(57)【要約】そのような分子の安定性および製造可能性を改善する特定の変異および変異の組み合わせであるような、改変単鎖ｔｒａｉｌ分子が提供される。これらの分子は抗癌治療薬として使用するために提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖を含む、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖であって、
前記変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成され、
前記各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、前記２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み、
前記３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、
前記変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成された前記Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す、単一変異ポリペプチド鎖。
【請求項２】
前記少なくとも１つの安定化変異は、野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である、請求項１に記載のポリペプチド鎖。
【請求項３】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである、請求項２に記載のポリペプチド鎖。
【請求項４】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はバリン（Ｉ２４７Ｖ）である、請求項２に記載のポリペプチド鎖。
【請求項５】
前記少なくとも１つの安定化変異はＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖから選択される、請求項１に記載のポリペプチド鎖。
【請求項６】
前記少なくとも１つの安定化変異は下記６つの組み合わせから選択される少なくとも２つの安定化変異の組み合わせを含む、請求項１に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；
２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに
６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【請求項７】
ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖であって、
前記変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒト血清アルブミン部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成され、
前記各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、前記２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み、
前記３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、
前記変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成された、前記Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す、単一変異ポリペプチド鎖。
【請求項８】
前記少なくとも１つの安定化変異は野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である、請求項７に記載のポリペプチド鎖。
【請求項９】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである、請求項８に記載のポリペプチド鎖。
【請求項１０】
前記イソロイシン以外のアミノ酸はバリン（Ｉ２４７Ｖ）である、請求項８に記載のポリペプチド鎖。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの安定化変異はＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖから選択される、請求項７に記載のポリペプチド鎖。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの安定化変異は下記６つの組み合わせから選択される少なくとも２つの安定化変異の組み合わせを含む、請求項７に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；
２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに
６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【請求項１３】
ヒト患者において癌を治療する方法であって、前記患者に、有効量の、請求項１−１２のいずれか一項に記載の変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成されたＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であり、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多く以上での置換を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１５】
Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
２１３および２１５位の一方または両方での置換をさらに含む、請求項１４−１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換をさらに含む、請求項１４−１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
下記からなる群より選択される１組の置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【請求項２０】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質は約６０℃を超える融解温度を有する、タンパク質。
【請求項２１】
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質は、９０％マウス血清中、１μＭの最終濃度で７日間３７℃でのインキュベーション後、初期活性の少なくとも１０％を保持する、タンパク質。
【請求項２３】
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質であって、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、前記タンパク質はマウス循環において１０時間以上の終末相半減期を有する、タンパク質。
【請求項２５】
各ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの安定化変異は、下記からなる群より選択される安定化変異の組み合わせを含む、請求項１に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの安定化変異は、下記からなる群より選択される安定化変異の組み合わせを含む、請求項７に記載のポリペプチド鎖：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【請求項２８】
下記からなる群より選択される１組の置換を含む、請求項１４に記載のポリペプチド：
１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；
２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；
５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；
６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；
７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに
８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１６年３月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３０９，３５２号、２０１６年４月１５日に出願された６２／３２３，５０１号、および２０１７年１月１２日に出願された６２／４４５，５５６号に対し優先権を主張する。前記出願の内容はこれにより参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
序論
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド、ＣＤ２５３）は、デスレセプタ（特定的には、ＤＲ４およびＤＲ５）に結合し、これを活性化するＴＮＦファミリーのメンバーである。ＴＲＡＩＬはまた、非シグナル伝達デコイ受容体、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、およびオステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）（ＯＰＧ）にも結合する。ＴＲＡＩＬは天然に２型膜貫通タンパク質として生じ、切断され、可溶性三量体タンパク質を放出することができる細胞外ドメインを有する。例えば、ＴＲＡＩＬの三量体構造により媒介される受容体複合体のクラスター化は、デスレセプタによる効率的なシグナル伝達およびアポトーシスの誘導には必要である。加えて、受容体複合体の高次オリゴマ化はシグナル伝達を増幅することができ、アポトーシスのより大きな誘導が得られる。
【０００３】
可溶性組換えＴＲＡＩＬが生成され、癌治療薬として試験されてきた。これはヒトにおいて短い半減期を有し（およそ０．５−１時間）（Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０  Ｊｕｎ  １０；２８（１７）：２８３９−４６）、これがおそらくその有効性を制限した。
【０００４】
加えて、ＴＲＡＩＬリガンドの発現は困難である。組換えＴＲＡＩＬコンストラクトは不安定であり、低い融解温度（Ｔｍ）およびミスフォールドした強凝集体を形成する傾向により特徴付けられ、望まれない毒性という結果になってしまうことがある（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１  Ａｐｒ；７（４）：３８３−５）。三量体の安定化は、主に、足場ドメインへのＮ末端融合により試みられた（例えば、改変ロイシンジッパーまたはテネイシン−Ｃの三量体形成ドメイン。）（Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９９  Ｆｅｂ；５（２）：１５７−６３）。これらの安定化ドメインにより免疫原性が付加される可能性があり、治療法におけるそれらの有用性が制限される。ペプチドリンカーにより連結されたＴＲＡＩＬの単鎖融合ポリペプチドが三量体化ＴＲＡＩＬを生成させる代替法として記載されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１０  Ａｕｇ  ２６；１：ｅ６８）。しかしながら、我々は、この分子は、凝集、低い熱融解温度、および／または血清中でインキュベートざれた場合の活性の損失により特徴付けられる不安定性を表すので、臨床開発には適していないことを観察した。
【０００５】
治療薬としての組換えヒトＴＲＡＩＬを調製するための前の試みの主な欠点の１つは短い血清半減期である（表１）。
【表１】
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【０００６】
ペプチドリンカーが隣接するＴＲＡＩＬ単量体を連結するのに使用されたＴＲＡＩＬの単一ポリペプチド鎖バリアントはその血清半減期（Ｔ１／２約３５分）および生理活性をわずかに改善したことが示されている（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１０  Ａｕｇ  ２６；１：ｅ６８）。しかしながら、改善されたＴ１／２は有効な臨床用途には依然として短すぎた。
そのため、発現させ、精製することができ、商業的製造および分配のために十分な安定性を有し、インビボで生物活性を保持するデスレセプタアゴニストが依然として必要とされている。本開示はこの要求に対処し、追加の利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１０  Ｊｕｎ  １０；２８（１７）：２８３９−４６
【非特許文献２】Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１  Ａｐｒ；７（４）：３８３−５
【非特許文献３】Ｗａｌｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９９  Ｆｅｂ；５（２）：１５７−６３
【非特許文献４】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＆  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１０  Ａｕｇ  ２６；１：ｅ６８
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬを表示したものである。ｓｃＴＲＡＩＬ（灰色）は、抗ＥｐＣＡＭ  ＭＯＣ３１重鎖（白色）のＣ末端に融合される。ＭＯＣ３１の軽鎖は斜線で示される。Ｆａｂの定常ドメイン間の単一ジスルフィド結合（直線）およびＦａｂをＴＲＡＩＬ単量体に連結させ、ＴＲＡＩＬ単量体を互いに連結させるグリシン−セリンリンカー（曲線）もまた、示される。
【図１Ｂ】ｓｃＴＲＡＩＬバリアント（Ｔ１−Ｔ９）がＴＲＡＩＬ配列長およびグリシンセリンリンカー長の行列で表される。図は、それぞれ、出現順での、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０８−１０９および１０６を開示する。
【図１Ｃ】非還元および還元条件下でのＴ１−Ｔ９バリアント（２μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１Ｄ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｅ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｆ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｇ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｈ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｉ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｊ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｋ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図１Ｌ】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラムを使用した、Ｔ１−Ｔ９バリアントのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。主要ピークのパーセンテージが示される。
【図２Ａ】ＨｅＬａ細胞を用いた細胞生存率アッセイにおけるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１−Ｔ９で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図２Ｂ】ＨｅＬａ細胞を用いた細胞生存率アッセイにおけるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１−Ｔ９で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図２Ｃ】ＨｅＬａ細胞を用いた細胞生存率アッセイにおけるＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１−Ｔ９で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図３】ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（白色）のＣ末端に融合された、ｓｃＴＲＡＩＬ（灰色）のホモ二量体の模式図表示である。ヒンジ領域のジスルフィド結合およびＴＲＡＩＬ単量体を連結させるＧＳリンカーもまた、示される。
【図４】ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＳＷ３０００を使用する、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。非還元および還元条件下でのＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（１μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５Ａ】ＣＯＬＯ２０５（図５Ａ）、ＨＣＴ１１６（図５Ｂ）、ＤＵ１４５細胞（図５Ｃ）、およびＪｕｒｋａｔ細胞（図５Ｄ）を使用した、細胞生存率アッセイにおけるＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ、ならびに作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図５Ｂ】ＣＯＬＯ２０５（図５Ａ）、ＨＣＴ１１６（図５Ｂ）、ＤＵ１４５細胞（図５Ｃ）、およびＪｕｒｋａｔ細胞（図５Ｄ）を使用した、細胞生存率アッセイにおけるＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ、ならびに作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図５Ｃ】ＣＯＬＯ２０５（図５Ａ）、ＨＣＴ１１６（図５Ｂ）、ＤＵ１４５細胞（図５Ｃ）、およびＪｕｒｋａｔ細胞（図５Ｄ）を使用した、細胞生存率アッセイにおけるＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ、ならびに作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図５Ｄ】ＣＯＬＯ２０５（図５Ａ）、ＨＣＴ１１６（図５Ｂ）、ＤＵ１４５細胞（図５Ｃ）、およびＪｕｒｋａｔ細胞（図５Ｄ）を使用した、細胞生存率アッセイにおけるＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ、ならびに作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図６Ａ】Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した、細胞生存率アッセイにおける作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。図６Ａでは、細胞を２４時間の間、濃度を増加させた抗ＤＲ４（白四角）、架橋抗ＤＲ４（黒四角）、抗ＤＲ５（白丸）、および架橋抗ＤＲ５（黒丸）で処理した。図６Ｂでは、細胞を２４時間の間、濃度を増加させた架橋抗ＤＲ４、架橋抗ＤＲ５、架橋抗ＤＲ４および５の組み合わせ、ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図６Ｂ】Ｊｕｒｋａｔ細胞を使用した、細胞生存率アッセイにおける作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。図６Ａでは、細胞を２４時間の間、濃度を増加させた抗ＤＲ４（白四角）、架橋抗ＤＲ４（黒四角）、抗ＤＲ５（白丸）、および架橋抗ＤＲ５（黒丸）で処理した。図６Ｂでは、細胞を２４時間の間、濃度を増加させた架橋抗ＤＲ４、架橋抗ＤＲ５、架橋抗ＤＲ４および５の組み合わせ、ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図７Ａ】ＤＵ１４５（図７Ａ）、ＣＯＬＯ２０５（図７Ｂ）、およびＰＡＮＣ１（図７Ｃ）細胞を使用した、細胞生存率アッセイにおける作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させた架橋抗ＤＲ４（黒四角）、架橋抗ＤＲ５（黒三角）、架橋抗ＤＲ４および５（黒丸）、ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（白丸）で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図７Ｂ】ＤＵ１４５（図７Ａ）、ＣＯＬＯ２０５（図７Ｂ）、およびＰＡＮＣ１（図７Ｃ）細胞を使用した、細胞生存率アッセイにおける作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させた架橋抗ＤＲ４（黒四角）、架橋抗ＤＲ５（黒三角）、架橋抗ＤＲ４および５（黒丸）、ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（白丸）で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図７Ｃ】ＤＵ１４５（図７Ａ）、ＣＯＬＯ２０５（図７Ｂ）、およびＰＡＮＣ１（図７Ｃ）細胞を使用した、細胞生存率アッセイにおける作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させた架橋抗ＤＲ４（黒四角）、架橋抗ＤＲ５（黒三角）、架橋抗ＤＲ４および５（黒丸）、ならびにＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（白丸）で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図８】Ｈ１９９３細胞を使用した、細胞生存率アッセイにおけるＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬおよびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑバリアントの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（丸）、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ１（菱形）、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ２（四角）、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ３（三角）で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図９Ａ】（図９Ａ）ＴＲＡＩＬおよびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬについての熱融解曲線を示す。（図９Ｂ）０、３、および７日血清インキュベーション後のＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間、濃度を増加させた、血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理し、細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図９Ｂ】（図９Ａ）ＴＲＡＩＬおよびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬについての熱融解曲線を示す。（図９Ｂ）０、３、および７日血清インキュベーション後のＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間、濃度を増加させた、血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理し、細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図１０Ａ】酵母ライブラリパニングのフローサイトメトリー分析を示す。細胞を、ビオチン−ＤＲ５−Ｆｃ（１０ｎＭ）および抗ＦＬＡＧ（２μｇ／ｍｌ）、続いてＳＡ／Ａｌｅｘａ６４７および抗マウス／Ａｌｅｘａ  ４８８で標識した。蛍光を測定し、二変量プロットで表した。（図１０Ａ）非選択ライブラリ。（図１０Ｂ）４ラウンドのパニング後の濃縮集団。（図１０Ｃ）野生型ＴＲＡＩＬと重ねられた例示的なクローン。
【図１０Ｂ】酵母ライブラリパニングのフローサイトメトリー分析を示す。細胞を、ビオチン−ＤＲ５−Ｆｃ（１０ｎＭ）および抗ＦＬＡＧ（２μｇ／ｍｌ）、続いてＳＡ／Ａｌｅｘａ６４７および抗マウス／Ａｌｅｘａ  ４８８で標識した。蛍光を測定し、二変量プロットで表した。（図１０Ａ）非選択ライブラリ。（図１０Ｂ）４ラウンドのパニング後の濃縮集団。（図１０Ｃ）野生型ＴＲＡＩＬと重ねられた例示的なクローン。
【図１０Ｃ】酵母ライブラリパニングのフローサイトメトリー分析を示す。細胞を、ビオチン−ＤＲ５−Ｆｃ（１０ｎＭ）および抗ＦＬＡＧ（２μｇ／ｍｌ）、続いてＳＡ／Ａｌｅｘａ６４７および抗マウス／Ａｌｅｘａ  ４８８で標識した。蛍光を測定し、二変量プロットで表した。（図１０Ａ）非選択ライブラリ。（図１０Ｂ）４ラウンドのパニング後の濃縮集団。（図１０Ｃ）野生型ＴＲＡＩＬと重ねられた例示的なクローン。
【図１１】Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体、Ｔ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３についてのアミノ酸置換および熱融解曲線を示す。
【図１２Ａ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１２Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１２Ｂ−１２Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間血清インキュベートさせたＴ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１２Ｂ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１２Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１２Ｂ−１２Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間血清インキュベートさせたＴ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１２Ｃ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１２Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１２Ｂ−１２Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間血清インキュベートさせたＴ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１２Ｄ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１２Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１２Ｂ−１２Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間血清インキュベートさせたＴ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１３】Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体、Ｔ１８３、Ｔ１８６、およびＴ１９１についてのアミノ酸置換および熱融解曲線を示す。
【図１４Ａ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１４Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１４Ｂ−１４Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間、血清インキュベートさせたＴ１８３（図１４Ｃ）、Ｔ１８６（図１４Ｂ）、およびＴ１９１（図１４Ｄ）で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１４Ｂ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１４Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１４Ｂ−１４Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間、血清インキュベートさせたＴ１８３（図１４Ｃ）、Ｔ１８６（図１４Ｂ）、およびＴ１９１（図１４Ｄ）で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１４Ｃ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１４Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１４Ｂ−１４Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間、血清インキュベートさせたＴ１８３（図１４Ｃ）、Ｔ１８６（図１４Ｂ）、およびＴ１９１（図１４Ｄ）で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１４Ｄ】血清インキュベートさせたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（図１４Ａ）およびＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ変異体（図１４Ｂ−１４Ｄ）の細胞生存率アッセイを示す。ＨＣＴ１１６細胞を２４時間の間、血清インキュベートさせたＴ１８３（図１４Ｃ）、Ｔ１８６（図１４Ｂ）、およびＴ１９１（図１４Ｄ）で処理した。細胞生存率曲線が０、３および７日インキュベートさせた試料について示される。
【図１５Ａ】ＰＡＮＣ−１（図１５Ａ）、ＤＵ１４５（図１５Ｂ）、Ａ５４９（図１５Ｃ）、ＳＫ−ＬＵ−１（図１５Ｄ）およびＨＯＰ６２（図１５Ｅ）細胞の細胞生存率アッセイを示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１９１およびＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。黒丸はＴＲＡＩＬを示し、白丸はＴ１９１を示す。
【図１５Ｂ】ＰＡＮＣ−１（図１５Ａ）、ＤＵ１４５（図１５Ｂ）、Ａ５４９（図１５Ｃ）、ＳＫ−ＬＵ−１（図１５Ｄ）およびＨＯＰ６２（図１５Ｅ）細胞の細胞生存率アッセイを示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１９１およびＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。黒丸はＴＲＡＩＬを示し、白丸はＴ１９１を示す。
【図１５Ｃ】ＰＡＮＣ−１（図１５Ａ）、ＤＵ１４５（図１５Ｂ）、Ａ５４９（図１５Ｃ）、ＳＫ−ＬＵ−１（図１５Ｄ）およびＨＯＰ６２（図１５Ｅ）細胞の細胞生存率アッセイを示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１９１およびＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。黒丸はＴＲＡＩＬを示し、白丸はＴ１９１を示す。
【図１５Ｄ】ＰＡＮＣ−１（図１５Ａ）、ＤＵ１４５（図１５Ｂ）、Ａ５４９（図１５Ｃ）、ＳＫ−ＬＵ−１（図１５Ｄ）およびＨＯＰ６２（図１５Ｅ）細胞の細胞生存率アッセイを示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１９１およびＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。黒丸はＴＲＡＩＬを示し、白丸はＴ１９１を示す。
【図１５Ｅ】ＰＡＮＣ−１（図１５Ａ）、ＤＵ１４５（図１５Ｂ）、Ａ５４９（図１５Ｃ）、ＳＫ−ＬＵ−１（図１５Ｄ）およびＨＯＰ６２（図１５Ｅ）細胞の細胞生存率アッセイを示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１９１およびＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。黒丸はＴＲＡＩＬを示し、白丸はＴ１９１を示す。
【図１６】ＤＵ１４５細胞を使用した細胞生存率アッセイにおいて測定されたＴ１９１の活性に対するＦｃ−媒介架橋の効果を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＴ１９１で、等モル濃度の抗Ｆｃ抗体あり（黒丸）またはなし（白丸）で処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【図１７】Ｔ１９１誘導アポトーシスの時間経過を示す。ＤＵ１４５細胞を１０ｎＭ  Ｔ１９１で２、４、８、または２４時間の間抗Ｆｃ架橋ありおよびなしで処理した。細胞溶解物をウエスタンブロットにより、カスパーゼ−８（５５／５３、４３／４１、１８ｋＤａ）、Ｂｉｄ（２２、１５ｋＤａ）、ＰＡＲＰ（１１６、８９ＫＤａ）、およびＧＡＰＤＨ（３７ｋＤａ）についてプローブした。カスパーゼ−８、ＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ）、およびＰＡＲＰの活性化（切断）がＴ１９１処理後２時間という早さで観察される。カスパーゼ−８およびＢＩＤのクリアランスもまた、より遅い時点で観察される。
【図１８】Ｔ１９１の薬物動態を示す。ここでは、５ｍｇ／ｋｇ用量で、ＤＲ５  ＥＬＩＳＡを使用して測定され、時間の関数としてプロットされた、異なる時点（ｎ＝３）での血清中での機能的Ｔ１９１レベルが示される。双指数関数的フィットおよび９５％信頼区間が示される。
【図１９】ＣＯＬＯ２０５異種移植片モデルにおけるＴＲＡＩＬおよびＴ１９１有効性の比較を示す。ヌードマウスに皮下、ＣＯＬＯ２０５細胞を注射し、ＰＢＳ、ＴＲＡＩＬまたはＴ１９１を投与した。平均腫瘍体積が時間の関数として、エラーバーとして表される標準誤差と共にプロットされる。処置群間の統計学的差（ｐ＜０．００５）は（＊）により示される。
【図２０Ａ】ＨＣＣ２９９８（図２０Ａ）およびＬＳ４１１Ｎ（図２０Ｂ）異種移植片モデルにおけるＴ１９１の有効性を示す。ヌードマウスに皮下、ＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎ細胞を注射し、ＰＢＳ（四角）またはＴ１９１（丸）を、接種後５日目および１２日目（矢印）に投与した。平均腫瘍体積が時間の関数として、エラーバーとして表される標準誤差と共にプロットされる。
【図２０Ｂ】ＨＣＣ２９９８（図２０Ａ）およびＬＳ４１１Ｎ（図２０Ｂ）異種移植片モデルにおけるＴ１９１の有効性を示す。ヌードマウスに皮下、ＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎ細胞を注射し、ＰＢＳ（四角）またはＴ１９１（丸）を、接種後５日目および１２日目（矢印）に投与した。平均腫瘍体積が時間の関数として、エラーバーとして表される標準誤差と共にプロットされる。
【図２１】ＭＯＣ−３１  ＩｇＧ重鎖（白色）のＣ末端に融合された抗ＥｐｃＡＭ  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬ（灰色）の概略図を示す。ＭＯＣ３１  ＩｇＧの軽鎖は斜線で示される。重および軽鎖定常領域間およびヒンジ領域間のジスルフィド結合は直線により示される。ＭＯＣ−３１  ＩｇＧとｓｃＴＲＡＩＬの間およびＴＲＡＩＬ単量体間のグリシン−セリンリンカーは曲線で示される。
【図２２】癌細胞株パネルにわたるＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬについての細胞生存率の動力学を示す。細胞を０．５、１、２、４、８および２４時間の間、濃度を増加させたＴＲＡＩＬおよびＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、ヒートマップとして可視化した。各細胞株内で、個々の四角は、対照（ゼロ時点で未処理細胞）に対する、単一分子濃度および時点を表す。細胞生存率は青色（１００％）および赤色（０％）により示される。
【図２３】ＨＣＴ１１６細胞におけるＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬのカスパーゼ８活性化を示す。細胞を０．５、１、２、４、８および２４時間の間、４１ｐＭのＴＲＡＩＬまたはＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理した。活性カスパーゼ８レベルを測定し、時間の関数としてプロットする前に、未処理対照に対して正規化した。
【図２４】ＨＣＴ１１６細胞を使用した細胞生存率アッセイにおいて測定されたＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を示す。細胞を２４時間の間、濃度を増加させたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬおよびＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率を、ＡＴＰレベルを測定することにより決定し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書では、少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖から構成されるＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖が提供される。
【００１０】
ヒト患者において循環血液での半減期の増加を提供する他のＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドもまた、提供される。これらとしては、ＴＲＡＩＬ三量体、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合物、ＴＲＡＩＬ−抗体Ｆａｂ断片融合物およびＴＲＡＩＬアルブミン融合物が挙げられる。
【００１１】
１つの実施形態では、変異鎖は、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分を含み、単一非分枝ポリペプチドが形成される。
【００１２】
別の実施形態では、単一非分枝ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む。
【００１３】
別の実施形態では、各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成される。
【００１４】
別の実施形態では、２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含む（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）。
【００１５】
別の実施形態では、３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含む。
【００１６】
別の実施形態では、変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成されたＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す。
【００１７】
別の実施形態では、少なくとも１つの安定化変異は野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である。別の実施形態では、イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである。
【００１８】
特定の実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖は少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖を含み、変異鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分を含み、単一非分枝ポリペプチドが形成され、これは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含み、ここで、各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、ここで、３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含み、ここで、変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成されたＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す。
【００１９】
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖は、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分にペプチド結合されたヒト血清アルブミン部分を含み、単一非分枝ポリペプチドが形成され、これは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、ＴＲＡＩＬ−Ｆｃリンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含み、ここで、各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含み（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）、ここで、３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成され、６５℃超または６５℃に等しい融解温度を示す。
【００２０】
本明細書では、ヒト患者において癌を治療する方法もまた提供され、方法は、患者に、有効量の、本明細書で記載される通りのＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド）を投与することを含む。
【００２１】
１つの実施形態では、治療方法は、患者に、有効量の、変異ポリペプチド鎖の２つのコピーの二量体化により形成されたＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドを投与することを含む。
【００２２】
別の実施形態では、本明細書で記載される治療方法は、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド）を、１つまたはそれより多くの他の抗悪性腫瘍薬（例えば、他の化学療法薬または他の小分子薬物）と併用して投与することを含む。別の実施形態では、３以下の他の抗悪性腫瘍薬が治療サイクル内で投与される。別の実施形態では、２以下の他の抗悪性腫瘍薬が治療サイクル内で投与される。別の実施形態では、わずか１つの他の抗悪性腫瘍薬が治療サイクル内で投与される。別の実施形態では、他の抗悪性腫瘍薬は治療サイクル内で投与されない。
【００２３】
本明細書で使用されるように、補助的投与または併用投与（共投与）は、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド）および１つまたはそれより多くの抗悪性腫瘍薬の、同じまたは異なる剤形中での同時投与、またはＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドおよび１つまたはそれより多くの抗悪性腫瘍薬の別々の投与（例えば、連続投与）を含む。そのような同時または連続投与により、好ましくは、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドおよび１つまたはそれより多くの作用物質の両方が処置患者において同時に存在するという結果になる。
【００２４】
別の実施形態では、患者は、ＦＤＡ認可試験に基づくＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドでの治療のために選択される。
【００２５】
本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた提供される。１つの実施形態では、ポリペプチドは、１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、２１３および２１５位の一方または両方での置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；（ｖｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；（ｖｉｉ）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに（ｖｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【００２６】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、および９７からなる群より選択される配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７に明記された配列を含む。
【００２７】
本明細書では、単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を形成する１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分を含むポリペプチドもまた提供される。１つの実施形態では、単鎖ＴＲＡＩＬ三量体は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、第１のＴＲＡＩＬ単量体、ＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のＴＲＡＩＬ単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む。別の実施形態では、各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成される。別の実施形態では、２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含む（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）。別の実施形態では、３つのＴＲＡＩＬ単量体の少なくとも２つは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない、少なくとも１つの安定化変異を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの安定化変異は野生型ＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の２４７位に対応する位置にあり、野生型ＴＲＡＩＬにおいてこの位置に位置するイソロイシン以外のアミノ酸である。別の実施形態では、イソロイシン以外のアミノ酸はグリシン、アラニン、バリンまたはロイシンである。
【００２８】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ：２８の１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ：２８の２１３および２１５位の一方または両方での置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；（ｖｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；（ｖｉｉ）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに（ｖｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。
【００２９】
別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、および８１からなる群より選択される配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０に明記された配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１に明記された配列を含む。
【００３０】
本明細書では、２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質もまた提供され、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、ここで、タンパク質は約６０℃を超える融解温度を有する（例えば、６１−７７℃の各々）。１つの実施形態では、タンパク質は６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７１℃の融解温度を有する。別の実施形態では、融解温度は示差走査蛍光光度法により測定される。
【００３１】
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ三量体は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分を含む。別の実施形態では、ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、下記からなる群より選択される配列を含む：Ｔ１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、Ｔ１５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、Ｔ１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、Ｔ１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、Ｔ１８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、Ｔ１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、Ｔ２０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、Ｔ２０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、Ｔ２０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、Ｔ２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、Ｔ２０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、Ｔ２０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、Ｔ２０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、Ｔ２０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、Ｔ２１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、Ｔ２１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ１５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ１８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは配列Ｔ２１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）を含む。
【００３３】
本明細書では、２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質もまた提供され、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、ここで、タンパク質は、９０％マウス血清中、１μＭの最終濃度で７日間３７℃でのインキュベーション後、初期活性の少なくとも１０％を保持する。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ活性は、ＨＣＴ１１６細胞死滅のＥＣ５０により測定される。
【００３４】
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ三量体は、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分を含む。別の実施形態では、ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、下記からなる群より選択される配列を含む：Ｔ１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、Ｔ１５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、Ｔ１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、Ｔ１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、Ｔ１８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、Ｔ１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、Ｔ２０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、Ｔ２０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、Ｔ２０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、Ｔ２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、Ｔ２０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、Ｔ２０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、Ｔ２０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、Ｔ２０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、Ｔ２１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、Ｔ２１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）。
【００３６】
本明細書では、２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質もまた提供され、各ポリペプチド鎖は抗体定常領域の一部および単鎖ＴＲＡＩＬ三量体を含み、ここで、タンパク質はマウス循環において１０時間以上の終末相半減期を有する。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ三量体は、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体部分を含む。別の実施形態では、ポリペプチド鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【００３７】
別の実施形態では、ポリペプチド鎖は、下記からなる群より選択される配列を含む：Ｔ１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、Ｔ１５１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、Ｔ１５３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、Ｔ１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、Ｔ１８６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）、Ｔ１９１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、Ｔ２０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、Ｔ２０３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、Ｔ２０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、Ｔ２０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、Ｔ２０６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、Ｔ２０７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、Ｔ２０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、Ｔ２０９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）、Ｔ２１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）、Ｔ２１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）。
【００３８】
本明細書ではｓｃＴＲＡＩＬに融合されたＭＯＣ３１  ＩｇＧ（抗ＥｐＣＡＭ）の重鎖を含むポリペプチドもまた提供される。１つの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ：２８の１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のＲ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｉ２４７Ｇ、Ｉ２４７Ａ、Ｉ２４７Ｖ、およびＩ２４７Ｌからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ：２８の２１３および２１５位の一方または両方での置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄからなる群より選択される少なくとも１つの置換を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；ならびに（ｖｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。別の実施形態では、ポリペプチドは下記からなる群より選択される１組の置換を含む：（ｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉ）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｉｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｉｖ）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（ｖ）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；（ｖｉ）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；（ｖｉｉ）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに（ｖｉｉｉ）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。別の実施形態では、ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書では、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドが提供される。１つの態様では、少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖から構成されるＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドの単一変異ポリペプチド鎖が開示される。別の態様では、抗体Ｆａｂ断片またはアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの他のタンパク質へのＴＲＡＩＬ融合物が提供される。さらに別の態様では、改善された特性（例えば、熱安定性および製造可能性）を提供するＴＲＡＩＬ単量体内の変異が提供される。本明細書では、患者に、有効量の、本明細書で記載されるＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドを投与することにより、ヒト患者において癌を治療する方法もまた提供される。
【００４０】
定義
便宜上、明細書、実施例および特許請求の範囲において使用されるある一定の用語および句の意味は下記で提供される。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「含む」は「包含する」、「含有する」または「により特徴付けられる」と同義であり、包括的で、または制約がなく、追加の、列挙されていない要素または方法ステップを排除しない。本明細書で使用されるように、「から構成される」は、請求項要素において特定されていない全ての要素、ステップ、または材料成分を排除する。本明細書で使用されるように、「から本質的に構成される」は、請求項の基本的特性および新規特性に実質的に影響しない材料またはステップを排除しない。本明細書におけるどの場合においても、「含む」、「から本質的に構成される」および「から構成される」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと任意で置き換えられ得、よって、対象物の範囲の代替態様を説明する。例示的に本明細書で好適に記載される発明は、本明細書で特定的に開示されていないいずれかの１つまたは複数の要素、１つまたは複数の制限なしで実施され得る。
【００４２】
本明細書で使用されるように、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に別記されない限り、複数の指示対象を含む。「または」または「および」の使用は、別記されない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含有している」という用語、ならびに他の形態、例えば「含有する（単複）」、および「含有した」という用語の使用は制限するものではない。
【００４３】
「約」という用語は、本明細書では、測定可能な値、例えば量、時間的持続期間などに言及する場合、指定値から最大±１０％までの変動を包含する。別記されない限り、本明細書で使用される、材料成分、特性、例えば分子量、反応条件、などの量を表す全ての数値は、「約」という用語により修飾されていると理解されるべきである。
【００４４】
本明細書で使用されるように、「被験体」または「患者」という用語はヒト患者（例えば、癌を有する患者）である。
【００４５】
「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、本明細書では、本明細書で記載される治療的または防止的手段を示す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害または再発疾患もしくは障害を防止、治癒、遅延させる、その重症度を低減させる、またはその１つまたはそれより多くの症状を寛解させるため、あるいはそのような治療なしで予測されるものを超えて被験体の生存を延長させるため、被験体への本明細書で開示される併用物の投与を採用する。
【００４６】
本明細書で使用されるように、「抗悪性腫瘍薬」は、ヒトにおける新生物、特に悪性（癌性）病変、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病の発症または進行を阻害する機能特性を有する作用物質を示す。転移の阻害は頻繁に、抗悪性腫瘍薬の特性となる。
【００４７】
本明細書で使用されるように、「ＴＲＡＩＬ」（「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド」および「ＣＤ２５３」とも呼ばれる）は、デスレセプタ（特定的にはＤＲ４およびＤＲ５）に結合し、これを活性化するＴＮＦファミリーのメンバーを示す。ヒトＴＲＡＩＬアミノ酸配列（１−２８１）（ＮＰ＿００３８０１．１）は下記である：
ＭＡＭＭＥＶＱＧＧＰＳＬＧＱＴＣＶＬＩＶＩＦＴＶＬＬＱＳＬＣＶＡＶＴＹＶＹＦＴＮＥＬＫＱＭＱＤＫＹＳＫＳＧＩＡＣＦＬＫＥＤＤＳＹＷＤＰＮＤＥＥＳＭＮＳＰＣＷＱＶＫＷＱＬＲＱＬＶＲＫＭＩＬＲＴＳＥＥＴＩＳＴＶＱＥＫＱＱＮＩＳＰＬＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）。
【００４８】
ＴＲＡＩＬはまた、非シグナル伝達デコイ受容体、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、およびオステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）（ＯＰＧ、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ）としても知られている）に結合する。ＴＲＡＩＬは天然に２型膜貫通タンパク質として生じ、切断され、可溶性三量体タンパク質を放出することができる細胞外ドメインを有する。例えば、ＴＲＡＩＬの三量体構造により媒介される、受容体複合体のクラスター化は、デスレセプタによる効率的なシグナル伝達およびアポトーシスの誘導に必要である。加えて、受容体複合体の高次オリゴマ化はシグナル伝達を増幅することができ、アポトーシスのより大きな誘導が得られる。
【００４９】
単鎖ＴＲＡＩＬ分子において使用するための本明細書で提供されるＴＲＡＩＬ単量体における有益な変異は下記の通りの個々の変異（上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８について番号付けされている）を含む：Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。変異の組み合わせもまた、提供される。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦｃ  ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。別の実施形態ではＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。さらに別の実施形態ではＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＨＳＡ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。そのようなＨＳＡ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドにおいて使用するのに好適なヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分としては、米国特許第８，９２７，６９４号および８，８７７，６８７号で開示される天然および変異ＨＳＡが挙げられる。
【００５０】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドを示す（例えば、ペプチドアイソスター）。ペプチドは２０の天然起源の核酸コードアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができ、天然プロセス、例えば翻訳後プロセシングにより、または当技術分野でよく知られている化学修飾技術により修飾されたアミノ酸配列を含むことができる。修飾はペプチド内のいずれの場所でも起こり得、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖ならびにアミノまたはカルボキシル末端が挙げられる。同じ型の修飾が、同じまたは様々な程度で、所定のペプチド内のいくつかの部位で存在することができることが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の修飾を含むことができる。ポリペプチドはユビキチン化の結果として分枝とすることができ、それらは、分枝ありまたはなしの環状とすることができる。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは自然の翻訳後プロセスから得ることができ、または合成方法により製造することができる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付着、ヘム部分の共有結合的付着、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合的付着、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合的付着、ホスホチジルイノシトールの共有結合的付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。
【００５１】
「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」という用語は、その起源または誘導元のために、その天然状態ではそれに付随する自然に関連する成分と関連しない；同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まない；異なる種由来の細胞により発現される；または、自然では起こらないタンパク質またはポリペプチドである。よって、化学的に合成された、または天然の起源となる細胞とは異なる細胞システムにおいて合成されたポリペプチドはその自然に関連する成分から「単離」されるであろう。タンパク質はまた、当技術分野でよく知られたタンパク質精製技術を使用する単離により、自然に関連する成分を実質的に含まないようにすることができる。
【００５２】
「バリアント」という用語は、本明細書では、野生型配列の改変または変更形態として規定され、例えば、この場合、１つまたはそれより多くのアミノ酸は、機能に実質的に影響しない他のアミノ酸（複数可）または非アミノ酸（複数可）により置き換えることができる。いくつかの実施形態では、バリアントは少なくとも１つのアミノ酸残基のための変更側鎖を含み得る。
【００５３】
「抗原」という用語は、本明細書では、免疫系応答を誘発する実体として規定される。その用語は、本明細書では、「Ａｇ」に省略され得る。
【００５４】
「免疫応答」は、脊椎動物内での、外来作用物質に対する生物学的応答を示し、その応答は、生物を、これらの作用物質およびそれらにより引き起こされる疾患に対して防御する。免疫応答は免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、樹状細胞または好中球）およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓により産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用により媒介され、これにより、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくは他の異常細胞、あるいは、自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞もしくは組織の選択的ターゲティング、これらへの結合、これらへのダメージ、これらの破壊、および／またはこれらの脊椎動物の身体からの排除が得られる。免疫反応としては、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞、例えばＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化または阻害、あるいはＴｒｅｇ細胞の阻害が挙げられる。
【００５５】
「阻害する」または「阻害」という用語は、測定可能な量だけ低減させることを意味する。
【００５６】
「阻害剤」および「アンタゴニスト」、または「活性化剤」および「アゴニスト」はそれぞれ、例えば、リガンド、受容体、補助因子、遺伝子、細胞、組織、または臓器の例えば、活性化のための阻害または活性化分子を示す。例えば、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞のモジュレーターは、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞の活性を変化させる分子であり、ここで、活性はその制御特性において活性化、阻害、または変化させることができる。モジュレーターは単独で作用してもよく、あるいは補助因子、例えば、タンパク質、金属イオン、または小分子を使用してもよい。阻害剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を、減少させ、ブロックし、防止し、活性化を遅延させ、不活性化し、脱感作させ、または下方制御する化合物である。活性化剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を増加させ、活性化し、促進し、活性化を増強させ、感作させ、または上方制御する化合物である。阻害剤は、恒常的活性を低減させ、ブロックし、または不活性化する化合物としても規定され得る。
【００５７】
「アゴニスト」は、標的と相互作用し、標的の活性化の増加を引き起こす、または促進する化合物である（例えば、ＴＲＡＩＬシグナル伝達を刺激する（促進する）ポリペプチド）。
【００５８】
「アンタゴニスト」はアゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止し、低減させ、阻害し、または中和する。アンタゴニストはまた、たとえ、同定されたアゴニストが存在しなくても、標的、例えば、標的受容体の恒常的活性を防止し、阻害し、または低減させることができる。
【００５９】
当業者であれば、特定的に例示されたもの以外の、開始材料、生物および化学材料、生物および化学試薬、合成方法、精製方法、分析方法、アッセイ方法、および生物学的方法は、過度の実験に頼ることなく、発明の実施で使用することができることを認識するであろう。任意のそのような材料および方法の全ての当技術分野で知られている機能等価物は、この開示に含まれることが意図される。
【００６０】
本明細書で使用された用語および表現は説明用語として使用されており、制限するものではなく、図示され、記載される特徴またはその一部のいずれかの等価物を排除するそのような用語および表現の使用は意図されていないが、様々な改変が特許請求される発明の範囲内で可能であることが認識される。よって、本発明の態様は、好ましい実施形態、例示的な実施形態および任意的な特徴を含み得る様々な実施形態により特定的に開示されてきたが、当業者であれば、本明細書で開示される概念の改変および変更を用いることができることが理解されるべきである。そのような改変および変更は記載され、添付の特許請求の範囲により規定され得る発明の実施形態の範囲内にあると考えられる。
【００６１】
Ａ．ＴＲＡＩＬ部分
本明細書では、ＴＲＡＩＬ部分を含むＴＲＡＩＬポリペプチドが提供される。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分は１つのＴＲＡＩＬドメイン（単量体）を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分は２つのＴＲＡＩＬ単量体（二量体）を含む。別の実施形態では、その部分は、３つのＴＲＡＩＬ単量体（三量体）を含む。別の実施形態では、その部分はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、抗体Ｆｃ領域もしくはその断片および／またはＦａｂもしくはその断片および／または抗体および／またはアルブミン（例えば、ＨＳＡ）に連結（例えば、融合）されたＴＲＡＩＬ部分を含む。
【００６２】
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は全長ヒトＴＲＡＩＬ（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１−２８１）を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８に明記されるアミノ酸配列の一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸１１４−２８１を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸１１４−２８１から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２０−２８１を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２０−２８１から構成される。
【００６３】
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９０−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９１−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９２−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９３−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９４−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９６−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９７−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９８−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９９−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１００−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０１−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０２−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０３−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０４−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０５−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０６−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０７−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０８−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１０９−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１０−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１１−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１２−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１３−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１４−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１５−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１６−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１７−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１８−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１１９−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２０−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２１−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２２−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２３−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２４−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２５−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２６−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２７−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２８−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１２９−２８１から構成され、またはこれを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１３０−２８１から構成され、またはこれを含む。
【００６４】
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９０−１３０のいずれか１つでＮ末端、および、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基２５１−２８１のいずれか１つでＣ末端を有する配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を含む、またはこれから構成される。
【００６５】
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は約２５０以下のアミノ酸残基、好ましくは約２００以下のアミノ酸残基、より好ましくは約１５０以下のアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、約２５０以下のアミノ酸残基、好ましくは約２００以下のアミノ酸残基、より好ましくは約１５０以下のアミノ酸残基から構成される。
【００６６】
別の実施形態では、融合ポリペプチドは、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体を含み、単鎖ＴＲＡＩＬ三量体が形成される。１つの実施形態では、単鎖ＴＲＡＩＬ三量体は、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、第１のＴＲＡＩＬ単量体、リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２のリンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む。別の実施形態では、各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成される。別の実施形態では、２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓドメインを含む。
【００６７】
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦｃ  ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。さらに別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＨＳＡ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。そのようなＨＳＡ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドにおいて使用するのに好適なヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分としては、米国特許第８，９２７，６９４号および８，８７７，６８７号で開示される天然および変異ＨＳＡが挙げられる。
【００６８】
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分は、そのシグナル伝達受容体（特定的にはＤＲ４およびＤＲ５）または非シグナル伝達デコイ受容体、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、およびオステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）（ＯＰＧ）の少なくとも１つに結合する。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分はアポトーシスを誘導する。
【００６９】
Ｂ．ＴＲＡＩＬ変異
本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の１２１、１３０、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでのアミノ酸置換を含む、ＴＲＡＩＬ単量体、二量体、三量体、およびその融合ポリペプチドが提供される。単鎖ＴＲＡＩＬ分子において使用するための、本明細書で提供されるＴＲＡＩＬ単量体における有益な変異は下記の通りの個々の変異を含む（上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８について番号付けされている）：Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。変異の組み合わせもまた提供され、下記の通りの番号付けされた組み合わせ１）−６）が挙げられる：１）Ｒ１２１ＩおよびＩ２４７Ｖ；２）Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ；３）Ｒ１３０ＧおよびＩ２４７Ｖ；４）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；５）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５ＤおよびＩ２４７Ｖ；６）Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。変異の組み合わせはまた、下記の通りの番号付けされた組み合わせ１）−８）を含み得る：（１）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＩ２４７Ｖ；（２）Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（３）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（４）Ｒ１２１Ｉ、Ｎ２２８Ｓ、およびＩ２４７Ｖ；（５）Ｒ１２１ＩおよびＲ１３０Ｇ；（６）Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、およびＮ２２８Ｓ；（７）Ｒ１２１ＩおよびＮ２２８Ｓ；ならびに（８）Ｒ１３０ＧおよびＮ２２８Ｓ。変異の前記番号付けされた組み合わせの各々を含む特定のＴＲＡＩＬ変異体は下記実施例および図で、下記として明記される：組み合わせ１）「Ｔ１４８」、組み合わせ２）「Ｔ１５１」、組み合わせ３）「Ｔ１５３」、組み合わせ４）「Ｔ１８３」、組み合わせ５）「Ｔ１８６」および組み合わせ６）「Ｔ１９１」。本明細書で提供される組成物および方法において有用な他のＴＲＡＩＬ変異体としては、「Ｔ１８２」、「Ｔ１９６」、「Ｔ２０２」、「Ｔ２０３」、「Ｔ２０４」、「Ｔ２０５」、「Ｔ２０６」、「Ｔ２０７」、「Ｔ２０８」、「Ｔ２０９」、「Ｔ２１０」、および「Ｔ２１１」が挙げられる。
【００７０】
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５のアミノ酸配列またはその一部を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５のアミノ酸配列から構成される。
【００７１】
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、本明細書で明記される配列のいずれか一つに高度に同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸残基１−２５４に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のアミノ酸残基１−２８１、９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２−９７、１０４、および１０５に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２−９７、１０４、および１０５に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列から構成される。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の残基１−２８１、９５−２８１、１１４−２８１、または１２０−２８１に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ単量体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２−９７、１０４、および１０５に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
「％同一」は、同じである（１００％同一）、または、２つの配列が最大一致に対して整列され、比較される場合、同じとなるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列または部分配列を示す。最大一致に対して整列させるために、ギャップが比較される配列の１つに導入され得る。対応する位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドがその後比較され、定量される。第１の配列内のある位置が第２の配列内の対応する位置と同じ残基により占有される場合、そうすると、配列はその位置では同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、その配列により共有される同一の位置の数の関数である（例えば、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数（例えば、オーバーラップ位置）×１００）。ある一定の実施形態では、２つの配列は同じ長さである。１つの配列はもう１つの配列と％同一と測定されたという決定は、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。２つの配列のそのような比較のために使用される数学的アルゴリズムの非限定的例は、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれる。例えば、アミノ酸配列を比較するために、ＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティが使用され得る。配列解析のための追加のアルゴリズムは当技術分野でよく知られており、多くがオンラインで入手可能である。
【００７３】
前記変異単鎖ＴＲＡＩＬポリペプチドで例示されるが、これらの変異および組み合わせは、例えば、３つのＴＲＡＩＬ単量体を含む単鎖ＴＲＡＩＬコンストラクトにおける、正確なフォーマットまたは融合パートナー（もしあれば）に関係なく、任意の単鎖ＴＲＡＩＬコンストラクトにおいて存在するものとして企図され、ここで、各変異、または変異の組み合わせは３つの単量体の各々に独立して存在し、または存在しないことができる。
【００７４】
１つの実施形態では、変異ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。別の実施形態では変異ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。別の実施形態では変異ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＦａｂ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。さらに別の実施形態では変異ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドはＨＳＡ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドである。そのようなＨＳＡ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドにおいて使用するのに好適なヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）部分としては、米国特許第８，９２７，６９４号および８，８７７，６８７号で開示される天然および変異ＨＳＡが挙げられる。
【００７５】
Ｃ．例示的なＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド
ｉ．ＴＲＡＩＬ単量体、二量体、および三量体
本明細書で提供されるように、ＴＲＡＩＬポリペプチドは、正確なフォーマットまたは融合パートナー（もしあれば）に関係なく、単鎖ポリペプチドコンストラクト内のＴＲＡＩＬ単量体、二量体、または三量体であってもよい。例えば、単鎖ＴＲＡＩＬコンストラクトは１、２、または３つのＴＲＡＩＬ単量体を含むことができる。
【００７６】
各単量体は１つの変異または変異の組み合わせを含んでもよく、３つの単量体の各々に独立して存在しても、しなくてもよい。ＴＲＡＩＬ変異は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８の１２１、１３０、２１３、２１５、２２８、および２４７位の１つまたはそれより多くでのアミノ酸置換から選択されてもよい。単鎖ＴＲＡＩＬ分子において使用するための、本明細書で提供されるＴＲＡＩＬ単量体における有益な変異は下記の通りの個々の変異を含む（上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８について番号付けされている）：Ｒ１２１Ｉ、Ｒ１３０Ｇ、Ｙ２１３Ｗ、Ｓ２１５Ｄ、Ｎ２２８ＳおよびＩ２４７Ｖ。
【００７７】
１つの態様では、３つの単量体の各々は同じ変異または同じ変異の組み合わせを含み、別の態様では、３つの単量体のうちの２つは同じ変異または同じ変異の組み合わせを含み、第３は異なる変異または変異の組み合わせを含み、または変異を含まず、さらに別の態様では、３つの単量体の各々は異なる変異または変異の組み合わせを含み、または３つの単量体の１つまたは２つにおいて変異は存在しない。例えば、例示的な単鎖変異ＴＲＡＩＬ三量体は、下記から選択され得る：「Ｔ１４８」、「Ｔ１５１」、「Ｔ１５３」、「ｔ１８２」、「Ｔ１８３」、「Ｔ１８６」、「Ｔ１９１」、「Ｔ１９６」、「Ｔ２０２」、「Ｔ２０３」、「Ｔ２０４」、「Ｔ２０５」、「Ｔ２０６」、「Ｔ２０７」、「Ｔ２０８」、「Ｔ２０９」、「Ｔ２１０」、および「Ｔ２１１」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１−８１、１０２、および１０３）。
【００７８】
ｉｉ．Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド
１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分はＦｃ領域またはその断片に連結される。
【００７９】
「Ｆｃ領域」（断片結晶化可能領域）または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）上に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合が含まれる）を媒介する抗体の重鎖のＣ末端領域を示す。よって、Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を排除する、抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプでは、Ｆｃ領域は抗体の２つの重鎖の第２の（ＣＨ２）および第３の（ＣＨ３）定常ドメイン由来の２つの同一のタンパク質断片を含み；ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は各ポリペプチド鎖において、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨドメイン２−４）を含む。ＩｇＧでは、Ｆｃ領域は免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１とＣγ２の間のヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃ２２６またはＰ２３０位でのアミノ酸残基（またはこれらの２つのアミノ酸の間のアミノ酸）から、重鎖のカルボキシ末端まで伸びると規定され、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０まで延在し、一方、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置し、すなわち、それは、ＩｇＧの約アミノ酸３４１から約アミノ酸４４７まで延在する。本明細書で使用されるように、Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃであってもよく、任意のアロタイプのバリアント、または変異Ｆｃ（例えば、非天然起源のＦｃ）が含まれる。Ｆｃはまた、単独で、またはＦｃを含むタンパク質ポリペプチド、例えば「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」（「Ｆｃ融合タンパク質」（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とも呼ばれる）との関連で、この領域を示してもよい。
【００８０】
別の実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは天然配列Ｆｃ領域を含む。「天然配列Ｆｃ領域」または「天然配列Ｆｃ」は、自然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；ならびに天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域ならびにその天然起源のバリアントを含む。天然配列Ｆｃは様々なアロタイプのＦｃを含む（例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ｍＡｂｓ  １：１を参照されたい）。
【００８１】
ある一定の実施形態では、Ｆｃ領域は、望ましい構造特徴および／または生物活性を提供するために、変異Ｆｃ領域、例えば、親Ｆｃ配列（例えば、バリアントを作成するためにその後に改変される未改変Ｆｃポリペプチド）に対して、（例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入により）改変されたＦｃ配列である。
【００８２】
例えば、親Ｆｃに比べて、（ａ）増加または減少した抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、（ｂ）増加または減少した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、（ｃ）Ｃ１ｑについての増加または減少した親和性および／または（ｄ）Ｆｃ受容体についての増加または減少した親和性を有するＦｃバリアントを作製するためにＦｃ領域において改変を作製してもよい。そのようなＦｃ領域バリアントは一般に、Ｆｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。アミノ酸改変の組み合わせは特に望ましいと考えられる。例えば、変異Ｆｃ領域は、例えば本明細書で同定される特定のＦｃ領域位置の２、３、４、５、などの置換をその中に含んでもよい。
【００８３】
変異Ｆｃ領域はまた、配列変更を含んでもよく、この場合、ジスルフィド結合形成に関与するアミノ酸が除去され、または他のアミノ酸と置き換えられる。そのような除去は、本明細書で記載される抗体を産生させるために使用される宿主細胞中に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避することができる。システイン残基が除去された場合であっても、単鎖Ｆｃドメインは依然として、非共有結合により一緒に保持される二量体Ｆｃドメインを形成することができる。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、選択された宿主細胞とより適合性を有するように改変され得る。例えば、典型的な天然Ｆｃ領域のＮ末端付近のＰＡ配列を除去してもよく、それは、大腸菌内の消化酵素、例えばプロリンイミノペプチダーゼにより認識され得る。他の実施形態では、Ｆｃドメイン内の１つまたはそれより多くのグリコシル化部位が除去され得る。典型的にグリコシル化される残基（例えば、アスパラギン）は細胞溶解性応答を与え得る。そのような残基は欠失させられてもよく、または非グリコシル化残基（例えば、アラニン）と置換されてもよい。他の実施形態では、補体との相互作用に関与する部位、例えばＣ１ｑ結合部位はＦｃ領域から除去され得る。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させても、置換させてもよい。ある一定の実施形態では、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位が除去され得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ部位を除去するように改変され得る。ＡＤＣＣ部位は当技術分野で知られており；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関しては、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）を参照されたい。変異Ｆｃドメインの具体例は例えば、ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号において開示される。
【００８４】
１つの実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変更される、例えば、増加または減少されるように改変される。このアプローチはさらに、米国特許第５，６７７，４２５号においてＢｏｄｍｅｒらにより記載される。Ｆｃのヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽および重鎖の組立を促進する、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるように変更される。１つの実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は抗体の生物学的半減期を減少させるように変異導入される。より特定的には、１つまたはそれより多くのアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインインターフェース領域に導入され、そのため、抗体は天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合に比べ、障害されたブドウ球菌プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）（ＳｐＡ）結合を有する。このアプローチはＷａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載される。
【００８５】
さらに他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能（複数可）を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより変更される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。それへの親和性が変更されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分とすることができる。このアプローチは米国特許第５，６２４，８２１号および５，６４８，２６０号（どちらもＷｉｎｔｅｒらによる）にさらに詳細に記載される。
【００８６】
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つまたはそれより多くのアミノ酸は、抗体が、変更されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは消滅した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。このアプローチはＩｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載される。
【００８７】
別の例では、アミノ酸位置２３１および２３９内の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基は変更され、これによって、抗体の補体を結合させる能力が変更される。このアプローチはＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１号にさらに記載される。
【００８８】
さらに別の例では、Ｆｃ領域は、下記位置の１つまたはそれより多くのアミノ酸を改変することにより、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増加させ、および／またはＦｃγ受容体についての親和性を増加させるように改変され得る：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９。例示的な置換としては、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄ、および３３２Ｅが挙げられる。例示的なバリアントとしては、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔ、および２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔが挙げられる。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を増強するための他の改変としては、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉ、および３９６Ｌが挙げられるが、それらに限定されない。これらのおよび他の改変はＳｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：６８５−６９１において概説される。
【００８９】
Ｆｃγ受容体への結合を増加させるＦｃ改変としては、Ｆｃ領域のアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２４、３２７、３２９、３３０、３３５、３３７、３３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９のいずれか１つまたはそれより多くでのアミノ酸改変が挙げられ、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスのものである（ＷＯ００／４２０７２号）。
【００９０】
Ｆｃに対して実施することができる他のＦｃ改変はＦｃγＲおよび／または補体タンパク質への結合を低減または除去するためのものであり、これにより、Ｆｃ媒介エフェクター機能、例えばＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが低減または除去される。例示的な改変としては、２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５、および３２８位での置換、挿入、および欠失が挙げられるが、それらに限定されず、ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う。例示的な置換としては２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌ、および３２８Ｒが挙げられるが、それらに限定されず、ここで、番号付けはＥＵインデックスに従う。Ｆｃバリアントは、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用を低減させるための他の改変としては、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐ、および２３４Ｖ、ならびに変異もしくは酵素手段による、またはタンパク質をグリコシル化しない細菌などの生物での産生による２９７位でのグリコシル化の除去が挙げられる。これらのおよび他の改変はＳｔｒｏｈｌ，２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：６８５−６９１で概説される。
【００９１】
任意で、Ｆｃ領域は、当業者に知られている追加および／または代替位置での非天然起源のアミノ酸残基を含み得る（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；６，２７７，３７５号；６，７３７，０５６号；６，１９４，５５１号；７，３１７，０９１号；８，１０１，７２０号；ＰＣＴ特許公開ＷＯ００／４２０７２号；ＷＯ０１／５８９５７号；ＷＯ０２／０６９１９号；ＷＯ０４／０１６７５０号；ＷＯ０４／０２９２０７号；ＷＯ０４／０３５７５２号；ＷＯ０４／０７４４５５号；ＷＯ０４／０９９２４９号；ＷＯ０４／０６３３５１号；ＷＯ０５／０７０９６３号；ＷＯ０５／０４０２１７号、ＷＯ０５／０９２９２５号およびＷＯ０６／０２０１１４号を参照されたい）。
【００９２】
抑制性受容体ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を増強させるＦｃバリアントもまた、使用され得る。そのようなバリアントは、ＦｃｙＲｌｌｂ＋細胞（例えば、Ｂ細胞および単球を含む）に関連する免疫調節活性を有するＦｃ融合タンパク質を提供することができる。１つの実施形態では、Ｆｃバリアントは、１つまたはそれより多くの活性化受容体に比べ、ＦｃｙＲｌｌｂに対する選択的に増強された親和性を提供する。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を変更するための改変としては、ＥＵインデックスに従う、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８、および３３２からなる群より選択される位置での１つまたはそれより多くの改変が挙げられる。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性を増強させるための例示的な置換としては、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙ、および３３２Ｅが挙げられるが、それらに限定されない。例示的な置換としては、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、および３２８Ｙが挙げられる。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合を増強させるための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅ、および２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。
【００９３】
そのリガンドについてのＦｃ領域の親和性および結合特性は、当技術分野で知られている様々なインビトロアッセイ方法（生化学または免疫学系アッセイ）により決定され得、限定はされないが、平衡法（例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動力学（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ分析）、および他の方法、例えば間接結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）が挙げられる。これらのおよび他の方法は、１つまたはそれより多くの調査される成分上の標識を使用し、および／または様々な検出方法、例えば、限定はされないが、発色性、蛍光、発光、または同位体標識を採用し得る。結合親和性および動力学の詳細な説明は、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）（これは、抗体−免疫原相互作用に焦点をあてている）において見出すことができる。
【００９４】
ある一定の実施形態では、抗体はその生物学的半減期を増加させるように改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、これはＦｃＲｎに対してＦｃ領域の結合親和性を増加させることにより実施され得る。例えば、下記残基の１つまたはそれより多くは、米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、変異させることができる：２５２、２５４、２５６、４３３、４３５、４３６。特定の例示的な置換としては、下記の１つまたはそれより多くが挙げられる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、および／またはＴ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号および６，１２１，０２２号に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で変更させることができる。ＦｃＲｎへの結合を増加させるおよび／または薬物動態特性を改善する他の例示的なバリアントは２５９、３０８、４２８、および４３４位での置換を含み、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、および４３４Ｍが挙げられる。ＦｃＲｎへのＦｃ結合を増加させる他のバリアントは下記を含む：２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６，Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７６：３４６−３５６）、２５６Ａ、２７２Ａ、２８６Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３０７Ｑ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７６Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，２７６（９）：６５９１−６６０４）、２５２Ｆ、２５２Ｔ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｓ、２５６Ｒ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、２５６Ｔ、３０９Ｐ、３１１Ｓ、４３３Ｒ、４３３Ｓ、４３３Ｉ、４３３Ｐ、４３３Ｑ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ、３０８Ｔ／３０９Ｐ／３１１Ｓ（Ｄａｌｌ  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２，１６９：５１７１−５１８０，Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８１：２３５１４−２３５２４）。ＦｃＲｎ結合を調節するための他の改変は、Ｙｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２：７６６３−７６７１に記載される。ある一定の実施形態では、特別な生物学的特性を有するハイブリッドＩｇＧアイソタイプが使用され得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントは、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、２つのアイソタイプが異なっている位置のＩｇＧ３由来のアミノ酸で置換することにより構築され得る。よって、１つまたはそれより多くの置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２１、４３５Ｒ、および４３６Ｆを含む、ハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。本明細書で記載される他の実施形態では、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントは、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、２つのアイソタイプが異なっている位置のＩｇＧ１由来のアミノ酸で置換することにより構築され得る。よって、１つまたはそれより多くの置換、例えば、下記アミノ酸置換の１つまたはそれより多くを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る：２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ（２３６位でのグリシンの挿入を示す）、および３２７Ａ。
【００９５】
その上、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位はマッピングされており、改善された結合を有するバリアントが記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４を参照されたい）。２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９位での特定の変異は、ＦｃγＲＩＩＩへの結合を改善することが示された。加えて、下記組み合わせ変異体はＦｃγＲＩＩＩ結合を改善したことが示された：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（増強されたＦｃγＲＩＩＩａ結合およびＡＤＣＣ活性を示すことが示されている）（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＦｃγＲＩＩＩａへの強く増強された結合を有する他のＩｇＧ１バリアントは同定されており、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントが挙げられ、これらは、ＦｃγＲＩＩＩａについての親和性の最高増加、ＦｃγＲＩＩｂ結合の減少、およびカニクイザルにおける強い細胞傷害性活性を示した（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。抗体、例えばアレムツズマブ（ＣＤ５２特異）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異）、リツキシマブ（ＣＤ２０特異）、およびセツキシマブ（ＥＧＦＲ特異）への三重変異導入は非常に増強されたＡＤＣＣ活性にインビトロで翻訳され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥバリアントはサルにおいてＢ細胞を枯渇させる増強された能力を示した（Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。加えて、ＦｃγＲＩＩＩａへの増強された結合、およびそれに付随して増強されたＡＤＣＣ活性を、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルにおけるヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するトランスジェニックマウスで示す、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００ＬおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体が同定された（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。使用され得る他のＦｃ変異体としては下記が挙げられる：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｌ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｌ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ、およびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ。
【００９６】
別の実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬポリペプチド鎖は、第２のＦｃ−ＴＲＡＩＬポリペプチド鎖に二量体化される（図３を参照されたい）。特定の実施形態では、２つのＦｃ−ＴＲＡＩＬポリペプチド鎖は少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。別の実施形態では、２つのＦｃ−ＴＲＡＩＬポリペプチド鎖は、少なくとも２つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。別の実施形態では、２つのＦｃ−ＴＲＡＩＬポリペプチド鎖は少なくとも３つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。
【００９７】
特定の実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化された２つのポリペプチド鎖を含み、各鎖は１組の３つのヒト４−ＴＲＡＩＬドメインにペプチド結合されたヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分を含み、単一非分枝ポリペプチドが形成され、これはアミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、リンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２の単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含み、ここで、各リンカーは１５−２０アミノ酸から構成され、２つのＴＲＡＩＬ単量体間リンカーの各々は３つのＧ４Ｓモチーフを含む。
【００９８】
別の実施形態では、Ｆｃ領域はエフェクター機能に関して改変され、そのため、疾患、例えば、癌の治療におけるポリペプチドの実効性が増強される。例えばシステイン残基（複数可）がＦｃ領域に導入され得、これにより、この領域での鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。このように生成されたホモ二量体ポリペプチドは、改善されたインターナリゼーション能力および／または増加された補体媒介細胞死滅および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体ポリペプチドはまた、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製してもよい。あるいは、二重Ｆｃ領域を有するポリペプチドが操作され得、これにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る。
【００９９】
特定の実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬドメインに結合された、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ部分、またはその断片を含み、単一非分枝ポリペプチドが形成され、これは、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、リンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２の単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む。特定の実施形態では、例えば、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５−５０、１００、および１０１のいずれか一つを含む。別の実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない少なくとも１、２、３、または４つの変異を含む。
【０１００】
１つの実施形態では、Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは癌細胞アポトーシスを誘導する。
【０１０１】
ｉｉｉ．Ｆａｂ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬおよびＦａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド
本明細書で記載されるＦｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、抗体Ｆａｂ領域、またはその断片をさらに含み得る（例えば、Ｆａｂ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド）。「Ｆａｂ」は、２つの鎖を含む抗体の抗原結合部分を示す：ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む第１の鎖ならびにＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む第２の鎖。Ｆａｂは典型的には、パパインで処理された抗体のＮ末端断片として説明され、ヒンジ領域の一部を含むが、本明細書では、結合ドメインを示すものとしても使用され、この場合、重鎖はヒンジの一部を含まない。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ融合物は全長重および軽鎖、またはその断片を含む。別の実施形態ではＴＲＡＩＬ融合物は全長抗体を含む。
【０１０２】
１つの実施形態では、Ｆａｂ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合物または全長重および軽鎖重鎖ＴＲＡＩＬ融合物、またはその断片は第２の融合ポリペプチド鎖に二量体化させることができる。特定の実施形態では、２つの融合ポリペプチド鎖は少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。別の実施形態では、２つの融合ポリペプチド鎖は少なくとも２つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。別の実施形態では、２つの融合ポリペプチド鎖は少なくとも３つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。
【０１０３】
別の実施形態では、Ｆａｂ−Ｆｃ、重および軽鎖、全長抗体、またはその断片は、リンカーによりＴＲＡＩＬ部分に融合される。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸リンカーである。改変は、これらの改変後の抗原結合親和性が維持される限り、Ｆａｂ領域または抗体の重および／または軽鎖可変領域のフレームワークまたは連結領域の１つまたはそれより多く内でも可能である。
【０１０４】
別の実施形態では、Ｆａｂ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体に結合された、ヒトＦｃ部分、またはその断片に結合されたヒトＦａｂ部分、またはその断片を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆｃ部分、リンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２の単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成される。別の実施形態では、Ｆａｂ−Ｆｃ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない少なくとも１、２、３、または４つの変異を含む。
【０１０５】
本明細書で記載されるＴＲＡＩＬ融合物はまた、抗体Ｆａｂ領域、またはその抗原結合部分を含んでもよい（Ｆａｂ−ＴＲＡＩＬ）。１つの実施形態では、Ｆａｂ領域は全長重鎖を含む。別の実施形態では、Ｆａｂ領域は全長重および軽鎖、またはその断片を含む。別の実施形態では、Ｆａｂ−ＴＲＡＩＬ融合物は第２の融合ポリペプチド鎖に二量体化させることができる。特定の実施形態では、２つの融合ポリペプチド鎖は少なくとも１つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。別の実施形態では、２つの融合ポリペプチド鎖は少なくとも２つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。別の実施形態では、２つの融合ポリペプチド鎖は少なくとも３つのＦｃ間ジスルフィド結合により二量体化される。
【０１０６】
別の実施形態では、Ｆａｂ、またはその断片は、リンカーによりＴＲＡＩＬ部分に融合される。別の実施形態では、リンカーはアミノ酸リンカーである。改変はまた、これらの改変後の抗原結合親和性が維持される限り、Ｆａｂ領域または抗体の重および／または軽鎖可変領域のフレームワークまたは連結領域の１つまたはそれより多く内で可能である。
【０１０７】
別の実施形態では、Ｆａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体に結合されたヒトＦａｂ部分、またはその断片を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、Ｆａｂ部分、リンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２の単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成される。別の実施形態では、Ｆａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、天然の野生型ヒトＴＲＡＩＬで見出されない少なくとも１、２、３、または４つの変異を含む。例示的なＦａｂ−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは、可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）部分に融合された抗ＥｐＣＡＭ  Ｆａｂを含み得る（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）。
【０１０８】
ｉｖ．アルブミン−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド
別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分はアルブミン部分（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））に連結される。別の実施形態では、アルブミン−ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチドは１、２、または３つのＴＲＡＩＬ単量体を含む。
【０１０９】
特定の実施形態では、単一ＴＲＡＩＬ融合ポリペプチド鎖は１組の３つのヒトＴＲＡＩＬ単量体にペプチド結合されたヒト血清アルブミン部分を含み、アミノ末端からカルボキシル末端の順で、アルブミン部分、リンカー、第１のＴＲＡＩＬ単量体、単量体間リンカー、第２のＴＲＡＩＬ単量体、第２の単量体間リンカー、および第３のＴＲＡＩＬ単量体を含む単一非分枝ポリペプチドが形成される。
【０１１０】
ｖ．二重特異性融合ポリペプチド
二重特異性抗体融合物もまた、提供される。１つの実施形態では、ＴＲＡＩＬ部分は、二重特異性抗体の重鎖のＣ末端に融合される。本明細書における二重特異性抗体は、好ましくは非オーバーラップまたは非競合エピトープに結合する同じまたは異なるタンパク質について少なくとも２つの結合特異性を含む。そのような二重特異性抗体は追加の結合特異性、例えば、別の抗原、例えば発癌遺伝子の産物についての第３のタンパク質結合特異性を含むことができる。二重特異性抗体は全長抗体または抗体断片として調製することができる（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。
【０１１１】
Ｄ．融合ポリペプチドを生成させるための方法
本明細書で記載されるＴＲＡＩＬ融合タンパク質は標準組換え技術により生成させることができる。組換え生成のための方法は技術水準において広く知られており、原核生物および真核生物細胞におけるタンパク質発現、ならびに抗体のその後の単離および通常、薬学的に許容される純度までの精製を含む。宿主細胞での結合タンパク質の発現については、個々のポリペプチドをコードする核酸が標準方法により発現ベクターに挿入される。発現は適切な原核生物または真核生物宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、または大腸菌細胞）において実施され、結合タンパク質が細胞（上清または溶解後の細胞）から回収される。抗体の組換え生成のための一般的方法は技術水準においてよく知られており、例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｓ．Ｃ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ  １７  １８３−２０２（１９９９）；Ｇｅｉｓｓｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８  ２７１−２８２（１９９６）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，ＭｏＩ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６  １５１−１６１（２０００）；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．４８  ８７０−８８０（１９９８）の総説に記載される。
【０１１２】
ポリペプチドは培地から従来の精製手順により好適に分離され得る。精製は、細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸またはタンパク質を排除するために、標準技術、例えば、当技術分野でよく知られたアルカリ性／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、などにより実施することができる。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。タンパク質精製のために異なる方法が確立され、広く使用されており、例えば、微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシルメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えば、β−メルカプトエタノールおよびＳＨリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザアレノフィリック樹脂、またはｍ−アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）−およびＣｕ（ＩＩ）−アフィニティー材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動的方法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）である（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｍ．Ａ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７５  ９３−１０２（１９９８））。ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡは従来の手順を用いて、容易に単離され、配列決定される。
【０１１３】
Ｅ．リンカー
様々なリンカーを本明細書で記載される融合ポリペプチドで使用することができる。「に連結された」は、文脈上、アミノ酸またはヌクレオチドの直接または間接連結または結合を示す。「リンカー」は、２つのドメインまたは領域を一緒に連結させる１つまたはそれより多くのアミノ酸を示す。そのようなリンカーポリペプチドは当技術分野でよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。使用に好適な追加のリンカーは、ｈｔｔｐ：／／ｐａｒｔｓｒｅｇｉｓｔｒｙ．ｏｒｇ／Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｄｏｍａｉｎｓ／Ｌｉｎｋｅｒの標準生物学パートのレジストリにおいて見出すことができる（例えば、Ｃｒａｓｔｏ  ＣＪ  ａｎｄ  Ｆｅｎｇ  ＪＡ．ＬＩＮＫＥＲ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２０００  Ｍａｙ；１３（５）３０９−１２およびＧｅｏｒｇｅ  ＲＡ  ａｎｄ  Ｈｅｒｉｎｇａ  Ｊ．Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｌｉｎｋｅｒｓ：ｔｈｅｉｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００２  Ｎｏｖ；１５（１１）８７１−９も参照されたい）。リンカーは１−１０、１０−２０、２０−３０、３０−４０、４０−５０、５０−６０、６０−７０、７０−８０、８０−９０または少なくとも９０−１００アミノ酸長であってもよい。
【０１１４】
Ｆｃ領域またはアルブミンは、ＴＲＡＩＬ部分からリンカーにより分離することができる。加えて、ＴＲＡＩＬ部分の各ＴＲＡＩＬ単量体は単量体間リンカーにより分離することができる。ある一定の実施形態では、各リンカーまたはドメイン間リンカーは５−２５のアミノ酸を含む。１つの実施形態では、リンカーまたはドメイン間リンカーは５−１０、５−１５、５−２０、５−２５、１０−１５、１０−２０、１０−２５、１５−２０、１５−２５、または２０−２５のアミノ酸を含む。別の実施形態では、リンカーまたは単量体間リンカーは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーまたは単量体間リンカーは１５−２０のアミノ酸を含む。別の実施形態では、リンカーまたは単量体間リンカーは少なくとも１、２、または３つのＧ４Ｓモチーフを含む。Ｇ４Ｓモチーフは４つのグリシン残基、続いて１つのセリン残基（すなわち、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ）を含む。特定の実施形態では、リンカーまたは単量体間リンカーは３つのＧ４Ｓモチーフを含む。
【０１１５】
Ｆ．組成物
別の態様では、本明細書で記載されるポリペプチドを含む組成物、ならびに、診断目的のため、または患者における疾患を治療するためにそのような組成物を使用する方法が提供される。本明細書で提供される組成物は、担体（例えば、「薬学的に許容される担体」）と一緒に製剤化された、本明細書で開示される１つまたはそれより多くのポリペプチドを含む。１つの実施形態では、組成物は、抗体Ｆｃ領域もしくはその断片および／またはＦａｂもしくはその断片および／または抗体および／またはアルブミン（例えば、ＨＳＡ）に連結（例えば、融合）されたＴＲＡＩＬ部分を含むポリペプチドを含む。
【０１１６】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性がある、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤、などを含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、およびその好適な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液は液体担体として、特に注射用溶液のために使用することができる。薬学的に許容される担体としては、滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌水溶液または分散物および滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は当技術分野で知られている。いずれの賦形剤、希釈剤または活性物質も、活性化合物と不適合である場合を除き、本明細書で提供される医薬組成物におけるその使用が企図される。補充活性化合物（例えば、追加の抗癌剤）もまた、組成物中に組み入れることができる。
【０１１７】
治療組成物は典型的には、製造および貯蔵の条件下で無菌で安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。組成物は、所望であれば、また、少量の湿潤または溶解度増強剤、安定剤、保存剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、塩化ナトリウム、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールを含むことは有用であろう。注射用組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることにより、実現することができる。
【０１１８】
患者において疾患を治療することとの関連で、好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば、注射または注入による）に好適である。投与経路によって、ポリペプチドは、酸の作用およびタンパク質を不活性化し得る他の天然条件から保護するためにある材料中でコートされ得る。例えば、ポリペプチドは患者に、適切な担体中、例えば、リポソーム、または希釈剤中で投与され得る。薬学的に許容される希釈剤としては、生理食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。リポソームとしては水中油中水ＣＧＦエマルジョン、ならびに従来のリポソームが挙げられる。組成物は、当技術分野で知られている様々な方法により投与することができる。当業者により認識されるように、投与経路および／または方法は所望の結果によって変動するであろう。
【０１１９】
医薬組成物は単独で、または併用療法で、すなわち、他の作用物質と組み合わせて（例えば、下記でさらに詳細に記載される通り）投与され得る。
【０１２０】
Ｇ．方法および使用
本明細書で記載されるポリペプチド、組成物、および方法は、例えば、癌細胞アポトーシスを誘導することおよび／または免疫応答の増強と関与する、多くのインビトロおよびインビボ有用性を有する。例えば、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、抗体Ｆｃ領域もしくはその断片および／またはＦａｂもしくはその断片および／または抗体および／またはアルブミン（例えば、ＨＳＡ）に連結（例えば、融合）されたＴＲＡＩＬ部分を含むポリペプチド）は培養下の細胞に、インビトロまたはエクスビボで、またはヒト被験体に、例えば、インビボで投与することができ、癌細胞アポトーシスを誘導する、および／または様々な疾患において免疫を増強させることができる。
【０１２１】
「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、本明細書では、本明細書で記載される治療的または防止的手段を示す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害または再発疾患もしくは障害を防止、治癒、遅延させる、その重症度を低減させる、またはその１つまたはそれより多くの症状を寛解させるため、あるいはそのような治療なしで予測されるものを超えて被験体の生存を延長させるため、患者への本明細書で開示されるポリペプチドの投与を採用する。
【０１２２】
本明細書で使用されるように、「有効量」という用語は、疾患またはその１つまたはそれより多くの症状の重症度および／または持続期間を低減もしくは寛解させる、疾患の進行を防止する、疾患の退縮を引き起こす、疾患と関連する１つまたはそれより多くの症状の再発、発生、発症または進行を防止する、疾患を検出する、または別の療法（例えば、予防または治療薬）の予防または治療効果（複数可）を増強もしくは改善するのに十分な療法の量を示す。
【０１２３】
１つの実施形態では、疾患は癌である。「癌」という用語は、本明細書では、細胞のコントロール不良の成長または増殖の組織、例えば腫瘍として規定される。本明細書で使用されるように、その用語は、前悪性ならびに悪性癌を含む。
【０１２４】
腫瘍の成長が被験体において阻害されるように、被験体に本明細書で記載されるポリペプチドを投与することを含む、被験体において腫瘍細胞の成長を阻害するための方法がさらに提供される。本明細書で使用されるように、腫瘍の「成長を阻害する」という用語は、腫瘍の成長における任意の測定可能な減少、例えば、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９９％、または１００％だけの腫瘍の成長の阻害を含む。
【０１２５】
癌は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍（液性腫瘍）を有する癌であり得る。本明細書で記載される方法はまた、転移性癌、切除不能および／または難治性癌（例えば、前の免疫療法に対して難治性の癌）、および再発癌の治療のために使用され得る。
【０１２６】
また、本明細書では、被験体における免疫応答が改変されるように、被験体に本明細書で記載されるポリペプチドを投与することを含む、被験体において免疫応答を改変する方法が提供される。好ましくは、応答は増強され、刺激され、または上方制御される。１つの実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチドを患者（例えば、ヒト患者）に投与することにより、癌療法のために免疫細胞を刺激する（活性化する）方法が提供される。別の実施形態では、養子細胞移入療法のためにＴ細胞を維持する方法が提供される。別の実施形態では、養子細胞移入療法のためにＴ細胞の増殖を刺激する方法が提供される。本明細書で記載されるポリペプチドにより増強、刺激することができるＴ細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞はＴｅｆｆ細胞、例えば、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞およびＴ細胞傷害性（Ｔｃ）細胞とすることができる。
【０１２７】
Ｈ．キットおよび製造物品
本明細書で記載されるポリペプチド組成物および使用説明書を含むキットがさらに提供される。キットは典型的には、説明書と共にあらかじめ決められた量の試薬のパッケージされた組み合わせならびにキットの中身の使用目的を示すラベルを含む。ラベルまたは説明書という用語は、キット上で、またはキット共に提供される任意の書面、または記録された材料を含み、または、これは、別様に、その製造、輸送、販売または使用中のどんな時でもキットに添付される。それは、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機関により規定された形態とすることができ、その提示はヒトへの投与のため、または獣医学使用のための、製造、使用または販売の機関による認可を反映する。ラベルまたは説明書はまた、広告ビラおよび小冊子、パッケージング材料、および音声もしくはビデオ説明書を包含することができる。
【０１２８】
例えば、いくつかの実施形態では、キットは好適な容器中のポリペプチドおよび本明細書で記載される治療レジメンにしたがう投与のための説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに追加の抗悪性腫瘍薬を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、好適な容器中で投与のための用量単位として提供される。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は様々な材料、例えばガラスまたはプラチック製であってもよい。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは凍結乾燥形態で提供され、キットは任意で、無菌の生理的に許容される再構成媒体、例えば水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、などを含んでもよい。それはさらに、商業上、およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含んでもよく、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および例えば、投与スケジュールを含む使用説明書を有する添付文書が挙げられ、施術者（例えば、医師、看護師、または患者）はその中に含まれる組成物を投与することができる。
【０１３０】
本出願を通して引用される全ての参考文献、例えば、発行または認可された特許または等価物を含む特許文書；特許出願公報；ならびに非特許文献文書または他の起源材料はこれにより、それらの全体が参照により、個々に参照により組み込まれるかのように、本明細書に組み込まれる。いずれの配列表および配列表情報もここの開示の一部と考えられる。
【０１３１】
当業者であれば、本明細書で記載される特定の実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または単なるルーチン実験を使用して確認することができる。そのような等価物は下記特許請求の範囲により包含されることが意図される。従属クレームまたは実施例のいずれか複数において開示される実施形態の任意の組み合わせは、本開示の範囲内にあることが企図される。
【０１３２】
下記実施例は、例示にすぎず、この開示の範囲をいかなる意味でも制限するものと解釈されるべきではない。というのも、多くの変更および等価物は本開示を読めば当業者に明らかになるであろうからである。
【０１３３】
本明細書で引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３４】
実施例
実施例１：改善されたｓｃＴＲＡＩＬフォーマット法の開発
タンパク質発現
ＴＲＡＩＬをコードするヌクレオチド配列はＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５７３）発現について最適化されたコドンであり、下記配列Ｔ１−Ｔ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）は合成され、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ制限部位でクローン化される。下線のついたテキストはリーダー配列を示し、抗ＥｐＣＡＭ抗体ＭＯＣ−３１の重鎖Ｆｖは太字で示される。各々のリーダー配列は下線がつけられる。
【化１】
2019518713.tif 000003
2019518713.tif 000004
2019518713.tif 000005
2019518713.tif 000006
2019518713.tif 000007
【０１３５】
ＭＯＣ−３１の軽鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）もまた合成され、ｐＣＥＰ４におけるＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位にクローン化される。
【化２】
2019518713.tif 000008
【０１３６】
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬを安定して発現するＨＥＫ−２９３Ｆ細胞（浮遊培養のために適合されたＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  ＨＥＫ−２９３細胞、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｃａｔ．＃Ｒ７９００７）を４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１％プルロニックＦ−６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、浮遊培養としてフラスコ内で、回転させながら（１２５ｒｐｍ）成長させる。細胞を別々に、かつ単独で、細胞培養物１ミリリットルあたり、０．５μｇのプラスミドｐＣＥＰ４−Ｔ１からｐＣＥＰ４−Ｔ９の１つ、０．５μｇのプラスミドｐＣＥＰ４−ＭＯＣ３１軽鎖（１μｇの全ＤＮＡ）、および２．５μｇの直鎖２５ｋＤａポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）の混合物でコトランスフェクトさせる。トランスフェクション時での細胞の密度は１．５−２．０ｅ６細胞／ｍｌである。細胞に次の日、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（「ＴＮ１」、Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）を与え、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。トランスフェクション後６日に、細胞培養物を１５分間５，０００×ｇで遠心分離し、細胞をペレット化する。精製のための準備において、上清培地を細胞からデカントし、０．２μｍフィルタを用いて濾過する。
【０１３７】
タンパク質精製
抗ＥｐＣＡＭ  Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントを含む培地を別々にＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）樹脂にＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてロードする。親和性捕捉後、樹脂を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．５で溶離させる。酸溶離液を、１：１００体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を用いて直ちに中和させる。タンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４中に一晩透析させ、次の日、−８０℃での貯蔵のためにアリコートした。
【０１３８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１マイクログラムの、精製抗ＥｐＣＡＭ  Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントの各々を、２−メルカプトエタノール（１％最終）の存在下または非存在下で、１０分間９５℃でインキュベートする。試料をＮＵＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動させ、ＳＩＭＰＬＹＢＬＵＥ  ＳＡＦＥＳＴＡＩＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて可視化する。染色されたゲルを、ＯＤＹＳＳＥＹ  ＣＬｘイメージャ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて走査する。
【０１３９】
サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＳＫＧＥＬ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ  ＩＤ×３０ｃｍ）（Ｔｏｓｏｈ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を４００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５と、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて平衡化させる。５０マイクログラムのタンパク質を、０．３５ｍｌ／分の流速で注入し、２８０ｎｍでの吸光度を、２０分の期間にわたって記録する。
【０１４０】
細胞培養
ＨｅＬａ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、フラスコ内で１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）と共に培養する。
【０１４１】
発光細胞生存率アッセイ
細胞を１０，０００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにおいて播種する。２４時間後、細胞を、濃度を増加させたＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質と共にインキュベートする。２４時間処理期間後、細胞ＡＴＰの量をＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により検出し、ＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定する。発光を未処理対照に対して正規化し、二つ組を平均化し、Ｆａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質濃度の関数としてプロットする。非線形回帰を、４パラメータ最小二乗フィットを用い、ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて適合させる。
【０１４２】
結果
改善された単鎖ＴＲＡＩＬ（ｓｃＴＲＡＩＬ）融合タンパク質を設計した。試験融合パートナーとして、免疫グロブリン由来ポリペプチドを、特に、この実施例で選択し、ｓｃＴＲＡＩを抗ＥｐＣＡＭ  Ｆａｂ（ＭＯＣ−３１）の重鎖のＣ末端に融合させた（図１Ａ）。ＴＲＡＩＬ配列を単一直鎖ポリペプチド鎖中に連結するための３つの異なる長さのＴＲＡＩＬ配列および３つの異なる長さのグリシンセリンリンカーは系統的に研究される（図１Ｂ）。
【０１４３】
合計９つのＦａｂ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合バリアントをＢｃｌ−ＸＬを安定に過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｆ細胞において生成させ、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製する。図１Ｃに示されるように、各バリアントについて、還元および非還元条件下での、各タンパク質の予測された、観察された移動は、予測された非還元および還元分子量に対応する（表２）。
【表２】
2019518713.tif 000009
【０１４４】
Ｔ９バリアントにおける短いＴＲＡＩＬ配列（ＴＲＡＩＬアミノ酸１２０−２８１）および長いリンカー長（１５アミノ酸：Ｇ４Ｓ×３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６））の組み合わせはＭＯＣ３１重鎖と軽鎖の間のジスルフィド形成に有害効果を有すると考えられ、約８３ｋＤａバンドは、非還元試料において出現すると予測される。残りのバリアントについては、これは観察されないはずであり、よってＴ９バリアントは好適ではない。
【０１４５】
分析的サイズ排除は、全てのバリアントの中で、Ｔ６が最高パーセンテージの単一主要種を含むことを示すと期待される（約９８％）（図１Ｄ−Ｌ）。全てのバリアントは、ＨＥＬＡ細胞を用いた細胞生存率アッセイにおいて機能的であると予測される（図２Ａ−Ｃ）。Ｔ７は、全てのバリアントの中で、示す効力の改善が小さいと予想されるが（ＩＣ５０＝２．７６ｅ−１０）、その予測された有利なＳＥＣプロファイルのために、Ｔ６バリアントのＴＲＡＩＬ配列およびリンカー長が使用のため選択される。次に、Ｔ６バリアントへの融合パートナーとしてのヒトＩｇＧ１  Ｆｃを使用して、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬを生成させる。
【０１４６】
実施例２：Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの発現および精製
方法
タンパク質発現
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬをコードするヌクレオチド配列を合成し、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ制限部位でクローン化した。下記配列において、リーダー配列（発現中に除去される）は太字で示され、３つのＴＲＡＩＬ単量体は異なる下線により示され：
【化３−１】
2019518713.tif 000010
【化３】
2019518713.tif 000011
【０１４７】
実施例１に記載されるように、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質をＢｃｌ−ＸＬを安定して発現するＨＥＫ−２９３Ｆ細胞において発現させ、精製した。
【０１４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣを実施例１に記載されるように実施した。
【０１４９】
結果
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬはよく発現され、非凝集形態で精製することができる
ｓｃＴＲＡＩＬをヒトＩｇＧ１のＦｃに融合させ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、薬物動態を改善させた。このフォーマットの追加の利点は、Ｆｃ断片のホモ二量体化のために、２つのＴＲＡＩＬサイトカインがごく接近して存在することである（図３）。これは、ＴＲＡＩＬの増加されたクラスター化がサイトカインの膜結合形態を模倣し、多くの癌細胞株にわたるアポトーシス促進性シグナルの強度を改善するので、有利である。
【０１５０】
精製Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの観察された分子量は、それぞれ、ジスルフィド連結されたホモ二量体および還元単量体についての１７５および８７ｋＤａの予測された分子量に対応した（図４、ゲル挿入図）。還元条件下で存在しなかった追加のバンドが非還元試料において観察された。これは、ゲル上での異常な移動となる、ＴＲＡＩＬ三量体内の間違った鎖内ジスルフィド結合形成のためであると考えられる。より高い分子量種については、これは、２つのＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬホモ二量体間の鎖間ジスルフィド結合形成のためであると考えられる。非還元試料では、還元試料と同じ位置で移動するバンドが観察され、ごく少量のＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬホモ二量体はジスルフィド連結されていないことが示される。分析サイズ排除クロマトグラフィー（図４）を用いて、精製Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、７．９４分の保持時間を有する単一主要種（約９８％）であることが観察され、これは、その理論的分子量と一致する。
【０１５１】
実施例３：Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのインビトロ活性
方法
細胞培養
ＣＯＬＯ２０５、ＨＣＴ１１６、ＤＵ１４５、ＰＡＮＣ１、およびＪｕｒｋａｔをフラスコ内で、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を用いて培養した。
【０１５２】
発光細胞生存率アッセイ
このアッセイを、実施例１に記載されるように実施した。抗体を等モル濃度の抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて架橋させた。
【０１５３】
結果
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、アゴニスト抗体より大きな効力で、細胞株にわたって細胞死滅を誘導する
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、癌細胞株ＣＯＬＯ２０５（結腸）、ＨＣＴ１１６（結腸）、ＤＵ１４５（前立腺）、およびＪｕｒｋａｔ（Ｔリンパ球）を使用する細胞生存率アッセイにおいて観察されるように、機能的に活性である。ＴＲＡＩＬならびに作動性ＤＲ４（Ｐｕｋａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００５  Ａｐｒ  ２５；９２（８）：１４３０−４１）およびＤＲ５（Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，２００８  Ａｐｒ；１５（４）：７５１−６１）抗体と比べて、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬはアポトーシスを誘導するのに最も活性であった（図５Ａ−５Ｄ）。ＣＯＬＯ２０５およびＨＣＴ１１６細胞の両方において、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、生存率曲線のＩＣ５０により示されるように、より低い濃度で細胞死を誘導した。ＤＵ１４５およびＪｕｒｋａｔ細胞において、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは細胞生存率の最大低減を誘導した。この改善された効力は我々の治療設計を支持し、この場合、１分子あたり２つのＴＲＡＩＬホモ三量体およびデスレセプタの六価結合を有することは、それぞれ、ＴＲＡＩＬおよびアゴニスト抗体の三価および二価受容体結合よりも良好である。
【０１５４】
図６Ａに示されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、架橋ＤＲ５抗体のみに応じてアポトーシスを受ける。架橋ＤＲ４抗体、または架橋のないＤＲ４およびＤＲ５抗体はほとんど影響しない。しかしながら、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは、架橋抗ＤＲ５よりも著しくより活性である（図６Ｂ）。架橋抗ＤＲ４、抗ＤＲ５または抗ＤＲ４および５の組み合わせと比べたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの優位性は、複数の癌細胞株、例えばＤＵ１４４５、ＣＯＬＯ２０５、およびＰＡＮＣ１細胞にわたって見られた（図７Ａ−Ｃ）。
【０１５５】
実施例４：Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのアポトーシス活性は多価に依存する
方法
ＴＲＡＩＬプロトマーの１、２または３における不活性化Ｑ２０５Ａ置換を含むＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのバリアントを、ＨＥＫ２９３発現についてコドン最適化し、合成し、ベクターｐＣＥＰ４にＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位を使用してクローン化した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＮＪ）。
【０１５６】
タンパク質発現
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬを安定して発現する、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞（浮遊培養のために適合されたＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  ＨＥＫ−２９３細胞、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｃａｔ．＃Ｒ７９００７）を、フラスコ内の浮遊培養物として４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１％プルロニックＦ−６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、回転させながら（１２５ｒｐｍ）成長させた。細胞を、細胞培養物１ミリリットルあたり、１μｇのプラスミドＤＮＡおよび２．５μｇの直鎖２５ｋＤａポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）でコトランスフェクトさせた。トランスフェクション時での細胞の密度は１．５−２．０ｅ６細胞／ｍｌであった。細胞に次の日Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）を与え、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。トランスフェクション後６日に、細胞培養物を１５分間５，０００×ｇで遠心分離し、細胞をペレット化した。上清培地を、精製のための準備において、細胞からデカントし、０．２μｍフィルタを用いて濾過した。
【０１５７】
細胞培養
Ｈ１９９３細胞をフラスコ内で、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を用いて培養した。
【０１５８】
発光細胞生存率アッセイ
このアッセイを、実施例１に記載されるように実施した。
【０１５９】
結果
アポトーシス活性とＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの六価性質の間の相関を確認するために、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのノックアウトバリアントをＱ２０５Ａ変異（ＤＲ４および５へのＴＲＡＩＬ結合を抑制することが知られている）を用いて作製した（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９（４）：６３３−４０）。下記バリアントを構築した：Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ１は、ＴＲＡＩＬプロトマー１において単一のＱ２０５Ａ変異を含み、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ２はＴＲＡＩＬプロトマー１および２において２つのＱ２０５Ａ変異を含み、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ３は３つ全てのＴＲＡＩＬプロトマーにおいて３つのＱ２０５Ａ変異を含む。３つ全てのバリアントを、Ｈ１９９３細胞を用いる細胞生存率アッセイにおいて、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬに対して比較した。図８に示されるように、価数の各低減と共に、ＩＣ５０および最大細胞死滅の両方が低減した。その上、２の価数を有するＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  Ｑ２の活性は二価ＤＲ４および５抗体について見られる活性と大して違わない。この研究は、アゴニスト抗体と比較した、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬフォーマットの利点を強調する。
【０１６０】
実施例５：熱および血清安定性アッセイにおけるＦＣ−ｓｃＴＲＡＩＬの安定性
方法
示差走査蛍光光度法
２５マイクログラムのタンパク質を、タンパク質サーマルシフトアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析し、蛍光を、ＶＩＩＡ  ７  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、２５−９９℃の融解範囲にわたって検出した。導関数決定ＴＭを、タンパク質サーマルシフトソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて取得した。
【０１６１】
マウス血清安定性アッセイ
血清安定性についてのインビトロスクリーンとして、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬを、９０％マウス血清（Ｓｉｇｍａ）中、１μＭの最終濃度で０、１、３および７日間３７℃でインキュベートした。試料を−８０℃で、インキュベーションの最後に凍結させる。Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を、細胞生存率アッセイにおいて、結腸直腸癌細胞株、ＨＣＴ１１６を用いて評価した。細胞を、１０，０００細胞／ウェルで、９６ウェル組織培養プレートにおいて播種した。２４時間後、細胞を希釈系列の血清−インキュベートしたＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと共に、１０ｎＭ濃度で始めてインキュベートした。２４−時間処理期間後、細胞ＡＴＰの量をＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて検出し、ＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定した。発光を未処理対照に対して正規化し、三つ組を平均化し、タンパク質濃度の関数としてプロットした。非線形回帰を４パラメータ最小二乗フィットを用い、ＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してフィッティングさせた。
【０１６２】
結果
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬは低い融解温度を有する
ＴＲＡＩＬまたは作動性ＤＲ４およびＤＲ５抗体と比べての、アポトーシス促進性活性の著しい改善にも関わらず、タンパク質不安定性のエビデンスがＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬについて観察された。図９Ａに示されるように、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの熱安定性を、示差走査蛍光光度法により決定した。予想外に、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのＴＭ（５３℃）は、ＴＲＡＩＬ（７１℃）より著しく低いことが観察された。加えて、タンパク質サーマルシフト色素とＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの間で非常に高いバックグラウンド相互作用を観察したが、ＴＲＡＩＬでは観察されず、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの非天然構造が示される。亜鉛の配位はＴＲＡＩＬの天然フォールディングに重要である（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００  Ｆｅｂ  １；３９（４）：６３３−４０）。そのため、精製Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの亜鉛含量を、誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いて分析した。既知の濃度のＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの亜鉛含量を測定し、モル比を基本とし、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬの２０％のみが亜鉛原子を含んだと推定した。
【０１６３】
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬはマウス血清中でのインキュベーション後活性を失う
血清安定性のためのインビトロスクリーンとして、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬを、９０％マウス血清（Ｓｉｇｍａ）中、１μＭの最終濃度で、０、１、３および７日間３７℃でインキュベートした。その後、各時点からの試料を細胞生存率アッセイにおいて結腸直腸癌細胞株、ＨＣＴ１１６を使用して評価し、結果を図９Ｂに示す。各時点対０日についてのＩＣ５０比を使用して、２４時間後には無視できる活性の損失があったが（図示せず）、しかしながら、３日（５倍）および７日後（３４倍）には活性の著しい損失があったことを観察した。
【０１６４】
実施例６：安定性を改善するＴＲＡＩＬへの変異の同定
方法
酵母ライブラリ構築
ＴＲＡＩＬ（１１４−２８１）についての核酸配列をサッカロマイセス・セレビシエに対してＪＣａｔコドン適合ツールを用いて最適化した（Ｇｒｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００５  ｖ  ３３，Ｉｓｓｕｅ  Ｓｕｐｐｌ  ２，ｐｐ  Ｗ５２６−Ｗ５３１）。ＴＲＡＩＬヌクレオチド配列の前にはＶ５エピトープタグがあり、続いてタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）配列およびＦＬＡＧエピトープタグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）がある。ＴＭＶ配列は、ＴＭＶのレプリカーゼ遺伝子において見出される終止コドンを含む２１塩基対配列を示し、サッカロマイセス・セレビシエにおいて３０％リードスルーを有することが報告された（Ｎａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．２００１  Ｓｅｐ；２（９）：７８７−９３）。ＴＭＶ配列を組み込み、可溶性ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ／ＡＧα融合タンパク質の両方の発現を可能にした。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２
ＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＡＣＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＣＡＴＴＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＧＴＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＡＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＴＣＴＡＡＴＴＴＧＣＡＣＴＴＡＡＧＡＡＡＣＧＧＴＧＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＡＣＴＴＣＡＧＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＡＣＡＡＴＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＴＡＣＡＣＡＡＧＴＴＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＣＧＡＡＴＡＣＧＧＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧＴＡＴＣＴＴＣＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＡＧＴＣＡＣＣＡＡＣＧＡＡＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＣＣＡＣＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＡＴＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＧＧＣＧＣＣＴＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡＡＧ
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２をフォワードプライマーＥＴ１（ＧＡＡＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＡＣＣＴＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）およびリバースプライマーＥＴ２（ＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＡＣＣＣＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を使用して、増幅させ、ＺＥＲＯ  ＢＬＵＮＴ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキットを使用してｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、プラスミドＶ１０を生成させた。
【０１６６】
ランダム変異誘発をＧＥＮＥＭＯＲＰＨ  ＩＩランダム変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。２０のＰＣＲ反応を設定し、各々が３ｎｇのＶ１０を鋳型ＤＮＡとして、ならびにフォワードおよびリバースプライマー、ＥＴ３１（ＴＡＣＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）およびＥＴ３２（ＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＡＴＴＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を含んだ。２０サイクルの増幅後、ＰＣＲ反応物をプールし、１％アガロースゲル上で電気泳動させた。ＰＣＲ産物を抽出し、ＷＩＺＡＲＤ  ＳＶゲルおよびＰＣＲクリーンアップキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。セカンダリＰＣＲ増幅をその後、Ｑ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して実施した。精製したプライマリＰＣＲ産物を８サイクルの間、フォワードおよびリバースプライマー、ＥＴ８１（ＴＡＣＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＧＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）およびＥＴ８２（ＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）を使用して増幅させ、前と同様にゲル精製した。酵母ディスプレイベクターｐＭＹＤ１０００（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）を制限酵素、ＢａｍＨＩおよびＫａｓＩで消化させ、ゲル精製した。電気穿孔のために、新たに調製したコンピテントＥＢＹＺ細胞（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）を３：１比（ｗ／ｗ）の精製セカンダリＰＣＲ産物および消化させたベクターと共にインキュベートし、以前に記載されるように電気穿孔させた（Ｂｅｎａｔｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。形質転換されたライブラリを一晩３０℃で振盪させながら（２２５ｒｐｍ）成長させ、アリコートし、−８０℃で保存した。ライブラリサイズを、選択培地上での細胞の段階希釈後、１．１ｅ８であると推定した。
【０１６７】
酵母ライブラリパニング
ライブラリパニングの調製において、抗原、ＤＲ５−Ｆｃ（Ａｂｃａｍ）をＥＺ−ＬＩＮＫ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で製造者の指示に従い標識した。我々は、１タンパク質あたり約３のビオチン分子の比を決定した。ライブラリ（１ｅ１０細胞）をＳＤＣＡＡ培地（デキストロース−２０ｍｇ／ｍｌ、カザミノ酸−１０ｍｇ／ｍｌ、酵母窒素塩基−３．４ｍｇ／ｍｌ、硫酸アンモニウム−１０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４−５．４ｍｇ／ｍｌおよびＮａＨ２ＰＯ４−７．４ｍｇ／ｍｌ）中、２４時間の間３０℃で振盪させながら（２２５ｒｐｍ）成長させた。細胞をその後、ペレット化し、ＳＤＧＡＡ培地（ガラクトース−２０ｍｇ／ｍｌ、カザミノ酸−１０ｍｇ／ｍｌ、酵母窒素塩基−３．４ｍｇ／ｍｌ、硫酸アンモニウム−１０ｍｇ／ｍｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４−５．４ｍｇ／ｍｌおよびＮａＨ２ＰＯ４−７．４ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁させ、さらに４８時間の間２０℃で振盪させながら成長させ、酵母細胞表面上でのＴＲＡＩＬの発現を誘導した。ライブラリパニングの第１ラウンドを、磁気細胞選別を用いて実施した。簡単に言うと、誘導されたライブラリ（１ｅ１０）由来の細胞をビオチン−標識ＤＲ５−Ｆｃ（１００ｎＭ）と共に１時間の間２５℃でインキュベートし、抗原結合細胞をストレプトアビジンビーズおよび磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて濃縮させた。細胞を磁気カラムからＳＤＣＡＡ培地中に溶離させ、一晩成長させ、続いて、前と同様に誘導した。パニングのその後のラウンドを、ＦＡＣＳを用いて実施した。パニングの第１ラウンドからの誘導細胞を１００ｎＭのビオチン−標識ＤＲ５−Ｆｃおよび１μｇ／ｍｌの抗ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に１時間の間２５℃でインキュベートした。細胞をその後、洗浄バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５％ＢＳＡを含む）で洗浄し、１μｇ／ｍｌの、ヤギ抗マウスＦｃ／Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびストレプトアビジン／Ａｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の両方と共に、１時間の間、４℃でインキュベートした。標識細胞をＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩＩ細胞選別機（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。トップ５％のダブルポジティブ細胞をＳＤＣＡＡ培地中に選別し、次のラウンドのために拡大させた。パニングラウンド３および４において、抗原を、それぞれ、２０および５ｎＭに低減させた。その後のパニングラウンドの両方において、トップ１．５％のダブルポジティブ細胞を次のラウンドに進めた。
【０１６８】
ラウンド４パニングから選別した細胞を、ＳＤＣＡＡ培地プレート上に蒔き、７２時間の間３０℃で成長させた。個々のコロニーをその後使用して、１ｍｌのＳＤＣＡＡ培養物を９６−ウェルプレートにおいて接種した。培養物を成長させ、前と同様に誘導した。細胞をその後、ペレット化し、１０ｎＭのＤＲ５−ＦｃまたはＤＲ４−Ｆｃ（Ａｂｃａｍ）のいずれかと共にインキュベートした。両方の受容体に対して最高レベルの結合を呈したクローンについて配列決定した。
【０１６９】
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬフォーマットへのＴＲＡＩＬ変異のクローニング
変異ＴＲＡＩＬヌクレオチド配列を、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬフォーマット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）における３つのＴＲＡＩＬ単量体位置の各々のための３対のフォワードおよびリバースプライマーを使用して、最初に増幅させた。
位置１
ＥＴ６２（ＧＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）
ＥＴ６３（ＴＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）
位置２
ＥＴ６４（ＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）
ＥＴ６５（ＴＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）
位置３
ＥＴ６６（ＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＧＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）
ＥＴ６７（ＴＣＴＣＴＣＧＧＴＣＴＣＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＧＡＴＧＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）
【０１７０】
加えて、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を合成し（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、フォワードプライマー、ＥＴ１６０（ＧＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＣＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、およびリバースプライマー、ＥＴ１６１（ＣＡＣＡＡＴＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＧＧＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を使用して増幅させた。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３
ＧＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＴＧＧＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＡＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＡＣＧＧＡＣＧＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＴＴＧＴＧＴＣＧＴＣＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＣＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＡＴＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＣＧＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＡＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＧＣＡＡＧＴＧＴＡＣＡＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＡＣＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＧＡＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＴＣＧＧＡＣＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＡＣＧＧＴＧＧＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＡＴＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＧＴＣＧＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＣＣＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＴＧ
【０１７１】
３０サイクルの増幅後、各個々の変異体についての３つの異なるＴＲＡＩＬアンプリコンを合わせ、プールとしてゲル精製した。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃアンプリコンを別にゲル精製した。併用制限消化／ライゲーション反応を下記の通り設定した：ＴＲＡＩＬアンプリコン、Ｆｃアンプリコン、およびｐＳＣ４ベクターを３：１：１モル比で合わせ、２０単位のＢｓａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）および６単位のＴ４リガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、Ｔ４リガーゼバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートした。反応は熱サイクラ内で、下記条件で進行した：
ステップ１−３７℃（２分）
ステップ２−１６℃（３分）
ステップ１および２を５０回サイクルさせ、続いて５０℃（５分）および８０℃（５分）とした。
【０１７２】
反応物をコンピテント５−α大腸菌細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換させ、カルベニシリンを含むＬＢプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ）上に蒔いた。次の日、コロニーを選択して、ＤＮＡ配列決定および単離のために培養した。
【０１７３】
タンパク質発現
変異Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質をＢｃｌ−ＸＬを安定して発現するＨＥＫ２９３  Ｆ細胞において発現させ、実施例１に記載されるように精製した。
【０１７４】
示差走査蛍光光度法
このアッセイを実施例５に記載されるように実施した。
【０１７５】
マウス血清安定性アッセイ
このアッセイを実施例５に記載されるように実施した。
【０１７６】
結果
複数の有用な変異を酵母ディスプレイ選択により同定した
ＴＲＡＩＬホモ三量体の安定性の改善は、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬのＴＭの増強および改善された血清安定性につながると仮定された。そのため、三量体形成を安定化し、ＤＲ５への結合を改善するＴＲＡＩＬ内の変異の同定が求められた。ＴＲＡＩＬ中のランダム変異のライブラリをエラープローンＰＣＲを用いて作製し、ＴＲＡＩＬ変異体のライブラリを酵母の表面上に提示させた。ライブラリの小さなサブセットの配列決定により、クローンの５５％が各々、１−２個のアミノ酸変異を含んだことが明らかになった。非選択ライブラリのフローサイトメトリー分析により、抗ＦＬＡＧを用いて測定される、表面上でのＴＲＡＩＬの良好な発現が明らかになったが；しかしながら、抗原、ビオチン−標識ＤＲ５−Ｆｃへの結合はほとんどなかった（図１０Ａ）。磁気細胞選別を用いるパニングの初期ラウンド、続いて３つのその後の、ＦＡＣＳおよび減少する濃度の抗原を使用したパニングのラウンド後、クローンの大半は今や、ＤＲ５結合に対して陽性であったことが観察された（図１０Ｂ）。選別された集団のトップ１％を成長させ、個々にキャラクタリゼーションを行った。野生型対照と比べてＤＲ５−Ｆｃ結合が著しく改善された例示的なクローンが図１０Ｃに示される。
【０１７７】
ＤＲ５−Ｆｃに加えて、ＤＲ４−Ｆｃに結合することが確認された個々のクローンをその後、ＤＮＡ配列決定した。変異ヌクレオチド配列をその後、哺乳類発現のために、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬフォーマットに導入した。変異Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質を前と同様に発現、精製させ、さらに、サーマルシフトアッセイを用いてキャラクタリゼーションを行った。野生型Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬでは４８℃に比べて、ＴＭにおいて最も著しい増強（６６−６９℃）を示した変異体Ｔ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３が図１１に示される。興味深いことに、３つ全ての変異体は保存的アミノ酸置換Ｉ２４７Ｖを含む。インビトロ血清アッセイでは、３つ全ての変異体は、野生型Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比べて、血清中での７−日インキュベーション後に活性消失の著しい低減を示した（６．５−１０倍）（図１２Ａ−１２Ｄ）。
【０１７８】
実施例７：変異は、安定性の増加のために、相加的にまたは相乗的に組み合わせることができる
方法
Ｔ１８３、Ｔ１８６およびＴ１９１のクローニング
変異ＴＲＡＩＬヌクレオチド配列を、Ｊｃａｔコドン適合ツールを使用してヒト発現に対してコドン最適化し、合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＮＪ）。合成ＤＮＡをその後、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）における３つのＴＲＡＩＬ単量体位置のための３対のフォワードおよびリバースプライマーを使用して増幅させた。
位置１
ＥＴ１５４（ＧＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）
ＥＴ１５５（ＣＡＣＡＡＴＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）
位置２
ＥＴ１５６（ＧＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）
ＥＴ１５７（ＣＡＣＡＡＴＧＧＴＣＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）
位置３
ＥＴ１５８（ＧＴＴＣＴＡＧＧＴＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）
ＥＴ１５９（ＣＡＣＡＡＴＧＧＴＣＴＣＴＡＴＴＡＧＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）
【０１７９】
３０サイクルの増幅後、各個々の変異体についての３つの異なるＴＲＡＩＬアンプリコンを合わせ、プールとしてゲル精製した。ＴＲＡＩＬアンプリコンおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃアンプリコンを、以上で記載される通り、ｐＳＣ４ベクターにクローン化した。
【０１８０】
示差走査蛍光光度法
このアッセイを実施例５に記載されるように実施した。
【０１８１】
マウス血清安定性アッセイ
このアッセイを実施例５に記載されるように実施した。
【０１８２】
結果
変異の組み合わせはさらに安定性を増強する
観察されたＴＭおよび血清安定性の改善に基づき、Ｔ１４８、Ｔ１５１、およびＴ１５３由来の変異を組み合わせて、３つの新規組み合わせ変異体、Ｔ１８３、Ｔ１８６、およびＴ１９１を作製した（図１３）。２つの追加の変異、Ｙ２１３ＷおよびＳ２１５Ｄ（発現を改善することが示されている）（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００５）もまた、含めさせた。サーマルシフトアッセイでは、Ｔ１８３およびＴ１９１はそれぞれ、７７および７２℃のさらにいっそう増強されたＴＭを提示し、一方、Ｔ１８６のＴＭは、親変異体から有意に改善されなかった。マウス血清中での７−日インキュベーション後、Ｔ１８３およびＴ１８６は、野生型と比べて、４倍および４．５倍の活性消失を示したが、Ｔ１９１は＜４倍活性消失を示し、最も改善された（図１４Ａ−１４Ｄ）。
【０１８３】
実施例８：例示的なクローンＴ１９１のインビトロ活性
方法
細胞培養
Ａ５４９、ＤＵ１４５、およびＨＯＰ６２細胞をフラスコ内で、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。ＰＡＮＣ−１はＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養したが、ＳＫ−ＬＵ−１は、ＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）を用いて培養した。どちらの培地も、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充された。
【０１８４】
発光細胞生存率アッセイ
このアッセイを実施例７に記載されるように実施した。
【０１８５】
結果
Ｔ１９１はｒｈＴＲＡＩＬ可溶性リガンドと比べて増強された細胞死滅を提示する
ＤＵ１４５、Ａ５４９、ＰＡＮＣ−１、ＨＯＰ６２、およびＳＫ−ＬＵ−１細胞株は、天然ＴＲＡＩＬに対して圧倒的に非感受性である。図１５Ａ−１５Ｅに示されるように、Ｔ１９１は、５つ全ての細胞株において、ＴＲＡＩＬと比べて、改善されたＩＣ５０だけでなく、より重要なことには増強された最大細胞死滅を示す。ＤＵ１４５細胞では、Ｆｃ−媒介架橋を提供するための等モル濃度の抗Ｆｃ抗体の付加は、細胞死を誘導するのに、Ｔ１９１の活性に影響を有さなかった（図１６）。
【０１８６】
実施例９：クローンＴ１９１はインビトロでアポトーシスを誘導する
カスパーゼ−８、Ｂｉｄ、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨの免疫ブロット分析
細胞を６−ウェルプレートに６．０×１０５細胞／ウェルで２．７ｍＬ培地中、一晩播種した。１０ｎＭのＡＦＦＩＮＩＰＵＲＥヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）ありまたはなしのＴ１９１（１０ｎＭ）を各ウェルに添加し２、４、８、または２４時間の間３７℃でインキュベートした。
【０１８７】
０および２４時間での未処理試料は対照として機能した。インキュベーションの最後に、個々のウェルからの培地を回収し、細胞を氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン処理し、１５ｍｌ管中に回収した。細胞をペレット化し、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、２５０μｌの溶解バッファー（ＲＩＰＡ溶解および抽出バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５０μＭフェニルアルシン、１０μＭ  ｂｐＶ、１０ｍＭ  βグリセロリン酸、１Ｍフッ化ナトリウム）中で溶解させた。細胞溶解物を氷上で最低３０分間インキュベートし；その後、１．５ｍｌマイクロ遠心管に移し、−８０℃で保存した。タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、製造者プロトコルに従い決定した。
【０１８８】
タンパク質試料（１５μｇ）を、ＮＵＰＡＧＥ４−１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードし、ゲル電気泳動により分離した。タンパク質をニトロセルロース膜にＩＢＬＯＴドライブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて転写させた。膜を１時間の間室温でＯＤＹＳＳＥＹブロッキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ）中でブロックし、続いて、一晩、４℃で、１：１のＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー／ＰＢＳＴ（ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋０．１％ＴＷＥＥＮ  ２０）で希釈した一次抗体と共にインキュベートした。下記タンパク質に対する抗体を使用した：カスパーゼ−８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−６１３６）、ＢＩＤ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２００２）、ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃９５３２）、およびＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２１１８）。次の日、膜をＰＢＳＴと一緒にし、二次抗体：ＩＲＤＹＥ  ８００ＣＷ  ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはＩＲＤＹＥ  ８００ＣＷ  ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＬＩ−ＣＯＲ）と共に、１時間の間、室温でインキュベートした。膜をもう一度ＰＢＳＴ中で洗浄し、ＯＤＹＳＳＥＹ  ＣＬｘイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて画像化した。
【０１８９】
Ｔ１９１はカスパーゼ−８切断により迅速にアポトーシスを誘導する
ＤＵ１４５細胞においてＴ１９１に誘導されたアポトーシスの時間的経過を調査した。細胞を１０ｎＭのＴ１９１で２、４、８および２４時間の間処理し、その後、溶解させ、免疫ブロッティングにより分析した。我々はまた、Ｔ１９１を抗ヒトＦｃ抗体の存在下でインキュベートすることにより、Ｔ１９１誘導アポトーシスに対するＦｃ架橋の効果を調査した。図１７に示されるように、Ｔ１９１処理のほんの２時間後にアポトーシスの誘導を観察した。４３／４１ｋＤａおよび１８ｋＤａでの切断生成物の検出により示される、カスパーゼ８活性化を２時間の処理後に観察したが、未処理細胞では０または２４時間のいずれでも観察されなかった。カスパーゼ８の総レベルは２４時間にわたって、プールが活性化後に枯渇するにつれ減少した。切断されたＢＩＤ（１５ｋＤａ）は、これは活性カスパーゼのための基質であるので、カスパーゼ８の活性を支持する。これはまた、アポトーシスのためのミトコンドリア経路を開始する。切断されたＰＡＲＰ（８９ｋＤａ）は全ての処理時点で観察され、細胞におけるアポトーシスの遂行を示す。カスパーゼ８、ＢＩＤ、およびＰＡＲＰ活性化の動力学はＦｃ−媒介架橋で変化しなかった。これらの結果は、処理後の細胞生存率の変化についてのメカニズムとしての、Ｔ１９１による迅速なアポトーシスの誘導を証明する。
【０１９０】
実施例１０：クローンＴ１９１のための半減期決定
方法
ＤＲ４およびＤＲ５−Ｈｉｓのクローニング
Ｈｉｓ６タグ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）に融合されたＤＲ４（１−２３９）およびＤＲ５（１−１８１）のヌクレオチド配列を合成し、ＨＥＫ２９３発現についてコドン最適化した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）。両方の配列をｐＣＥＰ４にＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ制限部位でクローン化した。
【０１９１】
タンパク質発現
ＤＲ４−ＨｉｓおよびＤＲ５−Ｈｉｓタンパク質を、浮遊培養として、フラスコ内で回転させながら（１２５ｒｐｍ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１％プルロニックＦ−６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させたＨＥＫ２９３Ｆ細胞において発現させた。細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトさせた。
【０１９２】
タンパク質精製
８００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．０を、約５ｍＭイミダゾールの最終濃度のために、ＤＲ４−ＨｉｓおよびＤＲ５−Ｈｉｓを含む培地に添加した。培地をその後、ＣＯＭＰＬＥＴＥ  Ｈｉｓ−タグ精製樹脂（Ｒｏｃｈｅ）上にＡＫＴＡＥＸＰＬＯＲＥＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてロードし、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ、ｐＨ７．０で洗浄した。両方のＨｉｓ−タグタンパク質をその後、４００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ、ｐＨ７．０を用いて溶離させ、一晩、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に透析し、−８０℃で保存した。
【０１９３】
マウスにおける半減期決定
６−８週齢および１８−２０ｇ体重の、４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの５つの群（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にそれぞれ、５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのＴ１９１を含むＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）のいずれかを注射し、特定の時点で出血させた：０．５、８．５、２４、４８、７２、９２、１２０、１６８、および２２４時間。各マウスを、０．５−時間群を除き、２つの時点で出血させ、前の時点は尾静脈出血であり、続いて、後の時点での終末心臓出血とした。０．５−時間群のマウスは単一終末出血を受けた。血液をレッドキャップ血清セパレータ中に収集し（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｃａｔ  ＃  １６．４４１．１００）、１２，５００ｒｐｍで８分間４℃で微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において遠心分離した。血清を新たな１．５ｍマイクロ遠心管に移し、−８０℃で保存した。
【０１９４】
マウス血清中のＴ１９１タンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。プレート（３８４−ウェル）を一晩室温で、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈させた１μｇ／ｍｌ  ＤＲ４−ＨｉｓまたはＤＲ５−Ｈｉｓのいずれかでコートした。プレートを、２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＰＢＳで、１時間の間室温でブロックし、その後、ＰＢＳＴ（ＤＰＢＳ＋０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）で洗浄する。血清試料を希釈バッファー（２％ＢＳＡおよび０．１％ＴＷＥＥＮ  ２０／ＤＰＢＳを含むＤＰＢＳを用いて段階希釈し（１０，０００−５００倍）、一方、バッファー中で希釈した、新たに解凍したＴ１９１（９００−０．１５ｎｇ／ｍｌ）を標準として使用した。試料を、コート受容体と共に、２時間の間、室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴ中で洗浄し、その後、ペルオキシダーゼコンジュゲートＡＦＦＩＮＩＰＵＲＥヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）と共に１時間の間室温でインキュベートする。プレートを再びＰＢＳＴで洗浄し、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートする。発光を、ＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて検出した。生発光を、バッファーのみウェルに対して正規化し、その後、検量線に４−ｐｔロジスティック曲線を用いて回帰させた。回帰させた値を希釈係数により較正し、その後、平均して、Ｔ１９１の試料濃度を決定する。
【０１９５】
時間（時間数）の関数としてのＴ１９１の血清レベルを双指数関数曲線（ｙ＝Ａｅ−αｔ＋Ｂｅ−βｔ）（ここで、ｙは薬物濃度を表し、ｔは時間を表し、β＜αである）に、ＭＡＴＬＡＢ（バージョン８．５．０．１９７６１３（Ｒ２０１５ａ）、ライセンス番号５１８８０８）を用いて、データの各群（５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ群、ＤＲ５−またはＤＲ４−結合アッセイ測定）についてフィットさせた。フィットを非線形最小二乗回帰関数（Ｍａｔｌａｂにおけるｎｌｉｎｆｉｔ．ｍ）を用いて達成し、重みを各血清薬物濃度に適用し（生物学的反復）、フィッティングされたモデルへのその値の影響を増加／減少させた。所定の時間に各血清薬物濃度に適用された重みは、その時点と関連する全ての血清薬物濃度の標準偏差の逆数に等しかった。勾配を使用して、終末相半減期を計算した（半減期＝ｌｏｇ（２）／β）。
【０１９６】
結果
Ｔ１９１はマウスにおいて延長された終末相半減期を有する
マウスにおいてＴ１９１が改善された薬物動態を有したかどうかを調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２つの用量、１および５ｍｇ／ｋｇのうちの１つで注射した。マウスを、いくつかの時点で出血させ（０．５、８．５、２４、４８、７２、９２、１２０、１６８、および２２４時間）、血清中でのＴ１９１の機能レベルをＤＲ４およびＤＲ５結合ＥＬＩＳＡにより決定した。薬物濃度をその後、時間の関数としてプロットし（図１５Ａ−１５Ｅ）、曲線から、Ｔ１９１についての終末相半減期を決定した（表３）。
【表３】
2019518713.tif 000012
【０１９７】
値は用量およびＥＬＩＳＡアッセイと独立して一致する。終末相半減期は、マウスにおける３．６分のＴＲＡＩＬの報告された半減期と比べて（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、３０時間より大きい。
【０１９８】
実施例１１：ＣＯＬＯ２０５異種移植片モデルにおけるＴ１９１の有効性
方法
タンパク質
組換えヒトＴＲＡＩＬを購入した（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）。Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアント、Ｔ１９１を、以上で記載される通り発現させ、精製した。
【０１９９】
ＣＯＬＯ２０５異種移植片モデル
６週齢および１８−２０ｇ体重のヌードマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、右側腹部において、５０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＣＯＬＯ２０５細胞（３ｅ６）の懸濁液を皮下注射した。腫瘍測定をデジタルキャリパーを用いて実施し、腫瘍体積を下記式を用いて計算し：π／６（Ｌ×Ｗ＾２）、ここで、「Ｗ」は最大幅であり、「Ｌ」は最大長である。腫瘍が十分なサイズを有するようになるとすぐに（２５０ｍｍ３）、マウスを５つの群に無作為化し（各々９匹のマウス）、２日後ＰＢＳ  ｐＨ７．４、ＴＲＡＩＬ、またはＴ１９１のいずれかを指示した用量およびスケジュールで注射した（表４）。
【表４】
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【０２００】
腫瘍体積および体重をその後週２回、合計２３日間モニタした。最後の測定後、マウスを出血させ、腫瘍を将来の組織学的評価のために収集した。処置群間の統計学的差を決定するために、一元配置ＡＮＯＶＡ分析を、２３日目に対する各マウスについての腫瘍体積の分数変化を使用して実施した。
【０２０１】
結果
Ｔ１９１はＣＯＬＯ２０５異種移植片モデルにおいて等しい投薬でより強い応答を証明する
Ｔ１９１の増加したインビトロ活性および延長された半減期が改善されたインビボ有効性に変換されたかどうかを調査するために、Ｔ１９１およびＴＲＡＩＬをＣＯＬＯ２０５異種移植片モデルにおいて比較した。図１９に示されるように、腫瘍はＰＢＳのみで処置されたマウスでは急速に成長したが、１ｍｇ／ｋｇでのＴＲＡＩＬの５回の連続投与は中程度に腫瘍成長を遅延させたが、ＰＢＳ対照からは統計的に有意であるとは決定されなかった（表５）。対照的に、１ｍｇ／ｋｇでのＴ１９１の５回の連続投与では、研究の１６日目まで初期退縮および成長遅延が得られ、一方、５ｍｇ／ｋｇでのＴ１９１の単回投与は、著しい腫瘍退縮を引き起こし、成長を２３−日研究の持続期間の間阻害した。Ｔ１９１処置群はどちらも、ＰＢＳ対照およびＴＲＡＩＬ処置マウスとは統計学的に異なっていると決定した（表５）。
【表５】
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【０２０２】
実施例１２：ＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎ異種移植片モデルにおけるＴ１９１の有効性
方法
ＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎ異種移植片モデル
６週齢、１８−２１ｇ体重のヌードマウス（ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に右側腹部において５０％マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＨＣＣ２９９８またはＬＳ４１１Ｎ細胞（５ｅ６）の懸濁液を皮下注射した。腫瘍測定をデジタルキャリパーを用いて実施し、腫瘍体積を下記式を用いて計算し：π／６（Ｌ×Ｗ＾２）、「Ｗ」は最大幅であり、「Ｌ」は最大長であった。腫瘍が十分なサイズ（約２００ｍｍ３）を有するようになるとすぐに、マウスを２つの群に無作為化し（各々５匹のマウス）、ＰＢＳ  ｐＨ７．４、Ｔ１９１のいずれかを、指示した用量およびスケジュールで注射した（表６）。
【表６】
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【０２０３】
腫瘍体積および体重を、それぞれ、週２回、処置後合計２７および１７日間、ＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎモデルにおいてモニタした。
【０２０４】
結果
Ｔ１９１はＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎ異種移植片モデルの両方において腫瘍退縮を証明する
さらにＴ１９１の腫瘍成長を抑制する能力を確認するために、ＨＣＣ２９９８およびＬＳ４１１Ｎを含む他の結腸直腸異種移植片モデルにおいて、このタンパク質の有効性を試験し、ＰＢＳ（対照）と比較した。図２０Ａ−２０Ｂに示されるように、ＰＢＳで処置された対照マウスにおいて腫瘍は急速に成長したが、一方、５ｍｇ／ｋｇでのＴ１９１の２回投与は、両方のモデルにおいて腫瘍成長を阻害した。Ｔ１９１は、ＬＳ４１１ＮよりもＨＣＣ２９９８において、より強い応答を引き起こし、これは、そのインビトロ活性と一致する。
【０２０５】
実施例１３：Ｔ１９１バリアントの逆変異分析
方法
タンパク質発現
変異Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質を、実施例７に記載されるようにクローン化し、実施例１に記載されるように、Ｂｃｌ−ＸＬを安定して発現するＨＥＫ２９３  Ｆ細胞において発現させ、精製した。
【０２０６】
示差走査蛍光光度法
このアッセイを実施例５に記載されるように実施した。
【０２０７】
マウス血清安定性アッセイ
このアッセイを実施例５に記載されるように実施した。
【０２０８】
結果
Ｔ１９１における変異を個々に野生型配列に逆変異させた。Ｔ１９１において見出される置換の全ての組み合わせを含む別個のＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントを作製した。バリアントＴ２０２、Ｔ２０３、Ｔ２０７、Ｔ２０８、Ｔ２０９、Ｔ２１０、およびＴ２１１の全アミノ酸配列は、下記表９に示される。
【０２０９】
Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬバリアントの熱融解を示差走査蛍光定量法により決定した（表７）。バリアントの大半（Ｔ２０２、Ｔ２０３、Ｔ２０７、Ｔ２０８、Ｔ２１０、およびＴ２１１）は、バリアントＴ２０９（これは６４．３℃のＴＭを提示した）を除いて、Ｔ１９１と同等の熱融解温度を示した。
【表７】
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【０２１０】
血清安定性を、マウス血清中、０および７日間のバリアントのインキュベーションにより測定し、活性をその後ＨＣＴ１１６細胞生存率アッセイにおいて測定し、ＩＣ５０を使用して説明した（表８、列２および４）。野生型と比べた各バリアントの活性は、０日でのバリアントＩＣ５０／Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ  ＩＣ５０の比により表す（表９、カラム３）。バリアントの大半は、０日でのそれらのＩＣ５０により観察されるように、改善された活性を示した。マウス血清中での７日後の活性の喪失は各タンパク質について７日目のＩＣ５０／０日でのＩＣ５０の比により表される（表９、カラム５）。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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2019518713.tif 000025
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【表１１】
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2019518713.tif 000039
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【表１２】
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【０２１１】
実施例１４：抗ＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質の開発
方法
ＳｃＴＲＡＩＬに融合されたＭＯＣ３１  ＩｇＧ（抗ＥｐＣＡＭ）の重鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）をＨＥＫ２９３発現についてコドン最適化し、合成し、ベクターｐＣＥＰ４にＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位を使用してクローン化し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＮＪ）、プラスミドｐＣＥＰ４−ＭＯＣ３１  ＨＣ−ｓｃＴＲＡＩＬを作製した。下線を引いた配列はリーダーペプチドを表す。
【０２１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８：
ＭＧＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧＥＶＱＬＶＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＡＳＡＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧ
【０２１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９は、リーダー配列を有さない成熟抗ＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬ重鎖融合物である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９
ＥＶＱＬＶＱＳＧＰＧＬＶＱＰＧＧＳＶＲＩＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＫＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＳＴＹＡＤＳＦＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＡＳＡＡＹＬＱＩＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＦＡＩＫＧＤＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＲＥＲＧＰＱＲＶＡＡＨＩＴＧＴＲＧＲＳＮＴＬＳＳＰＮＳＫＮＥＫＡＬＧＲＫＩＮＳＷＥＳＳＲＳＧＨＳＦＬＳＮＬＨＬＲＮＧＥＬＶＩＨＥＫＧＦＹＹＩＹＳＱＴＹＦＲＦＱＥＥＩＫＥＮＴＫＮＤＫＱＭＶＱＹＩＹＫＹＴＳＹＰＤＰＩＬＬＭＫＳＡＲＮＳＣＷＳＫＤＡＥＹＧＬＹＳＩＹＱＧＧＩＦＥＬＫＥＮＤＲＩＦＶＳＶＴＮＥＨＬＩＤＭＤＨＥＡＳＦＦＧＡＦＬＶＧ
【０２１４】
抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬを安定して発現する、ＨＥＫ−２９３Ｆ細胞（浮遊培養のために適合されたＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  ＨＥＫ−２９３細胞、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｃａｔ．＃Ｒ７９００７）を、フラスコ内で回転させながら（１２５ｒｐｍ）、浮遊培養物として、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および１％プルロニックＦ−６８（Ｇｉｂｃｏ）を含むＦＲＥＥＳＴＹＬＥ  Ｆ１７培地（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させる。細胞を、細胞培養物１ミリリットルあたり、０．５μｇのｐＣＥＰ４−ＭＯＣ３１重鎖−ｓｃＴＲＡＩＬおよび０．５μｇのｐＣＥＰ４−ＭＯＣ３１軽鎖（１μｇの全ＤＮＡ）、ならびに２．５μｇの直鎖２５ｋＤａポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）でコトランスフェクトさせた。トランスフェクション時での細胞の密度は１．５−２．０ｅ６細胞／ｍｌである。次の日、細胞にトリプトンＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）を与え、５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。トランスフェクション後６日に、細胞培養物を１５分間５，０００×ｇで遠心分離し、細胞をペレット化する。精製のための準備において、上清培地を細胞からデカントし、０．２μｍフィルタを用いて濾過する。
【０２１５】
タンパク質精製
ＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬを含む培地をＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）樹脂上にＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてロードした。親和性捕捉後、樹脂を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３．５で溶離させる。酸溶離液を、１：１００体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基を用いて直ちに中和させる。タンパク質をＰＢＳ、ｐＨ７．４中に一晩透析させ、次の日、−８０℃での貯蔵のためにアリコートする。
【０２１６】
発光細胞生存率およびカスパーゼ８活性アッセイ
１０，０００細胞／ウェルで９６ウェル組織培養プレートにおいて細胞を播種する。２４時間後、細胞を、濃度を増加させた、ＴＲＡＩＬ、Ｆｃ−ｓｃＴＲＡＩＬ、またはＭＯＣ３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬタンパク質のいずれかと共に、０．５、１、２、４、８または２４時間のいずれかの間インキュベートする。処理後、細胞生存率を、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞ＡＴＰの量を測定することにより決定した。活性カスパーゼ８レベルをカスパーゼ−Ｇｌｏ  ８アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。発光をＳＹＮＥＲＧＹ  Ｈ１プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）上で測定し、未処理対照に対して正規化し、タンパク質濃度または時間の関数としてプロットした。非線形回帰を、４パラメータ最小二乗フィットを用いてＰＲＩＳＭソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してフィッティングした。ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイの個々の測定発光測定はまた、ヒートマップにおいてＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｉｎｃ．）を使用して可視化した。
【０２１７】
結果
腫瘍関連抗原の結合がｓｃＴＲＡＩＬの細胞表面クラスター化を増加させ、アポトーシスのより大きな誘導を引き起こすことができるかどうかを決定するために、腫瘍抗原抗体−ｓｃＴＲＡＩＬ融合タンパク質を開発した。図２１に示されるように、ＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬは、ｓｃＴＲＡＩＬのＮ末端に融合された抗ＥｐＣＡＭ抗体ＭＯＣ−３１から構成される。
【０２１８】
ＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬの活性を評価するために、低い（ＡＣＨＮ、Ｈ１７０３、Ａ５４９、およびＯＶＣＡＲ８）または高い（Ｈ２１７０、Ｈ１９９３、ＨＣＴ１１６、ＤＵ１４５  ＳＫＯＶ３、ＨＴ２９、ＣＡＬＵ３およびＳＫＢＲ３）ＥｐＣＡＭレベルを有する癌細胞株パネルを濃度範囲（０．００５−１０ｎＭ）の天然ＴＲＡＩＬまたはＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬで０．５、１、２、４、８および２４時間の間処理した。細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイを用いて評価し、時間およびタンパク質濃度の関数としてヒートマップにおいて可視化した（図２２）。
【０２１９】
試験した細胞株のうち、ＥｐＣＡＭ発現とＴＲＡＩＬ感受性の間には正相関はなかった。ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに本質的に抵抗性であった細胞（Ａ５４９、ＳＫＯＶ３、ＨＴ−２９、ＯＶＣＡＲ８、ＣＡＬＵ３、およびＳＫＲＲ３）はまた、ＥｐＣＡＭレベルに関係なくＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬに抵抗性であった。よって、ＥｐＣＡＭ結合抗体の存在はＴＲＡＩＬ感受性を暗示しなかった。
【０２２０】
ＥｐＣＡＭの結合は、ＴＲＡＩＬ感受性細胞（Ｈ２１７０、Ｈ１９９３、ＡＣＨＮ、Ｈ１７０３、ＨＣＴ１１６およびＤＵ１４５）における効力を増加させた。これは、ＴＲＡＩＬと比べてＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬについてのより低いＩＣ５０において反映された。しかしながら、アポトーシスを受けた細胞の最大数は、ＥｐＣＡＭ結合では増加しなかった。ＭＯＣ  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬについてのアポトーシスの時間依存性を正確にモニタするために、カスパーゼ８活性化を測定した。というのも、これはアポトーシス経路の初期に現れるからである。図２３に示されるように、活性カスパーゼ８をＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬで処理したＨＣＴ１１６細胞において、２時間という早い時間に検出し、未処理細胞と比べて、８時間では約３．５倍の最大増加を有した。ＴＲＡＩＬ処理細胞では、カスパーゼ８は４時間まで遅延され、未処理細胞と比べて、８時間で１．５倍増加に達したにすぎなかった。
【０２２１】
ＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬはまた、細胞生存率アッセイにおいてＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比較した（図２４）。ＴＲＡＩＬとの比較と同様に、アポトーシスの有効濃度（ＩＣ５０）はＦｃ−ｓｃＴＲＡＩＬと比べて、ＭＯＣ−３１  ＩｇＧ−ｓｃＴＲＡＩＬを用いると著しく改善されたが、しかしながらアポトーシスを受けた細胞の最大割合は増加しなかった。
【０２２２】
等価物
当業者であれば、本明細書で記載される特定の実施形態の多くの等価物を認識するであろうし、または単なるルーチン実験を使用して確認することができる。そのような等価物は、下記特許請求の範囲に包含されることが意図される。従属クレームまたは実施例の任意の複数において開示される実施形態の任意の組み合わせは本開示の範囲内にあることが企図される。
【０２２３】
参照による引用
本明細書で言及される各および全ての米国および外国特許ならびに係属中の特許出願および公開の開示内容は、全ての配列表および図の内容と同様に、特定的に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2019518713.tif 000043
【図１Ｂ】
2019518713.tif 000044
【図１Ｃ】
2019518713.tif 000045
【図１Ｄ】
2019518713.tif 000046
【図１Ｅ】
2019518713.tif 000047
【図１Ｆ】
2019518713.tif 000048
【図１Ｇ】
2019518713.tif 000049
【図１Ｈ】
2019518713.tif 000050
【図１Ｉ】
2019518713.tif 000051
【図１Ｊ】
2019518713.tif 000052
【図１Ｋ】
2019518713.tif 000053
【図１Ｌ】
2019518713.tif 000054
【図２Ａ】
2019518713.tif 000055
【図２Ｂ】
2019518713.tif 000056
【図２Ｃ】
2019518713.tif 000057
【図３】
2019518713.tif 000058
【図４】
2019518713.tif 000059
【図５Ａ】
2019518713.tif 000060
【図５Ｂ】
2019518713.tif 000061
【図５Ｃ】
2019518713.tif 000062
【図５Ｄ】
2019518713.tif 000063
【図６Ａ】
2019518713.tif 000064
【図６Ｂ】
2019518713.tif 000065
【図７Ａ】
2019518713.tif 000066
【図７Ｂ】
2019518713.tif 000067
【図７Ｃ】
2019518713.tif 000068
【図８】
2019518713.tif 000069
【図９Ａ】
2019518713.tif 000070
【図９Ｂ】
2019518713.tif 000071
【図１０Ａ】
2019518713.tif 000072
【図１０Ｂ】
2019518713.tif 000073
【図１０Ｃ】
2019518713.tif 000074
【図１１】
2019518713.tif 000075
【図１２Ａ】
2019518713.tif 000076
【図１２Ｂ】
2019518713.tif 000077
【図１２Ｃ】
2019518713.tif 000078
【図１２Ｄ】
2019518713.tif 000079
【図１３】
2019518713.tif 000080
【図１４Ａ】
2019518713.tif 000081
【図１４Ｂ】
2019518713.tif 000082
【図１４Ｃ】
2019518713.tif 000083
【図１４Ｄ】
2019518713.tif 000084
【図１５Ａ】
2019518713.tif 000085
【図１５Ｂ】
2019518713.tif 000086
【図１５Ｃ】
2019518713.tif 000087
【図１５Ｄ】
2019518713.tif 000088
【図１５Ｅ】
2019518713.tif 000089
【図１６】
2019518713.tif 000090
【図１７】
2019518713.tif 000091
【図１８】
2019518713.tif 000092
【図１９】
2019518713.tif 000093
【図２０Ａ】
2019518713.tif 000094
【図２０Ｂ】
2019518713.tif 000095
【図２１】
2019518713.tif 000096
【図２２】
2019518713.tif 000097
【図２３】
2019518713.tif 000098
【図２４】
2019518713.tif 000099
【配列表】
2019518713000001.app
【国際調査報告】
2019518713.tif 000100
2019518713.tif 000101
2019518713.tif 000102
2019518713.tif 000103