(57)【要約】  本発明は、ｕＰＡＲＡＰを標的とする複合体、とりわけｕＰＡＲＡＰのＮ末端領域に対して作られたモノクローナル抗体を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞および組織への活性薬剤の送達でのその使用とに関する。本発明は、癌などの、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞を伴う疾患の処置での前述のＡＤＣの使用にさらに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｕＰＡＲＡＰに対して作られた抗体薬物複合体であって、
ａ．抗体であって、
ｉ．配列番号３６もしくは３７（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号３８もしくは３９（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号４０もしくは４１（ｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｖ．配列番号３０もしくは３１（ｕＰＡＲＡＰのシステインに富むドメイン（ＣｙｓＲ））のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号３２もしくは３３（ｕＰＡＲＡＰのフィブロネクチン型（ＦＮ−ＩＩ）ドメイン）のアミノ酸配列、および／または
ｖｉ．配列番号３４もしくは３５（ｕＰＡＲＡＰのＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）のアミノ酸配列
に結合可能な抗体、
ｂ．活性薬剤、ならびに任意選択で
ｃ．ａ）をｂ）に連結するリンカー
を含む、抗体薬物複合体。
【請求項２】
前記抗体が
ａ．配列番号３０もしくは３１のアミノ酸配列、または
ｂ．配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列
に結合できる、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３】
前記抗体が配列番号３２または３３のアミノ酸配列に結合できる、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４】
前記抗体が
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１もしくは９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および／または
ｉｉ．配列番号５もしくは１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．ａ）の前記抗体と同じエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、
ｃ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バーション、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｄ）ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｅ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号２、３、４、６、７および８のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号２、３および４のアミノ酸配列、および／または配列番号６、７および８のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号４２、４３、４４、４５、４６および４７の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号４２、４３および４４のアミノ酸配列、および／または配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項５】
前記抗体が
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および／または
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、またはｂ）の前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｄ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、またはｂ）の前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｅ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１２、１３、１４、１６、１７および１８のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号１２、１３および１４のアミノ酸配列、および／または配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号４８、４９、５０、５１、５２および５３の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号４８、４９および５０のアミノ酸配列、および／または配列番号５１、５２および５３のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
前記抗体が
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１９もしくは２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および／または
ｉｉ．配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．ａ）の前記抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、またはｂ）の前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｄ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、またはｂ）の前記抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｅ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号２１、２２、２３、２６、２７および２８のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号２１、２２および２３のアミノ酸配列、および／または配列番号２６、２７および２８のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメント、
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号５４、５５、５６、５７、５８および５９の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号５４、５５および５６のアミノ酸配列、および／または配列番号５７、５８および５９のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項７】
いずれの配列変化も相補性決定領域の外側である、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項８】
前記抗体がマウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト化抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体（ＳＣＡ）、その重鎖および／または軽鎖の可変部分、およびＦａｂミニ抗体から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１０】
前記抗体がヒト化されたもしくは完全にヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１１】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１２】
前記活性薬剤が治療薬、細胞毒性薬、放射性同位体および検出可能標識から選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１３】
前記活性薬剤が細胞毒性薬である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１４】
前記活性薬剤がアルキル化剤、アントラサイクリン系薬剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤／抗有糸分裂剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、ペプチド抗生物質、白金系抗悪性腫瘍薬、トポイソメラーゼ阻害薬および細胞毒性抗生物質からなる群から選択される化学療法薬などの、化学療法薬である、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１５】
前記活性薬剤がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、タキサン（例えばパクリタキセルもしくはドセタキセル）、ビンカアルカロイド（例えばビンプラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンもしくはビノレルビン）、コルヒチンまたはポドフィロトキシンからなる群から選択されるなどの、抗有糸分裂剤である、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１６】
前記活性薬剤がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１７】
前記活性薬剤がピロロベンゾジアゼピンまたはピロロベンゾジアゼピン二量体誘導体から選択されるＤＮＡ架橋剤などの、ＤＮＡ架橋剤である、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１８】
前記活性薬剤がデュオカルマイシンＳＡなどの、アルキル化剤である、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１９】
２と８の間など、例えば３と６の間、４または５などの、１と１０の間の薬物抗体比（ＤＡＲ）を有する、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２０】
前記抗体薬物複合体が切断可能なリンカーおよび切断不可のリンカーから選択されるリンカーを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２１】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１〜２０のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２２】
前記リンカーがカテプシンで切断可能なリンカーなどの、酵素切断可能なペプチドリンカーである、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２３】
前記リンカーがバリン−シトルリン（ＶＣ）またはバリン−アラニンン（ＶＡ）などの、ジペプチドを含むまたはジペプチドからなる、請求項１〜２２のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２４】
前記抗体薬物複合体がパラアミノ安息香酸（ＰＡＢ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むスペーサーなどの、スペーサーをさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２５】
前記抗体薬物複合体がＰＥＧ４であるスペーサーまたはＰＥＧ４を含むスペーサーをさらに含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２６】
前記抗体薬物複合体がマレイミドおよびカプロン酸（ＭＣ）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、アジド基もしくはアルキン基を含むまたはこれらからなる接着基、または前記抗体との反応によりこれらに由来する接着基などの、接着基をさらに含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２７】
前記抗体薬物複合体がベドチン（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２８】
前記抗体薬物複合体が以下のリンカー−スペーサー−毒素ユニット：ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２９】
前記抗体薬物複合体が以下のリンカー−スペーサー−毒素ユニット：ＰＥＧ４−ＶＡ−ＰＢＤを含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項３０】
前記抗体薬物複合体が以下のリンカー−スペーサー−毒素ユニット：ＰＥＧ４−ＶＣ−デュオカルマイシンＳＡを含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項３１】
薬物としての使用のための、請求項１〜３０のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体薬物複合体、および薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、アジュバントまたは賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞に活性薬剤を送達するための方法であって、前記活性薬剤が前記細胞に送達されるように、請求項１〜３１のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体または請求項３２に記載の前記医薬組成物を前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
対象におけるｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる疾患の治療のための方法であって、請求項１〜３１のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体または請求項３２に記載の前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる前記疾患が癌、骨粗鬆症などの骨劣化疾患、線維症、およびアテローム動脈硬化症または慢性炎症などのマクロファージ関連疾患または障害から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患が癌である、請求項３４〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が肉腫、神経膠芽細胞腫、前立腺癌、前立腺癌の骨移転、乳癌、頭部癌と頸部癌および白血病から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が固形腫瘍である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が神経膠芽細胞腫である、請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が骨肉腫などの、肉腫である、請求項３６〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体薬物複合体が非経口的に、例えば、静脈内に、脳室内に、関節内に、動脈内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、脳室内で、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に、もしくは皮下に、または輸液技術によって投与される、請求項３３〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体薬物複合体が静脈内に投与される、請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体薬物複合体が頭蓋内に投与される、請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体薬物複合体が皮下に投与される、請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体薬物複合体が１種または複数種のさらなる治療薬などの、１種または複数種のさらなる薬剤との組み合わせで投与される、請求項３３〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ｕＰＡＲＡＰを発現する前記細胞がｕＰＡＲＡＰの過剰発現を示す、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ｕＰＡＲＡＰを発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３３〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
ｕＰＡＲＡＰを発現する前記細胞が腫瘍関連細胞である、請求項３３〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体薬物複合体が細胞死を誘導しおよび／または前記ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞の成長および／または増殖を阻害する、請求項３３〜４８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項５０】
前記処置が寛解治療または根治的治療である、請求項３４〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
対象において腫瘍進行を阻害する方法であって、前記対象に請求項１〜３１のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体をまたは前記対象に請求項３２に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
対象において腫瘍の転移能力を阻害する、低下させるまたは除去するための方法であって、前記対象に請求項１〜３１のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体をまたは前記対象に請求項３２に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５３】
請求項１〜３１のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体または請求項３２に記載の前記医薬組成物を含むキットであって、任意選択で対象に前記抗体薬物複合体を投与するための手段および／または使用説明書をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は受容体ｕＰＡＲＡＰを標的にする分子複合体、とりわけｕＰＡＲＡＰに対して作られた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）と、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞および組織への活性薬剤の送達でのそれらの使用とに関する。本発明はさらに、特定の癌などの、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞を伴う疾患の処置での前述のＡＤＣの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ受容体関連タンパク質（ｕＰＡＲＡＰ）（ＣＤ２８０、Ｅｎｄｏ１８０およびマンノース受容体Ｃ２型としても知られている）は、エンドサイトーシス膜貫通糖タンパク質のマクロファージマンノース受容体ファミリーのメンバーである。ｕＰＡＲＡＰは、組織再構築時のマトリックスターンオーバー、とりわけコラーゲンの取り込みと細胞内分解に関与する膜タンパク質である。
【０００３】
受容体ｕＰＡＲＡＰは、肉腫および末期神経膠芽腫を含む、特定の癌の腫瘍細胞中で増加する。さらに、受容体ｕＰＡＲＡＰは、ほとんどの場合、固形腫瘍を取り囲む間質細胞中で増加し、一部の文献は、前立腺がんの骨転移におけるｕＰＡＲＡＰの高発現を示唆している（Ｃａｌｅｙら，２０１２，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  ５：７７５−７８３）。正常な成人個人において、受容体ｕＰＡＲＡＰは限られた発現パターンを示す（Ｍｅｌａｎｄｅｒら，  ２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ４７：１１７７−１１８８）。
【０００４】
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、標的療法として、特に癌治療のために設計される非常に強力なバイオ医薬品の新しい種類である。ＡＤＣは、不安定な結合を有することもある、安定な化学的リンカーを介して生物学的に活性な薬物または細胞毒性化合物に連結される抗体（モノクローナル抗体全体または抗体フラグメント）で構成される複合分子である。抗体特有の標的能力を細胞毒性薬物の細胞死滅能力と組み合わせることによって、抗体薬物複合体は、抗体抗原の発現に基づいて、正常な組織と病変組織との間の感受性識別を可能にする。これは、伝統的な化学療法薬と対照的に、抗体薬物複合体は活発に癌細胞を標的にし攻撃するので、抗原をほとんどまたは全く発現しない健康な細胞がひどく影響を受けないことを意味する。現在まで、３種のＡＤＣが市販承認を受けており、いくつかのＡＤＣが現在のところ臨床試験中である。
【０００５】
国際公開第２０１０／１１１１９８号は、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を含む複合体を開示し、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞への治療薬の送達におけるそのような複合体の使用を提案する。
【０００６】
治療方法は、現在のところほとんどの癌型に対して存在する。しかし、ほとんどの場合、治療の特異性の欠如により、不満足な効率、または有害な副作用を伴う。したがって、特異性が増進された、より効率的な治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ｕＰＡＲＡＰ受容体のＮ末端領域に結合できる抗ｕＰＡＲＡＰ抗体に基づく抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を提供する。本明細書に記載のＡＤＣは、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞および組織を特異的に標的にでき、認定される副作用なしにｉｎ  ｖｉｔｒｏｌおよびｉｎ  ｖｉｖｏで優れた有効性を有する。
【０００８】
特に、本開示は、以下を含む抗体薬物複合体に関する：
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号３６または３７（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号３８または３９（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号４０または４１（ｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｖ．配列番号３０または３１（ｕＰＡＲＡＰのシステインに富むドメイン（ＣｙｓＲ）のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号３２または３３（ｕＰＡＲＡＰのフィブロネクチンＩＩ型（ＦＮ−ＩＩ）ドメイン）のアミノ酸配列、
ｖｉ．配列番号３４または３５（ｕＰＡＲＡＰのＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１））のアミノ酸配列
に結合できる抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．活性薬剤、および任意選択で
ｃ．ａ）をｂ）に連結するリンカー。
【０００９】
さらに、本開示は、ｕＰＡＲＡＰ受容体の発現を伴う疾患および／または障害の治療について上述されるＡＤＣの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｕＰＡＲＡＰを含む、マンノース受容体ファミリーの４種のタンパク質ファミリーの略図である。これらのタンパク質のすべては、全体のドメイン構成が同じであり、Ｎ末端シグナルペプチドを有しその後にシステインに富むドメイン、フィブロネクチンＩＩ型ドメイン（ＦＮ−ＩＩドメイン）、８〜１０Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）、膜貫通領域および小さな細胞質尾部が続く（出典：Ｍｅｌａｎｄｅｒら，２０１５  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ４７：１１７７−１１８８）。
【図２】標的抗体の形態で、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−Ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）リンカー−毒素構築物に結合される、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣの略図を示す。標的抗体は、特定の癌型で高度に発現することが判明している受容体ｕＰＡＲＡＰに対して特異的である。リンカー−毒素構築物は、マレイミド化学によって遊離システインのチオールまたは還元された鎖間ジスルフィド架橋のチオールに接着される（Ｎ＝１〜１０毒素／抗体）。スペーサー実体へのペプチド／アミド結合を有するバリン−シトルリンリンカー領域は、カテプシンＢなどのリソソームプロテアーゼの基質であるが、細胞外環境中で十分に安定であり、標的抗原を発現している細胞によって取り込まれるときだけ、結合薬物を確実に放出する。結合薬物は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）の形態で非常に強力なチューブリン阻害剤である。ユニット（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）−ｖｃ−ＭＭＡＥ）として、このＡＤＣ構築物は、ｕＰＡＲＡＰ抗原を発現している細胞のみへの薬物成分の特異的送達、ならびにこれらの細胞中での結合薬物の細胞内放出を確実に行う。
【図３】フローサイトメトリーで測定された、ｕＰＡＲＡＰ陽性細胞系での、図２の説明文に記載の結合手順に類似した方法（部分的還元およびそれに続くマレイミド誘導体化ＡｌｘｅａＦｌｕｏｒ６４７試薬との反応）を用いてフルオロフォア（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７、ＡＦ６４７）で標識したモノクローナル抗体２ｈ９の細胞取り込みを示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。特異性比：２ｈ９−ＡＦ６４７対ａＴＮＰ−ＡＦ６４７のシグナル比率。ａＴＮＰは非標的対照のモノクローナル抗体である。これらの数値は、２ｈ９−ＡＦ６４７の特異的取り込みを示し、モノンクローナル抗体２ｈ９が、そのような結合方法に従って、ｕＰＡＲＡＰ陽性細胞によって取り込まれることを裏付ける。
【図４Ａ】標的抗体（２ｈ９）、約４〜５の適度な薬物抗体比（ＤＡＲ）を有するｍＡｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣ、および約８〜１０のＤＡＲを有するｍＡｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。結合モノクローナル抗体がゲル中で移動度の減少を示し、および適度に結合したＡＤＣ種がモノクローナル抗体重鎖を介して好ましく結合され、一方で高いＤＡＲを有するＡＤＣは重鎖と軽鎖の両方を介して結合されることが分かる。
【図４Ｂ】活性化した組換えカテプシンＢ（＋ｒｈ  カテプシンＢ）とのＡＤＣのインキュベーションがＡＤＣのゲル移動度を未修飾標的抗体のそれに戻し、したがってリンカー領域がカテプシンＢなどのリソソームプロテアーゼによって実際に切断可能であることを示す、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４Ｃ】結合手順の還元ステップの後に、ならびにＡＤＣの形態で、ｕＰＡＲＡＰに対するモノクローナル抗体２ｈ９の親和性が維持されていることを示すＥＬＩＳＡ分析。全体的に見て、これらのデータは、ＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥが、結合の後にゲル移動度および標的受容体に対する親和性に関して予想通りに挙動することを示している。
【図５】希釈系列でのＡＤＣへの曝露に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイを示す。希釈系列は、１０μｇ／ｍＬのＡＤＣ（モノクローナル抗体成分）で開始し、続いて一連のＡＤＣの４倍希釈を行なった。細胞を、比色生存率アッセイによる分析の前に、７２時間インキュベートした。ここで、アッセイは、標的受容体を発現する４種の細胞系（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＴ１０８０およびＫＮＳ４２細胞）では、非標的ＡＤＣ（ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）と比較して、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥとのインキュベーション後の全体的な生存率の特異的な減少を示し、一方で受容体陰性細胞系（ＣＨＯ−Ｋ１）は影響を受けないままである。これは、ＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥとのインキュベーションに続く、ｕＰＡＲＡＰ陽性細胞系の生存率における受容体特異的減少を示す。
【図６】１μｇ／ｍＬのｕＰＡＲＡＰに対するＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥもしくは対照ＡＤＣ  ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ、または５０ｎＭの遊離ＭＭＡＥ毒素の存在下での３日間のインキュベーションに続く、４種のｕＰＡＲＡＰ陽性細胞株（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＴ１０８０またはＫＮＳ４２）の細胞周期分布解析を示す。ＭＭＡＥはチューブリン阻害剤であるので、薬物効果は、Ｓｕｂ−Ｇ１期（最終的には、アポトーシスをもたらす）またはＧ２−Ｍ期（ＤＮＡ複製に続くゲノム分離の阻害）のいずれかでの細胞の割合の増加を引き起こし得る。ダッシュ記号は、広範囲にわたる細胞死と崩壊により、登録するには低すぎる細胞計数を示す。これらの試料中でのＳｕｂ−Ｇ１期およびＧ２／Ｍ期への細胞周期分布の移行から明らかなように、４種のすべての細胞株がｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ（および遊離ＭＭＡＥ）に対する特異的感受性を示すことが分かる。
【図７】１μｇ／ｍＬのｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥの存在下で、同時に異なる濃度の非複合標的抗体（２ｈ９）、ｕＰＡＲＡＰを標的とする別の抗体（５ｆ４）、または非標的対照抗体（ａＴＮＰ）の存在下で、３日間インキュベートされるＵ９３７細胞を示す、競合アッセイを示す。モル過剰の非複合標的抗体２ｈ９（１＋μｇ／ｍＬ競合モノクローナル抗体）だけが、ＡＤＣの効果と競合でき、それによってＡＤＣ媒介細胞死から細胞を救出することが分かる。それによって、ｕＰＡＲＡＰと標的抗体２ｈ９の間の相互作用が、観察される細胞毒性効果にとって重要であることが示される。
【図８】広域阻害剤のリソソームプロテアーゼ（Ｅ６４Ｄ）の存在下でＵ９３７細胞をプレインキュベートすることがｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥの細胞毒素効果の完全な抑止をもたらすことを示す。それによって、複合薬物のリソソーム放出が、細胞毒素効果を得るために重要であることが示される。
【図９】ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスにおいて細胞株Ｕ９３７の注射によって確立された、ｕＰＡＲＡＰ陽性皮下異種移植片腫瘍に対抗することにおけるｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥの有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を示す。マウスを、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ  （Ｎ＝１０）、対照ＡＤＣ  ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝９）、非複合モノクローナル抗体２ｈ９（Ｎ＝５）、または生理食塩水（ＰＢＳ、Ｎ＝５）のいずれかを腫瘍の近くに皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって処置する。すべての処置は、３ｍｇ／ｋｇ／モノクローナル抗体成分注射の用量を計４投与、４日ごとに投与することで行われる。０日は、腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の触知可能なサイズに達すると開始される、第１の注射の日を示す。グラフは各処置群にわたる平均腫瘍サイズを示す。ＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥによる処置が腫瘍増殖において大幅な減少をもたらすのに対して、他の処置群のすべては、処置の開始から１０〜１２日内に犠牲の段階に達することが分かる。これは、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥがｉｎ  ｖｉｖｏで前もって構築されたｕＰＡＲＡＰ陽性腫瘍の増殖を阻害することに有能であることを示す。さらに、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ処置群からのデータは、５０％の永久治癒率を表す（図１０も参照されたい）。
【図１０】図９に記載の２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ処置群の腫瘍増殖のより詳細な観察を示す。この群には非完全な処置と腫瘍再発を受けているマウス、ならびに腫瘍負荷が完全になくなり腫瘍再発を示さないマウスが含まれていることを示す。２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥで処置した１０匹のマウスのうち５匹は、処置後に腫瘍増殖のほぼ即時再発を示し、犠牲の段階に急速に達するのに対して、残りの５匹のマウスは腫瘍のすべての徴候を消失し、９０日の期間、腫瘍増殖がないままであり、皮下投与により２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ処置を受けたマウスについて５０％の全体的な永久治癒率を示した。
【図１１】ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスにおいて細胞株Ｕ９３７の注射によって確立された、ｕＰＡＲＡＰ陽性皮下異種移植片腫瘍に対抗することにおけるｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥの有効性のｉｎ  ｖｉｖｏ試験を示す。マウスを、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝１０）、対照ＡＤＣ  ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝１０）、非複合モノクローナル抗体２ｈ９（Ｎ＝５）、または生理食塩水（ＰＢＳ、Ｎ＝５）のいずれかを尾静脈から静脈内（ｉ．ｖ．）注射することによって処置する。すべての処置は、５ｍｇ／ｋｇ／モノクローナル抗体成分注射の用量を計３投与、４日ごとに投与することで行われる。０日は、腫瘍が５０〜１００ｍｍ３の触知可能なサイズに達すると開始される、第１の注射の日を示す。グラフは各処置群にわたる平均腫瘍サイズを示す。これらの条件下で、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥによる処置は、１０匹のすべてのマウスにおいて腫瘍負担の完全な抑止をもたらし、このＡＤＣの静脈内投与によりマウスの１００％の全体的な永久治癒率をもたらし、固形ｕＰＡＲＡＰ陽性腫瘍に対抗することにおけるＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥの有効性をさらに示す。
【図１２】Ｕ９３７細胞株での、非標的ＡＤＣ（ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ）と比較した、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ、またはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ  ５ｆ４−ｖｃ−ＭＭＡＥのいずれかとのインキュベーション後の、全体的な生存率の特異的な減少を示す、ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ細胞生存率アッセイを示す。データは、５ｆ４に基づくＡＤＣが２ｈ９抗体に基づくＡＤＣに相当する有効性を有することを示す。
【図１３】異なる肉腫（脂肪肉腫、粘液線維肉腫、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）および平滑筋肉腫（ＬＭＳ）の免疫組織化学染色を示す。染色方法は、濃い赤褐色の色としてｕＰＡＲＡＰの組織発現を示す。ｕＰＡＲＡＰの発現は悪性癌（腫瘍）組織の切片中で明らかであるのに対して、非癌組織の切片はｕＰＡＲＡＰを欠いており、肉腫中で見られるｕＰＡＲＡＰの発現レベルの増加を示す。スケールバー：２０μｍ。
【図１４】ｕＰＡＲＡＰのＮ末端部に対して作られる異なる抗体がＡＤＣ型で効率的な薬物送達のために使用できる。モノクローナル抗体−ｖｃ−ＭＭＡＥ組成を有するＡＤＣを、ｕＰＡＲＡＰの３つのＮ末端ドメイン内のエピトープに対して作られた３種の異なる抗体（モノクローナル抗体２ｈ９、モノクローナル抗体５ｆ４、モノクローナル抗体９ｂ７）を用いて、図２の説明文に記載のように調製した。比較のために、ＡＤＣを、同様の方法を用いるがＮ末端の３つのドメイン（モノクローナル抗体１１ｃ９）の外側のエピトープに対して作られる抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を使用して、調製した。Ｕ９３７細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存濾率アッセイを次いで、これらのＡＤＣすべてを使用して、図５の説明文に記載のように行なった。すべてのＡＤＣは、全体的な細胞生存率において特異的な減少を引き起こすが、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ、５ｆ４−ｖｃ−ＭＭＡＥおよび９ｂ７−ｖｃ−ＭＭＡＥに対する細胞感受性は１ｃ９−ｖｃ−ＭＭＡＥに対する感受性よりもかなり高い。
【図１５】異なる毒素がｕＰＡＲＡＰのＮ末端部を標的にするＡＤＣ型で使用できる。抗体成分としてモノクローナル抗体２ｈ９を有するＡＤＣを図２の説明文に記載のように調製したが、ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの代わりに以下のリンカー−細胞毒ユニットを使用した：ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ（ＭＭＡＦは、ＭＭＡＥのカルボキシル変種であるモノメチルアウリスタチンＦである）、およびＰＥＧ４−ｖａ−ＰＢＤ（ＰＥＧ４はポリエチレングリコールスペーサーを指し、ｖａはバリン−アラニンでありＰＢＤはピロロベンゾジアゼピン二量体を指す）。結果として生じるＡＤＣ（それぞれ、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦ、２ｈ９−ｖａ−ＰＢＤと呼ぶ）を、Ｕ９３７細胞でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイに用い、図５の説明文に記載のように行なった。Ｕ９３７細胞は、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦに対して非常に強い感受性を示し、２ｈ９−Ｖａ−ＰＢＤに対してはより穏やかな感受性を示した。
【図１６】抗体成分としてモノクローナル抗体２ｈ９を有するＡＤＣを、ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの代わりに以下のリンカー−細胞毒ユニット：ＰＥＧ４−ｖｃ−デュオカルマイシンＳＡ（ＰＥＧ４はポリエチレングリコールスペーサーを指し、ｖｃはバリン−シトルリンである）を用いて図２の説明文に記載のように調製した。結果として生じるＡＤＣ（２ｈ９−ｖｃ−ＤｕｏｃＳＡと呼ばれる）を、Ｕ９３７細胞でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイに使用し、図５の説明文に記載のように行なった。Ｕ９３７細胞は、２ｈ９−ｖｃ−ＤｕｏｃＳＡに対して低いが測定可能な感受性を示した。
【図１７】抗体成分としてモノクローナル抗体２ｈ９またはａＴＮＰを有するＡＤＣを、以下のリンカー−細胞毒ユニット：ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥまたはＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを用いて図２の説明文に記載のように調製した。結果として生じるＡＤＣ（２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦ、ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥおよびａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＦと呼ばれる）を、ヒト神経膠芽腫移植片細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイに使用し、図５の説明文に記載のように行なった。これらの神経膠芽腫移植片細胞は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ毒素に基づいて、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣに対する高度な特異的感受性を示した。
【図１８】「クローン化２ｈ９」と称される、組換えモノクローナル抗体  ２ｈ９産物を、モノクローナル抗体２ｈ９の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列（それぞれ、［配列番号１］および［配列番号５］）を含む発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中で産生した。この産物の反応性をウエスタンブロッティングで解析し、ハイブリドーマ細胞培養（「２ｈ９オリジナル」）によって産生されたモノクローナル抗体２ｈ９と比較した。ウエスタンブロッティングでは、ｕＰＡＲＡＰ陽性ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞から調製された界面活性剤による細胞溶解物を、一次抗体として同一の濃度の「クローン化２ｈ９」と「２ｈ９オリジナル」を使用して分析した。２つの抗体産物は同一の反応を示し、かつ両方ともｕＰＡＲＡＰタンパク質と特異的に反応する。一次抗体（陰性対照）の非存在下で反応は見られない。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
配列
【表１】
2019511205.tif 000002
2019511205.tif 000003
【００１２】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＤｕｎｂａｒとＤｅａｎｅ（２０１６）によって発表されたコンピュータ化Ｋａｂａｔ番号付けプログラムを使用して、参考文献（Ｋａｂａｔら（１９８３）、Ｋａｂａｔら（１９９１）およびＷｕとＫａｂａｔ（２００８））で特定されているように、Ｋａｂａｔらの規定スキームにしたがって予測した。Ｐａｒａｔｏｍｅアルゴリズムによる抗原結合領域（ＡＢＲ）もまた、参考文献（Ｋｕｎｉｋら（２０１２ａおよびｂ））で特定されるように予測した。ＡＢＲは、本明細書に開示する抗体の代替ＣＤＲを表す。
【００１３】
抗原認識および結合に関与する全ての領域は、特定されたＣＤＲおよびＡＢＲからわずかにそれることがあり得る。本明細書で特定される可変領域またはＦａｂフラグメントに含まれるすべての配列データは、抗原結合に潜在的に関与するので包含される。本明細書で用いるものと異なる方法またはアルゴリズムが、潜在的な結合／認識領域の同定のために用いられてよい。したがって、本明細書に提示される予測ＣＤＲに加えて、本発明は、そのような方法またはアルゴリズムを用いて、それぞれのＦａｂ領域および可変領域（それぞれ配列番号９、１０、１１、１５、２０および２５）に基づいてモノクローナル抗体２ｈ９、５ｆ４および９ｂ７中のＣＤＲまたはＡＢＲを表すと予測されるあらゆるアミノ酸配列を包含する。ＣＤＲの予測のためのさらなる方法およびアルゴリズムの例としては、ＩＭＧＴシステム（ＬｅＦｒａｎｃら，（２００３））が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１４】
Ｆａｂ  ９Ｂ７軽鎖および重鎖の配列決定の間、プライマー領域の位置のため、これらの配列のＮ末端領域において何らかの曖昧さが予想される。このように、配列番号１９の最初の７つのアミノ酸は、正確でないこともあり得る。配列番号２４のアミノ酸１〜８について、同じことが言える。配列番号２０と２５は配列番号１９と２４にそれぞれ対応し曖昧なＮ末端アミノ酸はない。
【００１５】
詳細な説明
本開示のｕＰＡＲＡＰを標的にする抗体薬物複合体は、
ａ）ｕＰＡＲＡＰのシステインに富むドメイン（ＣｙｓＲ）、フィブロネクチン型ＩＩ（ＦＮ−ＩＩ）ドメインにおよび／またはＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）に結合可能な抗体、
ｂ）活性薬剤、および
ｃ）任意選択でａ）をｂ）に連結するリンカー
を含む。
【００１６】
特定の態様において、本開示のｕＰＡＲＡＰを標的にする抗体薬物複合体は、
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号３６または３７（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号３８または３９（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号４０または４１（ｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｖ．配列番号３０または３１（ｕＰＡＲＡＰのシステインに富むドメイン（ＣｙｓＲ））のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号３２または３３（ｕＰＡＲＡＰのフィブロネクチン型ＩＩ（ＦＮ−ＩＩ）ドメイン）のアミノ酸配列、および／または
ｖｉ配列番号３４または３５（ｕＰＡＲＡＰのＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）のアミノ酸配列
に結合可能な抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．活性薬剤、ならびに任意選択で
ｃ．ａ）をｂ）に連結するリンカー
を含む。
【００１７】
ｕＰＡＲＡＰに対して作られる抗体
本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、細胞表面でｕＰＡＲＡＰに結合すると、内部移行され、したがってＡＤＣ複合体の活性薬剤の細胞内作用を可能にする。ｕＰＡＲＡＰに結合できるすべての抗体が同じ割合で、または同じ量で内部移行されるというわけではないことが、例えば国際公開第ＷＯ２０１０／１１１１９８号から知られている。実際、いくつかの抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は全く内部移行されず、したがって、ＡＤＣでの使用に好適でない。
【００１８】
ｕＰＡＲＡＰ受容体は、Ｎ末端システインに富むドメイン（ＣｙｓＲ）、フィブロネクチンＩＩ型（ＦＮ−ＩＩ）ドメイン、および８つのＣ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ１〜８）からなる（図１を参照されたい）。短いアミノ酸配列は、個々のドメインを接続する。本明細書に提示されるデータは、ｕＰＡＲＡＰの最もＮ末端の３つのドメインを標的とする抗ｕＰＡＲＡＰ抗体がＡＤＣでの使用に極めて効果的であることを示唆する。
【００１９】
このように、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、好ましくはｕＰＡＲＡＰのＮ末端領域に、より好ましくはｕＰＡＲＡＰの最もＮ末端の３つのドメイン、すなわちシステインに富むドメイン、フィブロネクチン型ＩＩドメインおよび／またはＣ型レクチン様ドメイン１（ｕＰＡＲＡＰのこれらのドメインをつなぐリンカー配列を含む）の３つのドメインに位置するエピトープに結合する。
【００２０】
このように、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ｕＰＡＲＡＰのシステインに富むドメイン（ＣｙｓＲ）（配列番号３０または３１）、フィブロネクチン型ＩＩ（ＦＮ−ＩＩ）ドメイン（配列番号３２または３３）および／またはＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）（配列番号３４または３５）を含む、またはそれらからなるペプチドに結合できる。
【００２１】
ＮＣＢＩによって記載されるシステインに富むドメイン、フィブロネクチン型ＩＩドメインおよびＣ型レクチン様ドメイン１（これらのドメインをつなぐリンカー配列を含む）は、全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸４６〜３６１に対応する。したがって、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体に関するエピトープは、配列番号２９（全長ヒトｕＰＡＲＡＰ）のアミノ酸４６〜３６１に位置する。一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、配列番号２９のアミノ酸３１〜３６５に、より好ましくは配列番号２９のアミノ酸４６〜３６１（本明細書では配列番号３６に対応する）に位置するエピトープに結合する。ＳＭＡＲＴは、これらのドメインを配列番号２９のアミノ酸４１〜３６０につなげるリンカー配列を含むＣＹＳＲ−ＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ１を予測する。したがって、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体に関するエピトープは、本明細書で配列番号３７に対応する、配列番号２９のアミノ酸４１〜３６０に位置する。
【００２２】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＣｙｓＲドメインおよび／またはＣＴＬＤ−１ドメインに結合する。
【００２３】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＣｙｓＲドメインに結合し、このドメインは、ＮＣＢＩによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸４６〜１６１からなり、本明細書で配列番号３０に対応し、およびＳＭＡＲＴによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸４１〜１６１からなり、本明細書で配列番号３１に対応する、すなわち、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は配列番号２９のアミノ酸４６〜１６１または４１〜１６１に位置するエピトープに結合する。
【００２４】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＦＮ−ＩＩドメインに結合し、このドメインは、ＮＣＢＩによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸１８１〜２２８からなり、本明細書で配列番号３２に対応し、およびＳＭＡＲＴによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸１８０〜２２８からなり、本明細書で配列番号３３に対応する。すなわち、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は配列番号２９のアミノ酸１８１〜２２８または１８０〜２２８に位置するエピトープに結合する。
【００２５】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＣＴＬＤ−１ドメインに結合し、このドメインは、ＮＣＢＩによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸２４７〜３６１からなり、本明細書で配列番号３４に対応し、およびＳＭＡＲＴによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸２３５〜３６０からなり、本明細書で配列番号３５に対応する。すなわち、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は配列番号２９のアミノ酸２４７〜３６１または２３５〜３６０に位置するエピトープに結合する。
【００２６】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＣｙｓＲおよびＦＮ−ＩＩドメイン（これらのドメインをつなぐリンカー配列を含む）、またはそれらからなるペプチドに結合でき、このドメインはＮＣＢＩによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸４６〜２２８からなり、配列番号３８に対応し、およびＳＭＡＲＴによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸４１〜２２８からなり、本明細書で配列番号３９に対応する。すなわち、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は配列番号２９のアミノ酸４６〜２２８または４１〜２２８に位置するエピトープに結合する。
【００２７】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＦＮ−ＩＩおよびＣＴＬＤ−１ドメイン（これらのドメインをつなぐリンカー配列を含む）を含む、またはそれらからなるペプチドに結合でき、このドメインはＮＣＢＩによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸１８１〜３６１からなり、配列番号４０に対応し、およびＳＭＡＲＴによる予測では全長ヒトｕＰＡＲＡＰのアミノ酸１８０〜３６０からなり、本明細書で配列番号４１に対応する。すなわち、一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は配列番号２９のアミノ酸１８０〜３６１または１８１〜３６０に位置するエピトープに結合する。
【００２８】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されているマウスモノクローナルＩｇＧ１κ抗体のクローン２．ｈ．９：Ｆ１２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＤＫ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａｎｔｉ−ＵＰＡＲ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ％２Ｃ−ｃｌｏｎｅ−２．ｈ．９％３ＡＦ１２．ＭＭ＿ＮＦ−ＭＡＢ２６１３？ｃｉｄ＝ＢＩ−ＸＸ−ＢＲＣ−Ｐ−ＧＯＯＧ−ＡＮＴＩ−Ｂ３０２−１０７５）またはその機能的フラグメントもしくは変異体、例えばキメラバージョンまたはヒト化バージョンである。マウスモノクローナルＩｇＧ１κ抗体クローン２．ｈ．９：Ｆ１２は、本明細書では「２ｈ９」抗体または「ｍＡｂ  ２ｈ９」と称される。２ｈ９抗体は、ヒトｕＰＡＲＡＰとマウスｕＰＡＲＡＰとの両方と反応し、したがって前臨床試験および臨床試験の両方に適切である。
【００２９】
これまでの試験は、２ｈ９抗体に関するエピトープがｕＰＡＲＡＰの最もＮ末端の３つのドメインに、具体的にはＣｙｓＲドメインまたはＣＴＬＤ−１ドメインに位置することを示す。ｕＰＡＲＡＰの３つのＮ末端ドメイン（ＣｙｓＲ、ＦＮ−ＩＩおよびＣＴＬＤ−１）からなる可溶性組換えタンパク質は、ＢＩＡｃｏｒｅ装置において固定化２ｈ９に結合し、これらの３つのＮ末端ドメインへのモノクローナル抗体２ｈ９による結合の部位を限定する（Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎら，２０１１，ＪＢＣ  ２８６（３７）：３２７３６−４８）。さらに、ｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩドメインを同じ受容体ファミリーの他のメンバーのＦＮ−ＩＩドメインと交換しても、モノクローナル抗体２ｈ９の結合に影響はなく、ＦＮ−ＩＩドメインがモノクローナル抗体２ｈ９に関するエピトープを含まない可能性を示唆している（Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎら，２０１４，ＪＢＣ  ２８９（１１）：７９３５−４７）。これは、ＣｙｓＲドメインまたはＣＴＬＤ−１ドメインのいずれかへのモノクローナル抗体２ｈ９の結合を効果的に限定する。
【００３０】
モノクローナル抗体２ｈ９の免疫グロブリン軽鎖可変領域の予想されるＣＤＲは、配列番号２〜４に対応し、モノクローナル抗体２ｈ９の免疫グロブリン重鎖可変領域の予想されるＣＤＲは、配列番号６〜８に対応する。
【００３１】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、以下からなる群から選択される２ｈ９抗体またはその機能的フラグメントもしくは変異体に対応する抗体である：
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１もしくは９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、またはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および／または
ｉｉ．配列番号５もしくは１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、またはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バーション、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｄ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｅ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号２、３、４、６、７および８のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号２、３および４のアミノ酸配列、および／または配列番号６、７および８のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号４２、４３、４４、４５、４６および４７の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号４２、４３および４４のアミノ酸配列、および／または配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００３２】
本明細書に開示される抗体の抗原認識を維持するために、配列変化は、通常ＣＤＲまたはＡＢＲ中にない。このように、好適な実施形態において、あらゆる配列変異はＣＤＲまたはＡＢＲの外側に位置する。本明細書に開示されるすべての変異抗体および抗原結合フラグメントは、ｕＰＡＲＡＰに結合する能力を保持する。
【００３３】
例えば、本開示の抗体は、以下を含み得る：
ａ．配列番号１もしくは９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、および
ｂ．配列番号５もしくは１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン重鎖可変領域：
ｉ．配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３
ここでいずれの配列変化もＣＤＲの外側である。
【００３４】
あるいは、本開示の抗体は以下を含み得る：
ａ．配列番号１もしくは９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ１、
ｉｉ．配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ２、
ｉｉｉ．配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ３、
ｂ．配列番号５もしくは１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン重鎖可変領域：
ｉ．配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ１、
ｉｉ．配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ２、
ｉｉｉ．配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ３、
ここでいずれの配列変化もＡＢＲの外側である。
【００３５】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、マウスモノクローナル抗体５ｆ４またはその機能的フラグメントもしくは変異体である。５ｆ４抗体は、ＩｇＧ１κである。
【００３６】
試験は、５ｆ４に関するエピトープがｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩ領域にあることを示した。Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎら，２０１４では、野生型ＦＮ−ＩＩドメインがｕＰＡＲＡＰのそれと交換された場合、５ｆ４抗体は野生型ｕＰＡＲＡＰに、およびマンノース受容体ファミリーの人工メンバーに結合できることを示している。野生型ＦＮ−ＩＩドメインがマンノース受容体ファミリーの他のメンバー由来の同等のドメインと交換された場合、５ｆ４は、それらの野生型形態でのマンノース受容体ファミリータンパク質の他のメンバーに結合できない、またはｕＰＡＲＡＰと結合できない（Ｊｕｒｇｅｎｓｅｎら，２０１４，ＪＢＣ  ２８９（１１）：７９３５−４７）。
【００３７】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、以下からなる群から選択される５ｆ４抗体またはその機能的フラグメントもしくは変異体に対応する抗体である：
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、またはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および／または
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、またはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バーション、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｄ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｅ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１２、１３、１４、１６、１７および１８のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号１２、１３および１４のアミノ酸配列、および／または配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号４８、４９、５０、５１、５２および５３のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号４８、４９および５０のアミノ酸配列、および／または配列番号５１、５２および５３のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００３８】
ＣＤＲの外側でいくつかの配列変化を可能にするために、本開示の抗体は  以下を含み得る：
ａ．配列番号１１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、および
ｂ．配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン重鎖可変領域：
ｉ．配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
ここでいずれの配列変化もＣＤＲの外側である。
【００３９】
あるいは、本開示の抗体は、以下を含み得る：
ａ．配列番号１１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ１、
ｉｉ．配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ２、
ｉｉｉ．配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ３、および
ｂ．配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン重鎖可変領域：
ｉ．配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ１、
ｉｉ．配列番号５２に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ２、
ｉｉｉ．配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ３、
ここでいずれの配列変化もＡＢＲの外側である。
【００４０】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、マウスモノクローナル抗体９ｂ７（ｍＡｂ  ９ｂ７）またはその機能的フラグメントもしくは変異体である。これまでの試験は、９ｂ７抗体に関するエピトープがｕＰＡＲＡＰの最もＮ末端の３つのドメインに位置することを示す。ｕＰＡＲＡＰの３つのＮ末端ドメイン（ＣｙｓＲ、ＦＮ−ＩＩおよびＣＴＬＤ−１）からなる可溶性組換えタンパクがＢＩＡｃｏｒｅ装置において固定化されるとき、モノクローナル抗体９ｂ７はこの構築物に結合する。
【００４１】
一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は以下からなる群から選択される：
ａ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１９もしくは２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、またはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および／または
ｉｉ．配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、またはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ．ａ）の抗体と同じエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｃ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バーション、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｄ．ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、またはｂ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｅ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号２１、２２、２３、２６、２７および２８のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号２１、２２および２３のアミノ酸配列、および／または配列番号２６、２７および２８のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ．抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号５４、５５、５６、５７、５８および５９のアミノ酸配列の１つもしくは複数、または
ｉｉ．配列番号５４、５５および５６のアミノ酸配列、および／または配列番号５７、５８および５９のアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【００４２】
一実施形態において、本開示の抗体は以下を含み得る：
ａ．配列番号１９もしくは２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、および
ｂ．配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン重鎖可変領域：
ｉ．配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、
ｉｉ．配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、
ｉｉｉ．配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３
いずれの配列変化もＣＤＲの外側である。
【００４３】
あるいは、本開示の抗体は、以下を含み得る：
ａ．配列番号１９もしくは２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域：
ｉ．配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ１、
ｉｉ．配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ２、
ｉｉｉ．配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ３、および
ｂ．配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の配列相同性、それと少なくとも８０％の配列相同性など、例えばそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含む、およびさらに以下を含む免疫グロブリン重鎖可変領域：
ｉ．配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ１、
ｉｉ．配列番号５８に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ２、
ｉｉｉ．配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＡＢＲ３
ここでいずれの配列変化もＡＢＲの外側である。
【００４４】
「抗体」によって、実質的に完全な抗体分子、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または軽鎖のホモ二量体とヘテロ二量体、および抗原結合フラグメントとその誘導体を包含する。
【００４５】
「抗原結合フラグメント」によって、ｕＰＡＲＡＰに結合できる抗体の機能的フラグメントを意味する。
【００４６】
一実施形態において、本開示による抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト化抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体（ＳＣＡ）、その重鎖および／または軽鎖の可変部分、またはＦａｂミニ抗体から選択され、これらのフラグメントまたは修飾抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体由来であってよい。
【００４７】
一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ヒト化されたもしくは完全にヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【００４８】
一実施形態において、本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、組換え抗体である。
【００４９】
本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含む任意の免疫グロブリンクラス、およびそのあらゆるサブクラスであってよい。ＩｇＧサブクラスはまた、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、抗体はＩｇＧモノクローナル抗体である。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１κである。
【００５０】
一実施形態において、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体は、抗原結合フラグメントである。
【００５１】
全抗体よりもむしろ抗体フラグメントを用いる利点は、数倍である。より小さいサイズのフラグメントは、良好な組織浸透などの薬理学的性質の改善をもたらし得る。さらに、抗原結合フラグメントは、大腸菌もしくは他の非哺乳動物宿主細胞中で発現させること、および大腸菌もしくは他の非哺乳動物宿主細胞から分泌させることが可能であり、したがって大量の前述のフラグメントを容易に生成することを可能にする。
【００５２】
Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の一部をもたらすように酵素パパインでの全抗体の消化によって、または他の特異的なタンパク質分解手段によって生成できる、抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメントである。
【００５３】
Ｆ（ａｂ’）２は、全抗体を酵素ペプシンで処置することによって、またはその後の還元なしに二価抗原結合フラグメントをもたらす他の特異的なタンパク質分解の手段によって得ることができる、抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によってまとめられる２つのＦａｂフラグメントの二量体である。
【００５４】
Ｆｖは、２本の鎖として発現される、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子組換えフラグメントである。
【００５５】
単鎖抗体（ＳＣＡ）は、ｓｃＦｖを含んで、遺伝子組換えにより融合された、単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子組換え分子である。
【００５６】
抗体および抗体フラグメントを生成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のｉｎ  ｖｉｖｏ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング、または培養中の細胞株によるモノクローナル抗体の生成を用いるいくつかの方法の任意の１つによって生成できる。これらとしては、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
同様に、抗体フラグメントは、当技術分野で周知の方法を使用して得ることができる。例えば、本発明による抗体フラグメントは、種々の酵素での抗体のタンパク質加水分解によって、またはフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養または他のタンパク質発現系）での発現によって調製できる。あるいは、抗体フラグメントは従来の方法により全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得ることができる。
【００５８】
ヒトの治療または診断のために、ヒト抗体またはヒト化抗体が好ましくは使用されることを当業者は理解されよう。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型は、非ヒト抗体由来の好ましくは最小部分を有する遺伝子組換えキメラ抗体または抗体フラグメントである。ヒト化抗体は、ヒト抗体（レシピエント抗体）相補性決定領域（ＣＤＲ）が所望の機能を有するマウス、ラットもしくはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域からの残基によって交換される抗体を含む。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって交換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体において、または移入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列において見つからない残基を含むこともある。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、一般的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、可変ドメイン中で相補性決定領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト抗体のそれらに対応し、およびフレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが関連するヒトコンセンサス配列のそれらに対応する。ヒト化抗体は任意選択で、一般的にヒト抗体由来の、Ｆｃ領域などの抗体定常領域の少なくとも一部分も含む。
【００５９】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１または複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基と呼ばれ、一般的に移入される可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、ヒトＣＤＲを対応する非ヒトＣＤＲで置換することによって記載のように行われてよい。したがって、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり、実質的に一つに満たない無傷のヒト可変ドメインが対応する非ヒト種由来の配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は一般的に、一部のＣＤＲ残基およびおそらく一部のフレームワーク残基が非ヒト抗体中の類似体部位からの残基によって置換される、ヒト抗体であり得る。
【００６０】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で知られている種々の手法を用いて特定もできる。
【００６１】
好適な抗体が得られたならば、それらは、例えばＥＬＩＳＡによって、抗原特異性について試験されてよい。
【００６２】
活性薬剤
本開示の抗ｕＰＡＲＡＰ  ＡＤＣは、活性薬剤、すなわち、その表面にｕＰＡＲＡＰを発現する細胞へ細胞内に送達され得る薬物を含む。活性薬剤は、例えば治療薬、細胞毒性薬、放射性同位体または検出可能な標識であり得る。好適な実施形態において、活性薬剤は治療薬である。
【００６３】
一実施形態において、活性薬剤は化学療法薬である。化学療法薬の種類としては、アルキル化剤、アントラサイクリン系薬剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤／抗有糸分裂剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、ペプチド抗生物質、白金系抗悪性腫瘍薬、トポイソメラーゼ阻害薬および細胞毒性抗生物質が挙げられる。
【００６４】
好適な実施形態において、活性薬剤は、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞を効果的に死滅させることができる細胞毒性剤である。
【００６５】
一実施形態において、活性薬剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、タキサン（例えば、パクリタキセルもしくはドセタキセル）、ビンカアルカロイド（例えばビンプラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンもしくはビノレルビン）、コルヒチンまたはポドフィロトキシンなどの抗有糸分裂剤である。
【００６６】
一実施形態において、細胞毒性薬はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。その高い毒性のため、ＭＭＡＥチューブリンの重合を阻止することによって細胞分裂を阻害するＭＭＡＥは、単剤化学療法薬として使用できない。しかし、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体（ブレンツキシマブベドチン、商標名Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））に連結されたＭＭＡＥの組み合わせは、細胞外液中で安定であり、カテプシンによって切断可能であり、および療法にとって安全であることが判明した。
【００６７】
一実施形態において、細胞毒性薬はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である。ＭＭＡＦは、抗微小管剤／抗有糸分裂剤でありＭＭＡＥのカルボキシル変種である。
【００６８】
一実施形態において、細胞毒性薬は、ピロロベンゾジアゼピンまたはピロロベンゾジアゼピン二量体誘導体などのＤＮＡ架橋剤である。
【００６９】
一実施形態において、細胞毒性薬は、デュオカルマイシンＳＡなどのＤＮＡアルキル化剤である。
【００７０】
さらなるアルキル化剤の例としては、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、およびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンとメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−ＩＩ（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎと９−アミノ基カンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（具体的にはクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢｌ−ＴＭｌを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、インホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネスエリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγＩＩとカリケアマイシンωＩＩ；ジネミシンＡを含むジネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連した色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））とデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））���カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、マイトテイン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フォリン酸などの葉酸補充物；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチラミン；トリコテセン（特にＴ‐２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡとアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作したナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；インホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；上記いずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンとプレドニゾロンの併用療法の省略形）などの上記の２つ以上の組み合わせ、ならびにＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと組み合わせられるオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））による治療計画の省略形）が挙げられる。
【００７１】
抗ホルモン剤は、癌の増殖を促進できるホルモンの効果を調節する、減少させる、阻止する、または阻害するように作用し、全身療法、すなわち全身治療として投与されることが多い。抗ホルモン剤は、ホルモン自体であり得る。例としては抗エストロゲン薬と選択的エストロゲン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）、例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹｌ１７０１８、オナプリストンとトレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））；抗プロゲステロン；エストロジェン受容体ダウンレギュレータ（ＥＲＤ）；卵巣機能を抑制または停止する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（例えば酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）とＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン酢酸およびトリプトレリン；他の抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；ならびにアロマターゼ阻害剤（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、エクセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））が挙げられる。加えて、ビスホスホネート、例えば、クロドロナート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；ｓｉＲＮＡ、リボザイムとアンチセンスオリゴヌクレオチド、具体的には異常細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するもの；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンと遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ラパチニブジトシラート（ＥｒｂＢ−２およびＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤（別名ＧＷ５７２０１６））；セレコキシブなどのＣＯＸ−２阻害剤（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフロロメチル）−ｌＨ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；ならびに上記のいずれかの薬学的に許与される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【００７２】
一実施形態において、活性薬剤は、オリゴヌクレオチドなどのヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。
【００７３】
抗体分子当たり１または複数の単位の薬物が存在し得る。抗体当たりの薬物分子数間の比率は、薬物対抗体比（ＤＡＲ）を示す。一実施形態において、ＤＡＲは１と１０の間であり、すなわち、抗体分子当たり１と１０の間の薬物単位がある。一実施形態において、ＤＡＲは２と８の間であり、４または５など、例えば３と６の間である。
【００７４】
リンカー
抗体と活性薬剤間の安定な連結は、ＡＤＣ技術の重要な側面である。リンカーは、例えば二硫化物、ヒドラゾンまたはペプチド（切断可能な）、またはチオエーテル（切断可能でない）を含む化学モチーフに基づいており、標的細胞への細胞毒性薬の分布および送達を制御できる。切断可能型および切断不可型リンカーは、前臨床試験および臨床試験で安全であることがわかっている。例えば、ブレンツキシマブベドチンは、酵素感受性の切断可能なリンカーを含み、合成抗腫瘍剤である、強力で毒性の高い微小管阻害薬モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を細胞に送達する。
【００７５】
別の承認されたＡＤＣであるトラスツズマブエムタンシンは、安定な切断不可リンカーにより接着される、メイタンシンの誘導体である微小管形成阻害剤メルタンシン（ＤＭ−１）、および抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）の組み合わせである。
【００７６】
切断可能型リンカーまたは切断不可型リンカーは、送達される薬物に特異性を与える。例えば、切断可能リンカーは、標的細胞中で酵素によって例えば切断され、活性薬剤、例えば細胞毒性薬の効果的な細胞内放出を引き起こす。対照的に、切断不可リンカーを含むＡＤＣは、薬物放出のための機構をもたず、薬物放出のために、標的抗体の分解などの機構に依存しなければならない。さらに、当業者が理解しているように、リンカー組成物は全体としてＡＤＣの溶解度および薬物動態特性などの重要な要素に影響を及ぼし得る。
【００７７】
両型のリンカーについて、薬物放出は、細胞効果を得るために重要である。細胞膜を横切って自由に拡散できる薬物は、標的細胞から免れることができ、「バイスタンダーキリング」と呼ばれるプロセスにおいて、隣接する細胞、例えばｕＰＡＲＡＰを発現する標的細胞の近傍の癌細胞を攻撃することもできる。
【００７８】
好適な実施形態において、本明細書に開示するＡＤＣ標的ｕＰＡＲＡＰは、抗ｕＰＡＲＡＰ抗体と活性薬剤とを連結するリンカーを含む。リンカーは切断可能または切断不可であり得る。一実施形態において、リンカーは切断可能なリンカーであり、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞の内部で活性薬剤の細胞内放出を可能にする。
【００７９】
切断可能な基としては、ジスルフィド結合、アミド結合、ペプチド結合の形の置換アミド結合、チオアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、隣接するジオール結合、またはヘミアセタールが挙げられる。これらのまたは他の切断可能な結合は、酵素的に切断できる結合、例えばペプチド結合（ペプチダーゼによって切断される）、リン酸結合（ホスファターゼによって切断される）、核酸結合（エンドヌクレアーゼによって切断される）、および糖結合（グリコシダーゼによって切断される）を含み得る。
【００８０】
リンカーは、例えばポリペプチドリンカー、ペプチドリンカーまたは核酸リンカーであり得る。
【００８１】
特定の実施形態において、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチド配列の選択は、複合体の成功にとってきわめて重大である。いくつかの実施形態において、リンカーは血清プロテアーゼに対し安定であるが、標的細胞中でリソソーム酵素によって切断される。非限定例において、リンカーは、プロタミン、プロタミンフラグメント、（Ａｒｇ）９、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンおよびアンテナペディアペプチドから選択されるペプチドである。他の非ヌクレオチドリンカーは、約５〜約１００原子のアルキル鎖またはアリル鎖を含む。いくつかの実施形態において、リンカーはヌクレオチドリンカーである。
【００８２】
一実施形態において、リンカーは、カテプシンで切断可能なペプチドを含有するリンカーなどの、酵素切断可能ペプチド含有リンカーである。カテプシンは、一群のリソソームプロテアーゼの１つであり、いくつかのカテプシン型の１つであり得る。
【００８３】
一実施形態において、リンカーは、バリン−シトルリン（ＶＣ）またはバリン−アラニン（ＶＡ）などのジペプチドを含む、またはジペプチドからなり、アミド結合を介して他の構造要素にさらに接続されてよい。シトルリンカルボキシル官能基が置換アミドに変更されるバリン−シトルリンベースのリンカーは、リソソームカテプシンによって切断され得るのに対して、アラニンカルボキシル官能基が置換アミドに変更されるバリン−アラニンベースのリンカーは、他のカテプシンを含む他のリソソームプロテアーゼによって切断され得る。
【００８４】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、スペーサーをさらに含む。スペーサーは例えば、リンカーおよび活性薬剤に接続できる。一実施形態において、スペーサーはパラアミノ安息香酸（ＰＡＢ）である。
【００８５】
一実施形態において、スペーサーは、ＰＥＧ４スペーサーなどのポリエチレングリコールスペーサーである、またはそれを含む。
【００８６】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、接着実体をさらに含む。接着実体は、例えば、抗体と切断可能リンカーを接続でき、この場合、接着実体は抗体アミノ酸の側鎖と、リンカー前駆体中の反応性接着基との間の反応生成物である。一実施形態において、この反応性接着基は、マレイミドとカプロン酸（ＭＣ）を含む、またはこれらからなり、この場合マレイミドは共役の間、好ましくはシステインチオールと反応する。他の実施形態において、接着基はＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、アジド基もしくはアルキン基を含む、またはこれらからなる。
【００８７】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、本明細書に開示される抗ｕＰＡＲＡＰ抗体およびリンカー薬物複合体ベドチンを含む。ベドチンは、細胞毒性薬ＭＭＡＥ、スペーサー（パラアミノ安息香酸）、カテプシン切断可能リンカー（バリン−シトルリンジペプチド）およびカプロン酸とマレイミドからなる接着基を含む、リンカー−薬物複合体である。ベドチンは、ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥである。ブレンツキシマブベドチン（商標名Ａｄｃｅｔｒｉｓ（商標））は、ベドチンを含むＦＤＡ承認ＡＤＣの一例である。
【００８８】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、本明細書に開示される抗ｕＰＡＲＡＰ抗体と、ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦであるリンカー−スペーサー−毒素ユニットとを含む。
【００８９】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、本明細書に開示される抗ｕＰＡＲＡＰ抗体と、ＰＥＧ４−ＶＡ−ＰＢＤであるリンカー−スペーサー−毒素ユニットとを含む。
【００９０】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、本明細書に開示される抗ｕＰＡＲＡＰ抗体と、ＰＥＧ４−ＶＣ−デュオカルマイシンＳＡであるリンカー−スペーサー−毒素ユニットとを含む。
【００９１】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６／０７４００８号に記載のリンカー−薬物複合体を含む。
【００９２】
リンカー−薬物構築物は例えば、還元された鎖間または鎖内ジスルフィド架橋のチオールへのマレイミド化学によって抗ｕＰＡＲＡＰ抗体に接着されてよい。
【００９３】
治療用途
本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰに対して作られたＡＤＣは、活性薬剤、例えば治療薬または細胞毒性薬を、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞に送達するのに有用であり、したがってｕＰＡＲＡＰの発現、特にｕＰＡＲＡＰの過剰発現によって特徴づけられるさまざまな疾患および障害の治療に有用である。
【００９４】
一実施形態において、本開示は、薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、アジュバントまたは賦形剤とともに、本明細書に記載の有効量の抗ｕＰＡＲＡＰ  ＡＤＣを含む医薬組成物を提供する。
【００９５】
医薬組成物は、十分に貯蔵安定性があり、ヒトおよび／または動物への投与に適しており、当技術分野で知られている方法で調製できる。例えば、医薬組成物は、例えばフリーズドライ、噴霧乾燥、噴霧冷却によって、または超臨界粒子形成からの粒子形成の使用により凍結乾燥されてよい。
【００９６】
「薬学的に許容される」によって、抗ｕＰＡＲＡＰ  ＡＤＣの有効性を低下させない非毒性物質を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝剤、担体または賦形剤は、当技術分野で周知である（それらの開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版，Ａ．  Ｋｉｂｂｅ，編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。
【００９７】
「緩衝剤」という用語は、ｐＨを安定させる目的で酸−塩基混合物を含んでいる水溶液を意味することを意図する。薬学的に許容される緩衝剤は、当技術分野で周知である。
【００９８】
「希釈剤」という用語は、医薬品中の薬剤を希釈する目的の水溶液または非水溶液を意味することを意図する。
【００９９】
「アジュバント」という用語は、本発明の薬剤の生物学的効果を増加させるために、製剤に添加されるあらゆる化合物を意味することを意図する。アジュバントは、異なる陰イオンを有する亜鉛塩、銅塩または銀塩の１つまたは複数であってよく、例えば、異なるアシル組成のフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および酢酸塩であり得るが、これらに限定されるものではない。アジュバントはまた、カチオン性ポリマー（例えば、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマー）、カチオン性合成ポリマー（例えばポリ（ビニルイミダゾール））、およびカチオン性ポリペプチド（例えば、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン）、ならびにこれらのアミノ酸を含むペプチドであってもよい。
【０１００】
賦形剤は、糖質、ポリマー、脂質およびミネラルの１つまたは複数であり得る。糖質の例としては、ラクトース、グルコース、ショ糖、マンニトールおよびシクロデキストリンが挙げられ、これらは例えば、凍結乾燥を容易にするために組成物に添加される。ポリマーの例としては、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸とその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解の異なる程度のポリビニルアルコール／ポリビニルアセテート、および異なる分子量のすべてのポリビニルピロリドンが挙げられ、これらは例えば、粘度調整のため、生体接着を達成するため、または化学的分解およびタンパク質分解から脂質を保護するため組成物に加えられる。脂質の例は、脂肪酸、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質およびすべての異なるアシル鎖長および飽和度の糖脂質、卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵レシチンおよび水素化大豆レシチンであり、これらはポリマーについての理由と同様の理由で組成物に添加される。ミネラルの例は、タルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、これらは液体の蓄積の減少または有利な色素特性などの利益を得るために、組成物に加えられる。
【０１０１】
本開示のＡＤＣは、その送達に適していることが当技術分野で知られている医薬組成物の任意の種類に製剤化されてよい。
【０１０２】
本開示のＡＤＣまたはＡＤＣを含む医薬組成物は、当業者に知られている任意の適切な経路を介して投与されてよい。このように、ありうる投与の経路としては、非経口（静脈、皮下、および筋肉内）、局所、経眼、経鼻、経肺、頬側、経口、腟内および経直腸が挙げられる。また、埋入物からの投与も可能である。
【０１０３】
好適な一実施形態において、医薬組成物は、非経口的に、例えば、静脈内に、脳室内に、関節内に、動脈内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、脳室内で、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に、もしくは皮下に投与され、または輸液技術によって投与されてよい。医薬組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有できる無菌水溶液の形態で便宜に使用される。水溶液は、必要に応じて適切に緩衝される必要がある。無菌条件下の適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準製薬技術によって、容易に達成される。
【０１０４】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでよい水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量用容器または複数回投与用容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアルで提供されてよく、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵されてもよく、使用直前に、無菌液体担体、例えば注射用水の添加だけを必要とする。即時注射溶液および懸濁剤は、すでに記載された種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてよい。
【０１０５】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、静脈内に投与される。
【０１０６】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、皮下に投与される。
【０１０７】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、頭蓋内に、または脳内に投与される。
【０１０８】
医薬組成物は、薬学的に有効な量で患者に投与されるであろう。本明細書で用いる場合、「治療有効量」または「有効量」または「治療効果のある」は、所与の病態および投与計画に対して治療効果を提供するその量を指す。これは、必要な添加物と希釈剤、すなわち担体または投与ビヒクルに関連して望ましい治療効果をもたらすために算出される活性物質の所定量である。さらに、それは宿主の活性、機能および応答における臨床的に重要な欠損を減少させる、最も好ましくは予防するために十分な量を意味することを意図する。あるいは、治療有効量は宿主において臨床的に重要な病態の改善を引き起こすのに十分である。当業者が理解するように、化合物の量はその比活性に応じて変化し得る。適切な投与量は、必要な希釈剤に関連して望ましい治療効果をもたらすために算出される活性組成物の所定量を含み得る。当技術分野で周知のように、治療有効量は、患者の特性、例えば、年齢、体重、性別、病態、合併症、他の疾患などに基づいて、熟練した医療従事者、または獣医学従事者によって決定されてよい。薬学的に有効な用量の投与は、個々の投与量単位、さもなければいくつかの少ない投与量単位の形態での単回投与によって、および特定の間隔での細分した投与量の複数回投与によっての両方で行われてよい。あるいは、投与量は長期間にわたる持続注入として提供されてよい。
【０１０９】
本明細書に記載のＡＤＣ標的ｕＰＡＲＡＰは単独でまたは他の治療薬と組み合わせて投与され得ることを、当業者は理解する。例えば、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的にするＡＤＣは、さまざまな抗癌剤、例えば代謝拮抗剤、アルキル化薬、アントラサイクリン系抗生物質と他の細胞毒性抗生物質、ビンカアルカロイド、抗微小管剤／抗有糸分裂剤、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、ペプチド抗生物質、白金系抗悪性腫瘍薬、エトポシド、タキサン系、トポイソメラーゼ阻害薬、抗増殖性免疫抑制薬、コルチコステロイド、性ホルモンとホルモン拮抗薬、細胞毒性抗生物質および他の治療薬）と組み合わせて投与されてよい。
【０１１０】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、ＡＤＣの機能効率を増加させることができるさらなる試薬および／または治療薬、例えば、リソソーム膜透過性を増加させ、それによってリソソーム内部から細胞質への分子移行を容易にする、確立された薬物もしくは新規薬物、または血液脳関門の浸透性を増加させる薬物との組み合わせで投与される。
【０１１１】
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰ標的ＡＤＣを含むキットまたはそれを含む医薬組成物を提供する。キットは任意選択で、ＡＤＣを対象に投与するための手段および使用説明書をさらに含んでよい。
【０１１２】
一実施形態において、本開示は、対象中のｕＰＡＲＡＰを発現細胞への活性薬剤の送達のための方法に関し、方法は、活性薬剤が前述の細胞に送達されるように、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ、またはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０１１３】
一実施形態において、本開示は、対象中のｕＰＡＲＡＰ発現細胞への活性薬剤の送達における使用のための、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ、または前述のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物に関し、方法は、活性薬剤が前述の細胞に送達されるように、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ、またはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を対象に投与することを含む。
【０１１４】
一実施形態において、本開示は、対象におけるｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる疾患または障害の処置のための方法に関し、方法は、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを対象に投与すること、またはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を前述の対象に投与することを含む。
【０１１５】
一実施形態において、本開示は、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる疾患または障害の処置における使用のための本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ、または前述のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物に関する。
【０１１６】
一実施形態において、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでｕＰＡＲＡＰを発現する細胞の増殖を阻害するための方法に関し、方法は本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ、またはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を投与することを含む。増殖のこの阻害は、細胞死を含んでよく、または細胞死のない増殖阻害を含んでよい。
【０１１７】
特に好ましい実施形態において、ｕＰＡＲＡＰ発現細胞は腫瘍細胞および／または腫瘍関連細胞であり、および本開示は対象における癌の治療の方法に関し、方法は前述の対象に本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣ、またはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を投与することを含む。
【０１１８】
腫瘍関連の細胞としては、活性線維芽細胞、筋線維芽細胞、血管新生およびマクロファージ−単球系統の浸潤細胞、または他の白血球細胞型、ならびに腫瘍を囲む間質組織の細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
一実施形態において、本開示は、対象において腫瘍進行を阻害する方法に関し、方法は、ｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを対象に投与すること、または本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を前述の対象に投与することを含む。腫瘍進行のこの阻害は、腫瘍の完全もしくは不完全な根絶を含んでよく、または細胞死のない増殖停止を含んでよい。
【０１２０】
一実施形態において、本開示は、対象において腫瘍の転移能力を阻害する、低下させる、または除去するための方法に関し、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣまたはｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを含む組成物を前述の対象に投与することを含む。
【０１２１】
一実施形態において、腫瘍細胞はｕＰＡＲＡＰを発現する、または過剰発現する。
【０１２２】
一実施形態において、腫瘍関連細胞は、ｕＰＡＲＡＰを発現する、または過剰発現する。
【０１２３】
一実施形態において、本開示は、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞の細胞死を誘導する、および／またはその成長および／または増殖を阻害するための、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的にするＡＤＣ、または本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的にするＡＤＣを含む医薬組成物の有効量を個人に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１２４】
治療は好ましくは、腫瘍細胞または腫瘍関連細胞などの、ｕＰＡＲＡＰ発現細胞の細胞死を誘導しおよび／またはその成長および／または増殖を阻害する。
【０１２５】
一実施形態において、処置は寛解治療である。
【０１２６】
一実施形態において、処置は根治的治療である。
【０１２７】
一実施形態において、本開示は、腫瘍細胞または腫瘍関連細胞などの、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞の細胞死を誘導するおよび／またはその成長および／または増殖を阻害するための薬物の調製のための、本明細書に記載のｕＰＡＲＡＰを標的とするＡＤＣを提供する。
【０１２８】
癌におけるｕＰＡＲＡＰの発現および役割は、いくつかの研究グループによって調査されている；Ｍｅｌａｎｄｅｒらによる総説（Ｍｅｌａｎｄｅｒら，２０１５，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ４７：１１７７−１１８８）およびＥｎｇｅｌｈｏｌｍらによる論文（Ｅｎｇｅｌｈｏｌｍら，２０１６，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２３８，１２０−１３３）を参照されたい。
【０１２９】
一実施形態において、癌は固形腫瘍であり、腫瘍細胞および／または腫瘍関連の細胞はｕＰＡＲＡＰを発現する。
【０１３０】
一実施形態において、癌は固形腫瘍であり、腫瘍細胞はｕＰＡＲＡＰを発現する。
【０１３１】
ｕＰＡＲＡＰの過剰発現によって特徴づけられる癌の例としては、骨肉腫を含む肉腫（Ｅｎｇｅｌｈｏｌｍら，２０１６，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２３８（１）：１２０−３３）ならびに他の肉腫、神経膠芽腫（Ｈｕｉｊｂｅｒｓら，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５（３）：ｅ９８０８）、前立腺癌および前立腺癌からの骨転移（Ｋｏｇｉａｎｎｉら，２００９，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５（４）：６８５−９３）、乳癌および特に「基底様」乳癌（Ｗｉｅｎｋｅら，２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １；６７（２１）：  １０２３０−４０）、および頭部癌と頸部癌（Ｓｕｌｅｋら，  ２００７，  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５５（４）：３４７−５３）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３２】
一実施形態において、癌は肉腫（例えば骨肉腫、脂肪肉腫、粘液線維肉腫、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）および／または平滑筋肉腫（ＬＭＳ））である。
【０１３３】
一実施形態において、癌は神経膠芽細胞腫である。
【０１３４】
一実施形態において、癌は固形腫瘍であり、腫瘍関連細胞はｕＰＡＲＡＰを発現する。ｕＰＡＲＡＰが腫瘍関連の細胞によって発現されるとき、治療効果は、いわゆる「バイスタンダー」効果を介して、および／または間質細胞が媒介する腫瘍増殖と播種の刺激の低下および／または除去を介して媒介されると思われる。
【０１３５】
腫瘍関連細胞中のｕＰＡＲＡＰの過剰発現によって特徴づけられる癌の例としては、乳癌（Ｓｃｈｎａｃｋら，２００２，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０；９８（５）：６５６−６４）、頭部癌と頸部癌（Ｓｕｌｅｋら，２００７，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５５（４）：３４７−５３）および多数の他の固形悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３６】
一実施形態において、癌は固形腫瘍でない。例えば、本開示のＡＤＣは、例えばｕＰＡＲＡＰ発現白血病の治療のために、例えば、マクロファージ−単球系統から用いることができる。
【０１３７】
他の実施形態において、ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる疾患または障害は、癌でない。
【０１３８】
ｕＰＡＲＡＰは、骨成長と恒常性に関与する（Ｍａｄｓｅｎら，２０１３，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５；８（８）：ｅ７１２６１）。このように、一実施形態において、本開示のＡＤＣは、骨劣化によって特徴づけられる疾患の治療のために用いることができ、骨劣化は、骨粗鬆症などの非悪性細胞によって媒介される。
【０１３９】
コラーゲン蓄積でのその役割のため、ｕＰＡＲＡＰの役割は線維症でも示された（Ｍａｄｓｅｎら，２０１２，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２２７（１）：９４−１０５）。このように、一実施形態において、本開示のＡＤＣは、例えば腎臓、肺および肝臓の線維症の治療で使用できる。
【０１４０】
一実施形態において、本開示のＡＤＣは、アテローム動脈硬化症と慢性炎症を含む、マクロファージ関連疾患および障害の治療に使用できる。
【０１４１】
参考文献
Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｂｉｌｏｆｓｋｙ，Ｈ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．（１９８３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  Ｂｅｔｈｅｓｄａ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ．
Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．，Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｆｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２．
Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（２００８）Ｐｉｌｌａｒｓ  ａｒｔｉｃｌｅ：ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ．Ｊ．Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．１３２，２１１−２５０．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８０，  ７０５７−７０９６．
Ｄｕｎｂａｒ，Ｊ．，Ｄｅａｎｅ，Ｃ．Ｍ．（２０１６）ＡＮＡＲＣＩ：  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３２，２９８−３００．
Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ，  Ｐｏｍｍｉｅ  Ｃ，  Ｒｕｉｚ  Ｍ，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ，  Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ  Ｅ，  Ｔｒｕｏｎｇ  Ｌ，  Ｔｈｏｕｖｅｎｉｎ−Ｃｏｎｔｅｔ  Ｖ，  Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｇ．（２００３）  ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７，５５−７７．
Ｋｕｎｉｋ  Ｖ，Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  Ｓ，Ｏｆｒａｎ  Ｙ．（２０１２ａ）  Ｐａｒａｔｏｍｅ：ａｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２１−４．  ｄｏｉ：  １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ４８０．  Ｅｐｕｂ  ２０１２  Ｊｕｎ  ６．
Ｋｕｎｉｋ  Ｖ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ，Ｏｆｒａｎ  Ｙ．（２０１２ｂ）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ａｍｏｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８．
【０１４２】
実施例１：ｕＰＡＲＡＰのＮ末端領域に対して作られたＡＤＣのＩｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
材料および方法
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣの調製および評価
ｕＰＡＲＡＰに対するまたはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、当技術分野で知られている確立された方法に従って、マウスの免疫後にハイブリドーマ技術を用いて生成し作製した。ｕＰＡＲＡＰに対するｍＡｂの場合、免疫のための宿主マウスはｕＰＡＲＡＰに関して遺伝子欠損であり、ヒト抗原およびマウス抗原の両方と反応する抗体をもたらした。ＡＤＣを、当技術分野でこれまでに記載されている、一般的に使用される結合方法によって調製した（Ｄｏｒｏｎｉｎａら，２００３  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら，２００３．Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−６５；Ｈａｍｂｌｅｔｔら，２００４．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０（２０）：７０６３−７０）。
【０１４３】
抗体を、５ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０緩衝液中で１０ｍＭのＤＴＴの存在下で３７℃にて１０分間のインキュベーションにより穏やかな還元にかけ、続いて３０ｋＤａのＮＭＷＬ遠心濾過器を用いて１ｍＭのＥＤＴＡを含む新鮮なＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液を交換することでＤＴＴを除去し、次いで濃度を２ｍｇ／ｍＬに調整した。この後、直ちに、水を含まないＤＭＳＯ中に溶解した、５〜１０倍モル過剰のマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンゾイルオキシカルボニル−モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、すなわちベドチン）への結合を、１０％ｖ／ｖの最終ＤＭＳＯ含有量になるまで、３７℃で２時間行った。得られたｍＡｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣを、ＰＤ−１０脱塩カラム上でゲル濾過によって精製した。得られたＡＤＣの平均薬物抗体比（ＤＡＲ）を、λ＝２４８ｎｍとλ＝２８０ｎｍでの精製複合体試料の吸光度比に基づいて決定した。未修飾モノクローナル抗体は、０．４３のＡ２４８ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比を示し、ＭＭＡＥのλ＝２４８ｎｍでのＡＭＡＸはｍＡｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣの高いＡ２４８ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比を引き起こし、これは、得られるＡＤＣのＤＡＲを反映することが示されている（Ｈａｍｂｌｅｔｔら，２００４．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０（２０）：７０６３−７０；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら，２００５．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：８４３−８５２）。
【０１４４】
細胞株
Ｕ９３７、ＴＨＰ−１およびＨＴ１０８０細胞はすべてＡＴＣＣから取得した。ＫＮＳ４２細胞は、Ｌａｒａ  Ｐｅｒｒｙｍａｎ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  （ＢＲＩＣ），  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）のご厚意で提供された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから取得した。すべての細胞は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベータ中で、１０％ウシ胎児血清と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した適切な培地中で維持した。
【０１４５】
複合体種のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４０ｍＭのＤＴＴの存在下にて試料緩衝液中で３分間沸騰することによって還元した、レーン当たり５μｇの総タンパク質を充填し、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを流すことにより行った。ゲルは、標準０．１％のクーマシーブルー染色を使用して染色した。カテプシンＢリンカー切断アッセイのために、試料をメーカーの説明書に従って組換えヒト（ｒｈ）カテプシンＢで処理し、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で２０μｇのＡＤＣ（モノクローナル抗体成分）に対して１００ｎｇの活性化ｒｈカテプシンＢを使用して、３７℃で終夜インキュベートした。
【０１４６】
モノクローナル抗体のｕＰＡＲＡＰ結合のＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、各ウェル当たり２５ｎｇの、ヒトｕＰＡＲＡＰの最初の３つのＮ末端ドメインを含む可溶性の切り詰め型ｕＰＡＲＡＰタンパク質と、モノクローナル抗体２ｈ９に対する完全なエピトープとで被覆した。無処置モノクローナル抗体（２ｈ９またはａＴＮＰ）、結合の還元手順（上記を参照されたい）にかけた同じモノクローナル抗体、またはＡＤＣである２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥあるいはａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥを一次抗体として次いで使用し、続いてＨＲＰ結合ウサギ抗マウスＩｇ二次抗体を使用した。最終的に、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩含有基質溶液を添加し、次いで１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて呈色反応を停止させた。プレートを、プレートリーダーを用いて、４９２ｎｍで読み取った。
【０１４７】
ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性−細胞生存率アッセイ
試験する細胞を、９０μＬの培地中で９６ウェルプレート中に低密度（２０〜２５％コンフルエンス、通常１ウェル当たり５〜１０×１０３細胞）で播種し、終夜インキュベートした。翌日、モノクローナル抗体２ｈ９、モノクローナル抗体５ｆ４または非標的対照モノクローナル抗体ａＴＮＰをベースにしたｍＡｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ複合体をＰＢＳ中の段階希釈（１：４）で調製し、各ウェルに１０μＬの量で添加し、最終的な最大ＡＤＣ濃度は１０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体成分であった。細胞を７２時間インキュベートし、その後ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＭＴＳ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を２０μＬ添加し、色が形成されるように適切な時間インキュベートした（通常１時間）。プレートを、プレートリーダーを使用して、６３０ｎｍでのバックグラウンド除去を用いて、４９０ｎｍで次いで読み取った。
【０１４８】
ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性−細胞周期解析
細胞周期解析は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−３０００システム（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ  Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して行い、各細胞のＤＮＡ含量に基づいて、細胞集団の細胞周期分布を解析するメーカーの標準プロトコルを用いた。細胞周期のＳｕｂ−Ｇ１、Ｇ１、ＳまたはＧ２／Ｍ期の細胞の割合は、ＮｕｃｌｅｏＶｉｅｗ  ＮＣ−３０００ソフトウェアを用いてヒストグラム解析から確立した。
【０１４９】
受容体競合およびリソソームプロテアーゼ阻害
リソソームプロテアーゼアッセイ、受容体枯渇アッセイ、およびリソソームプロテアーゼの阻害についてのアッセイのために、Ｕ９３７細胞を細胞生存率アッセイ（上記を参照されたい）のように播種した。受容体競合アッセイのために、１μｇ／ｍＬモノクローナル抗体成分の一定の２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ濃度をすべてのウェルで保持し、未修飾競合モノクローナル抗体を、競合モノクローナル抗体８μｇ／ｍＬの濃度で開始して希釈系列（１：２）で同時に添加した。細胞を次いで、７２時間の細胞毒性細胞生存率アッセイ（上記を参照されたい）にかけた。リソソームプロテアーゼ阻害アッセイのために、Ｕ９３７細胞を２０μＭのＥ６４Ｄプロテアーゼ阻害剤と２時間プレインキュベートし、その後７２時間の細胞毒性細胞生存率アッセイ（上記を参照されたい）を開始した。
【０１５０】
動物実験
すべての動物実験は、Ｔｈｅ  Ｄａｎｉｓｈ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎからの法的承認の下で行われた。動物実験のために使用したすべての試薬および細胞株は、マウスウイルス、細菌、マイコプラズマおよび真菌の存在についての試験で陰性であった。動物は標準的ケアを受け、次の徴候のいずれかが表れれば、犠牲にした：１０％を超える体重減少、目に見える苦痛もしくは疾病、食物摂取もしくは水分摂取もしくは排便の減弱、腫瘍付近での重度の炎症の徴候、または１０００ｍｍ３の体積を超えるもしくは動物の自由な動きを損なう腫瘍増殖。腫瘍増殖は、電子ノギスを使用して測定し、腫瘍容積は、式  体積＝（Ｌ×Ｗ２）／２（Ｌは腫瘍の最長寸法であり、Ｗは垂直寸法の幅である）を用いて算出した。
【０１５１】
マウスにおけるｕＰＡＲＡＰ陽性のＵ９３７異種移植腫瘍モデルの皮下注射による皮下処置
腫瘍確立のために、マウスの側腹部を剃毛し、１×１０６のＵ９３７細胞を皮下注射で投与し、次いで固形腫瘍の発症を観察するために綿密にモニターした。体積５０〜１００ｍｍ３の触知可能な腫瘍が形成されると、マウスは４つの処置群：２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝１０）、ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝９）、未修飾モノクローナル抗体２ｈ９（Ｎ＝５）またはＰＢＳ溶媒対照（Ｎ＝５）の１つでの措置を開始した。すべての処置は、４日間間隔で、腫瘍領域での３ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体成分の合計４回の皮下投与として施した。注射は、動物飼育係のリスクを回避するために、短時間のイソフルラン麻酔下で行なった。処置の間、犠牲の時点に達するまで、腫瘍を２日毎に評価した。いかなる腫瘍負荷も完全に失ったマウスを、処置の終了後３ヵ月間、週に２回チェックした。
【０１５２】
マウスにおけるｕＰＡＲＡＰ陽性のＵ９３７異種移植腫瘍モデルの静脈内注射による皮下処置
腫瘍確立のために、マウスの側腹部を剃毛し、１×１０６のＵ９３７細胞を皮下注射で投与し、次いで固形腫瘍の発症を観察するために綿密にモニターした。体積５０〜１００ｍｍ３の触知可能な腫瘍が形成されると、マウスは４つの処置群：２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝１０）、ａＴＮＰ−ｖｃ−ＭＭＡＥ（Ｎ＝１０）、未修飾モノクローナル抗体２ｈ９（Ｎ＝５）またはＰＢＳ溶媒対照（Ｎ＝５）の１つでの措置を開始した。すべての処置は、４日間間隔で、マウスの尾静脈での５ｍｇ／ｋｇのモノクローナル抗体成分の合計３回の静脈内投与として施した。処置の間、犠牲の時点に達するまで、腫瘍を２日毎に評価した。いかなる腫瘍負荷も完全に失ったマウスを、処置の終了後３ヵ月間、週に２回チェックした。
【０１５３】
統計
すべての試料は、三つ組で行なった。エラーバー：標準偏差。
【０１５４】
結果および結論
コラーゲン受容体ｕＰＡＲＡＰは、肉腫および末期神経膠芽腫を含む、特定の癌の腫瘍細胞において増加する。さらに、この受容体は、多くの場合、固形腫瘍を囲んでいる間質細胞で増加する。正常な成人において、この受容体は限定的な発現を示し、したがってこの受容体をＡＤＣ療法の潜在的標的とする。
【０１５５】
この目的のために、我々は、ｕＰＡＲＡＰ遺伝子欠損マウスの免疫後に得たモノクローナル抗体２ｈ９を選択し、十分に確立された結合方法を用いてｕＰＡＲＡＰ特異的ＡＤＣ（２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ）を調製した。標的抗体２ｈ９は、結合手順に十分に耐えることが示され、親和性の損失はごくわずかであった。生じたＡＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｕＰＡＲＡＰ陽性細胞において死滅させる、または増殖停止を誘導することに特異性が高いことを示し、Ｕ９３７細胞が試験した細胞株で最も感受性であった。ｕＰＡＲＡＰは構成的に再利用する受容体であり、そのカーゴをリソソーム区画に向ける。ｕＰＡＲＡＰ依存性細胞毒性がＥ６４Ｄによるリソソームカテプシンの阻害後に抑制されたので、Ｕ９３７細胞などの感受性が高い細胞におけるＡＤＣ効率は、リンカー切断に完全に依存したことが判明した。したがって、結合される細胞毒に対する感受性の全体的な相違と相俟って、リンカー切断のためのリソソーム能力が、異なる細胞型間のＡＤＣ感受性の相違に寄与することを我々は提案する。
【０１５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、ＣＢ１７ＳＣＩＤマウスでＵ９３７細胞を用いる増殖の早い皮下異種移植腫瘍モデルを利用した。このモデルを使用して、ＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥが、ｉｎ  ｖｉｖｏで固形Ｕ９３７腫瘍を根絶することに高効率であると判明した。局所皮下投与による次の処置の後、５匹のマウスは、処置計画の完了後９０日間、無腫瘍状態を維持し、したがって治癒率５０％を占める。より重要なことに、静脈内投与による処置の後、１００％治癒率をもたらす強力な効果が観察された。注目すべきことに、腫瘍のこの根絶は、処置されたマウスの定期的検査時に何ら明らかな有害反応を示すことなく観察された。重要なことに、２ｈ９抗体はヒトｕＰＡＲＡＰおよびマウスｕＰＡＲＡＰの両方に対して反応性が高く、交差反応性はこの抗体を産生するとき、免疫賦与用にｕＰＡＲＡＰ欠損マウスを用いることによって可能になる。したがって、この異種移植片モデルでは、有益な抗腫瘍効果に加えて、宿主に対するいかなる潜在的な有害副作用も明らかにされるが、有害な影響の徴候は見られなかった。
【０１５７】
２ｈ９抗体に関するエピトープは、ｕＰＡＲＡＰの最初の３つのＮ末端ドメイン内、より詳細にはＣｙｓＲドメイン内またはＣＴＬＤ−１内のいずれかに位置している。本明細書に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、ｕＰＡＲＡＰの最初の３つのＮ末端ドメインを標的にする抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を含む別のＡＤＣ、すなわち５ｆ４は、２ｈ９抗体を含むＡＤＣと同じくらい効果的であることを示す。５ｆ４抗体に関するエピトープは、ｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩドメインにある。したがって、ｕＰＡＲＡＰの最初の３つのＮ末端ドメイン内のエピトープに対して作られる抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を含むＡＤＣは、ＡＤＣとして特に効果的であると仮定する。
【０１５８】
結論として、本明細書に示すデータは、発現パターンおよび分子機能に基づくＡＤＣ癌療法において用途が広い標的として、コラーゲン受容体ｕＰＡＲＡＰの概念を極めて強力に支持する。さらに、これらのデータは、ｕＰＡＲＡＰの最初の３つのＮ末端ドメインに対して作られる抗体を含むＡＤＣ、例えばＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでｕＰＡＲＡＰ発現細胞を標的とするために極めて効果的であることを示している。
【０１５９】
実施例２：ＭＭＡＥベースＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
実施例１のＡＤＣに加えて、以下のＭＭＡＥ  ＡＤＣ：９ｂ７−ｖｃ−ＭＭＡＥおよび１１ｃ９−ｖｃ−ＭＭＡＥを生成した。
【０１６０】
モノクローナル抗体２ｈ９、モノクローナル抗体５ｆ４およびモノクローナル抗体９ｂ７はｕＰＡＲＡＰの３つのＮ末端ドメイン内のエピトープに対して作られ、モノクローナル抗体１１ｃ９はｕＰＡＲＡＰのＮ末端の３つのドメインの外側のエピトープに対して作られる抗ｕＰＡＲＡＰ抗体である。
【０１６１】
Ｕ９３７細胞を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイを、これらのすべてのＡＤＣを用いて、実施例１に記載のように行なった。すべてのＡＤＣは、全体的な細胞生存率において特異的な減少を引き起こすが、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥ、５ｆ４−ｖｃ−ＭＭＡＥおよび９ｂ７−ｖｃ−ＭＭＡＥに対する細胞感受性は１１ｃ９−ｖｃ−ＭＭＡＥに対する感受性よりもかなり高い（図１４）。
【０１６２】
したがって、本発明者らは、ｕＰＡＲＡＰの３つの最もＮ末端ドメイン内のエピトープに結合できる抗ｕＰＡＲＡＰ抗体を含むＡＤＣが極めて効果的なＡＤＣであると結論づける。
【０１６３】
実施例３：異なるリンカー、スペーサーおよび毒素を含むＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
ｕＰＡＲＡＰのＮ末端部を標的にするＡＤＣ型において異なる毒素を使用できる。抗体成分としてモノクローナル抗体２ｈ９を有するＡＤＣを、ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの代わりに以下のリンカー−細胞毒ユニットを用いて上述のように調製した：
−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ（ＭＭＡＦは、ＭＭＡＥのカルボキシル変種であるモノメチルアウリスタチンＦである）、
−ＰＥＧ４−ｖａ−ＰＢＤ（ＰＥＧ４はポリエチレングリコールスペーサーを指し、ｖａはバリン−アラニンであり、ＰＢＤはピロロベンゾジアゼピン二量体を指す）、
−ＰＥＧ４−ｖｃ−デュオカルマイシンＳＡ（ＰＥＧ４はポリエチレングリコールスペーサーを指し、ｖｃはバリン−シトルリンである）。
【０１６４】
結果として生じるＡＤＣ（それぞれ、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦ、２ｈ９−ｖａ−ＰＢＤおよび２ｈ９−ｖｃ−ＤｕｏｃＳＡと呼ぶ）を、Ｕ９３７細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイに用い、上記のように行なった。Ｕ９３７細胞は、２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦに対して非常に強い感受性を、２ｈ９−ｖａ−ＰＢＤに対してより穏やかな感受性を示し、２ｈ９−ｖｃ−ＤｕｏｃＳＡに対しては低いが測定可能な感受性を示した。結果を図１５および１６に示す。
【０１６５】
実施例４：ヒト神経膠芽腫移植片細胞に対するＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
ＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥおよび２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦを、ヒト神経膠芽腫移植片細胞を特異的に死滅させるその能力について、実施例１に記載のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイにより試験した。神経膠芽腫移植片細胞は、例えば、Ｓｔａｂｅｒｇら，２０１７，Ｃｅｌｌ  Ｏｎｃｏｌ．４０：２１−３２に記載されている。これらの細胞は、ＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＥならびにＡＤＣ  ２ｈ９−ｖｃ−ＭＭＡＦの両方に対する極めて強い、特異的な感受性を示し、したがってヒト神経膠芽腫細胞に対抗することにおけるこれらのＡＤＣの高い有効性を示す。結果を図１７に示す。
【０１６６】
実施例５：組換え抗体
［配列番号１］（ｕＰＡＲＡＰに対するモノクローナル抗体２ｈ９の軽鎖）および［配列番号５］（同じ抗体の重鎖）を含み、合成ＤＮＡによってコードされるタンパク質生成物を、ＣＨＯ細胞で発現させた。結果として生じた組換え抗体生成物を精製し、ハイブリドーマ細胞培養によって生成されたモノクローナル抗体２ｈ９と同じ方法でｕＰＡＲＡＰを特異的に認識することをウエスタンブロッティングによって示した（図１８）。
【図１】
2019511205.tif 000004
【図２】
2019511205.tif 000005
【図３】
2019511205.tif 000006
【図４】
2019511205.tif 000007
【図５】
2019511205.tif 000008
【図６】
2019511205.tif 000009
【図７】
2019511205.tif 000010
【図８】
2019511205.tif 000011
【図９】
2019511205.tif 000012
【図１０】
2019511205.tif 000013
【図１１】
2019511205.tif 000014
【図１２】
2019511205.tif 000015
【図１３】
2019511205.tif 000016
【図１４】
2019511205.tif 000017
【図１５】
2019511205.tif 000018
【図１６】
2019511205.tif 000019
【図１７】
2019511205.tif 000020
【図１８】
2019511205.tif 000021
【配列表】
2019511205000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月13日(2018.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｕＰＡＲＡＰに対して作られた抗体薬物複合体であって、
ａ）抗体であって、
ｉ．配列番号３６もしくは３７（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号３８もしくは３９（ｕＰＡＲＡＰのＣｙｓＲ−ＦＮ−ＩＩドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号４０もしくは４１（ｕＰＡＲＡＰのＦＮ−ＩＩ−ＣＴＬＤ−１ドメイン）のアミノ酸配列、
ｉｖ．配列番号３０もしくは３１（ｕＰＡＲＡＰのシステインに富むドメイン（ＣｙｓＲ））のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号３２もしくは３３（ｕＰＡＲＡＰのフィブロネクチン型ＩＩ（ＦＮ−ＩＩ）ドメイン）のアミノ酸配列、および／または
ｖｉ．配列番号３４もしくは３５（ｕＰＡＲＡＰのＣ型レクチン様ドメイン１（ＣＴＬＤ１）のアミノ酸配列
に結合する抗体、
ｂ）活性薬剤、ならびに
ｃ）ａ）をｂ）に連結するリンカー
を含む、抗体薬物複合体。
【請求項２】
前記抗体が
ａ）配列番号３０もしくは３１のアミノ酸配列、または
ｂ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列
に結合できる、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項３】
前記抗体が配列番号３２または３３のアミノ酸配列に結合できる、請求項１に記載の抗体薬物複合体。
【請求項４】
前記抗体が
ａ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１もしくは９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号５もしくは１０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、いずれの配列変化も相補性決定領域の外側である、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ）ａ）の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｃ）ａ）の抗体またはその抗原結合フラグメントのキメラバーション、
ｄ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号２、３および４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号６、７および８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｅ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号４２、４３、および４４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号４５、４６および４７のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ）ｄ）またはｅ）の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項５】
前記抗体が
ａ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、いずれの配列変化も相補性決定領域の外側である、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ）ａ）の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｃ）ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｄ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１２、１３および１４のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、
ｉｉ．配列番号１６、１７および１８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｅ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号４８、４９および５０のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号５１、５２および５３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ）ｄ）またはｅ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項６】
前記抗体が
ａ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号１９もしくは２０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号２４もしくは２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列を含むまたはそれからなる免疫グロブリン重鎖可変領域
を含み、いずれの配列変化も相補性決定領域の外側である、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｂ）ａ）の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン、
ｃ）ａ）の抗体もしくはその抗原結合フラグメントのキメラバージョン、
ｄ）抗体もしくはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号２１、２２および２３のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号２６、２７および２８のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、
ｅ）抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
ｉ．配列番号５４、５５および５６のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、および
ｉｉ．配列番号５７、５８および５９のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域
を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント、
ｆ）ｄ）またはｅ）の抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化バージョン
からなる群から選択される、請求項１〜３に記載の抗体薬物複合体。
【請求項７】
前記抗体がマウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト化抗原結合フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの単鎖抗体（ＳＣＡ）、その重鎖および／または軽鎖の可変部分、およびＦａｂミニ抗体から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項８】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項９】
前記抗体がヒト化されたもしくは完全にヒトのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１０】
前記抗体が組換え抗体である、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１１】
前記活性薬剤が治療薬、細胞毒性薬、放射性同位体および検出可能標識から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１２】
前記活性薬剤が細胞毒性薬である、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１３】
前記活性薬剤がアルキル化剤、アントラサイクリン系薬剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤／抗有糸分裂剤、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤、ペプチド抗生物質、白金系抗悪性腫瘍薬、トポイソメラーゼ阻害薬および細胞毒性抗生物質からなる群から選択される化学療法薬などの、化学療法薬である、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１４】
前記活性薬剤がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、タキサン（例えばパクリタキセルもしくはドセタキセル）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンプラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンもしくはビノレルビン）、コルヒチンまたはポドフィロトキシンからなる群から選択されるなどの、抗有糸分裂剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１５】
前記活性薬剤がモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）である、請求項１〜１４のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１６】
前記活性薬剤がピロロベンゾジアゼピンまたはピロロベンゾジアゼピン二量体誘導体から選択されるＤＮＡ架橋剤などの、ＤＮＡ架橋剤である、請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１７】
前記活性薬剤がデュオカルマイシンＳＡなどの、アルキル化剤である、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１８】
例えば２と８の間など、例えば３と６の間、４または５などの、１と１０の間の薬物抗体比（ＤＡＲ）を有する、請求項１〜１７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項１９】
前記リンカーが切断可能なリンカーおよび切断不可のリンカーから選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２０】
前記リンカーがペプチドリンカーである、請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２１】
前記リンカーがカテプシンで切断可能なリンカーなどの、酵素切断可能なペプチドリンカーである、請求項１〜２０のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２２】
前記リンカーがバリン−シトルリン（ＶＣ）またはバリン−アラニンン（ＶＡ）などの、ジペプチドを含むまたはジペプチドからなる、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２３】
前記抗体薬物複合体がパラアミノ安息香酸（ＰＡＢ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むスペーサーなどの、スペーサーをさらに含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２４】
前記抗体薬物複合体がＰＥＧ４であるスペーサーまたはＰＥＧ４を含むスペーサーをさらに含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２５】
前記抗体薬物複合体がマレイミドおよびカプロン酸（ＭＣ）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、アジド基もしくはアルキン基を含むまたはこれらからなる接着基、または前記抗体との反応によりこれらに由来する接着基などの、接着基をさらに含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２６】
前記抗体薬物複合体がベドチン（ＭＣ−ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）を含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２７】
前記抗体薬物複合体が以下のリンカー−スペーサー−毒素ユニット：ＶＣ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦを含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２８】
前記抗体薬物複合体が以下のリンカー−スペーサー−毒素ユニット：ＰＥＧ４−ＶＡ−ＰＢＤを含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項２９】
前記抗体薬物複合体が以下のリンカー−スペーサー−毒素ユニット：ＰＥＧ４−ＶＣ−デュオカルマイシンＳＡを含む、請求項１〜２８のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項３０】
薬物としての使用のための、請求項１〜２９のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれかに記載の抗体薬物複合体、および薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、担体、アジュバントまたは賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞に活性薬剤を送達するための方法であって、前記活性薬剤が前記細胞に送達されるように、請求項１〜３０のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体または請求項３１に記載の前記医薬組成物を前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
対象におけるｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる疾患の治療のための方法であって、請求項１〜３０のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体または請求項３１に記載の前記医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞によって特徴づけられる前記疾患が癌、骨粗鬆症などの骨劣化疾患、線維症、およびアテローム動脈硬化症または慢性炎症などのマクロファージ関連疾患または障害から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が癌である、請求項３３〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記癌が肉腫、神経膠芽細胞腫、前立腺癌、前立腺癌の骨移転、乳癌、頭部癌と頸部癌および白血病から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が固形腫瘍である、請求項３５〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が神経膠芽細胞腫である、請求項３５〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が骨肉腫などの、肉腫である、請求項３５〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体薬物複合体が非経口的に、例えば、静脈内に、脳室内に、関節内に、動脈内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、脳室内で、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に、もしくは皮下に、または輸液技術によって投与される、請求項３２〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体薬物複合体が静脈内に投与される、請求項３２〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体薬物複合体が頭蓋内に投与される、請求項３２〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体薬物複合体が皮下に投与される、請求項３２〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体薬物複合体が１種または複数種のさらなる治療薬などの、１種または複数種のさらなる薬剤との組み合わせで投与される、請求項３２〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
ｕＰＡＲＡＰを発現する前記細胞がｕＰＡＲＡＰの過剰発現を示す、請求項３２〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ｕＰＡＲＡＰを発現する前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
ｕＰＡＲＡＰを発現する前記細胞が腫瘍関連細胞である、請求項３２〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体薬物複合体が細胞死を誘導しおよび／または前記ｕＰＡＲＡＰを発現する細胞の成長および／または増殖を阻害する、請求項３２〜４７のいずれかに記載の抗体薬物複合体。
【請求項４９】
前記処置が寛解治療または根治的治療である、請求項３３〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
対象において腫瘍進行を阻害する方法であって、前記対象に請求項１〜３０のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体をまたは前記対象に請求項３１に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５１】
対象において腫瘍の転移能力を阻害する、低下させるまたは除去するための方法であって、前記対象に請求項１〜３０のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体をまたは前記対象に請求項３１に記載の前記医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５２】
請求項１〜３０のいずれかに記載の前記抗体薬物複合体、または請求項３１に記載の前記医薬組成物含むキットであって、任意選択で対象に前記抗体薬物複合体を投与するための手段および／または使用説明書をさらに含む、キット。
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月17日(2018.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019511205000001.app
【国際調査報告】
2019511205.tif 000022
2019511205.tif 000023
2019511205.tif 000024
2019511205.tif 000025