(57)【要約】  本発明は、多糖及びオリゴ糖、並びにその食品的効果の分野に関する。具体的には、（α１→３）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの製造方法に関する。本発明はまた、（α１→４）及び（α１→３）の交互のグルコシド結合を含み、（α１→３，４）分岐点を有する分岐鎖状α−グルカン、食品組成物、並びにデンプン含有食品材料の消化性炭水化物を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供する。更に、本発明のいくつかの態様は、細菌、酵素及び発現ベクターである。【選択図】  図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（α１→３）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの製造方法であって、
非還元末端に少なくとも２つの（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を、（α１→４）グルコシド結合を切断でき、かつ新しい（α１→３）グルコシド結合を生成できるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させて、連続する（α１→３）グルコシド結合を形成することなく、（α１→３）グルコシド結合を散在させた（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有するグルコースポリマーを形成するステップを含み、
前記α−グルカノトランスフェラーゼが、ＧＴＦＢ、ＧＴＦＣ及びＧＴＦＤタイプの酵素からなる群から選択される、又は、特定の酵素活性を有するそれらの機能的ホモログである、方法。
【請求項２】
前記α−グルカノトランスフェラーゼが、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α−グルカノトランスフェラーゼが、ラクトバシラス・ファーメンタムＧＴＦＢ酵素である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質が、少なくとも５の重合度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が、デンプン、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、（α１→４）グルカン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記基質が、穀粉中に含まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（α１→３）グルコシド結合が散在しており、（α１→３，４）分岐点を有する、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含むα−グルカンであって、
前記α−グルカンが少なくとも３％の分岐比率を有し、１重量％未満で連続する（α１→３）結合を含み、５×１０２Ｄａ〜１×１０７Ｄａの平均分子質量を有する、α−グルカン。
【請求項８】
請求項７に記載のα−グルカンを含む食品組成物。
【請求項９】
前記食品組成物が、飲料、朝食用シリアル、ペットフード製品、焼成された生地製品、又は菓子製品である、請求項８に記載の食品組成物。
【請求項１０】
食品材料の消化性炭水化物を還元するための、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用。
【請求項１１】
配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む細菌。
【請求項１２】
前記細菌がラクトバシラス・ファーメンタムである、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１３】
ラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８。
【請求項１４】
配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素。
【請求項１５】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖及びオリゴ糖、並びにその食品的効果の分野に関する。具体的には、（α１→３）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの製造方法に関する。本発明はまた、交互に（α１→４）及び（α１→３）のグルコシド結合を含み、（α１→３，４）分岐点を有する分岐鎖状α−グルカン、食品組成物、並びにデンプン含有食品材料の消化性炭水化物を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用、を提供する。更に、本発明のいくつかの態様は、細菌、酵素及び発現ベクターである。
【背景技術】
【０００２】
肥満及び過体重は、世界中で急激に増加している。満腹感が高く、かつエネルギー密度が低い食品の開発により、体重増加の防止及び体重減少の促進が可能となる。砂糖の代わりに非消化性炭水化物を含有する飲食品を消費することにより、砂糖含有飲食品と比較し、食後の血糖上昇が低く抑制される。
【０００３】
ヒトの食品の中で最も一般的な炭水化物は、デンプンである。この多糖類は、殆どの緑色植物により貯蔵エネルギーとして生産される。そして、ジャガイモ、小麦、トウモロコシ、米、キャッサバなどの主食に多く含まれる。デンプン及びマルトオリゴ糖を、非消化性炭水化物に化学修飾するための様々な方法が提案されている。
【０００４】
欧州特許第２４２７５６５号は、ラクトバシラス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）１２１ＧＴＦＢのグルカノトランスフェラーゼ酵素の使用による、デンプンから、比較的長いイソマルトオリゴ糖単位を含む直鎖状グルコオリゴ糖への変換について記載している。かかる材料は、部分的に消化に対する耐性を有するため、消費した際にグルコースの生成が少なく、肥満及びＩＩ型糖尿病の予防に役立つ。
【０００５】
アミロースは、（α１→４）結合のみを有し、消化性の高いα−グルカンである。（α１→３）結合したＤ−グルコース単位の導入により、消化性が低下する。Ｃｌａｄｏｎｉａ属の地衣類は、直鎖状構造の（α１→３）及び（α１→４）の交互結合を有するα−グルカンを産生するが（Ｗｏｒａｎｏｖｉｃｚ−Ｂａｒｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５２，１０６９〜１０７４（１９９９））、これらのα−グルカンは水不溶性であるため、それらの食品用途は限られたものとなる。
【０００６】
デンプン、デンプン誘導体及びマルトオリゴ糖を酵素的に改変して、それらの機能特性を変更し、それらの栄養的価値を高めるための更なる手段を提供することが望ましいと考えられる。得られる材料は、低い消化性及び良好な溶解性を両立するものであることが理想的である。特に、食品製造への使用に適し、良好な酵素活性及び耐熱性を示す酵素を用いてかかる修飾を行うことは有益である。
【０００７】
本明細書における先行技術文献のいかなる参照も、かかる先行技術が周知であると、又は当分野で共通の一般的な認識の一部を形成していると認めるものとはみなされるべきではない。本明細書中で使用される場合、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」という語、及び同様の語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは「含むが、これらに限定されない」ことを意味することを目的としている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の課題は、従来技術を改良すること、そして、デンプン及び他の多糖若しくはオリゴ糖を、消化性の低い材料へ酵素的に修飾するための改良手段を提供すること、又は少なくとも有用な代替物を提供することである。本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開するものである。
【０００９】
したがって、本発明は、第１の態様において、（α１→３）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの製造方法を提供するものであり、当該方法は、非還元末端に少なくとも２つの（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を、（α１→４）グルコシド結合を切断でき、新規な（α１→３）グルコシド結合を導入できるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させて、連続する（α１→３）グルコシド結合を形成することなく、（α１→３）グルコシド結合を散在させた（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有するグルコースポリマーを形成するステップを含み、α−グルカノトランスフェラーゼは、ＧＴＦＢ、ＧＴＦＣ及びＧＴＦＤタイプの酵素からなる群から選択される、又は、特定の酵素活性を有するそれらの機能的ホモログである。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、（α１→３）グルコシド結合が散在しており、（α１→３，４）分岐点を有する、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含むα−グルカンに関し、該α−グルカンは、少なくとも３％の分岐比率を有し、１重量％未満で連続する（α１→３）結合を含み、５×１０２Ｄａ〜１×１０７Ｄａの平均分子質量を有する。第３の態様において、本発明は、（α１→３）グルコシド結合が散在しており、（α１→３，４）分岐点を有する、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含むα−グルカンを含む食品組成物に関し、該α−グルカンは、少なくとも３％の分岐比率を有し、１重量％未満で連続する（α１→３）結合を含み、５×１０２Ｄａ〜１×１０７Ｄａの平均分子質量を有する。
【００１１】
本発明の更なる態様は、デンプン含有食品材料の消化性炭水化物を還元させるための、配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用である。更なる本発明の態様は、菌株ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８（ＮＣＣ  ２９７０）である。
【００１２】
乳酸菌は、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）に属する多様なグルカンスクラーゼ（ＧＳ）酵素を有し、（α１→２）−、（α１→３）−、（α１→４）−及び／又は（α１→６）−グリコシド結合の形成を経て、スクロースをα−グルカン多糖に変換する。近年、スクロースに対しては不活性であるが基質としてマルトデキストリン／デンプンを用いる、ＧＨ７０酵素の３つの新規サブファミリーが確立された（例えば欧州特許第２２４８９０７号に記載のラクトバシラス・ロイテリ１２１のＧＴＦＢ）。ＧＳに見られる広い結合特異性と比較し、同定されたスクロース非利用型のＧＨ７０酵素はいずれも、４，６−α−グルカノトランスフェラーゼ（４，６−α−ＧＴアーゼ）活性のみを示す。それらの酵素は（α１→４）結合を切断し、新規な（α１→６）結合を形成して、直鎖状（α１→６）α−グルカン鎖、又は交互にα（１→４）／（１→６）結合を有する分岐ポリマーを産生する。
【００１３】
発明者らは、ラクトバシラス・ファーメンタムＮＣＣ  ２９７０のゲノムにおける推定ＧＴＦＢ様ＧＨ７０ファミリーの酵素（１５９３アミノ酸、１８０ｋＤａ）をコードする単一の遺伝子を同定した。このタンパク質は、Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ  ４，６−α−ＧＴアーゼと７７％の配列同一性を有するが、ＧＳ内の基質結合残基を形成する残基のいくつかにおいて特有の変異を示す。このＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の、アミロースからの生成物の詳細な構造解析を含む、生化学的特性評価から、かかる酵素が、（α１→４）結合を切断し、直鎖方向又は分岐方向に新規な（α１→３）結合を形成する、４，３−α−グルカノトランスフェラーゼ（４，３−α−ＧＴアーゼ）として作用することが明らかとなった。この酵素は、連続的な（α１→３）結合を合成できず、その活性により、交互のα（１→３）／（１→４）結合及び（１→３，４）分岐位置を有する新規なタイプのα−グルカンの形成がもたらされる。ＧＨ７０ファミリー及びクランＧＨ−Ｈにおけるこの新規な反応特異性の発見は、合成できるα−グルカンの範囲を拡大するものであり、ＧＴＦＢ様ＧＨ７０サブファミリーの酵素の結合特異性を支配する活性部位内のキー部位の同定を可能にする。
【００１４】
ラクトバシラス・ファーメンタムＧＴＦＢ酵素によって形成されるα−グルカンの一次元１Ｈ−ＮＭＲ分析により、（α１→４）及び（α１→３）結合の存在が明らかとなった。α−グルカンのメチル化分析により、末端の３−置換、４−置換及び３，４−二置換のグルコピラノース残基の存在が明らかとなった。３−置換及び３，４−二置換グルコピラノース残基の存在は、ＧＴＦＢ酵素が直鎖及び分岐方向に（α１→３）結合を形成することを意味する。（α１→６）結合の検出はごくわずか（１％未満）であった。二次元ＮＭＲ分光分析及びスミス分解分析では、２つの連続する（α１→３）結合グルコピラノース残基を示すエビデンスは観察されなかった。ゆえに、メチル化分析によって検出されるすべての３−置換グルコピラノース残基は、（α１→４）結合しており、（α１→３）分岐位置を形成する、又は、単一の（α１→３）結合が散在している（α１→４）結合の直鎖状セグメントの一部を構成する筈である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＡＺｙデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＣＡＺｙ．ｏｒｇ）にアノテーションされたいくつかの同定されたＧＨ７０タンパク質、及びクエリー配列（太字で示す）としてＬ．ファーメンタムＧＨ７０  ＮＣＣ２９７０タンパク質を用いたＢＬＡＳＴ検索により同定した（推定の）ＧＨ７０  ＧＴＦＢ様タンパク質の、完全長アミノ酸配列アラインメントに基づき作成した系統樹を示す。進化の経緯は、ＪＴＴマトリックスベースのモデルに基づく最尤法を用いて推定した。バーは、一カ所あたり０．２置換の遺伝距離（２０％のアミノ酸配列差）を表す。主な分岐点に隣接するブートストラップ値は、１０００回の反復をベースとする確率を表す。タンパク質配列には、それらのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号及び由来細菌による注釈が付されている。Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢの４，６−α−ＧＴアーゼを、灰色でハイライトする。
【図２】Ｌ．ファーメンタム４，３−α−ＧＴ  ＧＴＦＢ酵素（Ａ）、（推定）ＧＴＦＢ様４，６−α−ＧＴアーゼ酵素（Ｂ）、Ｅ．シビリカムＧＴＦＣ  ４，６−α−ＧＴアーゼ酵素（Ｃ）、Ａ．クロオコッカムＧＴＦＤ  ４，６−α−ＧＴアーゼ酵素（Ｄ）、及びグルカンスクラーゼ酵素（Ｅ）の触媒ドメインにおける保存されたモチーフＩ〜ＩＶの配列アラインメントを示す。ＧＨ７０酵素における厳格に保存された７つのアミノ酸残基（配列上に番号１〜７により示す）は、新規なＬ．ファーメンタム４，３−α−ＧＴ  ＧＴＦＢタンパク質においても保存されている。触媒三残基を構成するアミノ酸を太字及び影付きで示す。記号：ＮＵ＝求核性、Ａ／Ｂ＝一般的な酸／塩基、ＴＳ＝遷移状態安定化。
【図３】Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ  ４，３−α−グルカノトランスフェラーゼ、Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ−ΔＮ  ４，６−α−グルカノトランスフェラーゼ及びＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＡグルカンスクラーゼのポリペプチド鎖に沿ったドメインの配置の概略図を示す。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２を使用し、Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ及びＧＴＦＡ配列との配列比較により、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの一次構造中のドメインＡ、Ｂ、Ｃ、ＩＶ及びＶを同定した。
【図４】異なる精製段階における、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ  ＧＨ７０タンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーンＭは分子量標準、レーン１は大腸菌細胞を含まない抽出物のサンプル、レーン２は溶解した細胞の遠心分離後の不溶性フラクションのサンプル、レーン３はＮｉ−ＮＴＡアガロースカラムクロマトグラフィー後にプールされたフラクション、レーン４は陰イオン交換Ｈｉ−ｔｒａｐカラムクロマトグラフィー後の精製ＧＴＦＢ  ４，３−α−グルカノトランスフェラーゼである。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢタンパク質に対応するバンドを矢印で示す。
【図５】精製Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の生化学的性質の諸態様を示す一連のグラフである。（Ａ）ＧＴＦＢ活性に対するｐＨの効果。実験は４０℃で実施し、酵素比活性をｐＨ５．５（１００％値）の場合と比較した。（Ｂ）ＧＴＦＢ活性に対する温度の効果。アッセイはｐＨ５．５で実施し、酵素比活性を５０℃（１００％値）の場合と比較した。（Ｃ）ＧＴＦＢ安定性に対する温度の効果。ＧＴＦＢ酵素（０．１ｍｇ／ｍｌ）を、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中で、示す温度で１０分間インキュベートした。実験項に記載の標準条件下、基質としてアミロースＶを用い、４０℃において残存活性をアッセイした。実験は３回実施し、バーは３回の反復実験における標準誤差を示す。
【図６】２５ｍＭのマルトオリゴ糖（ＤＰ２−ＤＰ７）、０．６％（ｗ／ｖ）のアミロースＶ、０．６％（ｗ／ｖ−）のジャガイモ由来可溶性デンプン、及び０．６％（ｗ／ｖ）のアミロペクチンと、２５μｇ／ｍＬのＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素とのインキュベートにより合成された生成物混合物のＴＬＣ解析を示す。反応混合物を２４時間、３７℃及びｐＨ５．５でインキュベートした。Ｓ：標準、Ｇ１：グルコース、Ｇ２〜Ｇ７：マルトースからマルトヘプタオース、ＡＭＶ：アミロースＶ、ＳＴＲ：デンプン、ＡＭＰ：アミロペクチン、Ｐｏｌ：ポリマー。
【図７】Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素２５μｇ／ｍＬと、２５ｍＭのマルトヘプタオース（ＤＰ７）（Ａ）及び０．６％（ｗ／ｖ）のアミロースＶ（Ｂ）との、２４時間、３７℃及びｐＨ５．５におけるインキュベートから形成される生成混合物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、３００Ｋ）である。Ｇα／β及びＲα／βとして示すアノマーのシグナルは、それぞれ、遊離型グルコース及び還元型−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃｐ単位に対応する。化学シフトは、内部アセトン（δ  ２．２２５）のシグナルに対するｐｐｍで示す。
【図８】０．６％（ｗ／ｖ）のアミロースＶと、２５μｇ／ｍＬのＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ（ｐＨ５．５）及びＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ（ｐＨ５．０）酵素との、２４時間、３７℃におけるインキュベート後に生成する反応生成物のＨＰＳＥＣ分子量分布を示す。点線は、アミロースＶの溶出プロファイルに対応する。黒及び灰色の実線は、それぞれ、Ｌ．ファーメンタム及びＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ酵素により合成された生成物の溶出プロファィルに対応する。
【図９】Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素（２５μｇ／ｍＬ）と０．６％（ｗ／ｖ）のアミロースＶとの２４時間のインキュベート後に得られた、バイオゲルＰ−２多糖フラクションＦ１の５００ＭＨｚ一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトル、二次元１Ｈ−１ＨのＣＯＳＹ，ＴＯＣＳＹスペクトル（混合時間１５０ｍｓ）、ＲＯＥＳＹ及び二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルである（Ｄ２Ｏ中、３００Ｋで記録）。（α１→４）及び（α１→３）のアノマーのシグナルのピークを示す。構造−レポーターシグナルを示す。
【図１０】一次元及び二次元ＮＭＲ分光分析、メチル化分析及びスミス分解分析により同定されたすべての構造要素を考慮した、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ多糖生成物の複合モデルである。残基の標識は、表３に示すものに対応する。
【図１１】（Ａ）２５μｇ／ｍＬのＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ及び（Ｂ）Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢとマルトヘプタオースとの、ｔ＝１０分、１時間及び２４時間（ｐＨ  ５．５、３７℃）でのインキュベートにより形成されるオリゴ糖混合物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す。確立されたオリゴ糖構造。ピークの同一性は、市販のオリゴ糖標準を用いて帰属した。
【図１２】（Ａ）２５μｇ／ｍＬのＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ及び（Ｂ）Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢとアミロースＶとの、ｔ＝１０分、１時間及び２４時間（ｐＨ５．５、３７℃）でのインキュベートにより形成されるオリゴ糖混合物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す。確立されたオリゴ糖構造。ピークの同一性は、市販のオリゴ糖標準を用いて確認した。
【図１３】アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）α−アミラーゼ、ケトミウム・エラチカム（Chaetomiumerraticum）デキストラナーゼ及びクレブシェラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）プルラナーゼＭ１によるＬ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマーの処理後のＴＬＣ解析である。レーン１：酵素処理前のＬ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマー、レーン２〜３：Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマー及びデンプン、それぞれのα−アミラーゼ酵素処理により生じる生成物混合物。レーン４〜５：Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマー及びＩＭＭＰ、それぞれのデキストラナーゼ酵素処理により生じる生成物混合物。レーン６〜７：Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマー及びＡ．クロオコッカムＧＴＦＤポリマー、それぞれのプルラナーゼ酵素処理により生じる生成物混合物。レーンＳ：標準、Ｇ１：グルコース、Ｇ２〜Ｇ７：マルトースからマルトヘプタオース、Ｐｏｌ：ポリマー。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
したがって、本発明は、一部において、（α１→３）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの製造方法に関するものであり、当該方法は、非還元末端に少なくとも２つの（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を、（α１→４）グルコシド結合を切断でき、かつ新しい（α１→３）グルコシド結合を生成できるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させて、連続する（α１→３）グルコシド結合を形成することなく、（α１→３）グルコシド結合を散在させた（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有するグルコースポリマーを形成するステップを含み、α−グルカノトランスフェラーゼは、ＧＴＦＢ、ＧＴＦＣ及びＧＴＦＤタイプの酵素からなる群から選択され（例えばＧＴＦＢタイプの酵素）、又は、特定の酵素活性を有するそれらの機能的ホモログである。
【００１７】
多糖類は、グリコシド結合により相互に結合される単糖単位の長鎖から構成される高分子炭水化物である。オリゴ糖は、少数の単糖（典型的に３〜９個）を含む糖ポリマーである。グルコースポリマーは、単糖がグルコースである糖ポリマーである。α−グルカンは、α型のグリコシド結合で結合されたＤ−グルコースモノマーから構成される多糖類である。アミロースは、その非還元末端に少なくとも２つの（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む基質の一例である。
【００１８】
直鎖状セグメントは、分岐しないポリマー構造部分であり、例えば一置換グルコピラノース残基の鎖である。本発明の文脈において、用語「散在させる」とは、間を置いて存在することを意味する。（α１→３）グルコシド結合を散在させた（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントにおいて、結合の順序は、１つ以上の（α１→４）結合、次に１つの（α１→３）結合、次に１つ以上の（α１→４）結合である。直鎖状セグメントにおいて、（α１→３）結合は（α１→４）結合の間に存在する。この構造における（α１→３）グルコシド結合は、「架橋」結合と称されることがある。
【００１９】
本発明の方法は、非還元末端に少なくとも２つの（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む多糖又はオリゴ糖基質を、（α１→４）グルコシド結合を切断でき、かつ新しい（α１→３）グルコシド結合を生成できるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させて、連続する（α１→３）グルコシド結合を形成することなく、（α１→３）グルコシド結合を散在させた（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有するグルコースポリマーを形成するステップを含んでよく、α−グルカノトランスフェラーゼは、（α１→３，４）分岐点を形成することができ、ＧＴＦＢ、ＧＴＦＣ、ＧＴＦＤタイプの酵素（例えばＧＴＦＢタイプの酵素）、又は特定の酵素活性を有する機能的ホモログからなる群から選択される。
【００２０】
本発明の方法によって製造されたα−グルカンは、少なくとも３％、例えば少なくとも５％の分岐比率を有していてもよく、例えば少なくとも７％であってもよい。本発明の前後関係において、分岐比率は、分岐アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）、すなわち、他の３つの単位に結合するＡＧＵの、分子内のＡＧＵの総数に対する総数として定義される。分岐比率は、公知技術の方法（例えばメチル化、及びそれに続くガスクロマトグラフィー）により測定することができる。分岐がα−グルカンにおいて多く存在する程、消化酵素が近づきにくくなり、α−グルカンの消化性が低くなる。加えて、分岐点の存在は、α−グルカンの溶解性を増加させ得る。本発明の方法は、低い消化性及び良好な溶解性を兼ね備えたα−グルカンを提供できるという意味で有利である。
【００２１】
本発明の方法により製造されるα−グルカンは、（α１→３）グルコシド結合及び少なくとも１つの（α１→３，４）分岐点に隣接する少なくとも１つの（α１→４）グルコシド結合を含み得る。本発明の方法により製造されるα−グルカンは、５０〜７０％の（α１→４）グルコシド結合、８〜３０％の単一の（α１→３）グルコシド結合、及び３〜２０％の（α１→３，４）分岐点、例えば５〜１５％の（α１→３，４）分岐点を含み得る。本発明の方法により製造されるα−グルカンは、連続する（α１→３）グルコシド結合を１％未満有するのがよく、例えば連続する（α１→３）グルコシド結合を０．５％未満有するのがよく、更なる例としては連続する（α１→３）グルコシド結合を有さなくてもよい。本発明の方法により製造されるα−グルカンは、（α１→６）グルコシド結合を１％未満有するのがよく、例えば（α１→６）グルコシド結合を０．５％未満有するのがよく、更なる例としては（α１→６）グルコシド結合を有さなくてもよい。結合のパーセンテージは、ある結合数の、結合総数に対するパーセンテージを指す。
【００２２】
ＧＴＦ酵素の触媒ドメイン内で、４つの保存領域が同定されている。これまでのタンパク工学に関する研究では、保存配列領域ＩＩＩ及びＩＶ（配列アラインメントについては図２を参照）に配置されるアミノ酸残基が、形成されるグリコシド結合のタイプに関するＧＴＦ酵素の生成物特異性を制御することが示されている。また、領域Ｉ及び領域ＩＩは、酵素活性及び反応特異性に関与するアミノ酸残基を含む。本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼは、ＧＴＦＢタンパク質の保全領域内に以下の変異のうちの少なくとも１つを含み得る（図２を参照）。
Ａ）（保存領域ＩＩ）：Ｄ９９１におけるＡｓｐ（Ｌ．ロイテリＧＴＦＢ  ４，６−α−グルカノトランスフェラーゼにおけるＮ１０１９のＡｓｎの置換）
Ｂ）（保存領域ＩＶ）：Ｉ１０９８におけるＩｌｅ（Ｌ．ロイテリＧＴＦＢ  ４，６−α−グルカノトランスフェラーゼにおけるＱ１１２６のＧｌｎの置換）
Ｃ）（保存領域ＩＶ）：Ｎ１１００におけるＡｓｎ（Ｌ．ロイテリＧＴＦＢ  ４，６−α−グルカノトランスフェラーゼにおけるＫ１１２８のＬｙｓの置換）
【００２３】
本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼは、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性（例えば配列番号１に対して少なくとも９２、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００２４】
本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼは、ラクトバシラス・ファーメンタムＧＴＦＢ酵素であってもよく、例えば、本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼは、ラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８ＧＴＦＢ酵素であってもよい。一態様において、本発明は、（α１→３）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの製造方法を提供するものであり、該方法は、少なくとも２つの（α１→４）結合したＤ−グルコース単位をその非還元末端に含む多糖又はオリゴ糖基質に、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）α−グルカノトランスフェラーゼ（例えばラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８ＧＴＦＢ酵素）を接触させるステップを含む。
【００２５】
本発明の方法における基質は、少なくとも５の重合度であってもよく、例えば、それは少なくとも５つのＤ−グルコース単位を含んでもよい。重合度は、ポリマー又はオリゴマー分子中のモノマー単位の数である。例えば、本発明の方法における基質は、少なくとも６の重合度を有してもよく、例えば、少なくとも６つのＤ−グルコース単位を含んでもよい。本発明の方法における基質は、デンプン（例えば、ワキシデンプン又は高アミロースデンプン）、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、グルコオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、（α１→４）グルカン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。デンプン誘導体は、天然のデンプンを物理的、酵素的又は化学的に処理してその特性を変化させることにより調製される。
【００２６】
本発明の方法における基質は、別の材料内に含まれてもよく、該基質は例えば穀粉の形の粉末状デンプンであってもよい。食品成分中に含まれる多糖類又はオリゴ糖を、消化性の低いα−グルカン、例えば分岐α−グルカンに変換することが有利である。このような変換は、成分中の繊維含量を増加させることができ、及び／又は、成分のカロリー含有量の低減を補助することができる。本発明の方法は、食品処理工程の一部として行ってもよく、例えばα−グルカノトランスフェラーゼ酵素を、工程中に食品成分に適用して、加工食品を提供してもよい。基質は、栄養価のあるプロファイルを既に有する材料中に含まれることもあり、例えば、該基質は、全粒小麦粉中に含まれ得る。
【００２７】
多糖又はオリゴ糖基質が本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素によって変換され得る程度は、反応時間を制限することによって調整できる。部分的に変換された基質は、物性の変化をもたらす。本発明の方法におけるα−グルカンの産生は、基質とα−グルカノトランスフェラーゼ酵素との間の反応が完了する前に停止されてもよく、例えば、変性（例えば加熱）又は酵素の除去によって停止されてもよい。
【００２８】
本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、固定化されてもよく、例えば多糖類又はオリゴ糖基質と接触させる前に固定化されてもよい。このような固定化技術は、従来技術において公知である。酵素を固定化することにより、（上記の）酵素の除去を容易に行うことができる。固定化法は、共有結合、封入、物理吸着、架橋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。共有結合による固定化においては、酵素中の、触媒活性には必須でない官能基を介して、酵素を支持体に共有結合させる。アルミナ、シリカ及びケイ素化アルミナ等の酸化物材料を用いて酵素を共有結合させることができる。封入による固定化においては、酵素はポリマーマトリックス又は膜の格子内に局在化される。封入の方法は、主に５つのタイプ、すなわち格子、マイクロカプセル、リポソーム、膜及び逆ミセル、に分類される。酵素は、様々な合成又は天然ポリマーのマトリックス中に封入される。イオノトロピックなゲル化によりゲルを形成する天然多糖類であるアルギン酸塩は、そのような固定化マトリックスの１つである。物理吸着による固定化は、担体への酵素の固定化方法のうちで最も簡単かつ古典的な方法である。吸着による固定化は、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、及びそれらの組み合わせなどの、酵素と担体との間の物理的相互作用に基づく方法である。吸着は一般に、化学的結合手段よりも酵素への損害が少ない。架橋による固定化は、酵素分子間の架橋試薬となる二又は多官能性の化合物を利用するものである。架橋は、吸着又は封入などの他の固定化方法と組み合わせて使用することができる。
【００２９】
多糖又はオリゴ糖基質は、２０℃〜６０℃（例えば４０℃〜５５℃）の温度、及び３．５〜８．０（例えば５．５〜７．５）のｐＨでα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触さることができる。
【００３０】
更なる実施態様において、本発明は、（α１→３）グルコシド結合が散在しており、（α１→３，４）分岐点を有する、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含むα−グルカンに関し、α−グルカンは、少なくとも３％（例えば少なくとも５％、更には例えば少なくとも７％）の分岐比率を有し、連続する（α１→３）結合の含量が１％未満（例えば連続する（α１→３）結合不含有）であり、５×１０２Ｄａ〜１×１０７Ｄａ（例えば１×１０４Ｄａ〜１×１０６Ｄａ）の平均分子質量である。本発明のα−グルカンは、（α１→３）結合を５０％未満で有してもよい。
【００３１】
本発明のα−グルカンは、例えば（α１→４，６）分岐点を１％未満で有してもよく、例えば（α１→４，６）分岐点を０．５％未満で有してもよく、例えば（α１→４，６）分岐点を有さなくともよい。本発明のα−グルカンは、Ｏ２、Ｏ４又はＯ６位において分岐を有さなくともよい。本発明のα−グルカンは、（α１→６）グルコシド結合を１％未満で有してもよく、例えば（α１→６）グルコシド結合を０．５％未満で有してもよく、更に、例えば（α１→６）グルコシド結合を有さなくともよい。
【００３２】
本発明のα−グルカンは、（α１→３）グルコシド結合に隣接する少なくとも１つの（α１→４）グルコシド結合と、少なくとも１つの（α１→３，４）分岐点と、を含んでもよい。本発明のα−グルカンは、５０〜７０％の（α１→４）グルコシド結合、８〜３０％の単一の（α１→３）グルコシド結合、及び３〜２０％の（α１→３，４）分岐点、例えば５〜１５％の（α１→３，４）分岐点を含み得る。本発明のα−グルカンは、連続する（α１→３）グルコシド結合を１％未満有するのがよく、例えば連続する（α１→３）グルコシド結合を０．５％未満有するのがよく、更なる例としては連続する（α１→３）グルコシド結合を有さない。本発明のα−グルカンは、（α１→６）グルコシド結合を１％未満で有してもよく、例えば（α１→６）グルコシド結合を０．５％未満で有してもよく、更に、例えば（α１→６）グルコシド結合を有さなくともよい。
【００３３】
本発明のα−グルカンは、食物繊維とみなすことができる。α−グルカンは、その高度な分岐構造のため、消化管上部における酵素的分解への耐性を示し、最終的には大腸において、大腸細菌叢による完全な発酵に用いられ得る。また、このような食物繊維は、ヒト又は動物における満腹感を増強する。食後の血糖値を上昇させる。本発明のα−グルカンは、デンプン等の材料と比較し消化性が低いため、これらを含む食事は、デンプンを含む同様の食事と比較し血糖値応答が低く、インスリン応答の誘導も緩やかである。本発明のα−グルカンを含む組成物は、対象における食後血中グルコース及びインスリン濃度の制御に用いられ得る。対象は、ヒト又は動物であってもよい。本発明のα−グルカンを含む組成物は、対象における食後血中グルコース及びインスリン濃度の増加に関連する障害の治療又は予防用のものであってもよい。障害は、例えば、妊娠糖尿病などの糖尿病、グルコース代謝異常、高インスリン血症又はインスリン抵抗性からなる群から選択され得る。対象は、糖尿病又は前糖尿病のヒト又はペットであってもよい。
【００３４】
典型的には、食後高インスリン血症はインスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、及び２型糖尿病の発症を促進し得る［Ｋｏｐｐ  Ｗ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２００３，Ｊｕｌ；５２（７）：８４０〜８４４］。しかしながら、食後のインスリン要求量を低下させることにより、一方では２型糖尿病における血糖調節の悪化を低減することができ、他方では２型糖尿病に罹患しやすい対象において発症のリスクを低減することができる。
【００３５】
「糖尿病前症患者」とはインスリン抵抗性又はグルコース代謝障害を示している対象であり、例えば家族歴、生活様式、又は遺伝的性質によって、後年になって糖尿病を発症しやすい。インスリン分泌の低減は、長期的には膵臓が疲弊するリスクを低下させることから、糖尿病前症者又は代謝疾患を有する患者における膵臓の管理にとって有益である。したがって、本発明のα−グルカンを含む組成物の使用により、これらの対象における糖尿病、グルコース代謝障害、高インスリン血症、若しくはインスリン抵抗性のリスク及び／又は発症を低減し得る。
【００３６】
糖尿病、インスリン抵抗性、又はグルコース不耐性の罹患は主として成人において認められる。しかしながら、ますます多くの小児が罹患しており、又は罹患しやすくなっており、若しくはこのような障害を後年になって発症するリスクを有している。したがって、これらの障害の予防及び／又は治療は若年期から開始するのが有利である。あるいは、ヒトにおいて観察されるのと同様に、糖尿病、高インスリン血症、又はインスリン抵抗性は、動物、特にペットとして飼育される動物においてもますます広まっている。したがって、本発明はまた、ネコ及びイヌにも関連する。
【００３７】
本発明のα−グルカンを含む組成物は、血漿中の食後グルコース及びインスリン濃度を減少させるための非治療的用途に用いられてもよい。本発明のα−グルカンを含む組成物を、例えば、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又はグルコース不耐性を後のある時点で発症するリスクのある健康な対象等の対象にも投与できることは有益である。本発明のα−グルカンを含む組成物は、本明細書に開示のとおり、摂取後にインスリン濃度を低下させる。多くの健康な人々が体重の減量を望んでいる。食物繊維を含有する食事を消費することは、満腹感を高めることができるため、消化性カロリーの消費を減少させたい人々の助けとなる。本発明のα−グルカンを含む組成物は、体重を減量させるための非治療的用途に用いられてもよい。
【００３８】
本発明の別の態様は、本発明のα−グルカンを含む食品組成物に関する。本発明のα−グルカンは、低消化性であるが良好な溶解性を有する炭水化物を提供し、低いカロリー含量が要求される食品での使用にとり理想的である。食品組成物は、飲料（例えば粉末状の飲料ミックス又は飲料用クリーマー）、朝食用シリアル、ペットフード製品、焼成された生地製品（例えばパン、ピザ又は具入りのセイボリーターンオーバー（savoury turnover））、又は菓子製品であってもよい。菓子製品は、アイスクリーム等の冷凍菓子製品、ビスケット（例えばフィリング入りビスケット又はウエハ）などの焼き菓子製品、チョコレート菓子製品、又はシュガースタイルの菓子製品（例えばガム、ゼリー、ハードキャンディ（hard-boiled sweet）又はチューイー・スゥイート（chewy sweet））であってもよい。「シュガースタイルの菓子製品」又は「シュガースタイルのキャンディ」という用語は、伝統的に砂糖を主成分とする菓子製品を意味するが、他の甘味料及び／又は砂糖代用品によって製造されてもよい。
【００３９】
更に別の実施形態において、本発明は、食品材料、例えばデンプン含有食品材料の消化性炭水化物を還元させるための、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９２、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む、又は配列番号１のアミノ酸配列を有するα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供する。本発明の範囲において、消化性炭水化物とは、全炭水化物のうち、消化可能で、体細胞へのエネルギー供給に利用できる部分に該当する。本発明に従い使用できるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、ラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８ＧＴＦＢ酵素であり得る。
【００４０】
本発明の更に別の実施形態は、配列番号２に対して少なくとも９０％の同一性（例えば配列番号２に対して少なくとも９２、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有する核酸配列を含む、又は配列番号２の核酸配列を有する細菌である。配列番号２により同定される核酸配列を含む細菌は、ラクトバシラス・ファーメンタム（例えばラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８）であってもよい。
【００４１】
本発明の一実施形態は、ラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８（またＮＣＣ  ２９７０とも呼称される）である。かかる細菌は、パスツール研究所（２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に２０１６年３月８日に寄託され、寄託番号Ｉ−５０６８を付与されている。
【００４２】
ラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８は、培養培地中で増殖させることができ、条件を最適化することでＧＴＦＢ酵素の産生を最大にできる。最適条件は、例えば酵素の発現をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で測定することにより決定できる。次に、アミロースなどの多糖又はオリゴ糖基質の転換は、培養液を使用して、又は、多糖若しくはオリゴ糖基質の存在下でラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８を培養することによって実施できる。ラクトバシラス・ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８は、簡便な凍結乾燥粉末の形態で提供してもよい。
【００４３】
更なる実施態様において、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素、例えば、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素を提供する。本発明は更に、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば配列番号１に対して少なくとも９２、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性）を有するポリペプチドをコードしている核酸配列を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、細菌を形質転換するためのベクターであってもよい。
【００４４】
当業者であれば、本明細者に開示される本発明のすべての特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の方法のために記載された特徴を本発明の製品と組み合わせてよく、逆もまた同様であってよい。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。周知の同等物が特定の特徴について存在する場合、このような同等物は、本明細書で具体的に言及されているのと同様に組み込まれる。本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び以下の実施例から明らかである。
【実施例】
【００４５】
実験項
イントロダクション
乳酸菌、特にロイコノストック（Leuconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ワイセラ（Weissella）属及びオエノコッカス（Oenococcus）属に存在するスクロースをα−グルカン多糖に変換するグルカンスクラーゼ酵素を準備するため、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ｗｗｗ．ＣＡＺｙ．ｏｒｇ）を最初に確立した。ＧＳ特異性に依存し、構造的に異なるα−グルカンが形成される。まずは、（α１→３）−（ムタン）又は（α１→６）結合（デキストラン）を有するα−グルカンを合成するグルカンスクラーゼ酵素の大部分が特性評価されており、また、近年では、（α１→２）又は（α１→４）結合を有する各種のα−グルカンが、グルカンスクラーゼ生成物として同定されている。交互の（α１→３）／（α１→６）結合（アルテルナン）（例えばロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）ＮＲＲＬ  Ｂ−１３５５のアルテルナンスクラーゼ）又は（α１→４）／（α１→６）結合（ロイテラン）（例えばラクトバシラス・ロイテリ１２１のロイテランスクラーゼ）を有するα−グルカンを生産するいくつかのグルカンスクラーゼ酵素が特性評価されている。また、分岐位置は、同じ酵素によって、又はＬ．メセンテロイデス株の別の（α１→２）又は（α１→３）分岐導入酵素によって導入してもよい。ＧＳはこのように、α−グリコシド結合［（α１→２）、（α１→３）、（α１→４）及び（α１→６）］の全４つの考えられる結合タイプを合成することが可能であるが、あるグリコシド結合の組み合わせは、同じα−グルカン内ではこれまで見つかっていない。例えば、α−グルカンを（α１→３）＋（α１→４）結合で合成する野生型グルランスクラーゼ酵素は、今まで報告されていない。ＧＳによって産生されるα−グルカンはまた、その分岐度、分子量、及び立体構造が異なる。かかる違いは、多様な産業工業的応用を可能にする様々な機能的特性を示すα−グルカンをもたらす。
【００４６】
ファミリーＧＨ７０のＧＳ酵素（スクロースに作用）は進化的に、ファミリーＧＨ１３  α−アミラーゼ酵素（マルトデキストリン／デンプンに作用）に関連し、クランＧＨ−Ｈを構成する。それらの進化的相関性のため、ＧＨ７０及びＧＨ１３ファミリー酵素は、それらの配列及び構造における類似性を示し、同等のα保持的、二重置換的触媒機構を用いるものである。両ファミリーは、そのタンパク質にドメインＡ、Ｂ、Ｃを有する触媒（β／α）８バレル構造を有し、また個々の酵素特異性についての配列フィンガープリントと考えられる４つの保存領域を有する活性部位を有する。しかしながら、ＧＳはまた固有の特徴をも示す。ファミリーＧＨ１３において、これらの４つの保存領域の順は、Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ−ＩＶである。一方、ＧＳ酵素におけるこの（β／α）８バレルは円形に配置され、それにより保存領域の順はＩＩ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ｉとなり、それらは、２つの余分の、また特有のドメインＩＶ及びＶを有する。また、ＧＳは「Ｕ字折れ曲がり」ドメイン構造を示し、そこでは５つのドメインのうちの４つ（ドメインＡ、Ｂ、ＩＶ及びＶ）がポリペプチド鎖の２つの不連続な部分から構築される。それらのＧＨ１３からの進化の間、ＧＨ７０酵素は、この独特の、円形で、順序を変えられたドメイン配置をもたらす一連の遺伝子再構成を受けたと考えられる。
【００４７】
近年において、ＧＨ１３及びＧＨ７０ファミリーの進化の相関性を裏付ける、いくつかのマルトデキストリン／デンプン変換酵素が、ＧＨ７０ファミリーの中から同定された。第１に、Ｌ．ロイテリ１２１がスクロースに不活性なＧＳ様酵素を産生することが判明した。この酵素をコードする遺伝子は、グルカンスクラーゼＧＴＦＡをコードする遺伝子の上流で発見され、ｇｔｆＢと命名された。Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢは、スクロースの代わりにマルトデキストリン及びデンプン基質に作用し、ドナー基質の非還元末端から（α１→４）結合を切断し、生成物の非還元末端上に新規な（α１→６）結合を合成する（４，６−α−グルカノトランスフェラーゼ活性、４，６−α−ＧＴアーゼ）。これにより、（α１→６）−及び（α１→４）結合の直鎖を有する生成物（イソマルト／マルト多糖、ＩＭＭＰ）の合成がなされる。合計５４の関連するＧＴＦＢタイプの酵素は、いずれもラクトバシラス属で見られる４つの例外を除き、データベース上で現在利用可能であり、それらは新規なＧＨ７０サブファミリーを構成する。多数の新規ゲノム配列のアノテーションに続いて、いくつかのファミリーＧＨ７０酵素も非ＬＡＢ属において発見された。以前、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）２５５−１５のＧＴＦＣ酵素（Ｇａｎｇｏｉｔｉ  Ｊ，Ｐｉｊｎｉｎｇ  Ｔ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８２：７５６〜７６６（２０１５））、及びアゾトバクター・クロオコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）ＮＣＩＭＢ  ８００３のＧＴＦＤ酵素（Ｇａｎｇｏｉｔｉ  Ｊ，ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  Ｓ，Ｖａｆｉａｄｉ  Ｃ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １８６０：１２２４〜１２３６（２０１６））が同定されている。これらのいずれの酵素も、スクロースに対し不活性で、マルトデキストリン／デンプンに対する活性、すなわち４，６−α−ＧＴアーゼ活性を有し、それにより、イソマルトース／マルトースオリゴ糖（ＩＭＭＯ）（ＧＴＦＣ）及びロイテランタイプのα−グルカン（ＧＴＦＤ）が合成される。驚くべきことに、ＧＴＦＣ及びＧＴＦＤにおけるドメイン順序は、保存領域Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ−ＩＶの順序を変えられていないＧＨ１３酵素のそれに似ており、また他のＧＨ７０酵素に存在するドメインＶが欠如している。ＧＴＦＣ及びＧＴＦＤは、更なる２つのＧＨ７０サブファミリーを代表し、ＧＨ１３  α−アミラーゼとＧＨ７０グルカンスクラーゼ酵素との間に位置する、構造的に非常に興味深い進化的中間型であるため、進化の起源及び（サブ）ファミリーのクランＧＨ−Ｈへの分化に関する更なる解析を可能にするものである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）。
【００４８】
ラクトバシラス・ファーメンタムＮＣＣ  ２９７０ゲノム配列のアノテーションは、ＧＴＦＢ−タイプの４，６−α−ＧＴアーゼ酵素に対し明らかな配列類似性を有する単一のファミリーＧＨ７０タンパク質の同定をもたらした。それはまた、典型的な４，６−α−ＧＴアーゼ酵素のすべての特徴を有し、スクロースに対し不活性で、マルトデキストリン／デンプンに対し活性を有していた。しかしながら、Ｌｂ．ファーメンタムＧＴＦＢアミノ酸配列は、活性部位のドナー／アクセプター基質結合サブ部位を構成する保存領域ＩＩ及びＩＶ中のいくつかの残基において特有の変異を示していた。発明者らはしたがって、生化学的にこのＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の、その生成物の詳細な特性評価解析を含めた特性評価を行うこととした。これにより、それがマルトデキストリン／デンプン対し、ファミリーＧＨ７０及びクランＧＨ−Ｈにおける新規な反応特異性である、４，３−α−グルカノトランスフェラーゼ（４，３−α−ＧＴアーゼ）活性を有することが明らかとなった。
【００４９】
材料及び方法
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢタンパク質配列の解析
クエリー配列としてＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＵ０８０１４．２）を用いたＢＬＡＳＴにより、ラクトバシラス・ファーメンタムＮＣＣ  ２９７０ゲノム（配列番号２）の解析を行い、ＧＨ７０タンパク質をコードする遺伝子の同定を可能にした。非冗長タンパク質配列データベースに対するＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）検索を用い、Ｌ．ファーメンタムＧＨ７０タンパク質配列との類似性を示す配列を発見した。複数のアミノ酸配列アラインメントは、Ｊａｌｖｉｅｗ  ２デスクトップアプリケーションを用い、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２により作成した。シグナルペプチドの有無は、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ４サーバを用いて解析した。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢタンパク質の細胞内の局在は、ＣＥＬＬＯ  ｖ．２．５：ｓｕｂＣＥＬｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎプレディクター（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｏ．ｌｉｆｅ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／）を用いて予測した。ＧＴＦＢタンパク質のＭｗ（分子量）の理論値は、ＥｘＰＡＳｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／Ｍｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）において予測した。
【００５０】
ＭＥＧＡ（バージョン６）（Ｔａｍｕｒａら、２０１３）を用いて、ＣＡＺｙにおいて割出された代表的な特徴のＧＨ７０タンパク質、及びＢＬＡＳＴｐにより同定されたＧＴＦＢ様タンパク質配列に対応する、合計７２のアミノ酸配列により、系統発生の解析を実行した。デフォルトパラメータを用い、ＭＵＳＣＬＥにより配列アラインメントを行った。ＭＥＧＡ６を用い、ＪＴＴマトリックスモデルに基づいて、最尤法により系統樹を構築した。アラインメントのギャップ及び欠損データを含む位置の部分的な削除を行った。推定された系統発生の関係の統計的信頼性は、１，０００回のブートストラップ反復試験を実行することにより評価した。
【００５１】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ遺伝子のクローニング
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ社、ヘルシンキ、フィンランド）を使用して、ＧＴＦＢタンパク質（アミノ酸６１６−１５９３）のＮ末端欠失バージョンをコードするＤＮＡ断片を、Ｌ．ファーメンタムＮＣＣ  ２９７０染色体ＤＮＡから増幅し、ライゲーション独立クローニング（ＬＩＣ）を用いて修飾ｐＥＴ１５ｂベクターへクローニングした。Ｎ末端欠失のｇｔｆＢ遺伝子変異体の増幅に用いたプライマーは、ＬＩＣクローニングを容易にするための５’伸長部分を有し（下線）、以下のとおりである：フォワード：ＣＡＧＧＧＡＣＣＣＧＧＴＴＴＴＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴＧ及びリバース：ＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＧＣＡＴＡＡＴＡＡＴＣ。得られたＰＣＲ産物をアガロースバンドから精製し、ｄＡＴＰの存在下で、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により切断した。同時に、ｐＥＴ−１５ｂ／ＬＩＣベクターをＫｐｎＩにより切断し、ゲルから単離し、次にｄＴＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で処理した。処理したｐＥＴ−１５ｂ／ＬＩＣベクター及びアンプリコンを１：４のモル比で混合し、混合物を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｐｈａｂａｇｅｎ社）を形質転換した。これにより、３Ｃプロテアーゼによって切断可能なＮ末端Ｈｉｓ６タグを含むｇｔｆＢ−ΔＮ構築物を得た。構築された発現ベクターｐＥＴ１５ｂ／ｇｔｆＢ−ΔＮを用い、宿主大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）を形質転換した。遺伝子配列は、ヌクレオチドシークエンシング（ＧＡＴＣ社、ケルン、ドイツ）により決定した。
【００５２】
酵素の発現及び精製
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の発現のため、ｐＥＴ１５ｂ／ｇｔｆＢ−ΔＮで形質転換した大腸菌ｓｔａｒ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩培養液を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した新鮮なＬＢ培地で１：１００に希釈し、６００ｎｍでの光学密度が約０．４に達するまで、３７℃及び２２０ｒｐｍで増殖させた。次に、培養温度を１６℃に低下させ、誘導因子であるイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドを０．１ｍＭの終濃度で添加した。２０時間後、細胞を遠心分離（１０，０００ｇ×２０分）により回収し、その後製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）により記載のプロトコルに従い、Ｂ−ＰＥＲ溶解試薬により破砕した。組換えＧＴＦＢタンパク質は、カラム材料としてＮｉ２＋−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）を用いたＨｉｓタグアフィニティークロマトグラフィー（シグマアルドリッチ社）により、無細胞抽出物から単離した。２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１ｍＭのＣａＣｌ２）によりカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を、同じ緩衝液中の２００ｍＭイミダゾールにより溶出させ、イミダゾールは、分子量カットオフ３０，０００の撹拌限外濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ、ベヴァリー、ＭＡ）を用いて除去した。更なる精製のため、タンパク質を１ｍＬのＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にロードし、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）（１ｍＭのＣａＣｌ２を含む）中のＮａＣｌ（０〜１Ｍ）の直線勾配を用いて溶出させた（１ｍＬ／分の流量）。Ａｋｔａ高速タンパク質液体クロマトグラフ（ＦＰＬＣ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて１ｍＬのフラクションを回収した。限外濾過（ＹＭ３０膜、ミリポア社、ビルリカ、ＭＡ）によりバッファー交換した。精製の過程は、フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により評価し、タンパク質濃度は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｄｅ  Ｍｅｅｒｎ、オランダ）を用いて求めた。
【００５３】
酵素活性のアッセイ
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ−ΔＮ酵素の総活性は、最初にアミロース−ヨウ素法で測定した（Ｇａｎｇｏｉｔｉ  Ｊ，Ｐｉｊｎｉｎｇ  Ｔ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８２：７５６〜７６６．（２０１５）、Ｂａｉ  Ｙ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋａａｉｊ  ＲＭ，Ｌｅｅｍｈｕｉｓ  Ｈ，Ｐｉｊｎｉｎｇ  Ｔ，ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ＳＳ，Ｊｉｎ  Ｚ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，２０１５．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８１：７２２３〜７２３２．（２０１５））。グリコシル化及び／又は加水分解活性から生じるα−グルカン−ヨウ素錯体の吸光度の減少を、４０℃で１４分間、６６０ｎｍでモニターした。反応混合物は、０．１２５％（ｗ／ｖ）のアミロースＶ（ＡＶＥＢＥ社、Ｆｏｘｈｏｌ、オランダ）、酵素２．５μｇ／ｍＬ、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び１ｍＭのＣａＣｌ２を含有した。活性の単位は、１分あたりに基質１ｍｇを変換する酵素の量である。
【００５４】
ｐＨが酵素活性に及ぼす影響を、４０℃でｐＨを３．５〜８．０で変化させることにより測定した。クエン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ）は、３．５〜７．０のｐＨ値において、リン酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ）は、７．０〜８．０のｐＨ値において用いた。最適温度は、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．５、１ｍＭのＣａＣｌ２中、３０〜６５℃の範囲の温度で測定した。３０〜５５℃の温度で１０分間、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）における０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で酵素をインキュベートことにより、ＧＴＦＢ−ΔＮ安定性に対する温度の効果を測定した。サンプルを次に、４℃で急冷し、４０℃で、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中で、標準反応条件下で残存活性を測定した。
【００５５】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢによる基質の利用
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ−ΔＮ（２５μｇ／ｍＬ）を、別々に、２５ｍＭのスクロース（Ａｃｒｏｓ社）、ニゲロース（シグマアルドリッチ社）、パノース（シグマアルドリッチ社）、イソマルトース（シグマアルドリッチ社）、イソマルトトリオース（シグマアルドリッチ社）、イソマルトペンタオース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社）、重合度（ＤＰ）２〜７のマルトオリゴ糖（ＭＯＳ）、及び０．６％（ｗ／ｖ）のアミロースＶ（ＡＶＥＢＥ、Ｆｏｘｈｏｌ、オランダ）、ジャガイモデンプン（シグマアルドリッチ社）及びアミロペクチン（シグマアルドリッチ社）と共にインキュベートした。すべての反応は、２４時間３７℃で、１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で実施した。１００℃で６分間インキュベートし、反応を停止させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び／又は高性能−アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）により反応の経過をモニターした。
【００５６】
パルス電流測定検出分析と組み合わせた、薄層クロマトグラフィー及び高性能アニオン交換クロマトグラフィー
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、シリカゲル６０  Ｆ２５４（２０×２０ｃｍのＴＬＣシート、メルク社、ダルムシュタット、ドイツ）で実施した。ＴＬＣプレートは、ｎ−ブタノール：酢酸：水（２：１：１、ｖ／ｖ）の溶媒系で６時間にわたり展開させた。炭水化物は、オルシノール／硫酸染色によって視覚化し、グルコース及びＭＯＳ（ＤＰ２〜ＤＰ７）の混合物を同時に展開させて比較した。
【００５７】
炭水化物サンプルをＤＭＳＯで３：１００に希釈し、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラム（Ｄｉｏｎｅｘ社、２５０×２ｍｍ）及びＥＤ４０パルス化アンペロメトリー検出システムを装備したＤｉｏｎｅｘ  ＤＸ５００ワークステーション（Ｄｉｏｎｅｘ社、アムステルダム、オランダ）を用い、ＨＰＡＥＣにより解析した。１００ｍＭのＮａＯＨ中、１０〜２４０ｍＭの酢酸ナトリウムの勾配を、０．２５ｍＬ／分の流量で５７分にわたり適用した。各サンプルの注入量は５μＬとした。ピークの同一性は、市販のオリゴ糖標準を用いて確認した。
【００５８】
ＨＰＳＥＣ解析
生成混合物のＨＰＳＥＣ解析は、マルチアングルレーザー光散乱検出器（ＳＬＤ  ７０００  ＰＳＳ、マインツ）、粘度計（ＥＴＡ−２０１０  ＰＳＳ、マインツ）及び示差屈折率検出器（Ｇ１３６２Ａ  １２６０  ＲＩＤ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を装備したサイズ排除クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）を用いて実施した（Ｇａｎｇｏｉｔｉ  Ｊ，ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  Ｓ，Ｖａｆｉａｄｉ  Ｃ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １８６０：１２２４〜１２３６．（２０１６））。ＰＦＧガードカラムに連結した、１００、３００及び４，０００Åの空隙率を有する３本のＰＦＧ−ＳＥＣカラムを用いて分離を行った。溶出剤としてＤＭＳＯ−ＬｉＢｒ（０．０５Ｍ）を、０．５ｍＬ／分の流量で用いた。３４２〜８０５，０００ＤａまでのＭｗの標準プルランキット（ＰＳＳ、マインツ、ドイツ）を用い、システムの較正及びバリデーションを行った。ＲＩ増加値の比率ｄｎ／ｄｃもまたＰＳＳで測定し、数値は０．０７２ｍＬ／ｇであった。アミロースＶ及びＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ−ΔＮ酵素により生成したポリマーの分子量を測定するため、マルチアングルレーザー光散乱シグナルを用いた。このシステムにおけるこれらの多糖類のＲＩ増加値の比ｄｎ／ｄｃはプルランと同じである。ユニバーサル較正法を用い、Ｌ．ロイテリＧＴＦＢ−ΔＮポリマーの分子量を測定した。ＷｉｎＧＰＣ  Ｕｎｉｔｙソフトウェア（ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ）をデータ処理に用いた。測定は二度行った。
【００５９】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢによりアミロースから合成される生成物の産生、その単離及び解析
「Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢによる基質利用」で上記した条件に従い、精製ＧＴＦＢ−ΔＮ（０．２５ｍｇ）を３７℃で４８時間、アミロースＶとインキュベートした。得られた生成混合物を、４８ｍＬ／ｈの流量で、溶出剤として１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を用い、ＢｉｏＧｅｌ  Ｐ２カラム（２．５×５０ｃｍ、バイオラド社、Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、オランダ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。異なるＢｉｏｇｅｌ  Ｐ２プールに存在する多糖／オリゴ糖を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法及びメチル化分析により解析した。
【００６０】
（ｉ）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定は、窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ｎｓパルス幅）を装備したＡｘｉｍａ（商標）質量分析装置（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｋｒａｔｏｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）により記録した。試料溶液（１μＬ）をＭＡＬＤＩ目標にスポットし、直後に１０％（ｗ／ｖ）の２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス水溶液１μＬと混合した。陽性イオンモードのスペクトルを、５０００の半値幅（ＦＷＨＭ）の解像度及び遅延抽出（４５０ナノ秒）のリフレクターモードを用いて記録した。質量スペクトルは通常、２００のイオンゲートブランキングで、１〜５０００Ｄａで得た。
【００６１】
（ｉｉ）ＮＭＲ分光法
一及び二次元１Ｈの核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、溶媒としてＤ２Ｏを用い、２９８Ｋのプローブ温度で、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００スペクトロメーター（ＮＭＲセンター、フローニンゲン大学）で記録した。分析前に、サンプルをＤ２Ｏ（９９．９ａｔｏｍ％  Ｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アンドーバー、ＭＡ）で二回バッファー交換し、中間の凍結乾燥を経て、０．６ｍＬのＤ２Ｏに溶解させた。すべてのＮＭＲスペクトルは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ  ５．３（Ｍｅｓｔｒｅｌａｂｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＬ、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌｌａ、スペイン）により処理した。化学シフト（δ）はｐｐｍで表し、内部標準のアセトン（１Ｈでδ  ２．２２５ｐｐｍ、１３Ｃでδ  ３１．０７）により較正した。異なる結合のパーセンテージは、各シグナルピーク面積の積分値により推定した。
【００６２】
（ｉｉｉ）メチル化分析
メチル化分析は文献に記載のとおり実施した（ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ＳＳ，Ｋｒａｌｊ  Ｓ，ｖａｎ  Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ  ＩＨ，Ｇｅｒｗｉｇ  ＧＪ，Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  Ｌ，Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ  ＪＰ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３４３：１２３７〜１２５０．（２００８））。簡潔には、ポリマー及びオリゴ糖サンプル（約５ｍｇ）を、ＤＭＳＯ中でＣＨ３Ｉ及び固体ＮａＯＨを用いて過メチル化し、次にトリフルオロ酢酸により加水分解した。部分的にメチル化された単糖を、ＮａＢＤ４により還元した。得られた部分メチル化されたアルジトールを、１２０℃のピリジン：無水酢酸（１：１  ｖ／ｖ）を用いて過アセチル化し、部分メチル化されたアルジトールアセタート（ＰＭＡＡ）の混合物を得た。ＰＭＡＡは、ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎら（２００８）に記載のように、ＧＬＣ−ＥＩ−ＭＳ及びＧＬＣ−ＦＩＤにより解析した。
【００６３】
スミス分解
１〜２ｍｇの多糖類のサンプルを、５０ｍＭのＮａＩＯ４を含む１００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．１）１ｍＬに溶解させ、暗所において４℃で１１２時間撹拌した。３００μＬのエチレングリコールを添加して過剰なＩＯ４−を中和した。ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ  １０００Ｄａカットオフ透析フローターを用いて、分解産物を４８時間水道水で透析した。透析後、サンプルを室温で一晩、ＮａＢＨ４により還元し、続いて上記のとおりの透析を行った。還元された多糖サンプルを、３０分間９０℃で、１ｍＬの９０％蟻酸溶液中で凍結乾燥し、加水分解した。室温に冷却した後、蟻酸をＮ２流中で蒸発させた。ＧＬＣ−ＥＩ−ＭＳ及びＧＬＣ−ＦＩＤ、並びにＶａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎら（２００８）のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより、ＴＭＳ誘導体として乾燥多糖フラグメントを解析した。
【００６４】
加水分解酵素によるＬ．ファーメンタムＧＴＦＢの生成物の解析
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ−ΔＮポリマーを、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、それぞれ過剰量のα−アミラーゼ（アスペルギルス・オリゼ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）、デキストラナーゼ（ケトミウム・エラチカム、シグマアルドリッチ社）及びプルラナーゼＭ１（クレブシェラ・プランチコラ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）と３７℃で４８時間インキュベートした。デンプン、ＩＭＭＰ  Ｌ．ロイテリ１２１  ＧＴＦＢポリマー及びＡ．クロッカムのロイテラン様ＧＴＦＤポリマーを、それぞれこれらの条件下で完全分解を生じるα−アミラーゼ、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ処理の陽性対照として用いた。加水分解の程度はＴＬＣ分析により試験した。
【００６５】
結果及び考察
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢタンパク質配列の解析
Ｌ．ファーメンタムのゲノムのアノテーションから、単一のＧＨ７０ファミリータンパク質が同定された。Ｌ．ファーメンタムＧＨ７０タンパク質のＢＬＡＳＴｐ解析から、このタンパク質の最も近いホモログは、すべて同一性が４７％以上のアミノ酸配列（表１）を有するＧＴＦＢ様４，６−α−ＧＴアーゼＧＨ７０サブファミリーのメンバーであることが明らかとなった。
【００６６】
【表１】
2019521660.tif 000003
【００６７】
【表２】
2019521660.tif 000004
【００６８】
Ｌ．ファーメンタムＧＨ７０タンパク質の、他の特徴づけられたＧＨ７０酵素及びこのＢＬＡＳＴｐ検索により同定された（推定の）ＧＨ７０の４，６−α−ＧＴアーゼとの系統発生の関連を図１に表す。グルカンスクラーゼ（ＧＳ）は、ロイコノストック属、ストレプトコッカス属、ラクトバシラス属、オネオコッカス属及びワイセラ属の乳酸菌のゲノムに存在するが、推定ＧＴＦＢホモログをコードする大部分の遺伝子は、現在のところラクトバシラス株で発見されている（但し、ペディオコッカス属及びロイコノストック属株に存在する４つのＧＴＦＢ様タンパク質を除く）。Ｌ．ファーメンタムＧＨ７０酵素は、Ｌ．ロイテリ１２１  ＧＴＦＢ  ４，６−α−ＧＴアーゼ及びそのホモログと共にクラスター形成し、このタンパク質がＧＨ７０サブファミリーのＧＴＦＢタイプのメンバーであることが示された。ＧＴＦＢ様タンパク質は、円形で、順序を変えられた（β／α）８バレルを有するＧＨ７０  ＧＳと類似したドメイン構成を示したが、生化学的に、それらはＥ．シビリカム２５５−１５  ＧＴＦＣ及びＡ．クロオコッカムＮＣＩＭＢ  ８００３  ＧＴＦＤ酵素との関連が強い。これらの観察と一致するように、ＧＴＦＢ様ＧＨ７０サブファミリーは、ＧＳと進化的に関連が強いが、かかるサブファミリーは、ＧＳと、Ｅ．シビリカム２５５−１５及びＡ．クロオコッカムＮＣＩＭＢ  ８００３によりコードされるＧＴＦＣ及びＧＴＦＤの４，６−α−ＧＴアーゼとの中間に位置する。
【００６９】
Ｌ．ファーメンタムから同定されたＧＴＦＢ遺伝子の配列は、計算上１８０ｋＤａの分子量を有する１５９３アミノ酸からなるポリペプチドをコードする。ＧＨ７０酵素の細胞外局在と一致するように、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、ＣＥＬＬＯ  ｖ．２．５：ｓｕｂＣＥＬｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎプレディクターサーバーにより細胞外タンパク質として機能予測された。Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  ４．０サーバのアルゴリズムを用いたＬ．ファーメンタムＧＴＦＢのＮ末端アミノ酸配列の分析から、このタンパク質が３９アミノ酸の古典的なグラム陽性Ｎ末端シグナルペプチドを含むことが明らかとなった。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、４，６−α−グルカノトランスフェラーゼ活性を有するものとして最初に特性評価されたＧＨ７０メンバー（欧州特許第２２４８９０７号）であるＬ．ロイテリ１２１  ＧＴＦＢと、顕著なアミノ酸同一性（７７％の同一性、５７％範囲）を有する。また、５つのドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＩＶ及びＶ）からなる大部分のＧＨ７０タンパク質に特有の典型的なＵ字フォールディングドメインの構成が、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素（図３）においても存在する。Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢと同様、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢタンパク質のドメインＡ、Ｂ、Ｃ及びＩＶは、ポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端へと不連続に構成され、一方ドメインＶはＮ末端ポリペプチド部分のみからなる。また、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、ラクトバシラス種の多くのグルカンスクラーゼ及びＧＴＦＢ様タンパク質に存在する約７００残基の大型の可変性のＮ末端ドメインを有し、それにより、細胞壁への結合に関与すると考えられる（Ｂａｔｈ  Ｋ，Ｒｏｏｓ  Ｓ，Ｗａｌｌ  Ｔ，Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｈ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２５３：７５〜８２．（２００５））。
【００７０】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の反応及び／又は生成物特異性を予測するため、このタンパク質のホモロジー領域Ｉ〜ＩＶを、他のＧＨ７０ファミリータンパク質との配列アラインメントにより同定した（図２）。これらの４つのホモロジーモチーフは、触媒性及び基質結合性の残基を含み、ゆえに、ＧＨ７０及びＧＨ１３ファミリー酵素における個々の酵素特異性についての配列フィンガープリントと考えられる。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢにおける保存領域Ｉ〜ＩＶの順序はＩＩ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ｉであり、グルカンスクラーゼ及びＧＴＦＢ様４，６−α−グルカノトランスフェラーゼに見られる順序に対応することから、その円形に順序を変えられたドメイン構造を反映するものである。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢのモチーフＩ〜ＩＶは、（推定）ＧＴＦＢ様４，６−α−グルカノトランスフェラーゼに対応するモチーフとの顕著な類似性を示した。最初に、ＧＨ７０ファミリー酵素のモチーフＩ〜ＩＶにおいて高度に保存される７つの残基は、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢにおいても存在する。これらの７つの残基のうち、３つの推定触媒性残基Ａｓｐ９８７、Ｇｌｕ１０２５及びＡｓｐ１０９７（Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの付番）は、それぞれ求核基、一般酸／塩基触媒及び遷移状態安定基として同定された。他のＧＴＦＢ様酵素と同様、分岐化スクラーゼを除き、チロシン残基は、すべてのＧＳにおいて保存されたサブ部位＋１／＋２  Ｔｒｐ残基（Ｌ．ロイテリＧＴＦ１８０  ＧＳにおけるＷ１０６５）を置換している。保存されたＷ１０６５（Ｌ．ロイテリ１８０のＧＴＦ１８０の付番）がまた、Ｅ．シビリカムＧＴＦＣ及びＡ．クロオコッカムＧＴＦＤの４，６−α−ＧＴアーゼ酵素におけるチロシン基により置換されていることは注目に値する。このように、典型的なＴｒｐ残基の代わりにこの位置にＴｙｒ残基が存在することは、「古典的」なＧＳとは異なり、デンプン／マルトデキストリン基質に対する活性を示すＧＨ７０タンパク質としての、１つの主要な相違点を表すものである。また、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、大部分のＧＴＦＢ様４，６−α−ＧＴアーゼの場合と同様、基質結合サブ部位＋１及び＋２に関与する位置１０２８及び１１３８（Ｌ．ロイテリ１８０のＧＴＦ１８０の付番）においてそれぞれＡｓｐ及びＡｒｇ残基を含む。しかしながら、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢではまた、モチーフＩＩ及びＩＶにおいて−１、＋１及び＋２ドナー／アクセプター結合サブ部位に関与する残基が、いくつかの特有の変異を示している。具体的には、グルカンスクラーゼ及びＧＴＦＢ様タンパク質において高度に保存されるサブ部位＋１のＡｓｎ残基（Ｌ．ロイテリＧＴＦ１８０のＧＳにおけるＮ１０２９）は、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢにおいてＡｓｐで置換されている。ＧＳにおいて、残基Ｎ１０１９は、活性及び結合特異性にとり重要であることが判明した。また、推定の遷移状態安定化基（Ｌ．ロイテリ１８０のＧＴＦ１８０の付番）に続く位置１１３７及び１１４０のアミノ酸は、多くのＧＴＦＢ−及びＧＴＦＣ様４，６−α−ＧＴアーゼに存在するＧｌｎ及びＬｙｓ残基の代わりに、Ｉｌｅ及びＡｓｎである。これらの２つの残基はＧＳにおけるグリコシド結合の特異性に���与することが、これまでの変異試験で明らかとなっている。特に、位置１１３７の残基は、サブ部位＋２で糖残基の方向修正にとり不可欠であることが判明した。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、Ｌ．ロイテリ１２１  ＧＴＦＢ  ４，６−α−ＧＴアーゼタンパク質との配列類似性を明らかに示すことは事実だが機能的に重要な位置において独自の配列上の特徴を有する。
【００７１】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの精製及び生化学的解析
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ−ΔＮタンパク質を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒにおいて良好に発現させた。用いた増殖及び誘導条件では、ＧＴＦＢ−ΔＮの発現レベルは、可溶性及び不溶性フラクションにおいて比較的低かった（図４）。実験項にて説明したように、金属キレートクロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィーからなる２つのクロマトグラフィー工程により、可溶性フラクションから酵素を精製した。精製された酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、配列から推定される理論値に対応する、見かけの分子量が約１１０ｋＤａの単一のタンパク質のバンドが見られた（図４）。この精製工程の結果、大腸菌培養液１Ｌあたり合計０．４ｍｇの純粋なＧＴＦＢ−ΔＮタンパク質が得られた。
【００７２】
この酵素活性に対するｐＨ及び温度の影響を、アミロースＶを基質とするヨウ素染色アッセイによって測定した。精製された組換え型Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、ｐＨ５．５で最も高い活性を示し、ｐＨ４〜６においてこの活性の８０％以上が保持された（図５Ａ）。酵素は３０〜６０℃で活性を示し、５０℃でその最大活性を示したが、反応を６５℃で実施したとき、活性が大幅に低下した（図５Ｂ）。更に、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中、４５℃超の温度で酵素は安定性が低下した（図５Ｃ）。同様のｐＨ及び温度の最適値が、Ｌ．ロイテリ１２１  ＧＴＦＢの４，６−α−ＧＴアーゼ酵素に関して報告されている。１ｍＭのＣａＣｌ２を含む酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、０．１２５％（ｗ／ｖ１）のアミロースＶに対する精製Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の総比活性は、ヨウ素染色アッセイにおいて、２２±０．３６Ｕ／ｍｇタンパク質として算出された。この数値は、Ｌ．ロイテリ１２１由来ＧＴＦＢに関する報告（ｐＨ５．０及び４０℃の最適条件下）（Ｂａｉら、２０１５）より約１０倍高く、すなわち２．８Ｕ／ｍｇであった。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの活性は、１０ｍＭの最終濃度でのキレート剤ＥＤＴＡの存在下においても分析したところ、若干の（２０％の）阻害が見られた。
【００７３】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの基質及び生成物特異性
ホモロジーモチーフにおいて観察された相違は、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢが新規な酵素反応及び／又は生成物特異性を有し得ることを示唆するものであった。したがって、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素を異なるオリゴ糖及び多糖と共に３７℃で２４時間インキュベートし、反応生成物をＴＬＣにより解析した（図６）。Ｌ．ロイテリＧＴＦＢと同様、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素は、スクロース、パノース、ニゲロース及びＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ５のイソマルトオリゴ糖とは反応しなかった（データ非掲載）。その代わり、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素は、ＤＰ６及び７のマルトオリゴ糖（ＭＯＳ）に対する加水分解及びトランスグリコシラーゼ（不均化）活性を示し、それはＭＯＳ基質以外の低分子及び高分子の生成物の蓄積から明白であった。しかしながら、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、４以下のＤＰのＭＯＳに対しては活性がなく、マルトペンタオース（ＤＰ５）に対する不均化活性は低かった。一方、Ｌ．ロイテリ１２１の場合、ＧＴＦＢ活性はマルトトリオース（ＤＰ３）において既に観察された。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素と、アミロースＶ、ジャガイモデンプン及びアミロペクチンとのインキュベートの結果、低分子量生成物に見られる外観が見られ、すなわち該酵素がこれらのポリマーに対する活性をも有することが示された。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素がＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢより顕著に多量のオリゴ糖生成物（主にアミロースＶから合成された（修飾型）ポリマー）を産生した点に留意する必要がある。ＴＬＣにより観察されるように、ＤＰ２〜５のＭＯＳは各種のポリマー基質から蓄積され、すなわちＬ．ファーメンタムＧＴＦＢがグルコースドナー基質としてマルトヘキサオース又はそれ以上のＭＯＳを必要とすることを物語るものである。
【００７４】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの生成物特異性の試験のため、マルトヘプタオース及びアミロースＶ由来の生成混合物を、一次元１Ｈ  ＮＭＲ分光法により解析した（図７）。両生成混合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルから、（α１→４）結合及び新規に合成された（α１→３）結合に対応する、δ約５．４０及び５．３５の２グループにおけるアノマー同士の重複シグナルの存在が明らかとなった。（α１→３）結合の存在は、δＨ−５４．１６ｐｐｍにおける（α１→３）結合の構造に由来するレポーター基シグナルにより再確認した。このスペクトルはまた、遊離グルコース単位（Ｇα  Ｈ−１、δ  ５．２２５；Ｇβ  Ｈ−１、δ  ４．６３７）及び４−置換還元末端グルコース残基（Ｒα  Ｈ−１、δ  ５．２２５；Ｒβ  Ｈ−１、δ  ４．６５２）に対応するシグナルも示した。（α１→６）結合（Ｈ−１、δ約４．９７）に対応するトレース量（１％未満）のシグナルが検出された。マルトヘプタオース及びアミロースＶ生成物における、（α１→４）結合−、（α１→３）結合グルコース残基のモル比は、それぞれ８６：１４及び８１：１９であった。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢにより生成するアミロースＶ由来生成混合物のメチル化分析により、２５、１６、５５及び４分子％の、末端、３−置換、４−置換及び３，４−二基置換のグルコピラノース残基の存在が示され、それは、１Ｈ  ＮＭＲにより測定された結合比率と一致しており、それにより、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢが（α１→３）結合特異性を有することが確認された。直鎖状（α１→６）グルカン鎖を生成するだけであるＬ．ロイテリＧＴＦＢ酵素（４，６−α−ＧＴアーゼ）とは対照的に、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、（α１→４）結合の切断及び新規な（α１→３）の直鎖方向又は分岐方向への形成をもたらす４，３−α−グルカノトランスフェラーゼ（４，３−α−ＧＴアーゼ）として作用する。
【００７５】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素のアミロースに及ぼす作用を、マルチ検出によるＨＰＳＥＣにより解析した（図８）。開始アミロースＶ基質のＨＰＳＥＣプロファイルは、２３．０ｍＬの溶出後、１７４×１０３Ｄａの平均Ｍｗの単一ピークを示した一方、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢで処理したアミロースＶは、２つの異なる分子量ピークの分布を示し、２１．５ｍＬで溶出する初期ピークは、８００×１０３Ｄａの平均Ｍｗを有する高分子量ポリマーに対応し、第２のピークは、１４００Ｄａの平均Ｍｗを有するオリゴ糖に対応する。Ｌ．ロイテリ１２１  ＧＴＦＢ  ４，６α−ＧＴの場合、ＩＭＭＰに対応するピークは２６．５ｍＬで溶出し、平均Ｍｗが１５×１０３Ｄａであった。このように、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、出発アミロースＶ基質及びＩＭＭＰ製品のものよりもそれぞれ約８及び５０倍高いＭｗ値を有するポリマーを合成できる。しかしながら、屈折率シグナルに基づくと、このポリマーは全生成混合物の２０％未満である一方で、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの生成混合物中には顕著な割合で低分子量グルカンが存在する。
【００７６】
アミロースＶからＬ．ファーメンタムＧＴＦＢにより合成される生成物の構造解析
更に詳細な構造解析を行うため、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢによりアミロースから産生される生成物を、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。得られた７つのフラクション（Ｆ１〜Ｆ７）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲ分光法により別々に分析した（表２）。フラクションＦ６及びＦ７には、それぞれ、加水分解物マルトトリオース（ＤＰ３）及びマルトース（ＤＰ２）が含まれ、更なる試験には用いなかった。一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、δ  ５．４１及び５．３７においてαアノマーシグナルを示し（図７）、この領域は、（α１→４）及び（α１→３）結合α−Ｄ−Ｇｌｃｐ残基のアノマーシグナルを両方含むと考えられる。したがって、（α１→４）及び（α１→３）結合の有無を測定し、分岐度を求めるため、フラクションＦ１〜Ｆ５ではメチル化分析も行った。メチル化分析データは、（α１→３）結合残基に対応するδ  ５．３７のピークに該当した（表２）。Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２フラクションの１Ｈ  ＮＭＲ及びメチル化分析から、（α１→３）結合のパーセンテージが、生成物のＤＰの増加と共に増加することが証明された（表２）。ＤＰ＞３０の重合物を含む、最も高い分子量の生成物フラクションであるＦ１では、全反応生成混合物における１６％及び４％と比較し、それぞれ→３）Ｇｌｃｐ（１→グルコシル単位（２８％）及び分岐→３，４）Ｇｌｃｐ（１→グルコシル単位（８％）のパーセンテージが増加していた。
【００７７】
【表３】
2019521660.tif 000005
【００７８】
ａ上記データは、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおいて、５．４１ｐｐｍで（α１→４）結合のシグナル、及び５．３７ｐｐｍで（α１→３）結合のシグナルのピーク面積の積分比を表す。
ｂ結合分布データを、ＧＬＣ強度に基づく分子パーセントにて示す。
【００７９】
フラクションＦ１に存在する構造エレメントを解明するため、二次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣ、１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹ及び１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ）実験を実施した（図９）。
【００８０】
重合フラクションＦ１の構造解析
多糖生成物（Ｆ１）の一次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図９）では鋭いアノマーシグナルがδ  ５．４１及びδ  ５．３７ｐｐｍにおいて示され、それぞれ、（α１→４）及び（α１→３）結合グルコース単位が、６：４の比率で存在することが、メチル化分析データ（表２）と整合した。表３は、ＮＭＲデータをまとめたものである。
【００８１】
二次元１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルにおけるＨ２シグナルから明らかなように、δ  ５．４１のアノマートラックにおいて、それぞれδ  ３．５９、３．６３及び３．６９において、少なくとも３種類の重複する残基が観察された（図９）。６０ｍｓ（図示せず）及び１５０ｍｓ（図９）の混合時間による二次元ＴＯＣＳＹスペクトルにおける更なる分析では、それぞれδ  ３．７０、３．８５及び３．９７における３つのＨ−３シグナル、及びδ  ３．６５〜３．６７及び３．４２におけるＨ−４シグナルが確認された。末端のα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基の場合、それぞれ、Ｈ−２、Ｈ−３及びＨ−４シグナルはδ  ３．５７、３．７１及び３．４２に予想され、（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基の場合、それぞれ、Ｈ−２、Ｈ−３及びＨ−４は、δ  ３．６３、３．９６及び３．６５で予想され、一方、（１→３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基は、それぞれ、δ  ３．６８、３．８５及び３．６５でＨ−２、Ｈ−３及びＨ−４を示さなければならない。二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルは、これらの残基で予想される１Ｈの化学シフトに対応する１３Ｃ化学シフトを示した。最も顕著には、δ  ７８．８の４−置換Ｃ−４値は、δ  ３．６５のＨ−４に対応し、δ  ８０．４のＣ−３は、δ  ３．８５ｐｐｍのＨ−３に対応した。この二次元ＮＭＲスペクトルで観測されたデータは、これら３種類の残基の生成と整合するものである。
【００８２】
δ  ５．３７のアノマートラックにおいて、二次元１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトル（図９）は、δ  ３．５７及び３．６１でＨ２シグナルを示し、少なくとも２種類の残基の存在を示唆した。二次元１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹスペクトルは、δ  ３．７５及び４．０３のＨ−３シグナル、並びにδ  ３．６７及び３．４３のＨ−４シグナル、並びにδ  ４．１６のＨ−５シグナルを明らかにした。δ  ３．５７、３．７５、３．４３のＨ−２〜Ｈ−４シグナルは、それぞれ、末端のα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−単位と予想されるシグナルに対応する。この単位のＨ−５シグナルは、δ約４．０２と予想され、それは同じ化学シフトを有する強いＨ−３シグナルと重複する。二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル（図９）は、δ  ４．０２の１Ｈの化学シフトに対応するＣ−５（δ  ７２．４）及びＣ−３値（δ  ７４．３）を示し、末端のα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−残基で予想されるδ  ４．０２のＨ−５との対応関係を示唆する。Ｈ−２〜Ｈ−５における残りのδ  ３．６１、４．０３、３．６７及び４．１６の組み合わせは、−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−残基に対応する。二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル（図９）は、１Ｈの化学シフトの帰属を確認しており、非置換のＣ−４値δ  ７１．２がδ  ３．６５のＨ−４に対応し、４−置換α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−残基に対応することを示している。３，４−二基置換残基では明瞭なシグナルは検出されなかったが、δ  ３．４２及び３．４３ｐｐｍの構造レポーターシグナルに示されるように、アノマーシグナルに対して８．４％を占める顕著な量の末端残基が観察された。（α１→４）及び（α１→３）のアノマーシグナルのみが観察されるため、分岐残基は３，４−二基置換でなければならない。これは更に、Ｆ１における約８％の３，４−二基置換残基を示すメチル化分析データにより裏付けられる（表２）。
【００８３】
特に、（α１→３）−アノマートラックは、δ  ３．８５のＨ−３シグナルを示さず、一方、二次元１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトルでは、δ  ３．８５でＨ−３に対応する３−置換Ｃ−３（δ  ８０．４）のみが示され、また二次元１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトル（図９、赤）では、（α１→３）−アノマーシグナルがδ  ３．８５のＨ−３とのみ残基間の対応関係を示し、すなわち連続する（α１→３）結合が発生しないことを示した。更に、４−置換Ｃ−４：Ｈ−４シグナルは、δ  ７８．８：３．６５〜３．６７ｐｐｍでのみ観察された。
【００８４】
【表４】
2019521660.tif 000006
【００８５】
スミス分解分析
連続的な（α１→３）結合がないことを確認するため、Ｆ１のサンプルを緩酸性条件でＮａＩＯ４によるスミス分解に供し、続いてＮａＢＨ４による還元及び蟻酸による穏やかな加水分解に供した。結合解析を考慮すると、過剰な加水分解によるエリトリトール及び［α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）］ｎＤ−Ｇｌｃｐ断片に起因する断片［α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−］ｎα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→２）−Ｌ−エリトリトールが、予想される。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析では、２分間及び６分間の溶出時間でフラグメントのピークを示した。断片［α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）］ｎα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→２）−Ｌ−エリトリトール及び［α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）］ｎＤ−Ｇｌｃｐ（ｎ≧１）の保持時間は１０分を上回ると予想されるため、これらの結果は、連続する（α１→３）結合が存在しないことを示唆する。
【００８６】
Ｆ１の複合モデルの構築
Ｆ１の一次元１Ｈ  ＮＭＲのスペクトルにおける、α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−及びα−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基に対応する、それぞれδ  ３．４３及び３．４２の構造レポーターシグナルは、８．４％の分岐形成を示す。２つの特徴的なピークの相対強度は等しく、４．２％  α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）−残基及び４．２％  α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基を示す。連続する（α１→３）結合残基がないことを考慮すると、すべての３−置換残基は（α１→４）結合でなければならない。また、分岐残基は（１→３，４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基であり、８．４％に達する。４０％（α１→３）の結合が観察されたため、残基の３１．６％は−（１→３）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）−残基でなければならない。（α１→３）結合残基の４．２％が末端であるため、３５．８％の−（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→３）残基が存在する。これより、１５．８％の（１→４）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（１→４）残基が残る。一次元及び二次元ＮＭＲ分光分析、メチル化分析及びスミス分解分析によるすべてのデータを総合すると、Ｆ１の複合モデルが構築され、同定されたすべての構造エレメントが正しい相対量を示している（図１０）。
【００８７】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素により、マルトヘプタオース及びアミロースＶから所定時間に形成されるオリゴ糖
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素の作用パターンをより詳細に解明するため、時間経過による実験を、マルトヘプタオース及びアミロースＶ基質を用いて実施した。１０分間、１時間及び２４時間の反応後に形成されたオリゴ糖生成物をＨＰＡＥＣにより分析した。マルトヘプタオース（Ｇ６及びＧ５がわずかに混入）との反応の初期において、Ｇ２が主な反応生成物として同定された（図１１Ａ）。グルコース（Ｇ１）及びマルトトリオース（Ｇ３）に対応する小規模なピークも同定されたが、また未知の構造であるが高ＤＰ含量のピークが５８分の時点で溶出された。Ｇ２の遊離は、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素が、ＤＰ含量の高い化合物の合成と共に、マルトペンタオシル単位のＭＯＳアクセプター基質への転移を触媒することを示唆する。時間の経過後、グルコース及びＤＰ２〜５を有するＭＯＳの量が増加し、一方、２４時間後にＧ６及びＧ７が減少した。更に、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの不均化活性の結果として、ＭＯＳ滞留時間にフィットせず、おそらく（１→３）結合を含むオリゴ糖に対応するピークが、Ｇ７の開始基質のそれより短い、及び長い保持時間で検出された。アミロースＶとのインキュベートにより、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５と共に、第１の明瞭な反応生成物としてＧ２が得られた（図１２Ａ）。これらのプロファイルは、Ｇ７及びアミロースＶが共に基質として用いられたときにＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ酵素により得られたものとは著しく異なった（図１１Ｂ及び図１２Ｂ）。両基質において、Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢは、反応の初期に主要な第１の生成物として、（Ｇ２の代わりに）グルコースを遊離させる。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢによるＤＰ２〜ＤＰ５を含むＭＯＳの顕著な蓄積は、Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢでは見られなかった。これらの結果は、Ｌ．ファーメンタム及びＬ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢ酵素が、それらの重合メカニズムにおいて異なることを示唆する。新規なＬ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素は、低分子ＤＰのＭＯＳの転移を優先的に触媒し、Ａ．クロオコッカムＧＴＦＤ酵素のそれに類似する作用様式を示す。一方、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ４，３−α−ＧＴでは、特定の最小限長（少なくともＤＰ６）のＭＯＳが、酵素活性に、並びにα（１→３）／（１→４）の交互の構造及びα（１→３）分岐点を有するα−グルカンの産生に必要であると考えられる。最後に、進化的に関連するＧＨ１３及びＧＨ７７ファミリーに属する酵素の場合に観察されるように、上記のデータは、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの４，３−α−ＧＴが複数のドナー結合サブ部位を有することを示す。
【００８８】
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ生成物の酵素処理
Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ酵素（Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２のフラクションＦ１）により合成されるポリマーを更に解析するため、このα−グルカンを、高い活性量のα−アミラーゼ、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ酵素で処理した。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢにより産生されるポリマーは、α−アミラーゼのエンド−（１→４）加水分解活性に対する抵抗性を示した。ＴＬＣ分析により明らかなように、グルコース、マルトース及び高分子量オリゴ糖は、４８時間のα−アミラーゼ分解後、極微量が検出された（図１３）。同じ反応条件下で、デンプン対照基質は完全に加水分解され、α−（１→３）結合の存在がＬ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマーをα−アミラーゼ消化に対して耐性にすることを示した。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマーを、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ酵素処理にも供した。デキストラナーゼはデキストランにおける連続する（１→６）結合のエンド加水分解を触媒し、一方、プルラナーゼはプルラン、デンプンのアミロペクチン及びα−及びβ−限界デキストリンに存在する（１→６）結合を切断する。すなわち、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ処理において、アミロースＶからＬ．ロイテリＧＴＦＢ及びＡ．クロオコッカムＧＴＦＤにより産生されるポリマーをそれぞれ陽性対照として含めた。予想通り、デキストラナーゼは、Ｌ．ロイテリ１２１ＧＴＦＢにより産生されるＩＭＭＰを効率的に加水分解し、一方プルラナーゼは、Ａ．クロオコッカムＧＴＦＤ酵素により合成されるロイテラン様ポリマーを完全に消化した。対照的に、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢポリマーの場合、加水分解は観察されず、１Ｈ  ＮＭＲ分析から推論される（１→６）結合の欠如（１％未満）と一致していた。
【００８９】
結論
本実施例は、Ｌ．ファーメンタムＮＣＣ２９７０がコードする、（α１→４）結合を切断し、（α１→３）結合を合成するＧＨ７０酵素を初めて同定し、解析したものである。発明者らは、この酵素を（α１→４）−α−Ｄ−グルカン：（α１→４）、（α１→３）−α−Ｄ−グルカンα−グルカノトランスフェラーゼ、略して４，３−α−グルカノトランスフェラーゼと命名することを提案する。その一次配列に関して、このタンパク質は明らかに、元来４，６−α−グルカノトランスフェラーゼを唯一含む新規なＧＴＦＢ様ＧＨ７０サブファミリーに属するが、しかしながら、それはまた、ＧＳのアクセプター結合サブ部位を形成する残基における独自の変異を有し、その活性部位が独自の特徴を示すことを示唆している。これらの知見と一致するように、Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢは、基質としてマルトデキストリン及びデンプンを用いる点で、従来同定されたＧＴＦＢ酵素に類似するが、連続する（α１→６）結合の合成を触媒する代わりに、（α１→３）結合に対する特異性を示す。Ｌ．ファーメンタム活性により、直鎖方向及び分岐方向における単一の（α１→３）結合により相互に結合した、異なるマルトオリゴ糖の長さを有する独特のα−グルカン構造が合成される。
【００９０】
ＧＳが、たとえ広い生成物スペクトラムを有して、様々な形状の結合を合成するとしても、今まで特徴づけられたＧＳのいずれも、（α１→４）及び（α１→３）結合からなるα−グルカンを産生しない。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢ生成物の構造はまた、異なる地衣類及び菌類に存在する（α１→４）及び（α１→３）結合の両方を含むα−グルカンに対応するものとは異なる。実際、大部分のこれらの多糖は直鎖状構造を有し、一方、他のものは主に（α１→３）結合から構成され、及び／又は、（α１→３，４）分岐点を有さない。Ｌ．ファーメンタムＧＴＦＢの食品マトリックス中に存在するデンプンへの直接作用は、低消化性と一致する構造的特徴を有するデンプン誘導体を提供する。
【図１】
2019521660.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2019521660.tif 000013
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2019521660000001.app
【国際調査報告】
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2019521660.tif 000022
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