(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及びその応用を提供する。提供される抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、腫瘍の生長を有効的に抑制でき、ヒトＳＩＲＰとヒトＣＤ４７とのシグナルを遮断することで、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用を促進し、腫瘍細胞が腫瘍免疫の防御システムから逃げることを阻止し、抗腫瘍の作用を発揮できる。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７と大食細胞の表面のＳＩＲＰとの結合を遮断することで、腫瘍細胞からの「食べないで」とのシグナルを遮断でき、大食細胞の腫瘍細胞に対する識別摂取を促進し、腫瘍細胞が呑食されることを促進できる。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７と大食細胞の表面のＳＩＲＰとの結合は、一般的な「食べないで」とのシグナルであり、抗ＣＤ４７抗体を腫瘍免疫システムにおける非常に有望な標的とすることができ、人類の腫瘍治療に強力で有効な作用を発揮する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体であって、
（I）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７で表され、
（II）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４で表され、
（III）（I）または（II）に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）で表されるアミノ酸配列と同じまたは類似するアミノ酸配列；または
（IV）（I）または（II）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である
ことを特徴とする、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項３】
前記置換が高度可変領域に発生し、
前記重鎖可変領域の高度可変領域がＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３であり、
配列番号２の高度可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４５で示され、ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４６で示され、そしてＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号４７で示され、
配列番号５の高度可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４８で示され、ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４９で示され、そしてＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５０で示され、
配列番号６の高度可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号５１で示され、ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号５２で示され、そしてＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５３で示され、
前記軽鎖可変領域の高度可変領域がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３であり、
配列番号９の高度可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５４で示され、ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５５で示され、そしてＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５６で示され、
配列番号１２の高度可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５７で示され、ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５８で示され、そしてＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５９で示され、
配列番号１３の高度可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号６０で示され、ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号６１で示され、そしてＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号６２で表される
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項４】
（i）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号８である軽鎖可変領域、
（ii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号９である軽鎖可変領域、
（iii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１０である軽鎖可変領域、
（iv）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１１である軽鎖可変領域、
（V）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１２である軽鎖可変領域、
（VI）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１３である軽鎖可変領域、
（VII）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１４である軽鎖可変領域
を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項５】
重鎖の類型がＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＭであり、軽鎖の類型がκであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体をコードする、ヌクレオチド。
【請求項７】
（I）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列、配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、または
（II）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列、配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列、または
（III）（I）または（II）のヌクレオチド配列と同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のため、（I）または（II）のヌクレオチド配列と異なる配列、または
（IV）（I）または（II）または（III）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列
を有することを特徴とする、請求項６に記載のヌクレオチド。
【請求項８】
（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列と同じまたは類似するヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項６または７に記載のヌクレオチド。
【請求項９】
前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１２】
配列番号２９〜３２のいずれか一つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗原。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を生産する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１４】
工程１：請求項１２に記載の抗原でマウスを免疫させた後、マウスの脾臓細胞を得ること、
工程２：前記脾臓細胞と骨髓腫細胞とを融合させ、ＣＤ４７と結合可能なハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、体外培養により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を作製すること、
を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜５いずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が化学的マーカーまたは生物学的マーカーで標識された結合物。
【請求項１６】
前記化学的マーカーが同位体、免疫毒素及び／または化学薬物であり、前記生物学的マーカーがビオチン、アビジンまたは酵素標識であることを特徴とする、請求項１５に記載の結合物。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体または請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物を、固体媒質または半固体媒質とカップリングさせてなるカップリング物。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、ＣＤ４７の発現検出用製品の製造における使用。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する製剤の製造における使用。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用指数を向上させる製剤の製造における使用。
【請求項２２】
前記腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、腫瘍細胞のアポトーシスを促進させる製剤の製造における使用。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫という疾患を予防治療する薬物の製造における使用。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物を含むことを特徴とする、薬物。
【請求項２７】
請求項１９に記載のキットでＣＤ４７の発現を検出し、ＣＤ４７の発現量により疾患を患っているか否かを判断する診断方法であって、前記疾患が白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫であることを特徴とする、疾患の診断方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の薬物を投与する疾患の予防治療方法であって、前記疾患が白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫であることを特徴とする、疾患の予防治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０１６年６月１７日に中国特許局に提出した、出願番号が２０１６１０４３６５１９．３で、発明名称が「抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及びその応用」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、そのすべての内容を本願に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は抗体薬物の技術分野に関するもので、特に抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及びその応用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４７
ＣＤ４７はインテグリン相関蛋白（ＩＡＰ）とも呼ばれ、最初にヒトの胎盤とインテグリンａＶβ３との共純化、及び血小板とβ３インテグリンとの共免疫沈殿で発見されるものとして知られており、細胞表面で広く発現される膜貫通糖タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するものである。
【０００４】
ＣＤ４７は細胞表面における極めて重要なマーカーで、分子量が４７〜５５Ｋｄであり、構造上、アミノ末端の細胞外可変領域１つと、３〜５個の高度に疏水の膜貫通断片からなる膜貫通領域１つと、親水であるカルボキシ基末端細胞質尾とを含む。ＣＤ４７は複数種の配位子、例えばインテグリン、ＳＩＲＰα（シグナル調節タンパク質α）、ＳＩＲＰγ及び血小板反応タンパク質と相互作用する。
【０００５】
ＳＩＲＰα
シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）も膜貫通タンパク質の一種であり、主に大食細胞、樹状細胞及び神経細胞の表面で発現される。その細胞外ドメインは、３つの免疫グロブリンスーパーファミリー領域を有し、そのうち、Ｎ末端領域がＣＤ４７との結合を媒介し、その細胞内ドメインが典型的な免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有する。ＣＤ４７と結合した後、ＳＩＲＰαのＩＴＩＭがリン酸化され、カスケード反応が起こり、大食細胞の食作用が抑制される。
【０００６】
ＣＤ４７／ＳＩＲＰαが腫瘍免疫逃避のメカニズムに関与する
先天性免疫系において、自己マーカーであるＣＤ４７が、大食細胞、好中球及び樹状細胞のような骨髄細胞によって発現されるＳＩＲＰαと結合することで、阻害性である「食べないで」とのシグナルを転送して機能する。よって、ＣＤ４７の生理学的条件下での広範な発現の作用は、健康な細胞を保護し、それらが先天性免疫系によって排除されるのを避けることである。しかしながら、腫瘍細胞はＣＤ４７を過剰に発現させることにより、免疫系の監視から有効的に逃げる。
【０００７】
近年、ＣＤ４７及びＣＤ４７−ＳＩＲＰαのシグナルシステムが注目されている。そのうち、一番注目されているのは、腫瘍治療の潜在的な薬物ターゲットであることである。ＣＤ４７の発現が大部分の人類の癌（例えば、ＮＨＬ、ＡＭＬ、乳癌、結腸癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、卵巣癌、膀胱癌及び前立腺癌）において向上し、且つ向上したＣＤ４７の発現レベルが侵襲性疾患と生存不良と関連することが、研究によって実証されている。スタンフォード大学のＷｅｉｓｓｍａｎは複数種の固形腫瘍におけるＣＤ４７の発現レベルを系統的に研究した結果、すべての人の固形腫瘍細胞におけるＣＤ４７が高い発現レベルを呈し、その平均発現レベルが対応の正常細胞の３．３倍程度であることが証明されている。それに、Ｗｅｉｓｓｍａｎらは固形腫瘍患者のＣＤ４７ｍＲＮＡのレベルと予後指数とが負の相関にあることを見出した。
さらに、イン・サイチュ免疫不全マウスに対する異種移植片動物モデルの実験により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を用いることで、大型腫瘍の生長及び転移が阻害され、小型腫瘍を治愈できることが見出された。
【０００８】
Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍらはイン・サイチュマウス乳癌モデル実験において、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の有効性と安全性を証明した。この研究により、高発現のＣＤ４７が腫瘍細胞が免疫監視から逃げるための一般的なメカニズムであることを証明しただけではなく、ＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル通路の遮断による腫瘍の治療にも重要な参考を提供している。
【０００９】
治療性抗ＣＤ４７抗体
ＣＤ４７が複数種の腫瘍において高度に発現され、「食べないで」とのシグナルとして食作用を抑制するということは、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα通路を標的とすることが複数種の腫瘍の治療方法になることを意味する。
【００１０】
ＲＡＵＨらは体内外の実験により、遮断性抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用を促進でき、マウス体内における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の形成を抑制し、体内に成功に移植されたＡＭＬを除去し、白血病幹細胞（ＬＳＣ）を標的として排除できることを証明した。ＣＨＡＯらの急性リンパ芽球性白血病に対する研究により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体とリツキシマブとの組合せが原始移植部位の腫瘍を除去できるだけでなく、血液循環及び肝臓、脾臓、リンパ節などの部位へ拡散する腫瘍も除去でき、長期生存および腫瘍の再発に対する抑制效果を達成する一方、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体または抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を単独に使用した場合、ＮＨＬの生長速度を抑制しただけであって、ＮＨＬを完全に除去できないことが見出された。
【００１１】
抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の腫瘍に対する作用をさらに証明するために、ＷＩＬＬＩＮＧＨＡＭらは免疫活性を有するマウスで移植腫瘍モデルを作り、抗マウス及び抗ヒトＣＤ４７モノクローナル抗体がいずれも腫瘍の生長を著しく抑制でき、且つ抗ＣＤ４７抗体が複数種の固形腫瘍を除去し、腫瘍の転移及び再発を抑制できること；また、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が腫瘍幹細胞（ＣＳＣ）及びそれより分化した亜種に対しても抗腫瘍作用を有し、腫瘍原性のＴＡＭを抗腫瘍性のエフェクターに変換させ、その食作用を強化できることが証明された。マウスＣＤ４７の発現を抑制することで、腫瘍細胞の放射線治療に対する敏感性を向上させることができ、正常組織に対して保護作用を有し、当該作用は宿主免疫細胞を誘導して防御的自己貪食を生じさせることに関連する可能性がある。
【００１２】
抗ＣＤ４７モノクローナル抗体による腫瘍の治療は複数種のメカニズムに関連する。まず、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は腫瘍細胞上のＣＤ４７と大食細胞のＳＩＲＰαとの結合を遮断することで、腫瘍細胞を貪食させる。また、抗体依存性かつ細胞媒介性細胞傷害及び補体依存性細胞傷害に関連し、抗ＣＤ４７抗体がＮＫ細胞が参与する頭頸部腫瘍細胞に対する細胞傷害を誘導できることが研究によって見出された。次に、腫瘍細胞はアポトーシスを直接誘導することによって排除される。最後に、免疫活性を有するマウスに対する研究により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体がＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させることができ、獲得性Ｔ細胞の免疫反応を引き起こし、さらに腫瘍細胞を死滅させることが見出された。
【００１３】
腫瘍分子の発生メカニズムの研究が深くなるにつれ、分子免疫治療が徐々に手術及び化学薬品治療以外のもう一つの有効な治療手段になっている。現在、腫瘍治療における生物治療の作用が年々向上していて、生物治療は腫瘍再発の防止、末期がんの治療及び併発症などのいろいろな面において、多くの利点を有する。よって、ＣＤ４７を標的とすることができる抗体及び治療に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【００１４】
以上のことを鑑みて、本発明の解決しようとする課題は、ヒトＣＤ４７及びサルＣＤ４７と結合でき、用量依存的にヒトＳＩＲＰとヒトＣＤ４７との結合を遮断でき、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用を促進させる抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及びその応用を提供することである。ＳＩＲＰとヒトＣＤ４７との結合シグナルを遮断することで、腫瘍細胞が腫瘍免疫の防御システムから逃げることを阻止し、抗腫瘍作用を発揮する。
【００１５】
本発明が提供するのは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体であって、
（I）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７で表される；
（II）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４で表される；
（III）（I）または（II）に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）で表されるアミノ酸配列と同じまたは類似するアミノ酸配列；または
（IV）（I）または（II）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。本発明では、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体において、
本発明の一部の具体的な実施形態では、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体のアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列において、前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個である。
【００１６】
前記置換が超可変領域に発生する；
前記重鎖可変領域の超可変領域がＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３である；
配列番号２の超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４５で表される；ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４６で表される；ＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号４７で表される；
配列番号５の超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４８で表される；ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４９で表される；ＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５０で表される；
配列番号６の超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号５１で表される；ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号５２で表される；ＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５３で表される；
前記軽鎖可変領域の超可変領域がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３である；
配列番号９の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５４で表される；ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５５で表される；ＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５６で表される；
配列番号１２の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５７で表される；ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５８で表される；ＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５９で表される；
配列番号１３の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号６０で表される；ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号６１で表される；ＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号６２で表される。
【００１７】
その重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１〜７のいずれか一項で表される；
その軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８〜１４のいずれか一項で表される。
【００１８】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、
（i）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号８である軽鎖可変領域；
（ii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号９である軽鎖可変領域；
（iii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１０である軽鎖可変領域；
（iv）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１１である軽鎖可変領域；
（V）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１２である軽鎖可変領域；
（VI）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１３である軽鎖可変領域；
（VII）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１４である軽鎖可変領域、
を有する。
【００１９】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の重鎖の類型がＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＭであり、その軽鎖の類型がκである。
【００２０】
また、本発明は、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体をコードする、ヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、
（I）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列；配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列；または
（II）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列；配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列；または
（III）（I）または（II）のヌクレオチド配列と同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のため、（I）または（II）のヌクレオチド配列と異なる配列；または
（IV）（I）または（II）または（III）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
を有する。
【００２２】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列と同じまたは類似するヌクレオチド配列を有する。
【００２３】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個である。
【００２４】
また、本発明は、本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００２５】
また、本発明は、本発明に記載の発現ベクターで形質転換される宿主細胞を提供する。
【００２６】
また、本発明は、配列番号２９〜３２のいずれか一項で表されるアミノ酸配列を有する抗原を提供する。
【００２７】
また、本発明は、本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提供する。
【００２８】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の製造方法は、
工程１：本発明が提供する抗原でマウスを免疫させた後、マウスの脾臓細胞を得ること；
工程２：前記脾臓細胞と骨髓腫瘍細胞とを融合させ、ＣＤ４７と結合可能なハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、体外培養により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を作製すること、
を含む。
【００２９】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が化学的マーカーまたは生物学的マーカーでマークされてなる結合物。
【００３０】
前記化学的マーカーが同位体、免疫毒素及び／または化学薬物である；
前記生物学的マーカーがビオチン、アビジンまたは酵素標識である。
【００３１】
本発明は、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体または結合物を、固体媒質または半固体媒質とカップリングさせてなるカップリング物を提供する。
【００３２】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、ＣＤ４７の発現検出用製品の製造における使用。
【００３３】
本発明は、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物を含むキットを提供する。
【００３４】
本発明が提供するキットでＣＤ４７の発現を検出し、ＣＤ４７の発現量に基づいて疾患を患っているか否かを判断する、疾患の診断方法。
【００３５】
前記疾患が白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫である。
【００３６】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する製剤の製造における使用。
【００３７】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用指数を向上させる製剤の製造における使用。
【００３８】
本発明の実施例において、腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞である。
【００３９】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、腫瘍細胞のアポトーシスを促進させる製剤の製造における使用。
【００４０】
本発明の実施例において、腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞である。
【００４１】
前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫という疾患を予防治療する薬物の製造における使用。
【００４２】
本発明は、本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、その結合物及び／またはカップリング物を含む薬物を提供する。
【００４３】
本発明に記載の薬物を投与する疾患の予防治療方法であって、前記疾患が白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫である疾患の予防治療方法。
【００４４】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、腫瘍の生長を有効的に抑制でき、ヒトＳＩＲＰとヒトＣＤ４７のシグナルを遮断することで、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用を促進し、腫瘍細胞が腫瘍免疫の防御システムから逃げることを阻止し、抗腫瘍の作用を発揮できる。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７と大食細胞の表面のＳＩＲＰとの結合を遮断することで、腫瘍細胞からの「食べないで」とのシグナルを遮断でき、大食細胞の腫瘍細胞に対する識別摂取を促進し、腫瘍細胞が呑食されることを促進できる。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７と大食細胞の表面のＳＩＲＰとの結合は、一般的な「食べないで」とのシグナルであり、抗ＣＤ４７抗体を腫瘍免疫システムにおける非常に有望な標的とすることができ、人類の腫瘍治療に強力で有効な作用を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】精製されたヒト及びサルのＣＤ４７をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により検出することを示す図である；レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；図１−Ａ：レーン１：ヒトＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ；レーン２：ヒトＣＤ４７−リンカーペプチド−Ｈｉｓ；図１−Ｂ、レーン１：マウスＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ；レーン２：マウスＣＤ４７−リンカーペプチド−Ｈｉｓ。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により陽性抗体（ＰＡＢ）を検出することを示す図である；レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：非還元ＰＡＢ；レーン２：還元ＰＡＢ。
【図３】精製された候補抗体を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により検出することを示す図である；レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：０５９−１．１１．１精製抗体；レーン２：０５９−１．２０．１精製抗体；レーン３：０５９−１．３０．１精製抗体；レーン４：０５９−１．４３．１精製抗体；レーン５：０５９−１．５１．２精製抗体；レーン６：０５９−１．８２．１精製抗体；レーン７：０５９−１．１００．５精製抗体。
【図４】全ＲＮＡの電気泳動を示す図である；Ｍ：ＤＬ２０００分子量マーカー、レーン１−７：それぞれ、０５９−１．１１．１、０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１、０５９−１．５１．２、０５９−１．８２．１、０５９−１．１００．５の全ＲＮＡ電気泳動バンドである。
【図５】ＰＣＲ増幅候補抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアガロース電気泳動の検出結果を示す図である。
【図６】抗体である０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１、０５９−１．８２．１がヒトＣＤ４７とＳＩＲＰαを遮断した結果を示す図である。
【図７】抗体である０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１、０５９−１．８２．１とｊｕｒｋａｔ細胞の表面のＣＤ４７と結合したＦＡＣＳ測定実験を示す図である；
【図８】抗体である０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１、０５９−１．８２．１が、マウス腹腔初代大食細胞のＪｕｒｋａｔ細胞に対する呑食を促進することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は抗ＣＤ４７モノクローナル抗体及びその応用を提供し、当業者は本明細書の内容に基づき、プロセスパラメータを適切に改善することにより実現できる。なお、すべての類似の代替及び変更は当業者にとって自明であり、それらは本発明に含まれるものと見なされる。本発明の方法及び応用は好ましい実施例により説明されたが、当業者が、本発明の内容、主旨及び範囲から逸脱しない限り、本発明の方法及び応用に対して修正または適切な変更と組み合わせを行うことで、本発明の技術を実現・応用できることは明らかである。
【００４７】
「抗体」とは、抗原を特異的に結合できる一種または複数種のポリペプチドからなるタンパク質である。抗体の一種の形態が抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、完全に同一である二対の抗体鎖からなり、各対には１つの軽鎖及び１つの重鎖が含まれる。各対の抗体鎖において、軽鎖及び重鎖の可変領域が互いに連合し、共に抗原の結合を担当し、定常領域は抗体のエフェクター機能に担う。
【００４８】
抗体重鎖または軽鎖の「可変領域」は、当該鎖のＮ末端の成熟領域である。現在、知られている抗体の類型には、κとλ軽鎖、及びα、γ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４)、δ、εとμ重鎖またはそれらの他の類型の等価物が含まれる。全長の免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４個のアミノ酸）は、ＮＨ２−末端における約１１０個のアミノ酸からなる１つの可変領域、及びＣＯＯＨ−末端における１つのκまたはλ定常領域を含む。全長の免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６個のアミノ酸）も同様に、１つの可変領域（約１１６個のアミノ酸）及び重鎖の定常領域の１つ、例えばγ（約３３０個のアミノ酸）を含む。
【００４９】
「抗体」はいずれのアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、或いは抗原との特異性結合を保持する抗体フラグメントを含み、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、および抗体の抗原結合部分並びに非抗体タンパク質を含有する融合タンパク質を含むが、それらに限定されない。抗体は、例えば、放射性同位素、検出可能な物質を生産できる酵素、蛍光タンパク質、ビオチンなどによってマーク・検出されることができる。抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含む固相ベクターに結合できが、それらに限定されない。
【００５０】
本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体であって、
（I）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７で表される；
（II）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４で表される；
（III）（I）または（II）に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）で表されるアミノ酸配列と同じまたは類似するアミノ酸配列；または
（IV）（I）または（II）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を提供している。
【００５１】
本発明の一部の具体的な実施形態では、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体のアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列において、前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個である。
【００５２】
前記置換が超可変領域に発生する；
前記重鎖可変領域の超可変領域がＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３である；
配列番号２の超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４５で表される；ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４６で表される；ＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号４７で表される；
配列番号５の超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４８で表される；ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４９で表される；ＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５０で表される；
配列番号６の超可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号５１で表される；ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号５２で表される；ＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５３で表される；
前記軽鎖可変領域の超可変領域がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３である；
配列番号９の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５４で表される；ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５５で表される；ＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５６で表される；
配列番号１２の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５７で表される；ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５８で表される；ＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５９で表される；
配列番号１３の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号６０で表される；ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号６１で表される；ＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号６２で表される。
【００５３】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、
（i）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号８である軽鎖可変領域；
（ii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号９である軽鎖可変領域；
（iii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１０である軽鎖可変領域；
（iv）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１１である軽鎖可変領域；
（V）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１２である軽鎖可変領域；
（VI）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１３である軽鎖可変領域；
（VII）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１４である軽鎖可変領域、
を有する。
【００５４】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の重鎖の類型がＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＭであり、その軽鎖類型がκである。
【００５５】
具体的には、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００５６】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００５７】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００５８】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００５９】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００６０】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００６１】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【００６２】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６３】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６４】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６５】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６６】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６７】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６８】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【００６９】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７０】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７１】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７２】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７３】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７４】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７５】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【００７６】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００７７】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００７８】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００７９】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００８０】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００８１】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００８２】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【００８３】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００８４】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００８５】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００８６】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００８７】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００８８】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００８９】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【００９０】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９１】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９２】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９３】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９４】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９５】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９６】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【００９７】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【００９８】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【００９９】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【０１００】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【０１０１】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【０１０２】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【０１０３】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【０１０４】
本発明の実施例において、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８で表される。
【０１０５】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される。
【０１０６】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される。
【０１０７】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される。
【０１０８】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号５で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２で表される。
【０１０９】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で
表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される。
【０１１０】
また、抗ＣＤ４７のモノクローナル抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号７で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１４で表される。
【０１１１】
本発明の抗体０５９−１．８２．１の重鎖定常領域がマウスＩｇＧ３であり、軽鎖定常領域がマウスκ鎖の定常領域であり、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１及び０５９−１．２０．１がいずれもマウスＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がマウスκ鎖の定常領域であり、０５９−１．１１．１、０５９−１．５１．２、０５９−１．１００．５の重鎖定常領域がマウスＩｇＭであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１−７の中の一つであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８−１４の中の一つである。
【０１１２】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体がヒトＣＤ４７及びサルＣＤ４７を結合できる；一部の実施形態において、抗体とその標的領域との間の親和力がＫａ、Ｋｄ（解離定数）、ＫＤ（平衡解離定数）で表され、本発明が提供する抗体のＫＤ値が３０Ｎｍ以下である。
【０１１３】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は用量依存的にヒトＳＩＲＰとヒトＣＤ４７との結合を遮断できる；その遮断効果はＥＣ５０値で表され、本発明が提供する抗体のＥＣ５０値が８５０ｎＭ以上である。
【０１１４】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は細胞の表面のＣＤ４７と結合できる；その効果の検出をＦＡＣＳ法で行い、その結果がＭＦＩ（蛍光強度）で表され、本発明が提供する抗体の細胞の表面のＣＤ４７との結合のＭＦＩ値が９５４７以上で、最高は１８５３３に達することができる。
【０１１５】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用を促進でき、その効果は蛍光イメージング法で測定し、その結果が食作用指数で表される。本発明が提供する抗体のｊｕｒｋａｔ細胞に対する食作用指数が７９に至ることができる。
【０１１６】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は腫瘍細胞のアポトーシスを誘導でき、その効果は、フローサイトメトリーにより検出される細胞アポトーシス率で表され、結果によれば、本発明が提供する抗体はｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導でき、そのアポトーシス率が４８％に至ることができる。
【０１１７】
Ｊｕｒｋａｔ細胞は急性Ｔ細胞白血病細胞株に属し、複数種の悪性腫瘍細胞の一種であり、他の悪性腫瘍と同じく、ｊｕｒｋａｔ細胞の表面でＣＤ４７が高度に発現される。本発明において、ｊｕｒｋａｔに対する実験によると、本発明が提供するＣＤ４７モノクローナル抗体はＳＩＲＰとヒトＣＤ４７との結合シグナルを遮断することで、腫瘍細胞が腫瘍免疫の防御システムから逃げることを阻止し、抗腫瘍の作用を発揮できることが証明されている。
【０１１８】
本発明が提供するモノクローナル抗体において、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号９で表される；重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表される；重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表される；重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１３で表される、モノクローナル抗体は、ヒトＣＤ４７やサルＣＤ４７と良好な親和力を有し、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断でき、細胞表面のＣＤ４７と結合でき、大食細胞の腫瘍細胞に対する呑食を促進し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導できる。
【０１１９】
ここで、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号４で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１１で表されるモノクローナル抗体の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する効果が最も優れている。また、それと腫瘍細胞表面のＣＤ４７との結合效果も、大食細胞が腫瘍細胞を呑食するように誘導する效果も最も優れている。しかし、腫瘍細胞のアポトーシスの誘導の面において、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号３で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１０で表されるモノクローナル抗体のほうが優れた効果を有する。
【０１２０】
本発明において、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドも提供されている。
【０１２１】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、
（I）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列；配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列；または
（II）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列；配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列；または
（III）（I）または（II）のヌクレオチド配列と同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のため、（I）または（II）のヌクレオチド配列と異なる配列；または
（IV）（I）または（II）または（III）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列、
を有する。
【０１２２】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列と同じまたは類似するヌクレオチド配列を有する。
【０１２３】
本発明の一部の具体的な実施形態において、前記ヌクレオチドは、（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列を有し、前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個である。
【０１２４】
また、本発明は、本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域を提供するヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０１２５】
また、本発明は、本発明に記載の発現ベクターで形質転換される宿主細胞を提供する。
【０１２６】
また、本発明は、配列番号２９〜３２のいずれか一項で表されるアミノ酸配列を有する抗原を提供する。
【０１２７】
また、本発明は、本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を提供する。
【０１２８】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の製造方法は、
工程１：本発明が提供する抗原でマウスを免疫させた後、マウスの脾臓細胞を得ること；
工程２：前記脾臓細胞と骨髓腫瘍細胞とを融合させ、ＣＤ４７と結合可能なハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、体外培養により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を作製すること、
を含む。
【０１２９】
本発明において、工程１における前記抗原のアミノ酸配列が配列番号２９または３１で表される。
【０１３０】
本発明において、抗原とアジュバントを混合した後、マウスを免疫させる。
【０１３１】
抗原とアジュバントの体積比が１：１である。
【０１３２】
前記免疫について、具体的には、第１回の免疫の二週間後に第２回の免疫を行い、３日後、血清力価が１：２０００００以上であるマウスに対して追加免疫を行う。
【０１３３】
第１回の免疫、第２回の免疫及び追加免疫の剤量が、抗原の質量として、いずれも１０μgである。
【０１３４】
免疫は２箇所注射で行う。
【０１３５】
第１回の免疫のアジュバントが完全フロインドアジュバントであり、第２回の免疫及び追加免疫のアジュバントが不完全フロインドアジュバントである。
【０１３６】
免疫に用いるマウスがＢＡＬＢ／Ｃマウスである。
【０１３７】
骨髓腫瘍細胞がＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３である。
【０１３８】
脾臓細胞と骨髓腫瘍細胞の個数比が５：１になるように融合する。
【０１３９】
前記スクリーニングについて、ＨＡＴ培地を用いてスクリーニングを行う。
【０１４０】
前記ＣＤ４７との結合は、具体的には、ＣＤ４７タンパク質と結合でき、且つ表面でＣＤ４７タンパク質を発現させる細胞と結合できることである。
【０１４１】
同定の結果、本発明が提供する方法で製造されたＣＤ４７モノクローナル抗体の、重鎖の類型がＩｇＧ３、ＩｇＭまたはＩｇＧ１型であり、軽鎖の類型がκである。
【０１４２】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が化学的マーカーまたは生物学的マーカーでマークされてなる結合物。
【０１４３】
前記化学的マーカーが同位体、免疫毒素及び／または化学薬物である。
【０１４４】
前記生物学的マーカーがビオチン、アビジンまたは酵素標識である。
【０１４５】
前記酵素標識が西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼであることが好ましい。
【０１４６】
前記免疫毒素がアフラトキシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、ヤドリギレクチン、モデシン、ＰＡＰ、サポリン、ゲロニンまたはヘチマ毒素であることが好ましい。
【０１４７】
本発明は、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体または結合物を、固体媒質または半固体媒質とカップリングさせてなるカップリング物を提供する。
【０１４８】
前記固体媒質または非固体媒質は金コロイド、ポリスチレンプレートまたはビーズから選択されるものである。
【０１４９】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、ＣＤ４７の発現検出用製品の製造における使用。
【０１５０】
実験で分かるように、本発明が提供するＣＤ４７モノクローナル抗体はＣＤ４７タンパク質と結合できるとともに、ＣＤ４７を表面に発現する細胞と結合できる。よって、本発明が提供するＣＤ４７モノクローナル抗体は、ＣＤ４７タンパク質またはＣＤ４７を表面に発現する細胞の検出に用いることができる。なお、腫瘍細胞の表面マーカーであるＣＤ４７の高度な発現のため、本発明が提供する抗体は、腫瘍表面マーカーであるＣＤ４７を検出するためのキットの製造に用いることができる。そのうち、ＣＤ４７タンパク質の検出にはＥＬＩＳＡ法を用いて、ＣＤ４７を表面に発現する細胞の検出にはＦＡＣＳ法を用いる。
【０１５１】
本発明は、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物を含むキットを提供する。
【０１５２】
ＣＤ４７タンパク質を検出するキットは、さらにコーティング緩衝液、洗浄液、ブロッキング液及び／または発色現像液を含む。
【０１５３】
前記コーティング緩衝液が炭酸塩緩衝液である。
【０１５４】
前記洗浄液が、ＰＢＳ、ツイン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウムを含む。
【０１５５】
前記ブロッキング液が、ＰＢＳ及びＢＳＡを含む。
【０１５６】
前記発色現像液が、ＴＭＢ溶液、基質緩衝液及び停止液を含む。
【０１５７】
前記基質緩衝液が、クエン酸及びリン酸水素二ナトリウムを含む。
【０１５８】
前記停止液が過酸化水素水溶液である。
【０１５９】
ＣＤ４７を表面に発現する細胞を検出するキットが、さらにＰＢＳ、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ及びＴＩＴＣの第２の抗体を含む。
【０１６０】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する製剤の製造における使用。
【０１６１】
前記ＣＤ４７を表面に発現する細胞が腫瘍細胞である。
【０１６２】
前記腫瘍細胞が白血病細胞、リンパ腫瘍細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、腸癌細胞、食道癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、腎臓癌細胞、膀胱癌細胞、膵臓癌細胞、神経膠腫瘍細胞及び／または黒色腫瘍細胞から選ばれる。
【０１６３】
本発明が提供するキットでＣＤ４７の発現を検出し、ＣＤ４７の発現量に基づいて疾患を患っているか否かを判断する、疾患の診断方法。
【０１６４】
前記疾患が白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫である。
【０１６５】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する製剤の製造における使用。
【０１６６】
本発明に記載の前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断するためのＥＣ５０値が８５０ｎＭ〜２３４０ｎＭである。
【０１６７】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用指数を向上させる製剤の製造における使用。
【０１６８】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナルの、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用指数を向上させるための剤量が、抗体濃度として１０μg／ｍＬである。
【０１６９】
本発明の実施例において、腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞である。
【０１７０】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、腫瘍細胞のアポトーシスを促進させる製剤の製造における使用。
【０１７１】
本発明の実施例において、腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞である。
【０１７２】
本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナルの、腫瘍細胞のアポトーシスを促進するための剤量が１０μg／ｍＬである。
【０１７３】
前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物の、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫という疾患を予防治療する薬物の製造における使用。
【０１７４】
本発明は、本発明に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、結合物及び／またはカップリング物を含む薬物を提供する。
【０１７５】
本発明に記載の薬物を投与する疾患の予防治療方法であって、前記疾患が白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫である疾患の予防治療方法。
【０１７６】
本発明が提供する薬物は、腫瘍細胞の「食べないで」とのシグナルを遮断することにより、大食細胞の腫瘍細胞に対する識別摂取を促進させ、腫瘍細胞が呑食されることを促進できる。
【０１７７】
本発明が提供する薬物の剤形が注射液または粉末注射剤である。
【０１７８】
前記注射液において、抗体の濃度が１０μg／ｍＬである。
【０１７９】
本発明が提供する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体は、腫瘍の生長を有効的に抑制でき、ヒトＳＩＲＰとヒトＣＤ４７のシグナルを遮断することで、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用を促進し、腫瘍細胞が腫瘍免疫の防御システムから逃げることを阻止し、抗腫瘍の作用を発揮できる。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７と大食細胞の表面のＳＩＲＰとの結合を遮断することで、腫瘍細胞からの「食べないで」とのシグナルを遮断でき、大食細胞の腫瘍細胞に対する識別摂取を促進し、腫瘍細胞が呑食されることを促進できる。腫瘍細胞の表面のＣＤ４７と大食細胞の表面のＳＩＲＰとの結合は、一般的な「食べないで」とのシグナルであり、抗ＣＤ４７抗体を腫瘍免疫系における非常に有望な標的とすることができ、人類の腫瘍治療に強力で有効な作用を発揮する。
【０１８０】
本発明に用いられる機器は全て普通の市販品であり、市場で入手できる。
【０１８１】
以下、実施例を組み合わせて本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１８２】
実施例１  抗原タンパク質及び陽性対照抗体の調製
１．１  抗原遺伝子の合成及び発現ベクターの構築
ヒト由来及びサル由来のＣＤ４７タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列と、リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃまたはリンカーペプチド−７ｈｉｓアミノ酸配列とを融合させ、アミノ酸配列の設計が配列番号２９、３０、３１、３２で表されたとおりである。
【０１８３】
上記の設計されたヒト及びサルＣＤ４７タンパク質細胞外領域融合タンパク質（ＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１ＦｃまたはＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓ）に対応するアミノ酸配列に対してコドンの人工最適化を行い、例えば、配列番号３３、３４、３５、３６の５’末端にＨｉｎｄ  III制限酵素切断部位及びＫｏｚａｋ配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣを付加し、３’末端に終止コドンＴＡＧ及びＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位を付加し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．に依頼して最適化されたＤＮＡを合成し、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．より提供されるもの）ベクターにクローニングし、ヒト及びサルのｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ及び／またはＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓプラスミドを得た。
【０１８４】
ヒト及びサルのプラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓ及びベクターｐｃＤＮＡ３．１を酵素消化させ（Ｈｉｎｄ  III及びＥｃｏＲ  Ｉ）、電気泳動により、得られた融合遺伝子フラグメントであるＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ及びＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓを回収し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターと連結反応し、再構築して、発現プラスミドを得た。
ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ；
ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓ；
ｐｃＤＮＡ３．１−サルＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ；
ｐｃＤＮＡ３．１−サルＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓ；
陽性抗体の遺伝子合成及び発現ベクターの構築
ｐＡｂ抗体の配列が下記の通りである。
配列番号３７、３８で表されるＰＡＢＨ：
配列番号３９、４０で表されるＰＡＢＬ：
上記抗体配列に対応するアミノ酸配列に対してコドンの人工最適化を行い、５’末端にＨｉｎｄ  III制限酵素切断部位及びＫｏｚａｋ配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣを付加し、３’末端に終止コドンＴＡＧ及びＥｃｏＲ  Ｉ制限酵素切断部位を付加し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．に依頼して最適化されたＤＮＡを合成し、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．より提供されるもの）ベクターにクローニングし、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＣＡＢＨ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＣＡＢＬプラスミドを得、プラスミドｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＣＡＢＨ、ｐＵＣ５７ｓｉｍｐｌｅ−ＰＣＡＢＬを酵素消化させた後（Ｈｉｎｄ  III及びＥｃｏＲ  Ｉ）、電気泳動により、得られた遺伝子フラグメントであるＰＣＡＢＨ、ＰＣＡＢＬを回収し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターと連結反応し、再構築して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＣＡＢＨ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＣＡＢＬを得た。
【０１８５】
１．２  一過性発現
ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＣＡＢＨ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＣＡＢＬ、ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−サルＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３．１−サルＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓに対して、一過性トランスフェクションおよび発現を行った。
【０１８６】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｆ細胞を用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地で一過性トランスフェクションおよび発現を行った。トランスフェクションの２４時間前に、１２５ｍＬの三角フラスコに０．６×１０６細胞／ｍｌの２９３Ｆ細胞を接種して、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１３０ｒｐｍで振とう培養した。トランスフェクションの際に、６０マイクロリットルの２９３ｆｅｃｔｉｎを１ｍｌのＯＰｔｉＭＥＭに加入し、よく混合した後、室温で５分間インキュベートした。その同時に、３：２：１の比例で組換えベクターを混合し、総ＤＮＡの量が３０μｇであり、１ｍｌのＯＰｔｉＭＥＭに溶解した。次に、ＤＮＡと２９３ｆｅｃｔｉｎとを十分に混合し、総体積が２ｍｌであり、室温で１５分間インキュベートした後、すべての混合物を細胞培養ウェルに添加し、良く混合し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１３０ｒｐｍで振とう培養した。培養液を高速遠心させ、精密ろ過膜で真空濾過した。
【０１８７】
１．３  タンパク質の精製
メーカーが提供する操作方法に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（タンパク質精製液体クロマトグラフィーシステム／ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ  １０、ＧＥ）で精製を行い、精製されたヒトＰＤＬ−１−ｍＩｇＧ２ａＦｃ融合タンパク質を得た。超純水でＡＫＴＡを洗浄し、１ｍｌのｒＰｒｏｔｉａｎＡ  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗプレパックカラムをＡＫＴＡに接続した。洗浄：５カラム容量の１Ｍ  ＨＡＣで洗浄を行った。平衡化：５カラム容量の２０ｍＭ  ＰＢ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化を行った。
【０１８８】
ローディング：細胞発現上清サンプルを１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心させ、上清を取り、８０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心させ、遠心後の上清を２０ｍｌ取り、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎでローディングを行った。平衡化：流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで５カラム容量の２０ｍＭ  ＰＢ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化を行った。洗浄：５カラム容量の２０ｍＭ  ＰＢ  １Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で洗浄を行った。平衡化：５カラム容量の２０ｍＭ  ＰＢ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化を行った。
【０１８９】
溶出：流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出を行った。ＵＶ２８０が１００ｍＡｕに達した時点で回収を始め、１００ｍＡｕに低下した時点で回収を停止した。１Ｍ  ＴｒｉｓでサンプルのｐＨを６〜８に調整し、図１〜２に示す。
【０１９０】
実施例２  モノクローナルハイブリドーマの調製
１、マウスの免疫：
抗原とアジュバントの体積比が１：１であるように、免疫原であるヒトＣＤ４７−ｈＦｃ（実施例１で調製されるもの）を乳化させた。第１回の免疫では完全フロインドアジュバントを用いて抗原を乳化させ、２週間後、第２回の免疫を始め、不完全フロインドアジュバントを用いて抗原を乳化させた。皮下注射を２箇所で行い、マウス一匹あたりに注射した抗原の量が１０μｇであり、注射箇所ごとに注射した体積が２５μＬであった。
【０１９１】
第２回の免疫の３日後、マウスに対して眼窩採血を行い、少量の血液サンプルを取り、血清力価の検出を行い、間接ＥＬＩＳＡ方法により検出された血清力価が１：２０００００またはそれ以上に達した後、マウスに対して追加免疫を行った。
【０１９２】
免疫を３組行い、各組のマウスが５匹であった。
【０１９３】
２、フィーダー細胞及び骨髓腫瘍細胞の準備
フィーダー細胞の準備において、正常のＢＡＬＢ／Ｃマウス（頸椎脱臼法で死亡させたもの）の腹部の皮膚を切って、腹膜を露出させた。注射器でＤＭＥＭ培地を吸い取ってから、マウスの腹腔に注入し、腹腔の大食細胞を洗浄して吸い取り、遠心チューブに収集し、１５００ｒｍｐ／ｍｉｎで３ｍｉｎ遠心させ、下層の褐色の沈殿物を取り重懸濁させた後、予備用として置いておく。上記の手順を繰り返し、3匹の正常マウスの腹腔大食細胞を得た。
【０１９４】
骨髓腫瘍細胞の準備において、１週間前にＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を予め解凍させ、１Ｘ  ８−アザグアニンを含む完全培地で培養し、融合の２日前に１５％ウシ胎児血清のＤＭＥＭに替えて培養し、融合する当日までＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の密度を７０％−８０％に維持した。
【０１９５】
３、細胞の融合及びＨＡＴスクリーニング
脾臓細胞の獲得及び調製：追加免疫されたマウス２匹（Ｌ１、Ｌ２と記す）に対して、Ｌ１、Ｌ２の免疫血清を採集した後、マウスを死亡させ、７５％のアルコールに浸した。免疫マウスの腹部の側面の皮膚及び腹膜を切って、脾臓を露出させた。周囲の組織をはさみの先端で除去して脾臓を得、研磨棒で研磨した後、細胞メッシュで濾過し、単一細胞懸濁液を調製した。
【０１９６】
細胞融合の前処理：培養フラスコ内のＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を収集し、１０００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心させた後、上清を除去し、再懸濁させてから生存細胞を計数した。２０００ｒｐｍ／５ｍｉｎで脾臓細胞の懸濁液を遠心させ、上清を除去し、再懸濁させてから生存細胞を計数した。Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の生存細胞数、脾臓細胞の生存細胞数を記録した。
【０１９７】
細胞融合：脾臓細胞：Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３＝５：１の割合で細胞を混合し、２０００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心させた後、上清を除去し、細胞の沈殿物を振とうして分散させた。３７℃の水浴に、予熱した５０％ＰＥＧ１５００溶液１ｍｌをゆっくり滴下し、チューブの底を３７℃の水中で丸を描きながら揺らし、上記の操作時間が１ｍｉｎ程度であり、静置して３０ｓ反応させ、管内に３７℃の予熱したＤＭＥＭ培地を徐々に速度を速めながら添加し、反応を停止させた。反応終了後の細胞懸濁液を８００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心させてから上清を除去し、細胞の沈殿物を軽く振とうして分散させた。
【０１９８】
ＨＡＴ培地のスクリーニング：１×ＨＡＴ、１×ペニシリン-ストレプトマイシン、１５％ウシ胎児血清及び８５％ＤＭＥＭ培地を含むＨＡＴスクリーニング培地を調製した。上記のＨＡＴスクリーニング培地でマウスハイブリドーマ細胞及びフィーダー細胞を再懸濁させ、それらを混合させた。３００μｌ／ウェルで細胞懸濁液を２０枚の９６ウェル細胞培養プレートに加え、３７℃の細胞培養インキュベーターで培養した。１週間培養した後、ＨＴ培地で１回目の培養液の交換を行い、３７℃の細胞培養インキュベーターで培養した。３日間培養した後、ＨＴ培地で２回目の培養液の交換を行った。
【０１９９】
４、陽性細胞株のスクリーニング
２週間融合させた後、細胞の上清を取りＥＬＩＳＡ実験を行い、細胞の上清とヒトＣＤ４７−ｈｉｓタンパク質との結合状況を検出し、ＥＬＩＳＡ結果が陽性である細胞をスクリーニングした後、２回目のＥＬＩＳＡ実験を行って再測定した。再測定の結果が陽性である細胞の上清を取りＦＡＣＳ実験を行い、細胞の上清とｊｕｒｋａｔ細胞表面のＣＤ４７タンパク質との結合状況を検出した。
【０２００】
５、培養の拡大
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの両方において陽性と検出された細胞株を９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移して培養し、コンフルエンス後に２５ｃｍ２の培養フラスコに移して培養した。
【０２０１】
６、限界希釈によるサブクローニング
ピペット操作を繰り返して陽性細胞株をよく混合し、生存細胞の計数を行うため、少量を吸い取った。細胞を約１００個吸い取り、４０ｍｌの完全培地に加えて、よく混合させ、２枚のプレートに蒔いた。別途、細胞を約１００個吸い取り、２０ｍｌの完全培地に加えて、よく混合させ、１枚のプレートに蒔いた。別途、細胞を約１０００個吸い取り、２０ｍｌの完全培地に加えて、よく混合させ、１枚のプレートに蒔いた。異なる３つの細胞密度で、即ち、それぞれ０．５細胞／ウェル、１細胞／ウェル、１０細胞／ウェルで４つのプレートに播種した。９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
【０２０２】
７、クローンの検出及び培養の増幅
モノクローナル細胞孔の上清を取りＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ実験を行い、細胞クローン抗体とヒト、サルＣＤ４７−ｈｉｓ標識との結合状況、及びｊｕｒｋａｔ細胞表面のＣＤ４７タンパク質との結合状況をそれぞれ検出した。ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの両方において陽性と検出された細胞株（全７株であり、それぞれ０５９−１．１１．１、０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１、０５９−１．５１．２、０５９−１．８２．１、０５９−１．１００．５と記す）を９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移して培養し、コンフルエンス後に２５ｃｍ２の培養フラスコに移して培養した。
【０２０３】
８、サブクラスの特定
１ウェルあたり５０μＬの２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）でプレートをコーティングし、４℃で一晩放置し、ＢＳＡでブロッキングし、検出待ちの細胞の上清を加え、室温で２時間をかけて酵素標識サブクラス２次抗体であるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、κ、λ（ａｂｃａｍ）を加え、発色させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取ったところ、検出された細胞株のサブクラスがＩｇＧ３またはＩｇＭまたはＩｇＧ１、κであると判断した。
【０２０４】
そのうち、抗体０５９−１．８２．１の重鎖定常領域がマウスＩｇＧ３であり、軽鎖定常領域がマウスκ鎖の定常領域であり、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１及び０５９−１．２０．１がいずれもマウスＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がマウスκ鎖の定常領域であり、０５９−１．１１．１、０５９−１．５１．２、０５９−１．１００．５の重鎖定常領域がマウスＩｇＭであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１−７の中の１つであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８−１４の中の１つである。
【０２０５】
液を加える前に、各ステップでは、ＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０２０６】
９、細胞の冷凍保存
冷凍保存液の調製：９０％ウシ胎児血清、１０％ＤＭＳＯ。
【０２０７】
培養フラスコ内の細胞を再懸濁させ、細胞の計数を行った後、１５００ｒｐｍ／ｍｉｎで３ｍｉｎ遠心させてから上清を除去し、１０％ＤＭＳＯを含むウシ胎児血清をピペッティングを繰り返すことで懸濁させ、チューブあたりに５×１０６の細胞数となるように得られた懸濁液を凍結保存ボックスで凍結保存し、−８０℃で一晩放置し、翌日、液体窒素に移した。
【０２０８】
１０、モノクローンハイブリドーマ遺伝子の保存
ＲＮＡを陽性モノクローナル細胞株ＲＮＡ抽出液から抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、−８０℃で永久保存した。
【０２０９】
実施例３  モノクローナル抗体の調製及び同定
１、体外培養法による抗体の調製
１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地を解凍させ、バイアル瓶で培養し、細胞コンフルエンスが約９０％になった後、継代拡大培養を行い、細胞培養の上清が約２００ｍｌに達するまで拡大培養する方法で、実施例２で調製されたハイブリドーマ細胞株を解凍させた。
【０２１０】
２、抗体の精製
約７日培養した細胞の上清を回収し、体積（約２００ｍｌ）を測定し、上清のＮａＣｌが２．５ＭになるようにＮａＣｌを加え、０．２２μｍの混合セルロース精密ろ過膜で真空ろ過した後、４℃で保存し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで抗体の精製を行った。ローディング：２．５Ｍ  ＮａＣｌを含む細胞培養の上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、３０ｍｌまで濃縮した後、そのままローディングした。流し洗い：ＵＶ２８０のベースラインが０になるまで、ｐＨ７．４の２．５Ｍ  ＰＢＳで流し洗いを行った。溶出：ｐＨ３．５の０．１Ｍクエン酸溶液で溶出させ、溶出液を各画分につき２ｍｌ集め、１００μＬの１Ｍトリス溶液を各試験管に加えた。回収液を濃縮し、初期成分の比率が０．１％以下になるまで、ＰＢＳで溶出を行った。精製した抗体の順度を確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った（図３）。
【０２１１】
実施例４  モノクローナル抗体の遺伝子配列決定及び組換え抗体の調製
１．モノクローナル抗体の遺伝子配列決定
免疫、融合及びモノクローナル化した後、親和性の実験結果に基づき０５９−１．１１．１、０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１、０５９−１．５１．２、０５９−１．８２．１、０５９−１．１００．５、モノクローナル抗体の細胞株を選択して全ＲＮＡの抽出を行い、ｃＤＮＡに逆転写した後、ｃＤＮＡを鋳型として抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に対してＰＣＲ増幅を行った。
【０２１２】
抗体遺伝子の重鎖及び軽鎖の配列分析を行った。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＴｒｉｚｏｌ(R)  ｒｅａｇｅｎｔキット（１５５９６−０２６）を用いて、その説明書に従って７株のモノクローナル抗体の全ＲＮＡを抽出し、その抽出結果を図４に示す。
【０２１３】
次に、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．の５’ＲＡＣＥ  ＦＵＬＬキット（Ｄ３１５）を用いて、全ＲＮＡを鋳型として、キットにおけるランダムプライマーを第１鎖のｃＤＮＡに逆転写し、そして、重鎖を常領域設計プライマー（ｍＩｇＧ  Ｒ）及びキットにおけるアダプタープライマーによりＰＣＲ増幅させ、軽鎖を定常領域設計プライマー（ｍＩｇＫ  Ｒ）及び試薬キットにおけるアダプタープライマーによりＰＣＲ増幅させた。ｍＩｇＧ  Ｒ及びｍＩｇＫ  Ｒの配列が下記の通りである。
ｍＩｇＧ  Ｒ：ＣＴＣＡＧＧＧＡＡＲＴＡＲＣＣＹＴＴＧＡＣ（配列番号４１で表される）；
ｍＩｇＫ  Ｒ：ＴＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣ（配列番号４２で表される）；
７個のモノクローナル抗体細胞株の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をＰＣＲ増幅させた後の電気泳動検出を図５に示す。
【０２１４】
アガロースゲル回収キットでＰＣＲフラグメントを回収し、ＴＡクローニングを行った後、単一のクローンを選択してＰＣＲ同定を行い、同定プライマーがＭ１３−Ｆ及びＭ１３−Ｒであり、正確であると同定された熱細胞株から一部のサンプルを選択し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎシークエンシングに供した。最終的に、重鎖可変領域のタンパク質配列が配列番号１〜７であり、軽鎖可変領域のタンパク質配列が配列番号８〜１４であり、重鎖ヌクレオチド配列が配列番号１５〜２１、軽鎖ヌクレオチド配列が配列番号２２〜２８であると確定した。
【０２１５】
同定プライマーＭ１３−Ｆが下記の通りである：
５’ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’（配列番号４３が表す通りである）；
同定プライマーＭ１３−Ｒが下記の通りである：
５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ３’（配列番号４４が表す通りである）。
【表１】
2019521653.tif 000002
【０２１６】
実施例５  親和性の測定及び競合ＥＬＩＳＡ測定
１．ヒトＣＤ４７との結合の検出（ＥＬＩＳＡ）
コーティング：ＰＢＳでｈＣＤ４７−ｈｉｓを１μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェルあたり１００μＬで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキング：プレートを３回洗浄し、１ウェルあたり３００μＬで１％ＢＳＡ＋ＰＢＳでブロッキングし、室温で２時間インキュベートした。候補抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、候補抗体の細胞培養の上清または陽性の対照または陰性の対照を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温で２時間インキュベートした。二次抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ、ＨＲＰ（１：１００００）を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温で１時間反応させた。発色：プレートを４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温且つ暗所で１０分間発色させた。停止：１００μｌ／ウェルで停止液を直接加え、反応を停止させた。検出：反応を停止させた後、直ちにＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡリーダーに置き、４５０ｎｍでそのＯＤ値を測定し、初期データを保存し、下記の表２にまとめた。
【０２１７】
【表２】
2019521653.tif 000003
【０２１８】
２．サルＣＤ４７との結合の検出（ＥＬＩＳＡ）
コーティング：ＰＢＳでサルＣＤ４７−ｈｉｓを１μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェルあたり１００μＬで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキング：プレートを３回洗浄し、１ウェルあたり３００μＬで１％ＢＳＡ＋ＰＢＳでブロッキングし、室温下で２時間インキュベートした。候補抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、候補抗体の細胞培養の上清または陰性の対照を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温で２時間インキュベートした。二次抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ、ＨＲＰ（１：１００００）を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温で１時間反応させた。発色：プレートを４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温且つ暗所で１０分間発色させた。停止：１００μｌ／ウェルで停止液を直接加え、反応を停止させた。検出：反応を停止させた後、直ちにＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡリーダーに置き、４５０ｎｍでそのＯＤ値を測定し、初期データを保存し、下記の表３にまとめた。
【０２１９】
【表３】
2019521653.tif 000004
【０２２０】
３．ヒトＣＤ４７タンパク質との親和性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置でヒトＣＤ４７抗体の親和定数を検出し、アミノ基の共有結合により抗マウスＦｃ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＢＲ−１００８−３８）をＣＭ５バイオセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にカップリングし、チップにおける抗マウスＦｃ抗体が候補モノクローナル抗体または陽性対照Ｂ６Ｈ１２（商業化ＣＤ４７抗体、Ａｂｃａｍより購入、製品番号：ａｂ３２８３）を捕獲し、異なる濃度のヒトＣＤ４７を３０μＬ／ｍｉｎの流速でチップにおける候補抗体に流し、ヒトＣＤ４７と候補抗体とを結合させ、結合時間が１２０ｓで、解離時間が３００ｓである。ＢＩＡｅｖａｌｕｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で動的フィッティングを行い、親和性が最も高いのは０５９−１．８２．１であり、得られた親和定数の結果を表４に示す。
【０２２１】
【表４】
2019521653.tif 000005
【０２２２】
実施例６  ヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰとの結合の容量依存的ブロッキング（ＥＬＩＳＡ法）
コーティング：ＰＢＳでヒトＣＤ４７−ｈＦｃを２μｇ／ｍｌに希釈し、１ウェルあたり１００μＬで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加え、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキング：プレートを３回洗浄し、１ウェルあたり３００μＬで１％ＢＳＡ＋ＰＢＳでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。候補抗体とＳＩＲＰ−ｈｉｓとの混合：精製された候補抗体をそれぞれＰＢＳＴで２μｇ／ｍｌに希釈し、ＰＢＳＴ溶液で３倍の段階希釈を行い、全部で７段階希釈した。ＰＢＳＴでヒトＳＩＲＰ−ｈｉｓタンパク質を５００ｎｇ／ｍｌに希釈し、希釈段階が異なる候補抗体とヒトＳＩＲＰ−ｈｉｓタンパク質を１：１で混合させ、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。候補抗体とヒトＳＩＲＰ−ｈｉｓタンパク質との混合物の添加：１ウェルあたり１００μＬで、室温で１ｈ反応させ、対照ウェルにＩｇＧアイソタイプ対照とヒトＳＩＲＰ−ｈｉｓタンパク質との混合物を加えた。二次抗体の添加：プレートを３回洗浄した後、抗Ｈｉｓタグ抗体、ＨＲＰ（１：１００００）を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温で１時間反応させた。発色：プレートを４回洗浄した後、ＴＭＢ発色液を１ウェルあたり１００μＬで加え、室温且つ暗所で１０分間発色させた。停止：ウェルあたり１００μｌで停止液を直接加え、反応を停止させた。検出：反応を停止させた後、直ちにＥＬＩＳＡプレートをＥＬＩＳＡリーダーにセットし、４５０ｎｍでそのＯＤ値を測定し、初期データを保存した。データの処理：初期データをＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ６．２．１というソフトウエアにインプットしてデータの処理を行った。結果を表５、図６に示す（図中のデータが最終の計算により得られたデータである）。
【０２２３】
【表５】
2019521653.tif 000006
【０２２４】
結果によると、候補抗体である０５９−１．１１．１、０５９−１．２０．１、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１及び０５９−１．８２．１はいずれも強い遮断効果を有するが、０５９−１．５１．２及び０５９−１．１００．５にはヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰとの結合を遮断する効果がない。
【０２２５】
実施例７  細胞表面ＣＤ４７との結合の検出（ＦＡＣＳ法）
Ｊｕｒｋａｔ細胞を培養して収集し、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心させ、ＰＢＳで１回洗浄し、生存細胞の計数を行った。チューブあたりに２．０×１０５の細胞を加え、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心させ、上清を除去し、チューブあたりに１００μＬの候補抗体の細胞の上清を加え、陽性対照チューブに１ｎｇ／ｍｌのＢ６Ｈ１２抗体（商業化ＣＤ４７抗体、Ａｂｃａｍより購入、製品番号：ａｂ３２８３）１００μＬを加え、陰性対照チューブにＤＭＥＭ培地１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心させ、ＰＢＳで３回洗浄し、チューブあたりに４ｎｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ、ＦＩＴＣ二次抗体１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心させ、ＰＢＳで３回洗浄した。チューブあたりにＰＢＳ３００μＬを加え、フローサイトメーターの試料注入管に移し、フローサイトメーターで検出した。結果を表６、図７に示す。
【０２２６】
【表６】
2019521653.tif 000007
【０２２７】
結果によると、候補抗体と細胞表面のＣＤ４７とが明らかな結合活性を有する。
【０２２８】
実施例８  ＣＤ４７抗体が媒介となるマウス腹腔の原発大食細胞のＪｕｒｋａｔ細胞に対する呑食実験
１．Ｃ５７マウス腹腔の原発大食細胞の調製
頸椎脱臼法でマウスを死亡させ、その尻尾を持ち、全マウスを７０％のアルコールに３〜５秒浸漬した。動物を解剖台に置き、注射針で手足を固定し、双手でピンセットを持ち、皮膚を切って両側に引っ張り、腹膜を露出させ、７０％のアルコールで腹膜壁を洗浄した後、Ｅａｇｌｅ液１０ｍｌを注射器で腹腔に注入し、それと同時に、液体を腹腔内に十分に流動させるように両側から指で腹膜壁を揉んだ。注射針で腹膜壁を拾い上げ、動物の体が少し片側に傾き、腹腔中の液体を注射針の先端まわりに集め、注射器に吸い取った。注射針を丁寧に抜き、液体を遠心チューブに注入し、２５０ｇを４℃で１０分間遠心させ、上清を除去し、Ｅａｇｌｅ培地１０ｍｌを加え、細胞を計数した。平方センチメートルあたり３×１０５個の付着細胞を得るため、２．５×１０６個／ｍｌの濃度で接種する必要がある。培養細胞を精製するため、他の白血球を除去し、接種した数時間後に培養液を除去し、Ｅａｇｌｅ液で１〜２回洗浄した後、新たなＥａｇｌｅ培養液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
【０２２９】
２．大食細胞の呑食実験
蛍光イメージング法により、実施例５で調製したＣＤ４７抗体の、Ｃ５７ＢＬマウス腹腔の原発大食細胞のＪｕｒｋａｔ細胞に対する呑食作用への影響を考察した。開始の前日にＰＫＨ２６染料でマウス大食細胞を染色し（４マイクロモル、５ｍｉｎ）、２万細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種した。翌日にＣＦＳＥ染料でＪｕｒｋａｔ細胞を染色し（２マイクロモル、１０ｍｉｎ）、洗浄した後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を無血清培地で再懸濁させ、８万細胞／ウェルで大食細胞に接種した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を接種する２時間前に、大食細胞における血清含有培地を無血清培地に替え、各抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で二種類の細胞の懸濁液に加えた。２時間培養した後、呑食されていないＪｕｒｋａｔ細胞を洗い流し、蛍光顕微鏡で細胞イメージングを行った後、１００個の大食細胞あたりに呑食されたＪｕｒｋａｔ細胞の数、即ち呑食指数を計算し、ＣＤ４７抗体の呑食促進効果の優劣を定量的に分析した。結果を図８（呑食效果図）及び表７（呑食指数）に示す。文献に記載の通り、Ｂ６Ｈ１２（商業化ＣＤ４７抗体、Ａｂｃａｍより購入、製品番号：ａｂ３２８３）の呑食促進効果が弱い。実施例５から選別された４つの抗体分子はいずれも良好な呑食促進効果を有し、特に０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１及び０５９−１．８２．１の呑食促進効果がより一層優れる。
【０２３０】
【表７】
2019521653.tif 000008
【０２３１】
実施例９  ＣＤ４７抗体によるＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスの体外誘導実験
対数増殖したＪｕｒｋａｔ細胞を収集し、无血清培地で洗浄した後、５％ＦＢＳ−１６４０で単細胞の懸濁液を調製し、細胞を１０×１０５／ｍｌになるように再懸濁させ、５×１０５／ウェル、即ち５００μｌ／ウェルで２４ウェルプレートで培養した。実験を下記のように設計した：ＣＤ４７抗体（最終濃度が１０μｇ／ｍｌである）を５０μｌ／ウェルで加え、ａｎｔｉ−Ｆａｓ陽性対照ウェルを設け、抗体の加入が不要である場合、同じ体積の培地を補充した。５時間後に、細胞の懸濁液を１．５ｍｌＥＰチューブに収集し、５００ｇ×５ｍｉｎで遠心させた。上清を除去し、各チューブにＰＢＳ１００μｌを加え、細胞を再懸濁させ、よく混合し、アネキシン−Ｖ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で４℃且つ暗所で３０分間染色した。ＰＢＳで３回洗浄し、各チューブにＰＢＳ５００μｌを加え、細胞を再懸濁させ、よく混合し、フローサイトメーター供する１０−１５ｍｉｎ前にＰＩを加え、（最終濃度が１μｇ／ｍｌである）、フローサイトメーターで検出したアネキシン−Ｖ陽性細胞、アネキシン−ＶおよびＰＩ二重陽性細胞の、総細胞に占める割合が、Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシス率である。結果を表８に示す。
【０２３２】
【表８】
2019521653.tif 000009
【０２３３】
Ｂ６Ｈ１２はＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導しないが、測定された４つの０５９抗体は異なる程度でＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導し、０５９−１．３０．１の誘導作用が最も高い。大食細胞の呑食の促進及びＪｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスの誘導において、０５９−１．３０．１が最も優れている。
【０２３４】
以上は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとって、本発明の原理から逸脱しない限り、若干の改良及び変更を行うこともでき、これらの改良および変更も本発明の保護範囲に含まれるものである。
【図１】
2019521653.tif 000010
【図２】
2019521653.tif 000011
【図３】
2019521653.tif 000012
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年12月28日(2018.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体であって、
（I）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７で表され、
（II）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４で表され、
（III）（I）または（II）に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）で表されるアミノ酸配列と同じまたは類似するアミノ酸配列；または
（IV）（I）または（II）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である
ことを特徴とする、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個であることを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項３】
前記置換が高度可変領域に発生し、
前記重鎖可変領域の高度可変領域がＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３であり、
配列番号２の高度可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４５で示され、ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４６で示され、そしてＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号４７で示され、
配列番号５の高度可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号４８で示され、ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号４９で示され、そしてＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５０で示され、
配列番号６の高度可変領域ＨＶＲ−Ｈ１配列が配列番号５１で示され、ＨＶＲ−Ｈ２配列が配列番号５２で示され、そしてＨＶＲ−Ｈ３配列が配列番号５３で示され、
前記軽鎖可変領域の高度可変領域がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３であり、
配列番号９の高度可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５４で示され、ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５５で示され、そしてＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５６で示され、
配列番号１２の高度可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号５７で示され、ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号５８で示され、そしてＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号５９で示され、
配列番号１３の高度可変領域ＨＶＲ−Ｌ１配列が配列番号６０で示され、ＨＶＲ−Ｌ２配列が配列番号６１で示され、そしてＨＶＲ−Ｌ３配列が配列番号６２で表される
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項４】
（i）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号８である軽鎖可変領域、
（ii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号９である軽鎖可変領域、
（iii）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１０である軽鎖可変領域、
（iv）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１１である軽鎖可変領域、
（V）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１２である軽鎖可変領域、
（VI）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１３である軽鎖可変領域、
（VII）アミノ酸配列が配列番号１、２、３、４、５、６、又は７である重鎖可変領域、及びアミノ酸配列が配列番号１４である軽鎖可変領域
を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項５】
重鎖の類型がＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＭであり、軽鎖の類型がκであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体をコードする、ヌクレオチド。
【請求項７】
（I）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列、配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、または
（II）配列番号１５−２１で表される重鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列、配列番号２２−２８で表される軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の相補的配列、または
（III）（I）または（II）のヌクレオチド配列と同一のタンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のため、（I）または（II）のヌクレオチド配列と異なる配列、または
（IV）（I）または（II）または（III）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列
を有することを特徴とする、請求項６に記載のヌクレオチド。
【請求項８】
（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）または（III）または（IV）で表されるヌクレオチド配列と同じまたは類似するヌクレオチド配列を有することを特徴とする、請求項６または７に記載のヌクレオチド。
【請求項９】
前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個であることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換されることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項１２】
配列番号２９〜３２のいずれか一つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗原。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を生産する、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１４】
工程１：請求項１２に記載の抗原でマウスを免疫させた後、マウスの脾臓細胞を得ること、
工程２：前記脾臓細胞と骨髓腫細胞とを融合させ、ＣＤ４７と結合可能なハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、体外培養により、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体を作製すること、
を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜５いずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体が化学的マーカーまたは生物学的マーカーで標識された結合物。
【請求項１６】
前記化学的マーカーが同位体、免疫毒素及び／または化学薬物であり、前記生物学的マーカーがビオチン、アビジンまたは酵素標識であることを特徴とする、請求項１５に記載の結合物。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体または請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物を、固体媒質または半固体媒質とカップリングさせてなるカップリング物。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、ＣＤ４７の発現検出用製品の製造における使用。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの結合を遮断する製剤の製造における使用。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、大食細胞の腫瘍細胞に対する食作用指数を向上させる製剤の製造における使用。
【請求項２２】
前記腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、腫瘍細胞のアポトーシスを促進させる製剤の製造における使用。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞がヒト末梢血白血病Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物の、白血病、リンパ腫、乳癌、肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、神経膠腫及び／または黒色腫という疾患を予防治療する薬物の製造における使用。
【請求項２６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗ＣＤ４７モノクローナル抗体、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の結合物及び／または請求項１７に記載のカップリング物を含むことを特徴とする、薬物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明が提供するのは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体であって、
（I）前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５または配列番号６または配列番号７で表される；
（II）前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号８または配列番号９または配列番号１０または配列番号１１または配列番号１２または配列番号１３または配列番号１４で表される；
（III）（I）または（II）に記載のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された、機能が（I）または（II）で表されるアミノ酸配列と同じまたは類似するアミノ酸配列；または
（IV）（I）または（II）に記載の配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体。
本発明の一部の具体的な実施形態では、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体のアミノ酸配列が、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列において、前記数個が２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個または３２個である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
また、本発明は、前記抗ＣＤ４７モノクローナル抗体をコードする、ヌクレオチド配列を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
１．２  一過性トランスフェクションおよび発現
ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＣＡＢＨ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＰＣＡＢＬ、ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１−サルＣＤ４７−リンカーペプチド−ｈＩｇＧ１Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３．１−サルＣＤ４７ＥＣＤ−リンカーペプチド−７ｈｉｓに対して、一過性トランスフェクションおよび発現を行った。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ２９３Ｆ細胞を用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地で一過性トランスフェクションおよび発現を行った。トランスフェクションの２４時間前に、１２５ｍＬの三角フラスコに０．６×１０６細胞／ｍｌの２９３Ｆ細胞を接種して、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１３０ｒｐｍで振とう培養した。トランスフェクションの際に、６０マイクロリットルの２９３ｆｅｃｔｉｎを１ｍｌのＯＰｔｉＭＥＭに加入し、よく混合した後、室温で５分間インキュベートした。その同時に、３：２：１の比例で組換えベクターの軽鎖、重鎖およびトランスフェクション試薬を混合し、総ＤＮＡの量が３０μｇであり、１ｍｌのＯＰｔｉＭＥＭに溶解した。次に、ＤＮＡと２９３ｆｅｃｔｉｎとを十分に混合し、総体積が２ｍｌであり、室温で１５分間インキュベートした後、すべての混合物を細胞培養ウェルに添加し、良く混合し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで１３０ｒｐｍで振とう培養した。培養液を高速遠心させ、精密ろ過膜で真空濾過した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
溶出：流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出を行った。ＵＶ２８０が１００ｍＡｕに達した時点で回収を始め、１００ｍＡｕに低下した時点で回収を停止した。１Ｍ  ＴｒｉｓでサンプルのｐＨを６〜８に調整し、精製されたサンプルを図１〜２に示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
そのうち、抗体０５９−１．８２．１の重鎖定常領域がマウスＩｇＧ３であり、軽鎖定常領域がマウスκ鎖の定常領域であり、０５９−１．３０．１、０５９−１．４３．１及び０５９−１．２０．１の重鎖定常領域がいずれもマウスＩｇＧ１であり、軽鎖定常領域がマウスκ鎖の定常領域であり、０５９−１．１１．１、０５９−１．５１．２、０５９−１．１００．５の重鎖定常領域がマウスＩｇＭであり、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１−７の中の１つであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号８−１４の中の１つである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
アガロースゲル回収キットでＰＣＲフラグメントを回収し、ＴＡクローニングを行った後、単一のクローンを選択してＰＣＲ同定を行い、同定プライマーがＭ１３−Ｆ及びＭ１３−Ｒであり、正確であると同定された細胞株から一部のサンプルを選択し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎシークエンシングに供した。最終的に、重鎖可変領域のタンパク質配列が配列番号１〜７であり、軽鎖可変領域のタンパク質配列が配列番号８〜１４であり、重鎖ヌクレオチド配列が配列番号１５〜２１、軽鎖ヌクレオチド配列が配列番号２２〜２８であると確定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
実施例８  ＣＤ４７抗体が媒介となるマウス腹腔の原発大食細胞のＪｕｒｋａｔ細胞に対する呑食実験
１．Ｃ５７マウス腹腔の原発大食細胞の調製
頸椎脱臼法でマウスを死亡させ、その尻尾を持ち、全マウスを７０％のアルコールに３〜５秒浸漬した。動物を解剖台に置き、注射針で手足を固定し、双手でピンセットを持ち、皮膚を切って両側に引っ張り、腹膜を露出させ、７０％のアルコールで腹膜壁を洗浄した後、Ｅａｇｌｅ液１０ｍｌを注射器で腹腔に注入し、それと同時に、液体を腹腔内に十分に流動させるように両側から指で腹膜壁を揉んだ。注射針で腹膜壁を拾い上げ、動物の体が少し片側に傾き、腹腔中の液体を注射針の先端まわりに集め、注射器に吸い取った。注射針を丁寧に抜き、液体を遠心チューブに注入し、２５０ｇを４℃で１０分間遠心させ、上清を除去し、Ｅａｇｌｅ培地１０ｍｌを加え、細胞を計数した。平方センチメートルあたり３×１０５個の付着細胞を得るため、接種後の細胞濃度が２．５×１０６個／ｍｌとなるように接種する必要がある。培養細胞を精製するため、他の白血球を除去し、接種した数時間後に培養液を除去し、Ｅａｇｌｅ液で１〜２回洗浄した後、新たなＥａｇｌｅ培養液を添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
【国際調査報告】
2019521653.tif 000018
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