(57)【要約】本発明は、本明細書において、硫化剤が未反応５’−ＯＨ基をキャッピングするとき、キャッピング工程を必要とすることなくチオール化オリゴヌクレオチドを調製するための合成方法を記載する。【選択図】図１
2019518778.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスであって
ａ）式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2019518778.tif 000047
を式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
2019518778.tif 000048
と反応させて、式（ＩＩＩ）の化合物：
【化３】
2019518778.tif 000049
を形成することと；
ｂ）前記式（ＩＩＩ）の化合物を、硫化剤を用いて硫化して、式（ＩＶ）の化合物：
【化４】
2019518778.tif 000050
を形成し、式（Ｉ）の未反応化合物から式（Ｖ）の化合物：
【化５】
2019518778.tif 000051
を形成することと；
を含み、
式中
各Ｒ１及びＲ１１は、独立して、核酸塩基であり、前記核酸塩基のＮＨ２が、存在する場合、アミン保護基によって保護されており；
各Ｒ２及びＲ１２は、Ｈ、ハロ、及びＣ１−６アルコキシによって任意選択的に置換されているＣ１−６アルコキシからなる群から独立して選択され；
Ｒ３は、リンカーを任意選択的に含む固体支持体であり；
Ｙは、非存在、ヌクレオチド、または２以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり；
各Ｒ４は、独立してＨであるか、またはＲ２の前記アルコキシ基と共に環を形成し；
各Ｒ１４は、独立してＨであるか、またはＲ１２の前記アルコキシ基と共に環を形成し；
Ｒ１５は、ヒドロキシ保護基であり；
Ｒ１６は、−ＣＮによって任意選択的に置換されているＣ１−６アルキルであり；
Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂは、独立してＣ１−６アルキルであり；
ＲＳは、前記硫化剤の副生成物から形成されたヒドロキシ保護基であり；
前記硫化剤は、式（Ｉ）の未反応化合物から前記式（Ｖ）の化合物に実質的に完全に変換し、かつ前記式（ＩＩＩ）の化合物から前記式（ＩＶ）の化合物に変換するのに十分な時間量で反応され；
式（Ｉ）の未反応化合物から式（Ｖ）の化合物に実質的に完全に変換し、かつ前記式（ＩＩＩ）の化合物から前記式（ＩＶ）の化合物に変換するのに十分な量の硫化剤が添加され；
前記式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）の化合物が、任意選択的に、薬学的に許容可能な塩の形態である、前記プロセス。
【請求項２】
ｃ）前記式（ＩＶ）の化合物を脱保護して、式（ＶＩ）の化合物：
【化６】
2019518778.tif 000052
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
ｄ）前記式（ＶＩ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物と反応させて、式（ＶＩＩ）の化合物：
【化７】
2019518778.tif 000053
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程と；
ｅ）前記式（ＶＩＩ）の化合物を、酸化剤を用いて酸化して、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【化８】
2019518778.tif 000054
を形成する工程と
をさらに含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
ｆ）前記式（ＶＩＩＩ）の化合物を脱保護して、式（ＩＸ）の化合物：
【化９】
2019518778.tif 000055
またはその薬学的に許容可能な塩
を形成する工程をさらに含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
前記式（ＶＩ）の化合物または前記式（ＩＸ）の化合物によって開始して、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）がｎ回繰り返され、工程ｄ）、ｅ）及びｆ）がｍ回繰り返され、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）、ならびに工程ｄ）、ｅ）及びｆ）の繰り返しが、互いに対していずれの順序で行われてもよく、ｎが少なくとも１であり、ｍが０、１、２、３、または４であり、式（Ｘ）もしくは（ＸＩ）のオリゴヌクレオチド：
【化１０】
2019518778.tif 000056
【化１１】
2019518778.tif 000057
またはその薬学的に許容可能な塩を形成すること、あるいは、オリゴヌクレオチドを形成することにおいて、工程ａ、ｂ、及びｃ、または工程ｄ、ｅ、及びｆの各繰り返しにより、式（ＶＩ）または（ＩＸ）のいくらかの未反応化合物を結果として生じ、これが、過剰の硫化剤または前記硫化工程後の前記硫化剤の副生成物と反応して、式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩＩ）の化合物：
【化１２】
2019518778.tif 000058
【化１３】
2019518778.tif 000059
式中、各Ｘは、ＳまたはＯから独立して選択され、ただし、前記式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、または（ＸＩＩＩ）の化合物において、４、３、２、１、または０回のみ、ＸがＯである；を形成する、請求項２または４に記載のプロセス。
【請求項６】
ｇ）前記式（ＶＩ）の未反応化合物をキャッピング剤と反応させて、式（ＸＩＶ）の化合物：
【化１４】
2019518778.tif 000060
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含み、Ｒｃが、前記キャッピング剤から形成されたヒドロキシ保護基である、請求項３に記載のプロセス。
【請求項７】
ｈ）前記式（ＶＩＩＩ）の化合物を脱保護して、式（ＩＸ）の化合物：
【化１５】
2019518778.tif 000061
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記式（ＶＩ）の化合物または前記式（ＩＸ）の化合物によって開始して、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）がｎ回繰り返され、工程ｄ）、ｅ）、ｇ）及びｈ）がｍ回繰り返され、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）ならびに工程ｄ）、ｅ）、ｇ）及びｈ）の繰り返しが、互いに対していずれの順序で行われてもよく、ｎが少なくとも１であり、ｍが０以上であり、式（Ｘ）もしくは（ＸＶＩＩ）のオリゴヌクレオチド：
【化１６】
2019518778.tif 000062
【化１７】
2019518778.tif 000063
またはその薬学的に許容可能な塩を形成すること、あるいは、オリゴヌクレオチドを形成することにおいて、工程ａ、ｂ、及びｃ、または工程ｄ、ｅ、及びｆの各繰り返しにより、式（ＶＩ）または（ＩＸ）のいくらかの未反応化合物を結果として生じ、これが、過剰の硫化剤または前記硫化工程後の前記硫化剤の副生成物と反応して、式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩＩ）の化合物：
【化１８】
2019518778.tif 000064
【化１９】
2019518778.tif 000065
式中、各Ｘは、ＳまたはＯから独立して選択される；を形成する、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
ｎが、２〜１０００である、請求項５または８に記載のプロセス。
【請求項１０】
ｎが、２〜５００である、請求項５または８に記載のプロセス。
【請求項１１】
ｎが、２〜１００である、請求項５または８に記載のプロセス。
【請求項１２】
ｎが、２〜５０である、請求項５または８に記載のプロセス。
【請求項１３】
ｎが、２〜２５である、請求項５または８に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記固体支持体に付着した前記リンカーが開裂される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記硫化剤が、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＸＨまたはＡＤＴＴ）であり、ＲＳが、−Ｃ（ＳＨ）（＝Ｎ）−ＣＮである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記硫化剤が、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）であり、ＲＳが、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記硫化剤が、３−（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール（ＤＤＴＴ）であり、ＲＳが、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｎ＝ＣＨＮ（ＣＨ３）２である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記硫化剤が、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
ＲＳが、
【化２０】
2019518778.tif 000066
である、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記硫化剤が、前記硫化剤を０〜３０分間再循環させることによって反応する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記硫化剤が、少なくとも０〜２０回再循環される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記硫化剤が、１〜２０回、１〜１０回、または１〜５回再循環される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記硫化剤は、前記リンカー、または第１ヌクレオチドが前記固体支持体に直接付着しているときには前記第１ヌクレオチドに対して、３〜６当量の硫化剤を再循環させることによって反応する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記硫化試薬の濃度が、０．０２Ｍ〜２．０Ｍである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記硫化試薬の濃度が、０．０５Ｍ〜０．５Ｍである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記硫化試薬が、０．０２Ｍ〜０．１Ｍの濃度で添加される３−（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール（ＤＤＴＴ）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記核酸塩基が、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、及び５−ヒドロキシメチルシトシンからなる群から選択され、前記核酸塩基の前記ＮＨ２基が、存在する場合、ＰｈＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ｉＰｒＣＯ−、Ｍｅ２Ｎ−ＣＨ＝、またはＭｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝によって保護されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記核酸塩基が、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、ウラシル、及び５−メチルシトシンからなる群から選択され、前記核酸塩基の前記ＮＨ２基が、存在する場合、ＰｈＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ｉＰｒＣＯ−、Ｍｅ２Ｎ−ＣＨ＝、またはＭｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝によって保護されている、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２９】
各Ｒ２及びＲ１２が、Ｈ、Ｆ、及びＣ１−４アルコキシによって任意選択的に置換されているＣ１−４アルコキシからなる群から独立して選択され；
各Ｒ４が、独立してＨであるか、またはＲ２の前記アルコキシ基と共に環を形成し、前記環が、１〜３個のＣ１−４アルキル基によって任意選択的に置換されている５または６員環であり；
Ｒ１６が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり；
Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂが、独立して、Ｃ１−４アルキルであり；
各Ｒ１４が、独立してＨであるか、またはＲ１２の前記アルコキシ基と共に環を形成し、前記環が、１〜３個のＣ１−４アルキル基によって任意選択的に置換されている５または６員環である；
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３０】
各Ｒ２及びＲ１２が、Ｈ、または、Ｃ１−４アルコキシによって任意選択的に置換されているＣ１−４アルコキシから独立して選択され；
Ｒ１５が、４，４’−ジメトキシトリチルであり；
Ｒ１６が、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり；
Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂが、独立して、Ｃ１−６アルキルであり；
ＲＳが、−Ｃ（＝Ｎ）（ＳＨ）−ＣＮまたは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である；
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３１】
Ｙが存在しない、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３２】
Ｙが、単一のヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３３】
Ｙが、２〜５０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３４】
Ｙが、２〜４０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３５】
Ｙが、２〜３０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３６】
Ｙが、２〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３７】
式（Ｘ）の化合物が、２〜３０のヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項３８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、修飾ＲＮＡのみを含む、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ及び修飾ＲＮＡを含む、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマーである、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡのみを含む、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号１である、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号２である、請求項３７に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列が、配列番号８である、請求項３７に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下に、２０１６年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／３５４，４３３号の出願日の優先権を主張し、その全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
現出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列表を包含し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１７年６月２０日に作成されており、名称が１２３４２９−００２２０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが３，１０１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、研究及び医療目的で化学的に合成され得る短いＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーである。オリゴヌクレオチドは、特定の配列を生成するためにヌクレオチド残基を段階的に付加することによって典型的には調製される。チオール化オリゴヌクレオチドの現在の固相合成製造法は、サイクル当たり４反応、すなわち、脱保護（例えば、脱トリチル化）、カップリング、硫化、及びキャッピングの繰り返しを使用する。キャッピング工程は、各サイクルにおいてホスホロアミダイトとカップリングしなかったあらゆる未反応の５’−ヒドロキシル基をブロックするように設計されたものであったため、失敗配列が、後のサイクルにおいてカップリング反応にさらに関与せず、失敗したカップリングのヌクレオシドが存在しない不純物を発生させる。キャッピング工程は、典型的には、塩基触媒、例えばピリジンまたはＮ−メチルモルホリンと共に無水酢酸を使用して行われる。
【０００４】
成長するオリゴマーに各ヌクレオチドを付加するために４つの工程のそれぞれを完了させる必要があるため、工程の数を減少させることが、各ヌクレオチドの付加に必要とされる時間量を減少させ、その上、オリゴヌクレオチド合成を完了するのに必要とされる試薬量を減少させる。そのため、オリゴヌクレオチドを調製するための新規の合成方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、従来のサイクル当たり４反応ではなく、サイクル当たり３反応、すなわち、脱トリチル化、カップリング、及び硫化の繰り返しを使用した、完全または部分チオール化オリゴヌクレオチドの固相合成製造法を本明細書において記載する。
【０００６】
典型的には、ヌクレオチドは、固体支持体に付着したオリゴマーの最後のヌクレオチドの遊離５’−ヒドロキシルを、適切なホスホロアミダイトとカップリングすることによって、成長するオリゴマー鎖に付加される。カップリング反応における非効率さは、後のカップリング反応において自由に反応する５’−ヒドロキシル基のいくらかのを脱離させ、結果として、単一なヌクレオチドが存在しない、しかしランダムである、複雑なオリゴマー混合物を生じさせる。したがって、未反応の５’−ヒドロキシルが後に反応することを防止するために、５’−ヒドロキシルが、硫化工程の前または後に、キャッピング試薬、例えば無水酢酸の使用を介してキャッピングされる。
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、硫化工程の前または後のキャッピング工程を排除したプロセスを開発した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、未反応の５’−ヒドロキシル基を、プロセスに新たに導入される必要がある試薬、例えば、無水酢酸によってキャッピングするのではなく、硫化工程の際に発生する副生成物が未反応の５’−ヒドロキシ基をキャッピングするのに使用され得ることを発見した。これらの副生成物、または、ある特定の場合には、硫化剤それ自体、例えばＰＡＤＳが、固体支持体にわたって再循環されて、ホスホロアミダイトとカップリングしなかった５’−ヒドロキシ基をキャッピングし得る。未反応の５’ヒドロキシル基は、別個のキャッピング工程を必要とすることなく硫化副生成物と反応し、後のサイクルにおいてカップリングすることにはもはや利用することはできない。
【０００８】
完全チオール化オリゴヌクレオチド（すなわち、ホスホロチオレート（−Ｐ＝Ｓ）結合のみを含むオリゴヌクレオチド）に関して、キャッピング工程は全く必要でなく、上記プロセスは、サイクル当たり３反応のみ（脱保護、カップリング、及び硫化）を含む。
【０００９】
ここで記載されているプロセスは、ホスホロチオレート（−Ｐ＝Ｓ）及びホスホジエステル（−Ｐ＝Ｏ）の両結合を含む部分チオール化オリゴヌクレオチドを調製するのにも使用され得る。部分チオール化オリゴヌクレオチドは、サイクルにおける第３工程が、−Ｐ＝Ｏ結合または−Ｐ＝Ｓ結合のいずれが望ましいかに応じて酸化または硫化のいずれかである、４反応工程サイクルによって従来的に調製されている。本明細書で記載されているプロセスの使用は、硫化工程の後のキャッピング工程を排除するのに使用され得る。しかし、酸化工程の副生成物は、未反応の５’−ヒドロキシをキャッピングしないため、残存量の未反応の５’−ヒドロキシル基が、酸化工程の後に残存し得る。しかし、少数の、例えば、４つ以下の−Ｐ＝Ｏ結合を含む部分チオール化オリゴヌクレオチドに関しては、酸化工程後にキャッピング工程を用いなくても、本明細書で記載されているプロセスを使用することができる。多数の、例えば５以上の−Ｐ＝Ｏ結合を含む部分チオール化オリゴヌクレオチドに関しては、本明細書で記載されているプロセスを使用することができるが、例えば無水酢酸を用いた従来のキャッピング工程を、各酸化工程の後に使用してもよい。しかし、キャッピング工程は、どれだけ多くの−Ｐ＝Ｏ結合が存在するかにかかわらず、硫化工程後になお必要とされない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３工程オリゴヌクレオチド合成方法の図を示す。
【図２】従来の４工程オリゴヌクレオチド合成方法の図を示す。なお、硫化工程は、サイクルプロセス当たり従来の４反応においてキャッピング工程の前または後に実施されてよい。
【図３】ＰＡＤＳを用いた４反応サイクル（上部）；ＰＡＤＳを用いた３反応サイクル（中央）；及びキサンタンヒドリドを用いた３反応サイクル（下部）について質量分析によって純度を比較したクロマトグラムである。
【図４】硫化剤としてＰＡＤＳを用いた４反応サイクルプロセス（下部）及び３反応サイクルプロセス（上部）によって調製されたＢＩＩＢ０７８を比較したＲＰＩＰ  ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】硫化剤としてＰＡＤＳを用いた４反応サイクルプロセス（下部）及び３反応サイクルプロセス（上部）によって調製されたＢＩＩＢ０７８を比較したＲＰＩＰ  ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】硫化剤としてＰＡＤＳを用いた４反応サイクルプロセス（下部）及び３反応サイクルプロセス（上部）によって調製されたＢＩＩＢ０７８を比較した質量分析クロマトグラムである。
【図７】硫化剤としてＰＡＤＳを用いた４反応サイクルプロセス（下部）及び３反応サイクルプロセス（上部）によって調製されたＢＩＩＢ０７８を比較した質量分析クロマトグラムである。
【図８】ＰＡＤＳを、アセトニトリル−ｄ３中、３−ピコリンによってエージングした、ＢｕＯＨ、Ｐ（ＯＭｅ）３及びＰＡＤＳの反応混合物の経時的な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図９】ＰＡＤＳを、アセトニトリル−ｄ３中、Ｎ−メチルイミダゾールによってエージングした、ＢｕＯＨ、Ｐ（ＯＭｅ）３及びＰＡＤＳの反応混合物の経時的な１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１実施形態は、オリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスであって
ａ）式（Ｉ）の化合物：
【００１２】
【化１】
2019518778.tif 000003
【００１３】
を式（ＩＩ）の化合物：
【００１４】
【化２】
2019518778.tif 000004
【００１５】
と反応させて、式（ＩＩＩ）の化合物：
【００１６】
【化３】
2019518778.tif 000005
【００１７】
を形成することと；
ｂ）式（ＩＩＩ）の化合物を、硫化剤を用いて硫化して、式（ＩＶ）の化合物：
【００１８】
【化４】
2019518778.tif 000006
【００１９】
を形成し、式（Ｉ）の未反応化合物から式（Ｖ）の化合物：
【００２０】
【化５】
2019518778.tif 000007
【００２１】
を形成することと；
を含み、
式中、
各Ｒ１及びＲ１１は、独立して、核酸塩基であり、核酸塩基のＮＨ２が、存在する場合、アミン保護基によって保護されており；
各Ｒ２及びＲ１２は、Ｈ、ハロ、及びＣ１−６アルコキシによって任意選択的に置換されているＣ１−６アルコキシからなる群から独立して選択され；
Ｒ３は、リンカーを任意選択的に含む固体支持体であり；
Ｙは、非存在、ヌクレオチド、または２以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり；
各Ｒ４は、独立してＨであるか、またはＲ２のアルコキシ基と共に環を形成し；
各Ｒ１４は、独立してＨであるか、またはＲ１２のアルコキシ基と共に環を形成し；
Ｒ１５は、ヒドロキシ保護基であり；
Ｒ１６は、−ＣＮによって任意選択的に置換されているＣ１−６アルキルであり；
Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂは、独立してＣ１−６アルキルであり；
ＲＳは、硫化剤の副生成物から形成されたヒドロキシ保護基であり；
硫化剤は、式（Ｉ）の未反応化合物から式（Ｖ）の化合物に実質的に完全に変換し、かつ式（ＩＩＩ）の化合物から式（ＩＶ）の化合物に変換するのに十分な時間量で反応され；
式（Ｉ）の未反応化合物から式（Ｖ）の化合物に実質的に完全に変換し、かつ式（ＩＩＩ）の化合物から式（ＩＶ）の化合物に変換するのに十分な量の硫化剤が添加され；
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）の化合物が、任意選択的に、薬学的に許容可能な塩の形態である、上記プロセスである。
【００２２】
本明細書において使用されているとき、「十分な時間量」は、反応条件に基づいて当業者によって決定され得る。例えば、第１３実施形態において提供されている時間、すなわち、０〜３０分、例えば、０、５、１０、１５、２０、２５、または３０分は、「十分な時間量」である。
【００２３】
本明細書において使用されているとき、「実質的に完全に変換すること」は、反応条件に基づいて当業者によって決定され得る。特に、実質的に完全に変換することは、式（Ｉ）の未反応化合物または式（ＩＩＩ）の５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を、それぞれ、式（Ｖ）または式（ＩＶ）に変換することを意味する。
【００２４】
第１実施形態のいくつかの態様において、上記プロセスは、工程ｂの後に追加のキャッピング工程を含まない。具体的には、式（Ｉ）、（ＶＩ）、または（ＩＸ）の任意の未反応化合物は、式（Ｉ）、（ＶＩ）、または（ＩＸ）の任意の未反応化合物をキャッピングするいずれの他の試薬も添加する必要なく、硫化工程ｂの副生成物によってキャッピングされる。
【００２５】
第１実施形態の特定の態様において、
Ｒ１１は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン（または５−メチルウラシル）、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、及び５−ヒドロキシメチルシトシンからなる群から選択され、ここで、核酸塩基のＮＨ２基は、存在する場合、ＰｈＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ｉＰｒＣＯ−、Ｍｅ２Ｎ−ＣＨ＝、またはＭｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝によって保護されている。
Ｒ１２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１−４アルコキシ、及びＣ１−４アルコキシＣ１−４アルコキシからなる群から選択され；
各Ｒ１４は、独立してＨであるか、またはＲ１２のアルコキシ基と共に５もしくは６員環を形成し；
Ｒ１５は、４，４’−ジメトキシトリチル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）またはトリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）から選択されるヒドロキシ保護基である。
Ｒ１６は、−ＣＮで置換されたＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂは、独立して、Ｃ１−４アルキルである。
【００２６】
特定の実施形態において、
第１実施形態の具体的な態様において、式（ＩＩ）は、以下の構造式：
【００２７】
【化６】
2019518778.tif 000008
【００２８】
式中、ＤＭＴＯは、４，４’−ジメトキシトリチル保護５’−ヒドロキシであり、Ｒ１１は、第１実施形態で定義されている通りである；のいずれか１つから選択される。
【００２９】
本発明の第２実施形態は、第１実施形態またはこれらのいずれかの態様で記載されているプロセスであって、ｃ）式（ＩＶ）の化合物を脱保護して式（ＶＩ）の化合物：
【００３０】
【化７】
2019518778.tif 000009
【００３１】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含む、上記プロセスである。
【００３２】
本発明の第３実施形態は、第２実施形態で記載されているプロセスであって、ｄ）式（ＶＩ）の化合物を式（ＩＩ）の化合物と反応させて、式（ＶＩＩ）の化合物：
【００３３】
【化８】
2019518778.tif 000010
【００３４】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程と；
ｅ）式（ＶＩＩ）の化合物を、酸化剤を用いて酸化して、式（ＶＩＩＩ）の化合物：
【００３５】
【化９】
2019518778.tif 000011
【００３６】
を形成する工程とをさらに含む、上記プロセスである。
【００３７】
本発明の第４実施形態は、第３実施形態で記載されているプロセスであって、ｆ）式（ＶＩＩＩ）の化合物を脱保護して式（ＩＸ）の化合物：
【００３８】
【化１０】
2019518778.tif 000012
【００３９】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含む、上記プロセスである。
【００４０】
本発明の第５実施形態は、第２及び第４実施形態で記載されているプロセスであって、式（ＶＩ）の化合物または式（ＩＸ）の化合物によって開始して、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）がｎ回繰り返され、工程ｄ）、ｅ）及びｆ）がｍ回繰り返され、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）、ならびに工程ｄ）、ｅ）及びｆ）の繰り返しが、互いに対していずれの順序で行われてもよく、ｎが少なくとも１以上であり、ｍが０、１、２、３、または４であり、式（Ｘ）もしくは（ＸＩ）のオリゴヌクレオチド：
【００４１】
【化１１】
2019518778.tif 000013
【００４２】
【化１２】
2019518778.tif 000014
【００４３】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成すること、あるいは、オリゴヌクレオチドを形成することにおいて、工程ａ、ｂ、及びｃ、または工程ｄ、ｅ、及びｆの各繰り返しにより、式（ＶＩ）及び（ＩＸ）のいくらかの未反応化合物を結果として生じ、これが、過剰の硫化剤または硫化工程後の硫化剤の副生成物と反応して、式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩＩ）の化合物：
【００４４】
【化１３】
2019518778.tif 000015
【００４５】
【化１４】
2019518778.tif 000016
【００４６】
式中、各Ｘは、ＳまたはＯから独立して選択され、ただし、式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、及び（ＸＩＩＩ）の化合物において、４、３、２、１、または０回のみ、ＸがＯである；を形成する、上記プロセスである。特に、ｎは、１〜３０、５〜２５、または１０〜１５であり、ｍは、０、１、２、３、または４である。
【００４７】
第５実施形態で上記に記載されているプロセスは、所望のオリゴヌクレオチドを形成するためのヌクレオチドの段階的付加を含む。これらの工程は、それぞれ、ヌクレオチドを、成長するオリゴヌクレオチドに付加する、３反応を含む。第１工程（工程ａ及びｄに相当する）において、ヌクレオシド（例えば、式（Ｉ）の化合物）の５’末端が、ヌクレオチド（例えば、式（ＩＩ）の化合物）の３’末端にカップリングされる。これらの２つの新たに結合されたヌクレオチド間の連結がホスホチオエート（すなわち、例えば、式（ＩＶ）におけるようなＰ＝Ｓ結合）であるべきかまたはホスホジエステル（すなわち、例えば、式（ＶＩＩＩ）におけるようなＰ＝Ｏ結合）であるべきかに応じて、オリゴヌクレオチドは、それぞれ、硫化される（工程ｂ）か、または酸化される（工程ｅ）かのいずれかとなる。最後に、次の５’−ヒドロキシ基が脱保護され（工程ｃまたはｆ、例えば、式（ＶＩ）及び（ＩＸ））、上記プロセスが繰り返されて次のヌクレオシドを付加する。上記のように「式（ＶＩ）及び（ＩＸ）のいくらかの未反応化合物」は、カップリング工程ａ）またはｄ）が完了しても、式（ＶＩ）及び（ＩＸ）のいくらかの化合物が未反応で残存して後のカップリング反応に利用可能であり、結果として、所望のオリゴヌクレオチドと比較して、オリゴヌクレオチドが存在しないオリゴヌクレオチドを生じさせ得ることを意味する。所望のオリゴヌクレオチドと比較して、たった１つのオリゴヌクレオチドも存在しないオリゴヌクレオチド（「Ｎ−１不純物」）は、所望のオリゴヌクレオチドから分離することが難しい可能性があるため、Ｎ−１不純物の形成を防止するために、未反応の５−ＯＨのヒドロキシのキャッピングが必要である。「いくらかの」により、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満が残存し得る任意の量が企図される。
【００４８】
そのため、このプロセスは、いずれのキャッピング工程も全く必要とすることなく、任意の数のホスホチオエート結合及び最大４つのホスホジエステルを有するオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。なぜなら、いずれの未反応の５’−ヒドロキシ基も、硫化剤それ自体、または硫化剤と２つのヌクレオシド間の連結におけるリン原子との反応の副生成物と反応するからである。これは、カップリング工程の後に未反応の５’ＯＨのいずれかをブロックするキャッピング工程が行われる従来の合成とは対照的である。
【００４９】
本発明の第６実施形態は、第３実施形態で記載されているプロセスであって、ｇ）式（ＶＩ）の未反応化合物をキャッピング剤と反応させて、式（ＸＩＶ）の化合物：
【００５０】
【化１５】
2019518778.tif 000017
【００５１】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含み、Ｒｃが、キャッピング剤から形成されたヒドロキシ保護基である、上記プロセスである。「キャッピング剤」は、塩基触媒、例えばピリジンまたはＮ−メチルモルホリンを用いる、当業者に公知のいずれのキャッピング剤、例えば、無水酢酸であってもよい。
【００５２】
本発明の第７実施形態は、第６実施形態で記載されているプロセスであって、ｈ）式（ＶＩＩＩ）の化合物を脱保護して式（ＸＶ）の化合物：
【００５３】
【化１６】
2019518778.tif 000018
【００５４】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成する工程をさらに含む、上記プロセスである。
【００５５】
本発明の第８実施形態は、第７実施形態で記載されているプロセスであって、式（ＶＩ）の化合物または式（ＩＸ）の化合物によって開始して、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）がｎ回繰り返され、工程ｄ）、ｅ）、ｇ）及びｈ）がｍ回繰り返され、工程ａ）、ｂ）、及びｃ）ならびに工程ｄ）、ｅ）、ｇ）及びｈ）の繰り返しが、互いに対していずれの順序で行われてもよく、ｎが少なくとも１であり、ｍが０以上であり、式（Ｘ）もしくは（ＸＶＩＩ）のオリゴヌクレオチド：
【００５６】
【化１７】
2019518778.tif 000019
【００５７】
【化１８】
2019518778.tif 000020
【００５８】
またはその薬学的に許容可能な塩を形成すること、あるいは、オリゴヌクレオチドを形成することにおいて、工程ａ、ｂ、及びｃ、または工程ｄ、ｅ、及びｆの各繰り返しにより、式（ＶＩ）及び（ＩＸ）のいくらかの未反応化合物を結果として生じ、これが、過剰の硫化剤または硫化工程後の硫化剤の副生成物と反応して、式ＸＩＩまたはＸＩＩＩの化合物：
【００５９】
【化１９】
2019518778.tif 000021
【００６０】
【化２０】
2019518778.tif 000022
【００６１】
式中、各Ｘは、ＳまたはＯから独立して選択される；を形成する、上記プロセスである。特に、ｎは、１〜３０、５〜２５、または１０〜１５であり、ｍは、０〜１０、０〜５、または５〜１０である。
【００６２】
第８実施形態で上記に記載されているプロセスは、所望のオリゴヌクレオチドを形成するためのヌクレオチドの段階的付加を含む。これらの工程は、それぞれ、ホスホチオエート連結を含有するヌクレオチドを、成長するオリゴヌクレオチドに付加する、３反応、及びホスホジエステル連結を含有するヌクレオチドを、成長するオリゴヌクレオチドに付加する、４反応を含む。第１工程（工程ａ及びｄに相当する）において、ヌクレオシド（例えば、式Ｉの化合物）の５’末端が、ヌクレオチド（例えば、式ＩＩの化合物）の３’末端にカップリングされて、これら２つのヌクレオチドをカップリングする（化合物、例えば式（ＩＩＩ）及び（ＶＩＩ）の化合物を形成する。これらの２つの新たに結合されたヌクレオチド間の連結が、ホスホチオエート（すなわち、Ｐ＝Ｓ結合）であるべきかまたはホスホジエステル（すなわち、Ｐ＝Ｏ結合）であるべきかに応じて、オリゴヌクレオチドは、硫化される（工程ｂ、化合物、例えば式（ＩＶ）の化合物を形成する）かまたは酸化される（工程ｅ、化合物、例えば式（ＩＶ）または（ＶＩＩＩ）の化合物を形成する）かのいずれかとなる。第５実施形態で上記に記載されているプロセスとは異なり、第８実施形態は、非限定数のホスホジエステル連結を許容するため、キャッピング工程は、各酸化工程（工程ｇ）の後に完了されなければならない。しかし、第５実施形態としては、硫化工程の後にキャッピング工程が必要とされない。第５実施形態としては、次の５’−ヒドロキシ基が脱保護され（工程ｃまたはｈ、例えば、式（ＶＩ）及び（ＩＸ））、上記プロセスが繰り返されて次のヌクレオシドを付加する。そのため、このプロセスは、任意の数のホスホチオエート結合及びホスホジエステル結合によるオリゴヌクレオチドの合成を可能にし、酸化工程を含むサイクルの後にのみキャッピング工程を必要とする。これは、硫化工程を含んでいても、未反応の５’ＯＨのいずれかをブロックするキャッピング工程がサイクルごとになされる従来の合成とは対照的である。
【００６３】
第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び第８実施形態のいくつかの態様において、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、または（ＸＶ）の化合物が、塩ではない。
【００６４】
第５または第８実施形態の特定の態様において、ｎは、２〜１０００である。特に、ｎは、２〜５００である。特に、ｎは、２〜５０である。特に、ｎは、２〜２５である。
【００６５】
第９実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び第８実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、固体支持体に付着したリンカーが、開裂している。
【００６６】
第１０実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、及び第９実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化剤が式Ａの化合物：
【００６７】
【化２１】
2019518778.tif 000023
【００６８】
式中、Ｒ１及びＲ２の各々が、Ｈ、任意選択的に置換されているアルキル及び任意選択的に置換されているアリール基から独立して選択される；である。第１０実施形態の特定の態様において、Ｒ１及びＲ２は、両方がＨであり：
【００６９】
【化２２】
2019518778.tif 000024
【００７０】
これは、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＸＨまたはＡＤＴＴ）として知られている。いくつかの態様において、ＲＳは、−Ｃ（ＳＨ）（＝Ｎ）−ＣＮである。
【００７１】
第１０実施形態の特定の態様において、Ｒ１及びＲ２は、両方がメチルであり：
【００７２】
【化２３】
2019518778.tif 000025
【００７３】
これは、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール（ＤＤＴＴ）として知られている。いくつかの態様において、ＲＳは、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｎ＝ＣＨＮ（ＣＨ３）２である。
【００７４】
第１１実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、及び第９実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化剤は、式Ｂの化合物：
【００７５】
【化２４】
2019518778.tif 000026
【００７６】
式中、Ｒ１及びＲ２の各々は、Ｈ、任意選択的に置換されているアルキル及び任意選択的に置換されているアリール基から独立して選択される；である。第１０実施形態の特定の態様において、Ｒ１及びＲ２は、両方がベンジル（ＰｈＣＨ２）であり：
【００７７】
【化２５】
2019518778.tif 000027
【００７８】
これは、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）として知られている。特定の態様において、ＲＳは、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【００７９】
第１２実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、及び第９実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化剤は、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）：
【００８０】
【化２６】
2019518778.tif 000028
【００８１】
である。第１２実施形態の具体的な態様において、ＲＳは、
【００８２】
【化２７】
2019518778.tif 000029
【００８３】
である。
【００８４】
第１３実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化剤は、０〜３０分、例えば、０、５、１０、１５、２０、２５、または３０分間硫化剤を再循環させることによって反応する。一実施形態において、硫化剤は、１〜３０分、１〜２０分、１〜１０分、または１〜５分間再循環される。別の実施形態において、硫化剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０分間再循環される。
【００８５】
第１４実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、及び第１３実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化剤は、少なくとも０〜２０回、例えば、１、２、５、１０、１５、２０回再循環される。一実施形態において、硫化剤は、１〜２０回、１〜１０回、または１〜５回再循環される。
【００８６】
第１５実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、及び第１４実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化剤は、固体支持体に付着した第１ヌクレオシドの量に対して３〜６当量の硫化剤を再循環させることによって反応する。
【００８７】
第１６実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、及び第１５実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、硫化試薬の濃度は、０．０２Ｍ〜２．０Ｍである。いくつかの態様において、硫化剤は、ピリジン、３−ピコリン、アセトニトリル、またはこれらの混合物に溶解される。第１６実施形態の特定の態様において、硫化試薬の濃度は、０．０５Ｍ〜０．５Ｍである。特定の態様において、硫化試薬は、ピリジンに溶解された、０．０２Ｍ〜０．１Ｍ、例えば、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７，０．０８、０．０９、または０．１Ｍの濃度で添加された３−（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール（ＤＤＴＴ）である。特定の態様において、硫化試薬は、アセトニトリル（ＡＣＮ）中、０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２Ｍの濃度で添加された３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）である。特定の態様において、硫化試薬は、アセトニトリル（ＡＣＮ）／３−ピコリン中、０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７，０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２Ｍの濃度で添加されたフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）である。特定の態様において、硫化試薬は、ピリジン中、０．０１Ｍ〜０．２Ｍ、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７，０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２Ｍの濃度で添加された３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＸＨまたはＡＤＴＴ）である。
【００８８】
ある特定の実施形態において、上記の硫化試薬（例えば、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）または３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＸＨ））は、本発明のプロセスでの使用の前に塩基で処理される（すなわち、エージング）。例示的な塩基として、限定されないが、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン及び３−ピコリンが挙げられる。硫化試薬は、１分〜５日、例えば５分〜２４時間、１０分〜１２時間、３０分〜１０時間、１時間〜８時間、２時間〜６時間、または３時間〜５時間、塩基によってエージングされ（すなわち、塩基で処理され）得る。一実施形態において、硫化試薬は、４時間エージングされる。別の実施形態において、硫化試薬ＰＡＤＳは、本発明のプロセスにおいて使用される前に、３−ピコリンによって４時間エージングされる。
【００８９】
第１７実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、及び第１６実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、核酸塩基は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン（または５−メチルウラシル）、ウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、及び５−ヒドロキシメチルシトシンからなる群から選択され、ここで、核酸塩基のＮＨ２基は、存在する場合、ＰｈＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ｉＰｒＣＯ−、Ｍｅ２Ｎ−ＣＨ＝、またはＭｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝によって保護されている。特定の実施形態において、核酸塩基は、シトシン、グアニン、アデニン、チミン（または５−メチルウラシル）、ウラシル、及び５−メチルシトシンからなる群から選択され、ここで、核酸塩基のＮＨ２基は、存在する場合、ＰｈＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ｉＰｒＣＯ−、Ｍｅ２Ｎ−ＣＨ＝、またはＭｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝によって保護されている。
【００９０】
第１８実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、及び第１７実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、各Ｒ２及びＲ１２は、Ｈ、Ｆ、及びＣ１−４アルコキシによって任意選択的に置換されているＣ１−４アルコキシからなる群から独立して選択され；各Ｒ４は、独立してＨであるか、またはＲ２のアルコキシ基と共に環を形成し、ここで、当該環は、１〜３個のＣ１−４アルキル基によって任意選択的に置換されている５または６員環であり；Ｒ１６は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり；Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂは、独立して、Ｃ１−４アルキルであり；各Ｒ１４は、独立してＨであるか、またはＲ１２のアルコキシ基と共に環を形成し、当該環は、１〜３個のＣ１−４アルキル基によって任意選択的に置換されている５または６員環である。
【００９１】
第１９実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７及び第１８実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、各Ｒ２及びＲ１２は、ＨまたはＣ１−４アルコキシによって任意選択的に置換されているＣ１−４アルコキシから独立して選択され；Ｒ１５は、４，４’−ジメトキシトリチルであり；Ｒ１６は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮであり；Ｒ１７ａ及びＲ１７ｂは、独立して、Ｃ１−６アルキルであり；ＲＳは、−Ｃ（＝Ｎ）（ＳＨ）−ＣＮまたは−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
【００９２】
第２０実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、及び第１９実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、Ｙは、存在しない。代替的には、Ｙは、単一のヌクレオチドである。代替的には、Ｙは、２〜５０のヌクレオチド、特に、２〜４０のヌクレオチド、２〜３０のヌクレオチド、または２〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。
【００９３】
第２１実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、及び第２０実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、式（Ｘ）または（ＸＩ）の化合物は、２〜３０のヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾ＲＮＡのみを含む。代替的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ及び修飾ＲＮＡを含む。特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーである。代替的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのみを含む。
【００９４】
第２２実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、及び第２１実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、（５’〜３’）の配列
ＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧ（配列番号１）、
ここで、オリゴヌクレオチドの各インターヌクレオシド連結は、ホスホロチオエート連結であり、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）ヌクレオシドであり、各シトシンは、５−メチルシトシンである；を有するホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。配列番号１は、ＢＩＩＢ０５８としても知られており、ＷＯ２００７／００２３９０、ＷＯ２０１０／１４８２４９、及びＵＳ８，９８０，８５３に記載されており、それぞれの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
第２３実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、及び第２１実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、（５’〜３’）の配列
ＣＡＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴ（配列番号２）、
ここで、ヌクレオシド１〜５及び１６〜２０は、それぞれ、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド６〜１５は、それぞれ、２’−デオキシヌクレオシドであり、ヌクレオシド２〜３、４〜５、１６〜１７、及び１８〜１９間のインターヌクレオシド連結は、ホスホジエステル連結であり、ヌクレオシド１〜２、３〜４、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、９〜１０、１０〜１１、１１〜１２、１２〜１３、１３〜１４、１４〜１５、１５〜１６、１７〜１８、及び１９〜２０間のインターヌクレオシド連結は、ホスホロチオエート連結であり、各シトシンは、５’−メチルシトシンである；を有する。配列番号２は、以下の化学表記法によって記載されている：ｍＣｅｓ  Ａｅｏ  Ｇｅｓ  Ｇｅｏ  Ａｅｓ  Ｔｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｄｓ  Ａｄｓ  Ｔｄｓ  Ｔｄｓ  Ｔｄｓ  ｍＣｄｓ  Ｔｄｓ  Ａｄｓ  ｍＣｅｏ  Ａｅｓ  Ｇｅｏ  ｍＣｅｓ  Ｔｅ；
Ａ＝アデニン、
ｍＣ＝５’−メチルシトシン
Ｇ＝グアニン、
Ｔ＝チミン、
ｅ＝２’−Ｏ−メトキシエチルリボース修飾糖、
ｄ＝２’−デオキシリボース糖、
ｓ＝ホスホロチオエートインターヌクレオシド連結、及び
ｏ＝ホスホジエステルインターヌクレオシド連結。
配列番号２は、ＢＩＩＢ０６７またはＩＳＩＳ  ６６６８５３として知られている通りであり、ＷＯ２０１５１５３８００に記載されており、その教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９６】
第２４実施形態において、上記プロセスは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、及び第２１実施形態のいずれか１つ、またはこれらのいずれかの態様で記載されている通りであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、４−８−６ギャップマーであり、（５’〜３’）の配列：
ＧＣＣＣＣＴＡＧＣＧＣＧＣＧＡＣＵＣ（配列番号８）
ここで、ヌクレオシド１〜４及び１３〜１８は、それぞれ、２’−Ｏ−メトキシエチルリボース修飾ヌクレオシドであり、ヌクレオシド５〜１２は、それぞれ、２’−デオキシリボヌクレオチドであり、ヌクレオシド２〜３、３〜４、１３〜１４、１４〜１５、及び１５〜１６間のインターヌクレオシド連結は、ホスホジエステル連結であり、ヌクレオシド１〜２、４〜５、５〜６、６〜７、７〜８、８〜９、９〜１０、１０〜１１、１１〜１２、１２〜１３、１６〜１７及び１７〜１８間のインターヌクレオシド連結は、ホスホロチオエート連結であり、各シトシンは、５−メチルシトシンであり、ウラシルは、５−メチルウラシルである；を有する。配列番号８以下の化学表記法によって記載されている：
【００９７】
【化２８】
2019518778.tif 000030
【００９８】
「アミン保護基」は、アミン基、ＮＨ２を保護するのに好適な任意の基を包含し、例えば、限定されないが、ＰｈＣＯ−、ＣＨ３ＣＯ−、ｉＰｒＣＯ−、及びＭｅ２Ｎ−ＣＨ＝、Ｍｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝が挙げられる。Ｍｅ２Ｎ−ＣＨ＝及びＭｅ２Ｎ−ＣＭｅ＝によって保護されるアミノ基の得られる構造は以下の通りである：
【００９９】
【化２９】
2019518778.tif 000031
【０１００】
さらなるアミン保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ，ＴＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（２００７）に見出され得る。
【０１０１】
理論によって拘束されることを望まないが、カップリング工程の際にカップリングしなかった５’−ヒドロキシは、例えばＰＡＤＳなどの硫化剤による硫化からヒドロキシル誘導体を、またはキサンタンヒドリドからＮ−シアノカーボンイミドチオエートを、またはＤＤＴＴからＮ，Ｎ−ジメチルチオ尿素−Ｎ−チオカルボキシレートを形成すると考えられる：
【０１０２】
【化３０】
2019518778.tif 000032
【０１０３】
「ヒドロキシ保護基」は、ヒドロキシ基ＯＨを保護するのに好適な任意の基を包含する。これらの保護基及びヒドロキシ保護基のさらなる例は、Ｇｒｅｅｎｅ，ＴＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（２００７）に見出され得る。
【０１０４】
具体的な実施形態において、ヒドロキシ保護基は、キャッピング剤から形成され（例えば、式（ＸＩＶ）におけるＲｃ）、例えば、アセチル（Ａｃ）；ベンゾイル（Ｂｚ）；ベンジル（Ｂｎ）；β−メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）；メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）；メトキシトリチル［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル、ＭＭＴ）；ｐ−メトキシベンジルエーテル（ＰＭＢ）；メチルチオメチルエーテル；ピバロイル（Ｐｉｖ）；テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）；シリルエーテル（限定されないが、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、及びトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）エーテルを含む）；メチルエーテル、ならびにエトキシエチルエーテル（ＥＥ）から選択され得る。
【０１０５】
代替的には、ヒドロキシ保護基は、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの５’−ヒドロキシをブロックし（例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（ＶＩＩ）、及び（ＶＩＩＩ）におけるＲ１５）、特定の態様においては、４，４’−ジメトキシトリチル、［ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］（ＤＭＴ）またはトリチル（トリフェニルメチル、Ｔｒ）から選択される、酸に不安定な保護基である。
【０１０６】
「核酸塩基」は、ヌクレオシドの複素環式塩基部分を意味する。核酸塩基は、天然に存在するものであっても、修飾されていてもよい。ある特定の実施形態において、核酸塩基は、別の核酸の核酸塩基に水素結合することが可能である任意の原子または原子の基を含んでいてよい。特に、核酸塩基は、複素環式塩基、典型的には、プリン及びピリミジンである。「非修飾」または「天然」核酸塩基、例えば、プリン核酸塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン核酸塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）に加えて、当業者に公知の多くの修飾核酸塩基または核酸塩基類似体が、本明細書に記載されている方法によって合成される化合物への組み込みに適している。ある特定の実施形態において、修飾核酸塩基は、親核酸塩基、例えば７−デアザプリン、５−メチルシトシン、またはＧ−クランプなどに構造がかなり類似する核酸塩基である。ある特定の実施形態において、核酸塩基類似体は、例えば三環式フェノキサジン核酸塩基類似体などの、より複雑な構造を含む。上記の修飾核酸塩基の調製のための方法は、当業者に周知である。
【０１０７】
「ヌクレオシド」は、複素環式塩基部分及び糖部分を含む化合物を意味する。
【０１０８】
「ヌクレオチド」は、ホスフェート連結基を含むヌクレオシドを意味する。
【０１０９】
「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。ある特定の実施形態において、複数のヌクレオシドの１つ以上が修飾されている。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
【０１１０】
「インターヌクレオシド連結」は、オリゴヌクレオチドの隣接するヌクレオシド間の共有結合的連結を意味する。
【０１１１】
「ギャップマー」は、リボヌクレアーゼＨ開裂を支持する複数のヌクレオシドを有する内部領域が、１つ以上のヌクレオシドを有する外部領域間に位置付けられているキメラアンチセンス化合物を意味し、ここで、内部領域を含むヌクレオシドは、外部領域を含むヌクレオシド（複数可）とは化学的に異なっている。
【０１１２】
本明細書において使用されているとき、「アルキル」という用語は、完全飽和の分岐または非分岐炭化水素部分を指す。好ましくは、アルキルは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１６個の炭素原子、１〜１０個の炭素原子、１〜６個の炭素原子、または１〜４個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態において、アルキルは、６〜２０個の炭素原子を含む。アルキルの代表例として、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、またはｎ−デシルが挙げられる。
【０１１３】
「アリール」という用語は、環部分において６〜１４個の炭素原子を有する単環式、二環式または三環式芳香族炭化水素基を指す。一実施形態において、アリールという用語は、６〜１０個の炭素原子を有する単環式及び二環式芳香族炭化水素基を指す。アリール基の代表例として、フェニル、ナフチル、フルオレニル、及びアントラセニルが挙げられる。
【０１１４】
「アリール」という用語はまた、少なくとも１つの環が芳香族であり、１または２つの非芳香族炭化水素環（複数可）に縮合している二環式または三環式基も指す。非限定例として、テトラヒドロナフタレン、ジヒドロナフタレニル及びインダニルが挙げられる。
【０１１５】
アルキルまたはアリールの両方の基についての任意選択的な置換基は、各事象において、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、３〜７員のカルボシクリル、３〜７員のヘテロシクリル、ハロ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−ＯＲａ、−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｎ（Ｒａ）２、−ＮＯ２、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−ＳＲａ、−Ｓ（Ｏ）Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒａ、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、及び−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒａ）２から独立して選択され；
Ｒａは、各事象において、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、３〜６員の単環式カルボシクリル、及び３〜６員の単環式ヘテロシクリルから独立して選択される。
【０１１６】
本明細書において使用されているとき、「カルボシクリル」という用語は、３〜７個の炭素原子、３〜６、または５〜７個の炭素原子の飽和または不飽和の単環式または二環式炭化水素基を指す。「カルボシクリル」という用語は、シクロアルキル基及び芳香族基を包含する。「シクロアルキル」という用語は、３〜７個の炭素原子、３〜６個の炭素原子、または５〜７個の炭素原子の完全飽和の単環式または二環式炭化水素基を指す。例示的な単環式カルボシクリル基として、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロブタジエニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル、フェニル及びシクロヘプタトリエニルが挙げられる。例示的な二環式カルボシクリル基として、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプテニル、トリシクロ［２．２．１．０２，６］ヘプタニル、６，６−ジメチルビシクロ［３．１．１］ヘプチル、または２，６，６−トリメチルビシクロ［３．１．１］ヘプチル、スピロ［２．２］ペンテニル、及びスピロ［３．３］ヘプタニルが挙げられる。
【０１１７】
「架橋環系」という用語は、本明細書において使用されているとき、カルボシクリルまたはヘテロシクリル環を有する環系であって、当該環の２つの非隣接原子が、Ｃ、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１つ以上（好ましくは１〜３つ）の原子によって接続されている（架橋されている）、上記環系である。架橋環系は、６〜７環員を有していてよい。
【０１１８】
「スピロ環系」という用語は、本明細書において使用されているとき、２つの環を有する環系であって、環のそれぞれが、カルボシクリルまたはヘテロシクリルから独立して選択され、２つの環構造が１つの環原子を共通して有している、上記環系である。スピロ環系は、５〜７環員を有する。
【０１１９】
本明細書において使用されているとき、「ヘテロシクリル」という用語は、３〜７環員、または特に３〜６環員もしくは５〜７環員を有する飽和または不飽和の、単環式または二環式（例えば、架橋もしくはスピロ環系）環系であって、これらの少なくとも１つが、ヘテロ原子であり、これらの最大４つ（例えば、１、２、３、または４）が、ヘテロ原子であってよく、当該ヘテロ原子が、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択され、ここで、Ｃが酸化され得（例えば、Ｃ（Ｏ））、Ｎが酸化（例えば、Ｎ（Ｏ））または四級化され得、Ｓが、スルホキシド及びスルホンに任意選択的に酸化され得る、上記環系を指す。不飽和複素環式環として、ヘテロアリール環が挙げられる。本明細書において使用されているとき、「ヘテロアリール」という用語は、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する芳香族の５または６員の単環式環系であって、Ｎが、酸化（例えば、Ｎ（Ｏ））または四級化され得、Ｓが、スルホキシド及びスルホンに任意選択的に酸化され得る、上記環系を指す。一実施形態において、ヘテロシクリルは、３〜７員の飽和単環式、３〜６員の飽和単環式、または５〜７員の飽和単環式環である。一実施形態において、ヘテロシクリルは、３〜７員の単環式、３〜６員の単環式または５〜７員の単環式環である。別の実施形態において、ヘテロシクリルは、６〜７員の二環式環である。ヘテロシクリル基は、ヘテロ原子または炭素原子において付着され得る。ヘテロシクリルの例として、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、オキサジリジニル、ジオキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、チオラニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、ジオキソラニル、ジチオラニル、オキサチオラニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、チアニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジオキサニル、ジチアニル、トリオキサニル、トリチアニル、アゼパニル、オキセパニル、チエパニル、ジヒドロフラニル、イミダゾリニル、ジヒドロピラニル、及びヘテロアリール環などが挙げられ、これらとして、アジリニル、オキシレニル、チイレニル、ジアジリニル、アゼチル、オキセチル、チエチル、ピロリル、フラニル、チオフェニル（またはチエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、フラザニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ジチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラニル、チオピラニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサジニル、チアジニル、ジオキシニル、ジチイニル、オキサチアニル、トリアジニル、テトラジニル、アゼピニル、オキセピニル、チエピニル、ジアゼピニル、及びチアゼピニルなどが挙げられる。二環式複素環式環系の例として、３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、３−アザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、２−アザスピロ［３．３］ヘプタニル、２−オキサ−６−アザスピロ［３．３］ヘプタニル、及び５−アザスピロ［２．３］ヘキサニルが挙げられる。
【０１２０】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであってよい。
【実施例】
【０１２１】
例示
実施例１  オリゴヌクレオチド合成。
オリゴヌクレオチドを、固体支持体としてＮｉｔｔｏｐｈａｓｅ  ＨＬ  ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（Ｋｉｎｏｖａｔｅ、３５０μｍｏｌ／ｇを投入）を用いてＡＫＴＡ１００固相合成機を使用して０．７２〜２．２ｍｍｏｌスケールで合成した。各ヌクレオシドを付着させるための合成サイクルは、３反応工程：脱トリチル化、カップリング、及び硫化；からなる。脱トリチル化工程を、試薬としてトルエン（１０％）中ジクロロ酢酸によって達成した。カップリング工程を、固体支持体を通して、対応するホスホロアミダイト（アセトニトリル中０．１〜０．２Ｍ）及び４，５−ジシアノイミダゾール（０．１Ｍ  Ｎ−メチルイミダゾールを含有するアセトニトリル中１．０Ｍ）の溶液を循環させることによって行った。硫化工程を、以下の溶液：（ａ）アセトニトリル／３−ピコリン（１：１、ｖ／ｖ）中０．２Ｍ  ＰＡＤＳ；（ｂ）ピリジン中０．２Ｍの３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＸＨ）；（ｃ）アセトニトリル中０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキサイド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）；または（ｄ）ピリジン中０．１Ｍの３−（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）；のうちいずれか１つを循環させることによって完了させた。対照実験では、合成は、４反応工程：脱トリチル化、カップリング、及び硫化、及びキャッピング工程からなる。硫化工程後にキャッピング工程を用いることを除いて、全ての工程を上記と同様に実施した。キャッピングを、アセトニトリル中の無水酢酸、ピリジン、及びＮ−メチルイミダゾールの混合物によって行った。支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂及び塩基の脱保護を昇温（５０〜６０℃）にて濃水酸化アンモニウム中で実施した。合成反応パラメータを以下の表１にまとめる。オリゴヌクレオチド生成物をＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０１２２】
【表１−１】
2019518778.tif 000033
【表１−２】
2019518778.tif 000034
【０１２３】
プロセスによって調製されるオリゴヌクレオチド：
１．ＢＩＩＢ０５８（配列番号１）、１８マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、各リボオリゴヌクレオチドは、２’位にメトキシ−エチル（ＭｏＥ）を含む。
２．ＢＩＩＢ０６７（配列番号２）、５−１０−５ギャップマーホスホチオエステル及びホスホジエステル混合骨格オリゴヌクレオチド。ギャップマーの中心ブロックは、１０デオキシリボヌクレオチドであり、これは、２’−ＭｏＥリボヌクレオチドのブロックによりフランクされている。
３．以下の表２に示すホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ。
４．ＢＩＩＢ０７８（配列番号８）、４−８−６ギャップマーホスホチオエステル及びホスホジエステル混合骨格オリゴヌクレオチド。ギャップマーの中心ブロックは、８デオキシリボヌクレオチドであり、これは、２’−ＭｏＥリボヌクレオチドのブロックによりフランクされている。
【０１２４】
【化３１】
2019518778.tif 000035
【０１２５】
（配列番号８）
下線：ＭｏＥリボヌクレオチド
Ｐ＝Ｏ：ホスホジエステル
任意の他のもの：ホスホチオエステル
【０１２６】
【表２】
2019518778.tif 000036
【０１２７】
結果
１．ＢＩＩＢ０５８
ＢＩＩＢ０５８を本発明のプロセス（すなわち、３反応サイクル）を使用して調製し、サイクルプロセス当たり従来の４反応のものと比較した。ＰＡＤＳ及びキサンタンヒドリドを硫化剤として使用した。硫化反応を、５分間、再循環モードとした。各プロセスの結果を表３に示す。
【０１２８】
【表３】
2019518778.tif 000037
【０１２９】
ＰＡＤＳを硫化剤として用いて４反応サイクルを３反応サイクルと比較すると、ＢＩＩＢ０５８の収率及び純度が３反応サイクルにおいて増大し、新たな不純物が発生しなかった。ＰＡＤＳと同様に実施した３反応サイクルにおけるキサンタンヒドリド。質量分析クロマトグラムの比較を図３に与える。
【０１３０】
２．ＢＩＩＢ０６７
ＰＡＤＳを硫化剤として用いて、ＢＩＩＢ０６７を本発明のプロセス（すなわち、３反応サイクル）を使用して調製し、サイクルプロセス当たり従来の４反応のものと比較した。硫化反応を、５分間、再循環モードとした。ＢＩＩＢ００５８とは異なり、ＢＩＩＢ０６７は、Ｐ＝Ｏ結合ならびにＰ＝Ｓ結合を含む。そのため、３つの異なる反応を行った：１）４反応サイクル、２）３反応サイクル、及び３）酸化工程の後のみにキャッピング工程を有する３反応サイクル。そのため、かかるヌクレオチドについては硫化工程ではなく酸化が含まれており、酸化工程の後にキャッピング工程を行わなかった。各プロセスの結果を表４に示す。
【０１３１】
【表４】
2019518778.tif 000038
【０１３２】
４反応サイクルを、酸化後にキャッピング反応を用いない３反応サイクルと比較すると、ＢＩＩＢ０６７の収率及び純度が増大し、新たな不純物が発生しなかった。酸化反応の後にのみキャッピング工程を有しても、３反応サイクルによって調製されるＢＩＩＢ０６７の全体の純度は改善されなかった。そのため、キャッピングを有さない３反応サイクルは、Ｐ＝Ｏ結合を含むオリゴヌクレオチドについても使用することができる。
【０１３３】
３．オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ
オリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥを本発明のプロセスを使用して調製し、サイクルプロセス当たり従来の４反応のものと比較した。表５は、合成に使用したアミダイトを与える。使用した硫化剤を表６に示す。
【０１３４】
【表５−１】
2019518778.tif 000039
【表５−２】
2019518778.tif 000040
【０１３５】
【表６】
2019518778.tif 000041
【０１３６】
表７に示すように、本発明のプロセスからの粗オリゴヌクレオチドの収率、ＵＶ純度及びＭＳ不純物プロファイルは、従来の４反応サイクルプロセスによって調製された粗オリゴヌクレオチドと同様である。
【０１３７】
【表７−１】
2019518778.tif 000042
【表７−２】
2019518778.tif 000043
【０１３８】
４．ＢＩＩＢ０７８
ＢＩＩＢ０７８を本発明のプロセス（すなわち、３反応サイクル）を使用して調製し、従来の、サイクルプロセス当たり４反応のものと比較した。ＰＡＤＳを硫化剤として使用した。硫化反応を、３分間、再循環モードとした。各プロセスの結果を表８及び図４〜７に示す。
【０１３９】
【表８】
2019518778.tif 000044
【０１４０】
４反応サイクルを、ＰＡＤＳを硫化剤として用いる３反応サイクルと比較すると、ＢＩＩＢ０７８の収率及び純度が３反応サイクルにおいて増大し、新たな不純物が発生しなかった。ＨＰＬＣクロマトグラム及び質量分析クロマトグラムの比較を図４〜７に与える。
【０１４１】
実施例２．硫化及びキャッピングについての二役のＰＡＤＳのＮＭＲ研究
最初のＮＭＲ実験において、ＰＡＤＳをアセトニトリル−ｄ３中の３−ピコリンにおいて２２℃で１６時間エージングした（スキーム１）。エージング後、ｎ−ＢｕＯＨを溶液に添加し、異なる点においてＮＭＲスペクトルを採取した。スペクトルは、ＰＨＣＨ２ＣＯ２Ｂｕの形成が非常に遅いことを示した。
【０１４２】
上記と同じ手順の後の別個の実験において、ＢｕＯＨの添加後、反応混合物にＰ（ＯＭｅ）３を添加し、反応混合物のＮＭＲスペクトルを異なる点において記録した。Ｐ（ＯＭｅ）３は、固相合成におけるホスファイト中間体と同様の構造を有する。スペクトルは、約２分でＰ（ＯＭｅ）３の硫化が完了し、ＢｕＯＨのエステル化（キャッピング）が生じたことを示した（図８）。
【０１４３】
これらの実験結果は、硫化の際に活性なキャッピング試薬が発生し、存在するアルコールをキャッピングしたことを実証した。
スキーム１．
【０１４４】
【化３２】
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【０１４５】
塩基としてＮ−メチルイミダゾールを用いて同じ実験を繰り返してＰＡＤＳをエージングし、同様の結果を得た（スキーム２）。Ｐ（ＯＭｅ）３を添加しないと、エステル化反応は非常に遅いが、ＢｕＯＨのエステル化は硫化反応後すぐに生じた。これらの結果は、同じく、硫化及びキャッピングが、一旦硫化が起こって生じたことを示した（図９）。
スキーム２．ＮＭＩにおけるＰＡＤＳのエージング
【０１４６】
【化３３】
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【０１４７】
ＮＭＩ：Ｎ−メチルイミダゾール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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