(57)【要約】単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片が開示される。この抗ＳＣＵＢＥ２抗体は、ＳＣＵＢＥ２（配列番号：６６）内に位置する標的ドメインに特異的に結合する抗原結合領域を含み、ＶＥＧＦ誘導性血管新生を阻害する特性を示す。標的ドメインは、ＳＣＵＢＥ２（配列番号：６６）の、アミノ酸位置１７５〜３２３の範囲のＥＧＦ様モチーフ４〜６、又はアミノ酸位置４４１〜６５９の範囲のスペーサ領域、又はアミノ酸位置６６８〜７２５の範囲の第１のシステインリッチモチーフからなる群より選択される。抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被検体におけるＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置に使用するためのものであり、腫瘍の処置を必要とする被験体における腫瘍の処置に又は腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害を必要とする被験体における腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害に使用するためのものである。【選択図】図１６
2019511545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＣＵＢＥ２（配列番号：６６）内に位置する標的ドメインに特異的に結合する抗原結合領域を含み、ＶＥＧＦ誘導性血管新生を阻害する特性を示す、単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片であって、
前記標的ドメインが、ＳＣＵＢＥ２（配列番号：６６）の、アミノ酸位置１７５〜３２３の範囲のＥＧＦ様モチーフ４〜６、又はアミノ酸位置４４１〜６５９の範囲のスペーサ領域、又はアミノ酸位置６６８〜７２５の範囲の第１のシステインリッチモチーフからなる群より選択される、
単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項２】
ＶＥＧＦ誘導性血管新生を阻害する前記特性が、腫瘍血管新生、並びにＶＥＧＦ刺激性内皮細胞増殖及び毛細管形成の、阻害を含む、
請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項３】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片であって、
（ａ）前記ＶＨが配列番号：１７のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号：１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｂ）前記ＶＨが配列番号：１のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号：２のアミノ酸配列を含む；又は
（ｃ）前記ＶＨが配列番号：３３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号：３４のアミノ酸配列を含む；又は
（ｄ）前記ＶＨが配列番号：４９のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬが配列番号：５０のアミノ酸配列を含む、
単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項４】
（ｉ）前記ＶＨが、配列番号：１９のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；又は
（ｉｉ）前記ＶＨが、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；又は
（ｉｉｉ）前記ＶＨが、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；又は
（ｉｖ）前記ＶＨが、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；前記ＶＬが、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、
請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項６】
ヒト化されている、請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項７】
Ｆｖ断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ'断片、及びＦｄ断片、及び単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片。
【請求項８】
リポソーム内に封入されている、請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又は結合断片。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片を含む、融合タンパク質。
【請求項１０】
（ｉ）治療有効量の、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片；及び
（ｉｉ）治療有効量の、ＶＥＧＦに特異的な抗ＶＥＧＦ抗体
を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
（ｉ）前記抗ＳＣＵＢＥ２抗体のＶＨが配列番号：１７のアミノ酸配列を含み、前記抗ＳＣＵＢＥ２抗体のＶＬが配列番号：１８のアミノ酸配列を含む、又は
（ｉｉ）前記抗ＳＣＵＢＥ２抗体のＶＨが、配列番号：１９のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；前記抗ＳＣＵＢＥ２抗体のＶＬが、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、
請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗ＳＣＵＢＥ２抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被験体において、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患を処置するための医薬品の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片の使用。
【請求項１４】
ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する前記疾患が、腫瘍、血管新生眼障害、硝子体過形成遺残症候群、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脈絡膜血管新生、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、及び卵巣過剰刺激からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被験体において、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患を処置するための医薬品の製造における、ＶＥＧＦに特異的な抗ＶＥＧＦ抗体の使用と組み合わせた、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、一般に抗血管新生療法に関するものであり、より具体的には抗血管新生療法のための抗ＳＣＵＢＥ２抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生の主要なメディエーターである。ＶＥＧＦは、内皮細胞（ＥＣ）の表面上の、そのレセプターＶＥＧＦＲ２（レセプターチロシンキナーゼ、ＲＴＫ）に結合し、二量化及びトランスリン酸化を誘発して、ＥＣの移動、増殖、及び細管形成に必要とされるｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＡＫＴを含むシグナル伝達カスケードを活性化する。これらのＶＥＧＦ応答は、ニューロピリン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ＣＤ４４、及びＣＤ１４６などの、少ない数のＶＥＧＦＲ２コレセプターによって、さらに促進することができる。しかしながら、ＶＥＧＦ誘導性血管新生を調節する、ＶＥＧＦＲ２の追加のコレセプターが存在し、未だ発見されていない可能性がある。
【０００３】
ＳＣＵＢＥ２は、もともとヒトのＥＣから同定された３つの異なる遺伝子（ＳＣＵＢＥ１、２、及び３）から構成される、小さい、進化的に保存された遺伝子ファミリーの第２のメンバーである。この遺伝子は、５のタンパク質ドメイン：ＮＨ２末端シグナルペプチド、ＥＧＦ様モチーフの９のタンデム反復、スペーサ領域、３のシステインリッチ（ＣＲ）反復、及びＣＯＯＨ末端の１のＣＵＢドメインを備える、モジュール式にまとめられた約１，０００アミノ酸ポリペプチドをコードしている。これらのＳＣＵＢＥは、そのスペーサ領域及びＣＲ反復を介して、２つの別個の膜アンカーメカニズム（すなわち、静電的相互作用及びレクチン−グリカン相互作用）によって、表在性膜タンパク質として細胞表面上につながれて、多数の増殖因子のコレセプターとして機能することができる。正常内皮に発現されることに加えて、ＳＣＵＢＥ２はまた、低酸素腫瘍微小血管系においても高度に発現される。しかしながら、ＳＣＵＢＥ２がＶＥＧＦＲ２のコレセプターとしての機能を果たすことができるかどうかと、ＶＥＧＦ誘導性血管新生におけるその役割とは、未だ決定されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の概要
一つの態様において、本発明は、単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片に関する。この単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、ＳＣＵＢＥ２（配列番号：６６）内に位置する標的ドメインに特異的に結合する抗原結合領域を含み、ＶＥＧＦ誘導性血管新生を阻害する特性を示し、標的ドメインが、ＳＣＵＢＥ２（配列番号：６６）の、アミノ酸位置１７５〜３２３の範囲のＥＧＦ様モチーフ４〜６、又はアミノ酸位置４４１〜６５９の範囲のスペーサ領域、又はアミノ酸位置６６８〜７２５の範囲の第１のシステインリッチモチーフからなる群より選択される。
【０００５】
一つの実施形態において、本発明の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、腫瘍血管新生並びにＶＥＧＦ刺激性内皮細胞増殖及び毛細管形成を阻害する特性を示す。
【０００６】
別の実施形態において、本発明の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
（ａ）ＶＨが配列番号：１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号：１８のアミノ酸配列を含む；又は
（ｂ）ＶＨが配列番号：１のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号：２のアミノ酸配列を含む；又は
（ｃ）ＶＨが配列番号：３３のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号：３４のアミノ酸配列を含む；又は
（ｄ）ＶＨが配列番号：４９のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号：５０のアミノ酸配列を含む。
【０００７】
別の実施形態において、抗ＳＣＵＢＥ２抗体のＶＨ及びＶＬはそれぞれ、以下のように相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む：
（ｉ）ＶＨが、配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；ＶＬが、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；又は
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；ＶＬが、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；又は
（ｉｉｉ）ＶＨが、配列番号：３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；ＶＬが、配列番号：３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む；又は
（ｉｖ）ＶＨが、配列番号：５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；ＶＬが、配列番号：５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【０００８】
別の実施形態において、本発明の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、モノクローナル抗体である、ヒト化されている、融合タンパク質である、又はＦｖ断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ'）２断片、Ｆａｂ'断片、Ｆｄ'断片、及びＦｄ断片、及び単鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群より選択される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又は結合断片は、リポソーム内に封入されている。
【００１０】
別の態様において、本発明は、（ｉ）治療有効量の、本発明の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片；及び（ｉｉ）治療有効量の、ＶＥＧＦに特異的な抗ＶＥＧＦ抗体を含む、医薬組成物に関する。
【００１１】
一つの実施形態において、医薬組成物中の抗ＳＣＵＢＥ２抗体のＶＨ及びＶＬは、以下のようにアミノ酸配列を含む：（ｉ）ＶＨが配列番号：１７のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号：１８のアミノ酸配列を含む、又は（ｉｉ）ＶＨが、配列番号：１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；ＶＬが、配列番号：２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号：２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号：２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【００１２】
別の実施形態において、医薬組成物中の抗ＳＣＵＢＥ２抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体であってよい。
【００１３】
別の実施形態において、本発明の単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、ヒト血管内皮細胞上で発現されるＳＣＵＢＥ２及びマウス血管内皮細胞上で発現されるＳＣＵＢＥ２によって共有される交差反応性エピトープに対する特異的結合親和性を示す。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被験体において、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患を処置するための医薬品の製造における、単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片の使用に関する。一つの実施形態において、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患は、腫瘍、血管新生眼障害、硝子体過形成遺残症候群、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、脈絡膜血管新生、子宮内膜症、子宮出血、卵巣嚢胞、及び卵巣過剰刺激からなる群より選択される少なくとも１つである。別の実施形態において、本発明の使用は、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被験体において、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患を処置するための医薬品の製造における、ＶＥＧＦに特異的な抗ＶＥＧＦ抗体の使用と組み合わせられる。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、腫瘍の処置を必要とする被験体において腫瘍を処置するための又は腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害を必要とする被験体において腫瘍血管新生及びがん細胞成長を阻害するための医薬品の製造における、単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片の使用に関する。あるいは、本発明は、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被検体におけるＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置に使用するための、又は腫瘍の処置を必要とする被験体における腫瘍の処置に若しくは腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害を必要とする被験体における腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害に使用するための、単離された抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片に関する。本発明の抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片は、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被検体におけるＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置に使用するために、又は腫瘍の処置を必要とする被験体における腫瘍の処置に若しくは腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害を必要とする被験体における腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害に使用するために、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体と組み合わせて使用してよい。
【００１６】
本発明はまた、ＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患の処置を必要とする被験体においてＶＥＧＦ誘導性血管新生に関連する疾患を処置するための、又は腫瘍の処置を必要とする被験体において腫瘍を処置する若しくは腫瘍血管新生及びがん細胞成長の阻害を必要とする被験体において腫瘍血管新生及びがん細胞成長を阻害するための、方法に関する。本方法は、治療有効量の、本発明の抗ＳＣＵＢＥ２抗体又はその結合断片を、それを必要とする被験体に投与することを含む。本方法はさらに、治療有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を、それを必要とする被験体に投与することを含んでもよい。
【００１７】
これらの及び他の態様は、以下の図面と合わせて、好ましい実施形態の以下の説明から明らかとなるであろう。ここで、本開示の新規の概念の精神及び範囲から逸脱することなく、好ましい実施形態の中の変形及び改変が影響を受ける可能性がある。
【００１８】
添付の図面は、本発明の１又は複数の実施形態を示しており、明細書とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。図面全体を通して、一実施形態の同じ又は類似の要素を指すために、可能な限り同じ参照番号が使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＳＣＵＢＥ２が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞表面に発現し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）誘導性ＨＵＶＥＣ増殖及び管形成を調節していることを示している。Ａ及びＢ、ＳＣＵＢＥ２蛍光免疫染色（緑色）及びフローサイトメトリー。矢印は、ＥＣ膜上に発現したＳＣＵＢＥ２を示している。核は、ＤＡＰＩで青色に染色されている。Ｃ、サブコンフルエント（増殖）及びコンフルエント（非増殖）ＨＵＶＥＣにおけるＳＣＵＢＥ２タンパク質発現のウエスタンブロット分析。Ｄ−Ｆ、ＳＣＵＢＥ２過剰発現がＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖及び細管形成を増強する。空のレンチウイルス又はＦＬＡＧタグ化ＳＣＵＢＥ２をコードする組換えレンチウイルスを導入されたＨＵＶＥＣにおいて発現された外因性ＳＣＵＢＥ２（Ｄ）。ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ細胞成長に対するＳＣＵＢＥ２過剰発現の効果（Ｅ）。データは平均±ＳＤであり、３つの独立した実験からの、非刺激細胞に対して増加したパーセントを表す。＊＊はＰ＜０．０１である。ＶＥＧＦ誘導性管形成に対するＳＣＵＢＥ２過剰発現の効果のインビトロＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）血管新生アッセイ（Ｆ）。代表的な画像が、上部に示されており、１視野あたりの細管の総数を数えることによって定量化される。データは、３つの独立した実験から計算された平均±ＳＤであり、＊＊はＰ＜０．０１である。Ｇ−Ｉ、ＳＣＵＢＥ２ノックダウンは、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖及び管形成を減少させる。ＳＣＵＢＥ２発現は、ＨＵＶＥＣにおいて、２つの独立したＳＣＵＢＥ２標的化ｓｈＲＮＡレンチウイルス（ＳＣＵＢＥ１−ｓｈＲＮＡ＃１及び＃２）によって下方制御された（Ｇ）。ルシフェラーゼｓｈＲＮＡレンチウイルスはネガティブコントロール（対照ｓｈＲＮＡ）であった。ＶＥＧＦ誘導性（Ｈ）ＨＵＶＥＣ細胞成長及び（Ｉ）管形成に対するＳＣＵＢＥ２ノックダウンの効果。データは平均±ＳＤであり、３つの独立した実験からの、非刺激細胞に対して増加したパーセントを表す。＊＊はＰ＜０．０１である。ＶＥＧＦ誘導性管形成に対するＳＣＵＢＥ２ノックダウンの効果のインビトロＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）血管新生アッセイ。代表的な画像が、上部に示されており、１視野あたりの細管の総数を数えることによって定量化される（Ｉ）。データは、３つの独立した実験から計算された平均±ＳＤであり、＊＊はＰ＜０．０１である。
【００２０】
【図２】図２は、低酸素が、ＨＵＶＥＣにおける、ＳＣＵＢＥ２のＨＩＦ−１α誘導性上方制御を媒介したことを示す。Ａ及びＢ、ＳＣＵＢＥ２は、低酸素に応答して、ＨＵＶＥＣにおいて上方制御された。ＨＵＶＥＣを、正常酸素又は低酸素（１％）下で、１２時間培養した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ａ）及びウエスタンブロット（Ｂ）分析によって立証された、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方でのＳＣＵＢＥ２の発現。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。＊＊はＰ＜０．０１である（正常酸素と比較）。Ｃ、天然型（ＷＴ）又は変異型（Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３）ＨＩＦ−１α結合部位を含むＳＣＵＢＥ２プロモーターレポーター構築物のスキーム。ＳＣＵＢＥ２遺伝子のプロモーター（−１５００〜＋１）の位置は、横線で示されている。ＨＩＦ−１α結合部位はダイヤモンドでマークされ、変異部位は「ｘ」マークとして示されている。ＣｈＩＰアッセイにおいて使用されるアンプリコン領域及びプライマーがラベルされている（上のパネル）。Ｄ、ＨＩＦ−１αは、ＳＣＵＢＥ２プロモーター駆動ルシフェラーゼ活性を転写活性化する。ＨＵＶＥＣに一過的に遺伝子導入されたＳＣＵＢＥ２  ＷＴ又は変異型プロモーター構築物の活性の定量化。ルシフェラーゼ活性を、遺伝子導入効率についての対照となるウミシイタケルシフェラーゼ活性（ｐＲＬ−ＴＫ）に対して正規化した。Ｅ、ＨＩＦ−１αは、低酸素状態でＳＣＵＢＥ２プロモーターに直接結合する。２３８ｂｐ断片を増幅するＨＩＦ−１αに特異的なプライマーを用いたＰＣＲによって分析された、ＨＵＶＥＣにおける、ＳＣＵＢＥ２のプロモーターへのＨＩＦ−１αタンパク質のインビボ結合のＣｈＩＰアッセイ。細胞溶解物がないもの（−）はネガティブコントロールであった。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００２１】
【図３】図３は、Ｓｃｕｂｅ２  ＥＣ−ＫＯマウスの成体血管新生の減弱を示す。Ａ−Ｄ、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグアッセイ。注射後７日目の対照及びＥＣ−ＫＯマウスから除去した、生理食塩水（−）又はＶＥＧＦ（＋）を含有するＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグの代表的な写真（Ａ）。対照及びＥＣ−ＫＯマウスからの、生理食塩水（−）及びＶＥＧＦ（＋）が補充されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグのヘモグロビン含量（Ｂ）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。＊＊はＰ＜０．０１である。対照及びＥＣ−ＫＯマウスから切除された、生理食塩水（−）又はＶＥＧＦ（＋）を含有するＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグの切片の抗ＣＤ３１染色（Ｃ）。スケールバー＝４０μｍ。ＩＭＡＧＥＪ（商標）を使用することにより、抗ＣＤ３１抗体陽性によって決定される、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグの血管新生（Ｄ）。データは平均±ＳＤ（ｎ＝５）である。＊＊はＰ＜０．０１である。Ｅ−Ｈ、後肢虚血誘導性血管新生。マウスにおける右大腿動脈結紮前後の、代表的なレーザードップラー画像（Ａ）及び後肢血流の定量化（Ｂ）。対照及びＥＣ−ＫＯマウスにおける、大腿動脈結紮後２１日目の、ふくらはぎ血管の抗ＣＤ３１免疫染色の代表的な画像（Ｃ）及び定量化（Ｄ）。スケールバー＝１００μｍ。データは平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。＊＊はＰ＜０．０１である（対照と比較）。
【００２２】
【図４】図４は、ＳＣＵＢＥ２が、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦＲ２リン酸化及び下流シグナル伝達を調節していることを示す。Ａ及びＢ、ＳＣＵＢＥ２ノックダウンは、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦシグナル伝達を損なう。ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦシグナル伝達のウエスタンブロット分析（Ａ）、及びＨＵＶＥＣにおける、対照及びＳＣＵＢＥ２  ｓｈＲＮＡノックダウンを用いた、Ｔｙｒ１０５９でのＶＥＧＦＲ２、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でのｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、及びＳｅｒ４７３でのＡＫＴの、ＶＥＧＦ誘導性リン酸化の定量化（Ｂ）。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。＊はＰ＜０．０５；＊＊はＰ＜０．０１である（対照と比較）。Ｃ及びＤ、ＥＣにおけるＶＥＧＦシグナル伝達のウエスタンブロット分析（Ｃ）、及び対照及びＳＣＵＢＥ２過剰発現ＥＣにおける、ＶＥＧＦＲ２  Ｔｙｒ１０５９、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、及びＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３のＶＥＧＦ誘導性リン酸化の定量化（Ｄ）。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。＊はＰ＜０．０５；＊＊はＰ＜０．０１である（ベクターと比較）。
【００２３】
【図５】図５は、ＥＣ−ＫＯマウス肺ＥＣ（ＭＬＥＣ）における、ＶＥＧＦ応答及びシグナル伝達の減弱を示す。Ａ及びＢ、ＥＣ−ＫＯ  ＭＬＥＣのＶＥＧＦ刺激性細管形成（Ａ）及び増殖（Ｂ）。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。＊＊はＰ＜０．０１である（対照と比較）。Ｃ及びＤ、ＭＬＥＣにおけるＶＥＧＦシグナル伝達のウエスタンブロット分析（Ｃ）、及び対照及びＥＣ−ＫＯ  ＭＬＥＣにおける、ＶＥＧＦＲ２  Ｔｙｒ１０５９、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ  Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、及びＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３のＶＥＧＦ誘導性リン酸化の定量化（Ｄ）。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである。＊はＰ＜０．０５；＊＊はＰ＜０．０１である（対照と比較）。Ｅ、顕微鏡写真は、対照及びＥＣ−ＫＯマウス由来の、５日間培養コラーゲン包埋胸部大動脈リング外植片の血管新生応答を示す。スケールバー＝１ｍｍ。Ｆ、微小血管出芽の数及び長さの定量化。成長している微小血管の数を定量化することによって（左）、及び新しく形成された微小血管が占める全体の長さを測定することによって（右）、それぞれの個々の冠動脈リング外植片について血管新生応答を決定した。
【００２４】
【図６】図６は、ＳＣＵＢＥ２が腫瘍内皮細胞（ＥＣ）において高度に発現されていることを示す。マウス（乳、肺、メラノーマ）（Ａ）及びヒト（前立腺、肉腫、膀胱）（Ｂ）がんにおける、ＳＣＵＢＥ２の富化されたＥＣ発現（赤色の矢印によって示される褐色）の免疫組織化学法。トランスジェニックマウス乳房腫瘍ウイルスポリオーマ中型Ｔ（ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ）モデルを使用して、肺転移に由来する自然発生マウス乳腫瘍を得た。加えて、同系のメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）又はルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞の皮下注射によって、２の異種移植腫瘍を発症させた。内皮免疫反応性は、メラノーマ腫瘍において、メラノーマ細胞のメラニンバックグラウンドのために、（褐色の代わりに）赤色として現像した。ヒト正常及び腫瘍対は、商業的組織マイクロアレイ供給源から購入した。
【００２５】
【図７】図７は、内皮Ｓｃｕｂｅ２の喪失が、ＥＣ−ＫＯマウスにおける腫瘍血管新生及び腫瘍成長を遅延させることを示す。Ａ−Ｄ、対照及びＥＣ−ＫＯマウスに、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞又はルイス肺がん（ＬＬＣ）腫瘍細胞を皮下注射した。移植後１６日目のＢ１６Ｆ１０（Ａ）及びＬＬＣ（Ｂ）腫瘍の代表的な写真、及び示された時点で測定された腫瘍成長の割合（Ｃ及びＤ）。スケールバー＝１０ｍｍ。Ｅ−Ｈ、ＥＣ−ＫＯマウスにおいて損なわれた腫瘍微小血管系。ＥＣ−ＫＯマウスにおいてＥＣ及び血管構造の数が減少していることを示す、腫瘍切片の抗ＣＤ３１染色（Ｅ及びＦ）。腫瘍細胞の移植後１６日目の腫瘍血管新生の定量化（Ｇ及びＨ）。スケールバー＝４０μｍ。データは平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００２６】
【図８】図８は、ＥＣ−ＫＯ腫瘍が酸素及び栄養物を奪われるとアポトーシスを受けることを示す。対照又はＥＣ−ＫＯマウス由来のＢ１６Ｆ１０又はＬＬＣ誘導性腫瘍切片における、Ｈ＆Ｅ染色（Ａ）、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｃ）、及びＫｉ−６７染色（Ｅ）。腫瘍壊死（Ｂ）、腫瘍−細胞アポトーシス（Ｄ）及び増殖（Ｆ）の定量化。スケールバー＝１００μｍ。データは平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００２７】
【図９】図９は、内皮Ｓｃｕｂｅ２の喪失が、ＥＣ−ＫＯマウスにおける腫瘍血管新生及び腫瘍成長を遅延させることを示している。Ａ及びＢ、対照及びＥＣ−ＫＯマウスに、ＭＬＴＣライディッヒ腫瘍細胞を皮下注射した。移植後６０日目のＭＬＴＣライディッヒ腫瘍の代表的な写真（Ａ）及び示された時点で測定された腫瘍成長の割合（Ｂ）。スケールバー＝１０ｍｍ。Ｃ及びＤ、ＥＣ−ＫＯマウスにおいてＥＣ及び血管構造の数が減少していることを示す、腫瘍切片の抗ＣＤ３１染色（Ｃ）。腫瘍細胞の移植後１６日目の腫瘍血管新生の定量化（Ｄ）。スケールバー＝４０μｍ。データは平均±ＳＤ（ｎ＝６）である。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００２８】
【図１０】図１０は、網膜血管構造の発達伸長に対するＳＣＵＢＥ２の内皮除去の効果を示す。Ａ、対照及びＥＣ−ＫＯ仔由来のホールマウントＰ５網膜を、汎内皮マーカーＣＤ３１で染色した。白い破線の円は平均対照血管新生領域を示し（左）、オレンジ色の破線の円は平均ＥＣ−ＫＯ血管新生領域を示す（右）。Ｂ、高倍率（１００Ｘ）の血管新生領域。黄色の点は、糸状仮足をマークしている。Ｃ及びＤ、糸状仮足の視神経からの径方向の距離（Ｃ）及び数（Ｄ）を測定することによる、網膜血管新生の定量化（対照のパーセンテージとして表される）。データは平均±ＳＤ（各群においてｎ＝５）である。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００２９】
【図１１】図１１は、内皮細胞におけるＳＣＵＢＥ２の欠失が、酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）を低下させることを示す。Ａ、ＯＩＲモデルの模式図。新生児マウスを、出生後日数（Ｐ）７〜Ｐ１２で７５％酸素に暴露し、Ｐ１２〜Ｐ１８で室内空気に戻して、Ｐ１８で最大病理学的血管新生を誘導した。Ｂ及びＣ、Ｐ１８（ｎ＝３）のＯＩＲ暴露した又は齢を合わせた正常酸素対照マウス網膜から全ＲＮＡを単離し、それに続いて、血管新生マーカー遺伝子（Ｂ）又はＳＣＵＢＥ遺伝子ファミリー（Ｃ）のｍＲＮＡ発現を分析するために、Ｑ−ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲに適用した。Ｄ、ＯＩＲモデルへの暴露後の対照又はＥＣ−ＫＯマウスの網膜血管構造のホールマウント分析。ｐ１８（７５％酸素から除去して６日後）の中央無血管エリア又は血管新生エリアのサイズの輪郭を、それぞれ赤色又は青色で描いている。Ｅ及びＦ、全体の網膜のサイズに対する血管新生エリア（Ｅ）又は中央無血管エリア（Ｆ）のサイズ（％で表される）は、ＯＩＲモデルに供された対照（ｎ＝５）と比較して、ＥＣ−ＫＯマウス（ｎ＝５）において顕著に小さかった。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００３０】
【図１２】図１２は、抗血管新生効果を有する抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂを示す。Ａ、抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂクローン及びそれらの標的化ドメイン。Ｂ、抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂは、インビトロ管形成アッセイによって、血管新生を阻害する。特異性及び抗血管新生効果を有する抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂの概要を示す。ｈ、ヒト；ｍ、マウス；ｚ、ゼブラフィッシュ。
【００３１】
【図１３】図１３は、抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂ  ＳＰ．Ｂ１が、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性応答及びシグナル伝達を阻害することを示す。Ａ及びＢ、抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂ  ＳＰ．Ｂ１の特徴付け。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において発現されるヒト及びマウス組換えＳＣＵＢＥ２（１及び３ではない）タンパク質（Ａ）及びＳＣＵＢＥ２のＨＵＶＥＣ上の細胞表面発現（Ｂ）を認識するｍＡｂ  ＳＰ．Ｂ１のウエスタンブロット分析及びフローサイトメトリー。Ｃ−Ｉ、ｍＡｂ  ＳＰ．Ｂ１は、ＶＥＧＦ刺激性細胞応答及びＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲ２リン酸化及びＭＡＰＫ／Ａｋｔ活性化をブロックする。対照ＩｇＧではなく、ＳＰ．Ｂ１の添加は、ＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ増殖（Ｃ）及び血管新生（Ｄ及びＥ）を用量依存的に抑制する。ＳＰ．Ｂ１又は対照ＩｇＧで、ＨＵＶＥＣにおいてＶＥＧＦにより誘導されたリン酸化及び全ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＰＫ、及びＡｋｔ（Ｆ）及び定量化（Ｇ−Ｉ）。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＤである（Ｇ−Ｉ）。＊＊はＰ＜０．０１である。
【００３２】
【図１４】図１４は、抗ＳＣＵＢＥ２  ＳＰ．Ｂ１及び抗ＶＥＧＦベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の併用処置が、肺がん成長及び血管新生に対し付加的な抗腫瘍効果を有したことを示す。Ａ、ＬＬＣ肺がん細胞の注射後の経時的な、各処置群における平均腫瘍体積（ｎ＝６）。矢印は抗体処置の時点を示す。Ｂ、各処置異種移植マウスの代表的なＬＬＣ肺がん。スケールバー＝１ｃｍ。Ｃ、腫瘍を切除し重さを測定した（ｎ＝６／群）。（Ｄ及びＥ）腫瘍の毛細血管密度。Ｄ及びＥ、ＩＭＡＧＥＪ（商標）の使用による、肺がん切片からの、代表的な抗ＣＤ３１免疫染色（Ｄ）及び定量化腫瘍血管新生（Ｅ）。スケールバー＝４０μｍ。＊はＰ＜０．０５であり；＊＊はＰ＜０．０１である。
【００３３】
【図１５】図１５は、抗ＳＣＵＢＥ２  ＳＰ．Ｂ１及び抗ＶＥＧＦベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の併用処置が、膵管がんの成長及び血管新生に対して付加的な抗腫瘍効果を有したことを示す。Ａ、ＰＡＮＣ−１膵管がん細胞の注射後の経時的な、各処置群における平均腫瘍体積（ｎ＝６）。矢印は抗体処置の時点を示す。Ｂ、各処置異種移植マウスの代表的なＰＡＮＣ−１膵臓がん。スケールバー＝１ｃｍ。Ｃ、腫瘍を切除し重さを測定した（ｎ＝６／群）。（Ｄ及びＥ）腫瘍の毛細血管密度。Ｄ及びＥ、ＩＭＡＧＥＪ（商標）の使用による、膵管がん切片からの、代表的な抗ＣＤ３１免疫染色（Ｄ）及び定量化腫瘍血管新生（Ｅ）。スケールバー＝４０μｍ。＊はＰ＜０．０５であり；＊＊はＰ＜０．０１である。
【００３４】
【図１６】図１６は、抗ＳＣＵＢＥ２  ＳＰ．Ｂ１及び抗ＶＥＧＦベバシズマブの併用処置が、結腸直腸腺がんの成長及び血管新生に対して付加的な抗腫瘍効果を有したことを示す。Ａ、ＬＳ  １７４Ｔ結腸がん細胞の注射後の経時的な、各処置群における平均腫瘍体積（ｎ＝６）。矢印は抗体処置の時点を示す。Ｂ、各処置異種移植マウスの代表的なＬＳ  １７４Ｔ結腸直腸腺がん。スケールバー＝１ｃｍ。Ｃ、腫瘍を切除し重さを測定した（ｎ＝６／群）。（Ｄ及びＥ）腫瘍の毛細血管密度。Ｄ及びＥ、ＩＭＡＧＥＪ（商標）の使用による、結腸直腸腺がん切片からの、代表的な抗ＣＤ３１免疫染色（Ｄ）及び定量化腫瘍血管新生（Ｅ）。スケールバー＝４０μｍ。＊はＰ＜０．０５であり；＊＊はＰ＜０．０１である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の実施例においてより具体的に説明され、以下の実施例は、それらにおける多数の改変及び変形が当業者には明らかであるため、例示としてのみ意図される。ここで、本発明の様々な実施形態を詳細に説明する。図面を参照すると、図面全体を通して、同様の番号は同様のコンポーネントを示す。本明細書の記述において、及び以下の特許請求の範囲全体を通して使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形の参照を含む。また、本明細書の記述において、及び以下の特許請求の範囲全体を通して使用されるように、「ｉｎ」の意味は、文脈上他に明確に指示されない限り、「ｉｎ」及び「ｏｎ」を含む。さらに、読者の便宜のために、明細書においてタイトル又はサブタイトルを使用する可能性があるが、これらは本発明の範囲に影響を与えないものとする。加えて、この明細書で使用されるいくつかの用語を、以下により具体的に定義する。
【００３６】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が支配する。
【００３７】
用語「抗体断片」又は「その断片」は、明細書及び特許請求の範囲で使用されて、インタクトな抗体分子の一部又は断片を意味し、この断片は、抗原結合機能を保持する、すなわち、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、Ｆｄ'及びＦｄ断片である。ｍＡｂから様々な断片を産生するための方法は、当業者に周知である。
【００３８】
用語「ヒト血管内皮細胞上で発現されるＳＣＵＢＥ２及びマウス血管内皮細胞上で発現されるＳＣＵＢＥ２によって共有される交差反応性エピトープに対する特異的結合親和性又は結合特異性」（又は「ヒトＳＣＵＢＥ２とマウスＳＣＵＢＥ２との間の交差反応性エピトープに対する結合特異性」）は、本明細書で使用されて、ヒトＳＣＵＢＥ２及びマウスＳＣＵＢＥ２の両方に存在する交差反応性エピトープに結合する抗ＳＣＵＢＥ２抗体の特性を意味する。ここで、（ａ）そのようなエピトープは、ＳＣＵＢＥ２を発現する血管内皮細胞の表面上で接近可能であり、（ｂ）マウス内皮細胞上に存在するＳＣＵＢＥ２エピトープへの結合は、アイソタイプ対照免疫グロブリンによって示される結合より大きいものであり、「より大きい」ことは、以下の実施例においてより明らかになるように、抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂの結合から１標準偏差を差し引いたものが、アイソタイプ対照免疫グロブリンの結合に１標準偏差を加えたものより大きい必要がある、というように、定量的に測定することができ、（ｃ）免疫反応性の標準アッセイにおいて検出した場合に、マウス内皮細胞上で発現されるＳＣＵＢＥ２への抗ＳＣＵＢＥ２抗体の結合は、ヒト内皮細胞上で発現されるＳＣＵＢＥ２への抗ＳＣＵＢＥ２抗体の結合と比較して、少なくとも２倍少ない。
【００３９】
コレセプターは、リガンド認識を促進して生物学的プロセスを開始するために、主レセプターに加えてシグナル伝達分子に結合する、細胞表面レセプターである。
【００４０】
ヒトＳＣＵＢＥ２  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６５）；ヒトＳＣＵＢＥ２のアミノ酸配列（配列番号：６６）。
【００４１】
略語：ＥＣ、内皮細胞；ＥＣ−ＫＯマウス、ＥＣ特異的Ｓｃｕｂｅ２−ノックアウトマウス；ＬＬＣ、ルイス肺がん；ＡＰ、アルカリホスファターゼ；ＨＩＦ、低酸素誘導性因子；ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞；ＫＯ、ノックアウト；ＭＡＰＫ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ；ＭＬＥＣ、マウス肺内皮細胞；ＲＴＫ、レセプターチロシンキナーゼ；ＳＣＵＢＥ２、シグナルペプチド−補体タンパク質Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓ、Ｕｅｇｆ、及びＢｍｐ１（ＣＵＢ）−表皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン含有タンパク質２；ｓｈＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子；ＶＥＧＦＲ２、血管内皮増殖因子レセプター２。
【００４２】
効用／適応症
（１）病理学的腫瘍血管新生；及び
（２）血管新生眼疾患
【００４３】
ＳＣＵＢＥ２は、正常及び腫瘍血管内皮細胞（ＥＣ）において発現される表在性膜タンパク質である。しかしながら、血管新生におけるその役割はあまり理解されていないままである。我々は、ＶＥＧＦＲ２のコレセプターとしてのＳＣＵＢＥ２及びＶＥＧＦ誘導性血管新生におけるその役割を発見した。ＳＣＵＢＥ２は、低酸素条件に応答して低酸素誘導性因子（ＨＩＦ−１α）によって上方制御され、ヒトＥＣにおいてＶＥＧＦＲ２と相互作用した。ここで、ＳＣＵＢＥ２は、ＶＥＧＦＲ２とのコレセプターとして作用して、ＶＥＧＦ結合を促進し、その下流シグナル伝達を増強し、したがってＶＥＧＦ誘導性血管新生及び腫瘍血管新生を促進した。このＳＣＵＢＥ２とＶＥＧＦＲ２との相互作用及びそのシグナル伝達の増強は、内皮Ｓｃｕｂｅ２遺伝子不活性化、ＳＣＵＢＥ２  ｓｈＲＮＡ媒介性ノックダウン、及びインビトロとインビボの両方における抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂ中和によって阻害することができた。内皮Ｓｃｕｂｅ２ノックアウト（ＥＣ−ＫＯマウス）は、血管発達において欠陥を示さなかったが、移植されたＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグにおけるＶＥＧＦ誘導性血管新生の低下及び後肢虚血を誘導した後の血流の回復の低下を示した。ＳＣＵＢＥ２は、虚血によって又は低酸素条件下で誘導される出生後の血管新生中に特に、ＶＥＧＦＲ２媒介性シグナル伝達を微調整することによって、ＥＣのＶＥＧＦ誘導性管形成及び増殖を調節する、ＶＥＧＦＲ２の新規のコレセプターである。腫瘍ＥＣにおけるこのＳＣＵＢＥ２機能の標的化は、腫瘍血管新生を阻害することを介する潜在的な抗腫瘍治療法を表す可能性がある。
【００４４】
我々は、ＳＣＵＢＥ２がＶＥＧＦＲ２のコレセプターとして作用して、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合を増強し、ＶＥＧＦＲ２リン酸化及びｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）／Ａｋｔ活性化を含むそのシグナルを増大させ、したがってＥＣにおける細胞増殖及び細管形成を促進することを発見した。マウスにおいてＳｃｕｂｅ２の内皮除去をしたものでは、生理的血管新生は正常のままであった。そして実験的腫瘍における病理学的血管新生は変化し、腫瘍はより小さくなり、毛細血管密度は低下した。腫瘍の血管新生環境をシミュレーションするために、Ｓｃｕｂｅ２欠損ＥＣを単離し、インビトロでＶＥＧＦと共に増殖させた。変異ＥＣは、ＶＥＧＦの結合、ＶＥＧＦに対する増殖及び出芽応答、並びに下流シグナル活性化の顕著な低下を示した。さらに、抗ＳＣＵＢＥ２及び抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体は、異種移植肺腫瘍に対して付加的な阻害効果を有した。合わせて、我々の発見は、ＳＣＵＢＥ２が腫瘍ＥＣにおけるＶＥＧＦ応答の重要なレギュレータであることを確立し、抗ＳＣＵＢＥ２戦略が組み合わせ抗血管新生がん療法において大きな可能性を有することを示唆するものである。
【実施例】
【００４５】
本発明の範囲を限定しようとするものではないが、本発明の実施形態に係る、例示的な器具、装置、方法及びそれらの関連する結果を以下に示す。読者の便宜のために、タイトル又はサブタイトルを実施例において使用する可能性があるが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。さらに、本明細書中に、ある特定の理論が提案及び開示される。しかしながら、そのような特定の理論は、正しかろうと間違っていようと、特定の理論又は行動計画とは関係なく本発明に従って本発明を実施する限り、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
材料及び方法
【００４７】
抗体及び試薬。
抗ＳＣＵＢＥ２、抗ＨＩＦ−１α、及び抗リン酸化チロシンポリクローナル抗体は、ＧｅｎｅＴｅｘ（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）から入手した。抗リン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｔｈｒ１０５９）、抗リン酸化ＭＡＰＫ  ｐ４４／ｐ４２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、抗ＭＡＰＫ  ｐ４４／ｐ４２、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、抗ＡＫＴ、及び抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から入手した。抗ＶＥＧＦＲ２及び抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から、それぞれ入手した。抗ＣＤ３１、抗リン酸化セリン／スレオニン、抗ＶＥＧＦＲ１、及び抗ニューロピリン−１抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手した。抗Ｋｉ６７及び抗βアクチン抗体は、ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔａｔｉｏｎ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＮＯＶＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ）から、それぞれ入手した。組換えＶＥＧＦ１６５タンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した。
【００４８】
抗ＳＣＵＢＥ２モノクローナル抗体の作製。
ＳＣＵＢＥ２に特異的な抗体を、以下のように作製した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から産生された精製組換えＳＣＵＢＥ２−スペーサ領域（アミノ酸４４５〜６６７）で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）と融合させて、ハイブリドーマを産生した。このハイブリドーマ細胞株を、以前に説明されているように調製し、サブクローニングした（Hadas et al. "Production of monoclonal antibodies. The effect of hybridoma concentration on the yield of antibody-producing clones" J Immunol Methods  1987; 96:3-6）。ＳＣＵＢＥ２（ＳＣＵＢＥ１及び３ではない）陽性であるハイブリドーマ細胞株を、説明されているように同定した（Tu et al "Localization and characterization of a novel protein SCUBE1 in human platelets" Cardiovasc Res. 2006;71:486-95; Cheng et al "SCUBE2 suppresses breast tumor cell proliferation and confers a favorable prognosis in invasive breast cancer" Cancer Res. 2009; 69:3634-41）。
【００４９】
条件付きＳｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ及び内皮特異的Ｓｃｕｂｅ２−ノックアウト（ＥＣ−ＫＯ）マウスの作製。
エキソン２〜２１をカバーする６５ｋｂのゲノム配列によって分離された２つのｌｏｘＰ部位を含む条件付きＳｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ対立遺伝子を、記載の通りに産生した。内皮特異的条件付きＫＯマウスを作製するために、Ｔｉｅ２プロモーター２の制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現し、Ｓｃｕｂｅ２についてヘテロ接合型の（Ｔｉｅ２−Ｃｒｅ；Ｓｃｕｂｅ２＋／−）トランスジェニックマウスを、Ｓｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘ動物と交配させて、実験的Ｔｉｅ２−Ｃｒｅ；Ｓｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／＋（対照）及びＴｉｅ２−Ｃｒｅ；Ｓｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／−（ＥＣ−ＫＯ）マウスを得た。オスマウスは主に、各遺伝子型群（指定どおりにｎ＝５以上）における全ての表現型比較のために、使用された。全ての動物実験は、アカデミアシニカの研究所動物実験委員会によって承認された。
【００５０】
腫瘍異種移植。
１ｘ１０６メラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０）又はルイス肺がん細胞（ＬＬＣ）を、対照及びＥＣ−ＫＯマウスの横腹に皮下注射することによって、異種移植腫瘍を作製した。デジタルノギスを使用して１週間に２回腫瘍サイズを測定し、長さｘ幅ｘ高さｘ０．５２３６（ｍｍ３）によって計算した。１６日間の腫瘍成長の後、腫瘍を固定し、組織切片化のためにパラフィンに包埋した。ピモニダゾール及びＡＰＯ−ＢＲＤＵ（商標）（ＴＵＮＥＬ）アポトーシス試薬を製造者の指示に従って使用した。ＬＬＣ及びＢ１６Ｆ１０腫瘍の組織血管及び増殖を、それぞれＣＤ３１及びＫｉ−６７抗体を使用することによって視覚化した。
【００５１】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）血管新生アッセイ。
血管新生モデルは、対照又はＥＣ−ＫＯマウスにおけるＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）移植の使用に基づいた。１００ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦを含む又は含まない、０．５ｍｌの量の増殖因子低下ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を、マウス横腹に注射した。シリンジの内容物が単一のプラグとして送達されることを保証するために、注射は２６Ｇ針で迅速に行った。１週間後、プラグを採取しＲＩＰＡ溶解バッファー中でホモジナイズした。遠心分離によって破片を除去した後、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することによってヘモグロビン濃度を測定した。あるいは、プラグを一晩４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋し、切片にし、抗ＣＤ３１抗体で染色した。
【００５２】
後肢虚血モデル。
後肢虚血モデルを、以前に説明されているように実施した。３簡単に言うと、対照及びＥＣ−ＫＯマウス（８週齢）の大腿動脈を露出させ、大腿神経及び静脈から単離し、５ｍｍ離れた２つの位置（これらの位置の一方は鼠径部靭帯の直近位であり、二番目の他方の位置は、前記一方の位置に対して遠位であり膝窩動脈の近位にある）で結紮した。皮膚を、４−０の結節縫合により閉鎖した。レーザードップラー血流イメージングは、手術前後の異なる時点の、麻酔下のマウスを用いたＭｏｏｒの赤外レーザードップラーイメージャの使用を伴った。近位大腿動脈結紮の３週間後に、麻酔下でマウスからふくらはぎの筋肉を採取し、ＣＤ３１染色に使用した。
【００５３】
冠動脈リング出芽アッセイ。
マウス冠動脈リング出芽アッセイは、本質的に報告されているように調製した。大動脈をマウスから採取した。全ての無関係な脂肪、組織及び分岐血管を、鉗子及びメスで除去する。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を含むペトリ皿に大動脈を移し、大動脈をおよそ０．５ｍｍの厚さのリングにスライスした。このリングを１ｍｇ／ｍｌのタイプＩコラーゲンに包埋し、次いでそれを３７℃／５％  ＣＯ２で１時間インキュベートした。２．５％  ＦＢＳ及び３０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦが補充されたＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を添加し、冠動脈リングを取り囲んだ。微小血管出芽の数及び長さを５日目に計算した。
【００５４】
免疫組織化学法。
組織切片（５μｍ厚）をキシレンで脱ワックスし、勾配のついた濃度のアルコールで再水和し、３％  Ｈ２Ｏ２で２０分間処理し、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング液（２％  ＢＳＡ及び２％正常ヤギ血清が補充されたＰＢＳＴ）で１時間ブロッキングし、一次抗体とともに室温で一晩インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体及び安定性３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）ペルオキシダーゼ基質を使用して、抗体結合を検出した。対比染色にはヘマトキシリンを使用した。
【００５５】
初代マウス肺ＥＣ（ＭＬＥＣ）単離、特徴付け、及び培養。
対照及びＥＣ−ＫＯマウスの肺組織から、記載の通りに初代ＭＬＥＣを作製した。６各マウス（６週齢）は、最初にヘパリン（１４０Ｕ／ｍｌ）の１００μｌ筋肉内注射を受け、次いで１０分後に、マウスを麻酔し、胸腔を露出させた。右心室を介して冷たいＭ１９９培地を注射し、肺から血液細胞を洗い流した。次いで１ｍｌの量のコラゲナーゼＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を、気管を通して肺に迅速に注入した。肺を除去し、５ｍｌ  コラゲナーゼＡと共に３０分間３７℃でインキュベートした。７０μｍストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過し、次いで５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。増殖培地（２０％  ウシ胎児血清、５０μｇ／ｍｌ  ＥＣ増殖因子、１００μｇ／ｍｌ  ヘパリン、２ｍＭ  グルタミン、１００単位／ｍｌ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンが補充されたＭ１９９培地）中に細胞ペレットを再懸濁し、さらに２日間、ゼラチンコーティング組織培養ディッシュに播種した。トリプシンを使用して細胞を除去し、抗ＣＤ３１−ＰＥ抗体染色及びＦＡＣＳソーティングのために１つの懸濁液にプールした。
【００５６】
ＨＵＶＥＣにおける低酸素処理及びレンチウイルスＳＣＵＢＥ２過剰発現／ノックダウン。
ＨＵＶＥＣを生物資源収集研究センター（台湾）から購入し、供給者の推奨に従って培養した。低酸素処理のために、９５％  Ｎ２／５％  ＣＯ２の混合ガスを供給したＣＯ２インキュベーターでインキュベーションすることによって、ＨＵＶＥＣを低酸素（１％  Ｏ２）に暴露した。自己不活性化レンチウイルス導入システムによって、ＨＵＶＥＣを完全長ＳＣＵＢＥ２発現ベクター又は空ベクターで操作した。我々は、ＲＮＡｉコンソーシアムによって作製された、ベクターに基づく短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、ＨＵＶＥＣの内因性ＳＣＵＢＥ２をノックダウンした。
【００５７】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）。
ＣｈＩＰ分析は、ＥＺ−ＭＡＧＮＡ  ＣｈＩＰ（商標）Ｇキットを用いて、記載の通りに行った。簡単に言うと、１％  ホルムアルデヒドを使用することによってＨＵＶＥＣ（１×１０７細胞）を架橋し、５００μｌ  溶解バッファー中に溶解し、およそ５００ｂｐ断片になるように超音波処理した。ＣｈＩＰは、ＨＩＦ−１α又はＩｇＧに対する抗体を含んでいた。インプット対照ＤＮＡ又は免疫沈降したＤＮＡを、プライマー（表Ｉ）を用いて、２μｌの溶出したＤＮＡ鋳型で構成される５０μｌ  反応体積中で増幅した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間、６３．５℃で３０秒間、７２℃で４０秒間、次いで７２℃で５分間の３５サイクル、Ｔａｑポリメラーゼを使用することを含んだ。各ＰＣＲ反応からの１０μｌ  アリコートを１．５％  アガロースゲルで分離した。
【００５８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。
製造者の指示に従ってＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）を使用することにより、４．５μｇのＳＣＵＢＥ２プロモータールシフェラーゼレポータープラスミド（ＷＴ、Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３）及び内部対照（０．４５μｇのｐＲＬ−ＴＫウミシイタケルシフェラーゼプラスミド）でＨＵＶＥＣを一過的に遺伝子導入した。細胞をさらに２日間培養し、採取して、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いたレポーターアッセイのために調製した。
【００５９】
ＥＣ増殖アッセイ。
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）アッセイによって、記載の通りに、ＥＣ増殖に対するＳＣＵＢＥ２の効果を決定した。簡単に言うと、ＥＣをトリプシン処理し、１００μｌの完全培地中に２０００細胞／ウェルで、９６穴細胞培養プレート上に播種した。翌日、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）又は対照培地で４日間細胞を刺激し、細胞数を調べた。
【００６０】
ＥＣ細管形成アッセイ。
ＥＣ（１ウェルあたり３ｘ１０３細胞）を、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む１５穴マイクロスライドアンジオジェネシスプレート中のＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上に播種した。１６時間後、１ウェルあたり３つのランダムな視野において血管の数を数えることによって、細管形成を決定した。
【００６１】
ＶＥＧＦ−アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合アッセイ。
ＡＰタグ化ＶＥＧＦタンパク質の産生及び結合実験を、本質的に記載の通りに実施した。以下のプライマー：CCG CTC GAG GCA CCC ATG GCA GAA GGA（配列番号：６７）及びGCT CTA GAT TAT CAC CGC CTC GGC TTG TCA CA（配列番号：６８）を用いるＰＣＲを使用して、ＶＥＧＦ  ｃＤＮＡの一部を増幅することにより、ＡＰ−ＶＥＧＦキメラリガンドを構築した。次いで、４９８ｂｐの増幅された断片を、ＡＰｔａｇ−５のＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限部位にクローニングした。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への一過性遺伝子導入によって、ＡＰ−ＶＥＧＦ融合タンパク質及び対照ＡＰタンパク質を産生させた。遺伝子導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の上清を回収し、濃縮し、保存した。ＶＥＧＦＲ２を単独で又はＳＣＵＢＥ２と共に過剰発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びＥＣを、４時間上清中でインキュベートし、４℃でＰＢＳで３回洗浄した。次いで、５分間氷上で、溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０％  グリセロール、及び１％  トリトンＸ−１００）中に、細胞を溶解した。細胞溶解物を、１０，０００ｘｇで２０分間４℃での遠心分離によって清澄化した。ｐ−ニトロフェニルリン酸基質を使用して、ＡＰ活性を検出した。
【００６２】
プルダウンアッセイ。
インビトロ転写／翻訳法を使用して、Ｍｙｃタグ化ＶＥ−カドヘリン−ＦＬ、Ｄ１、及びＤ２タンパク質（Ｍｙｃ．ＶＥ−カドヘリン−ＦＬ、−Ｄ１、−Ｄ２）を産生させた。バクテリアライセートの可溶性画分から、グルタチオン−セファロース（商標）ビーズを用いて、組換えＧＳＴタグ化ＳＣＵＢＥ２−ＣＵＢタンパク質（ＧＳＴ．ＳＣＵＢＥ２−ＣＵＢ）を精製した。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞からの過剰発現によって、ＦＬＡＧタグ化ＳＣＵＢＥ２−ＦＬ、ＥＧＦ、スペーサ、ＣＲ、及びＣＵＢタンパク質（ＦＬＡＧ．ＳＣＵＢＥ２−ＦＬ、−ＥＧＦ、−スペーサ、−ＣＲ、−ＣＵＢ）を産生させた。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから組換えＶＥＧＦ１６５タンパク質を購入した。ＳＣＵＢＥ２及びＶＥＧＦ１６５の相互作用アッセイのために、０．５ｍｌの結合バッファー［４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  ＮＯＮＩＤＥＴ（商標）Ｐ−４０、及び２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール］中で、組換えＶＥＧＦ１６５タンパク質を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体−アガロースビーズ又は対照ビーズに結合したＦＬＡＧ．ＳＣＵＢＥ２−ＦＬ、ＥＧＦ、スペーサ、ＣＲ、及びＣＵＢタンパク質と混合した。４時間４℃でインキュベーションした後、ビーズを広く洗浄した。そして、抗ＶＥＧＦ抗体を使用するイムノブロッティングによって、相互作用するタンパク質を可視化した。ＳＣＵＢＥ２及びＶＥＧＦＲ２の相互作用アッセイのために、０．５ｍｌの結合バッファー中で、ＧＳＴタグ化ＳＣＵＢＥ２−ＣＵＢタンパク質をＭｙｃ．ＶＥＧＦＲ２−ＦＬ、−Ｄ１、−Ｄ２タンパク質と混合した。４時間４℃でインキュベーションした後、タンパク質溶液を、グルタチオン−セファロース（商標）と共に、２時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。結合バッファーで３回洗浄した後、抗Ｍｙｃ抗体を使用するイムノブロッティングによって、沈降した複合体を可視化した。
【００６３】
共焦点免疫蛍光顕微鏡法。
内皮細胞を４％  ホルムアルデヒド中で固定し、２％  ウシ胎児血清で１時間ブロッキングし、ニワトリ抗ＳＣＵＢＥ２及びマウス抗ＶＥＧＦＲ２抗体と共に１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回洗浄し、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４標識抗ニワトリＩｇＧ抗体で１時間染色し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄し、ＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）封入剤を使用して封入した。蛍光画像を、室温で、共焦点顕微鏡下で取得した。
【００６４】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、及びＲＴ−ＰＣＲ
【００６５】
ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）法によって、培養細胞から全ＲＮＡを調製した。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩ逆転写酵素を用いるファーストストランドｃＤＮＡ合成は、５μｇのＲＮＡを伴った。ファーストストランドｃＤＮＡ反応物の１０分の１を、各ＰＣＲについて鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を１％  アガロースゲル上で泳動した。プライマーを表１に列挙する。
【００６６】
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
【００６７】
Ｍｙｃタグ化ＶＥＧＦＲ２発現構築物を、単独で、及び示されたＦＬＡＧタグ化ＳＣＵＢＥ２タンパク質をコードする一連の発現プラスミドと組み合わせて、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入の２日後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、溶解バッファー（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μｇ／ｍｌ  アプロチニン、５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０％  グリセロール、及び１％  トリトン（登録商標）Ｘ−１００）中で５分間氷上で溶解した。細胞溶解物を、１０，０００ｘｇで２０分間４℃での遠心分離によって清澄化した。１μｇの示された抗体及び２０μｌの５０％（ｖ／ｖ）  プロテインＡ−アガロースと共に、２時間穏やかに振盪しながら、サンプルをインキュベートした。溶解バッファーで３回洗浄した後、沈降した複合体を、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー中で煮沸することによって可溶化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ＰＶＤＦ膜（これは、０．１％  ゼラチン及び０．０５％  ツイーン（登録商標）２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）でブロッキングした）に移し、示された抗体でブロッティングした。２回の洗浄後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に、１時間、ブロットをインキュベートした。膜を洗浄した後、ＶＩＳＧＬＯＷ（商標）化学発光基質、ＨＲＰシステム（Ｖｉｓｕａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を使用して、反応性バンドを可視化した。
【００６８】
統計的分析。データは平均±ＳＤとして示され、両側の対応のあるｔ検定によって分析した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。
【００６９】
表１は、ＲＴ−ＰＣＲ用（配列番号：６９−８２；８５−８６）；ＣｈＩＰ用（配列番号：８３−８４）；Ｑ−ＰＣＲ用（配列番号：８７−９４）；遺伝子型判定用（配列番号：９５−１０２）のプライマー配列及び配列番号を列挙している。
【００７０】
【表１】
2019511545.tif 000003
【００７１】
結果
【００７２】
ＳＣＵＢＥ２はヒトＥＣにおいて発現し、ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ増殖及び管形成を調節する
【００７３】
我々は最初に、免疫染色（図１Ａ）、フローサイトメトリー（図１Ｂ）、及びウエスタンブロット分析（図１Ｃ）によって、ＨＵＶＥＣにおけるＳＣＵＢＥ２タンパク質発現を確認した。共焦点蛍光免疫染色及びフローサイトメトリーは、ＳＣＵＢＥ２がＥＣ膜上に部分的に局在することを明らかにした（図１Ａ及び１Ｂ）。加えて、タンパク質レベルは、成長停止したコンフルエントＥＣよりも、増殖性のサブコンフルエントＥＣにおいて、より高かった（図１Ｃ）。
【００７４】
次いで我々は、ヒトＥＣにおいてＳＣＵＢＥ２を過剰発現及びノックダウンすることによって、ＶＥＧＦ応答の調節におけるＳＣＵＢＥ２の潜在的な役割を調査した。完全長ＦＬＡＧタグ化ＳＣＵＢＥ２又は２つの独立したＳＣＵＢＥ２標的化短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ＃１及び＃２）をコードする組換えレンチウイルスをＨＵＶＥＣに導入した後、ＲＴ−ＰＣＲ又はウエスタンブロット分析によってＳＣＵＢＥ２の過剰発現及びノックダウンを立証した（図１Ｄ及び１Ｇ）。ＶＥＧＦ誘導性ＥＣ成長及びＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）上での毛細管様ネットワーク形成は、ＳＣＵＢＥ２過剰発現によって顕著に増加し（図１Ｅ及び１Ｆ）、ＳＣＵＢＥ２ノックダウンによって顕著に低下した（図１Ｈ及び１Ｉ）。合わせて、これらのデータは、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性増殖及び細管形成の調節におけるＳＣＵＢＥ２の役割を支持する。
【００７５】
ＨＵＶＥＣにおける、ＨＩＦ−１αによるＳＣＵＢＥ２の上方制御
【００７６】
ＨＩＦ−１αによる低酸素誘導性ＶＥＧＦ発現が、出生後の血管新生にとって重要であるため、次いで我々は、内皮ＳＣＵＢＥ２も同様のメカニズムによって上方制御されるのかどうかを調査した。ＨＵＶＥＣを低酸素に１２時間暴露した後、ＳＣＵＢＥ１又はＳＣＵＢＥ３ではなく、ＳＣＵＢＥ２の発現が、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方において顕著に増加し、これにはＨＩＦ−１αの蓄積が付随した（図２Ａ及び２Ｂ）。さらに、ＣｈＩＰアッセイ及びプロモーター突然変異分析によって、内因性ＨＩＦ−１αが実際に、ＳＣＵＢＥ２プロモーター内にコンセンサスＨＩＦ結合モチーフ（Ａ／ＧＣＴＧＡ）を有するＤＮＡ領域と相互作用し、低酸素処理でＨＵＶＥＣにおけるＳＣＵＢＥ２発現を転写活性化させることができたことが確認された（図２Ｃ−２Ｅ）。
【００７７】
ＥＣ特異的Ｓｃｕｂｅ２−ノックアウト（ＥＣ−ＫＯ）マウスの作製
【００７８】
インビボでのＶＥＧＦ応答に対する内皮Ｓｃｕｂｅ２の役割をさらに調査するために、我々は、Ｓｃｕｂｅ２の条件付き「Ｆｌｏｘｅｄ」対立遺伝子［９のＥＧＦ様反復をコードするエキソン、スペーサ領域、３のシステインリッチモチーフ、及びＣＵＢドメインを、ｌｏｘＰで挟んでいる］を保有するマウスを、汎内皮発現しているアンジオポエチンレセプター（Ｔｉｅ２）プロモーターの制御下でバクテリオファージリコンビナーゼＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスと交配することによって、ＥＣにおいてＳｃｕｂｅ２を特異的にノックアウトした。オスＴｉｅ２−Ｃｒｅ；Ｓｃｕｂｅ２＋／−をメスＳｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／Ｆｌｏｘマウスと交配して、Ｔｉｅ２−Ｃｒｅ；Ｓｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／＋（「対照」に指定）及びＴｉｅ２−Ｃｒｅ；Ｓｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ／−（ＥＣ−ＫＯに指定）マウスを得た。
【００７９】
Ｓｃｕｂｅ２Ｆｌｏｘ対立遺伝子の内皮特異的組換え効率を決定するために、初代肺ＭＬＥＣを対照及びＥＣ−ＫＯマウスから単離した。これらの細胞のおよそ９５％がＣＤ３１を発現していたため、フローサイトメトリーによって、これらの細胞集団がＥＣに高度に富化されていたことが明らかになった。加えて、Ｓｃｕｂｅ２のｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方が、ＥＣ−ＫＯ  ＭＬＥＣにおけるＳｃｕｂｅ１及びＳｃｕｂｅ３の明らかな補償的上方制御なしに、効率的に且つ特異的に除去された。一貫して、成体マウス肺の免疫染色は、ＥＣ−ＫＯマウスにおける内皮（しかし気管支上皮ではない）のＳｃｕｂｅ２発現が完全に無くなったことを立証した。したがって、成体ＥＣ−ＫＯマウスの内皮コンパートメントにおいて、Ｓｃｕｂｅ２は効率的に除去された。
【００８０】
対照及びＥＣ−ＫＯマウスは、予想されるメンデル比で回収され、正常パターンの体重増加を示した。そのため、脈管形成及び血管新生は、正常な発達に十分であった。我々は、対照動物とＥＣ−ＫＯ動物との間で、全体的な健康及び挙動における表現型の差異を観察しなかった。ＥＣ−ＫＯメスは、正常に繁殖し、正常な同腹仔サイズを有した。このことは、コロニー繁殖を可能にするのに十分な生殖血管新生があることを示唆した。合わせて、これらのデータは、生理的血管新生が、Ｓｃｕｂｅ２の内皮不活性化によって大幅に影響されなかったことを示唆している。
【００８１】
Ｓｃｕｂｅ２  ＥＣ−ＫＯマウスにおいて、外因性ＶＥＧＦへの応答及び成体血管新生が損なわれる
【００８２】
インビボでのＶＥＧＦ刺激性血管新生における内皮Ｓｃｕｂｅ２の潜在的な機能を調査するために、我々は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグアッセイを使用した。このアッセイでは、ＶＥＧＦ（＋）又は生理食塩水（−）と混合したＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を、齢及び性別を合わせたＥＣ−ＫＯ及び対照マウスに皮下投与し、７日後に回収した（図３）。肉眼検査で、対照マウス由来のＶＥＧＦ含有ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグは赤褐色であった（図３Ａ）。しかしながら、ＥＣ−ＫＯマウス由来のＶＥＧＦ含有プラグは、対照プラグよりも淡かった（図３Ａ）。一貫して、総ヘモグロビン含量は、新しく形成された毛細管ネットワークの量に関連するインタクトな血管形成の尺度であり、ＶＥＧＦ−含有ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）プラグにおいてＥＣ−ＫＯマウスで約５０％低下した（図３Ｂ）。このヘモグロビンの差異が微小血管系の密度の低下によって引き起こされたことを保証するために、抗ＣＤ３１抗体（内皮のマーカー）を用いた免疫染色によって、移植物における血管浸潤を定量化した（図３Ｃ及び３Ｄ）。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）を移植された対照マウスとは対照的に、移植されたＥＣ−ＫＯマウスは、生理食塩水含有プラグにおいても、血管新生の減少を示した（図３Ｃ）。さらに、ＶＥＧＦ含有プラグの毛細血管密度は、ＥＣ−ＫＯにおいて、対照マウスよりも５０％低く（図３Ｄ）、大きい血管は見られなかった（図３Ｃ）。このことは、ＶＥＧＦ誘導性成体血管新生応答が、インビボで内皮Ｓｃｕｂｅ２に依存することを示唆している。
【００８３】
内皮Ｓｃｕｂｅ２の血管新生促進効果をさらに評価するために、我々は、第２の成体血管新生モデル（すなわち、後肢虚血）を使用した：対照及びＥＣ−ＫＯマウスにおいて総大腿動脈を結紮し、血流並びに血管再生及び血管新生を、それぞれレーザードップラーイメージング及び抗ＣＤ３１免疫染色によって、経時的にモニターした。レーザードップラー分析によって、手術後の対照及びＥＣ−ＫＯ動物の結紮肢における血流の低下が、非結紮対側肢と比較したときに、同様の程度であったことが明らかとなった（図３Ｅ及び３Ｆ）。このことは、両方の系統において手術後虚血が同等であったことを示す。対照マウスにおいて、血流は、手術後２１日目までにほぼベースラインレベルに回復した。しかしながら、血流回復はＥＣ−ＫＯ動物において顕著に損なわれた（図３Ｅ及び３Ｆ）。一貫して、腓腹筋（ふくらはぎ）筋肉の組織学法は、２１日目で、ＥＣ−ＫＯマウスにおいて、対照マウスよりも低い、結紮により誘導された抗ＣＤ３１陽性毛細管密度を示した（図３Ｇ及び３Ｈ）。それ故に、機能的Ｓｃｕｂｅ２は、大腿動脈結紮により誘導された虚血後の再血管新生のために、内皮において必要とされる可能性がある。
【００８４】
ＳＣＵＢＥ２は、ＶＥＧＦＲ２と共局在及び相互作用し、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合を増強する
【００８５】
ＳＣＵＢＥ２が、インビトロ及びインビボの両方でＶＥＧＦ応答を調節することができ（図１及び３）、ＳＣＵＢＥタンパク質がシグナル伝達レセプターセリン／スレオニンキナーゼ又はＲＴＫのコレセプターとして機能することができるため、我々は、ＳＣＵＢＥ２がＨＵＶＥＣのＶＥＧＦＲ２と共局在及び相互作用するかどうかを調べた。共焦点顕微鏡法及び共免疫沈降実験によって、ＶＥＧＦが、原形質膜でのそれらの共局在化を促進し、ＳＣＵＢＥ２のＶＥＧＦＲ２との会合を増強し、ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ刺激の１０分後にピークとなることが、実際に明らかとなった。この結果は、ＳＣＵＢＥ２のＣＵＢドメインがＶＥＧＦＲ２の細胞外免疫グロブリン様フォールドと相互作用することができることを示す、ＳＣＵＢＥ２及びＶＥＧＦＲ２発現プラスミドを遺伝子導入したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において、さらに詳細に述べられた。加えて、抗ＳＣＵＢＥ２免疫沈降によってＶＥＧＦＲ１及びＥＧＦＲ又は別のＶＥＧＦＲ２コレセプターニューロピリン−１などの他のＲＴＫが沈降しなかったため、このＳＣＵＢＥ２−ＶＥＧＦＲ２相互作用は、特異的であるようであった。最も重要なことに、ＶＥＧＦＲ２への結合に加えて、ＳＣＵＢＥ２は、そのＥＧＦ様反復を介してＶＥＧＦ−Ａ１６５に直接結合することができた。我々は、ＳＣＵＢＥ１又はＳＣＵＢＥ３もまたＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲ２に結合することができるかどうかを立証するために、追加の共免疫沈降実験を実施した。ＶＥＧＦに特異的に結合することができるＳＣＵＢＥ２とは異なり、ＳＣＵＢＥ１及びＳＣＵＢＥ３はＶＥＧＦと相互作用することができない。このことは、ＳＣＵＢＥ１又はＳＣＵＢＥ３がＶＥＧＦのコレセプターとして機能しない可能性があることを示唆している（Lin et al. "Endothelial SCUBE2 Interacts With VEGFR2 and Regulates VEGF-Induced Angiogenesis" Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37:144-155を参照されたい）。
【００８６】
ＳＣＵＢＥ２がＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合を実際に増加させることができたかどうかを評価するために、我々は最初に機能的アルカリホスファターゼ（ＡＰ）−ＶＥＧＦ融合タンパク質を記載の通りに産生した。対照ＡＰタンパク質と比較して、ＡＰ−ＶＥＧＦタンパク質は、ＶＥＧＦＲ２を内因的に発現するＨＵＶＥＣ上への結合を示した。興味深いことに、対応する対照ＨＵＶＥＣと比較して、ＡＰ−ＶＥＧＦ結合はＳＣＵＢＥ２過剰発現によって増加し、ＳＣＵＢＥ２ノックダウン又は遺伝的ノックアウトによって減少した。一貫して、スキャッチャード解析は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において、ＳＣＵＢＥ２と共発現したＶＥＧＦＲ２では、ＶＥＧＦＲ２単独よりも、ＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ２への結合親和性が、約３倍大きかったことを示した（Ｋｄ＝０．２１対０．５８ｎＭ）。合わせて、これらのデータは、ＳＣＵＢＥ２がＶＥＧＦＲ２のコレセプターとして作用し、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合を増強することを示唆している。
【００８７】
ＳＣＵＢＥ２は、ＨＵＶＥＣにおいて、ＶＥＧＦＲ２リン酸化及び下流シグナル伝達を調節する
【００８８】
我々は次に、ＨＵＶＥＣにおいてＳＣＵＢＥ２がＶＥＧＦ活性化シグナルを促進するかどうかを調査した。この目的のために、我々は、刺激物質としてのＶＥＧＦ及びＳＣＵＢＥ２  ｓｈＲＮＡノックダウン又はＳＣＵＢＥ２過剰発現を使用して、ＶＥＧＦ誘導性シグナル伝達に対するＳＣＵＢＥ２の機能を評価した。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ２  Ｔｙｒ１０５９リン酸化、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫシグナル伝達カスケード、及びＡＫＴ活性化を誘導することができた。しかしながら、ＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲ２リン酸化、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫシグナル伝達カスケード、及びＡＫＴ活性化は、ＳＣＵＢＥ２  ｓｈＲＮＡノックダウンによって低下し（図４Ａ−Ｂ）、ＳＣＵＢＥ２過剰発現（図４Ｃ−Ｄ）によって増強された。我々のデータは、ＶＥＧＦＲ２コレセプターとして、ＳＣＵＢＥ２がＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ誘導性ＶＥＧＦＲ２下流シグナルの調節に関与していることを強く示している。我々は、ＶＥＧＦの処理をしたときの、ＨＵＶＥＣにおける、ＳＣＵＢＥ２のリン酸化状態を決定した。ＶＥＧＦ刺激の後、抗ＳＣＵＢＥ２免疫沈降物を、それぞれ、抗ホスホチロシン（ｐ−Ｔｙｒ）又は抗ホスホセリン／スレオニン（ｐ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）汎特異的抗体でブロッティングした。ＳＣＵＢＥ２は、３０分間までのＶＥＧＦでの処理をしたときに、リン酸化されないようである。しかしながら、ＶＥＧＦ刺激の後にＳＣＵＢＥ２がリン酸化されるかどうかを立証するためには、さらなるリン酸プロテオミクス解析が必要となるだろう。
【００８９】
Ｓｃｕｂｅ２は、初代マウス肺ＥＣ（ＭＬＥＣ）においてＶＥＧＦシグナル伝達を調節する
【００９０】
ＨＵＶＥＣにおける我々のノックダウン実験（図１Ｇ−１Ｉ）と同様に、ＶＥＧＦ誘導性細胞増殖及び管形成は、対照ＭＬＥＣと比較して、ＥＣ−ＫＯ  ＭＬＥＣにおいて顕著に減弱した（図５Ａ−Ｂ）。我々はさらに、ＶＥＧＦ誘導性シグナル伝達に対する内皮Ｓｃｕｂｅ２遺伝子欠失の効果を評価した。我々は、対照及びＥＣ−ＫＯ  ＭＬＥＣを、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦで、０、１０、２０、及び３０分間刺激した。ＨＵＶＥＣにおけるＳＣＵＢＥ２  ｓｈＲＮＡノックダウンと一致して、ＶＥＧＦＲ２、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ、及びＡＫＴのリン酸化によって決定されるＶＥＧＦシグナル伝達は、対照ＭＬＥＣよりもＥＣ−ＫＯ  ＭＬＥＣにおいて、顕著に低かった（図５Ｃ−Ｄ）。
【００９１】
Ｓｃｕｂｅ２  ＥＣ−ＫＯマウスの大動脈外植片からの微小血管伸長の減少
【００９２】
我々はさらに、生体外冠動脈リング出芽アッセイを使用して、血管新生におけるＳＣＵＢＥ２の役割を調査する。ここで我々は、対照及びＥＣ−ＫＯマウスに由来する大動脈断片の血管新生能力を比較した。対照及びＥＣ−ＫＯマウスから単離した冠動脈リングをＰＢＳ又はＶＥＧＦで処理し、次いで成長している微小血管の数を定量化すること、及び新しく形成された微小血管が占める全体の長さを測定することによって、それぞれの個々の冠動脈リング外植片について血管新生応答を決定した。ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）に応答した、５日目の管様構造（出芽）の数及び出芽の長さの定量化は、対照冠動脈リングと比較して、ＥＣ−ＫＯ冠動脈リングにおいて、両方のパラメーターの顕著な減少を示した（図５Ｅ−５Ｆ）。それ故に、これらの生体外の結果は、インビトロのデータを確認し、ＶＥＧＦＲ２媒介性血管新生におけるＳＣＵＢＥ２の役割を支持するものである。
【００９３】
ＥＣ−ＫＯマウスにおいて腫瘍成長が低下する
【００９４】
ＳＣＵＢＥ２は、腫瘍内皮細胞において高度に発現されている。図６は、免疫組織化学法の結果を示しており、これは、乳、肺、メラノーマ（Ａ）並びに前立腺、肉腫、及び膀胱がん（Ｂ）において、ＳＣＵＢＥ２のＥＣ発現が富化されている（矢印）ことを示している。成体血管新生における内皮Ｓｃｕｂｅ２の本質的役割（図３）を考慮して、我々は次いで、病理学的腫瘍血管新生及び腫瘍成長に対するＳｃｕｂｅ２の内皮不活性化（ＥＣ−ＫＯ）の効果を調べた。対照及びＥＣ−ＫＯマウスに、同系のメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）又はルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞を皮下注射した。腫瘍の成長及びサイズの両方が、対照マウスよりもＥＣ−ＫＯについて低かった（図７Ａ−Ｄ）。Ｓｃｕｂｅ２の内皮喪失を伴う成体血管新生欠陥に則って、毛細血管密度（抗ＣＤ３１染色によって見られる）は、対照腫瘍よりもＥＣ−ＫＯ腫瘍において、顕著に低かった（図７Ｅ−Ｈ）。このことは、内皮Ｓｃｕｂｅ２が、腫瘍血管新生及び成長の促進において本質的役割を果たしていることを示唆している。重要なことに、非腫瘍性の成体皮膚における血管密度は、対照動物とＥＣ−ＫＯ動物との間で同等であった（データは示さず）。
【００９５】
ＥＣ−ＫＯマウスにおいて観察された血管新生欠陥は、腫瘍細胞が栄養物及び酸素を奪われ、それ故にアポトーシス及び壊死を受ける可能性があることを示唆した。この概念と一致して、ヘマトキシリン及びエオシン染色は、ＥＣ−ＫＯ腫瘍において壊死組織の中央コアを明らかにしたが、対照腫瘍における壊死エリアのほうがはるかに小さかった（図８Ａ−Ｂ）。さらに、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ及びＫｉ−６７免疫染色は、対照腫瘍と比較したときに、ＥＣ−ＫＯ腫瘍において、アポトーシスがより大きく、腫瘍細胞の増殖が顕著に低下したことを示した（図８Ｃ−Ｆ）。再び、これらの結果は、内皮Ｓｃｕｂｅ２が、腫瘍細胞の生存を維持するための血管新生に不可欠であることを示している。
【００９６】
図９は、内皮Ｓｃｕｂｅ２の喪失が、ＥＣ−ＫＯマウスにおける腫瘍血管新生及び腫瘍成長を遅延させることを示している。移植後６０日目のＭＬＴＣライディッヒ腫瘍の代表的な写真及び示された時点で測定された腫瘍成長の割合が示されている（Ａ、及びＢ）。ＥＣ−ＫＯマウスは、腫瘍微小血管系が損なわれた。ＥＣ−ＫＯマウスにおいてＥＣ及び血管構造の数が減少していることを示す、腫瘍切片の抗ＣＤ３１染色（Ｃ）。腫瘍細胞の移植後１６日目の腫瘍血管新生の定量化（Ｄ）。
【００９７】
ＥＣ−ＫＯマウスにおいて網膜血管構造成長が低下する
【００９８】
図１０は、網膜血管構造の発達伸長に対するＳＣＵＢＥ２の内皮除去の効果を示す。
【００９９】
ＥＣ−ＫＯマウスにおいて酸素誘導性網膜症が低下する
【０１００】
図１１は、内皮細胞におけるＳＣＵＢＥ２の欠失が、酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）を低下させることを示す。
【０１０１】
抗ＳＣＵＢＥ２抗体
【０１０２】
ＳＣＵＢＥ２は、少なくとも５の別個のドメインモチーフ（図１２Ａ）：ＮＨ２−末端シグナルペプチド配列、続いて９コピーのＥＧＦ様反復（Ｅ）、スペーサ領域、３のシステインリッチモチーフ（Ｃｙｓ−ｒｉｃｈ）、及びＣＯＯＨ末端に１のＣＵＢドメイン、を有する。各ドメインのアミノ酸は、（１）ＳＰ：ａ．ａ．１−３７；（２）ＥＧＦ様反復：ａ．ａ．４９−４４２；（３）スペーサ：ａ．ａ．４４３−６６９；（４）ＣＲ：ａ．ａ．７０−８０３；及び（５）ＣＵＢ：ａ．ａ．８３８−９４７である。ドメイン予測に基づいて、成熟ＳＣＵＢＥ２タンパク質（ａ．ａ．３８−ａ．ａ．１０２８）を細胞外培地に分泌させることができる。
【０１０３】
抗ＳＣＵＢＥ２抗体を産生させた。図１２Ａは、各抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂクローンの特異的標的化ドメインを示す。クローンＥＧＦ−Ｃ３は、ＥＧＦ様反復４−６（ａ．ａ．１７５−３２３）を認識する一方で、ＳＰ−Ａ１（ａ．ａ．４４１−６５９）、Ｂ１（ａ．ａ．４４１−６５９）、及びＢ２（ａ．ａ．４４１−６５９）クローンはＳＣＵＢＥ２のスペーサ領域に結合する。ＣＲ−＃５クローンは、ＳＣＵＢＥ２の第１のシステインリッチモチーフ（ａ．ａ．６６８−７２５）を検出する。ＥＧＦ−Ｃ３クローンを、ＳＣＵＢＥ２のＥＧＦ様反復を含む組換えタンパク質で免疫化することによって得た。そして、ＳＰ−Ａ１、Ｂ１及びＢ２クローンを、ＳＣＵＢＥ２のスペーサ領域を含む組換えタンパク質で免疫化することによって得た。同様に、ＣＲ−＃５クローンを、第１のシステインリッチモチーフを含む組換えタンパク質で免疫化することによって得た。
【０１０４】
これらの抗体は、インビトロ細管形成アッセイにおいて、内皮細胞と共にインキュベートした際に、血管形成に対する阻害活性を示した（図１２Ｂ）。これらの抗ＳＣＵＢＥ２  ｍＡｂクローンの種特異性及び抗血管新生活性が示されている（図１２Ｂ）。表２−６は、抗ＳＣＵＢＥ２モノクローナル抗体のＣＤＲ配列を示している。相補性決定領域１−３（ＣＤＲ１−３）、及びフレームワーク領域１−４（ＦＷ１−４）が、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方について、示されている。
【０１０５】
血管新生眼疾患の処置
【０１０６】
網膜血管新生に対する抗ＳＣＵＢＥ２抗体の硝子体内注射の効果を、酸素誘導性網膜症のマウスモデルにおいて調べる。我々の予備データは、インビトロ内皮細胞管形成アッセイによって、これらの抗ＳＣＵＢＥ２抗体が血管新生を抑制することができたことを示した。例えば、ＳＰ．Ｂ１クローンは、ＶＥＧＦによって刺激される内皮細胞増殖及び毛細管形成を阻害することができる（図１３Ｃ−Ｅ）。
【０１０７】
抗ＳＣＵＢＥ２（ＳＰ．Ｂ１）及び抗ＶＥＧＦ（ベバシズマブ）は、肺、膵臓、及び結腸直腸がん成長を相乗的に阻害する
【０１０８】
我々の結果が、膜関連ＳＣＵＢＥ２が腫瘍血管新生において決定的役割を果たすことを示唆したため、我々は、中和ｍＡｂによるＳＣＵＢＥ２の阻害が、固形腫瘍を処置するための潜在的な薬剤でありうるかどうかを評価した。ＳＣＵＢＥ２に特異的なｍＡｂ（クローンＳＰ．Ｂ１）を開発した。このｍＡｂは、ＳＣＵＢＥ１又は３と交差反応しなかった（図１３Ａ−Ｂ）。このことは、顕著なオフターゲット効果の欠如を示している。ＳＣＵＢＥ２の血管新生促進活性を考慮して、我々は最初に、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ刺激性応答におけるこのｍＡｂのインビトロ効果を評価した。対照ＩｇＧではなく、ＳＰ．Ｂ１  ｍＡｂのインキュベーションは、ＶＥＧＦＲ２リン酸化及びｐ４４／４２  ＭＡＰＫ／Ａｋｔ活性化を含むＶＥＧＦ誘導性シグナルをブロックした（図１３Ｆ−Ｉ）。このｍＡｂの機能的活性は、ＶＥＧＦによって刺激されるＥＣ増殖及び毛細管形成を阻害する、その特異的能力によって立証された（図１３Ｃ−Ｅ）。
【０１０９】
さらに、我々は、ＳＣＵＢＥ２又はＶＥＧＦＲ２を発現しない、肺がんＬＬＣ細胞を用いる腫瘍モデルを確立した。ＳＰ．Ｂ１  ｍＡｂとのインキュベーションは、細胞成長に対して効果を及ぼさなかった（データは示さず）。そのため、ＳＰ．Ｂ１  ｍＡｂは、実際の腫瘍細胞を標的とすることができず、腫瘍成長の低下はいずれも、抗血管新生効果から生じたのであろう。ＳＣＵＢＥ２がＶＥＧＦＲ２のコレセプターとして働き、ベバシズマブが腫瘍血管新生を阻害することができるため、我々はまた、ＳＰ．Ｂ１及びベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の併用処置が肺腫瘍成長の抑制に対して付加的な効果を及ぼすことができるかどうかを調査した。肺腫瘍が５０ｍｍ３に達すると、治療的注射が開始された。ＬＬＣ成長は、マウス又はヒトＩｇＧ処置と比較して、ＳＰ．Ｂ１、ベバシズマブ、及び併用処置（ＳＰ．Ｂ１＋ベバシズマブ）によって顕著に阻害された（図１４Ａ−Ｃ）。さらに、ＳＰ．Ｂ１（２９％）又はベバシズマブ（４０％）単独よりも、ＳＰ．Ｂ１＋ベバシズマブは、腫瘍成長に対して大きな阻害効果を有した（５６％）（図１４Ｃ）。そのため、これらの２つの薬剤は、腫瘍血管新生にとって重要な異なる経路に、少なくとも部分的に作用し得る。加えて、免疫組織化学的分析は、ＳＰ．Ｂ１及びベバシズマブ処置の両方で、毛細血管密度が顕著に低下したことを示した（図１４Ｄ−Ｅ）。重要なことに、ＳＰ．Ｂ１＋ベバシズマブでは、それぞれＳＰ．Ｂ１及びベバシズマブ処置単独よりも、血管数が４９％及び３１％少なかった。ＳＰ．Ｂ１及びベバシズマブの併用処置は、臨床で腫瘍血管新生を標的とする能力を有し得る。
【０１１０】
図１５は、抗ＳＣＵＢＥ２  ＳＰ．Ｂ１及び抗ＶＥＧＦベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））の併用処置が、膵管がんの成長及び血管新生に対して付加的な抗腫瘍効果を有したことを示す。図１６は、抗ＳＣＵＢＥ２  ＳＰ．Ｂ１及び抗ＶＥＧＦベバシズマブの併用処置が、結腸直腸腺がんの成長及び血管新生に対して付加的な抗腫瘍効果を有したことを示す。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
【表５】
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【０１１５】
【表６】
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【０１１６】
要約すると、我々は、ＳＣＵＢＥ１又は３ではなく、ＳＣＵＢＥ２が、低酸素下で、ＨＵＶＥＣにおいて、ＨＩＦ−１αによって特異的に上方制御されたことを示した。ＳＣＵＢＥ２のこの独特の低酸素誘導は、後肢虚血後の血流回復の調節におけるその独特の役割を、部分的に説明するかもしれない。血管新生におけるＳＣＵＢＥ２の関与は、ＶＥＧＦの作用に限定されなかった。ソニックヘッジホッグ又はＶＥ−カドヘリンシグナル伝達によって媒介される出生後の血管新生にＳＣＵＢＥ２が関与しているかどうかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。ここで、我々のデータは、ＶＥＧＦＲ２媒介性シグナル伝達を微調整することによって、ＶＥＧＦ誘導性管形成及びＥＣの増殖を調節する、新規のＶＥＧＦＲ２コレセプターとしてのＳＣＵＢＥ２を明らかにした。ＳＣＵＢＥ２は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、及び加齢性黄斑変性などの様々な血管新生関連疾患の病因において、臨床的に重要であり得る。正常器官ＥＣにおけるその発現に加えて、ＳＣＵＢＥ２はまた、多数のタイプのヒトがん及び異種移植腫瘍のＥＣにおいても、高度に発現されている（我々の未公開データ）。内皮ＳＣＵＢＥ２が腫瘍血管新生に関与しているかどうかを検証するためにはさらなる研究が必要とされるが、ＳＣＵＢＥ２は、ＳＣＵＢＥ２不活性化のその抗血管新生の効果のために、がん療法のための将来有望な標的分子であり得る。内皮ＳＣＵＢＥ２の薬理的妨害は、血管新生関連障害のための新規の治療的戦略を表し得る。異常又は過度の血管新生によって特徴付けられる又は引き起こされる疾患の例を表７に列挙する。
【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
本発明の例示的な実施形態の前述の説明は、例示及び説明の目的でのみ提示されたものであり、包括的であること、又は開示される厳密な形態に本発明を限定することを意図したものではない。上記の教示に照らして、多くの改変及び変形が可能である。特許、特許出願及び様々な刊行物を含み得るいくつかの参考文献が、本発明の説明において引用され論じられている。そのような参考文献の引用及び／又は議論は、単に本発明の説明を明確にするために提供されており、そのような参考文献が本明細書に記載された発明に対する「先行技術」であることを認めるものではない。この明細書において引用され論じられた全ての参考文献は、各参考文献が参照により個々に組み込まれたのと同じ程度に、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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