(57)【要約】  本発明の目的は、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）が関与する疾患に対する治療および診断に有用なモノクローナル抗体またはその使用方法を提供することにある。  本発明は、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む治療薬、および該抗体または該抗体断片を含む診断薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域が配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域が配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項２】
抗体の重鎖可変領域が配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域が配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項３】
システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２を介するアミノ酸の細胞内取り込みを阻害する請求項１または２に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項４】
細胞障害活性を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項５】
細胞障害活性が抗体依存性障害活性または補体依存性障害活性である請求項４に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項６】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項７】
遺伝子組換え抗体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項８】
ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項７に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
【請求項１３】
請求項９に記載のハイブリドーマ、または請求項１２に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、培養物からモノクローナル抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２が関与する疾患の治療薬。
【請求項１５】
システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２が関与する疾患が癌である請求項１４に記載の治療薬。
【請求項１６】
癌が血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌または前立腺癌である請求項１５に記載の治療薬。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いるシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２の免疫学的検出または測定方法。
【請求項１８】
免疫学的測定方法が免疫沈降法である請求項１７に記載の検出または測定方法。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いるシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２が発現する細胞の免疫学的検出または測定方法。
【請求項２０】
免疫学的検出方法が蛍光細胞染色法である請求項１９に記載の検出または測定方法。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を含むシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２の免疫学的検出用または測定用試薬。
【請求項２２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を含むシステムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２が関与する疾患の診断薬。
【請求項２３】
システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２が関与する疾患が癌である請求項２２に記載の診断薬。
【請求項２４】
癌が血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌または前立腺癌である請求項２３に記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ｓｙｓｔｅｍ  ＡＳＣ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ  ２、以下、ＡＳＣＴ２と表記する）の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む治療薬、および該抗体または該抗体断片を含む診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＳＣＴ２ポリペプチドは全長５４１アミノ酸からなる１０回膜貫通蛋白質であり、ナトリウムイオン依存的に細胞膜を介して中性アミノ酸を輸送するトランスポーターとして機能する。【０００３】
アミノ酸トランスポーターは基質特異性などの機能的特徴に基づきいくつかの“システム”に分類されているが、ＡＳＣＴ２はシステムＡＳＣに属し、ナトリウムイオン依存性にＬ−アラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミンなどの中性アミノ酸の細胞内取り込みに機能する（非特許文献１）。【０００４】
また、ＡＳＣＴ２は、タイプＤサルレトロウイルスと３つのタイプＣウイルス［ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、ヒヒ内因性ウイルス、鳥類細網内皮症ウイルス］とが共有するウイルスの細胞表面レセプターである（非特許文献２、３）。【０００５】
ＡＳＣＴ２の名称としては、ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｅｕｔｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｔｙｐｅ  ２、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＡＡＡＴ、ｎｅｕｔｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｂ、ＡＴＢ、ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｂ０、ＡＴＢ０、ＡＴＢＯ、ｂａｂｏｏｎ  Ｍ７  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｍ７Ｖ１、Ｍ７ＶＳ１、ｉｎｓｕｌｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＦＬＪ３１０６８、ＲＤ１１４  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＤ１１４／ｓｉｍｉａｎ  ｔｙｐｅ  Ｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＤＲ、ＲＤＲＣ、またはＲ１６が知られている（非特許文献１、３）。【０００６】
さらに、ＡＳＣＴ２の別の名称としては、Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １（ｎｅｕｔｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ），ｍｅｍｂｅｒ  ５、Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  １  ｍｅｍｂｅｒ  ５、またはＳＬＣ１Ａ５が知られており、ＳＬＣ１ファミリーに属する。【０００７】
癌とＡＳＣＴ２またはＳＬＣ１Ａ５の発現との関係に関しては、ＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ）データベースを用いた検討でＳＬＣ１Ａ５、ＳＬＣ７Ａ５およびＳＬＣ３８Ａ５の３つが癌組織で顕著に発現が亢進していることが知られている（非特許文献４）。【０００８】
また、正常の肝臓においてＳＬＣ１Ａ５の発現は全く認められないのに対して、肝細胞癌や肝芽腫の臨床組織においてＳＬＣ１Ａ５の発現が認められる（非特許文献５）。さらに、低分化星状細胞腫や多形性膠芽腫の臨床組織においても正常組織と比べてＳＬＣ１Ａ５の発現が亢進している（非特許文献６）。【０００９】
また、大腸癌と前立腺癌の臨床組織においてＡＳＣＴ２の発現が免疫組織染色やウェスタンブロッティングによって検出され、ＡＳＣＴ２の発現が高い患者では予後が悪い（非特許文献７、８）。【００１０】
さらに、大腸癌、肝癌、乳癌、星状細胞腫および神経芽細胞腫の幾つかの細胞株において、グルタミンの取り込みがＡＳＣＴ２により担われている（非特許文献９〜１２）。ＡＳＣＴ２の基質であるアラニン−セリン−スレオニン混合物を用いてグルタミンの細胞内取り込みを競合阻害させることにより、細胞の増殖が抑制される（非特許文献９）。【００１１】
ＡＳＣＴ２に結合する抗体としては、ヒトＡＳＣＴ２の細胞内Ｎ末端やＣ末端の部分ペプチドに対するポリクローナル抗体が知られている（非特許文献１３、１４、１５）。【００１２】
生体内において、抗体が細胞膜上に発現している抗原蛋白に結合すると、抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）や補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）などの抗体の有するエフェクター活性による細胞障害が誘導されることが知られている（非特許文献１６）。【００１３】
また、ヒトＡＳＣＴ２を認識するポリクローナル抗体が、ライフスパンバイオサイエンス社（カタログ番号：ＬＳ−Ｃ１６８４０およびＬＣ−Ｃ３１８８７）、アビアシステムズバイオロジー社（カタログ番号：ＡＲＰ４２２４７＿Ｔ１００）、サンタクルーズバイオテクノロジー社（カタログ番号：ｓｃ−５０６９８およびｓｃ−５０７０１）、またはミリポア社（カタログ番号：ＡＢ５４６８）から市販されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，１８６５７（１９９６）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，２１２９（１９９９）
【非特許文献３】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３，４４７０（１９９９）
【非特許文献４】Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，２５４（２００５）
【非特許文献５】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８３，Ｇ１０６２（２００２）
【非特許文献６】ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ，１５，５７５（２００４）
【非特許文献７】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，２５５５（２００２）
【非特許文献８】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３，３４１３（２００３）
【非特許文献９】Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０，１４９（２０００）
【非特許文献１０】Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１７６，１６６（１９９８）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６６，９５９（２００１）
【非特許文献１２】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８２，Ｃ１２４６（２００２）
【非特許文献１３】Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６，２４９（２００４）
【非特許文献１４】Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８１，Ｃ９６３（２００１）
【非特許文献１５】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３８２，２７（２００４）
【非特許文献１６】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
非特許文献１３〜１５に記載の抗体はいずれもＡＳＣＴ２の細胞内部分を認識する抗体である為、細胞の細胞膜上に発現しているＡＳＣＴ２に結合することができない。【００１６】
また、非特許文献１６に記載の抗体は細胞の細胞膜上に発現しているＡＳＣＴ２に結合することができない為、これらエフェクター活性による細胞障害は期待できない。また、これらの抗体はいずれもＡＳＣＴ２の細胞内部分を認識する抗体である為、生きた細胞に発現しているＡＳＣＴ２によるアミノ酸の細胞内取り込みを阻害することができない。【００１７】
さらに、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識して結合し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体は知られていない。【００１８】
したがって、本発明の課題は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を提供することにある。また、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む治療薬、および該抗体または該抗体断片を含む診断薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）が配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）が配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（以下、ＡＳＣＴ２と表記する）の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
（２）抗体のＶＨが配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含み、抗体のＶＬが配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片。
（３）ＡＳＣＴ２を介したアミノ酸の細胞内取り込みを阻害する（１）または（２）に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（４）細胞障害活性を有する（１）〜（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（５）細胞障害活性が抗体依存性障害（ＡＤＣＣ）活性または補体依存性障害（ＣＤＣ）活性である（４）に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（６）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（７）遺伝子組換え抗体である、（１）〜（６）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（８）ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（７）に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片。
（９）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
（１０）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１１）（１０）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１２）（１１）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１３）（９）に記載のハイブリドーマ、または（１２）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、培養物からモノクローナル抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片の製造方法。
（１４）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するＡＳＣＴ２が関与する疾患の治療薬。
（１５）ＡＳＣＴ２が関与する疾患が癌である（１４）に記載の治療薬。
（１６）癌が血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌または前立腺癌である（１５）に記載の治療薬。
（１７）（１）〜（８）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いるＡＳＣＴ２の免疫学的検出または測定方法。
（１８）免疫学的測定方法が免疫沈降法である（１７）に記載の検出または測定方法。
（１９）（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を用いるＡＳＣＴ２が発現する細胞の免疫学的検出または測定方法。
（２０）免疫学的検出方法が蛍光細胞染色法である（１９）に記載の検出または測定方法。
（２１）（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含むＡＳＣＴ２の免疫学的検出用または測定用試薬。
（２２）（１）〜（８）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を含むＡＳＣＴ２が関与する疾患の診断薬。
（２３）ＡＳＣＴ２が関与する疾患が癌である（２２）に記載の診断薬。
（２４）癌が血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌または前立腺癌である（２３）に記載の診断薬。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを導入して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法を提供することができる。【００２１】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は、ＡＳＣＴ２が関与する疾患の治療薬および診断薬等に用いることができ、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１（Ａ）】図１（Ａ）は、ＮＭ＿００５６２８とＨＣＨＯＮ２００１７１２のアライメントを示す。塩基配列が一致した箇所を＊印で示す。
【図１（Ｂ）】図１（Ｂ）は、ＮＭ＿００５６２８とＨＣＨＯＮ２００１７１２のアライメントを示す。塩基配列が一致した箇所を＊印で示す。
【図１（Ｃ）】図１（Ｃ）は、ＮＭ＿００５６２８とＨＣＨＯＮ２００１７１２のアライメントを示す。塩基配列が一致した箇所を＊印で示す。Ｑ−ＰＣＲで用いた増幅用プライマーの設計位置（Ｆｗ＃１はＮＭ＿００５６２８の塩基番号２２８１から２３０１、ＨＣＨＯＮ２００１７１２の塩基番号１６８９から１７０９、Ｒｖ＃１はＮＭ＿００５６２８の塩基番号２７３９から２７１９の逆鎖、ＨＣＨＯＮ２００１７１２の２１３９から２１１９の逆鎖）を下線で示す。
【図１（Ｄ）】図１（Ｄ）は、ＮＭ＿００５６２８とＨＣＨＯＮ２００１７１２のアライメントを示す。塩基配列が一致した箇所を＊印で示す。Ｑ−ＰＣＲで用いた増幅用プライマーの設計位置（Ｆｗ＃１はＮＭ＿００５６２８の塩基番号２２８１から２３０１、ＨＣＨＯＮ２００１７１２の塩基番号１６８９から１７０９、Ｒｖ＃１はＮＭ＿００５６２８の塩基番号２７３９から２７１９の逆鎖、ＨＣＨＯＮ２００１７１２の２１３９から２１１９の逆鎖）を下線で示す。
【図２（Ａ）】図２（Ａ）は、癌細胞株、ゼノグラフト、正常組織および臨床癌組織におけるＡＣＳＴ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す。
【図２（Ｂ）】図２（Ｂ）は、癌細胞株、ゼノグラフト、正常組織および臨床癌組織におけるＡＣＳＴ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を示す。
【図３】図３（ａ）は、ベクター導入ＣＨＯ細胞（Ｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ）に対するマウスＩｇＧ１抗体の反応性を蛍光細胞染色（フローサイトメーター）によって測定した結果を示す。図３（ｂ）は、ベクター導入ＣＨＯ細胞（Ｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ）に対する抗ｍｙｃ抗体（Ａｎｔｉ−Ｍｙｃ）の反応性を蛍光細胞染色（フローサイトメーター）によって測定した結果を示す。図３（ｃ）は、ベクター導入ＣＨＯ細胞（Ｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ）に対する抗Ｈｉｓ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ）の反応性を蛍光細胞染色（フローサイトメーター）によって測定した結果を示す。図３（ｄ）は、固定化したヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対するマウスＩｇＧ１抗体の反応性を蛍光細胞染色（フローサイトメーター）によって測定した結果を示す。図３（ｅ）は、固定化したヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対する抗ｍｙｃ抗体（Ａｎｔｉ−Ｍｙｃ）の反応性を蛍光細胞染色（フローサイトメーター）によって測定した結果を示す。図３（ｆ）は、固定化したヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対する抗Ｈｉｓ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ）の反応性を蛍光細胞染色（フローサイトメーター）によって測定した結果を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。抗体を黒の塗りつぶしで、バッファーを白の曲線でそれぞれ示す。
【図４】図４は、ＡＳＣＴ２のＮ末ペプチドに対するモノクローナル抗体ＫＭ３８４２のバンディングＥＬＩＳＡにおけるＡＳＣＴ２のＮ末ペプチドに対する反応性を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は吸光度比（ＯＤ４１５／４９０）を示す。ヒトＡＳＣＴ２のＮ末ペプチド−ＴＨＹコンジュゲートを用いた場合の吸光度比を▲印で、コントロールペプチド−ＴＨＹコンジュゲートを用いた場合の吸光度比を■印でそれぞれ示す。
【図５】図５（ａ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ３９９８の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対する反応性を示す。図５（ｂ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ３９９８の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるベクター導入ＣＨＯ細胞（Ｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ）に対する反応性を示す。図５（ｃ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ３９９８の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるＫＭＳ−１１に対する反応性を示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。ＫＭ３９９８を黒の塗りつぶしで、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢを白の曲線でそれぞれ示す。
【図６】図６（ａ）および（ｂ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対する反応性を示す。図６（ｃ）および（ｄ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるベクター導入ＣＨＯ細胞（Ｖｅｃｔｏｒ／ＣＨＯ）に対する反応性を示す。図６（ｅ）および（ｆ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるＫＭＳ−１１に対する反応性を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。ＫＭ５１１の平均蛍光強度を●印と実線で、ＫＭ４０００の平均蛍光強度を■印と実太線で、ＫＭ４００１の平均蛍光強度を▲印と点線で、ＫＭ４００８の平均蛍光強度を○印と点線で、ＫＭ４０１２の平均蛍光強度を□印と点線で、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢの平均蛍光強度を□印と実線で、ＫＭ４０１８の平均蛍光強度を▲印と実太線でそれぞれ示す。
【図７】図７は抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ３９９８のヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒのグルタミン依存性増殖に対する抑制活性を示す。横軸はＫＭ３９９８の最終濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は抗体未処理細胞における増殖を１００％とした時の相対値（％）を示す。ＫＭ３９９８の相対増殖率を◆印と実線で、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢの相対増殖率を×印と実線で、ＡＳＴ混合液の相対増殖率を点線でそれぞれ示す。
【図８】図８（ａ）および（ｂ）は、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８のヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒのグルタミン依存性増殖に対する抑制活性を示す。横軸は各抗体の最終濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は抗体未処理細胞における増殖を１００％とした時の相対値（％）を示す。ＫＭ４０００の相対増殖率を◆印と実線で、ＫＭ４００１の相対増殖率を■印と実線で、ＫＭ４００８の相対増殖率を△印と実線で、ＫＭ４０１２の相対増殖率を○印と実線で、ＫＭ５１１の相対増殖率を×印と実線で、ＫＭ４０１８の相対増殖率を■印と実線で、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢの相対増殖率を×印と実線で、ＡＳＴ混合液の相対増殖率を点線でぞれぞれ示す。
【図９】図９（ａ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対する反応性を示す。図９（ｂ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるヒト多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ−２に対する反応性を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。ｃＫＭ４００８の平均蛍光強度を○印と実線で、ｃＫＭ４０１２の平均蛍光強度を△印と実線で、ｃＫＭ４０１８の平均蛍光強度を■印と実線でそれぞれ示す。
【図１０】図１０は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体のヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１に対するＡＤＣＣ活性を示す。横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＡＤＣＣ活性を示す。ｃＫＭ４００８のＡＤＣＣ活性を○印と実線で、ｃＫＭ４０１２のＡＤＣＣ活性を△印と実線で、ｃＫＭ４０１８のＡＤＣＣ活性を■印と実線でそれぞれ示す。
【図１１】図１１（ａ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体のヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対するＣＤＣ活性を示す。図１１（ｂ）は、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に対するＣＤＣ活性を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸はＣＤＣ活性を示す。ｃＫＭ４００８のＣＤＣ活性を○印と実線で、ｃＫＭ４０１２のＣＤＣ活性を△印と実線で、ｃＫＭ４０１８のＣＤＣ活性を■印と実線でそれぞれ示す。
【図１２】図１２は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体のヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒのグルタミン依存性増殖に対する抑制活性を示す。横軸は各抗体の最終濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は抗体未処理細胞における増殖を１００％とした時の相対値（％）を示す。ｃＫＭ４００８の相対増殖率を○印と実線で、ＫＭ４０１２の相対増殖率を△印と実線で、ＫＭ４０１８の相対増殖率を■印と実線で、ＫＭ５１１の相対増殖率を＋印と実線で、ＡＳＴ混合液の相対増殖率を点線でぞれぞれ示す。
【図１３】図１３（ａ）は、ヒトＡＳＣＴ２蛋白質の模式図を示す。図１３（ｂ）は、マウスＡＳＣＴ２蛋白質の模式図を示す。推定細胞外領域（ＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３、ＥＬ４およびＥＬ５）においてヒトとマウスで異なるアミノ酸を黒色で示す。
【図１４】図１４（ａ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（ＡＳＣＴ２／ＣＨＯ）に対する反応性を示す。図１４（ｂ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３の蛍光細胞染色（フローサイトメーター）におけるヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１に対する反応性を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は平均蛍光強度を示す。ＨＶ２ＬＶ３の平均蛍光強度を○印と実線で、ＨＶ１０ＬＶ３の平均蛍光強度を△印と実線で、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８の平均蛍光強度を■印と実線でそれぞれ示す。
【図１５】図１５（ａ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３のヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１に対するＡＤＣＣ活性を示す。図１５（ｂ）は、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３のヒト多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１に対するヒト小細胞肺癌株ＳＢＣ−３に対するＡＤＣＣ活性を示す。横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）、縦軸はＡＤＣＣ活性を示す。ＨＶ２ＬＶ３のＡＤＣＣ活性を○印と実線で、ＨＶ１０ＬＶ３のＡＤＣＣ活性を△印と実線で、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８のＡＤＣＣ活性を■印と実線でそれぞれ示す。
【図１６】図１６は、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３のヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に対するＣＤＣ活性を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸はＣＤＣ活性を示す。ＨＶ２ＬＶ３のＣＤＣ活性を○印と実線で、ＨＶ１０ＬＶ３のＣＤＣ活性を△印と実線で、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８のＣＤＣ活性を■印と実線でそれぞれ示す。
【図１７】図１７は、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３のヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒのグルタミン依存性増殖に対する抑制活性を示す。横軸は各抗体の最終濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は抗体未処理細胞における増殖を１００％とした時の相対値（％）を示す。ＨＶ２ＬＶ３の相対増殖率を○印と実線で、ＨＶ１０ＬＶ３の相対増殖率を△印と実線で、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８の相対増殖率を■印と実線で、ＫＭ５１１の相対増殖率を＋印と実線で、ＡＳＴ混合液の相対増殖率を点線でぞれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片に関する。
【００２４】
本発明におけるＡＳＣＴ２としては、特に種を限定するものではないが、好ましくは哺乳動物が挙げられ、具体的にはヒトが挙げられる。
【００２５】
ＡＳＣＴ２のアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）などの公知のデータベースから取得することができる。
【００２６】
例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するヒトＡＳＣＴ２（ＮＣＢＩアクセション番号：ＮＰ＿００５６１９）、または配列番号８６で示されるマウスＡＳＣＴ２（ＮＣＢＩアクセション番号：ＮＰ＿０３３２２７）などが挙げられる。
【００２７】
本発明におけるＡＳＣＴ２としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号２で示されるアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドが挙げられる。
【００２８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列と好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドも本発明のＡＳＣＴ２に包含される。
【００２９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などを用いて、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
【００３０】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
【００３１】
ＡＳＣＴ２をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列が挙げられる。
【００３２】
配列番号１で示される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子も本発明のＡＳＣＴ２をコードする遺伝子に包含される。
【００３３】
また、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子も本発明のＡＳＣＴ２をコードする遺伝子に包含される。
【００３４】
さらに、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつＡＳＣＴ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のＡＳＣＴ２をコードする遺伝子に包含される。
【００３５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
【００３６】
具体的には、ハイブリダイズしたコロニーまたはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物またはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（１９９５）］を行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００３７】
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００３８】
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＡＳＣＴ２をコードする遺伝子に包含される。
【００３９】
本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよい。
【００４０】
塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００４１】
また、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
【００４２】
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ  ｂｌａｓｔ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ  の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ  Ｘ  ｄｒｏｐｏｆｆ  ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎ  の場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
【００４３】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができる。例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。
【００４４】
また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
【００４５】
さらに、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、または配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法およびｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
【００４６】
本発明におけるＡＳＣＴ２の細胞外領域としては、例えば、配列番号２で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）、ＴＭＨＭＭ  ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）またはＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／Ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）などを用いて予測された領域などが挙げられる。
【００４７】
具体的には、ＥｘＰＡＳｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｅｒｖｅｒにおいて予測される細胞外ドメインである７４〜９８番目、１５４〜２２４番目、２８７〜３０５番目、３５７〜３７６番目、および４２０〜４２５番目の５つの領域が挙げられる。
【００４８】
または、文献［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，１８６５７（１９９６）］または［Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７３，４４７０（１９９９）］で予測されている細胞外ドメインである６５〜８８番目、１５２〜２２４番目、２８８〜３０６番目、３６１〜３８０番目、および４４７〜４５１番目の５つの領域が挙げられる。
【００４９】
本発明において、ＡＳＣＴ２の５つの細胞外領域をＮ末側から順にＥＬ１領域、ＥＬ２領域、ＥＬ３領域、ＥＬ４領域およびＥＬ５領域と表す。例えば、配列番号２で示されるＡＳＣＴ２ポリペプチドのアミノ酸配列におけるＥＬ２領域は、１５４〜２２４番目または１５２〜２２４番目である。
【００５０】
本発明のモノクローナル抗体は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合するが、ＡＳＣＴ２の細胞外領域のうち、ＥＬ１〜ＥＬ５領域から選ばれる少なくとも１つの領域に結合することが好ましく、ＡＳＣＴ２の細胞外領域のうち、少なくともＥＬ２領域に結合することがより好ましい。
【００５１】
本発明におけるＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＡＳＣＴ２の細胞外領域が天然状態でとりうる立体構造と同等の立体構造を有していればいずれの構造でもよい。
【００５２】
本発明の抗体または該抗体断片が、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合することは、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたＡＳＣＴ２を発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法、好ましくは蛍光細胞染色法などの特定の抗原を発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を調べることができる方法により確認することができる。
【００５３】
例えば、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いる蛍光抗体染色法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］、フローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ジーイーヘルスケア社製）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法が挙げられる。
【００５４】
また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
【００５５】
ＡＳＣＴ２を発現した細胞としては、ＡＳＣＴ２を発現していればいずれの細胞でもよく、例えばヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株、または遺伝子組換え技術により得られた細胞などが挙げられる。
【００５６】
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発現している細胞が挙げられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで該ＡＳＣＴ２が発現している細胞などが挙げられる。
【００５７】
ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、上記の癌患者から得られた該ＡＳＣＴ２が発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ＡＳＣＴ２を発現している細胞株が挙げられる。
【００５８】
例えば、ヒトから樹立された細胞株である多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１［ヒューマンサイエンス研究資源バンク（ＨＳＲＲＢ）番号：ＪＣＲＢ１１７９］またはＲＰＭＩ８２２６（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ００３４）などが挙げられる。
【００５９】
遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、例えば、該ＡＳＣＴ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより得られる、該ＡＳＣＴ２が発現した細胞などが挙げられる。
【００６０】
本発明におけるモノクローナル抗体としては、例えば、ハイブリドーマにより生産される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
【００６１】
ハイブリドーマは、例えば、上記のＡＳＣＴ２を発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性を有する抗体生産細胞を誘導する。さらに、該抗体生産細胞と骨髄腫細胞とを融合させることにより、調製することができる。
【００６２】
前記ハイブリドーマを培養するか、または該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより抗ＡＳＣＴ２抗体を取得することができる。
【００６３】
抗原を免疫する動物としてはハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、好ましくはマウス、ラット、ハムスターまたはラビットなどを用いる。
【００６４】
また、このような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
【００６５】
本発明のハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマＫＭ３９９８により生産された抗体ＫＭ３９９８、ハイブリドーマＫＭ４０００により生産された抗体ＫＭ４０００、ハイブリドーマＫＭ４００１により生産された抗体ＫＭ４００１、ハイブリドーマＫＭ４００８により生産された抗体ＫＭ４００８、ハイブリドーマＫＭ４０１２により生産された抗体ＫＭ４０１２およびハイブリドーマＫＭ４０１８により生産された抗体ＫＭ４０１８などが挙げられる。
【００６６】
ハイブリドーマＫＭ４００８およびＫＭ４０１２は平成２０年５月１日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６２およびＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９６３として寄託されている（国際公開第２０１０／００８０７５号）。
【００６７】
さらに、上述のハイブリドーマより生産された抗体が結合するエピトープに結合するモノクローナル抗体も本発明のモノクローナル抗体に包含される。
【００６８】
本発明において遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはそれぞれの抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。
【００６９】
遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。遺伝子組換え抗体としては、例えば、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用いて改変したものが挙げられる。
【００７０】
本発明の遺伝子組換え抗体としては、具体的には、以下の（１）〜（３）の抗体が挙げられる。
（１）抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと記す）の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと表記する）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２６、２７および２８で表されるアミノ酸配列を含み、および／または、抗体の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと記す）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２９、３０、３１で表されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体
（２）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３２、３３および３４で表されるアミノ酸配列を含み、および／または、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３５、３６および３７で表されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体
（３）抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号４９、５０および５１で表されるアミノ酸配列を含み、および／または、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３がそれぞれ配列番号５２、５３および５４で表されるアミノ酸配列を含む遺伝子組換え抗体
【００７１】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）および軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体をいう。
【００７２】
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００７３】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、好ましくはｈＩｇＧクラスのものを用いる。さらに、ｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００７４】
また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００７５】
本発明のヒト型キメラ抗体としては、以下の（１）〜（３）が挙げられる。
（１）抗体のＶＨが、配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（２）抗体のＶＨが、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
（３）抗体のＶＨが、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが、配列番号４８で表されるアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体
【００７６】
本発明のヒト型キメラ抗体としては、具体的には、例えばヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８などが挙げられる。
【００７７】
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいい、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、再構成抗体（ｒｅｓｈａｐｅｄ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）などともいう。
【００７８】
本発明のヒト化抗体は、次のようにして製造することができる。ＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと記す）に移植した可変領域（以下、Ｖ領域と記す）をコードするｃＤＮＡを構築する。該ｃＤＮＡをヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築する。該発現ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、本発明のヒト化抗体を製造することができる。
【００７９】
ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。
【００８０】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）などに記載の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列などを用いる。
【００８１】
ヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましい。さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３およびｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
【００８２】
また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることができる。
【００８３】
本発明のヒト化抗体としては、具体的には、以下の（ａ）抗体のＶＨおよび（ｂ）抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体が好ましい。なお、以下の（ａ）および（ｂ）において、導入される改変の数に制限はない。
（ａ）配列番号７１で表されるアミノ酸配列、または配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌ、９番目のＳｅｒ、２０番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３８番目のＡｒｇ、４６番目のＧｌｕ、８６番目のＬｅｕ、９３番目のＶａｌ、９５番目のＴｙｒおよび１１６番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（ｂ）配列番号７２で表されるアミノ酸配列、または配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏ、１５番目のＶａｌ、３８番目のＧｌｎ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、７１番目のＰｈｅおよび８７番目のＴｙｒから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
【００８４】
本発明のヒト化抗体に含まれるＶＨとしては、以下の（１）〜（３）が好ましい。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒ、２０番目のＶａｌ、３８番目のＡｒｇ、４６番目のＧｌｕ、９３番目のＶａｌ、９５番目のＴｙｒおよび１１６番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌ、４６番目のＧｌｕ、９５番目のＴｙｒおよび１１６番目のＶａｌが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕ、および９５番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＨ
【００８５】
前記ＶＨのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００８６】
前記ＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の１〜１０個の改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００８７】
１０個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
【００８８】
９個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００８９】
８個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（４５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
【００９０】
７個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、以下の（１）〜（１９）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００９１】
６個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【００９２】
５個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（６）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００９３】
４個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００９４】
３個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（３５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００９５】
２個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（４５）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および９番目のＳｅｒをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および２０番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および２０番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、および３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（２７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、および８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（２８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（３２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（３７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（３８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の８６番目のＬｅｕをＶａｌに、および９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の８６番目のＬｅｕをＶａｌに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の８６番目のＬｅｕをＶａｌに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（４５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００９６】
１個の改変が導入されたＶＨのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１０）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９番目のＳｅｒをＰｒｏに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の２０番目のＶａｌをＩｌｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３０番目のＳｅｒをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＡｒｇをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の４６番目のＧｌｕをＬｙｓに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の８６番目のＬｅｕをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９３番目のＶａｌをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の９５番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７１で表されるアミノ酸配列中の１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
【００９７】
本発明のヒト化抗体に含まれるＶＬについては、以下の（１）および（２）が好ましい。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、７１番目のＰｈｅ、および８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌ、７１番目のＰｈｅおよび８７番目のＴｙｒが、他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むＶＬ
【００９８】
前記ＶＬのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【００９９】
前記ＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の１〜７個の改変が導入されたアミノ酸配列が挙げられる。
【０１００】
７個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列が挙げられる。
【０１０１】
６個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
【０１０２】
５個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（２１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および４４番目のＰｒｏをＶａｌに置換したアミノ酸配列
【０１０３】
４個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（４）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【０１０４】
３個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（１３）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＴｈｒに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【０１０５】
２個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（２１）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、および１５番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、および３８番目のＧｌｎをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、および４３番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、および４４番目のＰｒｏをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および３８番目のＧｌｎをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および４３番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（９）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および４４番目のＰｒｏをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１０）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、および４３番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（１３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、および４４番目のＰｒｏをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および４４番目のＰｒｏをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（１７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（１８）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＴｈｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（１９）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（２０）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＶａｌに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
（２１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【０１０６】
１個の改変が導入されたＶＬのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下の（１）〜（７）のアミノ酸配列が挙げられる。
（１）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８番目のＰｒｏをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（２）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の１５番目のＶａｌをＬｅｕに置換したアミノ酸配列
（３）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の３８番目のＧｌｎをＡｒｇに置換したアミノ酸配列
（４）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４３番目のＡｌａをＴｈｒに置換したアミノ酸配列
（５）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の４４番目のＰｒｏをＶａｌに置換したアミノ酸配列
（６）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の７１番目のＰｈｅをＴｙｒに置換したアミノ酸配列
（７）配列番号７２で表されるアミノ酸配列中の８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換したアミノ酸配列
【０１０７】
また、本発明のヒト化抗体の具体例としては、以下の（１）〜（１０）の抗体が挙げられる。
（１）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むヒト化抗体
（２）配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（３）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（４）配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（５）配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（６）配列番号７１で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（７）配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（８）配列番号７８で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（９）配列番号８０で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
（１０）配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬの少なくとも一方を含むを含むヒト化抗体
【０１０８】
これらの中でも、配列番号７６で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体、並びに配列番号８２で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＨおよび配列番号８４で表されるアミノ酸配列を含む抗体のＶＬを含むヒト化抗体が好ましい。
【０１０９】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的および発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども本発明のヒト抗体に包含される。
【０１１０】
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
【０１１１】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。
【０１１２】
前記ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【０１１３】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。
【０１１４】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法を用い、ヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることにより作製できる。
【０１１５】
上述のモノクローナル抗体または該抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつ上述の抗体または該抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体または該抗体断片も、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片に包含される。
【０１１６】
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、部位特異的変異導入法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などの周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数である。例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【０１１７】
上記の抗体のアミノ酸配列において１つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、次のことを示す。即ち、同一配列中の任意、かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味する。また、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じる場合もあり、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型いずれの場合もある。
【０１１８】
天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンおよびＬ−システインなどが挙げられる。
【０１１９】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【０１２０】
本発明において、抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【０１２１】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素であるパパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１２２】
本発明のＦａｂは、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体をパパインで処理して得ることができる。
【０１２３】
また、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することもできる。
【０１２４】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を蛋白質分解酵素であるペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有する断片である。
【０１２５】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体をペプシンで処理して得ることができる。また、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させ、作製することもできる。
【０１２６】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することもできる。
【０１２７】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のｓｃＦｖは、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１２８】
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１２９】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は既知の方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖは、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【０１３０】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によって製造することもできる。
【０１３１】
本発明のモノクローナル抗体には、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、または抗体医薬などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
【０１３２】
本発明における、抗体の誘導体は、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体または該抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらにはモノクローナル抗体または該抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、免疫賦活剤、蛋白質または抗体医薬などを化学的手法［抗体工学入門，地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
【０１３３】
また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質または抗体医薬をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
【０１３４】
放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、１９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、または２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。
【０１３５】
キレート剤としては、例えば、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
【０１３６】
低分子の薬剤としては、例えば、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗生物質、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤、またはキナーゼ阻害剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学，癌と化学療法社（１９９６）］、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、またはクレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法，医歯薬出版株式会社（１９８２）］などが挙げられる。
【０１３７】
抗癌剤としては、例えば、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、ＦＭＳ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（Ｆｌｔ３）阻害剤、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｏｔｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）阻害剤、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）阻害剤、イレッサ、タルセバなどのｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）阻害剤、ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、レナリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、カリケアマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タルグレチン、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケ���コナゾール、アミノグルテチミド、スラミン、メトトレキセート、マイタンシノイド、またはその誘導体などが挙げられる。
【０１３８】
低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
【０１３９】
高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的または生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失または抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
【０１４０】
ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、例えば、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などが挙げられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。
【０１４１】
ＰＥＧ化修飾試薬としては、例えば、リジンのε−アミノ基への修飾剤（日本国特開昭６１−１７８９２６号公報）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基への修飾剤（日本国特開昭５６−２３５８７号公報）、またはアルギニンのグアニジノ基への修飾剤（日本国特開平２−１１７９２０号公報）などが挙げられる。
【０１４２】
免疫賦活剤としては、イムノアジュバントとして知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、またはαガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）などが挙げられる。
【０１４３】
蛋白質としては、例えば、ＮＫ細胞、マクロファージおよび好中球などの免疫担当細胞を活性化するサイトカインまたは増殖因子、並びに毒素蛋白質などが挙げられる。
【０１４４】
サイトカインまたは増殖因子としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＮＦと記す）−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦ−γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などが挙げられる。
【０１４５】
毒素蛋白質としては、例えば、リシン、ジフテリアトキシン、またはＯＮＴＡＫなどが挙げられ、毒性を調節するためにタンパク質に変異を導入したタンパク毒素も含まれる。
【０１４６】
抗体医薬としては、例えば、抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原、腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗原、病変部位の血管新生に関与する抗原に対する抗体が挙げられる。
【０１４７】
抗体の結合によりアポトーシスが誘導される抗原としては、例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ  ＩＩ、またはＥｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）などが挙げられる。
【０１４８】
腫瘍の病態形成に関わる抗原または免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、またはＢ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、またはＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、またはＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、またはＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン［ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）β、またはＴＮＦαなど］、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、またはＣＴＡＣＫなど）、またはこれらのケモカインの受容体が挙げられる。
【０１４９】
病変部位の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、例えば、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ＥＧＦ、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、ＩＬ−８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ−１、またはこれらの受容体などが挙げられる。
【０１５０】
蛋白質または抗体医薬との融合抗体は、モノクローナル抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物または真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【０１５１】
上記抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、定量用試薬または診断薬として使用する場合に、本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片に結合する薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。
【０１５２】
標識体としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼおよびルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステルおよびロフィンなどの発光物質並びにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
【０１５３】
また、本発明には、ＡＳＣＴ２によるアミノ酸の細胞内取り込みを阻害するモノクローナル抗体および該抗体断片が包含される。
【０１５４】
本発明の抗体または該抗体断片の、ＡＳＣＴ２によるアミノ酸の細胞内取り込みを阻害する活性を評価する方法としては、例えば、ＡＳＣＴ２を発現している正常細胞や癌細胞に、抗体または該抗体断片を反応させ、グルタミン依存的な増殖が阻害されることを、生細胞数測定試薬など用いて評価する方法［Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０，１４９（２０００）］およびＡＳＣＴ２を発現している正常細胞や癌細胞に、抗体または該抗体断片を反応させ、放射性物質で標識したアラニンなどのアミノ酸の取り込みが阻害されることを、シンチレーションカウンターなどの機器を用いて評価する方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１４８８３（１９９６）］などが挙げられる。
【０１５５】
さらに、本発明には、補体結合細胞傷害（ＣＤＣ）活性、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性などの細胞傷害活性を有するモノクローナル抗体および該抗体断片が包含される。
【０１５６】
本発明の抗体または該抗体断片の抗原陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］により評価することができる。
【０１５７】
さらに、本発明には、アポトーシス誘導活性を有するモノクローナル抗体および該抗体断片が包含される。
【０１５８】
また、本発明には、マウスＡＳＣＴ２に結合せず、かつヒトＡＳＣＴ２に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片が包含される。
【０１５９】
さらに、本発明には、ヒトＡＳＣＴ２の細胞外領域のうち、少なくともＥＬ２領域に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片が包含される。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のうち１５４番目、１５９〜１６０番目、１６３〜１７１番目、１７３〜１７４番目、１７７番目、１８８番目、２０４〜２０５番目、２０７番目、２１０〜２１２番目、または２１４〜２２３番目のアミノ酸から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸に結合するモノクローナル抗体および該抗体断片が含まれる。
【０１６０】
本発明の抗体または該抗体断片の結合特異性を評価する方法としては、公知のエピトープ解析法を用いることができる。例えば、アミノ酸配列情報に従って、適当な箇所をマウスＡＳＣＴ２の配列に置換した、ヒト／マウスキメラＡＳＣＴ２に対する結合活性を測定することにより評価することができる。
【０１６１】
また、本発明は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有するＡＳＣＴ２が関与する疾患の治療薬に関する。
【０１６２】
ＡＳＣＴ２が関与する疾患としては、ＡＳＣＴ２が発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば、癌が挙げられる。
【０１６３】
癌としては、例えば、血液癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、食道癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌および膵臓癌などが挙げられる。これらの中でも、血液癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌および前立腺癌が好ましい。
【０１６４】
血液癌としては、例えば、骨髄性白血病、リンパ性白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫などが挙げられる。
【０１６５】
本発明の治療剤は、上述した本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有する。
【０１６６】
本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよい。通常は、薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
【０１６７】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、経口投与、並びに口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与が挙げられる。これらの中でも静脈内投与が好ましい。
【０１６８】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。
【０１６９】
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、および体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
【０１７０】
さらに、本発明は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を用いるＡＳＣＴ２の免疫学的検出または測定方法、ＡＳＣＴ２が発現する細胞の免疫学的検出または測定方法に関する。
【０１７１】
また、本発明は、ＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ＡＳＣＴ２の免疫学的検出用または測定用試薬およびＡＳＣＴ２が関与する疾患の診断薬に関する。
【０１７２】
本発明においてＡＳＣＴ２の量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法が挙げられる。例えば、免疫学的検出および測定方法などが挙げられる。
【０１７３】
免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、例えば、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウェスタンブロット法および物理化学的手法などが挙げられる。
【０１７４】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いてＡＳＣＴ２が発現した細胞を検出または測定することにより、上記のＡＳＣＴ２が関連する疾患を診断することができる。
【０１７５】
ＡＳＣＴ２が発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができる。免疫学的検出法としては、例えば、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法および免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などの蛍光抗体染色法なども用いることができる。
【０１７６】
本発明においてＡＳＣＴ２を検出または測定する対象となる生体試料としては、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液および培養液など、ＡＳＣＴ２が発現した細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
【０１７７】
本発明のモノクローナル抗体若しくは該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。
【０１７８】
抗原抗体反応を行なうための試薬としては、例えば、緩衝剤および塩などが挙げられる。検出用試薬としては、例えば、該モノクローナル抗体および該抗体断片、これらの誘導体を認識する標識された二次抗体、並びに標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
【０１７９】
以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、および疾患の診断方法について、具体的に説明する。
【０１８０】
１．モノクローナル抗体の製造方法
（１）抗原の調製
抗原となるＡＳＣＴ２またはＡＳＣＴ２を発現させた細胞は、ＡＳＣＴ２全長またはその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入することにより、得ることができる。
【０１８１】
また、ＡＳＣＴ２を多量に発現している各種ヒト腫瘍培養細胞、ヒト組織などからＡＳＣＴ２を精製し、得ることが出来る。また、該腫瘍培養細胞、または該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。
【０１８２】
さらに、Ｆｍｏｃ法およびｔＢｏｃ法などの化学合成法によりＡＳＣＴ２の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
【０１８３】
本発明で用いられるＡＳＣＴ２は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ＡＳＣＴ２をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
【０１８４】
まず、ＡＳＣＴ２をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。
【０１８５】
次に、得られた該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ＡＳＣＴ２を生産する形質転換体を得ることができる。
【０１８６】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製または染色体中への組込みが可能で、ＡＳＣＴ２をコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
【０１８７】
宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、または動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
【０１８８】
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ＡＳＣＴ２をコードする部分を含むＤＮＡ、および転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。
【０１８９】
また、前記組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
【０１９０】
前記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【０１９１】
また、前記ＡＳＣＴ２をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするＡＳＣＴ２の生産率を向上させることができる。
【０１９２】
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、ｐＫＫ２３３―２（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、日本国特開昭６０−２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）およびｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。
【０１９３】
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターおよびＴ７プロモーターなどの、大腸菌またはファージなどに由来するプロモーターが挙げられる。
【０１９４】
また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、またはｌｅｔ  Ｉプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
【０１９５】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９および大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。
【０１９６】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］が挙げられる。
【０１９７】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７  ［日本国特開平３−２２９７９号公報；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、またはｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）などが挙げられる。
【０１９８】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、並びにモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１９９】
宿主細胞としては、例えば、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞およびＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−０００２９９号公報）などが挙げられる。
【０２００】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などが挙げられる。
【０２０１】
以上のようにして得られるＡＳＣＴ２をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、または動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ＡＳＣＴ２を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ＡＳＣＴ２を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【０２０２】
真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖または糖鎖が付加されたＡＳＣＴ２を得ることができる。
【０２０３】
誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを培地に添加してもよい。また、例えば、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
【０２０４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］および１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地並びにこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。
【０２０５】
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【０２０６】
ＡＳＣＴ２をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産または融合蛋白質発現などの方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］を用いることができる。
【０２０７】
ＡＳＣＴ２の生産方法としては、例えば、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、または宿主細胞外膜上に生産させる方法がある。使用する宿主細胞、または生産させるＡＳＣＴ２の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
【０２０８】
ＡＳＣＴ２が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、日本国特開平０５−３３６９６３号公報、または国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ＡＳＣＴ２を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【０２０９】
また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平２−２２７０７５号公報）を利用してＡＳＣＴ２の生産量を上昇させることもできる。
【０２１０】
得られたＡＳＣＴ２は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。
【０２１１】
ＡＳＣＴ２が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、またはダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０２１２】
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法を用い、精製標品を得ることができる。
【０２１３】
単離精製法としては、例えば、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロースおよびフェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法並びに等電点電気泳動などの電気泳動法などが挙げられる。これらの手法は単独または組み合わせて用いてもよい。
【０２１４】
ＡＳＣＴ２が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ＡＳＣＴ２の不溶体を回収する。回収した該ＡＳＣＴ２の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該ＡＳＣＴ２を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【０２１５】
ＡＳＣＴ２またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ＡＳＣＴ２またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０２１６】
また、本発明において用いられるＡＳＣＴ２は、Ｆｍｏｃ法、またはｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社製、パーキン・エルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジインストルメント社製、シンセセル−ベガ社製、パーセプチブ社製、または島津製作所社製などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【０２１７】
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ＡＳＣＴ２ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
【０２１８】
免疫は、動物の皮下、静脈内または腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、または水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。
【０２１９】
抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
【０２２０】
抗原の投与は、１回目の投与の後、１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
【０２２１】
抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。
【０２２２】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を用いる。該株化細胞としては、例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］およびＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが挙げられる。
【０２２３】
該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２−メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、および８−アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
【０２２４】
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）、ＭＥＭ培地およびジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。
【０２２５】
さらに１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、およびアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【０２２６】
培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のバインディングアッセイなどのハイブリドーマの選択方法により、ＡＳＣＴ２を含む抗原に反応し、ＡＳＣＴ２を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。
【０２２７】
（５）精製モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理［２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。
【０２２８】
１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムまたはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧまたはＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【０２２９】
また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、５％ダイゴＧＦ２１を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地に懸濁し、３〜７日間培養する。得られた細胞懸濁液を遠心分離し、得られた上清よりプロテインＡ−カラムまたはプロテインＧ−カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。
【０２３０】
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）モノクローナル抗体の選択
モノクローナル抗体の選択は以下に示す酵素免疫測定法によるバインディングアッセイ、およびアミノ酸の細胞内取り込み阻害アッセイにより行う。
【０２３１】
（６−ａ）バインディングアッセイ
抗原としては、（１）で得られるＡＳＣＴ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞などに導入して得られた遺伝子導入細胞、リコンビナント蛋白質、またはヒト組織から得た精製ポリペプチド若しくは部分ペプチドなどを用いる。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡまたはＫＬＨなどのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製して、これを用いる。
【０２３２】
抗原を９６ウェルプレートなどのプレートに分注し、固相化した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清または精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。ＰＢＳまたはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなどで、よく洗浄した後、第２抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質または放射線化合物などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでよく洗浄した後、第２抗体の標識物質に応じた反応を行ない、免疫原に対し特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
【０２３３】
（６−ｂ）アミノ酸の細胞内取り込み阻害アッセイ
評価細胞として、（１）で得られた、ＡＳＣＴ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを動物細胞などに導入した遺伝子導入細胞、またはＡＳＣＴ２を発現している正常細胞若しくは癌細胞を用いる。
【０２３４】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片のＡＳＣＴ２によるアミノ酸の細胞内取り込みの阻害活性を評価する方法としては、例えば、ＡＳＣＴ２を発現している正常細胞や癌細胞にモノクローナル抗体または該抗体断片を反応させ、グルタミン依存的な増殖が阻害されることを、生細胞数測定試薬などを用いて評価する方法［Ｊ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９０，１４９（２０００）］、およびＡＳＣＴ２を発現している正常細胞や癌細胞にモノクローナル抗体または該抗体断片を反応させ、放射性物質で標識したアラニンなどのアミノ酸の取り込みが阻害されることを、シンチレーションカウンターなどの機器を用いて評価する方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１４８８３（１９９６）］などが挙げられる。
【０２３５】
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０２３６】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
【０２３７】
動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＨＳＧ２７４［Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１ｂｄ２−４［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）］およびｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）］などが挙げられる。
【０２３８】
動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーター［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）〕および免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）］などが挙げられる。
【０２３９】
遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）］を用いるが、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプを用いることもできる。
【０２４０】
タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターとしては、例えば、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）およびｐＥＥ１８［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）］などが挙げられる。
【０２４１】
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
【０２４２】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージまたはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０２４３】
前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分またはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージまたは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。
【０２４４】
組換えファージまたは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
【０２４５】
非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびラビットなどが挙げられるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
【０２４６】
ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、またはＲＮＡ  ｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社製）などのキットなどを用いる。
【０２４７】
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］、またはＯｌｉｇｏ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）、またはＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。
【０２４８】
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］、またはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロジェン社製）若しくはＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）などのキットなどを用いる。
【０２４９】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
【０２５０】
例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３−１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］、またはｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］などを用いる。
【０２５１】
ファージまたはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０２５２】
例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］、またはＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］などを用いる。
【０２５３】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ若しくは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、またはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］などを用いる。
【０２５４】
また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、ＰＣＲ法と表記する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）］を行うことよりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０２５５】
選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【０２５６】
塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］などの反応を行った後、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社製）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
【０２５７】
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。
【０２５８】
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定できる。更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。
【０２５９】
また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
【０２６０】
また、得られたＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴまたはＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］などの相同性検索を行い、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
【０２６１】
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２６２】
非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを作製する。作製されたＶＨおよびＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。
【０２６３】
また、非ヒト抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
【０２６４】
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
【０２６５】
非ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
【０２６６】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］などを用いる。
【０２６７】
抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
【０２６８】
次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
【０２６９】
設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計する。
【０２７０】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。
【０２７１】
ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０２７２】
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。
【０２７３】
ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、および抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
【０２７４】
抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］またはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築および解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有する改変ヒト化抗体を取得できる。
【０２７５】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、改変させることができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０２７６】
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
【０２７７】
例えば、（４）および（５）で得られるヒト化抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
【０２７８】
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
（３）および（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、またはそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０２７９】
発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＯＳ−７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］を用いる［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。
【０２８０】
ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入には、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ（１９９１）］、またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などを用いる。
【０２８１】
発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性は、酵素免疫抗体法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
【０２８２】
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の所得と遺伝子組換え抗体の調製
（３）および（６）で得られた遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平２−２５７８９１号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］などを用いる。
【０２８３】
遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
【０２８４】
例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］、α１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。
【０２８５】
また、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質若しくはＮ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質、または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、例えばα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）などを用いることもできる。
【０２８６】
発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
【０２８７】
動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、またはこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。
【０２８８】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、形質転換株は、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
【０２８９】
遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ−カラムを用いて精製する［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。
【０２９０】
精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］、またはウェスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］など用いて測定することができる。
【０２９１】
３．精製モノクローナル抗体または該抗体断片の活性評価
精製した本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。
【０２９２】
ＡＳＣＴ２発現細胞株に対する結合活性は、前述の１．（６ａ）記載のバインディングアッセイを用いて測定する。また、蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］またはＢｉａｃｏｒｅシステムなどを用いた表面プラズモン共鳴法などを用いて測定できる。
【０２９３】
ＡＳＣＴ２によるアミノ酸の細胞内取り込みを阻害する活性は、前述の１−（６ｂ）記載の方法などによって測定する。
【０２９４】
また、抗原陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］により測定する。
【０２９５】
４．本発明の抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体または該抗体断片を用いた疾患の治療方法
本発明のＡＳＣＴ２の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片は、ＡＳＣＴ２が関与する疾患の治療に用いることができる。
【０２９６】
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
【０２９７】
投与経路としては、経口投与、並びに口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与が挙げられる。
【０２９８】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏およびテープ剤などが挙げられる。
【０２９９】
経口投与に適当な製剤は、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、または顆粒剤などである。
【０３００】
乳剤またはシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトールおよび果糖などの糖類、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油および大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、並びにストロベリーフレーバーおよびペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
【０３０１】
カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖およびマンニトールなどの賦形剤、デンプンおよびアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤並びにグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
【０３０２】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤および噴霧剤などが挙げられる。
【０３０３】
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、またはその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
【０３０４】
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて製造する。
【０３０５】
噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。
【０３０６】
担体としては、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いる。また、エアロゾルまたはドライパウダーとして製造することもできる。
【０３０７】
さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０３０８】
５．本発明の抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体または該抗体断片を用いた疾患の診断方法
本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を用いて、ＡＳＣＴ２またはＡＳＣＴ２が発現した細胞を検出または測定することにより、ＡＳＣＴ２が関連する疾患を診断することができる。
【０３０９】
ＡＳＣＴ２が関連する疾患の一つである癌の診断は、例えば、以下のようにＡＳＣＴ２の検出または測定して行うことができる。
【０３１０】
まず、複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、ＡＳＣＴ２の検出または測定を行い、健常者の生体試料中のＡＳＣＴ２の存在量を調べる。
【０３１１】
次に、被験者の生体試料中についても同様にＡＳＣＴ２の存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者の該ポリペプチドの存在量が健常者と比較して増加している場合には、癌が陽性であると診断される。
【０３１２】
免疫学的手法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法および物理化学的手法などが挙げられる。
【０３１３】
放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させる。さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
【０３１４】
酵素免疫測定法は、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体または該抗体断片を反応させる。さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。
【０３１５】
酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法，医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識およびビオチン標識などが挙げられる。
【０３１６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。
【０３１７】
該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させる。次に第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識しておく。
【０３１８】
上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、または眼液などを反応させる。その後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
【０３１９】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。
【０３２０】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片との組み合わせでもよい。
【０３２１】
蛍光免疫測定法は、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法で測定する。
【０３２２】
蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、公知［蛍光抗体法，ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ、またはＲＩＴＣなどを用いる。
【０３２３】
発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光  臨床検査４２，廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、またはロフィンなどを用いる。
【０３２４】
ウェスタンブロット法は、次のように行う。抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］で分画する。その後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させる。さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、またはビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させる。その後、該標識を可視化することによって測定する。
【０３２５】
一例を以下に示す。配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１〜１０％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
【０３２６】
ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５〜０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。
【０３２７】
ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
【０３２８】
物理化学的手法は、例えば、抗原であるＡＳＣＴ２と本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。
【０３２９】
この他に物理化学的手法としては、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法およびラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要，金原出版（１９９８）］などが挙げられる。
【０３３０】
ラテックス免疫比濁法は、抗体または抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原または抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度または積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
【０３３１】
一方、ＡＳＣＴ２が発現している細胞の検出または測定は、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、好ましくは免疫沈降法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法または蛍光抗体染色法などを用いる。
【０３３２】
免疫沈降法は、ＡＳＣＴ２を発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる。または以下のような方法によっても行なうことができる。
【０３３３】
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに上述した本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が、例えばハイブリドーマ培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリン、抗ラットイムノグロブリン、プロテイン−Ａまたはプロテイン−ＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに固相化し、ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ培養上清を分注して結合させる。
【０３３４】
次に、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、ＡＳＣＴ２を発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出する。
【０３３５】
免疫細胞染色法または免疫組織染色法は、抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明のモノクローナル抗体と反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識またはビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体またはその結合断片と反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡する方法である。
【０３３６】
また、蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フロ−サイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］により検出を行うことができる。
【０３３７】
特に、ＡＳＣＴ２の細胞外領域に結合する、本発明のモノクローナル抗体または該抗体断片は、蛍光抗体染色法により天然型の立体構造を保持して発現している細胞の検出ができる。
【０３３８】
また、蛍光抗体染色法のうち、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）などを用いた場合には、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定できる。
【０３３９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０３４０】
［実施例１］
各種細胞株、ゼノグラフト、および正常組織におけるＡＳＣＴ２遺伝子の発現解析
（１）ＳＣＩＤマウスに皮下移植したゼノグラフトの作製と腫瘍塊の調製
以下に示した方法により、ヒト癌細胞株をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、ゼノグラフトを作製した。得られた該ゼノグラフトより腫瘍塊を摘出し、調製した。【０３４１】
ヒト膵臓癌細胞株［ＡＳＰＣ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６８２）、ＣａＰａｎ−１（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７９）、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４６９）］、ヒト大腸癌細胞株［Ｃｏｌｏ２０５（理研セルバンク番号：ＲＣＢ２１２７）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−３８）、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１８７）、ＳＷ１１１６（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２３３）、ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１８）］由来の細胞を約１×１０８個／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳに懸濁し、それぞれの細胞懸濁液１００μＬをＦｏｘ  ＣＨＡＳＥ  Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄＪｃｌマウス（雄、５週齢、日本クレア社製）４匹ずつの腹側部皮下に移植した。【０３４２】
各細胞は１０％の非働化牛胎児血清（インビトロジェン社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）に懸濁し継代培養したものを用い、培養は３７℃にてＣＯ２インキュベーター内で行った。得られたゼノグラフトは、それぞれｘＡＳＰＣ１、ｘＣａＰａｎ１、ｘＰＡＮＣ１、ｘＣｏｌｏ２０５、ｘＨＴ２９、ｘＬＳ１８０、ｘＳＷ１１１６、ｘＷｉＤｒとした。【０３４３】
腫瘍移植後、経日的にノギスによる腫瘍径の測定を行い、長径が１ｃｍ程度に到達した個体を順次麻酔下で脱血死せしめた後に、腫瘍塊の摘出を行った。各腫瘍塊は４つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結し、−８０℃フリーザー内で保存した。【０３４４】
（２）全ＲＮＡの抽出とポリＡ（＋）ＲＮＡの精製
細胞株および（１）で作製したゼノグラフトの腫瘍塊より、以下に示した方法により全ＲＮＡを抽出し、ポリＡ（＋）ＲＮＡを精製した。【０３４５】
細胞株としては、血液癌由来細胞株｛ＫＧ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４６）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−２０２）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４０）［以上、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）由来細胞株］、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１１９）、ＣＣＲＦ−ＳＢ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１２０）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１５２）、ＨＳＢ−２（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１２０）、ＨＰＢ−ＡＬＬ（理研セルバンク番号：ＲＣＢ１９３５）［以上、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）由来細胞株］、Ｋ−５６２（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４３）、ＫＵ８１２（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２０９９）［以上、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）由来細胞株］、ＫＭＳ−１１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ１１７９）、ＡＲＨ−７７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６２１）、ＩＭ−９（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１５９）、ＲＰＭＩ８２２６（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ００３４）、Ｕ２６６Ｂ１（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１９６）、ＭＣ／ＣＡＲ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−８０８３）［以上、多発性骨髄腫（ＭＭ）由来細胞株］、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４８４）、Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−８６）、Ｒａｍｏｓ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５９６）［以上、バーキット型リンパ腫（ＢＬ）由来細胞株］、Ｕ−９３７（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５９３．２）、ＭＬ−１（ＤＳＭＺ番号；ＡＣＣ４６４）［以上、組織球性リンパ腫（ＨＳ）由来細胞株］｝、肺癌由来細胞株［ＰＣ−１４（理研セルバンク番号：ＲＣＢ０４４６）、ＰＣ−７（免疫生物研究所社  製品番号：３７０１１）、ＰＣ−９（免疫生物研究所社  製品番号：３７０１２）、ＰＣ−１（免疫生物研究所社  製品番号：３７００８）（以上、非小細胞肺癌）、Ｌｕ−１３９（理研セルバンク番号：ＲＣＢ０４６９）、ＮＣＩ−Ｈ６９（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−１１９）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ０８１２）、ＳＢＣ−５（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ０８１９）（以上、小細胞肺癌）］、胃癌由来細胞株［Ｋａｔｏ  ＩＩＩ（理研セルバンク番号：ＲＣＢ２０８８）、ＭＫＮ−７４（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ０２５５）、ＮＵＧＣ−４（理研セルバンク番号：ＲＣＢ１９３９）、ＡＺ−５２１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ００６１）］、大腸癌由来細胞株｛Ｃｏｌｏ２０５（理研セルバンク番号：ＲＣＢ２１２７）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−３８）、ＬＳ１７４Ｔ［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）番号：８７０６０４０１］、ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ１８７）、ＳＷ１１１６（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２３３）｝、膵臓癌由来細胞株［ＡＳＰＣ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６８２）、ＢＸＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６８７）、ＣａＰａｎ−１（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７９）］、悪性黒色腫（メラノーマ）由来細胞株［Ｇ−３６１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４２４）、ＨＭＶ−１（理研セルバンク番号：ＲＣＢ０００４）、ＳＫ−ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７２）］、正常肺由来線維芽細胞［ＭＲＣ��５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−１７１）］を用いた。【０３４６】
細胞株からの全ＲＮＡの抽出は以下のようにして行った。接着系細胞株の場合には、アスピレーターを用いて培地を除き、適当量のＰＢＳで洗浄した後、シリコン製のヘラを使って細胞を回収した。これに培養プレート１０ｃｍ２分の細胞あたり１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加し、十分に懸濁して細胞を破砕した。さらに、得られた細胞破砕液を１８Ｇ注射針に１０回通し、ゲノムＤＮＡを寸断した。【０３４７】
浮遊系細胞株の場合には、冷却遠心機（日立工機社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ、ローター：Ｔ１１Ａ２１）を用いて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、デカンテーションにより培地を除いた後、細胞をＰＢＳに懸濁し、再度、冷却遠心機（日立工機社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ、ローター：Ｔ１１Ａ２１）を用いて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。【０３４８】
得られた細胞に、１×１０７個の細胞あたり１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を加え、十分に懸濁して細胞を破砕した。さらに、得られた細胞破砕液を１８Ｇ注射針に１０回通し、ゲノムＤＮＡを寸断した。【０３４９】
（１）で調製したゼノグラフトの腫瘍塊の破砕および全ＲＮＡ抽出は以下のようにして行った。凍結した腫瘍塊をＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）１０ｍＬに投入し、直ちにポリトロン  ホモジナイザー（キネマチカ社製、ＰＴ２１００）を用いて３００００ｒｐｍで１５秒間破砕した。【０３５０】
得られた細胞破砕液を、冷却遠心機（日立工機社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ、ローター：Ｔ１１Ａ２１）を用いて１１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を取らないように注意しながら、上清を新しいチューブに移した。得られた上清にクロロホルム２ｍＬを加え、１５秒間激しく振とうし、室温で２〜３分間静置後、冷却遠心機（日立工機社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ７Ｄ２、ローター：ＲＴ３Ｓ３）にて４℃、３０００ｒｐｍで９０分間遠心分離した。【０３５１】
上清を新しいチューブに移し、イソプロパノール５ｍＬを加え、緩やかに混和し、室温で１０分間静置後、冷却遠心機（日立工機社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ、ローター：Ｔ１１Ａ２１）にて１１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除いた後、７５％エタノール水溶液１０ｍＬを加えて混和し、さらに冷却遠心機（日立工機社製、Ｈｉｍａｃ  ＣＦ１５Ｒ、ローター：Ｔ１１Ａ２１）にて１１０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿を得た。【０３５２】
得られた沈殿を適当量のＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒにて溶解し、全ＲＮＡサンプルとした。全ＲＮＡサンプルは吸光光度計にて濃度測定を行い、Ａ２６０／Ａ２８０の比が１．７以上になっていることを確認した。Ａ２６０／Ａ２８０の比が１．７未満の場合には、さらにＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製を行った。【０３５３】
得られた全ＲＮＡサンプル４００μｇを、ＭｉｃｒｏＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ  Ｋｉｔ（アンビオン社製）を用い、添付説明書に従い、ポリＡ（＋）ＲＮＡを精製した。【０３５４】
（３）ｃＤＮＡの合成
（２）で得られたポリＡ（＋）ＲＮＡまたは市販の組織由来のｍＲＮＡより、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）を用い、ｃＤＮＡを合成した。【０３５５】
ヒトの正常組織（肝臓、肺、全脳、心臓、胃、脾臓、脊髄、小腸、骨格筋、子宮、気道、甲状腺、胸腺、精巣、唾液腺、前立腺、胎盤、リンパ節、膵臓、大腸、血液、または腎臓）由来のｍＲＮＡは市販ｍＲＮＡ（クロンテック社製）を使用した。【０３５６】
またヒトの臨床癌組織（肺癌、胃癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、子宮癌、乳癌、または食道癌）由来のｍＲＮＡも市販ＲＮＡ（バイオチェイン社製）を使用した。【０３５７】
（２）で得られたポリＡ（＋）ＲＮＡまたは市販の組織由来のｍＲＮＡ（１μｇ）に対してｄＮＴＰ混合溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１μＬ）、およびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（０．５μｇ／μＬ、１μＬ）を添加し、ＤＥＰＣ水を加え全量を７μＬにした。【０３５８】
６５℃で５分間加熱変性後、氷上で急冷し、１分間以上静置した後、１０×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ（２μＬ）、塩化マグネシウム（２５ｍｍｏｌ／Ｌ、４μＬ）、ＤＴＴ（０．１ｍｏｌ／Ｌ、２μＬ）、およびＲＮａｓｅＯＵＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１μＬ）を添加し、４２℃で２分間保温した。【０３５９】
さらにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＴ（１μＬ）を加え、４２℃、５０分間の逆転写反応を行い、続いて７０℃、１５分間加熱して酵素を失活させた。この後、反応液にＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅ  Ｈ（１μＬ）を加え、３７℃、２０分間反応した後、ＤＥＰＣ水を加え全量を１ｍＬとした。【０３６０】
以下、リアルタイムＰＣＲの反応系には、これをさらに５倍希釈した溶液１０μＬを用いた。【０３６１】
（４）リアルタイムＰＣＲ法（定量ＰＣＲ法、Ｑ−ＰＣＲ法）による細胞株、ゼノグラフトの腫瘍塊および正常組織におけるＡＳＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量の定量
（３）で得られたｃＤＮＡ１０μＬ［ポリＡ（＋）ＲＮＡ量として２ｎｇに相当］に、配列番号１より設計した配列番号３で示される配列からなるＡＳＣＴ２遺伝子のｃＤＮＡ検出用フォワードプライマー（Ｆｗ＃１）および配列番号４で示される配列からなるＡＳＣＴ２遺伝子のｃＤＮＡ検出用リバースプライマー（Ｒｖ＃１）（いずれもプロリゴ社製）をそれぞれ終濃度が３００ｎｍｏｌ／Ｌとなるように加え、さらに１０×Ｒ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋  ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社製、２μＬ）、Ｍｇ２＋  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２５０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２μＬ）、ｄＮＴＰ混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６μＬ）、Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｒ−ＰＣＲ（以上、タカラバイオ社製、０．２μＬ）、およびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（ベーエムエー社製、製品原液を２５００倍希釈したもの、１μＬ）を添加し、ＤＥＰＣ水を加え全量を２０μＬとした。【０３６２】
ＰＣＲ反応は、最初に９４℃で５分間かけてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを活性化および鋳型ＤＮＡを変性し、この後、９４℃で３０秒間の変性工程、６５℃で３０秒間のアニーリング工程、次いで７２℃で３０秒間のＤＮＡ伸長反応工程の３工程を１サイクルとして、これを計４５サイクル行うことにより実施した。【０３６３】
増幅産物にインターカレートしたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉが発する蛍光強度をＰＲＩＳＭ７７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて測定し、上記ＰＲＩＳＭ７７００付属のソフトウエアであるＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｖｅｒ．１．７ａによりデータ解析を行った。【０３６４】
リアルタイムＰＣＲ反応によって得られたシグナルが目的の増幅断片であるかどうかは、反応終了後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、主な増幅断片のサイズによって判断した。なお、上記リアルタイムＰＣＲ反応は、９６ウェルのＰＣＲプレートを用いて行った。【０３６５】
ＰＣＲプレートの各ウェルの検体には、上記ｃＤＮＡを含む反応液の他、陰性コントロール（滅菌水）、およびＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製したＡＳＣＴ２の部分断片をコードするプラスミドＨＣＨＯＮ２００１７１２［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｃＤＮＡ  ＦＬＪ４３２３２  ｆｉｓ、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）アクセッション番号：ＡＫ１２５２２２］を用いて作製した検量線作製用標品（１×１０〜１×１０６コピー／ウェル）を配置して行った。【０３６６】
ＡＳＣＴ２の標準配列であるＮＭ＿００５６２８（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００５６２８）と検量線作製用の鋳型として用いたプラスミドＨＣＨＯＮ２００１７１２の全長配列のアライメントを図１（Ａ）〜（Ｄ）に示す。ＮＭ＿００５６２８とＨＣＨＯＮ２００１７１２の全長配列の間には相違箇所があるが、ＡＳＣＴ２の発現量測定に用いた配列番号３で示される配列からなるｃＤＮＡ検出用フォワードプライマー（Ｆｗ＃１）および配列番号４で示される配列からなるｃＤＮＡ検出用リバースプライマー（Ｒｖ＃１）は、いずれもＮＭ＿００５６２８とＨＣＨＯＮ２００１７１２の配列が完全に一致する部分を用いて設計した。【０３６７】
このようにして得られた細胞株、ゼノグラフトの腫瘍塊および正常組織におけるＡＳＣＴ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量の結果を図２（Ａ）〜（Ｂ）に示す。ｍＲＮＡ発現量は、ポリＡ（＋）ＲＮＡ２ｎｇあたりのＡＳＣＴ２発現分子数、および正常組織で最も発現が高かった気道でのＡＳＣＴ２遺伝子発現量を１とした場合の相対比で示す。【０３６８】
図２（Ａ）〜（Ｂ）に示すように、血液癌由来細胞株のＫＧ−１（ＡＭＬ由来細胞株）、ＨＳＢ−２（ＡＬＬ由来細胞株）、Ｋ−５６２（ＣＭＬ由来細胞株）、ＫＭＳ−１１、ＡＲＨ−７７（以上、ＭＭ由来細胞株）で正常気道の１０倍以上、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＬＬ由来細胞株）、ＩＭ−９、ＲＰＭＩ８２２６（以上、ＭＭ由来細胞株）、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ（ＢＬ由来細胞株）、ＭＬ−１（ＨＬ由来細胞株）で５倍以上、ＴＨＰ−１（ＡＭＬ由来細胞株）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＬＬ由来細胞株）、ＫＵ８１２（ＣＭＬ由来細胞株）、Ｒａｊｉ（ＢＬ由来細胞株）、Ｕ−９３７（ＨＳ由来細胞株）並びに胃癌組織、食道癌組織で２倍以上の発現亢進が認められた。【０３６９】
［実施例２］
ヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株の造成
以下に示した方法により、配列番号５記載の遺伝子配列および配列番号６記載のアミノ酸配列を含むプラスミドｐＣＲ４−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得し、このプラスミドを用いてヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株を取得した。【０３７０】
配列番号７から１０の塩基配列を有するプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ、それぞれ１μＬ）に、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（１０μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（２ｍｍｏｌ／Ｌ、１０μＬ）、およびＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上、タカラバイオ社製、１μＬ）を添加し、さらに滅菌水を加え全量１００μＬとした。【０３７１】
実施例１（Ｃ）記載の方法と同様にして、９６℃で２分間の反応後、９６℃で１分間、６０℃で１分間、および７２℃で１分間の３工程を１サイクルとして、計３５サイクル行うＰＣＲ反応を行い、ヒトＡＳＣＴ２遺伝子の翻訳開始点の塩基を１とした時の１位から３７０位の遺伝子配列（以下、Ｎ−ＳＬＣ１Ａ５と表記する）を合成した。【０３７２】
反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、得られた約０．４ｋｂの増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクターにクローニングした（以下、ｐＣＲ４−Ｎ−ＳＬＣ１Ａ５と表記する）。【０３７３】
次に、ヒトＡＳＣＴ２遺伝子を含むプラスミドＨＣＨＯＮ２００１７１２（ＤＤＢＪアクセッション番号：ＡＫ１２５２２２）１０ｎｇを鋳型として、配列番号１１および配列番号１２記載の塩基配列を有するプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ、それぞれ１μＬ）、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（１０μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（２ｍｍｏｌ／Ｌ、１０μＬ）、およびＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上、タカラバイオ社製、１μＬ）を添加し、さらに滅菌水を加え全量１００μＬとした。【０３７４】
上記と同様の反応条件でＰＣＲ反応を行い、ヒトＡＳＣＴ２遺伝子の３６５位から１６２３位の遺伝子配列のＣ末端にｍｙｃ／Ｈｉｓが付加された融合蛋白質をコードする遺伝子配列（以下、Ｃ−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓと表記する）を合成した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、得られた約１．２ｋｂの増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。【０３７５】
得られた抽出断片を鋳型として、配列番号１１および配列番号１３記載の塩基配列を有するプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ、それぞれ１μＬ）、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（１０μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（２ｍｍｏｌ／Ｌ、１０μＬ）、およびＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上、タカラバイオ社製、１μＬ）を添加し、さらに滅菌水を加え全量１００μＬとした。上記と同様の反応条件でＰＣＲ反応を行い、Ｃ−ＳＬＣ１Ａ５−Ｍｙｃ／ＨｉｓのＣ末端にＮｏｔＩおよびＳｐｅＩ制限酵素サイトを付加した。【０３７６】
得られた反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、得られた約１．２ｋｂの増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクターにクローニングした（以下、ｐＣＲ４−Ｃ−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓと表記する）。得られた遺伝子配列は、配列番号１記載の配列と翻訳開始点の塩基を１とした時の１４５５番目のＴがＣに置換していたが、アミノ酸変異は認められなかった。【０３７７】
得られたｐＣＲ４−Ｎ−ＳＬＣ１Ａ５をＢｓｓＨＩＩ（タカラバイオ社製）とＳｐｅＩ（タカラバイオ社製）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、得られた約４．４ｋｂの遺伝子断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。【０３７８】
同様に、得られたｐＣＲ４−Ｃ−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／ＨｉｓをＢｓｓＨＩＩ（タカラバイオ社製）とＳｐｅＩ（タカラバイオ社製）で消化し、約１．４ｋｂの遺伝子断片を抽出した。それぞれの抽出断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。【０３７９】
得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機ＰＩ−５０（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、配列番号５記載の遺伝子配列および配列番号６記載のアミノ酸配列を含むプラスミドｐＣＲ４−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０３８０】
得られたｐＣＲ４−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／ＨｉｓをＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化し、上記と同様に遺伝子断片を抽出し、ヒトＡＳＣＴ２遺伝子のＣ末端にｍｙｃ／Ｈｉｓが付加された融合蛋白質をコードする遺伝子配列（以下、ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓと表記する）を含む断片を取得した。【０３８１】
得られたＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓを含む断片を、予めＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクター（ＷＯ９７／１０３５４）に連結し、上記と同様にして、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体を得た後、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０３８２】
ｐＫＡＮＴＥＸ−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓは、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により、以下のようにしてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へ導入した。【０３８３】
細胞は、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社製）およびゲンタマイシン（ナカライテスク社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、Ａ３倍地と表記する）に、１×ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加した培地で継代したものを用いた。【０３８４】
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を塩化カリウム（１３７ｎｍｏｌ／Ｌ）、塩化ナトリウム（２．７ｎｍｏｌ／Ｌ）、リン酸一水素二ナトリウム（８．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、リン酸二水素一ナトリウム（１．５ｎｍｏｌ／Ｌ）および塩化マグネシウム（４ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む緩衝液（以下、Ｋ−ＰＢＳと表記する）に懸濁して８×１０６個／ｍＬとし、得られた細胞懸濁液（２００μＬ、細胞数として１．６×１０６個）を発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓ（１０μｇ）と混和した。【０３８５】
得られた混和液をキュベット（電極間距離２ｍｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（バイオラッド社製）を用いてパルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を、Ａ３培地を含む細胞培養用容器に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。【０３８６】
４日間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加したＡ３培地に培地交換し、培養を続けた。途中培地交換と継代を行い、遺伝子導入より約２週間後に、Ｇ４１８に耐性を有する形質転換細胞株を取得した。【０３８７】
得られたＧ４１８に耐性形質転換細胞を１０ｍＬあたり５個の細胞数となるようにＧ４１８（ナカライテスク社製、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加したＡ３培地で希釈し、希釈した細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、段階的にメソトレキセート濃度を上昇させて処理することにより、ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを高発現するクローンを選択し、ヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株を取得した。【０３８８】
得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞（１×１０５〜５×１０５個）を、７０％エタノール−ＰＢＳ（１ｍＬ）に懸濁して氷温中で３０分間固定した。９６ウェルＵ字プレートに１×１０６〜５×１０６細胞／ウェルとなるように分注し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上清を除いて１％ＢＳＡ−ＰＢＳで氷温中３０分間ブロッキングした。【０３８９】
遠心分離により上清を除いて、１次抗体として抗ｍｙｃ抗体ＰＬ１４（医学生物学研究所製）、抗Ｈｉｓ抗体（キアゲン社製）およびマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ダコ社製）を、最終濃度がそれぞれ１．０、０．１および０．１μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、１００μＬ／ウェルずつ分注し、氷温中で６０分間反応させた。【０３９０】
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、２次抗体として１％ＢＳＡ−ＰＢＳで５０倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ダコ社製）を１００μＬ／ウェル加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。【０３９１】
再び１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ、ベックマン・コールター社製）で蛍光強度を測定した。結果を図３に示す。【０３９２】
図３に示すように、抗ｍｙｃ抗体および抗Ｈｉｓ抗体に高い反応性が検出されたことから、目的のヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株が造成されていることが確認された。【０３９３】
［実施例３］
ＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドに対するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
キャリア蛋白質との結合の為、配列番号１４記載のヒトＡＳＣＴ２のＮ末部分配列（Ｎ末端から数えて２番目から１６番目までのアミノ酸）のＣ末端にＣｙｓを付加したＮ末部分ペプチドを、自動合成機（ＰＳＳＭ−８、島津製作所社製）を用いて合成した。【０３９４】
免疫原性を高める目的で以下の方法でＫＬＨ（和光純薬社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳに溶解して１０ｍｇ／ｍＬに調製し、１／１０容量のＮ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミド（ＭＢＳ、ナカライテスク社製、２５ｍｇ／ｍＬ）を滴下した後３０分間撹拌し、反応させた。【０３９５】
反応液を予めＰＢＳで平衡化したゲルろ過カラム（セファデックスＧ−２５カラム、ジーイーヘルスケア社製）に通塔し、未反応のＭＢＳを除き、ＫＬＨ−ＭＢＳを得た。Ｃｙｓを付加したヒトＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチド（１ｍｇ）をリン酸ナトリウムバッファー（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０）に溶解し、ＫＬＨ−ＭＢＳ（２．５ｍｇ）を添加し、室温で３時間、攪拌反応させた。反応後、ＰＢＳで透析し、免疫原としてのヒトＡＳＣＴ２のＮ末ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを得た。【０３９６】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
（１）で得られたヒトＡＳＣＴ２のＮ末ペプチド−ＫＬＨコンジュゲート（１００μｇ）をアルミニウムゲル（２ｍｇ）および百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製、１×１０９細胞）とともに４週令雌ＳＤラット（日本エスエルシー社製）に投与し、更に初回投与２週間後よりコンジュゲート（１００μｇ）を１週間に１回、計４回投与した。尾静脈より採血し、ヒトＡＳＣＴ２部分ペプチドに対する反応性を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。【０３９７】
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離（ＣＲ５Ｂ、日立製作所社製）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。沈殿画分として得られた細胞画分をＭＥＭ培地で３回洗浄し、抗体産生細胞を調製した。【０３９８】
（３）酵素免疫測定法
アッセイ用の抗原として、配列番号１４記載のＣｙｓを付加したヒトＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドを以下の方法でサイログロブリン（以下、ＴＨＹと表記する）とのコンジュゲートを作製した。コンジュゲートの作製方法は（１）と同様であるが、ＭＢＳの代わりにスクシンイミジル  ４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、シグマ社）を用いた。【０３９９】
９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、得られたヒトＡＳＣＴ２のＮ末ペプチド−ＴＨＹコンジュゲート（１０μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。未吸着のコンジュゲートを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）を加え、室温１時間反応し、残っている活性基をブロックした。未反応のＢＳＡ−ＰＢＳを洗浄後、１次抗体として抗血清または培養上清などの被験物質を５０μＬ／ウェル分注し２時間反応させた。０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、２次抗体として希釈したペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン（ダコ社、５０μＬ／ウェル）を加え、室温で１時間反応させた。【０４００】
０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム（ＡＢＴＳ）基質液［ＡＢＴＳ（和光純薬社製、１ｍｍｏｌ／Ｌ）、クエン酸バッファー（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ４．２）、過酸化水素（０．１％）］を加え発色させた。サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４１５−ＯＤ４９０）をプレートリーダー（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用いて測定した。【０４０１】
（４）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１［Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１５９７、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］を、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）およびＦＢＳ（１０％）を添加した培地（以下、正常培地と表記する）で培養し、細胞融合時に必要な細胞数（２×１０７個以上）を確保し、細胞融合に親株として供した。【０４０２】
（５）ハイブリドーマの作製
（２）で得られた抗体産生細胞と（４）で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離（ＣＲ５Ｂ、日立製作所社製）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら３７℃でＰＥＧ−１０００（１ｇ）、ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製、１ｍＬ）およびジメチルスルホキシド（０．３５ｍＬ）の混液を１×１０８個の抗体産生細胞あたり０．５ｍＬ加えた。【０４０３】
前記懸濁液に１〜２分間毎にＭＥＭ培地（１ｍＬ）を数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。９００ｒｐｍ、５分間遠心分離（ＣＲ５Ｂ、日立製作所社製）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞を、正常培地にＨＡＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加した培地（以下、ＨＡＴ培地と表記する、１００ｍＬ）中に懸濁した。【０４０４】
得られた懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後の培養上清を用いて（３）に記載の酵素免疫測定を行い、ヒトＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドに特異的に反応するウェルを選択した。選択したウェルに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して、ＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ３８４２を取得した。ＫＭ３８４２の抗体クラスのサブクラスタイピングは、サブクラスタイピングキット（エービーディー  セロテック社製）を用いて、ラットＩｇＧ２ａと決定した。【０４０５】
（６）精製モノクローナル抗体の取得
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、日本エスエルシー社製）に（５）で得られたハイブリドーマ（５×１０６〜２０×１０６個／匹）をそれぞれ腹腔内に注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水（１〜８ｍＬ／匹）を採取し、３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離（ＣＲ５Ｂ、日立製作所社製）して固形分を除去した後、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］により精製し、ＫＭ３８４２精製抗体を取得した。【０４０６】
［実施例４］
ＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドに対するモノクローナル精製抗体の反応性検討
ＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドに対するモノクローナル抗体ＫＭ３８４２の反応性を実施例３（３）に記載の酵素免疫測定法により検討した。１次抗体として、実施例３（６）で得られたＫＭ３８４２精製抗体を１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて１０、１、０．１、０．０１、０．００１、および０．０００１μｇ／ｍＬにそれぞれ希釈したものを用いた。測定の結果、図４に示すように、ＫＭ３８４２はＡＳＣＴ２のＮ末部分ペプチドに対し、特異的な反応性を示した。【０４０７】
［実施例５］
ＡＳＣＴ２の細胞外領域に対するモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株を１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社）で２〜３日培養し、０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（ナカライテスク社製）を用いて剥離した。免疫動物１匹あたり６×１０６〜１×１０７個の細胞数となるようＰＢＳに懸濁した。【０４０８】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
（１）で得られた細胞懸濁液を百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製、１×１０９細胞）とともに、６週令雄ＢＸＳＢマウス（日本エスエルシー社製、３匹／１群）または４週令雌ＳＤラット（日本エスエルシー社製、３匹／１群）に投与した。投与１週間後より、毎週１回、計４回投与し、投与後、該マウスの眼底または該ラットの尾静脈より部分採血した。【０４０９】
前記血中抗体価を以下に示すセルベースアッセイシステム（ＡＢＩ  ８２００  セルラーディテクションシステム、アプライドバイオシステムズ社製）またはフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ、ベックマン・コールター社製）を用いた蛍光細胞染色法により測定した。十分な抗体価を示したマウスまたはラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。【０４１０】
実施例３（Ｂ）と同様に、得られた脾臓から抗体産生細胞を調製した。【０４１１】
（３）蛍光細胞染色法−１（セルベースアッセイシステム）
アッセイ用の細胞には、実施例２で得られたＡＣＳＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株とベクター導入ＣＨＯ細胞を用いた。それぞれの細胞を１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製）で剥離した細胞をＩＭＤＭ培地に懸濁し、ＡＢＩ  ８２００用黒色９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４個の細胞（１００μＬ）を播種し、１晩培養した。【０４１２】
前記プレートに１次抗体として抗血清または培養上清などの被検物質（１０μＬ／ウェル）で分注し、２次抗体として、ＡＬＥＸＡ６４７標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＡＬＥＸＡ６４７標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（共にインビトロジェン社製、１００μＬ／ウェル）を加えて遮光下で４時間放置した。【０４１３】
レーザー光（６３３ｎｍＨｅ／Ｎｅ）で励起される６５０〜６８５ｎｍの蛍光をＡＢＩ  ８２００  セルラーディテクションシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて測定した。【０４１４】
（４）蛍光細胞染色法−２（フローサイトメーター）
アッセイ用の細胞には、実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株とベクター導入ＣＨＯ細胞株を用いた。それぞれの細胞を１０％ＦＢＳ含有ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養した。【０４１５】
０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離した細胞をＰＢＳで洗浄し、さらに抗体の非特異的な吸着を避けるために１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて氷温中２０分間ブロッキングした。９６ウェルＵ字プレートに１ウェルあたり５×１０５個の細胞（５０μＬ）を播種し、１８００ｒｐｍ、２分間遠心分離（０５ＰＲ−２２、日立工機社製）した後、上清を除いた。【０４１６】
１次抗体として抗血清または培養上清などの被検物質を５０μＬ／ウェルで加え、氷温中で３０分間反応させた。ＰＢＳを用いた遠心分離法で３回洗浄した後、２次抗体としてＡＬＥＸＡ４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｇ＋Ｌ）またはＡＬＥＸＡ４８８標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｇ＋Ｌ）（共にインビトロジェン社製、５０μＬ／ウェル）を加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。【０４１７】
再びＰＢＳを用いて遠心分離法で３回洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、レーザー光（４８８ｎｍＡｒ）で励起される５１０〜５３０ｎｍの蛍光をフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ、ベックマン・コールター社製）を用いて測定した。【０４１８】
（５）ハイブリドーマの作製
実施例３（５）と同様に、（２）で得られた抗体産生細胞と実施例３（４）で得られた骨髄腫細胞との細胞融合を行った。
次に、細胞融合により得られた細胞をＨＡＴ培地に懸濁した。得られた細胞懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルで分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で８〜１０日間培養した。【０４１９】
培養後の培養上清の反応性を（３）および（４）に記載の蛍光細胞染色法により確認し、ヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株と反応し、かつベクター導入ＣＨＯ細胞に反応しないウェルを選択した。選択したウェルに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、ＡＳＣＴ２の細胞外領域に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＫＭ３９９８、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８を取得した。【０４２０】
得られたハイブリドーマのうち、マウスモノクローナル抗体のサブクラス決定は以下の方法により行った。【０４２１】
９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、抗マウス  イムノグロブリン・ウサギポリクローナル抗体（ダコ社、１０μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル）を分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。未吸着のコンジュゲートを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（１００μＬ／ウェル）を加え、室温１時間反応し、残っている活性基をブロックした。【０４２２】
未反応のＢＳＡ−ＰＢＳを洗浄後、被験物質を５０μＬ／ウェル分注し２時間反応させた。０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、２次抗体として希釈したサブクラス特異的ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン（インビトロジェン社、５０μＬ／ウェル）を加え、室温で１時間反応させた。【０４２３】
０．０５％ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、実施例３（３）で用いたＡＢＴＳ基質液を加え、発色させ、サンプル波長４１５ｎｍ、リファレンス波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４１５−ＯＤ４９０）をプレートリーダー（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用いて測定した。【０４２４】
上記方法でサブクラス決定ができなかったマウスモノクローナル抗体は、マウスラットモノクローナルアイソタイピングキット（大日本住友製薬社製）を用いて行った。また、ラットモノクローナル抗体のサブクラスはラットモノクローナルアイソタイピングキット（大日本住友製薬社製）を用いて決定した。【０４２５】
各ハイブリドーマの動物種と抗体クラス一覧を表１に示す。【０４２６】
【表１】
2011087091.tif 000002
【０４２７】
（６）精製モノクローナル抗体の取得−１
ＫＭ３９９８の精製抗体は、以下の方法により取得した。
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、日本エスエルシー社製）に（５）で得られたハイブリドーマ（５×１０６〜２０×１０６個／匹）をそれぞれ腹腔内に注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。【０４２８】
腹水のたまったマウスから、腹水（１〜８ｍＬ／匹）を採取し、フィルトレーション［ポール社製、５μｍ、ポリエーテルサルフォン（ＰＥＳ）膜］により固形分を除去した後、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］により精製した。【０４２９】
（７）精製モノクローナル抗体の取得−２
ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２またはＫＭ４０１８の精製抗体は、それぞれ以下の方法により取得した。【０４３０】
（５）で得られた各ハイブリドーマを１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０で５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で培養した。細胞数が５×１０７細胞となったところで１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離（ＣＲ５Ｂ、日立製作所社製）を行い、上清を除いた。【０４３１】
得られた細胞を、５％ダイゴＧＦ２１（和光純薬製）を添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ培地（ギブコ社製）に懸濁して１×１０５個／ｍＬの細胞数、５００ｍＬとなるよう調製し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３日間培養した。得られた細胞懸濁液を１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、得られた上清をボトルトップフィルター（コーニング社製、０．２μｍ、ＰＥＳ膜）を用いてフィルトレーションした。【０４３２】
ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８およびＫＭ４０１２については、プロテインＡ結合レジン（ミリポア社製）を、ＫＭ４０１８についてはプロテインＧ結合レジン（ミリポア社製）を用いて精製を行った。それぞれのレジンを１ｍＬミニカラムにパッキングし、１０ｍＬの平衡化緩衝液を通塔して平衡化した。【０４３３】
平衡化緩衝液としてプロテインＡ結合レジンはグリシン（１ｍｏｌ／Ｌ）−塩化ナトリウム（０．１５ｍｏｌ／Ｌ）（ｐＨ８．６）を、プロテインＧ結合レジンはグリシン（０．５ｍｏｌ／Ｌ）−ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた。フィルトレーション処理して得られた培養上清を、流速約１００ｍＬ／時間でカラムに通塔後、平衡化緩衝液１０ｍＬでカラムを洗浄した。【０４３４】
次にクエン酸バッファー（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ３．０）を用いてカラムに吸着している抗体を溶出した。溶出された抗体は、あらかじめトリス（２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０）を８０μＬ入れておいたチューブに５００μＬずつ分取した。【０４３５】
各チューブのＯＤ２８０ｎｍを、紫外可視分光光度計（ＵＶ−１６００、島津製作所社製）を用いて測定し、タンパク質が検出された画分を回収した。ＰＢＳにて４℃で終夜透析した後、フィルトレーション（ポール社製、０．２μｍ、ＰＥＳ膜）し、ＯＤ２８０ｎｍより抗体濃度を算出した［ＯＤ２８０ｎｍ測定値（Ａ）／１．４＝タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）］。【０４３６】
［実施例６］
ＡＳＣＴ２の細胞外領域に対するモノクローナル精製抗体の反応性検討
（１）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター）
実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、ベクター導入ＣＨＯ細胞、および多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ１１７９）をそれぞれ５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３〜４日間培養した。【０４３７】
ヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞とベクター導入ＣＨＯ細胞は、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離し、ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムの混合溶液で洗浄した。さらに抗体の非特異的な吸着を避けるためにヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞とベクター導入ＣＨＯ細胞は、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、また、ＫＭＳ−１１はヒトＩｇＧ（シグマ社、１００μｇ／ｍＬ）を用いて、氷温中、３０分間ブロッキングした。【０４３８】
９６ウェルＵ字プレートに１ウェルあたり１×１０５〜５×１０５個の細胞（１００μＬ）を播種し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離（０５ＰＲ−２２、日立工機社製）した後、上清を除いた。【０４３９】
１次抗体として被検物質である精製抗体およびラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢ（陰性対照、ベックマン・コールター社製）またはＫＭ５１１｛陰性対照、抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体抗体、［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，１０９５（１９８９）］、マウスＩｇＧ１｝を最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムの混合溶液（以下、希釈用溶液Ａと表記する）で希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、氷温中で６０分間反応させた。【０４４０】
希釈用溶液Ａで２回洗浄した後、２次抗体として希釈用溶液Ａで希釈したＡＬＥＸＡ４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｇ＋Ｌ）（インビトロジェン社製、１００μＬ／ウェル）またはＡＬＥＸＡ４８８標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｇ＋Ｌ）（インビトロジェン社製、１００μＬ／ウェル）、またはＦＩＴＣ標識抗マウスｋａｐｐａ−ｃｈａｉｎ抗体（サウザンバイオテック社製、１００μＬ／ウェル）またはＦＩＴＣ標識抗ラットｋａｐｐａ−ｃｈａｉｎ抗体（サウザンバイオテック社製、１００μＬ／ウェル）を加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。【０４４１】
再び希釈用溶液Ａで３回洗浄し、ＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ、ベックマン・コールター社製）で蛍光強度を測定した。測定の結果を図５および図６に示す。【０４４２】
図５に示すように、ＫＭ３９９８はヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞およびＡＳＣＴ２ｍＲＮＡを発現しているＫＭＳ−１１に強い結合性を示したが、ベクター導入ＣＨＯ細胞には全く結合性を示さなかった。また、陰性対照抗体ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢはいずれの細胞に対しても結合性を示さなかった。この結果から、ＫＭ３９９８はＡＳＣＴ２発現細胞に特異的な結合性を有することが示された。【０４４３】
また、図６に示すように、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８はヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞およびＡＳＣＴ２ｍＲＮＡを発現しているＫＭＳ−１１に強い結合性（平均蛍光強度）を示したが、ベクター導入ＣＨＯ細胞には全く結合性を示さなかった。【０４４４】
また、陰性対照抗体ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢおよびＫＭ５１１はいずれの細胞に対しても結合性を示さなかった。この結果から、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２、ＫＭ４０１８はＡＳＣＴ２発現細胞に特異的な結合性を有することが示された。【０４４５】
（２）ウェスタンブロッティング
実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、ベクター導入ＣＨＯ細胞、多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ１１７９）および大腸癌細胞株ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１８）に、トリス−塩酸（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、塩化ナトリウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化マグネシウム（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、塩化カルシウム（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．１％アジ化ナトリウム、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ、５μｍｏｌ／Ｌ）、Ｎ−エチルマレイミド（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌ）およびジチオトレイトール（０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）の混合溶液（以下、細胞溶解用緩衝液Ａと表記する）を、それぞれ５×１０７個の細胞あたり１ｍＬ添加し、４℃、２時間放置後、遠心分離して得られた上清を細胞溶解液として用いた。【０４４６】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥＬ、アトー社製）を用いて１レーンあたり５×１０４個の細胞分の各細胞溶解液を分画し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。転写した該ＰＶＤＦ膜を１０％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。【０４４７】
その後、一次抗体として、被検物質である精製抗体、実施例３で得られたＫＭ３８４２（陽性対照）、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢ（陰性対照、ベックマン・コールター社製）およびＫＭ５１１（陰性対照）を、それぞれ１０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、４℃で１晩反応させた。【０４４８】
得られたＰＶＤＦ膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと表記する）でよく洗浄し、２次抗体としてペルオキシターゼ標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ザイメット社製）またはペルオキシターゼ標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ダコ社製）を室温で１時間反応させた。【０４４９】
再び該ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴでよく洗浄し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いて、抗体が結合したバンドを検出した。【０４５０】
その結果、ＫＭ３８４２はヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、ＡＳＣＴ２ｍＲＮＡを発現しているＫＭＳ−１１細胞およびＷｉＤｒ細胞でＡＳＣＴ２の分子量に相当する分子量７５ｋＤａ付近にバンドを検出した。一方、ＫＭ３９９８、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８はＡＳＣＴ２を検出できなかった。また、ベクター導入ＣＨＯ細胞では、いずれの抗体の反応性も認められなかった。【０４５１】
上記、フローサイトメーターおよびウェスタンブロッティングの結果から、ＫＭ３９９８、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８のＡＳＣＴ２に対する結合活性はＡＳＣＴ２のＳＤＳ変性により失われたと考えられ、ＫＭ３９９８、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８はＡＳＣＴ２の天然型立体構造を認識して結合する抗体であることが示された。【０４５２】
（３）免疫沈降法
実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、およびベクター導入ＣＨＯ細胞に、トリス−塩酸（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、塩化ナトリウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＥＤＴＡ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．１％ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）およびＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）の混合溶液（以下、細胞溶解用緩衝液Ｂと表記する）を、それぞれ２×１０７個の細胞あたり１ｍＬ添加した。【０４５３】
４℃にて３０分間攪拌後、遠心分離（ＣＦ１５Ｄ、日立工機社製）を行った。得られた上清の蛋白濃度をプロテインアッセイ試薬（バイオ・ラッド社製）により測定し、細胞溶解用緩衝液Ｂで蛋白濃度を５ｍｇ／ｍＬに調製し、細胞溶解液として使用した。【０４５４】
被検物質である精製抗体、実施例３で得られたＫＭ３８４２（陽性対照）、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢ（陰性対照、ベックマン・コールター社製）およびＫＭ５１１（陰性対照）をそれぞれ２μｇと得られた細胞溶解液１ｍｇを４℃にて１時間混和させた。【０４５５】
プロテインＧ−セファロースビーズ（アマシャム社製、３０μＬ）またはプロテインＡ−セファロースビーズ（アマシャム社製、３０μＬ）を０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ（３００μＬ）にて３０分間以上前処理した後、遠心分離により上清を取り除き、トリス−塩酸（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、塩化ナトリウム（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＥＤＴＡ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）およびＰｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）の混合溶液（以下、ビーズ洗浄用緩衝液と表記する）（９０μＬ）に懸濁した。【０４５６】
ビーズ懸濁液に、抗体と細胞溶解液との混合溶液（１００μＬ）を加え、４℃にて２時間混和させた後、遠心分離によりビーズを回収した。回収したビーズはビーズ洗浄用緩衝液で３〜５回洗浄後、２％ＳＤＳ、トリス−塩酸（６２ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８）および１０％グリセロールの混合溶液（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーと表記する）にて溶解し、得られた溶液を以下のイムノブロットにより解析した。【０４５７】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により分画し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）に転写した。得られた該ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク−ＰＢＳＴでブロッキングした後、一次抗体として、実施例３で得られたＫＭ３８４２（陽性対照、３．５μｇ／ｍＬ）を室温にて２時間反応させた。【０４５８】
得られた該ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴでよく洗浄し、ペルオキシターゼ標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ダコ社製）を室温にて１時間反応させた。再び該ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴでよく洗浄し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャムファルマシア社製）を用いて、抗体が結合したバンドを検出した。【０４５９】
ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２、ＫＭ４０１８と陽性対照抗体ＫＭ３８４２で分子量７５ｋＤａ付近にバンドが検出された。その結果、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８は免疫沈降反応によるＡＳＣＴ２の検出が可能な抗体であり、ＡＳＣＴ２の立体構造を認識する抗体であることが示された。【０４６０】
（４）ＡＳＣＴ２を介したアミノ酸の細胞内取り込み阻害活性
１０％非働化透析牛胎児血清（以下ｄＦＢＳ、インビトロジェン社製）を添加したＤｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社製）（以下、グルタミン不含培地と表記する）で２×１０４個／ｍＬの細胞数に調製したヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１８）を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。【０４６１】
最終濃度が３１．６〜０．０３μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈調製した被検物質である精製抗体、ラットＩｇＧ２ａ−ＵＮＬＢ（陰性対照、ベックマン・コールター社製）、ＫＭ５１１（陰性対照）およびグルタミン競合アミノ酸混合液［ＡＳＴ混合液、アラニン、セリン、スレオニン（いずれもシグマ社製、各３．３ｍｍｏｌ／Ｌ）の混合液］を２０μＬ／ウェル加えた。【０４６２】
さらに、最終濃度０．２ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにグルタミン不含培地で調製したグルタミン溶液（インビトロジェン社製）を２０μＬ／ウェル加えた。コントロールのウェルおよびブランクプレートのウェルには、ＰＢＳ（２０μＬ／ウェル）と上記グルタミン溶液（２０μＬ／ウェル）を添加した。ブランクプレート以外は、抗体添加後、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間培養した。【０４６３】
グルタミン不含培地で５０％に希釈した｛４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼン  ジスルフォネート｝（以下、ＷＳＴ−１試薬、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２０μＬ／ウェル加え、さらに３７℃で２時間インキュベートした。【０４６４】
マイクロプレート分光光度計（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用い、４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。抗体非添加のコントロールのウェルの吸光度を１００％、ブランクプレートのウェルの吸光度を０％として、抗体を添加したウェルの相対増殖率（％）を算出した。【０４６５】
測定の結果を図７および図８に示す。【０４６６】
図７に示すように、ＫＭ３９９８は高濃度で若干細胞増殖を抑制したが、その効果はグルタミン競合アミノ酸混合液の効果に比べて低く、ＫＭ３９９８のＡＳＣＴ２に対する中和活性は低いことが示された。【０４６７】
また、図８に示すように、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８はいずれも抗体濃度依存的に細胞増殖を強力に抑制した。その結果、ＫＭ４０００、ＫＭ４００１、ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８は、グルタミンを細胞内に取り込むＡＳＣＴ２の機能を強力に中和することにより、癌細胞の増殖を顕著に抑制する活性を有することが示された。【０４６８】
［実施例７］
抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
実施例５（５）で得られたハイブリドーマＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８（それぞれ５×１０７個の細胞）より、ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）およびＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、添付説明書の方法に従い、約６μｇのｍＲＮＡを調製した。【０４６９】
（２）抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子クローニング
（１）で取得したＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８のｍＲＮＡの０．６μｇから、ＢＤ  ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ビーディー  バイオサイエンシズ社製）を用いて、添付説明書の方法に従い、それぞれ５’側にキット添付のＢＤ  ＳＭＡＲＴ  ＩＩ  Ａ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を有するｃＤＮＡを取得した。【０４７０】
得られたｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡｍｉｘと、配列番号１５、１６で示したマウスＩｇ（γ）特異的プライマー（ｍＧ３ａ２またはｍＧ２ｂａ１）または配列番号４３で示したラットＩｇ（γ）特異的プライマー（ｒＧ２ａ）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０４７１】
またＩｇ（γ）特異的プライマーの代わりに配列番号１７で示したマウスＩｇ（κ）特異的プライマー（ｍＫａ１）または配列番号４４で示したラットＩｇ（κ）特異的プライマー（ｒＫａ２）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。【０４７２】
ラットＩｇ（κ）特異的プライマー（ｒＫａ２）でのＰＣＲ反応は、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを４０回行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。【０４７３】
それ以外のＰＣＲ反応は９４℃で５分間加熱後、９４℃で１５秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で１５秒間、７２℃で３分間３０秒間からなる反応サイクルを５回、９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを３０回それぞれ行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。【０４７４】
ＰＣＲ反応はＰＴＣ−２００  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（バイオ・ラッド社製）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物はＨ鎖が約７００ｂｐ、Ｌ鎖が約８００ｂｐのサイズであった。【０４７５】
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定するため、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＰＣＲ産物をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。得られた抽出断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを（インビトロジェン社製）用いてｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクターに連結し、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。【０４７６】
得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機ＰＩ−５０（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ピーイー  バイオシステムズ社製）を用い、添付説明書に従って反応後、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７００（ピーイー・バイオシステムズ社製）により塩基配列を解析した。【０４７７】
その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＫＭ４００８のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド０８Ｈ２ｂ１０、ＫＭ４００８のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド０８Ｌａ４、ＫＭ４０１２のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１２Ｈａ５、ＫＭ４０１２のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１２Ｌａ４、ＫＭ４０１８のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１８ｒＨａ１およびＫＭ４０１８のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１８Ｌｂ３が得られた。【０４７８】
得られたＫＭ４００８のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド０８Ｈ２ｂ１０に含まれていたＶＨの全塩基配列を配列番号１８、該プラスミド０８Ｈ２ｂ１０に含まれていたＶＨの全塩基配列から推定されたシグナル配列を含んだ分泌型ＶＨの全アミノ酸配列を配列番号１９、ＫＭ４００８のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド０８Ｌａ４に含まれていたＶＬの全塩基配列を配列番号２０、該プラスミド０８Ｌａ４に含まれていたＶＬの全塩基配列から推定されたシグナル配列を含んだ分泌型ＶＬの全アミノ酸配列を配列番号２１、ＫＭ４０１２のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１２Ｈａ５に含まれていたＶＨの全塩基配列を配列番号２２、該プラスミド１２Ｈａ５に含まれていたＶＨの全塩基配列から推定されたシグナル配列を含んだ分泌型ＶＨの全アミノ酸配列を配列番号２３、ＫＭ４０１２のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１２Ｌａ４に含まれていたＶＬの全塩基配列を配列番号２４、および該プラスミド１２Ｌａ４に含まれていたＶＬの全塩基配列から推定されたシグナル配列を含んだ分泌型ＶＬの全アミノ酸配列を配列番号２５、ＫＭ４０１８のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１８ｒＨａ１に含まれていたＶＨの全塩基配列を配列番号４５、該プラスミド１８ｒＨａ１に含まれていたＶＨの全塩基配列から推定されたシグナル配列を含んだ分泌型ＶＨの全アミノ酸配列を配列番号４６、ＫＭ４０１８のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１８Ｌｂ３に含まれていたＶＬの全塩基配列を配列番号４７、該プラスミド１８Ｌｂ３に含まれていたＶＬの全塩基配列から推定されたシグナル配列を含んだ分泌型ＶＬの全アミノ酸配列を配列番号４８としてそれぞれ示した。【０４７９】
（３）抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
実施例５（７）で得られたＫＭ４００８、ＫＭ４０１２、ＫＭ４０１８の精製モノクローナル抗体におけるＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列に関して、プロテインシーケンサー（ＰＰＳＱ−１０、島津製作所社製）を用いて解析し、約２０残基を決定した。得られた結果と（２）で得られた各抗体の塩基配列から推定されたアミノ酸配列の比較を行った結果、各配列の一致が確認され、（２）で得られた塩基配列が目的抗体の塩基配列であることが確認された。【０４８０】
また、既知のマウス抗体、またはラット抗体のアミノ酸配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較から、単離したそれぞれのｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８をコードする完全長ｃＤＮＡであり、ＫＭ４００８のＨ鎖については配列番号１９に記載のアミノ酸配列の１〜１９番目、ＫＭ４００８のＬ鎖については配列番号２１に記載のアミノ酸配列の１〜２０番目、ＫＭ４０１２のＨ鎖については配列番号２３に記載のアミノ酸配列の１〜１９番目、ＫＭ４０１２のＬ鎖については配列番号２５に記載のアミノ酸配列の１〜２０番目、ＫＭ４０１８のＨ鎖については配列番号４６に記載のアミノ酸配列の１〜１９番目、ＫＭ４０１８のＬ鎖については配列番号４８に記載のアミノ酸配列の１〜２０番目が、それぞれ分泌シグナル配列であることが明らかとなった。【０４８１】
次に、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２、ＫＭ４０１８のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を用いて、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースに対してｂｌａｓｔｐ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］により検索した。その結果、ＶＨおよびＶＬは共に完全に一致するアミノ酸配列は検索されず、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２、ＫＭ４０１８のＶＨおよびＶＬは共に新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。【０４８２】
また、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２、ＫＭ４０１８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号２９、配列番号３０および配列番号３１、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０１２のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０１８のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号５２、配列番号５３および配列番号５４に、それぞれ示した。【０４８３】
［実施例８］
抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の作製
（１）抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４００８＿９３の構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）と実施例７（２）で得られたＫＭ４００８のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド０８Ｈ２ｂ１０およびＫＭ４００８のＬ鎖ｃＤＮＡを含む０８Ｌａ４を用いて抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４００８＿９３を以下のようにして構築した。【０４８４】
実施例２と同様に、ＰＣＲ反応を行った。プラスミド０８Ｈ２ｂ１０（１００ｎｇ）を鋳型として、配列番号３８および配列番号３９記載の塩基配列を有するプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ、それぞれ１μＬ）、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、４μＬ）、およびＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上、タカラバイオ社製、１μＬ）を添加し、さらに滅菌水を加え全量５０μＬとした。ＰＣＲ反応は９６℃で２分間変性処理後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル、更に７２℃で５分間の反応条件で行い、ｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するための制限酵素認識配列が付加されたＫＭ４００８のＶＨをコードする遺伝子断片を増幅した。【０４８５】
また、プラスミド０８Ｌａ４（１００ｎｇ）を鋳型として、配列番号４０および配列番号４１記載の塩基配列を有するプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ、それぞれ１μＬ）、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、４μＬ）、およびＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（以上、タカラバイオ社製、１μＬ）より、上述と同様のＰＣＲ反応を行い、ｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するための制限酵素認識配列が付加されたＫＭ４００８のＶＬをコードする遺伝子断片を増幅した。【０４８６】
得られたそれぞれの反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、得られた約０．５ｋｂｐの増幅断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。得られた遺伝子断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを（インビトロジェン社製）用いてｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクターに連結し、実施例７（２）と同様にして大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、ＫＭ４００８のＶＨをコードする塩基配列を含むプラスミド０８ＶＨ３と、ＫＭ４００８のＶＬをコードする塩基配列を含むプラスミド０８ＶＬ６を取得した。【０４８７】
得られたプラスミド０８ＶＨ３を制限酵素Ａｐａ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＮｏｔ  Ｉ（タカラバイオ社製）で、プラスミド０８ＶＬ６を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＢｓｉＷ  Ｉ（タカラバイオ社製）でそれぞれ消化した後、アガロースゲル電気泳動で分離した。得られた約０．５ｋｂｐの遺伝子断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。【０４８８】
プラスミド０８ＶＬ６を消化して得られた断片を、同じくＥｃｏＲ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＢｓｉＷ  Ｉ（タカラバイオ社製）で消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターに連結し、実施例７（２）と同様にして大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてＫＭ４００８のＶＬが挿入されたｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを取得した。【０４８９】
得られたＫＭ４００８のＶＬが挿入されたｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターをＡｐａ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＮｏｔ  Ｉ（タカラバイオ社製）で消化した後、上述のプラスミド０８ＶＨ３を消化して得られた断片と連結して、実施例７（２）と同様にして大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて、ＫＭ４００８のＶＨおよびＶＬが挿入された抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４００８＿９３を取得した。【０４９０】
（２）抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１２＿９３の構築
（１）と同様にして、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）と実施例７（２）で得られたＫＭ４０１２のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１２Ｈａ５およびＫＭ４０１２のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１２Ｌａ４より、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１２＿９３を構築した。【０４９１】
プラスミド１２Ｈａ５およびプラスミド１２Ｌａ４を鋳型として、配列番号３８および配列番号４２に記載の塩基配列を有するＶＨ増幅用のプライマーおよび配列番号４０および配列番号４１に記載の塩基配列を有するＶＬ増幅用のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、遺伝子断片を増幅した。得られたそれぞれの反応産物を分離、抽出し、ｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、ＫＭ４０１２のＶＨをコードする塩基配列を含むプラスミド１２ＶＨ１と、ＫＭ４０１２のＶＬをコードする塩基配列を含むプラスミド１２ＶＬ１１を取得した。【０４９２】
得られたプラスミド１２ＶＨ１およびプラスミド１２ＶＬ１１をそれぞれ制限酵素にて消化した後、分離、抽出し、プラスミド１２ＶＨ１およびプラスミド１２ＶＬ１１の断片を取得した。得られたそれぞれの断片と、制限酵素にて消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、ＫＭ４０１２のＶＨおよびＶＬが挿入された抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１２＿９３を取得した。【０４９３】
（３）抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１８＿９３の構築
（１）と同様にして、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）と実施例７（２）で得られたＫＭ４０１８のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１８ｒＨａ１およびＫＭ４０１８のＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミド１８Ｌｂ３より、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１８＿９３を構築した。【０４９４】
プラスミド１８ｒＨａ１およびプラスミド１８Ｌｂ３を鋳型として、配列番号５５よび配列番号５６に記載の塩基配列を有するＶＨ増幅用のプライマーおよび配列番号５７および配列番号５８に記載の塩基配列を有するＶＬ増幅用のプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、遺伝子断片を増幅した。【０４９５】
得られたそれぞれの反応産物を分離、抽出し、ｐＣＲ４  ＴＯＰＯベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、ＫＭ４０１８のＶＨをコードする塩基配列を含むプラスミド１８ＶＨ５と、ＫＭ４０１８のＶＬをコードする塩基配列を含むプラスミド１８Ｖ２Ｌ１を取得した。【０４９６】
得られたプラスミド１８ＶＨ５およびプラスミド１８Ｖ２Ｌ１をそれぞれ制限酵素にて消化した後、分離、抽出し、プラスミド１８ＶＨ５およびプラスミド１８Ｖ２Ｌ１の断片を取得した。得られたそれぞれの断片と、制限酵素にて消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、ＫＭ４０１８のＶＨおよびＶＬが挿入された抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１８＿９３を取得した。【０４９７】
（４）抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の動物細胞での発現
上記（１）で得られた抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４００８＿９３を用いて抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行った。【０４９８】
また、同様にして抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１２＿９３、または抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターｃＫＭ４０１８＿９３を用いて、それぞれ抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の動物細胞での発現を行い、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体を産生する形質転換株を取得した。【０４９９】
（５）精製抗体の取得
上記（４）で得られた形質転換株を、それぞれ通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１５分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。得られた培養上清よりＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙレジン（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２、ｃＫＭ４０１８（以下ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２、ｃＫＭ４０１８と表記する）を精製した。【０５００】
得られたｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２、ｃＫＭ４０１８の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル（アトー社製、カタログ番号：Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いて、添付の説明書に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。精製した抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の泳動パターンは、非還元条件下では分子量１５０〜２００キロダルトン（以下、ｋＤａと表記する）付近に１本のバンドが、還元条件下では約５０ｋＤａと約２５ｋＤａの２本のバンドが認められた。【０５０１】
このような泳動パターンは、ＩｇＧクラスの抗体を、同様な条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］と一致している。【０５０２】
従って、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。【０５０３】
［実施例９］
抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体の反応性検討
（１）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター）
実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、および多発性骨髄腫細胞株ＯＰＭ−２（ＤＳＭＺ番号：ＡＣＣ５０）をそれぞれ５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３〜４日間培養した。ヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞は、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離し、抗体の非特異的な吸着を避けるために１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて氷温中、３０分間ブロッキングした。【０５０４】
９６ウェルＵ字プレートに１ウェルあたり１×１０５〜５×１０５個の細胞（１００μＬ）を播種し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離（０５ＰＲ−２２、日立工機社製）した後、上清を除いた。１次抗体として被検物質である精製抗体を最終濃度が０．００１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、氷温中で６０分間反応させた。【０５０５】
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した後、２次抗体として１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したＦＩＴＣ標識抗ヒトイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・ラボラトリーズ社製）を加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ、ベックマン・コールター社製）で蛍光強度を測定した。測定の結果を図９に示す。【０５０６】
図９に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８はそれぞれヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞強い結合性を示した。また、多発性骨髄腫細胞株であるＯＰＭ−２に強い反応性を示すことが明らかとなった。【０５０７】
（２）ＡＤＣＣ活性
標的細胞には多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ１１７９）を用い、ＦＢＳ（インビトロジェン社）を５％含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）（以下、ＡＤＣＣ活性測定用培地）で細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。【０５０８】
エフェクター細胞溶液の調製にはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ニコメッド社製）を用い、添付の使用説明書に従い、健常人末梢血から単核球（ＰＢＭＣ）画分を分離した。分離したＰＢＭＣ画分は、ＡＤＣＣ活性測定用培地で２回遠心分離して洗浄後、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調製し、エフェクター細胞溶液とした。【０５０９】
標的細胞溶液を、９６ウェルＵ字底プレート（ファルコン社製）に５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）分注し、次いでエフェクター細胞溶液を５０μＬ（エフェクター細胞と標的細胞の比は１０：１）を添加した。【０５１０】
更に、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２またはｃＫＭ４０１８をＡＤＣＣ活性測定用培地で希釈し、各最終濃度０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ（和光純薬社製）を用い、添付の説明書に従い、吸光度を測定することで検出した。【０５１１】
標的細胞自然遊離の吸光度は、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。【０５１２】
標的細胞全遊離の吸光度は、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用い、反応終了の４５分前に２０μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加して反応させ、上記と同様の操作を行うことで取得した。ＡＤＣＣ活性は以下の計算式により求めた。【０５１３】
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝［（検体の吸光度）−（エフェクター細胞・標的細胞自然遊離の吸光度）］／［（標的細胞全遊離の吸光度）−（標的細胞自然遊離の吸光度）］×１００【０５１４】
測定の結果を図１０に示す。図１０に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８は、抗体濃度依存的にＡＳＣＴ２を発現する細胞に対してＡＤＣＣ活性を有することが明らかとなった。【０５１５】
（３）ＣＤＣ活性
標的細胞には実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、および大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２２）を用い、０．０２％−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離し、ＣＤＣ測定用培地として作製した１．４％  ＢＳＡ（インビトロジェン社製）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）で洗浄後、同培地で２×１０５細胞／ｍＬに懸濁し、標的細胞溶液とした。【０５１６】
ヒト補体血清（シグマ社製、Ｓ２２５７−５ＭＬ）を脱イオン水５ｍＬにて溶解し、等量のＣＤＣ測定用培地を加えて２倍に希釈し、ヒト補体溶液とした。９６ウェル平底プレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに補体溶液を５０μＬ分注した。【０５１７】
次いで標的細胞溶液を５０μＬ加え、さらにＣＤＣ用培地で希釈した各抗体溶液を５０μＬ添加して、全量を１５０μＬとし、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間反応させた。【０５１８】
各ウェルにＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を１５μＬずつ添加してプレートミキサーで攪拌し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間反応させ、マイクロプレート分光光度計（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用い、４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。【０５１９】
補体溶液５０μＬ、ＣＤＣ用培地１００μＬを加えたウェルをブランクとして、また標的細胞、補体溶液、ＣＤＣ用培地を各５０μＬずつ加えたウェル（抗体非添加）の吸光度を測定し、ＣＤＣ活性は以下の計算式により算出した。【０５２０】
（式）
ＣＤＣ活性（％）＝｛１−［（抗体添加サンプル吸光度）−（ブランク吸光度）］／［（抗体非添加吸光度）−（ブランク吸光度）］×１００｝
測定の結果を図１１に示す。図１１に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８は、抗体濃度依存的にＡＳＣＴ２発現細胞に対しＣＤＣ活性を有することが明らかとなった。また、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に対してもＣＤＣ活性を有することが明らかとなった。【０５２１】
（４）ＡＳＣＴ２を介したアミノ酸の細胞内取り込み阻害活性
１０％ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を添加したＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）（以下、グルタミン不含培地と表記する）で１×１０４個／ｍＬの細胞数に調製したヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１８）を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。【０５２２】
最終濃度が１０〜０．０１μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈調製した被検物質である抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体、ＫＭ５１１（陰性対照）およびグルタミン競合アミノ酸混合液［ＡＳＴ混合液、アラニン、セリン、スレオニン（いずれもシグマ社製、各３．３ｍｍｏｌ／Ｌ）の混合液］を２０μＬ／ウェル加え、さらに、最終濃度０．２ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにグルタミン不含培地で調製したグルタミン溶液（インビトロジェン社製）を２０μＬ／ウェル加えた。【０５２３】
コントロールのウェルおよびブランクプレートのウェルには、ＰＢＳ（２０μＬ／ウェル）と上記グルタミン溶液（２０μＬ／ウェル）を添加した。ブランクプレート以外は、抗体添加後、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間培養した。【０５２４】
グルタミン不含培地で５０％に希釈したＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２０μＬ／ウェル加え、さらに３７℃で２時間インキュベートした。【０５２５】
マイクロプレート分光光度計（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用い、４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。抗体非添加のコントロールのウェルの吸光度を１００％、ブランクプレートのウェルの吸光度を０％として、抗体を添加したウェルの相対増殖率（％）を算出した。【０５２６】
測定の結果を図１２に示す。図１２に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８はいずれも抗体濃度依存的に細胞増殖を強力に抑制した。その結果、ｃＫＭ４００８、ｃＫＭ４０１２およびｃＫＭ４０１８は、グルタミンを細胞内に取り込むＡＳＣＴ２の機能を強力に中和することにより、癌細胞の増殖を顕著に抑制する活性を有することが示された。【０５２７】
［実施例１０］
マウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入細胞株（以下、マウスＡＳＣＴ２／ＣＨＯと表記）の造成
以下に示した方法により、配列番号５９記載の遺伝子配列および配列番号６０記載のアミノ酸配列を含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得し、このプラスミドを用いてマウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株を取得した。【０５２８】
マウスＡＳＣＴ２遺伝子クローン（Ｃｌｏｎｅ  ＩＤ：４１９２７９０、オープンバイオシステムズ社）の大腸菌液１０μＬをアンピシリン含有ＬＢ培地５０ｍＬに植菌し、一晩撹拌培養後に遠心分離（ＣＲ２ＤＧＩＩ、日立工機社製、６０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を回収し、プラスミド抽出キット（キアゲン社）を用いてマウスＡＳＣＴ２遺伝子を含むプラスミドを取得した。【０５２９】
前記プラスミドを鋳型として１００ｎｇ、１０×ＫＯＤ緩衝液Ｉ（１０  μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（２ｍｍｏｌ／Ｌ、５μＬ）、ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ、４μＬ）、配列番号６１および配列番号６２記載の塩基配列を有するプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ、それぞれ１μＬ）、ＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製、１μＬ）、ジメチルスルホキシド（５μＬ）を含む総量１００μＬからなる溶液を、９６℃で３分間の反応後、９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で１．５分間の３工程を１サイクルとして、計３５サイクル、７２℃で７分間反応させた。【０５３０】
反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、得られた約１．７ｋｂの増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。得られた抽出断片を、ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて再抽出した。【０５３１】
ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）ベクターに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。【０５３２】
得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機ＰＩ−５０（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、配列番号５９記載の遺伝子配列および配列番号６０記載のアミノ酸配列を含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５３３】
得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／ＨｉｓをＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化し、上記と同様に遺伝子断片を抽出し、予めＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクター（ＷＯ９７／１０３５４）に連結した。【０５３４】
上記と同様にして、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体を得た後、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５３５】
ｐＫＡＮＴＥＸ−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓは、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により、以下のようにしてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５５（１９８６）］へ導入した。細胞は、１０％ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）およびゲンタマイシン（ナカライテスク社製、５０μｇ／ｍＬ）を添加したＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）（以下、Ａ４倍地と表記する）に、１×ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加した培地で継代したものを用いた。【０５３６】
ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を塩化カリウム（１３７ｎｍｏｌ／Ｌ）、塩化ナトリウム（２．７ｎｍｏｌ／Ｌ）、リン酸一水素二ナトリウム（８．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、リン酸二水素一ナトリウム（１．５ｎｍｏｌ／Ｌ）および塩化マグネシウム（４ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む緩衝液（以下、Ｋ−ＰＢＳと表記する）に懸濁して８×１０６個／ｍＬとし、得られた細胞懸濁液（２００μＬ、細胞数として１．６×１０６個）を発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ（１０μｇ）と混和した。【０５３７】
得られた混和液をキュベット（電極間距離２ｍｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（バイオラッド社製）を用いてパルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液を、Ａ４培地を含む細胞培養用容器に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。【０５３８】
４日間培養後、Ｇ４１８（ナカライテスク社製、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加したＡ４培地に培地交換し、培養を続けた。途中培地交換と継代を行い、遺伝子導入より約２週間後に、Ｇ４１８に耐性を有する形質転換細胞株を取得した。【０５３９】
得られたＧ４１８に耐性形質転換細胞を１ｍＬあたり５個の細胞数となるようにＧ４１８（ナカライテスク社製、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加したＡ４培地で希釈し、希釈した細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、段階的にメソトレキセート濃度を上昇させて処理することにより、マウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを高発現するクローンを選択し、マウスＡＳＣＴ２／ＣＨＯを取得した。【０５４０】
［実施例１１］
マウス／ヒトキメラＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入細胞株（以下、マウス／ヒトキメラＡＳＣＴ２／ＣＨＯと表記）の造成
ヒトとマウスのＡＳＣＴ２蛋白質の模式図を図１３に示す。図１３中のマウスＡＳＣＴ２蛋白質の模式図において、黒色で示した部分（マウスＡＳＣＴ２の細胞外領域において、ヒトの７４番目、７９番目、８４番目、８７番目、９０番目、１５４番目、１５９番目、１６０番目、１６３〜１７１番目、１７３番目、１７４番目、１７７番目、１８８番目、２０４番目、２０５番目、２０７番目、２１０〜２１２番目、２１４〜２２３番目、２８７番目、２９３番目、２９６番目、２９７番目、３００番目、３０１番目および３６７番目に相当するアミノ酸）がヒトとマウスで異なるアミノ酸である。【０５４１】
ＡＳＣＴ２の細胞外領域において、ヒトとマウスで異なるアミノ酸はＥＬ１では５箇所、ＥＬ２ではヒトとマウスでは大きく異なり、ＥＬ３では６箇所、ＥＬ４では１箇所である。ＥＬ１、ＥＬ２およびＥＬ３については、各領域を含むドメインをその近傍に位置する制限酵素サイトで切り出し、組み換えによりマウス置換体を得るため、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用いたサイレント変異の導入により、ヒトＡＳＣＴ２遺伝子についてはＥＬ３後方のＮｃｏＩサイトを消失し、ＢａｍＩＩＩサイトを導入した。【０５４２】
また、マウスＡＳＣＴ２遺伝子についてはＥＬ２中のＮｃｏＩサイトを消失した。１箇所のアミノ酸の相違であるＥＬ４については、変異導入によりヒトＡＳＣＴ２遺伝子をマウス型に置換した。各変異体のＣ末端側にｍｙｃ／Ｈｉｓタグを融合させた蛋白質の遺伝子を以下のようにして作成し、ＣＨＯ細胞に導入した。【０５４３】
（１）変異ヒトＡＳＣＴ２遺伝子の構築
実施例２で作製したｐＣＲ４−ＳＬＣ１Ａ５−ｍｙｃ／Ｈｉｓを鋳型とし、配列番号６３および配列番号６４記載の塩基配列を有するプライマー（０．１μｇ／ｍＬ、２．５μＬ）とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔに添付の１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）、ｄＮＴＰ混合液（１μＬ）を含む総量５０μＬからなる溶液にＰｆｕＴｕｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１μＬ）を加えた。【０５４４】
９５℃で３０秒間の反応後、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で５分間の３工程を１サイクルとして、計１８サイクルからなるＰＣＲ反応を行い、反応終了後に１μＬのＤｎｐＩを加えて３７℃で１時間反応させた。【０５４５】
反応産物２μＬを用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔに添付の大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（ストラタジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換体より自動プラスミド抽出機ＰＩ−５０（クラボウ社製）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミドｐＣＲ４−ｈＮｃｏ１ＫＯ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５４６】
前記プラスミドを鋳型とし、配列番号６５および配列番号６６記載の塩基配列を有するプライマー（０．１μｇ／ｍＬ、２．５μＬ）を用い、上記と同様の方法でプラスミドｐＣＲ４−ｈＢａｍ３ＫＩ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５４７】
取得したプラスミドをＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて抽出し、予めＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）ベクター（ストラタジーン社製）に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて連結した。【０５４８】
その後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、上記と同様の方法で、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）ｈＢａｍ３ＫＩ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５４９】
（２）変異マウスＡＳＣＴ２遺伝子の構築
実施例１０で作製したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−Ｍｏｕｓｅ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを鋳型とし、配列番号６７および配列番号６８記載の塩基配列を有するプライマーを用い、実施例１１（１）と同様の方法で、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＮｃｏＫＯ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５５０】
（３）マウス／ヒトキメラＡＳＣＴ２／ＣＨＯの造成
（１）および（２）で得たプラスミドでｄａｍ−の大腸菌株（カタログ番号：Ｃ２９２５、ニューイングランドバイオラボ社製）を再度形質転換して取得したプラスミドを、ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）およびＢｃｌＩ（ＦｂａＩと同一、タカラバイオ社製）で消化した。ヒトＡＳＣＴ２遺伝子を含むプラスミドをベクターとし、マウスＡＳＣＴ２遺伝子をインサートとして連結させ、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。【０５５１】
ＥＬ１がマウス型に置換したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ１＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。同様に、ＢｃｌＩおよびＮｃｏＩサイトでの組み換えで、ＥＬ２がマウス型に置換したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ２＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを、ＮｃｏＩおよびＢａｍＩＩＩサイトでの組み換えで、ＥＬ３がマウス型に置換したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ３＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５５２】
（１）で取得したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）ｈＢａｍ３ＫＩ＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを鋳型とし、配列番号６９および配列番号７０記載の塩基配列を有するプライマーを用い、実施例１１（１）と同様の方法で、ＥＬ４がマウス型に置換したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ４＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓを取得した。【０５５３】
得られたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ１＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ２＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ３＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／ＨｉｓおよびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）−ｍＥＬ４＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／ＨｉｓをＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）とＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）で消化した。【０５５４】
上記と同様に遺伝子断片を抽出し、予めＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクター（ＷＯ９７／１０３５４）に連結し、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体を得た。その後、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ１＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ２＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ３＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／ＨｉｓおよびｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ４＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓをそれぞれ取得した。【０５５５】
ｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ１＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ２＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ、ｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ３＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／ＨｉｓおよびｐＫＡＮＴＥＸ−ｍＥＬ４＿ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓはエレクトロポレーション法により、実施例１０と同様の方法でＣＨＯ／ＤＧ４４細胞へ導入した。【０５５６】
マウスＥＬ１型ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株（以下、ｍＥＬ１／ＣＨＯと表記）、マウスＥＬ２型ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株（以下、ｍＥＬ２／ＣＨＯと表記）、マウスＥＬ３型ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株（以下、ｍＥＬ３／ＣＨＯと表記）およびマウスＥＬ４型ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞株（以下、ｍＥＬ４／ＣＨＯと表記）をそれぞれ取得した。【０５５７】
［実施例１２］
マウスＡＳＣＴ２／ＣＨＯおよびマウス／ヒトキメラＡＳＣＴ２／ＣＨＯに対する抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体の反応性
実施例１０および実施例１１で作製したマウスＡＳＣＴ２／ＣＨＯおよびマウス／ヒトキメラＡＳＣＴ２／ＣＨＯ細胞を用い、実施例９（１）と同様の方法で、２次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ダコ社製）またはＡＬＥＸＡ４８８標識抗ラットイムノグロブリンＧ（Ｇ＋Ｌ）（インビトロジェン社製）を用いて、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８の反応性を測定した。【０５５８】
測定の結果を表２に示す。表２において、反応性ありを＋印で、反応性なしを−印で、反応性低下を±印でそれぞれ示す。表２に示すように、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８、ＫＭ４０１２およびＫＭ４０１８は何れもマウスＡＳＣＴ２には反応しなかった。【０５５９】
また、ＫＭ４００８およびＫＭ４０１２では、ｍＥＬ２／ＣＨＯに対して反応性の低下が認められた。一方、ＫＭ４０１８では、ｍＥＬ２／ＣＨＯに対しては反応せず、ｍＥＬ１／ＣＨＯおよびｍＥＬ３／ＣＨＯに対して反応性の低下が認められた。【０５６０】
以上の結果から、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４００８およびＫＭ４０１２はＥＬ２を、抗ＡＳＣＴ２モノクローナル抗体ＫＭ４０１８はＥＬ１、ＥＬ２およびＥＬ３からなる立体構造を認識し結合することが明らかとなった。【０５６１】
【表２】
2011087091.tif 000003
【０５６２】
［実施例１３］
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の作製
（１）抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。【０５６３】
初めに、実施例７（３）で得られた、配列番号２６〜２８でそれぞれ表されるＫＭ４００８ＶＨのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（ジェネティック・コンピューター・グループ社製）を用いて、既存の蛋白質のアミノ酸データベースをＢＬＡＳＴＰ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］によりＫＭ４００８と相同性の高いヒト抗体を検索した。【０５６４】
相同性スコアと実際のアミノ酸配列の相同性を比較したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースアクセッションナンバー：ＢＡＣ０１３４２、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ＶＨＤＪ  ｒｅｇｉｏｎ（以下、ＢＡＣ０１３４２と表記）が７７．０％を示し、最も相同性の高いヒト抗体であったため、この抗体のＦＲのアミノ酸配列を選択した。【０５６５】
以上のようにして決定したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に配列番号２６〜２８で示したＫＭ４００８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。このようにして、配列番号７１で表される抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０を設計した。【０５６６】
次に、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。【０５６７】
実施例７（３）で得られた、配列番号２９〜３１でそれぞれ表されるＫＭ４００８ＶＬのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。【０５６８】
カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性からサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩ〜ＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＫＭ４００８のＶＬのＦＲのアミノ酸配列との相同性検索を実施した。【０５６９】
相同性を検索した結果、ＨＳＧＩ、ＨＳＧＩＩ、ＨＳＧＩＩＩ、およびＨＳＧＩＶの相同性はそれぞれ７７．５％、６０．０％、６３．８％、および６８．８％であった。従って、ＫＭ４００８ＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。【０５７０】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置にＫＭ４００８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号２１で表されるＫＭ４００８のＶＬのアミノ酸配列中の１２４番目のＬｅｕは、カバットらが挙げるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のＫＭ４００８のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。【０５７１】
このようにして、配列番号７２で表される抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。【０５７２】
上記で設計した抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＡＳＣＴ２マウスモノクローナル抗体ＫＭ４００８のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。【０５７３】
しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体のＦＲへのマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多い。【０５７４】
このため、結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を改変することが行われている。【０５７５】
そこで、本実施例でも、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。【０５７６】
まず、上記で設計した抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域（以下、ＨＶ０ＬＶ０と表す）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。【０５７７】
三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社製）を添付の使用説明書に従い、用いた。また、抗ＡＳＣＴ２マウスモノクローナル抗体ＫＭ４００８のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。【０５７８】
更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、ＫＭ４００８と異なっているアミノ酸残基を選択し、ＫＭ４００８のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製したＫＭ４００８、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。【０５７９】
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＨＶ０では２番目のＶａｌ、９番目のＳｅｒ、２０番目のＶａｌ、３０番目のＳｅｒ、３８番目のＡｒｇ、４６番目のＧｌｕ、８６番目のＬｅｕ、９３番目のＶａｌ、９５番目のＴｙｒ、および１１６番目のＶａｌを、ＬＶ０では８番目のＰｒｏ、１５番目のＶａｌ、３８番目のＧｌｎ、４３番目のＡｌａ、４４番目のＰｒｏ、７１番目のＰｈｅ、および８７番目のＴｙｒをそれぞれ選択した。【０５８０】
これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をＫＭ４００８の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。【０５８１】
具体的には、ＶＨについては、配列番号７１で表されるアミノ酸配列の２番目のＶａｌをＩｌｅに、９番目のＳｅｒをＰｒｏに、２０番目のＶａｌをＩｌｅに、３０番目のＳｅｒをＴｈｒに、３８番目のＡｒｇをＬｙｓに、４６番目のＧｌｕをＬｙｓに、８６番目のＬｅｕをＶａｌに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、９５番目のＴｙｒをＰｈｅに、および１１６番目のＶａｌをＬｅｕに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０５８２】
また、ＶＬについては、配列番号７２で表されるアミノ酸配列の８番目のＰｒｏをＴｈｒに、１５番目のＶａｌをＬｅｕに、３８番目のＧｌｎをＡｒｇに、４３番目のＡｌａをＴｈｒに、４４番目のＰｒｏをＶａｌに、７１番目のＰｈｅをＴｙｒに、および８７番目のＴｙｒをＰｈｅに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。【０５８３】
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲに存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を改変した抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の抗体Ｖ領域として、ＨＶ０ＬＶ３、ＨＶ２ＬＶ０、ＨＶ２ＬＶ３、ＨＶ４ＬＶ０、ＨＶ４ＬＶ３、ＨＶ７ＬＶ０、ＨＶ７ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ０、およびＨＶ１０ＬＶ３をそれぞれ設計した。Ｈ鎖可変領域ＨＶ２、ＨＶ４，ＨＶ７，ＨＶ１０およびＬ鎖可変領域ＬＶ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７６、７８、８０、８２および８４に示した。【０５８４】
（２）抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の作製
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＫＭ４００８のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡで用いられているコドンを利用し、アミノ酸改変を行う場合は、哺乳動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて、作製した。【０５８５】
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体のＨＶ０およびＬＶ０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を配列番号７３、７４にぞれぞれ示し、またアミノ酸改変を行った可変領域ＨＶ２、ＨＶ４、ＨＶ７、ＨＶ１０、およびＬＶ３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を、配列番号７５、７７、７９、８１、および８３にそれぞれ示した。【０５８６】
これらＤＮＡ配列を用いて、以下の方法にてヒト化抗体の発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現をそれぞれ行った。【０５８７】
［実施例１４］
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の作製
（１）抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体発現ベクターＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３＿９３の構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）と配列番号８７および配列番号８８の合成遺伝子を用いて抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体発現ベクターＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３＿９３を以下のようにして構築した。【０５８８】
配列番号８７の合成遺伝子を制限酵素Ａｐａ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＮｏｔ  Ｉ（タカラバイオ社製）で、配列番号８８の合成遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＢｓｉＷ  Ｉ（タカラバイオ社製）でそれぞれ消化した後、アガロースゲル電気泳動で分離した。得られた約０．５ｋｂｐの遺伝子断片をＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。【０５８９】
配列番号８８の合成遺伝子を消化して得られた断片を、同じくＥｃｏＲ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＢｓｉＷ  Ｉ（タカラバイオ社製）で消化したｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターに連結し、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて配列番号８８の合成遺伝子が挿入されたｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを取得した。【０５９０】
得られた配列番号８８の合成遺伝子が挿入されたｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターをＡｐａ  Ｉ（タカラバイオ社製）およびＮｏｔ  Ｉ（タカラバイオ社製）で消化した後、上述の配列番号８７の合成遺伝子を消化して得られた断片と連結し、大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、プラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いて、配列番号８７および配列番号８８の合成遺伝子が挿入された抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体発現ベクターＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３＿９３を取得した。【０５９１】
（２）抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体発現ベクターＫＭ４００８ＨＶ１０ＬＶ３＿９３の構築
（１）と同様にして、ヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４）と配列番号８８および配列番号８９の合成遺伝子より、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体発現ベクターＫＭ４００８ＨＶ１０ＬＶ３＿９３を構築した。【０５９２】
（３）抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の動物細胞での発現
上記（１）および（２）で得られた抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体発現ベクターＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３＿９３およびＫＭ４００８ＨＶ１０ＬＶ３＿９３を用いて抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行い、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体を産生する形質転換株を取得した。【０５９３】
（４）精製抗体の取得
上記（３）で得られた形質転換株を、それぞれ通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で１５分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。【０５９４】
得られた培養上清よりＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙレジン（ミリポア社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＫＭ４００８ＨＶ２ＬＶ３、ＫＭ４００８ＨＶ１０ＬＶ３（以下ＨＶ２ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ３と表記する）を精製した。【０５９５】
得られたＨＶ２ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ３の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル（アトー社製、カタログ番号：Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いて、添付の説明書に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。【０５９６】
精製した抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の泳動パターンは、非還元条件下では分子量１５０〜２００キロダルトン（以下、ｋＤａと表記する）付近に１本のバンドが、還元条件下では約５０ｋＤａと約２５ｋＤａの２本のバンドが認められた。【０５９７】
このような泳動パターンは、ＩｇＧクラスの抗体を、同様な条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］と一致している。【０５９８】
従って、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。【０５９９】
［実施例１５］
抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体の反応性検討
（１）蛍光細胞染色法（フローサイトメーター）
実施例２で得られたヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞、および多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ１１７９）をそれぞれ５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で３〜４日間培養した。細胞は０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離し、抗体の非特異的な吸着を避けるために１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて氷温中、３０分間ブロッキングした。【０６００】
９６ウェルＵ字プレートに１ウェルあたり１×１０５〜５×１０５個の細胞（１００μＬ）を播種し、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離（０５ＰＲ−２２、日立工機社製）した後、上清を除いた。【０６０１】
１次抗体として被検物質である精製抗体を最終濃度が０．００１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、氷温中で６０分間反応させた。【０６０２】
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した後、２次抗体として１％ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈したＦＩＴＣ標識抗ヒトイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（ジャクソン・ラボラトリーズ社製）を加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。【０６０３】
１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに懸濁してフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００  ＭＰＬ、ベックマン・コールター社製）で蛍光強度を測定した。【０６０４】
測定の結果を図１４に示す。図１４に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８と同様に、ヒトＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ遺伝子導入ＣＨＯ細胞に強い結合性を示した。【０６０５】
また、多発性骨髄腫細胞株であるＫＭＳ−１１にも強い反応性を示すことが明らかとなった。【０６０６】
（２）ＡＤＣＣ活性
標的細胞には多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−１１（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ１１７９）および小細胞肺癌株ＳＢＣ−３（ＨＳＲＲＢ番号：ＪＣＲＢ０８１８）を用い、ＦＢＳ（インビトロジェン社）を５％含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）（以下、ＡＤＣＣ活性測定用培地）で細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。【０６０７】
エフェクター細胞溶液の調製にはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ニコメッド社製）を用い、添付の使用説明書に従い、健常人末梢血から単核球（ＰＢＭＣ）画分を分離した。分離したＰＢＭＣ画分は、ＡＤＣＣ活性測定用培地で２回遠心分離して洗浄後、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調製し、エフェクター細胞溶液とした。【０６０８】
標的細胞溶液を、９６ウェルＵ字底プレート（ファルコン社製）に５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）分注し、次いでエフェクター細胞溶液を５０μＬ（エフェクター細胞と標的細胞の比は１０：１）を添加した。【０６０９】
更に、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ３または抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８をＡＤＣＣ活性測定用培地で希釈し、各最終濃度０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。【０６１０】
反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ（和光純薬社製）を用い、添付の説明書に従い、吸光度を測定することで検出した。【０６１１】
標的細胞自然遊離の吸光度は、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。【０６１２】
標的細胞全遊離の吸光度は、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用い、反応終了の４５分前に２０μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加して反応させ、上記と同様の操作を行うことで取得した。ＡＤＣＣ活性は以下の計算式により求めた。【０６１３】
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝［（検体の吸光度）−（エフェクター細胞・標的細胞自然遊離の吸光度）］／［（標的細胞全遊離の吸光度）−（標的細胞自然遊離の吸光度）］×１００【０６１４】
測定の結果を図１５に示す。図１５に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８と同様に、抗体濃度依存的にＡＳＣＴ２を発現する細胞に対してＡＤＣＣ活性を有することが明らかとなった。【０６１５】
（３）ＣＤＣ活性
標的細胞には大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２２２）を用い、０．０２％−ＥＤＴＡ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社製）で剥離し、ＣＤＣ測定用培地として作製した１．４％  ＢＳＡ（インビトロジェン社製）、５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）で洗浄後、同培地で２×１０５細胞／ｍＬに懸濁し、標的細胞溶液とした。【０６１６】
ヒト補体血清（シグマ社製、Ｓ１７６４−１ＭＬ）を脱イオン水１ｍＬにて溶解し、等量のＣＤＣ測定用培地を加えて２倍に希釈し、ヒト補体溶液とした。【０６１７】
９６ウェル平底プレート（住友ベークライト社製）の各ウェルに補体溶液を５０μＬ分注した。次いで標的細胞溶液を５０μＬ加え、さらにＣＤＣ用培地で希釈した各抗体溶液を５０μＬ添加して、全量を１５０μＬとし、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間反応させた。【０６１８】
各ウェルにＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を１５μＬずつ添加してプレートミキサーで攪拌し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２時間反応させ、マイクロプレート分光光度計（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用い、４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。【０６１９】
補体溶液５０μＬ、ＣＤＣ用培地１００μＬを加えたウェルをブランクとして、また標的細胞、補体溶液、ＣＤＣ用培地を各５０μＬずつ加えたウェル（抗体非添加）の吸光度を測定し、ＣＤＣ活性は以下の計算式により算出した。【０６２０】
（式）
ＣＤＣ活性（％）＝｛１−［（抗体添加サンプル吸光度）−（ブランク吸光度）］／［（抗体非添加吸光度）−（ブランク吸光度）］×１００｝【０６２１】
測定の結果を図１６に示す。図１６に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８と同様に、抗体濃度依存的に大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に対しＣＤＣ活性を有することが明らかとなった。【０６２２】
（４）ＡＳＣＴ２を介したアミノ酸の細胞内取り込み阻害活性
１０％ｄＦＢＳ（インビトロジェン社製）を添加したＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）（以下、グルタミン不含培地と表記する）で１×１０４個／ｍＬの細胞数に調製したヒト大腸癌細胞株ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２１８）を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。【０６２３】
最終濃度が１０〜０．０１μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈調製した被検物質である抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３、ＨＶ１０ＬＶ３、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８、ＫＭ５１１［陰性対照、抗Ｇ−ＣＳＦ誘導体抗体、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，１０９５（１９８９）、マウスＩｇＧ１］およびグルタミン競合アミノ酸混合液［ＡＳＴ混合液、アラニン、セリン、スレオニン（いずれもシグマ社製、各３．３ｍｍｏｌ／Ｌ）の混合液］を２０μＬ／ウェル加えた。さらに、最終濃度０．２ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにグルタミン不含培地で調製したグルタミン溶液（インビトロジェン社製）を２０μＬ／ウェル加えた。【０６２４】
コントロールのウェルおよびブランクプレートのウェルには、ＰＢＳ（２０μＬ／ウェル）と上記グルタミン溶液（２０μＬ／ウェル）を添加した。ブランクプレート以外は、抗体添加後、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間培養した。【０６２５】
グルタミン不含培地で５０％に希釈したＷＳＴ−１試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を２０μＬ／ウェル加え、さらに３７℃で２時間インキュベートした。【０６２６】
マイクロプレート分光光度計（Ｅｍａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、モレキュラー・デバイス社）を用い、４５０ｎｍ（対照波長６５０ｎｍ）の吸光度を測定した。抗体非添加のコントロールのウェルの吸光度を１００％、ブランクプレートのウェルの吸光度を０％として、抗体を添加したウェルの相対増殖率（％）を算出した。【０６２７】
測定の結果を図１７に示す。図１７に示すように、抗ＡＳＣＴ２ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３は、抗ＡＳＣＴ２ヒト型キメラ抗体ｃＫＭ４００８と同様に、抗体濃度依存的に細胞増殖を強力に抑制した。その結果、ＨＶ２ＬＶ３およびＨＶ１０ＬＶ３は、グルタミンを細胞内に取り込むＡＳＣＴ２の機能を強力に中和することにより、癌細胞の増殖を顕著に抑制する活性を有することが示された。【０６２８】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１０年１月１５日付けで出願された米国仮出願（６１／２９５２９７号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０６２９】
本発明によれば、システムＡＳＣアミノ酸トランスポーター２（ＡＳＣＴ２）の細胞外領域の天然型立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体または該抗体断片、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体、該ハイブリドーマまたは該形質転換体を用いる抗体または該抗体断片の製造方法、該抗体または該抗体断片を含む治療薬、および該抗体または該抗体断片を含む診断薬を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０６３０】
配列番号３−人工配列の説明：ＡＳＣＴ２プライマー（Ｆｗ＃１）
配列番号４−人工配列の説明：ＡＳＣＴ２プライマー（Ｒｖ＃１）
配列番号５−人工配列の説明：ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ配列
配列番号６−人工配列の説明：ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ配列
配列番号７−人工配列の説明：Ｎ−ＡＳＣＴ２プライマー（＃１）配列
配列番号８−人工配列の説明：Ｎ−ＡＳＣＴ２プライマー（＃２）配列
配列番号９−人工配列の説明：Ｎ−ＡＳＣＴ２プライマー（＃３）配列
配列番号１０−人工配列の説明：Ｎ−ＡＳＣＴ２プライマー（＃４）配列
配列番号１１−人工配列の説明：Ｃ−ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｆｗ＃２）配列
配列番号１２−人工配列の説明：Ｃ−ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｒｖ＃２）配列
配列番号１３−人工配列の説明：Ｃ−ＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｒｖ＃３）配列
配列番号１４−人工配列の説明：ＡＳＣＴ２ペプチド（２−１６，Ｃｙｓ）配列
配列番号１５−人工配列の説明：プライマー（ｍＧ３ａ２）配列
配列番号１６−人工配列の説明：プライマー（ｍＧ２ｂａ１）配列
配列番号１７−人工配列の説明：プライマー（ｍＫａ１）配列
配列番号３８−人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＨ／ｃＫＷ４０１２ＶＨプライマー（Ｆｗ）配列
配列番号３９−人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＨプライマー（Ｒｖ）配列
配列番号４０−人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＬ／ｃＫＭ４０１２ＶＬプライマー（Ｆｗ）配列
配列番号４１−人工配列の説明：ｃＫＭ４００８ＶＬ／ｃＫＭ４０１２ＶＬプライマー（Ｒｖ）配列
配列番号４２−人工配列の説明：ｃＫＭ４０１２ＶＨプライマー（Ｒｖ）配列
配列番号４３−人工配列の説明：プライマー（ｒＧ２ａ）配列
配列番号４４−人工配列の説明：プライマー（ｒＫａ２）配列
配列番号５５−人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＨプライマー（Ｆｗ）配列
配列番号５６−人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＨプライマー（Ｒｖ）配列
配列番号５７−人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＬプライマー（Ｆｗ）配列
配列番号５８−人工配列の説明：ｃＫＭ４０１８ＶＬプライマー（Ｒｖ）配列
配列番号５９−人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ配列
配列番号６０−人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓ配列
配列番号６１−人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｆｗ）配列
配列番号６２−人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２−ｍｙｃ／Ｈｉｓプライマー（Ｒｖ）配列
配列番号６３−人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２  ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｆｗ）配列
配列番号６４−人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２  ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｒｖ）配列
配列番号６５−人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２  ＢａｍＩＩＩサイト導入用プライマー（Ｆｗ）配列
配列番号６６−人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２  ＢａｍＩＩＩサイト導入用プライマー（Ｒｖ）配列
配列番号６７−人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２  ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｆｗ）配列
配列番号６８−人工配列の説明：マウスＡＳＣＴ２  ＮｃｏＩサイト変異導入用プライマー（Ｒｖ）配列
配列番号６９−人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２  ＥＬ４マウス型置換用プライマー（Ｆｗ）配列
配列番号７０−人工配列の説明：ヒトＡＳＣＴ２  ＥＬ４マウス型置換用プライマー（Ｒｖ）配列
配列番号７１−人工配列の説明：ＫＭ４００８  ＨＶ０配列
配列番号７２−人工配列の説明：ＫＭ４００８  ＬＶ０配列
配列番号７３−人工配列の説明：ＫＭ４００８  ＨＶ０配列
配列番号７４−人工配列の説明：ＫＭ４００８  ＬＶ０配列
配列番号７５−人工配列の説明：ＨＶ２配列
配列番号７６−人工配列の説明：ＨＶ２配列
配列番号７７−人工配列の説明：ＨＶ４配列
配列番号７８−人工配列の説明：ＨＶ４配列
配列番号７９−人工配列の説明：ＨＶ７配列
配列番号８０−人工配列の説明：ＨＶ７配列
配列番号８１−人工配列の説明：ＨＶ１０配列
配列番号８２−人工配列の説明：ＨＶ１０配列
配列番号８３−人工配列の説明：ＬＶ３配列
配列番号８４−人工配列の説明：ＬＶ３配列
配列番号８７−人工配列の説明：ＨＶ２合成遺伝子配列
配列番号８８−人工配列の説明：ＬＶ３合成遺伝子配列
配列番号８９−人工配列の説明：ＨＶ１０合成遺伝子配列
【図１（Ａ）】
2011087091.tif 000004
【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図１（Ｄ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図３】
2011087091.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2011087091000001.app
【国際調査報告】
2011087091.tif 000025
2011087091.tif 000026
2011087091.tif 000027
2011087091.tif 000028