(57)【要約】  本発明は、変異型mRNAの対立遺伝子特異的サイレンシングを誘導するためのAAV媒介RNA干渉アプローチを用いた、心臓リアノジン受容体2型(RYR2)遺伝子における変異に関連する、常染色体優性カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍の治療方法を提供する。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む、心臓リアノジン受容体2型(RYR2)遺伝子の変異型対立遺伝子の発現を抑制する二本鎖短鎖干渉核酸(siNA)分子であって、センス鎖は、アンチセンス鎖に相補的である、siNA分子。
【請求項２】
短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)又は環状RNA分子である、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項３】
アンチセンス鎖が、変異型対立遺伝子の発現に関連するRNAの少なくとも一部に相補的な配列を含む、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項４】
配列番号4〜18、配列番号21〜35、配列番号38〜52、配列番号55〜69、配列番号72〜86、配列番号89〜104、配列番号107〜119からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含む、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項５】
RYR2遺伝子の変異型対立遺伝子が、野生型RYR2遺伝子とは最大7個の核酸残基によって異なる、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項６】
RYR2遺伝子が、ヒトRYR2遺伝子(NM_001035.2; コード配列配列番号1)である、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項７】
RYR2変異型対立遺伝子が、少なくとも1つの疾患原因変異を有する、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項８】
センス鎖が、5'-UAUUUUGCUUGCAACUUUUAC-3'(配列番号112)を含む、請求項７に記載のsiNA分子。
【請求項９】
少なくとも一部のヌクレオチドが、修飾を含む、請求項１に記載のsiNA分子。
【請求項１０】
修飾が、2'O-メチル修飾を含む、請求項９に記載のsiNA分子。
【請求項１１】
修飾が、2'フルオロ修飾である、請求項１０に記載のsiNA分子。
【請求項１２】
siNA中に、少なくとも1つのホスホチオエート結合が存在する、請求項１に記載のsiNA。
【請求項１３】
標的細胞又は組織に送達されたとき、請求項１に記載のsiNA分子を発現する、組換えプラスミド又はウイルスベクターを含む組成物。
【請求項１４】
ウイルスベクターが、血清型9アデノ随伴ウイルス(AAV2/9)ベクター又は血清型6アデノ随伴ウイルス(AAV2/6)ベクター又は血清型8アデノ随伴ウイルス(AAV2/8)ベクターである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
医薬担体又は希釈剤をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
医薬担体又は希釈剤が、カチオン性脂質又はリポソームから選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
心臓リアノジン受容体2型(RYR2)遺伝子中の変異に関連する状態に罹患している被験体を治療的又は予防的に処置するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のsiNA分子であって、被験体のRYR2遺伝子の変異型対立遺伝子の発現に関連するRNAを標的とする、siNA分子。
【請求項１８】
心臓リアノジン受容体2型(RYR2)遺伝子中の変異に関連する状態に罹患している被験体を治療的又は予防的に処置するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のsiNA分子であって、該siNA分子は、RYR2遺伝子のコード領域中の一塩基多型(SNP)の発現に関連するRNAを標的とし、該SNPは、同じ対立遺伝子中の又はもう一方の対立遺伝子中の変異と共分離し、それにより、変異を有するRYR2対立遺伝子がサイレンシングされる、siNA分子。
【請求項１９】
被験体に送達されたウイルスベクターから発現される、請求項１７又は１８に記載のsiNA分子。
【請求項２０】
ウイルスベクターが、血清型9アデノ随伴ウイルス(AAV2/9)ベクター又は血清型6アデノ随伴ウイルス(AAV2/6)ベクター又は血清型8アデノ随伴ウイルス(AAV2/8)ベクターである、請求項１９に記載のsiNA分子。
【請求項２１】
AAV2/9又は(AAV2/6)又は(AAV2/8)が、被験体の心筋細胞に送達される、請求項２０に記載のsiNA分子。
【請求項２２】
前記状態が、心臓疾患である、請求項１７又は１８に記載のsiNA分子。
【請求項２３】
前記状態が、カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍(CPVT)である、請求項２２に記載のsiNA分子。
【請求項２４】
前記状態が、RyR2遺伝子変異による、不整脈原性右室心筋症(ARVC)又は特発性心室細動(IVF)及び肥大型心筋症又は拡張型心筋症である、請求項２２に記載のsiNA分子。
【請求項２５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のsiNAを含むキット。
【請求項２６】
RYR2遺伝子の野生型対立遺伝子と比較して、RYR2遺伝子の変異型対立遺伝子を選択的にサイレンシングすることができるsiNAを同定する方法であって、
i. HEK-293細胞に、変異型及び野生型レポーター対立遺伝子と、多様なsiNA二重鎖とを共トランスフェクトすること、
ii. 変異型対立遺伝子が野生型対立遺伝子と比較して実質的にサイレンシングされているかどうかを決定すること、及び
iii. 実質的なサイレンシングに関連するsiNAを決定し、それにより、RYR2遺伝子の野生型対立遺伝子と比較して変異型対立遺伝子を選択的にサイレンシングすることができるsiNAを同定すること
を含む、方法。
【請求項２７】
優性遺伝したCPVTに罹患した哺乳動物において対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを行い、それにより、哺乳動物に存在するRYR2の変異型対立遺伝子をサイレンシングするための、哺乳動物の変異型RYR2対立遺伝子に存在する少なくとも1つの変異の発現に関連するRNAを標的とするsiNA配列をコードするベクター。
【請求項２８】
優性遺伝したCPVTに罹患した哺乳動物において対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを行い、それにより、変異を有するRYR2対立遺伝子をサイレンシングするための、RyR2遺伝子のコード領域中のコモン一塩基多型(SNP)の発現に関連するRNAを標的とするsiNA配列をコードするベクターであって、該SNPは、同じ対立遺伝子中の又はもう一方の対立遺伝子中の変異と共分離する、ベクター。
【請求項２９】
前記siNAが、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のものである、請求項２７又は２８に記載のベクター。
【請求項３０】
CRUの及びミトコンドリアにおける構造異常を防止する又は元に戻すための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のsiNA分子であって、該異常が、RyR2遺伝子のR4496C変異に関連する、siNA分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型mRNAの対立遺伝子特異的サイレンシングを誘導するためのAAV媒介RNA干渉アプローチを用いた、心臓リアノジン受容体2型(RYR2)遺伝子における変異に関連する、常染色体優性カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍(CPVT)は、生命を脅かす不整脈に対する高い感受性を特徴とする遺伝性のチャネル病である。この疾患の2つの形態、すなわち、常染色体優性バリアント及び常染色体劣性バリアントが記載されている。最初のバリアントは、心臓リアノジン受容体2型(RYR2)遺伝子における変異に関連しており(Priori SG et al., 2001)、一方、常染色体劣性バリアントは、心臓カルセクエストリン2(CASQ2)遺伝子における変異に関連している(Lahat H et al., 2001)。臨床観察では、CPVTの優性形態を有する患者は、交感神経活性化に応答して二方向性及び多形性心室頻拍を発症するが、その安静時ECGは目立つものではなく、心臓構造は保存されていることが示されている。現在の療法に対する応答は、罹患個体における突然死を効果的に減少させることができず、したがって、CPVTの優性形態において観察される機能的障害の全ての態様を修正することができる革新的治療が必要である。
【０００３】
その病理は、心臓における興奮収縮連関の基礎をなす「カルシウム誘発性カルシウム放出」(CICR)と呼ばれる生理学的メカニズムの異常な機能に関連している。
【０００４】
心筋細胞の膜に位置する電位依存性イオンチャネルの高度に調整された開閉は、心臓活動電位を生成する。活動電位のプラトー相の間、電位依存性L型Ca2+チャネルの開口により、原形質膜におけるCa2+の流入が可能となる。このプロセスは、カルシウムトランジェントを引き起こし、筋小胞体(SR)Ca2+放出チャネルであるリアノジン受容体2(RyR2)の開口を誘導する(Bers DM, 2002)。これらの局所放出は、カルシウム放出ユニット(CRU)と呼ばれる特殊な構造で生じる。CRUは横行小管(T管)のレベルに優先的に局在し、そこではSRの膜は細胞膜に対し並列に配置されている。1つのCRUは、L型Ca2+チャネル(細胞膜上)に近接しているRyR2のクラスター(SR膜にまたがる)によって形成される(Franzini-Armstrong et al., 2005)。SRから放出されたCa2+は、トロポニンCに結合し、ミオシンフィラメントにおける一連のアロステリック変化を誘導し、筋繊維収縮を引き起こす。その後のCa2+の除去は、同時に起こる、RyR2の閉鎖と、Ca2+をSR貯蔵にポンプして戻すSR Ca2+ ATPase(SERCA)の作用とによって媒介される。
【０００５】
Ca2+トランジェント終結の別の構成要素は、Na+-Ca2+交換体(NCX)である。NCXは、細胞に取り込まれた3つのNa+イオン(3つの正電荷)ごとに1つのCa2+イオン(2つの正電荷)を押し出す。したがって、NCXは、正味の内向き脱分極電流、すなわち、一過性内向き電流(Iti)(Pieske B et al., 1999)を生成することによって、Ca2+を取り除く。NCXは、例えば、RYR2遺伝子変異の場合の、カルシウム過負荷を特徴とする状態において、Ca2+の除去に非常に重要になる。
【０００６】
CPVTにおける不整脈はCa2+放出事象によって誘発され、このCa2+放出事象は、活動電位によって誘発されず、したがって、「自発的カルシウム放出」(SCR)と呼ばれる。SCRは、単一のCRUを伴う局所的事象として開始するが、近隣のCRUに拡散し、より多くのCa2+放出を引き起こして、細胞全体にわたるカルシウム波を生成することもできる。SCRがカルシウム波を引き起こす確率は、SRからのCa2+放出を誘導する、SR Ca2+含有量とCa2+の濃度との間のバランス、いわゆるSRカルシウム閾値によって影響を受ける。RyR2機能は、閾値を制御する上で重要な役割を果たす。CPVTに関連するいくつかのRYR2変異は、SRからのカルシウムの放出のためのSR閾値を低下させ、したがって、自発的カルシウム放出の発生を促進する(Venetucci L et al., 2012)。
【０００７】
異常なCa2+放出が起こると、サイトゾルCa2+濃度は一過性に増加し、細胞は、Ca2+恒常性の破壊を防ぎCa2+の生理学的拡張期レベルを再確立するためのメカニズムを活性化しなければならない。NCXを介したCa2+の押し出しは、サイトゾルCa2+を減少させるための好ましい様式であるが、1つのCa2+を押し出すために、NCXは3つのNa+を細胞内に取り込み、こうして、一過性内向き電流又はItiと呼ばれる正味の内向き電流を生成する。この電流は、遅延後脱分極(DAD)として知られている一過性膜脱分極を生じる。DADの振幅が電位依存性Na+チャネルの開口の電圧閾値に達すると、「撃発(triggered)」活動電位が生成される。心臓全体への活動電位の伝播は、期外収縮を生じる。この一連の事象が反復性になり、いくつかのDADが伝播性活動電位の生成の閾値に達すると、不規則な撃発活動が誘発され、それは複雑で生命を脅かす不整脈を生じる。RYR2の変異は、β-アドレナリン刺激の間に自発的カルシウム放出の発生を促進し、次いでDAD及び撃発活動を誘発し、重度の心室性不整脈を引き起こすことが示されている(Liu N et al., 2006)。
【０００８】
常染色体優性CPVTのRyR2R4496C/+ノックインマウスモデルの生成及び特徴付け(Cerrone M et al., 2005; 特許: US 7741529 B1)は、この疾患の根底にある病原メカニズムについての大きな洞察を提供している。RyR2R4496C/+ヘテロ接合マウスはヒトCPVTを再現し、アドレナリン作動性で誘導された二方向性及び多形性の心室性不整脈を発症する。R4496C変異は、RyR2チャンネルの内腔カルシウムに対する感受性を増加させ、したがって、筋小胞体からのカルシウムの自発的放出を促進する。自発的カルシウム放出は、単一のCRUを伴う局所的事象として開始するが、近隣のCRUに伝播し、より多くのCa2+放出を引き起こして、細胞全体にわたるカルシウム波を生成し得る。SCRがカルシウム波を引き起こす確率は、SRからのCa2+放出を誘導する、SR Ca2+含有量とCa2+の濃度との間のバランス、いわゆるSRカルシウム閾値によって影響を受ける。RyR2機能は、閾値を制御する上で重要な役割を果たす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第7741529号(B1)
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Priori SG, Napolitano C, Colombo B, Memmi M, Bloise R. Mutations of the cardiac Ryanodine receptor (RYR2) gene are associated to heterogeneous clinical phenotypes and high lethality. Circulation 2001;104(suppl II):335.
【非特許文献２】Lahat H, Pras E, Olender T, Avidan N, Ben Asher E, Man O, Levy-Nissenbaum E, Khoury A, Lorber A, Goldman B, Lancet D, Eldar M. A missense mutation in a highly conserved region of CASQ2 is associated with autosomal recessive catecholamine-induced polymorphic ventricular tachycardia in Bedouin families from Israel. Am J Hum.Genet. 2001;69:1378-1384.
【非特許文献３】Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature 415, 198-205 (2002).
【非特許文献４】Franzini-Armstrong, C., Protasi, F. & Tijskens, P. The assembly of calcium release units in cardiac muscle. Ann. NY Acad. Sci. 1047, 76-85 (2005).
【非特許文献５】Pieske, B., Maier, L. S., Bers, D. M. & Hassenfuss, G. Ca2+  handling and sarcoplasmic reticulum Ca2+  content in isolated failing and nonfailing human myocardium. Circ. Res. 85, 38-46 (1999).
【非特許文献６】Venetucci L, Denegri M, Napolitano C, Priori SG. Inherited calcium channelopathies in the pathophysiology of arrhythmias. Nat Rev Cardiol. 9(10), 561-75 (2012).
【非特許文献７】Liu N, Colombi B, Memmi M, Zissimopoulos S, Rizzi N, Negri S, Imbriani M, Napolitano C, Lai FA, Priori SG. Arrhythmogenesis in Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia. Insights From a RyR2 R4496C Knock-In Mouse Model. Circulation Research 2006;99:292-298.
【非特許文献８】Cerrone M, Colombi B, Santoro M, Raffale di Barletta M, Scelsi M, Villani L, Napolitano C, Priori SG. Bidirectional Ventricular Tachycardia and Fibrillation Elicited in a Knock-In Mouse Model Carrier of a Mutation in the Cardiac Ryanodine Receptor (RyR2). Circulation Research 2005;96:e77-e82.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、RyR2遺伝子の正常対立遺伝子を罹患対立遺伝子から区別することを可能にする配列をサイレンシングすることによる、常染色体優性カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍の治療方法に関する。
【００１２】
本発明による常染色体優性カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍の治療方法は、治療的な転写後遺伝子サイレンシングの利用を含む。本発明者らは、RyR2R4496C/+ヘテロ接合被験体において観察される機能的障害を治すために、内在性RNA干渉(RNAi)経路(Elbashir et al., 2001)を利用して、心臓細胞に人工miRNA発現ベクターを送達することにより、野生型RyR2転写産物の発現をほとんど変化させずに、変異型RyR2 mRNAの発現を選択的に抑制することができることを見出した。
【００１３】
RNAiアプローチの開発には、何らかのリスク、例えば、干渉RNA種の超生理学的発現、及び必須遺伝子(正確にはRYR2であるが)のハプロ不全を引き起こす可能性が伴う。それにもかかわらず、干渉RNA配列の的確な選択によって、並びに適切なAAV血清型、プロモーター、及びベクター用量を用いることによって、所望の効果、すなわち、アドレナリン作動性撃発活動が発生することから心筋細胞を保護するが、正常な心機能に影響しない効果を誘発するために十分な変異型対立遺伝子の遺伝子サイレンシングの程度を達成することが可能である。この目的を達成するために、初期のin vitroスクリーニングから得られた、強力で効率的で、かつ厳密に特異的な分子のみが、in vivo実験での使用に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】RyR2変異を含む対立遺伝子をサイレンシングするのに適したsiRNAを選択するためにクリニックで使用されるステップを示すフローチャート。
【図２】野生型及び変異型RYR2 mRNA発現の内因性ヘテロ接合性発現をシミュレートするためのレポーター対立遺伝子を用いた一過性発現系において複数のsiRNA二重鎖をスクリーニングするために使用される実験プロトコール。
【図３】レポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を一過性にトランスフェクトしたHek293細胞におけるリアルタイムPCRによる野生型(黒色)及び変異型(白色)対立遺伝子発現の評価。
【図４】レポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を一過性にトランスフェクトしたHek293細胞における蛍光分析。
【図５】レポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を一過性にトランスフェクトしたHek293細胞におけるHA(Wt対立遺伝子)及びFLAG(Mut対立遺伝子)配列に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロット。
【図６】miRYR2-U10発現カセットを、pAAV2.1アデノ随伴ウイルスベクター骨格プラスミドにクローニングした。得られたプラスミドを、療法の機能的効果をin vivoで研究するため、RyR2R4496C/+ヘテロ接合マウスに感染させるAAV9_miRyR2-U10粒子の生成に使用した。
【図７】レポーター対立遺伝子並びにpAAV2.1-miRyRU10若しくはpAAV2.1-miRNAスクランブルを一過性にトランスフェクトしたHek293細胞におけるリアルタイムPCRによる野生型(黒色)及び変異型(白色)対立遺伝子発現の評価。
【図８】レポーター対立遺伝子並びにpAAV2.1-miRyRU10若しくはpAAV2.1-miRNAスクランブルを一過性にトランスフェクトしたHek293細胞におけるHA(WT対立遺伝子)及びFLAG(Mut対立遺伝子)配列に対する特異的抗体を用いたウェスタンブロット。
【図９】レポーター遺伝子(EmGFP)の発現の存在及びレベルを評価するために、感染動物由来の単離された心筋細胞(位相差、PhC)を蛍光顕微鏡で観察した。
【図１０】陰性GFP細胞(非感染RYR2-R4496C+/-細胞)及び陽性GFP細胞(AAV2/9-EmGFP-miRYR2による感染RYR2-R4496C+/-細胞)に由来する単離された心筋細胞における撃発活動の例。
【図１１】対立遺伝子特異的サイレンシング投与後の心室性不整脈の発生率の評価。A、in vivoエピネフリン及びカフェイン投与は、Het及びHet-SCRでは二方向性心室頻拍を誘発したが、Het-U10マウスでは誘発しなかった。B、p8で感染したHet、Het-SCR及びHet-U10マウスにおける心室性不整脈(VT)の発生率の定量化(***P<0.001)。C、p30で感染したHet、Het-SCR及びHet-U10マウスにおける心室性不整脈(VT)の発生率の定量化(*P<0.05; ***P<0.001)。
【図１２】対立遺伝子特異的サイレンシングで処置したWT及びRyR2R4496C/+マウスにおけるCRUの電子顕微鏡分析。A、WT心筋細胞では、jSR槽は通常狭く平らである。カルセクエストリン-2(CASQ2)は、SR膜と平行に走る鎖状の電子密度の高い線(単一黒色矢印)としてはっきりと見える。Aのより小さい矢印は、SRと原形質膜との間の狭い接合間隙にまたがるRYR2の細胞質ドメイン又は足を指す。B、Het心筋細胞では、jSRの形状はより多様でわずかに幅広であり、CASQ2の鎖状の電子密度の高い重合体を常に含有するとは限らない。C、Het-SCR心筋細胞では、CRUは、Het心筋細胞の場合と同様に見える。D、Het-U10におけるウイルス感染は、CRUプロファイルを救済し、回復させる。スケールバー: 0.1mm。
【図１３】対立遺伝子特異的サイレンシングで処置したWT及びRyR2R4496C/+マウスにおける収縮要素及びミトコンドリアの電子顕微鏡分析。A〜E、WT(A)、Het(B〜C)、Het-SCR(D)、Het-U10(E)における心臓細胞の代表的な電子顕微鏡写真。挿入図は、ミトコンドリア内部クリステの詳細を示す。F、重度の構造異常を示す心臓細胞の割合の定量的分析(Het、Het-SCR及びHet-U10 対WT、*P<0.05; Het-U10 対Het、§P<0.05; Het-SCR 対Het、＃有意ではない)。スケールバー=パネルA〜E、1μm; 挿入図、0.2μm。
【図１４】hRYR2レポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を一過性にトランスフェクトしたHek293細胞におけるリアルタイムPCRによる野生型(c.1359C)(黒色)及びS453S SNP(c.1359T)含有対立遺伝子(白色)発現の評価。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、マウスモデル又はヒト患者におけるRYR2(NM_023868.2、NM_001035.2)変異に関連する常染色体優性カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍の治療方法に関する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、マウスモデルにおいて又は優性遺伝したCPVTに罹患したヒト個体において対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを行う方法であって、その必要がある被験体に、二本鎖短鎖干渉核酸(siNA)をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを有するベクターを投与することによる方法であり、前記siNAは、ヌクレオチド変異(複数可)を含有するRYR2領域を標的とし、野生型RYR2転写産物の発現をほとんど変化させずに、配列相補性によって変異型mRNAの高いノックダウン率を得るように最適化されている、方法を提供する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、siNA分子は、短鎖干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)又は環状RNA分子を表す。
【００１８】
標的とされるRYR2遺伝子配列は、マウス特異的又はヒト特異的であってよい。ヒトCPVT患者において、この遺伝子は、ヒトRYR2(NM_001035.2; コード配列: 配列番号1)である。
【００１９】
一般に、RYR2遺伝子の対立遺伝子は、対立遺伝子特異的サイレンシングによって標的とされるべき1塩基対〜最大7塩基対で異なる。
【００２０】
ヌクレオチド変化(複数可)を含むRYR2領域を標的とするsiNA分子の使用に加えて、本発明者らは、コモンSNP(common SNP)を利用して、変異型RYR2発現を選択的にサイレンシングする干渉核酸を生成できることを見出した。RYR2変異型対立遺伝子特異的サイレンシングに対するこの代替アプローチは、多数の異なる患者特異的な疾患原因変異を考慮すると特に便利である。
【００２１】
ヒトRYR2遺伝子においてコモン疾患原因変異としては、以下に限定されないが、R2474S、R4497C、R176Q、P2328S、Q4201R、V4653F、R176Q、T2504M、C2277R、E1724K、A2254V、A2394G、F4020L、E4076K、N4104I、H4108N、H4108Q、G4662S、H4762P、V4771I、P4902S、N4014K、及びN4895Dが挙げられる。
【００２２】
コモン一塩基多型は、ヒト間の遺伝的多様性の大部分を含み、RYR2遺伝子は、一方の対立遺伝子において又はもう一方の対立遺伝子において別個に標的とされ得る一塩基多型を含有する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、優性遺伝したCPVTに罹患したヒト個体又はマウスモデルにおいて対立遺伝子特異的遺伝子サイレンシングを行う方法であって、その必要がある被験体に、二本鎖短鎖干渉核酸(siNA)をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する発現カセットを有するベクターを投与することによる方法であり、前記siNAは、RYR2遺伝子のコード領域中のコモン一塩基多型(SNP)を標的とし、前記SNPは、同じ対立遺伝子中の又はもう一方の対立遺伝子中の変異と共分離し、それにより、野生型RYR2転写産物の発現をほとんど変化させずに、変異が存在するRYR2対立遺伝子がサイレンシングされる、方法を提供する。
【００２４】
SNPタイピング、及びSNPと変異との間の連鎖解析は、CPVT患者において日常的である遺伝子スクリーニングの時、又は患者が遺伝子治療アプローチで治療されることを勧められた時に、容易に評価され得る。
【００２５】
SNP部位で同じ配列が両方の対立遺伝子上に存在するため、ホモ接合性キャリアは、当然、変異の代理標的として作用するのに適していないので、利用可能なデータベース(Exome Variant Server)及びCPVT患者のコホートを使用して、SNPの頻度及び分布のバイオインフォマティクス評価が行われ、30％〜40％の間のマイナーな対立遺伝子頻度(MAF)を有し、それにより、比較的頻度が高いが、マイナー対立遺伝子のホモ接合性キャリアの高い割合をもたらすほど頻度が高すぎないSNPが同定されている。
【００２６】
バイオインフォマティクス研究を行うことにより、3つの主要なSNPが同定された: rs3765097(c.1359C>T; p.S453S)、rs684923(c.7806C>T; p.H2602H)及びrs34967813(c.8873A>G; p.Q2958R)。異なるデータベースによるこれらのSNPのMAFを表1に報告する。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
これらの3つのSNPを使用して、ヘテロ接合性キャリアの70％が3つのSNPのうち少なくとも1つを有すると推定されている。
【００２９】
この推定値を試験するために、本発明者らは、RYR2変異関連CPVTについて遺伝子型決定された176人の患者のコホートにおいて、これらの3つのSNPのキャリアの割合を定量化するための標的と分析を行った。本発明者らは、138人が3つのバリアントのうち少なくとも1つをヘテロ接合性で有し、一方、38人の患者のみがその多型のいずれをもヘテロ接合性で有していないことを観察した。
【００３０】
したがって、ほんの6個の特異的なsiNA、例えばmiRNAを作製することによって、患者を治療することが可能であり、それにより、RyR2変異を有するCPVT患者の大多数について対立遺伝子特異的なサイレンシング治療が可能になる。
【００３１】
このアプローチに基づいて、特異的なヒトヌクレオチドバリアント及びその野生型対応物を標的とする以下の一連のsiRNA二重鎖が設計された。21-merオリゴヌクレオチドは、in vitroスクリーニングにおいて特異的ヌクレオチド変化(複数可)に対する最良のサイレンシング効力及び選択性を実証しているsiRNA二重鎖配列に由来する。
【００３２】
SNP: rs3765097 p.(S453S)
原因となる変異がrs3765097とcisにあるかどうかを試験するためのsiRNA二重鎖
2019504648.tif 000004
【００３３】
【表２】
2019504648.tif 000005
【００３４】
原因となる変異がrs3765097とtransにあるかどうかを試験するためのsiRNA二重鎖
2019504648.tif 000006
【００３５】
【表３】
2019504648.tif 000007
【００３６】
SNP: rs684923 p.(H2602H)
原因となる変異がrs684923とcisにあるかどうかを試験するためのsiRNA二重鎖
2019504648.tif 000008
【００３７】
【表４】
2019504648.tif 000009
【００３８】
原因となる変異がrs684923とtransにあるかどうかを試験するためのsiRNA二重鎖
2019504648.tif 000010
【００３９】
【表５】
2019504648.tif 000011
【００４０】
SNP: rs34967813 p.(Q2958R)
原因となる変異がrs34967813とcisにあるかどうかを試験するためのsiRNA二重鎖
2019504648.tif 000012
【００４１】
【表６】
2019504648.tif 000013
【００４２】
原因となる変異がrs34967813とtransにあるかどうかを試験するためのsiRNA二重鎖
2019504648.tif 000014
【００４３】
【表７】
2019504648.tif 000015
【００４４】
変異型転写産物を抑制するためのSNPを標的とする対立遺伝子特異的サイレンシングの適用のための臨床的アプローチ
RYR2変異を含む対立遺伝子をサイレンシングするのに適したsiRNAを選択するためにクリニックで使用されるステップを示すフローチャートが、図1に示される。
【００４５】
この療法は、3つのSNPのそれぞれのWT又は変異型バリアントを標的とするための6つの異なる生成物で利用可能であり、目的の配列を含むRNA領域を標的とするようにsiNAが開発される: 1359C; 1359T; 7806C; 7806T; 8873A; 8873G。
【００４６】
対立遺伝子特異的サイレンシングによる遺伝子治療の候補であるRYR2遺伝子における病原変異の各CPVT患者キャリアは遺伝子型決定され、疾患原因変異及び3つのSNPの共分離を決定する。
【００４７】
変異と共分離するバリアント(複数可)が同定されると、患者は1つ又は2つ又は3つの生成物で治療するのに適している可能性がある。使用されるべき生成物の選択は、変異型とWT対立遺伝子との間で最も高い選択性を有する配列に基づく。
【００４８】
ヒト患者において、ヘテロ接合性である場合、二本鎖短鎖干渉核酸は、以下に限定されないが、rs3765097(c.1359C>T)、rs684923(c.7806C>T)及びrs34967813(c.8873A>G)を含む、コモンSNPに標的とされるため、それらを使用して、野生型から疾患原因変異を有する対立遺伝子を識別できる。これにより、RYR2遺伝子における異なる患者特異的変異をサイレンシングすることができる少数のsiNA配列を生成することが可能になる。
【００４９】
好ましい態様において、操作されたpre-siNA(例えば、pre-miRNA)発現カセットは、ベクター、好ましくはウイルスベクターに挿入される。pre-siNAコード配列は、プロモーターに作動可能に連結され、このプロモーターは、CMV、又は心臓特異的プロモーター、例えばcTnT、TnC、α-MHC、MLC-2、及び他の組織特異的プロモーターであり得る。
【００５０】
操作されたpre-siNA発現カセットは、好都合には、血清型9アデノ随伴ウイルス(AAV2/9)ベクターに挿入されてもよい。あるいは、操作されたpre-siNA発現カセットは、好都合には、血清型6アデノ随伴ウイルス(AAV2/6)ベクター又は血清型8アデノ随伴ウイルス(AAV2/8)ベクターに挿入されてもよい。
【００５１】
操作されたpre-miRNA発現カセットが発現のために心臓細胞に導入されると、pre-miRNAは、内在性pre-miRNAの構造と類似した分子内ステムループ構造を形成し、これは、次に、内在性Dicer酵素によって成熟miRNAにプロセシングされる(Cullen et al., 2004)。
【００５２】
本発明による方法は、変異型リアノジン受容体2型mRNAが、人工的に発現されたmiRNAによって選択的にノックダウンされるウイルス遺伝子治療法によって、常染色体優性CPVTを有する動物モデルにおける二方向性及び多形性の不整脈の修正を可能にする。
【００５３】
人工miRNA発現ベクターは、好ましくは心筋細胞に送達され、発現されるはずであり、それにより、心臓の正常かつ抗不整脈性の収縮機能が回復する。
【００５４】
別の実施形態において、本発明は、ヘテロ接合状態にある複数の対立遺伝子特異的siRNA二重鎖のin vitroスクリーニング方法であって、2つのレポーター対立遺伝子と、公知の配列を有するsiRNA二重鎖とを、培養したHEK-293細胞に共トランスフェクションすること、及び変異型対立遺伝子は実質的にサイレンシングされ、一方で、野生型対立遺伝子は実質的に正常な発現を保持しているかどうかを決定することを含む、方法を提供する。
【００５５】
具体的には、本発明は、RYR2遺伝子の野生型対立遺伝子と比較して、RYR2遺伝子の変異型対立遺伝子を選択的にサイレンシングすることができるsiNAを同定する方法であって、
i. HEK-293細胞に、変異型及び野生型レポーター対立遺伝子と、多様なsiNA二重鎖とを共トランスフェクトすること、
ii. 変異型対立遺伝子が野生型対立遺伝子と比較して実質的にサイレンシングされているかどうかを決定すること、及び
iii. 実質的なサイレンシングに関連するsiNAを決定し、それにより、RYR2遺伝子の野生型対立遺伝子と比較して変異型対立遺伝子を選択的にサイレンシングすることができるsiNAを同定すること
を含む、方法を提供する。
【００５６】
別の好ましい態様において、本発明によるsiNA分子は、好都合には、RyR2遺伝子のR4496C変異に関連するCRUの及びミトコンドリアにおける構造異常を防止する又は元に戻すことを可能にする。
【実施例】
【００５７】
実験設定
この研究では、遺伝子はマウスRyR2(NM_023868.2)であり、標的とされるヌクレオチドバリアントは、マウスRyR2タンパク質におけるR4496Cアミノ酸変化を引き起こすタンパク質コードmRNA上のC13483Tである。
【００５８】
RYR2遺伝子におけるR4496C変異を含む対立遺伝子をサイレンシングするための対立遺伝子特異的標的化研究
カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍のRyR2R4496C/+マウスモデルにおける変異型遺伝子の対立遺伝子特異的サイレンシングを誘導するためのAAV媒介RNA干渉アプローチ
1) レポーター対立遺伝子を用いた一過性発現系における複数のsiRNAのスクリーニング
細胞モデルを用いて、一過性発現系において変異型対立遺伝子を標的とすることが可能であるかどうかを試験した。野生型対立遺伝子より優先的に変異型対立遺伝子を認識し、かつ効率的にサイレンシングするsiRNAを同定するために、本発明者らは、複数の潜在的siRNAをスクリーニングするための一連のin vitro mRNA及びタンパク質ベースのアッセイを行った。
【００５９】
この系を使用して、2つのレポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を、培養したHEK-293細胞に共トランスフェクトすることによって生成されるヘテロ接合状態下で、対立遺伝子特異的サイレンシングにおける変異型対立遺伝子に対する一連のsiRNA二重鎖の効果、及びWT対立遺伝子に対するオフターゲットサイレンシングを調べることができる(図2)。レポーター対立遺伝子として、以下を含有する2つのプラスミドを生成した。
1) CMVプロモーターと、それに続く、WT-mRYR2(エクソン91〜96)に対応するマウスcDNA配列及びタグ配列(3×HA)にインフレームで連結されたレポーター遺伝子(赤色蛍光タンパク質、RFP)(図2)。
2) CMVプロモーターと、それに続く、R4496C-mRYR2(エクソン91〜96)に対応するマウスcDNA配列及びタグ配列(3×FLAG)にインフレームで連結されたレポーター遺伝子(緑色蛍光タンパク質、GFP)(図2)。
【００６０】
そのような対立遺伝子特異的RNAiを誘導するために、本発明者らは、対応する野生型対立遺伝子から標的疾患対立遺伝子を識別するための標的疾患対立遺伝子を特徴付けるヌクレオチド変異を有するsiRNAを設計した。野生型及び変異型RYR2 mRNA並びに設計されたsiRNAのヌクレオチド配列は、以下に示され(表8)、5'→3'センス鎖(パッセンジャー)siRNA要素の配列に基づく。変異型認識部位(MRS)には下線が引かれている(表8)。
【００６１】
2019504648.tif 000016
【００６２】
【表８】
2019504648.tif 000017
【００６３】
2) 一過性にトランスフェクトしたHek293細胞におけるリアルタイムPCR、蛍光顕微鏡及びウェスタンブロットによる野生型及び変異型対立遺伝子発現の評価
続いて、設計されたsiRNA二重鎖の、変異型及び野生型の両方の対立遺伝子の抑制に対する効果を、特異的プライマーでGFP及びRFP遺伝子を増幅するリアルタイムPCRによって調べ、野生型及び変異型対立遺伝子mRNAをそれぞれ定量した(発現データは、2-ΔΔCt法を用いて解析され、GAPDH発現で標準化され、スクランブルsiRNAで処理された細胞と比較されている)(図3)。
【００６４】
siRNA二重鎖の大部分は、RYR2 mRNA発現の抑制における強い効果を実証している。さらに、それらのうちのいくつかは、変異型対立遺伝子に対して非常に選択的であった。
【００６５】
したがって、本発明者らは、この最初のスクリーニングから5つのsiRNAを選択し(siRyR-U8、U9、U10、U14及びU16)、緑色及び赤色蛍光を可視化するための共焦点顕微鏡法(図4)、並びに抗HA及び抗FLAGエピトープの特異的抗体を用いたウェスタンブロットによってそれらの効果を深く分析して、野生型及び変異型対立遺伝子の相対的タンパク質発現をそれぞれ評価した(図5)。
【００６６】
3) 人工miRNA発現AAV骨格プラスミドへの候補siRNAのクローニング及び確認
前のステップから、本発明者らは、siRyR-U10を、サイレンシング分子の連続的及び長期的な発現を可能にする人工miRNA発現ベクターにクローニングすべき候補として選択した。
【００６７】
このsiRNAは、野生型対立遺伝子に対して弱い抑制を誘導するが、変異型対立遺伝子に対して強いサイレンシングを誘導するため、有望であった。
【００６８】
中間ベクターとして、本発明者らは、BLOCK-iT(商標)Pol II miR RNAi発現ベクター(Life Technologies)を使用した。このベクターは、従来のPol III-shRNA発現プラスミドを超える以下の3つの利点を有する。
【００６９】
1. ポリメラーゼII転写された人工miRNAは、shRNAと比較して強力な遺伝子サイレンシング能力を維持しながら、忍容性レベルで発現され、一方そのshRNAは、Pol IIIプロモーターからのそれらの調節されていない大量の発現のために毒性を誘導し得る。
2. エメラルドGFP(EmGFP)の共シストロン性発現は、本発明者らのmi-RNAiからのノックダウンとEmGFP発現との相関をもたらす。
3. 組織特異的又は他の調節されたプロモーター(又は組織特異的)を用いる選択肢を有する、CMV前初期プロモーターからの強力な発現。
【００７０】
続いて、CMVプロモーター、EmGFP、pre-miRNA配列及びTKpolyAからなる断片を、BLOCK-iT(商標)Pol II miR RNAi発現ベクター(Life Technologies)から増幅し、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターコア機関(Tigem, Napoli, Italy)によって提供されたアデノ随伴ウイルス骨格ベクターpAAV2.1にサブクローニングした(図6)。
【００７１】
得られたプラスミドを、2つのレポーター対立遺伝子のトランスフェクションによって作製されたヘテロ接合状態を有するHek293細胞系におけるリアルタイム(図7)及びウェスタンブロット(図8)分析によって確認した。miRYR2-U10は、野生型を超えて変異型対立遺伝子発現を実質的に抑制することにおけるsiRYR-U10の能力を保持することが実証された。発現データを、レポーター対立遺伝子及びmiRNAスクランブル発現プラスミドをトランスフェクトした細胞で得られた結果と比較した(図7〜8)。
【００７２】
4) 効率的なmiRYR2-U10移入のためのAAV2/9ベクターを用いた心臓マウス筋細胞のin vivo感染
本発明者らは、腹腔内(I.P.)注射により、miRYR2-U10発現カセットを含有する血清型9アデノ随伴ウイルス(AAV2/9)ベクター100μlを用いて、新生仔(出生後P8/P9)RyR2R4496C/+ヘテロ接合マウスに感染させた(図5)。マウスをその発達中にモニターしたが、本発明者らは非感染同腹仔と比較したいずれの差異も観察しなかった。マウスの感染効率を評価するために、本発明者らは、感染8週間後の酵素消化による心筋細胞単離の標準的な手順を行った(4)。単離された細胞をカバーガラス上にプレーティングし、レポーター遺伝子eGFPの発現の存在及びレベルを評価するために蛍光顕微鏡で観察した(図9)。
【００７３】
5) AAV2/9-miRYR2-U10感染は、RyR2R4496C/+ヘテロ接合心臓細胞の機能的表現型を回復させる
本発明者らの以前の調査から、本発明者らは、CPVT不整脈が、単一の心筋細胞のレベルでの遅延後脱分極(DAD)及び撃発活動(TA)によって引き起こされることを知っていた。パッチクランプ技術を用いて(電流クランプモードで)、本発明者らは、基礎状態における及びアドレナリン刺激後のDAD及び/又はTAの発生を分析した。
【００７４】
落射蛍光シグナル(本発明者らのウイルス構築物に存在するEmGFP由来)を用いて、非感染(すなわち、非蛍光)細胞と感染(すなわち、緑色蛍光)細胞とを区別し、DAD及びTA発生の比較アッセイを行った。単離された筋細胞を拡張期閾値の1.5倍で5Hzの周波数でペーシングし、活動電位を連続的に記録した。GFP陰性(非蛍光)細胞の平均67％が、ISO(30nM)刺激後にTAを示したが、同じ実験条件下で、GFP陽性感染細胞の6％のみがTAを示した(図10)。
【００７５】
6) RyR2R4496C/+マウスで観察された機能不全特性のin vivo修正
本発明者らは、皮下ECGテレメーターを用いて、安静状態における不整脈の発生率と、エピネフリン及びカフェイン注射によって誘導されたアドレナリン作動性ストレスの間の不整脈の発生率をモニターし、比較した。
【００７６】
本発明者らは、本発明者らの常染色体優性CPVTマウスモデルの以前の特徴付けから、RyR2R4496C/+ヘテロ接合マウスの少なくとも50％〜60％は、エピネフリン及びカフェイン注射によって誘導されるアドレナリン作動性ストレスの間に二方向性心室頻拍を示すことを知っている(Cerrone M et al., 2005)。逆に、本発明者らは、AAV9-miRYR2-U10に感染した本発明者らのRyR2R4496C/+ヘテロ接合CPVTマウスモデルにおいて不整脈原性基質のin vivo特徴づけを行ったとき、10匹の処置されたマウスにおいて、1匹のみが心室性不整脈を発症した(10％)ことを観察した。
【００７７】
本発明者らは、新生仔マウスで試験された治療用構築物の投与が、成体マウスにおいても不整脈基質を元に戻すことができるかどうかを評価するための実験を行った。したがって本発明者らは、新しい一連の動物を研究し、8週齢のRyR2R4496C/+ヘテロ接合マウス(Het)で起こる不整脈事象を、AAV9-miRYR2-U10(Het-U10)及びAAV9-miRNA-スクランブル(Het-SCR)に感染したRyR2R4496C/+ヘテロ接合マウスで感染2ヶ月後に観察される不整脈事象と比較した(図11A)。データは、Hetマウスの52％(11/21)及びHet-SCRマウスの65％(15/23)が典型的な二方向性心室頻拍を示し、一方で、miRYR2-U10による処置が不整脈の発症を完全に防止したことを示した(0/25; Het-U10対Het-SCR ***P<0.001; Het-U10対Het ***P<0.001; 図11B)。成人期のウイルス送達2ヶ月後の3ヶ月齢のマウスにおいても不整脈感受性のin vivo評価を行い、Het-SCR(13/21、62％)及びHetマウス(10/20、50％)と比較して、Het-U10(2/24、8％)では心室頻拍発生の注目すべき減少が明らかになった(Het-U10対Het-SCR ***P<0.001; Het-U10対Het *P<0.05; 図11C)。このデータセットは、対立遺伝子特異的なサイレンシングに基づく遺伝子治療が、出生時に投与されたときに不整脈事象の発生を防止するだけでなく、思春期後の動物に送達されたときにも不整脈原性基質を元に戻すことを実証する。
【００７８】
7) RYR2R4497C/WT心臓におけるCRUの形態変化は、AAV2/9-miRYR2-U10ウイルス感染によって救済される
本発明者らが、WT及びRyR2R4496C/+ヘテロ接合マウスの心臓組織について電子顕微鏡検査を行い、劣性CPVTを有するマウスと同様に(Denegri M et al., 2014)、CPVTの優性形態を有するマウスも超微細構造異常を示すかどうかを調べたところ、本発明者らは、カルシウム放出ユニット(CRU)の構造に異常を観察した(図12)。jSRの表面上で、リアノジン受容体チャネルを可視化することができる(図12A、小さな矢印)。WT心筋細胞では、jSR槽は通常狭く平らである。カルセクエストリン-2(CASQ2)は、SR膜と平行に走る鎖状の電子密度の高い線としてはっきりと見える(図12A)。RyR2R4496C/+心筋細胞では、jSRの形状はより多様でわずかに幅広であり、CASQ2の鎖状の電子密度の高い重合体(図12; 単一の黒色矢印)を常に含有するとは限らない。AAV2/9-miRNA-スクランブルを感染させたRyR2R4496C/+ヘテロ接合マウス(Het-SCR)由来の心筋細胞では、CRUはHet心筋細胞の場合と同様に見え(図12D)、一方で、AAV2/9-miRYR2-U10によるウイルス感染は、CRUプロファイルを救済し、回復させる(Het-U10; 図12C)。興味深いことに、本発明者らは、WTマウスからの心臓サンプルが、平行して密に詰まった内部クリステを有する電子密度の高いマトリックスを示す、互いに横方向によく整列した収縮要素、及び筋原繊維間に縦方向に分布するミトコンドリアを有する(図13A)一方で、Hetマウスの心臓由来の筋細胞の約46％が、空の細胞質空間の増加及び収縮要素の変化を伴う、損傷したミトコンドリアを示した(図13B〜C)ことも観察した。関連して、AAV2/9-miRYR2-U10で処置された心臓(Het-U10; 図13E)は、重度のミトコンドリア異常を有する心臓細胞の割合の減少を示した(Hetの46％からHet-U10の28％; 図13F)が、AAV2/9-miRNA-スクランブルで処置された心臓では示さなかった(Het-SCR; 図13D)。
【００７９】
8) ヒトRYR2遺伝子におけるrs3765097(c.1359C>T; p.S453S)又はそのWT対応物を含む転写産物の発現を抑制することができる、対立遺伝子特異的サイレンシング分子のin vitro同定
野生型RYR2転写産物の発現をほとんど変化させずに、変異が存在するhRYR2対立遺伝子がサイレンシングされるように、ヒトRYR2遺伝子、及び同じ対立遺伝子中の又はもう一方の対立遺伝子中の変異と共分離するコモンSNPにも上記の方法を移行するため、野生型対立遺伝子より優先的にSNP含有対立遺伝子を認識し、かつ効率的にサイレンシングする分子(SNPが変異とcisにある状況を模倣する)、及びその逆の分子(SNPが変異とtransにある状況を模倣する)を同定するように、本発明者らは、複数の潜在的siRNAをスクリーニングするための一連のin vitro mRNA及びタンパク質ベースのアッセイを行った。試験したsiRNAは、T含有対立遺伝子を標的とするための配列番号4〜配列番号18、及びC含有対立遺伝子を標的とするための配列番号21〜配列番号35の配列である。
【００８０】
2つのレポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を、培養したHEK-293細胞に共トランスフェクトすることによって生成されるヘテロ接合状態下で、対立遺伝子特異的サイレンシングにおける試験したsiRNA二重鎖の効果、及びオフターゲット効果を調べた。レポーター対立遺伝子として、以下を含有する2つのプラスミドを生成した。
1) CMVプロモーターと、それに続く、WT-hRYR2(エクソン11〜15)に対応するマウスcDNA配列及びタグ配列(3×HA)にインフレームで連結されたレポーター遺伝子(赤色蛍光タンパク質、RFP)。
2) CMVプロモーターと、それに続く、S453S-hRYR2(エクソン11〜15)に対応するマウスcDNA配列及びタグ配列(3×FLAG)にインフレームで連結されたレポーター遺伝子(緑色蛍光タンパク質、GFP)。
【００８１】
興味深いことに、ヒトRYR2遺伝子のエクソン15のrs3765097に標的とされたいくつかのsiRNAは、非キャリア対立遺伝子の発現の変化は最小限のままで、多型キャリア対立遺伝子の発現を抑制することができる(図14参照)。
【００８２】
材料及び方法
動物の使用
動物は、イタリアのカルコ(Calco)のCharles River Laboratoriesで維持及び飼育され、表現型の特徴付けのためにMaugeri Foundationに移された。動物は、Maugeri FoundationのAnimal Care and Use機関によって承認されたプロトコールに従って維持及び研究された。アデノ随伴ウイルス送達は、成体マウス(8週齢)及び/又は新生仔マウス(出生後9日目(P9)前)における、25ゲージシリンジを用いた100〜200μlの精製ウイルスの尾静脈内及び/又は腹腔内注射によるものであった。
【００８３】
定量的リアルタイムPCR
リアルタイムPCRを、Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection Systemを用いて行い、Bio-Rad CFX Managerソフトウェアパッケージ(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)を用いて分析した。簡潔に言えば、全RNAを、レポーター対立遺伝子とsiRNA二重鎖、又はレポーター対立遺伝子とpAAV2.1-miRyRU10若しくはpAAV2.1-miRNAスクランブルを一過性にトランスフェクトしたHek293細胞から、Rneasyミニキット(Qiagen)を用いて精製した。260nmでの吸光度(A260)を、NanoDrop(ND-1000)分光光度計(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)を用いて、各RNA試料について測定した。全量1μgの鋳型RNAを、iScript cDNA Synthesisキット(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)で行った逆転写に使用した。定量的リアルタイムPCR分析を、変異型対立遺伝子又は野生型mRNAをそれぞれ定量するためのプライマーミックスである、GFP又はRFP配列(フォワード: 5'-CTATATCATGGCCGACAAGCAG-3'(配列番号120)、5'-GCGTGATGAACTTCGAGGACG-3'(配列番号121)、リバース: 5'-GCTCGTCCATGCCGAGCGTG-3'(配列番号122)、5'-CAGCCCATGGTCTTCTTCTGC(配列番号123))、FLAG又はHA(フォワード: 5'-GAACCTCCAGCGATACTGC-3'(配列番号124)、リバース: 5'-CTGGTACCCTTGTCATCGTCATCCTTGTAATCG-3'(配列番号125)、5'-CTGGTAACCTATTAAGCGTAGTCAGGTAC(配列番号126))を選択的に増幅するための特異的プライマーミックス、並びに20ngのcDNA鋳型を用いたSsoFast EvaGreen Supermixを用いて、三重試験で、CFX96検出モジュール(Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いて光学96ウェルプレートで行った。閾値サイクル(Ct)決定値は、Bio-Rad CFX Managerソフトウェア1.5により自動的に生成された。GAPDHを、以下のプライマーを用いて内部参照として使用した: フォワード: 5'-AAATCCCATCACCATCTTCC-3'(配列番号127)及びリバース: 5'-GGTTCACACCCATGACGAAC-3'(配列番号128)。
【００８４】
蛍光顕微鏡法
レポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖を一過性にトランスフェクトしたHek293細胞を、室温で10分間、3.7％パラホルムアルデヒド中でカバーガラス上で固定した。次いで、カバーガラスをPBS中で穏やかに振とうしながら洗浄した。細胞をPBS中で数回洗浄し、封入剤(Dako Fluorescent Mounting Medium, Dako North America, Inc, CA)を用いてスライド上に載せた。共焦点顕微鏡検査を、HCX PL APO 40x/開口数=1.25油浸対物レンズを備えたLeica TCS-SP2デジタル走査型共焦点顕微鏡を用いて行った。本発明者らは、EmGFPの励起に488nmのアルゴンレーザー線を使用し、RFPの励起に594nmのHe/Neレーザー線を使用した。ピンホールの直径はエアリー(Airy)1で維持した。画像を、Adobe Photoshop CS3(Adobe Systems, Mountain View, CA)にエクスポートした。
【００８５】
イムノブロッティング
レポーター対立遺伝子及びsiRNA二重鎖、又はレポーター対立遺伝子及びpAAV2.1-miRyRU10若しくはpAAV2.1-miRNAスクランブルを一過性にトランスフェクトしたHek293細胞を、RIPA緩衝液中で溶解し、全タンパク質を抽出した。全タンパク質(30μg/サンプル、BCAアッセイによって定量化)を、10×トリス/グリシン/SDS緩衝液(BIORAD)を用いたMini PROTEAN TGX Stain-Free 4-15％勾配ゲル(BIORAD)でのSDSゲル電気泳動により分離し、Trans Blot Turbo Transfer System(BIORAD)を用いて0.2μmのニトロセルロース上にブロットした。そのメンブレンを、種々の抗体、すなわち、抗FLAG(F3165, SIGMA)、抗HA(H3663, SIGMA)及び抗アクチン(A1978, SIGMA)(参照タンパク質として)を用いてプローブした。二次抗体をHRP(1:5000, Promega)とコンジュゲートさせた。特異的シグナルを、Clarity Western ECL基質(BIORAD)を用いて発生させ、ChemiDoc MP Imaging System(BIORAD)を用いて検出した。
【００８６】
ECGモニタリング及び薬物試験
ECGラジオテレメトリーモニター(Data Sciences International)を、全身麻酔下(Avertin 0.025mg/kg)で皮下移植した。体温を、熱制御加熱パッド(Harvard Apparatus)を用いて37℃に維持した。手術から72時間回復した後、表現型の特徴付けを行った。まず、基礎ECGを10分間記録し、不整脈の存在を調べた。続いて、制御された刺激下で心室性不整脈を誘導するために、マウスにエピネフリン及びカフェインを注射した(I.P.により、それぞれ2及び120mg/kg)。ECG記録を行っている間、全ての動物は自由に動いていた。
【００８７】
成体マウスの心室筋細胞の単離
心室筋細胞を、確立された酵素消化プロトコール(Hilal-Dandan et al., 2000)を用いて、それぞれの性別の、RyR2R4496C/+ヘテロ接合マウス、AAV9-miRyR2-U10に感染したRyR2R4496C/+ヘテロ接合マウス、及び野生型(WT)マウス(8週)から単離した。
【００８８】
単離した心室筋細胞における電気生理学的記録
心筋細胞を、倒立顕微鏡のステージ上に取り付けられたガラス底灌流チャンバーに播種した。5分後、筋細胞を、140 NaCl、4 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES、及び5 グルコース(mmol/L単位)を含有する溶液(NaOHでpH 7.4)に浸した。ディッシュを囲む、サーモスタット制御の加熱リングを用いて、浴溶液を35℃に維持した。膜内外電位差を、MultiClamp 700B増幅器(Axon Instruments)を用いて、全細胞電流クランプモードで記録した。パッチ電極は、P-97水平プラー(Sutter Instruments)上でホウケイ酸ガラス(WPI, Inc.)から引き出した。電極は、120 アスパラギン酸カリウム、20 KCl、1 MgCl2、4 Na2ATP、0.1 GTP、10 HEPES、10 グルコース(mmol/L単位)を含有するパッチ電極溶液(NaOHでpH 7.2)で充填した場合、2〜3MΩの抵抗を有した。全てのシグナルを10kHzで取得し(Digidata 1322A, Axon Instruments)、pCLAMPバージョン9.2ソフトウェア(Axon Instruments)を実行するパーソナルコンピュータを使用して分析した。明瞭な横紋を有し、-80mV以下の静止電位を有する、静止期のカルシウム耐性の棒状細胞のみを、電気生理学的記録に用いた。筋細胞を、3msの持続時間、及び活動電位を引き起こすのに必要とされる最小電流の1.5倍の振幅を有する脱分極パルスを用いて、パッチ電極による細胞内電流注入によって電気的に刺激した。ピペットと浴溶液との間の液間電位差を、pCLAMPソフトウェアを用いて計算し、実験後に修正した。
【００８９】
ベクターの設計及び生成
R4496C変異を含有するRYR2 mRNA(NM_023868.2)を標的とするように設計されたsiRYR2-U10 siRNA二重鎖配列を、サイレンシング分子の連続的及び長期的な発現を可能にする人工miRNA発現ベクターBLOCK-iT(商標)Pol II miR RNAi発現ベクター(Life Technologies、カタログ番号: K4936-00)中にクローニングした。クローニング手順は、アニーリングされたオリゴヌクレオチド(5'TGCTGTAAAAGTTGCAAGCAAAATAGTTTTG 3'(配列番号129)、5'GCCACTGACTGACTATTTTGCGCAACTTTTAC 3'(配列番号130)、5'CCTGGTAAAAGTTGCGCAAAATAGTCAGTCA 3'(配列番号131)、5'GTGGCCAAAACTATTTTGCTTGCAACTTTTAC 3'(配列番号132))の、直鎖化したベクター(pcDNA(商標)6.2-GW/EmGFPmiR-(Life Technologies、カタログ番号: K4936-00))とのライゲーションに基づく。
【００９０】
得られたプラスミドから、CMVプロモーター、EmGFP、premiRNA配列及びTKpolyAからなる断片を、NheI(フォワード)及びEco RI(リバース)クローニング部位を含む特異的プライマー(フォワード: 5' TAGCTAGCTGCTTCGCGATGTACGG 3'(配列番号133)及びリバース 5' GTGAATTCGAACAAACGACCCAACACCCG 3'(配列番号134))を用いたPCRによって増幅し、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターコア機関(Tigem, Napoli, Italy)によって提供された、予め消化されたNhe I-Eco RI部位アデノ随伴ウイルス骨格ベクターpAAV-2.1に挿入した。全ての使用したプラスミドを配列決定した。
【００９１】
AAVの生成は、Tigemコア機関と協力して行った(http://www.tigem.it/core-facilities/adeno-associated-virus-aav-vector-core)。AAVベクターを、pAdヘルパー、pAAV rep-cap(パッケージング)、pAAV Cis(pAAV2.1-CMV-eGFPプラスミドMCS中にクローニングされた本発明者らの挿入物であるmiRYR2を含む)の3つのプラスミドの、293細胞への一過性トランスフェクションを用いて生成した。ベクターを、CsCl遠心分離によって精製し、リアルタイムPCR及び物理的タイターのドットブロット分析、又はSDS PAGEのクマシー染色などの品質管理を行い、キャプシドタンパク質の存在及び純度、感染性(eGFP+細胞/ml、CMV-eGFP調製物についてのみ)及び無菌性(大型動物で使用される調製物について)を評価した。当該サービスは、総収量>1×1012ゲノムコピーを有するPBS中のウイルス調製物で戻された。全てのAAVストックを、単一バイアル中で-80℃で凍結し、外科手術中に解凍した。
【００９２】
電子顕微鏡法
WT、ヘテロ接合RyR2R4496C/+及び感染したヘテロ接合RyR2R4496C/+マウスから単離された心臓を、0.1mol/LのNaCaCo緩衝液(pH7.2)中の3.5％グルタルアルデヒドで逆行性大動脈灌流により固定し、分析した。乳頭筋の小束を、NaCaCo緩衝液中の2％OsO4で2時間、後固定し、次いで、飽和酢酸ウラニル中でブロック染色した。脱水後、標本をエポキシ樹脂(Epon 812)中に包埋した。超薄切片を、Diatomeダイヤモンドナイフ(Diatome Ltd. CH-2501 Biel, Switzerland)を用いてLeica Ultracut Rミクロトーム(Leica Microsystem, Austria)で切断し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で二重染色した。全ての切片を、Megaview IIIデジタルカメラ及びSoft Imaging System(Munster, Germany)を備えたFP 505 Morgagni Series 268D電子顕微鏡(FEI Company, Brno, Czech Republic)で調べた。重度の構造変化を示す心臓細胞の割合を定量化した。重度の損傷と考えられる細胞は、内部の大部分におけるミトコンドリアに影響を及ぼす重度の構造異常を特徴とする。ほとんどの場合、重度に変化したミトコンドリアを有する心臓細胞はまた、見たところ空の細胞質空間の広い領域、及び収縮要素に影響を及ぼす変化を示す。
【００９３】
略語
以下の略語を本明細書で使用している。CASQ2: カルセクエストリン2; CPVT: カテコールアミン誘発性多形性心室頻拍; CICR: カルシウム誘発性カルシウム放出; CRU: カルシウム放出ユニット; DAD: 遅延後脱分極; ECカップリング: 興奮収縮連関; ECG: 心電図; CMV: サイトメガロウイルス; GFP: 緑色蛍光タンパク質; RFP: 赤色蛍光タンパク質; AAV: アデノ随伴ウイルス; EP: 電気生理学; I.P.: 腹腔内; ISO: イソプロテレノール; RYR2: リアノジン受容体2型; WT: 野生型; siRNA: 低分子干渉RNA; miRNA: マイクロRNA; SNP: 一塩基多型; HA: ヒトインフルエンザヘマグルチニン; MRS: 変異型認識部位; RNAi: RNA干渉; TK polyA: HSVチミジンキナーゼ(TK)ポリアデニル化シグナル配列。
【００９４】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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