(57)【要約】  本開示は、標的化サイトカインデリバリーのための組成物および方法を包含する。本明細書で開示される組成物は、ＮＫＧ２ＤリガンドまたはＰＤ１リガンドに結合したサイトカインを含み、免疫療法に関連する副作用を制限することによって免疫療法を改善し得る。本開示はまた、ＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドまたはＰＤ１リガンドを用いて細胞傷害性リンパ球を標的細胞に動員するための組成物および方法を包含する。本明細書で開示される組成物は、ＮＫＧ２Ｄ受容体リガンドおよび標的化分子を含み、免疫療法に関連する副作用を制限することによって免疫療法を改善し得る。
2019511905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞表面タンパク質標的化リガンドに結合したサイトカインを含むキメラペプチド。
【請求項２】
前記サイトカインがＩＬ２サブファミリーの一部である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項３】
前記サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１およびその突然変異型からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項４】
前記サイトカインがインターロイキン−２（ＩＬ２）、突然変異ＩＬ２またはその変異体である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項５】
前記突然変異ＩＬ２が、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、請求項４に記載のキメラペプチド。
【請求項６】
前記ＩＬ２が、配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のキメラペプチド。
【請求項７】
前記サイトカインがＩＬ１ファミリーの一部である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項８】
前記サイトカインがＩＬ１８またはその突然変異型である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項９】
前記免疫細胞表面タンパク質標的化リガンドがＮＫＧ２Ｄリガンドである、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項１０】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体である、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１１】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対する高い親和性を有する抗体である、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体がＫＹＫ−１である、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体がＫＹＫ−１のｓｃＦｖである、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１４】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体がＫＹＫ−２である、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１５】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体がＫＹＫ−２のｓｃＦｖである、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１６】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１７】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１８】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１９】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項２０】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３５および配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項２１】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３７および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のキメラペプチド。
【請求項２２】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号３９または配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のキメラペプチド。
【請求項２３】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗体であり、前記抗体が、配列番号４１または配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のキメラペプチド。
【請求項２４】
前記ＮＫＧ２Ｄリガンドがオルソポックスウイルス主要組織適合複合体クラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）またはその一部である、請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項２５】
前記ＯＭＣＰが配列番号７、配列番号１３もしくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその一部を含む、請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
前記ＯＭＣＰの一部がＯＭＣＰの活性化部分を含む、請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項２７】
前記ＯＭＣＰの活性化部分がＯＭＣＰのＨ２Ｂヘリックス部分を含む、請求項２６に記載のキメラペプチド。
【請求項２８】
前記サイトカインが腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のメンバーまたはその突然変異型である、請求項２４から２７のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項２９】
前記サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂリガンド（ＲＡＮＫＬ）、リンホトキシン−α（ＬＴＡ）、リンホトキシン−β（ＬＴＢ）、Ｆａｓリガンド（ＦＡＳＬ）およびＣＤ２７Ｌからなる群から選択される、請求項２８に記載のキメラペプチド。
【請求項３０】
前記ＯＸ４０Ｌが、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０または配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のキメラペプチド。
【請求項３１】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号６５または配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のキメラペプチド。
【請求項３２】
前記免疫細胞表面タンパク質標的化リガンドがＰＤ１リガンドである、請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項３３】
前記ＰＤ１リガンドが抗体である、請求項３２に記載のキメラペプチド。
【請求項３４】
前記ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１またはその一部である、請求項３２に記載のキメラペプチド。
【請求項３５】
前記ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２またはその一部である、請求項３２に記載のキメラペプチド。
【請求項３６】
前記ＰＤ１リガンドが、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４または配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のキメラペプチド。
【請求項３７】
標的化分子に結合したオルソポックスウイルス主要組織適合複合体クラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）またはその一部を含むキメラペプチド。
【請求項３８】
前記標的化分子が、細胞上で発現される標的分子に結合する、請求項３７に記載のキメラペプチド。
【請求項３９】
前記標的分子が、前記細胞の表面上で発現されるタンパク質である、請求項３８に記載のキメラペプチド。
【請求項４０】
前記タンパク質が受容体である、請求項３９に記載のキメラペプチド。
【請求項４１】
前記細胞が、がん細胞、血管内皮細胞、腫瘍関連線維芽細胞および単球からなる群から選択される、請求項３８または３９に記載のキメラペプチド。
【請求項４２】
前記標的化分子が抗体である、請求項３７に記載のキメラペプチド。
【請求項４３】
前記抗体が、腫瘍間質中に存在する抗原に結合する、請求項４２に記載のキメラペプチド。
【請求項４４】
前記抗体がメソテリンに結合する、請求項４２に記載のキメラペプチド。
【請求項４５】
前記抗体が癌胎児抗原（ＣＥＡ）に結合する、請求項４２に記載のキメラペプチド。
【請求項４６】
前記標的化分子が受容体標的化アゴニスト抗体である、請求項３７に記載のキメラペプチド。
【請求項４７】
前記標的化分子が受容体標的化アンタゴニスト抗体である、請求項３７に記載のキメラペプチド。
【請求項４８】
前記標的化分子がＴＮＦ関連アポトーシス誘発標的化分子である、請求項３７に記載のキメラペプチド。
【請求項４９】
前記標的化分子が４−１ＢＢアゴニストである、請求項４８に記載のキメラペプチド。
【請求項５０】
前記ＯＭＣＰが配列番号７、配列番号１３もしくは配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはその一部を含む、請求項３７から４９のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５１】
前記ＯＭＣＰの一部がＯＭＣＰの活性化部分を含む、請求項３７から４９のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５２】
前記ＯＭＣＰの活性化部分がＯＭＣＰのＨ２Ｂヘリックスを含む、請求項５１に記載のキメラペプチド。
【請求項５３】
前記リンカーがペプチドリンカーであり、約２０〜約３０個のアミノ酸を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５４】
前記リンカーが、（ＡＡＳ）ｎ、（ＡＡＡＬ）ｎ（配列番号６８）、（ＧｎＳ）ｎまたは（Ｇ２Ｓ）ｎ（式中、Ａはアラニンであり、Ｓはセリンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは１〜２０または１〜１０または３〜１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５５】
前記リンカーが、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグからなる群から選択される少なくとも１つのタグを含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５６】
前記リンカーが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１から５２のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５７】
配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５または配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチド。
【請求項５８】
配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９または配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチド。
【請求項５９】
配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチド。
【請求項６０】
請求項１から５９のいずれか一項に記載のキメラペプチドをコードする配列を含む核酸分子。
【請求項６１】
請求項１から５９のいずれか一項に記載のキメラペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６２】
請求項６１に記載の医薬組成物とＰＤ−１インヒビターおよび／またはＰＤ−Ｌ１インヒビターとを含む併用療法。
【請求項６３】
前記ＰＤ−１インヒビターがＰＤ−１抗体である、請求項６２に記載の併用療法。
【請求項６４】
前記ＰＤ−１抗体が、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＰＤＲ００１およびＭＥＤＩ０６８０からなる群から選択される、請求項６３に記載の併用療法。
【請求項６５】
前記ＰＤ−１インヒビターがＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項６２に記載の併用療法。
【請求項６６】
ＰＤＬ−１抗体が、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブまたはＢＭＳ−９３６５５９またはＳＴＩ−Ａ１０１０、ＳＴＩ−Ａ１０１１、ＳＴＩ−Ａ１０１２、ＳＴＩ−Ａ１０１３、ＳＴＩ−Ａ１０１４およびＳＴＩ−Ａ１０１５からなる群から選択される、請求項６５に記載の併用療法。
【請求項６７】
がんと診断された対象を治療する方法であって、請求項６１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項６８】
前記がんが、黒色腫、腎細胞癌、肺がんおよび血液がんからなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項６２に記載の併用療法を投与することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物が、（ｉ）ＩＬ２もしくはその突然変異型に結合したＯＭＣＰもしくはその一部、（ｉｉ）ＩＬ２もしくはその突然変異型に結合した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、（ｉｉｉ）ＩＬ２もしくはその突然変異型に結合したＰＤＬ１もしくはＰＤＬ２、（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌもしくはその突然変異型に結合したＯＭＣＰもしくはその一部、または（ｖ）４−１ＢＢＬもしくはその突然変異型に結合したＯＭＣＰもしくはその一部を含むキメラペプチドを含む、請求項６７から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
サイトカインを標的細胞に送達する方法であって、標的細胞を請求項１から５９のいずれか一項に記載のキメラペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項７２】
前記キメラペプチドが、ＩＬ２またはその突然変異型に結合したＯＭＣＰまたはその一部を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記標的細胞がＮＫ細胞またはＣＤ８＋ＣＴＬである、請求項７１または請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
免疫細胞を活性化する方法であって、免疫細胞を請求項１から５９のいずれか一項に記載のキメラペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項７５】
前記キメラペプチドが、（ｉ）ＩＬ２もしくはその突然変異型に結合したＯＭＣＰもしくはその一部、（ｉｉ）ＩＬ２もしくはその突然変異型に結合した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、（ｉｉｉ）ＩＬ２もしくはその突然変異型に結合したＰＤＬ１もしくはＰＤＬ２、（ｉｖ）ＯＸ４０Ｌもしくはその突然変異型に結合したＯＭＣＰもしくはその一部、または（ｖ）４−１ＢＢＬもしくはその突然変異型に結合したＯＭＣＰもしくはその一部を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫細胞がＮＫ細胞およびＣＤ８＋ＣＴＬである、請求項７４または請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記活性化ＮＫ細胞が腫瘍細胞を溶解する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記キメラペプチドが、ＩＬ１５、ＩＬ１８またはその突然変異型に結合したＯＭＣＰまたはその一部を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫細胞がＮＫ細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ウイルス感染症を治療する方法であって、請求項６１に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項８１】
前記ウイルス感染症がフラビウイルスによって引き起こされる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記フラビウイルスが西ナイルウイルス（ＷＮＶ）である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記組成物が、ＩＬ２またはその突然変異型に結合したＯＭＣＰまたはその一部を含むキメラペプチドを含む、請求項８０から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
エキソビボでリンパ球を拡大する方法であって、請求項１から５９のいずれか一項に記載のキメラペプチドの存在下でリンパ球を培養することを含む方法。
【請求項８５】
前記キメラペプチドが、ＩＬ２またはその突然変異型に結合したＯＭＣＰまたはその一部を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
対象の養子細胞免疫療法を改善する方法であって、請求項１から５９のいずれか一項に記載のキメラペプチドの存在下で培養したリンパ球を含む治療用組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項８７】
前記キメラペプチドが、ＩＬ２またはその突然変異型に結合したＯＭＣＰまたはその一部を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
対象の肺がんを治療する方法であって、有効量の併用療法を前記対象に投与することを含み、前記併用療法が（ｉ）ＯＭＣＰまたはその一部およびＩＬ２またはその突然変異型を含むキメラペプチドと（ｉｉ）抗ＰＤ−１抗体とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって与えられたＡＩ０７３５５２、ＡＩ０１９６８７、ＡＩ１０９９４８、ＨＨＳＮ２７２２０１２０００２６ＣおよびＨＬ１１３９３１の下で政府支援によりなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示の各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／２９２，０４６号、２０１６年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３４２，６３０号、２０１６年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，０５６号および２０１６年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４１９，１４６号の利益を主張する。
【０００３】
本開示は、サイトカインの標的デリバリーのためのおよび免疫細胞を標的細胞に動員するための組成物および方法を包含する。サイトカインおよび他の薬剤の特異的デリバリーを通して、本明細書に開示される組成物は、免疫療法を改善し、いくつかの例では、免疫療法に関連する副作用を制限することができる。
【背景技術】
【０００４】
高用量インターロイキン２（ＩＬ２）の全身投与は、免疫療法の最も強力な形態の１つであり、現在、いくつかの悪性腫瘍の治療のためにＦＤＡによって承認されている。この治療の有効性は、活性化細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）、例えばナチュラルキラー細胞（ＮＫ）およびＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＤ８＋ＣＴＬ）に依存する。臨床試験は、約１５％の部分的または完全な腫瘍反応を実証し、患者の最大５％が治癒に似た耐久性のある長期持続反応を有した。少数の患者におけるこれらの励みになる結果にもかかわらず、ほとんどは利益を達成しない、または血圧変化および肺もしくは全身毛細血管漏出などの合併症のためにＩＬ２療法を早期に停止する。ＩＬ２の血管内皮に対する直接作用がこれらの副作用の大部分に寄与すると考えられる。ＩＬ２の有効性はまた、腫瘍免疫応答を減少させるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の優先的活性化によっても制限される。これらの理由のために、高用量ＩＬ２を用いた治療は臨床的には人気を失った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＩＬ２療法の副作用および有効性減少は、ベースラインで血管内皮細胞およびＴｒｅｇｓよって発現される高親和性三量体αβγ  ＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒ）によって生じる。よって、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓおよび血管内皮は、静止時にＩＬ２Ｒの低親和性βγ鎖を発現するＮＫ細胞よりもずっと低用量のＩＬ２で活性化される。ＮＫ細胞は活性化後にＩＬ２Ｒの高親和性α鎖を発現し、ピーク細胞溶解能力を発揮するためにこの三量体受容体に依存する。ＩＬ２Ｒαに対する親和性が低下したＩＬ２の突然変異形態が記載されており、より好ましい副作用プロファイルを提供する。しかしながら、これらはまた、ＣＴＬ活性化の低下により低い有効性および減少した治療可能性をもたらす。そのため、Ｔｒｅｇｓおよび内皮細胞を活性化することなく、ＣＴＬに優先的に結合し、これを活性化することができるようなＩＬ２の形態が当技術分野で必要とされている。このようなＩＬ２誘導体は、このような臨床的な障害を克服し、より少ない副作用で有効な免疫療法をもたらし得るだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本開示は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合したサイトカインを含む組成物を提供する。１つの特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である。
【０００７】
別の態様では、本開示は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するリガンドと標的化分子とを含む組成物を提供する。標的化分子は、組成物を標的細胞上の結合対へと導き、免疫細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合しているリガンド上に免疫細胞を動員する。一例では、リガンドがオルソポックスウイルス（ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）主要組織適合複合体クラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）である。標的化分子をリガンドに結合させることもまたは結合させないこともでき、リガンドを含む単一組成物で一緒に提供することもまたは別個の組成物で同時に投与することもできる。
【０００８】
別の態様では、本開示は、サイトカインを標的細胞に送達する方法であって、標的細胞を、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合したサイトカインを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、免疫細胞を活性化する方法であって、免疫細胞を、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合した炎症性サイトカインを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。リガンドは、免疫細胞上の受容体に特異的に結合し、それによって細胞を活性化する。
【０００９】
さらに別の態様では、本開示は、特定の標的細胞で免疫細胞を動員および活性化する方法であって、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するリガンドと、標的化分子とを含む組成物を提供することを含む方法を提供する。
【００１０】
なおさらに別の態様では、本開示は、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する対象を同定することと、治療上有効量のＮＫＧ２Ｄリガンドに結合した炎症性サイトカインを含む組成物を対象に投与することとを含む方法を提供する。
【００１１】
異なる態様では、本開示は、ウイルス感染症を治療する方法であって、治療上有効量のＮＫＧ２Ｄリガンドに結合した炎症性サイトカインを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。他の態様では、本開示は、サイトカインペプチドと、ＮＫＧ２Ｄリガンドペプチドとを含むキメラペプチドを提供する。
【００１２】
一定の態様では、本開示は、サイトカインペプチドと、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とを含むキメラペプチドを提供する。
【００１３】
別の態様では、本開示は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）リガンドに結合したサイトカインを含む組成物を提供する。１つの特定の実施形態では、ＰＤ１リガンドがプログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１）である。別の特定の実施形態では、ＰＤ１リガンドがプログラム細胞死リガンド２（ＰＤＬ２）である。
【００１４】
別の態様では、本開示は、サイトカインを標的細胞に送達する方法であって、標的細胞を、ＰＤ１リガンドに結合したサイトカインを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、免疫細胞を活性化する方法であって、免疫細胞を、ＰＤ１リガンドに結合した炎症性サイトカインを含む組成物と接触させることを含む方法を提供する。リガンドは免疫細胞上の受容体に特異的に結合し、それによって細胞を活性化する。
【００１５】
なおさらに別の態様では、本開示は、腫瘍を治療する方法であって、腫瘍を有する対象を同定することと、治療上有効量のＰＤ１リガンドに結合した炎症性サイトカインを含む組成物を対象に投与することとを含む方法を提供する。
【００１６】
異なる態様では、本開示は、ウイルス感染症を治療する方法であって、治療上有効量のＰＤ１リガンドに結合した炎症性サイトカインを含む組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。他の態様では、本開示は、サイトカインペプチドおよびＰＤ１リガンドペプチドを含むキメラペプチドを提供する。
【００１７】
一定の態様では、本開示は、サイトカインペプチドおよび抗ＰＤ１抗体を含むキメラペプチドを提供する。
【００１８】
別の異なる態様では、本開示は、本開示のキメラペプチドをコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【００１９】
さらに別の異なる態様では、本開示は、本開示のキメラペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００２０】
なおさらに別の異なる態様では、本開示は、がんと診断された対象を治療する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
別の態様は、（１）腫瘍を有する対象を同定することと；（２）治療上有効量の本明細書に記載される併用療法を対象に投与することとによって、腫瘍を治療する方法である。
【００２２】
別の態様は、治療上有効量の本明細書に記載される併用療法を対象に投与することによって、ウイルス感染症を治療する方法である。
【００２３】
本明細書で提供される種々の方法のいくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物が、ＰＤ−１インヒビターと組み合わせて投与される。一定の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＲＥＧＮ２８１０、ＰＤＲ００１およびＭＥＤＩ０６８０からなる群から選択される。
【００２４】
本明細書で提供される種々の方法の他の実施形態では、本開示の医薬組成物がＰＤ−Ｌ１インヒビターと組み合わせて投与される。一定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体がアンタゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、デュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブまたはＢＭＳ−９３６５５９、ＳＴＩ−Ａ１０１０、ＳＴＩ−Ａ１０１１、ＳＴＩ−Ａ１０１２、ＳＴＩ−Ａ１０１３、ＳＴＩ−Ａ１０１４およびＳＴＩ−Ａ１０１５からなる群から選択される。
【００２５】
本出願ファイルは、色で実行される少なくとも１つの図面を含む。色の図面を含む本特許出願公開の複製は、請求および必要な手数料の支払いにより、特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅおよび図１Ｆは、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の生成およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）評価を示す図表、免疫ブロットおよびグラフを示す。（図１Ａ）ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の概略構造。（図１Ｂ）ｍｕｔＩＬ２および野生型ＩＬ２と比較したＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の分子量。ＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２を哺乳動物細胞で生成したところ、グリコシル化により高い分子量を有する。ｍｕｔＩＬ２についての下に移動したバンドは、おそらく生成細胞の溶解による、非グリコシル化タンパク質に相当する。分子量の違いに基づいて、全てのサイトカインおよびコンストラクトを、本明細書において１０００ＩＵ当量（ＩＵｅ）として定義される４．４μＭ溶液１μｌで、モル基準で投与した。これにより、分子量が異なるにもかかわらず、ＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の間での等モル比較が有効に可能になる。（図１Ｃ、図１Ｄ）１００ＩＵｅのサイトカインまたはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２コンストラクト中で３６時間の培養後のＡ／Ｊリンパ球サブセットのインビトロ活性化。（図１Ｅ、図１Ｆ）１０００ＩＵｅ／ｍｌのサイトカインまたはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２コンストラクト中で５日間の培養後のＢ６リンパ球サブセットの増殖。１条件当たり３〜６連を表すグラフ。黒色＝生理食塩水；青色＝ｗｔＩＬ２、赤色＝ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２、緑色＝ｍｕｔＩＬ２。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｇ、図２Ｈ、図２Ｉ、図２Ｊ、図２Ｋ、図２Ｌ、図２Ｍ、図２Ｎおよび図２Ｏは、ＩＬ２およびＩＬ２コンストラクトのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与を示すグラフおよび画像を示す。動物死亡率（図２Ａ）および体重減少によって評価した罹患（図２Ｂ）腹水および胸膜液の蓄積（代表的な注射器−図２Ｃ；群の全てのマウスからの平均−図２Ｄ）および（図２Ｅ）ｗｔＩＬ２の投与後の臓器炎症。Ａ／Ｊマウスにおいて抗アシアロＧＭ１（実線）またはウサギＩｇＧ処理（点線）における、高用量ｗｔＩＬ２（図２Ｆ、図２Ｇ）、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２（図２Ｈ、図２Ｉ）およびｍｕｔＩＬ２（図２Ｊ、図２Ｋ）の投与後の動物死亡率（図２Ｆ、図２Ｈ、図２Ｊ）および体重減少によって評価した罹患（図２Ｇ、図２Ｉ、図２Ｋ）。２００，０００ＩＵｅのｗｔＩＬ２、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２で処理したマウスにおける、体重減少（図２Ｌ）、腹水（代表的な注射器−図２Ｍ；群の全てのマウスからの平均−図２Ｎ）および臓器炎症（図２Ｏ）。全てのグラフは、１処理条件当たり４６匹の動物を表す。ｎｓ  ｐ＞．０５；＊ｐ＜．０５；＊＊ｐ＜．０１；＊＊＊ｐ＜．００１；黒色＝生理食塩水；青色＝ｗｔＩＬ２、赤色＝ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２、緑色＝ｍｕｔＩＬ２。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ、図３Ｈ、図３Ｉおよび図３Ｊは、インビボでのＩＬ２およびＩＬ２コンストラクト投与に関連する免疫学的変化を示すグラフおよび画像を示す。（図３Ａ、図３Ｂ）５日間の２００，０００ＩＵｅのＩＬ２（青色）、ｍｕｔＩＬ２（緑色）およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２（赤色）後の総脾細胞数。（図３Ｃ）脾臓の細胞数（上）およびＫＬＲＧ１上方制御（下）によって測定されるＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２、高用量ＩＬ２、高用量ｍｕｔＩＬ２およびＩＬ２／抗ＩＬ２複合体後のＮＫ細胞拡大および活性化。（図３Ｄ）脾臓の細胞数（上）およびＩＣＯＳ上方制御（下）によって測定されるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ拡大および活性化、ならびに（図３Ｅ）脾臓におけるＮＫ／Ｔｒｅｇ比。７５０，０００ＩＵｅのサイトカインまたはコンストラクトで処理したＢ６マウスにおける脾細胞（図３Ｆ、図３Ｇ）およびＮＫ細胞（図３Ｈ）の拡大。Ｂ６マウスの脾臓における、Ｔｒｅｇ拡大および活性化（図３Ｉ）ならびにＮＫ：Ｔｒｅｇ比（図３Ｊ）。全てのグラフは、１群当たり５〜１０匹のマウスからの平均細胞数±ＳＥＭを表す。ｎｓ  ｐ＞．０５；＊ｐ＜．０５；＊＊ｐ＜．０１；＊＊＊ｐ＜．００１；黒色＝生理食塩水；青色＝ｗｔＩＬ２、赤色＝ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２、緑色＝ｍｕｔＩＬ２。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄおよび図４Ｅは、サイトカイン媒介腫瘍免疫療法を示すグラフおよび画像を示す。（図４Ａ）静脈内注射後のＹＡＣ−１リンパ腫に対するインビボ細胞傷害性。（図４Ｂ、図４Ｃ）腫瘍注射５〜１０日後に１０用量として与えられる５日間の７５０，０００ＩＵｅのサイトカイン処理後のＬＬＣ腫瘍成長。ＮＫ細胞が枯渇したマウス（図４Ｄ）またはＮＫＧ２Ｄが欠損した突然変異型マウス（図４Ｅ）におけるＬＬＣ腫瘍成長。データは、１群当たり５〜６匹のマウスを表す。ｎｓ  ｐ＞．０５；＊ｐ＜．０５；＊＊ｐ＜．０１；＊＊＊ｐ＜．００１；黒色＝生理食塩水；青色＝ｗｔＩＬ２、赤色＝ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２、緑色＝ｍｕｔＩＬ２。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ、図５Ｇ、図５Ｈ、図５Ｉ、図５Ｊおよび図５Ｋは、ＮＫ細胞におけるＩＬ２シグナル伝達を示すグラフおよび概略図を示す。（図５Ａ、図５Ｂ）１×１０６ＩＵｅの蛍光色素標識サイトカインまたはコンストラクトの静脈内注射後の血清レベル。（図５Ｃ）１０００ＩＵｅ／ｍｌでの表面ＣＤ１０７ａ発現によって測定されるサイトカインの存在下でのＮＫ細胞の脱顆粒およびＮＫＧ２Ｄの五量体ＯＭＣＰ媒介架橋。漸増容量のサイトカインによるＡ／Ｊ（図５Ｄ）またはＢ６マウス（図５Ｅ）からの単離ＮＫ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化。１０００ＩＵｅ／ｍｌ（図５Ｆ）または１００ＩＵｅ／ｍｌ（図５Ｇ）のＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による１５分間の刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化の減衰。（図５Ｈ）ＩＬ２についてのＮＫ細胞と間質細胞との間の競合の提案されたモデル。（図５Ｉ）ｗｔＩＬ２およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による他の脾細胞の存在下でのＢ６  ＮＫ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化。（図５Ｊ）競合脾細胞の存在下でのｗｔＩＬ２およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による野生型またはＮＫＧ２Ｄ−／−ＮＫ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化。（図５Ｋ）飽和濃度のラット抗マウスＣＤ２５（クローン３Ｃ７）またはラットＩｇＧアイソタイプ対照で処理した競合脾細胞の存在下での野生型ＮＫ細胞の、生理食塩水処理対照に対する倍数変化によって測定されるＳＴＡＴ５リン酸化。
【図６】図６は、Ｂ６  ＮＫ細胞が低用量ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によって優先的に活性化されるが、この選択性が最高用量のサイトカインでまたはＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ発現の非存在下で選択的に消失することを示すグラフを示す。左の２つのグラフはＢ６  ＮＫ細胞を示し、右の２つのグラフはＢＫ  ＮＫＧ２Ｄ−／−ＮＫ細胞を示す。
【図７】図７Ａ、図７Ｂおよび図７Ｃは、内臓の検査により５日間の２００，０００または７５０，０００ＩＵｅのｗｔＩＬ２後の摂食量の制限が実証されることを示す画像を示す。図７Ｄは、Ａ／Ｊ系統と異なり、Ｂ６マウスは、７５０，０００ＩＵｅ後に中程度の体重減少のみで高用量のｗｔＩＬ２に耐容性を示すことができることを示すグラフを示す。高用量の１，５００，０００ＩＵｅのＩＬ２は、体重減少の増加をもたらした。このレジメンより上の用量は動物の死をもたらした。
【図８】図８Ａは、ＩＬ２／抗ＩＬ２抗体または高用量ｍｕｔＩＬ２で処理したＡ／Ｊマウスが処理中に有意な体重を喪失したことを示すグラフを示す。ＩＬ２／抗ＩＬ２処理マウスの大部分が、全２００，０００ＩＵｅの投与を生き残ることができず、処理開始の４日後、よって１６０，０００〜１８０，０００ＩＵｅを受けた後、屠殺した。図８Ｂは、Ａ／Ｊ脾臓におけるＵＬＢＰ３−ｍｕｔＩＬ２および低用量のＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によるＮＫ拡大を示すグラフおよびフローサイトメトリープロットを示す（上）。Ａ／Ｊ脾臓における２００，０００ＩＵｅのｍｕｔＩＬ２（緑色）またはＵＬＢＰ３−ｍｕｔＩＬ２（紫色）で処理したＮＫ細胞上の表面ＫＬＲＧ１発現によって測定されるＮＫ活性化（下）。図８Ｃおよび図８Ｄは、ＮＫ細胞の場合とは異なり、ＩＬ２、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２処理マウスにおいて、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞のわずかな拡大しか明らかでなかったことを示すグラフを示す。図８Ｅは、高用量ｍｕｔＩＬ２またはＩＬ２／抗ＩＬ２抗体複合体で処理したＢ６マウスにおける体重減少を示すグラフを示す。図８Ｆおよび図８Ｇは、サイトカイン処理Ｂ６マウスにおけるＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の拡大を示すグラフを示す。グラフは１群当たり５〜１０匹のマウスを表す。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、１０用量にわたって与えられた５日間の２００，０００ＩＵｅのサイトカイン後のバルク脾細胞によるＡ／Ｊ腫瘍、例えばＬＭ２肺腺癌（図９Ａ）またはＹＡＣ−１リンパ腫（図９Ｂ）のインビトロ溶解を示すグラフを示す。図９Ｃは、１０用量で５日間にわたって与えられた７５０，０００ＩＵｅのサイトカインまたはコンストラクトで処理したＢ６脾細胞によるＬＬＣ肺がんのインビトロ溶解を示す。
【図１０】図１０Ａは、１，０００ＩＵｅ／ｍｌで添加されたサイトカインによるＮＫ脱顆粒のプレート結合抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（クローンＡ１０）媒介増大を示すフローサイトメトリープロットを示す。図１０Ｂは、１００ＩＵｅ／ｍｌのＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２と五量体ＯＭＣＰで培養したＮＫ細胞上のＣＤ６９レベルを示すフローサイトメトリープロットを示す。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、インビボでの示差的ＩＬ２結合および活性化の模式図を示す。（図１１Ａ）通常の野生型ＩＬ２は、共にＩＬ２受容体のシグナル伝達β鎖およびγ鎖と一緒に高親和性α鎖を発現するＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓおよび血管内皮などの細胞に優先的に結合する。（図１１Ｂ）ＩＬ２におけるＲ３８ＡおよびＦ４２Ｋ突然変異は、ＩＬ２受容体のα鎖に対する親和性を低下させる。（図１１Ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２を高親和性ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合させることによって、ＯＭＣＰデリバリーおよびこのサイトカインのＮＫＧ２Ｄ発現ＣＴＬ、例えばＮＫ細胞および活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞との結合が増加する。矢印の幅はＩＬ２結合および／またはシグナル伝達の提案される強度を示す。
【図１２】図１２は免疫療法実験の実験設計の概略図を示す。
【図１３】図１３はワクチン接種実験の実験設計の概略図を示す。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、マウスの肺がん感受性系統および耐性系統を示すグラフを示す。（図１４Ａ）ＡＪおよび１２９マウス系統は腫瘍量によって証明されるように肺がんに感受性である一方、Ｂ６およびＣ３Ｈマウス系統は腫瘍量によって証明されるように肺がんに耐性である。（図１４Ｂ）種々のマウス系統から新たに単離したＮＫ細胞とインキュベーションすると、Ｂ６およびＣ３Ｈ  ＮＫ細胞は、ＡＪおよび１２９  ＮＫ細胞よりも有意に多いＬＭ２肺癌細胞溶解をもたらす。
【図１５】図１５は、ヒト男性において、「感受性」患者に対して「耐性」患者で、より高い割合のＮＫ細胞がＴＮＦαを産生するように見えることを示すグラフを示す。
【図１６】図１６は、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）サイトカイン活性化がナチュラルキラー細胞機能障害を反転させることができることを示すグラフを示す。がん細胞の有意な溶解を示さなかったマウスＮＫ細胞（１２９＆ＡＪ系統のＮＫ細胞）は、ＩＬ２で処理すると、溶解においてはるかに有効であった。がん耐性系統のＮＫ細胞も比溶解（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｓｉｓ）の％増加を示した。
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｅおよび図１７Ｆは、バルク脾細胞において３７℃で、インビトロで試験した蛍光標識コンストラクトの結合を示すグラフを示す。コンストラクトは、ＮＫ細胞（ＮＫＧ２Ｄを発現する）にのみ結合するように見える。（図１７Ａ）ＤＸ５＋ＣＤ３−ＮＫ細胞；（図１７Ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞；（図１７Ｃ）ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞；（図１７Ｄ）ＣＤ１１Ｃ＋ＣＤ１１ｂ−ＤＣｓ；（図１７Ｅ）ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１１ｂ＋Ｍａｃｓ；（図１７Ｆ）ＣＤ１９＋ＣＤ３−Ｂ細胞。
【図１８】図１８はＩＬ２またはＩＬ２コンストラクトについての概略投与レジメンを示す。
【図１９】図１９は照射後のＩＬ２またはＩＬ２コンストラクトについての概略投与レジメンを示す。
【図２０】図２０Ａ、図２０Ｂおよび図２０Ｃは、ＯＭＣＰ構造の画像およびアラインメントを示す。（図２０Ａ）ＣＰＸＶ  ＯＭＣＰのリボンダイアグラム。二次構造要素を記述し、Ｓはβ鎖、Ｈはヘリックスを示す。プラットホームドメインのα１／α２部分をそれぞれシアンおよびマゼンタで示す。（図２０Ｂ）α３ドメインを明確さのために除去した、ＭＩＣＡ（ＰＤＢ識別子１ＨＹＲ）のα１／α２ドメインのリボンダイアグラム。ＮＫＧ２Ｄに接触している残基を黄色に着色している。（図２０Ｃ）ＮＫＧ２ＤＬを有するＯＭＣＰの構造アラインメント。ＯＭＣＰＢＲ（ＣＰＸＶ−ＢＲ−０１８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６１９８０７；ＰＤＢ識別子４ＦＦＥ）およびＯＭＣＰＭＰＸ（ＭＰＸＶ−ＺＡＲ＿１９７９＿００５−１９８；Ｎ３Ｒ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＹ９７３９６）の成熟配列を、ＭＩＣＡ（１ＨＹＲ）、ＭＩＣＢ（１ＪＥ６）、ＵＬＢＰ３（１ＫＣＧ）およびＲＡＥ−１β（１ＪＦＭ）の外部ドメイン配列とアラインメントする。ＮＫＧ２ＤＬについて公知のＮＫＧ２Ｄ接触残基を黄色で示す。グリコシル化されそうなＡｓｎ残基をパネルＣで黒色箱によって記述し、パネルＡおよびＢで黒色側鎖として記述する。ＯＭＣＰｂｒ＝配列番号１３、ＯＭＣＰｍｐｘ＝配列番号１４；ＭＩＣＡ＝配列番号１５；ＭＩＣＢ＝配列番号１６；ＵＬＢＰ３＝配列番号１７；およびＲＡＥ−１Ｂ＝配列番号１８
【図２１】図２１は、ＩＬ１５のＯＭＣＰ標的化デリバリーを示すグラフを示す。等モル用量では、裸のサイトカイン単独と比較して、ＩＬ１５をＯＭＣＰによって送達する場合、より高レベルのＣＤ２５が明らかである。
【図２２】図２２は、ＯＭＣＰにおけるＤ１３２Ｒ突然変異が、そのＮＫＧ２Ｄ結合を有意に減少させることを示すグラフを示す。ｍｕｔＩＬ２、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２およびＤ１３２ＲＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の存在下でのＮＫ拡大および活性化を試験した。Ｄ１３２Ｒ突然変異は、サイトカイン単独に対してナチュラルキラー細胞活性化の優位性を改善した。
【図２３】図２３は本発明の種々の実施形態を示す。１．はサイトカインに結合したＯＭＣＰヘリックス２を示す。２．は組成物のペグ化を示す。３．は操作されたグリカンを含む組成物を示す。４．は種々のリンカー長さおよび組成を示す。５．はサイトカインに結合した抗体を示す。例えば、Ｆａｂ特異的ＮＫＧ２Ｄ抗体。６．はサイトカインに結合したＮＫＧ２ＤＬを示す。例えば、ＭＩＣまたはＵＬＢＰ。７．はサイトカインに結合した代替ＯＭＣＰを示す。例えば、ＯＭＣＰｍａｘはＮＫＧ２Ｄ結合についての機能獲得を表し、突然変異型ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄ結合についての機能喪失を表し得る。８．は組成物におけるＯＭＣＰの再標的化（ｒｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）を示す。例えば、ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ等へと導かれ得る。９．はサイトカインに結合した他のウイルスタンパク質を示す。例えば、他のウイルスタンパク質も免疫細胞上の受容体に結合し得る。１０．は突然変異型サイトカインに結合したＯＭＣＰを示す。ＯＭＣＰ配列は、牛痘またはサル痘などの種々の供給源由来であり得ることが理解される。また、ＯＭＣＰとＩＬ２のＦｃキメラ、およびこれらの変異体が使用され得る。
【図２４】図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＮＫＧ２Ｄと複合体であるＯＭＣＰの構造を示す。（図２４Ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合したＯＭＣＰ。ＯＭＣＰをマゼンタに着色し、ＮＫＧ２Ｄのプロモーターをシアン（「Ａ」）および黄色（「Ｂ」）に着色する。ＮＫＧ２ＤＡはＨ２ａヘリックスと主に接触し、ＮＫＧ２ＤＢはＨ２ｂと接触する。代替結晶充填を促進するために導入された突然変異を赤色で示す。Ｓ１９３−Ｓ１９４結合を各ＮＫＧ２Ｄプロモーター上でボールとして示す。推定上のｈＮＫＧ２Ｄグリコシル化部位のアスパラギンを橙色で示す。ＯＭＣＰの確認されたＮ−グリカン部位のアスパラギンを緑色で示す（データは示さず）。（図２４Ｂ）ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ間の界面の図。ＯＭＣＰのα２ドメインを、後ろのα１ドメインの前に示す。ＯＭＣＰおよびＮＫＧ２Ｄを主鎖についてカートゥーン表現で示し、接触残基の側鎖を棒として示す。水素結合および塩橋を緑色点線で示す。
【図２５】図２５Ａ、図２５Ｂおよび図２５Ｃは、ＯＭＣＰおよびＮＫＧ２Ｄの界面を示す。（図２５Ａ）Ｄ１３２Ｒ残基を囲むＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ結合界面の局所的環境。Ｄ１３２Ｒ突然変異は、ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ結合を切断する。（図２５Ｂ）ＳＰＲによるＷＴおよび（Ｄ１３２Ｒ）ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄの結合についての代表的な実験。１００ｎＭのＯＭＣＰまたは（Ｄ１３２Ｒ）ＯＭＣＰを、固定化したビオチン化マウスＮＫＧ２Ｄを含むフローセル上５０μｌ／分で注射した。（図２５Ｃ）ＮＫＧ２Ｄ、ＦＣＲＬ５または空のベクターで形質導入したＢａ／Ｆ３細胞を、ＯＭＣＰ四量体（実線）、Ｄ１３２Ｒ四量体（破線）またはＷＮＶ  ＤＩＩＩ四量体対照（灰色ヒストグラム）を用いて染色した。３つの独立した実験からの代表的な結果。
【図２６】図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃおよび図２６Ｄは、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄのβ５’−β５ループ（Ｌ２）の差異を示す。（図２６Ａ、図２６Ｂ）ｍＮＫＧ２Ｄ（灰色）（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＨＱ８）とＯＭＣＰ−ｈＮＫＧ２Ｄ（黄色およびシアン）の構造の重ね合わせ。コア結合残基Ｙ１５２（Ｙ１６８）およびＹ１９９（Ｙ２１５）は位置的に保存されているが、コア結合残基Ｍ１８４（Ｉ２００）はされていない。（図２６Ｃ）β５’−β５ループと相互作用するＯＭＣＰの表面表現（マゼンタ）。（図２６Ｄ）Ｍ１８４およびＱ１８５の保存。マウス、ラット、モルモットおよびオオコウモリ（図示せず）のＮＫＧ２Ｄのみが異なる。保存スコアはＣｏｎＳｕｒｆサーバーによって計算される通りである。ヒト、オランウータン（ｏｒｇａｎｇｕｔａｎ）、チンパンジー、テナガザル、マカク−配列番号１９；ミドリザル−配列番号２０；マーモセット−配列番号２１；マウス−配列番号２２；ラット−配列番号２３；モルモット−配列番号２４；ジリス−配列番号２５；シロアシネズミ−配列番号２６；ハダカデバネズミ−配列番号２７；プレーリーハタネズミ−配列番号２８；ヨーロッパトガリネズミ−配列番号２９；ホシバナモグラ−配列番号３０；チャイニーズハムスター−配列番号３１；ネコ−配列番号３２。
【図２７】図２７Ａ、図２７Ｂ、図２７Ｃ、図２７Ｄ、図２７Ｅ、図２７Ｆ、図２７Ｇ、図２７Ｈおよび図２７Ｉは、新規なＮＫＧ２Ｄ結合適合を示す。ＮＫＧ２Ｄの表面表現ならびにＯＭＣＰ、ＭＩＣＡおよびＵＬＢＰ３の表面およびカートゥーン表現。ＮＫＧ２ＤＡおよびＮＫＧ２ＤＢについての埋没表面積をそれぞれシアンおよび黄色で示す。ＮＫＧ２Ｄによる埋没表面積をＯＭＣＰ（マゼンタ）、ＭＩＣＡ（緑色）およびＵＬＢＰ３（橙色）について示す。ＮＫＧ２Ｄのコア結合残基およびＮＫＧ２ＤＬのＮＫＧ２Ｄ結合要素を示す。ＮＫＧ２Ｄ（図２７Ａ）およびＯＭＣＰ（図２７Ｂ、図２７Ｃ）の結合相互作用。ＮＫＧ２Ｄ（図２７Ｄ）およびＭＩＣＡ（図２７Ｅ、図２７Ｆ）の結合相互作用。ＮＫＧ２Ｄ（図２７Ｇ）およびＵＬＢＰ３（図２７Ｈ、図２７Ｉ）の結合相互作用。（図２７Ｊ）ＮＫＧ２ＤＬ（ＰＤＢ  ＩＤ：ＯＭＣＰ（４ＦＦＥ）、ＭＩＣＡ（１ＨＹＲ）、ＭＩＣＢ（１ＪＥ６）、ＵＬＢＰ３（１ＫＣＧ）およびＲＡＥ−１β（１ＪＳＫ））の二次構造によるアラインメント。接触残基をＯＭＣＰ（マゼンタ）、ＭＩＣＡ（緑色）、ＵＬＢＰ３（橙色）およびＲＡＥ−１β（太字およびイタリック）について示す。二次構造要素を配列の上に記述する（βシートについては矢印、αヘリックスについては円筒）。予測されるグリカン部位を黒色で強調する。ＯＭＣＰｂｒ＝配列番号１３；ＯＭＣＰｍｐｘ＝配列番号１４；ＭＩＣＡ＝配列番号１５；ＭＩＣＢ＝配列番号１６；ＵＬＢＰ３＝配列番号１７；およびＲＡＥ−１Ｂ＝配列番号１８。
【図２８】図２８Ａ、図２８Ｂ、図２８Ｃ、図２８Ｄおよび図２８Ｅは、細胞結合性ＯＭＣＰによるＮＫ細胞の活性化を示す。（図２８Ａ）宿主、（図２８Ｂ）がん誘導、（図２８Ｃ）ウイルスまたは（図２８Ｄ）キメラリガンドとのＮＫＧ２Ｄ相互作用を示すモデル。ＮＫＧ２Ｄ媒介シグナル伝達をもたらす結合相互作用を、ＤＡＰ１０チロシンリン酸化（赤色で満たされた円）によって示す。（図２８Ｅ）ＩＬ２活性化脾細胞を、安定形質導入Ｂａ／Ｆ３細胞株に対する細胞傷害性エフェクターとして使用した。脾細胞を２００Ｕ／ｍｌのＩＬ２で２４時間活性化した。標識標的細胞を、エフェクター：標的比１０：１、２０：１および４０：１で、活性化脾細胞と４時間、共にインキュベートした。フローサイトメトリーを用いてＣＦＳＥ標識標的細胞による７ＡＡＤの組み込みによって死滅を測定した。５つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【図２９】図２９Ａおよび図２９Ｂは、シスペプチド立体配座を支持する電子密度を示す。ｈＮＫＧ２Ｄのβ５−β６ループの立体図。残基１９３−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−１９７（配列番号３３）をＯＭＣＰ−ｈＮＫＧ２Ｄ構造（黄色）およびｈＮＫＧ２Ｄ単独の構造（灰色）について示す。ＯＭＣＰ−ｈＮＫＧ２Ｄについての２Ｆｏ−Ｆｃマップを２σで示す。
【図３０】図３０Ａおよび図３０Ｂは、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）による感染後のＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスの生存曲線を示すグラフを示す。マウスを、ＷＮＶによる感染後、ＯＭＣＰ−ＩＬ２、ＯＭＣＰ（Ｄ１３２Ｒ）−ＩＬ２、ＩＬ２、ＩＬ（３８Ｒ／４２Ａ）またはＰＢＳで処理した。ＯＭＣＰ−ＩＬ２およびＩＬ２（３８Ｒ／４２Ａ）による感染は、ＰＢＳまたはＯＭＣＰ（Ｄ１３２Ｒ）−ＩＬ２による処理後の０匹のマウスと比較してマウスの４０％で２１日超の生存をもたらした。
【図３１】図３１Ａ、図３１Ｂ、図３１Ｃおよび図３１Ｄは、ＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２がＮＫおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することを示すフローサイトメトリーデータを示す。図３１Ａは比較的高い割合のＮＫ細胞がＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２群で明らかであったことを示している。図３１Ｂは、パーフォリンレベルが、生理食塩水（黒色）、ＩＬ２（青色）または突然変異型ＩＬ２（緑色）処理細胞と比較してＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２処理ＮＫ細胞（赤色）で高かったことを示している。図３１Ｃは、ＮＫ細胞と同様に、他の条件と比較してＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞でパーフォリンの高い細胞内レベルが明らかであったことを示している。図３１Ｄは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞をゲーティングすると、他の条件と比較してＩＬ２処理末梢血リンパ球培養液で、比較的高い割合の活性化ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−調節性Ｔ細胞が明らかであったことを示している。
【図３２】図３２は種々のＩＬ１８−ＯＭＣＰコンストラクトの概略図を示す。それぞれＷＴヒトＩＬ−１８、ＷＴマウスＩＬ−１８または突然変異型ヒトＩＬ−１８（ＩＬ−１８ＢＰとの相互作用を抑制する）と結合したＯＭＣＰを有する、３つのバージョンを作成した。
【図３３】図３３は、ＩＬ１８−ＯＭＣＰがＮＫ細胞を活性化することを示すフローサイトメトリープロットを示す。末梢血リンパ球を、４．４μＭの野生型ＩＬ−１８（青色）、ＯＭＣＰ−ＩＬ１８（赤色）または生理食塩水（黒色）中で４８時間培養した。表面ＣＤ６９発現によって測定される、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞の活性化は、野生型ＩＬ１８と比較してＯＭＣＰ−ＩＬ１８で優れていた。
【図３４】図３４は、アイソタイプ抗体、抗ＰＤ−１抗体、ＯＭＣＰ−ＩＬ２とアイソタイプ抗体、および抗ＰＤ−１抗体とＯＭＣＰで処理したマウスコホートの肺を示す。
【図３５】図３５は、図３４のマウスコホートの肺から測定される肺重量を示す。
【図３６】図３６は、本発明の種々の実施形態を示す。１．サイトカインに結合した全長ＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含む組成物を示す。２．サイトカインに結合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２由来ペプチドを含む組成物を示す。３．サイトカインに結合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含み、ペグ化された組成物を示す。４．サイトカインに結合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含み、Ｎ−グリカンを含む組成物を示す。５．サイトカインに結合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含み、リンカーが種々の配列および種々の長さを含む組成物を示す。６．サイトカインに結合したＰＤ１に対するＦａｂ特異抗体を含む組成物を示す。７．サイトカインに結合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の突然変異バージョンを含む、種々のＰＤ１リガンドを含む組成物を示す。ＰＤＬ１またはＰＤＬ２は改善した結合親和性または弱い結合親和性を有するよう突然変異され得る。８．突然変異サイトカインに結合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２を含む組成物を示す。ＰＤＬ１またはＰＤＬ２配列がヒト、マウスまたはサルなどの種々の供給源に由来し得ることが理解される。また、ＰＤＬ１またはＰＤＬ２とＩＬ２のＦｃキメラおよびその変異体が使用され得る。
【図３７】図３７Ａ、図３７Ｂ、図３７Ｃ、図３７Ｄおよび図３７Ｅは、野生型ＩＬ−２（青色）またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２（赤色）を用いたインビトロ拡大後のＮＫ細胞生理学を示すグラフを示す。図３７ＡはＮＫ細胞の拡大を示す。図３７ＢはＮＫ細胞上のＰＤ１発現を示す。図３７ＣはＮＫ細胞増殖を示す。図３７ＣはＮＫ細胞の生存率を示す。図３７Ｅは、ＮＫ細胞上のＴｉｍ３およびＬａｇ３発現のフローサイトメトリープロットを示す。
【図３８】図３８Ａ、図３８Ｂ、図３８Ｃ、図３８Ｄおよび図３８Ｅは、野生型ＩＬ−２（青色）またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２（赤色）を用いたインビトロ拡大後のＴ細胞生理学を示すグラフを示す。図３８ＡはＴ細胞の拡大を示す。図３８ＢはＴ細胞上のＰＤ１発現を示す。図３８ＣはＴ細胞増殖を示す。図３８ＣはＴ細胞の生存率を示す。図３８ＥはＴ細胞上のＴｉｍ３およびＬａｇ３発現のフローサイトメトリープロットを示す。
【図３９】図３９Ａ、図３９Ｂ、図３９Ｃおよび図３９Ｄは、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ突然変異型ＩＬ−２の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体媒介デリバリーを示すグラフを示す。１０Ｕ／ｍｌで、ＯＭＣＰ突然変異型ＩＬ−２は、抗体媒介デリバリーに対して上昇したパーフォリンレベルに向かう傾向を実証したが、統計学的有意性に達しなかった（図３９Ａ）。１００Ｕ／ｍｌで、２ＨＬ２および２ＬＨ２抗体で処理したＮＫ細胞は、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２処理細胞と同程度のパーフォリンを合成したが、１ＨＬ２および１ＬＨ２処理ＮＫ細胞では低レベルのパーフォリンが明らかであった（図３９Ｂ）。全コンストラクトに対して野生型ＩＬ−２処理培養物で高レベルのＣＤ２５が明らかであった（図３９Ｃ、図３９Ｄ）。４〜７の別個の実験を表すデータ。＊＝ｐ＜０．０５およびｎｓ＝ｐ＞０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書に記載される一定の組成物および方法は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを介したサイトカインの規定の細胞へのデリバリーを提供する。サイトカインと、標的細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合するＮＫＧ２Ｄリガンドの融合により、サイトカインのデリバリーのための「住所」が作り出される。具体的には、本明細書で開示される発明を用いて、ＩＬ２が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を介して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのリンパ球に直接標的化される。しかしながら、それだけに限らないが、ＯＭＣＰリガンド、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、Ｈ６０、Ｒａｅ−１α、Ｒａｅ−１β、Ｒａｅ−１δ、Ｒａｅ−１γ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ｈ−ＨＬＡ−Ａを含む他のＮＫＧ２Ｄリガンドを抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の代わりに使用することもできるだろう。ＩＬ２のリンパ球への特異的デリバリーはＩＬ２の有効性を増強し、投与量減少および関連する毒性の有意な減少をもたらすことができるだろう。この方法論を、それだけに限らないが、ＩＬ１５、ＩＬ１８、インターフェロンおよび腫瘍壊死ファミリーのメンバー（それだけに限らないが、ＴＮＦ−αを含む）、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７ＬおよびＲＡＮＫＬを含む他のサイトカインに使用することができる。
【００２８】
本明細書に記載される他の組成物および方法は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に対するリガンドと標的化分子の組み合わせを介した、ＮＫ細胞およびＣＴＬの活性化および特定の細胞または組織への動員を提供する。具体的には、一定の態様では、本明細書で開示される発明を用いて、ＮＫ細胞およびＣＴＬが、ＯＭＣＰリガンドまたはその一部と標的化分子とを含む組成物を介して、標的細胞に動員される。標的化分子は、ＮＫ細胞およびＣＴＬの特定の標的細胞への動員を可能にし、ＯＭＣＰリガンドまたはその一部がＮＫ細胞およびＣＴＬの動員およびいくつかの例では活性化を提供して、部位特異的応答をもたらす。標的化分子は、それだけに限らないが、受容体リガンドおよび抗体を含む、疾患状態の細胞に特異的な標的または疾患細胞を囲む細胞外マトリックスに結合することができる任意の分子を含み得る。本発明の具体的な態様を以下で詳細に記載する。
【００２９】
Ｉ．組成物
一態様では、本発明は、免疫細胞表面タンパク質標的化リガンドに結合したサイトカインを含む組成物を包含する。具体的な態様では、サイトカインがＮＫＧ２Ｄリガンドに結合している。別の態様では、サイトカインがＰＤ１表面タンパク質を標的化するリガンドに結合している。組成物は、サイトカインをリガンドに連結するリンカーをさらに含み得る。サイトカイン、リガンドおよびリンカーを以下でさらに詳細に記載する。以下で詳細に記載されるサイトカインのいずれも、以下に記載されるリンカーのいずれかの非存在下でも存在下でも、以下で詳細に記載されるリガンドのいずれかに結合することができることが理解されるべきである。別の態様では、本発明は、サイトカイン、リガンドおよび適宜、リンカーをコードする核酸分子を提供する。
【００３０】
（ａ）サイトカイン
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは細胞シグナル伝達に重要な小タンパク質（約５〜２０ｋＤａ）である。サイトカインは細胞によって放出され、他の細胞および／またはサイトカインを放出する細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインの非限定的な例としては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、モノカインおよびコロニー刺激因子が挙げられる。サイトカインは、それだけに限らないが、免疫細胞、例えばマクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞および単球、内皮細胞、線維芽細胞および間質細胞を含む広範な細胞によって産生され得る。サイトカインは２種以上の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を通して作用し、免疫系で特に重要であり、液性免疫応答と細胞性免疫応答の間のバランスを調節し、細胞集団の成熟、成長および応答性を調節する。サイトカインは、感染症に対する宿主応答、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、がんおよび生殖において重要である。本発明のサイトカインは天然サイトカインであり得る、または天然サイトカインの突然変異バージョンであり得る。本明細書で使用される場合、野生型とも呼ばれ得る「天然」は、対立遺伝子変動を含む。天然サイトカインの突然変異バージョンまたは「突然変異型」は、サイトカインの機能、活性および／または特異性を変化させるために天然配列になされた特異的突然変異を指す。一実施形態では、突然変異がサイトカインの機能、活性および／または特異性を増強させ得る。別の実施形態では、突然変異がサイトカインの機能、活性および／または特異性を低下させ得る。突然変異はサイトカインの１個または複数のアミノ酸残基の欠失または付加を含み得る。
【００３１】
サイトカインは、構造に基づいて分類され得る。例えば、サイトカインは４つの種類に分類され得る：４−α−ヘリックスバンドルファミリー、ＩＬ１ファミリー、ＩＬ１７ファミリーおよびシステインノットサイトカイン。４−α−ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、αヘリックスの４つの束を含む三次元構造を有する。このファミリーは３つのサブファミリーにさらに分けられる：ＩＬ２サブファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）サブファミリーおよびＩＬ１０サブファミリー。ＩＬ２サブファミリーは最大であり、それだけに限らないが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含むいくつかの非免疫学的サイトカインを含む。一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、４−α−ヘリックスバンドルファミリーのサイトカインまたはその突然変異型である。当業者であれば、４−α−ヘリックスバンドルファミリー内のサイトカインを決定することができるだろう。他の実施形態では、組成物のサイトカインが、ＩＬ２サブファミリーサイトカインまたはその突然変異型である。ＩＬ２サブファミリーのメンバーの非限定的な例としては、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１が挙げられる。具体的な実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ２またはその突然変異型である。一定の実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ１５またはその突然変異型である。全長ヒトＩＬ１５アミノ酸配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＧ４６７７７．１、ＡＡＩ００９６２．１またはＡＡＩ００９６３．１を用いて見出すことができる。全長ヒトＩＬ１５  ｍＲＮＡ配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＲ５４２００７．１、ＫＪ８９１４６９．１、ＮＭ＿１７２１７５．２、ＮＭ＿０００５８５．４またはＣＲ５４１９８０．１を用いて見出すことができる。当業者であれば、ＩＬ１５を種々の種で見出すことができることを認識し、ＩＬ１５のアナログまたはホモログを同定する方法は以下で詳細に記載されるように当技術分野で公知である。
【００３２】
別の実施形態では、本発明のサイトカインがＩＬ１ファミリーサイトカインまたはその突然変異型である。ＩＬ１ファミリーは、免疫および炎症反応の調節で中心的な役割を果たす１１種のサイトカインの群である。一般的に、サイトカインのＩＬ１ファミリーは、炎症反応を調節および開始する炎症性サイトカインである。ＩＬ１ファミリーサイトカインの非限定的な例としては、ＩＬ１α、ＩＬ１β、１Ｌ１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ３６Ｒａ、ＩＬ３６α、ＩＬ３７、ＩＬ３６β、ＩＬ３６γ、ＩＬ３８およびＩＬ３３が挙げられる。ＩＬ１ファミリーメンバーは、類似の遺伝子構造を有する。当業者であれば、ＩＬ１ファミリー内のサイトカインを決定することができるだろう。一定の実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ１８またはその突然変異型である。全長ヒトＩＬ１８アミノ酸配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＧ４６７７１．１を用いて見出すことができる。全長ヒトＩＬ１８  ｍＲＮＡ配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＲ７１０１４７．１、ＣＲ５４２００１．１、ＣＲ５４１９７３．１またはＫＪ８９７０５４．１を用いて見出すことができる。当業者であれば、ＩＬ１８を種々の種で見出すことができることを認識し、ＩＬ１８のアナログまたはホモログを同定する方法は以下で詳細に記載されるように当技術分野で公知である。
【００３３】
他の実施形態では、組成物のサイトカインがインターフェロンサブファミリーサイトカインまたはその突然変異型である。インターフェロンは、ウイルス感染から細胞を保護することによって、ウイルス複製を「妨害する（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）」その能力のために命名されている。ＩＦＮは他の機能も有する：ＩＦＮはナチュラルキラー細胞およびマクロファージなどの免疫細胞を活性化する；ＩＦＮは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）抗原の発現を増加させることによって抗原提示を上方制御することにより宿主防御を増加させる。シグナル伝達する受容体の種類に基づいて、ヒトインターフェロンは３つの主な種類に分類されている：Ｉ型ＩＦＮ、ＩＩ型ＩＦＮおよびＩＩＩ型ＩＦＮ。Ｉ型ＩＦＮは、ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２鎖からなるＩＦＮ−α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られる特異的細胞表面受容体複合体に結合する。ヒトに存在するＩ型インターフェロンの非限定的な例は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−ωである。よって、一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、それだけに限らないが、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κおよびＩＦＮ−ωの野生型および突然変異形態を含む、１型ＩＦＮサイトカインまたはその突然変異型である。ＩＩ型ＩＦＮは、ＩＦＮＧＲ１およびＩＦＮＧＲ２鎖からなるＩＦＮＧＲに結合する。ヒトに存在するＩＩ型インターフェロンの非限定的な例はＩＦＮ−γである。よって、一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、それだけに限らないが、ＩＦＮ−γの野生型および突然変異形態を含む、ＩＩ型ＩＦＮサイトカインまたはその突然変異型である。ＩＩＩ型ＩＦＮは、ＩＬ１０Ｒ２（ＣＲＦ２−４とも呼ばれる）およびＩＦＮＬＲ１（ＣＲＦ２−１２とも呼ばれる）からなる受容体複合体を通してシグナル伝達する。ＩＩＩ型インターフェロンの非限定的な例としては、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２およびＩＦＮ−λ３（それぞれＩＬ２９、ＩＬ２８ＡおよびＩＬ２８Ｂとも呼ばれる）が挙げられる。よって、一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、それだけに限らないが、ＩＦＮ−λ１、ＩＦＮ−λ２およびＩＦＮ−λ３の野生型および突然変異形態を含む、ＩＩＩ型ＩＦＮサイトカインまたはその突然変異型である。
【００３４】
他の実施形態では、組成物のサイトカインが、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のメンバーまたはその突然変異型である。ＴＮＦＳＦメンバーは、炎症状態を誘発し、免疫細胞機能を刺激する免疫細胞によって主に発現される炎症性サイトカインである。それだけに限らないが、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７；ＣＤ２７Ｌ）、ＥＤＡ、ＦＡＳＬ（ＴＮＦＳＦ６；Ｆａｓリガンド）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１リンホトキシンα）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３；リンホトキシンβ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ；ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂリガンド）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８を含む少なくとも１８個のＴＮＦＳＦホモログが存在する。よって、一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、それだけに限らないが、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７；ＣＤ２７Ｌ）、ＥＤＡ、ＦＡＳＬ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８を含む腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーまたはその突然変異型である。
【００３５】
一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、ＯＸ４０Ｌ、その断片またはその突然変異型である。全長ヒトＯＸ４０Ｌアミノ酸配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿０１６８５７７１９．１、ＸＰ＿０１６８５７７１８．１、ＸＰ＿０１６８５７７１７．１、ＸＰ＿０１１５０８２６６．２、ＮＰ＿００１２８４４９１．１、ＮＰ＿００３３１７．１、ＣＡＧ４６８３０．１を用いて見出すことができる。全長ヒトＯＸ４０Ｌ  ｍＲＮＡ配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＲ＿００１７３７３９６．１、ＸＲ＿００１７３７３９５．１、ＸＲ＿００１７３７３９４．１、ＸＲ＿００１７３７３９３．１、ＸＭ＿０１７００２２３０．１、ＸＭ＿０１７００２２２９．１、ＸＭ＿０１７００２２２８．１、ＸＭ＿０１１５０９９６４．２、ＮＭ＿００１２９７５６２．１、ＮＭ＿００３３２６．４を用いて見出すことができる。当業者であれば、ＯＸ４０Ｌを種々の種で見出すことができることを認識し、ＯＸ４０Ｌのアナログまたはホモログを同定する方法は以下で詳細に記載されるように当技術分野で公知である。
【００３６】
当業者であれば、ＯＸ４０Ｌを種々の種で見出すことができることを認識するだろう。非限定的な例としては、マウス（ＮＰ＿０３３４７８．１）、ブタ（ＮＰ＿００１０２０３８８．１）、ウシ（ＮＰ＿００１１９２６４４．１）、ラット（ＮＰ＿４４６００４．１）、ウサギ（ＮＰ＿００１０７５４５４．１）、ヤギ（ＸＰ＿０１３８２５６４４．１）、ヒツジ（ＸＰ＿０１２０４２６８０．１）、ニワトリ（ＸＰ＿４３０１４７．２）、ハムスター（ＸＰ＿００７６１０８３９．１）およびイヌ（ＸＰ＿００３６３９２１５．１）が挙げられる。本発明が他の生物のＯＸ４０Ｌのアナログに関し、ヒトアナログに限定されないことが認識される。ホモログは、当技術分野で公知の方法によって他の種で見出すことができる。例えば、配列類似性は、典型的にはベストフィット（ｂｅｓｔ  ｆｉｔ）を達成するために少数のギャップの導入を可能にする、従来のアルゴリズムによって決定され得る。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性％」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993）を用いて決定される。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＢＬＡＳＴＮプログラムで行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。等しく、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＸプログラムで行って、本発明のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが使用される。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一般的に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９％相同性を有する。別の実施形態では、配列が、ＯＸ４０Ｌと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であり得る。
【００３７】
具体的な実施形態では、組成物のサイトカインがＯＸ４０Ｌの野生型配列である。具体的な実施形態では、サイトカインが野生型ＯＸ４０Ｌ断片、例えば配列番号５７に示される配列(QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)を含み得る。一定の実施形態では、これらの断片を、リンカー断片を介して連続ペプチドに連結することができる。具体的な実施形態では、サイトカインが、リンカーペプチドを介して連結したＯＸ４０Ｌ断片、例えば配列番号５８に示される配列(QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)であり得る。代替実施形態では、組成物のサイトカインがＯＸ４０Ｌの突然変異配列である。一実施形態では、突然変異が、ＯＸ４０Ｌを腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０としても知られている、ＣＤ１３４としても知られている）に結合させるが、そのシグナル伝達を抑制する突然変異である。例えば、突然変異は、配列番号５６中の全長ＯＸ４０Ｌ配列に関してＮ１６６ＡおよびＦ１８０Ａの群から選択される１つまたは複数の突然変異であり得る。具体的な実施形態では、ＯＸ４０Ｌの突然変異バージョンが、配列番号５６中の全長ＯＸ４０Ｌ配列に関してＮ１６６ＡおよびＦ１８０Ａからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。具体的な実施形態では、サイトカインが、突然変異ＯＸ４０Ｌ断片、例えば配列番号５９に示される配列(QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVL)を含み得る。一定の実施形態では、これらの断片を、リンカー断片を介して連続ペプチドに連結することができる。具体的な実施形態では、サイトカインが、リンカーペプチドを介して連結した突然変異および非突然変異ＯＸ４０Ｌ断片、例えば配列番号６０に示される配列(QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)であり得る。別の具体的な実施形態では、サイトカインが、リンカーペプチドを介して連結した突然変異および非突然変異ＯＸ４０Ｌ断片、例えば配列番号６１に示される配列(QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)であり得る。
【００３８】
一定の実施形態では、組成物のサイトカインが４−１ＢＢＬ、その断片またはその突然変異型である。全長ヒト４−１ＢＢＬアミノ酸配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３８０２．１を用いて見出すことができる。全長ヒト４−１ＢＢＬ  ｍＲＮＡ配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３８１１．３を用いて見出すことができる。当業者であれば、４−１ＢＢＬを種々の種で見出すことができることを認識し、４−１ＢＢＬのアナログまたはホモログを同定する方法は以下で詳細に記載されるように当技術分野で公知である。
【００３９】
当業者であれば、４−１ＢＢＬを種々の種で見出すことができることを認識するだろう。非限定的な例としては、マウス（ＮＰ＿０３３４３０．１）、ブタ（ＸＰ＿００３４８０８６３．１）、ウシ（ＮＰ＿００１３０６８３１．１）、ラット（ＮＰ＿８５２０４９．１）、ウサギ（ＸＰ＿００８２５１１２３．１）、ヤギ（ＸＰ＿０１３８２０６８３．１）、ヒツジ（ＸＰ＿０１４９５１１３６．１）、ハムスター（ＸＰ＿００７６２７３６９．１）およびイヌ（ＸＰ＿００５６３３０２９．１）が挙げられる。本発明が他の生物の４−１ＢＢＬのアナログに関し、ヒトアナログに限定されないことが認識される。ホモログは、当技術分野で公知の方法によって他の種で見出すことができる。例えば、配列類似性は、典型的にはベストフィットを達成するために少数のギャップの導入を可能にする、従来のアルゴリズムによって決定され得る。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性％」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993）を用いて決定される。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＢＬＡＳＴＮプログラムで行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。等しく、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＸプログラムで行って、本発明のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが使用される。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一般的に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９％相同性を有する。別の実施形態では、配列が、４−１ＢＢＬと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であり得る。
【００４０】
具体的な実施形態では、組成物のサイトカインが４−１ＢＢＬの野生型配列である。具体的な実施形態では、サイトカインが野生型４−１ＢＢＬ断片、例えば配列番号６５に示される配列(ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE)を含み得る。一定の実施形態では、これらの断片を、リンカー断片を介して連続ペプチドに連結することができる。具体的な実施形態では、サイトカインが、リンカーペプチドを介して連結した４−１ＢＢＬ断片、例えば配列番号６６に示される配列(ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGGSGGGSGACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGGSGGGSGACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE)であり得る。代替実施形態では、組成物のサイトカインが４−１ＢＢＬの突然変異配列である。一実施形態では、突然変異が、４−１ＢＢＬとその受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９、４−１ＢＢとしても知られている、ＣＤ１３７としても知られている）との間の結合親和性に影響を及ぼす突然変異である。
【００４１】
一定の実施形態では、本発明のサイトカインがインターロイキンまたはその突然変異型である。インターロイキンの大部分はヘルパーＣＤ４  Ｔリンパ球によってならびに単球、マクロファージおよび内皮細胞により合成される。インターロイキンは、ＴおよびＢリンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進し得る。インターロイキンの非限定的な例としては、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５またはＩＬ３６が挙げられる。よって、一定の実施形態では、組成物のサイトカインが、それだけに限らないが、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５またはＩＬ３６の野生型および突然変異形態を含む、インターロイキンまたはその突然変異型である。具体的な実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ２またはその突然変異型である。ＩＬ２は、応答性Ｔ細胞の増殖を誘導するリンホカインである。さらに、これは成長因子および抗体産生刺激剤として、受容体特異的結合を介して、一部のＢ細胞に作用する。ＩＬ２タンパク質は、単一グリコシル化ポリペプチドとして分泌され、その活性にシグナル配列の切断が要求される。ＩＬ２の構造は、２つの短いヘリックスおよび数個のあまり定義されていないループが隣接した４つのヘリックス（Ａ〜Ｄと呼ばれる）の束を含む。ヘリックスＡ、およびヘリックスＡとＢとの間のループ領域中の残基が受容体結合にとって重要である。二次構造分析は、ＩＬ４および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）との類似性を示唆している。具体的な実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ２またはその変異体である。変異体は切断または突然変異ＩＬ２であり得る。全長ヒトＩＬ２アミノ酸配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５９１４０．１またはＡＡＨ７０３３８．１を用いて見出すことができる。全長ヒトＩＬ２  ｍＲＮＡ配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０７０３３８．１またはＭ２２００５．１を用いて見出すことができる。
【００４２】
当業者であれば、ＩＬ２を種々の種で見出すことができることを認識するだろう。非限定的な例としては、マウス（ＡＡＩ１６８７４．１）、ブタ（ＮＰ＿９９９０２６．１）、ウシ（ＡＡＱ１０６７０．１）、ラット（ＥＤＭ０１２９５．１）、ウサギ（ＡＡＣ２３８３８．１）、ヤギ（ＡＡＱ１０６７１．１）、ヒツジ（ＡＢＫ４１６０１．１）、ニワトリ（ＡＡＶ３５０５６．１）、ハムスター（ＥＲＥ８８３８０．１）およびイヌ（ＡＡＡ６８９６９．１）が挙げられる。本発明が他の生物のＩＬ２のアナログに関し、ヒトアナログに限定されないことが認識される。ホモログは、当技術分野で公知の方法によって他の種で見出すことができる。例えば、配列類似性は、典型的にはベストフィットを達成するために少数のギャップの導入を可能にする、従来のアルゴリズムによって決定され得る。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性％」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993）を用いて決定される。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＢＬＡＳＴＮプログラムで行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。等しく、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＸプログラムで行って、本発明のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが使用される。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一般的に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９％相同性を有する。別の実施形態では、配列が、ＩＬ２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であり得る。
【００４３】
具体的な実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ２の野生型配列、例えば配列番号５に示される配列(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT)である。代替実施形態では、サイトカインがＩＬ２の突然変異バージョンである。一実施形態では、突然変異が、ＩＬ２を受容体ＩＬ２βγに優先的に結合させる突然変異である。別の実施形態では、突然変異が、ＩＬ２がＩＬ２受容体α（ＩＬ２Ｒα）に対する低下した親和性を有するように、ＩＬ２の機能を変化させる突然変異である。例えば、突然変異は、配列番号５に関してＲ３８Ａ、Ｆ４２Ｋおよび／またはＣ１２５Ｓからなる群から選択される１つまたは複数の突然変異であり得る。Ｃ１２５Ｓ突然変異を含めてタンパク質凝集を減少させることができる。具体的な実施形態では、ＩＬ２の突然変異バージョンが、配列番号５に関してＲ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。別の具体的な実施形態では、ＩＬ２の突然変異バージョンが配列番号５に関してＲ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ｓを含む。具体的な実施形態では、組成物のサイトカインがＩＬ２の突然変異配列、例えば配列番号６に示される配列(APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)である。
【００４４】
代替態様では、毒素がサイトカインに置き換わる。「毒素」という用語は、その起源および製造方法にかかわらず、植物、動物、微生物（それだけに限らないが、細菌、ウイルス、真菌、リケッチアまたは原虫を含む）の毒性物質もしくは生成物、または感染性物質、または組換えもしくは合成分子を意味する。毒素は、身体組織と接触するまたは身体組織によって吸収されると、酵素または細胞受容体などの生体高分子と相互作用して、疾患を引き起こすことができる小分子、ペプチドまたはタンパク質であり得る。毒素は、毒素を生物起源のものとして明示的に特定するために使用される「生体毒素」であり得る。生体毒素は、真菌生体毒素、略してマイコトキシン、微生物生物毒素、植物生物毒素、略してフィトトキシン、および動物生物毒素にさらに分類され得る。生物毒素の非限定的な例としては、シアノバクテリアによって産生されるシアノトキシン、例えばミクロシスチン、ノジュラリン、アナトキシンａ、シリンドロスパーモプシン（ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｏｐｓｉｎ）、リングビアトキシンａ、サキシトキシン、リポ多糖、アプリシアトキシン、ＢＭＡＡ；渦鞭毛藻類によって産生されるジノトキシン（ｄｉｎｏｔｏｘｉｎ）、例えばサキシトキシンおよびゴニアウトキシン（ｇｏｎｙａｕｔｏｘｉｎ）；例えば、毒グモまたはドクイトグモ、ほとんどのガラガラヘビおよびクサリヘビ、パフアダー、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）によって産生される壊死毒；例えば、クロゴケグモ、ほとんどのサソリ、ハコクラゲ、コブラ科のヘビ、イモガイ、ヒョウモンダコ、毒魚類、カエル、パリソアサンゴ（ｐａｌｙｔｈｏａ  ｃｏｒａｌ）、種々の異なる種類の藻類、シアノバクテリアおよび渦鞭毛藻類によって産生される神経毒、例えばボツリヌス毒素（例えば、Ｂｏｔｏｘ）、破傷風毒素、テトロドトキシン、クロロトキシン、コノトキシン、アナトキシンａ、ブンガロトキシン、カラムボキシン（ｃａｒａｍｂｏｘｉｎ）、クラーレ；例えば、ヘビおよびトカゲ毒に見られるミオトキシン；ならびに細胞毒、例えばトウゴマの種子のリシン、ミツバチのアピトキシン、および一定の毒キノコのＴ−２マイコトキシンが挙げられる。一定の実施形態では、毒素が細胞毒である。一実施形態では、細胞毒が、リシン、アピトキシンおよびＴ−２マイコトキシンからなる群から選択される。具体的な実施形態では、毒素がリシンである。
【００４５】
一定の実施形態では、本発明のサイトカインまたは毒素を、全身半減期の改善および投与頻度の減少のためにペグ化することができる。一実施形態では、ＰＥＧをサイトカインまたは毒素に付加することができる。よって、本発明の組成物は、ＰＥＧを含むサイトカインまたは毒素を含み得る。一実施形態では、ＰＥＧが、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−２０ＫおよびＰＥＧ−４０Ｋからなる群から選択され得る。ＰＥＧをタンパク質にコンジュゲートする方法は、当技術分野で標準的である。例えば、参照により全体が本発明に組み込まれる、Kolate et al, Journal of Controlled Release 2014;192(28):67-81を参照されたい。なおさらに、本発明のサイトカインまたは毒素を修飾してＴ細胞エピトープを除去することができる。Ｔ細胞エピトープは、組成物を対象に投与した際の免疫原性の問題の原因となり得る。Ｔ細胞へのその提示を通して、これらは抗薬物抗体の発達の過程を活性化する。Ｔ細胞エピトープの前臨床スクリーニングをインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で行い、引き続いてインビトロおよびインビボで検証することができる。ＥｐｉＭａｔｒｉｘなどのＴ細胞エピトープマッピングツールは、免疫応答の高度に正確な予測因子となり得る。Ｔ細胞エピトープの計画的除去によって、免疫原性を減少させることができる。その免疫原性を減少させることにより、本発明の組成物の安全性および有効性を改善する他の手段には、ヒト化およびペグ化が含まれる。
【００４６】
（ｂ）リガンド
本明細書で使用される場合、「リガンド」とは、標的細胞上の受容体に特異的に結合し、リガンドに結合したサイトカインに対応する結合パートナーではないタンパク質である。リガンドは真核生物、原核生物またはウイルスのものであり得る。一定の実施形態では、リガンドがウイルスのものであり得る。本明細書における「特異的に結合する」という句は、リガンドが少なくとも０．１ｍＭ〜１ｐＭの範囲、または少なくとも０．１ｐＭ〜２００ｎＭの範囲、または少なくとも０．１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲の親和性（Ｋｄ）で標的タンパク質に結合することを意味する。解離定数（Ｋｄ）は、大きな物体が小さな構成要素に可逆的に分離（解離）する傾向を測定する。解離定数は結合定数の逆数である。解離定数を使用して、リガンド（Ｌ）と標的タンパク質（Ｐ）との間の親和性を記載することができる。よって、Ｋｄ＝（［Ｐ］×［Ｌ］／［Ｃ］）（式中、Ｃはリガンド−標的タンパク質複合体であり、［Ｐ］、［Ｌ］および［Ｃ］はそれぞれタンパク質、リガンドおよび複合体のモル濃度を表す）。リガンドが標的タンパク質に結合するかどうかを決定する方法は当技術分野で公知である。例えば、Rossi and Taylor, Nature Protocols 2011;6:365-387を参照されたい。
【００４７】
リガンドは、標的細胞上の受容体との結合を通してシグナルを誘因し得る。受容体は、細胞の外側から化学シグナルを受信する、細胞の形質膜表面内に埋め込まれ得るタンパク質分子である。このような化学シグナルが受容体に結合すると、これらがある形態の細胞／組織応答を引き起こす。好ましい実施形態では、標的細胞が免疫細胞である。したがって、組成物のリガンドが、免疫細胞上で発現される受容体に結合する。免疫細胞の非限定的な例としては、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好中球が挙げられる。よって、一定の実施形態では、免疫細胞が、それだけに限らないが、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好中球を含む。具体的な実施形態では、免疫細胞がナチュラルキラー細胞またはＴリンパ球である。免疫細胞上で発現される受容体の非限定的な例としては、主要組織適合複合体（ＭＨＣ；例えばＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩおよびＭＨＣＩＩＩ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ；例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２およびＴＬＲ１３）、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリー受容体、エンドセリン受容体、受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーが挙げられる。よって、一定の実施形態では、標的細胞上の受容体が、それだけに限らないが、主要組織適合複合体（ＭＨＣ；例えばＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩおよびＭＨＣＩＩＩ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ；例えばＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２およびＴＬＲ１３）、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリー受容体、エンドセリン受容体、受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーを含む。具体的な実施形態では、標的細胞上の受容体がＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリー受容体である。別の具体的な実施形態では、組成物のリガンドが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上で発現される受容体に特異的に結合する。好ましい実施形態では、組成物のリガンドが、血管内皮細胞または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）上の受容体に特異的には結合しない。
【００４８】
ＮＫ細胞およびＣＴＬ上で発現される受容体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリー受容体またはＫＬＲＧ１であり得る。ＫＬＲＧ１（キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧメンバー１）は、ヒトにおいてＫＬＲＧ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリー受容体は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔリンパ球のサブセットの表面上で主に発現されるＣ型レクチン受容体のファミリーである。これらの受容体はＮＫ細胞の細胞傷害活性を刺激または抑制するので、これらはその機能により活性化受容体と抑制性受容体に分けられる。ＣＤ９４／ＮＫＧ２はＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質を認識する。ＣＤ９４／ＮＫＧ２ファミリーは、７つのメンバー：ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦおよびＮＫＧ２Ｈを含む。よって、一定の実施形態では、本発明のリガンドが、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦおよびＮＫＧ２Ｈからなる群から選択される受容体に特異的に結合する。ＮＫＧ２受容体は、ＣＤ９４分子と二量体化するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ９４は短い細胞質ドメインを含み、これはシグナル伝達を担う。そのため、ＮＫＧ２受容体は、ジスルフィド結合したヘテロ二量体を形成する。ＮＫＧ２Ｄは例外を表し、ホモ二量体である。ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｂ受容体は抑制シグナルを伝達する。ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥおよびＮＫＧ２Ｈは活性化受容体である。ＮＫＧ２Ｄも活性化受容体であるが、これはシグナル伝達モチーフＹＩＮＭ（配列番号３４）を有するアダプタータンパク質ＤＡＰ１０と結合する。ＳｒｃまたはＪａｋキナーゼがＤＡＰ１０をリン酸化し、次いで、これがＰＩ（３）Ｋのｐ８５サブユニットまたはアダプター分子Ｇｒｂ２と会合し得る。このシグナル伝達は、アクチン再構成（細胞分極）および脱顆粒を誘因する。ＮＫＧ２Ｆ受容体機能はまだ分類されていない。
【００４９】
具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（αβとγδの両方）上に見られる活性化受容体である。ＮＫＧ２Ｄの構造は２つのジスルフィド結合ＩＩ型膜貫通タンパク質からなり、シグナルを伝達することができない短い細胞内ドメインを有する。ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの機能は、同時刺激シグナルを送信して自身を活性化することである。一実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドが抗ＮＫＧ２Ｄ抗体であり得る。「抗ＮＫＧ２Ｄ」は、ＮＫＧ２Ｄ内のエピトープに特異的に結合する全ての抗体を含む。「抗体」という用語は、「モノクローナル抗体」という用語を含む。「モノクローナル抗体」とは、例えば任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む、単一コピーまたはクローンに由来する抗体を指す。モノクローナル抗体は、例えば当技術分野で周知のハイブリドーマ技術、ならびに組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術またはこのような技術の組み合わせおよび当技術分野で容易に知られる他の技術を用いて製造することができる。さらに、「抗体」によって、機能的モノクローナル抗体またはその免疫学的に有効な断片；例えばそのＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片が意味される。タンパク質がその意図した標的に特異的に結合する能力を保持する限り、そのタンパク質は「抗体」という用語に含まれる。例えば、この特異性を有する、抗体の、一般的にＦｖと示される一本鎖形態、領域も「抗体」という定義に含まれる。これらのｓｃＦｖは、リンカーによって連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域で構成される。ｓｃＦｖを作成および使用する方法は当技術分野で公知である。さらに、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である、一般的にｓｄＡｂと示される単一ドメイン抗体が「抗体」という定義に含まれる。ｓｄＡｂ抗体は、ラクダ（ＶＨＨ断片）または軟骨魚類（ＶＮＡＲ断片）に由来し得る。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」は、非ヒト相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を有する抗体の配列を変化させることによって、ヒト抗体生殖系列に由来するアミノ酸配列で部分的にまたは完全に構成される抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含む。最も単純なこのような変化は、単純に、マウス定常領域の代わりにヒト抗体の定常領域を用いて、医薬用途に許容されるのに十分低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラを得ることからなり得る。しかしながら、好ましくは、抗体の可変領域およびＣＤＲさえも、当技術分野で現在周知の技術によってヒト化する。可変領域のフレームワーク領域を対応するヒトフレームワーク領域に置換し、非ヒトＣＤＲを実質的にそのままにする、またはＣＤＲさえもヒトゲノム由来の配列で置換する。ＣＤＲを、ＮＫＧ２Ｄに対する結合活性および親和性が、完全ヒト生殖系列フレームワーク領域または実質的にヒトであるフレームワーク領域の文脈で維持されるまたは増強されるように、ランダムに突然変異させることもできる。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００５０】
１つの特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、Kwong, et al, J Mol Biol. 2008 Dec 31;384(5):1143-56に記載されるＫＹＫ−１またはＫＹＫ−２である。ＫＹＫ−１の軽鎖は配列番号３５に示されるアミノ酸配列(QPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYC QVWDDNNDEWV FGGGTQLTVL)を含み、ＫＹＫ−１の重鎖は配列番号３６に示されるアミノ酸配列(EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSS)を含む。ＫＹＫ−２の軽鎖は配列番号３７に示されるアミノ酸配列(QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVN WYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPS GVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPV FGGGTKLTVL)を含み、ＫＹＫ−２の重鎖は配列番号３８に示されるアミノ酸配列(QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS)を含む。
【００５１】
別の特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１に由来するｓｃＦｖである。例えば、ＫＹＫ−１  ｓｃＦｖは配列番号３９に示されるアミノ酸配列(QPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSS)を含む。あるいは、ＫＹＫ−１  ｓｃＦｖは配列番号４０に示されるアミノ酸配列(EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVL)を含む。
【００５２】
別の特定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２に由来するｓｃＦｖである。例えば、ＫＹＫ−２  ｓｃＦｖは配列番号４１に示されるアミノ酸配列(QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS)を含む。あるいは、ＫＹＫ−２  ｓｃＦｖは配列番号４２に示されるアミノ酸配列(QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTV)を含む。
【００５３】
上述のように、種々のＫＹＫ−１およびＫＹＫ−２抗体またはこれらのｓｃＦｖを、本明細書に記載されるリンカーのいずれかの非存在下または存在下で、本明細書で開示されるサイトカインのいずれかと組み合わせて、本発明の組成物またはキメラペプチドを提供することができる。ＫＹＫ−１およびＫＹＫ−２抗体は本組成物に使用するのに適した抗体の例であることも理解されるべきであり、当業者であれば、本開示に基づいて、他の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体も同様に適していることを理解するだろう。
【００５４】
別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドが、ＮＫＧ２Ｄとの相互作用のための共通の部位を構成するＭＨＣクラスＩ関連α１α２スーパードメインを共有する。ＮＫＧ２Ｄに結合するリガンドの非限定的な例としては、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質、例えばＭＩＣファミリータンパク質（すなわち、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ）、ＵＬ１６結合ファミリータンパク質（すなわち、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６）、レチノイド酸初期誘導遺伝子１（Ｒａｅ１）様タンパク質（すなわち、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、Ｒａｅ１ε）、Ｈ６０タンパク質ファミリーのメンバー（すなわち、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ）、ｈ−ＨＬＡ−ＡならびにマウスのＭｕｌｔ１およびＯＭＣＰが挙げられる。一定の実施形態では、リガンドがＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質である。他の実施形態では、本発明のリガンドが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ１α、Ｒａｅ１β、Ｒａｅ１γ、Ｒａｅ１δ、Ｒａｅ１ε、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、ｈ−ＨＬＡ−Ａ、Ｍｕｌｔ１およびＯＭＣＰからなる群から選択される。一実施形態では、リガンドがＵＬ１６結合ファミリータンパク質またはＭＩＣファミリータンパク質である。具体的な実施形態では、リガンドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５およびＵＬＢＰ６からなる群から選択される。別の具体的な実施形態では、リガンドがＵＬＢＰ３である。具体的な実施形態では、リガンドがＯＭＣＰまたはその変異体である。変異体は、全長ＯＭＣＰとほぼ同じ結合親和性を有する切断または突然変異ＯＭＣＰであり得る。一実施形態では、変異体が、全長ＯＭＣＰの結合親和性に対してわずかに低い結合親和性を有する切断または突然変異ＯＭＣＰであり得る。別の実施形態では、変異体が、全長ＯＭＣＰの結合親和性に対してわずかに高い結合親和性を有する切断または突然変異ＯＭＣＰである。標的タンパク質に対するリガンドの結合親和性を決定する方法は当技術分野で公知であり、上に記載されている。ＯＭＣＰは、約０．１〜約５ｎＭの結合親和性でＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する。例えば、ＯＭＣＰは、特別に、約０．２ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合し、約３ｎＭの結合親和性でマウスＮＫＧ２Ｄに結合する。好ましい実施形態では、ＯＭＣＰまたはその変異体が、約１０００ｎＭ〜約０．１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。一定の実施形態では、ＯＭＣＰまたはその変異体が、約１００ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約１０ｎＭ〜約０．１ｎＭまたは約１ｎＭ〜約０．１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。他の実施形態では、ＯＭＣＰまたはその変異体が、約１０００ｎＭ〜約１ｎＭ、または約１０００ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約１０００ｎＭ〜約１００ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。さらに他の実施形態では、ＯＭＣＰまたはその変異体が、約１００ｎＭ〜約１ｎＭ、または約１００ｎＭ〜１０ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。例えば、ＯＭＣＰまたはその変異体は、約１０００ｎＭ、約５００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭまたは約０．１ｎＭの結合親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する。別の実施形態では、変異体が、ＮＫＧ２Ｄ以外の１つまたは複数のＮＫＧ２ファミリー受容体に対する結合親和性を有する切断または突然変異ＯＭＣＰである。例えば、変異体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦおよびＮＫＧ２Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のＮＫＧ２ファミリー受容体に対する結合親和性を有する切断または突然変異ＯＭＣＰである。ＯＭＣＰへの突然変異は構造に基づく知識を介して合理的に選択され得る、またはＯＭＣＰへの突然変異は選択に基づく突然変異誘発を介して同定され得る。一定の実施形態では、突然変異が、ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ界面で起こって結合親和性を増強または低下させるように合理的に選択され得る。ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ界面での結合に関与するアミノ酸を実施例で記載する。
【００５５】
ＯＭＣＰの構造は、ＭＨＣＩ様α１／α２プラットホームドメインからなる（図２０Ａ）。ＯＭＣＰのプラットホームドメインは、短い隣接ヘリックスを有する６本鎖βシートのみを有するようトリミングされている。ＯＭＣＰ  α１ドメインのヘリックス（Ｈ１）は連続的であるが、α２ドメインのヘリックスは２つの領域（Ｈ２ａおよびＨ２ｂ）に割れている。ヘリックスは６本鎖βシートに隣接し、一緒になってＭＨＣタンパク質を定義する特性プラットホームを形成する。他のＮＫＧ２ＤＬのように（図２０Ｂ）、ＯＭＣＰのαヘリックスは一緒に近くに位置し、よって、結合ペプチドまたは他のリガンド、例えば抗原提示ＭＨＣプラットホームドメインのための溝を有さない。ＯＭＣＰはＳ５とＨ２ｂとの間に１つのジスルフィド結合を含み、このジスルフィド結合はほとんどのＮＫＧ２ＤＬで保存されている（図２０Ｃ）。一定の実施形態では、本発明のリガンドが、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のαヘリックスの１つまたは複数を含む。他の実施形態では、本発明のリガンドが、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のαヘリックスの１つまたは複数からなる。より具体的には、本発明のリガンドが、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のα１ドメイン（Ｈ１）、α２ドメイン（Ｈ２）、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂまたはこれらの組み合わせを含む。または、本発明のリガンドが、ＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のα１ドメイン（Ｈ１）、α２ドメイン（Ｈ２）、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂまたはこれらの組み合わせからなる。具体的な実施形態では、本発明のリガンドがＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のα２ドメイン（Ｈ２）を含む。別の具体的な実施形態では、本発明のリガンドがＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質のα２ドメイン（Ｈ２）からなる。当業者であれば、例えば、配列アラインメントを用いて、他のＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質におけるαヘリックスの位置を決定することができるだろう（参照により全体が本明細書に組み込まれる、Lazear et al. J Virol 2013;87(2):840-850から再現されている図２０Ｃ参照）。一実施形態では、本発明のリガンドがＯＭＣＰのαヘリックスの１つまたは複数を含む。別の実施形態では、本発明のリガンドがＯＭＣＰのα１ドメイン（Ｈ１）、α２ドメイン（Ｈ２）、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂまたはこれらの組み合わせを含む。さらに別の実施形態では、本発明のリガンドがＯＭＣＰのα２ドメイン（Ｈ２）を含む。具体的な実施形態では、本発明のリガンドがＯＭＣＰのαヘリックスの１つまたは複数からなる。別の具体的な実施形態では、本発明のリガンドがＯＭＣＰのα１ドメイン（Ｈ１）、α２ドメイン（Ｈ２）、Ｈ２ａ、Ｈ２ｂまたはこれらの組み合わせからなる。さらに別の具体的な実施形態では、本発明のリガンドがＯＭＣＰのα２ドメイン（Ｈ２）からなる。
【００５６】
全長ＯＭＣＰアミノ酸配列についての配列情報は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号４ＦＦＥ＿Ｚ、４ＦＦＥ＿Ｙまたは４ＦＦＥ＿Ｘを用いて見出すことができる。当業者であれば、ＯＭＣＰのホモログが他の種またはウイルスで見出され得ることを認識するだろう。例えば、牛痘ウイルス株とサル痘ウイルス株との間の１８種のＯＭＣＰ変異体を記載する、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Lefkowitz et al, Nucleic Acids Res 2005; 33: D311-316を参照されたい。一実施形態では、ＯＭＣＰがオルソポックスウイルスのものである。具体的な実施形態では、ＯＭＣＰが牛痘ウイルスまたはサル痘ウイルスのものである。別の具体的な実施形態では、ＯＭＣＰが牛痘ウイルスのブライトンレッド株（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  Ｒｅｄ  ｓｔｒａｉｎ）のものである。ホモログは、当技術分野で公知の方法によって他の種で見出すことができる。例えば、配列類似性は、典型的にはベストフィットを達成するために少数のギャップの導入を可能にする、従来のアルゴリズムによって決定され得る。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性％」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1993）を用いて決定される。このようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＢＬＡＳＴＮプログラムで行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。等しく、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＢＬＡＳＴＸプログラムで行って、本発明のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴがＡｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）に記載されるように利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメータが使用される。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一般的に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９％相同性を有する。別の実施形態では、配列が、ＯＭＣＰと少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であり得る。
【００５７】
当業者であれば、ＯＭＣＰの構造的ホモログを他の種またはウイルスで見出すことができることを認識するだろう。構造的ホモログは構造的に関連するタンパク質であり得るが、配列は遠位ホモログである。例えば、ＯＭＣＰは内因性ＮＫＧ２Ｄとの低い配列同一性を有するが、ＯＭＣＰが構造的相同性に基づいてＮＫＧ２Ｄに結合することが発見された。構造的ホモログは、当技術分野で公知の方法によって他の種で見出すことができる。例えば、タンパク質構造予測は、ＰｈｙｒｅおよびＰｈｙｒｅ２などの種々のデータベースによって決定され得る。このようなデータベースは、構造的ホモログを決定するために使用され得る信頼できるタンパク質モデルをもたらす。Ｐｈｙｒｅ２の主な結果の表は、検出された鋳型の供給源に応じて、信頼できる推定、画像ならびにタンパク質データベースの構造分類（ＳＣＯＰ）またはタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から得られる三次元予測モデルおよび情報へのリンクを提供する。各一致について、ユーザーは、リンクを辿ると、ユーザー配列と公知の三次元構造の配列との間のアラインメントの詳細な図へと導かれる。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／を参照されたい。一般的に、構造的ホモログは、ＯＭＣＰについて少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９％信頼度を有する。一実施形態では、構造的ホモログが、ＯＭＣＰについて少なくとも６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８または６９％信頼度を有する。別の実施形態では、構造的ホモログが、ＯＭＣＰについて少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８または７９％信頼度を有する。さらに別の実施形態では、構造的ホモログが、ＯＭＣＰについて少なくとも８０、８１、８２、８３、６４、８５、８６、８７、８８または８９％信頼度を有する。なおさらに別の実施形態では、構造的ホモログが、ＯＭＣＰについて少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％信頼度を有し得る。ＯＭＣＰヒトＮＫＧ２Ｄについての構造情報は、ＰＤＢ  ＩＤ：４ＰＤＣを用いて見出され得る。
【００５８】
具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＯＭＣＰの配列、例えば配列番号７に示される配列(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTG)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号７と少なくとも８０％の同一性を含むＯＭＣＰの配列である。例えば、リガンドは、配列番号７と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００５９】
別の具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＯＭＣＰの配列、例えば配列番号１３に示される配列(GHKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKR)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を含むＯＭＣＰの配列である。例えば、リガンドは、配列番号１３と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６０】
さらに別の具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＯＭＣＰの配列、例えば配列番号１４に示される配列(HKLVHYFNLKINGSDITNTADILLDNYPIMTFDGKDIYPSIAFMVGNKLFLDLYKNIFVEFFRLFRVSVSSQYEELEYYYSCDYTNNRPTIKQHYFYNGEEYTEIDRSKKATNKNSWLITSGFRLQKWFDSEDCIIYLRSLVRRMEDSNK)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を含むＯＭＣＰの配列である。例えば、リガンドは、配列番号１４と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６１】
代替態様では、免疫細胞上で発現される受容体がＰＤ１であり得る。プログラム細胞死タンパク質１およびＣＤ２７９（表面抗原分類２７９）としても知られているＰＤ１は、ヒトにおいて、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上で発現される細胞表面受容体である。ＰＤ１は２つのリガンド、ＰＤＬ１およびＰＤＬ２に結合する。免疫チェックポイントとして機能するＰＤ１は、Ｔ細胞の活性化を防止することによって、免疫系の下方制御において重要な役割を果たす。一定の実施形態では、組成物のリガンドが、ＰＤ１に特異的に結合する。一実施形態では、ＰＤ１に特異的に結合するリガンドが抗ＰＤ１抗体である。「抗ＰＤ１抗体」は、ＰＤ１内のエピトープに特異的に結合する全ての抗体を含む。「抗体」という用語は上に記載されている。別の実施形態では、ＰＤ１に特異的に結合するリガンドがＰＤＬ１またはＰＤＬ２であり得る。ＰＤＬ１（表面抗原分類２７４（ＣＤ２７４）としても知られているプログラム死リガンド１）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）は、ヒトにおいて、ＣＤ２７４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤＬ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄系細胞上で見られるその受容体、ＰＤ１に結合して、活性化または抑制を調節する。解離定数Ｋｄによって定義されるＰＤＬ１とＰＤ１との間の親和性は７７０ｎＭである。ＰＤＬ２（表面抗原分類２７３（ＣＤ２７３）またはＢ７ＤＣとしても知られているプログラム死リガンド２）は、ヒトにおいて、ＰＤＣＤ１ＬＧ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤＬ２はまたＰＤ１受容体にも結合する。解離定数Ｋｄによって定義されるＰＤＬ２とＰＤ１との間の親和性は５９０ｎＭである。
【００６２】
全長ＰＤＬ１  ｍＲＮＡについての配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０１４１４３、ＮＭ＿００１２６７７０６、ＮＲ＿０５２００５、ＮＭ＿００１３１４０２９を用いて見出すことができ、全長アミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３００９５８、ＮＰ＿００１２５４６３５、ＮＰ＿０５４８６２を用いて見出すことができる。当業者であれば、ＰＤＬ１のホモログを他の種で見出すことができることを認識するだろう。特定の実施形態では、ＰＤＬ１がヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に由来する。配列類似性は、ＯＭＣＰについて本明細書の上で記載されるような従来のアルゴリズムを介して決定され得る。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性％」は、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定される。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一般的に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９％相同性を有する。別の実施形態では、配列が、ＰＤＬ１と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であり得る。
【００６３】
具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＰＤＬ１の配列、例えば配列番号５１に示される配列(MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPGNILNVSIKICLTLSPST)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号５１と少なくとも８０％の同一性を含むＰＤＬ１の配列である。例えば、リガンドは、配列番号５１と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６４】
さらに別の具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＰＤＬ１の配列、例えば配列番号５２に示される配列(MRIFAVFIFMTYWHLLNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号５２と少なくとも８０％の同一性を含むＰＤＬ１の配列である。例えば、リガンドは、配列番号５２と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６５】
さらに別の具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＰＤＬ１の配列、例えば配列番号５３に示される配列(MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号５３と少なくとも８０％の同一性を含むＰＤＬ１の配列である。例えば、リガンドは、配列番号５３と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６６】
全長ＰＤＬ２  ｍＲＮＡについての配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０２５２３９およびＸＭ＿００５２５１６００を用いて見出すことができ、全長アミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０７９５１５およびＸＰ＿００５２５１６５７を用いて見出すことができる。当業者であれば、ＰＤＬ１のホモログを他の種で見出すことができることを認識するだろう。特定の実施形態では、ＰＤＬ２がヒトに由来する。配列類似性は、ＯＭＣＰについて本明細書の上で記載されるような従来のアルゴリズムを介して決定され得る。特に、２つのポリペプチドまたは２つの核酸配列の「同一性％」は、デフォルトパラメータを用いるＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定される。さらなる詳細については、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。一般的に、ホモログは、少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８または８９％相同性を有する。別の実施形態では、配列が、ＰＤＬ２と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％相同であり得る。
【００６７】
具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＰＤＬ２の配列、例えば配列番号５４に示される配列(IFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPFCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAI)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号５４と少なくとも８０％の同一性を含むＰＤＬ２の配列である。例えば、リガンドは、配列番号５４と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６８】
別の具体的な実施形態では、組成物のリガンドがＰＤＬ２の配列、例えば配列番号５４に示される配列(MIFLLLMLSLELQLHQIAALFTVTVPKELYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASYRKINTHILKVPETDEVELTCQATGYPLAEVSWPNVSVPANTSHSRTPEGLYQVTSVLRLKPPPGRNFSCVFWNTHVRELTLASIDLQSQMEPRTHPTWLLHIFIPFCIIAFIFIATVIALRKQLCQKLYSSKDTTKRPVTTTKREVNSAVNLNLWSWEPG)である。一実施形態では、組成物のリガンドが、配列番号５４と少なくとも８０％の同一性を含むＰＤＬ２の配列である。例えば、リガンドは、配列番号５４と約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の同一性を有し得る。
【００６９】
別の態様では、組成物のリガンドがグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ）リガンド（ＧＩＴＲＬ）であり得る。ＧＩＴＲＬによるＧＩＴＲ活性化は、エフェクターおよび調節性Ｔ細胞の活性に影響を及ぼし、よって、腫瘍および感染因子に対する免疫応答の発達、ならびに自己免疫および炎症性疾患に関与する。ＧＩＴＲ誘因は、Ｔエフェクター活性を刺激し、Ｔｒｅｇ活性を抑制する。ＧＩＴＲ抑制は自己免疫／炎症性疾患を改善し得る一方で、ＧＩＴＲ活性化はウイルス、細菌および寄生虫感染症を治療すると同時に、腫瘍に対する免疫応答を押し上げ得る。ＧＩＴＲＬは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および内皮細胞上で、高レベルで発現されるＩＩ型膜貫通タンパク質である。
【００７０】
一定の実施形態では、本発明のリガンドが、全身半減期の改善および投与頻度の減少のために修飾される。一実施形態では、Ｎ−グリカンがリガンドに付加され得る。生物学的機能は一般的にタンパク質成分によって決定されるが、炭水化物が分子安定性、溶解度、インビボ活性、血清半減期および免疫原性において役割を果たし得る。特に、炭水化物のシアル酸成分が、タンパク質療法薬の血清半減期を延長することができる。したがって、新たなＮ−結合グリコシル化コンセンサス配列をペプチド骨格中の望ましい位置に導入して、シアル酸含有炭水化物が増加したタンパク質を生成し、それによって長期血清半減期によりインビボ活性を増加させることができる。別の実施形態では、ＰＥＧをリガンドに付加することができる。ＰＥＧをタンパク質にコンジュゲートする方法は当技術分野で標準的である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kolate et al, Journal of Controlled Release 2014; 192(28):67-81を参照されたい。一実施形態では、本発明の組成物が、ＰＥＧおよび／または１つもしくは複数のＮ−グリカンを含むリガンドを含み得る。一実施形態では、ＰＥＧが、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−２０ＫおよびＰＥＧ−４０Ｋからなる群から選択される。なおさらに、本発明のリガンドを修飾してＴ細胞エピトープを除去することができる。Ｔ細胞エピトープは、組成物を対象に投与した際の免疫原性の問題の原因となり得る。Ｔ細胞へのその提示を通して、これらは抗薬物抗体の発達の過程を活性化する。Ｔ細胞エピトープの前臨床スクリーニングをインシリコで行い、引き続いてインビトロおよびインビボで検証することができる。ＥｐｉＭａｔｒｉｘなどのＴ細胞エピトープマッピングツールは、免疫応答の高度に正確な予測因子となり得る。Ｔ細胞エピトープの計画的除去によって、免疫原性を減少させることができる。その免疫原性を減少させることにより、本発明の組成物の安全性および有効性を改善する他の手段には、ヒト化およびペグ化が含まれる。
【００７１】
（ｃ）リンカー
一態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含む。リンカーを使用してサイトカインをリガンドに連結することができる。サイトカインをリガンドに結合することは、サイトカインの機能にもリガンドの機能にも悪影響を及ぼさないことを理解すべきである。適切なリンカーは、サイトカインとリガンドの両方またはこれらの組み合わせとカップリングするために、反応性基で官能化されたアミノ酸鎖およびアルキル鎖を含む。
【００７２】
一実施形態では、リンカーがペプチドリンカーと呼ばれるアミノ酸側鎖を含み得る。アミノ酸残基リンカーは通常、少なくとも１個の残基であり、５０個以上の残基であることもできるが、単独では標的タンパク質に特異的に結合しない。一実施形態では、リンカーが約１〜約１０個のアミノ酸であり得る。別の実施形態では、リンカーが約１０〜約２０個のアミノ酸であり得る。さらに別の実施形態では、リンカーが約２０〜約３０個のアミノ酸であり得る。なおさらに別の実施形態では、リンカーが約３０〜約４０個のアミノ酸であり得る。異なる実施形態では、リンカーが約４０〜約５０個のアミノ酸であり得る。他の実施形態では、リンカーが５０個超のアミノ酸であり得る。例えば、リンカーは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のアミノ酸であり得る。具体的な実施形態では、リンカーが約２０〜約３０個のアミノ酸である。別の具体的な実施形態では、リンカーが約２６個のアミノ酸である。
【００７３】
リンカーが標的タンパク質に特異的に結合しない限り、任意のアミノ酸残基をリンカーに使用することができる。結合に使用される典型的なアミノ酸残基はグリシン、セリン、アラニン、ロイシン、チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸などである。例えば、リンカーは（ＡＡＳ）ｎ、（ＡＡＡＬ）ｎ（配列番号６８）、（ＧｎＳ）ｎまたは（Ｇ２Ｓ）ｎ（式中、Ａはアラニンであり、Ｓはセリンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは１〜２０または１〜１０または３〜１０の整数である）であり得る。したがって、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり得る。よって、一定の実施形態では、リンカーが、それだけに限らないが、（ＡＡＳ）ｎ、（ＡＡＡＬ）ｎ（配列番号６８）、（ＧｎＳ）ｎまたは（Ｇ２Ｓ）ｎ（式中、Ａはアラニンであり、Ｓはセリンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは１〜２０または１〜１０または３〜１０の整数である）を含む。リンカーは１つまたは複数のエピトープタグを含み得る。例えば、リンカーは１、２、３、４、５、６、７または８つのエピトープタグを含み得る。具体的な実施形態では、リンカーが２つのエピトープタグを含む。エピトープタグの非限定的な例としては、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＫエピトープ（配列番号９））、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡエピトープ（配列番号１０））、Ｈｉｓタグ（６ｘ−Ｈｉｓまたは８ｘ−Ｈｉｓ）、Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬエピトープ（配列番号１１））およびＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴエピトープ（配列番号１２））が挙げられる。一実施形態では、リンカーが、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグからなる群から選択される少なくとも１つのタグを含み得る。具体的な実施形態では、リンカーがＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含む。別の具体的な実施形態では、リンカーが配列番号８に示される配列(GSSGSSDYKDDDDKHHHHHHHHGSSGSS)を含む。
【００７４】
別の実施形態では、アルキル鎖結合基を、末端アミノ基または末端カルボキシル基をアルキル鎖上の官能基、例えばカルボキシル基または活性化エステルと反応させることによって、サイトカインにカップリングすることができる。その後、リガンドをアルキル鎖に結合して、アルキル鎖上の第２の官能基をリガンド上の適切な基と反応させることによって、複合体の形成を完了する。アルキル鎖上の第２の官能基は、リガンド上の官能基と反応性であるが、サイトカインと反応性でない置換基から選択される。例えば、リガンドがカルボキシル基または活性化エステルなどの官能基を組み込む場合、アルキル鎖結合基の第２の官能基がアミノ基であり得る、または逆もまた同様である。望ましくない生成物の形成を回避するために、コンジュゲートの形成が存在する官能基の保護および脱保護を要し得ることが認識されるだろう。有機合成の分野で一般的な保護基、試薬およびプロトコルを用いて、保護および脱保護が達成される。特に、固相ペプチド合成に使用される保護および脱保護技術を使用することができる。あるいは、結合基を最初にリガンドにカップリングし、次いで、サイトカインにカップリングすることができることが認識される。
【００７５】
アルキル鎖との代替化学結合基は、上記のアルキル鎖と同様に官能化されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。このようなリンカーは、ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーまたはホモ二官能性ＰＥＧリンカーと呼ばれ得る。ヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーの非限定的な例としては、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−［２−（ビオチニルアミノ）エチル］オクタエチレングリコール；Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）ポリエチレングリコールヒドロクロリドＭｐ３０００；Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）ポリエチレングリコール５，０００ヒドロクロリドＭｐ５，０００；Ｏ−（２−アミノエチル）ポリエチレングリコール３，０００Ｍｐ３，０００；Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−（スクシニルアミノ）エチル）ポリエチレングリコールヒドロクロリドＭｐ１０，０００；Ｏ−（２−アジドエチル）ヘプタエチレングリコール；Ｏ−（２−（ビオチニルアミノ）エチル］−Ｏ’−（２−カルボキシエチル）ウンデカエチレングリコール；２１−［Ｄ（＋）−ビオチニルアミノ］−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサヘンエイコサン酸；Ｏ−（２−カルボキシエチル）−Ｏ’−［２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）エチル］ヘプタコサエチレングリコール；Ｏ−（２−カルボキシエチル）−Ｏ’−（２−メルカプトエチル）ヘプタエチレングリコール；Ｏ−（３−カルボキシプロピル）−Ｏ’−［２−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコールＭｗ３０００；Ｏ−（３−カルボキシプロピル）−Ｏ’−［２−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコールＭｗ５０００；Ｏ−［Ｎ−（３−マレイミドプロピオニル）アミノエチル］−Ｏ’−［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシ）−３−オキソプロピル］ヘプタコサエチレングリコール；およびＯ−［２−（３−トリチルチオプロピオニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコールＭｐ３０００が挙げられる。ホモ二官能性ＰＥＧリンカーの非限定的な例としては、ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（二官能性マレイミドＰＥＧマレイミド）；ＯＰＳＳ−ＰＥＧ−ＯＰＳＳ（ＯＰＳＳ：オルトピリジルジスルフィド；ＰＤＰ−ＰＥＧ−ＰＤＰ）；ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ（二官能性チオールＰＥＧチオール）；ＳＧ−ＰＥＧ−ＳＧ（二官能性ＰＥＧスクシンイミジルグルタレートＮＨＳエステル）；ＳＳ−ＰＥＧ−ＳＳ（二官能性ＰＥＧスクシンイミジルスクシネートＮＨＳエステル）；ＧＡＳ−ＰＥＧ−ＧＡＳ（二官能性ＰＥＧスクシンイミジルエステルＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）；ＳＡＳ−ＰＥＧ−ＳＡＳ（二官能性ＰＥＧスクシンイミジルエステルＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）；アミン−ＰＥＧ−アミン（二官能性ＰＥＧアミンＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２）；ＡＣ−ＰＥＧ−ＡＣ（二官能性アクリレートＰＥＧアクリレート）；ＡＣＡ−ＰＥＧ−ＡＣＡ（二官能性重合性ＰＥＧアクリレートアクリルアミド）；エポキシド−ＰＥＧ−エポキシド（二官能性ＰＥＧエポキシドまたはＥＰ）；ＮＰＣ−ＰＥＧ−ＮＰＣ（二官能性ＮＰＣ  ＰＥＧ、ニトロフェニルカルボネート）；アルデヒド−ＰＥＧ−アルデヒド（ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ、二官能性ＰＥＧプロピ���ンアルデヒド）；ＡＡ−ＰＥＧ−ＡＡ（酸−ＰＥＧ−酸、ＡＡ−酢酸またはカルボキシルメチル）；ＧＡ−ＰＥＧ−ＧＡ（酸−ＰＥＧ−酸、ＧＡ：グルタル酸）；ＳＡ−ＰＥＧ−ＳＡ（二官能性ＰＥＧカルボン酸−コハク酸）；ＧＡＡ−ＰＥＧ−ＧＡＡ（二官能性ＰＥＧカルボン酸、グルタルアミド酸）；ＳＡＡ−ＰＥＧ−ＳＡＡ（二官能性ＰＥＧカルボン酸、スクシンアミド酸）；アジド−ＰＥＧ−アジド（二官能性ＰＥＧアジド、Ｎ３−ＰＥＧ−Ｎ３）；アルキン−ＰＥＧ−アルキン（二官能性アルキンまたはアセチレンＰＥＧ）；ビオチン−ＰＥＧ−ビオチン（二官能性ビオチンＰＥＧリンカー）；シラン−ＰＥＧ−シラン（二官能性シランＰＥＧ）；ヒドラジド−ＰＥＧ−ヒドラジド（二官能性ＰＥＧヒドラジド）；トシレート−ＰＥＧ−トシレート（二官能性ＰＥＧトシル）；およびクロリド−ＰＥＧ−クロリド（二官能性ＰＥＧハライド）が挙げられる。
【００７６】
一定の実施形態では、本発明のリンカーが、全身半減期の改善および投与頻度の減少のために修飾され得る。一実施形態では、Ｎ−グリカンがリンカーに付加される。生物学的機能は一般的にタンパク質成分によって決定されるが、炭水化物が分子安定性、溶解度、インビボ活性、血清半減期および免疫原性において役割を果たし得る。特に、炭水化物のシアル酸成分が、タンパク質療法薬の血清半減期を延長することができる。したがって、新たなＮ−結合グリコシル化コンセンサス配列をペプチド骨格中の望ましい位置に導入して、シアル酸含有炭水化物が増加したタンパク質を生成し、それによって長期血清半減期によりインビボ活性を増加させることができる。別の実施形態では、ＰＥＧをリガンドに付加する。ＰＥＧをタンパク質にコンジュゲートする方法は当技術分野で標準的である。例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kolate et al, Journal of Controlled Release 2014; 192(28):67-81を参照されたい。一実施形態では、本発明の組成物が、ＰＥＧおよび／または１つもしくは複数のＮ−グリカンを含むリガンドを含む。一実施形態では、ＰＥＧが、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−２０ＫおよびＰＥＧ−４０Ｋからなる群から選択される。
【００７７】
本発明の別の態様は、本発明のペプチドを架橋してその薬物動態、免疫原性、診断および／または治療属性を改善することを含む。架橋は、本発明のサイトカインおよびリガンド上の適切な部位（複数可）（例えば、一級アミン、スルフヒドリル）での化学反応を通した共有結合によって２個の分子を連結することを含む。一実施形態では、サイトカインおよびリガンドを共に架橋することができる。架橋剤は、サイトカインとリガンドとの間に切断可能または切断不可能なリンカーを形成し得る。サイトカインとリガンドとの間に切断不可能なリンカーを形成する架橋剤は、マレイミドまたはハロアセチルに基づく部分を含み得る。本発明によると、このような切断不可能なリンカーはマレイミドまたはハロアセチルに基づく部分に由来すると言われる。マレイミドに基づく部分を含む架橋剤には、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」アナログ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル［ＡＭＡＳ］、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が含まれる。これらの架橋剤は、マレイミドに基づく部分に由来する切断不可能なリンカーを形成する。ハロアセチルに基づく部分を含む架橋剤には、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が含まれる。これらの架橋剤は、ハロアセチルに基づく部分に由来する切断不可能なリンカーを形成する。サイトカインとリガンドとの間に切断不可能なリンカーを形成する架橋剤は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−ブチレート（ＳＤＰＢ）、２−イミノチオランまたは無水アセチルコハク酸を含み得る。
【００７８】
（ｄ）キメラペプチド
別の態様では、本発明は、サイトカインペプチドおよびＮＫＧ２Ｄリガンドペプチドを含むキメラペプチドを包含する。代替態様では、本発明は、サイトカインペプチドおよびＰＤ１リガンドペプチドを含むキメラペプチドを包含する。本組成物および方法に使用するのに適した種々のサイトカインおよびリガンドの本明細書における説明の目的のために、「リガンドペプチド」は「リガンド」と互換的に使用され、「サイトカインペプチド」は「サイトカイン」と互換的に使用されることが理解されるべきである。一定の実施形態では、サイトカインペプチドがＩＬ２サブファミリーである。より具体的には、サイトカインペプチドが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５およびＩＬ２１からなる群から選択される。具体的な実施形態では、サイトカインペプチドがＩＬ１５またはその突然変異型である。別の具体的な実施形態では、サイトカインペプチドがＩＬ２またはその突然変異型である。別の実施形態では、サイトカインペプチドが、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ＫおよびＣ１２５Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む突然変異型ＩＬ２である。具体的な実施形態では、サイトカインペプチドが、配列番号５または配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、サイトカインペプチドがＩＬ１ファミリーである。より具体的には、サイトカインペプチドが、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ３６Ｒａ、ＩＬ３６α、ＩＬ３７、ＩＬ３６β、ＩＬ３６γ、ＩＬ３８およびＩＬ３３からなる群から選択される。具体的な実施形態では、サイトカインペプチドがＩＬ１８またはその突然変異型である。
【００７９】
一定の実施形態では、サイトカインペプチドが腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）である。より具体的には、サイトカインペプチドが、ＴＮＦ−α、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢリガンド、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、リンホトキシンα、リンホトキシンβ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７ＬおよびＲＡＮＫＬからなる群から選択される。具体的な実施形態では、サイトカインペプチドがＯＸ４０Ｌまたはその突然変異型である。別の具体的な実施形態では、サイトカインペプチドがＯＸ４０Ｌ断片を含む。具体的な実施形態では、ＯＸ４０Ｌ断片が、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。一定の具体的な実施形態では、ＯＸ４０Ｌ断片を、リンカーペプチドを介して連続コンストラクトに連結することができる。具体的な実施形態では、ＯＸ４０Ｌ断片を含むコンストラクトが、配列番号５８に示されるアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが、Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａの群から選択される少なくとも１つの突然変異型を含む突然変異型ＯＸ４０Ｌである。具体的な実施形態では、サイトカインが、Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａの群から選択される少なくとも１つの突然変異型を含む突然変異型ＯＸ４０Ｌ断片を含む。具体的な実施形態では、突然変異型ＯＸ４０Ｌ断片が、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む。一定の具体的な実施形態では、突然変異型ＯＸ４０Ｌ断片または突然変異および非突然変異ＯＸ４０Ｌ断片を、リンカーペプチドを介して連続コンストラクトに連結することができる。具体的な実施形態では、突然変異および非突然変異ＯＸ４０Ｌ断片を含むコンストラクトが、配列番号６０または配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む。代替の具体的な実施形態では、サイトカインペプチドが４−１ＢＢＬまたはその突然変異型である。別の具体的な実施形態では、サイトカインペプチドが４−１ＢＢＬ断片を含む。具体的な実施形態では、４−１ＢＢＬ断片が、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む。一定の具体的な実施形態では、４−１ＢＢＬ断片を、リンカーペプチドを介して連続コンストラクトに連結することができる。具体的な実施形態では、４−１ＢＢＬ断片を含むコンストラクトが、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが突然変異型４−１ＢＢＬである。一定の実施形態では、サイトカインが突然変異型４−１ＢＢＬ断片を含む。一定の実施形態では、突然変異型４−１ＢＢＬ断片または突然変異および非突然変異４−１ＢＢＬ断片を、リンカーペプチドを介して連続コンストラクトに連結することができる。
【００８０】
一定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンドペプチドが抗ＮＫＧ２Ｄ抗体である。別の実施形態では、ＮＫＧ２ＤリガンドペプチドがＭＨＣクラスＩ関連糖タンパク質である。別の実施形態では、リガンドペプチドがＯＭＣＰ、その一部、またはその突然変異型である。一実施形態では、リガンドペプチドが、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋ＣＴＬ上で発現される受容体に結合する。具体的な実施形態では、リガンドペプチドがＮＫＧ２Ｄ受容体に結合する。一定の実施形態では、リガンドペプチドが、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することができる配列番号７に示されるアミノ酸配列またはその一部を含む。
【００８１】
一定の実施形態では、ＰＤ１リガンドペプチドが抗ＰＤ１抗体である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドペプチドがＰＤＬ１、その一部またはその突然変異型である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドペプチドがＰＤＬ２、その一部またはその突然変異型である。一実施形態では、リガンドペプチドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージ上で発現される受容体に結合する。具体的な実施形態では、リガンドペプチドがＰＤ１受容体に結合する。一定の実施形態では、リガンドペプチドが、ＰＤ１受容体に結合することができる配列番号４８もしくは配列番号５０に示されるアミノ酸配列またはその一部を含む。
【００８２】
他の実施形態では、キメラペプチドがリンカーペプチドをさらに含む。一定の実施形態では、リンカーペプチドが、（ＡＡＳ）ｎ、（ＡＡＡＬ）ｎ（配列番号６８）、（ＧｎＳ）ｎまたは（Ｇ２Ｓ）ｎ（式中、Ａはアラニンであり、Ｓはセリンであり、Ｌはロイシンであり、Ｇはグリシンであり、ｎは１〜２０または１〜１０または３〜１０の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。異なる実施形態では、リンカーペプチドが、ＦＬＡＧラグおよびＨｉｓタグからなる群から選択される少なくとも１つのタグを含む。一実施形態では、リンカーペプチドが約２０〜約３０個のアミノ酸である。具体的な実施形態では、リンカーペプチドが、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８３】
本発明はまた、本明細書に記載されるキメラペプチドをコードする核酸分子を包含する。さらに、本発明は、本明細書に記載されるキメラペプチドを含む医薬組成物を包含する。医薬組成物はＩ（ｈ）節にさらに詳細に記載する。
【００８４】
本開示のキメラペプチドは、シグナルペプチドおよび／または精製部分を含んでもよい。存在する場合、典型的には、シグナルペプチドはキメラペプチドのＮ末端にあり、精製部分はキメラペプチドのＣ末端にある。あるいは、シグナルペプチドおよび精製部分は、共にキメラペプチドのＮ末端にある。シグナルペプチドの選択は、それだけに限らないが、所望の細胞位置および細胞の種類を含む種々の因子に応じて変化することができ、変化するだろう。シグナルペプチドをコードする適切なポリヌクレオチド配列は当技術分野で公知であり、そこからコードされるポリペプチド配列も公知である。具体的な実施形態では、シグナルペプチドが配列番号６９(MGILPSPGMPALLSLVSLLSVLLMGCVAETG)を含む。同様に、精製部分の選択も変化することができ、変化するだろう。適切な精製部分は当技術分野で公知であり、これらをコードするポリヌクレオチド配列も公知である。一般に、シグナルペプチドおよび／または精製部分は、プロセシング中に切断され、医薬組成物に使用するための最終キメラペプチドには含まれない。
【００８５】
本開示はまた、本開示のキメラペプチドをコードすることができる核酸配列を含むベクターを包含する。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、遺伝物質を導入するための媒体として使用される核酸分子として定義される。ベクターには、それだけに限らないが、プラスミド、ファージミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、コスミド、転位因子、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えばレトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶ等由来）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来するもの）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能、複製不全およびガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）形態を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタインバーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが含まれる。本開示のキメラペプチドをコードする発現ベクターは、ウイルスベクターを用いて、または非ウイルス導入法を介して、細胞に送達することができる。核酸を細胞に導入するのに適したウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ラブドウイルスおよびヘルペスウイルスが含まれる。非ウイルス核酸導入法は、ネイキッド核酸、リポソームおよびタンパク質／核酸コンジュゲートを含む。細胞に導入される本開示のキメラペプチドをコードする発現コンストラクトは、直鎖または環状であり得、一本鎖または二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその任意の修飾もしくは組み合わせであり得る。本開示はまた、本開示のキメラペプチドをコードすることができる核酸配列を含むベクターを含む細胞株を包含する。いくつかの実施形態では、細胞株が不死化細胞株である。
【００８６】
（ｅ）標的化分子
本明細書で使用される場合、「標的化分子」とは、疾患状態の細胞に特異的な標的または疾患細胞を囲む細胞外マトリックスに結合することができる分子である。いくつかの例では、標的化分子が、細胞上で発現される標的分子実体に結合する。標的化分子は、それだけに限らないが、受容体リガンドおよび抗体を含む、このような会合または結合が可能な任意の分子であり得る。種々の種類の標的化分子が当業者に知られるであろう。例えば、受容体リガンドは、細胞の表面上で発現される標的受容体に結合する。標的化分子はまた、インターフェロンα、βおよびγなどの他の分子を含み得る。標的化分子の他の例としては、ＴＮＦ受容体に対するアゴニストおよびアンタゴニスト抗体、腫瘍間質に存在する抗原に対する抗体、メソテリンに対する抗体ならびに癌胎児抗原に対する抗体を含む抗体が挙げられる。特定の抗原標的に対する抗体は、本開示において前に論じられる方法を含む、当業者に公知の手段によって生成され得る。一定の態様では、標的化分子がリガンドまたは抗体の結合部分などの分子の一部のみを含み得る。標的化分子を、本開示において論じられるリンカーによってリガンドに結合することができる。本発明の標的化分子は、当業者に公知の手段によって製造することができる。
【００８７】
（ｆ）併用療法
本明細書で使用される場合、「組み合わせ」とは、別々に投与され得る、例えば、別個の投与のために別々に製剤化され得る（例えば、キットで提供され得るように）療法、および単一製剤で（すなわち、「合剤」）一緒に投与され得る療法を含むことが意図される。本明細書で提供されるポリペプチドと１種または複数の活性治療剤の組み合わせは、順次（例えば、ある薬剤が１つまたは複数の他の薬剤の前に投与される）または同時（例えば、２つ以上の薬剤が同時にまたはほぼ同時に投与される）に投与または施用することができる。いくつかの実施形態では、投与が順次である。他の実施形態では、投与が同時である。２つ以上の薬剤が順次または同時投与されるかどうかにかかわらず、これらは本開示の目的のために組み合わせて投与されると考えられる。
【００８８】
したがって、本明細書に記載されるポリペプチドの方法および使用は、別の治療の前に、別の治療と実質的に同時に、または別の治療の後に実行することができ、他の形態の療法を補充することができる。
【００８９】
一態様では、本明細書に記載される組成物とＰＤ−１インヒビターとを含む併用療法が本明細書で提供される。「ＰＤ−１インヒビター」とは、ヒトＰＤ−１の変異体、アイソフォーム、種ホモログ（例えばマウス）およびＰＤ−１と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログを含む、ＰＤ−１（例えば、プログラム細胞死タンパク質１；ＰＤ−１（ＣＤ２７９）；ＧＩ：１４５５５９５１５）の活性または発現を低下させる、抑制する、遮断する、抑止するまたは妨害する部分（例えば、化合物、核酸、ポリペプチド、抗体）を指す。ＰＤ−１インヒビターは、分子および高分子、例えば化合物、核酸、ポリペプチド、抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）およびその機能的断片または変異体を含む。本明細書に記載される特定の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。ＰＤ−１インヒビター（抗ＰＤ−１抗体を含む）は、ＰＤ−１活性または発現に拮抗することができる。抗ＰＤ−１抗体は本明細書に記載されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がモノクローナル抗体である。他の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がポリクローナル抗体である。０）。
【００９０】
一実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＲＥＧＮ２８１０、ＰＤＲ００１およびＭＥＤＩ０６８０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがニボルマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがペンブロリズマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがピジリズマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがＡＭＰ−２２４である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがＲＥＧＮ２８１０である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがＰＤＲ００１である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターがＭＥＤＩ０６８０である。
【００９１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＮＫＧ２Ｄリガンドに結合した本明細書で提供されるサイトカインを含む組成物とを含む併用療法を包含する。組成物は、サイトカインを本明細書で提供されるリガンドに連結するために本明細書に記載されるリンカーをさらに含み得る。例えば、サイトカインは、本明細書に記載されるもの（例えば、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ３６Ｒａ、ＩＬ３６α、ＩＬ３７、ＩＬ３６β、ＩＬ３６γ、ＩＬ３８およびＩＬ３３）を含むＩＬ１ファミリーサイトカインであり得る。例えば、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１などのＩＬ２サブファミリーサイトカインであり得る。いくつかの実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。他の実施形態では、サイトカインがＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。例えば、サイトカインは、本明細書に記載されるインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ１０Ｒ２またはＩＦＮＬＲ１）であり得る。別の例では、サイトカインが、それだけに限らないが、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５またはＩＬ３６などのインターロイキンである。別の例では、サイトカインが、それだけに限らないが、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）、ＥＤＡ、ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８などのＴＮＦＳＦファミリーのメンバーである。例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、本明細書に記載されるＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦまたはＮＫＧ２Ｈであり得る。リガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ１、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、ｈ−ＨＬＡ−Ａ、Ｍｕｌｔ１またはＯＭＣＰからなる群から選択され得る。一定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンドが、本明細書に記載されるＯＭＣＰ（例えば、配列番号７、１３または１４）である。
【００９２】
一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および標的化分子を含む組成物とを含む。ＯＭＣＰを標的化分子に結合することができる、またはＯＭＣＰの一部を標的化分子に結合することができる。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバーを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＴＮＦ関連アポトーシス誘発標的化分子を含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および４−１ＢＢリガンドを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および４−１ＢＢアゴニストを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＴＮＦαを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＯＸ４０Ｌを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＦａｓリガンドを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびリンホトキシンα（ＬＴ−ａ）を含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびリンホトキシンβ（ＬＴ−ｂ）を含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＣＤ４０Ｌを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＣＤ２７Ｌを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、ＯＭＣＰおよびｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂ標的化分子（ＲＡＮＫＬ）を含む組成物とを含む。
【００９３】
一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＫＹＫ−１、ＫＹＫ−１のｓｃＦｖ、ＫＹＫ−２またはＫＹＫ−２のｓｃＦｖ）に結合したサイトカインとを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合したサイトカインとを含み、ＮＫＧ２Ｄリガンドが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００９４】
一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドおよびサイトカイン）とを含む。併用療法は、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５または配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質とを含むことができる。
【００９５】
ＰＤ−１インヒビターと、本明細書に記載されるキメラペプチドとを含む併用療法が本明細書でさらに提供される。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターと、本明細書に記載されるサイトカインペプチドおよび本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄリガンドペプチドを含むキメラペプチドとを含む。一定の例では、サイトカインペプチドが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１およびこれらの突然変異型からなる群から選択され得る。一実施形態では、併用療法のサイトカインペプチドがＩＬまたはその突然変異型（例えば、配列番号５または６）である。本明細書に記載される併用療法におけるキメラペプチドのＮＫＧ２Ｄリガンドには、本明細書で提供されるリガンド（例えば、ＫＹＫ−１、ＫＹＫ−１のｓｃＦｖ、ＫＹＫ−２またはＫＹＫ−２のｓｃＦｖ）が含まれる。別の例では、併用療法のキメラペプチドのＮＫＧ２Ｄリガンドが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００９６】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む併用療法が本明細書で提供される。サイトカインペプチドは本明細書の上で記載されるサイトカインである。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は本明細書の上で記載される通りである。
【００９７】
一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法が、ＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【００９８】
一実施形態では、併用療法が、ＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法が、ＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【００９９】
他の実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ−１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【０１０１】
本発明の別の態様では、本明細書に記載される組成物と、ＰＤ−Ｌ１インヒビターとを含む併用療法が本明細書で提供される。「ＰＤ−Ｌ１インヒビター」という用語は、ＰＤ−Ｌ１の活性、ＰＤ−Ｌ１とその受容体の結合、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ１（例えば、プログラム細胞死１リガンド；ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）；ＧＩ：３００８８８４３）（ＰＤ−Ｌ１と少なくとも１つの共通のエピトープを有するヒトＰＤ−Ｌ１の変異体、アイソフォーム、種ホモログ（例えば、マウス）およびアナログを含む）の発現を低下、抑制、遮断、抑止または妨害する部分（例えば、化合物、核酸、ポリペプチド、抗体）を指す。ＰＤ−Ｌ１インヒビターは、例えば、化合物（小分子化合物）、核酸、ポリペプチド、抗体、ペプチボディ、ダイアボディ、ミニボディ、単鎖抗体またはナノボディ、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）およびこれらの断片または変異体などの分子および高分子を含む。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＰＤ−Ｌ１インヒビター（抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む）は、ＰＤ−Ｌ１活性、そのＰＤ−１との結合またはその発現に拮抗することができる。代表的なＰＤ−Ｌ１インヒビターには、それだけに限らないが、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ、アテゾリズマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＳＴＩ−Ａ１０１０、ＳＴＩ−Ａ１０１１、ＳＴＩ−Ａ１０１２、ＳＴＩ−Ａ１０１３、ＳＴＩ−Ａ１０１４およびＳＴＩ−Ａ１０１５が含まれる。
【０１０２】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＮＫＧ２Ｄリガンドに結合した本明細書で提供されるサイトカインを含む組成物とを含む併用療法を包含する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターがデュルバルマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターがアベルマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターがアテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターがＢＭＳ−９３６５５９である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターがＳＴＩ−Ａ１０１０、ＳＴＩ−Ａ１０１１、ＳＴＩ−Ａ１０１２、ＳＴＩ−Ａ１０１３、ＳＴＩ−Ａ１０１４またはＳＴＩ−Ａ１０１５である。
【０１０３】
組成物は、サイトカインを本明細書で提供されるリガンドに連結するために本明細書に記載されるリンカーをさらに含み得る。サイトカインは本明細書に記載されるサイトカインである。例えば、サイトカインは、本明細書に記載されるもの（例えば、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ３６Ｒａ、ＩＬ３６α、ＩＬ３７、ＩＬ３６β、ＩＬ３６γ、ＩＬ３８およびＩＬ３３）を含むＩＬ１ファミリーサイトカインであり得る。例えば、サイトカインはＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５およびＩＬ２１などのＩＬ２サブファミリーサイトカインであり得る。いくつかの実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。他の実施形態では、サイトカインがＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。例えば、サイトカインは、本明細書に記載されるインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＬ１０Ｒ２またはＩＦＮＬＲ１）であり得る。別の例では、サイトカインが、それだけに限らないが、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５またはＩＬ３６などのインターロイキンである。別の例では、サイトカインが、それだけに限らないが、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ７０（ＴＮＦＳＦ７）、ＥＤＡ、ＦＡＳＬＧ（ＴＮＦＳＦ６）、ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ１５３）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＲＡＮＫＬ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８などのＴＮＦＳＦファミリーのメンバーである。ＮＫＧ２Ｄリガンドは上に記載される通りである。例えば、リガンドは、本明細書に記載されるＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２ＦまたはＮＫＧ２Ｈであり得る。リガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ１、Ｈ６０ａ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、ｈ−ＨＬＡ−Ａ、Ｍｕｌｔ１またはＯＭＣＰからなる群から選択され得る。一定の例では、ＮＫＧ２Ｄリガンドが、本明細書に記載されるＯＭＣＰ（例えば、配列番号７、１３または１４）である。
【０１０４】
一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および標的化分子を含む組成物とを含む。ＯＭＣＰを標的化分子に結合することができる、またはＯＭＣＰの一部を標的化分子に結合することができる。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバーを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＴＮＦ関連アポトーシス誘発標的化分子を含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および４−１ＢＢリガンドを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部および４−１ＢＢアゴニストを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＴＮＦαを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＯＸ４０Ｌを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＦａｓリガンドを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびリンホトキシンα（ＬＴ−ａ）を含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびリンホトキシンβ（ＬＴ−ｂ）を含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＣＤ４０Ｌを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書で提供されるＯＭＣＰまたはその一部およびＣＤ２７Ｌを含む組成物とを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、ＯＭＣＰおよびｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂ標的化分子（ＲＡＮＫＬ）を含む組成物とを含む。
【０１０５】
一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＫＹＫ−１、ＫＹＫ−１のｓｃＦｖ、ＫＹＫ−２またはＫＹＫ−２のｓｃＦｖ）に結合したサイトカインとを含む。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合したサイトカインとを含み、ＮＫＧ２Ｄリガンドが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書に記載される融合タンパク質（例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドおよびサイトカイン）とを含む。併用療法は、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５または配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質とを含むことができる。
【０１０７】
ＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書に記載されるキメラペプチドとを含む併用療法が本明細書でさらに提供される。一実施形態では、併用療法が、本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、本明細書に記載されるサイトカインペプチドおよび本明細書に記載されるＮＫＧ２Ｄリガンドペプチドを含むキメラペプチドとを含む。一定の例では、サイトカインペプチドが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１およびこれらの突然変異型からなる群から選択され得る。一実施形態では、併用療法のサイトカインペプチドがＩＬまたはその突然変異型（例えば、配列番号５または６）である。本明細書に記載される併用療法におけるキメラペプチドのＮＫＧ２Ｄリガンドには、本明細書で提供されるリガンド（例えば、ＫＹＫ−１、ＫＹＫ−１のｓｃＦｖ、ＫＹＫ−２またはＫＹＫ−２のｓｃＦｖ）が含まれる。別の例では、併用療法のキメラペプチドのＮＫＧ２Ｄリガンドが、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１または配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ−Ｌ１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む併用療法が本明細書で提供される。サイトカインペプチドは本明細書の上で記載されるサイトカインである。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は本明細書の上で記載される通りである。
【０１０９】
別の実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む併用療法が本明細書で提供される。サイトカインペプチドは本明細書の上で記載されるサイトカインである。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は本明細書の上で記載される通りである。
【０１１０】
一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−Ｌ１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法が、ＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【０１１１】
一実施形態では、併用療法が、ＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−Ｌ１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法が、ＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【０１１２】
他の実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ−１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。
【０１１４】
（ｇ）好ましい実施形態
非限定的な例として、本発明のいくつかの好ましい組成物を図２３に示す。１．はサイトカインに結合したＯＭＣＰのα２ドメイン（Ｈ２）を含む組成物を示す。２．はペグ化された、サイトカインに結合したＯＭＣＰを含む組成物を示す。３．はＮ−グリカンを含む、サイトカインに結合したＯＭＣＰを含む組成物を示す。４．はサイトカインに結合したＯＭＣＰを含む組成物であって、リンカーが種々の配列および種々の長さを含む組成物を示す。５．はサイトカインに結合したＮＫＧ２Ｄに対するＦａｂ特異抗体を含む組成物を示す。６．はサイトカインに結合した種々のＮＫＧ２Ｄリガンドを含む組成物を示す。７．はサイトカインに結合したＯＭＣＰの突然変異バージョンを含む組成物であって、ＯＭＣＰが、改善した結合親和性または弱い結合親和性を有するよう突然変異され得る組成物を示す。８．はサイトカインに結合したＯＭＣＰの突然変異バージョンを含む組成物であって、ＯＭＣＰが、他のＮＫＧ２受容体に対する結合親和性を有するよう突然変異され得る組成物を示す。９．はサイトカインに結合したウイルスタンパク質を含む組成物を示す。例えば、ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄに結合する。さらに、ＣＰＸＶ２０３はＭＨＣＩに結合する。１０．は突然変異サイトカインに結合したＯＭＣＰを含む組成物を示す。ＯＭＣＰ配列は牛痘またはサル痘などの種々の供給源のものであり得ることが理解される。また、ＯＭＣＰとＩＬ２およびその変異体のＦｃキメラも使用され得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、組成物が、ＯＭＣＰに結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１１６】
好ましい実施形態では、組成物が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１１７】
異なる好ましい実施形態では、組成物が、ＯＭＣＰに結合したＩＬ２を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＩＬ２を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＩＬ２を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＩＬ２を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１１８】
異なる好ましい実施形態では、組成物が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＩＬ２を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１１９】
代表的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄリガンドが抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはそのｓｃＦｖ、例えばＫＹＫ−１抗体、ＫＹＫ−２抗体、ＫＹＫ−１  ｓｃＦｖまたはＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。１つの特定の代表的な実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がｍｕｔＩＬ２に結合したＫＹＫ−１であり、配列番号４３に示されるアミノ酸配列(QPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSSGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含む、あるいは配列番号４４に示されるアミノ酸配列(EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRFGYYLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQPSSVSVAPGETARIPCGGDDIETKSVHWYQQKPGQAPVLVIYDDDDRPSGIPERFFGSNSGNTATLSISRVEAGDEADYYCQVWDDNNDEWVFGGGTQLTVLGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含むキメラペプチドが提供される。別の特定の代表的な実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がｍｕｔＩＬ２に結合したＫＹＫ−２であり、配列番号４５に示されるアミノ酸配列(QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSSGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含む、あるいは配列番号４６に示されるアミノ酸配列(QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVLGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含むキメラペプチドが提供される。
【０１２０】
代表的な実施形態では、組成物が配列番号１０に示されるＤＮＡ配列(CACAAACTCGCATTCAACTTCAATCTAGAAATAAATGGCAGTGATACACATTCTACAGTAGATGTATATCTTGATGATTCTCAAATTATAACGTTTGATGGAAAAGATATCCGTCCAACCATCCCGTTCATGATAGGTGATGAAATTTTCTTACCGTTTTATAAAAATGTGTTTAGTGAGTTTTTCTCTCTGTTTAGAAGAGTTCCTACAAGTACTCCATATGAAGACTTGACATATTTTTATGAATGCGACTATACAGACAATAAATCTACATTTGATCAGTTTTATCTTTATAATGGCGAAGAATATACTGTCAAAACACAGGAGGCCACTAATAAAAATATGTGGCTAACTACTTCCGAGTTTAGACTAAAAAAATGGTTCGATGGCGAAGATTGTATAATGCATCTTAGATCGTTAGTTAGAAAAATGGAGGACAGTAAACGAAACACTGGTGGTACCGGAAGTAGCGGTAGTAGTGATTACAAGGACGATGACGACAAGCACCACCATCATCATCATCACCACGGTAGCAGCGGCAGCAGTGCCCCCACCTCTAGCAGCACAAAGAAGACCCAGCTGCAACTGGAACACCTCCTGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACCGCCATGCTGACCAAAAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTTAAACACCTGCAATGCCTTGAGGAGGAGCTGAAGCCCTGGAGGAGGTACTGAACCTGGCCCAGAGCAAGAACTTTCATCTGAGGCCCAGGGACCTGATTAGCAACATCAACGTGATCGTGTTGGAGTTGAAGGGCAGCGAGACCACGTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACGGCCACCATAGTGGAGTTTCTTAACAGGTGGATCACCTTCTCACAGTCTATCATCAGCACCCTGACC)を含む。
【０１２１】
別の代表的な実施形態では、組成物が配列番号２０に示されるアミノ酸配列(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTGGTGSSGSSDYKDDDDKHHHHHHHHGSSGSSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含む。
【０１２２】
好ましい実施形態では、組成物が、ＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。前記実施形態の各々では、ＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトが突然変異Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａを含むＯＸ４０Ｌの突然変異バージョンであり得る。
【０１２３】
好ましい実施形態では、組成物が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬまたはこれらの断片コンストラクトを含む。前記実施形態の各々では、ＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトが突然変異Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａを含むＯＸ４０Ｌの突然変異バージョンであり得る。
【０１２４】
異なる好ましい実施形態では、組成物が、ＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。前記実施形態の各々では、ＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトが突然変異Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａを含むＯＸ４０Ｌの突然変異バージョンであり得る。
【０１２５】
好ましい実施形態では、組成物が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合したＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトを含む。前記実施形態の各々では、ＯＸ４０Ｌまたはその断片コンストラクトが突然変異Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａを含むＯＸ４０Ｌの突然変異バージョンであり得る。
【０１２６】
代表的な実施形態では、ＮＫＧ２ＤリガンドがＯＭＣＰである。代表的な実施形態では、サイトカインがＯＸ４０Ｌである。特定の代表的な実施形態では、サイトカインがＯＸ４０Ｌ断片を含むコンストラクトである。特定の代表的な実施形態では、ＯＸ４０Ｌ断片が連続コンストラクトに合体される。１つの特定の代表的な実施形態では、ＯＭＣＰがリンカーペプチドを介してＯＸ４０Ｌコンストラクトに結合しており、配列番号６２に示されるアミノ酸配列(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTGGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSGGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)を含むキメラペプチドが提供される。特定の代表的な実施形態では、サイトカインが、アミノ酸位置Ｎ１６６ＡおよびＦ１８０Ａで突然変異を含む突然変異ＯＸ４０Ｌ断片を含むコンストラクトである。特定の代表的な実施形態では、突然変異ＯＸ４０Ｌ断片が、非突然変異ＯＸ４０Ｌ断片を含むまたは含まない連続コンストラクトに合体される。１つの特定の代表的な実施形態では、ＯＭＣＰがリンカーペプチドを介して突然変異ＯＸ４０Ｌコンストラクトに結合しており、配列番号６３(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTGGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSGGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)または配列番号６４(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTGGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSGGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVAGGELILIHQNPGEACVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVLGGSGGGSGGGSGQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL)に示されるアミノ酸配列を含むキメラペプチドが提供される。
【０１２７】
異なる好ましい実施形態では、組成物が、ＯＭＣＰに結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＯＭＣＰに結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。
【０１２８】
異なる好ましい実施形態では、組成物が、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介して抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合した４−１ＢＢＬまたはその断片コンストラクトを含む。
【０１２９】
代表的な実施形態では、ＮＫＧ２ＤリガンドがＯＭＣＰである。代表的な実施形態では、サイトカインが４−１ＢＢＬである。特定の代表的な実施形態では、サイトカインが４−１ＢＢＬ断片を含むコンストラクトである。特定の代表的な実施形態では、４−１ＢＢＬ断片が連続コンストラクトに合体される。１つの特定の代表的な実施形態では、ＯＭＣＰがリンカーペプチドを介して４−１ＢＢＬコンストラクトに結合しており、配列番号６７に示されるアミノ酸配列(HKLAFNFNLEINGSDTHSTVDVYLDDSQIITFDGKDIRPTIPFMIGDEIFLPFYKNVFSEFFSLFRRVPTSTPYEDLTYFYECDYTDNKSTFDQFYLYNGEEYTVKTQEATNKNMWLTTSEFRLKKWFDGEDCIMHLRSLVRKMEDSKRNTGGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSGGACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGGSGGGSGACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGSGGGSGGGSGACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE)を含むキメラペプチドが提供される。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、組成物がＯＭＣＰまたはその一部および標的化分子を含む。別の好ましい実施形態では、ＯＭＣＰまたはその一部がリンカーを介して標的化分子に結合している。なおさらに別の好ましい実施形態では、ＯＭＣＰの一部が、ＯＭＣＰの活性化部分であるＨ２ｂを含む。特定の好ましい実施形態では、ＯＭＣＰの活性化部分がＨ２Ｂヘリックスを含む。
【０１３１】
別の非限定的な例では、ＰＤ１受容体に結合する本発明のいくつかの好ましい組成物を図３６に示す。
【０１３２】
好ましい実施形態では、組成物が、ＰＤＬ１に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＰＤＬ１に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＰＤＬ１に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＰＤＬ１に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１３３】
別の好ましい実施形態では、組成物が、ＰＤＬ２に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介してＰＤＬ２に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介してＰＤＬ２に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介してＰＤＬ２に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１３４】
さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、抗ＰＤ１抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。別の好ましい実施形態では、組成物が、ペプチドリンカーを介して抗ＰＤ１抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。さらに別の好ましい実施形態では、組成物が、約２０〜約３０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して抗ＰＤ１抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。なおさらに別の好ましい実施形態では、組成物が、ＦＬＡＧタグおよびＨｉｓタグを含むペプチドリンカーを介して抗ＰＤ１抗体に結合したＩＬ２、ＩＬ１５またはＩＬ１８を含む。前記実施形態の各々では、ＩＬ２が突然変異Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ｋを含むＩＬ２の突然変異バージョンであり得る。
【０１３５】
代表的な実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。１つの特定の代表的な実施形態では、ＰＤ１リガンドがｍｕｔＩＬ２に結合したＰＤＬ１であり、配列番号４８に示されるアミノ酸配列(AFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含むキメラペプチドが提供される。特定の代表的な実施形態では、組成物が、配列番号４７に示されるＤＮＡ配列(GCCTTCACCGTGACTGTGCCCAAGGATCTGTACGTCGTGGAGTACGGCTCCAACATGACAATCGAGTGCAAGTTCCCCGTGGAGAAGCAGCTGGACCTGGCGGCACTGATCGTGTACTGGGAGATGGAGGACAAGAACATCATCCAGTTCGTTCATGGCGAAGAGGATCTCAAGGTGCAGCACAGCAGCTACAGGCAGAGGGCCCGACTGCTGAAGGACCAGCTGAGCCTGGGCAACGCCGCACTGCAAATCACCGACGTGAAGCTGCAGGACGCTGGCGTGTACAGGTGTATGATAAGCTACGGCGGAGCTGACTACAAGAGAATCACGGTTAAGGTAAACGCCCCCTACGGGGGCAGTAGCGGAAGCTCCGGCTCAAGCCACCACCATCATCATCATCACCACGGCGGCAGCAGCGGGAGCTCAGGTAGCAGTGGTGGGGCACCTACCTCTTCCAGCACCAAGAAGACGCAGCTCCAGTTGGAACACCTTCTCCTTGACCTCCAGATGATCCTGAACGGCATCAACAACTACAAAAATCCCAAGCTGACCGCGATGCTGACGAAGAAATTCTACATGCCAAAGAAGGCCACCGAGCTGAAACACCTGCAGTGTCTTGAGGAGGAACTTAAGCCGCTCGAGGAGGTACTGAACCTGGCCCAGAGTAAGAACTTCCACCTGAGGCCCAGGGACCTCATCAGCAACATCAATGTGATCGTCCTTGAGCTTAAGGGCAGCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTATGCGGACGAAACGGCCACAATCGTCGAGTTTCTGAATAGGTGGATCACTTTCAGCCAGAGCATCATCTCTACCCTGACC)を含む。
【０１３６】
代表的な実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。１つの特定の代表的な実施形態では、ＰＤ１リガンドがｍｕｔＩＬ２に結合したＰＤＬ２であり、配列番号５０に示されるアミノ酸配列(LYIIEHGSNVTLECNFDTGSHVNLGAITASLQKVENDTSPHRERATLLEEQLPLGKASFHIPQVQVRDEGQYQCIIIYGVAWDYKYLTLKVKASGGSSGSSGSSHHHHHHHHGGSSGSSGSSGGAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTKKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT)を含むキメラペプチドが提供される。特定の代表的な実施形態では、組成物が、配列番号４９に示されるＤＮＡ配列(CTGTACATCATCGAGCACGGCAGTAACGTGACCCTGGAGTGCAACTTCGACACCGGCAGCCACGTGAATCTGGGCGCCATCACAGCTTCACTGCAGAAGGTGGAGAATGACACCTCTCCCCACAGGGAGCGAGCCACCCTGCTTGAGGAACAACTGCCTCTCGGCAAGGCCAGCTTCCACATCCCCCAGGTGCAGGTGAGGGACGAGGGCCAGTACCAGTGCATAATCATCTACGGCGTGGCCTGGGACTACAAGTACCTGACACTTAAGGTGAAAGCCTCCGGCGGTTCTTCCGGCTCTTCAGGCAGCTCACACCATCATCATCATCACCACCATGGCGGCAGCAGCGGGAGCTCTGGTAGCAGTGGCGGTGCCCCCACCAGCAGTAGCACTAAGAAGACCCAGCTGCAACTGGAGCACTTGCTCCTGGACCTGCAAATGATCCTCAACGGCATCAACAACTATAAGAACCCCAAGCTGACGGCCATGCTGACCAAAAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGTTGAAACACTTGCAGTGCCTGGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTGGAAGAGGTGCTGAACCTGGCCCAGAGCAAGAATTTTCATCTGAGGCCTAGGGACCTGATTAGCAACATCAACGTGATCGTGTTGGAGCTTAAAGGCTCCGAGACCACCTTTATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCGACTATCGTGGAGTTCCTGAACAGGTGGATCACCTTTTCACAGAGCATCATAAGCACACTGACC)を含む。
【０１３７】
（ｈ）医薬組成物
本開示はまた、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、有効成分としての、上に詳述される本発明の組成物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含むことができる。本明細書で提供される医薬組成物はまた、本明細書に記載される併用療法を含むこともできる。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。
【０１３８】
薬学的に許容される賦形剤は、希釈剤、結合剤、充填剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、崩壊剤、分散剤、保存剤、潤滑剤、矯味剤、香味剤または着色剤であり得る。医薬組成物を形成するために利用される賦形剤の量および種類は、薬科学の公知の原則に従って選択され得る。
【０１３９】
一実施形態では、賦形剤が希釈剤であり得る。希釈剤は圧縮性（すなわち、塑性変形可能な）または研磨的に脆性であり得る。適切な圧縮性希釈剤の非限定的な例としては、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、酢酸および酪酸混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、トウモロコシデンプン、リン酸化トウモロコシデンプン、α化トウモロコシデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン−ラクトース、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール（ｍａｌｉｔｏｌ）、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリンおよびトレハロースが挙げられる。適切な研磨的に脆性の希釈剤の非限定的な例としては、第二リン酸カルシウム（無水または二水和物）、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸マグネシウムが挙げられる。
【０１４０】
別の実施形態では、賦形剤が結合剤であり得る。適切な結合剤には、それだけに限らないが、デンプン、α化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２〜Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびこれらの組み合わせが含まれる。
【０１４１】
別の実施形態では、賦形剤が充填剤であり得る。適切な充填剤には、それだけに限らないが、炭水化物、無機化合物およびポリビニルピロリドンが含まれる。非限定的な例として、充填剤は硫酸カルシウム（第二と第三の両方）、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、第二リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、加工デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールであり得る。
【０１４２】
さらに別の実施形態では、賦形剤が緩衝剤であり得る。適切な緩衝剤の代表的な例としては、それだけに限らないが、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、トリス緩衝剤および緩衝生理食塩水の塩（例えば、トリス緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられる。
【０１４３】
種々の実施形態では、賦形剤がｐＨ調節剤であり得る。非限定的な例として、ｐＨ調節剤は炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸またはリン酸であり得る。
【０１４４】
さらなる実施形態では、賦形剤が崩壊剤であり得る。崩壊剤は非発泡性であっても発泡性であってもよい。非発泡性崩壊剤の適切な例としては、それだけに限らないが、デンプン（トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、そのα化デンプンおよび加工デンプンなど）、甘味料、粘土（ベントナイトなど）、微結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ガム（寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチンおよびトラガカントなど）が挙げられる。適切な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムおよび酒石酸と組み合わせた重炭酸ナトリウムが挙げられる。
【０１４５】
さらに別の実施形態では、賦形剤が分散剤または分散増強剤であり得る。適切な分散剤には、それだけに限らないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファス（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ）ケイ酸塩および微結晶セルロースが含まれ得る。
【０１４６】
別の代替実施形態では、賦形剤が保存剤であり得る。適切な保存剤の非限定的な例としては、抗酸化剤（ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥまたはパルミチン酸レチニル、クエン酸、クエン酸ナトリウムなど）；キレート剤（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなど）；および抗微生物剤（パラベン、クロロブタノールまたはフェノールなど）が挙げられる。
【０１４７】
さらなる実施形態では、賦形剤が潤滑剤であり得る。適切な潤滑剤の非限定的な例としては、鉱物（タルクまたはシリカなど）；および脂肪（植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸など）が挙げられる。
【０１４８】
さらに別の実施形態では、賦形剤が矯味剤であり得る。矯味剤には、セルロースエーテル；ポリエチレングリコール；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールとポリエチレングリコールのコポリマー；モノグリセリドまたはトリグリセリド；アクリル酸ポリマー；アクリル酸ポリマーとセルロースエーテルの混合物；酢酸フタル酸セルロース；およびこれらの組み合わせが含まれる。
【０１４９】
代替実施形態では、賦形剤が香味剤であり得る。香味剤は、合成香味油および香味芳香剤および／または天然油、植物、葉、花、果実からの抽出物、ならびにこれらの組み合わせから選択され得る。
【０１５０】
なおさらなる実施形態では、賦形剤が着色剤であり得る。適切な着色添加剤には、それだけに限らないが、食品医薬品化粧品用着色剤（ＦＤ＆Ｃ）、医薬品化粧品用着色剤（Ｄ＆Ｃ）または外用薬化粧品用着色剤（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が含まれる。
【０１５１】
組成物中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分率は、組成物の総重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下または約１％以下であり得る。
【０１５２】
組成物を種々の剤形に製剤化し、治療上有効量の有効成分を送達するいくつかの異なる手段によって投与することができる。このような組成物は、所望のように慣用的な非毒性の薬学的に許容される担体、補助剤および媒体を含む投与単位製剤で、経口的に、非経口的にまたは局所的に投与することができる。局所投与はまた、経皮パッチまたはイオン導入装置などの経皮投与の使用を含み得る。本明細書で使用される非経口という用語は、皮下、静脈内、筋肉内もしくは胸骨内注射、または注入技術を含む。薬物の製剤化は、例えば、Gennaro, A.R., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Eaton, Pa.(18th ed, 1995)およびLiberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. (1980) に論じられている。
【０１５３】
経口投与のための固形剤形には、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、散剤、ペレット剤および顆粒剤が含まれる。このような固形剤形では、有効成分を通常、その例が上に詳述される１種または複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせる。経口製剤はまた、水性懸濁剤、エリキシル剤またはシロップ剤としても投与され得る。これらのために、有効成分を種々の甘味または香味剤、着色剤および所望であれば、乳化剤および／または懸濁化剤、ならびに希釈剤（水、エタノール、グリセリンなど）ならびにこれらの組み合わせと組み合わせることができる。
【０１５４】
非経口投与（皮下、皮内、静脈内、筋肉内および腹腔内を含む）のために、製剤は水溶液であっても油性溶液であってもよい。水溶液は、滅菌希釈剤（水、生理食塩水溶液、薬学的に許容されるポリオール（グリセロール、プロピレングリコールなど）または他の合成溶媒など）；抗菌および／または抗真菌剤（ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサールなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）；ならびに／あるいは張性を調節するための剤（塩化ナトリウム、デキストロースまたはポリアルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）など）を含み得る。水溶液のｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調節され得る。油性溶液または懸濁液は、ゴマ油、落花生油、オリーブ油または鉱油をさらに含み得る。
【０１５５】
局所（例えば、経皮または経粘膜）投与のために、透過するバリアに適した浸透剤を製剤に含めるのが一般的である。経粘膜投与は鼻腔スプレー、エアゾールスプレー、錠剤または坐剤の使用を通して達成することができ、経皮投与は当技術分野で一般的に知られる軟膏、油薬、ゲル、パッチまたはクリームを介して可能である。
【０１５６】
一定の実施形態では、本発明の化合物を含む組成物を、適切な媒体にカプセル化して、化合物の標的細胞へのデリバリーを助ける、組成物の安定性を増加させる、または組成物の潜在的な毒性を最小化する。当業者によって認識されるように、種々の媒体が本発明の組成物を送達するのに適している。適切な、構造化された流体デリバリーシステムの非限定的な例としては、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、デンドリマーおよび他のリン脂質含有システムが挙げられ得る。組成物をデリバリー媒体に組み込む方法は当技術分野で公知である。
【０１５７】
１つの代替実施形態では、リポソームデリバリー媒体が利用され得る。リポソームは、実施形態に応じて、その構造および化学特性に照らして、本発明の化合物のデリバリーに適している。一般的に言って、リポソームはリン脂質二重膜を含む球状小胞である。リポソームの脂質二重層は、他の二重層（例えば、細胞膜）と融合するので、リポソームの内容物を細胞に送達することができる。このようにして、標的化細胞の膜と融合するリポソームにカプセル化することによって、本発明の化合物を細胞に選択的に送達することができる。
【０１５８】
リポソームは、変化する炭化水素鎖長を有する種々の異なる種類のリン脂質で構成され得る。リン脂質は一般的に、グリセロールリン酸を通して、種々の極性基の１つに結合した２個の脂肪酸を含む。適切なリン脂質には、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が含まれる。リン脂質を含む脂肪酸鎖は、約６〜約２６炭素原子長に及び得、脂質鎖は飽和であっても不飽和であってもよい。適切な脂肪酸鎖には、（一般名は括弧内に提示される）ｎ−ドデカノエート（ラウレート）、ｎ−テトラデカノエート（ｔｒｅｔｒａｄｅｃａｎｏａｔｅ）（ミリステート）、ｎ−ヘキサデカノエート（パルミテート）、ｎ−オクタデカノエート（ステアレート）、ｎ−エイコサノエート（アラキデート）、ｎ−ドコサノエート（ベヘネート）、ｎ−テトラコサノエート（リグノセレート）、ｃｉｓ−９−ヘキサデセノエート（パルミトレエート）、ｃｉｓ−９−オクタデカノエート（オレエート）、ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２−オクタデカンジエノエート（リノレエート）、全ｃｉｓ−９，１２，１５−オクタデカトリエノエート（リノレネート）および全ｃｉｓ−５，８，１１，１４−エイコサテトラエノエート（アラキドネート）が含まれる。リン脂質の２個の脂肪酸鎖は同一であっても異なっていてもよい。許容されるリン脂質には、ジオレオイルＰＳ、ジオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＳ、ジステアロイルＰＣ、ジミリストイルＰＳ、ジミリストイルＰＣ、ジパルミトイルＰＧ、ステアロイル、オレオイルＰＳ、パルミトイル、リノレニルＰＳなどが含まれる。
【０１５９】
リン脂質は任意の天然供給源からのものであり得、よって、リン脂質の混合物を含み得る。例えば、卵黄はＰＣ、ＰＧおよびＰＥに富み、ダイズはＰＣ、ＰＥ、ＰＩおよびＰＡを含み、動物の脳および脊髄はＰＳに富む。リン脂質は合成供給源からのものでもあり得る。様々な比の個々のリン脂質を有するリン脂質の混合物が使用され得る。異なるリン脂質の混合物は、有利な活性または活性特性の安定性を有するリポソーム組成物をもたらし得る。上述のリン脂質を、カチオン性脂質、例えばＮ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ（ｄｉｏｌｅｏｌｙｏｘｙ））プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニパークロアレート（ｐｅｒｃｈｌｏａｒａｔｅ）、３，３’−デヘプチルオキサカルボシアニンヨージド、１，１’−デドデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロアレート、１，１’−ジオレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンメタンスルホネート、Ｎ−４−（デリノレイルアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージドまたは１，１−ジリノレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロアレートと最適な比で混合することができる。
【０１６０】
リポソームは、スフィンゴシンがグリセロールおよびホスホグリセリドの脂肪酸の１つの構造的対応物であるスフィンゴ脂質、またはコレステロール、動物細胞膜の主成分を含んでもよい。リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリマーに共有結合した脂質であるペグ化脂質を含んでもよい。ＰＥＧはサイズが約５００〜約１０，０００ダルトンに及び得る。
【０１６１】
リポソームは適切な溶媒をさらに含み得る。溶媒は有機溶媒であっても無機溶媒であってもよい。適切な溶媒には、それだけに限らないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル（ａｃｅｔｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランまたはこれらの組み合わせが含まれる。
【０１６２】
本発明の化合物を有する（すなわち、少なくとも１種のメチオニン化合物を有する）リポソームは、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，２４１，０４６号明細書、同第４，３９４，４４８号明細書、同第４，５２９，５６１号明細書、同第４，７５５，３８８号明細書、同第４，８２８，８３７号明細書、同第４，９２５，６６１号明細書、同第４，９５４，３４５号明細書、同第４，９５７，７３５号明細書、同第５，０４３，１６４号明細書、同第５，０６４，６５５号明細書、同第５，０７７，２１１号明細書および同第５，２６４，６１８号明細書に詳述されるような薬物デリバリーのためのリポソームを調製する公知の任意の方法によって調製され得る。例えば、リポソームは、水溶液中での脂質の超音波処理、溶媒噴射、脂質水和、逆蒸発または繰り返しの凍結および解凍による凍結乾燥によって調製され得る。好ましい実施形態では、リポソームが超音波処理によって形成される。リポソームは、タマネギのように多くの層を有するマルチラメラであっても、ユニラメラであってもよい。リポソームは大きくても小さくてもよい。連続高せん断超音波処理は、より小さいユニラメラリポソームを形成する傾向がある。
【０１６３】
当業者に明らかであるように、リポソーム形成を支配するパラメータの全ては変化し得る。これらのパラメータには、それだけに限らないが、温度、ｐＨ、メチオニン化合物の濃度、脂質の濃度および組成、多価カチオンの濃度、混合速度、溶媒の存在および濃度が含まれる。
【０１６４】
別の実施形態では、本発明の組成物をマイクロエマルジョンとして細胞に送達することができる。マイクロエマルジョンは、一般的に、水溶液、界面活性剤および「油」を含む透明な、熱力学的に安定な溶液である。この場合の「油」は超臨界流体相である。界面活性剤は、油−水界面にとどまる。本明細書に記載されるまたは当技術分野で公知のものを含む種々の界面活性剤のいずれもマイクロエマルジョン製剤に使用するのに適している。本発明に使用するのに適した水性微小ドメインは、一般的に、約５ｎｍ〜約１００ｎｍの特徴的な構造寸法を有する。このサイズの凝集体は、可視光の乏しい散乱体であるので、これらの溶液は光学的に透明である。当業者によって認識されるように、マイクロエマルジョンは、球、ロッドまたはディスク形状の凝集体を含む多数の異なる微細構造を有することができ、有するだろう。一実施形態では、構造が、一般的に球状または円筒状物体である最も単純なマイクロエマルジョン構造であるミセルであり得る。ミセルは水中油型の液滴のようであり、逆ミセルは油中水型の液滴のようである。代替実施形態では、マイクロエマルジョン構造がラメラである。これは、界面活性剤の層によって分離された水と油の連続層を含む。マイクロエマルジョンの「油」は、最適にはリン脂質を含む。リポソームについて上に詳述されるリン脂質のいずれも、マイクロエマルジョンに関する実施形態に適している。本発明の組成物を、当技術分野で一般的に公知の任意の方法によってマイクロエマルジョンにカプセル化することができる。
【０１６５】
さらに別の実施形態では、本発明の組成物を樹状高分子またはデンドリマーで送達することができる。一般的に言えば、デンドリマーは、各枝が、一定の長さの後に２つの新たな枝（分子）に分かれる分子の連結鎖である分枝樹木様分子である。この分枝は、林冠が球を形成するほど枝（分子）が密に詰められるまで続く。一般的に、デンドリマーの特性はその表面の官能基によって決定される。例えば、カルボキシル基などの親水性末端基は、典型的に水溶性デンドリマーを作り出すだろう。あるいは、リン脂質をデンドリマーの表面に組み込んで、皮膚を横切る吸収を促進することができる。リポソーム実施形態における使用について詳述されるリン脂質のいずれもデンドリマー実施形態における使用に適している。当技術分野で一般的に公知の方法を利用して、デンドリマーを作成し、本発明の組成物をその中にカプセル化することができる。例えば、デンドリマーは、各追加の反復が高次のデンドリマーをもたらす反応工程の反復配列によって製造することができる。結果として、これらは、ほぼ均一なサイズおよび形状を有する規則的な高度分枝３Ｄ構造を有する。さらに、デンドリマーの最終的なサイズは、典型的には、合成中に使用される反復工程の数によって制御される。種々のデンドリマーサイズが本発明における使用に適している。一般的に、デンドリマーのサイズは約１ｎｍ〜約１００ｎｍに及び得る。
【０１６６】
ＩＩ．方法
一態様では、本発明は、サイトカインを標的細胞に送達する方法を包含する。本方法は、標的細胞をリガンドに結合したサイトカインを含む組成物に接触させることを含み、リガンドが標的細胞上の受容体に特異的に結合する。さらに、本方法は、標的細胞を第Ｉ節に記載されるキメラペプチドを含む組成物と接触させることを含む。標的細胞は、リガンドが特異的に結合する標的受容体を含む任意の細胞であり得る。リガンドおよび特異的結合は第Ｉ節に記載される。一定の実施形態では、標的細胞が免疫細胞であり得る。免疫細胞の非限定的な例としては、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好中球が挙げられる。一定の実施形態では、免疫細胞が、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球および好中球からなる群から選択される。具体的な実施形態では、標的細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。他の実施形態では、標的細胞がＮＫＧ２Ｄ発現細胞である。ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の非限定的な例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（αβとγδの両方）が挙げられる。さらに他の実施形態では、標的細胞がＰＤ１発現細胞である。ＰＤ１発現細胞の非限定的な例としては、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および骨髄系細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、療法が、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを含む。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの実施形態では、本方法が、本明細書で提供される併用療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一実施形態では、サイトカインを標的細胞に送達する方法であって、本明細書で提供される組成物の投与を含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、サイトカインを標的細胞に送達する方法であって、本明細書で提供される併用療法の投与を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質���、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの実施形態では、標的細胞が対象の標的細胞である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の成績をもたらすのに十分な本明細書で提供される医薬組成物の量を指す。具体的な実施形態では、対象がヒトである。一定の実施形態では、対象ががんまたは腫瘍を有する対象である。具体的な実施形態では、がんまたは腫瘍が肺がんまたは腫瘍である。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、免疫細胞を活性化する方法を包含する。本方法は、免疫細胞をリガンドに結合したサイトカインを含む組成物と接触させることを含み、リガンドが免疫細胞上の受容体に特異的に結合し、それによって細胞を活性化する。さらに、いくつかの実施形態では、本方法が、免疫細胞を第Ｉ節に記載されるキメラペプチドを含む組成物と接触させることを含む。免疫細胞の非限定的な例としては、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好中球が挙げられる。一定の実施形態では、免疫細胞が、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球および好中球からなる群から選択される。具体的な実施形態では、免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。さらに他の実施形態では、標的細胞がＰＤ１発現細胞である。ＰＤ１発現細胞の非限定的な例としては、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および骨髄系細胞が挙げられる。免疫細胞の活性化を促進するために、サイトカインは炎症性サイトカインであり得る。「炎症性サイトカイン」という用語は、全身性炎症を促進するサイトカインである。当業者であれば、炎症性であるサイトカインを決定することができるだろう。一定の実施形態では、炎症性サイトカインがＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＭＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬまたはこれらの突然変異型である。一実施形態では、炎症性サイトカインがＩＬ１ファミリーサイトカインである。一定の実施形態では、ＩＬ１ファミリーサイトカインが、ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ１８、ＩＬ３６Ｒａ、ＩＬ３６α、ＩＬ３７、ＩＬ３６β、ＩＬ３６γ、ＩＬ３８、ＩＬ３３およびこれらの突然変異型からなる群から選択される。具体的な実施形態では、炎症性サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２１およびこれらの突然変異型からなる群から選択される。別の具体的な実施形態では、炎症性サイトカインが、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１８およびこれらの突然変異型からなる群から選択される。代表的な実施形態では、炎症性サイトカインがＩＬ２またはその突然変異型である。他の一定の実施形態では、炎症性サイトカインがＴＮＦＳＦファミリーサイトカインである。一定の実施形態では、ＴＮＦＳＦファミリーサイトカインがＴＮＦα、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬまたはＲＡＮＫＬを含む群から選択される。別の具体的な実施形態では、炎症性サイトカインがＯＸ４０Ｌまたは４−１ＢＢＬから選択される。代表的な実施形態では、炎症性サイトカインがＯＸ４０Ｌまたはその突然変異型である。別の代表的な実施形態では、炎症性サイトカインが４−１ＢＢＬまたはその突然変異型である。免疫細胞の活性化は腫瘍細胞の溶解をもたらし得る。したがって、免疫細胞の活性化は、腫瘍細胞溶解の量を決定することによって測定され得る。一実施形態では、免疫細胞の活性化が、腫瘍細胞の約１０％〜約１００％の溶解をもたらし得る。別の実施形態では、免疫細胞の活性化が、腫瘍細胞の約２０％〜約８０％の溶解をもたらし得る。さらに別の実施形態では、免疫細胞の活性化が腫瘍細胞の４０％超の溶解をもたらし得る。例えば、免疫細胞の活性化は、腫瘍細胞の４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超または９９％超の溶解をもたらし得る。腫瘍細胞の溶解は、任意の標準的なアッセイ（例えば、カスパーゼアッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイ、細胞透過性アッセイおよびアネキシンＶアッセイ）を用いて測定され得る。いくつかの実施形態では、療法が、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを含む。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの実施形態では、本方法が、本明細書で提供される併用療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一実施形態では、免疫細胞を活性化する方法であって、本明細書で提供される組成物の投与を含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、免疫細胞を活性化する方法であって、本明細書で提供される併用療法の投与を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの実施形態では、免疫細胞が対象の免疫細胞である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。一定の実施形態では、対象ががんまたは腫瘍を有する対象である。具体的な実施形態では、がんまたは腫瘍が肺がんまたは腫瘍である。
【０１６８】
さらに別の態様では、本発明は、腫瘍を治療する方法を包含する。本方法は、腫瘍を有する対象を同定することと、リガンドに結合したサイトカインを含む組成物を対象に投与することとを含み、リガンドが標的細胞上の受容体に特異的に結合する。さらに、本方法は、第Ｉ節に記載されるキメラペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。具体的には、本発明者らは、サイトカインを標的細胞に送達することによって、組成物が結合している細胞が活性化され、活性化細胞が腫瘍細胞を特異的に溶解し、それによってがん細胞の量が減少することを示した。具体的な実施形態では、サイトカインが、前記段落に記載される炎症性サイトカインである。したがって、本発明の組成物は、対象のがんおよび関連疾患の治療、安定化および予防に使用することができる。「がんの治療、安定化または予防」によって、腫瘍のサイズもしくはがん細胞の数の減少を引き起こすこと、腫瘍のサイズの増加もしくはがん細胞増殖を遅延もしくは予防すること、腫瘍もしくは他のがんの消失とその再出現との間の無病生存期間を増加させること、腫瘍もしくは他のがんの初期もしくはその後の出現を予防すること、または腫瘍もしくは他のがんに関連する有害症状を減少させることが意味される。本発明者らは、本発明の組成物が、組成物が結合しているナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を活性化し、活性化ＮＫ細胞が腫瘍細胞を特異的に溶解し、それによって腫瘍細胞の量が減少することを示した。例えば、がん性細胞が「ストレスを受ける」と、ＮＫＧ２Ｄリガンドが上方制御され、細胞をＮＫ細胞媒介溶解に感受性にする。望ましい実施形態では、治療を生き残る腫瘍またはがん性細胞のパーセントは、任意の標準的なアッセイ（例えば、カスパーゼアッセイ、ＴＵＮＥＬおよびＤＮＡ断片化アッセイ、細胞透過性アッセイおよびアネキシンＶアッセイ）を用いて測定されるように、腫瘍またはがん性細胞の初期数よりも少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％低い。望ましくは、本発明の組成物の投与によって誘導される腫瘍またはがん性細胞の数の減少は、非腫瘍または非がん性細胞の数の減少よりも少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０倍大きい。望ましくは、本発明の方法は、標準的な方法を用いて決定されるように、腫瘍のサイズまたはがん性細胞の数の２０、３０、４０、５０、６０、５０、８０、９０または１００％の減少をもたらす。望ましくは、治療された対象の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５％が、腫瘍またはがんの全ての証拠が消失する完全寛解を有する。望ましくは、腫瘍またはがんが再出現しない、または少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５もしくは２０年後に再出現する。いくつかの実施形態では、本方法が、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを投与することをさらに含む。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの実施形態では、本方法が、本明細書で提供される併用療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一実施形態では、対象の腫瘍を治療する方法であって、本明細書で提供される組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、対象の腫瘍を治療する方法であって、本明細書で提供される併用療法を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では���抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。具体的な実施形態では、腫瘍が肺腫瘍である。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、免疫細胞を抑制する方法を包含する。本方法は、免疫細胞をリガンドに結合したサイトカインを含む組成物と接触させることを含み、リガンドが免疫細胞上の受容体に特異的に結合し、それによって細胞を抑制する。さらに、本方法は、免疫細胞を、第Ｉ節に記載されるキメラペプチドを含む組成物と接触させることを含む。免疫細胞の非限定的な例としては、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球、好中球が挙げられる。一定の実施形態では、免疫細胞が、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、肥満細胞、単球、樹状細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好塩基球および好中球からなる群から選択される。具体的な実施形態では、免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。具体的な実施形態では、免疫細胞がＮＫＧ２Ｄを発現している。代替の具体的な実施形態では、免疫細胞がＰＤ１を発現している。免疫細胞の抑制を促進するために、サイトカインは抗炎症性サイトカインであり得る。「抗炎症性サイトカイン」という用語は、炎症の種々の態様、例えば細胞活性化または炎症性サイトカインの産生を中和し、よって、炎症反応の大きさの制御に寄与するサイトカインである。当業者であれば、抗炎症性であるサイトカインを決定することができるだろう。一定の実施形態では、抗炎症性サイトカインがＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１６、ＩＬ３５、ＩＦＮα、ＴＧＦβ、Ｇ−ＣＳＦまたはこれらの突然変異型である。具体的な実施形態では、抗炎症性サイトカインがＩＬ１０またはその突然変異型である。別の実施形態では、本発明は免疫細胞を死滅させる方法を包含する。本方法は、免疫細胞をリガンドに結合した毒素を含む組成物と接触させることを含み、リガンドが免疫細胞上の受容体に特異的に結合し、それによって細胞を死滅させる。免疫細胞の抑制または死滅は、過活動免疫細胞によって引き起こされる自己免疫疾患の治療、安定化および予防をもたらし得る。ＮＫＧ２Ｄ発現細胞および／または宿主ＮＫＧ２ＤＬの異常発現は、糖尿病、セリアック病および関節リウマチに関係している。例えば、ＮＫ細胞は膵β細胞を認識し、これらを破壊し得る。膵β細胞の破壊は１型糖尿病をもたらし得る。別の例として、過活動免疫細胞が移植／移植片拒絶に関与する。したがって、本発明の組成物を対象の自己免疫疾患の治療、安定化および予防に使用することができる。具体的な実施形態では、自己免疫疾患が１型糖尿病である。別の具体的な実施形態では、自己免疫疾患が移植または移植片拒絶である。さらに別の具体的な実施形態では、自己免疫疾患が関節リウマチである。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書で提供される併用療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一実施形態では、対象の免疫細胞を抑制する方法であって、本明細書で提供���れる組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、対象の免疫細胞を抑制する方法であって、本明細書で提供される併用療法を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。一定の実施形態では、対象ががんまたは腫瘍を有する対象である。具体的な実施形態では、がんまたは腫瘍が肺がんまたは腫瘍である。
【０１７０】
なおさらに別の態様では、本発明は、感染症を治療する方法であって、リガンドに結合したサイトカインを含む組成物を投与することを含む方法を包含する。例えば、リガンドに結合したサイトカインを含む組成物が免疫細胞に特異的に結合し、次いで、これが感染宿主細胞を標的化および溶解するよう活性化される。さらに、本方法は、第Ｉ節に記載されるキメラペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。本明細書で使用される「感染症」という用語は、その増殖が阻害されると、対象に利益をもたらす、対象中または上の病原体の存在を含む。よって、「感染症」という用語は、病原体の存在を指すことに加えて、望ましくない常在菌叢も指す。本明細書で使用される「病原体」という用語は、疾患をもたらし得る感染因子を指す。感染因子の非限定的な例としては、対象において疾患を引き起こすウイルス、細菌、プリオン、真菌、ウイロイドまたは寄生生物が挙げられる。具体的な実施形態では、感染症が細菌またはウイルスなどの病原体によって引き起こされる。一定の実施形態では、感染症が細胞内感染症である。一実施形態では、感染症がウイルス感染症である。別の実施形態では、ウイルス感染症がフラビウイルスによって引き起こされる。フラビウイルスはフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの属である。フラビウイルスの非限定的な例としては、ガジェッツガリー（Ｇａｄｇｅｔ’ｓ  Ｇｕｌｌｙ）ウイルス、カダム（Ｋａｄａｍ）ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ランガト（Ｌａｎｇａｔ）ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、跳躍病ウイルス、アロア（Ａｒｏａ）ウイルス、デングウイルス１〜４、ケドウゴウ（Ｋｅｄｏｕｇｏｕ）ウイルス、カシパコア（Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ）ウイルス、コウタンゴ（Ｋｏｕｔａｎｇｏ）ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウスツ（Ｕｓｕｔｕ）ウイルス、西ナイルウイルス、ヤオンデ（Ｙａｏｕｎｄｅ）ウイルス、ココベラ（Ｋｏｋｏｂｅｒａ）ウイルス群、ココベラウイルス、バガザ（Ｂａｇａｚａ）ウイルス、イレウスウイルス、イスラエル七面鳥髄膜脳脊髄炎ウイルス、タヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス、テンブス（Ｔｅｍｂｕｓｕ）ウイルス、ジカウイルス、バンジウイルス、バーボン（Ｂｏｕｂｏｕｉ）ウイルス、エッジヒルウイルス、ジュグラ（Ｊｕｇｒａ）ウイルス、サボヤ（Ｓａｂｏｙａ）ウイルス、セピク（Ｓｅｐｉｋ）ウイルス、ウガンダＳウイルス、ヴェッセルスブロン（Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ）ウイルス、黄熱病ウイルス、エンテベコウモリウイルス、ヨコセウイルス、アポイウイルス、カウボーンリッジウイルス、ジュチアパ（Ｊｕｔｉａｐａ）ウイルス、モドック（Ｍｏｄｏｃ）ウイルス、サルビエハ（Ｓａｌ  Ｖｉｅｊａ）ウイルス、サンペリータ（Ｓａｎ  Ｐｅｒｌｉｔａ）ウイルス、ブカラサコウモリウイルス、カーレー島ウイルス、ダカーコウモリウイルス、モンタナミオチス白質脳炎ウイルス、プノンペンコウモリウイルス、リオブラボーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス遺伝子型１〜６ならびにＧＢウイルスＡおよびＢが挙げられる。一定の実施形態では、フラビウイルスが、西ナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルスおよび黄熱病ウイルスからなる群から選択され得る。具体的な実施形態では、ウイルス感染症が西ナイルウイルスによって引き起こされる。一定の実施形態では、病原体、より具体的にはウイルスが、ＮＫＧ２Ｄが結合するタンパク質の発現を誘導することができる。したがって、リガンドに結合したサイトカインを含む組成物がＮＫ細胞に特異的に結合し、次いで、これがＮＫＧ２Ｄを発現する感染宿主細胞を標的化および溶解するよう活性化される。別の実施形態では、リガンドに結合したサイトカインを含む組成物が、標的化死滅のための他の機構を介して感染細胞を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを投与することをさらに含む。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの他の実施形態では、本方法が本明細書で提供される併用療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一実施形態では、対象の感染症を治療する方法であって、本明細書で提供される組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、対象の感染症を治療する方法であって、本明細書で提供される併用療法を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。
【０１７１】
異なる態様では、本発明は、放射線曝露またはリンパ球毒性（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｃ）物質に関連する免疫抑制を緩和する方法であって、リガンドに結合したサイトカインを含む組成物を投与することを含む方法を包含する。さらに、本方法は、第Ｉ節に記載されるキメラペプチドを含む組成物を投与することを含む。さらに、本発明の組成物を使用して、ＨＩＶ陽性対象のＣＤ４数を上昇させることができる。例えば、本発明の組成物を使用して、免疫細胞を活性化して、対象の免疫系を回復させるのを助けることができる。いくつかの実施形態では、本方法が、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを投与することをさらに含む。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。いくつかの実施形態では、本方法が本明細書で提供される併用療法を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一実施形態では、対象の放射線曝露またはリンパ球毒性物質に関連する免疫抑制を緩和する方法であって、本明細書で提供される組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、対象の放射線曝露またはリンパ球毒性物質に関連する免疫抑制を緩和する方法であって、本明細書で提供される併用療法を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、免疫抑制が放射線曝露に関連する。別の実施形態では、免疫抑制がリンパ球毒性物質に関連する。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。一定の実施形態では、対象ががんまたは腫瘍を有する対象である。具体的な実施形態では、がんまたは腫瘍が肺がんまたは腫瘍である。
【０１７２】
代替態様では、本発明は、ワクチン組成物中の補助剤として使用する方法を包含する。一実施形態では、対象におけるワクチン接種の方法であって、本明細書で提供される組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、対象におけるワクチン接種の方法が、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを投与することを含む。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一実施形態では、対象におけるワクチン接種の方法であって、本明細書で提供される併用療法を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキ���ラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。
【０１７３】
他の態様では、ＣＤ８＋メモリー細胞拡大に使用するための本発明の組成物が本明細書で提供される。一実施形態では、対象のＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大する方法であって、本明細書で提供される組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。一実施形態では、対象のＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大する方法であって、ＰＤ１リガンドおよびサイトカインを含むキメラペプチドを投与することをさらに含む方法が本明細書で提供される。別の実施形態では、キメラペプチドがリンカーをさらに含む。一実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ１である。別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤＬ２である。さらに別の実施形態では、ＰＤ１リガンドがＰＤ１に特異的な抗体である。別の実施形態では、サイトカインがＩＬ２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一実施形態では、対象のＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大する方法であって、本明細書で提供される併用療法を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、併用療法が、本明細書で提供されるＰＤ−１インヒビターと、サイトカインペプチドおよび抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を含むキメラペプチドとを含む。一定の実施形態では、サイトカインペプチドが本明細書の上に記載されるサイトカインである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が本明細書の上に記載される通りである。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。一実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、ＰＤ−１インヒビターとを含む。別の実施形態では、併用療法がＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラタンパク質と、抗ＰＤ−１抗体とを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質がリンカーをさらに含む。他の実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−１である。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＫＹＫ−２である。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体およびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２およびＰＤ１インヒビターを含む。いくつかの実施形態では、併用療法が抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ、ＩＬ２および抗ＰＤ１抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体がアンタゴニスト抗体である。一定の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−１  ｓｃＦｖである。他の実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖがＫＹＫ−２  ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２がキメラポリペプチドとして提供される。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドがリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖおよびＩＬ２が融合タンパク質として提供される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質がリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態ではＩＬ２がＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ形態である。一定の実施形態では、対象がそれを必要としている。一定の実施形態では、対象が有効量の併用療法を投与される。具体的な実施形態では、対象がヒトである。一定の実施形態では、対象ががんまたは腫瘍を有する対象である。具体的な実施形態では、がんまたは腫瘍が肺がんまたは腫瘍である。
【０１７４】
他の態様では、本開示はエキソビボで細胞傷害性リンパ球を拡大する方法を提供する。本方法は、本明細書で提供される組成物の存在下でリンパ球を培養することを含む。リンパ球は公的に入手可能な細胞株、例えばＡＴＣＣ（商標）細胞株に由来し得る。あるいは、リンパ球は対象から単離され得る。リンパ球は単一対象から得ても、複数の対象から得てもよい。複数とは、少なくとも２人（例えば、２人以上）の対象を指す。得られたリンパ球が複数の対象からのものである場合、それらの関係は自家、同系、同種異系または異種であり得る。具体的には、リンパ球が第Ｉ節に記載されるキメラペプチドの存在下で培養され得る。一定の実施形態では、キメラペプチドが、ＩＬ２またはその突然変異型に結合したＯＭＣＰまたはその断片を含む。他の実施形態では、キメラペプチドが、突然変異型ＩＬ２に結合したＯＭＣＰを含む。別の態様では、本開示は、対象における養子細胞免疫療法を改善する方法を提供する。本方法は、本明細書で提供される組成物の存在下で培養された単離細胞傷害性リンパ球を含む治療用組成物を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「ＡＣＩ」とも呼ばれる「養子細胞免疫療法」は、リンパ球を対象から採取し、刺激および／または遺伝子操作するリンパ球に基づく免疫療法である。集団拡大後、リンパ球を移入により対象に戻す。したがって、本開示の方法を使用して、リンパ球の数を増加させることが望ましい疾患または障害を治療することができる。例えば、がんおよび慢性ウイルス感染症がある。ウイルス感染症に関しては、ウイルス特異的Ｔ細胞のＡＣＩにより、対象におけるウイルス特異的免疫を回復させて、ウイルス疾患を予防または治療することができる。したがって、ウイルス特異的Ｔ細胞を使用して移植後の抗ウイルス免疫を再構成および／または活性ウイルス感染症を治療することができる。一実施形態では、ウイルス感染症の治療または予防のためにＴ細胞を受ける対象が免疫不全であり得る。
【０１７５】
（ａ）投与
一定の態様では、薬学的有効量の本発明の組成物を対象に投与することができる。投与は、末梢的（すなわち、中枢神経系への投与によらずに）または中枢神経系に局所的を含む、標準的な有効な技術を用いて行われる。末梢投与には、それだけに限らないが、静脈内、腹腔内、皮下、肺、経皮、筋肉内、鼻腔内、頬側、舌下または坐剤投与が含まれる。中枢神経系（ＣＮＳ）への直接を含む局所投与には、それだけに限らないが、腰部、心室内もしくは実質内カテーテルを介する、または外科的に埋め込まれた制御放出製剤を用いることが含まれる。フェレーシスを使用して本発明の組成物を送達することができる。一定の実施形態では、本発明の組成物が注入（連続またはボーラス）を介して投与され得る。
【０１７６】
有効な投与のための医薬組成物は、選択された投与様式に適するよう慎重に設計され、薬学的に許容される賦形剤、例えば適合性分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが適宜使用される。全体が参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN:0-912734-04-3, latest editionは、実務家に一般的に公知の製剤化技術の概要を提供する。
【０１７７】
静脈内または腹腔内または皮下注射による有効な末梢全身デリバリーは、生きている患者への好ましい投与方法である。このような注射に適した媒体は直接的である。しかしながら、さらに、投与を鼻腔内エアゾールまたは坐剤によって粘膜を通して行うこともできる。このような投与様式に適した製剤は周知であり、典型的には、膜横断輸送を促進する界面活性剤を含む。このような界面活性剤は通常、ステロイドに由来する、またはカチオン性脂質、例えばＮ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）または種々の化合物、例えばコレステロールヘミスクシネート、ホスファチジルグリセロールなどである。
【０１７８】
治療用途のために、治療上有効量の本発明の組成物が対象に投与される。「治療上有効量」とは、測定可能な反応（例えば、免疫賦活性、抗血管新生反応、細胞傷害反応、腫瘍退縮、免疫阻害、免疫抑制、感染症減少）をもたらすのに十分な治療用組成物の量である。本発明の治療用組成物中の有効成分の実際の投与レベルを、特定の対象のための所望の治療反応を達成するのに有効な活性化合物（複数可）の量を投与するように変化させることができる。選択される投与レベルは、治療用組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、腫瘍サイズおよび寿命、自己免疫疾患、感染症、ならびに健康状態、ならびに治療している対象の以前の病歴を含む種々の因子に依存する。いくつかの実施形態では、最小用量を投与し、用量制限毒性の非存在下で用量を上昇させる。治療上有効用量の決定および調節、ならびにこのような調節をいつどのようにするかの評価は、医学の分野の当業者に公知である。一態様では、典型的な用量が、約１０ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇの本明細書に記載されるサイトカインを含む。一実施形態では、典型的な用量が約１０ＩＵ／ｋｇ〜約１００ＩＵ／ｋｇを含む。別の実施形態では、典型的な用量が約１００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／ｋｇを含む。さらに別の実施形態では、典型的な用量が約１，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。なおさらに別の実施形態では、典型的な用量が約１０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。異なる実施形態では、典型的な用量が約１００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。一定の実施形態では、典型的な用量が約５００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１，０００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。他の実施形態では、典型的な用量が約１００，０００ＩＵ／ｋｇ〜約５００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。あるいは、典型的な用量が約５０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。別の実施形態では、典型的な用量が約１０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約５０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。さらに別の実施形態では、典型的な用量が約５，０００ＩＵ／ｋｇ〜約１０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。具体的な実施形態では、典型的な用量が約５，０００ＩＵ／ｋｇ〜約２００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。別の具体的な実施形態では、典型的な用量が約５，０００ＩＵ／ｋｇ〜約５００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。さらに別の具体的な実施形態では、典型的な用量が約５０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約５００，０００ＩＵ／ｋｇを含む。なおさらに別の具体的な実施形態では、典型的な用量が約２５０，０００ＩＵ／ｋｇ〜約７５０，０００ＩＵ／ｋｇを含む。
【０１７９】
投与頻度は、症状または疾患を有効に治療するのに必要とされるように１日１回、２回、３回もしくはそれ以上、または１週間もしくは１か月当たり１回、２回、３回もしくはそれ以上であり得る。一定の実施形態では、投与頻度が１日１回、２回または３回であり得る。例えば、一用量を２４時間毎、１２時間毎または８時間毎に投与することができる。具体的な実施形態では、投与頻度が１日２回であり得る。
【０１８０】
治療期間は、１回ベースで投与される単一用量から一生涯にわたる治療的処置まで及び得る。治療期間は、治療される対象およびがんまたは自己免疫疾患または感染症に応じて変化することができ、変化するだろう。例えば、治療期間は１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日であり得る。または、治療期間は１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間であり得る。あるいは、治療期間は１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月または１２か月であり得る。さらに別の実施形態では、治療期間が１年、２年、３年、４年、５年または５年超であり得る。投与を一定期間頻繁にし、その後、投与を一定期間、間隔をあけることができることも熟慮される。例えば、治療期間を５日間とし、その後、治療なしを９日間、その後、治療を５日間とすることができる。
【０１８１】
疾患自体および治療期間に対する治療の投与のタイミングは、症例を取り巻く状況によって決定される。治療を、診断時など直ちに開始することができる、または治療を外科手術後に開始することができる。治療を病院もしくは診療所自体で、または退院後もしくは外来診療所で診た後の後で開始することができる。
【０１８２】
さらに、上記の組成物による治療を、本明細書に記載されるＰＤ−１インヒビターまたはＰＤ−Ｌ１インヒビターの投与と一緒に（例えば、順次または同時に）投与レジメンで開始することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、それを必要とする患者の体重に関する尺度としての量で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。
【０１８３】
さらに他の実施形態では、いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。ＰＤ−Ｌ１抗体は約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇの量で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇまたは約２００ｍｇの量で併用療法中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇまたは約２０００ｍｇの量で併用療法中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、約１０００ｍｇ〜約２０００ｍｇの量で併用療法中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約３０ｍｇ〜約６０ｍｇ、約４０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約７５ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約１５００ｍｇ、約１２００ｍｇ〜約１５００ｍｇまたは約１５００〜約２０００ｍｇの量で併用療法中に存在する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬまたは約５００ｍｇ／ｍＬの量で併用療法中に存在する。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ；約２０ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ；約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬまたは約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量で併用療法中に存在する。
【０１８６】
一定の例では、治療上有効量のＰＤ−Ｌ１インヒビターが、ＰＤ−Ｌ１インヒビターと共に提供される添付文書に提供される量として決定される。添付文書という用語は、ＦＤＡまたは米国以外の国の同様の規制当局によって承認される医薬品のコマーシャルパッケージに慣用的に含められる指示を指し、例えば、このような医薬品の使用に関する使用法、投与量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、それを必要とする患者の体重に関する尺度としての量で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇまたは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの量で存在する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇまたは約２０００ｍｇの量で併用療法中に存在する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約３０ｍｇ〜約６０ｍｇ、約４０ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約７５ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇ、約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ、約５００ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約１５００ｍｇ、約１２００ｍｇ〜約１５００ｍｇまたは約１５００ｍｇ〜約２０００ｍｇの量で併用療法中に存在する。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬまたは約５００ｍｇ／ｍＬの量で併用療法中に存在する。一実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬまたは約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの量で併用療法中に存在する。
【０１９１】
一定の例では、治療上有効量のＰＤ−１インヒビターが、ＰＤ−１インヒビターと共に提供される添付文書に提供される量として決定される。
【０１９２】
本明細書に記載される併用療法の相乗効果によって、組み合わせ（例えば、本明細書に記載される組成物とＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１インヒビター）の成分の１つまたは複数の少ない投与量の使用が可能になり得る。相乗効果は、本明細書に記載される疾患、障害または状態を有する対象への投与される療法（例えば、本明細書に記載される組成物とＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１インヒビター）の少なくとも１つの低頻度の投与を可能にし得る。このような少ない投与量および減少した投与頻度によって、治療の有効性を低下させることなく、対象への療法（例えば、本明細書に記載される組成物とＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１インヒビター）の少なくとも１つの投与に関連する毒性を減少させることができる。本明細書に記載される相乗効果によって、本明細書に記載される療法のいずれかの使用に関連する有害なまたは望ましくない副作用を回避するまたは減少させることができる。
【０１９３】
前記方法が、適切な適合により、本発明の組成物または併用療法の投与に最も簡便で、最も適切で有効であるように思われるが、本明細書においては適切な製剤化を利用する限り心室内投与、経皮投与および経口投与などの他の有効な投与技術を使用してもよい。
【０１９４】
さらに、生分解性フィルムおよびマトリックス、または浸透圧ミニポンプ、またはデキストランビーズ、アルギン酸塩もしくはコラーゲンに基づくデリバリーシステムを用いる制御放出製剤を使用することが望ましい場合もある。
【０１９５】
（ｂ）腫瘍
本発明の組成物を方法に使用して、新生物またはがんに由来する腫瘍を治療または認識することができる。新生物は悪性であっても良性であってもよく、がんは原発性であっても転移性であってもよく、新生物またはがんは早期であっても末期であってもよい。治療され得る新生物またはがんの非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫（小児小脳および大脳）、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳幹グリオーマ、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路および視床下部グリオーマ）、乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児、消化管）、未知の原発性癌、中枢神経系リンパ腫（原発性）、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、腫瘍のユーイングファミリーのユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍（小児）、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼のがん（眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、胚細胞腫瘍（小児頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、グリオーマ（成人、小児脳幹、小児大脳星状細胞腫、小児視経路および視床下部）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頚部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視経路グリオーマ（小児）、眼内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ性、慢性骨髄性、有毛細胞）、口唇および口腔がん、肝臓がん（原発性）、肺がん（非小細胞、小細胞）、リンパ腫（ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系）、マクログロブリン血症（ワルデンシュトレーム）、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫（小児）、黒色腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫（成人悪性、小児）、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多内分泌腺腫瘍症候群（小児）、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（慢性）、骨髄性白血病（成人急性、小児急性）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害（慢性）、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、膵臓がん（膵島細胞）、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉腫瘍（小児）、下垂体腺腫、形質細胞新生物、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞癌（腎臓がん）、腎盂および尿管移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（小児）、唾液腺がん、肉腫（腫瘍のユーイングファミリー、カポジ、軟部組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫、黒色腫）、皮膚癌（メルケル細胞）、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮頸部がん（転移性）、胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍（小児）、Ｔ細胞リンパ腫（皮膚）、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫（小児）、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、甲状腺がん（小児）、腎盂および尿管の移行上皮がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明部位（成人、小児）、尿管および腎盂移行上皮がん、尿道がん、子宮がん（子宮内膜）、子宮肉腫、膣がん、視経路および視床下部グリオーマ（小児）、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症およびウィルムス腫瘍（小児）が挙げられる。一定の実施形態では、新生物またはがんが、黒色腫、腎細胞癌、肺がんおよび血液がんからなる群から選択され得る。一実施形態では、腫瘍が黒色腫である。別の実施形態では、腫瘍が腎細胞癌である。一実施形態では、腫瘍が肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、腫瘍が本明細書に記載される血液がんである。本明細書で使用される場合、「血液がん」は、血液、骨髄およびリンパ系を冒すがんである。血液がんの３つの主なグループが存在する：白血病、リンパ腫および骨髄腫。白血病の４つの広範な分類は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。リンパ腫は２つのカテゴリーに分けられる：ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫。ほとんどの非ホジキンリンパ腫はＢ細胞リンパ腫であり、急速に（高悪性度）またはゆっくり（低悪性度）成長する。１４種類のＢ細胞非ホジキンリンパ腫が存在する。残りはＴ細胞リンパ腫であり、以後、異なるがん性白血球またはリンパ球と呼ばれる。骨髄腫はしばしば骨髄の多くの部位で生じるので、通常、多発性骨髄腫と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本方法が、本明細書で提供される併用療法の投与を含む。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−１インヒビターが抗ＰＤ−１抗体である。いくつかの実施形態では、併用療法がＰＤ−Ｌ１インヒビターを含む。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１インヒビターが抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【０１９６】
（ｃ）対象
適切な対象にはヒト、家畜動物、コンパニオンアニマル、実験動物または動物学的動物が含まれる。一実施形態では、対象が齧歯動物、例えばマウス、ラット、モルモット等であり得る。別の実施形態では、対象が家畜動物であり得る。適切な家畜動物の非限定的な例としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカが挙げられ得る。さらに別の実施形態では、対象がコンパニオンアニマルであり得る。コンパニオンアニマルの非限定的な例としては、イヌ、ネコ、ウサギおよび鳥などのペットが挙げられ得る。さらに別の実施形態では、対象が動物学的動物であり得る。本明細書で使用される場合、「動物学的動物」とは、動物園で見ることができる動物を指す。このような動物には、ヒト以外の霊長類、大型ネコ科動物、オオカミおよびクマが含まれ得る。具体的な実施形態では、動物が実験動物である。実験動物の非限定的な例としては、齧歯動物、イヌ、ネコおよびヒト以外の霊長類が挙げられ得る。一定の実施形態では、動物が齧歯動物である。齧歯動物の非限定的な例としては、マウス、ラット、モルモット等が挙げられ得る。好ましい実施形態では、対象がヒトである。
【０１９７】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【実施例】
【０１９８】
以下の実施例を、本発明の好ましい実施形態を実証するために含める。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、よって、その実施のための好ましい様式を構成するとみなすことができることが当業者によって認識されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができることを認識し、さらに類似または同様の結果を得るはずである。
【０１９９】
実施例１〜６の導入
ＩＬ２Ｒα鎖は細胞表面でＩＬ２を捕捉して、受容体、すなわちＩＬ２Ｒβγ鎖のシグナル伝達部分との後の結合を促進する。静止細胞傷害性リンパ球、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面で認識できるＩＬ２Ｒαを発現しないので、低レベルのＩＬ２によって活性化されない１。しかしながら、ＩＬ２Ｒαは最初の活性化後にこの集団で発現され、最大の細胞傷害性リンパ球拡大に要求される２。高用量ＩＬ２は全ての細胞傷害性Ｉ  ｓｒ、ｌｏｆＱＷ２／ＧＶ  Ａリンパ球（Ａ／ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の活性化を誘導することができ、約１５％の部分または完全腫瘍反応を有し、いくつかの悪性腫瘍の治療に承認されている３〜５。ほとんどの患者は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の活性化、ならびに血管内皮の活性化による重度の血圧変化、全身毛細血管漏出および終末臓器不全などの合併症のためにこのような療法から利益を得ない６、３、７。血管内皮とＴｒｅｇｓの両方がＩＬ２Ｒαを発現するので、ＩＬ２によって細胞傷害性リンパ球よりも優先的に活性化される８。ＩＬ２用量を低下させることによって、副作用を改善することができるが、有効性も減少させ得る。ＩＬ２の突然変異形態、例えば３８位におけるアラニンのアルギニンによる置換（Ｒ３８Ａ）および／または４２位におけるリジンのフェニルアラニンによる置換（Ｆ４２Ｋ）を有するものは、ＩＬ２Ｒαに対するＩＬ２の親和性を低下させるので、多くの副作用を排除する９。このようなＩＬ２α突然変異型は免疫療法の有効性も低下させ得る２。ＩＬ２Ｒα反応性の非存在下で細胞傷害性リンパ球を優先的に活性化し得るＩＬ２の形態は、臨床用途に極めて有利となるだろう。
【０２００】
ＮＫＧ２Ｄは、悪性またはウイルス形質転換細胞によって発現されるＭＨＣクラスＩ関連ストレスリガンドを認識する１０。全ての活性化免疫受容体の中で、ＮＫＧ２Ｄは、マウスとヒトの両方のＮＫ細胞ならびに活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞上で構成的に発現されるので、細胞傷害性リンパ球に対する最も高い特異性を有する１１。結果的に、腫瘍およびウイルス感染細胞が、免疫回避の機構として流出ＮＫＧ２Ｄリガンドを利用することが議論されている１２、１３。オルソポックス主要組織適合複合体クラスＩ様タンパク質またはＯＭＣＰは、サル痘および牛痘ウイルス感染細胞によって流出されるＮＫＧ２Ｄリガンドデコイである。これは、天然痘ウイルスによってもワクシニアウイルスによっても発現されないので、天然痘ワクチンで免疫されたものによって認識されない。ＯＭＣＰは公知のリガンドの最高の親和性でヒトとマウス両方のＮＫＧ２Ｄに結合するので、本発明者らは、これがＩＬ２を細胞傷害性リンパ球に最適に送達するための理想的な標的化ベクターとして機能し得ると考えた１４、１５。ここで、本発明者らは、ＩＬ２Ｒα突然変異型をＮＫＧ２Ｄ発現リンパ球に送達するよう設計された融合タンパク質の構成および機能を説明する１５。本発明者らは、このコンストラクトが、好ましい安全性プロファイルを保持しながら、ＩＬ２Ｒα結合領域中の突然変異に関連する有効性低下を克服することを実証する。この融合タンパク質の全身投与により、固形腫瘍と液体腫瘍の両方に対する免疫療法が改善される。よって、ＩＬ２の標的化デリバリーを安全に使用して、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄ発現リンパ球を最大限活性化し、全身副作用なしに免疫療法を最適化することができる。
【実施例１】
【０２０１】
ＩＬ２突然変異型のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーは、インビトロで細胞傷害性リンパ球を優先的に活性化する。
ＩＬ２Ｒα発現細胞の優先的活性化を克服するために、本発明者らは、直接ＮＫＧ２Ｄ受容体を介して細胞傷害性リンパ球を標的化するＩＬ２融合タンパク質を設計した。この融合タンパク質は、高親和性ＮＫＧ２ＤリガンドＯＭＣＰを、ＩＬ２Ｒα反応性を低下させるよう突然変異されたＩＬ２と組み合わせている。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２と呼ばれる本発明者らのコンストラクトは、可撓性３０残基リンカーを介して、ヒトＩＬ２の１３３アミノ酸Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ突然変異形態（ｍｕｔＩＬ２）のＮ末端に融合した１５２残基ＯＭＣＰタンパク質からなる（図１Ａ〜図１Ｂ）。コンストラクトを最初にそのインビトロ結合親和性について評価した。蛍光標識コンストラクトの結合をバルク脾細胞において３７℃で、インビトロで試験した。図１７は、コンストラクトがＮＫＧ２Ｄを発現しているＮＫ細胞にのみ結合するように見えることを示している。コンストラクトは、ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ１１Ｃ＋ＣＤ１１ｂ−ＤＣ、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１１ｂ＋ＭａｃまたはＣＤ１９＋ＣＤ３−Ｂ細胞との結合を示さない。
【０２０２】
本発明者らは、マウスＮＫ細胞の細胞傷害性および肺がんの免疫監視における系統特異的差異を以前実証した１６（および実施例７）。そのため、本発明者らは、マウスの２つの異なる系統、すなわち乏しいＮＫ機能を有するＡ／Ｊと堅牢なＮＫ機能を有するＢ６のＮＫ細胞の活性化におけるＯＭＣＰ−ｍｕｔ−ＩＬ２の有効性を調べることに着手した。野生型ＩＬ２（ｗｔＩＬ２）またはｍｕｔＩＬ２と比較して、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、１００ＩＵｅ／ｍｌのサイトカインとの３６時間の共培養後に、両系統のＮＫ細胞上でＣＤ６９を強く上方制御した（図１Ｃ、左；図６、左の２つのグラフ）１６、１７。高濃度において、ＯＭＣＰ−ｍｕｔ−ＩＬ２、ｗｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２で、ＣＤ６９発現の同様の増加が観察された（図６）。ＩＣＯＳの上方制御によって測定されるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの活性化は、ｗｔＩＬ２でのみ明らかであり、ｍｕｔＩＬ２でもＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２でも明らかでなかった（図１Ｃ〜図１Ｄ）。他方、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−エフェクターＴ細胞は、最高用量のサイトカインでさえも、３６時間後にＣＤ６９の上方制御を実証しなかった（図１Ｃ〜図１Ｄ、データは示さず）。５日間の期間にわたる長期の曝露は、ｗｔＩＬ２とＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２に曝露したＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖をもたらした（図１Ｅ〜図１Ｆ）。重要なことに、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、ＮＫＧ２Ｄ−／−脾細胞においてｍｕｔＩＬ２と同等にＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化し、活性化増加がＮＫＧ２Ｄ保有細胞に対するＯＭＣＰ標的化の効果によるものであったことを示唆している（図１Ｆ；図６、右の２つのグラフ）。ｗｔＩＬ２とのインキュベーションのみが、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇｓおよびＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−エフェクター細胞増殖をもたらした（図１Ｅ〜図１Ｆ）。よって、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２への曝露は、用量依存的様式で、ｗｔＩＬ２より優れたまたはこれと同等の優先的ＮＫ活性化をもたらす。ＣＤ８＋Ｔ細胞も活性化され得るが、高用量のＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２への長期の曝露を要する。
【実施例２】
【０２０３】
低用量サイトカイン療法は好ましい安全性プロファイルを提供する。
用量依存的毒性がインビボでのサイトカイン投与を制限し得る。ヒト免疫療法プロトコルをモデル化するために、本発明者らは、次に、Ａ／Ｊマウスを、５日間サイクルにわたって１０回用量として与えられるｗｔＩＬ２で処理した１８。Ａ／Ｊマウスは７５０，０００ＩＵｅのｗｔＩＬ２に耐容性を示したが、より高用量では有意な死亡率が明らかであった（図２Ａ〜図２Ｂ）。７５０，０００ＩＵｅ用量の後でさえ、マウスは極度の苦痛、体重減少、摂食量減少、腹水および肝臓炎症を実証した（図２Ａ〜図２Ｅ；図７Ａ〜図７Ｃ）。これらの副作用は、ヒトにおける高用量ＩＬ２療法に関連する毛細血管漏出および苦痛を反映している７。抗アシアロ−ＧＭ１による処理が、Ａ／Ｊマウスにおいて死亡率を改善したが、高用量ｗｔＩＬ２（１，５００，０００ＩＵｅ）によって誘導される体重減少は改善せず、このような療法の副作用がＮＫ細胞と独立して生じ得ることが確認された（図２Ｆ〜図２Ｋ）。ｗｔＩＬ２の場合と異なり、ＮＫ細胞の存在下または非存在下における１，５００，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２後には動物の死が明らかでなかった。１，５００，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２後の動物の体重減少は、ＮＫが十分なマウスでのみ生じ、本発明者らのコンストラクトの毒性が免疫活性化によるものだけであったことを示唆している（図２Ｆ〜図２Ｋ）。２００，０００ＩＵｅのレジメンは、全てのサイトカインについて最小限の体重減少、苦痛または臓器炎症で、Ａ／Ｊマウスにおいて十分耐容性を示した（図２Ｌ〜図２Ｏ）。しかしながら、この用量では、毛細血管漏出はｗｔＩＬ２後に胸水および腹水の蓄積によりまだ明らかであったが、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２でもｍｕｔＩＬ２でも明らかでなかった。Ｂ６マウスは高用量のｗｔＩＬ２に耐容性を示すことができたが、７５０，０００ＩＵｅ超ではまだ有意な罹患率に悩まされた（図７Ｄ）。
【実施例３】
【０２０４】
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２はｗｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２と比較してインビボでＮＫ細胞を優先的に拡大および活性化する。
サイトカイン処理に関連する免疫学的変化を評価するために、Ａ／Ｊマウスに、５日間にわたる１０等用量として与えられる２００，０００ＩＵｅのサイトカインまたはコンストラクトを投与した。脾臓リンパ球を６日目にフローサイトメトリーによって評価した。ｗｔＩＬ２とＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の両方が、生理食塩水処理対照に対してリンパ球含量および脾臓サイズを増加させた（図３Ａ〜図３Ｂ）。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、細胞充実性および表面ＫＬＲＧ１レベルによって測定されるＮＫ細胞の実質的な拡大および活性化をもたらした（図３Ｃ）。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理マウスでは、ＮＫ細胞は、全脾臓リンパ球の半分近くを構成し、生理食塩水またはｍｕｔＩＬ２処理マウスの総リンパ球数に匹敵するまたはこれを上回りさえした（図３Ａ対図３Ｃ）。２００，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によるＮＫ増殖は、ほぼ毒性用量のｗｔＩＬ２（７５０，０００ＩＵ）、高用量ｍｕｔＩＬ２（３，５００，０００ＩＵｅ）または抗ＩＬ２抗体（クローンＭＡＢ６０２）と複合体化したｗｔＩＬ２よりも優れていた１９（図３Ｃ）。実際、マウスの大多数が全２００，０００ＩＵｅのｗｔＩＬ２／抗ＩＬ２抗体に耐容性を示すことができず、動物の苦痛および急速な体重減少による動物屠殺の必要性により、注射を１６０，０００または１８０，０００ＩＵｅで終結しなければならなかった（図８Ａ）。ｗｔＩＬ２は、抗ＩＬ２抗体と複合体化した場合でさえ、Ａ／ＪマウスにおいてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ、特にＩＣＯＳ＋サブセット６の有意な拡大をもたらした（図３Ｄ）。重要なことに、免疫療法の成功のための予測因子として記載されている２０、ＮＫ／Ｔｒｅｇ比が、全ての他の処理条件と比較してＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理マウスで劇的に増加した（図３Ｅ）。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によるＮＫ細胞の優れた拡大は、ｗｔＩＬ２よりも２倍低い用量でさえ可能であった（図８Ｂ）。しかしながら、約５００倍低い親和性のＮＫＧ２Ｄリガンド、ＵＬＢＰ３を用いてＮＫＧ２Ｄを標的化することによって、拡大についての融合コンストラクトの有効性が改善したが、ｍｕｔＩＬ２単独と比較して優れたＮＫ活性化をまだ提供した（図８Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞拡大の傾向は明らかであったが、ｗｔＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理後に、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−またはＣＤ８＋Ｔリンパ球の統計学的に有意な増加は明らかでなかった（図８Ｃ〜図８Ｄ）。このようなデータは、特異的病原体フリーマウスにおいて低レベルのＩＬ２受容体およびＮＫＧ２Ｄを発現しているナイーブＴリンパ球の普及と一致する。
【０２０５】
Ａ／Ｊ系統とは異なり、２００，０００ＩＵｅのｗｔＩＬ２で処理したＢ６マウスでは、リンパ球の免疫活性化はほとんど明らかでなかった（データは示さず）。７５０，０００ＩＵｅの高用量では、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２が、この系統においてｗｔＩＬ２よりも堅牢にＮＫ細胞を拡大した（図３Ｆ〜図３Ｈ）。ＩＬ２／抗ＩＬ２抗体複合体はＴｒｅｇ拡大を防いだが、Ａ／Ｊ系統と同様に、このような処理は毒性を有し、Ｂ６マウスの大部分が全７５０，０００ＩＵｅ用量に耐容性を示すことができなかった（図３Ｉ）。しかしながら、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２はこの用量で十分耐容性を示し、高いＮＫ／Ｔｒｅｇ比をもたらした（図３Ｊ）。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理Ｂ６  ＮＫＧ２Ｄ−／−突然変異型では、ＮＫ細胞の拡大は明らかでなく、本発明者らのコンストラクトの機能におけるＮＫＧ２Ｄの必要条件を確認した（データは示さず）。ｗｔＩＬ２投与後にＣＤ８＋Ｔ細胞拡大の傾向は明らかであったが、いずれの処理群でもＢ６  ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の統計学的に有意な拡大は明らかでなかった（図８Ｆ〜図８Ｇ）。Ａ／Ｊ系統とＢ６系統の両方で肺に存在するリンパ球について同一のデータが得られた（データは示さず）。
【実施例４】
【０２０６】
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、ｗｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２と比較してヒト末梢血リンパ球においてＮＫ細胞を優先的に拡大および活性化する。
ヒトリンパ球におけるＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の有効性を実証するために、ヒト末梢血リンパ球を、１００ＩＵｅの野生型ＩＬ２、ＩＬ２のＲ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ突然変異形態またはＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２中で３６時間共培養した。
【０２０７】
ＮＫ細胞：細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の相対的普及を条件間で比較した。相対的に高い割合のＮＫ細胞がＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２群で明らかであった（図３１Ａ）。パーフォリンレベルは、生理食塩水（黒色）、ＩＬ２（青色）または突然変異型ＩＬ２（緑色）処理ＮＫ細胞と比較して、ＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２処理ＮＫ細胞（赤色）で高かった（図３１Ｂ）。
【０２０８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞：ＮＫ細胞と同様に、他の条件と比較して、ＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ２で処理したＣＤ８＋Ｔ細胞で、パーフォリンの高い細胞内レベルが明らかであった（図３１Ｃ）。
【０２０９】
Ｔｒｅｇｓ：ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞をゲーティングする場合、他の条件と比較して、ＩＬ２処理末梢血リンパ球培養物で、比較的高い割合の活性化ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−調節性Ｔ細胞が明らかであった（図３１Ｄ）。まとめると、このデータは、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２が、ｗｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２と比較して、ヒト末梢血リンパ球においてＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞を優先的に拡大および活性化することを示唆している。重要なことに、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、ＩＬ２に対して有意には調節性Ｔ細胞を活性化しない。
【実施例５】
【０２１０】
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による処理は、インビボで悪性腫瘍の優れた免疫学的制御を提供する。
最適な抗原特異性腫瘍細胞傷害性のために過去の抗原遭遇を要求するＴリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、過去の感作なしに、自然細胞傷害性を媒介することができる。ＮＫ細胞はまた、リンパ球および肺がんなどの特定の悪性腫瘍の拡大にとっての一次防壁を形成する１６、１７、２１、２２。ｗｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２と比較して、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２でＡ／Ｊマウスを処理すると、バルク脾細胞によるＹＡＣ−１細胞のインビボクリアランスおよびインビトロ溶解の増強がもたらされた（図４Ａ、図９Ａ〜図９Ｂ）。ｗｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２と比較して、７５０，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２後に、Ｂ６マウスにおいて高悪性度ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞株の成長減少が明らかであった。ＬＬＣ細胞株については、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理脾細胞において細胞傷害性増加も明らかであった（図４Ｂ〜図４Ｃ；図９Ａ〜図９Ｃ）。ＮＫＧ２Ｄ−／−マウスにおいて、またはＮＫ枯渇後、免疫療法の増強が喪失した（図４Ｄ〜図４Ｅ）。宿主ＮＫＧ２Ｄの非存在下では、ｍｕｔＩＬ２がＬＬＣ成長速度を実際に増加させた。よって、ｍｕｔＩＬ２のＯＭＣＰ媒介標的化は、種々の系統のマウスにおいて、固形腫瘍と液体腫瘍の両方にとってのより安全でより有効な形態の免疫療法を提供する。
【実施例６】
【０２１１】
ＩＬ２シグナル伝達に対するＮＫＧ２Ｄ標的化の影響
抗体−ＩＬ２コンジュゲートまたはＩＬ２／抗ＩＬ２抗体複合体は、血清半減期の持続時間を延長することによって、精製サイトカインよりも改善した生物学的活性を実証する２３、２４。ＩＬ２とＯＭＣＰの結合が血清半減期を増加させたかどうかを調査するために、本発明者らは、５００，０００ＩＵｅの蛍光標識ｗｔＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２をＡ／ＪおよびＢ６マウスに注射し、連続採血によって血清クリアランスを監視した。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は早い時点でわずかに高い血清濃度を有したが、全てのコンストラクトが注射１時間後に血中で検出不可能であった（図５Ａ〜図５Ｂ）。これは、抗体−ＩＬ２コンジュゲートの記載される１１〜１４時間血清半減期よりも有意に短い２３。興味深いことに、同量のサイトカインを注射したにもかかわらず、全ての時点で、Ａ／Ｊマウスと比較して低いサイトカインレベルがＢ６マウスで検出された。このようなデータは、ＩＬ２のクリアランスにおける系統特異的差異を指示しており、なぜＢ６マウスがＮＫ拡大について高用量のサイトカインに耐容性を示すと同時にそれを必要とし得るのかを説明することができる。それにもかかわらず、このデータに基づくと、コンストラクトの延長した循環がｗｔＩＬ２に対して増加したＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の活性を担った可能性は低い。
【０２１２】
本発明者らは、次に、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の優位性が、この受容体の抗体媒介架橋がＮＫ細胞を活性化し得るので、ＮＫＧ２Ｄを通したシグナル伝達の結果である可能性を考えた（図１０Ａ）２５。精製ＯＭＣＰをｍｕｔＩＬ２に付加しても、インビトロでもインビボでもＮＫ活性化も拡大も増加させなかったが（データは示さず）、単量体リガンドがＮＫＧ２Ｄを架橋することは考えにくい。よって、本発明者らは、１０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２および等モル濃度の五量体化ＯＭＣＰと組み合わせたｍｕｔＩＬ２の存在下でＮＫ細胞活性化を直接比較した。五量体化ＯＭＣＰの存在下では、ＣＤ６９上方制御または脱顆粒によって測定されるＮＫ活性化の増加は明らかでなかった（図５Ｃ、図１０Ｂ）。このことは、ＮＫＧ２Ｄ架橋が、生理的濃度でＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によるＮＫ細胞活性化の増加を担っていないことを示唆している。
【０２１３】
ＩＬ２シグナル伝達を評価するために、本発明者らは、次に、インビトロで新たに単離したＮＫ細胞の１５分間のサイトカイン刺激後のＳＴＡＴ５リン酸化を定量化した。試験した全ての濃度で、Ｂ６  ＮＫ細胞と比較して低レベルのＳＴＡＴ５リン酸化がＡ／Ｊで明らかであり（図５Ｄ〜図５Ｅ）、Ａ／Ｊマウスのリンパ球機能不全が少なくとも部分的には不十分なＩＬ２シグナル伝達の結果であり得ることを示唆している。驚くべきことに、Ｂ６とＡ／Ｊの両方のＮＫ細胞について、ｗｔＩＬ２およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２はＳＴＡＴ５リン酸化の同一の用量依存的パターンを実証した（図５Ｄ〜図５Ｅ）。ＮＫＧ２Ｄの非存在下では、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の反応性は、ｍｕｔＩＬ２単独に対してＳＴＡＴ５リン酸化を増加させることができなかった。まとめると、これらのデータは、ＩＬ２α反応性が静止ＮＫ細胞におけるピークＩＬ２シグナル伝達にとって重要であること、およびＮＫＧ２Ｄ結合がＩＬ２媒介シグナル伝達におけるＩＬ２Ｒα結合に有効に取って代わり得ることを示唆していた。しかしながら、このようなデータは、インビボまたはバルク脾細胞培養物におけるＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による優れたＮＫ活性化を説明することができなかった（図１Ｃ〜図１Ｄ、図３）。
【０２１４】
ＩＬ２シグナル伝達は、ＩＬ２／ＩＬ２Ｒの内部移行をもたらし、ＩＬ２およびＩＬ２Ｒβγのその後の分解ももたらす。よって、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２と、ＩＬ２受容体とＮＫＧ２Ｄの両方との結合は、ＩＬ２シグナル伝達を延長することによって、内部移行変化およびＮＫ細胞活性化増強をもたらすことができるだろう。これを試験するために、本発明者らは、新たに単離したＮＫ細胞を１５分間刺激し、培養培地をサイトカインフリー培地に交換し、ＳＴＡＴ５リン酸化を４時間監視した。ｗｔＩＬ２とＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の両方について、同一のホスホ−ＳＴＡＴ５の崩壊が明らかであった（図５Ｆ〜図５Ｇ）。よって、ＩＬ２シグナル伝達の持続時間を変化させることがＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による優れたＮＫ活性化を担っているわけではない。
【０２１５】
本発明者らは、次に、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２による優れたＮＫ活性化が、競合する間質細胞とのサイトカイン相互作用の変化の結果であり得る可能性を考えた（図５Ｈ）。実際、他の脾細胞の存在下では、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、ｗｔＩＬ２に対してＮＫ  ＳＴＡＴ５リン酸化の用量依存的増強を実証した（図５Ｉ）。本発明者らは、次に、ＩＬ２シグナル伝達における、間質細胞によるＩＬ２Ｒα発現と、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ発現との間の相互作用を調査した。これを達成するために、本発明者らは、野生型またはＮＫＧ２Ｄ−／−Ｂ６マウスから脾臓ＮＫ細胞を単離し、これらを、ＮＫ細胞が枯渇した野生型脾細胞と組み合わせた。培養物を、静止野生型Ｂ６マウス中に通常存在する割合に似た１：２０のＮＫ：脾細胞比で組み替えた。いくつかの培養物については、ＮＫ細胞枯渇脾細胞を飽和濃度のＩＬ２Ｒαブロッキング抗体（クローン３Ｃ７）で処理した後、野生型ＮＫ細胞で組み換えた。次いで、培養物を１０００ＩＵｅのｗｔＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２で１５分間刺激した。ｗｔＩＬ２の存在下では、ＮＫＧ２Ｄ−／−または野生型ＮＫ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化は同一であった（図５Ｊ、左の２つの列）。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２と培養した野生型ＮＫ細胞は、ｗｔＩＬ２との培養物よりも優れたＳＴＡＴ５リン酸化を実証した。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２と培養したＮＫＧ２Ｄ−／−ＮＫ細胞では、ＳＴＡＴ５リン酸化がほとんど明らかでなかった（図５Ｊ、右の２つの列）。競合する脾細胞間質細胞のＩＬ２Ｒα遮断の存在下では、ｗｔＩＬ２によるＮＫ細胞ＳＴＡＴ５リン酸化が、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２に匹敵するレベルまで増加した（図５Ｋ）。まとめると、これらのデータは、「競合する」間質細胞によるＩＬ２−Ｒα発現が、ｗｔＩＬ２によるＮＫ細胞活性化を制限し、ＮＫＧ２Ｄ標的化、ＩＬ２Ｒα結合障害ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２コンストラクトによってこの競合を排除することができることを実証している。
【０２１６】
実施例１〜６についての考察
ＩＬ２療法は最初大きな見込みを示したが、Ｔｒｅｇｓの活性化および血管内皮の活性化に関連する毒性副作用によってこれは制限されてきた。細胞傷害性リンパ球を優先的に活性化するためのいくつかの戦略が提案されてきた。１つの戦略は、ＩＬ２Ｒαに対する優先性を除去するためにＩＬ２Ｒβに対して増加した親和性を有する突然変異型を作り出すことであった２６、２７。重要なことに、これらのＩＬ２突然変異型はＩＬ２Ｒαに対する野生型結合を保持しているので、まだＴｒｅｇ細胞および血管内皮によって認識されるだろう。本発明者らの結果もまた、ＩＬ２−Ｒα＋発現細胞との競合が、細胞傷害性リンパ球に対するｗｔＩＬ２の生物学的利用能を制限することを示唆している。
【０２１７】
別の有望な療法は、ｗｔＩＬ２がＩＬ２Ｒαに結合することを立体的に阻害する抗ＩＬ２抗体を含む１、２８、２９。このような処理は、抗体のＦｃ領域、およびもしかするとＩＬ２Ｒα発現細胞から減少したｗｔＩＬ２に対する競合のために、血清半減期を延長することができる２４。ＩＬ２を特異的腫瘍抗原に標的化するための抗体−ＩＬ２融合タンパク質も設計されてきた３０、３１。個人化された療法の可能性を提供するものの、このようなＩＬ２の腫瘍への抗体媒介デリバリーは、公知の腫瘍関連抗原の発現に依存し、しばしばそうした状況は存在しない。この手法は、標的化抗原の腫瘍媒介変化によって潜在的にさらに制限され得るだろう。
【０２１８】
最後に、ＩＬ２Ｒαに対して減少した親和性を有するＩＬ２突然変異型が広範に試験された。ｗｔＩＬ２と比較して、これらの突然変異型は、ＩＬ２Ｒα媒介毛細血管漏出も全身毒性もなしに治療における最大投与量以上の用量で投与することができる３２。これらの突然変異型は優れた安全性プロファイルを有するが、これらは細胞傷害性リンパ球の活性化が不十分である（図５Ｃ〜図５Ｅ）３３。本発明者らの手法は、上記の概念のいくつかを組み合わせて、ＩＬ２の安全な形態を、腫瘍の代わりに、細胞傷害性リンパ球に直接標的化する。これは、ＩＬ２のＩＬ２Ｒαへの通常の標的化をＮＫＧ２Ｄによって置き換えることによって達成される。高親和性ＮＫＧ２Ｄリガンドに融合した、ＩＬ２Ｒα欠損ＩＬ２の組み合わせは、Ｔｒｅｇｓの明らかな活性化も毛細血管漏出もなく、ＮＫ細胞を特異的に拡大することによって前の戦略を改善する。これらの所見は、ＩＬ２の潜在的に安全で、極めて有効な形態の見込みを提供する。
【０２１９】
近交系実験動物からヒトへと結果を橋渡しすることにおける１つの制限は、サイトカイン反応性における自然の多様性およびリンパ球活性化についての環境に依存した閾値である。以前の研究によって、腫瘍細胞のエキソビボ死滅と長期がん免疫増強との間の相関が実証された３４。そのため、いずれの潜在的療法も、異なるレベルの細胞傷害性リンパ球活性を有する集団を説明する必要がある。よって、本発明者らは、発癌に高度に耐性（Ｂ６）または感受性（Ａ／Ｊ）であることが知られている２つの系統のマウスを使用することによって、この自然変動をモデル化しようとした。例えば、Ｂ６マウスのＮＫ細胞はｗｔＩＬ２および極端な用量のｍｕｔＩＬ２によって活性化される。対照的に、ＩＬ２／抗ＩＬ２抗体複合体は、Ａ／ＪマウスではＮＫ細胞の拡大をもたらしたが、Ｂ６マウスではもたらさなかった。このような変動は、単一系統のマウスに由来する結果を免疫学的に多様なヒトへと橋渡しすることの制限を強調する。重要なことに、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２コンストラクトは両系統のマウスのＮＫ細胞を拡大することができ、この療法が多様なＮＫ機能およびサイトカイン反応性を有する集団において有効であり得ることを示している。
【０２２０】
ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄの進化的アンタゴニストとして記載されているので３５、腫瘍療法時のこの免疫受容体の遮断は逆効果とみなされ得る。それにもかかわらず、確立された腫瘍の存在下でさえ、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理マウスで自然細胞傷害性および腫瘍クリアランスが増加した。これは、最小のまたは一過的なＮＫＧ２Ｄ受容体占有および機能の保存を示唆している。あるいは、近年の報告では、流出したＮＫＧ２Ｄリガンドが、慢性アゴニスト会合によって課せられるＮＫ脱感作の反転を通した腫瘍免疫を実際に促進し得ることが実証された３６。本発明者らは単量体またはさらに五量体ＯＭＣＰによるＮＫ活性化も拡大も検出しなかったが、腫瘍床内では、このような競合的アンタゴニズムがＮＫ活性化において逆説的役割を果たす可能性がある。さらに、ＩＬ２は、ＮＫ移動および腫瘍浸潤に必要な受容体を上方制御し得る。よって、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によって媒介される抗腫瘍免疫が、腫瘍床の外側に位置し、局所的な腫瘍特異的寛容またはアネルギーを受けないＮＫ細胞に依存し得る可能性がある。さらに、ＯＭＣＰは、ヒトＮＫＧ２Ｄとの結合の高い親和性および長い半減期のために理想的な「標的化ベクター」となり得る。
【０２２１】
２つの別個の系統のマウスのＮＫ細胞がＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２によって活性化されたが、本発明者らは本発明者らのコンストラクトによるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の全体的拡大を検出しなかった。これはおそらく、ＮＫＧ２ＤがＣＤ８＋Ｔ細胞の特定のサブセット、すなわちメモリーまたは活性化細胞傷害性リンパ球上でのみ発現されるという事実による。特異的な病原体フリー環境中で生じるマウス中のこの細胞集団の不足に基づいて、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２媒介活性化は、本発明者らの系においてＮＫ細胞に制限された。このため、本発明者らは、その成長がＮＫ細胞によって主に調節される肺がんおよびリンパ腫のための免疫療法に焦点を当てた１６、１７、２２、３７。それにもかかわらず、インビトロで、高濃度で投与すると、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２はＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大することができた（図１Ｅ〜図１Ｆ）。よって、免疫刺激サイトカインのＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーは、正常な免疫学的条件下で、長期腫瘍免疫のために抗原特異的ＣＤ８＋メモリー細胞の拡大および／または活性化をもたらし得る可能性があり得る。
【０２２２】
実施例１〜６のための方法
サイトカインおよびコンストラクト生成：ヒトＩＬ２（１〜１３３；Ｃ１２５Ｓ）および突然変異型ＩＬ２（１〜１３３；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ｋ、Ｃ１２５Ｓ）をコードする配列を、Ｎ末端ＦＬＡＧ／ヘキサヒスチジンタグを有するｐＦＭ１．２Ｒ３８にクローニングした。キメラＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２分子は、ｐＦＭ１．２ＲベクターにクローニングされたＣ末端ＦＬＡＧ／ヘキサヒスチジンタグ−突然変異型ＩＬ２（１〜１３３；Ｒ３８Ａ、Ｆ４２ｋ、Ｃ１２５Ｓ）とインフレームでクローニングされた全長ＯＭＣＰ（１〜１５２）コード配列を含む。ＨＥＫ２９３Ｆ（Ｌｉｆｅ＿Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への一過的トランスフェクションによって、タンパク質を発現させた。上清をトランスフェクションの７２時間後および１４４時間後に回収した。上清に５ｍＭイミダゾールおよび０．０２％アジ化ナトリウムを補充し、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）クロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。精製タンパク質を、生理食塩水に緩衝液交換し、液体窒素中で瞬間凍結した。院内で生成した野生型ＩＬ２とＮＣＩ貯蔵所（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から入手可能なテセロイキン（Ｔｅｃｉｎ（商標））について、等しいインビトロおよびインビボ活性が記録された。よって、いくつかの実験について、ＩＬ２のこれらの２つの調製物を互換的に使用した。
【０２２３】
野生型ＩＬ２は１５×１０６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する３９。よって、１５．５ｋＤａの分子量に基づいて、４．４μＭ溶液は１０００ＩＵ／μｌに相当する。この計算に基づいて、全てのサイトカインおよびコンストラクトを、１０００ＩＵ当量（これからはＩＵｅ）として定義される４．４μＭ溶液１μｌのモル基準で投与した。このような系によって、分子量が異なるにも関わらず、ＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２およびＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２間の等モル比較が可能になる。
【０２２４】
動物：Ａ／Ｊ（８〜１２週齢）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（６〜９週齢）系統のマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入した。Ｂ６背景のＮＫＧ２Ｄ−／−マウスは、Ｗａｙｎｅ  Ｙｏｋｏｙａｍａから快く提供され、院内で飼育された（セントルイス・ワシントン大学のＨｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）。動物を、バリア付き施設において、空気を充填したケージ内に収容し、食物および水を自由に入手できるようにした。いくつかの実験については、Ａ／Ｊマウスを枯渇濃度の抗アシアロ−ＧＭ１（−２日目５０μｌ；−１日目２５μｌ）または対照ウサギＩｇＧ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で処理した。動物の手順は、ミズーリ州のセントルイス・ワシントン大学医学校の動物実験委員会によって承認された。
【０２２５】
組織収穫およびインビトロ培養物：７０μｍセルストレーナーを通して全脾臓を粉砕した後、ＡＣＫ緩衝液（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）によってＲＢＣ溶解し、４０μｍフィルターを通して再濾過することによって、脾細胞の単一細胞懸濁液を得た。肺を１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および５Ｕ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ）中、３７℃で９０分間消化した後、脾臓と同様に処理した。
【０２２６】
インビトロ培養物については、Ａ／Ｊ、Ｂ６またはＮＫＧ２Ｄ−／−マウスの脾細胞を、滅菌様式で抽出し、１ウェル当たり１ｍｌ当たり５００万個の細胞で、完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンならびに５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０）中１２ウェルプレートに播種した。細胞を、原稿に記載されるように漸増容量のヒト組換えＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２またはＯＭＣＰで３６時間処理した。いくつかの実験については、バルク脾細胞をＣＦＳＥで標識し、１０００ＩＵｅ／ｍｌのサイトカイン中で５日間培養した後、フローサイトメトリーによって分析した。ＮＫ単離実験については、バルク脾細胞を、ＮＫ細胞単離キットＩＩまたはＣＤ４９ｂ（ＤＸ５）陽性磁気ビーズ選択（共にＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて処理した。ＳＴＡＴ５リン酸化実験については、単離したＮＫ細胞を、増加する濃度のＩＬ２またはコンストラクト中１００，０００個細胞／５００μｌで１５分間刺激した。ＮＫ細胞と脾臓間質の相互作用を評価する実験については、ＤＸ５陽性選択ＮＫ細胞をＣＦＳＥで標識し（同定のために、固定および透過処理後）、ＮＫ枯渇間質細胞で組み換えた。原稿に記載されるように、いくつかの試験については、ＮＫＧ２Ｄ−／−ＮＫ細胞を野生型脾細胞間質細胞と組み合わせた。他の実験については、野生型Ｂ６マウスのＮＫ枯渇脾細胞を飽和濃度の抗ＩＬ２αブロッキング抗体（クローン３Ｃ７）またはアイソタイプ対照（共にＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）で処理した後、ＮＫ細胞で組み換えた。このような競合ＳＴＡＴ５リン酸化実験については、１００，０００個の細胞を、１，０００ＩＵ／ｍｌのｗｔＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２（新たに調製し、予熱した）を含有する完全培地２μｌに再懸濁した。次いで、細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。
【０２２７】
フローサイトメトリー：全てのフローサイトメトリー分析を、２％ＦＢＳおよび０．４％ＥＤＴＡを含むＰＢＳからなるＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で飽和濃度の蛍光色素コンジュゲート抗体を用いて行った。全ての抗体が抗マウスであり、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入し、抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５またはＲＭ４−５）、抗ＣＤ８（クローン５３−６．７）、抗ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）（クローン：７Ｅ．１７Ｇ９）、抗ＣＤ２５（クローンＰＣ６１）、抗ＫＬＲＧ１（クローン２Ｆ１）、ＣＤ４９ｂ（インテグリンα２）（クローンＤＸ５）、抗ＣＤ３ｅ（クローン１４５２Ｃ１１）、抗ＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１）、抗ＣＤ６９  ＰＥ（クローンＨ１．２Ｆ３）、抗ＧＩＴＲ（クローンＤＴＡ−１）、抗Ｆｏｘｐ３（クローン：ＦＪＫ−１６ｓ）および抗Ｓｔａｔ５（クローン４７／Ｓｔａｔ５；ｐＹ６９４）からなっていた。抗体をＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰｅｒＣＰ−ＣｙＴＭ５．５、ＰＥ−シアニン７、ＡＰＣ、ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０、ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）４５０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７にコンジュゲートした。
【０２２８】
パラホルムアルデヒド固定、メタノール透過処理およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；クローン６１２５９９）による染色によって、ホスホ−ＳＴＡＴ５評価を行った。これを達成するために、単離したＮＫ細胞またはＮＫ枯渇脾細胞間質細胞と組み合わせたＮＫ細胞を、１５分間のＩＬ２刺激後に、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中３７℃で１０分間固定した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍｌ／チューブの氷上９０％メタノールを添加することによって１時間透過処理した。細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し（メタノールを除去するため）、室温において抗Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）抗体で１時間染色し、引き続いてＰＢＳ／０．５％ウシ胎児血清中で１回洗浄した。
【０２２９】
インビトロ細胞傷害性：標的細胞を１００ｍＣｉの５１クロム酸ナトリウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）と共に１時間インキュベートすることによって、５１クロム放出を行った。バルク脾細胞をエフェクター細胞として使用し、定義されたエフェクター：標的比で標的と共に、丸底９６ウェルプレート中３７℃で４時間インキュベートした。比溶解を（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００％として表した（０％比溶解が最も低い発現値）。
【０２３０】
インビボサイトカイン注射：選択実験のために、マウスに、５日間にわたって１日２回与えられる１０等用量として与えられる２００μｌ体積のサイトカインの腹腔内注射を行った。上記のように、全てのサイトカインをモル基準でＩＵｅに正規化した。選択実験のために、次いで、マウスを６日目に屠殺し、臓器を組織学的分析のために１０％緩衝ホルマリンに固定した。他の実験のために、脾細胞および肺リンパ球集団をフローサイトメトリーによって分析した。全てのインビボサイトカイン処理実験のために、動物の体重を計り（毎日または隔日）、サイトカイン療法の開始からの変化％として表した。
【０２３１】
血清濃度の評価のために、ｗｔＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２を製造業者の指示に従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）で標識した。血清を指定された時に回収し、サイトカイン濃度を検量線に従って蛍光顕微鏡で決定した。
【０２３２】
インビボ腫瘍試験：ルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を、滅菌生理食塩水１００μｌ中マウス１匹当たり１×１０５個細胞で、Ｂ６またはＢ６  ＮＫＧ２Ｄ−／−マウスに皮下注射した。一旦目に見える腫瘍が明らかになったら、注射５日後、５日間のサイトカイン処理を上記のように開始した。断面腫瘍直径の測定を、キャリパーを用いて行い、腫瘍体積を４／３πｒ３として推定した。注射後２４日目または最大腫瘍直径２０ｍｍに達したら、マウスを屠殺した。ＮＫ細胞枯渇については、マウスを、実験期間中−２日目５００μｇ、−１日目２５０μｇおよび毎週２５０μｇで、抗ＮＫ１．１抗体（クローンＰＫ１３６）またはマウスＩｇＧアイソタイプ対照（共にＢｉｏＸｃｅｌｌ製）で処理した。リンパ腫クリアランス実験のために、Ａ／Ｊマウスを上記のように５日間にわたって１０用量のサイトカインで処理し、６日目に、５×１０６個細胞／マウスのＣＦＳＥで標識したＹＡＣ−１細胞を静脈内注射した。マウスを４時間後に屠殺し、肺を消化し、ＣＦＳＥ＋細胞の前方および側方散乱分析によってＹＡＣ−１の生存率を決定した。
【０２３３】
統計：種々のサイトカイン処理条件間の脾臓および肺に存在するリンパ球の比較を、不等分散または不等サンプルサイズを説明するためにウェルチの補正を用いた独立ｔ検定によって行った。異なるサイトカイン条件間の腫瘍成長を、シダック−ボンフェローニの補正を用いて種々の時点での種々の条件間で行われる多重独立ｔ検定によって比較した。ＳＴＡＴ５リン酸化の倍数変化を、同様にウェルチの補正を用いた独立ｔ検定によって評価した。
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【０２３４】
実施例７〜１０の導入
ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）によって媒介される細胞内監視は重要な宿主免疫機能であり、よって、ＭＨＣＩ分子はウイルスにより破壊または細胞内保持のために頻繁に標的化される［１］。多くのヘルペスウイルスは、ＭＨＣＩの細胞表面発現を防ぐ少なくとも１種のタンパク質をコードする［１、２］。しかしながら、この免疫回避戦略は、抑制シグナルの喪失により、感染細胞をＮＫ細胞媒介溶解に感受性にする［３］。ウイルス感染はまた、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄによって認識されるＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２ＤＬ）の細胞表面呈示をもたらし、感染細胞を、ＮＫ細胞媒介溶解をさらに受けやすくする。そのため、ＭＨＣＩ発現を標的化するウイルスはまた、通常、感染細胞上のＮＫＧ２ＤＬを標的化することによってＮＫＧ２Ｄ媒介細胞応答を妨害する［４〜７］。
【０２３５】
ＮＫＧ２ＤＬは通常は細胞表面上で発現されないが、細胞ストレスによって誘導され得る［８］。ＮＫＧ２ＤＬ発現のための特異的トリガーは未知であるが、ＮＫＧ２ＤＬはいくつかのウイルス感染症に応じて上方制御される［９〜１２］。ＮＫＧ２ＤＬは、配列同一性が低いにもかかわらず、全てＮＫＧ２Ｄによって認識される大きなグループのタンパク質を含む。ＮＫＧ２ＤＬは、ヒトにおけるＭＩＣ（ＡおよびＢ）およびＵＬＢＰ（１〜６）ファミリーならびにマウスにおけるＭＵＬＴ１およびＲＡＥ−１（α〜ε）およびＨ６０（ａ〜ｃ）ファミリーを含む［１３］。ＮＫＧ２ＤＬの冗長性は、おそらくリガンドの組織特異的発現パターンの組み合わせおよびウイルスＮＫＧ２Ｄ回避戦略に対抗する必要性による［１４］。多くのウイルスが、ウイルス感染のＮＫＧ２Ｄ監視に干渉する手段として、ＮＫＧ２ＤＬの細胞表面発現を抑制する機構を進化させてきた。この戦略はβ−およびγ−ヘルペスウイルスで最も明らかであり、４つのマウスサイトメガロウイルスタンパク質（ｍ１３８、ｍ１４５、ｍ１５２、ｍ１５５）［１５〜１８］、２つのヒトサイトメガロウイルスタンパク質（ＵＬ１６、ＵＬ１４２）［１９、２０］および１つのカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスタンパク質（Ｋ５）［２１］がＮＫＧ２ＤＬ表面発現を遮断することが実証されている。Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３／４ａおよびヒト免疫不全ウイルスＮｅｆタンパク質もＮＫＧ２ＤＬのサブセットの発現を遮断するので、この回避戦略はＲＮＡウイルスにも見られる［２２、２３］。さらに、ヒトサイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス１型およびエプスタインバーウイルスもそれぞれ、ＭＩＣＢの翻訳を防止する少なくとも１つのｍｉＲＮＡをコードする［２４、２５］。同様に、ＪＣＶおよびＢＫＶポリオーマウイルスは、ｍｉＲＮＡによりＵＬＢＰ３を標的化する［２６］。しかしながら、単一ウイルスタンパク質もｍｉＲＮＡも全てのＮＫＧ２ＤＬの発現を遮断することは示されていないので、感染細胞上のＮＫＧ２ＤＬ発現の遮断は不完全な回避戦略である。
【０２３６】
いくつかのヘルペスウイルスと同様に、牛痘ウイルス（ＣＰＸＶ）もＭＨＣＩ発現を妨害する。ＣＰＸＶは、それぞれＴＡＰ媒介ペプチド輸送および細胞表面へのＭＨＣＩ輸送を防止する２つのタンパク質、ＣＰＸＶ０１２およびＣＰＸＶ２０３を発現する［２７〜３４］。エクトロメリアウイルス、関連オルソポックスウイルスはＮＫＧ２ＤＬ発現を誘導し、ＮＫＧ２Ｄはエクトロメリア（ｅｃｔｏｍｅｌｉａ）ウイルス発病の制御にとって重要である［３５］。別のオルソポックスウイルス、サル痘ウイルスによる感染は、ＮＫ細胞の劇的拡大をもたらすが、ＮＫ細胞機能障害をもたらす［３６］。まとめると、これは、ＣＰＸＶ感染ウイルスがＮＫ細胞媒介溶解に感受性であることを示唆している。
【０２３７】
ヘルペスウイルスとは異なり、ＣＰＸＶはＮＫＧ２ＤＬを標的化しない。代わりに、このウイルスは、ＮＫＧ２ＤＬの競合インヒビター、オルソポックスウイルスＭＨＣクラスＩ様タンパク質（ＯＭＣＰ）をコードすることによって直接ＮＫＧ２Ｄを標的化する［３７、３８］。ＯＭＣＰは、感染細胞から分泌され、ＮＫＧ２ＤＬ発現標的細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介死滅に拮抗する１５２残基タンパク質である［３７］。ＯＭＣＰはまた、インビボで重要な役割を果たし、ＯＭＣＰ欠損ＣＰＸＶはマウス感染症モデルにおいて弱毒化される（Ｍ．Ｓｕｎら、私信）。ＯＭＣＰは、全ての試験マウスＮＫＧ２ＤＬ以上の親和性でマウスＮＫＧ２Ｄに結合し、ヒトＮＫＧ２ＤＬよりも約５０００倍高い親和性でヒトＮＫＧ２Ｄに結合する［３７〜４０］。
【０２３８】
配列同一性の相違にもかかわらず、全ての公知の宿主ＮＫＧ２ＤＬが共通の構造的特徴を共有する［４１、４２］。ＮＫＧ２ＤＬは、２つのヘリックスを有する８本鎖βシートで構成されたＭＨＣＩ様プラットホームドメインを含む［４３〜４７］。プラットホームドメインは、各ドメインが４本のβ鎖および１本のαヘリックスを含む、α１およびα２ドメインに細分化される。ＭＨＣＩとは異なり、ＮＫＧ２ＤＬプラットホームドメインのヘリックス間の溝が閉じているので、ＮＫＧ２ＤＬがペプチドに結合しない。
【０２３９】
宿主ＮＫＧ２ＤＬと同様に、ＯＭＣＰはまた、ＭＨＣＩ様プラットホームドメインを採用している［３８］。しかしながら、ＯＭＣＰのプラットホームドメインは、短い隣接ヘリックスを有する６本鎖βシートのみを有するようトリミングされている。本発明者らは、α１ドメインのヘリックスをＨ１と呼び、α２ドメインの不連続ヘリックスをＨ２ａおよびＨ２ｂと呼ぶ。ＯＭＣＰのＨ２ａおよびＨ２ｂヘリックスはまた、βシートに対して平らに、互いに離れて広がるように再配列される。ＯＭＣＰ構造のこれらの差異が、ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄの高親和性結合にとって重要であると仮定した。しかしながら、ＯＭＣＰはなお宿主ＮＫＧ２ＤＬと同じ配向で、すなわち、αヘリックスが対称ＮＫＧ２Ｄ結合溝内に斜めに配向して、ＮＫＧ２Ｄに結合すると予想された。
【０２４０】
ここで、本発明者らは、牛痘ウイルスのブライトンレッド株のＯＭＣＰに結合したヒトＮＫＧ２Ｄの２．０Å分解構造を報告する。構造により、宿主ＮＫＧ２ＤＬに対するＮＫＧ２Ｄ結合溝中のＯＭＣＰの有意な再配向が明らかになる。ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄの界面は高度に相補的であり、宿主ＮＫＧ２ＤＬよりも有意に大きな表面積を埋め、ＮＫＧ２Ｄ結合溝全体にわたって連続的なままである。この新規な結合適合および高親和性によって、ＯＭＣＰが高い局所濃度の膜結合宿主ＮＫＧ２ＤＬと競合することが可能になる。本発明者らはさらに、ＮＫＧ２Ｄアンタゴニム機構が、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達をもたらさないようにＯＭＣＰが分泌されることを要することを示す。
【実施例７】
【０２４１】
ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄの構造決定
本発明者らは、以前、ＯＭＣＰ単独の構造を解明し、宿主ＮＫＧ２ＤＬと同様に、ＯＭＣＰがＭＨＣＩ様プラットホームドメインを採用していることを示した［３８］。ＯＭＣＰと宿主ＮＫＧ２ＤＬのドメイン構造の全体的類似性にもかかわらず、ＯＭＣＰは、ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄの高親和性結合にとって重要であると仮定された推定上のＮＫＧ２Ｄ結合部位におけるいくつかの顕著な逸脱を有していた。ＮＫＧ２Ｄに対するＯＭＣＰの異常に高い親和性をさらに理解するために、本発明者らは、ヒトＮＫＧ２Ｄに結合したＯＭＣＰの構造を結晶化および解明した。
【０２４２】
ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄを用いた最初の結晶化試験により、約３０種の異なる結晶化状態が得られた。後のデータ回収および複数の低分解能結晶形態の分子置換は全て、不定密度によって分離されたＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ複合体の交互のシートを有する類似の部分解をもたらした。ＯＭＣＰ単独の元の構造では、βシートが中心から離れて配向したαヘリックスとの三量体を形成するよう充填していた［３８］。ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ部分解において、同一のＯＭＣＰ三量体が形成され、ＮＫＧ２Ｄは今や外側に面したヘリックスと結合していた（データは示さず）。格子充填を変化させようとして、本発明者らは、三量体界面を破壊するよう設計された突然変異をＯＭＣＰのβシートに導入した。これらの突然変異は、ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ結合の破壊を回避するために、ＮＫＧ２Ｄ結合部位とは反対のＯＭＣＰ面上にあった。ＯＭＣＰの突然変異形態（Ｙ２３Ｄ、Ｆ９５Ｄ）は新たな空間群中でＮＫＧ２Ｄと結晶化し、結晶は２．０Åに回折した（表１）（図２４Ａ）。
【０２４３】
電子密度図は、ＯＭＣＰのＱ１０８を除いて、構造の全ての鎖を通して連続的かつ明確であった。この残基は、ＯＭＣＰの最大のループの中心に位置しており、この残基についての明確な密度はＯＭＣＰ単独の構造からは欠けていた［３８］。ＮＫＧ２Ｄに結合したＯＭＣＰの構造は、全原子についてのＲＭＳＤが０．８Åであり、ＯＭＣＰ単独の本発明者らの以前の構造との大きな差異を示さなかった。同様に、ＮＫＧ２Ｄも、ＲＭＳＤが０．５〜０．９Åに及び以前のＮＫＧ２Ｄ構造と類似であった。ＮＫＧ２Ｄのβ３−β４ループが、平均以上Ｂ因子を示したＯＭＣＰまたはＮＫＧ２Ｄの唯一の領域である。このループは、可撓性であると考えられ、全ての以前のＮＫＧ２Ｄ構造で平均以上Ｂ因子を有していた［４８］。興味深いことに、本発明者らのＮＫＧ２Ｄ構造中のＳ１９３−Ｓ１９４間のペプチド結合は、他のＮＫＧ２Ｄ構造に記載されないシス立体配座を有していた（図２９）。
【実施例８】
【０２４４】
ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄとの間の界面
（ｉ）ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄについて宿主ＮＫＧ２ＤＬと競合し、（ｉｉ）ＮＫＧ２ＤのＮＫＧ２ＤＬ結合ポケット内の突然変異がＯＭＣＰ結合親和性を変化させたので、ＯＭＣＰは宿主ＮＫＧ２ＤＬによって使用されるのと同じＮＫＧ２Ｄの面に結合すると仮定された［３８］。ＯＭＣＰは、宿主ＮＫＧ２ＤＬと同じ凹面結合ポケットを用いてＮＫＧ２Ｄに結合する（図２４Ａ）。ＯＭＣＰは、主に、そのα２ドメインの不連続ヘリックス、Ｈ２ａおよびＨ２ｂを用いて結合する。Ｈ２ａおよびＨ２ｂヘリックスの位置は、結合部位内の両ヘリックスの全ての表面に露出した側鎖がＮＫＧ２Ｄに直接接触するようになっている（図２４Ｂ）。Ｈ２ａおよびＨ２ｂの外側には、Ｉｌｅ４９およびＡｒｇ６６の２つの接点のみが見られる。これらの残基の両方がα１ドメイン内にあるが、Ｈ１ヘリックスの外側にある。
【０２４５】
１２個のＯＭＣＰ残基が１８個のＮＫＧ２Ｄ残基と接触して、結合型の混合物を形成する（表２）。各ＮＫＧ２Ｄ半部位中の３個の残基は、全ての公知の宿主ＮＫＧ２ＤＬと接触するので、コア結合残基として知られている。ＮＫＧ２ＤサブユニットＡ（ＮＫＧ２ＤＡ）のコア残基（Ｔｙｒ１５２、Ｔｙｒ１９９、Ｍｅｔ１８４）は２つの水素結合を形成し、ＯＭＣＰ残基との広範な疎水性接点を作る。ＮＫＧ２ＤＡのコア残基は、４個のＯＭＣＰ残基と接触し、これらの残基の最も重要なのがＰｈｅ１２２である。Ｐｈｅ１２２は、Ｔｙｒ１５２とのπスタッキングを含む、全３個のＮＫＧ２ＤＡコア残基との複数の疎水性接点を作る。Ｐｈｅ１２２はまた、Ｔｙｒ１５２との骨格−側鎖水素結合を形成する。興味深いことに、ＯＭＣＰは全６個のＮＫＧ２Ｄコア結合残基を利用しない最初のＮＫＧ２Ｄリガンドであり、ＮＫＧ２ＤサブユニットＢ（ＮＫＧ２ＤＢ）のＭｅｔ１８４およびＴｙｒ１５２のみがＯＭＣＰに接触している。ＮＫＧ２ＤＢ  Ｍｅｔ１８４およびＴｙｒ１５２はそれぞれ、単一水素結合およびＯＭＣＰ残基との疎水性接点を作る。２個のＯＭＣＰ残基、Ｔｒｐ１２７およびＡｓｐ１３２が両ＮＫＧ２Ｄプロモーターとの接点を作る。ＯＭＣＰ  Ｔｒｐ１２７がＮＫＧ２ＤＡのＬｙｓ１５０との水素結合を形成し、ＮＫＧ２ＤＢのＬｅｕ１４８、ＮＫＧ２ＤＡのＬｙｓ１５０およびＳｅｒ１５１とのいくつかの疎水性接点を作る。ＯＭＣＰ  Ａｓｐ１３２はＮＫＧ２ＤＢのＴｙｒ１５２との水素結合を形成し、ＮＫＧ２ＤＡのＬｙｓ１５０との塩橋を形成する（図２５Ａ）。
【０２４６】
ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用の高い親和性のために、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ結合欠損突然変異型を見つけるためのハイスループットインビトロ選択手法を利用した（表３）。スクリーニングの結果は、ＮＫＧ２Ｄ結合を破壊するのに重要な残基としてＤ１３２を同定した。次いで、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄ結合を完全に切断しようとして突然変異Ｄ１３２Ｒを生成した。驚くべきことに、Ｄ１３２Ｒ突然変異型単独では、ＫＤより３５倍高い濃度でＮＫＧ２Ｄに結合することができなかったが（図２５Ｂ）、ＯＭＣＰとＦｃＲＬ５発現細胞の結合には影響を及ぼさなかった（図２５Ｃ）。この突然変異はおそらく、有意な立体衝突を引き起こすと同時に、Ａｓｐ１３２とＮＫＧ２ＤＡ  Ｌｙｓ１５０による相互作用とＡｓｐ１３２とＮＫＧ２ＤＢ  Ｔｙｒ１５２による相互作用の両方を破壊する（図２５Ａ）。
【０２４７】
以前、マウスＮＫＧ２Ｄに対してヒトについて１４倍高いＯＭＣＰ親和性が、Ｌ２と略されるＮＫＧ２Ｄのβ５’−β５ループ中の３つのアミノ酸置換にマッピングされた［３８］。置換自体（Ｉ１８２Ｖ、Ｍ１８４ＩおよびＱ１８５Ｐ）に加えて、ＮＫＧ２Ｄオルソログ間のループの位置が異なる。ヒトＮＫＧ２ＤのＬ２は、マウスＮＫＧ２ＤのＬ２と比較して、凹面結合空洞の中心に向けて曲がっている。ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＯＭＣＰ構造上にマウスＮＫＧ２Ｄを重ね合わせると、ＯＭＣＰとＮＫＧ２ＤＢ中のＭｅｔ１８４（ｍＮＫＧ２Ｄ残基Ｉ２００）との間およびＮＫＧ２ＤＡ中のＭｅｔ１８４（Ｉ２００）とＧｌｕ１８５（Ｐ２０１）との間の接点が、マウスβ５’−β５ループの位置が異なるために、変化していることが明らかになる（図２６Ａ〜図２６Ｂ）。この変化が、ＯＭＣＰ  Ｈ２ａ中の３個の残基、Ｈ２ｂ中の３個の残基およびα１ドメイン内のＡｒｇ６６との接点を破壊するだろう。Ｌ２の接触残基の中で、Ｍｅｔ１８４が両ＮＫＧ２Ｄ中で最も重要な接点を作る（表２）（図２６Ｃ）。決定的には、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な５８個のＮＫＧ２Ｄ配列のうち、５４個が高親和性ヒトＮＫＧ２Ｄに見られるＭｅｔ１８４およびＧｌｕ１８５を保存している（図２６Ｄ）。
【０２４８】
１８個のＯＭＣＰ変異体が異なるＣＰＸＶおよびＭＰＸＶ株間で記載されている［５１］。この試験では、本発明者らは、まとめてＯＭＣＰｍｐｘと呼ばれる、他の１７個のＯＭＣＰ変異体の高度に保存された配列と６０％超の配列同一性を有するＣＰＸＶのブライトンレッド株からＯＭＣＰを結晶化した。観察された１２個のＯＭＣＰ接触残基のうち、９個はＯＭＣＰｍｐｘと同一である。残りの接点のうち、全３つは保存的疎水性置換（Ｉ４９Ｌ、Ｔ１１８ＩおよびＭ１３５Ｉ）である（図２７）。ＯＭＣＰｍｐｘはＮＫＧ２Ｄに結合し、ＮＫＧ２Ｄ接触残基中の置換はＮＫＧ２Ｄに対するＯＭＣＰｍｐｘの親和性に大きくは影響しないようである［３７］。
【実施例９】
【０２４９】
新規なＮＫＧ２Ｄ結合適合
宿主ＮＫＧ２ＤＬは、低い配列同一性を有するが、全体的に類似の構造を有し、ＭＨＣＩ様プラットホームドメインは、ＮＫＧ２Ｄホモ二量体によって作り出された対称な結合溝を斜めに横切って結合している［１３、４１、５２］。宿主リガンドは、１つのＮＫＧ２Ｄ半部位とＨ１およびＳ１−Ｓ２ループにより接触し、第２のＮＫＧ２Ｄ半部位とＨ２ｂにより接触する。類似のＭＨＣＩ様折り畳みにもかかわらず、ＯＭＣＰは、宿主ＮＫＧ２ＤＬに対して約４５°回転した、新規な配向でＮＫＧ２Ｄ結合溝に結合する（図２７）。宿主リガンドのようにＨ１およびＳ１−Ｓ２ループを使用する代わりに、ＯＭＣＰはこれらの接点をＨ２ａによって置き換えている。この回転により、溝を斜めに横切って横たわる代わりに、ＯＭＣＰのヘリックスがＮＫＧ２Ｄ結合溝に垂直になる。
【０２５０】
Ｈ２ａおよびＨ２ｂの２つの特有の再配列がＯＭＣＰ配向を可能にする。ＯＭＣＰのα２ヘリックスと宿主ＮＫＧ２ＤＬは不連続であり、２つの短いヘリックスが互いに対してヒンジになっている。宿主リガンドについては、Ｈ２ａとＨ２ｂの角度が約９０°であり、Ｈ２ａがＮＫＧ２Ｄ界面から離れて位置している。対照的に、ＯＭＣＰはヘリックス間のヒンジ角度を約２０°増加させ、ＯＭＣＰのβシートに対して平らなα２ヘリックスをもたらした。α２ヘリックスの平坦化によって、Ｈ２ａおよびＨ２ｂが、ＮＫＧ２Ｄホモ二量体の凹面結合溝を密接に補足することが可能になる（図２４Ｂ）。ＮＫＧ２Ｄに対するα２ヘリックスの密着は、高い形状相補性（０．７７）および埋もれた表面積（２，６１２Å２）に反映される。対照的に、宿主ＮＫＧ２ＤＬは、０．６３〜０．７２に及ぶ形状相補性および１，７００〜２，１８０Å２に及ぶ埋もれた表面積を有している［４３、４４、４６］。
【０２５１】
α２ヘリックスの第２のユニークな特徴は、Ｈ２ａとＨ２ｂの互いの分離である。この領域はまた、Ｈ２ａとＨ２ｂを２つの別個のヘリックスに完全に分離する移動も含む。この移動は、各ヘリックスが各ＮＫＧ２Ｄモノマーのコア結合部位上の中心を直接占めることを可能にするので、ＮＫＧ２Ｄ結合にとって重要である（図２７）。これにより、ＮＫＧ２Ｄ二量体によって作り出される対称結合溝を認識するＯＭＣＰ上の対称結合部位が作り出される。ＯＭＣＰとＮＫＧ２Ｄ結合との間の対称性は、非対称宿主リガンドと対称ＮＫＧ２Ｄ結合溝の標準的結合と全く対照的である［５２］。しかしながら、各ＮＫＧ２Ｄ半部位が異なるＮ−またはＣ末端配向のＯＭＣＰヘリックスを認識するので、非対称性の１つの要素がＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ相互作用に残っており、ＮＫＧ２Ｄ厳密適合認識の柔軟性を再び実証している［４１、５３］。
【０２５２】
ＮＫＧ２Ｄと宿主ＮＫＧ２ＤＬとの間の接触部位は、ＮＫＧ２ＤとＮＫＧ２ＤＬのＨ１／Ｓ１−Ｓ２ループおよびＨ２ｂとのコア結合部位に中心をおく２つのパッチで構成される［４１］。結果として、ＮＫＧ２ＤとＮＫＧ２ＤＬの界面は、特にＮＫＧ２Ｄ結合溝の中心で不連続である（図２７）。ＯＭＣＰのユニークな配向のために、Ｈ２ａおよびＨ２ｂはＮＫＧ２Ｄ結合溝全体に沿って連続接点を作る（図２７）。ＯＭＣＰ  Ｌｙｓ１２６、Ｔｒｐ１２７、Ｇｌｕ１３１およびＡｓｐ１３２の側鎖はＮＫＧ２Ｄ結合溝の中心の残基と接点を作り、各ＮＫＧ２Ｄ単量体上のコア結合部位を架橋する（図２４Ｂ）。特に、ＯＭＣＰ  Ｔｒｐ１２７はＮＫＧ２Ｄ二量体の中心に向けられており、両ＮＫＧ２Ｄ単量体上の残基と疎水性接点を作り、結合界面のギャップを有効に近づける。
【実施例１０】
【０２５３】
リガンド会合時のＮＫＧ２Ｄのシグナル伝達
ＣＰＸＶおよびＭＰＸＶ感染細胞は、ＮＫＧ２Ｄアンタゴニストとして作用することができるＯＭＣＰを分泌する［３７］。この免疫回避戦略は、がん誘導ＮＫＧ２ＤＬ流出を暗示する。いくつかのがん細胞は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を用いて細胞表面からＮＫＧ２ＤＬをタンパク質分解により切断すると同時に、ＮＫＧ２Ｄ保有リンパ球ががん細胞を標的化するのを防ぎ、可溶性ＮＫＧ２ＤＬを作り出してＮＫＧ２Ｄをトランスに抑制する。細胞結合ＮＫＧ２ＤＬはＮＫＧ２Ｄエフェクター機能を誘因するが（図２８Ａ）、がん誘導可溶性ＮＫＧ２ＤＬはＮＫＧ２Ｄ機能を遮断する（図２８Ｂ）。流出ＮＫＧ２ＤＬのように、ＯＭＣＰは可溶性であり、ＮＫＧ２Ｄ機能をトランスに遮断する［３７］（図２８Ｃ）。宿主ＮＫＧ２ＤＬとは異なり、ＯＭＣＰは新規な配向でＮＫＧ２Ｄに結合する。そのため、本発明者らは、ＯＭＣＰが、宿主ＮＫＧ２Ｄリガンドと同様に、細胞膜の文脈でＮＫＧ２Ｄアゴニストとして働き得るかどうかを調べた。ＯＭＣＰは分泌タンパク質であるので、人工的に細胞に結合したＯＭＣＰを、Ｔｈｙ１．１からの異種膜貫通ドメインを用いることによって構築した［３７］（図２８Ｄ）。ＮＫＧ２Ｄ媒介細胞死滅を測定するために、本発明者らは、ＯＭＣＰ−Ｔｈｙ１．１コンストラクトまたは宿主ＮＫＧ２ＤＬを発現するレトロウイルスベクターを用いてＢａ／Ｆ３細胞に安定的に形質導入した。ＯＭＣＰ−Ｔｈｙ１．１発現標的細胞は、宿主ＮＫＧ２ＤＬ形質導入標的細胞と等しく死滅し、その結合配向が変化したにもかかわらず、細胞結合ＯＭＣＰがＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を活性化することができたことを示している（図２８Ｅ）。よって、ＯＭＣＰは、拡散による有効性の潜在的な喪失にもかかわらず、ＮＫＧ２Ｄエフェクター機能を活性化しないように分泌されなければならない。
【０２５４】
実施例７〜１０についての考察
多くのウイルスが感染細胞内の複数の宿主によってコードされるＮＫＧ２Ｄリガンドを保持しようとすることによる一般的なＮＫＧ２Ｄ妨害機構を採用しているが、ＣＰＸＶおよびＭＰＸＶはＮＫＧ２Ｄを直接標的化する極めて異なる手法をとっている。ＮＫＧ２Ｄは単形態性であるので、この機構は、感染細胞のＮＫＧ２Ｄ認識を防止するために単一のタンパク質を要求するという有意な利点を有する。多数の配列多様宿主ＮＫＧ２ＤＬおよびその関連多型性は、病原体によってコードされるＮＫＧ２ＤＬアンタゴニストからの選択によって駆動されると考えられる［１４］。同様に、ウイルスＮＫＧ２Ｌアンタゴニストは、連続適合サイクルにおける多様な宿主ＮＫＧ２ＤＬからの選択圧下にある。複数のＮＫＧ２ＤＬを認識する必要性のために、ＮＫＧ２Ｄは適合のための限られた突然変異空間を有する。ＮＫＧ２Ｄが突然変異する能力が限られていることは、ＮＫＧ２ＤＬの代わりに、ＮＫＧ２Ｄを直接標的化するＯＭＣＰのさらに別の利点となる。
【０２５５】
ＯＭＣＰと同様に、いくつかのがん細胞は宿主ＮＫＧ２ＤＬを流出して自身の可溶性ＮＫＧ２Ｄアンタゴニストを作り出す。しかしながら、この戦略は、宿主ＮＫＧ２ＤＬをがん細胞の表面から除去するという追加の利点を有する。対照的に、ＣＰＸＶおよびＭＰＸＶは、宿主ＮＫＧ２ＤＬ表面発現を遮断する公知の機構を欠いている。そのため、分泌されたＯＭＣＰが、感染細胞上の高い局所濃度の複数の宿主ＮＫＧ２ＤＬに対して、ならびに感染細胞からの拡散に対して効率的に競合することができなければならない。宿主リガンドと競合するＯＭＣＰの能力を増加させる１つの可能な方法は、複数のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを有することによりＯＭＣＰの結合活性を増加させることであるだろう。しかしながら、多量体ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄを架橋し、ＮＫＧ２Ｄ媒介死滅を潜在的に誘因し得るだろう。そのため、分泌されたＯＭＣＰは異常なＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を防止するために単量体でなければならない。よって、これらの欠陥を補うために、ＯＭＣＰは細胞結合宿主ＮＫＧ２ＤＬと有効に競合することができる最高の親和性を有さなければならない［３７、３８］。リガンド−受容体相互作用の半減期は、生理的競合性とよく相関する［５５］。ＯＭＣＰは、ほとんどのＮＫＧ２ＤＬの１．５〜１８秒の半減期と比較して、それぞれ３４８秒および５４秒の半減期でヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄに結合する［３８、４４、５６］。実際、ＮＫＧ２Ｄについての増加した半減期によって、マウス感染症モデルにおいてＯＭＣＰがＮＫＧ２Ｄ媒介免疫に有効に拮抗することが可能になる（Ｍ．Ｓｕｎら、私信）。
【０２５６】
ＮＫＧ２ＤについてのＯＭＣＰの長い半減期に関する分子的基盤を理解するために、本発明者らは、以前、ＯＭＣＰ単独の構造を決定したが、ここで、本発明者らは、ＮＫＧ２Ｄに結合したＯＭＣＰの構造を報告する。ＯＭＣＰ単独の構造は、非定型のＭＨＣＩ様プラットホームドメインを含む宿主ＮＫＧ２Ｄリガンドの構造と大いに類似であった。宿主ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＮＫＧ２Ｄの対称結合溝内に斜めに配向したそのプラットホームドメインのヘリックスと結合する。よって、ＯＭＣＰが宿主ＮＫＧ２Ｄリガンドのウイルス模倣物であり、同様にＮＫＧ２Ｄと相互作用すると予想された。
【０２５７】
代わりに、ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄの構造は、ＮＫＧ２Ｄ結合溝中のＮＫＧ２Ｄリガンドについての新規な配向を明らかにした。α２ドメインヘリックス内の変化によって、ＯＭＣＰが、結合溝内でそのヘリックスを垂直に配列することを可能にする。この再配向は、Ｈ２ａおよびＨ２ｂヘリックスをＮＫＧ２Ｄのコア結合部位と直接接触して配置し、またＮＫＧ２Ｄとの最大かつほとんど連続した結合界面を形成する。タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する力（水素結合、ファンデルワールス、疎水性相互作用）は個別には弱いので、高い形状相補性による大きな連続的界面によってタンパク質間の累積的に強い相互作用が可能になる。ＯＭＣＰの結合配向のこの変化は、どのように宿主リガンドによって使用されるＭＨＣＩ様プラットホームがＮＫＧ２Ｄ結合を増強するために病原体によって適合され得るのかを明らかにする。
【０２５８】
宿主ＮＫＧ２ＤＬおよびＯＭＣＰは類似のＭＨＣＩ様プラットホームを有するので、なぜ宿主リガンドがＮＫＧ２Ｄとの類似の高親和性相互作用を進化させなかったのだろうかと思うことは合理的である。１つのもっともらしい理由は、宿主免疫応答を慎重に調整して、自己免疫の脅威から保護する必要性と釣り合いをとらなければならないということである。細胞表面上のＮＫＧ２ＤＬの発現はエフェクター機能のためのシグナルを伝達するので、細胞表面上の少量の高親和性宿主リガンドでさえ免疫応答を誘因し、結果として生じた組織損傷が宿主にとって有害となり得る。実際、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞および／または宿主ＮＫＧ２ＤＬの異常な発現が糖尿病、セリアック病および関節リウマチに関係している［５７〜６０］。ウイルスは自己免疫選択圧によって束縛されない。そのため、ＣＰＸＶおよびＭＰＸＶは、免疫回避能力を最大化するための最高の可能な親和性で、ウイルスＮＫＧ２ＤＬを自由に進化させることができた。
【０２５９】
興味深いことに、ＯＭＣＰは、宿主ＮＫＧ２ＤＬに対するＯＭＣＰの新規な配向にもかかわらず、標的細胞膜に結合すると、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を誘因する。宿主ＮＫＧ２ＤＬと二量体ＮＫＧ２Ｄの相互作用は、ＭＨＣ分子とその同族Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の間の相互作用との広範な構造類似性を有する。両方の場合で、ＮＫＧ２ＤＬ／ＭＨＣは二量体ＮＫＧ２Ｄ／ＴＣＲによって作り出された面を斜めに横切って位置する。しかしながら、ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄのように、慣例に従わない配向と相互作用するＭＨＣ−ＴＣＲ複合体のいくつかの例が存在する［６１〜６５］。これらの複合体のいくつかは、ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体についての正常な範囲の外側に傾いたまたは回転した自己免疫ＭＨＣ−ＴＣＲ複合体を含んでいた［６１、６５］。これらの受容体は高いＭＨＣ濃度でＴＣＲシグナル伝達を誘因することができたので、特徴的な免疫シナプスを構築することができなかった［６６］。インビトロペプチドライブラリー−ＭＨＣ−ＴＣＲ（Ｈ２−Ｌｄ−４２Ｆ３）スクリーニングが、他のＨ２−Ｌｄ−４２Ｆ３複合体に対して約４０°回転した界面を有するｐ３Ａ１−Ｈ２−Ｌｄ−４２Ｆ３複合体を生成した際、慣例に従わない結合の顕著な例が見出された。この回転はＴＣＲをＭＨＣペプチド結合溝とほぼ平行に配置し、ほぼ全体的に界面中心をＭＨＣαヘリックスの１つの上−ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄの界面と酷似した配向にシフトした［６５］。興味深いことに、ｐ３Ａ１−Ｈ２−Ｌｄ−４２Ｆ３複合体はＴＣＲシグナル伝達を誘導することができなかった［６５］。よって、ＯＭＣＰ／ＮＫＧ２Ｄとは異なり、ＴＣＲに対するＭＨＣの配向がシグナル伝達にとって重要な因子である。
【０２６０】
ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄとｐ３Ａ１−Ｈ２−Ｌｄ−４２Ｆ３は、極めて類似の配向を有するにもかかわらず、逆のシグナル伝達結果をもたらす。ＴＣＲシグナル伝達は、それぞれ、ＭＨＣＩＩまたはＭＨＣＩのα２／β２またはα３ドメインと結合した共受容体を要する。ｐ３Ａ１−Ｈ２−Ｌｄ−４２Ｆ３がシグナル伝達をすることができないことおよび他の慣例に従わないＭＨＣ−ＴＣＲ複合体が真の免疫シナプスを形成することができないことは、潜在的に、共受容体がシグナル伝達のための正しい四次構造を形成することができないためである［６４、６５、６７］。ＮＫＧ２Ｄによるシグナル伝達は共受容体刺激を要することが知られておらず、ＮＫＧ２ＤＬの大部分が真のＭＨＣ分子のα２／β２またはα３ドメインに結合した共受容体を欠いている。共受容体依存性のこの差が、なぜＯＭＣＰ（膜貫通を介して結合する場合）が、慣例に従わない結合配向を有するＭＨＣ−ＴＣＲ複合体と比較してＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を刺激する能力が依然としてあるのかを説明し得る。さらに、これは、細胞表面上のＮＫＧ２Ｄのクラスター形成がＮＫＧ２Ｄ媒介活性化の主要な決定因子であることを示唆している。
【０２６１】
実施例７〜１０のための方法
ＮＫＧ２Ｄ結合欠損突然変異型Ｄ１３２Ｒの同定。コンビナトリアル細胞表面ディスプレイに基づくハイスループットインビトロ選択手法を利用して、ＮＫＧ２Ｄ結合欠損突然変異型を同定した。ＯＭＣＰの配列を、エラープローンＰＣＲを用いて全体的に突然変異誘発し、突然変異アンプリコンを、オーバーラップ伸長ＰＣＲを介してシグナルレスＴｈｙ１．１  ｃＤＮＡにスプライシングした。非突然変異Ｔｈｙ１．１に融合した突然変異ＯＭＣＰのこのライブラリーを、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレトロウイルス導入ベクター（Ｔｏｓｈｉｏ  Ｋｉｔａｍｕｒａ、東京大学からの親切な贈り物）にクローニングして、Ｂａ／Ｆ３細胞への形質導入用の分子ライブラリーを作成した。次いで、形質導入体を緑色蛍光および抗Ｔｈｙ１．１発現について選別して、そのメンバーが全てＯＭＣＰの表面発現を有していた細胞ライブラリーを得て、フレームシフト、未成熟終止コドンおよび折りたたみ不適合ＯＭＣＰをもたらす突然変異を取り除いた。このＯＭＣＰライブラリーを、ＮＫＧ２Ｄ四量体を用いてＮＫＧ２Ｄ結合について選別した。選別した細胞を、限界希釈によってクローニングし、分析した。ＮＫＧ２Ｄ結合活性が欠如したまたは低下した細胞のレトロウイルスカセットを増幅し、配列決定した。この手法を利用して、本発明者らは、Ａｓｐ１３２をＮＫＧ２Ｄ結合にとって重要な残基として同定した。
【０２６２】
タンパク質発現および精製。ＯＭＣＰＢＲおよびヒトＮＫＧ２Ｄ発現コンストラクトが以前記載された［３８］。（Ｄ１３２Ｒ）ＯＭＣＰＢＲタンパク質を、ＷＴ  ＯＭＣＰＢＲと同一に調製した。（２３Ｄ／９５Ｄ）ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ複合体を、以前記載されたように、精製封入体からの酸化的同時再折りたたみ（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｏ−ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）によって再構成した［３８］。再折りたたみタンパク質を水でゆっくり１０倍希釈し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に捕捉させた。捕捉タンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌでバルク希釈した。次いで、溶出タンパク質を濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ７５カラム（１６／６０；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製した。単分散ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ複合体（約５０ＫＤａ）を含む画分をプールし、２５ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ７．４に緩衝液交換した。
【０２６３】
結晶化、データ収集および処理。１５％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．７５を含むウェル溶液にストリークすることによって、２０℃でのハンギングドロップ蒸気拡散法によって、天然のタンパク質結晶を育てた。結晶を、１５％グリセロールを含むウェル溶液で凍結保護した後、液体窒素浴中で直接瞬間凍結した。回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅシンクロトロン（ビームライン４．２．２）で収集した。天然の（２３Ｄ／９５Ｄ）ＯＭＣＰ−ｈＮＫＧ２Ｄ結晶回折データを１００Ｋおよび１．００００４Åの波長で収集した。追加の回折データ統計を表１に要約する。ＨＫＬ２０００［６８］によるデータ処理は、原始的な単斜空間群Ｐ２１（空間群＃４）に属する結晶を示した。結晶の非対称単位は、（２３Ｄ／９５Ｄ）ＯＭＣＰ−ｈＮＫＧ２Ｄ複合体の２つのコピーを含んでいた。
【０２６４】
モデル構成および精密化。ヒトＮＫＧ２Ｄ（１ＭＰＵ）［４８］およびＯＭＣＰ（４ＦＦＥ）［３８］の構造を、Ｐｈｅｎｉｘ［６９］を通した分子置換のための検索モデルとして使用した。反復的精密化および手動再構成を、それぞれＰｈｅｎｉｘおよびＣｏｏｔ［７０］を用いて行った。２Ｆｏ−ＦｃマップとＦｏ−Ｆｃマップの両方を手動構成および溶媒分子を配置するために使用した。最終モデルは、Ｒｗｏｒｋ１６．６％およびＲｆｒｅｅ２１．４％をもたらし、全反射の４％を自由Ｒ因子交差検証のためにとっておいた。また、精密化の進行をＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹウェブサーバー［７１］を用いて測定した。モデルについての最終的なラマチャンドラン統計は９８％が好ましく０％が外れ値であった。追加の精密化統計を表１に要約する。構造の画像はプログラムＰｙＭｏｌ［７２］を用いて作成した。
【０２６５】
構造分析。ＯＭＣＰ−ＮＫＧ２Ｄ界面の接触残基、埋没表面積および形状相補性の分析を、プログラムＬｉｇｐｌｏｔ＋［７３］、ＰＩＳＡ［７４］およびＳＣ［７５］を用いて行った。ＳＢＧｒｉｄコンソーシアム［７６］によってコンパイルされた構造プログラム。ＮＫＧ２Ｄ保存の分析を、ＣｏｎＳｕｒｆサーバー［７７〜８０］を用いて行った。Ｃｏｎｓｕｒｆ分析に使用される種についてのＧｅｎＢａｎｋ番号は、ヒト（３０７４９４９４）、ボルネオオランウータン（２１９０２２９９）、チンパンジー（５７１１３９８９）、テナガザル（３３２２３２６８４）、マカク（３５５７８５８８８）、ミドリザル（６３５０６３４８５）、コモンマーモセット（３８０８４８７９９）、マウス（１４８６６７５２１）、ドブネズミ（１４９０４９２６３）、モルモット（３４８５６９０９２）、ジリス（５３２１１４３８７）、シロアシネズミ（５８９９６７９０５）、ハダカデバネズミ（５１２８６８７３３）、プレーリーハタネズミ（５３２０５３０３３）、ヨーロッパトガリネズミ（５０５８３４６０８）、ホシバナモグラ（５０７９７８７１６）、チャイニーズハムスター（５３７１３６２３０）およびネコ（４１０９６３８２６）である。
【０２６６】
原子座標。原子座標（登録コード４ＰＤＣ）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）に寄託されている。
【０２６７】
インビトロＮＫ細胞死滅アッセイ。Ｃ５７ＢＬ／６の脾細胞を２００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ２で２４時間予め活性化し、標準的な死滅アッセイにおいて安定に形質導入されたＢａ／Ｆ３細胞株に対する細胞傷害性エフェクターとして使用した。標的細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識し、活性化脾細胞と、エフェクター：標的比１０：１、２０：１および４０：１で、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、共にインキュベートした。死滅割合を、フローサイトメトリーによって評価される、死細胞除外色素７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）のＣＦＳＥ＋標的集団への組み込みによって決定した。比溶解％を、式［（実験死％−バックグラウンド死％）／（最大放出死％−バックグラウンド死％）］×１００を用いて計算した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは国立がん研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、ＭＡ）から得た。マウスを特異的病原体フリー条件下で維持し、８〜１２週齢で使用した。死滅アッセイに使用される脾細胞の単一細胞懸濁液は、標準的プロトコル［８１］を用いて生成した。
【０２６８】
【表２】
2019511905.tif 000010
【０２６９】
【表３】
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【０２７０】
【表４】
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実施例７〜１０についての参考文献
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【実施例１１】
【０２７１】
十分に機能しないナチュラルキラー細胞を有する個体は悪性腫瘍に対してより感受性である。
図１４Ａは、ＡＪおよび１２９マウスにおいて見られるより大きな腫瘍量に基づいて、ＡＪおよび１２９がマウスの肺がん感受性系統であり、Ｂ６およびＣ３Ｈがマウスの肺がん耐性系統であることを示している。図１４Ｂは、種々のマウス系統のＮＫ細胞を様々な比でＬＭ２肺癌細胞とインキュベートすると、Ｂ６およびＣ３Ｈマウス（肺がん耐性系統）から新たに単離したＮＫ細胞が、ＡＪおよび１２９マウス（肺がん感受性系統）から新たに単離したＮＫ細胞よりも有意に多いＬＭ２肺癌細胞の溶解をもたらしたことを示している。まとめると、これらのデータは、肺がんに耐性のマウス系統が、肺癌細胞をより有効に溶解するＮＫ細胞を有することを示している。さらに、感受性系統は十分に機能しないＮＫ細胞を有する。
【０２７２】
このデータはまた、ヒトデータとも相関する。図１５は、「感受性」患者に対して、「耐性」患者において、ＮＫ細胞のより多くの割合がＴＮＦαを産生しているように見えることを示している。さらに、ＮＫ細胞が以前極めて機能的であった場合でさえも、腫瘍がＮＫ細胞の溶解能力を下方制御することが示されている５３。よって、極めて機能的なＮＫ細胞を有する個体でさえ、ＮＫ細胞機能を増強する療法から利益を得ることができる。
【０２７３】
特に、エキソビボサイトカイン活性化はナチュラルキラー細胞機能不全を好転させることができる。図１６は、耐性（Ｂ６およびＣ３Ｈ）マウス系統と感受性（ＡＪおよび１２９）マウス系統の両方のＩＬ２活性化ＮＫ細胞がＬＭ２肺がん細胞を溶解することができることを示している。したがって、がん細胞の有意な溶解を示さなかったマウスＮＫ細胞（１２９＆ＡＪ系統のＮＫ細胞）は、ＩＬ２で処理をすると、溶解においてはるかに有効であった。がん耐性系統のＮＫ細胞も比溶解の％増加を示した。
【実施例１２】
【０２７４】
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２はインビボでの免疫療法を媒介した。
悪性腫瘍の免疫調節は、複数の細胞成分の複雑な相互作用を伴う。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓは、複数のモデルにおいて、腫瘍特異的寛容性に寄与し、腫瘍成長を促進することが示されてきた４、１６、１７。ＮＫ細胞およびＣＤ８＋ＣＴＬは黒色腫などの複数の腫瘍の免疫調節に寄与する１２、１８。肺がんなどの他の腫瘍は、適応免疫系による寄与がほとんどなく、ＮＫ細胞によってほぼ専ら制御される１９、２０（および未公開データＡＳ．Ｋｒｕｐｎｉｃｋ）。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２媒介免疫療法を試験するために、本発明者らは、モデル腫瘍抗原卵白アルブミンを発現するＢ１６黒色腫（ＭＯ５腫瘍細胞株）２１に頼るだろう。複数の試験によって、黒色腫成長の制御におけるＮＫ細胞とＣＤ８＋ＣＴＬの両方の役割が実証された２２〜２４。よって、黒色腫モデルは、両細胞型を活性化することができるＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２を試験することにおいて実験的利点を提供する（図１Ｅ〜図１Ｆ）。この腫瘍に特異的な試薬、例えば黒色腫腫瘍結合抗原チロシナーゼ関連タンパク質２ペプチドＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３）に特異的なＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体のための四量体は、容易に商業的に購入することができる（Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＩ．）。卵白アルブミン発現細胞株の使用はまた、結合活性が低いＴ細胞を一般的に増殖させるチロシナーゼ関連タンパク質２などの天然腫瘍結合抗原に加えて、極めて免疫原性のペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）に対する免疫応答を試験する利点も提供する２５、２６。
【０２７５】
試験を行うために、Ｂ６マウスに１×１０６個のＭＯ５黒色腫細胞を皮下注射する。腫瘍注射の１週間後、マウスを４つの群（１群当たり１０匹のマウス）に分割し、以下のいずれかの１０回の１日２回注射で処理した：野生型ＩＬ２（１群）；ｍｕｔＩＬ２（２群）；ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２（３群）または生理食塩水（４群）（図１２）。腫瘍成長を、４週間または群の１つが直径２ｃｍ超の腫瘍を発生するまで、毎日の直径測定によって追跡する。その時点で、全群のマウスを分析のために屠殺する。腫瘍成長に加えて、腫瘍と流入領域鼠径リンパ節の両方のリンパ球浸潤をフローサイトメトリーによって評価する。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの総数および活性化状態（ＩＣＯＳおよびＧＩＴＲ上方制御によって評価される）を定量化する。また、ＩＦＮ−γ産生およびＣＤ６９上方制御によって測定されるＮＫ細胞数および活性化も評価する。抗原特異的ＣＴＬ生成を、腫瘍クリアランスを主に担うＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏｗエフェクター細胞（ＥＣ）の両方を定量化することによって評価する２２、２７、２８。卵白アルブミンペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）または黒色腫特異的チロシナーゼ関連タンパク質２ペプチドＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３）（両四量体ともＰｒｏｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＩ．製）に特異的なＴ細胞受容体を用いてＣＤ８＋ＣＴＬを同定することによって、抗原特異性を決定する。ＴＵＮＥＬ染色によって腫瘍アポトーシスを定量化する。
【０２７６】
インビトロ腫瘍データとインビボ表現型分析に基づいて、本発明者らは、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２群が、多数のＮＫ細胞、抗原特異的ＣＴＬ、具体的にはＣＤ８＋ＥＣおよび少ないＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓで腫瘍成長の減弱を実証すると疑う。これが事実ということになれば、枯渇実験によってＣＤ８＋またはＮＫ  ＣＴＬについての相対的役割が決定されるだろう。ＣＴＬが増加する場合であっても、ＭＯ５成長が変化しない可能性がある。これが事実であれば、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇｓについてまたはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２処理マウスにおける骨髄由来サプレッサー細胞の存在および活性化におけるさらなる詳細を調べるだろう。黒色腫データに基づいて、同様の方法を用いて追加の腫瘍を試験する。
【実施例１３】
【０２７７】
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２融合コンストラクトによる処理後のＣＤ８＋メモリーＴ細胞生成。
一旦Ｔ細胞受容体を通して活性化したら、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞溶解能力を有する短命のＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｌｏｗエフェクター細胞（ＥＣ）に主に分化する。しかしながら、活性化細胞の一部は長命のＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｈｉ中心メモリーＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＭ）に分化する２９〜３１。ＣＤ８＋ＣＭは細胞性防御のための抗原特異的リザーバーとして作用し、再刺激すると、細胞溶解機能を有するＣＤ８＋ＥＣに分化する。ＣＤ８＋ＣＭの耐久性は、これらを長期保護のためのエキソビボ生成および養子移入のための理想的な標的にする３１。インビボでこの細胞集団を生成する可能性は、複数の腫瘍結合抗原に反応性のポリクローナル集団を確立することならびにドナーフェレーシスおよびエキソビボ増殖に関連するコスト回避を含む、エキソビボ系に対する複数の利点を提供する。腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋ＣＭのインビボ拡大はまた、頻繁なフェレーシスおよび細胞再投与の必要性を排除し得る。
【０２７８】
高用量ＩＬ２療法は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇｓとＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化をもたらすが、腫瘍結合抗原特異的ＣＤ８＋ＣＭ生成に対するその効果は未知である。抗体枯渇を用いて、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓが腫瘍特異的ＣＤ８＋ＣＭ生成を妨害することを実証する報告もあるが１７、３２、異なるモデルを用いて、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ枯渇がＣＤ８＋メモリー形成を損なうことを実証する報告もある３３、３４。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓが維持されるが活発には拡大されないユニークな免疫学的環境を作り出す（図３）。ＮＫＧ２Ｄは静止ＣＤ８＋Ｔ細胞上では発現されないが、活性化するとこの集団で誘導される３５。よって、ｍｕｔＩＬ２とは異なり、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２は、ＮＫＧ２Ｄが十分なマウスにおいて野生型ＩＬ２に匹敵するレベルでＣＤ８＋Ｔ細胞増殖をもたらす（図１Ｅ〜図１Ｆ）。しかしながら、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２のＣＤ８＋Ｔ細胞メモリー形成に対する効果は未知であるが、この細胞集団が与え得る長期の腫瘍特異的免疫に基づいて解読することが重要である。
【０２７９】
インビボでのサイトカイン刺激後の長期メモリー形成を試験するために、本発明者らは、照射腫瘍細胞ワクチン接種およびサイトカイン処理のモデルを利用する。これを達成するために、本発明者らは、１×１０７個の致死的照射（１０Ｇｙ）ＭＯ５黒色腫細胞をＣ５７Ｂｌ／６マウスに皮下注射する。次いで、レシピエントマウスを、５日間にわたって１日２回用量で、通常のＩＬ２（１群）、ｍｕｔＩＬ２（２群）、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２（３群）または生理食塩水（４群）で処理する（図１３）。注射１〜３か月後に及ぶ種々の時点でマウスを屠殺する（図１３）。脾臓、末梢リンパ節、肺および肝臓に存在するＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｈｉＣＭの表現型分析によって、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＭ形成を評価する。卵白アルブミンペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号４）または黒色腫特異的チロシナーゼ関連タンパク質２ペプチドＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号３）（共にＰｒｏｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＩ．製）についてのＭＨＣクラスＩ染色によって抗原特異性を決定する。
【０２８０】
別個のセットの実験でこのようなワクチン接種プロトコルの機能的保護を試験するために、上記の４つの群のマウスを表現型分析のために屠殺せず、生ＭＯ５黒色腫（１×１０６個細胞／マウス、皮下）を再注射する。腫瘍直径の連続測定によって黒色腫成長を評価する。マウスの一部におけるＣＤ８特異的抗体枯渇によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫学的保護への寄与を評価する（クローンＹＴＳ１６９．４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）。
【実施例１４】
【０２８１】
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ融合コンストラクトによるＣＴＬ活性化機構
ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２キメラによるエフェクター細胞機能の活性化増強の機構的理解がこの治療薬を最適化するために重要となる。融合タンパク質とＩＬ２ＲおよびＮＫＧ２Ｄの相互作用は、リンカーペプチドの長さを含むいくつかの因子に依存するようである（図１Ｅ〜図１Ｆ）。そのため、コンストラクトの最適化および将来の免疫療法プロトコルの設計を可能にするために、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２キメラ媒介ＣＴＬ活性化の機構を理解することが重要である。２ドメインキメラタンパク質は、３つの相互排他的でない機構によって、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の活性化を潜在的に増加させ得る。第一に、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２コンストラクトは標的化細胞に結合するｍｕｔＩＬ２の結合活性を増加させ得る。これにより、ｍｕｔＩＬ２と比較して占有された受容体の数の増加および増加したシグナル伝達の強度がもたらされ得る。さらに、ＮＫＧ２ＤとＩＬ２Ｒの両方との二重結合によって、受容体内部移行率が減少し、ＩＬ２によるシグナル伝達の持続時間が増加し得る。ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２コンストラクトが、ＩＬ２とＮＫＧ２Ｄの両方の刺激経路を活性化することによって、標的細胞によるシグナル伝達プロファイルを変化させることも可能である。これらの３つの相互排他的でない効果が、ＮＫＧ２Ｄ媒介様式でのＣＴＬの、本発明者らのコンストラクトの活性化の増加を説明し得る。
【０２８２】
直接的（放射標識、蛍光）または間接的（抗原排除）に、細胞に対するタンパク質の結合活性を決定するいくつかの方法が存在する３８、３９。本発明者らは、ＫｉｎＥｘＡ４０を用いて、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔリンパ球に対する野生型ＩＬ２、ｍｕｔＩＬ２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の結合活性を決定する予定である。これを達成するために、本発明者らは、磁気ビーズ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．）を用いて、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６またはＣ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＮＫＧ２Ｄ−／−マウスの脾細胞から細胞を単離する。標的細胞を、０．０５％ＮａＮ３を含む培地中１１本のファルコンチューブに２倍連続希釈する。１２番目のチューブは培地のみを含む。次いで、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２またはｍｕｔＩＬ２単独を、野生型またはＮＫＧ２Ｄ−／−細胞の各チューブに添加し、細胞とサイトカインを４℃で３６時間回転させる。３６時間の最後に、細胞を２４００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上清中に存在する遊離コンストラクトを抗ＩＬ２  ＥＬＩＳＡによって測定する。次いで、平衡解離定数（Ｋｄ）を計算する４１。この手法は、生理的密度で細胞表面分子の結合活性を測定する利点を有し、その抗原に対する抗体の親和性を人工的に低下させ得る標識の必要性を排除する４２、４３。
【０２８３】
融合タンパク質の２ドメイン構造は、ＮＫＧ２Ｄ＋およびＩＬ２Ｒ＋細胞の表面上のタンパク質の半減期を有意に増加させる可能性が高い。表面半減期の増加は、結合受容体の内部移行とシグナル伝達の強度および持続時間の両方に影響を及ぼす可能性が高い。受容体の内部移行に対処するために、本発明者らは、一定範囲の時間、各コンストラクトを上述の細胞型とインキュベートし、以前記載されたように４４フローサイトメトリーを用いてＩＬ２ＲβγおよびＮＫＧ２Ｄの細胞表面発現の変化を監視する。各コンストラクトのシグナル伝達プロファイルが重要である。ＩＬ２−ＩＬ２Ｒ会合がＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路を通してシグナル伝達する一方、ＮＫＧ２ＤがＤＡＰ１０／１２経路を通してシグナル伝達する。単量体の可溶性ＯＭＣＰはＮＫＧ２Ｄシグナル伝達を誘導しないが、ＯＭＣＰは細胞表面上で局所的に濃縮されるとシグナル伝達することができる４５。そのため、キメラがＩＬ２ＲおよびＮＫＧ２Ｄを通して二重シグナル伝達を誘導することができるかどうかを決定することが重要である。コンストラクトとインビトロでインキュベートした新たに単離したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ、ＮＫ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞中のリン酸化ＪＡＫ１およびＪＡＫ３についてのウエスタンブロット法によって、ＩＬ２媒介シグナル伝達を評価する４６、４７。以前記載されたように４８、４９、ＤＡＰ１０またはＤＡＰ１２の免疫沈降、引き続いてホスホチロシンについてのウエスタンブロット法によって、ＮＫＧ２Ｄ媒介シグナル伝達を評価する。
【０２８４】
ＩＬ２とＯＭＣＰの両方が高い親和性でその同族受容体と相互作用し；２つのタンパク質の融合体が、ＩＬ２ＲとＮＫＧ２Ｄの両方を発現する細胞に対するキメラコンストラクトの結合活性を大いに増強すると予想される。結果として、コンストラクトと２つの細胞表面受容体の係留が内部移行減少およびシグナル伝達持続時間の増加をもたらし得る。これらの２つの減少の組み合わせが、インビボにおけるＮＫ細胞の増殖増加の大概の機構を表す。ＮＫＧ２Ｄを介したシグナル伝達は、受容体クラスター形成に頼る４５。コンストラクトは可溶性であるので、ありそうにはないが、キメラがＮＫＧ２Ｄをクラスター化し、ＤＡＰ１０／１２シグナル伝達を誘導する可能性がある。しかしながら、ＤＡＰ１０／１２シグナル伝達が検出されるならば、Ｖａｖ１ノックアウトマウスに由来する細胞を用いて、ＮＫ細胞の増殖におけるこのシグナル伝達の重要性を調査するだろう。Ｖａｖ１はＤＡＰ１０の下流のシグナルメディエーターである５０。Ｖａｖ１ノックアウトを用いることは、ＤＡＰノックアウトと対照的に、ＮＫＧ２Ｄ発現をそのままにしておくという利点を有する５０。これによってＮＫＧ２Ｄシグナル伝達成分を除去しながら、ＮＫＧ２Ｄ依存性標的化をそのままにしておく。ＯＭＣＰ−ＩＬ２キメラ依存性増殖の作用機構のより明確な理解が、治療薬のさらなる精密化にとって重要となる。これらのパラメータの理解によって、キメラの効果を調整するための、主にＯＭＣＰとＩＬ２との間のリンカーの長さにおける異なるコンストラクト設計の試験が可能になる。
【実施例１５】
【０２８５】
ＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２またはＯＭＣＰ標的化ＩＬ２コンストラクトによるインビボ免疫療法。
本発明者らのコンストラクトが悪性腫瘍ならびにウイルス感染症の免疫調節において役割を果たすかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｂ１６黒色腫およびマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）のインビボモデルに頼る。実験の１セットにおいて、Ｂ６マウスに１×１０６個細胞の免疫原性が低いＢ１６黒色腫細胞株を皮下注射する。腫瘍注射１週間後、マウスを１３群（１群当たり５匹のマウス）に分割し、図１８および表４に記載されるように、ＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２、ＯＭＣＰ融合コンストラクトまたは生理食塩水の１日５回の注射で処理する。腫瘍成長を、４週間または群の１つが直径２ｃｍ超の腫瘍を発生するまで、毎日の直径測定によって追跡する。その時点で、全群のマウスを分析のために屠殺する。腫瘍成長に加えて、腫瘍と流入領域鼠径リンパ節の両方のリンパ球浸潤をフローサイトメトリーによって評価する。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの総数および活性化状態（腫瘍浸潤リンパ球の％およびＩＣＯＳ＋％として表される）を定量化する。また、ＩＦＮ−γ産生およびＣＤ６９上方制御によって測定されるＮＫ細胞数および活性化も評価する。ＴＵＮＥＬ染色によって腫瘍アポトーシスを評価する。
【０２８６】
【表５】
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【０２８７】
感染性疾患モデルにおいてＩＬ２の治療能力を評価するために、Ｂ６マウスを、以前記載されたように２９、致死量以下の用量のＭＣＭＶ（５×１０４個）粒子形成単位（ＰＦＵ）に感染させる。感染後１日目に、マウスを１３群（１群当たり５匹）に分割し、図１８および表４に記載されるように、ＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２、ＯＭＣＰ融合コンストラクトまたは生理食塩水の１日５回の注射で処理する。感染後６日目に、マウスを屠殺し、脾臓および肺ウイルス量を標準的なプラークアッセイによって決定する。
【０２８８】
可能な結果には、本発明者らがＣＴＬに対するＴｒｅｇｓの優先的活性が見られると予想する通り、純粋なＩＬ２による処理が、腫瘍成長にもウイルス量にもほとんど効果を有さないという所見が含まれる。本発明者らは、ＩＬ２の突然変異型Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ型の投与が、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの活性化が少ないために野生型ＩＬ２と比較して低い腫瘍およびウイルス量をもたらすと疑っている。それにもかかわらず、低レベルのＴｒｅｇ活性化にもかかわらず、ＩＬ２の突然変異形態によるＮＫ活性化の減少のためにＩＬ２とＲ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬとの間で腫瘍量は同一となる可能性もある。可能な結果には、ＯＭＣＰ  ＩＬコンストラクト処理マウスが、純粋なサイトカインと比較して低い腫瘍量を有するという所見が含まれ、ＯＭＣＰ−Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２が最も好ましい副作用プロファイルで免疫療法の最良の有効性を実証することが予想される。
【０２８９】
ＩＬ２コンストラクトを発現するＯＭＣＰの効果が見られない場合、極度の刺激による過剰ＣＴＬ死ならびに肝臓および肺などの全身臓器におけるＣＴＬの可能な隔離などの交絡因子についてのデータを密接に評価する。仮説が裏付けられて、ＯＭＣＰコンストラクト処理後にＮＫ細胞が活性化され、腫瘍成長が改善されたら、ＮＫ枯渇（抗ＮＫ１．１クローンＰＫ１３６、マウス抗マウス枯渇抗体を使用）およびＣＤ８枯渇（クローンＹＴＳ１６９、ラット抗マウスＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇抗体）（共にＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ製）後にこれらの実験を繰り返すだろう。これらの結果に基づいて、将来の研究は原発性発癌モデルにおける免疫療法に焦点を当てる。
【実施例１６】
【０２９０】
放射線曝露後の免疫抑制に対するＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２またはＯＭＣＰ標的化ＩＬ２コンストラクトの効果。
致死量以下の放射線曝露は、戦闘任務に関わる者に対する恒常的リスクである。放射線誘発ＤＮＡ損傷の直接的な発癌効果に加えて、致死量以下の放射線は、リンパ球サブセットの選択的死による免疫学的損傷をもたらす。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４４ｌｏナイーブＴ細胞は、放射線誘発死に特異的に感受性である一方、ＮＫ細胞機能は照射後に有意に低下する。しかしながら、ＣＤ４＋２５＋Ｔ細胞ならびにＣＤ４４ｈｉメモリー様Ｔ細胞は、照射後の生存利点を有する。ＣＤ４＋２５＋Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉＴ細胞の両方が免疫応答を下方制御し、なぜ限られた放射線への曝露であっても有意な免疫抑制がもたらされ得るのかを説明している。免疫系を回復させるための薬理的干渉によって、放射線中毒の罹患率および死亡率を改善することができる。驚くべきことに、放射線誘発変化を改善することにおけるＩＬ２の役割は研究されてこなかった。低親和性ＩＬ２受容体が、骨髄に存在する造血幹細胞およびコミットされたＮＫ前駆細胞上で発現される。さらに、ＮＫ細胞は刺激を受けると、造血回復を助けることができるサイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を分泌することができる。これらのデータに基づいて、この目的で、本発明者らは、ＩＬ２またはＯＭＣＰ−ＩＬ２コンストラクトが致死量以下および致死量の照射後の造血回復を助けることができるという仮説を試験する予定である。
【０２９１】
放射線誘発造血損傷および回復の以前記載されたモデルに基づいて、本発明者らは、Ｂ６マウスにセシウム源からの致死量以下の４．５Ｇｙまたは致死量の７．５Ｇｙを照射する。曝露１時間以内に、両照射量のマウスを表４に記載される１３群にランダムに分割し、低用量、中間用量または高用量のＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２またはＯＭＣＰ発現ＩＬ２コンストラクトで５日間処理する（図１８）。マウスの一部に、照射後に生理食塩水を注射し（１３群）（表４）、未照射未処理Ｂ６マウスも対照としてインキュベートする（１４群）。６日目に、表面下顎静脈サンプリングによって得られた末梢血のフローサイトメトリー分析によって造血回復を監視する。試料を血液１ｍｌ当たりのＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、顆粒球ならびに単球およびマクロファージの総数について分析する。未処理マウスの９０％が７．５Ｇｙへの曝露の１５〜２５日後に死亡するので、マウスを毎日追跡し、各処理群における生存曲線をカプラン・マイヤー分析によって比較する。７．５Ｇｙ群の瀕死のマウスを、フローサイトメトリーおよび組織培養によって、感染症と造血不全の両方について骨髄、脾臓および末梢臓器を評価して、死因について慎重に分析する。致死量以下の４．５Ｇｙ群のマウスは長期間生存すると予想されるので、曝露１か月後に屠殺し、末梢リンパ器官ならびに骨髄をフローサイトメトリー分析によって造血回復について評価する。
【０２９２】
放射線関連ＤＮＡ損傷は悪性形質転換をもたらす。造血悪性腫瘍は放射線曝露後に特に顕著である。ＩＬ２またはＯＭＣＰに結合したＩＬ２コンストラクトが放射線曝露後の造血悪性腫瘍を除去するのを促進する能力を評価するために、Ｂ６マウスを致死量以下のセシウム源からの４．５Ｇｙに曝露することによってＢ６マウスを処理する。照射２日後、マウスに１０３個のＲＭＡ−Ｓリンパ腫細胞を腹腔内注射し、３日後、低用量、中間用量または高用量のＩＬ２、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２またはＯＭＣＰ発現ＩＬ２コンストラクトで５日間処理する（表４、図１９）。非照射Ｂ６マウスも対照（１４群）として含める。マウスを生存について追跡する。
【０２９３】
本発明者らは、野生型ＩＬ２単独では、照射後に既に保存されているＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの優先的増殖をもたらす可能性が最も高いので、免疫修復に対する取るに足りない効果しかもたらさないと予想する。しかしながら、本発明者らは、ＧＭ−ＣＳＦなどの恒常性サイトカインの分泌を通して間接的であるにもかかわらず、Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ  ＩＬ２ならびにＯＭＣＰ発現ＩＬ２コンストラクトが、末梢血においてＮＫ画分を拡大し、広範な造血回復に寄与すると疑う。ＩＬ２と生理食塩水処理群との間で造血回復の差を検出しなかったら、免疫系の恒常性増殖誘導変化およびこのような増殖に対するＩＬ２またはＯＭＣＰ発現ＩＬ２コンストラクトの効果などの他の交絡因子を調査する。Ｂ６マウスへの毎日の２００，０００ＩＵのＩＬ２投与は致死性ではないが、本発明者らは、照射に直面して、マウスが弱くなり得ると理解する。よって、投与を調節する必要があるかもしれない。この実験の「機能的」部分のために、本発明者らは、特に、血液悪性腫瘍の制御においてＮＫ細胞が役割をもつので、ＲＭＡ−Ｓリンパ腫チャレンジの十分に確立されたモデルを利用する予定である。この確立されたアッセイにより、この目的を前進させるための迅速な実験データを得ることが可能になる。このデータに基づいて、本発明者らは、原発性発癌モデルも利用して、将来的にこの目的を拡張する。
【実施例１７】
【０２９４】
ＩＬ１５のＯＭＣＰ標的化デリバリーはＣＤ２５上方制御を増強する。
インターロイキン１５（ＩＬ１５）はＩＬ２との構造的類似性を有するサイトカインである。ＩＬ２のように、ＩＬ１５は、ＩＬ２／ＩＬ１５受容体β鎖（ＣＤ１２２）および共通のγ鎖（γ−Ｃ、ＣＤ１３２）で構成される複合体に結合し、これを通してシグナル伝達する。ＩＬ１５は、ウイルスによる感染後に単核貪食細胞（およびいくつかの他の細胞）によって分泌される。ＩＬ１５はＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および増殖を調節する。抗原の非存在下でメモリーＴ細胞を維持する生存シグナルがＩＬ１５によって提供される。このサイトカインはまた、ＮＫ細胞発達にも関係している。ＩＬ−１５はサイトカインの４αヘリックスバンドルファミリーに属する。
【０２９５】
ＯＭＣＰをサイトカインＩＬ１５に結合し、ＩＬ１５単独と比較してＮＫ細胞を活性化するその能力を調査した。ＮＫ細胞活性化をＣＤ２５上方制御によって測定した。図２１に実証されるように、等モル用量では、裸のサイトカイン単独に対して、ＩＬ１５をＯＭＣＰによって送達すると、高レベルのＣＤ２５が明らかである。
【実施例１８】
【０２９６】
ＩＬ１８のＯＭＣＰ標的化デリバリーはＮＫ細胞活性化を増強する。
ＯＭＣＰをＷＴヒトＩＬ１８、ＷＴマウスＩＬ１８または突然変異型ヒトＩＬ１８（ＩＬ１８ＢＰとの相互作用を抑制する）に結合し、ＮＫ細胞を活性化するその能力を調査した（図３２）。末梢血リンパ球を４．４μＭの野生型ＩＬ１８（青色）、ＯＭＣＰ−ＩＬ１８（赤色）または生理食塩水（黒色）中で４８時間培養した。表面ＣＤ６９発現によって測定される、ＣＤ５６＋ＣＤ３−ナチュラルキラー細胞の活性化は、野生型ＩＬ１８と比較して、ＯＭＣＰ−ＩＬ１８で優れていた（図３３）。このデータは、ＯＭＣＰとＩＬ１８の結合がまた、ＯＭＣＰのないＩＬ１８に対してＮＫ細胞活性化を増強させることを実証している。
【実施例１９】
【０２９７】
ＯＭＣＰにおけるＤ１３２Ｒ突然変異はそのＮＫＧ２Ｄ結合を有意に減少させる。
ＩＬ２の標的化デリバリーにおけるＮＫＧ２Ｄ結合の必要性をさらに試験するために、ｍｕｔＩＬ２、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２および（Ｄ１３２Ｒ）ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２の存在下で、ＮＫ拡大および活性化を試験した。Ｄ１３２Ｒ突然変異は、サイトカイン単独に対してナチュラルキラー細胞活性化の優位性を改善した（図２２）。よって、高親和性ＮＫＧ２Ｄ結合は、ＩＬ２による標的化デリバリーおよびリンパ球活性化にとって重要である。
【実施例２０】
【０２９８】
ＯＭＣＰ−ＩＬ２は西ナイルウイルス（ＷＮＶ）によって引き起こされる感染症を有効に治療する。
本発明の種々のコンストラクトが西ナイルウイルス（ＷＮＶ）によって引き起こされる感染症を治療する能力を評価した。マウスにＯＭＣＰ−ＩＬ２、ＯＭＣＰの結合欠損突然変異型、ＯＭＣＰ（Ｄ１３２Ｒ）−ＩＬ２、ＩＬ２単独、ＩＬ２（３８Ｒ／４２Ａ）単独およびＰＢＳを与えた。ＯＭＣＰ（Ｄ１３２Ｒ）−ＩＬ２およびＰＢＳで処理すると、全てのマウスが約１１日目までに感染症で死んだ。ＩＬ２単独での処理後、マウスの約２０％が２１日目まで生存した。しかしながら、ＩＬ２（３８Ｒ／４２Ａ）およびＯＭＣＰ−ＩＬ２による処理は、マウスの約４０％の２１日を超える生存をもたらした（図３０Ａ）。これらの結果は、図３０Ｂに実証されるように一貫して反復可能であった。
実施例１１〜２０についての参考文献。
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【実施例２１】
【０２９９】
Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ突然変異型ＩＬ−２の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体媒介デリバリー。
ｍｕｔＩＬ２の抗体媒介デリバリーとｍｕｔＩＬ２のＯＭＣＰ媒介デリバリーを比較するために、ＫＹＫ１およびＫＹＫ２抗体の記載される配列に基づいて（J Mol Biol 2008, 384(5), 1143-1156）、４つの抗ヒトＮＫＧ２Ｄ単鎖可変断片ドメインを設計した。ｋｙｋ１抗体由来の１ＨＬ２および１ＬＨ２ならびにｋｙｋ２抗体由来の２ＨＬ２および２ＬＨ２である。ＯＭＣＰ、ＫＹＫ１およびＫＹＫ２の結合係数はそれぞれ０．１ｎＭ、２７ｎＭおよび６ｎＭである。
【０３００】
ＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ−２、ＩｇＧ−突然変異型ＩＬ−２、野生型ＩＬ−２およびＰＢＳ対照に結合した抗体を、１０Ｕ／ｍｌまたは１００Ｕ／ｍｌの最終濃度のサイトカインまたはコンストラクトで、５００μｌの培地中、２．５×１０６個の末梢血リンパ球と共培養した。４８時間後、ＮＫ活性化を、ＰＢＳ対照と比較した細胞内パーフォリンの相対中央蛍光強度として評価した。ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｆｏｘｐ３＋活性化を、ＰＢＳ対照と比較した表面ＣＤ２５の相対中央蛍光強度として評価した。
【０３０１】
１０Ｕ／ｍｌでは、ＯＭＣＰ−突然変異型ＩＬ−２は抗体媒介デリバリーに対して増加したパーフォリンレベルへの傾向を実証したが、統計学的有意性には達しなかった（図３９）。１００Ｕ／ｍｌでは、２ＨＬ２および２ＬＨ２抗体で処理したＮＫ細胞がＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２処理細胞と同程度のパーフォリンを合成したが、１ＨＬ２および１ＬＨ２処理ＮＫ細胞では低レベルのパーフォリンが明らかであった。野生型ＩＬ２処理培養物では、全てのコンストラクトに対して高レベルのＣＤ２５が明らかであった。したがって、結果は、ＮＫＧ２Ｄ抗体に結合した突然変異型ＩＬ−２が突然変異型ＩＬ−２に結合したＯＭＣＰと同等に働くことを実証している。
【実施例２２】
【０３０２】
ＯＭＣＰ−ＩＬ２とＰＤ−１インヒビターによる併用療法。
この実施例は、ＰＤ−１抗体と組み合わせたＯＭＣＰ−ＩＬ２の併用療法のインビボ試験を記載している。
【０３０３】
合計１６匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、尾静脈注射を介してマウス１匹当たり１００，０００個のルイス肺癌細胞を播種して、腫瘍細胞の肺への播種を誘導した。その後、マウスを、細胞播種５日後に開始する以下の療法を受ける４つの群にランダム化した：
１群−抗体アイソタイプ対照、
２群−抗ＰＤ−１抗体療法、
３群−抗体アイソタイプ対照＋ＯＭＣＰ−ＩＬ２、
４群−抗ＰＤ−１抗体＋ＯＭＣＰ−ＩＬ２。
【０３０４】
１群−マウスに、２５０μｇのアイソタイプ対照抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌクローン番号２Ａ３、カタログ番号ＢＰ００８９）を、合計で４用量（合計１０００μｇ）の抗体で、週に２回、２週間、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
【０３０５】
２群−マウスに、２５０μｇの抗ＰＤ−１抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌクローン番号ＲＭＰ１−１４、カタログ番号ＢＰ０１４６）を、合計で４用量（合計１０００μｇ）の抗体で、週に２回、２週間、ｉ．ｐ．投与した。
【０３０６】
３群−マウスに、（ｉ）７５，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質を、合計で１０用量（７５０，０００ＩＵｅ）のＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質で、１日２回、５日間；および（ｉｉ）２５０μｇのアイソタイプ対照抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌクローン番号２Ａ３、カタログ番号ＢＰ００８９）を、合計で４用量（合計１０００μｇ）の抗体で、週に２回、２週間、ｉ．ｐ．投与した。
【０３０７】
４群−マウスに、（ｉ）７５，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質を、合計で１０用量（７５０，０００ＩＵｅ）のＯＭＣＰ−ＩＬ２融合タンパク質で、１日２回、５日間；および（ｉｉ）２５０μｇの抗ＰＤ−１抗体（Ｂｉｏｘｃｅｌｌクローン番号ＲＭＰ１−１４、カタログ番号ＢＰ０１４６）を、合計で４用量（合計１０００μｇ）の抗体で、週に２回、２週間、ｉ．ｐ．投与した。
【０３０８】
それぞれの療法の完了後、３週間、マウスを保持し、その時点でマウスを安楽死させた。
【０３０９】
腫瘍量が肺の重量を測定できるほどに増加させるので、肺重量を療法有効性の主要測定値として使用した。図３４は、１〜４群のマウスコホートの肺の写真を示しており、図３５は、１〜４群のマウスコホートの肺から測定される肺重量を示している。図３４および図３５に示されるように、抗ＰＤ−１抗体とＯＭＣＰ−ＩＬ２の組み合わせ（４群）は、肺の腫瘍成長を実質的に排除し、ＯＭＣＰ−ＩＬ２療法単独（３群）または抗ＰＤ−１抗体療法単独（２群）に対して腫瘍量を相乗的に減少させることが分かった。よって、併用療法は、単独で投与される各成分よりも驚くほど大きな有効性を実証した。
【実施例２３】
【０３１０】
ＩＬ２突然変異型のＰＤ１標的化デリバリーは、インビトロで細胞傷害性リンパ球を優先的に活性化する。
この実施例は、ＰＤ１リガンド療法のインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２融合タンパク質の免疫細胞活性化を実証する。
【０３１１】
合計４匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。脾細胞を以下の群に従って３６時間、３連で培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１００ＩＵｅ／ｍＬのｗｔ  ＩＬ２、３群−１００ＩＵｅ／ｍＬのｍｕｔ  ＩＬ２、４群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ１、５群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ２、６群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２、７群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２。３６時間の培養期間後、細胞を標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーについて染色し、細胞活性化を評価する。
【０３１２】
細胞集団を以下のゲーティング戦略を介して定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋、ＮＫ細胞−ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３３５＋、Ｔｅｆｆ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋。細胞活性化を、以下のマーカーが上方制御され（ｕｐｅｒｇｕｌａｔｅｄ）ているかどうかの評価を介してさらに定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＩＣＯＳ、ＮＫ細胞−ＣＤ６９およびＫＬＲＧ１、Ｔｅｆｆ−ＣＤ６９。
【０３１３】
潜在的結果には、ＮＫ細胞がｗｔＩＬ２、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２による処理によって有意に活性化されるという所見が含まれる。Ｔｅｆｆ細胞はまた、ｗｔＩＬ２、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２による処理によっても活性化され得る。これは、ｗｔＩＬ２による処理によって活性化されるが、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２によってもＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２によっても活性化されないＴｒｅｇｓと対照的である。
【０３１４】
これらの結果は、ＰＤ１リガンド融合タンパク質を介したＰＤ１細胞に対する標的化ＩＬ２療法が、ＮＫ細胞およびＴｅｆｆ細胞などの抗腫瘍細胞集団におけるＩＬ２療法の有効性を有意に増強しながら、Ｔｒｅｇ細胞などの免疫寛容集団の活性化を回避することを示唆しているだろう。
【実施例２４】
【０３１５】
ＩＬ２突然変異型のＰＤ１標的化デリバリーは、インビトロでの細胞傷害性リンパ球の増殖を誘導する
この実施例は、ＰＤ１リガンド療法のインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２融合タンパク質による細胞傷害性免疫細胞拡大を実証する。
【０３１６】
合計４匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。脾細胞を培養前にＣＦＳＥで染色する。ＣＦＳＥはＤＮＡに持続的に結合し、後の細胞分裂による蛍光の減少を介して細胞増殖の兆候を提供する。次いで、染色脾細胞を以下の群に従って６日間、３連で培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのｗｔ  ＩＬ２、３群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのｍｕｔ  ＩＬ２、４群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ１、５群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ２、６群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２、７群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２。６日間の培養期間後、細胞を標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーについて染色し、細胞増殖を評価する。
【０３１７】
細胞集団を以下のゲーティング戦略を介して定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋、ＮＫ細胞−ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３３５＋、Ｔｅｆｆ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋。
【０３１８】
潜在的結果には、ｗｔＩＬ２、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２がＮＫ細胞集団において有意な増殖を誘導するという所見が含まれる。本発明者らはまた、これらの同じ処理群を介して、Ｔｅｆｆ細胞が増殖するよう誘導されることも見出し得る。しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞はｗｔＩＬ２処理によってのみ増殖するよう誘導され、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２処理によって比較的静止状態のままである。そのため、ＮＫ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比、免疫細胞活性化およびがん治療応答についての予後のマーカーは、ｗｔＩＬ２処理単独に対してＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２処理によって有意に増強する。
【０３１９】
これらの結果は、ＰＤ１リガンド融合タンパク質を介したＰＤ１細胞に対する標的化ＩＬ２療法が、ＮＫ細胞およびＴｅｆｆ細胞などの抗腫瘍細胞集団の増殖能力を有意に増強しながら、Ｔｒｅｇ細胞などの免疫寛容集団の活性化を回避することを示唆しているだろう。
【実施例２５】
【０３２０】
リンパ球細胞傷害性は、突然変異型ＩＬ２のＰＤ１標的化デリバリーによって増強される
この実施例は、ＰＤ１リガンド療法のインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２融合タンパク質による処理後の細胞傷害性免疫細胞応答を実証する。
【０３２１】
合計６匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。バルク脾細胞を以下の群に従って６日間培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのｗｔ  ＩＬ２、３群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのｍｕｔ  ＩＬ２、４群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ１、５群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ２、６群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２、７群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２。６日間の培養期間後、細胞を、製造業者のプロトコルに従ってキットを用いて（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、品目番号６００１２０）、Ｋ５６２細胞に対する７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞傷害性アッセイのために調製する。各群の脾細胞に、以下の比で、３連で標的Ｋ５６２細胞を播種する：標的細胞なし、１５．６：１、３１．２５：１、６２．５：１、１２５：１、２５０：１、５００：１。４時間後、フローサイトメトリーを介して、生標的細胞対死標的細胞の比を評価する。
【０３２２】
潜在的結果には、ｗｔＩＬ２とインキュベートした脾細胞が、生理食塩水対照に対して、増強した標的細胞に対する細胞傷害性機能を有するという所見が含まれる。本発明者らはさらに、ＰＤＬ１−ｍｕＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２処理が脾細胞の細胞傷害性をさらに増強させることを見出すと予想する。
【０３２３】
これらの結果は、ＰＤ１リガンドＩＬ２融合タンパク質が、ｗｔＩＬ２療法に対して脾細胞細胞傷害活性を増加させることを示唆するだろう。これは、脾細胞集団内のＴｒｅｇ活性化の減少の関数となり得る。これはさらに、ＴおよびＮＫ細胞上のＩＬ２受容体を通した融合タンパク質のｍｕｔＩＬ２部分の結合およびシグナル伝達の増強の関数となり得る。
【実施例２６】
【０３２４】
ＰＤ１標的化療法によるインビボ処理後の腫瘍成長および生存
この実施例は、ＰＤ１リガンド療法が腫瘍またはがん進行を抑制するという概念のインビボ証明を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２融合タンパク質によるインビボ処理後の腫瘍成長および全体生存指標を実証する。
【０３２５】
合計５０匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用する。マウスに、マウス１匹当たり１×１０５個の細胞で側腹部にルイス肺癌を皮下注射する。処理を５日後、腫瘍が十分成長し、目に見え、測定可能になった時に開始する。初期腫瘍サイズおよびマウス体重をとり、初期腫瘍サイズおよびマウス体重が群間で同様となるように、マウスを１０匹のマウスの群にランダム化する。処理群は以下の通りである：１群−生理食塩水対照、２群−ｗｔ  ＩＬ２、３群−ｍｕｔ  ＩＬ２、４群−ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２、５群−ＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２。
【０３２６】
全てのマウスを、合計１０用量、１２時間間隔で１日２回、５日間、それらの群に従って処理する。１群−マウスに、陰性対照として全ての処理について２００μＬの生理食塩水を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与する。２群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのｗｔ  ＩＬ２を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのｗｔ  ＩＬ２でｉ．ｐ．投与する。３群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのｍｕｔ  ＩＬ２を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのｍｕｔ  ＩＬ２でｉ．ｐ．投与する。４群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２でｉ．ｐ．投与する。５群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２でｉ．ｐ．投与する。
【０３２７】
全ての腫瘍を、キャリパー測定を介して測定し、マウス体重を処理中毎日測定する。治療過程の完了後、マウス体重および腫瘍を１週間に３回測定する。苦痛または治療的処理の他の効果の徴候について試験の全体にわたってマウスを監視する。最大腫瘍直径が２０ｍｍの時に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍を後の分析のために取っておく。公知のまたは未知の原因により早まって死亡したマウスは最終的な測定を行い、組織を可能な限り早く回収する。
【０３２８】
潜在的結果には、ｗｔ  ＩＬ２で処理したマウスが生理食塩水対照と比較して相当な生理的苦痛を示し、血管漏出症候群（ＶＬＳ）のために処理自体が原因で早まって死亡さえし得るという所見が含まれる。処理を生き残ったマウスは、生理食塩水対照と比較して、いくらかの減弱した腫瘍成長および増加した生存を有し得る。潜在的結果にはさらに、ｍｕｔ  ＩＬ２で処理したマウスがＶＬＳおよび関連する生理的ストレスを有さないが、生理食塩水対照マウスと比較して腫瘍成長の減弱をほとんどまたは全く有さないという所見が含まれる。比較すると、潜在的結果には、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２が、生理食塩水対照とｗｔ  ＩＬ２群の両方に対して、有意に腫瘍成長を減弱し、生存を増加させるという所見が含まれ得る。
【０３２９】
本発明者らはさらに、免疫組織化学を介してリンパ球浸潤について残存腫瘍を分析する。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍内浸潤を評価する。さらに、本発明者らは、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、カタログ番号Ｓ７１００）を介してアポトーシスレベルを評価する。潜在的結果には、ＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２による処理が、生理食塩水対照マウスまたはｗｔ  ＩＬ２処理マウスに対してＣＤ８＋ＴｅｆｆおよびＮＫ細胞の腫瘍内浸潤を有意に増加させるという所見が含まれる。
【０３３０】
これらの結果は、ＰＤ１リガンドＩＬ２融合タンパク質、具体的にはＰＤＬ１−ｍｕｔＩＬ２およびＰＤＬ２−ｍｕｔＩＬ２が、ｗｔ  ＩＬ２またはｍｕｔ  ＩＬ２サイトカイン処理単独と比較して増加した治療利益を有することを示唆するだろう。ＰＤ１発現細胞に対してＩＬ２処理を標的化することによって、ｗｔ  ＩＬ２処理と比較して、意図しない毒性および副作用が減少する。さらに、細胞傷害性リンパ球の腫瘍内浸潤は、ＰＤ１リガンドＩＬ２融合タンパク質によって増強され、これらの細胞集団の標的化活性化がこれらの細胞が腫瘍細胞の免疫抑制を克服する能力を増加させることを示唆している。
【実施例２７】
【０３３１】
ＯＸ４０ＬのＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーは、インビトロで細胞傷害性リンパ球を優先的に活性化する。
この実施例は、ＯＸ４０Ｌ療法のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーのインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌの免疫細胞活性化を実証する。この実施例はさらに、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１およびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２によるＯＸ４０Ｌシグナル伝達の阻害を実証する。
【０３３２】
合計４匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。脾細胞を以下の群に従って３６時間、３連で培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ、３群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、４群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、５群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ、６群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、７群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２。３６時間の培養期間後、細胞を標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーについて染色し、細胞活性化を評価する。
【０３３３】
細胞集団を以下のゲーティング戦略を介して定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋、ＮＫ細胞−ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３３５＋、Ｔｅｆｆ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋。細胞活性化を、以下のマーカーが上方制御され（ｕｐｅｒｇｕｌａｔｅｄ）ているかどうかの評価を介してさらに定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＩＣＯＳ、ＮＫ細胞−ＣＤ６９およびＫＬＲＧ１、Ｔｅｆｆ−ＣＤ６９。
【０３３４】
潜在的結果には、ＮＫ細胞がＯＸ４０ＬおよびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌによる処理によって有意に活性化されるという所見が含まれる。Ｔｅｆｆ細胞は、ＯＸ４０ＬおよびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌによる処理によっても活性化され得る。これは、ＮＫ細胞活性化を阻害するはずであるＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１およびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２と対照的である。さらに、Ｔｅｆｆ細胞は、ＮＫ細胞活性化を阻害するはずであるＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１およびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２による処理によっても阻害され得る。
【０３３５】
これらの結果は、ＯＭＣＰリガンド融合タンパク質を介したＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対する標的化ＯＸ４０Ｌ療法が、ＮＫ細胞およびＴｅｆｆ細胞などの抗腫瘍細胞集団におけるＯＸ４０Ｌ療法の有効性を有意に増強することを示唆するだろう。
【実施例２８】
【０３３６】
ＯＸ４０ＬのＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーは、インビトロで細胞傷害性リンパ球の増殖を誘導する
この実施例は、ＯＸ４０Ｌ療法のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーのインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌの細胞傷害性免疫細胞拡大を実証する。
【０３３７】
合計４匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。脾細胞を培養前にＣＦＳＥで染色する。ＣＦＳＥはＤＮＡに持続的に結合し、後の細胞分裂による蛍光の減少を介して細胞増殖の兆候を提供する。その後、染色脾細胞を以下の群に従って６日間、３連で培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ、３群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、４群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、５群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ、６群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、７群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２。６日間の培養期間後、細胞を標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーについて染色し、細胞増殖を評価する。
【０３３８】
細胞集団を以下のゲーティング戦略を介して定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋、ＮＫ細胞−ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３３５＋、Ｔｅｆｆ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋。
【０３３９】
潜在的結果には、ＯＸ４０ＬおよびＯＭＣＰ−ＯＸ４０ＬがＮＫ細胞集団において有意な増殖を誘導するという所見が含まれる。本発明者らはまた、これらの同じ処理群を介して、Ｔｅｆｆ細胞が増殖するよう誘導されることも見出し得る。しかしながら、潜在的結果には、ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１およびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２による処理がＮＫ細胞拡大もＴｅｆｆ細胞拡大も誘導しないという所見が含まれ得る。ＮＫ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比、免疫細胞活性化およびがん治療応答についての予後についてのマーカーは、ＯＸ４０Ｌ処理単独に対してＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ処理によって有意に増強する。
【０３４０】
これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄリガンド融合タンパク質を介したＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対する標的化ＯＸ４０Ｌ療法が、ＮＫ細胞およびＴｅｆｆ細胞などの抗腫瘍細胞集団の増殖能力を有意に増強することを示唆しているだろう。
【実施例２９】
【０３４１】
リンパ球細胞傷害性は、ＯＸ４０ＬのＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーによって増強される
この実施例は、ＯＸ４０Ｌ療法のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーのインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌによる処理後の細胞傷害性免疫細胞応答を実証する。
【０３４２】
合計６匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。バルク脾細胞を以下の群に従って６日間培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ、３群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、４群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、５群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ、６群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、７群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２。６日間の培養期間後、細胞を、製造業者のプロトコルに従ってキットを用いて（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、品目番号６００１２０）、Ｋ５６２細胞に対する７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞傷害性アッセイのために調製する。各群の脾細胞に、以下の比で、３連で標的Ｋ５６２細胞を播種する：標的細胞なし、１５．６：１、３１．２５：１、６２．５：１、１２５：１、２５０：１、５００：１。４時間後、フローサイトメトリーを介して、生標的細胞対死標的細胞の比を評価する。
【０３４３】
潜在的結果には、ＯＸ４０Ｌとインキュベートした脾細胞が、生理食塩水、ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１およびＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２対照に対して、増強した標的細胞に対する細胞傷害性機能を有するという所見が含まれる。潜在的結果にはさらに、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ処理が脾細胞の細胞傷害性をさらに増強するという所見が含まれる。
【０３４４】
これらの結果は、ＮＫＧ２ＤリガンドＯＸ４０Ｌ融合タンパク質が、ＯＸ４０Ｌ療法に対して脾細胞細胞傷害活性を増加させることを示唆するだろう。これは、ＴおよびＮＫ細胞上のＯＸ４０受容体を通した融合タンパク質のＯＸ４０Ｌ部分の結合およびシグナル伝達の増強の関数となり得る。
【実施例３０】
【０３４５】
ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ標的化療法によるインビボ処理後の腫瘍成長および生存
この実施例は、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ療法が腫瘍またはがん進行を抑制するという概念のインビボ証明を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質によるインビボ処理後の腫瘍成長および全体生存指標を実証する。
【０３４６】
合計７０匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用する。マウスに、マウス１匹当たり１×１０５個の細胞で側腹部にルイス肺癌を皮下注射する。処理を５日後、腫瘍が十分成長し、目に見え、測定可能になった時に開始する。初期腫瘍サイズおよびマウス体重をとり、初期腫瘍サイズおよびマウス体重が群間で同様となるように、マウスを１０匹のマウスの群にランダム化する。処理群は以下の通りである：１群−生理食塩水対照、２群−ＯＸ４０Ｌ、３群−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、４群−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２、５群−ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ、６群−ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１、７群−ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２。
【０３４７】
全てのマウスを、合計１０用量、１２時間間隔で１日２回、５日間、それらの群に従って処理する。１群−マウスに、陰性対照として全ての処理について２００μＬの生理食塩水を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与する。２群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＸ４０Ｌを処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＸ４０Ｌでｉ．ｐ．投与する。３群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１でｉ．ｐ．投与する。４群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ２でｉ．ｐ．投与する。５群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌを処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌでｉ．ｐ．投与する。６群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１でｉ．ｐ．投与する。マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ  ２を処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ  ２でｉ．ｐ．投与する。
【０３４８】
全ての腫瘍を、キャリパー測定を介して測定し、マウス体重を処理中毎日測定する。治療過程の完了後、マウス体重および腫瘍を１週間に３回測定する。苦痛または治療的処理の他の効果の徴候について試験の全体にわたってマウスを監視する。最大腫瘍直径が２０ｍｍの時に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍を後の分析のために取っておく。公知のまたは未知の原因により早まって死亡したマウスは最終的な測定を行い、組織を可能な限り早く回収する。
【０３４９】
潜在的結果には、ＯＸ４０Ｌで処理したマウスが生理食塩水対照と比較していくらかの減弱した腫瘍成長および増加した生存を有し得るという所見が含まれる。潜在的結果にはさらに、ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ  １またはＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ  ２で処理したマウスが、生理食塩水対照マウスと比較して腫瘍成長の減弱をほとんどまたは全く有さないという所見が含まれる。比較すると、潜在的結果には、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌによる処理が、生理食塩水、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ１およびＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌ  ｍｕｔ  ２対照ならびにＯＸ４０Ｌ群に対して、有意に腫瘍成長を減弱し、生存を増加させるという所見が含まれ得る。
【０３５０】
本発明者らはさらに、免疫組織化学を介してリンパ球浸潤について残存腫瘍を分析する。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍内浸潤を評価する。さらに、本発明者らは、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、カタログ番号Ｓ７１００）を介してアポトーシスレベルを評価する。潜在的結果には、ＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌによる処理が、生理食塩水対照マウスまたはＯＸ４０Ｌ処理マウスに対してＣＤ８＋Ｔｅｆｆ  ＮＫ細胞腫瘍内浸潤を有意に増加させるという所見が含まれる。
【０３５１】
これらの結果は、ＮＫＧ２ＤリガンドＯＸ４０Ｌ融合タンパク質、具体的にはＯＭＣＰ−ＯＸ４０Ｌが、ＯＸ４０Ｌ処理単独と比較して増加した治療利益を有することを示唆するだろう。さらに、細胞傷害性リンパ球の腫瘍内浸潤は、ＮＫＧ２ＤリガンドＯＸ４０Ｌ融合タンパク質によって増強され、これらの細胞集団の標的化活性化がこれらの細胞が腫瘍細胞の免疫抑制を克服する能力を増加させることを示唆している。
【実施例３１】
【０３５２】
４−１ＢＢＬのＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーは、インビトロで細胞傷害性リンパ球を優先的に活性化する。
この実施例は、４−１ＢＢＬ療法のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーのインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬの免疫細胞活性化を実証する。
【０３５３】
合計４匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。脾細胞を以下の群に従って３６時間、３連で培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１００ＩＵｅ／ｍＬの４−１ＢＢＬ、３群−１００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ。３６時間の培養期間後、細胞を標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーについて染色し、細胞活性化を評価する。
【０３５４】
細胞集団を以下のゲーティング戦略を介して定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋、ＮＫ細胞−ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３３５＋、Ｔｅｆｆ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋。細胞活性化を、以下のマーカーが上方制御されているかどうかの評価を介してさらに定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＩＣＯＳ、ＮＫ細胞−ＣＤ６９およびＫＬＲＧ１、Ｔｅｆｆ−ＣＤ６９。
【０３５５】
潜在的結果には、ＮＫ細胞が４−１ＢＢＬおよびＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬによる処理によって有意に活性化されるという所見が含まれる。Ｔｅｆｆ細胞は−１ＢＢＬおよびＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬによる処理によっても活性化され得る。潜在的結果にはさらに、ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬが、４−１ＢＢＬリガンド単独に対してより大きなＮＫ、および潜在的にＴｅｆｆ細胞の活性化を示すという所見が含まれる。
【０３５６】
これらの結果は、ＯＭＣＰリガンド融合タンパク質を介したＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対する標的化４−１ＢＢＬ療法が、ＮＫ細胞およびＴｅｆｆ細胞などの抗腫瘍細胞集団における４−１ＢＢＬ療法の有効性を有意に増強することを示唆するだろう。
【実施例３２】
【０３５７】
４−１ＢＢＬのＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーは、インビトロで細胞傷害性リンパ球の増殖を誘導する
この実施例は、４−１ＢＢＬ療法のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーのインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬによる細胞傷害性免疫細胞拡大を実証する。
【０３５８】
合計４匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。脾細胞を培養前にＣＦＳＥで染色する。ＣＦＳＥはＤＮＡに持続的に結合し、後の細胞分裂による蛍光の減少を介して細胞増殖の兆候を提供する。その後、染色脾細胞を以下の群に従って６日間、３連で培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１０００ＩＵｅ／ｍＬの４−１ＢＢＬ、３群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ。６日間の培養期間後、細胞を標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーについて染色し、細胞増殖を評価する。
【０３５９】
細胞集団を以下のゲーティング戦略を介して定義する：Ｔｒｅｇｓ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋、ＮＫ細胞−ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ４９ｂ＋ＣＤ３３５＋、Ｔｅｆｆ−ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋。
【０３６０】
潜在的結果には、４−１ＢＢＬおよびＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬがＮＫ細胞集団において有意な増殖を誘導するという所見が含まれる。本発明者らはまた、これらの同じ処理群を介して、Ｔｅｆｆ細胞が増殖するよう誘導されることも見出し得る。潜在的結果にはさらに、ＮＫ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する比、免疫細胞活性化およびがん治療応答についての予後についてのマーカーは、４−１ＢＢＬ処理単独に対してＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ処理によって有意に増強するという所見が含まれる。
【０３６１】
これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄリガンド融合タンパク質を介したＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対する標的化４−１ＢＢＬ療法が、ＮＫ細胞およびＴｅｆｆ細胞などの抗腫瘍細胞集団の増殖能力を有意に増強することを示唆しているだろう。
【実施例３３】
【０３６２】
リンパ球細胞傷害性は４−１ＢＢＬによるＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーによって増強される
この実施例は、４−１ＢＢＬ療法のＮＫＧ２Ｄ標的化デリバリーのインビトロ試験を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬによる処理後の細胞傷害性免疫細胞応答を実証する。
【０３６３】
合計６匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用して新鮮な脾細胞培養物を調製する。バルク脾細胞を以下の群に従って６日間培養する：１群−生理食塩水対照、２群−１０００ＩＵｅ／ｍＬの４−１ＢＢＬ、３群−１０００ＩＵｅ／ｍＬのＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ。６日間の培養期間後、細胞を、製造業者のプロトコルに従ってキットを用いて（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、品目番号６００１２０）、Ｋ５６２細胞に対する７−ＡＡＤ／ＣＦＳＥ細胞傷害性アッセイのために調製する。各群の脾細胞に、以下の比で、３連で標的Ｋ５６２細胞を播種する：標的細胞なし、１５．６：１、３１．２５：１、６２．５：１、１２５：１、２５０：１、５００：１。４時間後、フローサイトメトリーを介して、生標的細胞対死標的細胞の比を評価する。
【０３６４】
潜在的結果には、４−１ＢＢＬとインキュベートした脾細胞が、生理食塩水対照に対して、増強した標的細胞に対する細胞傷害性機能を有するという所見が含まれる。潜在的結果にはさらに、ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ処理が脾細胞の細胞傷害性をさらに増強するという所見が含まれる。
【０３６５】
これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄリガンド４−１ＢＢＬ融合タンパク質が、４−１ＢＢＬ療法に対して脾細胞細胞傷害活性を増加させることを示唆するだろう。これは、ＴおよびＮＫ細胞上の４−１ＢＢ受容体を通した融合タンパク質の４−１ＢＢＬ部分の結合およびシグナル伝達の増強の関数となり得る。
【実施例３４】
【０３６６】
ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ標的化療法によるインビボ処理後の腫瘍成長および生存
この実施例は、ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ療法が腫瘍またはがん進行を抑制するという概念のインビボ証明を記載する。具体的には、この実施例は、精製サイトカインに対して改善したＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ融合タンパク質によるインビボ処理後の腫瘍成長および全体生存指標を実証する。
【０３６７】
合計３０匹の６〜９週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを利用する。マウスに、マウス１匹当たり１×１０５個の細胞で側腹部にルイス肺癌を皮下注射する。処理を５日後、腫瘍が十分成長し、目に見え、測定可能になった時に開始する。初期腫瘍サイズおよびマウス体重をとり、初期腫瘍サイズおよびマウス体重が群間で同様となるように、マウスを１０匹のマウスの群にランダム化する。処理群は以下の通りである：１群−生理食塩水対照、２群−４−１ＢＢＬ、３群−ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬ。
【０３６８】
全てのマウスを、合計１０用量、１２時間間隔で１日２回、５日間、それらの群に従って処理する。１群−マウスに、陰性対照として全ての処理について２００μＬの生理食塩水を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与する。２群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅの４−１ＢＢＬを処理後合計７５０，０００ＩＵｅの４−１ＢＢＬでｉ．ｐ．投与する。３群−マウスに、各用量について７５，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬを処理後合計７５０，０００ＩＵｅのＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬでｉ．ｐ．投与する。
【０３６９】
全ての腫瘍を、キャリパー測定を介して測定し、マウス体重を処理中毎日測定する。治療過程の完了後、マウス体重および腫瘍を１週間に３回測定する。苦痛または治療的処理の他の効果の徴候について試験の全体にわたってマウスを監視する。最大腫瘍直径が２０ｍｍの時に全てのマウスを安楽死させ、腫瘍を後の分析のために取っておく。公知のまたは未知の原因により早まって死亡したマウスは最終的な測定を行い、組織を可能な限り早く回収する。
【０３７０】
潜在的結果には、４−１ＢＢＬで処理したマウスが生理食塩水対照と比較していくらかの減弱した腫瘍成長および増加した生存を有し得るという所見が含まれる。比較すると、潜在的結果にはさらに、ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬによる処理が、生理食塩水対照ならびに４−１ＢＢＬ群の両方に対して、有意に腫瘍成長を減弱し、生存を増加させるという所見が含まれる。
【０３７１】
本発明者らはさらに、免疫組織化学を介してリンパ球浸潤について残存腫瘍を分析する。具体的には、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍内浸潤を評価する。さらに、本発明者らは、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡｐｏｐＴａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、カタログ番号Ｓ７１００）を介してアポトーシスレベルを評価する。潜在的結果には、ＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬによる処理が、生理食塩水対照マウスまたは４−１ＢＢＬ処理マウスに対してＣＤ８＋ＴｅｆｆおよびＮＫ細胞の腫瘍内浸潤を有意に増加させるという所見が含まれる。
【０３７２】
これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄリガンド４−１ＢＢＬ融合タンパク質、具体的にはＯＭＣＰ−４−１ＢＢＬが、４−１ＢＢＬ処理単独と比較して増加した治療利益を有することを示唆するだろう。さらに、細胞傷害性リンパ球の腫瘍内浸潤は、ＮＫＧ２Ｄリガンド４−１ＢＢＬ融合タンパク質によって増強され、これらの細胞集団の標的化活性化がこれらの細胞が腫瘍細胞の免疫抑制を克服する能力を増加させることを示唆している。
【実施例３５】
【０３７３】
エキソビボ細胞療法培養物を拡大するためのＯＭＣＰ−ＩＬ２
インビトロ細胞傷害性リンパ球拡大に対する標的化サイトカインデリバリーの有用性を評価するための実験を行った。開示されるキメラペプチド、具体的にはＯＭＣＰ−ＩＬ２を使用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞などのＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大することができる。これらの療法を、典型的にはＩＬ２の存在下、エキソビボで培養してその拡大を促進することができる。ＯＭＣＰ−ＩＬ２がＩＬ２単独よりもよくエキソビボ培養リンパ球を拡大するかどうかを決定するための実験を行った。
【０３７４】
この試験では、２．５×１０６個のＣ５７ＢＬ／６脾細胞を、プレート結合抗ＣＤ３と１０００ＩＵｅ／ｍｌの野生型ＩＬ−２またはＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２のいずれかの存在下で培養した。ＣＤ３刺激を７２時間後に除去し、サイトカイン含有培地を１日おきに補充して、培地消耗を回避した。ＣＤ３＋Ｔ細胞ならびにＮＫ１．１＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の総数を２週間の経過にわたってフローサイトメトリーによって計数し、増殖の表現型マーカー（ＫＩ６７発現）、生存率（生存率色素Ｌ３４９５９の排除による染色）および消耗（表面ＰＤ１発現）。実験の完了時（１３日目）、Ｌａｇ３およびＴｉｍ３などの他の消耗のマーカーについて細胞を評価した。
【０３７５】
結果は、野生型ＩＬ−２に対して、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２で拡大させた培養物で、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方の数の増加が明らかであることを実証した（図３７、図３８）。２つの培養物間で同様の増殖レベルが明らかであったが、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２処理細胞の生存率が高く、細胞数の増加をおそらく説明している。ＮＫ細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞の両方でＰＤ−１レベルが上昇したが、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ−２処理細胞では培養の６〜９日目までに有意に低下し、野生型ＩＬ−２処理細胞では低下しなかった。Ｔｉｍ−２およびＬａｇ−３などの他の消耗のマーカーは、野生型ＩＬ−２処理培養物でも増加した。したがって、これらの結果は、ＯＭＣＰ−ｍｕｔＩＬ２がリンパ球のエキソビボ拡大において野生型ＩＬ−２よりも有効であることを実証している。これは、養子細胞免疫療法などの療法にとって重要な意味を有する。養子細胞免疫療法は、Ｔ細胞を対象からとり、インビトロで刺激および／または遺伝子操作し、次いで、移入により患者に戻して腫瘍または感染症と戦う、Ｔ細胞に基づく免疫療法である。
【０３７６】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−１１２】
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【表６−１１３】
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【表６−１１４】
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【表６−１１５】
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【表６−１１６】
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【表６−１１７】
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【表６−１１８】
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【表６−１１９】
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【表６−１２０】
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【表６−１２１】
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【表６−１２２】
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【表６−１２３】
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【表６−１２４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２７−６】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図３９−４】
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【配列表】
2019511905000001.app
【国際調査報告】
2019511905.tif 000233
2019511905.tif 000234
2019511905.tif 000235
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