(57)【要約】  本発明は、特に医薬品としての、選択的に脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質（ＧｃＭＡＦ）とコレカルシフェロール（カルシオール）との二量体複合体に関する。本発明はさらに、このような複合体を生成する方法に関し、当該方法ではビタミンＤ結合タンパク質をカルシオールと反応させ、反応させる前または反応させた後に選択的に脱グリコシル化する。結果として得られる生成物を、６０ｋＤａより大きいカットオフ値を有する分子ふるいを使用して、より大きい分子量を有する不純物、特に選択的脱グリコシル化プロセスの酵素から最終的に分離する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的に脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質（ＧｃＭＡＦ）とコレカルシフェロール（カルシオール）とからなる二量体複合体。
【請求項２】
薬物としての、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
請求項１に記載の複合体を生成する方法であって、
ビタミンＤ結合タンパク質をカルシオールと反応させて、反応させる前または反応させた後に選択的に脱グリコシル化し、結果として生じる生成物を、６０ｋＤａより大きいカットオフ値を有する分子ふるいを使用して、より大きい分子量を有する不純物、特に選択的脱グリコシル化処理の酵素から、最終的に分離することを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
結果として生じる生成物を、高々１０ｋＤａのカットオフ値を有する分子ふるいを使用して、開裂した糖残基から分離することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的に脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質（ＧｃＭＡＦ）、コレカルシフェロール（カルシオール）及び生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレカルシフェロールは、カルシオールとも称し、ヒトの内部におけるビタミンＤの最も重要な生理学的な形態であることが知られている。この理由で、コレカルシフェロールは栄養補助食品に用いられることが多い。コレカルシフェロールは、体内でカルシトリオールに変換される。カルシトリオールは、位置１及び位置２５に２つのＯＨ基を有する点で、カルシオールと相違する。
【０００３】
カルシオールは、カルシジオール及びカルシトリオールと同様に疎水性であり、したがってビタミンＤは血液中で、Ｇｃグロブリン（Ｇｃ＝群特異的成分）とも称するビタミンＤ結合タンパク質によって輸送される。ビタミンＤ結合タンパク質が選択的に脱グリコシル化されると、有効なマクロファージ活性化剤である分子が得られる。このことは、例えば、特許文献１の段落［０００９］から知られている。したがって、この分子を、以下ではＧｃＭＡＦ（ＭＡＦ＝マクロファージ活性化因子）と称する。上述の文献から、ＧｃＭＡＦは、例えば腫瘍の治療に有効であることが知られている。ＧｃＭＡＦはマクロファージを活性化し、次いで今度はマクロファージが腫瘍細胞を攻撃すると考えられている（上述の文献の段落［００１０］）。
【０００４】
一方、カルシトリオールも、腫瘍、特に前立腺癌の治療に役立つことが知られている（上記の文献の段落［００６４］）。
【０００５】
したがって、上記の文献では、癌患者（段落［００１６］）、特に前立腺癌及び乳癌の患者（段落［００６６］）に対してＧｃＭＡＦ及びカルシトリオールを含む成分を管理することも提案されている。特定の生成方法は示されていないため、２つの成分は互いに独立して存在し、互いに化学結合していないものとする。
【０００６】
特許文献２によれば、ＧｃＭＡＦ、カルシトリオール、及び不飽和脂肪酸の三量体複合体が生成される。二量体複合体であるＧｃＭＡＦ−カルシトリオールが中間生成物として生成されるように、ＧｃＭＡＦをまずカルシトリオールと反応させる。
【０００７】
本発明に関連して、驚くべきことに、ＧｃＭＡＦ−カルシオール複合体がＧｃＭＡＦ−カルシトリオール複合体に対して、ＧｃＭＡＦ−カルシオール複合体の食作用活性がより高く、スーパーオキシドラジカルアニオン（Ｏ２●−）の形成がより弱いという点で優れていることがこれまでに分かっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ  ０１／８５１９４  Ａ
【特許文献２】ＷＯ  ２０１４／２０２９５６  Ａ
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明は、特に医薬品としての、選択的に脱グリコシル化されたビタミンＤ結合タンパク質（ＧｃＭＡＦ）とコレカルシフェロール（カルシオール）との二量体複合体に関する。
【００１０】
本発明に関連してさらに確立されたように、有効性は、浄化の質に相当な程度依存する。したがって、本発明はさらに、このような複合体を生成する方法に関し、当該方法ではビタミンＤ結合タンパク質をカルシオールと反応させ、反応させる前または反応させた後に選択的に脱グリコシル化し、結果として得られる生成物を、６０ｋＤａより大きいカットオフ値を有する分子ふるいを使用して、より大きい分子量を有する不純物、特に選択的脱グリコシル化プロセスの酵素から最終的に分離し、好ましくは、さらに、高々１０ｋＤａのカットオフ値を有する分子ふるいを使用して、開裂した糖残基から分離する。
【００１１】
本発明に関連して実施される測定によれば、公知のＧｃＭＡＦ−カルシトリオール複合体の食作用活性はＧｃＭＡＦ単独の食作用活性に実質的に等しく、対照的に、ＧｃＭＡＦ−カルシオール複合体は著しく高い食作用活性を有する。
【００１２】
スーパーオキシドラジカルアニオンの生成が低減されることは利点であり、スーパーオキシドラジカルアニオンは腫瘍細胞を破壊するが、スーパーオキシドラジカルアニオンはさらに、健全な細胞及びマクロファージに同程度の損傷を引き起こし、それによって腫瘍治療に僅かな作用しか及ぼし得ない上に、それにも増してスーパーオキシドラジカルアニオンの直接の作用を弱める。
【００１３】
血液中のビタミンＤに対する標準試験であるＥＬＩＳＡ試験は、カルシジオール（位置２５にＯＨ基を有する）に対して選択性を有する。この試験では、Ｇｃ−カルシジオール複合体がＥＬＩＳＡ試験の受容体部位に結合しないため、最初に、ビタミンＤ結合タンパク質からカルシジオールを分離する必要がある。ＥＬＩＳＡ試験の受容体部位は人体内のビタミンＤ受容体に類似するため、このことからこの複合体はこれらのビタミンＤ受容体にも結合しないことを推論することができる。同じことがＧｃＭＡＦ−カルシトリオール複合体に当てはまる。しかし、驚くべきことに、ＧｃＭＡＦ−カルシオール複合体は、実際にはＥＬＩＳＡ試験の受容体部位に結合する、したがって人体のビタミンＤ受容体にも結合することが分かっており、これがおそらくＧｃＭＡＦ−カルシオール複合体の優位な作用の理由である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
次に、以下の記載によって、本発明をより詳細に説明する。
【００１５】
まず生成方法を説明すると、本発明に係る複合体は、Ｇｃタンパク質または組み換えＧｃタンパク質から、続くコレカルシフェロール結合によって生成される。
【００１６】
セファロース４Ｂ、またはシアノ基によって活性化された電磁ビーズ、または他の開裂候補による固定化酵素の生成
【００１７】
使用するバッファまたは溶液  
結合バッファ：２ｌの水に１６．８ｇのＮａＨＣＯ３及び５８．４４ｇのＮａＣｌを溶解する  
０．２Ｍのグリシンバッファ：１ｌの水に１５．０１ｇのグリシンを溶解する  
８ＭのＮａＯＨ濃縮液：１００ｍｌの水に３２ｇのＮａＯＨを溶解する  
０．１Ｍのアセテートバッファ：５．７６ｍｌの氷酢酸（１００％）を１ｌの水に添加し、それに２９．２２ｇ（０．５Ｍ）のＮａＣｌを溶解し、８ＭのＮａＯＨ濃縮液液滴をｐＨが４．０になるまで（少なくとも５０滴）添加する  
水：浸透精製処理する（さらに、手術に好適；導電率＜０．２μＳ／ｃｍ）
【００１８】
Ａ．）シアノ基によって活性化されたセファロース４Ｂ
【００１９】
１）１．２ｇのシアノ基によって活性化されたセファロース４Ｂを２４０ｍｌの１ＭのＨＣｌ（冷；１ｌ中に８３．３ｇ）中で３０分間、懸濁させる。これをクロマトグラフィーカラムに移し、６０ｍｌの水で洗い流す。この後に、クロマトグラフィーカラムによって６０ｍｌの結合バッファを平衡化する。再バッファ後に、ゲルを１５ｍｌの結合バッファ中に移して２つの７．５ｍｌ管に分け、３０００ｒｐｍで２分間、遠心分離する。  
上澄みを４．５ｍｌになるまで除去する。
【００２０】
２）こうしてゲルを活性化させ、  
１ｍｌの結合バッファと２ｍｇのガラクトシダーゼとを、または  
１ｍｌの結合バッファと５Ｕのノイラミニダーゼとを、それぞれ結合させる。  
２つの４．５ｍｌのゲルに一方の物質をそれぞれ添加し、２６℃で２時間、撹拌する。
【００２１】
３）セファロースの残留活性ＣＮ基のグリシンによる封止  
２つのゲルを酵素とともにクロマトグラフィーカラムに移し、５つの５ｍｌの結合バッファを用いて未結合の酵素を除去する（６０００ｒｐｍの遠心分離と、ゲルからのバッファの除去と、結合バッファによる洗浄と、合計５回の繰り返しの遠心分離とによっても可能である）。  
最後に、  
２つの５ｍｌの結合バッファに入れて１５ｍｌの管に移し、３０００ｒｐｍで２分間、遠心分離する。  
次いで、１０ｍｌのｐＨ８．０の０．２Ｍのグリシンをそれぞれ加え、４〜６℃で２０時間、放置し、数回撹拌する。
【００２２】
４）酵素によって活性化された、未結合グリシンのゲルの浄化  
管を遠心分離機にかけ、上澄みを除去する。  
結合バッファの添加と、２分間の３０００ｒｐｍでの遠心分離と、上澄みの除去とを５回行うことによって、酵素ゲルの浄化を実施する。  
この後に、結合バッファに代えてアセテートバッファを５回添加する同じ処理を繰り返す。  
０．０５％のアジ化ナトリウムが添加された５ｍｌの１ＭのＮａＣｌ水溶液で５回洗浄した後に、保管を実施する。  
最後に、ゲルを滅菌管に移して、４〜６℃で保管する（＝使用に備える）。
【００２３】
Ｂ．）シアノ基によって活性化された電磁ビーズ（ＣＮ−ＭＢ）  
【００２４】
１）１００ｍｌの１ＭのＨＣｌ（冷、１ｌ中に８３．３ｇ）中で１．２ｇのＣＮ−ＭＢを数回洗浄する（遠心分離及び磁気結合による）。この後に、水で洗浄し、結合バッファで平衡化する。  
再バッファ後に、１．２ｇのＣＮ−ＭＢを２つの０．５ｍｌ管に移し、３０００ｒｐｍで２分間、遠心分離する。上澄みを除去する。
【００２５】
２）こうして電磁ビーズを活性化させ、  
１ｍｌの結合バッファと２ｍｇのガラクトシダーゼとを、  
１ｍｌの結合バッファと５Ｕのノイラミニダーゼとを、それぞれ結合させる。  
０．６ｇのＣＮ−ＭＢに一方の物質をそれぞれ添加し、２６℃で２時間、撹拌する。
【００２６】
３）電磁ビーズの残留活性ＣＮ基のグリシンによる封止  
両方のＣＮ−ＭＢ酵素を磁石によって引き留め、上澄みを除去する。１ｍｌの結合バッファの添加、シェイキング、ＣＮ−ＭＧ酵素の再度の磁気結合と上澄みの除去。  ４回繰り返す。これによって、未結合の酵素を除去する。  
次いで、１ｍｌのｐＨ８．０の０．２Ｍのグリシンをそれぞれ添加し、４〜６℃で２０時間、放置し、数回撹拌する。
【００２７】
４）酵素によって活性化された、未結合グリシンの電磁ビーズの浄化  
原理：磁気結合と浄化バッファの除去  
１ｍｌの結合バッファをそれぞれ５回添加し、この後に、１ｍｌのアセテートバッファを５回添加する同じ処理を繰り返す。  
０．０５％のアジ化ナトリウムが添加された１ｍｌの１ＭのＮａＣｌ水溶液で５回洗浄した後に、０．５ｍｌの斯かる水溶液中における４〜６℃でのガラクトシダーゼ−ＭＢ及びシアリダーゼ−ＭＢの保管を実施する（＝使用に備える）。
【００２８】
ガラクトシダーゼ及びシアリダーゼ（またはノイラミニダーゼ）によって活性化されたＣＮ−セファロース４Ｂによる、またはＣＮによって活性化された電磁ビーズによる、ガラクトースまたはシアル酸（ノイラミン酸）の開裂
【００２９】
使用するバッファ  
０．１ＭのｐＨ６．０及びｐＨ７．０のリン酸バッファ  
１ｍｌの０．１ＭのｐＨ６．０のリン酸バッファに、１ｍｇのＧｃタンパク質を溶解する。  
そのうちの４００μｇを２５０ｍｌの室温の水に溶解し（透析ホース、ろ過管）、２４時間置きに３回取り換える。
【００３０】
Ａ）ノイラミニダーゼ開裂  
浄化されたＧｃタンパク質を、３ｍｌの活性セファロースまたは０．５ｍｌの活性電磁ビーズのいずれかを用いて、上記で生成された静止させたノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）と１０ｍｌ管内で接触させ、３７℃、５００ｒｐｍで２時間、インキュベートする。
インキュベーション後に、  
ａ）ノイラミニダーゼによって活性化されたセファロースゲルに対して、６０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、次いで９００μｌを除去する。  
シアリダーゼゲルを１ｍｌのｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸バッファと混合し（＝一度再洗浄する）、６０００ｒｐｍで２分間、再度遠心分離し、再度９００μｌを除去する。さらに２回再洗浄し、遠心分離し、除去する。除去した上澄みを合わせる。
ｂ）ノイラミニダーゼによって活性化された電磁ビーズに対して、電磁ビーズを引き留め、９００μｌを除去する。  
１ｍｌのｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸バッファをＭＢに添加し、混合し、再度９００μｌを除去する。３回目の処理を実施したら、除去した上澄みを浄化する。  
ａ）及びｂ）の開裂生成物に対する浄化ステップ：開裂した糖残基を除去するために、６０００ｒｐｍで５分間、フィルタ（１０，０００Ｄａフィルタ）を介して遠心分離する。  
４ｍｌのｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸バッファ中の上澄みを取り出し、再度ろ過する。これの３回目を実施する。１ｍｌのｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸バッファ中の上澄みを取り出す。
【００３１】
Ｂ）ガラクトシダーゼによる開裂は、活性化されたセファロースまたは電磁ビーズを介したシアリダーゼまたはノイラミニダーゼによる開裂と同様に起こる。
【００３２】
開裂した生成物の分離、再バッファ、浄化
【００３３】
ａ）セファロースの場合  
ろ過残留物を１ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液で懸濁させる。この後に、６０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、１ｍｌを除去する。  
残りを１ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液で懸濁させ、６０００ｒｐｍで２分間、再度遠心分離し、１ｍｌを除去する。これを２回繰り返す。
【００３４】
ｂ）電磁ビーズの場合  
ろ過残留物を１ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液で懸濁させる。この後に、単にビーズを磁石で引き留めてタンパク質（＝α−グロブリン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を除去する。この後に、１ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液をそれぞれ添加し、混合し、磁石を作用させ、上澄みを除去する。処理を３回繰り返す。
【００３５】
６０００ｒｐｍで８分間、１０，０００Ｄａフィルタを介して、すべての部分を合わせて遠心分離し、水溶液を濃縮する（これに代えて、圧力透析を実施することができる）。
残留物に４ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液を添加し、６０００ｒｐｍで１０分間、再度ろ過する。残留物は約５００μｌである。  
４ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液を再度添加し、６０００ｒｐｍで１０分間、再度ろ過し、１ｍｌの０．９％のＮａＣｌ水溶液中の残留物を取り出す。  
結果：シアル酸が分離し、ガラクトースが分離し、ＤＮＡ、ＲＮＡは無い。
【００３６】
最後に、遠心分離によって１００，０００Ｄａフィルタを介してろ過を実施する。ろ液中にＧｃＭＡＦを配置し（約５３ｋＤａ）、固定化物質の存在し得る酵素をフィルタ残留物中で分離する。これにより、９９．５％を超える極めて高い純度の生成物が生じる。
【００３７】
この後に、ＧｃＭＡＦ−コレカルシフェロール複合体を形成するために、コレカルシフェロールを添加する。結果として得られる複合体を、１０，０００Ｄａ分子フィルタを使用して、過剰なコレカルシフェロールから分離する（６０００ｒｐｍで１０分間、３回遠心分離し、１０ｍＭのｐＨ７．４のＰＢＳで洗浄する）。タンパク質定量は、３９８ｎｇ／ｍｌの所望の複合体を示した。
【００３８】
ただし、最初にコレカルシフェロールをＧｃタンパク質と反応させ、次いで上述のように糖残基を開裂することも可能である。
【００３９】
続く比較試験のために、コレカルシフェロールの代わりにカルシトリオールを使用して同じ生成方法を実施した。複合体の収量は４４０ｎｇ／ｍｌであった。
【００４０】
“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０：  １６８４−１６９２，  １９７１においてＨａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｓ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  ＥＡにより記載されているように、食作用活性化を定量した。
【００４１】
２４ウェルプレート内でカバーガラス上に腹膜マウス細胞をコートした。３時間の薬物処理の後に、食作用活性について培養組織を試験した。溶血性のウサギ血清（イギリスのＳｅｒｏｔｅｃ  Ｌｔｄ．の抗ヒツジ赤血球Ｃ１２ＨＳＢ）を用いてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）をオプソニン化した。ＲＰＭＩ  １６４０（血清フリー）中のオプソニン化されたＳＲＢＣ（０．５％）を、マクロファージによってコートされた各カバーガラス上に層状化させ、９０分間、培養した。カバーガラスを低張液（１／５  ＰＢＳ）に浸漬することによって、インターナライズされていない赤血球を溶解した。マクロファージを、メタノールで固定し、風乾し、ギムザ染色した。細胞当たりの貪食された赤血球の数を顕微鏡で測定したところ、各データ点に対して２５０のマクロファージが計数された。当該データは、赤血球を取り込んだマクロファージの割合にマクロファージ当たりの赤血球の平均数を乗じたものとして定義される食作用指標として表される。
【００４２】
結果は以下の通りである。
【表１】
2019515953.tif 000002
【００４３】
自作のＧｃＭＡＦの活性のほうが高いことは、より良い浄化、特に１００，０００Ｄａフィルタを用いる最終ろ過に起因すると考えられる。
【００４４】
ヒトの全血中の単球におけるスーパーオキシドラジカルアニオンの形成の定量を、以下のように実施した。
【００４５】
密度勾配遠心分離法によって、ヘパリン添加全血からの末梢単核球の分離を実施する。血液をＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇなし）で１：２に希釈し、１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ-１０７７上に層状化した。この後に、細胞懸濁液を７００×ｇ、２０℃で３０分間、遠心分離する。パスツールピペットを用いて単核球を伴う中間期を入念に除去し、３０ｍｌのＰＢＳ（Ｃａ／Ｍｇなし）と調合し、３５０×ｇで５分間、遠心分離する。上澄みを静かに移し、ＲＰＭＩ  １６４０培地中で細胞を取り出し、フローサイトメータで計数する。細胞を１０５単球／ｍｌに調整する。試験バッチについて、１ｍｌの細胞懸濁液をそれぞれ５ｍｌ管にピペットで移す。ＬＰＳ１００ｎｇ／ｍｌを対照として使用する。試験物質（ＧｃＭＡＦ、ＧｃＭＡＦ−カルシオール、またはＧｃＭＡＦ−カルシトリオール）を５０ｐｇ／ｍｌの濃縮液で使用する。細胞をＣＯ２インキュベータ内で合計３時間、インキュベートする。インキュベーションの終了の１５分前に、それぞれ５μｌのＣＤ４５−Ｖ４５０抗体と、１μｌの１ｍＭのＭｉｔｏＳＯＸ原液とを添加する。この後に、細胞懸濁液を、それぞれ２ｍｌのＲＰＭＩ培地と調合し、室温、３５０×ｇで５分間、遠心分離する。上澄みを静かに移し、細胞を５００μｌのＲＰＭＩ培地中で再度懸濁させる。細胞をフローサイトメータで測定及び分析する。“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＧｃＭＡＦ）  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，”  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：  ４２９７−４３００  （２００２）において、Ｓａｈａｒｕｄｄｉｎ  Ｂｉｎ  Ｍｏｈａｍａｄ，  Ｈｉｄｅｋｏ  Ｎａｇａｓａ  Ｗａ，  Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ  Ｕｔｏ，  ａｎｄ  Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｈｏｒｉにより記載されているように、平均蛍光強度に基づいて評価を実施する。
【００４６】
スーパーオキシド形成アッセイ  
【００４７】
使用した方法は、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等によって記載された方法の修正バージョンであった。簡単に説明すると、サンプルの３時間の処理の後に、プレートをＰＢＳ（−）で２回、ｐＨ７．４のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸バッファで１回洗浄し、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸バッファに１．５ｍｌの５０μＭのシトクロムＣを添加し、各ウェル内の０．５μｇ／ｍｌの最終濃縮液にホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）を添加し、湿潤インキュベータ内で９０分間、培養した。
【００４８】
氷浴を使用して反応を停止させた。培養された培地をエッペンドルフ管内に配置し、８０００ｇで遠心分離した。空測定として、細胞を有さないプレートの混合物を使用して、５４０ｎｍ（Ｕ−２０００、日立）の基準を用いて５５０ｎｍにおいて上澄みの光学密度を分光分析により測定した。式Ｅ５５０ｎｍ＝２．１・１０−１Ｍ−１ｃｍ−１を用いて、還元型シトクロムＣの濃度を特定した。
【００４９】
結果は以下の通りであった。
【表２】
2019515953.tif 000003
【００５０】
本発明に係る複合体のスーパーオキシド活性は、試験されたすべての物質の中で最も低く、純粋なＧｃＭＡＦのスーパーオキシド活性に匹敵する。したがって、ＧｃＭＡＦに対するカルシオールの結合は、そのマクロファージ活性を著しく増大させ得るが、この増大を達成するためにスーパーオキシド活性の増大の不利点を受け入れなければならないことを意味しない。
【００５１】
本発明に係る複合体は、経口投与され得る。経口投与後に血液中のビタミンＤ含有量を測定したところ、含有量は３５．９ｎＭ（投与前）から４４．２５ｎＭ（投与の１２時間後）に上昇した。したがって、本発明に係る複合体は、経口投与で人体により吸収される。さらに、本発明に係る複合体は毒性を有さない。
【００５２】
本発明に係る複合体の経口投与後に、続いてマクロファージに変換される単球細胞の著しい増加を示すことも可能であった。
【国際調査報告】
2019515953.tif 000004
2019515953.tif 000005
2019515953.tif 000006
2019515953.tif 000007