(57)【要約】  本発明は、細胞質浸透抗体およびその用途に関し、具体的には、生きている細胞内部に細胞膜の膜タンパク質を介して内在化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）した後、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）へ脱出する、エンドソーム脱出を起こす構造的な機序を究明し、エンドソーム脱出効率性が著しく向上した細胞質に位置する軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域、それを含む細胞質浸透抗体、その製造方法、およびその用途に関する。【選択図】図１
2019520086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で表される配列をＣＤＲ３に含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含み、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１
［ここで、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はエンドソーム脱出能モチーフであり、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、
Ｚ１は、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択されるものである］
前記Ｚ１を含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、エンドソーム酸性ｐＨ条件で抗体の特性変化を起こし、
前記抗体の特性変化により、抗体がエンドソームから細胞質への脱出能を示すことを特徴とする、細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸は、前記Ｚ１とエンドソーム酸性ｐＨ条件で相互作用して特性変化を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のエンドソーム脱出能モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３は、トリプトファンを１つ以上含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のエンドソーム脱出能モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３は、次の群から選択される配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片：
Ｗ−Ｗ−Ｗ、Ｗ−Ｗ−Ｈ、Ｗ−Ｙ−Ｗ、Ｙ−Ｗ−Ｗ、Ｗ−Ｙ−Ｈ及びＹ−Ｗ−Ｈ［ここで、Ｗはトリプトファンであり、Ｙはチロシンであり、Ｈはヒスチジンである］。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域は、前記Ｘ３とＺ１との間に、（ａ１−…−ａｎ）で表されるアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記配列は、前記Ｘ１と連結されるＺ２をさらに含み、下記の一般式で表されることを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片：
Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１
［ここで、前記Ｚ２は、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）およびヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される］。
【請求項８】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸が前記Ｚ１および／またはＺ２とエンドソーム酸性ｐＨ条件で相互作用し、特性変化を誘導することを特徴とする、請求項７に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域は、前記Ｘ１とＺ２との間に、（ｂ１−…−ｂｎ）で表されるアミノ酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号８〜１２、２４および５１で構成された群から選択される１つ以上の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記重鎖可変領域のＣＤＲ３は、配列番号４６〜４９、および５３で構成された群から選択される１つ以上の配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１〜５、１３〜２３、２５〜３７、５０、および６０〜６４で構成された群から選択される軽鎖可変領域の配列と８０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記重鎖可変領域は、配列番号３９〜４２、５２、および５４〜５９で構成された群から選択される重鎖可変領域の配列と８０％以上の相同性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
完全免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ；ＩｇＧ）形態であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞質内活性物質伝達用組成物。
【請求項１９】
前記活性物質は、ペプチド、タンパク質、毒素、抗体、抗体切片、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
エンドソーム脱出能モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１［ここで、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される］を軽鎖および／または重鎖可変領域のＣＤＲ３にグラフトする（ｇｒａｆｔｉｎｇ）ステップを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質浸透抗体およびその用途に関し、具体的に、生きている細胞内部に細胞膜の膜タンパク質を介して内在化（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）してエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）へ脱出するエンドソーム脱出能力が著しく向上されるように、細胞質に分布する細胞質浸透抗体（Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）のエンドソーム脱出効能を高めることができるエンドソーム脱出誘導モチーフ、それを含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域、それを含む細胞質浸透抗体、その製造方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般の抗体と高分子バイオ医薬品は、疎水性である細胞膜を通過できないため、細胞質内部の様々な疾病関連物質と結合し、それを阻害することができないという限界がある。また、既存の抗体は、大きいサイズと親水性により、生きている細胞（ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の内部に直接浸透することができない。
【０００３】
したがって、既存の抗体の殆どは、細胞外に分泌されたタンパク質または細胞膜タンパク質を特異的に標的としている。
【０００４】
また、一般に、細胞の生長、特異的抑制などのような機序研究のための実験で用いられる、細胞内部物質と特異的に結合する商業的抗体は、生きている細胞に対して直接処理することが不可能であり、細胞内部物質と結合するためには、両親媒性グリコシドであるサポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）を用いた細胞膜透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）工程により細胞膜に穿孔を形成するための前処理工程が要求される。
【０００５】
ターゲットタンパク質に高特異的、高親和度で結合する特徴により、細胞膜または細胞外に分泌されたタンパク質を標的とする多数の治療用抗体が開発されてきた。細胞膜タンパク質を標的とする抗体は、細胞膜タンパク質に結合した後、膜受容体タンパク質の内在化（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）過程を経てエンドソーム経路（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）を介して細胞内部に入ることができる。
【０００６】
このような過程は、最初に初期エンドソーム（ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）過程の後、様々な経路を経る。すなわち、１）殆どの抗体は、初期エンドソームから後期エンドソーム（ｌａｔｅ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）を経て、リソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）へ移動し、酸性雰囲気条件とタンパク質加水分解酵素によって完全に破壊される経路を辿ることとなり、２）一部の抗体は、初期エンドソーム酸性条件でＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）受容体と結合し、リサイクリングエンドソーム（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）経路により、さらに細胞外に出る経路を辿ることができる。
【０００７】
したがって、殆どの抗体は、ターゲット膜タンパク質との強い結合によってリソソーム経路を辿って殆どが破壊される。前記エンドソーム経路において、エンドソームの成熟化に伴って、内部がプロトンポンプ（ｐｒｏｔｏｎ  ｐｕｍｐ）によって徐々に酸性化されるが、初期エンドソームのｐＨは５．５−６．５、後期エンドソームのｐＨは４．５−５．５、リソソームのｐＨは３．５−４．５程度であると知られており（Ｑｕａｄｉｒ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；  Ｌｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、エンドソームの内部で多くのタンパク質加水分解酵素が活性化され、外部から内在化されたタンパク質がエンドソームの内部で破壊される。
【０００８】
結局、抗体が受容体による細胞内への内在化の後にエンドソーム経路に沿って移動する際に、リソソームに行く前に初期または後期エンドソームから脱出して細胞質に位置するためには、ターゲット膜タンパク質と分離され、エンドソームに穿孔を設けて脱出しなければならない。
【０００９】
細胞の内部にある自然界に存在する物質のうちウイルスおよび毒素などは、細胞内在化（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により能動的に生きている細胞内部へ浸透すると知られている。細胞内在化によって細胞内部に浸透した物質が細胞質で活性を示すためには、エンドソームから細胞質へ脱出する過程、「エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ）」が必須である。エンドソーム脱出機序（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）については未だに明らかになっていないが、現在までのエンドソーム脱出機序についての仮説として、大きく３つが挙げられる。
【００１０】
第一の仮説は、エンドソーム膜に穿孔を形成する機序であって、エンドソーム膜に、カチオン両親媒性ペプチド（Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のような物質が負電荷の細胞二重脂質膜に結合して内部応力または内膜収縮を起こし、結果として円筒状の孔（ｂａｒｒｅｌ−ｓｔａｖｅ  ｐｏｒｅ）またはドーナツ状の通路（ｔｏｒｏｉｄａｌ  ｃｈａｎｎｅｌ）を形成するということであり  （Ｊｅｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、穿孔形成機序（ｐｏｒｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と呼ばれる。
【００１１】
第二の仮説は、プロトンスポンジ効果（ｐｒｏｔｏｎ  ｓｐｏｎｇｅ  ｅｆｆｅｃｔ）によってエンドソームが裂ける機序であって、プロトン化アミン基（ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ  ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）により、アミン基を有する物質の高い緩衝効果によってエンドソームの浸透圧が増加することで、エンドソーム膜が崩壊され得るということである（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｂｅｒｓｅｎ，２００８）。
【００１２】
第三の仮説は、中性では親水性のコイル状を保持するが、エンドソームのような酸性では疎水性の螺旋状構造に変形される特定のモチーフがエンドソーム膜と融合することで、モチーフが含まれたウイルスおよび毒素がエンドソームから脱出するという仮説であり、脂質膜融合機序（Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と呼ばれる（Ｋａｒｅｎ  Ｊ．  Ｃｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。かかる３つの仮説が、ウイルスタンパク質および植物／バクテリア由来の毒素タンパク質の細胞内在化の後、エンドソームから脱出する機序として提案されている。しかしながら、抗体における、このようなエンドソーム脱出機序は具体的に解明されていない。
【００１３】
上記のようなエンドソーム脱出機序において共通的に観察される現象は、エンドソームおよびリソソームの環境である酸性ｐＨ条件でエンドソーム脱出が起こるという点である。ｐＨに応じて機能が変化するタンパク質の場合、ｐＨに応じて構造が変化する特性を有する。負電荷を帯びるアミノ酸（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））と疎水性アミノ酸（メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ））は、中性のｐＨ条件で相互作用がないが、ｐＨが低くなるにつれて、負電荷を帯びるアミノ酸の側鎖のカルボキシル酸（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ａｃｉｄｓ、ＣＯＯ−）が水素化されて（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）疎水性を有することになり（Ｋｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、次いで、周辺の疎水性アミノ酸と疎水性相互作用（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をすることができることになる。その結果、２つのアミノ酸間の距離が近くなり、全体的なタンパク質の構造および機能が変化する。このような変化を起こす現象は、タンフォードトランジション（Ｔａｎｆｏｒｄ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）と命名されている（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００１４】
一例として、窒素輸送酵素であるニトロフォリン４（Ｎｉｔｒｏｐｈｏｒｉｎ  ４）は、中性の水素イオン濃度条件で開放型構造を有するが、ｐＨが中性（ｐＨ７．４）から弱酸性（ｐＨ６．０）に低くなるにつれて、アスパラギン酸とロイシンの疎水性相互作用によって閉鎖型構造に変化することで、窒素輸送機能を行うことになる（Ｄｉ  Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００１５】
しかし、現在まで、抗体ではこのようなｐＨ依存的な構造変化が明らかになっておらず、特に、細胞内在化をする抗体については報告されていない。
【００１６】
一例として、従来の抗体技術において、ｐＨ依存的な抗原結合を誘導するための抗体工学的改良技術は、抗原結合部位、すなわち、ＣＤＲｓ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）のヒスチジン（Ｈ）導入、またはヒスチジン（Ｈ）を含んでいるランダム突然変異が導入されたライブラリーにおける、ｐＨ依存的な抗原結合抗体の選別方法である（Ｂｏｎｖｉｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかし、２つの方法は、何れも構造の変化をもたらさず、ｐＨ依存的な抗原結合を誘導するためには、ライブラリーに基づく選別作業が先行されなければならないという限界を有している。
【００１７】
細胞質の内部で活性を示す物質の効果を高めるためには、窮極的に細胞質に位置する物質の量が増加しなければならないため、エンドソーム脱出能を向上させるための研究が行われたことがある。かかる研究は、細胞浸透ペプチド（Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＰＰ）で主に行われてきた。一部の細胞浸透ペプチドがエンドソーム脱出経路を介して細胞質に位置すると報告されたが、正確なエンドソーム脱出機序に関する詳細な研究がなく、エンドソーム脱出効率も非常に低くて、細胞内在化されたペプチドの約０．１〜４％程度のみが細胞質で分布すると知られている。
【００１８】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、細胞の内部に浸透して細胞質に分布する細胞質浸透抗体（Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）のエンドソーム脱出効能を高めることができるエンドソーム脱出モチーフを解明し、それに基づいて、エンドソーム脱出能が向上したエンドソーム脱出モチーフを有する軽鎖または重鎖可変領域、およびそれを含む抗体、またはその抗原結合断片を開発することができることを確認した。
【００１９】
また、本出願の発明者らは、このようなエンドソーム脱出モチーフを、その他の種類の軽鎖または重鎖可変領域にグラフトすることで、エンドソーム脱出能を有する細胞質浸透抗体が製造できることを確認し、本発明を完成した。
【００２０】
本背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に既知の先行技術を形成する情報を含まないことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、エンドソーム脱出能を有する細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片を提供するところにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供するところにある。
【００２３】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸を含むベクター，  前記ベクターで形質転換された細胞および前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供するところにある。
【００２４】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体−薬物接合体を提供するところにある。
【００２５】
本発明のさらに他の目的は、前記細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞質内活性物質伝達用組成物を提供するところにある。
【００２６】
本発明のさらに他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
前記目的を達成するために、本発明は、  
下記一般式で表される配列をＣＤＲ３に含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含み、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１
［ここで、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はエンドソーム脱出能モチーフであり、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、
Ｚ１は、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択されるものである］  
前記Ｚ１を含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、エンドソーム酸性ｐＨ条件で抗体の特性変化を誘導して、
前記抗体の特性変化により、抗体がエンドソームから細胞質への脱出能を示すことを特徴とする、細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２８】
本発明に係る細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片において、前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。
【００２９】
本発明はまた、前記細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。  
【００３０】
発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。
【００３１】
発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００３２】
発明はまた、前記細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞質内活性物質伝達用組成物を提供する。
【００３３】
発明はまた、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１エンドソーム脱出能モチーフ（ここで、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される。）を軽鎖および／または重鎖可変領域のＣＤＲ３にグラフトする（ｇｒａｆｔｉｎｇ）ステップを含む、細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によるエンドソーム脱出モチーフを含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片は、生きている細胞への浸透によって細胞質に位置するため、窮極的に特別な外部タンパク質伝達システムなしに、抗体またはその抗原結合断片を生きている細胞内部に浸透させ、細胞質に分布させることができる。
【００３５】
本発明による細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片は、様々なヒト軽鎖可変領域または重鎖可変領域との結合が容易であり、且つエンドソーム脱出機能により細胞質に位置する軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含む細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片であって、細胞の内部に浸透して細胞質に分布し、細胞に非特異的細胞毒性を示さない。
【００３６】
本発明による高効率の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片のエンドソーム脱出機序に基づき、エンドソーム脱出能の向上のための抗体ライブラリーおよび突然変異の設計を行うことができる。
【００３７】
本発明による細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片に含まれているエンドソーム脱出モチーフをその他の抗体に導入することで、エンドソーム脱出能の付与を期待することができる。
【００３８】
また、本発明による細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片は、生きている細胞の細胞質内部に活性物質を伝達するキャリアとして活用可能であり、疾病の治療および予防のための薬学組成物として活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】細胞内に流入された細胞質浸透抗体（ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）ＴＭａｂ４または細胞浸透ペプチドＴＡＴの輸送過程と安定度を観察するために、パルス追跡実験（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）を行い、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果である。
【図２ａ】細胞質浸透抗体ＴＭａｂ４または細胞浸透ペプチドＴＡＴの、阻害因子の有無による細胞質浸透能を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図２ｂ】図２ａの共焦点顕微鏡写真のＦＩＴＣ（緑色蛍光）蛍光を定量した棒グラフである。
【図２ｃ】細胞質浸透抗体ＴＭａｂ４または細胞浸透ペプチドＴＡＴの、阻害因子の有無による細胞質への移動を、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）を用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図２ｄ】図２ｃの共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【図３ａ】ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）でヘパラナーゼの発現を抑制したことをウエスタンブロットで確認したものである。
【図３ｂ】ヘパラナーゼの発現を抑制することによる細胞質浸透抗体とリソソームとの重畳を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図３ｃ】ヘパラナーゼの発現を抑制することによる細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図４】細胞質浸透抗体が細胞内在化されて細胞質に位置するまでの全体的なトラフィッキング過程を示した全般的な模式図である。
【図５】ｐＨに応じて、細胞膜を通過して細胞質浸透抗体が流入されることができるか、また、他の物質の細胞膜通過を誘導することができるかを、抗体を直接蛍光標識し、Ｒａｍｏｓ細胞株で共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【図６ａ】ｐＨに応じて、細胞質浸透抗体によって膜透過能のないトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）を穿孔により獲得可能であるかを、Ｒａｍｏｓ細胞株で光学燎微鏡にて確認した結果である。
【図６ｂ】トリパンブルーを獲得した細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図７ａ】ｐＨ５．５の条件で、細胞質浸透抗体によって生成された細胞膜の穿孔が一時的で、且つ可逆的な現象であるかを、光学顕微鏡にて確認した結果である。
【図７ｂ】トリパンブルーを獲得した細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図８】ｐＨに応じて、細胞質浸透抗体と対照群抗体のアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の細胞膜結合を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
【図９】ｐＨに応じて、細胞質浸透抗体と対照群抗体のアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の細胞膜脂質フリップ−フラップ誘導能を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
【図１０】前記実験により予想した細胞質浸透抗体の穿孔形成モデルを示した模式図である。
【図１１】細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＷＡＭモデリング構造に基づいて、ｐＨに応じた細胞質浸透抗体の構造的変化を予測し、構造的変化に関与するアミノ酸および構造的変化によって露出するアミノ酸を示した図である。
【図１２】酸性ｐＨで細胞質浸透抗体の特性変化を誘導する軽鎖可変領域（ＶＬ）の１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸、９５番目のアミノ酸であるメチオニンを、それぞれアラニン、グルタミン酸、ロイシンで置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図１３】細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３のアミノ酸のうち、エンドソーム脱出に関与する可能性のあるアミノ酸をそれぞれアラニンで置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図１４ａ】ＨＳＰＧ受容体に結合して細胞質浸透能を担う細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２をヒト由来生殖腺配列で置換した突然変異の細胞質浸透能を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【図１４ｂ】ＨＳＰＧ受容体に結合して細胞質浸透能を担う細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２をヒト由来生殖腺配列で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図１５ａ】細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。
【図１５ｂ】細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の細胞質浸透能が維持されるかを共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図１６】野生型細胞質浸透抗体およびエンドソーム脱出能向上期待突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図１７ａ】野生型細胞質浸透抗体またはエンドソーム脱出能向上突然変異ＴＭａｂ４−ＷＹＷの細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図１７ｂ】図１７ａの共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【図１８】野生型細胞質浸透抗体またはエンドソーム脱出能向上突然変異が細胞質に位置する場合、改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合によるＧＦＰ蛍光が観察される過程を示した模式図である。
【図１９】ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された野生型細胞質浸透抗体およびエンドソーム脱出能向上突然変異の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。
【図２０ａ】ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された野生型細胞質浸透抗体およびエンドソーム脱出能向上突然変異の改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合によるＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図２０ｂ】図２０ａの共焦点顕微鏡写真のＧＦＰ蛍光を定量したグラフである。
【図２１ａ】トリプトファンと反対される性質を有するアミノ酸であるアルギニン、イソロイシン、およびグリシンでそれぞれ置換した突然変異の細胞膜結合を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析したグラフである。
【図２１ｂ】トリプトファンと反対される性質を有するアミノ酸であるアルギニン、イソロイシン、およびグリシンでそれぞれ置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図２１ｃ】トリプトファンと反対される性質を有するアミノ酸であるアルギニン、イソロイシン、およびグリシンでそれぞれ置換した突然変異の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【図２２ａ】エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透抗体突然変異の活性を確認するために、完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図２２ｂ】完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。
【図２２ｃ】完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体と細胞質に位置した細胞骨格であるチューブリンとの重畳有無を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【図２３ａ】エンドソーム脱出能が向上した突然変異の活性を確認するために、完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図２３ｂ】完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したものである。
【図２３ｃ】Ｋ−ＲＡＳ突然変異体Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２ＤのＧｐｐＮＨｐが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためにＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を行った結果である。
【図２４】完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体と、細胞内活性化されたＨ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重畳有無を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【図２５ａ】酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の特性変化を誘導する細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸を種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図２５ｂ】酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の特性変化を誘導する  細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）９５番目のアミノ酸であるメチオニンをそれぞれ種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図２６ａ】追加的な酸性ｐＨ認知特性変化を誘導する目的で設計した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図２６ｂ】追加的な酸性ｐＨ認知特性変化を誘導する目的で設計した突然変異の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【図２７】細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を構成するアミノ酸の個数を異ならせた突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図２８ａ】既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図２８ｂ】既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の抗体のＨＳＰＧ結合能および細胞質浸透能が減少もしくは除去されたかを、蛍光顕微鏡にて観察した結果である。
【図２８ｃ】既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の抗体による、酸性ｐＨによるトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図２９ａ】既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体のＫ−ＲＡＳ突然変異体Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２ＤのＧｐｐＮＨｐが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためのＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図２９ｂ】ＲＧＤ１０ペプチド融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図２９ｃ】ＲＧＤ１０ペプチド融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体と、細胞内活性化されたＨ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重畳有無を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【図３０ａ】エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図３０ｂ】エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３０ｃ】ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された、エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体の改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合によるＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図３０ｄ】エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【図３１ａ】酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の特徴変化を誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）の１番目のアミノ酸であるグルタミン酸を種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３１ｂ】酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の特徴変化を誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）の１０２番目のアミノ酸であるロイシンを種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３２ａ】３つのトリプトファンで置換したエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３２ｂ】３つのトリプトファンで置換したエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【図３３ａ】改善されたエンドソーム脱出モチーフが重鎖可変領域に導入され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図３３ｂ】改善されたエンドソーム脱出モチーフが重鎖可変領域に導入され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【図３３ｃ】改善されたエンドソーム脱出モチーフが重鎖可変領域に導入され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３４ａ】既存の治療用抗体の重鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【図３４ｂ】既存の治療用抗体の重鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３５】アスパラギン酸を導入した重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【図３６ａ】ｉｎｄｅｘ  Ｇ１条件で形成されたＣＴ−５９Ｆａｂの結晶をＲＩ１０００（Ｒｏｃｋ  Ｉｍａｇｅｒ１０００；全自動タンパク質結晶画像分析装置）で観察した結果である。
【図３６ｂ】ｐｙｍｏｌプログラムを用いてＲｅｆｉｎｅｍｅｎｔおよびｖａｌｉｄａｔｉｏｎが完了されたＣＴ−５９の３次構造を示した構造である。１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）と９５番目のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）は黄色で示し、９２番から９４番までのアミノ酸は橙色で示した。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
【００４１】
本発明は、一観点において、下記一般式で表される配列をＣＤＲ３に含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含み、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１
［ここで、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はエンドソーム脱出能モチーフであり、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択され、
Ｚ１は、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）からなる群から選択されるものである］  
前記Ｚ１を含む軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域が、エンドソーム酸性ｐＨ条件で抗体の特性変化を誘導して、
前記抗体の特性変化により、抗体がエンドソームから細胞質への脱出能を示すことを特徴とする、細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４２】
本発明において、「エンドソーム脱出」とは、細胞内在化により、能動的に生きている細胞に浸透した後、酸性条件でエンドソームから脱出して細胞質に位置することを意味し得る。
【００４３】
本発明において、「エンドソーム脱出モチーフ」は、酸性条件でエンドソーム脱出を誘導する特徴を有する特定のアミノ酸配列を含む１次構造、これにより形成された３次構造を含み、「エンドソーム脱出能モチーフ」または「エンドソーム脱出能保有モチーフ」と混用可能である。「エンドソーム脱出モチーフ」を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）または重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗体は「細胞質浸透」が可能であって、「細胞質浸透抗体」とは、細胞内在化により細胞の内部に浸透した抗体が酸性条件でエンドソームから細胞質へ脱出したことを意味し、「細胞質浸透能を有する抗体」と混用可能である。
【００４４】
本発明において、エンドソーム脱出モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１を構成するＺ１は、カバット（Ｋａｂａｔ）ナンバリングに従って軽鎖可変領域の９５番または重鎖可変領域の１０２番のアミノ酸に位置することができ、疎水性を帯びるアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、負電荷を帯びるアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、正電荷を帯びるアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）であり、本発明による細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸は、エンドソームの酸性ｐＨ条件で負電荷を帯びるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）および軽鎖可変領域の９５番または重鎖可変領域の１０２番のアミノ酸のＺ１と相互作用し、前記細胞質浸透抗体の特性変化を誘導することで、エンドソームから細胞質への脱出能を有することができる。
【００４５】
本発明の細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片において、前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸が前記Ｚ１とエンドソーム酸性ｐＨ条件で相互作用し、前記細胞質浸透抗体の特性変化を誘導することを特徴とする。
【００４６】
また、ｐＨ７．４からエンドソームの酸性条件ｐＨ５．５に変更されるにつれて、前記エンドソーム脱出モチーフＺ１と、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸との相互作用が変わることになる。すなわち、Ｚ１が、疎水性を帯びるアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、または負電荷を帯びるアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）で構成される際に、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）との相互作用で、負電荷を帯びるアミノ酸側鎖のカルボキシル酸が前記酸性条件で一定部分が水素化され（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）、疎水性を帯びる特徴による疎水性相互作用（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をする。
【００４７】
また、前記エンドソーム脱出モチーフＺ１と、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番のアミノ酸との相互作用によるｐＨ依存的な特性変化の誘導中に、Ｚ１が、疎水性を帯びるアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、および重鎖可変領域または軽鎖可変領域の１番のアミノ酸である、負電荷を帯びるアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）と相互作用する際に、中性ｐＨ条件では相互作用がないが、ｐＨが低くなるにつれて、負電荷を帯びるアミノ酸の水素化による疎水性結合（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）により、２つのアミノ酸間の距離が近くなり、タンパク質の構造および機能の変化を誘導する現象であるタンフォードトランジション（Ｔａｎｆｏｒｄ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）過程を含むことができる。
【００４８】
また、Ｚ１がヒスチジン（Ｈ）で構成される際に、ｐＨ７．４からｐＨ５．５に変更されるにつれて、アミノ酸側鎖の実効電荷（Ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）が正電荷を帯びることになり、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）と静電気的相互作用（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をする。
【００４９】
本発明の実施例において、軽鎖可変領域の１番と９５番のアミノ酸対によるｐＨ依存的特性変化の誘導を確認するために、それぞれアラニン置換突然変異を用いてエンドソーム脱出能を分析した結果、それぞれのアラニン置換突然変異は、ｐＨによるエンドソーム脱出能を示さなかった。また、９５番のアミノ酸を２０種のアミノ酸で置換したそれぞれの突然変異を用いてエンドソーム脱出能を分析した結果、本発明による細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域の９５番のアミノ酸が、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびヒスチジン（Ｈ）で構成された突然変異で、ｐＨ依存的なエンドソーム脱出能を示した。
【００５０】
また、本発明の実施例において、前記実施例と同様の方法でアラニン置換突然変異の実験により発見した、前記抗体のｐＨ依存的な特性変化を誘導したアミノ酸である重鎖可変領域の１番と１０２番のアミノ酸対に対して、１０２番のアミノ酸を１３種のアミノ酸で置換したそれぞれの突然変異を用いてエンドソーム脱出能を分析した結果、本発明による細胞質浸透抗体の重鎖可変領域の１０２番のアミノ酸がメチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、およびヒスチジン（Ｈ）で構成された突然変異でｐＨ依存的なエンドソーム脱出能を示した。
【００５１】
また、本発明の一実施例において、前記細胞質浸透抗体は、前記Ｘ３とＺ１との間に、（ａ１−…−ａｎ）（ｎは１以上１０以下の整数）で表されるアミノ酸配列をさらに含むことが可能である。本発明の一実施例において、前記細胞質浸透抗体が（ａ１−…−ａｎ）（ｎは１以上１０以下の整数）で表されるアミノ酸配列をさらに含む場合、ＣＤＲ３の長さが増加することで、本発明によるエンドソーム脱出モチーフの特性変化が容易になることができる。
【００５２】
本発明において、エンドソーム脱出モチーフは、軽鎖可変領域；重鎖可変領域；軽鎖可変領域および重鎖可変領域に含まれるＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１の構造を有し、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３のそれぞれは、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）で構成された群から選択される。  
【００５３】
本発明において、前記エンドソーム脱出モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３は、細胞内部のエンドソームの弱酸性ｐＨ、例えば、初期エンドソームのｐＨ条件である５．５−６．５で反応し、Ｚ１と、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番のアミノ酸との相互作用により特性が変化された抗体のエンドソーム脱出効率を著しく向上させることができる。
【００５４】
本発明において、エンドソーム脱出モチーフＸ１、Ｘ２、およびＸ３は、エンドソームの内膜を成すリン脂質の主要構成成分である１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の親水性の頭部および疎水性の尾部との相互作用が容易なアミノ酸で構成された群から選択される。
【００５５】
具体的に、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）と２０種のアミノ酸との平均結合力は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）の順に高い。
【００５６】
具体的に、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の親水性の頭部と２０種のアミノ酸との結合力は、アルギニン（Ｒ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）の順に高く、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の疎水性の尾部と２０種のアミノ酸との結合力は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）の順に高い。  
【００５７】
本発明において、エンドソーム脱出モチーフＸ１、Ｘ２、およびＸ３を構成するアミノ酸は、野生型細胞質浸透抗体を構成しているチロシン（Ｙ）とヒスチジン（Ｈ）を含み、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との平均結合力がチロシン（Ｙ）より高いトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）を含んでもよい。
【００５８】
本発明の一実施例において、文献調査により、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との相互作用が容易なアミノ酸を分析した。親水性の頭部および疎水性の尾部に対する結合力が最も高いトリプトファン（Ｗ）エンドソーム脱出モチーフＸ１、Ｘ２およびＸ３に導入してエンドソーム脱出能を分析した結果、本発明による改善された細胞質浸透抗体は、既存のＸ１、Ｘ２、Ｘ３のチロシン（Ｙ）、チロシン（Ｙ）、およびヒスチジン（Ｈ）で構成された野生型細胞質浸透抗体よりもｐＨ依存的に高いエンドソーム脱出能が観察された。
【００５９】
他の一実施例において、エンドソーム脱出のための１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との相互作用において、頭部または尾部が重要であるかを確認するために、エンドソームモチーフＸ１、Ｘ２、Ｘ３に、頭部との結合のみが容易なアルギニン（Ｒ）、尾部との結合のみが容易なイソロイシン（Ｉ）、および脂質との相互作用が著しく低いグリシン（Ｇ）が導入された突然変異を構築し、エンドソーム脱出能を分析した結果、本発明によるトリプトファン（Ｗ）が導入された細胞質浸透抗体を除いた２つの突然変異で、何れもエンドソーム脱出能が著しく減少した。したがって、脂質の親水性の頭部と疎水性の尾部との相互作用が、両方ともエンドソーム脱出に関与することが分かる。
【００６０】
他の一実施例において、前記軽鎖可変領域のエンドソーム脱出能モチーフは、トリプトファンを１つ以上、１つまたは２つを含んでもよい。
【００６１】
細胞質の内部で活性を示す物質の効果を高めるためには、窮極的に細胞質に位置する物質の量が増加すべきであるため、エンドソーム脱出能を向上させるための研究が行われた。かかる研究は、細胞浸透ペプチド（Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＣＰＰ）で主に行われており、特に、細胞脂質膜の通過のための脂質膜との相互作用が必須であるため、これを向上させるための方策を導入した。一例として、アルギニンが豊富な細胞浸透ペプチドに、トリプトファンをＮ−末端とペプチドとの間に追加したことがある。
【００６２】
しかし、このようなアプローチが抗体に対して行われたことはない。トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｗ）は、細胞膜を成す主要リン脂質である１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の親水性の頭部と疎水性の尾部との相互作用が両方とも優れるアミノ酸であるため、エンドソーム内膜との相互作用およびエンドソーム脱出が増加することができる。
【００６３】
具体的に、本発明の一実施例によると、前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のエンドソーム脱出能モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３は、次の群から選択される配列を含んでもよい：Ｗ−Ｗ−Ｈ、Ｗ−Ｙ−Ｗ、Ｙ−Ｗ−Ｗ、Ｗ−Ｙ−Ｈ、Ｙ−Ｗ−Ｈ、およびＷ−Ｗ−Ｗ。
【００６４】
本発明の一実施例によると、前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域のエンドソーム脱出モチーフＸ１−Ｘ２−Ｘ３は、エンドソーム酸性ｐＨ条件で相互作用が誘導され、特性変化によりエンドソーム脱出能を向上させることを確認した。
【００６５】
本明細書で用いられた用語、「エンドソーム酸性ｐＨ」は、初期エンドソームと後期エンドソームのｐＨ条件を満たし、アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ）の側鎖の特性が変更可能なｐＨ６．０〜４．５の範囲のことである。
【００６６】
前記エンドソーム脱出モチーフを含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、次の配列番号８〜１２、および５１で構成された群から選択される１つ以上の配列を含んでもよい：
ＱＱＹＷＷＨＭＹＴ  （配列番号  ８）；
ＱＱＹＷＹＷＭＹＴ  （配列番号  ９）；
ＱＱＹＹＷＷＭＹＴ  （配列番号  １０）；
ＱＱＹＷＹＨＭＹＴ  （配列番号  １１）；  
ＱＱＹＹＷＨＭＹＴ  （配列番号  １２）；  および
ＱＱＹＷＷＷＭＹＴ  （配列番号  １３）  。
【００６７】
前記エンドソーム脱出モチーフを含む軽鎖可変領域は、例えば、配列番号１〜５、１３〜２３、２５〜３７、５０、および６０〜６４で構成された群から選択される軽鎖可変領域の配列と８０％以上の相同性、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性を有する配列を含んでもよい。
【００６８】
改善されたエンドソーム脱出効率は、重鎖可変領域にエンドソーム脱出モチーフを含ませる場合にも同様に達成することができ、前記重鎖可変領域がＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１（ここで、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される）をＣＤＲ３に含み、前記重鎖可変領域のＺ１が１番目のアミノ酸とエンドソーム酸性ｐＨ条件で相互作用し、細胞質浸透抗体の特性が変化することで、エンドソームから細胞質への脱出能を有する重鎖可変領域に関する。
【００６９】
前記エンドソーム脱出モチーフを含む重鎖可変領域のＣＤＲ３は、次の配列番号４６〜４９、および５３で構成された群から選択される１つ以上の配列を含んでもよい：
ＧＷＹＷＭＤＬ  （配列番号  ４６）；
ＧＷＹＷＦＤＬ  （配列番号  ４７）；
ＧＷＹＷＧＦＤＬ  （配列番号  ４８）；
ＹＷＹＷＭＤＬ  （配列番号  ４９）；および
ＧＷＷＷＭＤＬ  （配列番号  ５３）。
【００７０】
前記エンドソーム脱出モチーフを含む重鎖可変領域は、例えば、配列番号３９〜４２、５２、および５４〜５９で構成された群から選択される重鎖可変領域の配列と８０％以上の相同性、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相同性を有する配列を含んでもよい。
【００７１】
また、本発明の一実施例において、前記配列は、前記Ｘ１と連結されるＺ２をさらに含んで、下記の一般式で表されることが可能である。
Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１
（ここで、前記Ｚ２は、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）およびヒスチジン（Ｈ）からなる群から選択される）  。
【００７２】
上記のように、前記配列がＺ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚ１で表される場合、前記軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の１番目のアミノ酸が前記Ｚ１および／またはＺ２と相互作用し、エンドソーム酸性ｐＨ条件でｐＨ依存的にエンドソーム脱出を誘導することを特徴とする。
【００７３】
前記エンドソーム脱出モチーフを含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、次の配列番号２４の配列を含んでもよい：  
ＱＨＹＷＹＷＭＹＴ（配列番号  ２４）。
【００７４】
本発明で使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ターゲットに特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体の抗原結合断片も含まれる。
【００７５】
完全型抗体は、二つの全長（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および二つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合によって連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有して、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００７６】
抗体の抗原結合断片または抗体断片とは、抗原結合能力を有する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖを含む。抗体断片の中Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有している最小の抗体断片として、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二本鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ＣｈａｉｎＦｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されているされたり、またはＣ末端で直ちに連結されるため、二本鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を形成することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術を介して製作することができる。
【００７７】
一実施例で、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態であってもよい。本発明に係る細胞質浸透抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥであってもよく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ５、またはＩｇＤタイプであってもよく、最も好ましくはＩｇＧタイプのクローン性抗体であってもよい。
【００７８】
また、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）中いずれか一つのイソタイプから選択され得る。サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖不変領域は、カッパまたはラムダ型であってもよい。
【００７９】
本明細書で使用される用語、「重鎖」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む全長重鎖およびこれの断片をいずれも意味する。また、本明細書で使用される用語、「軽鎖」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびこれの断片をいずれも意味する。
【００８０】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）および抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、または前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されない。
【００８１】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識および結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖで頑固に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【００８２】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および不変ドメインと、重鎖の可変および第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）抗体断片は、一般にそれらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近くに共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【００８３】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的する構造を形成することができるようにするＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含んでもよい。
【００８４】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から収得した抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が微量で存在することができる可能な天然発生的突然変異を除いては同じであることを指し示す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。
【００８５】
前記「ヒト化」形態の非−ヒト（例：ミューリン）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、収容者の超可変領域からの残基を目的する特異性、親和性および能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基で代替させたヒト免疫グロブリン（収容者抗体）である。
【００８６】
前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体が、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列で構成されているものを意味する。
【００８７】
重鎖および／または軽鎖の一部が特別な種から由来したり特別な抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である一方、残りの鎖（等）は、さらに他の種から由来したりさらに他の抗体部類または亜部類に属する抗体内の相応する配列と同じだったりこれと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでなく目的する生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
【００８８】
本願に使用されたような「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、および骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を指し示す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインを指し示す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインを指し示す。
【００８９】
「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）」は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し示す。各可変ドメインは、典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００９０】
「骨格領域（ＦＲ）」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された四つのＦＲを有する。
【００９１】
他の観点において、本発明は、細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞質内活性物質伝達用組成物に関する。
【００９２】
前記活性物質は、抗体に融合または結合された形態であってもよいが、活性物質は、  例えば、ペプチド、タンパク質、毒素、抗体、抗体切片、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されない。
【００９３】
前記タンパク質は、抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体、または化学的に改質されたタンパク質等であってもよい。
【００９４】
前記ＲＮＡまたはリボ核酸（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、五炭糖の一種であるリボースをベースとして鎖構造のヌクレオチドを成す核酸の一種であって、１本の螺旋が長くねじれている構造を有し、ＤＮＡの一部が転写されて作られる。本発明の一具体例において、前記ＲＮＡは、ｒＲＮＡ，ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ，ｓｎｏＲＮＡ，ａＲＮＡからなる群から選択されてもよいが、これに限定されない。
【００９５】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡで構成された小さいサイズを有しているＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）物質であって、標的配列を有しているｍＲＮＡと結合して分解する役割を果たし、疾病の治療剤として利用されたり、標的ｍＲＮＡを分解し、標的ｍＲＮＡによって翻訳（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）されるタンパク質の発現を抑制する活性を用いて本願で広く用いられる。
【００９６】
前記ＤＮＡまたはデオキシリボ核酸（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）は、核酸の一種であり、単糖類であるデオキシリボースにリン酸基が結合された形態の主鎖（Ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｃｈａｉｎ）と、プーリン（Ｐｕｒｉｎ）、ピリミジン（Ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）の２種類を有している核酸塩基（Ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）で構成されており、細胞の遺伝情報を記憶する物質である。
【００９７】
本発明において、小分子薬物は、約１０００ダルトン未満の分子量を有して疾病の治療剤として活性度を有する有機化合物、無機化合物または有機金属化合物を示すもので、本願で広範囲に使用される。本願で小分子薬物は、オリゴペプチドおよび約１０００ダルトン未満の分子量を有するその他のバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
【００９８】
本発明において、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、直径１〜１０００ｎｍ大きさを有する物質からなる粒子を意味し、前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む金属シェルで構成される金属／金属コアシェル複合体、金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む非金属シェルで構成される金属／非金属コアシェルまたは非金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む金属シェルで構成される非金属／金属コアシェル複合体であってもよい。一具体例によると、前記金属は、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウム、白金、磁性鉄およびその酸化物から選択されるものであってもよいが、これに限定せず、前記非金属は、シリカ、ポリスチレン、ラテックスおよびアクリレート系列の物質から選択されてもよいが、これに限定しない。
【００９９】
本発明において、リポソームは、自己自ら会合できる、水性内部区画を囲む一つ以上の脂質二重層膜で構成される。リポソームは、膜タイプおよびその大きさによって特定することができる。小さいユニラメラ小胞（ＳＵＶ）は単一膜を有して２０ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有することができる。大きいユニラメラ小胞（ＬＵＶ）は、５０ｎｍ以上の直径を有することができる。オリゴラメラ大きい小胞およびマルチラメラ大きい小胞は、多重、一般に同心円、膜層を有して直径が１００ｎｍ以上であってもよい。多くの非同心円膜を有するリポソーム、すなわちより大きい小胞内で含まれた多くの小さい小胞は、マルチ小胞性小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）という。
【０１００】
前記「融合」または「結合」とは、機能または構造が異なるか同じ二つの分子を一体化するもので、前記タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームに前記腫瘍浸透性ペプチドが結合できるいずれの物理、化学的または生物学的方法による融合であってもよい。前記融合は、好ましくは連結子ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）によって行われ、この連結子ペプチドは、本発明の抗体軽鎖可変領域、抗体、またはこれの切片の様々な位置で前記生体活性分子との融合を中継することができる。
【０１０１】
さらに他の観点において、本発明は、前記細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片、およびこれによって伝達される細胞質内活性物質を含む、癌の予防または治療用薬学的組成物に関する。
【０１０２】
抗体が有する抗原高特異性および高親和度に影響を与えずに前記活性物質を含む癌の予防または治療用薬学的組成物を利用して前記抗体が細胞の内部に浸透および細胞質に残留する特性を付与することができ、これを介して前記抗体が現在の小分子薬物を利用した疾病治療に標的物質に分類されている細胞質内に存在しながらタンパク質とタンパク質との間に広くて平たい表面を介して構造複合性相互作用をなす腫瘍および疾患関連因子に対する治療および診断に高い効果を期待することができる。
【０１０３】
本発明の一実施例によると、前記薬学的組成物は、既存様々な腫瘍治療剤の主な薬物抵抗性関連因子であるＫＲａｓ突然変異を選択的阻害が可能でかつ既存治療剤との並行治療を介して効果的な坑癌活性を期待することができる。
【０１０４】
前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、および頭頸部癌からなる群から選択されるものであってもよい。
【０１０５】
前記組成物は、癌の予防または治療用薬学的組成物で製造されている場合、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【０１０６】
前記癌の予防または治療用薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃腸からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。
【０１０７】
前記癌の予防または治療用薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のうような要因によって多様に処方されることができる。前記組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ範囲内である。用語「薬学的有効量」とは、癌を予防または治療するのに、または血管新生による疾患の予防または治療するのに十分な量を意味する。
【０１０８】
前記組成物は、当該当業者が容易に実施できる方法に従って、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することによって単位容量形態で製造されたり、または多用量容器内に取り込んで製造できる。この時、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳剤形態やエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤として投与されたり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与されることができる。一方、前記組成物は、抗体また、抗原結合断片含むので、免疫リポソームで剤形化されることができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法により製造されることができる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングルリコル−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として逆相蒸発法によって製造されることができる。例えば、抗体のＦａｂ´断片はジスルフィド−交換反応を介してリポソームに接合されることができる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加でリポソーム内に含まれることができる。
【０１０９】
さらに他の観点において、本発明は、前記細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片、およびこれによって伝達される細胞質内活性物質を含む、癌診断用組成物に関する。  
【０１１０】
用語「診断」とは、病態生理の存在または特徴を確認することを意味する。本発明での診断は、癌の発病の有無および経過を確認するものである。  
【０１１１】
前記完全型免疫グロブリン形態の抗体およびこれの切片は、映像を介して癌を診断するために分子映像用蛍光体と結合することができる。
【０１１２】
前記分子映像用蛍光体は、蛍光を発生させるあらゆる物質をいい、赤色や近赤外線（ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ）の蛍光を発光することが好ましく、量子収得量（ｑｕａｎｔａｕｍ  ｙｉｅｌｄ）が高い蛍光体がより好ましいが、これに限定されない。  
【０１１３】
前記分子映像用蛍光体は、前記完全型免疫グロブリン形態の抗体およびこれの切片に特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチドと結合できる蛍光体、蛍光タンパク質または、その他映像用物質が好ましいがこれに限定されない。
【０１１４】
前記蛍光体は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＹＰＹ）、テトラメチルローダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）またはこれらの誘導体が好ましいが、これに限定されない。
【０１１５】
蛍光タンパク質は、Ｄｒｏｎｐａタンパク質、蛍光発色遺伝子（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光プロテイン（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲＦＰ）、近赤外線蛍光を示すシアニン蛍光体であるＣｙ５．５またはその他蛍光タンパク質が好ましいがこれに限定されない。  
【０１１６】
その他映像用物質は、酸化鉄、放射性同位元素などが好ましいが、これに限定されず、ＭＲ、ＰＥＴのような映像装備に応用されることができる。
【０１１７】
さらに他の観点において、本発明は、前記細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸癌診断用組成物に関する。
【０１１８】
前記核酸は，  ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）として，  前記「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、一本鎖または二本鎖形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびこれから転写されるＲＮＡ配列を包括して、特に言及しない限り天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。
【０１１９】
前記ポリヌクレオチドは、前述したエンドソーム脱出能が向上した軽鎖可変領域（ＶＬ）およびエンドソーム脱出能が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするヌクレオチド配列だけでなく、その配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は、前記ヌクレオチド配列に完ぺきに相補的な配列だけでなく、実質的に相補的な配列も含む。これは当業界に公示された苛酷条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で、例えば、配列番号１〜５、１３〜２３、２５〜３７、５０、および６０〜６４、および配列番号３９〜４２、５２、および５４〜５９で構成された群から選択されるいずれか一つの配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするヌクレオチド配列と混成化できる配列も含んでもよい。
【０１２０】
前記ポリヌクレオチドは、前述した軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列だけでなく、その配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は、前記ヌクレオチド配列に完ぺきに相補的な配列だけでなく、実質的に相補的な配列も含む。これは当業界に公示された苛酷条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で、例えば、配列番号１〜３中いずれか一つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と混成化できる配列を意味する。
【０１２１】
前記核酸は変形されることができる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失または非保存的置換または保存的置換を含む。前記アミノ酸配列をコードする核酸は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインメントして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインメントされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、最小９０％の相同性または最小９５％の相同性を示す配列であってもよい。
【０１２２】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離または合成する。
【０１２３】
本発明は、他の観点において、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｚエンドソーム脱出能モチーフ（ここで、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３はそれぞれ、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択）を軽鎖および／または重鎖可変領域のＣＤＲ３にグラフトする（ｇｒａｆｔｉｎｇ）ステップを含む、細胞質浸透抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関する。
【０１２４】
既存の従来抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を、エンドソーム脱出能が向上した軽鎖可変領域（ＶＬ）で置換し、重鎖可変領域（ＶＨ）を、エンドソーム脱出能が向上した重鎖可変領域（ＶＨ）で置換することで、細胞質浸透能を有する抗体またはその抗原結合断片を提供することができる。
【０１２５】
一実施例において、エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）、およびエンドソーム脱出能が付与された細胞質浸透重鎖可変領域（ＶＨ）を用いた、細胞の内部に浸透して細胞質に分布する完全免疫グロブリン形態の抗体を製造する方法は次のステップを含む：
【０１２６】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖で、軽鎖可変領域（ＶＬ）をエンドソーム脱出能が付与された軽鎖可変領域（ＶＬ）で置換するか、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖不変領域（ＶＨ）をエンドソーム脱出能が付与された重鎖可変領域（ＶＨ）で置換した核酸をベクターにクローニングし、前記ベクターを宿主細胞に形質転換して抗体またはその抗原結合断片を発現させるステップと、前記発現された抗体または抗原結合断片を回収するステップ。
【０１２７】
前記方法は、エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を製造することができる。また、細胞の内部の特定タンパク質を認知できる重鎖可変領域を含む重鎖を発現するベクターと共に形質転換を介して、細胞の内部に浸透して細胞質に分布して特定タンパク質と結合することができる抗体を発現することができる。
【０１２８】
ベクターは、軽鎖と重鎖を一つのベクターで同時に発現するベクターシステム、またはそれぞれ別途のベクターで発現させるシステム共に可能である。後者の場合、二つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）および標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞に導入されることができる。  
【０１２９】
本発明で使用する用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界でたびたび使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６Ｍ、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９等）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０等）を操作して製作されることができる。
【０１３０】
前記組換えベクターで本発明で提供する軽鎖可変領域、および軽鎖不変領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、プロモーターに作動的に連結されることができる。用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。従って、これによって前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写および／または、解読を調節することができる。
【０１３１】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公示された様々な方法を介して構築できる。
【０１３２】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築されることができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターで、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。ベクターが、真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点およびＢＢＶ複製原点などを含むか、これに限定されない。また、ほ乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）またはほ乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【０１３３】
本発明のさらに他の様態は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することができる。
【０１３４】
宿主細胞は、当業界に公示されたいずれの宿主細胞も利用することができ、原核細胞では、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルス・サブチルスおよびバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンスおよび種々のシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあって、ベクターを真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株などが利用されることができる。
【０１３５】
本発明のさらに他の様態は、前記宿主細胞を培養する工程を含む、細胞の内部に浸透して細胞質に位置する完全型免疫グロブリン形態の抗体製造方法を提供することができる。
【０１３６】
前記組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界に広く知られた挿入方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または、電気穿孔方法などが使用でき、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の問題によってインタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇ形態の抗体生産には適さないが、ＦａｂおよびＦｖのような抗原結合断片の生産には使用されることができる。
【０１３７】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を利用して、当業界に広く知られた方法により容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれた培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【実施例】
【０１３８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【０１３９】
実施例１．細胞質浸透抗体（Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）の発現および精製
細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出機序を明らかにし、それを向上させるための開発に用いるために、細胞質浸透抗体を精製した。
【０１４０】
具体的には、完全ＩｇＧ形態の単クローン抗体の形態で生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５´末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合された抗体の重鎖可変領域（ヒト化ｈＴ０  ＶＨ：配列番号３８）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。
【０１４１】
また、軽鎖を発現するベクターを構築するために、５´末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合された細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４  ＶＬ：配列番号６５）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。
【０１４２】
前記軽鎖、重鎖発現ベクターを一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することで、タンパク質を発現および精製した。振盪フラスコにて、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞をプラスミドおよびポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物で形質転換した。振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて２００ｍＬ形質転換する際に、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２Ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種し、１５０ｒｐｍ、８％のＣＯ２で培養した。それぞれの単クローン抗体の生産のために適した重鎖と軽鎖プラスミドを、１０ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇ、総２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）に希釈し、ＰＥＩ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合し、室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を、上記で１００ｍｌに播種した細胞に入れ、１５０ｒｐｍ、８％のＣＯ２で４時間培養した後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地を追加して６日間培養した。
【０１４３】
標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上清からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に抗体を適用し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍのグリシン緩衝液を用いてｐＨ３．０で抗体を溶離した後、１ＭのＴｒｉｓ緩衝液を用いてサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画は、透析方法によりＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液を交換しながら濃縮を行った。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍの波長で吸光度と吸光係数を用いて定量した。
【０１４４】
実施例２．細胞質浸透抗体の細胞内在化後のトラフィッキングの確認
開発した細胞質浸透抗体が細胞内在化の後に細胞質に位置するまでのトラフィッキングを確認した。これは、細胞質に位置するためにエンドソームから脱出する機序を究明するにおいて重要な手掛かりとなり得る。
【０１４５】
図１は、胞内に流入された細胞質浸透抗体（ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）ＴＭａｂ４または細胞浸透ペプチドＴＡＴの輸送過程と安定度を観察するために、パルス追跡実験（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）を行い、共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果である。
【０１４６】
具体的には、２４ウェルプレートにカバースリップをし、各ウェル当たり２．５ｘ１０４個のＨｅＬａ細胞を１０％のＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れ、５％のＣＯ２、３７℃の条件で１２時間培養した。細胞が安定化すると、ｐｃＤＮＡ３．４−ｆｌａｇ−ｒａｂ１１を一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。一過性形質転換の効率を最大化するために、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）を使用した。一過性形質転換すべきの５００ｎｇのｐｃＤＮＡ３．４−ｆｌａｇ−ｒａｂ１１を、チューブ上でＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ｍｅｄｉａ  ５０μｌ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ）  ２μｌとともに２０分間常温で反応させた後、各ウェルに添加した。さらに、抗生剤のないＤＭＥＭ培地４５０μｌを入れ、３７℃、５％のＣＯ２で６時間培養した後、１０％のＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地５００μｌで交換した後、２４時間培養した。その後、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４  ３μＭを３７℃で３０分処理した後、迅速にＰＢＳで３回洗浄し、培地を添加して、３７℃の条件で０時間、２時間、６時間培養した。その後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭのグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ２．５）で細胞表面に付いたタンパク質を除去した。ＰＢＳで洗浄した後、４％のパラホルムアルデヒドを添加してから２５℃の条件で１０分間細胞を固定した。
【０１４７】
その後、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに０．１％のサポニン、０．１％のアジ化ナトリウム、１％のＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養し、細胞膜に孔を形成する過程を経た。さらに、ＰＢＳで洗浄した後、非特異的な結合を抑制するために、ＰＢＳに２％のＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃で１時間反応させた。次に、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）またはＴＲＩＴＣ（赤色蛍光）が結合されているヒトＦｃを特異的に認知する抗体（Ｓｉｇｍａ）で染色した。Ｒａｂ５は、初期エンドソームのマーカーであるｒａｂ５を標識するａｎｔｉ−ｒａｂ５、リサイクリングエンドソームのマーカーであるｒａｂ１１のｆｌａｇ−ｔａｇを標識するａｎｔｉ−ｆｌａｇ抗体を２５℃で１時間反応させ、ＴＲＩＴＣ（赤色蛍光）またはＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結された二次抗体を２５℃で１時間反応させた。後期エンドソームとリソソームは、細胞固定する３０分前に、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９  １ｍＭを培養中の細胞に直接処理した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＴＭａｂ４はＴＡＴと異なって、２時間までは初期エンドソームに位置しており、その後、リソソームまたはリサイクリングエンドソームに輸送されなかった。
【０１４８】
実施例３．初期エンドソームでの酸性化がエンドソーム脱出に及ぶ影響の確認
本発明による細胞質浸透抗体が初期エンドソームでエンドソームから脱出するということのさらに明確な証拠を得るために、阻害因子を用いて実験した。
【０１４９】
具体的に使用した阻害因子は、初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟を抑制するｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＡＴＰａｓｅプロトンポンプを抑制してエンドソーム酸化を阻止するｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ、エンドソームから小胞体およびゴルジへの輸送を抑制するｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａである。
【０１５０】
図２ａは、本発明による細胞質浸透抗体ＴＭａｂ４または細胞浸透ペプチドＴＡＴの、阻害因子の有無による細胞質浸透能を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０１５１】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、細胞が安定化すると、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ  ２００ｎＭ、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  ２００ｎＭ、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ  ７μＭを３０分間培養した。その後、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＴＡＴ  ２μＭを３７℃で６時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。ＴＭａｂ４は、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＴＭａｂ４は、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎを処理した細胞でのみ、細胞質に広がった緑色蛍光が観察されず、全部斑点状の蛍光を示した。
【０１５２】
図２ｂは、図２ａの共焦点顕微鏡写真のＦＩＴＣ（緑色蛍光）蛍光を定量した棒グラフである。
【０１５３】
具体的には、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を用いて各条件で２０個の細胞をそれぞれ指定した後、得られた蛍光の平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。
【０１５４】
図２ｃは、  本発明による細胞質浸透抗体ＴＭａｂ４または細胞浸透ペプチドＴＡＴの、阻害因子の有無による細胞質への移動を、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）を用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０１５５】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、血清のない培養液に、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ  ２００ｎＭ、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ  ２００ｎＭ、ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ  ７μＭを３０分間培養した。その後、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４  ２μＭ、ＴＡＴ  ２０μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。
【０１５６】
Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。本発明による細胞質浸透抗体ＴＭａｂ４とＴＡＴにより、カルセインがエンドソームから脱出して細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光を示した。しかし、ＴＭａｂ４の場合、ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎを処理した細胞でのみ、他の阻害因子で処理した細胞と異なって細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光が観察されなかった。
【０１５７】
図２ｄは、図２ｃの共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。具体的には、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を用いて各条件で２０個の細胞をそれぞれ指定した後、得られた蛍光の平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。
【０１５８】
実施例４．初期エンドソームでのＨＳＰＧ分解がエンドソーム脱出に及ぶ影響の確認
細胞質浸透抗体は、細胞表面のＨＳＰＧとの結合により細胞内在化される。この際、プロ−ヘパラナーゼとともに細胞内在化される。プロ−ヘパラナーゼは、エンドソームの酸化によって活性化される（Ｇｉｎｇｉｓ−Ｖｅｌｉｔｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。活性化されたヘパラナーゼはＨＳＰＧを分解し、細胞質浸透抗体がエンドソームの内部で自由に存在することができる。
【０１５９】
図３ａは、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）でヘパラナーゼの発現を抑制したことをウエスタンブロットで確認したものである。
【０１６０】
具体的には、６ウェルプレートに、各ウェル当たり１ｘ１０４個のＨｅＬａ細胞を１０％のＦＢＳが含まれた培地１ｍｌに入れ、５％のＣＯ２、３７℃の条件で１２時間培養した。２４時間培養した後、ｓｉＲＮＡを一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。一過性形質転換する標的能のない対照群ｓｉＲＮＡと、ヘパラナーゼ発現抑制を標的するｓｉＲＮＡのそれぞれ５００ｎｇを、チューブ上でＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）５００μｌ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）  ３．５μｌとともに２０分間常温で反応させた後、各ウェルに添加した。さらに、抗生剤のないＤＭＥＭ  ｍｅｄｉａ  ５００μｌを入れ、３７℃、５％のＣＯ２で６時間培養した後、１０％のＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地１ｍｌで交換してから、７２時間培養した。
【０１６１】
培養後、細胞溶解物を得るために溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＳＤＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｓｉｇｍａ））を入れた。細胞溶解物はＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルをＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移し、それぞれヘパラナーゼとβ−アクチンを認知する抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）と２５℃で２時間反応させ、ＨＲＰが結合された二次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を２５℃で１時間反応させた後、検出した。分析にはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
【０１６２】
図３ｂは、ヘパラナーゼの発現を抑制することによる細胞質浸透抗体とリソソームとの重畳を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０１６３】
具体的には、実施例２と同様にヘパラナーゼの発現を抑制したＨｅＬａと対照群ＨｅＬａ細胞を準備し、ＴＭａｂ４  ３μＭ、ＦＩＴＣ−ＴＡＴ  ２０μＭを３７℃で３０分間処理した後、迅速にＰＢＳで３回洗浄し、培地を添加して３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。
【０１６４】
ＴＭａｂ４は、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。リソソームのマーカーであるＬＡＭＰ−１を標識するａｎｔｉ−ＬＡＭＰ−１（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）を２５℃で１時間反応させ、ＴＲＩＴＣ（赤色蛍光）が連結された二次抗体を２５℃で１時間反応させた。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＴＭａｂ４は、ヘパラナーゼの発現を抑制した際に、ＬＡＭＰ−１との重畳が確認された。
【０１６５】
図３ｃは、ヘパラナーゼの発現を抑制することによる細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０１６６】
具体的には、ヘパラナーゼの発現を抑制したＨｅＬａおよび対照群のＨｅＬａ細胞を実施例２と同様に準備し、ＴＭａｂ４  ２μＭ、ＴＡＴ  ２０μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ヘパラナーゼの発現を抑制した細胞では、ＴＭａｂ４によって細胞質に広がったカルセイン蛍光が観察されなかった。
【０１６７】
図４は、細胞質浸透抗体が細胞内在化されて細胞質に位置するまでの全体的なトラフィッキング過程を示した全般的な模式図である。
【０１６８】
実施例５．ｐＨに応じた、細胞質浸透完全ＩｇＧ形態の単クローン抗体の細胞膜通過による抗体の流入の確認
本発明による細胞質浸透抗体が細胞内在化された後に最終的に細胞質に位置するためには、エンドソームから脱出する過程が必須である。今まで、抗体のエンドソーム脱出に関しては報告がない。エンドソーム脱出機序を究明するために、先ず、エンドソームのｐＨを模擬して実験を行った。
【０１６９】
初期エンドソームの内部リン脂質層と細胞膜の外部リン脂質層は、その構成成分が類似であり（Ｂｉｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ，  ２０１３）、主要構成成分は１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）である。したがって、ＨＳＰＧが発現されないＲａｍｏｓ細胞株の細胞膜の外部リン脂質層を、初期エンドソームの内部リン脂質層と同一視して実験した。
【０１７０】
図５は、ｐＨに応じて、細胞膜を通過して細胞質浸透抗体が流入されることができるか、また、他の物質の細胞膜通過を誘導することができるかを、抗体を直接蛍光標識し、Ｒａｍｏｓ細胞株で共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【０１７１】
具体的には、２４ウェルプレートにカバースリップをし、浮遊細胞であるｒａｍｏｓをプレートに付着させるために、０．０１％のｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液を２００μｌ入れ、２５℃の条件で２０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、各ウェル当たり５ｘ１０４個のｒａｍｏｓ細胞を、１０％のＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて３７℃の条件で３０分間培養させた。細胞付着を確認し、ｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、およびｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０  ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＰＢＳおよび蛍光試薬であるＤｙＬｉｇｈｔ−４８８で直接標識したＴＭａｂ４  １０μＭおよび標識していないＴＭａｂ４  １０μＭと、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８で直接標識した対照群抗体であるアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）２μＭを入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。対照群として使用するアダリムマブは、細胞外部サイトカインを標的する治療用抗体である。
【０１７２】
実施例２と同様の方法によりＰＢＳで洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ｐＨ５．５の条件で、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８で直接標識したＴＭａｂ４の蛍光が観察され、ｐＨ５．５の条件で、ＴＭａｂ４とＤｙＬｉｇｈｔ−４８８で直接標識したアダリムマブを処理した細胞では緑色ＦＩＴＣ蛍光が観察されることを確認した。細胞質浸透抗体が酸性ｐＨで細胞膜を通過して流入され、自分ではなく他の物質もともに流入させることができることを確認した。
【０１７３】
また、物質が外部から流入されたにもかかわらず、細胞膜の形態が維持されることを確認した。
【０１７４】
実施例６．ｐＨに応じた、細胞質浸透抗体のトリパンブルーの獲得による穿孔形成有無の確認
知られているエンドソーム脱出機序のうち、上記の実験結果のように、エンドソームの形態を維持しながら物質がエンドソームから脱出し、完全ＩｇＧ形態で実現し得る、最も有力なエンドソーム脱出機序は穿孔形成であると予想した。
【０１７５】
実施例５の実験と類似に、細胞質浸透抗体が細胞膜を通過する時の細胞膜の形態を確認するために実験を行った。
【０１７６】
図６ａは、ｐＨに応じて、細胞質浸透抗体によって膜透過能のないトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）を穿孔により獲得可能であるかを、Ｒａｍｏｓ細胞株で光学燎微鏡にて確認した結果である。
【０１７７】
具体的には、２４ウェルプレートに、実施例５と同様に各ウェル当たり５ｘ１０４個のｒａｍｏｓ細胞を付着させた。細胞付着を確認し、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４、ａｄａｌｉｍｕｍａｂを１μＭおよび１０μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。
【０１７８】
図６ｂは、トリパンブルーを獲得した細胞の数を定量的に比較したグラフである。
具体的には、全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。
【０１７９】
図６ｂにおいて、ｐＨ５．５の条件でのみ、本発明による細胞質浸透抗体であるＴＭａｂ４を添加した細胞で、濃度に比例してトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）が獲得されることを確認した。また、細胞質浸透抗体が細胞膜を通過する時の細胞膜の形態が維持されることを確認した。
【０１８０】
実施例７．細胞質浸透抗体による一時的、可逆的な穿孔形成の確認
既存のエンドソーム脱出機序として、穿孔形成機序を示すと知られているペプチドの場合、ペプチドのアルファ−螺旋構造が細胞膜を貫通する穿孔を形成すると知られている。
【０１８１】
しかし、抗体の場合、アルファ−螺旋構造を有していないため、全体的に細胞膜を貫通する穿孔を形成することはほぼ不可能であると判断した。したがって、一時的に穿孔を形成して抗体がエンドソームから脱出した後、細胞膜が可逆的に再び回復すると仮定し、これを証明するために実験を行った。
【０１８２】
図７ａは、ｐＨ５．５の条件で、細胞質浸透抗体によって生成された細胞膜の穿孔が一時的で、且つ可逆的な現象であるかを、光学顕微鏡にて確認した結果である。
【０１８３】
具体的には、２４ウェルプレートに、実施例５と同様に各ウェル当たり５ｘ１０４個のｒａｍｏｓ細胞を付着させた。細胞付着を確認し、初期エンドソームのｐＨである５．５に維持するために、ｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）、５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌにＴＭａｂ４  １０μＭを入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。また、緩衝液を除去して新しい培地に交替した後、２時間培養することで、細胞が回復するようにする。  その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。
【０１８４】
図７ｂは、トリパンブルーを獲得した細胞の数を定量的に比較したグラフである。
総４００個以上の細胞数を計数して平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。図７ｂにおいて、ｐＨ５．５の条件で本発明によるエンドソーム脱出機能を有するＴＭａｂ４を添加した細胞で、ＴＭａｂ４を添加した直後にトリパンブルーの獲得が観察されたが、培地で回復時間を経た細胞の場合、トリパンブルーが獲得されないことを確認した。すなわち、細胞質浸透抗体による穿孔の形成は一時的で、且つ可逆的な現象であることを確認した。
【０１８５】
実施例８．ｐＨに応じた、細胞質浸透完全ＩｇＧ形態の単クローン抗体の膜結合および脂質膜フリップ−フラップの確認
穿孔形成機序は、膜の全体的な形態は維持しながら穿孔を形成し、その穿孔を介してエンドソーム内部の物質が細胞質へ脱出する機序である。穿孔を形成するためには、先ず、エンドソーム内部のリン脂質層と相互作用した後、フリップ−フラップ機序によって膜の穿孔が形成されると知られている（Ｈ．Ｄ．Ｈｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０１８６】
したがって、初期エンドソームで穿孔形成によるエンドソーム脱出が起こるためには、先ず、抗体が、エンドソームの酸化によって膜結合するかを確認しようとした。
【０１８７】
図８は、ｐＨに応じて、細胞質浸透抗体と対照群抗体のアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の細胞膜結合を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
【０１８８】
具体的には、各サンプル当たり１ｘ１０５個のＲａｍｏｓ細胞を準備した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞質のｐＨ条件である７．４に維持するために、ｐＨ７．４の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）にＴＭａｂ４、アダリムマブ５μＭを入れ、４℃で１時間培養した。各ｐＨの緩衝液で洗浄した後、ＴＭａｂ４、アダリムマブは、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体と４℃の条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、流細胞分析機で分析した結果、ｐＨ５．５の条件で、ＴＭａｂ４のみが細胞膜に結合することを確認した。
【０１８９】
図９は、ｐＨに応じて、細胞質浸透抗体と対照群抗体のアダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の細胞膜脂質フリップ−フラップ誘導能を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析した結果である。
【０１９０】
具体的には、各サンプル当たり１ｘ１０５個のＲａｍｏｓ細胞を準備した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、ｐＨを細胞質条件である７．４に維持するためにｐＨ７．４の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、およびｐＨを初期エンドソーム条件である５．５に維持するためにｐＨ５．５の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）に、ＴＭａｂ４、アダリムマブ５μＭを入れて４℃で１時間培養した。
【０１９１】
各ｐＨの緩衝液で洗浄した後、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖを２５℃の条件で１５分間反応させた。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖは、細胞膜の内部にのみ存在する脂質であるホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）を標的する物質であって、細胞膜脂質フリップ−フラップが起こる場合にのみ、脂質が外部に露出してＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖが結合することができる。反応後、ＰＢＳで洗浄した後、流細胞分析機で分析した結果、ｐＨ５．５の条件でＴＭａｂ４のみ、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖが結合することを確認した。
【０１９２】
図１０は、前記実験により予想した細胞質浸透抗体の穿孔形成モデルを示した模式図である。
【０１９３】
実施例９．ｐＨ依存的な特性変化予測論理
本発明による細胞質浸透抗体がｐＨ条件に応じて細胞質浸透特性の差を示すことは、ｐＨ条件依存的に、抗体残基間の相互作用の変化によって特性変化が引き起こされたのであろうと予想した。
【０１９４】
この仮説を証明するために文献を調査した結果、アミノ酸のうち、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は、中性ｐＨ７．４からｐＨ５．０に減少するにつれて、プロトン付加により負電荷を失い、疎水性を帯びることになることを確認した（Ｋｏｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０１９５】
具体的に、疎水性を帯びることになったアスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）は、元々疎水性を帯びているアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）、およびイソロイシン（Ｉ）との疎水性相互作用（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が形成される。新しく形成された相互作用により周辺のアミノ酸が影響を受け、構造的変形が誘導される現象をタンフォードトランジション（Ｔａｎｆｏｒｄ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）と定義し（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、このようなｐＨ依存的な特性変化を誘導するための例を確認した（Ｄｉ  Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０１９６】
細胞質浸透軽鎖可変領域であるｈＴ４  ＶＬ  構造を用いて、軽鎖可変領域でｐＨ７．４とｐＨ５．０で差を示し得るアミノ酸であるヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、およびグルタミン酸（Ｅ）を中心に、周辺に隣接した疎水性アミノ酸であるメチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、およびロイシン（Ｌ）を調査した。
【０１９７】
このうち、２つのアミノ酸の側鎖間の距離が６−７Å未満である候補アミノ酸を確認し、Ｎ末端から１番目、９５番目のアミノ酸対を、タンフォードトランジション効果を示すことができる候補として選定した。
【０１９８】
前記１番、９５番のアミノ酸対のうち、９５番のアミノ酸は、細胞質浸透軽鎖可変領域であるｈＴ４  ＶＬの固有の配列であるＶＬ−ＣＤＲ３に存在するアミノ酸であり、１番のアミノ酸との相互作用により、タンフォードトランジションのような現象によってＶＬ−ＣＤＲ３環構造の変化を誘導できる可能性を確認した。
【０１９９】
細胞質浸透軽鎖可変領域であるｈＴ４  ＶＬで、前記１番、９５番のアミノ酸によって構造変化が誘導されたＶＬ−ＣＤＲ３環を構成するアミノ酸は、初期エンドソーム内部のリン脂質層の主要構成成分である１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との相互作用が容易なチロシン（Ｙ）が非常に高い比重で存在することを確認した（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２００】
図１１は、細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＷＡＭモデリング構造に基づいて、ｐＨに応じた細胞質浸透抗体の構造的変化を予測し、構造的変化に関与するアミノ酸および構造的変化によって露出するアミノ酸を示した図である。
【０２０１】
前記１番、９５番のアミノ酸対によるｐＨ依存的な特性変化の誘導およびそれによるエンドソーム脱出を確認するために、前記１番と９５番のアミノ酸をアラニン（Ａ）で置換した突然変異を構築した。
【０２０２】
また、前記１番、９５番のアミノ酸対によるｐＨ依存的な特性変化の誘導およびそれによるエンドソーム脱出を確認するために、前記１番と９５番のアミノ酸を、各アミノ酸と類似の性質を有するグルタミン酸（Ｅ）、ロイシン（Ｌ）で置換した突然変異を構築した。
【０２０３】
表１は、ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０２０４】
【表１】
2019520086.tif 000003
【０２０５】
実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０２０６】
実施例１０．細胞質浸透抗体突然変異のｐＨ依存的な特性変化の確認
図１２は、酸性ｐＨで細胞質浸透抗体の特性変化の誘導に関与する軽鎖可変領域（ＶＬ）の１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）で置換した突然変異（ＴＭａｂ４−Ｄ１Ａ）、９５番目のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）をアラニン（Ａ）で置換した突然変異（ＴＭａｂ４−Ｍ９５Ａ）、１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａ）をグルタミン酸（Ｅ）で置換した突然変異（ＴＭａｂ４−Ｄ１Ｅ）、および９５番目のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）で置換した突然変異（ＴＭａｂ４−Ｍ９５Ｌ）による、ｐＨ条件変化に応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０２０７】
具体的に、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、細胞質のｐＨ条件である７．４に維持するためにｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨ条件である５．５に維持するためにｐＨ５．５の緩衝液  （ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４、アダリムマブ、ＴＭａｂ４−Ｄ１Ａ、ＴＭａｂ４−Ｍ９５Ａ、ＴＭａｂ４−Ｄ１Ｅ、ＴＭａｂ４−Ｍ９５Ｌを１０μＭ入れ、３７℃の条件で細胞を２時間培養させた。
【０２０８】
ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した
【０２０９】
ＴＭａｂ４と異なって、突然変異であるＴＭａｂ４−Ｄ１Ａ、ＴＭａｂ４−Ｍ９５Ａは、トリパンブルーの獲得が殆ど起こらないことを確認した。ＴＭａｂ４−Ｄ１Ｅ、ＴＭａｂ４−Ｍ９５Ｌは、ＴＭａｂ４と類似の程度にトリパンブルーを獲得することを確認した。すなわち、エンドソーム脱出において、１番目のアミノ酸と９５番目のアミノ酸が重要な役割を果たしていることを確認した。
【０２１０】
実施例１１．細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能に寄与するアミノ酸およびモチーフの探索
上記の実施例の実験結果から、細胞質浸透抗体の１番と９５番のアミノ酸の相互作用により、ｐＨ依存的な抗体特性変化が起こることを確認し、その特性変化によってエンドソーム脱出能が誘導されることを確認した。
【０２１１】
前記ｐＨ依存的な特性変化によるエンドソーム脱出を確認するために、ＶＬ−ＣＤＲ３を構成するアミノ酸のうち、リン脂質と直接的に相互作用すると予想されるアミノ酸に対して、それぞれアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ、Ａ）で置換した突然変異を構築した。
【０２１２】
具体的に、構造モデリングで分析した結果、最も表面に露出すると予想される９２番、９３番、９４番のアミノ酸を一度にアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ、Ａ）で置換した突然変異を構築した。
【０２１３】
表２はｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０２１４】
［表２］
2019520086.tif 000004
【０２１５】
実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０２１６】
図１３は、細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３のアミノ酸のうち、エンドソーム脱出に関与する可能性のある９２番目、９３番目および９４番目のアミノ酸をアラニンで置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０２１７】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、  細胞質のｐＨ条件である７．４に維持するためにｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨ条件である５．５に維持するためにｐＨ５．５の緩衝液  （ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、緩衝液、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−Ｙ９１Ａ、ＴＭａｂ４−Ｙ９２Ａ、ＴＭａｂ４−Ｙ９３Ａ、ＴＭａｂ４−Ｈ９４Ａ、ＴＭａｂ４−ＡＡＡ、ＴＭａｂ４−Ｙ９６Ａを１０μＭ入れ、細胞を７℃の条件で２時間培養させた。
【０２１８】
ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。ＴＭａｂ４−Ｙ９２Ａ、ＴＭａｂ４−Ｙ９３Ａ、ＴＭａｂ４−Ｈ９４Ａは、ＴＭａｂ４と比べてトリパンブルーの獲得が有意に減少することを確認した。特に、ＴＭａｂ４−ＡＡＡは、トリパンブルーの獲得が殆どなかった。これに対し、ＴＭａｂ４−Ｙ９１Ａ、ＴＭａｂ４−Ｙ９６Ａは、ＴＭａｂ４と類似の程度のトリパンブルーの獲得を確認した。すなわち、エンドソーム脱出において、９２番、９３番、９４番のアミノ酸が大きく寄与していることを確認した。
【０２１９】
実施例１２．細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２のエンドソーム脱出能寄与度の確認
今までの実験結果により、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ３がエンドソーム脱出に関与することを証明した。次に、細胞内在化を担当する（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２がエンドソーム脱出に及ぶ影響を明らかにするために実験を行った。
【０２２０】
軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２を、ヒト由来生殖腺配列のうち、アミノ酸の個数が等しいか、細胞内在化を担当するＣＤＲ１のカチオンパッチ配列が含まれていないアミノ酸配列を有するＣＤＲ配列で置換した。この際、既存の軽鎖可変領域の安定性に重要であると知られたアミノ酸は保存した。
【０２２１】
表３は、遺伝子合成により構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０２２２】
【表３】
2019520086.tif 000005
【０２２３】
実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０２２４】
図１４ａは、ＨＳＰＧ受容体に結合して細胞質浸透能を担う細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２をヒト由来生殖腺配列で置換した突然変異の細胞質浸透能を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【０２２５】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−０１、ＴＭａｂ４−０２、ＴＭａｂ４−０３  ２μＭを３７℃で６時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。
【０２２６】
ＴＭａｂ４は、Ａｌｅｘａ−４８８（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。３つの突然変異は、何れも野生型ＴＭａｂ４に比べて細胞内部の蛍光が減少し、特に、ＴＭａｂ４−０３の場合、細胞内部の蛍光が殆ど観察されなかった。
【０２２７】
図１４ｂは、ＨＳＰＧ受容体に結合して細胞質浸透能を担う細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１とＣＤＲ２をヒト由来生殖腺配列で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０２２８】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、細胞質のｐＨ条件である７．４に維持するためにｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨ条件である５．５に維持するためにｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、緩衝液、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−０１、ＴＭａｂ４−０２、ＴＭａｂ４−０３を１０μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。突然変異であるＴＭａｂ４−０１、ＴＭａｂ４−０３は、ＴＭａｂ４と類似の程度のトリパンブルーの獲得を確認した。すなわち、軽鎖可変領域内で細胞内在化を担当する部位（ＶＬ−ＣＤＲ１とＶＬ−ＣＤＲ２）と、エンドソーム脱出を担当する部位（ＶＬ−ＣＤＲ３）が区分されていることを証明した。  
【０２２９】
実施例１３．細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能の向上論理
細胞質浸透軽鎖可変領域であるｈＴ４  ＶＬの１番、９５番のアミノ酸対の相互作用によるＶＬ−ＣＤＲ３の特性変化により、エンドソーム脱出の初期機序である初期エンドソーム内膜のリン脂質との結合のために、溶媒接近性が向上すると予想されるアミノ酸は９２番、９３番、９４番のアミノ酸であり、それぞれチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｙ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈ）である。
【０２３０】
前記アミノ酸は、エンドソーム内部のリン脂質層の主要構成成分である１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との相互作用が容易である。
【０２３１】
ｐＨ条件の変化によって露出すると予想される前記３つのアミノ酸が、初期エンドソーム内部のリン脂質層との相互作用およびエンドソーム脱出に関与することを確認し、エンドソームから脱出する細胞質浸透抗体の割合を向上させるために、９２番、９３番、９４番のアミノ酸に対する突然変異を製作した。
【０２３２】
突然変異の構築論理は、既存文献を調査して１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）との相互作用が容易なアミノ酸を把握し（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、該９２番、９３番、および９４番のアミノ酸に、選定されたアミノ酸を導入するように設計された。
【０２３３】
具体的に、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）と２０種のアミノ酸との平均結合力は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）の順に高い。
【０２３４】
具体的に、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の親水性の頭部と２０種のアミノ酸との結合力は、アルギニン（Ｒ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）の順に高く、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）の疎水性の尾部と２０種のアミノ酸との結合力は、トリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）の順に高い。
【０２３５】
このような結果に基づいて、初期エンドソーム内部のリン脂質層の主要構成成分であるＰＯＰＣとの相互作用が最も容易なアミノ酸はトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｗ）である（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。したがって、本発明では、１つもしくは２つのアミノ酸をトリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｗ）で置換する方策を選択した。
【０２３６】
下記表４、５、６は、設計された細胞質浸透能を有するヒト抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の軽鎖可変領域の配列を示す。表４は、ヒト抗体軽鎖可変領域の全体配列をカバットナンバリングに従って示した表であり、表５、表６は、前記表４の抗体配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の配列またはＣＤＲ３の配列のみを別に表記した内容である。
【０２３７】
［表４］
2019520086.tif 000006
【０２３８】
［表５］
2019520086.tif 000007
【０２３９】
［表６］
2019520086.tif 000008
【０２４０】
実施例１４．細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の発現および精製、並びに細胞質浸透能の維持確認
細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能の向上が期待される突然変異の動物細胞の発現のために、前記実施例１と同様に軽鎖を発現するベクターを構築するために、５´末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合された細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４  ＶＬ）、または突然変異抗体の軽鎖可変領域（ｈＴ４−ＷＷＨ  ＶＬ，  ｈＴ４−ＷＹＷ  ＶＬ，  ｈＴ４−ＹＷＷ  ＶＬ，  ｈＴ４−ＷＹＨ  ＶＬ，  ｈＴ４−ＹＷＨ  ＶＬ）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。
【０２４１】
その後、ヒト化ｈＴ０  ＶＨをコードしている動物発現ベクターと、構築されたエンドソーム脱出能向上期待軽鎖可変領域を含む軽鎖がコードされた動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の精製は、実施例１と同様に行った。
【０２４２】
図１５ａは、細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。
【０２４３】
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認し、還元性条件では、重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現および精製された細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能の向上が期待される突然変異が溶液状態で単体として存在し、非自然的ジスルフィド結合によって二重体またはオリゴマーを形成しないことを示す。
【０２４４】
図１５ｂは、細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異の細胞質浸透能が維持されるかを共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０２４５】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−ＷＷＨ、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＹＷＷ、ＴＭａｂ４−ＷＹＨ、ＴＭａｂ４−ＹＷＨ  ２μＭを３７℃で６時間培養した。
【０２４６】
実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。各抗体は、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。５種の突然変異で、何れも細胞質浸透能が維持されることを確認した。
【０２４７】
実施例１５．細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上期待突然変異のｐＨ依存性の確認
図１６は、野生型細胞質浸透抗体およびエンドソーム脱出能向上期待突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０２４８】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４、アダリムマブ、ＴＭａｂ４−ＷＷＨ、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＹＷＷ、ＴＭａｂ４−ＷＹＨ、ＴＭａｂ４−ＹＷＨを１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。５種の突然変異のうち、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＹＷＷ、ＴＭａｂ４−ＷＹＨ、ＴＭａｂ４−ＹＷＨは、トリパンブルーの獲得の割合が増加し、中でも、ＴＭａｂ４−ＷＹＷはｐＨ依存的なトリパンブルーの獲得が起こることを確認した。
【０２４９】
野生型の細胞質浸透能が維持され、且つｐＨ依存的なトリパンブルーの獲得が増加したＴＭａｂ４−ＷＹＷを最終クローンとして選定した。
【０２５０】
実施例１６．細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上突然変異の細胞質位置の向上確認
図１７ａは、野生型細胞質浸透抗体またはエンドソーム脱出能向上突然変異ＴＭａｂ４−ＷＹＷの細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０２５１】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、血清のない培養液に、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ  ０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＴＭａｂ４−ＷＹＷは、ＴＭａｂ４に比べてより低い濃度でも強い強度の緑色カルセイン蛍光が観察されることを確認した。
【０２５２】
図１７ｂは、図１７ａの共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【０２５３】
具体的には、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を用いて各条件で２０個の細胞をそれぞれ指定した後、得られた蛍光の平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。
【０２５４】
実施例１７．改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合による細胞質浸透単クローン抗体の細胞質位置の確認
図１８は、野生型細胞質浸透抗体またはエンドソーム脱出能向上突然変異が細胞質に位置する場合、改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合によるＧＦＰ蛍光が観察される過程を示した模式図である。
【０２５５】
具体的には、細胞質浸透抗体が細胞質に位置することを直接確認するために、改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的システムを使用した。緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰを１−１０番、１１番の片に分割すると蛍光を帯びる特性が除去され、２つの片の距離が近くなって結合すると、蛍光を帯びる特性を回復することができる（Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０２５６】
このような特性を用いて、ＧＦＰの１−１０番の片は細胞質に発現させ、ＧＦＰの１１番の片は、細胞質浸透抗体の重鎖Ｃ−末端に融合させた。また、ＧＦＰ断片間の相補的な結合を補完するために、高い親和度を有するストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）とストレプトアビジン−結合ペプチド２（ＳＢＰ２）をそれぞれＧＦＰ断片に融合する。したがって、ＧＦＰ蛍光が観察されるということは、細胞質浸透抗体が細胞質に位置するということを反証する。
【０２５７】
実施例１８．ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２が融合された細胞質浸透抗体の発現および精製
ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された細胞質浸透抗体の動物細胞の発現のために、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２を重鎖Ｃ−末端に、ＧＧＧＧＳ３個のリンカーを用いて遺伝工学的に融合した。その後、前記細胞質浸透軽鎖とエンドソーム脱出能向上細胞質浸透軽鎖をコードしている動物発現ベクターと、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２が融合された重鎖がコードされた動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された細胞質浸透抗体の精製は、実施例１と同様に行った。
【０２５８】
図１９は、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された野生型細胞質浸透抗体およびエンドソーム脱出能向上突然変異の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。
【０２５９】
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認し、還元性条件で、重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現および精製されたＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された細胞質浸透抗体が溶液状態で単体として存在し、非自然的ジスルフィド結合によって二重体またはオリゴマーを形成しないことを示す。
【０２６０】
実施例１９．ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された細胞質浸透抗体の細胞質位置によるＧＦＰ蛍光の確認
図２０ａは、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された野生型細胞質浸透抗体およびエンドソーム脱出能向上突然変異の改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合によるＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０２６１】
具体的には、実施例２と同様にＳＡ−ＧＦＰ１−１０を安定して発現する形質転換されたＨｅＬａ細胞株を準備し、細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２  ０．２、０．４、０．６、０．８、１．６、３．２μＭを３７℃で６時間培養した。
【０２６２】
実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。ＴＭａｂ４−ＷＹＷは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＴＭａｂ４に比べて低い濃度でも強い強度の緑色ＧＦＰ蛍光が観察されることを確認した。
【０２６３】
図２０ｂは、図２０ａの共焦点顕微鏡写真のＧＦＰ蛍光を定量したグラフである。
具体的には、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を用いて各条件で２０個の細胞をそれぞれ指定した後、得られた蛍光の平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。
【０２６４】
細胞質の内部に位置するＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体と、エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透抗体の細胞質内濃度とエンドソーム脱出効率を定量的に示して比較するために実験を行った。
【０２６５】
下記表７は、細胞質の内部に位置するＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体と、エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透抗体の細胞質内濃度とエンドソーム脱出効率を示した表である。
【０２６６】
［表７］
2019520086.tif 000009
【０２６７】
実施例２０．エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透抗体と脂質の相互作用の深層分析
野生型細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３の９２番、９４番目のアミノ酸をトリプトファンで置換した際に、エンドソーム脱出能が向上することを確認した。
【０２６８】
このようなエンドソーム脱出能の向上が、脂質のどの部分との相互作用が向上したためであるかを確認するために実験を行った。トリプトファン（Ｗ）は、脂質の親水性の頭部および疎水性の尾部との相互作用が両方とも容易なアミノ酸である。親水性の頭部との相互作用が容易なアルギニン（Ｒ）、疎水性の尾部との相互作用が容易なイソロイシン（Ｉ）、脂質との相互作用が非常に弱いグリシン（Ｇ）で置換し、その活性を比較すれば、脂質のどの部分との相互作用が重要な役割をするのかが分かる。
【０２６９】
エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透抗体と脂質の相互作用を深層分析するために、トリプトファンをそれぞれアルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、グリシン（Ｇ）で置換した突然変異を構築した。
【０２７０】
表８は、ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０２７１】
［表８］
2019520086.tif 000010
【０２７２】
実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０２７３】
実施例２１．細胞質浸透抗体と脂質の相互作用の深層分析
図２１ａは、トリプトファンと反対される性質を有するアミノ酸であるアルギニン、イソロイシン、およびグリシンでそれぞれ置換した突然変異の細胞膜結合を流細胞分析機（ＦＡＣＳ）で分析したグラフである。
【０２７４】
具体的には、各サンプル当たり１ｘ１０５個のｒａｍｏｓ細胞を準備した。細胞をＰＢＳで洗浄した後、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）に、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＲＹＲ、ＴＭａｂ４−ＩＹＩ、ＴＭａｂ４−ＧＹＧを３μＭ入れ、４℃で１時間培養した。各ｐＨの緩衝液で洗浄した後、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＲＹＲ、ＴＭａｂ４−ＩＹＩ、ＴＭａｂ４−ＧＹＧは、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体と４℃の条件で３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、流細胞分析機で分析した結果、ｐＨ５．５の条件でＴＭａｂ４のみが細胞膜に結合することを確認した。
【０２７５】
図２１ｂは、トリプトファンと反対される性質を有するアミノ酸であるアルギニン、イソロイシン、およびグリシンでそれぞれ置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０２７６】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、  細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＴＢＳ，２％  ＢＳＡ，５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）  ２００μｌに、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＲＹＲ、ＴＭａｂ４−ＩＹＩ、ＴＭａｂ４−ＧＹＧを１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。ＴＭａｂ４−ＷＹＷに比べて、ＴＭａｂ４−ＲＹＲ、ＴＭａｂ４−ＩＹＩ、ＴＭａｂ４−ＧＹＧはトリパンブルーの獲得が減少した。
【０２７７】
図２１ｃは、トリプトファンと反対される性質を有するアミノ酸であるアルギニン、イソロイシン、およびグリシンでそれぞれ置換した突然変異の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【０２７８】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、ＴＭａｂ４、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＲＹＲ、ＴＭａｂ４−ＩＹＩ、ＴＭａｂ４−ＧＹＧ  ０．５μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＴＭａｂ４−ＲＹＲ、ＴＭａｂ４−ＩＹＩ、ＴＭａｂ４−ＧＹＧを処理した細胞では、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光の強度がＴＭａｂ４−ＷＹＷを処理した細胞に比べて弱かった。
【０２７９】
したがって、脂質の親水性の頭部および疎水性の尾部との相互作用が両方ともエンドソーム脱出に関与し、その理由から、トリプトファンで置換した際にエンドソーム脱出能が向上したことを確認した。
【０２８０】
実施例２２．完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の発現、精製
エンドソーム脱出能が向上した突然変異は、最終的に細胞質に位置する抗体の量が増加するはずであるため、細胞質の内部に位置するタンパク質をより効果的に標的することができる。
【０２８１】
図２２ａは、エンドソーム脱出能が向上した細胞質浸透抗体突然変異の活性を確認するために、完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０２８２】
完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透単クローン抗体の動物細胞の発現のために、実施例１と同様に、５´末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合され、細胞骨格であるチューブリンに特異的に結合する重鎖可変領域と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした（Ｌａｕｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２８３】
その後、前記細胞質浸透軽鎖とエンドソーム脱出能向上細胞質浸透軽鎖をコードしている動物発現ベクターと、構築されたチューブリンに特異的に結合する重鎖可変領域を含む重鎖がコードされた動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の精製は、実施例１と同様に行った。
【０２８４】
図２２ｂは、完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果である。
【０２８５】
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認し、還元性条件では、重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現および精製された完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体が溶液状態で単体として存在し、非自然的ジスルフィド結合によって二重体またはオリゴマーを形成しないことを示す。
【０２８６】
実施例２３．完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体の細胞骨格チューブリンとの特異的結合の確認
図２２ｃは、完全ＩｇＧ形態の抗−チューブリン細胞質浸透抗体と細胞質に位置した細胞骨格であるチューブリンとの重畳有無を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【０２８７】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、１０％のＦＢＳが含まれた培地５００μｌに、ＰＢＳ、ＴｕＴ４、ＴｕＴ４−ＷＹＷ  ３μＭを入れ、３７℃で６時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。
【０２８８】
細胞骨格であるチューブリンは、抗−チューブリン抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）を用いて２５℃で１時間反応させ、ＴＲＩＴＣ（赤色蛍光）が連結された二次抗体を２５℃で１時間反応させた。各抗体は、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【０２８９】
図２２ｃに示されたように、赤色蛍光のチューブリンが位置する細胞質の部分に、緑色蛍光のＴｕＴ４−ＷＹＷが繊維状に重なっているのに対し、ＴｕＴ４は重なっていなかった。
【０２９０】
実施例２４．完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の発現、精製、およびＫ−ＲＡＳ突然変異の親和度の分析
細胞骨格であるチューブリン以外に、他の細胞質内部のタンパク質を効果的に標的することができるか、実験を行った。
【０２９１】
図２３ａは、エンドソーム脱出能が向上した突然変異の活性を確認するために、完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０２９２】
完全ＩｇＧ形態のＲａｓ標的細胞質浸透抗体の動物細胞の発現のために、実施例５と同様に、５´末端に分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡが融合され、重鎖可変領域依存的にＧＴＰが結合されたＫ−ＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域（ＲＴ１１  ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡを、それぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。
【０２９３】
その後、前記細胞質浸透軽鎖とエンドソーム脱出能向上細胞質浸透軽鎖をコードしている動物発現ベクターと、構築されたＧＴＰが結合されたＫ−ＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域を含む重鎖がコードされた動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、完全ＩｇＧ形態のＲａｓ標的細胞質浸透抗体の精製は、実施例１と同様に行った。
【０２９４】
図２３ｂは、完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の精製後、還元性または非還元性条件で、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したものである。
【０２９５】
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認し、還元性条件では、重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現および精製された完全ＩｇＧ形態のＲａｓ標的細胞質浸透抗体が溶液状態で単体として存在し、非自然的ジスルフィド結合によって二重体またはオリゴマーを形成しないことを示す。
【０２９６】
図２３ｃは、Ｋ−ＲＡＳ突然変異体Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２ＤのＧｐｐＮＨｐが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【０２９７】
具体的には、ＧＴＰは非常に加水分解されやすいため、ＧＴＰが結合された形態のＫ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｄの形態を維持することが困難である。そこで、安定してＧＴＰとともにＫ−ＲＡＳが活性化された構造を有するように、加水分解されないＧＴＰ類似体であるＧｐｐＮＨｐを用いて、ＧＴＰ結合形態のＫ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ抗原を構築した。標的分子Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２ＤのＧｐｐＮＨｐが結合された形態と、ＧＤＰが結合された形態を９６ウェルのＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３７℃で１時間結合させた後、０．１％のＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間、３回洗い出した。５％のＰＢＳＳ（５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％のＰＢＳＴで１０分間、３回洗い出した。その後、ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体ＴＭａｂ４、ＲＴ１１、ＲＴ１１−ＷＹＷを結合させた後、０．１％のＰＢＳＴで１０分間、３回洗い出した。標識抗体として、塩素由来のＡＰが接合された抗−ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）に結合させた。ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）で反応させ、４０５ｎｍの吸光度を定量した。
【０２９８】
Ｋ−ＲＡＳ突然変異に対して親和度を分析した結果、野生型であるＲＴ１１と突然変異であるＲＴ１１−ＷＹＷとの間に、親和度の差が殆どないことを確認した。陰性対照群として使用されたＴＭａｂ４の場合、結合しておらず、ＧＤＰが結合されたＫ−ＲＡＳでは、全てのクローンが結合しなかった。
【０２９９】
実施例２５．完全ＩｇＧ形態の抗−ＲＡＳ  ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞内のＧＴＰが結合されたＫ−ＲＡＳとの特異的結合の確認
図２４は、完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体と、細胞内活性化されたＨ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重畳有無を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【０３００】
具体的には、２４ウェルプレートにｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｓｉｇｍａ）をコーティングした後、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）Ｈ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖが発現されるＮＩＨ３Ｔ３細胞株をそれぞれウェル当たり２ｘ１０４個を０．５ｍｌに希釈し、１２時間、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した後、ＴＭａｂ４、ＲＴ１１、ＲＴ１１−ＷＹＷ  ２μＭを処理し、３７℃で１２時間培養した。その後、実施例２と同様の条件で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。
【０３０１】
図２４に示されたように、赤色蛍光の活性化されたＲＡＳが位置する細胞内膜部分に、緑色蛍光のＲＴ１１、ＲＴ１１−ＷＹＷが重なっているのに対し、ＴＭａｂ４は重なっていなかった。
【０３０２】
上記の実験結果から、細胞内の活性化されたＲＡＳと完全ＩｇＧ形態のＲａｓ標的細胞質浸透抗体が特異的に結合することを確認し、重なる程度はＲＴ１１−ＷＹＷ、ＲＴ１１の順であった。
【０３０３】
実施例２６．ｐＨ条件に応じた構造変化を誘導するＤ１−Ｍ９５の特性分析
ｐＨに応じた細胞質浸透抗体の特性変化を誘導する軽鎖可変領域（ＶＬ）の１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）、９５番目のアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）の特性をさらに詳細に分析するために、抗体骨格に位置する１番目のアミノ酸を、生殖腺由来の配列に存在するグルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、アルパラギン（Ｎ）で置換し、ＣＤＲ３に位置する９５番目のアミノ酸は、２０個のアミノ酸で全て置換して突然変異を構築した。
【０３０４】
また、この突然変異を構築する際に、改善されたエンドソーム脱出能モチーフによって減少したタンパク質の発現収率を高めるために、８７番目のアミノ酸であるチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）をフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）で置換した。フェニルアラニンは、重鎖可変領域の骨格に位置する芳香環を有するアミノ酸および疎水性アミノ酸との相互作用が容易であり、軽鎖可変領域と重鎖可変領域のインターフェイスを強化することができるアミノ酸である。８７番目のアミノ酸がフェニルアラニンで置換され、９２−９４番目のアミノ酸を、改善されたエンドソーム脱出能モチーフであるＷＹＷとして有する軽鎖可変領域を「ｈＴ４−３」と命名した。したがって、前記軽鎖可変領域を含む細胞質浸透完全ＩｇＧ形態の抗体は「ＴＭａｂ４−３」と命名した。
【０３０５】
各突然変異は、実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０３０６】
図２５ａは、酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の構造的変化の誘導に関与する細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）の１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸を種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３０７】
具体的には、ＨＳＰＧ受容体を発現しない付着細胞ｐｇｓＤ−６７７細胞株（１ｘ１０４）を２４ウェルプレートに培養する。翌日、実施例５と同様に、ｐＨを細胞質のｐＨ条件に維持するためにｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、およびｐＨを初期エンドソームのｐＨ条件に維持するためにｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４−３、ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ａ、ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ｅ、ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ｎ  １μＭを入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０３０８】
ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ｅは略類似の程度のトリパンブルーの獲得を示し、ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ａ、ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ｎ突然変異は、トリパンブルーの獲得が減少した。
【０３０９】
図２５ｂは、酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の構造的性変化の誘導に関与  する  細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）９５番目のアミノ酸であるメチオニンをそれぞれ種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３１０】
具体的には、前記実施例２６と同様にｐｇｓＤ−６７７細胞を準備し、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４−３、ＴＭａｂ４−３  Ｍ９５Ｘ突然変異１９種を１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。
【０３１１】
これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。ＴＭａｂ４−３と比較して、ＴＭａｂ４−３  Ｍ９５Ｌ、Ｍ９５Ｉ、Ｍ９５Ｈは、類似の程度のトリパンブルーの獲得を示し、ＴＭａｂ４−３  Ｍ９５Ａ、Ｍ９５Ｓ、Ｍ９５Ｖ、Ｍ９５Ｇ、Ｍ９５Ｐ突然変異は、トリパンブルーの獲得が減少した。また、ＴＭａｂ４−３  Ｍ５９Ｄ、Ｍ５９Ｅは、ｐＨ依存的にトリパンブルーの獲得が増加したが、ＴＭａｂ４−３  Ｍ９５Ｋ、Ｍ９５Ｒ突然変異は、中性ｐＨでのトリパンブルーの獲得が増加した。
【０３１２】
このことから、酸性ｐＨを認知して構造変化を起こすためには側鎖の長さが長い疎水性アミノ酸と、負電荷を帯びるアミノ酸およびヒスチジン（Ｈ）の相互作用が最も効果的であることを確認した。
【０３１３】
軽鎖可変領域の９５番のアミノ酸が、疎水性を帯びるアミノ酸であるメチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、または負電荷を帯びるアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）で構成される際に、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）との相互作用で、一定部分の負電荷を帯びるアミノ酸側鎖のカルボキシル酸が水素化され（ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）、疎水性を帯びる特徴による疎水性相互作用（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をすると予想される（Ｄｕ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｄｉ  Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０３１４】
また、軽鎖可変領域の９５番のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）で構成される際に、ｐＨ７．４からｐＨ５．５に変更されるにつれて、アミノ酸側鎖の実効電荷（Ｎｅｔ  ｃｈａｒｇｅ）が正電荷を帯びることになり、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の１番のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）と静電気的相互作用（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）をすることで、エンドソーム脱出を誘導すると予想される。
【０３１５】
実施例２７．「ｐＨ認知特性変化誘導」アミノ酸導入突然変異の設計
本研究者らは、既存のＤ１−Ｍ９５の他に、ｐＨ条件に応じた相互作用の変化によりエンドソーム脱出能を誘導することができるアミノ酸を導入しようとした。
【０３１６】
構造モデリング分析により、１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸（Ｄ）と相互作用できる９０番目、９１番目のアミノ酸を、可能性のある候補として選定した。酸性ｐＨ条件で相互作用できるように、前記９０番目のアミノ酸をヒスチジンで置換（ＴＭａｂ４−３  Ｑ９０Ｈ）、９１番目のアミノ酸をヒスチジンで置換（ＴＭａｂ４−３  Ｙ９１Ｈ）した。
【０３１７】
また、疎水性を帯びる２番目のアミノ酸との追加的な相互作用が可能な９１番目のアミノ酸をアスパラギン酸（ＴＭａｂ４−３  Ｙ９１Ｄ）で置換した。
【０３１８】
また、負電荷を帯びる１番目のアミノ酸と相互作用できるように、２番目のアミノ酸も負電荷を帯びるグルタミン酸（Ｅ）で置換し、疎水性を帯びる９５番目のアミノ酸と相互作用できるように、９０番目のアミノ酸をロイシン（Ｌ）で置換（ＴＭａｂ４−３  Ｌ２Ｅ  Ｑ９０Ｌ）し、負電荷を帯びる１番目のアミノ酸と相互作用できるように、２番目のアミノ酸も負電荷を帯びるグルタミン酸（Ｅ）で置換し、疎水性を帯びる９５番目のアミノ酸と相互作用できるように、９７番目のアミノ酸をイソロイシン（Ｉ）で置（ＴＭａｂ４−３  Ｌ２Ｅ  Ｔ９７Ｉ）換した。
【０３１９】
下記表９はｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０３２０】
［表９］
2019520086.tif 000011
【０３２１】
各突然変異は実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０３２２】
実施例２８．「ｐＨ認知特性変化誘導」アミノ酸導入突然変異のエンドソーム脱出能の向上の確認
図２６ａは、「ｐＨ認知特性変化誘導」目的で設計した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３２３】
具体的には、実施例２６と同様に細胞を準備した後、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），  ５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４−３、ＴＭａｂ４−３  Ｄ１Ｅ−Ｍ９５Ｌなどの突然変異７種を０．５または１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０３２４】
ＴＭａｂ４−３に比べて、ＴＭａｂ４−３  Ｑ９０Ｈ突然変異は、０．５μＭで高いトリパンブルーの獲得を示した。さらに、野生型と有意差を示したＴＭａｂ４−３  Ｑ９０Ｈ突然変異を用いて実験を行った。
【０３２５】
図２６ｂは、「ｐＨ認知特性変化誘導」目的で設計した突然変異の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【０３２６】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、ＴＭａｂ４−３、ＴＭａｂ４−３  Ｑ９０Ｈ  ０．２５、０．５、１μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した  。
【０３２７】
ＴＭａｂ４−３を処理した細胞に比べて、ＴＭａｂ４−３  Ｑ９０Ｈを処理した細胞では、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光が向上した。したがって、細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域の９５番のアミノ酸以外にも、９０番のアミノ酸が１番のアミノ酸と相互作用することで、ｐＨ依存的な相互作用の変化によりエンドソーム脱出能を誘導することを確認した。
【０３２８】
下記表１０は、追加的なｐＨ認知特性変化の誘導によりエンドソーム脱出能が向上した突然変異の軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列を示す。
【０３２９】
［表１０］
2019520086.tif 000012
【０３３０】
実施例２９．軽鎖可変領域のＣＤＲ３の長さに応じたエンドソーム脱出能の探索
軽鎖可変領域のＣＤＲ３は、８５％以上が９個のアミノ酸で構成されている。アミノ酸の個数と構成に応じて、ＣＤＲ３環構造が変わる。本発明では、アミノ酸の個数と構成に応じて、エンドソーム脱出能がどのように変わるかを分析するために、ＣＤＲ３を構成するアミノ酸の個数が各８、１０、１１個からなる突然変異を構築した。
【０３３１】
表１１はｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０３３２】
［表１１］
2019520086.tif 000013
【０３３３】
各突然変異は実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０３３４】
図２７は、細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を構成するアミノ酸の個数を異ならせた突然変異らのｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３３５】
具体的には、実施例２６と同様に細胞を準備した後、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４−３、ＴＭａｂ４−３  Ｌ８−１などの突然変異７種を１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０３３６】
ＴＭａｂ４−３に比べて、アミノ酸の個数が増加するほど、中性ｐＨでのトリパンブルーの獲得が増加した。これは、アミノ酸の個数が増加して全体ＣＤＲ３環構造が伸びることとなり、エンドソーム脱出のためにエンドソーム細胞膜に結合するエンドソーム脱出モチーフであるＷＹＷが外部に露出し、中性ｐＨでもトリパンブルーの獲得が起こるのであると判断される。
【０３３７】
また、上記の実験結果から、既存のｐＨ依存的な相互作用の変化によりエンドソーム脱出を誘導する９５番のアミノ酸と、リン脂質との結合によりエンドソーム脱出に影響する９２番、９３番、９４番の残基間の距離が増加しても、エンドソーム脱出モチーフの特性が維持されることを確認した。
【０３３８】
実施例３０．既存の治療用抗体の軽鎖可変領域への、改善されたエンドソーム脱出能モチーフの付与可能論理
現在市販されている治療用抗体のうち、細胞表面受容体、特に細胞内在化が起こる細胞表面受容体を標的する単クローン抗体の種類は非常に多い。しかし、従来のこのような抗体は、細胞内在化された後、抗原との結合が切れず、エンドソーム脱出能を有しないため、細胞質へ移動できずにさらに細胞外に吐出される。したがって、このような細胞内在化が起こる受容体標的抗体にエンドソーム脱出能を付与することができれば、今よりさらに広い範囲で応用可能であるという利点がある。
【０３３９】
また、市販されている治療用抗体の安定した骨格を用いて全体的な発現収率の増加を期待することができ、腫瘍組織特異的ではない収容体であるＨＳＰＧとの親和度を除去して腫瘍組織特異的特性を付与することを可能とする利点を有している。
【０３４０】
改善されたエンドソーム脱出能モチーフを付与するために、細胞内在化が起こる受容体標的抗体の軽鎖可変領域の配列と細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域の配列を比較し、１番目のアミノ酸が負電荷を帯び、ＣＤＲ３環構造に影響し得る骨格に位置する主要アミノ酸が同一である候補軽鎖可変領域の配列をまとめた。
【０３４１】
候補軽鎖可変領域のＣＤＲ３の配列を、細胞質浸透抗体のＣＤＲ３の配列で置換する突然変異を構築した。
【０３４２】
表１２は遺伝子合成法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０３４３】
［表１２］
2019520086.tif 000014
【０３４４】
図２８ａは、既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０３４５】
実施例１と同様に、軽鎖可変領域のクローニングを行い、ＧＴＰが結合されたＫ−ＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域を含む重鎖がコードされた動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、完全ＩｇＧ形態の抗−ＲＡＳ  ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの精製は、実施例１と同様に行った。
【０３４６】
実施例３１．既存の治療用抗体の軽鎖可変領域への、改善されたエンドソーム脱出能モチーフの付与可能確認
図２８ｂは、既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の抗体のＨＳＰＧ結合能および細胞質浸透能が減少もしくは除去されたかを、蛍光顕微鏡にて観察した結果である。
【０３４７】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＲＴ１１−３、ＲＴ１１−Ｎｅｃｉ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−Ｎｉｍｏ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−Ｐａｎｉ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−Ｐｅｒｔ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−Ｌｕｍｒ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−Ｅｍｉｂ−ＷＹＷ  １μＭを３７℃で６時間培養した。
【０３４８】
実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。各抗体は、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。６種の改善されたエンドソーム脱出能を付与した単クローン抗体骨格を含む完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体では、何れも細胞内部での蛍光が観察されなかった。
【０３４９】
図２８ｃは、既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の抗体による、酸性ｐＨによるトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３５０】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＲＴ１１−３，ＲＴ１１−Ｎｅｃｉ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｎｉｍｏ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｐａｎｉ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｐｅｒｔ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｌｕｍｒ−ＷＹＷ，およびＲＴ１１−Ｅｍｉｂ−ＷＹＷ１μＭを入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。
【０３５１】
全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。ＲＴ１１−Ｐｅｒｔを除いた５種の改善されたエンドソーム脱出能を付与した治療用抗体骨格を含む完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の場合、ＲＴ１１−３と類似のトリパンブルーの獲得が観察された。
【０３５２】
実施例３２．改善されたエンドソーム脱出能を付与した治療用抗体骨格を含む完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体のＧＴＰが結合されたＫ−ＲＡＳとの特異的結合維持の確認
図２９ａは、既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体のＫ−ＲＡＳ突然変異体Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２ＤのＧｐｐＮＨｐが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためのＥＬＩＳＡを行った結果である。
【０３５３】
具体的には、標的分子Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２ＤのＧｐｐＮＨｐが結合された形態と、ＧＤＰが結合された形態を、９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）に３７℃で１時間結合させた後、０．１％のＰＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間、３回洗い出した。５％のＰＢＳＳ（５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％のＰＢＳＴで１０分間、３回洗い出した。その後、ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体ＲＴ１１−３，ＲＴ１１−Ｎｅｃｉ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｎｉｍｏ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｐａｎｉ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｐｅｒｔ−ＷＹＷ，ＲＴ１１−Ｌｕｍｒ−ＷＹＷ，およびＲＴ１１−Ｅｍｉｂ−ＷＹＷを結合させた後、０．１％のＰＢＳＴで１０分間、３回洗い出した。標識抗体として、塩素由来のＡＰが接合された抗−ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）に結合させた。ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ）で反応させ、４０５ｎｍの吸光度を定量した。
【０３５４】
Ｋ−ＲＡＳ突然変異に対して親和度を分析した結果、ＲＴ１１−Ｎｉｍｏを除いた５種の改善されたエンドソーム脱出能を付与した治療用抗体骨格を含む完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の場合、ＲＴ１１−３と親和度の差を示さず、陰性対照群として使用されたＧＤＰが結合されたＫ−ＲＡＳには、全てのクローンが結合しなかった。
【０３５５】
図２９ｂは、ＲＧＤ１０ペプチド融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０３５６】
改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体は細胞浸透能が除去されたため、細胞浸透が可能であるように、新生血管細胞および種々の腫瘍で過発現されるインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αｖβ３）に特異性を有するＲＧＤ１０ペプチドを、軽鎖のＮ−末端にＧＧＧＧＳ２個のリンカーを用いて遺伝工学的に融合した。ＲＧＤ１０ペプチドの場合、ＲＧＤ４Ｃペプチドと類似の親和度を有しているが、２つのシステインによる１つのジスルフィド結合のみが存在し、遺伝工学的な融合が可能であるという特徴がある。
【０３５７】
また、発現収率、エンドソーム脱出能、Ｒａｓに対する親和度の分析実験結果に基づいて、優れた候補抗体であるＲＴ１１−Ｐａｎｉ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−Ｎｅｃｉ−ＷＹＷの軽鎖可変領域のＮ−末端にＲＧＤ１０ペプチドを融合した。
【０３５８】
図２９ｃは、ＲＧＤ１０ペプチド融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体と、細胞内活性化されたＨ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重畳有無を共焦点顕微鏡にて確認した結果である。
【０３５９】
具体的には、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ突然変異を有するヒト大腸癌細胞株であるＳＷ４８０細胞株を、２４ウェルプレートのそれぞれのウェル当たり２ｘ１０４個を０．５ｍｌに希釈し、１２時間、３７℃、５％のＣＯ２条件で培養した後、ＲＴ１１−ｉ３、ＲＴ１１−ｉ−Ｎｅｃｉ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−ｉ−Ｐａｎｉ−ＷＹＷ  １μＭを処理し、３７℃で１２時間培養した。その後、実施例２と同様の条件で抗体と核を標識し、Ｒａｓ標識抗体を３７℃の条件で１時間反応させた後、二次抗体で染色して共焦点顕微鏡で観察した。
【０３６０】
図２９ｃに示されたように、赤色蛍光の活性化されたＲＡＳが位置する細胞内膜部分に、緑色蛍光のＲＴ１１−ｉ３、ＲＴ１１−ｉ−Ｎｅｃｉ−ＷＹＷ、ＲＴ１１−ｉ−Ｐａｎｉ−ＷＹＷが重なっていた。
【０３６１】
上記の実験結果から、細胞内の活性化されたＲＡＳと、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態のＲＡＳ標的細胞質浸透抗体が特異的に結合することを確認した。
【０３６２】
実施例３３．重鎖可変領域のＣＤＲへの、改善されたエンドソーム脱出能モチーフの付与可能論理
重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、β−ひだ折れ構造を骨格とし、環構造を有する３個のＣＤＲからなっているという構造的な共通点がある。したがって、軽鎖可変領域のｐＨ依存的な相互作用の変化によるエンドソーム脱出能誘導モチーフを重鎖可変領域にも付与可能であると判断した。
【０３６３】
このような現象を重鎖可変領域で再現可能であるかを、重鎖可変領域の配列および３次構造を用いて分析した結果、重鎖可変領域の１番目のアミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）と相互作用できる距離にあるＣＤＲ３に、改善されたエンドソーム脱出能モチーフをグラフトすることができた。
【０３６４】
野生型重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸の個数は１１個であり、その構造上、既に表面側に環の中心部が多く露出しているため、軽鎖可変領域のようにｐＨ依存的な現象が起こることが困難であると判断した。そこで、配列を一部維持しつつ、ＣＤＲ３のアミノ酸の個数を７個または８個に減らした。
【０３６５】
また、重鎖可変領域の１番目のアミノ酸と初期エンドソームｐＨ５．５条件で相互作用できるアミノ酸として、重鎖可変領域の１０２番目のアミノ酸が適した距離に位置すると判断し、このアミノ酸をロイシン（Ｌ）で置換した。
【０３６６】
改善されたエンドソーム脱出能モチーフを重鎖可変領域のＣＤＲ３に導入した突然変異を構築した。
【０３６７】
下記表１３、１４、および１５は、設計されたエンドソーム脱出能モチーフを重鎖可変領域にグラフトした重鎖可変領域の突然変異の配列を示す。表１３は、ヒト抗体の軽鎖可変領域の全体配列をカバットナンバリングに従って示した表であり、表１４および１５は、前記表１３の抗体配列において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２の配列またはＣＤＲ３の配列のみを別に表記した内容である。
【０３６８】
［表１３］
2019520086.tif 000015
【０３６９】
［表１４］
2019520086.tif 000016
【０３７０】
［表１５］
2019520086.tif 000017
図３０ａは、エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０３７１】
この際、改善されたエンドソーム脱出能モチーフが導入された重鎖可変領域のエンドソーム脱出能を評価するために、既存の軽鎖可変領域に存在するエンドソーム脱出能を担当する９２−９４番目のアミノ酸であるＷＹＷをＡＡＡ（連続した３個のアラニン）で置換し、その機能を除去した。実施例１と同様に、重鎖可変領域のクローニングを行い、エンドソーム脱出能が除去された軽鎖可変領域を含む軽鎖とともにＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０３７２】
改善されたエンドソーム脱出能モチーフが導入された重鎖可変領域を含む細胞質浸透抗体をより明瞭に命名するために、前記ＴＭａｂ４をＣＴと略称する。すなわち、ＴＭａｂ４−ＡＡＡはＣＴ−ＡＡＡである。
【０３７３】
実施例３４．重鎖可変領域のＣＤＲへの、改善されたエンドソーム脱出能モチーフの付与可能確認
図３０ｂは、エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３７４】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＴＭａｂ４−ＷＹＷ、ＴＭａｂ４−ＡＡＡ、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０２−ＡＡＡ、ＣＴ０３−ＡＡＡ、ＣＴ０４−ＡＡＡ  １μＭを入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０２−ＡＡＡ、ＣＴ０３−ＡＡＡ、およびＣＴ０４−ＡＡＡ突然変異で、何れもＴＭａｂ４−３に比べて半分程度のトリパンブルーの獲得が観察された。しかし、ＣＴ０４−ＡＡＡ突然変異では、中性ｐＨでもトリパンブルーの獲得が観察された。
【０３７５】
図３０ｃは、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合された、エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体の改善された分割緑色蛍光タンパク質の相補的な結合によるＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０３７６】
具体的には、実施例２と同様に、ＳＡ−ＧＦＰ１−１０を安定して発現する形質転換されたＨｅＬａ細胞株を準備し、細胞が安定化すると、ＰＢＳ、ＣＴ０１−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＣＴ０２−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＣＴ０３−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＣＴ０４−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２  １．６μＭを３７℃で６時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＣＴ０１−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＣＴ０２−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＣＴ０３−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２、ＣＴ０４−ＡＡＡ−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２を処理した細胞内部で、緑色ＧＦＰ蛍光が観察されることを確認した。
【０３７７】
図３０ｄは、エンドソーム脱出能を除去した細胞質浸透抗体の軽鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を有する細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０３７８】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０２−ＡＡＡ、ＣＴ０３−ＡＡＡ  ０．２、０．５、１μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０２−ＡＡＡを処理した細胞では、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光が、ＴＭａｂ４を処理した細胞と類似に観察された。これに対し、ＣＴ０３−ＡＡＡを処理した細胞では、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光がＣＴより弱く観察された。
【０３７９】
したがって、改善されたエンドソーム脱出能モチーフを重鎖可変領域に付与する場合にもエンドソーム脱出が可能であり、最終的に細胞質の内部に位置することを確認した。
【０３８０】
実施例３５．重鎖可変領域に位置する、ｐＨに応じた構造変化を誘導するＥ１−Ｌ１０２の特性分析
ｐＨに応じた構造変化を誘導する重鎖可変領域（ＶＨ）の１番目のアミノ酸であるグルタミン酸、１０２番目のアミノ酸であるロイシンの特性をより詳細に分析するために、抗体骨格に位置する１番目のアミノ酸は、生殖腺由来の配列に存在するアルパラギン酸、アラニン、グルタミンで置換し、ＣＤＲ３に位置する１０２番目のアミノ酸は、軽鎖可変領域で中性または酸性ｐＨ条件でトリパンブルーの獲得を示した１２個のアミノ酸で置換して構築した。各突然変異は実施例１と同様に、クローニングを行ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０３８１】
図３１ａは、酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の構造的変化の誘導に関与する重鎖可変領域（ＶＨ）の１番目のアミノ酸であるグルタミン酸を種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３８２】
具体的には、前記実施例２６と同様に、ｐｇｓＤ−６７７細胞株（１ｘ１０４）を２４ウェルプレートに培養した。翌日、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｅ１Ａ、ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｅ１Ｄ、およびＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｅ１Ｑを１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で  細胞を観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｅ１Ｄは、野生型と略類似の程度のトリパンブルーの獲得を示し、ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｅ１Ａ、ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｅ１Ｑ突然変異は、トリパンブルーの獲得が減少した。
【０３８３】
図３１ｂは、酸性ｐＨ５．５で細胞質浸透抗体の構造的変化の誘導に関与する重鎖可変領域（ＶＨ）の１０２番目のアミノ酸であるロイシンを種々のアミノ酸で置換した突然変異による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３８４】
具体的には、前記実施例２６と同様にｐｇｓＤ−６７７細胞を準備し、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＣＴ０１−ＡＡＡ，ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｌ１０２突然変異１９種を１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。  ＣＴ０１−ＡＡＡと比較して、ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｌ１０２Ｉ，Ｌ１０２Ｍ，Ｌ１０２Ｈは、略類似の程度のトリパンブルーの獲得を示し、ＣＴ０１−ＡＡＡ  Ｌ１０２Ｋ，Ｌ１０２Ｒ突然変異は、中性ｐＨで  トリパンブルーの獲得が減少した。  
【０３８５】
このことから、軽鎖可変領域の９５番のアミノ酸と同様に、重鎖可変領域でも１０２番のアミノ酸が、初期エンドソームｐＨ５．５を認知して相互作用変化によりエンドソーム脱出を起こすためには、側鎖の長さが長い疎水性アミノ酸、負電荷を帯びるアミノ酸、およびヒスチジン（Ｈ）の相互作用が最も効果的であることを確認した。
【０３８６】
実施例３６．３個のトリプトファン残基を有しているエンドソーム脱出モチーフ突然変異の構築
２個のトリプトファンを有しているエンドソーム脱出モチーフのエンドソーム脱出能を向上させるために、９２−９４番目のアミノ酸を全てトリプトファンで置換し、総３個のトリプトファンを有しているエンドソーム脱出モチーフを構築した。
【０３８７】
下記表１６と１７はそれぞれ３個のトリプトファンを有しているエンドソーム脱出モチーフを導入した軽鎖可変領域の突然変異の配列を示す。表１６は、ヒト抗体の軽鎖可変領域の全体配列をカバットナンバリングに従って示した表であり、表１７は、前記表１６の抗体配列において、ＣＤＲ３の配列のみを別に表記した内容である。
【０３８８】
［表１６］
2019520086.tif 000018
【０３８９】
［表１７］
2019520086.tif 000019
【０３９０】
下記表１８と１９はそれぞれ３個のトリプトファンを有しているエンドソーム脱出モチーフを導入した重鎖可変領域の突然変異の配列を示す。表１８は、ヒト抗体の重鎖可変領域の全体配列をカバットナンバリングに従って示した表であり、表１９は、前記表１８の抗体配列において、ＣＤＲ３の配列のみを別に表記した内容である。
【０３９１】
［表１８］
2019520086.tif 000020
【０３９２】
［表１９］
2019520086.tif 000021
【０３９３】
この際、３個のトリプトファンで構成されたエンドソーム脱出能モチーフを含む重鎖可変領域または軽鎖可変領域のエンドソーム脱出能を評価するために、エンドソーム脱出能モチーフを含まない重鎖可変領域または軽鎖可変領域とともにＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で前記実施例１と同様に発現および精製して実験した。
【０３９４】
実施例３７．２個または３個のトリプトファン残基からなるエンドソーム脱出能モチーフ導入重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能の向上の確認
エンドソーム脱出能を向上させるための１つの方策として、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方にエンドソーム脱出能モチーフを付与した。したがって、１つの完全なＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体に、総４個のエンドソーム脱出能モチーフを含むことになる。
【０３９５】
２個または３個のトリプトファンで構成されたエンドソーム脱出能モチーフを含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域をともにＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で前記実施例１と同様に発現および精製して実験した。
【０３９６】
図３２ａは、３つのトリプトファンで置換したエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０３９７】
具体的には、前記実施例２６と同様にｐｇｓＤ−６７７細胞を準備し、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＣＴ−３、ＣＴ−３＿ＷＷＷ、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−ＡＡＡ、ＣＴ０１−３、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−３＿ＷＷＷを０．５または１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。  
【０３９８】
既存のエンドソーム脱出モチーフを含むＣＴ−３、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０１−３に比べて、ＣＴ−３＿ＷＷＷ、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−ＡＡＡ、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−３＿ＷＷＷは、有意に向上したトリパンブルーの獲得を示した。また、ＣＴ−３、ＣＴ０１−ＡＡＡに比べて、重鎖および軽鎖可変領域の両方にエンドソーム脱出モチーフを含むＣＴ０１−３、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−３＿ＷＷＷは、より高いトリパンブルーの獲得を示した。
【０３９９】
図３２ｂは、３つのトリプトファンで置換したエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【０４００】
具体的には、実施例２と同様にＨｅＬａ細胞株を準備し、ＣＴ−３、ＣＴ−３＿ＷＷＷ、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−ＡＡＡ、ＣＴ０１−３、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−３＿ＷＷＷ  ０．２５、０．５、１μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【０４０１】
既存のエンドソーム脱出モチーフを含むＣＴ−３、ＣＴ０１−ＡＡＡ、ＣＴ０１−３を処理した細胞に比べて、ＣＴ−３＿ＷＷＷ、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−ＡＡＡ、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−３＿ＷＷＷを処理した細胞で、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光が強く観察された。また、ＣＴ−３、ＣＴ０１−ＡＡＡに比べて、重鎖および軽鎖可変領域の両方にエンドソーム脱出モチーフを含むＣＴ０１−３、ＣＴ０１＿ＷＷＷ−３＿ＷＷＷを処理した細胞で、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光が強く観察された。
【０４０２】
トリプトファンの個数が３個であるエンドソーム脱出能モチーフが、既存のエンドソーム脱出能モチーフに比べてエンドソーム脱出能が向上し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域にエンドソーム脱出モチーフを付与した場合にも、エンドソーム脱出能が向上することを確認した。
【０４０３】
実施例３８．改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された重鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出能を付与した治療用抗体骨格を有する軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能の向上の確認
重鎖可変領域と軽鎖可変領域の両方にエンドソーム脱出能モチーフを付与した際のエンドソーム脱出能の向上を確認するために、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域と、エンドソーム脱出能を付与した治療用抗体骨格を有する軽鎖可変領域をともに、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験を行った。
【０４０４】
具体的に、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域と、改善されたエンドソーム脱出能を付与した治療用抗体骨格を有する軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体は細胞浸透能が除去されたため、細胞浸透が可能であるように、大腸癌を始めとする種々の腫瘍で細胞膜の表面に過発現されるＥｐＣＡＭに特異性を有するＥｐＣＡＭ標的原型ペプチドを軽鎖のＮ−末端にＧＧＧＧＳ２個のリンカーを用いて遺伝工学的に融合した（ＵＳ２０１５／０２４６９４５Ａ１）。
【０４０５】
図３３ａは、改善されたエンドソーム脱出モチーフが重鎖可変領域に導入され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０４０６】
具体的には、実施例１と同様に、改善されたエンドソーム脱出モチーフ導入重鎖可変領域を含む重鎖と、改善されたエンドソーム脱出能を付与した単クローン抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖がコードされた動物発現ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一過性形質転換（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の精製は、実施例１と同様に行った。
【０４０７】
図３３ｂは、  改善されたエンドソーム脱出モチーフが重鎖可変領域に導入され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の細胞質への移動を、カルセインを用いて共焦点顕微鏡で観察し、共焦点顕微鏡写真のカルセイン蛍光を定量した棒グラフである。
【０４０８】
具体的には、実施例２と同様に、Ｋ−ＲＡＳ  Ｇ１３Ｄ突然変異を有するヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞株を準備し、ＣＴ−ｅｐ４１、ＣＴ０１−ｅｐ４１  ０．１、０．２５、０．５μＭを３７℃で６時間培養した。４時間が経過した後、ＰＢＳまたは抗体の入ったウェルにカルセイン１５０μＭを処理し、３７℃で２時間培養した。実施例２と同様の方法によりＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄した後、細胞固定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を用いて核を染色（青色蛍光）し、共焦点顕微鏡で細胞を観察した。ＣＴ０１−ｅｐ４１を各濃度毎に処理した細胞では、細胞質に広がっている緑色カルセイン蛍光の強度が、ＣＴ−ｅｐ４１を処理した細胞に比べて強かった。
【０４０９】
図３３ｃは、  改善されたエンドソーム脱出モチーフが重鎖可変領域に導入され、ＥｐＣＡＭ標的ペプチドを融合した既存の治療用抗体の軽鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０４１０】
具体的には、実施例５と同様にｒａｍｏｓ細胞をプレートに付着させた後、ｐＨを細胞質のｐＨである７．４に維持するためにｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、およびｐＨを初期エンドソームのｐＨである５．５に維持するためにｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＣＴ−ｅｐ４１、ＣＴ０１−ｅｐ４１  ０．５、１μＭを入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で観察した。全体細胞のうち、トリパンブルーを獲得した細胞の数を計数してパーセントで示した。総４００個以上の細胞数を計数し、平均値（ｍｅａｎ）を図表で示した。ＣＴ０１−ｅｐ４１の場合、ＣＴ−ｅｐ４１に比べて濃度依存的にトリパンブルーの獲得が増加したことを観察した。
【０４１１】
したがって、エンドソーム脱出モチーフを重鎖可変領域と軽鎖可変領域にそれぞれ導入した際に、軽鎖可変領域のみにエンドソーム脱出モチーフが存在する場合に比べてエンドソーム脱出能が向上した。
【０４１２】
実施例３９．既存の治療用抗体の重鎖可変領域への、改善されたエンドソーム脱出能モチーフの付与可能論理
既存の治療用抗体の軽鎖可変領域にエンドソーム脱出能モチーフを付与した論理と同様に、市販されている治療用抗体の安定した骨格を用いて全体的な発現収率の増加を期待することができ、エンドソーム脱出能モチーフが１つのモチーフとして働くことができるかを確認するために、既存の治療用抗体の重鎖可変領域にもエンドソーム脱出能モチーフを付与した。
【０４１３】
候補重鎖可変領域のＣＤＲ３を、細胞質浸透抗体のＣＤＲ３で置換する突然変異を構築した。
【０４１４】
表２０は遺伝子合成法を用いて構築した突然変異の名称および配列を示す。
【０４１５】
［表２０］
2019520086.tif 000022
【０４１６】
図３４ａは、既存の治療用抗体の重鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の構築を説明する模式図である。
【０４１７】
実施例１と同様に、重鎖可変領域のクローニングを行い、改善されたエンドソーム脱出能モチーフが導入された単クローン抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖とともにＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０４１８】
実施例４０．単クローン抗体の重鎖可変領域への、改善されたエンドソーム脱出能モチーフの付与可能確認
図３４ｂは、既存の治療用抗体の重鎖可変領域に、改善されたエンドソーム脱出モチーフが導入された完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０４１９】
具体的には、前記実施例２６と同様にｐｇｓＤ−６７７細胞を準備し、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＣＴ０１−ｅｐ４１，Ｈｕ０１−ｅｐ４１，Ｈｅｒ０１−ｅｐ４１，Ａｖａ０１−ｅｐ４１を０．５または１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。  全ての突然変異は、ＣＴ０１−ｅｐ４１と類似の程度のトリパンブルーの獲得を示した。．
【０４２０】
実施例４１．細胞質浸透抗体の物性の改良を目的でアスパラギン酸を導入した重鎖可変領域および軽鎖可変領域の構築
細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能を向上させるために、エンドソーム脱出モチーフを重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＣＤＲ３に導入した。この際、エンドソーム脱出モチーフを構成している疎水性アミノ酸であるトリプトファン（Ｗ）とチロシン（Ｙ）により、細胞質浸透抗体が高い疎水性を帯びることになる。本研究者らは、このような疎水性を相殺するために、エンドソーム脱出モチーフと隣接するアミノ酸を、負電荷を帯びるアスパラギン酸で置換する突然変異を構築した。抗体の可変領域の骨格およびＣＤＲ部位にアスパラギン酸を導入し、抗体の全般的な安定性を高め、抗体の高い疎水性によるタンパク質集成（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を減少させる研究を参考して突然変異を構築した（Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｄｕｄｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０４２１】
重鎖可変領域の３２番目、３３番目、５８番目のアミノ酸は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のエンドソーム脱出モチーフと隣接しているため、このアミノ酸をアスパラギン酸で置換した。これらを、ＣＴ１１  ＶＨ（Ｆ３２Ｄ、Ｓ３３Ｄ）、またはＣＴ１２  ＶＨ（Ｆ３２Ｄ、Ｓ３３Ｄ、Ｙ５８Ｄ）と命名した。
【０４２２】
また、軽鎖可変領域の  ２７ｂ番目、３３番目、５８番目のアミノ酸は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のエンドソーム脱出モチーフと隣接しているため、このアミノ酸をアスパラギン酸で置換した。これらを、ｈＴ４−６０  ＶＬ（Ｌ２７ｂＤ），ｈＴ４−６１  ＶＬ（Ｗ５０Ｄ），ｈＴ４−６２  ＶＬ（Ｗ５０Ｄ，Ａ５１Ｄ），またはｈＴ４−６３  ＶＬ（Ｌ２７Ｂｄ，Ｗ５０Ｄ，Ａ５１Ｄ）と命名した。
【０４２３】
この際、突然変異の鋳型となった重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、動物細胞発現システムで高い収率を示し、且つエンドソーム脱出モチーフが導入された抗体の可変領域であり、それぞれＣＴ０１  ＶＨ、ｈＴ４−５９  ＶＬと命名した。
【０４２４】
下記表２１および２２は、抗体可変領域の骨格およびＣＤＲ部位にアスパラギン酸を導入した重鎖可変領域または軽鎖可変領域の突然変異の配列を示す。
【０４２５】
［表２１］
2019520086.tif 000023
【０４２６】
［表２２］
2019520086.tif 000024
【０４２７】
実施例１と同様に、各重鎖可変領域のクローニングを行い、改善されたエンドソーム脱出能モチーフが導入された単クローン抗体の軽鎖可変領域を含む軽鎖とともにＨＥＫ２９３Ｆ細胞株で発現および精製して実験した。
【０４２８】
実施例４２．アスパラギン酸を導入した重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体のエンドソーム脱出能向上の確認
図３５は、アスパラギン酸を導入した重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む完全ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体による、ｐＨに応じたトリパンブルー獲得細胞の数を定量的に比較したグラフである。
【０４２９】
具体的には、前記実施例２６と同様にｐｇｓＤ−６７７細胞を準備し、実施例５と同様に、細胞質のｐＨであるｐＨ７．４の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）、および初期エンドソームのｐＨであるｐＨ５．５の緩衝液（ＨＢＳＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ），５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５）２００μｌに、ＣＴ１０−ｅｐ５９，ＣＴ１１−ｅｐ５９，ＣＴ１２−ｅｐ５９，ＣＴ１０−ｅｐ６０，ＣＴ１０−ｅｐ６１，ＣＴ１０−ｅｐ６２，ＣＴ１０−ｅｐ６３，ＣＴ１２−ｅｐ６３を１μＭ入れ、細胞を３７℃の条件で２時間培養させた。ＰＢＳで静かに洗浄した後、ＰＢＳ１９０μｌにトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）１０μｌを混合し、各ウェル当たり２００μｌずつ分注して顕微鏡で細胞を観察した。その後、ＰＢＳで静かに洗浄した後、１％のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）５０μｌずつ入れて細胞を溶解させた。これを９６ウェルプレートに移し、５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。全ての突然変異は、上述の実施例で実験したＣＴ０１−ｅｐ４１と類似の程度のトリパンブルーの獲得を示した。したがって、アスパラギン酸が導入された場合にも、エンドソーム脱出能が減少しないことを確認した。前記抗体に対する抗体安定性の実験は、後ほど行う予定である。
【０４３０】
実施例４３．細胞質浸透抗体の構造分析
ＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体の構造を究明するために、エンドソーム酸性ｐＨ条件でエンドソーム脱出能を有する細胞質浸透抗体のうち、生産収率が非常に高いＣＴ−５９抗体を使用した。これは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がそれぞれｈＴ０  ＶＨとｈＴ４−５９  ＶＬで構成されたＩｇＧ形態の細胞質浸透抗体である。
【０４３１】
３次構造を究明するために、既存のＨＥＫ２９３細胞株を用いて生産されたＩｇＧ形態のＣＴ−５９をパパイン（ｐａｐａｉｎ）で処理した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムおよびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ）により高純度のＦａｂを分離および精製した。その後、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ−ＬＣＰ機器上で、スクリーニングバッファーＩｎｄｅｘ  Ｇ１条件（０．２ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、２５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ３３５０）で、構造を究明するための結晶が形成された。細胞質浸透抗体とスクリーニングバッファーの混合時に、最終ｐＨは８．１である。
【０４３２】
図３６ａは、ｉｎｄｅｘ  Ｇ１条件で形成されたＣＴ−５９Ｆａｂの結晶をＲＩ１０００（Ｒｏｃｋ  Ｉｍａｇｅｒ１０００；全自動タンパク質結晶画像分析装置）で観察した結果である。
【０４３３】
Ｘ線回折データは５Ｃ  ｂｅａｍｌｉｎｅ（Ｐｏｈａｎｇ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＰＡＬ））を用いて得て、ＨＫＬ２０００  ｐａｃｋａｇｅ（ＨＫＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，米国）を用いてｉｎｄｅｘｉｎｇおよびｓｃａｌｉｉｎｇした後、分子置換（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＭＲ）方法によりＣＴ−５９  Ｆａｂの初期電子密度マップを得た。ＭＲ方法を用いるために、ＣＴ−５９と類似の構造を有するタンパク質の３次元構造データが必要であるが、ＦＦＡＳサイト（ｈｔｔｐ：／／ｆｆａｓ．ｓａｎｆｏｒｄｂｕｒｎｈａｍ．ｏｒｇ／ｆｆａｓ−ｃｇｉ／ｃｇｉ／ｆｆａｓ．ｐｌ）を用いて類似の構造をモデルとして使用した。ＣＴ−５９  Ｆａｂの初期位相情報はＣＣＰ４を用いて得て、得られた初期位相情報に基づいて、ＣＯＯＴ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ  Ｔｏｏｌｋｉｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｃｏｏｔ／）を用いてモデルビルディング（ｍｏｄｅｌ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ）作業を行い、Ｒｅｆｍａｃ５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ／ｈｔｍｌ／ｒｅｆｍａｃ５．ｈｔｍｌ）とＰＨＥＮＩＸ（Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ＥＮｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｘｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｉｘ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／）  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔおよびｖａｌｉｄａｔｉｏｎ作業を完了した（図３６ｂ参照）。
【０４３４】
その結果、最終ｐＨ８．１条件で、１．８Åレベルの高解像度の３次構造を究明し、ＣＴ−５９の軽鎖可変領域の１番のアスパラギン酸（Ｄ）と９５番目のメチオニン（Ｍ）の側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）間の距離が６．８７Åであることを確認した。
【０４３５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
2019520086.tif 000025
【図２ａ】
2019520086.tif 000026
【図２ｂ】
2019520086.tif 000027
【図２ｃ】
2019520086.tif 000028
【図２ｄ】
2019520086.tif 000029
【図３ａ】
2019520086.tif 000030
【図３ｂ】
2019520086.tif 000031
【図３ｃ】
2019520086.tif 000032
【図４】
2019520086.tif 000033
【図５】
2019520086.tif 000034
【図６ａ】
2019520086.tif 000035
【図６ｂ】
2019520086.tif 000036
【図７ａ】
2019520086.tif 000037
【図７ｂ】
2019520086.tif 000038
【図８】
2019520086.tif 000039
【図９】
2019520086.tif 000040
【図１０】
2019520086.tif 000041
【図１１】
2019520086.tif 000042
【図１２】
2019520086.tif 000043
【図１３】
2019520086.tif 000044
【図１４ａ】
2019520086.tif 000045
【図１４ｂ】
2019520086.tif 000046
【図１５ａ】
2019520086.tif 000047
【図１５ｂ】
2019520086.tif 000048
【図１６】
2019520086.tif 000049
【図１７ａ】
2019520086.tif 000050
【図１７ｂ】
2019520086.tif 000051
【図１８】
2019520086.tif 000052
【図１９】
2019520086.tif 000053
【図２０ａ】
2019520086.tif 000054
【図２０ｂ】
2019520086.tif 000055
【図２１ａ】
2019520086.tif 000056
【図２１ｂ】
2019520086.tif 000057
【図２１ｃ】
2019520086.tif 000058
【図２２ａ】
2019520086.tif 000059
【図２２ｂ】
2019520086.tif 000060
【図２２ｃ】
2019520086.tif 000061
【図２３ａ】
2019520086.tif 000062
【図２３ｂ】
2019520086.tif 000063
【図２３ｃ】
2019520086.tif 000064
【図２４】
2019520086.tif 000065
【図２５ａ】
2019520086.tif 000066
【図２５ｂ】
2019520086.tif 000067
【図２６ａ】
2019520086.tif 000068
【図２６ｂ】
2019520086.tif 000069
【図２７】
2019520086.tif 000070
【図２８ａ】
2019520086.tif 000071
【図２８ｂ】
2019520086.tif 000072
【図２８ｃ】
2019520086.tif 000073
【図２９ａ】
2019520086.tif 000074
【図２９ｂ】
2019520086.tif 000075
【図２９ｃ】
2019520086.tif 000076
【図３０ａ】
2019520086.tif 000077
【図３０ｂ】
2019520086.tif 000078
【図３０ｃ】
2019520086.tif 000079
【図３０ｄ】
2019520086.tif 000080
【図３１ａ】
2019520086.tif 000081
【図３１ｂ】
2019520086.tif 000082
【図３２ａ】
2019520086.tif 000083
【図３２ｂ】
2019520086.tif 000084
【図３３ａ】
2019520086.tif 000085
【図３３ｂ】
2019520086.tif 000086
【図３３ｃ】
2019520086.tif 000087
【図３４ａ】
2019520086.tif 000088
【図３４ｂ】
2019520086.tif 000089
【図３５】
2019520086.tif 000090
【図３６ａ】
2019520086.tif 000091
【図３６ｂ】
2019520086.tif 000092
【配列表】
2019520086000001.app
【国際調査報告】
2019520086.tif 000093
2019520086.tif 000094
2019520086.tif 000095
2019520086.tif 000096
2019520086.tif 000097
2019520086.tif 000098