(57)【要約】  ある特定の実施形態では、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原に対する免疫応答を発生させるための方法及び組成物が提供される。特定の実施形態では、アデノウイルスに対して既存の免疫を有する個体のワクチン接種を可能にする、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原をコードする核酸配列を含有する組換えアデノウイルス系ベクターワクチンを構築し産生するための方法が提供され得る。【選択図】図１
2019521099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブHER2/neuタンパク質の断片であるHER2/neu抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ウイルスベクターを含む組成物。
【請求項２】
HER2/neu抗原が、ネイティブHER2/neuタンパク質の細胞内ドメインを有しない、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
HER2/neu抗原が、ネイティブHER2/neuタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
HER2/neu抗原が、配列番号1又は配列番号2と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を有し、核酸配列が、配列番号1、又は配列番号3の1033〜3107位と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を有し、及び/又は複製欠損型ウイルスベクターが、配列番号3と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
複製欠損型ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
アデノウイルスベクターが、E1領域、E2b領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
アデノウイルスベクターが、E2b領域において欠失を含む、請求項5又は6に記載の組成物。
【請求項８】
アデノウイルスベクターが、E1領域、E2b領域、及びE3領域において欠失を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも1×109〜少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも5×109個のウイルス粒子を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも5×1010個のウイルス粒子を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも5×1011個のウイルス粒子を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
複製欠損型ウイルスベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
複製欠損型ウイルスベクターが、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその組合せを含む、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
共刺激分子が、B7、ICAM-1、及びLFA-3の組合せを含む、請求項15又は16に記載の組成物。
【請求項１８】
同じ複製欠損型ウイルスベクターに位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
別の複製欠損型ウイルスベクターに位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
1つ以上の標的抗原又はその免疫学的エピトープをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
複製欠損型ウイルスベクターが、1つ以上の標的抗原又はその免疫学的エピトープをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
1つ以上の標的抗原が、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原虫抗原、寄生虫抗原、マイトゲン、又はその組合せである、請求項20又は21に記載の組成物。
【請求項２３】
1つ以上の標的抗原が、葉酸受容体アルファ、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER2/neu、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2、多型)、BRACHYURY(IVS7 T/C多型)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1-c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CEA、CDK-4/m、HER3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、若しくはTEL/AML1、若しくはその改変変異体、スプライス変異体、機能的エピトープ、エピトープアゴニスト、又はその組合せである、請求項20〜22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
1つ以上の標的抗原が、CEA、Brachyury、MUC1、MUC1-c、又はその任意の組合せである、請求項20〜23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
1つ以上の標的抗原がCEAである、請求項20〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
1つ以上の標的抗原がBrachyuryである、請求項20〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
1つ以上の標的抗原が、MUC1又はMUC1-cである、請求項20〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
1つ以上の標的抗原がHER3である、請求項20〜23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
CEAが、配列番号30、配列番号31、又は配列番号29の1057〜3165位と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
MUC1-cが、配列番号32又は配列番号33と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
Brachyuryが、配列番号34と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
HER3が、配列番号27と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む、請求項28に記載の組成物。
【請求項３３】
複製欠損型ウイルスベクターが、選択可能マーカーをさらに含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
選択可能マーカーが、lacZ遺伝子、チミジンキナーゼ、gpt、GUS、若しくはワクシニアK1L宿主域遺伝子、又はその組合せである、請求項33に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３６】
請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物を含む宿主細胞。
【請求項３７】
腫瘍ワクチンを製造する方法であって、請求項35に記載の医薬組成物を製造するステップを含む方法。
【請求項３８】
それを必要とする対象における免疫応答を増強する方法であって、請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物又は請求項35に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項３９】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物又は請求項35に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
前記医薬組成物を対象に再投与するステップをさらに含む、請求項38又は39に記載の方法。
【請求項４１】
免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与するステップをさらに含む、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
免疫チェックポイント阻害剤が、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、又はCD244を阻害する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
免疫チェックポイント阻害剤が、PD1又はPDL1を阻害する、請求項41又は42に記載の方法。
【請求項４４】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗PD1又は抗PDL1抗体である、請求項41〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗PDL1抗体である、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
投与が、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、経口、膀胱内注入による、又はスカリフィケーションによる、請求項38〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
増強される免疫応答が、細胞性又は液性応答である、請求項38〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
増強される免疫応答が、B細胞増殖の増強、CD4+ T細胞増殖の増強、CD8+ T細胞増殖の増強、又はその組合せである、請求項38〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
増強される免疫応答が、IL-2産生の増強、IFN-γ産生の増強、又はその組合せである、請求項38〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
増強される免疫応答が、抗原提示細胞増殖の増強、機能の増強、又はその組合せである、請求項38〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
対象が、アデノウイルスベクターを過去に投与されている、請求項38〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
対象が、アデノウイルスベクターに対して既存の免疫を有する、請求項38〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
対象が、アデノウイルスベクターに対して既存の免疫を有すると決定される、請求項38〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
化学療法剤、放射線、異なる免疫療法、又はその組合せを対象に投与するステップをさらに含む、請求項38〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
対象がヒト又は非ヒト動物である、請求項38〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
対象が、がんに関して過去に治療されている、請求項38〜55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
治療有効量を投与するステップが、少なくとも3回繰り返される、請求項38〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
組成物が、少なくとも1×109〜少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む、請求項38〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
治療有効量を投与するステップが、1用量あたり5×109個のウイルス粒子を含む、請求項38〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
治療有効量を投与するステップが、1用量あたり少なくとも5×1010個のウイルス粒子を含む、請求項38〜59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
治療有効量を投与するステップが、1用量あたり少なくとも5×1011個のウイルス粒子を含む、請求項38〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
治療有効量を投与するステップが、1用量あたり少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む、請求項38〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
治療有効量を投与するステップが、2週間又は3週間毎に繰り返される、請求項38〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
治療有効量を投与するステップの後に、同じ組成物又は医薬組成物を含むブースター免疫を行う、請求項38〜63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
ブースター免疫が1カ月、2カ月、又は3カ月毎に投与される、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
ブースター免疫が3回以上繰り返される、請求項64に記載の方法。
【請求項６７】
治療有効量を投与するステップが、初回免疫を、1週間毎、2週間毎、又は3週間毎に3回繰り返した後に、ブースター免疫を、1カ月毎、2カ月毎、又は3カ月毎に3回以上繰り返すことである、請求項38〜66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項38〜67のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
工学操作されたNK細胞が、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変された1つ以上のNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変された1つ以上のNK細胞、及び1つ以上のCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変された1つ以上のNK細胞、又はその任意の組合せを含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
工学操作されたNK細胞が、KIRの発現を本質的に欠如するように改変された1つ以上のNK細胞を含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７１】
工学操作されたNK細胞が、高親和性CD16変異体を発現するように改変された1つ以上のNK細胞を含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７２】
工学操作されたNK細胞が、1つ以上のCARを発現するように改変された1つ以上のNK細胞を含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７３】
CARが、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER2/neu、HER3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せのCARである、請求項68又は72に記載の方法。
【請求項７４】
複製欠損型アデノウイルスベクターが、細胞内に含まれる、請求項38〜73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
細胞が樹状細胞(DC)である、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項38〜75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
対象が、HER2/neu発現がんを有する、請求項38〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
対象が、HER2/neu発現乳がんを有する、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
対象が、HER2/neu発現骨がんを有する、請求項77に記載の方法。
【請求項８０】
がんが骨肉腫である、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
対象が、HER2/neu発現胃がんを有する、請求項77に記載の方法。
【請求項８２】
対象が、切除不能、局所進行、又は転移性がんを有する、請求項77〜81のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
追加のがん治療剤を対象に投与するステップをさらに含む、請求項38〜82のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年7月12日に出願された米国仮特許出願第62/361,292号及び2016年6月3日に出願された米国仮特許出願第62/345,575号の利益を主張するものであり、これらの開示内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利に関する記述
本発明は、国立がん研究所(NCI)により授与されたSBIR助成金第1R43CA139663-01号、SBIR契約第HHSN261201100090C号、SBIR契約第HHSN261201300066C号、及び国防総省の奨学金W81XWH-12-1-0574;BC113107に基づく米国政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明に関する一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、有害物質及び疾患細胞を認識し破壊するように免疫系を訓練することにより、身体が疾患に対抗することを助ける。ワクチンは、予防ワクチン及び治療ワクチンという大きく2つのタイプにグループ分けすることができる。予防ワクチンは、特定の疾患の発症を防止するために健常な人々に与えられるのに対して、免疫療法とも呼ばれる治療ワクチンは、疾患の診断を受けた個人に、疾患の発達及び伝播の阻止に役立てるため、又は防止策として与えられる。
【０００４】
現在、感染性疾患及びがんに対抗するのを助けるためのウイルスワクチンが開発されている。こうしたウイルスワクチンは、宿主の細胞内で疾患に関連する遺伝子のほんの一部の発現を誘導し、これが宿主の免疫系を増強して疾患細胞を識別し破壊することによって機能する。したがって、ウイルスワクチンの臨床的応答は、ワクチンが高レベルの免疫原性を得る能力及び持続的な長期発現を有する能力に依存し得る。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、がんなどの複雑な疾患に対する治療応答を増強させる新規組成物及び方法を開発する必要がある。
【０００６】
種々の態様において、本開示は、ネイティブHER2/neuタンパク質の断片であるHER2/neu抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ウイルスベクターを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、HER2/neu抗原は、ネイティブHER2/neuタンパク質の細胞内ドメインを有しない。いくつかの態様において、HER2/neu抗原は、ネイティブHER2/neuタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する。いくつかの態様において、HER2/neu抗原は、配列番号1又は配列番号2と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を有し、核酸配列は、配列番号1又は配列番号3の1033〜3107位と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を有し、及び/又は複製欠損型ウイルスベクターは、配列番号3と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を有する。
【０００７】
いくつかの態様において、複製欠損型ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターは、E1領域、E2b領域、E3領域、E4領域、又はその組合せにおいて欠失を含む。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターは、E2b領域に欠失を含む。いくつかの態様において、アデノウイルスベクターは、E1領域、E2b領域、及びE3領域において欠失を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、組成物は、少なくとも1×109〜少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも5×109個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも5×1010個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも5×1011個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、複製欠損型ウイルスベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、複製欠損型ウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む。さらなる態様では、共刺激分子は、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその組合せを含む。いくつかの態様において、共刺激分子は、B7、ICAM-1、及びLFA-3の組合せを含む。
【００１０】
いくつかの態様において、組成物は、同じ複製欠損型ウイルスベクターに位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。
【００１１】
いくつかの態様において、組成物は、別の複製欠損型ウイルスベクターに位置する複数の共刺激分子をコードする複数の核酸配列をさらに含む。
【００１２】
いくつかの態様において、組成物は、1つ以上の標的抗原又はその免疫学的エピトープをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、複製欠損型ウイルスベクターは、1つ以上の標的抗原又はその免疫学的エピトープをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原は、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、組織特異的抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、酵母抗原、真菌抗原、原虫抗原、寄生虫抗原、マイトゲン、又はその組合せである。いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原は、葉酸受容体アルファ、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER2/neu、BRCA1、BRACHYURY、BRACHYURY(TIVS7-2、多型)、BRACHYURY(IVS7 T/C多型)、T BRACHYURY、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1-c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CEA、CDK-4/m、HER3、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、若しくはTEL/AML1、若しくはその改変変異体、スプライス変異体、機能的エピトープ、エピトープアゴニスト、又はその組合せである。いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原は、CEA、Brachyury、MUC1、MUC1-c、又はその任意の組合せである。いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原はCEAである。
【００１３】
いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原はBrachyuryである。
【００１４】
いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原は、MUC1又はMUC1-cである。
【００１５】
いくつかの態様において、1つ以上の標的抗原はHER3である。
【００１６】
いくつかの態様において、CEAは、配列番号30、配列番号31、又は配列番号29の1057〜3165位と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む。いくつかの態様において、MUC1-cは、配列番号32又は配列番号33と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、Brachyuryは、配列番号34と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、HER3は、配列番号27と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である配列を含む。
【００１９】
いくつかの態様において、複製欠損型ウイルスベクターは、選択可能マーカーをさらに含む。いくつかの態様において、選択可能マーカーは、LacZ遺伝子、チミジンキナーゼ、gpt、GUS、若しくはワクシニアK1L宿主域遺伝子、又はその組合せである。
【００２０】
種々の態様において、本開示は、本明細書に記述される任意の組成物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
種々の態様において、本開示は、本明細書に記述される任意の組成物を含む宿主細胞を提供する。
【００２２】
種々の態様において、本開示は、腫瘍ワクチンを製造する方法であって、本明細書に記述される任意の医薬組成物を製造するステップを含む、方法を提供する。
【００２３】
種々の態様において、本開示は、それを必要とする対象における免疫応答を増強する方法であって、本明細書に記述される任意の組成物又は本明細書に記述される任意の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２４】
種々の態様において、本開示は、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、本明細書に記述される任意の組成物又は本明細書に記述される任意の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２５】
いくつかの態様において、本方法は、医薬組成物を対象に再投与するステップをさらに含む。
【００２６】
いくつかの態様において、本方法は、免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与するステップをさらに含む。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、又はCD244を阻害する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、PD1又はPDL1を阻害する。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗PD1又は抗PDL1抗体である。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗PDL1抗体である。
【００２７】
いくつかの態様において、投与は、静脈内、皮下、リンパ内、腫瘍内、皮内、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、経口、膀胱内注入による、又はスカリフィケーション（scarification）による。
【００２８】
いくつかの態様において、増強される免疫応答は細胞性又は液性応答である。いくつかの態様において、増強される免疫応答は、B細胞増殖の増強、CD4+ T細胞増殖の増強、CD8+ T細胞増殖の増強、又はその組合せである。いくつかの態様において、増強される免疫応答は、IL-2産生の増強、IFN-γ産生の増強、又はその組合せである。いくつかの態様において、増強される免疫応答は、抗原提示細胞増殖の増強、機能の増強、又はその組合せである。
【００２９】
いくつかの態様において、対象は、アデノウイルスベクターを過去に投与されている。いくつかの態様において、対象は、アデノウイルスベクターに対して既存の免疫を有する。いくつかの態様において、対象は、アデノウイルスベクターに対して既存の免疫を有すると決定されている。
【００３０】
いくつかの態様において、本方法は、化学療法剤、放射線、異なる免疫療法、又はその組合せを対象に投与するステップをさらに含む。
【００３１】
いくつかの態様において、対象はヒト又は非ヒト動物である。
【００３２】
いくつかの態様において、対象は、がんに関して過去に治療されている。
【００３３】
いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、少なくとも3回繰り返される。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、少なくとも1×109〜少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、1用量あたり5×109個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、1用量あたり少なくとも5×1010個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、1用量あたり少なくとも5×1011個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、1用量あたり少なくとも5×1012個のウイルス粒子を含む。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、2週間又は3週間毎に繰り返される。
【００３４】
いくつかの態様では、治療有効量を投与するステップの後に、同じ組成物又は医薬組成物を含むブースター免疫を1回以上行う。いくつかの態様において、ブースター免疫は、1カ月毎、2カ月毎、3カ月毎、4カ月毎、5カ月毎、6カ月毎、7カ月毎、8カ月毎、9カ月毎、10カ月毎、11カ月毎、若しくは12カ月毎、又はそれより多くの月数毎で投与される。いくつかの態様において、ブースター免疫は、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、又は12回以上繰り返される。いくつかの態様において、治療有効量を投与するステップは、初回免疫を、1週間毎、2週間毎、又は3週間毎に3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、又は12回以上繰り返した後に、ブースター免疫を、1カ月毎、2カ月毎、3カ月毎、4カ月毎、5カ月毎、6カ月毎、7カ月毎、8カ月毎、9カ月毎、10カ月毎、11カ月毎、若しくは12カ月毎、又はそれより多くの月数毎で3回以上繰り返すことである。
【００３５】
一部の態様において、方法は、工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞の集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を実質的に欠如するように改変されている1つ以上のNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されている1つ以上のNK細胞、及び1つ以上のCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されている1つ以上のNK細胞、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、KIRの発現を実質的に欠如するように改変されている1つ以上のNK細胞を含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、高親和性CD16変異体を発現するように改変されている1つ以上のNK細胞を含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、1つ以上のCARを発現するように改変されている1つ以上のNK細胞を含む。さらなる態様において、CARは、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、HER2/neu、HER3、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せのCARである。
【００３６】
いくつかの態様において、複製欠損型アデノウイルスベクターは、細胞内に含まれる。いくつかの態様において、細胞は樹状細胞(DC)である。
【００３７】
いくつかの態様において、本方法は、IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む。
【００３８】
いくつかの態様において、対象は、HER2/neu発現がんを有する。いくつかの態様において、対象は、HER2/neu発現乳がんを有する。いくつかの態様において、対象は、HER2/neu発現骨がんを有する。いくつかの態様において、がんは骨肉腫である。いくつかの態様において、対象は、HER2/neu発現胃がんを有する。いくつかの態様において、対象は、切除不能、局所進行、又は転移性がんを有する。いくつかの態様において、本方法は、追加のがん治療剤を対象に投与するステップをさらに含む。
【００３９】
以下の図面は、本明細書の一部を成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組合せて、1つ以上のこれらの図面を参照することによってより良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuベクター、pAd5CMV/HER2/neu/Δppの制限地図の例示的な実施形態を示す。
【図２】臨床研究デザイン及び処置レジメンの例示的な実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
様々な実施形態の作製及び使用を、以下に詳細に考察するが、本明細書において提供される本発明の多くの応用可能な概念を広く多様な特定の状況で具体化することができると認識すべきである。本明細書において考察した特定の実施形態は、本発明を作製及び使用するための特定の方法の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を定めるものではない。
【００４２】
ある特定の態様の理解を容易にするため、複数の用語を以下に定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００４３】
「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」などの用語は、単数形の実体のみを指すと意図されず、その例示のために具体例が使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、その使用は、特許請求の範囲に概要されている場合を除き、本発明の範囲を定めるものではない。
【００４４】
「個体」、「対象」、又は「患者」は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、又はブタを含むがこれらに限定されない、治療が望ましい任意の単一の対象を意味する。疾患のいかなる臨床徴候も示さない、臨床研究試験に関係する任意の対象、疫学的試験に関係する対象、又は対照として使用される対象も同様に、対象として含まれると意図される。
【００４５】
本明細書において使用される用語「遺伝子」は、機能的タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする単位を指す。当業者によって理解されるように、この機能的用語は、人為的に変更されていてもよいものを含む、ゲノム配列、cDNA配列、又はその断片若しくは組合せ、並びに遺伝子産物を含む。精製された遺伝子、核酸、タンパク質等は、それが一般に会合している少なくとも1つの混入している核酸又はタンパク質から同定及び分離されている場合にこれらの実体を指すために使用される。用語「アレル」、又は「アレル型」は、同じ機能的タンパク質をコードするが同じ遺伝子の別の型と比較してヌクレオチド配列の差を含む、遺伝子の代替型を指す。ある特定の態様では、「遺伝子」という用語は、遺伝子、及びその現在知られているすべての変異体、及びさらに解明され得るあらゆるさらなる変異体を意味する。
【００４６】
本明細書において使用される「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成された断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼの作用、及びエキソヌクレアーゼの作用のいずれかによって生成された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(DNA及びRNAなどの)、又は天然に存在するヌクレオチドのアナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα-エナンチオマー型)、又はその両方の組合せであるモノマーで構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び/又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖の修飾は、例えば1つ以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基への置換を含むか、又は糖を、エーテル若しくはエステルとして官能化することができる。その上、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環糖アナログなどの立体的及び電子的に類似の構造に置換することができる。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーを、ホスホジエステル結合又はそのような結合のアナログによって結合することができる。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート等が挙げられる。用語「核酸分子」はまた、ポリアミド骨格に結合した、天然に存在する又は修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００４７】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、冠詞「1つの」は、それ以外であることが明白に提供されていない限り、1つ以上を意味する。
【００４８】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、「含む(contain)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(including)」等の用語は、「含む」を意味する。
【００４９】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、用語「又は」は、結合的又は離接的であり得る。
【００５０】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、任意の実施形態を、他の任意の実施形態と組み合わせることができる。
【００５１】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、本明細書における一部の本発明の実施形態は、数字の範囲を企図している。多様な態様を、範囲の形式で表すことができる。範囲の形式での記載は単に簡便及び簡潔にするためであり、本発明の範囲の変更できない制限として解釈すべきではないと理解すべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能性がある小範囲、並びにその範囲内の個々の数値を明白に記載されているかのように有すると考えるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等などの具体的に開示された小範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、3、4、5、及び6を有すると考えるべきである。このことは、範囲の幅によらず当てはまる。範囲が存在する場合、範囲は範囲の終点を含む。
【００５２】
用語「アデノウイルス」又は「Ad」は、アデノウイルス(Adenoviridae)科の無エンベロープDNAウイルス属を指す。ヒト宿主に加えて、これらのウイルスは、鳥類、ウシ、ブタ、及びイヌ種に見出され得るがこれらに限定されない。ある特定の態様は、E2b欠失型ウイルスベクター又は本明細書に記載の他の欠失を含むベクターの基礎として、アデノウイルス科の4つの属(例えば、アビアデノウイルス(Aviadenovirus)、マストアデノウイルス(Mastadenovirus)、アタデノウイルス(Atadenovirus)、及びシアデノウイルス(Siadenovirus))のいずれかの任意のアデノウイルスの使用を企図し得る。加えて、いくつかの血清型が各々の種に見出される。Adはまた、同種又は異種DNA配列の遺伝子変異、欠失、又は転位を含むがこれらに限定されないこれらのウイルス血清型のいずれかの遺伝的誘導体にも関する。
【００５３】
「ヘルパーアデノウイルス」又は「ヘルパーウイルス」は、特定の宿主細胞が供給することができないウイルス機能を供給することができるAdを指す(宿主は、E1タンパク質などのAd遺伝子産物を提供し得る)。このウイルスは、第二のウイルス又はヘルパー依存性ウイルス(例えば、gutted若しくはgutlessウイルス、又はE2b若しくは本明細書に記載の他の領域などの特定の領域が欠失しているウイルス)において欠如している機能(例えば、タンパク質)をトランスで供給するために使用され、第一の複製インコンピテントウイルスは、第二のヘルパー依存性ウイルスを「助け」、それによって細胞における第二のウイルスゲノムの産生を可能にすると言われる。
【００５４】
本明細書において使用される用語「アデノウイルス5 null(Ad5null)」は、発現のためのいかなる異種核酸配列も含まない非複製Adを指す。
【００５５】
本明細書において使用される用語「第一世代アデノウイルス」は、初期領域1(E1)が欠失しているAdを指す。追加の例において、非必須の初期領域3(E3)も同様に欠失していてもよい。
【００５６】
本明細書において使用される用語「gutted」又は「gutless」は、全てのウイルスコード領域が欠失されているアデノウイルスベクターを指す。
【００５７】
本明細書において使用される用語「トランスフェクション」は、外来核酸を真核細胞に導入することを指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈殿、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及び遺伝子銃を含む当技術分野で公知の多様な手段によって達成することができる。
【００５８】
用語「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトした」は、トランスフェクトした細胞のゲノムへの外来核酸、DNA、又はRNAの導入及び組み込みを指す。用語「安定なトランスフェクタント」は、外来DNAがゲノムDNAに安定に組み込まれている細胞を指す。
【００５９】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター分子(酵素を含む)をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」は、酵素ベース検出アッセイ(例えば、ELISA並びに酵素ベース組織化学アッセイ)、蛍光、放射活性、及び発光系を含むがこれらに限定されない多様な任意の検出系において検出可能である。
【００６０】
一実施形態において、大腸菌(E. coli)β-ガラクトシダーゼ遺伝子(Pharmacia Biotech, Pistacataway, N.J.から入手可能)、緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clontech, Palo Alto, Calif.から販売)、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子がレポーター遺伝子として提供され得るが、他のレポーター遺伝子が当技術分野で公知であり、これらを使用してもよい。
【００６１】
本明細書において使用される用語「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、及び「をコードするDNA」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。このように、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００６２】
本明細書において使用される用語「異種核酸配列」は、それが天然においてライゲートされていない又は天然において異なる位置でライゲートされている核酸配列に、ライゲートされているヌクレオチド配列、又はライゲートされるように操作されているヌクレオチド配列を指す。異種核酸は、それが導入されている細胞に天然に見出されるヌクレオチド配列を含み得るか、又は異種核酸は、天然に存在する配列と比較して何らかの修飾を含み得る。
【００６３】
用語「トランスジーン」は、試験対象の細胞又はゲノムに導入されている、任意の遺伝子コード領域、天然若しくは異種核酸配列、又は融合された同種若しくは異種核酸配列のいずれかを指す。ある特定の態様において、トランスジーンは、対象の細胞にトランスジーンを導入するために使用される任意のウイルスベクター上に担持される。
【００６４】
本明細書において使用される用語「第二世代アデノウイルス」は、E1、E2、E3、及びある特定の実施形態において、E4 DNA遺伝子配列の全て又は一部がウイルスから欠失(除去)されているAdを指す。
【００６５】
本明細書において使用される、核酸配列、遺伝子、又はポリペプチドに適用される用語「断片又はセグメント」は、通常、長さが少なくとも約5連続核酸塩基(核酸配列又は遺伝子に関して)又はアミノ酸(ポリペプチドに関して)であり、典型的に少なくとも約10連続核酸塩基又はアミノ酸、より典型的に少なくとも約20連続核酸塩基又はアミノ酸、通常少なくとも約30連続核酸塩基又はアミノ酸、好ましくは少なくとも約40連続核酸塩基又はアミノ酸、より好ましくは少なくとも約50連続核酸塩基又はアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約60〜80又はそれより多い続核酸塩基又はアミノ酸であろう。本明細書において使用される「重複する断片」は、核酸又はタンパク質のアミノ末端で始まり、核酸又はタンパク質のカルボキシ末端で終わる連続する核酸又はペプチド断片を指す。各々の核酸又はペプチド断片は、次の核酸又はペプチド断片と共通する少なくとも約1つの連続する核酸又はアミノ酸位置、より好ましくは共通する少なくとも約3個の連続する核酸塩基又はアミノ酸位置、最も好ましくは、共通する少なくとも約10個の連続する核酸塩基、アミノ酸位置を有する。
【００６６】
核酸の状況において有意な「断片」は、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的に少なくとも20ヌクレオチド、より一般的に少なくとも23ヌクレオチド、通常、少なくとも26ヌクレオチド、より通常、少なくとも29ヌクレオチド、しばしば少なくとも32ヌクレオチド、よりしばしば少なくとも35ヌクレオチド、典型的に少なくとも38ヌクレオチド、より典型的に少なくとも41ヌクレオチド、通常、少なくとも44ヌクレオチド、より通常、少なくとも47ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも53ヌクレオチドの連続するセグメントであり、特に好ましい実施形態において、少なくとも56ヌクレオチド以上であろう。
【００６７】
「ベクター」は、細胞に形質導入、トランスフェクト、形質転換、又は感染し、それによって細胞に対してネイティブであるもの以外の、又は細胞に対してネイティブでない方法で、核酸及び/又はタンパク質を細胞に発現させることができる組成物である。細胞は、核酸が細胞外環境から細胞内に移動した場合、核酸によって「形質導入」されている。核酸を細胞内に移入する任意の方法を使用してもよく、この用語は、特に示していない限り核酸を細胞に送達するいかなる特定の方法も意味しない。細胞は、核酸が、細胞に形質導入され、安定に複製される場合、核酸によって「形質転換」されている。ベクターは、細胞が発現する核酸(通常、RNA又はDNA)を含む。ベクターは、任意選択でウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等などの、細胞への核酸の流入の達成を助ける材料を含む。「細胞形質導入ベクター」は、核酸が細胞に形質導入されると、細胞において安定に複製及び発現することができる核酸をコードするベクターである。
【００６８】
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用する場合の用語「変異体」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義はまた、例えば、「アレル」、「スプライス」、「種」、又は「多型」変異体を含み得る。スプライス変異体は、参照分子と有意な同一性を有し得るが、一般的にはmRNAプロセシングの間のエクソンの選択的スプライシングにより、より多くの又はより少ない数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有してもよく、又はドメインを有しなくてもよい。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。野生型標的遺伝子の変異体は、本発明において特に有用である。変異体は、核酸配列における少なくとも1つの変異に起因し、それによって変化したmRNAをもたらし得るか、又はその構造若しくは機能が変化してもよく若しくは変化しなくてもよいポリペプチドをもたらし得る。任意の所定の天然又は組み換え遺伝子が、ゼロ、1つ、又は複数のアレル型を有し得る。変異体を生じる一般的な変異による変化は、一般的にヌクレオチドの天然の欠失、付加、又は置換が原因である。これらのタイプの変化の各々は、単独で、又は他と組み合わせて、所定の配列において1回以上起こり得る。
【００６９】
本明細書において使用されるポリペプチドの「変異体」は、1つ以上のアミノ酸残基が変化しているアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造又は化学特性を有する「保存的」変化(例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換)を有し得る。よりまれではあるが、変異体は、「非保存的」変化(例えば、グリシンのトリプトファンへの置換)を有し得る。類似の少数の多様性はまた、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はその両方を含み得る。生物活性を失うことなくいずれのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失することができるかを決定するための指針は、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を使用して見出され得る。
【００７０】
得られたポリペプチドは、一般的に互いと比較して有意なアミノ酸同一性を有する。多型変異体は、所定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における多様性である。多型変異体はまた、「一塩基多型」(SNP)又はポリヌクレオチド配列が1塩基のみ異なる一塩基変異も包含し得る。
【００７１】
「抗原」は、抗体又はTリンパ球(T細胞)と特異的に反応する任意の物質である。「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子の部分である。さらに、抗原結合部位は、MHC分子又はT細胞受容体を含むがこれらに限定されない任意の抗原結合分子上の任意のそのような部位を含む。「抗原の処理」は、抗原の断片への分解(例えば、タンパク質のペプチドへの分解)、及び「抗原提示細胞」によって特異的T細胞に提示するための、これらの断片の1つ以上とMHC分子との会合(例えば、結合を介して)を指す。
【００７２】
「樹状細胞」(DC)は、in vivoで強固な適応免疫応答を誘発することができる強力な抗原提示細胞である。活性化された成熟DCは、T細胞の活性化及び増殖にとって必要なシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは、2つのタイプに分類することができる。第一のタイプは、免疫応答の特異性を生じ、T細胞受容体/CD3(「TCR/CD3」)複合体と、APCの表面上の主要組織適合遺伝子複合体(上記で定義した「MHC」)クラスI又はIIタンパク質によって提示される抗原性ペプチドとの間の相互作用を介して媒介される。第二のタイプのシグナルは、共刺激シグナルと呼ばれ、抗原特異的でもMHC拘束性でもなく、第一のタイプのシグナルの存在下でT細胞の完全な増殖応答及びT細胞エフェクター機能の誘導をもたらし得る。したがって、この二重のシグナリングによって、強固な免疫応答をもたらし得る。上記で注目したように、ほとんどの鳥類以外の脊椎動物において、DCは、骨髄由来前駆体から生じる。未成熟DCは、末梢血及び臍帯血及び胸腺において見出される。追加の未成熟集団が他所に存在し得る。様々な成熟段階のDCはまた、脾臓、リンパ節、扁桃、及びヒト腸にも見出される。鳥類のDCは、鳥類に独自の主要な免疫器官であるファブリキウス嚢にも見出され得る。特定の実施形態において、樹状細胞は、哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、又はラットである。
【００７３】
「共刺激分子」は、T細胞表面上のT細胞受容体に結合したペプチドMHC複合体と共に作用すると、ペプチドに結合するT細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する任意の単一の分子又は分子の組合せを包含する。
【００７４】
「診断」又は「診断された」は、病態の存在又は性質を特定することを意味する。診断方法は、その感度及び特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、試験陽性である疾患を有する個体の百分率(「真の陽性」の百分率)である。アッセイによって検出されない疾患を有する個体は「偽陰性」である。疾患を有さず、アッセイにおいて試験陰性である対象は「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、1マイナス偽陽性率であり、「偽陽性」率は、試験陽性であるが疾患を有しない対象の割合として定義される。特定の診断方法は状態の確定診断を提供しない場合があるが、方法が診断を助ける陽性の指標を提供すれば、それで十分である。
【００７５】
本出願を通して、用語「約」は、値が、装置の誤差の固有の変動、値を決定するために使用する方法、又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００７６】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される用語「含む(comprising)」(並びに「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの「含む」の任意の形態)、「有する(having)」(並びに「有する(have)」及び「有する(has)」などの「有する」の任意の形態)、「含む(including)」(並びに「含む(includes)」及び「含む(include)」などの「含む」の任意の形態)、又は「含む(containing)」(並びに「含む(contains)」及び「含む(contain)」などの「含む」の任意の形態)は、包括的であるか又は非制限的であり、追加の列挙されていない構成要素又は方法のステップを除外しない。本明細書において使用される語句「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、明記された材料又はステップ、及び特許請求される発明の基本的な新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップに限定する。本明細書において使用される語句「からなる」は、例えば構成要素又は限定に通常付随する不純物を除いて、特許請求の範囲に明記されていないいかなる構成要素、ステップ、又は成分も除外する。
【００７７】
本明細書において使用される用語「又はその組合せ」は、用語の前にある記載の項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「A、B、C、又はその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、又はABCの少なくとも1つ、及び特定の文脈において順序が重要である場合には、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、又はCABも同様に含むと意図される。この例を続けると、1つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組合せ、例えばBB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等も、明白に含まれる。当業者は、本文から明らかである場合を除き、典型的に、任意の組合せの項目又は用語の数に制限がないことを理解するであろう。
【００７８】
本明細書において使用される、「約」、「実質的な」、又は「実質的に」などの、しかしこれらに限定されない近似の用語は、そのように修飾された場合に必ずしも絶対又は完全であると理解されないが、状態が存在することを当業者が明確に示すのを保証するために十分に近いと考えられる状態を指す。記載が変動し得る程度は、どれほど多くの変化を設定することができ、それでもなお当業者が、修飾された構成が修飾されていない構成の必要な特徴及び能力をなおも有すると認識することができるかに依存する。一般的に、しかし先の考察を受けて、「約」などの近似の用語で修飾された本明細書における数値は、記載の値から少なくとも±1、2、3、4、5、6、7、10、12、又は15%変動し得る。
【００７９】
上述の種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照され、かつ/又は出願データシートに列記された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許公開文献はすべて、各個別の公開文献、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
実施形態の態様は、種々の特許、出願、及び公開文献の概念を用いてなおもさらなる実施形態を提供するために必要であれば、改変してもよい。
【００８１】
これら及び他の変更は、上記に詳述された記述を考慮のうえ、諸実施形態に行ってよい。概して、続く特許請求の範囲において使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、むしろ、そのような特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と併せて可能性のあるすべての実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
【００８２】
I.  HER2/neu標的抗原
ある特定の態様では、例えば本明細書に記述されるHER2/neu抗原又はエピトープなどの目的の標的タンパク質又は標的抗原を1つ以上コードする核酸配列を含む、発現構築物又はベクターが提供され得る。
【００８３】
HER-2/neu(p185)は、HER-2/neuがん遺伝子のタンパク質産物である。いくつかの態様において、HER-2/neu遺伝子が増幅され、HER-2/neuタンパク質は、乳がん、卵巣がん、胃がん、結腸がん、肺がん、前立腺がん、及び骨がんをはじめとする様々ながんで過剰発現する。いくつかの態様において、HER-2/neuは、悪性形質転換に関連している。いくつかの態様において、これは、腺管上皮内がんの50%〜60%及びすべての乳がんの20%〜40%に見られるほか、卵巣、前立腺、結腸、及び肺で生じる腺がんにおいてもかなりの割合で見られる。いくつかの態様において、HER-2/neuタンパク質は、骨肉腫を含む骨のがんで過剰発現する。いくつかの態様において、HER-2/neuはすべての浸潤性乳がんの四分の一に見られ、悪性表現型のみならず悪性腫瘍の侵襲性とも深く関連している。いくつかの態様において、HER-2/neuの過剰発現は、乳がん及び卵巣がんの両方における予後不良と相関している。
【００８４】
いくつかの態様において、HER-2/neuは、およそ1255アミノ酸(aa)長である185kdの相対分子質量を有する膜貫通タンパク質である。これは、上皮増殖因子受容体(EGFR)に対して40%の相同性があるおよそ645aaの細胞外結合ドメイン(ECD)、高度に疎水性の膜貫通ドメイン(TM)、及びEGFRに対して80%の相同性があるおよそ580aaの細胞内ドメインを有する。
【００８５】
さらなる態様では、少なくとも、最大で、又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、若しくは500個、又はこれらの数から得られる任意の数字若しくは範囲の、様々な目的の標的抗原をコードする核酸を含有し得る、発現構築物又はベクターが提供され得る。発現構築物又はベクターは、1つのHER2/neu抗原の複数の断片又はエピトープをコードする核酸配列を含有し得るか、又は本明細書に記述されるHER2/neu抗原又はエピトープを含む多数の異なる標的抗原の1つ以上の断片又はエピトープを含有し得る。
【００８６】
HER2/neu抗原は、完全長タンパク質である場合もあれば、その免疫原性断片(例えばエピトープ)である場合もある。免疫原性断片は、例えば、Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)及びこの文献に引用された参考文献に概説されているものなど、利用可能な技術を使用して特定することができる。免疫原性断片を特定するための代表的な技術は、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株クローンと反応する能力に関するポリペプチドのスクリーニングを含む。特定の標的ポリペプチドの免疫原性断片は、完全長の標的ポリペプチドの反応性を(例えばELISA及び/又はT細胞反応性アッセイにおいて)実質的に下回らないレベルでそのような抗血清及び/又はT細胞と反応する断片であり得る。言い換えると、免疫原性断片は、そのようなアッセイにおいて完全長ポリペプチドの反応性と同様か又はそれを上回るレベルで反応し得る。そのようなスクリーニングは概して、例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記述されているものなど、当業者に利用可能な方法を使用して行うことができる。
【００８７】
場合により、HER2/neuエピトープなどの免疫原性エピトープは、8〜10アミノ酸長であり得る。場合により、HER2/neuエピトープは、4〜10アミノ酸長であるか、又は10アミノ酸長を超える。HER2/neuエピトープなどの免疫原性エピトープは、少なくとも、約、又は最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個、又はこれらの数から得られる任意の数字若しくは範囲のアミノ酸長を含み得る。HER2/neuエピトープなどの免疫原性エピトープは、任意のアミノ酸長とすることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、HER2/neuエピトープは、配列番号1(膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含有する切断型HER2/neuの核酸配列)又は配列番号3の1033〜3107位と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を有し得る。ある特定の実施形態では、HER2/neuエピトープは、配列番号1又は配列番号3の1033〜3107位(Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuベクターの核酸配列(ここで、HER2/neuは配列番号1の切断型HER2/neuである))に記載の配列を有し得る。いくつかの実施形態では、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuベクターは、配列番号3と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンは、Ad5[E1-,E2b-]-HER3ワクチンと組み合わせてもよく、ここでHER3抗原は、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含む切断型HER3抗原であってもよい。いくつかの実施形態では、HER3抗原は、配列番号27(膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを含有する切断型HER3の核酸配列)と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一である核酸配列を有し得る。
【００８９】
標的抗原のさらなる非限定的な例としては、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2/neu)、がん胎児抗原(CEA)、腫瘍ネオ抗原若しくは腫瘍ネオエピトープ、葉酸受容体アルファ、WT1、brachyury(TIVS7-2、多型)、brachyury(IVS7 T/C多型)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、HER2/neu、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1-c、MUC1-n、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、ヒト上皮増殖因子受容体3(HER3)、アルファアクチニン4、ARTC1、CAR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、ベータカテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、ミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARアルファ融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1融合タンパク質若しくはSYT-SSX2融合タンパク質、TGFベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、GAGE-1、2、8、Gage 3、4、5、6、7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、ムチン、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、マンマグロビン-A、メラン-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、IL13Rアルファ2、腸管カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトプロテイン、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、p53、PBF、PRAME、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、サバイビン、テロメラーゼ、VEGF、又はその任意の組合せが挙げられる。
【００９０】
いくつかの態様において、本明細書で使用される腫瘍ネオエピトープは、EQVWGMAVR(配列番号6)又はCQGPEQVWGMAVREL(配列番号7)(FLRT2のR346W突然変異)、GETVTMPCP(配列番号8)又はNVGETVTMPCPKVFS(配列番号9)(VIPR2のV73M突然変異)、GLGAQCSEA(配列番号10)又はNNGLGAQCSEAVTLN(配列番号11)(FCRL1のR286C突然変異)、RKLTTELTI(配列番号12)、LGPERRKLTTELTII(配列番号13)、又はPERRKLTTE(配列番号14)(FAT4のS1613L突然変異)、MDWVWMDTT(配列番号15)、AVMDWVWMDTTLSLS(配列番号16)、又はVWMDTTLSL(配列番号17)(PIEZO2のT2356M突然変異)、GKTLNPSQT(配列番号18)、SWFREGKTLNPSQTS(配列番号19)、又はREGKTLNPS(配列番号20)(SIGLEC14のA292T突然変異)、VRNATSYRC(配列番号21)、LPNVTVRNATSYRCG(配列番号22)、又はNVTVRNATS(配列番号23)(SIGLEC1のD1143N突然変異)、FAMAQIPSL(配列番号24)、PFAMAQIPSLSLRAV(配列番号25)、又はAQIPSLSLR(配列番号26)(SLC4A11のQ678P突然変異)などの腫瘍特異的エピトープである。
【００９１】
腫瘍関連抗原は、宿主によって通常発現されない抗原であり得る。それらは、宿主によって通常発現される分子の突然変異型、切断型、ミスフォールディング型、又は異常な発現物(manifestation)である場合もあり、通常発現される分子と同一であるが異常に高いレベルで発現される場合もあり、又は異常な背景若しくは環境で発現される場合もある。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質若しくはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生体分子、又はその任意の組合せであり得る。
【００９２】
II.  CEA標的抗原
本明細書において開示されるものには、HER2/neu抗原をコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はCEAなどのムチンファミリー抗原をコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はBrachyuryをコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はMUC1-cをコードする1つ以上の核酸配列を同じ又は別の複製欠損型ベクターに含む、複製欠損型ベクターを含む組成物が含まれる。
【００９３】
CEAは、ほぼすべての直腸結腸がん及び膵がんで過剰発現し、一部の肺がん及び乳がん、並びに甲状腺髄様がんなどの珍しい腫瘍でも発現するが、胃腸上皮における低レベルの発現を除いては他の体細胞で発現しないため、免疫療法のための魅力的な標的抗原である。CEAは、MHC制限様式でT細胞によって認識され得るエピトープを含有する。
【００９４】
マウスにおいて、腫瘍抗原CEAをコードするAd5[E1-,E2b-]-CEA(6D)による複数回の同種免疫化は、既存又は誘導性のAd5中和抗体の存在にもかかわらず、抗腫瘍活性を伴うCEA特異的な細胞性免疫(CMI)応答を誘導した。この第I/II相研究では、進行直腸結腸がん患者のコホートが漸増用量のAd5[E1-,E2b-]-CEA(6D)で免疫化された。患者の過半数(61.3%)において既存のAd5免疫が存在したにもかかわらず、CEA特異的CMI応答が観察された。重要なことに、毒性は最小限であり、全体的な患者の生存率(12カ月で48%)は、既存のAd5中和抗体価を問わず同様であった。この結果は、がん患者において、新規のAd5[E1-,E2b-]遺伝子送達プラットフォームが、天然の獲得免疫及び免疫化により誘導されたAd5特異免疫の両方の状況で腫瘍抗原CEAに対してかなりのCMI応答を発生させることを示す。
【００９５】
CEA抗原特異的CMIは、例えば、106個の末梢血単核球(PBMC)あたり10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000、又はそれより多くのIFN-γスポット形成細胞(SFC)であり得る。いくつかの実施形態では、免疫応答は、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、1000、12000、15000、又はそれより多くの既存の逆(inverse)Ad5中和抗体価でヒト対象において上昇する。免疫応答は、本明細書に記述されるように、細胞性免疫及び/又は液性免疫を含み得る。免疫応答は、本明細書に記述されるように、また当業者に利用可能である範囲において、細胞内サイトカイン染色(ICS)、ELISpot、増殖アッセイ、クロム放出アッセイ若しくは同等のアッセイを含む細胞傷害性T細胞アッセイ、及び任意の数のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した遺伝子発現解析又はRT-PCRベースのアッセイ、並びに当技術分野で公知である免疫応答を測定するための任意の他の好適なアッセイのうちの1つ以上によって、測定することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスベクターは、ポリペプチドの野生型サブユニットと、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、又は99.9%の同一性を有するサブユニットをコードする改変配列を含む。
【００９７】
免疫原性ポリペプチドは、突然変異体CEA又はその断片であり得る。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、610位にAsn→Asp置換を有する突然変異体CEAを含む。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドと、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、又は99.9%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号30(CEA-CAP1(6D)の核酸配列)又は配列番号31(突然変異型CAP1(6D)エピトープのアミノ酸配列)の配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、配列番号30又は配列番号31と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、又は99.9%の同一性を有する配列、又は代替的コドンの置き換えによって配列番号30又は配列番号31から生成された配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトCEA配列と比較して、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、又はそれより多くの点突然変異、例えば単一アミノ酸置換又は欠失を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、配列番号30若しくは配列番号31の配列、又は、例えば最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、又はそれより多くの点突然変異、例えば単一アミノ酸置換又は欠失を含む、配列番号30又は配列番号31の改変バージョンを含む。
【０１００】
CEA遺伝子ファミリーのメンバーは、配列類似性、発生上の発現パターン、及びそれらの生物学的機能に基づいて、12種の遺伝子(CEACAM1、CEACAM3〜CEACAM8、CEACAM16、及びCEACAM18〜CEACAM21)を含有するCEA関連細胞接着分子(CEACAM)サブグループ、11種の密接に関連した遺伝子(PSG1〜PSG11)を含有する妊娠特異糖タンパク質(PSG)サブグループ、及び11種の偽遺伝子(CEACAMP1〜CEACAMP11)のサブグループの、3つのサブグループに細分される。CEACAMサブグループのほとんどのメンバーは、免疫グロブリン可変ドメインとの構造相同性がある単一のN末端Vセットドメインから構成された細胞外Ig様ドメインに続いて、様々な数のA又はBのサブタイプのC2セットドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる同様の構造を有する。CEACAMサブグループには、その構造組織においていくつかの例外を示す2つのメンバー(CEACAM16及びCEACAM20)が存在する。CEACAM16は、そのN及びC末端に2つのIg様V型ドメインを含有し、CEACAM20は、切断型Ig様V型1ドメインを含有する。CEACAM分子は、その膜貫通ドメインを介して細胞表面に固定される場合(CEACAM5からCEACAM8)、又はグリコホスファチジルイノシトール(GPI)脂質部分に直接結合する場合(CEACAM5、CEACAM18からCEACAM21)がある。
【０１０１】
CEAファミリーメンバーは様々な細胞型で発現し、広範囲の生物学的機能を有する。CEACAMは、ほとんどの上皮細胞に顕著に見られ、様々な白血球に存在する。ヒトでは、CEAファミリーの祖先メンバーであるCEACAM1が、上皮細胞及び内皮細胞の頂端側、並びにリンパ球系細胞及び骨髄系細胞で発現する。CEACAM1は、出血性相互作用(CEACAM1〜CEACAM1)のほか、ヘテロタリックな相互作用(例えばCEACAM1〜CEACAM5)によって細胞間の接着を媒介する。加えて、CEACAM1は、血管新生、細胞遊走、及び免疫機能など、多くの他の生物学的プロセスに関与している。CEACAM3及びCEACAM4の発現は主に顆粒球に制限されており、またこれらは、ナイセリア属(Neisseria)、モラクセラ属(Moraxella)、及びヘモフィルス属(Haemophilus)種を含むいくつかの細菌性病原体の取り込み及び破壊を媒介することができる。
【０１０２】
したがって、種々の実施形態において、組成物及び方法は、CEACAM1、CEACAM3、CEACAM4、CEACAM5、CEACAM6、CEACAM7、CEACAM8、CEACAM16、CEACAM18、CEACAM19、CEACAM20、CEACAM21、PSG1、PSG2、PSG3、PSG4、PSG5、PSG6、PSG7、PSG8、PSG9、及びPSG11からなる群から選択されるCEAに対する免疫応答を高めることに関する。本方法及び組成物を使用すると、CEAのうちの1つ以上を発現又は過剰発現する細胞、例えばがん細胞に対して免疫応答が高められ得る。いくつかの実施形態では、そのようながん細胞における1つ以上のCEAの過剰発現は、非がん細胞と比較して5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍又はそれより多くである。
【０１０３】
ある特定の態様では、本明細書で使用されるCEA抗原は、野生型CEA抗原、又はCEAのCAP1エピトープであるYLSGANLNL(配列番号28)に少なくとも1つの突然変異を有する改変されたCEA抗原である。突然変異は、保存的又は非保存的、置換、付加、又は欠失であってもよい。ある特定の実施形態では、本明細書で使用されるCEA抗原は、突然変異型CAP1エピトープであるYLSGADLNL(配列番号31)に記載のアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態において、第1の複製欠損型ベクター又はCEAを発現する複製欠損型ベクターは、配列番号29(改変されたCEA抗原を発現するアデノウイルスベクターの予測配列)の任意の部分、例えば配列番号29の1057〜3165位、又は完全長の配列番号29と、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、99.9%、又は100%同一であるヌクレオチド配列を有する。
【０１０４】
III.  ムチンファミリー標的抗原
本明細書において開示されるものには、HER2/neu抗原をコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はMUC1などのムチンファミリー抗原をコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はBrachyuryをコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はCEAをコードする1つ以上の核酸配列を同じ又は別の複製欠損型ベクターに含む、複製欠損型ベクターを含む組成物が含まれる。
【０１０５】
ヒトムチンファミリー(MUC1〜MUC21)は、体内における上皮表面での保護的な粘膜防壁の形成に関与する分泌型及び膜貫通型のムチンを含む。これらのタンパク質は、気道や胃腸管を覆い、例えば乳腺、肝臓、胃、膵臓、及び腎臓などの重要な臓器内の管を覆う上皮の保護において機能する。
【０１０６】
MUC1(CD227)は、ヒトがん腫の大部分及びいくつかの血液悪性腫瘍で過剰発現するTAAである。MUC1(GenBank:X80761.1、NCBI:NM_001204285.1)は、ヒト疾患に関与することが知られる多くの重要な細胞経路を活性化させる。MUC1は、いくつかのヒトがんで一般的に過剰発現する、2つのサブユニットから形成されたヘテロ二量体タンパク質である。MUC1は自己タンパク分解を経てMUC1n及びMUC1cという2つのサブユニットを生成し、これらが安定な非共有結合性のヘテロ二量体を形成する。
【０１０７】
MUC1のC末端サブユニット(MUC1c)は、58aaの細胞外ドメイン(ED)、28aaの膜貫通ドメイン(TM)、及び72aaの細胞質ドメイン(CD)を含み得る。MUC1cは、MUC1の二量体化を可能にし得る「CQC」モチーフを含有する場合もあり、これは細胞に発がん性機能を与える場合もある。場合により、MUC1は、MUC1cを介して細胞シグナル伝達を誘導することにより発がん性機能を与えることができる。MUC1cは、EGFR、ErbB2、及び他の受容体チロシンキナーゼと相互作用し、PI3K→AKT及びMEK→ERKの細胞経路の活性化に寄与し得る。核内において、MUC1cは、Wnt/β-カテニン、STAT、及びNF-κB RelA細胞経路を活性化させる。場合により、MUC1は、MUC1nを介して細胞シグナル伝達を誘導することにより発がん性機能を与えることができる。MUC1のN末端サブユニット(MUC1n)は、グリコシル化されている場合がある可変数の20アミノ酸タンデムリピートを含み得る。MUC1は通常、腺上皮細胞の表面で発現し、がん腫においては過剰発現し、異常にグリコシル化される。MUC1は、腫瘍免疫療法のための標的として利用され得るTAAである。免疫療法ワクチンにおけるMUC1の使用を評価するために、いくつかの臨床治験が過去にも現在にも行われている。重要なことに、これらの治験は、MUC1の標的化を用いた免疫療法が安全であり、いくつかの利益を提供し得ることを示している。
【０１０８】
しかしながら、臨床治験は、MUC1が比較的弱い免疫原であることも示している。これを克服するため、本発明者らは、MUC1腫瘍性タンパク質のC末端領域(MUC1-C又はMUC1c)におけるTリンパ球免疫エンハンサーペプチド配列を特定した。天然のペプチド配列と比較すると、それらの改変型のMUC1-Cのアゴニストは、(a)より低いペプチド濃度でHLA-A2に結合し、(b)より高いHLA-A2への結合活性を示し、(c)抗原提示細胞とともに使用したとき、天然ペプチドを使用した場合よりも多くのT細胞によるIFN-γの産生を誘導し、(d)がん患者からMUC1特異的ヒトT細胞株をより効率的に生成することができた。重要なことに、このアゴニストエピトープを使用して生成されたT細胞株は、天然エピトープを用いて生成されたものと比べ、天然エピトープをパルスした標的の溶解に関し、またMUC1を発現するHLA-A2ヒト腫瘍細胞の溶解において、より効率的であった。さらに、本発明者らは、MUC1-CのさらなるCD8+細胞傷害性Tリンパ球免疫エンハンサーアゴニスト配列エピトープを特定した。
【０１０９】
ある特定の態様では、免疫エンハンサー能力のために改変された強力なMUC1-C(mMUC1-C又はMUC1-C又はMUC1c)が提供される。本開示は、新しくより強力な免疫療法ワクチンを産生するために組換えAd5[E1-,E2b-]プラットフォームに組み込まれた、免疫エンハンサー能力のために改変された強力なMUC1-Cを提供する。例えば、この免疫療法ワクチンは、MUC1発現がん又は感染性疾患を処置するためのAd5[E1-,E2b-]-mMUC1-Cであり得る。
【０１１０】
翻訳後修飾は、体内そしてヒト疾患においてタンパク質機能をコントロールするのに重要な役割を果たす。例えば、上記に詳解したタンパク分解切断に加えて、MUC1は、グリコシル化、シアリル化、パルミトイル化、又はその組合せなど、いくつかの翻訳後修飾を特定のアミノ酸残基に有し得る。本明細書では、MUC1のグリコシル化、シアリル化、リン酸化、又はパルミトイル化修飾を標的とする免疫療法が提供される。
【０１１１】
MUC1は、高度にグリコシル化されている場合がある(N結合型及びO結合型の炭水化物、並びに各タンデムリピート内のセリン及びスレオニン残基における様々な程度のシアル酸。モノグリコシル化からペンタグリコシル化に及ぶ)。乳がんでは3,4結合したGlcNAcで差次的にO-グリコシル化されている。N-グリコシル化は、分泌型MUC1/SECの高マンノース型、酸性複合型、及びハイブリッド型のグリカン、並びに膜貫通型MUC1/TM.4の中性複合型からなる。本開示は、差次的にO-グリコシル化された形態のMUC1を標的とする免疫療法を提供する。
【０１１２】
さらに、MUC1はシアリル化されていてもよい。腎がん細胞及び乳がん細胞に由来する膜脱落糖タンパク質は、優先的にシアリル化されるコア1構造を有するが、同じ組織に由来する分泌型は、主にコア2構造を提示する。O-グリコシル化の内容は、これら両方の組織で重複しており、末端フコース及びガラクトース、2結合及び3結合ガラクトース、3結合及び3,6結合GalNAc-オール、並びに4結合GlcNAcが大部分を占める。本開示は、種々のシアリル化形態のMUC1を標的とする免疫療法を提供する。エンドソームから原形質膜への再循環のためには、CQCモチーフ内のシステイン残基における二重パルミトイル化が必要である。本開示は、種々のパルミトイル化形態のMUC1を標的とする免疫療法を提供する。
【０１１３】
リン酸化は、ヒトの健康に重要である特異的な細胞シグナル伝達応答を誘導するMUC1の能力に影響を及ぼし得る。本開示は、種々のリン酸化形態のMUC1を標的とする免疫療法を提供する。例えば、MUC1は、C末端ドメイン内のチロシン及びセリン残基においてリン酸化されていてもよい。C末端ドメイン内のチロシンにおけるリン酸化により、MUC1及びβ-カテニンの核内位置を増加させ得る。PKCデルタによるリン酸化は、β-カテニン/CTNNB1に対するMUC1の結合を誘導し、β-カテニン/E-カドヘリン複合体の形成を減少させ得る。MUC1のSrc媒介性リン酸化は、GSK3Bとの相互作用を阻害し得る。Tyr-1229におけるMUC1のSrc媒介性及びEGFR媒介性のリン酸化は、β-カテニン/CTNNB1に対する結合を増大させ得る。Ser-1227におけるMUC1のGSK3B媒介性リン酸化により、この相互作用が減少し得るが、β-カドヘリン/E-カドヘリン複合体の形成は回復する。MUC1のPDGFR媒介性リン酸化は、MUC1CT及びCTNNB1の核内に共存を増大させ得る。本開示は、MUC1の細胞シグナル伝達能力を制御することが知られる様々なリン酸化形態のMUC1、MUC1c、及びMUC1nを標的とする免疫療法を提供する。
【０１１４】
本開示は、MUC1cの細胞質ドメイン及び細胞におけるその機能を調節する免疫療法を提供する。本開示は、MUC1cのCQCモチーフを調節することを含む免疫療法を提供する。本開示は、MUC1cの細胞外ドメイン(ED)、膜貫通ドメイン(TM)、細胞質ドメイン(CD)、又はその組合せを調節することを含む免疫療法を提供する。本開示は、EGFR、ErbB2、又は他の受容体チロシンキナーゼを介して細胞シグナル伝達を誘導するMUC1cの能力を調節することを含む免疫療法を提供する。本開示は、PI3K→AKT、MEK→ERK、Wnt/β-カテニン、STAT、NF-κB RelA細胞経路、又はその組合せを誘導するMUC1cの能力を調節することを含む免疫療法を提供する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、MUC1c免疫療法は、同じ複製欠損型ウイルスベクター又は別の複製欠損型ウイルスベクターにおける、HER2/neu、CEA、又はBrachyury免疫療法をさらに含み得る。
【０１１６】
本開示は、MUC1n及びその細胞機能を調節する免疫療法も提供する。本開示は、MUC1nのタンデムリピート、MUC1nのタンデムリピート上のグリコシル化部位、又はその組合せを含む免疫療法も提供する。いくつかの実施形態では、MUC1n免疫療法は、同じ複製欠損型ウイルスベクター又は別の複製欠損型ウイルスベクターにおける、HER2/neu、CEA、又はBrachyury免疫療法をさらに含む。
【０１１７】
本開示は、MUC1n、MUC1c、HER2/neu、brachyury、CEA、又はその組合せを含むワクチンも提供する。本開示は、MUC1c及びHER2/neu、brachyury、CEA、又はその組合せを含むワクチンを提供する。本開示は、MUC1n及びHER2/neu、Brachyury、CEA、又はその組合せを標的とするワクチンも提供する。いくつかの実施形態では、抗原の組合せは、本明細書において提供される1つのベクターに含有されている。いくつかの実施形態では、抗原の組合せは、本明細書において提供される別のベクターに含有されている。
【０１１８】
本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む血清型5の複製欠損型アデノウイルスベクターに関する。免疫原性ポリペプチドは、MUC1のアイソフォーム又はそのサブユニット若しくは断片であってもよい。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドと、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、又は99.9%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトMUC1配列と比較して、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、又はそれより多くの点突然変異、例えば単一アミノ酸置換又は欠失を含む。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、改変されたMUC1であり得、配列番号32と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるヌクレオチド配列を有し得る。ある特定の態様では、本開示のMUC1-c抗原は、配列番号32に記載のヌクレオチド配列を有し得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、改変されたMUC1であり得、配列番号33と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるアミノ配列を有し得る。ある特定の実施形態では、本開示のMUC1-c抗原は、配列番号33に記載のアミノ酸配列を有し得る。
【０１２１】
IV.  Brachyury標的抗原
本明細書において開示されるものには、HER2/neu抗原をコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はMUC1などのムチンファミリー抗原をコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はBrachyuryをコードする1つ以上の核酸配列、及び/又はCEAをコードする1つ以上の核酸配列を同じ又は別の複製欠損型ベクターに含む、複製欠損型ベクターを含む組成物が含まれる。
【０１２２】
本開示は、Brachyuryに対する1つ以上の抗原を含む免疫療法を提供する。Brachyury(ヒトにおいては「T」タンパク質としても知られる)は、初期発生中、主に正常な中胚葉の形成及び分化において重要な役割を果たす転写因子のTボックスファミリーのメンバーであり、Tドメインと呼称される高度に保存されたDNA結合ドメインを特徴とする。上皮間葉転換(EMT)は、Brachyuryが決定的な役割を果たす転移段階に原発腫瘍が進行する間の重要なステップである。ヒトがん腫細胞におけるBrachyuryの発現は、間葉系マーカーの上方制御、上皮系マーカーの下方制御、並びに細胞の遊走及び浸潤の増大を含む、EMTの特徴の変化を誘導する。逆に、Brachyuryの阻害は、間葉系マーカーの下方制御並びに細胞の遊走及び浸潤の喪失をもたらし、転移を生じるヒト腫瘍細胞の能力を低下させた。Brachyuryは、上皮間葉転換を媒介し、浸潤を促進するように機能することができる。
【０１２３】
本開示は、がんなどの細胞増殖疾患において上皮間葉転換機能に対するBrachyuryの影響を調節する免疫療法も提供する。本開示は、がんなどの細胞増殖疾患において浸潤を促進するBrachyuryの能力を調節する免疫療法も提供する。本開示は、BrachyuryのTボックスドメインのDNA結合機能を調節する免疫療法も提供する。いくつかの実施形態では、Brachyury免疫療法は、HER2/neu、CEA、又はMUC1、MUC1c、若しくはMUC1nに対する1つ以上の抗原をさらに含み得る。
【０１２４】
Brachyuryの発現は、ほとんどの正常なヒト組織においてほぼ検出不可能であり、ヒト腫瘍に高度に制限されており、過剰発現することが多いため、免疫療法のための魅力的な標的抗原となっている。ヒトにおいてBrachyuryは、T遺伝子(GenBank:AJ001699.1、NCBI:NM_003181.3)によってコードされる。ヒトにおいて見られる選択的スプライシングにより産生される、少なくとも2つの異なるアイソフォームが存在する。各アイソフォームがいくつかの天然変異体を有する。
【０１２５】
Brachyuryは免疫原性であり、インビトロで増殖したBrachyury特異的CD8+ T細胞は、Brachyuryを発現する腫瘍細胞を溶解することができる。Brachyuryは、これらの特徴のため、免疫療法のための魅力的な腫瘍関連抗原(TAA)である。Brachyuryタンパク質は、Tボックス転写因子である。これは、そのN末端におけるTボックスと呼ばれる領域を介して、特異的なDNAエレメントであるほぼ回文構造の配列「TCACACCT」に結合することができ、そのような部位に結合すると遺伝子転写を活性化させる。
【０１２６】
本開示は、Brachyury、HER2/neu、MUC1、CEA、又はその組合せを含むワクチンも提供する。いくつかの実施形態では、抗原の組合せは、本明細書において提供される1つのベクターに含有されている。いくつかの実施形態では、抗原の組合せは、本明細書において提供される別々のベクターに含有されている。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする配列を含む血清型5の複製欠損型アデノウイルスベクターに関する。免疫原性ポリペプチドは、Brachyuryのアイソフォーム又はそのサブユニット若しくは断片であり得る。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスベクターは、免疫原性ポリペプチドと、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%、又は99.9%の同一性を有するポリペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記述されるアデノウイルスベクターによりコードされる免疫原性ポリペプチドは、野生型ヒトBrachyury配列と比較して、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、又はそれより多くの点突然変異、例えば単一アミノ酸置換又は欠失を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示のBrachyury抗原は、配列番号34と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%同一であるアミノ配列を有し得る。ある特定の態様では、本開示のBrachyury抗原は、配列番号34に記載のアミノ酸配列を有し得る。
【０１２９】
V.  ベクター
ある特定の態様は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原を1つ以上コードする1つ以上の核酸配列を含む発現構築物を細胞に移入することを含む。ある特定の実施形態において、発現構築物の細胞への移入は、ウイルスベクターを使用して達成され得る。ウイルスベクターは、その中でクローニングされている組み換え遺伝子構築物を発現するために十分なウイルス配列を含むそれらの構築物を含むために使用され得る。
【０１３０】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、線形の二本鎖ゲノムを含む正二十面体の非エンベロープカプシドによって特徴付けられるDNAウイルス科である。ヒトアデノウイルスの中で、新生物疾患に関連しているウイルスはなく、免疫応答性を有する個体において比較的軽度の自己限定性の疾患を引き起こすに過ぎない。
【０１３１】
アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAへの低い組み込み能を有し得る。アデノウイルスベクターによって、非常に効率的な遺伝子移入が起こり得る。アデノウイルスベクターの追加の利点には、分裂していない細胞及び分裂している細胞の両方への遺伝子送達が効率的であり、大量に産生できることが挙げられる。
【０１３２】
組み込みウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、潜在的遺伝子毒性を生じることなく、エピソームとして複製することができることから、アデノウイルスが宿主細胞に感染しても、染色体の組み込みが起こらない場合がある。同様に、アデノウイルスベクターは、構造的に安定であり得て、広範な増幅の後でもゲノム再構成は検出されていない。アデノウイルスは、その中間的なサイズのゲノム、扱いやすさ、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染力のために、遺伝子移入ベクターとして使用するために特に適している。
【０１３３】
ウイルスによって発現される第一の遺伝子はE1遺伝子であり、これは野生型ゲノムに存在する他のAd5遺伝子プロモーターから高レベルの遺伝子発現を開始するように作用する。ウイルスDNA複製及び子孫ビリオンのアセンブリは、感染した細胞の核内で起こり、約36時間で全ライフサイクルが起こり、細胞1個あたりおよそ104個のビリオンを産生する。
【０１３４】
野生型Ad5ゲノムは、およそ36kbであり、それらがDNA複製の前又は後に発現されるか否かに応じて、初期及び後期ウイルス機能に分けられる遺伝子をコードする。Ad5に過去に感染した細胞の重感染によって、自身のゲノムの複製が終わるまで重感染ウイルスからの後期遺伝子発現の欠如が起こることが証明されていることから、初期/後期の描写はほぼ絶対である。理論により拘束されるものではないが、これは、複製されたゲノムが被包化されて存在するまで後期遺伝子発現(主にAd5カプシドタンパク質)を防止する、Ad5主要後期プロモーター(MLP)の複製依存的シス活性化による可能性がある。組成物及び方法は、進化した世代のAdベクター/ワクチンを開発するためにこれらの特徴を利用することができる。
【０１３５】
アデノウイルスベクターは、複製欠損型であり得るか、又は少なくとも条件的に欠損であり得る。アデノウイルスは、42種の異なる公知の血清型又はサブグループA〜Fのいずれであってもよく、他の血清型又はサブグループも想定される。サブグループCのアデノウイルス5型を、複製欠損型アデノウイルスベクターを得るために特定の実施形態において使用してもよい。これは、アデノウイルス5型が、豊富な生化学及び遺伝的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に関して歴史的に使用されてきたためである。
【０１３６】
アデノウイルスの増殖及び操作は、当業者に公知であり、in vitro及びin vivoで広い宿主範囲を示す。CARドメインが変化したアデノウイルスなどの改変ウイルスも同様に使用してもよい。ウイルスのリポソーム封入などの送達を増強する又は免疫応答を回避する方法も同様に想定される。
【０１３７】
ベクターは、E2欠失型アデノウイルスベクター、又はより詳しくはE2b欠失型アデノウイルスベクターなどのアデノウイルスの遺伝子操作型を含み得る。本明細書において使用される用語「E2b欠失型」は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止するように変異させた特定のDNA配列を指す。このため、ある特定の実施形態において、「E2b欠失型」は、Adゲノムから欠失(除去)されている特定のDNA配列を指す。E2b欠失型又は「E2b領域内の欠失を含む」は、AdゲノムのE2b領域内の少なくとも1塩基対の欠失を指す。ある特定の実施形態において、1塩基対超が欠失しており、さらなる実施形態において、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、又は150塩基対が欠失している。別の実施形態において、欠失は、AdゲノムのE2b領域内の150、160、170、180、190、200、250、又は300塩基対超の欠失である。E2b欠失は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止する欠失であり得て、したがってE2b特異的タンパク質の一部をコードするエクソン内の欠失並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態において、E2b欠失は、E2b領域のDNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質(preterminal protein)の1つ又は両方の発現及び/又は機能を防止する欠失である。さらなる実施形態において、「E2b欠失型」は、1つ以上のコードタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列における1つ以上の点突然変異を指す。そのような変異は、それによってアミノ酸配列が変化して、非機能的タンパク質が起こる、異なる残基に置換される残基を含む。
【０１３８】
本開示を読むことによって当業者によって理解されるように、Adゲノムの他の領域を欠失させることができる。このため、本明細書において使用されるAdゲノムの特定の領域において「欠失」させるのは、その領域によってコードされる少なくとも1つの遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止するように変異させた特定のDNA配列を指す。ある特定の実施形態において、特定の領域において「欠失」させるのは、その領域によってコードされる発現及び/又は機能(例えば、DNAポリメラーゼのE2b機能又は末端前タンパク質機能)を防止するようにAdゲノムから欠失(除去)されている特定のDNA配列を指す。特定の領域内で「欠失された」又は「欠失を含む」は、Adゲノムのその領域内の少なくとも1塩基対の欠失を指す。
【０１３９】
このため、ある特定の実施形態において、1塩基対超が欠失され、さらなる実施形態において、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、又は150塩基対が特定の領域から欠失されている。別の実施形態において、欠失は、Adゲノムの特定の領域内の150、160、170、180、190、200、250、又は300塩基対超である。これらの欠失は、領域によってコードされる遺伝子産物の発現及び/又は機能が防止されるような欠失である。このため、欠失は、タンパク質の一部をコードするエクソン内の欠失、並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。さらなる実施形態において、Adゲノムの特定の領域において「欠失される」のは、1つ以上のコードタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列における1つ以上の点突然変異を指す。そのような変異は、それによってアミノ酸配列が変化して、非機能的タンパク質が起こる異なる残基に置換されている残基を含む。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1領域において欠失を有するE2b欠失型アデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、Adゲノムの他のいかなる領域も欠失されていない。
【０１４１】
別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1及びE3領域において欠失を有するE2b欠失型アデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の領域が欠失されていない。
【０１４２】
さらなる実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1、E3において欠失を有し、同様に任意選択でE4領域が部分的又は完全に除去されているアデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０１４３】
別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1及び/又はE4領域において欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を含まない。
【０１４４】
追加の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2a、E2b及び/又はE4領域において欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０１４５】
一実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1及び/又はE2b領域のDNAポリメラーゼ機能が欠失しているベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０１４６】
さらなる実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1及び/又はE2b領域の末端前タンパク質機能が欠失している。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０１４７】
別の実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1、DNAポリメラーゼ、及び/又は末端前タンパク質機能が欠失している。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。1つの特定の実施形態において、本明細書における使用が企図されるアデノウイルスベクターは、E2b領域及び/又はE1領域の少なくとも一部が欠失している。
【０１４８】
一部の例において、そのようなベクターは、「gutted」アデノウイルスベクターではない。この点において、ベクターは、E2b領域のDNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質機能の両方が欠失していてもよい。追加の実施形態において、使用するアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE1、E2b、及び/又は100K領域において欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。ある特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、「gutted」アデノウイルスベクターであり得る。
【０１４９】
一実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1、E2b、及び/又はプロテアーゼ機能が欠失しているベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０１５０】
さらなる実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1及び/又はE2b領域が欠失しているが、ファイバー遺伝子が変異又は他の変化(例えば、Adの指向性を変化させる)によって改変されている。E3又はE4領域からの遺伝子の除去を、言及したアデノウイルスベクターのいずれかに付加してもよい。
【０１５１】
欠失型アデノウイルスベクターは、当技術分野で公知の組み換え技術を使用して生成することができる(例えば、Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33、Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59を参照されたい)。当業者によって認識されるように、ある特定の態様において使用するアデノウイルスベクターは、E2b遺伝子産物及び欠失されていてもよい必要な遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して高い力価で首尾よく増殖させることができる。ある特定の実施形態において、E1及びDNAポリメラーゼタンパク質を構成的に発現するのみならず、Ad末端前タンパク質を発現するHEK-293由来細胞を使用することができる。一実施形態において、E.C7細胞を使用して、アデノウイルスベクターの高力価ストックを首尾よく増殖させる(例えば、Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33、Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59を参照されたい)。
【０１５２】
自己増殖アデノウイルスベクターから重要な遺伝子を欠失させるために、標的遺伝子によってコードされるタンパク質を、HEK-293細胞又は類似の細胞においてE1タンパク質と一緒に発現させてもよい。したがって、構成的に同時発現された場合に非毒性であるタンパク質(又は誘導可能に発現される毒性タンパク質)のみを利用することができる。HEK-293細胞におけるE1及びE4遺伝子の同時発現は証明されている(構成的ではない、誘導型プロモーターを利用する)(Yeh, et al. J. Virol. 1996; 70:559、Wang et al. Gene Therapy 1995; 2:775、及びGorziglia, et al. J. Virol. 1996; 70:4173)。E1及びプロテインIX遺伝子(ビリオン構造タンパク質)は、同時発現されており(Caravokyri, et al. J. Virol. 1995; 69: 6627)、E1、E4、及びプロテインIX遺伝子の同時発現もまた記載されている(Krougliak, et al. Hum. Gene Ther. 1995; 6:1575)。E1及び100k遺伝子は、E1及びプロテアーゼ遺伝子と同様に、トランス相補性(transcomplementing)細胞株において首尾よく発現されている(Oualikene, et al. Hum Gene Ther 2000; 11:1341-53、Hodges, et al. J. Virol 2001; 75:5913-20)。
【０１５３】
高力価のE2b欠失型Ad粒子を増殖させるために使用するE1及びE2b遺伝子産物を同時発現する細胞株は、米国特許第6,063,622号に記載されている。E2b領域は、Adゲノム複製にとって絶対的に必要であるウイルス複製タンパク質をコードする(Doerfler, et al. Chromosoma 1992; 102:S39-S45)。有用な細胞株は、およそ140kDaのAd-DNAポリメラーゼ及び/又はおよそ90kDaの末端前タンパク質を構成的に発現する。特に、毒性を示すことなくE1、DNAポリメラーゼ、及び末端前タンパク質の高レベルの構成的な同時発現を有する細胞株(例えば、E.C7)は、複数回のワクチン接種において使用するAdの増殖に使用するために望ましい。これらの細胞株は、E1、DNAポリメラーゼ、及び末端前タンパク質に関して欠失しているアデノウイルスベクターの増殖を可能にする。
【０１５４】
組み換えAdは、当技術分野で公知の技術を使用して増殖させることができる。例えば、ある特定の実施形態において、E.C7細胞を含む組織培養プレートに、アデノウイルスベクターウイルス保存液を適切なMOI(例えば、5)で感染させ、37.0℃で40〜96時間インキュベートする。感染した細胞を回収して、10mM  Tris-Cl(pH8.0)中に再懸濁させ、超音波処理し、ウイルスを、2ラウンドの塩化セシウム密度勾配遠心によって精製する。ある特定の技術において、ウイルスを含むバンドをSephadex CL-6Bカラム(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.)において脱塩し、スクロース又はグリセロールを添加し、アリコートを-80℃で保存する。一部の実施形態において、ウイルスをA195などのその安定性を増強させるように設計した溶液中に入れる(Evans, et al. J Pharm Sci 2004; 93:2458-75)。ストックの力価を測定する(例えば、SDS溶解後のウイルスのアリコートの260nmでの吸光度の測定によって)。別の実施形態において、組み換えE2b欠失型アデノウイルスベクター全体を包含する、直線状又は環状のいずれかのプラスミドDNAを、E.C7又は類似の細胞にトランスフェクトさせ、ウイルス産生の証拠(例えば、細胞変性効果)が存在するまで37.0℃でインキュベートすることができる。次に、これらの細胞からの条件培地を使用して、より多くのE.C7又は類似の細胞を感染させ、産生されたウイルス量を増大させた後、精製することができる。精製は、2ラウンドの塩化セシウム密度勾配遠心又は選択的濾過によって達成することができる。ある特定の実施形態において、ウイルスは、市販の製品(例えば、Puresyn, Inc., Malvem, PAのAdenopure)又は注文品のクロマトグラフィーカラムを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、組み換えアデノウイルスベクターは、感染させる細胞が、ある特定の数のウイルスに確実に出会うように、十分量のウイルスを含み得る。このため、組み換えAdのストック、特に組み換えAdのRCAフリーのストックを提供してもよい。Adストックの調製及び分析は、当技術分野で利用可能な任意の方法を使用することができる。ウイルスストックは、主としてウイルスの遺伝子型、並びにそれらを調製するために使用するプロトコール及び細胞株に応じて、力価がかなり変動する。ウイルスストックは、少なくとも約106、107、又は108ウイルス粒子(VP)/mlの力価を有することができ、そのような多くのストックは、少なくとも約109、1010、1011、又は1012VP/mlなどのより高い力価を有し得る。
【０１５６】
ある特定の態様は、米国特許第6,063,622号、第6,451,596号、第6,057,158号、第6,083,750号、及び第8,298,549号に記載のベクターなどの、E2b欠失型アデノウイルスベクターの使用を企図する。E2b領域において欠失を有するベクターは、多くの場合、ウイルスタンパク質発現を損なうか、及び/又は複製コンピテントAd(RCA)を生成する頻度を減少させる。
【０１５７】
これらのE2b欠失型アデノウイルスベクターの増殖は、欠失したE2b遺伝子産物を発現する細胞株を利用して行うことができる。ある特定の態様はまた、そのようなパッケージング細胞株、例えばHEK-293細胞株に由来するE.C7(正式にはC-7と呼ばれる)を提供する。
【０１５８】
さらなる態様において、E2b遺伝子産物、DNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質は、E.C7又は類似の細胞において、E1遺伝子産物と共に構成的に発現させることができる。Adゲノムからの遺伝子セグメントを産生細胞株に移入することは、直接的な利益を有する:(1)運搬能の増加、及び(2)典型的にRCAを生成するために2回以上の独立した組み換え事象が必要である、RCA生成能の減少。本明細書において使用されるE1、Ad DNAポリメラーゼ、及び/又は末端前タンパク質発現細胞株は、夾雑ヘルパーウイルスを必要とすることなく、13kbに近づく運搬能を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能にすることができる。加えて、ウイルスのライフサイクルにとって極めて重要な遺伝子(例えば、E2b遺伝子)が欠失している場合、Adの複製又は他のウイルス遺伝子タンパク質の発現のさらなる妨害が起こる。これは、ウイルス感染細胞の免疫による認識を減少させ、外来トランスジーン発現の持続の延長を可能にすることができる。
【０１５９】
E1、DNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質欠失型ベクターは、典型的にE1及びE2b領域からのそれぞれのタンパク質を発現することができない。さらに、それらはウイルス構造タンパク質のほとんどの発現の欠如を示し得る。例えば、Adの主要後期プロモーター(MLP)は、後期構造タンパク質L1からL5の転写の要因である。MLPは、Adゲノム複製前は最小の活性であるが、ウイルスゲノム複製が起こった後に限って、非常に毒性の強いAd後期遺伝子がMLPから主に転写及び翻訳される。後期遺伝子転写のこのシス依存的活性化は、ポリオーマ及びSV-40の増殖の場合などのDNAウイルス全般の特徴である。DNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質は、Ad複製にとって重要である(E4又はプロテインIXタンパク質とは異なり)。E1領域の欠失は、アデノウイルスベクター後期遺伝子発現に対して極めて有害であり得、これにより、抗原提示細胞(APC)などの細胞における後期遺伝子発現の毒性作用が抑えられる場合がある。したがって、E1欠失型アデノウイルスベクターは、APCの毒性を最小限に抑えながら防御免疫応答を誘導するために、治療用ワクチンレジメンにおいて本明細書に記述されるようなAPCに抗原を送達するためのワクチン骨格として使用するのに有利である。
【０１６０】
ある特定の態様は、E1欠失型アデノウイルスベクターの使用を企図する。第一世代又はE1欠失型アデノウイルスベクターAd5[E1-]は、トランスジーンが遺伝子のE1領域のみを置換するように構築される。典型的に、野生型Ad5ゲノムの約90%がベクターにおいて保持されている。Ad5[E1-]ベクターは、複製能が減少しており、Ad5 E1遺伝子を発現しない細胞に感染した後に感染性ウイルスを産生することができない。組み換えAd5[E1-]ベクターは、ヒト細胞(典型的に293細胞)において増殖し、Ad5[E1-]ベクターの複製及びパッケージングを可能にする。Ad5[E1-]ベクターは、複数の正の属性を有し、最も重要な1つは、規模拡大が比較的容易であること及びcGMP産生である。現在、優に220を超えるヒト臨床試験が、Ad5[E1-]ベクターを利用しており、2000人超の対象がウイルスを皮下、筋肉内、又は静脈内に投与されている。
【０１６１】
さらに、Ad5ベクターは、組み込まれない。そのゲノムはエピソームとして留まる。一般的に宿主ゲノムに組み込まれないベクターでは、挿入変異誘発及び/又は生殖系列伝播のリスクは、たとえあったとしても極めて低い。通常のAd5[E1-]ベクターは、7kbに近づく運搬能を有する。
【０１６２】
ヒト及び動物での試験は、Ad5に対する既存の免疫が、Adベースワクチンの商業的使用に対する阻害因子であり得ることを証明している。ヒトの多くが、ヒトワクチンに関して最も広く使用されるサブタイプであるAd5に対する抗体を有し、調べたヒトの3分の2がAd5に対してリンパ増殖性の応答を有する。この既存の免疫は、典型的なAd5ワクチンを使用する免疫又は再免疫を阻害することができ、後にAd5ベクターを使用して第二の抗原に対するワクチンの免疫を排除し得る。既存の抗ベクター免疫の問題を克服することは、集中的な研究の主題であった。代替のヒト(非Ad5ベースの)Ad5サブタイプ又はAd5の非ヒト型さえ使用する研究が行われている。これらのアプローチは、初回免疫では成功するが、その後のワクチン接種は、新規Ad5サブタイプに対する免疫応答により問題となり得る。
【０１６３】
Ad5免疫の問題を回避するため、及び第一世代Ad5[E1-]ベクターが最適な免疫応答を誘導する限定的な有効性を改善するために、次世代Ad5ベクターベースのワクチンプラットフォームに関連するある特定の実施形態が提供される。次世代Ad5プラットフォームは、E2b領域において追加の欠失を有し、DNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質遺伝子を除去する。Ad5[E1-,E2b-]プラットフォームは、可能性がある多くの遺伝子を含めることができるよう十分な増大したクローニング能を有する。Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターの7kbの運搬能と比較して、最大約12kbの遺伝子運搬能を有し、必要に応じて複数の遺伝子のための場所を提供する。一部の実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11kb超のインサートを、Ad5[E1-,E2b-]ベクターなどのAd5ベクターに導入する。
【０１６４】
E2b領域の欠失は、Ad5ベクターに有利な免疫特性を付与することができ、しばしばAdウイルスタンパク質に対する免疫応答を最小限にしながら、HER2/neu抗原又はエピトープなどの標的トランスジーン抗原に対して強力な免疫応答を誘発する。
【０１６５】
種々の実施形態において、Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad免疫の存在下であっても、強力な細胞性免疫(CMI)を誘導するほか、HER2/neu抗原又はエピトープなど、ベクターが発現する標的抗原に対する抗体を誘導し得る。
【０１６６】
Ad5[E1-,E2b-]ベクターはまた、Ad5[E1-]ベクターと比較して有害反応、特に肝毒性及び組織損傷の発生が低減している。
【０１６７】
これらのAd5ベクターのある特定の態様及びAd後期遺伝子の発現は、大きく低減される。例えば、カプシドファイバータンパク質の産生は、Ad5[E1-]ベクターに関してin vivoで検出され得るが、ファイバー発現は、Ad5[E1-,E2b-]ベクターワクチンでは除去されている。野生型Adに対する生得の免疫応答は複雑である。Ad5[E1-,E2b-]ベクターから欠失されたタンパク質は、一般的に重要な役割を果たす。具体的には、末端前タンパク質又はDNAポリメラーゼが欠失しているAd5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターと比較して、注射後最初の24〜72時間の間の炎症の低減を示す。様々な実施形態において、Ad5遺伝子発現がないことにより、感染細胞は抗Ad活性によって認識されず、感染細胞はトランスジーンを長期間発現することが可能となり、それによって標的に対する免疫を発達させる。
【０１６８】
様々な実施形態は、Ad5[E1-,E2b-]ベクターが、樹状細胞を形質導入する能力を増加させること、Ad5[E1-,E2b-]ベクターウイルスタンパク質に対する炎症応答の低減を利用することによって、ワクチンにおける抗原特異的免疫応答を改善すること、及び結果として既存のAd免疫を回避することを企図する。
【０１６９】
一部の例において、この免疫誘導は、数カ月を要し得る。Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、抗原特異的免疫応答の誘導に関してAd5[E1-]ベクターより安全であるのみならず、優れているように思われ、それらは、臨床応答を引き起こし得る腫瘍ワクチンを送達するためのプラットフォームとしてさらにより適切となる。
【０１７０】
ある特定の実施形態において、他のAd5システムにおいて見出される問題を克服し、過去にAd5に曝露されている人の免疫を可能にする、治療的腫瘍ワクチンを開発するためにAd5[E1-,E2b-]ベクターシステムを利用することによる方法及び組成物が提供される。
【０１７１】
E2b欠失型ベクターは、第一世代アデノウイルスベクターの5〜6kbの運搬能と比較して最大13kbの遺伝子運搬能を有することができ、HER2/neu抗原又はエピトープなどの任意の多様な標的抗原をコードする核酸配列のための場所を容易に提供する。
【０１７２】
E2b欠失型アデノウイルスベクターはまた、第一世代アデノウイルスベクターと比較して低減された有害反応を有することができる。E2b欠失型ベクターでは、ウイルス遺伝子の発現が低減されており、この特徴によってin vivoでの長期間のトランスジーンの発現がもたらされ得る。
【０１７３】
第一世代アデノウイルスベクターと比較すると、第二世代E2b欠失型アデノウイルスベクターのある特定の実施形態は、DNAポリメラーゼ遺伝子(pol)における追加の欠失及び末端前タンパク質(pTP)の欠失を含む。
【０１７４】
アデノウイルスベクターから発現されるAdタンパク質は重要な役割を果たすように思われる。具体的には、E2b欠失型ベクターにおける末端前タンパク質及びDNAポリメラーゼの欠失は、注射後最初の24〜72時間の間の炎症を低減させるように思われるが、第一世代アデノウイルスベクターは、この期間で炎症を刺激する。
【０１７５】
加えて、E2b欠失によって作製される追加の複製ブロックもまた、Ad後期遺伝子の発現の10,000倍の低減をもたらし、これはE1、E3欠失単独によって与えられる低減を優に超えていることが報告されている。E2b欠失型アデノウイルスベクターによって産生されるAdタンパク質レベルの減少は、Ad抗原に対する競合的で望ましくない免疫応答、Adで免疫された又は曝露された個体におけるプラットフォームの繰り返し使用を妨げる応答の可能性を有効に低減させる。
【０１７６】
第二世代E2b欠失型ベクターによる炎症応答の誘導が低減されることによって、抗原提示細胞(すなわち、樹状細胞)の感染の間に、ベクターがHER2/neu抗原又はエピトープなどの所望のワクチン抗原を発現する可能性が増加し、抗原が競合する可能性を減少させ、それによって、第一世代アデノウイルスベクターによる同一の試みと比較して所望の抗原に対するワクチンのより大きい免疫が得られる。
【０１７７】
E2b欠失型アデノウイルスベクターは、第一世代アデノウイルスベクターを使用する既に記載されたワクチン候補物より安全で、より有効でより汎用性が高い、改善されたAdベースのワクチン候補物を提供する。
【０１７８】
このため、第一世代のE1欠失型アデノウイルスサブタイプ5(Ad5)ベースのベクターは、ワクチンとして使用するための有望なプラットフォームであるが、天然に存在する又は誘導されたAd特異的中和抗体により、活性が妨げられ得る。
【０１７９】
理論により拘束されるものではないが、例えば減損した後期ウイルスタンパク質発現により、E1並びにDNAポリメラーゼ及び末端前タンパク質をコードするE2b領域が欠失しているAd5ベースのベクター(Ad5[E1-,E2b-])は、免疫学的クリアランスを回避し、Ad免疫宿主においてHER2/neu抗原又はエピトープなどのコードされる抗原トランスジーンに対してより強力な免疫応答を誘導し得る。
【０１８０】
VI.異種核酸
いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターなどのベクターは、免疫応答を調節することができる、HER2/neu抗原若しくはエピトープ、その融合物又はその断片などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含んでもよい。特定の態様において、HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む、第二世代E2b欠失アデノウイルスベクターが提供され得る。
【０１８１】
かくして、本明細書にさらに記載される任意の供給源由来のHER2/neu抗原又はエピトープをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター又はコンストラクト、及びそのようなベクター又は発現コンストラクトで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞が提供され得る。
【０１８２】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において本質的に互換的に使用される。当業者によって同様に認識されるように、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、一本鎖(コード又はアンチセンス)又は二本鎖であってもよく、DNA (ゲノム、cDNA、又は合成)又はRNA分子であってもよい。RNA分子には、イントロンを含有し、DNA分子に1対1的に対応するHnRNA分子、及びイントロンを含有しないmRNA分子が含まれ得る。追加のコード又は非コード配列は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在しなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子及び/又は支持物質に連結されてもよいが、連結されなくてもよい。単離ポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離DNA分子は、本明細書で使用される場合、大きな染色体断片又は他の機能遺伝子若しくはポリペプチドコード領域など、大部分の関係がないコードDNAを含有しない。当然ながら、これは、最初に単離されたDNA分子を指し、実験室での組換えにより該セグメントに後で付加された遺伝子又はコード領域を排除しない。
【０１８３】
当業者に理解されるように、ポリヌクレオチドには、本明細書に記載される標的抗原、抗原、ペプチドの断片等を発現する、又は発現するように適合され得るゲノム配列、ゲノム外配列及びプラスミドコード配列、並びにより小さな工学操作された遺伝子セグメントが含まれ得る。そのようなセグメントは、天然に単離されてもよく、又は人の手によって合成的に改変されてもよい。
【０１８４】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列(すなわち、HER2/neu抗原若しくはエピトープ又はその一部などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする内因性配列)を含んでもよく、又はそのような配列の変異体若しくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の突然変異型腫瘍抗原をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ネイティブヌクレオチド配列又は変異体とは実質的に異なり得るが、類似のタンパク質抗原をコードし得る、特定の細胞型(すなわち、ヒト細胞株)における発現が最適化されている新規遺伝子配列を意味する。
【０１８５】
他の関連する実施形態では、本明細書に記述される方法(例えば、後述する標準的パラメータを使用したBLAST解析)を使用した場合に、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原を1つ以上コードする天然配列と実質的な同一性を有するポリヌクレオチド変異体、例えば、配列番号1に記載の天然ポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも60、70、80、90、95、96、97、98、99、又は100%の配列同一性(又はこれらの数から得られる任意の範囲若しくは数字)、特に少なくとも75%から最大99%又はそれより高い配列同一性を含むもの、又は、配列番号2と、少なくとも60、70、80、90、95、96、97、98、99、又は100%(又はこれらの数から得られる任意の範囲若しくは数字)、特に少なくとも75%から最大99%又はそれより高い配列同一性を有する、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原を1つ以上コードするポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含むものが提供され得る。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置等を考慮することにより、2つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためにこれらの値が適切に調整され得ることを認識する。
【０１８６】
典型的には、ポリヌクレオチド変異体は、好ましくは、変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性、又は異種標的タンパク質の免疫原性が、ネイティブポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比べて実質的に減少しないように、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含有する。本明細書の他の部分に記載されているように、ポリヌクレオチド変異体は、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する変異体ポリペプチド又はその断片(例えば、エピトープ)の性質が、ネイティブポリペプチドと比べて実質的に減少していない、HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原の変異体、又はその断片(例えば、エピトープ)を好ましくはコードする。「変異体」という用語は、異種起源の相同遺伝子を包含することも理解されるべきである。
【０１８７】
特定の態様において、本明細書に記載される標的タンパク質抗原を含むポリペプチドをコードする、少なくとも約5〜1000以上までの連続するヌクレオチド、及び間の全ての中間の長さを含む又はからなるポリヌクレオチドが提供され得る。この文脈における「中間の長さ」は、200〜500; 500〜1,000等からの全ての整数を含む、引用された値の間の任意の長さ、例えば16、17、18、19等; 21、22、23等; 30、31、32等; 50、51、52、53等; 100、101、102、103等; 150、151、152、153等を意味することが容易に理解される。本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列は、エピトープ又は異種標的タンパク質などの本明細書に記載されるポリペプチドをコードする、ネイティブ配列には見出されない追加のヌクレオチドにより、一端又は両端で伸長され得る。この追加の配列は、開示された配列のどちらかの末端又は開示された配列の両端の1〜20以上のヌクレオチドからなってもよい。
【０１８８】
ポリヌクレオチド又はその断片は、コード配列自体の長さにかかわらず、その全長が大幅に異なり得るように、プロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメント等などの他のDNA配列と組み合わせることができる。それ故に、ほとんどどの長さの核酸断片が使用されてもよく、意図された組換えDNAプロトコルにおける調製及び使用の容易さにより全長が好ましくは制限されることが企図される。例えば、約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、約500、約200、約100、約50  塩基対長等(全ての中間の長さを含む)の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、特定の態様において有用であることが企図される。
【０１８９】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、2つの配列は、以下に記載されるように、最大の一致が得られるように整列されるとき2つの配列におけるヌクレオチドの配列が同じであるならば、「同一」であると言われる。2つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウで配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定及び比較することにより行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも約20の連続する位置、通常は30〜約75、40〜約50の連続する位置のセグメントを指し、この中で、2つの配列を最適に整列された後、配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【０１９０】
比較のための配列の最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergeneスイートのMegalignプログラム(DNASTAR, Inc.、Madison、WI)を用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されたいくつかのアライメントスキームを具体化している:Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff MO (編) Atlas of Protein Sequence and Structure、National Biomedical Research Foundation、Washington DC Vol. 5、Suppl. 3、345〜358頁; Hein J Unified Approach toAlignment and Phylogenes、626〜645頁(1990); Methods in Enzymology vol.183、Academic Press, Inc.、San Diego、CA; HigginsらPM CABIOS 1989; 5:151-53; Myers EWらCABIOS 1988; 4:11-17; Robinson ED Comb. Theor 1971; 11A 05; Saitou NらMol. Biol. Evol. 1987; 4:406-25; Sneath PHA及びSokal RR Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy、Freeman Press、San Francisco、CA (1973); Wilbur WJらProc. Natl. Acad.、Sci. USA 1983 80:726-30)。
【０１９１】
或いは、比較のための配列の最適なアライメントは、SmithらAdd. APL. Math 1981; 2:482の局所同一性アルゴリズム、NeedlemanらMol. Biol. 1970 48:443の同一性アライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444の類似性方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装(Wisconsin Genetics Software Package、GeneticsコンピュータGroup (GCG)、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTA)、又は検査により実施されてもよい。
【０１９２】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの1つの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschulら、Nucl. Acids Res. 1977 25:3389-3402、及びAltschulらJ. MoI. Biol. 1990 215:403-10に記載されている。BLAST及びBLAST 2.0は、例えば本明細書に記載されたパラメーターを用いて使用されて、ポリヌクレオチドのパーセント配列同一性を決定することができる。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に入手可能である。1つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターM (一対のマッチ残基に対する報酬スコア;常に>0)及びN (ミスマッチ残基に対するペナルティスコア;常に<0)を用いて計算され得る。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少するとき; 1つ以上のマイナススコア残基アライメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ以下になるとき;又はどちらかの配列の末端に達したとき、各方向におけるワードヒットの伸長は停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アライメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとしてワード長(W) 11、及び期待値(E) 10、及びBLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffらProc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 89:10915参照)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M=5、N=-4、並びに両鎖の比較を使用する。
【０１９３】
ある特定の実施形態において、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも20の位置の比較ウィンドウで2つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウの中のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのための参照配列(付加又は欠失を含まない)と比較して、20パーセント以下、通常は5〜15パーセント、又は10〜12パーセントの付加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基が両方の配列で生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列(すなわち、ウィンドウサイズ)中の位置の総数で除し、該結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【０１９４】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載される目的とする特定の抗原、又はその断片をコードする多くのヌクレオチド配列があることが当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列と最小相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の違いのために異なるポリヌクレオチドが具体的に企図される。
【０１９５】
さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルも企図され得る。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換などの1つ以上の変異の結果として変化する内因性遺伝子である。得られるmRNA及びタンパク質は、構造又は機能が変化していてもよいが、していなくてもよい。アレルは、標準的な手法(ハイブリダイゼーション、増幅、及び/又はデータベース配列比較など)を用いて同定することができる。
【０１９６】
それ故に、別の実施形態において、部位特異的変異誘発などの変異誘発アプローチが、本明細書に記載されるHER2/neu抗原若しくはエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原、又はその断片をコードする核酸配列の変異体及び/又は誘導体の調製に使用される。このアプローチによって、それらをコードする基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発によりポリペプチド配列の特定の改変がなされ得る。これらの手法は、例えば、1つ以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することにより、前述の検討事項の1つ以上を組み込む配列変異体を調製及びテストするための直接的アプローチを提供する。
【０１９７】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、及び十分な数の隣接するヌクレオチドを使用して、横断される欠失接合部の両側で安定な二本鎖を形成するのに十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を提供することにより、変異体の作製を可能にする。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善し、変更し、低下させ、改変し、若しくはさもなければ変化させる、及び/又はコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、若しくは一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０１９８】
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメント又は断片は、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて一般に行われているように、化学的手段により断片を直接合成して容易に調製することができる。また、断片は、米国特許第4,683,202号のPCR(商標)技術などの核酸再生技術の適用、組換え作製のための組換えベクターへの選択された配列の導入、及び分子生物学の当業者に一般的に知られている他の組換えDNA法(例えば、Current Protcols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、NY、NY参照)により得ることもできる。
【０１９９】
本明細書に記載される、HER2/neu抗原若しくはエピトープなどの所望の腫瘍抗原、そのポリペプチド若しくは断片、又は上記のいずれかを含む融合タンパク質を発現させるために、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は機能的等価物が、当技術分野で知られている組換え法を用いて、本明細書に記載される複製欠損型アデノウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入される。適当なベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメント、並びに任意の所望のリンカーを含有する。
【０２００】
HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原をコードする配列、並びに適当な転写及び翻訳制御エレメントを含有するこれらのベクターを構築するのに、当業者に利用可能な方法が使用され得る。これらの方法には、インビトロ組換えDNA法、合成法、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような手法は、例えば、AmalfitanoらJ. Virol. 1998; 72:926-33; HodgesらJ Gene Med 2000; 2:250-259; Sambrook Jら(1989) Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.、及びAusubel FMら(1989) Current Protcols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York. N.Yに記載されている。
【０２０１】
様々なベクター/宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含有及び作製するのに利用され得る。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、若しくはコスミドDNAベクターで形質転換された細菌などの微生物;酵母ベクターで形質転換された酵母;ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)若しくは細菌ベクター(例えば、Ti又はpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞系;又は動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
アデノウイルスベクターなどのベクター中に存在する「制御エレメント(control element)」又は「調節配列(regulatory sequence)」は、ベクターのそれらの非翻訳領域-エンハンサー、プロモーター、5'及び3'非翻訳領域-であり、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行する。そのようなエレメントは、その強度及び特異度が異なる可能性がある。利用されるベクター系及び宿主に応じて、構成性及び誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが使用され得る。例えば、HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原をコードする配列が、後期プロモーター及び三連リーダー配列からなるAd転写/翻訳複合体にライゲートされてもよい。ウイルスゲノムの非必須E1又はE3領域への挿入が、感染宿主細胞において該ポリペプチドを発現することができる生ウイルスを得るのに使用されてもよい(Logan JらProc. Natl. Acad. Sci 1984; 87:3655-59)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるのに使用されてもよい。
【０２０３】
特定の開始シグナルも、HER2/neu抗原若しくはエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原をコードする配列のより効率的な翻訳を達成するのに使用され得る。そのようなシグナルには、ATG開始コドン及び隣接配列が含まれる。該ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、及び上流配列が適当な発現ベクターに挿入される場合、追加の転写又は翻訳制御シグナルは必要とされない可能性がある。しかし、コード配列、又はその一部のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確保するために正しいリーディングフレームにあるべきである。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源であってもよい。発現の効率は、文献に記載されているものなど、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーの包含により高めることができる(Scharf D.らResults Probl. Cell Differ. 1994; 20:125-62)。転写又は翻訳のどちらかに特異的な終止配列も、選択ポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために組み込まれてもよい。
【０２０４】
産物に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体のどちらかを用いる、ポリヌクレオチドコード産物(例えば、HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原)の発現を検出及び測定するための様々なプロトコルが、当技術分野で知られている。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及び蛍光活性化細胞選別(FACS)が含まれる。所定のポリペプチド上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用に好ましいが、競合的結合アッセイも使用され得る。これらの及び他のアッセイは、特に、Hampton Rら(1990; Serological Methods、a Laboratory Manual、APS Press、St Paul. Minn.)及びMaddox DEらJ. Exp. Med. 1983; 758:1211-16)に記載されている。
【０２０５】
特定の実施形態において、HER2/neu抗原若しくはエピトープなどの所望の腫瘍抗原の発現を増加させるエレメントが、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターなどの発現コンストラクト又はベクターの核酸配列に組み込まれてもよい。そのようなエレメントは、内部リボソーム結合部位(IRES; WangらCurr. Top. Microbiol. Immunol 1995; 203:99; EhrenfeldらCurr. Top. Microbiol. Immunol. 1995; 203:65; ReesらBiotechniques 1996; 20:102; SugimotoらBiothechnology 1994; 2:694)を含む。IRESは、翻訳効率を向上させる。同様に、他の配列は発現ストックを増強することができる。いくつかの遺伝子に関して、特に5'末端の配列は転写及び/又は翻訳を阻害する。これらの配列は、通常は、ヘアピン構造を形成することができるパリンドロームである。送達される核酸中の任意のそのような配列は、一般的には欠失される。どの配列が発現に影響を与えているかを確認又は解明するために、転写体又は翻訳産物の発現レベルがアッセイされる。転写レベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、RNaseプローブ保護等を含む任意の既知の方法によりアッセイすることができる。タンパク質レベルは、ELISAを含む任意の既知の方法によりアッセイすることができる。
【０２０６】
当業者によって認識されるように、異種核酸配列を含む本明細書に記載されたアデノウイルスベクターなどのベクターは、MaioneらProc Natl Acad Sci USA 2001; 98:5986-91; MaioneらHum Gene Ther 2000 1:859-68; SandigらProc Natl Acad Sci USA、2000; 97:1002-07; HaruiらGene Therapy 2004; 11:1617-26; ParksらProc Natl Acad Sci USA 1996; 93:13565-570; DelloRussoらProc Natl Acad Sci USA 2002; 99:12979-984; Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、NY、NY)に記載されているものなど、当技術分野で知られている組換え法を用いて生成することができる。
【０２０７】
VII.医薬組成物
ある特定の態様では、免疫応答を発生させようとするHER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原を1つ以上コードする核酸配列を含む医薬組成物が提供され得る。例えば、腫瘍抗原は、HER2/neu抗原若しくはエピトープ、又は、本明細書に記述される若しくは当技術分野で利用可能である1つ以上のさらなる腫瘍抗原との組合せを含み得るが、これらに限定されない。
【０２０８】
例えば、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターストックは、適当な緩衝液、生理学的に許容される担体、賦形剤等と組み合わせることができる。特定の実施形態において、適当な数のアデノウイルスベクター粒子が滅菌PBSなどの適当な緩衝液中で投与される。特定の状況において、本明細書に開示されたアデノウイルスベクター組成物を非経口、静脈内、筋肉内、又はさらには腹腔内に送達することが望ましい。
【０２０９】
特定の実施形態において、遊離塩基又は薬学的に許容される塩としての医薬組成物の溶液が、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製されてもよい。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。他の実施形態において、E2b欠失アデノウイルスベクターは、嚥下又は座薬により送達されるピル形態で送達されてもよい。
【０２１０】
注射用途に適した例示的な薬学的形態には、滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が含まれる(例えば、米国特許第5,466,468号参照)。全ての場合において、該形態は滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。該形態は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌、カビ及び菌類などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０２１１】
担体は、例えば、水、脂質、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合物、及び/又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要とされる粒径の維持、及び/又は界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により促進することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物において使用することによりもたらされ得る。
【０２１２】
1つの実施形態において、水溶液での非経口投与に関して、溶液は必要に応じて適切に緩衝化されてもよく、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に分かるであろう。例えば、1回投与量は、1mlの等張NaCl溶液に溶解し、及び1000mlの皮下注入液に添加する、又は提案された注入部位で注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁及び1570〜1580頁参照)。投与量のいくらかのばらつきは、治療される対象の状態に応じて必然的に生じるであろう。さらに、ヒト投与に関して調製は、FDA生物製剤基準局によって要求される無菌性、発熱性、及び全般的安全性、及び純度基準を当然ながら好ましくは満たすであろう。
【０２１３】
担体は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等をさらに含むことができる。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が、活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるこの使用が企図される。補足活性成分も組成物に組み込むことができる。語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与される場合、アレルギー反応又は類似の有害反応を生まない分子実体及び組成物を指す。
【０２１４】
本明細書に記載された治療組成物の投与経路及び頻度、並びに投与量は、個体によって、及び疾患によって異なり、標準的な手法を用いて容易に確立することができる。一般に、医薬組成物及びワクチンは、注射により(例えば、皮内、筋肉内、静脈内又は皮下)、鼻腔内に(例えば、吸引により)、ピル形態で(例えば、嚥下、膣又は直腸送達用の座薬)  投与され得る。特定の実施形態において、1〜3用量が6週間にわたって投与されてもよく、さらなるブースターワクチン接種がその後定期的に与えられてもよい。
【０２１５】
例えば、適切な用量は、上記されたように投与される場合、本明細書の他の部分に記載されているように標的抗原免疫応答を促進することができるアデノウイルスベクターの量である。特定の実施形態において、免疫応答は、基礎(すなわち、未治療)レベルを少なくとも10〜50%上回る。そのような応答は、患者における標的抗原に対する抗体の測定によって、又はインビトロで標的抗原を発現する細胞を殺傷する能力がある細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性生成によって、又は当技術分野で公知である免疫応答をモニタリングするための他の方法によって、モニタリングすることができる。標的抗原は、本明細書に記述されるHER2/neu抗原又はエピトープである。
【０２１６】
一般に、適当な投与量及び治療レジメンは、予防効果を提供するのに十分な量でアデノウイルスベクターを提供する。防御免疫応答は一般的に、免疫(ワクチン接種)の前及び後に患者から得られた試料を用いて行われ得る標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、又はサイトカインアッセイを用いて評価することができる。
【０２１７】
特定の態様において、患者又は対象に投与される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の種類、以前の又は同時の治療的介入、患者の特発性疾患、及び投与経路などの物理的及び生理的要因により決定することができる。投与に対して責任を負う開業医は、いずれにしても、組成物中の活性成分(複数可)の濃度及び個々の対象にとって適当な用量(複数可)を決定することになる。
【０２１８】
本明細書に記載された組成物及び方法の1つの利点は、特にAdに対して既存の免疫を有する個体において、同じアデノウイルスベクターで複数回ワクチン接種を行えることであるが、本明細書に記載されたアデノウイルスワクチンは、初回及び追加刺激レジメンの一環として投与することもできる。混合モダリティ初回刺激及びブースター接種スキームは、免疫応答の増強をもたらし得る。故に、1つの態様は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の腫瘍抗原をコードする核酸配列を含むプラスミドベクターなどのプラスミドワクチンで、該プラスミドワクチンを少なくとも1回投与して対象を初回刺激し、所定の時間の長さを経過させ、次いで本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを投与して追加刺激する方法である。
【０２１９】
複数の初回刺激、例えば、1〜3回が使用され得るが、より多い回数が使用されてもよい。初回刺激から追加刺激までの時間の長さは、典型的には約6カ月〜1年まで異なり得るが、他の時間枠が使用されてもよい。
【０２２０】
特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書でワクチンとして使用される発現コンストラクト若しくはベクター、関連脂質ナノ小胞、又は治療剤を充填されたエクソーム若しくはナノ小胞などの治療剤を、例えば少なくとも0.1%含むことができる。他の実施形態において、治療剤は、例えば、単位重量の約2%〜約75%、又は約25%〜約60%、及びその中の導き出せる任意の範囲を含むことができる。他の非限定的な例において、用量は、投与あたり約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重から約1000mg/kg/体重以上まで、及びその中の導き出せる任意の範囲を含むこともできる。本明細書に列挙された数字から導き出せる範囲の非限定的な例において、約5マイクログラム/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重等の範囲が投与されてもよい。
【０２２１】
医薬組成物の有効量は、意図された目標に基づき決定される。「単位用量」又は「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、投与、すなわち、適当な経路及び治療レジメンに関連して上記に論じた所望の応答を引き起こすように計算された所定量の医薬組成物を含有する。治療回数及び単位用量の両方に従って投与される量は、所望の保護又は効果によって決まる。
【０２２２】
医薬組成物の正確な量も開業医の判断によって決まり、各個体に固有である。用量に影響を与える要因には、患者の物理的及び臨床状態、投与経路、治療の意図された目標(例えば、症状の緩和対治癒)、並びに特定の治療物質の効力、安定性及び毒性が含まれる。
【０２２３】
特定の態様において、本明細書に記述されるワクチン接種レジメンを含む組成物は、任意の経路によって、単独で又は薬学的に許容される担体若しくは賦形剤と一緒に投与することができ、そのような投与は、単回及び複数回投与の両方で実行することができる。より具体的には、医薬組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハンドキャンディー、粉末、スプレー、水性懸濁液、注射可能な溶液、エリキシル、シロップ等の形態で様々な薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。そのような担体には、固体希釈剤又は充填剤、滅菌水性媒体、及び様々な非毒性有機溶媒等が含まれる。さらに、そのような経口医薬製剤は、適切に甘くされ及び/又は風味付けされてもよい(そのような目的のために一般に使用されるタイプの様々な薬剤を用いて)。全体を通して記載される組成物は、疾患、例えば、がんと診断された、それを必要とするヒト若しくは哺乳動物を治療するために、又は免疫応答を増強するために、薬剤に製剤化及び使用することができる。
【０２２４】
特定の実施形態において、本明細書に記載されたウイルスベクター又は組成物は、アジュバントなどの1つ以上の免疫刺激剤と合わせて投与されてもよい。免疫刺激剤は、抗原に対する免疫応答(抗体及び/又は細胞媒介性)を増強又は強化する本質的にあらゆる物質を指す。免疫刺激剤の1つのタイプは、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された水酸化アルミニウム又は鉱油などの物質、及びリピドA、百日咳菌(Bortadella pertussis)又は結核菌由来タンパク質などの免疫応答の刺激物質を含有する。特定のアジュバントは、例えば、Freund's Incomplete Adjuvant及びComplete Adjuvant (Difco Laboratories); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc.) AS-2 (SmithKline Beecham);水酸化アルミニウムゲル(alum)又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩;カルシウム、鉄又は亜鉛の塩;アシル化チロシンの不溶性懸濁液;アシル化糖;カチオン又はアニオン誘導体化多糖;ポリホスファゼン;生分解性ミクロスフェア;モノホスホリルリピドA及びキルA (quil A)として市販されている。サイトカイン、例えば、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、及び/又はIL-32、並びに増殖因子のような他のものも、アジュバントとして使用することができる。
【０２２５】
特定の実施形態内で、アジュバント組成物は、主にTh1型の免疫応答を誘導するものであってもよい。高レベルのTh1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2及びIL-12)は、投与された抗原に対して細胞性免疫応答の誘導を促す傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10)は、液性免疫応答の誘導を促す傾向がある。本明細書に提供されるワクチンの適用後、患者は、Th1及び/又はTh2型応答を含む免疫応答を支持することができる。応答が主にTh1型である特定の実施形態内で、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルより大幅に上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価することができる。故に、様々な実施形態は、複製欠損型ウイルスベクター治療と同時に供給されるサイトカイン、例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13及び/又はIL-15を用いて、標的抗原、例えばHER2/neu抗原又はエピトープに対する免疫応答を産生する療法に関する。いくつかの実施形態において、サイトカイン又はサイトカインをコードする核酸は、本明細書に記載された複製欠損型ウイルスベクターと一緒に投与される。いくつかの実施形態において、サイトカイン投与は、ウイルスベクター投与の前又は後に行われる。いくつかの実施形態において、標的抗原、例えばHER2/neu抗原又はエピトープに対する免疫応答を産生することができる複製欠損型ウイルスベクターは、サイトカインをコードする配列をさらに含む。
【０２２６】
主にTh1型応答を誘発するための特定の例示的なアジュバントには、例えば、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAなどのモノホスホリルリピドAの、アルミニウム塩と一緒の組合せが含まれる。MPL(登録商標)アジュバントが市販されている(例えば、米国特許第4,436,727号;第4,877,611号; 4,866,034号; 及び4,912,094号参照)。CpG含有オリゴヌクレオチド(CpGジヌクレオチドがメチル化されていない)も、主にTh1応答を誘導する(例えば、WO 96/02555、WO 99/33488、並びに米国特許第6,008,200号及び5,856,462号参照)。免疫刺激性DNA配列も使用することができる。
【０２２７】
いくつかの実施形態において使用するための別のアジュバントは、Quil A、若しくはQS21及びQS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.)を含むその誘導体、エスチン;ジギトニン;又はカスミソウ(Gypsophila)若しくはキノア(Chenopodium quinoa)サポニンなどのサポニンを含む。他の製剤は、アジュバント組合せ、例えば、以下の群(QS21、QS7、Quil A、β-エスチン、又はジギトニンを含む)の少なくとも2つのうちの組合せにおいて1つ超のサポニンを含んでもよい。
【０２２８】
いくつかの実施形態において、組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び/又は他のエアロゾル送達ビヒクルにより送達することができる。鼻腔内微粒子樹脂及びリゾホスファチジル-グリセロール化合物を用いた薬物送達が使用されてもよい(例えば、米国特許第5,725,871号参照)。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態の例示的な経粘膜薬物送達が使用されてもよい(例えば、米国特許第5,780,045参照)。
【０２２９】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞等は、適切な宿主細胞/生物への本明細書に記載される組成物の導入に使用することができる。本明細書に記載される組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子等にカプセル化されたいずれの送達用にも製剤化することができる。或いは、本明細書に記載される組成物は、そのような担体ビヒクルの表面に共有又は非共有結合されてもよい。リポソームは、遺伝子、様々な薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクター等を、様々な培養細胞株及び動物に導入するのに効果的に使用することができる。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の自己免疫応答又は容認できない毒性と関連するようには思われない。いくつかの実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、多重膜同心円状二層小胞(すなわち、多重膜小胞(MLV))を自発的に形成する。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物又はベクターの薬学的に許容されるナノカプセル製剤が提供される。ナノカプセルは、一般的に、医薬組成物を安定及び再生可能な方法で封入することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、そのような超微粒子(およそ0.1μmの大きさの)が、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計されてもよい。
【０２３１】
特定の態様において、IL-15を含む医薬組成物が、それを必要とする個体に、本明細書に提供された1つ以上の療法、特に、1つ以上の標的抗原、例えばHER2/neu抗原又はエピトープをコードする核酸配列を含む1つ以上のアデノウイルスベクターと組み合わせて投与されてもよい。
【０２３２】
インターロイキン15 (IL-15)は、IL-2と構造的類似性を有するサイトカインである。IL-2のように、IL-15は、IL-2/IL-15受容体ベータ鎖(CD122)及び共通ガンマ鎖(ガンマ-C、CD132)からなる複合体に結合し、これを通してシグナルを送る。IL-15は、ウイルスによる感染後、単核食細胞(及びいくつかの他の細胞)により分泌される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞、すなわち、主な役割がウイルス感染細胞を殺傷することである自然免疫系の細胞の細胞増殖を誘導する。
【０２３３】
IL-15は、前臨床モデルにおいてCD8+ T細胞の抗腫瘍免疫を増強することができる。転移性黒色腫及び腎細胞がん(腎臓がん)患者においてIL-15の安全性、投薬、及び抗腫瘍効果を評価する第I相臨床試験は、国立衛生研究所で患者を登録し始めている。
【０２３４】
本明細書に開示されたIL-15は、この天然型の機能を維持するように改変されたIL-15の変異体を含むこともできる。
【０２３５】
IL-15は、マウスの第4染色体の34kb領域4q31、及び第8染色体の中心領域によりコードされた14〜15kDa糖タンパク質である。ヒトIL-15遺伝子は、9つのエクソン(1〜8及び4A)及び8つのイントロンを含み、このうちの4つ(エクソン5から8)が成熟タンパク質をコードする。同じタンパク質をコードするこの遺伝子の2つの選択的スプライシング転写変異体が報告されている。48個のアミノ酸の長いシグナルペプチド(IL-15 LSP)を有する最初に同定されたアイソフォームは、316bp 5'非翻訳領域(UTR)、486bpコード配列、及びC末端400bp 3'UTR領域からなる。他のアイソフォーム(IL-15 SSP)は、エクソン4A及び5によりコードされた21個のアミノ酸の短いシグナルペプチドを有する。両方のアイソフォームは、N末端のシグナル配列間に11個のアミノ酸を共有した。両方のアイソフォームは同じ成熟タンパク質を産生するが、細胞トラフィッキングの点で異なる。IL-15 LSPアイソフォームは、ゴルジ装置(GC)、初期エンドソーム、及び小胞体(ER)で同定された。IL-15 LSPアイソフォームは、特に樹状細胞で分泌され、膜結合される2つの形態で存在する。一方、IL-15 SSPアイソフォームは分泌されず、細胞質及び核に限局し、ここで細胞周期の制御において重要な役割を果たすようである。
【０２３６】
IL-15 mRNAの2つのアイソフォームは、マウスにおいて選択的スプライシングにより生成されることが示されている。別の3'スプライシング部位を含有する選択的エクソン5を有したアイソフォームは、高い翻訳効率を示し、この産物はN末端のシグナル配列に疎水性ドメインを欠く。これは、このアイソフォーム由来のタンパク質が細胞内に位置することを示唆している。選択的エクソン5の完全なスプライシングにより生成される、通常のエクソン5を有する他方のアイソフォームは、細胞外に放出され得る。
【０２３７】
IL-15 mRNAは、肥満細胞、がん細胞、又は線維芽細胞を含む多くの細胞及び組織で見出すことができるが、このサイトカインは、主に樹状細胞、単球、及びマクロファージによって成熟タンパク質として産生される。IL-15 mRNAの広範な出現とタンパク質の限られた産生の間のこの不一致は、IL-15 mRNAの翻訳を阻止することができる、ヒトでは12個及びマウスでは5個の上流開始コドンの存在により説明され得る。翻訳不活性なmRNAは細胞内に貯蔵され、特異的シグナル時に誘導され得る。IL-15の発現は、GM-CSFなどのサイトカイン、二本鎖mRNA、非メチル化CpGオリゴヌクレオチド、Toll様受容体(TLR)を通じたリポ多糖(LPS)、インターフェロンガンマ(IFN-γ)により、又は単球ヘルペスウイルス、結核菌、及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の感染後に刺激され得る。
【０２３８】
VIII.ナチュラルキラー(NK)細胞
特定の実施形態において、ネイティブ又は工学操作されたNK細胞が、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターベースの組成物又は免疫療法と組合せて、それを必要とする対象に投与されるために提供され得る。
【０２３９】
免疫系は、免疫細胞の多様なファミリーの複雑に絡み合ったものであり、免疫細胞はそれぞれ、感染及び疾患からの防御においてそれ自身の異なる役割を有する。これらの免疫細胞の中には、身体防御の最前線としてのナチュラルキラー細胞、又はNK細胞がある。NK細胞は、他の支持分子による事前曝露又は活性化なしに、がん又はウイルス感染細胞などの異常な細胞を迅速に探索及び破壊する生得的能力を有する。T細胞などの適応免疫細胞とは対照的に、NK細胞は、第I相臨床試験で細胞ベースの「既製」治療として利用されており、がんに関する殺腫瘍能力を示している。
【０２４０】
1. aNK細胞
ネイティブNK細胞に加えて、病変細胞がNK細胞の殺傷機能を逃れるためにしばしば利用するキラー抑制性受容体(KIR)を発現しない、患者へ投与するためのNK細胞が提供され得る。この独特の活性化NK細胞、又はaNK細胞は、これらの抑制性受容体を欠くが、病変細胞の選択的標的化及び殺傷を可能にする多岐にわたる活性化受容体を保持する。aNK細胞はまた、より大きな搭載量のグランザイム及びパーフォリン含有顆粒も有し、これによりはるかに大きな搭載量の致死的酵素を複数の標的に送達できるようにする。
【０２４１】
2. taNK細胞
キメラ抗原受容体(CAR)技術は、現在開発中の最も新規ながん治療アプローチの1つである。CARは、特異的表面抗原を提示するがん細胞を、免疫エフェクター細胞が標的化できるようにするタンパク質である。taNK(標的活性化ナチュラルキラー(target-activated Natural Killer))は、aNK細胞が1つ以上のCARと工学操作されてがんで見出されるタンパク質を標的化し、次いで広範なスペクトラムのCARと一体化されるプラットフォームである。この戦略は、自己T細胞などの患者又はドナー源エフェクター細胞を用いる他のCARアプローチと比べて、特に拡張性、品質管理、及び一貫性の点で複数の利点を有する。
【０２４２】
がん細胞殺傷の多くは、エフェクター免疫細胞が抗体に結合すると、今度は抗体が標的がん細胞に結合され、これによりエフェクター細胞によるがんの殺傷を促進するADCC (抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害)に依存している。NK細胞は、ADCCにとって体内の重要なエフェクター細胞であり、抗体を結合するための特殊化した受容体(CD16)を利用する。
【０２４３】
3.haNK細胞
研究は、おそらくヒト集団の20%のみがCD16の「高親和性」変異体(haNK細胞)を一律に発現し、該変異体は、「低親和性」CD16を有する患者と比べてより好ましい治療転帰と強く相関することを示している。さらに、多くのがん患者は、化学療法、疾患自体、又は他の要因のために免疫系がひどく弱まっている。
【０２４４】
特定の態様において、NK細胞は、高親和性CD16(haNK細胞)を発現するように改変される。かくして、haNK細胞は、がん細胞に対する広範囲の抗体の治療効果を強化することができる。
【０２４５】
IX.併用療法
随所に記述されるHER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原をコードする核酸配列を含む、アデノウイルスベクター系ワクチン接種を含む組成物は、薬学的医薬に製剤化され、疾患、例えばがんの診断を受けた、それを必要とするヒト又は哺乳動物を処置するために使用され得る。これらの医薬は、1つ以上のさらなるワクチン又は他のがん療法とともに、ヒト又は哺乳動物に共投与されてもよい。
【０２４６】
ある特定の態様では、本明細書に記述される医薬は、1つ以上の利用可能な乳がん療法、例えば、手術、放射線療法、又はホルモン遮断療法剤、化学療法剤、若しくはモノクローナル抗体などの投薬といった従来のがん療法と組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記述される任意のワクチン(例えば、Ad5[E1-,E2b-]-HER3)を低用量化学療法剤又は低用量放射線と組み合わせてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、投与される化学療法剤の用量が臨床標準治療よりも低くなるように、本明細書に記述される任意のワクチン(例えば、Ad5[E1-,E2b-]-HER3)を化学療法剤と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、化学療法剤はシクロホスファミドとすることができる。シクロホスファミドは、臨床標準治療の用量よりも低い用量で投与され得る。例えば、化学療法剤は、合計8週間にわたって2週間毎に、1〜5日目及び8〜12日目に1日2回(BID)50mg投与してよい。いくつかの実施形態では、投与される放射線の用量が臨床標準治療よりも低くなるように、本明細書に記述される任意のワクチン(例えば、Ad5[E1-,E2b-]-HER3)を放射線と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、8Gyにおける併用体幹部定位照射(SBRT)を、8日目、22日目、36日目、50日目に与えてもよい(2週間毎の計4回用量)。SBRTを使用した場合、実行可能な腫瘍部位のすべてに放射線を投与することができる。
【０２４７】
ある特定の態様では、乳がん処置のために使用される投薬には、ホルモン遮断剤、化学療法剤、及びモノクローナル抗体が含まれる。一部の乳がんは、増殖を続けるためにエストロゲンを必要とする。これらは、表面上のエストロゲン受容体(ER+)及びプロゲステロン受容体(PR+)(あわせてホルモン受容体と呼ばれることもある)の存在によって特定することができる。これらのER+がんは、受容体を遮断する薬物、例えばタモキシフェン、或いは、アロマターゼ阻害剤によりエストロゲンの産生を遮断する薬物、例えばアナストロゾール又はレトロゾールのいずれかを用いて処置され得る。タモキシフェンの使用は10年間にわたって推奨されている。アロマターゼ阻害剤は閉経後の女性に有用であるが、この群においてはタモキシフェンよりも良好なようである。これは、閉経後の女性における活性アロマターゼが、閉経前の女性に多い形態と異なるためであり、したがってこれらの薬剤は、閉経前の女性に顕著なアロマターゼの阻害においては効果的でない。
【０２４８】
化学療法は、主としてステージ2〜4の乳がんの症例に使用され、エストロゲン受容体陰性(ER-)疾患において特に有益である。化学療法剤は、通常3〜6カ月の期間にわたり、組み合わせて投与される。最も一般的なレジメンのうちの1つは「AC」として公知であり、シクロホスファミドをドキソルビシンと組み合わせたものである。ドセタキセル(Taxotere)などのタキサン薬が加えられることもあり、この場合のレジメンは「CAT」として公知である。別の一般的な処置は、シクロホスファミド、メトトレキサート、及びフルオロウラシル(すなわち「CMF」)である。ほとんどの化学療法剤は、複製時にDNA損傷を引き起こすこと、又は他の機構のいずれかにより、急速に増殖するがん細胞及び/又は急速に複製するがん細胞を破壊することによって機能する。しかしながら、これらの薬は、急速に増殖する正常な細胞をも損傷するため、深刻な副作用を引き起こし得る。例えば、心筋への損傷がドキソルビシンの最も危険な合併症である。
【０２４９】
HER2/neuは、モノクローナル抗体であるトラスツズマブ(市販名Herceptin)の標的である。HER2/neu(一部の乳がん細胞で特に活性のある細胞受容体)に対するモノクローナル抗体であるトラスツズマブは、ステージ1〜3のHER2/neu陽性乳がんの5年無疾患生存率を約87%(全生存率95%)まで改善させている。化学療法も受けているHER2/neu陽性乳がん患者のすべてに対し、1年間のトラスツズマブ療法が推奨されている。
【０２５０】
ある特定の増殖因子によって刺激されると、HER2/neuは、細胞の増殖及び分裂を引き起こし、この増殖因子による刺激の非存在下では、細胞は通常、増殖を止める。25%から30%の間の乳がんにおいてHER2/neu遺伝子又はそのタンパク質産物が過剰発現し、乳がんにおけるHER2/neuの過剰発現は、疾患再発の増大及び予後の悪化に関連している。トラスツズマブが受容体を過剰発現する乳がん細胞中のHER2/neuに結合すると、トラスツズマブは、増殖因子が受容体に結合してこれを刺激することを防止し、がん細胞の増殖を効果的に遮断する。トラスツズマブがHER2/neuに結合することの重要な下流効果は、細胞増殖を停止させるタンパク質であるp27の増大である。したがって、トラスツズマブは、HER2/neuが増幅/過剰発現する乳がん患者に有用である。
【０２５１】
別のモノクローナル抗体であるペルツズマブは、HER2/neu及びHER3受容体の二量体化を阻害するもので、トラスツズマブとの併用が2012年6月にFDAによって認可された。
【０２５２】
さらに、NeuVax(Galena Biopharma)は、HER2/neuを発現するがん細胞に「キラー」T細胞の標的を定めてこれを破壊させる、ペプチドベースの免疫療法である。これは第3相臨床治験に進んでいる。
【０２５３】
PI3K/AKT分子経路を阻害する薬物は、実際には、ER-/HER2/neu+乳がん患者と比較して、ER+(エストロゲン受容体陽性)/HER2/neu+乳がん患者に対してより有効な場合があることが見出された。
【０２５４】
HER2/neuの過剰発現は、他の遺伝子の増幅によって抑制される場合もある。どの遺伝子がこの望ましい効果を有し得るかを発見するため、現在調査が行われている。
【０２５５】
HER2/neuの発現は、エストロゲン受容体を介したシグナル伝達によって制御される。通常は、エストロゲン受容体を介して作用するエストラジオール及びタモキシフェンがHER2/neuの発現を下方制御する。しかしながら、コアクチベーターAIB-3の比がコリプレッサーPAX2の比を超過すると、タモキシフェンの存在下でHER2/neuの発現が上方制御され、タモキシフェン抵抗性乳がんにつながる。
【０２５６】
ある特定の態様では、本明細書に記述されるこれらの医薬は、本明細書に記述される1つ以上の従来のがん療法若しくは代替的ながん療法又は免疫経路チェックポイント調節薬と併用され得る。アデノウイルスベクター系医薬を用いる併用療法は、任意のがん、特に乳がん、又は切除不能、局所進行、若しくは転移性がんを処置するために使用してよい。
【０２５７】
従来のがん治療は、化学又は放射線ベースの治療及び手術の群から選択される1つ以上の治療を含む。化学療法には、例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロスウレア、ダクチノマイシン、ダウルノビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、ミトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、又は前述の任意の類似体若しくは誘導体変異体が含まれる。
【０２５８】
DNA損傷を引き起こし、広く使用されている放射線療法には、γ-線、X-線として一般に知られているもの、及び/又は放射性同位元素の腫瘍細胞への直接送達が含まれる。マイクロ波及びUV照射などのDNA損傷要因の他の形態も企図される。これらの要因の全ては、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製及び修復、並びに染色体の構築及び維持に広範囲の損傷をもたらす可能性が最も高い。X-線の線量範囲は、長期間(3〜4週)では日線量50〜200レントゲンから、単回線量2000〜6000レントゲンにわたる。放射性同位元素の線量範囲は大きく異なり、同位元素の半減期、放射される放射線の強さ及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０２５９】
細胞に適用される場合、「接触された」及び「曝露された」という用語は、治療コンストラクト及び化学療法剤又は放射線療法剤が、標的細胞に送達される又は標的細胞と直接並列して置かれるプロセスを記載するのに本明細書で使用される。細胞殺傷又は静止を達成するために、両方の薬剤は、細胞を殺傷する又は分裂を防ぐのに有効な合計量で細胞に送達される。
【０２６０】
がんを有する人の約60%は、予防的、診断又は病期診断的、根治的、及び緩和的手術を含む何らかの手術を受けることになる。根治的手術は、本明細書に記載された治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び/又は代替療法などの他の療法と合わせて使用され得るがん治療である。
【０２６１】
根治的手術は、がん組織の全て又は一部が物理的に除去、摘出、及び/又は破壊される切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術(モース手術)が含まれる。本明細書に記載された治療方法は、表在がん、前がん、又は付随的な量の正常組織の除去と合わせて使用され得ることがさらに企図される。
【０２６２】
がん細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全てを摘出すると、体内に空洞が形成される場合がある。治療は、追加の抗がん療法による該エリアの灌流、直接注射、又は局所適用により達成され得る。そのような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、若しくは14日毎、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20週毎、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24カ月毎に繰り返されてもよい。これらの治療は、同様に様々な投与量となり得る。
【０２６３】
代替がん治療には、手術、化学療法及び放射線療法以外の、免疫療法、遺伝子療法、ホルモン療法又はそれらの組合せなどの任意のがん治療が含まれる。本方法を用いて予後不良と同定された対象は、従来の治療(複数可)単独に好ましい応答を得られない可能性があり、1つ以上の代替がん治療そのものを、又は1つ以上の従来の治療と組合せて処方又は投与され得る。
【０２６４】
免疫療法薬は、一般的に、がん細胞を標的化し、破壊するのに免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体は単独で療法のエフェクターとして機能し得、又は他の細胞を動員して実際に細胞殺傷をもたらし得る。抗体は、薬物又は毒素(化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等)にコンジュゲートされ、単に標的化剤として機能することもできる。或いは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接又は関節的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞及びNK細胞が含まれる。
【０２６５】
遺伝子療法は、DNA又はRNAを含むポリヌクレオチドを対象の細胞及び組織に挿入して、疾患を治療することである。アンチセンス療法も遺伝子療法の一形態である。治療ポリヌクレオチドは、最初のがん治療の前、後、又は同時に投与されてもよい。様々なタンパク質をコードするベクターの送達が、いくつかの実施形態において提供される。例えば、p53、p16及びC-CAMなどの外因性腫瘍抑制がん遺伝子の細胞発現は、過剰な細胞増殖を阻害する機能を発揮するであろう。
【０２６６】
治療の治療効果を改善するのに使用される追加の薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体及びGAPジャンクションの上方制御に影響を与える薬剤、細胞分裂阻害剤及び分化剤、細胞接着阻害剤、又はアポトーシス誘導剤に対する過剰増殖細胞の感度を高める薬剤が含まれる。免疫調節薬剤には、腫瘍壊死因子;インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマ; IL-2及び他のサイトカイン; F42K及び他のサイトカイン類似体;又はMIP-1、MIP-1ベータ、MCP-1、RANTES、及び他のケモカインが含まれる。Fas/Fasリガンド、DR4又はDR5/TRAILなどの細胞表面受容体又はそのリガンドの上方制御は、過剰増殖細胞に対するオートクリン又はパラクリン作用の確立によりアポトーシス誘導能を強化することがさらに企図される。GAPジャンクションの数を高めることによる細胞間シグナル伝達の増加は、付近の過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増大させるであろう。他の実施形態において、細胞分裂阻害剤又は分化剤が、治療の抗過剰増殖効果を改善するのに本明細書に記載された医薬組成物と組合せて使用されてもよい。細胞接着阻害剤は、本明細書に記載された医薬組成物の効果を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ(FAK)阻害剤及びロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を高める他の薬剤、例えば抗体c225が、治療効果を改善するのに本明細書に記載された医薬組成物と組合せて使用され得ることがさらに企図される。
【０２６７】
ホルモン療法も、以前に記載された任意の他のがん治療と組み合わせて使用することができる。ホルモンの使用は、テストステロン若しくはエストロゲンなどの特定のホルモンのレベルを低下させる、又は該ホルモンの作用を遮断するために、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、又は子宮頸がんなどの特定のがんの治療において使用することができる。この治療は、治療選択肢として少なくとも1つの他のがん治療剤と組合せて、又は転移のリスクを低減するためにしばしば使用される。
【０２６８】
「化学療法剤」又は「化学療法化合物」及びこの文法的等価物は、本明細書で使用される場合、がんの治療において有用な化学化合物であってもよい。開示されたT細胞と組合せて使用することができるがん化学療法剤には、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)が含まれるが、これらに限定されない。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びナベルビン(商標) (ビノレルビン、5'-ノルアンヒドロブラスチン(noranhydroblastine))が含まれる。さらに他の実施形態において、がん化学療法剤には、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼI阻害剤が含まれる。本明細書で使用される場合、「カンプトテシン化合物」には、Camptosar(商標) (イリノテカンHCL)、Hycamtin(商標) (トポテカンHCL)、及びカンプトテシン由来の他の化合物、及びその類似体が含まれる。本明細書に開示された方法及び組成物において使用することができるがん化学療法剤の別のカテゴリーは、エトポシド、テニポシド及びミトポドジドなどのポドフィロトキシン誘導体である。
【０２６９】
特定の態様において、本明細書に記載された方法又は組成物は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤として知られる他のがん化学療法剤の使用をさらに包含する。これらには、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロルナファジン、及びダカルバジンが含まれるが、これらに限定されない。本開示は、化学治療剤としての代謝拮抗薬を包含する。これらのタイプの薬剤の例には、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びプロカルバジンが含まれる。
【０２７０】
本明細書に開示された方法及び組成物において使用され得るがん化学療法剤の追加のカテゴリーには、抗生物質が含まれる。例には、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC、及びダウノマイシンが含まれるが、これらに限定されない。これらの化合物には市販されている数多くのリポソーム製剤がある。特定の態様において、本明細書に記載された方法又は組成物は、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イフォスファミド、及びミトキサントロンを含むがこれらに限定されない、他のがん化学療法剤の使用をさらに包含する。
【０２７１】
本明細書に開示されたアデノウイルスワクチンは、細胞傷害性/抗新生物剤及び抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害性/抗新生物剤は、がん細胞を攻撃及び殺傷する薬剤として定義することができる。いくつかの細胞傷害性/抗新生物剤は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロルナファジン、及びダカルバジンであってもよい。他の細胞傷害性/抗新生物剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びプロカルバジンであってもよい。他の細胞傷害性/抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC、及びダウノマイシンであってもよい。これらの化合物には市販されている数多くのリポソーム製剤がある。さらに他の細胞傷害性/抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)であってもよい。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びエトポシドが含まれる。種々の細胞傷害性/抗新生物剤には、タキソール及びその誘導体、L-アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、VM-26、イフォスファミド、ミトキサントロン、及びビンデシンが含まれる。
【０２７２】
CAR T細胞、T細胞受容体改変T細胞、B細胞受容体改変細胞の集団を含む追加の製剤が、本明細書に記載された医薬組成物の投与と共に、前に、又は後に、対象に投与されてもよい。養子移入細胞の治療的に有効な集団が、本明細書に記載された方法が行われるときに対象に投与されてもよい。一般に、約1×104〜約1×1010のCAR T細胞、T細胞受容体改変細胞、又はB細胞受容体改変細胞を含む製剤が投与される。いくつかの場合において、製剤は、約1×105〜約1×109の改変細胞、約5×105〜約5×108の改変細胞、又は約1×106〜約1×107の改変細胞を含む。しかし、対象に投与される改変細胞の数は、がんの位置、発生源、同一性、程度及び重症度、治療される対象の年齢及び状態等に応じて、幅広い制限間で異なる。医師は、使用される適当な投与量を最終的に決定することになる。
【０２７３】
抗血管新生剤も使用することができる。開示された方法及び組成物における使用に適した抗血管新生剤には、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む抗VEGF抗体、抗VEGFアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。血管新生の他の阻害剤には、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1 (α及びβを含む)、インターロイキン12、レチノイン酸、及びメタロプロテアーゼ1及び2の組織阻害剤が含まれる(TIMP-1及び2)。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼII阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子も、使用することができる。
【０２７４】
場合により、例えば、がんを処置する組成物、製剤、及び方法において、投与される組成物又は製剤の単位投与量は、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg、又はこれらの数から得られる任意の介在値若しくは範囲であり得る。場合により、投与される組成物又は製剤の総量は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100g、又はこれらの数から得られる任意の介在値若しくは範囲であり得る。
【０２７５】
X.免疫学的融合パートナー抗原標的
本明細書に記載されたウイルスベクター又は組成物は、HER2/neu抗原、又は本明細書に開示された任意の他の標的抗原などの標的抗原の免疫原性を高めることができるタンパク質、又は「免疫学的融合パートナー」をコードする核酸配列をさらに含んでもよい。これに関して、そのようなタンパク質を含有するウイルスベクターによる免疫後に産生されるタンパク質は、目的とする標的抗原の免疫原性を高めるタンパク質に融合された、目的とする標的抗原を含む融合タンパク質となり得る。さらに、HER2/neuをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター、及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、両方の治療的部分の組合せが、HER2/neuをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター単独、又は免疫学的融合パートナー単独のどちらかより、免疫応答を相乗的に追加刺激するように作用するような、免疫応答の追加刺激をもたらすことができる。例えば、HER2/neuをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター、及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+ T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に対するNK細胞応答の刺激、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性T細胞性抗体依存性細胞食作用(ADCP)機構を介した感染細胞の殺傷に対する好中球若しくは単球細胞応答の刺激、又はそれらの任意の組合せの相乗的増強をもたらすことができる。この相乗的追加刺激は、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を著しく改善することができる。特定の実施形態において、HER2/neuをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象において、約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む免疫応答の惹起をもたらすことができる。別の実施形態において、免疫応答の惹起は、HER2/neu抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の惹起は、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2 (IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される場合、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的細胞性免疫活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の惹起は、本明細書に記載されるHER2/neu抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーを投与された対象における、適当な対照と比較して1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の惹起は、アデノウイルスベクターを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０２７６】
追加の例として、標的エピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+ T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に対するNK細胞応答の刺激、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性T細胞食細胞作用(ADCP)機構介した感染細胞の殺傷に対する好中球若しくは単球細胞応答の刺激、又はそれらの任意の組合せの相乗的増強をもたらすことができる。この相乗的追加刺激は、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を著しく改善することができる。特定の実施形態において、標的エピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象において、約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む免疫応答の惹起をもたらすことができる。別の実施形態において、免疫応答の惹起は、標的エピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の惹起は、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2 (IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される場合、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的細胞性免疫活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の惹起は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを投与された対象における、適当な対照と比較して1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の惹起は、アデノウイルスベクターを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０２７７】
1つの実施形態において、そのような免疫学的融合パートナーは、結核菌由来Ra12断片など、マイコバクテリウム種に由来する。マイコバクテリウム種由来の免疫学的融合パートナーは、配列番号35〜配列番号43に記載された配列のいずれか1つであってもよい。Ra12組成物、並びに異種ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列の発現及び/又は免疫原性の増強においてRa12  組成物を使用するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,009,042号に記載されている。簡単には、Ra12は、結核菌MTB32A核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域を指す。MTB32Aは、結核菌の病原性及び非病原性株の遺伝子によりコードされた32kDaのセリンプロテアーゼである。MTB32Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が記載されている(例えば、米国特許第7,009,042号; Skeikyら、Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999)参照。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。MTB32Aコード配列のC末端断片は、高レベルで発現することができ、精製プロセス全体を通して可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ra12は、Ra12が融合される異種免疫原姓ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。Ra12融合ポリペプチドは、MTB32Aのアミノ酸残基192〜323に対応する14kDa C末端断片を含むことができる。他のRa12ポリヌクレオチドは、一般的に、Ra12ポリペプチドの一部をコードする少なくとも15、30、60、100、200、300、又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。Ra12ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列(すなわち、Ra12  ポリペプチド又はその一部をコードする内因性配列)を含んでもよく、又はそのような配列の変異体を含んでもよい。Ra12ポリヌクレオチド変異体は、コードされた融合ポリペプチドの生物活性が、ネイティブRa12ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比べて実質的に減少しないように、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含有してもよい。変異体は、ネイティブRa12  ポリペプチド又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、80%、又は90%の同一性、又はそれ以上を有することができる。
【０２７８】
特定の態様において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質、タンパク質Dに由来することができる。タンパク質D由来の免疫学的融合パートナーは、配列番号44に記載された配列であってもよい。いくつかの場合において、タンパク質D誘導体は、該タンパク質の最初の約三分の一(例えば、最初のN末端100〜110アミノ酸)を含む。タンパク質D誘導体は脂質化されてもよい。特定の実施形態内で、リポタンパク質D融合パートナーの最初の109残基が、追加の外因性T細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するためにN末端に含まれる。該エピトープは、大腸菌における発現レベルを増加させることができ、発現エンハンサーとして機能することができる。脂質尾部は、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確保することができる。他の融合パートナーには、インフルエンザウイルス、NS1 (ヘマグルチニン)由来の非構造タンパク質が含まれ得る。典型的には、N末端の81個のアミノ酸が使用されるが、Tヘルパーエピトープを含む種々の断片が使用され得る。
【０２７９】
特定の態様において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして知られるタンパク質、又はその一部(特にC末端部分)であってもよい。LYTA由来の免疫学的融合パートナーは、配列番号45に記載された配列であってもよい。LYTAは、(LytA遺伝子によってコードされた)アミダーゼLYTAとして知られるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリン又はDEAEなどのいくつかのコリン類似体への親和性に関与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現する大腸菌C-LYTAの開発に利用されている。C-LYTA断片をアミノ末端に含有するハイブリッドタンパク質の精製が使用され得る。別の実施形態内で、LYTAの反復部分が融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、例えば、残基178で始まるC末端領域で見出すことができる。1つの特定の反復部分は、残基188〜305を組み込む。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーに融合される。標的抗原融合は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの1つ以上と実質的な同一性を有するタンパク質を作製することができる。標的抗原融合は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの1つ以上と実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸をコードすることができる。いくつかの実施形態において、標的抗原融合は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる1つ以上の免疫学的融合パートナーをさらに含む。IFN-γの配列は、配列番号46に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。TNFαの配列は、配列番号47に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-2の配列は、配列番号48に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-8の配列は、配列番号49に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-12の配列は、配列番号50に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-18の配列は、配列番号51に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-7の配列は、配列番号52に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-3の配列は、配列番号53に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-4の配列は、配列番号54に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-5の配列は、配列番号55に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-6の配列は、配列番号56に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-9の配列は、配列番号57に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-10の配列は、配列番号58に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-13の配列は、配列番号59に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-15の配列は、配列番号60に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-16の配列は、配列番号87に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-17の配列は、配列番号88に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-23の配列は、配列番号89に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-32の配列は、配列番号90に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。いくつかの実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーを有する細胞において共発現される。
【０２８２】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、CpG ODN (非限定的な例示的配列は、配列番号61に示されている)、コレラ毒素(非限定的な例示的配列は、配列番号62に示されている)、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域(非限定的な例示的配列は(非限定的な例示的配列は、配列番号63に示されている)に示されている、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域(非限定的な例示的配列は、配列番号64に示されている)、Hp91 (非限定的な例示的配列は、配列番号65に示されている)、CCL20 (非限定的な例示的配列は、配列番号66に示されている)、CCL3 (非限定的な例示的配列は、配列番号67に示されている)、GM-CSF (非限定的な例示的配列は、配列番号68に示されている)、G-CSF (非限定的な例示的配列は、配列番号69に示されている)、LPSペプチド模倣体(非限定的な例示的配列は、配列番号70〜配列番号81に示されている)、志賀毒素(非限定的な例示的配列は、配列番号82に示されている)、ジフテリア毒素(非限定的な例示的配列は、配列番号83に示されている)、又はCRM197 (非限定的な提示的配列は、配列番号86に示されている)を含む、免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、IL-15スーパーアゴニストを含む免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。インターロイキン15 (IL-15)は、ウイルス感染後に分泌される天然に存在する炎症性サイトカインである。分泌されたIL-15は、エフェクター免疫細胞上のIL-15の同族受容体を介したシグナル伝達により機能を実行することができ、故に、エフェクター免疫細胞活性の全体的な増強をもたらすことができる。
【０２８４】
細胞性免疫応答を刺激及び維持するIL-15の幅広い能力に基づき、IL-15は、特定のがんを治癒する可能性がある有望な免疫治療薬であると考えられている。しかし、IL-15の臨床開発における重大な制限には、標準的哺乳動物細胞発現系における低い産生収量、及び短い血清半減期が含まれ得る。さらに、遊離IL-15サイトカインよりむしろ、同じ細胞により共発現されるタンパク質を含むIL-15:IL-15Rα複合体が、IL-15βγc受容体を有する免疫エフェクター細胞の刺激に関与している可能性がある。
【０２８５】
これらの短所に取り組むために、IL-15Rβγcに結合する能力が増大し、生物活性が増強した新規IL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)が同定された。マウス又はヒトどちらかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を等モル濃度のIL-15N72Dに加えると、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、IL-15依存的細胞増殖を支持する半有効濃度(EC50) (遊離IL-15サイトカインのそれより10倍超低かった)を示すほど、IL-15生物活性のさらなる増加をもたらすことができる。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、IL-15スーパーアゴニストは、新規IL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)であってもよい。特定の実施形態において、マウス又はヒトどちらかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を等モル濃度のIL-15N72Dに加えると、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、IL-15依存的細胞増殖を支持する半有効濃度(EC50) (遊離IL-15サイトカインのそれより10倍超低くなり得る)を示すほど、IL-15生物活性のさらなる増加をもたらすことができる。
【０２８７】
故に、いくつかの実施形態において、本開示は、IL-15依存的細胞増殖を支持するEC50が、遊離IL-15サイトカインのそれより2倍超低い、3倍超低い、4倍超低い、5倍超低い、6倍超低い、7倍超低い、8倍超低い、9倍超低い、10倍超低い、15倍超低い、20倍超低い、25倍超低い、30倍超低い、35倍超低い、40倍超低い、45倍超低い、50倍超低い、55倍超低い、60倍超低い、65倍超低い、70倍超低い、75倍超低い、80倍超低い、85倍超低い、90倍超低い、95倍超低い、又は100倍超低いIL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体を提供する。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、IL-15スーパーアゴニストは、ALT-803としても知られる、2つのIL-15N72D分子及び二量体の可溶性IL-15Rα/Fc  融合タンパク質の生物学的に活性なタンパク質複合体である。ALT-803の組成物並びにALT-803を作製及び使用する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2015/0374790号に記載されている。N末端にいわゆる「スシ」ドメイン(Su)を含有する可溶性IL-15Rα断片は、高親和性サイトカイン結合に関与する構造エレメントの大部分を有し得ることが知られている。可溶性融合タンパク質は、ヒトIL-15RαSuドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を、Fcドメイン(232個のアミノ酸)を含有するヒトIgG1 CH2-CH3領域と連結させて生成することができる。このIL-15RαSu/IgG1 Fc融合タンパク質は、IgG1ドメインを介したジスルフィド結合による二量体形成、及び標準的なプロテインA親和性クロマトグラフィー方法を用いる精製の容易さという利点を有し得る。
【０２８９】
いくつかの実施形態において、ALT-803は、二量体IL-15Rαスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質に対する高親和性と関連するヒトIL-15変異体の2つのタンパク質サブユニットからなる可溶性複合体を有してもよい。IL-15変異体は、ヘリックスC N72Dの72位でAsnからAspに置換している、成熟ヒトIL-15サイトカイン配列を含む114アミノ酸ポリペプチドである。ヒトIL-15Rスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質は、Fcドメイン(232個のアミノ酸)を含有するヒトIgG1 CH2-CH3領域と連結されたIL-15Rサブユニットのスシドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を含む。N72D置換は別にして、タンパク質配列の全てはヒトである。該サブユニットのアミノ酸配列に基づき、2つのIL-15N72Dポリペプチド(例示的なIL-15N72D配列は配列番号84に示されている)及びジスルフィド連結ホモ二量体IL- l5RαSu/IgG1 Fcタンパク質(例示的なIL-15RαSu/Fcドメインは配列番号85に示されている)を含む複合体の計算された分子量は、92.4kDaである。いくつかの実施形態において、標的抗原及びALT-803をコードする組換えベクターは、標的抗原をコードするのに本明細書に記載されたいずれの配列も有することができ、ALT-803をコードするのに、配列番号84、配列番号84、配列番号85、及び配列番号85をいずれの順番でも有することができる。
【０２９０】
各IL-15N720ポリペプチドは、約12.8kDaの計算された分子量を有し、IL-15RαSu/IgG 1 Fc融合タンパク質は、約33.4kDaの計算された分子量を有する。IL-15N72D及びIL-15RαSu/IgG 1 Fcタンパク質は両方ともグリコシル化され得、サイズ排除クロマトグラフィーによる約114kDaのALT- 803の見かけの分子量をもたらす。ALT-803について決定された等電点(pI)は、約5.6〜6.5にわたり得る。故に、融合タンパク質はpH7で負に荷電され得る。
【０２９１】
HER2/neuをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及びALT-803による併用療法は、両方の治療的部分の組合せが、どちらかの療法単独より、免疫応答を相乗的に追加刺激するように作用するような、免疫応答の追加刺激をもたらすことができる。例えば、HER2/neu抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及びALT-803による併用療法は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+ T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に対するNK細胞応答の刺激、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、又は抗体依存性細胞食作用(ADCP)機構を介した感染細胞の殺傷に対する好中球若しくは単球細胞応答の刺激の相乗的増強をもたらすことができる。HER2/neu抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及びALT-803による併用療法は、上記の応答のいずれか1つ、又は上記の応答の組合せを相乗的に追加刺激して、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を著しく改善することができる。
【０２９２】
本明細書に記載されたいずれの免疫原性増強剤も、本明細書に記載された任意の組換えベクターを用いて、免疫原性増強剤及び標的抗原を同じ組換えベクターで発現させて、標的抗原に融合又は連結することができる。
【０２９３】
そのような免疫原性増強剤をコードする核酸配列は、配列番号35〜配列番号90のいずれか1つであってもよく、表1にまとめられている。
【０２９４】
【表１】
2019521099.tif 000003
2019521099.tif 000004
2019521099.tif 000005
2019521099.tif 000006
2019521099.tif 000007
2019521099.tif 000008
2019521099.tif 000009
【０２９５】
いくつかの実施形態において、標的抗原及び免疫学的融合パートナーをについての核酸配列は、任意の核酸によって隔てられない。他の実施形態において、リンカーをコードする核酸配列が、本明細書に記載された任意の標的抗原をコードする核酸配列と、本明細書に記載された任意の免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に挿入されてもよい。故に、特定の実施形態において、標的抗原、リンカー、及び免疫学的融合パートナーを含有するウイルスベクターで免疫後に産生されたタンパク質は、目的とする標的抗原とこれに続くリンカーを含み、免疫学的融合パートナーで終わり、故にリンカーを介して目的とする標的抗原の免疫原性を高める免疫学的融合パートナーに標的抗原を連結する融合タンパク質となり得る。いくつかの実施形態において、リンカー核酸の配列は、約1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸配列は、1つ以上のアミノ酸残基をコードしてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーのアミノ酸配列は、約1〜約50、又は約5〜約25アミノ酸残基長であってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーの配列は10アミノ酸未満を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、又はアラニン及びグリシンの両方を有するリンカーであってもよい。
【０２９６】
そのようなリンカーをコードする核酸配列は、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つであってもよく、表2にまとめられている。
【０２９７】
【表２】
2019521099.tif 000010
【０２９８】
XI.共刺激分子
HER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原を含有する組換えアデノウイルス系ベクターワクチンの使用に加えて、共刺激分子を当該ワクチンに組み込んで免疫原性を増大させることができる。免疫応答の開始は、APCによるネイティブT細胞の活性化のための少なくとも2つのシグナルを必要とする(DamleらJ Immunol 148:1985-92 (1992); GuinanらBlood 84:3261-82 (1994); HellstromらCancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996); HodgeらCancer Res 39:5800-07 (1999))。抗原特異的第一シグナルは、ペプチド/主要組織適合性複合体(MHC)を介してT細胞受容体(TCR)を通じて送達され、T細胞を細胞周期に入らせる。第二シグナル、又は共刺激物質シグナルは、サイトカイン産生及び増殖のために送達され得る。
【０２９９】
専門の抗原提示細胞(APC)の表面で通常見出される少なくとも3つの異なる分子、すなわち、B7-1 (CD80)、ICAM-1 (CD54)、及びLFA-3 (ヒトCD58)が、T細胞活性化のための第二のシグナルを提供できると報告されている(DamleらJ Immunol 148:1985-92 (1992); GuinanらBlood 84: 3261-82 (1994); WingrenらCrit Rev Immunol 15: 235-53 (1995); ParraらScand. J Immunol 38: 508-14 (1993); HellstromらAnn NY Acad Sci 690: 225-30 (1993); ParraらJ Immunol 158: 637-42 (1997); SperlingらJ Immunol 157: 3909 -17 (1996); DubeyらJ Immunol 155: 45-57 (1995); CavalloらEur J Immunol 25: 1154 -62 (1995))。
【０３００】
これらの共刺激分子は、異なるT細胞リガンドを有する。B7-1はCD28及びCTLA-4分子と相互作用し、ICAM-1はCD11a/CD18 (LFA-1β2インテグリン)複合体と相互作用し、及びLFA-3はCD2 (LFA-2)分子と相互作用する。それ故に、好ましい実施形態において、HER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原をコードする1つ以上の核酸を含有する組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンと組み合わされる場合、特異的標的抗原に対する抗腫瘍免疫応答をさらに増大/増強するB7-1、ICAM-1、及びLFA-3をそれぞれ含有する組換えアデノウイルスベクターを有することが望ましいであろう。
【０３０１】
XII.免疫経路チェックポイント調節因子
ある特定の実施形態において、免疫経路チェックポイント阻害剤は、本明細書に開示されたアデノウイルスベクターを含む組成物と組み合わされる。ある特定の実施形態において、患者は、本明細書に記載されたワクチン又は医薬組成物と合わせて、免疫経路チェックポイント阻害剤を受け取った。さらなる実施形態において、組成物は、1つ以上の免疫経路チェックポイント調節因子と投与される。活性化シグナルと阻害シグナルのバランスは、Tリンパ球と病変細胞の相互作用を制御し、T細胞受容体(TCR)による抗原認識を通じてT細胞応答が開始される。阻害経路及びシグナルは、免疫経路チェックポイントと呼ばれる。正常な状況では、免疫経路チェックポイントは、自己免疫の制御及び防止において重要な役割を果たし、また病原性感染への応答における組織損傷から保護する。
【０３０２】
特定の実施形態は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための、免疫経路チェックポイント阻害経路を調節するウイルスベクターベースのワクチン及び組成物を含む併用免疫療法を提供する。いくつかの実施形態において、調節は、遺伝子又はタンパク質の発現又は活性を増大させる。いくつかの実施形態において、調節は、遺伝子又はタンパク質の発現又は活性を低下させる。いくつかの実施形態において、調節は、遺伝子又はタンパク質のファミリーに影響を与える。
【０３０３】
一般に、免疫阻害経路は、リガンド-受容体相互作用により開始される。疾患において、疾患は、対象における免疫耐性を誘導する機構として免疫チェックポイント経路を利用できることが現在明らかになっている。
【０３０４】
所与の疾患による対象における免疫耐性又は免疫阻害経路の誘導は、1つ以上の免疫阻害経路を調節することが知られているsiRNAs、アンチセンス、小分子、模倣体、リガンドの組換え形態、受容体若しくはタンパク質、又は抗体(Ig融合タンパク質であってもよい)などの分子組成物により遮断することができる。例えば、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原  4 (CTLA4)及びプログラム細胞死タンパク質1 (PD1)などの免疫チェックポイントタンパク質の遮断薬での予備的臨床所見は、抗腫瘍免疫の増強への見込みを示している。
【０３０５】
病変細胞は、複数の阻害性リガンドを発現でき、疾患浸潤性リンパ球は、複数の抑制性受容体を発現できるため、免疫経路チェックポイントタンパク質の二重又は三重遮断は、抗疾患免疫を増強する可能性がある。本明細書に提供される併用免疫療法は、以下の免疫チェックポイントタンパク質、すなわち、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3 (CD276としても知られる)、B7-H4 (B7-S1、B7x及びVCTN1としても知られる)、BTLA (CD272としても知られる)、HVEM、KIR、TCR、LAG3 (CD223としても知られる)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3 (HAVcr2としても知られる)、GAL9、A2aR、及びアデノシンの1つ以上を標的化する免疫経路チェックポイント調節因子を含む1つ以上の組成物を含むことができる。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、分子組成物はsiRNAsを含む。いくつかの実施形態において、分子組成物は小分子を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物はリガンドの組換え形態を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物は受容体の組換え形態を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物は抗体を含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、1つ超の分子組成物及び/又は分子組成物の1つ超のタイプを含む。当業者によって理解されるように、免疫チェックポイント阻害経路の今後発見されるタンパク質も、本開示によって包含されることが想定される。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、CTLA4の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、PD1の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、PDL1の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、LAG3の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、B7-H3の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、B7-H4の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、TIM3の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、調節は発現の増加又は増強である。他の実施形態において、調節は発現の欠如の減少である。
【０３０８】
2つの非限定的な例示的免疫経路チェックポイント阻害剤には、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4 (CTLA-4)及びプログラム細胞死タンパク質-1 (PD1)が含まれる。CTLA-4は、もっぱらT細胞上で発現することができ、ここでCTLA-4は初期のT細胞活性化を制御する。CTLA-4は、共刺激性T細胞受容体CD28と相互作用し、T細胞活性を阻害するシグナル伝達をもたらすことができる。TCR抗原認識が起こると、CD28シグナル伝達は、いくつかの場合において活性化T細胞をもたらすTCRシグナル伝達を増強し得、CTLA-4はCD28のシグナル伝達活性を阻害する。本開示は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための抗CTLA-4モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供する。本開示は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のためのCTLA-4分子組成物と組み合わせた、本明細書に提供されるワクチン又は免疫療法を提供する。
【０３０９】
プログラム死細胞タンパク質リガンド-1 (PDL1)は、B7ファミリーのメンバーであり、様々な組織及び細胞型に分布している。PDL1は、T細胞活性化及びCTL媒介性溶解を阻害するPD1と相互作用することができる。様々なヒト腫瘍におけるPDL1の著しい発現が示されており、PDL1発現は、腫瘍が宿主の抗腫瘍免疫応答を逃れる重要な機構の1つである。プログラム死リガンド1 (PDL1)及びプログラム細胞死タンパク質-1 (PD1)は、免疫経路チェックポイントとして相互作用する。この相互作用は、抗腫瘍免疫応答の鈍化及びその後の腫瘍進行をもたらす主要な寛容機構であり得る。PD1は活性化T細胞に存在し、PD1の主要なリガンド、PDL1は、腫瘍細胞及び抗原提示細胞(APC)、並びにB細胞を含む他の細胞でしばしば発現される。PDL1は、T細胞上のPD1と相互作用し、T細胞活性化及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)媒介性溶解を阻害する。本開示は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための抗PD1又は抗PDL1  モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供する。
【０３１０】
特定の実施形態は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のためのPD1又は抗PDL1分子組成物と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供することができる。特定の実施形態は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための抗CTLA-4及び抗PD1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供することができる。特定の実施形態は、抗CTLA-4及びPDL1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供することができる。特定の実施形態は、がん及び感染疾患の治療のための、抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1モノクローナル抗体、又はそれらの組合せと組み合わせた、本明細書に提供されるワクチン又は免疫療法を提供することができる。
【０３１１】
免疫経路チェックポイント分子は、T細胞によって発現され得る。免疫経路チェックポイント分子は、免疫応答を下方調節又は阻害するための「ブレーカー」として効果的に機能することができる。免疫経路チェックポイント分子には、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死1 (PDCD1又はCD279としても知られるPD1又はPD-1、受託番号NM_005018)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4 (CD152としても知られるCTLA-4、GenBank受託番号AF414120.1)、LAG3 (CD223としても知られる、受託番号NM_002286.5)、Tim3 (A型肝炎ウイルス細胞受容体2 (HAVCR2)としても知られる、GenBank受託番号JX049979.1)、B及びTリンパ球関連(BTLA) (CD272としても知られる、受託番号NM_181780.3)、BY55 (CD160としても知られる、GenBank受託番号CR541888.1)、TIGIT (IVSTM3としても知られる、受託番号NM_173799)、LAIR1 (CD305としても知られる、GenBank受託番号CR542051.1)、SIGLECIO (GenBank受託番号AY358337.1)、ナチュラルキラー細胞受容体2B4 (CD244としても知られる、受託番号NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIFL、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3が含まれるが、これらに限定されない。例えば、PD1は、アデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わされてそれを必要とする患者を治療することができる。
【０３１２】
標的化され得る追加の免疫経路チェックポイントは、アデノシンA2a受容体(ADORA)、CD276、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害剤1 (VTCN1)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1 (IDO1)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、3ドメイン、長い細胞質尾部1 (KIR3DL1)、T細胞活性化(VISTA)のVドメイン免疫グロブリン抑制因子、サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1 (HPRT)、アデノ随伴ウイルス組み込み部位1 (AAVS1)、又はケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5 (遺伝子/偽遺伝子) (CCR5)、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【０３１３】
表3は、網羅するものではなく、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターベースの組成物の効率を改善するために不活性化され得る、例示的な免疫経路チェックポイント遺伝子を示す。免疫経路チェックポイント遺伝子は、表3に列挙されたそのような遺伝子、並びに共抑制性受容体機能、細胞死、サイトカインシグナル伝達、アルギニントリプトファン飢餓、TCRシグナル伝達、誘導性T-reg抑制、転写因子制御性枯渇又はアネルギー(transcription factors controlling exhaustion anergy)、及び低酸素媒介性寛容に関与する他の遺伝子から選択することができる。
【０３１４】
【表３】
2019521099.tif 000011
【０３１５】
アデノウイルスベースの組成物及び免疫経路チェックポイント調節因子の組合せは、どちらかの薬剤単独と比較して、治療患者における疾患の感染、進行、又は症状の低減をもたらし得る。別の実施形態において、アデノウイルスベースの組成物及び免疫経路チェックポイント調節因子の組合せは、どちらかの薬剤単独と比較して、治療患者の全生存の改善をもたらし得る。いくつかの場合において、アデノウイルスベースの組成物及び免疫経路チェックポイント調節因子の組合せは、どちらかの薬剤単独と比較して、治療患者における疾患特異的T細胞応答の頻度又は強度を増加させ得る。
【０３１６】
特定の実施形態は、アデノウイルスベクターベースの組成物の性能を改善するための免疫経路チェックポイント阻害の使用も提供することができる。特定の免疫経路チェックポイント阻害剤は、アデノウイルスベクターベースの組成物の時間で投与することができる。特定の免疫経路チェックポイント阻害剤は、アデノウイルスベクターベースの組成物の投与後に投与することもできる。免疫経路チェックポイント阻害は、アデノウイルスワクチン投与と同時に生じてもよい。免疫経路チェックポイント阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、又は60分後に生じてもよい。免疫経路チェックポイント阻害はまた、アデノウイルスベクターベースの組成物の投与の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24時間後に生じてもよい。いくつかの場合において、免疫阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6、又は7日後に生じてもよい。免疫経路チェックポイント阻害は、アデノウイルスベクターベースの組成物の投与前又は投与後いつでも生じてもよい。
【０３１７】
別の態様において、抗原及び免疫経路チェックポイント調節因子をコードする1つ以上の核酸を含むワクチンを含む方法が提供される。例えば、対象の細胞における免疫経路チェックポイントタンパク質、例えばPD1又はPDL1、及びこの天然の結合パートナーの下方制御から恩恵を受けるであろう状態を有する対象を治療する方法が提供される。
【０３１８】
免疫経路チェックポイント調節因子は、任意の抗原をコードする1つ以上の核酸を含むアデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わせることができる。例えば、抗原は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原、又は本明細書に記載された任意の抗原であってもよい。
【０３１９】
免疫経路チェックポイント調節因子は、ワクチンなどのアデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わされる場合、相乗効果を生み得る。免疫経路チェックポイント調節因子は、アデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わされる場合、有益な効果も生み得る。
【０３２０】
XIII.がん
いくつかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、それを必要とする対象のがんを処置するために使用される。特定の態様において、これらのがんは、HER2/neu標的抗原を過剰発現する。HER2/neuは、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、肺がん、及び骨がんをはじめとする、様々な異なるがんにおいて過剰発現する。HER2/neuの過剰発現は、がん処置における予後マーカーとして有用であり得る。
【０３２１】
本明細書に記述されるアデノウイルスベクターを含む組成物は、過形成、異形成、新形成、前がん、がん、原発腫瘍、又は転移腫瘍など、諸段階の疾患を評価又は処置するために使用され得ることが明確に想定される。特定の実施形態では、対象は、乳がん、より特定すると、転移性乳がん、若しくは標準的な乳がん処置などの他のがん療法に対して無応答性の乳がん、切除不能若しくは局所進行の乳がんを有するか、有するリスクがあるか、又は有するものと診断される。
【０３２２】
本明細書で使用される場合、「新生物細胞」及び「異常増殖」という用語は互換的に使用することができ、及び相対的に自律的増殖を示し、その結果、細胞増殖制御の著しい喪失を特徴とする異常な増殖表現型を示す細胞を指す。新生物細胞は、悪性又は良性であり得る。特定の態様において、異常増殖は異形成及びがんの両方を含む。新生物は、良性、前がん性(上皮内がん又は異形成)、又は悪性(がん)であり得る。新生物細胞は、しこり(すなわち、腫瘍)を形成する場合又はしない場合がある。
【０３２３】
「異形成」という用語は、初期の上皮内新生物の場合のように、細胞の異常性が発生組織に限定される場合に使用され得る。異形成は、初期の新生物プロセスを示し得る。「がん」という用語は、未制御細胞増殖を伴う様々な疾患の広範な群を含む悪性新生物を指し得る。
【０３２４】
転移、又は転移性疾患は、1つの臓器又は部分から別の非隣接臓器又は部分へのがんの広がりを指し得る。故に生じた疾患の新たな出現が転移と呼ばれ得る。
【０３２５】
開示される方法及び組成物によって評価又は処置され得るがんとしては、特に乳房のがん細胞が挙げられるが、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、胃(gastric)、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃(stomach)、舌、又は子宮の細胞及びがん細胞を挙げることもできる。
【０３２６】
さらに、がんは、具体的に以下の組織型であってもよいが、これらに限定されない:新生物、悪性;がん腫;がん腫、未分化;巨細胞がん及び紡錘体細胞がん;小細胞がん;乳頭がん;扁平上皮がん;リンパ上皮がん;基底細胞がん;毛質性上皮がん;移行上皮がん;乳頭状移行上皮がん;腺がん;ガストリノーマ、悪性;胆管がん;肝細胞がん;混合型肝細胞がん及び胆管がん;索状腺がん;腺様嚢胞がん;腺腫性ポリープ内腺がん;腺がん、家族性結腸ポリポーシス;固体がん;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞腺がん;乳頭状腺がん;色素嫌性がん;好酸性がん;好酸性腺がん;好塩基性がん;透明細胞腺がん;顆粒細胞がん;濾胞性腺がん;乳頭状及び濾胞性腺がん;非被包性硬化性がん;副腎皮質がん;類内膜がん;皮膚付属器がん;アポクリン腺がん;皮脂腺がん;耳垢腺がん;粘液性類表皮がん;嚢胞腺がん;乳頭状嚢胞腺がん;乳頭状漿液嚢胞腺がん;粘液性嚢胞腺腺がん;粘液性腺がん;印環細胞がん;浸潤性腺管がん;髄様がん;小葉がん;炎症性がん;パジェット病、乳腺;腺房細胞がん;腺扁平上皮がん;扁平上皮化生を伴う腺がん;胸腺腫、悪性;卵巣間質性腫瘍、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;男性ホルモン産生細胞腫、悪性;セルトーリ細胞がん;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;パラガングリオーマ、悪性;乳房外パラガングリオーマ、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑の悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;がん肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎生期がん;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛がん;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫瘍;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星細胞腫;星状芽細胞腫;神経膠芽細胞腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;原始神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞がん、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の特定の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球増殖症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;及び有毛細胞白血病。
【０３２７】
乳がん
ある特定の態様では、HER2/neu抗原又はエピトープを含む複製欠損型ベクターを含む方法及び組成物は、乳がん、特に切除不能、局所進行、若しくは転移性の乳がんを有するか、有するリスクがあるか、又は有するものと診断される対象を処置するために使用される。
【０３２８】
ある特定の態様では、乳がんは、乳房患部の試料又は生検の顕微鏡解析によって診断される。また、専門の研究室での検査を必要とするタイプの乳がんも存在する。
【０３２９】
2つの最も一般的に使用されるスクリーニング方法である、医療提供者による乳房の物理的検査及びマンモグラフィーは、しこりががんである可能性の概算を提示することができ、単純嚢胞などの一部の他の病変を検出する場合もある。これらの検査は決定的ではないものの、医療提供者は、しこりから顕微鏡解析のための流体試料を取り出し(穿刺吸引又は穿刺吸引及び細胞診(FNAC、fine needle aspiration and cytology)として公知の手技)、診断を確定する助けとすることができる。透明な流体の所見は、しこりががん性である可能性が極めて低いことを示すが、血の混じった流体は、がん性細胞についての顕微鏡検査に送られる場合がある。乳房の物理的検査、マンモグラフィー、及びFNACをあわせて使用すると、良好な正確度で乳がんを診断することができる。
【０３３０】
生検の他の選択肢としては、乳房のしこりの切片を除去する手技であるコア生検若しくは真空補助乳房生検、又はしこり全体を除去する切除生検が挙げられる。ほとんどの場合、医療提供者による物理的検査、マンモグラフィー、及び特殊な状況下で行われ得るさらなる試験(例えば超音波又はMRIによる撮像)の結果は、切除生検を確定診断及び一次処置の方法とする正当な理由となるのに十分である。
【０３３１】
乳がんは、様々なスキーマによって分類され得る。これらの態様のそれぞれが処置応答及び予後に影響する。乳がんの表現には、これらの分類態様のすべてに加え、物理的検査で見られた徴候などの他の所見が含まれるのが最適である。完全な分類は、病理組織学的タイプ、グレード、ステージ(TNM)、受容体ステータス、及びDNA試験により判定される遺伝子の存在又は非存在を含む。
【０３３２】
病理組織学。乳がんの相当な大部分が、管又は小葉を覆う上皮に由来し、乳管がんに分類される。上皮内がんとは、周囲組織に浸潤しない上皮組織内でのがん細胞の増殖である。対照的に、浸潤性がん腫は周囲組織に浸潤する。神経周囲及び/又はリンパ管の空間への浸潤は、通常、乳がんの組織学的表現の一部とみなされ、存在する場合、より侵襲性の高い疾患に関連している場合がある。
【０３３３】
グレード。グレーディングは、正常な乳房組織の外見と比較した乳がん細胞の外見に注目する。乳房などの臓器の正常細胞は分化する。つまり、その臓器の一部としての細胞の機能を反映する特定の形状及び形態をとるようになる。がん性細胞は、この分化を行わなくなる。がんの場合、通常は乳管を構成するように規則的に並ぶ細胞が無秩序になる。細胞分裂がコントロール不良になる。細胞核の均一性が低下する。病理学者は、正常な乳房細胞に見られる特徴を細胞が次第に失うにつれて、細胞を高分化型(低グレード)、中分化型(中間グレード)、及び低分化型(高グレード)と表現する。低分化型がんは、より不良な予後を有する。
【０３３４】
ステージ。乳がんをステージ分けするためのTNM分類は、体内でがんが最初に始まった場所におけるがんのサイズ、及びがんが移動した位置に基づく。これらのがんの特徴は、腫瘍のサイズ(T)、腋窩、頸部、及び胸部内のリンパ節に腫瘍が伝播したか否か(N)、並びに腫瘍が転移したかどうか(M)(すなわち、身体のうちより遠位の部分への伝播)として表現される。より大きなサイズ、結節への伝播、及び転移があると、ステージ数が大きくなり、予後が悪化する。
【０３３５】
主なステージは、ステージ0、ステージ1、ステージ2、ステージ3、及びステージ4である。
【０３３６】
乳頭の非浸潤性(in situ)疾患又はパジェット病であるステージ0。ステージ0は、前がん性又はマーカー状態で、乳管内上皮内がん(DCIS)又は非浸潤性小葉がん(LCIS)のいずれかである。
【０３３７】
ステージ1〜3は、乳房又は局所リンパ節内である。
【０３３８】
ステージ4は、転移性がんである。転移性乳がんは、より好ましくない予後を有する。
【０３３９】
受容体ステータス。細胞は、その表面上に、また細胞質及び核内に、受容体を有する。ホルモンなどの化学伝達物質が受容体に結合し、これが細胞に変化を引き起こす。乳がん細胞は、多くの異なるタイプの受容体を有する場合も有しない場合もあり、現在の分類で最も重要なのは、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、及びHER2/neuの3つである。これらの受容体を有する又は有しない細胞は、ER陽性(ER+)、ER陰性(ER-)、PR陽性(PR+)、PR陰性(PR-)、HER2/neu陽性(HER2/neu+)、及びHER2/neu陰性(HER2/neu-)と呼ばれる。これらの受容体のいずれも有しない細胞は、基底様又はトリプルネガティブと呼ばれる。
【０３４０】
骨肉腫
いくつかの実施形態では、HER2/neu抗原又はエピトープを含む複製欠損型ベクターを含む方法及び組成物は、骨がん、特に骨肉腫を有するか、有するリスクがあるか、又は有するものと診断される対象を処置するために使用される。ある特定の実施形態では、骨肉腫は、高グレード骨肉腫、中間グレード骨肉腫、又は低グレード骨肉腫であり得る。骨肉腫は、若年の対象において最も一般的に見られる骨のがんである。これらのがんは、新しい骨が成長する領域に起因するのが最も一般的である。いくつかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、あらゆるグレード又はタイプの骨肉腫を有する対象を処置するために投与され得る。
【０３４１】
胃がん
いくつかの実施形態では、HER2/neu抗原又はエピトープを含む複製欠損型ベクターを含む方法及び組成物は、胃がんを有するか、有するリスクがあるか、又は有するものと診断される対象を処置するために使用される。胃がんは、胃に起因するがんであり、そのうち90〜95%近くが腺がんである。ある特定の実施形態では、胃がんは、腺がん、リンパ腫、消化管間質腫瘍、又はカルチノイド腫瘍であり得る。胃がんは、ヘリコバクターピロリ(Helicobacter pylori)による感染から発生する場合もある。いくつかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、あらゆるグレード又はタイプの骨肉腫を有する対象を処置するために投与され得る。
【０３４２】
XIV.  処置の方法
本明細書に記述されるHER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原を含む複製欠損型アデノウイルスベクターは、本明細書に記述される1つ以上の標的抗原に対する免疫応答を発生させるために、いくつかのワクチン設定で使用することができる。いくつかの実施形態では、HER2/neu抗原又はエピトープなどの任意の標的抗原に対する免疫応答を発生させる方法が提供される。
【０３４３】
アデノウイルスベクターは、Adに対して既存の免疫を有する対象において免疫応答を発生させるために使用され得、かつ、アデノウイルスベクターを使用した複数ラウンドの免疫化を含むワクチン接種レジメン、すなわち前世代のアデノウイルスベクターを使用して行うことができないレジメンにおいて使用され得るという予期せぬ所見のために、特に重要である。
【０３４４】
一般に、免疫応答を発生させることは、液性応答及び/又は細胞性応答の誘導を含む。目的の標的抗原に対する免疫応答を増大させることが望ましい場合がある。
【０３４５】
免疫応答を発生させることは、ある特定の免疫系細胞の活性及び/若しくは数の低下、又はある特定のサイトカイン若しくは他のエフェクター分子のレベル及び/若しくは活性の低下を含み得る。免疫応答(例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性)の変化を検出するための様々な方法が利用可能であり、いくつかの態様において有用である。この文脈で有用である例示的な方法としては、細胞内サイトカイン染色(ICS)、ELISpot、増殖アッセイ、クロム放出アッセイ若しくは同等のアッセイを含む細胞傷害性T細胞アッセイ、及び任意の数のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した遺伝子発現解析又はRT-PCRベースのアッセイが挙げられる。
【０３４６】
免疫応答を発生させることは、対照と比較して本明細書に記述されるアデノウイルスベクターを投与された対象における標的抗原特異的CTL活性の1.5〜5倍の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を発生させることは、対照と比較してアデノウイルスベクターを投与された対象における標的特異的CTL活性の約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、16、17、18、19、20倍、又はそれより多くの増大を含む。
【０３４７】
免疫応答を発生させることは、適切な対照と比較して、標的抗原をコードする核酸を含む本明細書に記述されるアデノウイルスベクターを投与された対象における、標的抗原特異的HTL活性、例えばヘルパーT細胞の増殖の、1.5〜5倍の増大を含み得る。別の実施形態では、免疫応答を発生させることは、対照と比較した標的特異的HTL活性の約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、16、17、18、19、20倍、又はそれより多くの増大を含む。この文脈において、HTL活性は、特定のサイトカイン、例えばインターフェロン-γ(IFN-γ)、インターロイキン-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、若しくは他のサイトカインの産生の、上述のような増大、又は減少を含み得る。これに関して、免疫応答を発生させることは、Th2型応答からTh1型応答への推移、又はある特定の実施形態では、Th1型応答からTh2型応答への推移を含むことがある。他の実施形態では、免疫応答を発生させることは、主としてTh1又はTh2型応答の刺激を含み得る。
【０３４８】
免疫応答を発生させることは、適切な対照と比較して、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを投与した対象において標的特異的抗体産生の1.5〜5倍の間の増加を含み得る。別の実施形態において、免疫応答を発生させることは、対照と比較してアデノウイルスベクターを投与した対象における標的特異的抗体産生の約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、16、17、18、19、20倍又はそれ超の増加を含む。
【０３４９】
したがって、ある特定の実施形態では、HER2/neu抗原又はエピトープなどの目的の標的抗原に対する免疫応答を発生させるための方法であって、a)E2b領域に欠失を有する複製欠損型アデノウイルスベクター、及びb)HER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを個体に投与することと;アデノウイルスベクターを個体に少なくとも1回再投与することにより、標的抗原に対する免疫応答を発生させることとを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態では、投与されるベクターがguttedベクターではない方法が提供される。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、変異体、又は変異体断片であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。
【０３５０】
さらなる実施形態では、Adに対して既存の免疫を有する個体において標的抗原に対する免疫応答を発生させるための方法であって、a)E2b領域に欠失を有する複製欠損型アデノウイルスベクター、及びb)標的抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを個体に投与することと、アデノウイルスベクターを個体に少なくとも1回再投与することにより、標的抗原に対する免疫応答を発生させることとを含む、方法が提供される。特定の実施形態では、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、変異体、又は変異体断片であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、例えばHER2/neu抗原又はエピトープ、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。
【０３５１】
Adに対する既存の免疫に関して、これは、Ad抗体の存在に関して試験する抗体ベースアッセイなどの、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。さらに、ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法は、最初に個体がAdに対して既存の免疫を有することを決定するステップ、次に、本明細書に記載のE2b欠失型アデノウイルスベクターを投与するステップを含み得る。
【０３５２】
一実施形態は、個体における1つ以上の標的抗原に対する免疫応答を惹起する方法であって、複製欠損型アデノウイルスベクターを含む第一のアデノウイルスベクターを個体に投与するステップであって、アデノウイルスベクターが、E2b領域において欠失を有し、及び少なくとも1つの標的抗原をコードする核酸を有する、ステップ、複製欠損型アデノウイルスベクターを含む第二のアデノウイルスベクターを個体に投与するステップであって、アデノウイルスベクターが、E2b領域において欠失を有し、及び少なくとも1つの標的抗原をコードする核酸を有する、ステップを含み、第二のアデノウイルスベクターの少なくとも1つの標的抗原が、第一のアデノウイルスベクターの少なくとも1つの標的抗原と同じ又は異なる、方法を提供する。特定の実施形態において、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、変異体、又は変異体断片であり得る。一部の実施形態において、標的抗原は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。
【０３５３】
このように、ある特定の実施形態は、同じE2b欠失型アデノウイルスベクターによる複数回の免疫、又は異なるE2b欠失型アデノウイルスベクターによる複数回の免疫を企図する。各々の例において、アデノウイルスベクターは、本明細書において他所で記載の1つ以上の標的抗原をコードする核酸配列を含み得る。ある特定の実施形態において、方法は、1つの標的抗原をコードするE2b欠失型アデノウイルスによって複数回免疫するステップ、及び同じアデノウイルスベクターの複数回の再投与によって、標的抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む。一部の実施形態において、標的抗原は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。
【０３５４】
さらなる実施形態において、方法は、1つ以上の標的抗原をコードする第一のアデノウイルスベクターによって免疫するステップ、次いで第一のアデノウイルスベクターによってコードされる抗原と同じ又は異なり得る1つ以上の標的抗原をコードする第二のアデノウイルスベクターを投与するステップを含む。この点において、コードされる標的抗原の1つが異なっていてもよく、又はコードされる抗原の全てが異なっていてもよく、又は一部が同じで、一部が異なっていてもよい。さらに、ある特定の実施形態において、方法は、第一のアデノウイルスベクターを複数回投与するステップ、及び第二のアデノウイルスを複数回投与するステップを含む。この点において、方法は、第一のアデノウイルスベクターを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15回、又はそれ超投与するステップ、及び第二のアデノウイルスベクターを1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15回又はそれ超投与するステップを含む。投与の順序は、第一のアデノウイルスを1回又は複数回連続して投与するステップ後に、第二のアデノウイルスベクターを1回又は複数回連続して投与するステップを含み得る。ある特定の実施形態において、方法は、第一及び第二のアデノウイルスベクターを1回投与毎、2回投与毎、3回投与毎等に交互に投与するステップを含む。ある特定の実施形態において、第一及び第二のアデノウイルスベクターは、同時に投与される。他の実施形態において、第一及び第二のアデノウイルスベクターは、逐次的に投与される。一部の実施形態において、標的抗原は、HER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。
【０３５５】
当業者に容易に理解されるように、2つ超のアデノウイルスベクターを本明細書に記載の方法において使用してもよい。3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれ超の異なるアデノウイルスベクターを、本明細書に記載の方法において使用してもよい。ある特定の実施形態において、方法は、1つ超のE2b欠失型アデノウイルスベクターを一度に投与するステップを含む。この点において、目的の複数の標的抗原に対する免疫応答は、各々が1つ以上の標的抗原をコードする核酸配列を含む、複数の異なるアデノウイルスベクターを同時に投与するステップによって惹起することができる。
【０３５６】
アデノウイルスベクターは、がん腫又は肉腫(例えば、固形腫瘍、リンパ腫、及び白血病)などのがんに対する免疫応答を惹起するために使用することができる。アデノウイルスベクターは、がん、例えば神経系のがん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃がん、多発性骨髄腫、肝腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)、又は他のがんに対する免疫応答を惹起するために使用することができる。
【０３５７】
本明細書に記載の感染疾患又はがんのいずれかの症状を治療又は改善する方法も同様に提供される。治療方法は、本明細書に記載の感染疾患又はがんに罹っている又は罹るリスクを有する個体に、アデノウイルスベクターを1回以上投与するステップを含む。そのため、ある特定の実施形態は、そのような疾患を発症するリスクを有する個体において感染疾患又はがんに対してワクチン接種する方法を提供する。リスクを有する個体は、ある時点で感染病原体に曝露されている可能性があるか、若しくは過去に曝露されているが、まだ感染症の症状を有していない個体、又はがんを発症する遺伝的素因を有するか、若しくは感染病原体に対して特に感受性がある個体であり得る。本明細書に記載の感染疾患又はがんに罹っている個体は、本明細書における治療を誘導するために使用され得る標的抗原を発現及び/又は提示すると決定されていてもよい。例えば、例が、標的抗原を発現及び/又は提示すると見出され得、標的抗原、その変異体、断片、又は変異体断片をコードするアデノウイルスベクターをその後投与してもよい。
【０３５８】
ある特定の実施形態は、標的抗原、又はその断片、変異体、若しくは変異体断片をコードする核酸のin vivoでの送達のためのアデノウイルスベクターの使用を企図する。対象に注射すると、核酸配列が発現され、その結果、配列によってコードされる抗原に対する免疫応答が得られる。アデノウイルスベクターワクチンは、「有効量」、すなわち本明細書において他所で記載の免疫応答を誘発するために選択された投与経路又は複数の投与経路において有効であるアデノウイルスベクターの量で投与することができる。有効量は、標的感染病原体又はがんに対する宿主の保護又は治療を促進するために有効な免疫応答を誘導することができる。各ワクチンの用量におけるベクターの量は、典型的なワクチンに一般的に関連する有意な副作用を示すことなく、免疫応答、免疫保護応答、又は他の免疫治療応答を誘導する量として選択される。ワクチン接種後、対象を、ワクチン治療の有効性を決定するためにモニターしてもよい。ワクチン接種の有効性のモニタリングは、当業者に公知の任意の方法によって行ってもよい。一部の実施形態において、抗体レベルを検出するために、血液又は体液試料をアッセイしてもよい。他の実施形態において、循環中の血液細胞又はリンパ組織細胞から細胞性免疫応答を検出するために、ELISpotアッセイを実施してもよい。
【０３５９】
ある特定の実施形態において、1〜10の間の用量を52週間の間、投与してもよい。ある特定の実施形態において、6用量を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24カ月、又はそこから誘導可能な任意の範囲若しくは値の間隔で投与し、その後定期的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、若しくは24カ月、又はそこから誘導可能な任意の範囲若しくは値の間隔でブースターワクチン接種をさらに行ってもよい。代替のプロトコールは、個々の患者にとって適切であり得る。そのため、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ超の用量を1年間の間、又はそれより短い若しくは長い期間の間、例えば35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100週間の間投与してもよい。用量は、1、2、3、4、5、若しくは6週間の間隔、又はそれより長い間隔で投与してもよい。
【０３６０】
ワクチンは、約4時間未満の期間、より好ましくは約3時間未満の期間の間注入することができる。例えば、最初の25〜50mgを、30分以内、好ましくはさらには15分以内に注入し、残りを続く2〜3時間の間に注入することができる。より一般的には、投与されるワクチン構築物の用量を、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20週間毎に1用量として投与してもよく、これを全体で少なくとも3用量繰り返してもよい。又は、構築物を、週に2回、4〜6週間投与してもよい。投与スケジュールを任意選択で、他の間隔で繰り返すことができ、用量及びスケジュールを適切に調節して、様々な非経口経路を通して用量を投与してもよい。本明細書に記載の組成物は、任意の数の関連する治療モダリティと共に(例えば、前、同時、又は後に)患者に投与することができる。
【０３６１】
適した用量は、上記のように投与した場合に、本明細書において他所で記載の標的抗原免疫応答を促進することができるアデノウイルスベクターの量である。ある特定の実施形態において、免疫応答は、基底(すなわち、無処置)レベルより少なくとも10〜50%上である。ある特定の実施形態において、免疫応答は、基底レベルより少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、125、150、200、250、300、400、500、又はそれ超上である。そのような応答は、患者における標的抗原抗体を測定することによって、又はin vitroで患者の腫瘍若しくは感染細胞を殺滅することができる細胞傷害性エフェクター細胞のワクチン依存的生成によって、又は免疫応答をモニターする当技術分野で公知の他の方法によってモニターすることができる。そのようなワクチンはまた、非ワクチン接種患者と比較してワクチン接種患者において当該疾患の臨床転帰の改善をもたらす免疫応答を引き起こすことができるはずである。一部の実施形態において、臨床転帰の改善は、疾患を治療する、疾患の症状を低減する、疾患の進行を変化させる、又は生命を延長させるステップを含む。
【０３６２】
本明細書に提供する任意の組成物を、個体に投与してもよい。「個体」は、「対象」又は「患者」と互換的に使用され得る。個体は、哺乳動物、例えばヒト又は動物、例えば非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、又はヒツジであり得る。実施形態において、個体は、ヒトである。実施形態において、個体は、胎児、胚、又は小児である。一部の例において、本明細書に提供する組成物は、ex vivoで細胞に投与される。一部の例において、本明細書に提供する組成物は、疾患又は障害を治療する方法として個体に投与される。一部の実施形態において、個体は、遺伝疾患を有する。一部の例において、個体は、疾患、例えば本明細書に記載の任意の疾患を有するリスクを有する。一部の実施形態において、個体は、不十分な量のタンパク質又は不十分な活性のタンパク質によって引き起こされる疾患又は障害を有するリスクが増加している。個体が、疾患又は障害を有する「リスクが増加している」場合、方法は、防止的又は予防的治療を伴う。例えば、個体は、家族の病歴のために、そのような疾患又は障害を有するリスクが増加し得る。典型的に、そのような疾患又は障害を有するリスクが増加している個体は、予防的治療から利益が得られる(例えば、疾患又は障害の発生又は進行を防止又は遅らせることによって)。
【０３６３】
一部の例において、対象は疾患を有しない。一部の例において、本明細書に記載の治療は、疾患の発生前に投与される。対象は検出されない疾患を有し得る。対象は、低い疾患負荷を有し得る。対象はまた、高い疾患負荷を有し得る。ある特定の例において、対象は、分類尺度に従って本明細書に記載の治療を投与され得る。分類尺度は、グリーソン分類であり得る。グリーソン分類は、腫瘍組織が正常な前立腺組織とどれほど異なるかを反映している。これは、1から5の尺度を使用する。医師は、がん細胞のパターン及び増殖に基づいて、がんに数値を与える。数値が低ければ、がん細胞はより正常に見え、グレードはより低い。ある特定の例において、低いグリーソンスコアを有する患者に治療を投与してもよい。好ましくは、グリーソンスコア3以下の患者に、本明細書に記載の治療を投与してもよい。
【０３６４】
様々な実施形態は、選択された患者集団におけるHER2/neu抗原又はエピトープなどの1つ以上の特定の標的抗原に対する免疫応答を惹起するための組成物及び方法に関する。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、がん腫又は肉腫、例えば神経系のがん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞がん、子宮がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃がん、多発性骨髄腫、肝腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)を含むがこれらに限定されないがんを有する患者を標的としてもよく、又は他のがんを治療の標的とすることができる。一部の例において、標的の患者集団は、結腸直腸腺がん、転移性結腸直腸がん、進行MUC1、MUC1c、MUC1n、T若しくはCEA発現結腸直腸がん、頭頸部がん、肝臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、又は膵臓がんを有する個体に限定され得る。選択されたがん、例えば結腸直腸腺がんの組織学的に確認された診断を使用してもよい。特定の疾患進行期又は進行を選択してもよく、例えば1つ以上の転移性、再発性のステージIII又はステージIVのがんを有する患者を、本明細書に記載の方法及び組成物による治療のために選択してもよい。一部の実施形態において、患者は、フルオロピリミジン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、又はパニツムマブを含む治療を含むがこれらに限定されない他の治療を受けている必要があってもよく、任意選択でそれらの治療を通して進行していてもよい。一部の例において、そのような治療を受けることを個体が拒絶しても、患者を、本明細書に記載の方法及び組成物による治療に関する適格プールに含めることができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける個体は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、18、21、又は24カ月の推定余命を有する必要があり得る。本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者のプールは、年齢が限定され得る。例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、60歳より上又はそれより高齢の個体は、本明細書に記載の方法及び組成物による治療にとって適格であり得る。別の例では、75、70、65、60、55、50、40、35、30、25、20歳より下又はそれより若い個体は、本明細書に記載の方法及び組成物による治療にとって適格であり得る。
【０３６５】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者は、適切な血液機能、例えば以下の1つ以上を有する個体に限定される:白血球(WBC)数が、1マイクロリットルあたり、少なくとも1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個、又はそれ超、ヘモグロビンレベルが、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14g/dL、又はそれ超、血小板数が、1マイクロリットルあたり、少なくとも50,000、60,000、70,000、75,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000個、又はそれ超、PT-INR値が0.8、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、又はそれ超より小さいか又はそれに等しく、PTT値が、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0×ULN又はそれ超より小さいか又はそれに等しい。様々な実施形態において、血液機能の指標の限界は、異なる性別及び年齢群、例えば、0〜5、5〜10、10〜15、15〜18、18〜21、21〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、又は80歳超の群の個体に関して異なるように選択される。
【０３６６】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者は、適切な腎機能及び/又は肝機能、例えば、以下の1つ以上を有する個体に限定される:血清中クレアチニンレベルが、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL又はそれ超より低いか又はそれに等しく、ビリルビンレベルが、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL又はそれ超であるが、ギルバート症候群の上限、例えば1.5、1.6、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、又は2.4mg/dLより低いか又はそれに等しい値が許容され、ALT及びAST値が、1.5、2.0、2.5、3.0×正常値上限(ULN)又はそれ超より低いか又はそれに等しい。様々な実施形態において、腎機能又は肝機能の指標の限界は、異なる性別及び年齢群、例えば0〜5、5〜10、10〜15、15〜18、18〜21、21〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、又は80歳超の群の個体に関して異なるように選択される。
【０３６７】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療の候補である個体のK-ras変異状態を決定することができる。予め選択したK-ras変異状態を有する個体を、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する適格患者のプールに含めることができる。
【０３６８】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受けている患者は、同時の細胞傷害性化学療法若しくは放射線療法を行っていない個体、現在の脳転移若しくは脳転移の病歴がない個体、自己免疫疾患、例えば炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、甲状腺疾患及び白斑など、しかしこれらに限定されない疾患の病歴がない個体、重篤な併発性の慢性若しくは急性疾患、例えば心疾患(NYHAクラスIII又はIV)若しくは肝疾患を有しない個体、起こり得るプロトコール遵守に対する医学的若しくは心理学的障害を有しない個体、非黒色腫皮膚がん以外、子宮頸部上皮内がん以外、制御された表在性膀胱がん以外、若しくは治療されている他の上皮内がん以外の同時の(又は最後の5年以内)の二次悪性疾患を有しない個体、尿路感染症、HIV(例えば、ELISAによって決定し、ウェスタンブロットによって確認する)、及び慢性肝炎を含む活動性の急性若しくは慢性感染症を有しない個体、又は同時のステロイド療法(又は他の免疫抑制薬、例えばアザチオプリン若しくはシクロスポリンA)を行っていない個体に限定される。一部の例において、任意のステロイド療法(化学療法又はコントラスト強調試験の前投薬として使用する場合を除く)を少なくとも3、4、5、6、7、8、9、又は10週間中断した患者は、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する適格患者のプールに含めてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者は、甲状腺疾患及び白斑を有する個体を含む。
【０３６９】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体からの試料、例えば血清又は尿試料を回収してもよい。試料は、治療前、治療中、及び/又は治療後に、例えば治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、又は12週間以内に、治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間以内に、治療中に1週間、10日間、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間の間隔で、治療後に1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年の間隔で、治療後1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年、又はそれ超以内に、6カ月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年間又はそれ超の期間、回収してもよい。試料を、本明細書に記載の血液学、腎機能、又は肝機能指標のいずれかに関して、並びに当技術分野で公知の適したその他の指標、例えば妊娠可能女性に関するβ-HCGに関して試験してもよい。その点において、血球数分類（cell blood count with differential）、PT、INR及びPTT、Na、K、Cl、CO2、BUN、クレアチニン、Ca、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、AST、ALT、及びグルコースを測定する検査を含む血液及び生化学検査が、ある特定の態様において企図される。一部の実施形態において、HIV抗体、肝炎BsAg、又はC型肝炎抗体の存在又は量を、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体からの試料において決定する。
【０３７０】
標的抗原に対する抗体又はAd5ベクターに対する中和抗体などの生物マーカーを、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体からの血清などの試料において試験することができる。一部の例において、血液試料などの1つ以上の試料を、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体から回収して保管することができる。回収した試料を、免疫学的評価に関してアッセイすることができる。本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体を、イメージング試験において、例えば胸部、腹部、又は骨盤のCTスキャン又はMRIを使用して評価することができる。イメージング試験は、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療前、治療中、又は治療後に、治療中、及び/又は治療後に、例えば治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、又は12週間以内に、治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間以内に、治療中に1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間の間隔で、治療後に1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年の間隔で、治療後1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年、又はそれ超以内に、6カ月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年、又はそれ超の期間、実施することができる。
【０３７１】
本明細書に記載の組成物及び方法は、治療中に、様々な用量及び投与レジメンを企図する。患者に、1つ以上の複製欠損型アデノウイルス又はアデノウイルスベクター、例えば本明細書に記載の標的抗原に対する免疫応答を個体において惹起することができる標的抗原を含むAd5[E1-,E2B-]-ベクターを投与してもよい。
【０３７２】
ある特定の実施形態において、複製欠損型アデノウイルスは、そのような免疫応答を行うために適した用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×108個のウイルス粒子〜約5×1013個のウイルス粒子の用量で投与される。場合により、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×109〜約5×1012個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×108個のウイルス粒子〜約5×108個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約5×108個のウイルス粒子〜約1×109個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×109個のウイルス粒子〜約5×109個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約5×109個のウイルス粒子〜約1×1010個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1010個のウイルス粒子〜約5×1010個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約5×1010個のウイルス粒子〜約1×1011個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1011個のウイルス粒子〜約5×1011個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約5×1011個のウイルス粒子〜約1×1012個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1012個のウイルス粒子〜約5×1012個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約5×1012個のウイルス粒子〜約1×1013個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1013個のウイルス粒子〜約5×1013個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×108個のウイルス粒子〜約5×1010個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1010個のウイルス粒子〜約5×1012個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1011個のウイルス粒子〜約5×1013個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×108個のウイルス粒子〜約1×1010個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1010個のウイルス粒子〜約1×1012個のウイルス粒子の用量で投与される。いくつかの実施形態では、複製欠損型アデノウイルスは、免疫化1回あたり約1×1011個のウイルス粒子〜約5×1013個のウイルス粒子の用量で投与される。一部の例において、複製欠損型アデノウイルスは、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で投与される。一部の例において、複製欠損型アデノウイルスは、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で投与される。様々な実施形態において、本明細書に記載の所望の用量は、製剤緩衝液の適した容量で、例えば、約0.1〜10mL、0.2〜8mL、0.3〜7mL、0.4〜6mL、0.5〜5mL、0.6〜4mL、0.7〜3mL、0.8〜2mL、0.9〜1.5mL、0.95〜1.2mL、又は1.0〜1.1mLの容量で投与される。当業者は、容量が、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内(例えば、約0.5mL〜約1.1mL)に入り得ることを認識する。ウイルス粒子の投与は、適した多様な送達経路を通して行うことができ、例えば投与は、注射(例えば、皮内、筋肉内、静脈内、又は皮下)によって、鼻腔内(例えば、吸入によって)、ピルの形態(例えば、嚥下、膣又は直腸送達のための坐剤)であり得る。一部の実施形態において、皮下送達が好ましく、樹状細胞に対してより大きいアクセスを提供することができる。
【０３７３】
個体へのウイルス粒子の投与を繰り返してもよい。ウイルス粒子の繰り返し送達は、スケジュールに従ってもよく、或いは、必要に応じて行ってもよい。例えば標的抗原、例えばHER2/neu抗原又はエピトープなどの腫瘍抗原、その断片、変異体、又は変異体断片に対する個体の免疫を試験して、必要に応じて追加の送達を補充してもよい。一部の実施形態において、送達スケジュールは、定期的な間隔でウイルス粒子の投与を含む。スケジュール通りの期間及び/又は投与前に評価した必要性に基づく投与期間の1つ以上を含む関節への送達レジメンを設計してもよい。例えば、治療レジメンは、3週間毎に1回の皮下投与などの投与、その後死亡を含む任意の理由により治療から外れるまで3カ月毎に別の免疫療法治療を含み得る。別の例のレジメンは、3週間毎に3回の投与の後に3カ月毎に3回の別の組の免疫療法治療を含む。
【０３７４】
別の例のレジメンは、第一の投与回数の第一の頻度での第一の期間、第二の投与回数の第二の頻度での第二の期間、第三の投与回数の第三の頻度での第三の期間等を含み、任意選択で、必要に応じて不定回数の投与による1回以上の期間を含む。各期間の投与回数は、独立して選択することができ、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回、又はそれ超であり得る。各期間の投与頻度もまた、独立して選択することができ、例えば、ほぼ毎日、2日毎、3日毎、週に2回、週に1回、2週間に1回、3週間毎、毎月、6週間毎、2カ月毎、3カ月毎、4カ月毎、5カ月毎、6カ月毎、1年に1回等であり得る。治療は、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36カ月、又はそれ超の総期間を要し得る。
【０３７５】
免疫間の予定される間隔は、免疫間の間隔が、間隔の5分の1、4分の1、3分の1、又は2分の1まで改訂されるように変更してもよい。例えば、3週間の間隔のスケジュールの場合、20〜28日間(3週間-1日〜3週間+7日)の間で免疫を繰り返してもよい。最初の3回の免疫に関して、2回目及び/又は3回目の免疫が遅れる場合、その後の免疫は、免疫間に最少量の緩衝液を考慮に入れてシフトさせてもよい。例えば、3週間の間隔のスケジュールの場合、ある免疫が遅れると、その後の免疫は、前回の免疫後17、18、19、又は20日より早期に起こらないように予定してもよい。
【０３７６】
本明細書に記載の組成物は、様々な状態、例えば室温、氷中、又は凍結状態で提供することができる。組成物は、適したサイズの容器、例えば2mLバイアルのバイアルで提供され得る。一実施形態において、抽出可能なワクチン1.0mLを含む1つの2mlバイアルは、5×1011個の総ウイルス粒子/mLを含む。温度及び湿度を含む保存条件は異なり得る。例えば、治療に使用するための組成物を、室温、4℃、-20℃、又はそれより低い温度で保存してもよい。
【０３７７】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について、一般的な評価を行う。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週間目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫しない時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。
【０３７８】
一般的な評価は、病歴、ECOGパフォーマンススコア、カルノフスキーパフォーマンスステータス、及び主治医による体重を用いた全身理学的検査の1つ以上を含み得る。最後の診察以降に患者に投与している又は投与した他の任意の治療、薬剤、生物製剤、又は血液製剤を記録してもよい。患者を、任意の有害反応に関してモニターするために、診療所において、ワクチンの投与後適した期間、例えばおよそ30分間追跡してもよい。
【０３７９】
ある特定の実施形態において、ワクチンの各投与後の局所及び全身の反応源性を、選択した期間、例えば3日間(免疫の当日及びその後2日間)毎日評価してもよい。日記カードを使用して、症状を報告してもよく、定規を使用して、局所反応源性を測定してもよい。免疫注射部位を評価してもよい。胸部、腹部、及び骨盤のCTスキャン又はMRIを行ってもよい。
【０３８０】
様々な実施形態において、血液学及び生化学評価を、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について実施する。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫しない時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。血液学及び生化学評価は、血液化学検査及び血液検査、CBC分類(CBC with differential)、Na、K、Cl、CO2、BUN、クレアチニン、Ca、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、AST、ALT、グルコース、及びANAの1つ以上を含み得る。
【０３８１】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について、生物マーカーを評価する。1つ以上の任意の試験を必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週目等に実施してもよい。異なる組の試験を、免疫しない時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。
【０３８２】
生物マーカー評価は、適切な容量、例えば約5mlの血清試料から本明細書に記載の標的抗原又はウイルスベクターに対する抗体を測定するステップの1つ以上を含んでもよい。バイオマーカーは、決定され利用可能であれば、再検討してもよい。
【０３８３】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体に、免疫学的評価を行う。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫しない時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。
【０３８４】
末梢血、例えば、約90mLを、各免疫前及び免疫の少なくとも一部の後の時点で採取し、試験中及び/又は特定の回数の免疫後の特定の時点で免疫応答に及ぼす効果が存在するか否かを決定してもよい。免疫学的評価は、ELISpot、増殖アッセイ、マルチパラメータフローサイトメトリー分析、及び細胞傷害アッセイを使用してHER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原に対するT細胞応答に関して末梢血単核球(PBMC)をアッセイするステップの1つ以上を含み得る。各採血からの血清を保管して、送付し、決定してもよい。
【０３８５】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について、腫瘍の評価を行う。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば治療前、0、3、6週目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫しない時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。腫瘍の評価は、治療前、免疫の少なくとも一部の後の時点、及び選択した回数、例えば、第一の治療の2、3、又は4回の終了後およそ3カ月毎、及び例えば治療から外れるまで行われる、胸部、腹部、又は骨盤のCT又はMRIスキャンの1つ以上を含み得る。
【０３８６】
HER2/neu抗原又はエピトープなどの標的抗原に対する免疫応答は、ELISpot、サイトカインフローサイトメトリー、又は抗体応答などの、免疫応答の1つ以上の適した試験を使用して、個体の末梢血試料などの試料から評価してもよい。陽性の免疫応答は、T細胞応答を測定することによって決定することができる。T細胞応答は、抗原を含む6個のウェルにおけるバックグラウンドに関して調節したスポットの平均数が、6個の対照ウェルにおけるスポットの数を10超え、抗原を含む6個のウェルの単一の値と6個の対照ウェルの間の差が、スチューデントt検定を使用してp≦0.05のレベルで統計学的に有意であれば陽性であると考えることができる。免疫原性アッセイは、各々の免疫の前で、治療期間中の予定される時点で行ってもよい。例えば、治療の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、20、24、30、36、又は48週目付近での免疫原性アッセイの時点は、この時点で予定された免疫がなくとも予定してもよい。一部の例において、個体は、少なくとも最小回数の免疫、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9回又はそれ超の免疫を受けていれば、免疫応答に関して評価可能であると考えられ得る。
【０３８７】
一部の実施形態において、疾患の進行又は臨床応答の決定は、測定可能/評価可能な疾患を有する患者においてRECIST1.1基準に従って行う。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における完全奏効(CR;標的病変に関して全ての標的病変の消失、又は非標的病変に関して全ての非標的病変の消失及び腫瘍マーカーレベルの正常化)に影響を及ぼす。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における部分奏効(PR;標的病変のベースライン長径和を参照とした、標的病変の長径和の少なくとも30%の減少)に影響を及ぼす。
【０３８８】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における安定疾患(SD;標的病変に関して治療開始以降の最小の長径和を参照として、PRに適格となるほど十分な縮小がなく、PDに適格となるほど十分な増加がないこと)に影響を及ぼす。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における不完全奏効/安定疾患(SD;非標的病変に関して1つ以上の非標的病変の存続及び/又は正常上限を超える腫瘍マーカーレベルの維持)に影響を及ぼす。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における進行疾患(PD;標的病変に関して、治療開始以降に記録された最小の長径和を参照として、標的病変の長径和の少なくとも20%の増加、若しくは1つ以上の新規病変の出現、又は非標的病変に関して1つ以上の非標的病変の存続、及び/若しくは正常上限を超える腫瘍マーカーレベルの維持)に影響を及ぼす。
【０３８９】
XV.キット
本明細書に記載された組成物、免疫療法又はワクチンは、キットの形態で供給することができる。本開示のキットは、治療レジメン情報を含む投与量及び投与に関する説明書をさらに含むことができる。
【０３９０】
いくつかの実施形態において、キットは、記載された免疫療法又はワクチンを提供する組成物及び方法を含む。いくつかの実施形態においてキットは、キット内容物を投与する上で有用な内容物、及び内容物を調製する方法に関する説明書をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットは、適当な実験室検査により治療前及び治療後に患者のモニターを行う、又は結果及び患者データを医療スタッフとやりとりするためのソフトウェアをさらに含むことができる。
【０３９１】
キットを含む内容物は、乾燥又は液体形態であってもよい。それらが乾燥形態であるならば、キットは乾燥材料を可溶化する溶液を含んでもよい。キットは、液体又は乾燥形態でトランスファー因子も含むことができる。トランスファー因子が乾燥形態であるならば、キットはトランスファー因子を可溶化する溶液を含む。キットは、内容物を混合及び調製する容器も含むことができる。キットは、例えば針、チューブ、アプリケーター、吸入剤、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、又は任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルのような投与を補助する器具も含むことができる。本明細書に記載されるキット又は薬物送達システムは、典型的には、商業的販売及び流通用に本開示の組成物を密閉して含有する手段も含む。
【実施例】
【０３９２】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示された手法は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者によって発見された手法であり、故に本発明の実践における好ましい形態を構成すると見なすことができることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、開示された特定の実施形態において多くの変更が行われ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得ることができることを、本開示に照らして理解するべきである。
【０３９３】
[実施例1]
Ad5 [E1-, E2b-]ベクターの構築
【０３９４】
この実施例では、Ad5[E1-,E2b-]ベクターの構築を記述する。Ad5[E1-,E2b-]ベクター骨格の構築は以前に記述されている。pBHG11の約20kb Xba-BamHIサブ断片を、pBluescriptKSII+ (Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア)にサブクローニングし、pAXBを得た。プラスミドpAXBをBspEIで消化し、T4 DNAポリメラーゼ末端を平滑化し、BamHI消化し、約9.0kb断片を単離した。プラスミドpAXBもBspHIで消化し、T4 DNAポリメラーゼ末端を平滑化し、BamHI消化し、以前に単離した9.0kb断片に約13.7kb断片をライゲートし、pAXB-Δpolを生成した。
【０３９５】
このサブクローニング戦略により、該ポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端内の608bp (Δpol; Ad5ヌクレオチド7274〜7881)が欠失した。この欠失も、Adゲノム中のこの領域の右方向のリーディング鎖に存在するオープンリーディングフレーム9.4を効果的に除去した。pAXB-ΔpolのXba-BamHIサブ断片を、Xba-BamHI消化pBHG11に再導入してpBHG11-Δpolを生成した。
【０３９６】
[実施例2]
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neuワクチンの構築
この実施例では、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンの構築を記述する。最小サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーエレメント及びSV40由来ポリアデニル化シグナルと隣接する切断型HER2/neuトランスジーンを、シャトルpShuttleCMVにサブクローニングし、シャトルプラスミドpShuttleCMV/HER2/neuを生成した。シャトルプラスミドをPmeIで直鎖化し、プラスミドpAdΔppと相同組換え(大腸菌で)してpAdCMV/HER2/neu/Δpp生成した(図1)。
【０３９７】
PacIで直鎖化した10マイクログラムのpAdCMV/HER2/neu/Δppを、Ad E1,ポリメラーゼ(E2b)、及びpTP発現(E.C7細胞)にCaPO4コトランスフェクトした。トランスフェクション16時間後、細胞を回収し、細胞混合物を9つの24ウェル組織培養クラスタープレートに分配し、37℃で5〜9日間インキュベートした。ウイルス細胞変性効果を示す個々のウェルを回収し、単離したウイルスを、より多数のE.C7細胞の反復感染により増幅した。Ad5 [E1-, E2b-]HER2/neu組換えベクターの単離を、その後、(1)ベクターゲノムのDNA制限酵素マッピング、(2)HER2/neuの発現の確認、及び(3)複数回の機能試験により確認した。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuベクターの全配列は、配列番号3で確認できる。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuベクターの全配列(配列番号3)中のCMVプロモーター配列は、配列番号4で確認できる。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuベクターの全配列(配列番号3)中のSV40 polyAテール配列は、配列番号5で確認できる。
【０３９８】
[実施例3]
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの前臨床毒性学評価
この実施例では、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの前臨床毒性学評価を記述する。BALB/cマウスのGLP試験において、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの反復投与毒性を評価した。この研究は、4つのビヒクル対照群(第1群〜第4群)及び4つの試験品処置群(第5群〜第8群)の計8つの群からなった。1日目、22日目、及び43日目に1.7×108個のウイルス粒子(VP)/投与のAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuでマウスを免疫化した。ヒトの体重を60kg、マウスの体重を0.02kgと仮定すると、1.7×108VP/投与(8.3×109VP/kg)の用量のAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuが、ヒトにおいて提唱される最も高い用量である5×1011VP/投与(8.3×109VP/kg)のマウス対ヒト当量である。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuはマウスの皮下に投与した。皮下投与は、患者に対して意図される投与経路でもある。
【０３９９】
全体として、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuはマウスにおいてよく寛容であった。1匹のマウスが死亡したが、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンに関連したものではないとみなされた。ケージ側及びハンズオンの観察中に観察された臨床徴候はいずれも、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンに関連したものとはみなされなかった。他の動物はすべて、予定された屠殺まで生存した。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu処置動物の一部では紅斑及び浮腫が明らかであったが、紅斑は概して1日に起こった。紅斑の発生率及び重症度は低いため、紅斑は毒物学的に有意とみなされない。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuでの処置は、体重、体重増加、又は摂食量に対して毒物学的に有意な影響を一切及ぼさなかった。いずれの間隔における臨床病理データ、臓器重量データ、又は病理組織学データにも、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンの皮下注射による影響の証拠はなかった。
【０４００】
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンでの処置は、血球数;プロトロンビン時間(PT);活性化部分トロンボプラスチン時間;ナトリウム、カリウム、クロライド、カルシウム、クレアチンホスホキナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、コレステロール、総ビリルビン量、総タンパク質量、アルブミン、及びグロブリンのレベル;並びにアルブミン/グロブリン比に対して、生物学的に有意な影響を及ぼさなかった(表4〜5)。
【０４０１】
【表４】
2019521099.tif 000012
2019521099.tif 000013
【０４０２】
【表５】
2019521099.tif 000014
2019521099.tif 000015
【０４０３】
[実施例4]
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチン(注射用懸濁液)の調製
この実施例では、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチン(注射用懸濁液)の調製を記述する。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチン(注射用懸濁液)は、複製欠損型アデノウイルスベクター系である。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、Ad5[E1-,E2b-]ベクター及び改変されたHER2/neu遺伝子インサートを含むHER2/neu標的ワクチンである。HER2/neu遺伝子インサートは、細胞外ドメイン及び膜貫通領域からなる切断型ヒトHER2/neuタンパク質をコードする。発がん活性をもたらすキナーゼドメインを含有する細胞内ドメイン全体を除去した。
【０４０４】
薬学的特性
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、E1遺伝子の除去、E2b及びE3遺伝子の欠失、並びに細胞外ドメイン及び膜貫通領域からなるヒトHER2/neuの切断型遺伝子の挿入によって改変された組換え複製欠損型Ad5ベクターである。発がん活性をもたらすキナーゼドメインを含有する細胞内ドメイン全体を除去した(Gabitzsch ES and Jones FR. J Clin Cell Immunol. 2011a;S4:001、Hartman ZC, Wei J, Osada T, et al. An adenoviral vaccine encoding full-length inactivated human HER2/neu exhibits potent immunogenicty and enhanced therapeutic efficacy without oncogenicity. Clin Cancer Res. 2010;16:1466-1477)。
【０４０５】
外来性因子の安全性評価
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuを、E1、E2b、及びE3領域における有意な欠失、並びにヒトHER2/neu遺伝子の挿入によって改変した。結果として得られる複製欠損型ウイルスベクターは、欠失したE1及びE2b遺伝子産物をトランスで供給することができる所有権のあるのヒト胎児由来腎臓293細胞株(E.C7)において増殖可能である。しかしながら、複製可能なアデノウイルスが、E.C7(293)細胞株に存在するE1及びE2b配列の組換えによるアデノウイルスのウイルス粒子の製造中に形成され得る理論的可能性が存在する。したがって、複製可能なアデノウイルスに関する高感度試験をこのワクチンのための遊離試験に組み込んだ。
【０４０６】
E.C7マスター細胞バンク(MCB)及びマスターウイルスバンク(MVB)をウイルスの広範なパネルについて試験したところ、結果はすべて陰性であった。加えて、MCB又はMVBにおいて細菌、真菌、又はマイコプラズマの混入は検出されなかった。
【０４０７】
1つの動物由来の成分であるウシ胎仔血清(FBS)をE.C7細胞増殖のための増殖培地に使用した。オーストラリアから供給されたFBSは、生物製剤の生産に使用される動物起源の成分に関する9 CFR 113.53の要件を満たしていることが認定された。
【０４０８】
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、2mLの単回用量バイアルに入った無菌の透明な懸濁液として供給された。ワクチンは1mLあたり5×1011VPの濃度で提供され、ARM製剤緩衝液(20mMトリス、25mM NaCl、2.5%グリセロール、pH8.0)を含有した。各バイアルにはおよそ1.1mLのワクチンが含まれていた。
【０４０９】
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、使用の準備が整うまで薬局にて≦-20℃で保管した。注射の前に適切なバイアルを冷凍庫から取り出し、コントロールされた室温20〜25℃(68〜77°F)で20〜30にわたり自然解凍した。その後、バイアルは2〜8℃(35〜46°F)に保つべきである。
【０４１０】
[実施例5]
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuがんワクチンの前臨床研究
この実施例では、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuがんワクチンの前臨床研究を記述する。BALB/cマウスモデルにおいて、がんワクチンとしてのAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuを評価するために研究を行った。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、Ad5ナイーブマウス及びAd5免疫マウスにおいてHER2/neuに対する強力なCMIを誘導した。液性応答が誘導され、抗体は、インビトロの補体の存在下でHER2/neu発現腫瘍細胞を溶解する能力を示した。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、Ad5ナイーブ及びAd5免疫マウスモデルにおいてHER2/neu発現腫瘍の確立を防止し、確立した腫瘍の進行を有意に阻害した。これらのデータは、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuのインビボ送達が、抗HER2/neu免疫を誘導し、HER2/neu発現がんの進行を阻害し得ることを示す。
【０４１１】
前臨床研究及び特筆すべき所見を表6に提示する。
【０４１２】
【表６】
2019521099.tif 000016
2019521099.tif 000017
【０４１３】
[実施例6]
切除不能な局所進行又は転移性のHER2/neu発現乳がんを有する対象におけるAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチン接種の第I相研究
この実施例では、切除不能、局所進行、又は転移性のHER2/neu発現(IHC 1+又は2+)乳がんを有する対象におけるAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチン接種の第I相研究を記述する。HER2/neu発現乳がんを有する対象に、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンを3週間にわたって1週間に1回皮下(SC)投与し(合計3回の注射)、その後、3カ月間隔で3回のブースター注射を行う。このワクチンレジメンの全体的な安全性を判定し、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンの第2相における推奨用量を特定する。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuで処置したHER2/neu発現乳がんを有する対象において、客観的奏効率(ORR)、疾患コントロール率(DCR)、奏効の持続期間、無増悪生存率(PFS)、及び全生存率(OS)の予備評価を行う。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの免疫原性を評価し、対象の腫瘍のゲノムプロファイル及びプロテオミクスプロファイルを判定して、遺伝子突然変異、遺伝子増幅、RNA発現レベル、及びタンパク質発現レベルを特定する。ゲノム/プロテオミクスプロファイルと有効性転帰との相関性も評価する。
【０４１４】
臨床研究の要旨を表7に提示する。
【０４１５】
【表７】
2019521099.tif 000018
【０４１６】
二次エンドポイントには、固形がん効果判定基準(RECIST、Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)バージョン1.1.によるORR(完全奏効又は部分奏効の確認)、DCR(少なくとも6カ月間持続する奏効又は安定疾患の確認)、奏効の持続期間、無増悪生存率(PFS)、及び全生存率(OS)が含まれる。
【０４１７】
T細胞頻度、活性化ステータス、サイトカインプロファイル、及び抗体レベルのフローサイトメトリー解析により、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの免疫原性を評価する。遺伝子及びプロテオミクスのプロファイリングを行い、有効性との相関性を調べる。
【０４１８】
研究デザイン
切除不能な局所進行又は転移性のHER2/neu発現(IHC 1+又は2+)乳がんを有する対象を含む第I相治験を行う。この研究は2部構成で行う。第1部では3+3デザインを使用した用量漸増を用い、第2部では安全性、予備有効性、及び免疫原性をさらに評価するため最大耐用量(MTD)又は最高試験用量(HTD)の拡大を用いる。第1部では、用量コホート1から始めて3〜6名の対象を順次登録する。コホート1には5×1010個のウイルス粒子(VP)を与え、コホート2には5×1011VPを与え、必要に応じて、用量漸減コホート(コホート-1)に5×109VPを与える。対象の用量規制毒性(DLT)を評価する。用量拡大は、MTD又はHTDが判定されたときに行う。治験の用量拡大部分にさらに12名の対象を登録し、MTD又はHTDにおいて合計18名の対象とする。提唱される研究の概略を図2に示す。
【０４１９】
用量漸増部分では、用量コホート1から始めて3〜6名の対象を順次登録する(表8)。特定のコホートの登録期間中、連続的な対象の登録の間には最低7日間おく。DLTは継続的にモニタリングする。
【０４２０】
DLTは、National Cancer Institute(NCI)の有害事象共通用語基準(CTCAE、Common Terminology Criteria for Adverse Events)バージョン4.03に規定されるあらゆるグレード3以上の毒性、又はあらゆるグレード2以上の自己免疫反応若しくは即時型過敏反応と定義される。用量漸増は、表8に示したように行う。患者内の用量漸増は許可されない。
【０４２１】
【表８】
2019521099.tif 000019
【０４２２】
コホート1では、最初の3名の対象のいずれもDLTを経験しなければ、コホート2への用量漸増を開始する。最初の3名の対象のうちの1名がDLTを経験すれば、さらに3名の対象をコホート1に登録し、合計6名の対象とする。DLTを経験した対象が6名中1名以下であれば、コホート2への漸増を開始する。最初の3名の対象のうち、又は合計6名の対象のうち2名以上がDLTを経験した場合、漸減コホート-1への登録を開始する。
【０４２３】
コホート2では、DLTを経験するのが最初の3名の対象のうち1名以下であれば、さらに3名の対象をコホート2に登録し、合計6名の対象とする。DLTを経験した対象が6名中1名以下であれば、この用量レベルはHTDと定義される。最初の3名の対象のうち2名以上、又は合計6名の対象のうち2名以上がDLTを経験した場合、次のより低い用量レベルへの登録が次のように再開され得る。コホート1において3名の対象が処置される場合、この用量レベルでさらに3名の対象を登録し、合計6名の対象とする。DLTを経験した対象が6名中1名以下であれば、その用量はMTDと定義される。6名の対象のうち2名以上がDLTを経験した場合、漸減コホート-1への登録を開始する。さらに、コホート1において6名の対象が処置される場合、その用量はMTDと定義される。
【０４２４】
用量漸減コホート-1において、DLTを経験するのが最初の3名の対象のうち1名以下であれば、さらに3名の対象を漸減コホート-1に登録し、合計6名の対象とする。DLTを経験した対象が6名中1名以下であれば、この用量レベルはMTDと定義される。最初の3名の対象のうち2名以上、又は合計6名の対象のうち2名以上がDLTを経験した場合、投与を中断し、研究を再評価する。
【０４２５】
用量拡大は、入手可能な安全性に関する結果及び研究室の結果のすべてが安全性審査委員会(SRC、safety review committee)により審査された後、またMTD又はHTDが判定されたときに行う。研究の用量拡大部分にさらに12名の対象を登録し、MTD又はHTDにおいて合計18名の対象とする。
【０４２６】
研究による注射の一時中断を招く安全性事象には、研究薬剤に関連している可能性のある死、研究薬剤に関連している可能性のある2つのグレード4毒性事象、漸減コホート-1に最初に登録した6名の対象のうち2名以上がDLTを経験するかどうか、又は拡大段階におけるいずれかの時点で対象の33%超が研究による注射に関連している可能性のあるグレード3若しくは4の主要臓器毒性を経験するかどうかが含まれる。
【０４２７】
対象
この研究には最大30名の対象が登録される。対象は、HER2/neuを発現する切除不能な局所進行又は転移性の乳がん(IHC 1+又は2+)が組織学的に確認されたものである。HER2/neu IHC 3+腫瘍を有する対象は除外される。用量漸増部分では、用量コホート1から始めて3〜6名の対象を順次登録する。用量拡大部分では(すなわち、MTD又はHTDが特定されたら)、MTD/HTDコホートの対象が合計18名となるよう、さらに12名の対象を登録して、安全性、予備有効性、及び免疫原性に関するさらなるデータを得る。
【０４２８】
処置の持続期間
各対象は、およそ42週間(第0週、第3週、及び第6週に注射を行い、第18週、第30週、及び第42週にブースター注射を行う)、又は各対象が進行性疾患若しくは許容不可能な毒性を経験するか、同意を撤回するか、若しくは処置の継続がもはや最善とは言えないと研究者が感じるまで、処置を受けることが期待される。対象の処置の推定持続期間は、対象の疾患、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuを耐容する能力、研究に参加する意志、又は処置の継続がもはや最善とは言えないと研究者が感じるかどうかに応じて、延長又は短縮されてもよい。
【０４２９】
用量の改変
次の理由のうちいずれかが生じた場合、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは保留される:CTCAEバージョン4.03に規定されるあらゆるグレード3以上の毒性、あらゆるグレード2以上の自己免疫反応又は即時型過敏反応、左室駆出率(LVEF)の処置前の値からの16%未満又は16%の絶対的低下、機関が規定した正常下限(LLN)未満のLVEF、及びLVEFの処置前の値からの10%超又は10%の絶対的低下。
【０４３０】
次の理由のうちいずれかが生じた場合、HER2/neuは永久に打ち切られる:Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuに関連している可能性のあるあらゆる過敏症反応、生死に関わるアナフィラキシー反応、LVEFの低下に伴って症候性うっ血性心不全を発症する対象、生死に関わるあらゆる有害反応、グレード3以上の注射部位反応(例えば、潰瘍、壊死)、注射に起因するグレード4の毒性(発熱を除く)、又は48時間を超えて持続するグレード4の発熱。
【０４３１】
以下は、許容可能な投与遅延条件である。第1に、最初の3回のワクチン投与は、予定通り3週間毎(第0週、第3週、及び第6週)に行われるべきであり、矛盾する場合は、5日間の枠が許容可能である。第2に、予定されているワクチン接種の時点で存在する無関係の急性疾患については、症状が治まるまで投与を遅延してもよいし、又は研究員の自由裁量で対象の治験参加を中止してもよく、この状況では最長3週間の遅延が許容可能とみなされる。Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの用量低減はない。許可される併用薬は、併用されるビスホスホネート療法剤である。
【０４３２】
組み入れ基準
第I相臨床治験の対象の適格性は、組み入れ基準及び除外基準によって定義される。組み入れ基準には次のものが含まれる:年齢18歳以上、男性又は女性、機関審査委員会(IRB、Institutional Review Board)のガイドラインを満たす署名済みインフォームドコンセントを理解し提供する能力、解析のために利用可能である最も新しい入手可能な転移性生検試料、腫瘍組織(ブロック又はスライド)及び全血試料(アーカイブ組織は許可される)に由来する、組織学的に確認されたHER2/neuを発現する、切除不能な局所進行又は転移性の乳がん(IHC 1+又は2+)、並びに0又は1のEastern Cooperative Oncology Group(ECOG)性能ステータス。
【０４３３】
さらに、HER2/neu標的免疫療法(ワクチン)を過去に受けた対象は、この処置が登録の少なくとも3カ月前に打ち切られていれば、この治験に適格である。過去の化学療法、放射線療法、又は外科手技の有毒な副作用はすべて、NCI CTCAEグレード≦1になる。免疫抑制の病歴を有しない服薬中の対象は、この治験に適格である。さらに、スクリーニングにおいて妥当な血液学的機能は、次のように定義される:白血球数≧3000/マイクロリットル、ヘモグロビン≧9g/dL(このレベルを達成するために輸血又はエリスロポエチンを使用しなくてもよい)、血小板≧75,000/マイクロリットル、プロトロンビン(PT)国際標準比(INR)<1.5、及び部分トロンボプラスチン時間(PTT)<1.5×正常上限(ULN)。スクリーニングにおいて妥当な腎機能及び肝機能は、次のように定義される:血清クレアチニン<2.0mg/dL、ビリルビン<1.5mg/dL(ビリルビン≦2.0mg/dLを可能にするギルバート症候群を除く)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)≦2.5×ULN、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)≦2.5×ULN。
【０４３４】
適格性について付言すると、組み入れ基準には、LVEFが機関のLLN以上のマルチゲート回収(MUGA)スキャン又は心エコー図も含まれる(研究全体を通じて同じ撮像様式を使用するものとする)。妊娠の可能性がある女性の対象及び閉経発生から<12カ月の女性は、研究の持続期間及び治験薬の最後の注射後4カ月間にわたって許容可能な避妊方法を使用することに同意しなければならない。避妊法を用いる場合、次の予防措置のうち2つを使用しなければならない:パートナーの精管切除、卵管結紮、膣内ペッサリー、子宮内デバイス、コンドーム及び殺精子剤(ゲル/フォーム/クリーム/膣内坐薬)、又は完全な自制。男性の対象は、外科的に生殖不能であるか、又はコンドーム及び許容可能な避妊方法をパートナーとともに使用することに同意しなければならない。閉経後の女性の対象は、>12カ月連続して月経がないものと定義される。最後に、組み入れ基準には、要求される治験来院を行い、妥当なフォローアップのために再来院する能力が含まれる。
【０４３５】
除外基準
第I相臨床治験の対象の適格性は、組み入れ基準及び除外基準によって定義される。除外基準には次のものが含まれる:HER2/neu IHC 3+腫瘍を有する対象、トラスツズマブ、ペルツズマブ、T-DM1、及びラパチニブを含むHER2/neu指向療法が進行中の対象、この研究のためのスクリーニングの30日以内の治験薬又はデバイス研究への参加、妊娠中及び授乳中の女性、並びにパルボシクリブ、エベロリムス、又は免疫応答の誘導に干渉する他の乳がん療法が進行中の対象。
【０４３６】
さらなる除外基準には、細胞傷害性化学療法又は放射線療法を併用している対象が含まれる。先行するあらゆる他の化学療法(又は放射線療法)と研究処置との間には少なくとも1カ月おかなくてはならない。先行するあらゆるHER2/neu標的免疫療法(ワクチン)は、研究処置開始の少なくとも3カ月前に打ち切られていなければならない。対象は、この研究のためのスクリーニングの前に、先行する処置に由来するすべての急性毒性から回復している必要がある。
【０４３７】
さらなる除外基準は、活発な脳又は中枢神経系の転移、抗痙攣薬処置を必要とするけいれん、脳血管発作(<6カ月)、又は一過性脳虚血発作がある対象、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、強皮症、又は多発性硬化症などだがこれらに限定されない(自己免疫関連の甲状腺疾患及び白斑症は許可される)自己免疫疾患(活動性又は過去)の病歴がある対象、深刻な介入性慢性又は急性疾患、例えば心疾患若しくは肺疾患、肝疾患、又は治験薬処置に対するリスクが高いとみなされる他の疾病を有する対象、うっ血性心不全(New York Heart Associationの機能分類により定義されるクラスII、III、又はIV)などの心疾患の病歴、不安定若しくはコントロール不良のアンギナの病歴、又は心室性不整脈の病歴(<1年)がある対象、並びに、対象がプロトコールに従って療法を受ける能力を損なったり、プロトコール若しくはプロトコールに要求される来院及び手順に従う能力に影響を及ぼしたりする医学的又は心理学的障害を有する対象である。
【０４３８】
悪性腫瘍の病歴も除外基準であるが、次の場合を除く:適切に処置された非メラノーマ皮膚がん、子宮頸上皮内がん、表在性膀胱がん、又は5年を超えて処置なしで完全寛解している他のがん腫。ヒト免疫不全ウイルス(HIV、酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA]により判定され、ウェスタンブロットにより確認されたもの)並びにB型肝炎及びC型肝炎ウイルス(HBV/HCV、HBsAg及びC型肝炎血清学により判定されたもの)を含む、既知の活動性の急性又は慢性感染症の存在は、除外基準とみなされる。全身性静脈内又は経口ステロイド療法(又は他の免疫抑制薬、例えばアザチオプリン又はシクロスポリンA)を受けている対象は、免疫抑制の可能性に基づいて除外される。対象は、登録の少なくとも6週間前にあらゆるステロイド療法(化学療法又は造影研究のための前投薬として使用されるものを除く)が打ち切られていなければならない。
【０４３９】
治験製品のいずれかの成分に対するアレルギー又は過敏症を有することが既知の対象は除外される。四肢の皮膚への注射又は後の皮膚反応の可能性の評価に干渉する急性又は慢性の皮膚障害を有する対象は除外される。最後に、生(弱毒)ワクチン(例えば、FluMist(登録商標))又は死菌(不活化)/サブユニットワクチン(例えば、PNEUMOVAX(登録商標)、Fluzone(登録商標))を、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの最初の計画投与からそれぞれ28日間又は14日間以内にワクチン接種した対象は除外される。
【０４４０】
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neu投与準備
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンの製品名、剤形、単位用量、投与経路、物理的説明、及び製造元を表9にまとめる。
【０４４１】
【表９】
2019521099.tif 000020
【０４４２】
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの注射用量は、1mLあたり5×109VP(漸減コホート-1)、5×1010VP(コホート1)、又は5×1011VP(コホート2)である。注射の前に適切なバイアルを冷凍庫から取り出し、コントロールされた室温(20〜25℃、68〜77°F)で少なくとも20分間から30分間以下にわたり自然解凍する。その後、バイアルを2〜8℃(35〜46°F)に保つ。
【０４４３】
各バイアルはゴム栓で密封され、白色のフリップオフシールを有する。製品のエンドユーザーがキャップの白色のプラスチック部分を親指でフリップアップ/オフしてゴム栓を露出させ、栓を注射針で穿刺して液体を引き出す。ゴム栓はアルミニウムのクリンプシールでバイアルに固定される。解凍されたバイアルを回旋させてから、無菌法を使用し、薬剤師が1mLシリンジを使用して適切な容量を適切なバイアルから引き出す。
【０４４４】
このワクチン用量は、1〜1/2インチ、20〜25ゲージの針を使用して可能な限り早く注射する。ワクチンを直ちに注射することができない場合、シリンジを薬局に戻し、機関の方針及び手順に従って適切に処分し、治験製品管理記録に処分内容を記録する。
【０４４５】
バイアル内のワクチンの2〜8℃(35〜46°F)における保管は8時間を超えない。また、ワクチンが解凍されたら再冷凍はしない。
【０４４６】
コホート2(5×1011VP)の投与準備は次のとおりである。バイアルから内容物を1mL引き出し、注射部位をアルコールで準備し、さらなる操作を行わずにこの用量を対象の大腿への皮下注射によって投与する。
【０４４７】
コホート1(5×1010VP)の投与準備は次のとおりである。1.0mLツベルクリンシリンジを使用し、0.9%滅菌食塩水の5.0mLバイアルから0.50mLの流体を取り出し、4.50mL残す。別の1.0mLツベルクリンシリンジを使用し、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuと標識されたバイアルから0.50mLを取り出し、5mL滅菌食塩水バイアルに残っている4.5mLの滅菌食塩水に送給する。希釈されたAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuの5mL溶液を反転することにより内容物を混合する。希釈されたAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuを1mL引き出し、注射部位をアルコールで準備し、この用量を対象の大腿への皮下注射によって投与する。
【０４４８】
コホート-1(5×109VP、用量漸減)の投与準備は次のとおりである。0.50mLツベルクリンシリンジを使用して、0.9%滅菌食塩水の5.0mLバイアルから0.05mLの流体を取り出し、4.95mLを残す。別の0.50mLツベルクリンシリンジを使用し、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuと標識されたバイアルから0.05mLを取り出し、5mL滅菌食塩水バイアルに残っている4.95mLの滅菌食塩水に送給する。希釈された5mLのAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuを反転することにより内容物を混合する。希釈されたAd5[E1-,E2b-]-HER2/neuを1mL引き出し、注射部位をアルコールで準備し、この用量を対象の大腿への皮下注射によって投与する。
【０４４９】
投与
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuは、合計3回の注射を第0週、第3週、及び第6週に投与した後、3カ月間隔(第18週、第30週、及び第42週)で3回のブースター注射を行う。試験薬投与処置はすべて、予定来院日の±5日以内に行う。ワクチン注射はすべて、部位をアルコールで準備した後、大腿へのSC注射によって1mL容量として与えられるべきである。初回注射にはいずれの大腿を使用してもよい。その後の注射は初回注射と同じ大腿に与えなければならず、少なくとも5cm離れていなければならない。
【０４５０】
Ad5[E1-,E2b-]ベクターは非複製的であり、そのゲノムはヒトゲノムに統合されない。このベクターは非複製的組換えウイルスであるため、バイオセイフティーレベル2の条件下で扱われる。使用したバイアル内のAd5[E1-,E2b-]-HER2/neu物質はすべて、使用後にオートクレーブする。
【０４５１】
評価基準
安全性エンドポイントには、DLT、MTD、又はHTDの評価、処置により発生したAE、SAE、並びに安全性の研究室試験、物理的検査、ECG、LVEF、及びバイタルサインの臨床的に有意な変化が含まれる。毒性は、National Cancer Institute(NCI)の有害事象共通用語基準(CTCAE)バージョン4.03を使用してグレーディングする。有効性を評価するためには、RECISTバージョン1.1;奏効の持続期間、PFS、及びOSに従って腫瘍応答(ORR及びDCR)を評価する。
【０４５２】
有効性の評価
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンの有効性は、生存率及び抗腫瘍応答を評価することによって評価する。対象の治験終了又は参加中止後、12カ月間にわたって3カ月毎、その後12カ月間にわたっておよそ6カ月毎に、すべての対象の生存率を追跡調査する。
【０４５３】
腫瘍評価は次の評価を含み得る:物理的検査(必要に応じて皮膚病変の写真及び測定を用いる);胸部、腹部、及び骨盤(骨盤のスキャンは、既知の骨盤疾患がベースラインで存在する場合を除いて任意である)のコンピュータ断層撮影(CT)又は磁気共鳴撮像(MRI)スキャンを使用した断面撮像;骨病変が既知である/疑われる対象の骨の核スキャン;並びに脳のCT又はMRIスキャン(症状/所見に基づいて臨床的に正当とされる場合のみ)。好ましい疾患評価方法は、造影剤を用いたCTである。造影剤を用いたCTが禁忌となる場合、造影剤を用いない胸部のCT、及び造影剤を用いた腹部/骨盤のMRIスキャンが好ましい。
【０４５４】
ベースラインにおいて腫瘍病変が選択され、標的病変又は非標的病変に分類される。標的病変としては、少なくとも1つの寸法が、従来の技術を用いた場合に≧20mm、又はCTスキャンを用いた場合に≧10mmと正確に測定され得る病変が挙げられる。短軸径が≧15mmの悪性リンパ節は標的病変とみなすことができる。臓器毎に最大で2つまでの標的病変及び合計で5つの標的病変がベースラインで特定される。これらの病変は、関与している臓器すべての代表であり、それらのサイズ(直径が最も長いもの)及び正確な反復測定に対する好適性に基づいて選択されるべきである。標的病変のすべてに関して病変の最長径(LLD、longest lesion diameter)の和を算出し、ベースラインLLD和として報告する。標的病変と特定された悪性リンパ節に関しては、短軸径をLLD和の算出に使用する。他の病変(又は疾患部位)はすべて、非標的病変と特定される(骨病変を含む)。
【０４５５】
ベースライン後応答の評価はすべて、ベースラインで特定されたものと同じ病変の追跡調査である。対象の安全上の理由(例えば造影媒体へのアレルギー反応)のために変更の必要が生じる場合を除き、ベースラインで病変を特定/評価するために使用したものと同じ評価形式(例えばCT)を研究過程全体で使用する。
【０４５６】
RECIST奏効基準
標的病変及び/又は非標的病変の抗腫瘍活性は、以下に概説するRECISTバージョン1.1(Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, et al. Eur J Cancer. 2009;45:228-247)に従って評価される。
【０４５７】
標的奏効は、以下の2つの式によって標的病変サイズの変化率を評価することで定義される。第1に、完全奏効又は部分奏効を判定する場合は、[(事後値-ベースライン値)/ベースライン値]×100の式を使用して標的奏効を算出する。第2に、進行性疾患を判定する場合は、[(事後値-処置開始以降の最小値)/(処置開始以降の最小値)]×100の式を使用して標的奏効を算出する。
【０４５８】
標的奏効は、表10のRECISTバージョン1.1、標的病変奏効基準に従って分類される。
【０４５９】
【表１０】
2019521099.tif 000021
【０４６０】
非標的奏効は、表11のRECISTバージョン1.1、非標的病変奏効基準に従って分類される。
【０４６１】
【表１１】
2019521099.tif 000022
【０４６２】
【表１２】
2019521099.tif 000023
【０４６３】
全奏効は、表12のRECISTバージョン1.1、全奏効基準に従って分類される。
【０４６４】
探索的エンドポイントの解析
免疫応答は、フローサイトメトリーベースのアッセイ及び血清アッセイにおいて検出及び数量化する。T細胞頻度、活性化ステータス、サイトカインプロファイル、及び抗体レベルのフローサイトメトリー解析により、Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuの免疫原性を検出する。
【０４６５】
応答又は疾患進行に寄与し得るゲノムの相違を特定し、分子異常を理解するために、全血由来の非腫瘍細胞に対する腫瘍細胞のゲノムシーケンシングのプロファイリングを行う。RNAシーケンシングを行って発現データを作成し、DNA突然変異との関連性を明らかにする。定量的なプロテオミクス解析を行い、特定のタンパク質の精確な量を判定し、ワクチン免疫療法への応答及び疾患進行と相関する遺伝子の発現を確認する。
【０４６６】
薬力学的評価
Ad5[E1-,E2b-]-HER2/neuワクチンの薬力学評価は、末梢血の回収と回収した試料の免疫評価によって評価される。研究中及び/又は特定の注射後の特定の時点において、およそ80mLの末梢血を対象から採取し、試験薬が免疫応答に及ぼす影響を評価する。採血は、ベースライン、各注射の前、及び第3の注射のおよそ3週間後(第9週);並びに各ブースター注射(第18週、第30週、及び第42週)の前、及び各ブースター注射の3週間後(第21週、第33週、及び第45週)に行う。蓋が緑色の10mLヘパリンナトリウム管6本分をPBMC試料用に採取し、8mL血清分離管2本分を血清試料用に採取する。免疫評価は、フローサイトメトリーベースのアッセイ及び血清アッセイを含む。
【０４６７】
PBMCの解析は次のように行う。Ficoll-Hypaque密度勾配分離により分離した療法前及び療法後のPBMCについて、細胞内サイトカイン染色アッセイを使用した抗原特異的免疫応答の解析を行う。腫瘍関連抗原HER2/neuをコードする重複15マーペプチドプールを用い、PBMCをインビトロで刺激する。対照ペプチドプールは、ヒト白血球抗原ペプチドを陰性対照として、CEFTペプチドミックスを陽性対照として使用する。CEFTは、CMV、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザ、及び破傷風毒素のペプチドの混合物である。CD4及びCD8 T細胞の刺激後解析は、IFN-γ、IL-2、腫瘍壊死因子、及びCD107aの産生を伴う。十分なPBMCが利用可能であれば、他の腫瘍関連抗原に対するT細胞の発生についてアッセイを行う。PBMCにおける標準的な免疫細胞型(CD4及びCD8 T細胞、ナチュラルキラー[NK]細胞、制御性T細胞[Treg]、骨髄性抑制性細胞[MDSC]、並びに樹状細胞)、並びに123免疫細胞サブセットの変化を評価する。十分なPBMCが利用可能であれば、選択した対象から得たPBMCにおける、CD4及びCD8 T細胞、NK細胞、Treg、及びMDSCを含む特定の免疫細胞サブセットの機能を解析する。
【０４６８】
可溶性因子の解析は次のように行う。次の可溶性因子:可溶性CD27、可溶性CD40リガンド、並びにHER2/neu及び他の腫瘍関連抗原に対する抗体について、療法前及び療法後の血清を解析する。
【０４６９】
ゲノミクス及びプロテオミクス分子解析並びに腫瘍及び全血の解析
応答又は疾患進行に寄与し得るゲノムの相違を特定し、分子異常を理解するために、全血由来の非腫瘍細胞に対する組織由来の腫瘍細胞のゲノムシーケンシングのプロファイリングを行う。RNAシーケンシングを行って発現データを作成し、DNA突然変異との関連性を明らかにする。定量的なプロテオミクス解析を行い、特定のタンパク質の精確な量を判定し、ワクチン免疫療法への応答及び疾患進行と相関する遺伝子の発現を確認する。
【０４７０】
次世代シーケンシング及び質量分析ベースの定量的プロテオミクスにより、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腫瘍組織及び全血(腫瘍組織に対する対象適合の正常比較群)のゲノミクス及びプロテオミクス分子プロファイリングを行う。この研究では腫瘍組織及び全血の回収が必須である。腫瘍組織及び全血はスクリーニング時に取得する。
【０４７１】
単一のFFPE腫瘍組織ブロック又はスライドを使用し、腫瘍DNA、腫瘍RNA、及び腫瘍タンパク質の抽出を行う。対象の正常DNAの抽出には全血試料を使用する。腫瘍組織及び全血は、NantOmics, LLCのCLIA登録済み、CAP公認/CLIA認定研究室で処理する。
【０４７２】
統計方法
DLT率及びMTD又はHTDを評価する。処置により発生したAE、SAE、並びに安全性の研究室試験、物理的検査、ECG、LVEF、及びバイタルサインの臨床的に有意な変化という観点から、用量コホート内及び研究集団全体で、CTCAEバージョン4.03を使用したグレードによるAEの頻度集計表を使用した記述的解析により、全体的な安全性を評価する。RECISTバージョン1.1に従って用量コホート別及び全体のORR及びDCRを評価し、奏効の持続期間も評価する。カプランマイヤー法を使用し、用量コホート別及び全体のPFS及びOSを解析する。
【０４７３】
本明細書に開示及び請求された方法の全ては、過度な実験をすることなく本開示に照らして行われ、遂行され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、変形形態が、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法及び方法のステップ又は一連のステップに適用され得ることは当業者に明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載された薬剤は、化学的にも及び生理学的にも関連する特定の薬剤に代用され得るが、同じ又は類似の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似の代用及び改変は、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の趣旨、範囲、及び概念の内と見なされる。
【図１】
2019521099.tif 000024
【図２】
2019521099.tif 000025
【配列表】
2019521099000001.app
【国際調査報告】
2019521099.tif 000026
2019521099.tif 000027