(57)【要約】  本発明は、ブタシルコウイルス2型キャプシドタンパク質の調製方法及び前記を含む医薬組成物を提供する。当該調製方法は、ブタシルコウイルス2型キャプシドタンパク質の発現にアラビノース誘導発現ベクターを用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（a）アラビノース誘導発現ベクターを入手する工程、ここで、前記アラビノース誘導発現ベクターは発現エレメント及び標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記発現エレメントは、プロモーター、配列番号:01を有するT7ファージ翻訳強化エレメント、及び配列番号:02を有するリボソーム結合部位を含み；
（b）前記アラビノース誘導発現ベクターで大腸菌宿主を形質転換し、前記標的タンパク質の発現を誘導する工程、
を含む、タンパク質を発現する方法であって、
前記標的タンパク質はブタシルコウイルス2型（PCV2）キャプシドタンパク質又はブタインターフェロンである、前記方法。
【請求項２】
プロモーターの-16部位が配列番号:03を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
発現エレメントが配列番号:04を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アラビノース誘導発現ベクターがさらに、融合パートナーをコードするヌクレオチド配列及び/又はマーカー分子をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
融合パートナーが、大腸菌のMsyB、大腸菌のYjgD、ラムダファージのDタンパク質、パン酵母のSUMOタンパク質、又はそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マーカー分子が、Hisタグ、Strep IIタグ、Flagタグ、又はそれらの組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
標的タンパク質が、配列番号:09又は配列番号:24からコードされるPCV2キャプシドタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アラビノース誘導発現ベクターが配列番号:46を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ブタインターフェロンがブタインターフェロン-α又はブタインターフェロン-γである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的タンパク質がブタインターフェロンであり、ブタインターフェロンが配列番号:64又は配列番号:76からコードされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アラビノース誘導発現ベクターが配列番号:80、配列番号:87又は配列番号:95を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ブタインターフェロンの折畳み工程を含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに標的タンパク質を精製する工程（c）を工程（b）の後に含む、請求項８又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
さらに標的タンパク質をSUMOプロテアーゼで処理する工程（d）を工程（c）の後に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程（d）において、標的タンパク質対SUMOプロテアーゼの重量比が4：20である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
2.5〜250μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、
2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-α、
2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び
医薬的に許容できる担体、
を含む、ブタシルコウイルス2型（PCV2）感染を予防する組成物。
【請求項１７】
さらに医薬的に許容できるアジュバントを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
医薬的に許容できるアジュバントが、MONTANIDETM ISA 536VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、フロイントの完全又は不完全アジュバント、アルミニウムゲル、界面活性剤、多価陰イオンポリマー、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
3.5〜170μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、
5〜20μg/mLのブタインターフェロン-α、
5〜20μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び
医薬的に許容できる担体、
を含む、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PCV2キャプシドタンパク質の調製方法、具体的には原核細胞発現系を用いてPCV2キャプシドタンパク質を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタシルコウイルス2型（PCV2）は、世界中の養豚産業に甚大な影響を及ぼすウイルス病原体である。PCV2は主として離乳後の多器官消耗症候群（PMWS）を引き起こし、その症状は、発熱、リンパ節腫脹、体重減少又は衰弱、呼吸困難、下痢、身体蒼白、稀には黄疸などである。それはまたブタの皮膚炎及び腎症症候群（PDNS）、伝染性先天性振戦（ICT）、及び繁殖異常を引き起こすことがある。加えて、PCV2と他のウイルス又は細菌病原体との合併感染はブタの呼吸器疾患複合症（PRDC）を引き起こす。ブタのPCV2感染によって引き起こされる疾患は生存率低下及び飼料変換率の低下を生じ、養豚業者に深刻な経済的損失をもたらす。
当分野ではPCV2を予防及び制御するために飼育及び管理に関し20項目が提唱されている（例えばオールイン/オールアウト（AIAO）、正しい衛生管理、重篤な症状を有するブタの排除又は分離、及びワクチン接種）。とりわけ、ワクチン接種はPCV2感染率を効果的に低下させ、さらにまた生存率を増加させることができる。当分野のこれまでのPCV2ワクチンは3つのカテゴリーに分けられ、それには不活化PCV2ワクチン、不活化バキュロウイルスサブユニットワクチン、及び不活化PCV1-PCV2キメラウイルスワクチンが含まれる（Beach and Meng, 2012; Chanhee, 2012）。
【０００３】
不活化PCV2ワクチンは、ブタ腎細胞株PK-15にPCV2を感染させ、ウイルスを採集して不活化し、このウイルスをアジュバントと混合することによって生成される。不活化バキュロウイルスサブユニットワクチンについては、PCV2キャプシドタンパク質をコードするORF2遺伝子を保有するバキュロウイルスを昆虫細胞にトランスフェクトし、ORF2抗原を発現させる。抗原が細胞内で発現される場合は、細胞を含む培地を超音波破壊し、ウイルスを不活化し、さらにウイルスをアジュバントと混合することによってワクチンが調製される。抗原が細胞外環境に分泌される場合は、細胞培養上清を収集し、ウイルスを不活化し、さらにウイルスをアジュバントと混合することによってワクチンが調製される。不活化PCV1-PCV2キメラウイルスワクチンは、PCV1 ORF2をPCV2 ORF2に入れ替えて細胞を感染させ、ウイルスを採集し、ウイルスを不活化し、さらにウイルスをアジュバントと混合することによって調製される。
従来のPCV2ワクチン生成方法はいずれもウイルスを培養する方法を基本にしているという事実を見れば、これらの方法は長い調製時間及び高い製造コストという欠点を有する。PCV2ワクチンのコスト削減のために、現場の研究者らは、ワクチン抗原ORF2の製造のためにより培養コストの低い組換え大腸菌（E.coli）の使用を試みた。しかしながら、当該方法は、低いORF生産性、組換えORF2ウイルス様粒子の形成不能、複雑なプロセス又は低い免疫性という問題を有する。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、PCV2キャプシドタンパク質の調製方法を提供することであり、前記方法はPCV2ワクチンの製造時間及びコストを削減する。
本発明の別の目的は、PCV2感染を予防する組成物を提供することである。当該組成物は活性成分としてPCV2キャプシドタンパク質を使用しさらに適切なアジュバントを含み、当該産業のためにPCV2感染の予防ツールを提供する。
本発明の別の目的はブタインターフェロンの調製方法を提供することであり、前記方法は、ブタインターフェロンの製造時間及びコストを削減し、PCV2感染予防のための組成物にブタインターフェロンを適用し易くする。
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明はタンパク質を発現する方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：（a）アラビノース誘導発現ベクターを入手する工程（ここで、当該アラビノース誘導発現ベクターは発現エレメント及び標的タンパク質をコードする核酸配列を含み、当該発現エレメントは、プロモーター、配列番号:01を有するT7ファージ翻訳強化エレメント、及び配列番号:02を有するリボソーム結合部位を含む）；（b）当該アラビノース誘導発現ベクターで大腸菌宿主を形質転換する工程及び標的タンパク質の発現を誘導する工程（ここで、当該標的タンパク質はPCV2キャプシドタンパク質又はブタインターフェロンである）。
好ましくは、当該プロモーターの-16部位は配列番号:03を有する。
好ましくは、当該発現エレメントは配列番号:04を有する。
好ましくは、当該アラビノース誘導発現ベクターはさらに、融合パートナーをコードするヌクレオチド配列及び/又はマーカー分子をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、融合パートナーは、大腸菌のMsyB、大腸菌のYjgD、ラムダファージのDタンパク質、パン酵母のSUMOタンパク質、又はそれらの組合せである。好ましくは、マーカー分子は、Hisタグ、Strep IIタグ、FLAGタグ、又はそれらの組合せである。
好ましくは、標的タンパク質は、配列番号:09又は配列番号:24からコードされるPCV2キャプシドタンパク質である。好ましくは、アラビノース誘導発現ベクターは配列番号:46を有する。
【０００６】
好ましくは、ブタインターフェロンはブタインターフェロン-α又はブタインターフェロン-γである。好ましくは、標的タンパク質はブタインターフェロンであり、ブタインターフェロンは配列番号:64又は配列番号:76からコードされる。好ましくは、アラビノース誘導発現ベクターは配列番号:80、配列番号:87又は配列番号:95を有する。好ましくは、当該方法はブタインターフェロンの折畳み工程を含まない。
好ましくは、当該方法はさらに工程（b）の後で標的タンパク質を精製する工程（c）を含む。好ましくは、当該方法はさらに、工程（c）の後で標的タンパク質をSUMOプロテアーゼで処理する工程（d）を含む。好ましくは、工程（d）で、標的タンパク質対SUMOタンパク質の重量比は4：20である。
【０００７】
本発明はさらにPCV2感染を予防するための組成物を提供し、前記組成物は、2.5〜250μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-α、2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。
好ましくは、当該組成物はさらに医薬的に許容できるアジュバントを含む。好ましくは、当該医薬的に許容できるアジュバントは、MONTANIDETM ISA536 VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、フロイントの完全又は不完全アジュバント、アルミニウムゲル、界面活性剤、多価陰イオンポリマー、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せである。
好ましくは、当該組成物は、3.5〜170μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、5〜20μg/mLのブタインターフェロン-α、5〜20μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。
要約すれば、本発明は主として、アラビノース誘導発現ベクターを用いることによってタンパク質を発現する方法を提供する。本発明の方法は、PCV2キャプシドタンパク質及びワクチンでアジュバントとして用いられるブタインターフェロンの合成を効果的に促進する。他方、本発明の医薬的組成物は、優れた免疫原性誘発効果を得るために、当該キャプシドタンパク質及び他の有益な成分を適切な割合で結合させる。したがって、本発明の開示は当分野でのPCV2の予防及び治療のために顕著な利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１で調製したPCV2キャプシドタンパク質の5つの発現ベクターの模式図である。
【図２】実施例１で作成した５つの発現ベクターによる大腸菌宿主の形質転換後の当該大腸菌における短パク質発現の結果を、タンパク質の電気泳動及びウェスタンブロットを用いることによって示す。（A）タンパク質電気泳動の結果。（B）ウェスタンブロットの結果。レーン1：BL21(DE3)/pET29a；レーン2：BL21(DE3)/pET-SUMO-ORF2；レーン3：BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-ORF2；レーン4：Rosetta2/pET-SUMO-ORF2；レーン5：BL21(DE3)/pET-SUMO-OPTORF2；レーン6：BL21(DE3)/pET-OPTSUMO-OPTORF2；レーン7：BL21/pBA-OPTSUMO-OPTORF2。
【図３】実施例1で作製した4つの発現ベクターによって、大腸菌宿主の形質転換後に当該大腸菌で発現された融合タンパク質の可溶性を、タンパク質の電気泳動を用いることによって示す。
【図４】プラスミドpBA-OPTSUMO-OPTORF2を保有する大腸菌BL21(DE3)によって発現されたタンパク質及び金属イオン固定親和性クロマトグラフィーによって精製されたタンパク質の電気泳動図を示す。レーン1：大腸菌BL21(pBA-OPTSUMO-OPTORF2)の全細胞溶解物；レーン2：精製された融合タンパク質。
【図５】実施例2の組換えSUMOプロテアーゼ（SUMOPH）及び組換えD-SUMOプロテアーゼ（DSUMOPH）の宿主細胞（大腸菌BL21(DE3)）におけるタンパク質発現の結果を、タンパク質の電気泳動及びウェスタンブロットを用いることによって示す。（A）タンパク質電気泳動の結果。（B）ウェスタンブロットの結果。T：全細胞溶解物；S：可溶性タンパク質分画；IS：不溶性タンパク質分画。矢印は標的タンパク質を示す。
【図６】プラスミドpET-SUMOPH及びpET-D-SUMOPHを保有する大腸菌BL21(DE3)によって発現されたタンパク質並びに金属イオン固定親和性クロマトグラフィーによる精製タンパク質の電気泳動の図を示す。レーン1：精製SUMOプロテアーゼ（SUMOPH）；レーン2：精製D-SUMOプロテアーゼ（DSUMOPH）。
【図７】精製SUMO-ORF2、消化SUMO-ORF2及び精製ORF2の電気泳動の図を示す。レーン1：精製SUMO-ORF2融合タンパク質、レーン2：D-SUMOプロテアーゼによるSUMO-ORF2の切断混合物、レーン3：精製ORF2（100kDa分子量カットオフ膜でろ過した切断混合物）。
【図８】SUMO-ORF2融合タンパク質（A）、消化SUMO-ORF2（プロテアーゼによって切断したSUMO-ORF2融合タンパク質）（B）、及び精製ORF2（C）のウイルス様粒子の透過型電子顕微鏡画像を示す。
【図９】実施例3の組換えブタインターフェロンのタンパク質発現の電気泳動図を示す（T：全細胞溶解物；S：可溶性タンパク質分画）。(A)pET-OPTPIFNAH/大腸菌Shuffle；(B)pBA-OPTPIFNAH/大腸菌Shuffle；（C）pET-SUMO-OPTPIFNAH/大腸菌Shuffle；（D）pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH/大腸菌Shuffle；（E）pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH/大腸菌Shuffle；（F）pET-OPTPIFNRH/大腸菌BL21(DE3)；（G）pET-SUMO-OPTPIFNRH/大腸菌BL21(DE3)；（H）pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH/大腸菌BL21(DE3)；（I）pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH/大腸菌BL21(DE3)。矢印は標的タンパク質を示す。
【図１０】実施例3で発現された精製組換えブタインターフェロンの電気泳動図を示す。レーン1：大腸菌Shuffle(pET-OPTPIFNAH)によって発現された精製融合タンパク質；レーン2：大腸菌Shuffle(pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH)によって発現されD-SUMOプロテアーゼ切断され[pET-D-SUMOP/大腸菌BL21(DE3)細胞破壊]さらに精製された後の融合タンパク質；レーン3：大腸菌BL21(DE3)によって発現され(pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH)、D-SUMOプロテアーゼによって切断され[pET-D-SUMOP/大腸菌BL21(DE3)細胞破壊]さらに精製された後の融合タンパク質。
【図１１】実施例4の実験3のサンプルによって誘発されたブタの抗PCV2抗体力価のELISAによる結果を示す。
【図１２】実施例4の実験3のサンプルによってブタで軽減されたウイルス血症レベルを示す。
【図１３】実施例4の実験4のサンプルによって誘発されたブタの抗PCV2抗体力価のELISAによる結果を示す。
【図１４】実施例4の実験4のサンプルによってブタで軽減されたウイルス血症レベルを示す。
【図１５】実施例4の実験5のサンプルによって誘発されたブタの抗PCV2抗体力価のELISAによる結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
上記に記載したように、大腸菌発現系によりPCV2キャプシドタンパク質を生成するためにこれまで試みが為されてきたけれども、本発明の時点では、収量が低いという欠点は未だに克服されてなかった。したがって、PCV2の流行予防の進展に障害が存在する。
本発明の方法は、台湾特許出願103146225号（出願日：2014年12月30日）で本発明の出願人によって開示されたアラビノース誘導性発現エレメントをPCV2キャプシドタンパク質の発現のために用いる。当該台湾特許出願103146225号の全内容は参照により本発明に含まれる。
本明細書で用いられるように、“標的タンパク質”は原核細胞系によって発現されることが意図されるタンパク質を指す。本発明では、前述の標的タンパク質はPCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α、又はブタインターフェロン-γである。
本明細書で用いられるように、“標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列”又は他の同様な記述は、前述の標的タンパク質をin vivo又はin vitro転写/翻訳メカニズムによって形成することができるヌクレオチド配列を指す。したがって、“PCV2キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列”又は本発明の“ブタインターフェロンをコードするヌクレオチド配列”もまた上記のように定義される。同様に、“融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列”又は本発明の“マーカー分子をコードするヌクレオチド配列”もまた上記のように定義される。
【００１０】
本明細書で用いられるように、“融合パートナー”は、前述の合成される標的タンパク質の可溶性を増すために用いられる分子を指す。上記の目的のために、融合パートナーをコードするヌクレオチド配列及び前述の標的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、遺伝子操作方法によって同じ発現ベクター内で構築され、したがって前述の標的タンパク質は前述の融合パートナーと一緒に融合タンパク質として合成される。前述の融合パートナーは、例えば、大腸菌のMsyB、大腸菌のYjgD、ラムダファージのDタンパク質、パン酵母のSUMOタンパク質、又はそれらの組合せであるが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられるように、“マーカー分子”は、前述の標的タンパク質の合成の監視を容易にする分子、又は前述の標的タンパク質の精製を容易にする分子を指す。上記の目的のために、マーカー分子のヌクレオチド配列及び前述の標的タンパク質のヌクレオチド配列は、遺伝子操作方法により同じ発現ベクター内で構築され、したがって前述の標的タンパク質は前述のマーカー分子と一緒に融合タンパク質として合成される。前述のマーカー分子は、例えばHisタグ、Strep IIタグ、FLAGタグ又はそれらの組合せであるが、ただしこれらに限定されない。
【００１１】
本発明の第一の特徴は、PCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α、又はブタインターフェロン-γを調製する方法に関する。前述の方法は、（a）アラビノース誘導発現ベクターを入手する工程（ここで、当該アラビノース誘導発現ベクターは発現エレメント及び標的タンパク質をコードする核酸配列を含む）；及び（b）当該アラビノース誘導発現ベクターで大腸菌宿主を形質転換して当該標的タンパク質の発現を誘導する工程を含む。
また別の実施態様では、前述の標的タンパク質はPCV2キャプシドタンパク質である。また別の実施態様では、前述の標的タンパク質はブタインターフェロン-α又はブタインターフェロン-γである。
【００１２】
好ましい実施態様では、前述の発現エレメントは、本発明の出願人によって台湾特許出願103146225号（出願日：2014年12月30日）に記載されたものである。具体的には、前述の発現エレメントは、プロモーター、T7ファージ翻訳強化エレメント、及びリボソーム結合部位を含む。例えば、前述の実行エレメントは、台湾特許出願103146225号に記載されたaraB-M11発現エレメントである。
好ましい実施態様では、前述のT7ファージ翻訳強化エレメントは配列番号:01を有する。好ましい実施態様では、前述のリボソーム結合部位は配列番号:02を有する。好ましい実施態様では、前述のプロモーターの-16部位は配列番号:03を有する。好ましい実施態様では、前述の発現エレメントは配列番号:04を有する。
また別の実施態様では、前述の工程（b）はさらに、前述の標的タンパク質を精製する工程（c）を伴う。本発明の方法でマーカー分子としてHisタグが用いられるとき、当該標的タンパク質は金属イオン固定親和性クロマトグラフィーによって精製できる。
また別の実施態様では、本発明の方法で前述の融合パートナーとしてSUMOタンパク質が用いられるとき、前述の工程（c）の後に、標的タンパク質がSUMOプロテアーゼで処理される工程（d）がさらに含まれる。上記にいう“処理される”とは、SUMO融合パートナーがSUMOプロテアーゼによって切断されて当該標的タンパク質がSUMOタンパク質から分離されることを指す。
【００１３】
また別の実施態様では、SUMOプロテアーゼはT7発現ベクターによって生成される。好ましい実施態様では、前述の処理において標的タンパク質対SUMOプロテアーゼの重量比は4対20である。
好ましい実施態様では、前述の方法はブタインターフェロンの再折畳み工程を含まない。当業者には理解されるところであるが、原核細胞発現系の“再折畳み工程”は、尿素又は塩酸グアニジンを用いて封入体を分解し、得られたポリペプチドを続いて透析及び他の工程により再度折り畳むことによってポリペプチドの三次元又は四次元構造を形成するプロセスを意味する。したがって、本発明の“ブタインターフェロンの再折畳み工程を含まない”とは、本発明の方法で調製されるポリペプチドは、尿素又は塩酸グアニジン及び透析無しに自己折畳みを経て所望のタンパク質を形成できることを意味することは当業者には理解されよう。
また別の実施態様では、宿主は大腸菌である。好ましくは、大腸菌はBL21、BL21(DE3)、Rosetta、又はShuffleである。
【００１４】
本発明の第二の特徴はPCV2感染予防のための組成物であり、前記組成物はPCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α、ブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。
好ましい実施態様では、PCV2感染予防のための組成物は、2.5〜250μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-α、2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。なお別の好ましい実施態様では、PCV2感染予防のための組成物は、3.5〜170μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、5〜20μg/mLのブタインターフェロン-α、5〜20μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。
好ましい実施態様では、PCV2キャプシドタンパク質は本発明の方法によって生成される。好ましい実施態様では、ブタインターフェロン-α及び/又はブタインターフェロン-γは本発明の方法によって生成されるものである。
【００１５】
本発明の“医薬的に許容できる担体”は、医学的/製薬的見地から、当該組成物中のPCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α及び/又はブタインターフェロン-γによるPCV2感染予防の目的に対して負の影響を与えない物質を指す。また別の実施態様では、医薬的に許容できる担体は、例えば水、リン酸緩衝食塩水、アルコール、グリセリン、キチン、アルギン酸塩、コンドロイチン、ビタミンE、鉱物、又はそれらの組合せであるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では、組成物はさらに医薬的に許容できるアジュバントを含む。本発明の“医薬的に許容できるアジュバント”は、医学的/製薬的見地から、当該組成物中のPCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α及び/又はブタインターフェロン-γによるPCV2感染予防の目的を促進しさらに免疫性を高める物質を指す。また別の実施態様では、医薬的に許容できるアジュバントは、例えばMONTANIDETM ISA536 VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、フロイントの完全又は不完全アジュバント、アルミニウムゲル、界面活性剤、多価陰イオンポリマー、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せであるが、ただしこれらに限定されない。好ましい実施態様では、医薬的に許容できるアジュバントは、MONTANIDETM ISA536 VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、又はそれらの組合せである。
本発明の研究プロセスは下記実施例でさらに詳述されるであろう。しかしながら、下記の内容はより良い理解のために本発明の特色を単に例示するものである。本発明の趣旨から外れることなく下記の内容を修正し、さらに当分野の一般的な知識に基づいて下記の内容を当業者が変更することは可能であろうが、それらはなお本発明の範囲内である。
【００１６】
［実施例１］
PCV2キャプシドタンパク質（PCV2 ORF）発現ベクターの構築
PCV2ウイルスの単離及び配列決定
PCV感染を有する養豚場（Yunlin, Taiwan）から病気のブタのリンパ系器官（例えば脾臓及びリンパ節）を入手した。滅菌したハサミで切断後、リンパ系器官を無菌的な乳鉢及び乳棒ですり潰し、適量の無菌的リン酸緩衝溶液を加えて混合し乳濁液を作成した。当該乳濁液を遠心分離して（6,000ｘg、20分）上清を収集し、続いて上清をこし器でろ過して組織屑を除去した。DNAの抽出はDNA精製キット（DNeasy Blood & Tissue kit; Qiagen, USA）を用いて実施した。100μLの乳濁液上清を180μLのATL緩衝液及び20μLのプロテイナーゼK（10mg/mL）に加え、56℃で2時間インキュベートした。その後、200μLの無水アルコールを加えて良く混合した。全溶液をピペットでスピンカラムに移し、前記カラムを収集チューブに置いて遠心分離した（6,000ｘg、1分）。スピンカラムを新しい収集チューブに置き、500μLのAW1緩衝液を当該チューブに加え、チューブを遠心分離した（6,000ｘg、1分）。当該スピンカラムを新しい収集チューブに置き、500μLのAW2緩衝液を当該スピンカラムに加え、このスピンカラムを遠心分離した（20,630ｘg、5分）。スピンカラムを無菌的なエッペンドルフに置き、適量の無菌的脱イオン水を加えてDNAを溶出させた。
プライマー、PCVF（5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGC-3'（配列番号:05））及びPCVR（5'-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCGTTTTC-3'（配列番号:06））を設計し、PCV2ゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅した。PCR反応混合物の体積は100μLであり、10μLのリンパ系器官抽出DNA；10μLのTaq緩衝液（ｘ10）；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；及び2.5UのDreamTaq DNAポリメラーゼ（Thermo, USA）が含まれていた。PCR反応条件は、94℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、59℃で30秒、72℃で1分及び30秒（35サイクル）；72℃で7分（1サイクル）であった。DNA電気泳動を用いて予想サイズを有するDNAフラグメントの存在を確認した。
【００１７】
PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップキット（GMbiolab, Taiwan）で回収し、yT&Aクローニングベクターキット（Yeastern, Taiwan）を用いてTAクローニングに付した。実験手順は当該製造業者の前記キットのためのマニュアルにしたがって実施した。回収して精製したPCR生成物の5μLを、2μLのyT&Aベクター、1μLの連結緩衝液A、1μLの連結緩衝液B、及び1μLのT4 DNAリガーゼ（2単位/μL）と一緒に良く混合した。この混合物を22℃で30分インキュベートした。前記連結混合物の1μLで大腸菌ECOS9-5（Yeastern, Taiwan）を形質転換した。形質転換細胞を1mLのSOC回収培地に添加し、250rpmで振盪した（37℃、60分）。その後で、前記細菌溶液の適量をアンピシリン含有（最終濃度100μg/mL）固形培地に塗布して37℃で16時間培養した。
その後、形質転換体をコロニーポリメラーゼ連鎖反応によって選別した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応の手順を以下に記載する。まず初めに、50μLの2ｘプレミックス反応緩衝液（GMbiolab, Taiwan）、0.5μLの100mM PCVFプライマー、0.5μLの100mM PCVRプライマー及び49μLの滅菌水をエッペンドルフに加えて良く混合した。PCR反応溶液をPCRチューブに分配した（10μL/チューブ）。爪楊枝でコロニーをPCRチューブに入れた後で、PCRを実施した。PCR反応条件は、95℃で5分（1サイクル）；95℃で30秒、59℃で30秒、72℃で1分及び30秒（25サイクル）；72℃で7分（1サイクル）であった。DNA電気泳動を用いて予想サイズを有するDNAフラグメントの存在を確認した。形質転換体中の組換えプラスミドが挿入DNAを保有することを確認した後、この形質転換体のプラスミドを抽出し、DNA配列決定を実施した（Tri-I Biotech, Inc.）。PCV2 DNAを含むプラスミドをpTA-PCV2と名付けた。
【００１８】
ORF2遺伝子（すなわちキャプシドタンパク質をコードする遺伝子）の増幅及びコドン最適化
（1）ORF2遺伝子の増幅：
pTA-PCV2を鋳型として用い、下記ORF2F/ORF2RプライマーセットによりORF2遺伝子増幅を実施する（ORF2F；5'-CAATATGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTC-3'（配列番号:7）及びORF2R；5'-GATATAGTCGACTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAA-3'（配列番号:08））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpTA-PCV2；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、60℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。アガロースゲル電気泳動を用いて、前記PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含んでいるか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップキットで回収した。配列決定の結果に基づき、ORF2遺伝子の配列は配列番号:09として示される。
【００１９】
（2）コドン最適化ORF2（OPTORF2）の遺伝子合成：
ORF2のアミノ酸配列を、大腸菌の好ましいコドンを基準にしたヌクレオチド配列に入れ替えた。プライマーは、前述のヌクレオチド配列を基準にして設計した：OPTORF2-T1、OPTORF2-T2、OPTORF2-T3、OPTORF2-T4、OPTORF2-T5、OPTORF2-T6、OPTORF2-T7、OPTORF2-T8、OPTORF2-T9、OPTORF2-T10、OPTORF2-T11、OPTORF2-T12、OPTORF2F及びOPTORF2R。プライマーの配列は表1に示す。
【００２０】
表1：コドン最適化ORF2（OPTORF2）遺伝子の合成に用いられたプライマー
2019504047.tif 000002
【００２１】
OPTORF2-T1からOPTORF2-T12を鋳型プライマーとして用い、OPTORF2及びOPTORF2Rを増幅プライマーとして用いた。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（OEPCR）をコドン最適化ORF2遺伝子の大量増幅のために用いた。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの各プライマー；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応の後で、アガロースゲル電気泳動を用いて、前記PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含んでいるか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットで回収した。配列決定の結果に基づき、コドン最適化ORF2遺伝子の配列は配列番号:24として示される。
【００２２】
SUMO遺伝子の増幅及びコドン最適化
（1）SUMO遺伝子の増幅：
サンライトフード社（Sun Right Food Co.）のDIYインスタント酵母から単離したパン酵母（サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae））をYPD培地（20%ペプトン、10%酵母抽出物、20%グルコース（pH 6.5））に接種し、200rpmで振盪培養した（30℃、16時間）。培養後、酵母ゲノムの抽出をYeaStarTMゲノムDNAキット（Zymo Research, USA）で実施した。1.5mLの一晩培養ブロスをエッペンドルフに加え、細菌分画を遠心分離（2,000ｘg、5分、室温）によって収集し、120μLのYD消化緩衝液及び5μLのR-ザイモラーゼを十分に混合して37℃で1時間インキュベートした。続いて、120μLのYD溶解緩衝液を前記混合物に添加し、数回穏かに混合した。250μLのクロロホルムを混合物に加え、1分間振盪した。上清を遠心分離（10,000ｘg、2分、室温）によって収集した。スピンカラムを収集チューブに置き、上清をスピンカラムに加えた。遠心分離（10,000ｘg、2分、室温）の後で、ろ液を廃棄した。300μLのDNA洗浄緩衝液をスピンカラムに添加し、このスピンカラムを遠心分離して（10,000ｘg、2分、室温）ろ液を廃棄し、前記手順を1回繰り返した。スピンカラムを無菌的エッペンドルフに置き、適量の溶出溶液を当該スピンカラムに加え、当該スピンカラム及びエッペンドルフを遠心分離（10,000ｘg、2分、室温））してゲノムDNAを溶出した。
先のパラグラフで得たサッカロミセス・セレビシアエのDNAゲノムを鋳型として用い、さらにプライマーセットとして以下のSUMOF/SUMOR用いることによって、SUMO遺伝子を増幅した（SUMOF（5'-GATATAGGTACCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAG-3'（配列番号:25））；SUMOR（5'-CAATATGGATCCACCACCAATCTG TTCTCTGTGAGC-3（配列番号:26））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；200ngのサッカロミセス・セレビシアエゲノムDNA；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後に、アガロースゲル電気泳動を用いて、前記PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含んでいるか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットで回収した。
【００２３】
（2）コドン最適化SUMO（OPTSUMO）遺伝子の合成：
SUMOのアミノ酸配列を、大腸菌の好ましいコドンを基準にしたヌクレオチド配列に入れ替えた。プライマーは、前述のヌクレオチド配列を基準にして設計した：OPTSUMO-T1、OPTSUMO-T2、OPTSUMO-T3、OPTSUMO-T4、OPTSUMO-T5、OPTSUMO-T6、OPTSUMO-T7、OPTSUMO-T8、OPTSUMOF及びOPTSUMOR。配列は表2に示す。
【００２４】
表2：コドン最適化SUMOの合成に用いられたプライマー
2019504047.tif 000003
【００２５】
OPTSUMO-T1からOPTSUMO-T8を鋳型プライマーとして用い、OPTSUMOF及びOPTSUMORを増幅プライマーとして用いた。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応をコドン最適化SUMO遺伝子の大量増幅のために用いた。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの各プライマー；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応の後で、アガロースゲル電気泳動を用いて、前記PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含んでいるか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップキットで回収した。配列決定の結果に基づき、コドン最適化SUMO遺伝子の配列は配列番号:37として示される。
【００２６】
ORF2融合タンパク質の発現ベクターの構築
（1）pET-DRAHISの構築：
PCR反応は、鋳型としてpET29aを、プライマーセットとして下記のDRAF/T7ターミネーターを用いて実施した：DRAF（5'-GATATACATATGAAAAAAAAATTCGTATCGCATCACCATCACCATCACAGCGGTGGTGGTACCCCAGATCTGGGTACCCTGG-3'（配列番号:38））；T7ターミネーター（GCTAGTTATTGCTCAGCGG（配列番号:39））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのEx TaqTM緩衝液；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpET29a及び1.25UのTakaRa Ex Taq DNAポリメラーゼ（Takara, Japan）を含んでいた。PCR反応条件は、94℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で50秒（35サイクル）；72℃で7分（1サイクル）であった。反応後に、アガロースゲル電気泳動を用いて、前記PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含んでいるか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットで回収した。
PCR生成物をNdeI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌XL1-blue（Protech, Taiwan）を形質転換した。DNA配列の確認のために、形質転換体をランダムに選択した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-DRAHISと名付けた。このプラスミドは開始コドンに続いて下流配列（DS）AAAAAAAAATTCGTATCG（配列番号:40）及びHisタグDNA配列CATCACCATCACCATCAC（配列番号:41）を有する。
【００２７】
（2）pET-SUMO-ORF2発現ベクターの構築：
SUMO遺伝子をサッカロミセス・セレビシアエのゲノムから増幅し、KpnI及びBamHIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET-DRAHISにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-SUMOと名付けた。
PCV2 Yunlinウイルスゲノムから増幅させたORF2遺伝子をBamHI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET-SUMOにT4 DNAリガーゼを用いて挿入した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-SUMO-ORF2と名付けた（配列番号:42の配列を有する）。
【００２８】
（3）pET-OPTSUMO-ORF2発現ベクターの構築：
合成OPTSUMO遺伝子をKpnI及びBamHIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET-DRAHISにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-OPTSUMOと名付けた。
PCV2 Yunlinウイルスゲノムから増幅させたORF2遺伝子をBamHI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET-OPTSUMOにT4 DNAリガーゼを用いて挿入した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-OPTSUMO-ORF2と名付けた（配列番号:43を有する）。
【００２９】
（4）pET-SUMO-OPTORF2発現ベクターの構築：
合成OPTORF2遺伝子をBamHI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET-SUMOにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-SUMO-OPTORF2と名付けた（配列番号:44を有する）。
（5）pET-OPTSUMO-OPTORF2発現ベクターの構築：
合成OPTORF2遺伝子をBamHI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET-OPTSUMOにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-OPTSUMO-OPTORF2と名付けた（配列番号:45を有する）。
【００３０】
（6）pBA-OPTSUMO-OPTORF2発現ベクターの構築：
この実施例で構築するpBA-OPTSUMO-OPTORF2は、OPTSUMO-OPTORF2のDNAフラグメントを新規なアラビノース誘導性発現ベクターpBCM-araM11に挿入することによって入手された。pBCM-araM11は、アラビノース誘導性発現エレメント及びpBRCMMCS（配列番号:100）（台湾特許出願103146225号（出願日：2014年12月30日）及び103142753号（出願日：2014年12月9日）に開示）を用い本出願人によって構築された。この発現ベクターの構築プロセスを下記に記載する。
pARABM11-GFPTをEcoRI及びNdelIで切断した後、Gel-MTMゲル抽出システムキット（GMbiolab, Taiwan）を用いて、araC及びaraB-M11発現エレメントを含むDNAフラグメントを回収した。araC及びaraB-M11発現エレメントを同じ制限酵素で切断したpBRCMMCSにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別し、DNA配列の確認のためにプラスミドを抽出した。正確な配列を有するプラスミドをpBCM-araM11と名付けた（配列番号:98を有する）。
pET-OPTSUMO-OPTORF2をNdeI及びSalIで切断した後、Gel-MTMゲル抽出システムキット（GMbiolab, Taiwan）を用いて、OPTSUMO-OPTORF2を含むDNAフラグメントを回収した。OPTSUMO-OPTORF2を同じ制限酵素で切断したpBCM-araM11にT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別し、DNA配列の確認のためにプラスミドを抽出した。正確な配列を有するプラスミドをpBA-OPTSUMO-OPTORF2と名付けた（配列番号:46を有する）。
araB-M11発現エレメントを含むDNAフラグメントは本発明のアラビノース誘導性発現エレメントであり、プロモーター（当該-16部分は配列番号:03として示される）及びT7ファージ翻訳強化エレメント（配列番号:01）及びリボソーム結合部位（配列番号:02）を含む。当該アラビノース誘導性発現エレメントは台湾特許出願103146225号（出願日：2014年12月30日）に示されたとおりであり、配列番号:04を有する。
【００３１】
要旨
要約すれば、本実施例で、5つのPCV2キャプシドタンパク質発現ベクターが調製された。すなわち、pET-SUMO-ORF2（配列番号:42）pET-OPTSUMO-ORF2（配列番号:43）、pET-SUMO-OPTORF2（配列番号:44）、pET-OPTSUMO-OPTORF2（配列番号:45）、及びpBA-OPTSUMO-OPTORF2（配列番号:46）である。図1を参照されたい。
【００３２】
［実施例２］
本発明のPCV2キャプシドタンパク質の調製
上記で述べたように、実施例1で入手したベクター（配列番号:42〜46）は各々キャプシドタンパク質ORF2のDNAを含み、キャプシドタンパク質の生成に利用することができる。さらにまた、精製及び溶解性性能の目的のために、標的タンパク質をSUMOタンパク質及びHisタグと融合させた。この融合タンパク質は本明細書ではSUMO-ORF2融合タンパク質と称され、当該融合タンパク質がHisタグを含むという事実を再度述べることはないであろう。本実施例では実施例1に記載した発現ベクターを用いて、本発明のSUMO-ORF2融合タンパク質が調製されるであろう。
【００３３】
大腸菌の形質転換及び組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の誘導発現
（1）実験手順：
発現ベクター、例えばpET-SUMO-ORF2、pET-OPTSUMO-ORF2、pET-SUMO-OPTORF2、及びpET-OPTSUMO-OPTORF2で大腸菌BL21(DE3)（Yeastern, Taiwan）を形質転換した。pET-SUMO-ORF2で大腸菌Rosetta2（EMD Millipore, USA）を形質転換した。pBA-OPTSUMO-OPTORF2で大腸菌BL21（New England Biolabs, USA）を形質転換した。形質転換の方法は、製造業者によって提供された操作手順にしたがった。
大腸菌BL21(DE3)の形質転換体をカナマイシン含有（最終濃度：30μg/mL）LB培地に接種し、180rpmで振盪培養した（37℃）。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を1：100の割合でカナマイシン含有（最終濃度：30μg/mL）LB培地に接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌をOD600約0.4〜0.6の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）を添加した。誘導から4時間後に、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集し、SUMO-ORF2融合タンパク質の発現をタンパク質電気泳動及びウェスタンブロットによって観察した。ウェスタンブロット法に用いた一次及び二次抗体は、それぞれウサギ抗6Hisポリクローナル抗体（Protech, Taiwan）及びアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(H+L)であった。使用着色剤はNBT/BCIP（Thermo, USA）であった。細菌の可溶性及び不溶性タンパク質もまた弁別し、SUMO-ORF2融合タンパク質の可溶性はタンパク質電気泳動によって観察した。
【００３４】
大腸菌Rosetta2の形質転換体をクロラムフェニコール（34μg/mLの最終濃度）及びカナマイシン（30μg/mLの最終濃度）含有LB培地に接種した。振盪培養を180rpm、37℃で実施した。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を1：100の割合でクロラムフェニコール（34μg/mLの最終濃度）及びカナマイシン（30μg/mLの最終濃度）含有LB培地に接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌を約0.4〜0.6のOD600の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.1mMのIPTGを添加した。誘導から4時間後に、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集し、SUMO-ORF2融合タンパク質の発現をタンパク質電気泳動及びウェスタンブロットによって観察した。細菌の可溶性及び不溶性タンパク質もまた弁別し、SUMO-ORF2融合タンパク質の可溶性はタンパク質電気泳動によって観察した。
大腸菌BL21の形質転換体をクロラムフェニコール（25μg/mL）含有LB培地に接種した。振盪培養を180rpm、37℃で実施した。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を1：100の割合でクロラムフェニコール（25μg/mL）含有LB培地に接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌を約0.4〜0.6のOD600の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.2%のアラビノースを添加した。誘導から4時間後に、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集し、SUMO-ORF2融合タンパク質の発現をタンパク質電気泳動及びウェスタンブロットによって観察した。細菌の可溶性及び不溶性タンパク質もまた弁別し、SUMO-ORF2融合タンパク質の可溶性はタンパク質電気泳動によって観察した。
タンパク質電気泳動フィルムをスキャンした後、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の発現パーセンテージをイメージクォント（Image Quant）TL 7.0（GE Healthcare Life Sciences, USA）ソフトによって概算し、さらに融合タンパク質収量を計算した。
【００３５】
（2）実験結果：
結果は、pET-SUMO-ORF2及びpET-OPTSUMO-ORF2で形質転換し誘導を実施した大腸菌BL21(DE3)のグループでは、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質は完全に存在しないことを示した(図2)。pET-SUMO-ORF2で形質転換し誘導を実施した大腸菌Rosseta2のグループ（対応する希少コドンtRNAを生成することができる）では、結果によれば、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質は発現され(図2)、それらの大半は可溶性であった(図3)。可溶性の組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の収量は46.81mg/mLである。上記のORF2遺伝子は大腸菌BL21(DE3)では発現され得ないという事実は、ORF2が保持するコドンは大腸菌でのSUMO-ORF2融合タンパク質の性能に重大な影響を与えることを示している。
コドン最適化ORF2遺伝子を有するpET-SUMO-OPTORF2で大腸菌BL21(DE3)を形質転換し誘導を実施した。結果は、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質は首尾よく発現され(図2)、前記タンパク質は主に可溶性タンパク質であり(図3)、可溶性の組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の収量は54.62mg/mLであった。この結果は、ORF2コドンの最適化後、大腸菌BL21(DE3)におけるSUMO-ORF2融合タンパク質の性能は改善され得ることを示している。
【００３６】
コドン最適化ORF2完全長遺伝子及びコドン最適化SUMO遺伝子を保持するpET-OPTSUMO-OPTORF2発現ベクターで大腸菌BL21(DE3)を形質転換し誘導を実施した。結果は、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質は首尾よく発現され(図2)、前記タンパク質は主に可溶性タンパク質であり(図3)、可溶性の組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の収量は81.66mg/mLであった。この結果は、融合パートナー遺伝子のコドン使用頻度が最適化された後、大腸菌におけるORF2融合タンパク質の性能はさらに改善され得ることを示す。以前の研究では、最適化SUMO遺伝子コドンが融合タンパク質発現を増加させ得ることは全く示されなかった。本発明者らは、SUMO遺伝子コドンの最適化はSUMO-ORF2融合タンパク質の生成を高め得ることを確認した。
下流配列-HisタグDNA-コドン最適化SUMO遺伝子-コドン最適化ORF2遺伝子を保持するDNAフラグメントをアラビノース誘導性発現ベクターに挿入し、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の生成のために前記ベクターで大腸菌BL21を形質転換した。結果は、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質はまたアラビノース誘導性発現系を用いることによって生成され(図2)、前記タンパク質は主として可溶性タンパク質（図3）であることを示している。SUMO-ORF2融合タンパク質の生成のためにこの発現ベクターを用いることによって、最高の収量（103.04mg/mL）を達成することができた。T7発現系の最高収量（81.66mg/mL）と比較して、前記収量は約1.27倍増加し得た。本発明の実施例1の各発現ベクターは、本実験で下記表3に要約する可溶性SUMO-ORF2融合タンパク質収量を提示する。
【００３７】
表3：可溶性SUMO-ORF2融合タンパク質の収量
2019504047.tif 000004
【００３８】
金属イオン固定親和性クロマトグラフィーによる組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の精製
タンパク質は、当該タンパク質のN末端にHisタグを有するという組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の特色を利用することによって、金属イオン固定親和性クロマトグラフィーによって精製された（Hisタグはニッケル又はコバルトと共有結合を形成することができる）。精製は、タンパク質液体クロマトグラフィー系AKTAプライムプラス（GE Healthcare, Sweden）を用い5mLのHiTrapTM Niエクセルカラム（GE Healthcare, Sweden）で実施した。
ペレットを溶解緩衝液（50mMトリス-HCl、500mM NaCl（pH 8.0））に懸濁し、超音波粉砕装置によって破壊した。上清を遠心分離（8,000ｘg、15分）によって収集した。カラムを25mLの溶解緩衝液で平衡化した後、粉砕上清をHiTrapTM Niエクセルカラムに注入した。サンプル注入の完了後に、非特異的に結合したタンパク質を100mLの洗浄緩衝液（50mMトリス-HCl、500mM NaCl、30mMイミダゾール（pH 8.0））で洗浄した。最後に、樹脂上の組換えタンパク質を150mLの溶出緩衝液（50mMトリス-HCl、500mM NaCl、250mMイミダゾール（pH 8.0））で溶出させた。前記溶出緩衝液は、高濃度のイミダゾールによって組換えタンパク質と樹脂結合部位との結合について競合し、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質を樹脂から溶出させる。タンパク質電気泳動を用いて、組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の精製を観察した。実験結果は図4に示される。
【００３９】
本発明のSUMO-ORF2融合タンパク質はSUMOプロテアーゼで切断される
この実験はで、SUMOプロテアーゼを利用して、大腸菌発現系から調製したORF2融合タンパク質を切断した。切断後に、Hisタグ及びキャプシドタンパク質フラグメントを有するSUMO融合パートナーフラグメントを入手できる。この実験では、SUMOプロテアーゼを大腸菌発現系により生成し上述のように適用した。当業者はまた他の方法で得られるSUMOプロテアーゼを用いて前記工程を実施できる。
【００４０】
（1）組換えSUMOプロテアーゼ発現ベクターpET-SUMOPHの構築：
SUMOプロテアーゼ遺伝子を、鋳型としてサッカロミセス・セレビシアエゲノム及び鋳型セットとして下記のSUMOPF/SUMOPENZHISRを用いて増幅した：SUMOPF（5'-CAATATGGATCCCTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACG-3'（配列番号:47））、SUMOPENZHISR（5'-GATATACTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGACCACTGCCGCTACCTTTTAAAGCGTCGGTTAAAATCAAATG-3’（配列番号:48））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；200ngのサッカロミセス・セレビシアエのゲノムDNA；及び1U GDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
酵母ゲノムから増幅したSUMOプロテアーゼ遺伝子をBamHI及びXhoIで切断した後、このDNAフラグメントをBamHI及びSalIで切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-SUMOPHと名付けた（配列番号:49を有する）。
【００４１】
組換えD-SUMOプロテアーゼ発現ベクターpET-D-SUMOPHの構築：
Dタンパク質を、鋳型としてラムダファージDNA（Promega, USA）及びプライマーセットとして下記のDF及びDRを用いて増幅した：DF（5'-GATATAGGTACCATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC-3'（配列番号:50））、DR（5'-CAATATGGATCCAACGATGCTGATTGCCGTTC-3'（配列番号:51））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのラムダファージDNA；及び1U GDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
ラムダファージDNAから増幅したDタンパク質遺伝子をKpnI及びBamHIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-Dと名付けた（配列番号:99を有する）。
酵母ゲノムから増幅したSUMOプロテアーゼ遺伝子をBamHI及びXhoIで切断した後、このDNAフラグメントをBamHI及びSalIで切断したpETDにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-D-SUMOPHと名付けた（配列番号:52を有する）。
【００４２】
（3）組換えプロテアーゼの誘導発現及び精製：
それぞれ発現ベクターpET-SUMOPH及びpET-D-SUMOPHで大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。大腸菌BL21(DE3)形質転換体をカナマイシン含有（最終濃度：30μg/mL）LB培地に接種し、180rpm（37℃）で振盪培養した。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を1：100の割合でカナマイシン含有（最終濃度30μg/mL）LB培地に接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌をOD600約0.4〜0.6の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.1mMのIPTGを添加した。誘導から4時間後に、可溶性及び不溶性タンパク質の弁別のために、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集した。組換えプロテアーゼの可溶性は、タンパク質電気泳動及びウェスタンブロットによって観察した。ウェスタンブロット法に用いた一次及び二次抗体は、それぞれウサギ抗Hisタグポリクローナル抗体及びアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体であった。使用着色剤はNBT/BCIPであった。組換えプロテアーゼの精製方法はORF2融合タンパク質の精製方法と同じである。
SUMOプロテアーゼ及びD-SUMOプロテアーゼの両方が大腸菌BL21(DE3)で発現され（図5）、収量はそれぞれ20.55mg/L及び46.94 mg/Lであり、D-SUMOプロテアーゼの収量の方が高かった。そのモル数はSUMOプロテアーゼのモル数の約2.2倍であった。この結果は、融合発現手法は大腸菌でのSUMOプロテアーゼの発現レベルを高めることができることを示している。
このタンパク質を続いて金属イオン固定親和性クロマトグラフィーによって精製し、そのC-末端にHisタグを有するという組換えプロテアーゼの特色を利用した。結果は、可溶性組換えSUMOプロテアーゼ及びD-SUMOプロテアーゼは金属イオン固定親和性クロマトグラフィーを用いることによって精製できることを示し（図6）、D-SUMOプロテアーゼの精製収量の方が高かった。21.5mgのタンパク質が1Lの培地から精製でき、これは、SUMOプロテアーゼの精製収量の約1.4倍である。
【００４３】
（4）組換えSUMO-ORF2融合タンパク質の切断及びウイルス様粒子形成の観察：
精製した組換えSUMO-ORF2融合タンパク質を組換えプロテアーゼ（SUMOプロテアーゼ又はD-SUMOプロテアーゼ）と1：0.05の重量比で混合し（例えば1mgの組換えORF2融合タンパク質と0.05mgの組換えプロテアーゼ）、混合物を4℃で16時間インキュベートした。切断されたタンパク質溶液をアミコンウルトラ-15ウルトラセル-100Kスピンカラム（Merck Millipore, USA）に置き、適切な体積まで遠心分離した（2,600ｘg、4℃）。その後、100kDa再生セルロースフィルターを用いて前記切断タンパク質をろ過した。結果は、100kDa膜の使用は融合パートナーを効果的に除去できることを示し、ORFをその融合パートナーから分離するためにカラムクロマトグラフィーを使用する必要性を排除した（これは抗原生成コストを効果的に下げる）（図7）。
次に、SUMO-ORF2融合タンパク質、プロテアーゼ切断SUMO-ORF2融合タンパク質、及びプロテアーゼ切断及びろ過によって得られたORF2融合タンパク質を銅グリッド上に置き、室温で3分間放置した。続いて過剰な水を濾紙で除去し、ネガティブ染色のために酢酸ウラニル色素を添加した。染色時間は約40秒〜1分であった。続いて、過剰色素を濾紙で除去し、電界放射透過型電子顕微鏡JEM-2100F（JEOL,Japan）を用いてウイルス様粒子を観察した。
結果は、SUMO-ORF2融合タンパク質はウイルス様粒子を形成することはできないが、プロテアーゼで切断した組換えSUMO-ORF2融合タンパク質及びプロテアーゼで切断しろ過して得られたORF2融合タンパク質は、両方ともウイルス様粒子を形成できることを示した（図8）。透過型電子顕微鏡写真から計算したウイルス様粒子の平均粒子サイズは約19nmであった。
【００４４】
［実施例３］
ブタインターフェロンの調製
本発明は、ブタインターフェロンをアジュバントとして用いることができることを開示し、これはPCV2サブユニットワクチンに特に適切である。したがって、本実施例では、本発明のサブユニットワクチンに必要なブタインターフェロン-α及びブタインターフェロン-γが大腸菌宿主細胞で生成される。
【００４５】
組換えブタインターフェロン-α（IFN-α）及びγ（IFN-γ）遺伝子の合成
（1）IFN-α遺伝子の合成：
成熟ブタインターフェロン-α-6のアミノ酸配列は、大腸菌にとって好ましいコドンを基準にしてヌクレオチド配列から逆に誘導された。プライマーを以下のヌクレオチド配列に基づいて設計した：OPTIFNA-T1、OPTIFNA-T2、OPTIFNA-T3、OPTIFNA-T4、OPTIFNA-T5、OPTIFNA-T6、OPTIFNA-T7、OPTIFNA-T8、OPTIFNAF、及びOPTIFNAR。プライマー配列は表4に示される。
【００４６】
表4：コドン最適化ブタインターフェロン-α-6の合成のためのプライマー
2019504047.tif 000005
【００４７】
OPTIFNA-T1からOPTIFNA-T8を鋳型プライマーとして用い、OPTIFNAF及びOPTIFNARを増幅プライマーとして用いた。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、コドン最適化IFN-α遺伝子を大量に増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの各プライマー；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、58℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
遺伝子のクローニングはCloneJET PCRクローニングキット（Thermo, USA）を用いて実施し、連結混合物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpJET-IFNA-6と名付けた（配列番号:63を有する）。配列検証後、コドン最適化IFN-α遺伝子は配列番号:64を有する。
【００４８】
（2）IFN-γの合成：
成熟ブタインターフェロン-γのアミノ酸配列は、大腸菌にとって好ましいコドンを基準にしてヌクレオチド配列から逆に誘導された。プライマーを前述のヌクレオチド配列に基づいて設計した：OPTIFNR-T1、OPTIFNR-T2、OPTIFNR-T3、OPTIFNR-T4、OPTIFNR-T5、OPTIFNR-T6、OPTIFNR-T7、OPTIFNR-T8、OPTIFNRF及びOPTIFNRR。プライマー配列は表5に示される。
【００４９】
表5：コドン最適化ブタインターフェロン-γの合成のためのプライマー
2019504047.tif 000006
【００５０】
OPTIFNR-T1からOPTIFNR-T8を鋳型プライマーとして用い、OPTIFNRF及びOPTIFNRRを増幅プライマーとして用いた。オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、コドン最適化IFN-γ遺伝子を大量に増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの各プライマー；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、57℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
遺伝子のクローニングはCloneJET PCRクローニングキットを用いて実施し、連結混合物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpJET-IFNRと名付けた（配列番号:75を有する）。配列検証後、コドン最適化IFN-γ遺伝子は配列番号:76を有する。
【００５１】
ブタインターフェロン-α及びγ発現ベクターの構築
（1）pET-OPTPIFNAH発現ベクターの構築：
pJET-IFNA-6プラスミドを鋳型として、さらにプライマーセットとして下記PIFNANDEIF/PIFNAHISSALIRを用いてIFN-α遺伝子を増幅した（PIFNANDEIF：5’-CAATATCATATGTGCGATCTGCCGCAAACC-3’（配列番号:77）及び配列PIFNAHISSALIR：5’-GATATAGTCGACTTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCCTTTTTACGCAGGCGGTC-3’（配列番号:78））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpJET-IFNA-6；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
PCR生成物をNdeI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-OPTPIFNAHと名付けた（配列番号:79を有する）。
【００５２】
（2）pBA-OPTPIFNAH発現ベクターの構築：
PCR増幅IFN-α遺伝子をNdeI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントをそれぞれ、同じ制限酵素で切断したpBCM-araM11にT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpBA-OPTPIFNAHと名付けた（配列番号:80を有する）。
【００５３】
（3）pET-SUMO-OPTPIFNAH発現ベクターの構築：
サッカロミセス・セレビシアエゲノムを鋳型として、さらにプライマーセットとしてSUMOF（配列番号:25）/SUMOR2（5'-ACCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC-3'（配列番号:81））を用いてSUMO遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；200ngのサッカロミセス・セレビシアゲノムDNA；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。
pJET-IFNA-6プラスミドを鋳型として、さらにプライマーセットとしてSUMOIFNAF（5'-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTTGCGATCTGCCGCAAACC-3'（配列番号:82））/PIFNAHISSALIR（配列番号:78）を用いてIFN-α遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpJET-IFNA-6プラスミド；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。
SUMO-IFN-α融合遺伝子を、鋳型として上記で入手した2つのPCR生成物を、さらにプライマーセットとしてSUMOF（配列番号:25）/PIFNAHISSALIR（配列番号:78）を用いポリメラーゼ連鎖反応によって得た。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのSUMO PCR生成物；100ngのIFN-αPCR生成物；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
PCR生成物をKpnI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-SUMO-OPTPIFNAHと名付けた（配列番号:83を有する）。
【００５４】
(4)pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH発現ベクターの構築：
pET-OPTSUMO-ORF2（配列番号:43）を鋳型として、さらにプライマーセットとしてOPTSUMOF（配列番号:35）/OPTSUMOR2（5'-GCCGCCGATTTGTTCACGG-3'（配列番号:84））を用いてOPTSUMO遺伝子を増幅した。
50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpET-OPTSUMO-ORF2；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。
pJET-IFNA-6プラスミド（配列番号:63）を鋳型として、さらにプライマーセットとしてOPTSUMOIFNAF（CCGTGAACAAATCGGCGGCTGCGATCTGCCGCAAACC（配列番号:85））/PIFNAHISSALIR（配列番号:78）を用いてIFN-α遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpJET-IFNA-6；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。
OPTSUMO-IFN-α融合遺伝子を、鋳型として上記2つのPCR生成物及びプライマーセットとしてOPTSUMOF（配列番号:35）/PIFNAHISSALIR（配列番号:78）を用いポリメラーゼ連鎖反応によって得た。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのOPTSUMO PCR生成物；100ngのIFN-αPCR生成物；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
PCR生成物をKpnI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-OPTSUMO-OPTPIFNAHと名付けた（配列番号:86を有する）。
（5）pBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH発現ベクターの構築：
pET-OPTSUMO-OPTPIFNAHをNdeI及びSalIで切断した後、Gel-MTMゲル抽出システムキットを用いてOPTSUMO-IFN-α融合遺伝子を含むDNAフラグメントを回収した。このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpBCM-araM11にT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpBA-OPTSUMO-OPTPIFNAHと名付けた（配列番号:87を有する）。
【００５５】
（6）pET-OPTPIFNRH発現ベクターの構築：
pJET-IFNRプラスミドを鋳型として、プライマーセットとして下記PIFNRNDEIF/PIFNRHISSALIRを用いてIFN-γ遺伝子を増幅した（PIFNRNDEIF：5'-CAATATCATATGCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'（配列番号:88）；PIFNRHISSALIR：5'-GATATAGTCGACTTATTAGTGATG GTGATGGTGATGTTTGCTGGCACGCTGACC-3'（配列番号:89））。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpJET-IFNRプラスミド；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
PCR生成物をNdeI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-OPTPIFNRHと名付けた（配列番号:90を有する）。
【００５６】
（7）pET-SUMO-OPTPIFNRH発現ベクターの構築：
サッカロミセス・セレビシアエゲノムを鋳型として、さらにプライマーセットとしてSUMOF（配列番号:25）/SUMOR2（配列番号:81）を用いてSUMO遺伝子を増幅した。増幅条件及びPCR生成物回収方法は先に記載したとおりである。
pJET-IFNRプラスミド（配列番号:75）を鋳型として、さらにプライマーセットとしてSUMOIFNRF（5'-GCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAA-3'（配列番号:91））/PIFNRHISSALIR（配列番号:89）を用いてIFN-γ遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpJET-IFNRプラスミド；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。
SUMO-IFN-γ融合遺伝子を、鋳型として上記で入手した2つのPCR生成物を、さらにプライマーセットとしてSUMOF（配列番号:25）/PIFNRHISSALIR（配列番号:89）を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって得た。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのSUMO PCR生成物；100ngのIFN-γPCR生成物；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
PCR生成物をKpnI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-SUMO-OPTPIFNRHと名付けた（配列番号:92を有する）。
【００５７】
（8）pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH発現ベクターの構築：
pET-OPTSUMO-ORF2（配列番号:43）を鋳型として、さらにプライマーセットとしてOPTSUMOF（配列番号:35）/OPTSUMOR2（配列番号:84）を用いてOPTSUMO遺伝子を増幅した。増幅条件及びPCR生成物回収方法は先に記載したとおりである。
pJET-IFNRプラスミド（配列番号:75）を鋳型として、さらにプライマーセットとしてOPTSUMOIFNRF（5'-CCGTGAACAAATCGGCGGCCAAGCCCCGTTTTTCAAAGAAATC-3'（配列番号:93））/PIFNRHISSALIR（配列番号:89）を用いてブタインターフェロン-γ遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのpJET-IFNRプラスミド；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をGel-MTMゲル抽出システムキットを用いて回収した。
OPTSUMO-IFN-γ融合遺伝子を、鋳型として上記で入手した2つのPCR生成物を、さらにプライマーセットとしてOPTSUMOF（配列番号:35）/PIFNRHISSALIR（配列番号:89）を用いてポリメラーゼ連鎖反応によって得た。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μMのdATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；100ngのOPTSUMO PCR生成物；100ngのIFN-γPCR生成物；及び1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で2分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で1分（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
PCR生成物をKpnI及びSalIで切断した後、このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpET29aにT4 DNAリガーゼを用いて連結した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNAプラスミドを有するプラスミドをpET-OPTSUMO-OPTPIFNRHと名付けた（配列番号:94を有する）。
【００５８】
（9）pBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH発現ベクターの構築：
pET-OPTSUMO-OPTPIFNRHをNdeI及びSalIで切断した後、PCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いてOPTSUMO-IFR-γ融合遺伝子を含むDNAフラグメントを回収した。このDNAフラグメントを同じ制限酵素で切断したpBCM-araM11にT4 DNAリガーゼを用いて挿入した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpBA-OPTSUMO-OPTPIFNRHと名付けた（配列番号:95を有する）。
【００５９】
組換えブタインターフェロンの発現及び精製
（1）組換えブタインターフェロンの発現：
pET-OPTPIFNAH（配列番号:79）、pBA-OPTPIFNAH（配列番号:80）、pET-SUMO-OPTPIFNAH（配列番号:83）、pET-OPTSUMO-OPTPIFNAH（配列番号:86）及びpBA-OPTSUMO-OPTPIFNAH（配列番号:87）で大腸菌Shuffle（NEB, USA）をそれぞれ形質転換した。pET-OPTPIFNRH（配列番号:90）、pET-SUMO-OPTPIFNHR（配列番号:92）、pET-OPTSUMO-OPTPIFNRH（配列番号:94）、及びpBA-OPTSUMO-OPTPIFNRH（配列番号:95）で大腸菌BL21(DE3)をそれぞれ形質転換した。形質転換体をカナマイシン含有（最終濃度：30μg/mL）LB培地に接種し、180rpmで振盪培養した（37℃）。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を30μg/mLの最終濃度のコノマイシンを含むLB培地に1：100の割合で接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌をOD600約0.4〜0.6の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.1mMのIPTGを添加した（25℃、180rpm）。誘導から4時間後に、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集し、組換えブタインターフェロンの発現をタンパク質電気泳動によって観察した。加えて、細菌の可溶性及び不溶性タンパク質もまた弁別し、組換えブタインターフェロンの可溶性はタンパク質電気泳動によって観察した。
図9（AからE）の実験結果を参照されたい。結果は、本発明は、大腸菌Shuffle宿主を用いて可溶性組換えブタIFN-α及びSUMO-IFN-α融合タンパク質を首尾よく生成し、再折畳み工程を省略できること、したがって貧弱な再折畳み有効性によって生物学的活性が影響を受けることを回避できる可能性を示す。SUMO-IFN-α融合タンパク質の発現では、SUMO-IFN-α融合タンパク質の生成は、SUMO遺伝子コドンの最適化によって高めることができる。SUMO-IFN-α融合タンパク質の発現に対する異なる発現系の効果は、SUMO-IFN-αの生成が変異アラビノース誘導性発現系を用いることによってより高くなることを示した（155.07mg/mL；図9（E））。図9（FからI）を参照されたい。これらの結果は、SUMO融合タンパク質を有する手法は組換えブタIFN-γの可溶性を高めることができることを示す。SUMO遺伝子のコドンの最適化後に、SUMO-IFN-γ融合タンパク質の生成を増加させることができる。SUMO-IFN-γ融合タンパク質の発現に対する異なる発現系の効果は、T7誘導発現系及び変異アラビノース誘導発現系を用いることによってSUMO-IFN-γの生成は極めて満足なものであることを示した。
【００６０】
（2）組換えSUMOプロテアーゼ発現ベクターpET-D-SUMOPの構築及び発現：
先のパラグラフに記載した大腸菌発現系で発現されたブタインターフェロンを切断してSUMOタンパク質フラグメントの無いブタインターフェロンを得るために、本実験では大腸菌発現系によりSUMOプロテアーゼを生成した。当業者はまた他の方法で得られるSUMOプロテアーゼを用いてこの工程を実施してもよい。
サッカロミセス・セレビシアエゲノムを鋳型として、さらにプライマーセットとしてSUMPOF（配列番号:47）/SUMOPENZR（5'-GATATACTCGAGTTATTTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3（配列番号:96））を用いてSUMOプロテアーゼ遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；200ngのサッカロミセス・セレビシアゲノム；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
酵母ゲノムから増幅したSUMOプロテアーゼ遺伝子をBamHI及びXhoIで切断した後、このDNAフラグメントをBamHI及びSalIで切断したpET-DにT4 DNAリガーゼを用いて挿入した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-D-SUMOPと名付けた（配列番号:97を有する）。
pET-D-SUMOP（配列番号:97）で大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。この大腸菌BL21(DE3)をカナマイシン含有（最終濃度：30μg/mL）LB培地に接種し、180rpm（37℃）で振盪培養した。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を1：100の割合でカナマイシン含有（最終濃度30μg/mL）LB培地に接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌をOD600約0.4〜0.6の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.1mMのIPTGを添加した（28℃、180rpm）。誘導から4時間後に、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集した。
【００６１】
（3）組換えブタインターフェロンの切断及び精製：
SUMO-ブタインターフェロン融合タンパク質発現ベクター及びSUMOプロテアーゼ発現ベクターを保持する形質転換体の発現誘導後、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集した。前記収集細菌を適量の溶解緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl（pH7.4））に懸濁し、600nmでの吸収を50にした。超音波プロセッサーで細菌を破壊した後、上清を遠心分離（8,000ｘg、15分、4℃）によって収集した。この精製組換えSUMO-ブタインターフェロン融合タンパク質及び組換えプロテアーゼ（SUMOプロテアーゼ）を重量比4で混合して4℃で16時間インキュベートした。この間に、SUMO-ブタインターフェロン融合タンパク質は、SUMOプロテアーゼによってSUMOタンパク質とC-末端にHisタグを有するブタインターフェロンとに切断される。
前記タンパク質を続いて金属イオン固定親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。精製は、タンパク質液体クロマトグラフィー系AKTAプライムプラスを用い5mLのHiTrapTM Niエクセルカラムで実施した。カラムを25mLの溶解緩衝液で平衡化した後、融合タンパク質切断溶液をHiTrapTM Niエクセルカラムに注入した。サンプル注入の完了後に、非特異的に結合したタンパク質を100mLの洗浄緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、30mMイミダゾール（pH7.4））で洗浄した。最後に、樹脂上の組換えブタインターフェロンを150mLの溶出緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、250mMイミダゾール（pH7.4））で溶出させ、精製はタンパク質電気泳動によって観察した（図10に示される）。
【００６２】
［実施例４］
PCV2感染予防のための本組成物の調製及び適用
本実施例では、前述の実施例2及び実施例3で調製したORF2コードタンパク質、SUMO-ORF2融合タンパク質、及びブタインターフェロンを用いて、PCV2感染の予防及び治療用組成物を調製した。本明細書で用いた多くのサンプルで、当該組成物はさらに、MONTANIDETM ISA 563VGアジュバント（SEPPIC, France）及び/又はMONTANIDETM GEL01アジュバント（SEPPIC, France）を含む。組成物を以下の実験設計に基づいて混合し、続いて仔豚に接種して免疫応答又は有害作用が存在するか否かを観察する（有害作用は、例えば嘔吐、震え、抑うつ、息切れ、適用領域の腫脹であり、有害作用の少なくとも3つの発生率が50%を超える場合、当該組成物の安全性は低い）。
【００６３】
（1）実験1：本組成物の安全性におけるブタインターフェロン含有量の影響：
14匹の3週齢野外飼育仔豚を選択し、ランダムにグループ分けした。仔豚をAからGまで7グループに分けた。各グループの仔豚の数は2匹であった。各グループで筋肉内注射を1回実施し、免疫用量は2mLであった。各ワクチンの成分を下記表6に示す。ワクチン接種日及びその次の日に観察を実施し、臨床的有害作用の割合を記録した。
【００６４】
表6：実験1の実験設計
2019504047.tif 000007
【００６５】
この実験の結果（表7）は、V-001でワクチン免疫したブタは、抑うつの臨床症状を示したが他の有害作用は提示しないことを示した。V-002でワクチン免疫したブタは、嘔吐及び震えの症状を示した。その他に、V-003サンプルの安全性にはより強い疑念があり、接種ブタにおけるV-004、V-005又はV-006の有害作用はより軽度であった。これらの結果に基づいて、以下の実験ではブタインターフェロン含有量は1用量（2mL）当たり25μgで維持されるであろう。
【００６６】
表7：実験1の実験結果
2019504047.tif 000008
【００６７】
（2）実験2：本組成物の安全性におけるアジュバント含有量の影響：
73匹の3週齢野外飼育仔豚を選択し、ランダムにグループA及びBに分けた。グループAの仔豚の数は38匹で、グループBの数は35匹であった。各グループで筋肉内注射を1回実施し、免疫用量は2mLであった。各ワクチンの成分を下記表8に示す。ワクチン接種日及びその次の日に観察を実施し、臨床的有害作用の割合を記録した。実験結果（表9）は、V-009サンプルの安全性が高いが、V-008サンプルの安全性もまた許容できることを示している。
【００６８】
表8：実験2の実験設計
2019504047.tif 000009
表9：実験2の実験結果
2019504047.tif 000010
【００６９】
（3）実験3：本組成物の免疫誘発における種々のアジュバントの影響：
本実験は、動物衛生研究所の動物薬審査支部（Animal Drugs Inspection Branch of the Animal Health Research Institute（AHRI））の遺伝的改変生物（GMO）の動物飼育場で実施された。特定の病源体に感染していない11匹の4週齢仔豚をランダムにグループ分けし、AからＥの5グループに分けた。グループAからDは実験グループで、この実験グループでが各グループの仔豚の数は2匹であった。グループEはコントロールグループであり、このグループは3匹の仔豚を含む。グループAからDの仔豚にはそれぞれ4週齢及び6週齢で筋肉内免疫を実施し、免疫用量は2mLであった。グループEは免疫されなかった。各ワクチンの成分を下記表10に示す。
【００７０】
表10：実験3の実験設計
2019504047.tif 000011
【００７１】
各グループの仔豚を8週齢でPCV2によりチャレンジし、チャレンジ後4週間で全てを剖検した。免疫前（4週齢）及び免疫後（6及び8週齢）並びにチャレンジ後（9、10、11及び12週齢）にブタから血清及び血漿サンプルを収集した。市場で入手可能なELISAキット（BioCheck, Netherlands）を用いて、血清の抗PCV2抗体力価を決定した。リアルタイム定量性ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、血漿中のウイルス量を決定した。
この実験の結果は、V-009、V-010、V-011及びV-012はいずれも抗ORF2抗体を誘発し（図11）、実験ブタのウイルス血症を緩和した（図12）。この実験結果に基づけば、67μgのORF2を含む用量（2mL）（V-011及びV-012）はそれぞれ十分な免疫応答を生じ得ることもまた示されている。
【００７２】
（4）実験4：本組成物の免疫誘発におけるSUMO-ORF2融合タンパク質及びORF2の影響：
本実験は、動物衛生研究所（AHRI）の動物薬審査支部の遺伝的改変生物（GMO）の動物飼育場で実施された。特定の病源体に感染していない16匹の4週齢仔豚をランダムにグループ分けし、AからＥの5グループに分けた。グループAからDは実験グループで、この実験グループでは各グループの仔豚の数は3匹であった。グループEはコントロールグループであり、このグループは4匹の仔豚を含む。グループAからDの仔豚にはそれぞれ4週齢及び6週齢で筋肉内免疫を実施し、免疫用量は2mLであった。グループEは免疫されなかった。各ワクチンの成分を下記表11に示す。
【００７３】
表11：実験4の実験設計
2019504047.tif 000012
【００７４】
各グループのブタを8週齢でPCV2によりチャレンジし、チャレンジ後5週間で全てを剖検した。特定の時点で血清及び血漿サンプルを収集した。市場で入手可能なELISAキットを用いて、血清の抗PCV2抗体力価を決定した。リアルタイム定量性ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、血漿中のウイルス量を決定した。
結果は、各サンプルが抗PCV2抗体の生成のためにブタを誘発できること、及び最良の結果はV-013サンプル（27μgのORF2を含む）で得られることを示した（図13）。加えて、全てのサンプルがブタのウイルス血症を緩和した（図14）。
【００７５】
実験5：本組成物の免疫誘発におけるブタインターフェロン-α及びブタインターフェロン-γの影響：
本実験は、病原体汚染レベルが低くかつPCV2感染がないブタ農場で実施された。PCV2感染が無い20匹の4週齢SPF仔豚を選択し、ランダムにAからＥの5グループに分けた。前記グループで各グループは4匹の仔豚を含んでいた。グループAからDは実験グループで、グループEはコントロールグループであった。グループAからDのブタにはそれぞれ4週齢及び7週齢で筋肉内免疫を実施し、免疫用量は2mLであった。グループEは免疫されなかった。各ワクチンの成分を下記表12に示す。血清及び血漿サンプルを特定の時点で収集した。市場で入手可能なELISAキットを用いて、血清の抗PCV2抗体力価を決定した。
【００７６】
表12：実験5の実験設計
2019504047.tif 000013
【００７７】
実験結果は、本組成物へのIFN-α（V-018）又はIFN-γ（V-019）の単独添加は免疫応答の誘発で強化作用を有することを示している。IFN-α添加の効果はIFN-γ添加よりも高い。他方、本発明の組成物へのIFN-α及びIFN-γの両方の添加（V-020）はより良好な免疫応答を誘発した。これらの結果は、本発明の組成物でIFN-α及びIFN-γは免疫誘発に相乗作用を有することを示している。
【００７８】
開示の要旨
本発明は、PCV2キャプシドタンパク質の調製方法及び前記キャプシドタンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明の方法は、新規なアラビノース誘導発現ベクターを用い、それによって前記PCV2キャプシドタンパク質の合成効率を改善する。他方、本医薬組成物では、前記キャプシドタンパク質及び他の好ましい成分が優れた免疫誘発効果を達成できる適切な比率で混合されてある。
【図１】
2019504047.tif 000014
【図２Ａ】
2019504047.tif 000015
【図２Ｂ】
2019504047.tif 000016
【図３】
2019504047.tif 000017
【図４】
2019504047.tif 000018
【図５Ａ】
2019504047.tif 000019
【図５Ｂ】
2019504047.tif 000020
【図６】
2019504047.tif 000021
【図７】
2019504047.tif 000022
【図８Ａ】
2019504047.tif 000023
【図８Ｂ】
2019504047.tif 000024
【図８Ｃ】
2019504047.tif 000025
【図９（Ａ）】
2019504047.tif 000026
【図９（Ｂ）】
2019504047.tif 000027
【図９（Ｃ）】
2019504047.tif 000028
【図９（Ｄ）】
2019504047.tif 000029
【図９（Ｅ）】
2019504047.tif 000030
【図９（Ｆ）】
2019504047.tif 000031
【図９（Ｇ）】
2019504047.tif 000032
【図９（Ｈ）】
2019504047.tif 000033
【図９（Ｉ）】
2019504047.tif 000034
【図１０】
2019504047.tif 000035
【図１１】
2019504047.tif 000036
【図１２】
2019504047.tif 000037
【図１３】
2019504047.tif 000038
【図１４】
2019504047.tif 000039
【図１５】
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【配列表】
2019504047000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年6月28日(2018.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2.5〜250μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、
2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-α、
2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び
医薬的に許容できる担体、
を含む、ブタシルコウイルス2型（PCV2）感染を予防する組成物。
【請求項２】
3.5〜170μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、
2.5〜20μg/mLのブタインターフェロン-α、
2.5〜20μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び
医薬的に許容できる担体、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
3.5〜170μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、
2.5〜12.5μg/mLのブタインターフェロン-α、
2.5〜12.5μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び
医薬的に許容できる担体、
を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
さらに医薬的に許容できるアジュバントを含み、前記医薬的に許容できるアジュバントが、MONTANIDETM ISA 563VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、フロイントの完全又は不完全アジュバント、アルミニウムゲル、界面活性剤、多価陰イオンポリマー、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せである、請求項１に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明はさらにPCV2感染を予防するための組成物を提供し、前記組成物は、2.5〜250μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-α、2.5〜25μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。
好ましくは、当該組成物はさらに医薬的に許容できるアジュバントを含む。好ましくは、当該医薬的に許容できるアジュバントは、MONTANIDETM ISA563 VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、フロイントの完全又は不完全アジュバント、アルミニウムゲル、界面活性剤、多価陰イオンポリマー、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せである。
好ましくは、当該組成物は、3.5〜170μg/mLのPCV2キャプシドタンパク質、5〜20μg/mLのブタインターフェロン-α、5〜20μg/mLのブタインターフェロン-γ、及び医薬的に許容できる担体を含む。
要約すれば、本発明は主として、アラビノース誘導発現ベクターを用いることによってタンパク質を発現する方法を提供する。本発明の方法は、PCV2キャプシドタンパク質及びワクチンでアジュバントとして用いられるブタインターフェロンの合成を効果的に促進する。他方、本発明の医薬的組成物は、優れた免疫原性誘発効果を得るために、当該キャプシドタンパク質及び他の有益な成分を適切な割合で結合させる。したがって、本発明の開示は当分野でのPCV2の予防及び治療のために顕著な利点を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の“医薬的に許容できる担体”は、医学的/製薬的見地から、当該組成物中のPCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α及び/又はブタインターフェロン-γによるPCV2感染予防の目的に対して負の影響を与えない物質を指す。また別の実施態様では、医薬的に許容できる担体は、例えば水、リン酸緩衝食塩水、アルコール、グリセリン、キチン、アルギン酸塩、コンドロイチン、ビタミンE、鉱物、又はそれらの組合せであるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では、組成物はさらに医薬的に許容できるアジュバントを含む。本発明の“医薬的に許容できるアジュバント”は、医学的/製薬的見地から、当該組成物中のPCV2キャプシドタンパク質、ブタインターフェロン-α及び/又はブタインターフェロン-γによるPCV2感染予防の目的を促進しさらに免疫性を高める物質を指す。また別の実施態様では、医薬的に許容できるアジュバントは、例えばMONTANIDETM ISA563 VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、フロイントの完全又は不完全アジュバント、アルミニウムゲル、界面活性剤、多価陰イオンポリマー、ペプチド、オイルエマルジョン、又はそれらの組合せであるが、ただしこれらに限定されない。好ましい実施態様では、医薬的に許容できるアジュバントは、MONTANIDETM ISA563 VGアジュバント、MONTANIDETM GEL01アジュバント、又はそれらの組合せである。
本発明の研究プロセスは下記実施例でさらに詳述されるであろう。しかしながら、下記の内容はより良い理解のために本発明の特色を単に例示するものである。本発明の趣旨から外れることなく下記の内容を修正し、さらに当分野の一般的な知識に基づいて下記の内容を当業者が変更することは可能であろうが、それらはなお本発明の範囲内である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
（2）組換えSUMOプロテアーゼ発現ベクターpET-D-SUMOPの構築及び発現：
先のパラグラフに記載した大腸菌発現系で発現されたSUMO-ブタインターフェロンを切断してSUMOタンパク質フラグメントの無いブタインターフェロンを得るために、本実験では大腸菌発現系によりSUMOプロテアーゼを生成した。当業者はまた他の方法で得られるSUMOプロテアーゼを用いてこの工程を実施してもよい。
サッカロミセス・セレビシアエゲノムを鋳型として、さらにプライマーセットとしてSUMPOF（配列番号:47）/SUMOPENZR（5'-GATATACTCGAGTTATTTTAAAGCGTCGGT TAAAATCAAATG-3（配列番号:96））を用いてSUMOプロテアーゼ遺伝子を増幅した。50μLのPCR反応混合物は、1ｘのGDP-HiFi PCR緩衝液B；200μM dATP、dTTP、dGTP及びdCTP；1μMの増幅プライマー；200ngのサッカロミセス・セレビシアゲノム；並びに1UのGDP-HiFi DNAポリメラーゼを含んでいた。PCR反応条件は、96℃で5分（1サイクル）；94℃で30秒、55℃で30秒、68℃で30秒（35サイクル）；68℃で5分（1サイクル）であった。反応後、アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR生成物が予想サイズを有するDNAフラグメントを含むか否かを確認した。次に、PCR生成物をPCR-MTMクリーンアップシステムキットを用いて回収した。
酵母ゲノムから増幅したSUMOプロテアーゼ遺伝子をBamHI及びXhoIで切断した後、このDNAフラグメントをBamHI及びSalIで切断したpET-DにT4 DNAリガーゼを用いて挿入した。前記連結生成物で大腸菌ECOS9-5を形質転換した。コロニーポリメラーゼ連鎖反応によって形質転換体を選別した。形質転換体の組換えプラスミドが確かに挿入DNAを保持することをDNA電気泳動によって確認した後、当該形質転換体のプラスミドを抽出し、DNAの配列を決定した。正確なDNA配列を有するプラスミドをpET-D-SUMOPと名付けた（配列番号:97を有する）。
pET-D-SUMOP（配列番号:97）で大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。この大腸菌BL21(DE3)をカナマイシン含有（最終濃度：30μg/mL）LB培地に接種し、180rpm（37℃）で振盪培養した。一晩インキュベーションした後、前記細菌溶液を1：100の割合でカナマイシン含有（最終濃度30μg/mL）LB培地に接種し、振盪培養を実施した（180rpm、37℃）。細菌をOD600約0.4〜0.6の濃度に培養し（分光光度計で測定）、タンパク質発現誘導のために0.1mMのIPTGを添加した（28℃、180rpm）。誘導から4時間後に、細菌分画を遠心分離（8,000ｘg、30分、4℃）によって収集した。
【国際調査報告】
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