(57)【要約】  流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるためのシステムが開示される。システムは、出口の上流に配置されたフィルタ、及び斜めの角度で少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具を含む。画像化装置は、少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子の画像を取得及び処理するように構成されている。明視野照明を使用する、少なくとも一つの粒子を特徴付けるためのシステムも開示される。斜めの角度及び明視野照明のうちの少なくとも一つを使用する、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるための方法もまた、開示される。
2019511707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるためのシステムであって、
出口の上流に配置されたフィルタ、
明視野照明を使用して前記少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具、及び
前記少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それが前記フィルタ上に載っているときに、照明された前記少なくとも一つの粒子の画像を取得及び処理するように構成された画像化装置、
を有する、システム。
【請求項２】
前記フィルタの一つの平面と同一平面上の角度で前記少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具、
を更に有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記照明器具は、複数の照明装置を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記複数の照明装置は、前記フィルタの周りに放射状に配置され、かつ、前記フィルタに向かって内側に向けられている、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
斜めの角度で前記少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具、
を更に有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記画像化システムは、斜め角度照明及び明視野照明を含む合成画像を生成するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記画像化システムは、斜め角度照明及び明視野照明の組み合わせに基づいて複数の粒子を特徴付けるように構成されている、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
フィルタ上でそれぞれ終端となる複数のウェルをもつウェルプレートを更に有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記フィルタは、膜である、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記膜表面は、低い表面粗さをもつ、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ウェルプレートは、透明物質を有する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
負圧源に接続されており、前記複数のウェルとの流体連通に適するように構成されている、真空マニホールド、
を更に有する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
前記画像化装置は、機械学習アルゴリズムを使用して、前記少なくとも一つの粒子の物質の種類を特徴付け、同定するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記機械学習アルゴリズムは、モデルを構築するために、粒子の大きさ、形状、テクスチャ、暗視野強度及び内部蛍光のうちの少なくとも一つを含む、観察される特徴を使用する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記画像化装置は、それが前記フィルタ上に載っているときに、蛍光画像化を使用して、前記少なくとも一つの粒子の物質の種類を特徴付け、同定するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記蛍光画像化は、内部のマルチチャネルベースの蛍光を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記蛍光画像化は、標識化されたマルチチャネルベースの蛍光を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記画像化装置は、前記少なくとも一つの粒子が前記フィルタ上に捕捉される前及び後の両方に、前記フィルタを画像化するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前及び後の画像は、差異を発見するためにそれらを処理するアルゴリズムを使用して、共に処理される、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
前記画像化装置は、前記フィルタの上の複数の高さにおける、複数の画像を取得するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
前及び後の画像は、数学的に位置合わせされる、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２２】
前記蛍光画像化は、ＵＶ蛍光を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２３】
前記フィルタは、画像化された少なくとも一つの粒子の信号対雑音比を高めるための物質を含む膜である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記物質は、薄い金属層被覆である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記薄い金属層被覆は、金、クロミウム又はアルミニウムのうちの一つを含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記画像化装置は、ＵＶ蛍光を介してタンパク質性粒子及び非タンパク質性粒子を識別するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願への相互参照］
本出願は、２０１６年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，８３２号、及び２０１６年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／２９６，７０１号への優先権を主張する。それらの両方は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質治療法（Protein  therapeutics）は、過去２５年間にわたって劇的に成長しており、今や製薬市場の１５−３０％を構成する。この部類の治療法に関する主要な品質関心事は、それらが、抗薬物抗体を発現する患者からの免疫応答を誘発し得ることである。高レベルの抗薬物抗体は、身体から薬物を除去することによって治療効果を排除し得る。この免疫応答は患者の１−１０％に発症し、（affects）、その患者は、その薬物治療（medication）を取ることを止めなければならず、彼女ら／彼らの最初の病気にかかった状態に戻るであろう。これらの治療法における粒子状物質（particulate  matter）の存在（例えば、シリンジからのシェッドガラス（shed  glass）又はタンパク質凝集体）は、この免疫応答を強め、したがって連邦医薬品局（ＦＤＡ）は、存在し得る粒子の量を規制する。
【０００３】
ＦＤＡに規制される大きさ範囲内の粒子数及び大きさを提供し得る既存のツールがあるが、日常的且つ迅速に、実際にその粒子が何でできているかを同定することができる機器類（instrumentation）はない（例えば、Bee  JS,  Goletz  TJ,  Ragheb  JA.  The  future  of  protein  particle  characterization  and  understanding  its  potential  to  diminish  the  immunogenicity  of  biopharmaceuticals:  a  shared  perspective.  J  Pharm  Sci.  2012  Oct;101(10):3580-5;  Ripple  DC,  Dimitrova  MN.  Protein  particles:  What  we  know  and  what  we  do  not  know.  Journal  of  Pharmaceutical  Sciences.  2012  Oct;101(10):3568-79;  and  Zolls  S,  Tantipolphan  R,  Wiggenhorn  M,  Winter  G,  Jiskoot  W,  Friess  W,  et  al.  Particles  in  therapeutic  protein  formulations,  Part  1:  Overview  of  analytical  methods.  J  Pharm  Sci.  2012  Mar  1;101(3):914-35を参照）。タンパク質治療法において粒子を特徴付けるために使用される多数の分析機器が存在する。それらは、粒子計数技術及び粒子同定技術として類別され得る。１０ミクロン以上の規制されたスペース（the  regulated  space）についての主な粒子計数技術は、光オブスキュレーション（主要なワークホース）、膜顕微鏡検査（membrane  microscopy）、コールターカウンター及びマイクロ流画像化（ＭＦＩ）を含む。ＭＦＩは、このスペースにおける、より新しい技術であり、急速に増えてきた。それは、粒子計数を提供し得るが、画像形態（image  morphology）及び輝度（brightness）は粗い（crude）粒子同定の一つの形として作用し得るので、少しの混成物（hybrid）であると考えられ得る。具体的に、システムは、油滴及び気泡を同定し、それらの球形の特性（spherical  nature）によって、より固い粒子（more  solid  particles）からそれらを識別してもよい。更なる同定は、信頼されるものとしてではないが、不透明度（opacity）及び形状を見ることによって、その粒子がタンパク質凝集物（protein  aggregate）であるか又は一片の金属であるかに関して幾らかの推測（guesses）がなされ得る。確かに、この同定は定性的（qualitative）であり、決定的（definitive）ではない。規制されていないスペースにおける、より小さな大きさの粒子は、様々な機器を使用して分析され得るが、それらは、タンパク質治療法の試料を測定することにおいて、ＦＤＡがこの空間を規制し又は技術推奨を行うために、まだ十分に定量的ではない。これらは、ナノ粒子追跡アルゴリズム（ＮＴＡ）機器、油滴も検出することができる共鳴質量分析（ＲＭＭ）機器（すなわち、アルキメデスシステム）、粒子計数に関して定量的でない動的光散乱（ＤＬＳ）及びＩｚｏｎシステムを含む。
【０００４】
より決定的な同定のために、科学者らは、典型的に（１）分光法（spectroscopy）、主としてフィルタ表面上に捕捉された粒子のＦＴＩＲ及びラマン検査、（２）電子顕微鏡での元素分析、並びに時折（３）粒子を染色した後の蛍光顕微鏡検査に頼る。これらの技術の各々は、粒子の法医学分析を実行するための強力かつ有用な方法である。概して、それらは日常的な測定機器ではなく、低い処理量（throughput）及び資料調製の複雑さのために、時折使用されるのみである。電気顕微鏡は、高価であり、複雑な試料調製、高度に訓練された操作者及び高度な真空条件を要求する。蛍光顕微鏡は粒子の染色を要求し、それは望ましくない。タンパク質治療法スペースにおいて、希釈温度変化、追加的な試薬の追加を含む、試料への如何なる変化も、慎重に処方された試料の繊細な均衡を混乱させ得る。特に興味ある粒子と化学的に結びつく染料の場合において、試料への変化が測定に影響を及ぼし得るという恐れが常に存在する。
【０００５】
このように、粒子を同定できる機器は存在するが、それらは、操作が難しく、結果を提供するのに長い時間を要し、日常的な使用を妨げる。いくつかの物質は他の物質よりも危険であり、粒子がどのようなもので作られているかを知ることは、その原因に遡って迅速に汚染を追跡し、排除することを可能にするであろう（例えば、Rosenberg  AS.  Effects  of  protein  aggregates:  An  immunologic  perspective.  AAPS  J.  2006  Aug  4;8(3):E501-7;及びCarpenter  JF,  Randolph  TW,  Jiskoot  W,  Crommelin  DJA,  Middaugh  CR,  Winter  G,ら、Overlooking  subvisible  particles  in  therapeutic  protein  products:  gaps  that  may  compromise  product  quality.  J  Pharm  Sci.  2009  Apr;98(4):1201-5を参照）。日常的な技術の欠如は、科学者らは典型的に、彼女ら又は彼らの試料内に何があるかを知らず、従って有害な汚染を十分に早く検出することができないことを意味する。代わりに、科学者らは、それらの退屈な操作と低い処理量のために、トラブルシューティングの努力の間に粒子同定設備をしぶしぶと使用するのみである。これは、製品開発を遅らせ、全体の品質及び安全性を低下させる大きなフラストレーションの原因である。
【０００６】
現在の粒子分析システムもまた、極めて非効率的である。処方選択段階及び製造前に、研究者らが入手可能な試料はとても少ない。現在のツールは、数百マイクロリットルを必要とし、非常に低速度である。一つの結果として、研究者らは、目に見えるより小さな粒子の分析（sub  visible  particle  analysis）をしばしば完全に避けるか、又はより早い段階でそのような分析をわずかに行う。目に見えるより小さな粒子の分析は、製剤安定性のための最も敏感な測定の一つであることはよく知られている。研究者にとって、より良く、かつ、より効率的な、利用可能な分析ツールを早い研究段階で持つ能力は、当該分野にとって大きな改善となるであろう。
【０００７】
高い処理量で流体試料中の粒子を正確に特徴付けるための改良されたシステム及び方法の必要性が、当該分野において存在する。また、より少ない体積（volumes）で目に見えるより小さな粒子の分析を行う必要性が、存在する。全体的に、本明細書において記述されるような従来のシステムの様々な欠点を更に改善する必要性が、存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J  Pharm  Sci.  2012  Oct;101(10):3580-5
【非特許文献２】Journal  of  Pharmaceutical  Sciences.  2012  Oct;101(10):3568-79
【非特許文献３】J  Pharm  Sci.  2012  Mar  1;101(3):914-35
【非特許文献４】AAPS  J.  2006  Aug  4;8(3):E501-7
【非特許文献５】J  Pharm  Sci.  2009  Apr;98(4):1201-5
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一つの実施形態において、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付ける（characterizing）ためのシステムは、出口（outlet）の上流に配置されたフィルタ；斜めの角度（oblique  angle）で少なくとも一つの粒子を照明する（illuminate）ように構成された照明器具（luminaire）；及び少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子の画像を取得及び処理するように構成された画像化装置（imaging  device）を含む。一つの実施形態において、システムは、フィルタの一つの平面と同一平面上（coplanar）の角度で少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具、を含む。一つの実施形態において、照明器具は、複数の照明装置を有する。一つの実施形態において、複数の照明装置は、フィルタの周りに放射状に（radially）配置され、かつ、フィルタに向かって内側に向けられている。一つの実施形態において、照明装置は、ＬＥＤである。一つの実施形態において、システムは、明視野照明（bright  field  illumination）によって少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具、を含む。一つの実施形態において、画像化システムは、斜め角度照明及び明視野照明を含む合成画像（composite  image）を生成するように構成されている。一つの実施形態において、画像化システムは、斜め角度照明及び明視野照明の組み合わせに基づいて複数の粒子を特徴付けるように構成されている。一つの実施形態において、フィルタ上でそれぞれ終端となる（terminate）複数のウェルをもつウェルプレートを更に有する。一つの実施形態において、フィルタは、膜である。一つの実施形態において、膜は、黒色である。一つの実施形態において、表面は、低い表面粗さをもつ。一つの実施形態において、ウェルプレートは、透明物質（transparent  material）を有する。一つの実施形態において、ウェルプレートは、上面（top  surface）に不透明な層（opaque  layer）を備えた透明物質を有する。一つの実施形態において、ウェルプレートは、反射フィルムを有する。一つの実施形態において、ウェルプレートは、不透明な明るい白色の物質を有する。一つの実施形態において、複数のウェルは、フィルタに向かって動く、減少する半径をもつ。一つの実施形態において、システムは、負圧源に接続されており、複数のウェルとの流体連通に適するように構成されている真空マニホールドを含む。一つの実施形態において、ウェルプレートは、鏡、レンズ及びプリズムのうちの少なくとも一つを有する、光学的機構（optical  feature）を有する。一つの実施形態において、画像化装置は、機械学習アルゴリズムを使用して、少なくとも一つの粒子の物質の種類を特徴付け、同定するように構成されている。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、モデルを構築する（build）ために、粒子の大きさ、形状、テクスチャ、暗視野強度及び内部蛍光のうちの少なくとも一つを含む、観察される特徴を使用する。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、ブースティングアルゴリズムである。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、ニューラルネットワークを使用する。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、畳み込みニューラルネットワークを使用す���。一つの実施形態において、画像化装置は、それがフィルタ上に載っているときに、蛍光画像化（fluorescent  imaging）を使用して、少なくとも一つの粒子の物質の種類を特徴付け、同定するように構成されている。一つの実施形態において、蛍光画像化は、内部のマルチチャネルベースの蛍光（intrinsic  multi  channel  based  fluorescence）を含む。一つの実施形態において、蛍光画像化は、標識化されたマルチチャネルベースの蛍光を含む。一つの実施形態において、画像化装置は、少なくとも一つの粒子がフィルタ上に捕捉される前及び後の両方に、フィルタを画像化するように構成されている。一つの実施形態において、前及び後の画像は、差異を発見するためにそれらを処理するアルゴリズムを使用して、共に処理される。一つの実施形態において、画像化装置は、フィルタの上の複数の高さにおける、複数の画像を取得するように構成されている。一つの実施形態において、複数の画像は、高ダイナミックレンジの露出（exposures）の組から成る。一つの実施形態において、複数の画像は、共に併合されて単一の画像になる。一つの実施形態において、複数の画像は、複製を含む。一つの実施形態において、異なる高さにおける複数の画像は、共に併合されて単一の画像になる。一つの実施形態において、前及び後の画像は、数学的に位置合わせされる（mathematically  registered）。一つの実施形態において、画像を処理するためにメディアンフィルタが使用される。一つの実施形態において、二つ又はそれ以上の画像は、数学的に位置合わせされる。一つの実施形態において、画像化装置は、少なくとも一つの粒子を複数回画像化するように構成されている。一つの実施形態において、画像化装置は、画像を処理して粒子の数、粒子の大きさ及び粒子の光散乱のうちの少なくとも一つを提供するように構成されている。一つの実施形態において、システムは、フィルタの開口部と流体連通した負圧源を含む。一つの実施形態において、システムは、フィルタの下流及び出口の上流にウィッキング物質を含む。一つの実施形態において、フィルタは、チップの一つの構成要素である。一つの実施形態において、チップは、実質的に平面状である。
【００１０】
一つの実施形態において、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるための方法は：フィルタの上に流体試料を導入するステップ（introducing）；斜めの角度で少なくとも一つの粒子を照明するステップ（illuminating）；及び、少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子を画像化するステップ（imaging）、を含む。一つの実施形態において、方法は、明視野照明を使用して少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、斜め角度照明及び明視野照明に基づいて合成画像を生成するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、複数の照明装置で少なくとも一つの粒子を放射状に取り囲むこと及び斜めの角度から少なくとも一つの粒子を照明することによって、少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、ウェルプレート上に配置された複数のウェルのうちの一つの中で少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、流体試料がフィルタ上に導入される前及び後の画像化に基づいて、少なくとも一つの粒子を特徴付けるステップを含む。一つの実施形態において、方法は、複数のウェルの各々を独立かつ別個に画像化するステップを含む。一つの実施形態において、画像化するステップは、フィルタの上の複数の高さにおいて画像化することを含む。一つの実施形態において、複数の画像は、高ダイナミックレンジの露出の組を含む。一つの実施形態において、方法は、複数の画像を共に併合して単一の画像にするステップを含む。一つの実施形態において、複数の画像は、複製を含む。一つの実施形態において、方法は、二つ又はそれ以上の画像を数学的に位置合わせするステップを含む。一つの実施形態において、方法は、前及び後の画像を数学的に位置合わせするステップを含む。一つの実施形態において、方法は、ウェルプレート上のウェルの中に流体試料を導入するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、鏡、レンズ及びプリズムのうちの少なくとも一つを有する、ウェルプレートの光学的機構を通して、少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、機械学習アルゴリズムを使用して、少なくとも一つの粒子の物質の種類を特徴付け、同定するステップを含む。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、モデルを構築するために、粒子の大きさ、形状、テクスチャ、暗視野強度及び内部蛍光のうちの少なくとも一つを含む、観察される特徴を使用する。
【００１１】
一つの実施形態において、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるためのシステムは、出口の上流に配置されたフィルタ；明視野照明を使用して少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具；及び少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子の画像を取得及び処理するように構成された画像化装置を含む。一つの実施形態において、システムは、斜めの角度で少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具を含む。一つの実施形態において、システムは、フィルタの一つの平面と同一平面上の角度で少なくとも一つの粒子を照明するように構成された照明器具を含む。一つの実施形態において、照明器具は、複数の照明装置を有する。一つの実施形態において、システムは、複数の照明装置は、フィルタの周りに放射状に配置され、かつ、フィルタに向かって内側に向けられている。一つの実施形態において、フィルタは、チップ上に配置されている。一つの実施形態において、チップは、実質的に平面状である。一つの実施形態において、フィルタは、第一微細孔格子（micropore  grid）を有する。一つの実施形態において、フィルタは、高分子又は金属の膜を有する。
【００１２】
一つの実施形態において、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるための方法は、フィルタの上に流体試料を導入するステップ；明視野照明を使用して少なくとも一つの粒子を照明するステップ；及び、少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子を画像化するステップ、を含む。一つの実施形態において、方法は、斜めの角度又はフィルタの平面と同一平面上の角度で少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、複数の照明装置で少なくとも一つの粒子を放射状に取り囲むこと及び斜め又は同一平面上の角度から少なくとも一つの粒子を照明することによって、少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、ウェルプレート上に配置された複数のウェルのうちの一つの中で少なくとも一つの粒子を照明するステップを含み、ウェルの各々はフィルタにおいて終端となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
前述の目的及び特徴、並びに他の目的及び特徴は、以下の説明及び添付の図面を参照することにより明らかになるであろう。それらは、本発明の理解を提供するために含まれ、本明細書の一部を構成し、同様の数字は同様の要素を表す。
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、一つの実施形態による、流体試料中の粒子を特徴付けるためのシステムの図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、フィルタの上に流体試料が直接的にピペットで加えられる、システムの図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、一つの実施形態による、流体試料中の粒子を特徴付けるためのシステムのブロック図である。
【００１５】
【図２Ａ】図２Ａは、一つの実施形態による、流体試料中の粒子を特徴付けるためのシステムの図であり、画像化装置は、二つのカメラ及びフィルタから分離した画像化領域を有する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、一つの実施形態による、流体試料中の粒子を特徴付けるためのシステムの図であり、画像化装置は、一つのカメラ及び単一の画像化／フィルタ領域を有する。
【００１６】
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、一つの実施形態による、堰フィルタ（weir  filters）を有するチャネルの図である。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、一つの実施形態による、堰フィルタ（weir  filters）を有するチャネルの図である。
【００１７】
【図４】図４は、一つの実施形態による、フィルタチップの透視図及び部分拡大図である。
【００１８】
【図５】図５は、一つの実施形態による、フィルタ上で直接的に画像化することを可能にし得る、小型筐体の透視図である。
【００１９】
【図６Ａ】図６Ａは、ライトリング内のフィルタスタックである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、一つの実施形態による、フィルタスタックの分解図である。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａは、ウェルプレート及び膜の透視図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、一つの実施形態による、組み立てられたウェルプレート及び膜の写真である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ピペットを用いて各ウェルの中に挿入されている流体試料の例示を伴う、ウェルプレート及び膜の透視図である。
【００２１】
【図８】図８は、一つの実施形態による、ウェルプレート画像化システムの透視図である。
【００２２】
【図９Ａ】図９Ａは、ウェルプレート上のリングライトの断面図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、一つの実施形態による、ウェルプレート上のリングライトの写真である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、合成画像を作成する（create）ために使用された、側方照明画像である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、合成画像を作成するために使用された、明視野照明画像である。
【図９Ｅ】図９Ｅは、図９Ｃ及び図９Ｄの両方の画像を使用して作成された合成画像を示す。
【００２３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、一つの実施形態による、クリアなポリカーボネートプレートとして構築されたウェルプレートの図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、一つの実施形態による、不透明な物質によって覆われている、ウェルプレートの図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、一つの実施形態による、反射被覆を用いて塗装されている、ウェルプレートの図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、一つの実施形態による、明るい白色のポリカーボネートで作られたウェルプレートの図である。
【００２４】
【図１１Ａ】図１１Ａは、一つの実施形態による、隣接壁設計を有するウェルプレートの図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、一つの実施形態による、光源内臓型隣接壁を有するウェルプレートの図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、一つの実施形態による、フレネルレンズ設計を有するウェルプレートの図である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、一つの実施形態による、レンズ設計を有するウェルプレートの図である。
【００２５】
【図１２】図１２は、一つの実施形態による、ウェルプレートを製造するための治具（jig）の透視断面図である。
【００２６】
【図１３Ａ】図１３Ａは、一つの実施形態による、ウィッキング物質（wicking  material）を有する真空マニホールドの上に消耗品（consumable）を置くステップの図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、一つの実施形態による、膜を通して試料を引くステップの図である。
【００２７】
【図１４Ａ】図１４Ａは、一つの実施形態による、斜め角度照明を使用して粒子を特徴付ける方法のフローチャートである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、一つの実施形態による、明視野照明を使用して粒子を特徴付ける方法のフローチャートである。
【００２８】
【図１５Ａ】図１５Ａは、一つの実施形態による、追跡された粒子のギャラリーである。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、一つの実施形態による、ＭＦＩ粒子追跡グラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、一つの実施形態による、粒子径のヒストグラムである。
【００２９】
【図１６Ａ】図１６Ａは、一つの実施形態による、試料がウェルに加えられ、圧力制御部によって調節される真空圧を使用してメッシュを通して引かれた、システムの図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、一つの実施形態による、凝集したリゾチーム（２−５０ｕｍ）、ステンレス鋼ビーズ（１０−２０ｕｍ）及びラテックスビーズ（１５ｕｍ）の混合物の分離に続いての、メッシュの画像である。
【００３０】
【図１７Ａ】図１７Ａは、一つの実施形態による、ラマンデータ及びトポグラフィカルな類似性を示すために加えられた輪郭（outlines）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、一つの実施形態による、タンパク質性の（proteinaceous）物質を同定する、１７００波数におけるＡｍｉｄ  Ｉピークのヒートマップと共に、試料の迅速ＦＴＩＲ画像化データを示す。
【００３１】
【図１８Ａ】図１８Ａは、一つの実施形態による、“前の”画像を示し、前の画像のこの区画において５個の粒子が同定された。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、一つの実施形態による、以下で詳細に説明するように良好な“後の”閾値を同定する“後の”画像を示し、示された“後の”画像は１６個の粒子を同定した。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、“後の”画像に結びつけられた“前の”画像からの５個の粒子を示し、膜のこの区画において報告されるであろう１１個の新たな粒子を捕らえている（netting）。
【００３２】
【図１９Ａ】図１９Ａは、一つの実施形態による、六角（hex）フィルタ上の粒子を描写し、蛍光特徴付けによる二つの種類の物質の間の区別を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、実際のタンパク質凝集物と共に、タンパク質凝集物を模倣するＥＴＦＥ高分子基準（polymeric  standards）を識別する六角フィルタの能力を描写する。
【００３３】
【図２０Ａ】図２０Ａは、一つの実施形態による、機械学習モデルを構築するための図式（schematic）を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、一つの実施形態による、タンパク質対非タンパク質同定の一つの例示的な出力プロットを示す。
【００３４】
【図２１Ａ】図２１Ａは、粒子の焦点外画像である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、焦点融合技術が適用された後の粒子の補正された画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の図面及び説明は、本発明のより明確な理解に関連する要素を例示するために簡略化されており、同時に、明確化の目的で、流体試料中の粒子を特徴付けるシステム及び方法において見出される多くの他の要素が除かれていることが、理解されるべきである。当該分野において通常の技術を有する者は、本発明の実施において他の要素及び／又はステップが望ましいか且つ／或いは要求されることを認識し得る。しかしながら、そのような要素及びステップは当該分野において周知であり、また、それらは本発明のより良い理解を容易にしないので、そのような要素及びステップの検討は、本明細書において提供されない。本明細書における開示は、当業者に知られる、そのような要素及び方法に対する、全てのそのような変形及び変更を対象とする。
【００３６】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において通常の技術を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において説明されるものと類似又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実践又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料が説明される。
【００３７】
本明細書において使用される場合、以下の用語の各々は、この節においてそれと関連付けられる意味を有する。
【００３８】
冠詞“一つ”及び“ある”は、本明細書では、その冠詞の文法的目的語の一つ又はそれ以上（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。例として、“ある要素”は、一つの要素又は一つよりも多くの要素を意味する。
【００３９】
測定可能な値、例えば量、時間的期間等を指すときに本明細書で使用される“約”は、そのような変動が適切なときには、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、及び±０．１の変動を包含するように意図されている。
【００４０】
範囲：本開示を通じて、本発明の様々な態様が、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記述は、単に利便性及び簡潔さのために過ぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。適切な場合、範囲の記述は、その範囲内の可能な部分範囲（subranges）及び個々の数値の全てを具体的に開示しているものと考えられるべきである。例えば、１から６のような範囲の記述は、その範囲内の１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６等のような部分範囲、並びに個々の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を具体的に開示しているものと考えられるべきである。これは、範囲の幅に関わらず当てはまる。
【００４１】
これから、いくつかの図を通して同様の参照番号が同様の部品又は要素を示す図面を詳細に参照して、様々な実施形態において、流体試料中の粒子を特徴付けるためのシステム及び方法が、本明細書において提示される。
【００４２】
ここで図１Ａを参照すると、流体試料中の粒子１３０を特徴付けるためのシステム１００が示されている。システム１００は、流体試料１１２が画像化領域１１４及びフィルタ１１８を通って下流に流れ、その後出口１２２（図１Ａの視野においてはフィルタの下にある）を通って出ることを可能にするように構成された流体チャネル１１２を有するチップ１１０を含む。一つの実施形態において、出口は、フィルタの開口部と流体連通している、フィルタの下流のシステム内の任意の空間又は空隙である。下流方向はフィルタに対して相対的である。したがって、下流は、それがフィルタの方へ及び／又はフィルタを通って流れるときに、流体試料が通常移動するであろう方向（例えば、ある複数の実施形態においては、横方向に東又は西及び／又は下）である。ある複数の実施形態において、流れは、流体チャネル又は出口に真空圧力を加える負圧源によって生成される。ある複数の実施形態において、出口１２２は、フィルタ１１８の下、又は下流にある。フィルタ１１８は複数の孔１１９を有し、流体試料中に存在する粒子１３０を捕らえながら、流体は複数の孔１１９を通って流れることができる。有利には、システムの複数の実施形態は、従来のシステムよりも少なくとも１桁速い高い処理量の粒子同定を提供し、粒子計数情報は最先端の機器類と一貫している（consistent）。粒子１３０は、それらが流体チャネル１１２を進み、出口１２２においてフィルタ１１８によって捕まえられるときに、画像化装置１４０によって画像化（撮像）される。フィルタ１１８は、ある複数の実施形態において、篩（ふるい）（sieve）のように作用する高密度の微細孔格子である。上に載っている捕捉された粒子を有する篩は、粒子同定を提供するために、例えば、ＦＴＩＲによって画像化されてもよい。従来の技術を使用するこの種の分析は、達成するために数時間かかることがあるが、本明細書において記述される複数の実施形態は、３０分又はそれ以下の間に計数と分類（typing）の両方を実行することができる。日常的な粒子計数機器の追加的な分類能力は、臨床開発を加速し、より高品質でより安全な治療法を可能にする。
【００４３】
一つの実施形態において、流体試料は、画像化領域１１４及びフィルタ１１８を含む流体チャネル１１２を有するチップ１１０の中に注入される。粒子１３０は、それらが流体チャネル１１２，１５０を進むときに画像化される。一つの実施形態において、粒子分析はマイクロ流画像化（ＭＦＩ）であり、それは現在、大要の（規制されている）粒子範囲において日常的な特徴付けの一つの好ましい方法である。従来のＭＦＩシステムにおいて、流体試料は画像化され、次いでポンプで送られて浪費される。本明細書において記述される実施形態において、チャネル１１２の出口１２２は、フィルタ１１８によって塞がれている。フィルタ１１８は、ある複数の実施形態において、篩のように作用する孔１１９によって画定されるリソグラフィの格子である。孔１１９よりも大きい粒子１３０は、その篩によって捕らえられる。格子は、極めて密であり、カメラの視野内に適合してもよい。粒子１３０は、複数回画像化され、フィルタ１１８，１５２内のそれらの着地部位（landing  site）まで追跡される。試料が完全にポンプで通された後に、捕らえられた粒子１３０，１５４を特徴付け及び同定し、物質の種類を割り当てる（assign）ために画像化（例えば、ＦＴＩＲ画像化）が使用される。フィルタ１１８上にうまく画成された格子は、高速走査（rapid  scanning）のためには理想的であり、各粒子についてのスペクトルは、（ステップ１５０からの）粒子の画像に結合されて（linked）もよい。ある複数の実施形態において、動的な流体配送（dynamic  fluid  delivery）及び制御システムが実施される。フィルタが満たされたときに、流れ抵抗が増大し、流れセンサ及び圧力フィードバックの存在は、流量を動的に変更又は維持してもよい。さもなければ、不十分な制御は、膜を破裂させるか或いは変形可能な粒子を押し込んで膜を通すかのいずれかになり得る。
【００４４】
一つの実施形態において、チャネル１１２は、拡大光学系、及びカメラ露出とタイミングを合わされた明るい青色のＬＥＤフラッシュを使用して画像化される。粒子をフローセルの中に配送し、それらを画像化するこの方法は、現在のＭＦＩ機器がどのように働くか（例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｆｌｕｉｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。ＭＦＩ分析については、露光の間に粒子が失われないように、注意深い自動化が、流体の流れと一緒にフラッシュ照明及び露光のタイミングを取るために使用されてもよい。ある複数の実施形態において、各粒子の多数の写真が、それらを追跡し、画像をＦＴＩＲ分析に相関させるために撮影される。
【００４５】
ある複数の実施形態において、チップは、より短い流体チャネルを有するか又は全く流体チャネルを有しない。そして、流体試料は、フィルタの上に直接的にピペットで加えられる（例えば、図１Ｂを参照）。この種の実施形態において、画像化及び粒子の特徴付けは、単にフィルタ上の粒子を画像化することに基づいてもよい。ある複数の実施形態において、フィルタは、孔が漸進的に（progressively）小さくなるように連続して積み重ねられてもよい。例えば、一つの実施形態は、３つのフィルタ（２５ｕｍフィルタ、１０ｕｍフィルタ及び２ｕｍフィルタ）を含んでもよい。ある複数の実施形態において、フィルタ材料は、使用される分光法の形式に適するように変更されてもよい。ＦＴＩＲの場合において、透明な膜が使用されてもよい（例えば、窒化ケイ素又は二酸化ケイ素）。ラマン分光法の場合において、金又は銀の金属被覆が表面上に堆積させられてもよい。ある複数の実施形態において、フィルタ表面は、汚れを避けるため又は孔の流れ抵抗若しくは毛細圧を低減するために、防汚剤（例えば、ＰＥＧ、機能性シラン、界面活性剤）を用いて変更されてもよい。ある複数の実施形態において、全三次元における孔形状は、正確に制御されてもよい。例えば、円錐状の孔は、フィルタにかけられる物体の捕捉効率及び捕らえられる位置の精度を改善するために利用されてもよい。ある複数の実施形態において、光の一貫した透過（consistent  transmission）をもたらすために、一貫した孔径及び密度が利用される。光透過の減少はまた、捕らえられる粒子の濃度を定量化するため、及び／又は励起の波長を考慮して組成を決定するために使用されてもよい。
【００４６】
一つの実施形態において、孔径よりも大きな粒子が捕らえられるであろう。一つの実施形態において、主チャネルと格子の両方がカメラの視野内にあるだろうから、粒子は、孔格子上のそれらの着地部位まで直接的に追跡されてもよい。孔格子は、大量の全開口面積を有する密に集められた孔を正確にパターン化することができる光学リソグラフィによって作製されてもよい。一つの実施形態において、各粒子は、その着地部位まで追跡された後に、（ステップ１５０からの）それに関連付けられた高品質画像（ＭＦＩシステムと同様）並びにその位置を指定するｘ及びｙ格子位置を有する。これは、同定が行われる次のステップのために重要である。画像をスペクトルに結びつけることの一つの利点は、追加的な補強証拠のためであり、例えば、タンパク質凝集物のように見え、またタンパク質凝集物スペクトルを有する粒子は、追加的な信頼性を提供する。ある複数の実施形態において、より高いレベルの形態学的及び／又は光学的散乱強度分析を提供するために、同じ粒子の複数の画像が使用される。
【００４７】
ある複数の実施形態において、より正確に粒子追跡を行うために、より洗練された粒子位置予測が利用される。視野内でフィルタ用いてフローストリーム中の粒子を画像化することは、着地した粒子を流れている粒子に結びつけ、分光法と形態とを紐付ける（tie  together）ことを可能にする。予測方法は、流体力学に基づいており、分光法−形態の結合の精度を改善する。ある複数の実施形態において、良好な予測を行うために、以下の情報が利用されてもよい：（１）粒子は、概してそれらの流線内に留まる。もし流れが左から右であれば、一つの“緯度（latitude）”を流れる粒子は、同じ緯度の周りに着地しそうである。（２）着地する粒子は、フィルタ自体の上で見られるであろう。（３）粒子速度を同定するために、粒子の映像が使用されてもよい。低いレイノルズ数のポアユイズ流れ（Poiseuille  flow）条件が存在するであろう。粒子速度は、チャネル内の粒子の高さの予測を可能にし、従って、可能性のある着地部位の予測を可能にする。例えば、最も速い速度を有する粒子は、チャネルの（高さの）中間にあるであろう。もし流れが左から右に起こるならば、粒子は、フィルタの中央の“経度（longitudes）”（すなわち、東−西）に着地しそうである。
【００４８】
ある複数の実施形態において、粒子画像化は、粒子が（上で説明されたようにステップ１５０及び１５２においてフローセル内ではなく）フィルタ上に着地した後に起きる。互いに接近して着地した複数の粒子が、それらの着地時間を観察することによって識別されることができるように、ろ過プロセスを通して複数の画像が取得されてもよい。格子は、透明で、多くの異なる種類の画像を可能にしてもよい。粒子はそれらが捕捉された後に静止しているので、長い露光時間及び複数の画像化方法が、同じ粒子に順次使用されてもよく、各粒子が画像間で結合されることができるように、画像が重ねられることを可能にするであろう。
【００４９】
迅速な粒子同定（例えば、ＦＴＩＲ画像化、ステップ１５４）は、試料の全てがチャネル１１２を貫流させられ、粒子１３０がフィルタ１１８上に集められた後に行われる。ＦＴＩＲ画像化は、密に集められ、きれいに配列された（neatly  arranged）粒子に対して高処理量の分光法を実行するために使用される。ＦＴＩＲスペクトルは、粒子を同定するために使用され得るが、また、損傷の程度を知るためにタンパク質凝集物のタンパク質構造分析を実行するためにも使用され得る［３８］。ＦＴＩＲは、タンパク質治療法において広く使用される振動分光法（vibrational  spectroscopy）の一形態である。代替的な実施形態における他の可能性な選択肢である、ラマン分光法（Raman  spectroscopy）よりもＦＴＩＲ画像化を選択することには、少なくとも二つの利点がある。第一に、時間の節約−これらの粒子はきれいに集められて密な格子になっており、より遅い取得時間（acquisition  time）を有し、レーザスポットを走査しなければならないラマン法とは異なり、一度に多数の粒子を分析するためにＦＴＩＲ画像化が使用され得るからである。数時間を要するかも知れないラマン走査は、ＦＴＩＲ画像化システムを用いて５分間まで圧縮され得る。これは、システムを日常的な分析システムにするためには決定的である。第二に、ＦＴＩＲがより高速であるので、市場の複数のセグメントによって好まれる。金属を分類するためにはラマンもＦＴＩＲも使用されないが、これらは、これらの高度に不透明な特性によって（もし明示的に分類されなければ、）しばしばカテゴリ分けされ得る。ある複数の実施形態は、フィルタ格子の取り外し（removal）（又は取り外しなしの移送）を含み、使用者が金属のためにより適したシステム−例えばレーザー誘起破壊分光法（ＬＩＢＳ）又はＳＥＭ  ＥＤＳ分析に、それを移送することを可能にする。ある複数の実施形態において、スペクトルのデータベースを使用することによって、又は（ポンプ部品、シリンジストッパ、ガラスバイアル、賦形剤、シリコンオイル、医薬品等のような）可能性のある粒子発生源を手動で測定し、それらのスペクトルを保存することによって、物質のカスタムライブラリが構築されてもよい。物質のライブラリを予め選択することは、分光結果の精度を劇的に向上させ、ユーザーエクスペリエンス及び利便性を大幅に改善することができる。
【００５０】
有利には、本明細書において記述される実施形態による市販のチップは、製造可能であり、（例えばボリュームで５ドル又はそれ以下で）スケーラブル（scalable）であり、興味ある大きさ範囲（＞０．５μｍ）を捕捉してもよい。ある複数の実施形態において、処理量は、追跡及び同定される粒子の９０％超（＞９０％）について、１試料あたり３０分である。ある複数の実施形態において、ソフトウェアは、システム動作及びデータ処理を自動化するために使用される。ある複数の実施形態において、従来の粒子計数機器との＞９０％、＞９５％、＞９９％又は１００％の一致（agreement）がある。
【００５１】
ここで図１Ｃを参照すると、流体試料中の粒子を特徴付けるためのシステム１６０のブロック図が示されている。システムは画像化装置１８０を含み、画像化装置１８０は、一つ又はそれ以上のカメラ１６８、流体試料及び粒子を照明するための、（本明細書において記述されるリングライトのような）ライト１７０、カメラ１６８及びライト１７０を制御するための制御部１６２、並びに制御部１６２と通信するメモリモジュールを含んでもよい。制御部１６２は、様々な実施形態において記述されるように画像を処理してもよい。当該分野において通常の知識を有する者によって理解されるように、制御部１６２、メモリ１６４、カメラ１６８及びライト１７０は、いくつかの構成を介して通信してもよく、通信は、システム構成要素間で有線又は無線であってもよい。概して、ある複数の実施形態における画像化装置１８０は、互いに通信するための任意の構成のカメラ１６８及び制御部１６２を含み、そのため、画像化装置１８０は、画像を補足及び処理し、例えばディスプレイ１６６に、使用者のために粒子同定の結果を出力することができる。制御部１６２は、カメラ１６８の中に統合されてもよく、システム１６０の他の場所に配置されてもよく、又は遠隔に配置されて他のやり方でカメラ１６８、ライト１７０及び他のシステム１６０の構成要素と通信してもよい。制御部は、使用者に結果及び画像を通信するためにディスプレイ１６６に結びついてもよい。ディスプレイ１６６は、使用者入力をシステム１６０に提供するためのタッチスクリーンであってもよい。制御部１６２はまた、流体試料又はチップが載置されるステージ１７２と通信してもよい。ある複数の実施形態において、ステージは、試料をライト及びカメラの下で中心に置くように移動する。ステージはまた、制御部によって制御される照明要素を有してもよい。
【００５２】
図２Ａを参照すると、画像化装置１４０は、画像化領域１１４及びフィルタ１１８をそれぞれ画像化するための第一及び第二のカメラ１４２，１４４を含んでもよい。一つの実施形態において、両方の領域を画像化するために単一のカメラが使用される。ある複数の実施形態において、それぞれの領域を画像化するために一つより多くのカメラが使用される。一つの実施形態において、フィルタを画像化するために単一のカメラが使用され、流体試料はフィルタの上に直接的に提供される。システムがフィルタ上に捕らえられた粒子の画像化のみに関心を持つ場合など、画像化領域及びフィルタが同じ領域１１８である実施形態については、図２Ｂに具体的に示されるように、画像化装置１４０’は、単一のカメラ１４２を使用してもよい。これは、例えば、流体試料がフィルタ上に直接的にピペットで加えられる場合（例えば、図１Ｂ参照）に当てはまる。画像化装置は、一つの統合された制御部を介して、或いは画像化装置及びシステムと通信する一つ又はそれ以上の別個の制御部を介して、粒子を特徴付けるために画像を処理してもよいことが、当該分野において通常の知識を有する者によって理解されるであろう。ソフトウェア及び画像を保存するためのメモリモジュール、入力／出力構成要素、及び類似の種類のシステムにおいて通常見出される他の構成要素も存在し、当該分野において通常の知識を有する者にとって明らかであるような任意の方法で構成されてもよい。ある複数の実施形態において、定量的な高忠実度の粒子画像化（quantitative  high  fidelity  particle  imaging）は、流れ中ではなくフィルタ上で直接的に達成されてもよい。ある複数の実施形態において、顕微鏡を用いた観察は、フィルタ上への不動化（immobilization）に先立っての大きさ及び形態の特徴付けのための粒子画像化を可能にし、それは、より高い信頼性（confidence）の大きさ測定及び潜在的に粒子形態の３Ｄ再構成を可能にするであろう。
【００５３】
ある複数の実施形態において、代替的なフィルタの種類が使用される。ここで図３Ａ及び図３Ｂを参照すると、一つの実施形態において、微孔質格子の代わりに、堰フィルタ２００も粒子を捕捉するために使用され得る。これらのフィルタ２００は、チャネルとインラインであり、はるかに高密度のパックに粒子を集め、より高い処理量の分光を可能にするために使用されてしてもよい（図３Ｂ参照）。一つの実施形態において、更に下流であるほど漸進的に小さくなる、連続する複数の堰フィルタがある。堰フィルタの形状は様々であってもよい。一つの実施例において、隙間の表面積を増大させるために、ライン内のチャネルを横切って直線的に堰を延ばすのではなく、堰は、異なる形状、例えば‘Ｖ’、‘Ｕ’又は蛇状（serpentine）に形成される。一つの実施形態において、粒子計数又は質量の粗い推定は、粒子の集められたかたまり（the  packed  mass）の面積を測定すること、及び、これを堰の種類及びチャネル深さと組み合わせることによってなされてもよい。
【００５４】
ある複数の実施形態において、ある特定の大きさの粒子がフィルタの特定の部分に着地するか、または適切な堰をより容易に通過できるように、粒子の大きさに基づく選別（sorting）が上流で使用されてもよい。例えば、粒子選別器（sorter）はそれを配列してもよく、そのため、より大きな粒子は流れの方向に対して左に向かって位置付けられ、より小さな粒子は右に向かって移動する。このようにして、粒子が格子フィルタ上に着地するときに、それらは容易に定量化され得る。堰フィルタの場合において、大きな粒子及び小さな粒子は、そのように選別される場合、同じ流体流れライン内に存在しないであろう。これは、より大きな粒子が堰において捕捉されて、理想的には大きな粒子から逃れて更に下流に捕捉される、より小さな粒子の進行を妨害する状況を防止する。ある複数の実施形態において、マイクロメッシュは、装置間の流れ抵抗の低い変動性を通して、再現可能な（repeatable）流量対圧力依存性を可能にし、実行間の一貫性（run  to  run  consistency）を改善する。
【００５５】
ある複数の実施形態において、システムは、その後の再使用のための（例えば、Piranha／硫酸／過酸化水素、漂白剤を用いた）厳しい化学処理／洗浄を可能にするために無機材料から作られる。ある複数の実施形態において、デバイスの極端な平坦性が、画像化又はスペクトル信号の励起／収集のために光学系を再焦点合わせする必要なく大面積走査を可能にするように、ウェハグレードの材料が選択されてもよい。ある複数の実施形態において、自動化された画像化ステップのために、微細パターン化された基準点のマーク（fiduciary  mark）が表面上にパターン化されてもよい。例えば、基準点マークは、画像又は分光走査が開始する場所を示してもよい。別の実施例は、装置の傾き及び湾曲（bow）を定量化する目的で、装置を横切る異なる位置の複数のマークが画像化されてもよいことである。ある複数の実施形態において、装置の微細パターン形成は、連続したアセンブリ（例えば、流れアセンブリ、画像化アセンブリ）又は積み重ねデバイスにおける正確な位置合わせ（alignment）のために、装置材料の直ぐ上にエッチングされた位置合わせ機構（例えば、ガイドピン用の穴）の追加を可能にする。
【００５６】
したがって、従来のデバイスと比較して、本明細書において記述される複数の実施形態は、いくつかの利点を有する。粒子同定に関して、それらがフィルタ上に着地するときに粒子を画像化することによって、各粒子のスペクトルは、その画像に直接的に紐付けられ、それに正確な同一性を与えることができる。この特徴は、科学者にとって非常に望ましい。ろ過の利点もある。リソグラフィによって画定された孔は、優れた品質を有する。それらは、従来のフィルタと比較して要求される圧力を低減しながら体積流量を大幅に増加させる多量の開口面積を有する。結果は、はるかに穏やかなろ過及び柔軟な粒子がフィルタを押し通される見込みの減少である。ある複数の実施形態において、それらは分光法のために理想的な材料で作られ、密に集められた格子の特性は分光分析時間を劇的に短縮する。本明細書において記述される複数の実施形態は、標準的なろ過の欠点を克服する。従来のろ過顕微鏡検査は、粒子がフィルタを通って押し出されるか又は固体基材上に一度に画像化することが困難であり得るため、マイクロ流画像化よりも定量性が低いと認識されている。しかしながら、二つの技術を組み合わせることによって、フィルタ分光法の分類能力を利用しながら、ＭＦＩの定量的計数がテコ入れされ得る。流れ制御に関して、粒子が標準的なフィルタ上に蓄積するにつれて、圧力は強まり、強制的に変形可能な粒子をフィルタに通し得る。本明細書において記述される複数の実施形態によるチップは、（例えば、流量を減少させることによる）膜上の流体圧力の動的制御を可能にし、捕捉された各粒子に対する応力を危険な閾値以下に保つ。流れ制御はまた、フィルタ閉塞を検出することもできる。高処理量の分光法は、もう一つの重要な利点である。従来のＩＲ及びラマン顕微鏡検査は、組成マップ（compositional  map）を生成するために点光源及び単一素子検出器の走査を要求する。ＩＲ画像化で使用されるアレイ型検出器は、スペクトルの並行取得により有意に高い処理量を提供する。加えて、様々な実施形態によれば、試料バンキング（sample  banking）が改善される：使い捨てチップの使用は、将来的な、より深い調査又はＦＤＡ  ＱＣ記録保持に対するバックアップの必要性が生じた場合に、各試料がバンクされることを可能にする。チップはまた、“開かれて（opened）”、電子顕微鏡又はＬＩＢＳを用いて分析されてもよい。
【００５７】
ここで図４を参照すると、一つの実施形態において、フィルタチップ３００を作製するために、細胞分離装置のために従来使用されている標準的な微細作製（microfabrication）技術が利用される（例えば、Earhart  CM,  Wilson  RJ,  White  RL,  Pourmand,  N,  Wang  SX.  Microfabricated  magnetic  sifter  for  high-throughput  and  high-gradient  magnetic  separation  J.  Mag.  Mag.  Mat.  2009  May  1;321(10):1436-39;及びEarhart  CM,  Hughes  CE,  Gaster  RS,  Ooi  CC,  Wilson  RJ,  Zhou  LY,ら、Isolation  and  mutational  analysis  of  circulating  tumor  cells  from  lung  cancer  patients  with  magnetic  sifters  and  biochips.  Lab  Chip.  2014  Jan  7;14(1):78-88.を参照）。一つの実施形態において、二重研磨されたシリコンウェハ３０２は二酸化ケイ素の３ミクロン厚の層３０４で被覆され、それには、光学リソグラフィによって微細孔３０６がパターン化されることができる。これらの孔３０６は、深い反応性イオンエッチングによって、裏側を通して酸化物層で終わる、ハニカム構造をエッチングすることによって流体の流れのために開けられることができる。流体及び照明のアクセスのためのより大きな穴もまた、このステップにおいてエッチングされてもよい。一つの実施形態において、フィルタは、２×４ｍｍのパターン化されたフィルタ領域を有する１×２ｃｍの長方形のダイであり、アレイあたり３００−１５００個の孔を有する２４０個の六角形のアレイを含み、孔の大きさ（２−５μｍ）及び間隔に依存して装置あたり７２，０００−３６０，０００個の孔をもたらす。一つの実施形態において、Pharmacopeial  Conventionに記載された粒子濃度限界（〜６０００粒子／試料）を試料が含む場合に、粒子の１００％が捕らえられ、一つの粒子が各孔を占めると仮定して、流体抵抗が、１０％より小さくだけ変化することになるように、フィルタ能力は十分に高く決定される。パターン化された孔領域に隣接して、１．５ｍｍだけ隔てられて、２×４ｍｍの酸化物窓３０８があり、これを通してマイクロ流画像化のために照明が提供される。両方の領域は、４ｘ対物レンズ及び２２．５ｘ１６．９ｍｍのセンササイズを有するカメラを使用することによって提供される視界に適合するような大きさに作られている。この設計によって対処される一つの問題は、照明膜が機械的に安定であることを確かにすることである。リスク軽減ステップとして、一つの実施形態によれば、ハニカム支持構造を有する設計が実施される。支持構造体の上から直接的に粒子を画像化することはより困難であることが証明されるかも知れないが、高い標本化頻度（sampling  frequency）は、それが画像化領域を横断するときに、酸化膜の上からの粒子の画像化を可能にするはずである。図５に示されるように、小型筐体は、フィルタ上で直接的に画像化することを可能にしてもよい。一つの実施形態において、入口容器４０８及び出口４１０とは流体連通しており、出口４１０はフィルタ４０４によって覆われている。フィルタ４０４は、Ｏリング４０６で囲まれており、カバースリップ４０２によって覆われている。それ故に、単純な筐体に組み込まれているので、粒子の形態について直接的に画像化されることができる。
【００５８】
ここで図６Ａ及び図６Ｂを参照すると、一つの実施形態による、照明するための方法が示されている。フィルタスタック５０２は、不透明なトップリング５０４及び透明又は半透明（translucent）の両面テープ５０６、マイクロフィルタチップ５０８、両面テープ５１０及びボトムリング５１２を含む。組み立てられたフィルタスタック５０２は、リングライトアセンブリ５００内に適合するように構成され、それは、チップ５０８に向かって内側に向けられた複数のライト（例えば、ＬＥＤ）を含む。マイクロフィルタチップ５０８上の粒子画像化の品質は、照明の方法によって劇的に影響を受ける。ライトがチップ表面と面内で（in-plane）粒子に向けられる照明方法は、孔の過度の照明を防ぎながら粒子の優れた照明を提供する。孔の照明は、粒子と混同され得るため、画像を処理する際に困難を引き起こし得る。この効果的な照明を達成するために、ＬＥＤ５２０が半径方向内側を指しているＬＥＤ５２０のリングライト５００が開発された。リングライト５００は、ＬＥＤ５２０がマイクロフィルタチップ５０８の上面と面内になるように位置付けられる。この方法は、照明が側面から来て物体エッジが明るく見える暗視野照明に類似する。しかしながら、真の暗視野照明は、画像と面内ではない。マイクロフィルタチップ５０８の場合には、暗視野において孔縁（エッジ）も照明され、望ましくない。
【００５９】
大半のフィルタ用途において、フィルタは、側方から来る照明を遮断するか又は歪めるホルダ内に置かれる。光がこの層を通って進み試料を効果的に照明することを可能にする、透明又は半透明のテープ層を使用するフィルタホルダが開発されている。消耗品の構成は次のとおりである。リング形状の両面テープ接着剤５０６が、マイクロフィルタチップ５０８の上面に置かれる。テープ接着剤５０６は、中央に隙間を有し、液体がチップ５０８のフィルタ部分を通過することを可能にする。現在不透明なアクリルで作られている、リング形状の上部５０４は、テープ５０６がチップ５０８と上部のアクリルリング５０４との間に挟まれるように、両面テープ５０６の上面に置かれる。これは、液密であるマイクロフィルタチップ５０８の上面にリザーバを形成する。液体試料は、リザーバの中に分注され、吸引されて通ってもよい。真空引き後、マイクロフィルタチップ５０８の上面は、テープ層を通して照明されてもよい。不透明なトップリングは、クリアな又は半透明のリングより優れていることが判明した。これは、光をテープ層の中に閉じ込めることが、より多くの平面光が試料に到達することを確かにするからである。
【００６０】
一つの実施形態において、フィルタ上で画像化された粒子の高精度の類別（classification）は、粒子に対して集められるデータに機械学習アルゴリズムを適用することによって達成されてもよい。データは、画像、分光若しくは蛍光信号又はスペクトル、又は画像処理、信号処理、又は教師なし学習プラットフォームを通して画像、分光若しくは蛍光信号又はスペクトルから抽出された特徴を含んでもよい。データは、予測モデルを生成するために、単一機械学習アルゴリズム又は機械学習アルゴリズムの組み合わせ、例えば、ランダムフォレスト、ブースティング、又は人工ニューラルネットワークによって分析されてもよい。既知の同一性の粒子に対して集められたデータのトレーニングセットは、予測モデルを構築するために使用され、それは、次いで分類又は類別のために未知の粒子に適用され得る。類別情報は、粒子の種類（例えば、タンパク質、ガラス、ハイブリッド材料）又は亜類型（ガラス、金属、又はタンパク質の種類）を含んでもよい。類別はまた、タンパク質粒子について凝集状態又はありそうな凝集の原因を含んでもよい。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、ブースティングアルゴリズムである。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、ニューラルネットワークを使用する。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、畳み込みニューラルネットワークを使用する。機械学習アルゴリズムはまた、類別に代えて又は類別に加えて、連続的な出力を生み出すためにデータに適用されてもよい；例えば、タンパク質の凝集、変性、変性又は結晶化の程度。
【００６１】
一つの実施形態において、高真空圧力（すなわち、チップ下の低いチャンバ圧力）は、流体をフィルタ又は膜を介して迅速に駆動し、全体の処理時間を低減するという利点を有する。しかしながら、高真空圧力はまた、繊細な粒子を駆動して、代わりに捕捉することが望ましいであろう膜を通過させる危険性をもたらす。流体を駆動して膜を通過させるために、破過圧力が達成されなければならない。フィルタ孔で発生する可能性のある毛管力を克服するために、破過圧力はしばしばかなり高い。ひとたび流れが確立されると、しばしば強度がより低い、異なる真空圧力が適用されてもよい。この破過圧力を低減し、粒子を駆動してフィルタ孔を通過させる可能性を回避するために、様々な薄い表面処理がフィルタ表面の親水性を高めるために採用されてもよい。これらの処理の例は、ウシ血清アルブミン、蒸着され得る親水性シラン、膜の金表面上で自己集合し得る親水性チオール、及びポロクサマーpluronic  F-68の使用である。
【００６２】
一つの実施形態において、テクスチャ、蛍光強度、及び形態を使用した粒子の特徴付けは、各粒子の強度の正確な測定を要求する。従来の粒子の画像化は、単一の画像を取得すること及び飽和画素の数を最小化することによって行われ、これは、標準ダイナミックレンジ画像化（ＳＤＲ）として知られている。桁違いの大きさの差を有する複数の粒子集団を扱う場合、ＳＤＲ画像化を使用して集められた情報は、小さな粒子からの強度データが非常に低く、画像の背景から識別不能でさえあり得ることを要求する。高ダイナミックレンジ画像化（ＨＤＲ）は、コンピュータアルゴリズムを使用して、多くの桁の範囲にわたる複数の暴露時間で取得された多くのＳＤＲ画像を併合（merge）し、画像のフルダイナミックレンジを含む単一の高ビット深度（１６＋）画像にする。ＨＤＲ画像化の使用は、従来の方法を使用して達成され得るよりも有意に広い範囲の輝度レベルをもつ画像を結果としてもたらし、粒子のより良好な特徴付けを可能にする。
【００６３】
一つの実施形態において、分析される各粒子は、粒子の表面を記述し得る粒子の固有の（unique）強度マップを含むであろう。粒子の表面性質は、粒子種類に固有であり、いくつかの場合においては粒子の亜類型（sub-type）に固有である。これらの表面性質は、粒子を類別するために他の性質と共に使用されてもよい。粒子の表面に関する情報は、グレイレベル共起行列、ローカルバイナリパーティション（local  binary  partition）、エッジ密度及び方向（edge  density  and  direction）のような、数学的アルゴリズムを使用して抽出されてもよい。
【００６４】
一つの実施形態において、フィルタの裏面（非画像化側）に付着する液体の小滴は、孔を満たし、チップの上部に戻って入り、粒子及び粒子の縁を不明瞭にすることによって、画像化を混乱させ得る。この液体をチップから取り除くために、いくつかの方法が採用されている。一つの実施形態において、方法は、高流量（少なくとも２立方フィート毎分（約５６．６３リットル毎分））が可能な真空源を使用して、チップを十分な時間にわたって真空にすることである。一つの実施形態において、方法は、ガスの流れ（好ましくは、窒素ガスのような乾燥したもの）をチップの上部に向けてあてることである。一つの実施形態において、方法は、第二の方法のようにガスの流れを表面に向かって単にあてるのではなく、加圧されたガスを強制的に表面を通過させることである。これは、ガス源とチップとの間のシールを要求する。一つの実施形態において、方法は、空気を駆動して膜を通過させるために、チップの上又は下でファンを使用することである。表面下でファンを使用することは、粒子が膜に対して駆動され、チップの上のファンの場合のように粒子が吹き飛ばされる可能性がより少ないため、好ましい。一つの実施形態において、方法は、（セルロースパッド又はガラス繊維パッドのような）ウィッキング物質を使用して、液体がウィッキング物質に入るように、それをチップの底に適用することである。
【００６５】
ここで図７Ａ及び図７Ｂを参照すると、一つの実施形態において、使い捨て可能なウェルプレート６００は、流体試料のための複数の流体チャネル又はウェル６０６を含む。ウェルプレートは、３２−９６ウェル、最大３８４ウェル、最大１５３６ウェル又はそれ以上の複数のウェルを含んでもよい。一つの実施形態において、使い捨て可能なウェルプレート６００は、二つの層６０２，６０４からなる。孔６０６を有するポリカーボネート（透明）プレートである上部層６０２、及びポリカーボネート６０２に熱的に接合された（bonded）底部多孔質膜材料層６０４。多孔質膜（ポリカーボネートでもある）の孔径は現在４００ｎｍであり、商業的に入手可能である。一つの実施形態において、図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、各々直径４７ｍｍの二つのディスクが使用される。二つのディスクは、プレート６００上に組み立てられて３２個の試料ウェル６０６を形成する。膜は、熱接合技術を使用してプレートに接合される。一つの実施形態において、ウェルは、本明細書において記述されるリングライト内に適合するように円形パターンを形成する。流体試料は、図７Ｃに例示されように、ピペットによって各ウェルに導入されてもよい。
【００６６】
一つの実施形態による、ウェルプレートを画像化するためのロボット装置が、図８を参照して示される。ウェルプレート６００は顕微鏡ステージ７０２上に乗り、それは、何れのウェル又はウェルセットがリングライト７０６の下に位置付けられるかを操作することができるトラックシステム７０４上に更に乗る。画像化及び処理構成要素７１０は、流体試料及びウェル内の粒子を画像化するためにデッキの上に構成される。概して、機器は、本明細書において記述されるカメラ及び照明方法を備えたロボット顕微鏡である。一つの実施形態において、３２ウェルプレート６００が顕微鏡ステージ７０２上に置かれ、顕微鏡は、画像化のために対物レンズの下にウェルを自動的に位置付ける。大面積（例えば、４／３インチ）カメラセンサを画像化に利用されてもよく、それは低倍率レンズを用いて良好な画像を可能にする。これは、単一の画像内に膜の広い領域を適合させることを助け、画像化性能を過度に犠牲にすることなく、速度のために設計された構成である。
【００６７】
一つの実施形態において、ウェルプレートが機器７００の中に装填され（loaded）、少なくとも一つの“背景”画像を生成するためにプレートの画像が取得される。ある複数の実施形態において、複数の背景画像が実際に取得される。背景画像は、ある複数の実施形態において、複数の平均、複数の露光設定、複数の照明方法、複数の焦点高さ、及び当該分野で知られる同等の技術に基づいて生成されてもよい。おそらく、試料の導入前に存在する、計算に入れられるべきいくつかの粒子又は変形が膜上にあり、概して、計算に入れられなければならない背景の特徴が常に膜上にある。これらは、傷（scratches）、テクスチャ、製造からの粒子、又は空気などであり得る。試料からの正確な粒子計数を得るために、これらの背景の特徴は考慮に入れられるべきである。“前の画像”はこの目的のために収集され（acquired）、試料が膜上に充填されて真空にされる前に分析される。“前”及び“後”の画像は、正確な粒子データを得るために様々なアルゴリズムを使用して処理される。
【００６８】
次に、使用者は、試料をウェルの中にピペットを用いて加えることによってプレートを流体で充填してもよい。次いで、プレートは真空マニホールド上に置かれ、膜上に粒子のみが残されるように（流体なし）、真空が適用される。次に、使用者は、画像化及び分析のためにプレートを機器の中に装填してもよい。次いで機器は、一つ又はそれ以上の光学的条件下（例えば、明視野、暗視野、蛍光、異なる曝露）で、各ウェルを画像化する。ある複数の実施形態において、明視野及び斜め角度照明の組み合わせを使用して、合成画像（composite  image）が形成される。明視野を側方照明と組み合わせることは、異なる物質の粒子間の優れた区別（differentiation）をもたらす。ある複数の実施形態において、プレート通過（through-plate）斜め照明が使用される。次に、機器は、ウェルへ移動し、ソフトウェア技術を使用して焦点を合わせ、一つ又はそれ以上の技術を使用して画像を収集する。各技術について、画像の多重露光スタックが取得されてもよい。これらのスタックは、次いで組み合わされて単一の高ダイナミックレンジ画像にされてもよい。もし膜全体が１回の露光に適合しなければ、複数の領域が上述されたように別個に画像化され、組み合わされて単一のステッチ画像にされる。ある複数の実施形態において、焦点融合及び平均化技術が利用される。ＨＤＲ画像スタックは、多くの異なる高さで取得され、一緒に焦点融合されてもよい。また、全ての画像は、実際には同じ露出での一回又はそれ以上の繰り返しからなる平均化された画像であってもよい。ある複数の実施形態において、焦点融合を行うために、画像間のわずかな動きを計算に入れるために、各画像は互いに位置合わせされる必要がある。次のステップにおいて、次いでシステムは次のウェルに進む。画像は、画像処理ステップを使用して分析され、粒子を単離し、どの粒子が試料に由来するか、及び何れが前の画像に由来する背景粒子であったかを同定する。ある複数の実施形態において、両方の画像が重い画像処理を受け、前の画像は背景のテクスチャ及び粒子が除去されるような方法で後の画像と数学的に組み合わされる。次いで機器は、大きさ＋計数、形態学的性質（例えば、アスペクト比）粒子ＩＤ、輝度、不透明度、二つの異なる画像化モード間での輝度の比、又は他の安定性パラメータのような、所望の物理的及び化学的パラメータを出力する。次に、使用者は、プレートを取り出して、新しいアッセイのために追加の化学反応を実行してもよく、それは示差測定（安定性、溶解性、活性アッセイ）を行うために機器に戻される。粒子が集められた後に、それらは、追加的な技術（他のアッセイ、ＦＴＩＲ、ＥＤＸ）等によって更に分析されてもよい。有利には、プレートは粒子を捕捉し、それらを良い方法で他の機器に提示する。
【００６９】
先の実施形態の場合と同様に、機器の利点への鍵は、高い信号対雑音比をもたらす、膜上の粒子を照明する方法である。目的は、画像の背景を形成する膜と比較して、粒子が可能な限り明るく見えるような方法で試料を照明することである。この方法に関係する構成要素は、ＬＥＤリングライト、消耗プレート（consumable  plate）及び膜を含む。照明源は、ＬＥＤリングライトであり、図９Ａ及び９Ｂに示されるように、非常に斜めの角度で粒子を照明する。ＬＥＤリング８０４は表面実装型ＬＥＤｓを使用し、それらは、リング８０４の中心に向かって光を方向付ける。ＬＥＤｓは、可能な最も斜めの光を達成するように、可能な限り膜の近くに置かれる。この斜めの角度は、膜表面と比較して、優先的に粒子から光を散乱させると考えられる。これは、粒子信号対雑音比の増加を結果としてもたらす。いくつかの実施形態において、斜めの角度は、１７度よりも小さい。いくつかの実施形態において、斜めの角度は、１３度よりも小さい。ある複数の実施形態において、システムは、角度が表面と同一平面上であるように構成されている。一つの実施形態において、斜めの角度は、フィルタの平面（flat  plane）と比較して任意の９０度でない角度である。一つの実施形態において、斜めの角度は、３０度であるか又はそれよりも小さい。一つの実施形態において、斜めの角度は、２０度であるか又はそれよりも小さい。一つの実施形態において、斜めの角度は、１７度であるか又はそれよりも小さい。一つの実施形態において、斜めの角度は、１３度であるか又はそれよりも小さい。
【００７０】
一つの実施形態において、ＬＥＤｓから来る光は、粒子に達する前にプレートと相互作用するであろう。一つの実施形態において、透明プレートは、光がわずかな散乱でプレートを出入りすることを可能にする、磨かれた壁と共に利用される。一つの実施形態において、プレートは反射フィルムで被覆される。この場合、光はプレートのバルク材料に入り得ないが、画質はまだ高い。これは、光がウェルに入り、斜めの角度を維持しながらウェルの内側で反射するためであると思われる。
【００７１】
一つの実施形態において、ウェルの底部は、ウェルの上部よりも小さい半径を有する。画像化システムの対物レンズが膜上に焦点を合わせられるときに、ウェルの上部は焦点の外であり、膜の画像化に侵入する明るいボケ（blur）を生じさせ得る。このボケは、ウェル壁に近い粒子を不明瞭にし得る。したがって、ウェルの上部の半径を増大させることによって、最も焦点の外にある要素が膜から持ち去られ、膜の外側領域のより良好な画像を可能にする。
【００７２】
一つの実施形態において、画像化は、プレートに取り付けられていない裸の（bare）膜上で実行され、優れた画像化を提供するが、液体の制御されたアリコートを送達するための容易な方法を可能にしない。一つの実施形態において、ウェルの高さが低減されるか、或いは、ウェルは、水滴を泡立たせてその位置を維持する、非常に薄い疎水性材料を使用して他の方法で規定される。この薄い材料は、ある複数の実施形態において、画像化のために優れているであろう。
【００７３】
膜も同様に様々であってもよい。一つの実施形態において、膜は、例えば、EDM  Milliporeを通じて商業的に入手可能なもの（製品名：Isopore  black  membranes、製品番号HTBP04700）のような、黒色トラックでエッチングされた膜である。一つの実施形態において、膜の表面テクスチャは滑らかである。黒色材料は他の膜が散乱する光を吸収し、好ましい膜は、低い表面粗さを有するように見え、それもまた背景の散乱を低減することを助けると考えられる。一つの実施形態において、膜プレートは、フェルトのような暗く、非反射材料の上に置かれ、それは、光が反射し、膜を通って戻ることを防止することを助ける。テクスチャを有し、直接的に接触して置かれたときに膜上にバンプを作り出すことができるフェルトは、スペーサ／リップを使用して膜から分離される。一つの実施形態において、トラックエッチングされた膜は、例えば金、クロミウム又はアルミニウムのような薄い金属層でそれらを被覆することによっても変更され得る。
【００７４】
暗視野画像化では、膜の粗さが多く散乱させ、非常に高い強度の背景を作り出し、結果としてより低いＳＮＲをもたらす。この方法は暗視野照明より優れており、一つの可能な説明は、この場合における照明角度がより斜めであるということである。換言すれば、照明角が膜に平行に近く、膜と同一平面になるほど、粒子は膜からより良く際立つことができる。ある複数の実施形態において、少なくともいくつかのタンパク質凝集体では、明視野がより良好な照明方法を提供し、次に斜め角度側方照明である。したがって、両方の方法が、合成画像を作り出すために使用されてもよい。様々な実施形態によれば、二つの画像化技術の比は、複数の種類の粒子を計数し、差異を生じさせるための強力なツールとなり得る。図９Ｃ−９Ｅに示されるように、一つ又はそれ以上の側方照明画像９Ｃは、一つ又はそれ以上の明視野照明画像９Ｄと組み合わされて合成画像９Ｅを生成することができる。示された粒子は膜上にあり、チューブローテーターを使用して液体−空気界面の連続的な膨張及び拡張によって生成された高分子粒子とタンパク質凝集体との混合物である。図９Ｃに示される第一の画像は、斜め光技術を使用して取得される。この画像において、右下の高分子粒子は鋭く際立っている。他の粒子は容易に識別されない。図９Ｄに示される第二の画像において、４５５ｎｍの中心波長（青色）ＬＥＤを使用する明視野照明が粒子に適用される。この実施例における明視野照明は、試料の上から対物レンズを通して照らされる光からなる。図９Ｄにおいては、タンパク質凝集体及び高分子粒子の両方が見える。大半の粒子は、側方照明を使用して背景からより容易に識別されるが、これらの特定のタンパク質凝集体は、それらが平らに寝る原因となるそれらの柔軟且つ変形可能な特性のために、見ることがより困難であると考えられる。図９Ｅは、図９Ｃ及び図９Ｄに示される画像化の二つのモードを混ぜ合わせることによって形成された合成である。合成画像は、異なる材料の粒子が異なる照明条件の下でどのように非常に異なって見え得るか、及び、これが粒子を特徴付ける有効な方法となり得ることを示す。赤色の粒子はタンパク質凝集体であり、黄色の粒子は高分子である。したがって、一つの実施形態において、粒子は明視野照明のみによって特徴付けられる。一つの実施形態において、粒子は側方角度照明のみによって特徴付けられる。一つの実施形態において、粒子は明視野照明と側方角度照明の組み合わせによって同定される。
【００７５】
本発明の複数の実施形態によれば、また図１０Ａ−図１０Ｄに示されるように、異なるプレート構成が利用されてもよい。図１０Ａは、プレート９００及び膜９０２を示し、プレート９００はクリアなポリカーボネートプレートとして構築されている。図１０Ｂは、クリアなポリカーボネートプレート９１０及び膜９０２を示す。ある複数の実施形態において、膜は高分子又は金属の膜である。プレート９１０の上面は、不透明な物質９１２によって覆われている。図１０Ｃは、ポリカーボネートプレート９２０及び膜９０２を示す。プレート９２０は、反射被覆９２２を用いて塗装されている。図１０Ｄは、一つの実施形態による、明るい白色のポリカーボネートプレート９３０及び膜９０２を示す。最高の画像は１と３から来た。図１０Ａの実施形態は、光がプレートの上面の両方を通って（及び隣接するウェル壁を通って）入り、画像化されるべきウェルのウェル壁を通って出ると考えられるので、特定の利点を有する。図１０Ｃは、斜めの光がウェルに入り、それが表面に到達するまで壁から反射され、依然として斜めの角度で進むと考えられるので、特定の利点を有する。
【００７６】
ここで図１１Ａ−図１１Ｄを参照すると、本明細書において記述される実施形態への再び鍵となる利点は、照明光が非常に浅い角度で粒子に衝突し、それは背景物質に対して良好なコントラストを提供することである。ある複数の実施形態における照明光は、試料と相互作用する前にプレート材料を通過し、従ってプレートは、光を透過させることを助ける物質及び機構（フィーチャ）を用いて設計されてもよい。今まさに、光の多くは、その隣接するウェルを通ってウェルに入る。ある複数の実施形態において、光学的機構は、プレート材料自体の中に組み込まれ、より高い光強度における粒子（又は他の物体）と背景との間の改善されたコントラスト（それはカメラ露出がより短くなることを可能にし、時間の節約及び性能の改善につながる）のために、光を透過、焦点合わせ及び案内する鏡、レンズ及びプリズムを含む。ある複数の実施形態において、プレート材料又はプレート壁のバルクは、光ガイドとして作用するように設計される。図示される実施例において、光学的機構は、特定の屈折率を有する材料のような、プレート材料の中に組み込まれてもよく（図１１Ａ参照）、光源が隣接するウェル内に置かれてもよく（図１１Ｂ参照）、プレート材料の表面は、フレネルレンズのような特定の非直線の幾何学的形状を有してもよく（図１１Ｃ参照）、また、プレート材料は、レンズ設計を有してもよい（図１１Ｄ参照）。
【００７７】
ここで図１２を参照すると、一つの実施形態によれば、膜プレートを作り出すために熱接合技術が利用されてもよい。３２ウェルプレート１００６及び膜１００８は、上部１００２及び底部１００４を有する圧縮治具の中に置かれ、治具は、加熱されたプレスの中に置かれる。熱は、接合が行われるプレスの側面にのみ加えられる。次いで、接合を実行するために圧力が加えられる。膜及びプレートの両方はそれ自体ポリカーボネート製である。ポリカーボネートプレートは、熱接合が起こり得るよう、それらが膜の材料に適合するように選択された。熱接合技術の間のプレートの変形を防止するために、圧縮治具上部１００２は、熱を所望の接合領域に局在させるいくつかの突出したリングを介してのみプレート１００６と接触する。さらに、ウェルの中心の膜１００８は、圧縮治具底部１００４上にピン１０１０の使用によって比較的冷たく保たれる。これらのピン１０１０は、加熱処理の間に膜１０８に極めて接近しており、局所的な温度低下を引き起こすであろう。ある複数の実施形態において、３２ウェルプレートは、融解領域として作用する各ウェルの周りに突出した“ビーズ”材料を有する。ある複数の実施形態において、ビーズは、三角形の先端が膜と接触して最初に融解するような三角形の輪郭を有する。この方法は、接合をより頑健にし、制御されたものとし、強くする。
【００７８】
ここで図１３Ａ及び図１３Ｂを参照すると、一つの実施形態において、ウィッキング物質が真空マニホールドにおいて使用されてもよい。捕捉された粒子の正確な画像を取得するために、膜が乾いており、表面張力のために残り得る試料液滴がないことが重要である。試料を引いて膜の孔を通過させるために使用される真空マニホールドは、プレート及び膜の底面に接触するウィッキング材料（図１３Ａ参照）を加えることによって変更されてもよい。ウィッキング材料は、浸透圧を介してプレートから離れるようにバルク液滴を引き寄せる（図１３Ｂ参照）。試料が膜を通して完全に処理された後、プレートは、真空マニホールドから持ち上げられ、ウィッキング材料から離れる。微視的な膜の孔内の残りの液体は、急速に蒸発し（＜１ｓ）、プレートは即座に画像化のための準備ができる。
【００７９】
トレーサー粒子は、画像処理を改善するために利用されてもよい。異なる膜、プレート内の異なるウェル及び異なるライティング条件の間の変動のために、並びにカメラノイズ及び様々な他の原因のために、画像を定量的に比較することは常に困難である。既知の形状及び大きさのトレーサー粒子が、各ウェルに添加されてもよい。これらのトレーサー粒子は、画像バランシング、背景減算、閾値計算を支援する。一つの実施形態において、１０ミクロン及び１５ミクロンの大きさのポリスチレン及びポリカプロラクトンがそれぞれ利用される。一つの実施形態において、熱処理又は化学処理は、粒子を表面の上に固定し、それらが試料充填中に動かないようにするために使用される。例えば、ポリカプロラクトンは、６５℃で１分間にわたって加熱されてもよい。ポリスチレンは、硝酸で処理されるか、１５０℃まで加熱されてもよい（膜の変形を防ぐため）。ある複数の実施形態において、膜自体のような膜上の固有の特徴及び背景テクスチャが、処理を改善するために利用される。
【００８０】
ある複数の実施形態において、膜の周囲に物質がない場合（例えば、もしウェルプレートが膜から取り外され、光が通過する壁がなければ）、粒子対背景の最も高いシグナル対ノイズ比を有する照射が起こる。一つの実施形態において、画像化のためにウェルプレート自体が膜から取り外されるか、又は代替的に疎水性材料がウェルを後に残す形状にパターン化されるかのいずれかである。したがって、これらの実施形態において、壁は物理的ではなく化学的である。
【００８１】
有利には、本明細書において記述される実施形態によるシステム及び方法は、ウェルあたり１分未満（＜１ｍｉｎ）の速度で低体積から高体積の範囲（例えば、１０μＬ−１ｍＬ又は５０μＬ−１ｍＬの範囲）を処理することができる。この低体積の目に見えるより小さな粒子の分析（例えば、少なくとも１０μＬ又は５０μＬまで）は、従来技術の２−１０Ｘよりも小さい。優れた目に見えるより小さな粒子の分析技術は、ＦＬＯＷＣＡＭ及びＭＦＩである。それらは流体の流れの中で粒子を分析するので、それらは多くのデッドボリューム及びチュービングを要求する。
【００８２】
低体積の処理は、重要である。処方（formulation）選択の間（研究者は既にＡＰＩ候補を発見しており、今は体内で取り込まれ得る安定した形態にする時期である）、研究者は、製造（ひとたび処方が選択されており、スケールアップされている）とは異なり、余裕のある多くの材料を有しない。度々、彼女ら／彼らは、イニシアチブ全体で１試料あたり１ｍＬしか有しない。彼女ら／彼らは、いくつかの処方を試験するために目に見えるよりも小さな粒子の分析を行うことができるようにしたいと考えるであろうが、現在はツールの体積要求を所与とすると、できない。本明細書において記述されるアプローチは、大型の流体リザーバ及び多数のチュービング（デッドボリューム）を要求する代わりに、研究者は、標準プレートのように試料を手動でピペットを用いてウェルの中に入れるだけであるから、低体積及び高体積で行うことができる。もし粒子が多すぎるとフィルタが詰まり、画像化と流れの両方に影響を及ぼすので、体積は制約とならず、粒子の濃度であるから、本実施形態は、同様に大きな体積をも行うことができる。
【００８３】
本明細書において記述される実施形態はまた、より高い速度又は処理量で動作する。従来の流れ画像化（ＦＬＯＷＣＡＭ及びＭＦＩの両方）において、粒子は流体チャネル／フローセル内を流れ、各粒子が流れるときに画像が取得される。それらは、個々の粒子が流れるときに、個々の粒子を捕捉するために、毎秒複数の画像を取得する。１ｍｌの試料を分析するために、１０−１５分／試料がかかり、生み出されるファイルは膨大（極めて多くの画像）である。本実施形態は、流れ及び画像化条件によって、より高速である。流れに関しては、試料は、各ウェル内に独立して充填される（ピペットを用いて加えられる）。次いで試料は、真空を適用した後に、高い流量でメッシュ／ふるいを通して流される。メッシュの孔径よりも大きな粒子は、残りの流体が流れて通過する間、動かない。この処理にかかる時間は１秒より短くてもよい。ここでの流量は、ＭＦＩ及びＦＬＯＷＣＡＭよりも１００−１０００倍（１００−１０００Ｘ）高速である。これは、１０−１５分で１ｍｌを分析することから、数秒で１ｍｌヘと処理量を増大させる。加えて、複数の実施形態の分析は、せん断速度（shear  rate）が低いことを示す（複数の実施形態は、タンパク質がフィルタ上で詰まるときにタンパク質に影響を与えない）。画像化に関しては、次いで本実施形態は、今や粒子が全体にわたって広がっているメッシュ全体の広視野画像を取得する。したがって、粒子が存在することを望んで個々の写真を取得する代わりに（上のＭＦＩ図を参照）、本実施形態は、全ての粒子を迅速に流し、ひとたびそれらが動かなくなると、我々は全ての粒子を捕捉する単一の画像を取得することができる。本実施形態は、全ての粒子を含む数枚の写真を取得し、粒子から異なる物理的及び化学的パラメータを抽出するために異なる照明条件下でこれを行うことができる。
【００８４】
試料回収は、開示される実施形態の他の重要な側面である。従来の流れ画像化方法又は大部分の粒子分析方法とは異なり、本実施形態の消耗品は、粒子を捕らえ（それらは流し台に流れず、又は廃棄しない）、従って追加的な分析のために回収されてもよい。これは、追加的なアッセイ（安定性アッセイ、活性アッセイ、溶解度アッセイ）、又は質量分析、ＦＴＩＲ、ＵＶ−ＶＩＳ、ＳＥＭ、ＥＤＸ、ラマン等を含む他の検査技術を使用することを含む。研究者が戻ってそれらの処理を遡って調べることを可能にするので、試料バンキングは重要である。
【００８５】
本明細書において記述される実施形態は、多数の産業に適用可能である。例えば、タンパク質凝集体、賦形剤、シリコーン油滴、気泡、ガラス、金属、繊維材料、並びにバイオ医薬品製剤化プロセスの製剤化及び製造プロセスにおいて直面する他の内因性及び外因性粒子を含む、バイオ医薬品試料中の粒子；淡水、排水を含む水の研究（aquatic  research）並びに藻類を含む海洋研究における粒子；掘削液、フラク物質（frac  materials）及び燃料を含む石油及びガス産業における粒子；並びに、塗料及びセメント産業における粒子、を同定すること又は特徴付けすることである。
【００８６】
ここで図１４Ａを参照すると、一つの実施形態において、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるための方法１１００は、フィルタの上に流体試料を導入するステップ１１０１；斜めの角度で少なくとも一つの粒子を照明するステップ１１０２；及び、少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子を画像化するステップ１１０３、を含む。一つの実施形態において、方法は、明視野照明を使用して少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、斜め角度照明及び明視野照明に基づいて合成画像を生成するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、複数の照明装置で少なくとも一つの粒子を放射状に取り囲むこと及び斜めの角度から少なくとも一つの粒子を照明することによって、少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、ウェルプレート上に配置された複数のウェルのうちの一つの中で少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、流体試料がフィルタ上に導入される前及び後の画像化に基づいて、少なくとも一つの粒子を特徴付けるステップを含む。一つの実施形態において、方法は、複数のウェルの各々を独立かつ別個に画像化するステップを含む。一つの実施形態において、画像化するステップは、フィルタの上の複数の高さにおいて画像化することを含む。一つの実施形態において、複数の画像は、高ダイナミックレンジの露出の組を含む。一つの実施形態において、方法は、複数の画像を共に併合して単一の画像にするステップを含む。一つの実施形態において、複数の画像は、複製を含む。一つの実施形態において、方法は、二つ又はそれ以上の画像を数学的に位置合わせするステップを含む。一つの実施形態において、方法は、前及び後の画像を数学的に位置合わせするステップを含む。一つの実施形態において、方法は、ウェルプレート上のウェルの中に流体試料を導入するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、鏡、レンズ及びプリズムのうちの少なくとも一つを有する、ウェルプレートの光学的機構を通して、少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、機械学習アルゴリズムを使用して、少なくとも一つの粒子の物質の種類を特徴付け、同定するステップを含む。一つの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、モデルを構築するために、粒子の大きさ、形状、テクスチャ、暗視野強度及び内部蛍光のうちの少なくとも一つを含む、観察される特徴を使用する。
【００８７】
ここで図１４Ｂを参照すると、一つの実施形態において、流体試料からの少なくとも一つの粒子を特徴付けるための方法１２００は、フィルタの上に流体試料を導入するステップ１２０１；明視野照明を使用して少なくとも一つの粒子を照明するステップ１２０２；及び、少なくとも一つの粒子を特徴付けるために、それがフィルタ上に載っているときに、照明された少なくとも一つの粒子を画像化するステップ１２０３、を含む。一つの実施形態において、方法は、斜めの角度又はフィルタの平面と同一平面上の角度で少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、複数の照明装置で少なくとも一つの粒子を放射状に取り囲むこと及び斜め又は同一平面上の角度から少なくとも一つの粒子を照明することによって、少なくとも一つの粒子を照明するステップを含む。一つの実施形態において、方法は、ウェルプレート上に配置された複数のウェルのうちの一つの中で少なくとも一つの粒子を照明するステップを含み、ウェルの各々はフィルタにおいて終端となる。
【００８８】
［実験に基づく実施例］
これから、本発明が以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明は、決してこれらの実施例に限定されるものとして解釈されるべきでなく、むしろ本明細書において提供される教示の一つの結果として明らかになる任意の及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
【００８９】
更なる説明がない限り、当該分野において通常の技術を有する者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明を作製及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい複数の実施形態を具体的に指摘しており、決して本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９０】
ある複数の実施形態において、３Ｄ印刷されたフローセルは、電鋳された（electroformed）マイクロメッシュ上で保持し、孤立して（マイクロ流画像化なしで）実験を行うために使用される。他の複数の実施形態において、フローセルは、我々のフィルタチップを通した試料の同時マイクロ流画像化及び配送を可能にするように設計される。ある複数の実施形態において、設計は：（１）所望の粒子大きさ範囲が自由に通過することを可能にしながら、マイクロチャネルの全高が我々の画像化システムの被写界深度内にあるように、特定の厚さの流体チャネルを含まなければならず、（２）チップ及びフローセルのアセンブリは、単純かつ頑健であるべきであり（例えば、漏れ又は汚染物質の導入がない）、そして（３）マイクロメッシュの表面の上のフローセル厚さは、分光学的な特徴付け／画像化のための高倍率対物レンズによるアクセス及び画像化を可能にするために十分に薄くなければならない。一つの実施形態において、微細作製されたチップと赤外線透過性のためのＣａＦ２窓との間のガスケットとして、厚さ５０及び１００μｍのダイカットシリコーンテープが使用される。カスタムステンレス鋼ホルダは、NanoTweezer  Surface製品と類似する方法で、マイクロからマクロ流体のカップリングを実行するためにＯリング及びチューブ継手と共に機械加工される。機械加工されたホルダはまた、マイクロ流画像化のための照明光学系も収容することができる。代替的に、シリコーンテープの代わりにマイクロガスケットが使用されてもよく、分光法に先立っての通常のガラス片の除去を可能にする。他の複数の実施形態において、フローセルは画像化用に設計されておらず、代わりに粒子はマイクロメッシュ上で画像化される。この実施形態において、フローセルが透明である必要はない。画像化はマイクロメッシュ上で行われるので、マイクロメッシュの上方のフローセル及びフローセルカバーの厚さが制御される必要がある。理想的には、石英カバースリップが、粒子が流れて通過することを可能にするように、可能な限り薄い隙間で使用され得る。しかしながら、ガラスカバースリップも同様に使用され得る。カバースリップもまた、最良の画像化及び分光法の結果を得るために、分光法の前に取り外されてもよい。
【００９１】
ある特定の実施形態において、ウェハは、２μｍ，３μｍ及び５μｍの円形孔の設計からなるであろう。試料は、孔の詰まりに起因する各チップの抵抗が各々の孔の大きさについて５％よりも小さく変化するように、ｍＬ毎に、凡そ２，０００個の粒子、直径５−５０ミクロンを含むように調製される。各試料（１ｍＬ体積）は、０．２５−５ｍＬ／分の範囲の制御された流量（マイクロ流画像化において利用される現在の流量に匹敵する）でメッシュを通される。流量は、インライン流れセンサ及び我々の圧力調節モジュールを使用してアクティブフィードバックループを介して維持される。各孔径についての捕捉効率は、各メッシュ上での顕微鏡検査によって粒子計数を実行すること、及び計数をマイクロ流画像化によって決定される初期濃度と比較することによって定量化される。第二に、捕捉効率及び流量に対する粒子充填の効果、それ故に各フィルタ設計の能力が決定される。高濃度試料（１０，０００粒子／ｍＬ）は、一定の印加圧力で体積流量を監視しながら、各チップを通して流される。粒子がメッシュ上に捕らえられるにつれて、装置が詰まる（流量＝０）まで、又は粒子が押されて孔を通過するために捕捉効率が低下し、流量が低い値で安定化するまで、流量は減少すると期待される。この実験を通じて、捕らえられる粒子の総数の面でのフィルタ容量の推定、及びフィルタ容量に到達するときの（一定圧力での）流量シグネチャ（signatures）の理解の、両方を得ることが期待される。
【００９２】
予備データは、明視野照明に適するように構成されたOlympus（登録商標）BX-51顕微鏡、ラマン分析のための分光計（Tornado）及び７８５ｎｍレーザー（Innovative  Photonics  Solutions）、並びにＣＭＯＳカメラ（Basler）から成るプロトタイプ装置を使用して収集されている。セットアップに組み込まれているのは、高処理量の組成マッピングのための焦点面アレイ検出器である。ラマンシステムでは、スペクトルは２秒毎に一つの割合で収集される。５０００個の粒子が捕らえられたメッシュに関して、全ての粒子からスペクトルを収集するために約３時間を要求し、スペクトル処理及び同定が続く。焦点面アレイ検出器を利用するＦＴＩＲ画像化は、画像の各画素についてＩＲ吸収スペクトルの同時収集を可能にする。この形式において、極めて多量のスペクトルが、短時間に収集され得る。例えば、フェーズＩＩにおいて試験するように我々が構成した検出器、Brukerからの焦点面アレイを利用して、約０．５ｍｍ２／分で高分解能スペクトル画像化が得られる（１６走査平均、４ｃｍ−１分解能、５．５μｍ画素分解能）、これは、全フィルタ領域についてスペクトル（合計１４７，４５６スペクトル）を収集するための凡そ１０分間に換算される。我々は、微細作製チップ上に捕らえられたタンパク質凝集体試料を用いて二つのＦＰＡ検出器プロバイダーの処理量及び上述の分解能の両方を評価し、統合の性能及び費用に基づいて最良の構成要素を決定する。
【００９３】
カスタムマイクロ流画像化システムは、チップ設計及びチャネル寸法に関して最適化される。高出力４６０ｎｍ  ＬＥＤ（Luminus  Devices  Inc）及びヒートシンクを収容するカスタムボードは、フローアセンブリの底面に固定される。ＬＥＤの制御は、後述するように各粒子を複数回標本化するために十分であろう、６２ｆｐｓの割合で各画像収集の間にフラッシュするためにＣＭＯＳ顕微鏡カメラ（Basler  Inc.）と統合される。プロトタイプソフトウェアは、照明強度及びカメラの両方を制御し、使用者が収集時間、露出及び頻度を調整することを可能にする。４ｘ対物レンズ及び２２．５ｘ１６．９ｍｍのカメラセンササイズを使用すると、チップのメッシュ及びマイクロ流画像化領域の両方が同じ視野内で見られ得る。我々のマイクロ流画像化モジュールを用いて得られるデータは、粒子標準の添加された試料（spiked  samples）を使用して市販のマイクロ流画像化システム上で集められたデータと比較することによって、検証される。
【００９４】
ＦＴＩＲ分光法プラットフォーム及び流れ画像化構成要素は、スタンドアロン型の機器に統合される。ハードウェア統合のために、機器筐体は、（ＩＲ画像化及びマイクロ流画像化の要求に応じて、潜在的に二つの）顕微鏡対物レンズ、カメラにつながるスプリッタ、及びＦＰＡ検出器からなる、カスタムの水平光学トレインを収容する。機器ボックスもまた、ＩＲ画像化のための変調励起源、圧力制御ボード、並びにフローセル及びストロボ付き青色ＬＥＤ照明からなるマイクロ流画像化ユニットを収容する。
【００９５】
ソフトウェアプラットフォームは、日常的な試料分析を実施する。既存の粒子追跡アルゴリズムは、チップのマイクロ流画像化領域内に画像化された粒子を、我々のパターン化されたマイクロメッシュ上の特定の位置に結合させる。マイクロ流画像化条件、流れ条件（圧力及び流量）の両方の制御、並びにスペクトル収集も自動化され、それは、結果の一貫性だけでなく有用性を向上させるためにも役立つであろう。
【００９６】
ある複数の実施形態において、粒子追跡ソフトウェアは、流れ中の粒子の追跡及び測定のため、並びにメッシュ上に捕らえられた粒子の同定に使用される。ある複数の実施形態において、マイクロメッシュ上の各粒子について得られたスペクトルへのマイクロ流画像化データの結合が実施される。試料１０ｍＬあたり約５０００個の粒子の典型的な粒子計数では、任意の所与の瞬間において、我々の画像化領域内の流体体積（約０．４４μＬ（〜０．４４μＬ））は凡そ０．２２個の粒子を含有する。０．１ｍＬ／分の典型的な流量では、流体体積は、１秒あたり凡そ４回更新されるであろう。画像化は、画像化領域に入ってからメッシュ上に捕捉されるまでの間に粒子が数回画像化されることを確かにするために、流体体積の更新速度より少なくとも５倍（5x）高速のフレームレートで実装される。追跡の実施は、粒子が２度計数されないことを確かにするために標本化の間のギャップを意図的に組み込む従来のマイクロ流画像化を超えて、我々の標本化速度を強化するであろう。
【００９７】
ある複数の実施形態において、画像処理への粒子追跡の追加は、主としてNanoTweezer  Surfaceプラットフォームを基にし、それは、１０−２０個の粒子／フレームを含む８０，０００のフレームデータセット（これは３０ｆｐｓでのマイクロ流画像データの約４５分（〜４５）に相当する）に対する、スポット検出、スポットの結合、及び粒子特性の報告及び特性追跡を、１０分よりも短い時間で実行する。加えて、グラフィクス処理ユニット（ＧＰＵｓ）を利用するソフトウェアパッケージは、我々の処理時間を１０の倍率で低減するために実装されてもよい。
【００９８】
我々は最初に、粒子がチャネルの中に入ってから、それらがメッシュ上に捕らえられるまで追跡することを試みる。ひとたび粒子がマイクロ流画像化領域を離れると、マイクロメッシュのパターン化された背景の上の粒子を追跡することが困難になり得る。しかしながら、粒子が孔に捕えられた場合は、透過光の明確な減少が孔位置において観察される。もし我々がメッシュの上の粒子を追跡することができなければ、我々は、捕らえられた粒子の位置をそれらのマイクロ流画像化に結合させるためにこの機能を使用してもよい。典型的なバイオ医薬品（Biopharma）試料中の低濃度の粒子は、（１００−１０００個の粒子／ｍＬの範囲の濃度について、）平均して１−１０フレーム毎に一つの新しい粒子が観察されるであろうことを示唆する。この希少性は、透過光の局所的な変化を使用して、マイクロ流のその区分内で観察される粒子をメッシュ上の新たに捕えられる粒子に結合させることを容易にし得ると、我々は期待する。追加的なリスク軽減ステップとして、我々は、マイクロチャネル内に見られる層流条件下で、流れる粒子の観察された流線位置と、メッシュ上の捕らえられた位置との間に有用な相関があるかどうかを評価する。
【００９９】
ある複数の実施形態において、画像化条件、スペクトル収集条件及び流れ条件は、使用者によって決定され、組織内で開発されたソフトウェアパッケージを使用して手動で設定され、実行される。さらに、疑われる物質のスペクトルシグネチャ／ピーク位置は、組成マップを生成するために手動で我々のプログラムに追加される。集中的なトレーニングの必要性を無くすことに加えて、実行間の一貫性を改善するためにソフトウェアによる自動化が使用されてもよい。成功した実験の設定及び実行における鍵となるステップの自動化が、望ましい。第一に、露出時間並びに照明頻度及び強度は、試料によって導入された粒子についての画質を最大化するために、自動的に調整される。先に述べられたように、流れパラメータは、予め決定された体積が処理されたとき、又はフィルタ上の粒子充填の程度が達成されたときに実行が自動的に終了するように、監視されるであろう。スペクトル収集が実行されるときに、メッシュはその全面積にわたって自動的に標本抽出されるであろう。収集されるスペクトルは、組成を同定するために、スペクトルデータベースに対して照合されるであろう。
【０１００】
一つの実施形態において、ｐ蛍光画像化を利用するデータベースが利用される。異なる粒子は、異なる励起波長において異なる散乱性質を有し得る。モデルは、機械学習を使用して作成され又は訓練される。ある複数の実施形態において、蛍光は、それは高信号であるために、ラマン／ＦＴＩＲの代わりに使用される。蛍光はラマン／ＦＴＩＲを用いて達成されるスペクトルシグネチャほど特異的ではないが、汚染物質の種類が限られているため（タンパク質凝集物、金属、ゴム等）、複雑な分光法の全力が必要ではない。ある複数の実施形態において、３チャネルの蛍光及び各粒子種についての良好なモデルは、粒子の特徴付け及び同定のために十分である。
【０１０１】
装置のある複数の実施形態のために最も重要な大きさ範囲内での迅速な粒子組成情報を得るための一つの方法は、分光法を通じたものである。利用可能な様々な分光法のうち、質量分析法は、薬物設計の間により上流で典型的に使用され、非常に複雑な試料調製に悩まされる。ＦＴＩＲのような光学分光法は、興味ある接合が存在することを確かにするために、より一般的に使用される。ＦＴＩＲは、例えばラマンと比較してかなり高処理量である。ラマン分光法は、潜在的により化学的に敏感であるが、数桁低い信号及び処理量に悩まされる。さらに、それらの低い処理量のために、ＦＴＩＲもラマンも日常的なバイオフファーム分析には使用されず、法医学的分析（ひとたび物事が間違った）においてのみ使用される。タンパク質凝集体を日常的に同定することは、この研究ツールでは鍵である。タンパク質の凝集体情報を用いて、研究者らは、処方を見直すべきかどうか、又は他の粒子が存在するかどうかを証明し得る。低処理量ではなく日常のベースでこの測定を達成するために、マルチチャネル蛍光が利用され、ＦＴＩＲ又はラマンのような他の技術よりも優先される。蛍光は、日常的な要求を満たすために必要とされる処理量を備えた“粗分光法（crude  spectroscopy）”を達成してもよい。一つの実施形態において、粒子は異なる励起波長において異なる蛍光性質を示すため、マルチチャネル蛍光が利用される。例えば、Ｒ、Ｇ、Ｂを使用すると、各チャネルは、粒子の固有の光散乱特性を示し得る。一つの実施形態において、蛍光画像化は、固有のマルチチャネルベースの蛍光を使用する。一つの実施形態において、蛍光画像化は、標識化されたマルチチャネルベースの蛍光を使用する。
【０１０２】
蛍光画像化は、タンパク質自己蛍光を定量的に評価するための敏感かつ非侵襲的な方法である（Ghisaidoobe及びChung,  Int.  J.  Mol.  Sci.,  2014,  15,  22518）。タンパク質及びタンパク質凝集体は、成分の芳香族アミノ酸の存在に起因して深紫外波長範囲において内部蛍光を有する（励起約２８０ｎｍ（〜２８０ｎｍ）、発光３０３ｎｍ及び３５０ｎｍ）。加えて、一緒に凝集したタンパク質は、より大きな紫外−青色波長において追加的な蛍光エネルギーを配送する（励起約３４０ｎｍ（〜３４０ｎｍ）、発光４２５，４４５，４７０及び５００ｎｍ）（Chan,  Kaminski,  Schierle,  Kumitaら,  Analyst,  2013,  138,  2156）並びに（Shukla,  Mukherjee,  Sharmaら,  Archives  of  Biochemistry  and  Biophysics  2004,  428,  144）。この凝集蛍光は、より高次の凝集体構造又は共振結合の特徴（resonant  bond  features）の存在に根差すことが推測される。加えて、凝集の程度、並びに、より特異的な凝集体構造又は種類（例えば、ランダム対フィブリル）が、これらの凝集体特異的な波長の評価によって引き離され得ることが、考えられる。付随して、バイオ医薬品製造ストリーム及び処理設備に内在する（inherent）追加的な粒子物質の種類は、最終的にタンパク質とともに凝集するか、又は試料不純物を構成し得る。高分子、ガラス及び金属を潜在的に含むこれらの物質は、蛍光分光法を使用して迅速かつ日常的に評価され得る。
【０１０３】
光学分光法を使用した自家蛍光の非侵襲的評価に加えて、本明細書において記述される六角形格子のような幾何学的格子を備えたチップを利用するシステムは、使用者が蛍光のプローブ又は色素を使用して能動的に粒子物質を標識化する（label）ことを可能にする、任意的な（optional）能力を有することができる。システムは、六角形形状の格子上の捕捉された物質の上に蛍光色素又は抗体溶液を効果的に流し、続いて結合していない物質をすすぐように単純に適合させられてもよい。タンパク質染色の使用は、強化され、非常に特異的なタンパク質凝集体シグナル又は他の物質の種類を可能にし得る。例えば、チオフラビン−Ｔは、特異的アミロイド線維を含有する多量体のβシートと迅速に会合することが示されている（Groenning,  Olsen,  van  de  Weertら07’）。この追加された能力により、使用者は、必要が生じた場合に、光学分光法の結果に対して、より深くより特異的な捕捉された粒子物質の評価を用いて任意的に追跡調査（follow  up）するために、検証の長い歴史及び産業用途における価値を有する代替的な特異的かつ強力な蛍光の化学的／抗体抱合（conjugation）法を活用してもよい。本明細書において記述されるように、明視野（bright  field）及び側方照明（side  illumination）の組み合わせは、異なる物質の粒子間の優れた区別をもたらす。
【０１０４】
ある複数の実施形態において、本明細書において開示される複数の実施形態の技術には３つの段階がある：マイクロ流画像化（ＭＦＩ）、ろ過及び分光学的同定。ＭＦＩに関して、ＭＦＩセットアップを使用したフローセル内の高品質の粒子画像化は、実証されている（図１５Ａ−図１５Ｃ参照）。シミュレートされたバイオ医薬品試料は、タンパク質凝集体生成の熱処理法、及びそれに続く追加的な高分子微粒子（ＰＭＭＡ及びＰＣＬ）の添加によって調製された。次いで試料は、ＭＦＩシステム上で試験された。粒子のギャラリー（図１５Ａ）、処理後の粒子追跡（図１５Ｂ）及び粒子径のヒストグラム（図１５Ｃ）が示されている。
【０１０５】
ここで図１６Ａ及び図１６Ｂを参照すると、微細作製された格子上の高タンパク質含有率溶液中のタンパク質凝集体及び粒子の混合物からなる、シミュレートされたタンパク質治療法試料を捕捉するための方法が開発された。また、電鋳されたメッシュを用いて目に見えるより小さな粒子を捕らえることが、実証される。電鋳されたメッシュは、２０ｍｍ２の円にダイカットされ、カスタム構築されたフローセルの中に装填された。図１６Ａの図式に例示されるように、試料がウェルに加えられ、圧力制御部によって調節される真空圧を使用してメッシュを通して引かれた。分離に続き、その後試料は４倍の（４ｘ）対物レンズの下で画像化された。図１６Ｂの画像は、凝集したリゾチーム（２−５０ｕｍ）、ステンレス鋼ビーズ（１０−２０ｕｍ）及びラテックスビーズ（１５ｕｍ）の混合物の分離に続いての、メッシュを示す。同定に関して、ろ過ステップに続き、捕捉された粒子は、ロボットステージを備えたラマン顕微鏡を使用して（図１７Ａ参照）及びＦＴＩＲ顕微鏡を用いて（図１７Ｂ参照）、走査された。１７ミクロンの孔を有する微細作製された金メッシュ上に捕まった粒子の顕微鏡画像及び分光走査が示される。タンパク質凝集物及び高分子粒子の混合物は、フィルタで集められ、走査された。地形的な類似性を示す−それらははるかに小さい個々の粒子を概説しない）ために、ラマンデータ赤色の輪郭線が追加された（図１７Ａ参照）。追加的な未知の汚染物質が同定され、凡例（legend）に示された。タンパク質性の物質を同定する、１７００波数におけるＡｍｉｄ  Ｉピークのヒートマップと共に、試料の迅速ＦＴＩＲ画像化（図１７Ｂ参照）。
【０１０６】
ＭＦＩは、タンパク質治療法試料の日常的な測定（１日あたり約１０個（〜１０））のためにタンパク質治療スペース（及び他のもの）において増えてきた定量的な粒子画像化技術である。従来のＭＦＩシステムは粒子の一つの画像のみを取得するが、本発明の実施形態は、粒子を格子上の着地場所まで追跡するためにより高いフレームレートを使用する。我々は、高忠実度の粒子画像を得るためにＭＦＩセットアップを実施している。図１２において、我々は、フローセル内の粒子の画像を捕捉し、粒子追跡を実行し、粒子を分析して推定される直径を提供する我々の能力を実証する。医薬品の科学者は、（彼女ら又は彼らのＭＦＩシステム上に表示される）これらの粒子ギャラリーをしばしば見て、そうでなければ汚染されていない処方物を汚染するこれらの粒子が何であるか疑問をもつ。
【０１０７】
特定の予備データを収集するために、我々は、（ＮＳＦ  ＳＢＩＲを介して立ち上げられた）NanoTweezerプラットフォームを利用する。NanoTweezerシステムはまた、フローセル、粒子画像化、粒子追跡を使用する。生の（Live）粒子追跡は、ＧＰＵ処理を介して実装され、それはまたＭＦＩのための処理時間も大幅に改善することができる。最後に、ＭＦＩは慎重な流量制御を要求するため、NanoTweezerで使用されているのと同じ空気圧制御ポンプシステムが利用される。これは、良好な安定性（１％未満の変動計数（＜１％ｃ．ｖ．））で正確な流量（要求流量の５％以内）を得るために、ＰＩＤフィードバックループの一部としてインライン流れセンサを使用する。
【０１０８】
この概念実証データは、微細作製された構造を設計し、タンパク質治療セッティングにおける関連物質を捕捉し、続いて同定するためにそれらを使用する能力を示す。いくつかの異なる電鋳された微細孔格子が、材料としてニッケルと金の両方を使用して、１１μｍから２５μｍまでの範囲の孔径で使用された。ラマン分光法と組み合わされた場合の最良の結果は、金であった。それは、ラマン分光法で使用するための優れた性質を有する−低いバックグラウンド、高い反射率、及び時には表面増強ラマン分光法（ここでは使用されていない）を介した増強もある。前の節において記述されたのと同じシミュレートされたタンパク質治療法試料が使用され、孔上に粒子を捕捉した。これらのフィルタの非常に高い開口面積に起因して、現実の試料よりもはるかに多くの粒子を含む試料の全体ｍＬが、数秒以内でろ過された。わずか約１００ミリバールの真空圧が必要であった。図１３は、１７μｍ孔の金メッシュでの結果を示す。
【０１０９】
したがって、プロトタイプメッシュ装置上の標準粒子試料と混合されたタンパク質凝集体の画像化、トラッピング及び化学的同定は、フローセルの中に統合された電鋳されたメッシュ、カスタム構築されたラマン顕微鏡、及び各構成要素を駆動するプロトタイプソフトウェアを使用して実証されている。ある複数の実施形態において、電鋳されたメッシュを使用する代わりに、固体支持体上に構築された微細作製されたメッシュが使用され、フローセルの中へのスケーラブルな統合を可能にした。ある複数の実施形態において、ソフトウェア及びハードウェアは、単一の分析機器の中に統合される。ある複数の実施形態において、方法は、流れ中にメッシュ上の位置に画像化された粒子の自動マッピングのためのソフトウェア内に実装される。装置によって実行される操作及びデータ分析ステップは、自動化される。
【０１１０】
ウェルプレートを利用するある複数の実施形態に関して、画像収集は、高ダイナミックレンジ画像化を使用して達成された。ＨＤＲＩは、低露出から高露出までの画像を補足することから作成された合成画像を作成する一つの写真技術である（我々の場合は、一つの単一の合成ＨＤＲ画像を生成するために４から１０の画像を取得する）。これは、人が過度の露出のためにデータを失うことなく、広範囲の粒子径を捕捉することを可能にする。画像を捕捉するカメラは、ウェル毎に一つ又はいくつかのＨＤＲ画像を取得することが可能であるように、広視野カメラである。もし膜の全体を捕捉するために複数の組の画像が要求されるならば、それらは一緒にステッチされてもよい。
【０１１１】
上で説明されたように、我々がフィルタ材料用に使用している膜は、背景の特徴を完全に欠いてはいなかった；それらはテクスチャを有し、粒子の形でいくつかの汚染、又は材料自体に傷があるかも知れない。膜表面に加えられた粒子の数を正確に計数するために、この背景を計算に入れることが必要である。一つの実施形態において、我々は、“前の”画像及び“後の”試料画像を取得し、次いでソフトウェアアルゴリズムを使用して二つを比較することによって、これを行う。一つの方法は以下のとおりである：ステップ１：画像位置合わせ（registration）。前後の画像は、二つの画像によって共有される特徴がｘ、ｙ及び回転で整列される（aligned）ように、位置合わせされ、同時に、前後の画像内の特徴が同じｘ、ｙ位置にあるように、一方の画像にスケーリング係数を導入し、画像のいくらかの変形を許容する。ステップ２：ライトリングを取り外す。画像は、円形オブジェクトの矩形のビューである。円形膜の外側の画像の余分な領域は、除去される。ステップ３：ＳＮＲ変換。これは、画像上の不均一な照明を計算に入れるために画像を均一にする（levels）。これを行うための多くの方法がある。ローリングボール法、ハイパスフィルタ、高速フーリエ変換などを含む。画像は、局所的な中央値に強度を正規化することによって均等にされる（equalized）。これは、より高い強度の画像を取得し、各画素の強度を係数Ｆで除算することによって達成され、ここで、Ｆ＝画素周囲の大きな近傍（large  neighborhood）の中央値である。これは、“前の”画像及び“後の”画像の両方に対して行われる。ステップ４：背景減算。膜テクスチャに関して粒子を同定するために、変換された画像は、画素毎に互いに除算される。このように、我々は、“前”／“後”と“後”／“前”という二つの比率画像（ratio  images）を得て、第二の画像は“前の”画像が取得された後に捕捉された粒子を検出するために使用される。ステップ５：“前の”画像を閾値処理する（Threshold）。我々は、粒子を同定するために閾値処理技術を使用する。我々は、閾値明画素（threshold  bright  pixels）よりも明るい全ての画素が白（値１）になり、閾値よりも暗い（dimmer）全ての画素が黒（値０）になるように画像を閾値処理することによって、これを行う。数個の閾値が使用されてもよいが、我々は、典型的にいくつかの平均背景強度の倍数を使用する。現在、我々は背景強度の２倍を使用している。この後、エッジを閉じてギャップを埋めるためにいくつかの追加的な処理が行なわれてもよい。接続された白い画素の“ブロブ（blob）”は、粒子と考えられる。図１８Ａ“前の画像”を参照されたい。ステップ６：各粒子についての輝度、形態学的及び位置的データを提供するために粒子の位置が測定され得るように、マスクが画像に適用されてもよい。これらの詳細は表に記録されている。ステップ７：“後”／“前”画像において、我々は、追加された粒子を検出するために、１より高い閾値を選び取ってもよい（pick）。最適な閾値を選び取るために、ある複数の実施形態によれば、以下のステップが実行される。方法１：我々は、“後”／“前”画像閾値を以下の方法によって選び取る。我々は、一つの閾値においていくつかの推測を行う。それぞれの推測について、我々は、画像に閾値を適用し、粒子を同定し、この閾値を用いて見出された粒子のリストをコンパイルする。次いで我々は、後の粒子を前の粒子と比較する。各“前の”粒子について、我々は最も近い“後の”粒子を見つけ、結びつけられた対に“給付（benefit）”値を割り当てる。粒子の重心の距離が小さいほど、粒子の面積がより似ているほど、輝度がより似ているほど、形態学的特徴がより似ているほど、給付が高くなる。これらの属性の全てが使用される必要はない。推測された“後の”画像閾値について、結びつけられた粒子“給付”の合計値は、各々の結びつけられた粒子対を総計することによって計算される。次に、我々は、最良の“後の”閾値を選び取ることによって給付を最大化することを試みる。これは、反復して推測を行い、各推測の後に正しそうに見える方向に閾値を変更することによって行われてもよい。これは一種のフィードバックループである。代替的に、一連の予め定められた閾値が計算されてもよく、次いで、最大の“給付”を伴う閾値を選び取るために曲線近似又は推定法が使用されてもよい。理想的には、前の画像内に見出される全ての粒子は、後の画像内の粒子に対応するべきである。しかしながら、いくつかの粒子は、転位又は消滅しているかも知れない。図１８Ａ−図１８Ｃを参照されたい。前画像（図１８Ａ）は閾値処理され、前の画像のこの区画において５個の粒子が同定された。上のステップ７において記述されたような良好な“後の”閾値を同定した後に、後の画像（図１８Ｂ）は１６個の粒子を同定した。前の画像からの５個の粒子は、後の画像に結びつけられ、図１８Ｃに矢印で示されている。したがって、膜のこの区画において報告される１１個の新しい粒子が存在するであろう。方法２：前の画像内に見出される各粒子について、我々は、後の画像内の同じ領域を見て、どの閾値が最高の“給付”を生じさせるかを決定する。各粒子についてこれを実行した後に、我々は閾値又は更に最良の結果を与える複数の閾値を選び取る。ステップ８：転位した粒子を発見することを試みる。前の画像内にあったが後の画像内になかったいくつかの粒子は、同じ形態学的特性及び輝度特性を有する後の画像内の粒子を探すことによって、位置を特定されることを試みてもよい。ステップ９：結びつけられた粒子が同定された後に、後の画像内の同定された粒子の残りが、報告されてもよい。
【０１１２】
一つの態様において、異なる粒子は、内部蛍光性質の差異に基づいて識別されてもよい。蛍光画像化は、タンパク質自己蛍光を定量的に評価するための信頼性が高くかつ迅速な方法である。それらは、成分の芳香族アミノ酸の存在に起因して深紫外波長範囲において蛍光を発する（励起約２８０ｎｍ（〜２８０ｎｍ）、発光３０３ｎｍ及び３５０ｎｍ）からである。蛍光特性を試験するために、我々は、タンパク質凝集体（ウシ顆粒球コロニー刺激因子）及びポリスチレン粒子の多分散混合物からなる模擬的なバイオ医薬品試料を調製した。計数のために使用される“暗視野”画像を捕捉することに加えて、タンパク質内部蛍光チャネルを使用して、蛍光分類画像も収集された。その結果は、図１９Ａ及び図１９Ｂに示され、二つの種類の物質の間の容易な区別を示す。プロットの上部に示されている異なる複数の画像化モードは、個々の粒子を“切り抜いて（clip  out）”それらの特性をプロットするために、組み合わされて処理されてもよい。概して、最小量のタンパク質シグナルを有する粒子（高分子微小球（microsphere））は、添加された非タンパク質粒子の形態と一致する。より丸い粒子（ポリスチレン）もまた、タンパク質チャネルにおいて最も少ない蛍光を示したものであった。加えて、タンパク質凝集体は、より大きな紫外−青色波長において蛍光を発し（励起約３４０ｎｍ（〜３４０ｎｍ）、発光４２５，４４５，４７０及び５００ｎｍ）、この凝集蛍光は、より高次の凝集構造又は共振結合の特徴の存在に根差し、更に凝集体構造（例えば、ランダム対フィブリル）の情報を明らかにし、溶解可能な（危険な）凝集体対溶解可能でない凝集体との間を識別し得る。システムはまた、図１９Ｂに示されるように、実際のタンパク質凝集体とタンパク質凝集体を模倣するＥＴＦＥ高分子標準を識別してもよい。
【０１１３】
一つの実施形態において、画像化装置は、少なくとも一つの粒子がフィルタ上に捕捉される前及び後の両方に、フィルタを画像化するように構成されている。一つの実施形態において、前及び後の画像は、差異を発見するためにそれらを処理するアルゴリズムを使用して、共に処理される。一つの実施形態において、画像化装置は、フィルタの上の複数の高さにおける、複数の画像を取得するように構成されている。一つの実施形態において、複数の画像は、高ダイナミックレンジの露出の組から成る。一つの実施形態において、複数の画像は、共に併合されて単一の画像になる。一つの実施形態において、複数の画像は、複製を含む。一つの実施形態において、異なる高さにおける複数の画像は、共に併合されて単一の画像になる。一つの実施形態において、二つ又はそれ以上の画像は、数学的に位置合わせされる。一つの実施形態において、前及び後の画像は、数学的に位置合わせされる。一つの実施形態において、画像を処理するためにメディアンフィルタが使用される。
【０１１４】
機械学習アルゴリズムは、異なる粒子の種類の間を識別するために使用された。モデルを構築するために、大きさ、形状及び内部蛍光を含む、異なる複数の特徴が使用された。粒子を類別するために機械学習を使用することの実行可能性を試験するために、我々は、約４０，０００（〜４０，０００）の粒子画像を含むデータセットを集めた。トレーニングセットは、タンパク質凝集体、ガラス粒子、セルロース粒子、ステンレス鋼粒子、ＮＩＳＴからのＥＴＦＥ標準、及びラテックスビーズから成っていた。データセットの５０％は、予測モデルの最終評価のための試験セットとして使用されるために蓄えられた。残りの５０％は、ある機械学習アルゴリズム、xgブースト（ｘｇｂｏｏｓｔ）、極端勾配ブーストの略、を訓練するために使用された。このモデルのために、暗視野照明チャネル及び各蛍光チャネルについての強度信号対雑音比のみが、特徴として使用された。モデルの構築は、図２０Ａに模式的に示される。要するに、既知の粒子の集められた画像が分析され、抽出されたパラメータは一連の決定樹を構築するために使用され、それは次いで未知の種類の粒子を類別するために使用される。第一に、ｘｇｂｏｏｓｔモデルは、タンパク質性（タンパク質凝集体）対非タンパク質性（全ての他の粒子型）分類の単純な場合に対する予測を実行するために、トレーニングデータを用いて訓練された。モデルは１００個の決定樹で構成され、９５．５％の検査セット対する精度、９７．９％の感度、及び７７．４％の特異性をもたらした。この場合において、１６，２３８個の非タンパク質粒子が非タンパク質であるとして正確に同定され、３４２個の粒子は誤ってタンパク質として類別された。１７２７個のタンパク質凝集体はタンパク質性粒子として正確に同定され、５０４個は誤って非タンパク質性として類別された。タンパク質対非タンパク質同定の一つの例示的な出力プロットは、図２０Ｂに示され、タンパク質凝集体及びラテックスビーズを含む混合された試料に対して集められた。単純なタンパク質性又は非タンパク質性の決定の代わりに、多クラス類別のために、個々の粒子の種類を同定するために同じｘｇｂｏｏｓｔアルゴリズムが訓練された。同じトレーニングデータが使用され（各チャネルについてのＳＮＲ）、１００個の決定樹からなるｘｇｂｏｏｓｔモデルは、８９．７％−９９．７％の範囲の特異性、及び６９．２％−９５．１％の範囲の感度と共に、８８．６％の分類精度をもたらした。標識化対予測ケースの混同マトリクスは図１９Ｂに示され、ここで、対角線は正確に同定された場合を代表する。
【０１１５】
ここで図２１Ａ及び図２１Ｂを参照すると、粒子が捕捉及び画像化される膜は、通常、一つの画像について画像全体（図２１Ａ）を通して完全に焦点があっていることは決してなかった。局所的な膜の変形、画像のエッジでの球面収差、部分的に焦点がずれている大きな粒子の存在、及び機械的な位置ずれ又は平面性が存在するかも知れない。我々は、これらの問題に対処するために焦点融合として知られる技術を採用する。この技術は、新規ではないが、他の技術の全てと併せて使用される場合、全体的な画像化作業を行う上で本質的な部分である。焦点融合は、基板の上の異なる高さで多くの画像を取得し、それらを併合して単一の“焦点融合された”画像（図２１Ｂ）にすることによって働く。これは、画像全体にわたる特徴詳細が劇的に改善し、システムが背景テクスチャを正確に除去すること、計数、大きさを含む物理パラメータを収集することを可能にし、強度測定に関するより高い忠実度を提供し、焦点がずれた粒子が大きくぼやけて見えないことを確かにする。この技術は、先に述べられたＨＤＲ画像化のような他の画像化技術と組み合わせて使用され、画質を改善し、ノイズを低減するために同じ画像の複数の平均を取得する。
【０１１６】
本明細書において引用された各々及び全ての特許、特許出願及び刊行物の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、具体的な実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって本発明の他の実施形態及び変形が案出され得ることは明らかである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【国際調査報告】
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