２５４プレートは、Merck Ltd社、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。すべての他の化学物質は、別途示されない限り、Sigma Chemicals社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
【００４７】
イヌホオズキの粗抽出物及び単離した化合物のストックを、インビトロでの研究のためにＤＭＳＯ中に調製し、−２０℃で保管した。すべての研究において、ＤＭＳＯの濃度は、対照を含め、０．２％以下であった。細胞生存率アッセイは、７２時間の薬物処置の後に行ったが、全細胞ライセート調製及び細胞周期分析は、２４時間及び４８時間の薬物処置の後に行った。ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の研究のために、ウットロシドＢは、抽出前に２時間インキュベートした。
【００４８】
ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイは、標準的な比色分析アッセイであり、増殖、生存率、及び細胞毒性の分析に適切である。簡単に述べると、ＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェルプレートに播種した（２０００個の細胞／ウェル）。一晩インキュベートした後、細胞を、異なる濃度のイヌホオズキの有機抽出物（２５〜２５０μｇ／ｍｌ）及び単離した化合物ウットロシドＢ（２５０〜１２５０ｎＭ）で７２時間処置し、細胞毒性を測定した。２５μＬのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）及び７５μＬの完全培地を含有する新しい培地を、ウェルに添加し、２時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、溶解緩衝液（５０％ジメチルホルムアミド中、２０％ドデシル硫酸ナトリウム）を、ウェルに添加し（０．１ｍＬ／ウェル）、３７℃でさらに１時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Bio-Rad社）を使用して、５７０ｎｍで光学密度を測定した。パーセント単位の相対細胞生存率（relative cell viability）を、（処置サンプルのＡ５７０／未処置サンプルのＡ５７０）×１００として計算した。ＩＣ５０値を、研究データの多項式回帰分析から外挿した（Antony, J.; Saikia, M.; Vinod, V.; Nath, L. R.; Katiki, M. R.; Murty, M. S.; Paul, A.;Shabna, A.; Chandran, H.; Joseph, S. M.; Nishanth, K. S.; Panakkal, E. J.; Sriramya, I.;Sridivya, I.; Ran, S.; Sankar, S.; Rajan, E.; Anto, R. J. Sci. Rep. 2015, 5, 11107）。
【００４９】
クローン原性細胞生存率アッセイにより、無限に増殖し、それによって、大きなコロニー又はクローンを形成するその再生能力を保持する、細胞の能力を判定する（Milner, S. E.; Brunton, N. P.; Jones, P. W.; O' Brien, N. M.; Collins, S.G.; Maguire, A. R.J. Agric. Food. Chem. 2011, 59, 3454-3484）。この技法は、増殖する細胞の長期的な運命を判定するために使用されるが、これは、他の検出方法を使用した場合には後期に生じる細胞の増殖の不可逆的な停止を特定することが困難なためである（Jain, R.; Sharma, A.; Gupta, S.; Sarethy, I. P.; Gabrani, R. J. Clin. Ther. 2011, 16, 78-85）。簡単に述べると、５００〜１０００個の細胞／ウェルを、６ウェルプレートに播種し、異なる濃度の単離化合物（ウットロシドＢ）で７２時間処置した。次いで、培地を吸引し、新しい培地を添加し、１週間インキュベートした。発生したクローンを、グルタルアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットを使用して染色した。次いで、クローンを、顕微鏡下において確認し、写真を撮影し、コロニーを計数し、グラフをプロットした（Franken, N. A. P.; Rodermond, H. M.; Stap, J.; Haveman, J.; van Bree, C. Nat. Protoc.2006, 1, 2315-2319）。
【００５０】
ウエスタンブロット分析。およそ０．５×１０６個の細胞を、６０ｍｍの培養プレート上で増殖させ、示されるように、所望される時間の間、薬物に曝露させた。次いで、細胞を削ぎ落とし、氷冷１倍ＰＢＳ中で洗浄し、１３０００ｒｐｍで２分間ペレットにした。ペレットにした細胞を、１５０μＬの氷冷全細胞溶解緩衝液［（２０ｍＭ  ｐＨ７．４のＴｒｉｓ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、１ｍＭ  ＤＴＴ（１，４−ジチオスレイトール）、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、４ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、アプロチニン（５ｍｇ  ｍ／Ｌ）、及びロイペプチン（５ｍｇ  ｍ／Ｌ）］中に懸濁し、５分ごとに間欠的にボルテックスしながら氷中に３０分間保持した。インキュベーションの後に、ライセートを、１３０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を収集した。ライセート中の全タンパク質含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって推定した後、５倍ローディング色素とともに沸騰させることによって変性させた後、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってタンパク質を分離させた。電気泳動の後に、ポリアクリルアミドゲル及びＰＶＤＦ膜を、Ｔｏｗｂｉｎｓ緩衝液（１Ｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％（体積／体積）メタノール（ｐＨ８．３）で１５〜３０分間平衡させ、分離したタンパク質を、低温条件において２時間、Bio-Rad社のＭｉｎｉ  ＰＲＯＴＥＡＮ  IIIウェットブロット装置を１００Ｖで使用して、ＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、GE Healthcare Life science社）に電気的に移動させた。移動させた後、膜を、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）緩衝液ですすぎ、Ｐｏｎｃｅａｕ−Ｓで染色して、均一な移動を確認した。Ｐｏｎｃｅａｕ染色をＴＢＳＴで洗い流した後、膜を、室温で１時間、ＴＢＳＴ緩衝液中５％無脂肪乳に曝露して、抗体の非特異的結合をブロッキングした後、ＴＢＳＴ緩衝液中３％ＢＳＡにおいて一次抗体［１：１０００希釈］とともに、４℃で一晩インキュベートした。過剰な抗体を、ＴＢＳＴ緩衝液で洗い流し、ＴＢＳＴ緩衝液中５％無脂肪乳において、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した対応する二次抗体［１：５０００希釈］とともにインキュベートした。バンドを、化学発光強化キット（Millipore社、Ｓｔ  Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、可視化した。
【００５１】
フローサイトメトリー（Flow cytometry）：細胞周期分析は、周期の異なる段階への細胞集団の分布を区別するのに役立つ。フローサイトメトリーを使用した細胞周期分析を行って、ウットロシドＢによって誘導される細胞周期停止を調査した。細胞周期分析は、ヨウ化プロピジウムによってＤＮＡを染色することによる、細胞における核ＤＮＡ含量の定量的測定によって行う。ヨウ化プロピジウムは、ＤＮＡに結合する色素であり、二本鎖ＤＮＡの主要な溝にインターカレートし、その励起及び放出のピークを、４８８ｎｍ及び６００ｎｍ周辺で観察する。ヨウ化プロピジウムを、透過処理した細胞の懸濁液に添加した場合、その組込みは、ＤＮＡ含量に比例し、細胞周期の段階は、フローサイトメーターを使用して、全蛍光放出を測定することによって決定することができる。簡単に述べると、０．５×１０６個の細胞を、６０ｍｍのプレートに播種し、ウットロシドＢ処置に４８時間供した後、トリプシン処理し、ペレットにした。クルクミン（２５μＭ、２４時間）を、陽性対照として使用した。細胞ペレットを、７０％氷冷エタノール中に固定し、５μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）のＲＮａｓｅ  Ａで処置し、３７℃で３０分間インキュベートし、１０μＬ（１０  ｍｇ／ｍＬ）のヨウ化プロピジウムを添加し、フィルターチューブを通して濾過し、FACS Aria（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences社）を使用して分析した。
【００５２】
電気泳動移動度シフトアッセイのためのオリゴヌクレオチドプローブの放射標識：ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢで２時間処置し、削ぎ落とし、１５０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２μｇ／ｍＬロイペプチン、２μｇ／ｍＬアプロチニン、０．５ｍｇ／ｍｌベンズアミジン）中に３０分間懸濁し、その後で、４．５μｌの１０％ノニデットＰ−４０を添加した。ペレットを、２５μＬの核抽出緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．４Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２μｇ／ｍＬロイペプチン、２μｇ／ｍＬアプロチニン、０．５ｍｇ／ｍＬベンズアミジン）中に懸濁し、２時間後に遠心分離し、収集した核抽出物（８μｇのタンパク質）を使用し、１６ｆｍｏｌの３２Ｐ末端標識した４５量体二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド（ヒト免疫不全ウイルス−１の長い末端リピート、配列番号１（5-TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3）に由来する）及び結合緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１％ノニデットＰ−４０、及び５％グリセロール）中の１μｇ／ｍｌポリ（ｄＩｄＣ）とともに、３７℃で３０分間インキュベートすることによって、ＥＭＳＡを行った。ＤＮＡ−タンパク質複合体を、６．６％の天然のポリアクリルアミドゲルを使用して分解し、放射性バンドを、蛍光体撮像（phosphorimaging）（Bio-Rad社、Personal FX）によって可視化した（Antony, J.; Saikia, M.; Vinod, V.; Nath, L. R.; Katiki, M. R.; Murty, M. S.; Paul, A.;Shabna, A.; Chandran, H.; Joseph, S. M.; Nishanth, K. S.; Panakkal, E. J.; Sriramya, I.;Sridivya, I.; Ran, S.; Sankar, S.; Rajan, E.; Anto, R. J. Sci. Rep. 2015, 5, 11107）。
【００５３】
毒物学的評価：ａ．動物：６〜８週齢の雌性スイスアルビノマウス（１８〜２２ｇ）を、Animal Research Facility of Rajiv Gandhi Centre for Biotechnologyから入手し、Institutional Animal Ethical Committee of Rajiv Gandhi Centre for Biotechnology（ＩＡＥＣ番号：１５１（ａ）／ＲＵＢＹ／２０１２）によって承認されているプロトコールのもとに、研究を行った。ｂ．急性毒性研究：スイスアルビノマウスを、６匹の動物ずつ３つの群にランダムに分け、１週間順化させた。群Ｉは、対照とし、ビヒクルのみを受容させ、一方で群II及びIIIには、ＰＢＳ中に溶解した単回用量のウットロシドＢ（それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇ体重及び５０ｍｇ／ｋｇ体重）を受容させた。マウスを、肉眼的挙動の変化及び死亡がないかに関して、継続的に１時間観察した後、次の６時間及び２４時間は間欠的に観察した。処置の日から翌７日間は動物を頻繁に観察し、その後、動物を、ＣＯ２チャンバにおいて安楽死させた。肝臓機能の生物化学的パラメーターを分析するために、血清を採取した。異常な値は毒性を表す。肝臓を、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、薄いクライオスタット切片（LEICA社、CM 1850UVクライオスタット）を、組織病理学的評価のために、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した（Antony, J.; Saikia, M.; Vinod, V.; Nath, L. R.; Katiki, M. R.; Murty, M. S.; Paul, A.;Shabna, A.; Chandran, H.; Joseph, S. M.; Nishanth, K. S.; Panakkal, E. J.; Sriramya, I.;Sridivya, I.; Ran, S.; Sankar, S.; Rajan, E.; Anto, R. J. Sci. Rep. 2015, 5, 11107）。
【００５４】
スイスアルビノマウスを、６匹の動物ずつ２つの群にランダムに分け、１週間順化させた。群Ｉには、ビヒクルを受容させ、群IIには、１０ｍｇ／ｋｇ体重のウットロシドＢを受容させた。化合物は、１日おきに週３回、３カ月間、腹腔内注射として与えた。この期間の間、動物を頻繁に観察し、その後、動物を、ＣＯ２チャンバにおいて安楽死させた。肝臓機能の生物化学的パラメーターを分析するために、血清を採取した。異常な値は肝臓毒性を表す。肝臓を、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、薄いクライオスタット切片を、組織病理学的評価のために、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した（Zhou, X.; He, X.; Wang, G.; Gao, H.; Zhou, G.; Ye, W.; Yao, X. J. Nat. Prod. 2006, 69,1158-1163）。
【００５５】
インビボＨｅｐＧ２−異種移植片モデル：すべての動物研究は、Institute Animal Ethical Committee  ＩＡＥＣ番号：１５１（ｂ）／ＲＵＢＹ／２０１２によって承認されているプロトコールに従って行った。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）マウスにおける異所的な異種移植片モデルを、ウットロシドＢの抗がん特性を評価するために使用した。この研究に必要な動物は、Animal Research Facility of Rajiv Gandhi Centre for Biotechnologyから入手し、標準的な食餌ペレット及びオートクレーブした水を自由に摂取させた。動物の取り扱い、腫瘍の誘導、薬物処置、及び組織の採取は、滅菌状態において行った。
【００５６】
ヒト肝臓がん（ＨｅｐＧ２）異種移植片モデルにおけるイヌホオズキから単離したウットロシドＢの抗がん活性の評価：異種移植片モデルを、文献に記載されているように、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに樹立した（Sharma, S. C.; Chand, R.; Sati, O. P.; Sharma, A. K. Phytochemistry. 1983, 22, 1241-1244）。６〜８週齢の雄性ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）マウスを、この研究に使用した。マウスの右下又は左下側腹部へのＨｅｐＧ２細胞（１００μＬのマトリゲル中、７×１０６個の細胞）の皮下注射によって、腫瘍を誘導し、２週間の期間増殖させて、ノギスによって測定すると、およそ５０〜１００ｍｍ３のサイズが得られた。次いで、マウスを、９匹の動物ずつ対照及び処置群にランダムに分けた。処置群には、ウットロシドＢ（１０ｍｇ／ｋｇの用量、週３回）を１カ月間、腹腔内注射した。腫瘍体積を、７日間ごとに測定して、腫瘍の増殖及び薬物応答を評価した。動物は、研究の最後に殺処分し、組織病理学的及び免疫組織化学的分析のために腫瘍サンプルを採取した。
【００５７】
組織病理学：組織の凍結切片を、ＰＢＳ（５分間、２回）で洗浄し、蒸留水で５分間洗浄した。次いで、切片を、２分間、ヘマトキシリンで染色した。過剰な染料を洗い流し、スライドを、１〜２秒間、分別溶液（differentiation solution）に浸した。次いで、これらを、水道水中に１０分間及び７０％イソプロピルアルコール中に５分間それぞれ保持し、エオシン溶液で１分間対比染色した。次いで、切片を、１００％イソプロピルアルコールに移し、２分間保持し、キシレン中で１時間清浄し、ＤＰＸを使用して封入した。染色した切片を、光学顕微鏡を使用して観察し、写真を撮影した。肝臓及び腫瘍組織切片の病理学を調べ、Dr. Sankar Sundaram、Professor of Pathology、Medical College、Thiruvananthapuramが検証を行った。
【００５８】
異種移植片組織切片の免疫組織化学：異種移植片腫瘍組織切片中の様々なタンパク質の免疫組織化学的分析を、検出キットSuper Sensitive（商標）ポリマー−ＨＲＰ  ＩＨＣ検出システム（Biogenex社、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して行った。パラホルムアルデヒドで固定したＯＣＴを埋め込んだ組織切片を、１５分間、ＰＢＳ中に保持した。クエン酸緩衝液を使用した熱誘導型抗原賦活法を使用して、抗原賦活化を行った。組織切片上の非特異的抗体結合部位を、キットに提供されているPower Block（商標）試薬を使用して、ブロッキングした。予備希釈した一次抗体を、切片を覆うのに十分に添加し、４℃で１２時間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで洗い流して、未結合の一次抗体を除去した。次いで、切片を、Super Enhancer（商標）試薬で覆い、シグナルを強化するために、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳですすいだ。切片を、次いで、ポリ−ＨＲＰ試薬とともに、室温で３０分間インキュベートした。これらを、次いで、ＰＢＳを使用して洗浄し、その後で、基質溶液（ＤＡＢ色素体）を添加し、５分間インキュベートした。次いで、切片を、ＰＢＳ中で洗浄し、マイヤーのヘマトキシリンを使用して、１分間対比染色し、ＤＰＸを使用して、切片を封入した。Leica社のＤＭ  １０００顕微鏡を、４０倍で使用して、画像を捕捉した。
【００５９】
酸性小胞オルガネラ（acidic Vesicular Organelles（ＡＶＯｓ））のアクリジンオレンジ染色
オートファゴソームの特徴である酸性小胞の存在は、この方法を使用して分析することができる。アクリジンオレンジは、核を緑色に染色し、酸性小胞オルガネラ（ＡＶＯ）を赤色に染色する（Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K et al (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8: 445-544）。ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＶＯの存在を検出するために、５×１０３個の細胞を、９６ウェルプレートに播種し、ウットロシドＢで処置し、２４時間インキュベートした。細胞を、１倍ＰＢＳで２回すすいだ。次いで、処置した細胞を、１μｇ／ｍＬの最終濃度で添加したアクリジンオレンジで染色し、１５分間インキュベートし、蛍光顕微鏡を使用して、即座に写真を撮影した。
【００６０】
プラスミドの単離及びトランスフェクション
二重タグＧＦＰ−ＲＦＰ−ＬＣ３Ｂタンパク質の発現をもたらすｐｔｆ−ＬＣ３Ｂと称される新しいベクターの開発は、オートファジーフラックスの研究に役立っており、この組換えタンパク質により、オートファゴソーム（黄色）とオートファゴリソソーム（赤色）との区別が可能である（Nyfeler B, Bergman P, Wilson CJ, Murphy LO (2012). Quantitative visualization of autophagy induction by mTOR inhibitors. Methods MolBiol 821: 239-250）。ｐＧＦＰ−ｍＲＦＰ−ＬＣ３Ｂ（ｐｔｆ−ＬＣ３）ベクターを、Addgene社（２１０７４）から購入した。簡単に述べると、細菌ペレットに存在するプラスミドを、製造業者の使用説明書（GenElute（商標）プラスミドＭｉｎｉｐｒｅｐキット、Sigma-Aldrich社）に従って単離した。ＨｅｐＧ２細胞に、Lipofectamine LTX and Plus Reagent Kit（Invitrogen社、ＵＳＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ＧＦＰ−ＲＦＰタグＬＣ３（ｐｔｆＬＣ３）のタンデムリピートを一過的にトランスフェクトした。簡単に述べると、ＰｔｆＬＣ３ベクターＯｐｔｉ−ＭＥＭトランスフェクション培地（溶液Ａ）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭトランスフェクション培地中に溶解したLipofectamine試薬（溶液Ｂ）と混合し、室温で４５分間インキュベートした。トランスフェクション混合物を、次いで、６ウェルの組織培養プレートにおいて、５０〜８０％の密度で、細胞の上に入れ、６時間インキュベートした。トランスフェクション混合物を有する培地を、２４時間後に吸引した。
【００６１】
免疫蛍光
細胞内タンパク質の免疫細胞化学的局在化のために、細胞を、カバーガラス上で増殖させ、ウットロシドＢに２４時間曝露した。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、室温で１５分間、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで１時間、ブロッキングした。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中に希釈した抗体（抗ＬＣ３）（１：１００）を添加して、細胞を覆い、４℃で一晩インキュベートした。未結合の抗体を、ＰＢＳで洗い流し、細胞を、２μｇ／ｍｌのフルオレセインコンジュゲート又はローダミンコンジュゲートした二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした。次いで、未結合の二次抗体を洗い流し、細胞の核を、０．５μｇ／ｍｌの４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で１０分間染色した。細胞を有するカバーガラスを、グリセロールで封入し、蛍光顕微鏡を使用して試験し、写真を撮影した。
【００６２】
ベクリンｓｉＲＮＡトランスフェクション
Lipofectamine LTX Plus試薬キットを製造業者のプロトコール（Invitrogen社、ＵＳＡ）に従って使用して、ＨｅｐＧ２に、ベクリンｓｉＲＮＡ及び対照ｓｉＲＮＡを一過的にトランスフェクトした。１ウェル当たり０．３５×１０６個の細胞を、ＦＢＳを補充した２ｍｌの抗生物質不含正常増殖培地を含む６ウェルの組織培養プレートに播種し、細胞をインキュベートして、６０％のコンフルエンシーにした。ベクリンｓｉＲＮＡ二本鎖溶液（溶液Ａ）を、希トランスフェクション試薬（LP LTX plus試薬）（溶液Ｂ）に直接添加した。溶液を、ピペットに取って上下させることによって緩やかに混合し、室温で４５分間インキュベートした。細胞を、２ｍｌのトランスフェクション培地（ｏｐｔｉＭＥＭ培地）で緩やかに洗浄した。それぞれのトランスフェクションについて、０．８ｍｌのトランスフェクション培地を、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬混合物（溶液Ａ＋溶液Ｂ）を含有するそれぞれのチューブに添加した。これを、緩やかに混合し、混合物を、洗浄した細胞の上に入れた。細胞を、ＣＯ２インキュベーターにおいて、３７℃で５〜７時間インキュベートした。トランスフェクション培地を除去した後に、１ｍｌの正常増殖培地を添加し、細胞を、さらに１８〜２４時間インキュベートした。ベクリン発現のサイレンシングを、抗ベクリン−１を用いたウエスタンブロッティングによって確認し、トランスフェクション効率を、薬物処置の５０〜６０時間前で標準化した。
【００６３】
図１７は、ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導される形質学的変化及び液胞の形成を示す代表的な画像である。ＨｅｐＧ２細胞を、示されるようにウットロシドＢで処置し、２４時間インキュベートし、ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢでの処置後の形質学的変化に関して、位相差顕微鏡法によって研究した。ウットロシドＢはまた、オートファジーの特徴的な特性である液胞の形成も誘導する。
【００６４】
図１８は、アクリジンオレンジ染色により、ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞において酸性液胞の形成を誘導することを示す、代表的な画像である。ＨｅｐＧ２細胞におけるウットロシドＢによるオートファジーの誘導をさらに確認するために、細胞を、２４時間の期間、細胞毒性濃度のウットロシドＢに曝露し、アクリジンオレンジ色素で染色した。ＡＯオレンジは、核を緑色に染色し、主としてオートファゴソームである酸性小胞オルガネラを明るい赤色に染色する。これは、酸性コンパートメントに入り、プロトン化される。プロトン化された色素が積み重なり、積み重なったアクリジンオレンジは、赤色範囲で放出する。増加したオートファゴソームの予備的指標であるＡＯ陽性を、ウットロシドＢで処置したＨｅｐＧ２細胞において明確に見ることができた。
【００６５】
ウットロシドＢは、肝臓がんにおける極めて重要な生存性シグナルであるｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する。図１９は、ウットロシドＢによって誘導されるｍＴＯＲの下流標的であるホスホ−４Ｅ−ＢＰ１及びホスホ−ｐ７０Ｓ６キナーゼのリン酸化の動態を示す、ウエスタンブロットの図を示す。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる時間間隔で、ウットロシドＢで処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ホスホ−４ＥＢＰ１及びホスホ−ｐ７０Ｓ６キナーゼ抗体に対して免疫ブロッティングを行った。同時に、２つのｍ−ＴＯＲ基質であり、そのリン酸化をｍ−ＴＯＲ活性を表すものと考えることができる、ｐ７０Ｓ６キナーゼ及び４Ｅ−ＢＰ−１のリン酸化が、ウットロシドＢ処置に応答して低減されたことが見出された。ウットロシドＢは、肝臓がんにおける極めて重要な生存性シグナルであるｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する。ｍＴＯＲは、ＨＣＣの細胞増殖及び代謝において中枢的な役割を果たし、ＨＣＣの４０〜５０％において、上方調節されている。さらに、上方調節は、２番目に最も多い肝臓の原発性がんである胆管細胞癌において頻繁に観察される（Wang, C.; Cigliano, A.; Delogu, S.; Armbruster, J.; Dombrowski, F.; Evert, M.; Chen, X.; Diego F. Cell. Cycle. 2013, 12, 1999-2010）。ウットロシドＢでの処置はまた、２４４８及び２４８１リン酸化部位におけるｍ−ＴＯＲのリン酸化を阻害することも示されている［図４Ｅを参照されたい］。
【００６６】
図２０は、ウットロシドＢが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｐＧ２異種移植片腫瘍において、ホスホ−４ＥＢＰ１及びホスホ−ｐ７０Ｓ６キナーゼの発現を有意に下方調節することを示す、代表的なＨ＆Ｅ画像を示す。対照及びウットロシドＢで処置した腫瘍組織の免疫組織化学的染色を行った。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス異種移植片研究から得られた組織もまた、ｐ７０Ｓ６Ｋ及び４Ｅ−ＢＰ−１のリン酸化状態に関して調べた。インビトロでの研究において観察されているように、これらの両方の分子のリン酸化状態の有意な下方調節が、これらの組織においても観察された。
【００６７】
ウットロシドＢは、ＨｅｐＧ２細胞においてオートファジーを誘導する。図２１は、ＨｅｐＧ２細胞において、ＬＣ３  ＩからＬＣ３  II（微小管関連タンパク質１、軽鎖３）への内因性変換に対するウットロシドＢの時間依存性効果を示す。細胞を、異なる時間間隔で、ウットロシドＢで処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＬＣ３抗体に対して免疫ブロッティングを行った。ｍＴＯＲシグナル伝達軸を遮断することによってその活性を媒介する化合物は、おそらくはオートファジーを誘導することができるが、これは、ｍＴＯＲ活性を通じてオートファジーを抑制するシグナル伝達経路が存在するためである。いずれにせよ、これは、抗腫瘍剤によって誘導される細胞死に有意に影響を及ぼすことができ、ウットロシドＢでの処置に応答したオートファジープロセスの状態を調査し、細胞死の動態を調節することにおけるその役割を分析することが、必須である。オートファゴソームのマーカーである微小管関連タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）−ＩからＬＣ３−IIへの変換であるＬＣ３発現は、オートファジーの古典的なマーカーである（Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K et al (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8: 445-544、Mizushima N, Yoshimori T (2007). How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy 3: 542-545、Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T, Ohsumi Y (2004). In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. MolBiol Cell 15: 1101-1111）。オートファジーは、オートファゴソーム膜タンパク質ＬＣ３  IIを、オートファゴソームにロードされている細胞カーゴとともに分解することができる、動的プロセスである。したがって、オートファジーは、ＬＣ３  IIの代謝回転率を測定することによって、所与の時点におけるその発現レベルを表すよりも正確に表される。
【００６８】
図２２は、ＬＣ３の有意な下方調節を示す、ウットロシドＢで処置したＨｅｐＧ２異種移植片を有するＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腫瘍切片のＨ＆Ｅ染色を示す。ＬＣ３抗体を使用して、対照及びウットロシドＢで処置した腫瘍組織の免疫組織化学的染色を行った。ウットロシドＢが、肝臓腫瘍においても同じ効果を有することができるかどうかを調べるために、ＩＨＣ分析を、対照及びウットロシドＢで処置した腫瘍切片の両方において行った。ＬＣ３の組織レベルでの発現状態もまた、ウットロシドＢ処置マウスにおいては非常に高かった。図２３は、ＨｅｐＧ２細胞における様々なオートファジー関連タンパク質ベクリン−１、Ａｔｇ  ７、Ａｔｇ  ５に対する時間依存性効果を示す。細胞を、異なる時間間隔で、ウットロシドＢで処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＬＣ３、ベクリン−１、Ａｔｇ  ７、及びＡｔｇ  ５抗体に対して免疫ブロッティングを行った。ＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂにおける様々なオートファジー関連タンパク質の発現状態を研究するために、細胞を、時間依存性様式で、ウットロシドＢで処置し、ベクリン−１、Ａｔｇ  ５、Ａｔｇ  ３、Ａｔｇ  １２に対して免疫ブロッティングを行った。結果は、ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２において、時間依存性様式で、すべてのオートファジー関連タンパク質の上方調節を誘導することを示す。図２４は、別の肝臓がん細胞であるＨｅｐ３Ｂ細胞における様々なオートファジー関連タンパク質ベクリン−１、Ａｔｇ  ７、Ａｔｇ  ５、Ａｔｇ  ３、Ａｔｇ  １２に対するウットロシドＢの時間依存性効果を示す。細胞を、異なる時間間隔で、ウットロシドＢで処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ベクリン−１、Ａｔｇ  ７、Ａｔｇ  ５、Ａｔｇ  ３、及びＡｔｇ  １２抗体に対して免疫ブロッティングを行った。Ｈｅｐ３Ｂ細胞においても、同様に、ウットロシドＢは、時間依存性様式で、Ａｔｇ５、Ａｔｇ７、及びＬＣ３を誘導した。図２５は、ウットロシドＢが、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｐＧ２異種移植片において、ベクリン−１の発現を有意に上方調節することを示す。ベクリン−１抗体を使用して、対照及びウットロシドＢで処置した腫瘍組織の免疫組織化学的染色を行った。ベクリンは、複合体で存在する重要なタンパク質であり、オートファゴソームの生体発生を補助する（Meijer AJ, Codogno P (2004). Regulation and role of autophagy in mammalian cells. Int J Biochem Cell Biol 36: 2445-2462）。ヒト肝臓がん異種移植片の腫瘍切片におけるベクリン−１の発現状態を評価するために、免疫組織化学的分析を行った。ベクリン−１の組織レベルでの発現状態もまた、ウットロシドＢで処置したマウスにおいて非常に高く、肝臓がん細胞においてオートファジーを誘導することにおけるその有効性が示された。
【００６９】
図２６は、オートファゴソーム−リソソーム遮断を飽和するためのバフィロマイシンＡ１の濃度の標準化を示す。ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＣ３  ＩからＬＣ３  IIへの内因性変換に対するバフィロマイシンＡ１の濃度依存性効果。細胞を、異なる濃度のバフィロマイシンＡ１で処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＬＣ３抗体に対して免疫ブロッティングを行った。ウットロシドＢは、バフィロマイシンＡ１を使用して、オートファジーフラックスによって分析した場合、ＨｅｐＧ２細胞におけるオートファジー誘導剤である。オートファゴソーム誘導を証明するものの１つである、ＬＣ３の脂質付加されたオートファゴソーム関連形態（ＬＣ３II）の増加が、ウットロシドＢで処置したＨｅｐＧ２及びＨｅｐ３Ｂの両方の細胞株において観察されたことは、以前、すでに考察されている。ＬＣ３  IIの増加は、オートファゴソーム成熟からそのリソソームとの融合をもたらす任意のステップの遮断により、その蓄積が生じ得るため、オートファジー誘導の疑う余地のない証拠とは考えることはできない。そのため、ＨｅｐＧ２細胞におけるウットロシドＢの効果を、オートファジー−リソソーム阻害剤であるバフィロマイシンと共処置した場合のオートファジーをより正確に表すものである、オートファジーフラックスに関して分析した。バフィロマイシンＡは、オートファゴソームとリソソームとの融合を遮断することによって、オートファジーを遮断し、これにより、オートファゴソーム又はＬＣ３の蓄積が生じる。まず、オートファジー−リソソーム融合の遮断を飽和するために必要なバフィロマイシンＡ１の濃度を、標準化した。ＨｅｐＧ２におけるオートファゴソームの分解を遮断することに関して、バフィロマイシンＡ１の有効性は、１０ｎＭでピークに達することが見出され、これを上回った場合に、ＬＣ３  IIのさらなる蓄積は認められなかったが、これは、これまでの報告と一致していた（Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K et al (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8: 445-544、Mizushima N, Yoshimori T, Levine B (2010). Methods in mammalian autophagy research. Cell 140: 313-326、Yu R, Zhang ZQ, Wang B, Jiang HX, Cheng L, Shen LM (2014). Berberine-induced apoptotic and autophagic death of HepG2 cells requires AMPK activation. Cancer Cell Int 14: 49）。
【００７０】
図２７は、ウットロシドＢが、ＨｅｐＧ２細胞におけるオートファジー誘導剤であることを示す。細胞を、ＬＣ３  ＩからＬＣ３  IIへの内因性変換に関して、ウットロシドＢ（５００ｎＭ）及び／又はバフィロマイシンＡ１（１０ｎＭ）で２４時間処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＬＣ３抗体に対して免疫ブロッティングを行った。この濃度のバフィロマイシンは、ウットロシドＢと共処置した場合に、バフィロマイシン又はウットロシドＢのいずれか単独で処置した細胞と比較して、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＣ３IIの余剰な蓄積を生じた。ウットロシドＢが、オートファジー遮断剤であるならば、オートファジーはすでに遮断されているため、ＬＣ３IIの発現のさらなる強化は全く存在しないはずである。バフィロマイシンＡ１の存在下においてウットロシドＢによって誘導されるこのＬＣ３IIの余剰蓄積は、ウットロシドＢ処置に起因するオートファジーフラックスの強化を実証し、これは、ウットロシドＢがオートファジー誘導剤であることを強力に裏付ける。
【００７１】
タンデムＧＦＰ−ＲＦＰ  ＬＣ３レポータータンパク質を使用したオートファジーフラックスの定量的分析。図２８は、ＰｔｆＬＣ３レポータータンパク質を使用したオートファジーフラックスアッセイを示す。ＨｅｐＧ２細胞に、ＧＦＰ−ＲＦＰ−ＬＣ３をコードするＰｔｆＬＣ３レポータープラスミドを一過的にトランスフェクトし、完全培地において２４時間培養し、ウットロシドＢ（５００ｎＭ）で２４時間処置した。ＧＦＰ−ＲＦＰ−ＬＣ３の斑点を示す細胞の代表的な画像を、共焦点顕微鏡下において撮影した。スケールバー、２０μｍ。図２９は、ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるオートファジーの定量的分析を示す棒グラフである。ＨｅｐＧ２細胞に、前述のように、ＧＦＰ−ＲＦＰ−ＬＣ３をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトし、観察された斑点を計数し、ヒストグラムとしてプロットした。次に、タンデムＧＦＰ−ＲＦＰ  ＬＣ３レポータータンパク質を使用して、ウットロシドＢによって誘導されるオートファジーフラックスを検証し、定量化することを試みた。ＧＦＰ及びＲＦＰは、細胞のｐＨ条件に応じて蛍光を発する。オートファゴソームのｐＨが、５よりも高い場合、ＧＦＰ及びＲＦＰの両方が蛍光を発し、オートファゴソームは、緑色と赤色が合わさることにより、黄色として蛍光を発する。ｐＨが、５よりも低い、すなわち、オートファゴソームとリソソームとの融合に起因して酸性である場合、ＧＦＰは、クエンチされ、ＲＦＰのみが蛍光を発し、細胞は、赤色の斑点として現れることになる（Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K et al (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8: 445-544、Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, Yoshimori T, Ohsumi Y (2004). In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. MolBiol Cell 15: 1101-1111、Tanida I, Tanida-Miyake E, Ueno T, Kominami E (2001). The human homolog of Saccharomyces cerevisiae Apg7p is a Protein-activating enzyme for multiple substrates including human Apg12p, GATE-16, GABARAP, and MAP-LC3. J Biol Chem 276: 1701-1706）。ＨｅｐＧ２細胞に、ＬＣ３に融合したＧＰＦ−ＲＦＰのタンデムリピートを含むレポータープラスミドｐｔｆＬＣ３をトランスフェクトした。プラスミドは、細胞においてオートファゴソームに組み込まれ、これが、斑点として蛍光を発する。トランスフェクトした細胞を、ウットロシドＢで処置した場合、黄色の斑点及び赤色の斑点の量の増加があったため、オートファゴソームの形成及びそのオートファゴリソソームへの変換、すなわち、オートファジーフラックスが生じたことが示された。換言すると、ウットロシドＢで処置した細胞は、ＧＦＰ−ＲＦＰ＋（オートファゴリソソーム）とともに、ＧＦＰ＋ＲＦＰ＋（オートファゴソーム）の増加を示し、これは、オートファゴソームの強化及びそのオートファゴリソソームへの進化、並びにオートファジーの増加を表し、これを、斑点の計数によって定量化して、グラフでプロットした。これらのすべての証拠により、ウットロシドＢが、効率的なオートファジー誘導剤であることが示される。
【００７２】
オートファジーの阻害は、ＨｅｐＧ２において、ウットロシドＢによって誘導される細胞毒性及びアポトーシスを強化する。オートファジー及びアポトーシスは、同じ細胞において、多くの場合、オートファジーがアポトーシスに先行する順序で生じることが多い。これは、ストレスにより、特に、ストレスのレベルが致命的でない場合に、オートファジー応答が刺激されることが多いためである（Marino G, Niso-Santano M, Baehrecke EH, Kroemer G (2014). Self-consumption: the interplay of autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol 15: 81-94）。前臨床モデルにおいて、遺伝子的又は薬理学的手段による生存促進性オートファジーの阻害は、腫瘍細胞を殺滅させ、アポトーシスによる細胞死をトリガーすることが示されている（White E, DiPaola RS (2009). The double-edged sword of autophagy modulation in cancer. Clin Cancer Res 15: 5308-5316、Yang ZJ, Chee CE, Huang S, Sinicrope F (2011). Autophagy modulation for cancer therapy. Cancer BiolTher 11: 169-176）。ＨｅｐＧ２のアポトーシスプログラムを調節することにおける、ウットロシドＢによって誘導されるオートファジーの役割を、２つのオートファジーの薬理学的阻害剤、すなわち、３−ＭＡ及びバフィロマイシンＡ１を使用して分析した（Klionsky DJ, Abdalla FC, Abeliovich H, Abraham RT, Acevedo-Arozena A, Adeli K et al (2012). Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy 8: 445-544）。この態様を評価するために、ＨｅｐＧ２細胞を、阻害剤あり又はなしでウットロシドＢに曝露し、細胞毒性の強化を、ＭＴＴアッセイによって評価し、アポトーシスの程度を、ＰＡＲＰ及びカスパーゼ９の切断をモニタリングすることによって分析した。３−ＭＡは、クラス３のＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤であり、オートファジーの初期を遮断し、バフィロマイシンＡ１は、オートファジーの後期阻害剤であり、オートファゴソームとリソソームとの融合を遮断する。図３０では、３−ＭＡによるオートファジーの阻害が、ウットロシドＢによって誘導される細胞毒性を有意に強化し、ＨｅｐＧ２細胞を、示されるように、３ＭＡ（１ｍＭ）あり又はなしでウットロシドＢで処置し、７２時間インキュベートし、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイによって評価した。図３１（ＨｅｐＧ２細胞におけるウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断は、オートファジー阻害剤である３−ＭＡによって強化された。ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢ及び／又は３−ＭＡで１２時間処置し、全細胞ライセートを、１０％ゲルで分解し、ＰＡＲＰ抗体に対して免疫ブロッティングを行い、ＥＣＬによって検出した）並びに図３４（ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断は、オートファジー阻害剤であるバフィロマイシンＡ１によって強化される。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる期間、ウットロシドＢ及び／又はバフィロマイシン−Ａ１で処置し、全細胞ライセートを、１０％ゲルで分解し、ＰＡＲＰ抗体に対して免疫ブロッティングを行い、ＥＣＬで検出した）では、３−ＭＡ及びバフィロマイシン−Ａ１の両方の阻害剤での予備処置により、ウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断が強化され、図３２（ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰの切断の活性化は、オートファジー阻害剤である３−ＭＡによって���化される。ＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢ及び／又は３−ＭＡで１２時間処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＰＡＲＰ抗体に対して免疫ブロッティングを行い、ＥＣＬによって検出した）並びに図３３（ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるカスパーゼ９活性化は、オートファジー阻害剤であるバフィロマイシンＡ１によって強化される。ＨｅｐＧ２細胞を、異なる期間、ウットロシドＢ及び／又はバフィロマイシンＡ１で処置し、全細胞ライセートを、１５％ゲルで分解し、ＰＡＲＰ抗体に対して免疫ブロッティングを行い、ＥＣＬによって検出した）では、カスパーゼ９。結果は、３−ＭＡ及びバフィロマイシン−Ａ１によるオートファジーの阻害により、ＨｅｐＧ２細胞において、ウットロシドＢが誘導する細胞毒性及びアポトーシスの能力が、強化されることを明確に示す。この観察を、ベクリン−１のサイレンシングによるオートファジーの遺伝子的阻害によって確認した。多くの場合において、オートファジーの役割は、オートファジー関連タンパク質であるＡｔｇ６／ベクリン１の研究を通じて特定される。このタンパク質は、脂質キナーゼ複合体の一部であり、近年の研究では、これが、オートファジーの細胞保護的機能及び対照的なアポトーシスの細胞死プロセスを調整することにおいて中枢的な役割を果たすことが示唆されている（Yang ZJ, Chee CE, Huang S, Sinicrope F (2011). Autophagy modulation for cancer therapy. Cancer BiolTher 11: 169-176）。図３５Ａ（ＨｅｐＧ２細胞においてウットロシドＢによって誘導されるＰＡＲＰ切断は、ベクリン−１の遺伝子サイレンシングによって強化される。（ａ）ＨｅｐＧ２細胞に、ベクリンｓｉＲＮＡを一過的にトランスフェクトし、オートファジー阻害を、免疫ブロッティングによって確認した）では、ベクリン−１を阻害した細胞におけるオートファジーの阻害が、ＬＣ３免疫ブロッティングアッセイによって確認された。図３５Ｂ（ベクリン−１サイレンシングＨｅｐＧ２細胞を、ウットロシドＢあり又はなしで２４時間処置し、全細胞ライセートを、１０％ゲルで分解し、ＰＡＲＰ抗体に対して免疫ブロッティングを行った）では、ベクリン−１の発現をｓｉＲＮＡを使用して阻害した場合に、切断型ＰＡＲＰの発現の増加によって明らかなように、ウットロシドＢによって誘導されるアポトーシスに、強い強化が観察された。この実験により、ウットロシドＢの抗がん有効性が、オートファジーの阻害剤をウットロシドＢとともに使用した場合に、さらに強化されることが確認される。
【００７３】
アポトーシスの他に、ウットロシドＢはまた、オートファジーの特徴である液胞化した構造も誘導し、肝臓がん細胞Ｈｅｐｇ２及びＨｅｐ３Ｂにおいて、ＬＣ３  II、ベクリン１、Ａｔｇ７、Ａｔｇ５、Ａｔｇ１２、及びＡｔｇ３などのオートファジーマーカーの活性化を誘導する。ウットロシドＢで処置したＨｅｐＧ２細胞におけるオートファジーフラックスの増加を、バフィロマイシンＡ１を使用して確認し、ＲＦＰ−ＧＦＰ−ＬＣ３タグタンパク質アッセイによって定量化したが、これにより、ウットロシドが、オートファジー誘導剤であることが示される。ウットロシドは、ｍＴＯＲ並びにその下流標的ｐ−７０Ｓ６キナーゼ及び４Ｅ−ＢＰ−１を下方調節する。オートファジーの薬理学的遮断（バフィロマイシンＡ１を使用して）及び遺伝子的遮断（ベクリン−１  ｓｉ−ＲＮＡを使用して）により、ウットロシドＢによって誘導されるアポトーシスが強化され、これにより、オートファジーが、ウットロシドＢによって媒介されるアポトーシスの負の調節因子であることが示される。
【００７４】
肝臓がん細胞は、ウットロシドＢによって媒介される細胞毒性に対して最大の感受性を呈したが、正常不死化肝臓細胞には影響がなかった。ウットロシドＢは、肝臓機能試験及び組織病理学的分析によって評価された通り、薬理学的に安全である。
【００７５】
本明細書において考察されるいずれの実施形態も、本発明の任意の方法、キット、試薬、又は組成物に対して実装することができ、その逆もまた同様であることが、企図される。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００７６】
本明細書に記載される特定の実施形態は、例示のために示されるものであり、本発明を限定するものではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、日常的な研究を使用するだけで、本明細書に記載されている特定の手順の多数の均等物を認識するか、又は解明することが可能であろう。そのような均等物は、本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲に含まれる。
【００７７】
本明細書において言及されているすべての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能のレベルを示すものである。すべての刊行物及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７８】
特許請求の範囲及び／又は本明細書において、「含む（comprising）」という用語とともに使用される場合、「１つの（a）」又は「１つの（an）」という言葉の使用は、「１つ」を意味するが、「１又は２以上」、「少なくとも１つ」、及び「１又は１を上回る」という意味とも一致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されるか又は代替物が互いに排他的である場合を除き、「及び／又は」を意味するが、本開示は、代替物のみ並びに「及び／又は」に言及する定義を支持する。本明細書全体を通じて、デバイス、値を判定するために用いられる方法の誤差の本質的なばらつき、又は研究対象間に存在するばらつきを含むことを示すために、「約」という用語が使用される。
【００７９】
本明細書及び特許請求の範囲において使用されるとき、「含む（comprising）」（並びに「含む（comprise）」及び「「含む（comprises）」など、含む（comprising）の任意の形態）、「有する（having）」（並びに「有する（have）」及び「有する（has）」など、有する（having）の任意の形態）、「含む（including）」（並びに含む（includes）」及び「含む（include）」など、含む（including）の任意の形態）、又は「含有する（containing）」（並びに「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」など、含有する（containing）の任意の形態）は、非限定的であり、追加の言及されていない要素又は方法ステップを除外するものではない。
【００８０】
「又はそれらの組合せ」という用語は、本明細書において使用されるとき、その用語に先行する列挙されている項目のすべての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、並びに特定の文脈において順序が重要となる場合にはＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢのうちの少なくとも１つを含むことが意図される。この例に続いて、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢ、などといった１つ又は２つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組合せが、明示的に含まれる。当業者であれば、典型的には、文脈により明らかな場合を除き、任意の組合せに含まれる項目又は用語の数には制限がないことを理解するであろう。
【００８１】
本明細書に開示され、特許請求されるすべての組成物及び／又は方法は、本開示を踏まえれば、不必要な研究を行うことなく作製及び実施することができる。本発明の組成物及び方法を、好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨、及び範囲を逸脱することなく、本明細書に記載される組成物及び／又は方法、並びに方法のステップ若しくはステップの順序に、変化形が適用され得ることが、当業者には明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような類似の代替形及び修正形は、添付の特許請求の範囲によって定められる本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内であると考えられる。
【００８２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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