(57)【要約】  本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼに関連する障害の治療のためのタンパク質補充療法に関する組成物および方法を提供する。
2019520306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、
機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）と、
前記ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と前記機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）との間に位置するヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）と
を備える融合タンパク質。
【請求項２】
前記機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）は、前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）のＣ末端側である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）は、前記機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）の前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）であるか、または前記機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）とは異種である、
請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）は、配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有するヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳ、または配列ＩＤ番号６により表されるアミノ酸配列を有するヒトリポアミドデヒドロゲナーゼＭＴＳである、
請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）は、配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有するヒトクエン酸シンターゼＭＴＳである、
請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）は、配列ＩＤ番号５により表されるアミノ酸配列を有するヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼＭＴＳである、
請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
少なくとも１つのリンカーをさらに備える、
請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）は、リンカーを介して前記機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）および／または前記ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域に結合している、
請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
少なくとも１つの精製タグをさらに備える、
請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位をさらに備える、
請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列ＩＤ番号８により表されるアミノ酸配列を有する機能性ヒトＭＣＭに結合した、配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、
配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有するヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳと
を備え、
前記ヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳは、前記ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と前記機能性ヒトＭＣＭとの間に位置し、
前記機能性ヒトＭＣＭは、前記ヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳのＣ末端側である、
融合タンパク質。
【請求項１２】
配列ＩＤ番号１８または配列ＩＤ番号１９により表されるアミノ酸配列を有する、
請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列を有する機能性ヒトＭＣＭに結合した、配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、
配列ＩＤ番号６により表されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と前記機能性ヒトＭＣＭとの間に位置するヒトミトコンドリアリポアミドデヒドロゲナーゼＭＴＳと
を備え、
前記機能性ヒトＭＣＭは、前記ヒトミトコンドリアリポアミドデヒドロゲナーゼＭＴＳのＣ末端側である、
融合タンパク質。
【請求項１４】
配列ＩＤ番号２２または配列ＩＤ番号２３により表されるアミノ酸配列を備える、
請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
生理学的に許容可能な担体と、
有効成分としての、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質と
を備える組成物。
【請求項１６】
医薬的に許容可能な担体と、
有効成分としての、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質と
を備える医薬組成物。
【請求項１７】
ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害を治療または軽減するための、
請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）を治療または軽減するための、
請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害の治療または軽減の方法における使用のための、
請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記疾患または前記障害はＭＭＡである、
請求項１９に記載の、使用のための融合タンパク質または医薬組成物。
【請求項２１】
前記ＭＭＡは、孤発性ＭＭＡ（ＯＭＩＭ２５１０００）またはメチルマロン酸血症およびホモシスチン尿症（ＯＭＩＭ２７７４００）である、
請求項２０に記載の融合タンパク質または医薬組成物。
【請求項２２】
必要としている被験者における欠陥ヒトＭＣＭ、不完全ヒトＭＣＭまたは非機能性ヒトＭＣＭの活性を少なくとも部分的に置換する方法における使用のための、
請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
それを必要としている被験者におけるＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害を治療または軽減するための方法であって、
治療上有効な量の、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験者に投与し、それにより、前記ＭＣＭ欠乏または前記欠陥ＭＣＭに関連する前記疾患または前記障害を治療または軽減する段階
を備える方法。
【請求項２４】
それを必要としている被験者におけるメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）を治療または軽減するための方法であって、
治療上有効な量の、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験者に投与し、それにより、前記ＭＭＡを治療または軽減する段階
を備える方法。
【請求項２５】
前記ＭＭＡは、孤発性ＭＭＡ（ＯＭＩＭ２５１０００）またはメチルマロン酸血症およびホモシスチン尿症（ＯＭＩＭ２７７４００）である、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
追加の治療薬を前記被験者に投与する段階をさらに備える、
請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記追加の治療薬は
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質または前記医薬組成物は、前記被験者の静脈内に投与される、
請求項２３から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
それを必要としている被験者のミトコンドリアに機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）タンパク質を導入するための方法であって、
治療上有効な量の、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験者に投与し、それにより、機能性ヒトＭＣＭタンパク質を前記被験者の前記ミトコンドリアに導入する段階
を備える方法。
【請求項３０】
前記機能性ヒトＭＣＭタンパク質により、必要としている被験者における欠陥ヒトＭＣＭ、不完全ヒトＭＣＭまたは非機能性ヒトＭＣＭの活性を少なくとも部分的に置換する、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記機能性ヒトＭＣＭタンパク質は、非欠陥ヒトＭＣＭの前記活性の少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセントまたは最大１００パーセントを、必要としている被験者に提供する、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
必要としている被験者における欠陥ヒトＭＣＭ、不完全ヒトＭＣＭまたは非機能性ヒトＭＣＭの活性を少なくとも部分的に置換する方法であって、
治療上有効な量の、請求項１から１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１６に記載の医薬組成物を前記被験者に投与する段階
を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］  本願は、２０１６年４月１２日に出願された米国仮出願第６２/３２１，３５９号の利益および優先権を主張する。当該出願の内容は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［配列表の組み込み］  ２０１７年４月１０日に作成された、サイズが６９ＫＢである、「ＢＩＯＢ００８００１ＷＯＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルのコンテンツが、ここに、参照により、それらの全体が組み込まれる。
【０００３】
本開示は概して、酵素補充療法（ＥＲＴ）における使用に適したメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）融合タンパク質構造物に関する。
【背景技術】
【０００４】
メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）は、５０，０００人から１００，０００人毎に約１人という発生率の、長期生存の予後が悪い常染色体劣性遺伝性障害である。
【０００５】
ＭＭＡの事例の約６０％は、ＭＵＴ遺伝子の突然変異から生じている。この突然変異は、スクシニルＣｏＡへのメチルマロニルＣｏＡの異性化に触媒作用を及ぼし、補助因子としてのコバラミン（Ｂ−１２）を必要とするミトコンドリア内酵素メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）の欠陥につながる。スクシニルＣｏＡは、様々なアミノ酸および脂肪にとって、クエン酸回路（または「クレブスサイクル」）への入り口地点である。
【０００６】
当技術分野において知られているように、プロピオニル−コエンザイムＡ（ＣｏＡ）を介してクレブスサイクルに入るための、分岐鎖アミノ酸であるイソロイシンおよびバリン、ならびにメチオニン、スレオニン、奇数鎖脂肪酸およびコレステロールの異化には、スクシニルＣｏＡへの１−メチルマロニルＣｏＡの異性化が必要である。上述のように、この変換は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）と、ミトコンドリアマトリクス（１）に位置する核にコードされたホモ二量体であるアポ酵素（非活性酵素）と、コバラミン（ビタミンＢ１２）由来のＭＣＭ用補助因子であるアデノシルコバラミンとに関係している。
【０００７】
通常は早期乳児期に現れる、ＭＭＡの効果は、軽度のものから命に関わるものまで多様である。罹患している幼児は、嘔吐、脱水症状、筋緊張低下（低張）、発達の遅れ、極度の疲労（無気力）、肥大肝（肝臓肥大）、および期待される速度での体重増加と成長の失敗（発育の失敗）を経験し得る。長期的合併症は、授乳問題、知的障害、慢性腎疾患、および膵臓の炎症（膵炎）を含み得る。治療しないと、この障害は、昏睡および死につながることがあり得る。
【０００８】
ビタミンＢ１２（ヒドロキソコバラミン）に無反応であるＭＭＡ患者のための現在の管理アプローチは、プロピオンアミノ酸の摂取制限、栄養補助食品の投与および絶え間のない監視を含む。肝臓移植または肝臓移植／腎臓移植の組み合わせが、最も深刻な臨床症状があるＭＭＡ患者を治療するために用いられてきた（２）。
【０００９】
ＭＭＡ患者は、肝臓移植を受けた者でさえ、漸進的な腎機能障害を発症し得（３）、尿細管間質性腎炎により病理学的に特性評価され得（４、５）、結果的に腎臓移植が必要になり得る。患者集団において、さらには集中的に治療されている者において見られる疾患の発現は、新しい治療法、理想的には、肝臓および腎臓の両方を標的にすることで安定性を増やして腎不全から保護し得る治療法が必要であることを実証している。
【００１０】
最近、ｒＡＡＶ９遺伝子療法が、Ｍｕｔ  ｃＤＮＡの肝臓導入遺伝子の２４時間以内の発現を対象にし、Ｍｕｔ−／−マウスを致死的状態から効果的に救い、長期生存を与え、代謝を大幅に向上させ、腎機能および組織構造の顕著な維持をもたらしたことが報告された。ヒトの臨床試験において用いられるものと類似の用量（１グラム当たり２．５×１０９ＧＣのｒＡＡＶ９）のベクターを、より時を経た処理済みＭｕｔ−／−マウスに体系的に再投与すると、代謝産物の循環が低下し、生体内でのプロピオナート酸化能力が増し、腎臓および肝臓に導入遺伝子の発現が生じた（６）。
【００１１】
異なる高分子を生体外および生体内で細胞に輸送するための、タンパク質移行領域（ＰＴＤ）の融合タンパク質の使用に、大きな進展があった。ＰＴＤは、大きい分子の輸送ベクターとしての役割を果たすショートペプチドの群を指す。概して、ＰＴＤは、短い、水溶性の、部分的に疎水性の、および／または多塩基の、生理ｐＨにおいて正味の正電荷を有するペプチド（多くても３０〜３５個のアミノ酸残基）と定義される。ＰＴＤは、いかなるキラルレセプタも用いることなく、また、著しい膜の損傷をもたらすことなく、低マイクロモル濃度において生体内および生体外で細胞膜に浸透できる。さらに、これらのペプチドは、高効率かつ低毒性で、静電的に取り込まれることができるか、または薬物などの生物学的活性があるカーゴを共有結合できる。この新しい種類のペプチドは、１９８０年代後期に導入された。その後、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）コード化ＴＡＴペプチドが発見され、両親媒性のショウジョウバエアンテナペディアホメオドメイン由来の１６アミノ酸浸透ペプチド（ｐＡｎｔｐ）が、その数年後に発見された。
【００１２】
ＰＴＤは、血液脳関門にわたって、または核、ミトコンドリアおよびリソソームなど、標的としての特定の細胞内サブ局在部にわたって、脳にカーゴを輸送し得る。細胞に活性酵素を輸送するこの能力は、酵素補充療法（ＥＲＴ）の開発に寄与した。これにより、不完全な、または存在しない酵素が、ＰＴＤ輸送システムに基づいて、人工的に生産され、精製され、定期的に患者に与えられている。
【００１３】
最近、ミトコンドリアに酵素またはタンパク質を輸送するための融合タンパク質が報告された（７、８）。この過去に報告された輸送システムは、タンパク質形質導入領域（ＰＴＤ）を備える融合タンパク質に基づいている。ＰＴＤは、ミトコンドリア内酵素に融合されており、細胞質膜およびミトコンドリア膜の両方を通じて移植を容易にする。この融合タンパク質は、タンパク質形質導入領域とミトコンドリア内酵素またはタンパク質との間に存在するミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）をさらに備え得る。そのような構造物は概して、ミトコンドリア障害の治療または軽減に適していると説明された（８）。
【００１４】
加えて、国際公開第２０１４／１７０８９６号は、ＰＴＤと、ＭＴＳと、ヒトミトコンドリアタンパク質とを備える融合タンパク質を開示している。融合タンパク質において、ＭＴＳは、融合タンパク質構造物中に存在するヒトミトコンドリアタンパク質とは異種である。そのような構造物も、ミトコンドリア障害の治療または軽減に適していると説明された（９）。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本明細書に開示される主題をより良く理解すべく、また、当該主題が実際にどのように実行され得るかを例示すべく、添付図面を参照して、非限定的な例としてのみ、ここで、実施形態が説明される。
【００１６】
【図１】様々なメチルマロニルＣｏＡムターゼベースの（ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ）融合タンパク質の概略図である。略語：ＴＡＴ（転写活性化因子）、ＭＴＳ（ミトコンドリア移行配列）、ＭＣＭ、ｍｕｔ（メチルマロニルＣｏＡムターゼ）、ｃｓ（クエン酸シンターゼ）、ｌａｄ（リポアミドデヒドロゲナーゼ）、Δ（ＭＴＳなし）、矢印はＴｅｖ部位を示す、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）。
【００１７】
【図２】Ａは、示される様々な細菌宿主中の融合タンパク質ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ（）の非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における発現についてのナトリウムドデシルサルフェイトポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）分析を示す。Ｂは、示される様々な細菌宿主中の融合タンパク質ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭの非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における発現についてのナトリウムドデシルサルフェイトポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）分析を示す。Ｃは、示される様々な細菌宿主中の融合タンパク質ＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭの非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における発現についてのナトリウムドデシルサルフェイトポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）分析を示す。Ｄは、示される様々な細菌宿主中の融合タンパク質ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭの非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における発現についてのナトリウムドデシルサルフェイトポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）分析を示す。
【００１８】
【図３】Ａは、Ｃｏｄｏｎ＋細菌宿主およびＲｏｓｓｅｔａ細菌宿主中の非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭの発現についてのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｂは、Ｃｏｄｏｎ＋細菌宿主およびＲｏｓｓｅｔａ細菌宿主中の非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭの発現についてのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｃは、Ｃｏｄｏｎ＋細菌宿主およびＲｏｓｓｅｔａ細菌宿主中の非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭの発現についてのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｄは、Ｃｏｄｏｎ＋細菌宿主およびＲｏｓｓｅｔａ細菌宿主中の非誘導画分（ｕｎ）、ＩＰＴＧ誘導画分（ｉｎ）、全細胞抽出画分（ＷＣＥ）および可溶性画分（ｓｏｌ）における融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭの発現についてのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｅは、構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ（Ａにおけるものと同じ）についての、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す。Ｆは、構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ（Ｂにおけるもの同じ）についての、抗ヒスチジン抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す。
【００１９】
【図４】Ａは、Ｎｉ−キレートカラム親和性クロマトグラフィを用いた、融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭの精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｂは、Ｎｉ−キレートカラム親和性クロマトグラフィを用いた、融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭの精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｃは、Ｎｉ−キレートカラム親和性クロマトグラフィを用いた、融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭの精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｄは、Ｎｉ−キレートカラム親和性クロマトグラフィを用いた、融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭの精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。略語：Ｍ（マーカ）、ＷＣＥ（全細胞抽出）、ｐｒｅ‐ｒｕｎ（精製カラム上への充填前に）、ｆｌ（流れ）。
【００２０】
【図５】Ａは、示されているＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の特性評価のためのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｂは、示されているＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の特性評価のための抗ＭＣＭ抗体を用いたウェスタンブロット分析を示す。略語：ＨＴａｌｌＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ）、ＨＴｃｓＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ）、ＨＴｌａｄＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭ）、ＨＴΔＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ）およびＭＢＰＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＭＢＰ−ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ）。
【００２１】
【図６】細胞およびそれらのミトコンドリアへのＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の取り込みのウェスタンブロット分析を示す。Ａは、抗ＭＣＭ抗体を用いた、示される量のＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ融合タンパク質で２４時間にわたってインキュベーションされた６７３線維芽細胞の全細胞抽出のウェスタンブロット分析を示す。Ｂは、抗ヒスチジン抗体を用いてＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭまたはＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭで３時間にわたってインキュベーションされた６７３線維芽細胞から孤発したミトコンドリアのウェスタンブロット分析を示す。Ｃは、抗ＭＣＭ抗体を用いてＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭまたはＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭで３時間にわたってインキュベーションされた６７３線維芽細胞から孤発したミトコンドリアのウェスタンブロット分析を示す。Ｄは、抗ＭＣＭ抗体を用いて様々な融合タンパク質構造物で３時間にわたってインキュベーションされた６７３線維芽細胞から孤発したミトコンドリアのウェスタンブロット分析である。融合タンパク質構造物Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭは、右レーンに対照として示される。略語：Ｍｉｔｏ（ミトコンドリア）、Ｍｉｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（融合タンパク質構造物なしでインキュベーションされたミトコンドリア）、ＨＴａｌｌＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ）、ＨＴｃｓＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ）、ＨＴｌａｄＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭ）ＨＴΔＭＵＴ（Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ）およびＭ（マーカ）。
【００２２】
【図７】ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物でインキュベーションされた患者の細胞における相対ＡＴＰレベルの棒グラフを示す。Ａは、これらの融合タンパク質構造物の各々でインキュベーションされた３４６線維芽細胞のＡＴＰレベルを示す。Ｂは、これらの融合タンパク質構造物の各々でインキュベーションされたＧＭ０１６７３線維芽細胞のＡＴＰレベルを示す。Ｃは、これらの融合タンパク質構造物の各々でインキュベーションされたＧＭ０００５０線維芽細胞のＡＴＰレベルを示す。線維芽細胞は、グルコースを含まない培地において４８時間にわたって増殖され（１５×１０３個の細胞）、融合タンパク質構造物の各々１μｇで６時間にわたってインキュベーションされ、次に、全細胞ＡＴＰについて分析された。結果は、平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５を表す。略語：ＴＡＴ−ＭＴＳｍｂｐ−ＭＣＭ、Ｈｉｓ−ＭＢＰ−ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ。
【００２３】
【図８】ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物でインキュベーションされた患者の細胞における相対膜電位（ＴＭＲＥ／ＭＴＧ）を示す棒グラフである。グルコースを含まない培地において４８時間にわたって増殖されたＧＭ０１６７３線維芽細胞（１５×１０３個の細胞）のミトコンドリア膜電位が、示されている融合タンパク質構造物１．５μｇで６時間にわたってインキュベーションされた。インキュベーション期間（１時間）の終了前に、２００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭが加えられた。加えて、インキュベーション期間の終了の３０分前に、２０μＭのＦＣＣＰが対照として加えられ、インキュベーション期間の終了の２０分前に、２００ｎＭのＴＭＲＥが加えられた。結果は平均値ｎ＝２を表す。略語：対照（融合タンパク質構造物が無い状況でインキュベーションされた細胞）、ＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）、ＭＴＧ（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ）およびＦＣＣＰ（カルボニルシアニド−４−（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン）。
【００２４】
【図９】ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物でインキュベーションされた患者の細胞の相対酸素消費量の棒グラフを示す。グルコースを含まない培地において４８時間にわたって増殖され、様々な融合タンパク質１μｇで６時間にわたってインキュベーションされたＧＭ０１６７３線維芽細胞（１５×１０３個の細胞）の酸素消費量。酸素消費量は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ（ＸＦ）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて決定された。結果は平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３，ｐ＜０．０５を表す。略語：ＴＡＴ−ＭＴＳｍｂｐ−ＭＣＭ（Ｈｉｓ−ＭＢＰ−ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ）、対照（タンパク質構造物が無い状況でインキュベーションされた細胞）。
【００２５】
【図１０】ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質がＭＭＡ患者の細胞の細胞生存率を増加させていることを示す。Ａは、グルコースを含まない培地において２４時間にわたって増殖された、患者のＧＭ０１６７３線維芽細胞の細胞生存率レベルを示す。Ｂは、グルコースを含まない培地において２４時間にわたって増殖された、患者のＧＭ０００５０線維芽細胞の細胞生存率レベルを示す。Ｃは、グルコースを含まない培地において２４時間にわたって増殖された、患者の３４６線維芽細胞の細胞生存率レベルを示す。  １５×１０３個の細胞が、様々な融合タンパク質１．５μｇで７２時間にわたってインキュベーションされ、次に、細胞生存率について分析された。結果は、平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５を表す。
【００２６】
【図１１】ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質がＭＭＡ患者の細胞中のＭＭＡレベルを低下させていることを示す。グルコースを含まない培地において２４時間にわたって増殖された２×１０６個のＧＭ０１６７３線維芽細胞のＭＭＡ  ＥＬＩＳＡ分析。その後、細胞は、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ０．７５μｇまたは１．５μｇのいずれかで４８時間にわたってインキュベーションされ、次に、全細胞ＭＭＡレベルについて分析された。結果は平均値±ＳＥＭ，ｎ＝４，＊ｐ＜０．０５を表す。
【００２７】
【図１２】ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質がＭＣＭ（−／−）ＨｅｐＧ２細胞からのアルブミンおよび尿素の分泌を増加させていることを示す。Ａは、増殖培地における分泌されたアルブミンレベルを示す。Ｂは、増殖培地における分泌されたアルブミンレベルを示す。Ｃは、増殖培地における分泌されたアルブミンレベルを示す。ＭＣＭタンパク質の発現を失ったことが確認された５×１０５個のＨｅｐＧ２  ＭＣＭ（−／−）細胞（Ａ）が、ＯＸＰＨＯＳ依存培地において２４時間にわたって増殖された。その後、細胞は１．５μｇのＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭで２４時間にわたって（Ｂ）、または４８時間にわたって（Ｃ）インキュベーションされ、増殖培地が収集され、５００ｇで５分間にわたって遠心分離された。抗アルブミン抗体を用いたウェスタンブロット分析によりアルブミンレベルが決定された。増殖培地の等しいアリコートが充填された。Ｄは、ＢおよびＣの定量データを示す。Ｅは、増殖培地における分泌された尿素レベルを示す。  ５×１０５個のＨｅｐＧ２  ＭＣＭ（−／−）細胞が、１．５μｇのＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭを供給した完全な培地において２４時間にわたって増殖された。その後、細胞は、１．５μｇのＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭが加えられたＯＸＰＨＯＳ依存培地において、２４時間にわたってインキュベーションされた。次に、増殖培地が収集され、１４０００ｇで５分間にわたって遠心分離され、残りの細胞は溶解された。尿素レベルがＣｏｂａｓ  ａｎａｌｙｚｅｒにより決定された。結果は、平均値±ＳＥＭ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５を表す。
【００２８】
【図１３】Ａは、マウスの組織へのＴＡＴ−ＬＡＤの輸送を示す。Ｂは、マウスの組織へのＴＡＴ−ＬＡＤの輸送を示す。Ｃは、マウスの組織へのＴＡＴ−ＬＡＤの輸送を示す。Ｄは、マウスの組織へのＴＡＴ−ＬＡＤの輸送を示す。ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭがＣ５７ＢＬマウスに注入された。異なる時点において、マウスが殺され、脳、肝臓および心臓が除去された。組織溶解物が調製され、抗メチルマロニルＣｏＡムターゼおよび抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロット分析により分析された。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）融合タンパク質構造物の構造に基づく。そのような構造物は、タンパク質形質導入領域（ＴＡＴ輸送システム）およびミトコンドリア移行配列を備えており、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害の酵素補充療法（ＥＲＴ）における使用に適している。
【００３０】
図１に概略的に示されるように、様々なＭＣＭ融合タンパク質が、それらのミトコンドリア移行配列（ＭＴＳ）を変えて調製された。用いられたＭＴＳは、メチルマロニルＣｏＡムターゼの自然ＭＴＳまたは異なるミトコンドリアポリペプチド（異種のポリペプチド）のＭＴＳ、クエン酸シンターゼ（ｃｓ）およびリポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌａｄ）である。以下に示されるように、本明細書において説明されるように調製された融合ＭＣＭタンパク質構造物の全ては、ミトコンドリア中に取り込まれているように示され、それらの活性に必要な切断を経ている。
【００３１】
従って、本開示は、その態様のうちの１つにより、ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）と、上記ＴＡＴ領域と上記機能性ヒトＭＣＭとの間に位置するヒトミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）とを備える融合タンパク質を提供する。
【００３２】
「ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）」という用語は、メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの異性化に触媒作用を及ぼす酵素を指す。この酵素は、重要な代謝経路に含まれ、作用するのにビタミンＢ１２由来のプロテアーゼ基であるアデノシルコバラミン（一般に、コバマミドと称される）を必要とする。ＭＣＭは、核ＭＵＴ遺伝子によりコード化され、染色体６ｐ２１上に位置し、３５ｋｂに及ぶ１３個のエクソンから成る。ヒトＭＣＭ前駆体は、３２個のアミノ酸および２つの機能性領域から成るＮ末端ミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）と、（β／α）８バレル（残基８８〜４２２）基質結合部位と、Ｃ末端（βα）５  Ｂ１２結合領域（残基５７８〜７５０）とを含む。２つの同一のサブユニットが、ミトコンドリアに入ってリーダー配列を除去した後、機能性酵素（１０）を形成する。
【００３３】
本明細書において用いられるＭＣＭに関して、「機能性」という用語は、本開示において説明される構造物に含まれる任意のＭＣＭポリペプチドのうち、ミトコンドリアに入って中で切断されるとその生物活性を発揮することができるものを指す。ＭＣＭの生物活性は、例えば、限定はされないが、様々な融合タンパク質構造物について本明細書において以下に説明されるものなど、当技術分野において知られている任意の方法に従って決定され得る。
【００３４】
いくつかの特定の実施形態において、機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）は、このタンパク質の全長アミノ酸配列を指す。
【００３５】
上述および他の実施形態において、ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）は、「成熟した」タンパク質、すなわち、そのミトコンドリア標的配列（ＭＴＳ）がないタンパク質を指す。さらなる特定の実施形態において、本明細書において定義されるＭＣＭは、配列ＩＤ番号８により表されるアミノ酸配列を有する。
【００３６】
さらなる実施形態において、機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）は、上記タンパク質のミトコンドリア機能を依然として維持しつつ、ＭＣＭの自然アミノ酸残基のうちの１または複数が削除されているか、別のアミノ酸残基により置換されているか、または修正されている、上記タンパク質の突然変異誘導体である。
【００３７】
理論に束縛されることを望まないので、全ての実施形態において、本開示の主題による機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）は、ミトコンドリアに入ると融合タンパク質構造物から切断され、その中で、成熟して適切に折り曲げられた活性状態で存在する。いくつかの実施形態において、ＭＴＳが切断されると、機能性ヒトＭＣＭ単位が活性ポリペプチド二量体に会合する。
【００３８】
本開示の主題による融合タンパク質は、当業者に知られている任意の方法により調製され得る。例により、本明細書において定義される融合タンパク質は、融合タンパク質構造物をコード化する関連する核酸配列を当技術分野において知られている任意の適切な発現ベクターにクローニングし、この発現ベクターを有する細胞を変換し、変換された細胞を増殖し、採取して、融合タンパク質構造物を調製することにより、標準的な分子生物学的技術およびクローニング技術により、以下に例示されるように調製され得る。次に、本明細書において定義される融合タンパク質構造物は、当業者によく知られている方法により精製され得る。
【００３９】
本発明に関して、「融合タンパク質」という用語は、大部分（必ずしもそうではない）がペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸配列に関する。本開示の融合タンパク質による「融合」という用語は、少なくとも３つの異なる発生源、すなわち、ＴＡＴ領域、ミトコンドリア標的領域（ＭＴＳ）配列および機能性ＭＣＭのアミノ酸配列が、直接、またはアミノ酸配列を結合（架橋結合、共役結合、共有結合）させる）アミノ酸リンカーを介して、のいずれかで、互いに共有結合していることを指す。融合は、ペプチドを共役させるために用いられる最新の手法を用いることによるものなど、化学共役によるものであり得る。
【００４０】
本明細書において用いられる「アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の態様で機能し得るアミノ酸類似体およびアミノ酸疑似体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコード化されたものおよび後に修正されたアミノ酸であり、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体およびアミノ酸疑似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物を指す。そのような類似体は、修正Ｒ基または修正ペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を維持している。アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される、それらの一般に知られている３文字の記号または１文字の記号のいずれかにより称され得る。
【００４１】
アミノ酸残基は、様々な基に対するそれらの化学特性に従って、とりわけ、含まれる残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づいて分割され得ることが当技術分野においてよく知られている。
【００４２】
例えば、非極性の「疎水性」アミノ酸は、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）から成る群から選択され、「極性」アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）から成る群から選択され、正に帯電したアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）から成る基から選択され、「酸性」アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン酸（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）から成る群から選択される。「塩基性」アミノ酸は、極性であり、それらのｐＫａ未満のｐＨ値で正に帯電しており、非常に親水性があるヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）から成る群から選択される。
【００４３】
本開示はさらに、本明細書において開示される核酸配列を備えるＤＮＡ構造物に関する。本開示の主題のＤＮＡ構造物はさらに、助触媒、規制要素および対照要素、本発明の核酸配列に動作可能に結合された翻訳信号、発現信号および他の信号など、追加の要素を備え得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質は、上記ヒトＭＴＳのＣ末端側である機能性ヒトＭＣＭを備える。
【００４５】
ミトコンドリアに関連するタンパク質のほとんどは、移行機構を通じた細胞質からミトコンドリアへのそれらのインポートを可能にするミトコンドリア標的（または移行）配列（ＭＴＳ）と合成される。ＭＴＳは、一度ミトコンドリアに入ると、認識されて切断され、適切な処理が可能になり、必要な場合には、ミトコンドリア酵素複合体へのアセンブリが可能になる。
【００４６】
故に、本明細書において用いられる「ミトコンドリア標的配列」、「ＭＴＳ」または「ミトコンドリア移行配列」という用語は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸配列またはそれらと結合した化合物のミトコンドリアへの移植をもたらすことができるアミノ酸配列と、それらのあらゆる生物学的に活性がある断片とを指す。本開示の主題による融合タンパク質構造物において用いられる、機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）のＮ末端に位置するＭＴＳは一般的に、約３個から約５個の不連続の塩基性アミノ酸（アルギニン／リジン）残基を含む約１５個から約４０個のアミノ酸分の長さがあり、多くの場合、数個のセリン／スレオニン残基を有するが、酸性アミノ酸（アスパラギン酸／グルタミン酸）残基はない。それらの分子構造において、これらのＭＴＳは、効率的なミトコンドリアの移植のために必須である強い塩基性両親媒性α螺旋を形成することができる。
【００４７】
本明細書において以下に詳述されるように、様々なＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の、無傷の細胞内のミトコンドリアに到達する能力を試験すべく、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）タンパク質の遺伝子コード化において突然変異体を運ぶ患者の線維芽細胞が、本明細書において説明されるように調製された様々なＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物、すなわち、ＭＣＭの自然ＭＴＳを運ぶＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍと、ＭＣＭとは異種であるＭＴＳ、すなわち、クエン酸シンターゼ（ｃｓ）およびリポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌａｄ）のＭＴＳをそれぞれ運ぶＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭとの存在下でインキュベーションされた。
【００４８】
注目すべきことには、以下に説明されるように調製されたＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の全てが、ミトコンドリアに首尾よく取り込まれ、例えば図６のＣにおいて実証される処理を経た。
【００４９】
従って、いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質では、ヒトＭＴＳは、ヒトＭＣＭのＭＴＳ（すなわち、ＭＣＭの自然ＭＴＳ）であるか、または上記ヒトＭＣＭ（すなわち、異なるミトコンドリアタンパク質／酵素のＭＴＳ）の異種である。
【００５０】
特定の実施形態において、本開示による融合タンパク質は、配列ＩＤ番号５により表されるアミノ酸配列を有するヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼＭＴＳであるヒトＭＴＳを備える。
【００５１】
さらに別の実施形態において、本開示による融合タンパク質は、両方がＭＣＭのＭＴＳを備える配列ＩＤ番号２０または配列ＩＤ番号２１により表されるアミノ酸配列を有する。
【００５２】
上述のように、ＭＣＭ、すなわち、クエン酸シンターゼ（ｃｓ）およびリポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌａｄ）のＭＴＳをそれぞれ含むＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭとは異種であるＭＴＳを運ぶ融合タンパク質構造物も、ミトコンドリアに取り込まれ、その中で切断を経たものとして示されている。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、「異種」という用語は、本開示による機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）に融合されたＭＴＳに言及する場合、別の（別個の）ミトコンドリアタンパク質または酵素から取得されたＭＴＳ、すなわち、ＭＣＭの天然に存在しないＭＴＳ（例えば、限定はされないが、クエン酸シンターゼのＭＴＳまたはリポアミドデヒドロゲナーゼのＭＴＳ）であるＭＴＳを意味するものと解釈されるべきである。
【００５４】
故に、いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質は、配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有するヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳまたは配列ＩＤ番号６により表されるアミノ酸配列を有するヒトリポアミドデヒドロゲナーゼＭＴＳであるヒトＭＴＳを備える。
【００５５】
特定の実施形態において、本開示による融合タンパク質は、配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有するヒトクエン酸シンターゼＭＴＳであるヒトＭＴＳを備える。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本開示により提供される融合タンパク質は、配列ＩＤ番号８により表されるアミノ酸配列を有する機能性ヒトＭＣＭに結合した、配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有するヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳとを備える。上記ＭＴＳは、上記ＴＡＴ領域と上記機能性ヒトＭＣＭとの間に位置し、上記ＭＣＭは、上記ＭＴＳのＣ末端側である。
【００５７】
特定の実施形態において、ヒトミトコンドリアクエン酸シンターゼＭＴＳを備える、本開示による融合タンパク質は、配列ＩＤ番号１８または配列ＩＤ番号１９により表されるアミノ酸配列である。
【００５８】
他の特定の実施形態において、本開示による融合タンパク質は、配列ＩＤ番号６により表されるアミノ酸配列を有するヒトリポアミドデヒドロゲナーゼＭＴＳであるヒトＭＴＳを備える。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本開示により提供される融合タンパク質は、配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列を有する機能性ヒトＭＣＭに結合した、配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列を有するＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、配列ＩＤ番号６により表されるアミノ酸配列を有するヒトミトコンドリアリポアミドデヒドロゲナーゼＭＴＳとを備える。上記ＭＴＳは、上記ＴＡＴ領域と上記機能性ヒトＭＣＭとの間に位置し、上記ＭＣＭは、上記ＭＴＳのＣ末端側である。
【００６０】
特定の実施形態において、本開示による融合タンパク質は、配列ＩＤ番号２２または配列ＩＤ番号２３により表されるアミノ酸配列を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーをさらに備える。少なくとも１つのリンカーは、融合タンパク質構造物の異なる領域を共有結合させる。
【００６２】
本開示に関して、「リンカー」という用語は、異なる融合タンパク質領域間に位置し、それらを共に共有結合させる約４個から約２０個のアミノ酸残基から成るアミノ酸配列を意味する。例えば、本発明によるリンカーは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸分の長さであり得る。リンカーは、隣接するタンパク質領域が互いに対して自由に移動できるように、柔軟なアミノ酸残基、例えば、限定はされないが、グリシンおよびセリンで構成されることが多い。「リンカー」という用語は、「スペーサ」と同じ意味で用いられ得る。
【００６３】
タンパク質の様々な領域を適切に折り曲げることを可能にする、リンカーの設計が当技術分野においてよく知られている。本開示によるリンカーの非結合の例は、アミノ酸配列ＭＧＳＳ（配列ＩＤ番号９により表される）、ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭ（配列ＩＤ番号１０により表される）、ＧＳＤＰＮＳＳＳ（配列ＩＤ番号１１により表される）、ＧＳＤＰ（配列ＩＤ番号１２により表される）、ＧＳＤＰＭ（配列ＩＤ番号１３により表される）、ＧＳＳ（配列ＩＤ番号１４により表される）、ＮＧＩＥ（配列ＩＤ番号１５により表される）、ＮＩ（配列ＩＤ番号１６により表される）のいずれかである。
【００６４】
本発明に関して、融合タンパク質は、以下に例示される融合タンパク質の場合、任意選択的に、そのＮ末端に少なくとも１つのメチオニン（Ｍ）残基も備え得る。メチオニンは、ＴＡＴ領域のＮ末端に位置する。
【００６５】
融合は、本質的に全ての結合がペプチド結合であるように、組み換え技術、すなわち、融合タンパク質全体の核酸配列コード化（全セグメントのコード化）の構築によっても実現され得る。
【００６６】
本明細書において説明されるタンパク質構造物の精製を容易にすべく、本開示による融合タンパク質構造物は、最終的な融合構造物において除去または維持され得るＮ末端タグ（例えば、以下に例示されるＨｉｓタグ、つまり、いくつかであるが名称を挙げると、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＦＬＡＧオクタペプチド）も備え得る。そのようなタグは通常、ミトコンドリアに入ると、ＴＡＴ配列およびＭＴＳ配列と共に融合タンパク質から切断される。
【００６７】
故に、いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質は、少なくとも１つの精製タグ（精製を容易にすべく、例えば、Ｈｉｓタグまたはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ）をさらに備える。
【００６８】
また、精製タグは、プロテアーゼ切断部位を精製タグの近くの適切な部位に挿入することにより、本開示による融合タンパク質構造物から切断され得る。従って、いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質は、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位をさらに備える。
【００６９】
例えば、配列ＩＤ番号１８により表される融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭは、そのＮ末端からＣ末端にわたって、（配列ＩＤ番号９により表される）アミノ酸配列ＭＧＳＳを有するリンカーと、（配列ＩＤ番号１により表されるアミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨを有する）ヒスチジンタグと、配列ＩＤ番号１０により表されるアミノ酸配列ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭを有する追加のリンカーと、（配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）ＴＡＴ領域と、（配列ＩＤ番号１２により表される）アミノ酸配列ＧＳＤＰを有するさらなるリンカーと、（配列ＩＤ番号４により表される）クエン酸シンターゼのＭＴＳと、ＭＴＳとＭＣＭとの間に位置し、（配列ＩＤ番号１４により表される）アミノ酸配列ＧＳＳを有する追加のリンカーと、（配列ＩＤ番号８により表される）ＭＣＭタンパク質とを備える。
【００７０】
従って、いくつかの実施形態において、本開示による融合タンパク質は、リンカーを介して上記機能性ＭＣＭおよび／または上記ＴＡＴに結合したＭＴＳを備える。
【００７１】
上述のように、本明細書において定義される融合タンパク質構造物は、ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）領域も備える。本明細書において用いられる場合、「ＨＩＶ−１転写活性化因子（ＴＡＴ）」領域という用語は、タンパク質のうちＨＩＶ−１中のｔａｔ遺伝子によりコード化された部分であって、ＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質のうち、１１アミノ酸アルギニンリジンが豊富な部分を指す。いくつかの実施形態において、本明細書説明されるＴＡＴは、配列ＩＤ番号２において記載されるアミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する。
【００７２】
本開示の主題は、上記の定義されたＴＡＴ領域の任意の断片も含む。例えば、本開示の主題によるＴＡＴ領域は、アミノ酸配列ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列ＩＤ番号２）を有するＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の約３個から約１１個（例えば、４個から１１個、５個から１１個、６個から１１個、７個から１１個、８個から１１個、９個、１０個または１１個）の連続したアミノ酸残基を備え得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、上記の定義されたＴＡＴ領域の断片は、以下に例示される融合タンパク質構造物の調製に用いられる、配列ＩＤ番号３において記載されるアミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有するＨＩＶ−１Ｔａｔタンパク質の９個の連続したアミノ酸残基を備える。
【００７４】
故に、本開示の主題の上記の実施形態および他の実施形態において、融合タンパク質は、そのＮ末端にＴＡＴ領域を備え、そのＣ末端に機能性ＭＣＭを備える。これらの両方が、上記ＴＡＴ領域と上記機能性ＭＣＭとの間に位置するＭＴＳに共有結合（融合）している。言い換えると、本開示は、図１に概略的に示されるように、機能性ＭＣＭのＮ末端に融合したＭＴＳのＮ末端に融合したＮ末端ＴＡＴを備えるタンパク質構造物を提供する。
【００７５】
本開示は、その態様のうちの別の１つにより、生理学的に許容可能な担体と、有効成分としての本明細書において定義される融合タンパク質とを備える組成物を提供する。
【００７６】
本開示は、その態様のうちのさらに別の１つにより、医薬的に許容可能な担体と、有効成分としての本明細書において定義される融合タンパク質とを備える医薬組成物を提供する。
【００７７】
本明細書において定義される「組成物」は概して、その浸透圧を調節する薬剤である緩衝剤、ならびに、任意選択的に、当技術分野において知られている１または複数の医薬的に（または生理学的に）許容可能な担体、希釈剤、添加剤および賦形剤を備える。補助的な有効成分も組成物に組み込まれ得る。この医薬的に許容可能な担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレン、グリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。各担体は、他の成分と融和性があり患者にとって有害ではないという意味において、場合によっては生理学的または医薬的に許容可能であるべきである。
【００７８】
添加剤は、プロテアーゼ阻害剤、例えば、フッ化フェニルメタンスルホニルまたはフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ナファモスタットメシレート、４−（２−アミノエチル）フッ化ベンゼンスルフォニル塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ベスタチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４、ロイペプチン、１，  １０−フェナントロリンと、当技術分野において知られている任意の他のプロテアーゼ阻害剤とのうちの少なくとも一方であり得るが、それらに限定されない。
【００７９】
本開示の主題の「医薬組成物」は、当技術分野において知られている、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバントおよび／または賦形剤および／または添加剤を備える上述の組成物である。
【００８０】
以下に詳述されるように、本明細書において説明されるように調製された様々なミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物は、ミトコンドリアに取り込まれ、それらの活性形への切断を経る。このことは、ＭＭＡ患者から取得されたＧＭ０１６７３細胞のミトコンドリアにおける酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）により生成されたＡＴＰに影響を及ぼすという融合タンパク質構造物の能力を介して、生体外で実証された。図７のＢに示されるように、様々な融合タンパク質構造物での治療時にＡＴＰレベルの１５〜２５％の増加が観測され、一方で、融合タンパク質構造物ＴＡＴ‐ＭＴＳｃｓ‐ＭＣＭが最大の増加をもたらした。加えて、図９に示されるように、ミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物は、ミトコンドリアによる酸素消費に影響を及ぼすものとしてＧＭ０１６７３線維芽細胞中に示された（図９）。ミトコンドリア活性の追加のマーカである。
【００８１】
さらに、ミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物は、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）患者のＧＭ０１６７３細胞の細胞生存率に影響を及ぼすものとしても示された。図１０に示されるように、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ（２７％）融合タンパク質構造物およびＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭ（２４％）融合タンパク質構造物を有するＧＭ０１６７３線維芽細胞において、この対照と比べて著しい細胞生存率の向上が観測された。
【００８２】
従って、本開示は、さらに別の態様により、本明細書において定義される、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害を治療または軽減するための医薬組成物を提供する。
【００８３】
当技術分野において知られているように、また、本明細書において用いられる場合、「ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害」という用語は、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭが有る被験者に影響を及ぼすあらゆる疾患、障害、状態または病気を指す。ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭは、限定されないが、ＭＣＭをコード化するＭＵＴ遺伝子における突然変異から生じ得る。
【００８４】
「ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害」という用語は、例えば、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）を含む。
【００８５】
上記の実施形態および他の実施形態において、本明細書において定義されるＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する障害または疾患は、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）である。
【００８６】
当技術分野において知られ、本明細書において用いられる「メチルマロン酸血症」（ＭＭＡ）という用語は、メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの異性化に触媒作用を及ぼし、補助因子としてのコバラミン（Ｂ１２）を必要とするミトコンドリア内酵素メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）における突然変異から生じる常染色体劣性遺伝性障害を指す。従って、ＭＣＭまたはアデノシルコバラミンのいずれかの欠乏により、メチルマロン酸血症が生じる。
【００８７】
ＭＭＡは、孤発性メチルマロン酸血症（ＯＭＩＭ  ２５１０００）およびメチルマロン酸血症ならびにホモシスチン尿症（ＯＭＩＭ  ２７７４００）を含む。
【００８８】
従って、本開示のいくつかの実施形態において、ＭＭＡは孤発性ＭＭＡ、ＯＭＩＭ  ２５１０００である。ｍｕｔ型ＭＭＡ（ＯＭＩＭ  ２５１０００）としても知られる「孤発性メチルマロン酸血症」は、当技術分野において知られ、本明細書において定義される常染色体劣性遺伝障害であり、一般に、代謝性アシドーシスおよび高アンモニア血症と共に現れる。兆候が発現した年齢およびコバラミンに対する生体内の反応は、疾患の経過および存続の最も強い予測子である。遺伝子型と表現型の相関関係は、特に、ＭＣＭ（１１）をコード化するＭＵＴ遺伝子において、同型接合突然変異体および複合異型接合突然変異体の両方の混合物および存在量に起因して限定されてきた。孤発性メチルマロン酸血症（ＯＭＩＭ  ２５１０００）とも称されるｍｕｔ型ＭＭＡは、核ＭＵＴ遺伝子によりコード化されるＭＣＭアポ酵素の欠陥により生じる。
【００８９】
通常は早期乳児期に現れるＭＭＡの効果は、軽度から命に関わる程度まで多様である。罹患している幼児は、嘔吐、脱水症状、筋緊張低下（低張）、発達の遅れ、極度の疲労（無気力）、肥大肝（肝臓肥大）、および期待される速度での体重増加と成長の失敗（発育の失敗）を経験し得る。長期的合併症は、授乳問題、知的障害、慢性腎疾患、および膵臓の炎症（膵炎）を含み得る。治療しないと、この障害は昏睡および死につながることがあり得る。
【００９０】
ビタミンＢ１２（ヒドロキソコバラミン）に無反応であるＭＭＡ患者のための現在の管理アプローチは、プロピオンアミノ酸の摂取制限、栄養補助食品の投与および絶え間のない監視を含む。肝臓移植または肝臓移植／腎臓移植の組み合わせが、最も深刻な臨床症状があるＭＭＡ患者を治療するために用いられてきた。
【００９１】
ＭＭＡ患者は、肝臓移植を受けた者でさえ、漸進的な腎機能障害を発症し得、結果的に腎臓移植が必要になり得る。患者集団において、さらには集中的に治療されている者において見られる疾患の発現は、新しい治療法、理想的には、肝臓および腎臓の両方を標的にすることで安定性を増やして腎不全から保護し得る治療法が必要であることを実証している。
【００９２】
本開示は、本明細書において定義される、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害を治療または軽減する方法における使用のための融合タンパク質または医薬組成物をさらに提供する。
【００９３】
またさらに、本開示は、それを必要としている被験者におけるＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害を治療または軽減するための方法を提供する。上記方法は、治療上有効な量の、本開示による融合タンパク質または医薬組成物を上記被験者に投与し、それにより、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害を治療または軽減する段階を備える。
【００９４】
本明細書において定義される「治療する」、「治療」、「軽減」という用語またはそれらの活用形は、それを必要としている被験者の疾患または状態、すなわち、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または状態、例えばメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）の悪化を阻止し、または当該疾患または当該状態を停止し、もしくは軽減し、または治癒させることを意味する。
【００９５】
本発明に関して、「治療」、「治療する」または「軽減」という用語は、それが当該疾患をもたらす突然変異した遺伝子を変化させない場合、当該疾患の完全な治癒を指さない。この用語は、当該疾患に関連する望ましくない兆候のうちの少なくとも１つを軽減すること、被験者の生活の質を向上させること、疾患により生じる死亡を減らすこと、または、（当該治療が十分早期に施されている場合に）ミトコンドリア障害の完全な発現を、主に、高いエネルギー需要がある臓器および組織にミトコンドリア障害が生じる前に阻止することを指す。
【００９６】
言い換えると、本開示は、本明細書において定義される融合タンパク質もしくは医薬組成物、または、必要としている被験者における欠陥ヒトＭＣＭ、不完全ヒトＭＣＭもしくは非機能性ヒトＭＣＭの活性を少なくとも部分的に置換するために上記融合タンパク質もしくは上記医薬組成物を投与する段階を備える方法を提供する。
【００９７】
従って、本開示は、さらに別の態様により、必要としている被験者における欠陥ヒトＭＣＭ、不完全ヒトＭＣＭまたは非機能性ヒトＭＣＭの活性を少なくとも部分的に置換するための方法を提供する。上記方法は、治療上有効な量の、本明細書に定義される融合タンパク質または医薬組成物を上記被験者に投与する段階を備える。
【００９８】
本明細書において用いられる「置換」という用語は、欠陥ＭＣＭまたは非機能性ＭＣＭを置き換えるか、交換するか、その代わりに用いるか、またはその代替物として用いることを意味する。
【００９９】
いくつかの実施形態において、機能性ヒトＭＣＭタンパク質は、必要としている被験者における欠陥ヒトＭＣＭ、不完全ヒトＭＣＭまたは非機能性ヒトＭＣＭの活性を少なくとも部分的に置換する。特定の実施形態において、機能性ヒトＭＣＭタンパク質は、必要としている被験者において、非欠陥ヒトＭＣＭの活性の少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセントまたは最大１００パーセントを提供する。
【０１００】
本開示は、機能性ヒトメチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）タンパク質を、それを必要としている被験者のミトコンドリアに導入するための方法をさらに提供する。上記方法は、治療上有効な量の、本開示による融合タンパク質または医薬組成物を上記被験者に投与し、それにより、上記被験者のミトコンドリアに機能性ヒトＭＣＭタンパク質を導入する段階を備える。
【０１０１】
治療用組成物（もしくは製剤）または医薬組成物は、当業者により決定される任意の従来の経路および投与量で投与され得る。投与は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与および髄腔内投与のうちのいずれか１つであり得る。経口投与も考えられる。
【０１０２】
特定の実施形態において、本明細書において定義される融合タンパク質または医薬組成物は、上記被験者に静脈内投与される。
【０１０３】
本明細書に定義される目的で、本開示による融合ペプチドの「治療上有効な量」（または（複数の）量）という用語は、病状を治癒するか、または少なくとも停止するか、もしくは少なくとも軽減すべく、当技術分野において知られている考慮事項により定められる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、各患者について、その患者のＭＣＭの基底タンパク質の活性に基づいて個別に決定され得る。患者の基底タンパク質の活性またはタンパク質の活性レベルは、同様に、当技術分野において知られている任意の方法を用いて決定され得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、本開示による方法は、上記被験者に追加の治療薬を投与する段階をさらに備える。
【０１０６】
ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害（例えば、ＭＭＡ障害）に関して、「追加の治療薬」という用語は、例えば、プロピオンアミノ酸の摂取制限および栄養補助食品の投与といった、当業者に知られている投薬治療のあらゆる標準である。
【０１０７】
本明細書において用いられる「被験者」という用語は、例えば、本明細書において定義される治療薬または本発明の任意の医薬組成物の投与が所望されるラット、マウス、犬、猫、モルモット、霊長類およびヒトなど、任意の温血動物、すなわち、ＭＣＭ欠乏または欠陥ＭＣＭに関連する疾患または障害（例えば、ＭＭＡ）が有ると診断された被験者を意味する。
【０１０８】
本明細書において用いられる「約」という用語は、最大で１％、より具体的には、最大で５％、より具体的には、最大で１０％、より具体的には、最大で１５％のずれがあり得る値、および、いくつかの場合においては、言及される値より最大で２０％高いか、または低い値を示す。ずれの範囲は、整数値を含み、該当する場合には、連続した範囲を構成する非整数値も含む。
【０１０９】
明確にするために別個の実施形態に関して説明される、本開示の主題の特定の特徴は、単一の実施形態における組み合わせでも提供され得ることが理解されよう。逆に、簡潔性のために単一の実施形態に関して説明される、本発明の様々な特徴はまた、別々に、もしくは任意の適切なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の説明される実施形態において適切に提供され得る。様々な実施形態に関して説明される特定の特徴は、それらの実施形態の必須の特徴とみなされるべきではない。ただし、それらの要素がないと当該実施形態が動作不能である場合を除く。
【０１１０】
開示され、説明されたので、本発明は、本明細書において開示された特定の例、工程段階および材料に、そのような工程段階および材料がある程度変わり得るので、限定されないことが理解されるべきである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されるので、本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられており、限定を意図していないことも理解されるべきである。
【０１１１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、内容に別段の明確な規定がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。
【０１１２】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の必要がない限り、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語ならびにその変形である「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、あらゆる他の整数もしくは段階または整数もしくは段階の群の除外ではなく、記載される整数もしくは段階または整数もしくは段階の群の包含を示唆するものと理解される。
【０１１３】
別途定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書において説明される本発明の目的で定義される。
【０１１４】
以下の実施例は、本発明の態様の実行において発明者により使用された技術を表す。これらの技術は本発明を実施するための好ましい実施形態の例示であるが、当業者であれば、本開示を考慮すると、本発明の趣旨および意図される範囲から逸脱することなく多数の修正がなされ得ることを認識するであろう旨が理解されるべきである。
【０１１５】
［実施例］
さらに詳しく述べなくとも、当業者であれば、前述の説明を用いて、本発明をその最大限で利用し得ると考えられる。従って、以下の好ましい特定の実施形態は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、決して、特許請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。
【０１１６】
当技術分野において知られているが本明細書において特に説明されていない標準的な分子生物学のプロトコルが概して、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１年出版）におけるとおりに順守されている。
【０１１７】
［実施例１：一般的な方法］
［細胞培養］
メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）患者の線維芽細胞（ＧＭ０１６７３、ＧＭ０００５０）が、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ（ニュージャージー州カムデン）から取得され、推奨される培地（イスラエルの生物学系企業Ｂｅｉｔ  Ｈａ'ｅｍｅｋの、１０％ハイクローンＦＢＳ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを加えたＭＥＭ  ｅａｇｌｅ  ＲＰＭＩ培地）において増殖された。３４６線維芽細胞が、Ｈａｄａｓｓａｈ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｅｎｔｅｒのｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓから取得され、上記培地と同じ培地において増殖された。全ての細胞系が、加湿された雰囲気の５％ＣＯ２において、３７℃で増殖された。
［表１：融合タンパク質構造物のアミノ酸配列およびそれらの成分］
［プラスミド構造物］
【表１】
2019520306.tif 000003
【表１０】
2019520306.tif 000004
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
2019520306.tif 000007
【表１４】
2019520306.tif 000008
【表１５】
2019520306.tif 000009
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
2019520306.tif 000012
【表１９】
2019520306.tif 000013
【０１１８】
［タンパク質の発現］  本明細書において上記で説明される融合タンパク質ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質をコード化するプラスミドで変換された大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  （λＤＥ３）またはＲｏｓｓｅｔａコンピテント細胞が、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１２．５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含む生理食塩水ラクトース培地（ＳＬＢ培地）において３７℃でインキュベーションされた。Ｏ．Ｄ．６００が０．２〜０．３の時点で、０．１％グリセロールおよび０．１ｍＭカリウムグルタミン酸が培養物に加えられた。次に、この培養物が、４２℃で２０〜３０分間にわたって、熱ショックにさらされた。その後、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、終濃度については以下の表１を参照されたい）を加えることによりＯ．Ｄ．６００が０．８の時点でタンパク質の発現が誘導されるまで、細菌が３７℃で増殖された。１２℃で１８時間のインキュベーションの後に、これらの細胞は、遠心分離（４℃、２０００ｇで２０分間）により採取された。  以下の表２は、ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質の発現条件を要約したものである。
［表２：融合タンパク質構造物の増殖条件および濃度］
【表２】
2019520306.tif 000014
【０１１９】
［タンパク質の精製］  精製手順のために、発現した細胞の培養物４リットルから得られた細菌ペレットが、リゾチーム０．２ｍｇ／ｍｌを含む結合緩衝液（ｐＨ８．０のＴｒｉｓＨＣｌ  ２５ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．２Ｍ、１０％グリセロール、ベータメルカプトエタノール５ｍＭ、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）１ｍＭ）中で、マイクロフルダイザー（マイクロフルイディクス）を用いて破砕された。この懸濁液が遠心分離（４℃、２４，０００ｇで１時間）により清澄され、イミダゾール（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が終濃度１０ｍＭまで加えられた。融合タンパク質を含む上澄みが、（結合緩衝液中で）予め平衡化されたＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（ＨＰ）カラム（スウェーデン、ウプサラのＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に充填された。イミダゾールの濃度を増やしながら段階的に加えることにより、カラムが洗浄された。最終的に、標的タンパク質が溶出緩衝液（結合緩衝液、イミダゾール２５０ｍＭ）で溶出された。全ての精製手順は、ＦＰＬＣシステムＡＫＴＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実行された。精製されたタンパク質をＰＤ−１０脱塩カラム（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳに転写することにより、イミダゾールが除去された。タンパク質のアリコートが、使用されるまで、−８０℃で凍結したままで保たれた。
【０１２０】
［タンパク質濃度の決定］  タンパク質濃度が、ブラッドフォード試薬およびＢＳＡ標準曲線を用いて、ブラッドフォード法に従って測定された。タンパク質濃度は、波長５９５ｎｍにおいて決定された。
【０１２１】
［電気泳動によるタンパク質の分離］  様々なタンパク質画分（タンパク質５〜２０μｇ／レーン）から得た試料が１２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルに充填された。
【０１２２】
［ウェスタンブロット分析］  試料が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離された。次に、タンパク質がイモビロン−Ｐ転写膜（米国マサチューセッツ州ブラッドフォード、ミリポア）上に電気的に転写された。関連するタンパク質を識別するために、それぞれ希釈倍率１：１０００および１：３０，０００の抗ＭＣＭ（米国マサチューセッツ州のＡｂｃａｍ）抗体または抗ヒスチジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体のいずれかを用いて、ウェスタンブロット分析が実行された。強化化学発光キット（ＥＺ−ＥＣＬ、イスラエルの生物学系企業Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ）を用いてバンドの可視化が行われた。
【０１２３】
［ミトコンドリアの孤発］  分画遠心法を用いて、ミトコンドリアが孤発された。細胞が緩衝液Ａ（３２０ｍｍｏｌ／Ｌスクロース、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４のＥＧＴＡ  ２ｍｍｏｌ／Ｌ）中で均質化され、核および細胞の破片を除去するために２，０００ｇで３分間にわたって遠心分離された。ミトコンドリアをペレットするために、取得された上澄みが、４℃、１２，０００ｇで１０分間にわたって遠心分離された。ミトコンドリアペレットが再び緩衝液Ａで２回洗浄され、使用まで８０℃で保たれた。
【０１２４】
［細胞への融合タンパク質の輸送］  細胞が３つのＴ−７５フラスコで培養された。細胞が９０％の合流に達した時に、培地が、様々な期間にわたって、ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物０．０２〜０．０５μｇ／μｌ（終濃度）を含む未使用の培地で置換された。インキュベーション後、細胞がホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、トリプシン処理され、ペレットされてから、使用まで８０℃で保たれた。ペレットが、ＰＭＳＦ１ｍｍｏｌ／Ｌを含む細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で再懸濁され、氷上で１０分間にわたって保たれ、１５，０００ｇで１０分間にわたって遠心分離された。上澄みがウェスタンブロット法により分析された。
【０１２５】
［ＡＴＰレベルの測定］  （Ｄ−グルコース、ナトリウム、ピルビン酸およびＬ−グルタミンを含まない）ＤＭＥＭと、認証されている透析後１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、Ｌ−グルタミン２ｍＭと、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬと、ストレプトマイシン（イスラエルの生物学系企業Ｂｅｉｔ  Ｈａ'ｅｍｅｋ）１００μｇ／ｍＬと、ＭＣＭの必須補助因子であるビタミンＢ１２  １．２５μＭと、ガラクトース（シグマ）５ｍＭとを含むがグルコースを含まない培地において、細胞が４８時間にわたって培養された。
【０１２６】
４つの融合タンパク質構造物の各々１μｇのインキュベーション後、ミトコンドリアＡＴＰレベルが６時間決定された。ＡＴＰレベルが、製造業者の指示（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に従って、ＡＴＰＬｉｔｅ発光ベースアッセイを用いて測定され、対照患者の細胞、すなわち、（ＰＢＳのみが加えられた）融合タンパク質構造物のいずれでも治療されていない患者の細胞に対するレベルとして表されている。
【０１２７】
［ミトコンドリア膜電位］  ミトコンドリア含有量およびミトコンドリア膜電位が、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ（ＭＴＧ）（米国オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）（米国マサチューセッツ州のＡｂｃａｍ）をそれぞれ用いて概算された。ＭＴＧが既存の培地に終濃度２００ｎＭまで加えられ、これらの細胞が、３７℃の５％ＣＯ２で４５分間にわたってインキュベーションされた。ＴＭＲＥが既存の培地に終濃度２００ｎＭまで連続的に加えられ、これらの細胞が、３７℃の５％ＣＯ２でさらに２０分間にわたってインキュベーションされた。培地が、除去され、ＭＴＧについてはＰＢＳで、またはＴＭＲＥについてはＰＢＳ中の０．２％ＢＳＡで一度すすぎをした後に、ＰＢＳ１００μｌで置換された。プレートは、３７℃で、λｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５２８ｎｍ（ＭＴＧ）、およびλｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍ（ＴＭＲＥ）において読み取られた。
【０１２８】
［酸素消費量］  酸素消費速度（ＯＣＲ）が、ＸＦ２４  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｌｕｘ  ａｎａｌｙｚｅｒ（米国マサチューセッツ州北ビルリカのＳｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定された。
【０１２９】
［細胞生存率試験］  細胞が、９６ウェルプレートにおいて、グルコースを含まない培地１００μｌ中で２４時間にわたって培養された（ウェル１つ当たり細胞１５，０００個）。翌日、融合タンパク質１．５μｇが７２時間にわたって加えられた。ミトコンドリア孤発緩衝液単体が対照として用いられた。細胞生存率が、製造業者のマニュアルに従って、蛍光ベースアッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）を用いて分析された。
【０１３０】
［実施例２］
［ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の構造、発現および精製］
メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）に基づく融合タンパク質でミトコンドリアを効率的に標的にすることの実現可能性を試験すべく、転写活性化因子（ＴＡＴ）領域と、様々な異なるミトコンドリア移行配列（ＭＴＳ）とを備えるＭＣＭベースの融合タンパク質構造物が上記で詳述されるように調製され、分析された。
【０１３１】
用いられたＭＴＳは、ＭＣＭの均質な自然ＭＴＳ、またはヒトＭＣＭタンパク質をミトコンドリアの標的にする従来のＭＴＳ配列である核にコードされたミトコンドリアタンパク質であるヒトの異種ＭＴＳのいずれかだった。用いられた異種ＭＴＳは、リポアミドデヒドロゲナーゼ（本明細書において、配列ＩＤ番号６により表されるアミノ酸配列を有する「ｌａｄ」または「ＬＡＤ」とも称される）のものだった。これらのそれぞれの融合タンパク質構造物は、本明細書において、配列ＩＤ番号４により表されるアミノ酸配列を有する、クエン酸シンターゼ（ｃｓ）の「ＴＡＴ−ＭＴＳＴｌａｄ−ＭＣＭ」と称される。これらのそれぞれの融合タンパク質構造物は、本明細書において、「ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ」およびＭＣＭ（配列ＩＤ番号５により表されるアミノ酸配列を有するｍｃｍ）の自然ＭＴＳと称される。これらのそれぞれの融合タンパク質構造物は、本明細書において、「ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ」と称される。
【０１３２】
さらに、本明細書において「ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ」と称される、ＭＴＳが無い融合タンパク質構造物が調製された。
【０１３３】
プラスミドの全てが、それらの精製を容易にするためにそれらのコード化配列の５'末端においてＨｉｓタグでクローニングされ、コード化配列の全てが、Ｔ７促進剤の制御下に置かれた。
【０１３４】
様々な融合タンパク質構造物の概略図が図１に示される。上述のように調製された様々な融合タンパク質構造物の配列が表１に詳述されている。表１に示されるように、クエン酸シンターゼ（ｃｓ）のＭＴＳを備える２個の融合タンパク質構造物が調製された。「ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ」および「ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ変異体」ならびにそれらのアミノ酸配列はそれぞれ、配列ＩＤ番号１８および配列ＩＤ番号１９により表される。
【０１３５】
配列ＩＤ番号１８により表される融合タンパク質構造物（ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ）は、そのＮ末端からＣ末端にわたって、（配列ＩＤ番号９により表される）アミノ酸配列ＭＧＳＳを有するリンカーと、（配列ＩＤ番号１により表されるアミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨを有する）ヒスチジンタグと、配列ＩＤ番号１０により表されるアミノ酸配列ＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨＭを有する追加のリンカーと、（配列ＩＤ番号３により表されるアミノ酸配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する）ＴＡＴ領域と、（配列ＩＤ番号１２により表される）アミノ酸配列ＧＳＤＰを有するさらなるリンカーと、（配列ＩＤ番号４により表される）クエン酸シンターゼのＭＴＳと、ＭＴＳとＭＣＭとの間に位置し、（配列ＩＤ番号１４により表される）アミノ酸配列ＧＳＳを有する追加のリンカーと、（配列ＩＤ番号８により表される）ＭＣＭタンパク質とを備える。
【０１３６】
配列ＩＤ番号１９により表される融合タンパク質構造物（ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ変異体）は、表１から明らかであるように、リンカーＧＳＳを備えない。従って、この融合タンパク質構造物のＭＴＳ断片およびＭＣＭ断片は、直接連結されている。
【０１３７】
表１にも示されるように、メチルマロニルコエンザイムＡムターゼ（ＭＣＭ）のＭＴＳを備える２個の融合タンパク質構造物が調製された。それらのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２０および配列ＩＤ番号２１により表される。ヒトリポアミドデヒドロゲナーゼ（ｌａｄ）のＭＴＳを備える２個の融合タンパク質構造物が調製された。それらのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２２および配列ＩＤ番号２３により表される。
【０１３８】
融合タンパク質構造物を含む上記Ｈｉｓに加えて、Ｈｉｓ−Ｔａｇが最終生成物から除去され得る融合タンパク質構造物も調製された。この融合タンパク質構造物は、本明細書において「ＴＡＴ−ＭＴＳｍｂｐ−ＭＣＭ」またはＭＢＰ−ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭと称され、そのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２４により表される。この融合タンパク質構造物は、（そのＮ末端からＣ末端まで）Ｈｉｓタグおよびマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを備え、その後には、ＴＥＶタンパク質切断部位、ＴＡＴ領域、ＭＣＭの自然ＭＴＳ、およびＭＣＭが続く。
【０１３９】
ＭＴＳが無い融合タンパク質構造物も調製された。この融合タンパク質構造物は、本明細書において「Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ」と称され、そのアミノ酸配列は、配列ＩＤ番号２５により表される。クローンが制限酵素および配列分析により確認された。
【０１４０】
融合タンパク質構造物の発現が、大腸菌宿主内で実行された。（ＢＬ２１、ＢＬ２１、ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ、ＲｏｓｓｅｔａおよびＨＭＳから選択された）宿主、誘導因子（ＩＰＴＧ）の濃度、誘導期間の長さおよび条件（すなわち、上記表１に示される温度、化学物質の添加等）を含むいくつかのパラメータを変えることにより、発現宿主および発現状態が、ＴＡＴ融合タンパク質構造物の各々について個別に較正された。
【０１４１】
Ｃｏｄｏｎ＋細菌性細胞が融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭの発現用に選択され、一方、Ｒｏｓｓｅｔａ細菌細胞が融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ＭＴＳＴｌａｄ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ用に選択された。なぜなら、これらの細胞の発現は、図２に示されるように、最も効率的に見えるからである。
【０１４２】
上述のように、発現時に、細菌性細胞が破砕され、細胞のサブ画分が調製されて、これにより、可溶性画分および不溶性画分が分離された。図３に示されるように、融合タンパク質が発現したかどうかと、どの細胞サブ画分においてそれが堆積したのかを検査すべく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の全細胞細菌（ｗｃｅ）、可溶性画分（ｓｏｌ）および不溶性画分について、分析が実行された。目標は、今後の精製のために、発現細菌の可溶性サブ画分において高い発現レベルの異なるＴＡＴ融合タンパク質を得ることだった。また、ＥおよびＦに示されるように、異なるＴＡＴ融合タンパク質構造物は、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析により特性評価された。
【０１４３】
次に、上述のように、様々な融合タンパク質構造物が、親和性クロマトグラフィを用いて高度に精製された。図４のＡからＤにおいて実証されるように、異なるＭＴＳ配列を各々が備える融合タンパク質構造物の各々の可溶性画分が、Ｎｉ−キレートカラム上で充填された後、イミダゾールの濃度を増やしながら複数回の洗浄段階を経て、最終的に、高濃度のイミダゾールにおいて溶出された。
【０１４４】
融合タンパク質を特性評価すべく、溶出されたタンパク質が、抗ＭＣＭ抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロット分析により分析された。図５のＡおよびＢに示されるように、精製された融合タンパク質構造物は、期待されたサイズ（おおよそ８７ｋＤａ）において主帯域を示した。用いられた様々なＭＴＳポリペプチドの長さのばらつきから生じたわずかなサイズのばらつきが、４つの融合タンパク質構造物の間で観測された。
【０１４５】
［実施例３］
［ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の取り込みおよびそれらの処理］
様々なＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物の、無傷の細胞中のミトコンドリアに到達する能力を試験すべく、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＣＭ）タンパク質のための遺伝子コード化において終止コドン突然変異体を運ぶ、患者６７３の線維芽細胞が、まず、様々な濃度の（配列ＩＤ番号１８により表されるアミノ酸を有する）ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭで２４時間にわたってインキュベーションされ、（全細胞溶解物への）細胞の取り込みがウェスタンブロット分析により決定された。図６のＡに示されるように、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭは、細胞に首尾よく取り込まれた。
【０１４６】
追加の融合タンパク質構造物の、ミトコンドリアに取り込まれる能力も、以下に詳述されるように検査された。様々な融合タンパク質構造物の存在下における患者６７３の線維芽細胞のインキュベーション後、ミトコンドリアを細胞基質から分離すべく、サブ細胞画分が調製された。次に、ＭＣＭベースの融合タンパク質構造物の存在を確認するために、ミトコンドリア試料が、抗Ｈｉｓ抗体（図６のＢ）および抗ＭＣＭ抗体（図６のＣおよびＤ）を用いて、ウェスタンブロットにより分析された。
【０１４７】
図６に示されるように、ウェスタンブロット分析により、融合タンパク質構造物がミトコンドリア中に取り込まれたことが確認された。
【０１４８】
その上、抗ＭＣＭ抗体（図６のＣおよびＤ）を用いることにより、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物、ＴＡＴ−ＭＴＳｌａｄ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物およびＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物が処理を経たことが実証された。このことは、特定の抗体と反応した、そのより小さいサイズの追加の生成物の出現により明らかになった（図６のＣにおいて、処理されたタンパク質として示される）。
【０１４９】
しかしながら、図６のＤから明らかであるように、あらゆるＭＴＳが無いＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質構造物は、生物膜の横断を可能にするＴＡＴ配列にほぼ確実に起因してミトコンドリアに達しているが、いかなる処理も経なかった唯一の融合タンパク質構造物だった。
【０１５０】
［実施例４］
［ミトコンドリアＡＴＰ生成に対するミトコンドリア標的型ＭＣＭの効果］
ミトコンドリア中での酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）により生成されたＡＴＰにミトコンドリア標的ＭＣＭ融合タンパク質構造物が影響を及ぼすことができるかどうかを決定すべく、ＧＭ０１６７３線維芽細胞、ＧＭ０００５０線維芽細胞および３４６線維芽細胞が、エネルギー源としての透析後血清と、ＭＣＭの必須補助因子である１．２５μＭのビタミンＢ１２とを加えた、グルコースを含まないＯＸＰＨＯＳ依存培地において、４８時間にわたって培養された。
【０１５１】
ミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物（すなわち、配列ＩＤ番号１８、配列ＩＤ番号２２、配列ＩＤ番号２５、配列ＩＤ番号２４および配列ＩＤ番号２０によりそれぞれ表されるＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ、ＴＡＴ−ＭＴＳＴｌａｄ−ＭＣＭ、ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭ、ＴＡＴ−ＭＴＳｍｂｐ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ）の各々１０μｇ／ｍｌ（容積１００μｌ）でのインキュベーションの６時間後に、ミトコンドリアＡＴＰレベルが決定された。
【０１５２】
図７に示されるように、融合タンパク質構造物の全てを有する３４６細胞において１４〜２１％というＡＴＰレベルの著しい向上が観測され（Ａ）、一方で、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭが最大の増加をもたらした。
【０１５３】
ＧＭ０１６７３線維芽細胞（Ｂ）において様々な融合タンパク質構造物での治療時にＡＴＰレベルの１５〜２５％の増加が観測され、一方で、融合タンパク質構造物ＴＡＴ‐ＭＴＳｃｓ‐ＭＣＭが最大の増加をもたらした。興味深いことに、融合タンパク質構造物ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭは、これらの細胞における対照に対するＡＴＰレベルに影響を及ぼさなかった。これは、その処理がＭＣＭ活性にとって重要であることを示唆している。ＧＭ０００５０線維芽細胞は、対照と比べてＡＴＰレベルの著しい変化をもたらさなかった（Ｃ）。
【０１５４】
［実施例５］
［ミトコンドリア膜電位に対するミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物の効果］
ミトコンドリア標的型ＭＣＭがミトコンドリア膜電位に影響を及ぼし得るかどうかを決定すべく、エネルギー源としての透析後血清を加えた、グルコースを含まないＯＸＰＨＯＳ依存培地において、ＧＭ０１６７３線維芽細胞が２４時間にわたって培養され、１．２５μＭのビタミンＢ１２が加えられた。ミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物（配列ＩＤ番号１８および配列ＩＤ番号２０によりそれぞれ表されるＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭおよびＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ）１５μｇ／ｍｌ（容積１００μｌ）でのインキュベーションの６時間後に、ミトコンドリア膜電位が決定された。
【０１５５】
上述のように、インキュベーション時間の終了の１時間前（すなわち、５時間後）に、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭが終濃度２００ｎＭまで培地に加えられた。次に、インキュベーション時間の終了の３０分前に、ＦＣＣＰ（２０μＭ）が対照として加えられ、インキュベーション時間の終了の２０分前に、ＴＭＲＥが２００ｎＭ加えられた。ＴＭＲＥウェルが、０．２％ＢＳＡを加えたＰＢＳで一度洗浄され、追加の１００μｌ中で懸濁された。ＭＴＧウェルが、追加の１００μｌで一度洗浄され、その追加の１００μｌ中で懸濁された。ＴＭＲＥ／ＭＴＧ比が上述のように測定された。
【０１５６】
図８に示されるように、両方の融合タンパク質構造物により、ミトコンドリア膜電位が変化した。ここで、構造物ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭが、ＴＡＴ−ＭＴＳｍｃｍ−ＭＣＭ（４０％）よりわずかに大きいミトコンドリア膜電位の変化（５１％）をもたらした。
【０１５７】
［実施例６］
［酸素消費に対するミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物の効果］
ミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物が、ミトコンドリア活性の追加のマーカである、ミトコンドリアによる酸素消費に影響を及ぼすことができるかどうかを決定すべく、ＧＭ０１６７３線維芽細胞が、エネルギー源として透析後血清と、１．２５μＭのビタミンＢ１２とを加えた、グルコースを含まないＯＸＰＨＯＳ依存培地において、４８時間にわたって培養された。
【０１５８】
ミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質構造物の各々の１０μｇ／ｍｌ（容積１００μｌ）でのインキュベーションの６時間後に、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ（ＸＦ）  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、酸素消費量が決定された。図９に示されるように、様々な融合タンパク質構造物での治療時に、（対照と比べて）５０〜１０２％という著しい酸素消費量の向上が観測された。ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭが最大の酸素消費量増加をもたらし、一方で、ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭが再び活性の低下を示した。
【０１５９】
［実施例７］
［細胞生存率に対するミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質の効果］
ＭＭＡ患者の細胞へのＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質の輸送が細胞生存率に影響を及ぼし得るかどうかを決定すべく、患者のＧＭ０１６７３線維芽細胞、ＧＭ０００５０線維芽細胞または３４６線維芽細胞が、ＯＸＰＨＯＳ依存培地において、２４時間にわたって培養された。各融合タンパク質１５μｇ／ｍｌでのインキュベーションの７２時間後に、細胞生存率が決定された。図１０に示されるように、全ての融合タンパク質を有するＧＭ０１６７３線維芽細胞が１３〜３０％（Ａ）、ＧＭ０００５０線維芽細胞が１１〜３６％（Ｂ）、３４６線維芽細胞が１２〜２２％（Ｃ）という細胞生存率の著しい増加が観測された。再び、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ融合タンパク質での治療が、最も高い細胞生存率の向上（２７％）をもたらした。これに対して、ＴＡＴ−ΔＭＴＳ−ＭＣＭでの治療が、未処理の対照細胞と比較してＧＭ０１６７３細胞の活性が低下したことを示した。
【０１６０】
［実施例８］
［ＭＭＡレベルに対するミトコンドリア標的型ＭＣＭ融合タンパク質の効果］
ＭＭＡ病状の主な兆候は、ＭＭＡレベルが高くなることである。これは、多系統の病理学的な効果が原因であり得る［１２、１３］。ＭＭＡ患者の細胞へのＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質の輸送がＭＭＡレベルを低下させ得るかどうかを決定すべく、患者のＧＭ０１６７３線維芽細胞が、ＯＸＰＨＯＳ依存培地において２４時間にわたって培養された。ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ７．５μｇ／ｍｌまたは１５μｇ／ｍｌでのインキュベーションの４８時間後に、ＥＬＩＺＡキットを用いて、全細胞溶解物におけるメチルマロン酸レベルが決定された。図１１に示されるように、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ１５μｇ／ｍｌでの治療の後に、２５％という著しいＭＭＡレベルの低下が観測された。
【０１６１】
興味深いことに、アデノ随伴ウイルスである血清型８のベクター（ＡＡＶ８）を用いた遺伝子療法に基づく他の報告された治療［１４］も、ＭＭＡのレベルが、期待されるように十分に下げられていないことを示している（〜４０％の低下が観測された）［１５］。このことは、ＡＡＶ８が新生マウスに輸送される場合であっても、また、このウイルスの再投与後でも、一貫している［１６］。従って、ミトコンドリアは、治療の時点で既に不可逆的に損傷している可能性がある。故に、より早い段階で、例えば、妊娠中に治療を供することが検討されるべきである。
【０１６２】
［実施例９］
［肝臓分泌に対するＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質の効果］
ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質の効果は全て、ＭＭＡ患者から取得された線維芽細胞の培養物において試験された。しかしながら、ＭＭＡ病状において影響を受ける主な臓器は肝臓なので［１６］、我々は、ＭＭＡ肝臓の病状を模倣するために、ＭＣＭの発現が無い肝臓細胞の生成を目指した。最近、Ｅｒｌｉｃｈその他が、肥満細胞からのメディエータの分泌にはミトコンドリア機能が必須であることを示した［１７］。従って、我々の仮説は、ＭＣＭが突然変異した肝臓細胞における分泌が損なわれていた可能性があるというものであった。この仮説を確認するために、我々は、ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、アルブミンの分泌のための認められているモデルとして、ＨｅｐＧ２細胞から得たＭＵＴ遺伝子をノックアウトした［１８］。抗ＭＣＭ抗体を用いたウェスタンブロット分析により、ＭＵＴ遺伝子の削除が確認された（図１２のＡ）。ＭＣＭタンパク質レベルは、ＨｅｐＧ２  ＭＣＭ（−／−）細胞において検出されなかった。次に、対照との比較で、アルブミンのレベルが、１５μｇ／ｍｌのＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭで２４時間にわたって治療された（図１２のＢ）、または４８時間にわたって治療された（図１２のＣ）、ＨｅｐＧ２  ｍｕｔ（−／−）細胞の増殖培地（ＯＸＰＨＯＳ培地）において、ウェスタンブロット分析により決定された。図１２のＢおよびＣに示されるように、分泌されるアルブミンのレベルが、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭでの治療後に増やされた（２４時間で２１％、４８時間で６９％）。加えて、尿素が肝臓細胞から分泌されることがよく確認される。従って、増殖培地における尿素のレベルも、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭ融合タンパク質での４８時間にわたる治療の後に、Ｃｏｖａｓ分析により決定された（試料が、溶解した細胞のタンパク質濃度まで正規化された）。図１２のＣに示されるように、分泌される尿素のレベルが、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭでの治療の後に２９％まで増やされた。肝臓細胞におけるＭＣＭ活性の回復を終了すると、アルブミンおよび尿素の分泌など、肝臓の主な機能に影響を及ぼし得る。その上、我々は、肝臓からのメディエータの分泌におけるミトコンドリア機能およびＭＣＭ活性の役割を示唆した。
【０１６３】
［実施例１０］
［妊娠しているマウスにおける生体内で胎盤を横断するＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭ融合タンパク質］
多くの異なる種類の細胞および組織を横断する能力がＴＡＴにあることを前提として、我々は、ＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭが胎盤を横断できるであろうという仮説を立てた。我々は、胎盤を横断してマウスモデルに胚を輸送するというＴＡＴ−ＭＴＳ−ＭＣＭタンパク質の能力および効能、つまり、今後のヒトの治療のために重要でもある要件を試験した。
【０１６４】
マウスモデルにおいてメチルマロニルＣｏＡムターゼの死亡率は出生日の時点で観測されるので、我々は、処理において、妊娠最終週のＷ．Ｔ  Ｃ５７ＢＬマウスに注入を３回行った。数個の組織中に酵素が存在するかどうかが、メチルマロニルＣｏＡムターゼおよび抗βアクチン抗体を用いたウェスタンブロット分析により検査された。我々は、最も高いエネルギー需要を有するが故に通常はミトコンドリア障害において最も影響を受ける３つの主な臓器、つまり、肝臓、心臓（筋肉）および脳を用いた作業を選択した。図１３のＡ、Ｂ、ＣおよびＤに見られるように、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭタンパク質の量は、対照マウスと比較して、処理を受けた新生仔の心臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）において、そして最も重要なことには脳（Ａ）において、著しく高かった。これにより、組織にＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭが輸送されていること、さらには、ＴＡＴ−ＭＴＳｃｓ−ＭＣＭの量は、処理において注入された脳の母細胞において対照より多いことが実証された。
【０１６５】
我々は、ＭＵＴ／アクチン比も測定した。また、我々が確かめることができるように、処理済みのマウスの組織中のタンパク質の量は、対照マウスと比較してより多かった。
【０１６６】
［参考文献］  本開示の主題の背景として関連しているものとみなされる参考文献が以下に列挙される。
【表３】
2019520306.tif 000015
【０１６７】
本明細書における上記参考文献の確認は、これらの参考文献が本開示の主題の特許性に何らかの形で関連することを意味すると推定されるべきではない。
【０１６８】
【図１】
2019520306.tif 000016
【図２Ａ】
2019520306.tif 000017
【図２Ｂ】
2019520306.tif 000018
【図２Ｃ】
2019520306.tif 000019
【図２Ｄ】
2019520306.tif 000020
【図３Ａ】
2019520306.tif 000021
【図３Ｂ】
2019520306.tif 000022
【図３Ｃ】
2019520306.tif 000023
【図３Ｄ】
2019520306.tif 000024
【図３Ｅ】
2019520306.tif 000025
【図３Ｆ】
2019520306.tif 000026
【図４Ａ】
2019520306.tif 000027
【図４Ｂ】
2019520306.tif 000028
【図４Ｃ】
2019520306.tif 000029
【図４Ｄ】
2019520306.tif 000030
【図５Ａ】
2019520306.tif 000031
【図５Ｂ】
2019520306.tif 000032
【図６】
2019520306.tif 000033
【図７】
2019520306.tif 000034
【図８】
2019520306.tif 000035
【図９】
2019520306.tif 000036
【図１０】
2019520306.tif 000037
【図１１】
2019520306.tif 000038
【図１２】
2019520306.tif 000039
【図１３】
2019520306.tif 000040
【配列表】
2019520306000001.app
【国際調査報告】
2019520306.tif 000041
2019520306.tif 000042
2019520306.tif 000043
2019520306.tif 000044