(57)【要約】  ＣＤ４７とトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）との間の相互作用ではなく、ＣＤ４７とＣＤ４７シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）との間の相互作用を特異的に阻害するインテグリン関連タンパク質（ＩＡＰまたはＣＤ４７）抗体、および、治療薬としてこれらのモノクローナル抗体を使用する方法、が提供される。さらに、提供される抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列が開示される。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４７またはその免疫学的に活性なフラグメントに結合する単離されたモノクローナル抗体であって、該抗体はＣＤ４７とＴＳＰ−１との間の相互作用ではなくＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を阻害する、抗体。
【請求項２】
癌または他の腫瘍性疾患の症状を緩和する方法であって、被験体中のＪＡＧ１発現を低減するのに十分な量で、請求項１の抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項３】
被験体はヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、または、完全ヒト抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ４７はヒトＣＤ４７である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプおよびＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択されるＩｇＧアイソタイプである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＩｇＧ４ＰとＩｇＧ４ＰＥから選択されるＩｇＧアイソタイプである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
癌は乳癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
癌は急性骨髄性白血病である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年５月９日に出願され、かつすべての目的のために本明細書に全体として組み込まれる、米国特許出願第６２／３３３，６３１号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、概してＣＤ４７を認識するモノクローナル抗体に関し、より具体的には、ＣＤ４７とトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）との間の相互作用ではなく、ＣＤ４７とＣＤ４７シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）（ＣＤ４７−ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｌｐｈａ）との間の相互作用を特異的に阻害するＣＤ４７抗体に関し、および、治療薬としてこれらのモノクローナル抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４７は、免疫監視の回避を可能にする腫瘍細胞上で高度に発現される、自己認識タンパク質である。これは、マクロファージおよび樹状細胞などの貪食細胞の表面上で発現される、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）のためのリガンドとして作用する。ＣＤ４７とＳＩＲＰαの間の相互作用は、食作用の阻害をもたらすシグナル伝達カスケードを生じさせる。抗ＣＤ４７抗体での処置は、ＣＤ４７およびＳＩＲＰαの相互作用を阻害し、食作用の再開を可能にする。しかしながら、ほとんどのＣＤ４７抗体は、赤血球の血球凝集を引き起こすと報告されており、これは既存の抗体での治療的なＣＤ４７標的化の主要な制限である。トロンボスポンジン−１タンパク質（ＴＳＰ−１）は、健康な組織中の新血管新生および腫瘍形成の天然の阻害剤であることが示された多ドメインマトリックス糖タンパク質である。内皮細胞の接着、運動、および成長の正負両方の調節はＴＳＰ−１に起因しており、これは、ＣＤ３６、αｖインテグリン、β１インテグリン、シンデカンおよびインテグリン関連性タンパク質（ＩＡＰまたはＣＤ４７）を含む、少なくとも１２の細胞接着受容体と相互に作用するようである。ＴＳＰ−１は、またプラスミノゲン、ウロキナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシンおよびエラスターゼを含む、血管形成に関与する多数のプロテアーゼと相互作用する。従って、被験体に投与された時に、ＣＤ４７とＴＳＰ−１の間の相互作用ではなく、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を特異的に阻害する処置の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記述されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用をブロックする抗ＣＤ４７  ＭＡｂであり、それによって、腫瘍細胞のマクロファージ媒介性死滅を可能にする。これらの抗体は、ＣＤ４７発現、活性化および／またはシグナル伝達を調節することができ、例えば、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、または干渉することができ、これらの抗体は、本明細書で赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ）と呼ばれる、ヒト赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（ＲＢＣ）の有意なレベルの血球凝集を引き起こさない。しかしながら、これらの抗体の細胞表面上のＣＤ４７と結合し、かつ、細胞の凝集現象を引き起こさない能力は、赤血球に限定されるものではない。これらの抗体は、ＣＤ４７陽性細胞の凝集を促進しない方法で、一意にＣＤ４７と結合する。加えて、またはあるいは、ＩｇＧ４アイソタイプの抗体は、投与時に、血小板の重大な枯渇を引き起こさない。本明細書に記述される抗体およびその誘導体は、ＣＤ４７およびＳＩＲＰαの相互作用を調節することができ、例えば、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、または干渉することができ、これらの抗体は、ヒト赤血球（ＲＢＣ）の有意なレベルの血球凝集を引き起こさない。本明細書で提供される抗体は、まとめて「ＣＤ４７抗体」と称される。これらのＣＤ４７抗体は、ヒト赤血球の血球凝集を引き起こす既存のＣＤ４７抗体に対する著しい改良である。例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ．，  Ｕｎｏ  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ４７  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．。Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００４；  ３１５：９１２−８を参照。例えば、これらのＣＤ４７抗体は、既存のＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２、ＢＲＣ１２６およびＣＣ２Ｃ６の上の著しい改良である。その各々はＳＩＲＰαをブロックするが、下に詳細に記述されるように、ＲＢＣの血球凝集を引き起こす。例えば、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、マウスおよび／またはカニクイザルに投与した時に赤血球喪失および貧血症（ａｍｅｎｉａ）を引き起こす、親和性が発達したＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質に対する著しい改良である。Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＩＲＰａ  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；  ３４１：８８を参照。本明細書に記述された全ＩｇＧ  ＣＤ４７抗体（例えば、その内容が全体として本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）で開示されるような、表１に提供されたものを含む、２Ａ１およびそのヒト化誘導体）は、有意なレベルで細胞を凝集させない。例えば、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は赤血球（ＲＢＣ）を凝集させない。ＳＩＲＰαをブロックし、かつ、有意なレベルの凝集および／または血小板枯渇を引き起こさない、全ＩｇＧフォーマットでのＣＤ４７抗体が本明細書に記述される���加えて、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルのＲＢＣ枯渇および／または貧血症を引き起こさない。
【０００５】
本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、非限定的な例の一例として、有意なレベルの赤血球の血球凝集を引き起こさないＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰαとの間の相互作用の強力なブロック、ならびに、マウス異種移植片モデルにおける強力な抗腫瘍活性、などの多数の望ましい特性を示す。例えば、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体がない状態でのＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用のレベルと比較して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用をブロックする。
【０００６】
本明細書で開示されるＣＤ４７抗体は、有意なレベルの細胞の凝集を引き起こさず、例えば、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルの赤血球の血球凝集を引き起こさない。いくつかの場合には、有意なレベルの細胞の凝集とは、既存のＣＤ４７抗体の存在下における凝集のレベルを指す。一態様では、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体の存在下における凝集のレベルは、既存のＣＤ４７抗体の存在下での凝集のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０、％または少なくとも９９％、低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体がある状態の凝集のレベルが、既存のＣＤ４７抗体がある状態の凝集のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％、低減する場合、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、有意なレベルの凝集を引き起こさない。他の実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体がある状態の凝集のレベルが、ＣＤ４７抗体ＩＢ４がある状態の凝集のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％、低減する場合、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、有意なレベルの凝集を引き起こさず、該抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１にそれぞれ提供される可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む。本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、１０ｐＭと１０μＭの間の抗体濃度、例えば５０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭまたは５μＭの抗体濃度で、有意なレベルの細胞の凝集を引き起こさない。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ枯渇のレベルは、処置、例えば本明細書で開示された抗体、の投与の後に被験体中でＲＢＣ数を測定することにより判定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体を投与した後の被験体のＲＢＣ数が正常で健康な被験体の範囲内である場合、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルのＲＢＣ枯渇を引き起こさない。例えば、正常で健康な男性のヒトについてのＲＢＣ数は、血液サンプル１マイクロリットル当たり約４７０万から約６１０万の細胞である。例えば、正常で健康な女性のヒトについてのＲＢＣ数は、血液サンプル１マイクロリットル当たり４２０万から約５４０万の細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の投与後（５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、２日、４日、６日、１週、２週、３週、１か月、２か月、またはそれ以上）の被験体内のＲＢＣ数が、投与前のＲＢＣ数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％である場合、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルのＲＢＣ枯渇を引き起こさない。あるいは、または、これに加えて、本明細書に記載の抗体の投与後（５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、２日、４日、６日、１週、２週、３週、１か月、２か月、またはそれ以上）の被験体内のＲＢＣ数が、プラセボ処置（例えばビヒクル）の投与後の被験体内のＲＢＣ数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％である場合、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルのＲＢＣ枯渇を引き起こさない。ＲＢＣ数は当該技術分野の標準的な方法によって判定される。好ましくは、本明細書で開示されるＣＤ４７抗体は、１０ｐＭと１０μＭの間の抗体濃度、例えば５０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭまたは５μＭの抗体濃度で、有意なレベルのＲＢＣ枯渇を引き起こさない。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＣＤ４７抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の用量で投与される時、有意なレベルのＲＢＣ枯渇を引き起こさない。
【０００８】
本明細書で開示されたＣＤ４７抗体のＩｇＧ４アイソタイプは、有意なレベルの血小板枯渇を引き起こさない。例えば、ＩｇＧ４アイソタイプの抗体の投与は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の残存血小板パーセンテージをもたらす。好ましくは、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体のＩｇＧ４アイソタイプは、１０ｐＭと１０μＭの間の抗体濃度、例えば５０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭまたは５μＭの抗体濃度で、有意なレベルの血小板枯渇を引き起こさない。
【０００９】
また、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対して低い結合親和力を有する抗体を含むがこれに限定されない。例えば、抗体の定常領域は、ＩｇＧ１（野生型または突然変異体）、ＩｇＧ４（野生型または突然変異体、例えばＩｇＧ４Ｐ）などのサブクラスの抗体の定常領域よりも、ＦｃγＲに対して結合親和力が低い。
【００１０】
本明細書で開示された抗体はまた、当該技術分野で既知の抗体と比較して、腫瘍モデルにおいて著しくより強力である。例えば、本明細書に記載のＣＤ４７抗体の存在下においてマクロファージが腫瘍細胞を貪食する能力は、既存のＣＤ４７抗体の存在下においてマクロファージが腫瘍細胞を貪食する能力と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％増加する。
【００１１】
当業者は、過度の実験をすることなく、凝集のレベル、例えばＲＢＣの血球凝集のレベル、を定量することが可能であることを認識するだろう。例えば、当業者は、下記の実施例に述べられているように、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体の存在下において血球凝集アッセイを実施した後にＲＢＣドット（ＲＢＣ  ｄｏｔ）の領域を測定することにより血球凝集のレベルが確認されることを認識するだろう。いくつかの場合には、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体の存在下におけるＲＢＣドットの領域が、ＣＤ４７抗体がない状態、すなわち血球凝集がない状態、でのＲＢＣドットの領域と比較される。このように、血球凝集はベースライン対照に対して定量される。より大きいＲＢＣドット領域は血球凝集のより高いレベルに相当する。あるいは、ＲＢＣドットの濃度測定はまた、血球凝集を定量するために利用されてもよい。
【００１２】
当業者は、過度の実験をすることなく、ＲＢＣ枯渇のレベルを定量することが可能であることを認識するだろう。例えば、当業者は、例えば細胞カウンタまたは血球計の使用によりＲＢＣ数（すなわち血液サンプル中のＲＢＣの総数）を測定することによって、ＲＢＣ枯渇のレベルが確認されることを認識するだろう。当業者は、計数前に、例えば遠心分離を用いて全血を分画することにより、血液サンプル中のＲＢＣを随意に単離できることを認識するだろう。いくつかの場合には、本明細書に記載のＣＤ４７抗体の存在下におけるＲＢＣ数が、ＣＤ４７抗体がない状態、すなわちＲＢＣ枯渇がない状態、のＲＢＣ数と比較される。このように、ＲＢＣ枯渇の濃度はベースライン対照に対して正規化される。
【００１３】
本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、癌または他の腫瘍性疾患の処置、その進行の遅延、その再発の予防、またはその症状を緩和に有用である。例えば、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、血液学的悪性腫瘍および／または腫瘍、例えば血液学的悪性腫瘍および／または腫瘍、を処置するのに有用である。例えば、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７＋腫瘍を処置するのに有用である。非限定的な例としては、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、膀胱癌、黒色腫、大腸癌、膵癌、肺癌、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、膠芽腫、などの処置に有用である。固形腫瘍は、例えば乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫性の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、肺腫瘍、頭頚部腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍、を含む。
【００１４】
本明細書に使用されるように、「血液学的癌」は血液の癌を指し、特に白血病、リンパ腫および骨髄腫を含む。「白血病」とは、感染症の治療に効果のない白血球が多すぎて、それゆえ血小板や赤血球などの血液を構成する他の部分を押しのける（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｕｔ）血液の癌を指す。白血病の症例は急性または慢性として分類されることが理解される。白血病の特定の形式には、非限定的な例として、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）；および、脊髄形成異常症候群、が含まれる。「リンパ腫」は、とりわけ、ホジキンリンパ腫、無痛性かつ侵襲性の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）を指すことがある。骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖または、ベンスジョーンズ骨髄腫を指しうる。
【００１５】
本明細書で開示された例示的なモノクローナル抗体は、例えば、本明細書に記述される抗体を含んでいる。例示的な抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０から選択される可変重鎖、および、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７から選択される可変軽鎖、を有する抗体を含む。抗体はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０の少なくとも１つに開示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である可変重鎖、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７の少なくとも１つに開示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である可変軽鎖、を有する抗体を含む。好ましくは、抗体はヒトＣＤ４７を認識し結合し、有意なレベルのヒト赤血球の血球凝集を引き起こさない。これらの抗体はそれぞれ、本明細書でＣＤ４７抗体と呼ばれる。ＣＤ４７抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体、ならびにヒト化モノクローナル抗体およびキメラ抗体を含む。これらの抗体は、ヒトＣＤ４７についての特異性を示し、これらは、有意なレベルの赤血球の血球凝集、赤血球枯渇、貧血症および／または血小板枯渇を引き起こすことなく、ＣＤ４７発現、活性化、および／またはシグナル伝達を調節すること、例えば、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、または干渉することを示した。
【００１６】
本明細書で提供されるＣＤ４７抗体は、例えば、ＣＤ４７発現（例えばＣＤ４７の細胞表面発現の阻害）、活性化、および／またはシグナル伝達を阻害することにより、または、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用に干渉することにより、阻害活性を示す。本明細書で提供される抗体は、完全にまたは部分的に、ＣＤ４７（例えばヒトＣＤ４７）に結合またはそうでなければ相互作用する際に、ＣＤ４７発現または活性化を低減するかそうでなければ調節する。ＣＤ４７の生物学的機能の低減または調節は、抗体とヒトＣＤ４７ポリペプチドおよび／またはペプチドとの間の相互作用において、完全、有意、または部分的である。抗体がある状態でのＣＤ４７発現または活性化のレベルが、本明細書に記述される抗体との相互作用、例えば結合、がない状態でのＣＤ４７発現または活性化のレベルと比較して、少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少する場合、抗体は完全にＣＤ４７発現または活性化を阻害すると考えられる。ＣＤ４７抗体がある状態でのＣＤ４７発現または活性化のレベルが、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体との結合がない状態でのＣＤ４７発現または活性化のレベルと比較して、少なくとも５０％、例えば５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少する場合、ＣＤ４７抗体は有意にＣＤ４７発現または活性化を阻害すると考えられる。抗体がある状態でのＣＤ４７発現または活性化のレベルが、本明細書に記述される抗体との相互作用、例えば結合、がない状態でのＣＤ４７発現または活性化のレベルと比較して、９５％未満、例えば１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、減少する場合、抗体は部分的にＣＤ４７発現または活性化を阻害すると考えられる。
【００１７】
本明細書で開示された抗体はまた、特異的にＣＤ４７と結合するモノクローナル抗体を含み、ここで、該抗体は、有意なレベルの凝集、例えば赤血球の血球凝集（「ＲＢＣ血球凝集」）、を引き起こさない。本明細書に開示される抗体は、ＣＤ４７陽性細胞の凝集を促進しない方法で一意にＣＤ４７と結合し；しかしながら、本明細書で開示された抗体の、細胞表面上のＣＤ４７と結合し、かつ細胞凝集現象を引き起こさない能力は、赤血球に限定されるものではない。さらにまたはあるいは、本明細書で開示される抗体は、有意なレベルの血小板枯渇、ＲＢＣ枯渇、および／または貧血症を引き起こさない。
【００１８】
本明細書で開示される医薬組成物は、本明細書に開示される抗体および担体を含みうる。これらの医薬組成物は、例えば診断キットなどのキット内に含まれることができる。
【００１９】
ＣＤ４７に結合するモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントが本明細書に開示され、ここで、該抗体は、投与後に有意なレベルの細胞の凝集を引き起こさず、例えば、抗体は、投与後に有意なレベルの赤血球凝集を引き起こさない。加えてまたはあるいは、抗体またはそのフラグメントは、有意なレベルの血小板枯渇を引き起こさない。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体、またはヒト化抗体、または、完全ヒト（ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ）抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒトＣＤ４７に結合する。いくつかの実施形態では、抗体、または、その免疫学的に活性なフラグメントは、ＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用するのを防ぐ。抗体がある状態でのＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用のレベルが、抗体との相互作用、例えば抗体との結合、がない状態でのＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用のレベルと比較して、少なくとも９５％、例えば９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少する場合、抗体は完全にＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を阻害すると考えられる。抗体がある状態でのＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用のレベルが、抗体との相互作用、例えば抗体との結合、がない状態でのＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用のレベルと比較して、９５％未満、例えば１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％、減少する場合、抗体は部分的にＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を阻害すると考えられる。
【００２０】
被験体の癌を処置または予防するのに十分な抗体の量は、例えば、ＣＤ４７シグナル伝達を低減するのに十分な量である。（例えば以下を参照。Ｙａｍａｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３  Ｂｌｏｏｄ，  Ｊａｎ  ４．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］；  Ｓｏｔｏ−Ｐａｎｔｏｊａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ，  １７：８９−１０３；Ｉｒａｎｄｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  Ｅｐｕｂ  Ｊａｎ  ８；Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４：２２５−３２；Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，  ２０９（１０）：１８８３−９９；Ｃｓａｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，  ３２：２９６６−７３；Ｍａｘｈｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  １：３ｒａ７；Ｓａｒｆａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，  ９：８４２−８５０；Ｍｉｙａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，  １５：３９５０−３９６３；Ｅ．  Ｊ．  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｗ．  Ａ．  Ｆｒａｚｉｅｒ，  ２００１  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １１：１３０−１３５；Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９３：８５５−８６２；Ｂｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １９４：５４１−５４９；Ｏｌｄｅｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８８：２０５１−２０５４；およびＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７１：２１−２４）。例えば、被験体の癌を処置または予防するのに十分な抗体の量は、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達系中のＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用によって生成されたマクロファージ中の食作用阻害シグナルを低減するのに十分な量であり、すなわち、本明細書で開示される抗体は、ＣＤ４７発現細胞のマクロファージ媒介性食作用を促進する。本明細書に使用されるように、用語「低減された（ｒｅｄｕｃｅｄ）」は、本明細書で開示された抗体の存在下におけるＣＤ４７シグナル伝達の減少を指す。本明細書に開示されたＣＤ４７抗体のある状態でのＣＤ４７シグナル伝達のレベルが、ＣＤ４７シグナル伝達の対照レベル（すなわち、抗体がない状態でのＣＤ４７シグナル伝達のレベル）より、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％以上低い時、ＣＤ４７媒介性シグナル伝達は減少している。ＣＤ４７シグナル伝達のレベルは、非限定的な例として、下流遺伝子活性化、および／またはＣＤ４７活性化に反応するルシフェラーゼリポーターアッセイなどの、様々な標準的な技術のうちのいずれかを使用して、測定される。当業者は、例えば市販のキットを含む様々なアッセイを使用して、ＣＤ４７シグナル伝達のレベルを測定することができることを認識するだろう。
【００２１】
いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントはＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、抗体のグリコシル化を防ぐために、ヒトＩｇＧ１定常領域をアミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｂｏｘｅｄ、Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾する（例えばＡｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ））。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、抗体の定常領域をアミノ酸Ｌｅｕ２３５（Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾する（例えばＬｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ）またはＬｅｕ２３５Ａｌａ（Ｌ２３５Ａ））。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体相互作用、を変更するために、抗体の定常領域をアミノ酸Ｌｅｕ２３４（Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾する（例えばＬｅｕ２３４Ａｌａ（Ｌ２３４Ａ））。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、アミノ酸２３４および２３５の両方で変更される（例えばＬｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ）（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ２アイソタイプである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、抗体のグリコシル化を防ぐために、ヒトＩｇＧ２定常領域をアミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｂｏｘｅｄ、Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾する（例えばＡｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ））。
【００２５】
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ３アイソタイプである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、抗体のグリコシル化を防ぐために、ヒトＩｇＧ３定常領域をアミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｂｏｘｅｄ、Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾する（例えばＡｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ））。いくつかの実施形態では、半減期を伸長するために、ヒトＩｇＧ３定常領域をアミノ酸４３５、で修飾する（例えばＡｒｇ４３５Ｈ（Ｒ４３５Ｈ））（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する、ヒトＩｇＧ４アイソタイプである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、鎖交換反応を防止または低減するために、ヒトＩｇＧ４定常領域をヒンジ領域内で修飾する（例えばＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ））。他の実施形態では、Ｆｃ受容体相互作用を変更するために、ヒトのＩｇＧ４の定常領域をアミノ酸２３５で修飾する（例えばＬｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｌ２３５Ｅ））。いくつかの実施形態では、ヒトのＩｇＧ４定常領域をヒンジ内およびアミノ酸２３５で修飾する（例えばＳｅｒ２２８ＰｒｏおよびＬｅｕ２３５Ｇｌｕ（Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ））。いくつかの実施形態では、抗体のグリコシル化を防ぐために、ヒトＩｇＧ４定常領域をアミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾する（例えばＡｓｎ２９７Ａｌａ（Ｎ２９７Ａ））。本明細書で開示されるいくつかの実施形態において、ヒトのＩｇＧ４定常領域を、アミノ酸位置Ｓｅｒ２２８、Ｌｅｕ２３５およびＡｓｎ２９７で修飾する（例えばＳ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ／Ｎ２９７Ａ）。（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。本明細書で開示された他の実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ４サブクラスで、グリコシル化を欠く。これらの実施形態では、グリコシル化は、２９７位（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で変異によって除去することができる（例えばＮ２９７Ａ）。他の実施形態では、グリコシル化は、翻訳後グリコシル化の能力を欠く宿主細胞、例えば、細菌または酵母由来系または改変された哺乳動物細胞発現系、において抗体を産生することによって除去することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ヒトのＩｇＧ定常領域はＦｃＲｎ結合を増強するために修飾される。ＦｃＲｎに対する結合を増強するＦｃ変異の例は、Ｍｅｔ２５２Ｔｙｒ、Ｓｅｒ２５４Ｔｈｒ、Ｔｈｒ２５６Ｇｌｕ（それぞれＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ）（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ，  Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ．  ２８１（３３）  ２３５１４−２３５２４）、または、Ｍｅｔ４２８ＬｅｕおよびＡｓｎ４３４Ｓｅｒ（Ｍ４２８Ｌ，  Ｎ４３４Ｓ）（Ｚａｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｖｏｌ．  ２８（２）  １５７−１５９）である。（ＥＵ  ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ヒトのＩｇＧ定常領域は、抗体依存細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更するために修飾され、例えばＮａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６８（１０）：３８６３−７２；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６６（４）：２５７１−５；Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  ｍＡｂｓ，  ２（２）：１８１−１８９；Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６  ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．，  １０３（１１）：４００５−４０１０，  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  ＪＢＣ，  ２７６（９）：６５９１−６６０４；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６７（１８）：８８８２−８８９０；Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．，  ４８：１５２−１６４；Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １４８：３４６１−３４６８；に記載され、ＫａｎｅｋｏおよびＮｉｗａ，  ２０１１  Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，  ２５（１）：１−１１でレビューされたアミノ酸修飾である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ定常領域は、ヘテロ二量化を誘導するために修飾される。例えば、ＣＨ３ドメイン内でＴｈｒ３６６にアミノ酸修飾を有することは、より嵩張った（ｂｕｌｋｙ）アミノ酸（例えば、Ｔｒｙ（Ｔ３６６Ｗ））で置換されている時、Ｔｈｒ３６６、Ｌｅｕ３６８、および、Ｔｙｒ４０７の位置で嵩張りがより小さいアミノ酸（例えば、それぞれＳｅｒ、Ａｌａ、およびＶａｌ）へのアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３ドメインと好ましく対になることを可能にする（Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ）。ＣＨ３修飾を介するヘテロ二量化は、例えば、反対のＣＨ３ドメイン上のＳｅｒ３５４のＣｙｓへの変更（Ｓ３５４Ｃ）、およびＹ３４９のＣｙｓへの変更（Ｙ３４９Ｃ）によるジスルフィド結合の導入によりさらに安定化されることができる（Ｃａｒｔｅｒ，  ２００１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２４８：７−１５でレビューされる）。
【００３２】
本明細書で開示された他の実施形態では、抗体はグリコシル化を欠くが、アミノ酸Ａｓｎ２９７（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）で修飾されない。これらの実施形態では、グリコシル化は、翻訳後グリコシル化能力を欠く宿主細胞、例えば、細菌または酵母由来系または改変された哺乳動物細胞発現系、において抗体を産生することによって除去することができる。
【００３３】
また、ＣＤ４７またはその免疫学的に活性なフラグメントに結合する１つ以上のモノクローナル抗体を含んでいる、医薬組成物も本明細書に開示され、ここで、該抗体は、投与後に有意なレベルの赤血球の血球凝集を引き起こさない。
【００３４】
血球凝集は同型の相互作用の例であり、ここで、２つのＣＤ４７発現細胞は、二価のＣＤ４７結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）で処置された場合に、凝集またはクランプが引き起こされる。本明細書に開示される抗体の、細胞表面上のＣＤ４７に結合する能力、および細胞凝集現象を引き起こさない能力は、赤血球に限定されるものではない。本明細書で開示された抗体は、ＣＤ４７陽性細胞系（例えば、Ｄａｕｄｉ細胞）のクランピングを促進することがないようにＣＤ４７に一意的に結合すると観察されている。
【００３５】
いくつかの場合では、抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０からなる群から選択される可変重（ＶＨ）鎖領域を含む。抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７からなる群から選択される可変軽（ＶＬ）鎖領域を随意に含む。いくつかの場合では、抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０からなる群から選択されるＶＨ鎖領域を含み、および、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７からなる群から選択されるＶＬ鎖領域を含む。本明細書で開示される抗体はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０の少なくとも１つに開示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である可変重鎖領域を有し、および、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７の少なくとも１つに開示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である可変軽鎖領域を有する抗体を含んでいる。他の態様では、抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、７、８、１１、１５−１７、２０−２２および２７−３０のいずれか１つで提供されるＶＨ領域を含み、これらは、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−３９、４２、４３、４４および４７のいずれか１つで提供されるＶＬ領域と対になる。他の実施形態では、抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、７、８、１１、１２、１５−１７、２０−２２および２７−３０のいずれか１つで提供されるＶＨ領域を含み、これらは、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるような、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、３２、３５、４０、４１、４２、４３、４４および４７のいずれか１つで提供されるＶＬ領域と対になる。また別の態様では、抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるような、表１に列挙される組み合わせから選択される、ＶＨ鎖領域およびＶＬ鎖領域の組み合わせを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、に記載のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、に記載のＶＬ  ＣＤＲ１配列を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列を含み、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む。例えば、抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に記載のＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に記載のＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含む。別の例において、抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０に記載のＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に記載のＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２に記載のＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３に記載のＶＬ  ＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１に記載のＶＬ  ＣＤＲ２配列、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５に記載のＶＬ  ＣＤＲ３配列を含み、−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【００３７】
一実施形態では、本明細書に開示される抗体が、頭部がＣＤ４７発現細胞の膜の近くに重鎖が位置する側面へ配向するように結合し、軽鎖がＣＤ４７上のＳＩＲＰα結合部位を塞ぐ。他の実施形態では、本明細書に開示される抗体が、頭部がＣＤ４７発現細胞の膜の近くに軽鎖が位置する側面へ配向するように結合し、重鎖がＣＤ４７上のＳＩＲＰα結合部位を塞ぐ。
【００３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７（すなわち、シグナル配列（アミノ酸１−１８）を除くＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）に従って番号を付けた場合、ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７のアミノ酸残基１−１１６のいずれか１つを含むエピトープに結合する。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７に従って付けられた場合、本明細書で開示された抗体は、ＣＤ４７のアミノ酸残基Ｑ３１、Ｎ３２、Ｔ３３、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｖ３６、Ｙ３７、Ｖ３８、Ｋ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｉ４７、Ｙ４８、Ｔ４９、Ｆ５０、Ｄ５１、Ｇ５２、Ａ５３、Ｌ５４、Ｎ５５、Ｋ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｐ６０、Ｔ６１、Ｄ６２、Ｆ６３、Ｓ６４、Ｓ６５、Ａ６６、Ｋ６７、Ｉ６８、Ｅ６９、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｑ７２、Ｌ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｄ７７、Ａ７８、Ｓ７９、Ｌ８０、Ｋ８１、Ｍ８２、Ｄ８３、Ｋ８４、Ｓ８５、Ｄ８６、Ａ８７、Ｖ８８、Ｓ８９、Ｈ９０、Ｔ９１、Ｇ９２、Ｎ９３、Ｙ９４、Ｔ９５、Ｃ９６、Ｅ９７、Ｖ９８、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、Ｅ１０４、Ｇ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１０７、１１０８、１１０９およびＥ１１０の１つ以上を含むエピトープに結合する。−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【００３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７に従って番号付けされた場合、本明細書に開示された抗体は、ＣＤ４７のアミノ酸残基Ｙ３７、Ｖ３８、Ｋ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｉ４７、Ｙ４８、Ｔ４９、Ｆ５０、およびＤ５１の内の１つ以上を含む不連続なエピトープに結合する。例えば、本明細書で開示された抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７に従って番号付けされた場合、ＣＤ４７のアミノ酸残基Ｙ３７、Ｖ３８、Ｋ３９、Ｋ４１、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｄ５１、Ｈ９０、Ｎ９３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１０４、またはＥ１０６の内の１つ以上を含む不連続なエピトープに結合する。例えば、本明細書で開示された抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７に従って番号付けされた場合、少なくともＣＤ４７のＫＧＲＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）ループ（残基４３−４６）の残基を含む不連続なエピトープに結合する。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４７に従って番号付けされた場合、本明細書で開示された抗体は、少なくともＣＤ４７の残基Ｙ３７、Ｋ３９、Ｋ４１、ＫＧＲＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）ループ（残基４３−４６）、Ｄ５１、Ｈ９０、Ｎ９３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１０４、およびＥ１０６を含む不連続なエピトープに結合する。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４７に従って番号付けされた場合、本明細書で開示された抗体は、ＣＤ４７の残基Ｙ３７、Ｋ３９、Ｋ４１、ＫＧＲＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）ループ（残基４３−４６）、Ｄ５１、Ｈ９０、Ｎ９３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１０４、およびＥ１０６を含む不連続なエピトープに結合する。−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【００４０】
本明細書に記述されるＣＤ４７抗体のＶＨ領域は、ＣＤ４７のＫＧＲＤ（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）ループへの結合に主として関与する。従って、本明細書に記述される抗体が結合する一意の（ｕｎｉｑｕｅ）エピトープは、ＣＤ４７の側面にある。当該技術分野で知られる既存のＣＤ４７抗体とは対照的に、膜近傍位置（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）における本明細書に記述されるＣＤ４７抗体のＶＨドメインの配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）は、抗体が隣接した細胞上のＣＤ４７分子に架橋することができないように抗体を拘束することにより、細胞クランピング、例えば赤血球の赤血球凝集、を妨げるこれらの抗体の決定的な特徴である。さらに、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体のＶＫドメインは、ＳＩＲＰα結合に関与する、Ｙ３７、Ｔ１０２、およびＥ１０４などの頂点の残基（ａｐｉｃａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）と相互作用するので、主としてＶＫドメインがＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαを物理的に締め出す。
【００４１】
ＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用するのを妨げるための本明細書に記載されるＣＤ４７抗体と競合する、単離された抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントも提供される。
【００４２】
米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７に従って番号付けされた場合、ＣＤ４７のアミノ酸残基Ｙ３７、Ｋ３９、Ｋ４１、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｄ５１、Ｈ９０、Ｎ９３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１０４、およびＥ１０６を含むポリペプチドが本明細書に開示される。ＳＥＱ  ＩＤ番号：１４７に従って番号付けされた場合、ＣＤ４７のアミノ酸残基１−１１６の内の任意の１つを含むポリペプチドもまた提供される。例えば、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７に従って番号を付けられた時のＣＤ４７のアミノ酸残基Ｑ３１、Ｎ３２、Ｔ３３、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｖ３６、Ｙ３７、Ｖ３８、Ｋ３９、Ｗ４０、Ｋ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｇ４４、Ｒ４５、Ｄ４６、Ｉ４７、Ｙ４８、Ｔ４９、Ｆ５０、Ｄ５１、Ｇ５２、Ａ５３、Ｌ５４、Ｎ５５、Ｋ５６、Ｓ５７、Ｔ５８、Ｖ５９、Ｐ６０、Ｔ６１、Ｄ６２、Ｆ６３、Ｓ６４、Ｓ６５、Ａ６６、Ｋ６７、Ｉ６８、Ｅ６９、Ｖ７０、Ｓ７１、Ｑ７２、Ｌ７３、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｄ７７、Ａ７８、Ｓ７９、Ｌ８０、Ｋ８１、Ｍ８２、Ｄ８３、Ｋ８４、Ｓ８５、Ｄ８６、Ａ８７、Ｖ８８、Ｓ８９、Ｈ９０、Ｔ９１、Ｇ９２、Ｎ９３、Ｙ９４、Ｔ９５、Ｃ９６、Ｅ９７、Ｖ９８、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２、Ｒ１０３、Ｅ１０４、Ｇ１０５、Ｅ１０６、Ｔ１０７、Ｉ１０８、Ｉ１０９およびＥ１１０の１つ以上を含む。また、抗原、例えばＣＤ４７抗体と結合する抗原、としてこのポリペプチドを使用する方法も提供される。
【００４３】
本発明は、投与を必要とする対象に、ＣＤ４７に結合する１つ以上のモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントを投与することにより、癌または他の腫瘍性疾患を緩和する方法を提供し、ここで、該抗体は、投与後に、有意なレベルの赤血球の血球凝集、赤血球枯渇、貧血症、および／または血小板枯渇を引き起こさない。抗体は、癌または被験体の他の腫瘍性疾患の症状を緩和するのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体、またはヒト化抗体、または、完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒトＣＤ４７に結合する。いくつかの実施形態では、抗体、または、その免疫学的に活性なフラグメントは、ＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用するのを防ぐ。いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプ、ＩｇＧ３アイソタイプおよびＩｇＧ４アイソタイプからなる群から選択されたＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントは、ＩｇＧ４ＰとＩｇＧ４ＰＥからなる群から選択されたＩｇＧアイソタイプである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、１つ以上の追加の薬剤または追加の薬剤の組み合わせと共に使用される。適切な追加の薬剤は、意図される用途、例えば癌、のための現在の医薬的なおよび／または外科的治療を含む。例えば、ＣＤ４７抗体は、１つ以上の追加の化学療法剤または抗腫瘍剤と共に使用され得る。あるいは、追加の化学療法剤は、放射線療法である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、細胞死誘導剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、例えばホスファチヂルセリン（ＰＳ）の細胞表面露出をもたらす、細胞膜を非対称に横断するリン脂質の喪失を誘導する。いくつかの実施形態では、化学療法剤は小胞体（ＥＲ）ストレスを誘導する。いくつかの実施形態では、化学療法剤はプロテアソーム阻害剤である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、ＥＲタンパク質の細胞表面への転置を誘導する。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、カルレチキュリンの転移および細胞表面露出を誘導する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４７抗体および追加の薬剤は単一の治療の組成物に調製され、ＣＤ４７抗体および追加の薬剤は同時に投与される。あるいは、ＣＤ４７抗体および追加の薬剤は互いに分離され、例えば、そのそれぞれは別個の治療的な組成物に調製され、および、ＣＤ４７抗体および追加の薬剤は同時に投与され、またはＣＤ４７抗体および追加の薬剤は、処置レジメンの間の異なった時間に投与される。例えば、ＣＤ４７抗体は追加の薬剤の投与前に投与され、またはＣＤ４７抗体は追加の薬剤の投与後に投与され、または、ＣＤ４７抗体および追加の薬剤は交互に投与される。本明細書に記述されるように、ＣＤ４７抗体および追加の薬剤は単回投与または反復投与で投与される。
【００４６】
当業者は、本明細書で開示された抗体が様々な用途を有することを認識するだろう。例えば、本明細書で開示された抗体は、治療剤として、診断キットの試薬としてまたは診断ツールとして、または、治療的な試薬を生成するための競合アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の試薬として使用される。
【００４７】
本明細書で参照される特許文献および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。本明細書に引用されたすべての米国特許、および公開または非公開の米国特許出願が参照により援用される。本明細書で引用したすべての公開された外国の特許および特許出願が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用される受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩの提出が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用した他の公開された参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
本開示がその好ましい実施形態に関して特別に示され記載されてきたが、形式や詳細の様々な変更が、添付の請求項により包含される本開示の範囲から逸脱することなく本明細書で行われ得ることが当業者に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＤ４７−ＥＣＤ動態およびＣＤ４７−ＥＣＤの定常の（ｓｔｅａｄｙ）親和性を含む、ＣＤ−４７およびＴＳＰ−１結合を示す並列（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）のグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、試験ＣＤ４７抗体のブロッキング効果を示すグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、試験ＣＤ４７抗体に関わるＣＣＲＦ−ＣＥＭにおけるＣＤ４７抗体およびＴＳＰ−１の競合研究結果を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは全体的なＣＤ４７発現を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは全体的なＪＡＧ１発現を示す棒グラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、試験ＣＤ４７抗体を含む処置後の平均生存率を示す棒グラフである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、試験ＣＤ４７抗体で処置されたものを含む、マンモスフェアにおけるＪＡＧ１発現を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ヒトＣＤ４７を含むＣＤ４７に特異的に結合するモノクローナル抗体が本明細書に開示される。これらの抗体は、本明細書ではまとめてＣＤ４７抗体と呼ばれる。
【００５１】
標的細胞除去のための抗体の主要なＦｃ依存性機能は、Ｆｃ領域にＣｌｑを結合させることにより開始する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であり；Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲｓ）、免疫エフェクター細胞上の初代ＦｃγＲＩＩＩａ（例えばＮＫ細胞および好中球）とのＦｃ領域の相互作用によって媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）であり；および、ＦｃγＲＩを介してオプシン化された（ｏｐｓｉｎｉｚｅｄ）標的細胞の認識を通じてマクロファージによって実行される、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）である。抗体サブクラスは、Ｆｃ依存性エフェクター活性を媒介する能力において差異を有する。ヒトでは、ＩｇＧ１とＩｇＧ３サブクラスは、Ｃｌｑの結合のためにＣＤＣに対する高い効力を有する。加えて、ＩｇＧ１サブクラスは、ＦｃγＲに対して最も高い親和性を有し、それによりＡＤＣＣおよびＦｃ依存性ＡＤＣＰに関して最も強力である。ＩｇＧ４サブクラスはＣｌｑ結合能力を欠いており、ＦｃγＲ結合親和性が大きく低下しており、それによってエフェクター機能が著しく低下していた。
【００５２】
免疫グロブリンスーパーファミリーに属する複数にわたる膜貫通受容体（ａ  ｍｕｌｔｉ−ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、マクロファージ上のＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質ａ）と相互作用し、それによって食作用を減衰させる。この経路を接収する（ｃｏ−ｏｐｔ）癌細胞は食作用を回避する。下に詳細に記述されるように、これは腫瘍免疫回避の新しいメカニズムであり、ＣＤ４７を治療的に標的とすることは、多数の癌において広範囲に応用されている。
【００５３】
ＣＤ４７の発現は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、卵巣癌、神経膠腫、膠芽腫などを含む多くの別個の悪性腫瘍において臨床結果の悪化と相関する。加えて、ＣＤ４７は、白血病および固形腫瘍の両方において、癌幹細胞マーカーとして同定されている。（Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｃｅｌｌ，  １３８（２）：２７１−８５；  Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０６（３３）：１４０１６−２１；  Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｕｒｏｌ．，  ２０（５）：３９３−７；  Ｍａｊｅｔｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ３０（９）：１００９−１９）。
【００５４】
ＣＤ４７ブロッキング抗体は、複数のインビボ腫瘍モデルにおいて抗腫瘍活性を実証した。さらに、これらの抗体は、腫瘍モデルにおいてＲｉｔｕｘａｎ（商標）およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を含む他の治療的な抗体と相乗作用することを示した。ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用をブロックすることは、マクロファージによるＣＤ４７発現細胞の食作用を促進することができる（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４（２）：２２５−３２においてレビューされる）。ＣＤ４７を欠くマウスは放射線療法に対して際立って耐性であり、放射線療法と組み合わせたＣＤ４７標的化の役割を示唆している（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １７３（４）：１１００−１１１２；  Ｍａｘｈｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，  １（３）：３ｒａ７）。さらに、これらのマウスにおける同系腫瘍モデルは、野生型マウスと比較して骨転移の減少を示す（Ｕｌｕｃｋａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６９（７）：３１９６−２０４）。
【００５５】
ほとんどのＣＤ４７抗体は、ヒト赤血球の血球凝集ならびに赤血球枯渇および貧血症を引き起こすと報告されてきた。血球凝集は同型の相互作用の例であり、ここで、２つのＣＤ４７発現細胞は、二価のＣＤ４７結合物（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）で処置された場合に、凝集またはクランプが引き起こされる。例えば、ＣＤ４７抗体ＭＡＢＬが、全ＩｇＧ（ｆｕｌｌ  ＩｇＧ）またはＦ（ａｂ’）２として、赤血球の血球凝集を引き起こすと報告されており、ＭＡＢＬがｓｃＦｖまたは二価ｓｃＦｖへ変更された時だけ、この効果が緩和された。（例えばＵｎｏ  Ｓ．，  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｙ．，  Ａｚｕｍａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ４７  ｉｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｐ．  ２００７；  １７：１１８９−９４；  Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｙ．，  Ｕｎｏ  Ｓ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ４７  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００４；  ３１５：９１２−８を参照）。下に詳細に記述されるように、Ｂ６Ｈ１２、ＢＲＣ１２６およびＣＣ２Ｃ６を含む他の既知のＣＤ４７抗体も、ＲＢＣ赤血球凝集を引き起こす。
【００５６】
加えて、ＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質に拮抗するＣＤ４７抗体およびＣＤ４７は、マウスおよび／またはカニクイザルに投与された時、赤血球枯渇および貧血症を引き起こすと報告されてきた。（Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＩＲＰα  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；  ３４１：８８を参照）。貧血症は、組織に酸素を運ぶために十分な量の赤血球またはヘモグロビンが血液に欠けている状態である。貧血症は、当該技術分野において一般的に既知の多くの方法により診断できる。例えば、貧血症は、赤血球の数、サイズ、ボリュームおよびヘモグロビン含量を判定する完全血球算定（ＣＢＣ）の判定により診断される。貧血症はまた、血液の鉄の濃度、および／または、身体の合計鉄貯蔵の指標である血清フェリチン濃度の測定により診断される。加えて、貧血症は、ビタミンＢ１２と葉酸の濃度、網赤血球数およびビリルビンの測定により診断される。
【００５７】
したがって、細胞の凝集、ＲＢＣ枯渇および貧血症は、既存の十分なＩｇＧ抗体および／またはＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質でのＣＤ４７の治療的な標的化の主要な制限を示す。  
【００５８】
さらに、ＣＤ４７抗体の重要な特徴は、マクロファージによるＣＤ４７発現細胞の食作用を促進するためにＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用をブロックする能力である。多くの既存のＣＤ４７抗体がＳＩＲＰαをブロックする；しかしながら、本明細書に記述される本発明前には、ＳＩＲＰαをブロックした既存の抗体は、血球凝集の副作用を引き起こし、これは、上述されたように、望ましくない。２Ｄ３などの他の既存の抗体は血球凝集を引き起こさない；しかしながら、これらの抗体はまたＳＩＲＰαをブロックせず、食作用の促進において効果をなくす。したがって、本明細書に記述した本発明前には、細胞の凝集を引き起こさずにＳＩＲＰαをブロックするＣＤ４７抗体を同定する差し迫った必要性が存在した。
【００５９】
本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、赤血球凝集の望ましくない影響を回避し、それによって、治療的にＣＤ４７を標的とする効能を高め、ＳＩＲＰαでのＣＤ４７の相互作用をブロックする能力を維持し、それによって、ＣＤ４７発現細胞の食作用を促進する。具体的には、本明細書に開示される完全ＩｇＧ  ＣＤ４７抗体（例えば、２Ａ１および表１に提供されるものを含むそのヒト化誘導体）は、有意なレベルで細胞を凝集させない。例えば、本明細書で開示されるＣＤ４７抗体は、有意なレベルでＲＢＣを凝集させない。ＳＩＲＰαをブロックし、有意なレベルの赤血球凝集および／またはＲＢＣ枯渇を引き起こさない、完全なＩｇＧフォーマットでの第１のＣＤ４７抗体が本明細書に記述される。まとめると、本明細書で開示された抗体（例えば２Ａ１抗体およびそのヒト化誘導体）は、ＳＩＲＰαをブロックするが有意なレベルの赤血球凝集および／またはＲＢＣ枯渇を引き起こさないそれらの能力という点で、既存のＣＤ４７抗体の中でも独特である。
【００６０】
本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、非限定的な一例として、有意なレベルの赤血球の血球凝集を引き起こさない、または赤血球の血球凝集を調節しない、ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰαとの間の相互作用の強力なブロッキング、ならびに、強力な抗腫瘍活性、などの多数の望ましい特性を示す。例えば、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、本明細書に記述されるＣＤ４７抗体がない状態でのＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用のレベルと比較して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用をブロックする。本明細書で開示されるＣＤ４７抗体は、有意なレベルの細胞の凝集を引き起こさず、例えば、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルの赤血球の血球凝集を引き起こさない。例えば、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体の存在下における凝集のレベルは、既存のＣＤ４７抗体の存在下での凝集のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％、低減する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体がある状態の凝集のレベルが、ＣＤ４７抗体ＩＢ４がある状態の凝集のレベルと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％、低減する場合、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、有意なレベルの凝集を引き起こさず、該抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているように、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１に提供される可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む。本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、有意なレベルのＲＢＣ枯渇を引き起こさない。例えば、本明細書に開示される抗体の投与後（５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、２日、４日、６日、１週、２週、３週、１か月、２か月、またはそれ以上）の被験体内のＲＢＣ数が、投与前のＲＢＣ数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．５％である。あるいは、または、これに加えて、本明細書に開示される抗体の投与後（５分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１２時間、２４時間、２日、４日、６日、１週、２週、３週、１か月、２か月、またはそれ以上）の被験体内のＲＢＣ数が、プラセボ処置（例えばビヒクル）の投与後の被験体内のＲＢＣ数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％である。ＲＢＣ数は当該技術分野の標準的な方法によって判定される。本明細書で開示された抗体はまた、���該技術分野で既知の抗体と比較して、腫瘍モデルにおいて著しくより強力である。例えば、本明細書に記載のＣＤ４７抗体の存在下においてマクロファージが腫瘍細胞を貪食する能力は、既存のＣＤ４７抗体の存在下においてマクロファージが腫瘍細胞を貪食する能力と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９９％増加する。
【００６１】
当業者は、過度の実験をすることなく、凝集のレベル、例えばＲＢＣの血球凝集のレベル、を定量することが可能であることを認識するだろう。例えば、当業者は、下記の実施例に述べられているように、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体の存在下において血球凝集アッセイを実施した後にＲＢＣドット（ＲＢＣ  ｄｏｔ）の領域を測定することにより血球凝集のレベルが確認されることを認識するだろう。いくつかの場合には、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体の存在下におけるＲＢＣドットの領域が、ＣＤ４７抗体がない状態、すなわち血球凝集がない状態、でのＲＢＣドットの領域と比較される。このように、血球凝集はベースライン対照に対して定量される。より大きいＲＢＣドット領域は血球凝集のより高いレベルに相当する。あるいは、ＲＢＣドットの濃度測定はまた、血球凝集を定量するために利用されてもよい。
【００６２】
加えて、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体などの抗体は、投与時に血小板枯渇に（例えばＦｃ依存性の方法で）役割を果たすことができる。例えば、ＣＤ４７に結合するＩｇＧ１サブクラスの抗体でのカニクイザルの処置は、複数回投与で血小板の重大な枯渇をもたらす可能性がある。例えば実施例１２、図１２Ｃ−Ｄを参照。血小板枯渇の欠点は、重度の場合、致命的な出血を引き起こす可能性があることである。本発明は、ＦｃγＲ結合を減少させる抗体の変異は、高用量（例えば、１００ｍｇ／ｋｇ）であっても低レベルの血小板枯渇を検出しないという驚くべき発見に部分的に基づく。例えば実施例１２、図１２Ｇ−Ｈを参照。したがって、ＦｃγＲ結合およびエフェクター機能が著しく低下したＣＤ４７結合抗体は、血小板枯渇をもたらさない。
【００６３】
血小板数は、当業者に一般的に既知の通例の（ｒｏｕｔｉｎｅ）方法を使用して測定することができる。経時的な残存血小板パーセンテージは、治療の適用前（例えば１時間、３時間、６時間、１２時間、１日、２日、４日、５日、６日、または、それ以上）のいつかの血小板に正規化された、本明細書に開示された治療（例えばＣＤ４７抗体）の投与後の特定の時点での残存する血小板数として、計算されうる。著しい血小板枯渇は、投与後の１００％未満の残存血小板パーセンテージ（例えば９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％または１０％未満）として定義することができる。本明細書に開示される治療（例えば抗体）は、わずかなレベルの血小板枯渇（例えば、投与後の残存血小板パーセンテージが少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％）をもたらした。本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、ヒトＣＤ４７に結合し、ＳＩＲＰαとの相互作用をブロックする（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されている図１Ｂ、３および７Ｊ）。これらの抗体は、有意なレベルのヒト赤血球の血球凝集を引き起こさない（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されている図４。また、これらの抗体は、有意なレベルの血小板枯渇を引き起こさない特性を持つことができる（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される、実施例１２および図１２）。これらの抗体は、マクロファージによる腫瘍細胞の食作用を促進できる（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されている図９）。さらに、ＣＤ４７抗体は、ヒトリンパ腫のマウスモデルにおける強力な抗腫瘍活性を示す（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されている図１０）。したがって、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７の治療的標的化の主要な制限因子を回避する。従って、本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、複数の癌の処置に非常に重要になりうる。
【００６４】
赤血球の血球凝集を有意なレベルで引き起こすことなく、または赤血球の血球凝集を調節することなく、特異的にヒトＣＤ４７と結合し、ヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの間の相互作用をブロック、阻害、干渉、またはさもなければ調整する、抗体が本明細書で開示される。
【００６５】
本明細書に開示される抗体は、平衡結合定数（Ｋｄ）が≦１μＭ、例えば≦１００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭ、のＣＤ４７エピトープに結合する例えば、本明細書で提供されるＣＤ４７抗体は、約１ｎＭから約１ｐＭの範囲のＫ  ｄを示す。
【００６６】
本明細書で開示されたＣＤ４７抗体は、広く分配されたＣＤ４７の機能的な活性で調節、ブロック、阻害、低減、中和、またはさもなければ干渉する役目をする。ＣＤ４７の機能的な活性は、例えば、ＳＩＲＰαとの相互作用によるシグナル伝達、細胞外マトリックスへの細胞接着の際の細胞内のカルシウム濃度の調整、例えば上昇、トロンボスポンジンのＣ末端細胞結合ドメインとの相互作用、フィブリノゲンとの相互作用、および、様々なインテグリンとの相互作用、を含む。例えば、ＣＤ４７抗体は、部分的にまたは完全にＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を調節、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、またはさもなければ干渉することにより、完全にまたは部分的にＣＤ４７の機能的な活性を阻害する。
【００６７】
ＣＤ４７抗体がある状態でのＣＤ４７の機能的活性のレベルが、本明細書に記載のＣＤ４７抗体との結合がない状態でのＣＤ４７の機能的活性のレベルと比較して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少する場合、ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７の機能的活性を、完全に調節、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、またはさもなければ干渉すると考えられる。ＣＤ４７抗体がある状態でのＣＤ４７の活性のレベルが、本明細書に記載のＣＤ４７抗体との結合がない状態でのＣＤ４７の活性のレベルと比較して、少なくとも５０％、例えば５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少する場合、ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７の機能的活性を、著しくブロック、阻害、低減、拮抗、中和、またはさもなければ干渉すると考えられる。ＣＤ４７抗体がある状態でのＣＤ４７の活性のレベルが、本明細書に記載のＣＤ４７抗体との結合がない状態でのＣＤ４７の活性のレベルと比較して、９５％未満、例えば１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、または９０％減少する場合、ＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７の機能的活性を、部分的にブロック、阻害、低減、拮抗、中和、またはさもなければ干渉すると考えられる。
【００６８】
定義
他に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法は、当技術分野において周知で一般的に使用されている命名法である。標準的な技術は、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、および、組織の培養と形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素の反応および精製技術はメーカーの仕様書によって行なわれる、あるいは、技術中で一般に遂行されたとともに、または本明細書に記述されるとともに。前述の技術および手順は、一般に、当該技術分野で公知の従来の方法に従い、および、本明細書にわたって引用および議論される様々な一般的でより具体的な参考文献で記載されるように、行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９）参照。本明細書に記載された分析化学、合成有機化学、および薬学的および製薬化学に関連して用いられる命名法およびその検査法および技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬剤の調整、処方、および、送達、ならびに、患者の処置について、標準的な技術が用いられる。
【００６９】
本開示に従って利用される場合、以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【００７０】
本明細書に使用されるように、ＣＤ４７、インテグリン関連性タンパク質（ＩＡＰ）、卵巣癌抗原ＯＡ３、Ｒｈ関連抗原およびＭＥＲＧという用語は同義語であり、五感的に使用されてもよい。
【００７１】
赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ（ｓ））および赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ（ｓ））という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【００７２】
凝集という用語は細胞凝集を意味し、血球凝集という用語は細胞の特定のサブセット、すなわち赤血球の凝集を意味する。したがって、血球凝集は一種の凝集である。
【００７３】
本明細書に使用されるように、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、すなわち特異的に抗原と結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子、および、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、を指す。「特異的に結合する」または「免疫反応する」「〜に対して向けられる（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ）」とは、抗体が、所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか、またははるかに低い親和性で結合する（Ｋｄ＞１０−６）。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖｓ、およびＦａｂ発現ライブラリが含まれるが、これに限定されない。
【００７４】
基本的な抗体構造単位はテトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、同一の２組のポリペプチド鎖からなり、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５  ｋＤａ）、および１つの「重」鎖（約５０−７０  ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００から１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端の部分は、エフェクター機能の主に担う定常領域を定義する。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関し、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラス（アイソタイプとしても知られる）もある。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖でありうる。
【００７５】
用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書に使用されるように、一意の軽鎖遺伝子産物と一意の重鎖遺伝子産物とからなる抗体分子の分子種を１つだけ含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、それに対する一意の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００７６】
一般に、ヒトから得られた抗体分子は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれかに関し、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ほかなどのサブクラスも有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖でありうる。
【００７７】
用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖、軽（「Ｌ」）鎖のＮ−末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のＶ領域内の非常に分岐する３つのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）が、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる、より多くの保存された隣接するストレッチ間に挿入される。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリン中の超可変領域の間に、およびそれに隣接して、天然に存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するために３次元空間内で互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９８７  ａｎｄ  １９９１）），  ｏｒ  Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１−９１７（１９８７），  Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
【００７８】
本明細書に使用されるように、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはそのフラグメント、またはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。用語「エピトープ」は免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または砂糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面のグループからなり、通常、比電荷特性と同様に特異的な３次元の構造的な特性を有している。抗体は、解離定数が≦１μＭ、例えば≦  １００ｎＭ、好ましくは≦１０ｎＭ、より好ましくは≦１ｎＭである場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００７９】
本明細書に使用されるように、用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有結合の相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表現することができ、より小さいＫｄはより大きな親和性を表す。選択されるポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該技術分野において周知の方法を用いて定量されうる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度（ｒａｔｅ）を測定する必要があり、これら速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および、双方向への速度に等しく影響する幾何学的なパラメータに依存する。従って、「オンの速度定数」（ｋｏｎ）および「オフの速度定数」（ｋｏｆｆ）の両方は、結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および解離の濃度および現実の速度の計算により決定することができる。Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３）参照。ｋｏｆｆ／ｋｏｎの割合は、親和性に関係しない全てのパラメータの除外（ｃａｎｃｅｌｌａｔｉｏｎ）を可能にし、そして解離定数Ｋｄに等しい。（一般に、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９：４３９−４７３を参照）。放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー結合アッセイ、または当業者に周知の類似のアッセイなどのアッセイにより測定された場合、平衡結合定数（Ｋｄ）が、≦１μＭであり、好ましくは、≦１００ｎＭであり、さらに好ましくは≦１０ｎＭであり、もっとも好ましくは≦１００ｐＭから約１ｐＭである場合に、本発明の抗体は、ＣＤ４７に特異的に結合すると言われる。
【００８０】
本明細書に使用されるような用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起点またはいくつかのそれらの組み合わせのポリヌクレオチドを意味するべきであり、その起源に由来して、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）天然に「単離されたポリヌクレオチド」が見られるポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）せず、（２）天然にそれと連結（ｌｉｎｋ）しないポリヌクレオチドに機能可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結し、または、（３）より長い配列の部分として天然に生じない。
【００８１】
本明細書で参照される用語「単離されたタンパク質」は、本願においては、ｃＤＮＡ、組み換えＲＮＡ、または合成起点またはいくつかのそれらの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源または派生の源に由来して、「単離されたタンパク質」は、（１）天然に見られるタンパク質と結合しない、（２）同一のソースからの他のタンパク質を含んでいない（例えば、海洋タンパク質を含んでいない）、（３）異なる種からの細胞により発現される、または、（４）天然に生じない。
【００８２】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、フラグメント、またはアナログを指す一般的な用語として使用される。従って、天然のタンパク質のフラグメントおよびアナログはポリペプチド属の種（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｅｎｕｓ）である。
【００８３】
本明細書において対象物に適用される用語「天然に存在する」は、対象物が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に改変されていないか、または天然に存在する生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列である。
【００８４】
本明細書で使用される「機能可能に連結された」という用語は、そのように記載された成分の位置が、それらが意図された態様で機能することを可能にする関係にあることを指す。コード配列に「機能可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【００８５】
本明細書に使用されるような用語「制御配列」は、それらが結合される、コード配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は原核生物の宿主生命体に依存して異なり、その様な制御配列は、一般的にプロモーター、リボソーム結合部位および真核生物の転写終結配列を含み、一般的に、その様な制御配列は、プロモーター、および転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現およびプロセシングに必須である全ての要素を含むことを意図し、そしてまた、その存在が有利である追加の要素、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列（ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むことができる。用語「ポリヌクレオチド」は、本願で言及される場合、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドの重合ホウ素（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂｏｒｏｎ）、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、または、ヌクレオチドのどちらかのタイプの修飾された形態を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を含む。
【００８６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本願において、天然に生じるヌクレオチドおよび、天然に生じおよび非天然に生じるオリゴヌクレオチド連結によってお互いに連結される、修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般的に２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さ１０から６０塩基であり、もっとも好ましくは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０から４０塩基である。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、例えばプローブでは一本鎖であるが、例えば、遺伝子変異体の構築における使用では、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってよい。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのどちらかのオリゴヌクレオチドである。
【００８７】
本明細書に引用される用語「天然に生じるヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書に引用される用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾されたまたは置換された糖類などを有するヌクレオチドを含む。本明細書に引用される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、フォスフォロチオアート、フォスフォロジチオアート、フォスフォロセレロアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｒｌｏａｔｅ）、フォスフォロジセレノアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｓｅｌｅｎｏａｔｅ）、フォスフォロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、フォスホラニラダート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、フォスフォロニミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｎｍｉｄａｔｅ）等などのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば以下を参照。  ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），  Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），  Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｐｐ．  ８７−１０８（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，１５１，５１０；Ｕｈｌｍａｎｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３（１９９０）オリゴヌクレオチドは、所望の場合、検出のためのラベルを含むことができる。
【００８８】
用語「選択的にハイブリダイズする（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」は、検出可能にかつ特異的に結合することを指す。本発明に関するポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらのフラグメントは、ハイブリダイゼーションおよび非特異的な核酸への検出可能な結合のかなりの量を最小化する洗浄条件下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件（ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）は、その技術分野において周知であり、そして本願で検討されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用され得る。一般的に、本明細書に開示される、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびフラグメントと、目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であろうし、より典型的には、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の好ましく増加した相同性を有するだろう。２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間で部分的なまたは完全な一致がある場合に、相同である。例えば、８５％の相同は、２つの配列がもっとも一致して整列した場合に、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。一致するギャップ長を最大化する際に（２つの配列のいずれかに一致する）ギャップが許容され、５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、好ましくは、２つのタンパク質配列（または、それらに由来する、少なくとも３０アミノ酸長のポリペプチド配列）が、変異体データマトリクスおよび６以上のギャップペナルティを使用するＡＬＩＧＮプログラムを使用して、（標準偏差ユニットにおいて）５より大きい整列スコアを有している場合、この用語が本明細書で使用される通り、２つのタンパク質配列（または、少なくとも３０アミノ酸の長さのそれら由来のポリペプチド配列）は相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｐｐ．  １０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））および  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２  ｔｏ  ｔｈｉｓ  ｖｏｌｕｍｅ，  ｐｐ．  １−１０を参照。ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列させたとき、それらのアミノ酸が５０％以上同一である場合に、２つの配列またはその部分はより好ましく相同である。語「に対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分に相同（すなわち、同一であり、厳密に進化的に関連しない）であるという意味で使用され、または、ポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であるという意味で使用される。対照的に、用語「と相補的である」は、本願において、相補的な配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部分に相同であるという意味で使用される。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」と対応し、そして、参照配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。
【００８９】
次の用語は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列関連性を記載するのに用いられる：「参照配列」、「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列比較のための基礎として用いられる定義された配列であり、参照配列は、例えば全長のｃＤＮＡのセグメントまたは配列表にある遺伝子配列のセグメントのような、より大きな配列のサブセットでありえ、または、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含むことができる。一般的に、参照配列は、少なくとも１８ヌクレオチドまたは６アミノ酸長であり、しばしば、少なくとも２４ヌクレオチドまたは８アミノ酸長であり、そして多くの場合、少なくとも４８ヌクレオチドまたは１６アミノ酸長である。２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、それぞれ、（１）２つの分子の間で類似である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部分）を含んでもよく、および（２）２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で相違する（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）配列を更に含んでもよく、２つ（またはそれ以上）の分子の間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つの分子の配列を比較することにより行われ、そして配列類似性の局所領域（ｌｏｃａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）を同定および比較する。「比較ウィンドウ」は、本明細書に使用されるように、少なくとも１８の隣接したヌクレオチド位置または６アミノ酸の概念セグメント（ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ）を意味し、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも１８の隣接したヌクレオチドまたは６アミノ酸配列の参照配列と比較することができ、そして、比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメント（ないし整列、ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）のための参照配列（これは、付加または削除を含まない）と比較して２０パーセント以下の付加、削除、置換など（すなわちギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３（１９７０）のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８５：２４４４（１９８８）の類似法に関する検索により、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ、またはＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅｓ）により、または、検査により行われてもよく、様々な方法により生成されたもっとも良いアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたり、相同性の最も高いパーセンテージをもたらす）が選択される。
【００９０】
用語「配列同一性」は、比較ウィンドウにわたって２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドまたは残基と残基基準で）同一であることを意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、両方の配列において、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基が生ずる位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわちウィンドウの大きさ）で割り、そして結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。本明細書に使用される用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には少なくとも２４−４８ヌクレオチド（８−１６アミノ酸）位置のウィンドウにわたって、参照配列と比較した場合、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０から９５パーセントの配列同一性、より通常には、少なくとも９９パーセント配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって、参照配列を、参照配列の総計２０パーセント以下の欠損または付加を含み得る配列と比較することにより計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。
【００９１】
本明細書に使用されるように、２０の従来型のアミノ酸およびその省略表記は、従来型の用途に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅ．Ｓ．  Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．  Ｇｒｅｎ，  Ｅｄｓ．，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  ７  Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照。２０の従来型のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−、α−２基置換のアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型のアミノ酸などの非天然のアミノ酸はまた、本明細書に開示されるポリペプチドにとって適切な要素であり得る。非従来型アミノ酸の例は以下を含む。４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−フォスフォセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−フォルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書に使用されるポリペプチド表記では、標準的な用法および慣習に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、そして右側方向は、カルボキシ末端方向である。
【００９２】
同様に、もし他の方法で規定されなかったならば、単鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５’末端であり、二重鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’付加の方向は、ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’末端から５’末端にあるＤＮＡ鎖上の転写方向配列領域を指し、「上流配列」と称され、ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’側であるＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と称される。
【００９３】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な同一性」は、既定のギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔｓ）を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどして最適に整列させた場合、２つのペプチド配列は、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは、少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％配列同一性、およびもっとも好ましくは、少なくとも９９％配列同一性を共有することを意味する。
【００９４】
好ましくは、同一でない残基位置は、保存的なアミノ酸置換により異なる。
【００９５】
保存的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群はグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；脂肪族のヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリンとトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンとグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン、アルギニンおよびヒスチジンである；および、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインとメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニンバリン、グルタミン−アスパラギン、およびアスパラギン−グルタミン、である。
【００９６】
本明細書に議論されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかなバリエーションは、本願発明により包含されることが検討され、アミノ酸配列におけるバリエーションが、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、およびもっとも好ましくは９９％を維持することを提供する。保存的なアミノ酸置換が考えられる。保存的な置換は、アミノ酸の側鎖に関するアミノ酸ファミリー内で行われるものである。遺伝学的にコード化されたアミノ酸は、（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸である、リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸であるアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性アミノ酸であるグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、のファミリーに分けられる。親水性のアミノ酸はアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リジン、セリンおよびトレオニンを含んでいる。疎水性アミノ酸はアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンを含んでいる。アミノ酸の他のファミリーは、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；および（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを含む。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの分離した置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での分離した置換、スレオニンのセリンでの分離した置換、または、アミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での類似の置換は、特に、置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、結果の分子の結合または性質における主要な効果を有さないだろうことを期待することが妥当である。アミノ酸変更が機能的なペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的な活性をアッセイすることにより容易く決定され得る。アッセイは詳細に本明細書に記述される。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたはアナログは、当業者により容易く調製され得る。好ましいフラグメントまたはアナログのアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的なドメインの隣接の境界に生じる。構造的なおよび機能的なドメインは、公開のまたは自己の（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配列データベースとヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データの比較により同定され得る。好ましくは、コンピュータ化された比較方法が、既知の構造および／または機能を有する他のタンパク質で生じる配列モチーフまたは予想されるタンパク質コンフォメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ドメインを同定するのに使用される。既知の３次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定する方法が知られている。Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１）。従って、前述の例は、当業者が���本発明に一致する構造的なおよび機能的なドメインを定義するのに使用され得る配列モチーフおよび構造的なコンフォメーションを認識できることを表す。
【００９７】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解への感受性を減少させる、（２）酸化への感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および、（４）そのようなアナログの他の物理化学的なまたは機能的な性質を授与するまたは修正するものである。アナログは、天然に生ずるペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含むことができる。例えば、単一のまたは多重のアミノ酸置換（好ましくは保存的なアミノ酸置換）は、天然に生じる配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（１または複数）の外側のポリペプチドの部分において）行われ得る。保存的なアミノ酸置換は、親である配列の構造的な特徴を実質的に変化させるべきではない（例えば、アミノ酸置換は、親の配列において生ずるヘリックスを壊す傾向であるべきではなく、または、親の配列を特徴付ける二次構造の他のタイプを破壊する傾向であるべきではない）。技術分野で認識されるポリペプチドの二次構造または三次構造の例は、以下に記載される。（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｅｄ．，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．  Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｔｏｏｚｅ，  ｅｄｓ．，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ（１９９１））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５（１９９１）。
【００９８】
本明細書に使用されるような用語「ポリペプチドフラグメント」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠損を有するポリペプチドを指すが、残余のアミノ酸配列は、例えば、全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に生ずる配列における対応する位置と同一である。フラグメントは典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長であり、好ましくは、少なくとも１４アミノ酸長、さらに好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、通常は、少なくとも５０アミノ酸長であり、そしてさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書に使用されるような用語「アナログ」は、推定されるアミノ酸配列の一部分に実質的な同一性を有し、および適切な結合条件下でＣＤ４７に特異的な結合を有する、少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドアナログは、天然に生じる配列に対する保存的なアミノ酸置換（または付加若しくは削除）を含む。アナログは典型的には、少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長またはそれ以上、であり、そして、多くの場合、全長の天然に生じるポリペプチドと同じくらいの長さであり得る。
【００９９】
ペプチドアナログは、鋳型ペプチドの性質と類似した性質を有する非ペプチド薬として製薬業界において一般的に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド模倣剤」または「ペプチド模倣薬」と名付けられる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ（Ｊ．Ａｄｖ）。Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６），  Ｖｅｂｅｒ  ＆  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；ａｎｄ  Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３０：１２２９（１９８７）．そのような化合物は、通常、コンピュータ化された分子モデリングを用いて開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似のペプチド模倣剤は、同等の治療的な効果または予防効果を生じさせるために使用され得る。一般的に、ペプチド模倣剤は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（ｐａｒａｄｉｇｍ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）（すなわち、生化学的な性質または医薬的な活性を有するポリペプチド）に構造的に類似し、当該技術分野で周知の方法により、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨ２ＳＯ−−から成る群より選択される連結により随意に置換された１つ以上のペプチド連結を有する。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりのＤ−リシン）での体系的な置換は、より安定なペプチドを生じさせるのに使用され得る。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一であるコンセンサス配列バリエーションを含む拘束された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドは、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内在システイン残基を付加することによってなど、当該技術分野で知られた方法によって生成されうる（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：３８７（１９９２））。
【０１００】
用語「薬剤」は化合物、化合物の混合物、生物学的なマクロ分子、または生物学的な材料から作られる抽出物を指すために本明細書で使用される。
【０１０１】
本明細書に使用されるように、用語「ラベル」または「ラベルされた」は、例えば、放射線ラベルされたアミノ酸の取り込み、または、印のあるアビジン（例えば、蛍光マーカーまたは光学的な方法もしくは熱量測定法により検出され得る酵素学的な活性を含むストレプトアビジン）により検出され得るビオチニル部分（ｂｉｏｔｉｎｙｌ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）のポリペプチドへの取り付けによる、検出可能なマーカーの取り込みを指す。ある状況で、ラベルまたはマーカーはまた治療的でありうる。ポリペプチドと糖タンパク質にラベルを付ける様々な方法は、当該技術中で周知であり、使用されてもよい。ポリペプチドのためのラベルの例は限定されないが、下記を含んでいる：放射線同位体または放射線核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光ラベル（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体（ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｓ））、酵素ラベル（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル群（ｂｉｏｔｉｎｙｌ  ｇｒｏｕｐｓ）、二次レポーターにより認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に関する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態では、ラベルは潜在的立体障害を低減するために様々な長さのスペーサー腕（ｓｐａｃｅｒ  ａｒｍ）によって付けられる。本明細書に使用されるような用語「医薬的な薬剤または薬物」は、患者に適切に投与される場合、所望の治療的な効果を含むことができる化合物または組成物を意味する。
【０１０２】
用語「抗腫瘍剤」は、本明細書において、ヒトにおける腫瘍（例えば癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病のような）特に悪性（癌の）病変の発達ないし進行を阻害する機能的な性質を有する薬剤を指すために使用される。転移の阻害はしばしば、抗腫瘍剤の性質である。
【０１０３】
本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．，  Ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））により例示されるように、その技術分野の従来型の用途に従って用いられる。
【０１０４】
本明細書に使用されるように、「実質的に純粋な」とは、対象の種が優勢な種である（すなわち、モル基準（ｍｏｌａｒ  ｂａｓｉｓ）で、組成物中において他の個々の種よりも豊富である）こと、および、好ましくは、実質的に精製された分画は、目的の種は、全てのマクロ分子種の（モル基準で）少なくとも約５０パーセントを含む組成物であることを意味する。
【０１０５】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中にある全てのマクロ分子種の約８０パーセントを上回り、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％を上回って含むだろう。最も好ましくは、対象の種は、本質的な等質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）（混入種が、従来型の検出方法により組成物中に検出されない）を有するように精製され、組成物は、本質的に、単一のマクロ分子種からなる。
【０１０６】
ＣＤ４７抗体
本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、ＣＤ４７に結合し、ＣＤ４７へのＳＩＲＰαの結合を阻害し、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα媒介シグナル伝達を減少させ、食作用を促進し、および、腫瘍成長および／または転移を阻害する能力を有する。例えば、実施例において本願に記載される細胞アッセイを用いて阻害は決定される。
【０１０７】
本明細書で開示された例示的な抗体は２Ａ１抗体、２Ａ１のキメラバージョン、および２Ａ１のヒト化変異体を含んでいる。本明細書で開示された例示的な抗体は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０から選択される可変重（ＶＨ）鎖を有し、および、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７から選択される可変軽（ＶＬ）鎖を有する抗体を含む。具体的には、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される表１に提供されたものを含んでいる。
【０１０８】
また、本明細書に記述したＣＤ４７抗体と同じエピトープに結合する抗体が本発明に含まれている。例えば、本明細書に開示される抗体は、ヒトＣＤ４７（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ０８７２２．１参照）上の１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
【０１０９】
例示的なヒトＣＤ４７のアミノ酸配列は、以下に提供され（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｑ０８７２２．１（ＧＩ：１１７１８７９）、参照により本明細書に組み込まれる）。シグナル配列（アミノ酸１〜１８）は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８に関して下線が引かれている。
【０１１０】
分かりやすくするために、シグナル配列を除く例示的なヒトＣＤ４７のアミノ酸配列は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７として提供される。
【０１１１】
ＣＤ４７−ＩｇＶドメインを除く例示的なヒトＣＤ４７のアミノ酸配列は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されているように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９として提供される。本明細書で開示された例示的なモノクローナル抗体は、例えば、下記の配列に示される可変重鎖領域（ＶＨ）および／または可変軽鎖（ＶＬ）領域を有するヒト化抗体を含む。
【０１１２】
ＣＤ４７抗体の可変重鎖（ＶＨ）領域を以下に示す。ＣＤ４７抗体のＶＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、下で強調される（ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ）。いくつかの実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＧＦＮＩＫＤＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：５０）、ＧＹＴＦＴＹＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、ＧＦＴＦＴＹＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、ＧＹＮＦＴＹＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、ＧＹＴＩＴＹＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、ＧＹＴＦＫＹＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、ＧＹＴＦＴＤＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ＧＦＴＦＴＤＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、ＧＦＴＩＴＤＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ＧＹＴＦＫＤＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）またはＧＦＴＦＫＤＹＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）である。いくつかの実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＷＩＤＰＤＮＧＤＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）、ＷＩＤＰＤＱＧＤＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）、ＷＩＤＰＤＹＧＤＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、ＷＩＤＰＤＳＧＤＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、ＷＩＤＰＤＮＡＤＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）またはＷＩＤＰＤＮＴＤＴＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）である。いくつかの実施形態では、ＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＮＡＡＹＧＳＳＳＹＰＭＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）またはＮＡＡＹＧＳＳＰＹＰＭＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）であり、−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【０１１３】
ＣＤ４７抗体の可変軽鎖（ＶＬ）領域を以下に示す。ＣＤ４７抗体のＶＬ鎖のＣＤＲは下に強調される。いくつかの実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、ＫＡＳＱＤＩＨＲＹＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）、ＲＡＳＱＤＩＨＲＹＬＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）またはＲＡＲＱＧＩＨＲＹＬＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）である。いくつかの実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、ＲＡＮＲＬＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＲＡＮＲＬＱＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）、ＲＡＮＲＲＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）またはＲＡＮＲＬＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）である。いくつかの実施形態では、ＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＬＱＹＤＥＦＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）であり、−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【０１１４】
いくつかの場合には、本明細書に記載のＣＤ４７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０から選択される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７から選択される可変軽鎖領域を含む。例示的なＣＤ４７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５��示される可変軽鎖領域を含み、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７に示される可変重鎖領域およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５に示される可変軽鎖領域を含み、−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【０１１５】
本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７に提供されるＶＬ領域のいずれか１つと対になる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０に提供されるＶＨ領域のいずれか１つを含む。本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−３９、４２、４３、４４および４７に提供されるＶＬ領域のいずれか１つと対になる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、７、８、１１、１５−１７、２０−２２に提供されるＶＨ領域のいずれか１つを含み、−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【０１１６】
本明細書に記述されるＣＤ４７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、で提供されるＶＨ  ＣＤＲ１領域のうちのいずれか１つを含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、で提供されるＶＨ  ＣＤＲ２領域のうちのいずれか１つを含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、で提供されるＶＨ  ＣＤＲ３領域のうちのいずれか１つを含み：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：で提供されるＶＬ  ＣＤＲ１領域のうちのいずれか１つを含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、で提供されるＶＬ  ＣＤＲ２領域のうちのいずれか１つを含み、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５で提供されるＶＬ  ＣＤＲ３領域を含む。−すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるとおりのものである。
【０１１７】
当業者であれば、過度の実験をすることなく、モノクローナル抗体が本明細書に開示されるモノクローナル抗体（例えば、２Ａ１抗体、または米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３１から選択される可変重鎖と、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７から選択される可変軽鎖と、を有する抗体）と同じ特異性を有するかどうかを、後者がＣＤ４７に結合するのを前者が妨げるかどうかを確かめることによって、判定することができることを認識するだろう。本明細書に開示されるモノクローナル抗体による結合の減少によって表されるように、試験されるモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、２つのモノクローナル抗体は、同一のまたは密接に関連するエピトープに結合する。
【０１１８】
モノクローナル抗体が、本明細書に開示されるモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するための代わりの方法は、本明細書に開示されるモノクローナル抗体を、（本発明のモノクローナル抗体と正常に反応する）可溶性ＣＤ４７タンパク質と共に前インキュベート（ｐｒｅ−ｉｎｃｕｂａｔｅ）し、そして、試験されるモノクローナル抗体を添加して、試験されるモノクローナル抗体がそのＣＤ４７に結合する能力において阻害されるかどうかを判定することである。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合には、おそらく、本明細書に開示されるモノクローナル抗体と同一または機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
【０１１９】
本発明の抗体
本発明のモノクローナル抗体のスクリーニングは、例えば、ＣＤ４７媒介性シグナル伝達および／またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα媒介性シグナル伝達を測定すること、および、試験モノクローナル抗体がＣＤ４７媒介性シグナル伝達および／またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα媒介性シグナル伝達を、調節、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉できるか否かを決定すること、によっても実行され得る。これらのアッセイは競合的結合アッセイを含むことができる。さらに、さらに、これらのアッセイは、生物学的読出情報（ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅａｄｏｕｔ）、例えば、実施例９（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図９）に記載されるように、マクロファージによるＣＤ４７発現細胞の食作用を促進する能力、を測定することができる。
【０１２０】
ＣＤ４７、または、その誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログまたはオーソログに対するモノクローナル抗体の生成のために、本発明の技術分野において公知の種々の手法が使用され得る（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  Ｄ，  １９８８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，を参照。これは参照によって本明細書に組み込まれる）。完全なヒト抗体は抗体分子であり、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体配列がヒト遺伝子に由来する。そのような抗体は「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と本明細書に命名される。ヒトモノクローナル抗体は下に提供された例に述べられていた手術を使用して、例えば準備されている。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのトリオーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２を参照）；およびＥＢＶハイブリドーマ技法を使用することによっても調製され得る（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５  Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６を参照）。ヒトモノクローナル抗体が利用され得るし、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０を参照）、またはインビトロにおいてヒトＢ細胞をエプスタイン・バーウイルスで形質転換することによって生成され得る（Ｃｏｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５  Ｉｎ：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６を参照）。
【０１２１】
抗体は、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの、周知技術によって精製され、これは主に免疫血清のＩｇＧ分画を提供する。その後、またはその代わりに、探索される免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープをカラムに固定して、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって免疫特異的抗体が精製され得る。免疫グロブリンの精製は、例えＤ．  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．，  Ｖｏｌ．  １４，  Ｎｏ．  ８（Ａｐｒ．  １７，  ２０００），  ｐｐ．  ２５−２８）によって議論されている。
【０１２２】
本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、モノクローナル抗体である。ＣＤ４７媒介性細胞シグナリングおよび／またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα媒介性細胞シグナリングを調節、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和または干渉するモノクローナル抗体は、例えば、ヒトＣＤ４７または免疫原性のフラグメント、誘導体またはその変異体などの膜結合型ＣＤ４７および／または可溶性ＣＤ４７で動物を免疫化することにより、生成される。あるいは、ＣＤ４７を発現して形質導入された細胞の表面に出現させるようにＣＤ４７をコードする核酸分子を含むベクターで形質導入された細胞を用いて動物は免疫化される。あるいは、抗体は、ＣＤ４７に結合するための抗体または抗原結合ドメイン配列を含むライブラリをスクリーニングすることによって取得される。このライブラリは、例えば、バクテリオファージにおいて、集合した（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）ファージ粒子の表面上に発現するバクテリオファージコートタンパク質に対するタンパク質融合物またはペプチド融合物として、そしてファージ粒子内に含まれるコードＤＮＡ配列（すなわち、「ファージディスプレイライブラリ」）として調製される。骨髄腫／Ｂ細胞の融合に由来するハイブリドーマは、次にＣＤ４７への反応性に関してスクリーニングされる。
【０１２３】
モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）などに記載されるようなハイブリドーマ技法を使用して調製される。ハイブリドーマ技法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物は、典型的には免疫剤で免疫化されて、免疫剤に対して特異的に結合するであろう抗体を産生するか、または該抗体を産生することが可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化されうる。
【０１２４】
免疫剤は典型的にはタンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含むだろう。一般的には、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血液リンパ球が使用されるか、ヒト以外の哺乳類のソースが望まれる場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次に、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用してリンパ球を不死化細胞系統と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）  ｐｐ．  ５９−１０３）。不死化細胞系統は、通常、形質転換哺乳類細胞であり、特にげっ歯類、ウシおよびヒト由来の細胞の骨髄腫である。通常、ネズミまたはマウスの骨髄腫細胞系統が採用される。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含むことが好ましい、適切な培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合には、ハイブリドーマのための培養液は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げるだろう。
【０１２５】
本明細書で開示された不死化細胞系は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定で高レベルの発現を支持し、かつＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である。より好ましい不死化細胞系統はネズミ骨髄腫系統であり、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａから取得され得る。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統も、モノクローナル抗体の産生に関する記載がある。Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）  ｐｐ．５１−６３）を参照。
【０１２６】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養液は、次いで抗原に対するモノクローナル抗体の存在に関してアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が免疫沈降アッセイまたはインビトロ結合アッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって判定される。そのような技術およびアッセイは、本発明の技術分野において知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０７：２２０（１９８０）のスキャチャード解析によって判定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療上の適用において、標的抗原に関する高度な特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは重要である。
【０１２７】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後に、クローンは限界希釈法によってサブクローニングされ、標準的な方法によって成長させられる。Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）  ｐｐ．  ５９−１０３を参照。この目的のための適切な培養液は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳類の腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）としてインビボで成長させられ得る。
【０１２８】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製法によって培養液または腹水流動体から単離または精製され得る。
【０１２９】
モノクローナル抗体は、米国特許出願４，８１６，５６７号に記載される方法などの組み換えＤＮＡ法によって作製され得る。本明細書に開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手法を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離およびシーケンスされ得る。本明細書で開示されるハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい入手元としての役割を果たす。一度単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに入れることができ、次に発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、サルＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、または骨髄腫細胞などの宿主細胞あるいは他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞に形質導入して、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成物が得られる。例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換すること（米国特許４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，  ８１２−１３（１９９４）を参照）、または、免疫グロブリンをコードする配列の全部または一部を非免疫グロブリンポリペプチド共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾することもできる。本明細書で開示される抗体の定常ドメインは、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで置換され得るし、または本明細書で開示される抗体の１つの抗原組み合わせ部位の可変ドメインを置換してキメラ型二価抗体が作製され得る。
【０１３０】
ヒト抗体および抗体のヒト化
本明細書で開示されたモノクローナル抗体は完全ヒト化抗体またはヒト化抗体を含む。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引き起こすことなく、ヒトに投与するのに適している。
【０１３１】
ＣＤ４７抗体は、例えば、以下に提供される実施例に記載される手順を使用して生成される。例えば、本明細書中に開示されるＣＤ４７抗体は、マウスにおける修飾ＲＩＭＭＳ（反復免疫多重部位）（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｉｔｅｓ）免疫化戦略およびその後のハイブリドーマ生成を使用して同定される。
【０１３２】
他の代替方法では、ＣＤ４７抗体は、例えば、ヒト配列のみを含有する抗体を用いたファージディスプレイ法を用いて開発されている。そのようなアプローチは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９２／０１０４７および米国特許第６，５２１，４０４号において、当技術分野において周知である。このアプローチでは、軽鎖および重鎖のランダムな対を保有するファージのコンビナトリアルライブラリは、ｃｄ４７またはそのフラグメントの天然または組換えのソースを使用してスクリーニングされる。他のアプローチにおいて、ＣＤ４７抗体は、ヒトＣＤ４７タンパク質でトランスジェニック非ヒト動物を免疫化する１ステップを少なくとも含むプロセスによって生成することができる。この取り組みでは、この異種非ヒト動物の内因性重鎖および／またはカッパ軽鎖遺伝子座のいくつかは無能化されており、抗原に応答して免疫グロブリンをコードする遺伝子を生成するのに必要な再配列ができない。加えて、少なくとも１つのヒト重鎖遺伝子座および少なくとも１つのヒト軽鎖遺伝子座が、動物に安定的に形質導入されている。従って、投与された抗原に対する応答において、ヒト遺伝子座の再アレンジによって抗原に対して免疫特異的なヒト可変領域をコードする遺伝子が提供される。従って、免疫化の際に、ゼノマウスは完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産出する。
【０１３３】
異種非ヒト動物を作製するための種々の技術が当該分野で周知である。米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる。この一般的な戦略は、１９９４年に発表された最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）株の生成に関連して実証された。Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる。米国特許６，１６２，９６３号；第６，１５０，５８４号；第６，１１４，５９８号；第６，０７５，１８１号；および５，９３９，５９８および日本特許３０６８１８０Ｂ２、３０６８  ５０６Ｂ２および３０６８５０７Ｂ２および欧州特許ＥＰ０４６３１５１Ｂ１および国際特許出願  ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ００／７６３１０、および関連するファミリーメンバーも参照のこと。
【０１３４】
別のアプローチにおいて、他のものは、外因性Ｉｇ遺伝子座がＩｇ遺伝子座からの断片（個々の遺伝子）の包含を通して模倣される「ミニローカス」アプローチを利用してきた。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域および第２の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）が、動物の中への挿入のための構築物を形成される。例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号；第５，５９１，６６９号；第５，６１２，２０５号；第５，６２５，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６４３，７６３号；第５，６６１，０１６号；第５，７２１，３６７号；第５，７７０，４２９号；第５，７８９，２１５号；第５，７８９，６５０号；第５，８１４，３１８号；第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９号；第６，０２３，０１０号；および、第６，２５５，４５８号；ならびに、欧州特許０５４６７３０Ｂ１；および国際特許出願番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２およびＷＯ９８／２４８８４、および関連するファミリーメンバーを参照。
【０１３５】
マイクロセル融合を通して、大きな染色体片、または全染色体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成もまた証明されている。欧州特許出願７７３２８８および８４３９６１を参照。
【０１３６】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答により、業界はキメラ抗体またはそうでなければヒト化抗体を調製するようになった。キメラ抗体はヒト定常領域および免疫可変領域を有するが、特に抗体の慢性的利用またはマルチドーズ利用において、特定のヒト抗キメラ型抗体（ＨＡＣＡ）応答が観察されるであろうことが予想される。したがって、ＨＡＭＡまたはＨＡＣＡ応答の懸念および／または影響を無にするまたはそうでなければ軽減するために、ＣＤ４７に対する完全ヒト抗体を提供することが望ましいであろう。
【０１３７】
減少した免疫原性を有する抗体の生成は、ヒト化、キメラ化および適切なライブラリを使用するディスプレイ法を介しても達成される。マウス抗体または他の種由来の抗体を本発明の技術分野において公知の技術を使用してヒト化またはプリマタイズ（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）することができることが分かるだろう。Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４：４３  ４６（１９９３）  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｔ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２１２５−１６８（１９９２）を参照。対象の抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換するように組み換えＤＮＡ法によって遺伝子操作することができる（ＷＯ９２１０２１９０および米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７９２号；第  ５，７１４，３５０号；および第５，７７７，０８５号を参照）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用は当技術分野において公知である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄｓ．  Ｓｃｉｓ．  ８４：３４３９（１９８７）  ａｎｄ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３５２１（１９８７））。ｍＲＮＡは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを産生するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照）。あるいは、目的の配列を単離するためにライブラリが作製され、そしてスクリーニングされる。次に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をヒト定常領域配列に融合させる。ヒト定常領域の遺伝子の配列は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｎ．Ｉ．Ｈ．  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ９１−３２４２において見つけることができる。ヒトＣ領域の遺伝子は、既知のクローンから容易に利用可能である。アイソタイプの選択は、補体結合反応または抗体依存的細胞毒性における活性などの所望のエフェクター機能によってガイドされるだろう。好ましいアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４である。ヒト軽鎖定常領域（カッパまたはラムダ）の何れかが使用される。次に、キメラ型ヒト化抗体を従来の方法によって発現させる。  
【０１３８】
Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂなどの抗体フラグメントを、例えば、プロテアーゼまたは化学的切断による無処置のタンパク質の切断によって調製することができる。あるいは、切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの一部分をコードするキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含み、その後には、翻訳停止コドンが続き、切断した分子を産生する。
【０１３９】
Ｈ鎖およびＬ鎖のＪ領域のコンセンサス配列を使用してプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを設計して、その後のＶ領域セグメントとヒトＣ領域セグメントとの連結に有用な制限部位をＪ領域へ導入することができる。Ｃ領域ｃＤＮＡは、ヒト配列の類似の位置に制限部位を配置するために部位特異的突然変異誘発によって修飾することができる。
【０１４０】
発現ベクターはプラスミド、レトロウイルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ派生エピソームなどを含んでいる。便利なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリン配列をコードし、ＶＨまたはＶＬ配列のいずれかを容易に挿入かつ発現できるように遺伝子操作される適切な制限部位を有するものである。そのようなベクターでは、挿入されたＪ領域内のスプライスレセプター部位とヒトＣ領域の前方のスプライスアクセプター部位との間において通常スプライシングが生じ、そしてヒトＣＨエクソン内で生じるスプライス領域においてもスプライシングが生じる。ポリアデニル化および転写の終了が、コード領域の下流における天然の染色体部位で生じる。結果として生じるキメラ型抗体は、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、ＳＶ−４０初期（ｅａｒｌｙ）プロモーター）を含むいずれかの強力なプロモーターに結合することができる（Ｏｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．  ３：２８０（１９８３）），  Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ＬＴＲ（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ７９：６７７７（１９８２）），  および  ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ＬＴＲ（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  ４１：８８５（１９８５））。以下で分かるように、天然のＩｇプロモーターおよび同様のものも使用することができる。
【０１４１】
さらに、ヒト抗体または他の種由来の抗体は、ファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および他の技術（これらに限定されない）を含むディスプレイ型技術を介して、本発明の技術分野において良く知られた技術を使用して生成することができ、結果として生じる分子を親和性成熟などの追加の成熟化に供することができ、そのような技術は当該技術分野において良く知られている。Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５−１６８（１９９２），  Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｉｉｃｋｔｈｕｎ  ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７）（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｐｌａｙ），  Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ），  Ｓｃｏｔｔ，  ＴＩＢＳ，  ｖｏｌ．  １７：２４１−２４５（１９９２），  Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２（１９９０），  Ｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１０８１−１０８５（１９９３），  Ｈｏｇａｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３０：４３−６８（１９９２），  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  ａｎｄ  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ；１０：８０−８Ａ（１９９２）、および米国特許第５，７３３，７４３号。ディスプレイ技術をヒトでない抗体を生成するために利用する場合には、そのような抗体を上述のようにヒト化することもできる。
【０１４２】
これらの技術を使用して、ＣＤ４７発現細胞、可溶性の形状のＣＤ４７、それらのエピトープまたはペプチドおよびそれらに対する発現ライブラリ（例えば米国特許５，７０３，０５７号参照）に対する抗体を生成することができ、その後に本願に記載の活性について上述のようにスクリーニングすることができる。
【０１４３】
本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、上記の１本鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターによって発現することができる。
【０１４４】
これらは、ベクター、リポソーム、ネイキッドＤＮＡ、アジュバント−支援型ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含むことができる。ベクターは、標的化部分（ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、細胞の表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えば  ポリリシン）を含むＷＯ９３／６４７０１などに記載した化学コンジュゲート、ウイルスベクター（例えば  ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスベクター）、ターゲット部分および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質（例えば、ターゲット細胞に特異的な抗体）であるＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（ＷＯ９５／２２６１８）に記載したような融合タンパク質、プラスミド、ファージなどである。ベクターは、染色体、非染色体または合成のものであり得る。
【０１４５】
本明細書に開示されるベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学的コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。ＤＮＡウイルスベクターが好ましい。これらのベクターには、オルソポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクターなどのヘルペスウイルスベクターが含まれる（Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，  ６４：４８７（１９９５）；Ｌｉｍ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ）（１９９５）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．：Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：７６０３（１９９３）；Ｇｅｌｌｅｒ，  Ａ．  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１１４９（１９９０），  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｓｅｅ  ＬｅＧａｌ  ＬａＳａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５９：９８８（１９９３）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９（１９９３）；Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６９：２００４（１９９５）およびＡｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｓｅｅ  Ｋａｐｌｉｔｔ，  Ｍ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：１４８（１９９４）を参照。
【０１４６】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞質へ導入する。アビポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）ベクターが、神経細胞へ核酸を導入することに好ましい。アデノウイルスベクターは、結果的にアデノ随伴ウイルス（約４ヶ月間）よりも短期間で発現（約２ヶ月間）し、これはＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存するであろう。導入は標準的技術、例えば、感染、形質導入、トランスダクションまたはトランスフォーメーション、によって実行することができる。遺伝子導入の様式の例には、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＣａＰＯ  ４沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが含まれる。
【０１４７】
ベクターは、実質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために使用され得る。例えば、定位注射を使用して、ベクター（例えば、アデノウイルス、ＨＳＶ）を所望の位置に向かわせることができる。さらに、粒子は、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍなどのミニポンプ注入システムを用いた脳室内（ｉ．ｃ．）注入によって送達することができる。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法はまた、脳の広い領域に大きな分子を送達するのに効果的であることが証明されており、標的細胞にベクターを送達するのに有用であり得る。Ｂｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６６：２９２−３０５（１９９４）を参照。使用することができる他の方法はカテーテル、静脈内、腸管外、腹腔内および皮下注射、および経口または他の既知の投与ルートを含む。
【０１４８】
これらのベクターは、様々な方法で使用することができる大量の抗体を発現するために使用することができる。例えばサンプルのＣＤ４７の存在を発見することに使用することができる。抗体はまた、ＣＤ４７および／またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用ならびにＣＤ４７／ＳＩＲＰα媒介シグナル伝達に結合してそれらを破壊することを試みるためにも使用され得る。
【０１４９】
本明細書に開示される抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に、技術を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。加えて、タンパク質、それらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログの所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速でかつ有効な同定を可能にするように、Ｆａｂ発現ライブラリの構築に方法を適用することができる（例えば、Ｈｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１参照）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、（ｉ）  抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）  パパインおよび還元剤を用いた抗体分子の処理によって生成されるＦａｂフラグメントおよび（ｉｖ）Ｆｖフラグメント、を含むが、これらに限定されない本発明の技術分野において周知の技術によって生成することができる。
【０１５０】
本発明は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２ＣＤ４７フラグメント、単鎖ＣＤ４７抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディまたはＶＨＨｓ）、二重特異性ＣＤ４７抗体、およびヘテロコンジュゲートＣＤ４７抗体も含む。
【０１５１】
二重特異性の抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に結合特異性を有する抗体である。本発明の場合には、結合特異性の１つはＣＤ４７についてのものである。第２の結合ターゲットは、任意の他の抗原であり、有利には、細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１５２】
二重特異性抗体を作製するための方法は当該分野で公知である。従来は、二重特異性の抗体の組み換え生成は、免疫グロブリン重鎖／軽鎖の２つのペアの共発現に基づき、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな種別（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、１つのみが正しい二重特異性の構造を有する。正確な分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。類似の手法は１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：３６５５−３６５９（１９９１）  に開示されている。
【０１５３】
所望の結合特異性（抗体抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも１つの融合に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡｓ、および所望するならば免疫グロブリン軽鎖は、個別の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生命体へ共形質導入される。二重特異性の抗体の生成の更なる詳細は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１５４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載の他のアプローチによれば、１つのペアの抗体分子の間の界面は、組み換え細胞培養液から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にするように遺伝子操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖と同一または類似のサイズの代償的「キャビティ」が第二の抗体分子の界面に作り出される。このことは、ホモ二量体などの他の不所望の最終製造物を上回るようにヘテロ二量体の産出量を増加させるメカニズムを提供する。
【０１５５】
二重特異性の抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成するための技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学結合を使用して調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、無処置の抗体をタンパク分解的に開裂してＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手法を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯体化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近隣のジチオールを安定させて、分子間のジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体へ転換される。次いで、１つのＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体を、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換し、そして等モル量の他のＦａｂ’  −ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性の抗体は、酵素の選択的な固定のための薬剤として使用され得る。
【０１５６】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．コリから直接的に回収され得るし、化学的にカップル化されて二重特異性の抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：２１７−２２５（１９９２）は完全ヒト化二重特異性の抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を開示する。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するようにインビトロで指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）化学カップリングに供された。従って、形成された二重特異性の抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞およびノーマルヒトＴ細胞に結合することができ、そして、ヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞毒性のリンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１５７】
組み換え細胞培養液から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製および単離することに関する種々の技術も記載されてきた。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分が連結された。抗体ホモ二量体は、モノマーを形成するようにヒンジ領域において還元され、そして次に抗体ヘテロ二量体を形成するように再び酸化される。この方法は抗体ホモ二量体の製造にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製する代わりのメカニズムを提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬドメインおよびＶＨドメインと対合することを強いられ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５３６８（１９９４）を参照。
【０１５８】
２つを上回る結合価を有する抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０（１９９１）。
【０１５９】
例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも１つは、本明細書に開示されるタンパク質抗原に由来する。あるいは、免疫グロブリン分子の抗抗原性（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｇｅｎｉｃ）のアームは、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞の防御メカニズムに焦点を当てるようにＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、またはＢ７）またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧに関するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）のような白血球上のトリガー分子に対して結合するアームと組み合わせられ得る。二重特異性の抗体も、細胞毒性の薬剤を特定の抗原を発現する細胞に対して指向させるために使用され得る。これらの抗体は、抗原結合性アームおよびＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡなどの細胞毒性剤または放射性核種キレート剤を結合するアームを有する。目的の他の二重特異性の抗体は、本明細書に記載のタンパク質抗原を結合し、そして更に組織因子（ＴＦ）を結合する。
【０１６０】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本明細書に開示される範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合抗体からなる。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号を参照）、およびＨＩＶ感染の処置のために提案されている（ＷＯ９１／００３６０；  ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９参照）。抗体は、架橋剤を含むものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製することができると考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、例えば、米国特許４，６７６，９８０号に開示されたものを含む。
【０１６１】
本明細書に開示される抗体を修飾することは、例えば、異常なＣＤ４７シグナル伝達に関連する疾患および障害の治療における抗体の有効性を高めるように、エフェクター機能に関して可能である。例えば、システイン残留物をＦｃ領域へ導入することができ、それによって、この領域における鎖間のジスルフィド結合構成を可能にする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増加した補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，  １７６：１１９１−１１９５（１９９２）；Ｓｈｏｐｅｓ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、それによって補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強することができる抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照。
【０１６２】
本明細書に開示される免疫複合体は、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性なトキシン、またはそれらのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞毒性の薬剤にコンジュゲートされた抗体を含むものを含む。
【０１６３】
使用され得る酵素的に活性なトキシンおよびそのフラグメントは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。放射性コンジュゲート抗体の製造には様々な放射性核種が利用可能である。例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを含む。
【０１６４】
抗体および細胞毒性剤のコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレーン（ＩＴ）、イミドエステルの二重機能誘導体（ジメチルアジピミダートＨＣＬなど）、活性エステル（ジサクシニミジルスベラートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、および二重活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの多種多様な二重機能タンパク質−カップリング剤を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素１４標識の１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジオヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のコンジュゲーションのためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。
【０１６５】
当業者は、多種多様な可能性のある部分が、本明細書に開示される得られた抗体に結合され得ることを認識するであろう。例えば、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｃｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｅ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊｒ（ｅｄｓ），  Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）を参照。この内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
抗体および他の部分がそれらのそれぞれの活性を保持している限り、カップリングは２つの分子を結合する任意の化学反応によって達成され得る。この結合は、多くの化学的メカニズム、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および複合体形成を含み得る。しかしながら、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖を直接縮合させることによって、または外部架橋分子を組み込むことによって達成することができる。本明細書に開示されている抗体のような、タンパク質分子を他の分子にカップリングさせるのに、多くの二価または多価結合剤が有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンのような有機化合物を含み得る。このリストは、当技術分野において公知の様々な種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろより一般的なカップリング剤の例示である。Ｋｉｌｌｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：１３３５−２５４９（１９８４）；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．  ６２：１８５−２１６（１９８２）；およびＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）を参照。
【０１６７】
本明細書に開示されるリンカーは、文献に記載されたものを含む。例えばＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記載するＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４４：２０１−２０８（１９８４）を参照。オリゴペプチドリンカーによって抗体に結合されたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５０３０７１９号も参照。特に好ましいリンカーは以下を含む：（ｉ）ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４−サクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）−トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．，  Ｃａｔ  ＃２１６５１Ｇ）；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（サクシニミジル−６［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．  Ｃａｔ．  ＃２１６５−Ｇ）；（ｉｖ）スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（スルホサクシニミジル６［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．  Ｃａｔ．  ＃２１６５−Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣに対してコンジュゲートされるスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．，  Ｃａｔ．  ＃２４５１０）。
【０１６８】
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含み、したがって異なる物理化学的特性を有するコンジュゲートをもたらす。例えば、アルキルカルボキシラートのスルホ−ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシラートのスルホ−ＮＨＳエステルより安定である。リンカーを含むＮＨＳ−エステルは、スルホ−ＮＨＳエステルよりも低可溶性である。さらに、リンカーＳＭＰＴは立体障害のあるジスルフィド結合を含み、そして安定性が増した複合体を形成することができる。ジスルフィド結合はインビトロで開裂され、その結果利用可能なコンジュゲートが少なくなるので、ジスルフィド結合は一般に他の結合よりも不安定である。特にスルホ−ＮＨＳはカルボジイミドカップリングの安定性を高めることができる。カルボジイミドカップリング（ＥＤＣなど）をスルホ−ＮＨＳと組み合わせて使用すると、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対してより耐性のあるエステルが形成される。
【０１６９】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含有するリポソームは、以下のものなどに記載の当技術分野において公知の方法によって調製される。Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号；循環時間が延長されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０１７０】
リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームを所定の孔径のフィルターを通して押し出して所望の直径を有するリポソームを得る。本明細書に開示される抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィドインターチェンジ反応を介してリポソームに対してコンジュゲートされ得る。
【０１７１】
ＣＤ４７に対する抗体の使用
本発明による治療物質の投与は、適切な担体と、賦形剤と、改善された移行、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる他の薬剤と共に投与されるであろうことが理解されよう。多数の適切な製剤を、全ての薬剤師に知られている処方書（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１５ｔｈ  ｅｄ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ（１９７５）），  特にその中のＢｌａｕｇ，  Ｓｅｙｍｏｕｒ，による第８７章）に見出すことができる。これらの製剤は例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性の）を含む小胞（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、油中水および水中油エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物を含む。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理学的に適合性であり投与経路に耐えられるという条件で、前述の混合物のいずれも本発明による治療および治療に適切であり得る。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”  Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３２（２）：２１０−８（２０００），  Ｗａｎｇ  Ｗ．  “Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”  Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２０３（１−２）：１−６０（２０００），  Ｃｈａｒｍａｎ  Ｗ  Ｎ  “Ｌｉｐｉｄｓ，  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００），  Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”  ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ５２：２３８−３１１（１９９８）および製薬化学者によく知られている製剤、賦形剤および担体に関するさらなる情報については、その中の引用を参照のこと。
【０１７２】
本明細書に開示のモノクローナル抗体を含む本明細書に開示の抗体は、治療薬として使用することができる。そのような薬剤は一般に、被験体における異常なＣＤ４７発現、活性および／またはシグナル伝達に関連する疾患または病状を診断、予後予測、監視、治療、軽減および／または予防するために使用されるであろう。処置レジメンは、被験体（例えば、異常なＣＤ４７発現、活性および／またはシグナル伝達と関連した病気または疾患（例えば、癌または他の腫瘍性の疾患）を患う（または発症するリスクがある）ヒト患者）を、標準的な方法を使用して同定することによって実行される。抗体調製物、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものが、被験体に投与され、そして一般的にその標的との結合により効果を有する。抗体の投与は、標的（例えば、ＣＤ４７）の発現、活性および／またはシグナル伝達機能を無効にするかまたは阻害するかまたは干渉し得る。抗体の投与は、それが天然に結合する内因性リガンド（例えばＳＩＲＰα）との標的（例えばＣＤ４７）の結合を無効にするかまたは阻害するかまたは干渉することができる。例えば、抗体は標的に結合し、そしてＣＤ４７の発現、活性および／またはシグナル伝達を調節、ブロック、阻害、低減、拮抗、中和、またはそうでなければ妨害する。
【０１７３】
異常なＣＤ４７の発現、活性および／またはシグナル伝達に関連する疾患または障害には、非限定的な例として、血液の癌および／または固形腫瘍が含まれる。血液の癌は、例えば白血病、リンパ腫、髄腫を含む。白血病の特定の形式は、非限定的な例としては、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性疾患／腫瘍（ＭＰＤＳ）；および脊髄形成異常症候群、を含む。リンパ腫の特定の形式は、非限定的な例としては、ホジキンリンパ腫、無痛性かつ侵襲性の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）を含む。髄腫の特定の形式は、非限定的な例としては、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨大細胞髄腫、重鎖髄腫、および軽鎖または、ベンスジョーンズ骨髄腫を含んでいる。固形腫瘍は、例えば乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、黒色腫性の腫瘍、結腸直腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、肝臓腫瘍および腎臓腫瘍、を含む。
【０１７４】
癌および他の腫瘍性障害に関連する症状としては、例えば、炎症、発熱、一般的な倦怠感、発熱、しばしば炎症を起こした部位に限局するが、疼痛、食欲不振、体重減少、浮腫、頭痛、疲労、発疹、貧血症、筋力低下、筋肉疲労、ならびに、例えば腹痛、下痢または便秘などの腹部症状を含む。
【０１７５】
本明細書に開示される抗体の治療上有効な量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関する。上述のように、これは、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用であり得、これは、ある場合には、標的の機能を妨害する。投与に必要とされる量はさらに、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存し、そして投与された抗体が投与される他の被験体の自由体積（ｆｒｅｅ  ｖｏｌｕｍｅ）から枯渇する速度にも依存する。本明細書で開示された抗体または抗体のフラグメントの治療上有効な投薬のための一般的な範囲は、非限定的な例としては、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重までであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、またはより多い投与量を被験体に投与する。一般的な投与頻度は、例えば、１日２回から週１回の範囲であり得る。
【０１７６】
処置の有効性は、特定の炎症関連障害を診断または処置するための任意の公知の方法と関連して決定される。炎症関連障害の１つ以上の症状の軽減は、抗体が臨床的利益をもたらすことを示している。
【０１７７】
所望の特異性を有する抗体をスクリーニングするための方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で公知の他の免疫学的に媒介された技術を含むがこれらに限定されない。
【０１７８】
ＣＤ４７に対する抗体は、ＣＤ４７の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適切な生理学的サンプル内のＣＤ４７および／またはＣＤ４７およびＳＩＲＰαの両方のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所与の実施形態では、抗体由来の抗原結合ドメインを含む、ＣＤ４７に特異的な抗体、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、薬理学的に活性な化合物として利用される（以下「治療薬」と称される）。
【０１７９】
ＣＤ４７に特異的な抗体を用いて、免疫親和性、クロマトグラフィーまたは免疫沈降法のような標準的技術によりＣＤ４７ポリペプチドを単離することができる。ＣＤ４７タンパク質（あるいはそのフラグメント）に対して向けられた抗体は、臨床試験手順の一部として組織内のタンパク質レベルをモニタするために、例えば所定の処置レジメンの有効性を判定するために、診断的に使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング（すなわち、物理的に連結）することによって促進され得る。検出できる物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例は、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ；切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジアミンアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンが含まれ；発光材料の例にはルミノールが含まれ；生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれ、適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが含まれる。
【０１８０】
本明細書に開示される抗体はまた、サンプル中のＣＤ４７および／またはＣＤ４７とＳＩＲＰαタンパク質の両方（またはそのタンパク質フラグメント）の存在を検出するための薬剤として使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識を包含している。抗体はポリクローナル抗体、またはより好ましくはモノクローナル抗体である。無処置の抗体、またはそのフラグメント（例えばＦａｂ、ｓｃＦｖまたはＦ（ａｂ’）２）が使用される。用語「標識された」とは、プローブまたは抗体に関し、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち物理的に結合）することによってプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に標識することが含まれるように意図されている。間接標識の例としては、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生体サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞および体液、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および体液を含むことを意図している。従って、用語「生物サンプル」の使用には、血液、および血清、血漿またはリンパを含む血液の分画または構成要素が含まれる。すなわち、本明細書に開示される検出方法は、インビトロならびにインビボで生体サンプル中の分析物ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用され得る。例えば、分析物ｍＲＮＡの検出用のインビトロの技術はノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリッド形成を含んでいる。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法、および免疫蛍光法が含まれる。分析物ゲノムＤＮＡの検出用のインビトロの技術はサザンハイブリダイゼーションを含む。免疫測定を実施するための手順は、例えば以下に記載されている：“ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．  ４２，  Ｊ．  Ｒ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（Ｅｄ．）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  Ｎ．Ｊ．，  １９９５；“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，  Ｅ．  Ｄｉａｍａｎｄｉｓ  ａｎｄ  Ｔ．  Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｕｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  １９９６；および“Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，  Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  １９８５。さらに、分析物タンパク質を検出するためのインビボ技術は、標識された抗分析物タンパク質抗体を被験体に導入することを含む。例えば、抗体は、被験体におけるその存在および位置を標準的な画像化技術によって検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０１８１】
ＣＤ４７抗体の治療的投与および処方
本明細書に開示される抗体（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）、ならびにその誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物を調製することに含まれる原理および考察、ならびに成分の選択における手引きは、例えば、以下に提供されている。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９ｔｈ  ｅｄ．（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ）  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ，  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，  Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，  Ｐａ．，  １９９４；およびＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｖｏｌ．４），  １９９１，  Ｍ．  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【０１８２】
そのような組成物は典型的には抗体および薬学的に許容可能な担体を含む。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、および／または、組換えＤＮＡ技術によって生産しうる。例えばＭａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照。
【０１８３】
本明細書に使用されるように、用語「薬学的に許容可能な担体」は、医薬的な投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図している。適切な担体は、当該分野における標準引用文献であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載され、該文献は引用によって本願に組み込まれる。このような担体または希釈液の好ましい例は、水、食塩水、リンガー液、デキストロース溶液および５％のヒト血清アルブミンを含むが、これに限定されない。リポソーム、および、不揮発性油などの非水性のビヒクルも使用されてもよい。薬学的に活性な物質用のこうした媒体と薬剤の使用は当該技術分野では周知である。任意の従来の培地または薬剤が活性化合物と適合しない限り、治療用組成物のそれらの使用が企図される。
【０１８４】
インビボの投与に使用される製剤は無菌であるに違いない。これは濾過滅菌法膜による濾過によって容易に達成される。
【０１８５】
本明細書で開示される医薬組成物は、その意図した投与ルートと適合するように製剤化されてもよい。投与ルートの例には、腸管外、例えば、静脈内、真皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸内の投与、が含まれる。非経口、真皮内または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の構成要素を含むことができる：注射用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、などの無菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート試薬；クエン酸またはホスファートなどのバッファ、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧を調節するための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口の調製物は、アンプル、使い捨て可能なシリンジ、あるいはガラスまたはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入され得る。
【０１８６】
注射使用に適する医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性）、無菌分散剤、および、無菌注射溶液または分散剤の即席調製物のための無菌粉末、を含む。静脈内投与については、適切な担体は、生理食塩水、静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ  ｗａｔｅｒ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，  Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，  Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全てのケースにおいて、組成物は無菌状態でなければならず、かつ、注射器充填容易性（ｅａｓｙ  ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度の流動体であるべきである。これは、製造状態および貯留状態下で安定でなければならず、かつ、細菌および真菌などの微生物の異物混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および、液体のポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および、界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、によって達成されうる。多くの場合では、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム、を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、を組成物に含ませることによってもたらされる場合がある。
【０１８７】
無菌の注射可能な溶液は、上に列挙された成分の１つまたはその組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を組み入れることによって、必要に応じてその後の殺菌によって、調製される。概して、分散剤は、基本的な分散媒および上記に列挙したもの以外の必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルへと活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合には、調製方法は、真空乾燥と冷凍乾燥であり、これにより、あらかじめ無菌ろ過した溶液から任意のさらなる所望の成分と活性成分の粉末が得られる。
【０１８８】
経口の組成物は概して不活性希釈液または食用の担体を含んでいる。それらはゼラチンカプセル剤に封入されるか、または錠剤に圧縮されうる。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤に組み入れ、錠剤、トローチまたはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤として使用するための流体担体を使用して調製することができ、ここで、流体担体中の化合物は経口適用され、および洗口し（ｓｗｉｓｈｅｄ）および吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／または、アジュバント材料を、組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含むことができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味剤；あるいは、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジの調味料などの香料添加剤。
【０１８９】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤、例えば二酸化炭素などのガス、を含む被加圧容器、ディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形状で送達される。
【０１９０】
全身性投与は、また、経粘膜または経皮的な手段によることができる。経粘膜または経皮的な投与のために、障壁に浸透させるのに適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用には、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜な投与は、スプレー式点鼻薬または坐薬の使用を介して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、本発明の技術分野において一般的に知られているように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、膏薬（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１９１】
化合物はまた、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または直腸送達用の停留浣腸剤の形態で調製することもできる。
【０１９２】
一実施形態では、活性化合物は、維持型／コントロール型放出製剤などの、身体からの急速な脱離から化合物を保護するだろう担体と一緒に調製され、移植およびマイクロカプセル化送達システムを含む。エチレンビニルアセタート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生分解性で生体適合性のポリマーが、使用され得る。そのような製剤の調製のための方法は当業者に明白であろう。
【０１９３】
例えば、有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面のポリマー化によって調製されるマイクロカプセル、内に封入され得、例えば、それぞれ、（コロイド状の薬剤送達システム内（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）においてまたはマクロエマルジョンにおける、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル、内に封入され得る。
【０１９４】
徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例は、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性のマトリックスを含み、このマトリックスは造形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）など）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドを含む注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。一方、エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のなどのポリマーは、１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。
【０１９５】
これらの材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法によって調製することができる。
【０１９６】
経口または非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）に製剤され得る。本明細書に使用されるような投与単位形態は、処置される被験体のための単位投与量として適した、物理的に別々の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本明細書に開示される投与単位形態の仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、および個体の処置のためのそのような活性化合物を調合する技術に固有の制限によって決定され、これらに直接的に依拠している。
【０１９７】
医薬組成物は投与についての指示書と一緒に、容器、パックまたはディスペンサーに含むことができる。
【０１９８】
製剤は、処置される特定の症状に必要な場合には、１つを上回る活性化合物（好ましくは互いに不利に影響しない相補的な活性を有するもの）を含むこともできる。その代わりに、または更に、組成物は、例えば、細胞毒性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害性の薬剤などの、その機能を増強する薬剤を含むことができる。そのような分子は、意図した目的に有効な量の組み合わせで適切に存在する。
【０１９９】
本明細書に開示される活性化合物は、併用療法で、すなわち、様々な形態の癌、自己免疫障害および炎症性疾患などの病的状態または障害を処置するのに有用な他の薬剤、例えば治療薬、と組み合わせて、投与することができる。用語「組み合わせで」とは、薬剤が実質的に同時期、同時、または順次継続的のいずれか、で与えられることを意味する。順次継続的に与えられる場合には、第２の化合物の投与の開始時に、２つの化合物のうちの第１の化合物が、処置部位において依然として有効濃度で検出可能であることが好ましい。
【０２００】
例えば、以下により詳細に記述されるように、併用療法は、１以上の追加の治療剤（例えば、１つ以上のサイトカインおよび増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、および／または細胞毒性または細胞分裂抑制剤）と一緒に共製剤および／または共投与される、本明細書に開示される１つ以上の抗体を含むことができる。そのような併用療法は、投与される治療薬のより低い投与量を有利に利用することができ、それにより様々な単独療法に関連して起こり得る毒性または合併症を回避する。
【０２０１】
本明細書に開示されている治療薬は、炎症反応の様々な段階で干渉する薬剤とともに本明細書に開示されている抗体と組み合わせて使用することができ、および、炎症反応の様々な段階で干渉する薬剤を含むことができる。本明細書に記述される１つ以上の抗体は、他のサイトカインまたは増殖因子アンタゴニスト（例えば、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子、リガンド融合物）などの１つ以上の追加の薬剤；あるいは、他の標的に対して結合するその抗体または抗原結合フラグメント（例えば、他のサイトカインまたは増殖因子、それらの受容体、または他の細胞表面分子に対して結合する抗体）；および、その抗炎症性サイトカインまたはアゴニスト、と一緒に共製剤および／または共投与され得る。
【０２０２】
本明細書で開示される抗体は、自己免疫疾患、炎症性疾患などに対するワクチンアジュバントとして使用されてもよい。これらのタイプの疾患の処置のためのアジュバントの組み合わせは、標的とされた自己抗原、すなわち、自己免疫に関与する自己抗原、例えばミエリン塩基性たんぱく質；炎症性自己抗原（例えばアミロイドペプチドタンパク質）または、移植抗原（例えば同種抗原）、に由来する多種多様な抗原との組み合わせでの使用に適する。抗原は、タンパク質に由来するペプチドまたはポリペプチド、ならびに以下のいずれかのフラグメントを含み得る：サッカライド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植抗原、アレルゲンまたは他のマクロ分子構成要素。いくつかの例では、１つを超える抗原が抗原組成物に含まれている。
【０２０３】
他の治療薬の設計および生成
ＣＤ４７に関して本明細書中で産生され特徴付けられる抗体の活性に基づいて、抗体部分を超えた他の治療モダリティ（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）の設計が容易になる。そのようなモダリティは、二重特異性抗体などの先進的（ａｄｖａｎｃｅｄ）抗体治療薬、免疫毒素、および放射標識療法剤、ペプチド療法剤、遺伝子治療、特に細胞内抗体、アンチセンス療法剤および小分子の生成を含むがそれらに限定されない。
【０２０４】
例えば、二重特異性抗体に関して、（ｉ）１つはＣＤ４７に対する特異性を、もう１つは一緒に結合している第２の分子に対する特異性を有する２つの抗体、（ｉｉ）ＣＤ４７に特異的な１本の鎖と第２の分子に特異的な第２の鎖を持つ単一の抗体、あるいは（ｉｉｉ）ＣＤ４７に特異的な一本鎖抗体と第２の分子、を含む二重特異性抗体を生成しうる。そのような二重特異性抗体は、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）に関連しては、以下の周知の技術を用いて作製される。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：７２−８１（１９９４）  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｉｔ，  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１２５−１６８（１９９２）を参照、および、（ｉｉｉ）に関してはＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）  ７：５１−５２（１９９２）を参照。
【０２０５】
免疫毒素に関して、当技術分野で周知の技術を利用して、抗体を免疫毒素として作用するように修飾することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２５２（１９９３）を参照。米国特許５，１９４，５９４号も参照のこと。放射標識抗体の調製に関して、そのような修飾抗体はまた、本発明の技術分野において良く知られた技術を利用して容易に調製され得る。例えばＪｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６５５−６８６（２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，  ｅｄｓ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））を参照。また米国特許番号４，６８１，５８１号、第４，７３５，２１０号、第５，１０１，８２７号、第５，１０２，９９０号（ＲＥ  ３５，５００）、第５，６４８，４７１号および第５，６９７，９０２号も参照。免疫毒素および放射性標識分子のそれぞれは、ＣＤ４７を発現している細胞を死滅させる可能性がある。
【０２０６】
治療ペプチドの生成に関しては、本明細書に開示されている抗体またはペプチドライブラリのスクリーニングなどの、ＣＤ４７およびそれに対する抗体に関連した構造情報の利用またはペプチドライブラリのスクリーニングを介して、治療ペプチドをＣＤ４７に対して指向するように（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）生成することができる。ペプチド治療剤の設計およびスクリーニングは１３：４１２−４２１（１９９２），  Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．  ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５），  Ｐｉｎａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：９０１−９０５（１９９２），  ＢｌａｋｅおよびＬｉｔｚｉ−Ｄａｖｉｓ  ＢｉｏＣｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：５１０−５１３（１９９２）に関して議論される。免疫毒素および放射性標識分子もまた、抗体に関して上記で考察したように、ペプチド部分と関連して、そして同様の様式で調製され得る。ＣＤ４７分子（またはスプライス変異体もしくは代替形態などの形態）が疾患過程において機能的に活性であると仮定すると、従来の技術を通じて遺伝子およびそれに対するアンチセンス治療薬を設計することも可能であろう。そのような形式性はＣＤ４７の機能の調整のために利用することができる。それに関連して、本明細書に開示される抗体は、それに関連する機能的アッセイの設計および使用を容易にする。アンチセンス治療剤の設計および戦略は、国際特許出願ＷＯ９４／２９４４４にて詳細に議論される。遺伝子治療のための設計および戦略はよく知られている。しかしながら、特に、細胞内抗体を含む遺伝子治療技術の使用は特に有利であることが証明され得る。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：５９５−６０１（１９９４）  ａｎｄ  Ｍａｒａｓｃｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１１−１５（１９９７）を参照。遺伝子治療薬の一般的設計およびそれに関連する考慮事項もまた、国際特許出願番号ＷＯ９７／３８１３７に記載されている。
【０２０７】
ＣＤ４７分子の構造、ならびに、ＳＩＲＰαおよび／または本明細書に開示の抗体などの本明細書に開示の他の分子とのその相互作用は、さらなる治療モダリティの合理的な設計を容易にし得る。この点に関して、Ｘ線結晶学、コンピュータ支援型（またはアシスト型）分子モデリング（ＣＡＭＭ）、構造−活性の量的または質的関係（ＱＳＡＲ）および類似技術などの合理的な薬剤設計技術が、薬剤発見の試みに焦点をあてることに利用され得る。合理的な設計により、ＩＬ−６Ｒｃの活性を改変または調節するために使用することができる分子またはその特定の形態と相互作用することができるタンパク質または合成構造の予測が可能になる。そのような構造は化学的に合成することができ、または生物系において発現させることができる。このアプローチは、Ｃａｐｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇｓ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ（１９８８））においてレビューされている。更に、コンビナトリアルライブラリが設計および合成され得、高スループットスクリーニング試行（ｅｆｆｏｒｔｓ）などのスクリーニングプログラムにおいて使用され得る。
【０２０８】
スクリーニング法
本発明は、調節因子、すなわち、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を調節または干渉する候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の薬剤）、あるいは、ＣＤ４７および／またはＣＤ４７−ＳＩＲＰαのシグナル伝達機能を調節または干渉する候補または試験化合物または薬剤、を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。異常なＣＤ４７および／またはＣＤ４７−ＳＩＲＰαの発現、活性および／またはシグナル伝達に関連する障害を処置するのに有用な化合物を同定する方法もまた提供される。スクリーニング方法は、当技術分野において公知であるか使用されるもの、または本明細書に記載されるものを含み得る。例えば、ＣＤ４７をマイクロタイタープレート上に固定し、ＳＩＲＰαの存在下で候補化合物または試験化合物、例えばＣＤ４７抗体、と共にインキュベートすることができる。続いて、結合ＳＩＲＰαは二次抗体を用いて検出することができ、吸光度はプレートリーダーで検出することができる。
【０２０９】
マクロファージによって腫瘍細胞の食作用を促進することができる化合物を特定する方法も提供される。これらの方法は、当技術分野において公知であるかまたは使用されるもの、あるいは本明細書に記載されるものを含み得る。例えば、マクロファージは、候補化合物、例えばＣＤ４７抗体、の存在下において、標識された腫瘍細胞とインキュベートされる。しばらくして、マクロファージは、食作用を同定するための腫瘍標識の内部移行について観察され得る。これらの方法に関するさらなる詳細、例えばＳＩＲＰαブロッキングアッセイおよび食作用アッセイが実施例に提供されている。また、これらのスクリーニングアッセイで同定された化合物は本明細書に開示される。
【０２１０】
ＣＤ４７のシグナル伝達機能を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイが開示されている。本明細書に開示されている試験化合物は、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリ法における多数の方法のいずれかを用いて得ることができ、該方法は、生物学的ライブラリ；空間的にアドレス可能な平行な固相または液相ライブラリ；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリ法；「１ビーズ１化合物」ライブラリ法；および、アフィニティークロマトグラフィセレクションを使用する合成ライブラリ法、を含む。生物学的ライブラリアプローチはペプチドライブラリに限定されているが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリに適用可能である。例えば、Ｌａｍ，  １９９７．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １２：１４５を参照。
【０２１１】
本明細書に使用される「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指すことを意味する。小分子は、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、炭水化物、脂質、他の有機または無機分子でありうる。真菌、細菌、または藻類抽出物などの化学的および／または生物学的混合物のライブラリは当技術分野において公知であり、本明細書に開示されるアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。
【０２１２】
分子ライブラリの合成方法の例は当分野で、例えば以下に見出すことができる。ＤｅＷｉｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９０：６９０９；Ｅｒｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３７：２６７８；Ｃｈｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２，０５９；Ｃａｒｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  ３７：１２３３。
【０２１３】
化合物のライブラリは以下において提示されうる。溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，  １９９２  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１を参照）、ビーズ上（Ｌａｍ，  １９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４を参照）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，  １９９３  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６を参照）、細菌内（米国特許第５，２２３，４０９号を参照）、胞子（米国特許第５，２３３，４０９号を参照）、プラスミド（Ｃｕｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９を参照）、または、ファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  １９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；  Ｄｅｖｌｉｎ，  １９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；  Ｃｗｉｒｌａ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８７：６３７８−６３８２；  Ｆｅｌｉｃｉ，  １９９１  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：３０１−３１０；  ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ５，２３３，４０９を参照）。
【０２１４】
候補化合物を抗体−抗原複合体に導入し、候補化合物が抗体−抗原複合体を破壊するかどうかを決定することができ、ここで、この複合体の崩壊は、候補化合物がＣＤ４７のシグナル伝達機能および／またはＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間の相互作用を調節することを示している。本明細書で開示される可溶性ＣＤ４７および／またはＣＤ４７とＳＩＲＰαの両方のタンパク質が提供され、および、少なくとも１つの中和モノクローナル抗体に曝露される。抗体−抗原複合体の構成が検出され、１つ以上の候補化合物が複合体に導入される。抗体−抗原複合体が１つ以上の候補化合物の導入後に破壊される場合、候補化合物は異常なＣＤ４７および／またはＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達に関連する障害を処置するのに有用である。
【０２１５】
抗体−抗原複合体を干渉または破壊する試験化合物の能力の決定は、例えば、試験化合物の抗原またはその生物学的活性部分に対する結合が複合体中の標識された化合物を検出することによって判定され得るように試験化合物と放射線同位体または酵素標識とをカップリングすることによって、達成され得る。例えば、試験化合物は、直接的または間接的に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識することができ、放射性同位体は、電波放出（ｒａｄｉｏｅｍｉｓｓｉｏｎ）の直接的なカウントまたはシンチレーションカウントによって検出することができる。あるいは、試験化合物は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識され（ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ−ｌａｂｅｌｅｄ）、および、酵素標識は適切な基質から生成物への転換の判定によって検出され得る。
【０２１６】
アッセイは抗体−抗原複合体をテスト化合物と接触させること、および、抗原と相互作用するか、またはそうでなければ既存の抗体−抗原複合体を破壊する、試験化合物の能力を判定すること、を含みうる。試験化合物の、抗原と相互作用する能力および／又抗体−抗原複合体を破壊する能力の判定は、抗体と比較して、抗原またはその生物学的活性部分に対して優先的に結合する、試験化合物の能力を判定することを含む。
【０２１７】
アッセイはまた、抗体−抗原複合体を試験化合物と接触させること、および試験化合物が抗体−抗原複合体を調節する能力を判定すること、を含み得る。試験化合物の抗体−抗原複合体を調節する能力を判定することは、例えば、試験化合物の存在下で、抗原の抗体に結合するかまたは抗体と相互作用する能力を判定することによって達成することができる。
【０２１８】
本明細書中に開示されるスクリーニング方法のいずれにおいても、抗体は中和抗体であり得、これはＣＤ４７活性および／またはシグナル伝達を調節するかまたは干渉することを、当業者は認識するだろう。
【０２１９】
本明細書中に開示されるスクリーニング方法は、細胞ベースのアッセイとして、または無細胞アッセイとして行われ得る。本明細書に開示される無細胞アッセイは、可溶性形態または膜結合形態のＣＤ４７およびその断片の使用に適している。膜結合型の形態のＣＤ４７を含む無細胞アッセイの場合には、タンパク質の膜結合形態が溶液中で維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましい場合がある。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソポリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオール（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ）−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、または、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオール−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、などの非イオン洗剤を含む。
【０２２０】
候補化合物の導入後に一方または両方の複合体を形成していない形態から複合体を形成した形態の分離を容易にするため、ならびにアッセイの自動化に対応するために、抗体または抗原のいずれかを固定することが望ましい場合がある。候補化合物の存在下および非存在下での抗体−抗原複合体の観察は、反応物を入れるのに適した任意の容器中で達成することができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管およびマイクロ遠心分離管が含まれる。タンパク質の一方または両方をマトリックスに結合させることを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、ＧＳＴ−抗体融合タンパク質またはＧＳＴ−抗原融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させられ、これは次に試験化合物と組み合わせられ、そして、混合物は、複合体形成が行われる条件下で（例えば、生理的状態の塩およびｐＨで）インキュベートされ得る。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルは洗浄されて、非結合性の構成要素が除去され、ビーズの場合ではマトリックスは固定されており、複合体が直接的または間接的に判定される。あるいは、複合体をマトリックスから解離することができ、および抗体−抗原複合体形成のレベルを標準的な技術を用いて判定することができる。
【０２２１】
タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術もまた、本明細書中に開示されるスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、抗体（例えば２Ａ１抗体、または米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５−３０から選択される可変重鎖および米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１−４７から選択される可変軽鎖を有する抗体）、または抗原（例えばＣＤ４７タンパク質）を、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定することができる。ビオチン化抗体または抗原分子は、当該分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）を使用してビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され得、そしてストレプトアビジンコーティング９６ウェル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）中に固定され得る。  あるいは、目的の抗体または抗原とは反応するが目的の抗体抗原複合体の形成に干渉しない他の抗体はプレートのウェルに誘導体化され得るし、非結合性抗体または抗原は抗体コンジュゲーションによってウェルにトラップされた。そのような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体について上述したものに加えて、抗体または抗原と反応するそのような他の抗体を用いた複合体の免疫検出を含む。前述のスクリーニングアッセイのいずれかによって同定された新規な薬剤および本明細書に記載の処置のためのその使用も提供される。
【０２２２】
診断的および予防的な製剤
本明細書で開示されるＣＤ４７  ＭＡｂは、診断的および予防的な製剤において使用される。一実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ４７  ＭＡｂは、例えば、限定されないが、癌または他の腫瘍の疾患などの、１つ以上の前述の疾患を発達させる危険がある患者に投与される。前述の癌または他の腫瘍性疾患のうちの１つ以上に対する患者または器官の素因は、遺伝子型、血清学的または生化学的マーカーを使用して決定され得る。
【０２２３】
本明細書で開示された別の実施形態では、ＣＤ４７抗体は、例えば、限定されるものではないが、癌または他の腫瘍性疾患などの前述の疾患の１つ以上に関連する臨床的な徴候を診断されたヒト個体に投与される。診断の際、ＣＤ４７抗体は、前述の疾患のうちの１つ以上に関連する臨床的な徴候の影響を軽減または元に戻す（ｒｅｖｅｒｓｅ）ために投与される。
【０２２４】
本明細書に開示される抗体はまた、患者サンプル中のＣＤ４７および／またはＳＩＲＰαの検出にも有用であり、したがって診断薬としても有用である。例えば、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、患者サンプル中のＣＤ４７および／またはＳＩＲＰαレベルを検出するためのインビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、において使用される。
【０２２５】
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＤ４７抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定されている。固定された抗体は、試験サンプル中に存在しうるいずれかのＣＤ４７および／またはＳＩＲＰαについての捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）としての役割を果たす。固定された抗体を患者サンプルと接触させる前に、固体支持体をすすぎ、乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤で処理して、分析物の非特異的吸着を防ぐ。
【０２２６】
続いて、ウェルを、抗原を含有することが疑われる試験サンプルで、または標準量の抗原を含有する溶液で、処理する。そのようなサンプルは、例えば、病状の診断に役立つと考えられるレベルの循環抗原を有することが疑われる対象からの血清サンプルである。試験サンプルまたは標準品を洗い流した後、固体支持体を、検出可能なように標識されている二次抗体で処理する。標識された二次抗体は検出抗体として機能する。検出可能な標識のレベルを測定し、そして試験サンプル中のＣＤ４７および／またはＳＩＲＰαの濃度を、標準的なサンプルから作成された標準曲線との比較により決定する。
【０２２７】
インビトロ診断アッセイにおいて本明細書に開示されているＣＤ４７抗体を用いて得られた結果に基づいて、ＣＤ４７および／またはＳＩＲＰαの発現レベルに基づき、被験体における疾患（例えば、虚血、自己免疫または炎症性障害に関連する臨床的な兆候）をステージを分類する（ｓｔａｇｅ）ことが可能であることが理解されよう。所与の疾患について、血液サンプルは、疾患の進行における様々な段階で、および／または疾患の治療的処置における様々な時点で、診断されている被験体から、採取される。進行または治療の各ステージについて統計的に有意な結果を提供するサンプルの集団を使用して、各ステージの特徴と考えられ得る抗原の濃度範囲を指定する。
【０２２８】
本明細書で引用した全ての刊行物および特許文書は、あたかもそのような各刊行物または文書が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、それらが適切な先行技術であることを承認することを意図するものではなく、その内容または日付に関していかなる承認も構成するものでもない。本発明は、今、記載によって述べられているが、当業者は、本発明が多種多様な実施形態で実施され得ること、および上述の記載および以下の実施例が図示および請求の範囲の限定という目的のためのものでは無いことを認識するだろう。
【実施例】
【０２２９】
実施された実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２３０】
＜実施例１＞
＜ＣＤ４７抗体の生成および選択＞
ＣＤ４７抗体を、ＣＤ４７−ＩｇＶ（免疫グロビン様可変型）を表す組換えタンパク質でマウスを免疫化し、、複数の部位において改変急速免疫化法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒａｐｉｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）をすることによって生成した（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｒａｐｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＲＩＭＭＳ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６，  ３８１−３８９）。加えて、免疫化した群の半数のマウスに、抗マウスＧＩＴＲアゴニスト抗体ＤＴＡ−１の単回注射を受けさせた。免疫化スケジュールに続いて、すべてのマウス（ＤＴＡ−１処理および未処理）からのリンパ節を採取して解離させ、それによってＢ細胞の単離およびその後の骨髄腫細胞系への融合を可能にした。ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡおよびＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２１３）細胞上のフローサイトメトリーにより、ＣＤ４７への結合についてスクリーニングした（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図１Ａ）。また、ハイブリドーマ上清をＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用をブロックする能力について分析した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図１Ｂ）。組換えＣＤ４７をＭｅｄｉｓｏｒｐ（ＮＵＮＣ）マイクロタイタープレートに固定し、続いて、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合した組換えヒトＳＩＲＰα−ＥＣＤの存在下でハイブリドーマ上清とインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、プレートリーダーにおいて検出される吸光度６５０ｎｍで、結合したＳＩＲＰαを検出した。
【０２３１】
＜実施例２＞
＜ＣＤ４７抗体の特徴付け＞
本明細書に開示されている例示的なマウスＣＤ４７抗体を米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されている図２に示す。ＳＩＲＰαブロッキングＣＤ４７抗体の親和性ランク付けを、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−８６）（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図２Ａ）、および、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１１９）（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図２Ｂ）に対するフローサイトメトリーによって実行した。結合したＣＤ４７抗体をＦＩＴＣコンジュゲート型抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して検出した。当技術分野で周知のＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２を陽性対照として含ませた。例えば、米国特許５，０５７，６０４号参照。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図２Ｂでは、Ｂ６Ｈ１２および２Ｄ３両方（市販の非ＳＩＲＰαブロッキング抗体）を、本明細書で生成された抗体と比較された。本明細書に開示される抗体は、Ｂ６Ｈ１２および２Ｄ３抗体と比較して、内因性（細胞表面）形態のＣＤ４７に対してより高い親和性を示す。
【０２３２】
＜実施例３＞
＜ＣＤ４７抗体のＳＩＲＰαブロッキング活性＞
ＣＤ４７抗体によるＳＩＲＰαブロッキングの効力を、組換えＨｉｓタグ付きＣＤ４７−ＩｇＶをＭｅｄｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート上に固定したＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合した組換えＳＩＲＰαの結合を、漸増するＣＤ４７抗体の存在下でモニタした。結合したＳＩＲＰαを、ＨＲＰコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して測定した。本明細書で開示された抗体は、Ｂ６Ｈ１２抗体と比較して、ＳＩＲＰαブロッキングの増強された効力を示す。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されている図３Ａは、ＥＬＩＳＡに基づくＳＩＲＰαブロッキングアッセイの代表的なデータを示す。
【０２３３】
ＣＤ４７抗体を、組み換えＳＩＲＰαの細胞表面ＣＤ４７に対する結合をブロックするそれらの能力に関してフローサイトメトリーによって解析した。アッセイにおいて、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−１１９）細胞をＣＤ４７のソースとして使用し、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合した組み換えＳＩＲＰαの結合を、増加するＣＤ４７抗体の存在下でモニタした。結合したＳＩＲＰαを、ＡＰＣコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して測定した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図３Ｂ）。Ｂ６Ｈ１２および商業的に入手可能な非ＳＩＲＰαブロッキングＣＤ４７抗体２Ｄ３を、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。
【０２３４】
＜実施例４＞
＜ＣＤ４７抗体媒介性ホモタイプ相互作用＞
ＳＩＲＰαブロッキングＣＤ４７抗体を、細胞のクラスタリング（ＣＤ４７陽性細胞の間のホモタイプ相互作用として知られている）を誘導するそれらの能力について解析した。Ｄａｕｄｉ細胞およびラージ細胞をＣＤ４７発現細胞系の候補として使用した。検査した抗体の中で、本開示の２Ａ１抗体のみが、ＣＤ４７発現細胞のホモタイプ相互作用を促さないＳＩＲＰαブロッキング抗体であった。
【０２３５】
＜実施例５＞
＜ＣＤ４７抗体の赤血球凝集能＞
ホモタイプ相互作用の一例は、ＲＢＣの凝集によって表わされる赤血球凝集である。ＣＤ４７抗体を、ヒトＲＢＣの沈降（ｓｅｔｔｌｉｎｇ）を防止する抗体の能力によって観察されるＲＢＣ凝集についてスクリーニングした。予想されなかったことに、２Ａ１抗体は、赤血球凝集を促すことができないが、その一方で高い親和性とＳＩＲＰαをブロックする能力を有するという点で、他のＣＤ４７抗体の中にあって特異であることが分かった。赤血球凝集の減少を示す他の抗体は、ＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合をブロックしなかった。
【０２３６】
ＣＤ４７抗体の赤血球凝集能力を評価するために、ヒトＲＢＣをＰＢＳ中で１０％まで希釈し、丸底９６ウェルプレートにおいてＣＤ４７抗体の力価測定をしつつ３７℃で２−６時間インキュベートした。赤血球凝集の証拠は、非赤血球凝集ＲＢＣの赤いドット（ａ  ｐｕｎｃｔｕａｔｅ  ｒｅｄ  ｄｏｔ）に比べてぼんやりと現れる、非沈降ＲＢＣの存在によって示された。予想されなかったことに、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）で開示され図４Ａに示されるように、本開示のＣＤ４７抗体、特に本明細書において２Ａ１として言及される抗体は、赤血球凝集活性を示さなかった。グラフは赤血球凝集アッセイの定量を示し、表示値「赤血球凝集インデックス」は、抗体存在下でのＲＢＣペレットの面積を抗体不在下での面積に対して規格化して定量化することによって決定した。
【０２３７】
マウス９Ｅ４抗体は、試験されたすべての濃度において最も重大な赤血球凝集を引き起こした。したがって、９Ｅ４抗体はＣＤ４７に結合し、かつＣＤ４７とＳＩＲＰαの相互作用をブロックする；しかしながら、９Ｅ４抗体は重大な赤血球凝集を引き起こす。９Ｅ４抗体のＶＨ鎖領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８として提供される。９Ｅ４抗体のＶＬ鎖領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９として提供される。
【０２３８】
ＳＩＲＰαブロッキングＣＤ４７抗体に期待されるように、対照抗体Ｂ６Ｈ１２は赤血球凝集を引き起こした。２Ａ１抗体の非赤血球凝集能の独自性を調査するために、多数の他のＣＤ４７抗体をＲＢＣ赤血球凝集アッセイでスクリーニングした（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図４Ｂ）。このアッセイには２Ａ１抗体（２Ａ１−ｘｉ）のキメラ型バージョンが含まれ、それはマウスの２Ａ１の可変重鎖領域、アミノ酸１０６（すなわちＭ１０６Ｉ）において修飾されたマウスの２Ａ１の可変軽鎖領域、およびヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇκの定常領域から成る。２Ａ１抗体および２Ａ１−ｘｉ抗体のＶＨおよびＶＬ領域配列は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される表１に提供される。抗体を１２．５、２５、５０および１００ｎＭで試験した。予想外に、２Ａ１は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるように、図４Ｂで検査されたＣＤ４７抗体の中では珍しく、赤血球凝集能の欠如または減少を伴い、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるように図４Ｂにおける唯一の抗体であった。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるように、図４Ｅは、２Ａ１、キメラ型２Ａ１（２Ａ１−ｘｉ）、およびヒト化された変異体が赤血球凝集を引き起こさないことを示す。
【０２３９】
米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図４Ｃは、ＲＢＣ赤血球凝集アッセイにおける追加のＣＤ４７抗体をスクリーニングした結果を示す。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図４Ｃに示されるように、市販のＣＤ４７モノクローナル抗体２Ｄ３は、ＳＩＲＰαをブロックせず、赤血球凝集を引き起こさなかった。しかしながら、ＳＩＲＰαをブロックする他の市販のＣＤ４７抗体（例えばＣＣ２Ｃ６、ＢＲＣ１２６およびＢ６Ｈ１２）は、赤血球凝集を引き起こした（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図４Ｃ）。したがって、本明細書に記載の発明に先立って、ＳＩＲＰαをブロックした既存の抗体は赤血球凝集を引き起こし、他方で２Ｄ３などの既存の抗体はＳＩＲＰαをブロックせず、赤血球凝集を引き起こさなかった。総合すれば、本明細書に開示される抗体（例えば２Ａ１抗体およびそのヒト化された派生物）は、ＳＩＲＰαをブロックするが赤血球凝集を引き起こさないという能力の点で、既存のＣＤ４７抗体の中にあって特異である。
【０２４０】
選択したＣＤ４７抗体の高濃度範囲を、赤血球凝集アッセイにおいて再試験した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図４Ｄ）。このアッセイは、Ｂ６Ｈ１２と９Ｅ４による赤血球凝集のプロゾーン効果を明らかにし、ここで赤血球凝集は、試験された濃度の最高値と最低値で低減された。赤血球凝集インデックスのグラフ表示もまたプロゾーン効果を強調する。プロゾーン効果はさらに、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるように図４Ｃと４Ｅに明らかであった。重要なことには、マウス２Ａ１およびキメラ型２Ａ１  ＣＤ４７抗体は、すべての濃度において赤血球凝集能を欠いていた。
【０２４１】
米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図４Ｅに示されるように、マウス１Ｂ４抗体は狭い範囲の赤血球凝集を示した。
【０２４２】
１Ｂ４抗体のＶＨ鎖領域は、米国特許出願１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０として提供される。１Ｂ４抗体のＶＬ鎖領域は、米国特許出願１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるようにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１として提供される。
【０２４３】
マウス２Ａ１由来のヒト化抗体の凝集能を、上記のように試験した。重要なことには、多数のヒトＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ４−Ｓ２２８ＰおよびＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ）において代表的なヒト化抗体ＡＢ６．１２は、ＲＢＣ赤血球凝集を引き起こさなかった。２Ａ１および２Ａ１−ｘｉを非凝集抗体に関する対照として含み、他方でＢ６Ｈ１２と９Ｅ４を、赤血球凝集に関する陽性対照として含んだ（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図４Ｆ）。
【０２４４】
＜実施例６＞
＜カニクイザルＣＤ４７への結合＞
カニクイザル（ｃｙｎｏ）のＣＤ４７に結合するマウス２Ａ１の能力を評価した。Ｂ６Ｈ１２抗体は、ｃｙｎｏＣＤ４７と交差反応性であることが以前に報告されており、アッセイではｃｙｎｏＣＤ４７の存在に関する陽性対照として使用した。カニクイザルＣＤ４７への２Ａ１の結合を測定する実験は、カニクイザルＢ細胞およびヒト細胞のＣＤ４７への２Ａ１の結合を比較するように設計され、ここでラージ細胞系をヒトのＣＤ４７陽性細胞として使用した。カニクイザルの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ勾配遠心分離によって、カニクイザルの全血から単離した。カニクイザルおよびヒトのＢ細胞（ラージ）を１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ２０抗体オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ）で標識し、マウスＣＤ４７抗体２Ａ１またはＢ６Ｈ１２の希釈系列と反応させた。ヒトＣＤ２０抗体で標識されたＢ細胞を、ＤｙＬｉｔｅ６４９にコンジュゲートしたポリクローナル抗ヒト抗体で検出し、他方でＣＤ４７マウス抗体はＤｙＬｉｔｅ４８８にコンジュゲートしたポリクローナル抗マウス抗体で検出した。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、まずＦＳＣとＳＳＣによって生細胞をゲートオンし、次にＦＬ４陽性（ＣＤ２０陽性）細胞をゲートオンし、最後にＦＬ１（ＣＤ４７陽性）の中央値を測定した。データを、各濃度におけるシグナルを各細胞集団に対する各抗体の最大シグナルで割ることによって正規化した。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）で開示される図５に示される正規化された結果は、２Ａ１がｃｙｎｏＣＤ４７と交差反応すること、およびヒトＣＤ４７と比較して同等の親和性を有することを示す。上記の結果と整合して、Ｂ６Ｈ１２は、ラージ細胞とカニクイザルＢ細胞の両方の細胞表面ＣＤ４７に関して、本開示の抗体と比較してより低い親和性を有した。
【０２４５】
＜実施例７＞
＜キメラ型抗体の生成＞
マウス２Ａ１抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列を特定するために、リボ核酸（ＲＮＡ）をハイブリドーマから単離し、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において利用し、一本鎖ｃＤＮＡを生成した。ＶＨとＶＬの両方のマウス抗体リーダー配列の完全レパートリーをカバーする変性プライマーセットをＰＣＲにおいて使用し、ここで一本鎖ｃＤＮＡは鋳型としての役割を果たした。
【０２４６】
フォワードプライマー（マウスＩｇＧリーダー）は、ＶＨ１−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）；ＶＨ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）；ＶＨ１−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）；ＶＨ１−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５）；ＶＨ１−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６）；ＶＨ１−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７）；ＶＨ１−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８）；ＶＨ１−８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９）；ＶＨ１−９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０）；ＶＨ１−１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）；ＶＨ１−１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）；ＶＨ１−１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）；ＶＨ１−１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）；ＶＨ１−１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）；ＶＨ１−１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）；ＶＨ２−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）；ＶＨ２−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）；ＶＨ３−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）；ＶＨ３−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）；ＶＨ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）；ＶＨ５−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）；ＶＨ５−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）；ＶＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）；ＶＨ７−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）；ＶＨ７−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）；ＶＨ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）；ＶＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）；ＶＨ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）；ＶＨ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）；ＶＨ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）；ＶＨ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）；ＶＨ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）として提供され、すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照番号が米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）で開示される通りである。
【０２４７】
リバースプライマー（マウスＩｇＧ定常領域）は、ＨＣ−ｒｅｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）として提供され、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される通りである。
【０２４８】
フォワードプライマー（マウスＩｇκリーダー）は、ＶＫ１−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）；ＶＫ１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）；ＶＫ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）；ＶＫ４／５−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）；ＶＫ４／５−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；ＶＫ８−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）；ＶＫ８−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；ＶＫ９Ａ／９Ｂ−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；ＶＫ９Ａ／９Ｂ−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；ＶＫ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）；ＶＫ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；ＶＫ１２／１３−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；ＶＫ１２／１３−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；ＶＫ１２／１３−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８）；ＶＫ１２／１３−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）；ＶＫ１２／１３−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）；ＶＫ１９／２８−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；ＶＫ１９／２８−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）；ＶＫ１９／２８−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）；ＶＫ２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）；ＶＫ２１−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）；ＶＫ２１−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）；ＶＫ２２−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）；ＶＫ２２−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）；ＶＫ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）；ＶＫ２４／２５−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）；ＶＫ２４／２５−２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）；ＶＫ３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）；ＶＫ３３／３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）；ＶＫ３１／３８Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）：ＶＫＲＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）として提供され、すべてのＳＥＱ  ＩＤの参照番号は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される通りである。
【０２４９】
リバースプライマー（マウスＩｇκ定常領域）は、ＬＣ−ｒｅｖ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）として提供され、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される通りである。
【０２５０】
増幅されたＶＨおよびＶＬを、その後、マウスとヒトのキメラ型ＤＮＡ構築物を生成するために、それぞれ適切な抗体分泌配列と、ヒトＩｇＧ１およびＩｇκの定常領域を含むベクターへと、インフレームクローン化を行った。これらの構築物を、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に共トランスフェクトし、および結果として得られた抗体をプロテインＡクロマトグラフィによって細胞培養上清から精製した。正しいＶＨおよびＶＬの配列が特定されたことを判定するために、キメラ型２Ａ１（２Ａ１−ｘｉと称される）を、ラージ細胞上でのフローサイトメトリーによるマウスの親２Ａ１抗体とＣＤ４７結合アッセイと比較した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図６）。このアッセイは、陽性対照としてＢ６Ｈ１２をさらに含んだ。結合した２Ａ１−ｘｉを、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。結合した２Ａ１およびＢ６Ｈ１２を、ＦＩＴＣ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体を使用して検出した。明白な親和性を、様々な抗体濃度での蛍光強度の中央値の非線形モデル（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって判定した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される表２）。２Ａ１−ｘｉ抗体は、マウス２Ａ１抗体に類似する、細胞表面ＣＤ４７に対する結合親和性を有しており、ＶＨおよびＶＬの配列が適切に特定されたことを実証している。
【０２５１】
＜実施例８＞
＜抗体のヒト化＞
マウス２Ａ１  ＣＤ４７抗体を、ヒト患者に投与された時の免疫原生の潜在力を減らすために、ヒト化した。２Ａ１のＶＨ領域およびＶＬ領域の配列を、ＩＭＧＴデータバンクのヒト抗体配列と比較した。続いて、タンパク質データバンク（ＰＤＢ）において最も密接に関連したヒト化抗体およびヒト抗体の既知の構造を使用して、２Ａ１のＶＨ領域およびＶＬ領域の構造モデルを作成した。２Ａ１抗体の重鎖と軽鎖の両方における３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を固定し、およびマウスのフレームワークを、ＣＤＲの適切な配向を維持している可能性の最も高い多数のヒトフレームワークで置き換えた。各ヒト化２Ａ１変異体に対応する構築物を遺伝子合成によって作成し、適切な分泌配列とヒトＩｇＧ１およびＩｇκ定常領域を含むベクターにインフレームクローン化した。種々のヒト化重鎖および軽鎖の組み合わせを、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に共トランスフェクトし、および結果として得られた抗体をプロテインＡクロマトグラフィによって細胞培養上清から精製した。
【０２５２】
ヒト化抗体をフローサイトメトリーにより、ラージ細胞に結合するそれらの能力に関して試験した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図７）。２Ａ１−ｘｉ抗体を、これらのアッセイのほとんどにおいて、結合親和性のベンチマークを設定するための対照として使用した。発現を増強し、かつ潜在的な異性化および脱アミド部位を含む問題の部位を減らすために、ヒト化抗体をさらに最適化した。マウス２Ａ１抗体由来の最適化したヒト化抗体の例はＡＢ６．１２抗体と称され、２Ａ１−ｘｉ抗体と非常に類似する結合親和性を示す（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図７Ｈ；表３）。明白な親和性を、様々な抗体濃度での蛍光強度の中央値の非線形モデル（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって判定した。
【０２５３】
次に、ＡＢ６．１２抗体を、重鎖の定常領域の置換によってＩｇＧ１から他のヒトＩｇＧアイソタイプに変換した。図７Ｉに示されるように、ＩｇＧアイソタイプからヒンジ安定型バージョンのＩｇＧ４（ＩｇＧ４Ｐ：Ｓ２２８Ｐ）への変更、およびヒンジ安定型ＩｇＧ４のＦｃ受容体結合性低下型変異体（ＩｇＧ４Ｐｅ：Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅ）への変更は、細胞表面ＣＤ４７に対するヒト化抗体の結合親和性を変化させなかった（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図７Ｉ；表４）。明白な親和性を、様々な抗体濃度での蛍光強度の中央値の非線形モデル（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）によって判定した。
【０２５４】
ヒト化プロセスの全体にわたって、ＣＤ４７抗体を、ＳＩＲＰαブロッキング機能が完全であったことを確証するために試験した。図７Ｊに示すように、上記の実施例３に記載のフローサイトメトリーベースの方法を使用し、ヒト化抗体（ＡＢ６．１２）の複数のＩｇＧアイソタイプは、ＳＩＲＰα：ＣＤ４７相互作用をブロックした。例示的なＣＤ４７抗体およびそれらの対応するＶＨ領域とＶＬ領域は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）で開示されるように、表１に提供されたものを含む。
【０２５５】
ヒト化プロセス中に、いくつかの実施形態では、ＶＨのＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）の開始位置におけるアミノ酸配列モチーフ「ＮＡ」は、本明細書に記載されるＣＤ４７抗体の結合にとって重要である。いくつかの実施形態において、ＶＨのＣＤＲ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２またはＳＥＱＩＤＮＯ：７７、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）の開始位置におけるアミノ酸残基「ＮＡ」が存在しない場合に、本明細書に開示のＣＤ４７抗体はそれらの標的に結合しない、またはアミノ酸残基「ＮＡ」が存在する場合のものよりも低い親和性でそれらの標的に結合する。例えば、「ＮＡ」モチーフを、よりカノニカルなモチーフの「ＡＲ」または「ＡＴ」へ変更した場合には、結合が実質的に減少した（すなわち１０倍より大きく）。他の実施形態において、ＶＨのＣＤＲ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２またはＳＥＱＩＤＮＯ：７７、米国特許出願第１３９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）の開始位置におけるアミノ酸残基「ＮＡ」が存在しない場合に、本明細書に開示のＣＤ４７抗体は、アミノ酸残基「ＮＡ」が存在する場合の結合と比較して同等の親和性でそれらの標的に結合する。
【０２５６】
当業者は、過度の実験をせずに、本明細書に開示のＣＤ４７抗体の配列のアミノ酸置換が、実質的に同一の機能を有する抗体、例えば、ＳＩＲＰαをブロックするが、有意なレベルの赤血球凝集および／または血小板枯渇を引き起こさないという能力を有するＣＤ４７抗体、をもたらすかどうかを判定することができると認識するだろう。
【０２５７】
ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを有するＡＫＴＡ  ＦＬＰＣを使用した分子ふるいクロマトグラフィによる追跡の画像は、図８Ａに示される。ＡＢ６．１２抗体のＩｇＧ１、ＩｇＧ４ＰおよびＩｇＧＰＥ変異体が示される。３つの変異体はすべて、９８％を超えるモノマーである。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示されるように図８Ｂは、分解状態（Ｒ）および非分解状態（ＮＲ）の多数の２Ａ１のヒト化変異体の、クーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【０２５８】
＜実施例９＞
＜ＣＤ４７抗体は腫瘍細胞系の食作用を促進する＞
ＣＤ４７は、腫瘍細胞でアップレギュレートされる細胞表面受容体であり、またその天然のリガンドＳＩＲＰαとのその相互作用を介して免疫回避に寄与すると考えられる。ＣＤ４７とマクロファージのＳＩＲＰαとのライゲーションは、食細胞活性の減少をもたらす。以下に詳細に記載するように、２Ａ１抗体およびその変形の、ＣＤ４７結合およびＳＩＲＰαブロッキング活性が、ヒトマクロファージの存在下での腫瘍細胞食作用を促進するか否かを判定した。
【０２５９】
ＰＢＭＣをヒト血液から単離し、および単球を７日間、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でインキュベートすることによってマクロファージへ分化させた。これらの単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）は接着性になり、他の細胞を洗浄して取り除くことを可能にする。ＭＤＭをかき集め、および１２ウェル皿に再び平板培養し、そして２４時間接着させた。ヒト腫瘍細胞系ＣＣＲＦ−ＣＥＭを、その高いＣＤ４７発現ゆえに標的細胞タイプとして選択した。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を、０．３μＭのＣＦＳＥで、３７℃で１５分間標識し、続いて洗浄し、および４：１の食細胞あたりの腫瘍細胞の割合でＭＤＭに加え、そしてＣＤ４７抗体を様々な濃度で加えた。標的細胞の食作用を３時間許容した。その後、貪食されていない標的細胞をＰＢＳで洗浄した。残りの食細胞をかき集め、ＤｙＬｉｔｅ  ６４９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に結合したマクロファージマーカーＣＤ１４の抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーで分析した。食作用は、ＦＬ４陽性（ＣＤ１４＋）の生細胞をゲートオンし、次にＦＬ１（ＣＦＳＥ＋）陽性細胞の割合を評価することによって、測定した。
【０２６０】
米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図９は、ＣＤ４７抗体２Ａ１およびそのヒト化変異体が、ＭＤＭによる腫瘍細胞の食作用の用量依存的な増加を示したことを、示す。抗体２Ａ１およびヒト化変異体ＡＢ２．０５は、６６．７ｐＭで腫瘍細胞の食作用を誘導するその能力の点で特異であり、他方でＢ６Ｈ１２はその濃度では活性を有さなかった（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図９Ａ）。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図９Ｂは、２Ａ１と、ヒト化変異体ＡＢ２．０５、ＡＢ６．１２−ＩｇＧ１、ＡＢ６．１２−ＩｇＧ４ＰおよびＡＢ６．１２−ＩｇＧ４ＰＥがすべて、０．３μｇ／ｍｌまたは２ｎＭにおいてどのように最大の食作用を誘導するかを示し、他方でＢ６Ｈ１２がより高い濃度を必要とすることを示す。このデータは、ＣＤ４７抗体、２Ａ１（およびそれに由来するヒト化変異体）がＣＤ４７陽性腫瘍細胞のマクロファージ媒介性食作用を誘導することを実証する。この実施例では、ＣＣＦＲ−ＣＥＭ細胞を、ＣＤ４７陽性の標的細胞として用いた。
【０２６１】
＜実施例１０＞
＜ＣＤ４７抗体の抗腫瘍活性＞
マウスＣＤ４７抗体の抗腫瘍活性を、リンパ腫のラージモデルで評価した。ラージ細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に移植し、および無作為に５つの群に分けた（各群あたり１０のマウス、０日目）。群１：ビヒクル（緩衝剤のみ）；群２：Ｂ６Ｈ１２（陽性の対照）；群３：１Ｂ４；群４：２Ａ１；および群５：９Ｅ４。各抗体またはビヒクル（緩衝剤のみ）での処置は、腫瘍が触知可能な時（５０ｍｍ３、１３日目）に開始し、それらの腫瘍の体積が約１５００ｍｍ３に達した時にマウスを安楽死させた。腫瘍体積を週３回測定した。抗体を３週間、週３回、２００μｇで静脈内（ＩＶ）に投薬した（１つのマウス当たり計９回の投与）。１３日目に処置を開始し、３２日目に終了した。
【０２６２】
米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図１０Ａに示されるように、本開示のＣＤ４７抗体、特に２Ａ１抗体は、このリンパ腫の動物モデルにおいて抗腫瘍活性を示した。１５００ｍｍ３の腫瘍体積に達するために、群１（ビヒクルのみ）は〜２５日を要し；群２（Ｂ６Ｈ１２．２）は〜４５日を要し；群３（１Ｂ４）は〜３７日を要し；群４（２Ａ１）は〜８５日を要し；および群５（９Ｅ４）は、〜１５００ｍｍ３の腫瘍体積に達するのに〜４０日を要した。これらのデータは、ＣＤ４７に結合し、ＣＤ４７のＳＩＲＰαとの相互作用をブロックし、およびヒト癌のマウスモデルにおける腫瘍形成を抑制することが知られているＢ６Ｈ１２を含む試験された全てのＣＤ４７結合抗体よりも、抗体２Ａ１が有意により強力であったことを示す。予想されなかったことに、これらのＣＤ４７抗体の腫瘍抑制活性は、公開されたデータに基づいて予想される、ＣＤ４７に結合するそれらの効能、またはＣＤ４７のＳＩＲＰαとの相互作用をブロックするそれらの効能と相関しなかった。
【０２６３】
実施例２と３に記載したように、２Ａ１、１Ｂ４および９Ｅ４は、ＣＤ４７に対する類似の親和性を有するとともに、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用をブロックする類似の効能を有した。加えて、この研究で使用した全ての抗体は同一のマウスＩｇＧ１ドメインから成るため、２Ａ１の増強された効果を、記載した抗体のＦｃドメインにおける差異によって説明することができない。したがって、特有の組成に加えて、２Ａ１抗体は、ＣＤ４７発現細胞（例えば、赤血球）の間のホモタイプ相互作用を誘導することができないこと、およびＣＤ４７への結合の増強またはＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用をブロックする能力の増強により説明することのできない腫瘍抑制活性の増強、を含む予期せぬ特異な特徴を有する。
【０２６４】
ヒト化２Ａ１抗体がその抗腫瘍活性を維持したことを確認するために、類似するラージ腫瘍の試験を行った。試験の設計は上記と同じであった。ラージ細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に移植し、および無作為に５つの群に分けた（各群あたり１０のマウス、０日目）。この試験では、抗体を３週間、週３回２００μｇで腹腔内（ＩＰ）に投与し（１つのマウスにつき計９回の投与）、および腫瘍体積を週３回測定した。しかしながら、この試験に関しては、マウスＩｇＧ１  ２Ａ１抗体（群２）をヒト化誘導体、ＡＢ６．１２と比較した。この試験では、ＡＢ６．１２をヒトＩｇＧ１（群３）、ヒトＩｇＧ４Ｐ（群４）、およびヒトＩｇＧ４ＰＥ（群４）に構築した（実施例８に記載の通り）。したがって、この試験は、その腫瘍抑制活性に対する２Ａ１ヒト化の影響と、多くの抗体の抗腫瘍活性に寄与することが当技術分野で知られているＦｃドメインエフェクター機能の潜在的役割とを明らかにすることを目指した。ヒトＩｇＧ１がヒトＩｇＧ４Ｐと比較して有意により多くのエフェクター機能を有することはよく報告されている。エフェクター機能をさらに減少させるように、ＩｇＧ４ＰＥを開発した。米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図１０Ｂに見られるように、２Ａ１のヒト化は、２Ａ１の抗腫瘍活性を減ぜず、実際には増強する場合もある。ＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ１、ＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ４ＰおよびＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ４ＰＥはすべて、マウス２Ａ１（２Ａ１ｍＩｇＧ）よりも有意に大きい、類似の抗腫瘍活性を示した。２Ａ１ｍＩｇＧ１、ＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ１、ＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ４ＰおよびＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ４ＰＥが類似するＣＤ４７結合およびＳＩＲＰαブロッキング活性を有しているため、この結果は予期せぬものである。加えて、ＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ１、ＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ４ＰおよびＡＢ６．１２−ｈＩｇＧ４ＰＥが同様の抗腫瘍活性を有するため、エフェクター機能はヒト化２Ａ１抗体ＡＢ６．１２の有効性に寄与することがわかる。
【０２６５】
＜実施例１１＞
＜ＣＤ４７抗体のＣＤ４７との共結晶＞
ＣＤ４７は、６つの部位において高度にグリコシル化された単一の細胞外ＩｇＶ（免疫グロブリン様可変型）ドメインを備えた５回膜貫通型タンパク質である。ＣＤ４７−ＩｇＶドメインの構造は、ＳＩＲＰαのＩｇＶドメイン、その天然のリガンドとの複合体において解明されている（タンパク質データバンク（ＰＤＢ）参照番号２ＪＪＳ；Ｈａｔｈｅｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２５；３１（２）：２６６−７７［図１１Ａ］）。この構造は、ＣＤ４７のＮ末端のピログルタミン酸を含むアピカルエピトープ上のＣＤ４７−ＩｇＶに結合するＳＩＲＰα−ＩｇＶを示す。この構造は、どのように細胞表面膜貫通型タンパク質同士が、頭と頭が向き合う配向で隣接する細胞と生産的に相互作用するのかを十分に説明する。Ｂ６Ｈ１２のＦａｂとの複合体におけるＣＤ４７−ＩｇＶのＸ線結晶学的構造は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図１１Ｂに示される。明瞭化のために、Ｆａｂの定常領域（ＣＨ１とＣＬ）は図中で省略されており、ＦＶ（ＶＨとＶＬ）のみが示されている。これは、アピカル結合部位を示しており、細胞膜から非常に離れた末端部の表面上にこの抗体が位置することを示した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図１１Ｂ）。Ｂ６Ｈ１２によるＳＩＲＰαブロッキングのメカニズムはこの構造から明白である。この配向は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される図１１において、細胞膜の相対的位置が破線で示されることを意図する。
【０２６６】
本開示の抗体の標的エピトープを判定するために、ＣＤ４７−ＩｇＶドメインと２Ａ１−ｘｉのＦａｂ（ヒトＣＨ１とＣＬドメインを有するキメラ型抗体）の共複合体のＸ線結晶構造を判定した（米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示される図１１Ｃ）。明瞭化のために、Ｆａｂの定常領域（ＣＨ１とＣＬ）は図中で省略されており、ＦＶ（ＶＨとＶＬ）のみが示されている。以前に判定された頭と頭とが向き合うように配向するＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合構造（図１１Ａ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）、および膜から離れたアピカルに位置するＢ６Ｈ１２抗体（図１１Ｂ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）とは異なり、ＣＤ４７との複合体における２Ａ１の構造は、ＣＤ４７に対する抗体の膜近くの結合が、予期せぬ特異な頭と側面とが向き合う配向（ｈｅａｄ  ｔｏ  ｓｉｄｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）であることを明らかにした（図１１Ｃ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）。ＣＤ４７上の２Ａ１エピトープは不連続であり、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７（すなわち、シグナル配列［アミノ酸１−１８］を除いたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）に従って番号付けした場合に、ＣＤ４７の残基Ｙ３７、Ｋ３９、Ｋ４１、ＫＧＲＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）ループ（残基４３−４６）、Ｄ５１、Ｈ９０、Ｎ９３、Ｅ９７、Ｔ９９、Ｅ１０４、およびＥ１０６を含む。ＣＤ４７に結合した２Ａ１の構造はさらに、ＶＨがＣＤ４７のＫＧＲＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）ループへの結合に基本的に関与し、他方でＶＫドメインが、Ｙ３７、Ｔ１０２およびＥ１０４を含むアピカル残基（ＳＩＲＰα結合に関与する）と相互作用することを明らかにする：すべてのＳＥＱ  ＩＤ参照番号は、米国特許出願第１３／９６０，１３６号（公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９）に開示される。したがって、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を物理的に不可能にするものは、基本的にＶＫドメインである。これらの構造研究は、２Ａ１が結合する特異なエピトープがＣＤ４７の側面に存在することを示唆する。本発明の技術分野において既知のＣＤ４７抗体とは対照的に、膜の近位置における２Ａ１ＶＨ領域の配向は、この抗体が隣接する細胞上のＣＤ４７分子に架橋できないように拘束することによって有意なレベルの赤血球凝集を妨げるという、この抗体の重要な特性である。
【０２６７】
＜実施例１２＞
＜血小板枯渇に対するアイソタイプとアイソタイプの突然変異の効果＞
標的細胞除去に関する抗体（例えばＣＤ４７抗体）の主要なＦｃ依存性機能は、Ｆｃ領域へのＣｌｑの結合によって開始される補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）；Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞および好中球）上の主要なＦｃγＲＩＩＩａを伴うＦｃ領域との相互作用によって媒介される、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）；および、ＦｃγＲＩを介したオプシン化（ｏｐｓｉｎｉｚｅｄ）標的細胞の認識を通じて、マクロファージによって実行される抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）である。抗体のサブクラスは、Ｆｃ依存性エフェクター活性を媒介する能力に違いがある。ヒトでは、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のサブクラスは、Ｃｌｑに結合することによってＣＤＣに対する高い効能を有する。さらに、ＩｇＧ１サブクラスは、ＦｃγＲに対する最も高い親和性を有しており、その結果としてＡＤＣＣおよびＦｃ依存性ＡＤＣＰに関して最も強力なものである。ＩｇＧ４サブクラスは、Ｃｌｑ結合能を欠いており、およびＦｃγＲ結合親和力が大幅に低下しており、その結果としてエフェクター機能がかなりの程度低下している。
【０２６８】
血小板枯渇に対する、ＣＤ４７を結合する抗体の効果を調べた。ＣＤ４７に結合するＩｇＧ１サブクラスの抗体の単回投与によるカニクイザルの処置は、試験されたすべての用量（１０、３０、１００ｍｇ／ｋｇ）において血小板の有意な枯渇に帰結したが（図１２Ｃ−Ｄ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）、これに対してビヒクルを投与した場合には血小板の有意な枯渇はなかった（図１２Ａ−Ｂ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）。したがって、ＣＤ４７を結合するＩｇＧ１サブクラスの抗体は、Ｆｃ依存性の方法で血小板の枯渇をもたらし得る。
【０２６９】
抗体の異なるサブクラスもまた血小板枯渇を引き起こすかどうかを判定するために、ＩｇＧ４サブクラスのＣＤ４７抗体を用いて試験を繰り返した。ＣＤ４７を結合する抗体のＩｇＧ４サブクラス（抗体のヒンジ領域を安定させる変異Ｓ２２８Ｐを有するＩｇＧ４Ｐ）もまた、ＩｇＧ１サブクラスバージョンに対してより少ない程度であったとはいえ、試験されたすべての濃度において血小板の枯渇をもたらした（図１２Ｅ−Ｆ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）。次に、抗ＣＤ４７抗体のＩｇＧ４サブクラスの変異形態（ＦｃγＲ結合を減じるＬ２３５Ｅ変異と共にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４ＰＥ）を、血小板枯渇に関して試験した（図１２Ｇ−Ｈ、米国特許出願第１３／９６０，１３６号［公開番号ＵＳ２０１４０１４０９８９］に開示）。驚いたことに、非常に高い投与量（１００ｍｇ／ｋｇ）においても、ＩｇＧ４ＰＥ抗体は血小板の枯渇をもたらさなかった。したがって、ＦｃγＲ結合とエフェクター機能が非常に低下したＣＤ４７結合抗体は、血小板枯渇をもたらさない。
【０２７０】
＜実施例１３＞
＜ＣＤ４７抗体の赤血球（ＲＢＣ）枯渇活性＞
Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  らは、マウスＣＤ４７を結合したＣＤ４７抗体、または親和性の進化したＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質を、マウスおよび／またはカニクイザルに投与した場合に、赤血球の減少および貧血症が観察されることを発見した。Ｗｅｉｓｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＩＲＰα  Ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｔｏ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；３４１：８８を参照されたい。本明細書に提示される本発明に先立って、ＳＩＲＰαをブロックし、かつＦｃ領域を包むすべての既知のＣＤ４７結合分子（例えば、ＣＤ４７抗体および組換えＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質）もまた、ＲＢＣ枯渇を誘導した。
【０２７１】
インビボでの赤血球枯渇に対する、ＳＩＲＰαブロッキング、すなわち本明細書に開示の非赤血球凝集ＣＤ４７抗体の効果を判定するために試験を行った。驚いたことに、本明細書に開示の非赤血球凝集ＣＤ４７抗体は、投与後に有意な赤血球枯渇を引き起こさない。具体的には、ＡＢ０６．１２抗体のＩｇＧ４−ＰおよびＩｇＧ４−ＰＥ変異体を、静脈注射により１０、３０および１００ｍｇ／ｋｇの投与量でカニクイザルに与えた。各抗体に対して、用量群ごとに３匹のサルを使用した。赤血球数を経時的にモニタリングし、およびビヒクルで処置したサルと比較した。図１３は、抗体で治療したサルからのＲＢＣの平均数を示し、ビヒクルで処置したサルのＲＢＣの平均数に正規化されている。ビヒクルで処置された動物と比較して、抗体で処置されたサルでは有意なＲＢＣ枯渇は観察されず、非赤血球凝集ＣＤ４７は高用量で投与することが可能であり、かつ被験体に貧血症をもたらさないことが実証された。
【０２７２】
＜実施例１４＞
＜ＣＤ４７とＴＳＰ−１の競合研究＞
試験ＣＤ４７抗体の結合の特異性を特徴づけるために、試験を行った。ＣＤ４７は、他のタンパク質の中でもＳＩＲＰαとＴＳＰ−１にトランス相互作用（ｔｒａｎｓ−ｉｎｔｅｒａｃｔ）することができ、およびこれらの試験は、一方または両方のリガンドへのＣＤ４７の結合に試験抗体が干渉し得るかどうかを判定することを目指した。表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）と呼ばれる生化学的プラットフォームを使用して、組換えＣＤ４７およびＴＳＰ−１タンパク質の結合動態を評価した。まず、ＣＤ４７の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）とＴＳＰ−１の間に結合を確立した；続いて、ＣＤ４７とＴＳＰ−１の相互作用を妨害する性能を評価するために、試験抗体を導入した。結果は、試験抗体がＴＳＰ１へのＣＤ４７−ＥＣＤの結合をブロックしないことを実証する。
【０２７３】
さらに、ＣＤ４７への結合に関して、ＴＳＰ−１が試験抗体と競合するかどうかを問うことにより、試験抗体の相互作用の特異性を評価するために、細胞試験をさらに行った。この試験に使用された物質には、以下が含まれる：
・ＣＣＲＦ−ＣＥＭの腫瘍細胞系
・抗ＣＤ４７試験抗体：０．０２μｇ／ｍｌ
・抗ＣＤ４７−１Ａ２抗体ＩｇＧ２、マウスの背骨：０．０２μｇ／ｍｌ（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃ＬＳ−Ｃ１８８３２７）
・抗ＣＤ４７−２Ｄ３抗体ＩｇＧ１、マウスの背骨：０．０２μｇ／ｍｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１４０４７９）
・抗ＣＤ４７−Ｂ６Ｈ１２抗体ＩｇＧ１、マウスの背骨：０．０２μｇ／ｍｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃１４０４７８）
・組換えＴＳＰ−１：ＴＳＰ−１：０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０μｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  ＃３０７４−ＴＨ−５０）
・ＩｇＧアイソタイプ対照（Ｅｕｒｅｋａ）
・ヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ａ−２１４４５）
【０２７４】
細胞を完全なＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳで培養し、細胞を採取し、および冷たい１×ＰＢＳで洗浄した。それらを２×１０６細胞／ｍＬでＦＡＣＳ緩衝液（１％のＢＳＡ、１×ＰＢＳ）中で再懸濁し、および５０μＬ（１００Ｋ細胞／ウェル）をＵ底プレートの各ウェルに加えた。ＴＳＰ−１を、氷の上で１時間ＣＣＲＦ−ＣＥＭでインキュベートしたＦＡＣＳ緩衝液に希釈した。ＣＤ４７抗体を加え、および細胞を氷の上で追加の時間、インキュベートし、続いていくつかの冷たい１×ＰＢＳで洗浄した。１００μＬ／ウェルの二次Ａｂ（１０μｇ／ｍｌ）を適切なウェルに加え、暗やみで氷の上で３０分インキュベートした。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、およびＦＡＣＳによって分析した（１０，０００の事象）。
【０２７５】
ＣＤ４７抗体、試験抗体、ＣＤ４７−１Ａ４およびＣＤ４７−Ｂ６Ｈ１２を、１：６００のＡｂ：ＴＳＰ−１の比率で評価し、ここで抗体は０．０２または０．０５μｇ／ｍｌで存在し、およびＴＳＰ−１を０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０μｇ／ｍｌ加えた。結果（本明細書の上記に開示される図１Ａ−Ｂを参照）は、ＴＳＰ−１が、ＣＤ４７に結合する試験抗体とは競合しないが、ＣＤ４７に結合する他のＣＤ４７抗体、Ｂ６Ｈ１２（〜８０％）、２Ｄ３（〜４０％）および１Ａ２（〜５０％）と競合することを明らかにした。
【０２７６】
＜実施例１５＞
＜癌幹細胞ＣＤ４７の発現および抗ＣＤ４７の有効性＞
癌幹細胞（ＣＳＣ）とＣＤ４７の関係を検討するために、特に、より多くの幹様集団がより高レベルのＣＤ４７を発現するかどうか、および抗ＣＤ４７抗体での処置が癌幹細胞の生存率に好ましく影響するかどうかを検討するために、ＭＣＦ７乳癌細胞系を使用して試験を行った。試験はＥＲ＋／ＰＲ＋／Ｈｅｒ−２＋ＭＣＦ７乳癌細胞系を使用し、単層として３Ｄ培養で培養され、および密集してしっかり結合したマンモスフェアの形成を誘導して潜在的により多くの幹細胞様特性を誘発した。実験プロトコルは、単層培養のための３７℃、５％のＣＯ２でのインキュベーションを含み、４日間、培養培地（ＥＭＥＭ、１０％のウシ胎仔血清、１％の非必須アミノ酸）中に２０，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、６ウェルプレートの表面に細胞を付着させた。マンモスフェア培養については、７日間、完全なＭａｍｍｏｃｕｌｔ培地で、４０，０００細胞／ウェルの播種密度で、極めて低い付着の６ウェルプレート上で細胞を成長させた。
【０２７７】
細胞を以下のプロトコルに従って処置し、および各処置を４回繰り返した。以下の処置グループを、単層培養とマンモスフェア培養の両方において評価した：対照−抗体なし；抗ＣＤ４７抗体Ｂ６Ｈ１２−培養の１日目と３日目に２．５μｇ／ｍｌ；抗ＣＤ４７試験抗体−培養の１日目と３日目に２．５μｇ／ｍｌ。マンモスフェア数および細胞の生存率（マンモスフェア培養のみ）、Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒｇｌｏの細胞増殖と生存率、全ウェルから抽出されたｍＲＮＡによって判定されるＣＤ４７遺伝子発現；ＪＡＧ１の幹標識遺伝子発現分析、およびＡＬＤＨと細胞の存在に関して染色された細胞によって判定される幹フローマーカーを、評価した。
【０２７８】
この試験は、単層培養中の細胞と比較してＪＡＧ１、幹細胞マーカーおよびＣＤ４７を有意により高いレベルで発現するＣＳＣが、マンモスフェア培養中のＭＣＦ−７乳癌細胞に豊富であることを明らかにし、ＣＤ４７が癌幹細胞でアップレギュレートされ得ることを示唆した。腫瘍細胞増殖は、マンモスフェア培養においてＢ６Ｈ１２によって多少抑制され、および試験ＣＤ４７抗体で処理されたマンモスフェア培養においては非常に慎ましく抑制される。ＣＤ４７発現は、Ｂ６Ｈ１２または試験ＣＤ４７抗体で処理された単層とマンモスフェアの培養においてダウンレギュレートされる。ＪＡＧ１、幹標識遺伝子の発現もまた、試験ＣＤ４７抗体で処理された培養においてダウンレギュレートされる。要約すると、この試験からの発見（上記の図２Ａ−Ｄを参照）は、癌幹細胞集団においてＣＤ４７がアップレギュレートされ得ること、およびＣＤ４７のブロックは結果としてＣＳＣの成長と保全を遅らせ得ることを示唆する。ＣＤ４７の阻害は、乳癌および相当な癌幹細胞集団を伴う他の癌の処置を発展させるのに有益であり得る。他の細胞系および一次細胞サンプルにおけるさらなる研究によって、この発見が乳癌だけでなく他の固形腫瘍または血液系悪性腫瘍におよぶかどうかが明らかになるだろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際調査報告】
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