【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年9月14日(2021.9.14)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】毒性小胞体ストレスを抑制するための化合物、組成物および方法
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月１日出願の米国仮特許出願第６２／６３７，２４２号の利益を主張し、その出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
【０００２】
本発明は、とりわけ、構造
【化１】
2021518856.tif 000001
を有する化合物を提供する。また、本発明の化合物を含有する医薬組成物、ならびにこのような化合物および組成物を使用する方法が提供される。
政府の財政的支援
【０００３】
本発明は、ＤＯＤによって与えられた認可番号ＸＷ８１ＸＷＨ−１６−１−０２０４の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明にある一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、移動、呼吸、および摂食のような日々の必須機能を制御する細胞である脊髄運動ニューロンを標的とする神経変性障害である。ＡＬＳは、他の多くの神経変性障害と同様に、ミスフォールドタンパク質の蓄積によって特徴付けられる。ニューロンは、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）を発動させてミスフォールドタンパク質をリフォールドまたは排除するが、これらの試みが失敗すると、ＵＰＲは、細胞をアポトーシス細胞死に至らせる小胞体（ＥＲ）ストレス経路に移行する。近年の研究では、ＵＰＲおよびＥＲストレスは、家族性および孤発性ＡＬＳの病変形成に関与するとされている。
【０００５】
ＥＲストレスのマーカーは、幹細胞由来運動ニューロンおよびＡＬＳ関連突然変異担持マウスを含む、ＡＬＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルで検出された最初の病理学的特色の一部である。ＥＲストレスマーカーの持続的上方調節が、遺伝子導入ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの胚性幹（ＥＳ）細胞から誘導された脊髄運動ニューロンにおいて観察されたことが、既に報告されている（実施例１２を参照）。これらのマウスは、ＡＬＳに因果的に関連するヒトＳＯＤ１の変異型を過剰表現し、それらの表現型は、神経筋除神経および進行性麻痺を含む患者の病理の多くの態様を再現する。ＳＯＤ１においてＡＬＳを引き起こす突然変異は、一般に、ＳＯＤ１機能の喪失も獲得ももたらさないが、その代わりに、運動ニューロンにおけるミスフォールドＳＯＤ１種の蓄積および不溶性タンパク性凝集体の形成を促進し、それらは、これらの細胞におけるＥＲストレスマーカーの増大の根底にある可能性が高い。類似の凝集体が、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ、ＯＰＴＮ、およびＵＢＱＬＮ２を含む、多発性疾患を引き起こす突然変異を伴うＡＬＳモデルにわたって観察された（Ｂｌｏｋｈｕｉｓら、２０１３）。さらに、野生型脊髄運動ニューロンも、他の脊髄ニューロンサブタイプと比較して、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）のようなＥＲストレス誘発化合物に対して非常に敏感であることが見出された（図２Ｃ）。まとめると、これらの観察は、他のニューロンが免れる一方で脊髄運動ニューロンがＡＬＳに対して選択的に脆弱であることを理解する上での手掛かりを提供する。
【０００６】
ＥＲにおけるＣａ２＋取込みを防止し、それによってＣａ２＋依存性タンパク質フォールディングシャペロンの活性を遮断し、ＥＲストレスを急速に誘発する、ｓａｒｃｏ／ＥＲカルシウムＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）ポンプ阻害剤であるＣＰＡ（図２６）の影響を、運動ニューロンが非常に受けやすいことに基づいて、ＥＲストレス誘発性神経変性を逆転させることができるものについて小分子化合物のライブラリーをスクリーニングした（図２７）。
【０００７】
１００種を超える生物学的に活性な小分子のこのスクリーニングからのヒットの中には、Ｇｏ６９７６、スニチニブ、Ｋ２５２ａ（図２Ａ）、およびケンパウロンを含む広範なキナーゼ阻害剤が含まれていた（実施例１２を参照）。予備分析では、これらのレスキュー化合物の見込みある機能的標的として、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼＭＬＫ３およびＨＧＫが示唆された。これらの知見は、ＥＲストレス経路のＩＲＥ１ａの分岐がＪＮＫ経路を最終的に活性化し、それが多くの神経変性疾患モデルと関連するという過去の報告と一致した。過去の研究では、ＣＰＡがＩＲＥ１ａ活性を誘発し、ＪＮＫのすぐ下流のｃ−ｊｕｎのリン酸化を促進することも示されている（実施例１２を参照）。
【０００８】
４種のキナーゼ阻害剤のヒット化合物、ならびにケンパウロンよりも強力であることが見出されたケンパウロンの構造的アナログであるアルステルパウロン（ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ）について、３００種のキナーゼの触媒活性の公的に入手可能なデータベース（Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓら、２０１１年）を、０．５μＭの様々なキナーゼ阻害剤の存在下でマイニングし、二元階層クラスタリング分析を実施することによって、公知の標的を比較した（図１）。
【０００９】
その活性がすべての５種の神経保護化合物によって強力に阻害されたキナーゼ（１μＭ阻害剤濃度で残ったキナーゼ活性が＜１５％）には、ＭＡＰキナーゼＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）およびＭＡＰＫに関係するキナーゼＮＵＡＫ１が含まれていた。ＮＵＡＫ１のアブレーションは、タウオパチーのマウスモデルにおいて皮質ニューロンを保護するが、そのことは、ＮＵＡＫ１も運動ニューロンにおけるＣＰＡの神経毒性効果をモジュレートする可能性があることを示唆している（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓら、２０１６）。しかし、強力な選択的ＮＵＡＫ１阻害剤であるＷＺ４００３（ＮＵＡＫ１についてのＩＣ５０＝２０ｎＭ）は、６点希釈系列（０．１〜１０μＭ）にわたってＣＰＡ毒性からのレスキューをもたらすことができなかったことが見出された。１μＭおよびそれを超える濃度では、ＷＺ４００３は、ＣＰＡ誘発性神経変性を増強し、ＣＰＡがない状態でも運動ニューロンに対して毒性があった（図３）。同様に、ＳＵ６６５６（０．５μＭで残った活性１０．９％）およびＨＴＨ−０１−０５１（ＩＣ５０＝１００ｎＭ、Ｂａｎｅｒｊｅｅら、２０１４を参照）を含む他の選択的ＮＵＡＫ１阻害剤も、ＣＰＡ毒性からのレスキューをもたらすことができなかっただけでなく、より高い用量ではその毒性をさらに増強した（図３）。これらの結果は、ＮＵＡＫ１活性が、ＥＲストレスの状況、およびおそらくは基本条件下での運動ニューロンの生存に必須であることを示唆している。ＮＵＡＫ１がヒットレスキュー化合物の共通の標的であるということは、これらの化合物の機能的標的とのその構造的類似性または配列相同性に起因している可能性が高い。
【００１０】
一方、Ｙａｎｇら（２０１３）は、ＨＧＫが、神経栄養因子除去によって誘発される死滅からＥＳ由来の脊髄運動ニューロンをレスキューすることができる化合物についてのハイスループットスクリーニングにおいてヒットとして特定されたケンパウロンの、主な機能的標的であると推論した。後にＬａｒｈａｍｍａｒら（２０１７）は、ＴＮＩＫおよびＭＩＮＫ１の２つの他のＭＡＰ４キナーゼと組み合わされたＨＧＫが、マウス後根神経節ニューロンにおける神経栄養因子除去後に神経変性を媒介するという機能的証拠を提供した。ＥＲストレスの状況での運動ニューロンにおけるＨＧＫの役割をさらにアセスメントするために、選択的ＨＧＫ阻害剤であるＰＦ−６２６０９３３（Ａｍｍｉｒａｔｉら、２０１５）を６点希釈系列（０．０１μＭ〜５μＭ）で試験し、ＨＧＫが、用量依存方式でＣＰＡ毒性から保護されることを見出した（図３）。ＨＧＫ阻害剤であるＧＮＥ−４９５も同様に、神経保護をもたらした（図３）。この知見は、ＥＲストレス誘発性神経変性におけるＨＧＫの役割に関する予備的な裏付けを提供した。
【００１１】
Ｋ２５２ａ、Ｇｏ６９７６、およびアルステルパウロンの別の共通標的は、ＭＡＰＫ３キナーゼＭＬＫ３である。ケンパウロンおよびスニチニブは、ＭＬＫ３活性をわずかに阻害するのみであったが（０．５μＭにおける残りのＭＬＫ３活性がそれぞれ４９．３％および６８．４％、Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓら、２０１１を参照）、その文献では、多くの神経変性の状況におけるＭＬＫ３の役割について強力な裏付けがある。ＭＬＫ３活性を、強力に（残りの活性が＜１５％）、ただし非選択的に阻害する、ＣＥＰ１３４７、ＮＵ６１４０、ボスチニブ、ＪＡＫ３阻害剤ＩＶ、およびＳｙｋ阻害剤を含むいくつかのさらなる化合物が、ヒトＥＳ運動ニューロンにおけるＣＰＡ毒性からの用量依存的レスキューをもたらしたことが見出された（図３）。
【００１２】
これらの知見に基付くと、ＣＰＡ生存スクリーニングからのヒットキナーゼ阻害剤の保護効果は、それらのＨＧＫおよび／またはＭＬＫ３活性の阻害に起因する可能性が高かったと仮定される。理想的な化合物は、１）ＨＧＫおよびＭＬＫ３の両方を強力に阻害し、２）低（ナノモル〜マイクロモル）用量でＣＰＡ媒介性神経毒性を完全に逆転し、３）水性ビヒクルに可溶性であり、４）血液脳関門を透過可能であり、経口生体利用可能であり、５）ｉｎ  ｖｉｖｏでのその使用を最適化するさらなる構造的改変に適しているべきである。しかし、そのスクリーニングからのヒット化合物は、これらの基準を満たさなかった。Ｇｏ６９７６もスニチニブも、試験用量のいずれにおいてもＣＰＡ毒性からの完全なレスキューをもたらすことができなかった。一方、Ｋ−２５２ａは、その広範なキナーゼ阻害およびアナログ合成に対するその不応性の両方に起因して、適切なリード化合物ではない。この足場への熱意をさらに削ぐのは、構造的に関係する非特異的スタウロスポリンベースのキナーゼ阻害剤であるＣＥＰ−１３４７（図２Ａ）が、パーキンソン病の臨床試験における神経保護剤として効果がなかったという観察であった。ケンパウロンは、高度に選択的であるが、本発明者らがｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＰＡアッセイにおいて有効であることを見出した濃度では不溶性であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用には適していない。
【００１３】
文献による研究を通して、本発明者らは、小分子ＵＲＭＣ−０９９を有望なリード化合物（化合物１）として特定した（図２Ａ）。化合物１は、経口生体利用可能であり、脳に浸透し、ＭＬＫ３（ＩＣ５０＝１４ｎＭ）およびＨＧＫ（１μＭ処置の際の残りの酵素活性が０．５４％）の両方に強力に結合し、阻害し、アナログ合成に適している（図２８）。６点用量応答アッセイ（０．０１μＭ〜３μＭ）におけるヒトＡＬＳ幹細胞由来の運動ニューロンにおいてＣＰＡ毒性からのレスキューをもたらす化合物１の能力を試験し、化合物１が、１００ｎＭの出発濃度で保護効果を示したが、１μＭではＣＰＡ誘発性神経変性を完全に逆転させたことが見出された（図２Ｂ）。
【００１４】
次に、ＣＰＡ処置後の化合物１の保護効果が、ＨＧＫおよびＭＬＫ３によって媒介されたかどうかが決定された。ＥＲストレス経路の活性化が延長されると、ＪＮＫキナーゼカスケードが活性化され、最終的にはアポトーシスに至る（Ｓａｎｏら、２０１３参照）。ＭＡＰキナーゼＪＮＫ１〜３は、カスパーゼ３などのアポトーシス促進因子の発現を促進する転写因子であるｃ−ｊｕｎを直接的にリン酸化し、活性化する。ＣＰＡは、ＥＲストレス媒介性神経変性に対して特に脆弱なＥＳ  ＭＮにおいてｃ−ｊｕｎのリン酸化を誘発するが、耐性がある共培養ＥＳ由来の介在ニューロンにおいては誘発しないことが既に示されている（実施例１２参照）。化合物１は、ＣＰＡで処置したＭＮにおいて、ｃ−ｊｕｎリン酸化およびカスパーゼ３切断の両方を強力に抑制することが観察されたが（図４）、このことは、化合物１がアポトーシスの誘発を防止することを示している。次に、本発明者らは、ｃ−ｊｕｎのすぐ上流のＭＡＰＫ  ＪＮＫおよびＪＮＫのすぐ上流のＭＫＫ４のリン酸化状態を評価した。ＭＫＫ４およびＪＮＫリン酸化の変化は、化合物１の推定上の標的であるＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ）および／またはＭＬＫ３（ＭＡＰ３Ｋ）を含む上流キナーゼの活性を反映する。ＣＰＡ処置では、ＪＮＫおよびＭＫＫ４リン酸化が上方調節され、化合物１を添加すると、ＪＮＫおよびＭＫＫ４リン酸化が強力に減弱されたことが観察されたが（図４）、このことは、化合物１がＨＧＫおよび／またはＭＬＫ３に対して作用して、下流のアポトーシス経路の活性化を防止するという考えをさらに裏付けている。
【００１５】
これらの初期の結果は有望であったが、化合物１は、潜在的な臨床候補とみなされ得るまでにはさらなる最適化が必要であった。ミクロソーム安定性研究では、化合物１が、マウス肝ミクロソームにおいて半減期が短く（Ｔ１／２＝７．８分）、マウスにおいて約２〜３時間のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期であったことが示された。さらに化合物１は、非選択的であり、いくつかのキナーゼを阻害し、＞１００ｎＭの細胞効力を有しており、したがって、改良されたＰＫ性質を有する、より選択的で強力な誘導体が好ましく、またそれを得ることができる可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、化合物１の様々なアナログの探索、ならびに毒性小胞体（ＥＲ）ストレスを抑制するための組成物および方法が必要である。本発明は、これらおよび他の必要性を満たすことを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
特定の理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、潜在的アナログの設計の助けにするために、Ｇｌｉｄｅを使用してＨＧＫ（ＰＤＢ  ＩＤ：５ＤＩ１）の結晶構造に化合物１をドッキングした（図５Ａ）。ドッキングポーズおよび結合部位相互作用の図から（図５Ｂを参照）、１）７−アザインドール部分が、キナーゼのヒンジ領域に結合し、活性に必須であること、２）ピペラジン部分が、溶媒曝露領域内に延び、分子の物理的特性を改良し、その安定性を増強するように修飾され得ること、および３）側鎖が、結合ポケットにおけるさらなる相互作用を獲得し、キナーゼ特異性を増大するように修飾され得ることが見出された。
【００１８】
したがって、本発明の一実施形態は、式（Ｉ）による化合物
【化２】
2021518856.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩であり、
ただし、化合物は、
【化３】
2021518856.tif 000003
のどれでもない。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、
【化４】
2021518856.tif 000004
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、
【化５】
2021518856.tif 000005
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、
【化６】
2021518856.tif 000006
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、
【化７】
2021518856.tif 000007
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、医薬組成物である。この医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）による１つまたは複数の化合物
【化８】
2021518856.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含み、
ただし、化合物は、
【化９】
2021518856.tif 000009
のどれでもない。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態は、キットである。このキットは、本発明による化合物または医薬組成物を、それぞれ化合物または医薬組成物の使用のための使用説明書と共に含む。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化１０】
2021518856.tif 000010
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化１１】
2021518856.tif 000011
のどれでもない。
【００２６】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、薬学的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化１２】
2021518856.tif 000012
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量の医薬組成物を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化１３】
2021518856.tif 000013
のどれでもない。
【００２７】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、対象に、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化１４】
2021518856.tif 000014
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化１５】
2021518856.tif 000015
のどれでもない。
【００２８】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法である。この方法は、対象に、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化１６】
2021518856.tif 000016
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化１７】
2021518856.tif 000017
のどれでもない。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化１８】
2021518856.tif 000018
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化１９】
2021518856.tif 000019
のどれでもない。
【００３０】
本出願書類は、カラーで撮影された少なくとも１枚の写真を含有する。本特許出願のコピーは、要求に応じておよび必要経費の支払い後に、当局によりカラー写真と共に提供されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、標的キナーゼをランク付けするための、３００キナーゼのスポットファイヤ分析の結果を示す。
【００３２】
【図２】図２Ａは、ＣＥＰ−１３４７、Ｋ−２５２ａ、および化合物１（ＵＲＭＣ−０９９）の構造を示す。
【００３３】
図２Ｂは、３３μＭ  ＣＰＡでのヒトＡＬＳ  ｉＰＳ−ＭＮの処置により誘発されたＥＲストレス後の、化合物１のレスキュー効果を示す。
【００３４】
図２Ｃは、ＣＰＡの構造を示す。
【００３５】
【図３】図３は、ある特定のキナーゼ阻害剤の、予測される標的の、薬理学的阻害を示す。選択的ＮＵＡＫ１阻害剤ＷＺ４００３もＨＴＧ−０１−０１５も、ＣＰＡに対して神経保護をもたらさなかった。一方、選択的阻害剤ＰＦ６２６０９３およびＧＮＥ−４９５によるＨＧＫの阻害、ならびに非選択的阻害剤ボスチニブによるＭＬＫ３の阻害は、全て神経保護的であった。これらの結果を合わせると、ＭＬＫ３およびＨＧＫは化合物１の標的となり得るが、ＮＵＡＫ１は標的とならないことが示唆される。
【００３６】
【図４Ａ】図４Ａは、ＥＲストレスの文脈における化合物１の、種々の推定される下流標的の発現を示す。マウスＥＳ誘導性運動ニューロンを、ＣＰＡ、ＣＰＡ＋化合物１、またはビヒクル対照（ＤＭＳＯ）で、４時間処置した。次いで細胞を溶解してタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物を、リン酸化ＭＫＫ４（化合物１標的ＭＬＫ３の直ぐ下流にあるキナーゼ）、リン酸化ＪＮＫ（ＭＫＫ４の直ぐ下流にあるキナーゼ）、リン酸化ｃ−ｊｕｎ（ＪＮＫの直ぐ下流にある転写因子）、および切断カスパーゼ３（アポトーシス細胞死の、広く認識されたマーカー）を含む、化合物１の推定される下流標的の活性化形態の発現に関し、ウェスタンブロットにより分析した。全てはＣＰＡにより上方制御され、ＣＰＡが、ＪＮＫ経路で推進されるアポトーシスを経て運動ニューロン変性を引き起こすことが示される。一方、化合物１の添加は、これらの経路の構成要素の活性化を減衰させ、化合物１がこの経路内の上流キナーゼを標的としていることが確認される。
【００３７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫染色マウスＥＳ誘導性運動ニューロンを示す。ＥＳ誘導性運動ニューロンを、図４Ａに示されるものと同じ手法でＣＰＡ＋／−化合物１で処置して、化合物１標的活性の変調が運動ニューロンでまたはその他の汚染細胞型で生ずるか否かを決定した。得られた画像は、ＣＰＡ処置が運動ニューロンにおいてｃ−ｊｕｎリン酸化を強力にかつ選択的に誘発し、一方、化合物１はそれを完全に減衰させることを示す。運動ニューロンは、Ｉｓｌｅｔ１〜２免疫反応性によって示される。
【００３８】
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：５ＤＩ１）における化合物１のドッキングポーズを示す。
【００３９】
図５Ｂは、ドッキングポーズに相当する（矢印は水素結合を示す）ＨＧＫを持つ、化合物１のリガンド相互作用図を示す。
【００４０】
【図６】図６は、７ａａなどの化合物１アナログが、ＣＰＡに対する運動ニューロンの保護を増大させることを示す。ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンを３３μＭ  ＣＰＡおよび漸増濃度の化合物１またはそのアナログで処置した。生存する運動ニューロンの数を、ビヒクル処置された対照に対して正規化した。
【００４１】
【図７】図７Ａは、運動ニューロン生存率％と、ＭＬＫ１（Ｒ２＝０．４０）活性％またはＭＬＫ３（Ｒ２＝０．５２）活性％との相関を示す。ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンを、３３μＭ  ＣＰＡおよび１．０μＭの化合物１またはアナログ７ａ〜７ａｚで処置した。ＭＮ生存率％は、ＤＭＳＯ対照に対して著しい成長を示す細胞の量をベースにした。残されたＭＬＫ１活性％またはＭＬＫ３活性％は、１０μＭ  ＡＴＰ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）の存在下、０．１μＭの化合物の処置での、ビヒクル対照に対する酵素活性％の平均値である。
【００４２】
図７Ｂは、運動ニューロン生存率％およびＨＧＫ（Ｒ２＝０．８４）活性％の相関を示す。ヒト胚性幹細胞由来の運動ニューロンを、３３μＭ  ＣＰＡおよび１．０μＭの化合物１またはアナログ７ａ〜７ａｚで処置した。ＭＮ生存率％は、ビヒクル対照に対して著しい成長を示す細胞の量をベースにした。残されたＨＧＫ活性％は、１０μＭ  ＡＴＰ（Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）の存在下、０．０２５μＭの化合物の処置での、ＤＭＳＯ対照に対する酵素活性％の平均値である。
【００４３】
【図８】図８は、化合物１およびそのアナログ、化合物７ａｄ）による、選択された６０キナーゼの阻害の結果を示す。運動ニューロン生存アッセイにおいてＣＰＡに対して類似のレベルの保護を提供するにも関わらず、化合物７ａｄは、化合物１よりも少ないキナーゼの活性を阻害し、それによって、細胞生存の媒介において化合物１およびそのアナログの推定機能標的が強調される。
【００４４】
【図９】図９は、２種のＧＣＫ阻害剤、化合物１７およびＮＧ２５（共にＴａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５から）が、ＣＰＡ誘発性ＥＲストレスから運動ニューロンをレスキューすることができないことを示す。
【００４５】
【図１０−１】図１０Ａは、ＣＲＩＳＰＲによるＨＧＫノックアウトの生成を示す。２つのガイドＲＮＡは、ＨＧＫのＡＴＰ結合ドメインを取り囲むゲノム領域を標的とするように設計された。この領域のＣＲＩＳＰＲ媒介型励起は、非相同末端結合により二本鎖切断修復をもたらし得る。
【００４６】
図１０Ｂは、ＨＧＫタンパク質に関するウェスタンブロットによるＨＧＫノックアウトクローンの検証を示す。検出可能なＨＧＫタンパク質は、試験をした３種のノックアウトクローンに残されていなかった。
【００４７】
【図１０−２】図１０Ｃは、ＷＴ（青）およびＨＧＫノックアウト（オレンジ）でＣＰＡ用量応答処置した後の、運動ニューロン（ＭＮ）生存の結果を示す。運動ニューロンを、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により精製し、様々な用量のＣＰＡで、プレーティングから２４時間後に処置し、その４８時間後に撮影した。
【００４８】
図１０Ｄは、ＨＧＫノックアウトが、ＣＰＡ曝露後の早期に（＜８時間）、適度なしかし統計的に有意な（ｐ＜０．０００１、２元配置ＡＮＯＶＡ）神経保護を提供することを示す。ＭＡＣＳ精製された運動ニューロンを、１０μＭ  ＣＰＡで０〜２４時間処置し、２４時間の時点で撮影した。遺伝子型同士での生存率の最大の相違は、ＣＰＡ曝露の３〜８時間の間に生じたが、後の時点で消失した。
【００４９】
【図１０−３】図１０Ｅは、ＨＧＫノックアウトが、ＭＡＰＫ経路活性化をやや減少させることを示す（ｐ＜０．０１、２元配置ＡＮＯＶＡ）。化合物１の推定標的の下流にあるリン酸化（活性化）ｃ−ｊｕｎの発現を、ＦＲＥＴによりＣＰＡ曝露（１０μＭ）の過程でモニターした。ｃ−ｊｕｎは、野生型運動ニューロンに対し、ＨＧＫノックアウトにおいてＣＰＡにより適度にしかしかなり低く活性化された。
【００５０】
【図１１−１】図１１は、化合物１およびそのアナログ（７ｒ、７ｖ、７ｗ、７ｙ、７ａａ、７ａｄ、７ａｈ、７ａｌ、７ａｓ、７ａｔ、１２ｅ、１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ、１２ｉ、１２ｊ、１２ｋ、１２ｌ）の、ミクロソーム安定性アッセイの結果を示す。それらの構造およびマウス肝ミクロソームにおける半減期が示される。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１１−５】同上。
【図１１−６】同上。
【図１１−７】同上。
【図１１−８】同上。
【図１１−９】同上。
【図１１−１０】同上。
【００５１】
【図１２】図１２は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの添加が、化合物１およびそのアナログの溶解度を増大させることができることを示す。化合物１またはＤＭＳＯ（化合物１およびそのアナログの希釈物）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ用量に関連した値（２〜１０ｍｇ／ｋｇ）に相当する濃度で、種々のビヒクル組成物と混合した。ビヒクル１（５５％生理食塩液、４０％ＰＥＧ−４００、５％ＤＭＳＯ）は、化合物１のｉｎ  ｖｉｖｏ送達で既に使用された（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ＶＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。次いでこれらの混合物を、分光光度計で、５４０ｎＭで読み取って、混合物の透明度の尺度でありかつ沈殿物形成の指標である光学密度を評価した。ビヒクル１および２は、ＤＭＳＯ単独の存在下で沈殿物を形成しなかったが、化合物１の存在下では形成した。より高い濃度では、これらの沈殿物は、目で見ることができた。１１％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを、ビヒクル１の成分に添加することは、化合物１（ビヒクル３）を可溶化するのに十分であった。
【００５２】
【図１３】図１３Ａは、肝ミクロソーム安定性アッセイにおける化合物１および１２ｋの半減期を示す。最適化された化合物１２ｋの半減期（＞１２０分）は、化合物１の半減期（１５分）よりかなり長く、１２ｋは、より強力な代謝安定性を有することが示される。
【００５３】
図１３Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのいずれかの化合物が静脈内（ＩＶ）注射されたマウスの血漿および脳試料中の化合物１および１２ｋの濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。薬物濃度を、ＬＣ−ＭＳにより分析した。注射から１時間後の化合物１のレベルは、ＬＣ−ＭＳアッセイの検出限界よりも下であるが、１２ｋは依然として検出可能であった。さらに、脳内の１２ｋの量は、血漿における量を超えており、１２ｋは高度な血液脳関門透過剤であることが示される。
【００５４】
【図１４】図１４は、化合物１ならびにそのアナログ１２ｈおよび１２ｋで処置した後の、野生型マウスの嗅球におけるリン酸化（活性化）ｃ−ｊｕｎの発現を示す。１０ｍｇ／ｋｇの化合物を、腹腔内（ＩＰ）、経口、または皮下（ＳＣ）で送達した。動物を、処置から１時間後に屠殺した。それらの嗅球を切除し、ウェスタンブロット分析用に溶解した。ホスホ−ｃｊｕｎ発現を、ハウスキーピングタンパク質ＧＡＰＤＨに対して正規化した。未処置の動物と比較して、ホスホ−ｃｊｕｎレベルは、ほぼ全ての処置状態により減少しており、化合物１およびそのアナログはそれらがｉｎ  ｖｉｔｒｏにある場合と同じ標的にｉｎ  ｖｉｖｏで会合することが示される。
【００５５】
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｋは、２色運動ニューロン毒性スクリーンを設計するのに使用される新しいトランスジェニックマウスＥＳＣ系の誘導および特徴付けを示す。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１５−４】同上。
【図１５−５】同上。
【図１５−６】同上。
【図１５−７】同上。
【００５６】
図１５Ａは、運動ニューロン（ＭＮ）転写因子Ｈｂ９およびＩｓｌｅｔ１／２に関して染色されたＨｂ９：：ＲＦＰ  ｈＳＯＤ１ＷＴおよびＨｂ９：：ＧＦＰ  ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａからの胚様体の共焦点顕微鏡写真を示す。
【００５７】
図１５Ｂは、蛍光レポータータンパク質（ＦＰ）と転写因子（ＴＦ）との間の重なり合いの測定を示す。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００５８】
図１５Ｃは、２色培養を示す代表的な顕微鏡写真を有する、概略的な９６ウェルプレートを示す。
【００５９】
図１５Ｄは、Ｔｒｏｐｈｏｓ  Ｐｌａｔｅ  ＲｕｎｎｅｒＨＤで獲得された生細胞の、代表的な全ウェル画像を示す。
【００６０】
図１５Ｅは、図１５Ｄの拡大図およびＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを使用した自動化画像解析の結果を示す。
【００６１】
図１５Ｆは、生細胞を蛍光デブリから区別するのに有意な神経突起の存在を使用する、「健常細胞基準」を示す。
【００６２】
図１５Ｇは、種々の蛍光レポーターを発現する、トランスジェニックｈＳＯＤ１  ＷＴおよびＧ９３Ａ細胞系におけるＭＮ生存率を示す。生存率は、混合された赤−緑培養物（赤ＷＴ＃１＋緑Ｇ９３Ａ＃１、Ｎ＝６）または個別の培養物（緑ＷＴ＃１、緑Ｇ９３Ａ＃２、Ｎ＝３）における中度（Ｇ＋Ｆ＋Ｉ）および低度（Ｆ＋Ｉ）の神経栄養担体で評価した。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１を示す。
【００６３】
図１５Ｈは、曝露から４８時間での小分子スクリーンの結果を示し；濃青色データ点は、化合物に曝露されたウェルに関して正規化されたＧ９３Ａ／ＷＴ生存比を示し、明青色および黄色のデータ点は、対照に関するＧ９３Ａ／ＷＴ生存比を示す。円は、図１５Ｉで提示される、２次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示す。
【００６４】
図１５Ｉは、図１５Ｈに示される結果に基づいた、２次スクリーニング後の、有望なリード化合物のリストを示す。
【００６５】
図１５Ｊは、曝露から４８時間での小分子スクリーンの結果を示し；赤および緑色のデータ点は、化合物に曝露されたＨｂ９：：ＲＦＰ−ｈＳＤＯ１ＷＴ（赤）およびＨｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ（緑）細胞に関する生存率を示し、明青、黄、青、およびマゼンタ色のデータ点は、対照に関する生存率を示す。円は、図１５Ｋで提示される、２次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示す。
【００６６】
図１５Ｋは、図１５Ｊに示される結果に基づいた、２次スクリーニング後の、有望なリード化合物のリストを示す。
【００６７】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｊは、シクロピアゾン酸の特徴付けと、その運動ニューロンおよび介在ニューロンの生存に対する影響、ならびにカルシウムホメオスタシスに対する影響を示す。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【図１６−５】同上。
【図１６−６】同上。
【００６８】
図１６Ａは、Ｈｂ９：：ＲＦＰ  ｈＳＯＤ１ＷＴおよびＨｂ９：：ＧＦＰ  ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ  ＭＮの生存率を示す、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）に関する用量応答曲線を示す。
【００６９】
図１６Ｂは、正規化されたＧ９３Ａ／ＷＴ生存比を示す。バーは平均を示し、誤差バーは、ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１（Ｎ＝１０）を示す。
【００７０】
図１６Ｃは、全ウェル撮像からの代表的な画像と、ＣＰＡに曝露された同じウェルにおけるＨｂ９：：ＲＦＰ  ｈＳＯＤ１ＷＴおよびＨｂ９：：ＧＦＰ  ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ  ＭＮを示す拡大図を示す。
【００７１】
図１６Ｄは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡ曝露された、Ｔｕｊ−１（赤）に関して染色されたＨｂ９：：ＧＦＰ  ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００７２】
図１６Ｅは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡ曝露された、混合Ｈｂ９：：ＧＦＰ（緑）／Ｐｔｆ１α：：ｔｄトマトレッド）培養物の、顕微鏡写真を示す。
【００７３】
図１６Ｆおよび図１６Ｇは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡ曝露されたＭＮ、Ｔｕｊ−１＋、およびＰｔｆ１α＋ニューロンの生存率が、４８時間で定量されたことを示す（Ｎ＝３、両方の分析に関して）。バーは平均を示し、誤差バーは、ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１  ＊＊＊ｐ＜０．００１を示す。
【００７４】
図１６Ｈは、ＳＥＲＣＡ２（赤）、Ｔｕｊ−１（マゼンタ）、およびＤＡＰＩ（青）に関して染色された、精製されていないＨｂ９：：ＧＦＰ  ＭＮ培養物の顕微鏡写真を示す。
【００７５】
図１６Ｉは、細胞質Ｃａ＋＋においてＣＰＡで誘発された変化が、Ｆｕｒａ−２標識された精製済みｈＳＯＤ１ＷＴおよびｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡＭＮ培養物における３４０／３８０ｎｍの比（ＷＴに関してＮ＝５、Ｇ９３Ａに関してＮ＝４）を計算することによって評価されたことを示す。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００７６】
図１６Ｊは、Ｆｕｒａ−２比（Ｔａｕ）の減少の勾配が、ＣＰＡの非存在下または存在下で、カイニン酸（ＫＡ）に曝露された培養物中で測定されたことを示す。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００７７】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｇは、シクロピアゾン酸で処置した運動ニューロン培養物におけるＥＲストレスマーカーの特徴付けを示す。
【図１７Ｂ】同上。
【図１７Ｃ】同上。
【図１７Ｄ】同上。
【図１７Ｅ】同上。
【図１７Ｆ】同上。
【図１７Ｇ】同上。
【００７８】
図１７Ａは、ｑＰＣＲ結果が、ＣＰＡ曝露後の早期に特に目的の遺伝子を指し示すことを示す、ヒストグラムを示す。ＲＮＡは、非精製ｈＳＤＯ１Ｇ９３ＡＭＮ（Ｎ＝３）から抽出された。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００７９】
図１７Ｂは、ＣＰＡ曝露後の種々の時点でｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ  ９６７  ＭＮにおけるＸＢＰ１スプライシングを示す、ヒストグラムおよび反転ゲル画像を示す（Ｎ＝３）。バーは平均比ｓ／ｕを示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００８０】
図１７Ｃは、ＣＰＡ曝露後の種々の時点での、ＥＲストレス関連タンパク質およびそれらのローディングコントロールの発現の、免疫ブロットを示す。
【００８１】
図１７Ｄは、ＣＰＡで処置したｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ細胞の溶解産物におけるＳＯＤ１発現およびローディングコントロールの免疫ブロットを示す。中間レーンはｐａｎＳＯＤ１発現を示す。下のレーンは、ミスフォールディングされたｈＳＯＤ１種（Ｃ４Ｆ６およびＢ８Ｈ１０クローン）に特異的な抗体を使用して免疫沈澱された溶解産物を示す。
【００８２】
図１７Ｅおよび図１７Ｆは、ｃｔｒｌおよびＣＰＡで処置されたＭＮ培養物（Ｎ＝５）におけるホスホ−ｃ−ｊｕｎ＋ＭＮのヒストグラムおよび共焦点顕微鏡写真を示す。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１を示す。
【００８３】
図１７Ｇは、Ｐｔｆ１α＋：：ｔｄＴｏｍａｔｏ介在ニューロン（ＩＮ）およびＨｂ９：：ＧＦＰ運動ニューロン（ＭＮ）に対するＣＰＡ曝露の示差効果のヒストグラムを示し、バーは平均比ＭＮ／ＩＮを示し（Ｎ＝３  技術的反復）、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００８４】
【図１８Ａ】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＥＲストレスレスキュースクリーンから選択された結果、特に、運動ニューロン生存率および神経突起成長に関する結果を示す。化合物は、それらの推定作動メカニズムに基づいて、下位範疇化され、色分けされる。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す（Ｎ＝３〜６培養ウェル／化合物）。さらなる分析のカットオフレベルは、グレー線により示される。
【図１８Ｂ】同上。
【００８５】
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｆは、マウス運動ニューロンにおけるｃ−ｊｕｎリン酸化およびヒト運動ニューロンにおける生存率に対するそれらの影響を含む、レスキュー化合物の特徴付けを示す。
【図１９Ｂ】同上。
【図１９Ｃ】同上。
【図１９Ｄ】同上。
【図１９Ｅ】同上。
【図１９Ｆ】同上。
【００８６】
図１９Ａは、レスキュースクリーンからのリード化合物に関する用量応答曲線を示す（ＧＯ６９７６  Ｎ＝６培養ウェル、Ｋ２５２−ａ  Ｎ＝２独立培養物、ケンパウロン  Ｎ＝３独立培養物、ＴＵＤＣＡ  Ｎ＝２独立培養物）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【００８７】
図１９Ｂおよび図１９Ｃは、曝露から２時間の、ＣＰＡで処置したＭＮ培養物におけるホスホ−ｃ−ｊｕｎ発現に対するレスキュー化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｓ）の影響の、ヒストグラムおよび共焦点顕微鏡写真を示す。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１を示す。
【００８８】
図１９Ｄは、ＳＯＤ１＋／＋および同質遺伝的に遺伝子改変されたＳＯＤ１＋／Ａ４ＶｈＥＳＣ系とは差別化された、ＦＡＣＳ精製されたＨｂ９：：ＧＦＰ＋ヒトＭＮにおけるレスキュー化合物の非存在下または存在下でのＣＰＡの影響の、ヒストグラムを示す（両方の遺伝子型に関するＣＰＡ対ＣＴＲＬに関してＮ＝９、両方の遺伝子型に関するレスキュー化合物に関してＮ＝３）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を示す（ＣＰＡの影響を、ラインで示されるようにＳＯＤ１＋／＋とＳＯＤ１＋／Ａ４ＶＭＮとの間で比較し；レスキュー化合物の影響を、遺伝子型ごとにＣＰＡに関して比較した）。
【００８９】
図１９Ｅは、カルセイン＋細胞の代表的なクロッピングされた全ウェル画像を示す。
【００９０】
図１９Ｆは、レスキュー化合物に関するＣＰＡおよび標的に関する推定シグナル伝達経路の概略図である。上付き文字の数値は、裏付けとなる参考文献を示す（１Ｓａｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８、２Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８、３Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２、４Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３、５Ｏｚｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６、６Ｕｐｐａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７）。
【００９１】
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｆは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＵＤＣＡの栄養作用の特徴付けと、ＡＬＳのマウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの筋除神経に対する影響を示す。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２０−４】同上。
【図２０−５】同上。
【００９２】
図２０Ａおよび図２０Ｂは、カノニカル神経栄養因子と比較した、ＭＮ生存率および神経突起成長に対するＴＵＤＣＡの影響を示す（ＣＴ−１に関してＮ＝３、その他の群に関してＮ＝４）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を示す（対照と比較して）。
【００９３】
図２０Ｃは、Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋細胞の、代表的なクロッピングされた全ウェル画像を示す。
【００９４】
図２０Ｄは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける筋除神経に関する、ＴＵＤＣＡのｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関する実験設計の概略図を示す。
【００９５】
図２０Ｅは、ＴＡにおけるＮＭＪ神経支配の散乱プロットを示す（ＷＴ＋ＴＵＤＣＡに関してＮ＝４、Ｇ９３Ａ＋ＴＵＤＣＡに関してＮ＝６、Ｇ９３Ａ＋ビヒクルに関してＮ＝５）。データ点は個々の動物を表し、水平線は平均、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を表す。
【００９６】
図２０Ｆは、ビヒクルおよびＴＵＤＣＡで処置したｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの、ＴＡ  ＮＭＪの共焦点顕微鏡写真（α−ｂｔｘ  赤、ＶＡＣｈＴ  緑）を示す。円は、除神経されたＮＭＪを示す。
【００９７】
【図２１Ａ】図２１Ａ〜２１Ｋは、新たに誘導されたトランスジェニックＥＳ系の評価、正常なおよびミスフォールディングされたＳＯＤ１発現および分化細胞におけるｐＥｉｆ２αレベルの生化学分析、ならびに運動ニューロン培養物における神経栄養担体の用量設定を示す。
【図２１Ｂ】同上。
【図２１Ｃ】同上。
【図２１Ｄ】同上。
【図２１Ｅ】同上。
【図２１Ｆ】同上。
【図２１Ｇ】同上。
【図２１Ｈ】同上。
【図２１Ｉ】同上。
【図２１Ｊ】同上。
【図２１Ｋ】同上。
【００９８】
図２１Ａは、新たに誘導されたレポーター系からの、典型的なＥＳコロニーの光学顕微鏡写真を示す。
【００９９】
図２１Ｂは、野生型または突然変異したヒトＳＯＤ１の存在を確認する、配列決定結果を示す。
【０１００】
図２１Ｃ、図２１Ｄ、および図２１Ｅは、分化した新しいＥＳ系におけるレポーター検証の光学顕微鏡写真およびヒストグラムを示す（レポーターごとの２つの線は、２つの別々のラウンドに分化し、結果を平均値／レポーターとして提示する）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１０１】
図２１Ｆおよび図２１Ｇは、Ｈｂ９：：ＧＦＰ  ｈＳＯＤ１ＷＴまたはＨｂ９：：ＧＦＰ  ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ細胞の個々の培養物における運動ニューロン生存率および神経突起成長の評価を示す（両方の遺伝子型に関して、Ｎ＝３）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１０２】
図２１Ｈは、未処置の運動ニューロン培養物における全およびミスフォールディングされた（Ｃ４Ｆ６）ＳＯＤ１の発現を表示する免疫ブロットの、クロッピングされた画像を示す。ＷＴまたはＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスからのＰ１００脊髄を、対照として使用した。破線は、どこで下の図がクロッピングされたかを示す。
【０１０３】
図２１Ｉは、ミスフォールディングされた突然変異体ＳＯＤ１に関するＣ４Ｆ６およびＢ８Ｈ１０抗体に対する特異性を示す、免疫ブロットを示す。
【０１０４】
図２１Ｊおよび図２１Ｋは、フォルスコリン（Ｆ、範囲：１００μＭ〜０．７８１２５μＭ）、ＩＢＭＸ（Ｉ、範囲：１ｍＭ〜７．８１２５μＭ）、およびＧＤＮＦ（Ｇ、範囲：５０ｎｇ／ｍＬ〜０．１２８ｐｇ／ｍＬ）の組合せで処置された培養物における、運動ニューロン生存率に関する用量応答曲線を示す、ヒストグラムを示し、高中度担体を対照として使用した（ＮＴＦ）（Ｎ＝６  培養物ウェル／状態）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１０５】
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＣＰＡで処置された濃縮運動ニューロン培養物における、１次毒性スクリーンおよびカルシウム撮像実験からの追加の結果を示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２２Ｃ】同上。
【図２２Ｄ】同上。
【図２２Ｅ】同上。
【図２２Ｆ】同上。
【０１０６】
図２２Ａは、曝露から４８時間での小分子スクリーンの結果を示し；濃青色データ点は、化合物に曝露されたウェルに関して正規化されたＧ９３Ａ／ＷＴ生存比を示し、明青色および黄色のデータ点は、対照に関するＧ９３Ａ／ＷＴ生存比を示す。円は、２次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示し、これは以下の表に提示される。
【０１０７】
図２２Ｂは、曝露から４８時間での小分子スクリーンの結果を示し；赤および緑色のデータ点は、化合物に曝露されたＨｂ９：：ＲＦＰ−ｈＳＤＯ１ＷＴ（赤）およびＨｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ（緑）細胞に関する生存率を示し、明青、黄、青、およびマゼンタ色のデータ点は、対照に関する生存率を示す。円は、２次スクリーニング後に確認された有望なリード化合物を示し、これらを以下の表に提示する。
【０１０８】
図２２Ｃおよび図２２Ｅは、ＣＰＡ曝露の前または後のいずれかでカイニン酸塩パルスに供された濃縮運動ニューロン培養物におけるＦｕｒａ−２シグナル比３４０／３８０を示す（ＷＴに関してＮ＝５およびＧ９３Ａに関してＮ＝４）。データ点は平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１０９】
図２２Ｄは、カイニン酸塩に曝露されたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンのビデオからの、代表的な静止画像を示す。画像は、Ｆｕｒａ−２シグナル比３４０／３８０を示し、シグナルは、ＦＩＪＩ（ＮＩＨ）における画像ルックアップテーブル機能を使用して表示される。矢印は、Ｈｂ９：：ＲＦＰ＋細胞を示す。
【０１１０】
図２２Ｆは、Ｈｂ９：：ＲＦＰ−ｈＳＤＯ１ＷＴ（赤）およびＨｂ９：：ＲＦＰ−ｈＳＤＯ１ＷＴにおける、ピークカイニン酸塩およびＣＰＡ誘発型Ｆｕｒａ−２シグナル比３４０／３８０の、測定値のヒストグラムを示す。
【０１１１】
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｆは、混合されたおよびＦＡＣＳ選別された運動ニューロン培養物での、２つの独立した対の細胞系におけるＣＰＡ毒性の評価を示す。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【図２３−４】同上。
【０１１２】
図２３Ａ、図２３Ｂ、図２３Ｃ、および図２３Ｄは、レポーター細胞系の２つの異なる組合せでの、ＣＰＡで処置された培養物における生存比に関する用量応答曲線を示す。培養物は、未精製であったか、ＦＡＣＳを使用して精製された（図２３Ａ：Ｎ＝５、図２３Ｂ：Ｎ＝４、図２３Ｃ：Ｎ＝６培養ウェル、図２３Ｄ：Ｎ＝２）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１１３】
図２３Ｅおよび図２３Ｆは、レポーター系のＦＡＣＳ精製に関する代表的なゲートの散乱プロットを示す。
【０１１４】
【図２４Ａ】図２４Ａ〜２４Ｌは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＬＳ病因の態様を研究するための、ヒト同質遺伝子細胞系の生成を示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【図２４Ｄ】同上。
【図２４Ｅ】同上。
【図２４Ｆ】同上。
【図２４Ｇ】同上。
【図２４Ｈ】同上。
【図２４Ｉ】同上。
【図２４Ｊ】同上。
【図２４Ｋ】同上。
【図２４Ｌ】同上。
【０１１５】
図２４Ａは、ＨＵＥＳ３  Ｈｂ９：：ＧＦＰのＳＯＤ１遺伝子座に、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ突然変異対立遺伝子を導入するための、遺伝子標的戦略の図を示す。
【０１１６】
図２４Ｂは、ＳＯＤ１遺伝子座の配列決定を示す。
【０１１７】
図２４Ｃは、独自のＰｓｈＡＩ制限部位に関するＰＣＲ−ＲＦＬＰ分析が、正しい標的を確認したことを示す。
【０１１８】
図２４Ｄおよび図２４Ｅは、標的幹細胞系におけるＳＯＤ１発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲおよび免疫ブロットアッセイが、低減したレベルのＳＯＤ１転写およびタンパク質レベルを実証したことを示す。
【０１１９】
図２４Ｆは、ＧＦＰレポーターを発現する分化細胞の全く異なる集団を示す、ＦＡＣＳプロットを示す。ＭＮパターニング分子ＲＡおよびＳＡＧに曝露されない分化神経細胞は、緑色蛍光用のゲートに対する陰性対照として使用した。
【０１２０】
図２４Ｇは、Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋細胞が、脊椎ＭＮ同一性を確認する転写因子Ｉｓｌｅｔ１を発現することを示す。
【０１２１】
図２４Ｈおよび図２４Ｉは、混合培養物における細胞生存率アッセイが、同質遺伝子対照に対して、ＳＯＤ１Ａ４Ｖバリアントを発現する同質遺伝子ヒトＥＳ  ＭＮで低減した生存率の傾向を示すことを、示す。３日目および３０日目の、ヒト核およびＴｕｊ１染色の代表的な画像（Ｐ＝０．０９、ｎ＝４）。
【０１２２】
図２４Ｊは、生きている培養物におけるカルセイン標識により評価された、ＦＡＣＳ精製されたヒト同質遺伝子系における、ＭＮ生存率および神経突起成長の短期評価（解離後５日）を示す。
【０１２３】
図２４Ｋは、精製された同質遺伝子ヒト運動ニューロン培養物における神経突起成長のヒストグラムを示す。細胞を、対照条件下で成長させ、ＣＰＡで処置し、またはレスキュー化合物で前処置した後にＣＰＡで処置した（両方の遺伝子型に関するＣＰＡ対ＣＴＲＬではＮ＝９、両方の遺伝子型に関するレスキュー化合物ではＮ＝３）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を示す（ＣＰＡの影響を、線で示されるように、ＷＴ対ＡＬＳ  ＭＮの間で比較し；レスキュー化合物の影響を、遺伝子型ごとにＣＰＡと比較した）。
【０１２４】
図２４Ｌは、精製されたヒトＳＯＤ１＋／Ａ４ＶＥＳ  ＭＮにおけるＣＰＡ毒性に関する用量応答生存曲線を示す、ヒストグラムを示す。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す（Ｎ＝３  培養ウェル／濃度）。
【０１２５】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｈは、Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋運動ニューロンおよびＰｔｆ１ａ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ＋介在ニューロンとの、ＣＰＡで処置した混合培養物における、ｃ−ｊｕｎリン酸化およびカルシウムホメオスタシスを示す。コンジュゲートされた胆汁酸のＣＰＡレスキュー作用に関する小型スクリーン、ならびに高および低神経栄養担体の存在下でのＴＵＤＣＡの生存およびレスキュー作用。
【図２５Ｂ】同上。
【図２５Ｃ】同上。
【図２５Ｄ】同上。
【図２５Ｅ】同上。
【図２５Ｆ】同上。
【図２５Ｇ】同上。
【図２５Ｈ】同上。
【０１２６】
図２５Ａは、Ｈｂ９：：ＧＦＰ＋運動ニューロン（緑）およびＰｔｆ１：：ｔｄＴｏｍａｔｏ介在ニューロン（赤）におけるｐ−ｃ−ｊｕｎ（青）発現の共焦点顕微鏡写真を示す。
【０１２７】
図２５Ｂは、培養物中のその他のニューロンに対する、運動ニューロンにおけるＦｕｒａ−２シグナル比３４０／３８０を示す、ヒストグラムを示す（ＷＴに関してＮ＝５、Ｇ９３Ａに関してＮ＝４）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１２８】
図２５Ｃおよび図２５Ｄは、ＣＰＡで処置したＨｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおける、タウリンでコンジュゲートされた胆汁酸のレスキュー作用に関する小型スクリーンを示す（Ｎ＝３〜６  培養ウェル／化合物）。データ点は、平均値を示す。
【０１２９】
図２５Ｅおよび図２５Ｆは、低神経栄養担体での、ＣＰＡで処置したＨｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロン成長における、生存率および神経突起成長に対する、ＴＵＤＣＡおよびカノニカル神経栄養因子のレスキュー作用を示す、ヒストグラムを示す（Ｎ＝３）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１３０】
図２５Ｇは、高神経栄養担体の下での、Ｈｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロン成長における生存率および神経突起成長に対するＴＵＤＣＡの影響を示す（Ｎ＝３）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１３１】
図２５Ｈは、高神経栄養担体の下での、ＣＰＡで処置されたＨｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＤＯ１Ｇ９３Ａ運動ニューロン成長における生存率および神経突起成長に対するＴＵＤＣＡの影響を示す（Ｎ＝３）。バーは平均を示し、誤差バーはＳＥＭを示す。
【０１３２】
【図２６】図２６は、ＣＰＡがＥＲでのＣａ２＋の取込みを防止し、それによってＣａ２＋依存性タンパク質フォールディングシャペロンの活性を遮断し、ＥＲストレスを急速に誘発することを示す。
【０１３３】
【図２７】図２７は、ＣＰＡ毒性もレスキューするＡＬＳ関連ストレス化合物を同定するスクリーンプロセスの概略図を示す。
【０１３４】
【図２８】図２８は、化合物１アナログを合成するための潜在的な修正例を示す。
【０１３５】
【図２９】図２９は、合成されたアナログの代謝安定性を試験するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの概略図を示す。
【０１３６】
【図３０】図３０は、合成されたアナログのｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態に関する評価プロセスの概略図を示す。
【０１３７】
【図３１Ａ】図３１Ａは、化合物１およびアナログの阻害プロファイルを示し、ＨＧＫ、ＴＮＩＫ、およびＭＩＮＫ１を含む、ある特定のＭＡＰ４Ｋキナーゼの強力な阻害を示す。ＨＧＫ、ＴＮＩＫ、およびＭＩＮＫ１のＭＡＰ４Ｋ４触媒ドメインのアミノ酸配列アライメントが示される。
【０１３８】
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＣＰＡで処置したＥＳ  ＭＮにおける化合物１およびそのアナログの、神経保護作用に関する可能性のある作動メカニズムの概略図である。
【０１３９】
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、３種全てのキナーゼ（ＨＧＫ、ＴＮＩＫ、およびＭＩＮＫ１）の発現を減衰させるための手順を示す概略図である。
【０１４０】
【図３２】図３２は、所与のキナーゼの阻害と運動ニューロン生存率との間の相関を示す、ランク付けされたＲ平方値（ピアソンのｒ）を示す。化合物１アナログを、ＣＰＡ処置後の、化合物１の６０種の異なる公知の標的を阻害するそれらの能力および運動ニューロン生存率を促進させる能力に関して比較した。ＭＡＰ４Ｋ（緑色で強調）は、最も高くランク付けされたキナーゼの１つである。＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５。
【０１４１】
【図３３】図３３は、ＭＡＰ４ＫのＣＲＩＳＰＲノックアウトが神経保護的であり、運動ニューロンにおいて相加効果を有することを示し、それらは化合物１およびその神経保護的アナログの機能的標的であることが示されるものである。
【０１４２】
【図３４】図３４Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰまたはＯＧで１回投与され、脳および血漿中で経時的に評価された、化合物１の薬物動態結果を示す。
【０１４３】
図３４Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰまたはＯＧで１回投与され、脳および血漿中で経時的に評価された、化合物１２ｋの薬物動態結果を示す。
【０１４４】
【図３５Ａ】図３５Ａは、下記の設定でそれらの薬物動態結果を比較することによる、化合物１と化合物１２ｋとの間の相違を示す：脳対血漿、濃度は［ｎｇ／ｍＬまたはｎｇ／ｇ］で計算され、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰまたはＯＧで１回投与され、経時的に評価される。
【０１４５】
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、以下の設定でそれらの薬物動態結果を比較することによる、化合物１と化合物１２ｋとの間の相違を示す：脳対血漿、濃度は［ｎＭ］で計算され、１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰまたはＯＧで１回投与され、経時的に評価される。
【０１４６】
【図３５Ｃ】図３５Ｃは、［ｎＭ］での概算を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性と比較し、化合物は１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰで１回投与され、経時的に評価される。
【０１４７】
【図３６】図３６は、経時的な脳／血漿比を示し、化合物は１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰまたはＯＧで１回投与され、経時的に評価される。
【０１４８】
【図３７Ａ】図３７Ａは、７日間、飲料水でｏｓにより送達され、７日目の時点で評価された、化合物１対化合物１２ｋの比較結果を示す。
【０１４９】
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、１５日間、飲料水でｏｓにより送達され、１５日目の時点で評価された、化合物１対化合物１２ｋの比較結果を示す。
【０１５０】
【図３８−１】図３８Ａ〜３８Ｃは、化合物１２ｋが、化合物１よりも高いＭＡＰ４Ｋ阻害を示すことを、示す。
【図３８−２】同上。
【０１５１】
図３８Ａは、キナーゼファミリーにより分離された、化合物１の包括的キナーゼ阻害プロファイル示す。
【０１５２】
図３８Ｂは、キナーゼファミリーにより分離された、化合物１２ｋの包括的キナーゼ阻害プロファイル示す。
【０１５３】
図３８Ｃは、化合物１と比較して化合物１２ｋによる所与のキナーゼの阻害の倍率変化を示す。ＭＡＰ４Ｋ（緑）は、１２ｋの最も高められた標的の１つである。
【０１５４】
【図３９】図３９は、化合物１およびそのアナログが、ミクログリアによって炎症性サイトカインＴＮＦａ放出を抑制することを示す。
【０１５５】
【図４０】図４０は、化合物１およびアナログの機能的標的が、炎症対神経変性に関して異なることを示す。
【０１５６】
【図４１Ａ】図４１Ａ〜４１Ｃは、ＨＧＫ阻害剤が神経保護的であり、ＪＮＫ経路を経て作用することを示す。
【図４１Ｂ】同上。
【図４１Ｃ】同上。
【０１５７】
図４１Ａは、神経保護のキナーゼ標的の二元階層クラスタリングの結果が、先の生存率スクリーンからヒットされ、ＨＧＫおよびＮＵＡＫ１がこれらの化合物の共有標的であることが示される。ＭＡＰ４キナーゼには下線が引かれている。
【０１５８】
図４１Ｂは、希釈系列全体にわたって、より特異的なＨＧＫおよびＮＵＡＫ１阻害剤と比較した、図４１Ａ（グレー）からのヒットの最大有効性を示す。バーは、ＣＰＡ（３３μｍ）＋ビヒクル対照に対して正規化された試験化合物で処置した野生型運動ニューロンの平均±ＳＥＭを表す。ｎ＝９６ウェルプレートからの３複製ウェル。破線は、ＣＰＡ単独で処置された細胞における平均生存率を表す。
【０１５９】
図４１Ｃは、ビヒクル、ＣＰＡ、またはＣＰＡ＋化合物１（０．５μＭ）で処置された混合運動ニューロン培養物の、ウェスタンブロットの結果を示す。試料を、処置から４時間後に収集した。Ｎ＝別々に処置され溶解された３つの個別の運動ニューロンの分化からの試料。各分化からの細胞を、３つの試料に分割し、それぞれに１つの処置条件がある。全ての試料を、同じブロット上で同時に実行した。全てのバンド強度を、ＧＡＰＤＨに対して正規化して負荷を制御し、次いでＤＭＳＯおよびＣＰＡ＋化合物１の値を、ｎごとにＣＰＡ値に対して正規化した。１元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ＪＮＫリン酸化（Ｐ＝０．０００９；Ｆ＝２８．３３；Ｒ２＝０．９０４２）およびｃ−Ｊｕｎリン酸化（Ｐ＜０．０００１；Ｆ＝１０１．９；Ｒ２＝０．９７１４）に対する処置の全体的な影響を評価した。データは、平均ＣＰＡ＋化合物１の値、ＣＰＡ単独に対するｌｏｇ２倍率変化±ＳＥＭを表す。ボンフェローニの多重比較検定を使用して、ホスホ−ＪＮＫおよびホスホ−ｃ−Ｊｕｎに関するＣＰＡ対ＣＰＡ＋化合物１状態を比較した；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【０１６０】
【図４２Ａ】図４２Ａ〜４２Ｃは、化合物１アナログのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの特徴付けを示す。
【図４２Ｂ】同上。
【図４２Ｃ】同上。
【０１６１】
図４２Ａは、最初に生成した４９種の化合物１アナログにおける有効性（赤）および効力（青）の改善の概要を提供する。
【０１６２】
図４２Ｂは、希釈系列（ｌｏｇ  μＭ）全体にわたる、ＣＰＡ（３３μＭ）ならびに化合物１、１２ｆ、および１２ｋで処置したＳＯＤ１Ａ４Ｖ突然変異体ＡＬＳ運動ニューロンに関する生存率曲線を示す。化合物１２ｆは、１と比較して改善された効力および有効性を示すが、０．５μＭよりも上で突然毒性になる。化合物１２ｋは、１と比較して改善された効力および有効性を示し、より高い用量で１２ｆよりも毒性が少ない。データは、ＣＰＡ（３３μｍ）＋ビヒクル対照に対して正規化された試験化合物で処置された運動ニューロンの平均±ＳＥＭである。ｎ＝各試験化合物用量について９６ウェルプレートからの３複製ウェル。
【０１６３】
図４２Ｃは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）単独（左上）；ＣＰＡ（３３μｍ）単独（右上）；ＣＰＡ＋化合物１（０．５μＭ）（左下）；またはＣＰＡ＋化合物１２ｋ（０．１μＭ）（右下）で処置されたＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンの全ウェル画像からの代表的な視野を示す。
【０１６４】
【図４３Ａ】図４３Ａ〜４３Ｂは、特定のＮＵＡＫ１およびＨＧＫ阻害剤に関する完全用量応答曲線を示す。データは、ＣＰＡ＋ビヒクルに対して正規化された試験化合物±ＳＥＭで処置された、野生型運動ニューロンの平均である。ｎ＝９６ウェルプレートからの３複製ウェル。
【図４３Ｂ】同上。
【０１６５】
図４３Ａは、ＮＵＡＫ１阻害剤ＨＴＨ−０１−０１５およびＷＺ４００３に関する８点希釈曲線を示す。ＣＰＡ無しの平均は、化合物の固有の毒性を示すのに含まれる。
【０１６６】
図４３Ｂは、ＨＧＫ阻害剤ＵＲＭＣ−０９９（化合物１）、ＰＦ−６２６０９３３、およびＧＮＥ−４９５に関する８点希釈曲線を示す。
【０１６７】
【図４４】図４４は、化合物１２ｋが、ミクログリアサイトカイン放出を抑制する能力を維持することを示す。ミクログリアＮ９細胞を、増大させた濃度のＬＰＳ＋化合物１、１２ｋ、または１２ｅで処置した。ＴＮＦα放出を、細胞培養培地から定量的ＥＬＩＳＡにより測定した。化合物１は、ＬＰＳの全ての濃度にわたり、０．１μＭでＴＮＦα放出の著しい阻害を示した。化合物１２ｋは、このアッセイにおいて化合物１よりも約５倍低い効力であったが、依然としてＴＮＦα放出の抑制に成功していた。ＨＧＫを強力に阻害するがＭＬＫ３ではほとんど活性がない化合物１２ｅは、ＬＰＳの最高濃度を除き、０．５μＭでＴＮＦα放出を阻害しておらず、これはＴＮＦα放出の阻害がＨＧＫ阻害に関係しない可能性があり、代わりにＭＬＫ３などのその他のキナーゼの阻害に関係し得ることを示唆している。データは平均±ＳＥＭである。ｎ＝９６ウェルプレートの２つの複製ウェル。化合物１アナログ対ＬＰＳ濃度の全体的な影響を、２元配置ＡＮＯＶＡにより比較した（化合物１アナログの著しい影響、ＬＰＳ濃度、および相互作用、全てＰ＜０．０００１）。ＬＰＳ単独（ビヒクル、グレーのバー）に対する種々のＬＰＳ濃度での個々の化合物１アナログの影響を、ボンフェローニの多重比較検定により評価した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【０１６８】
【図４５】図４５は、化合物１２ｋに対する標的会合のマーカーを示す。
【０１６９】
【図４６Ａ】図４６Ａは、対照に対して化合物１２ｋを与えたマウスの体重変化を示す。
【０１７０】
【図４６Ｂ】図４６Ｂは、対照に対して化合物１２ｋを与えたマウスの握力変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７１】
本発明では、化合物１の新しいアナログが提供される。アナログの一部は、ミクロソーム安定性および溶解度が改良されており、その上、毒性ＥＲストレスの良好な阻害効力を維持する。したがって、本発明の一実施形態は、式（Ｉ）による化合物
【化２０】
2021518856.tif 000020
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩であり、
ただし、化合物は、
【化２１】
2021518856.tif 000021
のどれでもない。
【０１７２】
この実施形態の一態様では、化合物は、式（ＩＩ）の構造
【化２２】
2021518856.tif 000022
［式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルを形成し、ここでＣ５〜６ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有し、
ただし、化合物は、
【化２３】
2021518856.tif 000023
のどれでもない。
【０１７３】
この実施形態の別の態様では、化合物は、
【化２４】
2021518856.tif 000024
【化２５】
2021518856.tif 000025
【化２６】
2021518856.tif 000026
【化２７】
2021518856.tif 000027
【化２８】
2021518856.tif 000028
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０１７４】
好ましくは、化合物は、
【化２９】
2021518856.tif 000029
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０１７５】
より好ましくは、化合物は、
【化３０】
2021518856.tif 000030
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０１７６】
より好ましくは、化合物は、
【化３１】
2021518856.tif 000031
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０１７７】
より好ましくは、化合物は、
【化３２】
2021518856.tif 000032
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０１７８】
より好ましくは、化合物は、
【化３３】
2021518856.tif 000033
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０１７９】
本発明の別の実施形態は、医薬組成物である。この医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）による１つまたは複数の化合物
【化３４】
2021518856.tif 000034
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含み、
ただし、化合物は、
【化３５】
2021518856.tif 000035
のどれでもない。
【０１８０】
本発明の医薬組成物において使用される、適切な好ましい化合物は、先にも特定された特定の化合物を含む先の式（Ｉ）〜（ＩＩ）に開示されている。
【０１８１】
本発明のさらなる実施形態は、キットである。このキットは、本明細書に開示される化合物または医薬組成物を、それぞれ化合物または医薬組成物の使用のための使用説明書と共に含む。
【０１８２】
キットはまた、対象への活性剤の投与に使用するための、本発明の各化合物（例えば、医薬組成物の形態であってもよい）および他の試薬、例えば、緩衝液、平衡塩類溶液などに適した保存容器、例えば、アンプル、バイアル、管などを含むことができる。本発明の化合物および／または医薬組成物、ならびに他の試薬は、例えば、溶液または粉末形態などの任意の好都合な形態で、キットで提示することができる。キットはさらに、化合物および／または医薬組成物、ならびに他の必要に応じた試薬を収容するための１つまたは複数の部分を必要に応じて有するパッケージング容器を含むことができる。
【０１８３】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化３６】
2021518856.tif 000036
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化３７】
2021518856.tif 000037
のどれでもない。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」およびその文法的変形は、個々の対象を、その対象、例えば患者において生理的応答または転帰をもたらすことが望まれるプロトコール、レジメン、プロセスまたは療法に供することを意味する。特に、本発明の方法および組成物は、疾患の症状の発症を緩徐し、または疾患もしくは状態の発生を遅延し、または疾患発症の進行を停止させるために使用することができる。しかし、処置された各対象は、特定の処置プロトコール、レジメン、プロセスまたは療法に応答しない可能性があるので、処置することは、所望の生理的応答または転帰がありとあらゆる対象または対象集団、例えば患者集団において達成されることを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団、例えば患者集団は、処置に応答しない場合があり、または不適切に応答する場合がある。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、用語「改善する」、「改善すること」およびその文法的変形は、対象における疾患の症状の重症度を低減することを意味する。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、用語「投与すること」は、対象への経口投与、坐剤としての投与、局所的接触、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻腔内もしくは皮下投与、または徐放デバイス、例えば小型浸透圧性ポンプの移植を意味する。投与は、非経口、および経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣内、直腸、または経皮）を含む任意の経路によって行われる。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内が含まれる。他の送達方法には、それに限定されるものではないが、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれる。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。ヒトに加えて、本発明の範囲内の哺乳動物の分類には、例えば、農業用動物、獣医学的動物、実験動物などが含まれる。農業用動物の一部の例には、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギなどが含まれる。獣医学的動物の一部の例には、イヌ、ネコなどが含まれる。実験動物の一部の例には、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなどが含まれる。
【０１８８】
この方法において使用するのに適した好ましい化合物および医薬組成物は、先に特定される特定の化合物を含む先の式（Ｉ）〜（ＩＩ）に開示される通りである。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、障害は、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患である。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、障害は、対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる疾患である。本発明に従って対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる疾患の非限定的な例として、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性巨核芽球性白血病、小児白血病、家族性慢性リンパ性白血病、左右軸形成異常、悪性黒色腫、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、精巣がん、胃がん、消化管がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、大細胞型リンパ腫、軟組織肉腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、遺伝性出血性毛細血管拡張症２型（Ｏｓｌｅｒ−Ｒｅｎｄｕ−Ｗｅｂｅｒ症候群２）、腸管出血、動脈性高血圧、動静脈奇形、進行性骨化性線維異形成症、骨格奇形、骨外性骨形成、嗜癖、高血圧、心筋梗塞、遠位中間肢（ａｃｒｏｍｅｓｏｍｅｌｉｃ）異形成症、運動失調症、毛細血管拡張症、ゼッケル症候群、心不全、若年性ポリポーシス症候群、短指症Ａ２型（手の形成異常）、遠位中間肢軟骨異形成症（骨の形成異常）、外陰異常、原発性肺高血圧（ＰＰＨ１）、心臓・顔・皮膚症候群、若年性正中発生（ｍｉｄｌｉｎｅ）癌腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、心不整脈、体細胞黒色腫、家族性黒色腫、肉腫、頭頸部扁平上皮癌、上皮腫瘍、心肥大、レット症候群、Ｘ連鎖性乳児性痙攣症候群、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群、概日障害、乳管癌、乳腺過形成、錐体杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）５型、錐体杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）６型、レーバー先天黒内障１型（ＬＣＡ１）、てんかん、筋緊張症、筋消耗、白内障、性腺機能低下症、内分泌機能の欠損、男性脱毛症、ダウン症候群（ＤＳ）、膠芽腫、肝細胞癌、ファイファー症候群、カルマン症候群２、幹細胞白血病リンパ腫症候群（ＳＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、アペール症候群、ジャクソン−ワイス症候群、クルーゾン症候群、Ｂｅａｒｅ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ脳回状皮膚（ｃｕｔｉｓ  ｇｙｒａｔａ）症候群、軟骨無形成症、軟骨低形成症（ｈｙｐｏｃｈｒｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ）、タナトフォリック骨異形成症、アデレード型頭蓋骨癒合症、サンディエゴ型骨異形成症（ｄｉｓｐｌａｓｉａ）、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、下垂体腺腫、脊髄形成異常症、乳児毛細血管腫、特発性骨髄線維症、神経芽細胞腫、腎臓がん、乳頭状癌、高ＩｇＭ症候群、色素失調症、無汗性外胚葉形成不全、関節リウマチ、黒色表皮腫、松果体過形成、多嚢胞性卵巣症候群、非定型片頭痛、糖尿病性高脂血症、妖精症、細菌誘発性マクロファージアポトーシス、発熱性細菌感染症、子宮平滑筋肉腫、移植後リンパ増殖性障害、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｒｍｉａ  ｖｅｒａ）、脳腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肥満細胞症、まだら症、Ｔ細胞白血病、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群、ポイツ−ジェガース症候群、全身性エリテマトーデス、常染色体優性血小板減少症、網膜色素変性症、遺伝性乳頭状腎癌、ミュラー管症候群ＩＩ型、家族性肥大型心筋症、重症筋無力症、進行性聴覚消失、多発性嚢胞腎疾患、ユーイング腫瘍、非症候性精神遅滞タイプ��０（ＭＲＸ３０）、特発性好酸球増加症候群、二分脊椎症、Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ症候群（ＷＲＳ）、肝型糖原病、肝硬変、造血性悪性腫瘍、カーニー複合腫瘍、心収縮性、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管合併症、自閉症、優性脊髄小脳運動失調症１４型、痛覚、変形性関節症軟骨、膀胱がん、鼻咽頭癌腫、未分化大細胞型白血病、家族性甲状腺髄様癌（ＦＭＴＣ）、多発性内分泌腫瘍症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ）ＩＩＡ型（ＭＥＮ２Ａ）、ＭＥＮ２Ｂ、褐色細胞腫、甲状腺乳頭癌、ヒルシュスプルング（Ｈｉｓｃｈｓｐｒｕｎｇ）病、２型小口病、ＨＰＣ１、血液凝固、狭心症、腎膨大細胞腫、肺腺腫、優性短指症Ｂ型、劣性遺伝性Ｒｏｂｉｎｏｗ症候群（ＲＲＳ）、Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ症候群、ＣＮＳ腫瘍、Ｌｏｅｙｓ−Ｄｉｅｔｚ症候群、食道がん、遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ、Ｌｙｎｃｈ症候群）、マルファン症候群ＩＩ型、静脈形成異常、星状細胞腫、肥大性および拡張型心筋症、脛骨筋ジストロフィー、無汗症、偽性低アルドステロン症ＩＩ型、および慢性関節炎が挙げられる。
【０１９１】
この実施形態の一態様では、障害には、それに限定されるものではないが、外傷性脳傷害、脳卒中、虚血、双極性障害、心疾患、アテローム性動脈硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、がん、自己免疫疾患、および神経変性疾患が含まれ得る。
【０１９２】
この実施形態の一態様では、障害は、神経変性疾患である。本発明による神経変性疾患の非限定的な例として、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー−マリー−トゥース病、レビー小体認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性対麻痺が挙げられる。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【０１９４】
この実施形態の別の態様では、方法は、対象に、本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物と一緒に、有効量の１つまたは複数の追加の治療剤、例えば５−ヒドロキシトリプトファン、アクチバーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ）、ＡＦＱ０５６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、アグラスタット（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）、アルベンダゾール（Ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、アルファ−リポ酸／Ｌ−アセチルカルニチン、アルテプラーゼ（Ａｌｔｅｐｌａｓｅ）、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）（シンメトレル（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ））、アムロジピン、アンクロッド（Ａｎｃｒｏｄ）、アポモルヒネ（Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）（アポカイン（Ａｐｏｋｙｎ））、アリモクロモル（Ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）、アリクストラ（Ａｒｉｘｔｒａ）、アルモダフィニル（Ａｒｍｏｄａｆｉｎｉｌ）、アスコルビン酸、アスクリプチン（Ａｓｃｒｉｐｔｉｎ）、アスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）、アテノロール、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）、バクロフェン（リオレサール（Ｌｉｏｒｅｓａｌ））、バンゼル（Ｂａｎｚｅｌ）、ベンズトロピン（Ｂｅｎｚｔｒｏｐｉｎｅ）（コゲンチン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ））、ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、ＢＧＧ４９２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ボツリヌス毒素、バファリン（Ｂｕｆｆｅｒｉｎ）、Ｃａｒｂａｔｒｏｌ（登録商標）、カルビドパ／レボドパ即時放出（シネメット（Ｓｉｎｅｍｅｔ））、カルビドパ／レボドパ経口崩壊錠（パルコパ（Ｐａｒｃｏｐａ））、カルビドパ／レボドパ／エンタカポン（スタレボ（Ｓｔａｌｅｖｏ））、ＣＥＲＥ−１１０：ＮＧＦのアデノ随伴ウイルス送達（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、セレブロライシン、シノベックス（ＣｉｎｎｏＶｅｘ）、シタロプラム、シチコリン、クロバザム（Ｃｌｏｂａｚａｍ）、クロナゼパム（Ｃｌｏｎａｚｅｐａｍ）、クロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）、クロザピン（クロザリル（Ｃｌｏｚａｒｉｌ））、補酵素Ｑ、クレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）、ダビガトラン、ダルテパリン、ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）、ダブネチド（Ｄａｖｕｎｅｔｉｄｅ）、デフェリプロン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ）、Ｄｅｐａｋｅｎｅ（登録商標）、Ｄｅｐａｋｏｔｅ  ＥＲ（登録商標）、Ｄｅｐａｋｏｔｅ（登録商標）、デスモテプラーゼ（Ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ）、ダイアスタット（Ｄｉａｓｔａｔ）、ジアゼパム（Ｄｉａｚｅｐａｍ）、ジゴキシン（Ｄｉｇｏｘｉｎ）、Ｄｉｌａｎｔｉｎ（登録商標）、ジメボン（Ｄｉｍｅｂｏｎ）、ジピリダモール、ジバルプロエクス（デパコート（Ｄｅｐａｋｏｔｅ））、ドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）（アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ））、ＥＧｂ  ７６１、エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ）、ＥＬＮＤ００２（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、エナラプリル（Ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、エノキサパリン、エンタカポン（Ｅｎｔａｃａｐｏｎｅ）（コムタン（Ｃｏｍｔａｎ））、エポエチンアルファ、エプチフィバチド（Ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、エスシタロプラム（��ｓｃｉｔａｌｏｐｒａｍ）、エスリカルバゼピン（Ｅｓｌｉｃａｒｂａｚｅｐｉｎｅ）酢酸エステル、エスモロール（Ｅｓｍｏｌｏｌ）、エトスクシミド（Ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、エチル−ＥＰＡ（Ｍｉｒａｘｉｏｎ（商標））、エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、エクスタビア（Ｅｘｔａｖｉａ）、エゾガビン（Ｅｚｏｇａｂｉｎｅ）、フェルバメート（Ｆｅｌｂａｍａｔｅ）、Ｆｅｌｂａｔｏｌ（登録商標）、フィンゴリモド（Ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ）（ジレニア（Ｇｉｌｅｎｙａ））、フルオキセチン（プロザック（Ｐｒｏｚａｃ））、フォンダパリナックス、フラグミン（Ｆｒａｇｍｉｎ）、フリシウム（Ｆｒｉｓｉｕｍ）、ギャバペンチン（Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）、Ｇａｂｉｔｒｉｌ（登録商標）、ガランタミン（Ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ）、グラチラマー（Ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））、ハロペリドール（ハルドール（Ｈａｌｄｏｌ））、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、イデベノン（Ｉｄｅｂｅｎｏｎｅ）、Ｉｎｏｖｅｌｏｎ（登録商標）、インスリン、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ、イオフルパン１２３Ｉ（ＤＡＴＳＣＡＮ（登録商標））、ＩＰＸ０６６（Ｉｍｐａｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、ＪＮＪ−２６４８９１１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）、クロノピン（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ）、ラコサミド（Ｌａｃｏｓａｍｉｄｅ）、Ｌ−アルファグリセリルホスホリルコリン、Ｌａｍｉｃｔａｌ（登録商標）、ラモトリギン（Ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ）、レベチラセタム（Ｌｅｖｅｔｉｒａｃｅｔａｍ）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、リシノプリル（Ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）、炭酸リチウム、ロプレッサー（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ）、ロラゼパム（Ｌｏｒａｚｅｐａｍ）、ロサルタン、ラブノックス（Ｌｏｖｅｎｏｘ）、Ｌｕ  ＡＡ２４４９３、ルミナール（Ｌｕｍｉｎａｌ）、ＬＹ４５０１３９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）、リリカ（Ｌｙｒｉｃａ）、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、メコバラミン（Ｍｅｃｏｂａｌａｍｉｎ）、メマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）、メチルプレドニゾロン、メトプロロール酒石酸塩、ミニトラン（Ｍｉｎｉｔｒａｎ）、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、ミルタザピン、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）（ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ））、Ｍｙｓｏｌｉｎｅ（登録商標）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ））、Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（登録商標）、ナイアシンアミド（Ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅ）、Ｎｉｔｒｏ−Ｂｉｄ、Ｎｉｔｒｏ−Ｄｕｒ、ニトログリセリン、ニトロリンガル（Ｎｉｔｒｏｌｉｎｇｕａｌ）、ニトロミスト（Ｎｉｔｒｏｍｉｓｔ）、ニトロスタット（Ｎｉｔｒｏｓｔａｔ）、ニトロ−タイム（Ｎｉｔｒｏ−Ｔｉｍｅ）、ノルエピネフリン（Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）（ＮＯＲ）、カルバマゼピン（Ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）、オクトレオチド、Ｏｎｆｉ（登録商標）、オキシカルバゼピン（Ｏｘｃａｒｂａｚｅｐｉｎｅ）、塩化オキシブチニン（Ｏｘｙｂｕｔｉｎｉｎ）、ＰＦ−０４３６０３６５（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、フェノバルビタール（Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ）、Ｐｈｅｎｙｔｅｋ（登録商標）、フェニトイン（Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、ピクロゾタン、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ）、ポティガ（Ｐｏｔｉｇａ）、プラミペキソール（Ｐｒａｍｉｐｅｘｏｌｅ）（ミラペックス（Ｍｉｒａｐｅｘ））、プラムリンチド、プレドニゾン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プリミドン（Ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）、プリニビル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ）、プロベネシド、プロプラノロール（Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）、ＰＲＸ−０００２３（ＥＰＩＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＸＴ３００３、キナクリン（Ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ）、ラメルテオン（Ｒａｍｅｌｔｅｏｎ）、ラサギリン（Ｒａｓａｇｉｌｉｎｅ）（アジレクト（Ａｚｉｌｅｃｔ））、レビフ（Ｒｅｂｉｆ）、レシゲン（ＲｅｃｉＧｅｎ）、レマセミド、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、レタバーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ）、レテプラーゼ、リルゾール（リルテック（Ｒｉｌｕｔｅｋ））、リバスチグミン（Ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）（イクセロン（Ｅｘｅｌｏｎ））、ロピニロール（Ｒｏｐｉｎｉｒｏｌｅ）（レキップ（Ｒｅｑｕｉｐ））、ロチゴチン（Ｒｏｔｉｇｏｔｉｎｅ）（ニュープロ（Ｎｅｕｐｒｏ））、ルフィナミド（Ｒｕｆｉｎａｍｉｄｅ）、サブリル（Ｓａｂｒｉｌ）、サフィナミド（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＡ）、サラジェン（Ｓａｌａｇｅｎ）、サラフェム（Ｓａｒａｆｅｍ）、セレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）（ｌ−デプレニル、エルデプリル）、ＳＥＮ００１４１９６（Ｓｉｅｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｉｅｎａ、Ｉｔａｌｙ）、セルトラリン（ゾロフト（Ｚｏｌｏｆｔ））、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、ニトロプルシド（Ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉａｔｅ）ナトリウム（ＮＰＳ）、フェニル酪酸ナトリウム、スタンバック頭痛散剤（Ｓｔａｎｂａｃｋ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  Ｐｏｗｄｅｒ）、タクリン（Ｔａｃｒｉｎｅ）（コグネックス（Ｃｏｇｎｅｘ））、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ（登録商標）、テネクテプラーゼ（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）、テノーミン（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）、テトラベナジン（Ｔｅｔｒａｂｅｎａｚｉｎｅ）（キセナジン（Ｘｅｎａｚｉｎｅ））、ＴＨＲ−１８（Ｔｈｒｏｍｂｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）、チアガビン（Ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、チデグルシブ（Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ）、チロフィバン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、チザニジン（ザナフレックス（Ｚａｎａｆｌｅｘ））、ＴＮＫａｓｅ、トルカポン（Ｔｏｌｃａｐｏｎｅ）（タスマール（Ｔａｓｍａｒ））、トルテロジン（Ｔｏｌｔｅｒｏｄｉｎｅ）、Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標）、トピラマート（Ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ）、トリヘキシフェニジル（Ｔｒｉｈｅｘｙｐｈｅｎｉｄｙｌ）（以前はアーテン（Ａｒｔａｎｅ））、Ｔｒｉｌｅｐｔａｌ（登録商標）、ウルソジオール、バルプロ��、バルサルタン、バレニクリン（Ｖａｒｅｎｉｃｌｉｎｅ）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ビムパット（Ｖｉｍｐａｔ）、ビタミンＥ、ワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）、Ｚａｒｏｎｔｉｎ（登録商標）、ゼストリル（Ｚｅｓｔｒｉｌ）、Ｚｏｎｅｇｒａｎ（登録商標）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、ザイディス（Ｚｙｄｉｓ）セレギリンＨＣＬ経口崩壊錠（ゼラパール（Ｚｅｌａｐａｒ））、およびそれらの組合せを併用投与するステップをさらに含む。
【０１９５】
例えば、アルツハイマー病の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン（イクセロン）、ガランタミン（ラザダイン（Ｒａｚａｄｙｎｅ））、タクリン（コグネックス）、メマンチン（ナメンダ（Ｎａｍｅｎｄａ））、ビタミンＥ、ＣＥＲＥ−１１０：ＮＧＦのアデノ随伴ウイルス送達（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ）、ＬＹ４５０１３９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、エキセナチド、バレニクリン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０４３６０３６５（Ｐｆｉｚｅｒ）、レスベラトロールおよびドネペジル（Ｅｉｓａｉ  Ｋｏｒｅａ）が投与され得る。
【０１９６】
パーキンソン病の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、カルビドパ／レボドパ即時放出錠（シネメット）、カルビドパ／レボドパ経口崩壊錠（パルコパ）、カルビドパ／レボドパ／エンタカポン（スタレボ）、ロピニロール（レキップ）、プラミペキソール（ミラペックス）、ロチゴチン（ニュープロ）、アポモルヒネ（アポカイン）、セレギリン（ｌ−デプレニル、エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ）、ラサギリン（アジレクト）、ザイディスセレギリンＨＣＬ経口崩壊錠（ゼラパール）、エンタカポン（コムタン）、トルカポン（タスマール）、アマンタジン（シンメトレル）、トリヘキシフェニジル（以前はアーテン）、ベンズトロピン（コゲンチン）、ＩＰＸ０６６（Ｉｍｐａｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ラサギリン（Ｔｅｖａ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、イオフルパン１２３Ｉ（ＤＡＴＳＣＡＮ（登録商標））、サフィナミド（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）およびピオグリタゾンが投与され得る。
【０１９７】
筋萎縮性側索硬化症の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、リルゾール（リルテック）、炭酸リチウム、アリモクロモル、クレアチン、タモキシフェン、メコバラミン、メマンチン（エビクサ（Ｅｂｉｘａ））およびタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）が投与され得る。
【０１９８】
フリードライヒ運動失調症の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、イデベノン、補酵素Ｑ、５−ヒドロキシトリプトファン、プロプラノロール、エナラプリル、リシノプリル、ジゴキシン、エリスロポエチン、Ｌｕ  ＡＡ２４４９３、デフェリプロン、バレニクリン、ＩＶＩＧ、ピオグリタゾンおよびＥＧｂ  ７６１が投与され得る。
【０１９９】
多発性硬化症の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、アボネックス、ベータセロン、エクスタビア、レビフ、グラチラマー（コパキソン）、フィンゴリモド（ジレニア）、ナタリズマブ（タイサブリ）、ミトキサントロン（ノバントロン）、バクロフェン（リオレサール）、チザニジン（ザナフレックス）、メチルプレドニゾロン、シノベックス、レシゲン、マシチニブ、プレドニゾン、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂおよびＥＬＮＤ００２（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が投与され得る。
【０２００】
ハンチントン病の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、テトラベナジン（キセナジン）、ハロペリドール（ハルドール）、クロザピン（クロザリル）、クロナゼパム（クロノピン（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ））、ジアゼパム（バリウム（Ｖａｌｉｕｍ））、エスシタロプラム（レクサプロ（Ｌｅｘａｐｒｏ））、フルオキセチン（プロザック、サラフェム）、セルトラリン（ゾロフト）、バルプロ酸（デパケン（Ｄｅｐａｋｅｎｅ））、ジバルプロエクス（デパコート）、ラモトリギン（ラミクタール（Ｌａｍｉｃｔａｌ））、ジメボン、ＡＦＱ０５６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、エチル−ＥＰＡ（Ｍｉｒａｘｉｏｎ（商標））、ＳＥＮ００１４１９６（Ｓｉｅｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、フェニル酪酸ナトリウム、シタロプラム、ウルソジオール、ミノサイクリン、レマセミドおよびミルタザピンが投与され得る。
【０２０１】
伝達性海綿状脳症の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、および例えばキナクリンが投与され得る。
【０２０２】
シャルコー−マリー−トゥース病の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、アスコルビン酸およびＰＸＴ３００３が投与され得る。
【０２０３】
レビー小体認知症の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、アリセプト、ガランタミン、メマンチン、アルモダフィニル、ドネペジルおよびラメルテオンが投与され得る。
【０２０４】
大脳皮質基底核変性症の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、ダブネチドおよび補酵素Ｑ１０が投与され得る。
【０２０５】
進行性核上性麻痺の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、チデグルシブ、ラサギリン、アルファ−リポ酸／Ｌ−アセチルカルニチン、リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、ナイアシンアミドおよびリバスチグミンが投与され得る。
【０２０６】
遺伝性痙性対麻痺の効果を処置または改善するために、対象には、有効量の本発明の１つまたは複数の化合物または医薬組成物、ならびに例えば以下の１つまたは複数、バクロフェン、チザニジン、塩化オキシブチニン、トルテロジンおよびボツリヌス毒素が投与され得る。
【０２０７】
本発明では、１つまたは複数の化合物または医薬組成物は、医師によって最も適切とみなされる場合には、同じ組成物で一緒に、別々の組成物で同時に、または異なる時間で投与される別々の組成物として、それを必要とする対象に併用投与することができる。
【０２０８】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、薬学的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化３８】
2021518856.tif 000038
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量の医薬組成物を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化３９】
2021518856.tif 000039
のどれでもない。
【０２０９】
この方法において使用するのに適した好ましい医薬組成物は、先に特定される特定の化合物を含有する医薬組成物を含む先の式（Ｉ）〜（ＩＩ）に開示される通りである。この方法に従って処置され得る適切な好ましい対象は、先に開示される通りである。この実施形態では、方法は、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患および対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる疾患を含む上述の障害を処置するために使用することができる。
【０２１０】
この実施形態の別の態様では、方法は、本明細書に開示される有効量の１つまたは複数の追加の治療剤を対象に併用投与するステップをさらに含む。
【０２１１】
本発明の別の実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、対象に、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化４０】
2021518856.tif 000040
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化４１】
2021518856.tif 000041
のどれでもない。
【０２１２】
本明細書で使用される場合、「小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性」は、適切なＥＲ機能を妨害し、それによってＥＲストレスを引き起こすことができ、それによってタンパク質のフォールディングを著しく損ない、したがってタンパク質毒性（ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）のリスクを有するいくつかの生理的および病理的状態、ならびに様々な薬理学的薬剤、例えばシクロピアゾン酸（ＣＰＡ）を意味する。ＥＲストレスのためのアッセイは、本明細書において、例えば実施例セクションに開示される通りである。
【０２１３】
この方法において使用するのに適した好ましい化合物は、先に特定される特定の化合物を含む先の式（Ｉ）〜（ＩＩ）に開示される通りである。この方法に従って処置され得る適切な好ましい対象は、先に開示される通りである。この実施形態では、方法は、神経変性疾患を含む上述の障害を処置するために使用することができる。
【０２１４】
この実施形態の別の態様では、方法は、本明細書に開示される有効量の１つまたは複数の追加の治療剤を対象に併用投与するステップをさらに含む。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、用語「抑制する」、「抑制すること」およびその文法的変形は、毒性ＥＲストレスの発生を低減または低下するなどの変化を意味する。この実施形態では、「接触させること」は、化合物および必要に応じて１つまたは複数の追加の治療剤を、このようなモジュレーションを必要とする細胞に近接させることを意味する。このことは、対象にまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ状況において薬物を送達する従来技術を使用して、例えば化合物および必要に応じて他の治療剤を、細胞が置かれている培養培地に提供することによって達成することができる。
【０２１６】
この実施形態の一態様では、対象は、哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物は、ヒト、獣医学的動物、および農業用動物からなる群から選択される。より好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【０２１７】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法である。この方法は、対象に、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化４２】
2021518856.tif 000042
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化４３】
2021518856.tif 000043
のどれでもない。
【０２１８】
本明細書で使用される場合、「軸索変性」は、神経回路の機能的結合性を妨害し、脳卒中、緑内障、および運動神経障害を含む多くの神経変性状態における非常に重要な特色である特徴的事象を意味する。
【０２１９】
この方法において使用するのに適した好ましい化合物は、先に特定される特定の化合物を含む先の式（Ｉ）〜（ＩＩ）に開示される通りである。この方法に従って処置され得る適切な好ましい対象は、先に開示される通りである。この実施形態では、方法は、上述の障害を処置するために使用することができる。
【０２２０】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化４４】
2021518856.tif 000044
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここでヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、
ただし、化合物は、
【化４５】
2021518856.tif 000045
のどれでもない。
【０２２１】
この方法において使用するのに適した好ましい化合物は、先に特定される特定の化合物を含む先の式（Ｉ）〜（ＩＩ）に開示される通りである。この実施形態では、方法は、上述の障害を処置するために使用することができる。
【０２２２】
適切な好ましい対象は、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、方法は、上述の神経変性障害を処置するために使用することができる。
【０２２３】
この実施形態の一態様では、方法は、対象に、本明細書に開示される有効量の１つまたは複数の治療剤を併用投与するステップをさらに含む。
【０２２４】
本発明のさらなる実施形態は、
【化４６】
2021518856.tif 000046
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０２２５】
本発明のさらなる実施形態は、
【化４７】
2021518856.tif 000047
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０２２６】
本発明のさらなる実施形態は、
【化４８】
2021518856.tif 000048
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０２２７】
本発明のさらなる実施形態は、
【化４９】
2021518856.tif 000049
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である。
【０２２８】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化５０】
2021518856.tif 000050
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。
【０２２９】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化５１】
2021518856.tif 000051
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。
【０２３０】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化５２】
2021518856.tif 000052
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。
【０２３１】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化５３】
2021518856.tif 000053
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。
【０２３２】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化５４】
2021518856.tif 000054
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２３３】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化５５】
2021518856.tif 000055
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２３４】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化５６】
2021518856.tif 000056
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２３５】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化５７】
2021518856.tif 000057
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２３６】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、対象に、
【化５８】
2021518856.tif 000058
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２３７】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、対象に、
【化５９】
2021518856.tif 000059
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２３８】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、対象に、
【化６０】
2021518856.tif 000060
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２３９】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法である。この方法は、対象に、
【化６１】
2021518856.tif 000061
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２４０】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法である。この方法は、対象に、
【化６２】
2021518856.tif 000062
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２４１】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法である。この方法は、対象に、
【化６３】
2021518856.tif 000063
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２４２】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法である。この方法は、対象に、
【化６４】
2021518856.tif 000064
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２４３】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法である。この方法は、対象に、
【化６５】
2021518856.tif 000065
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む。
【０２４４】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化６６】
2021518856.tif 000066
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２４５】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化６７】
2021518856.tif 000067
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２４６】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化６８】
2021518856.tif 000068
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２４７】
本発明のさらなる実施形態は、それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法である。この方法は、対象に、有効量の
【化６９】
2021518856.tif 000069
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、本明細書で定義される通り薬学的に許容され、所望の薬理学的活性を有する、本発明の化合物の塩を意味する。このような塩には、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを用いて、または有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクタ−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などを用いて形成された酸付加塩が含まれる。薬学的に許容される塩には、存在する酸性プロトンが、無機または有機塩基と反応することが可能な場合に形成され得る塩基付加塩も含まれる。許容される無機塩基には、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウムおよび水酸化カルシウムが含まれる。許容される有機塩基には、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどが含まれる。
【０２４９】
本発明では、化合物または医薬組成物の「有効量」または「治療有効量」は、対象に投与される場合、本明細書に記載される通り、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分なこのような化合物または組成物の量である。有効な剤形、投与方法、および投薬量は、経験的に決定することができ、このような決定は、当業者により行われる。投薬量は、投与経路、排出速度、処置期間、投与される任意の他の薬物の識別、対象の年齢、サイズおよび種、ならびに例えば、薬および獣医学的薬の分野で周知の類似の因子と共に変わることが、当業者によって理解される。一般に、本発明による化合物または医薬組成物の適切な用量は、副作用をまったく伴わずにまたは最小限に抑えて所望の効果をもたらすのに有効な最低用量である、化合物または組成物の量である。本発明による化合物または医薬組成物の有効用量は、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多い副用量として投与することができる。
【０２５０】
本発明による化合物もしくは医薬組成物、またはこのような化合物を含む組成物の投薬量の適切な非限定的な例は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇを含む約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。本発明の化合物または医薬組成物の他の代表的な投薬量には、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約６００ｍｇ／ｋｇ、約７００ｍｇ／ｋｇ、約８００ｍｇ／ｋｇ、約９００ｍｇ／ｋｇ、または約１０００ｍｇ／ｋｇが含まれる。
【０２５１】
本発明の化合物または医薬組成物は、経口摂取のために、または目への局所投与のための軟膏もしくは点眼薬として、あるいは非経口または腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣内、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内もしくはリンパ内などの任意の適切な方式での他の投与のために、任意の所望の有効な方式で投与することができる。さらに、本発明の化合物または医薬組成物は、他の処置と併せて投与することができる。本発明の化合物または医薬組成物は、所望に応じて、カプセル化することができ、またはその他の方法で胃液もしくは他の分泌液から保護することができる。
【０２５２】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容され、１つまたは複数の活性成分を、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数の他の化合物、薬物、成分および／または材料との混合物において含む。本発明の化合物／医薬組成物は、選択された投与経路に関係なく、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．）を参照されたい。より一般的には、「薬学的に許容される」は、一般に安全な非毒性の、生物学的にもその他の方法でも望ましい組成物の調製に有用であることを意味し、獣医学的使用およびヒトの医薬品への使用に許容されるものを含む。
【０２５３】
薬学的に許容される担体および希釈剤は、当技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ．）およびＴｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）を参照されたい）、それには、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、生理食塩水、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、およびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド（ｔｒｙｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（無水物））、エラストマーマトリックス、リポソーム、ミクロスフェア、油（例えば、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、ゴマ、綿実、および落花生）、カカオバター、ワックス（例えば、坐剤ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、サリチレート（ｓｉｌｉｃｙｌａｔｅ）などが含まれる。本発明の組成物において使用される薬学的に許容される各担体または希釈剤は、製剤のその他の成分と適合性があり、対象にとって有害でないという意味で「許容され」なければならない。選択された剤形および意図された投与経路に適した担体または希釈剤は、当技術分野で周知であり、選択された剤形および投与方法に許容される担体または希釈剤は、当分野の技術を使用して決定することができる。
【０２５４】
本発明の医薬組成物は、必要に応じて、このような組成物において一般に使用される追加の成分および／または材料を含有することができる。これらの成分および材料は、当技術分野で周知であり、それには、（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアカシア、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土、（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、およびラウリル硫酸ナトリウム、（１０）懸濁化剤、例えばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、（１１）緩衝剤、（１２）賦形剤、例えばラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、カカオバター、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチレート、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、（１３）不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、（１４）防腐剤、（１５）表面活性剤、（１６）分散化剤、（１７）制御放出剤または吸収遅延剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、生分解性ポリマー、リポソーム、ミクロスフェア、モノステアリン酸（ｍｏｎｏｓｔｅｒａｔｅ）アルミニウム、ゼラチン、およびワックス、（１８）乳白剤、（１９）アジュバント、（２０）湿潤剤、（２１）乳化剤および懸濁化剤、（２２）可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、（２３）噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパン、（２４）抗酸化剤、（２５）製剤を、意図されたレシピエントの血液と等張にする薬剤、例えば糖および塩化ナトリウム、（２６）増粘剤、（２７）コーティング材料、例えばレシチン、ならびに（２８）甘味剤、香味剤、着色剤、賦香剤および防腐剤が含まれる。このような各成分または材料は、製剤のその他の成分と適合性があり、対象にとって有害でないという意味で「許容され」なければならない。選択された剤形および意図された投与経路に適した成分および材料は、当技術分野で周知であり、選択された剤形および投与方法に許容される成分および材料は、当分野の技術を使用して決定することができる。
【０２５５】
経口投与に適した化合物または医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤、水性もしくは非水性液体の溶液剤もしくは懸濁液剤、水中油もしくは油中水液体エマルション剤、エリキシル剤もしくはシロップ剤、トローチ剤、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤の形態であってもよい。これらの製剤は、当技術分野で公知の方法、例えば、従来のパンコーティング、混合、造粒または凍結乾燥プロセスを用いることによって調製することができる。
【０２５６】
経口投与のための固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、散剤、顆粒剤など）は、例えば、活性成分を、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または希釈剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤、および／または着色剤と混合することによって調製することができる。類似のタイプの固体組成物も、適切な賦形剤を使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセル剤における充填剤として用いることができる。錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の補助成分と共に圧縮または成型することによって作成することができる。圧縮錠剤は、適切な結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤、表面活性剤または分散化剤を使用して調製することができる。成型錠剤は、適切な機械で成型することによって作成することができる。錠剤、および他の固体剤形、例えば糖衣錠剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、必要に応じて刻み目を入れるか、またはコーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよび医薬製剤化分野で周知の他のコーティングを用いて調製することができる。それらはまた、それらに含まれる活性成分の持続放出または制御放出をもたらすように製剤化することができる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって滅菌することができる。これらの組成物は、必要に応じて乳白剤を含有することもでき、組成物が、活性成分を胃腸管のある特定の部分だけでまたは優先的に、必要に応じて遅延方式で放出するような組成であってもよい。活性成分はまた、マイクロカプセル化形態であってもよい。
【０２５７】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション剤、マイクロエマルション剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、当技術分野で一般に使用される適切な不活性希釈剤を含有することができる。経口組成物は、不活性希釈剤に加えて、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、賦香剤、ならびに防腐剤を含むこともできる。懸濁液は、懸濁化剤を含有することができる。
【０２５８】
直腸または膣内投与のための組成物は、坐剤として提示することができ、坐剤は、１つまたは複数の活性成分を、室温では固体であるが体温では液体になり、したがって直腸または膣腔内で溶融し、活性化合物を放出する１つまたは複数の適切な非刺激性担体と混合することによって調製することができる。膣内投与に適した組成物には、当技術分野で適切であることが公知の通り、このような薬学的に許容される担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤も含まれる。
【０２５９】
局所または経皮投与のための剤形には、粉末剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤、液滴剤および吸入剤が含まれる。活性剤／化合物は、滅菌条件下で、薬学的に許容される適切な担体または希釈剤と混合され得る。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、賦形剤を含有することができる。粉末剤およびスプレー剤は、賦形剤および噴射剤を含有することができる。
【０２６０】
非経口投与に適した組成物は、１つまたは複数の薬剤／化合物を、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張水性もしくは非水性溶液剤、分散剤、懸濁液剤もしくはエマルション剤、または使用直前に注射可能な滅菌溶液剤もしくは分散剤に復元され得る滅菌粉末剤と組み合わせて含み、適切な抗酸化剤、緩衝液、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有することができる。適切な流動性は、例えば、コーティング材料の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。これらの組成物は、適切なアジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および分散化剤を含有することもできる。組成物は、等張剤を含むことが望ましい場合もある。さらに、吸収を遅延する薬剤を含むことによって、注射可能な医薬形態の延長吸収をもたらすことができる。
【０２６１】
ある場合には、薬物（例えば、医薬製剤）の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射によるその吸収を緩徐することが望ましい。これは、水溶度が低い結晶性または非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成することができる。
【０２６２】
次に、活性剤／薬物の吸収速度は、その溶解速度に応じて変わり、溶解速度は、結晶の大きさおよび結晶形態に応じて変わり得る。あるいは、非経口投与された薬剤／薬物の遅延吸収は、活性剤／薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成することができる。注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマーにおける活性成分のマイクロ封入マトリックスを形成することによって作成することができる。ポリマーに対する活性成分の比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、活性成分の放出速度を制御することができる。また、デポー注射可能な製剤は、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を捕捉することによって調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって滅菌することができる。
【０２６３】
製剤は、単回用量または多回用量封止容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示することができ、滅菌液体担体または希釈剤、例えば注射用の水を使用直前に添加するだけで済む凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射溶液および懸濁液は、前述のタイプの滅菌粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
【０２６４】
先の実施形態において、以下の定義が適用される。
【０２６５】
用語「脂肪族」は、本明細書で使用される場合、芳香環を含有しない、炭素および水素から構成された基を指す。したがって、脂肪族基には、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびカルボシクリル基が含まれる。さらに、別段指定されない限り、用語「脂肪族」は、「非置換脂肪族」および「置換脂肪族」の両方を含むことが意図され、置換脂肪族は、脂肪族基の１つまたは複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有する脂肪族部分を指す。このような置換基には、例えば、ハロゲン、重水素、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、芳香族、または複素芳香族部分が含まれ得る。
【０２６６】
用語「アルキル」は、直鎖アルキル基および分岐鎖アルキル基を含む、環構造を有していない飽和脂肪族基のラジカルを指す。ある特定の実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格内に６個またはそれ未満の炭素原子を有する（例えば、直鎖ではＣ１〜Ｃ６、分岐鎖ではＣ３〜Ｃ６）。このような置換基には、安定性が禁制的である場合を除いて、以下に論じられる通り、脂肪族基を企図されたすべての置換基が含まれる。
【０２６７】
用語「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１個の二重結合を含有する脂肪族基を指し、別段指定されない限り、「非置換アルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含むことを意図され、置換アルケニルは、アルケニル基の１つまたは複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有するアルケニル部分を指す。このような置換基には、安定性が禁制的である場合を除いて、以下に論じられる通り、脂肪族基を企図されたすべての置換基が含まれる。例えば、１つまたは複数のアルキル、カルボシクリル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基によるアルケニル基の置換が企図される。
【０２６８】
さらに、別段指定されない限り、本明細書、実施例、および特許請求の範囲を通して使用される用語「アルキル」は、「非置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことを意図され、置換アルキルは、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有するアルキル部分を指す。実際、別段指定されない限り、本明細書で列挙されるすべての基は、置換および非置換選択肢の両方を含むことが意図される。
【０２６９】
用語「Ｃｘ〜ｙ」は、化学的部分、例えばアルキルおよびシクロアルキルと共に使用される場合、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含有する基を含むことを意味する。例えば、用語「Ｃｘ〜ｙアルキル」は、ハロアルキル基、例えばトリフルオロメチルおよび２，２，２−トリフルオロエチル（ｔｉｒｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）などを含む、鎖中にｘ〜ｙ個の炭素を含有する直鎖アルキルおよび分岐鎖アルキル基を含む置換または非置換の飽和炭化水素基を指す。
【０２７０】
用語「アリール」は、本明細書で使用される場合、環の各原子が炭素である、置換または非置換の単環芳香族基を含む。好ましくは、環は、３〜８員環、より好ましくは６員環である。用語「アリール」は、２個またはそれよりも多い環式環を有する多環式環系も含み、ここで２個またはそれよりも多い炭素は、２個の隣接する環に共通しており、環の少なくとも１個は、芳香族であり、例えば、他方の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルであってもよい。アリール基には、ベンゼン、ナフタレン、フェナントレン、フェノール、アニリンなどが含まれる。
【０２７１】
用語「アルキル−アリール」は、少なくとも１個のアリール基で置換されているアルキル基を指す。
【０２７２】
用語「アルキル−ヘテロアリール」は、少なくとも１個のヘテロアリール基で置換されているアルキル基を指す。
【０２７３】
用語「アルケニル−アリール」は、少なくとも１個のアリール基で置換されているアルケニル基を指す。
【０２７４】
用語「アルケニル−ヘテロアリール」は、少なくとも１個のヘテロアリール基で置換されているアルケニル基を指す。
【０２７５】
用語「アミノ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＮＲＲ’を指し、ここでＲおよびＲ’は、独立に、水素、アルキル、アシル、ヘテロアルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキルから選択され、そのいずれかは、それら自体が必要に応じて置換されていてもよい。さらに、ＲおよびＲ’は、合わさってヘテロシクロアルキルを形成することができ、そのいずれかは、必要に応じて置換されていてもよい。
【０２７６】
用語「アミド」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＲｎＥ（Ｏ）ｘＮＲ’２を指し、ここでＲおよびＲ’は、独立に、水素、アルキル、アシル、ヘテロアルキル、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリール、およびヘテロシクロアルキルから選択され、そのいずれかは、それら自体が必要に応じて置換されていてもよい。例として、カルボキサミド（ｎ＝１、Ｅ＝Ｃ、ｘ＝１）、ホスホラミド（ｎ＝２、Ｅ＝Ｐ、ｘ＝１）、およびスルホンアミド（ｎ＝１、Ｅ＝Ｓ、ｘ＝２）が挙げられる。
【０２７７】
用語「ベンゾ」および「ベンズ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、ベンゼンから誘導された二価のラジカルＣ６Ｈ４＝を指す。例として、ベンゾチオフェンおよびベンズイミダゾールが挙げられる。
【０２７８】
用語「カルバメート」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、窒素または酸末端のいずれかから親分子部分に結合することができ、本明細書で定義される通り必要に応じて置換されていてもよい、カルバミン酸のエステル（−ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ−）を指す。用語「Ｏ−カルバミル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＲ’基を指し、用語「Ｎ−カルバミル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、ＲＯＣ（Ｏ）ＮＲ’−基を指す。ＲおよびＲ’は、本明細書で定義される通りであるか、または具体的に列挙される指定の「Ｒ」基によって定義される通りである。
【０２７９】
用語「カルボニル」は、本明細書で使用される場合、単独の場合はホルミル［−Ｃ（Ｏ）Ｈ］を含み、組合せでは−Ｃ（Ｏ）−基である。
【０２８０】
用語「カルボキシル」または「カルボキシ」は、本明細書で使用される場合、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、または例えばカルボン酸塩で存在する対応する「カルボキシレート」アニオンを指す。「Ｏ−カルボキシ」基は、ＲＣ（Ｏ）Ｏ−基を指し、ここでＲは、本明細書で定義される通りである。「Ｃ−カルボキシ」基は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ基を指し、ここでＲは、本明細書で定義される通りである。
【０２８１】
用語「シアノ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＣＮを指す。
【０２８２】
用語「シクロアルキル」または代替として「炭素環」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、飽和または部分的に飽和の単環式、二環式または三環式アルキル基を指し、ここで各環式部分は、３〜１２個の炭素原子の環員を含有し、本明細書で定義される通り必要に応じて置換されているベンゾ縮合環系であってもよい。ある特定の実施形態では、前記シクロアルキルは、５〜７個の炭素原子を含む。このようなシクロアルキル基の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、オクタヒドロナフチル、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデニル、アダマンチルなどが挙げられる。「二環式」および「三環式」は、本明細書で使用される場合、縮合環系、例えばデカヒドロナフタレン、オクタヒドロナフタレン、ならびに多環式（多中心性）飽和または部分的に不飽和のタイプの両方を含むことを意図される。後者のタイプの異性体は、一般に、ビシクロ［１，１，１］ペンタン、カンファー、アダマンタン、およびビシクロ［３，２，１］オクタンによって例示される。
【０２８３】
用語「炭素環」、「カルボシクリル」、および「炭素環式」は、本明細書で使用される場合、環の各原子が炭素である、非芳香族の飽和または不飽和の環を指す。好ましくは、炭素環は、３〜１０個の原子、より好ましくは例えば５〜７個の原子、例えば６個の原子を含む、３〜８個の原子を含有する。用語「カルボシクリル（ｃａｂｏｃｙｃｌｅ）」は、アダマンチル環系を含む、二環、三環および他の多環式環系も含む。
【０２８４】
用語「ヘテロ原子」は、本明細書で使用される場合、炭素または水素以外の任意の元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、および硫黄であり、より好ましくは、窒素および酸素である。
【０２８５】
用語「ヘテロアルキル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、完全に飽和のまたは１〜３の不飽和度を含有し、記述された数の炭素原子ならびにＯ、ＮおよびＳから選択される１〜３個のヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分岐鎖もしくは環式炭化水素ラジカル、またはそれらの組合せを指し、ここで窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、ＮおよびＳは、ヘテロアルキル基の任意の内部の位置に置かれてもよい。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３などのように２個までのヘテロ原子が連続していてもよい。
【０２８６】
用語「ヘテロアリール」には、置換または非置換の芳香族の単一環構造、好ましくは３〜８員環、より好ましくは５〜７員環、さらにより好ましくは５〜６員環が含まれ、その環構造は、少なくとも１個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、より好ましくは１個または２個のヘテロ原子を含む。用語「ヘテロアリール」は、２個またはそれよりも多い環式環を有する多環式環系も含み、ここで２個またはそれよりも多い炭素は、２個の隣接する環に共通しており、環の少なくとも１個は、複素芳香族であり、例えば、他方の環式環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、および／またはヘテロシクリルであってもよい。ヘテロアリール基には、例えば、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどが含まれる。
【０２８７】
用語「ヘテロシクロアルキル」および交換可能に「複素環」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、それぞれ、環員として少なくとも１個のヘテロ原子を含有する飽和、部分的に不飽和または完全に不飽和の単環式、二環式、または三環式複素環式基を指し、ここで各前記ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、およびＳから独立に選択することができる。さらに、ヘテロシクロアルキルは、環員として、１個または２個のＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）２基を含有することができる。ある特定の実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、環員として１〜４個のヘテロ原子を含む。さらなる実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、環員として１〜２個のヘテロ原子を含む。ある特定の実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、各環において３〜８環員を含む。さらなる実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、各環において３〜７環員を含む。またさらなる実施形態では、前記ヘテロシクロアルキルは、各環において５〜６環員を含む。「ヘテロシクロアルキル」および「ヘテロシクリル」は、スルホン、スルホキシド、第三級窒素環員のＮ−オキシド、ならびに炭素環式縮合およびベンゾ縮合環系を含むことを意図され、さらに、それらの用語は共に、複素環の環が、本明細書で定義される通りのアリール基またはさらなる複素環基に縮合している系も含む。複素環基の例として、アジリジニル、アゼチジニル、１，３−ベンゾジオキソリル、ジヒドロイソインドリル、ジヒドロイソキノリニル、ジヒドロシンノリニル、ジヒドロベンゾジオキシニル、ジヒドロ［１，３］オキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジニル、ベンゾチアゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロピリジニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、イソインドリニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロピリジニル、ピペリジニル、チオモルホリニルなどが挙げられる。複素環基は、具体的に禁制されない限り、必要に応じて置換されていてもよい。
【０２８８】
用語「ヒドロキシ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＯＨを指す。
【０２８９】
用語「ハロ」および「ハロゲン」は、本明細書で交換可能に使用され、ハロゲンを意味し、クロロ、フルオロ、ブロモ、およびヨードを含む。
【０２９０】
用語「ハロアルコキシ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、酸素原子を介して親分子部分に結合しているハロアルキル基を指す。ハロアルコキシには、ペルハロアルコキシが含まれる。用語「ペルハロアルコキシ」は、水素原子のすべてがハロゲン原子によって置き換えられているアルコキシ基を指す。ペルハロアルコキシの一例は、ペルフルオロメトキシである。
【０２９１】
用語「ハロアルキル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、１つまたは複数の水素がハロゲンで置き換えられている、先に定義される通りの意味を有するアルキルラジカルを指す。具体的には、モノハロアルキル、ジハロアルキル、ポリハロアルキル、およびペルハロアルキルラジカルが包含される。一例として、モノハロアルキルラジカルは、ラジカル内にヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロ原子を有することができる。ジハロおよびポリハロアルキルラジカルは、２個またはそれよりも多い同じハロ原子または異なるハロラジカルの組合せを有することができる。ハロアルキルラジカルの例として、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルが挙げられる。「ハロアルキレン」は、２つまたはそれよりも多い位置において結合しているハロアルキル基を指す。ハロアルキルラジカルの例として、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルおよびジクロロプロピルが挙げられる。「ハロアルキレン」は、２つまたはそれよりも多い位置において結合しているハロアルキル基を指す。例として、フルオロメチレン（−ＣＦＨ−）、ジフルオロメチレン（−ＣＦ２−）、クロロメチレン（−ＣＨＣｌ−）などが挙げられる。用語「ペルハロアルキル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、水素原子のすべてがハロゲン原子によって置き換えられているアルキル基を指す。例として、ペルフルオロメチルが挙げられる。
【０２９２】
用語「アルコール」は、ヒドロキシル官能基（−ＯＨ）が飽和炭素原子に結合している有機化合物を意味する。
【０２９３】
用語「ケトン」は、構造ＲＣ（＝Ｏ）Ｒ’を有する有機化合物を意味し、ここでＲおよびＲ’のいずれも、水素原子ではあり得ない。
【０２９４】
用語「エステル」は、構造ＲＣ（＝Ｏ）ＯＲ’を有する有機化合物を意味し、ここでＲおよびＲ’のいずれも、水素原子ではあり得ない。
【０２９５】
用語「エーテル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、炭素原子において連結した２つの部分を架橋しているオキシ基を指す。
【０２９６】
用語「ニトロ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＮＯ２を指す。
【０２９７】
用語「ポリイン」は、交互に現れる単結合および三重結合、すなわち一連の連続したアルキン、（−Ｃ≡Ｃ−）ｎ（ｎは１を超える）を有する有機化合物を意味する。
【０２９８】
用語「チア」および「チオ」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、酸素が硫黄で置き換えられている−Ｓ−基またはエーテルを指す。チオ基の酸化誘導体、すなわちスルフィニルおよびスルホニルは、チアおよびチオの定義に含まれる。用語「スルファニル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−Ｓ−を指す。用語「スルフィニル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−Ｓ（Ｏ）−を指す。用語「スルホニル」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−Ｓ（Ｏ）２−を指す。
【０２９９】
用語「ウレア」または「カルバミド」は、本明細書で使用される場合、単独でまたは組合せで、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−を指す。
【０３００】
用語「置換されている」は、骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有する部分を指す。「置換」または「で置換されている」は、このような置換が、置換されている原子および置換基の許容される原子価に従って行われ、その置換が、例えば転位、環化、排除などによる変換を自然には受けない安定な化合物をもたらすという暗黙の条件を含むことを理解されよう。本明細書で使用される場合、用語「置換されている」は、有機化合物のすべての許容できる置換基を含むこと企図される。広範な一態様では、許容できる置換基には、有機化合物の非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式および複素環式の芳香族および非芳香族置換基が含まれる。適切な有機化合物のための許容できる置換基は、１つでも複数でもよく、同じでも異なっていてもよい。本発明の目的では、ヘテロ原子、例えば窒素は、ヘテロ原子の原子価を満たす水素置換基および／または本明細書に記載される有機化合物の任意の許容できる置換基を有することができる。置換基には、本明細書に記載される任意の置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が含まれ得る。炭化水素鎖上で置換されている部分は、適切な場合にはそれら自体が置換されていてもよいことが当業者には理解されよう。
【０３０１】
既に記載されている通り、具体的に「非置換」と記述されない限り、本明細書における化学的部分への言及は、置換バリアントを含むと理解される。例えば、「アリール」基または部分への言及は、置換および非置換バリアントの両方を暗示的に含む。
【０３０２】
本明細書で使用される場合、用語「フラニル」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７０】
2021518856.tif 000070
【０３０３】
本明細書で使用される場合、用語「インドリル」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７１】
2021518856.tif 000071
【０３０４】
本明細書で使用される場合、用語「インダゾール」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７２】
2021518856.tif 000072
【０３０５】
本明細書で使用される場合、用語「ピリジル」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７３】
2021518856.tif 000073
【０３０６】
本明細書で使用される場合、用語「ピリミジニル」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７４】
2021518856.tif 000074
【０３０７】
本明細書で使用される場合、用語「ピラゾール」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７５】
2021518856.tif 000075
【０３０８】
本明細書で使用される場合、用語「チエニル」または「チオフェン」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７６】
2021518856.tif 000076
【０３０９】
本明細書で使用される場合、用語「ベンゾチオフェニル」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７７】
2021518856.tif 000077
【０３１０】
本明細書で使用される場合、用語「ベンゾジオキサン」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７８】
2021518856.tif 000078
【０３１１】
本明細書で使用される場合、用語「ジベンゾフラニル」は、以下の構造を含有する任意の化合物または化学基を意味する。
【化７９】
2021518856.tif 000079
【０３１２】
本明細書における化合物の開示は、その化合物のすべての立体異性体を包含すると理解される。本明細書で使用される場合、用語「立体異性体」は、同じ結合によって結合した同じ原子から作成されているが、相互変換が不可能な異なる三次元構造を有する化合物を指す。三次元構造は、立体配置と呼ばれる。立体異性体には、エナンチオマーおよびジアステレオマーが含まれる。
【０３１３】
用語「ラセミ体」または「ラセミ混合物」は、等しいエナンチオマー部分の混合物を指す。用語「キラル中心」は、４個の異なる基が結合している炭素原子を指す。用語「エナンチオマー濃縮」は、本明細書で使用される場合、一方のエナンチオマーの量が、他方のエナンチオマーと比較して多いことを指す。
【０３１４】
本発明の化合物は、キラル中心を有する程度まで光学的に活性なラセミ形態で存在し、単離され得ると認識される。いくつかの化合物は、多型を示し得る。本発明は、本明細書に記載される有用な性質を有する本発明の化合物の任意のラセミ、光学的に活性なジアステレオマー、多形もしくは立体異性形態、またはそれらの混合物を包含し、光学的に活性な形態をどのように調製するか（例えば、再結晶化技術によるラセミ形態の分割によって、光学的に活性な出発材料からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離によって）については当技術分野で周知であることが理解されるべきである。
【０３１５】
光学的に活性な材料を得るための方法の例は、当技術分野で公知であり、少なくとも以下が含まれる。
ｉ）結晶の物理的分離−−個々のエナンチオマーの巨視的結晶が、手作業により分離される技術。この技術は、別々のエナンチオマーの結晶が存在する場合、すなわち材料が集合体であり、結晶が視覚的に区別される場合に使用することができる。
ｉｉ）同時結晶化−−個々のエナンチオマーが、ラセミ体の溶液から別々に結晶化される技術であり、ラセミ体が固体状態の集合体である場合にのみ可能。
ｉｉｉ）酵素的分割−−エナンチオマーが酵素と反応する速度の差によって、ラセミ体を部分的または完全に分離する技術。
ｉｖ）酵素的不斉合成−−合成の少なくとも１つのステップが、所望のエナンチオマーのエナンチオマー的に純粋なまたは濃縮された合成前駆体を得るための酵素反応を使用する合成技術。
ｖ）化学的不斉合成−−所望のエナンチオマーが、生成物において不斉性（すなわち、キラリティ）を生じさせる条件下でアキラル前駆体から合成される合成技術（本明細書により詳細に開示される通りのキラル触媒またはキラル補助基を使用して達成することができる）。
ｖｉ）ジアステレオマー分離−−ラセミ化合物が、個々のエナンチオマーをジアステレオマーに変換するエナンチオマー的に純粋な試薬（キラル補助基）と反応させられる技術。次に、生じたジアステレオマーは、クロマトグラフィーまたは結晶化によって、その時点でより明確な構造的な差によって分離され、後にキラル補助基が除去されて、所望のエナンチオマーが得られる。
ｖｉｉ）一次および二次不斉変換−−ラセミ体からのジアステレオマーが平衡に達して、所望のエナンチオマーからのジアステレオマーが溶液中で優勢になるか、または所望のエナンチオマーからのジアステレオマーの優先的な結晶化により平衡が乱され、したがって最終的には原理的にすべての材料が、所望のエナンチオマーから結晶性ジアステレオマーに変換される技術。次に、所望のエナンチオマーがジアステレオマーから放出される。
ｖｉｉｉ）動力学的分割−−この技術は、動力学的条件下でエナンチオマーとキラルな非ラセミ試薬または触媒との反応速度が不均一であることによって、ラセミ体の部分的または完全な分割（または部分的に分割された化合物のさらなる分割）が達成されることを指す。
ｉｘ）非ラセミ前駆体からのエナンチオ特異的合成−−所望のエナンチオマーが、非キラル出発材料から得られ、立体化学的完全性が、合成過程にわたって損なわれない、または最小限にのみ損なわれる合成技術。
ｘ）キラル液体クロマトグラフィー−−ラセミ体のエナンチオマーが、固定相とのそれらの異なる相互作用によって液体移動相中で分離される技術。固定相は、キラル材料から作成することができ、または移動相は、異なる相互作用を惹起するさらなるキラル材料を含有することができる。
ｘｉ）キラルガスクロマトグラフィー−−ラセミ体が揮発させられ、エナンチオマーが、固定された非ラセミキラル吸着剤相を含有するカラムを用いて、気体移動相におけるそれらの異なる相互作用によって分離される技術。
ｘｉｉ）キラル溶媒を用いる抽出−−一方のエナンチオマーが特定のキラル溶媒に優先的に溶解することによって、エナンチオマーが分離される技術。
ｘｉｉｉ）キラル膜を介する輸送−−ラセミ体が、薄膜バリアと接触して置かれる技術。バリアは、典型的に２つの混和性流体を分離し、一方はラセミ体を含有し、濃縮または圧力差などの駆動力が、膜バリアを介する優先的な輸送を引き起こす。分離は、ラセミ体の一方のエナンチオマーだけを通過させる膜の非ラセミキラル性質の結果として生じる。
【０３１６】
立体異性体はまた、塩基もしくはそれらの塩の分別結晶化、またはクロマトグラフィー技術、例えばＬＣもしくはフラッシュクロマトグラフィーを含む、当業者に公知の通常の技術によって分離することができる。（＋）エナンチオマーは、Ｊ．  Ｊａｃｑｕｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，  Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８１によって記載されるものなどの、当技術分野で周知の技術および手順を使用して、（−）エナンチオマーから分離することができる。例えば、適切な有機溶媒、例えばエタノール／アセトニトリルおよびＣｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤパック、２０ミクロンを用いるキラルクロマトグラフィーを利用して、エナンチオマーを分離することもできる。
【０３１７】
以下の実施例は、本発明の方法をさらに例示するために提供される。これらの実施例は、単に例示的なものであり、本発明の範囲をいかなる方式であっても制限することを意図されない。
【実施例】
【０３１８】
本発明を、例示的な目的で提供されかつ本発明をいかなる手法によっても限定するものではない以下の実施例によって、さらに例示する。当業者なら、本質的に同じ結果をもたらすよう変更または修正することができる、様々な重要ではないパラメーターを容易に認識されよう。
（実施例１）
方法および材料
化学物質
【０３１９】
出発材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｒｋ  Ｐｈａｒｍ、Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、またはＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、他に指示されない限り、受け取ったままの状態で使用した。全ての溶媒は、試薬グレードであった。
クロマトグラフィー
【０３２０】
カラムクロマトグラフィーを、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ＋で、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）順相シリカフラッシュカラムを使用して行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ＳｉｌｉａＰｌａｔｅ（商標）ガラスＴＬＣプレート（２５０μｍ、２０×２０ｃｍ）上で行った。指示される場合には、化合物を、ＧＸ−２７１液体ハンドラーを備えたＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸ−Ｃ１８カラム（２５０×２１．２ｍｍ、粒度：５μｍ、孔径：１１０Å）上で、分取ＨＰＬＣにより精製した。
分光法
【０３２１】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、指示されるように４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚの分光光度計を使用して、周囲温度で記録した。化学シフトを、残留溶媒ピークに対して、ｐｐｍを単位として報告する（１Ｈ  ＮＭＲ：  ＤＭＳＯ−ｄ６，  δ  ２．５０；  クロロホルム−ｄ，  δ  ７．２６；  メタノール−ｄ４，  δ  ３．３１）。下記の略称を、多重度を示すのに使用する：ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｈｅｐｔ（七重項）、ｍ（多重項）、ｂｒ（ブロード）。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、指示されるように、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により飛行時間型分光計で獲得し、ピークマッチングにより得た。全ての反応を、他に指示されない限り、アルゴン下で火力乾燥したガラス製品内の、窒素またはアルゴンの雰囲気下で実行した。水性溶液を、１８ＭΩ・ｃｍを超える抵抗率のナノ純水から調製した。他に指示しない限り、全ての試薬は市販のものだった。
ソフトウェア
【０３２２】
分子ドッキング、分子モデリング、および視覚化を、Ｇｌｉｄｅ（２０１２−２０１６版、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）およびＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｍａｅｓｔｒｏ（２０１７−１版）を使用して行った。全ての化学構造を、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ１６．０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して描いた。全てのミクロソーム安定性曲線を、Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して作製した。
（実施例２）
ピペラジンアナログの合成
【０３２３】
式（Ｉ）から（ＩＩ）の化合物を得るための一般的経路は、以下に例示する合成に従う。効力媒介基を、早期の代わりに最終ステップで添加した。各化合物の調製も提供する。
【化８０】
2021518856.tif 000080
スキーム１：化合物１および７ａ〜７ａｚに関する一般的合成スキーム。
４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（化合物３）の調製
【化８１】
2021518856.tif 000081
【０３２４】
５−ブロモ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（２、３．９４ｇ、２０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）および４−ホルミルフェニルボロン酸（３．３０ｇ、２２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を、圧力管に添加し、アセトニトリル（８０ｍＬ）および１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）を添加した。反応混合物を脱気し、アルゴン下で保持した。Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（０．７０ｇ、１．０ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）を添加し、その後、水性Ｎａ２ＣＯ３（２．０Ｍ、５０ｍＬ）を添加した。反応混合物を５分間撹拌し、油浴に移し、１３０℃で一晩撹拌した。室温に冷却後、反応混合物を、酢酸エチルとブラインとの間で分配し、分離し、水性層を酢酸エチルで抽出した（３×）。合わせた有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライト上で濾過した。溶媒を蒸発させ、粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（０〜１００％  ヘキサン中ＥｔＯＡｃ）により精製して、４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（３、２．１５ｇ、収率４８％）を無色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １１．８０  （ｓ，  １Ｈ），  １０．０６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０５  −  ７．９４  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ１４Ｈ１１Ｎ２Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：２２３．０８７２、実測値：２２３．０８７２。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物４）の調製
【化８２】
2021518856.tif 000082
【０３２５】
４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（３、２．１５ｇ、９．６６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジクロロメタン（約０．１Ｍ）中に懸濁し、１−メチルピペラジン（１．９３ｇ、２．１４ｍＬ、１９．３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）、およびＮａ（ＯＡｃ）３ＢＨ（３．０７ｇ、１４．５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を、ジクロロメタンとブラインとの間で分配し、層を分離し、水性層をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、セライト上で濾過し、溶媒を蒸発させて、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４、２．２グラム、収率７４％）を無色の固体として得た。生成物を、さらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６４  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．６３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．４４  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ１９Ｈ２３Ｎ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３０７．１９２３、実測値：３０７．１９１８。
３−ヨード−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物５）の調製
【化８３】
2021518856.tif 000083
【０３２６】
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（４、２．２ｇ、７．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、アセトン（０．０１５Ｍ、４８０ｍＬ）中に懸濁し、Ｎ−ヨードスクシンイミド（１．７８ｇ、７．９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（１％のＥｔ３Ｎを含有するＤＣＭ中０〜１０％ＭｅＯＨ）により精製して、３−ヨード−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５、２．３ｇ、収率７４％）を淡褐色の固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  １Ｈ），  ３．２１  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４Ｉ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４３３．０８８９、実測値：４３３．０８８３。
ｔｅｒｔ−ブチル３−ヨード−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボキシレート（化合物６）の調製
【化８４】
2021518856.tif 000084
【０３２７】
３−ヨード−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（５、２．３ｇ、５．３２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、ＴＨＦ（２５０ｍＬ）およびＤＭＦ（２０ｍＬ）の混合物に溶解した。Ｂｏｃ２Ｏ（３．４８ｇ、１５．９６ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）およびＤＭＡＰ（０．９７ｇ、７．９８ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。水を添加し、反応混合物を酢酸エチルで抽出した（３×）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗製材料を、シリカ上でのカラムクロマトグラフィー（１％のＥｔ３Ｎを含有するＤＣＭ中０〜１０％ＭｅＯＨ）により精製して、ｔｅｒｔ−ブチル３−ヨード−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボキシレートを淡褐色の固体（６、２．０ｇ、収率７１％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ８．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．５８  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．４７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．３０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６９  （ｓ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２４Ｈ３０Ｎ４Ｏ２Ｉ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５３３．１４１３、実測値：５３３．１４２３。
スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護の一般的手順
【化８５】
2021518856.tif 000085
スキーム２：スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的合成スキーム。
【０３２８】
ｔｅｒｔ−ブチル３−ヨード−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−カルボキシレート（６、２６．２ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、テフロン（登録商標）加工のキャップを備えた１ドラムガラスバイアル内で、１，４−ジオキサン（２．０ｍＬ）に溶解した。ボロン酸またはボロン酸エステル（０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加し、その後、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、５．８ｍｇ、５ｍｏｌ％）を添加した。反応混合物を脱気し、水性Ｎａ２ＣＯ３（２．０Ｍ、０．５ｍＬ）を添加し、１００℃で一晩撹拌した。反応混合物をセライト上で濾過し、セライトを酢酸エチルで洗浄した。溶媒を蒸発させ、粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、純粋な材料を得た。
３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１）の調製
【化８６】
2021518856.tif 000086
【０３２９】
化合物１を、５−インドリルボロン酸（１２．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１、１４．８ｍｇ、収率７０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．７，  ０．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５１  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．２，  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．００  −  ２．８０  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８７  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．分光データは、文献に報告されているデータと一致した。
３−（１Ｈ−インドール−２−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａ）の調製
【化８７】
2021518856.tif 000087
【０３３０】
化合物７ａは、２−ボロン酸ピナコールエステル（１８．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１Ｈ−インドール−２−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａ、１４．１ｍｇ、収率６７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５４  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４２  −  ７．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０７  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ７．２，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．００  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ７．１，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５６  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７５  −  ２．４０  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．３４  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２８Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２２．２３３９、実測値：４２２．２３３６。
３−（６−エトキシピリジン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｂ）の調製
【化８８】
2021518856.tif 000088
【０３３１】
化合物７ｂは、６−エトキシ−３−ピリジニルボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（６−エトキシピリジン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｂ、１６．２ｍｇ、収率７６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ２．６，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．６，  ２．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．８８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．６，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．３４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．８０  −  ２．４５  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．４０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．４０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ３０Ｎ５Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２８．２４５０、実測値：４２８．２４４９。
３−（ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｃ）の調製
【化８９】
2021518856.tif 000089
【０３３２】
化合物７ｃを、４−（ジベンゾフラニル）ボロン酸（１５．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｃ、１２．６ｍｇ、収率５８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５７  （ｓ，  ２Ｈ），  ８．１８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１２  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．００  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．６，  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７０  −  ７．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５７  −  ７．４８  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．０５  −  ２．７５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．８５  −  ２．５５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．５９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３１Ｈ２９Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４７３．２３４１、実測値：４７３．２３４５。
３−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｄ）の調製
【化９０】
2021518856.tif 000090
【０３３３】
化合物７ｄを、１，４−ベンゾジオキサン−６−ボロン酸（１３．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｄ、１０．２ｍｇ、収率４６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１７  −  ７．１０  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．９１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２７  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．６０  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７７  −  ２．４６  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２９Ｎ４Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４１．２２９１、実測値：４４１．２２８７。
４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（化合物７ｅ）の調製
【化９１】
2021518856.tif 000091
【０３３４】
化合物７ｅを、４−アミノフェニルボロン酸ピナコールエステル（１７．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７ｅ、１４．４ｍｇ、収率７３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４６  −７．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．８４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．６３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．４９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２８Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３９８．２３４５、実測値：３９８．２３４４。
３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｆ）の調製
【化９２】
2021518856.tif 000092
【０３３５】
化合物７ｆを、ベンゾ［ｂ］チエン−３−イルボロン酸（１４．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｆ、１６．０ｍｇ、収率７３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９７  −  ７．８７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４４  −  ７．３３  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５５  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７１  −  ２．４５  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．３７  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２７Ｎ４Ｓ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４３９．１９５６、実測値：４３９．１９５５。
３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｇ）の調製
【化９３】
2021518856.tif 000093
【０３３６】
化合物７ｇを、ベンゾ［ｂ］チエン−２−イルボロン酸（１４．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｇ、１５．９ｍｇ、収率７３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７４  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３２  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．９，  ７．２，  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２６  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ７．２，  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５９  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．７２  −  ２．４８  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．３８  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２７Ｎ４Ｓ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４３９．１９５６、実測値：４３９．１９５９。
３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（化合物７ｈ）の調製
【化９４】
2021518856.tif 000094
【０３３７】
化合物７ｈを、３−アミノフェニルボロン酸塩酸塩（１３．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７ｈ、１４．９ｍｇ、収率７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０３  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．６，  １．７，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．６８  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．８，  ２．３，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６０  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５８  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．３４  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２８Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３９８．２３４５、実測値：３９８．２３３７。
２−フルオロ−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）安息香酸（化合物７ｉ）の調製
【化９５】
2021518856.tif 000095
【０３３８】
化合物７ｉを、３−カルボキシ−４−フルオロフェニルボロン酸（１３．８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、２−フルオロ−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）安息香酸（７ｉ、８．９ｍｇ、収率４０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．８，  ２．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．６，  ４．５，  ２．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １０．６，  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２６ＦＮ４Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４５．２０４０、実測値：４４５．２０３５。
３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）安息香酸（化合物７ｊ）の調製
【化９６】
2021518856.tif 000096
【０３３９】
化合物７ｊを、３−カルボキシフェニルボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリンブおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）安息香酸（７ｊ、１２．０ｍｇ、収率５６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６２  −  ８．５６  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．３６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０２  −  ７．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２７Ｎ４Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２７．２１３４、実測値：４２７．２１３７。
５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン（化合物７ｋ）の調製
【化９７】
2021518856.tif 000097
【０３４０】
化合物７ｋを、２−アミノピリミジン−５−ボロン酸（１１．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−アミン（７ｋ、１６．４ｍｇ、８２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．８７  （ｓ，  ２Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．９３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２３Ｈ２６Ｎ７［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４００．２２５０、実測値：４００．２２５０。
３−メチル−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリジン−２−アミン（化合物７ｌ）の調製
【化９８】
2021518856.tif 000098
【０３４１】
化合物７ｌを、２−アミノ−３−メチルピリジン−５−ボロン酸ピナコールエステル（１８．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−メチル−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリジン−２−アミン（７ｌ、８．２ｍｇ、収率４０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ２．２，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１４  −  ８．０８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．０４  −  ２．６８  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８７  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３７  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４１３．２４５４、実測値：４１３．２４５７。
５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリジン−２−アミン（化合物７ｍ）の調製
【化９９】
2021518856.tif 000099
【０３４２】
化合物７ｍを、２−アミノピリジン−５−ボロン酸ピナコールエステル（１６．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ピリジン−２−アミン（７ｍ、１５．２ｍｇ、収率７６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．３，  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ２．２，  ０．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．２，  ０．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４６  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２０  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．９３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２４Ｈ２７Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３９９．２２９７、実測値：３９９．２３０７。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｎ）の調製
【化１００】
2021518856.tif 000100
【０３４３】
化合物７ｎを、４−ピリジニルボロン酸（１０．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｎ、８．７ｍｇ、収率４５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６８  −  ８．６４  （ｍ，  ３Ｈ），  ８．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ８．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２４Ｈ２６Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３８４．２１８８、実測値：３８４．２１９４。
４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ベンゾニトリル（化合物７ｏ）の調製
【化１０１】
2021518856.tif 000101
【０３４４】
化合物７ｏを、４−シアノフェニルボロン酸（１１．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ベンゾニトリル（７ｏ、１４．４ｍｇ、収率７１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９７  −  ７．９１  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．８３  −  ７．７７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．８９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９６  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．８９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２６Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４０８．２１８８、実測値：４０８．２１９８。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｐ）の調製
【化１０２】
2021518856.tif 000102
【０３４５】
化合物７ｐを、３−ニトロフェニルボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｐ、１５．４ｍｇ、収率７２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１５  （ｄｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．７，  ４．３，  ２．１，  １．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４４  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２６Ｎ５Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２８．２０８７、実測値：４２８．２０８１。
３−（４−イソプロポキシフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｑ）の調製
【化１０３】
2021518856.tif 000103
【０３４６】
化合物７ｑを、４−イソプロポキシフェニルボロン酸（１３．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（４−イソプロポキシフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｑ、１８．２ｍｇ、収率８３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６４  −  ７．５８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．０８  −  ６．９８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．６５  （七重線，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０２  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ３３Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４１．２６５４、実測値：４４１．２６４６。
３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェノール（化合物７ｒ）の調製
【化１０４】
2021518856.tif 000104
【０３４７】
化合物７ｒを、３−ヒドロキシフェニルボロン酸（１０．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェノール（７ｒ、９．８ｍｇ、収率４９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８０  −  ７．７３  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２４  −  ７．１７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．１６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．７８  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．１，  ２．５，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４２  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２７Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３９９．２１８５、実測値：３９９．２１８０。
３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｓ）の調製
【化１０５】
2021518856.tif 000105
【０３４８】
化合物７ｓを、１−メチルピラゾール−４−ボロン酸ピナコールエステル（１６．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｓ、１４．８ｍｇ、収率７７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９５  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９４  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２３Ｈ２７Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３８７．２２９７、実測値：３８７．２３０３。
４−（（５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）チオフェン−２−イル）メチル）モルホリン（化合物７ｔ）の調製
【化１０６】
2021518856.tif 000106
【０３４９】
化合物７ｔを、５−（モルホリノメチル）−２−チオフェンボロン酸ピナコールエステル（２４．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（（５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）チオフェン−２−イル）メチル）モルホリン（７ｔ、１０．０ｍｇ、収率４１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６４  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０６  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ４．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ３４Ｎ５ＯＳ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４８８．２４８４、実測値：４８８．２４７５。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（６−（メチルスルホニル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｕ）の調製
【化１０７】
2021518856.tif 000107
【０３５０】
化合物７ｕを、６−（メチルスルホニル）ピリジン−３−ボロン酸（１５．０ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（６−（メチルスルホニル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｕ、１１．０ｍｇ、収率４８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ９．１４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ２．２，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５９  （ｑ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ８．４６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．１１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２８Ｎ５Ｏ２Ｓ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４６２．１９６４、実測値：４６２．１９６８。
５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（化合物７ｖ）の調製
【化１０８】
2021518856.tif 000108
【０３５１】
化合物７ｖを、１Ｈ−インダゾール−５−ボロン酸（１２．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（７ｖ、８．４ｍｇ、収率４０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１３  −  ８．０９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８０  −  ７．７３  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６７  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ８．７，  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．９５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２７Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２３．２２９７、実測値：４２３．２２９８。
３−（フラン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｗ）の調製
【化１０９】
2021518856.tif 000109
【０３５２】
化合物７ｗを、３−フラニルボロン酸（７ｗ、８．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（フラン−３−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２．９ｍｇ、収率６９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５８  （ｓ，  ２Ｈ），  ８．０８  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６２  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．８７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．８，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．００  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２３Ｈ２５Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３７３．２０２８、実測値：３７３．２０３６。
１−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）エタン−１−オン（化合物７ｘ）の調製
【化１１０】
2021518856.tif 000110
【０３５３】
化合物７ｘを、４−アセチルフェニルボロン酸（１２．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）エタン−１−オン（７ｘ、１５．１ｍｇ、収率７１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．６５  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２９Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２５．２３４１、実測値：４２５．２３４７。
３−（３−フルオロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｙ）の調製
【化１１１】
2021518856.tif 000111
【０３５４】
化合物７ｙを、３−フルオロフェニルボロン酸（１０．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３−フルオロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｙ、１２．８ｍｇ、収率６４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６１  −  ７．５５  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５２  −  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１１  −  ７．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２６Ｎ４Ｆ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４０１．２１４２、実測値：４０１．２１４６。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ｚ）の調製
【化１１２】
2021518856.tif 000112
【０３５５】
化合物７ｚを、４−（トリフルオロメトキシ）フェニルボロン酸（１５．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を。分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ｚ、１７．４ｍｇ、収率７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８６  −  ７．８０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０５  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２６Ｆ３Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４６７．２０５９、実測値：４６７．２０６２。
４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（化合物７ａａ）の調製
【化１１３】
2021518856.tif 000113
【０３５６】
化合物７ａａを、１Ｈ−インダゾール−５−ボロン酸（１２．５ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（７ａａ、１５．６ｍｇ、収率７４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５８  −  ７．５１  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．４４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．２，  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２７Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２３．２２９７、実測値：４２３．２３０３。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｂ）の調製
【化１１４】
2021518856.tif 000114
【０３５７】
化合物７ａｂを、３−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１４．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｂ、１７．０ｍｇ、収率７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．００  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．０３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４２  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１２  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２６Ｆ３Ｎ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４５１．２１１０、実測値：４５１．２１１５。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｃ）の調製
【化１１５】
2021518856.tif 000115
【０３５８】
化合物７ａｃを、フェニルボロン酸（９．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｃ、１６．２ｍｇ、収率８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７６  −  ７．６９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５３  −  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３９  −  ７．２９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２７Ｎ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３８３．２２３６、実測値：３８３．２２３６。
３−（３−クロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｄ）の調製
【化１１６】
2021518856.tif 000116
【０３５９】
化合物７ａｄを、３−クロロフェニルボロン酸（１１．７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３−クロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｄ、１８．４ｍｇ、収率８８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７１  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６６  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３２  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．１，  ２．１，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９４  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２６ＣｌＮ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４１７．１８４６、実測値：４１７．１８４３。
３−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｅ）の調製
【化１１７】
2021518856.tif 000117
【０３６０】
化合物７ａｅを、２，４−ジクロロフェニルボロン酸（１４．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｅ、１４．９ｍｇ、収率６６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  １．４  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ７．４４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９４  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２５Ｃｌ２Ｎ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４５１．１４５６、実測値：４５１．１４４７。
３−（２，５−ジメチルフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｆ）の調製
【化１１８】
2021518856.tif 000118
【０３６１】
化合物７ａｆを、２，５−ジメチルフェニルボロン酸（１１．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２，５−ジメチルフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｆ、１４．０ｍｇ、６８％収率）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．４，  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．５０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．３０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３５  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２６  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ３１Ｎ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４１１．２５４９、実測値：４１１．２５５６。
１−メチル−６−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（化合物７ａｇ）の調製
【化１１９】
2021518856.tif 000119
【０３６２】
化合物７ａｇを、１−メチル−１Ｈ−インダゾール−６−ボロン酸（１３．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−メチル−６−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（７ａｇ、１３．２ｍｇ、収率６０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６０  −  ７．５２  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．１１  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２９Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４３７．２４５４、実測値：４３７．２４４９。
３−（１−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｈ）の調製
【化１２０】
2021518856.tif 000120
【０３６３】
化合物７ａｈを、１−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−４−ボロン酸（１５．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（１−ベンジル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｈ、１４．３ｍｇ、収率６２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３９  −  ７．２６  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．４２  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２９Ｈ３１Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４６３．２６１０、実測値：４６３．２６１２。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｉ）の調製
【化１２１】
2021518856.tif 000121
【０３６４】
化合物７ａｉを、１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−ボロン酸ピナコールエステル（１７．７ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（１，３，５−トリメチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｉ、７．６ｍｇ、収率３７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５６  −  ７．５０  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．９３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３７  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ３１Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４１５．２６１０、実測値：４１５．２６０４。
３−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｊ）の調製
【化１２２】
2021518856.tif 000122
【０３６５】
化合物７ａｊを、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１９．３ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｊ、１１．２ｍｇ、収率４３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２９  −  ８．２３  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．０２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０４  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２５Ｆ６Ｎ４［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５１９．１９８３、実測値：５１９．１９８３。
１−メチル−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（化合物７ａｋ）の調製
【化１２３】
2021518856.tif 000123
【０３６６】
化合物７ａｋを、（３−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ａ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−メチル−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（７ａｋ、６．４ｍｇ、収率１４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９６  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  −  ７．７５  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３９  −  ７．３１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．１８  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．３，  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．８０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ３１Ｎ６Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４５５．２５５９、実測値：４５５．２５５９。
メチル（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）カルバメート（化合物７ａｌ）の調製
【化１２４】
2021518856.tif 000124
【０３６７】
化合物７ａｌを、（３−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｂ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、メチル（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）カルバメート（７ａｌ、８．５ｍｇ、収率１９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７８  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４１  −  ７．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３６  −  ７．２７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．３８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．０４  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ３０Ｎ５Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４５６．２４００、実測値：４５６．２４００。
１−メチル−３−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（化合物７ａｍ）の調製
【化１２５】
2021518856.tif 000125
【０３６８】
化合物７ａｍを、（４−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｃ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−メチル−３−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（７ａｍ、５．１ｍｇ、収率２２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６５  −  ７．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５２  −  ７．４５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９９  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．８０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ３１Ｎ６Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４５５．２５５９、実測値：４５５．２５６６。
メチル（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）カルバメート（化合物７ａｎ）の調製
【化１２６】
2021518856.tif 000126
【０３６９】
化合物７ａｎを、（４−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｄ、１４．６ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）カルバメート（７ａｎ、７．６ｍｇ、収率３３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８２  −  ７．７２  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６１  −  ７．５１  （ｍ，  ４Ｈ），  ４．０４  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．７６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ３０Ｎ５Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４５６．２４００、実測値：４５６．２３９７。
３−（４−（（４−メトキシベンジル）オキシ）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｏ）の調製
【化１２７】
2021518856.tif 000127
【０３７０】
化合物７ａｏを、４−（４−メトキシベンジルオキシ）フェニルボロン酸（１９．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（４−（（４−メトキシベンジル）オキシ）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｏ、２０．４ｍｇ、収率７９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．３，  １．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  １．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６６  −  ７．５１  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．３７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．７，  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２８  −  ７．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ６．９８  −  ６．７７  （ｍ，  ３Ｈ），  ５．０５  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８０  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４４  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１６  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３３Ｈ３５Ｎ４Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５１９．２７６０、実測値：５１９．２７５５。
５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｐ）の調製
【化１２８】
2021518856.tif 000128
【０３７１】
化合物７ａｐを、３，４，５−トリメトキシフェニルボロン酸（１５．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｐ、１９．２ｍｇ、収率８１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．９６  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９２  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．８２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４６  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９３  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ３３Ｎ４Ｏ３［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４７３．２５５３、実測値：４７３．２５５４。
３−（４−メトキシ−３−メチルフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｑ）の調製
【化１２９】
2021518856.tif 000129
【０３７２】
化合物７ａｑを、４−メトキシ−３−メチルフェニルボロン酸（１２．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（４−メトキシ−３−メチルフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｑ、１７．２ｍｇ、収率８１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５１  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４８  −  ７．４４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１２  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．２８  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ３１Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４２７．２４９８、実測値：４２７．２５０１。
３−（３−（ベンジルオキシ）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｒ）の調製
【化１３０】
2021518856.tif 000130
【０３７３】
化合物７ａｒを、３−（ベンジルオキシ）フェニルボロン酸（１７．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（３−（ベンジルオキシ）フェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｒ、１５．４ｍｇ、収率６３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５８  （ｓ，  ２Ｈ），  ７．７９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４９  −  ７．４３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４３  −  ７．２２  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．０６  −  ６．９６  （ｍ，  １Ｈ），  ５．１７  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４３  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１５  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３２Ｈ３３Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４８９．２６５４、実測値：４８９．２６５７。
３−（２−クロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｓ）の調製
【化１３１】
2021518856.tif 000131
【０３７４】
化合物７ａｓを、２−クロロフェニルボロン酸（１７．１ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２−クロロフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｓ、１６．６ｍｇ、収率８０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．７，  ４．０，  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４３  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ７．５，  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ７．５，  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．９１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２６Ｎ４Ｃｌ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４１７．１８４６、実測値：４１７．１８４９。
３−（２−メトキシフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物７ａｔ）の調製
【化１３２】
2021518856.tif 000132
【０３７５】
化合物７ａｔを、２−メトキシフェニルボロン酸（１１．４ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、３−（２−メトキシフェニル）−５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（７ａｔ、１７．１ｍｇ、収率８３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６１  −  ７．５４  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．３８  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  ７．４，  １．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．３，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．０８  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ７．４，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８６  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．４２  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．１１  （ｓ，  ４Ｈ），  ２．９２  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２９Ｎ４Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４１３．２３４１、実測値：４１３．２３３７。
１−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）−３−フェニル尿素（化合物７ａｕ）の調製
【化１３３】
2021518856.tif 000133
【０３７６】
化合物７ａｕを、（３−（３−フェニルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｅ、１９．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を使用して、上述のように、スズキカップリングおよびｉｎ  ｓｉｔｕ脱保護に関する一般的手順に従い調製した。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）−３−フェニル尿素（７ａｕ、５．４ｍｇ、収率２１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７８  −  ７．７１  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４６  −  ７．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４１  −  ７．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３６  −  ７．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２４  −  ７．１７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．１３  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８５  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３２Ｈ３３Ｎ６Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５１７．２７１６、実測値：５１７．２７１３。
２−フルオロ−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ベンズアミド（化合物７ａｖ）の調製
【化１３４】
2021518856.tif 000134
スキーム３：化合物７ａｖの合成。
【０３７７】
２−フルオロ−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）安息香酸（７ｉ、３．３ｍｇ、７．４μｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２．８ｍｇ、１４．８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）、およびＨＯＢＴ（２．０ｍｇ、１４．８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）を、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）に溶解した。フルフリルアミン（１．４ｍｇ、１．３μＬ、１４．８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）およびＥｔ３Ｎ（１．５ｍｇ、２．０μＬ、１４．８μｍｏｌ、２．０ｅｑ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製混合物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、２−フルオロ−Ｎ−（フラン−２−イルメチル）−５−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）ベンズアミド（７ａｖ、３．８ｍｇ、収率９８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．９，  ２．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．６，  ４．８，  ２．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．９，  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １０．７，  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．３７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．２，  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．３３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．２，  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８４  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９７  −  ２．８４  （ｍ，  ８Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３１Ｈ３１ＦＮ５Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５２４．２４６２、実測値：５２４．２４５２。
１−シクロヘキシル−３−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（化合物７ａｗ）の調製
【化１３５】
2021518856.tif 000135
スキーム４：化合物７ａｗの合成。
【０３７８】
４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７ｅ、１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１０ｍｇ、１４μＬ、０．１ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を添加した。溶液を、トリホスゲン（３．０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶かした溶液に滴加し、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、シクロヘキシルアミン（１９．８ｍｇ、２３μＬ、０．２ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）をＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶かした溶液に添加し、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製混合物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−シクロヘキシル−３−（４−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（７ａｗ、２．８ｍｇ、収率５４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６８  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６４  −  ７．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４９  −  ７．４４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．８２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．６５  −  ３．５４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．００  −  ２．７４  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．００  −  １．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８４  −  １．７１  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．４８  −  １．３４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３６  −  １．１６  （ｍ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３２Ｈ３９Ｎ６Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５２３．３１８５、実測値：５２３．３１８２。
（Ｒ）−１−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）−３−（１−フェニルエチル）尿素（化合物７ａｘ）の調製
【化１３６】
2021518856.tif 000136
スキーム５：化合物７ａｘの合成。
【０３７９】
３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７ｈ、１６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１６．２ｍｇ、２２μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を添加した。溶媒を、トリホスゲン（４．７５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶かした溶液に滴加し、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、（Ｒ）−（＋）−α−メチルベンジルアミン（３８．８ｍｇ、４１μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶かした溶液に添加し、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製混合物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、（Ｒ）−１−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）−３−（１−フェニルエチル）尿素（７ａｘ、６．７ｍｇ、収率３１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７８  −  ７．７２  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４２  −  ７．２８  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．２３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．１８  −  ７．１１  （ｍ，  １Ｈ），  ４．９５  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．１４  −  ２．５０  （ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８８  （ｓ，  ３Ｈ），  １．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３４Ｈ３７Ｎ６Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５４５．３０２９、実測値：５４５．３０２７。
１−（フラン−２−イルメチル）−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（化合物７ａｙ）の調製
【化１３７】
2021518856.tif 000137
スキーム６：化合物７ａｙの合成。
【０３８０】
３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７ｈ、１６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１６．２ｍｇ、２２μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を添加した。溶液を、トリホスゲン（４．７５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶かした溶液に滴加し、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、フルフリルアミン（３１．１ｍｇ、２８．３μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶かした溶液に添加し、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製混合物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−（フラン−２−イルメチル）−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（７ａｙ、８．６ｍｇ、収率４１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６９  −  ８．６６  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．８２  −  ７．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４１  −  ７．３４  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．３５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．２，  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．２８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．２，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．１１  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．８９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３１Ｈ３３Ｎ６Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５２１．２６６５、実測値：５２１．２６７０。
１−（２−メトキシエチル）−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（化合物７ａｚ）の調製
【化１３８】
2021518856.tif 000138
スキーム７：化合物７ａｚの合成。
【０３８１】
３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）アニリン（７ｈ、１６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１６．２ｍｇ、２２μＬ、０．１６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を添加した。溶液を、トリホスゲン（４．７５ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶かした溶液に滴加し、室温で５分間撹拌した。反応混合物を、２−メトキシエタン−１−アミン（２４．０ｍｇ、２７．８μＬ、０．３２ｍｍｏｌ、２０．０ｅｑ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶かした溶液に添加し、一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製混合物を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、１−（２−メトキシエチル）−３−（３−（５−（４−（（４−メチルピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）フェニル）尿素（７ａｚ、４．０ｍｇ、収率２０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６１  −  ７．５３  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．４５  −  ７．２５  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．５４  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４７  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．２７  −  ３．１２（ｂｓ，  ８Ｈ），  ２．８７  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２９Ｈ３５Ｎ６Ｏ２［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４９９．２８２１、実測値：４９９．２８２７。
（実施例３）
化合物９ａ〜９ｃの合成
【０３８２】
化合物９ａ〜９ｃを得るための一般的経路は、下記に示される合成に従う。各化合物の調製も提供する。
【化１３９】
2021518856.tif 000139
スキーム８：化合物９ａ〜９ｃに関する一般的合成スキーム。
【０３８３】
５−ブロモ−３−ヨード−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン１（８、１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、１，４−ジオキサン（２０ｍＬ）に溶解した。ボロン酸（２．３ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加し、その後、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（７０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、５ｍｏｌ％）を添加した。反応混合物を、アルゴン下で超音波処理することによって脱気した。水性Ｎａ２ＣＯ３を添加し、反応混合物を、完全に終了するまで（典型的には、８時間）４５℃で撹拌した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃとブラインとの間で分配し、層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃで抽出した（２×）。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗製材料を、シリカ上でのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中、０〜５０％ＥｔＯＡｃ）により精製して、所望の生成物（９ａ〜ｃ）を得た。
４−（５−ブロモ−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（化合物９ａ）の調製
【化１４０】
2021518856.tif 000140
【０３８４】
上述の一般的手順に従い、４−（５−ブロモ−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（９ａ）を、淡褐色の固体（４６１ｍｇ、収率４７％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  １０．２９  （ｂｓ，  １Ｈ），  ８．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１９  −  ８．１３  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．１３  −  ８．１０  （ｍ，  ２Ｈ），  ８．０５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ６．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３７  −  ７．３１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．９，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．４１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２１Ｈ１６Ｎ４Ｏ２ＳＢｒ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４６７．０１７７、実測値：４６７．０１７６。
５−ブロモ−３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物９ｂ）の調製
【化１４１】
2021518856.tif 000141
【０３８５】
上述の一般的手順に従い、５−ブロモ−３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９ｂ）を、無色の固体（６１７ｍｇ、収率６７％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ８．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．４４  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３６  −  ７．２８  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．２７  −  ７．２１  （ｍ，  １Ｈ），  ７．０８  （ｔｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ２．６，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２０Ｈ１５Ｎ２Ｏ２ＦＳＢｒ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４５．００２２、実測値：４４５．００２０。
５−ブロモ−３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物９ｃ）の調製
【化１４２】
2021518856.tif 000142
【０３８６】
上述の一般的手順に従い、５−ブロモ−３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（９ｃ）を、無色の固体（８５０ｍｇ、収率８８％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  ８．５０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８９  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５６  −  ７．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４６  −  ７．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４０  −  ７．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２０Ｈ１５Ｎ２Ｏ２ＳＢｒＣｌ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４６０．９７２６、実測値：４６０．９７１５。
（実施例４）
化合物１０ａ〜１０ｃの合成
【０３８７】
化合物１０ａ〜１０ｃを得るための一般的経路は、下記に示される合成に従う。各化合物の調製も提供される。
【化１４３】
2021518856.tif 000143
スキーム９：化合物１０ａ〜１０ｃに関する一般的合成スキーム。
【０３８８】
基質（９ａ〜ｃ、１．０ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、圧力管内で１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）に溶解し、４−ホルミルフェニルボロン酸（２２５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加した。反応混合物を、アルゴン下での超音波処理により脱気し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（１１６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１０ｍｏｌ％）を添加した。水性Ｎａ２ＣＯ３（１２．５ｍＬ、２．０Ｍ）を添加した後、反応混合物を１００℃で一晩撹拌した。粗製混合物を、ＥｔＯＡｃとブラインとの間で分配し、層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃで抽出した（３×）。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、セライト上で濾過した。溶媒を蒸発させ、粗製材料を、シリカ上でのカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中、０〜１００％ＥｔＯＡｃ）により精製して、所望の生成物（１０ａ〜ｃ）を得た。
４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（化合物１０ａ）の調製
【化１４４】
2021518856.tif 000144
【０３８９】
上述の一般的手順に従って、４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ａ）を淡褐色の固体（３５０ｍｇ、収率７１％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  １０．３７  （ｂｓ，  １Ｈ），  １０．０６  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２３  −  ８．１７  （ｍ，  ３Ｈ），  ８．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５９  −  ７．５１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４０  −  ７．３２  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．４１  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ２１Ｎ４Ｏ３Ｓ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４９３．１３３４、実測値：４９３．１３２９。
４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（化合物１０ｂ）の調製
【化１４５】
2021518856.tif 000145
【０３９０】
上述の一般的手順に従って、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ）を、無色の固体（４６６ｍｇ、収率９９％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  １０．０８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４７  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ７．９，  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４０  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３６  −  ７．２８  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．１０  （ｔｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４，  ２．６，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．４０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２０Ｎ２Ｏ３ＦＳ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４７１．１１７９、実測値：４７１．１１８５。
４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（化合物１０ｃ）の調製
【化１４６】
2021518856.tif 000146
【０３９１】
上述の一般的手順に従って、出発材料を２．０ｍｍｏｌまで増やし、４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｃ）を、無色の固体（７３０ｍｇ、収率８７％）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  クロロホルム−ｄ）  δ  １０．０８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．２４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５９  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５０  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．６，  １．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．９，  ２．０，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３６  −  ７．２９  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４０  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２０Ｎ２Ｏ３ＣｌＳ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４８７．０８８３、実測値：４８７．０８７８。
（実施例５）
化合物１２ａ〜１２ｌの合成
【０３９２】
化合物１２ａ〜１２ｌを得るための一般的経路は、以下に例示する合成に従う。各化合物の調製も提供される。
【化１４７】
2021518856.tif 000147
スキーム１０：化合物１２ａ〜１２ｌに関する一般的合成スキーム。
【０３９３】
二環式ピペラジンアナログ１２ｅおよび１２ｆの詳細な合成を、下記のスキームに例示する。
【化１４８】
2021518856.tif 000148
スキーム１１：化合物１２ｅおよび１２ｆの合成。
【０３９４】
アナログ１２ｇ〜１２ｌの合成およびマウス肝ミクロソームにおけるそれらの半減期を、以下のスキームに示す。
【化１４９】
2021518856.tif 000149
スキーム１２：（Ａ）アナログ１２ｇ〜１２ｌの合成；（Ｂ）アナログ１２ｇ〜１２ｌの構造およびマウス肝ミクロソームにおけるそれらの半減期。
【０３９５】
アルデヒド（１０ａ〜ｃ、または１１（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ＶＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３））（０．５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をジクロロメタンに溶解し、対応するアミン（１．０ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）およびＮａ（ＯＡｃ）３ＢＨ（１５９ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、ジクロロメタンとブラインとの間で分配した。水性層をジクロロメタンで抽出し（２×）、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗製生成物を、さらに精製することなく、脱保護ステップで使用した。
【０３９６】
中間体を、アセトン（２０ｍＬ）、メタノール（３０ｍＬ）、および水性ＮａＯＨ（２．０Ｍ、１５ｍＬ）の混合物に溶解し、６５℃で３時間撹拌した。反応混合物を、酢酸エチルと水性ＮａＯＨ（１．０Ｍ）との間で分配した。層を分離し、水性層を酢酸エチルで抽出した（２×）。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させた。粗製材料を、分取ＨＰＬＣ精製により精製して、生成物（１２ａ〜ｌ）を得た。
３−（４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）−８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（化合物１２ａ）の調製
【化１５０】
2021518856.tif 000150
【０３９７】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１１、１００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（４５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、３−（４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）−８−オキサ−３−アザビシクロ［３．２．１］オクタン（１２ａ）を、薄茶色の固体（３７．２ｍｇ、収率４３％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４６  −  ７．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．４９  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．１，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２０  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ４．７，  ２．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．４，  ２．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．００  −  １．９０  （ｍ，  ３Ｈ），  １．８６  −  １．７３  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３２Ｈ３３Ｎ６Ｏ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：５１７．２７１６、実測値：５１７．２７１３。
３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１２ｂ）の調製
【化１５１】
2021518856.tif 000151
【０３９８】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１１、６７．１ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）および８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン（１６ｂ、５５．５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ、３．２ｅｑ）を出発材料として、３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２ｂ）を、淡褐色の固体（２．６ｍｇ、収率４％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．６，  ０．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．５６  −  ７．３８  （ｍ，  ５Ｈ），  ７．２７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２３  （ｓ，  ４Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２９Ｈ３０Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４８．２５０１、実測値：４４８．２５０５。
３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１２ｃ）の調製
【化１５２】
2021518856.tif 000152
【０３９９】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１１、６０．２ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）および３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン（１６ａ、３６．６ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）を出発材料として、３−（１Ｈ−インドール−５−イル）−５−（４−（（３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２ｃ）を、淡褐色の固体（９．６ｍｇ、収率１８％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．７４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １．７，  ０．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８６  −  ７．７９  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．７４  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６８  −  ７．６４  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５４  −  ７．５０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４８  −  ７．４３  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．１２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８４  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．１０  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ２．６９  （ｓ，  ３Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２９Ｈ３０Ｎ５［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４８．２５０１、実測値：４４８．２５０３。
４−（５−（４−（（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（化合物１２ｄ）の調製
【化１５３】
2021518856.tif 000153
【０４００】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ａ、４９．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン（１６ｂ、３９．１ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、３．１ｅｑ）を出発材料として、４−（５−（４−（（８−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−３−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（１２ｄ）を、薄茶色の固体（１１．７ｍｇ、収率２６％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  −  ７．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．４３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．５，  １．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．９４  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １３．１，  ２．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．８０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．６７  −  ２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２７  −  ２．１９  （ｂｓ，  ４Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ２９Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４９．２４５４、実測値：４４９．２４６２。
４−（５−（４−（（３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（化合物１２ｅ）の調製
【化１５４】
2021518856.tif 000154
【０４０１】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（１Ｈ−インダゾール−４−イル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ａ、４９．２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン（１６ａ、３４．０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、２．７ｅｑ）を出発材料として、４−（５−（４−（（３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）−１Ｈ−インダゾール（１２ｅ）を、薄茶色の固体（１２．０ｍｇ、収率２７％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ０．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５４  −  ７．５１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ５．６，  ２．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．１８  （ｄ，  Ｊ  ＝  １１．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．６１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．４５  −  ２．３６  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ２９Ｎ６［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４９．２４５４、実測値：４４９．２４５５。
３−（３−クロロフェニル）−５−（４−（（３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１２ｆ）の調製
【化１５５】
2021518856.tif 000155
【０４０２】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｃ、４８．６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン（１６ａ、２５．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、３−（３−クロロフェニル）−５−（４−（（３−メチル−３，８−ジアザビシクロ［３．２．１］オクタン−８−イル）メチル）フェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２ｆ）を、薄黄色の固体（１８．０ｍｇ、収率４１％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８１  −  ７．７５  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．７０  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６８  −  ７．６１  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３０  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ２．１，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２５  −  ３．１６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．０４  −  ２．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．４２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．６，  ４．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２７Ｈ２８Ｎ４Ｃｌ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４３．２００２、実測値：４４３．２００５。
５−（４−（［１，４’−ビピペリジン］−１’−イルメチル）フェニル）−３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１２ｇ）の調製
【化１５６】
2021518856.tif 000156
【０４０３】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ、２６．０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）および４−ピペリジノピペリジン（１８．６ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、５−（４−（［１，４’−ビピペリジン］−１’−イルメチル）フェニル）−３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２ｇ）を、オフホワイトの固体（６．２ｍｇ、収率２４％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．６６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５７  −  ７．５３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５２  −  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０４  （ｔｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．２，  ２．６，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６３  −  ３．４７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．２３  −  ３．１２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．０３  （ｔ，  Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．２０  −  ２．０８  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．０４  −  １．９４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．８６  −  １．７３  （ｍ，  ２Ｈ），  １．６４  −  １．４６  （ｍ，  １Ｈ），  １．４２  −  １．２６  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ３０Ｈ３４Ｎ４Ｆ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４６９．２７６８、実測値：４６９．２７７１。
２−（４−（４−（３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−オール（化合物１２ｈ）の調製
【化１５７】
2021518856.tif 000157
【０４０４】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ、３１８ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ）および１−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン（１７６ｍｇ、１６６μＬ、１．３５ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、２−（４−（４−（３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−オール（１２ｈ）を、オフホワイトの固体（１５３．７ｍｇ、収率５３％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５５  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５１  −  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０５  （ｄｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．０，  ８．２，  ２．６，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９５  −  ３．８５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．５８  （ｂｓ，  ４Ｈ），  ３．３４  （ｂｓ，  ６Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２８Ｎ４ＯＦ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４３１．２２４７、実測値：４３１．２２５０。
（Ｒ）−１−（４−（３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−オール（化合物１２ｉ）の調製
【化１５８】
2021518856.tif 000158
【０４０５】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ、３１８ｍｇ、０．６７５ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−３−ピロリジノール（１１８ｍｇ、１０９μＬ、１．３５ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、（Ｒ）−１−（４−（３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−オール（１２ｉ）を、オフホワイトの固体（１１３ｍｇ、収率４３％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８４  −  ７．７７  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６８  −  ７．６１  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５２  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５０  −  ７．３８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０２  （ｄｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．０，  ８．２，  ２．６，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６６  −  ４．３４  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．８２  −  ３．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４１  −  ３．２０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４９  −  １．９２  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２４Ｈ２３Ｎ３ＯＦ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：３８８．１８２５、実測値：３８８．１８２４。
５−（４−（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（化合物１２ｊ）の調製
【化１５９】
2021518856.tif 000159
【０４０６】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−フルオロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｂ、３２．８ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）および１−ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン（１５．７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、５−（４−（（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェニル）−３−（３−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン（１２ｊ）を、オフホワイトの固体（９．８ｍｇ、収率４０％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．６３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．６０  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８３  −  ７．７８  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．６５  −  ７．６０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５６  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．８，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５２  −  ７．４２  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０５  （ｄｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．０，  ８．２，  ２．６，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．８９  −  ３．０４  （ｍ，  ８Ｈ），  １．４４  （ｓ，  ９Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２８Ｈ３２Ｎ４Ｆ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４３．２６１１、実測値：４４３．２６１０。
２−（４−（４−（３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−オール（化合物１２ｋ）の調製
【化１６０】
2021518856.tif 000160
【０４０７】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｃ、４１８ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）および１−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン（２２４ｍｇ、２１１μＬ、１．７２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、２−（４−（４−（３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピペラジン−１−イル）エタン−１−オール（１２ｋ）を、オフホワイトの固体（１３９．９ｍｇ、収率３６％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８０  （ｓ，  １Ｈ），  ７．７６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．６５  （ｔ，  Ｊ  ＝  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６４  −  ７．５７  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．４２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２９  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ２．１，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．９３  −  ３．８６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６２  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．４１  （ｓ，  ４Ｈ），  ３．３５  −  ３．３１  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２６Ｈ２８Ｎ４ＯＣｌ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４４７．１９５２、実測値：４４７．１９５４。
（Ｒ）−１−（４−（３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−オール（化合物１２ｌ）の調製
【化１６１】
2021518856.tif 000161
【０４０８】
上述の一般的手順に従い、４−（３−（３−クロロフェニル）−１−トシル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンズアルデヒド（１０ｃ、１７７ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−３−ピロリジノール（１５０ｍｇ、１３９μＬ、１．７２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ）を出発材料として、（Ｒ）−１−（４−（３−（３−クロロフェニル）−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−イル）ベンジル）ピロリジン−３−オール（１２ｌ）を、オフホワイトの固体（１７７ｍｇ、収率５１％、２ステップにわたり）として単離した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ８．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．７８  −  ７．７１  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．６４  −  ７．６０  （ｍ，  ３Ｈ），  ７．５８  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １．７，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ２．２，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５８  （ｓ，  １Ｈ），  ４．５４  −  ４．３２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．８２  −  ３．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．５０  −  １．９６  （ｍ，  ２Ｈ）  ｐｐｍ．ＨＲＭＳ（ＡＰＣＩ＋、ｍ／ｚ）：Ｃ２４Ｈ２３Ｎ３ＯＣｌ［Ｍ＋Ｈ＋］に関する計算値：４０４．１５３０、実測値：４０４．１５２９。
（実施例６）
ボロン酸１３ａ〜１３ｅの合成
【０４０９】
化合物１３ａ〜１３ｅを得るための一般的な経路は、以下に例示される合成に従う。各化合物の調製も提供される。
【化１６２】
2021518856.tif 000162
スキーム１３：化合物１３ａ〜１３ｅに関する一般的な合成スキーム。
【０４１０】
ボロン酸（３−アミノフェニルボロン酸または４−アミノフェニルボロン酸、８７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）をＤＣＭ（４ｍＬ）中に懸濁し、トリエチルアミン（２０２ｍｇ、２７７μＬ、２．０ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を添加した。得られた溶液を、トリホスゲン（５９ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶かした溶液に滴加し、室温で５分間撹拌した。アミン（０．６ｍｍｏｌ、３ｅｑ）またはアルコール（過剰）を滴加し、混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、トルエンを添加し、溶媒を再び蒸発させた。粗製材料をＮＭＲにより分析し、さらに精製することなく次のステップで使用した。
（３−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（化合物１３ａ）の調製
【化１６３】
2021518856.tif 000163
【０４１１】
上述の一般的手順に従い、３−アミノフェニルボロン酸およびメチルアミンにより、（３−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ａ）を、オフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．４９  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７７  （ｓ，  ３Ｈ）．
（３−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（化合物１３ｂ）の調製
【化１６４】
2021518856.tif 000164
【０４１２】
上述の一般的手順に従い、３−アミノフェニルボロン酸およびメタノールにより、（３−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｂ）を、オフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．５９  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．４８  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．２６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７３  （ｓ，  ３Ｈ）．
（４−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（化合物１３ｃ）の調製
【化１６５】
2021518856.tif 000165
【０４１３】
上述の一般的手順に従い、４−アミノフェニルボロン酸およびメチルアミンにより、（４−（３−メチルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｃ）を、オフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．６２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７７  （ｓ，  ３Ｈ）．
（４−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（化合物１３ｄ）の調製
【化１６６】
2021518856.tif 000166
【０４１４】
上述の一般的手順に従い、４−アミノフェニルボロン酸およびメタノールにより、（４−（（メトキシカルボニル）アミノ）フェニル）ボロン酸（１３ｄ）を、オフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｓ，  ３Ｈ）．
（３−（３−フェニルウレイド）フェニル）ボロン酸（化合物１３ｅ）の調製
【化１６７】
2021518856.tif 000167
【０４１５】
上述の一般的手順に従い、３−アミノフェニルボロン酸およびアニリンにより、（３−（３−フェニルウレイド）フェニル）ボロン酸（１３ｅ）を、オフホワイトの固体として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  メタノール−ｄ４）  δ  ７．６２  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３４  −  ７．２３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．０８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．５，  ７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．７１  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．７，  １．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．６７  （ｔｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  １．１  Ｈｚ，  １Ｈ）．
（実施例７）
二環式ピペラジン１６ａおよび１６ｂの合成
【０４１６】
化合物１６ａおよび１６ｂを得るための一般的な経路は、以下に例示される合成に従う。各化合物の調製も提供される。
【化１６８】
2021518856.tif 000168
スキーム１４：化合物１６ａおよび１６ｂに関する一般的な合成スキーム。
【０４１７】
Ｂｏｃ保護化二環式ピペラジン（１４ａ〜ｂ；２５０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ）を、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１）の混合物に溶解した。ホルムアルデヒド（Ｈ２Ｏ中３７％、２８７μＬ、３．５３ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ）を添加し、その後、Ｎａ（ＯＡｃ）３ＢＨ（２７４．５ｍｇ、１．３０ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加し、反応混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製生成物を、シリカ上のカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中、０〜２０％ＭｅＯＨ）により精製した。生成物を、ＫＭｎＯ４染色を使用してＴＬＣプレート上に視覚化した。
【０４１８】
Ｂｏｃ基を除去するために、生成物（１５ａ〜ｂ）をＤＣＭに溶解し、過剰なＴＦＡを添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、トルエンを添加し、溶媒を再び蒸発させた。粗製生成物（１６ａ〜ｂ）を、さらに精製することなく次のステップで使用し、分光データを、文献（Ｐａｌｉｕｌｉｓ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）に報告されるデータと一致させた。
（実施例８）
ＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）は化合物１およびそのアナログの顕著な生物学的に関連ある標的である
【０４１９】
上記の合成されたアナログにより、個々の生存率アッセイを、このアッセイの実時間フィードバックおよび最適化を可能にすると考えられる、ＣＰＡで処置された（３３μＭ）ヒト胚性幹細胞誘導性運動ニューロン（ＨＢ９：：ＧＦＰレポーター、およびＳＯＤ１  Ａ４Ｖ突然変異）で行った。次に、生存率アッセイを、低変動性のデータ集合を生成させるため、一度に全てのアナログで行った。全ての化合物を、３回の技術的反復および２回の生物学的反復で、０．１〜３．０μＭに及ぶ濃度（５点希釈）で評価した。
【０４２０】
ＨＧＫリン酸化を阻害するアナログの能力を評価するため、アナログを、１０μＭのＡＴＰの存在下、０．０２５μＭまたは０．１μＭの用量で、Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．からのハイスループット放射標識ＡＴＰアッセイに供した。対照としてスタウロスポリンを、２０μＭで開始する１０用量ＩＣ５０４倍系列希釈で試験した。このように、アナログがＨＧＫに結合するか否かだけでなくそのキナーゼ活性を妨げるか否かも試験することができた。試験されたアナログの約４５％は、０．０２５μＭの用量でＨＧＫ活性の少なくとも半分を阻害することが見出され、それによってコンピューターによるアナログ設計が検証された。ＭＬＫ１およびＭＬＫ３のリン酸化を阻害するアナログの能力も、１０μＭ  ＡＴＰの存在下、０．１μＭの用量で評価した。ＭＬＫ１およびＭＬＫ３の阻害の全体はより低いが、試験をしたアナログの約４０％は依然として、０．１μＭの用量でＭＬＫ３活性の少なくとも半分を阻害した。
【０４２１】
次に本発明者らは、各アナログが酵素活性を抑制する程度と、ＣＰＡ毒性をレスキューする程度との間の相関を評価した。全体として適度な相関が、ＣＰＡ処置後の運動ニューロン生存率％と、ＭＬＫ１活性％（Ｒ２＝０．４０）またはＭＬＫ３活性％（Ｒ２＝０．５２）との間で観察され（図７Ａ参照）、ＭＬＫ１およびＭＬＫ３は、ＥＲストレスおよびＣＰＡ誘発性細胞死経路の文脈において、化合物１およびそのアナログ（７ａ〜７ａｚ）の生物学的に関連ある標的ではないことを示唆している。
【０４２２】
非常に強力な相関が、ＣＰＡ処置後の運動ニューロン生存率％とＨＧＫ活性％（Ｒ２＝０．８４）との間で観察され（図７Ｂ参照）、ＨＧＫまたは緊密に関連するＭＡＰ４Ｋキナーゼファミリーのメンバーは、ＣＰＡ誘発性ＥＲストレスおよび運動ニューロン変性の文脈において、化合物１およびそのアナログ（７ａ〜７ａｚ）の生物学的に関連ある標的となり得ることを示唆している。
【０４２３】
ＣＲＩＳＰＲ戦略を開発して、マウスＥＳ細胞におけるＨＧＫ発現を完全にアブレーションした（図１０Ａ）。使用されるＥＳ系は導入遺伝子を含有し、細胞表面マーカーＣＤ１４が、運動ニューロン特異的ＨＢ９プロモーターの制御下で発現し、したがって、運動ニューロンは、下流アッセイの磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により混合分化培養物から精製できる。ＣＲＩＳＰＲ戦略では、そのキナーゼ活性を媒介するＨＧＫのＡＴＰ結合部分の上流および下流のゲノム領域を標的とする２つのガイドＲＮＡを用いる。二本鎖切断修復は、このシナリオでは非相同末端結合により実現され、一般に、フレームシフトおよび発現の完全なアブレーションをもたらす。ＨＧＫアブレーションは、ウェスタンブロット法により、分化した運動ニューロンで確認した（図１０Ｂ）。
【０４２４】
ＣＲＩＳＰＲ媒介型ＨＧＫアブレーションは、ＣＰＡの用量を増大させる本発明者らの典型的な４８時間用量応答アッセイでは、神経保護をもたらさなかった（図１０Ｃ）。このアッセイでは、運動ニューロンは、ＭＡＣＳ精製されかつＣＰＡで４８時間処置された後に、撮像される。
【０４２５】
ＭＡＣＳ精製済みＷＴまたはＨＧＫノックアウト運動ニューロンが、ごく短い期間にわたり（１〜２４時間）ＣＰＡで処置されるように、本発明者らのＣＰＡ処置パラダイムをモジュレートすることによって、本発明者らは、ＨＧＫアブレーションがＣＰＡに対して適度なしかし高度に統計的に有意な神経保護をもたらすのを、観察することができた（図１０Ｄ）。したがってＨＧＫは、ＣＰＡ処置後の細胞死カスケードにおいて初期の役割を演じ；しかしながらそのアブレーションの影響が後の時点では検出できないという事実は、最終的にその非存在下で役割を引き継ぐその他の冗長なキナーゼが存在し得ることを示唆する。本発明者らは、ＴＮＩＫおよびＭＩＮＫ１などのその他の構造的に相同なＭＡＰ４Ｋキナーゼが、ＨＧＫと重複して作用して、ＥＲストレスの文脈で神経変性を媒介する可能性があり、化合物１およびそのアナログは、これらの関連あるＭＡＰ４Ｋの全てを標的としてニューロン生存を促進させ得ることを提示する（図３１Ａ）。
【０４２６】
化合物１およびそのアナログの生物学的に関連ある標的をより良く理解するために、無細胞キナーゼアッセイの第２のラウンドを行った。この拡張されたアッセイでは、本発明者らは、ＣＰＡアッセイにおいて中程度から非常に強力に保護的であるものに及ぶ１０種のアナログを選択した。これらのアナログは、それらが０．１μＭおよび０．５μＭで選択された６０種のキナーゼを阻害する能力に関して評価した。この６０種のキナーゼのリストは、化合物１の公知の標的（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３）、レスキューを示したその他のキナーゼ阻害剤の公知の標的、および文献からの関連ある標的、ＣＰＡ生存率アッセイで保護的であったその他のキナーゼ阻害剤の公知の標的、および文献からの関連ある標的から誘導された。ＲＮＡｓｅｑデータを使用して、ＥＳ  ＭＮにおける各キナーゼの発現を確認した（実施例１２参照）。
【０４２７】
化合物１に対するアナログの中で、増大した標的選択性に向かう包括的な傾向はなく、アナログ生成そのもののプロセスは選択性を改善せず、かつ選択性も乱雑さもＣＰＡ生存率アッセイでの神経保護により追跡されないことが示された。しかしながら、化合物７ａｄは同様に、化合物（１）に対して神経保護的であり、それと共に、試験された６０種のキナーゼの中で高い標的選択性を示しており：０．５μＭで、化合物１は、６０種のキナーゼの中で２７種（＜２０％残留活性）を強力に阻害し、一方、化合物７ａｄは、６０種のキナーゼの中で１２種を強力に阻害した（図８）。
【０４２８】
相対的な選択的神経保護アナログの標的を、化合物１の場合と比較することにより、標的は、ＣＰＡ生存率アッセイにおいて神経変性を軽減する可能性が最も高いことが強調される。ＨＧＫに加え、選択的化合物７ａｄは、ＴＮＩＫ、ＭＩＮＫ１、ＫＨＳ（ＭＡＰ４Ｋ５）、およびＧＣＫ（ＭＡＰ４Ｋ２）を含む密接に関連したＭＡＰ４キナーゼを最も強力に阻害する（図８）。これらの知見は、本発明者らの予備スクリーンからのヒット化合物の共有標的の本発明者らの分析（図３）とも矛盾がなく、ＨＧＫ、ＭＩＮＫ、ＫＨＳ、およびＧＣＫは、最も高度にランク付けされた標的の中にあった（ＴＮＩＫ活性は、既存の公的に利用可能なデータベース；Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１で評価されなかった）。
【０４２９】
全体として本発明者らは、０．５μＭおよび０．１μＭで、ＭＡＰ４Ｋ阻害と神経保護との間で化合物１およびそのアナログに関する適度な相関を観察したが（図３２）、意味のある相関は、適度に神経保護的な化合物であってもこれらの濃度で依然としてＭＡＰ４Ｋをロバストに阻害するという事実によって不明瞭になる可能性が高かった。さらに、ＭＡＰ４Ｋファミリーメンバーのキナーゼドメイン間の高度な構造的相同性は、個々のＭＡＰ４Ｋの阻害がＣＰＡアッセイにおける生存に機能的に関連があるのかまたは単に偶発的であるのかを解析するのを難しくする。
【０４３０】
したがって、個々のＭＡＰ４Ｋに対して、他のＭＡＰ４に対するよりも選択的な化合物は僅かしか存在しない；しかしながら本発明者らは、ＧＣＫ選択的阻害剤（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５中の化合物１７およびＮＧ−２５；図９）が、ＣＰＡ生存率アッセイでＭＮをレスキューできなかったため、化合物１アナログの可能性ある機能性標的は、ＨＧＫ、ＭＩＮＫ１、ＴＮＩＫ、もしくはＫＨＳ、またはこれらのいくつかの組合せに限定されることを見出した（図３３）。
【０４３１】
さらに、Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ  （２０１７）からの最近の研究は、ＨＧＫ、ＴＮＩＫ、およびＭＩＮＫ１を阻害する化合物が、神経栄養因子除去に供される原発性後根神経節ニューロンにおいて神経保護的であり、３種全てのキナーゼの発現を、個々にではなくまとめて減衰させることは、化合物の効果を反映することを示している（図３１Ｃ）。これらは、その神経変性アッセイにおけるＨＧＫ、ＴＮＩＫ、およびＭＩＮＫ１の役割が冗長であり、単一キナーゼを疎外する効果は、残りのキナーゼの活性により克服できることを論じている。したがって、多数のＭＡＰ４キナーゼを組み合わせた阻害は、ＣＰＡで処置されたＥＳ  ＭＮにおける化合物１およびそのアナログの神経保護作用の基礎をなすことが可能である（図３１Ｂ）。
（実施例９）
アナログの代謝安定性
【０４３２】
アナログの代謝安定性を試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソーム安定性アッセイを実施した。このアッセイにおいて、ＥＲストレスアッセイで優れたレスキュー特性を示したアナログを、ＮＡＤＰＨ再生系を含有する緩衝液中でマウス肝ミクロソームと共にインキュベートした。アリコートを、２時間にわたって採取し、内部標準を使用するＨＰＬＣ−ＭＳにより分析して、経時的な化合物安定性を評価した（図２９）。
方法および材料
【０４３３】
ミクロソーム安定性アッセイを、９６ウェルフォーマット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＳｔｏｒＰｌａｔｅ−９６Ｕ、ＰＰ、９６ウェル、丸底）で行った。各ウェルに、リン酸緩衝液（１８２．２μＬ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ）を添加し、その後、ＮＡＤＰＨ再生系溶液Ａ（１０μＬ）およびＮＡＤＰＨ再生系溶液Ｂ（２μＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｅｎｔｅｓｔ  ３Ｐ  ＮＡＤＰＨ再生系溶液Ａ（＃４５１２２０）およびＢ（＃４５１２００））を添加した。分析がなされる化合物のストック溶液（０．８μＬ、５ｍＭ）またはエトキシクマリン（陽性対照、０．８μＬ、５ｍＭ）を添加し、混合物を、５分間にわたり３７℃に温めた。マウスミクロソーム（ＣＤ−１、５μＬ、使用前に３７℃の水浴で解凍、２０ｍｇ／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。選択された時点（０、１５、３０、４５、６０、および１２０分）で、アリコート（１５μＬ）をプレートから引き出し、９６ウェルプレート内で内部標準（５μＭ）を含有する冷アセトニトリル（６０μＬ）に添加してクエンチした。試料を１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上澄み（４０μＬ）を引き出し、挿入物が入っている試料バイアルに移した。試料をＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０４３４】
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００と、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｈｙｓｔａｒ３．２により制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたＢｒｕｋｅｒ  ａｍａＺｏｎ  ＳＬとを含む、プラットフォームで行った。クロマトグラフィー分離は、試料５μＬを、２０℃で維持されたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）に注入することによって行った。流量は、４００μＬ／分で維持した。初期流動条件は、６０％溶媒Ａ（０．１％酢酸を含有する水）および４０％溶媒Ｂ（０．１％酢酸を含有するメタノール）であった。溶媒Ｂは、０．２５分で６０％まで上昇し、６．７５分までに７０％まで上昇した。溶媒Ｂは、７．００分までに９５％まで上昇し、８．００分までに元の初期条件（４０％）まで低下し、その全実行時間は９．００分であった。
結果
【０４３５】
最初に、選択された１１種のアナログを、それらのマウス肝ミクロソームでの安定性に関して分析した（図１１）。ミクロソーム内での半減期が３０分未満である化合物は、その高いクリアランス率に起因して、一般に、理想的な薬物候補ではない。先に公開された研究に従い、本発明者らは、化合物１がマウス肝ミクロソーム内で比較的短い半減期（Ｔ１／２＝１５分）を有することを見出した。最初に評価された１１種のアナログの中から、３種のアナログ（７ｙ、７ａｄ、および７ａｔ）のみが、マウス肝ミクロソームにおいて有望な半減期（＞３０分）を示した。
【０４３６】
次に、化合物修飾を実施して、半減期を改善した。コンピューターによるドッキング実験は、メチルピペラジン部分が溶媒に曝露されることを示した。したがって本発明者らは、それらの代謝安定性を増大させると同時にＥＲストレスアッセイでのそれらの効力を維持する（または改善する）目的で、アナログのピペラジン基を修飾した。
【０４３７】
最も強力なアナログの１つへの二環式メチルピペラジンの導入（スキーム１１参照）は、半減期を９分（化合物７ａａ）から１３分（化合物１２ｅ）まで延ばした。本発明者らのアナログのミクロソーム安定性をさらに高めるために、同じ二環式ピペラジンを、＞３０分の半減期を有する初期系列からアナログの１つに導入した（スキーム１１、化合物１２ｆ）。この場合、半減期は、３８分（化合物７ａｄ）から１５８分（化合物１２ｆ）まで延び、有意な改善であった。化合物１２ｆは、ＥＲストレスアッセイにおいてより強力であり、０．３μＭで完全なレスキューを示したが、＞０．５μＭの濃度で僅かに高い毒性も示した。効力およびミクロソーム安定性を維持しながら、この毒性の増大を低減させるため、本発明者らは、７−アザインドールの足場の３位にｍ−クロロフェニルまたはｍ−フルオロフェニル置換基を含有する、別の系列のアナログ（スキーム１２）を合成した。
【０４３８】
これらの化合物の効力を、ＥＲストレスアッセイで評価し、それらの安定性をミクロソーム安定性アッセイで評価した。これらの化合物の２種、１２ｇおよび１２ｊは、望まれるよりも短い半減期を有していたか、またはＥＲストレスアッセイで効力の減少を示した。残りの４種の化合物（１２ｈ、１２ｉ、１２ｋ、および１２ｌ）は、ＣＰＡで誘発されたＥＲストレスから運動ニューロンを強力にレスキューし、＜０．３μＭの濃度でＣＰＡ処置の影響を完全に無効にすることができた。これらの非常に強力なアナログの中で、１２ｈおよび１２ｋは、それらのマウス肝ミクロソーム内での改善された安定性により、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ研究に関する最も有望な候補であった（図１１；図１３Ａ）。
（実施例１０）
化合物の薬物動態評価
化合物１およびそのアナログの溶解度の改善
【０４３９】
先の刊行物は、５５％の生理食塩液、４０％のＰＥＧ−４００、および５％のＤＭＳＯから構成された化合物１のｉｎ  ｖｉｖｏ送達用の基本的な製剤について記述した。意外にも本発明者らは、この製剤において、化合物１が細胞培養培地に高度に不溶性であることを観察し、製剤はｉｎ  ｖｉｖｏ実験に適していないことが示された。ビヒクル製剤を最適化するために、本発明者らは、ｐＨと、様々な濃度での可溶化剤との、化合物１およびそのアナログに対する影響を、迅速にスクリーニングすることを可能にし得る９６ウェルフォーマット分光光度アッセイを開発した（図３０）。
【０４４０】
種々のビヒクル製剤に希釈された化合物を、本発明者らのｉｎ  ｖｉｖｏ投薬スキームと矛盾のない比で、透明な細胞培養培地に添加した。次いでプレートを、化合物が光を吸収しない波長の５４０ｎＭで、分光光度計で読み取って、光学密度を測定し、光を妨害する沈殿物が形成されるか否かを決定した。本発明者らは、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、十分に特徴付けられた安全性プロファイルを持つ環状糖オリゴマーを添加することが、化合物１およびそのアナログを完全に可溶化するのに十分であることを見出した（図１２）。
動物の処置
【０４４１】
全ての研究は、コロンビア大学医療センター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）施設に、１２時間の明／暗サイクルで、食物および水を随意摂取できる状態で収容した、６週齢のオスＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスで行った。全ての動物の手順は、コロンビア大学（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ＩＡＣＵＣにより承認されたものである。化合物１およびそのアナログを、２０％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（１１％の最終濃度）を含有する５０％のｄｄＨ２Ｏ＋４０％のＰＥＧ−４００＋５％のＤＭＳＯで構成されたビヒクルで製剤化した。動物を計量し、指示された用量（１０または２０ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内（ＩＰ）に１回注射した。３０分後、動物に、２．５％のアベルチンで深く麻酔をかけた。全血を、心臓穿刺により、０．５Ｍ  ＥＤＴＡが抗凝固剤として入っている試験管に収集し、８４５ｒｃｆで１０分間、４°で遠心分離して、血漿を単離した。心臓穿刺後、動物の頭部を除去して、脳を切除し、計量した。脳試料を、ガラスダウンス型ホモジナイザーで、５体積のｄｄＨ２Ｏ中に均質化した。脳および血漿試料を、液体窒素中でスナップ冷凍し、さらに処理する前に−８０℃で保存した。
血漿中の化合物濃度
【０４４２】
血漿試料をエッペンドルフ管に移し（試料当たり５０μＬ）、アセトニトリル（２００μＬ）で希釈した。試料を１分間超音波処理し、その後、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを、別のエッペンドルフ管に移し、溶媒を一晩蒸発させた。試料を、４０μＬのアセトニトリルおよび１０μＬの水の混合物に入れて復元し、挿入物が入っている試料バイアルに移し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
脳内での化合物濃度
【０４４３】
均質化された脳試料（２５０μＬ）をエッペンドルフ管に移し、アセトニトリル（７５０μＬ）で希釈した。試料を１分間、超音波処理し、その後、１６，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄み（９００μＬ）を別のエッペンドルフ管に移し、溶媒を一晩蒸発させた。試料を、８０μＬのアセトニトリルおよび２０μＬの水の混合物に入れて復元し、挿入物が入った試料バイアルに移し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
ＬＣ−ＭＳ分析
【０４４４】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００と、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｈｙｓｔａｒ３．２により制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたＢｒｕｋｅｒ  ａｍａＺｏｎ  ＳＬとを含む、プラットフォームで行った。各血漿試料中の化合物濃度を、較正曲線を使用して決定した。クロマトグラフィー分離を、２０℃に維持されたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）に１０μＬの試料を注入することによって行った。流量は、４００μＬ／分で維持した。初期流動条件は、６０％溶媒Ａ（０．１％酢酸を含有する水）および４０％溶媒Ｂ（０．１％酢酸を含有するメタノール）であった。溶媒Ｂを、０．２５分かけて６０％まで上昇させ、６．７５分までに７０％にした。溶媒Ｂを、７．００分までに９５％に上昇させ、８．００分までに元の初期状態（４０％）まで低下させ、その全実行時間は９．００分であった。
結果
【０４４５】
脳および血漿内の、種々の投薬量における、選択された化合物（１２ｈ、１２ｉ、１２ｋ、１２ｌ）の薬物動態結果を、以下の表にまとめる。化合物１と化合物１２ｋとの間の比較をさらに示し、少なくとも図１３Ｂ、図３４Ａ〜３４Ｂ、図３５Ａ〜３５Ｃ、図３６、図３７Ａ〜３７Ｂ、および実施例１３で論じる。
【表１】
2021518856.tif 000169
【表２】
2021518856.tif 000170
（実施例１１）
化合物のバイオアベイラビリティーおよび最良の送達経路
【０４４６】
本発明者らは、ホスホ−ｃｊｕｎ発現が、ＣＰＡ処置によって強力に上方制御されかつ化合物１によって強力に減衰され、および化合物１のキナーゼ標的（複数可）の下流エフェクターとなり得ることを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察した（図４Ａおよび図４Ｂ）。したがって本発明者らは、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ研究用の標的会合のマーカーとしてホスホ−ｃｊｕｎを選択した。ｃ−ｊｕｎは、ネズミ中枢神経系全体にわたって、特に嗅球において高度に発現する。８週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）を、強制経口投与、腹腔内注射、または皮下注射により送達された１０ｍｇ／ｋｇの化合物１、１２ｈ、または１２ｋで処置した（図１４）。次いで動物を、１時間後に屠殺にし、それらの嗅球を部分的に切除し、さらなるウェスタンブロット分析用に溶解した。試料を、リン酸化ｃ−ｊｕｎに特異的な抗体でプローブ処理し（セリン６３で；細胞シグナル伝達）、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化した。ほぼ全ての薬物処置済み試料が、未処置の対照と比較してｃｊｕｎリン酸化の低減を示し、これは薬物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそうであるようにｉｎ  ｖｉｖｏで同じ標的に会合することを示す。さらに、強制経口投与により処置された動物からの試料におけるｃｊｕｎリン酸化の低減は、１２ｈおよび１２ｋが共に経口的にバイオアベイラブルであることを示す。
（実施例１２）
感受性２色運動ニューロンスクリーニングは、ＡＬＳ関連ストレッサーおよび神経保護剤を明らかにする
【０４４７】
筋萎縮性側索硬化症は、運動皮質、脳幹、および脊髄のニューロンを標的とする神経変性疾患である。ＡＬＳを引き起こす突然変異は、何ダースもの多様な遺伝子で発見されているが、それでも分化運動ニューロン感受性の理由は、十分理解されていないままである。本発明者らは、ＡＬＳ運動ニューロン変性に関与する細胞自律的メカニズムを研究するために、感受性２色培養系を開発した。生物活性化合物のライブラリーのスクリーニングは、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）、小胞体で発現したカルシウムポンプ（ＳＥＲＣＡ）の阻害剤を、ＡＬＳを引き起こすＧ９３Ａ突然変異を持つヒトＳＯＤ１を発現する運動ニューロンが高度な感受性を持つストレッサーとして特定した。重要なことは、運動ニューロンが、脊髄介在ニューロンよりも、ＣＰＡと、小胞体（ＥＲ）ストレスの誘発および非フォールディングタンパク質応答経路とに対して、著しく感受性を持つことである。２次スクリーニングは、３種のキナーゼ阻害剤およびタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ＦＤＡ承認済み胆汁酸誘導体を含む、ＣＰＡ誘発性変性から運動ニューロンをレスキューする化合物を同定した。ＴＵＤＣＡによる、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａを発現するマウスの処置は、早期の筋除神経を改善した。同定された化合物の神経保護作用は、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ１７突然変異を持つ同質遺伝子胚性幹細胞系から分化したヒト運動ニューロンを使用して検証された。全体として本発明者らの結果は、神経変性疾患の処置における新薬標的を同定するための価値あるツールとして働くことができる、開発されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物発見プラットフォームのトランスレーショナルポテンシャルを強調する。
【０４４８】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、運動皮質内のニューロンならびに脳幹および脊髄内の運動ニューロンを優先的に標的とする後期発症型神経変性疾患である。家族性ＡＬＳを引き起こす、＞４０の突然変異の発見にも関わらず（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）、運動ニューロン変性をもたらす病原性プロセスと、広く発現した突然変異体タンパク質に対する分化ニューロンサブタイプ感受性に関する理由は、十分理解されないままである。
【０４４９】
ＡＬＳの有効なモデリングは、患者および動物モデルの運動ニューロンの限られたアクセス性によって、ならびにＡＬＳが後期発症型であり比較的ゆっくり進行する疾患であるという事実によって、妨げられる。疾患を引き起こす突然変異を持つ脊髄運動ニューロンの大規模生産を容易にする、幹細胞技術の開発は、最初の課題を回避し、関連ある細胞の文脈において生化学分析および薬物スクリーニングを可能にした（Ａｍｏｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｄｉｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｈｏｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）。しかしながら、幹細胞由来の運動ニューロンは、転写的および電気生理学的に未成熟であり、胚性または生後初期の運動ニューロンに最も密接に似ている（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｍｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）。最も重要なことは、ＡＬＳを引き起こす突然変異を持つ幹細胞由来の運動ニューロンが、突然変異体タンパク質の凝集など、運動ニューロン疾患の重要な特徴を示さないことである（Ｂｏｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）。
【０４５０】
それらの比較的未成熟な状態にも関わらず、いくつかの研究は、培養されたヒトおよびマウス肝細胞に由来するＡＬＳ運動ニューロンの、生存率、生理学、および生化学における相違を報告した（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ａｌａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５；Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｎａｕｊｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６；Ｓａｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｓｉｖａｄａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６；Ｗａｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）。これらの表現型は、培養細胞において病理過程の時期尚早のまたは異常な症状を引き起こす、ストレスフルなｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境から得られる可能性があるが、それでもこれらの培養関連のストレッサーの性質は、明確に定義されないままである。どの特異的ストレッサーが疾患関連運動ニューロンの病理を増強させるのかを理解することにより、ＡＬＳのより忠実なモデル、即ち疾患の発症および進行を理解するためのならびに神経保護薬のスクリーニングのためのより良好なツールの開発が可能になると考えられる。
【０４５１】
ここで本発明者らは、高度に感受性である運動ニューロン生存率アッセイを開発し、それを使用して、トランスジェニックマウスでＡＬＳ様運動ニューロン変性を引き起こす、Ｇ９３Ａ突然変異を持つヒトＳＯＤ１導入遺伝子（ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）の過発現に対して運動ニューロンを感作させるストレッサーに関する生物活性化合物のライブラリーをスクリーニングした（Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４）。スクリーニングは、小胞体で発現するカルシウムポンプの阻害剤（ＳＥＲＣＡ）（Ｇｏｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８）であるシクロピアゾン酸（ＣＰＡ）、を、ＡＬＳ運動ニューロンが高度に感受性である化合物であると同定した。本発明者らは、ＣＰＡが、小胞体（ＥＲ）ストレスおよび非フォールディングタンパク質応答経路を培養運動ニューロンにおいて急速に誘発することを実証する。ミスフォールディングタンパク質の蓄積は、多くの神経変性疾患の特徴であり、ＡＬＳの動物および幹細胞ベースのモデルにおける（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｈｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）、ならびにＡＬＳ患者からの事後分析脊髄試料における（Ｈｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ａｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；Ａｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）、ＥＲストレスの活性化との関連で記述されてきた。
【０４５２】
この加速された運動ニューロン変性パラダイムを利用して、本発明者らは第２のスクリーニングを行って、ＣＰＡ毒性に対して脊髄運動ニューロンを保護する化合物を同定した。本発明者らは、運動ニューロンを神経栄養因子除去から保護することが最近示された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）タンパク質キナーゼ阻害剤であるケンパウロンも、ＣＰＡアッセイで運動ニューロンを保護することを実証する。ケンパウロンに加え、本発明者らは、追加のキナーゼ阻害剤および胆汁酸成分、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）を含むいくつかのその他の保護化合物を同定した。マウス肝細胞由来の運動ニューロンにおけるこれら化合物のレスキュー作用は、ヒト幹細胞由来の運動ニューロンでも再現された。さらに本発明者らは、ＴＵＤＣＡが、この疾患の早期症候性段階で、トランスジェニックｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスでの神経筋接合部の除神経を低減させることを見出した。
【０４５３】
まとめると、これらの知見は、開発された幹細胞ベースの運動ニューロン生存率アッセイのトランスレーショナルポテンシャルを強調する。ＥＲストレスを誘発する化合物ＣＰＡが、運動ニューロンに対して優先的に毒性であると同定する際、本発明者らの初期ストレッサースクリーニグは、ＡＬＳ病理に関与することが公知である経路を独立して再発見した（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｎｉｓｈｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。さらに、ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおけるＴＵＤＣＡの保護作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングプラットフォームから生じる化合物が、ＡＬＳのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにシームレスに移行できるという原理証明となる。
ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａを発現する肝細胞由来の運動ニューロンの生存率および神経突起成長における僅かな欠陥
【０４５４】
突然変異体ＳＯＤ１タンパク質を発現する動物での、運動ニューロン変性の発症に関与する病理過程に対する見通しを得るために、本発明者らは、２色運動ニューロン生存率アッセイを開発した。本発明者らは、ＡＬＳを引き起こす突然変異に対する運動ニューロンの感受性増大に関与するメカニズムの発見は、運動ニューロン細胞自律表現型をより前進的段階の疾患に関連した非細胞自律表現型と区別することができる、ロバストで、感受性のある、拡大縮小可能なシステムを必要とするであろうと推論した（Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；Ｂｏｉｌｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）。
【０４５５】
野生型（ＷＴ）と突然変異体運動ニューロンとを区別し、ウェルごとのばらつきを最小限に抑え、拡大縮小性を増大させるために、本発明者らは、ｈＳＯＤ１ＷＴ（対照）およびｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ（突然変異体）導入遺伝子を含有するマウス（Ｇｕｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４）を、運動ニューロン特異的Ｈｂ９（Ｍｎｘ１）プロモーターの制御下で、ｅＧＦＰ（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）またはｔａｇＲＦＰを発現するマウスと交雑させることによって、新しい多能性胚性幹細胞（ＥＳＣ）系を作製した（図１５Ａ；図２１Ａ、および図２１Ｂ）。Ｈｂ９に対する抗体による免疫染色および運動ニューロン転写因子Ｉｓｌ１は、新しい細胞系が、同等の効率を持つ運動ニューロンに分化することを確認した（図１５Ａおよび図１５Ｂ、図２１Ｃ〜２１Ｅ）。次に本発明者らは、新しい突然変異体細胞系が公知のＡＬＳ表現型を再現するか否かを決定しようとした。免疫組織化学および生化学を使用して（データは図示せず）、本発明者らは、ＡＬＳ患者からの死後組織で典型的には観察される、突然変異体運動ニューロン内での大きなＳＯＤ１凝集体を観察しなかった（Ｇｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）。しかしながら、ミスフォールディングされたヒトＳＯＤ１上の配座エピトープを特異的に認識する抗体による免疫沈澱は、ミスフォールディングされたＳＯＤ１種の存在を明らかにし（図２１Ｈ）、これはＡＬＳ病因への関与が既に示唆されているものである（Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。
【０４５６】
新生運動ニューロンは、それらの生存のためにおよび神経突起伸長のために、神経栄養因子に非常に依存する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９４；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２；Ｓｅｎｄｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）。準最適条件下で運動ニューロンを成長させることが、ＷＴ運動ニューロンよりも突然変異体で優先的な変性をもたらすか否かを決定するために、本発明者らは、量を減少させた神経栄養因子が補われた培地で両方の遺伝子型を培養し、運動ニューロン生存率および神経突起成長を評価した。最も支持的な培地は、運動ニューロン生存率および神経突起伸長に対して文書化された影響を持つ神経栄養因子：グリア細胞由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、およびインスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）を含有していた。本発明者らは、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）のレベルを増大させ、ニューロトロフィンと相乗的に作用して１次的な運動ニューロン生存率を支持することを既に示している（Ｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）２種の化合物、ＩＢＭＸおよびフォルスコリンの影響も評価した。ＩＢＭＸおよびフォルスコリンは単独で、プレーティング後の最初の２４時間にわたり運動ニューロン生存を支持したが、それらの影響は、その後の２４〜４８時間にわたり急速に減じられた（図２１Ｊ）。一方、ＧＤＮＦは単独で、培養の１週間まで運動ニューロン生存に関するロバストな支持を提供し、その影響は、ｃＡＭＰ上昇化合物によって増強することができた（図２１Ｋ）。これらの結果に基づき、本発明者らは、３つの異なる培養条件：低神経栄養支持（１０μＭ  フォルスコリン＋１００μＭ  ＩＢＭＸ）、中神経栄養支持（１０μＭ  フォルスコリン＋１００μＭ  ＩＢＭＸ＋０．４ｎｇ／ｍｌ  ＧＤＮＦ）、および強神経栄養支持（１０μＭ  フォルスコリン＋１００μＭ  ＩＢＭＸ＋１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、およびＩＧＦ−１）について評価した（図２１Ｆおよび図２１Ｇ）。
【０４５７】
細胞生存率および神経突起伸長を、蛍光運動ニューロンの自動化ライブ撮像（Ｔｒｏｐｈｏｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｕｎｎｅｒ）によって評価した（図１５Ｄおよび図１５Ｅ）。生細胞とＧＦＰ陽性死細胞または蛍光デブリとを区別するために、本発明者らは、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、平均細胞体直径の５倍に等しい神経突起長を持つ細胞のみが分析に含まれる「健常細胞基準」を適用した（図１５Ｆ）。６日間の過程で生きている運動ニューロンの数の定量（図２１Ｆおよび図２１Ｇ）は、対照に対して、適度であるが一貫して１５〜２０％の突然変異体運動ニューロンの生存率および神経突起成長の低減を明らかにした。この相違は、高度におよび適度に支持され、各遺伝子型の赤−緑の混合培養物または個別の培養物で観察された（図１５Ｇ）。まとめると、これらの知見は、神経栄養因子の除去が、ＥＳＣ由来のｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ発現運動ニューロンで検出された生存欠陥を増強しないことを示す。
突然変異体運動ニューロンの優先的な変性を誘発するストレッサー用の２色スクリーン
【０４５８】
突然変異体運動ニューロンの変性に関与する経路を同定するために、本発明者らは、ＲＦＰ発現制御運動ニューロンをＧＦＰ発現突然変異体ニューロンと等しい割合で混合しかつ中程度の神経栄養支持下で９６ウェルプレートで培養する、ストレッサーアッセイを設計した（図１５Ｃ）。本発明者らは、その他の腹側脊髄ニューロンおよび両方の遺伝子型からのグリア細胞も含有する混合培地での運動ニューロン生存率を分析することにより、本発明者らの研究を運動ニューロン生存率の細胞自律型変化に焦点を当てることができると推論した。したがって、ＡＬＳ星状細胞毒性（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７）などの任意の非細胞自律型因子の影響は、両方の遺伝子型の生存率に等しく影響を及ぼし得るので、最小限に抑えることができる。
【０４５９】
プレーティングされた運動ニューロンは、１２７５生物活性小分子のライブラリーで処置する前の２４時間にわたり回収可能でありかつ神経突起を伸長させることができた（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｍｉｎｉ  ａｎｄ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｔｏｃｒｉｓ）。化合物を、自動化ロボット支援型液体取扱いプラットフォーム（Ｔｅｃａｎ）を使用して、１０μＭの最終濃度で添加し、細胞を、４８および７２時間後にライブ撮像することによって分析した。本発明者らは、下記のパラメーターを測定した：生きている蛍光運動ニューロンの数（「運動ニューロン生存率」、図１５Ｊ）、細胞当たりの平均神経突起伸長（「全神経突起成長」、図２２Ｂ）、対照ウェル内の運動ニューロンのＧＦＰ／ＲＦＰ比に対して正規化されたＧＦＰ／ＲＦＰ運動ニューロン比（「正規化生存比」、図１５Ｈ）、およびＧＦＰ／ＲＦＰ平均神経突起成長比（「選択的神経突起成長」、図２２Ａ）。突然変異体運動ニューロンを優先的に標的とするストレッサーを同定するために、本発明者らは最初に、対照および突然変異体の両方の運動ニューロンに対して明らかに毒性のある全ての化合物を排除した（平均生存率は突然変異体および対照細胞の＜２５％）。残りの化合物の中で、突然変異体運動ニューロンの生存率を優先的に減少させかつ少なくとも５０％の生存率の差に対応する比をもたらした部分集合は、膜受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、イオンポンプおよびチャネル阻害剤、抗有糸分裂薬、ならびに一般的なアポトーシス促進剤を含んでいた（図１５Ｈおよび図１５Ｉ）。
【０４６０】
本発明者らが同定した選択的ストレッサーの１つは、シクロピアゾン酸（ＣＰＡ）、筋小胞体関連のカルシウムＡＴＰアーゼ（ＡＴＰｓｅ）（ＳＥＲＣＡ）を可逆的に遮断するマイコトキシンであった。ＳＥＲＣＡは、カルシウムを細胞質から小胞体（ＥＲ）に隔離することに関与する（Ｇｏｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８）。ＳＥＲＣＡの阻害は、ＥＲにおけるカルシウム濃度を低下させ、タンパク質フォールディングの機能不全、非フォールディングタンパク質応答の活性化、ＥＲストレス、およびアポトーシスをもたらす（Ｄｏｕｔｈｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）。本発明者らは、ＣＰＡを用量設定して、突然変異体運動ニューロンが対照運動ニューロンに比べて低い生存率を示す有効濃度範囲（６．２５〜１２．５μＭ）を確立した（図１６Ａ〜１６Ｃ、図２３Ａおよび図２３Ｂ）。全ての後続実験では、他に指示しない限り、運動ニューロンを７．５μＭ  ＣＰＡで処置した。
【０４６１】
ＣＰＡの影響をさらに調査するために、本発明者らは、運動ニューロンに直接作用するのかまたは培養物中のその他の細胞を通して間接的に作用するのかを検査した。本発明者らは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により精製された（図２３Ｃ〜２３Ｆ）運動ニューロンが、混合培養物中の運動ニューロンとしてＣＰＡに対して感受性があることを見出し、これはＣＰＡが、後で２次毒素を生成するその他の細胞型ではなく、運動ニューロンに直接作用することを示している（Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；Ｈａｉｄｅｔ−Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）。これらの知見は、混合培養物中に存在するその他の細胞型が、ＣＰＡで処置された運動ニューロンに対して保護をもたらさないことも示唆する。
【０４６２】
脊髄運動ニューロンおよび運動皮質内のニューロンの、その他のタイプの神経細胞に優先する変性は、ＡＬＳの特徴である。運動ニューロンが、その他のタイプのニューロンよりもＣＰＡ処置に対して感受性があるか否かを決定するために、本発明者らは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ発現脊髄運動ニューロン、介在ニューロン、およびその他の細胞型から構成される混合培養物を分析した。生存細胞の免疫染色は、ＧＦＰを発現する運動ニューロンの生存を明らかにし、ｐａｎニューロンマーカーＴｕｊ１は約７１％低減し、一方、全てのＧＦＰ−  Ｔｕｊ−１＋非運動ニューロンの生存は、約２３％のみ低減した（図１６Ｄおよび図１６Ｆ）。ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡＥＳＣ系から誘導された混合培養物中の様々なニューロンサブタイプ同士の、ＣＰＡ感受性におけるこのかなりの相違があったので、ＷＴ系から誘導された培養物でも同様であるかを調べようとした。
【０４６３】
この分析では、本発明者らは、Ｐｔｆ１α発現前駆細胞から誘導されたｄＩ４およびｄＩＬ背側脊髄阻害介在ニューロンにおいてｔｄＴｏｍａｔｏを発現する新しいＥＳＣ系を生成させた（Ｈｏａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７、データは非公開）。本発明者らは、背側介在ニューロンの詳細の同一性を促進させる条件下、この系を差別化した。ＦＡＣＳ精製されたｔｄＴｏｍａｔｏ発現介在ニューロンを、ＦＡＣＳ精製されたＧＦＰ発現脊髄運動ニューロンと共に同時培養した（図１６Ｅおよび図１６Ｇ）。ＲＦＰ対ＧＦＰ陽性ニューロンの定量は、ＣＰＡ処置が、同時培養された脊髄運動ニューロンの生存率を約７０％低減させるのに比べ、背側脊髄介在ニューロン生存率を約１７％のみ低減させることを明らかにした。これらのデータを合わせると、その他の腹側または背側脊髄ニューロンと比較して、ＣＰＡに対する脊髄運動ニューロンの感受性が増大することが明らかになった。
細胞質カルシウムレベルに対するＣＰＡの影響
【０４６４】
ＣＰＡは、小胞体内への細胞質カルシウムの隔離に重要な、ＳＥＲＣＡポンプの可逆的阻害剤である。免疫染色は、培養されたＥＳＣ由来の運動ニューロンが高レベルのＳＥＲＣＡ２アイソフォーム（ＡＴＰ２Ａ２）を発現することを明らかにした（図１６Ｈ）。運動ニューロンにおけるカルシウム取扱いに対するＣＰＡの影響を研究するために、本発明者らは一連の撮像実験を行って、遊離細胞質カルシウムを視覚化しかつカルシウム指標Ｆｕｒａ−２の放射測定分析により測定した。ＧＦＰとＦｕｒａ−２蛍光との間のクロストークを回避するために、実験は、選別されたＨｂ９：：ｔａｇＲＦＰ発現運動ニューロンで行った。まず、本発明者らは、変力性グルタミン酸受容体アゴニストカイニン酸（ＫＡ）によって引き起こされたカルシウムトランジェントを測定することにより、プレーティングから３日後に対照および突然変異体の運動ニューロンにおける全体的なカルシウムの取扱いを特徴付けた（Ｃａｒｒｉｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；Ｃａｒｒｉｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６）。１００μＭ  ＫＡの５秒パルスへの細胞の曝露は、ＥＳＣ誘導性運動ニューロンにおける細胞質カルシウムの急速な上昇を誘発し、その後、カルシウムがベースラインレベルに戻る隔離期間があり（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）、これは１次運動ニューロン培養物に類似していた（Ｃａｒｒｉｅｄｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。６０秒の撮像ウィンドウ以内にベースラインに戻ることができなかった運動ニューロンを、さらなる分析から除去した。５分間の回収期間後、細胞を７．５μＭ  ＣＰＡに曝露し、さらに２０分間にわたり撮像した。連続ＣＰＡ曝露は、両方の遺伝子型で低速のカルシウムトランジェントを誘発し（図１６Ｉ）、最終的には、撮像順序の終わりに向かってベースライン近くのレベルまで戻った。細胞を、さらに５分間回収させ、その後、第２のＫＡパルスにＣＰＡの存在下で供し、ベースラインに戻る急速なカルシウムトランジェントを引き起こした（図２２Ｅ）。これにより本発明者らは、ＥＲ内でのカルシウム隔離が遮断されたとき、細胞がどのように細胞質カルシウムの上昇を取り扱うかを検査した。ＣＰＡは著しく遅くなるが、ＫＡ誘発性カルシウムの隔離を解消せず（図１６Ｊおよび図２２Ｅ）、運動ニューロンは、細胞質カルシウムを隔離するのに通常はＥＲに依拠するが、この区画の損失によりその他の隔離経路を使用できることを示した。この相違は、ＫＡにより反復される刺激に起因するものではなかったが、それはＣＰＡが存在しない状態での多数の連続ＫＡパルスによる並行実験が、カルシウム隔離の速度におけるいかなる障害も明らかにしなかったからである（データは図示せず）。対照および突然変異体の運動ニューロンを比較するとき、本発明者らは、ＣＰＡの非存在下または存在下（図１６Ｊ）、ＫＡ誘発性カルシウム隔離の速度（Ｔａｕ）における遺伝子型同士でいかなる相違も観察せず、これはＣＰＡがカルシウムの取り扱いに比較的影響を及ぼすことを示している。
【０４６５】
上昇した細胞質カルシウムは、細胞死経路を含めた多数の細胞内シグナル伝達プロセスを活性化することができ（Ｄｅ  Ｓｔｅｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７；Ｐｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）、ＡＬＳを含む多くの神経変性状態においてカルシウム調節不全への関与が示唆されている（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｍａｒｉｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０；Ｔａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；Ｔｒａｄｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１；ｖｏｎ  Ｌｅｗｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  ２００５）。したがって、ＥＲ内へのカルシウム隔離の改善またはカルシウムシグナル伝達が促進される変性経路の不活性化は、潜在的にＣＰＡ毒性を打ち消す。したがって、本発明者らは、細胞質カルシウムの取扱いおよび／またはシグナル伝達に対して公知の影響を有する８種の化合物のパネルを評価した。これらには、ＢＡＰＴＡ−ａｍ、細胞透過性カルシウムキレーター；ダントロレン、ＥＲストアから細胞質内にカルシウムを放出するリアノジン受容体の阻害剤；カルパイン、カルシウム依存性システインプロテアーゼのファミリーの、３種の阻害剤；およびカルシウム活性化キナーゼＣａＭＫＫ／ＩＩの３種の阻害剤が含まれた。特に、これらの処置は、運動ニューロン生存率またはＣＰＡ曝露によって引き起こされた神経突起退縮を改善しなかった（図１８Ａ〜１８Ｂ）。これらのデータは、ＣＰＡ誘発性細胞質カルシウムレベルが脆弱な運動ニューロンおよび耐性非運動ニューロンで本質的に等しい（図２５Ｂ）という観察事項と合わせて、細胞質カルシウムの過負荷はＣＰＡ誘発性運動ニューロン死の主な原因になり難いことを示唆した。
脊髄運動ニューロンはＥＲストレス経路の活性化に対して感受性がある
【０４６６】
細胞質カルシウムに対するその影響に加えて、ＣＰＡ処置は、ＥＲにおいてカルシウムレベルを減少させ、ＥＲストレス経路の活性化に繋がることが示されてきた（Ｄｏｕｔｈｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）。これらの経路は、結合免疫グロブリンタンパク質（ＢｉＰ；熱ショックタンパク質７０、ＨＳＰ７０；７８ｋＤａ  グルコース調節型タンパク質、ＧＲＰ−７８）、ＥＲ常在シャペロンであって、ＥＲ管腔内の非フォールディングタンパク質の検出後にそのＥＲ膜結合ストレスセンサー上の結合部位から転座されるものによって、開始される。非結合ＢｉＰは、ＥＲストレスに関連した３つの別々のシグナル伝達経路：ＰＥＲＫ、ＡＴＦ−６、およびＩＲＥ１α経路の活性化に関わり、以後、これらを非フォールディングタンパク質応答と呼ぶ（ＵＰＲ、図１９Ｆ）（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｈｅｔｚ  ２０１２；Ｌｕｒｌａｒｏ  ａｎｄ  Ｍｕｎｏｚ−Ｐｉｎｅｄｏ  ２０１６；Ｋｏｚｕｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８）。
【０４６７】
ＣＰＡに曝露された運動ニューロンにおけるこれらの経路の活性化を評価するために、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンにおけるＣＰＡ処置後の３つの時点で１５のストレス関連遺伝子の発現レベルを検査した（図１７Ａ）。本発明者らは、Ｂｉｐおよび重要な下流エフェクターＣｈｏｐ（Ｄｄｉｔ３）の発現の急速な増加を観察した。Ｂｉｐは、ＣＰＡ曝露の１時間後に２倍に増大し、８時間までに約５倍に増大し続けた。Ｃｈｏｐは、ＣＰＡ処置の１時間で４倍に誘発され、４および８時間で１６倍の誘発に到達した。＞２倍の誘発を有するその他の遺伝子には：ｐ５８ＩＰＫ  ２５５（８時間で６．５倍）、ＥＲストレス誘発性タンパク質キナーゼ；成長停止およびＤＮＡ損傷誘発性タンパク質４５アルファ（Ｇａｄｄ４５ａ；４時間で５倍）、発症前ＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスの脊髄で上方制御されることが最近示された（Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）；Ｅｒｄｊ４、ＥＲ関連タンパク質分解（ＥＲＡＤ）における関与を伴うＢｉｐ補因子（４〜８時間で５倍）；Ａｔｆ４、ＵＰＲのＰＥＲＫ軸の下流メディエーター（８時間で３倍）；カルレティキュリン、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスにおける非媒介型運動ニューロン変性に関連づけられたＥＲ関連シャペロン（８時間で３倍）（Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｍａｒｉｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）；ならびにＮｒｆ２、ＰＥＲＫ基質（８時間で２倍）が含まれた。全体として、これらの発現の変化は、ＣＰＡに曝露された運動ニューロンにおける非フォールディングタンパク質応答（ＵＰＲ）の多数の軸の強力な活性化を指し示した（図１９Ｆ）。
【０４６８】
ＣＰＡに１、２、４、８、および２４時間曝露された対照および突然変異体の運動ニューロンからのタンパク質抽出物のウェスタンブロット分析は、ＰＥＲＫ経路の早期活性化（ＣＰＡ曝露から１時間で既に検出可能なＥｉｆ２αのリン酸化の増大）と、両方の遺伝子型で８時間（図１７Ｃ）で検出可能なＡＴＦ−６の活性切断形態の蓄積を、確認した。ＩＲＥ１αブランチの活性化は、Ｘ−ｂｏｘ結合タンパク質１（ＸＢＰ１）スプライシングのｑＰＣＲ分析により評価し、これは既にＣＰＡ処置から１時間までに誘発されかつ曝露から４時間でピークに達したものである（図１７Ｂ）。本発明者らは、ｃ−ｊｕｎリン酸化の免疫細胞化学分析により（Ｕｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）、ＩＲＥ１αブランチの活性化も評価し、これはＣＰＡ処置の２時間後にピークに達した（図１７Ｅおよび図１７Ｆ）。
【０４６９】
ＵＰＲ／ＥＲストレス経路のＰＥＲＫおよびＡＴＦ−６ブランチの活性化は、タンパク質合成の減衰およびミスフォールディングされたタンパク質クリアランスの加速を目的とする保護細胞応答に関連付けられる（Ｈｅｔｚ  ２０１２；Ｌｕｒｌａｒｏ  ａｎｄ  Ｍｕｎｏｚ−Ｐｉｎｅｄｏ  ２０１６）。したがって本発明者らは、培養された運動ニューロンにおけるミスフォールディングされたＳＯＤ１タンパク質の蓄積に対するＣＰＡ処置の影響について、検査を試みた（Ｂｏｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；Ｈｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｎｉｓｈｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。本発明者らは、突然変異体運動ニューロンを、ＣＰＡまたはビヒクルで処置し、２つの異なる立体配座特異的ｈＳＯＤ１抗体を使用してミスフォールディングされたＳＯＤ１を免疫沈澱させた。ウェスタンブロット分析は、ミスフォールディングされたＳＯＤ１の蓄積の予期せぬＣＰＡ依存的な増大を明らかにし、ＣＰＡ処置がミスフォールディングされたＳＯＤ１タンパク質のクリアランスを損なうことが示された（図１７Ｄ）。
【０４７０】
ＥＲストレスの活性化と運動ニューロン変性との間の関連を強化するために、本発明者らは、本発明者らの研究を、ＥＲストレスを活性化する２つの追加の化合物：タプシガルギン、ＳＥＲＣＡポンプを阻害することによってＣＰＡと同様に作用するが不可逆的である薬物（Ｌｙｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９１）と、ツニカマイシン、ＥＲでのタンパク質Ｎ−グリコシル化を阻害することによってカルシウムに依存しない手法でＥＲストレスをトリガーする薬物（Ｏｓｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）とを含むように拡張した。本発明者らは、ＧＦＰ発現運動ニューロンとｔｄＴｏｍａｔｏ発現背側介在ニューロンとの同時培養物を、漸増濃度のタプシガルギンおよびツニカマイシンに曝露して、ＣＰＡの場合のように、本発明者らは脊髄運動ニューロンが両方の化合物に対して選択的に感受性があることを観察した。したがって、ＣＰＡの運動ニューロン毒性作用は、ＥＲストレス経路のその活性化に関連があるようであり、その作用はカルシウムレベルまたはその他のオフターゲット作用に関連しないようである（図１６Ｇ）。
運動ニューロンをＣＰＡ誘発性変性から保護する化合物
【０４７１】
運動ニューロンが、その他の脊髄ニューロンよりも、ＵＰＲ／ＥＲストレス経路の活性化に対して感受性があることを理解したので、本発明者らは、ＣＰＡ毒性から運動ニューロンを保護することができる化合物を同定することを目的としたスクリーニング済み候補分子を設定しようとした。ＥＲストレスは、ＡＬＳならびに多くのその他の神経変性状態の病因への関与が示唆されてきたからである（Ｈｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓａｘｅｎａ  ２０１７）。本発明者らは、社内ライブラリーから編集されたおよび文献調査から生じた化合物が補われた、＞１００種の化合物のパネルをスクリーニングした（表３）。このパネルは、ＥＲストレスの種々のブランチをモジュレートする化合物、カルシウム隔離に影響を及ぼす化合物、神経栄養因子として作用する化合物、および運動ニューロン生存率を促進させることが既に示されている化合物を含んでいた。混合型運動ニューロン培養物を、７．５μＭのＣＰＡに曝露する前に、レスキュー化合物で４５分間前処置した。生存率および神経突起成長を、２４および４８時間後に評価した。スクリーニングは、ＣＰＡに応答して死滅する運動ニューロンの５０％超を保護するいくつかの化合物（図１８Ａ〜１８Ｂ）：ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤ＳＰ６００１２５；チロシンキナーゼ阻害剤スニチブ；広範なキナーゼ阻害剤Ｒｏ３１−８２２０メシレート、ケンパウロン、ＧＯ６９７６、Ｈ−７およびＫ２５２ａをもたらした（Ｓａｋａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｋａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７；Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。神経突起成長の５０％超をレスキューした化合物は、神経栄養因子カルジドトロフィン−１；ｐ３８阻害剤ＳＢ２９３０６３およびＳＢ２０３５８０；ＳＰ６００１２５；スニチニブ；胆汁酸ＴＣＡ、ＴＧＣＡ、およびＴＵＤＣＡ；ならびにキナーゼ阻害剤Ｒｏ３１−８２２０メシレート、ＧＯ６９７６、ケンパウロン、Ｈ−７およびＫ２５２ａを含んでいた（図１８Ｂ）。全体として、ＧＯ６９７６、ケンパウロン、Ｋ２５２ａ、およびＴＵＤＣＡは、それらの低濃度での強力な生存促進作用（ＧＯ６９７６、ケンパウロン、Ｋ２５２ａ）または強力な神経突起成長促進（ＴＵＤＣＡ）に起因して最も有望な候補であるように見え、さらなる特徴付けに向けて選択された。
【０４７２】
ケンパウロン、タンパク質キナーゼ阻害剤は、最近、ＥＳＣ由来の運動ニューロンにおける神経栄養因子の除去をレスキューする化合物のスクリーニングからのヒットとして出現した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）。本発明者らは、ＣＰＡに応答して運動ニューロン変性も有効に防止することを見出した。本発明者らは、２種の追加のキナーゼ阻害剤、運動ニューロンに同等のレスキューを提供するがケンパウロンよりも低い濃度（ケンパウロンの５〜１０μＭと比較して、０．５〜２μＭ）で活性であるスタウロスポリンアナログＧＯ６９７６およびＫ２５２ａを同定した（図１９Ａ）。本発明者らは、ＴＵＤＣＡ、化学シャペロンとして機能する酸塩基両性胆汁酸成分が、神経突起成長をレスキューする（図２５Ｆ）が運動ニューロン変性に対して中程度の影響しか示さないことも決定した（図１９Ａ）。
【０４７３】
幹細胞由来の運動ニューロン生存率アッセイの１つの利点は、ヒト運動ニューロンに、容易に拡張できることである。ヒト細胞にアッセイを適合するために、本発明者らは、Ｈｂ９運動ニューロンプロモーターの制御下で、ＧＦＰを発現するヒトＥＳＣ系から誘導されたＥＳＣ系の新しい同質遺伝子対を生成させた（ＨＵＥＳ３  ＨＢ９：：ＧＦＰ、（Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８））。ＡＬＳを引き起こすＡ４Ｖ突然変異を、ヒト患者遺伝子型を再現するのにジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をベースにしたゲノム工学を使用して、ＳＯＤ１遺伝子の単一の対立遺伝子に導入した（図２４Ａ〜２４Ｌ）。細胞系の対を、既に公開されたプトロコール（Ａｍｏｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｍａｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）を使用して、並行して運動ニューロンに分化し、ＣＰＡ濃度が増大する状態で生存率および神経突起成長に関して特徴付けた。ヒト運動ニューロンは、マウス運動ニューロンよりもＣＰＡに対してそれほど感受性はないが（図２４Ｊ）、本発明者らは、対照ニューロン（約７１％損失）と比較して、３３μＭ  ＣＰＡ（約８６％損失）に曝露された突然変異体ヒトＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンの著しく増大した変性を検出し、それによって、マウス運動ニューロンにおけるＣＰＡの遺伝子型依存作用が再現された（図１９Ｄおよび図１９Ｅ）。
【０４７４】
次に、本発明者らは、マウス運動ニューロンに対して保護的な化合物が、３３μＭ  ＣＰＡに曝露されたヒト運動ニューロンを保護できることになるのか否かを試験するアッセイを使用した。注目すべきは、マウス運動ニューロンスクリーニングで同定された全ての試験された保護化合物は、ＣＰＡに対してヒト運動ニューロンを保護するのにも有効であった。ケンパウロンによるヒト運動ニューロンの前処理は、ＷＴ運動ニューロンにおけるＣＰＡ誘発性細胞死の４２％を、およびＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンにおける３１％をレスキューしたが（図１９Ｄ）、神経突起成長に対しては有意な影響はなかった（図２４Ｉ）。ＧＯ６９７６は、ＷＴ運動ニューロンにおける細胞死の４５％を、およびＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンにおける３４％をレスキューし（図１９Ｄ）、神経突起成長の減少も有意にレスキューした（図２４Ｋ）。Ｋ２５２ａは、全体として最も有望な化合物であり、ＷＴにおける細胞死の５６％を、およびＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンにおける細胞死の１００％をレスキューし（図１９Ｄおよび図１９Ｅ）、後の群に関する神経突起成長に著しい影響を及ぼした。最後に、ＴＵＤＣＡは、ＷＴおよびＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロンの細胞死を、それぞれ３４％および９％低減させ、神経突起成長には実質的な影響はなかった（図１９Ｄ、図２４Ｋ）。
表３．ＣＰＡ毒性のレスキューに関するスクリーン
ＣＰＡ誘発性ＭＮ毒性および／または神経突起退縮を反転させるそれらの能力に関して試験をした化合物のリスト。化合物は、推定経路または作動メカニズムに基づいて細分される。レスキュー作用は、最良の時点（ＣＰＡ後、２４または４８時間）および試験される濃度に関して、生存率および神経突起成長に関するＣＰＡ影響の反転％として表される。値は、複製培養ウェルの平均、または追跡実験で評価された化合物に関する独立した実験からのいずれかを表す。
【表３−１】
2021518856.tif 000171
【表３−２】
2021518856.tif 000172
栄養補助食品ＴＵＤＣＡは、神経保護的であり、ＣＰＡ誘発性神経突起退縮を反転させ、ＡＬＳ関連筋除神経をｉｎ  ｖｉｖｏで遅延させる
【０４７５】
ＴＵＤＣＡは、ＦＤＡ承認済み栄養補助食品であり、その多様な病的状態に対する影響は、多数の臨床試験の焦点となっている（ＮＣＴ００８７７６０４、ＮＣＴ０２２１８６１９、ＮＣＴ００７７１９０１、ＮＣＴ０１８２９６９８）。ＴＵＤＣＡは、一般に安全であり、副作用がほとんどなく、皮下または経口投与したときに良好な血液脳関門透過を示す（Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。神経筋接合部（ＮＭＪ）の除神経は、ＡＬＳのマウスモデルで観察される最も早期の表現型の１つであるので（Ａｚｚｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７；Ｍａｓｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３；Ｔｓｕｊｉｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８４；Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）、本発明者らは、ＴＵＤＣＡが運動軸索末端の一体性の維持を促進しかつ除神経プロセスを遅延させ得ると推論した。
【０４７６】
ＴＵＤＣＡの有効性をそのアナログと比較するために、本発明者らは、それを並行して１０種の共役胆汁酸によりＣＰＡ処置済み運動ニューロンにおいてスクリーニングした。タウリン−グリシン共役コール酸（ＴＧＣＡ）は、運動ニューロン生存率に対するＴＵＤＣＡの適度な影響に一致するが、より低い濃度で働き；しかしながら神経突起伸長に対してはＴＵＤＣＡよりも影響が小さかった（図２５Ｃおよび図２５Ｄ）。タウリン共役コール酸、ＴＣＡは、運動ニューロン生存率および神経突起伸長の両方に対してＴＵＤＣＡと同様の影響を示したが、薬物の開発に関していかなる利点ももたらさなかった。したがって本発明者らは、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ実験に関してＴＵＤＣＡで進める決定をした。
【０４７７】
ＴＵＤＣＡが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＬＳモデルにおいて運動軸索を保存する能力を試験するために、本発明者らは、疲労し易い後脚前脛骨筋（ＴＡ）の除神経を評価する小規模な研究を設計した（図２０Ｄ）。本発明者らは、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／ＪマウスにおけるＴＡ運動ニューロンがＰ３０で開始するＥＲストレス期間を受け、その後、Ｐ５０に延びる筋除神経を受けることを、既に決定している（Ｋａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４）。この期間中、ＴＡ筋は、後の時点で実質的に萎縮されるようになる前に、２５〜４０％の除神経を表す。ＥＲストレス関連の神経変性のこの窓を標的とするために、本発明者らは、ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウスを皮下ＴＵＤＣＡ注射で３日ごとに、Ｐ３０〜Ｐ５０の間で処置した。実験の終わりに、本発明者らは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８共役α−ブンガロトキシンでＴＡ筋上のアセチルコリン受容体を染色することによって、全ＮＭＪをカウントし、小胞アセチルコリントランスフェラーゼ（ＶＡＣｈＴ）に対する抗体で運動軸索を染色することにより、それらの神経支配を評価した（図２０Ｆ）。マウスが、２１日間の処置の過程で７回しか注射を受けなかった事実にも関わらず、本発明者らは、未処置の動物と比較して、ＴＵＤＣＡ処置済みｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスにおいてＮＭＪ神経支配の適度なしかし統計的に有意な増大を観察した（図２０Ｅ）。
考察
【０４７８】
細胞培養系における変性疾患のモデリングは、疾患を引き起こす突然変異と関連した病理過程を調査するための、および新規な治療剤をスクリーニングするための、新しい機会を開く。しかしながら、原因となる突然変異が、細胞機能の僅かな変化または軽度な生存率もしくは形態学的表現型をもたらす成人発症変性疾患は、ハイスループット薬物スクリーニングに適合可能な種類の短期培養系においてモデル化することが難しい。本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの運動ニューロンにおける表現型の変化を誘発し加速させるストレッサーの発見が、運動ニューロン変性に関与する分子経路に洞察を与えることができ、かつ新規な運動ニューロン保護化合物の発見をもたらすことができると推論した。
【０４７９】
ＡＬＳを引き起こす突然変異は、脊髄運動ニューロンに対して明らかに毒性ではなく：患者は、疾患の発症前段階中にいかなる明瞭な運動欠陥も示さず、これは典型的には何十年も続くものである。突然変異体ｈＳＯＤ１の過発現によって引き起こされるＡＬＳの侵襲的マウスモデルにおいても、運動ニューロンの死は成体期まで観察されず（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）、ＡＬＳ突然変異の影響が蓄積されること、または年齢および／もしくは環境関連ストレッサーによって強化されることを示す。突然変異体運動ニューロンの変性に関与するストレッサーを同定するために、本発明者らは、高度に感受性があり、内在的に制御された生存率アッセイを設計した。同時培養の設定は、非細胞自律型毒性因子の影響を低減させ、疾患を引き起こす突然変異体ＳＯＤ１タンパク質を発現する運動ニューロンの、内在的な増大する脆弱性に焦点を当てさせる。このプラットフォームを使用して、本発明者らは、対照ＥＳＣ誘導性運動ニューロンよりも突然変異体に対して有毒な化合物として、ＣＰＡを同定した。おそらく、さらになお興味深い観察は、運動ニューロンが、その他のタイプの脊髄ニューロンよりも、ＣＰＡおよびその他のＥＲストレス誘発化合物に対してかなり感受性が高いことであった。
【０４８０】
ＣＰＡは、ＳＥＲＣＡポンプを阻害し、ＡＬＳに既に関連したいくつかの経路および細胞プロセスに影響を及ぼす（Ｋｉｓｋｉｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４；Ｈｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｓａｘｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３；Ｎｉｓｈｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８；Ｂｅｒｎａｒｄ−Ｍａｒｉｓｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｊａｉｓｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９；Ｔａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９；ｖｏｎ  Ｌｅｗｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  ２００５；Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；Ｐａｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）。本発明者らは、ＣＰＡ処置（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）がカルシウムの取扱いを撹乱し；（Ａｍｏｒｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）ＥＲストレスおよび非フォールディングタンパク質応答をトリガーし；および（Ｄｉｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）ｈＳＯＤ１Ｇ９３ＡＥＳＣ誘導性運動ニューロンにおける突然変異体ＳＯＤ１の蓄積をもたらすことを示す。この最後の知見は、突然変異体ＳＯＤ１が、通常は構成経路を経てクリアにされることを示唆するが、これはＳＥＲＣＡ阻害後に損なわれるものである。ミスフォールディングされた形態のＳＯＤ１は、ヒト死後組織試料でおよびいくつかのＡＬＳモデルで観察されているが、それを通して運動ニューロンの死を永続させる正確なメカニズムは、明らかではない（Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０；Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）。ＳＯＤ１が遊離細胞質リボソーム上で翻訳されたとしても、以前の研究は、突然変異体形態をミトコンドリアおよびＥＲ内で検出できると示している（Ｋｉｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；Ｖａｎｄｅ  Ｖｅｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。
【０４８１】
ＣＰＡ媒介型神経変性におけるＥＲストレス誘発に対する異常なカルシウム取扱いの役割を解析するために、本発明者らは、細胞内カルシウムレベルをモジュレートさせるまたはＥＲストレスをカルシウム独立経路を経て誘発する、一連の薬理学的薬剤を試験した。これらの研究に基づき、本発明者らは、カルシウムの誤った扱いが、ＣＰＡに応答して観察された急性変性プロセスを推進させそうにないと結論付けた。したがって本発明者らは、非フォールディングタンパク質応答およびＥＲストレスに関連したおよびその下流の経路に焦点を当てた。
【０４８２】
候補である神経活性化合物のスクリーニングは、ＣＰＡの有害な影響を反転させることができるいくつかの強力な薬物を同定した。２つのクラスの化合物が、特に目的とされるものであった：キナーゼ阻害剤および胆汁酸誘導体。キナーゼ阻害剤は、運動ニューロンをＣＰＡ毒性から保護する顕著な能力を示した。１つの化合物、ケンパウロンは、運動ニューロンを神経栄養欠乏から保護することが既に示された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）。生存率を改善し、ＦＵＳ遺伝子内に突然変異を持つ患者からのヒト幹細胞由来の運動ニューロンにおける電気生理学的欠陥を反転させることも、実証された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６）。ケンパウロンに加え、本発明者らは、２種のスタウロスポリンアナログ、Ｋ２５２ａおよびＧＯ６９７６を同定し、これらは既に、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ神経変性モデルにおいて、ニューロン生存率を増大させると報告されている（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２；Ｊｅｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）。しかしながら、これらの阻害剤は、さらなる最適化を必要とすることになる。ケンパウロンは、その最も有効な濃度で水性溶液に不溶であり、そのビヒクル組成物を再度製剤化する広範な試みのない、さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ研究を除外する。Ｋ２５２ａおよびＧＯ６９７６は、本発明者らの生存率アッセイにおいて、ケンパウロンより強力でより可溶性であるが（データは図示せず）；しかしながらこれらの化合物は、広域スペクトル阻害剤であり、それぞれが＞１００種の異なるキナーゼを標的とし、運動ニューロン変性に関連した標的の同一性は、明確に定義されていないままである。本発明者らは現在、これらの標的を同定しかつさらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のさらに特異的なアナログを開発する研究をしている。
【０４８３】
本発明者らのスクリーニングから生ずる第２のクラスの神経保護化合物は、伝統的なチベット医学および漢方医学で広範に使用されてきた哺乳動物の胆汁酸の誘導体であった。このクラスの化合物は、死滅しかけている運動ニューロンの＜３０％を保護したが、それは完全に、神経突起成長を元に戻した。ヒトへの使用が承認されていないキナーゼ阻害剤とは対照的に、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）は、広く入手可能な栄養補助食品であり、そのアナログであるＵＤＣＡは、痒みおよび肝疾患を処置するための、水溶性のＦＤＡ承認済み薬物である。ＴＵＤＣＡは、ハンチントン病およびアルツハイマー病のマウスモデルにおいて有益な影響を有することが、既に示されている（Ｋｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２；Ｋｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；Ｎｕｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２）。ＴＵＤＣＡは、２型糖尿病のマウスモデルにおける非フォールディングタンパク質応答のマーカーの発現を、部分的にはミスフォールディングタンパク質のシャペロンとして作用させることによって、低減させることも示されている（Ｏｚｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；Ｕｐｐａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１７）。本発明者らは、ＴＵＤＣＡがＡＬＳのマウスモデルにおいて神経筋接合部の一体性を保存し、ＴＵＤＣＡ単独またはその他の処置との組合せが運動疾患の発症または進行を遅延させ得る可能性を上昇させることを実証することにより、これらの研究を拡張した。
【０４８４】
本発明者らの知見は、ＥＲストレスがＡＬＳにおける運動ニューロン細胞死に関与するという山のような証拠に加わるものであり、本発明者らは、ＥＲストレスの細胞自律作用およびそれらを反転させる手段の両方をプローブするための、拡大縮小可能な幹細胞ベースのシステムについて記述する。このシステムは、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、およびアルツハイマー病などの、ＥＲストレスが特徴であるその他の神経変性状態に、容易に適合できる（Ｈｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓａｘｅｎａ  ２０１７）。最も重要なのは、本発明者らが、ヒト運動ニューロン上で直接、神経保護化合物を試験するのに、アッセイを適合させたことであり、それにより、ヒト患者で有効となり得る可能性を最大限にすることによって運動ニューロン生存率をモジュレートする薬物の臨床前評価を加速させることができた。
材料および方法
マウストランスジェニック胚性幹細胞系の誘導
【０４８５】
ヘテロ接合Ｔｇ（Ｈｌｘｂ９−ＧＦＰ）１ＴｍｊまたはＴｇ（Ｈｌｘｂ９−ｔａｇＲＦＰ）レポーターマウスを、ヒトＳＯＤ１の突然変異型（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ）またはＷＴ型（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１）２Ｇｕｒ／Ｊ）を発現するマウスと交雑させた。胚盤胞を、胚性期３．５日目に収集した。マウス胚性幹細胞（ＥＳＣ）系を、前述のように誘導した（５）。新しい系を遺伝子型化し、配列決定して、導入遺伝子およびＧ９３Ａ点突然変異の両方の存在を確認した。
【０４８６】
介在ニューロン分化の場合、マウス胚性幹細胞系を、Ｒｏｓａ−ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーターマウスと交雑させたＰｔｆ１α：：ｃｒｅマウス（Ｄｒ．Ｋａｌｔｓｃｈｍｉｄｔにより提供された腎臓）から誘導した（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２；Ｍａｄｉｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。
遺伝子標的化による同質遺伝子ヒト胚性幹細胞系の生成
【０４８７】
マウスアッセイからの結果を外挿するために、本発明者らは、Ａ４Ｖ突然変異を、ヒト胚性幹細胞系ＨＵＥＳ３  Ｈｂ９：：ＧＦＰの野生型ＳＯＤ１座に導入することによって、ＳＯＤ１＋／Ａ４ＶおよびＳＯＤ１＋／＋同質遺伝子細胞系の独立した集合を生成させた（Ｄｉ  Ｇｉｏｒｇｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）。２段階ヌクレアーゼ媒介型遺伝子標的戦略（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）を再び使用して、本発明者らは、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ突然変異をＨＵＥＳ３  Ｈｂ９：：ＧＦＰ遺伝的背景に導入した（図２４Ａ）。所望のＳＯＤ１遺伝子編集を裏付けた後（図２４Ｂおよび図２４Ｃ）、本発明者らは、ＳＯＤ＋／Ａ４ＶおよびＳＯＤ１＋／＋ＨＵＥＳ３  Ｈｂ９：：ＧＦＰ細胞の分化を、脊髄運動ニューロンを含有する培養物に分化させた。両方の遺伝子型のＧＦＰ＋運動ニューロンは、ＦＡＣＳ（図２４Ｄ）を使用して単離することができ、これらの細胞内でのＳＯＤ１転写およびタンパク質発現が、確認された（図２４Ｆおよび図２４Ｇ）。新しい系は、運動ニューロン転写因子Ｉｓｌｅｔ１を染色し（図２４Ｅ）、短期および長期培養物中での生存率を評価することによって、さらに検証した（図２４Ｈおよび図２４Ｉ）。
マウスおよびヒト運動ニューロン分化
【０４８８】
トランスジェニックマウスＥＳＣの運動ニューロン分化を、前述の通り行った（Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。簡単に言うと、細胞を分化の６日目に解離させ、ポリオルニチン（Ｓｉｇｍａ、１００μｇ／ｍｌ）およびラミニン（４μｇ／ｍｌ）でコーティングされた表面にポレーティングした。細胞を、ｃＡＭＰ上昇化合物フォルスコリン（１０μＭ）およびＩＢＭＸ（１００μＭ）の存在下、テキストに記述されるように神経栄養因子（ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１）の種々の集合と組み合わせて培養した（図２１Ｇ、図２１Ｋ、および図２１Ｌ）。運動ニューロンを含有する全ての実験マウス培養物の大部分で、介在ニューロンおよびグリア前駆細胞を使用し（「運動ニューロン培養物」と呼ぶ）、いくつかの実験では、運動ニューロンをＦＡＣＳにより精製した（以下、参照）。
【０４８９】
ｄＩ４介在ニューロンへの分化の場合、Ｐｔｆ１α−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ＥＳＣを解離させ、細胞８．０×１０５個／１０ｃｍ培養処理ペトリ皿の密度で、胚様体（ＥＢ）として懸濁液中で培養した。分化２日目、ＥＢを収集し、遠心沈殿させ、新しいペトリ皿に１：４で分割し、１μＭ  ＲＡを補った。培地を、分化の４および６日目に交換した。ｄＩ４  ＩＮ分化の終点は８日目であり、ＥＢを、同時培養研究のために収集した。
【０４９０】
ヒト同質遺伝子ＨＵＥＳ３  ＥＳＣ  ＨＢ９：：ＧＦＰレポーター系の、運動ニューロンへの分化を、前述のように行った（Ｍａｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）。細胞を、分化の１６日目に解離させ、ＦＡＣＳ選別し、上述のようにポリオルニチンおよびラミニンでコーティングされた表面にプレーティングした。無血清ヒト運動ニューロンプレーティング培地に、抗有糸分裂ＵＦｄＵと、神経栄養因子ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、およびＩＧＦ１（全て、１０ｎｇ／ｍＬで）とを、上述のように補った（Ｊｏｈｎｓｏｎ−Ｋｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１５）。
【０４９１】
使用した全ての細胞系を、マイコプラズマに関して定期的に試験した。
フローサイトメトリー支援型細胞選別（ＦＡＣＳ）
【０４９２】
細胞を、１００μｍのセラミックノズルと共に構成された５レーザーＡＲＩＡ−ＩＩｕ  ＲＯＵ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、２０ｐｓｉで動作させて、ＧＦＰまたはＲＦＰ発現に基づき選別した。
２色ＥＳＣ運動ニューロン同時培養アッセイ
【０４９３】
解離した蛍光Ｈｂ９：：ＲＦＰ−ｈＳＯＤ１ＷＴ細胞を、血球計算盤によりカウントし、同数のＨｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ運動ニューロンと混合し、各遺伝子型の５００個の蛍光細胞がウェル当たりにプレーティングされるようにした。細胞を、ＦＳＫおよびＩＢＭＸ（低栄養支持、細胞死の陽性対照）；またはＦＳＫ、ＩＢＭＸ、および２５０ｐｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（中栄養支持、生存のための陽性対照）を含有する培地中で、コーティングされた９６ウェルプレートにプレーティングした。
自動化画像解析
【０４９４】
生きているＧＦＰ＋細胞の全ウェル画像を、Ｐｌａｔｅ  ＲｕｎｎｅｒＨＤシステム（Ｔｒｏｐｈｏｓ）を使用して獲得した。画像を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して解析して、細胞体直径の＞５倍の成長を示す「健康な」蛍光細胞の数を評価し（全生存率の評価）、細胞当たりの平均神経突起長を評価した（神経突起成長の評価）。これらのパラメーターを、研究の全体にわたり一貫して使用した。ヒト系における内因性Ｈｂ９：：ＧＦＰレポーターは、本発明者らの自動化撮像プラットフォームで検出されるほど十分に明るくなかったので、細胞を、撮像直前に、生細胞色素カルセイン−ＡＭ（１．３３μＭ）で１０分間処置し、その後、ヘモグロビンをＰＢＳに溶かした１０％溶液でクエンチした。
小分子スクリーニング
【０４９５】
Ｔｏｃｒｉｓ  Ｍｉｎｉ  Ｓｃｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｃｕｓｔｏｍ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの約１３００種の生物活性化合物を、１０μＭの最終濃度で、各１枚のスクリーニングプレートに添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であった。生存比は、化合物に曝露してから４８および７２時間後に、生存しているＧＦＰ＋細胞の数を、ＲＦＰ＋細胞の数で除することによって、計算した。本発明者らは一貫して、生存している未処置のＧ９３Ａ突然変異体運動ニューロンの、未処置の野生型運動ニューロンに対する比が、約０．８３であることを観察し；遺伝子型に対して相乗的に作用する化合物を検出するために、全てのデータをこの比に対して正規化した。生存率の５０％差に相当する、＜０．６７倍のＧ９３ＡのＷＴに対する生存比をもたらす化合物を、５点２倍希釈系列で再試験した。全ヒット化合物を視覚的に評価し、自己蛍光および過剰な細胞集塊などの明らかなアーチファクトを持つウェルを除去した。一般的に毒性である化合物、即ち、両方の遺伝子型に関して低栄養支持で対照よりも低い生存率をもたらす化合物を、１：１０希釈系列で再度スクリーニングした。次いで１次スクリーンの影響を再現する化合物を、細胞系の独立集合で試験し、共に混合されたおよびＦＡＣＳ精製された同時培養物中で試験して、細胞自律作用を確認した。
ＥＲストレスレスキュースクリーン
【０４９６】
解離した蛍光Ｈｂ９：：ＧＦＰ−ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ  ５５４細胞をカウントし、コーティングされた９６ウェルプレートに、蛍光細胞１０００個／ウェルの密度で、ＦＳＫ、ＩＢＭＸ、およびＧＤＮＦを含有する培地にプレーティングした。細胞を、レスキュー化合物または対照としての培地＋０．５％ＤＭＳＯと共に、４５分間インキュベートした。レスキュー化合物を、初期２色スクリーンから、またはその他のモデルでＥＲストレスに対して文書化された影響を有する化合物に焦点を当てた文献調査から、選択した。次いで細胞を、７．５μｍ  ＣＰＡ、または対照として培地＋０．５％ＤＭＳＯに、曝露した。細胞を撮像し、先のセクションに記述されるようにスコアを付けた。ヒトＥＳＣ由来ＨＢ９：：ＧＦＰ−ＳＯＤ１＋／＋およびＨＢ９：：ＧＦＰ−ＳＯＤ１＋／Ａ４Ｖ運動ニューロンを、先のセクションで記述したように、細胞２０００個／ウェルで、９６ウェルプレートに別々にプレーティングし、試験化合物を、上述の１０ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、およびＩＧＦ１が補われた無血清ヒト運動ニューロンプレーティング培地に添加した。３３μＭ  ＣＰＡ（またはＤＭＳＯ対照）および様々なレスキュー化合物を、同時に添加した。
免疫細胞化学
【０４９７】
生きている培養物を、培地に直接固定剤を添加することにより、４％ＰＦＡと共に氷上に事前に２分間固定し、ついで、ウェル内容物を４％ＰＦＡと置き換えることによってさらに１５分間固定し、４℃でインキュベートした。固定された培養物を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘおよび２０％ロバ血清を含有する０．０１Ｍ  ＰＢＳと共に、１時間室温で遮断した。１次抗体を、遮断溶液で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。培養物を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有する０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗浄し、その後、２次抗体（Ａｌｅｘａ  ｄｏｎｋｅｙ４８８／５５５／６４７）と共に６０分間、室温でインキュベートした。下記の１次抗体を使用した：マウスＨｂ９およびマウスｉｓｌｅｔ１／２、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ製（１：１００）；Ｔｕｊ−１、ＮｅｕｒｏｍｉｃｓまたはＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製（１：５００）；ならびにホスホｃ−ｊｕｎ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ製（１：１００）およびＳＥＲＣＡ２、Ｐｉｅｒｃｅ製（２Ａ７Ａ１、１：１００）。スライドを、Ｃｏｏｌｓｎａｐ  ＨＱ２カメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）を備えたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  Ｍｅｔａ  ５１０、またはＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ８８０  Ａｘｉｏｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１共焦点顕微鏡のいずれかで検査した。画像は、プレゼンテーションの目的で、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ｓｕｉｔ  ６、Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理し、時々クロッピングし、変更を画像全体に、さらにそこから全ての画像に等しい割合で加えた。
生化学
【０４９８】
６日目に、ＥＢを、プロテアーゼ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ）およびホスファターゼ（ＰｈｏＳｔｏｐ）阻害剤を含有するＴＮＧ−Ｔ溶解産物緩衝液（３６）に３０分間溶解し、その後、２６Ｇシリンジで機械的に研和した。免疫沈澱のため、Ｃ４Ｆ６およびＢ８Ｈ１０抗体（ＭｅｄｉＭａｂｓ）を、タンパク質−Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓに連結し、Ｇｒｏｓ−Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０により記述されるように、ミスフォールディングｈＳＯＤ１の免疫沈降のために使用した。対照ＩｇＧ抗体を、陰性対照として使用した（図２１Ｉ）。ｐａｎ−ＳＯＤ１抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏ）を、免疫ブロットのために使用し、入力量の５％をローディングコントロールとして使用した。ウェスタンブロットでは、以下の抗体を使用した：Ｃａｓｐａｓｅ−３（１：１０００）、ＣＨＯＰ（１：５００）、ホスホ−Ｅｉｆ２α（１：１０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＯＤ１およびＡＴＦ−６（１：２００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、αチューブリン（１：５００００、ＡｂＣａｍ）。代表的なゲルを、元フィルムの走査済み画像からクロッピングする。本発明の研究に関係のない個々のバンドは、図中に破線により示す。バンド強度を、Ａｎａｌｙｚｅ−Ｇｅｌｓアプリケーションを使用してＩｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）で測定した。
定量ＰＣＲ
【０４９９】
試料をＴＲＩｚｏｌで溶解し、さらなる処理まで−８０℃で凍結した。ＲＮＡを、製造業者のプロトコールに従い、ＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒおよびＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。１〜２μｇの全ＲＮＡを、反転転写反応ごとに使用し、反応を、ＴａｑＭａｎ  ＲＴキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して行った。プライマー対を、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、標的転写物用に設計した。定量ＰＣＲ反応を、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。反応を実行し、絶対定量設定を使用してＶｉｉＡ  ７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ｑＰＣＲ機器上で分析した。
ＸＢＰ１スプライシング
【０５００】
ＰＣＲを、１０ｐｍｏｌのＸＢＰ−１特異的プライマーを含有する、５０μＬのｊｕｍｐｓｔａｒｔ  Ｔａｑ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号Ｄ９３０７）反応で行って、スプライシング（フォワード：５’−ＧＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＡＣＴＣ−３’＆リバース：５’−ＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧ−３’）を検出した。ＰＣＲ条件は、下記の通りであった：９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間を、３０サイクル；ならびに７２℃で１分間を１サイクル。ＰＣＲ生成物を、３０分間、臭化エチジウムを含有する２．５％アガロースゲル上に流した。バンドを観察し、Ｓｙｎｇｅｎｅ  Ｇ：ＢｏｘおよびＧｅｎｅｓｉｓソフトウェアを使用して定量した。バンド強度を、Ａｎａｌｙｚｅ−Ｇｅｌｓアプリケーションを使用して、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ）で測定した。
カルシウム撮像
【０５０１】
Ｈｂ９：：ＲＦＰ運動ニューロンを、分化から６日目に解離させ、ガラスカバースリップ上で培養した。解離後３日目に、カバースリップを、５μＭ  Ｆｕｒａ−２  ＡＭ、比率計測カルシウム指示色素（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、カバースリップを、４０×１．３０ＮＡ対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、ＵＳＡ）、ｐｃｏ．ＥＤＧＥ  ＣＭＯＳカメラ（ｐｃｏ、ドイツ）、Ｌａｍｂｄａ  ＬＳ光源、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍ励起フィルター（共にＳｕｔｔｅｒ、ＵＳＡ）を備えたＬａｍｂｄａ  ＬＳ−２フィルターホイールを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ  ３５００倒立型顕微鏡に取り付けた。画像を、明視野および蛍光フィルターを使用して最初に獲得して、後のステップで分析される細胞を同定した。薬物施用は、視野から約１００μｍに位置させた、注文製作された焦点アプリケーションシステムを使用して実施した。次いでＦｕｒａ−２シグナルに関する５秒ベースラインを獲得し、その後、１００μＭのカイニン酸（ＫＡ）の１秒パルスを獲得した。落射蛍光画像を、１画像／秒の速度で１分間取り込み、５００ミリ秒ごとに３４０ｎｍフィルターと３８０ｎｍフィルターとの間で切り換えた。細胞を２分間回収させ、細胞がベースラインに戻ったカバースリップのみをさらに分析した。次いでカバースリップを、７．５μＭ  ＣＰＡに連続曝露し、それと共に１画像／３０秒を２０秒間獲得し、その後、２分回収し、最後にＫＡの第２のパルスを獲得した。獲得後、画像の各対の３４０／３８０比を、ＦＩＪＩソフトウェアｖ．１．４（ｗｗｗ．ｆｉｊｉ．ｓｃ）を使用して画素ごとに計算した。目的の領域を、鋳型として単一の３４０画像からの細胞のモルホロジーを使用して、手作業で描いた。定量を、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ  ｖ．６（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ、ＵＳＡ）を使用して実施した。誘発型のカルシウムトランジェントがベースラインに戻る速度を、ピークの８０％から２０％へのＣａ強度トレースの降下部分に当て嵌めた単一の指数関数曲線のタウ（時間定数）から計算した。ピーク比の値の１０％まで回復したニューロンのみを、分析に含めた。
ＴＵＤＣＡのｉｎ  ｖｉｖｏ投与
【０５０２】
Ｐ３０マウスを３つのコホートに分割した：（１）皮下で０．０１Ｍ  ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｇのＴＵＤＣＡを受けたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス；（２）皮下で０．０１Ｍ  ＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｇのＴＵＤＣＡを受けて、ＮＭＪ除神経および薬物の突然変異特異的作用を評価するためのｈＳＯＤ１ＷＴマウス；ならびに（３）ビヒクル対照として皮下で０．０１Ｍ  ＰＢＳを受けたｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａマウス。薬物を、Ｐ３０からＰ５１まで３日ごとに、合計７回の注射で投与した。Ｐ５１で、ケタミン／キシラジンを使用してマウスに深く麻酔をかけ、約１５ｍＬの室温のリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を心臓内潅流し、その後、約３０ｍＬの４％ＰＦＡを潅流した。切除後、前脛骨（ＴＡ）筋をＰＢＳで一晩洗浄し、次いで凍結防止埋込み用に処理した。ＮＭＪを視覚化するために、全ＴＡの３０μｍの縦方向凍結切片を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ４８８（１：５００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされたα−ブンガロトキシン、および小胞アセチルコリントランスポーター（ＶＡＣｈＴ；ウサギで上昇、Ｃｏｖａｎｃｅ  １：３２，０００）に対する抗体と共にンキュベートして、運動神経終板および神経末端をそれぞれ標識した。同時局在化の欠如は筋除神経を示したので、ＮＭＪ神経支配％は、ＶＡＣｈＴとＢＴＸシグナル間で重なり合う領域の総数（神経支配された終板の総数）を、ＢＴＸシグナルを含有する領域の数（終板の総数）で除することにより決定した。１つのＴＡを、動物（ｎ＝４〜６）ごとに評価し、全筋肉にわたって３セクションごとに染色し、カウントして、動物当たり最小で１０００ＮＭＪが評価されるようにした。画像を、４×または１０×対物レンズを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ−２０００−Ｅ蛍光顕微鏡を使用して獲得した。全ての動物の研究は、コロンビア大学（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）ＩＡＣＵＣプロトコールに準拠して行った。
統計
【０５０３】
細胞培養では、最小で３つの独立した実験を一般に行い、これは培養条件および細胞系が一定に保持されるこのタイプのアッセイによる以前の実験に基づいて十分であると見なされた。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、パイロット研究に基づく検定力分析を行って、研究された影響を検出するのに必要とされる動物の数を推定した。データ集合は、論文全体を通して平均値＋／−ＳＥＭと表される。統計分析は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ．７、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）またはＲ’（）で行った。正規分布および等分散が想定される場合、有意性の分析は、一対比較用に両側独立スチューデントｔ検定で、または事後Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定による一元配置Ａｎｏｖａで行った。そうでない場合には、分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定であってＤｕｎｎ多重比較事後検定にを伴うもので、代わりに行った。統計的有意性は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１によって示される。他に指示しない限り、各Ｎは、独立した実験または動物を表す。ただ１つの生物学的複製物が分析されたいくつかの事象では、適用可能な場合には図の凡例に示されるように、技術的複製物を使用してヒストグラムを作成した。統計分析は、これらのデータのいずれにおいても行わなかった。
（実施例１３）
運動ニューロン保護剤としてのＭＡＰ４キナーゼ阻害剤の開発
【０５０４】
本明細書に記述される化合物１のＭＡＰ４Ｋ阻害誘導体の中で、化合物１２ｋは、その特に優れた神経保護性および薬物動態プロファイルが際立っており、特にその増大した代謝安定性および高い脳透過性が際立っていた。化合物１２ｋは、いくつかのＭＡＰ４Ｋのナノモル濃度でほぼ完全な阻害も示した。さらに本発明者らは、化合物１２ｋが、化合物１の抗炎症特性を保持することを示した。したがって化合物１２ｋは、神経変性疾患の動物モデルにおける将来の試験に向けて準備される。
ＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）およびＮＵＡＫ１は神経保護キナーゼ阻害剤の一般的な標的である
【０５０５】
本発明者らは、新しい潜在的なリード化合物の選択肢を知らせるように、当初のヒット化合物の標的を比較しようとした。本発明者らは、公的に利用可能なデータベース（Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）を掘り出して、初期スクリーンからの４つのヒット：Ｇｏ６９７６、スニチブ、Ｋ２５２ａ、およびケンパウロンの存在下で＞３００キナーゼの触媒活性を比較した。本発明者らは、ＣＰＡ生存率アッセイにおいてケンパウロンよりも強力であることが見出されたケンパウロンの構造的アナログであるとして、アルステルパウロンもこの分析に添加した（図４１Ｂ）。次いで本発明者らは、二元階層クラスタリング分析を行って、これら化合物の共有標的をランク付けした。その活性が５つ全ての化合物によって強力に阻害されたキナーゼ（＜１５％キナーゼ活性、０．５μＭ阻害剤濃度で残されている）は、ＭＡＰ４Ｋ／ＳＴＥ２０キナーゼＨＧＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）およびＡＭＰＫ関連キナーゼＮＵＡＫ１を含んでいた（図４１Ａ）。
ＮＵＡＫ１阻害剤ではなくＨＧＫ阻害剤が強力に神経保護的である
【０５０６】
ＨＧＫおよびＮＵＡＫ１の、ＥＲストレス媒介型神経変性に対する機能的関連性を評価するために、本発明者らは、ヒト運動ニューロンＣＰＡ生存率アッセイで公知のＨＧＫおよびＮＵＡＫ１阻害剤を試験した。化合物を、健常な患者から誘導されたヒト幹細胞由来運動ニューロンで試験し、ＣＰＡを３３μＭで添加し７２時間おいた。これらの条件下、運動ニューロン生存率は、ビヒクルのみで処置した対照の約４０％まで降下する。
【０５０７】
本発明者らは、ＮＵＡＫ１阻害剤ＷＺ４００３（ＮＵＡＫ１に関するＩＣ５０＝２０ｎＭ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４））およびＨＴＨ  ０１−０１５（ＮＵＡＫ１に関するＩＣ５０＝１００ｎＭ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４））が、８点希釈系列全体にわたってＣＰＡ毒性をレスキューできないことを見出した（図４１Ｂおよび図４３Ａ）。２μＭよりも上の濃度では、ＣＰＡが存在しない場合であっても、ＷＺ４００３およびＨＴＨ  ０１−０１５が共に、運動ニューロンに対して毒性であった（図４３Ａ）。まとめると、これらの結果は、ＥＲストレス媒介型神経変性の処置においてＮＵＡＫ１阻害剤が適切なリード化合物ではないことを示した。
【０５０８】
一方、本発明者らは、ＨＧＫ活性を阻害することが既に示された３種の化合物：ＰＦ−６２６０９３３（Ａｍｍｉｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）、ＧＮＥ−４９５（Ｎｄｕｂａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）、およびＵＲＭＣ−０９９（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）も試験した。ＰＦ−６２６０９３３およびＧＮＥ−４９５は、元々、ＨＧＫを阻害するよう設計されており（共にＩＣ５０は３．７ｎＭである；（Ａｍｍｉｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；Ｎｄｕｂａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５））、一方、ＵＲＭＣ−０９９は、元々、ＭＡＰ３ＫキナーゼＭＬＫ３を阻害するよう最適化された。それにも関わらず、ＵＲＭＣ−０９９は、１μＭでの無細胞アッセイで、ＨＧＫを結合しかつその活性の＞９９％を阻害することを示した（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。
【０５０９】
ＰＦ−６２６０９３３は、ＣＰＡ処置後に運動ニューロン生存率を、１．２μＭでビヒクル対照の６３％までレスキューした（図４１Ｂおよび図４３Ｂ）。ＧＮＥ−４９５は、生存率を、２．４μＭで基礎レベルの最大７３％まで回復させた。３種の化合物の中で、ＵＲＭＣ−０９９は、ＣＰＡ誘発性神経変性からの運動ニューロンのレスキュー時に最も有効であり、０．６μＭで基礎レベルの９０％まで生存率を回復させた（図４１Ｂおよび図４３Ｂ）。したがって本発明者らは、さらなる分析および最適化のために、ＵＲＭＣ−０９９（化合物１）を選択した。
化合物１はＪＮＫ経路のＥＲストレス媒介型活性化を阻害する
【０５１０】
化合物１が、本発明者らが既に同定している神経保護キナーゼ阻害剤と同じ分子経路を通して作用するか否かを決定するために、本発明者らは、そのストレス関連転写因子ｃ−Ｊｕｎの活性化を阻害する能力を評価した。本発明者らは、ＣＰＡ処置が、セリン６３、アポトーシス遺伝子転写を媒介することが公知の部位（Ｐｕｌｖｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）で、ｃ−Ｊｕｎリン酸化を急速に増大させること、ならびにＫ２５２Ａ、ケンパウロン、およびＧｏ６９７６が、ｃ−Ｊｕｎリン酸化をこの部位で減少させることを示してきた（実施例１２参照）。ＨＧＫ阻害剤ＧＮＥ−４９５は、神経栄養因子除去に供されたニューロンにおけるｃ−Ｊｕｎリン酸化も阻害する（Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。ここで本発明者らは、ウェスタンブロットによって、化合物１がＣＰＡ処置済み運動ニューロンにおいてｃ−Ｊｕｎリン酸化を、検出閾値よりも低いレベルまで減少させることを観察した（図４１Ｃ）。
【０５１１】
ストレスを受けたニューロンにおいて、ｃ−Ｊｕｎは、ＪＮＫキナーゼ（ＭＡＰＫ８−１０）によりセリン６３でリン酸化される（Ｐｕｌｖｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。化合物１は、炎症促進性条件下、マウスミクログリアにおいてＪＮＫリン酸化を減衰させることが示されており（Ｍａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）；同様に、ＨＧＫ阻害剤ＧＮＥ−４９５は、ストレス受けた感覚ニューロンにおけるＪＮＫリン酸化を減衰させることが示されている（Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。化合物１が、ＥＲストレスに供された運動ニューロンにおいてＪＮＫ経路にも作用するか否かを決定するために、本発明者らは、ストレス応答を調節することが公知の部位でリン酸化された３種全てのＪＮＫキナーゼを認識する抗体を使用して、ＣＰＡ処置済み運動ニューロン培養物に対してウェスタンブロットを行った。本発明者らは、化合物１が、ＣＰＡ処置のみと比較して、ＪＮＫリン酸化を著しく減少させることを見出した（図４１Ｃ）。これらの知見は、化合物１の神経保護活性が、そのＪＮＫ経路の減衰にリンクしており、かつＨＧＫをＪＮＫ活性化にリンクさせた以前の研究に倣うことを示唆している（Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。
構造ベースの化合物設計は強力かつ有効な化合物１の誘導体をもたらす
【０５１２】
ＵＲＭＣ−０９９が、ＭＬＫ３阻害に関して当初は最適化されたことを考慮して、本発明者らは、より強力で有効な誘導体が、ＨＧＫを阻害するようにそれらの能力を最適化することによって得ることができると推測した。潜在的なアナログの設計を助けるため、本発明者らは、Ｇｌｉｄｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｓｕｉｔｅ）を使用して、ＵＲＭＣ−０９９（化合物１）をＨＧＫ（ＰＤＢ  ＩＤ：５ＤＩ１）の結晶構造にドッキングさせた（図５Ａ）。ドッキングポーズおよび結合部位相互作用図（図５Ｂ）から：１）７−アザインドール部分は、キナーゼのヒンジ領域に結合し、かつ活性に必須であり；２）ピペラジン部分は、溶媒曝露領域内に延び、かつ分子の安定性および物理化学特性を改善するよう修飾することができ；および３）インドール側鎖は、結合ポケットにおける相互作用を最適化しかつキナーゼ特異性を増大するように修飾することができることが、明らかにされた。
【０５１３】
これらの観察に基づいて、本発明者らは、一連の化合物１アナログを生成させることとした。しかしながら、公開された合成経路は容易に拡大縮小されなかった：側鎖（スキーム１、Ｒ基）は第１のステップで導入され、合成全体を通して保持されなければならず、これは多数の側鎖アナログの生成に効率的ではない。したがって本発明者らは、柔軟性が増大した、改善された合成経路を開発した（スキーム１）。第１のステップにおいて、圧力管内での５−ブロモ−７−アザインドール（２）と４−ホルミルボロン酸とのスズキカップリングは、アルデヒド３を提供した。ジクロロメタン中での、室温での１−メチルピペラジンとの還元的アミノ化は、化合物４をもたらした。次の２つのステップでは、化合物４は、３位でヨウ素化され、その後、アザインドール上にＢｏｃ基が導入された。この基に先立つ初期の試みは、後続のスズキカップリングで著しく減少した収率をもたらした。化合物５は、いくつかのボロン酸およびボロン酸ピナコールエステルとの最終的なスズキカップリングの基質として使用した。都合の良いことに、Ｂｏｃ基は、これらの反応条件下で脱保護され、追加の脱保護ステップが回避された。化合物１および所望のアナログ６ａ〜６ａｚを、分取ＨＰＬＣによる精製後に、中程度から良好な収率（４０〜８８％）で単離した。
【０５１４】
この合理化された合成経路を確立した後、本発明者らは、新たに設計された化合物１アナログを、運動ニューロンにおけるＣＰＡ毒性をレスキューする能力のために生成された（一度に約５）として評価し、アナログ設計に対する実時間フィードバックが得られた。各生存率アッセイ後、最も有効な化合物を、新しいアナログ集合の足場として使用した。この反復最適化プロセスを経て、本発明者らは最初に化合物１の４９種のアナログを開発し、試験した。
【０５１５】
これらおよび全ての後続の生存率実験で、本発明者らは、ＡＬＳを引き起こすＳＯＤ１Ａ４Ｖ突然変異を持つヒトＥＳ運動ニューロンを使用して、本発明者らのアナログのトランスレーショナルポテンシャルを最大化させた（実施例１２参照）。これらの細胞における生存率は、ＣＰＡ処置（３３μＭ）の７２時間後に、未処置の対照の約１０％まで降下した（以前使用されていた対照ヒト運動ニューロン系における約４０％と比較して）。これらの条件下、化合物１による処置は、ＣＰＡ誘発性神経変性を、１μＭで完全にレスキューした（未処置の対照の１０２％）（図４２Ｂ）。４９種のアナログの中で、１１種は、化合物１よりも大きい最大有効性が実証され（図３Ａおよび表Ｓ１）、一部のアナログは、ＣＰＡとは独立して７２時間のアッセイ全体にわたり生じた細胞死の基礎レベルに対抗することも示している。さらに、５種のアナログは、化合物１よりも強力であり（ＥＣ５０≦０．２２ｍＭ）、４種の化合物は、化合物１よりも有効でありかつ強力であった（図４２Ａおよび表Ｓ１）。２種のアナログのみが、完全に効果がなかった（生存率≦ＣＰＡのみ）。まとめると、これらの結果は、ここで着手した薬物設計に対する反復手法の有効性を強調する。
表Ｓ１．化合物１およびそのアナログに関するＥＣ５０およびＥｍａｘの概要
【表Ｓ１−１】
2021518856.tif 000173
【表Ｓ１−２】
2021518856.tif 000174
代謝安定性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ最適化が化合物１２ｋをもたらす
【０５１６】
強力に神経保護的なアナログの代謝安定性を評価するために、本発明者らは、ＮＡＤＰＨ再生系を含有する緩衝液中で化合物をマウス肝ミクロソームと共にインキュベートする、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを確立した。アリコートを、２時間の過程で採取し、内部標準を使用するＨＰＬＣ−ＭＳにより分析して、経時的な化合物安定性を評価した。既に公開された研究（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）に従って、本発明者らは、化合物１が、マウス肝ミクロロームにおいて比較的短い半減期を有することを見出した（Ｔ１／２＝１５分；図１３Ａ）。ミクロソームにおける３０分未満の半減期を持つ化合物は、それらの高いクリアランス率に起因して、一般に理想的な薬物候補ではない。最初に評価された１１種のアナログの中で、２種のアナログ（７ｙ、７ａｄ）のみが有望な半減期（＞３０分、図１１）を示した。
【０５１７】
次に本発明者らは、さらなる構造修正を経てアナログの半減期を改善しようと試みた。本発明者らの計算的ドッキング実験は、メチルピペラジン部分が溶媒曝露されることを示し、これはその修正が、化合物の薬物動態特性を変化させ得ると共にＥＲストレスアッセイでそれらの効力が維持されることを示唆している。
【０５１８】
二環式メチルピペラジンの、本発明者らの最も強力なアナログの１種への導入（スキーム１１）は、半減期を９分から１３分に延ばした（化合物１２ｅ；図１１）。本発明者らのアナログのミクロソーム安定性をさらに高めるために、本発明者らは、同じ二環式ピペラジンを、半減期が＞３０分である初期の系列からのアナログの１種に導入した（化合物７ａｄ；図１１）。この場合、本発明者らは、半減期を３８分から１５８分に、かなり延ばすことができた（化合物１２ｆ；図１１）。
【０５１９】
化合物１２ｆは、運動ニューロン生存率アッセイにおいて化合物１よりも強力であり、ＥＣ５０は０．１１μＭ（表Ｓ１）であったが、０．３μＭよりも高い濃度では急激に毒性になった（図４２Ｂ）。効力およびミクロソーム安定性を維持しつつ、この毒性の増大を軽減するために、本発明者らは、７−アザインドール足場の３位にｍ−クロロフェニルまたはｍ−フルオロフェニル置換基を含有する別の系列のアナログを合成した（スキーム１２）。本発明者らは、ＥＲストレスアッセイにおけるこれらの化合物の効力、およびそれらのミクロソーム安定性アッセイにおける安定性を評価した。これらの化合物の２種、１２ｇおよび１２ｊは、望まれるよりも短い半減期を有するか、またはＥＲストレスアッセイにおいて効力の減少を示した。残りの４種の化合物（１２ｈ、１２ｉ、１２ｋ、および１２ｌ）は、ＣＰＡ誘発性ＥＲストレスから運動ニューロンを強力にレスキューし、＜０．３μＭの濃度でＣＰＡ処置の影響を完全に否定することができた。得られた化合物の１種、１２ｋは、ミクロソームアッセイにおいて＞１２０分の半減期を有し（図１３Ａ）、０．０９９μＭの改善されたＥＣ５０で、ＣＰＡ誘発性神経変性をレスキューした（図４２Ｂ）。
化合物１２ｋはｉｎ  ｖｉｖｏで安定であり経口的にバイオアベイラブルであり高度に脳透過性がある
【０５２０】
ミクロソームアッセイにおけるその強力な性能に基づいて、１２ｋを、ｉｎ  ｖｉｖｏでのさらなる薬物動態分析用に選択した。化合物１および１２ｋを、８週齢の野生型Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊマウスに、腹腔内（ＩＰ）注射または強制経口投与（ＯＧ）を経て１０ｍｇ／ｋｇで投与した。脳および血漿を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に、２４時間かけて４点にわたり収集した。
【０５２１】
１２ｋの薬物動態特性を、いくつかの尺度に関して１に対して改善した。血漿における曲線下面積（ＡＵＣ）は、１と比較して１２ｋで低減したが、脳における１２ｋのＡＵＣは、ＩＰおよびＯＧ投与の両方の後で大きく増大し、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソームアッセイにより予測されたクリアランス率の減少と一致した（表４）。脳内の１２ｋの濃度は、脳対血漿比の場合のように、評価される全ての時点および投与経路において１に対して増大し（図３４Ａおよび図３４Ｂ、ならびに表４）、脳透過性の改善が示された。ＩＰ注射された動物における１２ｋの脳Ｃｍａｘは、１１６２ｎｇ／ｇ（＝２．６０μＭ；図３４Ａおよび図３４Ｂ、ならびに表４）であり、これは、ＣＰＡ運動ニューロン生存率アッセイでレスキューするのに必要とされる閾値濃度を大きく超えた（図４２Ｂ）。ＯＧ処置された動物に対する、ＩＰにおける血漿測定に対する経口バイオアベイラビリティー（Ｆ％）は、化合物１に関して４６％であり、これはＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．により報告された値と一致する（Ｆ％＝４１；（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３））。一方、１２ｋに関するＦ％は７３％であり、１と比較して著しく増大した。類似の結果が、脳測定値（Ｆ％＝７３％）を比較することにより、１２ｋに関して得られた。まとめると、これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、特に中枢神経系の研究における将来の使用に１２ｋが十分適していることを示す。
【表４】
2021518856.tif 000175
ＭＬＫ３阻害ではなくＨＧＫ阻害が運動ニューロン生存率に強力に相関する
【０５２２】
本明細書で生成させ試験された一群の化合物１アナログは、化合物１がＭＬＫを阻害するよう最初に最適化されたので、ＨＧＫまたはＭＬＫ阻害が運動ニューロン生存率に関してより重要か否かを調査するための、独自の機会を提供した。化合物１および５３種のアナログ（７ｂ〜１２ｅ）の神経保護作用を、１μＭで、ＣＰＡ処置されたヒトＡＬＳ運動ニューロン培養物中で同時に評価した（表Ｓ２）。一方、同じアナログを、放射標識ＡＴＰアッセイにおいて分析して（１０μＭ  ＡＴＰ；Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）、それらが無細胞環境でＨＧＫ、ＭＬＫ１、またはＭＬＫ３の活性を阻害できる程度を比較した（表Ｓ３およびＳ４）。化合物を、ＭＬＫ１およびＭＬＫ３阻害に関して０．１μＭで、ならびにＨＧＫ阻害に関して０．０２５μＭおよび０．１μＭで試験した。０．０２５μＭアッセイからのデータは、多くの化合物が０．１μＭでＨＧＫを完全に阻害するので、さらなる分析のために選択され、それによって神経保護アナログ同士のＨＧＫ阻害の僅かな相違がマスキングされた（表Ｓ４）。
【０５２３】
次いで本発明者らは回帰分析を使用して、ＨＧＫ、ＭＬＫ１、またはＭＬＫ３を阻害する所与のアナログの能力を、ＣＰＡ生存率アッセイでヒトＡＬＳ運動ニューロンをレスキューするその能力と比較した。全体として、本発明者らは、ＭＬＫ３活性の阻害と神経保護との間に適度なしかし有意な相関を観察した（Ｒ２＝０．５２；ｐ＜０．０００１；図７Ａ）。本発明者らは、ＭＬＫ１、ＪＮＫ経路を活性化することも示されているＭＬＫ３のパラログに関して同じ分析を行ったが（Ｇａｌｌｏ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  ２００２）、その相関がさらに弱いことを見出した（Ｒ２＝０．４０；ｐ＜０．０００１；図７Ａ）。一方、本発明者らは、ＨＧＫ活性の阻害と神経保護との間にロバストな相関を観察した（Ｒ２＝０．８４；ｐ＜０．０００１；図７Ｂ）。これらの知見は、ＨＧＫが、化合物１およびそのアナログの潜在的に重要な生物学的標的であることを指摘する。
表Ｓ２．１μＭでの５４種のアナログに関するＳＯＤ１Ａ４Ｖ運動ニューロン生存率の結果。
【表Ｓ２−１】
2021518856.tif 000176
【表Ｓ２−２】
2021518856.tif 000177
表Ｓ３．化合物１および６０種のアナログに関してＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐによって行われた放射リガンド結合アッセイを使用するＭＬＫ１およびＭＬＫ３に関する阻害プロファイル。
【表Ｓ３−１】
2021518856.tif 000178
【表Ｓ３−２】
2021518856.tif 000179
＊化合物は、０．１μＭの濃度で、単回用量二重モードで試験した。反応は、１０μＭ  ＡＴＰで実施した。
表Ｓ４．化合物１および６４種のアナログに関してＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐによって行われた放射リガンド結合アッセイを使用したＨＧＫに関する阻害プロファイル。
【表Ｓ４−１】
2021518856.tif 000180
【表Ｓ４−２】
2021518856.tif 000181
＃６  ＊化合物は、ＨＧＫに関して０．０２５μＭおよび０．１μＭの濃度で、２回用量単一検体モードで試験した。反応は、１０μＭ  ＡＴＰで実施した。
関連あるＭＡＰ４Ｋの阻害は運動ニューロン生存率に相関する
【０５２４】
化合物１およびそのアナログの生物学的に関連ある標的をさらに調べるために、本発明者らは、ＣＰＡアッセイで中程度から非常に強力な保護にまで及ぶ１０種のアナログを選択し、放射標識ＡＴＰアッセイにおいて０．１μＭで６０種のヒトキナーゼのパネルを阻害するそれらの能力を評価した（表Ｓ５）。拡張パネルのキナーゼは、公知の化合物１の標的（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）、公知のその他のキナーゼ阻害剤の標的であってＣＰＡ生存率アッセイでは保護的であるもの（実施例１２参照）、および文献からの関連ある標的から選択した。ＲＮＡｓｅｑデータを使用して、ＥＳ運動ニューロンにける各キナーゼの発現を確認した（実施例１２参照）。
【０５２５】
ＣＰＡアッセイにおけるアナログの機能的標的を解析するために、本発明者らは、所与のキナーゼの活性の阻害が相関する程度を、ＣＰＡアッセイにおける神経保護と比較する回帰分析を行った。試験されるアナログの１０種全てによって活性が不十分に阻害されたキナーゼ（０．１μＭで、＞２０％の活性が残される）は、分析から除外した。本発明者らは、ＨＧＫ、ＴＮＩＫ、ＭＩＮＫ１（ＭＡＰ４Ｋ６）、ＧＣＫ（ＭＡＰ４Ｋ２）、およびＫＨＳ（ＭＡＰ４Ｋ５）の阻害が、神経保護に強力に相関することを見出した（図３２）。これらの知見は、本発明者らの予備スクリーンからヒットされた化合物の共有標的の、本発明者らの分析とも一致しており（図４１Ａ）、ＨＧＫ、ＭＩＮＫ１、ＧＣＫ、およびＫＨＳは全て、最も高度にランク付けされた標的の中にあった（ＴＮＩＫは、共有標的の本発明者らの初期分析で現れなかったが、その活性が既存の公的に利用可能なデータベースで評価されなかったからである（Ａｎａｓｔａｓｓｉａｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１））。全てのＭＡＰ４Ｋキナーゼの触媒ドメインは高度に保存されているので、神経保護は、いくつかのＭＡＰ４Ｋファミリーメンバーの阻害によって同時に媒介されるようである（Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。
表Ｓ５．化合物１および９種のアナログに関してＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐによって行われた放射リガンド結合アッセイを使用した化合物１の６０種の公知の標的に関する阻害プロファイル（化合物は、０．１μＭの濃度で、単回用量単一検体モードで試験した。反応は、１０μＭ  ＡＴＰで実施した）。
【表Ｓ５−１】
2021518856.tif 000182
【表Ｓ５−２】
2021518856.tif 000183
化合物１２ｋの追加のキナーゼ標的の同定
【０５２６】
１２ｋの増大した効力および好ましい薬物動態プロファイルは、１２ｋを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの将来の研究に向けた強力な候補にし、その場合、オフターゲット作用が考慮されることになる。包括的なキナーゼ阻害プロファイルを得るために、化合物１および１２ｋを、３７１ヒトキナーゼの拡張パネル全体にわたり、無細胞放射標識ＡＴＰアッセイで０．０２５μＭで試験した（図３８Ａおよび図３８Ｂ、表Ｓ６）。本発明者らは、ＭＡＰ４Ｋ、ＭＩＮＫ１、ＫＨＳ、ＨＧＫ、ＧＬＫ、およびＧＣＫが、１に対して１２ｋ曝露後の活性に最高度の変化を示すことを見出した（それぞれ、２２．５６、１７．３６、１４．９２、６．８４、および６．２２倍の変化；図３８Ｃ）。しかしながら、いくつかの非ＭＡＰ４キナーゼは、神経変性への関与が既に示唆されているキナーゼであるＮＵＡＫ１（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）およびＬＲＲＫ２（Ｉｓｌａｍ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，  ２０１７）も含め、１の曝露に対し、１２ｋによってさらに効率的に（＞１．５倍）阻害された。これらの観察は、ＭＡＰ４Ｋを超える追加のキナーゼ標的が、１２ｋの高い効力に関与するという可能性を上昇させた。遺伝的ノックダウンまたはノックアウトなどのさらなる標的分析は、本発明者らの神経変性モデルにおけるこれら追加のキナーゼの役割を解析するために正当化され得る。
表Ｓ６．化合物１および１２ｋアナログに関してＲｅａｃｔｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐによって行われた放射リガンド結合アッセイを使用する３７１野生型ヒトキナーゼに関する阻害プロファイル
【表Ｓ６−１】
2021518856.tif 000184
【表Ｓ６−２】
2021518856.tif 000185
【表Ｓ６−３】
2021518856.tif 000186
【表Ｓ６−４】
2021518856.tif 000187
【表Ｓ６−５】
2021518856.tif 000188
【表Ｓ６−６】
2021518856.tif 000189
【表Ｓ６−７】
2021518856.tif 000190
【表Ｓ６−８】
2021518856.tif 000191
【表Ｓ６−９】
2021518856.tif 000192
＊化合物を、０．１μＭの濃度で、単回用量単一検体モードで試験した。反応は、１０μＭ  ＡＴＰで実施した。
化合物１２ｋは化合物１の抗炎症特性を維持するがそのＭＡＰ４Ｋでの活性を通してではない
【０５２７】
化合物１は、ＨＩＶ関連神経炎症のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルで当初検証され、ミクログリアによって炎症性サイトカイン産生が減衰することが示された（Ｍａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。本明細書に記述される化合物１アナログを開発する際の本発明者らの目的は、ニューロン死を予防できる、強力な、代謝的に安定な薬物を生成させることであったが、ＡＬＳなどの神経変性障害が侵襲的小膠細胞症も伴い（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）かつ小膠細胞症の薬物媒介型阻害がＡＬＳのげっ歯モデルで保護的である（Ｔｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）ことを踏まえ、本発明者らは、最適化された化合物がミクログリアサイトカイン放出もモジュレートできるのか否かを問うた。この疑問は、Ｍａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に従って、化合物１の抗炎症作用がミクログリア内のＭＬＫ３によって編成される事実によっても促された（Ｍａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）；一方、ここで試験されるアナログの全ては、化合物１と比較してＭＬＫ３で活性が減じられることを示した。
【０５２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでミクログリア活性化をモデル化するために、本発明者らは、マウスＮ９ミクログリア細胞を高濃度のＥ．ｃｏｌｉ由来のリポ多糖（ＬＰＳ）（０．１〜５μＭ）で刺激して、炎症促進性サイトカインＴＮＦαの細胞培養培地への放出を測定した。ここで選択されたＬＰＳ濃度の範囲は、ＴＮＦα分泌の用量依存的増加を誘発したが（図４４）、Ｎ９細胞死は誘発しなかった（データは図示せず）。次いで本発明者らは、ＬＰＳおよび化合物１または最適化されたアナログ１２ｋで同時処置された培養物中のＴＮＦα分泌を比較し、ＭＡＰ４Ｋで増大した活性が示されたが（図４２Ｂ）、ＭＬＫ３では僅かに減少した活性が示された（６６．９９％のＭＬＫ３活性が０．２５μＭの１２ｋで残され、それに対して５６．３９％のＭＬＫ３活性が０．０２５μＭの１で残された；表Ｓ６）。本発明者らは、化合物１２ｅも試験し、これはＨＧＫ活性を強力に阻害し（２．７３％のＨＧＫ活性が０．０２５μＭの１２ｅで残される；表Ｓ４）かつ高度に神経保護的であったが（表Ｓ２）、ＭＬＫ３では活性がほとんどなかった（１に関する１０．５％と比較して、７１．８１％のＭＬＫ３活性が０．１μＭの１２ｅで残された；表Ｓ３）。
【０５２９】
本発明者らは、化合物１が、ＬＰＳの全濃度にわたり、刺激を与えたミクログリアにおいてＴＮＦα分泌を著しくかつ用量依存的に減少させたことを見出したが、これはその既に報告された抗炎症作用と矛盾のないものであった（図４４）。化合物１２ｋも、ＴＮＦα分泌を著しく減少させたが、このアッセイでは化合物１ほど強力ではなかった（図４４）。一方、化合物１２ｅは、最高ＬＰＳ濃度を除いて０．５μＭで添加したとき、ＴＭＦαレベルを著しく減少させなかった（図４４）。まとめると、これらの知見は、この文脈においてＭＡＰ４Ｋ阻害がＴＮＦα放出を軽減させず、かつＭＬＫ３などの非ＭＡＰ４Ｋ標的の保持が抗炎症活性を化合物１アナログに与え得ることを示唆する。さらに、これらの知見は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのキナーゼ阻害の抗炎症作用に対して神経保護を解離させるのに、１２ｅが価値あるツール化合物になり得ることも示す。
考察
【０５３０】
ＥＲストレスに供されたヒト運動ニューロンにおける本発明者らの以前の研究は、強力な神経保護剤として広域スペクトルキナーゼ阻害剤を指摘した。ここで本発明者らは、これらの保護化合物の共有標的が、ＨＧＫ、ＭＩＮＫ１、ＧＣＫ、およびＫＨＳ、密接に関連するＭＡＰ４Ｋの群を含むことを決定した。化合物１を足場として使用して、本発明者らは、その有効性がＭＡＰ４Ｋを遮断するそれらの能力で追跡される、神経保護的で薬理学的に安定な化合物のアレイを開発した。
【０５３１】
本発明者らの初期の焦点は、ＨＧＫ、運動ニューロン変性への関与がこれまで示唆されてきたキナーゼに対するものであったが（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）、多数のＭＡＰ４Ｋが、ＥＲストレスの文脈で神経変性を媒介するよう協働して働くことが可能である。Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）は、ＧＮＥ−４９５、即ちＨＧＫ、ＴＮＩＫ、およびＭＩＮＫ１を阻害する小分子が、神経栄養因子除去に供された１次後根神経節ニューロンにおいて神経保護的であることを示してきた。さらに、３種全てのキナーゼは一緒に−個々にではなく−阻害剤の影響を再現した。それらは、それらの神経変性アッセイで関連あるＭＡＰ４Ｋの役割が冗長であり、単一キナーゼを阻害する作用が残りのキナーゼの活性によって打ち負かされる可能性があると論じている。したがって、多数のＭＡＰ４Ｋを組み合わせた阻害は、ＣＰＡ処置済み運動ニューロンにおいて化合物１およびそのアナログのロバストな神経保護作用の基礎をなすことが可能である。
【０５３２】
一方、ＥＲストレスの文脈における活性化ＭＡＰ４Ｋの下流標的は、不完全に理解される。本発明者らは、ＣＰＡ処置が、ＪＮＫおよびｃ−Ｊｕｎリン酸化を誘発し、化合物１によってこれら全てを反転させることができることを見出した。本発明者らは、ＭＬＫ３およびＭＬＫ１、共に化合物１によって強力に標的とされるＭＡＰ３Ｋの阻害が、適度にしかし有意に神経保護に相関することも見出し、これは多数のＭＡＰ３Ｋキナーゼの活性が、下流のＭＡＰ２Ｋ標的に会合するのに必要とされる可能性があることを示唆している。この考えに沿って、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）は、ＨＧＫ阻害剤ケンパウロンが、運動ニューロンにおける神経栄養因子除去後にＴＡＫ１（ＭＡＰ３Ｋ７）のリン酸化を防止することを見出した。その他の研究は、軸索損傷へのＤＬＫ（ＭＡＰ３Ｋ１２）の関与を示唆しており、ここで、ＤＬＫは神経変性（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）および軸索再生（Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）の両方を促進する。感覚ニューロンにおける神経栄養因子除去が、カンペノットチャンバーの軸索区画に制限される実験では、ＤＬＫのアポトーシス促進活性が、ＭＡＰ４Ｋによって媒介されることが示された（Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７ａ）。まとめると、これらの観察は、ＭＡＰ４Ｋの下流エフェクターが、細胞型または損傷に応じて変化し得ること、さらに化合物１およびそのアナログが神経変性の多数のモデルにわたって保護的になり得ることを示唆している。
【０５３３】
同時に、１および１２ｋのキノームワイドプロファイル（図３８Ａおよび図３８Ｂ；表Ｓ６）は、どちらの化合物もＭＡＰキナーゼに関して完全に選択的ではないことを明らかにする。化合物１およびそのアナログの非ＭＡＰＫ標的の一部は、それらの神経保護作用を高め得ることが可能である。その阻害が神経保護に強力に相関しているその他のキナーゼには、ＰＲＫＤ３、ＡＢＬ１、およびＡＢＬ２が含まれる（表Ｓ６）。したがって本発明者らは、非サブタイプ特異的な手法でＰＫＣまたはＡＢＬキナーゼを標的とするキナーゼ阻害剤が（例えば、それぞれＲｏ−３１８２２０メシレートおよびボスチニブ）、ＣＰＡ処置済み運動ニューロンにおいて適度に保護的であることを観察した（データは図示せず）。さらに、ボスチニブの添加およびＡＢＬ１の遺伝的アブレーションは共に、ＡＬＳのヒト幹細胞由来の運動ニューロンモデルにおいて神経保護的であることが示されている（Ｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。ＰＲＫＤ３およびＡＢＬ１などのキナーゼがＣＰＡの文脈においてどのように活性化され得るのか明らかではない（おそらくＪＮＫ経路の下流または直交して活性化され得る）が化合物１およびそのアナログの広域スペクトル作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ運動ニューロン生存率アッセイにおいてそれらが首尾良くなされるのに重要となり得る。
【０５３４】
本発明者らの研究は神経変性に焦点を当てるが、ｉｎ  ｖｉｖｏで非ＭＡＰ４キナーゼおよび／または非ニューロン細胞を標的とすることもさらに相当な利益となり得る。主な例は、化合物１がＭＬＫ３を介してミクログリア活性化をロバストに阻害し、それによって、ＨＩＶ関連の神経炎症の文脈でシナプス損失が防止されることである（Ｍａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。小膠細胞症は、多くの神経変性障害の特徴であり、ＡＬＳのネズミモデルで容易に観察される（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ミクログリアがＡＬＳの文脈で助けになるのか有害であるのかに関し、いくつかの議論があるが（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；Ｇｏｗｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；Ｓｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）（おそらくは共に、疾患のステージに依存する）しかしキナーゼ阻害剤マシチニブによる処置は、小膠細胞症を減衰させかつ後期ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ突然変異体ラットにおける疾患の進行を遅くすることが示されてきた（Ｔｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。本発明者らは、最適化されたアナログ１２ｋが、ミクログリアサイトカイン放出を阻害する能力を保持し、それがＭＬＫ３活性を遮断するその能力に依存し得ることを見出した。したがって、神経変性を超えて、神経炎症および神経変性経路を共に標的としてここで生成した化合物１２ｋおよびその他の化合物１アナログは、ＡＬＳに関する特に強力な治療候補になり得る。
【０５３５】
最後に、ＭＡＰ４Ｋは、肥満症（Ｄａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）、インスリン耐性（Ａｍｍｉｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５；Ｂｏｕｚａｋｒｉ  ａｎｄ  Ｚｉｅｒａｔｈ，  ２００７；Ｃｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；Ｆｌａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６；２０１７；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｔｅｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、アテローム性動脈硬化症（Ａｏｕａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；Ｖｉｒｂａｓｉｕｓ  ａｎｄ  Ｃｚｅｃｈ，  ２０１６）、肝細胞癌（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）、肺腺癌（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、結直腸がん（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８；Ｓａｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１８）、およびヒト腫瘍の多くのタイプにおける一般的な形質転換および転移プロセス（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）も含め、ＣＮＳ以外の多数の多様な障害への関与が示唆されてきた。したがって、ここで生成した化合物は、幅広いヒト疾患にわたって広範な治療可能性を有し得る。
材料および方法
ヒトおよびマウス幹細胞系の生成
【０５３６】
リード化合物を同定するための予備的な生存率アッセイを、野生型運動ニューロンレポーターｉＰＳ細胞系から誘導されたヒト運動ニューロンで行った。この系は、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子標的戦略を使用して、ＮＣＲＭ−１対照ｉＰＳ系（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ−１Ｅ７１）から生成させたが、この場合、ｉＣｒｅ−ＩＲＥＳを運動ニューロン特異的ＶＡＣｈＴプロモーター領域のＮ末端で挿入し、ＣＡＧＧＳ−ｌｏｘ−ＳＴＯＰ−ｌｏｘ−ＴｄＴｏｍａｔｏをＡＡＶＳ１セーフハーバー座に挿入した。クローンを配列決定して両方の挿入を確認し、さらなる伝播のために選択されたクローンを核型化した。
【０５３７】
化合物１アナログを特徴付けるための生存率アッセイを、前述のようにヘテロ接合型ＳＯＤ１Ａ４Ｖ点突然変異を持つＨＢ９：ＧＦＰ運動ニューロンレポーター胚性幹細胞系から誘導されたヒト運動ニューロンで行った（実施例１２参照）。
【０５３８】
ウェスタンブロット実験を、ヘテロ接合型Ｔｇ（Ｈｌｘｂ９−ＧＦＰ）１Ｔｍｊ運動ニューロンレポーターマウスと、野生型ヒトＳＯＤ１（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１）２Ｇｕｒ／Ｊ）を発現するマウスとの交雑から、Ｔｈａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．により生成させた（実施例１２参照）ＥＳ由来のマウス運動ニューロンで実施した。
【０５３９】
全ての細胞系を、マイコプラズマに関して通常通り試験した。
ヒト運動ニューロン分化
【０５４０】
ヒト運動ニューロンを、上述のように、上記ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞から分化させた（Ｍａｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４；実施例１２）。幹細胞を、ノックアウトマウス血清代替物（２０％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、非必須アミノ酸（１％、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベータ−メルカプトエタノール（０．１％、Ｓｉｇｍａ）、およびヒト組換え線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補われた無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、照射されたＣＦ−１マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）上で維持した。
【０５４１】
０日目、幹細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して単一細胞内に解離し、懸濁液中で培養される胚様体として１６日間にわたり、運動ニューロンに分化させた。分化は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：１混合物、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１％）、ベータ−メルカプトエタノール（０．１％）、Ｎ２（１％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂ２７（２％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ならびにアスコルビン酸（１０μＭ、Ｓｉｇｍａ）から構成される、Ｎ２Ｂ２７培地で実施した。０〜１日目、分化培地に、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｙ−２７６３２ジヒドロクロリド（１０μＭ、Ａｂｃａｍ）、ＳＢ４３１５４２水和物（ＳＢ、２０μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ、０．１μＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、およびＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ、３μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を補った。２〜７日目、分化培地に、ＳＢ（２０μＭ）、ＬＤＮ（０．１μＭ）、ＣＨＩＲ（３μＭ）、レチノイン酸（１００ｎＭ）、およびソニックヘッジホッグアゴニスト（ＳＡＧ、５００ｎＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補った。７〜９日目、分化培地に、レチノイン酸（１００ｎＭ）、およびＳＡＧ（５００ｎＭ）、および脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補った。９〜１４日目、分化培地に、レチノイン酸（１００ｎＭ）、ＳＡＧ（５００ｎＭ）、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、およびＤＡＰＴ（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）を補った。１４〜６日目、分化培地にレチノイン酸（１００ｎＭ）、ＳＡＧ（５００ｎＭ）、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ）、およびグリア由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補った。
【０５４２】
分化の１６日目、胚様体を、０．０５％トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および機械的研和を使用して解離し、運動ニューロンを、ポリオルニチン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）およびマウスラミニン（３μｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、細胞２０００個／ウェルでプレーティングした。培養物を、Ｎ−２（１％）、Ｂ２７（２％）、抗有糸分裂剤としてウリジンおよびフルオロデオキシウリジンの１：１カクテル（１μＭ、Ｓｉｇｍａ）、ならびに以下の組換えヒト神経栄養因子：ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）で、全て１０ｎｇ／ｍＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で補われた、無血清ニューロバーサル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。
ヒト運動ニューロン生存率アッセイ
【０５４３】
解離およびプレーティング（ＤＩＶ２）後４８時間で、運動ニューロンを、ＣＰＡ（３３μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）および試験化合物で同時に処置した。ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）をビヒクル対照として使用した。全ての試験化合物に関し、ストック溶液をＤＭＳＯ中に調製し、作業溶液を運動ニューロン培地中に調製した。ＷＺ４００３（Ｔｏｃｒｉｓ）およびＨＴＨ  ０１−０１５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を、３複製ウェル中で、０．２５〜３２μＭの、８点２倍希釈系列で試験した。ＰＦ−６２６０９３３（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、ＧＮＥ−４９５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、およびＵＲＭＣ−０９９（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を、３複製ウェルで、０．０７５〜９．６μＭの８点２倍希釈系列で試験した。化合物１アナログを、３複製ウェルで、０．１、０．３、０．５、１、および３μＭで評価した。化合物１アナログのＥＣ５０を、化合物１および５３種のアナログが同時にアッセイされる実験から、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して決定した。
【０５４４】
運動ニューロンを、ＣＰＡおよび試験化合物と共に７２時間、インキュベートした。生細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（１．３μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して視覚化し、バックグラウンド蛍光を、ＰＢＳ中において、ＰＢＳに溶かした１０％ブリリアントブラックの溶液（Ｓｉｇｍａ）でクエンチした。ウェル全体の画像を、Ｐｌａｔｅ  ＲｕｎｎｅｒＨＤシステム（Ｔｒｏｐｈｏｓ）を使用して獲得した。細胞を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してカウントした。全ての細胞のカウントは、生存しているビヒクル（ＤＭＳＯ）処置済み細胞のパーセンテージとして表す。
マウス運動ニューロン分化
【０５４５】
本発明者らは、タンパク質抽出に必要とされる量でマウス運動ニューロンを素早く生成させることができるので、生化学アッセイではヒト運動ニューロンではなくマウスを使用した。分化は、記述されるように実施した（実施例１２；Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。ＥＳ細胞を、ＣＦ−１  ＭＥＦフィーダー層上に維持し、次いで解離し、レチノイン酸（１μＭ）およびＳＡＧ（０．５μＭ）を使用して６日間、分化させた。運動ニューロンを、２％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＧＤＮＦ（４００ｐｇ／ｍＬ）、フォルスコリン（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、およびＩＢＭＸ（１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で維持した。
ＪＮＫ経路調節の生化学分析
【０５４６】
分化６日目の全マウス胚様体を、ＣＰＡ（１０μＭ）および試験化合物で４時間処置し、次いでＨＥＰＥＳ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（１００ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（１％）、ＳＤＳ（０．１％）、ＤＴＴ（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する氷冷緩衝液中に溶解し超音波処理した。総タンパク質含量を、製造業者の使用説明書（Ｐｉｅｒｃｅ）に従い、ＢＣＡキットを使用して分析した。試料ごとに、５０μｇの総タンパク質をＤＴＴ（１００ｍＭ）で１０分間、７０℃で還元し、ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％ビス−ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中にＬＤＳローディング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と共に投入した。試料を、１００Ｖで４時間、４℃で流し、次いでｉＢｌｏｔ乾燥移送システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してニトロセルロース膜に転写した。膜を、５％ＢＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｔｒｉｓ−緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）で遮断し、次いで１次抗体と共に、ＴＢＳ中に５％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎを含有する緩衝液中で、４℃で一晩インキュベートした。１次抗体をホスホ−ｃ−Ｊｕｎに対して（セリン６３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃９２６１）、１：５００で添加し；１次抗体をホスホ−ＪＮＫに対して（ｔｈｒ１８３／ｔｙｒ１８５；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃４６８８）、１：１０００で添加し；１次抗体をＧＡＰＤＨに対して（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１：１０００で、ローディングコントロールとして添加した。０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＢＳ中で洗浄した後、膜を、ヤギ抗ウサギＨＲＰ共役２次抗体溶液（１：１０，０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１時間インキュベートした。次いで膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＴＢＳ中で再び洗浄し、次いでＦｅｍｔｏ  ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で５分間インキュベートした。化学発光を、ＬｉＣｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙを使用して視覚化した。ホスホ−ｃ−Ｊｕｎおよびホスホ−ＪＮＫバンド強度を、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。
化合物１アナログおよび中間体の合成のための一般的な実験の詳細
【０５４７】
出発材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｒｋ  Ｐｈａｒｍ、Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、またはＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、他に指示されない限り、受け取ったままの状態で使用した。全ての溶媒は、試薬グレードであった。カラムクロマトグラフィーを、Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆ＋で、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）順相シリカフラッシュカラムを使用して行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ＳｉｌｉａＰｌａｔｅ（商標）ガラスＴＬＣプレート（２５０μｍ、２０×２０ｃｍ）上で行った。指示される場合には、化合物を、ＧＸ−２７１液体ハンドラーを備えたＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣを使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸ−Ｃ１８カラム（２５０×２１．２ｍｍ、粒度：５μｍ、孔径：１１０Å）上で、分取ＨＰＬＣにより精製した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、指示されるように４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚ分光光度計を使用して、周囲温度で記録した。化学シフトは、残留溶媒ピークに対し、ｐｐｍを単位として報告する（１Ｈ  ＮＭＲ：  ＤＭＳＯ−ｄ６，  δ  ２．５０；  クロロホルム−ｄ，  δ  ７．２６；  メタノール−ｄ４，  δ  ３．３１）。下記の略称を、多重度を示すのに使用する：ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｈｅｐｔ（七重項）、ｍ（多重項）、ｂｒ（ブロード）。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、指示されるように、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により飛行時間型分光計で獲得し、ピークマッチングにより得た。全ての反応を、他に指示されない限り、アルゴン下で火力乾燥したガラス製品内の、窒素またはアルゴンの雰囲気下で実行した。水性溶液を、１８ＭΩ・ｃｍを超える抵抗率のナノ純水から調製した。他に指示しない限り、全ての試薬は市販のものだった。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏミクロソーム安定性
【０５４８】
ミクロソーム安定性アッセイを、９６ウェルフォーマット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＳｔｏｒＰｌａｔｅ−９６Ｕ、ＰＰ、９６ウェル、丸底）で行った。各ウェルに、リン酸緩衝液（１８２．２μＬ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ）を添加し、その後、ＮＡＤＰＨ再生系溶液Ａ（１０μＬ）およびＮＡＤＰＨ再生系溶液Ｂ（２μＬ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｅｎｔｅｓｔ  ３Ｐ  ＮＡＤＰＨ再生系溶液Ａ（＃４５１２２０）およびＢ（＃４５１２００））を添加した。分析がなされる化合物のストック溶液（０．８μＬ、５ｍＭ）またはエトキシクマリン（陽性対照、０．８μＬ、５ｍＭ）を添加し、混合物を３７℃で５分間温めた。マウスミクロソーム（ＣＤ−１、５μＬ、使用前に３７℃の水浴で解凍、２０ｍｇ／ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。選択された時点（０、１５、３０、４５、６０、および１２０分）で、アリコート（１５μＬ）をプレートから引き出し、９６ウェルプレート内で内部標準（５μＬ）を含有する冷アセトニトリル（６０μＬ）を添加してクエンチした。試料を、１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離した。上澄み（４０μＬ）を引き出し、挿入物が入っている試料バイアルに移した。試料をＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０５４９】
ＬＣ−ＭＳ分析を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００と、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｈｙｓｔａｒ３．２により制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたＢｒｕｋｅｒ  ａｍａＺｏｎ  ＳＬとを含むプラットフォームで行った。クロマトグラフィー分離は、試料５μＬを、２０℃で維持したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）に注入することによって行った。流量を、４００μＬ／分で維持した。初期流動条件は、６０％溶媒Ａ（０．１％酢酸を含有する水）および４０％溶媒Ｂ（０．１％酢酸を含有するメタノール）であった。溶媒Ｂを、０．２５分かけて６０％まで上昇させ、６．７５分までに７０％にした。溶媒Ｂは、７．００分までに９５％まで上昇させ、８．００分までに元の初期条件（４０％）まで低下させ、全実行時間は９．００分であった。
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態
【０５５０】
化合物１および１２ｋをＤＭＳＯに溶解して４０ｍｇ／ｍＬにした。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与では、ＤＭＳＯストックをさらに、４０％ＰＥＧ−４００（Ｓｉｇｍａ）および５５％の（２−ヒドロキシプロピル）−ベータ−シクロデキストリン溶液（ナノ純水中２０％、Ｓｉｇｍａ）を含有するビヒクル中で、２ｍｇ／ｍＬまで希釈した。化合物を、８週齢のオス野生型Ｃ５７ＢＩ６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に、腹腔内注射または強制経口投与によって１０ｍｇ／ｋｇで送達した。１５分、３時間、８時間、または２４時間後、動物に、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔をかけ、次いで頭部除去して体幹血液を収集し、新鮮な脳組織を切除した。血液試料をＥＤＴＡ溶液（５０ｍＭ最終濃度）で処置して凝固を防止し、８４５ｒｃｆで１０分間、４℃で遠心分離して、血漿を分離した。新鮮な脳を、５体積のｄｄＨ２Ｏに溶解した。
【０５５１】
血漿試料をエッペンドルフ管に移し（試料当たり５０μＬ）、アセトニトリル（２００μＬ）で希釈した。試料を１分間超音波処理し、その後、１６，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上澄みを別のエッペンドルフ管に移し、溶媒を一晩蒸発させた。試料を、４０μＬのアセトニトリルおよび１０μＬの水の混合物に入れて復元し、挿入物の入った試料バイアルに移し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０５５２】
均質化した脳試料（２５０μＬ）を、エッペンドルフ管に移し、アセトニトリル（７５０μＬ）で希釈した。試料を１分間超音波処理し、その後、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み（９００μＬ）を別のエッペンドルフ管に移し、溶媒を一晩蒸発させた。試料を、８０μＬのアセトニトリルおよび２０μＬの水の混合物に入れて復元し、挿入物の入った試料バイアルに移し、ＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０５５３】
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００と、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｈｙｓｔａｒ３．２により制御されるエレクトロスプレーイオン化源を備えたＢｒｕｋｅｒ  ａｍａＺｏｎ  ＳＬとを含むプラットフォームで行った。各血漿試料中の化合物濃度は、較正曲線を使用して決定した。クロマトグラフィー分離は、試料１０μＬを、２０℃で維持したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）に注入することによって行った。流量を４００μＬ／分で維持した。初期流動条件は、６０％溶媒Ａ（０．１％酢酸を含有する水）および４０％溶媒Ｂ（０．１％酢酸を含有するメタノール）であった。溶媒Ｂを、０．２５分かけて６０％まで上昇させ、６．７５分までに７０％にした。溶媒Ｂは、７．００分までに９５％まで上昇させ、８．００分までに元の初期条件（４０％）まで低下させ、全実行時間は９．００分であった。
ミクログリア培養物、ＬＰＳ処置、およびＴＮＦα  ＥＬＩＳＡ
【０５５４】
不死化Ｎ９マウスミクログリア細胞（Ｃｏｒｒａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）を、ゼラチンでコーティングされた（０．１％、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）９６ウェルプレートに、細胞８０００個／ウェルでプレーティングした。培養物を、ＦＢＳ（１０％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＧｌｕｔａｍａｘ（１％、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＤＭＥＭ中で維持した。プレーティングから２４時間後、細胞を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４（Ｓｉｇｍａ）および試験化合物で、指示された濃度で、ＬＰＳで処置した。ＬＰＳ処置の開始から２４時間後、５０μＬの細胞培養培地（最終培養体積の２５％）を使用して、製造業者の使用説明書（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従い、ＴＮＦα放出に関する定量的ＥＬＩＳＡを行った。吸光度を、分光光度計（ＴＥＣＡＭ）で、４５０ｎＭで評価し、５４０ｎＭでの読取りを波長補正に使用した。培養皿に残されたＮ９細胞を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で処置して、生存能を評価した。５μＬのＡｌａｍａｒＢｌｕｅを各ウェル（５０μＬの培養培地を含有する）に添加し、３７℃で４時間インキュベートした。吸光度を５７０ｎＭで評価し、６００ｎＭでの読取りを波長補正に使用した。
ソフトウェア
【０５５５】
Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（２０１７版、ＴＩＢＣＯ）を使用して、実施例１２に記載される当初のスクリーンからのヒット化合物のキナーゼ標的を比較し、階層的クラスタリングを行った。分子ドッキング、分子モデリング、および視覚化は、Ｇｌｉｄｅ（２０１２−２０１６版、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）およびＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｍａｅｓｔｒｏ（２０１７−１版）を使用して行った。全ての化学構造は、ＣｈｅｍＤｒａｗ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ１６．０（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して描いた。ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＬｉｔｅ（ＬｉＣｏｒ）は、ウェスタンブロットバンド強度を評価するのに使用した。Ｐｒｉｓｍ５、７、および８（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）は、運動ニューロン生存率データおよびＥＣ５０、ウェスタンブロットバンド強度、ミクロソーム安定性データ、ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態パラメーター、キナーゼ活性の阻害と化合物１アナログに関する生存率との間の相関、ならびにＴＮＦα  ＥＬＩＳＡデータを分析するのに使用した。
統計分析
【０５５６】
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで行った。データを、平均±ＳＥＭとして表す。運動ニューロン生存率アッセイからの平均のプロットは、単一アッセイから３重のウェルを表す。データを、正規分布に関して評価した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ウェスタンブロットアッセイにおける運動ニューロンに対する処置の影響を比較した。二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、Ｎ９ミクログリアに対する、ＬＰＳ対化合物１アナログの処置の影響を比較した。一元および二元配置ＡＮＯＶＡは、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定で補って、条件間での相互作用を評価した。Ｐｅａｒｓｏｎのｒを、キナーゼ阻害の程度と運動ニューロンレスキューの程度との間の相関の尺度として使用した。
（実施例１４）
化合物１２ｋに関するＣＮＳにおける安全性および標的会合
【０５５７】
化合物１２ｋに関するＣＮＳでの標的会合を調べるため、化合物１および１２ｋを、野生型マウス（処置当たりｎ＝３）に経口で連続投与した。化合物１を、１００ｍｇ／ｋｇで投与し；化合物１２ｋを、５または１０ｍｇ／ｋｇで投与した。新鮮な脳試料を、処置から７日後に収集した。低減した脳試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗体でプローブし、これはサイクリン依存型キナーゼおよび分裂促進活性化キナーゼの標的に対応するモチーフでリン酸化されたリンタンパク質を認めた。図４５に示されるように、化合物１２ｋは一貫して、ビヒクルまたは化合物１に比べて高分子量バンドの強度を減少させた（矢印）。
【０５５８】
化合物１２ｋの長期投与の安全性を評価するために、化合物１２ｋを、野生型マウスに、１０ｍｇ／ｋｇに相当する濃度の飲料水で連続経口投与した。処置は、Ｐ３０で開始し、６０日間継続した。１２ｋ（ｎ＝３）で処置したマウスは、ビヒクル処置された対照（ｎ＝３）に比べて体質量の適度な増加を実証したが、その他は健常であった（図４６Ａ）。生存率、後肢強度、または肉眼所見における相違は、処置条件の間で観察されなかった（図４６Ｂ）。
引用文献
【化１６９】
2021518856.tif 000193
【化１７０】
2021518856.tif 000194
【化１７１】
2021518856.tif 000195
【化１７２】
2021518856.tif 000196
【化１７３】
2021518856.tif 000197
【化１７４】
2021518856.tif 000198
【化１７５】
2021518856.tif 000199
【化１７６】
2021518856.tif 000200
【化１７７】
2021518856.tif 000201
【化１７８】
2021518856.tif 000202
【化１７９】
2021518856.tif 000203
【化１８０】
2021518856.tif 000204
【化１８１】
2021518856.tif 000205
【化１８２】
2021518856.tif 000206
【化１８３】
2021518856.tif 000207
【化１８４】
2021518856.tif 000208
【化１８５】
2021518856.tif 000209
【化１８６】
2021518856.tif 000210
【化１８７】
2021518856.tif 000211
【０５５９】
本出願で引用された全ての文献は、本明細書で完全に列挙されたかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０５６０】
本発明の例示的な実施形態を本明細書に記述してきたが、本発明は、記述されたものに限定するものではなく、本発明の範囲または精神から逸脱することなく様々なその他の変更または修正を当業者が行ってもよいことを、理解すべきである。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）による化合物
【化２０１】
2021518856.tif 000212
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩であって、
ただし、前記化合物が、
【化２０２】
2021518856.tif 000213
のどれでもない、化合物。
【請求項２】
式（ＩＩ）の構造を有する、請求項１に記載の化合物
【化２０３】
2021518856.tif 000214
［式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで前記Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩であって、
ただし、前記化合物が、
【化２０４】
2021518856.tif 000215
のどれでもない、化合物。
【請求項３】
【化２０５】
2021518856.tif 000216
【化２０６】
2021518856.tif 000217
【化２０７】
2021518856.tif 000218
【化２０８】
2021518856.tif 000219
【化２０９】
2021518856.tif 000220
【化２１０】
2021518856.tif 000221
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項４】
【化２１１】
2021518856.tif 000222
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３に記載の化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項５】
【化２１２】
2021518856.tif 000223
である、請求項４に記載の化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項６】
【化２１３】
2021518856.tif 000224
である、請求項４に記載の化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項７】
【化２１４】
2021518856.tif 000225
である、請求項４に記載の化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項８】
【化２１５】
2021518856.tif 000226
である、請求項４に記載の化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項９】
薬学的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）による１つまたは複数の化合物
【化２１６】
2021518856.tif 000227
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含み、
ただし、前記化合物が、
【化２１７】
2021518856.tif 000228
のどれでもない、医薬組成物。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の化合物が、式（ＩＩ）の構造
【化２１８】
2021518856.tif 000229
［式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで前記Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有し、
ただし、前記化合物が、
【化２１９】
2021518856.tif 000230
のどれでもない、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２２０】
2021518856.tif 000231
【化２２１】
2021518856.tif 000232
【化２２２】
2021518856.tif 000233
【化２２３】
2021518856.tif 000234
【化２２４】
2021518856.tif 000235
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される構造、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２２５】
2021518856.tif 000236
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される構造、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２２６】
2021518856.tif 000237
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２２７】
2021518856.tif 000238
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２２８】
2021518856.tif 000239
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２２９】
2021518856.tif 000240
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を、前記化合物の使用のための使用説明書と一緒に含むキット。
【請求項１８】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、前記医薬組成物の使用のための使用説明書と一緒に含むキット。
【請求項１９】
それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化２３０】
2021518856.tif 000241
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、
ただし、前記化合物が、
【化２３１】
2021518856.tif 000242
のどれでもない、方法。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の化合物が、式（ＩＩ）の構造
【化２３２】
2021518856.tif 000243
［式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで前記Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有し、
ただし、前記化合物が、
【化２３３】
2021518856.tif 000244
のどれでもない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２３４】
2021518856.tif 000245
【化２３５】
2021518856.tif 000246
【化２３６】
2021518856.tif 000247
【化２３７】
2021518856.tif 000248
【化２３８】
2021518856.tif 000249
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２３９】
2021518856.tif 000250
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２４０】
2021518856.tif 000251
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２４１】
2021518856.tif 000252
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２４２】
2021518856.tif 000253
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２４３】
2021518856.tif 000254
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記障害が、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が、前記対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記障害が、軸索変性を伴う疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記障害が、外傷性脳傷害、脳卒中、虚血、双極性障害、心疾患、アテローム性動脈硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、がん、自己免疫疾患、および神経変性疾患からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー−マリー−トゥース病、レビー小体認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性対麻痺からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる前記疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性巨核芽球性白血病、小児白血病、家族性慢性リンパ性白血病、左右軸形成異常、悪性黒色腫、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、精巣がん、胃がん、消化管がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、大細胞型リンパ腫、軟組織肉腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、遺伝性出血性毛細血管拡張症２型（Ｏｓｌｅｒ−Ｒｅｎｄｕ−Ｗｅｂｅｒ症候群２）、腸管出血、動脈性高血圧、動静脈奇形、進行性骨化性線維異形成症、骨格奇形、骨外性骨形成、嗜癖、高血圧、心筋梗塞、遠位中間肢異形成症、運動失調症、毛細血管拡張症、ゼッケル症候群、心不全、若年性ポリポーシス症候群、短指症Ａ２型（手の形成異常）、遠位中間肢軟骨異形成症（骨の形成異常）、外陰異常、原発性肺高血圧（ＰＰＨ１）、心臓・顔・皮膚症候群、若年性正中発生癌腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、心不整脈、体細胞黒色腫、家族性黒色腫、肉腫、頭頸部扁平上皮癌、上皮腫瘍、心肥大、レット症候群、Ｘ連鎖性乳児性痙攣症候群、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群、概日障害、乳管癌、乳腺過形成、錐体杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）５型、錐体杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）６型、レーバー先天黒内障１型（ＬＣＡ１）、てんかん、筋緊張症、筋消耗、白内障、性腺機能低下症、内分泌機能の欠損、男性脱毛症、ダウン症候群（ＤＳ）、膠芽腫、肝細胞癌、ファイファー症候群、カルマン症候群２、幹細胞白血病リンパ腫症候群（ＳＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、アペール症候群、ジャクソン−ワイス症候群、クルーゾン症候群、Ｂｅａｒｅ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ脳回状皮膚症候群、軟骨無形成症、軟骨低形成症、タナトフォリック骨異形成症、アデレード型頭蓋骨癒合症、サンディエゴ型骨異形成症、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、下垂体腺腫、脊髄形成異常症、乳児毛細血管腫、特発性骨髄線維症、神経芽細胞腫、腎臓がん、乳頭状癌、高ＩｇＭ症候群、色素失調症、無汗性外胚葉形成不全、関節リウマチ、黒色表皮腫、松果体過形成、多嚢胞性卵巣症候群、非定型片頭痛、糖尿病性高脂血症、妖精症、細菌誘発性マクロファージアポトーシス、発熱性細菌感染症、子宮平滑筋肉腫、移植後リンパ増殖性障害、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、真性赤血球増加症、脳腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肥満細胞症、まだら症、Ｔ細胞白血病、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群、ポイツ−ジェガース症候群、全身性エリテマトーデス、常染色体優性血小板減少症、網膜色素変性症、遺伝性乳頭状腎癌、ミュラー管症候群ＩＩ型、家族性肥大型心筋症、重症筋無力症、進行性聴覚消失、多発性嚢胞腎疾患、ユーイング腫瘍、非症候性精神遅滞タイプ３０（ＭＲＸ３０）、特発性好酸球増加症候群、二分脊椎症、Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ症候群（ＷＲＳ）、肝型糖原病、肝硬変、造血性悪性腫瘍、カーニー複合腫瘍、心収縮性、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管合併症、自閉症、優性脊髄小脳運動失調症１４型、痛覚、変形性関節症軟骨、膀胱がん、鼻咽頭癌腫、未分化大細胞型白血病、家族性甲状腺髄様癌（ＦＭＴＣ）、多発性内分泌腫瘍症ＩＩＡ型（ＭＥＮ２Ａ）、ＭＥＮ２Ｂ、褐色細胞腫、甲状腺乳頭癌、ヒルシュスプルング病、２型小口病、ＨＰＣ１、血液凝固、狭心症、腎膨大細胞腫、肺腺腫、優性短指症Ｂ型、劣性遺伝性Ｒｏｂｉｎｏｗ症候群（ＲＲＳ）、Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ症候群、ＣＮＳ腫瘍、Ｌｏｅｙｓ−Ｄｉｅｔｚ症候群、食道がん、遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ、Ｌｙｎｃｈ症候群）、マルファン症候群ＩＩ型、静脈形成異常、星状細胞腫、肥大性および拡張型心筋症、脛骨筋ジストロフィー、無汗症、偽性低アルドステロン症ＩＩ型、および慢性関節炎からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象に、５−ヒドロキシトリプトファン、アクチバーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ）、ＡＦＱ０５６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、アグラスタット（Ａｇｇｒａｓｔａｔ）、アルベンダゾール（Ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ）、アルファ−リポ酸／Ｌ−アセチルカルニチン、アルテプラーゼ（Ａｌｔｅｐｌａｓｅ）、アマンタジン（Ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）（シンメトレル（Ｓｙｍｍｅｔｒｅｌ））、アムロジピン、アンクロッド（Ａｎｃｒｏｄ）、アポモルヒネ（Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）（アポカイン（Ａｐｏｋｙｎ））、アリモクロモル（Ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）、アリクストラ（Ａｒｉｘｔｒａ）、アルモダフィニル（Ａｒｍｏｄａｆｉｎｉｌ）、アスコルビン酸、アスクリプチン（Ａｓｃｒｉｐｔｉｎ）、アスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ）、アテノロール、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）、バクロフェン（リオレサール（Ｌｉｏｒｅｓａｌ））、バンゼル（Ｂａｎｚｅｌ）、ベンズトロピン（Ｂｅｎｚｔｒｏｐｉｎｅ）（コゲンチン（Ｃｏｇｅｎｔｉｎ））、ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、ＢＧＧ４９２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐ．）、ボツリヌス毒素、バファリン（Ｂｕｆｆｅｒｉｎ）、Ｃａｒｂａｔｒｏｌ（登録商標）、カルビドパ／レボドパ即時放出（シネメット（Ｓｉｎｅｍｅｔ））、カルビドパ／レボドパ経口崩壊錠（パルコパ（Ｐａｒｃｏｐａ））、カルビドパ／レボドパ／エンタカポン（スタレボ（Ｓｔａｌｅｖｏ））、ＣＥＲＥ−１１０：ＮＧＦのアデノ随伴ウイルス送達（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ）、セレブロライシン、シノベックス（ＣｉｎｎｏＶｅｘ）、シタロプラム、シチコリン、クロバザム（Ｃｌｏｂａｚａｍ）、クロナゼパム（Ｃｌｏｎａｚｅｐａｍ）、クロピドグレル（Ｃｌｏｐｉｄｏｇｒｅｌ）、クロザピン（クロザリル（Ｃｌｏｚａｒｉｌ））、補酵素Ｑ、クレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）、ダビガトラン、ダルテパリン、ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）、ダブネチド（Ｄａｖｕｎｅｔｉｄｅ）、デフェリプロン（Ｄｅｆｅｒｉｐｒｏｎｅ）、Ｄｅｐａｋｅｎｅ（登録商標）、Ｄｅｐａｋｏｔｅ  ＥＲ（登録商標）、Ｄｅｐａｋｏｔｅ（登録商標）、デスモテプラーゼ（Ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ）、ダイアスタット（Ｄｉａｓｔａｔ）、ジアゼパム（Ｄｉａｚｅｐａｍ）、ジゴキシン（Ｄｉｇｏｘｉｎ）、Ｄｉｌａｎｔｉｎ（登録商標）、ジメボン（Ｄｉｍｅｂｏｎ）、ジピリダモール、ジバルプロエクス（デパコート（Ｄｅｐａｋｏｔｅ））、ドネペジル（Ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）（アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ））、ＥＧｂ  ７６１、エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ）、ＥＬＮＤ００２（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エナラプリル（Ｅｎａｌａｐｒｉｌ）、エノキサパリン、エンタカポン（Ｅｎｔａｃａｐｏｎｅ）（コムタン（Ｃｏｍｔａｎ））、エポエチンアルファ、エプチフィバチド（Ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）、エリスロポエチン（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、エスシタロプラム（Ｅｓｃｉｔａｌｏｐｒａｍ）、エスリカルバゼピン（Ｅｓｌｉｃａｒｂａｚｅｐｉｎｅ）酢酸エステル、エスモロール（Ｅｓｍｏｌｏｌ）、エトスクシミド（Ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、エチル−ＥＰＡ（Ｍｉｒａｘｉｏｎ（商標））、エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ���、エクスタビア（Ｅｘｔａｖｉａ）、エゾガビン（Ｅｚｏｇａｂｉｎｅ）、フェルバメート（Ｆｅｌｂａｍａｔｅ）、Ｆｅｌｂａｔｏｌ（登録商標）、フィンゴリモド（Ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ）（ジレニア（Ｇｉｌｅｎｙａ））、フルオキセチン（プロザック（Ｐｒｏｚａｃ））、フォンダパリナックス、フラグミン（Ｆｒａｇｍｉｎ）、フリシウム（Ｆｒｉｓｉｕｍ）、ギャバペンチン（Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）、Ｇａｂｉｔｒｉｌ（登録商標）、ガランタミン（Ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ）、グラチラマー（Ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ）（コパキソン（Ｃｏｐａｘｏｎｅ））、ハロペリドール（ハルドール（Ｈａｌｄｏｌ））、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、イデベノン（Ｉｄｅｂｅｎｏｎｅ）、Ｉｎｏｖｅｌｏｎ（登録商標）、インスリン、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ、イオフルパン１２３Ｉ（ＤＡＴＳＣＡＮ（登録商標））、ＩＰＸ０６６（Ｉｍｐａｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＪＮＪ−２６４８９１１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）、クロノピン（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ）、ラコサミド（Ｌａｃｏｓａｍｉｄｅ）、Ｌ−アルファグリセリルホスホリルコリン、Ｌａｍｉｃｔａｌ（登録商標）、ラモトリギン（Ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ）、レベチラセタム（Ｌｅｖｅｔｉｒａｃｅｔａｍ）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）、リシノプリル（Ｌｉｓｉｎｏｐｒｉｌ）、炭酸リチウム、ロプレッサー（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ）、ロラゼパム（Ｌｏｒａｚｅｐａｍ）、ロサルタン、ラブノックス（Ｌｏｖｅｎｏｘ）、Ｌｕ  ＡＡ２４４９３、ルミナール（Ｌｕｍｉｎａｌ）、ＬＹ４５０１３９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、リリカ（Ｌｙｒｉｃａ）、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ）、メコバラミン（Ｍｅｃｏｂａｌａｍｉｎ）、メマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）、メチルプレドニゾロン、メトプロロール酒石酸塩、ミニトラン（Ｍｉｎｉｔｒａｎ）、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、ミルタザピン、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）（ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ））、Ｍｙｓｏｌｉｎｅ（登録商標）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（タイサブリ（Ｔｙｓａｂｒｉ））、Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（登録商標）、ナイアシンアミド（Ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅ）、Ｎｉｔｒｏ−Ｂｉｄ、Ｎｉｔｒｏ−Ｄｕｒ、ニトログリセリン、ニトロリンガル（Ｎｉｔｒｏｌｉｎｇｕａｌ）、ニトロミスト（Ｎｉｔｒｏｍｉｓｔ）、ニトロスタット（Ｎｉｔｒｏｓｔａｔ）、ニトロ−タイム（Ｎｉｔｒｏ−Ｔｉｍｅ）、ノルエピネフリン（Ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）（ＮＯＲ）、カルバマゼピン（Ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）、オクトレオチド、Ｏｎｆｉ（登録商標）、オキシカルバゼピン（Ｏｘｃａｒｂａｚｅｐｉｎｅ）、塩化オキシブチニン、ＰＦ−０４３６０３６５（Ｐｆｉｚｅｒ）、フェノバルビタール（Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ）、Ｐｈｅｎｙｔｅｋ（登録商標）、フェニトイン（Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、ピクロゾタン、ピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、プラビックス（Ｐｌａｖｉｘ）、ポティガ（Ｐｏｔｉｇａ）、プラミペキソ���ル（Ｐｒａｍｉｐｅｘｏｌｅ）（ミラペックス（Ｍｉｒａｐｅｘ））、プラムリンチド、プレドニゾン（Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、プリミドン（Ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）、プリニビル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ）、プロベネシド、プロプラノロール（Ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）、ＰＲＸ−０００２３（ＥＰＩＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＸＴ３００３、キナクリン（Ｑｕｉｎａｃｒｉｎｅ）、ラメルテオン（Ｒａｍｅｌｔｅｏｎ）、ラサギリン（Ｒａｓａｇｉｌｉｎｅ）（アジレクト（Ａｚｉｌｅｃｔ））、レビフ（Ｒｅｂｉｆ）、レシゲン（ＲｅｃｉＧｅｎ）、レマセミド、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、レタバーゼ（Ｒｅｔａｖａｓｅ）、レテプラーゼ、リルゾール（リルテック（Ｒｉｌｕｔｅｋ））、リバスチグミン（Ｒｉｖａｓｔｉｇｍｉｎｅ）（イクセロン（Ｅｘｅｌｏｎ））、ロピニロール（Ｒｏｐｉｎｉｒｏｌｅ）（レキップ（Ｒｅｑｕｉｐ））、ロチゴチン（Ｒｏｔｉｇｏｔｉｎｅ）（ニュープロ（Ｎｅｕｐｒｏ））、ルフィナミド（Ｒｕｆｉｎａｍｉｄｅ）、サブリル（Ｓａｂｒｉｌ）、サフィナミド（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、サラジェン（Ｓａｌａｇｅｎ）、サラフェム（Ｓａｒａｆｅｍ）、セレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）（ｌ−デプレニル、エルデプリル）、ＳＥＮ００１４１９６（Ｓｉｅｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、セルトラリン（ゾロフト（Ｚｏｌｏｆｔ））、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）、ニトロプルシドナトリウム（ＮＰＳ）、フェニル酪酸ナトリウム、スタンバック頭痛散剤（Ｓｔａｎｂａｃｋ  Ｈｅａｄａｃｈｅ  Ｐｏｗｄｅｒ）、タクリン（Ｔａｃｒｉｎｅ）（コグネックス（Ｃｏｇｎｅｘ））、タモキシフェン（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ（登録商標）、テネクテプラーゼ（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）、テノーミン（Ｔｅｎｏｒｍｉｎ）、テトラベナジン（Ｔｅｔｒａｂｅｎａｚｉｎｅ）（キセナジン（Ｘｅｎａｚｉｎｅ））、ＴＨＲ−１８（Ｔｈｒｏｍｂｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）、チアガビン（Ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、チデグルシブ（Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ）、チロフィバン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、チザニジン（ザナフレックス（Ｚａｎａｆｌｅｘ））、ＴＮＫａｓｅ、トルカポン（Ｔｏｌｃａｐｏｎｅ）（タスマール（Ｔａｓｍａｒ））、トルテロジン（Ｔｏｌｔｅｒｏｄｉｎｅ）、Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標）、トピラマート（Ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ）、トリヘキシフェニジル（Ｔｒｉｈｅｘｙｐｈｅｎｉｄｙｌ）（以前はアーテン（Ａｒｔａｎｅ））、Ｔｒｉｌｅｐｔａｌ（登録商標）、ウルソジオール、バルプロ酸、バルサルタン、バレニクリン（Ｖａｒｅｎｉｃｌｉｎｅ）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ビムパット（Ｖｉｍｐａｔ）、ビタミンＥ、ワルファリン（Ｗａｒｆａｒｉｎ）、Ｚａｒｏｎｔｉｎ（登録商標）、ゼストリル（Ｚｅｓｔｒｉｌ）、Ｚｏｎｅｇｒａｎ（登録商標）、ゾニサミド（Ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、ザイディス（Ｚｙｄｉｓ）セレギリンＨＣＬ経口崩壊錠（ゼラパール（Ｚｅｌａｐａｒ））、およびそれらの組合せからなる群から選択される、有効量の１つまたは複数の追加の治療剤を併用投与するステップをさらに��む、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物が、ヒト、獣医学的動物、および農業用動物からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象が、ヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、薬学的に許容される担体または希釈剤、および式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化２４４】
2021518856.tif 000255
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量の医薬組成物を投与するステップを含み、
ただし、前記化合物が、
【化２４５】
2021518856.tif 000256
のどれでもない、方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の化合物が、式（ＩＩ）の構造
【化２４６】
2021518856.tif 000257
［式中、
Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、それらが結合している窒素原子と一緒になって、Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルを形成し、ここで前記Ｃ５〜６ヘテロシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有し、
ただし、前記化合物が、
【化２４７】
2021518856.tif 000258
のどれでもない、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２４８】
2021518856.tif 000259
【化２４９】
2021518856.tif 000260
【化２５０】
2021518856.tif 000261
【化２５１】
2021518856.tif 000262
【化２５２】
2021518856.tif 000263
【化２５３】
2021518856.tif 000264
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２５４】
2021518856.tif 000265
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２５５】
2021518856.tif 000266
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２５６】
2021518856.tif 000267
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２５７】
2021518856.tif 000268
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２５８】
2021518856.tif 000269
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記障害が、小胞体（ＥＲ）ストレスを伴う疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記障害が、前記対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記障害が、軸索変性を伴う疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記障害が、外傷性脳傷害、脳卒中、虚血、双極性障害、心疾患、アテローム性動脈硬化症、１型糖尿病、２型糖尿病、肥満、がん、自己免疫疾患、および神経変性疾患からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー−マリー−トゥース病、レビー小体認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性対麻痺からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記障害が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象における異常キナーゼレベルによって特徴付けられる前記疾患が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性前骨髄球性白血病、急性巨核芽球性白血病、小児白血病、家族性慢性リンパ性白血病、左右軸形成異常、悪性黒色腫、頭頸部がん、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵臓がん、肝臓がん、精巣がん、胃がん、消化管がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、子宮内膜がん、結腸がん、結腸直腸がん、大細胞型リンパ腫、軟組織肉腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、遺伝性出血性毛細血管拡張症２型（Ｏｓｌｅｒ−Ｒｅｎｄｕ−Ｗｅｂｅｒ症候群２）、腸管出血、動脈性高血圧、動静脈奇形、進行性骨化性線維異形成症、骨格奇形、骨外性骨形成、嗜癖、高血圧、心筋梗塞、遠位中間肢異形成症、運動失調症、毛細血管拡張症、ゼッケル症候群、心不全、若年性ポリポーシス症候群、短指症Ａ２型（手の形成異常）、遠位中間肢軟骨異形成症（骨の形成異常）、外陰異常、原発性肺高血圧（ＰＰＨ１）、心臓・顔・皮膚症候群、若年性正中発生癌腫、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、心不整脈、体細胞黒色腫、家族性黒色腫、肉腫、頭頸部扁平上皮癌、上皮腫瘍、心肥大、レット症候群、Ｘ連鎖性乳児性痙攣症候群、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群、概日障害、乳管癌、乳腺過形成、錐体杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）５型、錐体杆体ジストロフィー（ＣＯＲＤ）６型、レーバー先天黒内障１型（ＬＣＡ１）、てんかん、筋緊張症、筋消耗、白内障、性腺機能低下症、内分泌機能の欠損、男性脱毛症、ダウン症候群（ＤＳ）、膠芽腫、肝細胞癌、ファイファー症候群、カルマン症候群２、幹細胞白血病リンパ腫症候群（ＳＣＬＬ）、骨髄増殖性疾患、アペール症候群、ジャクソン−ワイス症候群、クルーゾン症候群、Ｂｅａｒｅ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ脳回状皮膚症候群、軟骨無形成症、軟骨低形成症、タナトフォリック骨異形成症、アデレード型頭蓋骨癒合症、サンディエゴ型骨異形成症、Ｍｕｅｎｋｅ症候群、下垂体腺腫、脊髄形成異常症、乳児毛細血管腫、特発性骨髄線維症、神経芽細胞腫、腎臓がん、乳頭状癌、高ＩｇＭ症候群、色素失調症、無汗性外胚葉形成不全、関節リウマチ、黒色表皮腫、松果体過形成、多嚢胞性卵巣症候群、非定型片頭痛、糖尿病性高脂血症、妖精症、細菌誘発性マクロファージアポトーシス、発熱性細菌感染症、子宮平滑筋肉腫、移植後リンパ増殖性障害、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、真性赤血球増加症、脳腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、肥満細胞症、まだら症、Ｔ細胞白血病、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群、ポイツ−ジェガース症候群、全身性エリテマトーデス、常染色体優性血小板減少症、網膜色素変性症、遺伝性乳頭状腎癌、ミュラー管症候群ＩＩ型、家族性肥大型心筋症、重症筋無力症、進行性聴覚消失、多発性嚢胞腎疾患、ユーイング腫瘍、非症候性精神遅滞タイプ３０（ＭＲＸ３０）、特発性好酸球増加症候群、二分脊椎症、Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ症候群（ＷＲＳ）、肝型糖原病、肝硬変、造血性悪性腫瘍、カーニー複合腫瘍、心収縮性、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管合併症、自閉症、優性脊髄小脳運動失調症１４型、痛覚、変形性関節症軟骨、膀胱がん、鼻咽頭癌腫、未分化大細胞型白血病、家族性甲状腺髄様癌（ＦＭＴＣ）、多発性内分泌腫瘍症ＩＩＡ型（ＭＥＮ２Ａ）、ＭＥＮ２Ｂ、褐色細胞腫、甲状腺乳頭癌、ヒルシュスプルング病、２型小口病、ＨＰＣ１、血液凝固、狭心症、腎膨大細胞腫、肺腺腫、優性短指症Ｂ型、劣性遺伝性Ｒｏｂｉｎｏｗ症候群（ＲＲＳ）、Ｃｏｆｆｉｎ−Ｌｏｗｒｙ症候群、ＣＮＳ腫瘍、Ｌｏｅｙｓ−Ｄｉｅｔｚ症候群、食道がん、遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん（ＨＮＰＣＣ、Ｌｙｎｃｈ症候群）、マルファン症候群ＩＩ型、静脈形成異常、星状細胞腫、肥大性および拡張型心筋症、脛骨筋ジストロフィー、無汗症、偽性低アルドステロン症ＩＩ型、および慢性関節炎からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象に、５−ヒドロキシトリプトファン、アクチバーゼ、ＡＦＱ０５６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、アグラスタット、アルベンダゾール、アルファ−リポ酸／Ｌ−アセチルカルニチン、アルテプラーゼ、アマンタジン（シンメトレル）、アムロジピン、アンクロッド、アポモルヒネ（アポカイン）、アリモクロモル、アリクストラ、アルモダフィニル、アスコルビン酸、アスクリプチン、アスピリン、アテノロール、アボネックス、バクロフェン（リオレサール）、バンゼル、ベンズトロピン（コゲンチン）、ベータセロン、ＢＧＧ４９２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｃｏｒｐ．）、ボツリヌス毒素、バファリン、Ｃａｒｂａｔｒｏｌ（登録商標）、カルビドパ／レボドパ即時放出（シネメット）、カルビドパ／レボドパ経口崩壊錠（パルコパ）、カルビドパ／レボドパ／エンタカポン（スタレボ）、ＣＥＲＥ−１１０：ＮＧＦのアデノ随伴ウイルス送達、セレブロライシン、シノベックス、シタロプラム、シチコリン、クロバザム、クロナゼパム、クロピドグレル、クロザピン（クロザリル）、補酵素Ｑ、クレアチン、ダビガトラン、ダルテパリン、ダプソン、ダブネチド、デフェリプロン、Ｄｅｐａｋｅｎｅ（登録商標）、Ｄｅｐａｋｏｔｅ  ＥＲ（登録商標）、Ｄｅｐａｋｏｔｅ（登録商標）、デスモテプラーゼ、ダイアスタット、ジアゼパム、ジゴキシン、Ｄｉｌａｎｔｉｎ（登録商標）、ジメボン、ジピリダモール、ジバルプロエクス（デパコート）、ドネペジル（アリセプト）、ＥＧｂ  ７６１、エルデプリル、ＥＬＮＤ００２（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、エナラプリル、エノキサパリン、エンタカポン（コムタン）、エポエチンアルファ、エプチフィバチド、エリスロポエチン、エスシタロプラム、エスリカルバゼピン酢酸エステル、エスモロール、エトスクシミド、エチル−ＥＰＡ（Ｍｉｒａｘｉｏｎ（商標））、エキセナチド、エクスタビア、エゾガビン、フェルバメート、Ｆｅｌｂａｔｏｌ（登録商標）、フィンゴリモド（ジレニア）、フルオキセチン（プロザック）、フォンダパリナックス、フラグミン、フリシウム、ギャバペンチン、Ｇａｂｉｔｒｉｌ（登録商標）、ガランタミン、グラチラマー（コパキソン）、ハロペリドール（ハルドール）、ヘパリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、イデベノン、Ｉｎｏｖｅｌｏｎ（登録商標）、インスリン、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ、イオフルパン１２３Ｉ（ＤＡＴＳＣＡＮ（登録商標））、ＩＰＸ０６６（Ｉｍｐａｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ＪＮＪ−２６４８９１１２（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｋｅｐｐｒａ（登録商標）、クロノピン、ラコサミド、Ｌ−アルファグリセリルホスホリルコリン、Ｌａｍｉｃｔａｌ（登録商標）、ラモトリギン、レベチラセタム、リラグルチド、リシノプリル、炭酸リチウム、ロプレッサー、ロラゼパム、ロサルタン、ラブノックス、Ｌｕ  ＡＡ２４４９３、ルミナール、ＬＹ４５０１３９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、リリカ、マシチニブ、メコバラミン、メマンチン、メチルプレドニゾロン、メトプロロール酒石酸塩、ミニトラン、ミノサイクリン、ミルタザピン、ミトキサントロン（ノバントロン）、Ｍｙｓｏｌｉｎｅ（登録商標）、���タリズマブ（タイサブリ）、Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（登録商標）、ナイアシンアミド、Ｎｉｔｒｏ−Ｂｉｄ、Ｎｉｔｒｏ−Ｄｕｒ、ニトログリセリン、ニトロリンガル、ニトロミスト、ニトロスタット、ニトロ−タイム、ノルエピネフリン（ＮＯＲ）、カルバマゼピン、オクトレオチド、Ｏｎｆｉ（登録商標）、オキシカルバゼピン、塩化オキシブチニン、ＰＦ−０４３６０３６５（Ｐｆｉｚｅｒ）、フェノバルビタール、Ｐｈｅｎｙｔｅｋ（登録商標）、フェニトイン、ピクロゾタン、ピオグリタゾン、プラビックス、ポティガ、プラミペキソール（ミラペックス）、プラムリンチド、プレドニゾン、プリミドン、プリニビル、プロベネシド、プロプラノロール、ＰＲＸ−０００２３（ＥＰＩＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＸＴ３００３、キナクリン、ラメルテオン、ラサギリン（アジレクト）、レビフ、レシゲン、レマセミド、レスベラトロール、レタバーゼ、レテプラーゼ、リルゾール（リルテック）、リバスチグミン（イクセロン）、ロピニロール（レキップ）、ロチゴチン（ニュープロ）、ルフィナミド、サブリル、サフィナミド（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、サラジェン、サラフェム、セレギリン（ｌ−デプレニル、エルデプリル）、ＳＥＮ００１４１９６（Ｓｉｅｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、セルトラリン（ゾロフト）、シンバスタチン、ニトロプルシドナトリウム（ＮＰＳ）、フェニル酪酸ナトリウム、スタンバック頭痛散剤、タクリン（コグネックス）、タモキシフェン、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ（登録商標）、テネクテプラーゼ、テノーミン、テトラベナジン（キセナジン）、ＴＨＲ−１８（Ｔｈｒｏｍｂｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．）、チアガビン、チデグルシブ、チロフィバン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、チザニジン（ザナフレックス）、ＴＮＫａｓｅ、トルカポン（タスマール）、トルテロジン、Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標）、トピラマート、トリヘキシフェニジル（以前はアーテン）、Ｔｒｉｌｅｐｔａｌ（登録商標）、ウルソジオール、バルプロ酸、バルサルタン、バレニクリン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ビムパット、ビタミンＥ、ワルファリン、Ｚａｒｏｎｔｉｎ（登録商標）、ゼストリル、Ｚｏｎｅｇｒａｎ（登録商標）、ゾニサミド、ザイディスセレギリンＨＣＬ経口崩壊錠（ゼラパール）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、有効量の１つまたは複数の追加の治療剤を併用投与するステップをさらに含む、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象が、哺乳動物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５５】
前記哺乳動物が、ヒト、獣医学的動物、および農業用動物からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、ヒトである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法であって、前記対象に、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化２５９】
2021518856.tif 000270
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含み、
ただし、前記化合物が、
【化２６０】
2021518856.tif 000271
のどれでもない、方法。
【請求項５８】
それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法であって、前記対象に、式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化２６１】
2021518856.tif 000272
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含み、
ただし、前記化合物が、
【化２６２】
2021518856.tif 000273
のどれでもない、方法。
【請求項５９】
それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の式（Ｉ）の構造を有する１つまたは複数の化合物
【化２６３】
2021518856.tif 000274
［式中、
Ｒ１は、アルキル−ヘテロシクロアルキルまたはアルキル−ヘテロビシクロアルキルであり、ここで前記ヘテロシクロアルキルまたはヘテロビシクロアルキルは、アルキル、ヒドロキシ、アルコール、またはヘテロシクロアルキルから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されており、
Ｒ２は、フェニル、インドリル、ピリジル、ジベンゾフラニル、ベンゾジオキサン、ベンゾチオフェニル、ピリミジニル、ピラゾール、チエニル、インダゾール、またはフラニルから選択され、そのいずれかは、アルキル、アルコキシ、アミノ、アミド、シアノ、エーテル、ニトロ、ヒドロキシ、ハロゲン、アルキル−ヘテロシクロアルキル、スルホニル、ケトン、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルフェニル、カルバメート、カルボン酸、またはウレアから選択される１つまたは複数の原子または基で必要に応じて置換されている］、
またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、
ただし、前記化合物が、
【化２６４】
2021518856.tif 000275
のどれでもない、方法。
【請求項６０】
前記１つまたは複数の化合物が、
【化２６５】
2021518856.tif 000276
ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩である、
請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２６６】
2021518856.tif 000277
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２６７】
2021518856.tif 000278
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２６８】
2021518856.tif 000279
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つまたは複数の化合物が、以下の構造
【化２６９】
2021518856.tif 000280
、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を有する、
請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、ハンチントン病、伝達性海綿状脳症、シャルコー−マリー−トゥース病、レビー小体認知症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、ポリグルタミン病、プリオン病、緑内障、および遺伝性痙性対麻痺からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象に、ドネペジル（アリセプト）、リバスチグミン（イクセロン）、ガランタミン（ラザダイン）、タクリン（コグネックス）、メマンチン（ナメンダ（Ｎａｍｅｎｄａ））、ビタミンＥ、ＣＥＲＥ−１１０：ＮＧＦのアデノ随伴ウイルス送達（Ｃｅｒｅｇｅｎｅ）、ＬＹ４５０１３９（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、エキセナチド、バレニクリン（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＦ−０４３６０３６５（Ｐｆｉｚｅｒ）、レスベラトロール、カルビドパ／レボドパ即時放出（シネメット）、カルビドパ／レボドパ経口崩壊錠（パルコパ）、カルビドパ／レボドパ／エンタカポン（スタレボ）、ロピニロール（レキップ）、プラミペキソール（ミラペックス）、ロチゴチン（ニュープロ）、アポモルヒネ（アポカイン）、セレギリン（ｌ−デプレニル、エルデプリル）、ラサギリン（アジレクト）、ザイディスセレギリンＨＣＬ経口崩壊錠（ゼラパール）、エンタカポン（コムタン）、トルカポン（タスマール）、アマンタジン（シンメトレル）、トリヘキシフェニジル（以前はアーテン）、ベンズトロピン（コゲンチン）、ＩＰＸ０６６（Ｉｍｐａｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、イオフルパン１２３Ｉ（ＤＡＴＳＣＡＮ（登録商標））、サフィナミド（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、ピオグリタゾン、リルゾール（リルテック）、炭酸リチウム、アリモクロモル、クレアチン、タモキシフェン、メコバラミン、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、イデベノン、補酵素Ｑ、５−ヒドロキシトリプトファン、プロプラノロール、エナラプリル、リシノプリル、ジゴキシン、エリスロポエチン、Ｌｕ  ＡＡ２４４９３、デフェリプロン、ＩＶＩＧ、ＥＧｂ  ７６１、アボネックス、ベータセロン、エクスタビア、レビフ、グラチラマー（コパキソン）、フィンゴリモド（ジレニア）、ナタリズマブ（タイサブリ）、ミトキサントロン（ノバントロン）、バクロフェン（リオレサール）、チザニジン（ザナフレックス）、メチルプレドニゾロン、シノベックス、レシゲン、マシチニブ、プレドニゾン、インターフェロンベータ１ａ、インターフェロンベータ１ｂ、ＥＬＮＤ００２（Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、テトラベナジン（キセナジン）、ハロペリドール（ハルドール）、クロザピン（クロザリル）、クロナゼパム（クロノピン）、ジアゼパム（バリウム（Ｖａｌｉｕｍ））、エスシタロプラム（レクサプロ（Ｌｅｘａｐｒｏ））、フルオキセチン（プロザック、サラフェム）、セルトラリン（ゾロフト）、バルプロ酸（デパケン（Ｄｅｐａｋｅｎｅ））、ジバルプロエクス（デパコート）、ラモトリギン（ラミクタール）、ジメボン、ＡＦＱ０５６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、エチル−ＥＰＡ（Ｍｉｒａｘｉｏｎ（商標））、ＳＥＮ００１４１９６（Ｓｉｅｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、フェニル酪酸ナトリウム、シタロプラム、ウルソジオール、ミノサイクリン、レマセミド、ミルタザピン、キナクリン、アスコルビン酸、ＰＸＴ３００３、アルモダフィニル、ラメルテオン、ダブネチド、チデグルシブ、アルファ−リポ酸／Ｌ−アセチルカルニチン、ナイアシンアミド、塩化オキシブチニン、トルテロジン、ボツリヌス毒素、およびそれらの組合せからなる群から選択される、有効量の１つまたは複数の追加の��療剤を併用投与するステップをさらに含む、請求項５９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、哺乳動物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記哺乳動物が、ヒト、獣医学的動物、および農業用動物からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が、ヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
【化２７０】
2021518856.tif 000281
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項７２】
【化２７１】
2021518856.tif 000282
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項７３】
【化２７２】
2021518856.tif 000283
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項７４】
【化２７３】
2021518856.tif 000284
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩。
【請求項７５】
薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化２７４】
2021518856.tif 000285
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩
を含む医薬組成物。
【請求項７６】
薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化２７５】
2021518856.tif 000286
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩
を含む医薬組成物。
【請求項７７】
薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化２７６】
2021518856.tif 000287
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩
を含む医薬組成物。
【請求項７８】
薬学的に許容される担体または希釈剤、および
【化２７７】
2021518856.tif 000288
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩
を含む医薬組成物。
【請求項７９】
それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２７８】
2021518856.tif 000289
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項８０】
それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２７９】
2021518856.tif 000290
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項８１】
それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２８０】
2021518856.tif 000291
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項８２】
それを必要とする対象における障害の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２８１】
2021518856.tif 000292
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項８３】
それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法であって、前記対象に、
【化２８２】
2021518856.tif 000293
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項８４】
それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法であって、前記対象に、
【化２８３】
2021518856.tif 000294
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項８５】
それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法であって、前記対象に、
【化２８４】
2021518856.tif 000295
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項８６】
それを必要とする対象における小胞体（ＥＲ）ストレスの毒性を抑制する方法であって、前記対象に、
【化２８５】
2021518856.tif 000296
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項８７】
それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法であって、前記対象に、
【化２８６】
2021518856.tif 000297
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項８８】
それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法であって、前記対象に、
【化２８７】
2021518856.tif 000298
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項８９】
それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法であって、前記対象に、
【化２８８】
2021518856.tif 000299
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項９０】
それを必要とする対象における軸索変性を伴う疾患の効果を処置または改善する方法であって、前記対象に、
【化２８９】
2021518856.tif 000300
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を含む、有効量のキナーゼ阻害剤を投与するステップを含む、方法。
【請求項９１】
それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２９０】
2021518856.tif 000301
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項９２】
それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２９１】
2021518856.tif 000302
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項９３】
それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２９２】
2021518856.tif 000303
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【請求項９４】
それを必要とする対象における神経変性疾患の効果を処置または改善するための方法であって、前記対象に、有効量の
【化２９３】
2021518856.tif 000304
の構造を有する化合物、またはそのＮ−オキシド、結晶形、水和物もしくは薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、方法。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2021518856.tif 000305
【図２】
2021518856.tif 000306
【図３】
2021518856.tif 000307
【図４Ａ】
2021518856.tif 000308
【図４Ｂ】
2021518856.tif 000309
【図５】
2021518856.tif 000310
【図６】
2021518856.tif 000311
【図７】
2021518856.tif 000312
【図８】
2021518856.tif 000313
【図９】
2021518856.tif 000314
【図１０−１】
2021518856.tif 000315
【図１０−２】
2021518856.tif 000316
【図１０−３】
2021518856.tif 000317
【図１１−１】
2021518856.tif 000318
【図１１−２】
2021518856.tif 000319
【図１１−３】
2021518856.tif 000320
【図１１−４】
2021518856.tif 000321
【図１１−５】
2021518856.tif 000322
【図１１−６】
2021518856.tif 000323
【図１１−７】
2021518856.tif 000324
【図１１−８】
2021518856.tif 000325
【図１１−９】
2021518856.tif 000326
【図１１−１０】
2021518856.tif 000327
【図１２】
2021518856.tif 000328
【図１３】
2021518856.tif 000329
【図１４】
2021518856.tif 000330
【図１５−１】
2021518856.tif 000331
【図１５−２】
2021518856.tif 000332
【図１５−３】
2021518856.tif 000333
【図１５−４】
2021518856.tif 000334
【図１５−５】
2021518856.tif 000335
【図１５−６】
2021518856.tif 000336
【図１５−７】
2021518856.tif 000337
【図１６−１】
2021518856.tif 000338
【図１６−２】
2021518856.tif 000339
【図１６−３】
2021518856.tif 000340
【図１６−４】
2021518856.tif 000341
【図１６−５】
2021518856.tif 000342
【図１６−６】
2021518856.tif 000343
【図１７Ａ】
2021518856.tif 000344
【図１７Ｂ】
2021518856.tif 000345
【図１７Ｃ】
2021518856.tif 000346
【図１７Ｄ】
2021518856.tif 000347
【図１７Ｅ】
2021518856.tif 000348
【図１７Ｆ】
2021518856.tif 000349
【図１７Ｇ】
2021518856.tif 000350
【図１８Ａ】
2021518856.tif 000351
【図１８Ｂ】
2021518856.tif 000352
【図１９Ａ】
2021518856.tif 000353
【図１９Ｂ】
2021518856.tif 000354
【図１９Ｃ】
2021518856.tif 000355
【図１９Ｄ】
2021518856.tif 000356
【図１９Ｅ】
2021518856.tif 000357
【図１９Ｆ】
2021518856.tif 000358
【図２０−１】
2021518856.tif 000359
【図２０−２】
2021518856.tif 000360
【図２０−３】
2021518856.tif 000361
【図２０−４】
2021518856.tif 000362
【図２０−５】
2021518856.tif 000363
【図２１Ａ】
2021518856.tif 000364
【図２１Ｂ】
2021518856.tif 000365
【図２１Ｃ】
2021518856.tif 000366
【図２１Ｄ】
2021518856.tif 000367
【図２１Ｅ】
2021518856.tif 000368
【図２１Ｆ】
2021518856.tif 000369
【図２１Ｇ】
2021518856.tif 000370
【図２１Ｈ】
2021518856.tif 000371
【図２１Ｉ】
2021518856.tif 000372
【図２１Ｊ】
2021518856.tif 000373
【図２１Ｋ】
2021518856.tif 000374
【図２２Ａ】
2021518856.tif 000375
【図２２Ｂ】
2021518856.tif 000376
【図２２Ｃ】
2021518856.tif 000377
【図２２Ｄ】
2021518856.tif 000378
【図２２Ｅ】
2021518856.tif 000379
【図２２Ｆ】
2021518856.tif 000380
【図２３−１】
2021518856.tif 000381
【図２３−２】
2021518856.tif 000382
【図２３−３】
2021518856.tif 000383
【図２３−４】
2021518856.tif 000384
【図２４Ａ】
2021518856.tif 000385
【図２４Ｂ】
2021518856.tif 000386
【図２４Ｃ】
2021518856.tif 000387
【図２４Ｄ】
2021518856.tif 000388
【図２４Ｅ】
2021518856.tif 000389
【図２４Ｆ】
2021518856.tif 000390
【図２４Ｇ】
2021518856.tif 000391
【図２４Ｈ】
2021518856.tif 000392
【図２４Ｉ】
2021518856.tif 000393
【図２４Ｊ】
2021518856.tif 000394
【図２４Ｋ】
2021518856.tif 000395
【図２４Ｌ】
2021518856.tif 000396
【図２５Ａ】
2021518856.tif 000397
【図２５Ｂ】
2021518856.tif 000398
【図２５Ｃ】
2021518856.tif 000399
【図２５Ｄ】
2021518856.tif 000400
【図２５Ｅ】
2021518856.tif 000401
【図２５Ｆ】
2021518856.tif 000402
【図２５Ｇ】
2021518856.tif 000403
【図２５Ｈ】
2021518856.tif 000404
【図２６】
2021518856.tif 000405
【図２７】
2021518856.tif 000406
【図２８】
2021518856.tif 000407
【図２９】
2021518856.tif 000408
【図３０】
2021518856.tif 000409
【図３１Ａ】
2021518856.tif 000410
【図３１Ｂ】
2021518856.tif 000411
【図３１Ｃ】
2021518856.tif 000412
【図３２】
2021518856.tif 000413
【図３３】
2021518856.tif 000414
【図３４】
2021518856.tif 000415
【図３５Ａ】
2021518856.tif 000416
【図３５Ｂ】
2021518856.tif 000417
【図３５Ｃ】
2021518856.tif 000418
【図３６】
2021518856.tif 000419
【図３７Ａ】
2021518856.tif 000420
【図３７Ｂ】
2021518856.tif 000421
【図３８−１】
2021518856.tif 000422
【図３８−２】
2021518856.tif 000423
【図３９】
2021518856.tif 000424
【図４０】
2021518856.tif 000425
【図４１Ａ】
2021518856.tif 000426
【図４１Ｂ】
2021518856.tif 000427
【図４１Ｃ】
2021518856.tif 000428
【図４２Ａ】
2021518856.tif 000429
【図４２Ｂ】
2021518856.tif 000430
【図４２Ｃ】
2021518856.tif 000431
【図４３Ａ】
2021518856.tif 000432
【図４３Ｂ】
2021518856.tif 000433
【図４４】
2021518856.tif 000434
【図４５】
2021518856.tif 000435
【図４６Ａ】
2021518856.tif 000436
【図４６Ｂ】
2021518856.tif 000437