(57)【要約】本明細書で提供されるのは、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗体、およびその抗原結合性断片、ならびにこれらを使用法（例えば、これらを使用する処置方法が挙げられる）である。本発明の抗体およびその抗原結合性断片は、とりわけ、ＧＩＴＲを発現する免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を標的化するために有用であり、がん免疫療法および免疫障害のための基礎として働き得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体または抗原結合性断片は、以下からなる群：
（ｉ）表面プラズモン共鳴によって測定される、約５．０ｎＭに満たないＫＤで３７℃において単量体ヒトＧＩＴＲに結合する；
（ｉｉ）約１２分より長いｔ１／２で３７℃において単量体ヒトＧＩＴＲに結合する；
（ｉｉｉ）表面プラズモン共鳴によって測定される、約９５０ｐＭに満たないＫＤで３７℃において二量体ヒトＧＩＴＲに結合する；
（ｉｖ）約７分より長いｔ１／２で３７℃において二量体ヒトＧＩＴＲに結合する；および
（ｖ）約２６０ｐＭに満たないＥＣ５０でヒトＧＩＴＲトランスフェクトしたヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）Ｄ９細胞に結合する、
より選択される１または複数の特性を示す、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記抗体または抗原結合性断片は、ヒトＧＩＴＲを活性化する、請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項３】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体または抗原結合性断片は、Ｆｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する、抗体または抗原結合性断片。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約３ｎＭに満たないＥＣ５０において約２５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する、請求項３に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約１．０ｎＭに満たないＥＣ５０でヒトＧＩＴＲを活性化する、請求項３または４に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項６】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体または抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイにおいて決定される、Ｆｃアンカリングの非存在下でＴ細胞増殖活性を示す、抗体または抗原結合性断片。
【請求項７】
前記抗体または抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイにおいて決定される、約８ｎＭまたはこれに満たないＥＣ５０で、Ｆｃアンカリングの非存在下でＴ細胞増殖活性を示す、請求項６に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項８】
前記抗体または抗原結合性断片は、Ｆｃアンカリングの存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する、請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項９】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体または抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイにおいて決定される、バックグラウンドを少なくとも２倍上回って、Ｆｃアンカリングの存在下でＴ細胞増殖活性を示す、抗体または抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記抗体または抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定される、約３４ｎＭに満たないＥＣ５０でＦｃアンカリングの存在下でＴ細胞増殖活性を示す、請求項９に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記抗体または抗原結合性断片は、ｈＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する、請求項１に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記抗体または抗原結合性断片は、Ｆｃアンカリングの非存在下でｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断する、請求項１１に記載の抗体または抗原結合性断片。
【請求項１３】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体または抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約４．０ｎＭに満たないＩＣ５０において約５４％より高い遮断パーセンテージでＦｃアンカリングの非存在下で、ｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断する、抗体または抗原結合性断片。
【請求項１４】
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体または抗原結合性断片は、（ａ）表１に表記されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｂ）表１に表記されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む、抗体または抗原結合性断片。
【請求項１５】
前記抗体または抗原結合性断片は、表１に表記されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲおよび表１に表記されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項１４に記載の単離された抗体または抗原結合性断片。
【請求項１６】
前記抗体または抗原結合性断片は、
（ｉ）配列番号１００、１６４、１９６、２４４、２９２、３４０、および３４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｉｉ）配列番号１０２、１６６、１９８、２４６、２９４、３４２、および３５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｉｉｉ）配列番号１０４、１６８、２００、２４８、２９６、３４４、３５２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｉｖ）配列番号１０８、１７２、２０４、２５２、３００、および４０４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｖ）配列番号１１０、１７４、２０６、２５４、３０２、および４０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン、ならびに
（ｖｉ）配列番号１１２、１７６、２０８、２５６、３０４、および４０８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、
を含む、請求項１４に記載の単離された抗体または抗原結合性断片。
【請求項１７】
前記抗体または抗原結合性断片は、
（ｉ）配列番号１００を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号１０２を含むＨＣＤＲ２；配列番号１０４を含むＨＣＤＲ３；配列番号１０８を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号１１０を含むＬＣＤＲ２；および配列番号１１２を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１６４を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号１６６を含むＨＣＤＲ２；配列番号１６８を含むＨＣＤＲ３；配列番号１７２を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号１７４を含むＬＣＤＲ２；および配列番号１７６を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｉｉ）配列番号１９６を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号１９８を含むＨＣＤＲ２；配列番号２００を含むＨＣＤＲ３；配列番号２０４を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号２０６を含むＬＣＤＲ２；および配列番号２０８を含むＬＣＤＲ３；
（ｉｖ）配列番号２４４を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号２４６を含むＨＣＤＲ２；配列番号２４８を含むＨＣＤＲ３；配列番号２５２を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号２５４を含むＬＣＤＲ２；および配列番号２５６を含むＬＣＤＲ３；
（ｖ）配列番号２９２を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号２９４を含むＨＣＤＲ２；配列番号２９６を含むＨＣＤＲ３；配列番号３００を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号３０２を含むＬＣＤＲ２；および配列番号３０４を含むＬＣＤＲ３；
（ｖｉ）配列番号３４０を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号３４２を含むＨＣＤＲ２；配列番号３４４を含むＨＣＤＲ３；配列番号４０４を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号４０６を含むＬＣＤＲ２；および配列番号４０８を含むＬＣＤＲ３；または
（ｖｉｉ）配列番号３４８を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）−１；配列番号３５０を含むＨＣＤＲ２；配列番号３５２を含むＨＣＤＲ３；配列番号４０４を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）−１；配列番号４０６を含むＬＣＤＲ２；および配列番号４０８を含むＬＣＤＲ３、
を含む、請求項１４に記載の単離された抗体または抗原結合性断片。
【請求項１８】
単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体またはその抗原結合性断片は、ＧＩＴＲへの結合に関して、配列番号９８／１０６；配列番号１６２／１７０；配列番号１９４／２０２；配列番号２４２／２５０；配列番号２９０／２９８；配列番号３３８／４０２；および配列番号３４６／１０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む参照抗体と競合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、ここで該抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９８／１０６；配列番号１６２／１７０；配列番号１９４／２０２；配列番号２４２／２５０；配列番号２９０／２９８；配列番号３３８／４０２；および配列番号３４６／１０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む参照抗体と、ＣＩＴＲ上の同じエピトープに結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合性断片、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の組成物を投与する工程を包含する、被験体においてがんを処置するための方法。
【請求項２２】
被験体において抗腫瘍免疫応答を調節するための方法であって、該方法は、請求項１〜１９のいずれかに記載のＧＩＴＲに結合する抗体またはその抗原結合性断片を該被験体に投与する工程を包含する方法。
【請求項２３】
第２のＴ細胞活性化受容体に結合する抗体またはその抗原結合性断片を投与する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞活性化受容体は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、またはＨＶＥＭである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞阻害受容体に結合する抗体またはその抗原結合性断片を投与する工程をさらに包含する、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞阻害受容体は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、またはＬＡＧ−３である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体に放射線療法を投与する工程をさらに包含する、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
１種または複数の化学療法剤を投与する工程をさらに包含する、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞阻害受容体は、ＰＤ１である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
Ｔ細胞受容体に結合する前記抗体は、ＲＥＧＮ  ２８１０である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＩＴＲに結合する前記抗体は、請求項１７に記載の抗体である、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性断片、ならびにその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーである。ＧＩＴＲ発現は、構成的には、調節性Ｔ細胞上では高く、ナイーブＴ細胞、ＮＫ細胞および顆粒球上では低／中程度であり、そして活性化に際して誘導可能である。ＧＩＴＲは、そのリガンドＧＩＴＲＬと相互作用し、このＧＩＴＲＬは、抗原提示細胞上で主に発現される。ＧＩＴＲ受容体活性化は、エフェクターＴ細胞増殖および機能の両方を増大させ得、かつ調節性Ｔ細胞によって誘導される抑制を減衰し得る。その結果として、ＧＩＴＲ活性の調節は、がん免疫療法および免疫障害のための基礎として働き得る。従って、ＧＩＴＲの活性を調節する薬剤（例えば、抗体）が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
要旨
本発明は、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、ＧＩＴＲを発現する免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を標的化するために有用である。
【０００４】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であっても、あるいは抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよく、機能性に影響を及ぼすよう、例えば、残存エフェクター機能を排除するよう修飾されていてもよい（Ｒｅｄｄｙら、（２０００年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４巻：１９２５〜１９３３頁）。
【０００５】
本発明の例示的な抗ＧＩＴＲ抗体は、本明細書における表１および２に列挙されている。表１は、例示的な抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を表記する。表２は、例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を表記する。
【０００６】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０００７】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【０００８】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペアを組んだ表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの内に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、９８／１０６；１６２／１７０；１９４／２０２；２４２／２５０；２９０／２９８；３３８／４０２；および３４６／４０２からなる群より選択される。
【０００９】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１０】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１１】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１２】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１３】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１４】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供
する。
【００１５】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペアを組んだ表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの内に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアは、１０４／１１２；１６８／１７６；２００／２０８；２４８／２５６；２９６／３０４；３４４／４０８；および３５２／４０８からなる群より選択される。
【００１６】
本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの内に含有される６個のＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６；１９６−１９８−２００−２０４−２０６−２０８；２４４−２４６−２４８−２５２−２５４−２５６；２９２−２９４−２９６−３００−３０２−３０４；３４０−３４２−３４４−４０４−４０６−４０８；および３４８−３５０−３５２−４０４−４０６−４０８からなる群より選択される。
【００１７】
関連する実施形態では、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有される６個のＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。例えば、本発明は、９８／１０６；１６２／１７０；１９４／２０２；２４２／２５０；２９０／２９８；３３８／４０２；および３４６／１０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は、本技術分野において周知のものであり、本明細書に開示されている規定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲの同定に使用することができる。ＣＤＲの境界の同定に使用することのできる例示的な慣例として、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般用語において、Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造的ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａアプローチの折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースを利用することもできる。
【００１８】
本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体またはその部分をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ１核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ２核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ３核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ１核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ２核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ３核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、前記ＨＣＶＲが、３個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙されている例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかによって定義される核酸分子も提供する。
【００２７】
本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、前記ＬＣＶＲが、３個のＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙されている例示的な抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかによって定義される核酸分子も提供する。
【００２８】
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、前記ＨＣＶＲが、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列と、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列とを含む。本発明の本態様に係るある特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、前記ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは両者共に、表１に列挙されている同じ抗ＧＩＴＲ抗体に由来する。
【００２９】
本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体の重または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に表記されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。係るベクターが導入された宿主細胞と共に、前記抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養し、このようにして産生された前記抗体および抗体断片を回収することにより前記抗体またはその部分を産生する方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、あるいは例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるために、オリゴ糖鎖に存在するフコース部分を欠く抗体が有用となることもある（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２年）ＪＢＣ  ２７７巻：２６７３３頁を参照）。他の適用では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体および第２の治療剤の組み合わせである組成物を特色とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＧＩＴＲ抗体と有利に組み合わされるいずれかの薬剤である。本発明は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗ＧＩＴＲ抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も提供する。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体に関与する例示的な併用療法、同時製剤およびＡＤＣは、本明細書の他の箇所に開示されている。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体の抗原結合部分を使用して、腫瘍細胞を殺傷するためまたは腫瘍細胞成長を阻害もしくは減衰させるための、またはがんに罹患した患者を別の方法で処置するための、治療方法を提供する。本発明の本態様に係る治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合性断片を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。処置される障害は、ＧＩＴＲを標的化することによって、ならびに／あるいはＴ細胞増殖もしくは機能を増大するおよび／または調節性Ｔ細胞によって誘導される抑制活性を阻害することによって、改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）される、回復（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）される、阻害される、または予防される任意の疾患または状態である。
【００３３】
さらに別の態様において、本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体または抗ＧＩＴＲ抗体の抗原結合部分および抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ１抗体の抗原結合部分の組み合わせを使用して、腫瘍細胞を殺傷するか、または腫瘍細胞成長を阻害もしくは減衰する、またはがんに罹患した患者を別の方法で処置するための治療法を提供する。本発明のこの態様に係る治療法は、治療有効量の、抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ１抗体または抗原結合性断片組成物の組み合わせを含む薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。処置される障害は、ＧＩＴＲおよびＰＤ１の両方を標的化することによって改善、回復、阻害または予防される任意の疾患または状態である。
【００３４】
他の実施形態は、次の詳細な説明の総説から明らかになるであろう。他の実施形態は、次の詳細な説明の総説から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、実施例７に記載されている腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットした各処置群の平均腫瘍容積（ｍｍ３±ＳＥＭ）を示す。マウスを、アイソタイプ抗体抗体（白丸、○）、抗ＰＤ−１抗体（白四角、□）、抗ＧＩＴＲ抗体（白角錐、△）、または抗ＰＤ−１および抗ＧＩＴＲの組み合わせ（逆向き黒角錐、下向き黒三角）のいずれかで処置した。
【００３６】
【図２】図２は、実施例７に記載されている抗マウスＧＩＴＲおよび抗マウスＰＤ１抗体の組み合わせで処置したＭＣ３８を有するマウスの生存分析を示す。マウスを、アイソタイプ抗体（白丸、○）、抗ＰＤ−１抗体（白四角、□）、抗ＧＩＴＲ抗体（白角錐、△）、または抗ＰＤ−１および抗ＧＩＴＲの組み合わせ（逆向き白角錐、▽）のいずれかで処置した。
【００３７】
【図３】図３は、実施例７に記載されている腫瘍なしのマウスまたはＭＣ３８もしくはＢ１６．Ｆ１０．９腫瘍細胞でチャレンジしたナイーブ対照マウスの個々の腫瘍成長曲線を示す。
【００３８】
【図４】図４は、実施例７に記載されている種々の枯渇抗体で処置したマウスの平均腫瘍容積を示す。
【００３９】
【図５】図５は、実施例７に記載されている腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ、ＣＤ４  Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比のＦＡＣＳ分析結果を示す。
【００４０】
【図６】図６は、実施例７に記載されている腫瘍におけるＴ細胞サブセットのパーセンテージおよび細胞数／ｍｍ３腫瘍を示す。
【００４１】
【図７】図７は、実施例７に示されている腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットした各処置群の平均腫瘍容積（ｍｍ３±ＳＥＭ）を示す。
【００４２】
【図８】図８は、実施例７に記載されている抗ヒトＧＩＴＲ抗体および抗マウスＰＤ１抗体の組み合わせで処置したＭＣ３８を有するＧＩＴＲ／ＧＩＲＬヒト化マウスの生存分析を示す。
【００４３】
【図９】図９は、実施例７に記載されている、ＣＤ８  Ｔ細胞の腫瘍内および脾臓パーセンテージ、Ｔｒｅｇ細胞のパーセンテージ、ならびにＣＤ８／Ｔｒｅｇ比のＦＡＣＳ分析を示す。
【００４４】
【図１０】図１０は、実施例７に記載されている腫瘍チャレンジ後の日数に対してプロットした各処置群の平均腫瘍容積（ｍｍ３±ＳＥＭ）を示す。
【００４５】
【図１１】図１１は、実施例７に記載されている抗マウスＧＩＴＲ抗体および抗ヒトＰＤ１抗体の組み合わせで処置したＭＣ３８を有するＰＤ１／ＰＤＬ１ヒト化マウスの生存分析を示す。
【００４６】
【図１２】図１２は、実施例７に記載されているＭＣ３８を有するマウスの腫瘍成長曲線を示す。Ｙ軸は、腫瘍容積（立方ミリメートル単位）を示し、Ｘ軸は、腫瘍チャレンジ後の時間（日数単位）を示す。白抜きの記号（白四角、白丸）は、アイソタイプ抗体（対照）でまず処置したマウスを表す。塗りつぶしの記号（黒四角、黒丸）は、抗ＣＤ２２６抗体でまず処置したマウスを表す。アイソタイプ抗体で次に処置したそれらマウスは、丸（白丸、黒丸）および実線によって表される。抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ−１の組み合わせで次に処置したそれらマウスは、四角（白四角、黒四角）および破線によって表される。
【００４７】
【図１３】図１３は、実施例７に記載されているＭＣ３８を有するマウスの生存曲線を示す。Ｙ軸は、％生存を示し、Ｘ軸は、腫瘍チャレンジ後の時間（日数単位）を示す。白抜き記号（白四角、白丸）は、アイソタイプ抗体（対照）でまず処置したマウスを表す。塗りつぶし記号（黒四角、黒丸）は、抗ＣＤ２２６抗体でまず処置したマウスを表す。アイソタイプ抗体で次に処置したそれらマウスは、丸（白丸、黒丸）および実線によって表される。抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ−１の組み合わせで次に処置されたそれらマウスは、四角（白四角、黒四角）および破線によって表される。
【００４８】
【図１４】図１４は、実施例７に記載されているアイソタイプＩｇＧで処置した、ＭＣ３８を有する野生型マウス（ひし形［白ひし形、黒ひし形］によって表される）またはＴＩＧＩＴノックアウトマウス（三角［白三角、黒三角］によって表される）の腫瘍成長曲線を示す。Ｙ軸は、腫瘍容積（立方ミリメートル単位）を示し、Ｘ軸は、腫瘍チャレンジ後の時間（日数単位）を示す。白抜き記号および破線は、アイソタイプ抗体（対照）でまず処置したマウスを表す。塗りつぶし記号および実線は、抗ＣＤ２２６抗体でまず処置したマウスを表す。
【００４９】
【図１５】図１５は、実施例７に記載されているアイソタイプＩｇＧで処置した、ＭＣ３８を有する野生型マウス（丸［白丸、黒丸］によって表される）またはＴＩＧＩＴノックアウトマウス（逆向き三角［逆向き白三角、逆向き黒三角］によって表される）の腫瘍成長曲線を示す。Ｙ軸は、腫瘍容積（立方ミリメートル単位）を示し、Ｘ軸は、腫瘍チャレンジ後の時間（日数単位）を示す。白抜き記号および破線は、アイソタイプ抗体（対照）でまず処置したマウスを表す。塗りつぶし記号および実線は、抗ＣＤ２２６抗体でまず処置したマウスを表す。
【００５０】
【図１６Ａ】図１６は、合計（パネルＡ）、クローン性拡大（パネルＢ）、または非拡大（パネルＣ）  ＣＤ８＋  Ｔ細胞における併用処置によるＣＤ２２６のアップレギュレートされた発現を示す累積分布関数（ＣＤＦ）プロットを含む。Ｘ軸は、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）におけるＣＤ２２６発現を示し、Ｙ軸は、累積度数を示す。赤線は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１処置を表す；黒線は、アイソタイプ抗体処置を表す；青線は、抗ＧＩＴＲ処置を表す；そして紫の線は、抗ＰＤ１処置を表す。
【図１６Ｂ】図１６は、合計（パネルＡ）、クローン性拡大（パネルＢ）、または非拡大（パネルＣ）  ＣＤ８＋  Ｔ細胞における併用処置によるＣＤ２２６のアップレギュレートされた発現を示す累積分布関数（ＣＤＦ）プロットを含む。Ｘ軸は、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）におけるＣＤ２２６発現を示し、Ｙ軸は、累積度数を示す。赤線は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１処置を表す；黒線は、アイソタイプ抗体処置を表す；青線は、抗ＧＩＴＲ処置を表す；そして紫の線は、抗ＰＤ１処置を表す。
【図１６Ｃ】図１６は、合計（パネルＡ）、クローン性拡大（パネルＢ）、または非拡大（パネルＣ）  ＣＤ８＋  Ｔ細胞における併用処置によるＣＤ２２６のアップレギュレートされた発現を示す累積分布関数（ＣＤＦ）プロットを含む。Ｘ軸は、ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）（Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  Ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ）におけるＣＤ２２６発現を示し、Ｙ軸は、累積度数を示す。赤線は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１処置を表す；黒線は、アイソタイプ抗体処置を表す；青線は、抗ＧＩＴＲ処置を表す；そして紫の線は、抗ＰＤ１処置を表す。
【００５１】
【図１７】図１７は、ＰＤ−１濃度の関数としてホスホ−ＣＤ３ζおよびホスホ−ＣＤ２２６の相対的発現を示すウェスタンブロットである。
【００５２】
【図１８Ａ】図１８、パネルＡ〜Ｄは、野生型マウス（白抜き棒）およびＣＤ２２６ノックアウトマウス（塗りつぶしの棒）において生成されたＴ細胞タイプの数の棒グラフを示す。パネルＡは、胸腺におけるＴ細胞発生（Ｔｃｏｎｖ、通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ；ＳＰ、シングルポジティブ；ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）のＦＡＣＳ分析（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＢは、野生型動物およびＣＤ２２６−／−動物における脾臓および血液中のＴ細胞サブセットの集団のＦＡＣＳ検証（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＣは、ＰＤ１を発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ、平均蛍光強度）を示す棒グラフである。パネルＤは、ＧＩＴＲを発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。パネルＥ〜Ｉは、脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ刺激した際の炎症性サイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ単位）を示す棒グラフである。ＣＤ２２６−／−マウス（塗りつぶしの棒）または野生型（ＷＴ）マウス（白抜き棒）の脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間刺激した。パネルＥ＝ＩＦＮ−γ；パネルＦ＝ＩＬ−２；パネルＧ＝ＴＮＦ−α；パネルＨ＝ＩＬ−６；およびパネルＩ＝ＩＬ−５。
【図１８Ｂ】図１８、パネルＡ〜Ｄは、野生型マウス（白抜き棒）およびＣＤ２２６ノックアウトマウス（塗りつぶしの棒）において生成されたＴ細胞タイプの数の棒グラフを示す。パネルＡは、胸腺におけるＴ細胞発生（Ｔｃｏｎｖ、通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ；ＳＰ、シングルポジティブ；ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）のＦＡＣＳ分析（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＢは、野生型動物およびＣＤ２２６−／−動物における脾臓および血液中のＴ細胞サブセットの集団のＦＡＣＳ検証（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＣは、ＰＤ１を発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ、平均蛍光強度）を示す棒グラフである。パネルＤは、ＧＩＴＲを発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。パネルＥ〜Ｉは、脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ刺激した際の炎症性サイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ単位）を示す棒グラフである。ＣＤ２２６−／−マウス（塗りつぶしの棒）または野生型（ＷＴ）マウス（白抜き棒）の脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間刺激した。パネルＥ＝ＩＦＮ−γ；パネルＦ＝ＩＬ−２；パネルＧ＝ＴＮＦ−α；パネルＨ＝ＩＬ−６；およびパネルＩ＝ＩＬ−５。
【図１８Ｃ】図１８、パネルＡ〜Ｄは、野生型マウス（白抜き棒）およびＣＤ２２６ノックアウトマウス（塗りつぶしの棒）において生成されたＴ細胞タイプの数の棒グラフを示す。パネルＡは、胸腺におけるＴ細胞発生（Ｔｃｏｎｖ、通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ；ＳＰ、シングルポジティブ；ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）のＦＡＣＳ分析（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＢは、野生型動物およびＣＤ２２６−／−動物における脾臓および血液中のＴ細胞サブセットの集団のＦＡＣＳ検証（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＣは、ＰＤ１を発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ、平均蛍光強度）を示す棒グラフである。パネルＤは、ＧＩＴＲを発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。パネルＥ〜Ｉは、脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ刺激した際の炎症性サイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ単位）を示す棒グラフである。ＣＤ２２６−／−マウス（塗りつぶしの棒）または野生型（ＷＴ）マウス（白抜き棒）の脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間刺激した。パネルＥ＝ＩＦＮ−γ；パネルＦ＝ＩＬ−２；パネルＧ＝ＴＮＦ−α；パネルＨ＝ＩＬ−６；およびパネルＩ＝ＩＬ−５。
【図１８Ｄ】図１８、パネルＡ〜Ｄは、野生型マウス（白抜き棒）およびＣＤ２２６ノックアウトマウス（塗りつぶしの棒）において生成されたＴ細胞タイプの数の棒グラフを示す。パネルＡは、胸腺におけるＴ細胞発生（Ｔｃｏｎｖ、通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ；ＳＰ、シングルポジティブ；ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）のＦＡＣＳ分析（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＢは、野生型動物およびＣＤ２２６−／−動物における脾臓および血液中のＴ細胞サブセットの集団のＦＡＣＳ検証（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＣは、ＰＤ１を発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ、平均蛍光強度）を示す棒グラフである。パネルＤは、ＧＩＴＲを発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。パネルＥ〜Ｉは、脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ刺激した際の炎症性サイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ単位）を示す棒グラフである。ＣＤ２２６−／−マウス（塗りつぶしの棒）または野生型（ＷＴ）マウス（白抜き棒）の脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間刺激した。パネルＥ＝ＩＦＮ−γ；パネルＦ＝ＩＬ−２；パネルＧ＝ＴＮＦ−α；パネルＨ＝ＩＬ−６；およびパネルＩ＝ＩＬ−５。
【図１８Ｅ−Ｆ】図１８、パネルＡ〜Ｄは、野生型マウス（白抜き棒）およびＣＤ２２６ノックアウトマウス（塗りつぶしの棒）において生成されたＴ細胞タイプの数の棒グラフを示す。パネルＡは、胸腺におけるＴ細胞発生（Ｔｃｏｎｖ、通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ；ＳＰ、シングルポジティブ；ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）のＦＡＣＳ分析（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＢは、野生型動物およびＣＤ２２６−／−動物における脾臓および血液中のＴ細胞サブセットの集団のＦＡＣＳ検証（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＣは、ＰＤ１を発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ、平均蛍光強度）を示す棒グラフである。パネルＤは、ＧＩＴＲを発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。パネルＥ〜Ｉは、脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ刺激した際の炎症性サイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ単位）を示す棒グラフである。ＣＤ２２６−／−マウス（塗りつぶしの棒）または野生型（ＷＴ）マウス（白抜き棒）の脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間刺激した。パネルＥ＝ＩＦＮ−γ；パネルＦ＝ＩＬ−２；パネルＧ＝ＴＮＦ−α；パネルＨ＝ＩＬ−６；およびパネルＩ＝ＩＬ−５。
【図１８Ｇ−Ｉ】図１８、パネルＡ〜Ｄは、野生型マウス（白抜き棒）およびＣＤ２２６ノックアウトマウス（塗りつぶしの棒）において生成されたＴ細胞タイプの数の棒グラフを示す。パネルＡは、胸腺におけるＴ細胞発生（Ｔｃｏｎｖ、通常型Ｔ細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）；ＤＰ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ；ＳＰ、シングルポジティブ；ＤＮ、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ）のＦＡＣＳ分析（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＢは、野生型動物およびＣＤ２２６−／−動物における脾臓および血液中のＴ細胞サブセットの集団のＦＡＣＳ検証（細胞数）を示す棒グラフである。パネルＣは、ＰＤ１を発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ、平均蛍光強度）を示す棒グラフである。パネルＤは、ＧＩＴＲを発現する、脾臓および血液中のＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析（ＭＦＩ）を示す棒グラフである。パネルＥ〜Ｉは、脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間、ｅｘ  ｖｉｖｏでＴＣＲ刺激した際の炎症性サイトカイン分泌（ｐｇ／ｍｌ単位）を示す棒グラフである。ＣＤ２２６−／−マウス（塗りつぶしの棒）または野生型（ＷＴ）マウス（白抜き棒）の脾細胞を、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８  Ａｂで１６時間刺激した。パネルＥ＝ＩＦＮ−γ；パネルＦ＝ＩＬ−２；パネルＧ＝ＴＮＦ−α；パネルＨ＝ＩＬ−６；およびパネルＩ＝ＩＬ−５。
【００５３】
【図１９Ａ−Ｂ】図１９は、腫瘍チャレンジ後の時間（日数単位）の関数として％動物生存を示す線グラフである。パネルＡは、ＭＣ３８腫瘍細胞でチャレンジしかつ抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１  Ａｂ（塗りつぶしの丸および四角）またはアイソタイプＡｂ（白抜きの丸および四角）のいずれかで処置した、ＣＤ２２６  ＫＯマウス（淡紅色の線）またはＷＴ同腹仔（黒線）を示す。パネルＢ〜Ｄは、（Ｂ）ＣＤ２８シグナリングを遮断する抗体で処置した動物（１０ｍｇ／ｋｇ  ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ；パネルＢ、緑の線）；（Ｃ）ＯＸ４０シグナリングを遮断する抗体で処置した動物（１０ｍｇ／ｋｇ  ＯＸ４０Ｌ遮断抗体；パネルＣ）；および（Ｄ）４−１ＢＢシグナリングを遮断する抗体で処置した動物（１０ｍｇ／ｋｇ  ４−１ＢＢＬ遮断抗体；パネルＤ）に対して抗体処置の効果を示す。
【図１９Ｃ−Ｄ】図１９は、腫瘍チャレンジ後の時間（日数単位）の関数として％動物生存を示す線グラフである。パネルＡは、ＭＣ３８腫瘍細胞でチャレンジしかつ抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１  Ａｂ（塗りつぶしの丸および四角）またはアイソタイプＡｂ（白抜きの丸および四角）のいずれかで処置した、ＣＤ２２６  ＫＯマウス（淡紅色の線）またはＷＴ同腹仔（黒線）を示す。パネルＢ〜Ｄは、（Ｂ）ＣＤ２８シグナリングを遮断する抗体で処置した動物（１０ｍｇ／ｋｇ  ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ；パネルＢ、緑の線）；（Ｃ）ＯＸ４０シグナリングを遮断する抗体で処置した動物（１０ｍｇ／ｋｇ  ＯＸ４０Ｌ遮断抗体；パネルＣ）；および（Ｄ）４−１ＢＢシグナリングを遮断する抗体で処置した動物（１０ｍｇ／ｋｇ  ４−１ＢＢＬ遮断抗体；パネルＤ）に対して抗体処置の効果を示す。
【００５４】
【図２０】図２０は、アイソタイプ（白抜きの丸および黒線）、抗ＰＤ１（白抜き四角、赤線）、抗ＧＩＴＲ（白抜き角錐および緑の線）、および抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１併用療法（白抜きの逆向き角錐および青線）で処置したマウスに関する腫瘍チャレンジ後の日数の関数として腫瘍サイズ（立方ミリメートル単位）を示す線グラフである。パネルＡは、ＣＤ１５５を発現しないＭＣ３８腫瘍を表す。パネルＢは、ＣＤ１５５を発現するＭＣ３８腫瘍を表す。
【００５５】
【図２１Ａ】図２１は、ＣＤ１５５を過剰発現するＭＣ３８腫瘍細胞（塗りつぶしの棒）およびＣＤ１５５を発現しないＭＣ３８腫瘍細胞（白抜きの棒）でチャレンジした動物からのＣＤ２２６（パネルＡ）、４−１ＢＢ（パネルＢ）、およびＩＦＮ−γ（パネルＣ）を発現する細胞数を示す棒グラフである。
【図２１Ｂ】図２１は、ＣＤ１５５を過剰発現するＭＣ３８腫瘍細胞（塗りつぶしの棒）およびＣＤ１５５を発現しないＭＣ３８腫瘍細胞（白抜きの棒）でチャレンジした動物からのＣＤ２２６（パネルＡ）、４−１ＢＢ（パネルＢ）、およびＩＦＮ−γ（パネルＣ）を発現する細胞数を示す棒グラフである。
【図２１Ｃ】図２１は、ＣＤ１５５を過剰発現するＭＣ３８腫瘍細胞（塗りつぶしの棒）およびＣＤ１５５を発現しないＭＣ３８腫瘍細胞（白抜きの棒）でチャレンジした動物からのＣＤ２２６（パネルＡ）、４−１ＢＢ（パネルＢ）、およびＩＦＮ−γ（パネルＣ）を発現する細胞数を示す棒グラフである。
【００５６】
【図２２】図２２は、抗ＰＤ−１  Ａｂ処置の関数としてＣＤ２２６  ＲＮＡ発現（ｌｏｇ２［ＲＰＫＭ］単位）を示すがん患者腫瘍生検のドットプロットＲＮＡ−ｓｅｑ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
本発明について記載する前に、記載されている特定の方法および実験条件は変動し得るため、本発明が、係る方法および条件に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において使用されている用語法が、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を企図しないことも理解されたい。
【００５８】
他に断りがなければ、本明細書において使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において、用語「約」は、特定の列挙されている数値に関連して使用されている場合、値が、列挙されている値から１％以下で変動し得ることを意味する。例えば、本明細書において、表現「約１００」は、９９および１０１ならびにその間のあらゆる値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【００５９】
本発明の実施または検査において、本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等のいかなる方法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料を次に説明する。本明細書に言及されているあらゆる特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６０】
定義
表現、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体、「ＧＩＴＲ」などは、本明細書において、配列番号４１３に表記されているアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション＃ＮＰ＿００４１８６．１）を含むヒトグルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体を指す。表現「ＧＩＴＲ」は、単量体および多量体両方のＧＩＴＲ分子を含む。本明細書において、表現「単量体ヒトＧＩＴＲ」とは、任意の多量体化ドメインを含みも有しもせず、単一のＧＩＴＲ分子として、別のＧＩＴＲ分子への直接的な物理的接続なしで通常の条件下で存在するＧＩＴＲタンパク質またはその部分を意味する。例示的な単量体ＧＩＴＲ分子は、配列番号４０９のアミノ酸配列（例えば、本明細書中の実施例３を参照されたい）を含む「ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ」と本明細書で指される分子である。本明細書において、表現「二量体ヒトＧＩＴＲ」とは、リンカー、共有結合、非共有結合を通じて、または多量体化ドメイン（例えば、抗体Ｆｃドメイン）を通じて互いに接続される２個のＧＩＴＲ分子を含む構築物を意味する。例示的な二量体ＧＩＴＲ分子は、それぞれ、配列番号４１０および配列番号４１１のアミノ酸配列（例えば、本明細書中の実施例３を参照されたい）を含む「ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ」および「ｈＧＩＴＲ．ｈＦｃ」と本明細書で指されるそれら分子を含む。
【００６１】
本明細書におけるタンパク質、ポリペプチドおよびタンパク質断片のあらゆる参照は、非ヒト種に由来すると明確に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質断片のヒトバージョンを指すよう企図されている。よって、表現「ＧＩＴＲ」は、例えば「マウスＧＩＴＲ」、「サルＧＩＴＲ」等のように非ヒト種に由来すると指定されない限り、ヒトＧＩＴＲを意味する。
【００６２】
本明細書において、表現「細胞表面に発現されたＧＩＴＲ」は、ＧＩＴＲタンパク質の少なくとも一部分が、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合部分に到達できるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の表面に発現される、１種もしくは複数のＧＩＴＲタンパク質（単数または複数）またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面に発現されたＧＩＴＲ」は、ＧＩＴＲタンパク質を正常に発現する細胞の表面に発現されたＧＩＴＲタンパク質を含む、またはこれからなることができる。あるいは、「細胞表面に発現されたＧＩＴＲ」は、その表面にヒトＧＩＴＲを正常には発現しないが、その表面にＧＩＴＲを発現するように人為的に操作された、細胞の表面に発現されたＧＩＴＲタンパク質を含む、またはこれからなることができる。
【００６３】
本明細書において、表現「抗ＧＩＴＲ抗体」は、単一特異性を有する一価抗体および単一特異性二価抗体、ならびにＧＩＴＲに結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異的抗体の両方を含み、前記抗ＧＩＴＲアームは、本明細書における表１に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む。表現「抗ＧＩＴＲ抗体」は、薬物または毒素（すなわち、細胞傷害性薬剤）にコンジュゲートされた抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も含む。表現「抗ＧＩＴＲ抗体」は、放射性核種にコンジュゲートされた抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）も含む。
【００６４】
用語「抗体」は、本明細書において、特定の抗原（例えば、ＧＩＴＲ）に特異的に結合するまたはこれと相互作用する、少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むいずれかの抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖である４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと省略）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと省略）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１個のドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名されたより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名された超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置された、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成されている。本発明の異なる実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であっても、あるいは天然にまたは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２種またはそれを超えるＣＤＲの対比（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）解析に基づき定義することができる。
【００６５】
用語「抗体」は、本明細書において、完全抗体分子の抗原結合性断片も含む。用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合性断片」その他は、本明細書において、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの天然に存在する、酵素により得ることができる、合成のまたは遺伝子改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、タンパク質分解による消化または抗体可変ドメインおよび任意選択で抗体定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子操作技法等、いずれかの適した標準技法を使用して、完全抗体分子から得られ得る。このようなＤＮＡは、公知であるおよび／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手することができる、または合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学的技法を使用することにより操作して、例えば、適した構成へと１種または複数の可変および／または定常ドメインを配置する、あるいはコドンを導入する、システイン残基を作出する、アミノ酸を修飾、付加または欠失させること等ができる。
【００６６】
抗原結合性断片の非限定例として、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチド等、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または制約されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン等、他の操作された分子も、本明細書における表現「抗原結合性断片」の内に包含される。
【００６７】
抗体の抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも１個の可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、いかなるサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、１個または複数のフレームワーク配列に隣接するまたはこれとインフレームの少なくとも１個のＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合するＶＨドメインを有する抗原結合性断片において、ＶＨおよびＶＬドメインは、いずれか適した配置において互いに対して位置することができる。例えば、可変領域は、二量体となり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有することができる。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有することができる。
【００６８】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１個の定常ドメインに共有結合により連結された少なくとも１個の可変ドメインを含有することができる。本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出すことができる可変および定常ドメインの非限定的な例示的構成として、以下が挙げられる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。上に列挙する例示的構成のいずれかを含む、可変および定常ドメインのいずれかの構成において、可変および定常ドメインは、互いに直接的に連結されていても、完全または部分的ヒンジまたはリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなることができ、これにより、単一ポリペプチド分子における隣接する可変および／または定常ドメインの間に可撓性または半可撓性連結がもたらされる。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いにおよび／または１個または複数の単量体ＶＨまたはＶＬドメインと非共有結合的に会合した（例えば、ジスルフィド結合（単数または複数）により）、上に列挙する可変および定常ドメイン構成のうちいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
【００６９】
完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異的または多特異的（例えば、二重特異的）となり得る。抗体の多特異的抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも２個の異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができるであろう。本明細書に開示されている例示的な二重特異的抗体フォーマットを含むいずれかの多特異的抗体フォーマットは、本技術分野で利用できる慣用的な技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合性断片の文脈における使用に適合させることができる。
【００７０】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能することができる。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における、本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞における結合された抗体を認識し、これにより標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、本技術分野で周知かつ利用できるアッセイを使用して測定することができる（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号ならびにＣｌｙｎｅｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９５巻：６５２〜６５６頁を参照）。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。よって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害を媒介するのに望ましいか否かに基づいて選択することができる。
【００７１】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むように企図されている。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異によって導入された変異）。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において、マウス等、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むようには企図されていない。用語「ヒト抗体」は、修飾もヒトの介入／操作もなしに、天然に存在する修飾されていない生きている生物において通常存在する天然に存在する分子を含まない。
【００７２】
本発明の抗体は、一部の実施形態では、組換えヒト抗体となり得る。用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（さらに後述する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（さらに後述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０巻：６２８７〜６２９５頁を参照）、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する他のいずれかの手段によって調製、発現、作出もしくは単離された抗体等、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されたあらゆるヒト抗体を含むよう企図されている。係る組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、係る組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックである動物が使用される場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に付され、これにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これに関係するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しなくてよい配列となる。
【００７３】
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する２種の形態で存在することができる。一形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって結び付けられた、およそ１５０〜１６０ｋＤａの安定的４鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は、鎖間ジスルフィド結合により連結されず、約７５〜８０ｋＤａの分子が、共有結合によりカップリングされた軽および重鎖で構成されて形成される（半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））。これらの形態は、親和性精製後であっても、分離が極めて困難であった。
【００７４】
様々なインタクトＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造の差によるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで、第２の形態の出現を有意に低下させることができる（Ａｎｇａｌら（１９９３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０巻：１０５頁）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１個または複数の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば、所望の抗体形態の収量を向上するための産生において望ましくなり得る。
【００７５】
本発明の抗体は、単離された抗体となり得る。「単離された抗体」は、本明細書において、その天然の環境の少なくとも１種の構成成分から同定および分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１個の構成成分からまたは抗体が天然に存在するもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から分離または取り出された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕにおける抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１種の精製または単離ステップに付された抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００７６】
本明細書に開示される抗ＧＩＴＲ抗体は、この抗体が得られた相当する生殖系列配列と比較して、重および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１個または複数のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含むことができる。係る変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手できる生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されているアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合性断片を含み、１個または複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の相当する残基（単数または複数）へと、または別のヒト生殖系列配列の相当する残基（単数または複数）へと、または相当する生殖系列残基（単数または複数）の保存的アミノ酸置換へと変異されている（係る配列変化は、本明細書において、「生殖系列変異」とまとめて称される）。当業者であれば、本明細書に開示されている重および軽鎖可変領域配列から始めて、１個または複数の個々の生殖系列変異またはその組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合性断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する本来の生殖系列配列に見出される残基へと逆変異されている。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸の内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸の内に見出される変異された残基のみまたはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の内に見出される変異された残基のみが、本来の生殖系列配列へと逆変異されている。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（単数または複数）のうち１個または複数が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の相当する残基（単数または複数）へと変異されている。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２個以上の生殖系列変異のいかなる組み合わせを含有することもできる、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の相当する残基へと変異されるが、本来の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持される、あるいは異なる生殖系列配列の相当する残基へと変異される。１個または複数の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合性断片を得たら、結合特異性の向上、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニスト性の生物学的特性の向上または増強（場合による）、免疫原性の低下等、１種または複数の所望の特性に関して容易に検査することができる。このような一般的な様式で得られる抗体および抗原結合性断片は、本発明の範囲内に包含される。
【００７７】
本発明はまた、１個または複数の保存的置換を有する、本明細書に開示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの改変体を含む抗ＧＩＴＲ抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。
【００７８】
用語「エピトープ」は、本明細書において、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２個以上のエピトープを有し得る。よって、異なる抗体は、抗原における異なる区域に結合することができ、異なる生物学的効果を有することができる。エピトープは、コンフォメーション性または直鎖状のいずれであってもよい。コンフォメーション性エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるエピトープである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原における糖類、ホスホリル基またはスルホニル基の部分を含むことができる。
【００７９】
用語「実質的同一性」または「実質的に同一」は、核酸またはその断片について言及する場合、後述するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ等、配列同一性のいずれか周知のアルゴリズムによって測定され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補ストランド）と最適に整列されたときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対し実質的同一性を有する核酸分子は、ある特定の事例において、参照核酸分子にコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００８０】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似の」は、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等により最適に整列されたときに、少なくとも９５％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基ポジションは、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２種以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知のものである。例えば、参考として本明細書に援用されるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２４巻：３０７〜３３１頁を参照のこと。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖がシステインおよびメチオニンであることが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置き換えは、参考として本明細書に援用されるＧｏｎｎｅｔら、（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１４４３〜１４４５頁に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有するいずれかの変化である。
【００８１】
配列同一性とも称されるポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、デフォルトパラメータにより使用して、異なる生物種由来の相同ポリペプチド等、密接に関係したポリペプチドの間、あるいは野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定することのできるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔ等のプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨されるパラメータを用いてＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、アライメントならびに問い合わせおよび検索配列間の最良の重複の領域のパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年）上記参照）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用したコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ参考として本明細書に援用されるＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３  ４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９  ４０２頁を参照のこと。
【００８２】
Ｆｃ改変体を含む抗ＧＩＴＲ抗体
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減弱化する１個または複数の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＧＩＴＲ抗体を含み、前記変異（単数または複数）は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０に及ぶエンドソーム）におけるＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。係る変異は、動物に投与される際に、抗体の血清半減期の増加をもたらすことができる。係るＦｃ修飾の非限定例として、例えば、２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）および２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）位における修飾；または４２８および／もしくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）位における修飾；または２５０および／もしくは４２８位における修飾；または３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位における修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。
【００８３】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群より選択される変異の１種または複数のペアまたは群を含むＦｃドメインを含む抗ＧＩＴＲ抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異および本明細書に開示されている抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能な組み合わせは、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００８４】
抗ＧＩＴＲ抗体の生物学的特徴
本発明は、高親和性で単量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。例えば、本発明は、表面プラズモン共鳴によって３７℃で、例えば、本明細書中の実施例３で定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約５．０ｎＭに満たないＫＤで単量体ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ）に結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。一部の実施形態では、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約４ｎＭに満たない、約３ｎＭに満たない、約２ｎＭに満たない、または約１．５０ｎＭに満たないＫＤで３７℃において単量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
【００８５】
本発明はまた、３７℃において表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約１２分より長い解離半減期（ｔ１／２）で、単量体ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍｍｈ）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態によれば、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約１２分より長い、約１３分より長い、約１４分より長い、約１５分より長い、またはこれより長いｔ１／２で、３７℃において単量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
【００８６】
本発明はまた、高親和性で二量体ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。例えば、本発明は、３７℃において表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約９５０ｐＭに満たないＫＤで二量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。ある特定の実施形態によれば、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約９００ｐＭに満たない、約８５０ｐＭに満たない、約８００ｐＭに満たない、約７００ｐＭに満たない、約６００ｐＭに満たない、約５００ｐＭに満たない、約４００ｐＭに満たない、約３００ｐＭに満たない、約２００ｐＭに満たない、または約１００ｐＭに満たないＫＤで、３７℃において二量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
【００８７】
本発明はまた、３７℃において表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約７分より長い解離半減期（ｔ１／２）で二量体ヒトＧＩＴＲ（例えば、ｈＧＩＴＲ．ｍＦｃ）に結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態によれば、表面プラズモン共鳴によって、例えば、本明細書中の実施例３に定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約１０分より長い、約２０分より長い、約３０分より長い、約４０分より長い、約５０分より長い、約６０分より長い、約７０分より長い、約８０分より長い、約９０分より長い、約１００分より長い、またはこれより長いｔ１／２で、３７℃において二量体ヒトＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
【００８８】
本開示はまた、細胞表面に発現したＧＩＴＲに結合する抗体およびその抗原結合性断片を含む。例えば、ヒトＧＩＴＲをトランスフェクトした胚性腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）  Ｄ９細胞に高親和性で結合する抗体が、本明細書で提供される。例えば、本開示は、エレクトロケミルミネッセンスによって、例えば、本明細書中の実施例４に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約２６０ｐＭに満たないＥＣ５０でヒトＧＩＴＲをトランスフェクトした胚性腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）Ｄ９細胞に結合する抗ＧＩＴＲ抗体を含む。ある特定の実施形態では、エレクトロケミルミネッセンスによって、例えば、本明細書中の実施例４に定義されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイを使用して測定される、約２５０ｐＭに満たない、約２４０ｐＭに満たない、約２３０ｐＭに満たない、または約２２０ｐＭに満たないＥＣ５０で、ヒトＧＩＴＲをトランスフェクトした胚性腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）Ｄ９細胞に結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。
【００８９】
本発明の抗体は、上述の生物学的特性の１つもしくは複数、またはこれらの任意の組み合わせを有し得る。本発明の抗体の生物学的特性の上記リストは、徹底的であるように意図されていない。本発明の抗体の他の生物学的特性は、本明細書の実施例を含む本開示を再検討することにより当業者に明らかとなる。
【００９０】
Ｆｃアンカリング依存性およびアンカリング非依存性のＧＩＴＲ活性化ならびにＧＩＴＲＬ遮断
本開示は、例えば、本明細書中の実施例５および／もしくは実施例６に記載されるアッセイフォーマットにおいて、または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて決定される、ヒトＧＩＴＲを活性化する抗体およびその抗原結合性断片を含む。本明細書において、「ヒトＧＩＴＲを活性化する」とは、そのコグネートリガンド、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）への結合を介するＧＩＴＲの活性化、またはＧＩＴＲへのアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗原結合タンパク質（単数または複数）の結合を指す。アゴニスト抗ＧＩＴＲ結合タンパク質によるＧＩＴＲの活性化に関して、「活性化」は、Ｆｃγ受容体にアンカーしている抗原結合タンパク質の存在下または非存在下にあり得る。ヒトＧＩＴＲ活性化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＩＴＲシグナリングの誘導または増強、エフェクターＴ細胞活性の調節性Ｔ細胞抑制の低下；ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの、循環するＴ  ｒｅｇレベルの低下、腫瘍内Ｔ  ｒｅｇｓのｉｎ  ｖｉｖｏでの低下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのエフェクターＴ細胞の活性化、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのエフェクターＴ細胞増殖の誘導または増強、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害または低減が挙げられるが、これらに限定されない、ある特定の生物学的活性を示すことにおいて現れる。
【００９１】
Ｆｃアンカリングの非存在下でのＧＩＴＲ活性化
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体およびその抗原結合性断片は、例えば、本明細書中の実施例５および／もしくは実施例６に記載されるアッセイフォーマットにおいて、または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する。本明細書において、「Ｆｃアンカリングの非存在下で」とは、ＧＩＴＲおよびＧＩＴＲ媒介性シグナリングの活性化またはＦｃγ受容体の異なるフォーマットによる抗ＧＩＴＲ抗体のクラスター化なしでのＧＩＴＲＬの遮断を指し、例えば、細胞表面に結合したＦｃγ受容体（単数または複数）の非存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養した初代Ｔ細胞の活性化を介して、決定および定量され得る。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約３ｎＭに満たないＥＣ５０において、約２５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約３ｎＭに満たないＥＣ５０において、約３０％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約６０％より高い、または約６５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約２ｎＭに満たないＥＣ５０において、約３０％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約６０％より高い、または約６５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約１．５ｎＭに満たないＥＣ５０において、約３０％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約６０％より高い、または約６５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約１．４ｎＭに満たないＥＣ５０において、約３０％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約６０％より高い、または約６５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約１．３ｎＭに満たないＥＣ５０において、約３０％より高い、約４０％より高い、約５０％より高い、約６０％より高い、または約６５％より高い活性化パーセンテージでヒトＧＩＴＲを活性化する。
【００９２】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下でＧＩＴＲに結合し、Ｔ細胞増殖活性を示す。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約８ｎＭまたはこれに満たないＥＣ５０でＦｃアンカリングの非存在下でＧＩＴＲに結合し、Ｔ細胞増殖活性を示す。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約２２ｎＭ  抗体（または抗原結合性断片）濃度においてバックグラウンドを少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１１倍上回って、Ｆｃアンカリングの非存在下でＧＩＴＲに結合し、Ｔ細胞増殖活性を示す。
【００９３】
Ｆｃアンカリングの存在下でのＧＩＴＲ活性化
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、本明細書中の実施例５および／もしくは実施例６に記載されるアッセイフォーマットにおいて、または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する。本明細書において、「Ｆｃアンカリングの存在下で」とは、ＧＩＴＲおよびＧＩＴＲ媒介性シグナリングの活性化、または抗体のＦｃ領域とＦｃγ受容体（ＦｃｇＲ）の種々の形態（例えば、ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａまたはＦｃｇＲＩＩＩａ）との相互作用を介する抗ＧＩＴＲ抗体のクラスター化を通じてのＧＩＴＲＬの遮断を指し、例えば、細胞表面に結合したＦｃγ受容体（単数または複数）の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養したＴ細胞の活性化を介して、決定および定量化され得る。
【００９４】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約３３ｎＭ  抗体（または抗体結合断片）濃度においてバックグラウンドを少なくとも約２倍上回って、Ｆｃアンカリングの存在下でＴ細胞増殖活性を示す。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約３３ｎＭ抗体（または抗原結合性断片）濃度においてバックグラウンドを少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍上回って、Ｆｃアンカリングの存在下でＴ細胞増殖活性を示す。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約３４ｎＭに満たないＥＣ５０で、Ｆｃアンカリングの存在下でＴ細胞増殖活性を示す。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイによって決定されるように、例えば、実施例６または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約３０ｎＭに満たない、約２０ｎＭに満たない、約１０ｎＭに満たない、約５ｎＭに満たない、または約４ｎＭに満たないＥＣ５０で、Ｆｃアンカリングの存在下でＴ細胞増殖活性を示す。
【００９５】
ＧＩＴＲリガンド媒介性受容体刺激を遮断する抗体
本開示は、例えば、本明細書中の実施例５に記載されるアッセイフォーマットにおいて決定されるように、ヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する抗体を含む。本明細書において、「ヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する」とは、抗ＧＩＴＲ抗原結合タンパク質がそのコグネートリガンド、ＧＩＴＲＬへのＧＩＴＲの結合を遮断する能力を指す。ＧＩＴＲリガンドの遮断は、調節性Ｔ細胞によるエフェクターＴ細胞活性化の抑制を回復し得る。ＧＩＴＲリガンドの遮断は、当該分野で公知の種々の方法を介して決定および定量され得る（例えば、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌の低減および循環する調節性Ｔ細胞のレベルの増大が挙げられる）。
【００９６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、例えば、本明細書中の実施例５に記載されるアッセイフォーマットにおいて決定されるように、ＧＩＴＲアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する。一部の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約４．０ｎＭに満たないＩＣ５０において約５５％より高い遮断パーセンテージでＦｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲリガンド媒介性受容体刺激を遮断する。一部の実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定されるように、例えば、実施例５または実質的に類似のアッセイフォーマットにおいて記載されるように、約４．０ｎＭに満たない、約３．０ｎＭに満たない、約２．０ｎＭに満たない、約１．０ｎＭに満たない、約０．９ｎＭに満たない、約０．８ｎＭに満たない、または約０．７ｎＭに満たないＩＣ５０において、約６０％より高い、約７０％より高い、約８０％より高い、または約８５％より高い遮断パーセンテージで、Ｆｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲリガンド媒介性受容体刺激を遮断する。
【００９７】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトＧＩＴＲを活性化し、ＮＦκＢレポーターアッセイによって、例えば、実施例５に記載されるアッセイまたは実質的に類似のアッセイにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約２５％に満たない遮断パーセンテージでヒトＧＩＴＲリガンド媒介性受容体刺激を遮断する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトＧＩＴＲを活性化し、ＮＦκＢレポーターアッセイによって、例えば、実施例５に記載されるアッセイまたは実質的に類似のアッセイにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約５４％に満たない遮断パーセンテージでヒトＧＩＴＲリガンド媒介性受容体刺激を遮断する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトＧＩＴＲを活性化し、ＮＦκＢレポーターアッセイによって、例えば、実施例５に記載されるアッセイまたは実質的に類似のアッセイにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で、約４０％に満たない、約３０％に満たない、約２０％に満たない、約１０％に満たない、約５％に満たない、または約１％に満たない遮断パーセンテージでヒトＧＩＴＲリガンド媒介性受容体刺激を遮断する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、少なくとも約５０％の活性化パーセンテージにおいてヒトＧＩＴＲを活性化し、ＮＦκＢレポーターアッセイによって、例えば、実施例５に記載されるアッセイまたは実質的に類似のアッセイにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で約５０％より高い遮断パーセンテージにおいて、ｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断しない。
【００９８】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ヒトＧＩＴＲを活性化しかつヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する。
【００９９】
一部の実施形態では、抗体は、例えば、本明細書中の実施例５に記載されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似のアッセイにおいて決定されるように、Ｆｃアンカリングの非存在下で、ヒトＧＩＴＲを活性化しかつヒトＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する。一部の実施形態では、
（Ａ）抗体または抗原結合性断片は、以下からなる群：
ｉ．ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約３ｎＭに満たないＥＣ５０において、約２５％より高い活性化パーセンテージで、Ｆｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する、および
ｉｉ．ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約１．０ｎＭに満たないＥＣ５０で、Ｆｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する、
より選択される特性のうちの少なくとも一方を有する；ならびに
（Ｂ）抗体または抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約４．０ｎＭに満たないＩＣ５０において、約５４％より高い遮断パーセンテージにおいてＦｃアンカリングの非存在下でｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断する。
【０１００】
一部の実施形態では、
（Ａ）抗体または抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約１．５ｎＭに満たないＥＣ５０において、約５０％より高い活性化パーセンテージにおいてＦｃアンカリングの非存在下でヒトＧＩＴＲを活性化する；および
（Ｂ）抗体または抗原結合性断片は、ＮＦκＢレポーターアッセイによって決定される、約４．０ｎＭに満たないＩＣ５０において、約５４％より高い遮断パーセンテージにおいてＦｃアンカリングの非存在下でｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断する。
【０１０１】
エピトープマッピングおよび関連技法
本発明の抗体が結合するエピトープは、ＧＩＴＲタンパク質の３個またはそれを超える（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれを超える）アミノ酸の単一の近接配列からなることができる。あるいは、エピトープは、ＧＩＴＲの複数の非近接アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなることができる。一部の実施形態では、エピトープは、ＧＩＴＲのＧＩＴＲＬ結合ドメインにまたはその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＧＩＴＲのＧＩＴＲＬ結合ドメインの外側に、例えば、係るエピトープに結合される場合、抗体が、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬ結合に干渉しないＧＩＴＲの表面における位置に位置する。
【０１０２】
当業者に公知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「１個または複数のアミノ酸と相互作用」するか決定することができる。例示的な技法は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ＮＹ）に記載されているもの等の慣用的なクロスブロッキングアッセイ、アラニン走査変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８巻：４４３〜４６３頁）およびペプチド切断解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾等の方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９巻：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することのできる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般用語において、水素／重水素交換方法は、目的のタンパク質を重水素標識するステップと、続いて抗体を重水素標識タンパク質
に結合させるステップを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護された残基（重水素標識されたままになる）を除く全残基において水素−重水素交換を行わせる。抗体の解離後に、標的タンパク質を、プロテアーゼ切断および質量分析による解析に付し、これにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７巻（２号）：２５２〜２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．７３巻：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照されたい。
【０１０３】
本発明は、本明細書に記載されている特異的な例示的な抗体（例えば、本明細書における表１に表記されているアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＧＩＴＲ抗体をさらに含む。同様に、本発明は、ＧＩＴＲへの結合に関して、本明細書に記載されている特異的な例示的な抗体（例えば、本明細書における表１に表記されているアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと競合する抗ＧＩＴＲ抗体も含む。
【０１０４】
本技術分野で公知かつ本明細書で例証されている慣用的な方法を使用することにより、抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープに結合するか、またはこれと結合に関して競合するか容易に決定することができる。例えば、被験抗体が、本発明の参照抗ＧＩＴＲ抗体と同じエピトープに結合するか決定するために、参照抗体を、ＧＩＴＲタンパク質に結合させる。次に、ＧＩＴＲ分子に結合する被験抗体の能力を評価する。被験抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体との飽和結合後にＧＩＴＲに結合することができる場合、被験抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方では、被験抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体との飽和結合後にＧＩＴＲ分子に結合できない場合、被験抗体は、本発明の参照抗ＧＩＴＲ抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得る。続いて、追加の慣用的な実験法（例えば、ペプチド変異および結合解析）を実行して、観察された被験抗体の結合の欠如が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、あるいは立体的遮断（または別の現象）が、観察される結合の欠如の原因であるかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは本技術分野で利用できる他のいずれかの定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。本発明のある特定の実施形態に従って、例えば、１、５、１０、２０または１００倍過剰な一方の抗体が、競合的結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０年：５０巻：１４９５〜１５０２頁を参照）において測定される通り、他方の結合を少なくとも５０％、ただし好ましくは７５％、９０％さらには９９％阻害する場合、２種の抗体は、同じ（または重複する）エピトープに結合する。あるいは、一方の抗体の結合を低下または排除する抗原における基本的にあらゆるアミノ酸変異が、他方の結合を低下または排除する場合、２種の抗体は、同じエピトープに結合すると考慮される。一方の抗体の結合を低下または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の結合を低下または排除する場合、２種の抗体は、「重複するエピトープ」を有すると考慮される。
【０１０５】
抗体が、参照抗ＧＩＴＲ抗体と結合に関して競合（または結合に関して交差競合）するか否か決定するために、２種の配向性において上に記載されている結合手法を行う：第１の配向性において、参照抗体を、飽和条件下でＧＩＴＲタンパク質に結合させ、続いてＧＩＴＲ分子への被験抗体の結合を評価する。第２の配向性において、被験抗体を、飽和条件下でＧＩＴＲ分子に結合させ、続いてＧＩＴＲ分子への参照抗体の結合を評価する。両方の配向性において、第１の（飽和）抗体のみが、ＧＩＴＲ分子に結合することができる場合、被験抗体および参照抗体が、ＧＩＴＲへの結合に関して競合すると結論付けられる。当業者によって認められる通り、参照抗体と結合に関して競合する抗体は、参照抗体と同じエピトープに必ずしも結合しないが、重複するまたは隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【０１０６】
ヒト抗体の調製
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、完全ヒト抗体となり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は、本技術分野で公知である。いずれかの係る公知の方法を本発明の文脈において使用して、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【０１０７】
例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための他のいずれかの同様の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＧＩＴＲに対する高親和性キメラ抗体が、最初に単離される。後述する実験セクションにおける通り、抗体は、親和性、リガンド遮断活性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特徴に関して特徴付けされ、選択される。必要に応じて、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域、例えば、野生型または修飾型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４と置き換えて、完全ヒト抗ＧＩＴＲ抗体を生成する。選択される定常領域は、特定の用途に応じて変動し得るが、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に属する。ある特定の事例において、完全ヒト抗ＧＩＴＲ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。
【０１０８】
生物学的同等物
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体および抗体断片は、記載されている抗体のアミノ酸配列から変動するがヒトＧＩＴＲに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。係る改変体抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の１個または複数の付加、欠失または置換を含むが、記載されている抗体の生物学的活性と基本的に同等な生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示されている配列と比較してヌクレオチドの１個または複数の付加、欠失または置換を含むが、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片と基本的に生物学的に同等である抗ＧＩＴＲ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。係る改変体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上記で検討されている。
【０１０９】
２種の抗原結合タンパク質または抗体が、例えば、同じモル濃度の用量にて類似の実験条件下、単一用量または複数用量のいずれかで投与された際に、その吸収の速度および程度が有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、両者は生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体が、その吸収の程度において同等であるが、その吸収速度においては同等ではない場合において、これら抗体は、同等物または薬学的代替物であるとみなされ、そして係る吸収速度における差が意図的であり、標識において反映され、例えば慢性使用における有効な体内薬物濃度の到達に必須ではなく、試験される特定の薬物製品にとって医学的に無意味であるとみなされるため、これらが生物学的に同等であると依然としてみなされ得る。
【０１１０】
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および効力において臨床的に有意義な差がない場合、生物学的に同等である。
【０１１１】
一実施形態では、参照産物および生物学的産物の間で切り替えない継続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減弱化を含む有害効果のリスクにおいて増大が予想されずに、患者に対して、参照産物および生物学的産物の間でこのような切り替えを１回または複数回行うことができる場合、２種の抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
【０１１２】
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質が両者共に、使用条件（単数または複数）に対し共通の作用機序（単数または複数）によって、係る機序が公知の程度まで作用する場合、２種の抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
【０１１３】
生物学的同等性は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって示すことができる。生物学的同等性の測定は、例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清または他の生体液における抗体またはその代謝物の濃度を測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ検査；（ｂ）ヒトｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティデータと相関され、これを合理的に予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査；（ｃ）時間の関数として抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果を測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ検査；および（ｄ）抗体の安全性、有効性またはバイオアベイラビリティまたは生物学的同等性を確立する十分に制御された臨床治験における検査を含む。
【０１１４】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の生物学的に同等な改変体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことによりまたは生物学的活性に必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることにより、構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失または他のアミノ酸と置き換えて、復元における不要なまたは不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の文脈において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む抗ＧＩＴＲ抗体改変体を含むことができる。
【０１１５】
種選択性および種交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトＧＩＴＲに結合するが、他の種由来のＧＩＴＲには結合しない抗ＧＩＴＲ抗体を提供する。本発明は、ヒトＧＩＴＲおよび１種または複数の非ヒト種に由来するＧＩＴＲに結合する抗ＧＩＴＲ抗体も含む。例えば、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲに結合することができ、場合により、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＧＩＴＲのうち１種または複数に結合しても結合しなくてもよい。本発明のある特定の例示的な実施形態によると、ヒトＧＩＴＲおよびカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＧＩＴＲに特異的に結合する抗ＧＩＴＲ抗体が提供される。本発明の他の抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲに結合するが、カニクイザルＧＩＴＲには結合しない、またはごく弱く結合する。
【０１１６】
多特異的抗体
本発明の抗体は、単一特異的または多特異的（例えば、二重特異的）となり得る。多特異的抗体は、１種の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的となり得る、あるいは２種以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻：６０〜６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するまたはこれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片等、１種または複数の他の分子実体へと機能的に連結して（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合または他の方法により）、第２の結合特異性を有する二重特異的または多特異的抗体を産生することができる。
【０１１７】
本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＧＩＴＲに結合し、免疫グロブリンの他方のアームが第２の抗原に特異的な二重特異的抗体を含む。ＧＩＴＲ結合アームは、本明細書における表１に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ヒトＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬ結合を遮断する。他の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ヒトＧＩＴＲに結合するが、ＧＩＴＲへのＧＩＴＲＬ結合を遮断しない。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ヒトＧＩＴＲに結合し、ＧＩＴＲシグナリングを活性化する。他の実施形態では、ＧＩＴＲ結合アームは、ＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断する。本発明はまた、抗体の一方のアームがヒトＧＩＴＲの第１のエピトープに結合し、その抗体の他方のアームがヒトＧＩＴＲの第２の異なるエピトープに結合する二重特異的抗体を含む。
【０１１８】
本発明の文脈において使用することのできる例示的な二重特異的抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用であって、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインが、互いに少なくとも１個のアミノ酸が異なり、少なくとも１個のアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠く二重特異的抗体と比較してプロテインＡへの二重特異的抗体の結合を低下させる使用を含む。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）等、プロテインＡ結合を低下または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含むことができる。第２のＣＨ３内に見出すことのできるさらなる修飾は、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）を含む。上に記載されている二重特異的抗体フォーマットにおける変種は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【０１１９】
本発明の文脈において使用することのできる他の例示的な二重特異的フォーマットとして、例えば、ｓｃＦｖに基づくまたはダイアボディ二重特異的フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブイントゥーホールを有する共通軽鎖等）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧおよびＭａｂ２二重特異的フォーマットが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、前述のフォーマットの総説に関して、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ  ４巻：６号、１〜１１頁およびこれに引用されている参考文献を参照）。二重特異的抗体は、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築することもでき、例えば、直交性の化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成すると、これは、特定された組成、結合価および幾何学を有する多量体の複合体へと自己集合する（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照）。
【０１２０】
治療製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、適した担体、賦形剤および移動、送達、耐性その他の向上をもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な製剤は、あらゆる薬剤師に公知の処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ等）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルならびにカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２巻：２３８〜３１１頁も参照されたい。
【０１２１】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路その他に応じて変動し得る。好まれる用量は、典型的には、体重または体表面積に従って計算される。成体患者において、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単一用量で、本発明の抗体を静脈内投与することが有利となり得る。状態の重症度に応じて、処置の頻度および持続時間を調整することができる。抗ＧＩＴＲ抗体を投与するための有効投薬量およびスケジュールは、経験的に決定することができる；例えば、患者の進行を定期的評価によってモニターすることができ、これに従って用量を調整することができる。さらに、投薬量を種間で一定の基準で決めることは、本技術分野で周知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｒｅｓ．８巻：１３５１頁）。
【０１２２】
様々な送達系が公知であり、本発明の薬学的組成物の投与に使用することができ、例えば、リポソーム中のカプセル化、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが挙げられる（例えば、Ｗｕら、１９８７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照）。導入の方法として、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。組成物は、いずれかの簡便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通した吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は、全身性であっても局所性であってもよい。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物は、標準的な針およびシリンジにより皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達装置（ｐｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ）は、本発明の薬学的組成物の送達において容易に適用される。係るペン型送達装置は、再使用可能または使い捨てとなり得る。再使用可能なペン型送達装置は、一般に、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空となったら、空のカートリッジを容易に廃棄し、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。続いて、ペン型送達装置を再使用することができる。使い捨てペン型送達装置において、交換可能なカートリッジは存在しない。寧ろ、使い捨てペン型送達装置は、装置内のリザーバーに保たれた薬学的組成物を予め充填した状態で届けられる。リザーバーから薬学的組成物が空になったら、装置全体が廃棄される。
【０１２４】
多数の再使用可能なペン型および自動注入送達装置が、本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される。例として、ほんの数例ではあるが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、英国ウッドストック）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、スイス、ブルグドルフ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、インディアナ州インディアナポリス）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、コペンハーゲン）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、コペンハーゲン）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、ドイツ、フランクフルト）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される使い捨てペン型送達装置の例として、ほんの数例ではあるが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注入装置（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
ある特定の状況において、薬学的組成物は、放出制御系において送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記参照；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．１４巻：２０１頁を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、１９７４年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、放出制御系は、組成物の標的に近接して置くことができ、このため、全身性用量の一部分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記参照中、２巻、１１５〜１３８頁を参照）。他の放出制御系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁による総説で検討されている。
【０１２６】
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入等のための剤形を含むことができる。これらの注射用調製物は、公に知られた方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、注射のために従来から使用されてきた無菌水性媒体または油性媒体において、上に記載されている抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化することにより調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、水素化ヒマシ油のＨＣＯ−５０（ポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］等、適切な可溶化剤と組み合わせて使用することのできる、生理食塩水、グルコースを含有する等張性溶液および他の補助的薬剤等が存在する。油性媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等、可溶化剤と組み合わせて使用することができる、ゴマ油、ダイズ油等が用いられている。このように調製された注射液は、好ましくは、適切なアンプル内に充填される。
【０１２７】
有利には、上に記載されている経口または非経口的使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量の剤形へと調製される。単位用量の係る剤形として、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射（アンプル）、坐剤等が挙げられる。含有されている先述の抗体の量は一般に、単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇである；特に注射形態において、先述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【０１２８】
抗体の治療的使用
本発明は、それを必要とする被験体に、抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、本明細書における表１に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む抗ＧＩＴＲ抗体）を含む治療組成物を投与するステップを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示されている抗ＧＩＴＲ抗体、その抗原結合性断片またはＡＤＣのいずれかと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含むことができる。
【０１２９】
本発明の抗体は、ＧＩＴＲ発現もしくは活性と関連するかまたはこれによって媒介されるか、あるいはＧＩＴＲとＧＩＴＲＬとの間の相互作用を遮断すること、ならびに／またはＧＩＴＲ活性および／もしくはシグナリングを阻害または刺激することによって処置可能であるいずれかの疾患または障害の処置、予防および／または改善にとりわけ有用である。例えば、本開示の抗体および抗原結合性断片は、例えば、ＧＩＴＲ活性化を通じて免疫応答を調節することによって、免疫および増殖性疾患または障害（例えば、がん）を処置するために使用され得る。
【０１３０】
本開示の抗体および抗原結合性断片は、免疫応答を増強することによって疾患または障害を処置するために使用され得る。本開示は、被験体において抗腫瘍免疫応答を調節するための方法を包含し、上記方法は、本明細書で記載される抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合性断片を被験体に投与する工程を包含する。ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、Ｔ調節性細胞によって、Ｔエフェクター細胞の抑制活性を低減する。一部の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、治療上の利益に寄与する腫瘍内Ｔエフェクター／Ｔ調節性細胞比を高める。一部の実施形態では、本開示の抗体または抗原結合性断片は、Ｔ細胞生存を促進する。
【０１３１】
抗体および抗原結合性断片によって処置され得る例示的な疾患または障害としては、免疫および増殖性疾患または障害、例えば、がんが挙げられる。本発明の抗体および抗原結合性断片を使用して、脳および髄膜、口腔咽頭部、肺および気管支樹、胃腸管、雄性および雌性生殖器管、筋肉、骨、皮膚および付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血性細胞および骨髄、肝臓および尿路ならびに眼等の特殊な感覚器官に生じる原発性および／または転移性腫瘍を処置することができる。一部の実施形態では、本開示の抗体および抗原結合性断片は、固形腫瘍または血液由来の腫瘍を処置するために使用される。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、以下のがんのうちの１種または複数を処置するために使用される：腎細胞がん、膵臓がん、頭頚部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（例えば、ＭＥＴ増殖を伴う胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頚がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、乳がん、黒色腫、精巣がん、腎臓がん、食道がん、子宮がん、子宮内膜がん、または肝臓がん。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、自己免疫疾患（円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために有用である。
【０１３３】
本明細書に記載されている処置方法の文脈において、抗ＧＩＴＲ抗体は、単独療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、または１種もしくは複数の追加的な治療剤と組み合わせて（その例は、本明細書の他の箇所に記載されている）投与することができる。
【０１３４】
併用療法および製剤
本開示の抗ＧＩＴＲ抗体および有利なことには、本開示の抗体またはその抗原結合性断片と併用され得る任意の追加的な治療剤を利用する併用療法もまた、本明細書で提供される。
【０１３５】
本発明は、１種または複数の追加的な治療的に活性な構成成分と組み合わせた本明細書に記載されている抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかを含む組成物および治療製剤、ならびにそれを必要とする被験体に係る組み合わせを投与するステップを含む処置方法を含む。
【０１３６】
本発明の抗体は、がん（例えば、腎細胞がん、結腸直腸がん、多形性膠芽腫、頭頚部の扁平上皮がん、非小細胞肺がん、結腸がん、卵巣がん、腺がん、前立腺がん、神経膠腫、および黒色腫が挙げられる）を処置するために使用される１種または複数の抗がん薬または治療と相乗作用的に組み合わされ得る。腫瘍成長を阻害するおよび／またはがん患者の生存を高めるために、免疫刺激療法および／または免疫支持療法（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）と組み合わせて、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体を使用することが本明細書で企図される。免疫刺激療法は、抑制される免疫細胞に対して「ブレーキを開放する」かまたは免疫応答を活性化するために「アクセルを踏む」かのいずれかによる、免疫細胞活性を増大させる直接的免疫刺激療法を含む。例としては、他のチェックポイント受容体の標的化、ワクチン接種およびアジュバントが挙げられる。免疫支持モダリティーは、免疫原性細胞死、炎症を促進することによって腫瘍の抗原性を増大させ得るか、または抗腫瘍免疫応答を促進する他の間接的効果を有し得る。例としては、放射線療法、化学療法、抗血管新生薬剤、および手術が挙げられる。
【０１３７】
本開示は、被験体において抗腫瘍免疫応答を調節するための方法を包含し、上記方法は、上記被験体に、受容体活性化に対する１種または複数のアゴニスト性抗体およびＴ細胞刺激を増強して、腫瘍破壊を促進する阻害性受容体に対する１種または複数の遮断抗体と組み合わせて、抗ＧＩＴＲ抗体を投与する工程を包含する。
【０１３８】
本開示は、被験体において抗腫瘍免疫応答を調節するための方法を包含し、上記方法は、第２のＴ細胞活性化受容体（すなわち、ＧＩＴＲ以外）に結合する１種または複数の単離された抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせて、本明細書で記載される抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合性断片を被験体に投与する工程を包含する。一部の実施形態では、その第２のＴ細胞活性化受容体は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、またはＶＥＭである。本開示はまた、本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片、および上記第２のＴ細胞活性化受容体に結合する抗体または抗原結合性断片を含む製剤を包含する。
【０１３９】
種々の実施形態では、本発明の１種または複数の抗体は、以下と組み合わせて使用され得る：ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−１に対する抗体（例えば、ニボルマブ）、ＬＡＧ−３インヒビター、ＣＴＬＡ−４インヒビター（例えば、イピリムマブ）、ＴＩＭ３インヒビター、ＢＴＬＡインヒビター、ＴＩＧＩＴインヒビター、ＣＤ４７インヒビター、別のＴ細胞コインヒビター（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）またはリガンド（例えば、ＣＤ−２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０またはＶＩＳＴＡに対する抗体）のアンタゴニスト、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）インヒビター、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、アフリベルセプトのような「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」もしくはＵＳ  ７，０８７，４１１に表記されている他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または抗ＶＥＧＦ抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ベバシズマブもしくはラニビズマブ）またはＶＥＧＦ受容体の低分子キナーゼインヒビター（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、もしくはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２インヒビター（例えば、ネスバクマブ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）インヒビター、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）インヒビター（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、共刺激受容体のアゴニスト（例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質のアゴニスト）、腫瘍特異的抗原（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍Ｍ２−ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ｍｕｃｉｎ−１、ＭＡＲＴ−１、およびＣＡ１９−９）に対する抗体、ワクチン（例えば、カルメットゲラン桿菌、がんワクチン）、抗原提示を増大させるアジュバント（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異的抗体（例えば、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異的抗体、ＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異的抗体）、細胞毒、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、およびビンクリスチン）、シクロホスファミド、放射線療法、ＩＬ−６Ｒインヒビター（例えば、サリルマブ）、ＩＬ−４Ｒインヒビター（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ−１０インヒビター、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５）、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９−ＤＭ４  ＡＤＣ、および抗ＤＳ６−ＤＭ４  ＡＤＣ）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド系抗炎症薬）、栄養補助食品（例えば、抗酸化剤またはがんを処置するための任意の緩和ケア）。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、抗腫瘍応答を増大させるために、がんワクチン（樹状細胞ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍細胞ワクチンなどを含む）と組み合わせて使用され得る。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用され得るがんワクチンの例としては、黒色腫および膀胱がんのためのＭＡＧＥ３ワクチン、乳がんのためのＭ��Ｃ１ワクチン、脳のがん（多形性膠芽腫を含む）のためのＥＧＦＲｖ３（例えば、Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）、またはＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ（ＣＥＡ＋がんのための）が挙げられる。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書で記載される１種または複数の抗ＧＩＴＲ抗体は、１種または複数の抗ＰＤ１抗体（米国特許公開番号２０１５／０２０３５７９（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｈ１Ｈ１４５３６Ｐ２またはＨ２ａＭ１４５３６Ｐ２である。一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ＲＥＧＮ  ２８１０（米国特許公開番号２０１５／０２０３５７９に開示されているＨ４Ｈ７７９８Ｎとしても公知）、ペムブロリズマブ、またはニボルマブである。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、長期の持続的抗腫瘍応答を生成するおよび／またはがんを有する患者の生存を高める方法において、放射線療法と組み合わせて投与され得る。一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、がん患者への放射線療法の投与の前に、同時に、または後に投与され得る。例えば、放射線療法は、腫瘍病変への１または複数の線量において投与され得、続いて、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の１または複数の用量が投与され得る。一部の実施形態では、放射線療法は、患者の腫瘍の局所的免疫原性を高める（放射線療法を助ける）および／または腫瘍細胞を殺傷する（切除的放射線療法）ために腫瘍病変に局所的に投与され得、続いて、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体が全身投与され得る。例えば、頭蓋内放射線療法は、脳のがん（例えば、多形性膠芽腫）を有する患者に、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の全身投与と組み合わせて投与され得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、放射線療法および化学療法剤（例えば、テモゾロミド）またはＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト）と組み合わせて投与され得る。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、ＬＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶまたはＨＣＶによって引き起こされる慢性ウイルス感染症を処置するために、１種または複数の抗ウイルス薬と組み合わせて投与され得る。抗ウイルス薬の例としては、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノフォビル、リルピビリンおよびコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、慢性ウイルス感染症を処置するために、ＬＡＧ３インヒビター、ＣＴＬＡ−４インヒビターまたは別のＴ細胞コインヒビターの任意のアンタゴニストと組み合わせて投与され得る。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、自己免疫疾患の処置のために、免疫細胞上のＦｃ受容体に対する抗体と組み合わされ得る。一実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、自己免疫組織に特異的な抗原に標的化される抗体または抗原結合タンパク質と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体（Ｆｃα（例えば、ＣＤ８９）、Ｆｃγ（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ１６ｂ）、ＣＤ１９などが挙げられるが、これらに限定されない）に標的化される抗体または抗原結合タンパク質と組み合わせて投与される。本発明の抗体またはその断片は、自己免疫疾患または障害（円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、血管炎およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するために当該分野で公知の任意の薬物または治療（例えば、コルチコステロイドおよび他の免疫抑制剤）と組み合わせて使用され得る。
【０１４４】
本開示はまた、被験体において抗腫瘍免疫応答を調節するための方法を包含し、上記方法は、Ｔ細胞阻害受容体に結合する１種または複数の単離された抗体またはその抗原結合性断片と組み合わせて、本明細書で記載される抗ＧＩＴＲ抗体または抗原結合性断片を被験体に投与する工程を包含する。一部の実施形態では、Ｔ細胞阻害受容体は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、またはＬＡＧ−３である。本開示はまた、本明細書で提供される抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性断片および上記Ｔ細胞阻害受容体に結合する抗体または抗原結合性断片を含む製剤を包含する。
【０１４５】
本開示はまた、本明細書で記載される抗体もしくはその抗原結合性断片または製剤を、放射線療法または化学療法とともに被験体に投与することによって、がんを処置するための方法を包含する。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４等、別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２［例えば、トラスツズマブまたはＴ−ＤＭ１｛ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）｝］、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体、またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアンタゴニスト（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（ａｎａｇｏｎｉｓｔ）（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体または例えば、イマチニブメシレートもしくはスニチニブマレート等の小分子キナーゼ阻害剤）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃまたは−Ｄ抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ等）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト等、ＶＥＧＦトラップ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１を参照（本明細書において、「ＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質」とも称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１等、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ等、ＵＳ２０１１／００２７２８６に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブ等、一価抗ＣＤ２０抗体）等からなる群より選択される１種または複数の追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）と同時製剤化されるおよび／またはこれらと組み合わせて投与される。本発明の抗体と組み合わせて有益に投与することができる他の薬剤は、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、ならびに小分子サイトカイン阻害剤およびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、Ｉ���−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等のサイトカインまたはこれらそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤を含む。
【０１４７】
本発明は、１種または複数の化学療法剤と組み合わせた、本明細書に記載されている抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかを含む組成物および治療製剤を含む。化学療法剤の例として、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））等、アルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）等、スルホン酸アルキル；ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等、アジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等、ナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等、抗生物質；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等、代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート等、葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン等、プリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等、ピリミジンアナログ；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等、アンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等、抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸等、葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチン等、白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン等、抗アンドロゲン剤；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体等、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
【０１４８】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、心保護薬（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、金属キレート剤、ＩＦＮ−ガンマおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与および／または同時製剤化することもできる。
【０１４９】
追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）、例えば、上に列挙されている薬剤またはその誘導体のいずれかは、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の投与の直前に、それと同時発生的に、またはその直後に投与することができる；（本開示の目的のため、係る投与レジメンは、追加的な治療的に活性な構成成分「と組み合わせた」抗ＧＩＴＲ抗体の投与とみなされる）。本発明は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体が、本明細書の他の箇所に記載されている追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）のうち１種または複数と同時製剤化された薬学的組成物を含む。
【０１５０】
追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の投与の前に、被験体に投与され得る。例えば、第１の構成成分は、その第１の構成成分が、第２の構成成分の投与の１週間前に、７２時間前に、６０時間前に、４８時間前に、３６時間前に、２４時間前に、１２時間前に、６時間前に、５時間前に、４時間前に、３時間前に、２時間前に、１時間前に、３０分前に、１５分前に、１０分前に、５分前に、または１分に満たない前に投与される場合、第２の構成成分の「前に」投与されると考えられ得る。他の実施形態では、その追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の投与後に被験体に投与され得る。例えば、第１の構成成分は、その第１の構成成分が、第２の構成成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第２の構成成分の「後に」投与されると考えられ得る。さらに他の実施形態では、その追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の投与と同時発生的に被験体に投与され得る。「同時発生的（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」投与は、本発明の目的のために、例えば、単一剤形において（例えば、同時製剤化）、または互いに約３０分またはそれに満たない時間内に被験体に投与される別個の剤形において、被験体への抗ＧＩＴＲ抗体および追加的な治療的に活性な構成成分の投与を含む。別個の剤形において投与される場合、各剤形は、同じ経路を介して投与され得る（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体および追加的な治療的に活性な構成成分の両方が、静脈内、皮下などに投与され得る）；あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与され得る（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、静脈内に投与され得、追加的な治療的に活性な構成成分は、皮下に投与され得る）。いずれにしても、単一剤形において、同じ経路によって別個の剤形において、または異なる経路によって別個の剤形において、その構成成分を投与することは、全て、本開示の目的のために「同時発生的投与」と見做される。本開示の目的のために、追加的な治療的に活性な構成成分の投与の「前に」、「同時発生的に」または「後に」（それらの用語は、本明細書中上記で定義されるとおり）、抗ＧＩＴＲ抗体を投与することは、追加的な治療的に活性な構成成分との「組み合わせ」での抗ＧＩＴＲ抗体の投与と見做される。
【０１５１】
本発明は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体が、本明細書中他の箇所で記載される追加的な治療的に活性な構成成分（単数または複数）のうちの１種または複数と、種々の投薬量の組み合わせを使用して同時製剤化される薬学的組成物を含む。
【０１５２】
抗ＧＩＴＲ抗体およびＶＥＧＦアンタゴニストを含む同時製剤の投与を含む、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体がＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトのようなＶＥＧＦトラップ）と組み合わせて投与される例示的な実施形態では、その個々の構成成分は、種々の投薬量の組み合わせを使用して、被験体に投与され得るおよび／または同時製剤化され得る。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、６．０ｍｇ、７．０ｍｇ、８．０ｍｇ、９．０ｍｇ、および１０．０ｍｇからなる群より選択される量において、被験体に投与され得るおよび／または同時製剤の中に含まれ得る；そしてＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトのようなＶＥＧＦトラップ）は、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．１ｍｇ、１．２ｍｇ、１．３ｍｇ、１．４ｍｇ、１．５ｍｇ、１．６ｍｇ、１．７ｍｇ、１．８ｍｇ、１．９ｍｇ、２．０ｍｇ、２．１ｍｇ、２．２ｍｇ、２．３ｍｇ、２．４ｍｇ、２．５ｍｇ、２．６ｍｇ、２．７ｍｇ、２．８ｍｇ、２．９ｍｇおよび３．０ｍｇからなる群より選択される量において、被験体に投与され得るおよび／または同時製剤の中に含まれ得る。その組み合わせ／同時製剤は、本明細書中他の箇所で開示される投与レジメンのうちのいずれかに従って被験体に投与され得る（例えば、１週間に２回、１週間に１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、１ヶ月ごとに１回、２ヶ月ごとに１回、３ヶ月ごとに１回、４ヶ月ごとに１回、５ヶ月ごとに１回、６ヶ月ごとに１回などが挙げられる）。
【０１５３】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によると、抗ＧＩＴＲ抗体（または抗ＧＩＴＲ抗体および本明細書に言及されている追加的な治療的に活性な薬剤のいずれかの組み合わせを含む薬学的組成物）の複数用量は、規定の時間経過にわたって被験体に投与することができる。本発明の本態様に係る方法は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の複数用量を被験体に逐次的に投与するステップを含む。本明細書において、「逐次的に投与する」は、抗ＧＩＴＲ抗体の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間）によって隔てられた異なる日に被験体に投与されることを意味する。本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体の単一の初回用量、続いて抗ＧＩＴＲ抗体の１または複数の二次用量と、任意選択で、続いて抗ＧＩＴＲ抗体の１または複数の三次用量を患者に逐次的に投与するステップを含む方法を含む。
【０１５４】
用語「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の投与の時系列を指す。よって、「初回用量」は、処置レジメンの初めに投与される用量であり（「ベースライン用量」とも称される）；「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回、二次および三次用量は全て、同じ量の抗ＧＩＴＲ抗体を含有することができるが、一般に、投与頻度の観点から互いに異なっていてもよい。しかし、ある特定の実施形態では、初回、二次および／または三次用量に含有されている抗ＧＩＴＲ抗体の量は、処置過程において互いに変動する（例えば、適宜、上方または下方に調整される）。ある特定の実施形態では、処置レジメンの初めに「負荷用量」として２以上の（例えば、２、３、４または５）用量が投与され、続いてより少ない頻度で投与されるその後の用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【０１５５】
本発明の例示的な特定の実施形態では、各二次および／または三次用量は、直前の用量から１〜２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２またはそれより長い）週間後に投与される。語句「直前の用量」は、本明細書において、一連の複数の投与において、介在する用量が存在しない順番において丁度次の用量の投与の前に患者に投与される抗ＧＩＴＲ抗体の用量を意味する。
【０１５６】
本発明の本態様に係る方法は、抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの数の二次および／または三次用量を患者に投与するステップを含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２もしくはそれより多い（例えば、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれより多い）二次用量が、患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれより多い）三次用量が、患者に投与される。投与レジメンは、特定の被験体の生涯にわたり無期限に、または係る処置がもはや治療上の必要がなくなるもしくは有利でなくなるまで行うことができる。
【０１５７】
複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間または１〜２か月後に患者に投与することができる。同じく、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜１２週間後に患者に投与することができる。本発明の特定の実施形態では、二次および／または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの過程にわたって変動し得る。投与の頻度は、医師によって、臨床検査後に個々の患者の必要に応じて処置過程の間に調整することもできる。
【０１５８】
本発明は、２〜６負荷用量が第１の頻度で（例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月間に１回、２ヶ月間に１回等）患者に投与され、続いて２またはそれを超える維持用量がより低い頻度で患者に投与される投与レジメンを含む。例えば、本発明の本態様によると、負荷用量が、１ヶ月間に１回の頻度で投与される場合、維持用量は、６週間に１回、２ヶ月間に１回、３ヶ月間に１回等で患者に投与することができる。
【０１５９】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体を使用して、例えば、診断目的で、試料におけるＧＩＴＲまたはＧＩＴＲ発現細胞を検出および／または測定することもできる。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体またはその断片を使用して、ＧＩＴＲの異常発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如等）によって特徴付けられる状態または疾患を診断することができる。ＧＩＴＲの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＧＩＴＲ抗体と接触させるステップを含むことができ、抗ＧＩＴＲ抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、未標識の抗ＧＩＴＲ抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉ等、放射性同位元素；フルオレセインもしくはローダミン等、蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ等、酵素となり得る。試料におけるＧＩＴＲの検出または測定に使用することのできる特異的な例示的アッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノＰＥＴ（例えば、８９Ｚｒ、６４Ｃｕなど）および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１６０】
本発明に係るＧＩＴＲ診断アッセイにおいて使用することのできる試料は、正常または病的状態における、検出可能な量のＧＩＴＲタンパク質またはその断片を含有する、患者から得ることができるいずれかの組織または流体試料を含む。一般に、健康な患者（例えば、異常なＧＩＴＲのレベルまたは活性に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られる特定の試料におけるＧＩＴＲのレベルを測定して、ＧＩＴＲのベースラインまたは標準レベルを最初に確立するであろう。続いて、ＧＩＴＲのこのベースラインレベルは、ＧＩＴＲ関連疾患または状態を有すると疑われる個体から得られる試料において測定されたＧＩＴＲのレベルに対して比較することができる。
【実施例】
【０１６１】
次の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供できるように示されており、本発明者らが自身の発明として考慮する範囲の限定を企図しない。使用された数に対する正確度を確保するための努力をしたが、一部の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に断りがなければ、分子量は、平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧またはその近辺である。
【０１６２】
実施例１．抗ＧＩＴＲ抗体の生成
抗ＧＩＴＲ抗体を、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）をヒトＧＩＴＲの可溶性二量体細胞外ドメインを含む免疫原で免疫化することによって得た。その抗体免疫応答を、ＧＩＴＲ特異的イムノアッセイによってモニターした。いくつかの完全ヒト抗ＧＩＴＲ抗体を、ＵＳ  ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、骨髄腫細胞に融合することなしに、抗原陽性Ｂ細胞から直接単離した。
【０１６３】
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＧＩＴＲ抗体の特定の生物学的特性を、下に記す実施例において詳細に説明する。
【０１６４】
（実施例２）重および軽鎖可変領域アミノ酸および核酸配列
表１は、本発明の選択された抗ＧＩＴＲ抗体の重および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を表記する。対応する核酸配列識別子を表２に表記する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【０１６５】
抗体は典型的には、本明細書において、次の命名法に従って参照される：表１および２に示す通り、Ｆｃ接頭語（例えば、「Ｈ１Ｈ」、「Ｈ４Ｈ」等）と、続く数的識別子（例えば、「１４４９３」、「１４４９５」等）と、続く「Ｐ」または「Ｐ２」接尾語。よって、この命名法に従って、抗体は、本明細書において、例えば、「Ｈ１Ｈ１４４８６Ｐ」、「Ｈ４Ｈ１４５３１Ｐ２」等と称することができる。本明細書に使用されている抗体名称におけるＨ１Ｈ、Ｈ４Ｈ接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有し、「Ｈ４Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」は、マウスＩｇＧ２  Ｆｃを有する（全ての可変領域は、抗体名称における最初の「Ｈ」によって表示される通り、完全にヒトのものである）。当業者であれば認められる通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができるが、いずれにせよ、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）（これは表１および２に示す数的識別子によって示される）は、同じままであり、結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず、同一または実質的に同様であると予想される。
【０１６６】
以下の実施例において使用される対照構築物
比較目的のために対照構築物を次の実験に含めた：抗ＧＩＴＲ対照Ａｂ  Ｉ：ＷＯ  ２００６／  １０５０２１  Ａ２に表記されている「クローン６Ｃ８」の相当するドメインのアミノ酸配列を有する可変性重鎖および軽鎖ドメインとのマウス抗ヒトＧＩＴＲハイブリドーマ；以下の実施例においてｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ構築物領域で生成される；および抗ＧＩＴＲ対照Ａｂ  ＩＩ：ＵＳ  ８７０９４２４  Ｂ２に表記されている「３６Ｅ５」の相当するドメインのアミノ酸配列を有する可変性重鎖および軽鎖ドメインを有するヒト抗ＧＩＴＲ抗体。
【０１６７】
実施例３．表面プラズモン共鳴からのヒトモノクローナル抗ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲ）抗体の結合親和性および動態学的定数の導出
３７℃における表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００またはＴ−２００）により、ヒト抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性および動態学的定数を決定した（表３）。抗体（ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４（すなわち、「Ｈ１Ｈ」または「Ｈ４Ｈ」名称）として発現される）を、マウス抗ヒトＦｃ  ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面（ｍＡｂ捕捉フォーマット）、および可溶性単量体（ヒト（ｈ）ＧＩＴＲ．ｍｍｈ；配列番号４０９およびＭａｃａｃａ  ｆａｓｉｃｕｌａｒｉｓ（ｍｆ）ＧＩＴＲ．ｍｍｈ；配列番号４１２）または二量体（ｈＧＩＴＲ．ｈＦｃ；配列番号４１１およびｈＧＩＴＲｍＦｃ；配列番号４１０）に捕捉した。ＧＩＴＲタンパク質を、センサー表面にわたって流速３０μＬ／分で注入した。全てのＢｉａｃｏｒｅ結合研究を、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ｖ／ｖ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０から構成される緩衝液（ＨＢＳ−ＥＴ泳動緩衝液）中で行った。抗体−試薬会合を、４分間モニターした一方で、ＨＢＳ−ＥＴ泳動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  （ｖ／ｖ）  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ｐＨ７．４）中での解離を１０分間モニターした。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃカーブフィッティングソフトウェアを使用して１：１結合モデルへとリアルタイムセンサーグラムをフィットさせることによって、動態学的会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。次の通り、動態学的速度定数から結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を計算した：ＫＤ［Ｍ］＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝（ｌｎ２／（６０＊ｋｄ）。結果を表３にまとめる。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１６８】
表３に示されるように、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は全て、ヒトＧＩＴＲに結合し、いくつかの抗体は、二量体ヒトＧＩＴＲタンパク質に対してナノモル濃度未満の親和性を示した。さらに、その抗ＧＩＴＲ抗体の大部分はまた、カニクイザルＧＩＴＲタンパク質に対して交差反応性を示した。齧歯類ＧＩＴＲタンパク質に対する交差反応性は観察されなかった（データは示さず）。
【０１６９】
実施例４．抗ＧＩＴＲ抗体はヒトＧＩＴＲ発現細胞に特異的にかつ強力に結合する
この実施例では、抗ＧＩＴＲ抗体がヒトＧＩＴＲ発現細胞株に特異的に結合する能力を、電気化学発光法（ＥＣＬ）ベースの検出を使用して決定した。
【０１７０】
簡単に説明すると、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）−２９３−Ｄ９細胞を、ヒトＧＩＴＲ（アミノ酸Ｍ１−Ｖ２４１、ＮＣＢＩアクセッション＃ＮＰ＿００４１８６．１、配列番号４１３）で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００媒介性方法論を介して安定してトランスフェクトした。トランスフェクト体を、完全増殖培地＋Ｇ４１８中で少なくとも２週間にわたって選択した。
【０１７１】
細胞結合研究のために、およそ１×１０５  ｈＧＩＴＲ／ＨＥＫ２９３−Ｄ９または親ＨＥＫ２９３−Ｄ９細胞（これは、ヒトＧＩＴＲを発現しない）を、９６ウェル炭素電極プレート（ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹ，  ＭＳＤ）上に１時間、３７℃において播種した。非特異的結合部位を、２％  ＢＳＡ（ｗ／ｖ）＋ＰＢＳで１時間、室温（ＲＴ）においてブロッキングした。次に、抗ＧＩＴＲ抗体の系列希釈（１．７ｐＭ〜１００ｎＭの範囲）を、細胞に１時間にわたってＲＴにおいて添加した。次いで、プレートを洗浄して、結合していない抗体を除去し（ＡｑｕａＭａｘ２０００プレート洗浄機、ＭＳＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、プレートに結合した抗体を、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）をコンジュゲートされた抗ヒトκ軽鎖ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で１時間にわたってＲＴにおいて検出した。
【０１７２】
洗浄後、発光シグナルを、ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（ＭＳＤ）機器で記録した。直接結合シグナル（相対発光量、ＲＬＵ）を、抗体濃度の関数として分析し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用してシグモイド（４パラメーターロジスティック）用量応答モデルとフィットさせた。ｈＧＩＴＲ／ＨＥＫ２９３−Ｄ９細胞への結合に関するＥＣ５０（最大結合シグナルの５０％が検出される抗体の濃度として定義される）を、各抗体の結合効力を示すために決定した。親細胞に対してｈＧＩＴＲ発現細胞に結合する１００ｎＭ  抗体で検出されたシグナルを、ＧＩＴＲ結合の強度および特異性の示度として記録した。結果を表４にまとめる。
【０１７３】
表４にまとめられるように、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の大部分は、親ＨＥＫ２９３に対して、２１０ｐＭ〜８５ｎＭの範囲に及ぶＥＣ５０でヒトＧＩＴＲ発現細胞に特異的に結合した。その抗体の大部分は、ヒトＧＩＴＲ発現細胞にナノモル濃度未満のＥＣ５０値で結合した。そのアイソタイプ対照抗体は、ｈＧＩＴＲ発現細胞株または親細胞株への結合を示さなかった。
【表４】
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【０１７４】
まとめると、この実施例は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体がヒトＧＩＴＲ発現細胞株への特異的かつ強力な結合を示すことを示す。
【０１７５】
実施例５．抗ＧＩＴＲ抗体は、ＦｃγＲ抗体アンカリングの存在下または非存在下でのＮＦ−κＢ／ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて部分的遮断因子および部分的活性化因子である
この実施例では、抗ＧＩＴＲ抗体がＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）への抗体アンカリングの存在下もしくは非存在下でｈＧＩＴＲを活性化するかまたはｈＧＩＴＲリガンド（ｈＧＩＴＲＬ）媒介性受容体刺激を遮断する能力を、ルシフェラーゼベースのレポーターアッセイを介して評価した。
【０１７６】
簡単に説明すると、ｈＧＩＴＲおよびＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼレポーターの安定な組み込みを有するＪｕｒｋａｔ細胞株を、操作した（ｈＧＩＴＲ／Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ−κＢＬｕｃ）。そのＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーターを、Ｃｉｇｎａｌ  Ｌｅｎｔｉ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒシステム（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞へと導入した。ｈＧＩＴＲを発現するレンチウイルスを、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を利用して、ＨＥＫ２９３／Ｔ１７において生成した。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ細胞を、ｈＧＩＴＲ発現受容体ウイルスでポリブレン媒介性形質導入を介して形質導入し、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８中で２週間にわたって選択した。抗体アンカリング研究に関しては、ＨＥＫ２９３細胞を、上記で記載されるように、ＦｃγＲＩ発現レンチウイルスで形質導入した。
【０１７７】
先ず、ＦｃγＲアンカリングの非存在下（アンカーされていないバイオアッセイフォーマット）で抗ｈＧＩＴＲ抗体の活性化および遮断特性を評価した。およそ４×１０４  Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦ−κＢＬｕｃ／ｈＧＩＴＲ細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ＋０．５％  ＦＢＳ中で、ＰＤＬコーティング９６ウェルプレートに一晩（ＯＮ）播種した。
【０１７８】
抗体活性化能力を決定するために、細胞を、６時間にわたって３７℃において、０．５ｐＭ〜１００ｎＭの範囲に及ぶ濃度で系列希釈した抗ｈＧＩＴＲ抗体またはｈＧＩＴＲＬとともに、インキュベートした。ｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激の抗体遮断を評価するために、細胞を、系列希釈した抗ｈＧＩＴＲ抗体（０．５ｐＭ〜１００ｎＭ）とともに３０分間プレインキュベートし、続いて、１０ｎＭ  ｈＧＩＴＲＬの一定用量で６時間インキュベートした。
【０１７９】
次に、ＦｃγＲアンカリングの存在下（アンカーされたバイオアッセイフォーマット）での選択れた抗ｈＧＩＴＲ抗体の活性化および遮断特性を決定した。上記と同様に、２．５×１０４Ｊｕｒｋａｔ／ＮｆκＢＬｕｃ／ｈＧＩＴＲ細胞を、完全増殖培地中でＰＤＬコーティング９６ウェルプレートに播種した。
【０１８０】
抗体活性化を評価するために、細胞を、１時間、３７℃において系列希釈した抗ｈＧＩＴＲ  ｍＡｂまたはｈＧＩＴＲＬ（０．５ｐＭ〜１００ｎＭ）とともにプレインキュベートした。次いで、１×１０４  ｈＦｃγ  Ｒ１／ＨＥＫ２９３細胞を直ぐにウェルに添加し、続いて、６時間インキュベートした。遮断を評価するために、ｈＧＩＴＲ／Ｊｕｒｋａｔ／ＮｆκＢＬｕｃ細胞を、１時間、系列希釈した抗ｈＧＩＴＲ抗体（０．５ｐＭ〜１００ｎＭ）とともにプレインキュベートした。１×１０４  ｈＦｃγＲ１／ＨＥＫ２９３細胞をウェルに添加し、続いて、一定用量の１０ｎＭ  ｈＧＩＴＲＬを添加した。
【０１８１】
アンカーされたバイオアッセイフォーマットおよびアンカーされていないバイオアッセイフォーマットの両方に関して、ルシフェラーゼ活性をＯｎｅ  ｇｌｏｗ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定し、相対発光量（ＲＬＵ）を、Ｖｉｃｔｏｒルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。そのＥＣ５０／ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して１２点応答曲線に対する４パラメーターロジスティック方程式から決定した。結果を表５および表６にまとめる。％遮断を決定するために、非処理ウェルからのバックグラウンドＲＬＵ（相対発光量）を、処理したウェルから差し引き、％遮断を、以下に従って計算する：［１００−（最大用量での抗体ＲＬＵ／一定リガンド用量ＲＬＵ）］＊１００］。％活性化を、以下の式に従って計算する：（正規化ｍＡｂ  ＲＬＵ／最大ＧＩＴＲリガンド応答）＊１００；正規化ｍＡｂ  ＲＬＵは、非処理したウェルのＲＬＵを処理したウェルから差し引くことによって決定する。平均倍数活性化を、以下のように計算する：最大抗体用量でのＲＬＵ／非処理ウェルからのバックグラウンドＲＬＵ。
【表５】
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【０１８２】
上記の表５および以下の表６においてまとめられるように、試験した抗体は、アンカーされていないバイオアッセイフォーマットおよびアンカーされたバイオアッセイフォーマットの両方において、部分的活性化および部分的遮断特性を示した。アンカーされていないフォーマットにおいて、抗体は、０．４ｎＭ〜２．５ｎＭの範囲に及ぶＥＣ５０で受容体刺激を媒介した。いくつかの抗体（例えば、Ｈ４Ｈ１４４７５ＰおよびＨ４Ｈ１４４９１Ｐ）は、それぞれ、７０％および６０％の活性化を示すＧＩＴＲ受容体の強力な活性化因子であった。その試験した抗体の大部分はまた、０．６ｎＭ〜３．８ｎＭの範囲に及ぶＩＣ５０で、ｈＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激の遮断を示した。いくつかの例示的抗体（例えば、Ｈ１Ｈ１４５１２ＰおよびＨ４Ｈ１４５３６Ｐ２）は、それぞれ、１００％および９０％という強力な遮断活性を示した。Ｈ４Ｈ１４４７５Ｐ（最も強力な活性化因子）は、遮断アッセイにおいて最低の活性を示した（％遮断：−２％）。
【表６】
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【０１８３】
ＦｃγＲアンカリングバイオアッセイフォーマットにおいて試験した、選択された抗体はまた、活性化および遮断特性の一定の範囲を示した。Ｈ４Ｈ１４４７５Ｐ（アンカーされていないフォーマットにおいて最強の活性化因子）はまた、基底シグナルの８．０倍上回る倍数活性化で、アンカーされたバイオアッセイフォーマットにおいてｈＧＩＴＲを強力に活性化した。アンカーされていない遮断フォーマットにおいて強い遮断因子（例えば、Ｈ１Ｈ１４５１２ＰおよびＨ４Ｈ１４５３６Ｐ２）はまた、アンカーされたアッセイにおいて強力な遮断を示した（％遮断：  ６０％および７０  ％）。
【０１８４】
まとめると、その結果は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体が、強力なＧＩＴＲ活性化特性、および操作されたバイオアッセイにおいてＦｃγＲアンカリングの非存在下でＧＩＴＲＬ媒介性受容体刺激を遮断する能力を示すことを示す。例示的な抗体（例えば、Ｈ４Ｈ１４７７５ＰおよびＨ４Ｈ１５３６Ｐ２）はまた、それぞれ、ＦｃγＲアンカリングの存在下で、それらの活性化および遮断特性を維持する。
【０１８５】
実施例６．抗ＧＩＴＲ抗体Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２は、ＦｃγＲアンカリングの存在下および非存在下でナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖アッセイにおいて強力な活性を示す
上記のように、抗ＧＩＴＲ抗体を、それらがアンカリングＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の存在下および非存在下でｈＧＩＴＲを活性化する能力について操作されたバイオアッセイにおいて試験した。この実施例では、ｈＧＩＴＲ活性化に対する抗体アンカリングの効果を、ナイーブヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖プライマリーバイオアッセイにおいて評価した。ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞システムは、ＧＩＴＲコピー数が内因性レベルにおいてあるのに対して、その操作されたシステムは、より高いＧＩＴＲコピー数を有する細胞を利用するという利点を有する。
【０１８６】
先ず、抗ＧＩＴＲ抗体を、プレートに結合した抗ＣＤ３の存在下でＣＤ４＋  Ｔ細胞増殖能力に関して試験した。簡単に説明すると、ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を、Ｈｕｍａｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して健康なドナーの白血球パックから単離した。ナイーブＴ細胞を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってＣＤ４５ＲＯ＋細胞の枯渇によってさらに富化した。およそ５×１０４  Ｔ細胞を、最適量未満の抗ＣＤ３  ｍＡｂ  ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍＬ）でプレコーティングした９６ウェルＵ底ポリスチレンプレートにプレートし、抗ＧＩＴＲ抗体または対照の量を滴定した。刺激後３日間、トリチウム化チミジン（１μＣｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＮＥＴ０２７００１）を、各マイクロウェルに添加し、１８時間適用した。細胞を、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄ９６１９６２）を使用して、フィルタープレート（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｃ  ６００５１７４）上に採取した。シンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０  ６０１３６２１）を、フィルタープレートに添加し、放射活性カウントを、プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ）を使用して測定した。対照に対するＴ細胞増殖（１０．６ｎＭの抗体濃度における平均倍数活性化として与えられる）を、表７に表す。このアッセイフォーマットにおいて、１０．６ｎＭは、Ｔ細胞増殖が用量応答曲線上でプラトーに達した点を表した。
【表７−１】
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【表７−２】
2019521098.tif 000012
【０１８７】
表７における結果が示すように、試験した抗ＧＩＴＲ抗体は、プレートに結合した抗ＣＤ３の存在下でプレートに結合した場合、Ｔ細胞増殖能力を示した。その抗ＧＩＴＲ対照Ａｂ  Ｉは、アイソタイプ対照を２７倍上回る増殖活性を示した。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の大部分は、アイソタイプ対照を２〜８倍上回る活性化を示し、いくつかの例示的な抗体（Ｈ４Ｈ１４４６９Ｐ、Ｈ４Ｈ１４５３９Ｐ２、およびＨ４Ｈ１４５３６Ｐ２）は、それぞれ、対照を１２倍、１３倍および２３倍上回る活性化を示した。まとめると、結果は、試験した抗ＧＩＴＲ抗体がこの古典的なフォーマットにおいてＴ細胞増殖活性を示すことを示す。
【０１８８】
次に、追加的なアッセイフォーマットを使用して、抗ＧＩＴＲ抗体が細胞表面に結合したＦｃγＲの存在下および非存在下でＴ細胞を活性化する濃緑を試験した。
【０１８９】
抗ＧＩＴＲ抗体がＦｃγＲ１アンカリングの存在下でＴ細胞を活性化する能力を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞を操作して、上記のように高親和性ｈＦｃγＲ１受容体を発現させた。ＨＥＫ２９３／ＦｃγＲＩ細胞を、３０分間、３７℃において５０μｇ／ｍＬ  マイトマイシンＣで処理して、増殖を阻害した。その後に洗浄して微量のマイトマイシンＣを除去した後、細胞を、３００ｎｇ／ｍＬ  抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３でコーティングして、Ｔ細胞活性化を刺激した。ＨＥＫ２９３／ＦｃγＲＩ細胞を、ヒトナイーブＣＤ４＋  Ｔ細胞とともに、１：２の比で共培養し、滴定した量の抗ＧＩＴＲ抗体または対照を、その共培養培地に添加した。
【０１９０】
Ｔ細胞増殖を、トリチウム化チミジン組み込みのレベルを測定することによって評価した。刺激後７２時間で、トリチウム化チミジン（０．５μＣｉ／ウェル、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、さらに１８時間、３７℃において各マイクロウェルに添加した。細胞を、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄ９６１９６２）を使用して、フィルタープレート（Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６  ＧＦ／Ｃ  ６００５１７４）上に採取した。シンチレーション液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ２０  ６０１３６２１）をフィルタープレートに添加し、放射活性カウントを、プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  ＮＸＴ）を使用して測定した。対照に対するＴ細胞増殖（３３ｎＭ濃度の抗体における平均倍数活性化として与えられる）を、表８に示す。このアッセイフォーマットにおいて、３３ｎＭは、Ｔ細胞増殖が用量応答曲線上でプラトーに達した点を表した。
【表８】
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【表９】
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【０１９１】
表８における結果がまとめるように、いくつかの抗体は、１〜２倍の範囲に及ぶレベルで対照を上回る活性化を示した。しかし、１つの例示的な抗体、Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２は、アンカーされた状況において強力なＴ細胞増殖活性を示した。５．５という平均倍数活性化で、Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２は、抗ＧＩＴＲ比較抗体（平均倍数活性化範囲：０．７〜２．０）と比較して、より大きなＴ細胞活性化を刺激した。Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２は、最も強力な抗ＧＩＴＲ対照Ａｂである対照Ｉ−ｍＩｇＧに関する３４．１ｎＭと比較して、３．２ｎＭというＴ細胞増殖の平均ＥＣ５０を有した（表９）。さらに、このアッセイフォーマットにおいて、Ｈ４Ｈ１４４７５Ｐ（上記の操作されたバイオアッセイにおける強力な活性化因子）は、このプライマリーバイオアッセイ状況において中程度の増殖活性を示した。
【０１９２】
次に、抗体を、ＦｃγＲアンカリングの非存在下でＴ細胞増殖活性に関して試験した。ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を、上記のように単離し、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３でプレコーティングした９６ウェルＵ底ポリスチレンプレート上にプレートした。上記と同様に、滴定した濃度の抗ＧＩＴＲ抗体または対照を、培養培地に添加した。Ｔ細胞増殖を、トリチウム化チミジン組み込みによって測定した。２２ｎＭ抗体濃度で４名のドナーにおいて観察されたＴ細胞増殖を、表１０において、アイソタイプ対照と比較して倍数活性化として表す。Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２のＥＣ５０（ｎＭ）も、表１１に示す。
【０１９３】
アンカーされたアッセイフォーマットにおいて観察されるように、Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２は、繰り返しになるが、アンカーされていないフォーマットにおいて２２ｎＭで強力なＴ細胞増殖活性を示した。Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２は、１１．０の平均倍数活性化および８．３ｎＭのＥＣ５０でＴ細胞を活性化した。このアッセイフォーマットにおいて、対照抗ＧＩＴＲ抗体Ｉは、Ｔ細胞増殖能力を示さなかった。
【表１０】
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【表１１】
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【０１９４】
まとめると、この実施例は、１つの例示的抗ＧＩＴＲ抗体であるＨ４Ｈ１４５３６Ｐ２が、ｈＦｃγＲ１アンカリングの存在下および非存在下での強力なＴ細胞増殖活性を示す一方で、抗ＧＩＴＲ比較抗体対照Ｉは、アンカーされていない状況においてＴ細胞増殖活性を示さなかったことを示す。従って、Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２がｈＦｃγＲ１アンカリングの非存在下でＴ細胞を活性化する能力は、特有の特性であり、これは、その抗体が活性を保持するためにＦｃγ受容体への内因性ＩｇＧ結合とｉｎ  ｖｉｖｏで競合しなくてもよい可能性があることを示唆する。Ｈ４Ｈ１４５３６Ｐ２のこの特有の特性は、治療状況において利点を付与し得る。
実施例７．抗ＰＤ１抗体との組み合わせでの抗ＧＩＴＲ抗体の投与は、腫瘍を相乗作用的にコントロールおよび根絶する
【０１９５】
抗ＧＩＴＲ抗体を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与することの腫瘍成長に対する効果の評価を、以下の方法を使用して行った。その評価の結果を、以下にまとめる。
【０１９６】
腫瘍移植、処置レジメンおよび成長測定
ＭＣ３８結腸直腸がん細胞（ＡＴＣＣから得た）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に移植した（３×１０５  細胞／マウス）（０日目として定義）。６日目（すなわち、腫瘍移植の６日後）に、マウスを４群に分け（５匹のマウス／群）、各群を、以下で腹腔内（ＩＰ）処置した：（１）ラットＩｇＧ２ａ（２Ａ３、Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００８９）（アイソタイプ対照）＋ラットＩｇＧ２ｂ（ＬＴＦ２、Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００９０）（アイソタイプ対照）、（２）抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体ＤＴＡ１（ラット抗マウスＧＩＴＲ、Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００６３）＋ラットＩｇＧ２ａ（対照）、（３）抗ＰＤ−１モノクローナル抗体ＲＰＭ１−１４（ラット抗マウスＰＤ−１、Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０１４６）＋ラットＩｇＧ２ｂ（対照）または（４）抗ＧＩＴＲ抗体ＤＴＡ１＋抗ＰＤ−１抗体ＲＰＭ１−１４。次いで、抗体注射（単数または複数）を、１３日目に再び投与した。抗体処置を、各抗体の５ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍を、二次元（長さ×幅）で測定し、腫瘍容積を計算した（長さ×幅２×０．５）。マウスを、腫瘍が指定された腫瘍エンドポイント（腫瘍容積＞２０００ｍｍ３または腫瘍潰瘍化）に達した場合に安楽死させた。
【０１９７】
腫瘍再チャレンジ評価
８０日間にわたって腫瘍なしを維持した、抗ＰＤ−１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体の組み合わせで処置したマウスに、３×１０５の同系腫瘍（ＭＣ３８）を右側腹部に、および２．５×１０５の同種異系（Ｂ１６Ｆ１０．９）腫瘍細胞株（黒色腫細胞株、ＡＴＣＣ）を左側腹部に、再チャレンジした。上記のように腫瘍をモニターした。
【０１９８】
抗体枯渇実験
腫瘍チャレンジの１日前に開始して、１週間に２回、合計８用量を与えて、異なる枯渇ｍＡｂ（抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５）を注射したマウスを、併用療法またはアイソタイプ対照ＩｇＧで処置した。その枯渇効率を、末梢血サンプルのＦＡＣＳ分析によって確認した。
【０１９９】
腫瘍内リンパ球のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析
マウスを上記のように処置した。抗体処置の５日後に、腫瘍および脾臓を集めた。腫瘍を鋏で切り刻み、Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ／ＤＮＡｓｅ  Ｉミックスで単一細胞懸濁物に解離した。脾臓を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒで解離した。細胞を、マウスＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５およびＦｏｘＰ３に対するＦＡＣＳ抗体のパネル、ならびに活性化マーカー（ＰＤ１、ＧＩＴＲ、Ｋｉ６７、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＫＬＲＧ１およびＣＤ４４）で染色した。細胞を、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０またはＬＳＲ  ＩＩで獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。
【０２００】
抗マウスＰＤ１抗体との組み合わせでの抗マウスＧＩＴＲ抗体の投与は、腫瘍退縮を有意に誘導し、ＭＣ３８を有するマウスにおいて長期の腫瘍寛解を提供する
上記の方法を使用して、皮下ＭＣ３８腫瘍のコントロールにおいて抗マウスＰＤ−１抗体（クローンＲＭＰ１−１４、Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０１４６）との組み合わせで抗マウスＧＩＴＲ抗体（クローンＤＴＡ−１、Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ００６３）を投与することの有効性を評価した。図１ならびに表１２および表１３に示されるように、ＰＤ１遮断および抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）抗体の併用処置は、抗ＰＤ−１もしくは抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ単独、またはアイソタイプ対照処置マウスと比較して、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍退縮を有意に誘導した。さらに、併用療法で処置したマウスは、そのマウスのうちの１００％が１２０日間超にわたって腫瘍なしを維持したので、長期の腫瘍寛解を示した（図２、表１４、表１５）。
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０２０１】
抗マウスＰＤ１抗体との組み合わせでの抗マウスＧＩＴＲ抗体の投与は、腫瘍／抗原特異的免疫記憶応答を誘導する
抗ＰＤ−１および抗ＧＩＴＲ抗体の併用投与で処置したマウスが腫瘍／抗原特異的記憶応答を発生させたか否かを決定するために、腫瘍なしの生存マウスに、３×１０５の同系ＭＣ３８結腸がん細胞を右側腹部に、および２．５×１０５の同種異系黒色腫細胞株Ｂ１６Ｆ１０．９を左側腹部に、再チャレンジした。ＭＣ３８腫瘍は、抗ＰＤ１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体組み合わせで処置したマウスにおいて成長しない一方で、その同じ腫瘍は、ナイーブ対照マウス（いかなる事前の処置もなし）において成長することが見出された（図３）。対照的に、その同種異系腫瘍（黒色腫）は、両方の群において成長しなかった。これは、その抗ＰＤ−１および抗ＧＩＴＲ抗体の組み合わせ投与が、その同じタイプの腫瘍での第２のチャレンジをコントロールできる腫瘍−抗原特異的免疫記憶応答を誘導することを示した。
【０２０２】
免疫集団研究
マウスを、抗ＰＤ−１抗体および抗ＧＩＴＲ抗体併用処置の前に、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５枯渇ｍＡｂで処置した。ＣＤ８＋細胞の枯渇が、抗腫瘍効果（ＭＣ３８腫瘍）を完全に排除する一方で、ＣＤ４またはＣＤ２５  Ｔ細胞の枯渇が部分的阻害を示すことを見出した（図４、表１５）。従って、ＭＣ３８腫瘍における併用療法の抗腫瘍効果は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に大部分は依存するようである。
【０２０３】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に対する抗ＧＩＴＲおよび抗ＰＤ１併用処置の効果を、評価した。その併用処置は、単独療法処置（抗ＰＤ−１もしくは抗ＧＩＴＲ）またはアイソタイプ対照と比較すると、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比において有意な増大を誘導することが見出された（図５）。ＣＤ４／Ｔｒｅｇ比に対する併用処置の効果は、それほど著しくないことが見出された。抗ＰＤ−１および抗ＧＩＴＲ併用処置は、ＣＤ８  Ｔ細胞を増大させた間に腫瘍内Ｔｒｅｇのパーセンテージを低下させた（図６）。さらに、抗ＰＤ−１処置単独は、Ｔｒｅｇ細胞数の拡大を誘導した一方で、抗ＰＤ−１／抗ＧＩＴＲ併用処置は、アイソタイプ対照処置マウスと比較して、Ｔｒｅｇ細胞数を有意に減少させた。
【表１５】
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【０２０４】
抗マウスＰＤ１抗体との組み合わせでの抗ヒトＧＩＴＲ抗体の投与は、ＭＣ３８を有するＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬヒト化マウスにおいて腫瘍退縮を有意に誘導し、長期の腫瘍寛解を提供する
皮下ＭＣ３８腫瘍のコントロールにおいて抗ヒトＧＩＴＲ抗体（Ｈ２ａＭ１４５３６Ｐ２）を抗マウスＰＤ−１抗体（クローンＲＭＰ１−１４  Ｂｉｏ  Ｘ  ｃｅｌｌ、カタログ番号ＢＥ０１４６）との組み合わせで投与することの有効性を、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬヒト化マウスにおいて評価した。抗マウスＰＤ−１遮断は、抗ヒトＧＩＴＲ抗体と相乗的に作用し、平均腫瘍成長曲線において示されるように（図７、表１６）、抗ＰＤ１（１／７）もしくは抗ＧＩＴＲ（１／７）ｍＡｂ単独、またはアイソタイプ対照（０／７）処置マウスと比較して、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍退縮を有意に誘導した（４／６マウス）。さらに、併用療法で処置したマウスは、そのマウスうちの６０％超が、アイソタイプ対照に関しては０％および抗ＰＤ−１または抗ＧＩＴＲ処置群に関しては１０％と比較して、５０日目に腫瘍なしを維持するので、長期の腫瘍寛解を示した（図８、表１６）。
【０２０５】
抗ヒトＧＩＴＲ抗体は、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比を増大させる
腫瘍内および脾臓のＴ細胞集団に対する抗ヒトＧＩＴＲ抗体の効果を評価した。抗ヒトＧＩＴＲ抗体、Ｈ２ａＭ１４５３６Ｐ２およびＨ１Ｈ１４５３６Ｐ２を評価した。両方の抗ヒトＧＩＴＲ抗体アイソタイプ（ｍＩｇ２ａおよびｈＩｇＧ１）は、腫瘍内ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比において有意な増大を誘導することを見出した（図９）。その同じ処置は、末梢脾臓Ｔ細胞サブセットに対して効果を有しなかった。ヒトＩｇＧ１およびマウスＩｇＧ２ａアイソタイプＩｇＧを、対照のためにアッセイにおいて使用した。
【表１６】
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【０２０６】
抗ヒトＰＤ１抗体との組み合わせでの抗マウスＧＩＴＲ抗体の投与は、ＭＣ３８を有するＰＤ１／ＰＤＬ１ヒト化マウスにおいて腫瘍退縮を有意に誘導し、長期の腫瘍寛解を提供する
皮下ＭＣ３８腫瘍のコントロールにおいて抗ヒトＰＤ−１抗体（ＲＥＧＮ２８１０（米国特許公開番号２０１５／０２０３５７９において開示されるようにＨ４Ｈ７７９８Ｎとしても公知））との組み合わせでの抗マウスＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）の投与の有効性を、ＰＤ１／ＰＤＬ１ヒト化マウスにおいて評価した。抗ヒトＰＤ−１遮断は、平均腫瘍成長曲線において示されるように、抗ＰＤ１もしくは抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ単独、またはアイソタイプ対照処置マウスと比較して、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおいて抗マウスＧＩＴＲ抗体と相乗的に作用し、腫瘍成長の遅れを誘導することが見出された（図１０、表１７）。さらに、併用療法で処置したマウスは、そのマウスのうちの４０％超が、アイソタイプ対照、抗ＰＤ−１または抗ＧＩＴＲ処置群に関して０％と比較して、４５日目で腫瘍なしを維持したので、長期の腫瘍寛解を示した（図１１）。
【表１７】
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【０２０７】
実施例８：ＲＮＡ抽出および分析
単一細胞ソーティングＲＮＡ−ｓｅｑ分析
腫瘍チャレンジ後の８日目および１１日目に、腫瘍の単一細胞懸濁物を、マウス腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，  ＤＥ）によって調製し、脾臓を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で解離した。同じ処置群に由来する腫瘍および脾臓をプールし、生きているＣＤ８＋  Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソートした。ＦＡＣＳでソートしたＴ細胞を、Ｃ１  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）と混合し、その後、５μｍ〜１０μｍのＣ１  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｉｒｃｕｉｔ（ＩＦＣ；  Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）上に載せた。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色溶液を、２．５μＬ  エチジウムホモ二量体−１および０．６２５μＬ  カルシウムＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、１．２５ｍＬ  Ｃ１  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）に添加することによって調製し、２０μＬをＣ１  ＩＦＣに載せた。各捕捉部位を、明視野においてＺｅｉｓｓ顕微鏡下で、ＧＦＰを、ならびに細胞ダブレットおよび生存性に関してはテキサスレッドチャネルを注意深く検査した。細胞溶解、逆転写、およびｃＤＮＡ増幅を、製造業者によって特定されるように（プロトコル１００−７１６８  Ｅ１）、Ｃ１  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏ  Ｐｒｅｐ  ＩＦＣで行った。ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を、単一細胞からのｃＤＮＡ合成に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮＧＳライブラリーを、ＮＥＸＴＥＲＡ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、製造業者の推奨（プロトコル１００−７１６８  Ｅ１）に従って構築した。合計で２，２２２個の単一細胞を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で、７５サイクルでの多重化シングルリード実行によって配列決定した。生の配列データ（ＢＣＬファイル）を、ＦＡＳＴＱフォーマットへとＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＡＳＡＶＡ  １．８．２を介して変換した。リードを、それらのバーコードに基づいて解読した。リードの品質を、ＦａｓｔＱＣを使用して評価した（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）。
【０２０８】
実施例９：併用処置におけるＣＤ２２６およびＴＩＧＩＴの役割
ＣＤ２２６の遺伝子不活性化または薬理学的阻害は、いくつかの実験において抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１併用処置によって媒介される腫瘍退縮を明らかにした一方で、他のＴＮＦ受容体またはＢ７スーパーファミリーメンバーの阻害は、効果を有しなかった。
【０２０９】
ＣＤ２２６遮断実験
０．５ｍｇの抗ＣＤ２２６（１０Ｅ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）またはラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照ＩｇＧ（ＬＴＦ２、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ，  Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，  ＮＨ）を、腫瘍チャレンジ後５日目におよび免疫療法の１日前に、腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した。垂直腫瘍直径を、デジタルカリパス（ＶＷＲ，  Ｒａｄｎｏｒ，  ＰＡ）を使用して、１週間に２〜３回盲目的に測定した。式Ｌ×Ｗ×０．５（ここでＬは、最も長い寸法であり、Ｗは、その垂直の寸法である）を使用して容積を計算した。生存における差異を、カプラン−マイヤー法によって各群について決定し、全体のＰ値を、ＰＲＩＳＭバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）によって生存分析を使用してログランク検定によって計算した。事象を、罹病率を最小限にするために、腫瘍負荷が最大腫瘍容積において２０００ｍｍ３というプロトコルが特定したサイズに達したときに死亡と定義した。
【０２１０】
図１２および図１３に示されるように、ＭＣ３８腫瘍を有するマウスを、ＣＤ２２６遮断ＡｂまたはアイソタイプＡｂ（対照ＩｇＧ）のいずれかで、抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１またはアイソタイプＡｂでの免疫療法の１日前に処置した。平均腫瘍成長曲線（図１２）および生存曲線（図１３）を示す。データは、３回の実験（ｎ＝５匹のマウス／群、ログランク検定による生存分析）の代表である。
【０２１１】
野生型またはＴＩＧＩＴ  ＫＯマウスを、ＭＣ３８腫瘍でチャレンジし、抗ＣＤ２２６または対照ＩｇＧで処置し、アイソタイプ対照（図１４）または抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１併用療法（図１５）のいずれかを受けた。データは、２回の実験の代表である平均腫瘍成長曲線を示す（ｎ＝４〜５匹のマウス／群）。
【０２１２】
ＣＤ２２６遮断ｍＡｂを使用して、ＣＤ２２６を通じての共刺激シグナリングが併用処置によって媒介される抗腫瘍免疫のために必要とされることが示された。さらに、そのＣＤ２２６シグナリング経路は、ＴＩＧＩＴ  ＫＯマウスにおいて増強された腫瘍監視のために必要とされた（図１４および１５）。
【０２１３】
併用処置サンプルに由来するＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＲＮＡシグネチャー
併用処置サンプルに由来するクローン性に拡大したＣＤ８＋  Ｔ細胞（１１日目に採取した腫瘍）における特有の遺伝子シグネチャーを同定するために、異なる処置群にわたる包括的な比較を行った。併用療法に由来するクローン性に拡大したＣＤ８＋  Ｔ細胞においてアップレギュレートした遺伝子を、アイソタイプ処置に由来するＣＤ８＋  Ｔ細胞または併用処置で拡大しなかったＣＤ８＋  Ｔ細胞のアップレギュレートした遺伝子と比較した。ヒートマッピング分析は、比較内で重なり合う３０の遺伝子を同定した。≧２倍のＲＮＡシグネチャー変化（ｐ＜０．０１）を、腫瘍の抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１併用処置後に、その３０の遺伝子に関してその拡大したＣＤ８  Ｔ細胞集団内で観察した。それら３０の遺伝子は、Ｉｄ２、Ｓ１００ａ１１、Ｎｄｕｆｂ３、Ｓｅｒｉｎｃ３、Ｃｔｓｄ、Ｓ１００ａ４、Ｐｐｐ１ｃａ、Ｌｂｒ、Ｐｅｌｉ１、Ｌｃｐ２、Ｕｂｅ２ｈ、Ｃｄ２２６、Ｍａｐｋａｐｋ３、Ｒａｃｇａｐ１、Ａｒｆ３、Ｍｋｉ６７、Ｅｒｇｉｃ２、Ａｚｉ２、Ｄｙｎｃ１ｉ２、Ｓｉｋ１、Ｐｄｅ４ｄ、Ｐｐｐ３ｃｃ、Ｎｅｋ７、Ｅｍｃ４、Ｖａｖ１、Ｄｏｃｋ１０、Ｔｍｅｍ１７３、Ｆａｍ３ｃ、Ｐｐｐ１ｃｃ、およびＧｌｕｄ１を含む。
【０２１４】
全５つの群（すなわち、（ｉ）アイソタイプ処置、（ｉｉ）抗ＧＩＴＲ拡大ＣＤ８、（ｉｉｉ）抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１併用拡大ＣＤ８、（ｉｖ）抗ＰＤ１拡大ＣＤ８、および（ｖ）抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１併用非拡大ＣＤ８）にわたる４元比較（ｆｏｕｒ−ｗａｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を、次に、併用療法  対  単独療法の処置に際して特異的にアップレギュレートした遺伝子を同定するために行った。２つの重なり合うアップレギュレートされた遺伝子（ｐ＜０．０１、発現において≧２倍の変化）を、４元分析において同定した。ＣＤ２２６（これは、抗腫瘍応答において重要な役割を果たす共刺激分子である）を、異なる比較ペアにわたって共有される２種の遺伝子のうちの一方として同定した。処置群（すなわち、（ｉ）アイソタイプ、（ｉｉ）抗ＧＩＴＲ、（ｉｉｉ）抗ＰＤ１、および（ｉｖ）抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１併用）にわたる腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔ細胞の異なるサブセット（（ａ）合計、（ｂ）クローン性に拡大、または（ｃ）非拡大）の発現分析は、ＣＤ２２６  ｍＲＮＡレベルが、クローン性に拡大したＴ細胞に対して併用処置によって有意に増大する（倍数変化＝１０．７）一方で、この差異は、バルク（倍数変化＝３．５）および非拡大ＣＤ８＋  Ｔ細胞（有意でない）において希釈されることを明らかにした。さらに、ＣＤ２２６  ｍＲＮＡレベルは、抗ＰＤ−１（倍数変化＝６．５）および抗ＧＩＴＲ（倍数変化＝９．２）と比較して、クローン性に拡大したＣＤ８  Ｔ細胞に対して併用処置によって有意に増大した（図１６）。
【０２１５】
ＰＤ１とＣＤ２２６との間の会合
ＰＤ１分子とＣＤ２２６分子との間の潜在的な会合を、次に調査した。ＣＤ２２６がＰＤ１−Ｓｈｐ２複合体による脱リン酸化（ｄｅｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）の標的であるか否かを調べるために、本発明者らは、無細胞ラージユニラメラ小胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｌａｒｇｅ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＬＵＶ）システムにおいてＴ細胞シグナリングに関与する種々の構成成分（すなわち、ＣＤ３、ＣＤ２２６、サイトゾルチロシンキナーゼＬｃｋ、Ｚａｐ７０、ＳＬＰ７６  ５２、およびＰＩ３Ｋ（ｐ８５ａ））を再構成した。ＬＵＶ上でのＰＤ−１滴定に応じた各構成成分の感受性を、ホスホチロシン（ｐＹ）イムノブロッティングによって測定した（図１７）。本発明者らは、ＴＣＲ／ＣＤ３ζがＰＤ−１−Ｓｈｐ２による脱リン酸化の標的ではないのに対して、ＣＤ２２６が３０分間の処置後に用量依存性の様式でＰＤ１−Ｓｈｐ２によって効率的に脱リン酸化されることを確認した（図１７）。このデータは、ＰＤ−１とＣＤ２２６との間の会合を示す。
【０２１６】
次に、ＰＤ−１阻害とＣＤ２２６発現との間の関係性を、臨床状況で調査した。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析を、ＰＤ−１標的化処置前および処置後の４３名の進行したがん患者から集めた腫瘍生検に対して行った。ＣＤ２２６発現は、がん患者における抗ｈＰＤ−１処置の２用量の後に有意に増大した（図２２）。さらに、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの臨床データは問い合わせされて、ＣＤ２２６発現レベルが全体的なＴ細胞活性化強度と相関し、がん患者におけるよりよい予後を推定し得るか否かを調べた。実際に、高いベースラインＣＤ２２６発現を有する患者は、評価した２０種の異なるタイプの癌（皮膚原発の黒色腫（ｓｋｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｌａｎｍａ）、肺腺がん、頭頚部の扁平上皮がん、子宮体部子宮内膜がん（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃｏｒｐｕｓ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫、直腸腺がん、浸潤乳がん（ｂｒｅａｓｔ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎明細胞がん（ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｎａｌ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸部扁平上皮がんおよび子宮頚管内腺がん、多形性膠芽腫、結腸腺がん、胃腺がん、膀胱尿路上皮がん、甲状腺がん、前立腺がん、膵臓腺がん、脳の低悪性度神経膠腫、肺扁平上皮がん、乳頭状腎細胞がん（ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｎａｌ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、および卵巣漿液性嚢胞腺がん）のうちの５種の（皮膚原発の黒色腫、肺腺がん、頭頚部扁平上皮がん、子宮体部子宮内膜がんおよび肉腫）において有意に高い生存可能性を有する。全体的に、これらの結果は、ＣＤ２２６シグナリングをブーストしながら、最大Ｔ細胞活性化のためにＴＩＧＩＴを同時に遮断する（例えば、抗ＧＩＴＲ処置を通じて）免疫療法ストラテジーを裏付ける。
【０２１７】
ＣＤ２２６の遺伝子不活性化
ＣＤ２２６遮断ｍＡｂを使用して、本発明者らは、ＣＤ２２６を通じての共刺激シグナリングが併用処置によって媒介される抗腫瘍免疫に必要とされることを示した（図１２、図１３）。ＣＤ２２６  ＡｂがおそらくＣＤ８  Ｔ細胞のサブセットに対する潜在的枯渇効果を有し得るので、ＣＤ２２６を、その結果を確認するためにＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのマウスにおいて遺伝的に不活性化した。ＣＤ２２６−／−マウスは、Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｒｅｇｓ）ホメオスタシスに対して欠陥を示さず（図１８、パネルＡ〜Ｄ）、ＴＣＲ活性化に対して野生型マウスと同様に応答した（図１８、パネルＥ〜Ｉ）。本発明者らは、併用処置がもはやＣＤ２２６−／−マウスにおいて抗腫瘍効果も生存利益も付与しないことを観察した。このことは、ＣＤ２２６が組み合わせの観察された抗腫瘍効果に必須であったことを示唆する（図１９、パネルＡ）。ＣＤ２２６の効果は特異的である。なぜならＴＮＦ受容体スーパーファミリーの他のメンバー（ＯＸ４０Ｌまたは４−１ＢＢＬ）の阻害、またはＣＴＬＡ４−Ｉｇを使用するＢ７共刺激分子（ＣＤ２８）の遮断は、併用療法によって媒介される抗腫瘍効果を保存したからである（図１９、パネルＢ〜Ｄ）。
【０２１８】
ＴＩＧＩＴ  Ｎｕｌｌ動物におけるＣＤ２２６の要求
全体的な単一細胞ソーティングＲＮＡ−ｓｅｑおよびＦＡＣＳ表現型決定データは、抗ＰＤ−１がＣＤ２２６の発現を有利にする一方で、抗ＧＩＴＲ処理がＴＩＧＩＴの表面発現をダウンレギュレートし、Ｔ細胞の恒常的機能を相乗作用的に回復させることを示した。
【０２１９】
本発明者らは、ＣＤ２２６シグナリング経路がＴＩＧＩＴ−／−マウスにおける増強された腫瘍監視に必要とされることを示した（図１４、図１５）。さらに、ＣＤ１５５／ＰＶＲ６（これはＣＤ２２６の腫瘍リガンドである）を過剰発現するＭＣ３８腫瘍細胞を有するマウスは、ＭＣ３８−空ベクター（ＭＣ３８−ＥＶ）腫瘍細胞またはアイソタイプ対照で処置したマウスと比較して、抗ＰＤ−１または抗ＧＩＴＲまたは併用療法に際して腫瘍成長の有意な遅れを示した（図２０）。ＭＣ３８−ＣＤ１５５を移植したマウスの免疫プロファイリング分析は、移植後にＭ３８−ＥＶ（空ベクター）を超える、ＭＣ３８−ＣＤ１５５細胞上で持続したより高いＣＤ１５５発現レベルを確認した。本発明者らは、ＭＣ３８腫瘍細胞上でのＣＤ１５５過剰発現が、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＴｒｅｇ細胞上での低下した検出可能なＣＤ２２６発現と関連する（図２１Ａ）一方で、それが腫瘍内Ｔ細胞上での増強されたＩＦＮγ（図２１Ｂ）および４−１ＢＢ（図２１Ｃ）の発現によって示されるようにＴ細胞活性化をブーストすることを見出した。末梢においては効果が観察されなかった。
【０２２０】
いかなる理論によっても拘束されないが、ＣＤ２２６発現レベルが全体的なＴ細胞活性化強度と相関するはずであり、がん患者におけるより良好な予後を予測し得ることが仮定される。実際に、高いＣＤ２２６発現を有する患者は、３タイプのがん（皮膚原発の黒色腫、肺腺がんおよび肉腫）において有意により高い生存可能性を有する。これらのデータは、ＣＤ２２６シグナリングをブーストしながら最大Ｔ細胞活性化のためにＴＩＧＩＴを同時に遮断する免疫療法ストラテジーを裏付ける。
【０２２１】
前述の実験は、抗ＧＩＴＲ抗体を抗ＰＤ１抗体と組み合わせて投与することの相乗効果を示す。特に、とりわけ、上記の実験は、抗ＧＩＴＲ抗体および抗ＰＤ１抗体の組み合わせ投与が腫瘍退縮を誘導し、長期の腫瘍寛解を提供し、そして腫瘍／抗原特異的免疫記憶応答を誘導することを示す。
【０２２２】
実施例１０：ＴＣＲ分析
ＴＣＲ分析のために、本発明者らは、ランダムプライミングショートＲＮＡ配列決定リードから、ＴＣＲ配列を、特に、ＴＣＲ−ＣＤＲ３配列を再構築および抽出するために、新たなバイオインフォマティクスパイプラインｒｐｓＴＣＲを開発した。ｒｐｓＴＣＲは、ペアになった末端のおよび単一末端の短いリードを取得し、これらのリードをマウスまたはヒトのゲノムおよびトランスクリプトームへとマッピングするが、デフォルトパラメーターでＴｏｐＨａｔ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，  １１０５−１１１１  （２００９））を使用してＴＣＲ遺伝子座および転写物をマッピングしない。マッピングされたリードを捨て、マッピングされていないリードをＴＣＲ配列の抽出のためにリサイクルする。マッピングされていないリードにおける低品質ヌクレオチドをトリミングした。次いで、３５ｂｐに満たない長さを有するリードを、ＨＴＱＣツールキット（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １４，  ３３  （２０１３）を使用して除去した。ＱＣを通過した短いリードを、ｉＳＳＡＫＥ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，  ４５８−４６４  （２００９））デフォルト設定を使用してより長いリードへとアセンブリした。ＴＣＲｋｌａｓｓ（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９４，  ４４６−４５４  （２０１５））を使用して、デフォルト１．７から２へと設定したＳｃｒ（保存された残基サポートスコア）でＣＤＲ３配列を同定した。健康なヒトＰＢＭＣサンプルからの標的化ＴＣＲ−ｓｅｑデータを、陽性対照として使用して、そのパイプラインに導入した余分の工程が、ＴＣＲｋｌａｓｓ単独と比較した場合により高い偽陽性または偽陰性率を生じるか否かを評価した。
【０２２３】
ＴＣＲＢ（６４，０３１）またはＴＣＲＡ（５１，４４８）に由来する特有のＣＤＲ３配列の大部分は、ｒｐｓＴＣＲおよびＴＣＲｋｌａｓｓの両方によって検出された。ｒｐｓＴＣＲとＴＣＲｋｌａｓｓとの間の二乗相関（ｓｑｕａｒｅｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）は、ＴＣＲＢ−ＣＤＲ３およびＴＣＲＡ−ＣＤＲ３に関してそれぞれ、０．９９９９および０．９３６５であった。６つのＴＣＲ陰性がんまたは非がん細胞株を、陰性対照として使用した。ＣＤＲ３配列は、ｒｐｓＴＣＲによって検出されなかったのに対して、いくつかのＣＤＲ配列は、ＴＣＲｋｌａｓｓによっていくつかのＴＣＲ陰性がん細胞株から抽出された。
【０２２４】
対象パイプライン（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｐｉｐｅｌｉｎｅ）の性能をさらに検証するために、本発明者らは、健康なマウスＰＢＭＣサンプルを、標的化ＴＣＲ−ｓｅｑおよびランダムプライミングＲＮＡ−ｓｅｑアプローチの両方を使用して配列決定した（２００Ｍ，  ２×１００ｂｐ）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータからアセンブリされたＣＤＲ３配列の数は、標的化ＴＣＲ−ｓｅｑアプローチからのものより遙かに小さかったものの、ｒｐｓＴＣＲを使用するＲＮＡ−ｓｅｑデータから同定されたＣＤＲ３配列のうちの約４５％が、標的化ＴＣＲ−ｓｅｑに由来するＣＤＲ３配列の中でも観察された。標的化ＴＣＲ−ｓｅｑの技術的制限が原因で、本発明者らがＲＮＡ−ｓｅｑデータから抽出したＣＤＲ３配列の一部は、ＴＣＲ−ｓｅｑ結果の中に存在しなかったことは、驚くべきことではない。例えば、標的化ＴＣＲ−ｓｅｑに使用される５’  ｒａｃｅアダプターの効率は概して低く、多重ＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｐｌｙ  ＰＣＲ）は、高頻度ＴＣＲを増幅する傾向にあるので、ＴＣＲの小さな部分のみが標的化され得る。予測されるように、ＲＮＡ−ｓｅｑデータからｒｐｓＴＣＲを使用して同定されたＣＤＲ３配列のうちの遙かにより高いパーセンテージ（約７０％）が、標的化ＴＣＲ−ｓｅｑに由来する高頻度ＣＤＲ３配列（＞＝０．１％）の中でも観察されたが、わずか約４０％が、ＴＣＲｋｌａｓｓ単独を使用して抽出された。さらに、本発明者らは、１００ｂｐリード長を５０ｂｐセグメント単位で切断し、２００Ｍリードをランダムに選択した。標的化ＴＣＲ−ｓｅｑアプローチによってランク付けされた上位１０個のＣＤＲ３配列の中で、８個のＣＤＲ３配列を本発明者らのｒｐｓＴＣＲによって検出したが、３個のみがＴＣＲｋｌａｓｓによって検出された。次いで、本発明者らは、本発明者らのｒｐｓＴＣＲパイプラインを、異なる抗体で処置したＭＣ３８の腫瘍内ＣＤ８  Ｔ細胞から生成した単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータからのＣＤＲ３配列の抽出に適用した。本発明者らのＣＤＲ３＿ｂｅｔａおよびＣＤＲ３＿ａｌｐｈａ配列検出率は、ＴＣＲ配列を、Ｔ細胞の単一細胞配列決定から検出するために、標的化ＴＣＲ−ｓｅｑアプローチを使用する公開されたデータに匹敵した。
【０２２５】
本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態による範囲内に限定されるべきではない。実際に、本発明の様々な修正が、本明細書に記載されているものに加えて、前述の記載および添付の図面から、当業者には明らかになるであろう。係る修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることを企図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ−Ｆ】
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【図１８Ｇ−Ｉ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図１９Ｃ−Ｄ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
2019521098.tif 000051
【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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