(57)【要約】  本発明はβ細胞ミメティック細胞に関する。また、β細胞ミメティック細胞を製造するための方法、並びに医薬としてのβ細胞ミメティック細胞の使用方法及び、対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のためのβ細胞ミメティック細胞の使用方法が提供される。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え細胞の炭水化物代謝に応答性であるプロモーターを含む核酸コンストラクトを含む組換え細胞であって、プロモーターが、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、組換え細胞。
【請求項２】
組換え細胞が、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトをさらに含む、請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
細胞外炭水化物を感知するための細胞成分が、膜タンパク質若しくはその断片又は膜タンパク質のサブユニット若しくはその断片である、請求項２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
細胞外炭水化物を感知するための細胞成分が膜タンパク質若しくはその断片又は膜タンパク質のサブユニット若しくはその断片であり、膜タンパク質が、Ｇタンパク質共役受容体、ＳＬＣ２Ａファミリーグルコース輸送体、ＳＬＣ５Ａファミリーナトリウム−グルコース結合輸送体、カリウムチャネル、カルシウムチャネル及びナトリウムチャネルからなる群より選択される、請求項２に記載の組換え細胞。
【請求項５】
細胞外炭水化物を感知するための細胞成分が電位開口型カルシウムチャネルである、請求項２に記載の組換え細胞。
【請求項６】
炭水化物代謝に応答性のプロモーターが、前記組換え細胞の炭水化物代謝によって引き起こされる膜脱分極の生理作用に応答性である、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項７】
炭水化物代謝に応答性のプロモーターがカルシウム応答性プロモーターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項８】
炭水化物代謝に応答性のプロモーターが、ＮＦＡＴファミリー、ＮＦｋＢファミリー、ＡＰ−１ファミリー及び／若しくはＣＲＥＢファミリー、並びに／又はｃＦＯＳの転写因子によって結合された核酸配列を含むカルシウム応答性プロモーターである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項９】
治療タンパク質が、ＧＬＰ１Ｒ−アゴニスト、インスリン、インスリンアナログ、成長ホルモン、インスリン様成長因子からなる群より選択されるインスリン生成剤；食欲抑制ホルモン；又は褐色脂肪代謝を活性化するタンパク質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１０】
治療タンパク質が代謝疾患に対する薬剤であり、代謝疾患が、Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）、Ｔ２Ｄ（２型糖尿病）、糖尿病性ケトアシドーシス、肥満、心血管疾患、メタボリックシンドローム及びがんからなる群より選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え細胞と半透膜とを含むカプセル化細胞。
【請求項１２】
医薬としての使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え細胞又は請求項１１に記載のカプセル化細胞。
【請求項１３】
対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための方法における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組換え細胞又は請求項１１に記載のカプセル化細胞。
【請求項１４】
治療タンパク質を発現する組換え細胞を製造する方法であって、
（ａ）  細胞集団を取得する工程；
（ｂ）  前記細胞の炭水化物代謝の産物に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを、前記細胞集団にトランスフェクトする工程であって、プロモーターが治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、工程；
（ｃ）  トランスフェクト細胞が治療タンパク質を発現するのを可能にするのに十分な時間、炭水化物の存在下で、トランスフェクト細胞の集団をインキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項１５】
治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを前記細胞に送達する方法であって、前記核酸コンストラクトを前記細胞に投与し、それによって治療タンパク質をコードする前記遺伝子が炭水化物刺激に応答して前記細胞において発現されることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β細胞ミメティック細胞に関する。β細胞ミメティック細胞を作成するための方法、並びに、医薬としてのβ細胞ミメティック細胞の使用の方法及び対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための、β細胞ミメティック細胞の使用の方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、多くの臨床的合併症を引き起こし得る代謝障害を含む病態生理を伴う、複雑かつ進行性の疾患である。糖尿病は現在、世界中で少なくとも４億１千５百万人（成人の１１人に１人）が罹患していると推定され（Diabetes Atlas 7Th Edition, International Diabetes Federation, 2015）、その数は１０年前に予測された２０２５年の値を既に超えている。糖尿病患者の最大の特徴は、高血糖症として知られている慢性的な血糖値の上昇であり、これは、膵臓インスリン産生β細胞の絶対的欠失（１型糖尿病、Ｔ１Ｄ）、又は運動不足、栄養失調若しくは肥満などの環境因子による活性β細胞の進行性消耗（２型糖尿病、Ｔ２Ｄ）から生じる。時間内に十分に治療されない限り、持続性高血糖症は、心血管疾患、腎不全、メタボリックシンドローム、神経因性疼痛、ホルモン機能障害及びがんなどのより重度の障害をもたらす多くの病的カスケードを起こしうる。したがって、厳密に制御されたインスリン送達を可能にするか、又は患者のβ細胞機能を回復させる治療介入による改善された血糖コントロールは、糖尿病治療において最も重要であろう。
【０００３】
Ｔ１Ｄ患者はβ細胞の選択的自己免疫破壊による完全なインスリン欠乏症に罹患しているため、治療の選択肢は、外因性インスリンの定期的又は自動的供給に集中する。対照的に、Ｔ２Ｄ療法のための可能な薬物標的の数は、この疾患型の進行性及び多因子性のために、より多い。例えば、インクレチンホルモン（例えばＧＬＰ−１−アナログ）は、グルコース刺激時に消耗性β細胞がインスリンを分泌する効率を向上させる。  近年、患者の体内でインスリン生成性成分を生成するために哺乳動物細胞の高能力を利用する研究は、効果的な薬物生成、送達及び投与量に関して有望であるため、ますます注目を集めている。例えば、幹細胞からの機能的グルコース応答性インスリン分泌性β細胞の再生（Pagliuca FW et al., Cell 159, 428-439 (2014))は、T1Dを治療するための大きな進歩であり、すなわちこのようなｅｘ  ｖｉｖｏでの再プログラム化細胞のＴ１Ｄ患者への移植は、彼らの欠陥のあるグルコース刺激インスリン発現を直ちに回復させるであろう。膵臓外哺乳類細胞型へのグルコース応答性インスリン発現エレメント（expression element）の送達に基づくアプローチ  （Han J et al., WJG 18, 6420-6426 (2012)）は、Ｔ１Ｄにおける自己免疫（再）標的化などの基本的な糖尿病の脆弱性（Aguayo-Mazzucato C and Bonner-Weir S, Nat Rev Endocrinol 6, 139-148 (2010)）及びＴ２Ｄにおける代謝ストレス誘発性β細胞アポトーシス（Marzban L et al., Diabetes 55, 2192-2201 (2006)）を防ぐことができる。近年、合成生物学にヒントを得た合理的な回路設計が、痕跡がなく（traceless）、かつ、非侵襲性のシグナルによるトリガー誘発性インスリン発現（Stanley S et al., Nat Med 21, 92-98 (2015)）又はＧＬＰ１発現（Ye H et al., Science 332, 1565-1568 (2011)）を可能にする免疫保護移植操作をもたらした。しかし、これらのアプローチのいずれも、直接的グルコース感知、治療量の内因性リアルタイム制御、及び非幹細胞ヒト細胞の直接的な操作を兼ね備えるものではない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、治療上適用可能なβ細胞ミメティック細胞及びそのようなβ細胞ミメティック細胞を製造するための方法を提供する。本発明のβ細胞ミメティック細胞は、細胞外炭水化物濃度を直接感知し、インスリン及びＧＬＰ−１などの治療タンパク質の用量依存性転写を調整することができる炭水化物誘発性転写系を含む。この系は、解糖と刺激分泌連関を組み合わせる機構を介して炭水化物をグルコースとして感知する、膵β細胞のコア機能を模倣する。移植されたβ細胞ミメティック細胞は、Ｔ１Ｄマウスにおいて、インスリン欠乏症を修正し、自律的に持続性高血糖症を消失させた。同様に、グルコース誘発性ＧＬＰ−１転写は、Ｔ２Ｄマウスにおいて、内因性のグルコース刺激インスリン放出及び耐糖能を改善した。本発明のβ細胞ミメティック細胞は、Ｔ１Ｄ、Ｔ２Ｄ、メタボリックシンドローム及び心血管疾患．からなる群より選択される例えば代謝疾患の治療に有用である。
【０００５】
したがって、第一の態様において本発明は、組換え細胞であって、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含む組換え細胞に関し、該プロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている。
【０００６】
さらなる態様において、本発明は、組換え細胞を含むカプセル化細胞に関する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、医薬としての使用のための組換え細胞又はカプセル化組換え細胞に関する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための方法における使用のための組換え細胞又はカプセル化組換え細胞に関する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、治療タンパク質を発現する組換え細胞を製造する方法であって、以下の工程を含む方法に関する：
（ａ）  細胞集団を取得する工程；
（ｂ）  前記細胞集団に、前記細胞の炭水化物代謝の産物に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトをトランスフェクトする工程であって、プロモーターが治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、工程；
（ｃ）  トランスフェクト細胞が治療タンパク質を発現するのを可能にするのに十分な時間、炭水化物の存在下で、トランスフェクト細胞の集団をインキュベートする工程。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを前記細胞に送達する方法であって、該プロモーターが治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている方法に関し、該方法は、前記核酸コンストラクトを前記細胞に投与し、それによって治療タンパク質をコードする前記遺伝子が炭水化物刺激に応答して前記細胞において発現されることを含む。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで治療タンパク質を製造するための方法であって、以下を含む方法に関する：
（ａ）  組換え細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ集団を移植可能な半透性装置内に提供すること；
（ｂ）  該細胞集団を有する装置を哺乳動物宿主に移植すること；及び
（ｃ）  細胞集団の少なくともいくつかの細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの炭水化物刺激に応答して治療用タンパク質を産生する細胞であるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記装置内の細胞集団を成熟させること。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、炭水化物の存在下でタンパク質、好ましくは治療タンパク質を発現している組換え細胞を含む細胞培養物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、哺乳動物細胞における興奮転写連関（excitation-transcription coupling）系の操作を示す。（Ａ）合成興奮転写連関システムの図解である。静止膜電位では、塩基性イオン電流は、細胞内カチオンの相対濃度（ｒｅｌ．［ｃａｔ．］ｉ）を低く保ち、原形質膜の過分極した状態を維持する。カルシウム特異的プロモーター（ＣＳＰ）からの遺伝子発現は、不活性のままである。外側のカリウムチャネル（Ｋ＋チャネル）を遮断することによって、又はカチオンの侵入を誘導することによって細胞内カチオンの連続的な増加をもたらす刺激は、膜の脱分極につながる。脱分極の程度及びその後の瞬間的な膜電位に応答して、異なる活性化閾値依存性電位開口型ナトリウム（Ｎａｖ）又はカルシウム（Ｃａｖ）チャネルが開き、脱分極シグナルを増幅する。細胞内カルシウムレベルの持続的増加は、核へ移行して、合成同種ＣＳＰからレポーター遺伝子の転写を開始する様々なカルシウム調節（calcium-regulated）転写因子（ＣＴＦ）を活性化する。（Ｂ）化学的に誘導された膜脱分極により活性化されたカルシウム特異的プロモーター。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５３（ＰｃＦＯＳ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）、ｐＨＹ３０（ＰＮＦＡＴ−ＩＬ２−ＳＥＡＰ−ｐＡ）、ｐＭＸ５６（ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４−ＳＥＡＰ−ｐＡ）又はｐＫＲ３２（ＰＮＦｋＢ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）をトランスフェクトし、０又は７５ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）含有する細胞培地中で増殖させた。ＫＣｌの添加の４８時間後に、培養上清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。（Ｃ）Ｃａｖ１．２増幅興奮転写連関。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５６（ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４−ＳＥＡＰ−ｐＡ）と、Ｃａｖ１．２（ｐＣａＶ１．２／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）又はｐｃＤＮＡ３．１（＋）のいずれかをコトランスフェクトし、異なるＫＣｌ濃度を含む細胞培地中で４８時間増殖させ、その後培養上清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。（Ｄ）ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４プロモーターの最適化ＨＥＫ−２９３細胞に、（ｐＭＸ５６、（ＮＦＡＴＩＬ４）３−Ｐｍｉｎ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）が３つ、（ｐＭＸ５７、（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）が５つ又は（ｐＭＸ５８、（ＮＦＡＴＩＬ４）７−Ｐｍｉｎ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）が７つのマウスＩｌ４由来ＮＦＡＴリピート（ＮＦＡＴＩＬ４）配列を含むプロモーター構築物によって駆動される、等量のＣａｖ１．２及びＳＥＡＰ発現ベクターをコトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を０又は４０ｍＭのＫＣｌを含有する細胞培地で４８時間増殖させ、その後培養上清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。（Ｅ）活性化閾値依存性興奮転写連関ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５７と、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、Ｃａｖ１．２（ｐＣａＶ１．２／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）又はＣａｖ２．２（ｐＣａｖ２．２／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）のいずれかをコトランスフェクトし、異なるＫＣｌ濃度を含む細胞培地中で４８時間増殖させ、その後培養上清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータはすべて、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。
【図２】図２は、膵外のヒト細胞におけるグルコース感知を示す。（Ａ）膵外ヒト細胞において異所性に発現させたグルコース感知成分の寄与分析。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５７と、（１）ｈＧＬＵＴ２（ｐｃＤＮＡ３．２／ｖ５−ＤＥＳＴ  ｈＧｌｕｔ２）、ＧＣＫ（ｐＭＸ９０）、ＫＡＴＰ（ｐＣＭＶ−ｈＳＵＲ１／ｐＣＭＶ６−ｈＫｉｒ６．２；１：１，ｗ／ｗ）及びＣａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）用の哺乳動物発現ベクター又は（０）：等量のｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ＰｈＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐＡ）をコトランスフェクトした。トランスフェクション及び低グルコース培地（２ｍＭ）中での培養の２４時間後に、示されている最終濃度までＤ−グルコースを添加した。培養上清中のＳＥＡＰレベルを、Ｄ−グルコースの添加の４８時間後に記録した。示したデータは平均値±ＳＤ、ｎ≧５；円はシミュレーション結果を示す。（Ｂ）ＨＥＫ‐２９３細胞における仮想グルコース感知機構の模式図低レベルの細胞外グルコースは、電位開口型Ｃａｖ１．３チャネルを活性化するための膜脱分極の誘導には不十分である。対照的に、より高いレベルの細胞外グルコースは、哺乳動物細胞によって取り込まれて、増加した量のＡＴＰを生成する。その後のＡＴＰ感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）の閉鎖が、Ｃａｖ１．３を活性化し、Ｃａ２＋流入の増加及びＮＦＡＴ調節転写単位のカルシニューリン依存性活性化をもたらす。
【図３】図３は、ＨｅＬａ及びヒトＭＳＣにおけるＣａｖ１．３／ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４調節ＳＥＡＰ発現を示す。（Ａ）ＨｅＬａ及び（Ｂ）ｈＭＳＣに、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）、ｐＭＸ５７及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）の等プラスミド量をコトランスフェクトし、細胞をグルコース不含培地中で１２時間培養した後、異なる濃度のＤ−グルコースを添加した。Ｄ−グルコースの添加から４８時間後、培養上清中のＳＥＡＰレベルを記録した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。
【図４】図４は、Ｃａｖ１．３／ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４で構成された興奮転写連関システムの特性評価を示す。（Ａ−Ｂ）Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ５７−トランスジェニック哺乳動物細胞の基質特異性。ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）及びｐＭＸ５７をコトランスフェクトし、グルコース不含培地中で１２時間培養した後、（Ａ）グルコース異性体及び浸透圧コントロール又は（Ｂ）栄養性糖化合物（nutritional sugar compound）を添加した。コントロール化合物の添加から４８時間後、培養上清中のＳＥＡＰレベルを記録した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｃ）右：Ｃａｖ１．３及びｐＦＳ１１９（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ：ｄｅｓｔ１−ｐＡ）をコトランスフェクトし、異なる濃度のＤ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）又は塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する培地中で培養したＨＥＫ−２９３細胞における代表的なＴｕｒｂｏＧＦＰ発現をプロファイリングする蛍光顕微鏡写真。左：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）及びｐＦＳ１１９をトランスフェクトしたコントロール細胞。
【図５】図５は、Ｃａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞株の特性評価を示す。（Ａ）Ｃａｖ１．３依存性グルコース感知。異なる量のＣａｖ１．３発現ベクター（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａｖｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）でのＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞のトランスフェクション及び低グルコース培地（２ｍＭ）中での培養から２４時間後に、示した最終濃度でＤ−グルコースを添加した。培養上清中のＳＥＡＰレベルを、Ｄ−グルコースの添加の４８時間後に記録した。曲線は、モデルのキャリブレーションに使用したデータ（１００％）と使用しなかったデータ（６６％と３３％）の対応するシミュレーションを示している。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｂ）ＳＥＡＰ発現動態。低グルコース培地（２ｍＭ）中での培養の１２時間後に、Ｃａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を、異なる濃度のＤ−グルコースを含有する細胞培地中で増殖させた。培養上清中のＳＥＡＰレベルを１２時間ごとにプロファイリングした。実線及び破線の曲線は、対応するモデルベースのシミュレーションを示している。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｃ）Ｃａｖ１．３／ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１系の時間遅延グルコース応答性。Ｃａｖ１．３−トランスジェニックＣａｖ１．３／ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を、低グルコース培地（２ｍＭ）中で０〜３６時間培養した後、示した最終濃度でＤ−グルコースを添加した。Ｄ−グルコースの添加から４８時間後、培養上清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｄ）合成興奮転写連関システムの可逆性。Ｃａｖ１．３−トランスジェニックＣａｖ１．３／ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を、細胞密度を０．７５ｘ１０６細胞／ｍＬにリセットし、Ｄ−グルコース濃度を２４時間ごとに替え、その後１２時間にわたって徹底的に洗浄しながら、高Ｄ−グルコース培地（４０ｍＭ）又は低Ｄ−グルコース培地（５ｍＭ）中で７２時間培養した。培養上清中のＳＥＡＰレベルは、高／低グルコースへの曝露の２４時間以内に１２時間ごとにプロファイリングされた。実線及び破線の曲線は、対応するモデルベースのシミュレーションを示している。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧４である。
【図６】図６は、糖尿病マウスにおけるＣａｖ１．３依存性グルコース感知及び抗糖尿病能を示す。（Ａ）異なる糖尿病マウスモデルにおける用量依存的血糖誘発性ＳＥＡＰ発現。ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞にＣａｖ１．３をトランスフェクトし、アルジネート−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルジネートビーズにマイクロカプセル化した。カプセル（１ｘ１０４；５００細胞／カプセル）を、異なる種類の糖尿病に罹患しているマウスに移植した。処置された動物の血流中ＳＥＡＰレベルを移植の４８時間後に定量した。（Ｂ，Ｃ）野生型及び２型糖尿病マウスにおける自律ＧＬＰ−１発現。ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３及びｐＭＸ１１５（（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ）をコトランスフェクトし、その後アルジネート−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルジネートビーズ（ＧＬＰ−１カプセル）にマイクロカプセル化した。コントロール移植片も同様に、カプセル化Ｃａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞（ＳＥＡＰカプセル）からなった。カプセル（１ｘ１０４；５００細胞／カプセル）を、野生型（ＷＴ）又は２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）マウスに移植した。移植の４８時間後に、血中の（Ｂ）ＧＬＰ−１及び（Ｃ）インスリンレベルをプロファイリングした。（Ｄ）野生型（ＷＴ）又は２型糖尿病マウスの腹腔内耐糖能試験（ＩＰＧＴＴ）。移植の４８時間後及び血清採取の前に、（Ｂ及びＣ）と同じマウス群に２ｇ／ｋｇのＤ−グルコース水溶液を腹腔内注射し、各動物の血糖プロファイルを３０分ごとに追跡した。データはすべて平均値±ＳＥＭで示されており、解析は両側ｔ検定で実施された（ｎ＝８マウス）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ．コントロール。（Ｅ）野生型及び１型糖尿病マウスにおける自律インスリン発現。ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３及びｐＭＸ１００（（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ−ｍＩＮＳ−ｐＡ）をコトランスフェクトし、その後アルジネート−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルジネートビーズ（ＩＮＳカプセル）にマイクロカプセル化した。コントロール移植片も同様に、カプセル化Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１１５−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞（ＧＬＰ−１カプセル）からなった。カプセル（１ｘ１０４；５００細胞／カプセル）を、野生型（ＷＴ）又は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）マウスに移植した。カプセル移植の７２時間後及び摂食の４時間後に、血清インスリンレベル（検出限界：０．２μｇ／Ｌ）をプロファイリングした。（Ｆ）Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１００トランスジェニック移植片の自律血糖コントロール。（Ｅ）と同じマウス群の空腹時血糖を、カプセル移植後９６時間追跡した。（Ｅ−Ｆ）のデータはすべて平均値±ＳＥＭで示されており、統計解析は両側ｔ検定で実施された（ｎ＝８マウス）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ．コントロール。
【図７】図７は、グルコースセンサー制御実験を示す。（Ａ）表Ｓ２に示す特異的プライマーを用いた、ＨＥＫ−２９３における内因性グルコーストランスポーター及びＫＡＴＰ−チャネルの、定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づく発現プロファイリング。未決定の値を４０サイクルの最大Ｃｔに設定することにより、転写レベルをグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）転写物に対して正規化した。データは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。（Ｂ）哺乳動物細胞における異なるグルコースセンサーの比較。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５７  １０００ｎｇ及び、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）又は完全（full）甘味受容体構成要素（componentry）（ｐＴ１Ｒ２／ｐＴ１Ｒ３／ｐＧＮＡＴ３；１：１：１，ｗ／ｗ）のいずれか１０００ｎｇをコトランスフェクトした。トランスフェクション及び低グルコース培地（２ｍＭ）中での培養の２４時間後、ｘ軸に示した最終濃度までＤ−グルコースを添加した。培養上清中のＳＥＡＰレベルを、Ｄ−グルコースの添加の４８時間後に記録した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｃ）Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ５７−トランスジェニック哺乳動物細胞の基質特異性。ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；各３３３ｎｇ）及びｐＭＸ５７（１０００ｎｇ）をコトランスフェクトし、グルコース不含培地中で１２時間培養した後、異なる濃度のＤ−グルコース（Ｄ−Ｇｌｃ）、グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）、ロイシン（Ｌ−Ｌｅｕ）、パルミチン酸（ＰＡ）又はリノール酸（ＬＡ）を添加した。コントロール化合物の添加から４８時間後、培養上清中のＳＥＡＰレベルを記録した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｄ）ＧＬｕｃ発現動態。ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；各３３３ｎｇ）及びｐＷＨ２９（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ＧＬｕｃ−ｐＡ；１０００ｎｇ）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度のＤ−グルコース（５又は４０ｍＭ）又はＫＣｌ（４０ｍＭ）を添加した。培養上清中のＧＬｕｃレベルを、ｘ軸に示したインデューサー化合物の添加後の、異なる時点でプロファイリングした。示したデータはすべて、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｅ，Ｆ）サイトカインシグナル伝達に対するＣａｖ１．３／ｐＭＸ５７−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞の非感受性。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５７（ＰＮＦＡＴ３−ＳＥＡＰ−ｐＡ；１０００ｎｇ）と、（Ｅ）Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；各３３３ｎｇ）又は（Ｆ）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（１０００ｎｇ）のいずれかをコトランスフェクトし、グルコース不含培地中で１２時間培養した後、異なる濃度の組換えヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）、  インターロイキン１２（ＩＬ−１２）及びインターロイキン１５（ＩＬ−１５）又は塩化カリウム（４０ｍＭ  ＫＣｌ；ポジティブコントロール）を添加し、４８時間後に培養上清中でＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。
【図８】図８は、安定なＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞株の設計及び構築を示す。（Ａ）異なるＰＮＦＡＴ−ＩＬ４−トランスジェニック細胞クローン（ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１）の脱分極刺激ＳＥＡＰ発現。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５７（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）を安定にトランスフェクトし、ランダムに選択した１６個の細胞クローンを塩化カリウム（ＫＣｌ）の存在下（５０ｍＭ）又は非存在下（０ｍＭ）で４８時間培養することによって、それらの脱分極刺激ＳＥＡＰ調節性能についてプロファイリングした。（Ｂ）ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞株の安定な脱分極刺激ＳＥＡＰ発現。異なる世代の５ｘ１０４個のＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を、塩化カリウム（ＫＣｌ）の存在下（５０ｍＭ）又は非存在下（０ｍＭ）で４８時間培養した後、培養上清中のＳＥＡＰレベルを記録した。示したデータはすべて、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。
【図９】図９は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤ−グルコース−及びＫＣｌ−刺激ＳＥＡＰ発現についての実験データ（記号）及びシミュレーション結果（線）を示す。（Ａ）Ｃａｖ１．３依存性興奮転写連関。ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ５７と、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（−Ｃａｖ１．３）又はＣａｖ１．３（＋Ｃａｖ１．３）のいずれかをコトランスフェクトし、異なる濃度のＫＣｌを含む細胞培地中で４８時間増殖させた後、培養上清中のＳＥＡＰレベルをプロファイリングした（図１Ｅも参照のこと）。示したデータはすべて、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｂ）Ｄ−グルコース活性化されたＰＮＦＡＴ３活性化ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３及びｐＭＸ５７をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、示した最終濃度までＤ−グルコースを添加した。コントロール化合物の添加から４８時間後、培養上清中のＳＥＡＰレベルを記録した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｃ，Ｄ）ＳＥＡＰ発現動態。ｐＭＸ５７（ＰＮＦＡＴ３−ＳＥＡＰ−ｐＡ）及びＣａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；１：１：１，ｗ／ｗ）での９ｘ１０５個のＨＥＫ−２９３細胞のトランスフェクションの１２時間後、培養上清を異なるＤ−グルコース濃度（Ｃ）及びＫＣｌ濃度（Ｄ）を含有する新鮮な培地と交換した。培養上清中のＳＥＡＰレベルを１２時間ごとにプロファイリングした。円は、同様に処理されたＣａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を表す。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。
【図１０】図１０は、グルコースセンサーのｉｎ  ｖｉｖｏ制御実験を示す。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣａｖ１．３依存性ＳＥＡＰ発現動態。野生型（ＷＴ、黒）又は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ、白）マウスにｐｃＤＮＡ３．１（＋）（−Ｃａｖ１．３）又はＣａｖ１．３（＋Ｃａｖ１．３）でトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を含有する１ｘ１０４個のマイクロカプセル（microencapsule）（５００細胞／カプセル）を移植し、血流中のＳＥＡＰレベルを２４時間ごとに定量化した（黒又は白抜きの円）。実線又は破線の曲線は、対応するモデルベースのシミュレーションを示している。平均値±ＳＤ、ｎ＝８マウスとしてデータを示す。（Ｂ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの食餌誘発性グルコース感知。野生型マウスに１ｘ１０４個のマイクロカプセル（５００ｘＣａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞／カプセル）を移植し、２００μｌの水、コカ・コーラ（登録商標）又はＤ−グルコース水溶液（０．５Ｍ）の経口投与を１日４回行った。カプセル移植の２４時間後、血流中のＳＥＡＰレベルを２４時間ごとに定量化した。平均値±ＳＤ、ｎ＝８マウスとしてデータを示す。（Ｃ，Ｄ）グルコース刺激及び脱分極刺激ｓｈＧＬＰ１発現（Ｃ）及びｍＩＮＳ発現（Ｄ）に対するＰＮＦＡＴ−ＩＬ４−プロモーターの最適化。（Ｃ）ＨＥＫ−２９３細胞に、１０００ｎｇのＣａｖ１．３及び１０００ｎｇのｐＭＸ６１（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ）、ｐＭＸ１１７（（ＮＦＡＴＩＬ４）７−Ｐｍｉｎ−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ）又はｐＭＸ１１５（（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度のＤ−グルコース（Ｇｌｃ）又は塩化カリウム（ＫＣｌ）を添加した。コントロール化合物添加の４８時間後、培養上清中のマウスのＩｇＧレベルを定量化した（ＢＤＬ：検出限界値の９．３７５ｎｇ／ｍＬ未満）。（Ｄ）ＨＥＫ−２９３細胞に、１０００ｎｇのＣａｖ１．３及び１０００ｎｇのｐＭＸ６８（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ｍＩＮＳ−ｐＡ）、ｐＭＸ９９（（ＮＦＡＴＩＬ４）７−Ｐｍｉｎ−ｍＩＮＳ−ｐＡ）又はｐＭＸ１００（（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ−ｍＩＮＳｐＡ）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度のＤ−グルコース（Ｇｌｃ）又は塩化カリウム（ＫＣｌ）を添加した。コントロール化合物添加の４８時間後、培養上清中のマウスのインスリンレベルを定量化した（ＢＤＬ：検出限界値の０．２μｇ／Ｌ未満）。示したデータはすべて、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。
【図１１】図１１（Ａ）は、健常マウス及びＴ１Ｄマウスの血糖コントロールを示す。（円）絶食ＣＤ−１スイスアルビノマウス（２ｘ８時間／日）に、新たに希釈したアロキサン一水和物（ＡＬＸ）の単回用量（ＡＬＸ；３００μＬリン酸緩衝生理食塩水中２００ｍｇ／ｋｇ）を注射し、ＡＬＸ注射後２４時間ごとに空腹時血糖を測定した。（四角）５ｘ１０６個のカプセル化Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１００−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞を含有する移植片を有する、同様に処置されたＣＤ−１スイスアルビノマウス。平均値±ＳＤ、ｎ＝６マウスとして、空腹時血糖データを示す。（Ｂ）健常な野生型（ＷＴ）マウスにおける耐糖能のモデルシミュレーション。５ｘ１０６個のＣａｖ１．３トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞移植の４８時間後、ＣＤ−１スイスアルビノマウスに２ｇ／ｋｇのＤ−グルコース水溶液を腹腔内注射し、各動物の血糖プロファイルを３０分ごとに追跡した。曲線は、対応するモデルベースのシミュレーションを示している。すべてのデータを、平均値±ＳＤ、ｎ＝８マウスとして示す。
【図１２】図１２は、１型糖尿病マウスにおけるβ細胞模倣デザイナー細胞（β-cell-mimetic designer cell）の治療能力を示す。（Ａ）ＨＥＫ−βの概略図。細胞外Ｄ−グルコースは、電位開口型カルシウムチャネルＣａＶ１．３を活性化する解糖依存性膜脱分極を引き起こし、その結果、Ｃａ２＋流入、カルモジュリン／カルシニューリンシグナル伝達カスケードの誘導、並びにインスリン発現及び分泌のＰＮＦＡＴ媒介性誘導をもたらす。（Ｂ）野生型及び１型糖尿病マウスにおける自律血糖コントロール。５Ｘ１０６６個のＨＥＫ−β細胞又は１．１Ｅ７細胞を、アルジネート−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルジネートビーズ（５００細胞／カプセル）にマイクロカプセル化し、野生型（ＷＴ）又は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）マウスに移植した（１ｘ１０４カプセル／マウス）。コントロール移植片は、マイクロカプセル化Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１１５−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞（ｃｎｔｒｌ）を含んでいた。処置された動物の空腹時血糖が、３週間記録された。ネガティブコントロール移植片で処置されたＴ１Ｄマウスは、（Ｄ）に示す７日目の耐糖能試験を生き延びなかった。（Ｃ）野生型及び１型糖尿病マウスにおける自律インスリン発現。（Ｂ）に示される治療群の食後血中インスリンレベルは、３週間までの間４日ごとにプロファイリングされた。（Ｄ）１型糖尿病マウスにおける腹腔内耐糖能試験。７日目と１４日目に、（Ｂ，Ｃ）に示す治療群に腹腔内Ｄ−グルコース（２ｇ／ｋｇ）注射を施し、個々の動物の血糖可動域を３０分間記録した。（Ｅ）ＨＥＫ−βＧＬＰの概略図。Ｄ−グルコースは、興奮転写連関によってＰＮＦＡＴ駆動プロモーターを活性化し、分泌型ヒトグルカゴン様ペプチド１（ｓｈＧＬＰ１）の用量依存的発現を引き起こす。ｓｈＧＬＰ１は、自己分泌ループを介して恒常的に発現されるＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を活性化し、ＰＣＲＥ駆動プロモーターからのインスリン発現を誘発する。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＨＥＫ−βＧＬＰ細胞によるインスリン発現は、腸細胞によるＧＬＰ−１の食後放出後にも引き起こされうる。（Ｆ）β細胞模倣移植片の餌に対する反応。野生型マウスに５ｘ１０６個のマイクロカプセル化Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ５７−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞（−ＧＬＰ１Ｒ）又はＣａｖ１．３／ｐＭＸ６１／ｐＭＸ２５８−トランスジェニックＨＥＫＧＬＰ１Ｒ細胞（＋ＧＬＰ１Ｒ）を移植し、２００μＬのＨ２Ｏ、コカ・コーラ（登録商標）又は砂糖水（０．５ＭのＤ−グルコース）を経口投与した。結果としての血中ＳＥＡＰレベルを４８時間後に定量化した。（Ｇ）野生型（ＷＴ）及び１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）マウスの経口耐糖能試験。マウスに、５ｘ１０６個のマイクロカプセル化ＨＥＫ−β、１．１Ｅ７若しくはＨＥＫ−βＧＬＰ細胞、又はＣａｖ１．３／ｐＭＸ１１５−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞（ｃｎｔｒｌ）を含有するネガティブコントロール移植片を移植した。砂糖水（Ｈ２Ｏ中２ｇ／ｋｇのＤ−グルコース）の経口投与後、個々の動物の血糖可動域を６時間記録した。（Ｈ）トランスジェニックＨＥＫ−β及びＨＥＫ−βＧＬＰ細胞含有移植片による自律血糖コントロール。５Ｘ１０６個のマイクロカプセル化ＨＥＫ−β又��ＨＥＫ−βＧＬＰ細胞を、野生型（ＷＴ）又は１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）マウス（１ｘ１０４カプセル／マウス）に移植した。処置された動物の空腹時血糖が、３週間記録された。データはすべて平均値±ＳＥＭで示されており、統計は両側ｔ検定を用いて実施された（ｎ＝８マウス）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１  ＨＥＫ−β  ｖｓ．コントロール。
【図１３】図１３は、安定なＨＥＫ−β細胞株の構築及び特性評価を示す。（Ａ，Ｂ）Ｃａｖ１．３  α１Ｄサブユニットを安定に発現するＨＥＫＭＸ２５２の特性評価。（Ａ）３ｘ１０６個のＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ２５２（ＩＴＲ−ＰｈＥＦ１α−Ｃａｃｎａ１ｄ−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ＢＦＰ−Ｐ２Ａ−ＰｕｒｏＲ−ｐＡ−ＩＴＲ；９５００ｎｇ）及び、２回の継代のために０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択されたｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００（ＰｈＣＭＶ−ＳＢ１００Ｘ−ｐＡ；５００ｎｇ）をコトランスフェクトし、その後生存集団の３ｘ１０５個の細胞（ＨＥＫＭＸ２５２）に、ｐＭＸ５７（ＰＮＦＡＴ３−ＳＥＡＰ−ｐＡ；１０００ｎｇ）及び、異なる量のｐＭＸ２５１（ＩＴＲ−ＰｈＥＦ１α−Ｃａｃｎａ２ｄ１−Ｐ２Ａ−Ｃａｃｎｂ３−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ｄＴｏｍａｔｏ−Ｐ２Ａ−ＢｌａｓｔＲ−ｐＡ−ＩＴＲ；０−２００ｎｇをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で１０００ｎｇまで充填）をコトランスフェクトした。トランスフェクション及び低グルコース培地（２ｍＭ）での培養の２４時間後、示した最終濃度までＤ−グルコース又は塩化カリウム（ＫＣｌ；５０ｍＭ）を添加した。Ｄ−グルコース添加の４８時間後に、培養上清中でＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｂ）ｐＭＸ５７（１０００ｎｇ）及び異なる量のｐＭＸ２５１（０−１０ｎｇをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で１０００ｎｇまで充填）をトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞のコントロール実験。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｃ）完全なＣａｖ１．３チャネル構成要素（Ｃａｃｎａ１ｄ／Ｃａｃｎｂ３／Ｃａｃｎａ２ｄ１）を安定的に発現するＨＥＫＣａｖ１．３の特性評価。３ｘ１０６個のＨＥＫＭＸ２５２細胞に、ｐＭＸ２５１（９５００ｎｇ）及び、３回の継代のために１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンを用いて選択されたｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００（５００ｎｇ）をコトランスフェクトし、その後生存集団の３ｘ１０５個の細胞（ＨＥＫＣａｖ１．３）に、ｐＭＸ５７（ＰＮＦＡＴ３−ＳＥＡＰ−ｐＡ；１９００ｎｇ）及びｐｃＤＮＡ３．１（＋）（１００ｎｇ）をコトランスフェクトした。ｐＭＸ５７単独（１９００ｎｇ）又はｐＭＸ２５２（１００ｎｇ）との組み合わせでコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３を、ネガティブコントロールとして使用した。トランスフェクション及び低グルコース培地（２ｍＭ）での培養の２４時間後、示した最終濃度までＤ−グルコース又は塩化カリウム（ＫＣｌ；５０ｍＭ）を添加した。Ｄ−グルコース添加の４８時間後に、培養上清中でＳＥＡＰ発現レベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｄ）ＨＥＫＣａｖ１．３におけるグルコース刺激及び脱分極刺激インスリン発現。３ｘ１０５個のＨＥＫＣａｖ１．３細胞に、異なる量のｐＭＸ２５６（ＩＴＲ−ＰＮＦＡＴ５−ＳＥＡＰ−Ｐ２Ａ−ｍＩＮＳ−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ＥＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＺｅｏＲ−ｐＡ−ＩＴＲ、１０００−２０００ｎｇをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で２０００ｎｇまで充填）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度���Ｄ−グルコース及びＫＣｌを添加した。コントロール化合物の添加の４８時間後、培養上清中でｍＩＮＳレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｅ，Ｆ）ＨＥＫ−β細胞のクローナル選択（Ｅ）３ｘ１０６個のＨＥＫＣａｖ１．３細胞に、ｐＭＸ２５６（９５００ｎｇ）及び、３回の継代のために１００μｇ／ｍＬのゼオシンを用いて選択されたｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００（５００ｎｇ）をコトランスフェクトし、最も高いＥＧＦＰ発現レベルを示す生存集団の５％をＦＡＣＳ媒介単一細胞クローニングに供した。５ｘ１０４細胞を高グルコース（４０ｍＭ）又は低グルコース培地（５ｍＭ）中で４８時間培養することによって、５０個の拡大細胞クローンをグルコース刺激ＳＥＡＰ発現についてプロファイリングした後、培養上清中でＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。（Ｆ）高グルコース（４０ｍＭ）又は低グルコース培地（５ｍＭ）中で５ｘ１０４個の細胞を４８時間培養することによって、（Ｅ）において最も高いグルコース刺激ＳＥＡＰ誘導を示した２０クローンを、グルコース刺激インスリン発現についてプロファイリングした後、培養上清中でｍＩＮＳレベルをプロファイリングした。さらなる分析のために、ＨＥＫ−β（ｎｏ．４の細胞クローン）を選択した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ＝３である。
【図１４】図１４は、モノクローナルＨＥＫ−β細胞株の特性評価を示す。（Ａ）３ｘ１０４個のＨＥＫ−β細胞を高グルコース（４０ｍＭ）又は低グルコース培地（５ｍＭ）中で４８時間培養し、Ｄ−グルコースの添加後１２時間ごとに培養上清中でｍＩＮＳレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｂ）５ｘ１０４個のＨＥＫ−β細胞を、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度のＤ−グルコースを添加し、２４時間後に培養上清中でｍＩＮＳレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｃ）可逆的グルコース刺激インスリン分泌。マウスへの移植に使用されたのと同じカプセルバッチ（ヒト膵島、図Ｓ１３；ＨＥＫ−β及び１．１Ｅ７、図６Ｂ）も、細胞培地中に３週間維持し、グルコース刺激（−、２．８ｍＭ；＋、３０ｍＭ）インスリン産生を週に１回２４時間にわたってプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。
【図１５】図１５は、ＨＥＫ−βＧＬＰの操作を示す。（Ａ）ＧＬＰ−１に誘発された、ＨＥＫ−２９３細胞におけるＳＥＡＰ発現３Ｘ１０５５個のＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＣＫ５３（ＰＣＲＥ−ＳＥＡＰ−ｐＡ；２００ｎｇ）及び異なる量のｐＭＸ２５０（ＩＴＲ−ＰｈＥＦ１α−ＧＬＰ１Ｒ−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ｄＴｏｍａｔｏ−Ｐ２Ａ−ＰｕｒｏＲ−ｐＡ−ＩＴＲ；１０−１０００ｎｇをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で１８００ｎｇまで充填）をコトランスフェクトした後、異なる濃度の組換えヒトＧＬＰ−１を添加した。ＧＬＰ−１添加の２４時間後、ＳＥＡＰレベルを培養上清中でプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｂ，Ｃ）ヒトＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を安定的に発現するＨＥＫＧＬＰ１Ｒの特性評価。（Ｂ）３ｘ１０６個のＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＭＸ２５０（９５００ｎｇ）及び、２回の継代のために１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択されたｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００（５００ｎｇ）をコトランスフェクトし、生存集団をＦＡＣＳで、異なる赤色蛍光強度を有する３集団に分類した（ＨＥＫＧＬＰ１Ｒ、ＨＥＫＧＬＰ１Ｒｍｅｄｉｕｍ、ＨＥＫＧＬＰ１Ｒｌｏｗ）。各集団（１ｘ１０５細胞）に、ｐＣＫ５３（１００ｎｇをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で２０００ｎｇまで充填）をトランスフェクトした後、異なる濃度の組換えヒトＧＬＰ−１を添加した。ＧＬＰ−１添加の２４時間後、ＳＥＡＰレベルを培養上清中でプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧３である。（Ｃ）ｐＣＫ５３（１００ｎｇをｐｃＤＮＡ３．１（＋）で２０００ｎｇまで充填）でトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞をネガティブコントロールとして使用した。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｄ，Ｅ）ＨＥＫ−βＧＬＰ回路の検証ＨＥＫＧＬＰ１Ｒに、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；各３３３ｎｇ）、ｐＭＸ６１（ＰＮＦＡＴ３−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ；１０００ｎｇ）及びｐＣＫ５３（ＰＣＲＥ−ＳＥＡＰ−ｐＡ；２５０ｎｇ）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度の（Ｄ）組換えヒトＧＬＰ−１又は（Ｅ）Ｄ−グルコースを添加した。ｐＭＸ６１／ｐＣＫ５３又はＣａｖ１．３／ｐＣＫ５３でコトランスフェクトされたＨＥＫＧＬＰ１Ｒ及びＣａｖ１．３／ｐＭＸ６１／ｐＣＫ５３でコトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３をネガティブコントロールとして使用した。Ｄ−グルコース添加の（Ｄ）２４時間後及び（Ｅ）７２時間後に、培養上清中でＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｆ，Ｇ）ＳＥＡＰ発現動態。ＨＥＫＧＬＰ１Ｒ細胞に、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；各３３３ｎｇ）、ｐＭＸ６１（ＰＮＦＡＴ３−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ；１０００ｎｇ）及びｐＣＫ５３（ＰＣＲＥ−ＳＥＡＰ−ｐＡ；２５０ｎｇ）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度の（Ｆ）組換えヒトＧＬＰ−１又は（Ｇ）Ｄ−グルコースを添加した。各化合物の添加の（Ｆ）２４時間又は（Ｇ）７２時間後に、ＳＥＡＰレベルを培養上清中でプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。（Ｈ）ＨＥＫ−βＧＬＰ．のｍＩＮＳ発現動態。ＨＥＫＧＬＰ１Ｒ細胞に、Ｃａｖ１．３（ｐＣａＶ１．３／ｐＣａＶｂ３／ｐＣａＶα２δ１；各３３３ｎｇ）、ｐＭＸ６１（ＰＮＦＡＴ３−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ；１０００ｎｇ）及びｐＤＡ１４５（ＰＣＲＥ−ｍＩＮＳ−ｐＡ；１０００ｎｇ）をコトランスフェクトし、低グルコース培地（２ｍＭ）中で１２時間培養した後、異なる濃度の組換えヒトＧＬＰ−１を添加した。コントロール化合物の添加の２４時間後に、培養上清中でＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。示したデータは、平均値±ＳＤ、ｎ≧５である。
【図１６】図１６は、カプセル化ヒト膵島で処置された１型糖尿病マウスの経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）を示す。２０００ＩＥＱのヒト膵島をアルジネート−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルジネートビーズ中にマイクロカプセル化し、４頭の１型糖尿病マウスのそれぞれに注射した。移植の７日及び１４日後に、動物にＤ−グルコース（２ｇ／ｋｇ）を経口投与し、それらの血糖可動域を２時間にわたり記録した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明がより容易に理解されうるように、最初に特定の用語を定義する。本明細書内で別途定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術的及び科学的用語は、その技術分野で認識されている意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。材料、方法、及び例は、単なる例示であって、限定を意図するものではない。用語「含む(comprising)、(including)」及び「有する(having)」は、別段の定めがない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「〜を含むがこれに限定されない」の意味）と解されるものとする。
【００１５】
本明細書で使用される場合、用語「ベータ細胞」又は「β細胞」とは、膵臓、特に哺乳動物の、より具体的にはヒトの膵島に見られる細胞型をいう。ベータ細胞は、インスリンの主要な産生体である。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「組換え細胞」とは、哺乳動物細胞に導入される遺伝子を発現するように、例えば発現ベクターなどの核酸コンストラクトを用いるトランスフェクション又は形質転換などの技術によって人工的に操作された細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞をいい、導入される遺伝子は発現ベクターなどの核酸コンストラクトに組み込まれる。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「トランスフェクション」又は「トランスフェクトされた」とは、核酸の導入、例えば本明細書に記載の核酸コンストラクトの細胞への導入をいう。核酸は一般に、ＤＮＡ配列、特に、本明細書に記載の治療タンパク質をコードする遺伝子などの目的遺伝子を担持するベクター又はプラスミドであり、本明細書に記載の適切なプロモーターに作動可能に連結されている。用いることができるトランスフェクション方法は、例えばＤＯＴＡＰ（ロッシュ）、トランスファスト（ＴｒａｎｓＦａｓｔ）（プロメガ）及びリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）等のカチオン性脂質又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストランといった担体分子を使用するものがある。その他の有用なトランスフェクション技術には、エレクトロポレーション、核酸でコーティングされた担体粒子での照射（遺伝子銃）、マイクロインジェクション及びウイルスベクターの使用が含まれる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「一過性にトランスフェクトされた」又は「一過性トランスフェクション」は、導入された核酸のエピソーム性による、目的遺伝子の一過性、すなわち非永久的な発現をいう。ＤＮＡ（プラスミド又はベクター）を含むエピソーム核酸は、２〜７日後に細胞によって分解され、それ故にその後目的遺伝子の発現は停止する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「安定にトランスヘクトされた」又は「安定なトランスフェクション」という用語は、トランスフェクトされたＤＮＡの、細胞のゲノムへの組み込みに起因する目的遺伝子の永久発現をいう。すべてではないにしても殆どの細胞は、非常に低い速度ではあるがエピソームＤＮＡをそれらのゲノムに取り込む可能性を有する。しかし、トランスフェクトされたＤＮＡを組み込んだ細胞を増やすために、洗練された選択戦略が採用されている。核酸コンストラクトが安定に組み込まれるためには、トランスフェクトされるべきＤＮＡを担持するベクターは通常、選択マーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子、例えばピューロマイシン耐性遺伝子を含有する。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「核酸コンストラクト」という用語は、核酸、好ましくは組換え核酸コンストラクト、すなわち遺伝子の核酸と宿主細胞におけるその転写を指示するための少なくとも１つのプロモーターとを含む遺伝子操作された核酸コンストラクトをいう。本発明の核酸コンストラクトは好ましくは、哺乳動物細胞発現に適している。核酸コンストラクト（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、コンストラクト、例えばベクターを真核生物における複製及び組込みに適したベクター（例えばシャトルベクター）にする追加の配列を含んでもよい。さらに、例えばクローニングベクターなどの典型的な核酸コンストラクトは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター、並びにポリアデニル化シグナルも含みうる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させて、ＲＮＡ合成を開始させることによって転写の開始を媒介する、遺伝子の上流に通常位置する調節ＤＮＡ配列をいう。本明細書で使用される「Ｐｍｉｎ」という用語は、最小プロモーター、好ましくは配列番号３３に示されるプロモーターをいう。最小プロモーターは通常、エンハンサーを含まず、すなわちエンハンサーエレメントを含まず、恒常的プロモーターではない。最小プロモーターは好ましくは、転写因子の非存在下では転写活性を全く示さないか、最小限しか示さない。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、遺伝子の同一性、遺伝子に対する配列の位置又は配列の方向と無関係に遺伝子の転写を増強するように作用するヌクレオチド配列をいう。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結されている」及び「作動可能に連結されている」という用語は、互換的に使用され、２つ以上のＤＮＡセグメント間、特に発現される遺伝子配列とそれらの発現を制御する遺伝子配列の間の機能的関係をいう。例えば、シス作用性転写調節エレメントの任意の組み合わせを含むプロモーター及び／又はエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写された遺伝子配列に作動可能に連結されているプロモーター調節配列は、転写された配列に物理的に隣接している。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーター」という用語は、細胞の炭水化物代謝の産物の存在又は非存在に応答して転写のために活性化又は抑制されるプロモーターをいう。細胞の炭水化物代謝は、炭水化物変換又は炭水化物分解の細胞経路の代謝、例えば細胞内ＡＴＰ産生などの解糖の産物、又は細胞内の炭水化物の代謝に対する細胞応答、例えば、細胞応答として膜脱分極を引き起こすＫＡＴＰチャネルの閉鎖をもたらす細胞内ＡＴＰの産生であってもよい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「細胞の炭水化物代謝」という用語は、生物における炭水化物の形成、分解及び相互変換を担う様々な生化学的プロセスをいう。オリゴ糖及び／又は多糖は、典型的にはグリコシドヒドロラーゼと呼ばれる酵素によってより小さい単糖に切断される。その後、単糖単位は、炭水化物変換又は炭水化物分解の細胞経路、すなわち解糖などのグルコース変換又は分解の細胞経路に入る。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「細胞外炭水化物を感知するための細胞成分」という用語は、例えば、グルコースの輸送体若しくはグルコース結合輸送体などの炭水化物の輸送体、例えばグルコースホメオスタシスなどの炭水化物ホメオスタシスの調節に関わる受容体、又は、遺伝子、好ましくはその発現レベルが細胞外炭水化物レベルと相関する、治療タンパク質をコードする遺伝子を活性化することによってグルコースなどの細胞外炭水化物を感知することができるカリウムチャネル、カルシウムチャネル又はナトリウムチャネル等の膜タンパク質などの細胞成分をいう。通常、本発明の組換え細胞の細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、遺伝子、好ましくはその発現レベルが、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性であるプロモーターを介した細胞外炭水化物レベルと相関する、治療タンパク質をコードする遺伝子を活性化することによってグルコースなどの細胞外炭水化物を感知することができ、プロモーターは治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結している。細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、好ましくは哺乳動物由来のもの、より好ましくはヒト由来のものである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「炭水化物」又は「糖質」は、この文脈内で互換可能にかつ同等に用いられ、通常は２：１の水素-酸素原子比（水と同じ）、言い換えれば実験式Ｃｍ（Ｈ２Ｏ）ｎ（式中、ｍはｎと異なりうる）を有する炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）及び酸素（Ｏ）原子からなる生体分子をいう。炭水化物には、単糖、二糖、オリゴ糖及び多糖、好ましくは単糖及び二糖、さらに好ましくは単糖、最も好ましくはグルコース、ガラクトース、フルクトース及びキシロース、並びにマンノースのようなそれらのエピマー型（epimeric form）からなる群より選択される単糖、特にグルコース及びマンノースが含まれる。最も広い意味での「グルコース」という用語は、グルコース及びマンノースのようなそのエピマー型を指す。好ましくは、用語「グルコース」は、グルコース（Ｄ−グルコース、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２，３，４，５，６−ペンタヒドロキシヘキサナール）を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「膜タンパク質」とは、細胞又は細胞小器官の膜に結合又は会合しているタンパク質分子をいう。膜タンパク質は、好ましくはヒトの細胞又は細胞小器官の膜タンパク質である。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「膜タンパク質の断片」という用語は、完全長の膜タンパク質と比較して長さが短い膜タンパク質の領域をいう。ただし、一部として使用される膜タンパク質のいかなる断片も完全長膜タンパク質の活性を保持することが、本発明の必要条件である。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「膜タンパク質のサブユニット」又は「膜タンパク質のモノマー」という用語は、この文脈内で互換可能にかつ同等に用いられ、連結した２つ以上のポリペプチド鎖から構成される膜タンパク質を作製する別々のポリペプチド鎖をいう。２つ以上のサブユニットから構成される膜タンパク質分子において、各サブユニットは、それ自体で安定な折り畳み構造を形成することができる。タンパク質のサブユニットのアミノ酸配列は、同一であっても、類似であっても、完全に異なっていてもよい。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「膜脱分極の生理作用」という用語は、細胞内で生理活性によって、特に前記細胞の炭水化物代謝によって引き起こされる、細胞の膜の脱分極による生理作用、例えば、細胞内カチオン（例えば細胞内カルシウム、細胞内ナトリウム又は細胞内カリウム）濃度、特に細胞内カルシウム濃度の変動をいう。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「カルシウム応答性プロモーター」という用語は、細胞中のカルシウムの存在又は非存在に応答して転写のために活性化又は抑制されるプロモーターをいう。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「発現系」とは、細胞内の一組のトランスジェニック遺伝子エレメント及び当該遺伝エレメントによってコードされたタンパク質をいう。
【００３４】
本明細書で使用される「Ｇタンパク質共役受容体」という用語は、細胞外の分子を感知し、Ｇタンパク質を介した特定の細胞内シグナル伝達経路と共役することによって細胞内の応答を活性化する膜貫通型受容体のファミリーをいう。好ましいＧタンパク質共役受容体は、ＧＰＲ１、ＴＡＳ１Ｒ２、ＴＡＳ１Ｒ３、ＧＬＰ１Ｒ又はこれらのオルソログのいずれかである。最も好ましいＧタンパク質共役受容体は、ＧＰＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＡ９８５９３．１）、ＴＡＳ１Ｒ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ８ＴＥ２３．２）、ＴＡＳ１Ｒ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ７ＲＴＸ０．２）及びＧＬＰ１Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４３２２０．２）である。
【００３５】
本明細書で使用される「グルコインクレチン（glucoincretin）受容体」という用語は、グルコインクレチン受容体、例えば胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）及びグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）などのグルコインクレチン受容体、好ましくはヒトグルコインクレチン受容体、例えばヒトＧＩＰＲ、例えばヒトＧＩＰＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４８５４６）及び／又はヒトＧＬＰ１Ｒ、例えばＧＬＰ１Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４３２２０．２）をいう。
【００３６】
本明細書で使用される「ＳＬＣ２Ａファミリーのグルコース輸送体」（ＧＬＵＴとしても知られている）という用語は、哺乳動物細胞への炭水化物の進入を触媒する膜貫通タンパク質のファミリーをいう。好ましいＳＬＣ２Ａファミリーのグルコース輸送体は、ＧＬＵＴ１（ＳＬＣ２Ａ１）、ＧＬＵＴ２（ＳＬＣ２Ａ２）、ＧＬＵＴ３（ＳＬＣ２Ａ３）、ＧＬＵＴ４（ＳＬＣ２Ａ４）、ＧＬＵＴ５（ＳＬＣ２Ａ５）、ＧＬＵＴ６（ＳＬＣ２Ａ６）、ＧＬＵＴ７（ＳＬＣ２Ａ７）、ＧＬＵＴ８（ＳＬＣ２Ａ８）、ＧＬＵＴ９（ＳＬＣ２Ａ９、ＧＬＵＴ１０（ＳＬＣ２Ａ１０）、ＧＬＵＴ１１（ＳＬＣ２Ａ１１）、ＧＬＵＴ１２（ＳＬＣ２Ａ１２）及びＧＬＵＴ１３（ＳＬＣ２Ａ１３）又はこれらのオルソログのいずれかである。最も好ましいＳＬＣ２Ａファミリーのグルコース輸送体は、ヒトＧＬＵＴ１、ヒトＧＬＵＴ２及びヒトＧＬＵＴ３である。
【００３７】
本明細書で使用される「ＳＬＣ５Ａファミリーのナトリウム−グルコース結合輸送体」（ＳＧＬＴとしても知られている）という用語は、哺乳動物細胞の原形質膜を横切る炭水化物のナトリウム依存性共輸送を媒介する膜貫通タンパク質のファミリーをいう。好ましいＳＬＣ５Ａファミリーのナトリウム−グルコース結合輸送体は、ＳＧＬＴ１（ＳＬＣ５Ａ１）、ＳＧＬＴ２（ＳＬＣ５Ａ２）及びＳＧＬＴ３（ＳＬＣ５Ａ３）又はこれらのオルソログのいずれかである。最も好ましいＳＬＣ５Ａファミリーのナトリウム−グルコース結合輸送体は、ヒトＳＧＬＴ１及びヒトＳＧＬＴ３である。
【００３８】
本明細書で使用される「カリウムチャネル」という用語は、細胞原形質膜を横切るカリウムイオンの輸送を促進する孔形成膜貫通タンパク質のファミリーをいう。好ましいカリウムチャネルは、ＡＴＰ感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）、カルシウム活性化カリウムチャネル（ＢＫＣａ）、内向き整流カリウムチャネル（Ｋｉｒ）及び電位依存性カリウムチャネル（Ｋｖ）である。最も好ましいカリウムチャネルは、ヒトＡＴＰ感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）、ヒトカルシウム活性化カリウムチャネル（ＢＫＣａ）、ヒト内向き整流カリウムチャネル（Ｋｉｒ）及びヒト電位依存性カリウムチャネル（Ｋｖ）である。
【００３９】
本明細書で使用される用語「カルシウムチャネル」とは、細胞原形質膜を横切るカルシウムイオンの輸送を促進する孔形成膜貫通タンパク質のファミリーをいう。好ましいカルシウムチャネルは、電位開口型カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸型のグルタミン酸（ＮＭＤＡ）受容体、Ｃａ２＋放出活性化Ｃａ２＋電流（ＣＲＡＣ）チャネル、及び一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰＣ）である。最も好ましいカルシウムチャネルは、ヒト電位開口型カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）、ヒトＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸型のグルタミン酸（ＮＭＤＡ）受容体、ヒトＣａ２＋放出活性化Ｃａ２＋電流（ＣＲＡＣ）チャネル、及びヒト一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰＣ）である。
【００４０】
本明細書で使用される用語「ナトリウムチャネル」は、細胞原形質膜を横切るナトリウムイオンの輸送を促進する孔形成膜貫通タンパク質のファミリーをいう。好ましいナトリウムチャネルは、電位開口型ナトリウムチャネル、最も好ましくはヒト電位開口型ナトリウムチャネルである。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「電位開口型カルシウムチャネル」（ＶＤＣＣ）とは、カルシウムイオンＣａ２＋に対する浸透性が膜電位と相関する興奮性細胞の膜に見出される一群の電位開口型イオンチャネル、好ましくはヒト電位開口型カルシウムチャネルをいう。電位依存性カルシウムチャネルは、いくつかの異なるサブユニットの複合体として形成される。知られているサブユニットは、孔形成Ｃａｖα１、細胞内Ｃａｖβ、膜貫通Ｃａｖγ、及びジスルフィド結合ダイマーＣａｖα２δである。α１サブユニットは、ＶＤＣＣにおいて機能するチャネルに必要な主サブユニットであって、それぞれ６つの膜貫通αヘリックスを含む特徴的な４つの相同なＩ-ＩＶドメインからなり、イオン伝導性細孔を形成する一方、関連サブユニットはゲーティングの調節を含めたいくつかの機能を有する。電位開口型カルシウムチャネルは、チャネル全体の活性化閾値を設定するα１サブユニットによって機能化される。α１サブユニットの非限定的な例は、Ｃａｖ１．１、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ１．３、Ｃａｖ１．４、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２及びＣａｖ３．３である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「治療タンパク質」とは、治療上適用可能なタンパク質を指し、すなわち治療タンパク質は、治療効果を提供するために発現されうる任意のタンパク質又はポリペプチド、特に代謝疾患に関する治療効果を提供するために発現されうるタンパク質である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、タンパク質、例えば受容体又はチャネルに関する「オルソログ」という用語は、異なる種に見られる２つ以上の相同遺伝子配列のうちの１つを指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「インスリン」は、血中グルコース濃度を低下させ、それ故に血糖値の調節に関与する、膵臓内のベータ細胞によって産生されるタンパク質ホルモンをいう。１国際単位のインスリン（１ＩＵ）は、３４．７μｇの純粋な結晶性インスリンの「生物学的等価物」と定義され、これは絶食ウサギの血糖濃度を４５ｍｇ／ｄｌ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）に下げるのに必要な量に相当する。インスリンは、結合しているＣ−ペプチドを介して連結しているインスリンのＢ鎖とＡ鎖からなるプロインスリン前駆体として産生される。インスリン自体は、Ｂ鎖とＡ鎖のみで構成されている。ヒトインスリンは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ-０００２０７２に対応するＩＮＳ遺伝子によってコードされる。用語「インスリン」又は「インスリン分子」は、Ａ鎖ペプチドとＢ鎖ペプチドを含む５１アミノ酸ヘテロダイマーを指す総称であり、ここでＡ鎖の６位と１１位のシステイン残基はジスルフィド結合で連結しており、Ａ鎖の７位とＢ鎖の７位のシステイン残基はジスルフィド結合で連結しており、Ａ鎖の２０位とＢ鎖の１９位のシステイン残基はジスルフィド結合で連結している。用語「インスリン」とは、動物の体内で炭水化物の代謝に影響を与え、糖尿病の治療において価値のある、膵臓の有効成分を意味する。この用語は、構造、使用及び意図された効果において天然に存在するインスリンと同じ又は類似しており、真性糖尿病の治療において価値のある合成及びバイオテクノロジー由来の製品を含む。
【００４５】
本明細書で使用される用語「インスリンアナログ」とは、天然Ａ鎖ペプチド及び／又はＢ鎖ペプチドの１つ以上の修飾を含む、任意のヘテロダイマーアナログ又は単鎖アナログを含む。修飾には、限定されないが、Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１６、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１７、Ｂ１８、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３０から選択される位置で天然アミノ酸をアミノ酸で置換すること；Ｂ１−４位及びＢ２６−３０位のいずれか又はすべてを削除すること；あるいは、直接又はポリマー若しくは非ポリマーリンカーによって、１以上のアシル、ポリエチルグリシン（ＰＥＧ）又は糖質部分（複数可）をコンジュゲートすること：あるいはこれらの組み合わせが含まれる。インスリンアナログの例には、限定されないが、公開国際出願ＷＯ２０１０００８０６０６、ＷＯ２００９０９９７６３及びＷＯ２０１００８０６０９（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に開示されているヘテロダイマー及び単鎖アナログが含まれる。また、単鎖インスリンアナログの例には、限定されないが、公開国際出願ＷＯ９６３４８８２、ＷＯ９５５１６７０８、ＷＯ２００５０５４２９１、ＷＯ２００６０９７５２１、ＷＯ２００７１０４７３４、ＷＯ２００７１０４７３６、ＷＯ２００７１０４７３７、ＷＯ２００７１０４７３８、ＷＯ２００７０９６３３２、ＷＯ２００９１３２１２９：米国特許第．５３０４４７３号及び第６６３０３４８号；並びにＫｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０５：９８１−９８６（１９９５）（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に開示されているものが含まれる。用語「インスリンアナログ」とは、インスリン受容体において検出可能な活性を殆ど又は全く有しないがインスリン受容体で活性を有するように１つ以上のアミノ酸修飾又は置換を含むように修飾された、インスリン受容体において天然インスリンと比較して少なくとも１％、１０％、５０％、７５％又は９０％の活性を有する単鎖及びヘテロダイマーポリペプチド分子をさらに含み、かつ、少なくとも１つのＮ結合グリコシル化部位をさらに含む。特定の態様では、インスリンアナログは、インスリン受容体において、天然インスリンの２分の１から１００分の１の活性を有する部分アゴニストである。他の態様では、インスリンアナログは、インスリン受容体、例えば、公開国際出願ＷＯ２０１００８０６０７（これは参照により本明細書に援用される）に開示されているＩＧＦ＜Ｂ１６Ｂ１７＞誘導体ペプチドにおいて増強された活性を有する。インスリン成長ホルモン受容体での活性の低下及びインスリン受容体での活性増強を有するこれらのインスリンアナログは、ヘテロダイマーと単鎖アナログの双方を含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「自己」又は「内因性」という用語は、前記組換え細胞又は生物に固有の細胞又は生物に存在する任意の物質をいう。
【００４７】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、特定の細胞に分化することができ、かつ、増殖してより多くの幹細胞を産生することができる未分化の生物細胞をいう。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「体細胞」とは、生殖系列細胞又は未分化幹細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞をいう。
【００４９】
用語「個体」、「対象」又は「患者」は、本明細書では互換的に使用される。特定の実施態様では、対象は哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）が含まれる。好ましい実施態様では、対象はヒトである。
【００５０】
本明細書で用いられる「約」という用語は、所与の測定値の＋／−１０％を指す。
【００５１】
第一の態様において本発明は、組換え細胞であって、前記細胞の炭水化物代謝応答性プロモーターを含む核酸コンストラクトを含む組換え細胞を提供し、該プロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている。好ましくは、炭水化物代謝産応答性プロモーターは、グルコース代謝に応答性である。
【００５２】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、前記組換え細胞の炭水化物代謝によって引き起こされる膜脱分極の生理作用に応答性である。好ましくは、細胞の炭水化物代謝によって引き起こされる膜脱分極の生理作用は、細胞外カルシウム流入である。したがって、好ましい実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、前記組換え細胞の炭水化物代謝によって引き起こされる膜脱分極の生理作用に応答し、前記細胞の炭水化物代謝によって引き起こされる膜脱分極の生理作用は、細胞外カルシウム流入である。したがって、さらなる好ましい実施形態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、細胞外カルシウム流入に応答性である。
【００５３】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、カルシウム応答性プロモーター、好ましくは、ＮＦＡＴファミリー、ＮＦｋＢファミリー、ＡＰ−１ファミリー及び／若しくはＣＲＥＢファミリー、並びに／又はｃＦＯＳの転写因子によって結合された核酸配列を含むカルシウム応答性プロモーター、より好ましくは、ＮＦＡＴファミリーの転写因子によって結合された核酸配列を含むカルシウム応答性プロモーターである。
【００５４】
ＮＦＡＴファミリーは、免疫応答において重要であることが示されている転写因子のファミリーである。ＮＦＡＴファミリーの１つ以上のメンバーが免疫系の殆どの細胞で発現される。ＮＦＡＴはまた、心筋、骨格筋及び神経系の発達にも関与している。ＮＦＡＴファミリーは、自身と同種のプロモーターに特異的に結合するＮＦＡＴ１、ＮＦＡＴ２、ＮＦＡＴ３、ＮＦＡＴ４及びＮＦＡＴ５タンパク質を含む。ＮＦＡＴ結合部位を含有する好ましいプロモーターは、１つ又は複数の５’−ＧＧＡＡＡ−３’コンセンサス部位を含有する合成又は天然プロモーターであり、より好ましいものは哺乳動物サイトカインプロモーター、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４プロモーター、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）プロモーター、オーファン核内受容体７７（ＮＵＲ７７）プロモーター、インターフェロンγプロモーター、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）プロモーター及び転写因子のＴボックスファミリー（Ｔ−ｂｅｘ及びエオメソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ））のプロモーターからなる群より選択される哺乳動物サイトカインプロモーター、好ましくはインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４プロモーター及びＰＰＡＲγプロモーターである。最も好ましいものは、マウスインターロイキン（ＩＬ）−４プロモーターである。したがって、一実施形態では、組換え細胞の炭水化物代謝に応答するプロモーターは、１つ又は複数の５’−ＧＧＡＡＡ−３’コンセンサス部位を含有するＮＦＡＴ結合部位を含有する合成又は天然プロモーター、より好ましくは哺乳動物サイトカインプロモーター、例えばインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４プロモーター、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）プロモーター、オーファン核内受容体７７（ＮＵＲ７７）プロモーター、インターフェロンγプロモーター、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）プロモーター、及び転写因子のＴボックスファミリーのプロモーター（Ｔ−ｂｅｘ及びエオメソデルミン）からなる群より選択される哺乳動物サイトカインプロモーター、好ましくはインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４プロモーター及びＰＰＡＲγプロモーター、最も好ましくはマウスインターロイキン（ＩＬ）−４プロモーターである。マウスインターロイキン（ＩＬ）−４プロモーターは、例えばＲｏｏｎｅｙ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３，６２５−６３３（１９９４）に記載されている。
【００５５】
ＮＦｋＢファミリーは、ＤＮＡの転写、サイトカイン産性及び細胞生存を制御する転写因子として作用するタンパク質複合体のファミリーである。ＮＦｋＢファミリーは、ＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ２、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ及びｃ−Ｒｅｌを含む。ＮＦｋＢファミリーの好ましいメンバーは、ＮＦ−κＢ１及びＮＦ−κＢ２、より好ましくはヒトＮＦ−κＢ１及びＮＦ−κＢ２である。
【００５６】
ＡＰ−１ファミリーは、サイトカイン、成長因子、ストレスおよび感染症を含む様々な刺激に応答して遺伝子発現を調節する転写因子のファミリーである。ＡＰ−１は、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ及びＪＤＰファミリーに属するタンパク質で構成されるヘテロダイマーである。ＡＰ−１ファミリーの好ましいメンバーは、ｃ−Ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎである。ｃＦＯＳは、転写因子のＦＯＳファミリーに属し、６２ｋＤａタンパク質をコードするヒトがん原遺伝子であり、転写因子のＪｕｎファミリーの一部）とヘテロダイマーを形成し、その結果、標的細胞のプロモーター及びエンハンサー領域のＡＰ−１特異的部位でＤＮＡと結合し、細胞外シグナルを遺伝子発現の変化に変換するＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）複合体が形成される。
【００５７】
ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）ファミリーは、高度に保存されたヌクレオチド配列、５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’を含むｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）に結合し、それによりＣＲＥ含有プロモーター（ＰＣＲＥ）からの標的遺伝子発現を調節する転写因子のファミリーである。ＣＲＥＢファミリーの好ましいメンバーは、ＣＲＥＢ１及びＡＴＦ４、より好ましくはヒトＣＲＥＢ１及びＡＴＦ４である。
【００５８】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターはカルシウム応答性プロモーターであり、カルシウム応答性プロモーターは、１つ又は複数のプロモーターに作動可能に連結されたＮＦＡＴファミリー、ＮＦｋＢファミリー、ＡＰ−１ファミリー及び／若しくはＣＲＥＢファミリー、並びに／又はｃＦＯＳ（ここで、１つ又は複数のプロモーターはエンハンサーエレメントを含まず、すなわち恒常的プロモーターではない）からなる群より選択される転写因子の結合部位の１つ又は複数のタンデムリピートからなる合成プロモーターである。
【００５９】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターはカルシウム応答性プロモーターであり、カルシウム応答性プロモーターは、１つ又は複数のプロモーターに作動可能に連結されたＮＦＡＴの結合部位の１つ又は複数のタンデムリピートからなる合成プロモーターであり、ここで、１つ又は複数のプロモーターはエンハンサーエレメントを含まず、カルシウム応答性プロモーターのＮＦＡＴ結合部位の配列は、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４プロモーター、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲγ）プロモーター、オーファン核内受容体７７（ＮＵＲ７７）プロモーター、インターフェロンγプロモーター、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（ＧＡＴＡ３）プロモーター、及び転写因子のＴボックスファミリーのプロモーター（Ｔ−ｂｅｘ及びエオメソデルミン）からなる群より選択される哺乳動物サイトカインプロモーターの、好ましくはインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４プロモーター及びＰＰＡＲγプロモーターの、最も好ましくはマウスインターロイキン（ＩＬ）−４プロモーターの１つ又は複数のタンデムリピート、特に配列番号３４に示されるマウスインターロイキン（ＩＬ）−４プロモーターの結合部位の１つ又は複数のタンデムリピート、好ましくは３から９つのタンデムリピート、より好ましくは３、５、７又は９つのタンデムリピートを含む。一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターはカルシウム応答性プロモーターであり、ここでカルシウム応答性プロモーターは、ＣＲＥ含有合成哺乳動物プロモーター、好ましくは、例えばＡｕｓｌａｎｄｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５５，３９７-４０８（２０１４）に記載のＰＣＲＥプロモーター、より好ましくは配列番号６０を含むＰＣＲＥプロモーターである。
【００６０】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、配列番号４を含む。
【００６１】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、配列番号５を含む。
【００６２】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、配列番号６を含む。
【００６３】
一実施態様では、炭水化物代謝に応答性のプロモーターは、配列番号３９を含む。
【００６４】
一実施態様では、組換え細胞は、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする、特に細胞外グルコースを感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。細胞外炭水化物、例えば細胞外グルコースを感知するための細胞成分は、好ましくは膜タンパク質若しくはその断片又は膜タンパク質のサブユニット若しくはその断片、より好ましくはＧタンパク質共役受容体、ＳＬＣ２Ａファミリーグルコース輸送体、ＳＬＣ５Ａファミリーナトリウム−グルコース結合輸送体、カリウムチャネル、カルシウムチャネル及びナトリウムチャネルからなる群より選択される膜タンパク質若しくはその断片又は膜タンパク質のサブユニット若しくはその断片、最も好ましくはカリウムチャネル、カルシウムチャネル及びナトリウムチャネルからなる群より選択される膜タンパク質若しくはその断片又は膜タンパク質のサブユニット若しくはその断片、特にカルシウムチャネル、より特定的には電位開口型カルシウムチャネルである。
【００６５】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答するプロモーターを含む２つ以上のコンストラクトを含むことができ、ここでプロモーターは治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている。好ましくは、各核酸コンストラクトは、異なる治療タンパク質をコードする遺伝子を含む。したがって、好ましい実施態様では、組換え細胞は２つ以上の核酸コンストラクトを含み、ここで第１の核酸コンストラクトは前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含み、ここでプロモーターは、第１の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第２の又はさらなる核酸コンストラクトは前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含み、ここでプロモーターは、第２の又はさらなる治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第１の治療タンパク質は、第２の又はさらなる治療タンパク質と異なっている。
【００６６】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第１のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここで第１のプロモーターは、第１の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、かつ、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第２のプロモーターを含む核酸コンストラクトをさらに含み、ここでプロモーターは第２の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第１の治療タンパク質は第２の治療タンパク質と異なっており、第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なるか又は同じであり、好ましくは第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なっている。
【００６７】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、かつ、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００６８】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第１のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここで第１のプロモーターは、第１の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、かつ、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第２のプロモーターを含む核酸コンストラクトをさらに含み、ここでプロモーターは第２の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第１の治療タンパク質は第２の治療タンパク質と異なっており、第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なるか又は同じであり、好ましくは第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なっており、組換え細胞は、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００６９】
一実施態様では、組換え細胞は、グルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクをさらに含む。グルコインクレチン受容体は、好ましくは胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）又はグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、より好ましくはＧＩＰＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ４８５４６）などのヒトＧＩＰＲ及び／又はＧＬＰ１Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４３２２０．２）などのヒトＧＬＰ１Ｒ、最も好ましくはヒトＧＬＰ１Ｒ、特にＧＬＰ１Ｒ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４３２２０．２）である。好ましい実施態様では、組換え細胞は、恒常的に発現するグルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００７０】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第１のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここで第１のプロモーターは、第１の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、かつ、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第２のプロモーターを含む核酸コンストラクトをさらに含み、ここでプロモーターは第２の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第１の治療タンパク質は第２の治療タンパク質と異なっており、第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なるか又は同じであり、好ましくは第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なっており、組換え細胞は、グルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００７１】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、かつ、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクト及びグルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００７２】
一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第１のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここで第１のプロモーターは、第１の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、かつ、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性の第２のプロモーターを含む核酸コンストラクトをさらに含み、ここでプロモーターは第２の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第１の治療タンパク質は第２の治療タンパク質と異なっており、第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なるか又は同じであり、好ましくは第１のプロモーターは第２のプロモーターと異なっており、組換え細胞は、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクト及びグルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００７３】
一実施態様では、組換え細胞は、細胞外炭水化物（例えば細胞外グルコース）を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトをさらに含み、ここで細胞外炭水化物（例えば細胞外グルコース）を感知するための細胞成分は、電位開口型カルシウムチャネルであって、通常はＣａｖ１．１、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ１．３、Ｃａｖ１．４、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２及びＣａｖ３．３からなる群より選択される電位開口型カルシウムチャネル、より好ましくはＣａｖ１．２、Ｃａｖ１．３、Ｃａｖ２．２、最も好ましくはＣａｖ１．３ｄである。好ましい実施態様では、細胞外炭水化物（例えば細胞外グルコース）を感知するための細胞成分は、電位開口型カルシウムチャネルのサブユニットの組み合わせ、より好ましくは、Ｃａｖβ１（ＣＡＣＮＢ１）、Ｃａｖβ２（ＣＡＣＮＢ２）、Ｃａｖβ３（ＣＡＣＮＢ３）及びＣａｖβ４（ＣＡＣＮＢ４）からなる群より選択されるβサブユニットと、Ｃａｖα２δ１（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）、Ｃａｖα２δ２（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、Ｃａｖα２δ３（ＣＡＣＮＡ２Ｄ３）及びＣａｖα２δ４（ＣＡＣＮＡ２Ｄ４）からなる群より選択されるα２δサブユニットと、Ｃａｖ１．１（ＣＡＣＮＡ１Ｓ）、Ｃａｖ１．２（ＣＡＣＮＡ１Ｃ）、Ｃａｖ１．３（ＣＡＣＮＡ１Ｄ）、Ｃａｖ１．４（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）、Ｃａｖ２．１（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、Ｃａｖ２．２（ＣＡＣＮＡ１Ｂ）、Ｃａｖ２．３（ＣＡＣＮＡ１Ｅ）、Ｃａｖ３．１（ＣＡＣＮＡ１Ｇ）、Ｃａｖ３．２（ＣＡＣＮＡ１Ｈ）及びＣａｖ３．３（ＣＡＣＮＡ１Ｉ）からなる群より選択されるα１サブユニットとの組み合わせ、さらにいっそう好ましくはＣａｖβ３（ＣＡＣＮＢ３）及びＣａｖα２δ１（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）と組み合わせたα１サブユニットのＣａｖ１．２（ＣＡＣＮＡ１Ｃ）、Ｃａｖ１．３（ＣＡＣＮＡ１Ｄ）、Ｃａｖ２．２（ＣＡＣＮＡ１Ｂ）、最も好ましくはＣａｖβ３（ＣＡＣＮＢ３）及びＣａｖα２δ１（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）と組み合わせたα１サブユニットのＣａｖ１．３（ＣＡＣＮＡ１Ｄ）である。
【００７４】
一実施態様では、組換え細胞は、自己細胞成分を発現する細胞（すなわち細胞外炭水化物を感知するための細胞成分を自己的に発現する細胞）であり、ここで細胞外炭水化物を感知するための自己細胞成分は、Ｇタンパク質共役受容体、ＳＬＣ２Ａファミリーグルコース輸送体、ＳＬＣ５Ａファミリーナトリウム−グルコース結合輸送体、カリウムチャネル、カルシウムチャネル及びナトリウムチャネルからなる群より選択される膜タンパク質、特にカルシウムチャネル、より具体的には電位開口型カルシウムチャネルである。好ましい実施態様では、組換え細胞は、カルシウムチャネル、好ましくは電位開口型カルシウムチャネル、特に、Ｃａｖ１．１、Ｃａｖ１．２、Ｃａｖ１．３、Ｃａｖ１．４、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３、Ｃａｖ３．１、Ｃａｖ３．２及びＣａｖ３．３からなる群より選択される電位開口型カルシウムチャネル、より好ましくはＣａｖ１．２、Ｃａｖ１．３、Ｃａｖ２．２、最も好ましくはＣａｖ１．３を自己的に発現する。好ましい実施態様では、細胞外炭水化物（例えば細胞外グルコース）を感知するための細胞成分は、電位開口型カルシウムチャネルのサブユニットの組み合わせ、より好ましくは、Ｃａｖβ１（ＣＡＣＮＢ１）、Ｃａｖβ２（ＣＡＣＮＢ２）、Ｃａｖβ３（ＣＡＣＮＢ３）及びＣａｖβ４（ＣＡＣＮＢ４）からなる群より選択されるβサブユニットと、Ｃａｖα２δ１（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）、Ｃａｖα２δ２（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、Ｃａｖα２δ３（ＣＡＣＮＡ２Ｄ３）及びＣａｖα２δ４（ＣＡＣＮＡ２Ｄ４）からなる群より選択されるα２δサブユニットと、Ｃａｖ１．１（ＣＡＣＮＡ１Ｓ）、Ｃａｖ１．２（ＣＡＣＮＡ１Ｃ）、Ｃａｖ１．３（ＣＡＣＮＡ１Ｄ）、Ｃａｖ１．４（ＣＡＣＮＡ１Ｆ）、Ｃａｖ２．１（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、Ｃａｖ２．２（ＣＡＣＮＡ１Ｂ）、Ｃａｖ２．３（ＣＡＣＮＡ１Ｅ）、Ｃａｖ３．１（ＣＡＣＮＡ１Ｇ）、Ｃａｖ３．２（ＣＡＣＮＡ１Ｈ）及びＣａｖ３．３（ＣＡＣＮＡ１Ｉ）からなる群より選択されるα１サブユニットとの組み合わせ、さらにいっそう好ましくはＣａｖβ３（ＣＡＣＮＢ３）及びＣａｖα２δ１（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）と組み合わせたα１サブユニットのＣａｖ１．２（ＣＡＣＮＡ１Ｃ）、Ｃａｖ１．３（ＣＡＣＮＡ１Ｄ）、Ｃａｖ２．２（ＣＡＣＮＡ１Ｂ）、最も好ましくはＣａｖβ３（ＣＡＣＮＢ３）及びＣａｖα２δ１（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１）と組み合わせたα１サブユニットのＣａｖ１．３（ＣＡＣＮＡ１Ｄ）である。
【００７５】
通常、本発明の組換え細胞の細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、前記組換え細胞に含まれる炭水化物代謝に応答性のプロモーターを活性化し、例えば本発明の組換え細胞の細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、前記組換え細胞に含まれる炭水化物代謝に応答性のプロモーターを活性化し、ここで、プロモーターが作動可能に連結された治療タンパク質をコードする遺伝子が発現され、前記遺伝子の発現レベルは細胞外炭水化物のレベルと相関する。特定の実施態様では、本発明の組換え細胞の細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、組換え細胞へのカルシウム流入を介してプロモーターを活性化する。
【００７６】
一実施態様では、組換え細胞は、非膵臓細胞、好ましくは非膵臓哺乳動物細胞、より好ましくは非膵臓ヒト細胞である。
【００７７】
一実施態様では、組換え細胞は、哺乳動物細胞、好ましくヒト細胞である。組換え哺乳動物細胞は、好ましくは、腎臓細胞、肝細胞、幹細胞、血球、脳細胞、神経細胞、腸細胞、線維芽細胞、及び脂肪由来細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞、より好ましくは幹細胞、腎臓細胞又は肝細胞、最も好ましくは幹細胞又は腎臓細胞、特に腎臓細胞である。組換えヒト細胞は、好ましくは、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ラット副腎髄質のクロム親和性細胞腫（ＰＣ１２）、マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎ２Ａ）、肝臓−肝細胞癌（ＨｅｐＧ２）、腸内分泌Ｌ−細胞、ヒト上皮結腸直腸腺癌（Ｃａｃｏ２）及び臨床グレードのヒト神経幹細胞（ＣＴＸ）からなる群より選択されるヒト細胞、好ましくはＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ及びＭＳＣ細胞、最も好ましくはＨＥＫ−２９３細胞である。
【００７８】
一実施態様では、組換え細胞は、一過性にトランスフェクトされた組換え細胞である。一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトで一過性にトランスフェクトされた組換え細胞（ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている）、好ましくは前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトで一過性にコトランスフェクトされた組換え細胞（ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている）であり、核酸コンストラクトは、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードし、かつ／又は核酸コンストラクトはグルコインクレチン受容体をコードする。
【００７９】
一実施態様では、組換え細胞は、安定にトランスフェクトされた組換え細胞である。一実施態様では、組換え細胞は、前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトで安定にトランスフェクトされた組換え細胞（ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている）、好ましくは前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトで一過性にコトランスフェクトされた組換え細胞（ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている）であり、核酸コンストラクトは、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードし、かつ／又は核酸コンストラクトはグルコインクレチン受容体をコードする。
【００８０】
特定の実施耐態様では、本発明の組換え細胞は、前記細胞のグルコース代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、また、任意選択的に該組換え細胞は、細胞外グルコースを感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクト及び／又はグルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００８１】
別の特定の実施態様では、本発明の組換え細胞は、カルシウム応答性プロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここでプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、また、任意選択的に該組換え細胞は、膜タンパク質若しくはその断片又は膜タンパク質のサブユニット若しくはその断片をコードする核酸コンストラクト（ここで膜タンパク質は、Ｇタンパク質共役受容体、ＳＬＣ２Ａファミリーグルコース輸送体、ＳＬＣ５Ａファミリーナトリウム−グルコース結合輸送体、カリウムチャネル、カルシウムチャネル及びナトリウムチャネルからなる群より選択され、特にカルシウムチャネルである）及び／又はグルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００８２】
別の特定の実施態様では、本発明の組換え細胞は、カルシウム応答性プロモーターを含む核酸コンストラクトを含み、ここプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、また、任意選択的に該組換え細胞は、電位開口型カルシウムチャネル核酸コンストラクト及び／又はグルコインクレチン受容体をコードする核酸コンストラクトをさらに含む。
【００８３】
本発明の発現系の特定の例示的実施態様を図２Ｂに示す。ここで、ＮＦＡＴ転写因子の結合部位の複数のタンデムリピートを含む合成プロモーターを含む核酸コンストラクト及びＣａｖ１．３チャネルをコードする核酸コンストラクトを含むＨＥＫ−２９３細胞が示されており、一方細胞外グルコースは細胞によって取り込まれて増加した量のＡＴＰを生成する。その後のＡＴＰ感受性カリウムチャネル（ＫＡＴＰ）の閉鎖が、Ｃａｖ１．３を活性化し、Ｃａ２＋流入の増加及びＮＦＡＴ調節転写単位のカルシウム依存性活性化をもたらす。
【００８４】
本発明の発現系の別の特定の例示的実施態様を図１２Ｅに示す。ここで、ｓｈＧＬＰ１をコードする遺伝子に連結されたＮＦＡＴ転写因子の結合部位の複数のタンデムリピートを含む合成プロモーターを含む核酸コンストラクトを含むＨＥＫ−２９３細胞、ｍＩＮＳをコードする遺伝子に連結されたＣＲＥＢ転写因子の結合部位を含む合成プロモーターを含む核酸コンストラクト、Ｃａｖ１．３チャネルをコードする核酸コンストラクト、及びＧＬＰ−１受容体をコードする核酸コンストラクトが示されている。Ｄ−グルコースは、興奮転写連関によってＰＮＦＡＴ駆動プロモーターを活性化し、分泌型ヒトグルカゴン様ペプチド１（ｓｈＧＬＰ１）の用量依存的発現を引き起こす。ｓｈＧＬＰ１は、自己分泌ループを介して恒常的に発現されるＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を活性化し、ＰＣＲＥ駆動プロモーターからのインスリン発現を誘発する。
【００８５】
一実施態様では、治療タンパク質は、ＧＬＰ１Ｒ−アゴニスト、インスリン、インスリンアナログ、成長ホルモン、インスリン様成長因子からなる群より選択されるインスリン分泌剤；食欲抑制ホルモン；又は褐色脂肪代謝を活性化するタンパク質であり、好ましくはＧＬＰ１Ｒ−アゴニスト、インスリン及びインスリンアナログからなる群より選択される。
【００８６】
一実施態様では、組換え細胞は２つの核酸コンストラクトを含み、ここで第１の核酸コンストラクトは前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含み、ここでプロモーターは、第１の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第２の核酸コンストラクトは前記組換え細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含み、ここでプロモーターは、第２の治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、第１の治療タンパク質は、第２の治療タンパク質と異なっている。特定の実施態様では、第１の治療タンパク質は、ＧＬＰ１Ｒ−アゴニスト、好ましくは配列番号３５に示されるｓｈＧＬＰ１、又はエキセジン−４であり、第２の治療タンパク質は、インスリンアナログ又はインスリン、好ましくはヒトインスリンである。
【００８７】
ＧＬＰ１Ｒ−アゴニストは、ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を活性化する任意の分子である。ＧＬＰ１Ｒ−アゴニストは通常、ＧＬＰ−１、ｓｈＧＬＰ１、好ましくは配列番号３５に示されるｓｈＧＬＰ１、エキセジン−４、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド及びデュラグルチドからなる群より選択される。好ましいＧＬＰ１Ｒ−アゴニストは、ＧＬＰ−１、ｓｈＧＬＰ１、好ましくは配列番号３５に示されるｓｈＧＬＰ１、及びエキセジン−４からなる群より選択される。最も好ましいｓｈＧＬＰ１は、配列番号３５に示されるｓｈＧＬＰ１である。
【００８８】
インスリンアナログは通常、薬剤学又は薬理学の向上という主目的のために構造が変更されているインスリンから誘導された化合物からなる群より選択される。好ましいインスリンアナログは、ヒト、げっ歯動物、ブタ又はウシインスリン、並びにリスプロ、アスパルト、グルリジン、グラルギン及びデテミルからなる群より選択される。
【００８９】
成長ホルモンは通常、動物又は植物の細胞の成長を刺激するホルモンの群から選択され、特に（動物の）下垂体から分泌されるものである。好ましい成長ホルモンは、エピネフリン、ノルエピネフリン及びグルココルチコイドからなる群より選択される。
【００９０】
インスリン様成長因子は通常、分子構造がインスリンと類似しているホルモンからなる群より選択される。好ましいインスリン様成長因子は、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２及びＩＧＦＢＰ−６からなる群より選択される。
【００９１】
食欲抑制ホルモンは通常、アディポネクチン、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、グレリン、レプチン、モチリン、プラムリンチド、セクレチン、ソマトスタチン及びペプチドＹＹからなる群より選択される。好ましい食欲抑制ホルモンは、アミリン、アディポネクチン、アミリンアナログ及びアディポネクチンアナログからなる群より選択される。アミリンアナログ及びアディポネクチンアナログは通常、天然に存在するアミリン及びアディポネクチンと、好ましくは天然に存在するヒトアミリン及びヒトアディポネクチンと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９７％、さらに詳細には少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９２】
褐色脂肪代謝を活性化するタンパク質は通常、β２ＡＲアクチベーター、ＢＭＰ７イリシン１０７、線維芽細胞増殖因子２１及びナトリウム利尿ペプチドからなる群より選択される。褐色脂肪代謝を活性化する好ましいタンパク質は、β２ＡＲアクチベーター及びナトリウム利尿ペプチドからなる群より選択される。
【００９３】
好ましい一実施態様では、治療タンパク質は、ヒトインスリン、ヒトＧＬＰ−１、又は修飾若しくは切断ＧＬＰ−１、好ましくは修飾ＧＬＰ１Ｒ−アゴニスト、配列番号３５に示されるｓｈＧＬＰ１である。
【００９４】
一実施態様では、治療タンパク質は、代謝疾患に対する薬剤であり、ここで代謝疾患は、Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）、Ｔ２Ｄ（２型糖尿病）、糖尿病性ケトアシドーシス、肥満、心血管疾患、メタボリックシンドローム及びがんからなる群より選択される。代謝疾患は好ましくは、Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）、Ｔ２Ｄ（２型糖尿病）、糖尿病性ケトアシドーシス及びメタボリックシンドロームからなる群より選択される。
【００９５】
１型糖尿病（１型真性糖尿病としても知られている）は、膵臓におけるインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊から生じる糖尿病の一形態である。その後のインスリンの欠乏は、血中および尿中のグルコースの増加をもたらす。
【００９６】
２型糖尿病（２型真性糖尿病としても知られている）は、高血糖、インスリン抵抗性及びインスリンの相対的欠乏を特徴とする長期代謝異常である。
【００９７】
心血管疾患は通常、心筋間質性疾患、心線維症、拡張期心不全（ＤＨＦ）を伴う心不全、保存駆出画分を有する心不全（ＨＦｐＥＦ）、うっ血性心不全（ＣＨＦ）などの心不全、無症候性左室拡張機能障害（ＡＬＶＤＤ）、冠状動脈アテローム性動脈硬化症、がん及び糖尿病、炎症性腸疾患、慢性前立腺炎、感染症、肺炎症、骨髄炎、腎疾患、痛風、関節炎及び衝撃からなる群より選択される。
【００９８】
メタボリックシンドローム（シンドロームＸとも称される）は、心血管系の罹患率及び死亡率の増加の原因となっているｊ一連のリスク因子である。全米コレステロール教育プログラムの成人治療パネル（ＮＥＣＰ−ＡＴＰＩＩＩ）は、メタボリックシンドロームを心血管疾患の独立したリスク因子として特定した。（国立保健研究機構：成人における高血中コレステロールの検出、評価、および治療に関する全国コレステロール教育プログラム専門家委員会の第３報（成人治療パネルＩＩＩ）。エグゼクティブパブリケーション番号０１−３６７０）。本明細書で使用される場合、メタボリックシンドロームは、糖尿病、耐糖能障害、空腹時血糖又はインスリン耐性障害、及び以下のうちの２つの存在を要件とする世界保健機関の基準（１９９９）に従って定義される：血圧：≧１４０／９０ｍｍＨｇ；脂質異常症：中性脂肪（ＴＧ）：≧１．６９５ｍｍｏｌ／Ｌ及び高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）≦０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）、≦１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）；中心性肥満：ウエスト・ヒップ比＞０．９０（男性）；＞０．８５（女性）及び／又はボディマス指数＞３０ｋｇ／ｍ２；微量アルブミン尿：尿中アルブミン排出率≧２０ｍｇ／分又は尿中アルブミン／クレアチン比≧３０ｍｇ／ｇ。
【００９９】
ある特定の実施態様では、治療タンパク質は、Ｔ１Ｄ及び／又はＴ２Ｄに対する薬剤である。
【０１００】
さらなる態様では、本発明は、上に記載の組換え細胞と、半透膜とを含むカプセル化細胞を提供する。
【０１０１】
カプセル化細胞の生体送達は、宿主内に移植する前に細胞を半透性の生体適合性膜で囲むことによってレシピエント宿主の免疫系から細胞を単離するという概念に基づく。細胞は、半透膜によって形成された移植可能なポリマーカプセル内にそれらを封入することによって宿主から免疫隔離される。この手法は、宿主組織と移植組織との間の細胞間接触を防ぎ、直接提示による抗原認識を排除する。
【０１０２】
本発明のカプセル化細胞は、成長因子ホルモン、神経伝達物質、ペプチド、抗体及び補体等の分子の拡散を、それらの分子量に基づいて制御するように調整された半透膜を有する。カプセル化技術を使用すると、免疫抑制薬の使用の有無にかかわらず、細胞を免疫拒絶反応なしに宿主に移植することができる。有用な生体適合性ポリマーカプセルは通常、液体培地に懸濁しているか固定化マトリックス内に固定化されている細胞を含むコアと、単離された細胞を含まない選択透過性マトリックス又は膜の周囲又は周辺領域（「ジャケット」）とを含み、これは、生体適合性であり、かつ、有害な免疫学的攻撃からコア内の細胞を保護するのに十分である。カプセル化は、免疫系の要素がカプセルに入るのを妨げ、それによってカプセル化細胞を免疫破壊から保護する。膜の半透性の性質はまた、目的の生物学的に活性な分子がカプセルから周囲の宿主組織へ容易に拡散することを可能にし、栄養素がカプセル内に容易に拡散し、カプセル化細胞を支持することを可能にする。該カプセルは、生体適合性材料から製造することができる。「生体適合性材料」は、宿主への移植後に、当該カプセルの拒絶反応を生じたり、例えば分解によって当該カプセルが作動不能になるのに足る有害な宿主応答を誘発しない材料である。生体適合性材料は、宿主の免疫系の成分などの大きな分子に対しては比較的不透過性であるが、代謝老廃物の除去は可能であるものの、インスリン、成長因子及び栄養素などの小，分子に対しては透過性である。本発明の組成物による成長因子の送達には、様々な生体適合性材料が適している。例えば国際公開第９２／１９１９５号又は同第９５／０５４５２号に記載されているように、様々な表面形状、並びにその他の機械的及び構造的特徴を有する多数の生体適合性材料が知られている。生体適合性材料の成分は、周囲の半透膜及び内部細胞支持足場を含みうる。好ましくは、組換え細胞は、選択性透過膜によってカプセル化されている足場上に播種される。繊維状の細胞支持足場は、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレンポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブテスター、絹、綿、キチン、カーボン又は生体適合性金属からなる群より選択される任意の生体適合性材料から作製することができる。また、結合繊維構造を細胞移植に使用することができる（米国特許第５５１２６００号、参照により援用）。生分解性ポリマーには、ポリ（乳酸）ＰＬＡ、ポリ（乳酸−コグリコール酸）ＰＬＧＡ及びポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、並びにこれらの等価物からなるものが含まれる。移植された細胞が上に付着することができる表面を提供するために発泡体足場が使用されてきた（国際公開第９８／０５３０４号、参照により援用）。編組メッシュチューブが血管移植片として使用されてきた（国際公開第９９／５２５７３号、参照により援用）。さらにコアは、細胞の位置を安定化させるヒドロゲルから形成された固定化マトリックスから構成することができる。ヒドロゲルは、実質的に水から構成されるゲルの形態の架橋親水性ポリマーの三次元ネットワークである。
【０１０３】
アルギン酸、アルギン酸−ポリリジン−アルギン酸、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アセチルセルロース及び硫酸セルロース、ポリアクリレート（アクリル共重合体を含む）、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル共重合体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、アセチルセルロース、ニトロセルロース、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロリド）、並びにこれらの誘導体、共重合体及び混合物を含む様々なポリマー及びポリマーブレンドを使用して、半透膜を製造することができる。このような膜及びそれを製造する方法は、例えば米国特許第５２８４７６１号及び第５１５８８８１号に開示されている。
【０１０４】
カプセルは、生物学的活性を維持し、製品又は機能の送達のためのアクセスを提供するのに適切な任意の構成、例えば円筒形、長方形、ディスク形、パッチ形、卵形、星形又は球形であってよい。さらに、カプセルを巻くか又は網目状若しくは入れ子状構造に包むことができる。カプセルが移植後に回収される場合、レシピエント宿主の血管内を移動するのに十分に小さい球形カプセルなどの、移植部位からのカプセルの移動をもたらす傾向がある構成は、好ましくない。長方形、パッチ、ディスク、シリンダー及びフラットシート等の特定の形状は、より優れた構造上の完全性を提供し、回収が望まれる場合に適している。
【０１０５】
カプセル化細胞装置は、既知の技術によって移植される。本発明の装置及び方法には、多くの移植部位が考えられる。このような移植部位には、腹腔内空洞（intraperitoneal cavity）腎臓被膜内、皮下組織、門脈、肝臓及び大脳皮質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
一実施態様では、カプセル化細胞は、アルギン酸、アルギン酸−ポリ−（Ｌ−リシン）−アルギン酸、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アセチルセルロース及び硫酸セルロースからなる群より選択される生体適合性材料、好ましくはアルギン酸、より好ましくはアルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸を含む。
【０１０７】
一実施態様では、半透膜は、アルギン酸、アルギン酸−ポリ−（Ｌ−リシン）−アルギン酸、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アセチルセルロース及び硫酸セルロースからなる群より選択される生体適合性材料、好ましくはアルギン酸、より好ましくはアルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸を含む。
【０１０８】
したがって、さらなる態様において本発明は、哺乳動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで治療タンパク質を製造するための方法であって、以下を含む方法を提供する：
（ａ）  本明細書に記載の組換え細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ集団を移植可能な半透性装置内に提供すること；
（ｂ）  細胞集団を有する装置を哺乳動物宿主に移植すること；及び
（ｃ）  細胞集団の少なくともいくつかの細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでの炭水化物刺激に応答して治療タンパク質を産生する細胞であるように、ｉｎ  ｖｉｖｏで前記装置内の細胞集団を成熟させること。
【０１０９】
一実施態様では、移植可能な半透膜装置は、アルギン酸、アルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アセチルセルロース及び硫酸セルロースからなる群より選択される生体適合性材料、好ましくはアルギン酸、より好ましくはアルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸からなるカプセル又はビーズである。
【０１１０】
さらなる態様において、本発明は、炭水化物の存在下、好ましくはグルコースの存在下で治療タンパク質を発現している、本明細書に記載の組換え細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物を提供する。細胞は、一般に知られているようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖及び維持することができる。栄養培地及び細胞は一般に、細胞の増殖及び維持を支えるために酸素及び二酸化炭素の適切な供給が与えられる適切な容器に入れられる。細胞培養は、培養中に栄養素が補充されないが必要に応じて酸素が添加されるバッチシステム、栄養素及び酸素濃度の双方が必要に応じてモニター及び補充されるフェドバッチシステム、並びに栄養素及び老廃物濃度がモニターされ、制御される灌流システムでありうる。細胞は、様々な培地中で培養することができる。例えばＨａｍ’ｓ  Ｆ１０（スイス、ブックスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、最小必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ＲＰＭＩ−１６４０（スイス、バーゼルのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）等の市販の培地が宿主細胞の培養に適している。
【０１１１】
さらなる態様において、本発明は、治療タンパク質を発現する組換え細胞を製造する方法、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（ａ）  細胞集団を取得する工程；
（ｂ）  前記細胞集団に前記細胞の炭水化物代謝の産物に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトをトランスフェクトする工程であって、プロモーターが治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている、工程；
（ｃ）  トランスフェクト細胞が治療タンパク質を発現するのを可能にするのに十分な時間、炭水化物の存在下で、トランスフェクト細胞の集団をインキュベートする工程。
【０１１２】
一実施態様では、細胞の集団は工程（ｂ）において、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトでさらにトランスフェクトされる。この方法で使用される細胞、炭水化物代謝に応答性のプロモーター、及び細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、上に記載の通りである。使用される炭水化物は、好ましくはグルコースである。炭水化物の存在下でのインキュベーション時間は通常、０．５から９６時間、好ましくは１から１２時間である。
【０１１３】
さらなる態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載の組換え細胞又はカプセル化細胞を提供する。
【０１１４】
さらなる態様において、本発明は、対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための方法における使用のための、本明細書に記載の組換え細胞又はカプセル化細胞を提供する。
【０１１５】
また、対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載の組換え細胞又はカプセル化細胞の使用も提供される。
【０１１６】
また、対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための、本明細書に記載の組換え細胞又はカプセル化細胞の使用も提供される。
【０１１７】
また、前記対象に本明細書に記載の組換え細胞又はカプセル化細胞を投与することを含む、対象における代謝疾患の予防、進行の遅延又は治療のための方法も提供される。
【０１１８】
一実施態様では、代謝疾患は、Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）、Ｔ２Ｄ（２型糖尿病）、糖尿病性ケトアシドーシス、肥満、心血管疾患、メタボリックシンドローム及びがんからなる群より選択される。代謝疾患は好ましくは、Ｔ１Ｄ（１型糖尿病）、Ｔ２Ｄ（２型糖尿病）、糖尿病性ケトアシドーシス及びメタボリックシンドロームからなる群より選択される。
【０１１９】
さらなる態様において、本発明は、細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含む核酸コンストラクトを前記細胞に送達する方法であって、該プロモーターが治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されている方法を提供し、該方法は、前記核酸コンストラクトを前記細胞に投与し、それによって治療タンパク質をコードする前記遺伝子が炭水化物刺激に応答して前記細胞において発現されることを含む。一実施態様では、細胞は、細胞外炭水化物を感知するための細胞成分をコードする核酸コンストラクトでさらにトランスフェクトされる。この方法で使用される、炭水化物代謝に応答性のプロモーター、及び細胞外炭水化物を感知するための細胞成分は、上に記載の通りである。使用される炭水化物は、好ましくはグルコースである。
【０１２０】
一実施態様では、核酸コンストラクトは、例えば遺伝子療法によって、対象の細胞に送達される。したがって、特定の実施態様において、本発明は、対象の細胞に核酸コンストラクトを送達する方法を提供し、ここで核酸コンストラクトは、前記細胞の炭水化物代謝に応答性のプロモーターを含み、該プロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されており、該方法は、前記核酸コンストラクトを前記対象に投与し、それによって治療タンパク質をコードする前記遺伝子が炭水化物刺激に応答して前記対象において発現されることを含む。
【０１２１】
対象の細胞への核酸コンストラクトの送達については、  特定の細胞型へ核酸コンストラクトを送達するためのベクターを利用又は設計するのが役立った例もある。特定のベクターは、特定の組織型に対して生来的屈性を示す。細胞型特異性又は細胞型標的化は、ウイルスエンベロープタンパク質の修飾による特徴的に広い感染性を有するウイルスに由来するベクターにおいて達成される。例えば、細胞標的化は、独特の細胞表面受容体との特異的相互作用を有する修飾ノブ及びファイバードメインの発現を達成するためのウイルスゲノムノブ及びファイバーコード配列の選択的修飾によりアデノウイルスベクターを用いて達成さてきた。細胞特異的標的化の他の方法は、エンベロープタンパク質への抗体又は抗体断片のコンジュゲーションによって達成されてきた。あるいは、特に部分をウイルス表面にコンジュゲートして標的化を達成することもできる。さらに、ウイルスでコードされた核酸コンストラクトはまた、特定の細胞型において優先的に治療タンパク質をコードする遺伝子の発現を可能にする組織特異的プロモーター領域の制御下にあってもよい。
【０１２２】
当業者には明らかなように、本発明による核酸コンストラクトは、経腸的に（経口、直腸又は舌下に）又は非経口（静脈内、皮下又は吸入による）を含む様々な方法で動物対象に導入することができる。核酸コンストラクトは、例えば移植されたカテーテルによって乗入動物に提供されうる。核酸コンストラクトを体腔内に注入して、周囲の組織への形質導入を容易にすることができる。核酸の送達のために中に溶液が提供されうるそのような体腔の例には、腹腔（peritoneal cavity）、胸膜腔及び腹腔（abdominal cavity）が含まれる。さらに、核酸コンストラクトは、他の流体含有空間内に提供されてもよい。
【０１２３】
対象の細胞に送達される核酸コンストラクトは、追加の担体、添加剤又は希釈剤をさらに含みうる。核酸コンストラクトを含む組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤等、生理的条件に近づくのに必要な、薬学的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアート等を含みうる。組成物中の核酸コンストラクトの濃度はばらつきが大きく、すなわち約０．１重量％未満から、通常は約２重量％又は少なくとも約２重量％、上は約２０重量％から約５０重量％以上にまでもなり得、選択された特定の投与様式に従って主に液量、粘度などによって選択されるであろう。
【実施例】
【０１２４】
一般的実験手順
[ベクター設計]  すべての発現ベクターについての包括的な設計及び構築の詳細を表１に提供する。いくつかの発現ベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（中国、上海のＯｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；カタログ番号ＢＡＣＲ（Ｃ）２０１４４００１）を用いてＧｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙにより構築された。ＫＡＴＰ−サブユニットをコードするプラスミド（ｐＣＭＶ  ヒトＳＵＲ１とｐＣＭＶ６ｃ  ｈＫｉｒ６．２（ＢＩＲ））は、清野進氏（Ｓｕｓｕｍｕ  Ｓｅｉｎｏ）（日本、神戸の神戸大学）のご厚意で提供された。Ｃａｖ２．２−、Ｃａｖ１．２−及びＣａｖ１．３−サブユニットをコードするプラスミド（ＣａＶ１．３ｅ［８ａ，１１，３１ｂ，Δ３２，４２ａ］、ＣａＶ１．２、Ｃａｖ２．２ｅ［Δａ１０，Δ１８ａ，Δ２４ａ，３１ａ，３７ａ，４６］、Ｃａｖｂ３及びＣａＶα２δ１）は、Ｄｉａｎｅ  Ｌｉｐｓｃｏｍｂｅ氏（米国ロードアイランド州のブラウン大学）のご厚意で提供された。
【０１２５】
表１：本明細書で使用のプラスミド及びオリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド：制限エンドヌクレアーゼ特異的部位には、オリゴヌクレオチド配列中で下線が引かれている。オリゴヌクレオチド配列に含まれるアニーリング塩基対は、大文字で示されている。
【０１２６】
略記：ａｔｔＲ１／２，Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）適合組換え部位；ＢＦＰ，青色蛍光タンパク質；ＢｌａｓｔＲ，ブラストサイジン耐性を付与する遺伝子；Ｃａｖ１．２，Ｌ型電位開口型Ｃａ２＋チャネルのＣａｖ１ファミリーの２番目のメンバー；Ｃａｖ１．３，Ｌ型電位開口型Ｃａ２＋チャネルのＣａｖ１ファミリーの３番目のメンバー；Ｃａｖ２．２，Ｎ型電位開口型Ｃａ２＋チャネル；ｃ−ｆｏｓ，転写因子のＦｏｓファミリーのヒトがん原遺伝子；Ｃａｃｎａ１ｂ，ラットＣａｖ２．２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２５７６４８）のα１−サブユニット；Ｃａｃｎａ１ｃ，マウスＣａｖ１．２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１２２８８）のα１−サブユニット；Ｃａｃｎａ１ｄ，ｏｆラットＣａｖ１．３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２９７１６）のα１−サブユニット；Ｃａｃｎｂ３，ラットＣａｖ１．３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２５２９７）のβ３−サブユニット；Ｃａｃｎａ２ｄ１，ラットＣａｖ１．３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２５３９９）のα２δ−サブユニッ；ｃｃｄＢ，ポジティブ選択用のＤＮＡジャイレーストキシン；Ｃｍｒ，ネガティブ選択用のクロラムフェニコール耐性遺伝子；ＣＲＥ，ｃＡＭＰ応答配列；ｄＴｏｍａｔｏ，不安定化赤色蛍光タンパク質変異体；ＥＧＦＰ，強化された緑色蛍光タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｕ５５７６２）；ＧＬＰ−１，グルカゴン様ペプチド１；ＧＬＰ１Ｒ，ヒトＧＬＰ−１受容体；ＧＬｕｃ，ガウシアプリンセプスルシフェラ−ゼ；  ｈＧＣＫ，  ヒト膵臓グルコキナーゼ（別名ヘキソキナーゼ４；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２６４５）；ｈＧｌｕｔ２，ヒト促進性グルコース輸送体の２番目のメンバー（別名ＳＬＣ２Ａ２；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５１４）；ｈＧＮＡＴ３，ヒトグアニンヌクレオチド結合タンパク質アルファ変換３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３４６５６２）；ｈＫｉｒ６．２，ヒト内向き整流ＫＡＴＰ−チャネルサブユニット（別名ＫＣＮＪ１１；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３７６７）；ｈＳＵＲ１，ヒトＫＡＴＰ−チャネル調節スルホニルウレア受容体サブユニット（別名ＡＢＣＣ８；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６８３３）；ｈＴ１Ｒ２，ヒト味覚受容体１型ファミリーの２番目のメンバー（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８０８３４）；ｈＴ１Ｒ３，ヒト味覚受容体１型ファミリーの３番目のメンバー（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：８３７５６）；ＩＬ２／４，インターロイキン２／４；ＩＴＲ，ＳＢ１００Ｘの末端逆位配列；ＫＡＴＰ，アデノシン三リン酸感受性カリウムチャネル；Ｌｕｃ，ホタルルシフェラーゼ；ＭＣＳ，マルチクローニングサイト；ｍＩＮＳ，ＨＥＫ−２９３細胞における最適発現のための配列番号３６に示されるような修飾ラットインスリン変異体；ＮＦＡＴ，活性化Ｔ−細胞の核内因子；ＮＦ−κＢ，活性化Ｂ細胞の核内因子カッパ軽鎖エンハンサー；Ｐ２Ａ，哺乳動物細胞におけるバイシストロニックな発現に最適化されたピコルナウイルス由来リボソームスキッピング配列；ｐＡ，ポリアデニル化シグナル；ＰｃＦＯＳ，四量体ｃ−ｆｏｓ応答配列（（ｃ−ｆｏｓ）４−Ｐｍｉｎを含む合成哺乳動物プロモーター；Ｓｈｅｎｇ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８，２７８７−９６（１９８８））；ＰＣＲ，ポリメラーゼ連鎖反応；ＰＣＲＥ，ＣＲＥ含有合成哺乳動物プロモーター；ＰＣＲＥｍ，修飾ＰＣＲＥ変異体；ＰｈＥＦ１α，ヒト伸長因子１αプロモーター；ＰＥＳＴ，プロリン、グルタミン酸、セリン及びスレオニンに富むペプチド配列；ＰｈＣＭＶ，ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター；ＰｈＣＭＶ＊−１，テトラサイクリン応答性プロモーター（ｔｅｔＯ７−ＰｈＣＭＶｍｉｎ）；ＰｈＣＭＶｍｉｎ，ＰｈＣＭＶの最小バージョン；Ｐｍｉｎ，配列番号３３に示される、最小真核生物ＴＡＴＡ−ボックスプロモーター（５’−ＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＧＡＡＧＣＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＧ−３’）；ＰＮＦＡＴ−ＩＬ２，マウスＩＬ２のＮＦＡＴ結合部位（（ＮＦＡＴＩＬ２）３−Ｐｍｉｎの３つのタンデムリピートを含む合成哺乳動物プロモーター；Ｒｏｏｎｅｙ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３，６２５−６３３（１９９４））；ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４，マウスＩＬ４のＮＦＡＴ結合部位（（ＮＦＡＴＩＬ４）３−Ｐｍｉｎの３つのタンデムリピートを含む合成哺乳動物プロモーター；Ｒｏｏｎｅｙ  ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３，６２５−６３３（１９９４））；ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４ｘ５，ヒトＩＬ４のＮＦＡＴ結合部位（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ）；の５つのタンデムリピートを含む合成哺乳動物プロモーター；ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４ｘ７，ヒトＩＬ４のＮＦＡＴ結合部位（（ＮＦＡＴＩＬ４）７−Ｐｍｉｎ）の７つのタンデムリピートを含む合成哺乳動物プロモーター；ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４ｘ９，ヒトＩＬ４のＮＦＡＴ結合部位（（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ）の９つのタンデムリピートを含む合成哺乳動物プロモーター；ＰＮＦｋＢ，ＮＦ−κＢ−応答配列を含む合成哺乳動物プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＵ５８１８６０．１）；ＰＲＰＢＳＡ，恒常的合成哺乳動物プロモーター；ＰＳＶ４０，シミアンウイルス４０プロモーター；ＰｕｒｏＲ，ピューロマイシン耐性を付与する遺伝子；ｒｔＴＡ，逆ＴｅｔＲ依存性哺乳動物トランスアクチベーター；ＳＢ１００Ｘ，最適化スリーピングビューティートランスポザーゼ；ＳＥＡＰ，ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ；ｓｈＧＬＰ１，短いヒトグルカゴン様ペプチド１；ｔｅｔＯ；ＴｅｔＲ特異的オペレーター；ＴｅｔＲ，テトラサイクリン耐性遺伝子大腸菌Ｔｎ１０由来テトラサイクリン依存性リプレッサー；ＴｕｒｂｏＧＦＰ：ｄｅｓｔ１，ＰＥＳＴタグ付きＴｕｒｂｏＧＦＰ変異体（Ｅｖｒｏｇｅｎ）；ＺｅｏＲ，ゼオシン耐性を付与する遺伝子。オリゴヌクレオチド：制限エンドヌクレアーゼ特異的部位には下線が引かれ、アニーリング塩基対は大文字で示されている。
【０１２７】
2019520837.tif 000003
2019520837.tif 000004
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【０１２８】
[細胞培養及びトランスフェクション]  １０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；スイス、ブックスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ｆ７５２４，ロット番号０２２Ｍ３３９５）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰｅｎＳｔｒｅｐ；フランス、ニュアイエのカタログ番号Ｌ００２２−１００）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、５％ＣＯ２含有加湿雰囲気下、３７℃でヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３Ｔ，ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１１２６８）を培養した。１０％ＦＢＳ及び１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、ヒト１．１Ｅ７β−細胞株（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号ＥＣ１００７０１０１）を培養した。ヒト膵島（ＨＩＲ；カリフォルニア州アーバインのＰｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ロット番号ＨＰ−１６１６１−０１）を１０％ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、１％ＩＴＳ、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１ｍＭ  ピルベート、１０ｍＭ  ニコチンアミド及び２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを補充したＰｒｏｄｏ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ培地（ＰＩＭ（Ｔ）（登録商標）；Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号ＩＭＴ００１ＧＭＰ）からＣＭＲＬ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  カタログ番号１１５３００３７）へ移し、３日ごとに新鮮なＣＭＲＬ培地に交換しながらカプセル化する前に７日間培養した。継代のために、０．０５％トプシン−ＥＤＴＡ（米国、カリフォルニア州Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号２５３００−０５４）中、３７℃で３分間のインキュベーションによって、プレコンフルエントなＨＥＫ−２９３細胞と１．１Ｅ７培養液を分離させ、１０ｍｌ細胞培地に回収し、２９０ｇで３分間遠心分離し、新しい細胞培養プレートに播種する前に、標準細胞密度（１．５ｘ１０５細胞／ｍＬ）で新しい培養培地に再懸濁させた。電界マルチチャネル細胞計数装置（Ｃａｓｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＴＴ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いて、細胞数及び生存率を定量した。トランスフェクションのために、２−３μｇのプラスミドＤＮＡ及び６−９μｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ；ドイツ、エッペルハイムのＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号２４７６５−２）を含む溶液を、３００μｌの血清及び抗生物質不含ＤＭＥＭ中、２２℃で３０分間インキュベートし、次に６ウェルプレートのウェルごとに播種した３ｘ１０５細胞に滴下した。ＰＥＩの添加から１２時間後、トランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ中でインキュベートすることにより分離し、遠心分離し（２９０ｇで３分間）、１０％ＦＢＳ、１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ、０−２ｍＭ  Ｄ−グルコース及び０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２）を補充した低／無グルコース培地（グルコース不含ＤＭＥＭ［米国、カリフォルニア州のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１１９６６−０２５］に再懸濁させ、２ｘ１０５／ｍＬの細胞密度で再播種した。特に明記しない限り、Ｄ−グルコース又は他のコントロール化合物を、低／無グル���ース条件下でさらに１２時間培養した後にトランスフェクト細胞に添加した。
【０１２９】
[標的遺伝子発現の定量化]  培養上清中のヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現レベルを、ｐ−ニトロフェニルホスフェートに基づく光吸収の経時変化に従って定量した（Wang H et al., Nucleic Acids Res 43(14):e91 (2015))。マウス血清中のＳＥＡＰレベルを、化学発光法に基づくアッセイを用いてプロファイリングした（ドイツ、マンハイムのＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ；カタログ番号１１  ７７９  ８４２  ００１）。１．１Ｅ７細胞及びヒト膵島によって分泌されるヒトインスリンレベルを、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡキット（スウェーデン、ウプサラのＭｅｒｃｏｒｄｉａ；カタログ番号１０−１１４１−０１）を使用して定量した。培養上清及びマウス血清中のマウスのインスリンレベル（ｍＩＮＳ）を、マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（スウェーデン、ウプサラのＭｅｒｃｏｒｄｉａ；カタログ番号１０−１２４７−０１）を用いて定量した。培養上清中の短いヒトグルカゴン様ペプチド１（ｓｈＧＬＰ１）レベルを、マウスＩｇＧ  ＥＬＩＳＡキット（オレゴン州ポートランドのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｃ．；カタログ番号Ｅ−９０Ｇ）を用いて定量した。マウス血清中の生物活性ＧＬＰ−１レベルを、高感度ＧＬＰ−１活性ＥＬＩＳＡキット（スイス、シャフハウゼンのＭｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ番号ＥＺＧＬＰＨＳ−３５Ｋ）を用いて定量した。Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｏｒｃａ  Ｆｌａｓｈ  ４デジタルカメラ、２０倍対物レンズ、４８８ｎｍ／５０９ｎｍ励起及び発光フィルターセット、並びにＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲソフトウェア（バーション４．３．０）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅベースの広視野顕微鏡（スイス、エックのＮｉｋｏｎ  ＡＧ）を使用して、ＴｕｒｂｏＧＦＰを蛍光顕微鏡法によって可視化した。
【０１３０】
[安定細胞株の生成]  ＥＫ−２９３細胞を、ｐＭＸ５７（ＰＮＦＡＴ３−ＳＥＡＰ−ｐＡ）とｐＺｅｏＳＶ２（＋）（ＰＳＶ４０−ｚｅｏ−ｐＡ）との２０：１（ｗ／ｗ）混合物でコトランスフェクトすることによって、続いて１ｍｇ／ｍＬゼオコシンを含有する培養培地（米国、カリフォルニア州のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号Ｒ２５０−０５）中で選択及びＦＡＣＳ媒介単一細胞クローニングすることによって、脱分極刺激ＳＥＡＰ発現用のトランスジェニックであるモノクローナルＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ細胞株を構築した。１６個の細胞クローンを選び、クラス最高のＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１をすべての追跡調査に使用した。
３ｘ１０６個のＨＥＫ−２９３細胞に９５００ｎｇのｐＭＸ２５０（ＩＴＲ−ＰｈＥＦ１α−ＧＬＰ１Ｒ−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ｄＴｏｍａｔｏ−Ｐ２Ａ−ＰｕｒｏＲ−ｐＡ−ＩＴＲ）と５００ｎｇのスリーピングビューティートランスポザーゼ発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００（ＰｈＣＭＶ−ＳＢ１００Ｘ−ｐＡ，（６１））をコトランスフェクトすることによって、高レベルＧＬＰ１Ｒ発現用のトランスジェニックであるポリクローナルＨＥＫＧＬＰ１Ｒ集団を構築した。２代継代のために１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択した後、生存している集団ＨＥＫＭＸ２５０を異なる赤色蛍光強度に従って３つの異なる亜集団にＦＡＣＳ選別した。トップ１０％のｄＴｏｍａｔｏ強度のＨＥＫＧＬＰ１Ｒを有する亜集団は、ＧＬＰ−１に対して最も高い感受性を示し、すべての追跡調査に使用された。
３ｘ１０６個のＨＥＫ−２９３細胞を９５００ｎｇのｐＭＸ２５２（ＩＴＲ−ＰｈＥＦ１α−Ｃａｃｎａ１ｄ−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ＢＦＰ−Ｐ２Ａ−ＰｕｒｏＲ−ｐＡ−ＩＴＲ）と５００ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００でコトランスフェクトすること、及び、２代継代のために０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで選択することによって、Ｃａｖ１．３のα１Ｄサブユニット（Ｃａｃｎａ１ｄ）の安定発現用のトランスジェニックであるポリクローナルＨＥＫＭＸ２５２集団を構築した。
３ｘ１０６個のＨＥＫＭＸ２５２細胞を、９５００ｎｇのｐＭＸ２５１（ＩＴＲ−ＰｈＥＦ１α−Ｃａｃｎａ２ｄ１−Ｐ２Ａ−Ｃａｃｎｂ３−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ｄＴｏｍａｔｏ−Ｐ２Ａ−ＢｌａｓｔＲ−ｐＡＩＴＲ）と５００ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００でコトランスフェクトすること、及び、３代継代のために１０μｇ／ｍＬのブラスチシジンで選択することによって、完全Ｃａｖ１．３チャネル構成要素の安定発現用のトランスジェニックであるポリクローナルＨＥＫＣａｖ１．３集団を構築した。
３ｘ１０６個のＨＥＫＣａｖ１．３細胞に９５００ｎｇのｐＭＸ２５６（ＩＴＲ−ＰＮＦＡＴ５−ＳＥＡＰ−Ｐ２Ａ−ｍＩＮＳ−ｐＡ：ＰＲＰＢＳＡ−ＥＧＦＰ−Ｐ２Ａ−ＺｅｏＲ−ｐＡ−ＩＴＲ）と５００ｎｇのｐＣＭＶ−Ｔ７−ＳＢ１００をコトランスフェクトすることによって、グルコース刺激ＳＥＡＰ−及びインスリン発現用のトランスジェニックであるモノクローナルＨＥＫ−β細胞株を構築した。３代継代のために１００μｇ／ｍＬのゼオシンで選択した後、最も高いＥＧＦＰ発現レベルを有する生存集団の５％をＦＡＣＳ媒介単一細胞クローニングに供した。５０個の細胞クローンを選択し、最適なグルコース誘導性インスリン発現を示すクローンＮｏ．４をすべての追跡調査に使用した。
【０１３１】
[ＦＡＣＳ媒介細胞選別ＥＧＦＰ]  （４８８ｎｍレーザー、５０５ｎｍロングパスフィルター、５３０／３０放出フィルター）又はｄＴｏｍａｔｏ（５６１ｎｍレーザー、５７０ｎｍロングパスフィルター、５８６／１５放出フィルター）を発現するＨＥＫ−２９３細胞を、死細胞及び細胞ダブレットを除去しながらＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（スイス、アルシュヴィルのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて選別した。未処理のＨＥＫ−２９３細胞又は親ポリクローナル集団をネガティブコントロールとして使用した。
【０１３２】
[ＲＴ−ＰＣＲ]  ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号ＥＮ０５２１）で処理したＺＲ  ＲＮＡ  ＭｉｎｉＰｒｅｐＴＭキット（米国カリフォルニア州のＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；カタログ番号Ｒ１０６４）を使用して、未処理ＨＥＫ−２９３細胞の全ＲＮＡを単離し、アプライドバイオシステムズＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（米国カリフォルニア州のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号４３６８８１４）を用いてｃＤＮＡを合成した。標的成分のアンプリコンを、表２に列挙したプライマーを用いた３０−４５サイクルの変性（９５℃、２０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）及び伸長（６８℃、３０秒）のＰＣＲ反応によって生成した。ＰＣＲ産物を、１×ＲｅｄＳａｆｅＴＭ（大韓民国、京畿道のｉＮｔＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；カタログ番号２１１４１）を補充した１．５％アガロースゲル上で分離し、ＵＶ光の下で可視化した。定量分析のために、ＰＣＲ反応（５０℃で２分間、９５℃で２０秒間と、９５℃で１秒間、その後６０℃で１分間の６０サイクル）を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （米国、カリフォルニア州のＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号４３０９１５５）及び表２に列挙したプライマーを使用してＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｒｅａｌｐｌｅｘ２  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（ドイツ、ハンブルクのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ）で実施した。相対サイクル閾値（ＣＴ）を決定し、内因性のヒトグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子に対して正規化した。
【０１３３】
2019520837.tif 000012
2019520837.tif 000013
【０１３４】
[グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）]  カプセル化ヒト膵島及び１．１Ｅ７細胞を０．２５ｍＬのクレブス−リンガー炭酸水素バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｋ４００２；１２９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で洗浄し（３０分間インキュベート）、さらに低グルコース（２．８ｍＭ）クレブス−リンガー炭酸水素バッファー中で３０分間インキュベートした。その後、さらに３０分間、培養液を高グルコース（３０ｍＭ）クレブス−リンガー炭酸水素バッファーに切り替えた。プロインスリンプロセシング中に産生された連結ペプチド（Ｃ−ペプチド）の分泌されたアイソフォームを超高感度ヒトＣ−ペプチドＥＬＩＳＡを用いて定量し、その後カプセルを新しい培地に移し、次のＧＳＩＳアッセイまで培地した。
【０１３５】
[化学薬品及びソフトドリンク]  エタノール（ＥｔＯＨ；カタログ番号０２８６０）、酢酸（カタログ番号Ａ６２８３）、塩化カルシウム二水和物（ｄｄＨ２Ｏ中０．５Ｍ原液；カタログ番号Ｃ７９０２）、Ｄ−グルコース（ｄｄＨ２Ｏ中１Ｍ原液；カタログ番号Ｇ−７０２１）、Ｄ−マンニトール（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号Ｍ４１２５）、Ｄ−マンノース（ｄｄＨ２Ｏ中１Ｍ原液；カタログ番号Ｍ６０２０）、Ｄ−ガラクトース（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号４８２６３）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４；カタログ番号Ｍ２６４３）、ニコチンアミド（ｄｄＨ２Ｏ中０．５Ｍ原液；カタログ番号Ｎ０６３６）、一塩基性リン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４；カタログ番号５７６１）、ショ糖（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号Ｓ０３８９）、Ｄ−マルトース一水和物（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号Ｍ９１７１）、Ｄ−キシロース（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号Ｘ１５００）、Ｌ−グルタミン（ｄｄＨ２Ｏ中０．１５Ｍ原液；カタログ番号Ｇ３１２６）、３−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ；ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号Ｍ１２５４）、パルミチン酸（ＥｔＯＨ中０．０２Ｍ原液；カタログ番号Ｐ０５００）及びアロキサン一水和物（カタログ番号Ａ７４１３）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（スイス、ブックス）から購入した。ブラストサイジンＳＨＣｌ（カタログ番号Ａ１１１３９０３）、ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（カタログ番号３５０５００６１）、インスリン−トランスフェリン−セレン液体培地（ＩＴＳ；カタログ番号４１４０００４５）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；１Ｍ原液；カタロ番号１５６３００８０）、ピューロマイシン二塩酸塩（カタログ番号Ａ１１１３８０３）、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ原液；カタログ番号１１３６００７０）及びゼオシンＴＭ選択試薬（カタログ番号Ｒ２５００５）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（スイス、ライナハ）から購入した。組換えヒトＧＬＰ−１（ｄｄＨ２Ｏ中１ｍＭ原液；カタログ番号１３０−０８；ロット番号０１０８３５８）、ＩＬ−２（１０ｍＭ酢酸水溶液中１０μＭ原液；カタログ番号２００−０２；ロット番号０５１５１２−１）、ＩＬ−１２  ｐ７０（ＤＭＥＭ中１μＭ原液；カタログ番号２００−１２；ロット番号０９０９Ｓ９６）及びＩＬ−１５（ｄｄＨ２Ｏ中１μＭ原液；カタログ番号２００−１５；ロット番号０６１０２４）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  ＥＣ  Ｌｔｄ（英国、ロンドン）から購入した。Ｄ−フルクトース（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号１６１３５００１０）、Ｌ−ロイシン（グルコース不含ＤＭＥＭ中０．０１Ｍ原液；カタログ番号１２５１２１０００）及びリノール酸（ＥｔＯＨ中０．０２Ｍ；原液カタログ番号２１５０４００５０）は、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（ベルギー、へール）から購入した。無水Ｌ−グルコース（ｄｄＨ２Ｏ中１Ｍ原液；カタログ番号ＡＢ１１６９１９）は、ａｂｃｒ  ＧｍｂＨ（ドイツ、カールスルーエ）から購入した。塩化カリウムカリウム（ＫＣｌ；ｄｄＨ２Ｏ中４Ｍ原液；カタログ番号Ａ３５８２）及び塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；ｄｄＨ２Ｏ中５Ｍ原液；カタログ番号Ａ２９４２）は、ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。無水クエン酸（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号ｓｃ−２１１１１３）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国、ダラス）から購入した。ポリ（Ｌ−リジン）臭化水素酸塩（カタログ番号ＰＬＫＢ５０）は、Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（米国、アラバマ州）から購入した。クエン酸三ナトリウム２水和物（ｄｄＨ２Ｏ中０．１Ｍ原液；カタログ番号６４４８）は、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（スイス、シャフハウゼン）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；原液１０ｇ／Ｌ；カタログ番号Ｂ９０００Ｓ）は、ＮＥＢ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から購入し、ストレプトゾトシン（カタログ番号１６２１）は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（英国、ブリストル）から購入した。コークスは近隣のスーパーマーケットで購入し、激しく振盪することによって脱気し、マウスに直接投与した（４×２００μｌ）。
【０１３６】
[動物実験]  １型糖尿病マウスモデル（Ｔ１Ｄ）は、先述の通りに作成された（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014)）。つまり、絶食マウス（２ｘ１８時間／日）に単回用量の新たに希釈したアロキサン一水和物（ＡＬＸ；３００μｌのリン酸緩衝生理食塩水中２００ｍｇ／ｋｇ）を注射し、４８時間後、持続性空腹時高血糖（＞２０ｍＭ）が発症した。２型糖尿病マウスモデル（Ｔ２Ｄ）は、Ａｒｏｒａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３，８１−８４（２００９）に記載の通りに作成された。つまり、絶食マウス（２０時間／日）に新たに希釈したストレプトゾトシン（ＳＴＺ；２５０μｌの氷冷クエン酸ナトリウムバッファー中４０ｍｇ／ｋｇ［ｐＨ４．５、０．０１Ｍ、０．１１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ］）を１日量ずつ連続５日間注射し、３週間後に慢性空腹時高血糖（＞１０ｍＭ）が発症した。近隣の薬局で購入した市販のグルコメーター（Ｃｏｎｔｏｕｒ（登録商標）Ｎｅｘｔ；ドイツ、レーバークーゼンのバイエルヘルスケア；検出範囲：０．５−３５ｍＭ）で、マウスの血糖症を測定した。次のパラメーター：振動数１０２５Ｈｚの２００−μｍノズル、４１０単位の流速で操作される２５ｍＬシリンジ及びビーズ分散用の１．１２−ｋＶ電圧に設定されたＩｎｏｔｅｃｈ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ  ＲｅｓｅａｒｃｈユニットＩＥ−５０Ｒ（スイス、グライフェンゼーのＥｎｃａｐＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，）を使用してトランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞、１．１Ｅ７細胞又はヒト膵島を凝集性アルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸ビーズ（４００μｍ；５００細胞又は１−１０ＩＥＱ／カプセル）にカプセル化することによって、腹腔内移植片を作成した。週齢５−９のメスの野生型又はＡＬＸ／ＳＴＺ前処理ＣＤ−１スイスアルビノマウス（フランス、ル  ジュネスト  サン  ティスルのＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ）に、１ｘ１０４個のマイクロカプセルを含有する１ｍＬのグルコース不含ＤＭＥＭを腹腔内注射した。製造者の説明書に従ってマイクロテイナー血清分離チューブ（ＳＳＴ）を使用して血清を単離した（１００００ｘｇで５分間の遠心分離；英国、ブリマスのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カタログ番号３６５９６７）。動物に関する実験のほとんどは、フランス共和国によって承認された欧州共同体評議会の指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施され、クロード・ベルナール・リヨン第１大学（ＵＣＢ  Ｌｙｏｎ１）工学部（Ｆ−６９６２２  Ｖｉｌｌｅｕｒｂａｎｎｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）にてＧｈｉｓｌａｉｎｅ  Ｃｈａｒｐｉｎ−Ｅｌ  Ｈａｍｒｉ（Ｎｏ．６９２６６３０９；プロジェクト番号ＤＲ２０１３-０１（ｖ２））及びＭａｒｉｅ  Ｄａｏｕｄ−Ｅｌ  Ｂａｂａ（Ｎｏ．６９２６６３１０；プロジェクト番号ＤＲ２０１３-０１（ｖ２））によって行われた。図１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄ及び１２Ｇに関連する動物実験は、華東師範大学（ＥＣＮＵ）動物実験委員会（Animal Care and Use Committee）によって承認され、かつ中華人民共和国科学技術部の実験動物管理ガイドライン（Animal Care Guidelines）にも正に合致するプロトコール（プロトコールＩＤ：ｍ２０１４０３０１）に従って実施された。
【０１３７】
実施例１：解糖を介したカルシウム流入のβ細胞模倣カスケードの合成興奮転写連関システムへの結合
グルコース感知は、ヒト胎児腎臓細胞において解糖を介したカルシウム流入のβ細胞模倣カスケードを合成興奮転写連関システム（D’Arco M and Dolphin AC, Sci Signal 5, pe34 (2012)）に結合することによって達成された。このヒト細胞株は、イオンチャネル活性の研究に広く使用されており（Thomas P and Smart TG, J Pharmacol Toxicol Methods 51, 187-200 (2005)）、抗糖尿病タンパク質の最適生産能力を示している（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014)）。定量的レポータータンパク質による膜脱分極の刺激強度を評価するために、細胞ベースのアッセイをヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３）において構築した（図１Ａ）。異なるカルシウム応答性プロモーター（Hogan P et al., Genes Dev 17, 2205-2232 (2003)）を７５ｍＭ塩化カリウム（ＫＣｌ）に曝露した場合、マウスインターロイキン４  （ＩＬ４）プロモーター由来の、ＮＦＡＴリピートを含有する合成プロモーターＰＮＦＡＴ−ＩＬ４（Rooney JW et al., EMBO J 13, 625-633 (1994)）は、化学的に誘導された膜脱分極に最も応答性であった（図１Ｂ）。Ｃａｖ１．２などの電位開口型カルシウムチャネルのコトランスフェクションは、増幅された興奮転写連関及びより高い感度への用量反応曲線のシフトをもたらした（図１Ｃ）。最小真核生物ＴＡＴＡボックスプロモーター（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ）に先行する５つのタンデムＮＦＡＴＩＬ４リピート配列のプロモーター構造は、静止状態と膜電位と脱分極状態の膜電位との間で最適な誘導比を示した（図１Ｄ）。Ｂｅｃａｕｓｅこのプロモーターは異なる活性閾値の電位開口型カルシウムチャネルによって生成されたシグナルを区別することもできるため（図１Ｅ）、本発明者らは、興奮転写連関に関わるすべての後続研究用のレポーターシステムとして、ｐＭＸ５７（（ＮＦＡＴＩＬ４）５−Ｐｍｉｎ−ＳＥＡＰ−ｐＡ）を使用した。
【０１３８】
ｐＭＸ５７ベースの脱分極誘発性転写系を使用してグルコースを感知するための各β細胞由来成分（ＧＬＵＴ２、ＧＣＫ、ＫＡＴＰ、Ｃａｖ１．３）の寄与効果を実験的に評価するために、コンビナトリアルスクリーニングアプローチ（図２Ａ）を用いた。ＫＡＴＰ成分の発現はグルコース感知に有意な寄与を示さなかったが、ＧＬＵＴ２過剰発現は全体的なグルコース誘発性カルシウム依存性転写を増加させ（図２Ａ、条件＃１０）、ＧＣＫ過剰発現はより高い細胞外グルコース濃度で毒性効果を引き起こしうるＧＣＫ（図２Ａ、条件＃６、＃１４、＃１６）。実際、半定量的転写プロファイリングでは、ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ３グルコース輸送体（Castro M et al., Pflugers Arch 457, 519-528 (2008); Elsner M et al., Diabetologia 45, 1542-1549 (2002)）、並びに代謝依存性カリウムチャネルのＫＡＴＰサブユニットが野生型ＨＥＫ−２９３細胞において内因的に発現され（図７Ａ）、大半の哺乳動物細胞型は少なくとも１のヘキソキナーゼアイソフォーム（Robey RB and Hay N, Oncogene 25, 4683-4696 (2006)）を発現することが確認された。したがって、Ｃａｖ１．３チャネルの異所性発現は、ＨＥＫ−２９３細胞（図２Ａ、挿入図）、ＨｅＬａ（図３Ａ）及びヒト間葉系幹細胞（図３Ｂ）にグルコース感受性を付与するのに十分であった。対照的に、文献に報告されている推定上のグルコースセンサー、例えばＴ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３甘味受容体（Jang H et al., PNAS 104, 15069-15074 (2007)）は、血糖コントロールに関連するグルコースレベルに応答して標的遺伝子調節を媒介しなかった（図７Ｂ）。Ｃａｖ１．３は、ＨＥＫ−２９３細胞においてインタクトな、生理学的に関連のあるグルコース感知カスケードを再構成するための欠落部分（missing link）であることと（図２Ｂ）、非膵臓ヒト細胞においてβ細胞機能を模倣するには最小限の標的化操作しか必要とされないことが結論付けられる。
システムを定量的に分析し、設計段階における一貫性を保証し、かつ、最終的にｉｎ  ｖｉｖｏでの回路動作を予測するために、本発明者らは、β細胞由来グルコース感知カスケードのための動的数学モデルを開発した。つまり、この常微分方程式（ＯＤＥ）モデルは、図２Ｂに示されている成分、細胞の電気生理学の詳細図及び、以前に開発された、ｉｎ  ｖｉｖｏグルコース・インスリン相互作用の簡略図（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014)）を包含する。本発明者らは、システムの定量的表現を確立するために、諸条件にわたる実験データ及び実験アッセイを用いてモデルをパラメーター化した。このモデルはとりわけ、カリウム（図１Ｅ）及びグルコース（図２Ａ）の用量反応曲線を再現した。本発明者らは、定量的回路特性評価のために、そして最終的にはｉｎ  ｖｉｖｏ挙動の本質的な予測をするためにこのモデルを使用した。
【０１３９】
実施例２：Ｃａｖ１．３／ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４構成グルコース感知システムの基質特異性
Ｃａｖ１．３／ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４構成グルコース感知システムの基質特異性を試験するために、Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ５７−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞を浸透圧調節剤（図４Ａ）、一般的な食用砂糖及びその他の栄養素（図７Ｃ）等の異なる糖化合物（図４Ｂ）を含有する培養培地中で培養した。Ｄ−グルコース及びＤ−マンノースは、それらの生理学的に適切な濃度で合成興奮転写連関システムからのＳＥＡＰ発現を活性化した、ＨＥＫ−２９３細胞における試験基質の中で唯一の成分であった。ＨＥＫ−２９３細胞は、グルコースに最も特異的なＧＬＵＴ１輸送体を使用する（図７Ａ）。他の哺乳動物細胞は、Ｄ−フルクトース及びＤ−ガラクトースなどの他の炭水化物に対しても透過性であるＧＬＵＴ２などの他のトランスポーターを発現する（ＨＥＫ−２９３の場合には該当しない）（Augustin R, IUBMB Life 62, 315-333(2010)）。ＨＥＫ−２９３細胞を用いた場合と同様の性能が、他の糖を用いた場合でもその糖が例えばＧＬＵＴ２によって媒介されるならば、期待できるであろう。マンノースは、ほぼ同一の構造を有するグルコースのエピマーであり、ＨＥＫ−２９３細胞がグルコースを処理するのと同じ方法で、ＨＥＫ−２９３細胞に輸送され、ＨＥＫ−２９３細胞によって代謝されうる。ＰＮＦＡＴ３調節遺伝子発現系（図４Ｃ）の厳密な誘導動態（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｋｉｎｔｅｉｃｓ）及びシステムの厳密なＣａｖ１．３依存性活性化（図４Ｃ及び図７Ｄ）を利用して、ＰＮＦＡＴ−ＩＬ４駆動ＳＥＡＰ発現についてトランスジェニックな安定なヒトＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１レポーター細胞株（図８）を構築した。ＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１におけるＣａｖ１．３チャネルの異所性発現は、その一過性に構築された対応システム（図２Ａ；〜２．６倍の誘導）と比較して、低い細胞外グルコース濃度と高い細胞外グルコース濃度間の誘導比の改善をもたらした（図５Ａ；５ｍＭから２５ｍＭグルコースまで〜４．６倍の誘導）。Ｃａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞の誘導は、最初の２４時間で明らかに有意であり、高グルコース培地中での４８時間の培養後に最大ＳＥＡＰ発現レベルに達した（図５Ｂ）。さらに、ＳＥＡＰ発現はＣａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞を低グルコース条件（２ｍＭ）下で異なる期間維持した後でも用量依存的調節に切り替えることができ（図５Ｃ）、かつ、グルコース媒介システム感作及び飢餓媒介脱感作を示す独自の経時変化実験により、合成興奮転写連関システムの可逆性が確認された（図５Ｄ）。数学的モデルはこの挙動を定量的に再現し（図５、Ａ、ＢおよびＤ；図９）、様々なＣａｖ１．３投与量についての独自予測は実験とよく一致し（図５Ａ）、コンストラクト及び条件にわたるモデルの一貫性を強調した。
【０１４０】
実施例３：マイクロカプセル化Ｃａｖ１．３トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞による糖尿病治療
糖尿病治療のためのグルコース誘発性興奮転写連関システムの応用可能性を試験するために、凝集性で、半透性かつ免疫保護性のアルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）−アルギン酸ビーズにＣａｖ１．３−トランスジェニックＨＥＫ−２９３ＮＦＡＴ−ＳＥＡＰ１細胞をマイクロカプセル化し、マウスの腹膜に移植し、ここでそれらは血管新生化し、適切な酸素供給により動物の血流に接続される（Jacobs-Tulleneers-Thevissen D et al., Diabetologia 56, 1605-1614 (2013)）。またｉｎ  ｖｉｖｏでは、転写調節系は、マウス生理機能の数式的表現に結び付けられた同じｉｎ  ｖｉｔｒｏの動的モデルによって再現されるように、用量依存的かつＣａｖ１．３依存的に作動した（図１０Ａ）。重要なことに、このシステムは、野生型、並びにＴ１Ｄ及びＴ２Ｄ糖尿病マウスモデルの特徴的平均空腹時血糖値を、相応して血清中に発現されたＳＥＡＰレベルに変換した（図６Ａ）。野生型非糖尿病マウスにＤ−グルコース水溶液（０．５Ｍ）又はコカ・コーラ（登録商標）などの濃縮糖溶液（総糖類の１１重量％）を与えた場合、血流中のＳＥＡＰ発現は、同じ量の水を与えたコントロール群と比較して有意にアップレギュレートされなかった（図１０Ｂ）が、これは健常マウスにおけるインタクトな耐糖能を示している。したがって、このグルコース誘導転写系は、栄養などの標準的な一時的血糖変動に対して非感受性のままでありながら、慢性高血糖症の症状を専ら標的とするように適合させることができる。
真性糖尿病に対する最先端の治療選択肢は、薬物注射の頻度を週周期に減らすことができる（Trujillo J et al.,Ther Adv Endocrinol Metab 6, 19-28 (2015)）長時間作用型薬物（例えば安定化ＧＬＰ−１変異体など）（Ｔ２Ｄ）、又は患者の瞬間血糖値に応じて速効型インスリンアナログを自律的に注入する携帯型の外付けポンプシステム（Ｔ１Ｄ）（Pickup JC, N Engl J Med 366, 1616-1624 (2012)）のいずれかである。グルコース誘発性興奮転写連関システムで達成された発現レベルが抗糖尿病治療活性と対応しているかを試験するために、ＨＥＫ−２９３細胞に、Ｃａｖ１．３及び以前に報告された短いヒトＧＬＰ−１（ｓｈＧＬＰ１）コンストラクト（Ye H et al., Science 332, 1565-1568 (2011））（高血糖条件下で専らＧＬＰ−１を発現する治療用哺乳動物細胞を操作するためのｐＭＸ１１５；（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ−ｓｈＧＬＰ１−ｐＡ）をコトランスフェクトした（図１０Ｃ）。５ｘ１０６個のマイクロカプセル化Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１１５−トランスジェニックＨＥＫ−２９３細胞を２型糖尿病マウスに移植した場合（Arora S et al., Global J Pharmacol 3, 81-84 (2009)）、血流中の生物活性ＧＬＰ−１の自律的な外因性発現（図６Ｂ）がグルコース刺激インスリン分泌の内因性調節を改善し（図６Ｃ）、それが耐糖能を実質的に改善した（図６Ｄ）。同様に、Ｃａｖ１．３とインスリンの同質遺伝子発現ベクター（ｍＩＮＳ；  最適化分泌のための改変されたラットインスリン変異体）（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014））（ｐＭＸ１００；ＨＥＫ−２９３細胞への（ＮＦＡＴＩＬ４）９−Ｐｍｉｎ−ｍＩＮＳ−ｐＡ）による血糖誘発性インスリン発現細胞の生成（図１０Ｄ）。実験とモデルとの間で一致して、Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１００−トランスジェニック移植片からの自律インスリン発現は、１型糖尿病マウスモデル（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014)）における典型的なインスリン欠乏症（Polonsky KS, N Engl J Med 367, 1332-1340 (2012)）を回復させた（図６Ｅ）が、２−３日以内に動物の持続性高血糖症も直した（図６Ｆ）。重要なことに、古典的インスリン単独療法においてしばしば観察される正常血糖レベルでの基礎又は過剰インスリン発現に起因する低血糖副作用（Pickup JC, N Engl J Med 366, 1616-1624 (2012)）は、検出されなかった（図６Ｅ及びＦ）。Ｔ１Ｄマウスは１週間以内に高致死的転帰を伴う高血糖症を発症し（インスリン処置なしの死亡例３７．５％；ｎ＝２４）、一方、Ｃａｖ１．３／ｐＭＸ１００−トランスジェニック細胞移植片で処置されたＴ１Ｄ動物は高血糖症を全く示さず、生活の質の改善を示した（死亡例０％；ｎ＝２４）（図１１）ため、Ｔ１Ｄ患者における生涯血糖コントロールを達成するための最適な治療法選択肢となる操作システムのさらなる開発も現実的と思われる。
【０１４１】
実施例４：マイクロカプセル化ＨＥＫ−β細胞による糖尿病治療
β細胞は、グルコースへの応答だけでなく、ＧＬＰ−１などのグルコインクレチン作用によってもインスリン放出を調節する（Lee YS, Metabolism 63, 9-19 (2014)）。したがって、本発明者らは、ＨＥＫ−β構成要素のため、並びにＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）の恒常的発現及びＰＣＲＥ駆動インスリン発現のためにＨＥＫ−２９３を操作した（図１２Ｅ）。得られたＨＥＫ−βＧＬＰは、ＨＥＫ−βと比較して実質的に改善されたインスリン分泌動態（図１５）を示しただけでなく、動物によって摂取された食餌に対しても感受性であった（図１２Ｆ）。ＨＥＫ−βＧＬＰは、経口耐糖能試験における血糖可動域の減衰においてＨＥＫ−βと同程度に強力であったが（図１２Ｇ）、ＨＥＫ−βと比較して１型糖尿病マウスではグルコースホメオスタシスはあまり効率的に回復しなかった（図１２Ｈ）。この知見はモデルシミュレーションによって確認され、主要なβ細胞模倣デザインとしてのＨＥＫ−βを確立した。
可逆的グルコース刺激インスリン分泌（図１３、１４）について安定的にトランスジェニックなマイクロカプセル化ＨＥＫ−β細胞の移植（図１２Ａ）は、数学モデルによって予測された通り、１型糖尿病マウスにおいてグルコース（図１２Ｂ）及び血中インスリンホメオスタシス（図１２Ｃ）を回復させた。重要なことには、処置されたＴ１Ｄマウスのグルコースホメオスタシスは３週間の研究全体を通してロバストであり（図１２Ｂ）、摂食応答をシミュレートするための耐糖能試験（図１２Ｄ）を受けた処置動物は、正常血糖のＨＥＫ−β媒介性回復の間、血糖可動域の悪化はなかった（図１２Ｂ）。対照的に、ネガティブコントロール移植片（ＣａＶ１．３／ｐＭＸ１１５−トランスジェニック  ＨＥＫ−２９３細胞）を移植されたＴ１Ｄマウスは高血糖のままであり、７日目の最初の耐糖能試験（図１２Ｂ、Ｄ）を生き延びなかった。
β細胞模倣ＨＥＫ−β、膵臓β細胞株１．１Ｅ７（McCluskey JT, The Journal of biological chemistry 286, 21982-21992 (2011)）及びヒト膵島による３週間にわたる可逆的グルコース刺激インスリン分泌の比較分析において、ＨＥＫ−βは、１．１Ｅ７及びヒト膵島よりも高いインスリン分泌能をｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した（図１４Ｃ）。１型糖尿病マウスでは、埋め込まれたマイクロカプセル化ＨＥＫ−β及び１．１Ｅ７は、食後のグルコース代謝において同等に効率的であった（図１２Ｇ）が、ＨＥＫ−βは２週間後に１．１Ｅ７よりも効率的にグルコースホメオスタシスを回復し、野生型マウスの３週間にわたる空腹時血糖レベルに達した（図１２Ｂ）。ヒト膵島については、食後のグルコース代謝は、４頭のＴ１Ｄマウスのうち２頭でのみ回復することができ（図１６）、これによりカプセル化ヒト膵島の性能変動が確認される。しかしながら、食後のグルコース代謝を回復することができた２頭のＴ１Ｄマウス（図１６）では、ヒト膵島は、耐糖能の提供においてＨＥＫ−βと同様の効率を示した（図１２Ｄ）。
ＣａＶ１．３に基づくグルコース感知とンスリン産生及び分泌とのカップリングにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．で膵臓細胞株１．１Ｅ７及びヒト膵島と比較して増加した３週間のインスリン分泌プロファイルをもたらしたβ細胞模倣ＨＥＫ−βが得られた。食後のグルコース代謝の制御は、ＨＥＫ−βと１．１Ｅ７の間で同様であったが、ＨＥＫ−βのみが健常マウスの血糖レベルに達した。興味深いことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＥＫ−β、１．１Ｅ７及びヒト膵島の異なるインスリン放出動態は、明らかに食後のグルコース代謝に有意な影響を及ぼさなかったため、分泌様式の違い  ―  ＨＥＫ−βの場合は恒常的、１．１Ｅ７及びヒト膵島の場合は小胞  ―  は、摂食応答においては一般的に考えられているほど関係があるわけではない可能性がある。これは、本発明者らのモデルシミュレーションと、投与と食事を同期させる必要なしに最大４２時間自律的グルコースコントロールを提供する、例えばインスリンデグルデグ（トレシーバ（登録商標）、ノボノルディスク）などの基礎インスリンアナログとによってサポートされている。
【０１４２】
マイクロカプセル化哺乳動物細胞の患者への移植は、宿主と移植片が、半透性生体適合性膜を横切って拡散する分泌代謝物を介して連絡するため、免疫抑制を必要としない（Jacobs-Tulleneers-Thevissen D et al., Diabetologia 56, 1605-1614 (2013)）。ラット膵島細胞を収容する最初の移植可能なアルギン酸−ポリ−（Ｌ−リジン）カプセルが約３５年前に提示されて以来、マイクロカプセル化膵β細胞の技術は、糖尿病治療に対して継続的に最適化されており、いくつかの臨床治験も既に政府によって承認されている。しかし、幹細胞研究における現在の進歩（Pagliuca FW et al., Cell 159, 428-439 (2014)）は乏しい供給源利用可能性及び、観察可能な抗糖尿病機能を誘発する十分な数の機能性β細胞を生じさせるための分化効率という以前からの問題を首尾よく解決したものの（Kobayashi N, Cell Transplant 15, 849-854 (2006)）、再生膵β細胞は一般に、インスリン欠乏１型糖尿病の治療に限定されている（Bruin JE et al., Stem Cell Reports 4, 605-620 (2015)）。しかし、２型糖尿病は、はるかに一般的であり、全糖尿病症例の９５％以上を占め、過剰なレベルの循環インスリンに対する体細胞の感受性の低下をしばしば含む原因を有する（Johnson AM and Olefsky JM, Cell 152, 673-684 (2013）。グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、摂食後に腸から自然に放出されるインクレチンホルモンで、インスリンの食後放出を刺激するためにβ細胞に作用する（Drucker DJ et al., Lancet 368, 1696-1705 (2006)）だけでなく、他の体細胞に循環して、（ｉ）満腹感を促進し、（ｉｉ）肝臓インスリン感受性を改善し、（ｉｉｉ）胃内容排出を遅くし、かつ、（ｉｖ）グルカゴン分泌を阻害する（Ye H et al., PNAS  110, 141-146 (2013)）。現在、長時間作用型ＧＬＰ−１アナログの皮下注射は、殆どの２型糖尿病症例にとって最先端の治療法の選択肢である（Trujillo J et al., Ther Adv Endocrinol Metab 6, 19-28 (2015)）。
細胞ベースのグルコースセンサーの探求は、生物医学研究のために常に大きな需要があった（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014)）。ＧＰＣＲを含む種々の推定グルコース感知成分ｓ（Jang H et al., PNAS 104, 15069-15074 (2007)）、細菌性転写抑制因子（Gaigalat L et al., BMC Mol Biol 8, 104 (2007)）及びヒト核内受容体（Mitro N et al., Nature 445, 219-223 (2007)）の特性評価が行われているが、本発明者らの知る限り、グルコース入力のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗糖尿病活性を含む転写メッセージへの翻訳の成功は、まだ達成されていない。この研究において、本発明者らは、血糖に関連する細胞外グルコースレベルは感知するが生理学的に適切な濃度範囲内で代謝産物及び塩などの他の潜在的な誘因化合物に対して非感受性のままであるために、弱い膜脱分極  の間に長時間持続するＣａ２＋流入を可能にする低閾値電位開口型カルシウムチャネルＣａｖ１．３（Lipscombe D et al., J Neurophysiol 92, 2633-2641 (2004)）を使用した（図４Ｂ、図７Ｃ）。このことは、ヒト胚腎臓細胞において、グルコース誘発性転写単位を操作するための唯一の欠けている構成要素であった。したがって、本研究は、解糖刺激カルシウム流入のグルコース感知メカニズムがβ細胞に限定されない可能性があり、それが他の哺乳動物細胞型にグルコース応答性を付与するための青写真として役立つ可能性があることを示した。まとめると、本発明者らの、操作されたグルコース誘発性興奮転写システムは、将来の臨床応用において糖尿病治療のための改善された代替法の、以下のすべての潜在的な利点を統合した：第１に、糖尿病性ケトアシドーシス中の低血中ｐＨを介して間接的にグルコースレベルをプロファイリングする技術（Auslander D et al., Mol Cell 55, 397-408 (2014)）とは異なり、本発明者らの細胞ベースのグルコースセンサーは、乳酸アシドーシス又はアルコールアシドーシスなどの他のタイプのアシドーシスとの干渉がなく、直接高血糖を定量する。第２に、インスリンなどの血糖降下タンパク質の高血糖誘発性発現は、自動化された方法で自己（不）活性化する閉ループ補綴遺伝子回路の操作を可能にする。すなわち、インスリン発現はもっぱら糖尿病性高血糖条件下で起こり、正常血糖条件下では不活性のままである。このような自律的セラノスティックデバイス（Kojima R et al., Curr Opin Chem Biol 28, 29-38 (2015)）は、最適な生物学的に利用可能な濃度での治療タンパク質の送達を保証するであろう。第３に、このデバイスは、産出タンパク質の柔軟で患者中心のカスタマイズを可能にする。高血糖性疾患のマーカーは、インスリン（Ｔ１Ｄ）及びＧＬＰ−１（Ｔ２Ｄ）などのインスリン分泌物質だけでなく、原則として、心血管疾患又はメタボリックシンドロームなどの他の高血糖症関連疾患に対する任意の薬物の自律的発現に結びつけることができる。第４に、合成生物学に触発された遺伝子回路の操作は、膵島移植又は幹細胞分化などの他の技術と比較した場合、費用及び時間に関して経済的であり、したがってマイクロカプセル移植片における細胞置換の定期的な必要性という主な限界を補う（Yang HK and Yoon KH, J Diabetes Complications 5, 737-43 (2015)）。
ＨＥＫ−βなどのβ細胞ミメティックデザイナー細胞は次の全ての戦略の中から最善のものを組み合わせることができる：β細胞ミメティックデザイナー細胞は、（ｉ）天然β細胞の中で進化したグルコースセンサー成分を使用する。（ｉｉ）ロバストネスと信頼度で知られている、バイオ医薬品製造の実績のある親細胞株を利用する。（ｉｉｉ）β細胞株及びヒト膵島に匹敵するグルコース誘発性インスリン放出性能を示す。さらに、デザイナー細胞の合理的プログラミングは、（ｉｖ）性能パラメーターの直接的な微調整を可能にし、（ｖ）２型糖尿病の治療に必要なＧＬＰ−１などの他の治療タンパク質の生産にグルコース感知を結び付ける柔軟性を提供する。
【０１４３】
Ｔ１Ｄ療法のための理想的な移植片の遺伝子型は食事性糖質摂取後の血糖レベルの即時摂動を減衰させる食後インスリン放出も含むかもしれないが、本発明者らの実験及び計算解析は、グルコース誘発性インスリン発現システムが、自律的かつ（予測される）ロバストな方法で、ホメオスタシスに近い血中インスリン及びグルコースレベルを回復することによって、Ｔ１Ｄ動物モデルの重篤な高血糖の急速な減衰を達成したことを示した。特に、Ｔ１Ｄマウスにおける血糖コントロールは、移植後１週間以内に回復したが、これは、膵臓前駆細胞（３０週間；（Rezania A et al., Diabetes 61, 2016-2029 (2012)）、又は７段階のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化プロトコールによってヒト多能性幹細胞から産生されたβ細胞模倣物（４０日間；（Rezania A et al., Nat Biotechnol 32, 1121-1133 (2014)）を用いた動物における実験細胞ベース治療と比較して有利な応答時間であった。さらに、動物実験では、現在の移植バーションで既に、治療からわずか１週間以内に絶対的に上昇した生存率が実証されたが、これはスステムの効率を判断するのに最も重要な基準となるはずである。したがって、本研究は、既に実施妥当性の基準で達成されている治療的特徴を有する糖尿病治療のための魅力的な代替概念を紹介する原理証明研究と考えられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図１Ｄ−Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図７Ｅ−Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ−Ｃ】
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【図１２Ｄ−Ｅ】
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【図１２Ｆ−Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ−Ｄ】
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【図１３Ｅ−Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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