(57)【要約】  安定化されたＧＬＰ−１アゴニストの持続放出コンジュゲートは、月１回またはより少ない頻度での投与スケジュールで糖尿病および関連疾患を治療するために、アゴニストの安定性と放出速度とのバランスをとって長期にわたる投与を提供する。【選択図】図４
2019511497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の共有結合したリンカー−アゴニストペプチドを含む不溶性マトリックスを有するＧＬＰ−１アゴニストの持続放出コンジュゲートであって、該リンカーが生理学的条件のｐＨおよび温度で開裂して遊離ペプチドアゴニストを放出するものであり、かつ、該リンカー−アゴニストペプチドのアゴニストペプチドが、生理学的条件のｐＨおよび温度で１ヶ月にわたって１０％未満の分解を示す前記ＧＬＰ−１アゴニストである、持続放出コンジュゲート。
【請求項２】
次式：
Ｍ−（Ｌ−Ｅ）ｘ
［式中、Ｍは不溶性マトリックスであり；Ｌは、３７℃、ｐＨ７．４で３２０〜２４００時間の開裂半減期を有する開裂型リンカーであり；Ｅは、ｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月後に１０％未満の化学分解を示すＧＬＰ−１アゴニストであり；ｘは、該マトリックスが占有する体積１ｍｌ中に１〜１０００ｍｇのペプチド濃度を提供するのに必要なＬ−Ｅ単位の数を表す整数である］
を有する、請求項１に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項３】
ＧＬＰ−１アゴニストが、天然エキセンジン配列中のＮ２８に対応する位置にアミノ酸置換を含む安定化されたエキセンジンであり、該天然エキセンジンが配列番号１または配列番号７からなる、請求項１に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項４】
ＧＬＰ−１アゴニストがＮ２９Ｄ、Ｎ２８Ａ、Ｎ２８ＫまたはＮ２８Ｑ置換された配列番号１または配列番号７からなる、請求項３に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項５】
ＧＬＰ−１アゴニストが配列番号２または配列番号８である、請求項４に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項６】
不溶性マトリックスが、架橋剤によって連結されたポリマーを含む生分解性の架橋ヒドロゲルである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項７】
前記ヒドロゲルが生分解性の架橋ポリ（エチレングリコール）である、請求項６に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項８】
前記ヒドロゲルがミクロスフェアの形態である、請求項６に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項９】
前記ヒドロゲルを構成するポリマーが、β脱離によって開裂される架橋剤により架橋されている、請求項６に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルに含まれる架橋剤が、式（１）のものであり、
【化１】
2019511497.tif 000014
式中、
ｍは０または１である；
Ｘと、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５の１つは、ヒドロゲル中に含まれるポリマーに連結され、
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；
あるいはＯＲ９またはＮＲ９２（ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）である；
ＳＲ４であるか、
ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
残りのＲ１およびＲ２は、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであり；かつ
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、または、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルであり、それぞれ置換されてもよい；
あるいは、前記ヒドロゲルに含まれる架橋剤が、式（２）のものであり、
【化２】
2019511497.tif 000015
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ５の２つは、ヒドロゲル中に含まれるポリマーに連結され；
ｍは０〜１であり；
ｎは１〜１０００であり；
ｓは０〜２であり；
ｔは２、４、８、１６または３２であり；
Ｑは、価数ｔを有するコア基であり；
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化３】
2019511497.tif 000016
または
【化４】
2019511497.tif 000017
であり、ここで、Ｒ６は、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいアリールアルキル、または置換されてもよいヘテロアリールアルキルであり；
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；
あるいはＯＲ９またはＮＲ９２（ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）である）；
ＳＲ４であるか、
ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルでああり；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
残りのＲ１およびＲ２は、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであり；かつ
残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルである、
請求項９に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項１１】
Ｌが式（３）のリンカーであり、
【化５】
2019511497.tif 000018
式中、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つまたは両方は、独立して、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであるか；
あるいはＲ３は、ＯＲ９またはＮＲ９２であり（ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
ＳＲ４であるか
ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
Ｒ１およびＲ２の１つのみは、Ｈ、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであってもよく；
Ｒ５の一つは、（ＣＨ２）ｙＺ＊、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚ＊または（ＣＨ２）ｙＮＨ ＣＯ （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚ＊（ここで、ｘは１〜１００、ｙ＝１〜６）であり、他方のＲ５は、Ｈ、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルであり；かつ
Ｚ＊は、不溶性マトリックスへの連結を示す；
請求項２に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項１２】
Ｒ１がＣＮまたはＲ３ＳＯ２であり、ここで、Ｒ３は置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、または（Ｒ９）２Ｎであり、ここで、各Ｒ９は独立してＨまたは置換されてもよいアルキルであり；
Ｒ５の一つが（ＣＨ２）ｙＺ＊、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚ＊または（ＣＨ２）ｙＮＨ ＣＯ （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚ＊（ここで、ｘは１〜１００、ｙ＝１〜６）であり、他方のＲ５がＨまたは非置換アルキルである、
請求項１１に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項１３】
Ｒ１がＣＮまたはＣＨ３ＳＯ２であり；Ｒ２がＨであり；Ｒ５の一つが（ＣＨ２）ｙＺ＊（ここで、ｙは５である）であり；他方のＲ５がＨである、請求項１２に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項１４】
リンカー−アゴニストペプチドが架橋剤に共有結合されている、請求項６に記載の持続放出コンジュゲート。
【請求項１５】
式（４）の化合物：
【化６】
2019511497.tif 000019
［式中、
Ｅは、ｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月後に１０％未満の化学分解を示すＧＬＰ−１アゴニストであり；
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つまたは両方は、独立して、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３
ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであるか；
あるいはＲ３は、ＯＲ９またはＮＲ９２であり（ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
ＳＲ４であるか、
ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；
それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；
それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであり；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
Ｒ１およびＲ２の１つのみは、Ｈ、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであってもよく；
Ｒ５の一つは、（ＣＨ２）ｙＺ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚまたは（ＣＨ２）ｙＮＨ ＣＯ （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚ（ここで、ｘは１〜１００、ｙ＝１〜６）であり、他方のＲ５は、Ｈ、又は、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルであり、
Ｚは、不溶性マトリックスに連結するための官能基である］。
【請求項１６】
前記官能基が、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、ＳＨ、Ｓ−ｔｅｒｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、１，３ ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリレート、アミノオキシ、ケトまたはアクリルアミドを含む、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１がＣＮまたはＲ３ＳＯ２であり、ここで、Ｒ３は置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、または（Ｒ９）２Ｎであり、ここで、各Ｒ９は独立してＨまたは置換されてもよいアルキルであり；
Ｒ５の一つが（ＣＨ２）ｙＺ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚまたは（ＣＨ２）ｙＮＨ ＣＯ （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚ（ここで、ｘは１〜１００、ｙ＝１〜６）であり、他方のＲ５がＨまたは非置換アルキルである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１がＣＮまたはＣＨ３ＳＯ２であり；Ｒ２がＨであり；Ｒ５の一つが（ＣＨ２）ｙＺ（ここで、ｙは５である）であり；他方のＲ５がＨである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｅが、天然エキセンジン配列中のＮ２８に対応する位置にアミノ酸置換を含む安定化されたエキセンジンであり、ここで、前記天然エキセンジンが配列番号１または配列番号７からなる、請求項１５〜１８のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２０】
Ｅが、Ｎ２９Ｄ、Ｎ２８Ａ、Ｎ２８ＫまたはＮ２８Ｑ置換された配列番号１または配列番号７である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｅが配列番号２である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１アゴニストを投与するためのプロトコルであって、ＧＬＰ−１アゴニストにより恩恵を受ける状態である対象者に、請求項１〜５のいずれか１項に記載のコンジュゲートを、１〜３ヶ月に１回投与することを含んでなるプロトコル。
【請求項２３】
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＱＧＧ  ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２（配列番号２）からなる構造を有するペプチド（［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド）またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２４】
請求項２３に記載のペプチドまたは塩を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項２５】
ＧＬＰ−１アゴニストを投与するためのプロトコルであって、ＧＬＰ−１アゴニストにより恩恵を受ける状態の対象者に、請求項２３に記載のペプチド若しくは塩または請求項２４に記載の医薬組成物を投与することを含んでなるプロトコル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達および持続放出製剤の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＧＬＰ−１アゴニストの安定化形態を１ヶ月以上にわたって送達する持続放出組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキセナチド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）は、ＧＬＰ−１受容体の強力なアゴニストである３９アミノ酸ペプチドであり、該受容体を血糖調節作用のあるインスリン分泌促進因子にする。これは遊離ペプチドとして２型糖尿病の治療に広く使用されており、Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ社）として販売されている；該ペプチドは、２．５時間という短いインビボ半減期のために、１日２回注射される。エキセナチドおよび関連ＧＬＰ−１アゴニストペプチドの半減期を延長して、それらの有効性を改善し、副作用を低減し、患者への治療負担（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｕｒｄｅｎ）を軽減することが非常に望ましい。
【０００３】
ペプチドの半減期は、従来、いくつかの方法の１つまたは組み合わせによって延長されている：（ｉ）代謝を遅くするためのペプチドの化学的修飾；（ｉｉ）徐放性デポー製剤を提供するためのカプセル化；および（ｉｉｉ）クリアランスを遅くするための巨大分子とのコンジュゲーション。例えば、Ｃａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （２０１３）  ７：９６３ ９７０を参照されたい。
【０００４】
半減期を増加させるための該ペプチドの化学的修飾は、例えばリキシセナチド（Ｌｙｘｕｍｉａ（登録商標））およびリラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））などの、１日１回投与のＧＬＰ−１アゴニストをもたらした。ＰＬＧＡ（ポリ乳酸−コ−グリコール酸）微粒子への該ペプチドのカプセル化は、週１回の皮下注射を可能にする、Ｂｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標）（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ社）として販売される徐放性製剤を製造するために使用された。トリグリセリド製剤を用いてＢｙｄｕｒｅｏｎの持続期間を月１回投与にまで延長しようとする試みは、成功したことがまだ実証されていない。ＧＬＰ−１ペプチドアゴニストとＦｃ抗体ドメインまたはランダム配列ポリペプチド（ＸＴＥＮ）とのコンジュゲーションは、半減期を５〜６日までしか延長することができなかった。
【０００５】
投与の必要条件を理解する上で、血漿中半減期、すなわち薬物の半分が該系から失われるのに要する時間、を考慮することは都合がよい。投与頻度は、薬物レベルを一定の有効レベル以上に維持する必要性によって決まる。投与を半減期ごとに１回行うことになっている場合、用量は、有効レベルの２倍の初期薬物レベルを与えるようなものでなければならない；同様に、２半減期ごとに１回投与する場合、用量は、有効レベルの４倍の初期薬物レベルを与えるようなものでなければならない。理論的には、１回あたりに投与される薬物の量を単に増加することによって、半減期にかかわらず、投与頻度を希望するだけ少なくすることができる。しかしながら、多くの薬物は高い初期濃度に関連する毒性を示し、半減期の関数としての投与頻度に実際上の制限が課される。だいたい１〜２半減期の投与間隔が典型的である。月１回の投与に適した有効半減期を有するＧＬＰ−１アゴニストペプチドの数種の製剤が開示されているが、これらにはいくつかの欠点がある。封入ミクロスフェアおよび相転移脂質製剤は、ペプチドの初期バースト相放出に見舞われることがあり、患者を望ましくない高い初期薬物レベルにさらす可能性がある。埋め込み可能なポンプは、埋め込みおよび取り出しのための手術を必要とする。
【０００６】
薬物放出の初期バーストは、共有結合型コンジュゲートの使用によって回避することができる。可溶性の循環コンジュゲートは、典型的には、月１回の薬物投与を支持するのに十分な半減期を有しないが（ヒトにおけるポリ（エチレングリコール）の最大半減期は約１週間である）、ヒドロゲルのような不溶性コンジュゲートインプラントは適している。エキセナチドなどの薬物が制御可能な薬物放出速度を有するリンカーを介して様々なマトリックスに共有結合されている組成物は、例えば、米国特許第８，９４６，４０５号に開示される不溶性マトリックスおよびＵＳ２０１４／０２８８１９０（‘１９０）に開示されるヒドロゲルを含めて、米国特許第８，６８０，３１５号；同第８，７５４，１９０号；同第８，７０３，９０７号に以前に開示されている。‘１９０公開公報の一実施形態では、エキセナチドはヒドロゲルマトリックスに連結されており、皮下腔内への注入時に、該ヒドロゲルはデポーを提供し、そのデポーからリンカーのβ脱離反応開裂によってエキセナチドを放出して、該薬物の長時間作用型供給源を提供する。そのようなヒドロゲルは、その名のとおり、主として水から構成されており、したがって、エキセナチドは、デポーの持続時間の間、水性環境にさらされる。この水性環境はタンパク質の複雑な構造を維持するのに有利であると考えられるが、特定のペプチド配列はこのような長期にわたる条件下では不安定になることがある。
【０００７】
生理学的条件下でのヒドロゲル中のエキセナチドの分解速度は、このような製剤の月１回またはそれより少ない頻度での投与を実施不能にすることが見出された。エキセナチドは、Ｍ１４およびＷ２５での酸化、ならびにＱ１３およびＮ２８での側鎖アミド加水分解から生じる化学的不安定性をストレス条件下（ｐＨ７．９、４０℃で６日間）で示すことが報告されている（米国特許出願第２００６／０１９４７１９号；Ｚｅａｌａｎｄ社）。その不安定性の詳細な動態は開示されなかった。ペプチド中のＡｓｎ残基の脱アミドの詳細なモデルは記載されているが（Ｇｅｉｇｅｒ  ＆  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８７）  ２６２：７８５ ７９４）、生理学的条件下でのペプチドおよびタンパク質の脱アミドの速度は非常に変わりやすいことが知られている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  （２０１０）  ９８：１２４０９−１２４１３）。エキセナチド自体は、１日２回の投与（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））およびＰＬＧＡインプラントによる週１回の投与（Ｂｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標））に対して十分に安定である。
【０００８】
エキセナチドの安定化形態はすでに開示されている。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／１１６２９４  （Ｍａｔｒｅｇｅｎ社）は、Ｑ１３、Ｍ１４およびＮ２８の３つの位置で改変された安定化エキセナチド類似体を開示している。エキセナチド配列中の複数のアミノ酸置換が許容され得るが、Ｎ２８のより安定した残基による置換は、ｐＨ７．４、３７℃でのペプチドの効果的な安定化にとって十分であることが今や見出されている。エキセナチド脱アミドのいくつかの生成物、例えばＮ２８ＤおよびＮ２８−ｉｓｏＤは、上記の米国特許出願第２００６／０１９４７１９号（Ｚｅａｌａｎｄ社）に開示されており、ＧＬＰ−１受容体活性化の効力を維持することが判明している。しかしながら、これらの生成物は相互変換系（ｉｎｔｅｒｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を形成し、生成物の元の混合物との平衡に対して不安定である。
【０００９】
ｐＨ７．４、３７℃（すなわち、生理学的ｐＨおよび温度）の水性緩衝液中でのエキセナチドの運命の詳細な研究から、それは、緩衝液に応じて、８〜１４日の半減期でＡｓｎ２８  （Ｎ２８）での脱アミドを受けることが分かっている。したがって、月１回投与するように設計されたヒドロゲルコンジュゲートは、８〜１４日後に主としてエキセナチドの分解生成物を放出することになろう。かくして、投与期間の終わりまでに放出される分解形態の量を最小限に抑えるために、安定化されたＧＬＰ−１アゴニストが化学分解に対して十分な抵抗性を有することは、不可欠である。これは、ＧＬＰ−１アゴニストがｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月後に１０％未満の分解生成物を形成する場合、好ましくはｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月後に５％未満の分解生成物を形成する場合に達成される。
【発明の概要】
【００１０】
発明の開示
本発明は、安定化されたＧＬＰ−１アゴニストペプチドの持続放出を提供するコンジュゲートに関し、該コンジュゲートは、これらのペプチドの月１回の投与またはさらに少ない頻度での投与を支持し、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満などの代謝性疾患および症状の治療に有用である。該コンジュゲートは、ＧＬＰ−１アゴニストの持続した安定性と、放出のためのデポーとして作用するリザーバーマトリックスへの適切なリンカーによって提供される制御放出時間とを同時に実現する。
【００１１】
一態様において、本発明は、多数の共有結合したリンカー−ペプチドを含む不溶性マトリックスからなる持続放出コンジュゲートを提供し、ここで、該リンカーは遊離ペプチドを放出するようにｐＨおよび温度の生理学的条件下で開裂するものであり、該ペプチドは、ｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月にわたって１０％未満の分解を示す安定化されたＧＬＰ−１アゴニストである。本発明のコンジュゲートは、概略的に式（１）として記載することができ、
Ｍ−（Ｌ−Ｅ）ｘ      （１）
式中、Ｍは、開裂型リンカーＬを介して多数（ｘ個）のＧＬＰ−１アゴニストペプチドＥに連結された不溶性マトリックスである。Ｅは、１ヶ月にわたって１０％未満の分解を示すように、ｐＨおよび温度の生理学的条件下で生じる分解に対して安定化された、ＧＬＰ−１アゴニストである。ｘは、該マトリックスの容積中の適切な濃度を生じさせるＬ−Ｅ部分の数を表す整数である。適切な濃度は、マトリックス１ｍｌあたり１〜１０００ｍｇのペプチドである。リンカーＬは、所望の投与期間に適した半減期で遊離ペプチドを放出する。
【００１２】
第二の態様において、本発明は、式（４）を有するリンカー−ペプチドＬ−Ｅを提供し、
【化１】
2019511497.tif 000003
式中、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つまたは両方は、独立して、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３（ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであるか；あるいはＲ３は、ＯＲ９またはＮＲ９２であり、ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
ＳＲ４（ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）である；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
Ｒ１およびＲ２の１つのみは、Ｈ、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであってもよく；
Ｒ５の一方は、（ＣＨ２）ｙＺ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚまたは（ＣＨ２）ｙＮＨ ＣＯ （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ  ＣＨ２ＣＨ２Ｚ（ここで、ｘは１〜１００、ｙ＝１〜６）であり、他方のＲ５は、Ｈ、又は、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルであり；
Ｚは、不溶性マトリックスへの結合を媒介するための官能基であり、そしてＮＨは、ＧＬＰ−１アゴニストＥのアミノ基の残基である。
【００１３】
一実施形態では、Ｒ１はＣＮまたはＲ３ＳＯ２であり、ここでＲ３はアルキルまたはＲ９２Ｎであり、ここで各Ｒ９はＨ、アルキルまたは置換アルキルであり、一方のＲ５はＨで、他方のＲ５は（ＣＨ２）ｎＺであり、ここでｎ＝１〜６であり、Ｚは官能基（リンカー−ペプチドは該官能基を介してＭに結合することができる）である。
【００１４】
一実施形態では、Ｅは、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（配列番号２）である。本発明はまた、このペプチドおよびその薬学的に許容される塩、その医薬組成物、ならびにＧＬＰ−１アゴニストにより恩恵を受ける症状を有する対象者に、このペプチドをその塩の形態で用いた組成物を投与することを含む、ＧＬＰ−１アゴニストを投与するためのプロトコルを包含する。
【００１５】
第三の態様において、本発明は、式（１）のコンジュゲートを投与するためのプロトコルに関する。一実施形態では、該コンジュゲートは、細いゲージの針を用いる皮下注射に適したヒドロゲルミクロスフェアとして調製される。本発明のコンジュゲートは、ヒトと動物の両方における代謝性疾患および症状の治療に有用であることが期待される。１〜３ヶ月の持続放出用量が達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図１〜６は、本発明の持続放出コンジュゲートの様々な実施形態の概略図である。
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、概略形態の該コンジュゲートの全体図を示す。図１Ａにおいて、構成成分の一方は８アームマクロモノマーであり、他方は４アームマクロモノマーである；ここで、ＧＬＰ−１アゴニストに結合したリンカーは８アームマクロモノマーのアームに連結されている。図１Ｂにおいて、この構造はリンカー−アゴニストの架橋剤自体への結合を提供する。
【図２】図２は、図１Ａにおける結合（ｌｉｎｋａｇｅ）の詳細を示す。
【図３】図３は、異なるマクロモノマーを連結する架橋部分に、リンカー結合アゴニストを結合させるための反応性基を提供する、実施形態の概略図である。
【図４】図４は、リンカーペプチドを結合させた図３のマトリックスを示す。
【図５】図５は、本明細書の実施例４に記載される特定の実施形態を示す。
【図６】図６は、本明細書の実施例４に記載される特定の実施形態を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、投与頻度に対するコンジュゲートデポーからの薬物の放出速度と、設定された最終濃度（Ｃｍｉｎ）を達成するのに必要な相対用量との間の関係を示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、３７℃の２００ｍＭリン酸緩衝液，  ｐＨ７．４中でのエキセナチドおよび［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの安定性を示す。
【図９】図９は、図８Ａおよび８Ｂに示される５６日間のエキセナチド分解反応からの単離されたピーク中のイソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）含量についてのペプチドイソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）アッセイの結果を示す。Ｔ＝０日および５６日でのエキセナチド反応混合物のＩｓｏＡｓｐ測定、ならびに５６日での分解混合物の単離された成分。Ｌ−ＡｓｐおよびＤ−ｉｓｏＡｓｐを含有するペプチドの値は、サンプル中のＨＰＬＣにより検出された少量のＬ−ｉｓｏＡｓｐペプチドについて補正された。ＲＶ  ９．９および１０．４の残留ＰＩＭＴ陽性ピークは、単離されたＨＰＬＣ画分中の低レベルの［Ｌ−ｉｓｏＡｓｐ２８］エキセナチド不純物に起因する。エラーバーは±ＳＤである。
【図１０】図１０は、ヒドロゲルに連結した非改変エキセナチド（Ｒ１＝ＣＮ；Ｒ２＝Ｈ）を投与した後のラットにおけるエキセナチドの薬物動態を示す。エキセナチドのインビトロ放出動態（ｔ１／２＝１４００時間）および既知の薬物動態パラメータの結果に基づいて、予想される濃度対時間曲線を作成した（破線）。実験データ（四角）は、全体的なｔ１／２＝１９０時間であるヒドロゲル上のエキセナチドの分解を説明するモデル（実線）により良く適合する。
【図１１】図１１は、ヒドロゲルに連結した［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを皮下投与した後のラットにおける［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの薬物動態を示す。パネルＡは、ペプチドがＲ１＝ＭｅＳＯ２であるＬを用いて連結されて、ｔ１／２＝３５０時間を与える場合のヒドロゲルを示す。パネルＢは、ペプチドがＲ１＝ＣＮであるＬを用いて連結されて、ｔ１／２＝７６０時間を与える場合のヒドロゲルを示す。したがって、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの血漿レベルは、単回投与後に少なくとも１ヶ月間維持され得る。
【図１２】図１２は、経口ブドウ糖負荷試験におけるエキセナチドおよび［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの比較結果を示す。
【図１３】図１３は、図１２に示される経口ブドウ糖負荷試験データのＡＵＣ分析を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｅは、糖尿病性ＺＤＦラットにおける［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（「ＰＬ−ｃｍｐｄ」）を含むヒドロゲルミクロスフェア製剤の月１回投与の結果を示す。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、実施例８Ａに記載される、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを含むヒドロゲルミクロスフェア製剤の皮下投与後のラット血清における［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの薬物動態を示す。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、実施例８Ｂに記載される、ミクロスフェアコンジュゲートをマウスに皮下注射した後の血清［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ペプチドの月１回の投与を達成するためには、薬物放出のためのデポーとして作用する、循環しない不溶性マトリックスの形態で、ペプチドを供給する必要がある。循環する薬物の巨大分子コンジュゲートは、コンジュゲートそれ自体がその系、例えば血漿そのもの、からクリアランスされるので、満足のいくものではない。したがって、ペプチドは、マクロ規模であるマトリックス内に供給されなければならず、その場合、ペプチド（または他の薬物）は、マトリックスの容積中に１〜１０００ｍｇペプチド／ｍｌマトリックス、好ましくは１〜１００ｍｇペプチド／ｍｌマトリックス、より好ましくは１〜５０ｍｇペプチド／ｍｌマトリックスの濃度で存在する。かくして、マトリックスは識別できる容積のものであり、ミクロスフェアの形態で都合よくかつ集合的に投与され得る。（しかし、「マトリックスの容積」は、ミクロスフェアの用量を含めて、供給される用量の全容積である。）
【００１８】
本発明に含まれる構造体の性質を大局的にとらえるために、本出願人は、本発明の範囲内に入る典型的な実施形態の概要を示す図１〜６を提供する。
【００１９】
本発明によるペプチドが連結された典型的な不溶性ヒドロゲルマトリックスの描写を図１Ａに示す。これは、８アームのマクロモノマーＰのアームの半分が４アームのマクロモノマーＴのアームと架橋されるように、化学量論的にＰをＴと架橋することにより形成されたマトリックスの理想的な構造である。Ｐの残りの非架橋アームはリンカー−ペプチドに連結される。このタイプのヒドロゲルの調製は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１３／０３６８４７に記載されており、調製Ｅに後述するように例示される。
【００２０】
図１Ｂは、放出型リンカー−薬物が分解性架橋剤に連結される代替例を示す。図１Ｂは、４アームマクロモノマーＡ  （Ａの各アームは、直交する第１および第２の官能基を含む基で終結する）と、第２の４アームマクロモノマーＢ  （Ｂの各アームは、マクロモノマーＡの第１または第２の官能基のうちの１つのみと反応性である官能基で終結する）とを架橋することによって形成されたマトリックスの理想的な例示的構造を示す。マクロモノマーＡの残りの官能基は、該マクロモノマーの残りの官能基と反応性である官能基を含むリンカー−ペプチドとの反応に利用可能である。リンカー−ペプチドの結合は、ゲル形成の前にマクロモノマーＡとリンカー−ペプチドとを反応させ、続いてマクロモノマーＢと架橋することによって、またはＡとＢを架橋してヒドロゲルを形成し、続いてリンカー−ペプチドと反応させることによってゲル形成の後に、行うことができる。上記のように、不溶性ヒドロゲルマトリックスを形成するための架橋反応は、バルク材料として、または懸濁液若しくはエマルション中で、微細な粒子状ポリマー、例えば本明細書の実施例２に記載するようなミクロスフェアを形成するように、行うことができる。
【００２１】
図２は、図１Ａに概略を示したように、各Ｐにｎ個のリンカー−ペプチドをさらに含むマトリックス中の８アームマクロモノマーＰと４アームマクロモノマーＴとの間の架橋の一般構造を示す。リンカー−アゴニストがヒドロゲルの架橋剤部分に連結される代替例は、図１Ｂおよび以下の実施例４に記載される。
【００２２】
この代替例の一般的な説明は、図３および図４に示される。図３は、接近可能なアミン基を有する不溶性マトリックスの、シクロオクチン基を導入する試薬による誘導体化の例を示す。この例では、以下の調製Ｄに示されるマトリックスの調製で使用されるマクロモノマーＡが、リシン残基を含む。マクロモノマーＢと架橋することによってマトリックスが形成されると、得られたマトリックスは、例えばシクロオクチン基を導入する試薬との反応による、さらなる官能化に適した接近可能なアミン基を有する。
【００２３】
図４は、放出型リンカー−ペプチドを含む分解性ヒドロゲルの一般構造を示す。２つのマクロモノマーＡおよびＢ（例えば、以下の調製Ｄに示される）を架橋させると、各架橋が放出型リンカー−ペプチドを含むようになる。この図では、各ＡおよびＢが示された架橋によって連結されて不溶性マトリックスを形成する。ＹおよびＺは連結官能基である。
【００２４】
図５および図６は、実施例４で調製される持続放出コンジュゲートにおける結合の構造を示す。図５において、ヒドロゲルマトリックスは、分解をモジュレーターであるビス（２−エトキシ）アミノスルホニルによって制御させた架橋を含み、一方ヒドロゲルからの配列番号２のペプチドの放出はモジュレーターＣＮによって制御される。連結官能基は、シクロオクチンＭＦＣＯへのアジド基の付加により生じるトリアゾールである。
【００２５】
図６は、ヒドロゲル架橋の分解とヒドロゲルからのペプチドの放出の両方がモジュレーターＣＮによって制御され、かつ連結官能基が５−ヒドロキシシクロオクチンへのアジド基の反応から生じるトリアゾールであることを除いて、図５と同じ構造を示す。
【００２６】
マトリックスＭ：
マトリックスＭは、リンカー−ペプチドＬ−Ｅが結合される不溶性支持体であり、この不溶性支持体はリザーバーとして働き、そこからＥが治療期間にわたって放出される。Ｍは、リンカー−ペプチドＬ−Ｅの結合に適していなければならず、そうでなければ、そのような結合を可能にするように誘導体化され得る官能基を含まなければならない。Ｍは、リンカーＬの開裂によってペプチドＥが放出されたら、ペプチドＥの自由拡散を可能にしなければならない。Ｍはさらに、可溶性生成物へと生分解可能でなければならず、また、過剰量の可溶性Ｍ−Ｌ−Ｅ断片を形成することなくＥの放出を可能にするのに十分ゆっくりと分解するが、連続投与シナリオでＥ放出後に残存する薬物フリーのＭ−Ｌの重荷を最小にするように十分迅速に分解する必要がある。
【００２７】
一実施形態において、Ｍは、ＰＣＴ特許公開公報ＷＯ２０１３／０３６８４７およびＵＳ２０１４／０２８８１９０に開示されるように調製される生分解性ヒドロゲルであり、両公開公報は、そのようなヒドロゲルの説明のために参照により本明細書に組み込まれる。これらのヒドロゲルは、分解速度を制御できるβ脱離型架橋剤を含む。したがって、いくつかの実施形態において、架橋剤は、以下のような式（１）または式（２）のものである。
【化２】
2019511497.tif 000004
式中、
ｍは０または１である；
Ｘと、Ｒ１、Ｒ２およびＲ５の１つは、それぞれ、ポリマーに結合するための官能基を含む；
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３（ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；あるいはＯＲ９またはＮＲ９２（ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）である）；
ＳＲ４（ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）である；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
任意の残りのＲ１およびＲ２は、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであり；および
任意の残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルであり、；
あるいは、前記架橋剤は、式（２）のものであり、
【化３】
2019511497.tif 000005
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ５の２つは、ポリマーに結合するための官能基を含む；
ｍは０〜１である；
ｎは１〜１０００である；
ｓは０〜２である；
ｔは２、４、８、１６または３２である；
Ｑは、価数ｔを有するコア基である；
Ｗは、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｓ、
【化４】
2019511497.tif 000006
または
【化５】
2019511497.tif 000007
であり、ここで、Ｒ６は、Ｈ、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいアリールアルキル、または置換されてもよいヘテロアリールアルキルである；
ただし、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つは、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３（ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル；あるいはＯＲ９またはＮＲ９２（ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）である）；
ＳＲ４（ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）である；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
任意の残りのＲ１およびＲ２は、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであり、；および
任意の残りのＲ５は、独立して、Ｈであるか、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐＯ アルキル（ｐ＝１〜１０００）、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルである。
【００２８】
これらの架橋剤をマトリックスに結合させるために使用される官能基としては、以下が挙げられる：Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、ＳＨ、Ｓ−ｔｅｒｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、１，３ ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリレート、アミノオキシ、ケトおよびアクリルアミド。式（１）および（２）の２つの官能基は、互いに異なり、同族体（ｃｏｇｎａｔｅ）ではない。例えば、一方がアジドである場合、他方はシクロオクチンまたはアルキンではない。
【００２９】
Ｌ−Ｅの開裂からのＥ放出の速度よりも数倍遅い速度でＭの分解および可溶化をもたらすβ脱離型架橋剤を選択することにより、可溶性Ｍ−Ｌ−Ｅ断片の形成が最小限に抑えられると同時に、マトリックスの有効な可溶化およびクリアランスが提供される。本発明の一実施形態では、これらのヒドロゲルは、マルチアームポリ（エチレングリコール）を架橋することによって調製される。本発明では、さらに、架橋デキストランおよびヒアルロン酸を含めて、他の有用なマトリックスも考えられる。
【００３０】
そのようなマトリックスは、細いゲージの針を用いた注射に適しているミクロスフェアのスラリーとして有利に調製され得る。こうしたスラリーは、公知の方法を用いて、例えば、バルク相乳化、またはより正確には、プレポリマー混合物のマイクロ流体液滴乳化によって、調製することができる。粒度分布は、必要に応じて、公知の方法により、例えばふるい分け（ｓｉｅｖｉｎｇ）により、細分化することができる。
【００３１】
ペプチドＥ：
本発明によって送達されるペプチド（Ｅ）はＧＬＰ−１アゴニストであり、ＧＬＰ−１アゴニストとは、ＧＬＰ−１受容体に結合して活性化することができるペプチドを意味する。ＧＬＰ−１アゴニストの例には、天然に存在するエキセンジン類、例えば、エキセナチド（エキセンジン−４；配列番号１）、リラグルチド（配列番号１３）、リキシセナチド（配列番号７）、タスポグルチド（配列番号１２）、およびそれらの配列変異体が含まれる。ＧＬＰ−１受容体に結合してそれを活性化する合成配列、例えばインビトロスクリーニングおよび／または選別によって誘導される配列も考えられる（Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ．  （２０１５）  ６：８９１８）。
【００３２】
配列番号１    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［エキセナチド］
配列番号２    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＱＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド
配列番号３    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ａ］エキセナチド
配列番号４    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ｋ］エキセナチド
配列番号５    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ｄ］エキセナチド
配列番号７    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ２
［リキシセナチド］
配列番号８    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＱＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ｑ］リキシセナチド
配列番号９    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ａ］リキシセナチド
配列番号１０    ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＳＫＫＫＫＫＫ−ＮＨ２
［Ｎ２８Ｋ］リキシセナチド
配列番号１１    ＥＬＶＤＮＡＶＧＧＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＱＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＮＨ２
配列番号１２    ＨＵＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＵＲ−ＮＨ２
［タスポグルチド］  Ｕ＝２ アミノイソ酪酸
配列番号１３    ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ＊ＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ−ＯＨ
Ｋ＊＝Ｌｙｓ（ｙ−Ｇｌｕ−パルミトイル）
【００３３】
ペプチドアゴニストＥは、投与期間中に生理学的条件下で化学的に安定であることが不可欠である。これはペプチドの直接投与に関する問題ではないかもしれないが、それらの迅速なクリアランスおよび頻繁な投与を考慮すると、持続放出製剤はペプチドの安定性に対してより厳しい要件を課す。例えば、１４日の半減期で生理学的条件下に分解するペプチドは、該ペプチドのわずか５％が１日で分解するにすぎないので、１日１回の投与に最適であり得る。３０日の持続放出条件下（すなわち、月１回の投与）での同じペプチドは、投与期間の最後までに８０％が分解されてしまうので、不適当であろう。
【００３４】
エキセナチド中に配列Ａｓｎ−Ｇｌｙ、例えばＮ２８−Ｇ２９ジペプチド、を含むペプチドの分解の作用機序を以下に示す。示されるように、最初にＬ−スクシンイミドが形成され、これはアスパラギン残基をアスパラギン酸またはイソアスパラギン酸に変換させる。Ｄ体とＬ体の両方の改変アミノ酸が得られる。
【化６】
2019511497.tif 000008
【００３５】
エキセナチド自体の配列変異体の試験から、Ｎ２８を他のアミノ酸で置換すると、ＧＬＰ−１受容体に結合してそれを活性化する該ペプチドの効力に最小限の影響しか及ぼさずに、持続放出コンジュゲートによる月１回の投与を支持するのに十分な安定性のアゴニストが提供され得ることが明らかにされた。こうして、配列番号１のＮ２８がそれぞれＱ、ＡまたはＫで置換された配列番号２〜４を有するアゴニストは、天然エキセナチドと同等の親和性および効力でＧＬＰ−１受容体に結合してそれを活性化する一方で、１ヶ月間にわたって１０％未満または９％未満の化学的分解を示すことが見出されている。
【００３６】
本発明は、エキセナチド以外の適切に安定化されたＧＬＰ−１アゴニストの使用をさらに企図している。上記の不安定性は、Ａｓｎ−Ｇｌｙジペプチド配列を有する他のＧＬＰ−１アゴニスト、例えばリキシセナチドおよび他の合成ペプチド配列で起こると予想される。これらのペプチドは、上に示したのと同じ一連の分解反応を受けると予想される。本発明において有用なこれらのＧＬＰ−１アゴニストの適切に安定化された形態には、配列番号８〜１１が含まれる。タスポグルチド（配列番号１３）およびリラグルチド（配列番号１４）は、不安定なＡｓｎ−Ｇｌｙジペプチドを含まず、本発明での使用に適している。不安定性の他の原因も修正することができる。本発明のアゴニストでは、安定化された形態は、ｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月後に１０％未満の分解生成物、好ましくはｐＨ７．４、３７℃で１ヶ月後に９％未満の分解生成物を生じる。
【００３７】
開裂型リンカーＬ：
開裂型リンカーはＧＬＰ−１アゴニストＥを不溶性マトリックスＭに連結し、かつ生理学的条件下で開裂して遊離のＥを放出する。リンカー開裂の速度は、ペプチドの有効半減期を決定し、所望の投与頻度に基づいて選択される。さらに、マトリックスの分解速度およびペプチドの放出速度を所望の投与頻度と調和させることが重要である。以前には、これらの特徴のバランスをとる試みはなされたことがなく、こうしたバランスは、月１回またはより少ない頻度での投与を可能にする上で、本発明の組成物の成功にとって必要である。このバランスを結果的に達成させるリンカーはどれも満足できるものである。薬物の放出速度とマトリックスの脱ゲル化（ｄｅｇｅｌａｔｉｏｎ）速度との間の関係についての堅苦しい規則はないが、便利な経験則として、脱ゲル化速度は遊離ペプチドの放出速度の約３倍でなければならない。脱ゲル化が起こる前にペプチドがあまりにも速く放出される場合、その後の投与の時点で対象者にゲルの沈着物が残される。放出が脱ゲル化速度に比べて遅すぎる場合には、循環へと放たれたゲルの部分にペプチドが結合したままである。いずれの状況も望ましいことではない。この関係は、Ｒｅｉｄ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  （２０１５）  ４８：７３５９−７３６９に記載されている。種々のマトリックスの脱ゲル化速度を決定づける構造的特徴は、架橋部分に依存しており、構造相関を用いてマトリックスの適切な脱ゲル化速度を提供することができる。
【００３８】
分解速度と放出速度のバランスは、以下のように視覚化される：
共有結合リンカーの開裂によるデポーからの比較的迅速にクリアランスされる薬物の放出は、血漿中の薬物の半減期にリンカー開裂の半減期を付与する。投与頻度は薬物血漿半減期に依存するので、リンカー開裂速度と投与頻度との間の関係もまた存在する。過剰に高い薬物濃度から生じる毒性の可能性を低減すると同時に、次回の服用までの効能に必要な量を維持するために、典型的には、患者が暴露される薬物の最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）と最小血漿濃度（Ｃｍｉｎ）との間の差を最小にすることが望ましい。
【００３９】
例えば、投与頻度を薬物の血漿半減期に等しく設定する場合、ＣｍａｘとＣｍｉｎとの間には２倍の差があり、一方薬物を２血漿半減期ごとに１回投与する場合、その差は４倍に増加する。したがって、Ｃｍａｘを最小にするために、服用と服用の間の薬物半減期の数を最小にすることが通例である。持続放出コンジュゲートの場合、これは放出速度を減少させることによって達成される。
【００４０】
しかし、持続放出コンジュゲートでは、デポーからの薬物の定常状態レベルは、放出速度に反比例する。コンジュゲートからの薬物の放出速度を遅くすることによってＣｍａｘ／Ｃｍｉｎ比を任意に下げることができるが、許容される用量を使用しつつＣｍｉｎの一定値を維持する必要性は、このアプローチに制限を加える。単回投与の場合、用量（ｄｏｓｅ）は、次式：
【数１】
2019511497.tif 000009
によって算出することができ、ここで、ＣＬ＝薬物クリアランス速度、Ｆ＝バイオアベイラビリティ、ｋ１＝コンジュゲートデポーからの薬物放出の速度、ｔｍｉｎ＝Ｃｍｉｎに達するまでの時間。この式から、所与のｔｍｉｎの間Ｃｍｉｎを維持するのに必要な最低用量は、ｋ１＝１／ｔｍｉｎのときに達成されることが示される。言い換えると、これは薬物放出半減期（＝ｌｎ（２）／ｋ１）＝ｌｎ（２）＊ｔｍｉｎである場合である。したがって、特定の投与頻度に対する最適な薬物放出半減期は、ｌｎ（２）＊（投与間隔）として与えられる。放出半減期が最適よりも短い場合には、ｔｍｉｎに達する前にデポーが枯渇するために、必要とされる用量が増加する。
【００４１】
一般的に言えば、最適よりも遅い薬物放出速度は、速すぎる薬物放出速度よりも許容される。したがって、薬物放出速度が月１回の投与を支持するコンジュゲートはまた、２週に１回または週１回の投与計画にも有用であり得る。さらに、薬物放出速度とＣｍｉｎを維持するのに必要な用量との間の関係は、理想からの多少のずれが許容されるようなものである。これは、図７Ａおよび図７Ｂに上記のパラメータに従って描写される。図７Ａに示すように、最適用量（１）は、投与頻度に対する放出半減期の比がｌｎ（２）＝０．６９３である場合に観察される。図７Ａのこの描写は、投与量レベルに応じて許容され得る放出速度の範囲を示す。より高い投与量レベルは、必要最低限以上の濃度が依然として維持されるので、より高い放出速度を許容する上に、薬物がこのより長い時間にわたってより高いレベルで提供されるので、より低い放出速度をも許容するだろう。具体的には、投与量を最大１０％まで増やす場合には、投与頻度の０．４５倍〜１．１倍の放出半減期が許容される。投与量を最大２０％まで増やすことができる場合には、投与頻度の０．４倍〜１．４倍の放出半減期が許容される。投与量を最大５０％まで増やすことができる場合には、投与頻度の０．３倍〜２倍の放出半減期が許容される。
【００４２】
図７Ｂに示すように、詳細には、１ヶ月間持続する単回投与（ｔｍｉｎ＝７２０時間）の場合、最適な薬物放出速度は５００時間であるが、約１０％の用量増加により３２０〜８００時間、約２０％の用量増加により２８０〜１０００時間、または約５０％の用量増加により２２０〜１４４０時間の任意の放出速度を使用することもできる。同様に、３ヶ月間持続する単回投与（ｔｍｉｎ＝７２０時間）では、最適な薬物放出速度は１５００時間であるが、約１０％の用量増加により３２０〜２４００時間、約２０％の用量増加により８４０〜３０００時間、または約５０％の用量増加により６６０〜４３５０時間の任意の放出速度を使用することもできる。２週間持続する単回投与（ｔｍｉｎ＝３３６時間）では、最適な薬物放出速度は２３０時間であるが、約１０％の用量増加により１５０〜３８０時間、約２０％の用量増加により１３０〜４７０時間、または約５０％の用量増加により１００〜６８０時間の任意の放出速度を使用することもできる。
【００４３】
同様に、反復投与シナリオにおいて定常状態でＣｍｉｎ以上に薬物濃度を維持するために必要な用量（ｄｏｓｅ）は、次式：
【数２】
2019511497.tif 000010
として示される。
【００４４】
反復投与のシナリオでは、上記のような最適用量は存在せず、むしろ必要な用量は放出速度の低下とともに減少する。なぜなら、薬物の比較的高い割合が前回の用量から残っており、したがって存在する総薬物デポーを増加させるからである。
【００４５】
しかしながら、生分解性マトリックスからの薬物含有ゲル断片の放出を最小限にする必要性、患者への総デポー負荷を最小限に抑えたいという要望、および定常状態の薬物レベルを達成するための時間の増加を考えると、用量を減らすためのより遅い放出速度の使用には実際的な限界がある。
【００４６】
一実施形態において、開裂型リンカーＬは、式（３）を有し、
【化７】
2019511497.tif 000011
式中、
Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つまたは両方は、独立して、ＣＮ；ＮＯ２；
置換されてもよいアリール；
置換されてもよいヘテロアリール；
置換されてもよいアルケニル；
置換されてもよいアルキニル；
ＣＯＲ３またはＳＯＲ３またはＳＯ２Ｒ３（ここで、Ｒ３は、Ｈまたは置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルであるか；あるいはＲ３は、ＯＲ９またはＮＲ９２であり、ここで、各Ｒ９は、独立して、Ｈまたは置換されてもよいアルキルであるか、両方のＲ９基は、それらが結合している窒素と一緒になって複素環を形成する）；
ＳＲ４（ここで、Ｒ４は、置換されてもよいアルキル；それぞれ置換されてもよいアリールまたはアリールアルキル；それぞれ置換されてもよいヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである）である；
Ｒ１およびＲ２は、結合して３〜８員環を形成していてもよく；
Ｒ１およびＲ２の１つのみは、Ｈ、または、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アリールアルキル若しくはヘテロアリールアルキルであってもよく；
Ｒ５の一方は、（ＣＨ２）ｙＺ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２Ｚまたは（ＣＨ２）ｙＮＨ ＣＯ （ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ  ＣＨ２ＣＨ２Ｚ（ここで、ｘは１〜１００、ｙ＝１〜６）であり、他方のＲ５は、Ｈ、又は、それぞれ置換されてもよい、アルキル、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール若しくはヘテロアリールアルキルであり；および
Ｚは、マトリックスへの結合を媒介するための官能基である。
【００４７】
このようなリンカーは、β脱離によって開裂する。本発明の好ましい実施形態では、Ｒ１はＣＮまたはＲ３ＳＯ２であり、ここでＲ３は置換若しくは非置換アルキルまたはＲ９２Ｎであり、ここで各Ｒ９は独立して置換または非置換アルキルであり；Ｒ２はＨであり；一方のＲ５は（ＣＨ２）ｙＺで、他方のＲ５はＨである。ＺはＮ３、ＳＨ、ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＯＮＨ２、またはＯ−ＮＨ２である。特に好ましい実施形態では、Ｒ１はＣＮまたはＣＨ３ＳＯ２であり、かつ／またはＺはＮ３である。
【００４８】
他のタイプの開裂型リンカー、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００６／１３６５８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような、酵素的または非酵素的加水分解によって開裂するリンカーを使用することができる。唯一の必要条件は、リンカーの開裂速度が上記のような必要な投与計画に適切であることである。
【００４９】
本発明の一実施形態では、リンカーは、月１回の投与を支持するのに適した生理学的条件下での半減期で開裂して、Ｅを放出する；すなわち、リンカーは２２０〜１４４０時間の半減期で開裂し、Ｅを放出する。より好ましい実施形態では、リンカーは２８０〜１０００時間、さらに好ましくは３２０〜８００時間の半減期で開裂し、Ｅを放出する。本発明の他の実施形態では、リンカーは、３ヶ月に１回または２週に１回の投与を支持するのに適した生理学的条件下での半減期で開裂して、Ｅを放出する。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、リンカーＬは、Ｒ１がＣＮである式（５）を有する。実施例５に示すように、このリンカーはラットにおいてヒドロゲルから７６０時間の半減期でペプチドを放出する。
【００５１】
別の特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｒ１がＣＨ３ＳＯ２である式（５）を有する。実施例５に示すように、このリンカーはラットにおいてヒドロゲルから３５０時間の半減期でペプチドを放出する。
【００５２】
リンカーＬは、ＬのＣ＝Ｏ基とＥのアミノ基との間のカルバメート結合の形成を介してペプチドＥに連結される。アミノ基は、Ｎ末端のα−アミノ基またはリシン側鎖のε−アミノ基のいずれであってもよい。両方を調製するための方法は当技術分野で公知である。一実施形態では、Ｌはペプチドの固相合成中にＥのα−アミノ基に結合される。
【００５３】
リンカーＬは基Ｚをさらに含み、基Ｚは、ペプチドＥ上の官能基の存在下で適合性でありかつ選択的である化学反応を用いて、マトリックスへのリンカー−ペプチドＬ−Ｅの結合を可能にする。Ｚはアジドであり得、この場合、Ｌ−Ｅは、１，２，３−トリアゾール結合を形成する１，３−双極子付加環化反応、またはアミドを形成するホスフィン媒介Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションのいずれかを用いて、マトリックスに連結される；両反応とも当技術分野で十分に解説されている。付加環化反応は、アルキン誘導体化マトリックスへの銅触媒付加、またはシクロオクチン若しくはビシクロノニン誘導体化マトリックスへのひずみ促進（ｓｔｒａｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ）付加のいずれであってもよい。また、Ｚはアミノオキシまたはアミノオキシ−アセトアミド基とすることもでき、この場合、Ｌ−Ｅはオキシム化反応を用いてケト誘導体化マトリックスに連結される。あるいは、Ｚ自体が、マトリックス上のアミノオキシ基に連結する、ケト基であってもよい。また、Ｚはチオール基であり得、この場合、Ｌ−Ｅはチオエーテルの形成を介してハロアセチル誘導体化、マレイミド誘導体化、またはエポキシ誘導体化マトリックスに連結される。
【００５４】
したがって、Ｌをマトリックスに結合させるために使用される官能基としては、以下が挙げられる：Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、ＳＨ、Ｓ−ｔｅｒｔＢｕ、マレイミド、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２−ｔｅｒｔＢｕ、１，３ ジエン、シクロペンタジエン、フラン、アルキン、シクロオクチン、アクリレート、アミノオキシ、ケトまたはアクリルアミド。
【００５５】
コンジュゲートの調製：
コンジュゲートは、ペプチドＥと、開裂型リンカーＬと、マトリックスＭとを連結することによって調製される。一実施形態では、この連結はペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）で行われ、連結の順序は特に決まっていない。したがって、ペプチドＥを、最初にリンカーＬに連結し、得られたＬ−ＥをマトリックスＭに連結することができる。あるいは、リンカーＬをマトリックスＭに連結し、次いでＥをＭ−Ｌに連結してもよい。Ｍがモノマー単位の重合によって調製されるマトリックスである場合には、Ｍ−ＬまたはＭ−Ｌ−Ｅは、重合反応において架橋性モノマー−Ｌまたはモノマー−Ｌ−Ｅ単位を使用することによる重合プロセスの結果であってもよい。
【００５６】
生物学的使用のために、コンジュゲートは、無菌状態および内毒素汚染についての厳しい基準を満たさなければならない。いくつかの場合には最終滅菌プロセスを使用することが可能であり得るが、一般的に、本発明のコンジュゲートはこれに適していない。例えば、不溶性ヒドロゲルもまた、滅菌濾過に適していない。したがって、本発明のコンジュゲートは、無菌条件下で調製されることが望ましい。コンジュゲートは、注射可能なミクロスフェア懸濁液として調製されるか、またはモノマー単位の同時注入によってその場で形成され得る。
【００５７】
製剤：
前記コンジュゲートは、注射可能性および貯蔵安定性を改善するために、標準的な薬学的に許容される緩衝液および医薬用添加剤を用いて製剤化することができる。典型的な製剤には、ｐＨを４〜７、好ましくは５〜６に維持するための緩衝液が含まれる。医薬用添加剤は、ペプチド薬物のための安定化剤、例えば、抗菌剤および／または酸化防止剤（例：ｍ−クレゾール）、等張化剤（例：マンニトールのようなポリオール）、ならびに粘度降下剤（例：タウリン、テアニン、サルコシン、シトルリンおよびベタイン）を含むことができる。
【００５８】
使用方法：
本発明のコンジュゲートは、ＧＬＰ−１アゴニストの投与が有効であることが知られているヒトおよび動物の代謝性の疾患および症状（２型糖尿病、メタボリックシンドローム、および肥満を含むが、これらに限定されない）の治療に有用である。大幅に増加した有効半減期により、月１回の投与が可能となり、したがって患者のコンプライアンスが改善され（飲み忘れを未然に防ぐ）、かつ患者の生活の質（ＱＯＬ）が向上する。投薬は優先的に皮下注射によって行われ、オートインジェクター（ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ）を用いて実施することができる。
【００５９】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６０】
調製Ａ
エキセナチドのインビトロ分解
２００ｍＭ  ＮａＰｉ，  ｐＨ７．４中の２．４ｍＭエキセナチド（１ｍＬ）、０．１％ＮａＮ３および内部標準としての２００μＭ  Ｌｙｓ（ＤＮＰ）ＯＨの溶液を３７℃に保った。間隔をおいて、５０μＬアリコートを取り出し、アッセイまで−２０℃で凍結させた。種々のサンプルを解凍し、ａ）ＨＰＬＣにより、ｂ）ＧＬＰ１Ｒアゴニスト活性について、およびｃ）タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ活性について分析した。５６日間インキュベートしたサンプルをＨＰＬＣにかけ、ＲＶ  ９．９、１０．４および１０．８のサンプルを回収し、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度、ＧＬＰ１Ｒアゴニスト活性およびＰＩＭＴ活性について個々に分析した。
【００６１】
（ａ）  エキセナチドの脱アミドの時間に対するＨＰＬＣプロファイルを図８Ａ〜８Ｃに示す。５６日間の反応からの各ピークをＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。パネルＡは、天然エキセナチドについて０日（最上位）、７日、２８日および５６日（最下位）に得られたＨＰＬＣトレースを示す。エキセナチドの最初の単一ピークは、数種の分解生成物のピークによって徐々に置き換えられる。パネルＢは、パネルＡのデータから誘導されるエキセナチドの分解の経時変化を示す。エキセナチド（四角）の減少および主要な分解生成物の増加は、約１０日のｔ１／２を示す。パネルＣは、パネルＡのエキセナチドについてのＨＰＬＣトレースに対応する、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドで得られたＨＰＬＣトレースを示す。単離された分解生成物の分析用ＨＰＬＣは、Ｌ−ＡｓｐおよびＤ−ｉｓｏＡｓｐのピークがそれぞれ約７％および１２％の汚染ＩｓｏＡｓｐを含んでいたことを示した；単離されたＩｓｏＡｓｐは単一のピークを示した。
【００６２】
（ｂ）  ＧＬＰ１Ｒ  ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）バイオアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）により、ＧＬＰ−１受容体活性化について時間点を分析した。ＥＣ５０値を以下の表１に要約する。
【００６３】
【表１】
2019511497.tif 000012
【００６４】
脱アミド混合物から単離されたＡｓｐペプチドは、干渉する可能性があるｉｓｏＡｓｐペプチドを少量含んでいたが、合成［Ａｓｐ２８］エキセナチドは、エキセナチドに匹敵するアゴニスト活性を示した。５６日間の脱アミド反応で形成されたＤ−ｉｓｏＡｓｐの量は非常に少なく（約１２％）、その混合物のアゴニスト活性に有意に寄与することはない。
【００６５】
（ｃ）  イソアスパラギン酸の存在をアッセイするために、タンパク質イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）アッセイを、供給業者（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって推奨されるＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）イソアスパラギン酸検出キットを用いて実施した。ｔ＝０日およびｔ＝５６日のサンプル混合物、ならびにｔ＝５６日の混合物から精製した個々のサンプルを、ｉｓｏＡｓｐペプチドについてアッセイした。図９は、ａ）  全混合物において形成された、およびｂ）  ＲＶ１０．８を有するピークから少量の汚染ｉｓｏＡｓｐについて補正された、単離されたピークＲＶ９．９およびＲＶ１０．４において形成された、ＡｄｏＨＣｙｓ／ペプチド比活性を示す。
【００６６】
調製Ｂ
エキセナチド類似体の調製
エキセナチドのＡｓｎ２８のＡｌａ、Ａｓｐ、ＧｌｎおよびＬｙｓによる置換体を、ＳＰＰＳによって調製した。全ての［Ｘａａ２８］エキセナチドは、ＧＬＰ−１ＲＡアッセイにおいてエキセナチド（１７ｐＭ）に匹敵するＥＣ５０値（１７〜４１ｐＭ）を有していた。これらの［Ｘａａ２８］エキセナチドの２００ｍＭ  Ｐｉ，  ｐＨ７．４中３７℃での長期インキュベーション（約３ヶ月）後、［ｉｓｏＡｓｐ２８］エキセナチドにゆっくりと異性化された［Ａｓｐ２８］エキセナチドを除き、主要な新しいピークは観察されなかった。低ペプチド濃度（約０．２ｍＭ）では、容器表面への非特異的吸着と一致して、Ａ２８０においてわずかな損失が観察された。２ｍＭ  ［Ｇｌｎ２８］エキセナチドでは、ペプチド損失のｔ１／２が≧３０週と見積もられた。したがって、［Ｇｌｎ２８］エキセナチドは生理学的条件下で非常に安定である。３０週のｔ１／２は１ヶ月で９％未満の損失を与えるであろう。
【００６７】
調製Ｃ
エキセンジン類似体のインビトロ受容体結合および活性
ＧＬＰ−１受容体を活性化する種々のエキセナチド類似体の能力を、ｃＡＭＰアッセイ（ＧＬＰ１Ｒ  ｃＡＭＰ  Ｈｕｎｔｅｒ（商標）バイオアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社））を用いて評価した。Ｎ２８Ｄ、Ｎ２８Ａ、Ｎ２８Ｋ、およびＮ２８Ｑ類似体は、エキセナチドに匹敵する能力を有することが判明した。
類似体        ＥＣ５０ 
エキセナチド    ２９ｐＭ
Ｎ２８Ｄ          ４１
Ｎ２８Ａ          ２５
Ｎ２８Ｋ          ３５
Ｎ２８Ｑ          １７
【００６８】
分解生成物の混合物（図８Ａ、５６日）をｃＡＭＰアッセイで試験したとき、それは出発エキセナチド（図８Ａ、０日）と同等のＥＣ５０を有していた。同様に、該混合物から精製された推定上の［ＩｓｏＡｓｐ］２８および［Ａｓｐ］２８エキセナチドならびに合成［Ａｓｐ］２８エキセナチドは、エキセナチドと類似したＥＣ５０値を示した。しかしながら、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂ）で試験した場合、単離された脱アミド生成物および合成［Ｎ２８Ｄ］エキセナチドは、大幅に減少した親和性を示した（ＥＣ５０  エキセナチド，  ０．２ｎＭ；Ｎ２８Ａ＝６ｎＭ；Ｎ２８Ｑ＝１０ｎＭ；Ｎ２８Ｄ＞１００ｎＭ；Ｎ２８Ｋ＞１００ｎＭ）。したがって、主要な分解生成物はエキセナチドと同等のアゴニスト活性を有するが、血清エキセナチドに使用されるＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＥＬＩＳＡアッセイでは測定されなかったであろう。
【００６９】
調製Ｄ
分解性ミクロスフェアの調製
マクロモノマーＡの調製
（ａ）  ５ｍＬのアセトニトリル中の１−（ビス−（２−メトキシエチル）アミノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルスクシンイミジルカーボネート（ＷＯ２０１３／０３６８４７に記載の方法を用いて製造；１．１２ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｍＬの水と５ｍＬのアセトニトリル中のＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ  （３００ｍｇ，  １．２２ｍｍｏｌ）およびＮａＨＣＯ３  （４２０ｍｇ，  ５．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。０．５時間後、この溶液を真空下で濃縮してアセトニトリルを除去し、１Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。抽出物を水およびブラインで洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発させて粗Ｎａ−［１−（ビス−（２−メトキシエチル）アミノスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルオキシ）カルボニル］−Ｎｅ−（ＢＯＣ）−リシン（「アジド−リンカー［ｍｏｄ］−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ」）を得た。
【００７０】
この方法に従って、モジュレーターがビス−（２−メトキシエチル）アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、シアノ、メチルスルホニル、４−メチルピペリジニルスルホニル、モルホリノスルホニルまたはフェニルスルホニルであるアジド−リンカー［ｍｏｄ］−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを調製した。
【００７１】
（ｂ）  上記の粗アジド−リンカー［ｍｏｄ］−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１３８ｍｇ，  １．２ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（キシレン中の６０重量％溶液０．５ｍＬ）で２時間処理した。その混合物をろ過し、ヘキサン中のアセトンの勾配を用いてＳｉＯ２でのクロマトグラフィーにかけて、スクシンイミジルエステルであるアジド−リンカー［ｍｏｄ］−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＳｕを得た。
【００７２】
この方法に従って、モジュレーターがビス−（２−メトキシエチル）アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、シアノ、メチルスルホニル、４−メチルピペリジニルスルホニル、モルホリノスルホニルまたはフェニルスルホニルであるアジド−リンカー［ｍｏｄ］−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＳｕを調製した。
【００７３】
（ｃ）  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８０ｍＭ，  ０．８ｍｍｏｌ，  ２当量）を含むアセトニトリル中の２０ｋＤａ  ４アームＰＥＧ−テトラアミンの溶液（１０ｍＬ，  ２００ｍｇ／ｍＬ，  ４０ｍＭアミン，  ０．４ｍｍｏｌ，  １当量）を、アセトニトリル中のアジド−リンカー［ｍｏｄ］−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＳｕの溶液（３．３ｍＬ，  １４５．５ｍＭ，  ０．４８ｍｍｏｌ，  １．２当量）で処理した。得られた混合物を室温で１時間維持し、次いで０．０１０ｍＬサンプルを、標準物質としてＰＥＧ−テトラアミンを用いてＴＮＢＳアッセイによりアミン含量について評価した；典型的には出発アミンの＜１％が残存する。次いで、この反応物を無水酢酸（４０．８ｍｇ，  ０．０３７８ｍＬ，  ０．４ｍｍｏｌ，  １当量）で１５分間処理してから、真空下で粘性シロップ（約４ｍＬ）へと濃縮し、これをＭＴＢＥ（３５０ｍＬ）にゆっくりと添加した。得られた懸濁液を１時間撹拌し、次いで沈殿物をろ過により回収し、ＭＴＢＥ（１５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させてマクロモノマーＡを白色固体として得た。
【００７４】
この方法に従って、モジュレーターがビス−（２−メトキシエチル）アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、シアノ、メチルスルホニル、４−メチルピペリジニルスルホニル、モルホリノスルホニルまたはフェニルスルホニルであるマクロモノマーＡを調製した。
【００７５】
マクロモノマーＢの調製
４ｍＬのスクリュートップバイアルにＰＥＧ２０ｋＤａ−［ＮＨ２］４  （ＳｕｎＢｒｉｇｈｔ  ＰＴＥ−２００ＰＡ；  １５０ｍｇ，  ７．６μｍｏｌ  ＰＥＧ，  ３０．２μｍｏｌ  ＮＨ２，  １．０当量，  最終アミン濃度２０ｍＭ）、ＭｅＣＮ  （１．５ｍＬ）、およびｉＰｒ２ＮＥｔ  （７μＬ，  ４０μｍｏｌ，  １．３当量，  最終濃度２７ｍＭ）を投入した。活性化エステルシクロオクチン（３９μｍｏｌ，  １．３当量，  最終濃度２７ｍＭ）の溶液を加え、その反応混合物を周囲温度で撹拌した。反応をＣ１８  ＨＰＬＣ  （１１分かけて２０〜８０％のＢ）でＥＬＳＤによりモニタリングした。完了したら、反応混合物にＡｃ２Ｏ  （３μＬ，  ３０μｍｏｌ，  １当量／出発ＮＨ２）を添加し、その混合物を３０分間撹拌した。次いで、反応混合物を濃縮して濃厚なオイルとし、ＭＴＢＥ  （２０ｍＬ）中に懸濁させた。得られた懸濁液を１０分間激しく撹拌した。激しく混合し、遠心分離機（２８００ｒｐｍ，  ４℃，  １０分）でペレット化し、上清をピペットで除去することにより、得られた固形物をＭＴＢＥ  （２０ｍＬ）で３回トリチュレートした。得られた固体を周囲温度で真空下に３０分間だけ乾燥させた。２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  （ｐＨ５）中に２０ｍＭの標的アミン濃度でストック溶液を調製した。次いで、シクロオクチン濃度を、ＰＥＧ７−Ｎ３  （２当量）で処理し、未反応ＰＥＧ７−Ｎ３をＤＢＣＯ−ＣＯ２Ｈで逆滴定することによって確認した。
【００７６】
この手順を用いて調製されるマクロモノマーには、シクロオクチン基がＭＦＣＯ、５−ヒドロキシシクロオクチン、３−ヒドロキシシクロオクチン、ＢＣＮ、ＤＩＢＯ、３−（カルボキシメトキシ）シクロオクチン、および３−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロオクチンであるマクロモノマーが含まれる。こうしたマクロモノマーは、ＭＦＣＯペンタフルオロフェニルエステル、５−（（４−ニトロフェノキシ−カルボニル）オキシ）シクロオクチン、３−（４−ニトロフェノキシカルボニル）オキシシクロオクチン、ＢＣＮヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、ＤＩＢＯ  ４−ニトロフェニルカーボネート、３−（カルボキシメトキシ）シクロオクチンスクシンイミジルエステルまたは３−（ヒドロキシエトキシ）シクロオクチン４−ニトロフェニルカーボネートを用いて調製される。
【００７７】
調製Ｅ
図１Ａの例示的なヒドロゲルの調製
誘導体化された８アームマクロモノマーＰは、次のように調製される：
マクロモノマーＰは８アームＰＥＧであり、各アームがシクロオクチンで終結している。２ｍＬのＤＭＦ中の２００ｍｇの４０ｋＤａ  ８アームＰＥＧ−アミン・ＨＣｌ  （ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；  ４０μｍｏｌ  ＮＨ２）、２０ｍｇのＢＣＮ  ｐ−ニトロフェニルカーボネート（ＳｙｎＡｆｆｉｘ社；  ６３μｍｏｌ）、および２０μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５μｍｏｌ）の溶液を周囲温度で１６時間撹拌した。０．１Ｍ  ＫＰｉ，  ｐＨ７．５中の１００ｍＭタウリン０．５ｍＬで１時間クエンチした後、その混合物を、１２ｋＤａメンブレンを用いて水、１：１メタノール／水およびメタノールに対して順次透析した。蒸発後、残渣を２ｍＬのＴＨＦに溶解し、１０ｍＬのメチルｔ−ブチルエーテルで沈殿させた。その生成物を回収して乾燥させた（１９０ｍｇ）。他のシクロオクチンを含むマクロモノマーＰは、適切な活性化シクロオクチンを用いることにより、同様に調製することができる。
【００７８】
誘導体化された４アームマクロモノマーＴは、次のように調製される：
Ｔは４アームＰＥＧを含み、各アームが放出型リンカー−アジドで終結している。１ｍＬのＡＣＮ中の２５μｍｏｌのアジド−リンカー−スクシンイミジルカーボネート（ＷＯ２０１３／０３６８４７に記載の方法を用いて調製した）の溶液を、１ｍＬの水および４０μＬの１．０Ｍ  ＮａＨＣＯ３  （４０μｍｏｌ）中の５μｍｏｌ  （１００ｍｇ）の２０ｋＤａ  ４アームＰＥＧ−アミン塩酸塩（ペンタエリスリトールコア，  ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の混合物に添加した。周囲温度で１時間後、その溶液を１Ｌの５０％メタノール、続いて１Ｌのメタノールに対して透析した（１２〜１４ｋ  ＭＷＣＯ）。蒸発後、残渣（１０９ｍｇ）を２．１２ｍＬの滅菌ろ過した１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，  ｐＨ５．０中に溶解し、−２０℃で凍結保存した。ＤＢＣＯ−酸との反応によって決定されたアジド濃度は９．５ｍＭであった。別のモジュレーターを有するリンカー−アジドを含むマクロモノマーＴは、適切なアジド−リンカー−スクシンイミジルカーボネートを用いて同様に調製することができる。
【００７９】
ペプチド放出性ヒドロゲルは、誘導体化されたマクロモノマーから、少なくとも２つの異なる方法で調製することができる。
【００８０】
（ａ）  一実施形態では、不溶性ヒドロゲルマトリックスの形成前にリンカー−ペプチドをマクロモノマーＰに結合させる。本明細書の実施例１に例示される式（４）のアジド−リンカー−ペプチドを、Ｐのアームのある部分がリンカー−ペプチドで誘導体化されるような化学量論でマクロモノマーＰと混合する。次いで、得られた物質を、Ｐの残りのアームとマクロモノマーＴのアームとを反応させるのに十分なマクロモノマーＴを用いて架橋して、不溶性マトリックスを形成させる。したがって、式（４）のアジド−リンカー−ペプチドのｎモルが、適切な溶媒、典型的には緩衝化水性媒体中で、マクロモノマーＰのｎ／（８ｆ）モルと混合される；ここで、ｆ＝リンカー−ペプチドによるアームの所望の部分的負荷（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｌｏａｄｉｎｇ）（すなわち、アームの５０％負荷では、ｆ＝０．５）である。アジド−リンカー−ペプチドを十分な時間反応させた後、得られた溶液をｎ（１／ｆ−１）／４モルのマクロモノマーＴと混合して不溶性ヒドロゲルマトリックスを形成させる。典型的には、ｆは、ヒドロゲルマトリックス中の各Ｐ残基に対して＞３個の架橋アームが存在するように選択される（ｆ＜０．６２５）。不溶性ヒドロゲルマトリックスを形成するための架橋反応は、微細な粒子状ポリマー、例えば本明細書の実施例２に記載されるようなミクロスフェア、を形成するように、バルク材料として、または懸濁液若しくはエマルション中で実施することができる。
【００８１】
（ｂ）  あるいは、不溶性ヒドロゲルマトリックスを調製し、その後でリンカー−ペプチドを結合させることができる。マトリックス中の各Ｐマクロモノマー残基につき８ｆ当量のリンカー−ペプチドを含む最終ヒドロゲルでは、ｎ／（８ｆ）モルのマクロモノマーＰとｎ（１／ｆ−１）／４モルのマクロモノマーＴとの反応により不溶性ヒドロゲルマトリックスが形成される。不溶性ヒドロゲルマトリックスを形成するための架橋反応は、微細な粒子状ポリマー、例えば本明細書の実施例２に記載されるようなミクロスフェア、を形成するように、バルク材料として、または懸濁液若しくはエマルション中で実施することができる。次いで、リンカー−ペプチドが該マトリックスに共有結合されるように、重合したマトリックスを少なくともｎモルの式（４）のアジド−リンカー−ペプチドの溶液と反応させる。未反応のアジド−リンカー−ペプチドをマトリックスから洗浄すると、ペプチド放出性ヒドロゲルが得られる。
【００８２】
実施例１
式（４）のアジド−リンカー−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの調製
式中、Ｒ１＝ＣＮまたはＭｅＳＯ２；Ｒ２＝Ｈ；一方のＲ５＝Ｈおよび他方のＲ５＝（ＣＨ２）５Ｎ３；Ｅ＝Ｎα−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド
ペプチドは、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（登録商標）ペプチド合成装置でＣｈｅｍｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５ｍｅｑ（ミリ当量）／ｇ）を用いて標準固相法により合成した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（カップリングあたり５当量）を、周囲温度でＤＭＦ中のＨＣＴＵ（カップリングあたり４．９当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（カップリングあたり１０当量）を用いて、ペプチド鎖のＮ末端にダブルカップリングさせた。ＤＭＦ中の２０％の４−メチルピペリジンを用いてＦｍｏｃ基を除去した。［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを脱保護し、トリフルオロ酢酸／トリイソプロピルシラン／ジチオスレイトール９５：２．５：２．５を用いて樹脂から切断した。
【００８３】
粗製の［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（２２ｍｇ）は、Ｐｅａｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＨｉＱ（登録商標）５μ  Ｃ１８カラム（５０×２０ｍｍ  ＩＤ）を装備したＳｈｉｍａｄｚｕ（商標）ＬＣ−２０ＡＤシステムを使用し、水（０．１％ＴＦＡ）中の３０％〜６０％ＭｅＣＮ  （０．１％ＴＦＡ）の直線勾配で溶出して、セミ分取（ｓｅｍｉ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）スケールで精製した。分析用Ｃ１８  ＨＰＬＣで判定して、最も純粋な画分を一緒に合わせ、約４０％まで濃縮してＭｅＣＮを除去し、凍結乾燥して［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（６．４ｍｇ，  １．４ｍｍｏｌ）をフワフワした白色固体として得た。２８０ｎｍで測定したＣ１８  ＨＰＬＣ純度：８６％純粋（ＲＶ＝９．４分）；［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド；ｍ／ｚ＝４２００。
【００８４】
ペプチドの樹脂上でのＮ末端カルバモイル化は、以前に記載された方法（３月１日オンライン公開前のＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｅ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｏｎｇ．  Ｃｈｅｍ  （２０１６））の変法により実施され、以下に例示される。
【００８５】
Ｎα−（７−アジド−１−シアノ−２−ヘプチルオキシカルボニル）−［Ｇｌｎ２８］エキセナチド
セプタム付きキャップを備えた１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ内で、ＮＨ２［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（遊離αアミン）  Ｃｈｅｍｍａｔｒｉｘ（登録商標）  Ｒｉｎｋアミド樹脂（０．５ｍｅｑ／ｇ置換，  ０．４８ｍｍｏｌペプチド／ｇペプチド−樹脂，  ４．００ｇペプチド−樹脂，  ０．４８ｍｍｏｌペプチド）を、４０ｍＬのＤＭＦ中で周囲温度にてＮ２下に３０分間穏やかに撹拌した。次いで、膨潤した樹脂を８ｍＬのＯ−（７−アジド−１−シアノ−２−ヘプチル）−Ｏ'−スクシンイミジルカーボネート（ＤＭＦ中０．１８Ｍ，  １．４４ｍｍｏｌ，  ３０ｍＭ最終）および４−メチル−モルホリン（１５８μＬ，  １．４４ｍｍｏｌ）で処理した。この反応混合物をＮ２下で２時間穏やかに撹拌した後、真空ろ過した。樹脂をＤＭＦ（３×３０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（４×５０ｍＬ）で順次洗浄し、その後高真空下で乾燥させた。カイザーテスト（Ｋａｉｓｅｒ  ｔｅｓｔ）は、中間体リンカー修飾樹脂（３．８４ｇ）中の遊離アミンについて陰性であった。次に、Ｎ２下で撹拌しながら樹脂を４０ｍＬのＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ２Ｏ  （９０：５：５）で処理した。２．５時間後、樹脂を真空ろ過し、ＴＦＡ（２×１０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮して約２０ｍＬとした。４本の風袋計量済（ｔａｒｅｄ）５０ｍＬファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブ中の氷冷したＥｔ２Ｏ：ヘキサン（２：１，  １６０ｍＬ）にＴＦＡ濃縮物を滴下して粗リンカー−ペプチドを沈殿させた。氷上で３０分間インキュベートした後、粗リンカー−ペプチドを遠心分離（２０００×ｇで３分）によりペレット化し、上清をデカントした。ペレットを氷冷Ｅｔ２Ｏ：ヘキサン（２：１，  １６０ｍＬ）でトリチュレート／ボルテックスし、氷上でインキュベートし、遠心分離して、上記のようにデカントした。高真空下で乾燥させた後、粗リンカー−ペプチドを灰白色の固体（１．７６ｇ）として単離し、次いで５％ＡｃＯＨに溶解した。４０℃で１時間加熱した後、粗物質を分取ＨＰＬＣで精製した。ＭＳ：  ｍ／ｚ＝４４０８。
【００８６】
同様に、Ｏ−（７−アジド−１−（メチルスルホニル）−２−ヘプチル）−Ｏ'−スクシンイミジルカーボネートを用いて、Ｎα−［１−（メチルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルオキシカルボニル］−エキセナチドを調製した。ＭＳ：  ｍ／ｚ＝４４６１。
【００８７】
実施例２
ＰＥＧヒドロゲルミクロスフェアの調製
７つの平行な５０μｍ液滴形成チャネルを有する２試薬用のＴｅｌｏｓ（登録商標）疎水性フローフォーカシング（ｆｌｏｗ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）型マイクロ流体チップ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）を使用した。流体の流れは、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ製のＭｉｔｏｓ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｐｕｍｐと同様の機能を有するガス圧駆動ポンプによって制御した。これらのポンプは、マイクロ流体チップを通る液体の流れを駆動するために加圧ガスを使用する。駆動圧は、液体流センサ（Ｓｅｎｓｉｒｉｏｎ社，  ＳＬＩ−０４３０）からのフィードバックループを用いて安定した流量を維持するために、比例式圧力調節器（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  Ａｉｒ社，  ＭＰＶシリーズ）を使用してコンピュータ制御される。このタイプの流量制御は、マルチリットルリザーバーから液体を供給するようにスケーラブル（ｓｃａｌａｂｌｅ）であり、また、約１％の標準偏差で流量をもたらし、流量が最大２０％まで変動することがよくあるシリンジポンプよりも優れている。このシステムを用いて、２つのヒドロゲルプレポリマー溶液および連続相を供給した。典型的な流量は、各プレポリマー溶液が２．１ｍｌ／ｈであり、連続相が１４ｍＬ／ｈであった。連続相は、１％ｗ／ｖのＡｂｉｌ（登録商標）ＥＭ９０  （Ｅｖｏｎｉｋ社）および１％ｗ／ｖのＰＧＰＲ  （Ｄａｎｉｓｃｏ社）を含むデカンから構成されていた。この装置の出口チューブをフラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ  ＦＣ２０３Ｂ）に接続し、フラクション（画分）を１０分間隔で収集した。品質管理は、該チップの７つのチャネルを視覚化するための自動ステージを備えた顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ（商標），  ＥＱ  ５１４３６）に取り付けられた高速カメラ（ＵｎｉＢｒａｉｎ（登録商標），  Ｆｉｒｅ  Ｉ  ５８０ｂ）を用いて倍率５Ｘで該チップを撮影することによって行った。各チャネルの画像を５分ごとに収集した。装置の不具合により生じる大きな粒子を含む画分は、バッチから除去することができる。
【００８８】
ミクロスフェアの洗浄は、５０ｍＬ  Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＦＥＰ）遠心管（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，  ３１１４−００５０）中で行った。洗浄後、ミクロスフェアを遠心分離で回収した。有機相の分離では３０００ｇで５分間、水相の分離では２０分間、遠心分離を行う。全ての溶液および洗浄溶媒を０．２μｍのナイロン６６フィルター（Ｔｉｓｃｈ，  ＳＰＥＣ１７９８４）でろ過した。
【００８９】
界面活性剤含有デカン中のマイクロフルイディクス実験（３０ｍＬ）からのミクロスフェアの懸濁液を、室温で２４時間硬化させた。デカン層を除去し、ミクロスフェアを０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３水溶液（１５ｍＬ）とペンタンとに分配した。その混合物を３０分間撹拌した後、ペンタン相を遠心により分離した。次いで、ミクロスフェア懸濁液を水（３０ｍＬ）で処理し、ペンタン（３９ｍＬ）部分で連続して５回洗浄した。遠心分離後、過剰の水相を除去し、滅菌のためにミクロスフェアスラリーを等容量の５０％ｗ／ｖ  ＴＦＡで３０分間処理した。ミクロスフェアを１０００ｇでの遠心分離によって回収した（注：該スフェアはＴＦＡ中で収縮して、コンパクトなペレットを形成するので、過度の力は避けるべきである）。ペレットを０．１２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  （１５０ｍＬ）で処理してｐＨ約６．５の懸濁液を得た。１８時間膨潤させた後、該スフェアを遠心分離によって回収し、次いで水１００ｍＬ部分で５回洗浄し、最後に７０％エタノール１００ｍＬ部分で５回洗浄した。スラリーを最終濃度に３０００ｇで３０分間ペレット化した。上清の吸引後、ミクロスフェアスラリーを、ルアー（Ｌｕｅｒ）継手で別の６０ｍＬシリンジに接続した６０ｍＬシリンジ（ＢＤ  Ｎｏ．３０９６５３）に移し、数回前後に往復させて均質化し、小さな塊を分散させた。スラリーを含むシリンジを用いて、個々の１０ｍＬシリンジにルアー継手から投入し、これらのシリンジを使用するまで４℃で保存した。
【００９０】
アセトニトリル中のアミノ−ミクロスフェアスラリー０．１００ｍＬ部分を３つ秤量して、それらの密度を決定した（０．７９±０．２ｇ／ｍＬ）。次いで、各部分を０．９００ｍＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨにより室温で１８時間処理して架橋を開裂し、［Ｈ２Ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ＮＨ］４−ＰＥＧ２０ｋＤａモノマーを形成させた。各サンプルの全アミン濃度をＴＮＢＳアッセイで分析するため、マイクロタイタープレートにおいてホウ酸緩衝液（１００ｍＭ，  ｐＨ９．３）で０．０３０ｍＬ〜０．１２０ｍＬに希釈し、次いで０．０４％ｗ／ｖの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウムを含有するホウ酸緩衝液０．１５０ｍＬで処理した。４２０ｎｍでのＴＮＢＳ反応物の吸光度の変化を、プレートリーダーで２５℃にて３時間モニタリングし、次いで４２０ｎＭでの最終吸光度を記録した。ＴＮＢＳのみを含む等価反応物をバックグラウンドの減算のために使用し、４０、２０または１０μＭのリシンを含む反応物をアミン濃度標準のために使用した。ミクロスフェア消化物の全アミン濃度／２は、ゲルの遊離ｅ−アミン含量を提供する。
【００９１】
実施例３
シクロオクチン−ミクロスフェアの調製
この反応は、次のようにシリンジ反応容器内で行われる。ゲルスラリー１ｍＬあたり２μｍｏｌのアミンを含むＭｅＣＮ中のアミノ−ミクロスフェアの充填懸濁液の各４ｍＬに、ＭｅＣＮ  １ｍＬ中の３２μｍｏｌのＤＩＰＥＡ（４当量）、およびＭｅＣＮ  １ｍＬ中の９．６μｍｏｌ（１．２当量）の１−フルオロ−２−シクロオクチン−１−カルボキシレートペンタフルオロフェニルエステル（ＭＦＣＯ−ＰＦＰ）を添加する。周囲温度で１時間振盪した後、少量（約５０μＬ）のミクロスフェアをシリンジ出口から排出し、０．１Ｍホウ酸ナトリウム，  ｐＨ約９．３（１）中の０．０４％ｗ／ｖ  ＴＮＢＳ  ０．５ｍＬで３０分間処理する；完全な反応は、強いオレンジ色に染まる出発アミノ−ミクロスフェアと比較して、ＴＮＢＳ溶液に一致するミクロスフェアの色によって示される。反応後、ミクロスフェアを、ＭｅＣＮ  １ｍＬ中の８μｍｏｌ（１当量）のＡｃ２Ｏを１０分間添加することによってキャップする。上清を除去した後、約２ｍＬのミクロスフェアを第２の１０ｍＬシリンジに移し、各スラリーを、充填スラリー容量あたり４×３倍容量のＭｅＣＮで洗浄し、スラリーを合わせる。
【００９２】
実施例４
ペプチド放出性ＰＥＧヒドロゲルミクロスフェアの調製
実施例１で調製したアジド−リンカー−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドのカップリングを、（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ，  前出）に記載のシリンジ反応容器内で行った。１０ｍＬシリンジ内の３０％ＭｅＣＮ中の実施例３のＭＦＣＯ誘導体化ミクロスフェア（１１．２μｍｏｌ  ＭＦＣＯ）のスラリー２．４ｇの懸濁液に、３０％ＭｅＣＮ  ２ｍＬ中の４６ｍｇ  （１０．４μｍｏｌ）のＮα−［１−（メチルスルホニル）−７−アジド−２−ヘプチルオキシカルボニル］−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの溶液を添加した。アリコートのＯＤ２８０が約２４時間で一定になるまで、その混合物をゆっくりと回転させた。スラリーの約５０％を第２のシリンジに移し、両方のサンプルを４×２ｍＬの３０％ＭｅＣＮ、次いで５×５ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＰｉ，  ０．０４％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０，  ｐＨ６．２で洗浄した。次いで、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド負荷ミクロスフェアを、シリンジからシリンジへの移行で、数本の１．０ｍＬ投薬シリンジに移した。ミクロスフェアの総負荷量は、ｐＨ８．４で放出された総ペプチドにより測定して、スラリー１グラムあたり１．９μｍｏｌのペプチドであった。
【００９３】
ミクロスフェアからの遊離［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの放出は、０．１Ｍホウ酸塩，  ｐＨ９．４中に該コンジュゲートのサンプルを懸濁させ、３７℃でＯＤ２８０の増加により可溶化を追跡することによって、インビトロで測定した（図５）。一次放出が観察され、ｐＨ９．４で半減期＝６．７時間を示した。これはｐＨ７．４では６７０時間に相当する。Ｎα−［１−シアノ−７−アジド−２−ヘプチルオキシカルボニル］−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを負荷したミクロスフェアを同様に調製した。これらのミクロスフェアからの遊離［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの放出は、０．１Ｍホウ酸塩，  ｐＨ９．４中に該コンジュゲートのサンプルを懸濁させ、３７℃でＯＤ２８０の増加により可溶化を追跡することによって、インビトロで測定した。一次放出が観察され、ｐＨ９．４で半減期＝１６．５時間を示した。これはｐＨ７．４では１６５０時間に相当する。
【００９４】
Ｒ１＝ＣＮおよびＲ２＝Ｈであるリンカーを介して結合された［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを含むミクロスフェアは、Ｎα−［１−シアノ−７−アジド−２−ヘプチルオキシカルボニル］−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（実施例１）を用いて、同様に調製した。最終調製物は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む等張酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩，  １２０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ５．０）中に２．２μｍｏｌペプチド／グラムを含んでいた。
【００９５】
実施例５
ラットでの薬物動態
実施例４で調製したミクロスフェアスラリーを含む風袋計量済１ｍＬ投薬シリンジの内容物を、２７ゲージ針によって、カニューレを挿入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（約３５０ｇ）の脇腹に皮下投与した。各シリンジは、１．９μｍｏｌペプチド／ｇスラリーで０．４５または０．９８μｍｏｌのペプチドを含んでいた。各ラットに送達された質量を確認するために、投与の前後にシリンジを秤量した。血液サンプル（３００μＬ）を採取し、分析まで血清を−８０℃で凍結させた。
【００９６】
エキセナチド濃度は、メーカーのプロトコル（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，  ＃Ｓ−１３１１）に従ってＥＬＩＳＡにより測定した。凍結した血清サンプルを氷上で解凍し、提供されたラット血清中で５〜２０倍に希釈した。標準エキセナチドはＥＣ５０＝０．２２ｎＭを示した（０．１９ｎＭと報告される）。データレプリケートを平均化し、適切な薬物動態モデルに適合させた。血清中の［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド濃度をＬＣ ＭＳ／ＭＳで測定した。
【００９７】
結果を図１０および図１１に示す。
【００９８】
図１０は、ヒドロゲル連結型（天然形態のエキセナチドを使用し、Ｒ１＝ＭｅＳＯ２であることを除いて、実施例４のものと同じ）を投与した後のラットにおけるエキセナチドの薬物動態を示す。エキセナチドのインビトロ放出動態（ｔ１／２＝１４００時間）および既知の薬物動態パラメータの結果に基づいて、予想される濃度対時間曲線を作成した（破線）。実験データ（四角）は、全体的なｔ１／２＝１９０時間であるヒドロゲル上のエキセナチドの分解を説明するモデル（実線）により良く適合する。
【００９９】
図１１は、皮下投与後のラットにおける実施例４の［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの薬物動態を示す。パネルＡは、ペプチドがＲ１＝ＭｅＳＯ２のＬを用いて連結されて、ｔ１／２＝３５０時間を与える場合のヒドロゲルを示す。パネルＢは、ペプチドがＲ１＝ＣＮのＬを用いて連結されて、ｔ１／２＝７６０時間を与える場合のヒドロゲルを示す。したがって、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの血漿レベルは、単回投与後に少なくとも１ヶ月間維持され得るが、図１１のデータは、はるかに短いｔ１／２を示す。
【０１００】
実施例６
経口ブドウ糖負荷試験
エキセナチドに比べて、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドが経口ブドウ糖のボーラスに対して耐性を付与する能力を、マウスにおいて測定した。合計５４匹の８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ＪａｎＶｉｅｒ  Ｆｒａｎｃｅ）を２週間馴化させ、次いで９群（ｎ＝６）に分けた。０日目に、マウスを４時間絶食させた後、ｔ＝−１５分に被験物質を皮下注射で投与し、続いて０分にブドウ糖を投与した。血糖を−６０分、−１５分、０分、１５分、３０分、６０分、および１２０分で測定した。インスリン測定用の血液サンプルを０分および１５分で採取した。結果を図１２および図１３に示す。エキセナチドおよび［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドは経口ブドウ糖負荷試験において同等の活性を示した。
【０１０１】
図１２は、経口ブドウ糖負荷試験におけるエキセナチドおよび［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの比較結果を示す。エキセンジン−４および［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを５つの異なる濃度で−３０分に投与されたＣ５７ＢＬ／Ｊマウスの経口ブドウ糖負荷試験では、エキセナチドおよび［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドについて明確かつ同様の用量応答が観察された。各線はビヒクルとの著しい違いを表している。ビヒクルと比較した二元配置反復測定分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ＡＮＯＶＡ）。Ｐ＜０．０５ボンフェローニ事後検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）。ブドウ糖ボーラスは、１０ｍｌ中の２ｇ／ｋｇ、経口であった。
【０１０２】
図１３は、図７に示した経口ブドウ糖負荷試験データのＡＵＣ分析を示す。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）後の曲線下面積データでは、エキセナチドおよび［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドについて明確かつ同様の用量応答が観察された。ビヒクルに対する一元配置ＡＮＯＶＡ、ボンフェローニ事後検定。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０１０３】
実施例７
エキセナチド連続注入に対するＱ４Ｗｋ注入されたヒドロゲルミクロスフェア−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドコンジュゲートの長期糖調節効果
合計５５匹の６週齢、１８０〜２００ｇの雄Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病性脂肪性ラット（Ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ）（ＺＤＦ−Ｌｅｐｒｆａ／Ｃｒｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社，  米国）を１匹ずつ飼育管理し、血糖および体重を週２回、２〜４週間監視した。朝給餌した血糖値に基づいて異常値を除外し、４０匹の糖尿病性ラット（平均体重３４０ｇ、血糖値９．７〜２２．５ｍＭ、平均１６．２ｍＭ）をｎ＝１０の４グループに分けた。
ｔ＝０で：
グループＩは、Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプ（２ＭＬ４）でビヒクルを受け取った；
グループＩＩは、Ａｌｚｅｔ（登録商標）ポンプでエキセナチド（３０μｇ／ｋｇ／日，  ＡｃＯＨ，  ｐＨ４．５中）を受け取った；
グループＩＩＩは、実施例４に記載の薬物放出モジュレーターＲ１＝ＣＮを有する皮下ヒドロゲルミクロスフェア−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（０．３７ｍｇペプチド）に加えてビヒクルポンプを受け取った；
グループＩＶは、皮下ヒドロゲルミクロスフェア−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（３．７ｍｇペプチド）に加えてビヒクルポンプを受け取った。
【０１０４】
４週間ＯＧＴＴの２日後の２９日目に、ポンプを交換し、ヒドロゲルミクロスフェア−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを同じレベルで皮下に再投与した。５６日目に、ポンプを除去し、動物を４週間回復させた。後日に糖尿病になった６匹のラットは、２８日目に浸透圧ポンプで［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド（３０μｇ／ｋｇ／日，  ＡｃＯＨ，  ｐＨ４．５中）を受け取り、５６日目にポンプを中止し、その後動物を４週間回復させた。
【０１０５】
体重を−３日目から試験中毎日監視した。食餌および水の摂取量は、−３日目に、そして初回投与後の最初の１１日間は毎日、残りの試験期間は週２回監視した。血液サンプリングを薬物動態研究のために初回投与の２日後に、その後は週に１回行った。ＨｂＡ１ｃをＯＧＴＴ前の−３日目、２６日目および５５日目に測定し、胃排出機能検査（ｇａｓｔｒｉｃ  ｅｍｐｔｙｉｎｇ  ｔｅｓｔ）を２６日目に実施した。ＯＧＴＴでは、ラットを一晩半絶食させ（６０％）、次いでＰＯブドウ糖（１０ｍＬ中２ｇ／ｋｇ）をｔ＝０で投与した。ブドウ糖負荷後のｔ＝−６０分、−１５分、０分、１５分、３０分、６０分および１２０分に血糖およびインスリンを測定した。胃排出を２６日目にＯＧＴＴと共にアセトアミノフェン（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与により測定し、血中濃度を１５分、３０分、６０分および１２０分で測定した。
【０１０６】
結果を図１４Ａ〜１４Ｅに示す。これらの図において、ビヒクル対照（黒色）、３０μｇ／ｋｇ／日で皮下ポンプを用いた連続注入によって送達されたエキセンジン−４（桃色）、２２０ｎｍｏｌペプチド／ｋｇで投与されたＰＬ−ｃｍｐｄ（灰色）、２２００ｎｍｏｌペプチド／ｋｇで投与されたＰＬ−ｃｍｐｄ（青色）、および３０μｇ／ｋｇ／日で皮下ポンプを用いた連続注入によって送達された［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド遊離ペプチド（緑色）。
【０１０７】
図１４Ａは、体重を示す。
【０１０８】
図１４Ｂは、ｍｍｏｌ／Ｌ単位での血糖値を示す。
【０１０９】
図１４Ｃは、４週および８週に実施された経口ブドウ糖負荷試験の結果を示す。
【０１１０】
図１４Ｄは、４週および８週での糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃのレベルを示す。
【０１１１】
図１４Ｅは、時間の関数としての血漿中のペプチドのレベルを示す。
【０１１２】
［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドを含むヒドロゲルミクロスフェア製剤の単回投与は、少なくとも１ヶ月間血糖を制御するのに有効であった。
【０１１３】
実施例８
ラットおよびマウスにおけるヒドロゲル−ミクロスフェアコンジュゲートの薬物動態
Ａ．  シリンジ（２９Ｇ×１／２インチの固定針付き０．５ｍＬ  Ｕ−１００インスリンシリンジ，  ＢＤ社）に等張酢酸塩（１０ｍＭ酢酸Ｎａ，  １４３ｍＭ  ＮａＣｌ）  ｐＨ５．０、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０中の実施例４で調製した［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド−ミクロスフェアスラリーを無菌条件下で充填した。薬物放出モジュレーターＲ１＝ＭｅＳＯ２を用いたミクロスフェアは１．３μｍｏｌペプチド／ｇスラリーを含み、薬物放出モジュレーターＲ１＝ＣＮを用いたミクロスフェアは１．４μｍｏｌペプチド／ｇスラリーを含んでいた。各シリンジの内容物を、６匹のカニューレを挿入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（平均体重２７０ｇ）の脇腹に皮下投与した。
【０１１４】
針アセンブリから空気をパージし、各ラットに送達されたスラリーの質量を決定するために投与前と投与後に針アセンブリを計量した；ＭｅＳＯ２モジュレーターの場合は、０．７ｍｇのペプチド（１７０ｎｍｏｌ）を含有する１３０ｍｇのスラリーを各ラットに投与し、ＣＮモジュレーターの場合は、２．５ｍｇのペプチド（５８０ｎｍｏｌ）を含有する４００ｍｇのスラリーを投与した。
【０１１５】
両方のリンカーについて０、１、２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８、２４０、３３６、４３２、５０４、６００、６７２時間で血液サンプル（３００μＬ）を採取し、ＣＮモジュレーターを含むリンカーについては８４０、１００８、１１７６、１３４４、１５１２、１６８０、１８４８および２０１６時間で追加のサンプルを得た。血清を調製し、分析まで−８０℃で凍結させた。血清［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１１６】
結果を図１５Ａおよび１５Ｂに示す。図１５Ａは、薬物放出モジュレーターＲ１＝ＭｅＳＯ２を有するヒドロゲル−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドミクロスフェア（１７０ｎｍｏｌ  ［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド／ラットまたは２．６ｍｇ／ｋｇ）を注射した後の結果を示す；ｔ１／２，βは３１０時間であった。図１５Ｂは、薬物放出モジュレーターＲ１＝ＣＮを有するヒドロゲル−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドミクロスフェア（６００ｎｍｏｌ  ［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド／ラットまたは８．９ｍｇ／ｋｇ）を注射した後の結果を示す；ｔ１／２，βは８８０時間であった。エラーバーは±ＳＥＭである。
【０１１７】
Ｂ．  マウスには少量のミクロスフェアが必要であり、正確な投与を可能にするために希釈剤を必要とした。デュアルシリンジベースの反応容器（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ社，  ２０１６  ＃２４）を用いて、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド−ミクロスフェアスラリーの緩衝液（薬物放出モジュレーターＲ１＝ＭｅＳＯ２では約１ｍＬ、Ｒ１＝ＣＮでは４ｍＬ）を、等張酢酸塩ｐＨ５．０（１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ，  １４３ｍＭ  ＮａＣｌ）、２５％グリセロールおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０の溶液と無菌的に交換した。この希釈剤は、投与の前および間にミクロスフェアを均質な懸濁液に保つのに役立ち、適切な容量の投与を可能にした。次いで、該スラリーを同じ混合物で希釈して２６４ｎｍｏｌペプチド／ｍｇスラリー（Ｒ１＝ＭｅＳＯ２）または７２０ｎｍｏｌペプチド／ｍｇスラリー（Ｒ１＝ＣＮ）を得た。シリンジ（２９Ｇ×１／２インチの固定針付き０．５ｍＬ  Ｕ−１００インスリンシリンジ，  ＢＤ社）に懸濁ミクロスフェアを無菌条件下で充填した。各シリンジの針アセンブリから空気をパージし、各マウスに送達されたスラリーの平均質量を決定するために投与前と投与後に針アセンブリを計量した。
【０１１８】
Ｒ１＝ＭｅＳＯ２の場合は、１３０μｇのペプチド（３０ｎｍｏｌ）を含有する１２０ｍｇのスラリーを１８匹のＣＤ−１マウス（平均体重３０ｇ）のそれぞれの脇腹に皮下投与した。血液サンプル（１００μＬ）を眼窩静脈叢（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、２４０、３３６、４０８、５０４、５７６および６７２時間に時間差計画（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）で採取して、各時点で６つのレプリケートを取得し、それぞれの血清を調製した。Ｒ１＝ＣＮの場合は、６０５μｇのペプチド（１４４ｎｍｏｌ）を含有する２００ｍｇのスラリーを、同様に、２４匹のＣＤ−１マウスに皮下投与した。血液サンプル（１００μＬ）を眼窩静脈叢から上記と同じ時間に、さらに８４０、１００８、１１７６、１３４４、１５１２、１６８０、１８４８、および２０１６時間に時間差計画で採取して、各時点で６つのレプリケートを得た。血清を調製し、分析まで−８０℃で凍結させた。血清［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１１９】
血清サンプルを３倍容量のＡＣＮで処理して、遠心分離した。上清を乾燥させ、再構成して、ＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳシステムにアプライした。該サンプルを、０．１％ギ酸を含有する水／ＡＣＮ勾配により溶出した。［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドの検量線は０．２５〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲で直線的であった。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムと連結したＳｃｉｅｘ  ５５００  ＱＴｒａｐ（登録商標）質量分析計で行った。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムは、２つのＬＣ−３０ＡＤ  ＨＰＬＣポンプと、１００μＬループ付きのＳＩＬ−３０ＡＣオートサンプラーから成っていた。クロマトグラフ分離は、３μｍ  Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ  ＨＰＬＣカラムで、移動相勾配を用いて行った。質量分析計は正のエレクトロスプレーイオン化モードで操作し、使用した分解能設定はＱ１とＱ３の両方についてユニット（ｕｎｉｔ）であった。多重反応モニタリング（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：  ＭＲＭ）の転移は、［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドについてｍ／ｚ＝８４１．１−＞３９６．３であった。ピーク面積の積分は、Ｓｃｉｅｘ社のＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（バージョン１．５．２）を用いて行った。
【０１２０】
結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。図１６Ａは、薬物放出モジュレーターＲ１＝ＭｅＳＯ２を有するヒドロゲル−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドミクロスフェア（３０ｎｍｏｌ  ［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド／マウスまたは４．２ｍｇ／ｋｇ）を注射した後の結果を示す。図１６Ｂは、薬物放出モジュレーターＲ１＝ＣＮを有するヒドロゲル−［Ｎ２８Ｑ］エキセナチドミクロスフェア（１４４ｎｍｏｌ  ［Ｎ２８Ｑ］エキセナチド／マウスまたは２０．２ｍｇ／ｋｇ）を注射した後の結果を示す。初期のデータ点は、吸収相の動態を求めるには不十分であり、示されたβ相のフィッティングには使用しなかった。エラーバーは±ＳＥＭである。
【０１２１】
Ｃ対ｔ曲線（テキスト）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、１／ＳＤ２による重み付けしてｅｑ  Ｘ（テキスト）の非線形回帰によって解析した；ｋａ＞＞ｋ１であるので、我々は、最初の数日より後のデータ点を用いて、終末相半減期の単一指数関数的段階をモデル化した。
【０１２２】
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019511497.tif 000042
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