(57)【要約】  本発明は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用してタウ凝集体を画像化および定量化するのに有用な、新規な選択的放射標識タウリガンドに関する。本発明はまた、このような化合物を含む組成物、このような化合物および組成物の調製方法、組織または対象をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで画像化するためのこのような化合物および組成物の使用、および前記化合物の前駆体も対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2019511461.tif 000030
［式中、
少なくとも１つの原子は放射性であり、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］
による化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
式（Ｉ’）
【化２】
2019511461.tif 000031
［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］を有する請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項３】
【化３】
2019511461.tif 000032
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物が滅菌溶液である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
タウ凝集体を結合させ、画像化するのに使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象の脳内のタウ凝集体の画像診断に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
タウオパチーに罹患している、または罹患している疑いのある患者のタウ凝集体を結合させ、画像化するのに使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
タウ凝集体を結合させ、画像化するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または請求項４もしくは５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
（ａ）式（Ｐ−１）［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１であり、［陰イオン］−は好適な陰イオン性対イオンである］の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、好適な条件下でフッ化物源１８Ｆ−と反応させるステップ、または（ｂ）式（Ｉ−Ａ）［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１であり、ＬＧは好適な脱離基である］の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、好適な条件下でフッ化物源１８Ｆ−と反応させるステップを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の調製方法。
【化４】
2019511461.tif 000033
【請求項１１】
式（Ｉ−Ａ）および（Ｐ−１）
【化５】
2019511461.tif 000034
［式中、ＬＧは好適な脱離基であり、［陰イオン］−は好適な陰イオン性対イオンであり、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］から選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１２】
式［１９Ｆ］−（Ｉ）
【化６】
2019511461.tif 000035
［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１３】
式（Ｉ−３）の化合物を、適切な式（ＩＩ）の４−アミノ−ピリジン化合物［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］と、
【化７】
2019511461.tif 000036
ブッフバルトアミノ化条件下で反応させるステップを含む、請求項１２に記載の化合物の調製方法。
【請求項１４】
式（Ｉ−３）
【化８】
2019511461.tif 000037
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を使用してタウ凝集体を画像化および定量化するのに有用な、新規な選択的放射標識タウリガンドに関する。本発明はまた、このような化合物を含む組成物、このような化合物および組成物の調製方法、組織または対象をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで画像化するためのこのような化合物および組成物の使用、および前記化合物の前駆体も対象とする。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老化に伴う神経変性疾患である。ＡＤ患者は、認知障害および記憶喪失、ならびに不安症などの行動問題を患う。ＡＤに罹患している人の９０％超が散発型の障害を有するが、この症例の１０％未満が家族性または遺伝性である。米国では、６５歳で約１０人に１人がＡＤを有するが、８５歳では２人に１人がＡＤに罹患している。初期診断からの平均余命は７〜１０年であり、ＡＤ患者は、介護付き生活施設での、または家族による、広範な介護を必要とする。人口に占める高齢者の数が増加するにつれ、ＡＤに対する医学的関心が高まっている。現在使用可能なＡＤの治療は、単にこの疾患の症状を処置するものに過ぎず、この疾患を引き起こす根底にある病理を処置するものではない。
【０００３】
ＡＤ患者の脳における顕著な病理学的特徴は、過剰リン酸化したタウタンパク質の凝集体によって生じる神経原線維変化、およびβ−アミロイドペプチドの凝集によって形成されるアミロイド斑である。最も蔓延している神経変性障害はＡＤであるが、凝集タウタンパク質はまた、「タウオパチー」として知られる他の神経変性疾患の特徴でもあり、その疾患には、追加として、以下のみというわけではないが、神経原線維変化のみの認知症（ＴＤ：ｔａｎｇｌｅ−ｏｎｌｙ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、および１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）が含まれる。これらの障害の異質性は、ヒトタウの広範なアイソフォームおよび翻訳後修飾と密接な関連がある。タウ凝集体は、超微細構造的に、対らせん状細線維（ＰＨＦ：ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）、直線状細線維（ＳＦ：ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）、ランダムコイル状細線維（ＲＣＦ：ｒａｎｄｏｍｌｙ  ｃｏｉｌｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）、またはねじれ状細線維（ＴＦ：ｔｗｉｓｔｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）として現れる場合があり、この多様性が翻訳されて多型になる。神経原線維変化と、ＡＤにおける認知障害のレベルおよび／またはＡＤを発症する確率との相関性が作られている。しかしながら、診断は依然として、死後に組織診／剖検によって行われ得るのみである。病歴および統計的な記憶試験に基づく検査は、障害または認知症の明らかな証拠を必要とし、不正確である、または感度が低いことが多く、腰椎穿刺による脳脊髄液中のＡβペプチドおよび総タウタンパク質の測定は侵襲的であり、有害作用を受けやすい。ＡＤに固有の複雑さは別にしても、早期診断、進行度分類、および疾患進行の正確なモニタリングのための信頼のおけるツールが不足しているため、治療法の開発が阻まれてきた。したがって、診断を行う、および／または疾患進行をモニターする手段を突き止めることが依然として必要である。タウ凝集体を画像化することは、特に抗タウ処置が登場したときに、このような手段になり得る。
【０００４】
ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）は、すべての核画像化技術の中で最高の空間および時間分解能を提供する非侵襲的画像化技術であり、組織中のトレーサー濃度の真の定量化を可能にすることができるという付加的な利点を有する。ＰＥＴは検出のためにポジトロン放出核種を使用する。これまでに、タウ凝集体の画像化用に、ポジトロン放出断層撮影放射性トレーサーがいくつか報告されている（レビューについては、例えばＡｒｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８，４３６５−４３８２を参照）。以下に限定されるものではないが、タウ凝集体に対する高親和性および高選択性、可逆的な結合、浸透性、好適な脳内薬物動態学的プロファイル、すなわち、脳全体への急速な分布、急速クリアランス、最小限の非特異的結合、ならびに合成の容易性を含む、特性のバランスが良好な、タウ凝集体を画像化するための選択的な改良型のポジトロン放出断層撮影放射性トレーサーを提供することが依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、タウＰＥＴ放射性トレーサーとして有用な化合物を提供することである。したがって、一態様において、本発明は式（Ｉ）
【化１】
2019511461.tif 000002
［式中、
少なくとも１つの原子は放射性であり、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］
を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
特に、本発明は式（Ｉ’）
【化２】
2019511461.tif 000003
［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、上記に定義した式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物を合成するための前駆体化合物に関する。したがって、本発明はまた、式（Ｉ−３）、（Ｉ−Ａ）および（Ｐ−１）
【化３】
2019511461.tif 000004
［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ＬＧは好適な脱離基であり、［陰イオン］−は好適な陰イオン性対イオンである］の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物にも関する。
【０００８】
好適な脱離基とは、１８Ｆに置換されることが可能なものであり、トリメチルアンモニウム、クロロ、ブロモ、ニトロおよび４−メチルベンゼンスルホネート（トシレート）からなる群から選択することができる。好適な陰イオン性対イオンとしては、トリフルオロアセテート（−［ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３］−）、有機スルホネート（例えばＣ１〜４アルキルスルホネート、またはフェニルがＣ１〜４アルキル、ハロまたはニトロ基で任意選択により置換されていてもよいフェニルスルホネート）およびタルトレートが挙げられる。Ｃ１〜４アルキルスルホネートの具体的な例としては、メタンスルホネート（メシレート）およびエタンスルホネートが挙げられ、フェニルスルホネートの具体的な例としては、ベンゼンスルホネート、４−メチルベンゼンスルホネート（トシレート）、４−ブロモベンゼンスルホネートおよび４−ニトロベンゼンスルホネートが挙げられる。特に、陰イオン性対イオンはトリフルオロアセテート（−［ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３］−）、トシレートおよびメシレートから選択される。
【０００９】
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物の関連材料であって、関連する非放射標識化合物に相当し、本明細書では式［１９Ｆ］−（Ｉ）
【化４】
2019511461.tif 000005
［式中、メチル置換基は、存在する場合、ピリジル環の任意の利用可能な炭素原子に結合しており、ｎは０または１である］の化合物と称す関連材料、ならびにその薬学的に許容される塩および溶媒和物にも関する。
【００１０】
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物にも関する。特に、前記医薬組成物は診断用医薬組成物である。前記医薬組成物は、具体的には滅菌溶液である。したがって、本発明の実例は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を含む滅菌溶液である。
【００１１】
本発明は、さらに、画像化剤としての式（Ｉ）の化合物の使用に関する。本発明の例示は、組織もしくは対象をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで画像化するための、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物の使用、または組織もしくは対象をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで画像化する方法である。
【００１２】
特に、本発明は、タウオパチーに罹患している、または罹患している疑いのある患者のタウ凝集体を結合させ、画像化するのに使用するための式（Ｉ）の化合物に関する。特定のタウオパチーは、例えば、アルツハイマー病、神経原線維変化のみの認知症（ＴＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、および１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）である。特に、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００１３】
本発明は、さらに、対象の脳内のタウ凝集体を画像診断するための式（Ｉ）の化合物、およびタウオパチーに罹患している、または罹患している疑いのある患者のタウ凝集体を結合させ、画像化することにおける式（Ｉ）の化合物の使用に関する。特定のタウオパチーは、例えば、アルツハイマー病、神経原線維変化のみの認知症（ＴＤ）、嗜銀顆粒病（ＡＧＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、および１７番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤＰ−１７）である。特に、タウオパチーはアルツハイマー病である。
【００１４】
本発明はまた、検出可能な量の本明細書に記載の式（Ｉ）の標識化合物を組織または対象に接触させる、または提供する、または投与するステップ、および式（Ｉ）の化合物を検出するステップを含む、組織または対象を画像化する方法にも関する。
【００１５】
本発明のさらなる例示は、本明細書に記載の式（Ｉ）の化合物を組織または対象に接触させる、または提供するステップ、およびポジトロン放出断層撮影画像化システムで組織または対象を画像化するステップを含む、組織または対象を画像化する方法である。
【００１６】
さらに、本発明は、（ａ）特に陰イオン性対イオンがトリフルオロアセテートである、本明細書に定義する式（Ｐ−１）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、好適な条件下でフッ化物源１８Ｆ−と反応させるステップ、または（ｂ）本明細書に定義する式（Ｉ−Ａ）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、好適な条件下でフッ化物源１８Ｆ−と反応させるステップを含む、本明細書に記載の式（Ｉ’）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物の調製方法に関する。好適な１８Ｆ−の源は、例えば４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］ヘキサコサンカリウムフルオリド−［１８Ｆ］（１：１）（［１８Ｆ］ＫＦ．Ｋ２２２とも呼ぶ）である。好適な条件には、当技術分野において公知の求核置換に適切な条件、例えば、通常加熱下、例えば約１２０℃で、反応を進行させて完了させることを可能にするのに十分な時間、ＤＭＦを溶媒として使用することが含まれる。
【化５】
2019511461.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】図１ｂに示す切片に隣接するヒト脳（ＡＤ）の凍結切片にＡＴ８抗体でインキュベートした後の免疫組織化学画像を示す。
【図１ｂ】ヒト脳（ＡＤ）の凍結切片に４Ｇ８抗体でインキュベートした後の免疫組織化学画像を示す。
【図２】図１ｂに示す切片に隣接するヒト脳（ＡＤ）の凍結切片上の［１８Ｆ］化合物番号１のオートラジオグラフィー画像（左）、結合した［１８Ｆ］化合物番号１の、１μＭ［１９Ｆ］化合物番号１での置換（中央）、および結合した［１８Ｆ］化合物番号１の、１μＭ［１９Ｆ］Ｔ８０８での置換（右）を示す。
【図３ａ】３匹の雌ウィスターラットの全脳における［１８Ｆ］化合物番号１のμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。ベースラインスキャン；前処置実験：非放射性化合物番号１、１０ｍｇ／ｋｇを、放射性トレーサー注射の６０分前に皮下注射、および追跡試験：非放射性化合物番号１、１ｍｇ／ｋｇを放射性トレーサー注射の３０分後に静脈内注射。
【図３ｂ】３匹の雌ウィスターラットの全脳における［１８Ｆ］Ｔ８０７のμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。ベースラインスキャン；前処置実験：Ｔ８０７、１０ｍｇ／ｋｇを、放射性トレーサー注射の６０分前に皮下注射、および追跡試験：Ｔ８０７、１ｍｇ／ｋｇを放射性トレーサー注射の３０分後に静脈内注射。
【図４】ウィスターラットの全脳における［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の小動物ＰＥＴ時間放射能曲線のベースライン比較を示す。
【図５ａ】アカゲザルの全脳、脳梁、小脳および嗅内皮質ならびに頭蓋における［１８Ｆ］化合物番号１のＰＥＴ時間放射能曲線を示す。
【図５ｂ】アカゲザルの全脳、脳梁、小脳および嗅内皮質ならびに頭蓋における［１８Ｆ］Ｔ８０７のＰＥＴ時間放射能曲線を示す。
【図６】雌アカゲザルおよび雄アカゲザルにおける、［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の平均全脳％ＳＵＶｍａｘ曲線をそれぞれ示す。
【図７ａ】雄アカゲザルの全脳、脳梁、小脳、エントリナル（ｅｎｔｈｏｒｉｎａｌ）皮質および頭蓋における、［１８Ｆ］化合物番号１のμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。
【図７ｂ】雄アカゲザルの全脳、脳梁、小脳、エントリナル（ｅｎｔｈｏｒｉｎａｌ）皮質および頭蓋における、［１８Ｆ］Ｔ８０７のμＰＥＴ時間放射能曲線を示す。
【図８】雄アカゲザルにおける［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の平均全脳％ＳＵＶｍａｘ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ある実施形態では、式（Ｉ）の、特に式（Ｉ’）の化合物は、化合物１（化合物番号１）、化合物２（化合物番号２）および化合物３（化合物番号３）：
【化６】
2019511461.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物から選択される。
【００１９】
本発明はまた、非放射標識化合物１、２および３に相当し、［１９Ｆ］−化合物
【化７】
2019511461.tif 000008
に相当する関連材料、ならびにその薬学的に許容される塩および溶媒和物にも関する。
【００２０】
［１９Ｆ］−化合物番号１は、化合物Ｔ−８０８（Ｔ−８０８、別名ＡＶ−６８０、ＣＡＳ［１３２０２１１−６１−７］、２−［４−（２−フルオロエチル）−１−ピペリジニル］−ピリミド［１，２−ａ］ベンゾイミダゾールは、Ｓｉｅｍｅｎｓが開発している。例えば、Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．２０１４，３８，１７１−１８４を参照）の内製のトリチウム類似体を使用した放射標識置換アッセイにおいて、抽出されたヒトタウに強力な結合（ｐＩＣ５０  ７．７）を示した。この類似体は本明細書で［３Ｈ］−Ｔ８０８と称する。加えて、化合物番号１は、フロルベタピル（別名Ａｍｙｖｉｄ（登録商標）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．製、またはＡＶ−４５、ＣＡＳ［９５６１０３−７６−７］、（Ｅ）−４−（２−（６−（２−（２−（２−フルオロエトキシ）エトキシ）エトキシ）ピリジン−３−イル）ビニル）−Ｎ−メチルベンゼンアミン、例えば、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１０，５１，９１３−９２０を参照）の内製のトリチウム類似体を使用した放射標識置換アッセイにおいて、１０μＭまで、抽出されたヒトアミロイド−β凝集体に測定可能な結合を示さない。この類似体は本明細書で［３Ｈ］−ＡＶ−４５と称する。プロトコルの説明は後段に記載する。
【００２１】
［１９Ｆ］−化合物番号２は、［３Ｈ］−Ｔ８０８を使用した放射標識置換アッセイにおいて、抽出されたヒトタウに強力な結合（ｐＩＣ５０  ７．５）を示し、［３Ｈ］−ＡＶ−４５を使用した放射標識置換アッセイにおいて、１０μＭまで、抽出されたヒトアミロイド−β凝集体に測定可能な結合を示さなかった。
【００２２】
［１９Ｆ］−化合物番号３は、［３Ｈ］−Ｔ８０８を使用した放射標識置換アッセイにおいて、抽出されたヒトタウに強力な結合（ｐＩＣ５０  ７．６）を示し、［３Ｈ］−ＡＶ−４５を使用した放射標識置換アッセイにおいて、１０μＭまで、抽出されたヒトアミロイド−β凝集体に測定可能な結合を示さなかった。
【００２３】
ｐＩＣ５０値からＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を使用してＫｉ値を導くことができる（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ，Ｐｒｕｓｏｆｆ  ＷＨ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２（２３）：３０９９−１０８）。化合物１および２：ａ，ｂの結合の結果のまとめ。
【００２４】
【表１】
2019511461.tif 000009
【００２５】
ａＫｉ値は少なくとも２回の測定値の平均であり、標準偏差を付記している。ｂＫｉ値は、ＩＣ５０値から次式：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（濃度ＲＬ／ＫＤ  ＲＬ）を使用して計算した。ここで、ＰＨＦのＫＤは３Ｈ−ＡＶ６８０について６．２７５ｎＭ、ＡβのＫＤは３Ｈ−ＡＶ４５について７．８５ｎＭ、両アッセイとも１０ｎＭのＲＬ濃度である。
【００２６】
［３Ｈ］−Ｔ８０８は、ブロモ前駆体（１当量）のメタノール溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（５当量）の存在下で、室温にて、パラジウム担持炭素（５％）で触媒によるトリチウム化を行うことによって得られた。ブロモ前駆体は、Ｔ８０８をアセトニトリル中Ｎ−ブロモスクシンイミド（１当量）で臭素化することによって得られた。
【００２７】
［３Ｈ］−ＡＶ−４５は、ジクロロメタンに溶解したＡＶ−４５に、イリジウムでの触媒（クラブトリー触媒）によるトリチウム交換をすることによって得られた。
【化８】
2019511461.tif 000010
【００２８】
既に述べたように、式（Ｉ）の化合物、および式（Ｉ）の化合物を含む組成物は、組織または対象を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで画像化するために使用することができる。特に、本発明は、組織または対象中のタウ凝集体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで画像化または定量化する方法に関する。
【００２９】
特に、タウを画像化する方法は、対象、特に患者に、検出可能な量の式（Ｉ）の化合物を提供するステップを含む。
【００３０】
さらに、本発明は、対象に検出可能な量の式（Ｉ）の化合物を提供するステップ、式（Ｉ）の化合物がタウ凝集体沈着物と結びつくのに十分な時間を与えるステップ、およびタウ凝集体沈着物と結びついた化合物を検出するステップを含む、タウ凝集体沈着物を画像化する方法に関する。
【００３１】
本方法がｉｎ  ｖｉｖｏで行われる場合、式（Ｉ）の化合物は、静脈内に、例えば、シリンジでの注射によって、または短カテーテルなどの末梢静脈ラインを用いて投与することができる。式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む滅菌溶液は、特に、腕の静脈内投与によって、特に手背の特定できる任意の静脈中に、または肘の肘正中皮静脈中に投与してもよい。
【００３２】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、本明細書に定義する式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む組成物、特に滅菌製剤を、対象に静脈内投与するステップ、およびポジトロン放出断層撮影画像化システムで対象を画像化するステップを含む、対象を画像化する方法に関する。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物を含む組成物を、対象に静脈内投与するステップ、およびポジトロン放出断層撮影画像化システムで画像化するステップを含む、対象におけるタウ凝集沈着物を定量化する方法に関する。
【００３４】
本化合物は検出可能な量で対象に提供され、化合物がタウ凝集沈着物と結びつくのに十分な時間が経過した後に、標識化合物は非侵襲的に検出される。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明は化合物（Ｉ−６）
【化９】
2019511461.tif 000011
［式中、［陰イオン］−は、本明細書に定義する好適な陰イオン性対イオンである］またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物に関する。特定の実施形態では、陰イオン性対イオンは、トリフルオロアセテート（−［ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３］−）、有機スルホネートおよびタルトレートからなる群から選択され、より特定するとトリフルオロアセテートである。
【００３６】
したがって、特定の実施形態では、本発明は化合物（Ｉ−６ａ）
【化１０】
2019511461.tif 000012
特にそのトリフルオロ酢酸塩または溶媒和物、特にその水和物に関する。
【００３７】
さらなる実施形態では、本発明は化合物（Ｉ−６ｂ）
【化１１】
2019511461.tif 000013
またはその溶媒和物、特にその水和物に関する。
【００３８】
さらなる実施形態では、本発明は、式（Ｉ−６ｃ）の化合物またはその溶媒和物、特にその水和物に関する。
【化１２】
2019511461.tif 000014
【００３９】
定義
本明細書で使用する場合、「組成物」という用語は、所定量の指定成分を含む生成物、および所定量の指定成分の組合せから直接的または間接的に生じる任意の生成物を包含するものとする。
【００４０】
本発明による化合物の付加塩もまた、本発明の範囲内に包含されることを意図した。
【００４１】
許容される本発明の化合物の塩は、対イオンが薬学的に許容されるものである。しかし、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製に用途がある場合がある。薬学的に許容されるか否かにかかわらず、すべての塩が本発明の範囲内に含まれる。薬学的に許容される塩は、本発明による化合物が形成することが可能な治療活性のある無毒性の酸付加塩形態を含むものと定義される。前記塩は、適切な酸、例えば無機酸、例えばハロゲン化水素酸、特に塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸およびリン酸；有機酸、例えば酢酸、ヒドロキシ酢酸、プロパン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸およびパモ酸で、本発明による化合物の塩基形態を処理することによって得ることができる。
【００４２】
逆に、前記塩形態は、適切な塩基で処理することによって遊離塩基形態に変換することができる。
【００４３】
さらに、本発明の化合物のうち一部は、水（すなわち水和物）または一般的な有機溶媒とともに溶媒和物を形成することができ、このような溶媒和物もまた、本発明の範囲内に包含されるものとする。
【００４４】
本明細書で使用する「対象」という用語は、処置、観察または実験の目的である、または目的となってきたヒトを指す。特に断りのない限り、「対象」には無症候性のヒト、前駆症候性のヒトおよびヒト患者が含まれる。
【００４５】
調製
本発明による化合物は、一般に、それぞれが当業者に公知の一連の工程によって調製することができる。特に、化合物は、以下の合成方法に従って調製することができる。
【００４６】
本明細書に開示している式［１９Ｆ］−（Ｉ）の化合物は、本明細書に記載の式（Ｉ−３）の化合物を、適切な式（ＩＩ）の４−アミノ−ピリジン化合物［式中、すべての変数は、［１９Ｆ］−（Ｉ）について本明細書に記載しているとおりである］と、
【化１３】
2019511461.tif 000015
ブッフバルトアミノ化条件下で反応させることによって調製することができる。
【００４７】
本明細書に開示している式（Ｉ’）の化合物は、本明細書に定義する式（Ｐ−１）または（Ｉ−Ａ）の化合物をフッ化物源１８Ｆ−と反応させることによって調製することができる。
【００４８】
したがって、本明細書に記載の式（Ｉ’）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、特に陰イオン性対イオンがトリフルオロアセテートである本明細書に定義する式（Ｐ−１）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、好適な条件下でフッ化物源１８Ｆ−と反応させることによって調製することができる。
【化１４】
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【００４９】
あるいは、本明細書に記載の式（Ｉ’）の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物は、本明細書に定義する化合物式（Ｉ−Ａ）またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を、好適な条件下でフッ化物源１８Ｆ−と反応させることによって調製することができる。
【化１５】
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【００５０】
好適な１８Ｆ−の源は、例えば４，７，１３，１６，２１，２４−ヘキサオキサ−１，１０−ジアザビシクロ［８．８．８］ヘキサコサンカリウムフルオリド−［１８Ｆ］（１：１）（［１８Ｆ］ＫＦ．Ｋ２２２とも呼ぶ）である。好適な条件には、当技術分野において公知の求核置換に適切な条件、例えば、通常加熱下、例えば約１２０℃で、反応を進行させて完了させることを可能にするのに十分な時間、ＤＭＦを溶媒として使用することが含まれる。
【００５１】
応用
本発明による化合物には、組織または対象をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で画像化するための様々な用途がある。したがって、例えば、本発明による化合物は、年齢および性別の異なる対象におけるタウ凝集体沈着物の特異的分布をマッピングするために使用することができる。さらに、アルツハイマー病を含むが、タウ凝集体沈着物に起因する他の疾患、すなわち他のタウオパチーも含む様々な疾患または障害に罹患している対象におけるタウ凝集体沈着物の特異的分布を調査することが可能になる。
【００５２】
したがって、過剰分布は、診断、症例発見、対象集団の層別化において、および個々の対象の疾患進行のモニタリングにおいて、特に抗タウ処置、例えば抗体が利用可能になった場合に役に立つ場合がある。放射性リガンドは、ＰＥＴ画像化用には微量、すなわち検出可能な量で投与されるため、本発明の放射性リガンドの投与による治療効果はあり得ない。
【実施例】
【００５３】
実験の部
Ｉ．化学的性質
本明細書で使用する場合、「ａｑ．」という用語は水溶液を意味し、「ｔＢｕＯＨ」はｔｅｒｔ−ブタノールを意味し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを意味し、「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテルを意味し、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを意味し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを意味し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＬＣＭＳ」は液体クロマトグラフィー／質量分析法を意味し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｍ．ｐ．」は融点を意味し、「Ｐｄ（ＯＡｃ）２」は酢酸パラジウム（ＩＩ）を意味し、「ｐｒｅｐ」は分取を意味し、「ｒｍ／ＲＭ」は反応混合物を意味し、「ｒ．ｔ．／ＲＴ」は室温を意味し、「Ｒｔ」は保持時間（単位、分）を意味し、「ｓａｔ．」は飽和を意味し、「ｓｏｌ．」は溶液を意味し、「ＴＢＡＦ」はテトラブチルアンモニウムフルオリドを意味し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを意味し、「ＴＦＡ」は状況に応じてトリフルオロ酢酸またはトリフルオロアセテートを意味し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し、「キサントホス」は４，５−ビス（ジフェニル−ホスフィノ）−９，９−ジメチルキサンテンを意味する。
【００５４】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、試薬用溶媒を使用してシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（Ｍｅｒｃｋ）で行った。オープンカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル、メッシュ２３０〜４００粒度および６０Å孔径（Ｍｅｒｃｋ）にて、標準技法で行った。自動フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Ｇｒａｃｅ（ＧｒａｃｅＲｅｓｏｌｖ（商標）カートリッジ）またはＴｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯ（ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）カートリッジ）から購入した接続準備済み使い捨てカートリッジを使用し、不定形シリカゲル、粒径３５〜７０μｍで、ＩＳＣＯ  ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈまたはＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａ（商標）Ｓｐｅｋｔｒａ装置にて行った。
【００５５】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）：いくつかの化合物では、それぞれ３６０ＭＨｚおよび４００ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ  ３６０ＭＨｚ  ＮＭＲまたはＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で標準パルス系列を使用して１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録した。試料をＤＭＳＯ−ｄ６またはＣＤＣｌ３に溶解し、５ｍｍ  ＮＭＲ管に移して測定した。化学シフト（δ）を、内部標準として使用したテトラメチルシラン（ＴＭＳ）より低磁場側の百万分率（ｐｐｍ）で報告する。
【００５６】
本明細書に記載する酸／塩基化学量論値および／または含水量値は、実験によって得られたものであり、異なる分析方法を使用した場合には変動し得る。例えば、本明細書で報告されるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の含量は、１３Ｃ  ＮＭＲ積分値、元素分析および／またはイオンクロマトグラフィーによって決定した。
【００５７】
本発明の化合物を調製するためのいくつかの方法を以下の実施例に例示するが、これらの実施例は、本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではない。特に断りのない限り、出発材料はすべて市販業者から入手し、さらに精製せずに使用した。
【００５８】
Ａ．中間体の合成
中間体１
【化１６】
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２−ブロモ−６−フルオロ−３−ピリジンアミン（２０ｇ、９６．３３ｍｍｏｌ）と、アクリル酸メチル（１３．０１ｍＬ、１４４．５０ｍｍｏｌ）と、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（２．８１ｇ、１２．５２ｍｍｏｌ）と、ＰＰｈ３（５．８１ｇ、２２．１６ｍｍｏｌ）と、ＴＥＡ（３０．１３ｍＬ、２１６．７５ｍｍｏｌ）とのＴＨＦ（１４３ｍＬ）中混合物を、封管中で１４０℃で２時間加熱した。反応生成物を室温まで冷却した。ＮａＨＣＯ３（飽和溶液）およびＥｔＯＡｃを添加し、相を分離した。水性相をＥｔＯＡｃでさらに２回抽出した。まとめた有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；ヘプタン／ＥｔＯＡｃ  １００／０〜６０／４０（乾式充填））により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させて、中間体１（１７．６ｇ、９３％）を橙色固体として得た。
【００５９】
中間体２
【化１７】
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中間体１（１４．８ｇ、７５．４４ｍｍｏｌ）とトリ−ｎ−ブチルホスフィン（１８．８４ｍＬ、７５．４４ｍｍｏｌ）とのＡｃＯＨ（１０７．８７ｍＬ）中混合物を、封管中で１１０℃で１時間加熱した。混合物を蒸発させ、次いでＤＩＰＥ（５００ｍＬ）中で撹拌した。固体を濾別し、５０℃で終夜真空乾燥し、中間体２（１１．３ｇ、９１％）を黄色固体として得た。
【００６０】
中間体３
【化１８】
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ＰＯＣｌ３（１．９２５ｍＬ、２０．７１ｍｍｏｌ）を中間体２（５ｇ、２０．７１ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（６４．３２ｍＬ）懸濁液に添加し、この混合物を圧力チューブ中で１１０℃で１時間加熱した。反応混合物を蒸発させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に溶かし、ＤＣＭで抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ヘプタン／ＥｔＯＡｃ  １００／０〜８０／２０（乾式充填））により精製した。所望の画分を蒸発させ、中間体３（３．３６ｇ、８９％）を白色固体として得た（試料を、１３ｍｏｌ％の中間体３ａを含有するものと判定した）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ）δ  ｐｐｍ  ７．３５（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．９Ｈｚ，１Ｈ）７．６５（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．２１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，０．７Ｈｚ，１Ｈ）８．３６−８．４５（ｍ，１Ｈ）．
【００６１】
中間体４
【化１９】
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手順ａ：３−クロロベンゾペルオキソ酸（７０％、８．３３ｇ、３３．８１ｍｍｏｌ）を１，５−ナフチリジン（２ｇ、１５．３７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。沈殿物が形成されたが、まだ一部の変換しか観察されなかった。追加の３−クロロベンゾペルオキソ酸（７０％、４．９２ｇ、１９．９８ｍｍｏｌ）を添加し、次いでメタノール（５０ｍＬ）を添加するとすべての沈殿物が溶解し、撹拌を終夜継続した。再度固体が形成され、これを濾過した。濾液を半分濃縮し、さらに沈殿物が形成され、これを濾過し、以前に得られた沈殿物と一緒にまとめた。この固体はまだ３−クロロ安息香酸を含有していることがわかり、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１）で１日トリチュレートし、濾過し、真空乾燥して、中間体４（２．１８ｇ、８８％）を黄色固体として得た。
【００６２】
手順ｂ：３−クロロベンゾペルオキソ酸（１６４．４ｇ、６６６．９ｍｍｏｌ）を、１，５−ナフチリジン（２８．０ｇ、２１５．１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１．４Ｌ）およびＭｅＯＨ（０．７Ｌ）溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。さらに３−クロロベンゾペルオキソ酸（５３．０ｇ、２１５．１ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を７２時間継続した。固体が形成され、これを濾過した。濾液を半分濃縮し、さらに沈殿物が形成され、これを濾過し、以前に得られた沈殿物と一緒にまとめた。この固体をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（９：１）でトリチュレートし、濾過し、真空乾燥して、中間体４（２８．０ｇ、１７２．７ｍｍｏｌ、８０％）を黄色固体として得た。
【００６３】
中間体５
【化２０】
2019511461.tif 000022
手順ａ：中間体４（１ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）とトリメチルアミン（ＴＨＦ中１Ｍ、３７．０２ｍＬ、３７．０２ｍｍｏｌ）とのＤＣＭ（５０ｍＬ）撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（２．５７ｍＬ、１８．５０ｍｍｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で撹拌し、完了次第（約３０分）、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）を添加し、撹拌を１時間継続した。白色塩を濾過により単離し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、終夜真空乾燥して、中間体５：トリメチルアミン．ＴＦＡ、４０：６０（３．４ｇ）を得た。
【００６４】
手順ｂ：中間体４（１ｇ、６．１７ｍｍｏｌ）とトリメチルアミン（ＴＨＦ中１Ｍ、３０．８４ｍＬ、３０．８４ｍｍｏｌ）とのＤＣＭ（５９．３ｍＬ）撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（２．５７ｍＬ、１８．５０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。この混合物を室温で１時間撹拌した。Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）を添加し、撹拌を１時間継続し、白色固体を濾過により単離し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、終夜真空乾燥して、中間体５（１．８３ｇ、純度９３％、６３％）を白色固体として得た。
【００６５】
手順ｃ：トリフルオロ酢酸無水物（６９．５ｍＬ、４９９．５ｍｍｏｌ）を、中間体４（２７．０ｇ、１６６．５ｍｍｏｌ）とトリメチルアミン（ＴＨＦ中１Ｍ、０．８５Ｌ、８５０ｍｍｏｌ）とのＤＣＭ（１．３５Ｌ）撹拌溶液に０℃で添加した。この混合物を室温で撹拌した。完了次第（約３０分）、Ｅｔ２Ｏ（１Ｌ）を添加し、撹拌を１時間継続した。白色塩を濾過により単離し、Ｅｔ２Ｏで洗浄し、終夜真空乾燥して、中間体５（６８ｇ、１４４．０ｍｍｏｌ、８６％）を得た。
【００６６】
中間体６Ａ、中間体６Ｂおよび中間体６Ｃ
【化２１】
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手順ａ：ＮａＨ（鉱油中６０％分散体、０．６１４ｇ、１５．３４ｍｍｏｌ）を、中間体５（手順ａから取得：純度４０％、６０％トリフルオロ酢酸トリメチルアンモニウムを含有；１．５８ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）と４−アミノ−２−メチルピリジン（０．２７７ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）との脱水ＤＭＦ（分子篩で、２５．２４ｍＬ）中混合物に０℃で添加した。得られた混合物を、室温までゆっくり加温しながら２０分間撹拌した（赤色が現れる）。シリカゲルおよび水（５ｍＬ）を添加し、溶媒を蒸発乾固し、フラッシュカラム（２４ｇシリカ）に充填し、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨで溶離した。生成物画分を蒸発させて、４２６ｍｇの粗製物を得、これを再度フラッシュカラムクロマトグラフィーにより２４ｇシリカで精製し、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨで溶離した。生成物画分を蒸発させて、中間体６ａ（トリフルオロ酢酸塩、３１８ｍｇ、２７％、純度９０％；３８ｍｇ、純度９６％）を黄色粘着性固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ２．６０（ｓ，３Ｈ）３．７１（ｓ，９Ｈ）７．６６（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）８．０６（ｄｄ，Ｊ＝６．２，１．８Ｈｚ，１Ｈ）８．１９（ｓ，１Ｈ）８．３７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）８．４３（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）８．４５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ）８．７１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）１１．１３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ２１．８１（ｓ，１Ｃ），３８．３０（ｓ，１Ｃ），５４．６８（ｓ，１Ｃ），６９．８４（ｓ，１Ｃ），１１１．０６（ｓ，１Ｃ），１１２．３０（ｓ，１Ｃ），１１６．３１（ｓ，１Ｃ），１２０．２８（ｓ，１Ｃ），１３５．８０（ｓ，１Ｃ），１３７．６２（ｓ，１Ｃ），１３８．２４（ｓ，１Ｃ），１３９．６４（ｓ，１Ｃ），１４２．０１（ｓ，１Ｃ），１４４．９８（ｓ，１Ｃ），１５０．３９（ｓ，１Ｃ），１５３．１７（ｓ，１Ｃ），１５４．７９（ｓ，１Ｃ），１５５．５２（ｓ，１Ｃ），１５８．１５（ｓ，１Ｃ），１６１．１３（ｓ，１Ｃ）．δｐｐｍ１５７．９９（Ｊ＝３３Ｈｚ）および１１７．４４（Ｊ＝３０１Ｈｚ）での四重線に加えて、対イオンとしてのＣＦ３ＣＯ２−の存在を確認した。
【００６７】
手順ｂ：この反応は、２つの別のバッチで行い、これらをまとめて一緒に後処理した：
バッチ１：ＮａＨ（３．８１ｇ、３５６ｍｍｏｌ、鉱油中６０％分散体）を、手順ｃに従って得られた中間体５（１５．０ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）と４−アミノ−２−メチルピリジン（３．４３ｇ、３１．８ｍｍｏｌ）とのＤＭＦ（３１３ｍＬ、分子篩で脱水）中混合物に０℃で添加した。得られた混合物を、室温までゆっくり加温しながら２０分間撹拌した（赤色が現れる）。溶媒を蒸発乾固し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）および水（２０ｍＬ）に再度溶解した。
【００６８】
バッチ２：ＮａＨ（１４．２２ｇ、３５６ｍｍｏｌ、鉱油中６０％分散体）を、中間体５（５６．０ｇ、１１９ｍｍｏｌ）と４−アミノ−２−メチルピリジン（１２．８ｇ、１１９ｍｍｏｌ）とのＤＭＦ（１１７０ｍＬ、分子篩で脱水）中混合物に０℃で添加した。得られた混合物を、室温までゆっくり加温しながら２０分間撹拌した（赤色が現れる）。溶媒を蒸発乾固し、ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）および水（６０ｍＬ）に再度溶解した。
【００６９】
両溶液をまとめ、その後、溶媒を再度蒸発させて黄色固体を得、これを分取ＨＰＬＣ（固定相：Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  ＯＤＢ−１０μｍ、２００ｇ、５ｃｍ、移動相：０．１％ＴＦＡ水溶液＋５％ＭｅＯＨ）により精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣ画分を蒸発乾固した。得られた油にエーテルを添加し、回転蒸発によりゆっくり蒸発させ（３回反復）、黄色結晶を形成させた。この結晶をエーテルで終夜トリチュレートして微粉末を得、これを濾過し、再度エーテルで洗浄し、５５℃で終夜真空乾燥し、次いで凍結乾燥器内で室温にて２４時間乾燥し、中間体６ｂ（元素分析によるとＴＦＡ複塩および半水和物、１２．３ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６＋Ｃ６Ｄ６，６１℃）δ  ｐｐｍ  ２．６５（ｓ，３Ｈ），３．７１（ｓ，９Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５２（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），８．６９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），１１．６８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
【００７０】
手順ｃ：ＮａＨ（鉱油中６０％分散体、４．９２ｇ、１２２．９８ｍｍｏｌ）を、中間体５（手順ｂから取得：純度９３％、９．６８ｇ、２０．５０ｍｍｏｌ）と４−アミノ−２−メチルピリジン（２．２２ｇ、２０．５０ｍｍｏｌ）とのＤＭＦ（分子篩で脱水、２０２．３ｍＬ）中混合物に０℃で添加した。得られた混合物を、室温までゆっくり加温しながら２０分間撹拌した（赤色が現れた）。溶媒を蒸発乾固し、残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、次いで水を添加し、この混合物を蒸発させて中間体６を黄色固体として得、これを分取ＨＰＬＣ（固定相：Ｕｐｔｉｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８  ＯＤＢ−１０μｍ、２００ｇ、５ｃｍ；移動相：０．１％ＴＦＡ水溶液＋５％ＣＨ３ＣＮ、ＭｅＯＨ）により精製して固体を得、これをＥｔ２Ｏに溶かし、濾過し、次いで４０℃で終夜真空乾燥して、中間体６ｃ（元素分析によるとＴＦＡ三重複塩および一水和物、２．４ｇ、２９％）を黄色固体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ２．７１（ｓ，３Ｈ）３．７１（ｓ，９Ｈ）７．７１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）８．１９（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ）８．４５−８．５２（ｍ，３Ｈ）８．５５（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ）８．８１（ｄｄ，Ｊ＝９．２，０．７Ｈｚ，１Ｈ）１１．５６（ｓ，１Ｈ）．
【００７１】
Ｂ．非放射性化合物の合成
【化２２】
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手順ａ：２−メチル−４−ピリジンアミン（１．６６ｇ、１５．３４ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（６１．６１ｍＬ）溶液に、中間体３（１．６６ｇ、１５．３４ｍｍｏｌ）、キサントホス（１７７．４７ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（６８．８６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（１３．９９ｇ、４２．９４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に窒素を５分間バブリングし、次いでバイアルを密封し、１４０℃で１８時間加熱した。次いで、混合物を室温まで冷却し、水およびＥｔＯＡｃで希釈し、固体の大部分が溶解するまで撹拌した。二相混合物をガラスフィルターで濾過し、これをＥｔＯＡｃおよび水ですすいだ。次に、有機層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃで抽出した（３×）。まとめた有機層を塩水で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発させた。
【００７２】
精製を分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ−１０μｍ、５０×１５０ｍｍ；移動相：０．２５％  ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液、ＭｅＯＨ）により行って、化合物１（９１５ｍｇ、２４％）を得た。
【００７３】
別法として、精製をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中７Ｎ  ＮＨ３、１００／０〜９０／１０）により行った。生成物画分を回収し、蒸発乾固し、次いでＤＩＰＥおよび水で処理し、二相混合物を２時間撹拌した。得られた結晶を濾過し、ＤＩＰＥおよび水で洗浄した。７５℃で３時間真空乾燥してから、化合物［１９Ｆ］−１を淡黄色結晶として得た。
【００７４】
手順ｂ：ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．２８ｍＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を中間体６ａ（３８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（０．９３ｍＬ）溶液に添加した。得られた混合物を９０℃で３０分間撹拌した。揮発分をすべて蒸発させた。残渣を、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、勾配（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中７Ｎ  ＮＨ３、１：０〜０：１）を使用して精製した。生成物画分を蒸発させて、化合物［１９Ｆ］−１（１５．４ｍｇ、６５％）を黄色結晶として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ２．４５（ｓ，３Ｈ）７．３９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ）７．４８（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ）７．７２−７．８５（ｍ，２Ｈ）８．１０（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）８．２８（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）８．３９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）９．９７（ｓ，１Ｈ）．
【００７５】
【化２３】
2019511461.tif 000025
３−メチルピリジン−４−アミン（１１８．５ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（４．４ｍＬ）溶液に、中間体３（２００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、キサントホス（１２．６８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（４．９ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）および第三リン酸カリウム（６５１．０ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に窒素を５分間バブリングし、次いでバイアルを密封し、１４０℃で１８時間加熱した。混合物を水およびＥｔＯＡｃで希釈し、固体の大部分が溶解するまで撹拌した。二相混合物をガラスフィルターで濾過し、これをＥｔＯＡｃおよび水ですすいだ。次に、有機層を分離し、水性層をＥｔＯＡｃで抽出した（３×）。まとめた有機層を塩水で洗浄し、次いで脱水し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、蒸発させた。精製を、分取ＨＰＬＣ（固定相：ＲＰ  ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤ−１０μｍ、３０×１５０ｍｍ、移動相：０．２５％ＮＨ４ＨＣＯ３水溶液、ＭｅＯＨ）により行い、生成物画分を蒸発させて固体を得、これをメタノールに再度溶解し、再度蒸発させて化合物［１９Ｆ］−２（３７ｍｇ（１３％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ２．３２（ｓ，３Ｈ）７．４６（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ）７．６９（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．１２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．２７−８．３４（ｍ，３Ｈ）８．５３（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ）８．８５（ｓ，１Ｈ）．
【００７６】
【化２４】
2019511461.tif 000026
４−アミノピリジン（１１４．４３ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（４．４０ｍＬ）溶液に、中間体３（２００ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）、キサントホス（１２．６８ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（４．９２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（１ｇ、３．０７ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を１４０℃で２４時間加熱した。混合物を減圧下で濃縮し、水に懸濁させ、ＤＣＭおよびＥｔＯＡｃで抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、溶媒を蒸発させた。次いでこれをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、４０ｇ）により、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ中ＮＨ３（１：０〜９５：５）の勾配を使用して精製して黄色固体を得、これをＤＩＰＥおよび水でトリチュレートし、濾過し、真空乾燥して化合物［１９Ｆ］−３（４６ｍｇ、１７％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（３６０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ  ｐｐｍ  ７．４０（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）７．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ）７．９４（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）８．１２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ）８．３６−８．４５（ｍ，３Ｈ）１０．１０（ｓ，１Ｈ）．
【００７７】
Ｃ．放射性合成
材料および方法
概要
化学薬品および試薬はすべて販売元から購入し、さらに精製せずに使用した。［１８Ｆ］Ｔ８０７（別名ＡＶ−１４５１、ＣＡＳ［１４１５３７９−５６−４］、７−（６−フルオロピリジン−３−イル）−５Ｈ−ピリド［４，３−ｂ］インドール）を、以前に報告された手順（Ｄｅｃｌｅｒｃｑ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１６，１４，１−１５）に従って放射標識した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を、ＵＶ検出器セットに接続したＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ  ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、２５４ｎｍで行った。放射標識化合物の分析については、ＨＰＬＣ溶出液を、ＵＶ検出器を通過させた後に、単一チャネル分析器に接続した３インチＮａＩ（Ｔｌ）シンチレーション検出器（ＧＡＢＩボックス；Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ヘと導いた。ＧＩＮＡ  Ｓｔａｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ）データ取得システムを使用して、データを取得し、分析した。生体内分布（データは示さず）および放射性代謝産物の試験の、試料中の放射能の定量化を、試料交換器中に据えた、多チャネル分析器に連結した３インチＮａＩ（Ｔｌ）ウェル型結晶を備えた自動γ計数管（Ｗａｌｌａｃ  ２４８０  Ｗｉｚａｒｄ  ３ｑ，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して行った。値はバックグラウンド放射、物理的減衰および計数管不感時間について補正される。定量的データは平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。平均値は、独立両側スチューデントのｔ−検定を使用して比較する。値はＰ≦０．０５を統計的に有意とみなした。１０μｍ厚のヒトＡＤ死後脳薄片（ＢｒａａｋのステージＶ−ＶＩ）を内製した（ＫＵ  Ｌｅｕｖｅｎ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ、地元の倫理委員会からの許可後）。動物は、温度調節され（約２２℃）、湿度制御された施設の中の個別に換気されたケージに収容し、１２時間−１２時間明暗周期とし、餌および水を自由に摂れるようにした。動物実験はすべて、大学（ＫＵ  Ｌｅｕｖｅｎ）動物倫理委員会の許可を得てから、ベルギーの、動物のケアおよび使用についての実施規定に従って行った。
【００７８】
化合物番号１の放射標識（Ｎ＝６）
【化２５】
2019511461.tif 000027
フルオリド−１８（［１８Ｆ］Ｆ−）を、Ｃｙｃｌｏｎｅ１８／９サイクロトロン（Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｕｖａｉｎ−ｌａ−Ｎｅｕｖｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）中で、２ｍＬの９７％濃縮１８Ｏ−Ｈ２Ｏ（Ｒｏｔｅｍ  ＨＹＯＸ１８，Ｒｏｔｅｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｅｒ  Ｓｈｅｖａ，Ｉｓｒａｅｌ）を１８−ＭｅＶプロトンで照射することによる１８Ｏ（ｐ，ｎ）１８Ｆ核反応によって生成した。照射後、［１８Ｆ］Ｆ−を、ＳｅｐＰａｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ａｃｃｅｌｌプラス第四級メチルアンモニウム（ＱＭＡ）陰イオン交換カートリッジ（ＣＯ３２−型、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に捕捉し、Ｋｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２．２．２（Ｋ−２２２、２７．８６ｍｇ）とＫ２ＣＯ３（２．５ｍｇ）とのＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．７５ｍＬ；９５：５ｖ／ｖ）中混合物で溶離した。ヘリウム流で１００℃にて溶媒を蒸発させてから、無水ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）を添加し、［１８Ｆ］Ｆ−を同じ条件下でさらに乾燥した。
【００７９】
０．５ｍｇの前駆体（Ｉ−６ａまたはＩ−６ｃ、それぞれモノ−またはトリスＴＦＡ−塩）のＤＭＦ（０．３ｍｌ）溶液を、乾燥した［１８Ｆ］Ｆ−／Ｋ２ＣＯ３／Ｋ−２２２残渣に添加し、この混合物を１２０℃で１０分間加熱した（通常加熱）。粗製放射標識混合物を０．６ｍＬの分取緩衝液（０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ９．６およびＥｔＯＨ（６５：３５ｖ／ｖ））で希釈し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用してＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で精製し、０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ９．６とＥｔＯＨとの混合物（６５：３５ｖ／ｖ）で流速０．８ｍＬ／分にて溶離し、２５４ｎｍでＵＶ検出をした。精製した放射性トレーサー溶液を生理食塩水で希釈して、静脈内注射に適したエタノール濃度＜１０％を得た。次いで、溶液を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に通過させて滅菌生成物を得た。品質管理を、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、ＸＢｒｉｄｇｅカラム（Ｃ１８、３．５μｍ、３．０ｍｍ×１００ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）にて、０．０１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ９．６とＣＨ３Ｎとの混合物（７０：３０ｖ／ｖ）で流速０．８ｍＬ／分にて溶離して行った。ＵＶ検出を２５４ｎｍで行った。
【００８０】
［１８Ｆ］化合物番号１を、減衰補正した平均放射化学的収率４６％（分取クロマトグラムにおける［１８Ｆ］Ｆ−の放射能に対して、ｎ＝６）で得た。放射化学的収率は［１８Ｆ］化合物番号１の前駆体のビス−およびトリスＴＦＡ塩と同じであった。放射化学的純度はＨＰＬＣを使用して分析用Ｃ１８カラムで試験し、９８％を超えていた。［１８Ｆ］化合物番号１は全合成時間６０分以内で得られ、合成の最後に（ＥＯＳ、ｎ＝６）比放射能６５±５５ＧＢｑ／μｍｏｌで回収した。
【００８１】
［１８Ｆ］−Ｔ８０７は、全合成時間６０分以内、比放射能４５±３５ＧＢｑ／μｍｏｌ、ＥＯＳ（ｎ＝４）、放射化学的純度９５％超で回収した。
【００８２】
ＩＩ．分析の部
ＬＣＭＳ一般手順
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定は、各方法に明記したＬＣポンプ、ダイオードアレイ（ＤＡＤ）検出器またはＵＶ検出器およびカラムを使用して行った。必要に応じて、追加の検出器を含めた（下の方法の表を参照）。
【００８３】
カラムからの流れを、大気圧イオン源を装備した質量分析計（ＭＳ）に導入した。化合物の公称モノアイソトピック分子量（ＭＷ）の特定を可能にするイオンを得るために、調整パラメータ（例えば、走査範囲、データ取込時間など）を設定することは当業者の知識の範囲内である。データ取得は、適切なソフトウェアを用いて行った。
【００８４】
化合物は、その実測保持時間（Ｒｔ）およびイオンで表される。データの表に別に明記されていなければ、報告される分子イオンは、［Ｍ＋Ｈ］＋（プロトン化分子）および／または［Ｍ−Ｈ］−（脱プロトン化分子）に相当する。化合物が直接イオン化できなかった場合、付加体の種類を明記する（すなわち、［Ｍ＋ＮＨ４］＋、［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−など）。複数の同位体パターンを有する分子（Ｂｒ、Ｃｌなど）については、報告される値は最低同位体質量について得られた値とする。得られた結果はすべて、使用する方法に通常付随する実験上の不確実性を伴っていた。
【００８５】
以下で、「ＳＱＤ」はシングル四重極検出器を意味し、「ＭＳＤ」は質量選択検出器を意味し、「ＲＴ」は室温を意味し、「ＢＥＨ」は架橋エチルシロキサン／シリカハイブリッドを意味し、「ＤＡＤ」はダイオードアレイ検出器を意味し、「ＨＳＳ」は高強度シリカを意味し、「Ｑ−Ｔｏｆ」は四重極飛行時間型質量分析計を意味し、「ＣＬＮＤ」は化学発光窒素検出器を意味し、「ＥＬＳＤ」は蒸発光走査検出器（Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を意味する。
【００８６】
【表２】
2019511461.tif 000028
【００８７】
融点
値はピーク値または融解範囲のいずれかであり、この分析方法に通常付随する実験上の不確実性を伴って得られる。
【００８８】
複数の化合物について、ＤＳＣ８２３ｅ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）で融点を測定した。融点は、１０℃／分の温度勾配で測定した。最高温度は３００℃とした。
【００８９】
【表３】
2019511461.tif 000029
【００９０】
ＩＩＩ．生物学的検査の部
ヒトＡＤ脳からの凝集タウおよびアミロイド斑の単離
濃縮した凝集タウ画分を、ＧｒｅｅｎｂｅｒｇおよびＤａｖｉｅｓが記述したプロトコル（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＳＧ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｐ．Ａ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９０；８７：５８２７−５８３１）をわずかに変更したバージョンに従い、ヒトＡＤ脳組織（タウ原線維の量が多い後頭皮質）を使用して調製した。手短に言えば、凍結したヒトＡＤ脳試料（約１０ｇ）を、１０体積の冷均質化緩衝液（１０ｍＭトリス、８００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０％スクロース、ｐＨ７．４、ＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼおよびｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴ不含プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｖｉｌｖｏｏｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有）を使用して、氷上で均質化した。２７０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離した後、上清を回収し、１％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンおよび１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを添加した。Ｎ−ラウロイルサルコシン／２−メルカプトエタノールの上清を、オービタルシェイカーで振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした。続いて、１０８０００×ｇにて室温で１．５時間超遠心分離して、凝集タウを濃縮してペレットにした。上清を除去し、ペレットを少量のＴＢＳ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で慎重に２回すすいだ。最後に、凝集タウのペレットをＴＢＳに入れて元通りにし、再懸濁させて試料の均質性を確認した。少量に等分して−８０℃で保管した。
【００９１】
濃縮した凝集β−アミロイド標本を、凍結したヒトＡＤ脳試料（１０ｇ−アミロイド斑の量が多い後頭皮質）から調製し、これを７倍体積の冷均質化緩衝液（２５０ｍＭスクロース、２０ｍＭトリス塩基、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡならびにＰｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼおよびｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤）を使用して氷上で均質化した。２７０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離した後、細胞片を除去した。アミロイド斑を含有する上清を等分し、−８０℃で保管した。
【００９２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合放射性リガンド結合アッセイ
競合放射性リガンド結合アッセイにより、用量反応濃度範囲の試験化合物の存在下で、放射標識した参照リガンドの結合を測定する。
【００９３】
手短に言えば、凝集タウ標本を、５％エタノールを含むＰＢＳ緩衝液に、１００μｇタンパク質／ｍｌまで希釈した。９６ウェル形式で、２０μｇタンパク質の凝集タウ標本の存在下にて、３Ｈ−Ｔ８０８（比放射能；３２．９７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度１０ｎＭで、漸増量の試験化合物に添加した。非特異的結合を、５０μＭチオフラビンＴ（一般的なβシート結合剤）の存在下で残存するカウント数として定義した。室温で２時間インキュベートしてから、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ９６ハーベスター装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｚａｖｅｎｔｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、ＧＦ／Ｂガラスフィルターで結合混合物を濾過することにより、結合していないリガンドを除去する。２０％エタノールを含有するＰＢＳ緩衝液で、フィルターを３回洗浄した。フィルタープレートを終夜乾燥してから、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ  Ｏ液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加した。原線維に結合した放射標識リガンドの数は、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）にて、液体シンチレーション計数により測定する。
【００９４】
半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、少なくとも２つの独立した実験の置換曲線から決定した。
【００９５】
凝集β−アミロイドに結合する化合物を判定するために、同様のアッセイを準備したが、一部、小さな変更を加えた。手短に言えば、アミロイド標本を、０．１％ＢＳＡおよび５％エタノールを含む５０ｍＭトリスに、１５０μｇタンパク質／ｍｌまで希釈した。３０μｇタンパク質のアミロイド斑標本の存在下で、３Ｈ−ＡＶ−４５（フロルベタピル−比放射能；４５．９５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を最終濃度１０ｎＭで、漸増量の試験化合物に添加した。非特異的結合を、５００μＭのチオフラビンＴの存在下で測定した。室温で１５０分インキュベートしてから、ＧＦ／Ｂガラスフィルターで結合混合物を濾過した。２０％エタノールを含有するＰＢＳ緩衝液で、フィルターを３回洗浄した。続くステップは凝集タウ標本について説明したものと同一とした。
【００９６】
この放射標識置換アッセイにおいて、［１９Ｆ］−化合物番号２および［１９Ｆ］−化合物番号３は、［３Ｈ］−Ｔ８０８を使用した際に、抽出されたヒトタウに強力な結合（それぞれｐＩＣ５０  ７．５および７．６）を示し、［３Ｈ］−ＡＶ−４５を使用した際に、１０μＭまで、抽出されたヒトアミロイド−β凝集体への測定可能な結合は示さなかった。
【００９７】
免疫組織化学検査：Ｍ＆Ｍヒト脳
ヒトＡＤ脳の塊（ＢｒａａｋのステージＶ−ＶＩ）を瞬間凍結し、クライオスタットでスライスし（２０μｍ厚）、免疫組織化学検査に使用するまで−８０℃で保管した。切片を乾燥し、ホルマリン中に固定し、過酸化水素（ＤＡＫＯ、Ｓ２０２３）で５分間、およびブロッキング試薬（ＰＢＳ１ｘ＋０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で１時間インキュベートした。抗アミロイドまたは抗タウ抗体［（４Ｇ８，Ｃｏｖａｎｃｅ，ＳＩＧ−３８２２０）、バックグラウンド低減成分（ＤＡＫＯ、Ｓ３０２２）を含む１／５００希釈の抗体希釈液、または（ＡＴ８（Ｂｉｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９２，１１（４）：１５９３−７）、内製、１ｍｇ／ｍｌ原液濃度）、バックグラウンド低減成分（ＤＡＫＯ、Ｓ３０２２）を含む０．２μｇ／ｍＬの抗体希釈液］、を切片に１時間適用した。大規模な洗浄の後に、スライドをＨＲＰコンジュゲート抗マウス二次抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＤＡＫＯ、Ｋ４０００）でインキュベートし、次いで発色ＤＡＢ標識した（ＤＡＫＯ、Ｋ３４６８）。ヘマトキシリンで対比染色してから、切片を脱水し、有機封入剤（Ｖｅｃｔａｍｏｕｎｔ，Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ，Ｈ−５０００）で封入した。図１ａは、ＡＴ８  ＩＨＣで検出したＡＤ脳におけるタウの病状を示し、図１ｂは、ＤＡＫＯ  ＩＨＣで検出したＡＤ脳におけるβ−アミロイドの病状を示す。高拡大画像は、赤い挿入の部位から取っている。
【００９８】
オートラジオグラフィー試験
ＡＤ患者（ＢｒａａｋのステージＶ−ＶＩ）の風乾凍結した２０μｍ厚の薄片を［１８Ｆ］化合物番号１（切片当たり７．４ｋＢｑ／５００μＬ）で６０分間インキュベートし、次いで、他で記載されているように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とエタノールとの混合物で洗浄した（Ｘｉａ  ＣＦ，Ａｒｔｅａｇａ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．［（１８）Ｆ］Ｔ８０７，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｕ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｅｍｅｎｔ．２０１３，１−１１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｌｚ．２０１２．１１．００８）。結合の特異性を査定するために、１μＭの標準Ｔ８０８または［１８Ｆ］化合物番号１の存在下で、薄片をトレーサーでインキュベートした。薄片を乾燥してから蛍光ストレージスクリーン（超分解能スクリーン、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に曝露した。スクリーンをＣｙｃｌｏｎｅ  Ｐｌｕｓシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で読み出し、Ｏｐｔｉｑｕａｎｔソフトウェアを使用して分析した。結果を平方ｍｍ当たりのデジタル光単位（ＤＬＵ／ｍｍ２）として表す。隣接するＡＤ薄片を抗タウ抗体（ＡＴ８）および抗Ａβ抗体（ＡＧ８）で免疫染色して、［１８Ｆ］化合物番号１の結合と関連付けた。図２は、オートラジオグラフィーにおけるＡＤ脳切片への［１８Ｆ］化合物番号１の結合を示す（左）。結合パターンは隣接するスライドにてＡＴ８  ＩＨＣで検出されたタウの病状（図１を参照）に十分に一致している。神経原線維変化（ＮＦＴ）へのトレーサー結合の特異性を査定するために、標準の化合物番号１およびＴ８０８での遮蔽試験を行った。１μＭの非放射性化合物番号１で自己遮蔽した結果は９９％阻害となった（図２、中央）。［１８Ｆ］化合物番号１の結合は、１μＭのＴ８０８の存在下では９８％低減した（図２、右）。遮蔽のパーセンテージは（１ｍｏｌ／Ｌ遮蔽剤の存在下でのＤＬＵ／ｍｍ２）／（ＤＬＵ／ｍｍ２トレーサーのみ）として計算した。
【００９９】
マイクロＰＥＴ画像化試験
ウィスターラット
動的１２０分マイクロＰＥＴスキャンを、Ｆｏｃｕｓ（商標）２２０マイクロＰＥＴスキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｋｏｎｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ，ＵＳＡ）で、３匹の雌ウィスターラットを全手順の間ガス麻酔下に置いて（Ｏ２中２．５％イソフルラン、流速１Ｌ／分）同時に行った。動物の頭部をマイクロＰＥＴスキャナーの視野の中央に置いた。スキャンをリストモードで取得し、取得データに２４の時間枠（４×１５秒、４×６０秒、５×１８０秒、８×３００秒、３×６００秒）でフーリエリビニングをした。データに３Ｄ最大事後確率（３Ｄ−ＭＡＰ）再構成を施し、アフィン変換を使用して、Ｐａｘｉｎｏｓの座標におけるラット脳［１８Ｆ］ＦＤＧテンプレートに手作業で位置合わせをし、事前定義した関心体積（ＶＯＩ）分析を可能にした。全脳の時間放射能曲線（ＴＡＣ）を、ＶＯＩを使用して、ＰＭＯＤソフトウェア（ｖ３．２、ＰＭＯＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｚｕｅｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で生成した。脳内の放射能濃度を、トレーサー注射後の時間の関数としての標準取込値（ＳＵＶ、（脳内放射能Ｂｑ／ｍＬ）／（全注入量（Ｂｑ）／体重ｇ）で計算）として表した。スキャンを、５０ＭＢｑの［１８Ｆ］化合物番号１または［１８Ｆ］Ｔ８０７のＩＶ注射直後に開始した（ｎ＝３／トレーサー）。前処置試験および置換試験のために、非放射性参照化合物である化合物番号１またはＴ８０７を、５％ＤＭＳＯと、５％Ｔｗｅｅｎ８０と、４０％（２−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン（ＣＤ）との混合物に溶解し（以下のように調製：化合物をＤＭＳＯに溶解し、次いで４０％ＣＤ水溶液で希釈し、次いで５％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液を添加し（沈殿を防止するため）、次いで最終ＤＭＳＯ濃度が５％になるまで４０％ＣＤ水溶液でさらに希釈した）、注射前に０．２２μｍ膜フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。前処置（ｎ＝１）は、放射性トレーサー注射の６０分前に、１０ｍｇ／ｋｇの化合物番号１またはＴ８０７を皮下（ＳＣ）注射することによって行った。置換（ｎ＝１）は、放射性トレーサー注射の３０分後に、１ｍｇ／ｋｇの化合物番号１またはＴ８０７をＩＶ注射することによって行った。μＰＥＴ画像を、未処置のラットにおいて取得したベースラインスキャン（ｎ＝１）と比較した。
【０１００】
［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の１２０分のベースライン、前処置および追跡試験の結果を、図３ａおよび３ｂにそれぞれ示す（時間放射能曲線、ＴＡＣ）。［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７のベースラインスキャンのＴＡＣは、両化合物について、初期脳取込みが高く、約１．６という比較的高強度の脳内ＳＵＶ値であったことを示した（図３および４）。［１８Ｆ］化合物番号１は、図４）のＳＵＶ曲線に示すように、［１８Ｆ］Ｔ８０７と比較して、ウォッシュアウト速度が最も速かった（注射の６０分後にＳＵＶ値０．２）。自己遮蔽も自己追跡効果も［１８Ｆ］化合物番号１には観察されなかったが、これは、脳内に、特異的な非タウ関連の結合は存在しないことを示すものである。前処置試験と比較して、［１８Ｆ］Ｔ８０７のベースラインスキャン中の脳取込みは低かったことが記録された。同様の効果が追跡試験において注射の４０分後に観察された。
【０１０１】
マイクロＰＥＴ画像化試験
アカゲザル（実験１）
［１８Ｆ］化合物番号１または［１８Ｆ］Ｔ８０７を使用した動的１２０分マイクロＰＥＴスキャンを、Ｆｏｃｕｓ（商標）２２０マイクロＰＥＴスキャナー（Ｃｏｎｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ，ＵＳＡ）にて、筋肉内（ＩＭ）注射によりケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標））およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））で鎮静状態にした雌アカゲザル（９歳アカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、５．３ｋｇ）および雄アカゲザル（６歳アカゲザル（ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、７．６ｋｇ）にそれぞれ行った。スキャン中、サルに、追加用量のケタミン／キシラジンをＩＶ注射により反復投与した。血液中Ｏ２飽和、呼吸頻度および心拍数を、全実験中モニターした。動物の頭部をマイクロＰＥＴスキャナーの視野の中央に置いた。スキャンをリストモードで取得し、取得データに２４の時間枠（４×１５秒、４×６０秒、５×１８０秒、８×３００秒、３×６００秒）でフーリエリビニングをした。データを、３Ｄ最大事後確率（３Ｄ−ＭＡＰ）反復再構成法を使用して再構成した。全脳、脳梁、小脳および嗅内皮質のＴＡＣを、ＶＯＩを使用して、ＰＭＯＤソフトウェアで生成した。脳内の放射能濃度を、トレーサー注射後の時間の関数としてのＳＵＶとして表す（図５ａおよび５ｂ）。スキャンを、１８５ＭＢｑの［１８Ｆ］Ｔ８０７の［１８Ｆ］化合物番号１を右肢の伏在静脈にＩＶ注射した直後に開始した。［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の１２０分ベースラインスキャンの結果を図５ａおよび５ｂにそれぞれ示す。再度、［１８Ｆ］化合物番号１のベースラインスキャンのＴＡＣは、初期脳取込みが高く、ウォッシュアウトが速い（ＳＵＶ値約１．８）ことを示し、白質結合の増加は記録されなかった（図５ａ）。脳内の［１８Ｆ］Ｔ８０７のベースラインスキャンのＴＡＣは、初期脳取込みがもっと遅く（ＳＵＶ値約１．３）、ウォッシュアウトがもっと遅いことを示す（図５ｂ）。頭蓋側部でのＴＡＣは、両化合物について、時間の関数としての増加はしなかった。したがって、［１８Ｆ］化合物番号１の頭蓋付近での高取込みの集中は、アクリル製ヘッドポストをサルの頭蓋に固定したことで生じた瘢痕または炎症組織に［１８Ｆ］化合物番号１が貯留したためである可能性が高い。
【０１０２】
アカゲザル（実験２）
［１８Ｆ］化合物番号１または［１８Ｆ］Ｔ８０７を使用した動的１２０分μＰＥＴスキャンを、Ｆｏｃｕｓ２２０μＰＥＴスキャナーにて、筋肉内（ＩＭ）注射によりケタミン（Ｋｅｔａｌａｒ（登録商標））およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））で鎮静状態にした雄アカゲザル（６歳アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、７．６ｋｇ）に行った。スキャン中、サルに、追加用量のケタミン／キシラジンをＩＶ注射により反復投与した。血液中Ｏ２飽和、呼吸頻度および心拍頻度を、全実験中モニターした。動物の頭部をμＰＥＴスキャナーの視野の中央に置いた。スキャンをリストモードで取得し、２４の時間枠（４×１５秒、４×６０秒、５×１８０秒、８×３００秒、３×６００秒）でフーリエリビニングをした。データを、３Ｄ最大事後確率（３Ｄ−ＭＡＰ）反復再構成法を使用して再構成した。全脳のＴＡＣを、ＶＯＩを使用して、ＰＭＯＤソフトウェアで生成した。脳内の放射能濃度を、トレーサー注射後の時間の関数としてのＳＵＶとして表す。スキャンを、１８５ＭＢｑの［１８Ｆ］化合物番号１または［１８Ｆ］Ｔ８０７を右肢の伏在静脈にｉ．ｖ．注射した直後に開始した。［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の１２０分ベースラインスキャンの結果を図７ａおよび７ｂにそれぞれ示す。脳内の［１８Ｆ］化合物番号１のベースラインスキャンのＴＡＣは、初期脳取込みが速く高く、ウォッシュアウトが速い（ＳＵＶ値約１．９、ピークまでの時間：１分）ことを示し、白質結合が低いことが記録された。脳内の［１８Ｆ］Ｔ８０７のベースラインスキャンのＴＡＣは、初期脳取込み（ＳＵＶ値約１．３、取込みピークまでの時間：１５分）およびウォッシュアウトがもっと遅いことを示す（図８）。頭蓋のＴＡＣは、両化合物について、ＳＵＶシグナルが時間の関数としての増加はしなかったことを示す。実験１で観察された［１８Ｆ］化合物番号１の頭蓋付近での高取込みの集中は、実験２では、同程度まで観察されなかった。［１８Ｆ］化合物番号１および［１８Ｆ］Ｔ８０７の頭蓋のＴＡＣにより、シグナルが経時で減少しているため、頭蓋付近での集中的な取込みの増加は［１８Ｆ］フルオリドに関連する骨取込みによるものではあり得ないことが示された。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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