(57)【要約】  対象者の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることによって対象者のＡＳＰＡ酵素活性を回復させることを通じて対象者のカナバン病を治療する方法がここに開示される。また、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞を作製するプロセス、並びに、このプロセスによって作製された神経前駆細胞が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者のカナバン病を治療するための方法であって、
前記対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、
野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、
前記遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び
前記神経前駆細胞を前記対象者の脳に移植するステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
前記リプログラムするステップは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣを含む一つ又はそれ以上のリプログラミング因子の存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リプログラムされたｉＰＳＣｓのＡＳＰＡ遺伝子は、一つ又はそれ以上の変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変異はヘテロ接合性の変異である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変異はホモ接合性の変異である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＳＰＡ遺伝子の変異は、５２７Ｇ＞Ａ、９１４Ｃ＞Ａ、又は８５４Ａ＞Ｃである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、又は他の容易にアクセス可能な体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、前記野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いて前記リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、又は遺伝子編集技術によって、導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターはレンチウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記神経前駆細胞は、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象者のカナバン病を治療する方法であって、前記対象者の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることによって前記対象者のＡＳＰＡ酵素活性を回復させることを含む、方法。
【請求項１３】
前記ＡＳＰＡ酵素活性は、前記対象者の脳にＡＳＰＡ神経前駆細胞を移植することによって回復させられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＡＳＰＡ神経前駆細胞を作製する方法であって、
カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、
野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び
前記遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記リプログラムするステップは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣを含む一つ又はそれ以上のリプログラミング因子の存在下で実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、又は他の容易にアクセス可能な体細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、前記野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いて前記リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、又は遺伝子編集技術を使用してＡＳＰＡ遺伝子の変異を修正することによって、導入される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターはレンチウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経前駆細胞は、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する神経前駆細胞であって、
カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、
野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び
前記遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、
を含むプロセスによって作製された、神経前駆細胞。
【請求項２２】
前記体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、又は他の容易にアクセス可能な体細胞である、請求項２１に記載の神経前駆細胞。
【請求項２３】
対象者のカナバン病を治療するための方法であって、
前記対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、
前記ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、
野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、前記神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び
遺伝的に修正された神経前駆細胞を前記対象者の脳に移植するステップ、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記神経前駆細胞は、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＡＳＰＡ神経前駆細胞を作製する方法であって、
カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、
前記ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び
野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、前記神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、
を含む、方法。
【請求項２６】
前記神経前駆細胞は、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する神経前駆細胞であって、
カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、
前記ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び
野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、前記神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、
を含むプロセスによって作製された、神経前駆細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の主張］
本出願は、２０１６年６月２２日に出願された“カナバン病の治療（Treatment  of  Canavan  Disease）”と表題が付けられた米国仮特許出願第６２／３５３，５１５号への優先権を主張し、当該米国仮特許出願は、本明細書において完全に述べられているかの如く、その全体について参照により本明細書に取り込まれる。
PRIORITY CLAIM
【０００２】
［政府出資の陳述］
本発明は、カリフォルニア再生医療機構（California  Institute  for  Regenerative  Medicine）によって与えられた認可番号ＴＲ２−０１８３２及びＲＢ４−０６２７７の下で政府の支援を受けてなされた。
【背景技術】
【０００３】
カナバン病（Canavan  disease）（ＣＤ）は、幼児期（early  infancy）に現れて急速に進行する症状を伴う破壊的な神経疾患である。起こり得る症状は、精神遅滞、獲得された運動技能の喪失、摂食困難、異常な筋緊張、異常に大きな頭、麻痺、盲目及び聴力損失を含む。カナバン病は、脳内のオリゴデンドロサイト（乏突起膠細胞）によって合成される代謝酵素をコードする、アスパルトアシラーゼ（aspartoacylase）（ＡＳＰＡ）遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされる１５。ＡＳＰＡは、脳内に非常に豊富に存在するアミノ酸誘導体である、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）を分解する。ＮＡＡの産生と分解のサイクルは、ミエリンによって覆われる神経線維から成る脳の白質を維持するために、決定的に重要であると思われる。カナバン病の兆候は、ＡＳＰＡ活性の欠如、脳内のＮＡＡの蓄積、並びに脳の海綿状変性及び脱髄（demyelination）を含む。
【０００４】
近年、カナバン病に対する潜在的な治療法の開発に向けられたより多くの研究が開始されている。ヒトＡＳＰＡ発現非ウイルスベクター又はＡＡＶベクターを使用したカナバン病に対する遺伝子療法は、カナバン病動物モデル、及びカナバン病患者に対する臨床試験の両方において、報告されている１６−２２。これらの研究は、ＡＳＰＡベクターが動物とヒトの対象者の両方において十分に耐容性を示し（well-tolerated）、様々な生化学的及び臨床的な改善が観察されていることを実証している１６−２２。修飾されたＡＳＰＡタンパク質（Modified  ASPA  protein）は、カナバン病マウスモデルにおいて酵素補充療法としての潜在的な使用について試験されている２３。治療を受けたマウスの脳において、高められたＡＳＰＡ活性及び低下させられたＮＡＡレベルが観察された２３。それが海綿状の変性、脱髄及び運動機能障害を改善することができるかどうかは、なお試験されるべきである。リチウムは、カナバン病動物モデル及び患者において評価されており、ＮＡＡレベルを低下させ、ＣＤ様ラット及びＣＤ患者において正常なミエリン発達に向かう傾向を誘発することが示されている。しかしながら、それはカナバン患者の運動機能を改善することはできない。食事性のグリセリルトリアセテート及びトリヘプタノインは、カナバン病動物モデルにおいて試験されており、治療されたマウスにおいて髄鞘形成（myelination）及び運動能力の改善が観察されている。しかしながら、ＮＡＡレベルの低下は観察されず、病理学的特質（pathological  features）の部分的な寛解（partial  amelioration）のみが観察された。現在まで、これらの手法のいずれも、疾患表現型の完全な救済を結果としてもたらしていない。この病気に対する治癒法（cure）も標準治療もまだ存在しない。
【０００５】
それゆえに、当分野において、カナバン病に対して効果的な治療法を提供することの必要性が存在する。本明細書において開示される発明は、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一つの態様において、本開示は、対象者のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、対象者の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることによって対象者のＡＳＰＡ酵素活性を回復させることを伴う。いくつかの実施形態において、ＡＳＰＡ酵素活性は、対象者の脳に、神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、野生型ＡＳＰＡ発現神経前駆細胞を提供することによって回復させられる。
【０００７】
一つの関連する態様において、本開示は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞（neural  precursor  cells）であって、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（induced  pluripotent  stem  cells）（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ（reprogramming  or  converting）、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓ（genetically  corrected  iPSCs）を得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ（introducing）、並びに、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させるステップ（differentiating）、を含むプロセスによって作製された、神経前駆細胞、に関連する。代替的に、外因性の野生型ＡＳＰＡを発現する、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、リプログラムされたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、を含むプロセスによって作製される。
【０００８】
一つの他の態様において、本開示は、対象者のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させるステップ、並びに、神経前駆細胞を対象者の脳に移植するステップ（transplanting）、を伴う。代替的に、本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、ｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させるステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び、遺伝的に修正された神経前駆細胞を対象者の脳に移植するステップ、を伴う。
【０００９】
いくつかの実施形態において、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞（urinary  cells）、脂肪細胞、角化細胞（keratinocytes）、歯髄細胞（dental  pulp  cells）、及び他の容易にアクセス可能な体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３  ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む一つ又はそれ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。いくつかの実施形態において、リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング（episomal  reprogramming）又はウイルス形質導入（viral  transduction）を介して実行される。
【００１０】
一つの他の態様において、本開示は、カナバン病を治療するための、ＡＳＰＡ酵素の供給源、並びに、ＷＴ  ＡＳＰＡ発現（WT  ASPA-expressing）オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生じさせるための神経前駆体（neural  precursors）として働く、野生型ＡＳＰＡ発現神経前駆細胞を作製する方法、に関連する。本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させるステップ、を含む。代替的に、本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、ｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む神経前駆細胞に分化させるステップ、並びに、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された前駆細胞を得るために、前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本出願は、カラーで制作された少なくとも一つの図面を包含する。カラーの（複数の）図面を含む本出願の写しは、請求及び必要な手数料の支払いにより、官庁によって提供されるであろう。
【００１２】
【図１】図１は、ＷＴ及びＣＤ患者の線維芽細胞に由来するｉＰＳＣｓの特徴付け（characterization）を説明する。ＣＤ  ｉＰＳＣｓにおけるヒトＥＳＣマーカーの発現。三人の患者、ＣＤ患者１、ＣＤ患者２及びＣＤ患者３に由来するＣＤ  ｉＰＳＣｓは、ヒト多能性因子（human  pluripotency  factors）ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ、並びにヒトＥＳＣ細胞表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８１を発現した。ＩＭＲ９０細胞に由来するＷＴ  ｉＰＳＣｓは、ＷＴ対照として含められた。スケールバー：１００μｍ。
【００１３】
【図２】図２Ａ‐２Ｄは、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓ及びＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓがヒトＥＳＣマーカーを発現することを説明する。図２Ａは、ＷＴ、ＣＤ及びＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓにおける内因性（ｅｎｄｏ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ発現のＲＴ‐ＰＣＲ解析を示す。ＣＤ患者線維芽細胞（ｆｉｂ）は、陰性対照（negative  control）として含められた。アクチンは、ローディング対照（loading  control）として含められた。図２Ｂ及び２Ｃは、ＷＴ、ＣＤ及びＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓにおける外因性（ｅｘｏ）リプログラミング因子のＲＴ‐ＰＣＲ解析を示す。ヒトＥＳＣｓは陰性対照として含められ、個々の因子を発現するプラスミドＤＮＡｓは陽性対照（positive  control）として含められた。図２Ｄは、対照及びＣＤ  ｉＰＳＣの核型を示す。
【００１４】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ‐３Ｆは、ＣＤ  ｉＰＳＣｓにおける変異の特徴付け及びｉＰＳＣｓの多能性の検証を説明する。図３Ａは、ＣＤ  ｉＰＳＣｓが患者固有のＡＳＰＡ変異を包含していたことを示す。図３Ｂは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのｉＰＳＣ多能性の検証を示す。ＣＤ１、ＣＤ２及びＣＤ３  ｉＰＳＣｓは、ＥＢ形成アッセイにおいて、３つの胚葉全て、ＳＯＸ１７陽性内胚葉、ＳＭＡ陽性中胚葉及びＴＵＪ１陽性外胚葉に分化することができた。ＩＭＲ９０細胞に由来するＷＴ  ｉＰＳ細胞は、対照として含められた。
【図３Ｃ−Ｆ】図３Ｃ及び図３Ｄは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのｉＰＳＣ多能性の検証を示す。免疫不全ＮＳＧマウスへの注射の後に、ＣＤ１  ｉＰＳＣｓ（３Ｃ）、並びにＣＤ２  ｉＰＳＣｓ及びＣＤ３  ｉＰＳＣｓ（３Ｄ）は、３つの胚葉の各々に特徴的な組織を包含する奇形腫（teratomas）を形成することができた。スケールバー：図３Ｂ‐３Ｄについては１００μｍ。図３Ｅ及び３Ｆは、親の（parental）ＣＤ１線維芽細胞（ｆｉｂ）及びＣＤ１  ｉＰＳＣｓにおけるＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧプロモーター領域のバイサルファイト配列解析（bisulfite  sequencing  analysis）を示す。白丸及び黒丸は、それぞれ、非メチル化及びメチル化ＣｐＧｓを指し示す。
【００１５】
【図４Ａ−Ｉ】図４Ａ‐４Ｍは、ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓがＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を包含し、多能性因子を発現することを説明する。図４Ａ、４Ｄ及び４Ｇは、ゲノムＤＮＡ配列決定が、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ｉＰＳＣｓにおけるＷＴ  ＡＳＰＡ配列の存在を確認することを示す。図４Ｂ、４Ｅ及び４Ｈは、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ｉＰＳＣｓにおけるヒト多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現を示す。核Ｄａｐｉ染色（Nuclei  Dapi  staining）は、青色で示されている。スケールバー：１００μｍ。図４Ｃ、４Ｆ及び４Ｉは、ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓにおけるヒトＥＳＣ細胞表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８の発現を示す。核Ｄａｐｉ染色は、青色で示されている。
【図４Ｊ−Ｍ】図４Ｊは、ゲノムＤＮＡ配列決定が、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２  ｉＰＳＣｓにおけるＷＴ  ＡＳＰＡ配列の存在を確認することを示す。図４Ｋ及び４Ｌは、ＲＴ‐ＰＣＲ（４Ｋ）及びウエスタンブロット解析（４Ｌ）によって明らかにされた、ＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣｓにおける形質導入されたＡＳＰＡの発現を示す。ＧＡＰＤＨ及びチューブリンは、ローディング対照として含められた。図４Ｍは、生体内でのＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣｓ、ＡＳＰＡ２  ｉＰＳＣｓ及びＡＳＰＡ３  ｉＰＳＣｓの発達的潜在能力（developmental  potential）の検証を示す。免疫不全ＮＳＧマウスへの注射の後に、ＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣｓ、ＡＳＰＡ２  ｉＰＳＣｓ及びＡＳＰＡ３  ｉＰＳＣｓは、３つの胚葉の各々に特徴的な組織を包含する奇形腫を形成することができた。スケールバー：１００μｍ。
【００１６】
【図５】図５Ａ‐５Ｇは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの特徴付けを説明する。図５Ａは、ＷＴ、ＣＤ１及びＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣｓに由来するＮＰＣにおける、ＮＰＣマーカーＰＡＸ６、ＳＯＸ２、ＮＣＡＤ、ＳＯＸ１及びＮＥＳＴＩＮについての免疫染色を示す。核Ｄａｐｉ染色は、青色で示されている。スケールバー：５０μｍ。図５Ｂは、ＲＴ‐ＰＣＲによって明らかにされた、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣにおけるＡＳＰＡ及びＮＰＣマーカーの発現を示す。ＷＴ及びＣＤ１  ＮＰＣｓは、対照として含められた。ＧＡＰＤＨは、ローディング対照として含められた。図５Ｃは、ＲＴ‐ＰＣＲによって明らかにされた、ＷＴ、ＣＤ１及びＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓにおける多能性因子の発現の欠如を示す。ＷＴ  ｉＰＳＣｓ及びＣＤ１線維芽細胞は、それぞれ陽性対照及び陰性対照として含められた。図５Ｄは、ＡＳＰＡ  ＮＰＣｓが、ＣＤ１  ＮＰＣｓに比べて、強い（potent）ＡＳＰＡ酵素活性を発揮したことを示す。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｓ．ｄ．）（ｎ＝５反復）である。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による。図５Ｅ及び５Ｆは、ＯＬＩＧ２及びＮＫＸ２．２を使用した、ＣＤ１  ＮＰＣｓ若しくはＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓに由来するｐｒｅ‐ＯＰＣｓの免疫染色（５Ｅ）、又は、Ｏ４を使用した、ＣＤ１  ＮＰＣｓ若しくはＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓに由来するＯＰＣｓの生体染色（live  staining）（５Ｆ）を示す。スケールバー：５Ｅについては１００μｍ、５Ｆについては５０μｍ。図５Ｇは、ＣＤ１  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓのＦＡＣＳ解析を示す。
【００１７】
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓが生き残り（survived）、ＯＬＩＧ２を発現したことを説明する。図６Ａは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓが新生仔ＣＤマウスに移植されたことを示す。移植の１ヶ月後に、マウスの脳は採取され、ヒト核抗原及びＯＬＩＧ２に対する抗体を用いて免疫染色された。スケールバー：１００μｍ。図６Ｂは、移植の１ヶ月後のロータロッド試験において明らかにされた、ＡＳＰＡ‐ＣＤ１  ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスの運動機能障害を救済したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ.ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【００１８】
【図７】図７Ａ‐７Ｃは、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓがＯＬＩＧ２＋細胞を生じさせたことを説明する。図７Ａは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓが新生仔ＣＤマウスに移植されたことを示す。移植の３ヶ月後に、マウスの脳は採取され、ヒト核抗原（緑色）及びＯＬＩＧ２（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色された。図７Ｂは、移植の３ヶ月後に、マウスの脳が採取され、ヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色されたことを示す。矢印によって指し示されたヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）‐二重陽性細胞の拡大画像は、下方のパネルに示された。図７Ｃは、生着ヒト細胞（engrafted  human  cells）が、ＧＦＡＰ＋（赤）グリア細胞に分化したことを示す。スケールバー：パネルＡについては１００μｍ、パネルＢの上方のパネルについては６３μｍ、下方のパネルについては１０μｍ、パネルＣについては６３μｍ。
【００１９】
【図８】図８Ａ‐８Ｅは、ＣＤマウスにおいてＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓがＮＡＡレベル及び空胞化（vacuolation）を減少させたことを説明する。図８Ａは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣ移植の３ヶ月後のＣＤマウスにおける高められたＡＳＰＡ酵素活性を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝５マウス）である。図８Ｂ及び８Ｃは、ＮＭＲを使用して測定された、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳における低下させられたＮＡＡレベルを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝５マウス）。図８Ｄ及び８Ｅは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳における、減少させられた空胞化を示す。対照ＣＤマウス及びＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスにおける視床、小脳及び脳幹のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色はパネル８Ｄに示され、百分率空胞化の定量化（quantification  of  percent  vacuolation）はパネル８Ｅに示される。スケールバー：１００μｍ。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ.ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、全ての定量化についてスチューデントのｔ検定による。
【００２０】
【図９】図９Ａ‐９Ｅは、ＣＤマウスにおいてＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓが髄鞘形成及び運動機能を改善したことを示す。図９Ａ及び９Ｂは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスにおける救済された髄鞘形成を示す。３月齢の野生型（ＷＴ）マウスの脳において無傷（Intact）で厚い（thick）髄鞘（myelin  sheaths）が検出されたことに対し、同腹仔のＣＤマウスの脳においては分裂した、より薄い髄鞘が見られた。３ヶ月間にわたってＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを移植されたＣＤマウスにおける髄鞘は、より無傷でより厚いように見えた。脳幹領域の画像が示されている。スケールバー：１μｍ。矢印は髄鞘を指し示す。図９Ｃは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスにおける体重減少を救済したことを示す。図９Ｄ及び９Ｅは、ロータロッド（９Ｄ）又はワイヤ懸垂（hanging  wire）（９Ｅ）試験において明らかにされた、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスの運動機能障害を救済したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ.ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、図９Ｂ‐９Ｅについてスチューデントのｔ検定による。
【００２１】
【図１０】図１０Ａ‐１０Ｄは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓが生体外で強いＡＳＰＡ酵素活性を呈したことを説明する。図１０Ａは、免疫染色によって、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓにおけるＮＰＣマーカーＮＥＳＴＩＮ及びＳＯＸ１の発現を示す。核Ｄａｐｉ染色は、合成画像において青色で示されている。スケールバー：１００μｍ。図１０Ｂは、ＲＴ‐ＰＣＲによって明らかにされた、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓにおける多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現の欠如を示す。ＥＳＣｓ及びＣＤ２、ＣＤ３線維芽細胞（Ｆｉｂ）は、それぞれ陽性対照及び陰性対照として含められた。図１０Ｃは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓのＦＡＣＳ解析を示す。図１０Ｄは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓが、ＣＤ２  ＮＰＣｓ及びＣＤ３  ＮＰＣｓに比べて、有意に上昇したＡＳＰＡ酵素活性を発揮したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ.ｅ．）である（ｎ＝６反復）。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【００２２】
【図１１】図１１Ａ‐１１Ｃは、Ａｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−（Ａｓｐａｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−）マウスが、親のＡｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７（Ａｓｐａｎｕｒ７）マウスと同様の病理学的特質を呈したことを実証する。図１１Ａは、Ａｓｐａｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−マウス及び親のＡｓｐａｎｕｒ７マウスの脳における同様のＡＳＰＡ酵素活性を示す。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝５マウス）である。＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。図１１Ｂ及び１１Ｃは、Ａｓｐａｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−マウス及び親のＡｓｐａｎｕｒ７マウスの脳における同様の空胞化を示す。対照ＣＤマウス及びＡＳＰＡ‐ＣＤ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスにおける視床、小脳及び脳幹のヘマトキシリン・エオシン染色は１１Ｂに示され、定量化は１１Ｃに示される。スケールバー：１００μｍ。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。
【００２３】
【図１２】図１２Ａ‐１２Ｂは、ＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓがＯＬＩＧ２＋オリゴデンドログリア系統細胞（oligodendroglial  lineage  cells）及びＭＢＰ＋オリゴデンドロサイトを生じさせたことを実証する。図１２Ａは、生着の３ヶ月後の、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤ脳における全ての生着ヒト細胞からのヒト核抗原（ｈＮｕ）＋及びＯＬＩＧ２＋細胞の百分率の定量化を示す。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、新生仔ＣＤマウスに移植された。移植の３ヶ月後に、マウスの脳は採取され、ヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色された。全てのｈＮｕ＋細胞のうちのｈＮｕ＋及びＯＬＩＧ２＋細胞の百分率が、示されている。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。図１２Ｂは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳におけるヒト核抗原及びＭＢＰに対する共染色を示す、直交図（orthogonal  view）である。スケールバー：１０μｍ。
【００２４】
【図１３】図１３は、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓがＧＦＡＰ＋細胞に分化し得ることを示す。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、新生仔ＣＤマウスに移植された。移植の３ヶ月後に、マウスの脳は採取され、ヒト核抗原（緑色）及びＧＦＡＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色された。スケールバー：６３μｍ。
【００２５】
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、移植されたＣＤマウス脳においてＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓが生き残り、ＯＬＩＧ２及びＧＦＡＰを発現したことを示す。ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓは、新生仔ＣＤマウスに移植された。図１４Ａは、移植の３ヶ月後に、マウスの脳が採取され、ヒト核抗原（緑色）及びＯＬＩＧ２（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色されたことを示す。スケールバー：２５μｍ。  図１４Ｂは、移植の３ヶ月後に、マウスの脳が採取され、ヒト核抗原（緑色）及びＧＦＡＰ（赤色）に対する抗体を用いて免疫染色されたことを示す。スケールバー：５０μｍ。
【００２６】
【図１５】図１５Ａ‐１５Ｇは、ＣＤマウスにおいてＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓが空胞化を減少させ、運動機能を改善したことを示す。図１５Ａは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓを移植されたＣＤマウスが、ヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）について免疫染色されたことを示す。矢印によって指し示されたヒト核抗原（緑色）及びＭＢＰ（赤色）‐二重陽性細胞の拡大画像は、下方のパネルに示された。スケールバー：上方のパネルについては５０μｍ、下方のパネルについては１０μｍ。図１５Ｂは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳におけるヒト核抗原及びＭＢＰに対する共染色を示す、直交図である。スケールバー：１０μｍ。図１５Ｃは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓを用いた移植の３ヶ月後のＣＤマウスの視床、小脳及び脳幹における高められたＡＳＰＡ活性を実証する。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。＊ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による。図１５Ｄ及び１５Ｅは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳における減少させられた空胞化を示す。百分率空胞化の定量化は、１５Ｄに示される。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。対照ＣＤマウス又はＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ若しくはＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓを移植されたＣＤマウスにおける視床、小脳及び脳幹のヘマトキシリン・エオシン染色は、１５Ｅに示される。スケールバー：１００μｍ。図１５Ｆ及び１５Ｇは、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓが、ロータロッド（１５Ｆ）又はワイヤ懸垂（１５Ｇ）試験において、移植されたＣＤマウスの運動機能障害を救済したことを示す。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ.ｅ．）である（ｎ＝６マウス）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による。
【００２７】
【図１６】図１６Ａ‐図１６Ｂは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスの脳内に腫瘍形成がないことを実証する。腫瘍は、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを用いた移植の１０ヶ月後に、ヘマトキシリン・エオシン染色を通じて解析された。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳内に、典型的な腫瘍組織は発見されなかった。スケールバー：１００μｍ。
【００２８】
【図１７】図１７Ａ‐１７Ｂは、移植の３ヶ月後での、ヒト生着細胞（human  engrafted  cells）の低いＫｉ６７指数を示す。図１７Ａは、ＡＳＰＡ‐ＣＤ１  ＮＰＣｓがＣＤマウス脳に移植されたことを示す。移植の３ヶ月後に、生着された脳は、ヒト核抗原（緑色）及びＫｉ６７（赤色）について免疫染色された。スケールバー：５０μｍ。図１７Ｂは、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳における、全てのｈＮｕ＋細胞のうちのヒト核抗原（ｈＮｕ）＋及びＫｉ６７＋細胞の百分率の定量化を示す。エラーバーは、平均値の標準誤差である（ｎ＝６マウス）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の本発明の記述は、単に本発明の様々な実施形態を例示するように意図されている。そのため、論じられる具体的な改変は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく様々な均等物、変更及び改変がなされ得ることが、当業者にとって明らかであろう。また、そのような均等な実施形態が本明細書に含まれることが理解される。
【００３０】
幹細胞技術は、神経障害の治療のために大いに有望である。しかしながら、幹細胞の増殖可能な供給源（expandable  sources）の利用可能性は、幹細胞技術をベッドサイドに移行させる上で決定的に重要な問題である。成人のヒト線維芽細胞をリプログラミングすることによって引き出されたヒトｉＰＳＣｓは、個々の患者からの特定の体細胞型及び組織の生成（generation）のための、継続的且つ自己由来のドナー供給源を提供し得る１−４。患者固有の（Patient-specific）ｉＰＳＣｓは、そうでなければ利用可能でないであろう、疾患細胞型の無限の貯蔵庫を提供し得る。さらに、患者固有のｉＰＳＣｓは特定の個人に合わせられており、従って免疫拒絶反応の可能性を減少させ得る。そのうえ、最近の研究は、野生型（ＷＴ）遺伝子のウイルス形質導入又は部位特異的な遺伝子編集によって、マウス及びヒトの両方から遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを生じさせることの実現可能性を実証している。これらのｉＰＳＣｓは、細胞療法（cell  therapy）のため及び疾患メカニズムを研究するために、興奮させるような展望を提供し得る。
【００３１】
遺伝子療法の細胞療法との組み合わせは、様々な遺伝性障害に対してとてつもない希望を提供する。患者固有のｉＰＳＣｓの遺伝子療法との治療的組み合わせは、生体外で遺伝子欠損を修正する機会を提供し、次いでこれらの遺伝的に修復された（genetically-repaired）ｉＰＳＣｓは、遺伝子修正が正確であることを確かにするために適切に特徴付けられてもよく、それにより、ランダムな遺伝子挿入のような、直接的な遺伝子療法と関連する安全性への懸念を低減する５，６。
【００３２】
ｉＰＳＣ技術の画期的な開発以来、神経変性疾患の患者からｉＰＳＣｓを生じさせることにかなりの関心が喚起されている。これらの患者固有のｉＰＳＣｓは、疾患モデリング、創薬及び細胞置換（補充）療法（cell  replacement  therapy）のために多くの機会を提供する。他方では、多能性幹細胞を異なる複数の神経系統に分化させる方法を開発及び最適化するために、広範囲にわたる努力がなされてきた。これらの方法は、細胞置換療法のために遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓからの神経細胞型の生成を可能にする。
【００３３】
脱髄疾患は、髄鞘再生（再ミエリン化）（remyelination）が単一細胞型を用いて達成されることができ、移植されたミエリン形成性細胞（myelinogenic  cells）は複雑な神経回路網に統合する必要がないため、中枢神経系障害の細胞ベースの治療に関する特に有望な標的として際立っている７。実際に、げっ歯類及びヒトの多能性幹細胞派生株（derivatives）のミエリン形成能（myelinogenic  potential）は、様々な動物モデルにおいて詳細に記録されている８‐１４。動物モデルにおいて観察され得る広範な髄鞘形成は、細胞治療が髄鞘形成不全及び脱髄の疾患における潜在的な治療的手法を提供するという考えを支持する。
【００３４】
本明細書において開示されるように、ｉＰＳＣベースの細胞療法手法は、野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する、遺伝的に修正された患者ｉＰＳＣｓ（ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓ）を生じさせるために、遺伝子療法手法と組み合わされる。続いて、ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓは、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞、オリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させられ、それらの治療的な潜在能力は免疫不全カナバン病マウスモデルにおいて評価される。
【００３５】
したがって、本明細書において開示されているのは、対象者のカナバン病を治療する方法である。本方法は、ＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を発現する遺伝的に修正された患者ｉＰＳＣｓを開発するために、患者固有のｉＰＳＣｓを遺伝子療法と組み合わせる。ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓは、ＮＰＣｓに分化した。代替的に、遺伝子修正は、神経前駆細胞レベルで起こってもよく、すなわち、遺伝的に修正された神経前駆細胞を生じさせるために、患者に由来するリプログラムされたｉＰＳＣｓが神経前駆細胞に分化させられ、次いで野生型ＡＳＰＡ遺伝子が神経前駆細胞に導入される。ＣＤ疾患表現型を緩和するこれらの神経前駆体の能力は、実施例において実証されるように、ＣＤマウスモデルにおいて試験された。また、ＣＤに対する治療上の候補（therapeutic  candidate）として働く、遺伝的に修正された患者ｉＰＳＣｓに由来する神経前駆細胞についての前臨床の効能（preclinical  efficacy）は、実施例において実証される。
【００３６】
ＣＤはＡＳＰＡ遺伝子の遺伝子変異によって引き起こされるので、ＣＤ患者のｉＰＳＣｓ又は神経前駆細胞は、レンチウイルス形質導入を通じてＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を導入することによって遺伝的に修正される。結果として生じるＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓは、神経前駆細胞に分化させられる。検出可能なＡＳＰＡ活性をほとんど呈しないＣＤ  ｉＰＳＣ由来のＣＤ  ＮＰＣｓとは対照的に、ＡＳＰＡ神経前駆細胞は強いＡＳＰＡ活性を呈する。ＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＡＳＰＡ活性の喪失、高められたＮＡＡレベル及び様々な脳領域における広範囲にわたる海綿変性を含むＣＤの主要な病理学的表現型を呈する、ＣＤマウスモデルに移植される。移植されたＡＳＰＡ神経前駆細胞は、移植後に生き残り、オリゴデンドログリア系統細胞に分化することができる。そのうえ、移植された細胞は、強いＡＳＰＡ酵素活性を呈し、移植されたＣＤマウスの脳内のＮＡＡレベル及び海綿変性を減少させることができる。ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞の移植はまた、ＣＤマウスの体重減少及び行動障害を救済し得る。重要なことに、移植されたマウスにおいて腫瘍発生又は他の有害作用は観察されない。これらの結果は、ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞がＣＤに対する潜在的な細胞置換治療上の候補として働き得ることを示す。
【００３７】
ＣＤに対する治癒法は存在せず、ＣＤに対する治療は対症療法のみである。細胞療法の適用は、それが広い治療的影響を有し得るので、大きな勢いを得ている。生着細胞は、欠けている酵素の持続的な供給源として働くだけでなく、宿主において喪失された細胞の置換を提供し得る。本明細書において開示されるように、神経前駆細胞は、ＣＤにおいて失われたオリゴデンドログリア系統細胞に分化する能力を有するので、ｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞はＣＤに対する細胞療法候補となり得る。具体的には、遺伝的に修正された、ＷＴ  ＡＳＰＡ発現ＣＤ  ｉＰＳＣｓに由来する神経前駆細胞が使用されてもよい。なぜなら、ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞は失われたオリゴデンドログリア系統細胞に置き換わるだけでなく、欠けているＡＳＰＡ酵素を再構成することができるからである。細胞療法をヒトに移行させるための主な妨げは、患者への移植のために十分な細胞を入手することである。ｉＰＳＣｓは、それらの容易なアクセス可能性及び広範囲にわたる増殖可能性（extensive  expandability）のために、そうでなければ細胞置換療法のために得ることが可能でない、細胞の無限の供給源を提供し得る。そのうえ、患者固有のｉＰＳＣは、同種異系の（allogeneic）細胞移植と関連する免疫原性を回避し得る、自己由来の細胞の供給源を提供することができ、従って、細胞置換療法を使用するヒト疾患の治療のための選択肢を提供する。
【００３８】
ｉＰＳＣｓの分化させられた産物は、奇形腫を形成することが示されていない。潜在的な奇形腫の発達と関連する安全性への懸念に対処するために、最終的なｉＰＳＣ由来の製品が未分化細胞を含まないことを確かめることが重要である。本明細書において開示される方法は、非常に高い効率でヒトｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させる。実施例において実証されるように、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓのＦＡＣＳ解析は、９８％を超える細胞が、ヒトＮＰＣｓの細胞表面マーカーであるＣＤ１３３に対して陽性であることを示した。対照的に、０．０５４％の細胞のみが、ヒトＥＳＣ表面マーカーであるＳＳＥＡ４に対して陽性である。ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓについては、高率のＣＤ１３３陽性細胞も検出された。そのうえ、多能性幹細胞の混入がないことを確かにするために、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣ移植のために、ＣＤ１３３についての正の選択及びＳＳＥＡ４についての負の選択の両方を通じて選別された細胞が使用された。
【００３９】
遺伝子療法は、ＣＤに対する有望な臨床的な選択肢である。前臨床及び臨床の遺伝子療法研究の両方が、野生型ヒトＡＳＰＡ遺伝子をＣＤ動物モデル又はＣＤ患者に送達することによって行われており、進歩を助長することがなされてきた１６‐２２。しかしながら、おそらく瀕死の（dying）オリゴデンドロサイトは遺伝子療法によって置き換えられ得ないため、病理学的特質の部分的な寛解のみが達成されている。オリゴデンドロサイトの前駆体へのＷＴ  ＡＳＰＡの標的化送達は、おそらくＷＴ  ＡＳＰＡがオリゴデンドログリア系統細胞において再構成されたため、改善された成果につながり、ＣＤに対する治療的デザインにおいてオリゴデンドロサイトを標的とすることの重要性を支持する。それにもかかわらず、遺伝子療法だけでは、失われた宿主細胞を置き換える能力を持たず、疾患の進行を妨げ、快復を促進することを助け得る潜在的な栄養的支持（trophic  supports）を提供し得ない。遺伝子療法の他に、最近の研究は、ＮＡＡシンターゼＮａｔ８Ｌ（Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ‐８様）遺伝子をノックアウトすることは、それらのＮＡＡを生成する能力を消失させることによって、ＡＳＰＡｎｕｒ７／ｎｕｒ７マウスがＣＤのある一定の病理学的態様を発達させることを妨げることを実証した。
【００４０】
ＣＤは脳のＡＳＰＡ酵素及びオリゴデンドロサイトの両方に欠乏（deficiency）を有するので、ＣＤの治療のための理想的な戦略は、組み合わされた細胞療法及び遺伝子治療を使用して、脳のＡＳＰＡ活性を回復させ、瀕死のオリゴデンドロサイトを置き換えることであろう。回復させられたＡＳＰＡ活性は、今度はＮＡＡレベルを低下させ得る。ＷＴヒトＡＳＰＡ遺伝子を発現し、ＯＰＣｓ及びオリゴデンドロサイトに分化する能力を所持するＮＰＣｓの移植は、欠けているＡＳＰＡ酵素及び失われたオリゴデンドログリア系統細胞の両方を再構成することによって、ＣＤに対する魅力的な治療的手法を提供する。実際に、ＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を用いて形質導入されたマウス神経前駆細胞は、生き残り、オリゴデンドロサイトに分化することができ、ＣＤマウスの脳の中への移植の後に、検出可能なＡＳＰＡ活性を呈した４１。このことは、神経前駆細胞がＣＤに対する細胞療法の潜在的な供給源として使用され得ることを示唆している。しかしながら、この以前の研究はマウス細胞を使用しており、これは臨床的に適用可能ではない４１。そのうえ、おそらくレトロウイルスベクターからの短期間の生体内の遺伝子発現のために、上昇したＡＳＰＡ酵素活性は移植後３週間で検出されたのみであり、ＡＳＰＡ活性は移植後５週間で検出不能になった４１。さらに、ＣＤの病理学的表現型に対する移植されたマウスＮＰＣｓの効果は、以前の研究では研究されなかった４１。実施形態において詳述されるように、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓは、ＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を発現するレンチウイルスを用いてＣＤ  ｉＰＳＣｓに形質導入することによって、遺伝的に修正されたヒトＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓを生じさせるために、遺伝子療法手法と組み合わされる。これらのｉＰＳＣｓは、続いてＡＳＰＡ神経前駆細胞に分化させられる。代替的に、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓが神経前駆細胞に分化させられ、次いでＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子が神経前駆細胞に導入される。結果として生じるＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＡＳＰＡ酵素の供給源として、そしてＷＴ  ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生じさせるための神経前駆細胞として働いた。移植の３ヶ月後でさえ、移植されたＣＤマウス脳における強健な（robust）ＡＳＰＡ酵素活性が検出された。より重要なことには、実質的に高められたＡＳＰＡ活性、低下させられたＮＡＡレベル及び空胞形成、増加させられた髄鞘形成、増加した体重並びに改善された運動機能を含む、ＣＤマウスにおける主な病理学的表現型及び行動障害の実質的な救済が検出された。したがって、これらの患者固有の且つ遺伝的に修正されたＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＣＤ患者にとって一つの理想的な細胞置換療法として働く。
【００４１】
カナバン病に対する既存の療法は、ある程度まで機能回復の改善をもたらした；しかしながら、本疾患と関連する病理学的特質の完全な修正を結果としてもたらしたものはない。本明細書において開示される方法は、細胞療法を遺伝子療法と組み合わせて酵素補充及び細胞置換を提供することによって、はるかに改善された臨床的な成果を呈する、カナバン病に対する新規療法を提供する。
【００４２】
本明細書に開示されるようなＣＤの免疫学的に欠陥のあるマウスのモデルの使用は、免疫拒絶反応なしにヒト神経前駆細胞の移植を可能にした。ＷＴとＡＳＰＡのＣＤ変異体との間には、最小限のアミノ酸の違いしかない。ＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを使用したＣＤに対する遺伝子療法の臨床試験において、ＣＤ患者に長期の有害事象は観察されなかった。したがって、追加的な利点は、ＡＳＰＡ‐ＣＤ神経前駆細胞におけるＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子の発現から免疫拒絶反応が結果としてもたらされないことである。
【００４３】
一つの態様において、本開示は、対象者のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、対象者の脳において外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させることによって対象者のＡＳＰＡ酵素活性を回復させることを伴う。いくつかの実施形態において、ＡＳＰＡ酵素活性は、対象者の脳にＡＳＰＡ神経前駆細胞を移植することによって回復させられる。これらのＡＳＰＡ神経前駆細胞は、ＡＳＰＡ酵素の供給源として、並びにＷＴ  ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生じさせるための神経前駆細胞として働く。本開示において詳述されるように、ＡＳＰＡ神経前駆細胞は、患者固有のｉＰＳＣｓに由来してもよい。例えば、本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させるステップ、を更に含む。代替的に、本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、ｉＰＳＣｓを、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む、神経前駆細胞に分化させるステップ、並びに、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、を更に含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、及び他の容易にアクセス可能な体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３  ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む一つ又はそれ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。いくつかの実施形態において、リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して実行される。患者の体細胞をｉＰＳＣｓに転換するためのリプログラミング技術を選択することは、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態において、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いてリプログラムされたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、リプログラムされたｉＰＳＣｓに導入される。形質導入後に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させるための適切なベクター及びプロモーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態において、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のような）遺伝子編集技術によって、導入される。
【００４５】
一つの他の態様において、本開示は、対象者のカナバン病を治療する方法に関連する。本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び、神経前駆細胞を対象者の脳に移植するステップ、を伴う。いくつかの実施形態において、本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び、遺伝的に修正された神経前駆細胞を対象者の脳に移植するステップ、を伴う。
【００４６】
いくつかの実施形態において、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、及び他の容易にアクセス可能な体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３  ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む一つ又はそれ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して実行される。患者の体細胞をｉＰＳＣｓに転換するためのリプログラミング技術を選択することは、当業者の知識の範囲内である。患者の体細胞から転換されたｉＰＳＣｓは、ＡＳＰＡタンパク質に一つ又はそれ以上の変異を包含する。例えば、カナバン病を患っている一部の患者は、それぞれ９１４Ｃ＞Ａ、８５４Ａ＞Ｃ及び５２７Ｇ＞Ａのコドン変化から結果として生じる、Ａ３０５Ｅ、Ｅ２８５Ａ又はＧ１７６Ｅ変異のように、ＡＳＰＡタンパク質に一つ又はそれ以上の変異を保持している。一部のカナバン病患者は、ＡＳＰＡタンパク質の異なる領域に他の変異を保持しているかも知れない。野生型ＡＳＰＡ遺伝子を患者ｉＰＳＣｓに導入すると、これらのｉＰＳＣｓは、外因性の野生型ＡＳＰＡタンパク質を発現し、ＡＳＰＡ酵素活性を呈するように遺伝的に修正される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いてリプログラムされたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、リプログラムされたｉＰＳＣｓに導入される。形質導入後に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させるための適切なベクター及びプロモーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。例えば、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むレンチウイルスを用いて患者ｉＰＳＣｓに形質導入することによって、導入されてもよい。カナバン病患者ｉＰＳＣｓにおけるＡＳＰＡ遺伝子変異はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術のような、遺伝子編集技術によって修正されてもよい。遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓは生体外で神経前駆細胞に分化させられ、それもまた野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する。カナバン病を患っている対象者の脳にこれらのＡＳＰＡ  ＮＰＣｓを移植した後に、ＡＳＰＡ神経前駆細胞が生体内でオリゴデンドログリア系統細胞に分化し、それにより正常なＡＳＰＡ酵素活性を回復させることによって疾患を治療してもよい。いくつかの実施形態において、遺伝的修正は、神経前駆細胞レベルで同様に起こる。ＣＤ患者ｉＰＳＣｓが神経前駆細胞に分化させられ、次いで野生型ＡＳＰＡ遺伝子が、当技術分野において既知の技術である、形質導入又は遺伝子編集によって神経前駆細胞に導入される。
【００４９】
一つの他の態様において、本開示は、カナバン病を治療するために、ＡＳＰＡ酵素の供給源並びにＷＴ  ＡＳＰＡ発現オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣｓ）及びオリゴデンドロサイトを生じさせるための神経前駆細胞として働く、ＡＳＰＡ神経前駆細胞を作製する（producing）方法に関連する。ＡＳＰＡ神経前駆細胞は、患者固有のｉＰＳＣｓに由来する。本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、を含む。代替的に、本方法は、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、を含む。
【００５０】
一つの関連する態様において、本開示は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現する神経前駆細胞であって、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを得るために、リプログラム又は転換されたｉＰＳＣｓに野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、及び、遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、を含むプロセスによって作製された神経前駆細胞、に関連する。代替的に、プロセスは、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞を、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）にリプログラム又は転換するステップ、ｉＰＳＣｓを神経前駆細胞に分化させるステップ、及び、野生型ＡＳＰＡを発現する遺伝的に修正された神経前駆細胞を得るために、神経前駆細胞に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を導入するステップ、を含む。本明細書において使用される場合、神経前駆細胞は、ＮＰＣｓ、グリア前駆細胞及びオリゴデンドログリア前駆細胞を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態において、体細胞は、線維芽細胞、血球、泌尿器細胞、脂肪細胞、角化細胞、歯髄細胞、及び他の容易にアクセス可能な体細胞を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、カナバン病を患っている対象者から分離された体細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ｐ５３  ｓｈＲＮＡ、並びに（ｃ‐ＭＹＣ及びＬ‐ＭＹＣのような）ＭＹＣを含む一つ又はそれ以上のリプログラミング因子の存在下でｉＰＳＣｓに転換される。いくつかの実施形態において、リプログラムするステップは、エピソーマルなリプログラミング又はウイルス形質導入を介して実行される。患者の体細胞をｉＰＳＣｓに転換するためのリプログラミング技術を選択することは、当業者の知識の範囲内である。いくつかの実施形態において、野生型ＡＳＰＡ遺伝子は、外因性の野生型ＡＳＰＡ遺伝子を含むベクターを用いてリプログラムされたｉＰＳＣｓに形質導入することによって、又は遺伝子編集技術によって、リプログラムされたｉＰＳＣｓに導入される。形質導入後に野生型ＡＳＰＡ遺伝子を発現させるための適切なベクター及びプロモーターを選択することは、当業者の知識の範囲内である。
【００５２】
状態に関して本明細書において使用される場合、用語“治療する（ｔｒｅａｔ）”、“治療すること”及び“治療”は、その状態を予防すること、その状態の発症又は進展の速度を遅くすること、その状態が進展するリスクを低減すること、その状態と関連する症状の進展を予防又は遅延させること、その状態と関連する症状を軽減又は終了させること、その状態の完全又は部分的な回帰を生じさせること、又はいつくかのそれらの組み合わせを指す。いくつかの実施形態において、状態を治療することは、状態が再発することなく治癒することを意味する。
【００５３】
用語“対象者”及び“患者”は、本開示において互換的に使用される。いくつかの実施形態において、対象者又は患者はカナバン病を患っている。いくつかの実施形態において、対象者又は患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、対象者又は患者はヒトである。
【００５４】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を更に説明する。実施例が本発明の範囲を限定することは決してない。
【実施例１】
【００５５】
材料及び方法
［ｉＰＳＣｓ生成］  エピソーマルなｉＰＳＣ誘導（episomal  iPSC  derivation）のために、ＩＭＲ９０線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、Ｉ９０‐１０）及びＣＤ患者線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＧＭ０４２６８）は、記載されているように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ‐Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８及びｐ５３  ｓｈＲＮＡを発現するエピソーマルベクターを使用してリプログラムされた３２。簡単に言えば、５×１０５個の線維芽細胞は、１．２５μｇの各エピソーマルベクターを用いて電気穿孔され（electroporated）、この日が０日目と呼ばれた。トランスフェクトされた細胞は、線維芽細胞培地（ＮＥＡＡを含むＭＥＭ、１５％非熱失活ウシ胎仔血清）中で培養され、培地は一日おきに交換された。細胞は５日目に解離させられ（dissociated）、６日目にＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｅ８）培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１５１６９−０１）に切り替えられた。ｉＰＳＣクローンは２０日目前後にピックされ、Ｅ８培地中で増殖させられた（expanded）。ウイルス性のｉＰＳＣ誘導のために、ＩＭＲ９０線維芽細胞又はＣＤ患者線維芽細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ、ＧＭ０００５９、ＧＭ０００６０及びＧＭ０４２６８）は、線維芽細胞培地中、ウェルあたり１×１０５細胞で６ウェルプレート上に播種された。翌日、ｉＰＳＣｓは、記載されているように、新たに調製されたＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃのウイルスを用いて形質導入され１、この日が０日目と呼ばれた。ウイルス形質導入の第２ラウンドは、１日目に実行された。５日目に、細胞は解離させられ、１から５で分けられた（split  at  1  to  5）。６日目に、細胞はＥ８培地に切り替えられ、その後培地は毎日交換された。ｉＰＳＣクローンは２０日目前後にピックされ、Ｅ８培地中で増殖させられた。
【００５６】
［胚様体（ＥＢ）形成］  ＥＢｓを形成するために、ｉＰＳＣｓは、０．０５ｍＭのＥＤＴＡを使用して小さなクラスターに解離させられ、Ｔ２５フラスコ中のＥ８培地に移された。Ｅ８培地中で２日間培養した後に、ＥＢ球（EB  spheres）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ノックアウト血清、１ｍＭ  Ｌ−グルタミンを包含するがｂＦＧＦを含まないヒトＥＳＣ培地に切り替えられた。２週間後に、ＥＢｓは、ゼラチンコートされた１２ウェルプレート上にプレーティングされ、免疫染色解析の前に更に２週間培養された。
【００５７】
［奇形腫形成］  ｉＰＳＣｓは、ＰＢＳで１から２倍希釈したａｃｃｕｔａｓｅを用いて解離させられ、Ｅ８培地とＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１）の氷冷混合液に１×１０７細胞／ｍｌの密度で再懸濁された。１００μｌの細胞懸濁液（１×１０６細胞）は、免疫不全Ｎｏｄ  Ｓｃｉｄ  Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスの背側腹部に皮下注射された。注射後８から１２週間に、奇形腫は解剖され、ホルマリンで固定された。固定された組織は、パラフィンに包埋され、切片にされてヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色された。
【００５８】
［ＡＳＰＡウイルス調製及び形質導入］  ＡＳＰＡ発現ウイルス（ASPA-expressing  virus）を作るために、鋳型としてヒトＡＳＰＡ  ｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ、ＭＧＣ‐３４５１７）を使用してヒトＡＳＰＡコード配列がＰＣＲ増幅され、ＰＣＲ産物は、ｐＳＩＮ‐ＥＦ２‐Ｓｏｘ２‐ｐｕｒからＳｏｘ２を除去する（Ａｄｄｇｅｎｅ、＃１６５７７）ことによって生成された、レンチウイルスベクターｐＳＩＮ‐ＥＦ２‐ｐｕｒにクローン化された（cloned）。ＡＳＰＡ発現ウイルスをパッケージするために、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、１５μｇのｐＳＩＮ‐ＥＦ２‐ｈＡＳＰＡ‐ｐｕｒ、５μｇのＶＳＶ‐Ｇ、５μｇのＲＥＶ及び１５μｇのＭＤＬがＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８から７２時間後に、ウイルスを含有する培地は採取され、０．４５μｍフィルターを通して濾過された。ウイルス形質導入のために、新たに採取されたＡＳＰＡ発現ウイルスがＣＤ  ｉＰＳＣｓに加えられた。ウイルス形質導入の２日後に、ピューロマイシン選択が開始され、７日間続けられた。選択されたＡＳＰＡ‐ｉＰＳＣクローンは、増殖させられ、特徴付けられた。
【００５９】
［ＡＳＰＡゲノムＤＮＡのエクソン配列決定］  ゲノムＤＮＡｓはＣＤ  ｉＰＳＣｓから抽出された。各エクソンを配列決定するために使用されたプライマーは、以下の表１に列挙されている。
【表１】
2019518775.tif 000002
【００６０】
［ヒトｉＰＳＣｓの神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）への分化］  ＮＰＣｓは、確立されたプロトコルに従ってヒトｉＰＳＣｓから得られた３３。神経誘導（neural  induction）を開始するために、ヒトｉＰＳＣｓは、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて解離させられ、Ｅ８培地中２０％の集密度でマトリゲルコートされたプレート上に継代された。２４時間後、細胞は、５０％Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１３３０‐０３２）、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１１０３‐０４９）、Ｎ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７５０２‐０４８）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１２５８７‐０１０）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３５０５０‐０６１）、４μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｄ＆Ｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＤＣ９７０３）、３μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｒ＆Ｄ、１６１４）及び２μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５４９９）を含有する、神経誘導培地１（Neural  Induction  Medium  １）（ＮＩＭ‐１）に切り替えられた。細胞はＮＩＭ‐１で２日間処理され、次いで、更に５日間、５０％Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１×Ｎ２、１×Ｂ２７、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、４μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ  ＳＢ４３１５４２及びＬＤＮ‐１９３１８９（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４‐００７４）を含有する、神経誘導培地２（ＮＩＭ‐２）に切り替えられた。次いで細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ａ６９６４）を用いて解離させられ、５０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ、１×Ｎ２、１×Ｂ２７、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、２μＭ  ＳＢ４３１５４２、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ及び２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦを含有する、神経幹細胞維持培地（Neural  Stem  cell  Maintenance  Medium）（ＮＳＭＭ）中で維持された。最初の６継代については、ＮＰＣｓは、解離させられるときに１０μＭ  ＲＯＣＫ阻害剤で処理された。ＮＰＣｓは、１４継代以内に新生仔マウスに移植された。
【００６１】
［ｉＰＳＣ由来のＮＰＣｓのオリゴデンドロサイトへの分化］  生体外でｉＰＳＣ由来のＮＰＣｓをオリゴデンドロサイトに分化させるために、ＮＰＣｓは、ＮＳＭＭ培地（上記参照）から、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬ  インシュリン、０．１μＭ  ＲＡ及び１μＭ  ＳＡＧを含有する神経誘導培地３（ＮＩＭ‐３）に切り替えられ、毎日培地を交換しながら、ＮＩＭ‐３培地中で４日間培養された。次に細胞は解離させられ、ＮＩＭ‐３に再懸濁され、ＮＩＭ‐３中で８日間培養された。その後、細胞は、次の１０日間、２日毎に培地を交換しながら、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬ  インシュリン（Ｓｉｇｍａ、１９２７８）、５ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９４‐ＨＧ‐０２５）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ‐ＡＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２２１‐ＡＡ‐０５０）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ‐１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２９１‐Ｇ１‐２００）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＮＴ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＦ０３１）、６０ｎｇ／ｍＬ  Ｔ３（Ｓｉｇｍａ、Ｔ２８７７）、１００ｎｇ／ｍＬ  ビオチン（Ｓｉｇｍａ、４６３９）及び１μＭ  ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ０２６０）を含有する、ＰＤＧＦ培地に切り替えられた。次いで細胞は、マトリゲルコートされた６ウェルプレート上に付着させられ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１×Ｎ２、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、２５μｇ／ｍＬ  インシュリン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ４０３４）、６０ｎｇ／ｍＬ  Ｔ３、１００ｎｇ／ｍＬ  ビオチン、１μＭ  ｃＡＭＰ及び２５μｇ／ｍＬ  アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ、Ａ４４０３）を含有するグリア培地中で、４５日間又はそれ以上培養した。
【００６２】
［免疫不全ＣＤマウスの生成及び維持］  全ての動物飼育条件及び外科的処置は、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅの機関内の動物飼育及び使用委員会によって承認され、それに従って実行された。ＡＳＰＡｎｕｒ７／＋（ＡＳＰＡｎｕｒ７／Ｊ、００８６０７）及びＲａｇ２−／−マウス（Ｂ６（Ｃｇ）‐Ｒａｇ２ｔｍ１．１Ｃｇｎ／Ｊ、００８４４９）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入された。ＡＳＰＡｎｕｒ７／＋マウスは、Ｒａｇ２−／−マウスと４世代戻し交配され、ＡＳＰＡｎｕｒ７／ｎｕｒ７及びＲａｇ２−／−変異のホモ接合性についてスクリーニングされた。
【００６３】
［定位的な移植］  新生仔マウス（Ｐ２‐Ｐ４）は、氷上で４分間麻酔され、次いで定位固定装置上に置かれた。細胞懸濁液は、３３ゲージ針付きハミルトンシリンジを使用して新生仔マウス脳に注射された。公開された研究４２から修正された以下の座標（coordinates）が、移植のために使用された。視床：（−０．５，１，−２．５）、小脳：（−２．０，０．８，−２．５）、及び脳幹（−２．０，０．８，−３．２）。全ての座標は、ラムダを参照して（Ａ，Ｌ，Ｖ）である。それぞれ、Ａは正中線からの前後を表し、Ｌは正中線からの横側を表し、Ｖは脳の表面からの腹側（ventral）を表す。１４継代以内のＮＰＣｓは、１部位あたり２００，０００細胞、２μＬ及びマウスあたり６部位で、視床、並びに小脳白質及び脳幹に両側的に（bilaterally）移植された。
【００６４】
［ＡＳＰＡ酵素活性アッセイ］  ＡＳＰＡ酵素アッセイは、公開されたプロトコルに基づいて開発された４３。４０マイクロリットルの細胞溶解物又は脳組織タンパク質上清は、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，ｐＨ８．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５％非イオン性界面活性剤、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＮＡＡ（Ｓｉｇｍａ、００９２０）を含有する、１０μｌのアッセイ緩衝液に加えられた。反応混合物は３７℃で９０分間インキュベートされ、次いでチューブを沸騰水中で３分間インキュベートすることにより反応は停止された。反応ブランクは、タンパク質ホモジネートの代わりに４０μｌのＨ２Ｏを加えることによって作られた。反応混合物は、沈殿物を除去するために１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。上清は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ，ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  α‐ケトグルタル酸、０．１５ｍＭ  β‐ＮＡＤＨ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ並びに各１０単位のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ及びグルタミン酸‐オキサロ酢酸トランスアミナーゼを含有する、酵素アッセイ緩衝液に加えられた。反応物は、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートされた。上清は、透明な９６ウェル平底プレートに移され、プレートリーダーを使用して３４０ｎｍで吸光度が測定された。
【００６５】
［ＮＡＡレベル測定］  水性の代謝産物（Aqueous  metabolites）は、記載されているように、過塩素酸（ＰＣＡ、Ｓｉｇｍａ、２４４２５３）の方法を使用して、指示されたマウスの視床、脳幹及び小脳から抽出された４４。簡単に言えば、組織は、迅速に小片に切り刻み、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに集められた。５ｍｌ／ｇ（湿重量基準）の６％氷冷ＰＣＡが各チューブに加えられ、続いて３０秒間ボルテックスし、更に１０分間氷上でサンプルをインキュベートした。混合物は、４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離された。ＰＣＡ上清は、新しいチューブに移され、２Ｍ  Ｋ２ＣＯ３を用いて中和され、ＣＯ２を逃がすために蓋を開けて氷上に置かれた。各試料は、ボルテックスされ、過塩素酸カリウム塩を沈殿させるために氷上で３０分間インキュベートされた。上清ｐＨは７．４±０．２に調整され、次いで４℃、１２，０００ｇで１０分間遠心分離された。上清はエッペンドルフチューブに移され、ドライアイス上で凍らされた。次いで試料は、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  ＨｏｐｅのＮＭＲコア施設においてＮＭＲ解析を受けた。
【００６６】
［電子顕微鏡法（ＥＭ）］  マウスは、イソフルランを用いて深く麻酔され、３７℃で、０．９％食塩水、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及び２．５％グルタルアルデヒドを含有する０．１Ｍ  ミロニヒ緩衝液（Millonig’s  buffer）を用いて灌流された。脳組織は解剖され、同じ固定液（fixative）中で一晩、後固定された。Ｍａｒｋ  Ｅｌｌｉｓｍａｎ博士のグループによって開発された重金属染色プロトコル４５に従った。標的組織は、Ｌｅｉｃａ  ＶＴ  １０００Ｓビブラトームを使用して約１５０μｍ（〜１５０μｍ）のビブラトーム切片に切られた。次いでビブラトーム切片は、２．５％グルタルアルデヒド及び２ｍＭ  塩化カルシウムを含有する、０．１５Ｍ  カコジル酸緩衝液，ｐＨ７．４中で一晩固定された。翌日、組織切片は、２ｍＭ  塩化カルシウムを含有する０．１５Ｍ  カコジル酸緩衝液，ｐＨ７．４中で５×３分間洗浄され、次いで１．５％フェロシアン化カリウム、２％水性四酸化オスミウム（aqueous  osmium  tetroxide）及び２ｍＭ  塩化カルシウムを含有する０．１５Ｍカコジル酸緩衝液，ｐＨ７．４中で１時間固定された。次いで試料は、１％チオカルボヒドラジド（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）中に２０分間置かれ、続いて２％四酸化オスミウム中で３０分間固定した。次いで試料は、４℃で１％水性酢酸ウラニル水溶液中に一晩置かれた。水を用いて５×３分間洗浄した後に、試料は、ウォルトンのアスパラギン酸鉛（Walton’s  lead  aspartate）を用いて、６０℃のオーブン内で３０分間、まとめて（en  bloc）染色された。更に５×３分間水中ですすいだ後に、試料は脱水され、Ｄｕｒｃｕｐａｎ  ＡＣＭ樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に包埋された。７０ｎｍ厚の超薄切片は、ダイヤモンドナイフを備えたＬｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＵＣＴウルトラミクロトームを使用して切られ、２００メッシュの銅ＥＭグリッド上にピックアップされた。透過型電子顕微鏡法は、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  ＨｏｐｅのＥＭコア施設において、Ｇａｔａｎ  Ｕｌｔｒａｓｃａｎ  ２Ｋ  ＣＣＤカメラを備えたＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  １２透過型電子顕微鏡によって実施された。
【００６７】
［ロータロッド試験］  マウスの運動能力は、記載されているように、マウスをロータロッドトレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって試験された３４。指示された細胞を用いて移植された１ヶ月齢又は３ヶ月齢のＡｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７Ｒａｇ２−／−マウス（ＣＤマウス）が、評価された。マウスは、５分間の試行期間中にロッドが加速する速度（５‐６５ｒｐｍ）で回転していた場合のロッド上の潜時について試験された。各マウスは、試験あたり３回、潜時についてモニターされた。
【００６８】
［ワイヤ懸垂試験］  肢の強さは、記載されているように、四肢の“ワイヤ懸垂”手法を通じて、神経筋機能の指標として評価された４６。１０ｃｍ×１５．５ｃｍのフィールドを形成するようにテープがワイヤケージの蓋に設けられ、フィールド中にマウスが置かれた。マウスがワイヤを強く握った後に、蓋は静かに逆さまに回され、クッションを備えた地面の上、およそ２０ｃｍに保持された。マウスが落下するまでの潜時が測定された。野生型マウスは通常、少なくとも６０秒間蓋を握ることができ、従って６０秒がカットオフ潜時として設定された。神経筋の不能は、蓋からの早過ぎる落下を結果としてもたらすであろう。
【００６９】
［ＲＮＡ調製及びＲＴ‐ＰＣＲ解析］  全ＲＮＡは、ＴＲＩａｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６０１８）を使用して、細胞から抽出された。逆転写は、Ｔｅｔｒｏ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、ＢＩＯ‐６５０４３）を使用して、１μｇのＲＮＡを用いて実行された。ＰＣＲのために使用されたプライマーは、表２に列挙されている。
表２  プライマーの配列
【表２】
2019518775.tif 000003
【００７０】
［免疫細胞化学］  細胞は、４％ＰＦＡを用いて室温で５‐１０分間固定された。固定の後に、細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄され、０．１％トリトンを含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を用いて２０分間ブロックされた。固定された細胞は、一次抗体と共に室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートされ、ＰＢＳを用いて２回洗浄され、次いで二次抗体と共に室温で１時間インキュベートされ、洗浄された。使用された一次抗体は、表３に列挙されている。
表３  一次抗体のリスト
【表３】
2019518775.tif 000004
【００７１】
［免疫組織化学］  免疫組織化学は、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定組織に対して実行された。動物は深く麻酔され、氷冷０．９％食塩水、続いて４％ＰＦＡを用いて経心的に（transcardially）灌流された。灌流された脳が取り出され、４％ＰＦＡ中で一晩、後固定され、次いで３０％スクロースを用いて凍結保護された（cryoprotected）。凍結保護された脳は急速冷凍され、−８０℃で保存された。免疫組織化学解析のために、脳切片はＰＢＳＴを含むＰＢＳ中で２０分間透過処理され、ＰＢＳＴ中で３×５分間洗浄された。切片は、一次抗体（表３）と共に４℃で一晩インキュベートされた。一次抗体のインキュベーション及び洗浄に続いて、切片は、抗マウスＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１５‐１６５‐１５０）、抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０６）、及び抗マウスＤｙｌｉｇｈｔ  ４８８（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、７１５‐４８７‐００３）を含む二次抗体と共に、室温で２時間インキュベートされ、１×ＰＢＳを用いて洗浄され、Ｄａｐｉを用いて対比染色され、４％ＰＶＡ封入剤を用いて封入された。染色を最適化するために抗原回収（antigen  retrieval）又は界面活性剤は要求されなかった。細胞運命及び増殖状態の評価は、抗ヒト核抗原ＳＣ１０１を、ＯＬＩＧ２、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ又はＫｉ６７に対する抗体と共に使用して二重免疫染色することによって実行された。共焦点顕微鏡法（Confocal  microscopy）はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって実行され、結果としてもたらされた画像はＺｅｎ  ２．３  ｌｉｔｅソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて解析された。脳全体が走査された。全てのマーカーについて染色の全深度を捉えるために、Ｚ‐積み重ね画像化（Z-stack  imaging）が実行された。ヒト核抗原＋細胞、ヒト核抗原＋ＯＬＩＧ２＋細胞又はヒト核抗原＋Ｋｉ６７＋細胞が計数された。定量化のために、各マウス脳から８切片毎のスライドが選択された。直交図ツールは、二重陽性細胞におけるヒト核抗原及びＭＢＰについての共染色を確認するために使用された。
【００７２】
［空胞化解析］  ８分の１シリーズの切片（one-in-eight  series  of  sections）は、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色され、視床、小脳及び脳幹を含む脳領域の体積を測定するために使用された。全領域がＺｅｉｓｓ共焦点顕微鏡下で走査された。Ｚ‐積み重ね画像が取得された。空胞化した脳領域及び無傷の脳領域の表面積は、全領域の画像を使用して画像Ｊにおいて追跡された。体積は、表面積の合計にサンプリングされた切片間の距離を掛けることによって計算された。％空胞化（%Vacuolation）＝空胞化した脳領域の体積／空胞化した脳領域の体積＋無傷の脳領域の体積。
【００７３】
［ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたマウスにおける腫瘍モニタリング］  ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、ＣＤマウスに最大１０ヶ月まで移植された。１０ヶ月の期間内に、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスは毎月モニターされた。移植の１０ヶ月後に、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスは灌流され、切片にされ、Ｈ＆Ｅ染色又はＫｉ６７染色を受けた。
【００７４】
［統計解析］  図の説明文に明記されているように、データは、平均値±標準偏差又は平均値±標準誤差として示されている。処置群あたりのマウスの数は、対応する図の説明文において“ｎ”として示されている。除外基準は適用されていない。動物は、無作為に処置群に割り当てられた。本研究は、ブラインドにされていない。各図の説明文において報告されているように、スチューデントのｔ検定が統計解析のために使用された。ｐ＜０．０５が、統計学的に有意であるとみなされた。
【実施例２】
【００７５】
ＣＤ  ｉＰＳＣｓの誘導及び特徴付け
一次皮膚線維芽細胞は、３人の臨床的に罹患しているカナバン病患者から得られた（表４）。２人のＣａｎａｖａｎ病患者（ＣＤ１及びＣＤ２）はそれぞれ、ＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド５２７（５２７Ｇ＞Ａ）及びヌクレオチド９１４（９１４Ｃ＞Ａ）の両方にヘテロ接合性の変異を有し、結果としてコドン１７６におけるグルタミン酸によるグリシンの置換（Ｇ１７６Ｅ）及びコドン３０５におけるアラニンのグルタミン酸による置換（Ａ３０５Ｅ）をもたらしている。第３のカナバン病患者（ＣＤ３）は、ＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド８５４にホモ接合性の変異を有し（８５４Ａ＞Ｃ）、結果としてコドン２８５におけるアラニンによるグルタミン酸の置換をもたらしている（Ｅ２８５Ａ）。Ｅ２８５Ａは、アシュケナージ系ユダヤ人集団の間で優勢な突然変異（変異の８２％以上を占める）であり２８，２９、一方Ａ３０５Ｅは、非ユダヤ人のカナバン病患者において最も一般的な変異（６０％）である３０。Ｇ１７６Ｅは、本明細書において開示されるように、カナバン病患者において同定された新しいＡＳＰＡ変異である。正常なヒト線維芽細胞ＩＭＲ９０は、野生型（ＷＴ）対照として含められた（表４）。
表４  研究に使用された野生型及びＣＤ細胞
【表４】
2019518775.tif 000005
【００７６】
これらの線維芽細胞は、ＷＴ及びＣＤ患者ｉＰＳＣｓ（ＣＤ  ｉＰＳＣｓ）を生じさせるために、エピソーマルなリプログラミング３１，３２又はウイルス形質導入１を介して、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣを含むリプログラミング因子を使用して、リプログラムされた。正常なヒト線維芽細胞及びＣＤ患者線維芽細胞の両方に由来するｉＰＳＣ系統は、主要なヒト多能性遺伝子、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ、並びにヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）特異的表面マーカー、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８１を発現した（図１）。ＲＴ‐ＰＣＲ解析によって明らかにされるように、内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ遺伝子発現の活性化が、ＷＴ及びＣＤ  ｉＰＳＣｓの両方において観察された（図２Ａ）。対照的に、外因性リプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣの発現は、これらのｉＰＳＣｓにおいて検出可能でなかった（図２Ｂ及び２Ｃ）。細胞遺伝学的解析は、試験された全てのｉＰＳＣクローンにおいて正常な核型を確認した（図２Ｄ）。
【００７７】
配列解析は、ＣＤ患者１（ＣＤ１）及びＣＤ患者２（ＣＤ２）ｉＰＳＣｓがＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド５２７（５２７Ｇ＞Ａ）及びヌクレオチド９１４（９１４Ｃ＞Ａ）に２つのヘテロ接合性の変異を包含し、一方ではＣＤ患者３（ＣＤ３）ｉＰＳＣｓがＡＳＰＡ遺伝子のヌクレオチド８５４にホモ接合性の変異を抱える（８５４Ａ＞Ｃ）ことを確認した（図３Ａ）。胚様体（ＥＢ）形成アッセイは、同定されたＣＤ  ｉＰＳＣクローンの多能性の潜在能力を実証するために実行された。ＷＴ及びＣＤ  ｉＰＳＣｓの両方が、特徴的なＳＯＸ１７陽性内胚葉細胞、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）陽性中胚葉細胞、及びβＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）陽性外胚葉細胞に分化することができた（図３Ｂ）。ＣＤ  ｉＰＳＣｓの生体内での発達的潜在能力は、奇形腫形成アッセイによって実証された。ＣＤ  ｉＰＳＣｓは、移植された免疫不全ＮＳＧマウスにおいて、３つの胚葉全てを代表する組織を包含する奇形腫を発達させることができた（図３Ｃ及び３Ｄ）。
【００７８】
バイサルファイト配列解析は、内因性Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇプロモーターがＣＤ  ｉＰＳＣｓにおいて大部分が脱メチル化されている（largely  demethylated）ことを明らかにした。対照的に、親のＣＤ線維芽細胞中のＯｃｔ４及びＮａｎｏｇプロモーターは高度にメチル化されていた（図３Ｅ及び３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、特徴的な多能性幹細胞であり、且つ患者のＡＳＰＡ変異を包含するＣＤ  ｉＰＳＣｓを本発明者らが首尾よく引き出したことを実証する。
【実施例３】
【００７９】
遺伝的に修正されたｉＰＳＣｓの生成
カナバン病はＡＳＰＡ遺伝子における遺伝子変異によって引き起こされるので、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓを修正するために、ＣＤ患者ｉＰＳＣｓは、構成的な（constitutive）ヒトＥＦ１αプロモーター下でヒトＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子を発現するレンチウイルスを用いて形質導入された。遺伝的に修正されたＣＤ患者ｉＰＳＣｓは、ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓと名付けられた。ＡＳＰＡ１（又はＡＳＰＡ‐ＣＤ１）、ＡＳＰＡ２（又はＡＳＰＡ‐ＣＤ２）、及びＡＳＰＡ３（又はＡＳＰＡ‐ＣＤ３）ｉＰＳＣｓは、それぞれＣＤ患者１、ＣＤ患者２、及びＣＤ患者３のｉＰＳＣｓに由来した。ＷＴ  ＡＳＰＡ遺伝子配列の存在は、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２、及びＡＳＰＡ‐３  ｉＰＳＣｓにおいて確認された（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇ及び４Ｊ）。
【００８０】
免疫染色は、ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓが多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧ並びにヒトＥＳＣ表面マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ‐１‐６０及びＴＲＡ‐１‐８１を発現し続けていることを明らかにした（図４Ｂ、４Ｃ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｈ、４Ｉ）。ＲＴ‐ＰＣＲは、ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓにおける内因性ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮＡＮＯＧ発現の誘導を確認した（図２Ａ）。対照的に、外因性リプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８及びＭＹＣは、これらのｉＰＳＣｓにおいて検出可能でなかった（図２Ｂ及び２Ｃ）。ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓはまた、それらの発達的潜在能力を維持した。免疫不全ＮＳＧマウスへの移植の後に、ＡＳＰＡ１、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ｉＰＳＣｓは、３つの胚葉全てを包含する奇形腫を発達させることができた（図４Ｍ）。
【実施例４】
【００８１】
ＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓの神経分化
ＷＴ、ＣＤ１及びＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣｓは、公開されたプロトコルに従って、神経前駆細胞（ＮＰＣｓ）に分化させられた３３。３つ全てのｉＰＳＣ系統に由来するＮＰＣｓが、ＰＡＸ６、ＳＯＸ２、Ｎ−カドヘリン、ＳＯＸ１及びＮＥＳＴＩＮを含む、典型的なＮＰＣマーカーを発現した（図５Ａ及び５Ｂ）。対照的に、多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現は、いずれの種類のＮＰＣｓにおいても検出されなかった（図５Ｃ）。ＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣ由来のＮＰＣｓ（ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓ）もまた、ＡＳＰＡ遺伝子を発現した（図５Ｂ）。
【００８２】
そのうえ、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、検出可能なＡＳＰＡ活性を呈しなかったＣＤ１  ｉＰＳＣ由来のＮＰＣｓ（ＣＤ１  ＮＰＣｓ）に比べて、強いＡＳＰＡ酵素活性を呈した（図５Ｄ）。オリゴデンドログリア系統に沿ったＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの更なる分化は、分化の１３日目までにＯＬＩＧ２＋ＮＫＸ２．２＋ｐｒｅ‐ＯＰＣを、分化の８０日目までにＯ４＋ＯＰＣｓを得ることを可能にした（図５Ｅ及び５Ｆ）。同様の結果が、ＣＤ１  ＮＰＣｓから得られた（図５Ｅ及び５Ｆ）。これらの結果は、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓが、強いＡＳＰＡ酵素活性を所持するだけでなく、オリゴデンドログリア系統細胞に分化する能力も有することを実証する。
【００８３】
蛍光活性化細胞選別（Fluorescence-activated  cell  sorting）（ＦＡＣＳ）は、ＣＤ１  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの大多数がＣＤ１３３陽性ＮＰＣｓであり、ＳＳＥＡ４陽性細胞のごくわずかな割合によって明らかにされるように、未分化のｉＰＳＣｓの混入が最小限であることを明らかにした（図５Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの同一性、純度及び有効性（potency）を実証する。
【実施例５】
【００８４】
ＡＳＰＡ  ＮＰＣｓは移植されたＣＤマウスにおいて生き残り、機能的救済を提供することができる
Ａｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７マウスは、ＡＳＰＡ遺伝子にナンセンス変異（Ｑ１９３Ｘ）を包含している３４。Ａｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７マウスは、ＡＳＰＡ酵素活性の喪失、高められたＮＡＡレベル及び様々な脳領域における広範囲にわたる海綿変性を含む、ＣＤ患者のものと似た主要な病理学的表現型を呈するので３４、それはＣＤについての信頼のおける（authentic）動物モデルであるとみなされる。したがって、Ａｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７マウスは、遺伝的に修正されたＡＳＰＡ  ｉＰＳＣｓに由来するＮＰＣｓの治療的効果を試験するための優れたプラットフォームを提供する。ヒト細胞がＣＤマウスモデルに移植される必要があるので、Ａｓｐａｎｕｒ７／／ｎｕｒ７マウスを、成熟Ｂ及びＴリンパ球を欠く免疫不全Ｒａｇ２−／−マウスと交配させることによって、免疫不全Ａｓｐａｎｕｒ７／／ｎｕｒ７マウスモデルが生成された。結果として生じるＡｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−マウスは、親のＡｓｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７マウスと大部分が類似しており、それらの両方が、ＷＴマウスと比較して、実質的に低下させられた脳内のＡＳＰＡ酵素活性を呈した（図１１Ａ）。ＡＳＰＡ活性の欠乏の他に、空胞化によって明らかにされるような海綿状変性は、ＣＤ患者及びマウスモデルの一つの他の特徴的な特質である。視床、小脳及び脳幹を含む、親のＡａｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７及びＡａｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−マウスの両方の様々な脳領域において、広範囲にわたる空胞化が観察された（図１１Ｂ及びＣ）。これらの結果はまとまって、免疫不全ＣＤマウス又は略してＣＤマウスと呼ばれるＡａｐａｎｕｒ７／ｎｕｒ７／Ｒａｇ２−／−マウスが、親のＡｓｐａｎｕｒ７／／ｎｕｒ７マウスに類似する、典型的なＣＤ表現型を呈することを示す。これらのＣＤマウスは、以下における、ＡＳＰＡ‐ＣＤ  ＮＰＣｓの効果を試験するための移植のために使用された。
【００８５】
ＡＳＰＡ１  ｉＰＳＣｓから分化させられたＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、新生仔ＣＤマウスの脳に移植された。２μＬ容量中の２０万個の細胞は、新生仔ＣＤマウスの脳の６部位に定位的に注射された（方法を参照のこと）。移植の１ヶ月後に、マウスの脳は採取され、移植されたヒト細胞を同定するためのヒト核抗原、及びオリゴデンドログリア系統細胞のためのマーカーであるＯＬＩＧ２について、免疫染色によって解析された。移植されたＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、小脳及び脳幹を含む、調べられた脳領域において生き残り、ＯＬＩＧ２を発現することができた（図６Ａ）。そのうえ、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを受けたＣＤマウスは、移植なしのＣＤマウスに比べて、実質的に改善されたロータロッド能力を実証した（図６Ｂ）。これらの結果は、ＡＳＰＡ発現ＮＰＣｓがＣＤマウスの脳内で生き残り、オリゴデンドログリア系統細胞に分化し、ＣＤマウスの運動機能を改善し得ることを示す。
【００８６】
一つの他の組の実験において、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは新生仔ＣＤマウスの脳に移植され、マウスは３ヶ月間生存期間を与えられた。次いで、移植されたマウスの脳は採取され、ヒト核抗原及びオリゴデンドロサイト系統転写因子ＯＬＩＧ２についての共染色によって解析された。移植されたＡＳＰＡ  ＮＰＣｓは、移植後の３ヶ月間を生き残り、オリゴデンドログリア系統細胞に分化することができた（図７Ａ）。ヒト核抗原陽性及びＯＬＩＧ２陽性細胞の定量化は、ＣＤマウスの視床において６０％を超えるヒト生着細胞がＯＬＩＧ２＋細胞に分化し、小脳及び脳幹においてそれぞれ約７２％及び４５％のヒト細胞がＯＬＩＧ２＋細胞になったことを明らかにした（図１２Ａ）。さらに、共焦点顕微鏡解析は、生着ヒト細胞はまた、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳においてミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を発現する成熟オリゴデンドロサイトに分化したことを明らかにした（図７Ｂ）。生着細胞におけるヒト核抗原及びＭＢＰについての共染色は、共焦点画像の直交図によって確認された（図１２Ｂ）。生着ヒト細胞の一部分は、ＧＦＡＰ＋星状細胞に分化した（図７Ｃ及び１３）。これらの結果は、ＡＳＰＡ発現ＮＰＣｓが長期の移植を生き残り、移植された脳においてオリゴデンドログリア系統細胞を生じさせることを示す。
【００８７】
ＡＳＰＡ酵素活性の欠乏がＣＤ患者及び動物モデルの両方における疾患表現型の根本的な原因であるので、ＡＳＰＡ酵素活性は、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣ移植の３ヶ月後に採取されたＣＤマウス脳において決定された。視床、小脳及び脳幹を含む、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたマウスの様々な脳領域において、移植なしのＣＤマウス脳における活性に比べて、強いＡＳＰＡ酵素活性が検出された（図８Ａ）。
【００８８】
ＡＳＰＡ欠乏は、ＣＤ患者及びマウスモデルの両方の脳において高められたＮＡＡレベルにつがなることが示されている１５，３４−３６。高められたＡＳＰＡ酵素活性と一貫して、ＣＤ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳におけるレベルに比べて、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳において低下させられたＮＡＡレベルが検出された（図８Ｂ，８Ｃ）。これらの結果は、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの移植がＡＳＰＡ酵素活性の欠乏を救済し、ＣＤ患者及びマウスモデルの両方における主な欠陥である、ＮＡＡレベルを低下させることができたことを示す。
【００８９】
広範囲にわたる海綿状変性は、ＣＤ患者及びマウスモデルの一つの他の主要な病理学的特質であり、これは様々な脳領域における空胞化によって明らかにされる１５，３４−３６。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスの脳における高められたＡＳＰＡ酵素活性及び低下させられたＮＡＡレベルの観察と一貫して、視床、小脳及び脳幹を含む、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスの様々な脳領域において、実質的に減少させられた程度（reduced  extent）の空胞化が検出された（図８Ｄ，８Ｅ）。
【００９０】
空胞化は、ＣＤマウスの脳においてミエリンの破壊に起因することが示唆されている３４。ＣＤマウスの脳における広範囲にわたる空胞化と一貫して、ＷＴマウスからの厚さに比べて、ＣＤマウスの脳において実質的に減少させられた厚さの髄鞘が観察された（図９Ａ，９Ｂ）。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤ脳における髄鞘は、未処置のＣＤ脳の髄鞘よりもはるかに厚かったが、ＷＴ脳の髄鞘に更に似ていた（図９Ａ，９Ｂ）。これらの結果は、ＣＤの病理学的表現型を寛解させるためのそれらの能力について、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの治療的潜在能力を更に支持する。
【００９１】
細胞レベルでのＣＤ表現型の改善に加えて、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの移植はまた、ＣＤマウスに対する全身的な効果と関連していた。体重減少は、ＣＤマウスにおいて報告されている２２，２６，３５。移植の３ヶ月後に、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓ又はＷＴ  ＮＰＣｓを用いて移植されたＣＤマウスにおいて、ＣＤ１  ＮＰＣｓを用いて移植されたＣＤマウスにおける体重に比べて、実質的な体重の増加が検出された（図９Ｃ）。
【００９２】
運動能力における欠陥は、ＣＤ患者や動物モデルに典型的である１５，３４−３６。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの移植がＣＤマウスにおいて欠陥のある運動能力を救済し得るかどうかを決定するために、ＷＴ  ＮＰＣｓ、ＣＤ１  ＮＰＣｓ、又はＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを用いて移植されたＣＤマウスは、２つの運動技能行動パラダイムで試験された。移植の３ヶ月後に、様々なＮＰＣｓの脳内注射を受けたＣＤマウスは、運動協調性及びバランスを試験するために設計された、加速するロータロッドトレッドミルを用いて調べられた。ＷＴ  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓの両方は、ＣＤ１  ＮＰＣｓに比べて、移植されたＣＤマウスにおけるロータロッド能力を実質的に改善したが、ＷＴ  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを用いて処置されたマウスの間に有意差は検出されなかった（図９Ｄ）。ワイヤ懸垂手法は、肢の強さを神経筋機能の指標として評価するために使用された３７。ＷＴ  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスの両方において、ＣＤ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスの握力に比べて、握力の実質的な増強（enhancement）が、ワイヤ懸垂試験において検出された（図９Ｅ）。これらの結果はまとまって、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを用いた移植がＣＤマウスにおいて運動機能を改善し得ることを示す。
【実施例６】
【００９３】
ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓは、ＣＤマウスにおける疾患表現型を救済し得る
ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓを用いて移植されたＣＤマウスにおいて疾患表現型の強健な改善を観察したのち、ＣＤ患者２及びＣＤ患者３のｉＰＳＣｓに由来するＡＳＰＡ  ＮＰＣｓの効果が試験された。ＣＤ２  ｉＰＳＣｓ及びＣＤ患者３  ｉＰＳＣｓは、ＡＳＰＡ発現レンチウイルスを用いて形質導入され、次いでこれらのｉＰＳＣｓはＮＰＣｓに分化させられた。結果として生じるＷＴ  ＡＳＰＡ発現ＮＰＣｓは、それぞれＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓと名付けられた。ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓの両方が、典型的なＮＰＣマーカーＮＥＳＴＩＮ及びＳＯＸ１を発現した（図１０Ａ）。  対照的に、多能性因子ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧの発現は、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓにおいて検出されなかった（図１０Ｂ）。
【００９４】
ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓは、ＮＰＣ表面マーカーＣＤ１３３を使用した正の選択及びヒトＥＳＣ表面マーカーＳＳＥＡ４を使用した負の選択によって選別された。分化細胞の大多数は、ＣＤ１３３陽性及びＳＳＥＡ４陰性であった（図１０Ｃ）。ＣＤ１３３陽性及びＳＳＥＡ４陰性の細胞集団が、移植実験のために採取された。移植前に、ＡＳＰＡ２及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓにおけるＡＳＰＡ活性が試験され、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓの両方がＣＤ２  ＮＰＣｓ及びＣＤ３  ＮＰＣｓに比べて強いＡＳＰＡ活性を呈したことが見出された（図１０Ｄ）。要約すると、移植前のＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓの同一性、純度及び有効性が実証されている。
【００９５】
選別されたＣＤ１３３陽性及びＳＳＥＡ４陰性のＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓは、上記及び方法に記載されたように、新生仔ＣＤマウスの脳に移植された。移植の３ヶ月後に、移植されたＣＤマウス脳においてヒト核抗原及びＯＬＩＧ２の両方について陽性である細胞が検出された（図１４Ａ）。そのうえ、生着細胞は、ＭＢＰ陽性の成熟オリゴデンドロサイトを生じさせることができた（図１５Ａ）。移植された脳におけるヒト核抗原及びＭＢＰの両方について陽性である生着細胞の存在は、共焦点画像の直交図によって確認された（図１５Ｂ）。移植された細胞の一部は、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓを移植されたＣＤ脳においてＧＦＡＰ陽性星状細胞を生じさせた（図１４Ｂ）。
【００９６】
ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓを用いて移植されたＣＤマウスの脳におけるＡＳＰＡ酵素活性が調べられた。視床、小脳及び脳幹を含む、移植された脳の複数の脳領域において、移植なしのＣＤマウス脳における活性に比べて、強いＡＳＰＡ酵素活性が検出された（図１５Ｃ）。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスと同様に、視床、小脳及び脳幹を含む、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣを移植されたＣＤマウス脳において、著しく減少させられた空胞化が検出された（図１５Ｄ及び１５Ｅ）。
【００９７】
次いで、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓを受けたＣＤマウスは、加速するロータロッドトレッドミルを用いて試験された。ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ及びＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓの両方が、移植なしのＣＤマウスに比べて、移植されたＣＤマウスにおけるロータロッド能力を実質的に改善した（図１５Ｆ）。ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓのいずれかを用いて移植されたＣＤマウスのワイヤ懸垂試験においても、移植なしのＣＤマウスに比べて、握力の実質的な増強が検出された（図１５Ｇ）。これらの結果はまとまって、ＡＳＰＡ２  ＮＰＣｓ又はＡＳＰＡ３  ＮＰＣｓのいずれかを用いた移植が、ＣＤのマウスモデルにおいて運動機能を実質的に改善し得ることを示す。これらの結果は、遺伝的に修正されたＣＤ患者ｉＰＳＣｓに由来するＮＰＣｓがＣＤの病理学的表現型を寛解させるための治療的潜在能力を有するという、概念証明（proof-of-concept）を提供する。
【実施例７】
【００９８】
ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたＣＤマウスに腫瘍は形成されない
ＡＳＰＡ１  ＮＰＣｓは、ＣＤマウスの脳に最大で１０ヶ月間にわたって移植された。これらの１０ヶ月以内に、移植されたマウスは毎月モニターされ、腫瘍形成の徴候は観察されなかった（表５）。１０ヶ月目の終わりに、移植されたマウスは採取され、更なる腫瘍解析のためにヘマトキシリン・エオシン染色によって解析された。これらの切片において、典型的な腫瘍組織は発見されなかった（図１６Ａ及び１６Ｂ）。ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたマウスにおける腫瘍形成の欠如は、ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを生着された脳におけるヒト核抗原陽性細胞及びＫｉ６７陽性細胞の低い割合によって明らかにされるように、非常に低い有糸分裂指数（mitotic  index）と相関していた（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
表５  ＡＳＰＡ１  ＮＰＣを移植されたマウスの安全性モニタリング
【表５】
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【００９９】
本明細書において引用された全ての刊行物及び特許文献は、参照によって取り込まれている。
【０１００】
［参考文献］
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【図１】
2019518775.tif 000007
【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｆ】
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【図４Ａ−Ｉ】
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【図４Ｊ−Ｍ】
2019518775.tif 000012
【図５】
2019518775.tif 000013
【図６】
2019518775.tif 000014
【図７】
2019518775.tif 000015
【図８】
2019518775.tif 000016
【図９】
2019518775.tif 000017
【図１０】
2019518775.tif 000018
【図１１】
2019518775.tif 000019
【図１２】
2019518775.tif 000020
【図１３】
2019518775.tif 000021
【図１４】
2019518775.tif 000022
【図１５】
2019518775.tif 000023
【図１６】
2019518775.tif 000024
【図１７】
2019518775.tif 000025
【配列表】
2019518775000001.app
【国際調査報告】
2019518775.tif 000026