(57)【要約】  本発明は、二重特異性ヘテロ二量体チェックポイント抗体を対象とする。【選択図】図１Ａ−Ｉ
2019525738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１の重鎖であって、
ｉ）第１の変異Ｆｃドメインと、
ｉｉ）第１の抗原に結合する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖ領域は、第１の可変重ドメイン（ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）、第１の可変軽ドメイン（ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）、および帯電ｓｃＦｖリンカーを含み、前記帯電ｓｃＦｖリンカーは、前記第１の可変重ドメインと前記可変軽ドメインを共有結合している、単鎖Ｆｖ領域と、を含む、第１の重鎖と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含む第２の重鎖であって、ＶＨは、第２の可変重ドメインであり、ＣＨ２−ＣＨ３は、第２の変異Ｆｃドメインである、第２の重鎖と、
ｃ）第２の可変軽ドメインおよび軽定常ドメインを含む、軽鎖と、を含み、
前記第２の変異Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ２４１Ｄを含み、前記第１および第２の変異Ｆｃドメインは各々、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、前記第１の変異Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２の変異Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第１の可変重ドメインおよび第１の可変軽ドメインは、配列番号１１３７６および配列番号１１３７７、配列番号２２９７０および配列番号２２９７１、配列番号１１３９４および配列番号１１３９５、配列番号１１３６７および配列番号１１３６８、ならびに配列番号１１４１２および配列番号１１４１３を含む組から選択され、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる、ヘテロ二量体抗体。
【請求項２】
前記第２の重鎖の前記ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構成要素が、配列番号３７７２５を有し、前記第１の変異Ｆｃドメインが、配列番号３７７２６を有し、前記定常軽ドメインが、配列番号３７７２７を有する、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３】
前記第２の可変重ドメインおよび前記第２の可変軽ドメインが、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＬＡＧ−３、ヒトＴＩＭ−３、およびヒトＴＩＧＩＴの群由来のヒトチェックポイント受容体に結合する抗原結合ドメインを形成している、請求項１または２に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４】
前記第１の可変重ドメインが、配列番号１１３９４を有し、第１の可変軽ドメインが、配列番号１１３９５を有する、請求項１、２、または３に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項５】
前記第１の重鎖が、配列番号２３５８１を有し、前記第２の重鎖が、配列番号２３５７６を有し、前記軽鎖が、配列番号２３５９１を有する、請求項１、２、３、または４に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項６】
ａ）請求項１〜５に記載の第１の重鎖をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１〜５に記載の第２の重鎖をコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項１〜５に記載の軽鎖をコードする第３の核酸と、をそれぞれ含む、核酸組成物。
【請求項７】
ａ）請求項６に記載の第１の核酸を含む、第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項６に記載の第２の核酸を含む、第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項６に記載の第３の核酸を含む、第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現する条件下で、請求項８に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月１４日出願の米国仮特許出願第６２／３５０，１４５号、２０１６年６月２２日出願の同第６２／３５３，５１１号、および２０１６年１１月１０日出願の同第．６２／４２０，５００号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、それらの全体が本明細書に参照により明示的かつ完全に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が本明細書に参照により組み込まれる配列表を含む。２０１７年６月９日作成のこのＡＳＣＩＩの複製は、０６７４６１＿５１９１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズは、３２，４４２，１４５キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１（プログラム細胞死１）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）などのチェックポイント受容体は、Ｔ細胞および他の細胞型の活性化、増殖、および／またはエフェクター活性を阻害する。チェックポイント受容体が、腫瘍細胞に対する内因性Ｔ細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレメリムマブを含む抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体の前臨床研究および臨床研究では、確かに、様々な悪性腫瘍を有するごく一部の患者において、チェックポイント遮断により、優れた抗腫瘍応答がもたらされ、内因性Ｔ細胞が刺激されて腫瘍細胞が攻撃され、長期の癌の寛解がもたらされることが示された。残念ながら、患者の一部のみがこれらの療法への応答を示し、その応答率は、適応症および他の要因に応じて、通常、１０〜３０％の範囲であり、各単剤療法に関してはそれよりも高いときもある。これらの作用剤の治療的組み合わせ、例えば、イピリムマブにニボルマブを加えた組み合わせは、場合によっては６０％近くの、さらにより高い応答率をもたらす。前臨床研究では、抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体と、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、およびＴＩＧＩＴを含む、最近になって同定されたチェックポイント受容体の遮断との間の付加的相乗効果が示された。複数のチェックポイント遮断の潜在能力が極めて有望である一方で、そのような作用剤との組み合わせ療法では、重い経済的負担を背負うことが求められる。さらに、組み合わせ療法、例えば、ニボルマブにイピリムマブを加えた療法の自己免疫毒性は、単剤療法と比較して大幅に上昇し、多くの患者を療法の停止へと至らしめる。
【０００４】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を調査したいくつかの研究（Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１１４：１５３７（２００９）、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７（１７）：７８７５−７８８０（２０１０）、Ｆｏｕｒｃａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（４）：８８７−８９６（２０１２）、およびＧｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（５）：２２４６（２０１４））では、ＴＩＬは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが示された。さらに、複数のチェックポイントを発現するＴＩＬは、おそらく、実際に最も腫瘍応答性であろう。これとは対象的に、末梢にある非腫瘍応答性Ｔ細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性が高い。単一特異性の完全長抗体を用いたチェックポイント遮断は、自己免疫毒性に寄与すると思われる自己抗原応答性の単一発現Ｔ細胞に対する腫瘍応答性ＴＩＬの抑制解除に関して、おそらく、無差別的である。
【０００５】
したがって、本発明は、２つの異なるチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する二重特異性抗体を対象とするものである。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヒトＰＤ−１、ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ−３、およびヒトＴＩＧＩＴなどの２つの異なるチェックポイント細胞表面受容体に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。したがって、いくつかの態様では、好適な二重特異性抗体は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡに結合する。
【０００７】
一態様では、本発明は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）を使用して連結された可変重ドメインおよび可変軽ドメインを有するｓｃＦｖ、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含むＦｃドメイン、ならびに本明細書で概説するチェックポイント受容体に結合するＦｖを含む第１の単量体（時として「ｓｃＦｖ重鎖」と称される「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを有するＦｃドメイン、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント受容体に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」または「重鎖」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適な単量体Ｆｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡが挙げられる。
【０００８】
本発明の他の態様を、本明細書に提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｉ】本発明のいくつかの型を示す。最初の型は、「栓抜き」型であり、第１および第２の抗抗原結合ドメインを有する。加えて、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中心−ｓｃＦｖ、中心−Ｆｖ、片腕中心−ｓｃＦｖ、１ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、および二重ｓｃＦｖ型全てが示されている。示されるｓｃＦｖドメインの全てについて、それらは、ＮからＣ末端可変重−（任意のリンカー）−可変軽、またはその逆のいずれかであり得る。加えて、片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂについて、ｓｃＦｖは、重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合され得る。
【図２】（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄ）臨床開発がしやすいようにヒトおよびカニクイザルの配列の両方に結合する抗原結合ドメインの開発を容易にするために、多くの場合ヒトおよびカニクイザルの両方を含む、本発明において使用するいくつかの抗原の抗原配列を示す。
【図３Ａ−３Ｆ】ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（非対称変異体およびｐＩ変異体を含む）を示す。図３Ｅでは、対応する「単量体２」の変異体が存在しない変異体が存在する。これらはどちらかの単量体で単独で使用されるか、または栓抜きのＦａｂ側に含まれ得るｐＩ変異体であり、例えば、適切な帯電ｓｃＦｖリンカーが第２の抗原結合ドメインとしてｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用され得る。好適な帯電リンカーは、図７に示される。
【図４】等配電子変異体抗体定常領域およびそれらのそれぞれの置換のリストを示す。ｐＩ＿（−）は、より低いｐＩ変異体を示し、一方でｐＩ＿（＋）は、より高いｐＩ変異体を示す。これらは、本発明の他の二量体化変異体と、（かつ本明細書に概説されるように、他の変異体の型と）任意選択かつ独立に組み合わせることができる。
【図５】ＦｃγＲ結合を切断する有用な切断変異体（「ノックアウト」または「ＫＯ」変異体と呼ばれることがある）を示す。一般に、切断変異体は、両方の単量体に見られるが、場合によっては、それらは、１つの単量体にしか存在しなくもよい。
【図６】図１Ａまたは図１Ｆの型のいずれかに使用することができる本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。図１Ａの型について、この実施形態の「非Ｆｖ」構成要素が図３７Ａに示されるが、他の型も（および図３８のものも）同様に使用することができる。
【図７】１つ以上のｓｃＦｖを構成要素として利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または減少させることにおいて有用であるいくつかの帯電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）陽性リンカーは、本明細書に示される特に抗ＣＤ３ｖｌおよびｖｈ配列と共に、本明細書において特に有用である。単一電荷を有する、単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（８）：９８９−９９５（１９９３）にちなんで、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と呼ばれる。このリンカーは、ｓｃＦｖにおいて、凝集の低減、およびタンパク質分解に対する安定性の増強に向けて使用されることに留意されたい。
【図８】操作されたヘテロ二量体非対称Ｆｃ変異体のリストをヘテロ二量体の収率（ＨＰＬＣ−ＣＩＥＸにより決定）および熱安定性（ＤＳＣにより決定）と共に示す。未決定の熱安定性は、「ｎ．ｄ．」と示される。
【図９Ａ−Ｅ】配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６としてリストに記載される追加の抗ＰＤ−１  ＡＢＤと共に、選択されたいくつかのＰＤ−１  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列において、ｓｃＦｖリンカーは正帯電ｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号３７７５５）であるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、その一部が図７に示される）、斜線は可変ドメインの境界（複数可）を示す。加えて、命名規則は、ＮからＣ末端のｓｃＦｖの配向を図示する。すなわち、「Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４」は、配向がｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌである（ＮからＣ末端、使用される型に応じて、任意選択のドメインリンカーが片側または両側にある）ことを示すが、これらの配列は、反対の配向の（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用することができる。同様に、「Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９」は、配向がｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈである（ＮからＣ末端、同様に、任意選択のドメインリンカーを有する）ことを示し、反対の配向も本発明内に含まれる。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用するｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ型またはＦａｂ型のいずれかで使用され得る。
【図１０Ａ−ＰＰ】配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６としてリストに記載される追加の抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤと共に、いくつかのＣＴＬＡ−４  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列において、ｓｃＦｖリンカーは正帯電ｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカー（配列番号３７７５５）であるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図７に示される）、斜線は可変ドメインの境界（複数可）を示す。上記のように、命名規則は、ＮからＣ末端のｓｃＦｖの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ（ＮからＣ末端）のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用することができる。加えて、配列番号２１〜２９１８、配列番号：２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用するｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ型またはＦａｂ型のいずれかで使用され得る。特に、図の多くは、ｓｃＦｖ型およびＦａｂ型の両方のＸＥＮＰ識別子を含み、例えば、ＸＥＮＰ１９２３５がＦａｂ型を使用する分子であり、ＸＥＮＰ１９７６９がｓｃＦｖ分子であることを示す図１０Ａを参照されたい。
【図１１Ａ−Ｎ】配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２としてリストに記載される追加の抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤと共に、いくつかのＬＡＧ−３  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列において、ｓｃＦｖリンカーは正帯電ｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図７に示される）、斜線は可変ドメインの境界（複数可）を示す。上記のように、命名規則は、ＮからＣ末端のｓｃＦｖの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ（ＮからＣ末端）のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用することができる。加えて、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用するｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ型またはＦａｂ型のいずれかで使用され得る。
【図１２Ａ−Ｃ】配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８としてリストに記載される追加の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤと共に、いくつかのＢＴＬＡ  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列において、ｓｃＦｖリンカーは正帯電ｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図７に示される）、斜線は可変ドメインの境界（複数可）を示す。上記のように、命名規則は、ＮからＣ末端のｓｃＦｖの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ（ＮからＣ末端）のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用することができる。加えて、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用するｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ型またはＦａｂ型のいずれかで使用され得る。
【図１３Ａ−Ｉ】配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６としてリストに記載される追加の抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤと共に、いくつかのＴＩＭ−３  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列において、ｓｃＦｖリンカーは正帯電ｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図７に示される）、斜線は可変ドメインの境界（複数可）を示す。上記のように、命名規則は、ＮからＣ末端のｓｃＦｖの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ（ＮからＣ末端）のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用することができる。加えて、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表１に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用するｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ型またはＦａｂ型のいずれかで使用され得る。
【図１４Ａ−Ｉ】栓抜き型の特定の抗ＣＴＬＡ−４  Ｘ抗ＰＤ−１抗体（Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にＦａｂ可変領域、次にｓｃＦｖ可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖、または軽鎖）を使用して命名される。ＣＤＲは下線が付され、斜線は可変領域の境界（複数可）を示す。ｓｃＦｖドメインは、示されるように、ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈのいずれかの異なる配向（ＮからＣ末端）を有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、１つ、または好ましくは両方のＦｃドメインにＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含むか、または除外することができる。
【図１５Ａ−Ｉ】特定の抗ＬＡＧ−３Ｘ抗ＰＤ−１  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にＦａｂ可変領域、次にｓｃＦｖ可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖、または軽鎖）を使用して命名される。ＣＤＲは下線が付され、斜線は可変領域の境界（複数可）を示す。ｓｃＦｖドメインは、配向（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈを有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、１つ、または好ましくは両方のＦｃドメインにＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含むか、または除外することができる。
【図１６】特定の抗ＢＴＬＡ  Ｘ抗ＰＤ−１  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にＦａｂ可変領域、次にｓｃＦｖ可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖、または軽鎖）を使用して命名される。ＣＤＲは下線が付され、斜線は可変領域の境界（複数可）を示す。ｓｃＦｖドメインは、配向（ＮからＣ末端）ｖｌ−リンカー−ｖｈを有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、１つ、または好ましくは両方のＦｃドメインにＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含むか、または除外することができる。
【図１７】特定の抗ＬＡＧ−３  Ｘ抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にＦａｂ可変領域、次にｓｃＦｖ可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖、または軽鎖）を使用して命名される。ＣＤＲは下線が付され、斜線は可変領域の境界（複数可）を示す。ｓｃＦｖドメインは、配向（ＮからＣ末端）ｖｈ−リンカー−ｖｌを有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、１つ、または好ましくは両方のＦｃドメインにＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含むか、または除外することができる。
【図１８】いくつかの抗ＬＡＧ−３ハイブリドーマスクリーニングの結果を示す。１０μＬ中１μｇのヒトＬＡＧ−３−ｈＩｇを、室温で２０分間、５０μＬのハイブリドーマ上清（２倍希釈、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地において８回）と混合した。４０μＬのＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ細胞（内因的にＭＨＣ−ＩＩを発現する）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ヒトＦｃ−Ａｌｅｘａ６４７二次抗体と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによりＡｌｅｘａ６４７について分析した。
【図１９Ａ−Ｂ】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および抗ＣＴＬＡ−４Ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体での処置後のサイトカイン放出アッセイ（Ａ：ＩＬ−２、Ｂ：ＩＦＮγ）を示す。
【図２０Ａ−Ｃ】ヒトＰＢＭＣが０日目にＮＳＧマウスに移植され、続いて、１日目に示される試験物品を投薬した後の、１４日目のＣＤ４５＋事象およびＣＤ８＋事象を示す。
【図２１Ａ−Ｂ】抗ＴＩＭ−３ハイブリドーマから生成されるキメラ抗体によるＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるＴ細胞結合を示す。
【図２２】３つの実験からのいくつかの抗ＴＩＭ−３抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、二価の実施形態のＸＥＮＰコード、誘導体クローン、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトＴＩＭ−３に対するＫＤ結合定数、会合定数、ならびに解離定数を示す。
【図２３Ａ−Ｎ】いくつかの抗ＰＤ−１抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、二価およびｓｃＦｖの実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、ｓｃＦｖ配向（ＮからＣ末端）、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトＰＤ−１に対するＫＤ結合定数、ならびにｓｃＦｖのＴｍを示す。
【図２４Ａ−Ｇ】いくつかの抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂスクリーニングの結果を示す。これは、ＦａｂおよびｓｃＦｖの実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトおよびｃｙｎｏＣＴＬＡ−４に対するＫＤ結合定数、ならびにｓｃＦｖおよびＦａｂのＴｍを示す。加えて、少なくとも１つのヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列と正確に一致した配列９量体の数は、ＦａｂおよびｓｃＦｖの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
【図２５Ａ−Ｂ】ニボルマブ（抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）として販売されている）単独、イピリムマブ単独（抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として販売されている）、ニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体、および「片腕」組み合わせ対照．によるＩＬ−２放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
【図２６】変異体ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂアームおよび変異体抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖアームを有する抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体、ならびにニボルマブ単独、イピリムマブ単独、ならびに対照としてニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体によるＩＬ−２放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
【図２７】抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体がヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着（ヒトＣＤ４５計数によって測定される）を増強することを示す。増強は、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独（破線）で見られるよりも大きい。
【図２８】移植片対宿主病における体重とＣＤ４５細胞計数との間の相関を示し、ＣＤ４５細胞レベルが疾患を予測することを示す。
【図２９】図２７に示される研究におけるＣＤ４５細胞計数とＩＦＮγ放出との間の相関を示す。
【図３０】抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体がヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着（ヒトＣＤ４５計数によって測定される）を増強することを示す。増強は、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独（破線）で見られるよりも大きい。
【図３１】図３０に示される研究におけるＣＤ４５細胞計数とＩＦＮγ放出との間の相関を示す。
【図３２】ニボルマブ単独よりも抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント抗体が一貫して優れていることを示す図２７および３０に示される研究間の試験物品効果の比較を示す。
【図３３Ａ−Ｂ】抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１、および抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体を評価するための混合リンパ球反応の結果を示す。分析物レベルを、ニボルマブ単独により誘導されたレベルに標準化した（１より大きい値はニボルマブに対する増強を表す）。
【図３４】抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体を評価するためのＳＥＢ反応を示す。抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性自体は対照に対するＩＬ−２応答を増強するが、ニボルマブ単独よりも劣っている。しかしながら、ニボルマブと組み合わされた抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体は、どちらかの単独よりも著しく高いＩＬ−２応答をもたらす。
【図３５】抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１、抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１、および抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体は、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける生着（ヒトＣＤ４５計数によって測定される）を増強する。増強は、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独で見られるよりも大きい。また、抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体は、ニボルマブと組み合わされて、最高生着レベルをもたらす。
【図３６Ａ−Ｂ】抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性体は、ニボルマブと同等の非抑制（ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ）活性を有するためにＨＶＥＭ／ＢＴＬＡ相互作用の破壊を必要とすることを示す。
【図３７Ａ−Ｅ】Ｆｖ配列を含まない（例えば、ｓｃＦｖ、ならびにＦａｂ側のｖｈおよびｖｌ）、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用な栓抜き型骨格の配列を示す。栓抜き骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体を含む。栓抜き骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体の異なる非対称変異体を含む。栓抜き骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体の異なる非対称変異体を含む。栓抜き骨格４は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体の異なる非対称変異体を含む。栓抜き骨格５は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体を含む。栓抜き骨格６は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体、ならびに両鎖上にＮ２９７Ａ変異体を含む。栓抜き骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。栓抜き骨格６および７の代替型は、両鎖の切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格８は、ヒトＩｇＧ４に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体、ならびに両鎖上にＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔにおいてＳ２４１Ｐである）変異体（当該技術分野に既知であるように、Ｆａｂアーム交換を切断する）を含む。栓抜き骨格８の代替型は、両鎖の切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４���８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体であるＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体を含む。骨格１０は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体、ならびに両鎖上にＳ２６７Ｋ変異体を含む。  当業者に理解されるように、また以下に概説されるように、これらの配列は、一方の単量体がｓｃＦｖを含み（任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカーを含む）、もう一方の単量体がＦａｂ配列（例えば、ｖｈが「Ｆａｂ側重鎖」に結合され、ｖｌが「定常軽鎖」に結合される）を含んで、本明細書に概説される任意のｖｈおよびｖｌ対で使用することができる。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＴＩＧＩＴ、および抗ＢＴＬＡについて本明細書に概説される任意のＦｖ配列は、ｓｃＦｖ（同様に、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカーを有する）またはＦａｂとしてにかかわらず、任意の組み合わせでこれらの図３７の骨格に組み込むことができる。図３７Ａに示される定常軽鎖は、図中の構築物のすべてに使用され得るが、カッパ定常軽鎖も置換され得る。  これらの栓抜き骨格は、第１のＦａｂと同じ抗原結合を有する追加の第２のＦａｂ（ｖｈ−ＣＨ１およびｖｌ定常軽）が「栓抜き側」上のｓｃＦｖのＮ末端に付加される場合、図１Ｆの中心−ｓｃＦｖ型において有用であることに留意されたい。  列挙される配列に対して９０、９５、９８、および９９％同一（本明細書に定義される）であり、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のさらなるアミノ酸置換（当業者に理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じてＩｇＧ２またはＩｇＧ４と比較して、既にいくつかのアミノ酸改変を含有する図の「親」と比較して）を含有する配列は、これらのそれぞれの骨格内に含まれる。すなわち、列挙される骨格は、この図の骨格内に含有される非対称、ｐＩ、および切断変異体に加えて、追加のアミノ酸改変（一般にアミノ酸置換）を含有し得る。
【図３８Ａ−Ｄ】本発明のＦｖ配列が付加される、本発明に使用されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格の配列を示す。ｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体を含む。骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体を含む。骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体、ならびに両鎖上にＮ２９７Ａ変異体を含む。骨格４は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて３と同一である。ｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格３および４の代替型は、両鎖の切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外することができる。骨格５は、ヒトＩｇＧ４に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体および両鎖上にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ切断変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体、ならびに両鎖上にＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔにおいてＳ２４１Ｐである）変異体（当該技術分野に既知であるように、Ｆａｂアーム交換を切断する）を含む。骨格６は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体を含む。骨格７は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｆａｂ側上にＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体のＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ非対称変異体、ならびに両鎖上にＳ２６７Ｋ変異体を含む。  当業者に理解されるように、また以下に概説されるように、これらの配列は、一方の単量体がＦａｂおよびｓｃＦｖの両方を含み（任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカーを含む）、もう一方の単量体がＦａｂ配列（例えば、ｖｈが「Ｆａｂ側重鎖」に結合され、ｖｌが「定常軽鎖」に結合される）を含んで、本明細書に概説される任意のｖｈおよびｖｌ対で使用することができる。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＴＩＧＩＴ、および抗ＢＴＬＡについて本明細書に概説される任意のＦｖ配列は、ｓｃＦｖ（同様に、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー）またはＦａｂとしてにかかわらず、任意の組み合わせでこの図３８の骨格に組み込むことができる。単量体１側は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ  ｐＩ陰性��であり、ヘテロ二量体化変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、等配電子ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ（全てＩｇＧ１に対して）を含む。モノマー２側は、ｓｃＦｖ  ｐＩ陽性側であり、ヘテロ二量体化変異体３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む。しかしながら、他の非対称変異体対、特に、［［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ］、および［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３９４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］が置換され得る。  図３８Ａに示される定常軽鎖は、図中の構築物のすべてに使用され得るが、カッパ定常軽鎖も置換され得る。  これらのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格は、図１ＨのｍＡｂ−Ｆｖ型（一方の単量体がＣ末端にｖｌを含み、もう一方がＣ末端にｖｈを含む）ならびに図１ＥのｓｃＦｖ−ｍＡｂ型（ｓｃＦｖドメインが単量体のうちの１つのＣ末端に付加される）の両方に有用であることに留意されたい。  列挙される配列に対して９０、９５、９８、および９９％同一（本明細書に定義される）であり、かつ／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のさらなるアミノ酸置換（当業者に理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または骨格に応じてＩｇＧ２またはＩｇＧ４と比較して、既にいくつかのアミノ酸改変を含有する図の「親」と比較して）を含有する配列は、これらのそれぞれの骨格内に含まれる。すなわち、列挙される骨格は、この図の骨格内に含有される非対称、ｐＩ、および切断変異体に加えて、追加のアミノ酸改変（一般にアミノ酸置換）を含有し得る。
【図３９Ａ−Ｂ】本発明の二重特異性チェックポイント抗体の可能な組み合わせのマトリックスを示す。図３９Ａにおいて、組み合わせは型に拘束されず、図１の任意の型を使用することができる。ボックス内の「Ａ」は、第１のＡＢＤからのＣＤＲ（Ｘ軸に列記される）が第２のＡＢＤのＣＤＲ（Ｙ軸に列記される）と組み合わされ得ることを意味する。ボックス内の「Ｂ」は、第１のＡＢＤからのｖｈおよびｖｌ鎖が第２のＡＢＤからのｖｈおよびｖｌ鎖と組み合わせられ得ることを意味する。ボックス内の「Ｃ」は、第１のＡＢＤからのＣＤＲが第２のＡＢＤからのｖｈおよびｖｌ鎖と組み合わせられ得ることを意味する。ボックス内の「Ｄ」は、第１のＡＢＤからのｖｈおよびｖｌ鎖が第２のＡＢＤからのＣＤＲと組み合わせられ得ることを意味する。ボックス内の「Ｅ」は、ＰＤ−１  ＡＢＤが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１の群から選択されることを意味する。ボックス内の「Ｆ」は、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０；［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、０［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４の群から選択されることを意味する。ボックス内の「Ｇ」は、ＴＩＭ−３  ＡＢＤが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０；７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０の群から選択されることを意味する。ボックス内の「Ｈ」は、ＬＡＧ−３  ＡＢＤが、識別子２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１の群から選択されることを意味する。ボックス内の「Ｉ」は、ボックス内の「Ｊ」は、ＢＴＬＡ  ＡＢＤが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１から選択されることを意味する。図３９Ｂは、図３９Ｂが栓抜き型に特異的であることを除いて、図３９Ａと同一である。Ｂにおいて、第１のＡＢＤがＰＤ−１に結合するとき、第１のＡＢＤはｓｃＦｖ単量体であり、他のＡＢＤ（ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、およびＢＴＬＡ）はＦａｂ単量体にある。Ｂにおいて、第１のＡＢＤがＣＴＬＡ−４に結合するとき、それはｓｃＦｖ単量体にあり（ＰＤ−１と組み合わされるとき、Ｆａｂ側であるときを除く）、他のＡＢＤ（ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３、およびＢＴＬＡ）はＦａｂ単量体にある。
【図４０】可能な栓抜き型の組み合わせのマトリックスを示す。ボックス内の「Ｑ」は、第１のＡＢＤドメイン（同様に、Ｘ軸に列記される）がｓｃＦｖであり、第２のＡＢＤ（再度、Ｙ軸に列記される）がＦａｂ側であることを意味する。ボックス内の「Ｒ」は、第１のＡＢＤがＦａｂ側であり、第２のＡＢＤがｓｃＦｖであることを意味する。ボックス内の「Ｓ」は、第１のＡＢＤが抗ＰＤ−１であり、ｓｃＦｖ側であることを意味する。ボックス内の「Ｔ」は、第１のＡＢＤが抗ＣＴＬＡ−４であり、ｓｃＦｖ側であることを意味する。ボックス内の「Ｕ」は、第１のＡＢＤが抗ＴＩＭ−３であり、ｓｃＦｖ側であることを意味する。ボックス内の「Ｖ」は、第１のＡＢＤが抗ＬＡＧ−３であり、ｓｃＦｖ側であることを意味する。ボックス内の「Ｗ」は、第１のＡＢＤが抗ＴＩＧＩＴであり、ｓｃＦｖ側であることを意味する。ボックス内の「Ｘ」は、第１のＡＢＤが抗ＢＴＬＡであり、ｓｃＦｖ側であることを意味する。加えて、図３９に概説される各組み合わせは、図３８のＣＤＲ、ｓｃＦｖ、ならびにｖｈおよびｖｌの組み合わせを使用することができる。加えて、図３９の栓抜き骨格の特定の実施形態は、図３６の配列である。
【図４１Ａ−Ｂ】二重特異性チェックポイント抗体が２つの異なる抗体または薬物を使用する組み合わせ療法で提供することができる利益と関連する概略図を示す。
【図４２】腫瘍ＴＩＬが複数のチェックポイントを共発現するため、二価結合が活性を増加させ、抗腫瘍活性を増強し、末梢毒性を回避することを示す、類似の概略図を示す。
【図４３】本発明の二重特異性チェックポイント抗体（例えば、抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４）が他の単一特異性チェックポイント抗体（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ）と組み合わされ得ることを示す。
【図４４】ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌、黒色腫、および卵巣癌を含む様々な腫瘍型において共発現されることを示す。
【図４５Ａ−Ｃ】Ｂ）抗ＰＤ−１二価および抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１、ならびにＣ）およびＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける片腕抗ＰＤ−１＋片腕抗ＣＴＬＡ−４および抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１、ならびにＣ）ＳＥＢ刺激なしの対照実験によるＩＬ−２の増強の比較を示す。
【図４６Ａ−Ｂ】片腕抗ＰＤ−１および片腕抗ＣＴＬＡ−４抗体と比較した、例示的な抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体によるＰＤ−１のリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の遮断を示す。
【図４７】例示的な抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体によるＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるＴ細胞結合を示す。
【図４８】抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体がヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着（ヒトＣＤ４５計数によって測定される）を増強することを示す。増強は、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独で見られるよりも大きい。
【図４９】抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性候補が、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおける「片腕」対照と比較して、Ｔ細胞により強力に結合することを示す。
【図５０Ａ−Ｂ】抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１キメラ二重特異性体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌を促進することを示す。ＰＢＭＣを、示される試験物品と共に１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。細胞上清を収集し、示される分析物についてＭＳＤでアッセイした。Ａ：２０μｇ／ｍＬの試験物品；Ｂ  ５μｇ／ｍＬの試験物品。
【図５１Ａ−Ｂ】抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１キメラ二重特異性体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌を促進することを示す。ＰＢＭＣを、示される試験物品と共に１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。細胞上清を収集し、示される分析物についてＭＳＤでアッセイした。Ａ：２０μｇ／ｍＬの試験物品；Ｂ  ５μｇ／ｍＬの試験物品。
【図５２Ａ−Ｂ】抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体（キメラおよびヒト化／最適化抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアーム）がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌およびＩＦＮ−γを促進することを示す。両パネルを、示される２０μｇ／ｍＬの試験物品と共に１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間ＰＢＭＣ刺激した。７２時間後に細胞上清を収集し、示される分析物についてアッセイした。
【図５３Ａ−Ｆ】ＧＶＨＤ研究における例示的な抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体によるＣＤ４５細胞計数およびＩＦＮγ分泌の経時変化（１０、１４、および２２日目）の増強を示す。
【図５４】ある９Ｃ６抗ＢＴＬＡ抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、二価の実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、ならびにＯｃｔｅｔにより測定される、ヒトＢＴＬＡに対するＫＤ結合定数を示す。
【図５５Ａ−Ｅ】ある２Ａ１１抗ＬＡＧ−３抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、Ｆａｂの実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトＬＡＧ−３に対するＫＤ結合定数、ならびにＦａｂのＴｍを示す。
【図５６Ａ−Ｋ】ある７Ｇ８抗ＬＡＧ−３抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、Ｆａｂの実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトＬＡＧ−３に対するＫＤ結合定数、ならびにＦａｂのＴｍを示す。
【図５７Ａ−Ｂ】Ｏｃｔｅｔにより測定される、最適化２Ａ１１または７Ｇ８抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂアームのいずれかに基づく抗ＬＡＧ−３Ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性ヘテロ二量体栓抜き型のＫｄを示す。
【図５８】抗ＬＡＧ−３（７Ｇ８）×抗ＣＴＬＡ−４および抗ＬＡＧ−３（２Ａ１１）×抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体が片腕抗ＬＡＧ−３対照よりも強力に結合することを示す。ＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。次いで、細胞を、４℃で３０分間、示される試験物品で処理し、２回洗浄した。次いで、細胞を抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＦｃ−ＡＰＣ抗体で処理した。次いで、細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。
【図５９Ａ−Ｂ】ＩＬ−２およびＩＦＮγ放出における増強によって示されるように、７Ｇ８に基づく抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体がＰＢＭＣで２Ａ１１に基づく抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体よりも選択的な機能を呈することを示す。ＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で２回洗浄し、示される量の試験物品と組み合わせて５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。細胞を、処理の２４時間後に、示される分析物（ＩＬ−２またはＩＦＮ−γのいずれか）についてアッセイした。各点は、技術的一重項で試験した固有のドナーを表す。
【図６０Ａ−Ｂ】抗ＬＡＧ−３Ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体との混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を示す。４０の固有のＭＬＲ反応を、２０ｕｇ／ｍＬの示される試験物品の存在下で行った。次いで、細胞上清を、Ａ：ＩＬ−２およびＢ：ＩＦＮγについて、処理の６日後に、ＭＳＤによりアッセイした。
【図６１Ａ−Ｂ】ＳＥＢアッセイにおける追加の抗ＬＡＧ−３Ｘ抗  ＣＴＬＡ−４候補によるＩＬ−２およびＩＦＮγ放出の増強を示す。ＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で２回洗浄し、示される量の試験物品と組み合わせて５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。細胞を、処理の２４時間後に、示される分析物（ＩＬ−２またはＩＦＮ−γのいずれか）についてアッセイした。各点は、技術的一重項で試験した固有のドナーを表す。
【図６２Ａ−Ｂ】Ｏｃｔｅｔにより測定される、最適化２Ａ１１または７Ｇ８抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂアームのいずれかに基づく抗ＬＡＧ−３Ｘ抗ＰＤ−１二重特異性ヘテロ二量体栓抜き型のＫｄを示す。
【図６３Ａ−Ｂ】内因的にＭＨＣ−ＩＩを発現するＤａｕｄｉ細胞へのＬＡＧ−３結合を遮断するヒト化／最適化７Ｇ８および２Ａ１１抗ＬＡＧ−３クローンの能力を示す。
【図６４Ａ−Ｂ】ＳＥＢ刺激Ｔ細胞に対する抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１候補機能を示す。ＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で２回洗浄し、示される量の試験物品と組み合わせて５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。細胞を、処理の２４時間後に、示される分析物についてアッセイした。各点は、技術的一重項で試験した固有のドナーを表す。
【図６５】腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が様々な腫瘍において複数のチェックポイント受容体を共発現することを示すグラフである。特に、グラフは、様々な腫瘍がＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ならびにＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４を共発現することを示す。示される結果は、ＴＣＧＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｎｅｔｗｏｒｋ：ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／によって生成されるデータに基づく。
【図６６】本明細書に提供される対象二重特異性抗体が二重チェックポイント陽性Ｔ細胞を選択的に標的とすることを示す。二重特異性ＰＤ−１ｘＬＡＧ−３抗体は、陰性対照と比較して、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激されたＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１およびＬＡＧ−３受容体占有率を示すために使用される。
【図６７Ａ−Ｆ】本明細書に提供される対象抗体の構成要素抗体ドメインがチェックポイント受容体／リガンド相互作用を遮断することが可能であることを示すグラフである。特に、１Ｇ６抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖアームを含む二重特異性抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用を遮断することが可能であり、７Ｇ８抗ＬＡＧ−３片腕は、ＬＡＧ−３／ＭＨＣ  ＩＩ相互作用を遮断することが可能であり、例示的な抗ＰＤ−１  Ｆａｂアームを含む二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４／ＣＤ８６相互作用を遮断することが可能であり、９Ｃ６抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームを含む二重特異性抗体は、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ相互作用を遮断することが可能である。
【図６８】例示的な抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体およびニボルマブによるＩＬ−２放出の増強を比較する。
【図６９】例示的な抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体、ニボルマブと組み合わせた同じ二重特異性抗体、およびニボルマブ単独によるＩＬ−２放出の増強を比較する。
【図７０】例示的な抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体およびニボルマブによるＩＬ−２放出の増強を比較する。
【図７１】例示的な抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体およびニボルマブによるＩＬ−２放出の増強を比較する。
【図７２】例示的な抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体、ニボルマブ単独、およびイピリムマブと組み合わせたニボルマブによるＧＶＨＤ（ＣＤ４５細胞計数によって示される）の増強を比較する。
【図７３】例示的な抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体およびニボルマブによるＧＶＨＤ（ＣＤ４５細胞計数によって示される）の増強を比較する。
【図７４】例示的な抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体、ニボルマブと組み合わせた同じ二重特異性抗体、およびニボルマブ単独によるＧＶＨＤ（ＣＤ４５細胞計数によって示される）の増強を比較する。
【図７５】例示的な抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体およびニボルマブによるＧＶＨＤ（ＣＤ４５細胞計数によって示される）の増強を比較する。
【図７６Ａ−Ｄ】抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体がインビボＴ細胞媒介抗腫瘍効力を促進し得ることを示す２つの研究を示す。ＫＧ１ａ−ｌｕｃがん細胞をマウスに移植した。２１日後、ｈｕＰＭＣを同じマウスに移植し、毎週抗体処置（抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体、抗ＰＤ−１二価抗体、または抗ＰＤ−１二価抗体＋抗ＣＴＬＡ−４二価抗体）を施した。ＩＶＩＳがん細胞撮像をマウスに対して行って、腫瘍束の変化によって決定される腫瘍サイズを評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ａ．資料の組み込み
１．図および凡例
米国特許出願第６２，３５０，１４５号、同第６２／３５３，５１１号、および同第６２／４２０，５００号のすべての図およびそれに付随する凡例は、特に本明細書に示されるアミノ酸配列に関して、その全体が本明細書に参照により明示的かつ独立して組み込まれる。
【００１１】
２．配列
添付の配列表に関して、以下の通り説明する：ＡＢＤとして使用するのに好適な抗ＰＤ−１配列としては、配列番号６２０９〜１１４６４（ＰＤ−１ｓｃのＦｖ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、Ｆａｂの形式になっている場合がある）、配列番号１１４６５〜１７１３４（ＰＤ−１のＦａｂ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号３３００３〜３３０７２（追加のＰＤ−１のＦａｂ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号３３０７３〜３５３９４（追加のＰＤ−１のｓｃＦｖ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、Ｆａｂの形式になっている場合がある）、および配列番号３６１２７〜３６１４６（ＰＤ−１の二価の構築物、これらは、ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかの形式になっている場合がある）が挙げられる。ＡＢＤとして使用するのに好適な抗ＣＴＬＡ−４の配列としては、配列番号２１〜２９１８（ＣＴＬＡ−４のｓｃＦｖ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、Ｆａｂの形式になっている場合がある）、配列番号２９１９〜６２０８（ＣＴＬＡ−４のＦａｂ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号３６７３９〜３６８１８（追加のＣＴＬＡ−４のＦａｂ配列ではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、および配列番号３５３９５〜３５４１６（ＣＴＬＡ−４の片腕構築物、これらは、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかの形式になっている場合がある）が挙げられる。ＡＢＤとして使用するのに好適な抗ＬＡＧ−３の配列としては、配列番号１７１３５〜２０７６４（ＬＡＧ−３のＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号３６８１９〜３６９６２（追加のＬＡＧ−３のＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号３５４１７〜３５６０６（追加のＬＡＧ−３のＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号２５１９４〜３２７９３（追加のＬＡＧ−３のＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、および配列番号３２７９４〜３３００２（片腕ＬＡＧ−３の構築物、これらはＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかの形式になっている場合がある）が挙げられる。ＡＢＤとして使用するのに好適な抗ＴＩＭ−３の配列としては、配列番号２０７６５〜２０８８４（ＴＩＭ−３のＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、配列番号３７５８７〜３７６９８（追加のＴＩＭ−３のＦａｂ、Ｆｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、および配列番号３６３４７〜３６７０６（二価のＴＩＭ−３の構築物、これらは、ＦａｂまたはｓｃＦｖのいずれかの形式になっている場合がある）が挙げられる。ＡＢＤとして使用するのに好適な抗ＢＴＬＡの配列としては、配列番号２０８８５〜２１５０３（ＢＴＬＡのＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、および配列番号３６７０７〜３６７３８（追加のＢＴＬＡのＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）が挙げられる。ＡＢＤとして使用するのに好適な抗ＴＩＧＩＴの配列としては、配列番号２１５０４〜２１５２３（ＴＩＧＩＴのＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）、および配列番号３７４３５〜３７５８６（追加のＴＩＧＩＴのＦａｂではあるが、それらの中のＦｖ配列は、ｓｃＦｖの形式になっている場合がある）が挙げられる。
【００１２】
本発明の二重特異性抗体には、配列番号３５６０７〜３５８６６および配列番号２１５２４〜２２６２０のＬＡＧ３とＣＴＬＡ４との構築物が含まれる。ＰＤ−１とＣＴＬＡ４との構築物には、配列番号３６１６７〜３６３４６および配列番号２３３１６〜２３７３５としてリストに記載されるものが含まれる。ＰＤ−１とＴＩＭ３との構築物には、配列番号２５１７４〜２５１９３としてリストに記載されるものが含まれる。ＰＤ−１とＬＡＧ３との構築物には、配列番号３５８６７〜３６１２６および配列番号２３７３６〜２５１３３としてリストに記載されるものが含まれる。ＰＤ−１とＴＩＧＩＴとの構築物には、配列番号２５１３４〜２５１７３としてリストに記載されるものが含まれる。ＰＤ−１とＢＴＬＡとの構築物には、配列番号２２７２４〜２３３１５および配列番号３６１４７〜３６１６６としてリストに記載されるものが含まれる。ＣＴＬＡ４とＢＴＬＡとの構築物には、配列番号２２６２４〜２２７２３としてリストに記載されるものが含まれる。最後に、ＸＥＮＰ２３５５２、ＸＥＮＰ２２８４１、ＸＥＮＰ２２８４２、ＸＥＮＰ２２８４３、ＸＥＮＰ２２８４４、ＸＥＮＰ２２８４５、ＸＥＮＰ２２８４６、ＸＥＮＰ２２８４７、ＸＥＮＰ２２８４８、ＸＥＮＰ２２８４９、ＸＥＮＰ２２８５０、ＸＥＮＰ２２８５１、ＸＥＮＰ２２８５２、ＸＥＮＰ２２８５８、ＸＥＮＰ２２８５４、ＸＥＮＰ２２８５５の名前はすべて、不注意に省かれた「Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ」の表示をタイトルに含むべきであった。
【００１３】
Ｂ．概要
ＰＤ−１などの免疫チェックポイント阻害剤に向けられる治療抗体は、癌治療の限定された状況では、大いに期待できる。癌は、患者が癌性細胞を認識し、排除することができないとみなされ得る。多くの事例において、これらの形質転換（例えば、癌性）細胞は、免疫監視を弱める。制御されていないＴ細胞活性を防止するために、体内でＴ細胞の活性化を制限する天然制御機構があり、これは、免疫応答を回避または抑制するために、癌性細胞によって利用され得る。癌を認識および排除するために、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞の能力を回復させることが、免疫療法の目標である。時折「免疫療法」と称される免疫腫瘍学の分野は、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、およびＯｐｄｉｖｏなどのＴ細胞チェックポイント阻害抗体のいくつかの最近の承認により、急速に展開している。これらの抗体は一般に、Ｔ細胞免疫の負の制御因子を遮断するため、「チェックポイント阻害物質」と称される。一般に、共刺激および共阻害性の両方の様々な免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を調整することができることが理解されている。
【００１４】
一般に、これらのモノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１等のチェックポイント阻害タンパク質に結合し、これにより、通常の状況であれば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化が予防または抑制される。例えば、これらのタンパク質に結合する抗体の使用によりチェックポイントタンパク質を阻害することによって、腫瘍に対するＴ細胞応答の増加が達成され得る。すなわち、これらの癌チェックポイントタンパク質は、免疫応答を抑制し、例えば、チェックポイントタンパク質に対して抗体を使用して、これらのタンパク質が遮断されたとき、免疫系が活性化され、癌および感染性疾患などの病態の治療をもたらす。
【００１５】
しかしながら、上述のように、ＴＩＬは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが研究により明らかになっており、これは、単一のチェックポイント遮断では、完全なＴ細胞応答を促進するのに十分ではないことを示唆している可能性がある。さらに、複数のチェックポイントを発現するＴＩＬは、実際には、最も腫瘍反応性である可能性が高く、したがって、２つ以上のチェックポイント抗原を塞ぐ療法が非常に有用であり得ることを示唆するものである。
【００１６】
したがって、本発明は、２つの抗原を発現する細胞に結合する二重特異性チェックポイント抗体と、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化させて、癌および感染性疾患などの疾患、または免疫活性を高めることによって治療される他の病態を治療する方法と、を提供する。
【００１７】
したがって、本発明は、場合によっては、単一細胞上で２つの異なるチェックポイント阻害剤分子に結合する二重特異性抗体を提供し、有利に１つの治療物質のみの投与を必要とすることにより、毒性の問題および複数の抗体投与の費用を解決することを対象とする。
【００１８】
２つの異なる標的を同時に結合することができる二重特異性抗体は、ＴＩＬ対末梢Ｔ細胞標的の選択性を改善する可能性を提供し、一方で療法の費用も低減する。細胞表面上の２つの標的との抗体の二価相互作用は、場合によっては、一度に１つの標的との一価相互作用に対してより高い結合力をもたらすはずである。このため、通常の二価抗体は、細胞表面上のそれらの標的に高い結合力を有する傾向がある。二重特異性抗体では、両方の標的への同時結合によって得られるより高い結合力を利用して、２つの異なる標的を同時に発現する細胞に対してより高い選択性を創出する可能性がある。
【００１９】
したがって、本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、２つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物を対象とする。したがって、例えば、抗ＰＤ１ｘ抗ＣＴＬＡ４（ＰＤ１×ＣＴＬＡ４）二重特異性抗体は、ＰＤ１＋ＣＴＬＡ４＋二重陽性ＴＩＬ対単一陽性ＰＤ１のみまたはＣＴＬＡ４のみＴ細胞により選択的であると予想される。したがって、二重陽性ＴＩＬ対単一陽性Ｔ細胞の選択的遮断は、組み合わされたチェックポイント遮断の治療指数を改善することが予想される。これは、本明細書に概説されるように、他の可能な組み合わせに関して同様に当てはまる。したがって、本発明の好適な二重特異性抗体は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は、各対について、「抗ＰＤ−１Ｘ抗ＣＴＬＡ−４」、または一般に単純化して、または簡単にするために（よって互換的に）、「ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４」等と命名されることに留意する。
【００２０】
本発明のヘテロ二量体二重特異性チェックポイント抗体は、様々な種類の癌を治療するのに有用である。当業者に理解されるように、腫瘍抗原に結合する従来のモノクローナル抗体、または例えばＣＤ３および腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体のより新しいクラス（例えば、ＵＳＳＮ１５／１４１，３５０に記載されるような）とは対照的に、チェックポイント抗体は、免疫応答を高めるために使用されるが、一般に、それらの作用において腫瘍特異的ではない。すなわち、本発明の二重特異性チェックポイント抗体は、免疫系の抑制を阻害し、一般にＴ細胞活性化につながり、これはがん性細胞に対するより大きな免疫応答、したがって、治療につながる。．したがって、そのような抗体は、多種多様な腫瘍型の治療のための有用性を見出すことが予想され得る。例えば、ＦＤＡは、腫瘍型ではなく遺伝子特徴に基づいた抗ＰＤ−１単一特異性抗体であるＫｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）を最近認可した。
【００２１】
以下で論じるように、Ｔ細胞活性化を測定することができる様々な方法がある。ＮＫおよびＴ細胞に対する二重特異性チェックポイント抗体の機能効果は、次のパラメータ：増殖、サイトカイン放出、および細胞表面マーカーの変化を測定することによって、インビトロで（および以下により完全に記載されるように、場合によっては、インビボで）評価され得る。ＮＫ細胞について、細胞増殖の増加、細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ、グランザイム、パーフォリン発現の増加によって測定される標的細胞を殺傷させる能力、または標的細胞殺傷を直接測定することによって）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）は、免疫調節、例えばがん細胞の増強された殺傷の指標となる。Ｔ細胞について、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカーの発現の増加（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、およびＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）は、免疫調節、例えばがん細胞の増強された殺傷の指標となる。したがって、治療の評価は、次のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる：（ｉ）免疫応答の増加、（ｉｉ）αβおよび／またはγδＴ細胞の活性化の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加、（ｖ）αβおよび／またはγδＴ細胞抑制の軽減、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌の増加、（ｖｉｉｉ）インターフェロンγ産生の増加、（ｉｘ）Ｔｈ１応答の増加、（ｘ）Ｔｈ２応答の減少、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞および細胞のうちの少なくとも１つの細胞数および／または活性の減少、（ｘｉｉ）腫瘍免疫浸潤物の増加。
【００２２】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、（ａ）炎症誘発性サイトカインの上方制御、（ｂ）Ｔ細胞の増殖、拡大、もしくは腫瘍浸潤の増加、（ｃ）Ｔ細胞によるインターフェロンγ、ＴＮＦ−α、および他のサイトカイン産生の増加、（ｄ）ＩＬ−２分泌の増加、（ｅ）抗体応答の刺激、（ｆ）癌細胞成長の阻害、（ｇ）抗原特異的Ｔ細胞免疫の促進、（ｈ）ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の促進、（ｉ）Ｔ細胞抑制の低減、（ｊ）ＮＫ細胞活性化の促進、（ｋ）癌細胞のアポトーシスまたは溶解の促進、ならびに／または（ｌ）癌細胞に対する細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制効果を必要とする対象に、これらのうちの１つ以上を実施するための、二重特異性チェックポイント抗体の使用を提供する。
【００２３】
したがって、本発明は、二重特異性ヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組織化する２つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、チェックポイント抗原を共捕捉することができるヘテロ二量体抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ／またはホモ二量体に関してヘテロ二量体精製の容易化を可能にする。
【００２４】
したがって、本発明は、二重特異性チェックポイント抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、２つ（以上）の異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖の遺伝子を宿主細胞（一般に、本発明において、本明細書に概説される２つの重鎖単量体および軽鎖の遺伝子）に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ）の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および／またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
【００２５】
この問題を解決するために、本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる機構がいくつか存在する。加えて、当業者に理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体抗体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体（例えば、以下に記載される「ノブアンドホール」または「非対称」変異体、および以下に記載される「電荷対」変異体）、ならびにヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を含み得る。
【００２６】
ヘテロ二量体形成を好み、ホモ二量体形成を好まないように立体および／または静電影響を創出するアミノ酸操作を指す、一般に当該技術分野において「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」）と呼ばれるか、または本明細書において「非対称」変異体と呼ばれることがある１つの機構を任意選択で使用することもでき、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号、ＵＳ２０１２／０１４９８７６に記載されるとおりである（それらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。図において、「ノブアンドホール」アミノ酸置換を含むいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対が同定されている。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）において記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をヘテロ二量体化へと非対称にすることができる。本発明において使用されるものは、特に以下に概説されるｐＩ変異体を含む他のヘテロ二量体化変異体と組み合わせて、Ｔ３６６Ｗと対であるＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ならびに架橋ジスルフィドを伴うこの変異体、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃと対であるＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃである。
【００２７】
ヘテロ二量体抗体の生成において有用である追加の機構は、「静電操縦」または「電荷対」と呼ばれることがあり、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）において記載されるとおりである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これは、本明細書において「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと非対称にするために使用される。当業者であれば、これらは、ｐＩに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても効果を有し得、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体と考えられ得ることを理解するであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定されないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体が対応するセットである）およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれ、他は図に示される。
【００２８】
本発明において、いくつかの実施形態では、ｐＩ変異体は、単量体のうちの１つまたは両方のｐＩを変えるために使用され、そうすることで、Ａ−Ａ二量体タンパク質、Ａ−Ｂ二量体タンパク質、およびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点分離を可能にする。
【００２９】
本発明において、ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にすることができるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、ｐＩ変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるｐＩを有し、そうすることで、Ａ−Ａ二量体タンパク質、Ａ−Ｂ二量体タンパク質、及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にする。あるいは、「三重Ｆ」型などのいくつかの足場型は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説されるように、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「非対称」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびｐＩ変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特に有用である。加えて、以下にさらに概説されるように、三重Ｆ型などのｓｃＦｖ（複数可）を利用する足場は、精製目的に向けて、さらなるｐＩの増大を与える帯電ｓｃＦｖリンカー（正か負のいずれか）を含むことができる。当業者に理解されるように、三重Ｆ型によっては、帯電ｓｃＦｖリンカーのみを有し、追加のｐＩ調整無しでも有用であるが、本発明は、帯電ｓｃＦｖリンカー（および本明細書に論じられるＦｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯの組み合わせ）を有する非対称変異体の使用も提供する。
【００３０】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドのうちの１つまたは両方に導入されてもよい。すなわち、単量体のうちの１つのｐＩ（本明細書において、単に「単量体Ａ」と呼ばれる）が単量体Ｂを除去するために操作され得るか、または単量体ＡおよびＢの両方が帯電され、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させることができる。以下に、より完全に概説されるように、単量体のいずれか、または両方のｐＩの変化は、帯電残基を除去もしくは追加（例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである）するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化（例えば、アスパラギン酸からリジンへ）させるか、または帯電残基を中性残基へと変化（例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する）させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。加えて、本明細書のヘテロ二量体抗体の創出に使用するための好適なｐＩ変異体は、例えば、著しい免疫原性を導入することなくｐＩを変化させるように、異なるＩｇＧアイソタイプからｐＩ変異体を移入する、アイソタイプのものであり、米国公開第２０１４／０２８８２７５号の図２９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００３１】
したがって、本発明のこの実施形態において、単量体のうちの少なくとも１つにおいて、ｐＩの十分な変化の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離され得る。当業者に理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのｐＩが増加もしくは減少（ｗｔ  Ａ−＋Ｂもしくはｗｔ  Ａ−−Ｂ）のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること（Ａ＋−Ｂ−もしくはＡ−Ｂ＋）によって行うことができる。
【００３２】
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、このアミノ酸変異体は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を単量体のうちの１つまたは両方へ組み込むことによって、「ｐＩ二量体」（タンパク質が抗体であるとき、これらは「ｐＩ抗体」と呼ばれる）を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが、わずか０．１ｐＨ単位でも異なれば達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。
【００３３】
当業者に理解されるように、良好な分離を得るために単量体（複数可）のそれぞれまたは両方に含まれるｐＩ変異体の数は、対象のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに依存する部分がある。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より正、もしくはより負）にするかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるＦｖであれば、本発明で活用される異なる出発ｐＩを有する。一般に、本明細書に概説されるように、ｐＩが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約０．１ｌｏｇの総ｐＩ差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総ｐＩ差異は、０．２〜０．５であることが好ましい。
【００３４】
さらに、当業者に理解され、本明細書に概説されるように、場合によっては（型による）、ヘテロ二量体は、サイズ（例えば分子量）に基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば、図１のいくつかの実施形態に示されるように、型によって、異なるサイズのホモ二量体およびヘテロ二量体をもたらす（例えば、栓抜きについて、１つのホモ二量体は「二重ｓｃＦｖ」型であり、１つのホモ二量体は標準抗体であり、ヘテロ二量体は１つのＦａｂおよび１つのｓｃＦｖを有する。
【００３５】
加えて、図１に示されるように、いくつかの抗原が二価で結合されることが可能である（例えば、単一抗原に対して２つの抗原結合部位）ことを認識する。理解されるように、ＦａｂおよびｓｃＦｖの任意の組み合わせを利用して、所望の結果および組み合わせを達成することができる。
【００３６】
ｐＩ変異体が、重鎖（複数可）の定常領域（複数可）を使用することによって、ホモ二量体を上回るヘテロ二量体精製を達成するために使用される場合は、抗体を含む多重特異性タンパク質の設計および精製に対する、よりモジュール型の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異体（非対称ヘテロ二量体化変異体および精製ヘテロ二量体化変異体を含む）は、可変領域に含まれておらず、その結果、個々の抗体は、それぞれ操作されなければならない。加えて、いくつかの実施形態では、ｐＩ変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、異なるＩｇＧアイソタイプ由来のｐＩ変異体を移入することによって、著しく低減され、その結果、著しい免疫原性を導入することなくｐＩを変化させる。したがって、解決すべき追加の問題は、ヒト配列含量が高い低ｐＩ定常ドメインの解明であり、例えば、何らかの特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。
【００３７】
このｐＩ操作で起こり得る付帯利点は、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加でもある。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４に記載されるように（参照によりその全体が組み込まれる）、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体においてみられるものを含む）のｐＩを下げることは、インビボにおいて、血清での保持が長期化することにつながり得る。血清半減期の増加に向けた、これらのｐＩ変異体によって、精製に向けたｐＩ変化も容易となる。
【００３８】
加えて、ホモ二量体が存在する場合に、排除、最小化、および区別するいずれかの能力が顕著であるため、ヘテロ二量体化変異体のｐＩ変異体が、二重特異性抗体の分析論および品質管理工程に追加の利点をもたらすことに留意されたい。同様に、ヘテロ二量体タンパク質産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。
【００３９】
当業者に理解され、以下により完全に論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、一般に、図１に示されるように、多種多様の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に１種類の特異性、およびもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｄｅｄ）」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも１種類の特異性、および分子の「下部」に１つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化（ｄｕａｌ  ｅｎｄｅｄ）」立体配置を示す。したがって、本発明は、第１の抗原および第２の抗原を共捕捉する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。本発明の第１および第２の抗原は、本明細書において、それぞれ、抗原−１および抗原−２（または「チェックポイント−１」および「チェックポイント−２」）と称される。
【００４０】
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、「三重Ｆ」または図１Ａに示される「栓抜き」足場型である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）を含み、もう一方の重鎖は、「定型的な（ｒｅｇｕｌａｒ）」ＦＡｂ型であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重Ｆ」型（ｓｃＦｖ−ＦＡｂ−Ｆｃ）、または栓抜きにおおよそ視覚的に類似している（図１Ａ参照）ことから「栓抜き」型と呼ばれることがある。２つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメインおよび／またはヒンジ領域）において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に記載される。
【００４１】
本「三重Ｆ」型には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるように、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖および軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減することができる。加えて、２つの重鎖および２つの軽鎖に依存する型とは対照的に、重鎖および軽鎖が、不正確に対になる（例えば、重１が、軽２と対になる等）という問題は存在しない。
【００４２】
さらに、本明細書で概説されるように、追加のアミノ酸変異体は、追加の機能性を追加するために、本発明の二重特異性抗体に導入することができる。例えば、Ｆｃ領域内のアミノ酸変化は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増加を容易にするため（例えば、Ｆｃγ受容体への結合を変える）、ならびにＦｃＲｎへの結合を増加し、かつ／または得られる分子の血清半減期を増加させるために（１つの単量体または両方の単量体のいずれかに）付加され得る。本明細書にさらに記載され、当業者に理解されるように、本明細書に概説されるすべての変異体が任意選択かつ独立して他の変異体と組み合わせることができる。
【００４３】
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Ｆｃγ切断変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯもしくはＫＯ）変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）のうちの１つ以上またはすべてに対するＦｃドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、一般に、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を切断して、ＡＤＣＣ活性を排除または著しく低減することが望ましい。好適な切断変異体は、図５に示される。
【００４４】
Ｃ．命名法
本発明の二重特異性抗体は、いくつかの異なる型でリストに記載される。各ポリペプチドは固有の「ＸＥＮＰ」番号を与えられるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列がより短い番号を含む場合がある。例えば、所与の配列の栓抜き型のｓｃＦｖ側単量体の重鎖は、第１のＸＥＮＰ番号を有し、一方でｓｃＦｖドメインは異なるＸＥＮＰ番号を有する。分子によっては３つのポリペプチドを有し、そのため、構成要素と共にＸＥＮＰ番号が名称として使用される。したがって、栓抜き型である分子ＸＥＮＰ２０７１７は、一般に、「ＸＥＮＰ２０７１７  ＨＣ−Ｆａｂ」、「ＸＥＮＰ２０７１７ＨＣ−ｓｃＦｖ」、および「ＸＥＮＰ２０７１７ＬＣ」と称される３つの配列、または等価物含むが、当業者は、配列アライメントによりこれらを容易に同定することができるだろう。これらのＸＥＮＰ番号ならびに識別子は、配列表にあり、図で使用されている。加えて、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子をもたらす。例えば、Ｆａｂ単量体のリストは、完全長配列、可変重配列、および可変重配列の３つのＣＤＲを有し、軽鎖は、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の３つのＣＤＲを有し、ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインは、完全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽配列、３つの軽ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重配列、および３つの重ＣＤＲを有する。ｓｃＦｖドメインを有する本明細書のすべての分子が単一の帯電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他が使用され得ることに留意する。加えて、特定の可変ドメインの命名法は、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」の種類の形式を使用し、番号は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、ＸＥＮＰ２２８４１のＦａｂ側の可変ドメインは、「７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４」であり、これは、可変重ドメインＨ３．３０が軽ドメインＬ１．３４と組み合わされたことを示す。これらの配列がｓｃＦｖｓとして使用される場合、指定「７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４」は、可変重ドメインＨ３．３０が軽ドメインＬ１．３４と組み合わされ、ＮからＣ末端のｖｈ−リンカー−ｖｌ配向にあることを示す。重可変ドメインおよび軽可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序であるこの分子は、「７Ｇ８＿Ｌ１．３４＿Ｈ３．３０」と命名されるであろう。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかであるように、重鎖および軽鎖を「うまく組み合わせる」ことができる。
【００４５】
Ｄ．定義
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意図する。
【００４６】
本明細書では、「切断」とは、活性の低減または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合の切断」は、特定の変異体を含有しないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域アミノ酸変異体が、出発結合の５０％未満を有することを意味し、活性を７０〜８０〜９０〜９５〜９８％超喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、またはＢＬＩアッセイにおいて、検出可能な結合レベルを下回る。ＦｃγＲ結合の切断において特に使用されるものは、図５に示されるものであり、これらは一般に両単量体に付加される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害性」とは、細胞が媒介する反応であり、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こすことを意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合と相関しており、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は、ＡＤＣＣ活性の増加につながる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞貪食とは、細胞が媒介する反応であり、ＦｃγＲを発現する非特異的貪食細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食を引き起こすことを意味する。
【００４９】
本明細書では、「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在するとき、本明細書で論じられるように、標的抗原に特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。したがって、「チェックポイント抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説される標的チェックポイント抗原に結合する。当該技術分野で知られるように、これらのＣＤＲは、一般に、可変重ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）の第１のセット、および可変軽ＣＤＲ（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）の第２のセットとして存在し、それぞれが、３つのＣＤＲ：重鎖のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ならびに軽鎖のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、それぞれ、可変重ドメインおよび可変軽ドメインに存在し、一緒にＦｖ領域を形成する。（表１およびＣＤＲ番号付けスキームについての上記の関連する考察を参照されたい）。したがって、場合によっては、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲは、可変重ドメインおよび可変軽ドメインにより寄与される。「Ｆａｂ」型において、６つのＣＤＲのセットは、２つの異なるポリペプチド配列である、可変重ドメイン（ｖｈまたはＶＨ；ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含有する）および可変軽ドメイン（ｖｌまたはＶＬ；ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含有する）により寄与され、ｖｈドメインのＣ末端が重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合され、ｖｌドメインのＣ末端が定常軽ドメインのＮ末端に結合する（したがって、軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖ型において、ｖｈおよびｖｌドメインは、本明細書に概説されるように、一般にリンカー（「ｓｃＦｖリンカー」の使用により、単一ポリペプチド配列に共有結合され、これは、（Ｎ末端から開始して）ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈのいずれかであってよく、前者が一般に好ましい（使用される型（例えば図１から）により、各側に任意選択のドメインリンカーを含む。一般に、ｓｃＦｖドメインのＣ末端は、第２の単量体のヒンジのＮ末端に結合される。
【００５０】
本明細書では、「改変」とは、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する変更を意味する。例えば、改変は、糖質の変更またはタンパク質に結合されたＰＥＧ構造であってよい。本明細書では、「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確化のために、別段の記載が無い限り、アミノ酸改変は、常に、ＤＮＡよってコードされるアミノ酸への改変であり、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいてコドンを有する２０個のアミノ酸である。
【００５１】
本明細書では、「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定位置で、アミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定位置で自然発生しないアミノ酸に対するものであり、生物内において、または何らかの生物において、いずれでも自然発生しない。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、位置２７２で、グルタミン酸が、チロシンで置き換えられているＦｃ変異体である。明確化のために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させないように操作されたタンパク質（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）に交換して、宿主生物の発現レベルを増加させる）は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にかかわらず、タンパク質が、それが開始した特定の位置で同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の追加を意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を指定する。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、位置２３３でグルタミン酸の欠失を指定する。加えて、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、位置２３３から始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を指定する。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するが、それほど多くはなく、変異体タンパク質は、以下に記載されるようなアライメントプログラムを用いて親タンパク質と整列しない。一般に、変異体タンパク質（本明細書で概説される変異体Ｆｃドメインなどは、一般に、ＢＬＡＳＴなどの以下に記載されるアライメントプログラムを使用して、親タンパク質に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。
【００５５】
以下に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えば、Ｆｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来の重定常ドメインまたはＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、変異体を有するヒト配列は、「親ポリペプチド」として機能することもでき、例えば、米国公開第２００６／０１３４１０５号のＩｇＧ１／２ハイブリッドが含まれ得る。本明細書のタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列と、少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５〜９８〜９９％の同一性を有する。したがって、本明細書で使用される場合、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は、少なくとも１つのアミノ酸改変の理由によって、親ＩｇＧ（同様に、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列から）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾の理由によって親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較して、Ｆｃドメインにアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。
【００５６】
本発明のＦｃ変異体は、それを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、位置４３４で置換セリンを有するＦｃ変異体であり、番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｍ４２８Ｌ及び置換Ｎ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性が、特定されていなくてもよく、その場合、先に記載した変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される規則は任意であることに留意されたい。つまり、例えば、Ｎ４３４Ｓ／Ｍ４２８Ｌは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異体である等である。本発明において論じられ、抗体に関連する位置のすべてで、別段の記載が無い限り、アミノ酸位置の番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。ＥＵインデックスまたはＫａｂａｔもしくはＥＵ番号付けスキームにあるようなＥＵインデックスは、ＥＵ抗体の番号付けを指す。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークへと分類し、そのリストを作製した（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。参照によって、全体が組み込まれる）。Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５も参照されたい。参照により全体が組み込まれる。改変は、追加、欠失、または置換であり得る。
【００５７】
本明細書では、「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドが含まれる。加えて、本発明の抗体を作りあげるポリペプチドは、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたはペプチド標識の追加を含んでよい。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「残基」とは、タンパク質における位置を意味し、アミノ酸同一性と関連する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における位置２９７の残基である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、一般に、２つの異なるポリペプチド鎖上にＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメイン（例えば、一方の鎖上にＶＨ−ＣＨ１、そしてもう一方の鎖上にＶＬ−ＣＬ）を含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、この領域を単独で、または本発明の二重特異性抗体の文脈においてこの領域を指してよい。Ｆａｂの文脈において、Ｆａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、ＡＢＤのＶＬドメインおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖ領域は、Ｆａｂ（上述のように、一般に、上記に概説される定常領域も含む２つの異なるポリペプチド）およびｓｃＦｖの両方として形式化されてよく、ここで、ｖｌおよびｖｈドメインは組み合わされて（一般に、本明細書で論じられるリンカーで）、ｓｃＦｖを形成する。
【００６１】
本明細書では、「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成するために、一般に本明細書に論じられるｓｃＦｖリンカーを使用して、可変軽ドメインに共有結合した可変重ドメインを意味する。．ｓｃＦｖドメインは、ＮからＣ末端のいずれかの配向（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）であってよい。配列表および図に示される配列において、ｖｈドメインおよびｖｌドメインの順序は名称で示され、例えば、Ｈ．Ｘ＿Ｌ．Ｙは、ＮからＣ末端がｖｈ−リンカー−ｖｌであることを意味し、Ｌ．Ｙ＿Ｈ．Ｘはｖｌ−リンカー−ｖｈである。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＧサブクラス改変」または「アイソタイプ改変」は、１つのＩｇＧアイソタイプの１個のアミノ酸を、異なる、整列されたＩｇＧアイソタイプにおいて、対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６に、ＩｇＧ１は、チロシンを含み、ＩｇＧ２は、フェニルアラニンを含むため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス改変であると考えられる。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「非自然発生改変」とは、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ヒトＩｇＧのいずれも位置４３４にセリンを含まないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４（またはそのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、非自然発生改変であると考えられる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされる自然発生する２０個のアミノ酸のうちの１つを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域と、Ｆｃ受容体またはＦｃリガンドとの相互作用からもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、限定されないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、限定されないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれる。Ｆｃリガンドは、ＦｃγＲに相同性のＦｃ受容体のファミリーであるＦｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６、参照により全体が組み込まれる）も含む。Ｆｃリガンドには、Ｆｃに結合する未発見分子が含まれてよい。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用される場合、「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質ファミリーの何らかのメンバーを意味し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされる。ヒトにおいては、このファミリーには、限定されないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、アイソフォームＦｃγＲＩｂ、およびアイソフォームＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびアロタイプＲ１３１を含む）、アイソフォームＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびアロタイプＦ１５８を含む）、およびアイソフォームＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびアロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５の全体が、参照によって組み込まれる）、ならびに何らかの未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはＦｃγＲアロタイプが含まれる。ＦｃγＲは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルが含まれる。マウスＦｃγＲには、限定されないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに何らかの未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはＦｃγＲアロタイプが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「ＦｃＲｎ」または「新生児型Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも一部がＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。ＦｃＲｎは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルが含まれる。当該技術分野で知られるように、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、２つのポリペプチドを含み、重鎖および軽鎖と呼ばれることが多い。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。別段の記載が無い限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合の増加に使用され、場合によっては、血清半減期の増加に使用される様々なＦｃＲｎ変異体。「ＦｃＲｎ変異体」は、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるものであり、好適なＦｃＲｎ変異体は以下に示される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」とは、後に改変されて変異体を生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、自然発生するポリペプチド、または自然発生するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってよい。したがって、本明細書で使用される場合、「親免疫グロブリン」とは、変異体を生成するように改変される未改変免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、変異体抗体を生成するように改変される未改変抗体を意味する。「親抗体」は、以下に概説されるように、既知の市販の組換え産生抗体を含むことに留意されたい。この文脈において、「親Ｆｃドメイン」は、列記される変異体に対してであり、したがって、「変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１の親Ｆｃドメインと比較され、「変異体ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン」は、親ＦｃドメインヒトＩｇＧ４等と比較される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、ＩｇＧ分子のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含み、場合によっては、ヒンジを含むポリペプチドを意味する。ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けにおいて、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２３１〜４４７を含み、ヒンジは２１６〜２３０である。したがって、「Ｆｃドメイン」の定義は、アミノ酸２３１〜４４７（ＣＨ２−ＣＨ３）もしくは２１６〜４４７（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の両方、またはその断片を含む。この文脈において、「Ｆｃ断片」は、ＮおよびＣ末端のいずれか、または両方からのより少ないアミノ酸を含有し得るが、一般にサイズに基づく（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等）標準的な方法を使用して検出され得るとき、依然として別のＦｃドメインもしくはＦｃ断片を有する二量体を形成する能力を保持する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインは、本発明において、特定の使用のものであり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４由来のＦｃドメインであり得る。
【００７１】
「変異体Ｆｃドメイン」は、親Ｆｃドメインと比較してアミノ酸改変を含有する。したがって、「変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、アミノ酸改変（一般に、アミノ酸置換だが、切断変異体の場合、アミノ酸欠失が含まれる）を含有するものである。一般に、変異体Ｆｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有する（以下に論じられる同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当該技術分野で知られるＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用する）。あるいは、変異体Ｆｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸改変を有し得る。加えて、本明細書で論じられるように、本明細書において変異体Ｆｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載される既知の技法を使用して測定されるように、依然として別のＦｃドメインを有する二量体を形成する能力を保持する。
【００７２】
本明細書において、「重鎖定常領域」とは、可変重ドメインを除く抗体（またはその断片）のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味し、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けにおいて、これはアミノ酸１１８〜４４７である。本明細書では、「重鎖定常領域断片」とは、ＮおよびＣ末端のいずれか、または両方からのより少ないアミノ酸を含有するが、依然として別の重鎖定常領域を有する二量体を形成する能力を保持する、重鎖定常領域を意味する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、タンパク質の配列における場所（ｌｏｃａｔｉｏｎ）を意味する。位置は、連続して番号付けされるか、または確立された形式に従ってよく、例えば、抗体の番号付けのためのＥＵインデックスに従ってよい。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域を含む抗原結合ドメインによって特異的に結合される分子を意味する。以下に論じられるように、本事例において、標的抗原はチェックポイント阻害剤タンパク質である。
【００７５】
本明細書において、本発明のヘテロ二量体抗体の単量体の構成における「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」とは、「適合」するＤＮＡの２つの鎖（ｓｔｒａｎｄ）と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、「適合」してヘテロ二量体を形成する能力を保つように、それぞれの単量体へと取り込まれることを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異体が、単量体Ａへと操作される（例えば、ｐＩを高くする）のであれば、「電荷対」である立体変異体も利用することができ、ｐＩ変異体を妨害しない。例えば、ｐＩを高くする電荷変異体を、同一「鎖」または同一「単量体」に加えることにより、両機能性が保持される。同様に、以下により完全に概説されるセットの対で起こる「非対称」変異体については、当業者は、ｐＩ分離も非対称のｐＩを使用して最大になるように、どの鎖または単量体を１セットの対に組み込むかを決定するときにｐＩを考慮する。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、標的抗原を発現している細胞を意味する。
【００７７】
本明細書において、本発明に従う二重特異性抗体を産生する文脈において、「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外来核酸を含有し、好適な条件下で二重特異性抗体を発現することができる細胞を意味する。好適な宿主細胞を以下に論じる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、それぞれ、カッパ免疫グロブリン、ラムダ免疫グロブリン、および重鎖免疫グロブリンの遺伝子座を作りあげるＶκ遺伝子、Ｖλ遺伝子、および／またはＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含み、抗原特異性を付与するＣＤＲを含有する免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重ドメイン」は「可変軽ドメイン」と対となり、抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）を形成する。加えて、各可変ドメインは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）（可変重ドメインについてｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３、ならびに可変軽ドメインについてｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）と、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含み、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００７９】
本明細書では、「野生型またはＷＴ」は、自然界にみられるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変動を含む。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００８０】
本発明は、ヒト抗体ドメインに対して配列同一性を有するいくつかの抗体ドメインを提供する。２つの類似する配列（例えば、抗体可変ドメイン）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［局地的相同性アルゴリズム］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）“Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［相同性アライメントアルゴリズム］、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［類似検索法］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ，（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（「ＢＬＡＳＴ」  アルゴリズム）（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）などのアルゴリズムにより測定することができる。前述のアルゴリズムのうちのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティ等）が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行われる。
【００８１】
本発明の抗体は、一般に、単離されているか、または組換え体である。「単離された」が、本明細書に開示される様々なポリペプチドについての説明に使用されるとき、それが発現される細胞または細胞培養から、同定され、分離され、および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製段階によって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、抗体が、外来宿主細胞において組換え核酸技法を使用して生成されることを意味し、それらも単離され得る。
【００８２】
「特異的結合（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  ｔｏ）」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に向けた特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ）」は、非特異的相互作用とは、測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合によって決定することができる。
【００８３】
特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに向けて、抗体が、少なくとも約１０−４ＭのＫＤ、少なくとも約１０−５ＭのＫＤ、少なくとも約１０−６ＭのＫＤ、少なくとも約１０−７ＭのＫＤ、少なくとも約１０−８ＭのＫＤ、少なくとも約１０−９ＭのＫＤ、あるいは、少なくとも約１０−１０ＭのＫＤ、少なくとも約１０−１１ＭのＫＤ、少なくとも約１０−１２ＭのＫＤ以上のＫＤを有することによって示すことができ、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数のＫＤを有する。
【００８４】
また、特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、対照に対して、抗体が、そのエピトープに向けて、少なくとも２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数の、抗原またはエピトープに向けたＫＡまたはＫａを有することによって示すことができ、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般に、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、またはＢＬＩアッセイを使用して測定される。
【００８５】
Ｅ．抗体
本発明は、本明細書で論じられるように、２つの異なるチェックポイント抗原に結合する二重特異性チェックポイント抗体の生成に関する。以下に論じられるように、「抗体」という用語が、一般に使用される。本発明において有用である抗体は、本明細書に記載されるいくつかの型を呈し、伝統的な抗体、ならびに本明細書に記載され、図に示される抗体の誘導体、断片、および模倣体が含まれる。
【００８６】
伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれの四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、それぞれの対が、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）、および１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。本発明は、一般に、ＩｇＧクラスに基づいた二重特異性抗体を対象とし、ＩｇＧクラスは、いくつかのサブクラスを有し、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれる。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４がＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）に多型を有する異なるアロタイプを有することに留意されたい。本明細書に示される配列は、３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプを使用しているが、他のアロタイプも本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプを置き換える３５６Ｄ／３５８Ｌを有し得る。
【００８７】
加えて、本明細書の抗体の多くは、位置２２０にセリンに置き換えられるシステインのうちの少なくとも１つを有し、一般に、これは、本明細書に示される配列の大半に関して「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を低減するために、「Ｆａｂ単量体」側にあるか、またはその両方にあってもよい。置き換えられたこれらのシステイン（Ｃ２２０Ｓ）の一方または両方が本明細書の配列内に具体的に含まれる。
【００８８】
したがって、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的特性および抗原特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照によって組み込まれる米国公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ヒトＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドの使用。
【００８９】
超可変領域は、軽鎖可変領域における、約アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、重鎖可変領域における、およそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は、重鎖を示す）、約５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および約９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、ならびに／または超可変ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、由来のアミノ酸残基を包含することが一般的である。本発明の特定のＣＤＲは、以下に記載される。
【００９０】
当業者に理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付けおよび配置は、異なる番号付けシステム間で異なり得る。しかしながら、可変重および／または可変軽配列の開示は関連する（固有）ＣＤＲの開示を含むことを理解されたい。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ番号付けの有用な比較は、以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（ｌ）：５５−７７（２００３）：を参照されたい。
【表１】
2019525738.tif 000003
2019525738.tif 000004
【００９１】
本明細書を通して、可変ドメイン（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、および重鎖可変領域の残基１〜１１３）における残基を指すときは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが一般に使用され、Ｆｃ領域についてはＥＵ番号付けシステムが一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記（１９９１））。
【００９２】
重鎖のＩｇドメインの別の型は、ヒンジ領域である。本明細書では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、抗体の第１の定常ドメインと第二定常ドメインとの間にアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置２１５で終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ位置２３１から始まる。したがって、ＩｇＧについて、抗体ヒンジは、本明細書において、位置２１６（ＩｇＧ１においてＥ２１６）〜２３０（ＩｇＧ１においてｐ２３０）を含むように定義され、番号付けは、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従う。場合によっては、「ヒンジ断片」が使用され、これは、ヒンジドメインのＮおよびＣ末端のいずれか、または両方により少ないアミノ酸を含有する。本明細書に示されるように、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域においても作製することができる。
【００９３】
軽鎖は、一般に、２つのドメイン、可変軽ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重ドメインと共にＦｖ領域を形成する）および定常軽鎖領域（ＣＬまたはＣκと呼ばれることが多い）を含む。
【００９４】
以下に概説される、追加の置換のための別の関心領域は、Ｆｃ領域である。
【００９５】
本発明は、多数の異なるＣＤＲのセットを提供する。この場合、「完全なＣＤＲのセット」は、３つの可変軽ＣＤＲおよび３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であり得る。加えて、より完全に本明細書に概説されるように、可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、重鎖および軽鎖が使用される場合（例えば、Ｆａｂが使用される場合）別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【００９６】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる、抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、通常、特定の構造特性、および特定の電荷特性を有する。単一抗原が２つ以上のエピトープを有してよい。
【００９７】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも呼ばれる）、および特異的な抗原結合ペプチドによって、効果的に遮断されるアミノ残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでよい。換言すれば、アミノ酸残基は、特異的な抗原結合ペプチドのフットプリントの範疇である。
【００９８】
エピトープは、立体構造的、または直線的のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、空間的に並置されたアミノ酸によって、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントから産生される。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体構造的エピトープおよび非立体構造的エピトープは、前者に対する結合であって、後者に対するものではない結合が、変性溶媒の存在下で消失するという点で区別されてよい。
【００９９】
エピトープは、固有の空間的立体構造において、典型的には少なくとも３個のアミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、１つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す単純な免疫アッセイにおいて検証することができ、例えば、「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」である。以下に概説されるように、本発明は、本明細書において列挙される抗原結合ドメインおよび抗体を含むだけでなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されるエピトープと結合について競合するものも含む。
【０１００】
したがって、本発明は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書に記載され、当該技術分野で知られるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、そのドメインはまた、重複し得る。これらのドメインには、限定されないが、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、ＦＡｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインが含まれる。
【０１０１】
したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、および任意選択でヒンジドメイン（−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合されるとき、それは、Ｆｃドメインのヒンジのすべてまたは一部に結合されるｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり、例えば、それは一般に、ヒンジの開始である配列ＥＰＫＳに結合される。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、ＣＨ２−ＣＨ３を含むＣＨ１−任意選択のヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説される構築物および配列の大半において、可変重鎖のＣ末端は、ｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合され、そのＣ末端は、可変軽鎖のＮ末端に結合される（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、それは交換することができる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態は、自然に発生しないが、一般に、ｓｃＦｖリンカーによって一緒に連結される可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含む。本明細書で概説されるように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌのようにＮからＣ末端に配向されるが、これは、ｓｃＦｖドメインのいずれか（またはＦａｂからのｖｈおよびｖｌ配列を使用して構築されるもの）に関して逆にすることができ、一端または両端の任意選択のリンカーは型（一般に図１を参照されたい）に依存する。
【０１０３】
本明細書に示されるように、使用され得るいくつかの好適なリンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかとして使用するための）があり、それらのリンカーは、組換え技術によって生成される伝統的なペプチド結合を含む、列記されるドメインを共有結合するために使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒ。リンカーペプチドは、２つの分子を連結するために適切な長さを有するべきであり、そのようにして、それらは、お互いに対して正しい立体構造をとり、その結果、それらは、所望の活性を保持する。一実施形態では、リンカーは、長さが、アミノ酸で約１〜５０個、好ましくは、長さが、アミノ酸で約１〜３０個である。一実施形態では、長さが、アミノ酸で１〜２０個であるリンカーを、いくつかの実施形態において有用である約５〜約１０個のアミノ酸と共に使用してよい。有用なリンカーには、グリシン−セリン重合体（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５７）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５８）を含み、ここで、ｎは、少なくとも１（かつ一般に３〜４）である整数である）、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、および他の可動性リンカーが含まれる。あるいは、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの共重合体を含む様々な非タンパク質性の重合体が、リンカーとして有用であり得る。
【０１０４】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではないが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの何らかの長さの何らかの配列を含んでよく、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基を含んでよい。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖由来であり得、例えば、ＣκまたはＣλである。リンカーは、何らかのアイソタイプの免疫グロブリン重鎖由来であり得、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμが含まれる。リンカー配列は、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、および他のタンパク質由来の他の天然の配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に一緒に概説されるあらゆる２つのドメインを連結させるために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図１Ｆにおいて、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合させるドメインリンカーが存在してよく、別の任意選択のドメインリンカーが、ｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合させる（しかし、多くの実施形態では、ヒンジがこのドメインリンカーとして使用される）。いずれの好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態は、ドメインリンカーとして、グリシン−セリン重合体を利用し、これには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５７）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７５８）（ここで、ｎは、少なくとも１（かつ一般に３〜４〜５）である整数である）、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さおよび柔軟性を有する、２つのドメインの組換え結合を可能にするあらゆるペプチド配列を含む。場合によっては、および以下に概説されるように「鎖性」に注目すると、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、帯電ドメインリンカーが使用され得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で論じられるように、ｖｈおよびｖｌドメインを共有結合させるために使用されるｓｃＦｖリンカーである。多くの場合では、ｓｃＦｖリンカーは、帯電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかは、
【０１０７】
図７に示される。したがって、本発明は、第１の単量体と第２の単量体との間でｐＩにおける分離を容易にするために帯電ｓｃＦｖリンカーをさらに提供する。すなわち、帯電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことによって、正であっても、負であっても（あるいは異なる単量体上でｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）、これは、帯電リンカーを含む単量体が、Ｆｃドメインをさらに変更することなくｐＩを変えることを可能にする。これらの帯電リンカーは、標準リンカーを含有するあらゆるｓｃＦｖに置換され得る。かさねて、当業者に理解されるように、帯電ｓｃＦｖリンカーは、ｐＩにおける所望の変更に従って、正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、三重Ｆ型のヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の最初のｐＩが計算され、１つがｓｃＦｖを作製するために選択され、ｐＩによって、正または負のリンカーいずれかが選択される。
【０１０８】
帯電ドメインリンカーはまた、本発明の単量体のｐＩ分離を増加するためにも使用することができ、したがって、
【０１０９】
図７に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書のいずれの実施形態においても使用され得る。
【０１１０】
具体的には、図１に示される型は、通常「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己組織化される少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、および少なくとも２つのＦｖ領域（ＦａｂとしてまたはｓｃＦｖとしてにかかわらず）を有することを意味する。
【０１１１】
キメラ抗体およびヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるか、または特定の生殖系列配列「に由来する」重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含むか、またはそれからなり得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列に最も近い（すなわち、最大の同一性％）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択する（本明細書に概説される方法を使用する）ことによってそのように同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、または特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生する体細胞変異または部位指向変異の意図的な導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を含有し得る。しかしながら、ヒト化抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較したとき、ヒト配列に由来するものとして抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるか、またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０個以上のアミノ酸差異を示さない（本明細書の任意の非対称、ｐＩ、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない）。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と５個以上、またはさらには４、３、２、もしくは１個以上のアミノ酸差異を示さない（同様に、本明細書の任意の非対称、ｐＩ、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない）。
【０１１２】
一実施形態では、親抗体は、親和性が成熟しており、当該技術分野で知られるとおりである。構造に基づく方法が、ヒト化および親和性の成熟に用いられてよく、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０において説明されるとおりである。抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟のために、選択に基づく方法が用いられてよく、限定されないが、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５、Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみの移植を伴うものでよく、限定されないが、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。
【０１１３】
ＩＶ．ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロ二量体Ｆｃドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成する、２つの異なる重鎖変異体Ｆｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。
【０１１４】
したがって、本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、２つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物を対象とする。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組織化する２つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、抗原を共捕捉することができるヘテロ二量体チェックポイント抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ／またはホモ二量体に関してテロ二量体精製の容易化を可能にする。
【０１１５】
したがって、本発明は、二重特異性抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、２つの異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、重鎖および軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−Ａ及びＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題を含まない））の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および／またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。
【０１１６】
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる機構がいくつか存在する。加えて、当業者に理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体（例えば、以下に記載される「ノブアンドホール」または「非対称」変異体、および以下に記載される「電荷対」変異体）、ならびにヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を含み得る。これにより、参照によりその全体が組み込まれ、特に「ヘテロ二量体化変異体」の議論について以下のようにＷＯ２０１４／１４５８０６において一般に記載されるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には、「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、時に本明細書では「非対称」変異体として（ＷＯ２０１４／１４５８０６の議論参照）、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載される「静電操縦」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるｐＩ変異体、ならびにＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説される一般的な追加のＦｃ変異体が含まれる。
【０１１７】
本発明には、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、ｐＩ変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるｐＩを有し、そうすることで、Ａ−Ａ二量体タンパク質、Ａ−Ｂ二量体タンパク質、及びＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にするものである。あるいは、「三重Ｆ」型などのいくつかの足場型は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説されるように、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「非対称」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびｐＩ変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特に有用である。
【０１１８】
一般に、本発明において特に有用な実施形態は、非対称変異体を含む変異体のセットに依存し、この変異体は、２つの単量体間でｐＩ差異を増加させるｐＩ変異体と共に、ホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促し、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体の精製を容易にする。
【０１１９】
加えて、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体抗体の型に応じて、ｐＩ変異体は、単量体の定常および／またはＦｃドメイン内のいずれかに含有され得るか、あるいはドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかである帯電リンカーが使用され得る。すなわち、三重Ｆ型などのｓｃＦｖ（複数可）を利用する足場は、精製目的に向けて、さらなるｐＩの増大を与える帯電ｓｃＦｖリンカー（正か負のいずれか）を含むことができる。当業者に理解されるように、三重Ｆ型によっては、帯電ｓｃＦｖリンカーのみを有し、追加のｐＩ調整無しでも有用であるが、本発明は、単量体のうちの１つまたは両方にあるｐＩ変異体、および／または帯電ドメインリンカーも提供する。加えて、代替機能性のために操作する追加のアミノ酸はまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯ変異体などのｐＩ変化を与え得る。
【０１２０】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドのうちの１つまたは両方に導入されてもよい。すなわち、単量体のうちの１つのｐＩ（本明細書において、単に「単量体Ａ」と呼ばれる）が単量体Ｂを除去するために操作され得るか、または単量体ＡおよびＢの変化の両方が帯電され、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させることができる。論じられるように、単量体のいずれか、または両方のｐＩの変化は、帯電残基を除去もしくは追加（例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである）するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化（例えば、アスパラギン酸からリジンへ）させるか、または帯電残基を中性残基へと変化（例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する）させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。
【０１２１】
したがって、本発明のこの実施形態は、単量体のうちの少なくとも１つにおいて、ｐＩの十分な変化の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離され得る。当業者に理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのｐＩが増加もしくは減少（ｗｔ  Ａ−＋Ｂもしくはｗｔ  Ａ−−Ｂ）のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること（Ａ＋−Ｂ−もしくはＡ−Ｂ＋）によって行うことができる。
【０１２２】
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、このアミノ酸変異体は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を単量体のうちの１つまたは両方へ組み込むことによって、「ｐＩ抗体」を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが、わずか０．１ｐＨ単位でも異なれば達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。
【０１２３】
当業者に理解されるように、良好な分離を得るために単量体（複数可）のそれぞれまたは両方に含まれるｐＩ変異体の数は、構成要素の出発ｐＩ、例えば、三重Ｆ型で、対象のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに依存する部分がある。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より正、もしくはより負）にするかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるＦｖであれば、本発明で活用される異なる出発ｐＩを有する。一般に、本明細書に概説されるように、ｐＩが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約０．１ｌｏｇの総ｐＩ差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総ｐＩ差異は、０．２〜０．５であることが好ましい。
【０１２４】
さらに、当業者に理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば図１に示されるように、型のいくつかは、サイズに基づくヘテロ二量体及びホモ二量体の分離を可能にする。
【０１２５】
Ａ．ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を提供し、これには、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体形成および／または精製を可能にするためにヘテロ二量体変異体を利用する様々な型のヘテロ二量体抗体を含む。
【０１２６】
いくつかの好適なヘテロ二量体化非対称変異体のセットの対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」で起こる。すなわち、対の一方のセットは、第１の単量体に組み込まれ、対のもう一方のセットは、第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基ともう一方の単量体上の残基との間の１対１の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも機能せず、すなわち、これらの対のセットは、ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止する２つの単量体の間で境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想された５０％よりもむしろ９０％を超えることを可能にする（２５％のホモ二量体Ａ／Ａ：５０％のヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％のホモ二量体Ｂ／Ｂ）ことに留意されたい。
【０１２７】
Ｂ．立体変異体
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって容易になる場合がある。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変化させることによって、同一Ｆｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、異なる重鎖が、会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が高くなる。好適な立体変異体は、図に含まれる。
【０１２８】
ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止するように立体的影響を創出するアミノ酸操作を指す、当該技術分野で一般に「ノブアンドホール」と呼ばれる１つの機構も任意選択で使用され得る。これは、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号（それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、「ノブアンドホール」と呼ばれる場合がある。「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対が図において同定されている。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、ヘテロ二量体化へと形成を非対称にすることができる。
【０１２９】
ヘテロ二量体の生成に有用である追加の機構は、「静電操縦」と呼ばれることがあり、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるとおりである。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、ヘテロ二量体化へと形成を非対称とするために使用される。当業者であれば、これらは、ｐＩに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体であり得るとも考えられることを理解するであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定されないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体が対応するセットである）およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれる。
【０１３０】
追加の単量体Ａ変異体および単量体Ｂ変異体を、本明細書に概説されるｐＩ変異体、またはＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他のこの当該特許文献の図および説明文ならびに配列番号は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体変異体を、何らかのｐＩ変異体（またはＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体等の他の変異体）と共に１つまたは両方の単量体へ、任意選択かつ独立して、組み込むことができ、本発明のタンパク質を独立かつ任意選択で含むか、またはこのタンパク質から除外することができる。
【０１３２】
好適な非対称変異体のリストは図３にみられ、図８は、多くの実施形態における特定の有用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態において特に使用されるものは、限定されないが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択で架橋ジスルフィド、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ）を含む、セットの対である。命名法の点から、上記のように、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、単量体のうちの一方が二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、もう一方が二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、これらの対の「鎖性」は出発ｐＩに依存する。
【０１３３】
Ｃ．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）変異体
一般に、当業者に理解されるように、ｐＩ変異体には２つの一般的なカテゴリー：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性の変化）、およびタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性の変化）が存在する。本明細書に記載されるように、これらの変異体のすべての組み合わせを行うことができる、つまり、一方の単量体が、野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異体であり得、もう一方は、より塩基性、またはより酸性であり得る。あるいは、それぞれの単量体を、１つはより塩基性へ、１つはより酸性へと変化させる。
【０１３４】
ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは図４に示される。本明細書に概説され、図に示されるように、これらの変化は、ＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプおよびアイソタイプハイブリッドを、このように変えることができる。重鎖定常ドメインが、ＩｇＧ２〜４由来である場合は、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑも使用することができる。
【０１３５】
一実施形態では、例えば、図１Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩ型では、ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体と、正の帯電ｓｃＦｖリンカー（（ＧＫＰＧＳ）４を含む）（配列番号３７７５５）を含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）とを有する。しかしながら、当業者に理解されるように、第１のモノマーは、位置２０８を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物において（例えば、ドメインのうちの１つにＣＨ１ドメインを利用しない抗体のため、例えば、図１Ｂ、Ｃ、またはＤに示されるものなどの二重ｓｃＦｖ型または「片腕」型において）、好ましい負のｐＩ変異体Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対しての場合、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
【０１３６】
したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図４からの置換のセットを有し、もう一方の単量体は帯電リンカー（型が指示するように、その単量体がｓｃＦｖまたは帯電ドメインリンカーを含むため、帯電ｓｃＦｖリンカーの形態のいずれかで、これは図７に示されるものから選択され得る）を有する。
【０１３７】
１．アイソタイプ変異体
加えて、本発明の多くの実施形態が、１つのＩｇＧアイソタイプから別のものへの、特定位置でのｐＩアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。これらのいくつかは、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれと比較して、より高いｐＩを有している（８．１０対７．３１）。特定位置で、ＩｇＧ２残基を、ＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または増加）し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、ＩｇＧ１は、位置１３７にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２は、グルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のｐＩに影響を与えることになる。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のｐＩに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるように、ＩｇＧ２分子における変化でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。
【０１３８】
以下にさらに記載されるように、他の実施形態では、得られるタンパク質の全体の電荷状態を低下（例えば、より高いｐＩアミノ酸を、より低いｐＩアミノ酸へと変化させることによって）させるか、または安定に向けた構造の適応を可能にする等のいずれかのために、非アイソタイプアミノ酸変化がなされる。
【０１３９】
加えて、重定常ドメインおよび軽定常ドメインの両方のｐＩ操作によって、ヘテロ二量体のそれぞれの単量体において、顕著な変化をみることができる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。
【０１４０】
Ｄ．ｐＩの計算
それぞれの単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメインおよび融合相手を含む、可変重鎖定常領域および総単量体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態では、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図１９中のチャートを使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて、ｐＩの変化が計算される。本明細書で論じられるように、どの単量体を操作するかは、一般に、Ｆｖおよび足場領域の固有ｐＩによって決定される。あるいは、それぞれの単量体のｐＩを、比較することができる。
【０１４１】
Ｅ．より良好なＦｃＲｎインビボ結合も付与するｐＩ変異体
ｐＩ変異体が、単量体のｐＩを減少させる場合、インビボでの血清における保持の改善という利点が追加され得る。
【０１４２】
未だ試験中であるが、Ｆｃ領域は、インビボにおいてより長い半減期を有すると考えられ、これは、エンドソームにおける、ｐＨ６でのＦｃＲｎに対する結合が、Ｆｃを隔離するためである（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８の全体が参照により組み込まれる）。その後、エンドソームの区画は、細胞表面へとＦｃを再循環させる。区画が、より高いｐＨである約７．４の細胞外空間へと一旦開くと、Ｆｃの放出が誘導され、血液へ戻る。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異型（Ｆｃ  ｍｕｔａｎｔ）が、実際は、血清濃度を低下させ、野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０の全体が参照により組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに向けたＦｃの親和性の増加は、Ｆｃが放出されて血流へ戻ることを妨げると考えられる。それ故に、インビボにおけるＦｃの半減期を増加させるであろうＦｃ変異は、より高いｐＨでのＦｃの放出を、可能なままにしつつ、より低いｐＨでＦｃＲｎ結合を理想的に増加させる。アミノ酸であるヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲において、その電荷状態が変化する。したがって、Ｈｉｓ残基が、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体において、重要な位置を占めるという発見は、驚くべきことではない。
【０１４３】
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体が、より長い血清半減期も有し得ることが示唆された（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２の全体が参照により組み込まれる）。しかしながら、この機構の理解は、依然として不十分である。その上、可変領域は、抗体毎に異なる。本明細書に記載されるように、ｐＩが低下し、半減期が延長している定常領域変異体は、抗体の薬物動態特性の改善に対する、よりモジュール型の手法を提供する。
【０１４４】
Ｆ．追加の機能性のための追加のＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異体に加えて、様々な理由から実施することのできる、いくつかの有用なＦｃアミノ酸改変が存在し、限定されないが、１つ以上のＦｃγＲ受容体に対する結合の変更、ＦｃＲｎ受容体に対する結合の変更等が含まれる。
【０１４５】
したがって、本発明のタンパク質は、アミノ酸改変を含むことができ、これには、ｐＩ変異体および立体変異体を含む、本明細書に概説されるヘテロ二量体化変異体が含まれる。変異体の各セットは、任意の特定のヘテロ二量体タンパク質を独立かつ任意選択で含むか、またはこのタンパク質から除外することができる。
【０１４６】
Ｇ．ＦｃγＲ変異体
したがって、ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を変えるために行うことができる有用なＦｃ置換がいくつか存在する。結合の増加、および結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害。これは、細胞が媒介する反応であって、ＦｃγＲを発現している、非特異性である細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす反応である）の増加をもたらすことが知られている。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）に対する結合の減少も、状況によっては、有益であり得る。本発明において有用であるアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６においてリストに記載されるものが含まれ、これらはすべて、参照により全体が明確に本明細書に組み込まれ、特に、そこで開示される変異体に向けて組み込まれる。有用な特定の変異体には、限定されないが、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれる。
【０１４７】
加えて、ＦｃＲｎ受容体に対する結合増加、および血清半減期の増加において有用な追加のＦｃ置換が存在し、参照により全体が組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９において具体的に開示されるとおりであって、限定されないが、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ、またはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌが含まれる。
【０１４８】
Ｈ．切断変異体
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Ｆｃγ切断変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯもしくはＫＯ）」変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）のうちの１つ以上またはすべてに対するＦｃドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特に、Ｆｃドメインのうちの１つが１つ以上のＦｃγ受容体切断変異体を含むように、ＦｃγＲＩＩＩａ結合を切断して、ＡＤＣＣ活性を排除するか、またはＡＤＣＣを大幅に低減することが望ましい二重特異性チェックポイント抗体の使用において、これらの切断変異体は、図５に示され、それぞれは、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される切断変異体を利用する好ましい態様と共に独立かつ任意選択で含むか、または除外することができる。本明細書において参照される切断変異体が、一般に、ＦｃＲｎ結合ではなくＦｃγＲ結合を切断することに留意されたい。
【０１４９】
当該技術分野で知られるように、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体への結合が最高であり、したがって、ヘテロ二量体抗体の骨格における定常ドメイン（またはＦｃドメイン）がＩｇＧ１である場合、切断変異体が使用され得る。あるいは、またはＩｇＧ１バックグラウンドにおける切断変異体に加えて、グリコシル化位置２９７における変異（一般に、ＡまたはＳに）は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を顕著に切断することができる。ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への自然に低減された結合を有し、したがって、これらの骨格は、切断変異体と共に、または切断変異体を伴わずに使用することができる。
【０１５０】
Ｉ．ヘテロ二量体およびＦｃ変異体の組み合わせ
当業者に理解されるように、「鎖性」または「単量体区分（ｍｏｎｏｍｅｒ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）」が保持される限り、列記されるヘテロ二量体化変異体（非対称および／またはｐＩ変異体を含む）はすべて、任意選択かつ独立して、何らかの方法で組み合わせることができる。加えて、これらの変異体はすべて、ヘテロ二量体化型のいずれかに組み入れることができる。
【０１５１】
ｐＩ変異体の場合、特に有用な実施形態は、図に示されているが、精製の容易化のために２つの単量体間のｐＩ差異を変える基礎的な規則に従って、他の組み合わせを生成することができる。
【０１５２】
加えて、ヘテロ二量体化変異体、非対称、およびｐＩのうちのいずれかはまた、一般的に本明細書に概説されるように、Ｆｃ切断変異体、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体と独立かつ任意選択で組み合わせられる。
【０１５３】
Ｖ．本発明の有用な型
当業者に理解され、以下により完全に論じられるように、本発明の二重特異性ヘテロ二量体抗体は、一般に、図１に示されるように、多種多様の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に１種類の特異性、およびもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｄｅｄ）」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも１種類の特異性、および分子の「下部」に１つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化（ｄｕａｌ  ｅｎｄｅｄ）」立体配置を示す。したがって、本発明は、異なる第１の抗原および第２の抗原を共捕捉する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。
【０１５４】
当業者に理解されるように、本発明のヘテロ二量体型は、異なる結合価を有し、かつ二重特異性であってよい。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、二価かつ二重特異性であってよく、一方のチェックポイント標的が、１つのＡＢＤによって結合され、もう一方のチェックポイント標的が、第２のＡＢＤによって結合される。ヘテロ二量体抗体はまた、三価かつ二重特異性であってよく、第１の抗原が、２つのＡＢＤによって結合され、第２の抗原が、第２のＡＢＤによって結合される。
【０１５５】
Ａ．栓抜き型
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、「三重Ｆ」または図１Ａに示される「栓抜き」足場型である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）を含有し、もう一方の重鎖は、「定型的な」Ｆａｂ型であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重Ｆ」型（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ−Ｆｃ）、または栓抜きにおおよそ視覚的に類似している（図１Ａ参照）ことから「栓抜き」型と呼ばれることがある。２つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、および／またはヒンジ領域）において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に説明される。
【０１５６】
本「三重Ｆ」型には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるように、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖および軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減することができる。加えて、２つの重鎖および２つの軽鎖に依存する型とは対照的に、重鎖および軽鎖が、不正確に対になる（例えば、重１が、軽２と対になる等）という問題は存在しない。
【０１５７】
本明細書に概説される実施形態の多くは、一般に、ｓｃＦｖを含む第１の単量体を含む栓抜き型に依存し、このｓｃＦｖは、ｓｃＦｖリンカー（全ての場合ではないが、多くの場合において帯電している）を使用して共有結合される可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含み、ｓｃＦｖは、通常ドメインリンカー（本明細書に概説されるように、非帯電であるか、または帯電されているかのいずれかであってよいを介して、第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合され、また外因性または内因性（例えば、ネイティブヒンジドメインすべてまたはその一部）であり得る。栓抜き型の第２の単量体は重鎖であり、組成物は、軽鎖をさらに含む。
【０１５８】
加えて、栓抜き型のＦｃドメインは、一般に、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、栓抜き型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント受容体に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント受容体に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適な単量体Ｆｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡが挙げられる。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、ＰＤ−１に結合するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ側を有し、特に有用である。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、ＣＴＬＡ−４に結合する［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９  ＡＢＤを含むｓｃＦｖ側を有し、特に有用である。
【０１６０】
いくつかの実施形態、特に栓抜き型における特定の使用ものは、ＣＴＬＡ−４  Ｘ  ＰＤ−１、ＬＡＧ−３  Ｘ  ＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０１６１】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列リストに開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、栓抜き型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、ＰＤ−１に結合するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ側を有し、特に有用である。この特定の実施形態では、これらの変異体を有する栓抜きは、ＣＴＬＡ−４に結合する［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３  Ｌ０．１２９  ＡＢＤを含むｓｃＦｖ側を有し、特に有用である。
【０１６３】
いくつかの実施形態、特に栓抜き型における特定の使用ものは、ＣＴＬＡ−４  Ｘ  ＰＤ−１、ＬＡＧ−３  Ｘ  ＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０１６４】
具体的には、図３７は、本発明に使用され得るＦｖ配列を欠くいくつかの栓抜き「骨格」配列を示す。すなわち、ｓｃＦｖ部分およびＦａｂ部分のＦｖ配列は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡのいずれの組み合わせから使用され得る。配列は、本明細書において配列表および／または図９〜１３に開示されるもののうちのいずれかであり得る。
【０１６５】
図３７の栓抜き骨格１について、本発明における特定のＦｖの使用の組み合わせとしては、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡが挙げられる。配列は、本明細書において配列表および／または図９〜１３に開示されるもののうちのいずれかであり得る。
【０１６６】
図３７の栓抜き骨格１について、本発明における特定のＦｖの使用の組み合わせとしては、ＣＴＬＡ−４（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＰＤ−１（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）、ＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＢＴＬＡ（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、およびＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【０１６７】
図３７の栓抜き骨格１（任意選択で４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１６８】
図３７の栓抜き骨格１（任意選択で４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１６９】
図３７の栓抜き骨格１（任意選択で４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１７０】
図３７の栓抜き骨格１（任意選択で４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１７１】
図３７の栓抜き骨格１（任意選択で４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１７２】
具体的な栓抜きの実施形態を以下に概説する。
【０１７３】
Ｂ．ｍＡｂ−Ｆｖ型
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｈに示されるｍＡｂ−Ｆｖ型である。この実施形態では、型は、一方の単量体に対する「余分な」可変重ドメインのＣ末端結合、およびもう一方の単量体に対する「余分な」可変軽ドメインのＣ末端結合の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、１つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
【０１７４】
この実施形態では、第１の単量体は、第１の可変重ドメインおよび第１の定常重ドメインを含む第１の重鎖を含み、この第１の定常重ドメインは、ドメインリンカーを使用して第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合される第１の可変軽ドメインを有する第１のＦｃドメインを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２）。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインの第２の可変重ドメインと、ドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合される第３の可変重ドメインとを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２。２つのＣ末端に結合された可変ドメインは、ｓｃＦｖを作りあげる。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０１７５】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０１７６】
加えて、ｍＡｂ−Ｆｖ型のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０１７９】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列について、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１８０】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列について、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１８１】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）に類似するｍＡｂ−ｓｃＦｖ配列について、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１８２】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列について、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１８３】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列について、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１８４】
Ｃ．ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｉに示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ型である。この実施形態では、型は、単量体のうちの１つに対するｓｃＦｖのＣ末端結合の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、１つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
【０１８５】
この実施形態では、第１の単量体は第１の重鎖を含み（可変重ドメインおよび定常ドメインを含む）、Ｃ末端共有結合されるｓｃＦｖは、いずれかの配向（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２またはｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）で、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、標的抗原のうちの１つに結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０１８６】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０１８７】
加えて、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ型のＦｃドメインは、一般に、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。ｍＡｂ−ｓｃＦｖ型において、本発明における特定のＦｖの使用の組み合わせとしては、ＣＴＬＡ−４（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＰＤ−１（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）、ＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＢＴＬＡ（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、およびＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【０１９０】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）において、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１９１】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）において、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１９２】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）において、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１９３】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）において、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１９４】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）において、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０１９５】
Ｄ．中心ｓｃＦｖ
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｆに示される中心ｓｃＦｖ型である。この実施形態では、型は、挿入ｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、一方のチェックポイント標的に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、もう一方のチェックポイント標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって、第３の抗原結合ドメインを提供する。
【０１９６】
この実施形態では、１つの単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意選択のヒンジ）、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含み、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含む。ｓｃＦｖは、任意選択のドメインリンカーを使用して、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃ  ドメインのＮ末端との間で共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意選択のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、またはｓｃＦｖのための反対の配向、ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意選択のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。他の単量体は標準的なＦａｂ側である。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、チェックポイント阻害剤に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０１９７】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０１９８】
加えて、中心ｓｃＦｖ型のＦｃドメインは、一般に、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、中心ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、中心ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４を含む。
【０２０１】
図３７の栓抜き骨格１に類似する／栓抜き骨格を利用する中心ｓｃＦｖ配列（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）ついて、本発明における特定のＦｖの使用の組み合わせとしては、ＣＴＬＡ−４（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＰＤ−１（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）、ＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＢＴＬＡ（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、およびＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【０２０２】
図３７の栓抜き骨格１に類似する／栓抜き骨格を利用する中心ｓｃＦｖ配列（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）ついて、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２０３】
図３７の栓抜き骨格１に類似する／栓抜き骨格を利用する中心ｓｃＦｖ配列（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）ついて、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２０４】
図３７の栓抜き骨格１に類似する／栓抜き骨格を利用する中心ｓｃＦｖ配列（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）ついて、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２０５】
図３７の栓抜き骨格１に類似する／栓抜き骨格を利用する中心ｓｃＦｖ配列（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）ついて、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２０６】
図３７の栓抜き骨格１に類似する／栓抜き骨格を利用する中心ｓｃＦｖ配列（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）ついて、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２０７】
Ｅ．中心Ｆｖ型
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｇに示される中心Ｆｖ型である。この実施形態では、型は、挿入ｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、一方のチェックポイント標的に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、もう一方のチェックポイント標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって、第３の抗原結合ドメインを提供し、各単量体は、ｓｃＦｖの構成要素を含有する（例えば、一方の単量体は、可変重ドメインを含み、もう一方は、可変軽ドメインを含む）。
【０２０８】
この実施形態では、一方の単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメイン、ならびに追加の可変軽ドメインを含む第１の重鎖を含む。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合される（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｌ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。もう一方の単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメイン、ならびに追加の可変重ドメインを含む第１の重鎖を含む（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意選択のリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合される。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、ＴＴＡに結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０２０９】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０２１０】
中心ｓｃＦｖ型において、本発明における特定のＦｖの使用の組み合わせとしては、ＣＴＬＡ−４（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＰＤ−１（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）、ＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、ＢＴＬＡ（Ｆａｂ）ＸＰＤ−１（ｓｃＦｖ）、およびＬＡＧ−３（Ｆａｂ）ＸＣＴＬＡ−４（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【０２１１】
中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２１２】
中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２１３】
中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２１４】
中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０；９Ｃ６  Ｈ１．１＿Ｌ１および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２１５】
中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２１６】
Ｆ．片腕中心ｓｃＦｖ
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｃに示される片腕中心ｓｃＦｖ型である。この実施形態では、一方の単量体は、Ｆｃドメインのみを含み、もう一方の単量体は、挿入ｓｃＦｖドメインを使用し、したがって、第２の抗原結合ドメインを形成する。この型では、Ｆａｂ部分のいずれかが１つのチェックポイント標的に結合し、ｓｃＦｖは別のチェックポイント標的に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。
【０２１７】
この実施形態では、１つの単量体は、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖを有する第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間で共有結合される。第２の単量体は、Ｆｃドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０２１８】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０２１９】
加えて、片腕中心ｓｃＦｖ型のＦｃドメインは、一般に、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ  Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、片腕中心ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４を含む。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、片腕中心ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４を含む。
【０２２２】
片腕中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２２３】
片腕中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２２４】
片腕中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２２５】
片腕中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２２６】
片腕中心ｓｃＦｖ型において、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２２７】
Ｇ．片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｄに示される片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型である。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、もう一方の単量体は、一般にリンカー：ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３または（逆の配向において）ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の使用により、重鎖のＮ末端で結合されるｓｃＦｖドメインを使用する。この型では、Ｆａｂ部分のいずれかが１つのチェックポイント標的に結合し、ｓｃＦｖは別のチェックポイント標的に結合する。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０２２８】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０２２９】
加えて、のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４を含む。
【０２３２】
片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型において、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２３３】
片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型において、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２３４】
片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型において、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２３５】
片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型において、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２３６】
片腕ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型において、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０；１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２  Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２３７】
Ｈ．ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型
本発明において特に有用な１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｅに示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ型である。この実施形態では、型は、単量体のうちの１つに対するｓｃＦｖのＮ末端結合の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、１つのチェックポイント標的に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、異なるチェックポイント標的に結合する。
【０２３８】
この実施形態では、第１の単量体は第１の重鎖を含み（可変重ドメインおよび定常ドメインを含む）、Ｎ末端共有結合されるｓｃＦｖは、いずれかの配向（（ｖｈ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）または（逆の配向でｓｃＦｖで）（（ｖｌ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ１−［任意選択のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３））で、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含む。この実施形態は、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用し、この軽鎖は、標的抗原のうちの１つに結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。この実施形態では、好適なＦｖの対としては、（Ｆａｂを最初に記載し、次にｓｃＦｖを記載する）ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３ＸＰＤ１、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−１、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＴＩＭ−３が挙げられる。ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴおよびＬＡＧ−３、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ＢＴＬＡおよびＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＴＩＧＩＴ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ。
【０２３９】
これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０２４０】
加えて、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ型のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０２４３】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）について、ヒトＰＤ−１に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１、ならびに配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２４４】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）について、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４、ならびに配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２４５】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）について、ヒトＬＡＧ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１、ならびに配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２４６】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）について、ヒトＢＴＬＡに結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１、ならびに配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２４７】
図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格１（任意選択でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）について、ヒトＴＩＭ−３に結合する特定のＡＢＤとしては、限定されないが、１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０  １Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０、ならびに配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のリストに記載されるものが挙げられる。
【０２４８】
Ｉ．二重ｓｃＦｖ型
本発明はまた、当該技術分野で知られ、図１Ｂに示される二重ｓｃＦｖ型も提供する。この実施形態では、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体（両方とも（ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）型または（ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意選択のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）型のいずれかで、または一方の単量体が一方の配向、そしてもう一方が他方の配向で構成される。
【０２４９】
この場合、全てのＡＢＤはｓｃＦｖ型であり、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡのいずれの組み合わせが有用である。これらの組み合わせのＡＢＤ配列は、配列表に開示されるか、または図９〜１３に示されるとおりであり、図３９および図４０に示される任意の組み合わせであり得る。
【０２５０】
加えて、二重ｓｃＦｖ型のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）、任意選択で帯電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異体を含む（図４に示されるものを含む）。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、二重ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、二重ｓｃＦｖ型は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに軽鎖の第１の可変軽ドメインと一緒になって、第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重ドメインを含む第１の単量体と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに第１の可変軽ドメインと一緒になって、本明細書に概説する第１のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる第１の可変重ドメイン、および第２の可変重鎖と一緒になって、第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体と、ｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖とを含む、栓抜き型を含む。この型のいくつかの実施形態における特定の使用のものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順）ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１、ＢＴＬＡＸＰＤ−１、およびＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４である。
【０２５３】
Ｊ．非ヘテロ二量体二重特異性抗体
当業者に理解されるように、本明細書に概説されるＦｖ配列は、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二量体二重特異性型の両方で使用することもできる。
【０２５４】
好適な非ヘテロ二量体二重特異性型は、当該技術分野で知られており、一般にＳｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６７）：９５−１０６（２０１５）およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ  ４：２，１８２−１９７（２０１２）（それらの両方が参照により、特に、その中の型に対する図、凡例、および引用に関して明確的に組み込まれる）に示されるいくつかの異なる型を含む。
【０２５５】
Ｋ．単一特異性モノクローナル抗体
当業者に理解されるように、本明細書に概説される新規Ｆｖ配列は、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二量体二重特異性型の両方で使用することもできる。したがって、本発明は、一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常領域を有する、６つのＣＤＲ、ならびに／または図のｖｈ配列およびｖｌ配列を含むモノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）がいくつかの実施形態において特に有用である。すなわち、「Ｈ＿Ｌ」指定を有する本明細書の任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結され得る。
【０２５６】
ＶＩ．抗原を標的とする抗原結合ドメイン
本発明の二重特異性抗体は、一般に図１に示されるように、二価の二重特異性型、または三価の二重特異性型のいずれかで、２つの異なる標的チェックポイント抗原（「標的対」）に結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を有する。好適な標的チェックポイント抗原としては、ヒト（および時としてｃｙｎｏ）ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡが含まれ、それらの配列は図２に示される。したがって、好適な二重特異性抗体は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＴＩＧＩＴ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４およびＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ−４およびＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ、ならびにＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は、各対について、「抗ＰＤ−１Ｘ抗ＣＴＬＡ−４」、または一般に単純化して、または簡単にするために（よって互換的に）、「ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４」等と命名されることに留意する。本明細書において指定されない限り、名称における抗原リストの順序は、構造を付与しないことに留意されたい。すなわち、ＰＤ−１ＸＣＴＬＡ−４栓抜き抗体はＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４に結合するｓｃＦｖを有し得るが、場合によっては、順序は示されるように構造を指定する。
【０２５７】
本明細書でより完全に概説されるように、ＡＢＤのこれらの組み合わせは、以下に概説されるように、様々な型であってよく、一般に、一方のＡＢＤがＦａｂ型であり、もう一方がｓｃＦｖ型である組み合わせである。本明細書で論じられ、図１に示されるように、いくつかの型は、単一のＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ（図１Ａ、Ｃ、およびＤ）を使用し、いくつかの型は、２つのＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ（図１Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩ）を使用する。
【０２５８】
Ａ．抗原結合ドメイン
本明細書で論じられるように、本発明の二重特異性チェックポイントヘテロ二量体抗体は、２つの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を含み、それらのそれぞれが異なるチェックポイントタンパク質に結合する。本明細書で概説されるように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価（各抗原が、例えば図１Ａに示される型で、単一のＡＢＤによって結合される）であるか、または二重特異性および三価（例えば図１Ｆに示されるように、一方の抗原が単一のＡＢＤによって結合され、もう一方が２つのＡＢＤによって結合される）であり得る。
【０２５９】
加えて、一般に、ＡＢＤのうちの１つは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌまたはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈのＮからＣ末端の配向で、本明細書に概説されるｓｃＦｖを含む。型により、他のＡＢＤの一方または両方は、一般にＦａｂであり、一方のタンパク質鎖（一般に、重鎖の構成要素として）上にｖｈドメインを含み、そして別のタンパク質鎖（一般に、軽鎖の構成要素として）上にｖｌを含む。
【０２６０】
本発明は、以下に概説されるように、いくつかの異なるチェックポイントタンパク質に結合するいくつかのＡＢＤを提供する。当業者に理解されるように、６つのＣＤＲまたはｖｈおよびｖｌドメインの任意のセットは、ｓｃＦｖ型またはＦａｂ型であり得、これは、次いで、重定常ドメインおよび軽定常ドメインに付加され、ここで、重定常ドメインは変異体を含む（ＣＨ１ドメインならびにＦｃドメイン内に含まれる）。配列表に含まれるｓｃＦｖ配列は特定の帯電リンカーを利用するが、本明細書で概説されるように、非帯電または他の帯電リンカーを使用することができ、図７に示されるものを含む。
【０２６１】
加えて、上述のように、ＣＤＲの識別配列表で使用される番号付けはＫａｂａｔであるが、異なる番号付けを使用することができ、表１に示されるように、ＣＤＲのアミノ酸配列が変化する。
【０２６２】
本明細書のリストに記載される可変重ドメインおよび可変軽ドメインの全てについて、さらなる変異体が作製され得る。本明細書で概説されるように、いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、フレームワーク（ＣＤＲを除く）が米国特許第７，６５７，３８０号の図１（図および凡例は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のリストに記載されるものから選択されるヒト生殖系列配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％の同一性を保持する限り、０、１、２、３、４、または５つのアミノ酸改変（アミノ酸置換が特に有用である）、ならびに可変重ドメインおよび可変軽ドメインのフレームワーク領域に変化を有することができる。したがって、例えば、本明細書に記載される同一のＣＤＲは、フレームワーク領域が米国特許第７，６５７，３８０号の図１のリストに記載されるものから選択されるヒト生殖系列配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％の同一性を保持する限り、ヒト生殖系列配列からの異なるフレームワーク配列と組み合わせることができる。あるいは、ＣＤＲは、アミノ酸改変（例えば、ＣＤＲのセットにおいて１、２、３、４、または５つのアミノ酸改変（すなわち、６つのＣＤＲのセットにおける総変化数が６未満のアミノ酸改変である限り、ＣＤＲを改変することができ、ＣＤＲの任意の組み合わせが変化する。例えば、ｖｌＣＤＲ１において１つの変化、ｖｈＣＤＲ２において２つの変化、ｖｈＣＤＲ３において変化なしなどであってよい）を有し、またフレームワーク領域が米国特許第７，６５７，３８０号の図１のリストに記載されるものから選択されるヒト生殖系列配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％の同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変化を有することができる。
【０２６３】
Ｂ．ＰＤ−１抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＰＤ−１に結合する。好適な６つのＣＤＲのセットならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のＡＢＤ配列は、図９に示され、識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列を含む。
【０２６４】
当業者に理解されるように、好適な抗ＰＤ−１ＡＢＤは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表１に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６のｖｈおよびｖｌ配列内の他のアライメントを使用して同定されるＣＤＲとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるｖｈおよびｖｌ配列全体も含み得る。Ｆｖ対ＰＤ−１を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、ＰＤ−１に結合するのはｓｃＦｖ単量体である。本明細書で論じられるように、ＰＤ−１が抗原のうちの１つであるときの標的対の他方は、ＣＴＬＡ−４（好適な配列は、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（好適な配列は、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（好適な配列は、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（好適な配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、およびＴＩＧＩＴ（好適な配列は、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０２６５】
ヒトＰＤ−１に結合する特に有用なＡＢＤには、限定されないが、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１が含まれる。
【０２６６】
ＡＢＤ対ＰＤ−１を形成する配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有することができる。
【０２６７】
ＡＢＤ対ＰＤ−１を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌ  ドメインを提供する。一実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌドメインはそれぞれ、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つで測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親ｖｈまたはｖｌに対して少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一である。
【０２６８】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、ｓｃＦｖ型の１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９抗ＰＤ−１  Ｆｖが挙げられる。
【０２６９】
具体的な好ましい実施形態としては、図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格のいずれかの中に含まれる、ｓｃＦｖ型の１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９抗ＰＤ−１  Ｆｖが挙げられる。
【０２７０】
Ｃ．ＣＴＬＡ−４抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＣＴＬＡ−４に結合する。好適な６つのＣＤＲのセットならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のＡＢＤ配列は、図１０に示され、識別子［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、０［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４を有する、配列表のそれらの配列も含む。
【０２７１】
当業者に理解されるように、好適な抗ＣＴＬＡ−４ＡＢＤは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表１に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６のｖｈおよびｖｌ配列内の他のアライメントを使用して同定されるＣＤＲとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるｖｈおよびｖｌ配列全体も含み得る。Ｆｖ対ＣＴＬＡ−４を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、ＣＴＬＡ−４に結合するのはｓｃＦｖ単量体である。本明細書で論じられるように、ＣＴＬＡ−４が抗原のうちの１つであるときの標的対の他方は、ＰＤ−１（好適な配列は、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（好適な配列は、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（好適な配列は、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（好適な配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、およびＴＩＧＩＴ（好適な配列は、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０２７２】
ＡＢＤ対ＣＴＬＡ−４を形成する配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有することができる。
【０２７３】
ＡＢＤ対ＣＴＬＡ−４を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌドメインはそれぞれ、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親ｖｈまたはｖｌに対して少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一である。
【０２７４】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、Ｆａｂ型の［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｖが挙げられる。
【０２７５】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、ｓｃＦｖ型の［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｖが挙げられる。
【０２７６】
具体的な好ましい実施形態としては、図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格のいずれかの中に含まれる、ｓｃＦｖ型の［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｖが挙げられる。
【０２７７】
具体的な好ましい実施形態としては、図３８のｍＡｂ−ｓｃＦｖ型骨格のいずれかの中に含まれる、Ｆａｂ型の［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｖが挙げられる。
【０２７８】
Ｄ．ＴＩＭ−３抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＴＩＭ−３に結合する。好適な６つのＣＤＲのセットならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のＡＢＤ配列は、識別子１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０を有する、配列表のそれらの配列を含む。
【０２７９】
当業者に理解されるように、好適な抗ＴＩＭ−３ＡＢＤは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表１に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６のｖｈおよびｖｌ配列内の他のアライメントを使用して同定されるＣＤＲとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるｖｈおよびｖｌ配列全体も含み得る。Ｆｖ対ＴＩＭ−３を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、ＴＩＭ−３に結合するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＴＩＭ−３が抗原のうちの１つであるときの標的対の他方は、ＰＤ−１（好適な配列は、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＣＴＬＡ−４（好適な配列は、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（好適な配列は、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（好適な配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、およびＴＩＧＩＴ（好適な配列は、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０２８０】
ＡＢＤ対ＴＩＭ−３を形成する配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有することができる。
【０２８１】
ＡＢＤ対ＴＩＭ−３を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌドメインはそれぞれ、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つで測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親ｖｈまたはｖｌに対して少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一である。
【０２８２】
ＬＡＧ−３抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＬＡＧ−３に結合する。好適な６つのＣＤＲのセットならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のＡＢＤ配列は、図１１に示され、識別子２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８  Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列も含む。
【０２８３】
当業者に理解されるように、好適な抗ＬＡＧ−３ＡＢＤは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表１に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２のｖｈおよびｖｌ配列内の他のアライメントを使用して同定されるＣＤＲとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるｖｈおよびｖｌ配列全体も含み得る。Ｆｖ対ＬＡＧ−３を含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、ＬＡＧ−３に結合するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＬＡＧ−３が抗原のうちの１つであるときの標的対の他方は、ＰＤ−１（好適な配列は、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＣＴＬＡ−４（好適な配列は、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（好適な配列は、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（好適な配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、およびＴＩＧＩＴ（好適な配列は、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０２８４】
ＡＢＤ対ＬＡＧ−３を形成する配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有することができる。
【０２８５】
ＡＢＤ対ＬＡＧ−３を形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌドメインはそれぞれ、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親ｖｈまたはｖｌに対して少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一である。
【０２８６】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、Ｆａｂ型の７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４抗ＬＡＧ−３  Ｆｖが挙げられる。
【０２８７】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、ｓｃＦｖ型の７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４抗ＬＡＧ−３  Ｆｖが挙げられる。
【０２８８】
Ｅ．ＢＴＬＡ抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＢＴＬＡに結合する。好適な６つのＣＤＲのセットならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８に示される。いくつかの実施形態における特定の目的のＡＢＤ配列は、図１２に示され、識別子９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０；９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列も含む。
【０２８９】
当業者に理解されるように、好適な抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表１に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、ｖｈおよびｖｌ配列の配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８の内の他のアライメントを使用して同定されるＣＤＲとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるｖｈおよびｖｌ配列全体も含み得る。Ｆｖ対ＢＴＬＡを含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、ＢＴＬＡに結合するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＬＡＧ−３が抗原のうちの１つであるときの標的対の他方は、ＰＤ−１（好適な配列は、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＣＴＬＡ−４（好適な配列は、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（好適な配列は、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（好適な配列は、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、およびＴＩＧＩＴ（好適な配列は、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０２９０】
ＡＢＤ対ＢＴＬＡを形成する配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態では、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（ｂｉｏｌａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ：バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つで測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有することができる。
【０２９１】
ＡＢＤ対ＢＴＬＡを形成する本明細書に開示される親可変重ドメインおよび可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌドメインはそれぞれ、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、親ｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸変化を有することができる。別の実施形態では、変異体ｖｈおよびｖｌは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定されるとき（多くの実施形態において後者が得に有用である）、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、それぞれの親ｖｈまたはｖｌに対して少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一である。
【０２９２】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、Ｆａｂ型の９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１抗ＬＡＧ−３  Ｆｖが挙げられる。
【０２９３】
具体的な好ましい実施形態としては、図３７の栓抜き型骨格のいずれかの中に含まれる、ｓｃＦｖ型の７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４抗ＬＡＧ−３  Ｆｖが挙げられる。
【０２９４】
Ｆ．ＴＩＧＩＴ抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＡＢＤのうちの１つはＴＩＧＩＴに結合する。好適な６つのＣＤＲのセットならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６に示される。
【０２９５】
当業者に理解されるように、好適な抗ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤは、下線が付されているように、または本明細書に記載され、表１に示されるように異なる番号付けスキームが使用される場合、配列番号２１５０４〜２１５２３および配列番号３７４３５〜３７５８６のｖｈおよびｖｌ配列内の他のアライメントを使用して同定されるＣＤＲとしてのいずれかで、これらの配列および図に示される６つのＣＤＲのセットを含み得る。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるｖｈおよびｖｌ配列全体も含み得る。Ｆｖ対ＴＩＧＩＴを含有する本明細書の実施形態の多くにおいて、ＴＩＧＩＴに結合するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＬＡＧ−３が抗原のうちの１つであるときの標的対の他方は、ＰＤ−１（好適な配列は、配列番号６２０９〜１１４６４、配列番号１１４６５〜１７１３４、配列番号３３００３〜３３０７２、配列番号３３０７３〜３５３９４、および配列番号３６１２７〜３６１４６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＣＴＬＡ−４（好適な配列は、配列番号２１〜２９１８、配列番号２９１９〜６２０８、配列番号３６７３９〜３６８１８、および配列番号３５３９５〜３５４１６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（好適な配列は、配列番号２０７６５〜２０８８４、配列番号３７５８７〜３７６９８、および配列番号３６３４７〜３６７０６（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（好適な配列は、配列番号１７１３５〜２０７６４、配列番号３６８１９〜３６９６２、配列番号３５４１７〜３５６０６、配列番号２５１９４〜３２７９３、および配列番号３２７９４〜３３００２（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、およびＢＴＬＡ（好適な配列は、配列番号２０８８５〜２１５０３および配列番号３６７０７〜３６７３８（ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０２９６】
Ｇ．具体的な二重特異性実施形態
本発明は、以下に概説されるように、いくつかの特定の二重特異性抗体を提供する。
【０２９７】
１．ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に結合する第１のＡＢＤと、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する第２のＡＢＤとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図１に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、ＦａｂがＬＡＧ−３側であり、ＣＬＴＡ−４側がｓｃＦｖ側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
【０２９８】
一実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、図１Ａの栓抜き型であり、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤはｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＬＡＧ−３  ＡＢＤはＦａｂ構成要素である。別の実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤはｓｃＦｖである。
【０２９９】
ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体（栓抜き型または中心ｓｃＦｖ型のいずれか）は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、２つの単量体のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）を含み、Ｆａｂ側を含む単量体（例えば、重鎖定常ドメイン）は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０３００】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、非対称変異体を有するＦｃドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ  ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を利用するが、配列表中のＣＴＬＡ−４またはＬＡＧ−３  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ  ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を利用するが、配列表中のＣＴＬＡ−４またはＬＡＧ−３  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３０３】
さらなる実施形態は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ  ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を有する、図３７からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３０４】
さらなる実施形態は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ  ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を有する、図３８からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＬＴＡ−４二重特異性抗体について、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ側のＦｖは、識別子２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２；２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖ側のＦｖは、識別子［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、０［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、配列番号３５６０７〜３５８６６および配列番号２１５２４〜２２６２０のリストに記載されるそれらの構築物から選択される。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、ＸＥＮＰ２０２０６、ＸＥＮＰ２１５８２、ＸＥＮＰ２１５８４、ＸＥＮＰ２１５８８、ＸＥＮＰ２２１２３、ＸＥＮＰ２２１２４、ＸＥＮＰ２２１２５、ＸＥＮＰ２２６０４、ＸＥＮＰ２２６７２、ＸＥＮＰ２２８４７、ＸＥＮＰ２２８４７、ＸＥＮＰ２２８４１、およびＸＥＮＰ２２８４９から選択される。
【０３０８】
２．ＢＴＬＡＸＰＤ−１
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＢＴＬＡに結合する第１のＡＢＤと、ヒトＰＤ−１に結合する第２のＡＢＤとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図１に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、ＦａｂがＢＴＬＡ側であり、ＰＤ−１側がｓｃＦｖ側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
【０３０９】
一実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ａの栓抜き型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＢＴＬＡ  ＡＢＤはＦａｂ構成要素である。別の実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。
【０３１０】
ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体（栓抜き型または中心ｓｃＦｖ型のいずれか）は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、２つの単量体のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）を含み、Ｆａｂ側を含む単量体（例えば、重鎖定常ドメイン）は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体は、非対称変異体を有するＦｃドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＢＴＬＡ  Ｆａｂ  ９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＢＴＬＡまたはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＢＴＬＡ  Ｆａｂ  ９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＢＴＬＡまたはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３１４】
さらなる実施形態は、ＢＴＬＡ  Ｆａｂ  ９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３７からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３１５】
さらなる実施形態は、ＢＴＬＡ  Ｆａｂ  ９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３８からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体について、ＢＴＬＡ  Ｆａｂ側のＦｖは、識別子９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。ＰＤ−１  ｓｃＦｖ側のＦｖは、識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体は、配列番号２２７２４〜２３３１５および配列番号３６１４７〜３６１６６としてリストに記載されるものを含む構築物から選択される。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、ＢＴＬＡＸＰＤ−１二重特異性抗体は、ＸＥＮＰ２０８９５、ＸＥＮＰ２１２２０、ＸＥＮＰ２１２２１、およびＸＥＮＰ２２８５８から選択される。
【０３１９】
３．ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＣＴＬＡ−４に結合する第１のＡＢＤと、ヒトＰＤ−１に結合する第２のＡＢＤとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図１に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、ＦａｂがＣＴＬＡ−４側であり、ＰＤ−１側がｓｃＦｖ側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
【０３２０】
一実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ａの栓抜き型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤはＦａｂ構成要素である。別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。
【０３２１】
ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体（栓抜き型または中心ｓｃＦｖ型のいずれか）は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、２つの単量体のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）を含み、Ｆａｂ側を含む単量体（例えば、重鎖定常ドメイン）は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、非対称変異体を有するＦｃドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３２５】
さらなる実施形態は、ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３７からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３２６】
さらなる実施形態は、ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３８からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体について、ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ側のＦｖは、識別子［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、０［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４を有する識別子を有する、配列表のそれらの配列から選択される。ＰＤ−１  ｓｃＦｖ側のＦｖは、識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、配列番号３６１６７〜３６３４６および配列番号２３３１６〜２３７３５としてリストに記載されるものから選択される。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、ＸＥＮＰ１９７３８、ＸＥＮＰ１９７３９、ＸＥＮＰ１９７４１、ＸＥＮＰ２００５３、ＸＥＮＰ２００６６、ＸＥＮＰ２０１３０、ＸＥＮＰ２０１４６、ＸＥＮＰ２０７１７、およびＸＥＮＰ２２８３６から選択される。
【０３３０】
４．ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＬＡＧ−３に結合する第１のＡＢＤと、ヒトＰＤ−１に結合する第２のＡＢＤとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図１に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、ＦａｂがＬＡＧ−３側であり、ＰＤ−１側がｓｃＦｖ側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
【０３３１】
一実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ａの栓抜き型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＬＡＧ−３  ＡＢＤはＦａｂ構成要素である。別の実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。
【０３３２】
ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体（栓抜き型または中心ｓｃＦｖ型のいずれか）は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、２つの単量体のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）を含み、Ｆａｂ側を含む単量体（例えば、重鎖定常ドメイン）は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、非対称変異体を有するＦｃドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＬＡＧ−３またはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＬＡＧ−３またはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３３６】
さらなる実施形態は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３７からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３３７】
さらなる実施形態は、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ  ７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３８からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体について、ＬＡＧ−３  Ｆａｂ側のＦｖは、識別子２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２；２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。ＰＤ−１  ｓｃＦｖ側のＦｖは、識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、配列番号３５８６７〜３６１２６および配列番号２３７３６〜２５１３３としてリストに記載されるものを含む構築物から選択される。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、ＸＥＮＰ２０２０６、ＸＥＮＰ２１５８２、ＸＥＮＰ２１５８４、ＸＥＮＰ２１５８８、ＸＥＮＰ２２１２３、ＸＥＮＰ２２１２４、ＸＥＮＰ２２１２５、ＸＥＮＰ２２６０４、ＸＥＮＰ２２６７２、ＸＥＮＰ２２８４７、ＸＥＮＰ２２８４７、およびＸＥＮＰ２２８４９から選択される。
【０３４１】
５．ＴＩＧＩＴＸＰＤ−１
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴＸＰＤ−１二重特異性抗体は、配列番号２５１３４〜２５１７３のリストに記載されるそれらの構築物から選択される。
【０３４２】
６．ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＴＩＭ−３に結合する第１のＡＢＤと、ヒトＰＤ−１に結合する第２のＡＢＤとを含む二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供し、図１に示される任意の型であり得る。本開示のほとんどは、ＦａｂがＴＩＭ−３側であり、ＰＤ−１側がｓｃＦｖ側である栓抜き型を指すが、これは、本明細書の実施形態のすべてについて逆であってもよい。
【０３４３】
一実施形態では、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ａの栓抜き型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。別の実施形態では、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＴＩＭ−３  ＡＢＤはＦａｂ構成要素である。別の実施形態では、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、図１Ｆの中心ｓｃＦｖ型であり、ＰＤ−１  ＡＢＤはｓｃＦｖである。
【０３４４】
ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体（栓抜き型または中心ｓｃＦｖ型のいずれか）は一般に、本明細書に概説される非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。すなわち、いずれかの型において、２つの単量体のＦｃドメインは、非対称変異体（例えば、図３および図８に示されるアミノ酸置換のセット）、任意選択で切断変異体（図５に示されるものを含む）を含み、Ｆａｂ側を含む単量体（例えば、重鎖定常ドメイン）は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１二重特異性抗体は、非対称変異体を有するＦｃドメインを含み、特に有用な非対称変異体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択される。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、および切断変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＴＩＭ−３またはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３ＸＰＤ−１抗体は、非対称変異体、ｐＩ変異体、切断変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、ａ）帯電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態では、図７の＋Ｈ配列が好ましい）、非対称変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、ならびに本明細書で概説するチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）と、ｂ）非対称変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、切断変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第２のチェックポイント阻害剤に結合するＦｖを作りあげる可変重ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）と、ｃ）軽鎖と、を含む。この実施形態の具体的な例は、ＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６  Ｌ１．１９４  Ｈ１．２７９を利用するが、配列表中のＴＩＭ−３またはＰＤ−１  Ｆｖのいずれかが任意の組み合わせで対となり、使用することができる。
【０３４８】
さらなる実施形態は、ＴＩＭ−３  Ｆａｂ側およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３７からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３４９】
さらなる実施形態は、ＴＩＭ−３  Ｆａｂ側およびＰＤ−１  ｓｃＦｖ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を有する、図３８からの骨格のうちのいずれかを含む。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、ＴＩＭ−３  Ｆａｂ側ＸＰＤ−１二重特異性抗体について、ＴＩＭ−３  Ｆａｂ側Ｆａｂ側のＦｖは、識別子１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０を有する、配列表のそれらの配列から選択される。ＰＤ−１  ｓｃＦｖ側のＦｖは、識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有する、配列表のそれらの配列から選択される。
【０３５１】
加えて、本発明の抗体は、本明細書に概説される抗原結合ドメインと同じエピトープ、または本明細書に概説される抗原結合ドメインとの結合について競合するエピトープのいずれかに結合するものを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイント抗体は、本明細書に概説されるＡＢＤのうちの１つと、本明細書に概要されるＡＢＤのうちの１つと結合について競合する第２のＡＢＤとを含有し得る。いくつかの実施形態では、両ＡＢＤは、本明細書に概説される対応するＡＢＤと結合について競合する。結合競合は一般に、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つを使用して決定され、多くの実施形態において、後者が特に有用である。
【０３５２】
ＶＩＩ．有用な実施形態
一実施形態では、本発明において有用な非対称変異体およびｐＩ変異体の特定の組み合わせは、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択で架橋ジスルフィド、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）であり、一方の単量体は、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み、もう一方の単量体は、正の帯電ｓｃＦｖリンカー（型がｓｃＦｖドメインを含む場合）を含む。当該技術分野で理解されるように、「ノブインホール」変異体は、ｐＩを変化させず、したがって、いずれの単量体で使用することができる。
【０３５３】
ＶＩＩＩ．本発明の核酸
本発明は、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸（または「単一特異性」抗体の場合、それらをコードする核酸も）組成物をさらに提供する。
【０３５４】
当業者に理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体タンパク質の型および足場に依存する。したがって、例えば、型が３つのアミノ酸配列を必要とする場合、例えば、二重ｓｃＦｖ型を除いて、図１に示される全ての型に関して、３つの核酸配列が発現のための１つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、いくつかの型（例えば、図１に開示されるものなどの二重ｓｃＦｖ型）２つの核酸のみが必要とされ、同様に、それらは、１つまたは２つの発現ベクターに加えられ得る。
【０３５５】
当該技術分野で知られるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、当該技術分野で知られる、および本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞によって、発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は、任意の数の制御要素（プロモーター、複製の起源、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、誘導物質など）に操作可能に連結される。発現ベクターは、外部染色体または統合ベクターであってもよい。
【０３５６】
本発明の核酸および／または発現ベクターは、その後、哺乳類、細菌、酵母菌、昆虫、および／または真菌細胞を含む当該技術分野でよく知られる任意の数の異なる型の宿主細胞に変換され、哺乳細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、多くの実施形態において有用である。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、型に応じて適用可能であるように、各単量体をコードする核酸および軽鎖をコードする任意選択の核酸は、一般に、異なるまたは同一のプロモーター制御下で、単一の発現ベクター内でそれぞれ含有される。本発明の特定使用の実施形態では、これらの２つまたは３つの核酸のそれぞれは、異なる発現ベクター上に含有される。本明細書および６２／０２５，９３１（参照により本明細書に組み込まれる）で示されるように、異なるベクターの比は、ヘテロ二量体形成を誘起するために使用され得る。すなわち、驚くべきことに、タンパク質が、１：１：２の比で第１の単量体：第２の単量体：軽鎖（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書の実施形態の多くの場合）を含むが、これらは、最良の結果をもたらす比ではない。
【０３５８】
本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野においてよく知られている発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦産生されると、イオン交換クロマトグラフィー段階を含む伝統的な抗体精製段階がなされる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。すなわち、各モノマーの等電点（ｐＩ）を変えるｐＩ置換を含むことにより、各単量体が異なるｐＩを有し、ヘテロ二量体も明確なｐＩを有し、したがって、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の等電精製（例えば、アニオン交換カラム、カチオン交換カラム）を容易にする。これらの置換は、何らかの混入している二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体およびｍＡｂホモ二量体の、精製（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析ＩＥＸカラム）後の判定および監視においても役に立つ。
【０３５９】
ＩＸ．ヘテロ二量体チェックポイント抗体の生物学的および生化学的機能性
一般に、本発明の二重特異性チェックポイント抗体本はがんを有する患者に投与され、有効性は本明細書に記載されるいくつかの方法で評価される。したがって、がん負荷、腫瘍のサイズ、および転移の存在またはその程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイが実行され得る一方で、免疫腫瘍学的治療は免疫状態評価に基づいて評価することもできる。これは、インビトロおよびインビボアッセイの両方を含む、いくつかの方法で行うことができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、ＬＮ関与、転移等の「従来の」測定と共に、免疫状態の変化の評価（例えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）が行われてもよい。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞傷害活性、ならびに／またはＣＴＬ媒介細胞枯渇、ＮＫ細胞活性、およびＮＫ媒介細胞枯渇に対するチェックポイントの阻害効果、Ｔｒｅｇ細胞分化および増殖、ならびにＴｒｅｇもしくは骨髄由来抑制因子細胞（ＭＤＳＣ）媒介免疫抑制もしくは免疫寛容に対するチェックポイントの増大効果、ならびに／または免疫細胞により産生された炎症誘発性サイトカイン、例えば、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、もしくはＴＮＦ−α産生に対するチェックポイントの効果のうちのいずれか、またはすべてが評価され得る。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン組み込み法を用いて、免疫細胞増殖を評価することによって行われる。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０のうちの１つ以上を含む活性化関連マーカーの遺伝子発現の増加、またはそのタンパク質レベルの増加、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定された細胞脱顆粒を評価することによって行われる。
【０３６２】
一般に、当該技術分野で知られる遺伝子発現アッセイが行われる。
【０３６３】
一般に、当該技術分野で知られるタンパク質発現測定も同様に行われる。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、共酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性などの多くの細胞パラメータを推定することにより、標的細胞の生存率を検出することによって測定される細胞傷害活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの具体的な例としては、限定されないが、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光に基づくアッセイ、およびその他が挙げられる。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、よく知られた技法を使用して、限定されないが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むサイトカインを使用して、培養上清においていずれの細胞内で測定する、サイトカイン産生によって測定されたＴ細胞活性を評価することによって行われる。
【０３６６】
したがって、治療の評価は、次のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる：（ｉ）免疫応答の増加、（ｉｉ）αβおよび／またはγδＴ細胞の活性化の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加、（ｖ）αβおよび／またはγδＴ細胞抑制の軽減、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌の増加、（ｖｉｉｉ）インターフェロンγ産生の増加、（ｉｘ）Ｔｈ１応答の増加、（ｘ）Ｔｈ２応答の減少、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇのうちの少なくとも１つの細胞数および／または活性の減少もしくは排除。
【０３６７】
有効性を測定するためのアッセイ
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、当該技術分野で知られる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３６８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって測定されるように、または他の翻訳後修飾を測定することによって、免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３６９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδＴ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばＣＤ１０７ａのような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される、ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδＴ細胞抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡにより、またはＬｕｍｉｎｅｘにより、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法により、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析により、またはＡｌｉｓｐｏｔ等により測定される、炎症誘発性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡにより、またはＬｕｍｉｎｅｘにより、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法により、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析により、またはＡｌｉｓｐｏｔ等により測定される、ＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡにより、またはＬｕｍｉｎｅｘにより、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法により、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析により、またはＡｌｉｓｐｏｔ等により測定される、インターフェロンγ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ１応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ２応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３７８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１つの細胞数および／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
【０３７９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、Ｍ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
【０３８０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｍ２マクロファージ腫瘍形成誘発活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
【０３８１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される、Ｎ２好中球増加における増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
【０３８２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｎ２好中球腫瘍形成誘発活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
【０３８３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３８４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される、ＣＴＬ活性化阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３８５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδＴ細胞消耗の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。以下に概説される適切な減少は増加に関するものと同じである。
【０３８６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδＴ細胞応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３８７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えばＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３８８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、ＣＦＳＥ希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、がん細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３８９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、ＣＦＳＥ希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、がん細胞に対する細胞傷害性効果または細胞増殖抑制性効果の刺激における増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３９０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、ＣＦＳＥ希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、がん細胞の直接殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３９１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３９２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルシンＡＭについてなどの細胞傷害性アッセイにより、または例えば、ＣＦＳＥ希釈またはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって例えば測定される、補体依存性細胞傷害および／または抗体依存性細胞傷害の誘導における増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。適切な活性の増加を以下に概説する。
【０３９３】
一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、がん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって例えば測定される。Ｔ細胞について、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）の増加は、がん細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となるだろう。
【０３９４】
一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、例えばがん細胞のような標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばＣＤ１０７ａ等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞について、増殖、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現の増加）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えばＣＤ２５）の増加は、がん細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となるだろう。
【０３９５】
一実施形態では、γδＴ細胞の活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０３９６】
一実施形態では、Ｔｈ１細胞の活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０３９７】
適切な活性または応答の増加（または上に概説されるように、必要に応じて減少）は、参照試料または対照試料のいずれか、例えば本発明の抗体を含有しない試験試料のシグナルに対する１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様に、参照または対照試料と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の増加は有効性を示す。
【０３９８】
Ｘ．治療
一旦作製されると、本発明の組成物は、がんを治療することによる、一般に、本発明の二重特異性チェックポイント抗体の結合と共に、Ｔ細胞活性の抑制を阻害することによる（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）いくつかの腫瘍学用途に有用である。
【０３９９】
したがって、本発明のヘテロ二量体組成物は、これらの癌の治療に有用である。
【０４００】
ＸＩ．併用療法
いくつかの実施形態では、二重特異性チェックポイントが抗ＰＤ−１抗原結合ドメインを含まない場合、二重特異性抗体は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））またはニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））などの別個の抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。共投与は、当業者に理解されるように同時にまたは順次行うことができる。
【０４０１】
すなわち、本明細書に開示されるＣＴＬＡ−４ＸＬＡＧ−３二重特異性チェックポイント抗体、または配列表の抗ＬＡＧ−３配列および抗ＣＴＬＡ−４配列を組み込むもののうちのいずれかなど、および特に、ＸＥＮＰ２２６０２、ＸＥＮＰ２２６７５、ＸＥＮＰ２２８４１、またはＸＥＮＰ２２８４３は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０２】
同様に、本明細書に開示されるＢＴＬＡＸＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント、または配列表の抗ＢＴＬＡ配列および抗ＣＴＬＡ−４配列を組み込むもののうちのいずれかなどは、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０３】
配列表の抗ＴＩＭ−３配列および抗ＣＴＬＡ−４配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＣＴＬＡ−４ＸＴＩＭ−３二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０４】
配列表の抗ＣＴＬＡ−４および抗ＴＩＧＩＴ配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＣＴＬＡ−４およびＴＩＧＩＴ二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０５】
配列表の抗ＴＩＭ−３配列および抗ＬＡＧ−３配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＴＩＭ−３およびＬＡＧ−３二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０６】
配列表の抗ＴＩＭ−３配列および抗ＴＩＧＩＴ配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＴＩＭ−３およびＴＩＧＩＴ二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０７】
配列表の抗ＴＩＭ−３および抗ＢＴＬＡ配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＴＩＭ−３およびＢＴＬＡ二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０８】
配列表の抗ＬＡＧ−３配列および抗ＴＩＧＩＴ配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＬＡＧ−３およびＴＩＧＩＴ二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４０９】
配列表の抗ＬＡＧ−３配列および抗ＢＴＬＡ配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＬＡＧ−３およびＢＴＬＡ二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４１０】
配列表の抗ＴＩＧＩＴ配列および抗ＢＴＬＡ配列を組み込むもののうちのいずれかなどのＴＩＧＩＴおよびＢＴＬＡ二重特異性チェックポイント抗体は、抗ＰＤ−１抗体と共投与することができる。
【０４１１】
ＸＩＩ．インビボ投与用の抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有し、任意選択で、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤（一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に概説される）と共に抗体を混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵向けに調製される。許容可能な担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の糖質、ＥＤＴＡなどのキレート物質、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０４１２】
投与様式
本発明の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈投与、または一定期間にわたる継続注入による静脈投与などの既知の方法に従って、対象に投与される。
【０４１３】
治療様式
本発明の方法において、療法は、疾患または状態に関する有益な治療応答を提供するために使用される。「有益な治療応答」は、疾患もしくは状態における改善、および／または疾患もしくは状態と関連する症状における改善を意図する。例えば、有益な治療応答は、疾患における下記の改善のうちの１つ以上を指す：（１）新生物細胞数の減少、（２）新生物細胞死の増加、（３）新生物細胞の生存阻害、（５）腫瘍成長の阻害（すなわち、ある程度の緩徐、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または状態と関連する１つ以上の症状のいくらかの緩和。
【０４１４】
何らかの所与の疾患または状態における有益な治療応答は、疾患または状態に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、ｘ−線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像法、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環における腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検試料採取などのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態学（すなわち、全体的な腫瘍量、腫瘍サイズなど）における変化で評価することができる。
【０４１５】
これらの有益な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状において、改善の有利な効果を経験し得る。
【０４１６】
本発明による治療は、使用する薬剤の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を達成するために有効である量を指す。
【０４１７】
治療有効量は、個々の疾患の状況、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個々における、薬剤の所望応答を引き出す能力に応じて変化してよい。治療有効量は、抗体または抗体部分の治療上有利な効果が、何らかの毒性作用または有害作用を凌ぐ量でもある。
【０４１８】
腫瘍治療に向けた「治療有効量」は、疾患の進行を安定化させるその能力によって測定されてもよい。がんを阻害する化合物の能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してよい。
【０４１９】
あるいは、組成物のこの性質は、当業者に知られるインビトロアッセイによって、化合物が、細胞の成長を抑制する能力、またはアポトーシスを誘導する能力を試験することによって評価されてもよい。治療用化合物の治療有効量によって、対象の腫瘍サイズが減少されるか、またはそうでなければ、対象の症状が回復し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物、または選択される投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定できるであろう。
【０４２０】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与するか、いくつかに分割された用量を長時間にわたって投与するか、または治療状況の要件が示すように、比例的に用量を減少または増加してよい。非経口組成物を、投与の容易化、および投与量の均一性のために、投与量単位形態に製剤化してよい。本明細書で使用される投与量単位形態は、治療される対象の単位投与量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果をもたらすために計算された既定の量の活性化合物を含有する。
【０４２１】
本発明の投与量単位形態のための規格は、（ａ）活性化合物特有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を、個々の感受性の治療向けに配合する技術分野での固有の制限、によって決定されると共に、直接的にそれらに応じて、決定される。
【０４２２】
本発明において使用される二重特異性抗体に向けた、効率的な投与量および投与レジメンは、治療される疾患または状態に依存し、当業者によって決定されてよい。
【０４２３】
本発明に使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的な非限定的な範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０４２４】
すべての引用文献は、参照によりそれらの全体が明確に本明細書に組み込まれる。
【０４２５】
例示目的に向けて、本発明の特定の実施形態を上に説明したが、当業者は、添付の特許請求の範囲において説明される本発明から逸脱することなく、多くの詳細の変更が行われ得ることを理解するであろう。
【実施例】
【０４２６】
本発明を示すために、実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を何らかの特定の応用、または実施理論に限定しようと意図するものではない。本発明において論じられる定常領域の位置のすべてに関して、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ。参照によって、全体が組み込まれる）にあるように、ＥＵインデックスに従う。抗体技術分野の当業者であれば、この慣習が、免疫グロブリン配列の特定領域における、非連続的な番号付けからなっており、免疫グロブリンファミリーにおける保存位置への標準化された参照が可能になっていることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義される、何らかの所与の免疫グロブリンの位置は、その連続配列に必ずしも対応していないことになる。
【０４２７】
一般的かつ特定の科学技法は、米国公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、およびＷＯ２０１４／１４５８０６に概説され、これらはすべて、参照により全体が明確に組み込まれ、特に、それらに概説される技術に関して組み込まれる。
【０４２８】
Ａ．実施例１：複数のがんの種類からのＴＩＬは免疫チェックポイント受容体を共発現する。
ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、およびＢＴＬＡ間の潜在的な関連性を調査するために、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ＴＣＧＡ）のＲＮＡ配列決定データを分析のために使用した。Ｖ２  ＲＳＥＭデータは、ＦｉｒｅＢｒｏｗｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｒｅｂｒｏｗｓｅ．ｏｒｇ／）からダウンロードされた。カスタムルーチンでＲを用いて分析を実施した。ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４発現との間の相関を、計算されたＲ２値（図１：ピアソン相関係数の２乗）と共に図６６に示す。図６６はさらに、ＰＤ−１とＬＡＧ−３発現、ＰＤ−１とＢＴＬＡ発現、およびＬＡＧ−３とＣＴＬＡ−４発現との間の相関を示す。
【０４２９】
図４４は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫、卵巣癌、および肺癌を含むがんにおいて共発現されたことを示し、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ、ならびにＬＡＧ−３およびＣＴＬＡ−４のセットが、膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および黒色腫の癌を含むがんにおいて共発現されたことを示す。
【０４３０】
Ｂ．実施例２：二重特異性免疫チェックポイント抗体は、単一特異性免疫チェックポイント抗体より優れている
二重チェックポイント遮断の効果を示すために、プロトタイプの免疫チェックポイント抗体（例えば、ニボルマブおよびイピリムマブ）およびプロトタイプ抗体に基づく二重特異性免疫チェックポイント抗体を産生した。別段の記載がない限り、本明細書において、二重特異性体は、最初にＦａｂ可変領域、そして次にｓｃＦｖ可変領域を使用して命名される。プロトタイプ抗体のアミノ酸配列は配列表のリストに記載される。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成によって生成し（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ）、標準的な分子生物学技法を使用して、二価または二重特異性定常領域を含有する発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞において一時的にトランスフェクトした。抗体を、プロテインＡクロマトグラフィー（および二重特異性抗体についてはカチオン交換クロマトグラフィー）により精製した。サイズ排除クロマトグラフィー、分析カチオン交換クロマトグラフィー、およびキャピラリー等電点電気泳動により純度を評価した。
【０４３１】
１．二重陽性細胞は、二重特異性免疫チェックポイント抗体によって選択的に占有される。
単一免疫チェックポイント受容体を発現する非腫瘍反応性Ｔ細胞に対する、複数の免疫チェックポイント受容体を発現する腫瘍反応性ＴＩＬの選択的標的（実施例１に示されるように）は、周辺毒性を回避しながら抗腫瘍活性を増強することができる（図４２に示されるように）。
【０４３２】
ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイを使用して、二重特異性免疫チェックポイント抗体のＴ細胞への結合を調査した。ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイは、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞増殖をアッセイし、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の集団を生成するためのインビトロ方法である。ＰＢＭＣがｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で刺激される場合、ＴＨ細胞集団は拡大し、続いてＣＴＬ集団が拡大する。ＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激し、次いで、４℃で３０分間、プロトタイプの抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体および陰性対照（Ｎｕｍａｘ、二価）で処理した。処理後、細胞を、４℃で３０分間、ＡＰＣ標識片腕抗ＬＡＧ−３抗体、ＦＩＴＣ標識片腕抗ＰＤ−１抗体、およびＢＶ６０５標識抗ＣＤ３抗体と共にインキュベートした。ＣＤ３＋Ｔ細胞の散布図を図６７に示す。データは、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３の両方を発現する二重陽性細胞が、二重特異性免疫チェックポイント抗体が複数のチェックポイント受容体を発現するＴ細胞を選択的に標的とすることを示す抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体によって選択的に占有されることを示す。
【０４３３】
２．抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体は混合リンパ球反応においてＩＬ−２応答を増強する
プロトタイプ免疫チェックポイント抗体ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ）およびＸＥＮＰ１６４３３（イピリムマブ）、ニボルマブおよびイピリムマブに基づく二重特異性免疫チェックポイント抗体ＸＥＮＰ１６００４、ならびに片腕（単一特異性、一価）組み合わせ対照を、混合リンパ球反応（混合白血球反応またはＭＬＲとしても知られる）において試験した。ＭＬＲは、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞増殖をアッセイし、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の集団を生成するための別のインビトロ方法である。同種（異なるＭＨＣハプロタイプ）リンパ球が一緒に培養される場合、ＴＨ細胞集団は拡大し、続いてＣＴＬ集団が拡大する。インターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を使用して、Ｔ細胞の活性化を監視した。
【０４３４】
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ密度勾配を使用して、ヒトＰＢＭＣの異なるセットを、異なる匿名の健常なボランティア（ＨｅｍａＣａｒｅ，ＶａｎＮｕｙｓ，ＣＡ）の白血球アフェレーシスから精製した。２人のドナー由来のＰＢＭＣを混合し、次いで、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品で処理した。上清を収集し、ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ−２の濃度を測定し、示されるデータはいくつかの抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂスクリーニングの結果を示す。これは、ＦａｂおよびｓｃＦｖの実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトおよびｃｙｎｏＣＴＬＡ−４に対するＫＤ結合定数、ならびにｓｃＦｖおよびＦａｂのＴｍを示す。加えて、少なくとも１つのヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列と正確に一致した配列９量体の数は、ＦａｂおよびｓｃＦｖの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
【０４３５】
図２５Ａ。各カラムについて、各データ点は異なるドナー−ドナーの組み合わせの別個の反応である。
【０４３６】
データは、プロトタイプ抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体がニボルマブおよびイピリムマブ単独よりも大幅にＩＬ−２応答を増大することを示す。特に、片腕の組み合わせ（二重特異性体のそれぞれの一価のアームに別個に付加される）は、抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体よりも劣り、二重陽性ＰＤ−１＋ＣＴＬＡ−４＋細胞に対して二重特異性体がより強く結合することを示唆し、これは抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体に関して図６７に示される所見と一致する。
【０４３７】
３．追加の二重特異性免疫チェックポイント抗体は、混合リンパ球反応においてＩＬ−２応答を増強する
追加の免疫チェックポイント受容体に向けられる追加のプロトタイプ免疫チェックポイント抗体および二重特異性免疫チェックポイント抗体を、上述のＭＬＲアッセイにおいて試験した。２０のドナーが１つレシピエントドナーを標的とし、別のセットの２０のドナーが別の１つのレシピエントドナーを標的とする、合計４０のＭＬＲ反応の２セットのＭＬＲを創出した。反応物を、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品と共に６日間インキュベートした。抗ＰＤ−１二価（ＸＥＮＰ１６４３２）での治療に対する示される試験物品での治療後のＩＬ−２およびＩＦＮγ（ＥＬＩＳＡによってアッセイされる）の倍数増加を示すデータを図３２に示す。データは、追加の二重特異性免疫チェックポイント抗体も活性化Ｔ細胞においてニボルマブ単独よりも優れていたことを示す。
【０４３８】
４．三重免疫チェックポイント遮断−抗ＰＤ−１二価および抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体は、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるＩＬ−２応答の増強において相乗的である
図４３に示される抗ＰＤ−１二価および抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体などによる三重免疫チェックポイント遮断がＴ細胞活性化の増強において追加の利益を提供するであろうと仮定された。仮説を試験するために、プロトタイプ免疫チェックポイント抗体ＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ）、２５Ｆ７およびイピリムマブに基づくプロトタイプ二重特異性抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４免疫チェックポイント抗体ＸＥＮＰ１６４３０、ならびにＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ１６４３０の組み合わせを、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。
【０４３９】
複数のドナー由来のヒトＰＢＭＣを、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品と共に、７２時間、１０ｎｇ  ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。処理後、細胞上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２についてアッセイした。Ｎｕｍａｘ二価に対するＩＬ−２の倍数増加についてのデータが図３３に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
【０４４０】
データは、抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント抗体（ＸＥＮＰ１６４３０）単独が、対照（Ｎｕｍａｘ二価）に対してＩＬ−２応答を増強したが、増強はニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独よりも低いことを示す。しかしながら、ニボルマブと組み合わせた抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＬＡＧ−３二重特異性体は、どちらかの単独よりも著しく高いＩＬ−２応答をもたらす。
【０４４１】
５．チェックポイント受容体／リガンド相互作用の遮断はＴ細胞活性化に必要である
バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）に基づく方法Ｏｃｔｅｔを使用して、プロトタイプ抗ＢＴＬＡ抗体４Ａ７、Ｅ８Ｄ９、および８Ｄ５を、そのリガンドＨＶＥＭとのＢＴＬＡ相互作用を遮断するそれらの能力についてスクリーニングした。Ｏｃｔｅｔの実験段階には、一般に以下が含まれた：固定化（リガンドまたは試験物品をバイオセンサ上に捕捉する）、会合（リガンドまたは試験物品コーティングしたバイオセンサを、対応する試験物品またはリガンドの連続希釈を含有するウェルに浸漬する）、および試験物品の一価親和性を決定するための解離（バイオセンサを、緩衝剤を含有するウェルに戻す）。緩衝液のみを含有する参照ウェルも、データ処理中のバックグラウンド補正の方法に含まれた。５００ｎＭの各抗ＢＴＬＡ抗体および１００ｎＭのＢＴＬＡ−Ｆｃを、１時間にわたってインキュベートした。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサを使用して、ＨＶＥＭ−Ｆｃ−Ｈｉｓを捕捉し、次いで、抗体／ＢＴＬＡ混合物に浸漬して、残留ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ結合を測定した。図３５Ｂに示されるように、８Ｄ５は、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ相互作用を遮断しなかったが、４Ａ７およびＥ８Ｄ９は、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ相互作用を遮断した。
【０４４２】
プロトタイプ抗ＢＴＬＡ抗体、およびプロトタイプ抗体に基づく抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームを有する抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。具体的には、ヒトＰＢＭＣを、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品と共に２０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで７２時間刺激した。処理後、細胞上清を、ＥＬＩＳＡによって、ＩＬ−２についてアッセイした。Ｎｕｍａｘ二価に対するＩＬ−２の倍数増加についてのデータを、図３５Ａに示す（各点は、一重項で試験した個々のＰＢＭＣドナーを表す）。データは、非遮断８Ｄ５抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームを有する二重特異性抗体がニボルマブよりも著しく少ないＩＬ−２を誘導したことを示し、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ相互作用の遮断がＴ細胞活性化の増強に必要であることを示す。
【０４４３】
６．二重特異性免疫チェックポイント抗体はヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおける生着および疾患活性を増強する
二重特異性チェックポイント抗体を、ＮＳＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ）免疫不全マウスにおいて実施された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおいて評価した。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注入したとき、ヒトＰＢＭＣはマウス細胞に対して自己免疫応答を発達させた。ヒトＰＢＭＣを注入されたＮＳＧマウスの処置後の免疫チェックポイント阻害剤での処置は移植されたＴ細胞を抑制解除（ｄｅ−ｒｅｐｒｅｓｓ）し、生着を増強する。
【０４４４】
１０００万個のヒトＰＢＭＣを、０日目にＩＶ−ＯＳＰを介してＮＳＧマウスに移植し、その後１日目に示される試験物品（５ｍｇ／ｋｇまたは示されるとおり）を投薬した。ＣＤ４５＋事象を１４日目に測定した（図３４）。ＧＶＨＤは直接測定されたが、ＣＤ４５＋細胞レベルの増加は体重の減少と相関する（ニボルマブ（抗ＰＤ−１モノクローナル抗体、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）として販売されている）単独、イピリムマブ単独（抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として販売されている）、ニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体、および「片腕」組み合わせ対照．によるＩＬ−２放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
【０４４５】
図２６Ｂ）、および疾患を予測する。
【０４４６】
データは、本発明の二重特異性チェックポイント抗体が、対照（ＰＢＳ＋ＰＢＭＣ）と比較して、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の増殖を増強することを示す。さらに、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独で見られるよりも、本発明の抗体を使用する方が増強が大きい。さらに、ニボルマブと組み合わせた抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＬＡＧ−３二重特異性体（ＸＥＮＰ１６４３０）は、実施例２Ｄのデータと一致する最高の生着レベルをもたらした。
【０４４７】
Ｃ．実施例３：ハイブリドーマ
１．ハイブリドーマ生成
本発明の二重特異性免疫チェックポイント抗体のＰＤ−１、ＬＡＧ−３、およびＢＴＬＡ標的アームを開発するために、標準的な方法またはＲａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ方法のいずれかによる、ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅのハイブリドーマ技術により、モノクローナル抗体を最初に生成した。
【０４４８】
標準的な方法に関して、抗原（複数可）を３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。ハイブリドーマ生成のために屠殺する７〜１０日前に、免疫化マウスは抗原ブーストを受けた。抗体力価は、ＥＬＩＳＡによって抗原で評価され、最良の応答マウスが融合のために選ばれる。最後の抗原ブーストは融合の４日前に与えられる。マウスからのリンパ球をプールし、精製し、次いで、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。融合した細胞を、１０〜１２日間、ＨＡＴ選択的単一段階クローニング媒体上で成長させ、この時点でハイブリドーマはスクリーニングに適した状態であった。
【０４４９】
Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ方法に関して、抗原（複数可）を３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。１９日後、マウスからのリンパ球をプールし、精製し、次いで、ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。融合した細胞を、１０〜１２日間、ＨＡＴ選択的単一段階クローニング媒体上で成長させ、この時点でハイブリドーマはスクリーニングに適した状態であった。
【０４５０】
抗ＰＤ−１ハイブリドーマの生成に関して、標準的な方法およびＲａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ方法が使用され、使用された抗原（複数可）は、ヒトＰＤ−１のマウスＦｃ融合体（ｈｕＰＤ−１−ｍＦｃ）、ｃｙｎｏ  ＰＤ−１のマウスＦｃ融合体（ｃｙｎｏＰＤ−１−ｍＦｃ）、Ｈｉｓタグ付きヒトＰＤ−１（ｈｉＰＤ−１−Ｈｉｓ）、Ｈｉｓタグ付きｃｙｎｏ  ＰＤ−１（ｃｙｎｏＰＤ−１−Ｈｉｓ）、またはこれらの混合物であった。
【０４５１】
抗ＢＴＬＡハイブリドーマの生成に関して、標準的な方法およびＲａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ方法が使用され、使用された抗原は、ヒトＢＴＬＡのマウスＦｃ融合体（ｈｕＢＴＬＡ−ｍＦｃ）、ｃｙｎｏ  ＢＴＬＡのマウスＦｃ融合体（ｃｙｎｏＢＴＬＡ−ｍＦｃ）、Ｈｉｓタグ付きヒトＢＴＬＡ（ｈｕＢＴＬＡ−Ｈｉｓ）、またはｈｕＢＴＬＡ−ｍＦｃおよびｃｙｎｏＢＴＬＡ−ｍＦｃの混合物であった。
【０４５２】
抗ＬＡＧ−３ハイブリドーマの生成に関して、Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ方法が使用され、使用された抗原は、ヒトＬＡＧ−３のマウスＦｃ融合体（ｈｕＬＡＧ−３−ｍＦｃ）、ｃｙｎｏ  ＬＡＧ−３のマウスＦｃ融合体（ｃｙｎｏＬＡＧ−３−ｍＦｃ）、Ｈｉｓタグ付きヒトＬＡＧ−３（ｈｉＬＡＧ−３−Ｈｉｓ）、ｈｕＬＡＧ−３−ｍＦｃおよびｃｙｎｏＬＡＧ−３−ｍＦｃの混合物、または混合物ｈｕＬＡＧ−３−ＨｉｓおよびｃｙｎｏＬＡＧ−３−Ｈｉｓであった。
【０４５３】
抗ＴＩＭ−３ハイブリドーマの生成に関して、標準的な方法およびＲａｐｉｄ  Ｐｒｉｍｅ方法が使用され、使用された抗原（複数可）は、ヒトＴＩＭ−３のマウスＦｃ融合体（ｈｕＴＩＭ−３−ｍＦｃ）、ｃｙｎｏ  ＴＩＭ−３のマウスＦｃ融合体（ｃｙｎｏＴＩＭ−３−ｍＦｃ）、Ｈｉｓタグ付きヒトＴＩＭ−３（ｈｉＴＩＭ−３−Ｈｉｓ）、Ｈｉｓタグ付きｃｙｎｏ  ＴＩＭ−３（ｃｙｎｏＴＩＭ−３−Ｈｉｓ）、またはこれらの混合物であった。
【０４５４】
２．抗ＰＤ−１ハイブリドーマクローンのスクリーニング
上述のように生成された抗ＰＤ−１ハイブリドーマクローンは、Ｏｃｔｅｔを使用して２回のスクリーニングを受けた。１回目に関して、抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）バイオセンサを使用してクローンを捕捉し、５００ｎＭの二価ヒトおよびｃｙｎｏ  ＰＤ−１−Ｆｃ−Ｈｉｓに浸漬した。２回目に関して、ヒトおよびｃｙｎｏ  ＰＤ−１の両方に対して陽性であった、１回目で同定されたクローンを、ＡＭＣバイオセンサ上に捕捉し、５００ｎＭ一価ヒトおよびｃｙｎｏ  ＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。
例示的な抗ＰＤ−１抗体の配列は、配列表にある。
【０４５５】
３．抗ＢＴＬＡハイブリドーマクローンのスクリーニング
上述のように生成された抗ＢＴＬＡハイブリドーマクローンは、Ｏｃｔｅｔを使用して２回のスクリーニングを受けた。１回目に関して、ＡＭＣバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、複数濃度のヒトおよびｃｙｎｏ  ＢＴＬＡ−Ｈｉｓに浸漬してＫＤを決定した。２回目に関して、遮断アッセイを使用して、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ相互作用を遮断したクローンを同定した。抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサを使用してＨＶＥＭ−Ｆｃ−Ｈｉｓを捕捉し、２５ｎＭのＢＴＬＡ−Ｆｃのみ、またはハイブリドーマ試料の２５ｎＭ  ＢＴＬＡ−Ｆｃ＋１：１希釈に浸漬して、残留ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ結合を測定した。例示的な抗ＢＴＬＡ抗体の配列は、配列表にある。
【０４５６】
４．抗ＬＡＧ−３ハイブリドーマクローンのスクリーニング
抗親和性を有するクローン、ＭＨＣ−ＩＩを内因的に発現するＲａｍｏｓ細胞に結合するＬＡＧ−３結合を遮断するクローン、および２５Ｆ７ｍＡｂと異なるエピトープに結合するクローンを同定するために、上述のように生成された抗ＬＡＧ−３ハイブリドーマクローンは、数回のスクリーニングを受けた。
【０４５７】
Ｏｃｔｅｔを使用して親和性を決定した。ＡＭＣバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、単一濃度のヒトＬＡＧ−３−Ｆｃおよびｃｙｎｏ  ＬＡＧ−３−Ｆｃに浸漬した。ＬＡＧ−３／ＭＨＣ−ＩＩ相互作用を遮断するクローンを同定するために、１０μＬ中１μｇのヒトＬＡＧ−３−ｈＩｇを、室温で２０分間、５０μＬのハイブリドーマ上清（２倍希釈、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地において８回）と混合した。４０μＬのＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ細胞（内因的にＭＨＣ−ＩＩを発現する）を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ヒトＦｃ−Ａｌｅｘａ６４７二次抗体と共に３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳによりＡｌｅｘａ６４７について分析した。データを図６２に示す。２５Ｆ７  ｍＡｂとは異なるエピトープに結合するクローンを同定するために、ＡＭＣバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、１００ｎＭヒトＬＡＧ−３−ｈＦｃまたは５００ｎＭ  ２５Ｆ７を含む１００ｎＭ  ＬＡＧ−３−ｈＦｃに浸漬して、残留結合を測定した。例示的な抗ＬＡＧ−３抗体の配列は、配列表にある。
【０４５８】
５．抗ＴＩＭ−３ハイブリドーマクローンのスクリーニング
上述のように生成された抗ＴＩＭ−３ハイブリドーマクローンは、２回のスクリーニングを受けた。１回目は、ＩｇＧ試料およびＩｇＭクローンのためのスクリーニングに分割された。ＩｇＧクローンに関して、ＡＭＣバイオセンサを使用してクローンを捕捉し、複数濃度のヒトおよびｃｙｎｏ  ＴＩＭ−３−Ｈｉｓに浸漬した。ＩｇＭクローンに関して、ＡＲ２Ｇを使用して抗ＩｇＭ  ｍＡｂをバイオセンサ上に結合し、バイオセンサは、複数濃度のヒトおよびｃｙｎｏ  ＴＩＭ−３−Ｈｉｓに浸漬された。ＩｇＭ試料のいずれもベースラインよりも高い結合シンガルをもたらさなかった。１回目のスクリーニングの後、ヒトおよびｃｙｎｏ  ＴＩＭ−３の両方に結合したＩｇＧクローンを、二価のヒトおよびｃｙｎｏ  ＴＩＭ−３−Ｆｃの二価型で再スクリーニングした。例示的な抗ＴＩＭ−３抗体の配列は、配列表にある。
【０４５９】
クローンのうちのいくつかをキメラ化し、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞結合について評価した。ヒトＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。刺激後、細胞を、示される試験物品で、４℃で３０分間処理した。ＣＤ３細胞に対する結合は、抗ヒトＦｃ二次抗体を用いて検出され、図２１に示された。
【０４６０】
６．ハイブリドーマ由来の構成要素抗体ドメインは、チェックポイント受容体／リガンド相互作用を遮断する
実施例２Ｅに示されるように、チェックポイント受容体／リガンド相互作用の遮断はＴ細胞活性化に必要である。ハイブリドーマに由来するドメインを含む例示的な抗体の遮断能力を、に示されるように、細胞結合アッセイまたはＯｃｔｅｔのいずれかを使用して調査し、本明細書に提供される対象抗体の構成要素抗体ドメインがチェックポイント受容体／リガンド相互作用を遮断することができることを示すグラフである。特に、１Ｇ６抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖアームを含む二重特異性抗体は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ２相互作用を遮断することが可能であり、７Ｇ８抗ＬＡＧ−３片腕は、ＬＡＧ−３／ＭＨＣ  ＩＩ相互作用を遮断することが可能であり、例示的な抗ＰＤ−１  Ｆａｂアームを含む二重特異性抗体は、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０およびＣＴＬＡ−４／ＣＤ８６相互作用を遮断することが可能であり、９Ｃ６抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームを含む二重特異性抗体は、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ相互作用を遮断することが可能である。
【０４６１】
図６８。
【０４６２】
ＰＤ−１を外因的に発現するＨＥＫ２９３ＴをＸＥＮＰ２０７１７と共にインキュベートすることにより、用量依存様式でＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１への結合が防止された。ＬＡＧ−３をＸＥＮＰ２２６０６と共にインキュベートすることにより、ＭＨＣ−ＩＩを外因的に発現するＤａｕｄｉ細胞へのその結合が防止された。ＣＴＬＡ−４をＸＥＮＰ２００６６と共にインキュベートすることにより、ＣＤ８０およびＣＤ８６への残留結合が阻害された。ＢＴＬＡをＸＥＮＰ２０８９５と共にインキュベートすることにより、ＨＶＥＭへの残留結合が阻害された。
【０４６３】
Ｄ．実施例４：親和性および安定性の最適化
１．抗ＰＤ−１  ｍＡｂ  １Ｇ６および２Ｅ９
実施例３で生成された抗ＰＤ−１ハイブリドーマクローン１Ｇ６および２Ｅ９は、二重特異性免疫チェックポイント阻害剤で使用するためのｓｃＦｖまたはＦａｂとの関連において最適な親和性および安定性を有するように操作された。クローンは、ストリング含有量最適化（ｓｔｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を使用して最初にヒト化された（例えば、米国．特許第７，６５７，３８０号、２０１０年２月２日発行を参照されたい）。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ．）によって生成し、標準分子生物学的技法を使用して発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。ｓｃＦｖのＣ末端は、ポリヒスチジンタグを含んだ。Ｆｖ変異体のライブラリは、完全長二価Ｆａｂ−Ｈｉｓおよび／またはｓｃＦｖ−Ｈｉｓ型で、標準的な変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，Ｔｘ）によって構築された。標準的なプロテインＡクロマトグラフィーにより二価ｍＡｂを精製し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによりＦａｂ−ＨｉｓおよびｓｃＦｖ−Ｈｉｓを精製した。本発明の例示的な１Ｇ６および２Ｅ９二価抗体、Ｆａｂ、ならびにｓｃＦｖの配列は、配列表のリストに記載されている（しかしながら、ポリヒスチジンタグはＦａｂおよびｓｃＦｖｓに関して除去された）。初期スクリーニング後、組み合わせは対象の変異体で構成され、これらは親和性および安定性について発現、精製、および再検査された。
【０４６４】
二価抗体の親和性スクリーニングをＯｃｔｅｔを使用して実施した。
抗ヒトＦｃ（ＡＨＣ）バイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、ＫＤ決定のために複数濃度のＰＤ−１−Ｈｉｓに浸漬した。ｓｃＦｖ−Ｈｉｓの安定性を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して評価した。ＤＳＦ実験をＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システムを使用して実施した。タンパク質をＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ蛍光色素と混合し、ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅの最終濃度は１０Ｘであった。２５℃での１０分間の初期インキュベーション期間後、タンパク質を１℃／分の加熱速度を使用して、２５℃から９５℃に加熱した。３０秒毎に蛍光測定を行った。融解温度（Ｔｍ）は、装置のソフトウェアを使用して計算した。親和性および安定性の結果を図２３に示す。
【０４６５】
２．抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ
抗ＣＴＬＡ−４抗体の親可変領域を、様々な二重特異性体の構成要素として使用するために操作した。改善された特性を有する変異体の同定を試みるために、２つのアプローチを取った：（１）単一、二重、および三重アミノ酸置換を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，Ｔｘ）変異誘発を介して行う、および（２）代替ヒト生殖系列（ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−１３、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０、ＩＧＫＶ３−１５）と交換されたそれらのフレームワークを有する再移植された配列がＤＮＡ合成およびサブクローニングによって構築された。変異体ＦａｂおよびｓｃＦｖを設計し、発現させ、精製した。ヒトおよびｃｙｎｏ  ＣＴＬＡ−４に対する親和性を、Ｏｃｔｅｔを使用して、Ｆａｂについて測定した。ＡＨＣバイオセンサを使用して、ヒトまたはｃｙｎｏ  ＣＴＬＡ−４のＦｃ融合体を捕捉し、ＫＤ決定のために複数濃度のＦａｂ試験物品に浸漬した。ＤＳＦを使用して、ＦａｂおよびｓｃＦｖの両方について熱安定性を測定した。加えて、少なくとも１つのヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列と正確に一致した配列９量体の数は、ＦａｂおよびｓｃＦｖの両方の可変領域のヒト性の尺度として計数された（例えば、米国特許第７，６５７，３８０号、２０１０年２月２日発行を参照されたい）。初期スクリーニング後、組み合わせは対象の変異体で構成され、これらは親和性および安定性について発現、精製、および再検査された。結果を図２４に要約する。いくつかの変異体は、ヒトおよびｃｙｎｏ  ＣＴＬＡ−４の両方に関して類似の親和性を保持しながら、親可変領域に対して増加した熱安定性を有した。加えて、ヒト生殖系列一致配列９量体の数によって測定される配列ヒト性の増加がいくつかの変異体に関して同定された。好ましい変異体としては、Ｈ０．２５＿Ｌ０、Ｈ０．２６＿Ｌ０、Ｈ０．２７＿Ｌ０、Ｈ０．２９＿Ｌ０、Ｈ０．３８＿Ｌ０、Ｈ０．３９＿Ｌ０、Ｈ０．４０＿Ｌ０、Ｈ０．７０＿Ｌ０、Ｈ０＿Ｌ０．２２、Ｈ２＿Ｌ０、Ｈ３＿Ｌ０、Ｈ３＿Ｌ０．２２、Ｈ３＿Ｌ０．６７、Ｈ３＿Ｌ０．７４、Ｈ３＿Ｌ０．４４、Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２０、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、Ｈ３．５＿Ｌ２．１、Ｈ３．５＿Ｌ２．２、Ｈ３．５＿Ｌ２．３、Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、およびＨ３．２５＿Ｌ０．１３２が含まれる。
【０４６６】
３．抗ＢＴＬＡ  ｍＡｂ  ９Ｃ６
実施例３で生成された抗ＢＴＬＡハイブリドーマクローン９Ｃ６は、一般に実施例４Ａで上述されるように、二価抗体型で最適な親和性および安定性を有するようにヒト化および操作された。本発明の例示的な抗ＢＴＬＡ二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
【０４６７】
変異体二価抗体の親和性スクリーニングをＯｃｔｅｔを使用して実施した。ＡＨＣバイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、ＫＤ決定のために、複数濃度のＢＴＬＡ−Ｈｉｓを含むウェルに浸漬した（抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１キメラ二重特異性体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌を促進することを示すＡおよびＢにおいて示される。ＰＢＭＣを、示される試験物品と共に１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。細胞上清を収集し、示される分析物についてＭＳＤでアッセイした。Ａ：２０μｇ／ｍＬの試験物品；Ｂ  ５μｇ／ｍＬの試験物品。
【０４６８】
図５２）。
【０４６９】
４．抗ＬＡＧ−３  ｍＡｂ  ７Ｇ８および２Ａ１１
実施例３で生成された抗ＬＡＧ−３ハイブリドーマクローン７Ｇ８および２Ａ１１は、一般に実施例４Ａに上述されるように、二重特異性免疫チェックポイント阻害剤で使用するためのＦａｂとの関連において最適な親和性および安定性を有するようにヒト化され、操作された。本発明の例示的な抗ＬＡＧ−３二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
【０４７０】
変異体抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂの親和性および安定性は、一般に実施例４Ａで上述されるように決定された。ＡＭＣバイオセンサを使用して、ヒトＬＡＧ−３のマウスＦｃ融合体を捕捉し、ＫＤ決定のために複数濃度の試験物品を含有するウェルに浸漬した。結果は、２Ａ１１変異体については図５３に示され、７Ｇ８変異体については図５４に示される。
【０４７１】
例示的な変異体２Ａ１１および７Ｇ８抗ＬＡＧ−３二価抗体を、ＭＨＣ−ＩＩを内因的に発現するＤａｕｄｉ細胞へのＬＡＧ−３結合を遮断するそれらの能力についてさらにスクリーニングした。１μｇのＬＡＧ−３−ｍＦｃを、室温で３０分間、示される濃度のｍＡｂと混合した。次いで、Ｄａｕｄｉ細胞を添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＬＡＧ−３−ｍＦｃ結合を、抗マウスＦｃ二次抗体で検出した。データを図６３に示す。
【０４７２】
５．抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂ
実施例３で生成された抗ＴＩＭ−３ハイブリドーマクローンは、一般に実施例４Ａで上述されるように、二価抗体型で最適な親和性および安定性を有するようにヒト化および操作された。本発明の例示的な抗ＴＩＭ−３二価抗体の配列は、配列表のリストに記載される。
【０４７３】
変異体二価抗体の親和性スクリーニングをＯｃｔｅｔを使用して実施した。ＡＨＣバイオセンサを使用して試験物品を捕捉し、ＫＤ決定のために複数濃度のＴＩＭ−３−Ｈｉｓを含有するウェルに浸漬した（図２２に示される）。
【０４７４】
最適化した変異体を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞結合についても試験した。ヒトＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで７２時間刺激した。刺激後、細胞を示される試験物品で処理した。３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１（ＸＥＮＰ２１１８９）のＣＤ３＋細胞に対する結合は、抗ヒトＦｃ二次抗体を用いて検出され、図２１に示された。７Ｂ１１＿ＨＪ１＿Ｌ１．１（ＸＥＮＰ２１１９６）のＣＤ３＋細胞に対する結合は、抗ヒトＩｇＧ−ＡＰＣ二次抗体を用いて検出され、図２１に示された。
【０４７５】
６．変異体抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の親和性スクリーニング
実施例４Ｄに記載される最適化した抗ＬＡＧ−３二価抗体に由来する抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂを含む二重特異性抗体、および実施例４Ｂに記載される例示的な抗ＣＴＬＡ−４ｓｃＦｖを、一般に上述のように、Ｏｃｔｅｔを使用して親和性についてスクリーニングした。具体的には、ＡＭＣまたはＨＩＳ１Ｋバイオセンサを使用して、ヒトＬＡＧ−３のマウスＦｃ融合体またはヒトＬＡＧ−３のＨｉｓ−Ａｖｉタグ付きＴＥＶ−Ｆｃ融合体を捕捉し、試験物品を含有するウェルに浸漬してＫＤを決定した。結果を図５５に示す。
【０４７６】
７．変異体抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体の親和性スクリーニング。
実施例４Ｄに記載される最適化した抗ＬＡＧ−３二価抗体に由来する抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂを含む二重特異性抗体、および実施例４Ａに記載される例示的な抗ＰＤ−１ｓｃＦｖを、一般に上述のように、Ｏｃｔｅｔを使用して親和性についてスクリーニングした。具体的には、ＡＭＣまたはＨＩＳ１Ｋバイオセンサを使用して、ヒトＬＡＧ−３のマウスＦｃ融合体またはヒトＬＡＧ−３のＨｉｓ−Ａｖｉタグ付きＴＥＶ−Ｆｃ融合体を捕捉し、試験物品を含有するウェルに浸漬してＫＤを決定した。結果を図６１に示す。
【０４７７】
Ｅ．実施例５：親和性および安定性最適化アームを有する二重特異性免疫チェックポイント抗体のインビトロ評価
１．抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体
ａ．二重特異性抗ＰＤ−１×抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体はＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２とのＰＤ−１相互作用を遮断する
ＰＤ−１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＸＥＮＰ２０７１７（抗ＰＤ−１×抗ＣＴＬＡ−４）、および片腕抗ＰＤ−１、および抗ＣＴＬＡ−４対照（それぞれ、ＸＥＮＰ２０１１１およびＸＥＮＰ２００５９）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃまたはＰＤ−Ｌ２−ｍＦｃを添加し、４℃で３０分間さらにインキュベートした。ＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃおよびＰＤ−Ｌ２−ｍＦｃを、抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出した。
【０４７８】
図４５は、ＸＥＮＰ２０７１７が用量依存様式でＰＤ−１のリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２への結合を遮断することができたことを示す。ＸＥＮＰ２０１１１もＰＤ−１のリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２への結合を遮断することができ、一方でＸＥＮＰ２０５５９はそのリガンドへのＰＤ−１結合を遮断しなかった。
【０４７９】
ｂ．ＣＤ３＋細胞上の二重特異性抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体のＴ細胞結合
ヒトＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激し、培養培地で２回洗浄し、次いで５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢでさらに２４時間再刺激した。次いで、ＰＢＭＣを、４℃で３０分間、ＸＥＮＰ２０７１７（抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１）で処理した。処理後、ＰＢＭＣを洗浄し、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＴ１）ｍＡｂを有するＣＤ３＋細胞上の抗ヒトＦｃ−（Ｆａｂ断片特異的）−ＡＰＣ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）と共にインキュベートした。次いで、ＰＢＭＣを２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。図４５は、７つの固有のＰＢＭＣドナーの平均ＭＦＩを示し、ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＸＥＮＰ２０７１７の結合を示し、結合が用量依存性様式であることを示す。
【０４８０】
ｃ．Ｔ細胞活性化に対する変異体抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体の評価
変異体抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂアームを有する抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体を、ＭＬＲアッセイにおいて試験した。混合ＰＢＭＣを、等モルＰＤ−１結合濃度の、６９．５ｎＭの二価抗体（例えば、ニボルマブ）または１３９ｎＭの二重特異性抗体（例えば、ＸＥＮＰ１６００４）で処理した。示されるデータはいくつかの抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂスクリーニングの結果を示す。これは、ＦａｂおよびｓｃＦｖの実施形態のＸＥＮＰコード、ｖｈおよびｖｌ操作されたドメインの指定、Ｏｃｔｅｔにより測定される、ヒトおよびｃｙｎｏＣＴＬＡ−４に対するＫＤ結合定数、ならびにｓｃＦｖおよびＦａｂのＴｍを示す。加えて、少なくとも１つのヒトＶＨまたはＶＬ生殖系列と正確に一致した配列９量体の数は、ＦａｂおよびｓｃＦｖの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
【０４８１】
図２５Ｂは、いくつかの二重特異性抗体がニボルマブ単独よりも優れたＩＬ−２誘導を可能にすることを示す。
【０４８２】
ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬのＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ）またはＸＥＮＰ２０７１７および５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで処理した。上清を、Ｔ細胞活性化の指標としてＩＬ−２についてアッセイした。図６９に示されるデータは、抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体がニボルマブ単独よりも顕著に多いＩＬ−２放出を誘導することを示す。
【０４８３】
別の研究において、ＸＥＮＰ１６４３２、ＸＥＮＰ２０７１７、および片腕組み合わせ対照を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。ＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで２０μｇ／ｍＬの試験物品および５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢを含む培養培地を添加した。上清を２４時間後に収集し、ＩＬ−２についてアッセイした。ＳＥＢ刺激なしの対照実験において、ＰＢＭＣを示される試験物品で３日間処理した後、上清をＩＬ−２についてアッセイした。Ｉｌ−２濃度の倍数変化は図４５Ａ〜Ｃに示される。図４５Ｂに示されるように、ＸＥＮＰ２０７１７は、ニボルマブよりも顕著に多くＩＬ−２分泌を増強した。データは、ＸＥＮＰ２０７１７が抗ＰＤ−１二価単独、ならびに片腕抗ＰＤ−１および片腕抗ＣＴＬＡ−４の組み合わせの両方よりも強くＴ細胞を活性化し、複数の免疫チェックポイント受容体を発現するＴ細胞を選択的に活性化する利点を示す。特に、および実施例２Ｂに記載される所見と一貫して、二重特異性体ＸＥＮＰ２０７１７は、ＸＥＮＰ２０７１７に由来する片腕抗体の組み合わせよりも大幅にＩＬ−２分泌を増強した。
【０４８４】
抗ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖアームおよび変異体２Ｅ９抗ＰＤ−１  Ｆａｂアームを有するＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を標的とする追加の二重特異性抗体および対照試験物品を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて試験した。ヒトＰＢＭＣを、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した。処理２４時間後に上清をＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイした（図１９ＡおよびＢにそれぞれ示される）。
【０４８５】
２．抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性チェックポイント抗体のインビトロ評価
ａ．Ｔ細胞活性化に対する変異体抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体の評価
ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬのＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ）またはＸＥＮＰ２２６０４および５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで処理した。上清を、Ｔ細胞活性化の指標としてＩＬ−２についてアッセイした（図６９に示される）。
【０４８６】
最適化２Ａ１１抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂアームを有する追加の抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体（実施例４に記載されるように生成された変異体ｍＡｂに由来する）も、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞活性化について評価した。複数のドナー由来のヒトＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬの示される試験物品と組み合わせて５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。処理の２４時間後、細胞上清を、ＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイした。Ｎｕｍａｘ二価に対するＩＬ−２およびＩＦＮγの倍数増加についてのデータが図６４に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
【０４８７】
データは、いくつかの抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体がニボルマブ単独または抗ＬＡＧ−３二価単独よりも強くＴ細胞を活性化することを示す。
【０４８８】
３．抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性チェックポイント抗体のインビトロ評価
ａ．ＣＤ３＋細胞上の二重特異性抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体のＴ細胞結合
最適化抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームを有する抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体（実施例４に記載されるように生成された変異体ｍＡｂに由来する）も、Ｔ細胞上の結合について評価した。ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激し、その後、ＰＢＭＣを、４℃で３０分間、示される試験物品で処理した。次いで、ＰＢＭＣを、抗ヒトＦｃ二次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。図４７は、ＣＤ３＋細胞上の示される試験物品の結合を示す。
【０４８９】
データは、本発明の抗ＰＤ−１ｘ抗ＢＴＬＡ二重特異性チェックポイント抗体（例えば、ＸＥＮＰ２０８９５、ＸＥＮＰ２１２２０、およびＸＥＮＰ２１２２１）が片腕対照（例えば、ＸＥＮＰ２１４４６およびＸＥＮＰ１６０１１）と比較してより強くＴ細胞に結合することを示す。これは、ヒトＴ細胞への結合が一般に、各アームが異なる抗原に一価的に結合する二重特異性抗体で、片腕対照などの一価の単一特異性抗体よりも良好であることを示す。
【０４９０】
ｂ．Ｔ細胞活性化に対する変異体抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性体の評価
プロトタイプ抗ＢＴＬＡ（例えば、４Ｃ７、８Ｄ５、およびＥ８Ｄ９）および９Ｃ６  Ｆａｂアームを有する抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞活性化について評価した。複数のドナー由来のヒトＰＢＭＣを、５μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬの示される試験物品と共に、７２時間、１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。処置後、細胞上清を、それぞれ、図１Ｊおよび１Ｋに示される、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイした。データは、９Ｃ６ハイブリドーマ由来アームを含む二重特異性抗体が、抗ＰＤ−１二価単独が増強するよりも大きいだけでなく、プロトタイプ抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームを有する二重特異性体が増強するよりも大きくＴ細胞活性化を増強したことを示す。
【０４９１】
例示的な抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１  ＸＥＮＰ−２１２２０およびＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ）を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて評価した。ＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬのＸＥＮＰ１６４３２またはＸＥＮＰ２１２２０および５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで処理した。上清を、Ｔ細胞活性化の指標としてＩＬ−２についてアッセイした（図６９に示される）。
【０４９２】
変異体９Ｃ６抗ＢＴＬＡ  Ｆａｂアームおよび片腕変異体９Ｃ６抗体（単独で、および片腕抗ＰＤ−１抗体との組み合わせで）を有する追加の抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性体を、上述のように、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてＴ細胞活性化について評価した。ＰＢＳでの処理に対するＩＬ−２およびＩＦＮγ分泌の倍数増加についてのデータが図１Ｌに示される。
【０４９３】
４．抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント抗体のインビトロ評価
ａ．ＣＤ３＋細胞上の二重特異性抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体のＴ細胞結合
抗ＬＡＧ−３  Ｆａｂアームおよび片腕変異体抗ＬＡＧ−３抗体を有する抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体を、Ｔ細胞で結合について評価した。ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激し、その後、ＰＢＭＣを、４℃で３０分間、示される試験物品で処理した。処理後、ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＦｃ−ＡＰＣ抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＢＭＣを２回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。図５６は、ＣＤ３＋Ｔ細胞上の示される試験物品の結合を示す。
【０４９４】
データは、本発明のいくつかの抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント抗体（例えば、ＸＥＮＰ２２５０５およびＸＥＮＰ２１８９６）が片腕対照（例えば、ＸＥＮＰ２２５１６）と比較してより強くＴ細胞に結合することを示す。これは、ヒトＴ細胞への結合が、各アームが異なる抗原に一価的に結合する二重特異性抗体で、片腕対照などの一価の単一特異性抗体よりも良好であり得ることを示す。
【０４９５】
ｂ．抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体によるＴ細胞活性化
抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体を、ＭＬＲおよびＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、Ｔ細胞活性化について評価した。
【０４９６】
４０のＭＬＲ反応を、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品の存在下で行い、細胞上清を、ＩＬ−２およびＩＦＮγについて、処理の６日後にアッセイした。図５９は、抗ＲＳＶ二価（ＸＥＮＰ１５０７４）に対するＩＬ−２およびＩＦＮγにおける倍数誘導を示す。
【０４９７】
ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、ＰＢＭＣを５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間処理した。次いで、細胞を洗浄し、２０μｇ／ｍＬのＸＥＮＰ１６４３２（ニボルマブ）、ＸＥＮＰ２２６０２、またはＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ２２６０２の組み合わせ、ならびに５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで処理した。上清を、Ｔ細胞活性化の指標としてＩＬ−２についてアッセイした（図６９に示される）。
【０４９８】
別のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、追加の抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体を評価した。複数のドナー由来のヒトＰＢＭＣを、５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で２回洗浄し、２０μｇ／ｍＬの示される試験物品と組み合わせて５００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激した。処理の２４時間後、細胞上清を、ＩＬ−２およびＩＦＮγについてアッセイした。Ｎｕｍａｘ二価に対するＩＬ−２およびＩＦＮγの倍数増加についてのデータが図５７および図５８および図６０に示される。各点は、技術的一重項において表されるドナーを示す。
【０４９９】
データは、抗ＰＤ−１二価および抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体の組み合わせがＴ細胞活性化において相乗的効果をもたらすことを示す実施例２Ｄと一致する。さらに、データは、７Ｇ８に基づく抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体がＰＢＭＣで２Ａ１１に基づく抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体よりも選択的な機能を呈することを示す。
【０５００】
Ｆ．実施例６：二重特異性免疫チェックポイント抗体のインビボ評価
１．抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体はヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
いくつかのＧＶＨＤ研究において、本発明の例示的な抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体は、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着および疾患活性を増強することが示された。
【０５０１】
第１の研究において、０日目に、ＩＶ−ＯＳＰを介して１０００万個のヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウスに移植した。１日目に、マウスにＸＥＮＰ１６４３２（２．８９ｍｇ／ｋｇ）、ＸＥＮＰ２００５３（２ｍｇ／ｋｇ）、ならびにＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ１６４３３（２．８９＋２．９２ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを投薬した。ＣＤ４５＋細胞計数を１４日目に測定した（図７０に示される）。
【０５０２】
変異体抗ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂおよび抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖアームを有する追加の抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体を評価した。１０００万個のヒトＰＢＭＣを、０日目にＩＶ−ＯＳＰを介してＮＳＧマウスに移植し、その後１日目に示される試験物品（５ｍｇ／ｋｇまたは示されるとおり）を投薬した。ＣＤ４５＋細胞計数を１４日目に測定した（図１ＱＡ、図１ＲＡ、および図１Ｓ）。ＩＦＮγレベルもＧＶＨＤの追加の指標として測定され、ＣＤ４５＋細胞レベルに対してプロットされた（変異体ＣＴＬＡ−４  Ｆａｂアームおよび変異体抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖアームを有する抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体、ならびにニボルマブ単独、イピリムマブ単独、ならびに対照としてニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体によるＩＬ−２放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
【０５０３】
図２７および図３０）。
【０５０４】
データは、本発明の抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント抗体が、対照（ＰＢＳ＋ＰＢＭＣ）と比較して、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の増殖を増強することを示す。さらに、ニボルマブ（ＸＥＮＰ１６４３２）単独で見られるよりも、本発明の抗体を使用する方が増強が大きい。図３１は、研究１６０３１４（図２６に提示される）と１６０３３１（図２９に提示される）との間のＣＤ４５＋細胞増殖に対する試験物品効果の比較を示す。両方の研究は、ニボルマブ単独よりも抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性チェックポイント抗体．が優れていることを一貫して示す。
【０５０５】
別の研究において、Ｘｔｅｎｄ  Ｆｃを有する抗ＣＴＬＡ−４ｘ抗ＰＤ−１二重特異性抗体を評価した。ＰＢＭＣ移植マウスに示される濃度で示される試験物品を投薬し、ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋事象を１４日目に測定した（図２０に示される）。
【０５０６】
２．抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性体はヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
第１の研究において、０日目に、ＩＶ−ＯＳＰを介して１０００万個のヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウスに移植した。１日目に、マウスにＸＥＮＰ１６４３２（２．８９ｍｇ／ｋｇ）およびＸＥＮＰ２０８９５（５ｍｇ／ｋｇ）を投薬した。ＣＤ４５＋細胞計数を１４日目に測定した（図７０に示される）。
【０５０７】
抗ＢＴＬＡｘ抗ＰＤ−１二重特異性体ＸＥＮＰ２０８９５を第２のＧＶＨＤ研究で評価した。１０００万個のヒトＰＢＭＣを、０日目にＩＶ−ＯＳＰを介してＮＳＧマウスに移植し、その後１日目に示される試験物品（示される濃度で）を投薬した。ＣＤ４５＋細胞計数およびＩＦＮγを、１０、１４、および２２日目に測定した（それぞれ、図５１に示される）。
【０５０８】
３．抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１二重特異性体はヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
ＧＶＨＤにおいて、０日目に、ＩＶ−ＯＳＰを介して１０００万個のヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウスに移植した。１日目に、マウスにＸＥＮＰ１６４３２（２．８９ｍｇ／ｋｇ）およびＸＥＮＰ２２６７２（５ｍｇ／ｋｇ）を投薬した。ＣＤ４５＋細胞計数を１４日目に測定した（図７０に示される）。
【０５０９】
実施例６Ａに記載される第２の研究において、別の例示的な抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＰＤ−１（ＸＥＮＰ２２８４７）も評価された（図２０Ｃ）。
【０５１０】
４．抗ＬＡＧ−３ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性体はヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおいて生着および疾患活性を増強する
ＧＶＨＤにおいて、０日目に、ＩＶ−ＯＳＰを介して１０００万個のヒトＰＢＭＣをＮＳＧマウスに移植した。１日目に、マウスにＸＥＮＰ１６４３２（２．８９ｍｇ／ｋｇ）、ＸＥＮＰ２２６７５（５ｍｇ／ｋｇ）、ならびにＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ２２６７５（５＋５ｍｇ／ｋｇ）の組み合わせを投薬した。ＣＤ４５＋細胞計数を１４日目に測定した（図７０に示される）。
【０５１１】
データは、ＸＥＮＰ２２６７５がニボルマブ単独での投薬を上回って生着および疾患活性を強化することを示す。特に、ニボルマブと組み合わせたＸＥＮＰ２２６７５は、相乗的に作用して生着をさらに増強する。
【０５１２】
Ｇ．実施例７：抗ＰＤ−１ｘ抗ＣＴＬＡ−４二重特異性抗体はＫＧ１  Ａ−ｌｕｃがん細胞およびヒトＰＢＭＣを移植されたＮＳＧマウスにおいて抗腫瘍活性を呈する
０日目に、ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスに、ＫＧ１Ａ−ｌｕｃがん細胞を移植した。２１日目に、ヒトＰＢＭＣをマウスに腹腔内移植した。ＰＢＭＣ生着後、腹腔内注入により示される試験物品を毎週投薬した（対照マウスにはＰＢＳを投薬した）。インビボ撮像システム（ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩＩ）を使用して、各マウスの総フラックスを測定することにより腫瘍成長を監視し、データは図７１に示される（最初の投薬後の日数）。
【０５１３】
ＸＩＩＩ．参照による組み込み
ＵＳＳＮ６２／４２０，５００からの「抗ＣＴＬＡ−４」（請求項セットＡ１〜Ａ３０）、「抗ＰＤ−１」（請求項セットＢ１〜Ｂ３０）、「抗ＬＡＧ−３」（請求項セットＣ１〜Ｃ２８）、「抗ＴＩＭ−３」（請求項セットＤ１〜Ｄ２８）、「抗ＴＩＧＩＴ」（請求項セットＥ１〜Ｅ２８）、「抗ＢＴＬＡ」（請求項セットＦ１〜Ｆ２８）、「骨格＋Ｆｖ」（請求項セットＹ１〜Ｙ５）、および「特定の分子」（請求項セットＸ１〜Ｘ１６）の請求項セットは、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【図１Ａ−Ｅ】
2019525738.tif 000005
【図１Ｆ−Ｉ】
2019525738.tif 000006
【図２Ａ】
2019525738.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2019525738.tif 000011
【図３Ｂ】
2019525738.tif 000012
【図３Ｃ】
2019525738.tif 000013
【図３Ｄ】
2019525738.tif 000014
【図３Ｅ】
2019525738.tif 000015
【図３Ｆ】
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【図４】
2019525738.tif 000017
【図５】
2019525738.tif 000018
【図６Ａ】
2019525738.tif 000019
【図６Ｂ】
2019525738.tif 000020
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
2019525738.tif 000033
【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
2019525738.tif 000039
【図１０Ｌ】
2019525738.tif 000040
【図１０Ｍ】
2019525738.tif 000041
【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１０Ｒ】
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【図１０Ｓ】
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【図１０Ｔ】
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【図１０Ｕ】
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【図１０Ｖ】
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【図１０Ｗ】
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【図１０Ｘ】
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【図１０Ｙ】
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【図１０Ｚ】
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【図１０ＡＡ】
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【図１０ＢＢ】
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【図１０ＣＣ】
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【図１０ＤＤ】
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【図１０ＥＥ】
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【図１０ＦＦ】
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【図１０ＧＧ】
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【図１０ＨＨ】
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【図１０ＩＩ】
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【図１０ＪＪ】
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【図１０ＫＫ】
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【図１０ＬＬ】
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【図１０ＭＭ】
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【図１０ＮＮ】
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【図１０ＯＯ】
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【図１０ＰＰ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
2019525738.tif 000073
【図１１Ｄ】
2019525738.tif 000074
【図１１Ｅ】
2019525738.tif 000075
【図１１Ｆ】
2019525738.tif 000076
【図１１Ｇ】
2019525738.tif 000077
【図１１Ｈ】
2019525738.tif 000078
【図１１Ｉ】
2019525738.tif 000079
【図１１Ｊ】
2019525738.tif 000080
【図１１Ｋ】
2019525738.tif 000081
【図１１Ｌ】
2019525738.tif 000082
【図１１Ｍ】
2019525738.tif 000083
【図１１Ｎ】
2019525738.tif 000084
【図１２Ａ】
2019525738.tif 000085
【図１２Ｂ】
2019525738.tif 000086
【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
2019525738.tif 000088
【図１３Ｂ】
2019525738.tif 000089
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2019525738.tif 000091
【図１３Ｅ】
2019525738.tif 000092
【図１３Ｆ】
2019525738.tif 000093
【図１３Ｇ】
2019525738.tif 000094
【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
2019525738.tif 000100
【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
2019525738.tif 000104
【図１４Ｉ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１６Ａ】
2019525738.tif 000117
【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１８】
2019525738.tif 000136
【図１９】
2019525738.tif 000137
【図１９Ａ】
2019525738.tif 000138
【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
2019525738.tif 000146
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【図２３Ｉ】
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【図２３Ｊ】
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【図２３Ｋ】
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【図２３Ｌ】
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【図２３Ｍ】
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【図２３Ｎ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２５】
2019525738.tif 000168
【図２６】
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【図２７】
2019525738.tif 000170
【図２８】
2019525738.tif 000171
【図２９】
2019525738.tif 000172
【図３０】
2019525738.tif 000173
【図３１】
2019525738.tif 000174
【図３２】
2019525738.tif 000175
【図３３Ａ】
2019525738.tif 000176
【図３３Ｂ】
2019525738.tif 000177
【図３４】
2019525738.tif 000178
【図３５】
2019525738.tif 000179
【図３６Ａ】
2019525738.tif 000180
【図３６Ｂ】
2019525738.tif 000181
【図３７Ａ】
2019525738.tif 000182
【図３７Ｂ】
2019525738.tif 000183
【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
2019525738.tif 000185
【図３７Ｅ】
2019525738.tif 000186
【図３８Ａ】
2019525738.tif 000187
【図３８Ｂ】
2019525738.tif 000188
【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
2019525738.tif 000190
【図３９Ａ】
2019525738.tif 000191
【図３９Ｂ】
2019525738.tif 000192
【図４０】
2019525738.tif 000193
【図４１Ａ】
2019525738.tif 000194
【図４１Ｂ】
2019525738.tif 000195
【図４２】
2019525738.tif 000196
【図４３】
2019525738.tif 000197
【図４４】
2019525738.tif 000198
【図４５Ａ】
2019525738.tif 000199
【図４５Ｂ】
2019525738.tif 000200
【図４５Ｃ】
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【図４６Ａ】
2019525738.tif 000202
【図４６Ｂ】
2019525738.tif 000203
【図４７】
2019525738.tif 000204
【図４８】
2019525738.tif 000205
【図４９】
2019525738.tif 000206
【図５０Ａ】
2019525738.tif 000207
【図５０Ｂ】
2019525738.tif 000208
【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
2019525738.tif 000210
【図５２Ａ】
2019525738.tif 000211
【図５２Ｂ】
2019525738.tif 000212
【図５３Ａ】
2019525738.tif 000213
【図５３Ｂ】
2019525738.tif 000214
【図５３Ｃ】
2019525738.tif 000215
【図５３Ｄ】
2019525738.tif 000216
【図５３Ｅ】
2019525738.tif 000217
【図５３Ｆ】
2019525738.tif 000218
【図５４】
2019525738.tif 000219
【図５５Ａ】
2019525738.tif 000220
【図５５Ｂ】
2019525738.tif 000221
【図５５Ｃ】
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【図５５Ｄ】
2019525738.tif 000223
【図５５Ｅ】
2019525738.tif 000224
【図５６Ａ】
2019525738.tif 000225
【図５６Ｂ】
2019525738.tif 000226
【図５６Ｃ】
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【図５６Ｄ】
2019525738.tif 000228
【図５６Ｅ】
2019525738.tif 000229
【図５６Ｆ】
2019525738.tif 000230
【図５６Ｇ】
2019525738.tif 000231
【図５６Ｈ】
2019525738.tif 000232
【図５６Ｉ】
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【図５６Ｊ】
2019525738.tif 000234
【図５６Ｋ】
2019525738.tif 000235
【図５７Ａ】
2019525738.tif 000236
【図５７Ｂ】
2019525738.tif 000237
【図５８】
2019525738.tif 000238
【図５９Ａ】
2019525738.tif 000239
【図５９Ｂ】
2019525738.tif 000240
【図６０Ａ】
2019525738.tif 000241
【図６０Ｂ】
2019525738.tif 000242
【図６１Ａ】
2019525738.tif 000243
【図６１Ｂ】
2019525738.tif 000244
【図６２Ａ】
2019525738.tif 000245
【図６２Ｂ】
2019525738.tif 000246
【図６３Ａ】
2019525738.tif 000247
【図６３Ｂ】
2019525738.tif 000248
【図６４Ａ】
2019525738.tif 000249
【図６４Ｂ】
2019525738.tif 000250
【図６５】
2019525738.tif 000251
【図６６】
2019525738.tif 000252
【図６７Ａ】
2019525738.tif 000253
【図６７Ｂ】
2019525738.tif 000254
【図６７Ｃ】
2019525738.tif 000255
【図６７Ｄ】
2019525738.tif 000256
【図６７Ｅ】
2019525738.tif 000257
【図６７Ｆ】
2019525738.tif 000258
【図６８】
2019525738.tif 000259
【図６９】
2019525738.tif 000260
【図７０】
2019525738.tif 000261
【図７１】
2019525738.tif 000262
【図７２】
2019525738.tif 000263
【図７３】
2019525738.tif 000264
【図７４】
2019525738.tif 000265
【図７５】
2019525738.tif 000266
【図７６Ａ】
2019525738.tif 000267
【図７６Ｂ】
2019525738.tif 000268
【配列表】
2019525738000001.app
【国際調査報告】
2019525738.tif 000269
2019525738.tif 000270
2019525738.tif 000271
2019525738.tif 000272
2019525738.tif 000273
2019525738.tif 000274