(57)【要約】  本発明は、急性重症大腸炎の処置応答を予測するための方法に関する。現在、薬剤応答のバイオマーカーは存在しない。本発明は、急性重症潰瘍性大腸炎における第一選択及び第二選択の処置に対する応答ための最初の予測ツールを提供する。調節不全マイクロＲＮＡの推定のｍＲＮＡターゲットを患者の生検から特定した。入院時の５個の生体値に加えて、１５個の大腸マイクロＲＮＡの１つの分類子が、ステロイドに対するレスポンダーと非レスポンダーとの区別について、９６．６％の予測精度で特定された。類似する方法を使用して、インフリキシマブ及びシクロスポリンに対するレスポンダーと非レスポンダーとを分類するのに、６及び４個の粘膜マイクロＲＮＡ系アルゴリズムが特定された。特に、本発明は、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することにより、急性重症大腸炎の処置応答を予測するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイドに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、
ｉ）コルチコステロイド投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダー又は非レスポンダーとなることを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項２】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイドに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、
ｉ）コルチコステロイド投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項３】
コルチコステロイドが、メチルプレドニゾロンである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象が抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、
ｉ）抗ＴＮＦα剤投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項５】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象が抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、
ｉ）抗ＴＮＦα剤投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項６】
抗ＴＮＦα剤が、インフリキシマブである、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、
ｉ）シクロスポリン投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｍｉＲ−９３８、ｍｉＲ−５１８ｂ及びｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項８】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、
ｉ）シクロスポリン投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、
方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の方法を行うことにより、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法。
【請求項１０】
ディープラーニング分類、線形判別分析（ＬＤＡ）、トポロジーデータ分析（ＴＤＡ）、ニューラルネットワーク及びランダムフォレストアルゴリズム（ＲＦ）から選択される分類アルゴリズムを使用して、対象応答を判定する工程を含む、請求項１、２、４、５、７、８又は９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
白血球、赤血球、好塩基球及びリンパ球カウント、ヘマトクリット、ヘモグロビン、グルコース、フェリチン、アルブミン、鉄、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）及びトランスフェリンからなる群より選択される少なくとも１つの生体値を測定することを含む、請求項１、２、４、５、７、８又は９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象においてコルチコステロイドにより急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、
ａ）対象がコルチコステロイドに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを請求項１又は２記載の方法を行うことにより判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてレスポンダーであると考えられた場合には、コルチコステロイドを投与する工程とを含む、
方法。
【請求項１３】
コルチコステロイドが、メチルプレドニゾロンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象において抗ＴＮＦα剤により急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、
ａ）対象が抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを請求項４又は５記載の方法を行うことにより判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてレスポンダーであると考えられた場合には、抗ＴＮＦα剤を投与する工程とを含む、
方法。
【請求項１５】
抗ＴＮＦα剤が、インフリキシマブである、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象においてシクロスポリンにより急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、
ａ）対象がシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを請求項７又は８記載の方法を行うことにより判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてレスポンダーであると考えられた場合には、シクロスポリンを投与する工程とを含む、
方法。
【請求項１７】
急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象においてコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤、シクロスポリン又は結腸切除術により急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、
ａ）対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを請求項９記載の方法を行うことにより判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対するレスポンダーであると考えられた場合には、コルチコステロイドを投与する工程、ｃ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対する非レスポンダーであり、抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーであると考えられた場合には、抗ＴＮＦα剤を投与する工程、ｄ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対する非レスポンダーであり、シクロスポリンに対するレスポンダーであると考えられた場合には、シクロスポリンを投与する工程、又は、ｅ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対する非レスポンダーであると考えられた場合には、結腸切除術により前記対象を処置する工程とを含む、
方法。
【請求項１８】
前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対する非レスポンダーであり、抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーであり、シクロスポリンに対するレスポンダーであると考えられた場合には、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンを投与する工程を含む、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性重症大腸炎の処置応答を予測するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、結腸直腸粘膜に影響を及ぼす生涯性、特発性の慢性炎症障害である［１］。約１５〜２５％ ＵＣ患者は、少なくとも１回の急性重症ＵＣ（ＡＳＵＣ）のエピソードを有する。このようなエピソードは、患者を敗血症、中毒性巨大結腸、結腸穿孔、消化器出血及び血栓塞栓性アクシデントを含む深刻な合併症に曝すため［２、３］、生命を脅かす症状であり、外科手術を必要とする。緊急の結腸切除術を必要としない患者において、静脈内（ＩＶ）コルチコステロイドが、処置の第一選択として推奨されている［４］。しかしながら、４０％の患者は、ＩＶステロイドに応答しないであろうし［５、６］、救済的結腸切除術又は、良好な効率及び安全性を有する［９］シクロスポリン（ＣｓＡ）［７］もしくはインフリキシマブ（ＩＦＸ）［８］による第二選択処置を必要とするであろう。これら２つの薬剤のいずれかに対して難治性の患者には、外科手術の遅延が死亡率の向上（２〜３％になると推定される［１０］）に関連するために、第三選択の医薬療法に代えて、緊急の結腸切除術が推奨される。このため、ＡＳＵＣの処置は、各医学処置に対する応答の早期評価を必要とする。しかしながら、現在、処置に関する医師の決定は、患者の評価と、わずかな臨床又は生体パラメータ、例えば、精度が低いOxford評価基準又はHo指標［１１］に基づいている。次に、薬効の関連及び早期予測子は未だに発見されていない。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＲＮＡＩＩＩにより最も一般的に転写され、タンパク質、例えば、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒにより処理される短い（２１〜２５個のヌクレオチド）、非コードＲＮＡ分子である［１２］。ｍｉＲＮＡは、最近、免疫発達及び応答の重要なメディエータとして出現してきた。これは、種々の疾患における診断、予後の判定及び／又は処置応答の予測のためのバイオマーカーとしてのその可能性のある有効性を示唆している［１３、１４］。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、ＵＣにおいて、複数の研究から、活動性及び非活動性患者の両方における粘膜又は血中ｍｉＲＮＡサインが特定された［１５］が、薬剤応答を予測するためのサインは特定されなかった。
【０００３】
発明の概要
本発明は、急性重症大腸炎の処置応答を予測するための方法に関する。特に、本発明は、特許請求の範囲により定義される。
【０００４】
発明の詳細な説明
急性重症潰瘍性大腸炎（ＡＳＵＣ）は、ステロイド抵抗性の症例において、静脈内ステロイドとインフリキシマブ又はシクロスポリンとにより管理される重篤な症状である。医学処置が失敗した場合、救済的結腸切除術は遅いであろう。同遅延は、死亡率の上昇につながる。現在、薬剤応答のバイオマーカーは存在しない。本目的は、ＡＳＵＣにおける第一選択及び第二選択処置に対する応答の予測子を特定することであった。ステロイド、シクロスポリン及びインフリキシマブに対するその応答について十分特徴付けられた、２つの三次フランスユニット（tertiary French units）からのＡＳＵＣを有する４７名の患者を遡及的に含ませた。臨床及び生体パラメータを入院時にレビューした。処置前又は同処置の最初の３日以内に取得した固定大腸生検を、マイクロアレイによるマイクロＲＮＡ発現プロファイルに使用した。ランダムフォレスト系分類アルゴリズムを使用して、各処置に対するレスポンダーと非レスポンダーとを区別するための候補バイオマーカーを導き出し、一個抜き交差検証により較正した。機能不全マイクロＲＮＡの推定のｍＲＮＡターゲットを特定した。入院時の５個の生物学的数値（ヘモグロビン、ヘマトクリット、アルブミン、ＣＲＰ及びトランスフェリンの発現レベル）に加えて、１５個の大腸マイクロＲＮＡの１つの分類子を、ステロイドに対するレスポンダーと非レスポンダーとの区別について、９６．６％の予測精度（ＡＵＣ＝０．９６）で特定した。類似する方法を使用して、インフリキシマブ（９０％−ＡＵＣ＝０．８６）及びシクロスポリン（８３％−ＡＵＣ＝０．８１）それぞれに対するレスポンダーと非レスポンダーとを分類するのに、６及び４個の粘膜マイクロＲＮＡ系アルゴリズムを特定した。マイクロＲＮＡ関連ｍＲＮＡターゲット分析により、ＡＳＵＣにおける薬剤応答プロファイルに関連する可能性のある粘膜変化が強調された。この研究において、ＡＳＵＣを有する患者における処置の第一選択及び第二選択に対する応答の新たな予測子を特定された。このため、本発明は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象の薬剤応答を予測するための方法を提供する。特に、本発明は、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対する応答を予測するための方法を提供する。
【０００５】
本明細書で使用する場合、「急性重症大腸炎」又は「ＡＳＣ」という用語は、急性重症大腸炎、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の可能性のある致死性合併症、大腸粘膜に影響を及ぼす特発性、慢性炎症性障害（例えば、世界保健機関分類で改定されたＫ５１−Ｋ５２）を指す。「急性重症大腸炎」という用語は、急性重症潰瘍性大腸炎も指す。急性重症大腸炎の活性を、当技術分野において認識された基準に従って測定することができる。急性重症大腸炎の活性を臨床試験及び身体検査、Ｌｉｃｈｔｉｇｅｒスコア及び組織学的類別により測定することができる。
【０００６】
本明細書で使用する場合、「ＡＳＣ処置」という用語は、コルチコステロイドの第一選択投与並びに抗ＴＮＦα剤（インフリキシマブ）及び／又は免疫抑制剤（シクロスポリン）により第二選択投与を含む、急性重症大腸炎の典型的な医療計画を指す。
【０００７】
本明細書で使用する場合、「コルチコステロイド」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、第一選択ＡＳＣ処置又は第一選択ＡＳＣ治療を指す。「コルチコステロイド」という用語は、抗炎症作用を有する水素化シクロペントパーヒドロフェナントレン環系を有する有効成分の分類である、コルチコステロイドの第一選択投与を指す。コルチコステロイド剤は、典型的には、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、ベクロメタゾン、ジプロピオナート、ブデソニド、デキサメタゾンリン酸ナトリウム、フルニソリド、プロピオン酸フルチカゾン、トリアムシノロンアセトニド、ベタメタゾン、フルオシノロン、フルオシノニド、ジプロピオン酸ベタメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、デソニド、デソキシメタゾン、フルオシノロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、プロピオン酸クロベタゾール及びデキサメタゾンを含む。
【０００８】
本明細書で使用する場合、「抗ＴＮＦα剤」という用語は、例えば、ＴＮＦαとＴＮＦαに対する細胞表面レセプターとの相互作用を阻害し、ＴＮＦαタンパク質生成を阻害し、ＴＮＦα遺伝子発現を阻害し、細胞からのＴＮＦα分泌を阻害し、ＴＮＦαレセプターシグナル伝達を阻害することにより、又は、対象におけるＴＮＦα活性の低下をもたらす任意の他の手段により、ＴＮＦα活性を直接又は間接的に阻害する、タンパク質、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（例えば、ＤＶＤ  Ｉｇ）、小分子ＴＮＦαアンタゴニスト及び類似する天然もしくは非天然分子、並びに／又はそのリコンビナント及び／もしくは操作形態を含む薬剤を包含するのを意図している。「抗ＴＮＦα剤」という用語は、好ましくは、ＴＮＦα活性と干渉する薬剤を含む。抗ＴＮＦα剤の例は、インフリキシマブ（REMICAD（商標）, Johnson and Johnson）、ヒト抗ＴＮＦモノクローナル抗体アダリムマブ（D2E7/HUMIRA（商標）, Abbott Laboratories）、エタネルセプト（ENBREL（商標）, Amgen）、セルトリズマブペゴール（CIMZIA（登録商標）, UCB, Inc.）、ゴリムマブ（SIMPONI（登録商標）; CNTO 148), CDP 571（Celltech）、CDP 870（Celltech）及び、ＴＮＦα活性が有害である対象に投与された場合、障害（すなわち、急性重症大腸炎）を処置することができるようにＴＮＦα活性を阻害する他の化合物を含むが、これらに限定されない。
【０００９】
本明細書で使用する場合、「シクロスポリン」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、免疫抑制剤を指す。シクロスポリン（「シクロスポリンＡ」又は「ＣｙＡ」とも呼ばれる）は、抗ＴＮＦ剤の登場まで、ステロイド難治性急性重症大腸炎のための救済的医学治療の基礎であった。ＣｙＡは、強力な免疫抑制特性を有する競合的カルシニュリン阻害剤である。
【００１０】
本明細書で使用する場合、「レスポンダー」という用語は、ＡＳＣ処置に応答するであろう急性重症大腸炎（ＡＳＣ）対象を指す。更なる態様では、「レスポンダー」という用語は、コルチコステロイドによる第一選択ＡＳＣ処置に応答するであろう急性重症大腸炎（ＡＳＣ）対象を指す。更なる態様では、「レスポンダー」という用語は、抗ＴＮＦα剤による第二選択ＡＳＣ処置に応答するであろう急性重症大腸炎（ＡＳＣ）対象を指す。更なる態様では、「レスポンダー」という用語は、シクロスポリンによる第二選択ＡＳＣ処置に応答するであろう急性重症大腸炎（ＡＳＣ）対象を指す。更なる態様では、「レスポンダー」という用語は、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンによる第二選択ＡＳＣ処置に応答するであろう急性重症大腸炎（ＡＳＣ）対象を指す。急性重症大腸炎の活性を、当技術分野において認識された基準に従って測定することができる。急性重症大腸炎の活性を臨床検査及び身体検査、Ｌｉｃｈｔｉｇｅｒスコア、組織学的類別並びに無増悪生存期間又は全生存期間により測定することができる。急性重症大腸炎（ＡＳＣ）処置に対する「レスポンダー」又は「応答性」対象は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）処置により処置された場合、疾患における臨床的に顕著な軽減を示すか、又は、示すであろう対象を指す。
【００１１】
本発明の第１の目的（「目的Ｎｏ．１」）は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイドに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、ｉ）コルチコステロイド投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、方法に関する。
【００１２】
一部の実施態様では、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のｍｉＲＮＡの発現レベルが判定される。一部の実施態様では、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐの発現レベルが測定される。
【００１３】
一部の実施態様では、９個のｍｉＲＮＡの発現レベルが測定される。前記９個のｍｉＲＮＡは、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８である。
【００１４】
本発明の第２の目的（「目的Ｎｏ．２」）は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象が抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、（ｉ）抗ＴＮＦα剤投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、（ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、（ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダー又は非レスポンダーとなることを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、方法に関する。
【００１５】
一部の実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される１、２、３、４、５又は６個のｍｉＲＮＡの発現レベルが判定される。一部の実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００の発現レベルが判定される。
【００１６】
一部の実施態様では、３個のｍｉＲＮＡの発現レベルが測定される。前記３個のｍｉＲＮＡは、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂである。
【００１７】
本発明の第３の目的（「目的Ｎｏ．３」）は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法であって、ｉ）シクロスポリン投与前又は同投与の初日の間に前記対象から得られた粘膜組織サンプル中の、ｈａｓ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈａｓ−ｍｉＲ−９３８、ｈａｓ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈａｓ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する工程と、ｉｉ）工程ｉ）において測定された発現レベルを参照値と比較する工程と、ｉｉｉ）粘膜組織サンプルと、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す参照値との間での発現レベルの差を検出する工程とを含む、方法に関する。
【００１８】
一部の実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される１、２、３又は４個のｍｉＲＮＡの発現レベルが判定される。一部の実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００の発現レベルが測定される。
【００１９】
一部の実施態様では、３個のｍｉＲＮＡの発現レベルが測定される。前記３個のｍｉＲＮＡは、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂである。
【００２０】
本発明の第４の目的（「目的Ｎｏ．４」）は、上記された目的１、２及び３の方法を行うことにより、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法に関する。一部の実施態様では、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する方法は、連続的又は同時に行われる。
【００２１】
一部の実施態様では、９個のｍｉＲＮＡの発現レベルが測定される。前記９個のｍｉＲＮＡは、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８である。
【００２２】
一部の実施態様では、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡの発現レベルを参照値と比較することからなる工程を含み、ここで、粘膜組織サンプルと参照値との間でのｍｉＲＮＡの発現レベルの差の検出は、前記対象がレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示すものである。
【００２３】
参照値は、各ｍｉＲＮＡについて決定される。典型的には、参照値は、閾値又はカットオフ値であることができる。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験的、経験的又は理論的に決定することができる。閾値は、当業者に認識されるであろうように、既存の実験及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択することもできる。閾値は、試験の機能による最適な感受性及び特異性並びに効果／リスクバランス（擬陽性及び擬陰性の臨床結果）を得るために決定される必要がある。典型的には、最適な感受性及び特異性（したがって、閾値）は、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定することができる。好ましくは、当業者であれば、（定義された閾値と、本発明の方法に従って得られた）ｍｉＲＮＡ発現レベルを比較することができる。本発明の一実施態様において、閾値は、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤又はシクロスポリンに対するレスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプル中で決定されたｍｉＲＮＡ発現レベル（又は比、又はスコア）から導出される。本発明の一実施態様において、閾値は、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤又はシクロスポリンに対する非レスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプル中で決定されたｍｉＲＮＡ発現レベル（又は比、又はスコア）から導出することもできる。更に、適切に預けられた過去の対象サンプルにおけるｍｉＲＮＡの発現レベル（又は比、又はスコア）の遡及的測定を、これらの閾値を確立するのに使用することができる。
【００２４】
一部の実施態様では、参照値は、ａ）コルチコステロイド処置前又は同処置の初日の間に対象から得られた粘膜組織サンプルのコレクションを提供する工程と、ｂ）工程ａ）において提供された各サンプルについて、実際の臨床アウトカム（応答又は無応答）に関する情報を提供する工程と、ｃ）一連の任意の定量値を提供する工程と、ｄ）工程ａ）において提供されたコレクションに含まれる各サンプルについてのｍｉＲＮＡのレベルを決定する工程と、ｅ）前記サンプルを、工程ｃ）において提供された１つの特定の任意の定量値について２つのグループそれぞれ：（ｉ）前記一連の定量値に含まれる前記任意の定量値より低いレベルの定量値を示すサンプルを含む第１のグループ；（ｉｉ）前記一連の定量値に含まれる前記任意の定量値より高い前記レベルの定量値を示すサンプルを含む第２のグループ（これにより、２つのグループのサンプルは、前記特定の定量値について得られ、ここで、各グループのサンプルは別々に列挙される）に分類する工程と、ｆ）（ｉ）工程ｅ）で得られた定量値と（ｉｉ）工程ｆ）で定義された第１及び第２のグループに含まれるサンプルから導出される対象の実際の臨床アウトカム（すなわち、応答又は無応答）との間の統計学的有意差を算出する工程と、ｇ）工程ｄ）において提供された全ての任意の定量値が試験されるまで、工程ｆ）及びｇ）を反復する工程と、ｈ）前記参照値を、最も高い統計学的有意差（最も有意）が工程ｇ）において算出される任意の定量値からなるように設定する工程とを含む方法を行うことにより決定することができる。
【００２５】
例えば、ｍｉＲＮＡのレベルは、１００名の対象の１００個のサンプルについて評価される。１００個のサンプルは、ｍｉＲＮＡのレベルに従って並べられる。サンプル１は、最も高いレベルを有し、サンプル１００は、最も低いレベルを有する。第１のグループ分けは、２つの部分集合：一方側にサンプルＮｒ１と、他方側に９９個の他のサンプルとを提供する。次のグループ分けは、一方側にサンプル１及び２と、他方側に９８個の残りのサンプルとを提供する等（最後のグループ分け：一方側にサンプル１〜９９と、他方側にサンプルＮｒ１００とを提供するまで）。対応する対象についての実際の臨床アウトカムに関する情報に従って、両部分集合間のｐ値が算出された。ついで、最小ｐ値の評価基準に基づく区別が最も強力であるように、参照値が選択される。換言すると、ｐ値が最小である両部分集合間の境界に対応するｍｉＲＮＡのレベルは、参照値と考えられる。参照値が、ｍｉＲＮＡのレベルの中央値である必要がないことに留意されたい。
【００２６】
このため、１つの「カットオフ」値の設定により、レスポンダー又は非レスポンダー間の区別が可能となる。実際には、高い統計学的有意差値（例えば、低いＰ値）は、一般的には、１つの任意の定量値のみについてではなく、連続的な任意の定量値の範囲について得られる。このため、本発明の１つの代替的な実施態様では、一定の参照値を使用するのに代えて、一定の範囲の値が提供される。したがって、最小統計学的有意差値（有意差の最小閾値、例えば、最大閾値Ｐ値）が任意に設定され、工程ｇ）において算出された統計学的有意差がより高い（より有意、例えば、より低いＰ値）複数の任意の定量値の範囲が保持され、そのため、一定範囲の定量値が提供される。定量値のこの範囲は、上記された「カットオフ」値を含む。例えば、１〜１０の仮定のスケールにおいて、理想的なカットオフ値（最も高い統計学的有意差を有する値）が５である場合、適切な（例示的な）範囲は、４〜６であることができる。したがって、対象は、ｍｉＲＮＡのレベルを測定することにより得られた値を比較することにより評価することができ、この場合、５より大きい値は、対象がレスポンダー（又は代替的には、非レスポンダー）であろうことを示し、５未満の値は、対象が非レスポンダー（又は代替的には、レスポンダー）であろうことを示す。別の実施態様では、対象は、ｍｉＲＮＡのレベルを測定することにより得られた値を比較すること及びスケールにおける値を比較することにより評価することができ、この場合、４〜６の範囲を上回る値は、対象がレスポンダー（又は代替的には、非レスポンダー）であろうことを示し、４〜６の範囲を下回る値は、対象が非レスポンダー（又は代替的には、非レスポンダー）であろうことを示す。ここで、４〜６の範囲内にある値は、中間の応答を示す。
【００２７】
一部の実施態様では、種々のｍｉＲＮＡの複数の発現レベルであるスコアも決定し、参照値と比較することができる。ここで、前記スコアと前記参照値との間の差は、前記対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤又はシクロスポリン処置に対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを示す。
【００２８】
一部の実施態様では、本発明の方法は、線形判別分析（ＬＤＡ）、トポロジーデータ分析（ＴＤＡ）、ニューラルネットワーク及び、例えば、実施例に記載されたランダムフォレストアルゴリズム（ＲＦ）から選択される分類アルゴリズムを使用して、対象応答を判定する工程を含む。一部の実施態様では、本発明の方法は、分類アルゴリズムがディープラーニング分類である分類アルゴリズムを使用して、対象応答を判定する工程を含む。本明細書で使用する場合、「分類アルゴリズム」という用語は、当技術分野においてその通常の意味を有し、例えば、ＵＳ第８，１２６，６９０号；ＷＯ第２００８／１５６６１７号に記載された当技術分野において周知の分類及び回帰木法及び多分散分類を指す。本明細書で使用する場合、「ランダムフォレストアルゴリズム」又は「ＲＦ」という用語は、当技術分野においてその通常の意味を有し、例えば、ＵＳ第８，１２６，６９０号；ＷＯ第２００８／１５６６１７号に記載された分類アルゴリズムを指す。ランダムフォレストは、Leo Breiman（Breiman L, 「Random forests,」 Machine Learning 2001, 45:5-32）により最初に開発されたアルゴリズムを使用して構築される決定木系分類子である。該分類子は、大量の個々の決定木を使用し、個々の木により決定される分類のモードを選択することによりクラスを決定する。個々の木は、下記アルゴリズム：（１）訓練事例集合における事例数がＮであり、分類子における変数の数がＭであると仮定し、（２）該木のノードにおける決定を判定するのに使用されるであろう入力変数の数を選択し（この数ｍは、Ｍより非常に少なくあるべきである）、（３）置換を有する訓練事例集合からのＮ個のサンプルを選択することにより訓練事例集合を選択し、（４）該木の各ノードについて、そのノードにおける決定に基づいてＭ個のうちのｍ個の変数をランダムに選択し、（５）訓練事例集合におけるこれらｍ個の変数に基づいて最良の分類を算出する、を使用して構築される。一部の実施態様では、スコアは、コンピュータプログラムにより生成される。
【００２９】
一部の実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６０３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより高い発現レベル並びにｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより低い発現レベルは、対象がコルチコステロイド処置に対するレスポンダーであろうことを示し、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６０３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより低い発現レベル並びにｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより高い発現レベルは、対象がコルチコステロイド処置に対する非レスポンダーであろうことを示す。
【００３０】
一部の実施態様では、参照値は、コルチコステロイド処置に対するレスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプルにおいて決定された発現レベルに対応させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６０３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値以上であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値以下である場合、対象は、コルチコステロイド処置に対するレスポンダーであろうと結論付けられ、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６０３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値未満であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値超である場合、対象は、コルチコステロイド処置に対する非レスポンダーであろうと結論付けられる。
【００３１】
一部の実施態様では、参照値は、コルチコステロイド処置に対する非レスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプルにおいて決定された発現レベルに対応させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６０３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値超であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値未満である場合、対象は、コルチコステロイド処置に対するレスポンダーであろうと結論付けられ、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−６０３からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値以下であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値以上である場合、対象は、コルチコステロイド処置に対する非レスポンダーであろうと結論付けられる。
【００３２】
一部の実施態様では、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより高い発現レベル並びにｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより低い発現レベルは、対象が抗ＴＮＦα剤処置に対するレスポンダーであろうことを示し、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより低い発現レベル並びにｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより高い発現レベルは、対象が抗ＴＮＦα剤処置に対する非レスポンダーであろうことを示す。
【００３３】
一部の実施態様では、参照値は、抗ＴＮＦα剤処置に対するレスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプルにおいて決定された発現レベルに対応させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値以上であり、並びに／又は、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値以下である場合、対象は、抗ＴＮＦα剤処置に対するレスポンダーであろうと結論付けられ、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値未満であり、並びに／又は、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値超である場合、対象は、抗ＴＮＦα剤処置に対する非レスポンダーであろうと結論付けられる。
【００３４】
一部の実施態様では、参照値は、抗ＴＮＦα剤処置に対する非レスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプルにおいて決定された発現レベルに対応させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値超であり、並びに／又は、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値未満である場合、対象は、抗ＴＮＦα剤処置に対するレスポンダーであろうと結論付けられ、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐからなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡについて決定された発現レベルが対応する参照値以下であり、並びに／又は、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８及びｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値以上である場合、対象は、抗ＴＮＦα剤処置に対する非レスポンダーであろうと結論付けられる。
【００３５】
一部の実施態様では、ｍｉＲ−４４２３−３ｐのより高い発現レベル並びに、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより低い発現レベルは、対象がシクロスポリン処置に対するレスポンダーであろうことを示し、したがって、ｍｉＲ−４４２３−３ｐのより低い発現レベル並びに、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのより高い発現レベルは、対象がシクロスポリン処置に対する非レスポンダーであろうことを示す。
【００３６】
一部の実施態様では、参照値は、シクロスポリン処置に対するレスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプルにおいて決定された発現レベルに対応させることができる。したがって、ｍｉＲ−４４２３−３ｐについて決定された発現レベルが対応する参照値以上であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値以下である場合、対象は、シクロスポリン処置に対するレスポンダーであろうと結論付けられ、したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐについて決定された発現レベルが対応する参照値未満であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値超である場合、対象は、シクロスポリン処置に対する非レスポンダーであろうと結論付けられる。
【００３７】
一部の実施態様では、参照値は、シクロスポリン処置に対する非レスポンダーである１名以上の対象から得られた粘膜組織サンプルにおいて決定された発現レベルに対応させることができる。したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐについて決定された発現レベルが対応する参照値超であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値未満である場合、対象は、シクロスポリン処置に対するレスポンダーであろうと結論付けられ、したがって、ｈａｓ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐについて決定された発現レベルが対応する参照値以下であり、並びに／又は、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００からなる群より選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルが対応する参照値以上である場合、対象は、シクロスポリン処置に対する非レスポンダーであろうと結論付けられる。
【００３８】
一部の実施態様では、本発明の方法は、白血球、赤血球、好塩基球及びリンパ球カウント、ヘマトクリット、ヘモグロビン、グルコース、フェリチン、アルブミン、鉄、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）並びにトランスフェリンからなる群より選択される少なくとも１つの生体値を測定することを更に含む。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「粘膜組織サンプル」という用語は、対象の結腸から得られる任意のサンプルを意味し、同サンプルは、粘膜細胞を含む。前記粘膜組織サンプルは、コルチコステロイドによる第一選択処置前又は同処置の初日の間に得ることができる。前記粘膜組織サンプルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価の目的で得られる。特定の実施態様では、粘膜組織サンプルは、対象の結腸で行われる内視鏡生検から生じる。前記内視鏡生検は、結腸の種々の領域から得ることができる。別の特定の実施態様では、粘膜組織サンプルは、対象の結腸の炎症している粘膜から単離することができる。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「ｍｉＲ」という用語は、当技術分野においてその通常の意味を有し、データベースhttp://microrna.sanger.ac.uk/sequences/からmiRBaseアクセッションナンバーで公衆に利用可能なｍｉＲＮＡ配列を指す。本発明に適したｍｉＲＮＡはそれ自体公知であり、以下の表Ａに列記される。
【００４１】
【表１】
2019520071.tif 000002
【００４２】
本発明によれば、対象から得られた粘膜組織サンプル中の本発明の表ＡのｍｉＲＮＡからなる群より選択されるｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することは、各種の技術により行うことができる。例えば、まず、サンプル（対象から調製された粘膜組織）に含有される核酸が、標準的な方法に従って、例えば、溶解酵素もしくは化学溶液を使用して抽出され、又は、核酸結合樹脂により製造メーカーの説明に従って抽出される。ＲＮＡを粘膜組織サンプルから単離するための従来法及び試薬は、高純度ｍｉＲＮＡ単離キット（Roche）、Trizol（Invitrogen）、グアニジニウムチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出、PureLink（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Invitrogen）、PureLink  Ｍｉｃｒｏ〜ＭｉｄｉトータルＲＮＡ精製システム（invitrogen）、RNeasyキット（Qiagen）、miRNeasyキット（Qiagen）、Oligtexキット（Qiagen）、フェノール抽出、フェノール−クロロホルム抽出、ＴＣＡ／アセトン沈殿、エタノール沈殿、カラム精製、シリカゲルメンブラン精製、PureYield（商標）RNA Midiprep（Promega）、PolyATractシステム１０００（Promega）、Maxwell（登録商標）16システム（Promega）、SVトータルＲＮＡ単離（Promega）、geneMAG-RNA/DNAキット（Chemicell）、TRI Reagent（登録商標）（Ambion）、RNAqueousキット（Ambion）、ToTALLY RNA（商標）キット（Ambion）、Poly(A)Purist（商標）キット（Ambion）及び市販されているか又は市販されていない当業者に公知の任意の他の方法を含む。
【００４３】
粘膜組織サンプルにおける１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルは、任意の適切な方法により決定することができる。サンプル中のｍｉＲＮＡのレベル又は量を測定するための任意の信頼できる方法を使用することができる。一般的には、ｍｉＲＮＡは、粘膜組織サンプル（その画分を含む）、例えば、単離されたＲＮＡサンプルから、ｍＲＮＡについて公知の種々の方法により検出し、定量することができる。同方法は、例えば、増幅系の方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ローリングサークル増幅等）、ハイブリダイゼーション系の方法（例えば、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、NanoString分析、ノーザンブロット分析、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等）及びシークエンシング系の方法（例えば、Illumina又はIonTorrentプラットフォームを使用する次世代シークエンシング法等）を含む。他の例示的な技術は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）及び質量分光法を含む。
【００４４】
一部の実施態様では、ＲＮＡは、分析前にＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｃＤＮＡは、従来技術を使用する、単離されたｍｉＲＮＡの逆転写により生成することができる。ｍｉＲＮＡ逆転写キットは公知であり、市販されている。適切なキットの例は、mirVana TaqMan（登録商標）ｍｉＲＮＡ転写キット（Ambion, Austin, TX）及びTaqMan（登録商標）ｍｉＲＮＡ転写キット（Applied Biosystems, Foster City, CA）を含むが、これらに限定されない。ユニバーサルプライマー又はｍｉＲＮＡ−特異的ステム−ループプライマーを含む特異的プライマーは公知であり、例えば、Applied Biosystemsから市販されている。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡは、測定前に増幅される。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、増幅プロセス中に測定される。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡの発現レベルは、測定前に増幅されない。サンプル中のｍｉＲＮＡの発現レベルを決定するのに適した一部の例示的な方法は、以下により詳細に記載されている。これらの方法は、例証としてのみ提供され、他の適切な方法を同様に使用することができることは、当業者に明らかであろう。
【００４５】
ｍｉＲＮＡの核酸配列の発現レベルを検出するための多くの増幅系の方法が存在し、同方法は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ及びローリングサークル増幅を含むが、これらに限定されない。他の増幅系の技術は、例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、multiplex ligatable probe amplification、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列系増幅（ＮＡＳＢＡ）、ＲＮＡ（Eberwine）増幅及び当業者に公知の他の方法を含む。典型的なＰＣＲ反応は、ターゲット核酸種を選択的に増幅する複数の工程又はサイクル：変性工程（同工程では、ターゲット核酸が変性される）；アニーリング工程（同工程では、ＰＣＲプライマー（すなわち、フォワード及びリバースプライマー）が相補的なＤＮＡ鎖にアニーリングする）及び伸長工程（同工程では、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる）を含む。これらの工程を複数回繰り返すことにより、ＤＮＡフラグメントが増幅されて、ターゲット配列に対応するアンプリコンを生成する。典型的なＰＣＲ反応は、変性、アニーリング及び伸長の２０回以上のサイクルを含む。多くの場合には、アニーリング及び伸長工程は、同時に行うことができ、その場合には、サイクルは、２つの工程のみを含む。逆転写反応（同反応により、ｍｉＲＮＡに対して相補性を有するｃＤＮＡ配列が生成される）は、ＰＣＲ増幅前に行うことができる。逆転写反応は、例えば、ＲＮＡ系ＤＮＡポリメラーゼ（リバーストランスクリプターゼ）及びプライマーの使用を含む。ｍｉＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ用のキットは公知であり、市販されている。適切なキットの例は、TaqMan（登録商標）ｍｉＲＮＡアッセイ（Applied Biosystems）及びmirVana（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍｉＲＮＡ検出キット（Ambion）を含むが、これらに限定されない。ｍｉＲＮＡは、リバーストランスクリプターゼの前にユニバーサルプライマー配列、ポリアデニル化配列又はアダプター配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチドにライゲーションすることができ、ユニバーサルプライマー配列に対して相補的なプライマー、ポリ（Ｔ）プライマー又はアダプター配列に対して相補的な配列を含むプライマーを使用して増幅することができる。一部の実施態様では、ｍｉＲＮＡレベルの決定のためのカスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発することができる。サンプル中のｍｉＲＮＡを測定するためのカスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを、例えば、広範な逆転写プライマー及びロックド核酸改良ＰＣＲを含む方法を使用して開発することができる。カスタムｍｉＲＮＡアッセイは、ターゲット配列に対応する化学合成されたｍｉＲＮＡの系列希釈においてアッセイを行うことにより試験することができる。これにより、各アッセイの定量の検出限界及び比例領域の決定が可能となる。更に、検量線として使用する場合、これらのデータにより、サンプル中で測定されたｍｉＲＮＡの絶対量の確立が可能となる。増幅曲線は、Ｃｔ値が各増幅プロットの比例領域において評価されるのを実証するために、場合により確認することができる。典型的には、比例領域は、複数の桁に広がる。アッセイされた各候補ｍｉＲＮＡについて、化学的に合成されたバージョンのｍｉＲＮＡを得ること��でき、アッセイの感度限界及び定量の比例領域を決定するために系列希釈で分析することができる。相対的な発現レベルは、例えば、Livak et al, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-ΔΔ C(T)) Method. Methods (2001) Dec;25(4):402-8に記載された２（−ΔΔＣ（Ｔ））法に従って決定することができる。
【００４６】
一部の実施態様では、２つ以上のｍｉＲＮＡが、１つの反応容量で増幅される。例えば、多重ｑ−ＰＣＲ、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、対象となる少なくとも２つのｍｉＲＮＡの同時増幅及び定量が１つの反応容量で１対以上のプライマー及び／又は１つ以上のプローブを使用することで可能となる。プライマーペアは、各ｍｉＲＮＡに特異的に結合する少なくとも１つの増幅プライマーを含み、プローブは、それら同士が区別可能なようにラベルされることにより、複数のｍｉＲＮＡの同時定量が可能となる。
【００４７】
ローリングサークル増幅は、等温条件下で線形又は幾何学的動力学のいずれかにより、環化されたオリゴヌクレオチドプローブを複製することができるＤＮＡポリメラーゼ駆動反応である（例えば、Lizardi et al., Nat. Gen. (1998) 19(3):225-232；Gusev et al, Am. J. Pathol. (2001) 159(l):63-69；Nallur et al, Nucleic Acids Res. (2001) 29(23):E118を参照のこと）。２つのプライマーの存在下で、一方が、ＤＮＡの（＋）鎖にハイブリダイズし、他方が、（−）鎖にハイブリダイズする。鎖置換の複合的なパターンにより、各ＤＮＡ分子の１０９個超のコピーの生成が９０分以内にもたらされる。閉環ＤＮＡ分子のタンデムに結合しているコピーは、１つのプライマーを使用することにより形成することができる。該プロセスは、マトリックス会合ＤＮＡを使用して行うこともできる。ローリングサークル増幅に使用されるテンプレートは逆転写することができる。この方法は、非常に低いｍｉＲＮＡ濃度でのｍｉＲＮＡ配列及び発現レベルの高感度な指標として使用することができる（例えば、Cheng et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. (2009) 48(18):3268-72；Neubacher et al, Chembiochem. (2009) 10(8): 1289-91を参照のこと）。
【００４８】
ｍｉＲＮＡの定量は、逆転写（ＲＴ）のためのステム−ループプライマー、続けて、リアルタイムTaqMan（登録商標）プローブを使用することにより行うことができる。典型的には、前記方法は、ステム−ループプライマーがｍｉＲＮＡターゲットにアニーリングされ、リバーストランスクリプターゼの存在下で伸長される第１の工程を含む。ついで、ｍｉＲＮＡ特異的フォワードプライマー、TaqMan（登録商標）プローブ及びリバースプライマーが、ＰＣＲ反応に使用される。ｍｉＲＮＡの定量は、測定されたＣＴ値に基づいて確立される。多くのｍｉＲＮＡ定量アッセイは、Qiagen（S. A. Courtaboeuf, France)、Exiqon（Vedbaek, Denmark)又はApplied Biosystems（Foster City, USA）から市販されている。
【００４９】
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、絶対発現レベル及び正規化発現レベルとして表現することができる。典型的には、発現レベルは、ｍｉＲＮＡの絶対発現レベルを、その発現を急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を患う対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対してレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定するのに関連するマーカーではないｍＲＮＡ、例えば、構成的に発現しているハウスキーピングｍＲＮＡの発現と比較することにより補正することで正規化される。正規化に適したｍＲＮＡは、Ｕ６、Ｕ２４、Ｕ４８及びＳ１８等のハウスキーピングｍＲＮＡを含む。この正規化により、１つのサンプル、例えば、対象サンプル中の発現レベルの別のサンプルに対する比較又は異なる供給元からのサンプル間の比較が可能となる。特定の実施態様では、発現レベルは、その発現を参照ｍＲＮＡの発現と比較することでｍｉＲＮＡの絶対発現レベルを補正することにより正規化される。
【００５０】
本明細書における対象となるｍｉＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとしての有用性が見出される。このような核酸は、同一である必要はないが、典型的には、比較可能なサイズの相同領域に対して、少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、及び更により好ましくは９０〜９５％同一であると理解される。特定の実施態様では、ハイブリダイゼーションを検出するのに適した手段、例えば、検出可能なラベルとの組み合わせで核酸を使用するのが有利であろう。広い各種の適切な指標が当技術分野において公知であり、同指標は、蛍光、放射線、酵素又は他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む。
【００５１】
プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズするｍｉＲＮＡに「特異的」であり、すなわち、それらは、好ましくは、高いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（最高融解温度Ｔｍに対応、例えば、５０％ ホルムアルデヒド、５×又は６×ＳＣＣ。ＳＣＣは、０．１５M ＮａＣｌ、０．０１５M クエン酸Ｎａである）でハイブリダイズする。
【００５２】
ｍｉＲＮＡは、ハイブリダイゼーション系の方法を使用して検出することができ、同方法は、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、NanoString分析、ノーザンブロット分析、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
マイクロアレイは、大量のｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に測定するのに使用することができる。マイクロアレイは、各種の技術を使用して作製することができる。同技術は、微小点状ピンによるガラススライド上への印刷、事前に作製されたマスクを使用するフォトリソグラフィー、動的マイクロミラー装置を使用するフォトリソグラフィー、インクジェット印刷又は微小電極アレイでの電気化学を含む。微小流体TaqMan低密度アレイも有用である。同アレイは、微小流体ｑＲＴ−ＰＣＲ反応のアレイ及び関連する微小流体ｑＲＴ−ＰＣＲ系の方法に基づいている。マイクロアレイ検出の１つの例において、ヒトセンスｍｉＲＮＡ配列に対応する種々のオリゴヌクレオチド（例えば、２００＋５’−アミノ−改変Ｃ６オリゴ）が、終濃度約２０μMで三次元CodeLinkスライド（GE Health/Amersham Biosciences）上にスポットされ、製造メーカーの推奨に従って処理される。２０μg TRIzol精製トータルＲＮＡから合成された第１鎖ｃＤＮＡは、ビオチン化ｄｄＵＴＰによりEnzo BioArray end labelingキット（Enzo Life Sciences Inc.）を使用してラベルされる。ハイブリダイゼーション、染色及び洗浄は、改良Affymetrix Antisenseゲノムアレイプロトコールに従って行うことができる。Axon B-4000スキャナ及びGene-Pix Pro 4.0ソフトウェア又は他の適切なソフトウェアを、画像をスキャンするのに使用することができる。バックグラウンドを差し引いた後の非陽性スポット及びＥＳＤ法により検出された外れ値が除去される。得られたシグナル強度値は、チップ当たりの中央値に正規化され、ついで、幾何平均及び標準誤差を各ｍｉＲＮＡについて得るのに使用される。各ｍｉＲＮＡシグナルは、対数底２に変換することができ、１サンプルｔ検定を行うことができる。各サンプルについての独立したハイブリダイゼーションを、データの堅牢性を向上させるために複数回スポットされた各ｍｉＲＮＡを有するチップ上で行うことができる。
【００５４】
マイクロアレイは、ｍｉＲＮＡの発現プロファイルに使用することができる。例えば、ＲＮＡは、サンプルから抽出することができ、場合により、ｍｉＲＮＡは、トータルＲＮＡからサイズ選択される。オリゴヌクレオチドリンカーを、ｍｉＲＮＡの５’及び３’端に付着させることができ、得られたライゲーション生成物は、ＲＴ−ＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用される。センス鎖ＰＣＲプライマーは、その５’端に付着した蛍光体を有することができ、これにより、ＰＣＲ生成物のセンス鎖をラベルすることができる。ＰＣＲ生成物は変性され、ついで、マクロアレイにハイブリダイズされる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的なターゲット核酸とも呼ばれるＰＣＲ生成物が、塩基対合を介して、捕捉プローブが固定されているスポットにハイブリダイズするであろう。ついで、スポットは、マイクロアレイレーザスキャナを使用した際に蛍光を発するであろう。ついで、各スポットの蛍光強度は、特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して、陽性及び陰性対照の数並びにアレイデータ正規化法を使用して評価される。同方法により、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの評価がもたらされるであろう。サンプルから抽出されたｍｉＲＮＡを含有するトータルＲＮＡを、ｍｉＲＮＡのサイズ選択なしに直接使用することもできる。例えば、ＲＮＡは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ及び蛍光体ラベルした短いＲＮＡリンカーを使用して３’端ラベルすることができる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的な蛍光体ラベルｍｉＲＮＡは、塩基対合を介して、捕捉プローブが固定されているスポットにハイブリダイズする。ついで、各スポットの蛍光強度が、特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して、陽性及び陰性対照の数並びにアレイデータ正規化法を使用して評価される。同方法により、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの評価がもたらされるであろう。複数種類のマイクロアレイを利用することができ、同マイクロアレイは、スポットオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、予め作製されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ又はスポットされた長いオリゴヌクレオチドアレイを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
したがって、核酸プローブは、例えば、ターゲット核酸分子の検出を開示されたプローブを使用して可能にするための１つ以上のラベルを含む。種々の用途、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法において、核酸プローブは、ラベル（例えば、検出可能なラベル）を含む。「検出可能なラベル」は、サンプル中のプローブ（特に、結合したプローブ又はハイブリダイズしたプローブ）の存在又は濃度を示す検出可能なシグナルを生成するのに使用することができる分子又は材料である。このため、ラベルされた核酸分子は、サンプル中のターゲット核酸配列（例えば、ゲノムターゲット核酸配列）の存在又は濃度の指標を提供する（同配列に、ラベルされた固有に特異的な核酸分子が結合し又はハイブリダイズする）。１つ以上の核酸分子（例えば、開示された方法により生成されたプローブ）と会合したラベルは、直接又は間接的のいずれかで検出することができる。ラベルは、任意の公知又は未だに発見されていないメカニズムにより検出することができる。同メカニズムは、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数及び紫外周波数の光子）の吸光、発光及び／又は散乱を含む。検出可能なラベルは、着色、蛍光、リン光及び発光分子及び材料、１つの物質を別の物質に変換して、（例えば、無色の物質を有色の物質に変換しもしくはその逆をすることにより、又は、沈殿を生じさせもしくはサンプルの濁度を上昇させることにより）検出可能な差を提供する触媒（例えば、酵素）、抗体結合相互作用により検出することができるハプテン並びに常磁性もしくは磁性の分子もしくは材料を含む。
【００５６】
検出可能なラベルの特定の例は、蛍光分子（又は蛍光色素）を含む。数多くの蛍光色素が当業者に公知であり、例えば、Life Technologies（以前は、Invitrogen）から選択することができ、例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照のこと。核酸分子（例えば、固有に特異的な結合領域）に付着する（例えば、化学的にコンジュゲートする）ことができる特定の蛍光体の例は、ＵＳ第５，８６６、３６６号（Nazarenko et al.）に提供され、例えば、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸、アクリジン及び誘導体、例えば、アクリジン及びアクリジンイソチオシアナート、５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）、４−アミノ−Ｎ−［３ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホナート（Lucifer Yellow VS）、Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド、Brilliant Yellow、クマリン及び誘導体、例えば、クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアノシン；４’，６−ジアミジノ（diarninidino）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体、例えば、エオシン及びエオシンイソチオシアナート；エリスロシン及び誘導体、例えば、エリスロシンＢ及びエリスロシンイソチオシアナート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体、例えば、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’７’ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）及びＱＦＩＴＣ  Ｑ（ＲＩＴＣ）；２’，７’−ジフルオロフルオレセイン（OREGON GREEN（登録商標））；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリスリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体、例えば、ピレン、ピレンブチラート及びスクシンイミジル  １−ピレンブチラート；Reactive Red 4（Cibacron Brilliant Red 3B-A）；ローダミン及び誘導体、例えば、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアナート、ローダミングリーン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１及びスルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Texas Red）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸及びテルビウムキレート誘導体である。他の適切な蛍光体は、約６１７nmで発光するチオール反応性ユーロピウムキレート（Heyduk and Heyduk, Analyt. Biochem. 248:216-27, 1997；J. Biol. Chem. 274:3315-22, 1999）並びにＧＦＰ、リサミン（商標）、ジエチルアミノクマリン、フルオレセインクロロトリアジニル、ナフトフルオレセイン、４，７−ジクロロローダミン及びキサンテン（ＵＳ第５，８００，９９６号（Lee et al.）に記載）及びそれらの誘導体を含む。当業者に公知の他の蛍光体、例えば、Life Technologies（Invitrogen; Molecular Probes（Eugene, Oreg.））から入手できる蛍光体並びに、ALEXA FLUOR（登録商標）シリーズの色素（例えば、ＵＳ第５，６９６，１５７号、同第６，１３０，１０１号及び同第６，７１６，９７９号に記載）、BODIPYシリーズの色素（ジピロメテンボロンジフルオリド色素、例えば、ＵＳ第４，７７４，３３９号、同第５，１８７，２８８号、同第５，２４８，７８２号、同第５，２７４，１１３号、同第５，３３８，８５４号、同第５，４５１，６６３号及び同第５，４３３，８９６号に記載）、Cascade Blue（ＵＳ第５，１３２，４３２号に記載されたスルホン化ピレンのアミン反応性誘導体）及びMarina Blue（ＵＳ第５，８３０，９１２号）を含む蛍光体も使用することができる。
【００５７】
上記された蛍光色素に加えて、蛍光ラベルは、蛍光ナノ粒子、例えば、半導体ナノ結晶、例えば、QUANTUM DOT（商標）（例えば、Life Technologies（QuantumDot Corp, Invitrogen Nanocrystal Technologies, Eugene, Oreg.)から得られる；ＵＳ第６，８１５，０６４号；同第６，６８２，５９６号；及び同第６，６４９、１３８号も参照のこと）であることができる。半導体ナノ結晶は、サイズ依存性光学特性及び／又は電気特性を有する微小粒子である。半導体ナノ結晶が一次エネルギー源により照射された場合、半導体ナノ結晶に使用される半導体材料のバンドギャップに対応する周波数のエネルギーの二次発光が生じる。この発光は、特定の波長の着色光又は蛍光として検出することができる。異なるスペクトル特性を有する半導体ナノ結晶は、例えば、ＵＳ第６，６０２，６７１号に記載されている。半導体ナノ結晶は、各種の生体分子（ｄＮＴＰ及び／又は核酸を含む）又は基質に、例えば、Bruchez et al., Science 281 :20132016, 1998；Chan et al., Science 281:2016-2018, 1998及びＵＳ第６，２７４，３２３号に記載された技術により結合させることができる。種々の組成の半導体ナノ結晶の形成は、例えば、ＵＳ第６，９２７、０６９号；同第６，９１４，２５６号；同第６，８５５，２０２号；同第６，７０９，９２９号；同第６，６８９，３３８号；同第６，５００，６２２号；同第６，３０６，７３６号；同第６，２２５，１９８号；同第６，２０７，３９２号；同第６，１１４，０３８号；同第６，０４８，６１６号；同第５，９９０，４７９号；同第５，６９０，８０７号；同第５，５７１，０１８号；同第５，５０５，９２８号；同第５，２６２，３５７号及びＵＳ第２００３／０１６５９５１号並びにＷＯ第９９／２６２９９号（１９９９年５月２７日公開）に開示されている。その異なるスペクトル特性に基づいて特定可能な半導体ナノ結晶の別々の集団を生成することができる。例えば、その組成、サイズ又はサイズおよび組成に基づいて異なる色を発する半導体ナノ結晶を生成することができる。例えば、サイズに基づいて異なる波長（発光波長５６５nm、６５５nm、７０５nm又は８００nm）で光を発する量子ドットは、本明細書に開示されたプローブにおける蛍光ラベルとして適しており、Life Technologies（Carlsbad, Calif.）から入手できる。
【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲは、典型的には、特定波長の光のビームにより各サンプルを照射する能力を有し、励起された蛍光体により発せられた蛍光を検出する熱サイクラーで行われる。熱サイクラーは、サンプルを素早く加熱し、冷却することもでき。これにより、核酸及び熱ポリメラーゼの物理化学特性の利点を得ることができる。現在上梓されている大部分の熱サイクラーは、類似する特徴を提供する。典型的には、熱サイクラーは、ガラスキャピラリー、プラスチックチューブ、９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレートのフォーマットを伴う。熱サイクラーは、ソフトウェア分析も伴う。
【００５９】
ｍｉＲＮＡは、nCounter Analysis System（NanoString Technologies, Seattle, WA）を使用して増幅なしに検出することもできる。この技術は、溶液中でハイブリダイズする２つの核酸系のプローブ（例えば、レポータープローブ及び捕捉プローブ）を利用する。ハイブリダイゼーション後に、過剰のプローブが除去され、プローブ／ターゲット複合体が、製造メーカーのプロトコールに従って分析される。nCounter  ｍｉＲＮＡアッセイキットは、NanoString Technologiesから入手できる。同キットにより、高い特異性により非常に類似するｍｉＲＮＡ間を区別可能である。nCounter（登録商標）分析システムの基礎は、アッセイされる各核酸ターゲットに割り当てられた固有のコードである（ＷＯ第０８／１２４８４７号、ＵＳ第８，４１５，１０２号及びGeiss et al. Nature Biotechnology. 2008. 26(3): 317-325；これらの文献の内容はそれぞれ、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる）。該コードは、アッセイされる各ターゲットに固有のバーコードを生成する着色蛍光スポットの順序系列から構成される。ビオチン化捕捉プローブ及び蛍光バーコードを有するレポータープローブのプローブペアが、各オリゴヌクレオチドターゲットのために設計される。このシステムは、本明細書において、ナノレポーターコードシステムとも呼ばれる。特定のレポーター及び捕捉プローブは、各ターゲットについて合成される。レポータープローブは、第１のシグナルを構成する光を発する１つ以上のラベルモノマーと付着する少なくとも第１のラベル付着領域；第２のシグナルを構成する光を発する１つ以上のラベルモノマーと付着する、第１のラベル付着領域と重ならない少なくとも第２のラベル付着領域；及び第１のターゲット特異的配列を含むことができる。好ましくは、各配列特異的レポータープローブは、１個以下の遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット特異的配列を含み、場合により、少なくとも３つ又は少なくとも４つのラベル付着領域を含み、前記付着領域は、少なくとも第３のシグナル又は少なくとも第４のシグナルそれぞれを構成する光を発する１つ以上のラベルモノマーを含む。捕捉プローブは、第２のターゲット特異的配列；及び第１の親和性タグを含むことができる。一部の実施態様では、捕捉プローブは、１つ以上のラベル付着領域も含むことができる。好ましくは、レポータープローブの第１のターゲット特異的配列及び捕捉プローブの第２のターゲット特異的配列は、検出される同じ遺伝子の異なる領域にハイブリダイズする。レポータープローブ及び捕捉プローブは全て、シングルハイブリダイゼーション混合物である「プローブライブラリ」内にプールされる。各ターゲットの相対量は、シングル多重化ハイブリダイゼーション反応において測定される。該方法は、サンプル中におけるターゲットの存在によりプローブペア−ターゲット複合体が生成されるように、サンプルをプローブライブラリと接触させることを含む。ついで、該複合体が精製される。より具体的には、サンプルがプローブライブラリと組み合わせられ、ハイブリダイゼーションが溶液中で生じる。ハイブリダイゼーション後に、３成分のハイブリダイズ複合体（プロ−ブペア及びターゲット）は、捕捉プローブ及びレポータープローブに存在するユニバーサル配列に相補的なオリゴヌクレオチドに結合した磁性ビーズを使用する２工程法で精製される。この二重精製プロセスにより、大過剰のターゲット特異的プローブによるハイブリダイゼーション反応を完了まで進行させることが可能となり、その時点で、それらは、最終的に除去されるため、サンプルの結合及び画像化を妨害しない。すべてのハイブリダイゼーション後の工程は、専用の液体取扱いロボット（Prep Station, NanoString Technologies）においてロボットにより取り扱われる。精製された反応物は、典型的には、サンプルカートリッジの個々のフローセル内のPrep Stationにより堆積され、捕捉プローブを介してストレプトアビジン被覆表面に結合し、レポータープローブを伸長するために電気泳動され、固定される。処理後に、サンプルカートリッジが完全に自動の画像化及びデータ収集装置（Digital Analyzer, NanoString Technologies）に移される。ターゲットの発現レベルは、各サンプルを画像化し、ターゲットが検出されるコードの回数をカウントすることにより測定される。各サンプルについて、典型的には、結合表面の約１０mm2を表す６００視野（ＦＯＶ）が画像化される（１３７６×１０２４ピクセル）。典型的な画像化密度は、多重化度合い、サンプル入力量及びターゲット量全体に応じて、視野当たりに１００〜１２００カウントされたレポーターである。データは、サンプル当たりのターゲット当たりのカウント数を列記する単純なスプレッドシートフォーマットで出力される。このシステムは、ナノレポーターと共に使用することができる。ナノレポーターに関する更なる開示は、ＷＯ第０７／０７６１２９号及び同第０７／０７６１３２号並びにＵＳ第２０１０／００１５６０７号及び同第２０１０／０２６１０２６号に見出すことができる。これらの文献の内容は、その全体が本明細書に組み入れられる。更に、核酸プローブ及びナノレポーターという用語は、ＷＯ第２０１０／０１９８２６号及びＵＳ第２０１０／００４７９２４号に記載された、合理的に設計された配列（例えば、合成配列）を含むことができる。これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
質量分光法を、ＲＮａｓｅマッピングを使用してｍｉＲＮＡを定量するのに使用することができる。単離されたＲＮＡは、ＭＳ又はタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）アプローチによるその分析前に、高い特異性を有するＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、全ての未修飾グアノシン残基の３’側で開裂させるＲＮａｓｅ  Ｔｌ）により酵素消化することができる。開発された最初のアプローチは、ＥＳＴＭＳに直接連結された逆相ＨＰＬＣによるエンドヌクレアーゼ消化のオンラインクロマトグラフィー分離を利用した。転写後修飾の存在を、ＲＮＡ配列に基づいて予測された質量からの質量シフトにより証明することができる。ついで、異常な質量／電荷値のイオンを、タンデムＭＳシークエンシングのために単離して、転写後に修飾されたヌクレオシドの配列配置を位置決定することができる。マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）も、転写後に修飾されたヌクレオシドについての情報を得るための分析アプローチとして使用されてきた。ＭＡＬＤＩ系のアプローチは、分離工程によりＥＳＴ系のアプローチと区別することができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、質量分光計は、ｍｉＲＮＡを分離するのに使用される。限られた量のインタクトなｍｉＲＮＡを分析するために、ナノＥＳＩ−ＭＳと連結させたキャピラリーＬＣのシステムを、特注ナノスプレーイオン源、Nanovolume Valve（Valco Instruments）及びスプリットレスナノＨＰＬＣシステム（DiNa, KYA Technologies)を備えた、リニアイオントラップ−オービトラップハイブリッド質量分光計（LTQ Orbitrap XL, Thermo Fisher Scientific）又はタンデム四重極飛行時間型質量分光計（QSTAR（登録商標） XL, Applied Biosystems）を使用することにより利用することができる。分析物／ＴＥＡＡが、ナノ−ＬＣトラップカラムにロードされ、脱塩され、ついで、濃縮される。インタクトなｍｉＲＮＡは、トラップカラムから溶出され、ＣＩ  ８キャピラリーカラム内に直接注入され、極性を増大させる溶媒の勾配を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによりクロマトグラフされる。クロマトグラフィー溶出物は、キャピラリーカラムに取り付けられた噴霧器先端から、イオンがネガティブ極性モードでスキャンされるのを可能にするイオン化電圧を使用してスプレーされる。
【００６１】
ｍｉＲＮＡ検出及び測定のための更なる方法は、例えば、ストランド侵入アッセイ（Third Wave Technologies, Inc.）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ｃＤＮＡ、ＭＴＤＮＡ（メタリックＤＮＡ；Advance Technologies, Saskatoon, SK）及び一分子法、例えば、US Genomicsにより開発された方法を含む。複数のｍｉＲＮＡは、表面酵素反応とナノ粒子増幅ＳＰＲ画像化（ＳＰＲＩ）とを組み合わせる新規なアプローチを使用するマイクロアレイフォーマットにおいて検出することができる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼの表面反応により、ロックド核酸（ＬＮＡ）マイクロアレイ上にハイブリダイズしたｍｉＲＮＡにポリ（Ａ）テイルが生成される。ついで、ＤＮＡ改変ナノ粒子が、ポリ（Ａ）テイルに吸着され、ＳＰＲＩにより検出される。この超高感度ナノ粒子増幅ＳＰＲＩ法は、アトモルレベルでのｍｉＲＮＡプロファイリングに使用することができる。ｍｉＲＮＡは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅を使用しても検出することができる（例えば、Urdea, Nature Biotechnology (1994), 12:926-928を参照のこと）。ｂＤＮＡシグナル増幅に基づくｍｉＲＮＡアッセイは市販されている。１つのこのようなアッセイは、QuantiGene（登録商標）2.0  ｍｉＲＮＡアッセイ（Affymetrix, Santa Clara, CA）である。ノーザンブロット及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションも、ｍｉＲＮＡを検出するのに使用することができる。ノーザンブロット及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うのに適した方法は、当技術分野において公知である。進歩したシークエンシング法は、利用可能であれば同様に使用することができる。例えば、ｍｉＲＮＡは、Illumina（登録商標）次世代シークエンシング（例えば、HiSeq、HiScan、GenomeAnalyzer又はMiSeqシステム（Illumina, Inc., San diego, CA））を使用する、例えば、Sequencing-By-Synthesis又はTruSeq法)を使用して検出することができる。ｍｉＲＮＡは、Ion Torrent Sequencing（Ion Torrent Systems, Inc., Gulliford, CT）又は半導体シークエンシングの他の適切な方法を使用しても検出することができる。
【００６２】
更なる目的は、本発明の方法を行うためのキットに関し、ここで、前記キットは、対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤又はシクロスポリン処置に対するレスポンダーであることを示す、表ＡのｍｉＲＮＡから選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定するための手段を含む。典型的には、該キットは、プライマー、プローブマイクロアレイ又は上記されたマイクロアレイを含むことができる。例えば、該キットは、上記定義され、通常、ＤＮＡから構成され、場合により、予めラベルされているｍｉＲＮＡのプローブセットを含むことができる。代替的に、プローブは、ラベルされていなくてもよく、ラベルするための成分を、別個の容器において該キットに含ませることができる。該キットは、ハイブリダイゼーション試薬又は特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要とされる他の適切に梱包された試薬及び材料（固相マトリックス、及び該当する場合、基準を含む）を更に含むことができる。代替的に、本発明のキットは、予めラベルされていることができるか又は親和性精製部分もしくは付着部分を含有することができる増幅プライマー（例えば、ステム−ループプライマー）を含むことができる。該キットは、増幅試薬を更に含むことができ、特定の増幅プロトコールに必要とされる他の適切に梱包された試薬及び材料も含むことができる。
【００６３】
このため、本発明の方法は、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤又はシクロスポリン処置に対するレスポンダー又は非レスポンダーとなる対象の部分集合を定義可能とする。
【００６４】
したがって、本発明の更なる目的は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象において、コルチコステロイドにより急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、ａ）目的ｎｏ．１に記載の方法を行うことにより、対象がコルチコステロイドに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてレスポンダーであると考えられた場合には、コルチコステロイドを投与する工程とを含む、方法に関する。
【００６５】
本発明の更なる目的は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象において、抗ＴＮＦα剤により急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、ａ）目的ｎｏ．２に記載の方法を行うことにより、対象が抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてレスポンダーであると考えられた場合には、抗ＴＮＦα剤を投与する工程とを含む、方法に関する。
【００６６】
本発明の更なる目的は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象において、シクロスポリンにより急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、ａ）目的ｎｏ．３に記載の方法を行うことにより、対象がシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてレスポンダーであると考えられた場合には、シクロスポリンを投与する工程とを含む、方法に関する。
【００６７】
本発明の更なる目的は、急性重症大腸炎（ＡＳＣ）の処置を必要とする対象において、コルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤、シクロスポリン又は結腸切除術により急性重症大腸炎（ＡＳＣ）を処置する方法であって、ａ）目的ｎｏ．４に記載の方法を行うことにより、対象がコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対するレスポンダーとなるか、又は非レスポンダーとなるかを判定する工程と、ｂ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対するレスポンダーであると考えられた場合には、コルチコステロイドを投与する工程、ｃ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対する非レスポンダーであり、抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーであると考えられた場合には、抗ＴＮＦα剤を投与する工程、ｄ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイドに対する非レスポンダーであり、シクロスポリンに対するレスポンダーであると考えられた場合には、シクロスポリンを投与する工程、並びに、ｅ）前記対象が工程ａ）においてコルチコステロイド、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンに対する非レスポンダーであると考えられた場合には、結腸切除術を行う工程とを含む、方法に関する。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「結腸切除術」という用語は、大腸（large intestine）（大腸（colon））の任意の程度の外科的切除を指す。本明細書において、結腸切除術は、結腸右半切除術、結腸左半切除術、拡大半結腸切除術、横行結腸切除術、S状結腸切除術、直腸S状結腸切除術、ハルトマン手術、「二重バレル」又はＭｉｋｕｌｉｃｚ人工肛門形成術、結腸全摘除術（Ｌａｎｅ手術としても公知）、結腸大腸全摘除術及び結腸亜全摘除術を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
一部の実施態様では、本発明の方法は、本発明の方法を行うことにより、対象がコルチコステロイドに対する非レスポンダーであり、抗ＴＮＦα剤に対するレスポンダーであり、シクロスポリンに対するレスポンダーであると考えられた場合、抗ＴＮＦα剤及びシクロスポリンを投与する工程を含む。
【実施例】
【００７０】
本発明は、下記実施例により更に例証されるであろう。ただし、この実施例は、本発明の範囲を限定すると何ら解釈されるものではない。
【００７１】
実施例
材料及び方法
患者
患者を2か所のフランスにおける三次施設：Beaujon病院（Assistance Publique des Hopitaux de Paris）及びHaut-Leveque（CHU de Bordeaux）病院から選択した。両施設の施設内審査委員会により、この研究は承認され、全ての患者に通知された。患者の選択を臨床ファイル及び病理データベースから遡及的に行った。組み入れ基準を下記のとおり：年齢１８歳超、ＥＣＣＯ基準［１６］に従って十分確立されたＵＣ診断、入院時における１０点超のＬｉｃｈｔｉｇｅｒ  ｉｎｄｅｘ［１７］に基づくＡＳＵＣエピソードでの入院及び入院後５日以内に行われた大腸生検についての可撓性の直腸Ｓ状結腸鏡検査とした。大腸生検を入院時又は、ＩＶステロイド処置の初日の間（３〜５日目でのこの処置に対する臨床応答の評価前）に採取した。除外基準は、下記のとおり：クローン病を有すること、入院時の生検が無いこと又はＲＮＡ量が不十分であること（５ng/μl未満）及びＡＳＵＣでの入院後３か月未満の経過観察期間とした。患者を２００７年１月から２０１４年１０月までリクルートした。同患者には、ＣＹＳＩＦ研究に以前に含まれた１１名の患者を含ませた。同研究では、ステロイド難治性ＡＳＵＣに対する第二選択医薬療法としてＣｓＡとＩＦＸとが比較された［９］。両施設において、患者に、第一選択治療としてのＩＶステロイド（少なくとも０．８mg/kg/d メチルプレドニゾロン）を受けさせた。３〜５日後に応答が不十分であった患者において、ＣｓＡ又はＩＦＸによる第二選択処置を臨床上の必要性及び熟練の臨床医のアドバイスにより結腸切除術を必要としない患者において開始した。ＣｓＡを２mg/kg/日で開始し、その後に、１５０〜２５０ng/mLのレベルを得るような血中濃度に適合させた。ＩＦＸを５mg/kgの通常用量で０、２及び６週で注入し、維持療法として継続した。チオプリンをステロイド、ＩＦＸ又はＣｓＡに応答する全ての患者に提供した。各処置について、使用された処置応答定義を、ＣＹＳＩＦトライアルからのものとした。処置失敗を１つ以上の下記条件：１０点超のＬｉｃｈｔｉｇｅｒ  ｉｎｄｅｘにより定義された７日目での臨床応答の不存在；１０点超又は３日間連続での３点超のＬｉｃｈｔｉｇｅｒ  ｉｎｄｅｘにより定義された３か月までの再発；新たな全身性ＵＣ治療の必要性；又は処置開始から３か月以内での結腸切除術もしくは死亡により定義した。逆に、処置成功を処置の最初の週内の少なくとも２日間連続でいずれの失敗基準なしに１０点未満のＬｉｃｈｔｉｇｅｒ  ｉｎｄｅｘにより定義した。
【００７２】
ＲＮＡ抽出
研究中に分析された生検を全て、Ｓ状結腸の炎症した粘膜から採取した。トータルＲＮＡをホルムアルデヒド固定及びパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織（７つの１０μm切片をミクロトームによりＦＦＰＥ組織ブロックから切断）から、RecoverAll（商標） Total Nucleic Acidキット（Ambion（登録商標）、life technologies（商標））を使用して抽出した。ＦＦＰＥサンプルを一連のキシレン及びエタノール洗浄を使用して脱パラフィン化し、ついで、厳密なプロテアーゼ消化に供した。核酸を急速なガラス繊維フィルタ法（同方法はフィルタ上でのＤＮＡｓｅ処理を含む）を使用して精製し、ついで、水中に溶出した。抽出されたトータルＲＮＡの純度及び量を分光計（Nanodrop（商標）分光計）によりアッセイした。全てのサンプルが、１．６超の２６０／２８０比を有した。
【００７３】
マイクロＲＮＡ評価
ヒトｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及び成熟ｍｉＲＮＡの発現レベルを、mirBASE v20に列記されたマイクロＲＮＡを１００％カバーするGeneChip（登録商標） miRNA4.0アレイ（Affymetrix, Santa Clara, USA）を使用して評価した。７０ng量 トータルＲＮＡをFlashTag Biotin HSR RNAラベル化キット（Affymetrix）を使用してビオチンラベル化した。簡潔に、サンプル中のターゲットＲＮＡへのポリ（Ａ）テーリング、続けて、ビオチン化シグナル分子のライゲーションにより開始した。一晩ハイブリダイゼーションした後、チップを特定のプロトコールに従ってfluidic station FS450（Affymetrix）で洗浄し、GCS3000 7Gを使用してスキャンした。ついで、スキャン画像をExpression Consoleソフトウェア（Affymetrix）により分析して、生データ（ＣＥＬファイル）及び品質管理のための基準を得た。これらの基準のうちの幾つかの観察及び生データの分布研究から、外れ値は示されなかった。ついで、ハイブリダイゼーションデータ（ＣＥＬファイル）をｍｉＲＮＡ  ＱＣツールにより正規化し、フラグ（存在又は不存在）によりフィルタした。アレイの生データを独立ｔ検定により分析した。
【００７４】
差分マイクロＲＮＡサイン発現分析
３，３９１個のｍｉＲＮＡ発現プロファイルについてのステロイド及びＣｓＡ／ＩＦＸのレスポンダーと非レスポンダーとの間の類似性を測定するために、R package「Limma」［１９］から適合された一般線形モデルを使用して、データをモデル化した。この段階で、「レスポンダー」ラベルも「非レスポンダー」ラベルもマトリックスの構築には考慮しなかった。第１のセットの２４個のｍｉＲＮＡ候補を偽発見率（ｆｄｒ＜０．０５）に基づいてトップクラスの候補から選択した。その後に、注釈付きヒートマップをR package「Heatplus」［２０］を使用して生成した。加えて、患者データ、すなわち、ｍｉＲＮＡ発現レベルからの推定に基づく患者特性を、生体指標と統合する予測生体マーカーを特徴づけるための混合戦略を開発した。このアプローチは、２つの補完的な機能：（１）特定のｍｉＲＮＡに関連する知識についての教師なし照会を統合して、以前のセットの特性を改良すること及び（２）重要な医療関連臨床指標のリストを統合することに基づいている。
【００７５】
予測分析
分類アルゴリズム及び交差検証法
初期の生検から得られた生体プロファイルを第一選択及び第二選択ＡＳＵＣ医療処置に対する応答を予測するのに使用した。レスポンダー又は非レスポンダーからのサンプルの分類を一式の方法により評価した。同方法は、線形判別分析（ＬＤＡ）、トポロジーデータ分析（ＴＤＡ、［２１］）、ニューラルネットワーク又はランダムフォレストアルゴリズム（ＲＦ）を含む。ただし、目的に合わせたディープラーニングモデル（ＤＬ、［＊＊  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｏｔｔｏｍ］）は、他の方法より性能に優れ、２つのコホート研究においてより統計学的な堅牢性を示した。方法の検証に関して、一個抜き交差検証（ＬＯＯ、［２３］）アプローチを各サンプルに使用した。これらの計算において、２つの性能関数：（１）残差平方和の性能関数（ＳＳＥ）及び（２）下記式：［Σエラー／（サンプルサイズ）］×１００からなる分類スコアが反復的に説明した。分類スコアをＲＦ分類法についての検定力の概算として使用するが、当該予測アルゴリズムにおける変動係数（ＣＶ）を算出するのにＳＳＥを利用した。ＣＶは、残差平方和（ＳＳＥ）及びアウトカム値の相対サイズに関するモデル当嵌めに関係することが留意される。
【００７６】
予測精度の分析
各ＤＬ薬剤分類の性能をその受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線により分析した。先のセクションに記載されたとの類似する交差法を使用して当該特性選択法の検証も求めた。このため、患者がＬＯＯ交差検証中に候補リストから除去された場合、当該患者を含ませずに特性選択法を行い、発見コホート及び検証コホートの両方それぞれにおいて、この手法により得られた１５個及び９個のｍｉＲＮＡを順位付けした。したがって、サンプル外患者の予測を行う場合、特性選択プロセス中も、又は、分類アルゴリズムの訓練中も当該患者のデータを使用しなかった。
【００７７】
ターゲット予測及び経路分析
選択された差分的に発現されたｍｉＲＮＡの仮定のレギュラトリーターゲットが生体経路をどの程度変化させるかを判定するために、予測生体マーカー候補のマッピングを、２種類のグループ：すなわち、（１）ターゲットスキャン［２６］及びｍｉＲＢａｓｅ［２７］に対するＫＥＧＧ及びＲｅａｃｔｏｍｅ（［２４、２５］）；（２）マイクロＴ−ＣＤＳ［２９］及びＴａｒＢａｓｅ［３０］に対するｍｉｒＰａｔｈ［２８］における、４種類のデータベースに対して適用した。超幾何分析検定により、デレギュレーションされた機能又は経路に関する各遺伝子セットエンリッチメントを数学的に評価した。選択されたｍｉＲＮＡのターゲット分析に類似して、特定のＫＥＧＧ又はＲｅａｃｔｏｍｅジーンオントロジー（ＧＯ）［３１］カテゴリー又は経路でのターゲット遺伝子における成熟ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ領域を評価した。
【００７８】
結果
患者
ＡＳＵＣを有する４７名の患者を含ませた。１０名の患者について、ＡＳＵＣをＵＣのその最初の発生とした。すべての患者は、大腸炎の重篤な臨床及び生体サインを表し、１３．４点の平均Ｌｉｃｈｔｉｇｅｒ  ｉｎｄｅｘ及び６０．３mg/l 平均Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルを有した。すべての患者は、３のＭａｙｏ内視鏡サブスコアを有し、そのうち１１名は、深い潰瘍形成が認められた。完結に、１４名の患者は、第一選択のＩＶステロイドに応答し、ほとんどに、チオプリンで更に処置した。３３名の患者は、ステロイドに抵抗性であり、第二又は第三選択の処置が必要であった。これら３３名の患者の中でも、２４名にＩＦＸを受けさせ、１５名にＣｓＡを受けさせ、６名に両薬剤を受けさせた。このため、１２名の患者がＩＦＸに応答し、１２名は応答しなかった。加えて、９名の患者がＣｓＡに応答し、６名の患者が応答しなかった。ステロイド非レスポンダーにおいて、１０名の患者に経過観察中に結腸切除術を受けさせた。
【００７９】
マイクロＲＮＡ発現プロファイル
発見コホート
ＡＳＵＣのエピソードで入院した４７名の患者からのＦＦＰＥ中に固定された大腸生検において、３，３９１個のヒトマイクロＲＮＡの発現を測定した。ＦＦＰＥ大腸生検をＩＶステロイド処置前の３５名の患者の炎症した粘膜から得た。１２名の患者に、ＩＶステロイドコースの最初の３日以内に大腸生検を行った。教師なしクラスタリング分析から、ステロイドレスポンダーと非レスポンダーとを明らかに分ける、２４個の最初のｍｉＲＮＡ候補が示された。サインを減らすために、特性選択のための統合法を更に適用した。１５個のｍｉＲＮＡのセット：ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３６６７、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５９、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８及びｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐが選択された。ステロイド−非レスポンダーグループにおいて、生検を第一選択のステロイド処置前（又は同処置中）に得た第二選択治療レスポンダーと非レスポンダーとの間を区別するために、ｍｉＲＮＡを使用した値を評価した。先の選択法に従って、ＩＦＸ及びＣｓＡそれぞれに対する応答に関連する６つ（ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８）及び４つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−４４２３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１００）を特定した。第二選択処置のレスポンダーｖｓ非レスポンダーにおいて差分的に発現されたｍｉＲＮＡには、ステロイド応答に関連する１５個のｍｉＲＮＡのセットが含まれていた。
【００８０】
検証コホート
ｑＰＣＲ分析により、補助的にリクルートされた類似する組み入れ基準を有する２９名の更なる患者からのＦＦＰＥ中に固定された大腸生検において、１５個の選択されたヒトｍｉＲＮＡの発現を測定した。１５個のうちの９個のｍｉＲＮＡ：ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−３９３４、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−７１８、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５０ａ−５ｐ、ｈｐ＿ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６８が発現され、候補として残った。次に、これらの９個のｍｉＲＮＡ候補をステロイドレスポンダーと非レスポンダーとの間での検証コホートへの区分において評価した（データを示さず）。３個のｍｉＲＮＡがＩＦＸ及びＣｓＡに対する応答に関連した（データを示さず）。
【００８１】
ディープラーニング分類
ステロイド、ＩＦＸ及びＣｓＡのレスポンダーｖｓ非レスポンダーについてのｍｉＲＮＡ分類子を開発するために、複数の分類法を適用した（添付の表１を参照のこと）。それらの中でも、ディープラーニング（ＤＬ）法を選択した。同方法の性能は、発見コホート及び検証コホートの両方について最良であった（図３）。この選択をＬＯＯ検証前に生のスコア及びＣＶスコアに基づいて行った（方法を参照のこと）。次に、２つの分類別特性、１４の数値レベルによるマルチ分類を行い、３３のインプットニューロンを有すると予測するＤＬにより、表Ｓ１に示されたように、最良の結果を得た。特性選択の使用により、方法セクションに記載されたように、発見コホートについての分類子は、１５個のｍｉＲＮＡのステロイド応答、６個のｍｉＲＮＡのＩＦＸ応答及び４個のｍｉＲＮＡのＣｓＡ応答であり、検証コホートについては、９個のｍｉＲＮＡのステロイド応答、３個のｍｉＲＮＡのＩＦＸ応答及び３個のｍｉＲＮＡのＣｓＡ応答であった。この段階では、３，３９１個から１５−９、６−３又は４−３個のｍｉＲＮＡを選択した過剰適合の内因性リスクを注意する必要がある。そのために、教師なし生体照会のみに基づく特性選択戦略を開発し、この特性選択戦略を以後的にＬＯＯ交差検証戦略に統合した。更に、該分類子をいくつかの生体データ（以下を更に参照こと）と組み合わせて、発見コホートにおけるステロイド、ＩＦＸ及びＣｓＡに対するレスポンダーと非レスポンダーとの間での約９４％、約９０％及び約８３％、並びに、検証コホートにおけるステロイド、ＩＦＸ及びＣｓＡに対するレスポンダーと非レスポンダーとの間での約９０％、約８４％及び約８０％の分類成功レベルを達成した。
【００８２】
分類値安定性の改善のための生体データの付加
階層化戦略を改善するために、半教師有り法において、ｍｉＲＮＡサインに対する生検と同時に収集された生体サンプル種からの値を加えた。サンプル種には、白血球、赤血球、ヘマトクリット、ヘモグロビン、グルコース、フェリチン、トランスフェリン、アルブミン、鉄、好塩基球及びリンパ球カウント並びにＣ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）レベルを含ませた。重要なことは、ステロイド応答についての予後値が、選択されたｍｉＲＮＡと、５つの臨床関連生体パラメータ（ヘモグロビン、ヘマトクリット、アルブミン、ＣＲＰ及びトランスフェリンレベル）の非線形変換とを組み合わせることにより改善された。これにより、ＤＬ階層化アルゴリズムによるステロイド応答予測性能（図４及び表２を参照のこと）は、発見コホート及び検証コホートそれぞれについて、約９７％／約９３％の成功レベルに向上した。しかしながら、生体値の組み合わせにより、ＩＦＸ及びＣｓＡの応答分類子を改善させることはできなかった。
【００８３】
交差検証
当該予測子を数学的に検証するために利用したパラメータをＣＶとした。同ＣＶは、当該戦略により示された良好性の指数及び分類の生のスコアとして使用した。このため、このスコアから、各ＤＬ薬剤の分析を通して、分類をその関連するＲＯＣ曲線に従って行った（図４）、すなわち、発見コホート及び検証コホートについてのＡＵＣステロイド＝０．９２−０．９６／０．８３−０．９１（生体指標の組込みの有無）、ＡＵＣＩＦＸ＝０．８６及びＡＵＣＣｓＡ＝０．８１。分類子性能であるステロイド、ＩＦＸ及びＣｓＡについてのＣＶ値は、０．０３−０．０１（生体指標の有無）、０．０５及び０．０８（表２を参照のこと）であった。教師なし特性選択法のベンチマークから、各実行において類似する予後値が示された（データを示さず）。
【００８４】
討論
我々の知る限りでは、本研究は、ＩＢＤにおける高精度な医学のためのｍｉＲＮＡ系のバイオマーカーを確立するための最初の研究である。臨床アウトカムにおける予測子の特定は、ＡＳＵＣ処置における主な課題である。ＡＳＵＣのためのステロイド処置を開始した後の思わしくない臨床アウトカムを予測するための複数のスコアが確立されてきた。Travis et al.により、静脈内処置の３日目に、その日に９回以上の便又は４５mg/l超 ＣＲＰを含む３〜８回の頻繁な便を伴う患者に対する処置は失敗であったであろうことが決定された［１８］。Seo et al.により、複合活性インデックス（６０×血便＋１３×腸運動＋０．５×赤血球沈降速度−４×ヘモグロビン−１５×アルブミン＋２００）が提唱された［１９］。パイロット研究において、治療後の２週間で１８０点を下回るインデックスにより示されるＡＳＵＣを有する全ての患者において緩和が生じた。一方、１８０点を上回るインデックスを有する患者の約６５％は、その後に、結腸切除術を必要とした［２０］。ＩＢＤ  ＵＫ審査からの最近の研究では、ＡＳＵＣを有する４２０名の患者の各コホートにおけるステロイド失敗を予測するためのＴｒａｖｉｓ及びＨｏ  ｉｎｄｅｘの値が分析された［１１］。Ｔｒａｖｉｓ及びＨｏグループにおける高リスク患者では、より低いリスクグループと比較した場合、ステロイド治療により失敗したようであった。Ｔｒａｖｉｓについて６４．５％  ｖｓ．３８．７％（Ｐ＜０．０００１）及びＨｏについて６６．２％  ｖｓ．４６．７％  ｖｓ．３６．６％（Ｐ＜０．０００１）［１１］。これらの結果から、ステロイドに対するレスポンダーｖｓ非レスポンダーを階層化するためのこれらのインデックスの限られた値が強調される。
【００８５】
近年、生体指標は、ＡＳＵＣ臨床アウトカムに関連付けられた。Ho et al.には、便カルプロテクチンが結腸切除術を必要とした患者において有意に高かったことが示された［２１］。ＡＳＵＣの小児コホートにおいて、上昇した便Ｍ２−ピルバートキナーゼレベルは、ステロイド応答と関連付けられた［２２］。一方、簡易な臨床インデックスである小児ＵＣ活性インデックスは、ＡＳＵＣにおける静脈内ステロイドコース後のアウトカムを予測するのにおいて、便マーカーより良好に行われた。
【００８６】
多くの努力にも関わらず、現在、ＡＳＵＣにおける処置に対する応答の正確な予測子は存在しない。ＡＳＵＣを有する７９名の患者の小児コホートにおいて、ＩＶステロイドコースの３日目でのインターロイキン−６（ＩＬ−６）の血漿レベルは、レスポンダーと非レスポンダーとの間で有意に異なっていた［２３］。しかしながら、多変量分析において、ＩＬ−６は、ステロイド応答と関連付けられなかった。このことから、ステロイド経路の失敗よりむしろ疾患活性との関連付けが示唆される［２３］。多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）のＧ２６７７Ｔ／Ａ多型（ＴＴ遺伝子型）は、ＡＳＵＣのステロイド抵抗性エピソードを有する１５４名の患者のコホートにおけるＣｓＡ失敗のリスクと関連付けられた［２４］。しかしながら、この遺伝子マーカーは、検証されることも、日常の実施において使用されることもなかった。ＴＮＦ−アルファの粘膜発現は、ＵＣにおけるＩＦＸ対する内視鏡及び臨床応答に逆相関した［２５］。同じグループにおいて、ＩＬ−１７Ａ及びＩＦＮ−γの高い発現レベルが３回のＩＦＸ注入後の緩和と有意に関連付けられたことも決定された（それぞれ、ＯＲ＝５．４、ｐ＝０．０１３及びＯＲ＝５．５、ｐ＝０．０１１）［２６］。近年、ＩＦＸの便への損失は、ＡＳＵＣにおけるＩＦＸ失敗及び重篤な大腸クローン病と関連付けられた［２７］。
【００８７】
標準的な薬剤応答を予測する簡易なスコアは、ＡＳＵＣを有する患者を処置するのにも事足りない。このため、ｍｉＲＮＡは、関連する候補であると考えられた。ｍｉＲＮＡの特定の部分集合のディスレギュレーションが、ＵＣを有する患者の炎症又は活動していない大腸粘膜において行われた研究で特定された［２８］。複数のｍｉＲＮＡの異常な発現が、複数の独立した研究において同様に特定された。これらのｍｉＲＮＡの大部分は、炎症した大腸粘膜において特定された。このことから、ディスレギュレーションされた炎症プロセスにおけるその関与が示唆される（ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ等）。興味深いことに、他の疾患、大部分がガンにおいて、一部のｍｉＲＮＡが、その可能性のある予後値について研究されてきた。我々の知る限り、マイクロＲＮＡ系の予後バイオマーカーは、ＩＢＤ管理について未だに確立されていない。
【００８８】
この予測アルゴリズムを構築するために、ＡＳＵＣのエピソードで入院したＵＣを有する患者の遡及的で、２中心的な十分定義されたコホートを確立した。処置法、応答又は再発の評価及び定義は、ＣＹＳＩＦランダム化トライアル基準に従って厳密に定義された［９］。含まれた患者の異なる臨床アウトカム及び薬剤応答プロファイルも遡及的に特徴付けられた。アルゴリズムの予測性は、生化学及び分子サインが最初の処置前又は同処置の初日の間に得られた事実から生じる。１２名の患者は、第一選択のＩＶステロイドの間に取得されたその生検を有した。１５個の選択されたｍｉＲＮＡのそれらのサインは、それらのナイーブなＩＶステロイド患者との比較に影響を及ぼさなかった（データを示さず）。
【００８９】
全体として、この予測アルゴリズムは、簡易なｍｉＲＮＡサインの範囲を超える数学的アプローチを利用する。同アルゴリズムは、ニューロン判定法のＤＬ層を使用する階層化ツールを使用する。同判定法により、複数の比較が、患者個々のデータ（ステロイドについての１５−９個のマイクロＲＮＡの粘膜発現と５つの生体値）と、所定の処置に対するそれらの応答について十分特徴付けられた患者のマトリックスの個々のデータとの間でなされる。このため、該アルゴリズムで試験された各患者について、ｑＰＣＲにおいて９個のｍｉＲＮＡ発現と定量的挙動が処置アウトプットの水準に類似する５個の生体指標により構成されるシステムのソリューションセットを正確に捕捉する非線形式を学習させることにより、ＩＶステロイド、ＩＦＸ及びＣｓＡに対するそれらの応答の可能性が得られる。当該アプローチにより、限られたセットの応答ドライバを特定するのに加えて、ｍｉＲＮＡのセット全体を考慮した場合でも、分類法の性能範囲の改善、例えば、約８０％〜約９３％（生体データについては約９７％）のアウトリーチからの古典的なロジスティック回帰分析が可能となる。最近公開された他の類似する研究［２９］とは異なり、当該方法は、少数の患者に対処した。この限界に対処するために、提唱した予測アルゴリズムの新規性は、粘膜ｍｉＲＮＡのサインで構築されるだけでなく、（１）過剰適合事項を最小化するための純粋に教師なし特性選択段階、（２）ランダムフォレストアルゴリズムを使用する分類タスク及び（３）効率を改善するための生体データの付加による多目的な方法でも構築される。特に、Li et al.［２９］におけるように、最良のｍｉＲＮＡを選択するのに差分的発現又はランダムフォレスト変数に頼っていない。その代わりに、当該選択アプローチは、階層的クラスタリングによる教師なし特性選択と、特定されたｍｉＲＮＡを既存の生物学的知識と合致させることによる統合的データ分析との組み合わせによる。外部知識とのこの統合により、小数の患者についての教師なし特性選択の性能が向上する。分類タスクが関係する限り、ランダムフォレストアルゴリズム（［２９］で使用された重心アルゴリズムではない）を利用する。同ランダムフォレストアルゴリズムを、患者数が限られているため一個抜き交差検証により較正した。５つの生体データ種は、これらのデータが入院時に収集されたため、ステロイドに対する応答を予測するのに役立ったが、第二選択処置の応答予測には役立たなかったことは注目に値する。
【００９０】
興味深いことに、治療前内視鏡評価における深い潰瘍形成の存在は、薬剤応答プロファイルの予測とは関連付けられず、この項目は、最終的なＤＬ予測アルゴリズムには保持されなかった。
【００９１】
まとめると、当該研究により、ＡＳＵＣにおける第一選択及び第二選択処置に対する応答のための最初の予測ツールが提供される。当該結果から、遡及的に検証される必要がある場合でも、ＵＣにおける予測医療の開発を促進される。
【００９２】
参考文献
この出願全体を通して、種々の参考文献には、本発明が属する技術水準が記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表２】
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2019520071.tif 000004
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【国際調査報告】
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