(57)【要約】【課題】組織検体のリアルタイム光学撮像のための装置及び方法を提供する。【解決手段】本装置は、照明光源を使用し、分光チャネルを通して組織検体の画像を取得するように、かつ光学的深部断面可視化を実行するように構成された主撮像システムと、組織検体の補助画像を取得するように構成された補助撮像システムと、内部に透明窓を有し、窓、検体ホルダは位置センサを含み、検体面において移動可能に構成された検体ホルダと、ユーザ入力を受け取るように、かつ検体ホルダがユーザ入力に応じてリアルタイムに移動するように構成されたユーザ入力装置と、主撮像システムにより取得される連続的な画像、補助画像、及び少なくとも１つの検体ホルダ位置に対して一連の命令を実行して検体中の細胞核の表示画像を含む組織検体の合成表示画像を生成するように構成された処理装置と、組織検体の合成表示画像をリアルタイム表示するように構成された表示装置とを備える。【選択図】図１
2019511736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織検体のリアルタイム光学撮像のための装置であって、
照明光源を使用して、１つ以上の分光チャネルを通して、組織検体の画像を取得するように構成されている主撮像システムであって、前記１つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つは、前記照明光源の波長範囲とは異なる波長範囲を検出するように構成されており、前記主撮像システムは、フレーム取得速度を有する倒立顕微鏡であり、光学的深部断面可視化を実行するように構成されており、前記主撮像システムは、連続的な画像を取得するように構成されている主撮像システムと、
補助撮像システムであって、前記補助撮像システムは、前記組織検体の補助画像を取得するように構成されており、前記補助画像の領域は、前記主撮像システムにより取得された前記連続的な画像の各画像の領域より大きい補助撮像システムと、
内部に透明窓を有する検体ホルダであって、前記検体ホルダは、前記主撮像システムの焦点面に一致する検体面に配設され、前記検体ホルダは、前記透明窓上に前記組織検体を保持するように構成されており、前記検体ホルダは、１つ以上の位置センサを含み、前記検体ホルダは、前記検体面において移動可能なように構成されており、前記１つ以上の位置センサは、検体ホルダ位置を測定するように構成されており、前記検体ホルダは、前記補助撮像システムの焦点面に対して移動可能なように構成されている検体ホルダと、
ユーザ入力を受け取るように構成されているユーザ入力装置であって、前記検体ホルダは、前記ユーザ入力に応じてリアルタイムに移動するように構成されているユーザ入力装置と、
前記主撮像システム、前記補助撮像システム、及び前記位置センサと電気的に通信する処理装置であって、前記処理装置は、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像、前記補助画像、及び少なくとも１つの検体ホルダ位置に対して一連の命令を実行して、前記検体中の細胞核の表示画像を含む前記組織検体の合成表示画像を生成するように構成されている処理装置と、
前記処理装置と電気的に通信する表示装置であって、前記組織検体の前記合成表示画像をリアルタイムに表示するように構成されている表示装置と、
を備える装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置において、前記細胞核の表示画像が、仮想透過照明顕微観察を含む装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置において、前記主撮像システムが、多光子、共焦点、光シート、紫外表面励起、又は構造化照明顕微鏡である装置。
【請求項４】
請求項２に記載の装置において、前記主撮像システムが、２つ以上の交換可能な対物レンズを備える装置。
【請求項５】
請求項２に記載の装置において、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像の各画像が、２つ以上の分光チャネルを通して取得され、
前記２つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つが、核造影剤により発光される光を検出するように構成されており、前記２つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つが、補完的な造影源から発光される光を検出するように構成されている装置。
【請求項６】
請求項２に記載の装置において、前記検体ホルダが、前記検体ホルダの移動のための１つ以上のアクチュエータを更に備える装置。
【請求項７】
請求項２に記載の装置において、前記ユーザ入力装置が、ジョイスティック、ノブ、ダイヤル、キーボード、又は他のデジタル入力装置である装置。
【請求項８】
請求項２に記載の装置において、前記ユーザ入力装置が、前記ユーザから前記検体ホルダへ力を伝達して前記検体ホルダを移動させる機械的伝達装置を含む装置。
【請求項９】
請求項２に記載の装置において、前記補助撮像システムが、光センサの一次元デジタル配列を有する装置。
【請求項１０】
請求項２に記載の装置において、前記補助撮像システムが、２つ以上の分光チャネルを有する装置。
【請求項１１】
請求項１０に記載の装置において、前記処理装置が、前記補助撮像システムの前記２つ以上の分光チャネルを比較して、前記組織サンプルにおける手術用インク、縫合糸、又は外在性マークの位置を特定するように構成されている装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置において、前記組織検体の前記合成表示画像は、前記組織検体における前記手術用インク、縫合糸、又は外在性マークの１つ以上の位置を含む装置。
【請求項１３】
請求項２に記載の装置において、前記補助撮像システムが、狭帯域照明器を備える装置。
【請求項１４】
請求項２に記載の装置において、前記検体ホルダが、取り外し可能な透明窓を更に備える装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載の装置において、前記取り外し可能な透明窓が、前記透明窓を囲む流体保持構造を含む装置。
【請求項１６】
請求項２に記載の装置において、前記検体ホルダが、検体仕切りを更に備える装置。
【請求項１７】
請求項２に記載の装置において、前記検体ホルダが、蓋を更に備える装置。
【請求項１８】
請求項２に記載の装置において、前記補助撮像システムが、照明光源を更に備える装置。
【請求項１９】
請求項１８に記載の装置において、前記照明光源が、前記蓋に取り付けられるように構成されている装置。
【請求項２０】
請求項１７に記載の装置において、前記蓋が、前記組織検体を前記透明窓に対して保持するように構成された検体ガイドを更に備える装置。
【請求項２１】
請求項２に記載の装置において、前記透明窓が、ガラス、溶融水晶、シリカ、又はフッ化カルシウムを含む装置。
【請求項２２】
請求項２に記載の装置において、前記処理装置が、並列処理のためのハードウェアを有するグラフィック処理装置を更に備え、更に、前記グラフィック処理装置が、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像に対する一連の並列処理動作のためのコンピュータ実行可能な命令を含む装置。
【請求項２３】
請求項２に記載の装置において、前記処理装置が、前記検体ホルダの２５０ミリ秒未満の移動後に、前記組織検体の合成表示画像を更新するように構成されている装置。
【請求項２４】
請求項２２に記載の装置において、前記グラフィック処理装置が、仮想透過照明顕微観察処理のための一連の並列処理動作のためのコンピュータ実行可能な命令を含む装置。
【請求項２５】
請求項５に記載の装置において、前記処理装置が、以下の非線形プロセス：
Ｒ＝（１／（１−ｅｘｐ（−ｋ））＾２）＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，Ｒｅｄ＊Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，Ｒｅｄ＊Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））
Ｇ＝（１／（１−ｅｘｐ（−ｋ））＾２）＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｇｒｅｅｎ＊Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｇｒｅｅｎ＊Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））
Ｂ＝（１／（１−ｅｘｐ（−ｋ））＾２）＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｂｌｕｅ＊Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｂｌｕｅ＊Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））
（式中、Ｒ、Ｇ、及びＢは、それぞれ、前記仮想透過照明画像の赤色、緑色、及び青色の強度であり、Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，Ｒｅｄ、Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｇｒｅｅｎ、及びＢ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｂｌｕｅは、赤色、緑色、及び青色それぞれの光についてのヘマトキシリンの吸光度であり、Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，Ｒｅｄ、Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｇｒｅｅｎ、及びＢ＿Ｅｏｓｉｎ，ｂｌｕｅは、赤色、緑色、及び青色それぞれの光についてのエオシンの吸光度であり、Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒは細胞核又は細胞核成分に対する発色特異性を有する前記造影剤の強度であり、Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙは前記補完的な造影源の強度であり、ｋは任意のスケール定数である。）
を使用した、前記連続的な画像に対する仮想透過照明顕微観察処理のためのコンピュータ実行可能な命令を含む装置。
【請求項２６】
請求項２に記載の装置において、前記組織検体の前記合成表示画像が、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像からの各画像に対して、
前記連続的な画像からの前記画像の表示画像、及び
前記連続的な画像からの前記画像が取得された前記検体ホルダ上の位置を示す前記補助画像のサブ領域を有する補助画像の表示画像であって、前記補助画像の前記サブ領域が、前記１つ以上の位置センサからの１つ以上の検体ホルダ位置を使用して計算される表示画像を含む装置。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の装置と、
前記主撮像システムにより発光される光を吸収する主蛍光核造影剤とを含み、
前記主蛍光核造影剤の蛍光発光波長は、前記分光チャネルの少なくとも１つに対応するキット。
【請求項２８】
請求項２７に記載の装置において、前記主蛍光核造影剤の前記蛍光発光波長とは異なる蛍光発光波長を有する二次蛍光造影剤を更に含み、
前記二次蛍光造影剤が、細胞質、間質、コラーゲン、又は筋肉から選択される構造に対する発色特異性を有する装置。
【請求項２９】
請求項２８に記載の装置において、前記二次蛍光造影剤がエオシン−Ｙである装置。
【請求項３０】
請求項２８に記載の装置において、前記主蛍光造影剤又は前記二次蛍光造影剤のうちの少なくとも一方が可溶性である流体媒体を更に含む装置。
【請求項３１】
請求項２７に記載の装置において、前記装置が、識別子リーダを更に含み、前記キットが、識別子を更に含む装置。
【請求項３２】
組織検体をリアルタイム光学撮像する方法であって、
１つ以上の蛍光造影剤を組織検体に適用するステップであって、前記１つ以上の蛍光造影剤の少なくとも１つは核造影剤である、ステップと、
装置を提供するステップであって、当該装置は
照明光源を使用して、１つ以上の分光チャネルを通して、組織検体の画像を取得するように構成されている主撮像システムであって、前記１つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つは、前記照明光源の波長とは異なる範囲の波長を検出するように構成されており、前記主撮像システムは、フレーム取得速度を有する倒立顕微鏡であり、光学的深部断面可視化を実行するように構成されており、前記主撮像システムは、連続的な画像を取得するように構成されている主撮像システムと、
補助撮像システムであって、前記補助撮像システムは、前記組織検体の補助画像を取得するように構成されており、前記補助画像の領域は、前記主撮像システムにより取得された前記連続的な画像の各画像の領域より大きい補助撮像システムと、
内部に透明窓を有する検体ホルダであって、前記検体ホルダは、前記主撮像システムの焦点面に一致する検体面に配設され、前記検体ホルダは、前記透明窓上に前記組織検体を保持するように構成されており、前記検体ホルダは、１つ以上の位置センサを含み、前記検体ホルダは、前記検体面において移動可能なように構成されており、前記１つ以上の位置センサは、検体ホルダ位置を測定するように構成されており、前記検体ホルダは、前記補助撮像システムの焦点面に対して移動可能なように構成されている検体ホルダと、
ユーザ入力を受け取るように構成されているユーザ入力装置であって、前記検体ホルダは、前記ユーザ入力に応じてリアルタイムに移動するように構成されているユーザ入力装置と、
前記主撮像システム、前記補助撮像システム、及び前記位置センサと電気的に通信する処理装置であって、前記処理装置は、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像、前記補助画像、及び少なくとも１つの検体ホルダ位置に対して一連の命令を実行して、細胞核の表示画像を形成し、前記組織検体の合成表示画像を生成するように構成されている処理装置と、
前記処理装置と電気的に通信している表示装置であって、前記表示装置は、前記組織検体の前記合成表示画像をリアルタイムに表示するように構成されている表示装置とを備えているステップと、
前記組織検体を、前記検体ホルダに載置するステップと、
前記検体ホルダを、前記補助撮像システムの前記焦点面に位置合わせするステップと、
前記補助撮像システムに、前記補助画像を取得させるステップと、
前記検体ホルダを、前記主撮像システムの前記焦点面に位置合わせするステップと、
前記主撮像システムに、前記連続的な画像を取得させるステップと、
処理装置に、前記組織検体内の細胞核を検出させ、前記組織検体の合成表示画像を生成させるステップと、
前記表示装置に、前記組織検体の前記合成表示画像をリアルタイムに表示させるステップと、
前記検体ホルダに、前記ユーザ入力装置を使用して、前記検体面において移動させるステップと、
を含む方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法において、前記連続的な画像を取得することが、多光子、共焦点、光シート、紫外表面励起、又は構造化照明顕微観察を使用することを含む方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法において、前記主撮像システムが、スキャンされる領域を変えることにより倍率を調節するように構成されており、前記方法が、前記主撮像システムの倍率を調節することを更に含む方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の方法において、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像の各画像が、２つ以上の分光チャネルを通して取得され、
前記２つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つが、前記核造影剤により発光される光を検出し、前記２つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つが、補完的な造影源から発光する光を検出する方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法において、前記核造影剤が、急速拡散剤である方法。
【請求項３７】
請求項３２に記載の方法において、前記核造影剤が、細胞核と会合することにより蛍光発光が増大する剤である方法。
【請求項３８】
請求項３２に記載の方法において、前記検体ホルダが、取り外し可能な窓を含み、前記方法が、
前記透明窓を前記検体ホルダから取り外すステップと、
１つ以上の組織検体を前記透明窓上に載置するステップと、
前記透明窓を前記検体ホルダに戻すように挿入するステップと、
を更に含む方法。
【請求項３９】
請求項３２に記載の方法において、前記検体ホルダが、２つ以上の組織検体を隔離するように構成されている検体仕切りを含む方法。
【請求項４０】
請求項３２に記載の方法において、前記検体ホルダが、蓋を含み、前記方法が、前記組織検体を前記蓋により覆うことを更に含む方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法において、前記蓋が、検体ガイドを含み、前記方法が、前記組織検体を前記透明窓に対して、前記検体ガイドを使用して圧迫することを更に含む方法。
【請求項４２】
請求項３２に記載の方法において、医療的処置の間に作製される前記組織検体における手術用インク、縫合糸、又は外在性マークを、前記補助画像を使用して特定することを更に含む方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法において、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像のうちの任意の１つにおける選択位置と、前記組織検体における前記手術用インク、縫合糸、又は外在性マークとの間の距離を、前記補助画像の表示画像を使用して測定することを更に含む方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法において、前記組織検体を、狭帯域照明により照明することと、手術用インク、縫合糸、又は外在性マークを、既知の吸収スペクトルから特定することとを更に含む方法。
【請求項４５】
請求項４２に記載の方法において、前記組織検体を、前記照明光源により透過照明することと、手術用インク、縫合糸、又は外在性マークを特定することとを更に含む方法。
【請求項４６】
請求項３２に記載の方法において、前記処理装置に、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像、前記検体ホルダ位置、前記補助画像、又は前記合成表示画像のうちの少なくとも１つを記録させることを更に含む方法。
【請求項４７】
請求項３２に記載の方法において、グラフィック処理装置に、前記連続的な画像に対する一連の並列処理動作のためのコンピュータ実行可能な命令を実行させることを更に含む方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法において、前記グラフィック処理装置が、仮想透過照明顕微観察処理のための一連の並列処理動作のためのコンピュータ実行可能な命令を含む方法。
【請求項４９】
請求項３２に記載の方法において、前記処理装置に、前記組織検体の前記合成表示画像を生成させることを更に含み、前記合成表示画像が、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像からの各画像に対して、
前記連続的な画像からの前記画像の表示画像、及び
前記連続的な画像からの前記画像が取得された前記検体ホルダ上の位置を示す前記補助画像のサブ領域を有する前記補助画像の表示画像であって、前記補助画像の前記サブ領域が、１つ以上の検体ホルダ位置を使用して計算される表示画像を含む方法。
【請求項５０】
底壁及び検体保持構造を有する開口端容器と、
前記開口端容器を閉じるように構成された検体カバーと、
前記開口端容器及び前記検体カバーを連結するように構成された検体カバーコネクタと、
透明窓と、
前記底壁又は前記検体カバーと前記透明窓とを連結するように構成された透明窓コネクタと、
前記開口端容器、前記透明窓、又は前記検体カバーの１つまたは複数における複数の穿孔と、
を備える、組織学用検体カセット装置。
【請求項５１】
請求項５０に記載の装置において、前記検体カバーコネクタが、ノッチ、タブ、ヒンジ、又は磁石の1つまたは複数である装置。
【請求項５２】
請求項５０に記載の装置において、前記検体保持構造が、外側表面を有する傾斜壁を備える装置。
【請求項５３】
請求項５０に記載の装置において、前記透明窓が、ガラス、溶融水晶、シリカ、又はフッ化カルシウムを含む装置。
【請求項５４】
請求項５０に記載の装置において、前記透明窓が、透明なプラスチックを含む装置。
【請求項５５】
請求項５０に記載の装置において、前記透明窓コネクタが、キシレン、アルデヒド、及びアルコールに耐性を有する装置。
【請求項５６】
請求項５０に記載の装置において、前記透明窓コネクタが、耐溶媒性接着剤を含む装置。
【請求項５７】
請求項５０に記載の装置において、前記透明窓コネクタが、組織学用処理溶媒に耐性を有する装置。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１６年２月１２日付けで出願された米国仮出願第６２／２９４，４７３号の利益を主張する。上記出願の教示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【政府支援の陳述】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所からのＲ０１−ＣＡ１７８６３６の下で米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
手術病理学は、医学的状態を処置するために手術中に患者から取り出された組織の評価に関する医学分野である。多くの外科手術において、手術中に取り出された組織について、更なる治療又は手術が必要となり得る病理の存在を顕微観察で評価する必要がある。顕微観察で評価される多くの組織は、ホルムアルデヒド又は他の固定剤により保存され、パラフィン又は類似する媒体内に包埋され、ついで、染色又は他の方法で標識された光学的に薄い切片に切断される。評価は、最も一般的には、検体を通過した光の吸収により画像が生成される透過照明顕微鏡によって行われる。組織を切断して染色するために広範囲に渡る化学処理が必要なことから、この評価方法は時間がかかり、かつ、コストが高くなり、又は場合によって非実用的なほどに、外科手術を遅延させるおそれがある。
【０００４】
冗長な処理のために、多くの種類の手術において組織学的評価が妨げられることにより、ガン又は他の病理（乳ガンを含む）の摘出を受ける患者は、病理組織の完全な除去を達成するために、複数回の手術が必要となる場合がある。例えば、乳房のガン腫についての乳房温存手術において、大部分の患者は、手術の終了後、切除された組織の表面に微小領域のガン腫の存在が発見されたことにより、疾患を完全に処置するために、２回目の手術が必要となる場合がある。手術中撮像技術、例えば、モース顕微鏡手術（ＭＭＳ）によれば、組織を凍結させ、薄い切片に切断し、次いで染色し、切片を従来の透過照明病理顕微鏡において評価して、摘出の妥当性を判定することによって、２回目の手術の割合を低下させることができる。これらの技術は、乳ガンを含む多くのガンの処置に適用するには、時間がかかり、感度が不十分である。代替的に、標準的なパラフィン包埋組織病理学（ＰＥＨ）は、費用対効果及び感度の両方が高いが、多くの手術ケースに適用するには、時間がかかり過ぎる（固定及びパラフィン包埋に１日近くの処理時間がかかる）。したがって、病理の存在について組織を評価する代替的な装置及び方法が必要である。
【０００５】
ＭＭＳ及びＰＥＨ等の処理には、長い処理時間がかかる。その主な理由は、染色、スライド上への載置、および透過照明病理顕微鏡による撮像が可能な薄い（典型的には、５ミクロンオーダーの）スライスに組織を物理的に切断する必要があるためである。透過照明顕微鏡観察では、検体を透過する光を利用しており、この透過光が、他の色に対して特定の色を減衰させることにより画像を生じさせる染料によって吸収される。このような透過光を利用するため、切断処理が必要となる。得られた色画像は、より大きい組織検体内で切断された１つの画像面を表わし、熟練の病理医による、病理の兆候（例えば、大きい又は不規則な形状の細胞又は細胞核）についての、組織又は個々の細胞の検査による診断に使用される。一般的には、この画像は、Ｈ＆Ｅ染料により生成される。同染料は、主に細胞核を紫色に染色する染料であるヘマトキシリンと、多くの他の組織組成成分、例えば、細胞質、間質、及びコラーゲンをピンク色にする対比染色染料であるエオシンとから構成される。この処理を機能させるために、光が検体を透過するのに十分な薄さに切断する必要があり、より大きい検体から面を物理的に切断することにより、１つの画像面を効果的に形成する。乳ガンの場合、診断は、主に、細胞核の外観、配向、及び密度に基づいて行われる。
【０００６】
検体調製時間を短縮するために、光学的深部断面可視化が過去に提案された。光学的深部断面可視化では、高度な顕微観察技術が、損傷していない、より大きな３次元検体内の１つの２次元面を選択的に撮像するのに使用される。これらの技術は、ＰＥＨ及びＭＭＳに関連する冗長な物理的切断処理を、光学的方法を使用して、１つの面を選択的に撮像することによって回避する。したがって、これらの技術を撮像時間の最短化が重要である場合に使用し得る。装置及び方法の中で、ガイドのための低倍率撮像と組み合わせた大きい検体の光学的な断面可視化による反射共焦点撮像が、主に、皮膚ガン等の用途について提案されてきた。しかし、反射共焦点のみでは、細胞核を画像化するのに必要な分子造影を提供できないため、診断の評価基準が細胞核の位置、組織化、及び外観の検査に決定的に依存する多くの手術病理用途（乳房温存手術を含む）における診断には使用できない。全視野光干渉断層撮影（full field optical coherence tomography）等の技術に基づく他の方法が提案されてきたが、これらも核を解像する能力を欠いている。
【０００７】
光学的断面可視化画像を生成し得る顕微観察技術の多くは、透過光の吸収によって画像を生成するわけではないので、本質的に、従来の透過照明顕微観察に類似する画像を生成しない。したがって、これらの方法により生成される画像の解釈は、従来の透過照明顕微観察に精通した病理医及び外科医の大部分にとって、困難であるか又は分かりにくい。透過照明と異なり、多くの光学的断面可視化技術は、照明及び撮像の両方が検体の同じ面からなされる落射照明モードにおいて作用する。更に、多くの光学的断面可視化技術は、検体により反射される光の総出力（反射共焦点顕微観察又は光干渉断層撮影）又は照明波長に対する検体から戻ってくる光（例えば、蛍光、第二高調波発生、又はラマン散乱）の波長のスペクトルシフトに基づいて画像を生成する。いずれの場合も、対象となる物質が存在する場合、より明るい画像が生成され、そうでなければより暗い画像が生成される。しかし、従来の透過照明顕微観察に存在する診断的特徴を、組織からコンピュータを用いる方法を使用して正確に再現し得る仮想透過照明画像を生成できることが証明されてきた。これらの方法は、仮想透過照明顕微観察（Virtual Transillumination Microscopy:ＶＴＭ）と呼ばれ、既存の病理学技術に精通した病理医が、核及び他の細胞成分を示す画像を生成することにより、Ｈ＆Ｅスライドを備えた透過照明顕微鏡における場合と同様に、より素早く診断を行うことを可能にする。ただし、ＶＴＭ法を手術病理撮像用の装置及び方法に適用することはほとんど注目されていないため、外科手術用途には普及していない。
【０００８】
更なる問題は、多くの手術切除サンプルのサイズが大きいこと、及び手術中にそれを評価するための時間が限られていることに関する。顕微観察評価は限られた視野での高倍率撮像を必要とするため、大きな手術サンプルにおける病理領域に位置合わせするのには、時間がかかる場合がある。例えば、共焦点撮像に使用される典型的な２０×倍率画像は、１平方ミリメートル未満をカバーできるが、典型的な乳房切除サンプルは、１０，０００平方ミリメートル超の表面積を有する場合がある。しかし、時間当たりの手術費用は高額であり、かつ患者が手術中に適切に維持され得る時間の最大値が存在するので、非常に大きい切除サンプル全体の広範囲な撮像は非実用的である。残念ながら、以前に提案された多くの手術撮像の装置及び方法は、大きなサイズの検体にとっては非実用的に遅いプロセス、すなわち表面全体を高解像で広範囲に撮像でき、多くの個々の画像のモザイクを繋ぎ合わせ、次いで診断用のモザイク画像を使用できることに依存する。
【０００９】
現在手術病理学に使用されている方法では、典型的には、切除中又は切除後であって組織学的検査前に、組織学的評価をガイドするために検体に付された種々のマーク、例えば、縫合糸又は着色インクを利用する。これらのマークは、多くの場合、組織を、この組織が抽出された手術腔に対して配向させること、および組織の組織学的に適切な面の位置を示すことの両方に使用される。例えば、乳房温存手術により処置される乳ガンにおいて、切除された組織は、患者から取り出され、最大６種類の色により着色される。各色は、検体の異なる面（側面）を示す。着色後に、検体は、組織学的に適切な外科的縁を示す縁において着色面を有する複数の薄いスライスに切断される。切断処理により、組織検体の元の形状が失われるが、スライスの縁に存在する着色インクを参照することにより、熟練の病理医であれば、組織の元の表面と位置合わせし、切除の外科的縁に対する任意の病理の近さを評価できる。病理が切除縁に存在するか、又は切除縁に近過ぎる場合、外科的縁は不十分であり、更なる手術切除が必要となると考えることができ、切除位置は、インクの色に基づいてガイドされる。着色法はまた、基底細胞ガンなどの皮膚の悪性腫瘍のための多くの処置を含む他の手術に使用される。その結果として、手術病理を評価するために使用される撮像システムは、縫合糸、手術用インク、又は他の外在性マークの位置を評価するための方法及び装置を含むことが不可欠である。しかし、縫合糸、手術用インク、又は他の外在性マークを撮像することは、蛍光撮像、反射共焦点撮像、又は光干渉断層撮影下では困難であるか又は不可能であり、関連しない撮像領域を避けつつ、診断上関連する領域にリアルタイムにユーザをガイドするために使用し得る他の方法、例えば、白色光撮像又は狭帯域撮像が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、一般的には、手術病理撮像の分野に関する。具体的には、本発明は、倒立顕微鏡を使用して、切除された手術組織をリアルタイムに病理評価するための装置及び方法に関する。
【００１１】
正常な、すなわち診断上無関係な組織のより大きな領域に埋まっている、病理の分離された領域又は焦点領域を含む可能性のある組織の大きな領域を迅速に評価することが可能なシステムが必要とされる。このようなシステムは、局所的な病理の存在について数千平方ミリメートルをリアルタイムに評価でき、ついで、ユーザ入力に応じてリアルタイムに焦点病理の高解像ＶＴＭ画像を提供でき得る。本明細書で記載されたシステム及び方法は、物理的に切片化することなく、大きな検体領域の組織学的分析、多くの外科的縁上での組織学的に正常な大きな領域の存在の組織学的分析、評価をガイドするための手術用マークの特定、及び、核の素早く効率的な可視化を可能にする特徴の組み合わせを含む。本明細書で開示されたシステム及び方法は、インク、手術用マーク、及び著しく明らかな病理領域を特定するために、細胞核用の蛍光造影剤、細胞解像光学的断面可視化蛍光撮像、リアルタイムガイド及びＶＴＭレンダリングを可能にする低遅延処理、並びに低倍率での巨視的な組織機構の同時撮像を含み得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の例示となる実施形態では、本発明は、組織検体のリアルタイム光学撮像のための装置である。本装置は、照明光源を使用して、１つ以上の分光チャネルを通して、組織検体の画像を取得するように構成されている主撮像システムであって、前記１つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つは、前記照明光源の波長範囲とは異なる波長範囲を検出するように構成されており、前記主撮像システムは、フレーム取得速度を有する倒立顕微鏡であり、光学的深部断面可視化を実行するように構成されており、前記主撮像システムは、連続的な画像を取得するように構成されている、主撮像システムと、補助撮像システムであって、前記補助撮像システムは、前記組織検体の補助画像を取得するように構成されており、前記補助画像の領域は、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像の各画像の領域より大きい、補助撮像システムと、内部に透明窓を有する検体ホルダであって、前記検体ホルダは、前記主撮像システムの焦点面と交わる検体面に配設され、前記検体ホルダは、前記透明窓上に前記組織検体を保持するように構成されており、前記検体ホルダは、１つ以上の位置センサを含み、前記検体ホルダは、前記検体面において移動可能なように構成されており、前記１つ以上の位置センサは、検体ホルダ位置を測定するように構成されており、前記検体ホルダは、前記補助撮像システムの焦点面に対して移動可能なように構成されている、検体ホルダと、ユーザ入力を受け取るように構成されているユーザ入力装置であって、前記検体ホルダは、前記ユーザ入力に応じてリアルタイムに移動するように構成されている、ユーザ入力装置と、前記主撮像システム、前記補助撮像システム、及び前記位置センサと電気的に通信する処理装置であって、前記処理装置は、前記主撮像システムにより取得される前記連続的な画像、前記補助画像、及び少なくとも１つの検体ホルダ位置に対して、一連の命令を実行して、前記検体中の細胞核の表示画像を含む前記組織検体の合成表示画像を生成するように構成されている、処理装置と、前記処理装置と電気的に通信している表示装置であって、前記表示装置は、前記組織検体の前記合成表示画像をリアルタイムに表示するように構成されている、表示装置とを含む。
【００１３】
第２の例示となる実施形態では、本発明は、本明細書で記載された装置の実施形態のいずれかと、前記主撮像システムにより発光される光を吸収する主蛍光核造影剤とを含み、前記主蛍光核造影剤の蛍光発光波長は、前記分光チャネルの少なくとも１つに対応する、キットである。
【００１４】
第３の例示となる実施形態では、本発明は、組織検体のリアルタイム光学撮像の方法であって、１つ以上の蛍光造影剤を組織検体に適用するステップであって、前記１つ以上の蛍光造影剤の少なくとも１つは核造影剤であるステップと、第１の例示となる実施形態に記載された装置の例示となる実施形態のいずれかを提供するステップと、前記組織検体を前記検体ホルダに載置するステップと、前記検体ホルダを前記補助撮像システムの前記焦点面に位置合わせするステップと、前記補助撮像システムに、前記補助画像を取得させるステップと、前記検体ホルダを前記主撮像システムの前記焦点面に位置合わせするステップと、前記主撮像システムに前記連続的な画像を取得させるステップと、処理装置に、前記組織検体内の細胞核を検出させ、前記組織検体の合成表示画像を生成させるステップと、前記表示装置に、前記組織検体の前記合成表示画像をリアルタイムに表示させるステップと、前記検体ホルダに前記ユーザ入力装置を使用して、前記検体面において移動させるステップとを含む。
【００１５】
第４の例示となる実施形態では、本発明は、底壁及び検体保持構造を含む開口端容器と、前記開口端容器を閉じるように構成されている検体カバーと、前記開口端容器及び前記検体カバーを連結するように構成されている検体カバーコネクタと、透明窓と、前記底壁又は前記検体カバーと前記透明窓とを連結するように構成されている透明窓コネクタと、前記開口端容器、前記透明窓、又は前記検体カバーの１つまたは複数における複数の穿孔とを含む、組織学用検体カセット装置である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
上記の内容は、添付の図面に例示されたように、本発明の例示となる実施形態の下記のより具体的な説明から明らかとなるであろう。同図面において、同じ参照符号は、異なる図面全体を通して同じ部分を指す。図面縮尺の必ずしも正確ではなく、本発明の実施形態を説明するために誇張されている場合がある。
【００１７】
【図１】開示された光学撮像システムを示す模式図である。前記光学撮像システムは、主撮像システムと、検体ホルダと、補助撮像システムと、ユーザ入力装置と、処理装置と、表示装置とからなる。
【図２】前記主撮像システムが多光子顕微鏡である、開示された光学撮像システムの実施形態を示す模式図である。
【図３】前記主撮像システムが共焦点顕微鏡である、開示された光学撮像システムの実施形態を示す模式図である。
【図４】前記主撮像システムが構造化照明顕微鏡である、開示された光学撮像システムの実施形態を示す模式図である。
【図５】開示された光学撮像システムの好ましい実施形態における２つ以上の分光チャネルのうちの２つの表示画像である。第１のチャネルは、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に発色特異性を有する造影剤からの蛍光画像を表わす。第２のチャネルは、補完的な造影源からの蛍光画像を表わす。
【図６】取り外し可能な透明窓及び流体保持構造を包含する前記検体ホルダの実施形態を示す図である。
【図７】開示された光学撮像システムの好ましい実施形態における前記検体ホルダ及びユーザ入力装置の図であり、（ａ）前記ユーザ入力装置は、一対のノブであり、それぞれが、トルクの機械的伝達により軸を制御し、（ｂ）前記ユーザ入力装置は、少なくとも２つの軸の電子的作動を制御するジョイスティックである。
【図８】前記検体ホルダを模式的に示す図であって、前記ユーザ入力装置は、ユーザがステージを直接移動させるのに機械的に適した、前記検体ホルダの一領域である。
【図９】前記補助撮像システムの実施形態の模式図であって、前記補助撮像システムは、光センサの一次元デジタル配列、レンズ、及び照明である。正面図及び横断面図の両方が表わされる。
【図１０】連続的な画像、前記補助画像の表示画像、及び前記補助画像のサブ領域からの画像の表示画像を含有する前記組織検体の合成表示画像を表示する前記表示装置の実施形態を示す図である。
【図１１】Ｗｉｎｄｏｗｓコンピュータを処理装置として使用して実行され、表示装置に表示された合成表示画像の例である。
【図１２】前記処理装置の図であって、前記処理装置は、グラフィック処理装置による前記連続的な画像からの画像の表示画像を生成する。前記グラフィック処理装置は、並列処理ハードウェアを有し、カーネルを実行する。
【図１３】細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する発色特異性による分光チャネルと、ＶＴＭ画像を構成する赤色、緑色、及び青色のチャネルを生成するのに好ましいＶＴＭ処理を使用して処理される前記補完的な造影源による分光チャネルとを示す、光学的に断面可視化されたヒトの乳房組織を示す。
【図１４】外在性マークを有する組織検体の図である。
【図１５】狭帯域照明及び広帯域照明を含有する前記補助撮像システムの実施形態を示す図である。
【図１６】組織検体のリアルタイム光学撮像を行うための方法の実施形態を示すフロー図である。
【図１７】本発明を使用して組織検体を病理の存在を評価するためのワークフローを実行する、一般的な手術中又は手術後法を示すフロー図である。
【図１８】乳ガンを処置するための乳ガン腫瘍摘出術中に外科的縁を評価するために、本発明を使用するワークフローを実行する方法の実施形態を示すフロー図である。
【図１９】前記主撮像システムが多光子顕微鏡である、本発明の例示となる実施形態の正面及び上面の写真を表わす。
【図２０】細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する発色特異性による分光チャネルと、前記補完的な造影源による分光チャネルとを示す、光学的に断面可視化されたヒトの乳房組織を示す。前記主撮像システムは、共焦点顕微鏡である。
【図２１】幾何形状にわたる前記組織検体を照明する照明光源を含有する前記補助撮像システムの実施形態を示す図である。
【図２２】取り外し可能な透明窓の実施形態を使用して、組織評価及び組織学的処理を行うための方法のフロー図である。
【図２３】仕切り及び検体ラベルを特徴とする検体ホルダの実施形態を示す図である。
【図２４】開示された光学撮像システムによる撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図２５】開示された光学撮像システムによる撮像に適しており、一方で、前記検体ホルダに搭載された組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図２６】（ａ）及び（ｂ）は、開示された光学撮像システムによる撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図２７】（ａ）及び（ｂ）は、前記透明窓が底壁の外側表面に存在する、本発明の撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図２８】（ａ）及び（ｂ）は、開示された光学撮像システムによる撮像に適しており、一方で、前記補助画像システムを使用することにより傾斜壁上のラベルを撮像可能とする組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図２９】（ａ）及び（ｂ）は、前記透明窓が検体カバーに連結されている、開示された光学撮像システムによる撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図３０】（ａ）及び（ｂ）は、２つの小さな組織検体を、個々の検体の識別性を損なうことなく搭載可能な仕切りを有する、開示された光学撮像システムによる撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【図３１】（ａ）及び（ｂ）は、前記検体保持構造が可撓性ヒンジを有する前記検体カバーに傾斜壁を有する前記検体保持構造の端部において連結されている、図２６の実施形態の代替的な実施形態を示す図である。
【図３２】（ａ）及び（ｂ）は、開示された光学撮像システムによる撮像に適しており、一方で、溶媒の素早く均一な浸透を可能にする、組織学用検体カセットの実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明の例示となる実施形態を説明する。
【００１９】
本明細書で開示された本発明の態様及び実施形態は、厚い組織検体に存在する病理の撮像を行い、一方で、組織検体の表示画像をリアルタイムに生成するための方法、システム、及び装置に関する。ここでのリアルタイムとは、動作に伴う遅延が僅かであることを意味すると理解される。本発明は、倒立配置における、対象となる画像面より相当厚い組織検体内を高解像で光学的断面可視化顕微観察を行うための主撮像システムを含む、複数の構成部品を備える。この撮像システムは、多光子顕微観察、共焦点蛍光顕微観察、光シート顕微観察、紫外表面励起による顕微観察、又は構造化照明に基づく技術を利用し得るが、従来の組織学的顕微鏡に匹敵する倍率及びリアルタイムユーザ評価に適した撮像速度で、蛍光又は反射光を検出し得る。補助撮像システムが主撮像システムと組み合わされて、対象となる領域の選択をガイドすること、あるいは病理、手術用インク、又は検体の縁間の物理的距離を評価することに使用され得る、より広い領域に渡る、より低い倍率での撮像を提供する。補助画像上で特定される対象となる領域を、ユーザが主撮像システムにより撮像できるように、撮像位置の連続的にかつリアルタイムにモニタリングするための位置センサを含む移動可能な検体ホルダが使用される。ユーザは、ユーザ入力装置を使用して検体ホルダをリアルタイムに移動させ得る。
【００２０】
主撮像システムにより撮像する位置を選択する際にユーザをガイドするために、検体ホルダ上の位置センサに対する主画像面及び補助画像面の物理的位置が既知である。したがって、既知の関係から、他の画像における同じ検体位置に対応する１つの画像における領域が特定される。好ましい実施形態では、検体ホルダ、位置センサ、及び主撮像システムと補助撮像システムとの間の既知の関係の組み合わせを用いて、検体を各撮像倍率について別個の位置に移動させることができ、これら２つの機器が顕微鏡における物理的に異なる領域を占めることができる。画像及び位置情報が、ユーザに対してリアルタイムに表示される。これはこの表示が、ユーザが組織検体を効率的に評価でき、当該表示に応じて検体を移動させる入力を機器に与えるのに十分に低い遅延速度で更新されることを意味する。このリアルタイム評価を可能にするために、処理装置が本発明に包含される。処理装置は、主撮像システム及び補助撮像システムの両方からの画像データ並びに位置センサからの位置データを受信する。好ましい実施形態では、主撮像システムは、正常な動作中に１秒当たり少なくとも１回の速度で画像フレームを連続的に戻す顕微鏡であり、補助撮像システムは、組織検体の１つの画像を、取得の開始時又はユーザにより命令された際に獲得する。これらのタスクを達成するために、処理装置は、データ取得を管理するための中央処理装置を含む、複数の構成装置及びユーザコマンドを包含する。処理装置は、評価を支援するために、ＶＴＭ又は従来の表示画像の色分けを含む複数の表示モードを含み得る。当該処理装置の一実施形態は、多くの動作を並列で行うことにより、画像の表示画像及び位置データの生成に関連する遅延を最少化するための並列処理能力を有するグラフィック処理装置（ＧＰＵ）を包含する。また処理装置は、低倍率画像と現在の検体ホルダ位置との間の関係を用いて、主撮像システムにより生成された連続的な画像の位置を、低倍率画像上に重ね合せ、又は示す。更に、一実施形態において、処理装置は、検体ホルダを移動させ、検体内の画像深さを調節し、顕微鏡の照明強度又は他の要素を調節することにより従来の病理医が用いる顕微鏡における調節ノブに類似する、１つ以上のデジタル制御機能を有していてもよい。
【００２１】
組織検体をリアルタイムで光学撮像するための装置及び方法を図１に示す。本装置は、照明光源１１３を使用するように構成されている主撮像システム１０３であって、細胞核又は細胞核成分に対して発色特異性を有する蛍光造影剤１０２により標識されている組織検体１０１の１つ以上の分光チャネルを通して連続的な画像を生成し、蛍光造影剤により標識された核を解像する倒立顕微鏡であり、光学的深部断面可視化を実行する主撮像システム１０３と、主撮像システムよりも大きい領域にわたって補助画像を取得するように構成されている補助撮像システム１０８と、透明窓１０５及び１つ以上の位置センサ１０６を有し、主撮像システムの焦点面において移動する検体ホルダ１０４と、ユーザが検体ホルダの移動をリアルタイムにガイドできるためのユーザ入力装置１０９と、主撮像システム、補助撮像システム、及び位置センサと電気的に通信し、主撮像システムにより生成される連続的な画像、補助撮像システムにより生成される補助画像、及び１つ以上の位置センサからの位置に対して一連の命令を実行して、組織検体１１１中の細胞核の表示画像を含む組織検体の合成表示画像を生成する処理装置１１０と、組織検体の合成表示画像をユーザにリアルタイムに表示するように包含される表示装置１１２とを含む。主撮像システムは、照明光源を含み、個々の細胞及び細胞核が組織内で解像され得る最大値である４０マイクロメートル未満の軸解像（撮像された深度断面可視化の幅）を有し、連続的な画像を１秒当たり１画像超の速度で生成する。主撮像システムにより生成される各画像は、１つ以上の分光チャネルのうちの少なくとも１つを含み、少なくとも１つの分光チャネルは、細胞核又は細胞核成分に対する発色特異性を有する蛍光造影剤が発する蛍光を検出する。
【００２２】
本発明の目的を達成するため、主撮像システムは、物理的切断の場合と同様の、より大きい検体内の特定の範囲の深さからの光学シグナルを分離し得る限りにおいて、個々の細胞の検査を可能にするのに十分な解像を有する光学的深部断面可視化の複数の手段を包含し得る。典型的には、これには、４０マイクロメートル未満の軸解像（深度断面可視化の幅）を必要とするであろう。更に、全ての実施形態において、主撮像システムにより検出可能な細胞核又は細胞核成分に対する発色特異性を有する少なくとも１つの蛍光光源が、組織検体に存在する。他の実施形態では、２つ以上の蛍光体を更に検出してもよく、１つの蛍光体と、例えば反射などの１つ以上の非蛍光の造影源とを検出してもよい。
【００２３】
図２は、多光子顕微観察を利用する、本発明の実施形態の模式図である。この実施形態では、主撮像システム２０３は、照明光源２１１からの光、この場合には、パルスレーザをスキャンするビームスキャナ２２４を使用することにより、スキャンレーザユニット２１８、ビームスプリッタ２１９、及び対物レンズ２１５を通して、細胞核又は細胞核成分２０２に対する発色特異性を有する蛍光造影剤により処理された検体について、組織検体２０１の光学的深部断面可視化を実行する。レーザ光は、ピコ秒以下のオーダーでのパルス持続時間を有する。励起波長が対象となる蛍光体により吸収される波長より長い場合、１つの光子プロセスによる励起は起こらないであろう。しかし、前記波長が吸収される波長の約２倍である場合、２つの光子吸収が照明の焦点内で生じ、マイクロメートル厚のオーダーで切片内において焦点の光学的深部断面可視化をもたらし得る。焦点の外側では、光強度は、２つの光子吸収に十分なほど大きくなく、励起は起こらない。一実施形態において、検体は、更なる内在又は外在の造影源、例えば、第２の蛍光剤、第二高調波を発する成分、又は、二色性ビームスプリッタ２２０及び１つ以上の蛍光フィルタ２２１並びに検出器当たり１つ以上の検出素子を有する１つ以上の検出器２２３によって標識された細胞核から分離され得る、内在性自己蛍光を含有する。多光子顕微鏡及びその動作原理の実行の詳細な説明は、「Nonlinear magic : multiphoton microscopy in the biosciences」, W. R. Zipfel, R. M. Williams and W. W. Webb（Nature Biotechnology 21:1369-1377(2003)）により与えられる。
【００２４】
図３は、共焦点顕微観察を利用する、本発明の実施形態の模式図である。この実施形態では、主撮像システム３０３は、照明光源３１１からの光をスキャンするビームスキャナ３２４を使用することにより、ビームスプリッタ３１９、スキャンレンズユニット３１８、及び対物レンズ３１５を通して、細胞核又は細胞核成分３０２に対する発色特異性を有する蛍光造影剤により処理された検体について、組織検体３０１の光学的深部断面可視化を実行する。照明光源は、好ましくは１つ以上のレーザであるが、パルス化される必要はない。この実施形態では、励起照明光源波長は、対象となる１つ以上の蛍光体の吸収波長に直接対応する。励起光の吸収及び蛍光の発光は、検体中の複数の深さで生じるが、スキャンレンズユニット３１８は、検体からの１つの面のみからの光を、開口３２５を通して、最終的に１つ以上の検出素子を有する検出器３２３上に中継する。光は、焦点面上又は同焦点面近くで生じた場合、実質的に減衰することなく、開口のみを通過し、焦点光以外を排除することにより光学的深部断面可視化をもたらし得る。開口の多くの実装態様が、ピンホール、光ファイバ、及びニプコーディスクを含む共焦点顕微観察について公知である。一実施形態において、検体は、更なる内在性又は外在性の造影源、例えば、第２の蛍光剤、内在性自己蛍光、又は二色性ビームスプリッタ３２０及び１つ以上の蛍光フィルタ３２１によって標識された細胞核から分離され得る直接反射光を含有する。共焦点顕微鏡及びその動作原理の実装の詳細な説明は、R. H. Webb, 「Confocal Optical Microscopy」（Reports on Progress in Physics 59 427-471 (1996)）により与えられる。
【００２５】
図４は、主撮像システム４０３が構造化照明顕微鏡である、本発明の実施形態の模式図である。この実施形態では、構造化照明に基づく技術であって、好ましくは、１つ以上のレーザ、ＬＥＤ、又は他の比較的明るい光源である照明光源４１１、及び空間光変調器４２４から生成される照明パターンが対物レンズ４１５を通して組織検体４０１上に投射される技術が、主撮像システムについて光学的深部断面可視化を実行するために使用される。これらのパターンは、焦点をぼかすことによりぼやけて、１つの面においてのみ焦点が合う。検体上に投射される２つ以上の別個のパターンを連続的に撮像することにより、アルゴリズムを使用して、拡散バックグラウンドからの焦点のシャープに画定された特徴を分離し得る。共焦点顕微鏡と同様に、本実施形態では、細胞核又は細胞核成分４０２に対する発色特異性を有する蛍光造影剤により染色された組織検体を撮像する。別の実施形態では、二色性ビームスプリッタ４２０により分光され得る第２の造影源である、内在性蛍光体、外在性蛍光剤、又は直接反射光のいずれかを使用する。１つ以上の分光チャネルからの造影は、１つ以上の蛍光フィルタ４２１を通して、検出素子の直線アレイ又は２次元アレイのいずれかを含む検出器４２３上のレンズ４２２により撮像される。他の実施形態では、１つの撮像システムに複数の異なる断面可視化技術の態様、例えば、１つ以上の蛍光剤の多光子励起及び散乱光の反射共焦点検出を包含してもよい。光シート顕微鏡を含む、本発明での使用に適した光学的深部断面可視化の多くの他の手段が説明されてきた。同顕微鏡は、２つの別個の対物レンズであって、１つ目は照明を提供し、２つ目は集光し、２つの対物レンズ焦点面の重なりに位置する物体のみを検出し得るように配置されるレンズを使用する。他の手段は、紫外（ＵＶ）吸収に基づく技術も含む。同技術は、紫外表面励起による顕微観察を含み、同顕微観察は、生体組織によって強力にＵＶ吸収されることから表面下の深部を照明することなく、検体の表面を照明するのに、典型的には、約３００ｎｍ以下の短波長ＵＶ光を使用する。
【００２６】
Ｈ＆Ｅにより染色されたＭＭＳ又はＰＥＨに存在する診断的特徴を再現するために、主撮像システムは、２つ以上の分光チャネルを有し、各チャネルは、組織検体の異なる面についての情報を提供することが好ましい。ヘマトキシリンと同様に、これらのチャネルのうち第１のチャネルは、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する発色特異性を有する必要がある。発色特異性は、核造影剤、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する親和性を有する外在性蛍光造影剤を使用して達成される。好ましい実施形態では、核造影剤は、染色が処置時間の相当な部分を占めないように、組織に素早く浸透する急速拡散剤であり、例えば、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、Ｓｙｔｏ−ｂｌｕｅ、Ｓｙｔｏ−ｏｒａｎｇｅ、Ｓｙｔｏ−ｒｅｄ、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、ＤＲＡＱ５、エチジウムブロマイド、メチレンブルー、ヨウ化プロピジウム、又はヨウ化へキシジウムが挙げられるが、これらに限定されない。照明光源の波長を吸収可能な造影剤が選択されることが不可欠であり、更に、２つ以上の造影剤が使用される場合、造影剤の発光波長が、それらが分光され得るように相異なるものであることが好ましい。造影を最大化するために、蛍光染料の好ましい実施形態は、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に結合することにより、大きな蛍光増強効果を有する。一実施形態において、主撮像システムの第２のチャネルは、補完的な造影源からの情報を、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する親和性を有する蛍光造影剤に提供する。補完的な造影源により、病理組織診断におけるエオシン染色と同様に、他の細胞機構及び組織組成成分の可視化が可能となる。これらとしては細胞質、間質、コラーゲン、及び筋肉が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、補完的な造影源は、エオシン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、スルホローダミン、トルイジンブルー、エリスロシン、又は、間質及び他の組織組成成分を標識するのに使用される別の蛍光剤からの蛍光を含む。病理組織診断においてエオシンにより標識される多くの組織組成成分が反射性若しくは自己蛍光性であり、又は、第二高調波（ＳＨＧ）を示すため、一実施形態において、補完造影を生じさせるのに外在性標識を使用しない。その代わりに、補完的な造影源は、内在性蛍光体、ＳＨＧ、又は直接反射照明光のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、蛍光剤、内在性蛍光体、ＳＨＧ、又は反射光は、２つの分光チャネルが共通する照明光源を使用して同時に生成され得るように選択され、ついで、異なる発光又は反射スペクトルに基づいて分離される。
【００２７】
図５は、本実施形態を表す。５０１は、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方５０３に対する発色特異性を有するチャネルを示す。５０２は、細胞質、間質、及びコラーゲン５０４を含む組織組成成分の可視化を、核又はＤＮＡに対する発色特異性を有する造影剤により造影することにより可能にする補完的な造影源を示す。一部の用途において、１つの造影チャネルのみが、この場合には、細胞核と、間質、コラーゲン、細胞質、筋肉、又は他の組織組成成分のうちの少なくとも一部の組成成分との両方を検出するのに必要とされ得る。この場合には、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対して不完全な発色特異性を有する造影剤（例えば、メチレンブルー又はアクリジンオレンジが挙げられるが、これらに限定されない）が使用されてよく、この方法においては、標識された細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方からの強力な発光が、他の組織組成成分に対するより弱い発光により造影される。照明スペクトルを可変にした状態で、各顕微観察視野において２つ以上の連続的な画像を取得することによって、単一の検出器を利用して、異なる吸収スペクトルを有し、かつ類似する発光波長を有する造影剤を区別することが可能になる。
【００２８】
本装置の一実施形態は、スペクトル選択的フィルタを使用して、その波長に基づいて検体から戻る光を分離する。一実施形態は、２２０、３２０、及び４２０により示された、４５度の波長選択的ビームスプリッタを使用して、光を、更なる波長選択的フィルタ２２１、３２１、及び４２１を有する２つの別個の検出器に向ける。これにより、一方の検出器は、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対して特異的な染料又は剤からの光を受容し、他方の検出器は、補完的な造影源に対して特異的である。補完的な造影源も蛍光体である場合には、両チャネルは、照明波長からの光を排除するであろう。第２の造影源が反射光である場合には、少なくとも１つのチャネルが、照明波長からの光を受容するであろう。別の実施形態では、２つのスペクトルチャネルを部分的であるが、不完全に分離する２つのスペクトル選択的フィルタを使用する。この場合、スペクトルは混じり合わず、一方のチャネルにおける既知量のシグナルが他方において検出され、ついで、表示画像を計算する際に数値的に除去される。別の実施形態では、スペクトル感度を有する１つの検出器、例えば、分光計、カラーカメラ、又は他の波長選択的光学デバイスを使用する。
【００２９】
種々の実施形態では、本明細書で記載された装置の検体ホルダは、検体仕切りを更に含む。例示となる実施形態では、検体ホルダは、蓋を更に含む。種々の実施形態では、補助撮像システムは、照明光源を更に含む。照明光源は、蓋に取付けられるように構成され得る。蓋は、組織検体を透明窓に対して保持するように構成されている検体ガイドを更に含む。透明窓は、ガラス、溶融水晶、シリカ、又はＵＶ透過性材料、例えば、フッ化カルシウムで作製され又はこれらを含み得る。
【００３０】
撮像中に検体を支持するために、本発明は、透明窓及び倒立状に配向された撮像光学系を有する検体ホルダを使用する。ここで、倒立状とは、検体が対物レンズ又は撮像レンズの上方に配置され、その焦点面に対して検体が移動可能な顕微鏡又は他の撮像装置を指す。倒立配置の使用により、厚みが変わる不規則な形状の検体を同じ検体ホルダ上に載置することが可能である。これは非倒立配置では検体を透明窓に対して逆さまに吊るす必要があるため困難である。機械的支持のための下方の厚いスライドガラスと、撮像のための上方の薄いカバーガラスとによる直立構成を使用する従来の透過照明顕微鏡とは対照的に、透明窓は、機械的支持及び撮像カバーガラス機能の両方を含む。典型的には、カバーガラスは、撮像に使用される顕微鏡の対物レンズの球面収差補正と一致する特定の厚みを有するように設計される。より低い開口数、典型的には、０．５より小さい開口数において、球面収差の効果は無視できる。その場合には、透明窓は、設計されたカバーガラスの厚みと比較して、相対的に厚くてよい。より高い球面収差又は非常に大きい若しくは重い検体を支持するように設計された検体ホルダに対して、厚い（典型的には、１〜２ｍｍ）カバーガラスの周囲に設計される特別の対物レンズが使用され得る。一実施形態において、透明窓は、高弾性率の弾性ガラス、例えば、ホウケイ酸から構成され、透明窓が設計された対物レンズによる実質的な収差を生じることなく、意図された検体搭載下で剛性であるように十分厚くなるように選択される。別の実施形態では、近赤外又はＵＶスペクトルにおいて高い透過率を有するように選択されるガラス又はプラスチックが選択される。一般的な市販の対物レンズについて、透明窓の厚みは、好ましくは、５００マイクロメートルのオーダーであろう。しかし、より大きい開口数の対物レンズが必要とされるか、又は、調節可能な球面収差補正を有する対物レンズが使用され得る場合には、より薄い窓が使用され得る。一実施形態において、撮像面にわたってパノラマ撮像する際に、焦点が常に組織表面に対して同じ面にあるように、表面歪みに対応するために、対物レンズの高さが調節されるように、組織検体又は透明窓の表面トラックキングが可能である。更に、蛍光造影剤による組織表面の素早い染色を容易にするために、組織検体を、透明窓上へ配置した後に染色し得る。
【００３１】
透明窓は、一度に複数の検体を支持するため、又は典型的な組織学検体より大きい検体を支持するために十分な大きさであり得る。一実施形態において、検体ホルダは、従来の組織病理診断における検体全体の載置手法と同様に、大きな手術切除サンプルの表面全体を、より小さな断片に切断することなく、撮像するのに十分に大きく設計される。この実施形態は、損傷していない検体全体を可視化できることが診断にとって利点となる場合、有利である。図２３に示された別の実施形態では、検体ホルダは、流体保持構造２３０４により囲まれた透明窓２３０５上において、組織検体２３０３同士を検体仕切りセルに隔離する構造体である検体仕切り２３０１を更に含む。検体仕切りは、検体が検体仕切りの他のセルに移動するのを妨ぐために十分厚いプラスチック又は金属で作製された物理的な格子状の障壁であり得る。一実施形態は、検体の識別又は追跡を容易にする格子内の組織検体を識別し又は順序付けするラベル２３０２を包含する。これらのラベルは、検体ラベルをユーザによって、または補助撮像システムを用いてデジタル的に読み取りできるように配置され得る。検体仕切りの他の実施形態は、透明窓に刻まれたガラス上の格子パターン、透明窓に塗工されたインク、又はプラスチック若しくは金属で作製された薄い障壁である。
【００３２】
図６に、取り外し可能な透明窓６０６を包含する検体ホルダ６０４の実施形態を示す。この実施形態では、透明窓は、位置センサ６０５から離れているが、より素早いワークフローを容易にし、又は、顕微鏡上での組織検体の取扱いを避けるように、組織検体６０１が載置される。検体が載置された後に、透明窓は、検体ホルダに戻すように挿入され得る。別の実施形態では、透明窓は、透明窓を囲み、搭載中に検体から流体が漏れるのを防止する流体保持構造６０７を有する。取り外し可能な透明窓のこの実施形態は、組織検体が透明窓上に存在する間に、組織検体を染色するために更に好ましい。一実施形態において、流体保持構造は、検体からの流体が検体ホルダの外側に漏れるのを防止するために、検体ホルダにおける透明窓の下に置かれる。別の実施形態では、この保持構造は、流体が漏れるリスクを低くするため、又は撮像中に室内灯を排除するために、密に嵌る蓋を更に含む。流体の外への漏れ、又は、光が中に入ることを確実に防止するために、密に嵌る蓋は、蓋と透明窓との間に、ゴムガスケット又は類似する障壁により形成される水密シールを更に含み得る。高出力レーザを使用するシステムにおいて、透明窓及び蓋が迷光レーザ照射からユーザを保護するのに適していない場合、蓋は、レーザ照明を不能にするインターロック部品も包含し得る。一実施形態において、蓋は、透明窓との組織の接触を促進することにより、組織検体の撮像を容易にする検体ガイドを含み得る。組織ガイドは、組織をガラスに対して、スポンジ、バネ、可膨張性膜、又は、組織検体上に制御された力を加え得る他の材料を使用して圧迫し得る。加えて、補助撮像システムによる撮像の際に、組織ガイドを通して組織検体が照明されるように、組織ガイドは透明又は半透明な材料で作製されることが有利であり得る。別の実施形態では、複数の透明窓が、１つの検体ホルダと連続的に組み合わされる。これにより、ユーザが、検体を２つ以上の窓に載置可能となり、ついで、それらを評価中に素早く交換できる。
【００３３】
別の実施形態では、検体仕切りは、透明窓に機械的に接続される。この実施形態では、各検体が各検体仕切りセル内でセルカバーを使用して保持されることが更に有利であり得る。この構成において、各検体は、閉鎖空間内に保持され、検体識別の失敗が起こらないようにする。各検体仕切りセルは、識別を容易にするラベルを更に含有してもよい。一実施形態において、個々の仕切りセルは、仕切り及びセルカバーに対して内部の流体が顕微鏡内へと漏出しないように密封され得る。別の実施形態では、仕切り又はセルカバーは、流体、試薬、固定剤、溶媒、又は蛍光造影剤が各仕切りセルの内外の移動を可能にする複数の穿孔を包含し得る。
【００３４】
例示となる実施形態では、本発明は、底壁及び検体保持構造を含む開口端容器と、開口端容器を閉じるように構成されている検体カバーと、開口端容器及び検体カバーを連結するように構成されている検体カバーコネクタと、透明窓と、底壁又は検体カバーと透明窓とを連結するように構成されている透明窓コネクタと、１つ以上の開口端容器、透明窓、又は検体カバーにおける複数の穿孔とを含む、組織学用検体カセット装置である。この実施形態の一態様において、検体カバーコネクタは、１つ以上のノッチ、タブ、ヒンジ、又は磁石である。別の態様では、検体保持構造は、外側表面を有する傾斜壁を含む。別の態様では、透明窓は、ガラス、溶融水晶、シリカ、又はＵＶ透過性材料、例えば、フッ化カルシウムを含む。別の態様では、透明窓は、透明なプラスチックを含む。別の態様では、透明窓コネクタは、キシレン、アルデヒド、及びアルコールに耐性を有する。別の態様では、透明窓コネクタは、耐溶媒性接着剤、例えば、２成分エポキシ若しくはＵＶ硬化樹脂、又は耐溶媒性であることが知られている市販の接着剤の任意の１つを含む。別の態様では、透明窓コネクタは、透明窓の周囲部分を溶かし得る材料、例えば、プラスチックを含む。別の態様では、透明窓コネクタは、組織学処理溶媒、例えば、ホルマリン、アルコール、及びキシレンに耐性を有する。例示となる実施形態では、本明細書で記載された組織学用検体カセット装置は、約４．５ｃｍ以下の最も長い軸（次元）に沿った長さと、約３．５ｃｍ以下の次に長い軸（次元）に沿った幅とを有する。組織学用検体カセット装置の種々の例示となる実施形態は、図２４〜３２を参照しながら以下において説明される。
【００３５】
別の実施形態では、複数の検体はそれぞれ、個々の組織学用検体カセットに挿入されてもよく、当該カセットはそれぞれ、開示された撮像システムによる撮像に適した透明窓を含有し、ユーザに対して複数のより小さな検体を、評価のために検体ホルダに独立してかつ同時に載置可能とする。各カセットは、識別又は順序付けを容易にするラベルを更に含有してもよい。このラベルは、ユーザによる又は補助撮像システムによる可視化を可能にするように配向され得る。この実施形態は、多くの小さな検体を評価する際に、ユーザが１つの大きな透明窓上にそれらを直接置くよりも、より容易にユーザが検体の順序、配向、又は識別を維持できることにより、有利であり得る。カセットが各種の既存の組織処理器具、例えば、カセットプリンタ又は真空浸透処理機と機械的に適合可能であるように、カセットを形成することが有利であり得る。この実施形態の利点は、透明窓が既存の組織学的カセットプリンタを使用してラベル表示され得ることである。この実施形態の更なる利点は、その後の組織学的処理操作、例えば、固定、脱水、又はパラフィン浸透が必要とされる場合、ユーザが従来の（透明窓を欠いている）組織学カセット又は他の処理容器内に検体を手作業で移す必要がなく、それらの操作を、カセット内にある、及び／又は透明窓と接触している組織に対して行い得ることである。
【００３６】
既存の組織処理器具との機械的な適合性のために、各カセットが、開口端容器を有することが好ましい。この場合、開口端容器は、底壁及び検体保持構造を含む。検体カバーは、開口端容器を閉じ、透明窓と接触している組織検体を保持するようにも構成され得る。検体カバーは、検体カバーコネクタを更に有し得る。この場合、コネクタは、カセット本体を検体カバーと連結するように構成されている。小さな検体のために、更なる材料、例えば、スポンジ又は組織ガイドが、組織を透明窓に対して保持するために挿入され得る。既存の組織処理器具において使用できるように、カセットの寸法は、従来の組織学的処理カセットに近似することが好ましい。典型的には、約４ｃｍの最も長い軸（次元）に沿った長さ及び約３ｃｍの次に長い軸（次元）に沿った幅である。３番目で最も短い軸（次元）は、典型的には、約０．５〜１．５ｃｍである。より大きな形状も可能であるが、特別な器具を必要とする場合があるため、処理コストの増大を招く。カセットラベルプリンタとの適合を可能にするために、透明窓、検体保持構造、及びカバーの一面は、ラベル表示又は印刷に適した約４５度の角度を有する面を包含する。これらの限定に適合する一実施形態において、検体保持構造の２つの実質的に平行な側面は、長さ約４ｃｍであり、検体保持構造の２つの実質的に平行な側面は長さ約３ｃｍであり、少なくとも１つの側面が約４５度の角度を有し、透明窓は、底壁内に埋め込まれ、カバーは、ヒンジ又は他の固定具により取付けられる。別の実施形態では、透明窓は、カバーに埋め込まれる。同カバーは、パラフィン化検体をカセットの後方に載置する必要がある既存のパラフィン切断ミクロトームとの適合性に有利であり得る。代替的な実施形態では、透明窓は、カセットの全体が透明窓の材料上に載置されるような底壁全体を含む。全ての実施形態において、透明窓の縁は、ユーザによるダメージから、又は、検体切断中におけるミクロトームとの接触から保護され得る。
【００３７】
図２４に、側面図２４１０及び上面図２４１１において、開示された撮像システムによる撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態の概略を示す。２４０６は、組織学用処理溶媒に対して化学的に耐性を有する接着剤２４０１を使用して、底壁２４０８に結合した透明窓を示す。傾斜壁２４０９は、その上に印刷された検体ラベル２４０２を有する。透明窓の中心において、組織検体２４０５が配置される。カセットの外側は、検体カバー２４０４を取付ける検体保持構造２４０３により形成される。検体カバーは、複数の穿孔２４０７を更に有する。図２４の実施形態は、従来の組織学処理機において、検体のラベル表示及び組織学的処理を可能にする。
【００３８】
図２５に、検体ホルダ２５０９に搭載された、開示された撮像システムによる撮像に適した組織学用検体カセットの実施形態の概略を示す。検体ホルダは、位置センサ２５０５を包含する。この実施形態では、取り外し可能な透明窓２５０６が、カセットに包含されており、検体保持構造２５０３に、組織学用処理溶媒に対して化学的に耐性を有する接着剤２５０１を使用して取付けられる。組織検体２５０２は、検体カバー２５０８直下の組織ガイド２５０７により適切に保持される。保持構造はまた、傾斜壁２５０４を包含する。
【００３９】
図２６（ａ）及び図２６（ｂ）は、開示された光学撮像システムによる撮像に適しており、一方で、検体のラベル表示及び従来の組織学処理機における組織学的処理を可能にする、組織学検体カセット２６００の実施形態を示す図である。この実施形態では、透明窓２６０１は、開口端容器２６１１の内側表面における底壁２６０２に、耐溶媒性接着剤（透明窓コネクタ）２６０５を使用して結合されている。この実施形態では、透明窓は、薄いガラス片である。検体保持構造２６０３は、底壁に結合されており、検体カバー２６０７は、可撓性のヒンジ及びノッチ（検体カバーコネクタ）２６０６を介して検体保持構造に連結され、適切にカチッと閉じられる。カバーは、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔２６０８を更に含有する。傾斜壁２６０４は、検体保持構造上に存在し、ラベル印刷用の表面を提供する。実施形態２６００では、検体のラベル表示及び従来の組織学処理機における組織学的処理が可能となる。
【００４０】
図２７（ａ）及び図２７（ｂ）は、透明窓が底壁の外側表面に存在する、本発明による撮像に適した組織学検体カセット２７００の実施形態を示す図である。これにより、透明窓を検体ホルダに載置することができ、検体ホルダにより決定される特定面に透明窓が存在することを確保でき、複数のカセットを共通する撮像面に維持するのに有利である。この実施形態では、透明窓２７０１は、開口端容器の外側表面における底壁２７０２に、耐溶媒性接着剤２７０５を使用して連結されている。この実施形態では、透明窓は、薄いガラス片である。検体保持構造２７０３は、底壁に連結されており、検体カバー２７０７は、可撓性のヒンジ及びノッチ２７０６を介して検体保持構造に連結され、適切にカチッと閉じられる。カバーは、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔２７０８を更に含有する。傾斜壁２７０４は、検体保持構造上に存在し、ラベル印刷用の表面を提供する。
【００４１】
図２８（ａ）及び図２８（ｂ）は、開示された光学撮像システムによる撮像に適しており、一方で、補助画像システムを使用することにより傾斜壁上のラベルを撮像可能である組織学検体カセット２８００の実施形態を示す図である。底壁２８０２及び透明窓２８０１は、耐溶媒性接着剤２８０５を使用して、カセットが透明窓に載置されるように底壁の外側表面に透明窓が取り付けられて連結されている。これにより、透明窓を検体ホルダに載置することができ、検体ホルダにより決定される特定面に透明窓が存在することを確保でき、複数のカセットを共通する撮像面に維持するのに有利である。この実施形態では、透明窓は、薄いガラス片である。検体保持構造２８０３は、底壁に連結されており、検体カバー２８０７は、可撓性のヒンジ及びノッチ２８０６を介して検体保持構造に連結され、適切にカチッと閉じられる。カバーは、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔２８０８を更に含有する。傾斜壁２８０４は、検体保持構造上に存在し、下向きに配向し、それにより補助撮像システムは、傾斜壁上に印刷された検体ラベルを下方から記録できる。
【００４２】
図２９（ａ）及び図２９（ｂ）は、透明窓が検体カバーに連結されている、開示された光学撮像システムによる撮像に適した組織学検体カセット２９００の実施形態を示す図である。この実施形態は、ミクロトームでの切断中に必要とされ得ることから、透明窓を組織学的処理後に開口端容器から取り外すことができるため有利であり得る。この実施形態では、透明窓２９０１は、内側表面上の検体カバー２９０７に、耐溶媒性接着剤２９０５を使用して連結されている。この実施形態では、透明窓は、薄いガラス片である。検体カバー２９０７は、可撓性のヒンジ及びノッチ２９０６を介して検体保持構造２９０３に連結され、適切にカチッと閉じられる。検体保持構造は、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔２９０８を含有する底壁２９０２に連結されており、傾斜壁２９０４は、検体保持構造上に存在し、ラベル印刷用の表面を提供し、下向きに配向し、それにより補助撮像システムは、傾斜壁上に印刷された検体ラベルを下方から記録できる。
【００４３】
図３０（ａ）及び図３０（ｂ）は、２つの小さな組織検体を個々の検体の識別性を損なうことなく装着できる仕切りを有する、開示された光学撮像システムによる撮像に適した組織学検体カセット３０００の実施形態を示す図である。この実施形態では、透明窓３００１は、開口端容器の外側表面における底壁３００２に、耐溶媒性接着剤３００５を使用して連結されている。これにより、透明窓を検体ホルダに載置することができ、検体ホルダにより決定される特定面に透明窓が存在することを確保でき、複数のカセットを共通する撮像面に維持するのに有利である。この実施形態では、透明窓は、薄いガラス片である。仕切り３００９は、開口端容器内に存在し、開口を、それぞれ検体を含有し得る２つの区画に隔離する。検体保持構造３００３は、底壁に連結されており、検体カバー３００７は、可撓性のヒンジ及びノッチ３００６を介して検体保持構造に連結され、適切にカチッと閉じられる。カバーは、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔３００８を更に含有する。傾斜壁３００４は、検体保持構造上に存在し、ラベル印刷用の表面を提供する。
【００４４】
図３１（ａ）及び図３１（ｂ）は、検体保持構造３１０３が検体カバー３１０７対して、傾斜壁を有する検体保持構造の端部における可撓性ヒンジにより連結されており、検体カバーがノッチ３１０６を使用して適切にカチッと閉じられる、図２６の実施形態の代替的な実施形態３１００を示す図である。この実施形態は、検体を載せる又は組織学検体カセットをラベル表示するのに有利である。この実施形態では、透明窓３１０１は、開口端容器の外側表面における底壁３１０２に、耐溶媒性接着剤３１０５を使用して連結されている。カバーは、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔３１０８を更に含有する。傾斜壁３１０４は、検体保持構造上に存在し、ラベル印刷用の表面を提供する。
【００４５】
図３２（ａ）及び図３２（ｂ）は、開示された光学撮像システムによる撮像に適しており、一方で、溶媒の素早く均一な浸透が可能な、組織学検体カセット３２００の実施形態を示す図である。この実施形態では、透明窓３２０１は、開口端容器の外側表面における底壁３２０２に、耐溶媒性接着剤３２０５を使用して連結されている。この実施形態では、透明窓は、薄いガラス片である。検体保持構造３２０３は、底壁に連結されており、検体カバー３２０７は、ヒンジ及びノッチ３２０６を介して検体保持構造に連結され、適切にカチッと閉じられる。カバー、透明窓、検体保持構造、及び底壁は、流体をカセット内に通過させ得る複数の穿孔３２０８を更に含有する。傾斜壁３２０４は、検体保持構造上に存在し、ラベル印刷用の表面を提供する。
【００４６】
組織処理器具、例えば、真空浸透処理機に適合させるために、取り外し可能な透明窓、組織保持構造、及びカバーの構成部品が、典型的な組織学処理溶媒（キシレン、アルデヒド、及びアルコールを含む）に対して化学的に耐性を有することが必須である。これは、透明窓を検体保持構造に、化学的に耐性を有する膠材を使用して結合することにより、透明窓を保持構造に熱融着させることにより、又は、他の手段により結合させることにより達成され得る。全ての場合において、透明窓、検体保持構造、検体カバー、底壁、及び、任意の組織ガイド又は、検体を透明窓に対して保持するように挿入される他の材料は、組織学処理溶媒に対して化学的に耐性を有する材料、例えば、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス、金属、又はポリオキシメチレンプラスチックで作製される必要がある。更に、組織処理中に固定剤、試薬、キシレン、パラフィンワックス、又は他の剤の流動を可能にするために、透明窓、検体保持構造、又はカバーの一部又は全部が、複数の穿孔を包含することが好ましい。これらは、各構成部品に孔を開け、透明窓にレーザ穿孔し、若しくは孔を包含する筐体を射出成形し、又は前述の全てをすることにより実行され得る。
【００４７】
主撮像システムが、大きな検体上における対象となる領域を選択できるように、本発明は、少なくとも２つの次元に沿った、検体ホルダの移動を可能にする。このような移動は、検体ホルダを、主撮像システムと補助撮像システムとの焦点面が一致しない場合には、両焦点面間で移動させるのに使用されてもよい。好ましい実施形態では、リニアモータ、ステッパモータ、又はユーザの操作からの直接的な機械的変換を使用して、移動を実行する。別の実施形態では、検体ホルダは、３つ全ての次元において移動し得る。ここで、検体ホルダの（主撮像システムに対して）垂直方向の移動は、焦点調節を有する透過照明顕微鏡と同様に、検体中の対象となる深さを選択するのに使用される。別の実施形態では、垂直方向移動させる手段は検体ホルダに組み込まれず、深さ調節は、主撮像システム光学系の移動により提供される。一実施形態において、主撮像システムは、従来の組織学顕微鏡の動作を再現し得る。ここで、ユーザは、検体ホルダ及び主撮像システムの高さの両方を、１つ以上のノブ、ダイヤルからの機械的変換により、又は、ユーザからの機械的入力を直接受容するのに十分機械的に堅牢に設計された検体ホルダの一部を押すことにより直接移動させる。検体ホルダの移動を追跡するために、本発明は、少なくとも２つの非垂直軸に沿った位置感知を包含する。一実施形態において、位置感知は、光学的、磁気的、ホール効果センサにより提供されるが、他の手段が使用される場合がある。ただし、それらが、主撮像システムにより撮像される領域サイズより良好な絶対位置精度を有する場合に限る。システムが垂直軸に沿った移動を包含する場合、垂直軸に沿った位置感知を包含するのも有利な場合がある。
【００４８】
図７（ａ）は、一対のノブを有するユーザ入力装置７０９を有する、検体ホルダ７０４を模式的に示す図である。一方の７１１は、軸１を制御し、他方の７１２は、軸２を制御する。この実施形態では、トルクが、ノブの回転からギアボックス７０７に、トルク伝達装置７１０を介して伝達される。検体ホルダの位置における変化は、位置センサ７０６により記録される。組織検体７０１は、透明窓７０５上に載置される。
【００４９】
図７（ｂ）は、ユーザ入力装置７２９が電子的なジョイスティックである、検体ホルダ７０４を模式的に示す図である。コマンドが、入力装置に入力され、電子的又は光学的に、少なくとも２つの軸において作動する電子アクチュエータ７０７に中継される。検体ホルダの変位は、位置センサ７０６により検出される。
【００５０】
図８は、ユーザ入力装置８０９が、ユーザがステージを直接移動させるのに機械的に適した検体ホルダの一領域である、検体ホルダ８０４を模式的に示す図である。検体ホルダの変位は、位置センサ８０６により検出される。
【００５１】
診断的特徴を解像するために、主撮像システムが、細胞特徴、例えば、細胞核を検出するのに十分な横方向（撮像面において、照明方向に対して横）の解像を有することが重要である。好ましい実施形態では、この最少横方向解像は、対象となる病理の診断基準に応じて、最大で５マイクロメートルであり、理想的には１マイクロメートル未満である。検体又は病理を異なる診断基準で撮像するのに対応できるように、主撮像システムは、異なる解像及び倍率を有する２つ以上の交換可能な対物レンズを包含し得る。別の実施形態では、主撮像システムは、共焦点又は多光子顕微観察を使用し、照明光源によりスキャンされる領域を変えることにより調節可能な倍率を有する。
【００５２】
主撮像システムにおいて特定の解像及び倍率を達成することによって、装置の視野が限定される。これにより、多くの場合、数ミリメートルを超える視野を撮像することが困難であるか又は高価となり、多くの実施形態では、直径１ミリメートル超の画像を生成することは非実用的であり得る。更に、主撮像システムは、手術用インク、縫合糸、又は他の外在性マークを含む、いくつかの肉眼的に明白な特徴を撮像することが困難な場合がある。主撮像システムの限定的な視野により、大きな検体の評価が困難になり、オペレータが対象となる領域を位置合わせできない場合、特定性が低下する場合がある。画像当たりの限定された広さの領域を補うために、本発明は、主撮像システムより低倍率を有する補助撮像システムを包含する。補助撮像システムは、細胞解像又は光学的深部断面可視化を必要とせず、主撮像システムと一致した焦点面を有さなくてもよく、検体全体を撮像し、病理を含む主撮像システムによる撮像のための領域の選択をガイドするのに使用できる。当該領域は、手術用インク、縫合糸、若しくは他の外在性マークにより評価用にマークされたもの、又はそれ以外では対象となるものである。
【００５３】
一実施形態において、補助撮像システムは、０．１〜５の倍率を有し、光センサの二次元アレイを含むカメラシステム、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）又は相補型金属酸化膜半導体アレイ（ＣＭＯＳ）と、主撮像システムとは物理的に区別されるカメラレンズとを備える。照明光源からの照明は、より厚い検体について透過又は落射配置の両方で提供され得るが、十分な照明を確保するのには、落射照明が好ましい。更に、透明窓からの任意の反射が補助撮像システムの角度容認の外側となるように、照明を、透明窓に対して傾けることが有利である。透過配置にある照明は、一部の場合において、落射形状の照明よりも好ましい。例えば、透過照明が手術用インク、縫合糸、又は他の外在性マークの可視化が、光を検体に通過させ、外在性又は内在性の特徴と検体全体にわたって相互作用させることにより改善し得る場合である。補助撮像システムの倍率は、透明窓の全体を撮像できる値に固定されてもよく、又は、検体サイズに応じて、ズームレンズを使用して調節可能であってもよい。ステージが補助画像の取得中に移動し得るため、補助撮像システム及び主撮像システムにより撮像される位置が一致しないことが必須ではなく、より好適であり得、したがって、このような移動によって透明窓及び組織検体を撮像システム間で移動させる必要があることは明らかであろう。この実施形態は、主撮像システムが撮像中に組織検体の一部を不明瞭にする場合もあるため、有利であり得る。
【００５４】
別の実施形態では、図９に示されたように、補助撮像システム９０５は、０．１〜５の全体倍率を有するレンズ９０７の後方に、ラインスキャンカメラなどの光センサ９０６の一次元デジタル配列を有する撮像システム９０４を備える。この実施形態では、検体ホルダ９０１及び透明窓９０２は、直線撮像焦点９１０に対して垂直に移動して、二次元画像を構築し得る。このアプローチの好ましい実施形態では、照明９０８も、透明窓上に補助撮像システムと空間的に重なるように配列された一次元ラインである。このアプローチは、二次元アレイを上回る複数の利点を有する。第一に、一次元撮像システムは、傾斜ミラー９０３の手段により、画像歪みなしに、透明窓に対して非垂直角で配向され得る。これは、第２の軸が物理的な移動により生じるためである。この構成は、高倍率撮像光学系が透明窓の部分を、非常に大きな視野を許容することにより不明瞭にする場合に有利であり得る。第二に、非垂直軸を使用することにより、透明窓からの任意の反射が更に低減され得るか、又は、より広い範囲の照明配置を使用し得る。最後に、透明窓が矩形である場合、表面の長軸を移動方向に配向させることにより、同等の広さの領域を撮像し得る二次元アレイの画素数よりも実質的に安価になり得る。
【００５５】
好ましい実施形態では、補助撮像システムは、脂肪又は間質などの組織特徴の識別を容易にし、かつ、外科的縁（摘出の縁）又は疑わしい病理の配向、位置を示すのに使用する手術用インクなどの着色組織マークを位置合わせするために、１つ以上の色で画像を生成する。一実施形態において、これは、白色光照明と、赤色、緑色、及び青色のフィルタ画素を使用して光を記録する一次元又は二次元色センサのいずれかとを含む。別の実施形態では、スペクトル選択性は、１つ以上の画素カラーフィルタを有するセンサと複数の波長又は狭帯域の連続的な照明とを組み合わせて、４つ以上の色チャネルにより画像を取得することにより向上し得る。この構成において、照明は、白色光発光ダイオード（ＬＥＤ）、次いで単色ＬＥＤ、レーザ、又は着色光の別の高強度光源により提供され得る。
【００５６】
別の実施形態では、補助撮像システムは、例えば、手術用インク、縫合糸、又は他の外在性マークなどの組織特徴の識別を容易にするために、図２１に示されたように、組織検体を透過配置において照明することにより画像を生成する。この実施形態では、補助撮像システム２１０４は、検体ホルダ２１０１の蓋２１０３上に、組織検体２１０２を上から照明する両照明２１０５を包含する。
【００５７】
複数の手術用インク色を使用する場合において、類似する着色組織からインクを区別するには、インクには存在するが、組織検体には存在しないことが知られているスペクトル特性に対応する照明波長を選択することが必須であり得る（例えば、血液からの赤色インク又は脂肪からの黄色インク）。この場合には、２つ以上の分光チャネルが、補助撮像システムに必要とされるであろう。ほとんどの組織の外観色は、複数の層間の複雑な相互作用によるため、多くの組織種は、吸収及び反射が可視スペクトル内で１０ナノメートルのスケールでほとんど変化しないように、広く、連続的に変化するスペクトルを有する。対照的に、多くの手術用インクは、波長の小さい変化による吸収又は反射における突然の変化をもたらす、シャープに画定された分子吸収バンドを有する材料から構成される。一実施形態において、２つ以上の分光チャネルが利用され、組織検体上での手術用インク、縫合糸、又は外在性マークの識別可能な色又はスペクトルは、組織ではなくインクに対して分光チャネルそれぞれにおいて異なる強度をもたらす。別の実施形態では、狭帯域照明波長は、インクにより強力に吸収され、かつインクにより強力に吸収されない波長に隣接する波長に対応するように選択される。この実施形態では、白色光照明は、インクからの反射光が中程度の減衰を示すであろう。一方、狭い帯域照明は、劇的な減衰を示すであろう。分光チャネル間の相対的な減衰を比較することにより、処理装置は、手術用インク、縫合糸、又は外在性マークの、医療的処置中に作製された組織検体上での位置を正確に決定し得る。この処理は、容易に検出可能な分光特性を有する各種の市販の手術用インクから選択することを更に含む。本発明の処理装置は、主撮像システム、補助撮像システム、及び検体ホルダ上の位置センサからの情報を処理して、図１０に示すような組織検体の合成表示画像１００２を生成し、ユーザに対して表示装置１００１上に表示する。組織検体の合成表示画像は、補助画像の表示画像１００４と組み合わせたＶＴＭを使用して処理され得る、連続的な画像からの画像の表示画像１００３と、処理装置により処理された１つ以上の位置センサ１００７からの位置の指示とを含む。最低でも、両表示画像は、表示装置の解像度内に適合するスケールである必要があり、ユーザが主撮像システムを使用し、一方で、大きな検体上での対象となる領域を位置合わせするのに補助画像及び位置センサデータを使用して、顕微観察的な病理を素早く評価できるように処理される必要がある。一実施形態において、この処理は、補助撮像システムからの色画像により、色に基づく手術用インク又は組織特徴の識別を増強する一連の命令である。別の実施形態では、補助表示画像を拡大し又は移動させる特徴は、処理装置により提供される。
【００５８】
好ましい実施形態では、合成表示画像は、細胞核１００５の可視化を改善するためのＶＴＭ処理を使用した主撮像システムにより生成された連続的に更新される連続的な画像である細胞解像、検体当たり１回程度の低頻度で更新される静的な補助画像、及び、組織検体ナビゲーションを支援するための処理装置により計算される主撮像システムの現在の撮像位置に対応する補助画像１００６上のサブ領域を含む。このサブ領域は、補助画面上に幾つかの方法で示され得る。その方法としては、各新しいフレームと同時に主撮像システムから更新された補助画像上にマーカーを置くことにより、又は、検体ホルダの任意の移動に比例する補助画像の移動を計算することによりグラフィカルに示す方法が挙げられるが、これらに限定されない。組織検体の主撮像システムに対する空間配向を決定する補助は、主撮像システムが外光、例えば、室内灯に対して敏感であることから、室内灯を遮断するために密に嵌る蓋を必要とする場合に、特に有益であり得る。この実施形態では、密に嵌る蓋は、主撮像システム又は補助撮像システムのいずれかにより検出される波長に対して不透明な材料から構成され、透明窓及び組織検体全体を完全に視認不能にし、室内の迷光を遮断する。この実施形態では、主撮像システムがアクティブである間は、ユーザによる検体への目視によるアクセスはないと考えられ、したがってユーザは、巨視的な組織特徴の配向、検査のための、また手術用インク又は縫合糸などの外在性マークを観察するための補助撮像システムに完全に依存するであろう。Ｗｉｎｄｏｗｓコンピュータを処理装置として使用して実行される合成表示画像の例を、図１１における表示装置上に示す。合成表示画像１１０１は、連続的な画像からの画像の表示画像１１０２と、ステージの現在の位置のグラフィック１１０４及び数値１１０５の表示画像を含む補助画像１１０３の表示画像との組み合わせからなる。ユーザは、撮像を開始し、撮像パラメータを調整し、又は、更なるコントロール１１０６を使用してデータを保存し得る。
【００５９】
好ましい実施形態では、処理装置は、中央処理装置（ＣＰＵ）及びグラフィック処理装置（ＧＰＵ）を有する、パーソナルコンピュータであるが、他の装置、例えば、マイクロコントローラ、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、又はシステムオンチップ（ＳＯＣ）が、パーソナルコンピュータ及びＧＰＵに加えて又はこれらに代えて利用され得る。図１２は、一実施形態を模式的に示す。この実施形態において、処理装置１２０２中のＧＰＵ１２０３上で動作し、グラフィックプログラム言語又はＡＰＩ（例えば、ＣＵＤＡ、ＯｐｅｎＣＬ、ＯｐｅｎＧＬ、ＷｅｂＧＬ、Ｄｉｒｅｃｔ３Ｄ、Ｍｅｔａｌ、Ｖｕｌｋａｎ、又はＭａｎｔｌｅが挙げられるが、これらに限定されない）で実行される、並列プログラムの一種であるカーネル１２０４により並列処理用のハードウェア１２０５を使用する。カーネルという用語は、一部のＡＰＩではシェーダ、ピクセルシェーダ、又はフラグメントシェーダを含む他の名称を有し得ることが理解される。グラフィックプログラム言語又はＡＰＩの使用は、それらがＧＰＵの能力を発揮させて、連続的な画像１２０１にわたって画像計算を素早く行い、画像処理タスクを多くの並列処理動作に分割し、当該動作をＧＰＵ内の数百又は数千の並列処理装置上で同時に動作させ得ることにより、連続的な画像の処理された表示画像１２０６をリアルタイムに生成するため、有利である。対照的に、従来のＣＰＵ又はＤＳＰ上での処理は、多くの場合、ほんの数個又はたった１つのみの同時動作に限定され、結果として、遅延が増大する。ただし、別の実施形態では、特に、主撮像システムの更新速度又は解像が、ＧＰＵ上での並列処理が不要なほど十分に低い場合、従来の非並列処理が使用され得る。
【００６０】
伝統的な組織病理診断に精通したユーザに対して、合成表示画像は、従来のＨ＆Ｅ組織病理診断又は、トリクローム染色若しくは免疫組織化学などの他の組織学技術の、外観をシミュレーションするＶＴＭを使用する、主撮像システムにより連続的に取得された画像の更なる処理を更に含んでもよい。多くの用途において、ＧＰＵにより実行される並列処理は、従来のプロセッサ上で連続的な画像のＶＴＭ表示画像をレンダリングするのに関連する待ち時間を最短化するのに使用され得る。１１０２は、組織検体の合成表示画像１１０１内の連続的な画像における１つの画像をＧＰＵによりレンダリングしたＶＴＭ表示画像を示す。
【００６１】
種々のアルゴリズムが、Ｈ＆Ｅ又は、トリクローム染色若しくは免疫組織化学などの他の組織学技術の、外観を再現するＶＴＭ表示画像を生成するために提案されてきた。最も単純なものは、分光画像それぞれを種々の色で直接着色し、ついで、種々の色を重ね合わせて、ＶＴＭ表示画像を形成する線形アルゴリズムである。ただし、これらの方法は、満足のいく画像を生成しない場合がある。Ｈ＆Ｅ染色を再現するＶＴＭ処理の好ましい実施形態は、下記式に従って、組織学スライドにおいて濃度を有する光の指数関数形吸収を再現する非線形アルゴリズムを使用する。
【００６２】
Ｒ＝（１／（１−ｅｘｐ（−ｋ））＾２）＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｒｅｄ＊Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｒｅｄ＊Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））
Ｇ＝（１／（１−ｅｘｐ（−ｋ））＾２）＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｇｒｅｅｎ＊Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｇｒｅｅｎ＊Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））
Ｂ＝（１／（１−ｅｘｐ（−ｋ））＾２）＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｂｌｕｅ＊Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））＊（ｅｘｐ（−Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｂｌｕｅ＊Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙ＊ｋ）−ｅｘｐ（−ｋ））
【００６３】
式中、Ｒ、Ｇ、及びＢは、表示装置に表示された際のＶＴＭ画像の赤色、緑色、及び青色それぞれの強度であり、Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｒｅｄ、Ｂ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｇｒｅｅｎ、及びＢ＿Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，ｂｌｕｅは、赤色、緑色、及び青色それぞれの光についてのヘマトキシリンの吸光度であり、Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｒｅｄ、Ｂ＿Ｅｏｓｉｎ，ｇｒｅｅｎ、及びＢ＿Ｅｏｓｉｎ，ｂｌｕｅは、赤色、緑色、及び青色それぞれの光についてのエオシンの吸光度であり、一方、Ｉ＿ｎｕｃｌｅａｒは、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する発色特異性を有する蛍光造影剤の強度であり、Ｉ＿ｓｅｃｏｎｄａｒｙは、補完的な造影源の強度であり、ｋは、表示の動的範囲全体を確実に利用するための任意のスケール定数である。ついで、上記式は、連続的な画像の各画像の各画素に画素毎に適用される。ｋの値は、画素のフォーマット及び強度値のスケールにより決まるが、好ましくは、０（黒色）と１（最大強度）との間で調整される画素値について、２．５のオーダーにある。赤色、緑色、及び青色のチャネルについてのＢ＿ヘマトキシリンの好ましい値はそれぞれ、約０．８６、１．０、０．３０であり、一方、赤色、緑色、及び青色のチャネルについてのＢ＿Ｅｏｓｉｎの好ましい値はそれぞれ、約０．０５、１．０、及び０．５４４である。この実施形態は、ヒトの乳房組織の光学的断面可視化画像を使用して、図１３に示され、ここでは、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方に対する発色特異性を有する分光チャネル１３０１及び補完的な造影源による分光チャネル１３０２は、ＧＰＵを使用してリアルタイムに処理されて、ＶＴＭ画像のリアルタイム配列を生成し、同配列から、上記等式を使用して赤色チャネル１３０３、緑色チャネル１３０４、及び青色チャネル１３０５で１つのフレームが構成される。上記式は、ＲＧＢ色空間、例えば、ｓＲＧＢを仮定して与えられるが、それらは、赤色、緑色、又は青色に代えて、他の主な色を使用する他の色空間にわずかに変換され得ることを理解されたい。
【００６４】
任意の実施形態において、ＶＴＭ処理は、連続的な画像において、透過照明顕微観察画像の外観を再現し得る。この場合画像は、対象となる物質が存在すればより明るく生成され、そうでない場合は暗くなる。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、処理装置は更に、図１４に示されるように、補助画像の表示画像１４０５がユーザを誘導して組織検体の関連領域１４０４を選択させ、補助画像のサブ領域１４０６を示すことにより主撮像システムを用いた評価をさせる処理工程を含んでもよい。これらの関連領域は、手術中に置かれた縫合糸１４０１、外科的縁を示す着色領域１４０２、又は他の外在性マーカー１４０３により示され得る。別の実施形態では、赤色、緑色、及び青色のチャネルは、白色光照明下で取得され、次いで連続的に、狭帯域照明下で取得され、１つ以上の波長での更なるチャネルが取得される。この実施形態では、補助撮像システムは、４つ以上の分光チャネルを含み、当該分光チャネルは示された手術用インク、縫合糸、又は外在性マークの位置により合成表示画像を生成するように処理され得る。例えば、一実施形態では、図１５に模式的に示された補助撮像システムを使用して、１つ以上の波長での狭帯域照明を使用することにより、血液、インク、又は両方のスペクトル特徴を特定して、ユーザが赤色インクと血液とを区別するのを補助してもよい。この実施形態では、補助撮像システム１５０７は、透明窓１５０１を択一的に照明する広帯域照明１５０２及び狭帯域照明１５０３の両方を包含する。これにより、補助画像は更なる分光チャネルを含むことができる。ついでインクの領域は、処理装置により、広帯域照明と狭帯域照明との間の吸収差を使用して位置決めすることができ、組織検体上の手術用インク、縫合糸、又は外在性マークの位置を含む組織検体の合成表示画像に組み込まれ得る。例えば、着色マージンの位置は、補助表示画像に固有の色で示されることができ、又は、補助画像の複数の表示画像を、示されたインクのみで及び示された組織のみで計算し得る。
【００６６】
組織検体の遡及的レビューを可能にするために、本発明は、データ記録及び記憶機能を包含してもよく、この場合、処理装置に対する一部又は全部の入力が、受信されたときに記録される。この特徴は、リアルタイム評価が完了した後に、組織検体の完全な評価が行われたことを記録するのに有利であり得る。一実施形態において、補助画像が記憶され、ついで、連続的に取得される画像において新たな画像が受信される毎に、現在の検体ホルダ位置が、画像と共に記録される。手順が終了した後に、手順中に生成された合成表示画像からの出力は、記憶された入力をロードし、実際の手順のように連続的に処理装置に対して提供することにより正確に再現できる。記憶スペースが限られる場合、データは、検体ホルダが移動する際の画像のみを記録し、又は、データ容量を更に小さくするために周知の画像圧縮技術を適用することにより、より効率的に記憶され得る。
【００６７】
主撮像システムの分光チャネルの構成が、使用される任意の蛍光造影剤の発光波長に依存することから、適切に選択された励起波長及び発光波長を有する蛍光造影剤を含む、キットに本装置を組み込むことが有利であり得る。このキットは、主撮像システムの照明光源波長と重なる励起波長と、分光チャネルのうちの少なくとも１つと重なる発光波長とを有する核造影剤を含み得る。更に、更なる第２の蛍光造影剤を、キットに含むことが有利であり得る。この剤は、主撮像システムの照明光源波長と重なる励起波長と、核造影剤とは異なる分光チャネルと重なる発光波長をも有するように選択される。一実施形態において、二次蛍光造影剤は、エオシン−Ｙである。別の実施形態では、二次造影は、蛍光標識抗体などの免疫組織化学を行う剤により提供される。別の実施形態では、キットは、例えばトリクローム染色を行うための、３つ以上の蛍光造影剤を含有し得る。
【００６８】
キットは、本発明に記載された装置により読取可能な識別子を更に含んでもよい。この識別子は、キットの内容物を説明し、複数の可能性のある用途を可能にし得る。例えば、一実施形態において、識別子は、キットの内容物を固有に識別する。これにより、キットが異なる蛍光造影剤を含有でき、処理装置が、蛍光造影剤の選択に応じて異なるシーケンスの命令を実行することができ、又は、スペクトル分解されたチャネルの波長を再構成することができる。これは、異なる医療的手法が、異なる蛍光造影剤を使用した異なる細胞機構の可視化を必要とする場合に有利であり得る。例えば、１つの識別子は、Ｈ＆Ｅ染色の特徴を再現する仮想透過顕微観察を行うためのキットを示してもよく、一方で、別のキットは、トリクローム染色又は免疫組織化学の仮想透過顕微観察レンダリングを行うための蛍光造影剤を含有してもよい。別の実施形態では、識別子は、キットの組成及び製造日の両方を固有に識別する。これにより、システムが、非常に古いキット、欠陥であると知られているバッチからのキット、又はシステムとの適合性が何らかの方法で未知であるキットを使用して、撮像することを排除できる。一実施形態において、識別子は、キットに一体化されたメモリとして実装でき、識別子リーダにより電気的に読み出されることができる。このシナリオでは、識別子リーダは、識別子と接触する電気回路で、装置の処理装置により制御され得る。別の実施形態では、識別子は、識別子リーダとの無線通信を可能にする無線、マイクロ波、近接場、又は他の電磁トランシーバに接続されたメモリとして実装され得る。別の実施形態では、識別子は、改ざんを防止する更なる特徴、例えば、埋め込みセキュリティ素子、暗号処理プロセッサ、又はキットの完全性を検証する他の処理を更に含み得る。
【００６９】
キット内において、種々の形態の蛍光造影剤を使用可能である。蛍光造影剤は、精製、脱水された形態において分散され得る。代替的に、各蛍光造影剤は、それ自体の媒体に溶解されて分散され得る。この溶媒は、造影剤を安定化させる、又は、組織への急速な分散を可能にするなどの機能を提供し得る。別の実施形態では、共通する媒体に対して可溶性であり、化学的に安定する２つ以上の蛍光造影剤を使用する。この媒体は、直接組織検体を染色するのに適していてもよく又は、例えば、緩衝生理食塩水に造影剤の濃縮液を混合して、使用直前に別の媒体と混合してもよい。別の実施形態では、使用直前に混合された複数の溶液を含み、これは１つ以上の蛍光造影剤が化学的に不安定な場合、又は貯蔵期間が限られる場合に有利であり得る。
【００７０】
時間が限られる医療シナリオにおいて、素早い染色を容易にするために、キットは、蛍光造影剤を混合するための容器、又は、蛍光造影剤により染色しながら組織を浸漬するための容器を更に含み得る。この容器は、素早い染色と、検体の検体ホルダへの移動を容易にし得る。別の実施形態では、染色は、検体ホルダにおいて、又は、取り外し可能な透明窓上において直接行われ得る。
【００７１】
組織検体のリアルタイム光学撮像を行うための方法１６００のフロー図を、図１６に示す。工程１６０１において、１つ以上の蛍光造影剤を、組織検体に適用する。工程１６０３において、組織検体を、検体ホルダに載置する。ついで、工程１６０５において、補助画像を、補助撮像システムにより取得する。次に、工程１６０７において、システムは、連続的な画像を取得し始める。工程１６０９において、連続的に取得された画像、位置センサの位置、及び補助画像を処理して、組織検体の合成表示画像を生成する。工程１６１１において、組織検体の合成表示画像を、ユーザにリアルタイムに表示する。最後に、工程１６１３において、合成表示画像を使用して、ユーザが検体ホルダの移動を決定する。ついで、方法１６００の工程１６０７から１６１３を繰り返し、合成表示画像は、位置及び診断情報の両方を提供する。最終的に、病理の存在について検体が十分に評価され、診断がなされる。
【００７２】
本発明を使用するワークフローを実行して、病理の存在について組織検体を評価するための一般的な手術中又は手術後の方法１７００を、図１７に示す。組織の評価の準備のために、工程１７０１及び１７０３において、組織を患者から切除し、組織検体の最適な評価を可能にするように、１つ以上の組織検体へと切り出す。工程１７０５において、組織検体を、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方を標識する少なくとも１つの外在性染料により素早く染色し、工程１７０７において、対象となる表面を倒立顕微鏡において評価できるように、透明窓上に配置する。透明窓は、補助撮像システムが組織検体の画像を取得でき（工程１７０９）、補助画像を記録する（工程１７１１）ように配置される。工程１７１３において、補助画像を使用して、対象となる組織検体を、ユーザが選択し、主撮像システム上を移動させる。工程１７１５において、主撮像システムが、連続的な画像の取得を開始し、組織検体の合成表示画像を、表示装置上で連続的に更新する（工程１７１７）。組織検体の合成表示画像を使用して、ユーザは、組織検体に存在する任意の病理を評価し得る。評価後に、ついで、ユーザは、透明窓上の別の組織検体を選択し（工程１７１９）、評価プロセスを繰り返すことができる（工程１７１３〜１７１９）。
【００７３】
図１８に、乳ガンを処置するための乳ガン腫瘍摘出術中に外科的縁を評価するために、本発明を使用するワークフローを実行する方法１８００のフロー図を示す。工程１８０１において、バルク乳房組織を患者から切除する。患者の体外でバルク乳房組織の向きを判別可能とするために、工程１８０３において、バルク乳房組織を種々の色の手術用インクにより着色し、手術腔の側面を示す。工程１８０５において、バルク組織を、１つ以上の組織検体へと切り出す。工程１８０７において、組織検体を、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方を可視化する少なくとも１つの造影剤により素早く染色する。先に記載された一般的な方法の場合と同様に、工程１８０９において、組織検体を、主撮像システム及び補助撮像システムにて評価するように、透明窓上に載置する（工程１８１１）。大きなサイズの多くの乳房切除サンプルであるため、複数の切片が同時に、検体ホルダに配置され得る。検体ホルダを、補助撮像システムが画像を取得し、補助画像が記録される（工程１８１３）ように配置する。工程１８１５において、補助画像の表示画像を使用して組織検体及び対象となる領域をユーザにより選択し、主撮像システム上に載置する。工程１８１７において、主撮像システムは、ＶＴＭ処理を含む、組織検体の連続的な画像及び合成表示画像の取得を開始し（工程１８１９）、処理装置により連続的に表示装置に更新される（工程１８２１）。工程１８２３において、補助画像を使用して、種々の色の手術用インクを可視化し、対象となる領域をこの情報に基づいて選択する。工程１８２５及び１８２７において、組織検体の合成表示画像を使用して、ユーザは、組織検体に存在する病理を評価し、補助画像の表示画像上に示された主撮像システムの位置を使用して、インクにより示された外科的縁に対する病理の距離を測定し得る。存在する病理が本来の外科的縁に近すぎる場合、患者は更なる手術が必要となり得る。必要に応じて、ユーザは、補助画像を使用して別の対象となる組織を選択し、評価手順を繰り返すことができる。
【００７４】
図２２は、外科的縁を評価するために本発明を使用し、ルーチンな組織学処理のための検体保持構造及び検体カバーを有する取り外し可能な透明窓に組織検体を提供するワークフローを実行する方法２２００のフロー図を示す。工程２２０１において、バルク組織を、患者から切除する。工程２２０３において、組織検体を、より小さい切片に切断し、工程２２０５において、細胞核若しくは細胞核成分又はこれら両方を標識する少なくとも１つの外在性染料により素早く染色する。工程２２０７において、各検体を、組織学検体カセットに搭載された透明窓上に載置し、複数の組織学検体を同時に、検体ホルダに載置する。工程２２０９において、病理医により、組織を主撮像システム及び補助撮像システムを使用して評価する。評価後に、工程２２１１及び２２１３において、組織学検体カセットに搭載された透明窓に、固定剤を浸透させる。固定後に、工程２２１５において、透明窓における検体を、組織処理機を使用して処理する。組織を処理した後に、工程２２１７において、ルーチンな組織学調製、例えば、パラフィン包埋及び組織薄片化を使用して病理学的評価を行う。本発明の実例を以下に紹介する。各例の詳細な仕様は、本発明がこの例に限定されることを意味しない。
【００７５】
図１９は、主撮像システムが多光子顕微鏡である、本発明の例示となる実施形態の正面及び上面の写真を表わす。例示となる実施形態は、取り外し可能な透明窓１９１０及び透明窓を囲む流体保持構造１９１１を有する検体ホルダ１９０１と、主撮像により使用される対物レンズ１９０２と、補助撮像システムにより使用されるカメラ１９０３及びライン照明１９０４と、組織検体１９０６の合成表示画像を示す表示装置１９０５と、検体ホルダの移動を提供するユーザ入力装置１９０７と、主撮像システム１９０８の垂直移動を提供する第２のノブとを包含する。主撮像システム及び二次撮像システムはともに、保護筐体１９０９に包囲され、防振フレーム１９１２上に配置される。
【００７６】
図１３は、図１９に撮影された本発明の実施形態により記録された連続的な画像からの画像を、別個の各核造影チャネル及び補完造影チャネルの両方並びに同じ画像のＶＴＭ表示画像として示す。この画像を取得するために、直径約５ｃｍと測定された乳房組織を、手術切除サンプルから得た。直径０．５ｃｍの組織検体を、乳房組織から切り出し、蒸留水に溶解させたＤＡＰＩ（濃度１０μｇ／ｍｌ）、エオシン（濃度２５０ｎｇ／ｍｌ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（濃度１００μｌ／ｍｌ）の溶液中で２分間染色した。染色後、組織を、ハンクス液（ＨＢＳＳ）中で洗浄して、任意の過剰な染色液を除去し、検体ホルダ上に配置された取り外し可能な透明窓上に載置した。透明窓を、補助撮像システムにより撮像した。補助画像の表示画像を使用して、組織検体を、主撮像システム上に、ユーザ入力装置としてのジョイスティックを使用して位置合わせした。主撮像システムは、検流計スキャナ（垂直軸）及び１６ＫＨｚのラインスキャンレートでのレゾナントスキャナ（水平軸）を使用して、１．０ＮＡ対物レンズを通して組織検体に対して二次元で、放射電力２０ｍＷ、波長７８０ｎｍ、パルス幅１６０ｆｓ、及びパルス反復速度８０ＭＨｚを有するパルスチタン−サファイアレーザでスキャンした。２つのＨａｍｍａｍａｔｓｕ  Ｈ７４２２−４０Ｐ  ＰＭＴは、５２５ｎｍ未満の波長を透過させ、より長い波長を反射させて、２つの分光チャネルを生成する、４５度の二色性ビームスプリッタを使用して分光チャネルを受容するように構成された。第１のチャネルは、４３５〜４８５ｎｍの通過帯域を有するバンドパス発光フィルタにより更にフィルタリングされ、第１のチャネルを、ＤＡＰＩから発光された蛍光１３０１を収集するために使用した。第２のチャネルは、５３８〜６４２ｎｍの通過帯域を有するバンドパス発光フィルタにより更にフィルタリングされ、第２のチャネルを、エオシン−Ｙから発光された蛍光１３０２を収集するために使用した。この実施形態を使用して、新たに切除したヒトの乳房組織の病理評価が、熟練の病理医により、外科手術中に撮像するのに適した速度で実証された。
【００７７】
図２０に、主撮像システムの実施形態が共焦点顕微鏡である、別個の核造影チャネル及び補完造影チャネルの両方として示された連続的な画像からの画像を示す。この実施形態における組織の初期調製を、多光子の例の場合と同様に行う。手術中に患者から切除したバルク組織を、組織検体へと切り出した。組織検体を、蒸留水に溶解させたＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（濃度２０μｇ／ｍｌ）、エオシン（濃度２５０ｎｇ／ｍｌ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（濃度１００μｌ／ｍｌ）の溶液中で２分間染色した。補助撮像システムを使用して、組織検体の画像を取得した。補助画像の表示画像を使用して、組織検体を、主撮像システム上に位置合わせする。主撮像システムは、ガルバニックミラーのセットを使用して、組織検体を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を励起する中心波長４０５ｎｍを有するダイオードレーザとエオシン−Ｙを励起する中心波長４８８ｎｍを有するアルゴンイオンレーザとの２つのレーザにより、二次元においてスキャンする。２つの分光検出器により、染色組織検体からの蛍光発光が収集される。共焦点顕微鏡は、照明光学経路と検出光学経路とを組み合わせるための１組の二色性ビームスプリッタを有する。この例では、多通過帯域ビームスプリッタユニットは、４０５ｎｍの光及び４８８ｎｍの光について高反射係数を有する。検出器は、４９０ｎｍ未満の波長を通過させる二色性ビームスプリッタを使用して分光されて、２つの分光チャネルを生成する。第１のチャネルは、４２０〜４８０ｎｍの通過帯域を有するバンドパス発光フィルタにより更にフィルタリングされ、第１のチャネルを、ＤＡＰＩから発行された蛍光２００１を収集するために使用した。第２のチャネルは、５３０〜７００ｎｍの通過帯を有するバンドパス発光フィルタにより更にフィルタリングされ、第２のチャネルを、エオシン−Ｙから発光された蛍光２００２を収集するために使用した。
【００７８】
全ての特許、公開された出願、及び本明細書で引用された参考文献の教示は、その全体が参照により組み込まれる。
【００７９】
本発明は、その例示となる実施形態を参照して特に示され、記載されているが、当業者であれば、形式及び詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなくなされ得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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