(57)【要約】本発明は、核酸配列決定のための環状一本鎖鋳型、その同じものを作製および使用する方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定のための標的核酸を調製する方法であって、以下：
（ａ）該標的核酸を含む試料を提供する工程；
（ｂ）該試料を少なくとも１つの二重鎖領域および少なくとも１つの非二重鎖領域を形成する２つの鎖を含むアダプター分子と接触させる工程、ここで該非二重鎖領域は少なくとも１つのユニバーサルプライマー結合部位を含むものである；および、
（ｃ）該アダプター分子を該標的核酸にライゲーションして少なくとも１つのユニバーサルプライマー結合部位を有する非二重鎖領域を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する工程；
を含む、前記方法。
【請求項２】
さらに以下：
（ｄ）該ジョイント分子を、好ましくは鎖置換ポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼおよび該プライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させる工程；および、
（ｅ）合成による配列決定により該ユニバーサルプライマーを伸長し、それにより該標的核酸の配列を決定する工程；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該アダプターが、２つのハイブリダイズしていない鎖を有する単一の非二重鎖領域に隣接する２つの二重鎖領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該アダプターが、少なくとも１つのステムループ構造に隣接する２つの二重鎖領域を含み、それぞれの構造が二重鎖ステム領域および非二重鎖ループ領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該アダプターのそれぞれの鎖が１つのプライマー結合部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程ｂ）の前に、該標的核酸の３’末端にヌクレオチドを、そして該アダプター分子の３’末端に相補的ヌクレオチドを、鋳型に無関係な様式で付加し、それにより突出末端を作り出す工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）の前に、該標的核酸および該アダプター分子を制限エンドヌクレアーゼで消化して適合する突出末端を生成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）の前に、該標的核酸および該アダプター分子の３’末端をエキソヌクレアーゼで消化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該標的核酸および該アダプター分子がウラシル塩基を含有し、工程ｂ）の前に該標的核酸および該アダプター分子をウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該アダプターが１以上のバーコード、好ましくはユニーク識別子（ＵＩＤ）、多重識別子（ＭＩＤ）またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
配列決定のための標的核酸を調製する方法であって、以下：
（ａ）該標的核酸を含む試料を提供する工程；
（ｂ）該試料を、二重鎖を形成する２つの鎖を含むアダプター分子と接触させる工程、ここでそれぞれの鎖はユニバーサルプライマー結合部位を含むものである；および、
（ｃ）該アダプター分子を該標的核酸にライゲーションして２つのユニバーサルプライマー結合部位を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する工程；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
さらに以下：
（ｄ）該ジョイント分子をＤＮＡポリメラーゼおよび該プライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させる工程；および、
（ｅ）合成による配列決定により該ユニバーサルプライマーを伸長し、それにより該標的核酸の配列を決定する工程；
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸を配列決定するための組成物であって、２つの鎖を含むアダプターにライゲーションされた該標的核酸からなる二本鎖環状分子を含み、該鎖が少なくとも１つの二重鎖領域および少なくとも１つの非二重鎖領域を形成しており、該非二重鎖領域中のそれぞれの鎖がユニバーサルプライマー結合部位を含有する、前記組成物。
【請求項１４】
さらにユニバーサルプライマーを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項１５】
さらに鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼを含む、請求項２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本発明は、核酸配列決定の分野に、より具体的には核酸配列決定のための環状鋳型の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  配列決定のための環状鋳型の使用は、当該技術で既知である。例えば、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳは、そのような鋳型を生成するためにＳＭＲＴＢｅｌｌアダプターを用いている。米国特許第７，３０２，１４６号および第８，１５３，３７５号を参照。環状一本鎖鋳型は、合成による配列決定においていくつかの利点を有する：配列決定ポリメラーゼがローリングサークル複製を行うことができる場合、鋳型は、多数回読まれると考えられ、ワトソンおよびクリック鎖の両方が読まれるであろう。対合した鎖の多数回の読みは、より正確なコンセンサス配列の出力を約束する。しかし、既存の環状鋳型は、２つの配列決定ポリメラーゼがそれぞれの鋳型に結合することができるように設計されている。その２つのポリメラーゼは、互いに干渉して合成の失速または終結を引き起こし、最適以下の配列決定データを生成する可能性を有する。本発明は、既存の技術に改良を加えてより正確な配列決定の読みを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第７，３０２，１４６号
【特許文献２】米国特許第８，１５３，３７５号
【発明の概要】
【０００４】
[0003]  一態様において、本発明は、以下の工程を含む、配列決定のための標的核酸を調製する方法である：標的核酸を含む試料を提供し；試料を少なくとも１つの二重鎖領域および少なくとも１つの非二重鎖領域を形成する２つの鎖を含むアダプター分子と接触させ、その非二重鎖領域は、少なくとも１つのユニバーサルプライマー結合部位を含み；そしてアダプター分子を標的核酸にライゲーションして少なくとも１つのユニバーサルプライマー結合部位を有する非二重鎖領域を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する。その方法は、さらに以下の工程を含むことができる：ジョイント分子をＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させ；合成による配列決定によりユニバーサルプライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定する。アダプターは、２つのハイブリダイズしていない鎖を有する単一の非二重鎖領域に隣接した２つの二重鎖領域を含むことができる。あるいは、アダプターは、少なくとも１つのステムループ構造に隣接する２つの二重鎖領域を含むことができ、それぞれの構造は、二重鎖ステム領域および非二重鎖ループ領域を含む。アダプターのそれぞれの鎖は、１つのプライマー結合部位を含むことができる。２つの鎖は、同じプライマー結合部位を有するか、または異なるプライマー結合部位を有する。ライゲーションは、平滑末端ライゲーションであることも突出末端ライゲーションであることもできる。ある態様において、方法は、鋳型に無関係な様式で標的核酸の３’末端にヌクレオチドを、そしてアダプター分子の３’末端に相補的ヌクレオチドを付加し、それにより突出末端を作り出す予備工程を含む。他の態様において、方法は、標的核酸およびアダプター分子を制限エンドヌクレアーゼで消化して適合する突出末端を生成する予備工程を含む。他の態様において、方法は、標的核酸およびアダプター分子の３’末端をエキソヌクレアーゼで消化する予備工程を含む。ある態様において、標的核酸は、３’末端付近に少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチドを含む。ある態様において、標的核酸およびアダプター分子は、ウラシル塩基を含有し、方法は、工程ｂ）の前に標的核酸およびアダプター分子をＮ−グリコシラーゼおよびＡＰ−リアーゼと接触させる工程を含む。例えば、標的核酸およびアダプター分子は、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと接触させられ、またはウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼおよびポリアミンと接触させられ、熱に曝露される。ある態様において、ポリメラーゼは、鎖置換ポリメラーゼである。ある態様において、試料は、複数の標的核酸を含む。ある態様において、標的核酸は、方法の工程を開始する前に断片化される。
【０００５】
[0004]  ある態様において、標的核酸は、方法の工程を開始する前にＤＮＡポリメラーゼによる末端修復を受ける。アダプターは、１以上のバーコード、ユニーク識別子（ＵＩＤ）、多重識別子（ＭＩＤ）またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【０００６】
[0005]  ある態様において、本発明は、以下の工程を含む、配列決定のための標的核酸を調製する方法である：標的核酸を含む試料を提供し；試料を二重鎖を形成する２つの鎖を含むアダプター分子と接触させ、ここで、それぞれの鎖は、ユニバーサルプライマー結合部位を含み；アダプター分子を標的核酸にライゲーションして２つのユニバーサルプライマー結合部位を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する。ある態様において、方法は、さらに、以下の工程を含む：ジョイント分子をＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させ；合成による配列決定によりユニバーサルプライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定する。ある態様において、それぞれの鎖は、同じプライマー結合部位を有する。他の態様において、２つの鎖は、異なるプライマー結合部位を有する。
【０００７】
[0006]  ある態様において、本発明は、２つの鎖を含むアダプターにライゲーションされた標的核酸からなる二本鎖環状分子を含む標的核酸を配列決定するための組成物であり、ここで、その鎖は、少なくとも１つの二重鎖領域および少なくとも１つの非二重鎖領域を形成しており、非二重鎖領域中のそれぞれの鎖は、ユニバーサルプライマー結合部位を含有する。組成物は、ユニバーサルプライマーおよび鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼの１以上も含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】[0007]  図１は、２つのステムループアダプターを用いて環状分子を組み立てる先行技術の方法の図である。
【図２】[0008]  図２は、スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）ライゲーションを用いて環状分子を組み立てる先行技術の方法の図である。
【図３】[0009]  図３は、単一の二本鎖アダプターを用いて環状分子を組み立てる新規の方法の図である。
【図４】[0010]  図４は、２つの二本鎖領域および２つのステムループ領域を有する単一のアダプターを用いて環状分子を組み立てる新規の方法の図である。
【図５】[0011]  図５は、一本鎖領域に隣接する２つの二本鎖領域を有する単一のアダプターを用いて環状分子を組み立てる新規の方法の図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
[0012]  以下の定義は、本開示の理解を助ける。
【００１０】
[0013]  用語“試料”は、標的核酸を含有する、または含有することが推定されるあらゆる組成物を指す。これは、個人から分離された組織または流体の試料、例えば皮膚、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血球、器官および腫瘍を含み、個人から採取された細胞から確立されたインビトロ培養物の試料も含み、ホルマリン固定されパラフィン包理された試料（ＦＦＰＥＴ）およびそれらから単離された核酸も含む。試料は、無細胞材料、例えば無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分も含むことができる。
【００１１】
[0014]  用語“核酸”は、ヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド、天然および非天然両方）のポリマーを指し、そのようなポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの下位カテゴリー、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等である。核酸は、一本鎖であることも二本鎖であることもでき、一般に５’−３’ホスホジエステル結合を含有するであろうが、ある場合には、ヌクレオチド類似体が、他の結合を有し得る。核酸は、天然存在塩基（アデノシン、グアノシン、シトシン、ウラシルおよびチミジン）ならびに非天然塩基を含むことができる。非天然塩基の一部の例は、例えばSeela et al., (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640において記載されている非天然塩基を含む。非天然塩基は、特定の機能、例えば二重鎖の安定性の増大、ヌクレアーゼ消化の阻害またはプライマー伸長もしくは鎖重合の遮断を有することができる。
【００１２】
[0015]  用語“ポリヌクレオチド”および“オリゴヌクレオチド”は、互換的に用いられている。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、より短いポリヌクレオチドを記載するために時々用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも６ヌクレオチド、例えば少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド、または約１５〜３０ヌクレオチドで構成されることができる。オリゴヌクレオチドは、当該技術で既知のあらゆる適切な方法により、例えばNarang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191において記載されているような直接的な化学合成を含む方法により調製される。
【００１３】
[0016]  用語“二重鎖”および“二本鎖領域”は、２つの核酸鎖がハイブリダイズしている領域を指すために互換的に用いられている。鎖は、二重鎖を維持するために完全に相補的である必要はない。配列に応じて、２つの核酸鎖は、二重鎖領域および非二重鎖領域を含有する構造を形成することができる。
【００１４】
[0017]  用語“プライマー”は、標的核酸中の配列（“プライマー結合部位”）にハイブリダイズして核酸の相補鎖に沿った合成の開始点の役目をそのような合成に適した条件下で果たすことができる一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
【００１５】
[0018]  用語“アダプター”は、別の配列にその配列に追加の特性を導入するために付加されることができるヌクレオチド配列を意味する。アダプターは、典型的には一本鎖もしくは二本鎖であることができる、または一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有することができるオリゴヌクレオチドである。
【００１６】
[0019]  用語“ライゲーション”は、２つの核酸鎖を連結する縮合反応を指し、ここで、一方の分子の５’−ホスフェート基が、別の分子の３’−ヒドロキシル基と反応する。ライゲーションは、典型的にはリガーゼまたはトポイソメラーゼにより触媒される酵素反応である。ライゲーションは、２つの一本鎖を連結して１つの一本鎖分子を作り出すことができる。ライゲーションは、それぞれが二本鎖分子に属する２つの鎖を連結し、そうして２つの二本鎖分子を連結することもできる。ライゲーションは、二本鎖分子の両方の鎖を別の二本鎖分子の両方の鎖に連結し、そうして２つの二本鎖分子を連結することもできる。ライゲーションは、二本鎖分子内の鎖の２つの末端を連結し、そうして二本鎖分子中のニックを修復することもできる。
【００１７】
[0020]  用語“バーコード”は、検出および同定されることができる核酸配列を指す。バーコードは、典型的には他の核酸中に組み込まれる。バーコードは、バーコードを組み込んでいる核酸がバーコードに従って識別または分類されることができるように十分に長く、例えば２、５、１０ヌクレオチドである。
【００１８】
[0021]  用語“多重識別子”または“ＭＩＤ”は、標的核酸の源（例えば、その核酸が由来する試料）を同定するバーコードを指す。同じ試料からの全ての、または実質的に全ての標的核酸は、同じＭＩＤを共有するであろう。異なる源または試料からの標的核酸が、混合され、同時に配列決定されることができる。ＭＩＤを用いて、その配列の読みは、その標的核酸が由来する個々の試料に割り当てられることができる。
【００１９】
[0022]  用語“ユニーク分子識別子”または“ＵＩＤ”は、それが結合している核酸を同定するバーコードを指す。同じ試料からの全ての、または実質的に全ての標的核酸は、異なるＵＩＤを有するであろう。同じ元の標的核酸に由来する子孫（例えば増幅産物）の全てまたは実質的に全ては、同じＵＩＤを共有するであろう。
【００２０】
[0023]  用語“ユニバーサルプライマー”および“ユニバーサルプライミング結合部位”は、プライマーおよび異なる標的核酸中に（典型的には、人工的に付加されることにより）存在するプライマー結合部位を指す。ユニバーサルプライミング部位は、標的核酸に、アダプターまたは５’−フラップ領域を有する標的特異的（非ユニバーサル）プライマー用いて付加される。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合してそこからのプライマー伸長を方向付けることができる。
【００２１】
[0024]  用語“突出末端”は、２つの核酸が例えば場合により末端のポリメラーゼ伸長を伴うライゲーションにより連結されることができるように第２二本鎖核酸の末端の一本鎖オーバーハングと二重鎖を形成することができる第１二本鎖核酸の末端の一本鎖オーバーハングを指す。２つの分子の突出末端は、２つの分子が連結されるために完全に相補的である必要はない。
【００２２】
[0025]  用語“標的配列”、“標的核酸”または“標的”は、検出または分析されるべき試料中の核酸配列の部分を指す。標的という用語は、標的配列の全てのバリアント、例えば１以上の変異体バリアントおよび野生型バリアントを含む。
【００２３】
[0026]  用語“配列決定”は、標的核酸中のヌクレオチドの配列を決定するあらゆる方法を指す。
【００２４】
[0027]  本発明は、以下の工程を含む、配列決定のための標的核酸を調製する方法を提供する：
（ａ）標的核酸を含む試料を提供し；
（ｂ）試料を少なくとも１つの二重鎖領域および少なくとも１つの非二重鎖領域を形成する２つの鎖を含むアダプター分子と接触させ、その非二重鎖領域は、少なくとも１つのユニバーサルプライマー結合部位を含み；そして
（ｃ）アダプター分子を標的核酸にライゲーションして少なくとも１つのユニバーサルプライマー結合部位を有する非二重鎖領域を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する。
その方法は、さらに以下の工程を含むことができる：
（ｄ）ジョイント分子をＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼであることができる）およびプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させ；そして
（ｅ）合成による配列決定によりユニバーサルプライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定する。
【００２５】
[0028]  アダプターは、２つのハイブリダイズしていない鎖を有する単一の非二重鎖領域に隣接する２つの二重鎖領域を含むことができる。アダプターは、少なくとも１つのステムループ構造に隣接する２つの二重鎖領域を含むこともでき、それぞれの構造は、二重鎖ステム領域および非二重鎖ループ領域を含む。アダプターのそれぞれの鎖は、１つのプライマー結合部位を含むことができる。
【００２６】
[0029]  ライゲーションは、平滑末端ライゲーションであることができ、または好ましくは突出末端ライゲーションであることができる。この場合、本発明の方法は、工程ｂ）の前に、鋳型に無関係な様式で標的核酸の３’末端にヌクレオチドを、そしてアダプター分子の３’末端に相補的ヌクレオチドを付加し、それにより突出末端を作り出す工程を含むことができる。本発明の方法は、工程ｂ）の前に、標的核酸およびアダプター分子を制限エンドヌクレアーゼで消化して適合する突出末端を生成する工程を含むこともできる。本発明の方法は、工程ｂ）の前に、標的核酸およびアダプター分子の３’末端をエキソヌクレアーゼで消化する工程を含むこともできる。次いで、標的核酸は、少なくとも１個のホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。標的核酸およびアダプター分子は、ウラシル塩基を含有することができ、方法は、工程ｂ）の前に標的核酸およびアダプター分子をＮ−グリコシラーゼおよびＡＰ−リアーゼと接触させる工程を含むことができる。それは、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩであることができる。標的核酸およびアダプター分子は、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼおよびポリアミン化合物と高温で接触させられることができる。
【００２７】
[0030]  試料は、複数の標的核酸を含むことができる。標的核酸は、工程ｂ）の前に断片化され、工程ｂ）の前にＤＮＡポリメラーゼによる末端修復を受けることができる。アダプターは、１以上のバーコードを含むことができ、それは、ユニーク識別子（ＵＩＤ）、多重識別子（ＭＩＤ）またはそれらの組み合わせの１以上を含むことができる。
【００２８】
[0031]  本発明は、以下の工程を含む、配列決定のための標的核酸を調製する方法も提供する：
（ａ）標的核酸を含む試料を提供し；
（ｂ）試料を、二重鎖を形成する２つの鎖を含むアダプター分子と接触させ、ここで、それぞれの鎖は、ユニバーサルプライマー結合部位を含み；そして
（ｃ）アダプター分子を標的核酸にライゲーションして２つのユニバーサルプライマー結合部位を含む二本鎖環状ジョイント分子を形成する。
方法は、さらに以下の工程を含むことができる：
（ｄ）ジョイント分子をＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー結合部位に相補的なユニバーサルプライマーと接触させ；そして
（ｅ）合成による配列決定によりユニバーサルプライマーを伸長し、それにより標的核酸の配列を決定する。
【００２９】
[0032]  それぞれの鎖は、同じまたは異なるプライマー結合部位を有することができる。
【００３０】
[0033]  本発明は、さらに、２つの鎖を含むアダプターにライゲーションされた標的核酸からなる二本鎖環状分子を含む、標的核酸を配列決定するための組成物を提供し、ここで、その鎖は、少なくとも１つの二重鎖領域および少なくとも１つの非二重鎖領域を形成しており、非二重鎖領域中のそれぞれの鎖は、ユニバーサルプライマー結合部位を含有する。組成物は、さらにユニバーサルプライマーまたは鎖置換活性を有する核酸ポリメラーゼまたは両方を含むことができる。
【００３１】
[0034]  ある態様において、本発明は、二本鎖標的核酸を配列決定において有用な環状のロックされた鎖の鋳型に変換する方法である。環状鋳型の使用は、当該技術で既知であり、合成による配列決定の適用においていくつかの利点を有する。米国特許第７，３０２，１４６号および第８，１５３，３７５号を参照。鎖置換ポリメラーゼが用いられる場合、それは、ローリングサークル複製に従事する（ｅｎｇａｇｅ）、すなわち新生鎖を連続的に置き換え、多数ラウンドの環状鋳型のコピーを行うであろう。標的を多数回配列決定し（読み通し）、連結されて環状構造になった核酸のワトソンおよびクリック鎖の両方を比較する能力は、エラーのない、または低エラーのコンセンサス配列を生成することを可能にする。
【００３２】
[0035]  しかし、図１を参照すると、既存の環状鋳型は、標的核酸１０２の両端にライゲーションされたアダプター１００を有するように設計されており、従って結果として得られる環状分子１０４は、２つのアダプター配列１００を含有する（図１）。それぞれのアダプターは、配列決定プライマーのための結合部位を有し、それは、２つのプライマーおよび２つのＤＮＡポリメラーゼのそれぞれの環状鋳型への結合を可能にする。一度配列決定反応が開始したら、２つのポリメラーゼは、互いに干渉して合成の失速または終結を引き起こし、配列決定データの読みの長さおよび収率を低下させる可能性を有する。これは、２つのポリメラーゼが互いに比較的近く着陸する（ｌａｎｄ  ｉｎ）より短い鋳型に関して特に問題となる。
【００３３】
[0036]  配列決定のための環状分子を組み立てる１つの方法は、二本鎖標的核酸の２つの鎖のそれぞれを単一のアダプター配列を有する別々の環状分子に変換することであった。米国特許出願公開第２０１２０００３６７５号および米国特許第７，８８３，８４９号を参照。このアプローチは、一本鎖が連結されて環になり得るように、アダプターおよび標的核酸の腕の間に相補性を必要とする。このアプローチは、複数の未知の配列の核酸のライブラリーの作製に関しては実用的ではない。
【００３４】
[0037]  本発明は、環状分子のライブラリーの形成を可能にする新規の方法であり、それは、配列にかかわらず、配列決定ポリメラーゼのための単一のプライマー結合部位を含む（図３、４および５）。本発明は、配列決定の質、読み通しおよび効率を増大させることができる新規の方法である。本発明の態様において、それぞれの二本鎖標的核酸は、単一のアダプターにコンジュゲートされる。結果として得られた環状二本鎖分子は、それぞれが、配列決定が開始される予定である単一のプライマー結合部位を有する２つの鎖を含む。
【００３５】
[0038]  本発明は、試料中の標的核酸を改変および配列決定することを含む。ある態様において、試料は、対象または患者に由来する。ある態様において、試料は、対象または患者から例えば生検により得られた固形組織または固形腫瘍の断片を含むことができる。試料は、体液（例えば尿、痰、血清、血漿またはリンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹腔液、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液および／または糞便試料）を含むこともできる。試料は、腫瘍細胞が存在し得る全血または血液画分を含むことができる。ある態様において、試料、特に液体試料は、無細胞材料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは無細胞腫瘍ＲＮＡを含む無細胞ＤＮＡもしくはＲＮＡを含むことができる。ある態様において、試料は、無細胞試料、例えば無細胞腫瘍ＤＮＡまたは無細胞腫瘍ＲＮＡが存在する無細胞血液画分である。他の態様において、試料は、感染性因子または感染性因子由来の核酸を含有する、または含有することが疑われる培養された試料、例えば培養物または培養上清である。ある態様において、感染性因子は、細菌、原生動物、ウイルスまたはマイコプラズマである。
【００３６】
[0039]  標的核酸は、本明細書で記載された酵素反応が起こることを可能にするために、単離される、すなわち他の組織および細胞構成要素から分離される。単離は、当該技術で既知のあらゆる適切な方法により実施されることができる。
【００３７】
[0040]  標的核酸は、試料中に存在し得る対象の核酸である。ある態様において、標的核酸は、遺伝子または遺伝子断片である。他の態様において、標的核酸は、遺伝的バリアント、例えば多型もしくは変異（一塩基多型またはバリアント（ＳＮＶのＳＮＰ）を含む）または結果として遺伝子融合をもたらす遺伝的再編成を含有する。ある態様において、標的核酸は、バイオマーカー、すなわち疾患または病気と関係する遺伝子または遺伝子バリアントを含む。他の態様において、標的核酸は、特定の生物に特徴的であり（例えば病原性生物の同定を助ける）、または病原性生物の特徴（例えば薬剤感受性または薬剤耐性）である。さらに他の態様において、標的核酸は、ヒトの対象に特徴的であり、例えば対象の特有のＨＬＡまたはＫＩＲ遺伝子型を定めるＨＬＡまたはＫＩＲ配列である。
【００３８】
[0041]  本発明の一態様において、二本鎖標的核酸は、本発明の鋳型構成に変換される。他の態様において、標的核酸は、天然に一本鎖形態で存在する（例えば、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ；または一本鎖ウイルスＤＮＡ）。一本鎖標的核酸は、本明細書で記載された方法の他の工程の開始前に二本鎖形態に変換される。より長い標的核酸は、断片化されることができるが、一部の適用において、より長い標的核酸は、より長い読みを達成することが所望され得る。ある態様において、標的核酸は、自然に断片化されている（例えば、循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）または化学分解された核酸、例えば化学的に保存された試料（ホルマリン固定されパラフィン包理された組織、ＦＦＰＥＴ）中で見られる核酸）。
【００３９】
[0042]  本発明の態様において、アダプター分子は、標的核酸の分子にライゲーションされている。標的核酸の両端は、単一のアダプターの末端にライゲーションされ、それによりジョイント分子を形成している。反応混合物の組成は、ライゲーション反応の速度論が１つの標的核酸の単一のアダプターへのライゲーションを有利にするような組成である。単一のアダプターのライゲーションは、自己環化および２つのアダプターへのライゲーションよりも有利にされている。ある態様において、試料中の標的核酸の濃度が、推定または定量化され、適切なモル量のアダプターが、添加される。ある態様において、標的対アダプター比は、１／２０、１／２００または１／４００である。当業者は、突出末端ライゲーションが平滑末端ライゲーションと比較してより効率的であり、より小さい濃度のアダプターを必要とするであろうことを、理解するであろう。
【００４０】
[0043]  ある態様において、アダプターおよび標的核酸またはアダプターのみが、ジョイント分子の形成を可能にするが自己ライゲーション（アダプターの二量体化および標的核酸の自己環化を含む）を防ぐために前処理される。ある態様において、アダプターは、二量体化を防ぐために３’−ホスフェート基で修飾される。他の態様において、標的核酸は、５’−ホスフェート基を除去して自己環化を防ぐためにアルカリホスファターゼで処理される。
【００４１】
[0044]  ある態様において、ライゲーションは、２工程で行われる：第１工程は、アダプターのライゲーションであり、第２工程は、ライゲーションされたジョイント分子の自己環化である。ある態様において、ライゲーションされていないアダプターは、第１工程後にジョイント分子から分離される。ある態様において、分離は、クロマトグラフィーまたは電気泳動による。ある態様において、ライゲーションされていない標的核酸またはライゲーションされていないアダプターは、最後のライゲーション工程後に例えばエキソヌクレアーゼ消化により除去される。ある態様において、自己環化した標的核酸は、それがプライマー結合部位を含有せず、方法のその後の工程に干渉しないと考えられるため、除去されない。
【００４２】
[0045]  ライゲーションは、平滑末端ライゲーションまたはより効率的な突出末端ライゲーションであることができる。標的核酸またはアダプターは、鎖を埋めること（ｓｔｒａｎｄ−ｆｉｌｌｉｎｇ）、すなわち３’末端をＤＮＡポリメラーゼにより伸長して５’オーバーハングを除去することにより平滑末端状にされることができる。
【００４３】
[0046]  ある態様において、アダプターおよび標的核酸の末端は、例えばＤＮＡポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼによるアダプターの３’末端への一種類のヌクレオチドの付加および標的核酸の３’末端への一種類の相補的ヌクレオチドの付加により、突出状にされることができる。さらに他の態様において、アダプターおよび標的核酸は、制限エンドヌクレアーゼによる消化により突出末端を獲得することができる。後者の選択肢は、制限酵素認識部位を含有することが既知である既知の標的配列に関してより好都合である。ある態様において、標的核酸は、標的核酸の一方または両方の鎖の一方の末端からの１以上のヌクレオチドの除去、従って突出末端の作製に有利な条件下でエキソヌクレアーゼと接触させられることができる。ある態様において、標的核酸の末端のエキソヌクレアーゼ消化は、例えば消化の時間を制御することにより、またはエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドの組み込みにより、制御されることができる。ある態様において、標的核酸は、１以上のエキソヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートヌクレオチドを含有するプライマーを用いてコピーまたは増幅される。一態様において、突出末端は、標的核酸においてグリコシラーゼおよびＡＰリアーゼの組み合わせにより作り出される。その態様において、標的核酸は、グリコシラーゼによる塩基除去に適したヌクレオチド（例えば、ウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼによる除去に適したデオキシウリジン塩基）を含有する。ある態様において、塩基除去反応の後、脱塩基部位におけるホスホジエステル骨格の熱的または酵素的破断が行われる。ある態様において、試料は、脱塩基部位のエンドヌクレアーゼによる切断を有利にする条件下でエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと接触させられる。他の態様において、脱塩基部位を有するＤＮＡは、熱分解を受ける。ある態様において、脱塩基ＤＮＡの熱分解の非酵素的増進剤、例えばポリアミン化合物が、添加されることができる（米国特許第８，６６９，０６１号を参照）。
【００４４】
[0047]  上記の態様のそれぞれにおいて、アダプター分子は、下記でさらに記載されるアダプターオリゴヌクレオチドの設計およびインビトロ合成により、所望の末端（平滑、一塩基伸長または多塩基オーバーハング）を獲得することができる。
【００４５】
[0048]  ある態様において、他の酵素的工程が、ライゲーションを成し遂げるために必要とされ得る。ある態様において、ポリヌクレオチドキナーゼが、標的核酸分子およびアダプター分子の一方または両方に５’−ホスフェートを付加するために必要である可能性がある。
【００４６】
[0049]  本発明は、標的核酸の一方または両方の末端にライゲーションされるためのアダプター分子の使用を含む。ある態様において、アダプターは、二本鎖構造を形成する２つの相補鎖を含む。例えば、図３を参照して、プラス鎖１２２ａおよびマイナス鎖１２２ｂを有する二本鎖ＤＮＡ断片１２２は、場合により２つの一本鎖分子（すなわちプラス鎖１２２ａおよびマイナス鎖１２２ｂ）を提供するために変性させられることができる。その後、二本鎖ＤＮＡ断片１２２（またはプラス鎖１２２ａおよびマイナス鎖１２２ｂのそれぞれ）は、アダプター１２４と（例えばライゲーションにより）組み合わせられて二本鎖環状分子１２６を提供する。一側面において、アダプター１２４のそれぞれの鎖は、単一のプライマー結合部位１２８を含むことができ、ここで配列決定が開始される予定である。
【００４７】
[0050]  図４に移って、ある態様において、アダプター１３０は、第１鎖１３０ａおよび第２鎖１３０ｂを含む十字架様の構造を有する。鎖１３０ａおよび１３０ｂのそれぞれは、少なくとも１つの二本鎖領域１３４および少なくとも１つの一本鎖領域１３６を含むステムループ二次構造１３２をとることができる。二本鎖領域１３４は、少なくとも部分的に自己相補性のある領域を含み、それは、本明細書で用いられる反応条件下での二次構造の安定性を確実にする。別の側面において、鎖１３０ａおよび１３０ｂの末端は、図４において示されている十字架様の構造を提供するために互いに少なくとも部分的に相補的であることができる。さらに別の側面において、アダプター１３０のそれぞれの鎖は、単一のプライマー結合部位１３８を含むことができ、ここで配列決定が開始される予定である。一例において、プライマー結合部位１３８は、ステムループ構造１３２の一本鎖領域１３６内に位置していることができる。アダプター１３０は、プラス鎖１４０ａおよびマイナス鎖１４０ｂを有する二本鎖ＤＮＡ断片１４０と組み合わせられて二本鎖分子１４２を提供することができる。
【００４８】
[0051]  図５を参照して、ある態様において、アダプター１４４は、少なくとも１つの二本鎖領域１４６を形成する少なくとも１つの実質的に相補的な領域を共有しており；かつ少なくとも１つの一本鎖領域１４８を形成する少なくとも１つの相補性がほとんどまたは全くない領域を有する２つの鎖１４４ａおよび１４４ｂを含む。ある態様において、アダプター１４４は、一本鎖領域１４８に隣接する２つの二本鎖領域１４６からなる構造を形成する２つの鎖からなる。図４におけるアダプター１３０の場合のように、図５におけるアダプター１４４のそれぞれの鎖は、単一のプライマー結合部位（示されていない）を含むことができ、ここで配列決定が開始される予定である。一例において、プライマー結合部位は、一本鎖領域１４８内に位置していることができる。アダプター１４４は、プラス鎖１５０ａおよびマイナス鎖１５０ｂを有する二本鎖ＤＮＡ断片１５０と組み合わせられて二本鎖分子１５２を提供することができる。
【００４９】
[0052]  ある態様において、アダプターの二本鎖領域は、二本鎖または一本鎖標的核酸へのライゲーションのために用いられる。他の態様において、アダプターの一本鎖部分は、二本鎖または一本鎖標的核酸にライゲーションされる。
【００５０】
[0053]  ある態様において、一本鎖核酸のライゲーションは、スプリントオリゴヌクレオチドを用いて実施される（例えば米国出願公開第２０１２０００３６５７号を参照）。例えば、図２を参照して、プラス鎖１０８ａおよびマイナス鎖１０８ｂを有する二本鎖ＤＮＡ断片１０８は、２つの一本鎖分子を提供するために変性させられることができる。その後、プラス鎖１０８ａの末端１１２に相補的である第１スプリントオリゴ１１０は、プラス鎖１０８ａとアニーリングされた後、プラス鎖１０８ａの末端の分子内ライゲーションが行われて環化された生成物１１４を提供することができる。同様に、マイナス鎖１０８ｂの末端１１８に相補的である第２スプリントオリゴ１１６は、マイナス鎖１０８ｂとアニーリングされた後、マイナス鎖１０８ｂの末端の分子内ライゲーションが行われて環化された生成物１２０を提供することができる。他の態様において、一本鎖核酸または部分的に一本鎖の核酸のライゲーションは、５’および３’末端の一本鎖領域（オーバーハング）を用いて実施される（例えば米国出願公開第２０１４０１９３８６０号を参照）。
【００５１】
[0054]  ある態様において、アダプターは、１以上のバーコード：多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）、ユニークＩＤ（ＵＩＤ）またはＵＩＤおよびＭＩＤの組み合わせを含む。ある態様において、単一のバーコードが、ＵＩＤおよびＭＩＤの両方として用いられる。
【００５２】
[0055]  ある態様において、アダプターのそれぞれの鎖は、ユニバーサルプライマー、例えばユニバーサル配列決定プライマーのためのプライマー結合部位を含む。ある態様において、１つのプライマー結合部位が、それぞれの鎖においてアダプター分子の一本鎖部分中に配置されている（図４、５）。ある態様において、１つのプライマー結合部位が、それぞれの鎖においてアダプター分子の二本鎖部分中に配置されている（図３）。別々の鎖上に配置された結合部位は、同一ではなく、すなわち、それぞれの鎖は、異なるプライマーに関する結合部位を有する。ある態様において、アダプターの一方の鎖のみが、プライマー結合部位を担持している。
【００５３】
[0056]  ある態様において、アダプター分子は、インビトロで、２つのインビトロ合成された人工オリゴヌクレオチドを組み合わせることにより組み立てられる。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、インビトロ合成された所望の二次構造を有することが既知の天然存在配列である。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、単離された天然存在分子または単離された非天然存在分子である。
【００５４】
[0057]  ある態様において、本発明は、酵素を利用する。酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ（配列決定ポリメラーゼを含む）、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、場合によりウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ、すなわちＡＰリアーゼを含む。
【００５５】
[0058]  ある態様において、標的核酸を含有する環状ジョイント分子が、配列決定される。ユニバーサルプライマーは、配列決定ポリメラーゼにより伸長されてそれにより二本鎖標的核酸の配列を決定することができる。ある態様において、配列決定は、単分子配列決定または核酸もしくは核酸誘導体のあらゆる配列決定を含む合成による配列決定である。配列決定技術は、ＰａｃＢｉｏ（登録商標）ＲＳシステム、ナノポア配列決定システムもしくはトンネル効果認識配列決定システムまたは鋳型の連続的な読みが可能であり所望されるあらゆる配列決定システムを含むことができる。それぞれの鎖は、独立して配列決定される。ある態様において、それぞれの鎖は、一回の読みで、例えばローリングサークル複製により多数回配列決定される。
【００５６】
[0059]  ある態様において、配列決定データは、アダプター中に存在するバーコードを用いてエラーに関して修正される。ある態様において、ユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）が、ＵＩＤにより同定されるような同じ元の分子の一部の（全てではないが）コピー中に存在する配列決定エラーを排除するために用いられる。ある態様において、ＵＩＤは、アダプター中に存在する２つのＵＩＤを合わせることにより同定される単一の標的分子の両方の鎖からの配列データを用いてコンセンサス配列を得るために用いられる。
【００５７】
[0060]  ある態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有し、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しない。ある態様において、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼおよびその派生物が、用いられる（米国特許第５，００１，０５０号、第５，５７６，２０４号、第７，８５８，７４７号および第８，９２１，０８６号参照）。
【００５８】
[0061]  ある態様において、本発明は、ＤＮＡリガーゼも利用する。ある態様において、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼが、用いられる。
【００５９】
[0062]  ある態様において、本発明は、鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばターミナルトランスフェラーゼも利用する。ある態様において、本発明は、哺乳類のターミナルトランスフェラーゼを用いる。
【実施例】
【００６０】
実施例１（仮想例）。二本鎖アダプターを用いる環状ジョイント分子の調製
[0063]  この実験において、二本鎖標的ＤＮＡが、得られる。ＤＮＡは、インビトロで適切な大きさに断片化されるか、または天然に断片化されている。アダプターは、それぞれの鎖の上にプライマー結合部位を含む二本鎖分子である（図３）。アダプターおよび標的核酸分子は、単一のアダプターのそれぞれの鋳型へのライゲーションを有利にする２００／１の相対濃度で存在する。標的核酸の両方の末端は、核酸ポリメラーゼにより埋められて平滑にされている。場合により、一種類のヌクレオチドが、アダプターの３’末端に付加され、相補的な一種類のヌクレオチドが、標的ＤＮＡに付加される。これらの工程は、ＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、マサチューセッツ州ウィルミントン）を用いて実施される。単一のアダプターが、ジョイント分子を作製するためにそれぞれの標的ＤＮＡにライゲーションされる。単一の配列決定プライマーが、アダプターの両方の鎖上の同じプライマー結合部位に相補的であり、または２つの結合部位は、異なっており、それぞれは、２つのプライマーの一方に相補的である。配列決定は、配列決定機器の製造業者により意図されるように進行する。配列決定データは、ＵＩＤにより同定されるような同じ元の分子の一部の（全てではないが）コピー中に存在する配列決定バリエーションを排除することにより、エラーに関して修正される。配列決定データは、アダプター中に存在する２つのＵＩＤを合わせることにより同定される単一の標的分子の両方の鎖からの配列データを用いてコンセンサス配列を得ることにより、さらに修正される。
【００６１】
実施例２（仮想例）。ステムループアダプターを用いる環状ジョイント分子の調製
[0064]  この実験において、二本鎖標的ＤＮＡが、得られる。アダプターは、一本鎖領域に隣接する２つの二本鎖領域を有する二本鎖分子であり、ここで、それぞれの鎖は、ステムループ構造を形成している（図４）。アダプターおよび標的核酸は、実施例１において記載されたように処理およびライゲーションされる。単一のアダプターが、ジョイント分子を作製するためにそれぞれの標的ＤＮＡにライゲーションされる。単一の配列決定プライマーが、アダプターの両方の鎖のループ部分中の同じプライマー結合部位に相補的であり、または２つの結合部位は、異なっており、それぞれは、２つのプライマーの一方に相補的である。配列決定は、配列決定機器の製造業者により意図されるように進行する。
【００６２】
[0065]  配列決定データは、ＵＩＤにより同定されるような同じ元の分子の一部の（全てではないが）コピー中に存在する配列決定バリエーションを排除することにより、エラーに関して修正される。配列決定データは、アダプター中に存在する２つのＵＩＤを合わせることにより同定される単一の標的分子の両方の鎖からの配列データを用いてコンセンサス配列を得ることにより、さらに修正される。
【００６３】
実施例３（仮想例）。部分的に一本鎖のアダプターを用いる環状ジョイント分子の調製
[0066]  この実験において、二本鎖標的ＤＮＡが、得られる。アダプターは、鎖が互いにハイブリダイズしていない一本鎖領域に隣接する２つの二本鎖領域を有する二本鎖分子である（図５）。アダプターおよび標的核酸は、実施例１において記載されたように処理およびライゲーションされる。単一のアダプターが、ジョイント分子を作製するためにそれぞれの標的ＤＮＡにライゲーションされる。単一の配列決定プライマーが、アダプターの両方の鎖のハイブリダイズしていない部分中の同じプライマー結合部位に相補的であり、または２つの結合部位は、異なっており、それぞれは、２つのプライマーの一方に相補的である。配列決定は、配列決定機器の製造業者により意図されるように進行する。
【００６４】
[0067]  配列決定データは、ＵＩＤにより同定されるような同じ元の分子の一部の（全てではないが）コピー中に存在する配列決定バリエーションを排除することにより、エラーに関して修正される。配列決定データは、アダプター中に存在する２つのＵＩＤを合わせることにより同定される単一の標的分子の両方の鎖からの配列データを用いてコンセンサス配列を得ることにより、さらに修正される。
【符号の説明】
【００６５】
１００  アダプター
１０２  標的核酸
１０４  環状分子
１０８  二本鎖ＤＮＡ断片
１０８ａ  プラス鎖
１０８ｂ  マイナス鎖
１１０  第１スプリントオリゴ
１１２  末端
１１４  環化された生成物
１１６  第２スプリントオリゴ
１１８  末端
１２０  環化された生成物
１２２  二本鎖ＤＮＡ断片
１２２ａ  プラス鎖
１２２ｂ  マイナス鎖
１２４  アダプター
１２６  二本鎖環状分子
１２８  プライマー結合部位
１３０  アダプター
１３０ａ  第１鎖
１３０ｂ  第２鎖
１３２  ステムループ二次構造
１３４  二本鎖領域
１３６  一本鎖領域
１３８  プライマー結合部位
１４０  二本鎖ＤＮＡ断片
１４０ａ  プラス鎖
１４０ｂ  マイナス鎖
１４２  二本鎖分子
１４４  アダプター
１４４ａ  鎖
１４４ｂ  鎖
１４６  二本鎖領域
１４８  一本鎖領域
１５０  二本鎖ＤＮＡ断片
１５０ａ  プラス鎖
１５０ｂ  マイナス鎖
１５２  二本鎖分子
【図１】
2019520839.tif 000002
【図２】
2019520839.tif 000003
【図３】
2019520839.tif 000004
【図４】
2019520839.tif 000005
【図５】
2019520839.tif 000006
【国際調査報告】
2019520839.tif 000007
2019520839.tif 000008
2019520839.tif 000009