(57)【要約】  核酸の一過性発現を実現することにより治療目的を果たすように造血幹細胞（又はそれに由来する細胞）を迅速且つ選択的に改変する組成物及び方法について、記載する。一過性発現は、改変後の細胞に永続的な治療的変化（本願では「ヒットエンドラン」効果と呼ぶ）をもたらす。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に投与するための造血系由来の選択された細胞集団の調製方法であって、
造血系由来の選択された細胞集団を含む不均一細胞混合物を含む試料を前記対象から採取する工程；
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む合成ナノ担体に前記試料を暴露することにより、前記選択された細胞集団に前記ナノ担体を選択的に送達し、前記選択された細胞集団内の細胞を改変する工程；及び
前記試料内の細胞を拡大培養する工程を含み；
それにより、前記選択された細胞集団を前記対象に投与できるように調製する、前記方法。
【請求項２】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合し、受容体誘導性エンドサイトーシスを開始する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料内の前記拡大培養した細胞が、前記選択された細胞集団の改変細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に、調製後の前記選択された細胞集団を細胞組成物に製剤化する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
更に、前記細胞組成物を前記対象に投与する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記暴露工程の前に、前記不均一細胞混合物における前記選択された細胞集団の百分率を増加させるための単離処置を、全く行わないか又は限定的にしか行わない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記合成核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記合成核酸が、配列番号１のｍｅｇａＴＡＬをコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子編集剤が、Ｓｈｐ−１ホスファターゼ、ＰＤ１受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４をコードする内在性遺伝子を破壊する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子編集剤が、ＴＣＲα鎖をコードする内在性遺伝子を破壊する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成核酸が、転写因子、キナーゼ及び／又は細胞表面受容体から選択される表現型を変化させるタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記表現型を変化させるタンパク質が、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合し、受容体誘導性エンドサイトーシスを開始する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記不均一細胞集団が、エクソビボ細胞培養物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記不均一細胞集団が、インビボである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組合せと選択的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマー又はそれらの組合せから選択される結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１又はトランスフェリン受容体と選択的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２０９又はＤＥＣ−２０５と選択的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合ドメインが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体の、ｓｃＦｖ断片から構成されるか又はこれらのｓｃＦｖ断片から本質的に構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記合成核酸が、合成ｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記担体が、正電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記正電荷をもつポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、アミン・エステル共重合体、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、Ｌ−ラクチド・Ｌ−リジン共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記コーティングが、中性又は負電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミサクシネート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、双性イオン型ポリマーを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、リポソームを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８と選択的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記担体が、ポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み、前記担体が、ポリ（β−アミノエステル）を含み、前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
対象を治療するための細胞の調製方法であって、
対象からリンパ球を採取する工程；及び
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む合成ナノ担体と前記リンパ球とを結合させる工程を含み；
前記結合後に前記リンパ球が前記核酸を一過性発現するように前記ナノ担体を前記リンパ球に選択的に取込ませる、前記方法。
【請求項３７】
更に、前記リンパ球を拡大培養する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
更に、前記リンパ球を細胞組成物に製剤化する工程を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記暴露工程の前に、前記不均一細胞混合物における前記選択された細胞集団の百分率を増加させるための単離処置を、全く行わないか又は限定的にしか行わない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記合成核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記合成核酸が、配列番号１のｍｅｇａＴＡＬをコードする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝子編集剤が、Ｓｈｐ−１ホスファターゼ、ＰＤ１受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４をコードする内在性遺伝子を破壊する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記遺伝子編集剤が、ＴＣＲα鎖をコードする内在性遺伝子を破壊する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記合成核酸が、転写因子、キナーゼ及び／又は細胞表面受容体から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記表現型を変化させるタンパク質が、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
前記不均一細胞集団が、エクソビボ細胞培養物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記不均一細胞集団が、インビボである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組合せと選択的に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマー又はそれらの組合せから選択される結合ドメインを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１又はトランスフェリン受容体と選択的に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２０９又はＤＥＣ−２０５と選択的に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合ドメインが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖ断片から構成されるか、又はこれらのｓｃＦｖ断片から本質的に構成される、請求項３５に記載の方法。
【請求項５５】
前記合成核酸が、合成ｍＲＮＡである、請求項３５に記載の方法。
【請求項５６】
前記担体が、正電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
前記正電荷をもつ脂質又はポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、アミン・エステル共重合体、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、Ｌ−ラクチド・Ｌ−リジン共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記コーティングが、中性又は負電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミサクシネート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、双性イオン型ポリマーを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、リポソームを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８と選択的に結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項６４】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６５】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６６】
前記担体が、ポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６７】
前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６８】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み、前記担体が、ポリ（β−アミノエステル）を含み、前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項６９】
治療を必要とする対象の治療方法であって、
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含むナノ担体により細胞に選択的に送達された前記核酸の一過性発現により改変された前記細胞を、治療有効量投与する段階を含み；
前記結合後に前記リンパ球が前記核酸を一過性発現するように前記ナノ担体を前記リンパ球に選択的に取込ませることにより、治療を必要とする前記対象を治療する、前記方法。
【請求項７０】
対象に投与するための選択された細胞集団の調製方法であって、
選択された細胞集団を含む不均一細胞混合物を含む試料を前記対象から採取する工程；
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む合成ナノ担体に前記試料を暴露することにより、前記選択された細胞集団に前記ナノ担体を選択的に送達し、前記選択された細胞集団内の細胞を改変する工程；及び
前記試料内の細胞を拡大培養する工程を含み；
それにより、前記選択された細胞集団の前記対象への投与のために調製する、前記方法。
【請求項７１】
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む合成ナノ担体。
【請求項７２】
前記合成核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７３】
前記合成核酸が、配列番号１のｍｅｇａＴＡＬをコードする、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７４】
前記遺伝子編集剤が、Ｓｈｐ−１ホスファターゼ、ＰＤ１受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４をコードする内在性遺伝子を破壊する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７５】
前記遺伝子編集剤が、ＴＣＲα鎖をコードする内在性遺伝子を破壊する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７６】
前記合成核酸が、転写因子、キナーゼ及び／又は細胞表面受容体から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７７】
前記表現型を変化させるタンパク質が、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７８】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項７９】
前記不均一細胞集団が、エクソビボ細胞培養物である、請求項７７に記載の合成ナノ担体。
【請求項８０】
前記不均一細胞集団が、インビボである、請求項７７に記載の合成ナノ担体。
【請求項８１】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組合せと選択的に結合する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８２】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマー又はそれらの組合せから選択される結合ドメインを含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８３】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１又はトランスフェリン受容体と選択的に結合する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８４】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２０９又はＤＥＣ−２０５と選択的に結合する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８５】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８６】
前記結合ドメインが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖ断片から構成されるか、又はそれらのｓｃＦｖ断片から本質的に構成される、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８７】
前記合成核酸が、合成ｍＲＮＡである、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８８】
前記担体が、正電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項８９】
前記正電荷をもつ脂質又はポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、アミン・エステル共重合体、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、Ｌ−ラクチド・Ｌ−リジン共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、請求項８７に記載の合成ナノ担体。
【請求項９０】
前記コーティングが、中性又は負電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項９１】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミサクシネート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、請求項８９に記載の合成ナノ担体。
【請求項９２】
前記中性又は負電荷をもつコーティングが双性イオン型ポリマーを含む、請求項８９に記載の合成ナノ担体。
【請求項９３】
前記中性又は負電荷をもつコーティングがリポソームを含む、請求項８９に記載の合成ナノ担体。
【請求項９４】
前記リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、請求項９２に記載の合成ナノ担体。
【請求項９５】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８と選択的に結合する、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項９６】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項９７】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項９８】
前記担体が、ポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項９９】
前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項１００】
前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み、前記担体が、ポリ（β−アミノエステル）を含み、前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、請求項７０に記載の合成ナノ担体。
【請求項１０１】
請求項７０に記載の合成ナノ担体を含有する組成物。
【請求項１０２】
治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の、請求項７０に記載のナノ担体又は、請求項１００に記載の組成物を投与することにより、治療を必要とする前記対象を治療する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸の一過性発現を実現することにより治療目的を果たすように造血幹細胞（又はそれに由来する細胞）を迅速且つ選択的に改変する組成物及び方法を、提供する。この一過性発現は、改変後の細胞に永続的な治療的変化（本願では「ヒットエンドラン」効果と呼ぶ）をもたらす。前記方法は、培養細胞でもインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）でも実施することができる。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療に成功するか否かは、選択された目的細胞への遺伝子送達機構の成功次第である。目下のところ、長期間の遺伝子治療に成功するための最も一般的な方法は、レンチウイルスベクターを利用するシステム等のウイルスシステムである。これらの遺伝子治療は、治療に有用なタンパク質の継続的な細胞内発現に依存している。このようなウイルスシステムは、遺伝子治療のために遺伝子を有効に送達することができるが、非選択的であり、費用がかかり、広く利用できない。更に、持続的な治療用タンパク質発現は、時間の経過に伴って生じる細胞内イベントにより経時的に低下する可能性がある。
【０００３】
遺伝子治療用に遺伝子を細胞内に送達するための機構として、エレクトロポレーションも開発されている。しかし、エレクトロポレーションは、細胞膜の機械的破壊と透過に依存するため、細胞生存性が低下し、治療用に理想的とは言い難い。更に、ウイルスを利用する方法と同様に、エレクトロポレーションは、不均一プールの中の特定の細胞種に遺伝子を選択的に送達するものではないため、事前に細胞選択・精製工程が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、核酸の一過性発現を実現することにより治療目的を果たすように、造血幹細胞（又はそれに由来する細胞）を迅速且つ選択的に改変する組成物及び方法を、提供する。一過性発現は、改変後の細胞に永続的な治療的変化（本願では「ヒットエンドラン」効果と呼ぶ）をもたらす。持続的な治療効果を得るために一過性発現しか必要としないため、治療用タンパク質発現の経時的な低下に関する問題が、解消される。更に、これらの組成物及び方法は、選択された細胞種を選択的に改変するため、改変の前に、細胞選択工程又は精製工程を必要としない。このため、治療用細胞のエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）製造が迅速になると共に、細胞のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）標的化遺伝子改変が可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願に記載するヒットエンドラン効果は、遺伝子編集を生じる核酸の一過性発現又は細胞の表現型を永続的に変化させるタンパク質の一過性発現を利用することにより、可能になる。遺伝子編集を生じる核酸の例としては、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが挙げられる。表現型を変化させるタンパク質の例としては、転写因子、キナーゼ及び細胞表面受容体が挙げられる。
【発明の効果】
【０００６】
本願に開示する組成物及び方法には、多数の用途がある。培養細胞における例としては、標的化ヌクレアーゼにより造血細胞（造血幹細胞を含む）のゲノムを編集する場合、特定の転写因子を一過性発現させることにより養子移入細胞に治療的に望ましい表現型を刷り込む場合、テロメラーゼ逆転写酵素もしくは抗アポトーシス遺伝子を発現させることにより養子移入細胞における細胞老化を抑制する場合、又はケモカイン受容体の発現により固有の細胞親和性を変化させる場合が、挙げられる。インサイチュの例としては、樹状細胞に選択的にトランスフェクトする担体に核酸を担持させて同時注入し、前記細胞の抗原提示能を高めることによりワクチンの力価を増強させる場合、又は、ワクチンでプライミングしたＴ細胞にトランスフェクトして長期間持続するメモリー表現型を誘導する場合が、挙げられる。
【０００７】
本願に添付する図面の多くはカラーで表示したほうが分かり易いが、出願時の特許出願公報にカラーでは掲載されない。出願人は、これらの図面のカラー版を出願当初に提出された書面の一部とみなし、後日の審査過程においてこれらの図面のカラー画像を提出する権利を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃ。治療用Ｔ細胞を遺伝的にプログラムするためのｍＲＮＡナノ担体の作製。図１Ａ：ポリマーナノ粒子に担持させた治療関連トランスジーンを発現させるために、培養Ｔ細胞をどのようにプログラムできるかを説明する模式図。これらの粒子は、これらの粒子を特定の細胞種にターゲティングするリガンドでコーティングされているため、そのｍＲＮＡカーゴを導入することができ、標的とする細胞に（転写因子やゲノム編集剤等の）選択されたタンパク質を発現させることができる。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｃ。治療用Ｔ細胞を遺伝的にプログラムするためのｍＲＮＡナノ担体の作製。図１Ｂ：ｍＲＮＡを担持させた標的化ナノ粒子のデザイン。挿入図は、代表的なナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す（スケールバー＝５０ｎｍ）。ナノ粒子に封入された合成ｍＲＮＡも示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｃ。治療用Ｔ細胞を遺伝的にプログラムするためのｍＲＮＡナノ担体の作製。図１Ｃ：本願に開示する実施形態で使用することができる遺伝子編集剤、表現型を変化させるタンパク質、標的遺伝子及びその使用の例。
【図２】フローサイトメトリーで使用した抗体。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃ。ｍＲＮＡを担持させたナノ粒子の物理的性質。図３Ａ：個々の粒子の有限飛跡長調整粒度分布。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃ。ｍＲＮＡを担持させたナノ粒子の物理的性質。図３Ｂ：ナノ粒子１個（左、スケールバー＝１００ｎｍ）及びナノ粒子集団（右、スケールバー＝２μｍ）の透過型電子顕微鏡写真。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃ。ｍＲＮＡを担持させたナノ粒子の物理的性質。図３Ｃ：対照ナノ粒子（−ＰＧＡ−Ａｂ）と、ＰＧＡをコーティングして抗体と結合させたナノ粒子（＋ＰＧＡ−Ａｂ）とを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で４０倍に希釈後にゼータ電位を測定し、比較した（ｎ＝５）。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄ。ｍＲＮＡナノ粒子トランスフェクションは、最小限の細胞操作しか必要とせず、細胞生存性に影響を与えずにリンパ球による確実なトランスジーン発現を実現する。図４Ａ：ＣＤ３を標的とするポリマーナノ粒子にＣｙ５で標識したｍＲＮＡを担持させて、一次Ｔ細胞と混合した。共焦点顕微鏡によると、これらの粒子は、細胞表面から迅速に内在化されることが明らかである。画像は１５カ所のランダムに選択した領域を表す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｄ。ｍＲＮＡナノ粒子トランスフェクションは最小限の細胞操作しか必要とせず、細胞生存性に影響を与えずにリンパ球による確実なトランスジーン発現を実現する。図４Ｂ：ＣＤ３を標的とするナノ粒子にｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡを担持させたものと共に保温してから２４時間後の、Ｔ細胞のフローサイトメトリー。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｄ。ｍＲＮＡナノ粒子トランスフェクションは最小限の細胞操作しか必要とせず、細胞生存性に影響を与えずにリンパ球による確実なトランスジーン発現を実現する。図４Ｃ、図４Ｄ：エレクトロポレーション及びナノ粒子遺伝子送達が細胞拡大培養に及ぼす影響を比較したもの。左図はナノ粒子のトランスフェクション（上）とエレクトロポレーション（下）とのワークフローを示す。右図は０日目と１２日目に刺激性ビーズで処理した３人の別個のドナーに由来する、ＰＢＭＣ培養物が拡大された倍率を示す。各ドナーに由来する培養物をマッチさせ、未処理のままとするか、あるいは５日目と１２日目にＣＤ３／ＣＤ２８を標的とするナノ粒子のトランスフェクション（図４Ｃ、右）又はエレクトロポレーション（図４Ｄ、右）により処理した。各線は１人のドナーを表し、各点はＴ細胞が拡大された倍率を反映する。群間の対応のある差をスチューデントのｔ検定により解析した（ｎｓ，非有位；＊，有位，ｎ＝３）。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｄ。ｍＲＮＡナノ粒子トランスフェクションは最小限の細胞操作しか必要とせず、細胞生存性に影響を与えずにリンパ球による確実なトランスジーン発現を実現する。図４Ｃ、図４Ｄ：エレクトロポレーションとナノ粒子遺伝子送達が細胞拡大培養に及ぼす影響を比較したもの。左図はナノ粒子のトランスフェクション（上）とエレクトロポレーション（下）のワークフローを示す。右図は０日目と１２日目に刺激性ビーズで処理した３人の別個のドナーに由来するＰＢＭＣ培養物が拡大された倍率を示す。各ドナーに由来する培養物をマッチさせ、未処理のままとするか、あるいは５日目と１２日目にＣＤ３／ＣＤ２８を標的とするナノ粒子のトランスフェクション（図４Ｃ、右）又はエレクトロポレーション（図４Ｄ、右）により処理した。各線は１人のドナーを表し、各点はＴ細胞が拡大された倍率を反映する。群間の対応のある差をスチューデントのｔ検定により解析した（ｎｓ，非有位；＊，有位，ｎ＝３）。
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂ。ナノ粒子トランスフェクションは迅速であり、凍結乾燥により悪化しない。図５Ａ：未処理の活性化Ｔ細胞又は抗ＣＤ３で標的化したｅＧＦＰをコードするＮＰの添加から５時間後に測定した、活性化Ｔ細胞１０６個におけるｅＧＦＰ発現。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂ。ナノ粒子トランスフェクションは迅速であり、凍結乾燥により悪化しない。図５Ｂ：凍結と再懸濁後にＮＰのトランスフェクション効率は維持される。新たに調製したＮＰ又は凍結乾燥して−８０℃で保存後に懸濁して元の体積にしたＮＰ（抗ＣＤ３又は抗ＣＤ８抗体により標的化したもの）を、条件毎に１０６個の活性化Ｔ細胞にトランスフェクトした。
【図６】ナノ粒子トランスフェクション及びエレクトロポレーションで処理したＴ細胞の相対生存率。条件毎に活性化Ｔ細胞２×１０６個の試料を未処理のままとするか、又は図２Ｃに記載するようにＮＰトランスフェクションもしくはエレクトロポレーションにより処理した。処理から１８時間後に細胞を蛍光色素で標識し、生存率を評価した。本図に示す結果は、３回の別個の実験を表す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ａ：ＣＡＲ−Ｔ細胞の標準的製造へのナノ粒子トランスフェクションの統合。抗ＣＤ３／ＣＤ２８をコーティングしたビーズによる刺激（０日）後、１日目と２日目にＣＤ８を標的とするｍＲＮＡ  ＮＰを導入した後、３日目に白血病特異的１９−４１ＢＢζ  ＣＡＲをコードするベクターのレンチウイルス導入を行った。ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼとｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡを担持させたＮＰ又はｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのみを担持させた対照粒子を添加した。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｂ：（ｅＧＦＰシグナルに基づく）ＮＰトランスフェクション効率のフローサイトメトリーはＮＰ処理後の（ＣＤ３シグナルに基づく）Ｔ細胞によるＴＣＲの表面発現レベルと相関していた。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｃ：１４日目のＣＤ３表面発現の低下により評価した編集効率を示す、サマリープロット（ｎ＝５）。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｄ：ＴＣＲα鎖遺伝子座破壊を確認する、サーベイヤーアッセイ。
【図７Ｅ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｅ：ゲノム編集したＴ細胞におけるレンチウイルス導入のフローサイトメトリーと対照Ｔ細胞におけるレンチウイルス導入のフローサイトメトリーとの比較。
【図７Ｆ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｆ：放射線照射したＴＭ−ＬＣＬ白血病細胞で共培養したＴＣＲ＋（対照）及びＴＣＲ−（ｍＴＡＬ  ＮＰで処理した）ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖。
【図７Ｇ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｇ：ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＣＤ１９−Ｋ５６２標的細胞の溶解の細胞傷害性アッセイ。
【図７Ｈ】図７Ａ〜７Ｈ。ＴＣＲαを標的とするｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＡＲによりプログラムされたリンパ球においてＴ細胞受容体をノックアウトすることができる。図７Ｈ：ＰＭＡとイオノマイシン（Ｐ／Ｉ）で刺激後のＩＬ−２及びＩＦＮ−γの細胞内サイトカイン発現。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｆ。Ｆｏｘｏ１３Ａ転写因子をコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞に特徴的な表面マーカーと転写パターンを誘導する。図８Ａ：ＣＤ３を標的とする対照（ＧＦＰ＋）又はＦｏｘｏ１３Ａ−ＧＦＰ  ＮＰで処理したＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞と一次Ｔ細胞において細胞内標識により測定した全Ｆｏｘｏ１タンパク質の発現。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｆ。Ｆｏｘｏ１３Ａ転写因子をコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞に特徴的な表面マーカーと転写パターンを誘導する。図８Ｂ：細胞をＦｏｘｏ１３Ａ−ｅＧＦＰ  ＮＰに暴露した後のＦｏｘｏ１３Ａ  ｍＲＮＡ相対発現量の経時的ｑＰＣＲ測定。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｆ。Ｆｏｘｏ１３Ａ転写因子をコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞に特徴的な表面マーカーと転写パターンを誘導する。ＣＤ８を標的とするＦｏｘｏ１３Ａ−ＧＦＰ  ＮＰが粒子処理から２４時間後のＣＤ６２Ｌ発現に及ぼす影響。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｆ。Ｆｏｘｏ１３Ａ転写因子をコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞に特徴的な表面マーカーと転写パターンを誘導する。図８Ｄ：ＣＤ８を標的とする対照又はＦｏｘｏ１３Ａ／ｅＧＦＰをコードするＮＰで処理し、選別後のＣＤ８＋ｅＧＦＰ＋細胞において粒子導入後１日、８日及び２０日培養時点で測定した、ＣＤ６２Ｌ＋細胞の百分率。これらの結果は、３人の別個のドナーから得られた結果である。比の対応のあるｔ検定から計算した指定条件間で、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｆ。Ｆｏｘｏ１３Ａ転写因子をコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞に特徴的な表面マーカーと転写パターンを誘導する。図８Ｅ：処理から８日後のＴＣＭ細胞、ナイーブ細胞及び対照細胞におけるＴＣＭシグネチャー遺伝子発現のヒートマップ。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｆ。Ｆｏｘｏ１３Ａ転写因子をコードするｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞に特徴的な表面マーカーと転写パターンを誘導する。図８Ｆ：Ｆｏｘｏ１３ＡＮＰで処理した細胞における、８日後の差次的遺伝子発現のボルカノプロット。ＴＣＭシグネチャー遺伝子及び選択されたメモリー表現型遺伝子を示す。Ｆｏｘｏ１３ＡとＴＣＭシグネチャー遺伝子セットのオーバーラップのＰ値を、（図９Ｂに示す解析による）ＧＳＥＡにより求めた。
【図９Ａ】図９Ａ、９Ｂ。遺伝子セットエンリッチメントの結果、ＴＣＭ細胞とＦｏｘｏ１３Ａナノ粒子で処理した細胞との間には強い相関があることが明らかである。図９Ａ：処理から８日後のＴＣＭ細胞、ナイーブ細胞及び対照細胞におけるＴＣＭダウンシグネチャー遺伝子発現のヒートマップ。
【図９Ｂ】図９Ａ、９Ｂ。遺伝子セットエンリッチメントの結果、ＴＣＭ細胞とＦｏｘｏ１３Ａナノ粒子で処理した細胞との間には強い相関があることが明らかである。図９Ｂ：ＴＣＭアップ及びＴＣＭダウンシグネチャー遺伝子セットに対して試験した場合にＦｏｘｏ１３Ａ  ＮＰで処理した細胞と対照ＮＰで処理した細胞で差次的に発現される遺伝子の遺伝子セットエンリッチメント解析結果。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｄ。ｍＲＮＡナノ担体は拡大培養又は表現型に及ぼす影響が最小限でありながら、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞の特異的トランスフェクションを可能にする。図１０Ａ：ＣＤ１０５のターゲティングは、動員されたＰＢＳＣから得られたＨＳＣ  ＣＤ３４＋細胞の特異的トランスフェクションを可能にする。これらの細胞を未処理のままとするか、又はＰＧＡでコーティングしたＮＰにｅＧＦＰをコードするｍＲＮＡを担持させて非特異的対照抗体（対照Ａｂ−ｅＧＦＰ  ＮＰ）もしくは抗ＣＤ１０５（α−ＣＤ１０５ＮＰ）と結合させたものをトランスフェクトした。ＮＰ暴露から２４時間後に、トランスフェクション効率を、フローサイトメトリーによりアッセイした。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｄ。ｍＲＮＡナノ担体は、拡大培養又は表現型に及ぼす影響が最小限でありながら、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞の特異的トランスフェクションを可能にする。図１０Ｂ：３人の別個のドナーからのＣＤ３４＋試料におけるＮＰトランスフェクション効率。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｄ。ｍＲＮＡナノ担体は、拡大培養又は表現型に及ぼす影響が最小限でありながら、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞の特異的トランスフェクションを可能にする。図１０Ｃ：対照又はＣＤ１０５を標的とするＮＰの添加後のＣＤ３４＋ＨＳＣのインビトロ拡大培養。図１０Ａと同様に細胞にトランスフェクトした後、粒子暴露から０日後、４日後及び８日後に総細胞数を評価した。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｄ。ｍＲＮＡナノ担体は、拡大培養又は表現型に及ぼす影響が最小限でありながら、ＣＤ３４＋ヒト造血幹細胞の特異的トランスフェクションを可能にする。図１０Ｄ：トランスフェクトしなかった細胞（破線）又は抗ＣＤ１０５ｍＲＮＡで処理した細胞（実線）における培養８日後のＨＳＣマーカーＣＤ３４、ＣＤ１３３及びＣＤ４９ｆのフローサイトメトリー解析。この結果、ＮＰを加えても主要な幹細胞マーカーの表面発現に影響がないと判断される。
【図１１−１】代表的な関連配列。
【図１１−２】代表的な関連配列。
【図１１−３】代表的な関連配列。
【図１１−４】代表的な関連配列。
【図１１−５】代表的な関連配列。
【図１１−６】代表的な関連配列。
【図１１−７】代表的な関連配列。
【図１１−８】代表的な関連配列。
【図１１−９】代表的な関連配列。
【図１１−１０】代表的な関連配列。
【図１１−１１】代表的な関連配列。
【図１１−１２】代表的な関連配列。
【図１１−１３】代表的な関連配列。
【図１１−１４】代表的な関連配列。
【図１１−１５】代表的な関連配列。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
遺伝子治療に成功するか否かは、選択された目的細胞への遺伝子送達機構の成功次第である。目下のところ、長期間の遺伝子治療に成功するための最も一般的な方法は、レンチウイルスベクターを利用するシステム等のウイルスシステムである。これらの遺伝子治療は、治療に有用なタンパク質の継続的な細胞内発現に依存している。このようなウイルスシステムは、遺伝子治療のために遺伝子を有効に送達することができるが、非選択的であり、費用がかかり、広く利用できない。更に、持続的な治療用タンパク質発現は、時間の経過に伴って生じる細胞内イベントにより経時的に低下する可能性がある。
【００１０】
遺伝子治療用に遺伝子を細胞内に送達するための機構として、エレクトロポレーションも開発されている。しかし、エレクトロポレーションは、細胞膜の機械的破壊と透過に依存するため、細胞生存性が低下し、治療用に理想的とは言い難い。更に、ウイルスを利用する方法と同様に、エレクトロポレーションは。不均一プールの中の特定の細胞種に遺伝子を選択的に送達するものではないため、事前に細胞選択・精製処理が必要である。
【００１１】
本開示は核酸の一過性発現を実現することにより治療目的を果たすように細胞を迅速且つ選択的に改変する組成物及び方法を提供する。一過性発現は改変後の細胞に永続的な治療的変化（本願では「ヒットエンドラン」効果と呼ぶ）をもたらす。持続的な治療効果を得るために一過性発現しか必要としないため、治療用タンパク質発現の経時的な低下に関する問題が解消される。更に、これらの組成物及び方法は選択された細胞種を選択的に改変するため、改変の前に、細胞選択工程又は精製工程を必要としない。このため、治療用細胞のエクスビボ製造が迅速になると共に、細胞のインビボ標的化遺伝子改変が可能になる。
【００１２】
本願に記載するヒットエンドラン効果は、遺伝子編集を生じる核酸の一過性発現又は細胞の表現型を永続的に変化させるタンパク質の一過性発現を利用することにより、可能になる。遺伝子編集を生じる核酸の例としては、ＴＡＬＥＮ、ｍｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが挙げられる。表現型を変化させるタンパク質の例としては、転写因子、キナーゼ及び細胞表面受容体が挙げられる。一過性発現とは、細胞への核酸導入後の短期間の組換え遺伝子産物の産生を意味する。特定の実施形態において、一過性発現は、１２時間〜２０日間、１８時間〜１８日間、２４時間〜１４日間、又は３６時間〜１０日間続く。細胞の表現型とは、その形質的特徴及び／又は生体内におけるその位置を意味する。
【００１３】
本願に開示する組成物及び方法には、多数の用途がある。例としては、標的化ヌクレアーゼによりリンパ球（例えば造血幹細胞（ＨＳＣ））のゲノムを編集する場合、樹状細胞にトランスフェクトする担体に核酸を担持させて同時注入し、前記細胞の抗原提示能を高めることによりワクチンの力価を増強させる場合、又はワクチンでプライミングしたＴ細胞にトランスフェクトして長期間持続するメモリー表現型を誘導する場合が挙げられる。
【００１４】
特定の実施形態は、特定の選択された細胞を標的とすることができるナノ担体を含み、単に前記ナノ担体を培養細胞とエクスビボで混合することにより、又は対象の体内の細胞とインビボで混合することにより、核酸の用量制御送達を行うことができる。特定の実施形態において、前記ナノ担体は（１）選択された細胞ターゲティングリガンドと、（２）担体と、（３）前記担体の内側に内包された核酸とを含む。特定の実施形態は、（１）選択された細胞ターゲティングリガンドと、（２）担体と、（３）前記担体の内側に内包された核酸と、（４）コーティングを含むナノ担体とを含む。
【００１５】
特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、ナノ担体を選択された細胞と選択的に結合させ、迅速な受容体誘導性エンドサイトーシスを開始し、前記ナノ担体を内在化させる表面係留ターゲティングリガンドを含むことができる。本願の他の箇所でより詳細に開示するように、選択された細胞ターゲティングリガンドは、抗体、ｓｃＦｖタンパク質、ＤＡＲＴ分子、ペプチド及び／又はアプタマーを含むことができる。特定の実施形態は、ヒトＴ細胞にトランスフェクトするために抗ＣＤ８抗体を利用し、ＨＳＣを標的とするためにＣＤ３４、ＣＤ１３３又はＣＤ４６を認識する抗体を利用する。
【００１６】
特定の実施形態において、担体は、核酸を圧縮して酵素分解から保護する担体分子を含む。本願の他の箇所でより詳細に開示するように、担体は、正電荷をもつ脂質及び／又はポリマーを含むことができる。特定の実施形態は、ポリ（β−アミノエステル）を利用する。
【００１７】
特定の実施形態において、核酸は担体の内側に封入されており、選択された細胞による細胞取込み後、遺伝子編集剤及び／又は細胞の表現型を永続的に変化させるタンパク質を発現する。本願の他の箇所により詳細に開示するように、核酸はｍｅｇａＴＡＬ又は転写因子を発現する合成ｍＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態はリンパ球によるＴ細胞受容体発現を妨害するために、（ｉ）メモリーＣＤ８Ｔ細胞を誘導する転写因子ＦＯＸＯ１、又は（ｉｉ）切断頻度の低い（ｒａｒｅ−ｃｌｅａｖｉｎｇ）ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ（例えばＢｏｉｓｓｅｌ  ＆  Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９，１７１−１９６（２０１５）参照）を発現するインビトロ転写ｍＲＮＡ（例えばＧｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９６９，５５−７２（２０１３）参照）を利用する。
【００１８】
特定の実施形態において、本願に開示するナノ担体は、封入された核酸を保護してオフターゲット結合を抑制するか又は防止する、コーティングを含む。ナノ担体の表面電荷を中性又は負になるまで減らすことにより、オフターゲット結合を抑制するか又は防止する。本願の他の箇所でより詳細に開示するように、コーティングは、中性又は負電荷をもつポリマー及び／又はリポソームをベースとするコーティングを含むことができる。特定の実施形態は、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）をナノ担体コーティングとして利用する。コーティングを使用する場合には、必ずしもナノ担体全体を覆う必要はないが、ナノ担体によるオフターゲット結合を抑制するために十分でなければならない。
【００１９】
本願に開示するナノ担体を不均一細胞混合物（例えばエクソビボ細胞培養物又はインビボ環境）に加えると、この人工ナノ担体は、選択された細胞集団と結合し、受容体介在性エンドサイトーシスを刺激し、このプロセスにより、前記担体に担持された核酸（例えば合成ｍＲＮＡ）が導入され、その結果、前記選択された細胞はコードされている分子を発現し始める（図１Ａ）。トランスジーンの核内輸送及び転写が不要であるため、このプロセスは、迅速で効率的である。必要に応じて、所望の結果が得られるまで、ナノ担体の追加添加を実施することができる。特定の実施形態において、ナノ担体は、生分解性で生体適合性であり、エクスビボ細胞製造では、改変細胞を治療のために対象に注入する前に、未結合のナノ粒子から遠心により容易に分離することができる。
【００２０】
特定の実施形態において、迅速とは、不均一細胞試料を本願に開示するナノ担体に暴露してから２４時間以内又は１２時間以内に、選択された細胞種の内側でコードされている核酸の発現が開始することを意味する。このタイムラインは、標的細胞の細胞質内への放出のほぼ直後（例えば数分以内）に転写され始める、ｍＲＮＡ等の核酸を利用することにより、可能である。
【００２１】
特定の実施形態において、効率的とは、標的細胞（例えばヒト一次Ｔ細胞）への遺伝子導入率が＞８０％であり、これらの細胞の少なくとも８０％、これらの細胞の少なくとも９０％、又はこれらの細胞の１００％で表現型改変が生じることを意味する。特定の実施形態において、効率的とは、標的細胞への遺伝子導入率が＞８０％であり、これらの細胞の少なくとも２５％、これらの細胞の少なくとも３３％、又はこれらの細胞の少なくとも５０％で表現型改変が生じることを意味する。特定の実施形態では、ナノ担体を取込む選択された細胞の３分の１で表現型改変を生じることができ、送達される核酸は、ヌクレアーゼをコードする。
【００２２】
以下、本開示のその他の任意事項と実施形態について、より詳細に記載する。
【００２３】
選択された細胞ターゲティングリガンド。本願に開示するナノ担体の選択された細胞ターゲティングリガンドは、不均一細胞集団内の目的免疫細胞と選択的に結合する。特定の実施形態において、目的免疫細胞は、リンパ球である。リンパ球としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球／マクロファージ及びＨＳＣが挙げられる。
【００２４】
各々異なる機能をもつＴ細胞の数種の異なるサブセットが、発見されている。特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、受容体介在性エンドサイトーシスにより特定のリンパ球集団への選択的誘導を実現する。例えば、大半のＴ細胞は、数種のタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つ。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体α及びβ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から生成されるα及びβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２本の別個のペプチド鎖から構成される。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、これらのＴ細胞への核酸の選択的送達を行うために、α及び／又はβ−ＴＣＲ鎖と結合することができる。
【００２５】
γδＴ細胞とは、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つ、Ｔ細胞の小さいサブセットのことである。γδＴ細胞において、ＴＣＲは、γ鎖１本とδ鎖１本とから構成される。このグループのＴ細胞は、αβＴ細胞よりも著しく少ない（全Ｔ細胞の２％）。それにも拘わらず、本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、これらのＴ細胞への核酸の選択的送達を行うために、γ及び／又はδ−ＴＣＲ鎖と結合することができる。
【００２６】
ＣＤ３は、全ての成熟Ｔ細胞上で発現される。したがって、本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、全ての成熟Ｔ細胞への核酸の選択的送達を行うためにＣＤ３と結合することができる。活性化Ｔ細胞は、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ６９及びＣＤ２５を発現する。したがって、本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、活性化Ｔ細胞への核酸の選択的送達を行うために４−１ＢＢ、ＣＤ６９又はＣＤ２５と結合することができる。ＣＤ５及びトランスフェリン受容体もまたＴ細胞上で発現されるものであり、これらを、Ｔ細胞への核酸の選択的送達を行うために使用することができる。
【００２７】
Ｔ細胞は、更に、ヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と、細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）とに分類することができる。ヘルパーＴ細胞は、例えば、Ｂ細胞から形質細胞への成熟及び細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化等の免疫プロセスにおいて、他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現することから、ＣＤ４＋Ｔ細胞とも呼ばれる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を提示されると、活性化される。活性化されると、迅速に分裂し、能動免疫応答を調節するか又は補助するサイトカインと呼ばれる小さいタンパク質を分泌する。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ヘルパーＴ細胞への核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ４と結合することができる。
【００２８】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞と腫瘍細胞とを破壊し、移植片拒絶反応にも関与している。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現することからＣＤ８＋Ｔ細胞とも呼ばれる。これらの細胞は、生体のほぼ全ての細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと会合した抗原と結合することにより、それらの標的を認識する。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＣＴＬへの核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ８と結合することができる。
【００２９】
本願で使用する「セントラルメモリー」Ｔ細胞（即ち「ＴＣＭ」）とは、抗原に暴露されたＣＴＬであり、その表面にＣＤ６２Ｌ又はＣＣＲ７とＣＤ４５ＲＯとを発現し、ナイーブ細胞に比較してＣＤ４５ＲＡを発現しないか又は発現が低下しているものを意味する。特定の実施形態において、セントラルメモリー細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ９５の発現が陽性であり、ナイーブ細胞に比較してＣＤ４５ＲＡの発現が低下している。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＴＣＭへの核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ及び／又はＣＤ９５と結合することができる。
【００３０】
本願で使用する「エフェクターメモリー」Ｔ細胞（即ち「ＴＥＭ」）とは、抗原に暴露されたＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞に比較してその表面にＣＤ６２Ｌを発現しないか又は発現が低下しており、ナイーブ細胞に比較してＣＤ４５ＲＡを発現しないか又は発現が低下しているものを意味する。特定の実施形態において、エフェクターメモリー細胞は、ナイーブ細胞又はセントラルメモリー細胞に比較してＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７の発現が陰性であり、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡの発現にばらつきがある。エフェクターＴ細胞は、メモリー又はナイーブＴ細胞に比較して、グランザイムＢ及びパーフォリンが陽性である。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＴＥＭへの核酸の選択的送達を行うためにグランザイムＢ及び／又はパーフォリンと結合することができる。
【００３１】
制御性Ｔ細胞（「ＴＲＥＧ」）は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、自己免疫疾患を防除する、Ｔ細胞の亜集団である。ＴＲＥＧは、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及びＬＡＰを発現する。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ナイーブＴＲＥＧへの核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ及び／又はＬＡＰと結合することができる。
【００３２】
本願で使用する「ナイーブ」Ｔ細胞とは、抗原に暴露されていないＴ細胞であり、セントラルメモリー細胞又はエフェクターメモリー細胞に比較して、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＡを発現し且つＣＤ４５ＲＯを発現しないものを意味する。特定の実施形態において、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及びＣＤ４５ＲＡを含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーを発現することを、特徴とする。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ナイーブＴ細胞への核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７及び／又はＣＤ４５ＲＡと結合することができる。
【００３３】
ナチュラルキラー細胞（別称ＮＫ細胞、Ｋ細胞及びキラー細胞）は、インターフェロン又はマクロファージ由来サイトカインに応答して活性化される。これらの細胞は、ウイルス感染症を排除することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞が適応免疫応答により生成されている間に、ウイルス感染症を抑制するように機能する。ＮＫ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ１６及びＣＤ５６を発現するが、ＣＤ３は発現しない。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、ＮＫ細胞への核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ８、ＣＤ１６及び／又はＣＤ５６と結合することができる。
【００３４】
マクロファージ（及びその前駆細胞である単球）は、生体の全ての組織に（場合により、小膠細胞、クッパー細胞及び破骨細胞として）存在し、アポトーシス細胞、病原体及び他の非自己成分を飲み込む。単球／マクロファージは、非自己成分を飲み込むので、これらの細胞による選択的取込みには本願に記載するナノ担体に特別なマクロファージ又は単球指向剤（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を付加する必要がない。あるいは、本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、単球／マクロファージへの核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＩＬ−４Ｒα及び／又はＣＤ１６３と結合することができる。
【００３５】
未成熟樹状細胞（即ち活性化前）は、末梢で抗原及び他の非自己成分を飲み込んだ後、活性化状態でリンパ組織のＴ細胞領域に移動し、Ｔ細胞への抗原提示を行う。したがって、マクロファージと同様に、樹状細胞のターゲティングは、選択された細胞ターゲティングリガンドに依存する必要がない。樹状細胞を選択的に標的とするために、選択された細胞ターゲティングリガンドを使用する場合には、以下のＣＤ抗原、即ちＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２１、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ１０１、ＣＤ１４８、ＣＤ２０９及びＤＥＣ−２０５と結合することができる。
【００３６】
Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の存在により、他のリンパ球から区別することができる。Ｂ細胞の主要な機能は、抗体の産生である。Ｂ細胞は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５２及びＣＤ８０を発現する。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、Ｂ細胞への核酸の選択的送達を行うためにＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ５２及び／又はＣＤ８０と結合することができる。また、Ｂ細胞サブタイプを標的とするためには、Ｂ細胞受容体アイソタイプ定常領域（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）を標的とする抗体を使用することもできる。
【００３７】
リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）は、全てのＴ細胞、Ｂ細胞及び単球／マクロファージで発現される。したがって、本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単球／マクロファージへの核酸の選択的送達を行うために、ＬＦＡ−１と結合することができる。
【００３８】
ＨＳＣも、本願に開示するナノ担体の選択的送達の標的とすることができる。ＨＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ１３３、Ｓｃａ−１及びＣＤ１１７を発現する。本願に開示する選択された細胞ターゲティングリガンドは、造血幹細胞への核酸の選択的送達を行うために、ＣＤ３４、ＣＤ４６、ＣＤ１３３、Ｓｃａ−１及び／又はＣＤ１１７と結合することができる。
【００３９】
「選択的送達」とは、核酸が、１個以上の選択されたリンパ球集団に送達・発現されることを意味する。特定の実施形態において、選択的送達は、選択されたリンパ球集団に限定される。特定の実施形態では、投与された核酸の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％が、選択されたリンパ球集団に送達及び／又は発現される。特定の実施形態において、選択的送達は、送達された核酸が、リンパ球以外の細胞で発現されないようにする。例えば、ターゲティング剤が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子であるとき、ＴＣＲ発現に必要なζ鎖をもつのはＴ細胞のみであるため、選択性が確保される。選択されていない細胞への核酸取込みの欠如又は核酸配列内の特定のプロモーターの存在に基づいて、選択的送達を行うこともできる。例えば、一過性発現された核酸は、Ｔ細胞特異的ＣＤ３δプロモーターを含むことができる。選択的送達を行うことができるその他のプロモーターとしては、Ｔ細胞もしくはＨＳＣ用のマウス幹細胞ウイルスプロモーターもしくは遠位ｌｃｋプロモーター；ＨＳＣ用のＣＤ４５プロモーター、ＷＡＳＰプロモーターもしくはＩＦＮβプロモーター；Ｂ細胞用のＢ２９プロモーター；又は単球／マクロファージ用のＣＤ１４プロモーターもしくはＣＤ１１ｂプロモーターが挙げられる。
【００４０】
記載の通り、選択された細胞ターゲティングリガンドは、リンパ球細胞上に存在するモチーフとの結合ドメインを含むことができる。選択された細胞ターゲティングリガンドは、更に、リンパ球への選択的取込みを可能にする任意の選択的結合機構を含むことができる。特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドは、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１、トランスフェリン受容体及びそれらの組合せとの結合ドメインを含む。
【００４１】
特定の実施形態において、結合ドメインは、細胞マーカーリガンド、受容体リガンド、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸、核酸アプタマー、スピエゲルマー又はそれらの組合せを含む。選択された細胞ターゲティングリガンドの文脈内において、結合ドメインは、別の物質と結合してエンドサイトーシスに介在することが可能な複合体を形成する、任意の物質を含む。
【００４２】
「抗体」は、結合ドメインの１例であり、全長抗体又は抗体の結合断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及び一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はリンパ球により発現されるモチーフと特異的に結合する免疫グロブリンの任意の生物学的に有効な断片）を含む。抗体又は抗原結合断片としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ミニボディ及び線状抗体の全部又は一部が挙げられる。
【００４３】
ヒト由来抗体又はヒト化抗体は、ヒトにおける免疫原性が低下又は消失しており、非ヒト抗体に比較して非免疫原性エピトープの数が少ない。抗体及びその断片は、一般にヒト対象における抗原性レベルが低下するか又はゼロになるように選択されよう。
【００４４】
リンパ球により発現されるモチーフと特異的に結合する抗体は、当分野における通常の知識を有する者に公知の通り、モノクローナル抗体を取得する方法、ファージディスプレイ法、ヒトもしくはヒト化抗体を作製する方法、又は抗体を産生するように人工的に作出されたトランスジェニック動物もしくは植物を使用する方法を使用して、作製することができる（例えば、米国特許第６，２９１，１６１号及び６，２９１，１５８号参照）。部分的又は完全合成抗体のファージディスプレイライブラリーは、入手可能であり、且つ、リンパ球モチーフと結合できる抗体又はその断片についてスクリーニング可能である。例えば、目的標的と特異的に結合するＦａｂ断片についてＦａｂファージライブラリーをスクリーニングすることにより、結合ドメインを同定することができる（Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４４，２００５参照）。ヒト抗体のファージディスプレイライブラリーもまた、入手可能である。更に、従来のシステム（例えばマウス、ＨｕＭＡｂマウス（Ｒ）、ＴＣマウス（ＴＭ）、ＫＭマウス（Ｒ）、ラマ、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ等）で目的標的を免疫原として使用する伝統的なハイブリドーマ作出ストラテジーもまた、結合ドメインを作出するために使用可能である。特定の実施形態において、抗体は、選択されたリンパ球により発現されるモチーフと特異的に結合し、非特異的成分又は無関係の標的とは交差反応しない。抗体をコードするアミノ酸配列又は核酸配列を、一旦同定した後で、単離及び／又は決定することができる。
【００４５】
特定の実施形態において、選択された細胞ターゲティングリガンドの結合ドメインは、Ｔ細胞受容体モチーフ抗体、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体を含む。これらの結合ドメインは、上記抗体のｓｃＦｖ断片から構成することもできる。
【００４６】
ペプチドアプタマーは、タンパク質骨格の両端に結合した（標的タンパク質に特異的な）ペプチドループを含む。この二重の構造的制約により、ペプチドアプタマーの結合親和性は著しく高くなり、抗体と同等のレベルに達する。可変ループ長は、一般的に８〜２０アミノ酸（例えば８〜１２アミノ酸）であり、骨格は、安定的で可溶性の小型で非毒性の任意タンパク質とすることができる（例えばチオレドキシンＡ、ステフィンＡ三重突然変異体、緑色蛍光タンパク質、エグリンＣ及び細胞転写因子Ｓｐｌ）。ペプチドアプタマー選択は、酵母ツーハイブリッドシステム（例えばＧａｌ４酵母ツーハイブリッドシステム）又はＬｅｘＡ相互作用トラップシステム等に種々のシステムを使用して行うことができる。
【００４７】
核酸アプタマーは、Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：５−９，１９９７及びＣｅｒｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５２８：１２−１６，２００２に記載されているように、特定の球状構造に折り畳むことにより機能する１本鎖核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）リガンドであるため、標的タンパク質又は他の分子と、高い親和性及び特異性で、結合する。特定の実施形態において、アプタマーは、小型である（１５ＫＤ又は１５〜８０ヌクレオチド又は２０〜５０ヌクレオチド）。アプタマーは、一般にＳＥＬＥＸ（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：指数的集積によるリガンドの系統的進化；例えばＴｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５−５１０，１９９０；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．７５−８６，１９９１；及びＧｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４：７６３−７９７，１９９５参照）と呼ばれる方法により、１０１４〜１０１５個のランダムなオリゴヌクレオチド配列から構成されるライブラリーから単離される。例えば米国特許第６，３４４，３１８号、６，３３１，３９８号、６，１１０，９００号、５，８１７，７８５号、５，７５６，２９１号、５，６９６，２４９号、５，６７０，６３７号、５，６３７，４６１号、５，５９５，８７７号、５，５２７，８９４号、５，４９６，９３８号、５，４７５，０９６号及び５，２７０，１６号には、アプタマーの他の作製方法も記載されている。スピエゲルマーは、少なくとも１個のβ−リボース単位が、β−Ｄ−デオキシリボース又は例えばβ−Ｄ−リボース、α−Ｄ−リボース、β−Ｌ−リボースから選択される糖単位異性体で置換えられている以外は、核酸アプタマーと同様である。
【００４８】
ポリ（エチレンイミン）／ＤＮＡ（ＰＥＩ／ＤＮＡ）複合体のように、リンパ球による内在化及び／又はリンパ球のトランスフェクションを助長することができる他の物質もまた、使用することができる。
【００４９】
担体。記載の通り、本願に開示するナノ担体の担体は、核酸を圧縮し、酵素分解から保護するように機能する。担体として使用するのに特に有用な材料としては、正電荷をもつ脂質及び／又はポリマーが挙げられ、例えばポリ（β−アミノエステル）が挙げられる。
【００５０】
正電荷をもつ脂質のその他の例としては、ホスファチジン酸とアミノアルコールのエステル（例えばジパルミトイルホスファチジン酸又はジステアロイルホスファチジン酸とヒドロキシエチレンジアミンのエステル）が挙げられる。正電荷をもつ脂質のより具体的な例としては、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡＣ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＲＩ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジオクタデシルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］プロパン（ＤＳＴＡＰ）、及び例えばＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２００５，１１，３７５−３９４に記載されているカチオン性脂質が挙げられる。
【００５１】
本開示内で担体として使用することができる正電荷をもつポリマーの例としては、ポリアミン、有機ポリアミン（例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミンセルロース）、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリアミノ酸（例えばポリリジン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン）、多糖類（例えばセルロース、デキストラン、ＤＥＡＥデキストラン、デンプン）、スペルミン、スペルミジン、ポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）、ポリ（４−ビニル−Ｎ−アルキルピリジニウム）、ポリ（アクリロイルトリアルキルアンモニウム）及びＴａｔタンパク質が挙げられる。
【００５２】
任意の濃度で任意の比の脂質とポリマーとのブレンドもまた、使用することができる。種々のグレードを使用して種々のポリマー種を種々の比でブレンドすると、成分であるポリマーの各々に由来する特徴が得られる。種々の末端基化学反応を取り入れることもできる。
【００５３】
上記以外に、本願に開示する特定の実施形態は、多孔質ネットワークを形成することが可能な任意材料から構成される、多孔質ナノ粒子を利用することもできる。代表的な材料としては、金属、遷移金属及び半金属が挙げられる。代表的な金属、遷移金属及び半金属としては、リチウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム及びシリカが挙げられる。特定の実施形態において、多孔質ナノ担体は、シリカを含む。メソポーラスシリカは、表面積が非常に大きい（１，０００ｍ２／ｇ超）ため、リポソーム等の従来のＤＮＡ担体を上回るレベルで核酸を担持することが可能である。
【００５４】
担体は、種々の異なる形状に形成することができ、球形、立方形、ピラミッド形、長楕円形、円筒形、ドーナツ形等が挙げられる。核酸を、担体の細孔に種々の方法で内包させることができる。例えば、核酸を、多孔質ナノ担体に封入することができる。他の態様では、核酸を、多孔質ナノ担体の表面又は表面の直下と（例えば共有的及び／又は非共有的に）結合させることができる。特定の実施形態では、核酸を、多孔質ナノ担体に組込むことができ、例えば、多孔質ナノ担体の材料に一体化することができる。例えば、核酸を、ポリマーナノ担体のポリマーマトリックスに組込むことができる。
【００５５】
コーティング。特定の実施形態において、本願に開示するナノ担体は、封入された核酸を保護してオフターゲット結合を抑制するか又は防止するコーティングを含む。ナノ担体の表面電荷を中性又は負になるまで減らすことにより、オフターゲット結合を抑制するか又は防止する。本願の他の箇所でより詳細に開示するように、コーティングは、中性又は負電荷をもつポリマー及び／又はリポソームをベースとするコーティングを含むことができる。特定の実施形態において、コーティングは、封入された核酸が選択された細胞内に放出される前に環境に暴露されないようにするために十分な、親水性ポリマー及び／又は中性電荷をもつ親水性ポリマーの稠密な表面コーティングである。特定の実施形態において、コーティングは、ナノ担体の表面の少なくとも８０％又は少なくとも９０％を覆う。特定の実施形態において、コーティングは、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む。
【００５６】
本開示の実施形態の範囲内でコーティングとして使用することができる中性電荷をもつポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）及びポリアルキレンオキシド共重合体（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（Ｒ），ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）が挙げられる。
【００５７】
中性電荷をもつポリマーとしては、双性イオン型ポリマーも挙げられる。双性イオン型とは、正電荷と負電荷の両方をもつが、全体としての電荷は中性である性質を意味する。双性イオン型ポリマーは、細胞とタンパク質の接着を阻止する細胞膜領域と同様に挙動することができる。
【００５８】
双性イオン型ポリマーは、双性イオン基をもつペンダント基（即ちポリマー主鎖からぶら下がった基）を含む双性イオン構成単位を含む。代表的な双性イオン性ペンダント基としては、カルボキシベタイン基が挙げられる（例えば−Ｒａ−Ｎ＋（Ｒｂ）（Ｒｃ）−Ｒｄ−ＣＯ２−であり、式中、Ｒａは、ポリマー主鎖をカルボキシベタイン基の窒素カチオン中心と共有結合させるリンカー基であり、Ｒｂ及びＲｃは、窒素置換基であり、Ｒｄは、窒素カチオン中心をカルボキシベタイン基のカルボキシ基と共有結合させるリンカー基である）。
【００５９】
負電荷をもつポリマーの例としては、アルギン酸、カルボン酸多糖類、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース−システイン、カラギーナン（例えばＧｅｌｃａｒｉｎ（Ｒ）２０９、Ｇｅｌｃａｒｉｎ（Ｒ）３７９）、コンドロイチン硫酸、グリコサミノグリカン、ムコ多糖類、負電荷をもつ多糖類（例えばデキストラン硫酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（Ｄ−アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ−アスパラギン酸）ナトリウム塩、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）ナトリウム塩、ポリ（メタクリル酸）、アルギン酸ナトリウム（例えばＰｒｏｔａｎａｌ（Ｒ）ＬＦ  １２０Ｍ、Ｐｒｏｔａｎａｌ（Ｒ）ＬＦ  ２００Ｍ、Ｐｒｏｔａｎａｌ（Ｒ）ＬＦ  ２００Ｄ）、カルボキシルメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、硫酸化多糖類（ヘパリン、アガロペクチン）、ペクチン、ゼラチン及びヒアルロン酸が挙げられる。
【００６０】
特定の実施形態において、本願に開示するポリマーは、中心核から２本以上のポリマー分岐鎖が延びている分岐ポリマーを意味する、「星型ポリマー」を含むことができる。中心核は、２個以上の官能基をもつ原子群であり、重合により、分岐鎖を延ばすことができる。
【００６１】
特定の実施形態において、分岐鎖は、双性イオン型又は負電荷をもつ、ポリマー分岐鎖である。星型ポリマーでは、分岐鎖前駆体を、加水分解、紫外線照射又は熱により、双性イオン型ポリマー又は負電荷をもつポリマーに変換することができる。不飽和モノマーの重合に有効な任意の重合法によりポリマーを得ることもでき、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）、光重合、開環重合（ＲＯＰ）、縮合、マイケル付加反応、分岐生成／伝播反応又は他の反応が挙げられる。
【００６２】
リポソームは、少なくとも１枚の同心円状脂質二重膜を含む微小胞である。小胞を形成する脂質は、最終的な複合体に指定される流動度又は剛性度が得られるように、選択される。特定の実施形態において、リポソームは、多孔質ナノ粒子を包囲する外層である脂質組成物を提供する。
【００６３】
リポソームは、中性（コレステロール）又は二極性とすることができ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）等のリン脂質や、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）のように炭化水素鎖長が１４〜２２であり、飽和であるか又は１個以上のＣ＝Ｃ二重結合をもつ他の型の二極性脂質が、挙げられる。単独で又は他の脂質成分と共に安定なリポソームを形成することが可能な脂質の例は、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）等のリン脂質である。リポソームに組込むことができるその他の非リン脂質としては、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキルアリールサルフェート、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、両性アクリルポリマー、ポリエトキシ化脂肪酸アミド、ＤＤＡＢ、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ＤＯＰＧ及びリン酸ジセチルが挙げられる。特定の実施形態において、本願に開示するリポソームを作製するために使用される脂質としては、コレステロール、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）及び誘導体化小胞形成脂質ＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
【００６４】
リポソームの形成方法は、例えば米国特許第４，２２９，３６０号、４，２２４，１７９号、４，２４１，０４６号、４，７３７，３２３号、４，０７８，０５２号、４，２３５，８７１号、４，５０１，７２８号及び４，８３７，０２８号と、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）及びＨｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）に記載されている。
【００６５】
核酸。本願に開示するナノ担体内で使用される核酸は、細胞運命、分化、生存性及び／又はトラフィキングを調節する遺伝子編集剤及び／又は表現型を変化させるタンパク質を、一過性発現することができる（例えば図１Ｂ、１Ｃ参照）。
【００６６】
特定の実施形態において、核酸は、合成ｍＲＮＡを含む。特定の実施形態では、５’キャッピングを使用して、細胞内安定性の高い合成ｍＲＮＡを人工的に作製する。合成ｍＲＮＡ分子の５’キャップを作るためには、複数の異なる５’キャップ構造を使用することができる。例えば、抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’三リン酸グアニン−グアニン結合を含むことができ、片方のグアニンがＮ７メチル基と３’−Ｏ−メチル基とを含む。５’キャップ構造の形成をもたらす酵素を使用して、合成ｍＲＮＡ分子を転写後キャッピングしてもよい。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素と組換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素とはｍＲＮＡの５’最末端ヌクレオチドとグアニンヌクレオチドとの間に標準的な５’−５’三リン酸結合を形成することができ、この場合にはグアニンがＮ７メチル化され、最末端の５’−ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルを含み、Ｃａｐ１構造を形成する。この結果、翻訳開始能及び細胞内安定性が高く且つ細胞内炎症性サイトカインの活性化が低下した、キャップが得られる。
【００６７】
合成ｍＲＮＡ又は他の核酸を、環状にしてもよい。ポリＡ結合タンパク質と５’末端結合タンパク質との相互作用を助長するように翻訳開始能の高い分子を作製するために、合成ｍＲＮＡを環状化してもよいし、コンカテマー化してもよい。環状化又はコンカテマー化の機構は、１）化学的経路、２）酵素経路及び３）リボザイム触媒経路の少なくとも３種類の異なる経路で生じることができる。新たに形成される５’−３’結合は、分子内でも分子間でもよい。
【００６８】
第１の経路では、相互に近接しているときに分子の５’末端と３’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応性基を、核酸の５’末端と３’末端とに導入することができる。有機溶媒中で合成ｍＲＮＡ分子の３’末端の３’アミノ末端ヌクレオチドが５’−ＮＨＳエステル部分を求核攻撃し、新たな５’−３’アミド結合を形成するように、５’末端に反応性ＮＨＳエステル基を導入し、３’末端に３’アミノ末端ヌクレオチドを導入することができる。
【００６９】
第２の経路では、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用して５’リン酸化核酸分子を核酸の３’ヒドロキシル基と酵素により連結し、新たなリン酸ジエステル結合を形成することができる。１例の反応では、核酸分子１μｇを、製造業者のプロトコールに従ってＴ４ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）１〜１０単位と共に３７℃で１時間保温することができる。ライゲーション反応は、酵素ライゲーション反応を助長するために５’領域と３’領域を並べて塩基対合することができるスプリントオリゴヌクレオチドの存在下で行うことができる。
【００７０】
第３の経路では、インビトロ転写中に得られた核酸分子がある核酸分子の５’末端をある核酸分子の３’末端にライゲーションすることが可能な活性なリボザイム配列を含むことができるように、ｃＤＮＡ鋳型の５’末端又は３’末端にリガーゼリボザイム配列をコードさせる。リガーゼリボザイムはグループＩイントロン、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来するものでもよいし、ＳＥＬＥＸ（指数的集積によるリガンドの系統的進化）により選択してもよい。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間行うことができる。
【００７１】
特定の実施形態において、核酸は、例えば遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質を発現するための配列（例えば遺伝子）を含むことができる、プラスミド、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む。適切なプラスミドとしては、遺伝子をリンパ球に導入するために使用することができる標準プラスミドベクター及びミニサークルプラスミドが挙げられる。核酸（例えばミニサークルプラスミド）は更に、選択的に改変された細胞における一過性発現を助長するための、任意の他の配列情報を含むことができる。例えば、核酸は汎用プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター及び／又は細胞質に特異的なプロモーター等のプロモーターを含むことができる。記載の通り、プロモーター及びプラスミド（例えばミニサークルプラスミド）は、一般に当分野で周知であり、従来技術を使用して作製することができる。
【００７２】
本願で使用する「遺伝子」なる用語は、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする核酸配列を意味する。この定義は、種々の配列多形、突然変異及び／又は配列変異体を含み、このような変異は、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質の機能に影響を与えるものではない。「遺伝子」なる用語は、コーディング配列だけでなく、プロモーター、エンハンサー及び終結領域等の調節領域も含むことができる。この用語は、更に、ｍＲＮＡ転写産物からスプライシングされた全イントロン及び他のＤＮＡ配列、及び、選択的スプライス部位から得られた変異体をも含むことができる。遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質の発現を導くＲＮＡとすることができる。これらの核酸配列は、特定の実施形態ではタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列を含む。これらの核酸配列は、全長核酸配列と、全長タンパク質から誘導される非全長配列の両者を含む。これらの配列は、天然配列の縮重コドン又は特定のリンパ球におけるコドン優先を確保するために導入され得る配列も、含むことができる。本願に開示する遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードするための遺伝子配列は、公共データベース及び刊行物で入手可能である。本願で使用する「コードする」なる用語は、プラスミド、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の核酸の配列が、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質の合成用の鋳型として機能する性質を意味する。
【００７３】
遺伝子編集剤。本願で使用する遺伝子編集剤は、選択された細胞の内在性ゲノムの特定の配列を改変又は変化させる、本願に記載するような一過性核酸発現の発現産物を含む。特定の実施形態において、前記改変は、内在性遺伝子の除去又は破壊を含み、その結果として、内在性遺伝子にコードされているタンパク質を、発現させないようにしたり、発現の程度を低下させたり、不完全なタンパク質、不安定なタンパク質、正しく折り畳まれていないタンパク質及び／又は非機能的タンパク質として発現させたりする。特定の実施形態において、結果は、干渉性ＲＮＡ型機構によるタンパク質の発現低下である。したがって、遺伝子編集剤は、ゲノム編集に有用であり、例えば遺伝子破壊、相同組換えによる遺伝子編集、及びヒトゲノムを含む適切な染色体標的位置に治療用遺伝子を挿入するための遺伝子治療に、有用である。
【００７４】
特定の実施形態は、遺伝子編集剤として転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を利用する。ＴＡＬＥＮとは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合タンパク質及びＤＮＡ切断ドメインを含む、融合タンパク質を意味する。ＴＡＬＥＮは、ＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導して細胞に修復機構を誘導することにより、遺伝子及びゲノムを編集するために使用される。一般に、ＤＮＡ切断ドメインが二量体化してＤＳＢを誘導するためには、２種類のＴＡＬＥＮが標的ＤＮＡ部位の両側に結合して挟み込む必要がある。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は外来二本鎖ドナーＤＮＡ断片との相同組換え（ＨＲ）により、細胞内で修復される。
【００７５】
記載の通り、ＴＡＬＥＮは、例えば内在性ゲノムの標的配列と結合し、標的配列の位置でＤＮＡを切断するように人工的に作製されている。ＴＡＬＥＮのＴＡＬＥはキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌により分泌される、ＤＮＡ結合タンパク質である。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、高度に保存された３３又は３４アミノ酸の反復配列を含むが、各反復配列の１２位及び１３位の残基は、可変である。これらの２つの位置は、反復可変二残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ：ＲＶＤ）と呼ばれ、特定のヌクレオチド認識と強い相関を示す。したがって、ＲＶＤのアミノ酸を置換し、通常とは異なるＲＶＤアミノ酸を組込むことにより、ターゲティング特異性を改善することができる。
【００７６】
ＴＡＬＥＮ融合体で使用することができるＤＮＡ切断ドメインの例は、野生型及び変異体ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。ＦｏｋＩドメインは、標的配列上の部位に対してユニークなＤＮＡ結合ドメインをもつ２つのコンストラクトを必要とする二量体として機能する。ＦｏｋＩ切断ドメインは、２つの逆向きの半分ずつの部位を分離する５又は６塩基対スペーサー配列の内側で切断する。
【００７７】
特定の実施形態は、ＭｅｇａＴＡＬを遺伝子編集剤として利用する。ＭｅｇａＴＡＬは、切断頻度の低い一本鎖ヌクレアーゼ構造をもち、ＴＡＬＥをメガヌクレアーゼのＤＮＡ切断ドメインと融合させたものである。メガヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼとも呼ばれ、ＤＮＡ認識とヌクレアーゼ機能を同一ドメインに併有する１本のペプチド鎖である。ＴＡＬＥＮとは対照的に、ｍｅｇａＴＡＬは、機能的活性に、１本のペプチド鎖の送達しか必要としない。ＴＣＲαに特異的な代表的なｍｅｇａＴＡＬタンパク質を、図１１に配列番号１として示す。
【００７８】
特定の実施形態は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を遺伝子編集剤として利用する。ＺＦＮは、特定位置でＤＮＡと結合して切断するように人工的に作製された部位特異的ヌクレアーゼの１分類である。ＺＦＮは、ＺＦＮが種々の異なる細胞のゲノム内のユニークな配列を標的にできるように、ＤＮＡ配列の特定部位にＤＳＢを導入するために使用される。更に、二本鎖切断後に、ＤＳＢを修復するために相同組換え又は非相同末端結合が行われ、こうしてゲノム編集が可能になる。
【００７９】
ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合することにより、合成される。前記ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子である３〜６種のジンクフィンガータンパク質を含む。前記ＤＮＡ切断ドメインは、例えばＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。
【００８０】
遺伝子編集剤と共に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム等のガイドＲＮＡを使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムはＣＲＩＳＰＲリピートと１組のＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃａｓ）を含む。
【００８１】
ＣＲＩＳＰＲリピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ：クラスター化され、規則的に間隔が空いた短いパリンドロームの繰返し）は、リピートと同等の寸法の短い可変配列のスペーサーにより分離された短いダイレクトリピートのクラスターを含む。リピートは、２４〜４８塩基対の寸法であり、ある程度のダイアド対称性があるため、ヘアピン等の二次構造の形成を伴うが、リピートは、正確にはパリンドロームではない。リピートを分離するスペーサーは、原核生物ウイルス、プラスミド及びトランスポゾンに由来する配列と厳密に一致する。Ｃａｓ遺伝子は、ＤＮＡを巻き戻して切断するヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡ結合タンパク質及びポリメラーゼをコードする。Ｃａｓ遺伝子の例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２及びＣａｓ９である。
【００８２】
ＣＲＩＳＰＲスペーサーの起源から見て、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、細菌における適応免疫に加担すると考えられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫系反応には少なくとも３種類があり、Ｃａｓ１遺伝子及びＣａｓ２遺伝子は、全３種類でスペーサー獲得に関与している。適応免疫の第１段階では、スペーサー獲得が行われ、侵入してくるウイルスＤＮＡの捕捉及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への挿入が行われる。より具体的には、Ｃａｓ１及びＣａｓ２が侵入してくるＤＮＡを認識し、プロトスペーサーを切断し、切断されたプロトスペーサーがリーダー配列に隣接するダイレクトリピートと連結されると、スペーサー獲得が開始する。その後、一本鎖伸長修復が行われ、ダイレクトリピートが複製される。
【００８３】
ＣＲＩＳＰＲ関連適応免疫の次段階は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）生合成であり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの型毎に夫々異なる方法で行われる。一般に、この段階の間に、ＣＲＩＳＰＲ転写産物は、Ｃａｓ遺伝子により切断され、ｃｒＲＮＡとなる。Ｉ型システムでは、Ｃａｓ６ｅ／Ｃａｓ６ｆが、転写産物を切断する。ＩＩ型システムは、トランス活性化型（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡを利用してｄｓＲＮＡを形成し、Ｃａｓ９とＲＮａｓｅ  ＩＩＩにより切断する。ＩＩＩ型システムは、切断にＣａｓ６ホモログを使用する。
【００８４】
ＣＲＩＳＰＲ関連適応免疫の最終段階では、プロセッシングされたｃｒＲＮＡがＣａｓタンパク質と会合し、干渉複合体を形成する。Ｉ型及びＩＩ型のシステムでは、Ｃａｓタンパク質は、侵入してくるＤＮＡを分解するために短い３〜５ｂｐＤＮＡ配列であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と相互作用するが、ＩＩＩ型システムは、分解にＰＡＭとの相互作用を必要としない。ＩＩＩ−Ｂ型システムでは、ｃｒＲＮＡは分解のために、標的ＤＮＡではなくｍＲＮＡと塩基対合する。
【００８５】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、原核生物ではＲＮＡｉ様免疫系として機能する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓテクノロジーは、ヒト細胞株及び細胞において遺伝子を不活性化させるために利用されている。１例として、ＩＩ型システムに基づくＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、ゲノム編集剤として使用されている。
【００８６】
ＩＩ型システムは、Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの３成分を必要とする。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとを繋げて１本の合成シングルガイトＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とすることにより、システムを簡易化することができる。
【００８７】
少なくとも３種類の異なるＣａｓ９ヌクレアーゼが、ゲノム編集用に開発されている。第１の分類は、野生型Ｃａｓ９であり、ＤＳＢを特定のＤＮＡ部位に導入して、ＤＳＢ修復機構を活性化させる。ＮＨＥＪ経路又は相同組換え修復（ＨＤＲ）経路により、ＤＳＢを修復することができる。第２の分類は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａと呼ばれる突然変異体Ｃａｓ９であり、ニッカーゼ活性しかもたないため、ＤＮＡ一本鎖のみを切断し、ＮＨＥＪを活性化しない。したがって、ＤＮＡ修復は、ＨＤＲ経路のみで進行する。第３の分類は、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であり、切断活性をもたないが、ＤＮＡと結合することができる。したがって、ｄＣａｓ９は、ゲノムの特定配列を切断せずに、標的とすることができる。ｄＣａｓ９を種々のエフェクタードメインと融合することにより、ｄＣａｓ９を、遺伝子サイレンシング又は活性化ツールとして使用することができる。
【００８８】
本願に開示するナノ担体により選択的に送達される遺伝子編集剤は、多数の遺伝子を標的とすることができる。具体例としては、Ｓｈｐ１ホスファターゼ遺伝子（例えば配列番号２）、ＰＤ１受容体遺伝子（例えば配列番号３）、ＴＣＲα遺伝子（例えば配列番号４）、ＣＣＲ５遺伝子（例えば配列番号５）及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子（例えば配列番号６）のターゲティングが挙げられる。
【００８９】
Ｓｈｐ−１（ｓｒｃホモロジー領域２ドメインを含むホスファターゼ１；別称非受容体型プロテインチロシンホスファターゼ６（ＰＴＰＮ６））は、ヒトではＰＴＰＮ６遺伝子にコードされている。Ｓｈｐ−１のＮ末端部分は、基質とのその相互作用を調節するために、他の細胞成分と相互作用するタンパク質ホスホチロシン結合ドメインとして機能する２つのＳｒｃホモロジー（ＳＨ２）ドメインを含む。Ｓｈｐ−１は、造血に関与する複数のシグナル伝達経路のレギュレーターとして主要な役割を果たし、造血細胞シグナル伝達に関与する種々のリンタンパク質と相互作用する。Ｓｈｐ−１は、タンパク質チロシンリン酸化によりＥＰＯ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦの受容体等の成長因子受容体、及び他のシグナル伝達タンパク質と結合する。Ｓｈｐ−１は、更に、免疫グロブリンγＦｃドメイン（ＦｃＶＲＩＩＢ１）、ＮＫ細胞阻害受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＣＤ２２及びＣＤ７２によりトリガーされる阻害シグナルにも介在する。異なるアイソフォームをコードする、ＰＴＰＮ６遺伝子の選択的スプライスバリアントが、存在する。哺乳動物Ｓｈｐ−１をコードする代表的な核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０５４９、ＮＭ＿０５３９０８．１及びＮＭ＿０１３５４５を参照されたい。
【００９０】
本願に開示する特定の実施形態は、Ｔ細胞シグナル伝達を変化させるために、Ｓｈｐ１ホスファターゼ遺伝子のターゲティングを含む。Ｓｈｐ１ホスファターゼ活性は、高親和性のＴ細胞受容体の機能的活性を制限するので、稀親和性又は低親和性の腫瘍抗原を標的とするためにこれらの受容体を治療用に使用する際の障害となっている。（Ｈｅｂｅｉｓｅｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＳＨＰ−１  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ．ＪＣＩ．２０１３）。また、Ｓｈｐ１活性は、固形腫瘍におけるＴ細胞療法剤の抗腫瘍活性の低下に関係がある。（Ｍｏｏｎ  ＥＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｐｏｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｔｈａｔ  Ｉｓ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｎ  Ｌｉｍｉｔ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４）。これらの理由から、Ｓｈｐ１のダウンレギュレーションにより、Ｔ細胞及び治療用Ｔ細胞製品の特異的認識及び機能的活性を、高めることができる。
【００９１】
ＰＤ１（プログラム細胞死タンパク質１；別称分化抗原群２７９（ＣＤ２７９））は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面受容体である。これは、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージの表面で発現され、ヒトではＰＤＣＤ遺伝子にコードされている。構造的には、ＰＤ−１は、細胞外ＩｇＶドメインと、膜貫通領域と、細胞内テールとを含む。細胞内テールは、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ及び免疫受容体チロシン依存性スイッチモチーフに位置する２つのリン酸化部位を含むため、ＰＤ−１は、ＴＣＲシグナルの負の調節に関与していると考えられる。ＰＤ−１は、免疫チェックポイントである。これはＴ細胞の活性化を抑えることにより免疫系を負に調節し、自己免疫を抑制し、自己免疫寛容を助長する。ＰＤ−１は、リンパ節において抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを助長すると同時に制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）のアポトーシスを抑制することによりその機能を果たす。ＰＤ−１は、リガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と結合する。哺乳動物ＰＤ−１をコードする代表的な核酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２３８５１７、ＮＭ＿００１１０６９２７及びＫＪ８６５８５８を参照されたい。
【００９２】
本願に開示する特定の実施形態は、ＰＤ１受容体遺伝子のターゲティングを含む。ＰＤ１抗体遮断は、治療効率を高めることが実証されているが、胃腸、肝臓及び内分泌系並びに他の臓器に潜在的に免疫関連有害事象を生じる可能性もある（Ｐｏｓｔｏｗ  ＭＡ，Ｍａｎａｇｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｉｄｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，ＡＳＣＯ，２０１５）。注入した治療用Ｔ細胞製品におけるＰＤ１受容体発現を遺伝子編集によって選択的に阻止又は抑制することにより、注入したＴ細胞の高いインビボ活性を維持しながら、オフターゲット炎症性副作用を、最小限にすることができる。
【００９３】
先述の通り、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合したペプチドとして抗原断片を認識する役割を果たすＴリンパ球の表面に発現される。ＴＣＲα鎖遺伝子については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０４９５４、Ｘ７２９０４．１及びＬ２１６９９．１を参照されたい。
【００９４】
本願に開示する特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖遺伝子のターゲティングを含む。内在性ＴＣＲの発現は、人工Ｔ細胞受容体の発現を妨害し、自己免疫又はアロ反応性応答を生じる可能性がある。ＴＣＲα鎖遺伝子のターティングは、人工Ｔ細胞受容体の発現を改善することができ、Ｔ細胞製品製造において部分的なドナー非依存性を可能にする。
【００９５】
ＣＣＲ５（ケモカイン受容体タイプ５；別称ＣＤ１９５）は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好酸球及び小膠細胞の表面で発現される。ヒトでは、ＣＣＲ５遺伝子にコードされている。ＣＣＲ５は、内在性タンパク質のβケモカイン受容体ファミリーに属するＧタンパク質共役型受容体である。
【００９６】
ＨＩＶを含む多くの種類のウイルスは、宿主細胞に侵入するために共受容体としてＣＣＲ５を使用する。ＨＩＶが宿主細胞に侵入するためには、その糖タンパク質（ｇｐ１２０）がＣＤ４と共受容体（ＣＣＲ５）との両方と結合する必要があることから、ＣＣＲ５は、共受容体と呼ばれる。
【００９７】
したがって、ウイルス感染を防止する１つの方法は、ＣＣＲ５の発現を阻止又は抑制することである。ＣＣＲ５及びＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０の相互作用を妨害するために、数種類のＣＣＲ５受容体拮抗薬が開発されている。このような拮抗薬の例としては、ＰＲＯ１４０（Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ）、Ｖｉｃｒｉｖｉｒｏｃ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、Ａｐｌａｖｉｒｏｃ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）及びＭａｒａｖｉｒｏｃ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。ＣＣＲ５のリガンドの例としては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１β及びＭＩＰ−１αが挙げられる。これらのリガンドは、ＨＩＶ−１感染をインビトロで抑制することができる。哺乳動物ＣＣＲ５をコードする代表的な核酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ６６２８５、ＦＪ５７３１９５及びＡＦ０２２９９０を参照されたい。
【００９８】
本願に開示する特定の実施形態は、ＨＩＶの細胞内侵入等のウイルス侵入を抑制するためにＣＣＲ５遺伝子のターティングを含む。
【００９９】
ＣＸＣＲ４（ＣＸＣケモカイン受容体タイプ４；別称フシン又はＣＤ１８４）は、ヒトではＣＸＣＲ４遺伝子にコードされている。ＣＣＲ５と同様に、ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶの細胞内侵入を含む細胞内へのウイルス侵入の共受容体である。ＣＸＣＲ４は、多くの種類のがん細胞でも発現される。ＣＸＣＲ４は、リンパ球に対する走化性活性をもつ分子である間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２）に特異的なαケモカイン受容体でもある。ＳＤＦ−１は、Ｔ細胞指向性ＨＩＶ−１分離株の複製を抑制する。哺乳動物ＣＣＲ４をコードする代表的な核酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００８５４０、ＮＭ＿０２２２０５及びＮＭ＿００９９１１を参照されたい。
【０１００】
本願に開示する特定の実施形態は、ＨＩＶの細胞内侵入等のウイルス侵入を抑制するためにＣＸＣＲ４遺伝子のターティングを含む。
【０１０１】
記載の通り、本願に開示する特定の実施形態は、表現型を変化させるタンパク質の発現に依存する。表現型を変化させるタンパク質は、例えば細胞分化、生存性又はトラフィキングを調節することができる。表現型を変化させるタンパク質の例としては、例えばＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及びＣＣＲ４が挙げられる。
【０１０２】
ＦＯＸＯ１（フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１即ち横紋筋肉腫におけるフォークヘッド）は、ヒトではＦＯＸＯ１遺伝子（例えば配列番号７）にコードされている転写因子である。ＦＯＸＯ１は、感染に対するメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答を調節する遺伝子プログラムに選択的に組込まれる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１３，３９（２）：２８６−９７）。Ｋｉｍらによると、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞にＦＯＸＯ１をもたないマウスは、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）感染に対する一次応答に欠陥はないが、二次応答に欠陥がある（前出）。メモリーＴ細胞の前駆細胞は、短寿命のエフェクターＴ細胞に比較して多量のＦＯＸＯ１を発現し、メモリーＴ細胞の前駆細胞の産生及び維持が助長された（前出）。転写因子Ｔｃｆ７及びケモカイン受容体ＣＣＲ７が、ＦＯＸＯ１と相互作用することも示されている（前出）。
【０１０３】
ＦＯＸＯ１は、エフェクターからメモリーへの移行及びメモリーＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の機能的成熟を助長する役割も果たす（Ｔｅｊａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１９１（１）：１８７−１９９）。ＦＯＸＯ１は、エフェクター細胞の分化に必要ないが、メモリーＣＤ８Ｔ細胞は、ＦＯＸＯ１の不在下で老化の特徴を示し、リコール応答の低下及び防御免疫の不良を生じた（前出）。哺乳動物ＦＯＸＯ１をコードする代表的な核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２１９８１、ＮＭ＿００１１９１８４６及びＮＭ＿０１９７３９を参照されたい。本願に開示する特定の実施形態は、ＦＯＸＯ１の発現を含む。
【０１０４】
ＬＫＢ１（肝臓キナーゼＢ１、別称腎臓がん抗原ＮＹ−ＲＥＮ−１９又はセリン／スレオニンキナーゼ１１（ＳＴＫ１１））は、ヒトではＳＴＫ１１遺伝子にコードされているセリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＬＫＢ１は、Ｔ細胞発生、生存性、活性化及び代謝の重要なレギュレーターである（ＭａｃＩｖｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，１８７（８）：４１８７−４１９８）。ＬＫＢ１を欠損するＴ細胞は、細胞増殖及び生存性の不良と、解糖系及び脂質代謝の変化とを示す（前出）。ＬＫＢ１は更に、エネルギー栄養素が不足しているときに、成長及び増殖を抑制するキナーゼ群（ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫ関連キナーゼを含む）を活性化させる。ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ関連キナーゼ及びＬＫＢ１は、細胞極性を維持することにより、腫瘍細胞の成長を抑制するのに重要な役割を果たす。哺乳動物ＬＫＢ１をコードする代表的な核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４５５、ＮＭ＿００１１０８０６９及びＡＢ０１５８０１を参照されたい。本願に開示する特定の実施形態は、ＬＫＢ１の発現を含む。代表的なＬＫＢ１配列は、配列番号８である。
【０１０５】
Ｔ細胞特異的転写因子７（ＴＣＦ７）は、リンパ球分化に重要な役割を果たす転写活性化因子である。この遺伝子は、主にＴ細胞で発現される。コードされているタンパク質は、エンハンサーエレメントと結合してＣＤ３Ｅ遺伝子を活性化させることができ、更にフィードバック機構によりＣＴＮＮＢ１遺伝子とＴＣＦ７Ｌ２遺伝子を抑制することができる。ヒトＴＣＦ７をコードする代表的な核酸配列については、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＣ＿０００００５．１０を参照されたい。本願に開示する特定の実施形態は、ＴＣＦ７の発現を含む。
【０１０６】
エオメソデルミン（ＥＯＭＥＳ）は、脊椎動物における中胚葉と中枢神経系の胚発生に重要な転写因子である。また、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の分化にも関与している。ヒトＥＯＭＥＳをコードする代表的な核酸配列については、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＣ＿０００００３．１２と配列番号９を参照されたい。本願に開示する特定の実施形態は、ＥＯＭＥＳの発現を含む。
【０１０７】
ＨＬＨタンパク質であるＤＮＡ結合阻害剤２（ＩＤ２）は、ヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）ドメインを含むが、塩基性ドメインを含まない転写調節因子である。このＤＮＡ結合阻害剤ファミリーのメンバーは、ＨＬＨドメインを介してそのヘテロ二量体化パートナーを抑制することにより、塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子の機能をドミナントネガティブに阻害する。ＩＤ２は、細胞分化を負に調節するのに加担する。ヒトＩＤ２をコードする代表的な核酸配列については、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＣ＿０００００２．１２と配列番号１０を参照されたい。本願に開示する特定の実施形態は、ＩＤ２の発現を含む。
【０１０８】
本願に開示する特定の実施形態は、治療効率の必要に応じてＴＥＭ、ＴＣＭ又はＴＲＥＧ細胞等の特定の細胞表現型を生じるために、転写因子及びシグナル伝達分子（例えばＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ及び／又はＩＤ２）の発現により、Ｔ細胞の分化を変化させることを含む。ＴＣＭ細胞及びＴＥＭ細胞は、抗腫瘍モデルで高い治療効率を示した。
【０１０９】
テロメラーゼは、ＤＮＡ鎖においてテロメアを伸長させることにより、老化細胞を分裂終了（ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ）細胞及びアポトーシス細胞ではなく潜在的に不死化細胞にすることができる、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼである。ヒトテロメラーゼ複合体は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、テロメラーゼＲＮＡ（ＴＲ又はＴＥＲＣ）及びジスケリン（ＤＫＣ１）を夫々２分子ずつ含む。ＴＥＲＴは、ＴＥＲＣと共働し、テロメアの末端へのＴＴＡＧＧＧ配列としてのヌクレオチド付加を触媒する。反復ＤＮＡ配列の付加は、有糸分裂による細胞分裂後の染色体末端の分解を防ぐ。即ち、テロメラーゼは、テロメアを修復・伸長させ、老化細胞を分裂させ、５０〜７０回という細胞分裂回数のヘイフリック限界を越えることができる。哺乳動物ＴＥＲＴをコードする代表的な核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１９８２５３、ＮＭ＿０５３４２３、ＮＭ＿００９３５４と、配列番号１１を参照されたい。
【０１１０】
正常な体細胞は、検出可能なテロメラーゼ活性をもたない。本願に開示する特定の実施形態は、ＴＥＲＴの発現を含む。養子移入したＴ細胞のインビボ持続性及び抗腫瘍効果を、ＴＥＲＴｍＲＮＡの送達により強化できることが研究報告により示されている（エレクトロポレーション使用、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１５）１，１５０４０）。
【０１１１】
一方、悪性腫瘍細胞は、テロメラーゼ活性が高いことが分かっている。そこで、悪性がんにおけるＴＥＲＴを標的とするために、上記のような遺伝子編集ツールを使用することができる。
【０１１２】
ＣＣＲ２ｂ（ＣＣケモカイン受容体タイプ２即ちＣＤ１９２（分化抗原群１９２））は、Ｇタンパク質共役型受容体である。ヒトにおいて、ＣＣＲ２はＣＣＲ２遺伝子にコードされている。この遺伝子は、単一遺伝子の択一的スプライシングにより、前記受容体の２種類のアイソフォームであるＣＣＲ２ａとＣＣＲ２ｂをコードする。
【０１１３】
ＣＣＲ２ｂは、ＭＩＰ−１（ＲＡＮＴＥＳ受容体）に近縁であり、単球走化性に介在するケモカインである、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）の受容体である。ＣＣＲ２は、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３及びＭＣＰ−４とも結合するが、親和性は低い。ＣＣＲ２ａ及びＣＣＲ２ｂは、そのＣ末端テールが相違する。ＭＣＰ−１は、ＣＣケモカインファミリーに属する低分子ケモカインである。ＭＣＰ−１は、組織損傷又は感染により生じる炎症部位への単球、メモリーＴ細胞及び樹状細胞の動員に関与する。ＭＣＰ−１は、乾癬、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症等の炎症性疾患における単球浸潤と、腫瘍に対する炎症反応に関与する。哺乳動物ＣＣＲ２ｂをコードする代表的な核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１２３３９６及びＮＭ＿００９９１５と、配列番号１２を参照されたい。
【０１１４】
本願に開示する特定の実施形態は、治療用Ｔ細胞の腫瘍トラフィキングを強化するためにＣＣＲ２ｂの発現を含む（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０  Ｏｃｔ；３３（８）：７８０−８）。
【０１１５】
ＣＣＲ４（ＣＣケモカイン受容体４即ちＣＤ１９４（分化抗原群１９４））は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーに属する。ヒトでは、ＣＣＲ４遺伝子にコードされている。ＣＣＲ４は、ＣＣケモカインであるＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＡＲＣ及びマクロファージ由来ケモカインの受容体である。ＣＣケモカインは、単球並びにＮＫ細胞及び樹状細胞等の他の細胞の移動を、誘導する。１例として、ＭＣＰ−１は、単球が血流から離れて周囲組織に流入し、組織マクロファージとなるように誘導する。ＲＡＮＴＥＳは、Ｔ細胞、好酸球及び好塩基球を誘引する。したがって、ＣＣＲ４及びそのリガンドであるＣＣケモカインは、種々のタイプの白血球の細胞トラフィキングを調節する。哺乳動物ＣＣＲ４をコードする代表的な核酸配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５５０８、ＮＭ＿１３３５３２及びＮＭ＿００９９１６．２と、配列番号１３を参照されたい。
【０１１６】
本願に開示する特定の実施形態は、治療用Ｔ細胞の腫瘍ホーミングと抗腫瘍活性を改善するためにＣＣＲ４の発現を含む（Ｂｌｏｏｄ．２００９  Ｊｕｎ  １８；１１３（２５）：６３９２−４０２）。
【０１１７】
特定の実施形態は、選択された細胞により発現用核酸を送達するために、ヒットエンドラン効果から独立して又はこの効果に加えて、本願に開示するナノ担体を利用する。特定の実施形態において、このような実施形態は、選択された細胞の成長、生存、免疫機能及び／又は腫瘍細胞ターゲティングを強化することができる。遺伝子改変の例としては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、αβＴ細胞受容体（又はその改変体）及び／又は炎症性サイトカインの発現を可能にする改変が挙げられる。ＣＡＲ改変及び／又はαβＴ細胞受容体改変により、改変後のリンパ球は、細胞種を特異的に標的とすることができる。
【０１１８】
１態様において、遺伝子改変リンパ球は、腫瘍認識を改善し、天然Ｔ細胞増殖及び／又はサイトカイン産生の増加を誘起することができる。
【０１１９】
「キメラ抗原受容体」即ち「ＣＡＲ」とは、少なくとも結合ドメイン及びエフェクタードメインを含み、更に任意にスペーサードメイン及び／又は膜貫通ドメインを含む、人工的にデザインされた受容体を意味する。
【０１２０】
結合ドメインは、特に標的細胞上のマーカーと特異的に結合する、任意ペプチドを含むことができる。結合ドメインの起源としては、各種生物種に由来する抗体可変領域が挙げられる（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖグラバボディ（ｇｒａｂａｂｏｄｙ）又は可溶性ＶＨドメインもしくはドメイン抗体の形態とすることができる）。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成することができ、即ちこれらの機能的抗体は、重鎖のみからなるホモダイマーである（「重鎖抗体」と呼ぶ）（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：１１６１，２００４；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２８５３，２００４；Ｂａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１２：５８０，２００６；及びＢａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：３６３９，２００８）。
【０１２１】
結合ドメインの別の起源としては、ランダムペプチドライブラリーをコードする配列、又は、ｓｃＴＣＲ（例えばＬａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７４５，１９９９；Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３０６：５１，２００５；米国特許第８，３６１，７９４号参照）、フィブリノーゲンドメイン（例えばＷｅｉｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３８８，１９８５参照）、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）型ドメイン（例えば米国特許第６，４２３，４９８号参照）、人工アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４８９，２００３及びＢｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５７５，２００４）、フィブロネクチン結合ドメイン（アドネクチン又はモノボディ）（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２６：１４７５，２００３；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃ．１８：４３５，２００５及びＨａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８１：１２３８−１２５２）、システインノットミニタンパク質（Ｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：６４０４−６４０８；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７１，２００２及びＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １３：７５５，２００５）、テトラトリコペプチドリピートドメイン（Ｍａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １１：４９７，２００３及びＣｏｒｔａｊａｒｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：１６１，２００８）、ロイシンリッチリピートドメイン（Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：４７１，２００３）、リポカリンドメイン（例えばＷＯ２００６／０９５１６４，Ｂｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９６：１８９８，１９９９及びＳｃｈｏｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０６：８１９８，２００９参照）、Ｖ領域様ドメイン（例えば米国特許出願公開第２００７／００６５４３１号参照）、Ｃ型レクチンドメイン（Ｚｅｌｅｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｒｅａｄｙ，ＦＥＢＳ  Ｊ．２７２：６１７９，２００５；Ｂｅａｖｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：７５３，１９９２及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：７７７９，２００３）、ｍＡｂ２又はＦｃａｂ（ＴＭ）（例えばＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００７／０９８９３４、ＷＯ２００６／０７２６２０参照）、アルマジロリピートタンパク質（例えばＭａｄｈｕｒａｎｔａｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２１：１０１５，２０１２；ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２００９／０４０３３８参照）、アフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２：１７２，２００７）、アフィボディ、アビマー、ノッティン、フィノマー��アトリマーもしくは細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ．Ｐｒｏｔｅｏ．１０：１５５，２０１３）等（Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：６０１，１９９５；Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：７７２，１９９７；Ｎｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：４２６９，２００１；Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２５７，２００５；Ｂｏｅｒｓｍａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８４９，２０１１）の、代替非抗体骨格のループ領域における種々の人工アミノ酸をコードする配列が、挙げられる。
【０１２２】
特定の実施形態において、結合ドメインは、目的標的（例えばペプチド−ＭＨＣ複合体）に特異的なＶα／β鎖とＣα／β鎖（例えばＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ，Ｖα−Ｖβ）又はＶα−Ｃα、Ｖβ−Ｃβ、Ｖα−Ｖβ対を含む、一本鎖Ｔ細胞受容体（ｓｃＴＣＲ）である。
【０１２３】
代表的なＣＡＲは、例えばメソテリン、Ｈｅｒ２、ＷＴ−１及び／又はＥＧＲＦを標的とする、リガンド結合ドメインを発現する。代表的なＴ細胞受容体改変体は、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）Ａ３ＴＣＲを標的とする。
【０１２４】
関連細胞マーカーと結合する結合ドメインを、ＴＣＲ又はＣＡＲの細胞外成分の内側に含むことにより、以下の特定のがんを標的とすることができる。
【０１２５】
【表１】
2019511234.tif 000002
【０１２６】
上記以外に、細胞マーカーとして、Ａ３３、ＢＡＧＥ、Ｂｃｌ−２、β−カテニン、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５１、ＣＤ１７１、ＣＤ２７６、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳ−１、ＣＴＬＡ−４、サイクリンＢ１、ＤＡＧＥ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、エフリンＢ２、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、エストロゲン受容体、ＦＡＰ、フェリチン、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、葉酸結合タンパク質、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）、ＧＡＧＥ、Ｇ２５０、ＧＤ−２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＧＩＴＲ、ＧＭ２、ｇｐ７５、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、ｇｐ１３０、ＨＬＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ｈＴＥＲＴ、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＫＤＲ、Ｋｉ−６７、ルイスＡ、ルイスＹ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ、ＬＲＰ５、ＬＴβＲ、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ、メソテリン、ＭＵＣ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１−Ｂ、ｍｙｃ、ＮＹＥＳＯ−１、Ｏ−アセチルＧＤ−２、Ｏ−アセチルＧＤ３、ＯＳＭＲβ、ｐ５３、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＲＡＭＥ、プロゲステロン受容体、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＲＡＮＫ、ｒａｓ、Ｒｏｂｏ１、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、テネイシン、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＷＥＡＫ−Ｒ、ＴＳＴＡチロシナーゼ、ＶＥＧＦ及びＷＴ１もまた、挙げられる。。
【０１２７】
特定のがん細胞マーカーとしては、以下のものが挙げられる。
【０１２８】
【表２】
2019511234.tif 000003
2019511234.tif 000004
【０１２９】
特定の実施形態において、前記結合ドメインは、ＰＳＭＡと結合することができる。ＰＳＭＡに特異的な多数の抗体が当業者に知られており、配列、エピトープ結合及び親和性について、容易に特性決定することができる。特定の実施形態において、前記結合ドメインは、抗メソテリンリガンド（卵巣がん、膵臓がん及び中皮腫の治療に関連）、抗ＷＴ−１（白血病と卵巣がんの治療に関連）、抗ＨＩＶ−ｇａｇ（ＨＩＶ感染症の治療に関連）、又は抗サイトメガロウイルス（ヘルペスウイルス等のＣＭＶ疾患の治療に関連）を含むことができる。
【０１３０】
特定の実施形態において、前記結合ドメインは、ＣＤ１９と結合することができる。特定の実施形態において、結合ドメインは、ＣＤ１９に特異的なＶＨ領域とＶＬ領域とを含む一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態において、前記ＶＨ領域とＶＬ領域とは、ヒトである。代表的なＶＨ領域及びＶＬ領域としては、抗ＣＤ１９特異的モノクローナル抗体ＦＭＣ６３のセグメントが挙げられる。特定の実施形態において、前記ｓｃＦＶは、ＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮ（配列番号２２）のＣＤＲＬ１配列と、ＳＲＬＨＳＧＶ（配列番号２３）のＣＤＲＬ２配列と、ＧＮＴＬＰＹＴＦＧ（配列番号２４）のＣＤＲＬ３配列とを含む軽鎖可変領域を含む、ヒト又はヒト化ｓｃＦＶである。特定の実施形態において、前記ｓｃＦＶは、ＤＹＧＶＳ（配列番号２５）のＣＤＲＨＩ配列と、ＶＴＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳ（配列番号２６）のＣＤＲＨ２配列と、ＹＡＭＤＹＷＧ（配列番号２７）のＣＤＲＨ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ヒト又はヒト化ＳｃＦｖである。ＳＪ２５Ｃ１及びＨＤ３７等の他のＣＤ１９ターゲティング抗体も知られている（ＳＪ２５Ｃ１：Ｂｅｊｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５，ＰＭＩＤ  ７５３８９０１；ＨＤ３７：Ｐｅｚｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．ＪＩ  １９８７，ＰＭＩＤ  ２４３７１９９）。配列番号２８は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３ＤＮＡ配列を示し、配列番号２９は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）ＦＭＣ６３アミノ酸配列を示す。
【０１３１】
特定の実施形態において、前記結合ドメインは、ＲＯＲ１と結合することができる。特定の実施形態において、前記ｓｃＦＶは、ＡＳＧＦＤＦＳＡＹＹＭ（配列番号３０）のＣＤＲＬ１配列と、ＴＩＹＰＳＳＧ（配列番号３１）のＣＤＲＬ２配列と、ＡＤＲＡＴＹＦＣＡ（配列番号３２）のＣＤＲＬ３配列とを含む軽鎖可変領域を含む、ヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。特定の実施形態において、前記ｓｃＦＶは、ＤＴＩＤＷＹ（配列番号３３）のＣＤＲＨ１配列と、ＶＱＳＤＧＳＹＴＫＲＰＧＶＰＤＲ（配列番号３４）のＣＤＲＨ２配列と、ＹＩＧＧＹＶＦＧ（配列番号３５）のＣＤＲＨ３配列とを含む重鎖可変領域を含む、ヒト又はヒト化ｓｃＦｖである。ＲＯＲ１に特異的な多数の抗体が当業者に知られており、配列、エピトープ結合及び親和性について容易に特性決定することができる。
【０１３２】
特定の実施形態において、前記結合ドメインは、ＴＣＲＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％一致する配列を含み、各ＣＤＲは、ＴＣＲ又は目的標的と特異的に結合するその断片もしくは誘導体に対する変異箇所が、ゼロであるか又は最大で１カ所、２カ所もしくは３カ所である。
【０１３３】
特定の実施形態において、前記結合ドメインＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβ領域は、既知ＴＣＲ（例えば高親和性ＴＣＲ）のＶα、Ｖβ、ＣαもしくはＣβに由来するか又はこれをベースとすることができ、既知ＴＣＲのＶα、Ｖβ、Ｃα又はＣβと比較した場合に、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）の挿入、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）の欠失、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換）又は上記変異の組合せを含む。各ＣＤＲの変異箇所がゼロであるか又は最大で１カ所、２カ所もしくは３カ所であり且つ改変Ｖα、Ｖβ、Ｃα又はＣβ領域を含む結合ドメインが野生型と同等の親和性でその標的と特異的に結合することができる限り、Ｖα、Ｖβ、Ｃα又はＣβ領域のアミノ末端又はカルボキシ末端又は両端を含めて、これらの領域のどの位置に挿入、欠失又は置換が存在していてもよい。
【０１３４】
特定の実施形態において、本開示の結合ドメインＶＨ領域は、既知モノクローナル抗体のＶＨに由来するか又はこれをベースとすることができ、既知モノクローナル抗体のＶＨと比較した場合に、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）の挿入、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）の欠失、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換）又は上記変異の組合せを含むことができる。各ＣＤＲの変異箇所がゼロであるか又は最大で１カ所、２カ所もしくは３カ所であり且つ改変ＶＨ領域を含む結合ドメインが野生型結合ドメインと同等の親和性でその標的と特異的に結合することができる限り、ＶＨ領域のアミノ末端又はカルボキシ末端又は両端を含めて、この領域のどの位置に挿入、欠失又は置換が存在していてもよい。
【０１３５】
特定の実施形態において、本開示の結合ドメインにおけるＶＬ領域は、既知モノクローナル抗体のＶＬに由来するか又はこれをベースとし、既知モノクローナル抗体のＶＬと比較した場合に、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）の挿入、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）の欠失、１カ所以上（例えば２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所）のアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）又は上記変異の組合せを含む。各ＣＤＲの変異箇所がゼロであるか又は最大で１カ所、２カ所もしくは３カ所であり且つ改変ＶＬ領域を含む結合ドメインが野生型結合ドメインと同等の親和性でその標的と特異的に結合することができる限り、ＶＬ領域のアミノ末端又はカルボキシ末端又は両端を含めて、この領域のどの位置に挿入、欠失又は置換が存在していてもよい。
【０１３６】
特定の実施形態において、結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）又は重鎖可変領域（ＶＨ）又はその両方のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％一致する配列を含むか又はこのような配列であり、各ＣＤＲは、モノクローナル抗体又は目的標的と特異的に結合するその断片もしくは誘導体に対する変異箇所がゼロであるか又は最大で１カ所、２カ所もしくは３カ所である。
【０１３７】
エフェクタードメインは、細胞に機能的シグナルを伝達することができる。特定の実施形態において、エフェクタードメインは、細胞応答を直接促進するか又は細胞応答を直接促進する１種以上の他のタンパク質と会合することにより、間接的に促進するであろう。ＣＡＲを発現するリンパ球を導入した場合に、エフェクタードメインは、標的細胞で発現されるマーカーと結合すると、このリンパ球の少なくとも１種の機能を活性化させることができる。リンパ球の活性化は、増殖、分化、活性化又は他のエフェクター機能の１種以上を含むことができる。特定の実施形態において、送達されるポリヌクレオチドは、エフェクタードメインをコードする。
【０１３８】
エフェクタードメインは、１個、２個、３個又はそれ以上の受容体シグナル伝達ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、共刺激ドメイン又はそれらの組合せを含むことができる。本開示のＣＡＲでは、種々のシグナル伝達分子（例えばシグナル伝達受容体）のいずれかに由来する任意の細胞内エフェクタードメイン、共刺激ドメイン又はその両方を、使用することができる。
【０１３９】
代表的なエフェクタードメインとしては、４−１ＢＢ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８（例えば配列番号３６）、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＯＴＣＨ１、Ｗｎｔ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２又はその任意の組合せに由来するものが挙げられる。
【０１４０】
Ｔ細胞活性化は、異なる２種類の細胞質シグナル伝達配列、即ち抗原依存性一次活性化を開始し、Ｔ細胞受容体様シグナルを提供する配列（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原非依存的に作用し、二次又は共刺激シグナルを提供する配列（二次細胞質シグナル伝達配列）とにより、誘導されると言うことができる。刺激するように作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、受容体チロシン活性化モチーフ又はｉＴＡＭと呼ばれるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ｉＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ３ζ、ＦｅＲγ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
【０１４１】
特定の実施形態において、エフェクタードメインは、細胞質シグナル伝達タンパク質と会合する細胞質部分を含み、前記細胞質シグナル伝達タンパク質は、リンパ球受容体もしくはそのシグナル伝達ドメイン、複数のＩＴＡＭを含むタンパク質、共刺激因子又はその任意の組合せである。
【０１４２】
細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＣＤ３ζ鎖、及び／又はＣＡＲ関与後にシグナル伝達を開始するように共働して作用する共受容体の細胞質配列と、これらの配列の任意の誘導体又は変異体に加え、同一の機能をもつ任意の合成配列が挙げられる。特定の実施形態では、任意の他の所望の細胞質ドメインと共に細胞内シグナル伝達ドメインを含むように、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインを設計することができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達領域とを含むことができる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を意味する。リンパ球がマーカーに応答するには、発現されるマーカーリガンドが必要であるが、共刺激分子は、このようなマーカーリガンド以外の細胞表面分子である。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１４３】
標的認識を最適化するように、標的上の個々のマーカーに合わせて、スペーサー領域をカスタマイズすることができる。特定の実施形態では、マーカーエピトープの位置、エピトープに対する抗体の親和性、及び／又はＣＡＲを発現するリンパ球がマーカー認識に応答してインビトロ及び／又はインビボ増殖する能力に基づいて、スペーサー長を選択することができる。
【０１４４】
一般的には、ＣＡＲの結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に、スペーサー領域が存在する。スペーサー領域は、結合ドメインに融通性をもたせることができ、改変細胞における発現レベルを高くすることができる。特定の実施形態において、スペーサー領域は、少なくとも１０〜２５０アミノ酸、少なくとも１０〜２００アミノ酸、少なくとも１０〜１５０アミノ酸、少なくとも１０〜１００アミノ酸、少なくとも１０〜５０アミノ酸又は少なくとも１０〜２５アミノ酸とすることができ、上記範囲のいずれも端点間の任意の整数を含む。特定の実施形態において、スペーサー領域は、２５０アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１５０アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。
【０１４５】
特定の実施形態において、スペーサー領域は、免疫グロブリン様分子のヒンジ領域に由来することができ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ領域の全部又は一部とすることができる。ヒンジ領域は、二量体化等の望ましくない構造的相互作用を避けるように改変することができる。特定の実施形態では、ヒンジ領域の全部又は一部を、免疫グロブリンの定常領域の１つ以上のドメインと繋げることができる。例えば、ヒンジ領域の一部を、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメイン又はその変異体の全部又は一部と繋げることができる。
【０１４６】
本願に開示するＣＡＲは、更に、膜貫通ドメインを含むことができる。特定の実施形態において、ＣＡＲポリヌクレオチドは、前記膜貫通ドメインをコードする。前記膜貫通ドメインは、ＣＡＲをリンパ球膜に係留するように機能する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来するものでも、合成起源に由来するものでもよい。起源が天然であるとき、前記ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来することができる。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域を含む。特定の実施形態において、合成又は変異体膜貫通ドメインは、ロイシンやバリン等の疎水性の高い残基を含む。
【０１４７】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的な一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（Ｊ５９１）と、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインから構成されるＰ２８ｚ融合受容体とを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３７のＰ２８ｚＣＡＲを含む。配列番号３７は、マウス成分を含む。アミノ酸１〜７９７位は、抗ＰＳＭＡｓｃＦｖ（Ｊ５９２）を含み、７９７〜１４７７位は、マウスＣＤ８膜貫通ドメインと、マウスＣＤ２８シグナル伝達ドメインと、マウスＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを含む。いずれのＰ２８ｚドメインも、最適化されたドメインで個々に置換えることができる。特定の実施形態では、配列番号３７の７９７〜１４７７位の膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとを、特にヒト又は他の動物用に最適化されたドメインで置換えることができる。特定の実施形態では、結合ドメインの全部もしくは一部、エフェクタードメインの全部もしくは一部、スペーサードメインの全部もしくは一部及び／又は膜貫通ドメインの全部もしくは一部を、ヒト又は他の動物用に最適化することができる。特定の実施形態では、Ｐ２８ｚＣＡＲを、ヒト用に最適化する。ヒト用に最適化すると、Ｐ２８ｚＣＡＲは、ヒトにおける免疫原性を低くすることができ、非ヒト抗体に比較して、非免疫原性エピトープ数を減らすことができる。
【０１４８】
特定の実施形態では、２Ａ２、Ｒ１２及びＲ１１ｍＡｂ（ＲＯＲ１）とＦＭＣ６３ｍＡｂ（ＣＤ１９）のＶＬ及びＶＨ鎖セグメントとを使用して、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲとＣＤ１９特異的ＣＡＲとを作製することができる。Ｒ１１及びＲ１２の可変領域配列は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６（６）：ｅ２１０１８，Ｊｕｎｅ  １５，２０１１に記載されている。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３８）タンパク質により、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」（２２９ＡＡ、配列番号４０）、「ヒンジ−ＣＨ３」（１１９ＡＡ、配列番号４１）又は「ヒンジ」単独（１２ＡＡ、配列番号４２）の配列を含むＩｇＧ４−Ｆｃ（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース：Ｐ０１８６１、配列番号３９）に由来するスペーサードメインと、各ｓｃＦＶを連結することができる。全スペーサーは、天然ＩｇＧ４−Ｆｃタンパク質の１０８位に位置する「ヒンジ」ドメイン内にＳ→Ｐ置換を含むことができ、ヒトＣＤ２８の２７ＡＡ膜貫通ドメイン（配列番号４３、代表的な全長ＣＤ２８については、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ１０７４７参照）と、（ｉ）天然ＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７位に位置するＬＬ→ＧＧ置換を含むヒトＣＤ２８の４１ＡＡ細胞質ドメイン（配列番号４４）又は（ｉｉ）ヒト４−１ＢＢの４２ＡＡ細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０７０１１、配列番号４５）のいずれかとを含むエフェクタードメインシグナル伝達モジュールに連結することができ、これらの細胞質ドメインは、各々ヒトＣＤ３ζのアイソフォーム３の１１２ＡＡ細胞質ドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２０９６３、配列番号４６）と連結することができる。このコンストラクトは、キメラ受容体の下流のＴ２Ａリボソームスキップエレメント（配列番号４７）とｔＥＧＦＲ配列（配列番号４８）をコードする。ＳＴＲＥＰ  ＴＡＧ（Ｒ）ＩＩ（配列番号４９）、Ｍｙｃタグ（配列番号５０）、Ｖ５タグ（配列番号５１）、ＦＬＡＧ（Ｒ）タグ（配列番号５２）、Ｈｉｓタグ、又は本願に開示する他のペプチドもしくは分子等の配列と結合するタグカセットで、ｔＥＧＦＲを置換してもよいし、追加してもよい。各トランスジーンをコードするコドン最適化遺伝子配列を合成し（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限部位を使用して、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターにクローニングすることができる。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターは、ｐＨＩＶ７のサイトメガロウイルスプロモーターをＥＦ−１プロモーターに置換することにより、ｐＨＩＶ７ベクターから得られる。パッケージングベクターであるｐＣＨＧＰ−２、ｐＣＭＶ−Ｒｅｖ２及びｐＣＭＶ−Ｇと、ＣＡＬＰＨＯＳ（Ｒ）トランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とを使用して、ＲＯＲ１キメラ受容体、ＣＤ１９キメラ受容体、ｔＥＧＦＲ又はタグカセットをコードするレンチウイルスを、２９３Ｔ細胞で作製することができる。
【０１４９】
ＨＥＲ２上の膜近傍エピトープを認識するＨＥＲ２特異的ｍＡｂのＶＬ及びＶＨ鎖セグメントを使用して、ＨＥＲ２特異的キメラ受容体を作製することができ、ｓｃＦＶをＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ３及びＩｇＧ４ヒンジ単独の細胞外スペーサードメインと、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに連結することができる。
【０１５０】
ＣＤ１９キメラ受容体は、ＣＤ１９特異的ｍＡｂＦＭＣ６３の配列に対応する一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ：ＶＬ−ＶＨ）と、「ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３」ドメイン（２２９ＡＡ、長いスペーサー）又は「ヒンジ」ドメイン単独（１２ＡＡ、短いスペーサー）を含むＩｇＧ４−Ｆｃに由来するスペーサーと、膜近傍ＣＤ２８又は４−１ＢＢ共刺激ドメインを単独又はタンデムに配置したＣＤ３ζのシグナル伝達モジュールとを含むことができる。トランスジーンカセットは、キメラ受容体遺伝子の下流に短縮型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）を含むことができ、キメラ受容体改変細胞の導入、選択及びインビボトラッキング用のタグ配列として機能するように、切断可能なＴ２Ａエレメントにより分離することができる。ＳＴＲＥＰ  ＴＡＧ（Ｒ）ＩＩ（配列番号４９）、Ｍｙｃタグ（配列番号５０）、Ｖ５タグ（配列番号５１）、ＦＬＡＧ（Ｒ）タグ（配列番号５２）、Ｈｉｓタグ、又は本願に開示するような他のペプチドもしくは分子等のＥｘｏＣＢＭと結合するタグカセットで、ｔＥＧＦＲを置換してもよいし、追加してもよい。
【０１５１】
非遺伝子改変リンパ球及び／又は他のＣＡＲよりも機能が改善されたＣＡＲを同定するために、種々のリガンド結合ドメイン、種々のスペーサー領域長、種々の細胞内結合ドメイン及び／又は種々の膜貫通ドメインをコードする種々の潜在的ＣＡＲ核酸コンストラクトを、（動物モデルで）インビボ及び／又はインビトロ試験することができる。特定の実施形態において、ＣＡＲは、本願に記載するヒットエンドラン効果から独立して又はそれに加えて発現される。
【０１５２】
本願に開示するナノ担体の寸法は、広い範囲をとることができ、種々の方法で測定することができる。例えば、本開示のナノ担体は、最小寸法を１００ｎｍとすることができる。本開示のナノ担体は、最小寸法を５００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下又は１０ｎｍ以下とすることもできる。特定の実施形態において、前記ナノ担体は、最小寸法を５ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、及び４０ｎｍ〜６０ｎｍとすることができる。特定の実施形態において、前記寸法は、ナノ粒子又は被覆ナノ粒子の直径である。特定の実施形態において、本開示のナノ担体集団は、平均最小寸法を５００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、又は１０ｎｍ以下とすることができる。特定の実施形態において、本開示の組成物におけるナノ担体集団は、平均直径を５ｎｍ〜５００ｎｍ、１０ｎｍ〜１００ｎｍ、２０ｎｍ〜９０ｎｍ、３０ｎｍ〜８０ｎｍ、４０ｎｍ〜７０ｎｍ、及び４０ｎｍ〜６０ｎｍとすることができる。前記ナノ担体の寸法は、例えば動的光散乱法及び／又は電子顕微鏡法等の従来技術を使用して、測定することができる。
【０１５３】
エクスビボ使用方法。本願に開示するナノ担体は、エクスビボ細胞製造で使用することができる（例えば図１Ａ及び４Ｃ参照）。例えば、このような方法は、対象からリンパ球を採取する工程を含むことができる。リンパ球は、例えば当分野で一般に公知の任意の手順を使用して、対象から採取することができる。
【０１５４】
リンパ球の起源としては、臍帯血、胎盤血及び末梢血が挙げられる。血液試料の採取、凝固防止及び処理等に関する方法は、公知である。例えば、Ａｌｓｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９４１，Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６；Ｄｅ  Ｇｏｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９４０，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．１１４：８５０；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３８：５７３；Ｒｏｕｓ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，１９１６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２３：２１９；及びＨｕｍ，１９６８，Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−１６０参照。リンパ球の起源としては、適切な年齢のドナーからの骨髄（Ｋｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４参照）、胚性細胞、大動脈・性腺・中腎由来細胞、リンパ、肝臓、胸腺及び脾臓もまた、挙げられる。採取した全リンパ球試料を、望ましくない成分についてスクリーニングし、その時点の最新公認標準に従って廃棄、処理又は使用することができる。
【０１５５】
特定の実施形態において、本願に開示するナノ担体は、不均一細胞集団内の選択された細胞種を選択的に標的とするので、リンパ球をナノ担体に暴露する前にそれ以上採取又は単離する必要がない。
【０１５６】
特定の実施形態では、本願に開示するナノ担体に暴露する前にある程度まで更に細胞採取・単離を行うと、有益な場合がある。任意の適切な技術を使用して、試料からリンパ球を採取・単離することができる。適切な採取・単離法としては、磁気分離法、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１００４；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｌｏｏｄ  ６８（１）：１２６−１３３）、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合させた物質又はモノクローナル抗体と併用する物質を利用する方法、固相マトリックスに固定化した抗体による「パニング」法（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：９３９−９５３）、大豆等のレクチンを使用した選択的凝集法（Ｒｅｉｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：１１６４）等が挙げられる。特定の実施形態は、限定分離法を利用することができる。限定分離法とは、例えば赤血球及び／又は接着性食細胞の除去による粗細胞集積を意味する。
【０１５７】
特定の実施形態では、磁気粒子に直接又は間接的に結合させた抗ＣＤ８又は抗ＣＤ３４抗体を磁気細胞細胞分離装置（例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（Ｒ）Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，ドイツ））と共に使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ３４＋ＨＳＰＣを選択／集積するように対象試料（例えば血液試料）を処理することができる。同様に、上記マーカー（例えばＴ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ３９、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１、トランスフェリン受容体）のいずれかを発現するリンパ球を単離し、これらのマーカーの抗体又は他の結合ドメインを使用するために、集積させることができる。
【０１５８】
特定の実施形態では、拡大培養工程の前又は初期段階でナノ担体をリンパ球と結合させる。このアプローチにより、少数の細胞の改変が可能になり、細胞集団が拡大するにつれて、改変は集団全体に広がる。特定の実施形態では、一過性発現に基づくヒットエンドラン効果を生じる本願に開示するナノ担体に暴露した後に、改変されたリンパ球の拡大培養を行うことができる。
【０１５９】
拡大培養は、アンジオポエチン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌｓ、例えばＡｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ７、Ａｎｇｐｔｌ５及びＭｆａｐ４）、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ−１）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン成長因子２（ＩＦＧ−２）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、幹細胞因子（ＳＣＦ；別称ｃ−ｋｉｔリガンド又は肥満細胞増殖因子）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びその類似体等の１種以上の成長因子の存在下で行うことができる（前記類似体としては天然の成長因子の生物学的活性をもつ成長因子の任意の構造変異体が挙げられる；例えばＷＯ２００７／１１４５２２７及び米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号参照）。
【０１６０】
特定の実施形態において、リンパ球を拡大培養するのに適した成長因子の量又は濃度は、増殖を促進するために有効な量又は濃度である。ヒト対象に少なくとも１回注入するために十分な数の細胞、典型的には細胞約１０４個／ｋｇ〜１０９個／ｋｇが得られるまで、リンパ球集団を拡大培養することが好ましい。
【０１６１】
リンパ球を拡大培養するのに適した成長因子の量又は濃度は、成長因子製剤の活性、及び成長因子とリンパ球との生物種対応等に依存する。一般に、成長因子とリンパ球とが同一の生物種に由来する場合には、培養培地中の成長因子の合計量は、１ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍ又は５ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌである。特定の実施形態において、成長因子の量は、５〜１０００ｎｇ／ｍｌ又は５０〜１００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【０１６２】
特定の実施形態では、拡大培養条件下に２５〜３００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦと、２５〜３００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌと、２５〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯと、２５〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３との濃度で、成長因子が存在する。特定の実施形態では、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦと、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌと、５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯと、５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６と、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３とを使用することができる。
【０１６３】
フィブロネクチン（ＦＮ）等の細胞外マトリックスタンパク質又はその断片（例えばＣＨ−２９６（Ｄａｏ  ｅｔ．ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９２（１２）：４６１２−２１）又はＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｒ）（組換えヒトフィブロネクチン断片（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）））を、固定化した組織培養ディッシュでリンパ球を拡大培養することができる。
【０１６４】
ＨＳＣを拡大培養するには、Ｎｏｔｃｈアゴニストが特に有用であると思われる。特定の実施形態では、固定化したＮｏｔｃｈアゴニスト及び５０ｎｇ／ｍｌもしくは１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、固定化したＮｏｔｃｈアゴニスト及び各々５０ｎｇ／ｍｌもしくは１００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６、ＴＰＯ及びＳＣＦ、又は固定化したＮｏｔｃｈアゴニスト及び各々５０ｎｇ／ｍｌもしくは１００ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６、ＴＰＯ及びＳＣＦと、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１１もしくはＩＬ−３に、ＨＳＣを暴露することにより、ＨＳＣを拡大培養することができる。
【０１６５】
記載の通り、対象からリンパ球を採取する。特定の実施形態では、ヒットエンドラン改変・拡大培養したリンパ球を、元の試料の採取源である同一対象に、治療有効量で再導入する。特定の実施形態では、ヒットエンドラン改変・拡大培養したリンパ球を、別の対象に治療有効量で投与する。治療有効量については、本願の他の箇所でより詳細に記載している。
【０１６６】
これらの実施形態では、ヒットエンドラン改変・拡大培養したリンパ球を、対象に投与するための細胞組成物（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）として、製剤化することができる。細胞組成物とは、拡大培養した細胞を、対象に投与するために、医薬的に許容される基剤に加えて調製したものを意味する。特定の実施形態では、投与を必要とする対象に、拡大培養と投与用製剤化の完了後に妥当な範囲でできるだけ早く、細胞組成物を投与する。
【０１６７】
特定の実施形態では、細胞を凍結保護することが、必要又は有益な場合がある。「凍結させた／凍結させる」及び「凍結保護した／凍結保護する」なる用語は、同義に使用することができる。凍結は、凍結乾燥を含む。
【０１６８】
当分野における通常の知識を有する者に理解される通り、細胞の凍結は、破壊性となる可能性がある（Ｍａｚｕｒ，Ｐ．，１９７７，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４：２５１−２７２参照）が、このような損傷を防ぐために、多数の処置方法を利用可能である。例えば、（ａ）凍結保護剤の使用、（ｂ）凍結速度の制御、及び／又は（ｃ）分解反応を最小限にするための十分低温での保存により、損傷を避けることができる。代表的な凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，１９５９，Ｎａｔｕｒｅ  １８３：１３９４−１３９５；Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，１９６１，Ｎａｔｕｒｅ  １９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，１９６０，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５７６）、ポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｖｄｉｎ，１９６２，Ｎａｔｕｒｅ  １９６：５４８）、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコール、ｉ−エリスリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６２，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．２１：１５７）、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン（Ｂｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．．，１９６０，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５：５２０）、アミノ酸（Ｐｈａｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｅｒ，１９６０，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０：６５１）、メタノール、アセトアミド、グリセリン一酢酸エステル（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ，１９５４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．５６：２６５）、及び無機塩類（Ｐｈａｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｅｒ，１９６０，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１０４：３８８；Ｐｈａｎ  Ｔｈｅ  Ｔｒａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｅｒ，１９６１，ｉｎ  Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｒｄ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｉｌｂｅｒｙ  ｅｄ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．５９）が挙げられる。特定の実施形態では、ＤＭＳＯを使用することができる。（例えば２０〜２５％までの濃度の）血漿を加えると、ＤＭＳＯの保護効果を高めることができる。ＤＭＳＯ濃度が１％では温度が４℃を越えると毒性となる可能性があるので、ＤＭＳＯの添加後、凍結時まで細胞を０℃に維持するとよい。
【０１６９】
細胞の凍結保護では、冷却速度を遅く制御することが重要であると考えられ、種々の凍結保護剤（Ｒａｐａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５（１）：１８−２５）及び種々の細胞種で、最適な冷却速度は異なる（例えば幹細胞の生存及びその移植能に及ぼす冷却速度の影響については、Ｒｏｗｅ  ａｎｄ  Ｒｉｎｆｒｅｔ，１９６２，Ｂｌｏｏｄ  ２０：６３６；Ｒｏｗｅ，１９６６，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３（１）：１２−１８；Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９６７，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ７（１）：１７−３２；及びＭａｚｕｒ，１９７０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６８：９３９−９４９参照）。水が氷に相転移する融解熱を、最小限にする必要がある。冷却処置は、例えばプログラマブル凍結装置又はメタノール浴法の使用により、実施することができる。プログラマブル凍結装置は、最適な冷却速度を決定することができ、標準的な再現可能な冷却が容易になる。
【０１７０】
特定の実施形態では、ＤＭＳＯで処理した細胞を、予め氷冷し、冷メタノールを入れたトレイに移し、−８０℃の自動式冷却装置（例えばＨａｒｒｉｓ又はＲｅｖｃｏ）に入れる。メタノール浴及び試料の熱電対測定によると、１〜３℃／分の冷却速度が好ましいと思われる。少なくとも２時間後に、試料は−８０℃の温度に達することができ、液体窒素（−１９６℃）に直接導入することができる。
【０１７１】
完全に凍結後、細胞を長期冷凍保存容器に速やかに移すとよい。特定の実施形態では、試料を液体窒素（−１９６℃）又は蒸気（−１℃）で冷凍保存することができる。このような保存は効率の高い液体窒素式冷却装置の入手可能性により容易になる。
【０１７２】
細胞の操作、凍結保護及び長期保存に関するその他の考慮事項と手順については、代表的な参考文献である米国特許第４，１９９，０２２号、３，７５３，３５７号及び４，５５９，２９８号；Ｇｏｒｉｎ，１９８６，Ｃｌｉｎｉｃｓ  Ｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １５（１）：１９−４８；Ｂｏｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ  Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ａ  Ｐａｎｅｌ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｊｕｌｙ  ２２−２６，１９６８，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｔｏｍｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｇｅｎｃｙ，Ｖｉｅｎｎａ，ｐｐ．１０７−１８６；Ｌｉｖｅｓｅｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｎｅｒ，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：２５５；Ｌｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３４（９）：１１２３−１１３５；Ｓｉｍｉｏｎｅ，１９９２，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４６（６）：２２６−３２）を参照されたい。
【０１７３】
凍結保護後、当分野における通常の知識を有する者に公知の方法に従って使用できるように、凍結させた細胞を解凍することができる。凍結させた細胞を速やかに解凍し、解凍直後にチルドにすることが好ましい。特定の実施形態では、凍結させた細胞をバイアルに入れてバイアルの首まで温水浴に浸し、静かに回転することにより、解凍に伴って細胞懸濁液を混合させ、温水から内部氷塊への熱移動を増加させてもよい。氷が完全に融けたら、直ぐにバイアルを氷上に移すとよい。
【０１７４】
特定の実施形態では、解凍中の細胞凝集を防ぐために、種々の方法を使用することができる。代表的な方法としては、凍結前及び／又は後にＤＮａｓｅ（Ｓｐｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃａｎｃｅｒ  ４５：３０７５−３０８５）、低分子デキストラン及びクエン酸塩、ヒドロキシエチルデンプン（Ｓｔｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０：１７−２４）等を添加する方法が挙げられる。
【０１７５】
当分野における通常の知識を有する者に理解される通り、人体に毒性の凍結保護剤を使用する場合には、治療に使用する前に除去する必要がある。ＤＭＳＯには重大な毒性がない。
【０１７６】
代表的な基剤及び細胞の投与方式は、米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号の１４〜１５頁に記載されている。その他の医薬基剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。
【０１７７】
特定の実施形態では、細胞を培養培地から回収し、洗浄し、濃縮して、治療有効量を基剤に懸濁することができる。代表的な基剤としては、塩類溶液、緩衝塩類溶液、生理食塩水、水、ハンクス液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ−Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｒ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せが挙げられる。
【０１７８】
特定の実施形態では、基剤にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくは他のヒト血清成分又は胎仔ウシ血清を添加することができる。特定の実施形態において、輸液用基剤は、５％ＨＳＡ又はデキストロースを添加した緩衝塩類溶液を含む。その他の等張化剤としては、多価糖アルコール類が挙げられ、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトール等の三価以上の糖アルコール類が挙げられる。
【０１７９】
基剤は、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、蓚酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び／又はトリメチルアミン塩等の緩衝剤を含むことができる。
【０１８０】
安定剤とは、増量剤の機能に始まり、容器壁への細胞付着を防ぐのに役立つ添加剤に至るまでの機能に対応することができる、広義の医薬品添加剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール類；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸及びスレオニン等のアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール及びシクリトール（例えばイノシトール）等の有機糖類又は糖アルコール類；ＰＥＧ；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の含硫還元剤；低分子ポリペプチド（即ち＜１０残基）；ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース及びスクロース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；並びにデキストラン等の多糖類を挙げることができる。
【０１８１】
必要又は有益な場合には、注射部位の痛みを和らげるために、リドカイン等の局所麻酔薬を、細胞組成物に添加することができる。
【０１８２】
代表的な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えばメチルパラベンやプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。
【０１８３】
細胞組成物に含まれる細胞の治療有効量は、１０２個超、１０３個超、１０４個超、１０５個超、１０６個超、１０７個超、１０８個超、１０９個超、１０１０個超、又は１０１１個超とすることができる。
【０１８４】
本願に開示する細胞組成物において、細胞は、一般的に、１リットル以下、５００ｍＬ以下、２５０ｍＬ以下又は１００ｍＬ以下の体積中に含まれる。したがって、投与される細胞の密度は、一般的に、１０４個超／ｍｌ、１０７個超／ｍｌ、又は１０８個超／ｍｌである。
【０１８５】
本願に開示する細胞組成物は、例えば注射、輸液、灌流又は洗浄による投与用に製造することができる。前記細胞組成物は、更に、骨髄、静脈内、皮内、動脈内、リンパ節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内及び／又は皮下注射用に、製剤化することができる。
【０１８６】
インビボ使用方法に用いる組成物。本願に開示するナノ担体は、対象に直接投与して選択的ターゲティング及びヒットエンドラン改変をインビボで行う組成物として、製剤化することもできる（当分野における通常の知識を有する者に理解される通り、本願に記載するエクスビボ及びインビボアプローチは、相互に排他的ではなく、組合せて実施することができる）。これらの組成物を、本願ではナノ担体組成物（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）と呼ぶ。
【０１８７】
特定の実施形態において、前記ナノ担体は、少なくとも０．１％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも１％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも１０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも２０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも３０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも４０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも５０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも６０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも７０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも８０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも９０％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、少なくとも９５％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体、又は少なくとも９９％ｗ／ｖもしくはｗ／ｗのナノ担体を含有することができる、ナノ担体組成物の一部として提供される。
【０１８８】
本願に開示するナノ担体組成物は、例えば注射、吸入、輸液、灌流、洗浄又は経口摂取による投与用に製剤化することができる。本願に開示するナノ担体組成物は、更に、静脈内、皮内、動脈内、リンパ節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、経口及び／又は皮下投与用に製剤化することができ、より特定的には静脈内、皮内、動脈内、リンパ節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内、経口及び／又は皮下注射用に、製剤化することができる。
【０１８９】
注射用では、ハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水を含む緩衝液等でナノ担体組成物を、水溶液として製剤化することができる。水溶液には、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤等の製剤添加物を添加することができる。あるいは、使用前に適切な溶媒（例えば滅菌パイロジェンフリー水）で再構成する凍結乾燥及び／又は粉末形態の製剤とすることもできる。
【０１９０】
経口投与用では、ナノ担体組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ジェル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等として製剤化することができる。例えば散剤、カプセル剤及び錠剤等の経口固体製剤に適した医薬品添加剤としては、結合剤（トラガカントガム、アラビアガム、コーンスターチ、ゼラチン）、賦形剤（例えばラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトール等の糖類；リン酸二カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム；トウモロコシ澱粉、コムギ澱粉、コメ澱粉、ジャガイモ澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のセルロース調製物）；顆粒化剤；及び結合剤が挙げられる。必要に応じてコーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸もしくはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を添加してもよい。必要に応じて、標準技術を使用して、固体剤形に糖衣又は腸溶コーティングを設けてもよい。ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバー等の着香剤も使用できる。
【０１９１】
吸入投与用では、適切な噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適切なガス）を利用することにより、加圧パック又はネブライザーからのエアゾールスプレーとしてナノ担体組成物を製剤化することができる。加圧エアゾールの場合には、定量を送達するように弁を設けることにより、用量単位を配量することができる。治療剤及びラクトースや澱粉等の適切な粉末基剤の粉末混合物を収容したインヘラー又はインサフレーター用ゼラチンカプセル及びカートリッジとして、製剤化することもできる。
【０１９２】
本願に開示する全ナノ担体組成物の製剤は、他の任意の医薬的に許容される基剤を有利に含有することができ、研究、予防及び／又は治療処置のいずれに使用するものかに関係なく、投与の効果を上回る著しく有害、アレルギー性又は他の不都合な反応を生じないものが挙げられる。代表的な医薬的に許容される基剤及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に開示されている。更に、米国ＦＤＡ生物学的製剤基準部（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び／又は他の該当する米国外の監督機関により定められた滅菌度、発熱性、一般安全性及び純度標準を満たすように、製剤を製造することができる。
【０１９３】
代表的な一般に使用される医薬的に許容される基剤としては、ありとあらゆる増量剤又は賦形剤、溶媒もしくは補助溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン及びビタミンＥ）、保存剤、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、ジェル剤、結合剤、崩壊剤及び／又は滑沢剤が挙げられる。
【０１９４】
代表的な緩衝剤としては、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、蓚酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び／又はトリメチルアミン塩が挙げられる。
【０１９５】
代表的な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム、塩化ヘキサメトニウム、アルキルパラベン（例えばメチルパラベンやプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。
【０１９６】
代表的な等張化剤としては、多価糖アルコール類が挙げられ、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトール等の三価以上の糖アルコール類が挙げられる。
【０１９７】
代表的な安定剤としては、有機糖類、多価糖アルコール類、ポリエチレングリコール、含硫還元剤、アミノ酸、低分子ポリペプチド、タンパク質、免疫グロブリン、親水性ポリマー又は多糖類が挙げられる。
【０１９８】
ナノ担体組成物を、デポ剤として製剤化することもできる。デポ剤は、（例えば許容される油類に分散したエマルションとして）適切なポリマーもしくは疎水性材料又はイオン交換樹脂を使用して製剤化することもでき、又はやや難溶性の誘導体（例えばやや難溶性の塩）として製剤化することもできる。
【０１９９】
また、少なくとも１種の有効成分を加えた固体ポリマーの半透性マトリックスを利用した徐放システムとして、ナノ担体組成物を製剤化することもできる。種々の徐放性材料が定着しており、当分野における通常の知識を有する者に周知である。徐放システムは、その化学的性質に応じて、投与後数週間から１００日を越えるまでの期間にわたって、有効成分を放出することができる。
【０２００】
使用方法。本願に開示する方法は、本願に開示する細胞組成物及びナノ担体組成物を対象（ヒト、飼育動物、家畜及び研究動物）に投与する段階を含む。記載の通り、これらの組成物は、がんから感染症までに至る種々多様な病態を治療することができる。これらの組成物は、ワクチンアジュバントとして使用することもできる。
【０２０１】
対象への投与は、治療有効量の送達を含む。治療有効量は有効量、予防処置及び／又は治療処置を提供することができる。
【０２０２】
「有効量」とは、対象に所望の生理的変化を生じるために必要な化合物の量である。研究目的には、有効量を投与することが多い。本願に開示する有効量は、遺伝子編集効果又は表現型を変化させるタンパク質の発現の効果として、細胞の表現型を変化させる。
【０２０３】
「予防処置」は、疾病もしくは病態の徴候もしくは症状を示していない対象又は前記疾病もしくは病態の初期徴候もしくは症状しか示していない対象に、前記疾病又は病態を抑制、防除又は発症の危険を低減する目的で施す処置を含む。したがって、予防処置は、疾病又は疾患に対する未然防止処置の役割を果たす。ワクチンは、予防処置の１例である。
【０２０４】
特定の実施形態では、ＨＩＶ等のウイルス感染症を処置するために、予防処置を施す。例えば、ウイルス感染症又はウイルス性疾患を、防除、抑制又は発症遅延させるために、ウイルス感染症を発症する危険のある対象又はウイルスに暴露されたことのある対象に、前記組成物を予防的に投与することができる。例えば、ウイルス（例えばＨＩＶ）に暴露された可能性のある対象又はウイルスに暴露される危険の高い対象に、前記組成物を投与することができる。
【０２０５】
「治療処置」は、疾病又は病態の症状又は徴候を示す対象に、前記疾病又は病態の前記徴候又は症状を軽減するか又は解消する目的で施す処置を含む。
【０２０６】
予防処置及び治療処置は、疾病又は病態を完全に予防又は治癒する必要はなく、部分的効果を提供するものでもよい。
【０２０７】
がんに関して、治療有効量は、腫瘍細胞数を減らすことができ、転移数を減らすことができ、腫瘍体積を減らすことができ、平均余命を延ばすことができ、がん細胞のアポトーシスを誘導することができ、がん細胞死を誘導することができ、がん細胞に薬剤感受性もしくは放射線感受性を誘導することができ、がん細胞の近傍の血管新生を抑制することができ、がん細胞増殖を抑制することができ、腫瘍成長を抑制することができ、転移を予防することができ、対象の寿命を延ばすことができ、がん関連痛を軽減することができ、転移数を抑制することができ、そして／又は処置後のがんの再発もしくは再燃を抑制することができる。
【０２０８】
ウイルスに関して、治療有効量は、ウイルス感染細胞数を減らすことができ、発熱、悪寒、嘔吐、関節痛等のウイルス感染に伴う１種以上の症状を軽減することができる。
【０２０９】
ＨＩＶに関して、治療有効量は、ＨＩＶ感染細胞数を減らすことができ、対象のＴ細胞数を増やすことができ、感染症の発生率、頻度もしくは重症度を下げることができ、平均余命を延ばすことができ、対象の寿命を延ばすことができ、そして／又はＨＩＶ関連痛もしくは認知障害を軽減することができる。
【０２１０】
ワクチンアジュバントに関して、ワクチンは、特定の疾患に対する対象の免疫を増強し、ワクチンアジュバントは、この増強を高める及び／又は長引かせる。当業者に自明の通り、免疫系は、一般に、自然免疫応答と適応免疫応答を生じることができる。自然免疫応答は、一般に、実質的に抗原特異的ではなく且つ／又は免疫記憶を生じないものとして特徴付けることができる。適応免疫応答は、実質的に抗原特異的であり、時間と共に成熟する（例えば抗原に対する親和性及び／又はアビディティーが増加する）ものと特徴付けることができ、一般に免疫記憶を生じることができる。自然免疫と適応免疫との間には、これら及び他の機能的相違を認めることができるとしても、当業者に自明の通り、自然免疫系と適応免疫系とは統合することができるため、協調して作用することができる。
【０２１１】
投与に際しては、インビトロアッセイ及び／又は動物モデル試験からの結果に基づいて、治療有効量（本願では用量とも言う）を先ず推定することができる。目的の対象における有用な用量をより正確に決定するために、このような情報を使用することができる。
【０２１２】
特定の対象に投与する実際の投与量は、標的、体重、病態の重症度、疾患の種類、過去又は同時に受けている治療介入、対象の特発性疾患及び投与経路を含む身体的及び生理的因子等のパラメータを考慮して、医師、獣医又は研究者が決定することができる。
【０２１３】
細胞組成物の有用な用量については、本願の他の箇所に記載する。ナノ担体組成物の有用な用量としては、０．１〜５μｇ／ｋｇ又は０．５〜１μｇ／ｋｇを挙げることができる。他の例において、ナノ担体組成物用量は、例えば、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、８０μｇ／ｋｇ、９０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、１０００μｇ／ｋｇ、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ又は０．５〜１ｍｇ／ｋｇを含むことができる。他の非限定的な例において、用量は、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上を含むことができる。
【０２１４】
治療有効量は、治療レジメンの期間中に、単回又は複数回投与することにより達成することができる（例えば１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、４カ月に１回、５カ月に１回、６カ月に１回、７カ月に１回、８カ月に１回、９カ月に１回、１０カ月に１回、１１カ月に１回又は１年に１回）。
【０２１５】
特に指定しない限り、本開示の実施には、従来の免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの技術を利用することができる。これらの方法は、以下の刊行物に記載されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＩＮ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．ＰＣＲ  ２：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，（１９９５）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）；及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）参照。
【０２１６】
標的とする遺伝子配列と、本願に開示するような表現型を変化させるタンパク質をコードする核酸配列とを同定するには、公共データベースにより提供される配列情報を使用することができる。代表的な配列を図１１に示す。
【０２１７】
本願に開示・参照する配列の変異体もまた、含まれる。タンパク質の変異体としては、１カ所以上の保存的アミノ酸置換を含むものを挙げることができる。本願で使用する「保存的置換」は、以下の保存的置換グループ、即ちグループ１：アラニン（Ａｌａ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）；グループ２：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グループ３：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）；グループ４：アルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）；グループ５：イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）；及びグループ６：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）のグループの１つに存在する置換を含む。
【０２１８】
また、類似する機能又は化学構造又は組成（例えば酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、含硫）により、アミノ酸を保存的置換グループに分けることもできる。例えば、脂肪族グループは、置換の目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅを含むことができる。相互に保存的置換であるとみなされるアミノ酸を含む他のグループとしては、含硫グループ：Ｍｅｔ及びシステイン（Ｃｙｓ）；酸性グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ及びＧｌｎ；小さい脂肪族で非極性又はやや極性の残基のグループ：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ；極性で負電荷をもつ残基とそのアミドのグループ：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；極性で正電荷をもつ残基のグループ：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；大きい脂肪族で非極性の残基のグループ：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ；並びに大きい芳香族残基のグループ：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐが挙げられる。その他の情報については、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０２１９】
他の箇所に示すように、遺伝子配列の変異体は、コードされている産物の機能に統計的に有意な程度まで影響を与えない範囲で、コドン最適化変異体、配列多形、スプライス変異体及び／又は突然変異を含む。
【０２２０】
本願に開示するタンパク質、核酸及び遺伝子配列の変異体は、更に、本願に開示するタンパク質、核酸又は遺伝子配列に対して少なくとも７０％の配列一致度、８０％の配列一致度、８５％の配列一致度、９０％の配列一致度、９５％の配列一致度、９６％の配列一致度、９７％の配列一致度、９８％の配列一致度又は９９％の配列一致度をもつ配列も含む。
【０２２１】
「配列一致度％」とは、配列を比較することにより決定される２つ以上の配列間の関係を意味する。当分野において、「一致度」とは、タンパク質、核酸又は遺伝子配列の文字列間のマッチにより決定されるこのような配列間の配列関連度をも意味する。「一致度」（「類似度」と言うことも多い）は、公知方法により容易に計算することができ、（これらに限定するものではないが）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９２）に記載されている方法が挙げられる。一致度の好ましい決定方法は、試験する配列間で最良のマッチが得られるようにデザインされる。一致度及び類似度の決定方法は、公共入手可能なコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメント及び一致度百分率計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを使用して実施することができる。Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  ＣＡＢＩＯＳ，５，１５１−１５３（１９８９））をデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）で使用して、配列の多重アラインメントを行うこともできる。関連するプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）；及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを実装したＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）も挙げられる。本開示の文脈内では、当然のことながら、配列解析ソフトウェアを解析に使用する���合には、解析の結果は参照するプログラムの「デフォルト値」を基準とする。本願で使用する「デフォルト値」とは、最初に初期化する際にソフトウェアから当初にロードされる数値又はパラメータの任意のセットを意味する。
【０２２２】
代表的な実施形態。
１．対象に投与するための造血系由来の選択された細胞集団の調製方法であって、
造血系由来の選択された細胞集団を含む不均一細胞混合物を含む試料を前記対象から採取する工程と；
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンド
を含む合成ナノ担体に前記試料を暴露することにより、前記選択された細胞集団に前記ナノ担体を選択的に送達し、前記選択された細胞集団内の細胞を改変する工程と；
前記試料内の細胞を拡大培養する工程とを含み；
それにより、前記選択された細胞集団を前記対象に投与できるように調製する、前記方法。
２．前記試料内の前記拡大培養した細胞が、前記選択された細胞集団の改変細胞を含む、実施形態１に記載の方法。
３．更に、前記調製後の選択された細胞集団を細胞組成物に製剤化する工程を含む、実施形態１又は２に記載の方法。
４．更に、前記細胞組成物を前記対象に投与する工程を含む、実施形態３に記載の方法。
５．前記暴露工程の前に、前記不均一細胞混合物における前記選択された細胞集団の百分率を増加させるための単離処置を、全く行わないか又は限定的にしか行わない、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．前記合成核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、実施形態１〜５のいずれか一項に記載の方法。
７．前記合成核酸が、配列番号１のｍｅｇａＴＡＬをコードする、実施形態６に記載の方法。
８．前記遺伝子編集剤が、Ｓｈｐ−１ホスファターゼ、ＰＤ１受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４をコードする内在性遺伝子を破壊する、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．前記遺伝子編集剤が、ＴＣＲα鎖をコードする内在性遺伝子を破壊する、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記合成核酸が、転写因子、キナーゼ及び／又は細胞表面受容体から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の方法。
１１．前記表現型を変化させるタンパク質が、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合する、実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
１３．前記不均一細胞集団がエクソビボ細胞培養物である、実施形態１２に記載の方法。
１４．前記不均一細胞集団がインビボである、実施形態１２に記載の方法。
１５．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組合せと選択的に結合する、実施形態１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマー又はそれらの組合せから選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１又はトランスフェリン受容体と選択的に結合する、実施形態１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２０９又はＤＥＣ−２０５と選択的に結合する、実施形態１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記結合ドメインが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖ断片から構成されるか又はこれらのｓｃＦｖ断片から本質的に構成される、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記合成核酸が合成ｍＲＮＡである、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記担体が、正電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．前記正電荷をもつポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、アミン・エステル共重合体、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、Ｌ−ラクチド・Ｌ−リジン共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態２２に記載の方法。
２４．前記コーティングが、中性又は負電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、実施形態１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記中性又は負電荷をもつコーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミサクシネート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態２４に記載の方法。
２６．前記中性又は負電荷をもつコーティングが双性イオン型ポリマーを含む、実施形態２４又は２５に記載の方法。
２７．前記中性又は負電荷をもつコーティングがリポソームを含む、実施形態２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．前記リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８と選択的に結合する、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
３０．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
３１．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記担体がポリ（β−アミノエステル）を含む、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．前記コーティングがポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み、前記担体がポリ（β−アミノエステル）を含み、前記コーティングがポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
３５．対象を治療するための細胞の調製方法であって、
対象からリンパ球を採取する工程；及び
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む合成ナノ担体と前記リンパ球を結合させる工程を含み；
前記結合後に前記リンパ球が前記核酸を一過性発現するように前記ナノ担体を前記リンパ球に選択的に取込ませる、前記方法。
３６．更に、前記リンパ球を拡大培養する工程を含む、実施形態３５に記載の方法。
３７．更に、前記リンパ球を細胞組成物に製剤化する工程を含む、実施形態３５又は３６に記載の方法。
３８．前記暴露工程の前に、前記不均一細胞混合物における前記選択された細胞集団の百分率を増加させるための単離処置を全く行わないか又は限定的にしか行わない、実施形態３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．前記合成核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、実施形態３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．前記合成核酸が、配列番号１のｍｅｇａＴＡＬをコードする、実施形態３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
４１．前記遺伝子編集剤が、Ｓｈｐ−１ホスファターゼ、ＰＤ１受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４をコードする内在性遺伝子を破壊する、実施形態３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．前記遺伝子編集剤が、ＴＣＲα鎖をコードする内在性遺伝子を破壊する、実施形態３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
４３．前記合成核酸が、転写因子、キナーゼ及び／又は細胞表面受容体から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、実施形態３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
４４．前記表現型を変化させるタンパク質が、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、実施形態４３に記載の方法。
４５．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合する、実施形態３５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
４６．前記不均一細胞集団が、エクソビボ細胞培養物である、実施形態４５に記載の方法。
４７．前記不均一細胞集団が、インビボである、実施形態４５に記載の方法。
４８．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組合せと選択的に結合する、実施形態３５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
４９．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマー又はそれらの組合せから選択される結合ドメインを含む、実施形態３５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
５０．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１又はトランスフェリン受容体と選択的に結合する、実施形態３５〜４９のいずれか一項に記載の方法。
５１．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２０９又はＤＥＣ−２０５と選択的に結合する、実施形態３５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
５２．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態３５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
５３．前記結合ドメインが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖ断片から構成されるか又はこれらのｓｃＦｖ断片から本質的に構成される、実施形態３５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
５４．前記合成核酸が、合成ｍＲＮＡである、実施形態３５〜５３のいずれか一項に記載の方法。
５５．前記担体が、正電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、実施形態３５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
５６．前記正電荷をもつ脂質又はポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、アミン・エステル共重合体、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、Ｌ−ラクチド・Ｌ−リジン共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態５５に記載の方法。
５７．前記コーティングが、中性又は負電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、実施形態３５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
５８．前記中性又は負電荷をもつコーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミサクシネート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態５７に記載の方法。
５９．前記中性又は負電荷をもつコーティングが双性イオン型ポリマーを含む、実施形態５７又は５８に記載の方法。
６０．前記中性又は負電荷をもつコーティングが、リポソームを含む、実施形態５７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
６１．前記リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態６０に記載の方法。
６２．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８と選択的に結合する、実施形態３５〜６１のいずれか一項に記載の方法。
６３．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態３５〜６２のいずれか一項に記載の方法。
６４．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態３５〜６３のいずれか一項に記載の方法。
６５．前記担体がポリ（β−アミノエステル）を含む、実施形態３５〜６４のいずれか一項に記載の方法。
６６．前記コーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態３５〜６５のいずれか一項に記載の方法。
６７．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み、前記担体がポリ（β−アミノエステル）を含み、前記コーティングがポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態３５〜６６のいずれか一項に記載の方法。
６８．治療を必要とする対象の治療方法であって、
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含むナノ担体により細胞に選択的に送達された前記核酸の一過性発現により改変された前記細胞を治療有効量投与する段階を含み；
前記結合後に前記リンパ球が前記核酸を一過性発現するように前記ナノ担体を前記リンパ球に選択的に取込ませることにより、治療を必要とする前記対象を治療する、前記方法。
６９．対象に投与するための選択された細胞集団の調製方法であって、
選択された細胞集団を含む不均一細胞混合物を含む試料を前記対象から採取する工程；
（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む合成ナノ担体に前記試料を暴露することにより、前記選択された細胞集団に前記ナノ担体を選択的に送達し、前記選択された細胞集団内の細胞を改変する工程；及び
前記試料内の細胞を拡大培養する工程を含み；
それにより、前記選択された細胞集団を前記対象に投与できるように調製する、前記方法。
７０．（ｉ）正電荷をもつ担体の内側に封入されており、遺伝子編集剤又は表現型を変化させるタンパク質をコードする合成核酸と；
（ｉｉ）前記担体の外表面に設けられた中性又は負電荷をもつコーティングと；
（ｉｉｉ）前記コーティングの表面から突き出した選択された細胞ターゲティングリガンドと
を含む、合成ナノ担体。
７１．前記合成核酸が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、実施形態７０に記載の合成ナノ担体。
７２．前記合成核酸が、配列番号１のｍｅｇａＴＡＬをコードする、実施形態７０又は７１に記載の合成ナノ担体。
７３．前記遺伝子編集剤が、Ｓｈｐ−１ホスファターゼ、ＰＤ１受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＣＲ５及び／又はＣＸＣＲ４をコードする内在性遺伝子を破壊する、実施形態７０〜７２のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
７４．前記遺伝子編集剤が、ＴＣＲα鎖をコードする内在性遺伝子を破壊する、実施形態７０〜７３のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
７５．前記合成核酸が、転写因子、キナーゼ及び／又は細胞表面受容体から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、実施形態７０〜７４のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
７６．前記表現型を変化させるタンパク質が、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、実施形態７５に記載の合成ナノ担体。
７７．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、不均一細胞集団内のリンパ球と選択的に結合する、実施形態７０〜７６のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
７８．前記不均一細胞集団が、エクソビボ細胞培養物である、実施形態７７に記載の合成ナノ担体。
７９．前記不均一細胞集団が、インビボである、実施形態７７に記載の合成ナノ担体。
８０．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞又はそれらの組合せと選択的に結合する、実施形態７０〜７９のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８１．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマー又は又はそれらの組合せから選択される結合ドメインを含む、実施形態７０〜８０のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８２．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１０１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１４８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、ＤＥＣ−２０５、Ｆ４／８０、ＩＬ−４Ｒα、Ｓｃａ−１、ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ−１又はトランスフェリン受容体と選択的に結合する、実施形態７０〜８１のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８３．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ２０９又はＤＥＣ−２０５と選択的に結合する、実施形態７０〜８２のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８４．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態７０〜８３のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８５．前記結合ドメインが、Ｔ細胞α鎖抗体、Ｔ細胞β鎖抗体、Ｔ細胞γ鎖抗体、Ｔ細胞δ鎖抗体、ＣＣＲ７抗体、ＣＤ１ａ抗体、ＣＤ１ｂ抗体、ＣＤ１ｃ抗体、ＣＤ１ｄ抗体、ＣＤ３抗体、ＣＤ４抗体、ＣＤ５抗体、ＣＤ７抗体、ＣＤ８抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１６抗体、ＣＤ１９抗体、ＣＤ２０抗体、ＣＤ２１抗体、ＣＤ２２抗体、ＣＤ２５抗体、ＣＤ２８抗体、ＣＤ３４抗体、ＣＤ３５抗体、ＣＤ３９抗体、ＣＤ４０抗体、ＣＤ４５ＲＡ抗体、ＣＤ４５ＲＯ抗体、ＣＤ４６抗体、ＣＤ５２抗体、ＣＤ５６抗体、ＣＤ６２Ｌ抗体、ＣＤ６８抗体、ＣＤ６９抗体、ＣＤ８０抗体、ＣＤ８６抗体、ＣＤ９５抗体、ＣＤ１０１抗体、ＣＤ１１７抗体、ＣＤ１２７抗体、ＣＤ１３３抗体、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）抗体、ＣＤ１４８抗体、ＣＤ１６３抗体、ＣＤ２０９抗体、ＤＥＣ−２０５抗体、Ｆ４／８０抗体、ＩＬ−４Ｒα抗体、Ｓｃａ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＧＩＴＲ抗体、ＧＡＲＰ抗体、ＬＡＰ抗体、グランザイムＢ抗体、ＬＦＡ−１抗体又はトランスフェリン受容体抗体のｓｃＦｖ断片から構成されるか又はこれらのｓｃＦｖ断片から本質的に構成される、実施形態７０〜８４のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８６．前記合成核酸が、合成ｍＲＮＡである、実施形態７０〜８５のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８７．前記担体が、正電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、実施形態７０〜８６のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
８８．前記正電荷をもつ脂質又はポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、アミン・エステル共重合体、ポリ（メタクリル酸ジメチルアミノエチル）（ＰＤＭＡＥＭＡ）、キトサン、Ｌ−ラクチド・Ｌ−リジン共重合体、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］（ＰＡＧＡ）又はポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（ＰＨＰ）を含む、実施形態８７に記載の合成ナノ担体。
８９．前記コーティングが、中性又は負電荷をもつ脂質又はポリマーを含む、実施形態７０〜８８のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９０．前記中性又は負電荷をもつコーティングが、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ（アクリル酸）、アルギン酸又はコレステリルヘミサクシネート／１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを含む、実施形態８９に記載の合成ナノ担体。
９１．前記中性又は負電荷をもつコーティングが、双性イオン型ポリマーを含む、実施形態８９又は９０に記載の合成ナノ担体。
９２．前記中性又は負電荷をもつコーティングが、リポソームを含む、実施形態８９〜９１のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９３．前記リポソームが、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、コレステロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）を含む、実施形態９２に記載の合成ナノ担体。
９４．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４及び／又はＣＤ８と選択的に結合する、実施形態７０〜９３のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９５．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、実施形態７０〜９４のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９６．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体のｓｃＦｖ断片から選択される結合ドメインを含む、実施形態７０〜９５のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９７．前記担体がポリ（β−アミノエステル）を含む、実施形態７０〜９６のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９８．前記コーティングがポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態７０〜９７のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
９９．前記選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体及び／又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含み、前記担体がポリ（β−アミノエステル）を含み、前記コーティングがポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を含む、実施形態７０〜９８のいずれか一項に記載の合成ナノ担体。
１００．実施形態７０〜９９のいずれか一項に記載の合成ナノ担体を含有する、組成物。
１０１．治療を必要とする対象の治療方法であって、治療有効量の実施形態７０〜９９のいずれか一項に記載の合成ナノ担体又は実施形態１００に記載の組成物を投与することにより、治療を必要とする前記対象を治療する、前記方法。
１０２．ＣＡＲ又はＴＣＲをコードする核酸を選択された細胞種に選択的に送達するための、本願に開示するナノ担体の使用。
【実施例】
【０２２３】
［実施例１］
緒言。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するようにＴ細胞を遺伝子操作することにより、がんに対する免疫応答を誘導する方法は、大きな成果を挙げ始めている治療法であり、重要な臨床試験が着手されようとしている。Ｔ細胞を生物工学的に操作して「リビングドラッグ（ｌｉｖｉｎｇ  ｄｒｕｇ：生きた薬剤）」に転化させ、数を増やすことができ、腫瘍細胞を逐次破壊することができ、最終的に寿命の長いメモリーＴ細胞に分化できるようにする方法では、受容体トランスジーンをリンパ球のゲノムに安定的に組込むことが必要である。ウイルスベクターは、作製に時間と費用がかかり、パッケージングできる遺伝子のサイズと個数が限られているが、用途に合わせた腫瘍認識能をもつようにこれらの細胞をプログラムするために、現時点で最も有効な手段である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６，７６３９（２０１５）；Ｃｒｉｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １３，９８（２０１３））。
【０２２４】
これらの慢性遺伝子発現システムとは別に、「ヒットエンドラン」機構を目標とする高分子の一過性発現により、細胞に表現型変化を誘導することも可能である。これらの一過性適用例の大半では、治療用トランスジーンの永続的発現が望ましくなく、潜在的に危険であり（Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４２，１１４−１２５  ｅ１１４（２０１４））、このような適用例としては、細胞分化を調節するために転写因子を使用する方法（Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，９２８−９３３（２０１３）；Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４２，１９４８−１９５９（２０１５））や、ゲノムを操作するために配列特異的ヌクレアーゼを発現させる方法（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２１，１２１−１３１（２０１５））が挙げられる。
【０２２５】
一過性遺伝子治療により人工Ｔ細胞の治癒能を実質的に改善することができる適用例の数は増えつつあるが、（先述の慢性発現方法と同様に、主にウイルスベクターに依存する）現在利用可能な方法は、形質導入を実施するために複雑なプロトコールが必要であり、その費用の点から難しくなっている（Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３，１１２１−１１３２（２００６））。代替トランスフェクション法としてエレクトロポレーションが開発されたが、原形質膜の機械的透過によりＴ細胞の生存性が低下するため、これらのアプローチは大規模用途には適していない。更に、ウイルスを利用する方法と同様に、エレクトロポレーションは、不均一プールの中の特定の細胞種に選択的にトランスフェクトすることができないため、事前に細胞精製工程が必要である。
【０２２６】
本実施例は、入り組んだプロトコールや複雑な補助装置を必要とせずに培養Ｔ細胞に一過性遺伝子発現を生じる、ナノ試薬について記載する。適切に設計されたｍＲＮＡナノ担体は、試薬を細胞とインビトロで混合するだけで、機能的高分子をリンパ球に用量制御下で送達することができる（図１Ａ）。
【０２２７】
これらのナノ粒子（ＮＰ）は、標的細胞サブタイプと結合し、受容体介在性エンドサイトーシスを刺激することができるため、これらの粒子に担持させた合成ｍＲＮＡを導入することができ、コードされている分子をリンパ球で発現させることができる。トランスジーンの核内輸送と転写とが不要であるため、この方法は、迅速で効率的である。臨床用の優れたＣＡＲ−Ｔ細胞製品を製造するために、この新規プラットフォームをどのようにして実施できるかについて、少なくとも２例で具体的に説明する。第１の適用例では、標的化ｍＲＮＡナノ担体を、Ｔ細胞のゲノム編集ツールとして使用した。切断頻度の低いｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２３９，１７１−１９６（２０１５））をコードするｍＲＮＡを送達すると、リンパ球によるＴ細胞受容体発現を効率的に妨害することができる。第２の適用例では、エフェクター細胞から機能性メモリー細胞への分化をリプログラムする主要なレギュレーターであるＦｏｘｏ１（Ｔｅｊｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１，１８７−１９９（２０１３）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９，２８６−２９７（２０１３））を一過性発現させた。その結果、人工ナノ粒子に暴露されると、Ｔ細胞はセントラルメモリー表現型に変化することが判明した。
【０２２８】
このシステムの最大の利点は、治療用細胞の遺伝子改変を臨床規模で簡易に実施できる点であり、適切なナノ粒子試薬をリンパ球と混合するだけでよい。遺伝子材料を一過性送達するために現在使用されているアプローチは、有効性が低く、知的所有権下にある特殊で高価な多数の工程を必要とすることから利用可能性が制限されているが、本願のアプローチは、既存のアプローチと明らかに対照的である。Ｔ細胞療法以外に、他の治療用細胞種（例えばナチュラルキラー細胞、樹状細胞、造血幹細胞又は間葉幹細胞）の治癒能を実質的に改善するために、操作時間、危険又は複雑さを増すことなく、この一過性遺伝子送達プラットフォームを、これらの細胞種の既存の調製方法に容易に統合することができよう。
【０２２９】
材料と方法。試験デザイン。このプロジェクトの目的は、一次Ｔ細胞へのインビトロ標的化ｍＲＮＡ送達用ナノ材料を開発することであった。個々のドナーから得られた細胞を使用して、ナノ担体による送達を特定用途に合わせて最適化するようにパイロット実験を実施した後に、複数のドナーからの試料を使用して、最適化プロトコールを反復した。
【０２３０】
ＰＢＡＥ４４７合成。このポリマーを、Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉら（Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ９，１２３６−１２４９（２０１５））により記載されている方法と同様の方法を使用して合成した。１，４−ブタンジオールジアクリレートを４−アミノ−１−ブタノールと１．１：１のジアクリレート対アミンモノマーモル比で混合した。この混合物を、撹拌下に９０℃まで２４時間加熱し、アクリレート基を末端にもつ４−アミノ−１−ブタノールと１，４−ブタンジオールジアクリレートとの共重合体を得た。このポリマー２．３ｇを、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２ｍｌに溶解した。ピペラジンでキャップした４４７ポリマーを形成するために、１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン７８６ｍｇをＴＨＦ１３ｍｌに溶解し、ポリマー／ＴＨＦ溶液に加えた。得られた混合物を、室温で２時間撹拌後、キャップしたポリマーを５倍容量のエチルエーテルで沈殿させた。溶媒をデカントした後、ポリマーを２倍容量の新鮮なエーテルで洗浄した後、使用時まで２日間減圧乾燥し、１００ｍｇ／ｍｌＤＭＳＯストックを形成し、−２０℃で保存した。
【０２３１】
ＰＧＡ−抗体コンジュゲーション。１５ｋＤポリグルタミン酸（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ製品）を２０ｍｇ／ｍｌとなるように水に溶解し、１０分間超音波処理した。等容量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）の４ｍｇ／ｍｌ水溶液を加え、溶液を室温で５分間混合した。得られた活性化ＰＧＡを、次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で抗体に４：１モル比で加え、室温で６時間混合した。未結合のＰＧＡを除去するために、ＰＢＳを３回交換しながら、溶液を５０，０００ＮＭＷＣＯメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で透析した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、抗体濃度を測定した。Ｔ細胞実験に使用した抗体を、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）、抗ＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、抗ＣＤ８（クローンＯＫＴ８）及び抗ＣＤ２８（クローン９．３、いずれもＢｉｏＸＣｅｌｌ製品）とした。クローンＣ１．１８．４を、対照抗体として使用した。ＨＳＣ導入には、ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧとポリクローナルヤギ抗マウスＣＤ１０５抗体（Ｆｉｓｈｅｒ）とを使用した。
【０２３２】
ｍＲＮＡ合成。ｅＧＦＰ、Ｆｏｘｏ１、Ｔｒｅｘ２及びＴＲＡＣ−ｍｅｇａＴＡＬのコドン最適化ｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに作製委託し、改変リボヌクレオチドであるシュードウリジン（Ψ）と５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で完全に置換し、ＡＲＣＡでキャップしたものを得た。これらの転写産物の送達を追跡するために、Ψとｍ５Ｃで修飾したｅＧＦＰ  ｍＲＮＡをｃｙ５で標識した（同じくＴｒｉＬｉｎｋに委託）。
【０２３３】
ナノ粒子作製。ｍＲＮＡストックを、ｐＨ５．２の滅菌ヌクレアーゼフリー２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ＮａＯＡｃ）で１００μｇ／ｍｌまで希釈した。ＰＢＡＥ−４４７ポリマーのＤＭＳＯ溶液を、ＮａＯＡｃで６ｍｇ／ｍｌまで希釈し、ｍＲＮＡに６０：１（ｗ：ｗ）比で加えた。得られた混合液を、中速で１５秒間ボルテックスした後、ＮＰを形成できるように室温で５分間保温した。ターゲティングエレメントをナノ粒子に加えるために、ＰＧＡと連結した抗体を、ＮａＯＡｃで２５０μｇ／ｍｌまで希釈し、ｍＲＮＡに２．５：１（ｗ：ｗ）比で加えた。得られた混合液を、中速で１５秒間ボルテックスした後、室温で５分間保温し、ＰＧＡ−ＡｂをＮＰに結合させた。
【０２３４】
凍結保護剤としてＤ−スクロース６０ｍｇ／ｍｌとナノ粒子とを混合し、液体窒素で瞬間凍結させた後、ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ２．５Ｌ凍結乾燥システム（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）で処理することにより、凍結乾燥した。凍結乾燥したＮＰを、使用時まで−８０℃で保存した。利用時には、凍結乾燥したＮＰを多量の滅菌水に再懸濁し、元の濃度に戻した。
【０２３５】
ナノ粒子特性決定。作製した粒子の流体力学的半径を、Ｎａｎｏｓｉｔｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ）で測定し、Ｚｅｔａｐａｌｓ計器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で検出した動的光散乱を使用してそのゼータ電位を求めた。寸法測定の際には、粒子を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１：４００（ｖ／ｖ）に希釈し、ゼータ電位計測の際には、１：４０に希釈した。透過型電子顕微鏡試験では、カーボン／フォルムバールをコーティングした２００メッシュ銅グリッドを、グロー放電で活性化したものにナノ粒子の２５μｌ試料を各々加えた。３０秒後にグリッドを１／２カルノフスキー固定液１滴、０．１Ｍカコジル酸緩衝液１滴、ｄＨ２Ｏ８滴、１％（ｗ／ｖ）濾過済み酢酸ウラニル１滴と順次接触させた。ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＵＳＡ）を使用して、これらの試料を試験した。
【０２３６】
細胞株及び培養培地。Ｋ５６２−ＣＤ１９及び対照Ｋ５６２細胞は、Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｒｉｄｄｅｌｌ博士（フレッド・ハッチンソンがん研究センター（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ））により提供された。ＴＭ−ＬＣＬは、ＥＢＶで形質転換させたＣＤ１９＋リンパ芽球様細胞株であり、Ｔ細胞拡大培養用フィーダーとして使用するように最適化されている（３６）。Ｊｕｒｋａｔ−Ｅ６Ｔ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。１０％ウシ胎仔血清、０．８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０を、Ｔ細胞培地（ＴＣＭ）とし、これらの細胞株を培養した。
【０２３７】
個々に指定する通り、５０ＩＵ  ＩＬ−２／ｍｌ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＴＣＭ又はＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ細胞拡大培養培地（ＸＦＳＦＭ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）中で、一次ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とＴ細胞を培養した。
【０２３８】
Ｔ細胞のｍＲＮＡトランスフェクション。正常ドナーからの凍結保護ＰＢＭＣを、加温ＴＣＭの滴下により解凍した後に遠心した。指定する場合には、ＣＤ８Ｔ細胞をネガティブ選択（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）により単離した。細胞を、ＴＣＭ＋ＩＬ−２中で１０６個／ｍｌとなるように培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：１のビーズ：細胞比で使用して刺激した。ＣＤ３を標的とするナノ粒子導入を行う実験では、ＮＰ添加の２４時間前に、これらのビーズを除去した。
【０２３９】
ＮＰによるトランスフェクションでは、Ｔ細胞をＸＦＳＦＭに２×１０６個／ｍｌの濃度となるまで再懸濁した。細胞１０６個当たりｍＲＮＡ２．５μｇを担持させた抗体標的化ＮＰをこの懸濁液に加え、３７℃で２時間暴露した後、細胞を３倍容量のＴＣＭ＋ＩＬ−２で洗浄した。対照ＮＰには、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを担持させた。ＴＣＲα遺伝子編集用ＮＰには、ＴＲＡＣ−ｍｅｇａＴＡＬ、Ｔｒｅｘ２及びｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを４２：４２：１６ｗ：ｗ：ｗの比で担持させた。Ｆｏｘｏ１３ＡＮＰには、Ｆｏｘｏ１３Ａ及びｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを８４：１６ｗ：ｗの比で担持させた。
【０２４０】
エレクトロポレーションでは、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したＰＢＳでＴ細胞２×１０６個を２回洗浄し、ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ３μｇを加えたＴ細胞エレクトロポレーション媒体（Ｌｏｎｚａ）１００μｌに再懸濁し、エレクトロポレーションキュベットに移し、プログラムＴ−２０を使用してＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）装置で処理した。抗体を加えずに２ｍｌのＴＣＭ＋ＩＬ−２を加えたプレートにエレクトロポレーション後の細胞を移した。
【０２４１】
ＣＤ３４＋細胞のＮＰ導入。正常ドナーから予め動員したＰＢＳＣから精製したＣＤ３４＋細胞を、フレッド・ハッチンソンがん研究センターの造血細胞処理・保管コア施設から入手した。解凍後、細胞を計数した後、ヒト幹細胞因子（Ｓｃｆ）５０ｎｇ／ｍｌ、マウスＦｌｔ３／Ｆｌｋ−２リガンド５０ｎｇ／ｍｌ及びヒトトロンボポエチン２５ｎｇ／ｍｌを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭＩＩ無血清培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＨＳＣ培地として、１０６個／ｍｌの濃度となるように一晩培養した。翌日、細胞を回収し、計数し、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）でサイトカインを含まないＨＳＣ１００μｌにウェル当たり細胞２．５×１０４個となるように再懸濁した。細胞を未処理のままとするか、又はＣＤ１０５を標的とするＮＰもしくは抗マウスを標的とする対照ＮＰにウェル当たり１μｇのｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを担持させたもので処理した。細胞をＮＰで１時間処理した後、サイトカインを含まないＨＳＣ培地１ｍｌで２回洗浄した。次に、洗浄した細胞を２４ウェル組織培養プレート内の完全ＨＳＣ培地５００μｌに移し、４８時間後に、フローサイトメトリーによる解析用に細胞をＣＤ３４とＣＤ１０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）に対して標識した。
【０２４２】
ＴＣＲαのＰＣＲ増幅とインデル検出。Ｇｅｎｅａｒｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用して、インデル検出を行った。要約すると、Ｔ細胞を溶解させ、ＴＲＡＣフォワードプライマーＣＣＣＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴ（配列番号５３）とＴＲＡＣリバースプライマーＡＴＣＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴ（配列番号５４）を使用して、ＴＣＲαＭｅｇａＴＡＬ標的部位を挟むゲノムＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を変性させ、再アニールし、特異的に切断されたバンドと生殖細胞のゲルバンド密度を比較することにより、インデル形成を評価できるように検出酵素で処理した。
【０２４３】
レンチウイルス導入及び１９−４１ＢＢζＣＡＲを使用したＴ細胞の拡大培養。４１ＢＢ及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むヒト抗ＣＤ１９ＣＡＲコンストラクト（１９−４１ＢＢζ）を、従来記載されているように単一のＳｔｒｅｐＴａｇで修飾し（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４，４３０−４３４（２０１６））、ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターに導入した。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクター、ウイルスパッケージングプラスミドｐＣＭＶｄＲ８．９１及びｐＭＤ２．Ｇを使用して、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のリン酸カルシウムトランスフェクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、ＶＳＶＧシュードタイプレンチウイルスを作製した。レンチウイルス導入では、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングしたプレート（Ｔａｋａｒａ）に、ポリブレン８μｇ／ｍｌと１９−４１ＢＢζ−ＣＡＲをコードするＭＯＩ５：１のレンチウイルスを加えた中にＴ細胞を移した後、３４℃で１時間８００×ｇでスピン感染を行った。１９−４１ＢＢζを導入した細胞を選択的に拡大培養するために、ＴＣＭ＋ＩＬ−２中で放射線照射（７０００ラド）したＣＤ１９＋ＴＭ−ＬＣＬ細胞を１：７の比となるように使用してリンパ球を刺激した。
【０２４４】
セルソーティング及びフローサイトメトリー。ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ又はＦａｃｓＣａｎｔｏ  ＩＩセルアナライザーを使用し、ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェアを実行してデータを獲得し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ−ＩＩでソートし、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．１で解析した。フローサイトメトリーで使用した抗体を図２にリストする。
【０２４５】
細胞内サイトカイン染色。ブレフェルジンＡ３μｇ／ｍｌ±ＰＭＡ２０ｎｇ／ｍｌとイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１μｇ／ｍｌとを添加したＴＣＭ中で、細胞を６時間培養した。固定する前に、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ３染色を使用してＴＣＲ＋ＣＤ８＋細胞サブセットとＴＣＲ−ＣＤ８＋細胞サブセットとを同定した。その後、細胞を固定・透過処理キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理した後、抗ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で標識した。
【０２４６】
Ｆｏｘｏ１の細胞内染色。ｅＧＦＰｍＲＮＡ３μｇ又はＦｏｘｏ１３Ａ２．５μｇとｅＧＦＰｍＲＮＡ０．５μｇを、担持させた抗ＣＤ３標的化ＮＰをＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞１０６個にトランスフェクトした。２４時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で固定し、１回洗浄し、９０％氷冷メタノールで３０分間透過処理した。これらの試料を、室温にて０．５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした後、ウサギ抗Ｆｏｘｏ１（クローンＣ２９Ｈ４）又はアイソタイプ（クローンＤＡＥ１）で染色後、抗ウサギＩｇＧ  Ｆ（ａＢ’）２  Ａｌｅｘａ−６４７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で染色した。
【０２４７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞殺傷アッセイ。ＣＡＲ標的細胞の特異的細胞溶解を、フローサイトメトリーによりアッセイした。標的Ｋ５６２−ＣＤ１９細胞と対照Ｋ５６２とを夫々低濃度（０．４μＭ）及び高濃度（４．０μＭ）のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で３７℃にて１５分間標識した。血清を添加した完全培地で両方の試料を洗浄し、１：１の比で混合した後、指定するエフェクター：標的比で１９−４１ＢＢζと共培養した。特異的細胞溶解を評価するために、各条件の試料を抗ＣＤ８  ｍＡｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色してＴ細胞を同定し、７ＡＡＤで染色して死細胞を排除し、フローサイトメトリーにより解析した。生存ＣＤ１９＋標的細胞（低濃度ＣＦＳＥ）と対照ＣＤ１９−Ｋ５６２細胞（高濃度ＣＦＳＥ）との比を測定することにより特異的細胞殺傷を評価した。
【０２４８】
顕微鏡試験。Ｔ細胞１０６個をＸＦＳＦＭ４００μｌに加え、ｃｙ５標識ｅＧＦＰ  ｍＲＮＡ３μｇを担持させた抗ＣＤ３標的化ＮＰで４℃にて１時間処理して表面結合させた後、３７℃で２時間保温して内在化させた。これらの処理後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）をコーティングしたスライドに４℃で３０分間付着させた。試料を２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントし、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０ＮＬＯ共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像形成した。
【０２４９】
ＲＮＡ精製、ＲＴ−ＰＣＲ、シーケンシング及びバイオインフォマティクス解析。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ａｍｂｉｏｎ）でＴ細胞を溶解させた後、オンカラムＤＮＡ消化方式のＤｉｒｅｃｔＺｏｌキット（Ｚｙｍｏ）を製造業者の指示に従って使用して、全ＲＮＡを単離した。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）では、大容量ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡを作製した。ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ  ｑＰＣＲアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してハウスキーピング遺伝子Ｂ２Ｍに対する内在性ＦＯＸＯ１とコドン最適化ＦＯＸＯ１３Ａの相対発現レベルを測定した。コドン最適化Ｆｏｘｏ１３Ａを検出するために使用したプライマーは内在性Ｆｏｘｏ１ｍＲＮＡの交差検出を避けるように選択した。
Ｆｏｘｏ１３Ａフォワード：ＧＧＡＣＡＧＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＧ（配列番号５５）
Ｆｏｘｏ１３Ａプローブ：ＡＧＧＴＣＧＧＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＣ（配列番号５６）
Ｆｏｘｏ１３Ａリバース：ＣＴＣＴＴＧＡＣＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＴＡＧ（配列番号５７）。
【０２５０】
ＲＮＡｓｅｑ解析では、インビトロ培養対照ＮＰとＦｏｘｏ１３ＡＮＰで処理したＣＤ８＋細胞から３日後と８日後にＲＮＡ試料を単離し、ドナーをマッチさせて凍結保護した２つの独立したＰＢＭＣ試料に由来する選別済みの参照ナイーブ（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋）細胞及びＴＣＭ（ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋）細胞と比較した。ＴｒｕＳｅｑ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造業者の指示に従って使用して、ＲＮＡＳｅｑライブラリーを調製した。ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ライブラリーを５０サイクルシーケンシングした（ペアードエンド法）。ＴｏｐＨａｔ  ｖ２．１．０を使用して、ヒトｈｇ３８ゲノムに対するＩｌｌｕｍｉｎａのベースコール・クオリティフィルターをパスした結果を整列させた。ｈｔｓｅｑ−ｃｏｕｎｔ（ｖ０．６．１ｐ１）を「ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ−ｓｔｒｉｃｔ」オーバーラップモードで実行して、各遺伝子のカウントを取得した。データ正規化及び発現変動解析には、ｅｄｇｅＲのＧＬＭ法を使用した。８日目にドナーをマッチさせた対照ＮＰで処理したＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ８＋ＴＣＭにおける発現が高いもの（ＴＣＭアップ）と低いもの（ＴＣＭダウン）とを統計的有位性によりランク付けした場合に、上位５００番目までの遺伝子としてＴＣＭシグネチャー遺伝子セットを定義した。変動倍数×１／（ｐ値）の符号によりランク付けした遺伝子リストを使用して、ＧＳＥＡＰｒｅｒａｎｋｅｄソフトウェアにより遺伝子セットエンリッチメントを解析した（３７）。ＲＮＡｓｅｑ解析からの生データ及び解析済みデータは、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ，ＧＥＯシリーズアクセッション番号ＧＳＥ８９１３４として登録されている（３８）。
【０２５１】
統計解析。特に明記しない限り、グラフは、平均±平均の標準偏差を示す。統計解析を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して行った。
【０２５２】
結果。Ｔ細胞で確実なトランスジーン発現を生じるようなｍＲＮＡナノ担体の設計。（非ウイルストランスフェクション法に不応であるとして一般に知られている）一次Ｔリンパ球を遺伝子改変することができる試薬を創製するために、以下の４種類の機能的成分を含むポリマーナノ粒子（図１Ｂ）を生物工学的に作製した。（ｉ）ナノ粒子をＴ細胞と選択的に結合させ、迅速な受容体誘導性エンドサイトーシスを開始して内在化させる表面係留ターゲティングリガンド。本実験では抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ８抗体とを使用した。（ｉｉ）ナノ粒子の表面電荷を減らすことによりオフターゲット結合を最小限にするようにナノ粒子を保護する負電荷をもつコーティング。ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）は既にドラッグデリバリープラットフォームで広く使用されているので、これをこの目的に選択した。（ｉｉｉ）核酸がエンドソーム内にあるときには核酸を圧縮し、酵素分解から保護するように機能するが、粒子が細胞質内に輸送されると、核酸を放出し、コードされているタンパク質の転写を可能にする担体マトリックス。この目的には、水性条件下の半減期が１〜７時間である生分解性ポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）ポリマー製剤を使用した。（ｉｖ）担体の内側に封入されており、遺伝子編集又はＴ細胞の表現型を永続的に変化させることが可能なタンパク質の一過性発現をもたらす核酸。ｍＲＮＡはゲノム組込みの危険がなく、発現に核局在化を必要としないので、治療用タンパク質の一過性発現に理想的なプラットフォームである。しかし、未修飾ｍＲＮＡは、細胞内ｔｏｌｌ様受容体を活性化する可能性があるため、タンパク質発現が制限され、毒性に繋がる（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３，１６５−１７５（２００５））。送達されたｍＲＮＡの安定性を改善すると共に免疫原性を低下させるために、修飾ヌクレオチドを組込んだ合成物を使用した。例えば、ウリジンとシチジンを人工塩基であるシュードウリジン及び５−メチルシチジンで置換すると、自然パターン認識受容体による認識が相乗的に阻止され、ｍＲＮＡ翻訳が助長される。
【０２５３】
２段階電荷駆動自己集合法を利用して、ＮＰを製造した。先ず、正電荷をもつＰＢＡＥポリマー及び合成ｍＲＮＡを複合体化し、ｍＲＮＡをナノサイズ複合体に圧縮した（図３Ａ、３Ｂ）。この工程に続き、抗体とＰＧＡとのコンジュゲートを加え、ＰＢＡＥ−ｍＲＮＡ粒子の正電荷を保護し、リンパ球ターゲティング機能を付与した。得られたｍＲＮＡナノ担体は、寸法が１０９．６±２６．６ｎｍであり、表面電荷がほぼ中性であった（ゼータ電位１．１±５．３ｍＶ、図３Ｃ）。
【０２５４】
ｍＲＮＡナノ担体は、Ｔ細胞トランスフェクション効率がエレクトロポレーションと同等でありながら、生存性を低下させない。目的は細胞療法薬の製造を合理化することであるので、標的化ｍＲＮＡナノ担体を既存のヒトリンパ球培養物に添加するだけでその確実なトランスフェクションを行うために十分であるか否かを試験した。ＣＤ３を標的とするＮＰにレポーター（高感度緑色蛍光タンパク質ｅＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡを担持させてこれらの細胞と共に保温すると、ＮＰはこれらの細胞と結合するだけでなく、受容体介在性エンドサイトーシスを刺激し、粒子に担持させた遺伝子を導入することができる（図４Ａ）。ＮＰを１回添加した（ＮＰ：Ｔ細胞比＝２×１０４：１）後に、これらの一次Ｔ細胞の８５％（図４Ｂ）が定常的にトランスフェクトされ、トランスフェクション後５時間という早期にトランスジーン発現が認められた（図５Ａ）。したがって、この方法は、迅速で効率的である。重要な点として、添加時毎に新たにｍＲＮＡ  ＮＰを作製する必要がなく、使用時まで凍結乾燥しておくことができ、性質や効果に全く変化を生じなかった（図５Ｂ）。
【０２５５】
次に、ｍＲＮＡを担持させた標的化ＮＰがＴ細胞拡大培養に及ぼす影響を評価した。悪性腫瘍は急速に進行することが多いため、人工Ｔ細胞を臨床的に適切な規模まで迅速に拡大培養できることが重要である。臨床研究室でポリクローナルリンパ球を増殖させるために広く使用されている１つのアプローチは、ＴＣＲ／ＣＤ３及び共刺激ＣＤ２８受容体に対する抗体を、コーティングしたビーズと共に保温する方法である。ＣＤ３を標的とするＮＰ（ＮＰ：Ｔ細胞比：２×１０４：１）を繰返しトランスフェクションしてもこれらのコーティング付きビーズにより刺激したＴ細胞の拡大培養に支障を生じなかった（図４Ｃ）。この結果は、並行して試験したＴ細胞エレクトロポレーションと著しく対照的である。エレクトロポレーションは、複雑な細胞操作工程（例えば媒体交換や遠心サイクル、図４Ｄ）が加わっただけでなく、この方法ではリンパ球の生存率も低下し（図６）、Ｔ細胞収率は６０分の１に低下した（図４Ｄ、右図）。
【０２５６】
ナノ粒子トランスフェクションは、効率的なゲノム編集を行うためにＣＡＲ−Ｔ細胞製造ワークフローに一体的に統合される。ＮＰによるｍＲＮＡトランスフェクションを白血病特異的１９−４１ＢＢζＣＡＲ  Ｔ細胞の製造に組込むことにより、このアプローチを臨床関連適用例で試験した（図７Ａ）。ＣＤ１９を標的とする受容体は、目下のところ最もよく検討されているＣＡＲ−Ｔ細胞製品であり、国内外で約３０件の臨床試験が進行中である（Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２５，３３９２−３４００（２０１５））。これに加えてゲノムエンジニアリングを実施できるならば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性及び有効性を改善することが可能になる。例えば、移植片対宿主病を避けるために内在性ＴＣＲの発現を排除することができる。更に、免疫チェックポイント遺伝子を選択的に欠失させて、免疫抑制的腫瘍環境におけるそれらの活性を強化することができる（Ｍｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７６，２０８７−２０９３（２０１６）；Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９，５６９７−５７０５（２０１２））。しかし、ゲノム編集剤を細胞に送達するためにエレクトロポレーションを使用すると、Ｔ細胞製造の大規模化は実質的に困難になる。そこで、ＴＣＲα遺伝子の定常領域（ＴＲＡＣ）を標的とし、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを担持させた粒子を作製することにより、ＮＰが遺伝子編集剤を送達する能力を測定した。ＮＰ製剤化方法により提供される融通性を利用し、ノックアウト効率を改善するためにＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼＴＲＥＸ２をコードするｍＲＮＡを担持させ、トランスフェクションを追跡するためにｅＧＦＰ  ｍＲＮＡも担持させた。対照粒子にはｅＧＦＰ  ｍＲＮＡのみを担持させた。ｅＧＦＰトランスフェクション（ＴＣＲ発現変化なし；図７Ｂ、上段）とは対照的に、ＴＣＲα−ｍｅｇａＴＡＬ粒子をＴ細胞培養物に加えると、５日目までにＴＣＲ発現が効率的に中断され、効果は、ｍＲＮＡの消失後も１２日目まで維持された（図７Ｂ、下段）。平均ＴＣＲ濃度は、対照に比較して６０．８％（±１７．７％；図７３Ｃ）であり、サーベイヤーアッセイ（図７Ｄ）を使用して求めたインデル頻度の百分率（ターゲティング効率の尺度）に一致する。重要な点として、１９−４１ＢＢζ  ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターによる導入効率は、ＮＰをトランスフェクトしたＴ細胞とトランスフェクトしなかったＴ細胞で同等であった（図７Ｅ）ことから明らかなように、ｍＲＮＡを担持させたナノ粒子の存在は、ウイルスによる腫瘍特異的ＣＡＲの遺伝子導入に影響を与えなかった。ＮＰによるゲノム編集及びレンチウイルス導入後に、ＣＡＲによりプログラムされたＴ細胞は、その増殖能、サイトカイン分泌能、及び白血病標的細胞を殺傷する能力を完全に維持した（図７Ｆ〜７Ｈ）。要するに、これらの結果から、リンパ球を標的とするｍＲＮＡナノ担体は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能を損なわずにその効率的なゲノム編集を実現できることが明らかである。
【０２５７】
転写因子Ｆｏｘｏ１をコードするｍＲＮＡをＮＰにより送達すると、メモリーＣＡＲ−Ｔ細胞に刷り込まれる。そこで、リンパ球を標的とするｍＲＮＡ  ＮＰがＣＡＲ−Ｔ細胞を好ましい表現型となるようにプログラムするｍＲＮＡを送達することにより、これらの細胞の治療活性を改善できるか否かについて検討した。ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）に由来するＴ細胞製品が動物モデルにおいて生着と機能の改善を示し、ＣＡＲ療法の成功は注入される製品におけるＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ表現型細胞の割合に関係していることが、臨床結果により既に立証されている（Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１８，６０５０−６０５６（２０１１）；Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ３０，４９２−５００（２０１６））。しかし、治療に適したリンパ球数に達するためには、細胞をＴＣＭ系列から最終分化及び老化へと導く工程であるインビトロ刺激／拡大培養工程にこれらの細胞を何回か供する必要がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ３５，６８９−７０１（２０１２））。この問題に対処するために、ＣＤ８Ｔ細胞におけるエフェクターからメモリーへの移行を調節するフォークヘッドファミリー転写因子であるＦｏｘｏ１（Ｔｅｊｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１，１８７−１９９（２０１３）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９，２８６−２９７（２０１３））をコードするｍＲＮＡを担持させ、Ｔ細胞を標的とするＮＰを作製した。インビトロ刺激／拡大培養中に、ＴＣＲ及びサイトカインシグナル伝達はＡＫＴキナーゼを活性化させる。この酵素は、Ｆｏｘｏ１をリン酸化し、その細胞質分離と転写活性の阻害とをもたらす。Ｆｏｘｏ１を培養Ｔ細胞中に維持するために、３種類の主要なリン酸化残基をアラニンに突然変異させた前記因子のＡＫＴ非感受性変異体を使用した（Ｆｏｘｏ１３Ａ）。エクスビボ拡大培養中にＦｏｘｏ１３Ａを担持させたＮＰをＴ細胞培養培地に添加すると、治療能を改善したＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ細胞の発生が促進されるであろうと仮定した。転写因子がリプログラミングに及ぼす影響はその発現の強さと期間により変動する。Ｆｏｘｏ１３Ａ−ＮＰ添加後のこれらの値を求めるために、ナノ粒子で処理した細胞におけるＦｏｘｏ１タンパク質及びｍＲＮＡ発現を測定した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株では、Ｆｏｘｏ１の内在性発現が低く、Ｆｏｘｏ１３Ａ  ＮＰ処理後に細胞内標識により測定した前記因子の総発現量は著しく増加していた（図８Ａ、左図）。一次Ｔ細胞では、Ｆｏｘｏ１タンパク質の発現レベルが元々高く、Ｆｏｘｏ１３Ａ−ＮＰによる増加は若干であった。したがって、ほぼ生理的レベルの活性なＦｏｘｏ１３Ａ転写因子をＮＰ処理により誘導できると判断される（図８Ａ、右図）。活性化されて増殖中のＴ細胞のＮＰトランスフェクション後のｍＲＮＡダイナミクスを調べるために、人工ｍＲＮＡに特異的なリアルタイム定量的ＰＣＲを使用してＦｏｘｏ１３Ａの発現を測定した。ｍＲＮＡ発現は、１日目に最大であり、トランスフェクション後８日までにベースラインに近付いた（図８Ｂ）。Ｔ細胞プライミング後にＦｏｘｏ１３Ａ  ＮＰでインビトロ処理すると、ＴＣＭをエフェクター集団及びエフェクターメモリー集団から区別する一次表面マーカーであるＣＤ６２Ｌ（Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１，７０８−７１２（１９９９））の発現が急速に増加した（図８Ｃ）。Ｆｏｘｏ１３Ａの一過性発現がＣＤ８＋Ｔ細胞分化に持続的な変化を生じることができるか否かを調べるために、ＣＤ８を標的とするＦｏｘｏ１３Ａ−ｅＧＦＰ  ＮＰで３人の別個のドナーからの細胞を処理し、ｅＧＦＰ発現に基づいて選別し、インビトロに維持した。トランスフェクション後２４時間以内にＣＤ６２Ｌ＋細胞頻度の増加が認められ、これはＮＰ添加から８〜２０日後でも維持された（図８Ｄ）。
【０２５８】
Ｆｏｘｏ１３Ａにより誘導される遺伝子調節ネットワーク及びＴＣＭ系統とのその関係を解明するために、エクスビボ単離したナイーブＣＤ８Ｔ細胞、ＴＣＭ  ＣＤ８Ｔ細胞及びインビトロ培養したＣＤ８Ｔ細胞を用意し、Ｆｏｘｏ１３ＡをコードするＮＰ又は対照粒子で処理した後にＲＮＡＳｅｑを実施した。平均的なＣＤ８Ｔ細胞に比較してＴＣＭ発現が高いものと低いものの上位５００番目までの遺伝子から構成されるＴＣＭシグネチャー（図８Ｅ及び図９Ａ）を同定した。これらの遺伝子の大多数は、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞で同調的に制御され、ナイーブとＴＣＭの間の密接な転写関係に一致する（Ｋａｅｃｈ  ＆  Ｃｕｉ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，７４９−７６１（２０１２））。Ｆｏｘｏ１３ＡをコードするＮＰで処理すると、多数の遺伝子の差次的発現を生じた。予想通り、これらの遺伝子には、主要なメモリー転写エフェクターであるＫＬＦ２をコードするものと、いずれもＣＤ８  ＴＣＭトラフィキング及び機能の重要なメディエーターである表面分子ＳＥＬＬ（ＣＤ６２Ｌ）、ＣＤ２８及びＳ１ＰＲ１をコードするものとが含まれていた（図８Ｆ）（Ｓｋｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，１２８５−１２９３（２０１３）；Ｂｏｅｓｔｅａｎｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２１，６９−７７（２００９））。ＴＣＭ遺伝子シグネチャーをＦｏｘｏ１３Ａボルカノプロットに重ねると、転写産物がよく一致していることが分かる。ＴＣＭシグネチャー遺伝子は、Ｆｏｘｏ１３ＡによりプログラムされたＣＤ８細胞中でアップレギュレートされた。遺伝子セットエンリッチメント解析の結果、Ｆｏｘｏ１３Ａにより調節される転写産物とＴＣＭ関連遺伝子発現との間に、強い関連性があることが確認された（図９Ｂ）。つまり、これらの結果から、Ｆｏｘｏ１３ＡをコードするＮＰは、表面マーカーに持続的な変化とＴＣＭ様表現型への転写プログラミングを誘導することが明らかである。
【０２５９】
考察。本実施例は適切に設計されたｍＲＮＡナノ担体が、一次リンパ球における遺伝子発現を一過性にプログラムできることを実証するものである。具体的には、メモリー表現型誘導と治療用ゲノム編集とを立証し、生物工学的に作製したナノ粒子をＴ細胞の培養物に添加するだけで如何にして細胞機能及び／又は分化を永続的にリプログラムできるかを、明らかにする。このナノテクノロジープラットフォームは特別な細胞操作を必要としないため、ワークフローや工程で使用される装置を変更せずに治療用Ｔ細胞の既存の製造用プロトコールに容易に統合することができる。これは、現時点でＴ細胞におけるヒットエンドラン遺伝子治療の選択方法であるＲＮＡエレクトロポレーション（Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２，１０４３７−１０４４２（２０１５）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４，ｅ３０（２０１６）；Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，（２０１５））に比較して製造に著しく有利になるであろう。図２に示すように、エレクトロポレーションは、高価な装置が必要であることに加え、多くの培地交換、遠心工程及び洗浄サイクルが必要である。これらの工程は各々間違いを起こしやすいため、汚染の危険が増し、疾患と戦うリンパ球の生産量が低下する。最新式のフローエレクトロポレーション装置でもＴ細胞生存性が低下し、したがって、製品収率及び品質も低下する（Ｋｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２，ｅ１１４（２０１３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５，３５９６−３６０７（２０１５））。本願のアプローチはトランスジーンを送達するために、細胞膜の機械的透過に依存しない。その代わり、人工ナノ粒子がＴ細胞と結合し、細胞生存性を低下させずに前記粒子に担持されたＲＮＡの導入を実現する生理的プロセスである、受容体介在性エンドサイトーシスを刺激する（図４Ｃ）。
【０２６０】
種々の分子カーゴの細胞内取込みを助長する低分子タンパク質である細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）も、治療薬を一次Ｔ細胞に輸送するために使用されている（Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ８，１９７２−１９９４（２０１４））。このアプローチを使用すると、大きいタンパク質でもＣＰＰドメインを付加すれば細胞質に導入することができる。しかし、ＣＰＰでは選択された細胞種の特異的ターゲティングは不可能であり、タンパク質導入は比較的非効率的である（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ８５７５５（２０１４）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ４，ｅ２３２（２０１５））。治療効果持続期間は導入したタンパク質の半減期にも強く依存する。それに比べ、合成ｍＲＮＡを担持させたナノ担体は、特定の細胞を標的とし、送達された全てのＲＮＡ分子が複数のタンパク質コピーの翻訳用鋳型として機能する。
【０２６１】
これらの実験で標的としたＣＤ３分子及びＣＤ８分子は、ｍＲＮＡをリンパ球に選択的にシャトリングするために使用することができる多数の抗原のうちのほんの２例に過ぎない。抗原に暴露されたリンパ球等の特定のＴ細胞サブセットのみを選択的に改変するためには、活性化マーカー（例えばＣＤ２５、４−１ＢＢ、ＯＸ４０又はＣＤ４０Ｌ）を標的とすることができる。更に、コアポリマー及び電荷を打ち消すコーティング材料の選択にも柔軟性があり、臨床規模での製造が行われる前に恐らく最適化されよう。コアポリマーについては、ハイパーブランチスターポリマー、ポリエチレングリコールグラフトポリエチレンイミン及びメソポーラスシリカナノ粒子を含む種々のカチオン性ポリマーを試験し、トランスフェクション効果に優れ、一次Ｔ細胞における生体材料による細胞毒性が低いことから、ＰＢＡＥ４４７を選択した。この製剤は、水性条件下の半減期が１〜７時間であり、生分解性が高いため、細胞毒性が低くなる（Ｍａｎｇｒａｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ９，１２３６−１２４９（２０１５））。このポリマーは、エンドソーム内に閉じ込められている間は圧縮しており、ｍＲＮＡを分解から有効に保護するが、細胞質に導入後にすぐに放出し、コードされているタンパク質の転写が可能になるため、この半減期は、遺伝子治療に理想的である。重要な点として、試験した全てのナノ粒子デザインにおいて、ＲＮＡ／ＰＢＡＥポリプレックスの正電荷を打ち消し、オフターゲット結合を防ぐために、負電荷をもつナノ粒子コーティングが必要であった。
【０２６２】
Ｔ細胞療法以外に、ＣＤ１０５を標的とするｍＲＮＡナノ担体（図１０）を使用してより有効な造血幹細胞（ＨＳＣ）製品を製造するために、本願に記載するアプローチを使用することも検討した。特に、ＨＳＣの自己再生能を改善するため又はそれらの運命決定を調節するためのストラテジーには大きな臨床的魅力がある（（Ｇａｌｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １４，２９８８−３０００（２０１６）；Ｒｅｎｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３２，５０８−５１１（２０１６））。養子免疫Ｔ細胞療法の分野では、寿命及び／又はインビボ有効性を改善したリンパ球を製造するための補助剤として薬理活性化合物が試験中であるが、同様に、ライブラリーの高スループットスクリーニングにより、幹細胞拡大を改変することができる低分子も同定されている（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｗ  ＆  Ｒｉｔｚ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １８，１０−１２（２０１６））。しかし、多くの化合物は、タンパク質機能を阻害することしかできず、所望の標的に対するそれらの特異性については疑わしいことが多い（Ｓｃｈｅｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ９，２３２−２４０（２０１３））。また、低分子を使用して各種タンパク質を調節することはできない。それに比べ、標的化ｍＲＮＡナノ担体は、ほぼあらゆる公知タンパク質（又はタンパク質組合せ）の発現を選択的に誘導することができる。更に、ナノ担体に担持させるヌクレオチドは公開されている配列に基づいて容易に作製することができる。
【０２６３】
要するに、実施例１は、単一のナノ粒子試薬を白血球培養物に添加するだけで「ヒットエンドラン」遺伝子改変を使用してＴ細胞を治療目的用に効率的にリプログラムできることを実証する。このプラットフォームは、特殊な装置や訓練を必要としないため、製造が複雑にならない。したがって、臨床規模での遺伝子細胞治療薬の製造を実質的に合理化することができ、遺伝子工学的に作製したＴ細胞による患者の治療をより低コストでより広く適用できるようになる。
【０２６４】
当分野における通常の知識を有する者に自明の通り、本願に開示する各実施形態は、明記しているその特定の要素、工程、成分又はコンポーネントを含むことができ、あるいは本質的にこれらから構成することができ、あるいはこれらから構成することができる。本願で使用する前半部と後半部を繋ぐ用語である「含む」とは、包含するが、限定されないという意味であり、具体的に記載していない要素、工程、成分又はコンポーネントを包含することも許容しており、その量は多量であってもよい。前半部と後半部を繋ぐ用語である「〜から構成される」とは、具体的に記載していない要素、工程、成分又はコンポーネントを除外する。前半部と後半部とを繋ぐ用語である「本質的に〜から構成される」とは、実施形態の範囲を、具体的に記載している要素、工程、成分又はコンポーネントと、この実施形態に重大な影響を与えない要素、工程、成分又はコンポーネントとに制限するものである。本願で使用する重大な影響とは、選択された細胞種を本願に開示するナノ担体に４８時間暴露後にこのナノ担体が選択された細胞種の表現型を変化させる能力に、統計的に有意な低下を生じるものである。
【０２６５】
特に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用する成分の量、分子量等の性質、反応条件等を表す全数値はいずれの場合も、「約」なる用語が付いていると理解すべきである。したがって、特に指定しない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載する数値パラメータは概数であり、本発明により獲得しようとする所望の性質に応じて変動することができる。特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではないが、最低限でも、各数値パラメータは少なくとも報告する有効数字を踏まえて通常の丸め方を適用することにより解釈すべきである。更に明瞭にする必要がある場合には、「約」なる用語は明記する数値又は範囲と共に使用するときに当業者が妥当に割り当てる意味であり、即ち記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％、又は記載値の±１％の範囲内までで記載値又は範囲よりも多少大きいか又は多少小さい数値又は範囲を意味する。
【０２６６】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるが、具体例に記載する数値は可能な限り正確に報告する。但し、如何なる数値もその夫々の試験測定値に存在する標準偏差により必然的に生じる所定の誤差を内在的に含む。
【０２６７】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用する不定冠詞、定冠詞及び同類の指示語は本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、単数と複数の両方に対応すると解釈すべきである。本願で数値範囲を記載する場合には、その範囲内に該当する個々の数値を個別に表す省略法として利用する目的に過ぎない。本願で特に指定しない限り、個々の数値を本願に個別に記載しているものとして本明細書に組み入れる。本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、本願に記載する全方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本願に記載するありとあらゆる例又は例示的文言（例えば「等の」）の使用は、本発明をより明瞭にする目的に過ぎず、それ以外の内容で請求されている本発明の範囲に制限を加えるものではない。本明細書中の如何なる文言も本発明の実施に不可欠な請求外の要素を表すと解釈すべきではない。
【０２６８】
本願に開示する発明の択一的要素又は実施形態のグループを、制限として解釈すべきではない。各グループメンバーを個々に又はそのグループの他のメンバーもしくは本願に記載する他の要素とのあらゆる組合せにおいて、言及及び請求することができる。便宜及び／又は特許性の理由からあるグループの１以上のメンバーをあるグループに組み入れることもできるし、削除することもできる。このような組み入れ又は削除が行われる場合には、明細書は変更後のグループを含むものとみなされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用される全マーカッシュグループの文言を満足する。
【０２６９】
本発明を実施するために本発明者が知る限り最良の実施形態を含めて、本願には、本発明の所定の実施形態を記載する。当然のことながら、記載するこれらの実施形態の変形も上記記載を通読後に当分野における通常の知識を有する者に容易に理解されよう。本発明者は、当業者がこのような変形を適宜利用するものと予想し、また、本発明者は、本願に具体的に記載する以外の方法で本発明が実施されることも想定している。したがって、準拠法により許可される範囲において本発明は添付の特許請求の範囲に記載する主題の全変形及び均等物を包含する。更に、本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、上記要素のあらゆる組合せを可能な全てのその変形として本発明に包含する。
【０２７０】
更に、本明細書では随所で特許及び出版物を多数引用している。上記引用文献及び出版物は各々その特定の引用教示を個々に本願に援用する。
【０２７１】
終わりに、当然のことながら、本願に開示する発明の実施形態は本発明の原理を例証するものである。利用できる他の変形も本発明の範囲に含まれる。要するに、限定するものではないが、例えば本発明の代替構成も本願の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は厳密に図示及び記載通りの内容に制限されない。
【０２７２】
本願に示す詳細事項は例示であり、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明する目的に過ぎず、本発明の種々の実施形態の原理と概念的側面の最も有用で理解し易い説明であると考えられるものを提供するために提示するに過ぎない。この点については、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細に本発明の構成内容を示そうとするものではなく、本発明の複数の形態を実際にどのように具体化できるかは説明を図面及び／又は実施例と勘案することにより当業者に容易に理解されよう。
【０２７３】
以下の実施例で明瞭・明白に変更されている場合又はその意味を適用すると構文の意味が通らない場合もしくは本質的に意味が通らない場合を除き、本開示で使用する定義及び説明は、後続する全構文に適用されるものとする。用語の構文で意味が通らない場合又は本質的に意味が通らない場合には、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ又はＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）等の当分野における通常の知識を有する者に公知の辞書から定義を参照されたい。
【図１Ａ】
2019511234.tif 000005
【図１Ｂ】
2019511234.tif 000006
【図１Ｃ】
2019511234.tif 000007
【図２】
2019511234.tif 000008
【図３Ａ】
2019511234.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2019511234.tif 000011
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2019511234.tif 000013
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
2019511234.tif 000019
【図７Ｂ】
2019511234.tif 000020
【図７Ｃ】
2019511234.tif 000021
【図７Ｄ】
2019511234.tif 000022
【図７Ｅ】
2019511234.tif 000023
【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2019511234.tif 000025
【図７Ｈ】
2019511234.tif 000026
【図８Ａ】
2019511234.tif 000027
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
2019511234.tif 000033
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2019511234.tif 000038
【図１１−１】
2019511234.tif 000039
【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
2019511234.tif 000046
【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１１−１１】
2019511234.tif 000049
【図１１−１２】
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【図１１−１３】
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【図１１−１４】
2019511234.tif 000052
【図１１−１５】
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【配列表】
2019511234000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月12日(2019.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血系由来の選択された細胞集団を選択的に改変する方法であって、
（ａ）電荷駆動自己集合法を利用して、細胞を標的とした合成ナノ担体を形成する工程であって、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）を含む工程、
（ｉ）造血系由来の選択された細胞集団に特異的に結合する、選択された細胞ターゲティングリガンドに結合したポリグルタミン酸（ＰＧＡ）を、正電荷をもつポリマー担体の内側に封入された核酸を含む溶液に添加する工程及び
（ｉｉ）溶液をインキュベートし、ここで添加から５分以内に、細胞を標的とした合成ナノ担体が形成する工程であって、合成ナノ担体は、以下の（Ａ）−（Ｃ）を含む工程、
（Ａ）正電荷をもつポリマー担体の内側に封入された核酸、
（Ｂ）正電荷をもつポリマー担体の外表面上のＰＧＡを含む、中性又は負電荷をもつコーティング、及び
（Ｃ）中性又は負電荷をもつコーティングの外表面から突き出した、選択された細胞ターゲティングリガンドであって、中性又は負電荷をもつコーティング内のＰＧＡに結合された細胞ターゲティングリガンド、及び
（ｂ）形成された、細胞を標的とした合成ナノ担体を、造血系由来の選択された細胞集団を含むエクソビボ細胞の不均一混合物に投与し、それにより、造血系由来の選択された細胞集団を選択的に改変する工程を含む、方法。
【請求項２】
正電荷をもつポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＧＡが、約１５ｋＤａのＰＧＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
エクソビボ細胞の不均一混合物が、無血清培地中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸が、配列番号１で表されるｍｅｇａＴＡＬ又は配列番号３７で表されるヒト化キメラ抗原受容体をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
核酸が合成ｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
合成ｍＲＮＡが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、ｍｅｇａＴＡＬｓ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
合成ｍＲＮＡが、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
造血系由来の選択された細胞集団が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞又は造血幹細胞から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４結合ドメイン又はＣＤ８結合ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
投与前に、不均一混合物内における、他の細胞に対する選択された細胞集団の百分率を増加させる細胞選択工程又は精製工程を行わない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
電荷駆動自己集合法を利用して、細胞を標的とした合成ナノ担体を形成する方法であって、
（ｉ）正電荷をもつポリマーを含む溶液にｍＲＮＡを添加し、室温で約５分間インキュベートする工程、及び
（ｉｉ）溶液へ、選択された細胞ターゲティングリガンドに結合したＰＧＡを加え、室温で約５分間インキュベートし、それにより、電荷駆動自己集合法を利用して、細胞を標的とした合成ナノ担体を形成する工程を含み、
該細胞を標的とした合成ナノ担体は、
正電荷をもつポリマー担体内に封入されたｍＲＮＡ、
正電荷をもつポリマー担体の外表面上にＰＧＡを含む、中性又は負電荷をもつコーティング、及び
中性又は負電荷をもつコーティングの外表面から突き出した、選択された細胞ターゲティングリガンドであって、中性又は負電荷をもつコーティングの内のＰＧＡに結合された細胞ターゲティングリガンド、を含む合成ナノ担体である工程、
を含む、方法。
【請求項１３】
正電荷をもつポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＧＡが、約１５ｋＤａのＰＧＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
核酸が、配列番号１で表されるｍｅｇａＴＡＬ又は配列番号３７で表されるヒト化キメラ抗原受容体をコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
核酸が合成ｍＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
合成ｍＲＮＡが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、ｍｅｇａＴＡＬｓ及び／又はジンクフィンガーヌクレアーゼから選択される遺伝子編集剤をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
合成ｍＲＮＡが、ＦＯＸＯ１、ＬＫＢ１、ＴＣＦ７、ＥＯＭＥＳ、ＩＤ２、ＴＥＲＴ、ＣＣＲ２ｂ及び／又はＣＣＲ４から選択される、表現型を変化させるタンパク質をコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
選択された細胞ターゲティングリガンドが、リンパ球受容体リガンド、リンパ球受容体抗体、リンパ球受容体ペプチドアプタマー、リンパ球受容体核酸アプタマー、リンパ球受容体スピエゲルマーから選択される結合ドメインを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
選択された細胞ターゲティングリガンドが、ＣＤ４抗体又はＣＤ８抗体から選択される結合ドメインを含む、請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
2019511234.tif 000054
2019511234.tif 000055