(57)【要約】  本明細書には、対象にアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）とアンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片に対するワクチンとの組合せを投与することを含む前立腺癌を治療する方法が開示される。また、前立腺癌を有する対象においてアンドロゲン除去療法の有効性を増強する方法であって、上記対象にアンドロゲン受容体又はその断片に対する有効量のワクチンを投与することを含み、前立腺癌の成長及び／又は去勢抵抗性前立腺癌の発生を阻害する、遅延させる又は低減する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌を有する対象において抗腫瘍応答を惹起する方法であって、
ａ．前記対象にアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）を投与する工程、及び
ｂ．前記対象に、転写調節エレメントに機能的に連結された、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡワクチンを投与する工程、
を含み、前記組換えＤＮＡワクチンが、前記前立腺癌に対して増強された抗腫瘍応答を惹起するような有効量で投与され、ＡＤＴと組換えＤＮＡワクチンの組合せ処置が前立腺癌の成長を阻害する、遅延させる又は低減することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡワクチンが、アンドロゲン受容体リガンド結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡワクチンが、２週毎〜３か月毎に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡワクチンが少なくとも６週間投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡワクチンが、少なくとも１０週間投与される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡワクチンが、約６〜約１０週間、隔週で投与され、その後、少なくとも１年間、年４回投与される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡワクチンが、少なくとも１８か月投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ワクチンが、約１０ｍｃｇ〜１ｍｇの用量で投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＤＴ及び組換えワクチンが、同時に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＤＴが、組換えワクチンを投与する前に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＤＴが、少なくとも１用量の組換えワクチンを投与した後に投与される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンドロゲン除去療法が、有効量の少なくとも１種類のアンドロゲン受容体経路標的薬を投与することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種類のアンドロゲン受容体経路標的薬が、ＬＨＲＨ（又はＧｎＲＨ）類似体、ＬＨＲＨ（又はＧｎＲＨ）拮抗薬、ＡＲ拮抗薬、アンドロゲン合成阻害剤、ＡＲ分解薬及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡワクチンが、アジュバントと併用投与される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アジュバントが、ＧＭ−ＣＳＦである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡワクチンが、エレクトロポレーションを用いて又は用いずに、皮内、筋肉内、皮下、静脈内又は動脈内に投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡワクチンが、ｐＴＶＧ−ＡＲＬＢＤを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡワクチンが、（ｉ）哺乳動物アンドロゲン受容体、（ｉｉ）リガンド結合ドメインを含むアンドロゲン受容体の断片、（ｉｉｉ）配列番号９により定義されるリガンド結合ドメインの断片、（ｉｖ）配列番号１０により定義されるリガンド結合ドメインの断片、（ｖ）配列番号１１により定義されるリガンド結合ドメインの断片、及び（ｖｉ）配列番号１２により定義されるリガンド結合ドメインの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含み、それにより、前記ＤＮＡワクチンが前記対象においてアンドロゲン受容体に対する免疫応答を惹起する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象に有効量のＰＤ経路阻害剤を投与することを更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前立腺癌を有する対象においてアンドロゲン除去療法の有効性を増強する方法であって、前記対象に、転写調節エレメントに機能的に連結され、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む、有効量の組換えＤＮＡワクチンを投与する工程を含み、前立腺癌の成長を阻害する、遅延させる又は低減することを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡワクチンが、ｐＴＶＧ−ＡＲＬＢＤを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡワクチンが、（ｉ）哺乳動物アンドロゲン受容体、（ｉｉ）リガンド結合ドメインを含むアンドロゲン受容体の断片、（ｉｉｉ）配列番号９により定義されるリガンド結合ドメインの断片、（ｉｖ）配列番号１０により定義されるリガンド結合ドメインの断片、（ｖ）配列番号１１により定義されるリガンド結合ドメインの断片、及び（ｖｉ）配列番号１２により定義されるリガンド結合ドメインの断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含み、それにより、前記ＤＮＡワクチンが、前記対象においてアンドロゲン受容体に対する免疫反応を惹起する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象に有効量のＰＤ経路阻害剤を投与することを更に含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＤ経路阻害剤が、抗ＰＤ−１遮断抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１９又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記前立腺癌が、再発性及び／又は転移性前立腺癌である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記前立腺癌が、新規に診断された前立腺癌である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
アンドロゲン除去療法と、抗アンドロゲン受容体免疫応答を惹起する組換えＤＮＡワクチンとを含む、前立腺癌を治療するためのキット。
【請求項２９】
前記組換えＤＮＡワクチンが、転写調節エレメントに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドがアンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードする、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記アンドロゲン受容体療法が、ＡＲ発現又はシグナル伝達に干渉することによってＡＲ経路を標的とする１以上の薬物からなる、請求項２７又は２８に記載のキット。
【請求項３１】
前記組換えＤＮＡワクチンが、ｐＴＶＧ−ＡＲＬＢＤである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
ＰＤ−１経路阻害剤を更に含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月９日出願の米国仮出願第６２／３４７，６４６号の優先権を主張するものであり、その内容は全て本明細書の一部として援用する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＣＡ１４２６０８の下、政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は５０歳を超える男性にとっての重大な健康リスクであり、米国では毎年約２００，０００症例が新規に診断されている（Ｊｅｍａｌ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，  ２００５  （２００５）  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ，  ５５：１０−３０）。前立腺癌は米国において、男性で診断される最も多い腫瘍であり、男性の癌関連死の原因の第二位である（Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，  ２００３  （２００３）  ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ，  ５３：５−２６）。スクリーニング及び早期検出の進歩にもかかわらず、根治的立腺切除又は切除を伴う放射線療法を受けている患者のおよそ３０％が１０年で再発疾患を有する（Ｏｅｆｅｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｊ  Ｕｒｏｌ，  １５８：１４６０−１４６５）。
【０００４】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、正常な前立腺組織の発達並びに前立腺癌の進行に重要な役割を果たすステロイドホルモン受容体である。転移性疾患を有する患者は、最初にアンドロゲン除去療法で治療され、ひと度患者が転移性前立腺癌を有すれば、一般にアンドロゲン除去が無期限に継続される。６０年を超えるこれに関するその使用を考えれば、アンドロゲン除去（ＡＤ）は、固形腫瘍の第一の真の「標的」療法の一つと言え、高い奏効率を有する(with as high a response rate)新規な癌標的化薬の現行装備に例は少ない。しかしながら、８０％を超える患者におけるこの治療に対する初期奏効に関わらず、通常、２〜３年の中央時間で去勢抵抗性が出現する。他のグループは、ＡＲの増幅がアンドロゲン除去療法に対する抵抗性の一般的な、おそらくは最も一般的な機構であり、去勢抵抗性疾患を有する患者の５０％超にＡＲ活性化突然変異、過剰発現及び／又は遺伝子増幅が見られることを確認した。これらの所見は、前立腺癌に対するＡＲの重要性を強調し、ヒト前立腺癌ではＡＲ抗原消失（免疫療法に対する抵抗性の主要な手段）はおそらく少ないことを示唆する。最近の所見はＡＲにより媒介されるシグナル伝達は大多数の去勢抵抗性腫瘍で活性を留めることを示したことから、好ましい名称は現在では、以前用いられていたような「アンドロゲン非依存性」ではなく、「去勢抵抗性」である。アンドロゲン除去に対する抵抗性の中枢的手段の一つは、ＡＲ発現の増強、ある場合には遺伝子増幅によるものであるので、ＡＲの薬理学的標的化は進行した去勢抵抗性疾患を有する患者において逆説的にＡＲを標的に留めることができる。去勢抵抗性である転移性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）は、この疾患の致死型である。ｍＣＲＰＣ患者の中央平均寿命は３年未満であり、去勢抵抗性の確立を遅延させ得る、又はこの疾患段階をより有効に治療できる処置が差し迫って必要である。
【０００５】
最近、前立腺癌に対する処置の装備にＤＮＡワクチンが加えられている。他のワクチンアプローチに比べて、ＤＮＡワクチンは、製造が比較的容易で安くつき、個別化というより「既製」であるという点で有利である。動物試験は、ＤＮＡワクチンが、自然に処理されたＭＨＣクラスＩ及びＩＩエピトープを介した抗原提示をもたらすことを実証した。いくつかのＤＮＡワクチンが、学術団体、業界団体によって種々の癌タイプに対する新規な治療として探索され、初期段階の臨床試験が、ＤＮＡワクチンが免疫応答を増強し、臨床応答の証拠を示すことを示している。本発明者らの研究室は、最近の努力を、前立腺癌の発生及び進行に重要な生物学的に関連のある標的タンパク質としての、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン（ＡＲ  ＬＢＤ）に注いできた。本発明者らの研究室は、多くの前立腺癌患者がＡＲ  ＬＢＤに特異的な既存の体液性及び細胞性免疫応答を示すこと、及びＡＲ  ＬＢＤに特異的な細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ拘束性様式でヒト前立腺癌細胞を溶解し得ることを実証した。本発明者らは更に、ＡＲ  ＬＢＤをコードするＤＮＡワクチンは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいてエピトープ特異的細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞を惹起することができ、これらのマウスをＡＲ  ＬＢＤ及び他の抗原を標的とするＤＮＡワクチンを評価するために腫瘍モデル系として使用されることを実証した。担癌マウスをＡＲ  ＬＢＤ  ＤＮＡワクチンで免疫誘導すると、抗腫瘍応答が惹起され、マウスの全生存期間が有意に延長された。
【０００６】
前立腺癌、特に、去勢抵抗性疾患の治療又は予防のための新規でより有効な処置の必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、アンドロゲン除去療法とアンドロゲン受容体に対するワクチンとの併用は、前立腺腫瘍成長を抑制し、転移性疾患の発症又は進行を遅延させるという驚くべき所見に基づく。
【０００８】
よって、第１の態様において、本開示は、前立腺癌を有する対象において抗腫瘍応答を惹起するための方法であって、ａ）前記対象にアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ又はアンドロゲン抑制療法）を投与すること、及びｂ）前記対象にアンドロゲン受容体に対するワクチンを投与することを含み、前記ワクチンは、前記前立腺癌に対して増強された抗腫瘍応答を惹起するような有効量で投与される方法を包含する。これは前立腺癌又は転移性疾患の阻害、遅延又は成長の軽減をもたらす。実施例は、ワクチンが標準的ＡＤＴ療法と組み合わせられた場合に腫瘍成長の有意な遅延を示す。一実施形態では、ワクチンは、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは、アンドロゲン受容体又はその断片を含むポリペプチドワクチンである。
【０００９】
よって、第２の態様において、本開示は、前立腺癌を有する対象において抗腫瘍応答を惹起するための方法であって、ａ）前記対象にＡＤＴを投与すること、及びｂ）前記対象に転写調節エレメントに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡワクチンを投与することを含み、前記ポリヌクレオチドは、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードし、前記ＡＤＴ及び組換えＤＮＡワクチンは、前立腺癌に対して増強された抗腫瘍応答を惹起するような有効量で投与され、かつ、前記組合せは、前立腺癌細胞の成長又は転移を遅延させる、軽減する又は阻害する方法を包含する。
【００１０】
第３の態様において、本開示は、前立腺癌を有する対象においてアンドロゲン除去療法の有効性を増強する方法であって、前記対象に、転写調節エレメントに機能的に連結された、ポリヌクレオチドを含む有効量の組換えＤＮＡワクチンを投与することを含み、前記ポリヌクレオチドは、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードし、前立腺癌の成長を阻害する、遅延させる又は低減する方法を包含する。
【００１１】
第４の態様において、本開示は、有効量の組換えＤＮＡワクチンと、ＡＤＴの抗腫瘍有効性を増強し、且つ／又はＡＤＴ処置に対する抗腫瘍応答を増強若しくは増大させるような有効量のＰＤ−１経路阻害剤を投与することにより、ＡＤＴの有効性を増強する、及び／又はＡＤＴ処置の抗腫瘍応答を増大させる若しくは増強する方法を包含する。この三重併用療法は、前立腺腫瘍の成長及び転移に有意な遅延をもたらす。
【００１２】
第５の態様において、本開示は、アンドロゲン除去療法と抗アンドロゲン受容体免疫応答を惹起するワクチンとを含む、前立腺癌を治療するためのキットを包含する。
【００１３】
更に別の態様では、本開示は、アンドロゲン除去療法と抗アンドロゲン受容体免疫応答を惹起するワクチンとＰＤ−１経路阻害剤とを含む、前立腺癌を治療するためのキットを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、短期又は長期アンドロゲン除去は２２Ｒｖ１前立腺癌細胞においてＡＲタンパク質発現を増強することを示す。
【図２】図２は、長期アンドロゲン除去は全長ＡＲ発現を増強し、短期アンドロゲン除去はＡＲ−Ｖ７発現に一過性の増強を誘導することを示す。上のパネル：相対発現（β−アクチン対照に対して正規化）。下のパネル：長期ＦＣＳ培養２２ｒｖ１細胞に対する発現の誘導倍率。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図３Ａ−３Ｄ】図３Ａ〜Ｄは、ＨＬＡ−Ａ２を発現する、長期アンドロゲン除去２２Ｒｖ１細胞がアンドロゲン受容体発現を増強したことを示す。２２Ｒｖ１／ＦＣＳ（アンドロゲンを含有するウシ胎児血清含有培地）及び２２Ｒｖ１／ＣＳＳ（チャコール処理済み血清含有培地、アンドロゲン除去）細胞株（又は非ＨＬＡ−Ａ２トランスフェクト２２Ｒｖ１対照）を、ＡＲタンパク質発現（図３Ａ）に関してはＥＬＩＳＡにより、ＲＮＡ発現（図３Ｂ）に関してはｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＨＬＡ−Ａ２発現（図３Ｃ）及びＰＤ−Ｌ１発現（図３Ｄ）に関してはフローサイトメトリーによって評価した（青：２２Ｒｖ１／ＦＣＳ；赤：２２Ｒｖ１／ＣＳＳ；黒：野生型２２Ｒｖ１；灰色：ＩｇＧ染色２２Ｒｖ１）。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、２２Ｒｖ１／ＦＣＳ（４Ａ）又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞の細胞内サイトカイン染色を示す（挿入内に定量された平均蛍光強度−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞のＣＤ６９発現を示す（挿入内に定量された平均蛍光強度−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ，０．０５を示す）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞の細胞傷害性を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞のＣＤ６９発現を示す（隣の棒グラフで定量−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（右のパネル）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（左のパネル）と共に培養したＴ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮγ×ＴＮＦα）を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、０（青）、１（緑）、２（黄）、３（橙）、又は４（赤）種類のＴｈ１関連分子（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、及び／又はグランザイムＢ）を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）と共に培養した後のＣＤ８＋Ｔ細胞によるグランザイムＢ発現を示す（隣の棒グラフで定量−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す）。
【図５Ｅ】図５Ｅは、表面脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養したＴ細胞の細胞傷害性を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、臨床試験のタイミングの図式を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、臨床試験におけるワクチンの投与計画の提案を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ及び７Ｂは、アンドロゲン除去２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞及び去勢抵抗性ＭｙｃＣａＰマウス前立腺癌細胞がＡＤＴ処置後にＡＲ発現を増強したことを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＧｎＲＨ拮抗薬デガレリクスを用いた化学的去勢後のｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭｙｃＣａＰ前立腺癌モデルの腫瘍におけるＡＲ発現の増強を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＡＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化から生じるＣＤ６９発現（左のパネル）、ＩＦＮγ及びＴＮＦαサイトカイン発現（中央のパネル）、及び細胞傷害性（右のパネル）によるＴ細胞の活性化を示す。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、採取され、ＭｙｃＣａＰ／ＣＲ腫瘍細胞に対する免疫応答に関して分析された脾細胞を細胞内サイトカイン染色により示し（左のパネル）、ＡＲペプチドにより刺激された、ｐＴＶＧ−ＡＲ免疫マウス由来脾細胞を、ＭｙｃＣａｐ／ＡＳ腫瘍細胞とＭｙｃＣａｐ／ＣＲ腫瘍細胞を溶解させる能力に関して測定した（右のパネル）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、腫瘍体積を追跡したマウスを示す。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、対照（偽処置）、デガレリクス＋ｐＴＶＧ４及びデガレリクス＋ｐＴＶＧ−ＡＲの刺激後の腫瘍体積を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＰＡＰ標的化ワクチンで従前に免疫誘導した患者由来ＰＢＭＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏにて、ＰＤ−１遮断抗体（又はＩｇＧ対照）の存在下、ＰＡＰと共に７２時間培養し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ（左のパネル）又はグランザイムＢ（右のパネル）分泌に関して測定したことを示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、免疫誘導後に患者から取得したＰＢＭＣをＰＡＰタンパク質及びＰＤ−１遮断抗体（又はＩｇＧ対照）と共にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの足蹠に注射し、２４時間後に足蹠の腫脹を測定したことを示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＰＡＰを標的とするＤＮＡワクチンで免疫誘導した後の持続的なＰＡＰ特異的Ｔｈ１バイアス免疫応答（Ｒ）を有する患者と不応答者（ＮＲ）に由来する循環腫瘍細胞でＰＤ−Ｌ１発現を測定したことを示す。処置前サンプルに対する処置後サンプルのＰＤ−Ｌ１  ＭＦＩ比を示す。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＡＤＴで処置し、ｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導したＭｙｃＣａＰ担癌動物由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＤ−１発現を増強したことを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、再発腫瘍はＰＤ−Ｌ１発現を増強したことを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ｐＴＶＧ−ＡＲ単独での免疫誘導に比べ、ＡＲ標的免疫誘導をＰＤ−１遮断抗体と組み合わせた場合のマウスの腫瘍成長は遅延することを示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＡＤとＡＲに向けられた免疫誘導及びＰＤ−１遮断との組合せは腫瘍成長を更に遅延させたことを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、富アンドロゲン（ＦＣＳ）培地又はアンドロゲン除去（ＣＳＳ）培地のいずれかで１〜７日間（１ｄ〜７ｄ）又は６か月より長く（長期：ＬＴ）培養した前立腺細胞株（不死化ヒト上皮株：ＲＷＰＥ−１及びＰｒＥＣ−Ｅ６；アンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株：ＤＵ−１４５及びＰＣ−３；及びアンドロゲン依存性前立腺癌細胞株：ＬＮＣａＰ及び２２Ｒｖ１）を定量的ＥＬＩＳＡによりアンドロゲン受容体タンパク質発現に関して分析したものを示す（パネルＡ）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、長期ＦＣＳ（薄い灰色）又はＣＳＳ（濃い灰色）培養前立腺細胞株を示す。培養細胞株をリガンド結合ドメイン（上のパネル）又はアミノ末端ドメイン（下のパネル）に特異的な抗体を用いた細胞内染色によってＡＲ発現に関して分析した。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、培養前立腺細胞株におけるＡＲ発現の定量した振幅を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、培養前立腺細胞株におけるＡＲ＋細胞の頻度を示す。
【図１１Ｅ】図１１Ｅは、種々の期間培養し、全長（濃い灰色）又はＡＲ−Ｖ７（薄い灰色）ＡＲ転写産物の存在に関して分析した２２ＲＶ１／ＣＳＳ細胞から定量したＲＮＡを示す。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示し、データは少なくとも２回の独立した実験を代表するものである。
【図１１Ｆ】図１１Ｆは、ＨＬＡ−Ａ２トランスフェクト２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞及び２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞の表現型バリデーションを示す。富アンドロゲン（２２Ｒｖ１／ＦＣＳ）培地又はアンドロゲン除去（２２Ｒｖ１／ＣＳＳ）培地で６か月より長く培養した２２Ｒｖ１細胞を、ＨＬＡ−Ａ２をコードするレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。次に、ＨＬＡ−Ａ２発現細胞を蛍光活性化セルソーティングによって選別し、拡大培養株を定量的ＥＬＩＳＡによりＡＲタンパク質に関して評価した。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１１Ｇ】図１１Ｇは、図１１Ｆの拡大培養株をｑＲＴ−ＰＣＲによりＡＲタンパク質に関して評価したものを示す。
【図１１Ｈ】図１１Ｈは、図１１Ｇの細胞をＨＬＡ−Ａ２の発現に関して分析したものを示す。
【図１１Ｉ】図１１Ｉは、図１１Ｇの細胞をフローサイトメトリーによりチェックポイントリガンドＰＤ−Ｌ１に関して分析したものを示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＡＲ特異的Ｔ細胞はアンドロゲン除去腫瘍細胞の認識及び溶解を増強したことを示す。ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞と共にインキュベートしたＡＲ８０５特異的ヒトＴ細胞培養物をＣＤ６９の表面発現に関して測定した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞でインキュベートしたＡＲ８０５特異的ヒトＴ細胞培養物を、ＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの細胞内サイトカイン発現に関して測定したものを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖｉ／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞と共にインキュベートしたＡＲ８０５特異的ヒトＴ細胞培養物において定量された多機能サイトカイン発現を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、細胞内グランザイムＢ発現により測定されたＡＲ特異的Ｔ細胞の細胞溶解性及び脱顆粒活性を示す。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、表面ＣＤ１０７ａ発現により測定されたＡＲ特異的Ｔ細胞の細胞溶解性及び脱顆粒活性を示す。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、ＡＲ特異的Ｔ細胞の腫瘍細胞の細胞傷害性を示す。
【図１２Ｇ】図１２Ｇは、ペプチド免疫誘導の後に得られたＡＲ特異的Ｔ細胞はアンドロゲン除去前立腺腫瘍細胞の認識及び溶解を増強したことを示す。ＡＲ８１１ペプチドで免疫誘導したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニック（ＨＨＤＩＩ−ＤＲ１）マウス由来の脾細胞を、ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞と共培養し、ＩＦＮｇ及びＴＮＦαの細胞内サイトカイン発現に関して測定した。
【図１２Ｈ】図１２Ｈは、図１２ＧのＡＲ特異的Ｔ細胞がそれらの表面にＣＤ６９を発現することを示す。
【図１２Ｉ】図１２Ｉは、図１２ＧのＡＲ特異的Ｔ細胞が細胞傷害性であることを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、アンドロゲン除去がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＭｙｃ−ＣａＰ腫瘍細胞のＡＲ発現を増強することを示す。アンドロゲン感受性細胞（Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ）及び去勢抵抗性細胞（Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ）を、定量的ＥＬＩＳＡによるＡＲタンパク質発現に関して分析したものを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、アンドロゲン感受性細胞（Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ）及び去勢抵抗性細胞（Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ）を、細胞内染色によりＡＲタンパク質発現に関して分析したものを示す（横のパネルに発現の振幅及び頻度に関して定量した）。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞及びＭｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ細胞由来のＲＮＡサンプルを全長又はスプライス変異体ｍＡＲ  Ｖ２又はｍＡＲ  Ｖ４の発現に関して定量的ＰＣＲにより分析したものを示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、触知可能な腫瘍を有するＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ担癌ＦＶＢマウスをデガレリクス（ｎ＝４）で処置するか又は偽処置（ｎ＝３）とし、腫瘍成長を追跡したものを示す。結果は２つの独立した試験を代表するものである。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、採取した再発腫瘍をリガンド結合ドメインに対する抗体を用いた細胞内染色によりＡＲ発現に関して分析したものを示す（横のパネルに定量した振幅及び頻度）。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ｐＴＶＧ−ＡＲを用いた免疫誘導と組み合わせたアンドロゲン除去は去勢抵抗性Ｍｙｃ−ＣａＰ腫瘍の再発を遅延させたことを示す。触知可能な腫瘍を有するＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ担癌マウスに、偽処置（ｎ＝３）又はｐＴＶＧ−ＡＲ（ｎ＝５）若しくはエンプティーベクター（ｎ＝５）により隔週で免疫誘導すると共にデガレリクスを施し、腫瘍成長（腫瘍体積）を追跡した。結果は３つの独立した試験を代表するものである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに関するカプラン・マイヤー曲線を示す。結果は３つの独立した試験を代表するものである。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞又はＭｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ細胞と共に培養したｐＴＶＧ４又はｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導したアンドロゲン除去動物由来の脾細胞を、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞細胞内サイトカイン発現に関して分析したものを示す（横の円グラフに定量した多機能発現を示す）。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞又はＭｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ細胞と共に培養したｐＴＶＧ４又はｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導したアンドロゲン除去動物由来の脾細胞を細胞傷害性に関して分析したものを示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、ｐＴＶＧ−ＡＲによる免疫誘導はＡＤＴの存在下又は不在下で腫瘍成長を遅延させ、腫瘍浸潤Ｔ細胞の増強をもたらすことを示す。Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ担癌マウスにデガレリクス処置又は偽処置を施し、次いで、ｐＴＶＧ−ＡＲ又はｐＴＶＧ４対照のいずれかで免疫誘導し、腫瘍成長（腫瘍体積）に関してアッセイした。
【図１４Ｆ】図１４Ｆは、図１４Ｅのマウスに関するカプラン・マイヤープロットを示す。
【図１４Ｇ】図１４Ｇは、図１４Ｅから採取された腫瘍の、ＩＨＣによる浸潤Ｔ細胞の頻度に関する分析を示す。*は、マン・ホイットニーＵ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、アンドロゲン除去はＰＴＥＮ欠損腫瘍におけるＡＲ発現を増強し、ｐＴＶＧ−ＡＲによる免疫誘導はＰｔｅｎ−／−マウスにおいて去勢抵抗性前立腺腫瘍の発生を遅延させることを示す。富アンドロゲン（ＦＣＳ）培地又はアンドロゲン除去（ＣＳＳ）培地で培養したＰＴＥＮ−ＣａＰ８腫瘍細胞を細胞内染色によりＡＲ発現に関して分析した（横のパネルに振幅及び発現に関して定量）。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、富アンドロゲン（ＦＣＳ）培地又はアンドロゲン除去（ＣＳＳ）培地で培養したＰＴＥＮ−ＣａＰ８腫瘍細胞の、定量的ＥＬＩＳＡによりＡＲ発現に関して分析した結果を示す。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、２０週齢のＰｂＣｒｅ+  ＰＴＥＮfl/flマウスに偽処置（ｎ＝９）、又はｐＴＶＧ４（ｎ＝１３）若しくはｐＴＶＧ−ＡＲ（ｎ＝１３）による隔週の免疫誘導と共にデガレリクスを５か月間施した結果を示す。処置の開始１週間前及び終了時に、動物に124Ｉ−ＣＬＲ１４０４を投与し、静注９６時間後にＰＥＴ／ＣＴスキャンを行った（処置前及び処置後のＰＥＴ／ＣＴ画像）。最大ＰＥＴシグナルの６０パーセントを超えるシグナルを用いて腫瘍に対する平均及び最大パーセント注射用量（％ＩＤ／ｇtissue）を計算し、バックグラウンド筋肉取り込みに対して正規化した。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、処置群の無作為化のための処置前平均124Ｉ−ＣＬＲ１４０４取り込みを示す。*は、マン・ホイットニーＵ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、処置群の無作為化のための処置前最大124Ｉ−ＣＬＲ１４０４取り込みを示す。*は、マン・ホイットニーＵ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、計算された処置前と処置後の％ＩＤ／ｇmean変化を示す（平均値は実線の水平のバーで示す）。*は、マン・ホイットニーＵ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ｇ】図１５Ｇは、計算された処置前と処置後の％ＩＤ／ｇmeanを示す（平均値は実線の水平のバーで示す）。*は、マン・ホイットニーＵ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１５Ｈ】図１５Ｈは、剖検の際に採取し分析した尿生殖器複合体質量を示す。*は、マン・ホイットニーＵ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１６】図１６は、抗アンドロゲン作用薬療法ロイプロリドとＤＮＡワクチン及び抗ＰＤ１療法との組合せを用いた処置の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［００７８］  本開示は、前立腺癌を治療するための組合せ療法に関する組成物及び方法を提供する。アンドロゲン療法とアンドロゲン受容体に対するワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）の特定の組合せは、転移性又は去勢抵抗性疾患を含む前立腺癌の治療のためのＡＤＴの有効性(efficacy ADT)を思いもよらず、相乗的に改善する。この併用療法は、ＡＤＴ単独に比べて腫瘍成長の有意な低減をもたらす。
【００１６】
［００７９］  一実施形態では、前立腺癌を有する対象において抗腫瘍応答を惹起するための方法であって、前記対象にＡＤＴを投与すること及び前記対象にアンドロゲン受容体に対するワクチンを投与することを含み、前記ワクチンは、ＡＤＴ処置単独に比べて前立腺癌に対して増強された抗腫瘍応答を惹起するような有効量で投与される方法。この前立腺癌に対して増強された抗腫瘍応答は、前立腺癌細胞の成長及び／又は転移の低減、阻害又は遅延、対象の生存の延長をもたらす。一実施形態では、組合せ処置の抗腫瘍応答は、ＡＤＴ処置単独に比べて腫瘍細胞成長に有意な遅延をもたらす。一実施形態では、ワクチンは、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは、アンドロゲン受容体又はそのフラグメントを含むポリペプチドワクチンである。
【００１７】
［００８０］  一実施形態では、本開示は、前立腺癌を有する対象において抗腫瘍応答を惹起する方法であって、ａ．前記対象にアンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）を投与すること、及びｂ．前記対象に、転写調節エレメントに機能的に連結された、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡワクチンを投与することを含み、前記ＡＤＴと組換えＤＮＡワクチンは、前立腺癌に対して抗腫瘍応答を惹起するような有効量で投与される方法を提供する。
【００１８】
［００８１］  対象における抗腫瘍応答は、腫瘍成長の低減、抑制、遅延若しくは予防、腫瘍体積の低減、及び／又は腫瘍転移の予防、抑制、遅延若しくは低減を含む。抗腫瘍応答は、対象内の腫瘍細胞の数の低減を含む。いくつかの実施形態では、抗腫瘍応答は、アンドロゲン受容体を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答、例えば、アンドロゲン受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性免疫反応を含む。例えば、抗腫瘍応答は、ＡＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍細胞の溶解を含み得る。好ましくは、アンドロゲン受容体に対する細胞性免疫反応は、体液性免疫反応を伴って又は伴わずに誘導される。
【００１９】
［００８２］  アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）は、アンドロゲンホルモンのレベルを低下させる、又は例えば、アンドロゲン受容体経路の標的化（例えば、抗アンドロゲン作用薬）又は化学的去勢の使用によって、アンドロゲン受容体機能／シグナル伝達に干渉する療法である。アンドロゲン除去療法は、有効量の少なくとも１種類のアンドロゲン受容体経路標的化薬を投与することを含む。好適な薬物は当業者に公知であり、限定されるものではないが、ＬＨＲＨ（又はＧｎＲＨ）類似体（作動薬）、ＬＨＲＨ（又はＧｎＲＨ）拮抗薬、ＡＲ拮抗薬、アンドロゲン合成阻害剤、他のＡＲ分解薬又は遮断薬、及びそれらの組合せが含まれる。好適なＡＤＴには、下記の薬物の１以上による処置が含まれる：
［００８３］  （ａ）限定されるものではないが、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、エンザルタミド、アパルタミド、酢酸シプロテロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、スピロノラクトン、カンレノン、ドロスピレノン、トピルタミド（フルリジル）、シメチジンを含むＡＲ拮抗薬；
［００８４］  （ｂ）限定されるものではないが、（ｉ）フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、及びソウパルメット抽出物の限定されない例を含む５α−レダクターゼ阻害剤、（ｉｉ）限定されない例として酢酸シプロテロン、スピロノラクトン、ダナゾール、ゲストリノン、ケトコナゾール、酢酸アビラテロンを含むＣＹＰ１７Ａ１（１７α−ヒドロキシラーゼ、１７，２０−リアーゼ）阻害剤；（ｉｉｉ）限定されない例としてダナゾール、ゲストリノン、酢酸アビラテロンを含む３β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤；（ｉｖ）限定されない例としてダナゾール、シンバスタチンを含む１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤；（ｖ）限定されない例としてアミノグルテチミド、ダナゾールを含むＣＹＰ１１Ａ１（コレステロール側鎖切断酵素）阻害剤；及び（ｖｉ）限定されない例としてスタチン（例えば、アトルバスタチン、シンバスタチン）を含むＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を含む、アンドロゲン合成阻害剤；
［００８５］  （ｃ）（ｉ）限定されない例としてプロゲステロン、酢酸シプロテロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、スピロノラクトン、ドロスピレノンを含むプロゲストゲン；（ｉｉ）エストラジオール、エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、コンジュゲートウマエストロゲンの限定されない例を含むエストロゲン；（ｉｉｉ）ＧｎＲＨ類似体、例えば、限定されない例としてブセレリン、デスロレリン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒストレリン、ロイプロレリン、ナファレリン、トリプトレリンを含むＧｎＲＨ作動薬；限定されない例としてアバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、ガニレリックスを含むＧｎＲＨ拮抗薬；及びそれらの組合せを含む、抗ゴナドトロピン。例えば、好適なＡＤＴ処置としては、限定されるものではないが、ＡＲ拮抗薬ビカルタミド（カソデックス、アストラゼネカ社（登録商標））、アパルタミド（ＡＲＮ−５０９、ヤンセン社）、又はエンザルタミド（イクスタンジ、アステラス社（登録商標））、ＧｎＲＨ拮抗薬(antanogist)デガレリクス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ、フェリング・ファーマ社（登録商標））、ガレテロン（トーカイ社）などのＡＲ分解薬などが含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＨＲＨ作動薬又は拮抗薬とＡＲ拮抗薬又は分解薬との組合せなどの１以上の好適なＡＤＴ薬が使用可能である。
【００２０】
［００８６］  いくつかの実施形態では、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）は、前立腺癌患者の腫瘍の大多数においてアンドロゲン受容体（ＡＲ）の過剰発現をもたらす。本開示が考察しているように、この過剰発現は腫瘍エスケープ変異体の発生を促進し得るが、それはまた前立腺腫瘍細胞にＡＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による溶解をより受けやすくさせる。実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標準的アンドロゲン除去後、又は市販のＡＲ拮抗薬ビカルタミド（カソデックス、アストラゼネカ社（登録商標））又はエンザルタミド（イクスタンジ、アステラス社（登録商標））での処置後に、前立腺腫瘍細胞においてＡＲ発現の増強が起こり得ることを示す。加えて、実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、デガレリクス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ、フェリング・ファーマ社（登録商標））によるアンドロゲン除去療法に臨床使用されているＧｎＲＨ拮抗薬(antanogist)である処置が、ＭｙｃＣａＰ前立腺腫瘍モデルにおいてＡＲ発現の増強をもたらすことを示す。重要なことには、デガレリクス単独による処置は腫瘍成長に遅延をもたらしたが、この処置をアンドロゲン受容体標的ワクチンと組み合わせると（ｐＴＶＧ−ＡＲ）、デガレリクス処置単独に比べて腫瘍成長に有意な遅延をもたらした。加えて、デガレリクスとｐＴＶＧ−ＡＲ処置の組合せの後に再発疾患を発症した動物では、腫瘍はＡＲ発現の有意な低下を示し、これが処置の不成功のバイオマーカーとなり得ることを示唆する。
【００２１】
［００８７］  多様なＡＲ標的医薬を用いてアンドロゲン除去を受けている患者は、アンドロゲン受容体に対するＤＮＡワクチン、例えば、ｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導して、これらの標準的療法に対する応答を改善することができる。改善された応答としては、腫瘍細胞の成長若しくは転移の阻害又は低減、及び／又は腫瘍細胞の成長若しくは転移の遅延が含まれる。
【００２２】
［００８８］  ＡＤＴは、当業者に既知のいずれの好適な用量及び計画で送達してもよい。例えば、限定されない例としては、ＬＨＲＨ作動薬単独又は抗アンドロゲン作用薬（例えば、ビカルタミド又はエンザルタミド）との組合せが含まれる。限定されない別の例は、ＬＨＲＨ作動薬とアビラテロン及びアパルタミドとの組合せである。
【００２３】
［００８９］  ＬＨＲＨ作動薬の好適な用量の限定されない例としては、例えば、３か月毎のロイプロリド２０〜２５ｍｇ（例えば、２２．５ｍｇ）ＩＭを含み；及び／又はゴセレリンＬＨＲＨ作動薬は一般に、３か月毎の約９〜１２ｍｇ（例えば、１０．８ｍｇ）ｓｃである。ＬＨＲＨ拮抗薬の用量の限定されない例としては、初回用量としてデガレリクス２４０ｍｇ  ｓｃを１回、その後、２８日毎に８０ｍｇ  ｓｃ；アビラテロン：毎日経口１０００ｍｇ；アパルタミド：毎日経口２４０ｍｇ；ビカルタミド：毎日経口５０ｍｇ；及び／又はエンザルタミド：毎日経口１６０ｍｇを含む。
【００２４】
［００９０］  いくつかの実施形態では、当技術分野で公知且つ理解されているＡＤＴの用量又は投与計画は、本発明に記載されるようなワクチンと組み合わせた場合に従来のパラメーターとは異なる可能性がある（例えば、量又は投与頻度の低減）ことが企図される。
【００２５】
［００９１］  本開示の方法で使用されるワクチンは、アンドロゲン受容体若しくはその断片をコードする組換えＤＮＡワクチン、又はポリペプチドアンドロゲン受容体若しくはその断片を含むペプチドワクチンであり得る。本開示の方法で使用される組換えＤＮＡワクチンは、哺乳動物アンドロゲン受容体、アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメイン、又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含み得る。使用に好適な組換えＤＮＡワクチンは、米国特許第７，９１０，５６５号及び同第８，９６２，５９０号明細書に「前立腺癌ワクチン」という名称で開示され、これらはその全内容が本明細書の一部として援用される。いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡワクチンは、哺乳動物アンドロゲン受容体、リガンド結合ドメイン若しくはリガンド結合ドメインの特定の断片を含む哺乳動物アンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む。プラスミドＤＮＡワクチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてヒトなどの対象に直接導入される場合、対象内でコードされているポリペプチドの発現を誘導し、対象の免疫系を前記ポリペプチドに対して反応性とする。これらのワクチンは、コードされているポリペプチドに対する免疫応答を惹起し得るいずれのポリヌクレオチドであってもよい。
【００２６】
［００９２］  いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ｐＴＶＧ−ＡＲ（ｐＴＶＧ−ＡＲ又はｐＴＶＧ−ＡＲＬＢＤは同じベクターであり、本明細書では互換的に使用される）を含む。ｐＴＶＧ−ＡＲは、全内容が本明細書の一部として援用される米国特許第７，９１０，５６５号明細書に開示されているように、免疫誘導ベクターｐＴＶＧ−ＡＲを作出するためにｐＴＶＧ４ベクターに挿入されたヒトアンドロゲン受容体遺伝子のリガンド結合ドメインのコード配列を含むベクターである。
【００２７】
［００９３］  本ワクチンは、対象内でアンドロゲン受容体に対する免疫応答を惹起するために対象に投与することができる。「有効量」又は「免疫学的に有効な量」とは、単回用量での又は一連の用量の一部としての対象へのその量の投与が、アンドロゲン受容体に対する（従って、アンドロゲン受容体を発現する細胞に対して）免疫反応を誘導するために有効であることを意味する。更に、本発明において企図される「有効量」は、ＡＤＴの抗腫瘍有効性を増大又は増強して前立腺腫瘍成長及び転移の遅延又は阻害(inhibitor)をもたらすワクチンの量である。
【００２８】
［００９４］  アンドロゲン受容体遺伝子は既知であり、多くの種からクローニングされている。例えば、ｃＤＮＡに相当するヒト、マウス、ラット、イヌ、チンパンジー、マカクザル、及びキツネザルアンドロゲン受容体ｍＲＮＡはアミノ酸配列と共に、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４４（ｃＤＮＡ−配列番号１及びアミノ酸配列−配列番号２）、ＮＭ＿０１３４７６（ｃＤＮＡ−配列番号３及びアミノ酸配列−配列番号４）、ＮＭ＿０１２５０２（ｃＤＮＡ−配列番号５及びアミノ酸配列−配列番号６）、ＮＭ＿００１００３０５３、ＮＭ＿００１００９０１２、Ｕ９４１７９、及びＵ９４１７８に見出すことができる。他の種に由来するアンドロゲン受容体遺伝子も知られている。これらの種としては、限定されるものではないが、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、アスタトティラピア・ブルトニー（Ａｓｔａｔｏｔｉｌａｐｉａ  ｂｕｒｔｏｎｉ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、マングローブ・キリフィッシュ（Ｋｒｙｐｔｏｌｅｂｉａｓ  ｍａｒｍｏｒａｔｕｓ）、アメリカアリゲーター（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉｅｎｓｉｓ）、カンギエイの一種（Ｌｅｕｃｏｒａｊａ  ｅｒｉｎａｃｅａ）、ハプロクロミスの一種（Ｈａｐｌｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｂｕｒｔｏｎｉ）、ファットヘッドミノ（Ｐｉｍｅｐｈａｌｅｓ  ｐｒｏｍｅｌａｓ）、ディケントラルクス・ラブラクス（Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓ  ｌａｂｒａｘ）、カダヤシ（Ｇａｍｂｕｓｉａ  ａｆｆｉｎｉｓ）、アトランティッククローカー（Ｍｉｃｒｏｐｏｇｏｎｉａｓ  ｕｎｄｕｌａｔｅｓ）、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）、クロダイ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ）、ウシガエル（Ｒａｎａ  ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）、ハイエナ（Ｃｒｏｃｕｔａ  ｃｒｏｃｕｔａ）、キツネザルの一種（Ｅｕｌｅｍｕｒ  ｆｕｌｖｕｓ  ｃｏｌｌａｒｉｓ）、及びウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）（それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２１４３１４（又はＡＦ１６１７１７）、ＡＹ０８２３４２、ＮＭ＿００１０４００９０、ＤＱ３３９１０５、ＡＢ１８６３５６、ＤＱ３８２３４０、ＡＦ１２１２５７、ＡＹ７２７５２９、ＡＹ６４７２５６、ＡＢ０９９３０３、ＡＹ７０１７６１、ＡＢ０７６３９９、ＡＹ２１９７０２、ＡＹ３２４２３１、ＡＹ１２８７０５、Ｕ９４１７８、及びＡＢ０２３９６０参照）。アンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインは当技術分野で周知である。本発明の目的で、ヒトアンドロゲン受容体のリガンド結合ドメインは、アミノ酸６５１番〜６８１番のいずれかのアミノ酸で始まり、アミノ酸９００番〜９２０番のいずれかのアミノ酸で終わるポリペプチドを指す。例えば、ヒトアンドロゲン受容体又はアミノ酸６８１〜９００を含むヒトアンドロゲン受容体の断片並びに前記をコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡワクチンは好適なワクチンである。当業者により容易に認識されるように、リガンド結合ドメイン又は上記の種並びに他の動物の１つに由来する全長受容体を含むアンドロゲン受容体のより長い断片をコードするいずれのＤＮＡ配列も本発明に好適である。
【００２９】
［００９５］  薬学上許容される担体は当業者に周知である（Ａｒｎｏｎ，  Ｒ．（Ｅｄ．）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉ：８３−９２，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．，  １９８７）。それらは患者にペプチド又はポリヌクレオチドを導入するためにビヒクルとして使用するために好適な液体培地を含むが、それら自体、その組成物を受容する個体に有害な抗体の生産を誘導してはならない。このような液体培地の例は生理食塩水である。
【００３０】
［００９６］  更に、ワクチンは、免疫応答を刺激し、且つそれによりワクチンの効果を増強するためのアジュバントも含有してよい。好適なアジュバントは当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ、モンタナイド、又はサポニン誘導体アジュバントが含まれる。
【００３１】
［００９７］  別の実施形態によれば、ＤＮＡワクチンは、転写調節エレメント（例えば、異種プロモーターなどのプロモーター）に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドは、（ｉ）哺乳動物アンドロゲン受容体（例えば、ヒトアンドロゲン受容体）、（ｉｉ）リガンド結合ドメインを含むアンドロゲン受容体の断片、（ｉｉｉ）配列番号９（ＬＬＬＦＳＩＩＰＶ、配列番号２のアミノ酸８１１〜８１９）により定義されるリガンド結合ドメインの断片；（ｉｖ）配列番号１０（ＲＭＬＹＦＡＰＤＬＶ、配列番号２のアミノ酸７６１〜７７０）により定義されるリガンド結合ドメインの断片、（ｖ）配列番号１１（ＦＬＣＭＫＡＬＬＬ、配列番号２のアミノ酸８０５〜８１３）により定義されるリガンド結合ドメインの断片、及び（ｖｉ）配列番号１２（ＱＬＴＫＬＬＤＳＶ、配列番号２のアミノ酸８５９〜８６７）により定義されるリガンド結合ドメインの断片から選択されるメンバーをコードし、前記ワクチンの対象への投与は、アンドロゲン受容体を発現する細胞に対する細胞傷害性免疫反応を誘導する。
【００３２】
［００９８］  ＤＮＡワクチンは、対象の細胞内でタンパク質（例えば、アンドロゲン受容体又はその断片）の発現を促進する転写調節エレメントに直接連結されたポリヌクレオチドを含み得る。好適な転写調節エレメント（例えば、異種プロモーターなどのプロモーター）は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、とりわけＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒト延長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーター、及びヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが含まれる。
【００３３】
［００９９］  ワクチンは、皮内、筋肉内、皮下、又は血管内（静脈内及び動脈内を含む）投与により、ヒトなどの哺乳動物に好適に投与される。別の態様では、ＤＮＡワクチンは、免疫誘導の部位においてＤＮＡの取り込みを増大させるために、筋肉又は皮膚エレクトロポレーションによる投与に好適である。
【００３４】
［００１００］  ワクチンは、アンドロゲン受容体に対するロバスト且つ持続的な免疫応答を誘導するために、プライム−ブースト法でＡＤＴ療法と共に使用することができる。同じ抗原構築物の反復注射に基づくプライミングおよびブースティングワクチン接種プロトコールは周知であり、強いＣＴＬ応答をもたらす。一般に、初回用量は防御免疫を生じなくてもよく、免疫系を「プライム」するだけである。防御免疫応答は第２又は第３用量後に生じる。
【００３５】
［００１０１］  本明細書に記載のワクチンは、前立腺腫瘍細胞の成長又は転移の遅延、低減又は阻害によって見て取れるＡＤＴ処置の有効性を増大または増強するような有効量で提供することができる。
【００３６】
［００１０２］  一実施形態では、ワクチンは、従来のプライム−ブースト法で使用することができ、この場合、同じ抗原が複数用量で動物に投与される。好ましい実施形態では、ＤＮＡ又はペプチドワクチンは、１回以上の接種で使用される。これらのブーストは従来技術に従って行われ、投与計画、投与経路、アジュバントの選択、用量、及び別のワクチン、療法又は同種ワクチンと共に投与される場合の潜在的順序に関して経験的に更に最適化することができる。
【００３７】
［００１０３］  一実施形態では、ワクチンは、２週間毎〜３か月毎に投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、少なくとも６週間、或いは少なくとも１０週間、或いは少なくとも１５週間、或いは少なくとも２０週間、或いは少なくとも２５週間、或いは少なくとも３０週間、或いは少なくとも３５週間、或いは少なくとも４０週間、或いは少なくとも４５週間、或いは少なくとも４８週間、或いは少なくとも５０週間、或いは少なくとも１年、或いは少なくとも１８か月、或いは少なくとも２０か月投与され、間のいずれの期間も含み得る（例えば、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２４週間など）。いくつかの実施形態では、ワクチンは、約６〜約１４週間隔週で投与され、その後、少なくとも１年間、年４回投与される。いくつかの実施形態では、ワクチンは、約６〜約１４週間隔週で投与され、その後、少なくとも１８か月間、年４回（すなわち、３か月毎に）投与される。
【００３８】
［００１０４］  ＤＮＡワクチンの好適な用量は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、一用量当たり約１０ｍｃｇ〜約１ｍｇのＤＮＡを含む。
【００３９】
［００１０５］  いくつかの実施形態では、ＡＤＴ及び組換えワクチンは、同時に投与される。他の実施形態では、対象はＡＤＴで処置された後に組換えワクチンで処置される。ＡＤＴと組換えワクチン投与の間の期間は短期間であってもよく（例えば、数時間又は数日）又はより長期間であってもよい（例えば、数週間又は数ヶ月）。いくつかの実施形態では、同時にという語は、２成分が互いに近いタイミングで投与される（例えば、数時間内又は同日）が、異なる投与経路で投与されてもよい（例えば、ＡＤＴは経口及びワクチンは注射）ことを意味する。いくつかの実施形態では、投与は離され、例えば、ワクチンとＡＤＴの間が数時間又は数日離される。いくつかの実施形態では、ワクチン及びＡＤＴは同じ期間、異なる日に投与を必要とする異なる投与計画を用いて投与される。本明細書では更に、ＡＤＴの用量計画を始める前の期間にワクチンが投与される投与計画など好適な投与計画が述べられる。
【００４０】
［００１０６］  いくつかの実施形態では、組換えＤＮＡワクチンは、アンドロゲン除去療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ＡＤＴ投与の開始前に２〜２４週間、隔週で投与され、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン投与は、ＡＤＴ療法中に２〜１６週間毎に継続される。いずれの理論にも縛られるものではないが、免疫誘導前のＡＤＴの投与はＴ細胞応答のプライミングに直接干渉し得ることが示されているので、アンドロゲン除去療法の投与前のＤＮＡワクチンの投与は、好ましい免疫応答及び抗腫瘍応答をもたらし得る。当業者ならば、ＡＤＴ及びワクチン投与の好ましい投与計画を決定することができる。
【００４１】
［００１０７］  いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
【００４２】
［００１０８］  いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ＡＤＴ処置を増強するために、対象にアンドロゲン受容体に対するワクチンに加えて有効量のチェックポイント経路阻害剤を投与することを更に含む。一例では、チェックポイント経路阻害剤は、ＰＤ経路阻害剤である。好適なＰＤ経路阻害剤は当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＰＤ経路阻害剤は、抗ＰＤ−１遮断抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【００４３】
［００１０９］  種々の腫瘍抗原系を用いて、本発明者らは、ＤＮＡワクチン接種は、ＩＦＮγを分泌する腫瘍特異的Ｔ細胞の惹起の結果として、腫瘍においてＰＤ−Ｌ１発現を惹起し得ることを見出した。具体的には、モデル抗原を発現する腫瘍は、その抗原をコードするＤＮＡワクチンでの免疫誘導後にＰＤ−Ｌ１発現の増強を示した（Ｒｅｋｏｓｋｅ，  Ｂ．Ｔ．，  Ｈ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．Ｍ．Ｏｌｓｏｎ，  Ｂ．Ｂ．Ｍａｒｉｃｑｕｅ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．ＭｃＮｅｅｌ．（２０１５）．“ＰＤ−１  ｏｒ  ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＳＳＸ２  Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．３：９４６−５５）。免疫誘導がより高いＰＤ−１発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を惹起するように改変された場合、これはより劣った抗腫瘍応答をもたらした。
【００４４】
［００１１０］  以下の実施例は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の標的化とＡＲ標的化ワクチンとの組合せが腫瘍により媒介される免疫抑制を軽減又は防止し得ることを示す。ＡＤで処置し、且つ、ｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導したＭｙｃＣａＰ担癌動物において、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＰＤ−１発現を上昇したことが見出された（図１０Ａ）。加えて、一部の再発腫瘍はＰＤ−Ｌ１発現を上昇した（図１０Ｂ）。ＡＲ標的免疫誘導をＰＤ−１遮断抗体と組み合わせた場合、この処置はｐＴＶＧ−ＡＲ単独での免疫誘導に比べて腫瘍成長を有意に遅延させた（図１０Ｃ）。更に、ＡＤＴとＡＲに向けられた免疫誘導及びＰＤ−１遮断を組み合わせると、腫瘍成長を更に遅延させた（図１０Ｄ）。よって、ワクチン接種及びＡＤＴと抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置との組合せはより大きい抗腫瘍応答をもたらし、腫瘍の根絶をもたらし得る。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置の追加は、アンドロゲン受容体に対する免疫応答を増大又は増強する。例えば、処置方法の１つの限定されない例として、ＬＨＲＨ、アビラテロン、アパルタミド又はそれらの組合せを含むＡＤＴとＡＲワクチン及び抗ＰＤ−１抗体の組合せが含まれる。
【００４５】
［００１１１］  本発明の方法では、本発明において企図される二重組合せ（ＤＮＡワクチン及びＡＤＴ）及び三重併用療法（ＤＮＡワクチン、ＰＤ−１経路阻害剤及びＡＤＴ）を用いた処置計画を含め、多くの異なる潜在的シナリオが想定される。これらのシナリオでは、二重組合せ及び三重組合せは併用投与するには及ばず、適切な投与計画で同じ期間に投与するだけでよい。他の実施形態では、各療法の開始は、最も効力のある投与計画を提供するように時差が設けられる（例えば、ＡＤＴ療法の開始前に少なくとも２以上のワクチン用量の投与）。いくつかの実施形態では、処置の方法は、ある期間、三重組合せを投与した後、第２の期間、二重組合せを投与することを含む。他の実施形態では、処置の方法は、ある期間、二重組合せを投与した後、ある期間、三重併用療法を投与することを含む。他の実施形態では、処置の方法は、二重又は三重組合せを投与する期間を含み、その期間内に１回以上のその処置は投与されないが他の療法は維持される期間を含む。例えば、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤は、ＡＤＴが投与される前に２〜１２週間、毎週又は隔週で投与されてよく、それにより、ＤＮＡワクチン、ＰＤ−１経路阻害剤及びＡＤＴは全て更に少なくとも１２〜４８週間投与され、その後、ワクチンのブースター投与がＰＤ−１経路阻害剤を伴って又は伴わずに続けられている間、ＡＤＴ療法は停止されてよい。場合によっては、ＡＤＴ療法は、数週間〜数ヶ月後に再開されてよい。これらの療法、処置回数及び投与計画の他の好適な組合せは当業者により決定されることが企図される。
【００４６】
［００１１２］  いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンとＡＤＴの二重併用療法が企図される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ＡＤＴの開始前に、少なくとも１回（すなわち、１〜１２回）毎週又は隔週で投与される。ＡＤＴ処置の前にワクチンを開始することは、本発明者らがＡＤＴ処置後に腫瘍細胞で過剰発現されることを見出したアンドロゲン受容体を発現する細胞に対して活性化されるように免疫系をプライムする上でいくつかの利点を持ち得る。これは腫瘍細胞に対してよりロバストな増強された免疫応答を可能とし、腫瘍成長の遅延又は低減をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡＤＴ療法は、ＤＮＡワクチンの投与前に開始され、例えば、ＤＮＡワクチンが投与される前少なくとも１か月以上である。
【００４７】
［００１１３］  いくつかの実施形態では、ＡＤＴ投与はまた間欠的であってもよい。間欠的ＡＤＴ投与中、ＡＤＴ療法を停止すべきか且つ／又は再開すべきかを決定するために対象のＰＳＡ数がモニタリングされてもよい。例えば、ＡＤＴは、ＰＳＡ数がひと度好適なレベルに低下し、且つ、安定した場合に中止され、また、ＰＳＡ数が再び増加すれば、ＡＤＴが再開される（時には数か月後、或いは数年後）。更に、ＤＮＡワクチンの使用は、ワクチンが抗腫瘍応答を惹起するために初年のうちは周期的に（例えば、２週間〜３か月毎）与えられ、その後、連続的又は間欠的ＡＤＴ投与と組み合わせて抗腫瘍免疫応答を維持するために維持ブースターとして臨時に（例えば、３か月以上）投与される用量を含み得る。
【００４８】
［００１１４］  いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン、ＰＤ−１経路阻害剤、及びＡＤＴはそれぞれ別個に投与され、それぞれは異なる重複期間に投与される。場合によっては、３つ全てが同じ期間に投与される。いくつかの実施形態では、３つの処置の全てが同じ期間に、絶えず、しかし異なるタイミング間隔で投与される。いくつかの実施形態では、３つの処置の全てが絶えず投与されるわけではない（例えば、それらの処置のうち１以上が投与されない期間がある）。いくつかの実施形態では、処置のそれぞれは、処置の開始後に異なる回数で、間隔をあけた異なる用量で提供される。例えば、ＤＮＡワクチンは、ＰＤ−１経路阻害剤による処置の開始前、ＡＤＴ処置の開始前に投与してよい。いくつかの例では、ＤＮＡワクチンは、１〜１２週間毎に１回、少なくとも６週間以上、例えば、毎週１回又は隔週１回、１〜２４週間、その後、３〜８週間毎に１回、少なくとも更に２４週間以上投与してよい。別の例では、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤は、ＡＤＴ処置の開始前に同じ投与計画で投与してよい（例えば、２週間毎に６〜３６週間、その後、４〜６週間毎に少なくとも更に６〜３６週間、その後、１２〜２４週間毎に少なくとも更に１年のブースター投与）。投与計画の他の好適な組合せも企図される。
【００４９】
［００１１５］  いくつかの実施形態では、各処置（ＤＮＡワクチン、ＰＤ−１経路阻害剤及びＡＤＴ）の長さ及び処置が少なくとも一部の時間提供される期間。いくつかの実施形態では、１以上の処置が同じ期間に投与される。例えば、ＤＮＡワクチン、ＰＤ−１経路阻害剤は、異なる用量で、異なる時点で、数ヶ月〜数年のコースで投与されてよく、一方、ＡＤＴは、既知のプロトコールにより、同じ数ヶ月又は数年の期間の一部又は全てにわたって投与することができる。
【００５０】
［００１１６］  いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤は、ＡＤＴの開始前に複数用量で投与され、ＡＤＴ投与中継続する。いくつかの実施形態では、処置の組合せは、次のように投与される：
ワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤を２〜４週間毎（例えば、２週間毎）に少なくとも８〜１６週間投与した後、ワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤を４週間毎に少なくとも更に８〜１６週間投与し、その後、ワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤を１２週間毎（或いは又３か月毎）に少なくとも更に２４週間投与し、ＡＤＴは、ワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤の初回投与の開始後１０週目〜１４週目の間に開始して投与し、１２週間毎に少なくとも更に４回の処置回数（すなわち、少なくとも４８週間）投与する。
【００５１】
［００１１７］  好ましい実施形態では、ワクチンは、アンドロゲン受容体に対するＤＮＡワクチンであり、ＰＤ−１経路阻害剤は抗ＰＤ−１抗体であり、ＡＤＴはロイプロリドデポー２２．５ｍｇ筋肉内投与又はゴセレリン１０．８ｍｇ皮下投与である。好適な投与計画は図１６に示され、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤が２週間毎に最初の１２週間投与された後、４週間毎に更に１２週間投与され、その後、１２週間毎に少なくとも更に２４〜４８週間投与される。この投与計画では、ＡＤＴは、初回ワクチン／ＰＤ−１阻害剤処置後１２週間、２４週間、３６週間及び４８週間で投与される。この投与計画は、腫瘍を治療するために少なくとも１年以上延長することができる。
【００５２】
［００１１８］  いくつかの実施形態では、本開示は、前立腺癌を有する対象においてアンドロゲン除去療法の有効性を高める方法であって、前記対象に、転写調節エレメントに機能的に連結された、アンドロゲン受容体又はアンドロゲン受容体の断片をコードするポリヌクレオチドを含む有効量の組換えＤＮＡワクチンを投与することを含む方法を提供し、その方法は、前立腺癌の成長を阻害、遅延又は低減する。いくつかの実施形態では、その方法は、前記対象に有効量のＰＤ経路阻害剤を投与することを更に含む。
【００５３】
［００１１９］  前記対象は、前立腺癌を有するものとして従前に診断されていてよい。いくつかの実施形態では、前立腺癌はいずれの病期であってもよく、例えば、初期前立腺癌又は新規に診断された前立腺癌である。いくつかの実施形態では、前立腺癌は転移性前立腺癌であってよい。別の実施形態では、前立腺癌は去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）である。
【００５４】
［００１２０］  いくつかの実施形態は、前立腺癌を治療するためのキットを提供する。そのキットは、抗アンドロゲン受容体免疫応答を惹起するアンドロゲン除去療法及びワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）を含む。ＡＤＴ及び組換えＤＮＡワクチンを投与するための用量及び投与計画についての説明書のセットも提供され得る。いくつかの実施形態では、アンドロゲン受容体療法は、ＡＲ発現又はシグナル伝達に干渉することによりＡＲ経路を標的とする１以上の薬物からなる。好適なワクチン及び薬物は上記に述べられる。
【００５５】
［００１２１］  別の実施形態では、そのキットは、アンドロゲン除去療法、抗アンドロゲン受容体免疫応答を惹起するワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン）及びＰＤ−１経路阻害剤（例えば、ＰＤ−１抗体）を含む。各処置に関する用量及び投与計画についての説明書のセットが提供されてよい。
【００５６】
［００１２２］  本発明は、下記の限定されない例を考慮すればより詳しく理解される。本開示に引用されている各刊行物、特許、及び特許公報は、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。
【実施例】
【００５７】
実施例１
アンドロゲン除去はアンドロゲン受容体（ＡＲ）発現を増強し、ＡＲ特異的Ｔ細胞応答に対する腫瘍細胞感受性を高める
［００１２３］  本実施例は、アンドロゲン除去が、その除去が短期間であった場合でも長期間であった場合でも、腫瘍細胞（２２Ｒｖ１細胞）において全長ＡＲ発現の増強をもたらすことを示す。ＡＲペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２発現腫瘍細胞と共培養すると、Ｔ細胞活性化、サイトカイン発現、及び細胞傷害性アッセイの増大が生じた。
【００５８】
材料及び方法
細胞培養
［００１２４］  ２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、及びＤＵ１４５細胞をＡＴＣＣから入手し、それらの同一性及びマイコプラズマ汚染の不在をＤＤＣメディカルにより確認した。細胞を２００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。この基本培地に１０％完全ＦＣＳ（ＲＰＭＩ／ＦＣＳ）、又は１０％チャコール処理済み血清（ＲＰＭＩ／ＣＳＳ）のいずれかを添加してアンドロゲン除去培養培地を作製した。チャコール処理済み血清は、デキストランコーティングチャコールを熱失活ＦＣＳと共にインキュベートし、４℃で一晩インキュベートした後、遠心分離及び無菌濾過を行い、その後、テストステロンＡｃｃｕＢｉｎｄ  ＥＬＩＳＡ（モノバインド社）によりテストステロンの分析を行うことによって作製した。
【００５９】
アンドロゲン受容体酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
［００１２５］  培養前立腺癌細胞を採取し、細胞溶解液を調製し、ＰａｔｈＳｃａｎアンドロゲン受容体（ＡＲ）ＥＬＩＳＡを製造者の説明書（セルシグナリングテクノロジー社）に従って用い、タンパク質発現を分析した。簡単に述べれば、マイクロウェルストリップ（抗ＡＲ抗体でプレコーティング）を３反復にて２ｍｇ／ｍＬタンパク質溶解液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、検出抗体を用いてＡＲを検出した後、ＨＲＰ結合二次抗体及びＴＭＢ基質の現像を行った。精製ＡＲ  ＬＢＤタンパク質（インビトロジェン社）を用いて標準曲線を作成し、細胞溶解液１ｍｇ当たりの相対ＡＲ濃度を得るために使用した。
【００６０】
アンドロゲン受容体定量的リアルタイムＰＣＲ
［００１２６］  培養前立腺癌細胞を採取し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ精製システムを用いてＲＮＡを調製し、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット(kid)（バイオラッド社）を用いてｃＤＮＡを合成するために一般的濃度のＲＮＡを用い、ＳｓｏＦａｓｔ  ｑＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオラッド社）を用いるｑＰＣＲ反応に鋳型として使用した。反応はアニーリング温度６０℃及び４０サイクルを用いるＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙｉＱサーモサイクラーで行った。プライマーセット：
ＡＲ−ＦＬ＿Ｆｗｄ（ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣ）（配列番号７）；
ＡＲ−ＦＬ＿Ｒｅｖ（ＴＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡＧＡＴ）（配列番号８）；
ＡＲ−Ｖ７＿Ｆｗｄ（ＣＣＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＧＣ）（配列番号１３）；
ＡＲ−Ｖ７＿Ｒｅｖ（ＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴ）（配列番号１４）；
β−アクチン＿Ｆｗｄ（ＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴ）（配列番号１５）；
β−アクチン＿Ｒｅｖ（ＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧ）（配列番号１６）。
【００６１】
［００１３３］  結果は、対照遺伝子としてのβ−アクチンに対して２-ΔCt法により分析し、ＦＣＳ処理細胞に対する誘導倍率を、公開されているように［６］、２-ΔΔCt法を用いて計算した。
【００６２】
ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１細胞の作出及びバリデーション
［００１３４］  ＲＰＭＩ／ＦＣＳ又はＲＰＭＩ／ＣＳＳで６か月より長く培養した２２Ｒｖ１細胞を、９６ウェル平底プレートにて５０細胞／ウェルの濃度で希釈し、ヒトＨＬＡ−Ａ２複合体をコードするレンチウイルスでトランスフェクトした。細胞を拡大培養し、ＨＬＡ−Ａ２−ＦＩＴＣ（バイオレジェンド社）で染色し、ＨＬＡ−Ａ２＋イベント（ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター、ＢＤバイオサイエンス社）に関して選別した。ＨＬＡ−Ａ２＋２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞及び２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞を拡大培養し、ＡＲタンパク質及びｍＲＮＡ発現を上記のようにバリデートし、ＨＬＡ−Ａ２及びＰＤ−Ｌ１発現をフローサイトメトリーにより評価した。
【００６３】
マウス免疫学アッセイ
［００１３５］  マウス免疫学研究のために、公開されているように（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１１），  ３３：  ６３９−６４７）、１００μｇの得られたＡＲ８１１ペプチドを２００μｌ完全フロイントアジュバント（シグマ社）と共にＨＨＤＩＩ−ＤＲ１異型接合性マウスの右後方側腹部に皮下免疫した。７日後、脾細胞を採取し、６日間ＡＲ８１１ペプチドで再刺激し、細胞内サイトカイン染色アッセイ及び細胞傷害性アッセイに使用した。細胞内サイトカイン染色のために、２００，０００個の脾細胞を培地単独、２０００個の２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞、２０００個の２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞、又はＰＭＡ／イオノマイシン陽性対照で１８時間刺激した。細胞を３７℃／５％ＣＯ2にて４時間モネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ、２μＭ、ＢＤバイオサイエンス社）で処理した。次に、細胞を蛍光標識したＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ８抗体、及びＣＤ６９抗体で染色し、固定及び透過処理後、ＩＦＮγ及びＴＮＦαに対する蛍光標識抗体（ＢＤバイオサイエンス社）又は対応するアイソタイプ対照を用いて細胞内染色を行った。その後、細胞を、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて分析し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋脾細胞にゲートを設定し、この集団のＩＦＮγ及び／又はＴＮＦαの発現、並びに表面ＣＤ６９発現を分析することによりイベントを分析した。細胞傷害性アッセイは従前に記載されているように行った（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（２０１１），  ７１：  ６７８５−６７９５）。簡単に述べれば、再刺激した脾細胞を２２Ｒｖ１／ＦＣＳ標的細胞株又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ標的細胞株と共に４〜６時間培養し、その後、ＬＤＨ放出を、Ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６アッセイキット(kid)（プロメガ社）の変形を用いて計算した。培地単独が寄与する光学密度（ＯＤ）シグナルを全ての値から減算した。全てのサンプル条件を３反復で評価し、標準誤差と共に示した。
【００６４】
［００１３６］ヒト免疫学アッセイ
ヒト免疫学研究のために、ヒトＴ細胞培養物を従前に記載されているように作出した（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１１），  ３３：  ６３９−６４７）。簡単に述べれば、ＨＬＡ−Ａ２＋前立腺癌患者由来のＰＢＭＣサンプルを照射済みペプチドでパルスした抗原提示細胞（自己ＤＣ株、ＰＢＭＣ株、又はリンパ芽球様Ｂ細胞株のいずれか）と共に培養した。２４時間後、細胞を１０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２で処理し、照射済みペプチドでパルスしたＡＰＣで毎週再刺激し、２〜８回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後、細胞傷害性アッセイを用いて培養物のサイトトリティック(cytotolytic)活性を試験した。次に、ＡＲ８０５ペプチド特異的Ｔ細胞を細胞内サイトカイン染色アッセイ及び細胞傷害性アッセイに使用した。細胞内サイトカイン染色のために、上記のように、ただし細胞内ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、及びグランザイムＢ（ＧｒＢ）、又は対応するアイソタイプ対照に対する蛍光標識抗体を用いてアッセイした。その後、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いて細胞を分析し、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞にゲートを設定し、この集団のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、及び／又はＧｒＢの発現、並びに表面ＣＤ６９及びＣＤ１０７ａ発現を分析することによりイベントを分析した。細胞傷害性アッセイは上記及び（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（２０１１），  ７１：  ６７８５−６７９５）に従前に記載されているように行った。
【００６５】
［００１３７］結果
［００１３８］  アンドロゲン除去はｉｎ  ｖｉｔｒｏでいくつかの前立腺癌細胞株においてＡＲタンパク質発現を増強する。ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、及び２２Ｒｖ１細胞を富アンドロゲン（ＦＣＳ；完全ＦＣＳを添加した培地）又はアンドロゲン除去（ＣＳＳ；チャコール処理済み血清）条件下で１、３、５、又は７日間又は少なくとも３か月（ＬＴ；長期）培養した。タンパク質溶解液を採取し、図１Ａ〜Ｄに示されるようにＥＬＩＳＡによりＡＲタンパク質発現を分析した。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００６６】
［００１３９］  アンドロゲン除去は、ＡＲ−Ｖ７  ｍＲＮＡ発現に一過性の増強を誘導し、全長ＡＲ  ｍＲＮＡの過剰発現を持続させる。２２Ｒｖ１細胞を富アンドロゲン条件又はアンドロゲン除去条件下で１、３、５、又は７日間又は少なくとも３か月培養した。ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを合成するために使用し、ｃＤＮＡを全長ＡＲ（図２Ａ及び２Ｃ、左のパネル）又はＡＲ−Ｖ７（図２Ｂ及び２Ｄ、右のパネル）発現のいずれかのためのｑＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。上のパネル：相対発現（β−アクチン対照に対して正規化）。下のパネル：長期ＦＣＳ培養した２２ｒｖ１細胞に対する発現誘導倍率。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００６７】
［００１４０］  ＡＲＬＢＤペプチド特異的Ｔ細胞は、富アンドロゲン条件で培養した細胞よりもアンドロゲン除去前立腺癌細胞に対してＴ細胞活性化、Ｔｈ１多機能サイトカイン発現、及び細胞傷害性のレベルを上昇させた。２２Ｒｖ１細胞を富アンドロゲン（ＦＣＳ）条件又はアンドロゲン除去（ＣＳＳ）条件で６か月より長く培養し、ＨＬＡ−Ａ２をコードするレンチウイルスでトランスフェクトし、フローサイトメトリーによりＨＬＡ−Ａ２発現細胞を選別した。次に、２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞株及び２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞株（又は非ＨＬＡ−Ａ２トランスフェクト２２Ｒｖ１対照）を、ＡＲタンパク質発現に関してはＥＬＩＳＡにより（図３Ａ）、ＲＮＡ発現に関してはｑＲＴ−ＰＣＲにより（図３Ｂ）、ＨＬＡ−Ａ２発現（図３Ｃ）、及びＰＤ−Ｌ１発現（図３Ｄ）に関してはフローサイトメトリーにより評価した（青：２２Ｒｖ１／ＦＣＳ；赤：２２Ｒｖ１／ＣＳＳ；黒：野生型２２Ｒｖ１；灰色：ＩｇＧ染色２２Ｒｖ１）。*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００６８】
［００１４１］  ＡＲ８１１ペプチドで免疫誘導したマウスは、アンドロゲン除去２２Ｒｖ１細胞に曝された際にサイトカイン発現、Ｔ細胞活性化、及び細胞傷害性の増強を示した。ＡＲ８１１ペプチドで免疫誘導したＨＨＤＩＩ−ＤＲ１異型接合性マウス由来の脾細胞を、ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞に対する免疫応答に関して評価した。図４Ａ〜Ｂは、２２Ｒｖ１／ＦＣＳ（図４Ａ）又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ（図４Ｂ）と共に培養した脾細胞の細胞内サイトカイン染色を示す。図４Ｃは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞のＣＤ６９発現を示す（挿入内に定量された平均蛍光強度−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す）。図４Ｄは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞の細胞傷害性を示す。
【００６９】
［００１４２］  ヒトＡＲ８０５ペプチド特異的Ｔ細胞は、アンドロゲン除去２２Ｒｖ１前立腺癌細胞に曝された際にＴ細胞活性化、Ｔｈ１多機能サイトカイン発現、及び細胞傷害性のレベルを上昇したことが示される。ＡＲ８０５ペプチド特異的Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋前立腺癌患者の末梢血から従前に培養（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．,  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．（２０１１）,  ７１：  ６７８５−６７９５））を、ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞に対する免疫応答に関して評価した。図５Ａは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養した脾細胞のＣＤ６９発現を示す（隣の棒グラフで定量−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す）。図５Ｂは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（右のパネル）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（左のパネル）と共に培養したＴ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＦＮγ×ＴＮＦα）を示す。図５Ｃは、０（青）、１（緑）、２（黄）、３（橙）、又は４（赤）種類のＴｈ１関連分子（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、及び／又はグランザイムＢ）を発現することが判明したＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。図５Ｄは、２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）と共に培養した後のＣＤ８＋Ｔ細胞によるグランザイムＢ発現を示す（隣の棒グラフで定量−*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す）。図５Ｅは、表面脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。図５Ｆは、２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞（青）又は２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞（赤）と共に培養したＴ細胞の細胞傷害性を示す。
【００７０】
［００１４３］  よって、アンドロゲン除去は、アンドロゲン受容体発現を増強し、前立腺腫瘍細胞にＡＲ特異的Ｔ細胞に対して増強した感受性を示させる。
【００７１】
実施例２
ＡＲ−ＬＢＤをコードするＤＮＡワクチンとアンドロゲン除去療法との組合せを評価する第Ｉ相臨床試験
［００１４４］  図６Ａは、臨床試験を示す。最近（１〜６か月以内）アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）を開始した転移性前立腺癌を有する男性を、ＡＲ  ＬＢＤ（ｐＴＶＧ−ＡＲ）をコードするＤＮＡワクチンの安全性及び免疫原性を評価する臨床試験に登録する。この臨床試験は、ＡＤＴとｐＴＶＧ−ＡＲを組み合わせることによりＡＤＴに対する抵抗性（ＡＲの過剰発現）の最も一般的な機構の１つを標的化することを利用し、理想的には進行（青い破線）から去勢抵抗性疾患（ＣＲＰＣ）までの時間の遅延をもたらそうとするものである。図６Ｂは、本試験の種々のＡＲＭＳを示す。患者は、単独又はＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて、６回の隔週の免疫誘導とその後の年４回のブースターか、又は１０週間毎の２回の隔週の免疫誘導かのいずれかを受ける。免疫誘導は１８か月又は疾患進行まで続ける。主要評価項目は安全性及びＡＲＬＢＤ特異的免疫性である。本臨床試験の第二の目的には、どの免疫誘導計画が長命なＡＲＬＢＤ特異的Ｔ細胞応答を最も惹起できるかを評価すること、免疫応答を生じるＧＭ−ＣＳＦの効果、並びにＰＳＡ進行までの中央時間及び１８か月ＰＳＡ無進行生存率を決定することが含まれる。
【００７２】
実施例３
［００１４５］ＡＲ過剰発現はＡＤ療法後のヒト及びマウス前立腺組織に見られ、ＡＲ特異的Ｔ細胞によるそれらの認識を増強する。
［００１４６］  アンドロゲン除去２２Ｒｖ１ヒト前立腺癌細胞及び去勢抵抗性ＭｙｃＣａＰマウス前立腺癌細胞は、ＡＤＴ処置後にＡＲ発現の増強を示す（図７Ａ及び７Ｂ）。本発明者らはまた、ＧｎＲＨ拮抗薬デガレリクスを用いた化学的去勢が腫瘍においてＡＲ発現の増強をもたらしたことから、このことがｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭｙｃＣａＰ前立腺癌モデルにおいても生じることを示した（図７Ｃ）。Ｔ細胞はアンドロゲン除去腫瘍細胞と共に培養した際に、より高いレベルの活性化、サイトカイン発現、及び細胞傷害性を示すので、このＡＲ発現の増強はまた、これらの腫瘍細胞をＡＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によってより良く認識されるようにした（図７Ｄ）。
【００７３】
［００１４７］  簡単に述べれば、富アンドロゲン（ＦＣＳ）条件若しくは除去（ＣＳＳ）条件で培養したヒト２２Ｒｖ１前立腺癌細胞（図７Ａ）、又は非処置マウス（ＭｙｃＣａＰ／ＡＳ）若しくは去勢（ＭｙｃＣａＰ／ＣＲ）マウスで連続的に継代したマウスＭｙｃＣａＰ細胞（図７Ｂ）を採取し、ｑＰＣＲ（左のパネル）、ＥＬＩＳＡ（中央のパネル）、及び細胞内染色（ＩＣＳ、右のパネル）によりＡＲ発現に関して分析した。図７Ｃ、ＦＶＢマウスをＭｙｃＣａＰ／ＡＳ腫瘍細胞及び所与のデガレリクスで刺激するか、又は偽処置とした。成長の時点で、腫瘍を採取し、細胞内フローサイトメトリーによりＡＲ発現に関して分析した（ＩｇＧ又はＡＲ細胞内抗体で染色したサンプルを用いたヒストグラム例；右のパネルで定量）。図７Ｄ、ＡＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞又は２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞と共に培養し、ＣＤ６９発現（左のパネル）、ＩＦＮγ及びＴＮＦαサイトカイン発現（中央のパネル）、及び細胞傷害性（右のパネル）によりＴ細胞活性化に関して評価した。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００７４】
実施例４
［００１４８］ＡＲに向けられた免疫誘導を伴うＡＤは抗腫瘍免疫応答を増強し、腫瘍再発を遅延する
［００１４９］  本実施例は、ＡＤとＡＲに向けられた免疫誘導の組合せは抗腫瘍免疫応答を増強することを示す。デガレリクス（ＡＤＴ処置）で処置した後にｐＴＶＧ−ＡＲ  ＤＮＡワクチンにて１週間隔で免疫誘導したＭｙｃＣａＰ担癌ＦＶＢマウスは、対照に比べて、アンドロゲン除去腫瘍細胞に対する免疫応答の増強及び前立腺癌の再成長の遅延を示した（図８）。簡単に述べれば、雄ＦＶＢマウス（ｎ＝８）にＭｙｃＣａＰ腫瘍を移植し、デガレリクスで処置し（又は偽処置）、ｐＴＶＧ−ＡＲ又は対照ｐＴＶＧ４で毎週免疫誘導を行った。図８Ａ、脾細胞を採取し、細胞内サイトカイン染色によりＭｙｃＣａＰ／ＣＲ腫瘍細胞に対する免疫応答に関して分析し（左のパネル）、ＡＲペプチドで刺激した、ｐＴＶＧ−ＡＲ免疫誘導マウス由来脾細胞の、ＭｙｃＣａｐ／ＡＳ腫瘍細胞とＭｙｃＣａｐ／ＣＲ腫瘍細胞を溶解する能力を測定した（右のパネル）。図８Ｂは、腫瘍体積を追跡したマウスを示す。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。図８Ｃは、対照（偽処置）、デガレリクス＋ｐＴＶＧ４及びデガレリクス＋ｐＴＶＧ−ＡＲの刺激後の腫瘍体積を示す。
【００７５】
実施例５
［００１５０］アンドロゲン除去後の前立腺癌細胞におけるアンドロゲン受容体発現の増強はアンドロゲン受容体特異的Ｔ細胞による認識を増強する
［００１５１］  本実施例はここでも、アンドロゲン除去がｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト及びマウス前立腺腫瘍細胞におけるＡＲ発現を増強することを示し、これは時間が経っても持続した。ＡＲ発現の増強は、ＡＲ特異的Ｔ細胞による認識及び細胞溶解活性の増強に関連していた。更に、ＡＤＴとＡＲのリガンド結合ドメインをコードするＤＮＡワクチンを用いたワクチン接種との組合せは、２つのマウス前立腺癌モデル（Ｍｙｃ−ＣａＰ及び前立腺特異的ＰＴＥＮ欠損マウス）において腫瘍体積及び去勢抵抗性前立腺腫瘍の出現の遅延により測定されるような抗腫瘍応答の改善をもたらした。このデータは、ＡＤＴとＡＲに向けられる免疫療法とを組み合わせることの、ＡＤＴと抵抗性の主要な機構であるＡＲの過剰発現を特異的に標的とすることによる他の免疫療法アプローチとを組み合わせることに優る利点を裏づける。
【００７６】
［００１５２］実施例５の材料及び方法
マウス及び細胞株
［００１５３］  ヒト前立腺癌細胞をＡＴＣＣから入手し、２００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。細胞密度及びマイコプラズマ検査は、ＤＤＣメディカル（フェアフィールド、ＯＨ）により確認した。Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞又はＭｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ細胞（元はチャールズ・ソーヤー氏により作出されたＭｙｃ−ＣａＰ親株のアンドロゲン感受性変異体及び去勢抵抗性変異体）及び培養条件は従前に記載されている（２２）。ヒト及びマウスの両細胞株は、富アンドロゲン条件又はアンドロゲン除去条件用の１０％完全ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）又はチャコール処理済み血清（ＣＳＳ）のいずれかで維持した。
【００７７】
［００１５４］  Ｍｙｃ−ＣａＰ腫瘍細胞を用いた腫瘍試験は、野生型雄ＦＶＢマウス（ジャクソン研究所、バー・ハーバー、ＭＥ）で行った。ＰＴＥＮノックアウトマウスは、Ｐｔｅｎ  ｆｌｏｘｅｄ（ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ）動物とＰｒｏｂａｓｉｎ−Ｃｒｅ（ＰＢ−Ｃｒｅ４＋）を従前に記載されているように（２３）交雑させることにより作出した。マウスをｆｌｏｘｅｄ又は野生型ＰＴＥＮ対立遺伝子に関してＰＣＲによりスクリーニングした（フォワードプライマー：ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＧＣ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＧ；リバースプライマー：ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＡＧＡ  ＴＧＣ）及びＰＢ−Ｃｒｅ導入遺伝子（フォワードプライマー：ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＧＧＧ  ＡＣＡ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  Ｇ；リバースプライマー：ＣＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＣＡＴ  ＣＧＡ  ＣＣ）。マウスは無菌条件下で維持し、全ての試験はＩＡＣＵＣにより承認されたプロトコールの下で行った。
【００７８】
腫瘍試験
［００１５５］  ＦＶＢマウスに１０６個のＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ腫瘍細胞を皮下接種し、触知可能な腫瘍の存在を毎日追跡した。ひと度、腫瘍が触知可能となれば、マウスに４週間毎にデガレリクス（２５ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクル偽処置のいずれかで皮下処置を行った。免疫誘導試験のため、デガレリクス処置動物を無作為化し、デガレリクス受容の１日後に開始する１００μｇ  ｐＴＶＧ４又はｐＴＶＧ−ＡＲで１週間毎に免疫誘導を行った。腫瘍成長を少なくとも３回毎週測定し、本発明者らが公開しているように（１９）腫瘍体積を計算した。安楽死の時点で、腫瘍及び脾臓を採取した。ＰＴＥＮ欠損マウスを用いた試験のために、動物に２０週齢（＋／−２週）の時点でデガレリクス（２５ｍｇ／ｋｇ）投与を始め、その後、ＡＤＴの１日後に開始する１００μｇ  ｐＴＶＧ４又はｐＴＶＧ−ＡＲによる隔週の免疫誘導を行った。動物を組織採取前に４０週齢（＋／−２週）まで処置した。
【００７９】
アンドロゲン受容体酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
［００１５６］  培養前立腺癌細胞を採取し、細胞溶解液を調製し、ＰａｔｈＳｃａｎアンドロゲン受容体ＥＬＩＳＡを製造者の説明書（セルシグナリングテクノロジー社、ダンヴァーズ、ＭＡ）に従って用い、タンパク質発現を分析した。簡単に述べれば、マイクロウェルストリップ（抗ＡＲ抗体でプレコーティング）を３反復にて２ｍｇ／ｍＬタンパク質溶解液でコーティングし、一晩インキュベートした。ＡＲを検出抗体、次いで、ＨＲＰ結合二次抗体及びＴＭＢ基質の現像を用いて検出した。精製ＡＲ  ＬＢＤタンパク質（インビトロジェン社、カールズバッド、ＣＡ）を用いて標準曲線を作成し、細胞溶解液１ｍｇ当たりの相対ＡＲ濃度を得るために使用した。
【００８０】
フローサイトメトリー
［００１５７］  アンドロゲン受容体細胞内染色に関して、細胞は、解離した腫瘍サンプルに対してＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ＧｈｏｓｔＤｙｅ７８０  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｓｔａｉｎ（トンボバイオサイエンス社、サンディエゴ、ＣＡ）及びＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１、トンボバイオサイエンス社）で染色し、アンドロゲン受容体リガンド結合ドメインに対する抗体（クローンＥＰ６７０Ｙ、アブカム社、ケンブリッジ、英国）及びアミノ末端ドメインに対する抗体（クローンＤ６Ｆ１１、セルシグナリングテクノロジー社）、又はアイソタイプ対照で細胞内染色した。ＨＬＡ−Ａ２及びＰＤ−Ｌ１発現に関しては、細胞をＨＬＡ−ＡＢＣ抗体（クローンＷ６／３２、イーバイオサイエンス社、サンディエゴ、ＣＡ）及びＰＤ−Ｌ１抗体（クローンＭＩＨ−５、イーバイオサイエンス社）で染色した。
【００８１】
アンドロゲン受容体定量的リアルタイムＰＣＲ
［００１５８］  前立腺腫瘍細胞（細胞株又は解離した腫瘍）を採取し、ＲＮＡを調製し（ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ精製システム；キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）、ｃＤＮＡを合成するために使用し（ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット；バイオラッド社、ハーキュリーズ、ＣＡ）、ＳｓｏＦａｓｔ  ｑＰＣＲ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオラッド社）を用いるｑＰＣＲ反応に鋳型として使用した。反応はアニーリング温度６０℃及び４０サイクルを用いるＢｉｏ−Ｒａｄ  ＭｙｉＱサーモサイクラーを使用して行った。プライマーセット：
・全長ヒトアンドロゲン受容体
フォワード：ＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＧＡＴＣＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣ配列番号７；
リバース：ＴＴＧＧＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＡＧＡＧＡＴ配列番号８、
・ＡＲ−Ｖ７
フォワード：ＣＣＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＡＴＧＡＡＧＣ配列番号１３；
リバース：ＴＴＴＧＡＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＣＴ配列番号１４、
・全長マウスＡＲ
フォワード：ＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧ配列番号１７；
リバース：ＡＴＣＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡ配列番号１８、
・マウスＡＲ−Ｖ２
フォワード：ＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧ配列番号１７；
リバース：ＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣ配列番号１９、
・マウスＡＲ−Ｖ４
フォワード：ＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＣＣＡＴＣＧ配列番号１７；
リバース：ＡＡＧＴＧＧＧＧＡＡＣＣＡＣＡＧＣＡＴ配列番号２０、及び
・β−アクチン
フォワード：ＴＣＡＴＧＡＡＧＴＧＴＧＡＣＧＴＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴ配列番号１５；
リバース：ＣＴＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧ配列番号１６）（２４−２６）。
結果は、公開されているように（２６）、対照遺伝子としてのβ−アクチンに対して２−ΔＣｔ法により分析した。
【００８２】
免疫学的アッセイ
［００１５９］  免疫応答を試験するために、ヒトＴ細胞株又は脾細胞を従前に記載されているように（２０）採取し、細胞内サイトカイン染色アッセイ及び細胞傷害性アッセイに使用した。細胞内サイトカイン染色のために、細胞を培地単独、ＡＲＬＢＤペプチドプール（１１残基が重複し、ＡＲ  ＬＢＤの全配列にわたる１５マーペプチドのプール；ＬｉｆｅＴｅｉｎ社、サマセット、ＮＪ）、腫瘍細胞、又はＰＭＡ／イオノマイシン陽性対照で１８時間刺激した。細胞をフィクサブルライブ／デッドマーカー（トンボバイオサイエンス社）並びに細胞外及び細胞内抗体を用いて染色した。ヒト抗体：ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８、イーバイオサイエンス社）、ＣＤ６９（クローンＦＮ５０、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ１０７ａ（クローンＨ４−Ａ３、ＢＤバイオサイエンス社）、ＩＬ２（クローンＭＱ１−１７Ｈ１２、イーバイオサイエンス社）、ＩＦＮγ（クローン４Ｓ．Ｂ３、バイオレジェンド社、サンディエゴ、ＣＡ）、ＴＮＦα（クローンＭＡｂ１１、ＢＤバイオサイエンス社）、ＧｒＢ（クローンＧＢ１１、ＢＤバイオサイエンス社）。マウス抗体：ＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ８（クローン５３−６．７、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ４５（クローン３０−Ｆ１１、ＢＤバイオサイエンス社）、ＣＤ６９（クローンＨ１．２Ｆ３、イーバイオサイエンス社）、ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２、ＢＤバイオサイエンス社）、ＴＮＦα（クローンＭＰ６−ＸＴ２２、ＢＤバイオサイエンス社）。次に、細胞を、ＬＳＲ  ＩＩ又はＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて分析し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞又はＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞にゲートを設定し、この集団のＣＤ６９、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、及び／又はＧｒＢの発現を分析することによりイベントを分析した。細胞傷害性アッセイは従前に記載されているように（２０）行った。簡単に述べれば、脾細胞をＡＲＬＢＤペプチドプールで５日間再刺激し、腫瘍細胞株と共に培養し、その後、ＬＤＨ放出を、従前に公開されているように（１９）、Ｃｙｔｏｔｏｘ  ９６アッセイキット（プロメガ社、マディソン、ＷＩ）を用いて計算した。
【００８３】
免疫組織化学
［００１６０］  パラフィン包埋ＭｙｃＣａＰ腫瘍を、従前に記載されているように（２０）免疫組織化学によりＣＤ３発現に関して染色した。切片を一次抗体（ＣＤ３：クローンＳＰ７、アブカム社）で染色し、ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（アジレントテクノロジー社、サンタクララ、ＣＡ）及びＭｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ  ＤＡＢ  ｍｅｔａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、ウォルサム、ＭＡ）を用いて現像し、オリンパスＢＸ５１蛍光顕微鏡（オリンパス社、ロンバード、ＩＬ）をＳＰＯＴ  ＲＴ分析ソフトウエア（スポットイメージングソリューションズ社、スターリングハイツ、ＭＩ）と組み合わせて用いて画像化し、盲検検査員により動物当たり腫瘍切片当たり少なくとも５視野を計数する１０倍視野当たりのＣＤ３＋細胞の頻度により定量した。
【００８４】
陽電子放射断層撮影法／コンピューター断層撮影法イメージング
［００１６１］  全てのマウスに５〜８ＭＢｑの１２４Ｉ−ＣＬＲ１４０４を静脈内投与し、次に、注射９６時間後にマイクロ陽電子放射断層撮影法／コンピューター断層撮影法（ＰＥＴ／ＣＴ）スキャンを行った。スキャン中、マウスは１Ｌ／分の純酸素を混合した２％イソフルラン吸入ガスで麻酔した（２７）。マウスを腹臥位でＳｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｖｅｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴ（シーメンスメディカルソリューションズ社、ノックスヴィル、ＴＮ）を用いてスキャンした。十分なシグナル／ノイズを得るためにＰＥＴスキャンに関してマウス当たり４０００万カウントを収集した。ＰＥＴデータは、１つの静的フレームにヒストグラム化した後、三次元のサブセット化による期待値最大化法（ＯＳＥＭ）を用いて再構築し、次いで、最大事後アルゴリズムを行い、ＮＥＭＡ  ＮＵ  ４画質パラメーター（２８）に基づいてＣＴ減衰及び散乱補正を適用した。
【００８５】
［００１６２］  全てのＰＥＴ及びＣＴ画像を同時登録した。画像データは、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｉｎｖｅｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ（シーメンスメディカルソリューションズ社）により提供されている遺伝子分析ツールを用いて分析した。データは各動物の減衰補正注射放射能に応じて等しくウインドウ化／平準化及びスケール化した。（Data were identically window/leveled and scaled according to each animal’s decay corrected injection activity.）これらのＰＥＴ及びＣＴ画像に基づき、参照関心領域（ＶＯＩ）を各腫瘍の周囲に描き、抽出された背景組織ＶＯＩを筋肉及び肝臓上に描いた。参照腫瘍ＶＯＩ内に限界があるＶＯＩを最大シグナルの６０パーセントより大きい全てのシグナルを含むように補正した。データは、全ての組織密度が水に類似する（１ｇ／ｍＬ）と仮定して、組織ＶＯＩの質量により正規化した注射用量パーセント（％ＩＤ／ｇ組織）として報告した。次に、処置前群と処置後群内でデータの平均をとり、背景組織値に対して正規化した。
【００８６】
［００１６３］結果
［００１６４］アンドロゲン除去は、アンドロゲン受容体発現を増強し、アンドロゲン除去前立腺腫瘍細胞株に対するＡＲ特異的Ｔ細胞応答を高める
［００１６５］  本実施例では、６種類の前立腺細胞株（２種の不死化前立腺上皮細胞株、２種のアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株、及び２種のアンドロゲン依存性前立腺癌細胞株）のパネルを短期間（１〜７日）又は長期間（６か月を超える）、アンドロゲン除去培地で培養し、ＡＲ発現を分析した。アンドロゲン除去は、定量的ＥＬＩＳＡにより（図１１Ａ）、並びにリガンド結合ドメインとアミノ末端ドメインの両方に対する抗体を用いた細胞内染色により（図１１Ｂ、図１１Ｃ及び１１ＤにそれぞれＡＲ発現の振幅及び頻度を定量）、アンドロゲン依存性前立腺腫瘍細胞においてＡＲタンパク質発現に増強をもたらすことが判明した。２２Ｒｖ１細胞（ＬＢＤ欠損スプライス変異体であるＡＲ−Ｖ７を発現することが知られる）の分析は、アンドロゲン除去は全長ＡＲに安定に増加する発現並びにＡＲ−Ｖ７に一過性の増加をもたらし（図１１Ｅ）、ＡＲ−Ｖ１、ＡＲ５６７ｅｓ、又は他のスプライス変異体に検出可能な発現は無いことを示した。しかしながら、ＡＲ−Ｖ７の発現は、全長ＡＲ転写産物に比べて有意に低いレベルであった。
【００８７】
［００１６６］  アンドロゲン除去後のこのＡＲ発現の増強がこれらの腫瘍細胞に対してＡＲ特異的Ｔ細胞のエフェクター機能の増大をもたらしたかどうかを決定するために、２２Ｒｖ１細胞をまず、モデルＭＨＣ分子及びＡＲ拘束エピトープが従前に同定されているもの（１９）としてのＨＬＡ−Ａ２を発現するようにトランスフェクトした。この細胞株を作出した後に、親細胞株でアンドロゲン除去の後にＡＲタンパク質及びＲＮＡ発現の増強が見られることを、これらのＨＬＡ−Ａ２発現株で確認した（図１１Ｆ〜Ｇ）。次に、これらの２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞及び２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２拘束ＡＲ８０５エピトープに特異的なＴ細胞株と共にインキュベートした。２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞株と共に培養したＴ細胞は、富アンドロゲン条件下で培養された２２Ｒｖ１細胞で刺激されたＴ細胞に比べて、より高レベルのＴ細胞活性化（ＣＤ６９発現により測定される−図１２Ａ）、並びに多機能サイトカイン発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞（図１２Ｃ）を含め、Ｔｈ１サイトカインの発現の増強（図１２Ｂ）を示すことが示された。２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞との共培養はまた、２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞との共培養に比べて、グランザイムＢ（図１２Ｄ）、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａ（図１２Ｅ）のより高い発現、並びに細胞傷害性の増強（図１２Ｆ）ももたらした。別のＨＬＡ−Ａ２拘束エピトープＡＲ８１１で直接免疫誘導したＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウス由来の脾細胞を用いた同様の試験は、アンドロゲン除去ＨＬＡ−Ａ２発現２２Ｒｖ１細胞と共に培養した場合のサイトカイン発現、Ｔ細胞活性化、及び細胞傷害性の増強という点でこれらの結果を再現した（図１２Ｇ）。２２Ｒｖ１／ＣＳＳ細胞及び２２Ｒｖ１／ＦＣＳ細胞はＨＬＡ−Ａ２及びＰＤ−Ｌ１の両方を同一レベルで発現したことから（図１１Ｈ−Ｉ）、Ｔ細胞認識及び細胞傷害性におけるこれらの差異は、おそらくＭＨＣクラスＩ発現の変化によるものでもＰＤ−Ｌ１発現の変化によるものでも無かった。
【００８８】
［００１６７］アンドロゲン除去はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＭｙｃ−ＣａＰ腫瘍細胞におけるＡＲ発現を増強する
［００１６８］  本発明者らは、腫瘍の発生及び進行に対するＡＲ標的ワクチンの影響を試験するために、ＴＲＡＭＰマウスモデルを従前に使用していた（２０）。しかしながら、ＴＲＡＭＰマウス、及び多くの他のマウス前立腺腫瘍モデルのアンドロゲン除去はＡＲの損失及び神経内分泌腫瘍の発生をもたらすことが従前に報告されている（２９）。そのため、本発明者らは、アンドロゲン除去後にもＡＲを発現し続けるヒト前立腺癌により典型的な他のモデルを評価しようとした。１つのこのようなモデルは、去勢後にＡＲ発現を維持するという点でヒト疾患を模倣するＭｙｃ−ＣａＰ細胞株である（２２）。このことを確認するために、アンドロゲン感受性Ｍｙｃ−ＣａＰ細胞（非処置ＦＶＢマウスから作出されたＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ）、及び去勢抵抗性Ｍｙｃ−ＣａＰ細胞（去勢マウスからのＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞株の連続継代から作出されたＭｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ）を試験した。ヒト前立腺癌細胞株において見られたものと同様に、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ細胞株は、定量的ＥＬＩＳＡ（図１３Ａ）及び細胞内染色の両方により、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞株に比べて全長ＡＲ発現を増強したことが判明した（図１３Ｂ）。ＲＮＡ転写産物の分析は、マウスＡＲスプライス変異体ｍＡＲ−Ｖ２及びｍＡＲ−Ｖ４の増加を示したが、これらのスプライス変異体は同様に、発現が全長ＡＲの数分の１であった（図１３Ｃ）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡＲの発現を試験するために、ＦＶＢマウスにＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞を接種した後、偽処置又はＧｎＲＨ拮抗薬（デガレリクス）の投与による去勢を行った。動物を腫瘍成長に関して追跡し（図１３Ｄ）、再発腫瘍を採取し、ＣＤ４５−細胞のＡＲ発現を細胞内染色により分析した。アンドロゲン除去後に再発した腫瘍は、ＡＲの検出可能な発現を有するＣＤ４５−細胞の頻度の点でもこれらの細胞内のＡＲ発現の振幅の点でも、ＡＲ発現を増強したことが判明した（図１３Ｅ）。
【００８９】
［００１６９］  ｐＴＶＧ−ＡＲによる免疫誘導はアンドロゲン除去後の去勢抵抗性前立腺腫瘍の成長を遅延させる
［００１７０］  本実施例はまた、アンドロゲン除去とＡＲ標的ワクチン接種の組合せが、ＡＲを過剰発現する細胞を特異的に標的とすることにより、去勢抵抗性腫瘍の成長を遅延させることを示す。マウスにＭｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ腫瘍を移植し、定着腫瘍を有するマウスに偽処置又はデガレリクスを与えた。次に、デガレリクスで処置したマウスを無作為化し、ＡＲ  ＬＢＤをコードするＤＮＡワクチン（ｐＴＶＧ−ＡＲ）、又はエンプティーベクター対照（ｐＴＶＧ４）で免疫誘導を行った。デガレリクスとｐＴＶＧ−ＡＲの組合せ処置は、デガレリクス処置及び対照ワクチンに比べて腫瘍成長を遅延することが判明した（図１４Ａ〜Ｂ）。加えて、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳ細胞株又はＭｙｃ−ＣａＰ／ＣＲ細胞株に対する免疫応答の証拠に関して動物を評価したところ、ｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導した動物は、サイトカイン発現（図１４Ｃ）の点でも細胞傷害性（図１４Ｄ）の点でも、去勢抵抗性細胞株に対する免疫応答を増強したことが判明した。並行試験で、本発明者らは、Ｍｙｃ−ＣａＰ／ＡＳを保持するマウスをｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導すると腫瘍浸潤ＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度が上昇し、これはワクチン接種とデガレリクス処置とを組み合わせた場合に更に増大したことを見出した（図１４Ｅ）。
【００９０】
［００１７１］アンドロゲン除去はＰＴＥＮ欠損腫瘍におけるＡＲ発現を増強し、ｐＴＶＧ−ＡＲによる免疫誘導とＡＤＴの組合せは去勢抵抗性腫瘍の成長を低減した
［００１７２］  ヒト前立腺癌のさらなる関連モデルとして、本実施例では、Ｃｒｅリコンビナーゼの前立腺特異的発現がＰＴＥＮ腫瘍抑制の欠失と自発性前立腺腫瘍の形成を駆動するＰｂＣｒｅ  ＰＴＥＮｆｌ／ｆｌマウスを使用した。ＰＴＥＮ−ＣａＰ８細胞株（これらの自発性腫瘍の１つに由来する）を富アンドロゲン培地又はアンドロゲン除去培地で同様に培養した。図１５Ａ〜Ｂに示されるように、アンドロゲン除去は、上記のヒト前立腺癌細胞株及びＭｙｃ−ＣａＰ細胞株と同様に、ＡＲタンパク質の発現に有意な増強をもたらした。次に、２０週齢のＰｂＣｒｅ＋ＰＴＥＮｆｌ／ｆｌマウスに偽処置又はデガレリクスとｐＴＶＧ−ＡＲワクチン若しくはベクター対照の組合せのいずれかを与えた。非侵襲的に腫瘍成長をモニタリングするため、並びに処置前に動物を無作為化するために、本発明者らは、新規な放射性トレーサー１２４Ｉ−ＣＬＲ１４０４、すなわち、これまでに悪性モデルの＞９５％で選択的腫瘍取り込みを示している（３０）放射性ヨウ化アルキルホスホコリン（ＡＰＣ）類似体を用いるｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴイメージングを使用した。動物に１２４Ｉ−ＣＬＲ１４０４を静脈内投与した後、療法の開始及び完了の前１週間以内にＰＥＴ／ＣＴスキャンを行い（図１５Ｃ）、イメージング結果を平均及び最大腫瘍取り込みに関して分析した。腫瘍前処置の分析は、平均腫瘍取り込みと最大腫瘍取り込みの間に差異を示さなかった（図１５Ｄ〜Ｅ）。大きな腫瘍を有する一部の動物は最後のイメージングセッションの前に死亡し、ゆえに全ての動物が処置後イメージングを受けたわけではなかったが、それにもかかわらず、それぞれ図１５Ｆ及び図１５Ｇに示されるように、アンドロゲン除去は１２４Ｉ−ＣＬＲ１４０４平均腫瘍取り込みと最大腫瘍取り込みの低下をもたらすことが示された。ＡＤＴ及び対照ワクチンを受容した動物とＡＤＴ及びＡＲ標的化ワクチンを受容した動物の間で処置後、％ＩＤ／ｇｍｅａｎ又は％ＩＤ／ｇｍａｘに有意差は検出されなかった。しかしながら、剖検中に測定されたように、デガレリクス及びｐＴＶＧ−ＡＲで処置された動物は、尿生殖器複合体重量により決定されるように、デガレリクス及びｐＴＶＧ４を受容した動物に比べて有意に小さい腫瘍体積を有した（図１５Ｈ）。
【００９１】
［００１７３］考察
［００１７４］  本実施例は、アンドロゲン除去はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて時間が経っても持続する全長ＡＲ発現の増強をもたらすこと、及びこのＡＲ発現の増強はこれらの細胞がＡＲ特異的Ｔ細胞のより良い標的となることと関連することを示す。更に、ＡＲ  ＬＢＤをコードするＤＮＡワクチンは、去勢抵抗性前立腺癌細胞を優先的に認識及び溶解した免疫応答を増強し、ＡＤＴと組み合わせた場合に去勢抵抗性疾患の再発を遅延した。ＡＲを標的とするワクチンは、特にＡＤＴと組み合わせた場合に、去勢抵抗性腫瘍成長を駆動する抵抗性の主要な機構を標的とすることにより、他の抗原特異的ワクチンよりも好ましいものとなり得る。
【００９２】
［００１７５］  要するに、本実施例は、ＡＤＴ後の前立腺癌細胞におけるＡＲ発現の増強がＡＲ特異的Ｔ細胞による認識及び溶解の増強をもたらすことを示す。ＡＤＴとＡＲ特異的免疫誘導の組合せはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗腫瘍Ｔ細胞免疫を増強すると共に、去勢抵抗性腫瘍の再発を遅延した。これらの試験は、第Ｉ相臨床試験（ＮＣＴ０２４１１７８６）で評価されているアプローチとしての、ＡＤＴとＡＲ標的免疫誘導を組み合わせることの根拠を提供する。
【００９３】
実施例６
［００１７６］免疫誘導は腫瘍においてＰＤ−Ｌ１発現を惹起し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断はＤＮＡワクチン接種の抗腫瘍有効性を高めることができる。
［００１７７］  種々の腫瘍抗原系を用い、本発明者らは、ＤＮＡワクチン接種は、ＩＦＮγを分泌する腫瘍特異的Ｔ細胞が惹起される結果として腫瘍においてＰＤ−Ｌ１発現を惹起できることを見出した。特に、本発明者らは、モデル抗原を発現する腫瘍はその抗原をコードするＤＮＡワクチンでの免疫誘導後にＰＤ−Ｌ１発現の増強を示したことを報告している（Ｒｅｋｏｓｋｅ，  Ｂ．Ｔ．，  Ｈ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．Ｍ．Ｏｌｓｏｎ，  Ｂ．Ｂ．Ｍａｒｉｃｑｕｅ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．ＭｃＮｅｅｌ．（２０１５）．“ＰＤ−１  ｏｒ  ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＳＳＸ２  Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．３：９４６−５５）。免疫誘導がより高いＰＤ−１発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を惹起するように改変された場合、これはより劣った抗腫瘍応答をもたらした。ワクチン接種と抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置を組み合わせると、一部の動物においてより大きい抗腫瘍応答及び腫瘍の根絶がもたらされた（Ｒｅｋｏｓｋｅ，  Ｂ．Ｔ．，  Ｈ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｂ．Ｍ．Ｏｌｓｏｎ，  Ｂ．Ｂ．Ｍａｒｉｃｑｕｅ，  ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．ＭｃＮｅｅｌ．（２０１５）．“ＰＤ−１  ｏｒ  ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＳＳＸ２  Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．３：９４６−５５）。本発明者らは最近、これがまた前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）をコードするＤＮＡワクチンで処置した進行前立腺癌を有する患者から採取した低温保存血液サンプルを用いたヒト免疫誘導後に生じ得ることを確認した。
【００９４】
［００１７８］  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ法を用い、本発明者らは、ＰＤ−１遮断と組み合わせた場合にＰＡＰに対する免疫応答が検出及び／又は増強されたことを見出した（図９Ａ、Ｂ）。更に、本発明者らは、ＤＮＡワクチン接種後に循環腫瘍細胞にＰＤ−Ｌ１の発現の増強を検出し、本発明者らは、より高い発現が持続的な抗原特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞免疫応答の生成と相関することを見出した（図９Ｃ）。本発明者らは、同じＰＡＰ抗原を標的とする前立腺癌に対するＦＤＡ承認ワクチンであるシプロイセル−Ｔで処置した患者由来の血液サンプルにおいて同様の結果を認めた（データは示されていない）。考え合わせると、これらのデータは、抗腫瘍ワクチンとＰＤ−１経路阻害剤を組み合わせることを裏づけるための根拠を与える。簡単に述べれば、図９Ａは、ＰＡＰ標的ワクチンで従前に免疫誘導した患者由来のＰＢＭＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで７２時間、ＰＤ−１−遮断抗体（又はＩｇＧ対照）の存在下でＰＡＰと共に培養し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮγ（左のパネル）又はグランザイムＢ（右のパネル）分泌に関して測定したことを示す。図９Ｂは、免疫誘導後に患者から取得したＰＢＭＣをＰＡＰタンパク質及びＰＤ−１遮断抗体（又はＩｇＧ対照）と共にＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの足蹠に注射し、２４時間後、足蹠の腫脹を測定したことを示す。図９Ｃは、ＰＡＰを標的とするＤＮＡワクチンで免疫誘導した後の持続的なＰＡＰ特異的Ｔｈ１バイアス免疫応答（Ｒ）を有する患者と不応答者（ＮＲ）に由来する循環腫瘍細胞でＰＤ−Ｌ１発現を測定したことを示す。処置前サンプルに対する処置後サンプルのＰＤ−Ｌ１  ＭＦＩ比を示す。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００９５】
［００１７９］  より最近の予備的データも、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の標的化とＡＲ標的ワクチンの組合せは、この腫瘍媒介型の免疫抑制の手段を回避するための理論的組合せであることを示唆する。ＡＤで処置し、且つ、ｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導したＭｙｃＣａＰ担癌動物では（図８の通り）、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＰＤ−１発現を上昇させたことが判明した（図１０Ａ）。加えて、それは、他のモデルでも免疫誘導後の抗原特異的免疫応答の生成の後に見られ、一部の再発腫瘍はＰＤ−Ｌ１発現を上昇させた（図１０Ｂ）。ＡＲ標的化免疫誘導をＰＤ−１遮断抗体と組み合わせた場合、この処置はｐＴＶＧ−ＡＲ単独での免疫誘導に比べて腫瘍成長を有意に遅延した（図１０Ｃ）。更に、ＡＤＴとＡＲに向けられる免疫誘導及びＰＤ−１遮断を組み合わせると、腫瘍成長を更に遅延した（図１０Ｄ）。考え合わせると、これらの所見は、ＰＤ−１経路阻害剤はＡＤＴとＡＲに向けられる免疫誘導の組合せに対する抵抗性を標的とするために有効な手段であろうこと、及び前立腺癌の致死的な去勢抵抗性の形成を回避し得る（又は有意に遅延し得る）ことを示唆する。
【００９６】
［００１８０］  簡単に述べれば、ＦＶＢマウスにＭｙｃＣａＰ腫瘍細胞を皮下移植し、翌日にデガレリクスで処置し、その翌日にｐＴＶＧ４（ベクター対照）又はｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導した。腫瘍成長時に、動物を脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１発現（図１０Ａ）及びＣＤ４５−腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現（図１０Ｂ）に関して分析した。図１０Ｃに関しては、ＦＶＢマウス（ｎ＝５）にＭｙｃＣａＰ腫瘍を移植し、翌日にｐＴＶＧ−ＡＲで免疫誘導し（毎週反復）、去勢を行わず、ワクチン接種後、毎日、ＰＤ−１遮断抗体又は対照で処置し、腫瘍成長を追跡した。図１０Ｄに関しては、ＭｙｃＣａＰ担癌ＦＶＢマウスをデガレリクス、ｐＴＶＧ−ＡＲ、及び抗ＰＤ−１（ｎ＝５）又はＩｇＧ対照  （ｎ＝９）で処置し、腫瘍成長を追跡した。全てのパネルで、*は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００９７】
実施例７
ＡＲ標的化ワクチン接種とアンドロゲン除去及びＴ細胞チェックポイント遮断の組合せを用いた臨床試験計画
［００１８１］  新規に診断された前立腺癌を有する最大５０名の患者で非盲検、無作為化パイロット臨床試験が実施されることになっている。患者は以下の３つの処置群のうち１つに無作為に割り当てられる。
【００９８】
［００１８２］試験目的：  本臨床試験の主要臨床目的は、各試験群の安全性及び病理学的完全奏功率である。主要目的には、新規に診断された前立腺癌を有する患者で組合せアンドロゲン除去単独又はペンブロリズマブを伴った若しくは伴わないｐＴＶＧ−ＡＲ  ＤＮＡワクチンとの組合せの安全性を評価すること、及び根治的前立腺切除の前に組合せアンドロゲン除去（ＬＨＲＨ作動薬、酢酸アビラテロン、及びアパルタミド）で又はペンブロリズマブを伴った若しくは伴わないｐＴＶＧ−ＡＲで処置した前立腺癌を有する患者において病理学的完全奏功率を決定することが含まれる。
【００９９】
［００１８３］  副次的目的には、１年ＰＳＡ無進行生存率を決定すること、ペンブロリズマブを伴った若しくは伴わないｐＴＶＧ−ＡＲによる処置が持続的全身性のＡＲ特異的Ｔｈ１バイアスＴ細胞応答を惹起するかどうかを決定すること、及びペンブロリズマブを伴った若しくは伴わないｐＴＶＧ−ＡＲによる処置が、前立腺組織浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の増強を惹起するかどうかを決定することが含まれる。
【０１００】
［００１８４］  対象集団：  適格対象は、摘出処置として根治的前立腺切除を受けることが予定されている、新規に診断された前立腺癌を有する患者である。対象はＨＬＡ−Ａ２陽性である必要はないが、エピトープ特異的Ｔ細胞分析のための患者を特定するために血清型分類が行われる。本発明者らの施設での従前の臨床試験では、本発明者らは患者の約５０％がＨＬＡ−Ａ２を発現することを見出しており、そのため、患者の約５０％がこれらの分析に有効であると予想する。
【０１０１】
［００１８５］  試験計画：  これは、ペンブロリズマブを伴って若しくは伴わずに与えられるｒｈＧＭ−ＣＳＦアジュバントを伴った、ＡＲをコードするＤＮＡワクチンの免疫学的及び臨床的効果を評価するように設計された無作為化、非盲検、多施設パイロット臨床試験とする。試験群は次のように定義される：
群１：ロイプロリドデポー（又は等価物）２２．５ｍｇ筋肉内注射  １日目、８５日目
酢酸アビラテロン１０００ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して手術前日まで
プレドニゾン５ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して術後１週まで、その後、漸
減
アパルタミド２４０ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して手術前日まで
群２：ロイプロリドデポー（又は等価物）２２．５ｍｇ筋肉内注射  １日目、８５日目
酢酸アビラテロン１０００ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して手術前日まで
プレドニゾン５ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して術後１週まで、その後、漸
減
アパルタミド２４０ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して手術前日まで
ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（２０８μｇ）を伴うｐＴＶＧ−ＡＲ（１００μｇ）皮内投与（ｉ．ｄ．）隔週６回、１日目から開始
群３：ロイプロリドデポー（又は等価物）２２．５ｍｇ筋肉内注射  １日目、８５日目
酢酸アビラテロン１０００ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して手術前日まで
プレドニゾン５ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して術後１週まで、その後、漸
減
アパルタミド２４０ｍｇ  ｐ．ｏ．毎日、１日目に開始して手術前日まで
ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（２０８μｇ）を伴うｐＴＶＧ−ＡＲ（１００μｇ）皮内投与（ｉ．ｄ．）３週間毎８回、１日目に開始
ペンブロリズマブ２ｍｇ／ｋｇ、３０分かけて静脈内投与、３週間毎８回、１日目に開始、各用量はｐＴＶＧ−ＡＲワクチン接種後
【０１０２】
［００１８６］  合計５０名の適格患者（群１は１０名、群２は２０名及び群３は２０名）を無作為化する。全ての対象の有害事象を追跡調査する；有害事象が忍容性限界を超える試験処置によるものであった場合には（≧３３％グレード  ＞２毒性、又は≧１０％グレード  ＞３毒性）、それ以上の登録は止める。
【０１０３】
［００１８７］  効果の測定：  本試験に適格な患者は登録の時点で転移性疾患を有さない。
【０１０４】
病理学的評価：  処置前、前立腺切除の時点で生検により得られた前立腺組織を標準的な臨床病理学的再調査に従って単独の病理学者（Ｄｒ．Ｊｉａｏｔｉ  Ｈｕａｎｇ、ＭＤ  ＰｈＤ又は指名された人）が再検証し、グレードを決定する。前立腺切除時に同定可能な前立腺癌が存在しないことを、病理学的完全奏効を定義するために使用する。
【０１０５】
［００１８８］  血清ＰＳＡ評価：  血清ＰＳＡは、残存／再発疾患の不在下での前立腺切除の後には検出できないと思われる。ゆえに、ＰＳＡ進行は、前立腺切除日の３か月後の任意の時点で検出可能な（臨床検査室の検出下限を超える）ＰＳＡと定義され、少なくとも２週間後の２回目の測定によって確認する。
【０１０６】
［００１８９］  安全性：  処置期間中に来所する度に症状評価のために全ての対象を診察する。検査室分析は、有害事象の証拠に関して定間隔で行う。これらの臨床検査室試験には、全血球計算値、クレアチニン、肝機能検査、ＰＳＡ、血清アルドラーゼ（筋関連毒性評価のため）、及び抗核抗体が含まれる。有害事象は、ＮＣＩ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａの最新版（４．０）によりグレードを決定する。毒性インシデントの数及び重篤度は表形式で記述的に分析する。
【０１０７】
［００１９０］  免疫学的モニタリング：  免疫誘導前、３か月の処置後、前立腺切除時、並びに前立腺切除後３か月、６か月、及び１２か月に、免疫学的モニタリングのために、末梢血採取（最大２１０ｍＬ）又は白血球搬出（５０〜１００ｍＬ）のいずれかにより採血する。ヘパリン処理血から、標準的技術を用いたフィコール−パークでの密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製する。ＰＢＭＣはそのまま分析に使用し、残った材料は採血時に採取した９０％自己血清、又は９０％ウシ胎仔血清、及び１０％ＤＭＳＯを用いて液体窒素中で低温保存する。血清は、レッドトップチューブから調製し、抗体分析のためにアリコートとして−８０℃で保存する。ＩＦＮγ及びグランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析、及び抗原特異的抗体に関するＥＬＩＳＡ検査が主要分析法である。試験する主要抗原は、ＡＲ（試験）、ＰＳＡ（陰性対照）、及び破傷風トキソイド（陽性対照）とする。主要免疫分析は、術後６か月時点で行い、処置前の時点と比較し、免疫応答（主要評価項目）に関して評価される患者については、この時点からの血液（ＰＢＭＣ及び血清）を分析に利用できなければならない。しかしながら、免疫モニタリングは、免疫の動態尺度を評価し、特定の表現型の持続的免疫応答が惹起され、且つ／又は維持されるかどうかを評価するために副次的分析において示されている他の時点でも行われる。アッセイは、サンプル採取（新鮮）の時点で行われてよく、且つ／又は種々の時点で採取された複数の低温保存サンプルからバッチ処理をして一度に行ってもよい。ＡＲ及び他のヒト組織抗原に対するエフェクター及び調節制御性Ｔ細胞応答の他の方法も使用可能である。
【０１０８】
［００１９１］ＡＲ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター免疫の定量的評価  ＡＲ特異的ＩＦＮγ分泌及びグランザイムＢ分泌Ｔ細胞前駆体頻度のＥＬＩＳＰＯＴによる定量：  ＥＬＩＳＰＯＴは、低頻度イベント（ＬＯＤ約１：１００，０００細胞）の分析を可能とし、また、低温保存バッチ検体の同時分析も可能とすることから［２２］、好ましい方法として使用される。ＩＦＮγ及びグランザイムＢは、これらが炎症／組織破壊性（Ｔｈ１型、細胞溶解性）免疫応答と特異的に関連することから、好ましい評価アナライトである。特に、種々の時点での対象由来の低温保存ＰＢＭＣを解凍し、静置し、その後、ＩＦＮγ又はグランザイムＢに特異的なモノクローナル捕捉抗体で予めコーティングした９６ウェルニトロセルロースマイクロタイター（ＥＬＩＳＰＯＴ）プレートに移す。ウェル当たり１０5細胞を培地（Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール及び１０％ヒトＡＢ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０）単独（抗原無し）、２μｇ／ｍｌ  ＡＲタンパク質、２μｇ／ｍｌ  ＰＳＡタンパク質（陰性対照）、２μｇ／ｍｌのＡＲ特異的ペプチドライブラリー又は対照、２５０ｎｇ／ｍｌ破傷風トキソイド、又は２．５μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（陽性有糸分裂促進対照）の存在下で２４〜４８時間培養する。次に、プレートを、０．０５％ツィーン−２０を含有するＰＢＳで洗浄し、ＩＦＮγ又はグランザイムＢのいずれかに対するビオチン化検出抗体５μｇ／ｍｌを含有する５０μｌ／ウェルＰＢＳで室温にて２．５時間インキュベートする。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、１００μｌ／ウェルストレプトアビジン標識アルカリ性ホスファターゼ（バイオラッド社、ハーキュリーズ、ＣＡ）で更にインキュベートし、次いで、１００μｌ／ウェルＢＣＩＰ／ＮＢＴ比色定量基質（バイオラッド社）で現像する。これらのプレートを冷却水道水下ですすぐことにより比色定量反応を停止させ、ウェルを完全に乾燥させた後、ＥＬＩＳＰＯＴ自動プレートリーダーでスポットを数える。
【０１０９】
［００１９２］  レポート作成及び応答定義：  結果は、従前に報告されているように、８ウェル反復アッセイから、抗原対照不含ウェルから得られたスポットの平均数を試験ウェルで得られた平均数から差し引くことにより計算され、１０6の開始ＰＢＭＣに対して正規化された、１０6細胞当たりのスポット形成単位（ｓｆｕ）（頻度）の平均（＋／−標準偏差）数として示す［２３］。試験ウェルと抗原不含の対照との比較は、２標本ｔ検定を用いて行い、ｐ＜０．０５（両側）を有意な抗原特異的Ｔ細胞応答として定義する。次に、免疫誘導をもたらす有意な抗原特異的応答は、術後６か月時点（又は評価される他の処置後時点）で検出可能な、すなわち、培地単独（上記の通り）よりも有意に高い、平均ベースライン値の少なくとも３倍の、且つ、頻度＞１０／１０6ＰＢＭＣのＡＲ特異的応答と定義される。
【０１１０】
［００１９３］抗原特異的抗体免疫の評価：  ＡＲに対する抗体応答の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：  共存するＡＲ（又は他の抗原）に対する体液性免疫応答の存在は、従前に記載されているもの［６１］と同様の間接的方法を用いたＥＬＩＳＡにより評価される。特に、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４  ＥＬＩＳＡプレート（ダイネックステクノロジーズ社）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3バッファー（ｐＨ９．６）中、２μｇ／ｍｌの精製ＡＲ  ＬＢＤタンパク質（リサーチダイアグノスティックス社、又は他の抗原若しくは商業ソース）で、４℃にて一晩コーティングする。室温にて１時間、ＰＢＳ／１％ＢＳＡでブロッキングした後、ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ツィーン−２０（ＰＢＳ−ツィーン）で洗浄し、次いで、１：２５、１：５０、１：１００及び１：２００希釈したヒト血清と共に１時間インキュベートする。洗浄後、次に、プレートをペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ検出抗体（アマシャム社）、次いで、ペルオキシダーゼ酵素ＴＭＢ基質（キルケゴール・アンド・ペリーラボラトリーズ社）と共に順次インキュベートする。呈色反応を１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4で停止し、４５０ｎｍで光学密度を測定する。ＡＲ特異的ＩｇＧ抗体に対する抗体力価を従前に記載のように測定する［６１］。
【０１１１】
［００１９４］  レポート作成及び応答定義：  これらは厳密には定量的アッセイではない。ＩｇＧ応答は、希釈曲線をグラフで示して報告され、力価により、陰性対照の平均＋３標準偏差を超える、ＩｇＧ応答が検出可能である最高血清希釈として定義される。免疫誘導をもたらす陽性ＩｇＧ応答は、処置後６か月の時点（又は評価される他の処置後時点）で検出可能なベースライン力価の少なくとも４倍の抗原特異的（抗ＡＲ）ＩｇＧ力と定義される。
【０１１２】
［００１９５］  組織病理学評価：  処置前及び前立腺切除時点で得られる組織生検は全ての対象で利用可能である。これらの試験の目的は、第一に、アンドロゲン除去単独処置（１群）がＣＤ８＋Ｔ細胞の増大をもたらすかどうか、及びこれがＡＲ標的化ワクチン（２群）、及び更にまたペンブロリズマブ（３群）の使用によって更に増大するかどうかを決定することである。これは標準的免疫組織化学、及び定量的フローサイトメトリー（新鮮組織で実現可能である場合）によって決定される。１つの探究方法として、他の集団に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度はまた、凍結又はパラフィン包埋組織サンプルのｍＲＮＡ分析によっても決定される。さらなる探究方法として、特定のＣＤ８＋Ｔ細胞集団の頻度は、凍結組織サンプル（アダプティブバイオテクノロジー社、シアトル、ＷＡ）を用いたＴＣＲシークエンシングにより決定される。
【０１１３】
［００１９６］  組織病理学的評価の第二の目標は、ｐＴＶＧ−ＡＲでの免疫誘導が腫瘍のＰＤ−Ｌ１発現に影響を及ぼすかどうか（おそらくはＩＦＮγを分泌する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を惹起することによる）、及び処置がＴ細胞上での他のＴ細胞制御性リガンド（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３）又は腫瘍上での他のＴ細胞制御性リガンド（例えば、ＨＶＥＭ、ホスファチジルセリン、ＰＤ−Ｌ２）の発現を増強するかどうかを決定することである。このため、処置前及び１２週間後に得られる生検検体をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ−３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ホスファチジルセリン、ＨＶＥＭ及び潜在的な他のマーカーに特異的な抗体で染色する。染色及び定量は処置群を伏せられた病理学者により再検証され、視野当たりのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）：ＣＤ８＋Ｔ細胞比、ＰＤ−Ｌ１発現、及びこれら又は１つの制御性受容体を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（又は１以上の制御性リガンドを発現する腫瘍細胞）の発現が処置前から前立腺切除時点まで変化するかどうかが決定される。
【０１１４】
［００１９７］  ウィスコンシン大学において、サンプルは、上記のように、ホルマリン固定、パラフィン包理、切片化、Ｈ＆Ｅ染色のため、最終的にはＩＨＣ分析のためにＵＷＣＣＣ  ＴＲＩＰ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）研究室に送られる。
【０１１５】
実施例８
［００１９８］  実施例７と同様に、ワクチン、ＡＤＴ及びＰＤ−１経路遮断を用いた組合せ処置のための好適な投与計画は、図１６に図示される。好適な試験パラメーターはタイムラインの下に示され、実施例７に述べられているように実施される。
【０１１６】
［００１９９］  本開示に引用されている各刊行物、特許、及び特許公報は、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。本発明は、以上の例に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲内に入るような全ての改変及び変形を包含する。
【０１１７】
［００２００］  実施例５の参照文献、それぞれその全内容が本明細書の一部として援用される。
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【０１１８】
［００２０１］  本明細書はコンピューター読み取り可能な形式で同時に提出された配列表を含む。この配列表は本明細書の一部として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｂ】
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【図３Ｃ−３Ｄ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ−５Ｆ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１０Ｃ−１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ−１１Ｅ】
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【図１１Ｆ−１１Ｉ】
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【図１２Ａ−１２Ｆ】
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【図１２Ｇ−１２Ｉ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１３Ｃ−１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１４Ｃ−１４Ｄ】
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【図１４Ｅ−１４Ｇ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ−１５Ｈ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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