(57)【要約】  本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；（ｂ）標的結合部分；並びに、（ｃ）任意に該アマトキシンと該標的結合部分を連結するリンカー：を含む、コンジュゲートに関する。本発明はさらに、かかるコンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。【選択図】図７
2019511484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；
（ｂ）標的結合部分；並びに
（ｃ）前記アマトキシンと前記標的結合部分を連結する切断可能なリンカー
を含む、コンジュゲート。
【請求項２】
以下の構造Ｉ：
【化１】
2019511484.tif 000036
（式中：
Ｒ２は、Ｓであり；
Ｒ３は、−ＮＨＲ５、−ＮＨ−ＯＲ５、及び−ＯＲ５から選択され；
Ｒ４は、Ｈであり；そして
ここでＲ５の１つは、−Ｌｎ−Ｘであり、ここでＬは、切断可能なリンカーであり、ｎは、０及び１から選択され、並びにＸは、標的結合部分であり、且つここで残余のＲ５は、Ｈである）
を有する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；
（ｂ）標的結合部分；並びに、
（ｃ）任意に前記アマトキシンと前記標的結合部分を連結するリンカー
を含む、コンジュゲート。
【請求項４】
以下の構造Ｉ：
【化２】
2019511484.tif 000037
（式中：
Ｒ２は、Ｓであり；
Ｒ３は、−ＮＨＲ５、−ＮＨ−ＯＲ５、及び−ＯＲ５から選択され；
Ｒ４は、Ｈであり；そして
ここでＲ５の１つは、−Ｌｎ−Ｘであり、ここでＬは、リンカーであり、ｎは、０及び１から選択され、並びにＸは、標的結合部分であり、そしてここで残余のＲ５は、Ｈである）
を有する、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含有する、医薬組成物。
【請求項６】
癌が、特に乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択される、患者における癌の治療において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項７】
（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；並びに、
（ｃ）前記アマトキシンを標的結合部分へ連結するための反応基Ｙを保持する切断可能なリンカー部分
を含む、構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；（ｂ）標的結合部分；並びに、（ｃ）任意に該アマトキシンと該標的結合部分を連結するリンカー：を含む、コンジュゲートに関する。本発明はさらに、かかるコンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アマトキシンは、タマゴテングダケ（Ａｍａｎｉｔａ  ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）キノコにおいて認められた８個のアミノ酸で構成された環状ペプチドである（図１参照）。アマトキシンは、哺乳動物細胞のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、これによりまた影響を受けた細胞の転写及びタンパク質生合成も阻害する。細胞における転写の阻害は、成長及び増殖の停止を引き起こす。アマニチンとＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩの間の複合は、共有結合ではないが、非常に堅固である（ＫＤ＝３ｎＭ）。酵素からのアマニチンの解離は、非常にゆっくりしたプロセスであり、結果的に影響を受けた細胞の回復は起こりそうにない。転写の阻害が非常に長く続く場合、細胞は、プログラム細胞死（アポトーシス）を受けるであろう。
【０００３】
腫瘍療法のための細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用は、１９８１年に、既にジアゾ化を介したＴｒｐ（アミノ酸４；図１参照）のインドール環に結合されたリンカーを使用する、抗−Ｔｈｙ１．２抗体のα−アマニチンへのカップリングにより、開発されている(Davis及びPreston、Science、213 (1981) 1385-1388)。Davis及びPrestonは、位置７’として付着部位を同定した。Morris及びVentonは、さらに、位置７’での置換は、誘導体を生じ、これは細胞毒性を維持していることを明らかにした(Morris及びVenton、Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419-430)。
【０００４】
欧州特許出願ＥＰ  １８５９８１１  Ａ１（２００７年１１月２８日に公開）は、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子が、直接、すなわちリンカー構造を伴わずに、アルブミンへ又はモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３、もしくはＰＡ−１へカップリングされているコンジュゲートを説明している。さらに、これらのコンジュゲートの乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）及びＴリンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対する阻害作用が、示された。アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含むリンカーを含んでなる、リンカーの使用が示唆されたが、かかる構築体は、実際には示されず、アマトキシン上の付着部位などの詳細は、提供されていない。
【０００５】
国際特許出願ＷＯ２０１０／１１５６２９及びＷＯ２０１０／１１５６３０（両方共２０１０年１０月１４日に公開）は、ヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５などの抗−ＥｐＣＡＭ抗体などの抗体が、アマトキシンへ、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子、（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ−原子を介して、又は（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ−原子を介して、各場合において、直接、又は抗体とアマトキシンの間のリンカーを介してのいずれかでカップリングされている、コンジュゲートを説明している。示唆されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含む。さらに、これらのコンジュゲートの乳癌細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、膵臓癌腫（細胞株Ｃａｐａｎ−１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、及び胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対する阻害作用が、示された。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ２０１２／１１９７８７は、標的結合部分は、アマトキシンへ、それらの標的、哺乳動物細胞のＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩとのそのようなアマトキシンの相互作用の干渉を伴わずに、トリプトファンアミノ酸４上の追加の結合部位で、すなわち位置１’−Ｎで、リンカーを介して付着することができることを説明している。
【０００７】
アマトキシンは、抗体分子などの、大型生体分子担体にカップリングされた場合に、相対的に無毒であること、並びにこれらは、生体分子担体が切断された後のみ、その細胞毒性活性を発揮することは、知られている。特に肝細胞に関するアマトキシンの毒性を考慮し、標的化された腫瘍療法のためのアマトキシンコンジュゲートは、血漿中で投与後に非常に安定し続けること、及びアマトキシンの放出は、標的細胞における内部移行後に起こることは、非常に重要である。この状況において、コンジュゲート安定性の小規模の改善は、治療域、及び治療的アプローチに関するアマトキシンコンジュゲートの安全性に関して飛躍的結果を有する可能性がある。
【０００８】
国際特許出願ＷＯ２０１２／０４１５０４は、結合分子へのリンカーとして尿素部分を使用する、アマトキシンの結合分子とのコンジュゲートを説明している。かかる連結は、エステル連結よりも著しくより安定していることが示されている。
【０００９】
従って、治療的使用のためのアマトキシン−ベースのコンジュゲートの開発において、著しい進歩が既に生じている。しかし本発明者らは、α−及びβ−アマトキシンを基にした構築体は、血漿中のストレス条件下では完全に安定しておらず、かなりの程度の架橋された生成物を生じることを発見した（図２から４参照）。しかし、高度に毒性のあるアマトキシンを含むコンジュゲートの安定性は、ヒトへの投与のための治療的分子として想起された使用に関して、非常に重要である。
【発明の概要】
【００１０】
発明の目的
従って、安定性が改善されたアマトキシン変種が、依然非常に必要とされている。この問題点を解くこと、すなわち基本的アマトキシン構造を形成する８個のアミノ酸残基の骨格への特定の修飾を同定することは、先行技術により提供も示唆もされていない。
【００１１】
発明の概要
本発明は、（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシンの変種型は、ストレス条件下で増大した安定性及び改善された治療係数を示すという予想外の知見を基にしている。
【００１２】
従って一態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；（ｂ）標的結合部分；並びに、（ｃ）任意に該アマトキシンと該標的結合部分を連結するリンカー：を含む、コンジュゲートに関する。
【００１３】
第二の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。
【００１４】
第三の態様において、本発明は、患者における癌の治療における使用のための本発明のコンジュゲートであって、ここで癌が、特に乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択されるものに関する。
【００１５】
第四の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；並びに、（ｃ）該アマトキシンを該標的結合部分に連結するための反応基を保持するリンカー部分、特に切断可能であるリンカー部分：を含む、構築体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、様々なアマトキシンの構造式を示す。太字の数字（１から８）は、アマトキシンを形成する８個のアミノ酸の標準の付番を示す。アミノ酸１、３及び４中の原子の標準の指定も、示されている（それぞれ、ギリシャ文字αからγ、ギリシャ文字αからδ、及び番号１’から７’へ）。
【図２】図２は、抗−アマニチンウエスタンブロットにおけるストレス試験の実験の結果を示している。トラスツズマブ−アマニチンコンジュゲート（Ｈｅｒ−３０．０６４３；６’−ＯＨを介したリジンコンジュゲート；安定したリンカー）は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、３７℃で５日間インキュベーションし、これは、過度の鎖間及び鎖内架橋につながり；抗体鎖の架橋は、遊離システインの添加により妨げることができる。
【図３】図３は、α−アマニチンは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でシステインと、強力な反応性を示すことを示している。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中α−アマニチン１ｍｇ／ｍＬ、システイン１０ｍｇ／ｍＬ、３７℃で、２４時間、４８時間及び６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８。
【図４】図４は、β−アマニチンは、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でシステインと、強力な反応性を示すことを示している。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中β−アマニチン１ｍｇ／ｍＬ、システイン１０ｍｇ／ｍＬ、３７℃で、２４時間、４８時間及び６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８。
【図５】図５は、アミノ酸４での６’−デオキシ変種（「アマニン」）は、システインと低下した反応性を示すことを示している。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中アマニン１ｍｇ／ｍＬ、システイン１０ｍｇ／ｍＬ、３７℃で、２４時間、４８時間及び６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８。
【図６】図６及び図７は、二重デオキシ変種ＨＤＰ  ３０．２１０５（アミノ酸４での６’−デオキシ及びアミノ酸８でのＳ−デオキシ；Ｒ３＝−ＯＲ５及び各Ｒ５＝Ｈである、式Ｉ）は、システインとの反応性が完全に存在しないことを示している。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ＨＤＰ  ３０．２１０５  １ｍｇ／ｍＬ、システイン１０ｍｇ／ｍＬ、３７℃で、２４時間、４８時間及び６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８；＊  不純物。
【図７】図６及び図７は、二重デオキシ変種ＨＤＰ  ３０．２１０５（アミノ酸４での６’−デオキシ及びアミノ酸８でのＳ−デオキシ；Ｒ３＝−ＯＲ５及び各Ｒ５＝Ｈである、式Ｉ）は、システインとの反応性が完全に存在しないことを示している。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ＨＤＰ  ３０．２１０５  １ｍｇ／ｍＬ、システイン１０ｍｇ／ｍＬ、３７℃で、２４時間、４８時間及び６日後のＲＰ−ＨＰＬＣ  Ｃ１８；＊  不純物。
【図８】図８は、ＡＡ４−６−ＯＨ部分に切断可能なリンカーを持つ、α−アマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．１６９９、ＡＡ１γ位置に切断可能なリンカーを持つβ−アマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．２０６０、並びにＡＡ１γ位置に切断可能なリンカーを持つ二重デオキシアマトキシン変種ＨＤＰ  ３０．２１１５を示す。
【図９】図９は、０、４及び１０日間、ヒト血漿、マウス血漿、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中３７℃でインキュベーションした後の、Ｔ−Ｄ２６５Ｃ抗体にコンジュゲートした、アマトキシン誘導体ＨＤＰ  ３０．１６９９、ＨＤＰ  ３０．２０６０及びＨＤＰ  ３０．２１１５の、ウェスタンブロット分析を示す。検出は、ウサギ由来のポリクローナル抗−アマニチン抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗−ウサギ抗体で行った。ＨＤＰ  ３０．１６９９及びＨＤＰ  ３０．２０６０は、かなりの架橋及びアマトキシン部分の喪失を示した。二重デオキシアマニチン変種ＨＤＰ  ３０．２１１５は、高い安定性及び有意に低下した架橋を示した。
【図１０】図１０は、Ｔ−Ｄ２６５Ｃ抗体へコンジュゲートされた、アマトキシン誘導体ＨＤＰ  ３０．１６９９、ＨＤＰ  ３０．２０６０及びＨＤＰ  ３０．２１１５の細胞傷害性を示している。試験品目は、ヒト血漿中、３７℃で、０又は４日間インキュベーションした。細胞傷害性アッセイは、ＳＫＢＲ−３細胞上で９６時間行った。ＨＤＰ  ３０．１６９９及びＨＤＰ  ３０．２０６０ベースのＡＤＣは、４日間の血漿ストレス後、顕著な細胞傷害性の喪失を示したのに対し、デオキシ化された誘導体ＨＤＰ  ３０．２１１５は、依然ピコモル活性を示している。
【図１１】図１１は、Ｔ−Ｄ２６５Ｃ抗体へコンジュゲートされた、アマトキシン誘導体ＨＤＰ  ３０．１６９９、ＨＤＰ  ３０．２０６０及びＨＤＰ  ３０．２１１５の細胞傷害性を示している。試験品目は、マウス血漿中、３７℃で、０又は４日間インキュベーションした。細胞傷害性アッセイは、ＳＫＢＲ−３細胞上で９６時間行った。ＨＤＰ  ３０．１６９９及びＨＤＰ  ３０．２０６０ベースのＡＤＣは、血漿ストレス後、顕著な細胞傷害性の喪失を示したのに対し、デオキシ化された誘導体ＨＤＰ  ３０．２１１５は、ほぼ変化がなかった。
【図１２】図１２は、Ｔ−Ｄ２６５Ｃ抗体へコンジュゲートされた、アマトキシン誘導体ＨＤＰ  ３０．１６９９、ＨＤＰ  ３０．２０６０及びＨＤＰ  ３０．２１１５の細胞傷害性を示している。試験品目は、ＰＢＳ中、３７℃で、０又は４日間インキュベーションした。細胞傷害性アッセイは、ＳＫＢＲ−３細胞上で９６時間行った。全てのＡＤＣは、非酵素環境に対し適切な安定性を示す。
【図１３】図１３は、Ｒａｊｉ  ｓ．ｃ．異種移植片モデルにおける異なるｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃ抗体−アマトキシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を比較している−単回投与実験。リンカー及び毒素の構造に応じて、抗腫瘍活性における有意差が認められる。デオキシアマニン変種ｃｈｉＢＣＥ１９−３０．２１１５（アミノ酸４での６’−デオキシ及びアミノ酸８でのＳ−デオキシ）は、全てのアマトキシンＡＤＣで最良の抗腫瘍活性を示し、対応する切断可能なリンカーＡＤＣのｃｈｉＢＣＥ１９−３０．１６９９（６’−ＯＨを介したリジンコンジュゲーション；アミノ酸８でのＳ＝Ｏ）よりも、著しくより良い治療係数を伴った。
【図１４】図１４は、全身Ｒａｊｉ腫瘍モデルにおけるカプランマイヤー生存分析を示す−単回投与試験。簡単に述べると、２．５×１０６個Ｒａｊｉ（ヒトバーキットリンパ腫）腫瘍細胞を、２００μＬ  ＰＢＳ／マウスで、静脈内に０日目に接種した。治療（単回投与、ｉｖ）は、腫瘍細胞接種後３日目に開始した。デオキシ−アマニン変種ｃｈｉＢＣＥ１９−３０．２１１５（アミノ酸４での６’−デオキシ及びアミノ酸８でのＳ−シデオキシ）は、α−アマニチン誘導体ＨＤＰ  ３０．１６９９、ＨＤＰ  ３０．０８８０及びＨＤＰ  ３０．０６４３、並びに対応するＭＭＡＥ−誘導体に勝る優れた生存を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に説明された特定の方法、プロトコール及び試薬に限定されず、これらは変更し得ることは理解されるべきである。同じく、本明細書に使用される専門用語は、単に特定の実施態様を説明することを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付された請求項によってのみ限定されることも理解されるべきである。別に定義しない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００１８】
特に、本明細書において使用される用語は、Leuenberger H.G.W、Nagel,B.及びKolbl,H.編集の「バイオテクノロジーの多言語用語集(A multilingual glossary of biotechnological terms)：(IUPAC推奨)」((1995)、Helvetica Chimica Acta、CH-4010、バーゼル、スイス)において説明されたように定義される。
【００１９】
以下の本明細書及び請求項を通じて、文脈が別に必要としない限りは、用語「含む」並びに「含む」及び「含んでいる」などの変化形は、言及された整数、組成物もしくは工程、又は整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、他方任意の追加の整数、組成物もしくは工程、又は整数、組成物もしくは工程の群も、任意に存在してよく、追加の整数、組成物もしくは工程又は整数、組成物もしくは工程の群が存在しないような実施態様も含むことが理解されるであろう。かかる後者の実施態様において、用語「含んでいる」は、「からなる」と同じ範囲で使用される。
【００２０】
複数の文献が、本明細書の本文を通じて引用されている。本明細書に引用された文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の説明書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号配列寄託など）の各々は、前掲又は後掲のいずれにかかわらず、その全体が各特許法の下で可能な限り、参照により本明細書中に組み込まれている。本発明は、先行する発明を理由としてかかる開示に先行しないことを承認するものと解されるべきではない。
【００２１】
本発明は、ここでさらに説明される。下記節において、本発明の様々な態様が、より詳細に定義される。そのように定義された各態様は、矛盾することが明確に示されない限りは、任意の他の態様又は態様類と組合せられる。特に、好ましい又は有利であると指摘された任意の特徴は、好ましい又は有利であると指摘された他の１又は複数の特徴と組み合わせられてよい。
【００２２】
本発明は、（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８による、アマトキシンの変種型は、ストレス条件下での増大した安定性及び改善された治療係数を示すという予想外の知見を基にしている。
【００２３】
従って、一態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８を含む、アマトキシン；（ｂ）標的結合部分；並びに、（ｃ）任意に該アマトキシンと該標的結合部分を連結するリンカー：を含む、コンジュゲートに関する。特に（ｃ）の任意のリンカーは存在し、且つ切断可能なリンカーである。
【００２４】
Zhaoら(ChemBioChem 16 (2015) 1420−1425)は、かかるジ−デオキシアマトキシンコアの合成を報告した。しかし、Zhaoらの方法は、４種の異なるジアステレオマーの混合物を生じ、その中のただ１種が、天然の生成物の所望の毒性を示す。従って、Zhaoらにより完全に正確に同定されたような、単独の毒性ジアステレオマーの純粋な形での生成については、依然重大な必要性が示されている(Zhaoら、loc. cit.、1424頁左欄)。Zhaoらは、そのような結果を達成するための可能性のある経路の長いリストを提唱したが、与えられた提唱は、せいぜい研究を実行するためのきっかけでしかない。加えてZhaoらは、その合成変種は、対応する天然の生成物の毒性を本質的に維持することを確認することができるが、彼等は(the)、それらの新規化合物の何らかの利点を示しておらず、特に、本発明のジ-デオキシコアを持つアマトキシン誘導体は、血漿中のストレス条件下で増大した安定性を示し且つ架橋された生成物を生じないことの何らかの教示又は何らかの示唆さえも提供していない。従ってZhaoらは、当業者にとって、かかる研究活動に必要とされる努力を払うための、何らかの特定の動機を提供しない。
【００２５】
特定の実施態様において、本発明は、下記構造Ｉを有するコンジュゲートに関する：
【化１】
2019511484.tif 000003
（式中：
Ｒ２は、Ｓであり；
Ｒ３は、−ＮＨＲ５、−ＮＨ−ＯＲ５、及び−ＯＲ５から選択され；
Ｒ４は、Ｈであり；並びに
ここでＲ５の１つは、−Ｌｎ−Ｘであり、ここでＬは、リンカー、特に切断可能なリンカーであり、ｎは、０及び１から選択され、並びにＸは、標的結合部分であり、且つここで残余のＲ５は、Ｈである）。
【００２６】
本発明の文脈において、用語「アマトキシン」は、テングダケ（Ａｍａｎｉｔａ）属から単離され、並びにWieland, T.及びFaulstich H.の文献(Wieland T、Faulstich H.、CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185-260)に説明された、８個のアミノ酸で構成された全ての環状ペプチドを含み、これらは、（ｉ）（すなわち、アミノ酸残基トリプトファンのインドール部分は、特に位置６’が水素原子を保有する場合、位置６’に、酸素−含有置換基を有さない）及び（ｉｉ）（すなわち、天然のアマトキシンのチオエーテルスルホキシド部分は、スルフィドにより置き換えられる）に従い特定の位置を含み、さらにそれらの全ての化学誘導体；さらにそれらの全ての半合成アナログ；天然の化合物のマスター構造（環状、８個のアミノ酸）に従うビルディングブロックから構成された全ての合成アナログ；さらにヒドロキシル化されたアミノ酸の代わりにヒドロキシル化されないアミノ酸を含む、全ての合成又は半合成アナログ；さらに全ての合成又は半合成アナログ：を含み、ここで各場合においてかかる誘導体又はアナログは、少なくとも先に言及された位置（ｉ）及び（ｉｉ）を保有し、且つ哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することにより機能的に活性化される。
【００２７】
機能的に、アマトキシンは、哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又はデプシペプチドとして定義されている。好ましいアマトキシンは、先に定義したようなリンカー分子又は標的結合部分と反応することができる、官能基（例えば、カルボキシル基又はカルボキサミドなどのカルボン酸誘導体、又はヒドロキサム酸、アミノ基、ヒドロキシル基、チオールもしくはチオール捕獲基）を持つものである。本発明のコンジュゲートに特に適しているアマトキシンは、図１に示されるような、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマヌリン、もしくはアマヌリン酸のジ−デオキシ変種、又はアマニン、アマニンアミド、γ−アマニン、もしくはγ−アマニンアミドのモノ−デオキシ変種、並びにそれらの塩、化学誘導体、半合成アナログ、及び合成アナログである。
【００２８】
特定の実施態様において、本発明のコンジュゲートは、９０％よりも大きい、特に９５％よりも大きい純度を有する。
【００２９】
本発明の文脈において、用語「純度」は、存在するコンジュゲートの総量を指す。９０％よりも大きい純度は、例えば、本発明のコンジュゲートを含有する組成物１ｍｇ中に、かかるコンジュゲートは、９０％より多く、すなわち９００μｇより多く存在することを意味する。その残りの部分は、すなわち不純物は、未反応の出発材料、並びに他の反応体、溶媒、切断生成物及び／又は副産物を含み得る。
【００３０】
特定の実施態様において、本発明のコンジュゲートを含有する組成物は、かかるコンジュゲートを、１００ｍｇより多く、特に５００ｍｇより多く、より特定すると１ｇより多く含有する。従って、例えば天然のスルホキシドの部分的還元から、ほぼ間違いなく先行技術のコンジュゲートの複合調製品中には存在し得る、微量の本発明のコンジュゲートは、明白に除外される。
【００３１】
本明細書において使用される用語「標的結合部分」は、標的分子又は標的エピトープへ特異的に結合することができる、任意の分子又は分子の一部を指す。本明細書の文脈における、好ましい標的結合部分は、（ｉ）抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｉｉ）抗体様タンパク質；及び、（ｉｉｉ）核酸アプタマーである。本発明における使用に適した「標的結合部分」は、典型的には、分子質量４００００Ｄａ（４０ｋＤａ）以上を有する。
【００３２】
本明細書で使用される第一の化合物（例えば抗体）の該第二化合物（例えば、標的タンパク質などの抗原）に対するの解離定数ＫＤが１００μＭ又はそれ未満、特に５０μＭ又はそれ未満、特に３０μＭ又はそれ未満、特に２０μＭ又はそれ未満、特に１０μＭ又はそれ未満、特に５μＭ又はそれ未満、より特定すると１μＭ又はそれ未満、より特定すると９００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると８００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると７００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると６００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると５００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると４００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると３００ｎＭ又はそれ未満、より特定すると２００ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると１００ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると９０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると８０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると７０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると６０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると５０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると４０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると３０ｎＭ又はそれ未満、さらにより特定すると２０ｎＭ又はそれ未満、及びさらにより特定すると１０ｎＭ又はそれ未満の場合に、第一化合物は第二化合物へ「特異的に結合する」と考えられる。
【００３３】
本出願の文脈において用語「標的分子」及び「標的エピトープ」は各々、標的結合部分によりそれぞれ特異的に結合されている、抗原及び抗原のエピトープを指す。特に標的分子は、腫瘍−関連抗原、特に、非−腫瘍細胞の表面上と比べ、増加した濃度及び／又は異なる立体配置で、１又は複数の腫瘍細胞型の表面上に存在する抗原又はエピトープである。特に、該抗原又はエピトープは、１又は複数の腫瘍細胞型の表面上に存在するが、非腫瘍細胞の表面上には存在しない。特定の実施態様において、標的結合部分は、以下から選択された抗原のエピトープに特異的に結合する：ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、シアリルルイスａ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）。他の実施態様において、該抗原又はエピトープは、自己免疫疾患に関連した細胞上で、優先的に発現される。特定のかかる実施態様において、標的結合部分は、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のエピトープへ特異的に結合する。
【００３４】
本明細書において使用される用語「抗体又はその抗原結合性フラグメント」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち抗原へ免疫特異的に結合する抗原−結合部位を含む分子を指す。従って用語「その抗原結合性フラグメント」は、少なくとも機能性抗原−結合ドメインを含む、抗体のフラグメントを指す。同じく、例えば標的分子へ、例えば以下から選択された標的タンパク質へ特異的に結合するファージディスプレイ法を含む、技術により選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる：ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２６９、シアリルルイスａ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及びＥｐＣＡＭ。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであることができる。本発明における使用に適した「抗体及びその抗原結合性フラグメント」は、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロコンジュゲート、多重特異性、ヒト、ヒト化（特にＣＤＲグラフトされた）、脱免疫化、又はキメラの抗体、１本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより生成されたフラグメント、ディアボディ又はテトラボディ(Holliger P.ら、Proc Natl Acad Sci USA. 90 (1993) 6444-8)、ナノボディ、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、並びに前述の任意のエピトープ結合性フラグメントを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
一部の実施態様において、抗原結合性フラグメントは、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、且つＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）及びＶＬドメインもしくはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントを含むが、これらに限定されるものではない。１本鎖抗体を含む、抗原結合性抗体フラグメントは、可変ドメイン（複数可）をそれのみ含むか、又は以下の全体もしくは一部と組合せて含んでよい：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン。同じく可変ドメイン（複数可）のヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインとの組合せを含む抗原結合性フラグメントも、本発明に含まれる。
【００３６】
本発明において有用な抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む、任意の動物起源に由来してよい。特に本抗体は、ヒト、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、もしくはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ又はイヌ起源に由来する。抗体は、ヒト又はマウス起源であることは、特に好ましい。本明細書において使用される「ヒト抗体」は、例えばKucherlapati及びJakobovitsの米国特許第５，９３９，５９８号に記載されたように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、並びにヒト免疫グロブリンライブラリーからもしくは１又は複数のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニック動物から単離された抗体、及び内在性免疫グロブリンを発現しない抗体を含む。
【００３７】
用語「抗体様タンパク質」は、標的分子に特異的に結合するように操作されている（例えばループの変異誘発により）タンパク質を指す。典型的には、かかる抗体様タンパク質は、タンパク質スキャフォールドの両端で結合された、少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重構造制限は、抗体様タンパク質の結合親和性を、抗体のそれと同等のレベルまで、大きく増加する。可変ペプチドループの長さは、典型的には１０〜２０個のアミノ酸からなる。スキャフォールドタンパク質は、良好な溶解特性を有する任意のタンパク質であってよい。特に、このスキャフォールドタンパク質は、小型の球状タンパク質である。抗体様タンパク質は、非限定的に、アフィボディ、アンチカリン、及び設計されたアンキリンリピートタンパク質を含む(総説に関しては：Binzら、Nat Biotechnol. 2005, 1257-68参照)。抗体様タンパク質は、例えば、大型ファージディスプレイライブラリーからパンニングされた突然変異体の大型ライブラリーに由来することができ、並びに通常の抗体と同様に単離されることができる。同じく、抗体様結合タンパク質は、球状タンパク質において表面に露出された残基のコンビナトリアル変異誘発により得ることができる。
【００３８】
用語「核酸アプタマー」は、標的分子に結合するよう、インビトロ選択又はＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）の反復されたラウンドにより操作されている核酸分子を指す（総説に関しては：Brody及びGold、J Biotechnol. 74 (2000) 5-13参照）。この核酸アプタマーは、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であってよい。アプタマーは、例えば２’−フッ素置換ピリミジンなどの、修飾されたヌクレオチドのような、修飾を含んでよい。
【００３９】
本発明の文脈における「リンカー」は、各々がリンカーの一端に結合されている、２つの成分を結合している構造を指す。リンカーが結合されている場合、アマトキシンの抗体への直接連結は、アマトキシンの、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用する能力を低下することがある。特定の実施態様において、リンカーは、２つの成分の間の距離を増加し、且つ抗体とアマトキシンの間に存在する場合などには、これらの成分の間の立体的干渉を緩和する。特定の実施態様において、リンカーは、その骨格に、１〜３０個の原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の原子）の連続鎖を有し、すなわちそのリンカーの長さは、アマトキシン部分と抗体の間の原子又は結合の数により測定される最短連結として定義され、ここでリンカー骨格の片側は、アマトキシンと反応し、他側は、抗体との反応に利用可能であるか、又は抗体と反応している。本発明の文脈において、リンカーは特に、任意に置換された、Ｃ１−２０−アルキレン、Ｃ１−２０−ヘテロアルキレン、Ｃ２−２０−アルケニレン、Ｃ２−２０−ヘテロアルケニレン、Ｃ２−２０−アルキニレン、Ｃ２−２０−ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である。リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの、１又は複数の構造要素を含んでよい。リンカーはまた、これらの構造要素の２又はそれよりも多い組合せも含んでよい。ひとつのこれらの構造要素の各々は、１回より多く、例えば２回、３回、４回、５回又は６回リンカー中に存在してよい。一部の実施態様において、リンカーは、ジスルフィド結合を含んでよい。リンカーは、アマトキシン及び抗体へ、単独工程で又は２もしくはそれよりも多い後続工程のいずれかで結合されていることは理解される。リンカーは、その末端に、特に近位端及び遠位端に２つの基を保有し、これらは（ｉ）結合されるべき成分の１つに存在する基、特にアマトキシン又は標的結合ペプチド上の活性化基と共有結合を形成し、あるいは（ｉｉ）アマトキシン上の基との共有結合を形成するよう、活性化されているか又は活性化され得る。従って化学基は、リンカーの遠位端及び近位端に位置し、これはカップリング反応の結果、例えば、エステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合などであることが、好ましい。
【００４０】
特定の実施態様において、リンカーＬは、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択された、１〜２０個の原子の、特に２〜１８個原子、より特定すると５〜１６個原子、さらにより特定すると６〜１５個原子の直鎖である。特定の実施態様において、直鎖内の原子の少なくとも６０％は、Ｃ原子である。特定の実施態様において、直鎖内の原子は、単結合により連結される。
【００４１】
特定の実施態様において、リンカーＬは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択された１〜４個のヘテロ原子を含む、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基であって、ここで該リンカーは、任意に置換されている。
【００４２】
用語「アルキレン」は、１〜１０個の炭素原子を有する基を含む、１〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基を指す。特定の実施態様において、アルキレン基は、低級アルキレン基であってよい。用語「低級アルキレン」は、１〜６個の炭素原子を有する、特定の実施態様においては１〜５個又は１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。アルキレン基の例は、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、及びｎ−ヘキシレンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
用語「アルケニレン」は、２〜２０個の炭素原子を有する、二価の直鎖基であって、ここで少なくとも一つの炭素−炭素結合は、二重結合であるが、他の結合は、単結合又は更なる二重結合であってよい基を指す。本明細書における用語「アルキニレン」は、２〜２０個の炭素原子を有する基であって、ここで少なくとも一つの炭素−炭素結合は、三重結合であるが、他の結合は、単結合、二重結合又は更なる三重結合であってよい基を指す。アルケニレン基の例は、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレンなどを含む。アルキニレン基の例は、エチニレン、１−プロピニレン、２−プロピニレンなどを含む。
【００４４】
本明細書において使用される「シクロアルキレン」は、任意の安定した単環又は多環の環系の一部である二価の環を指し、ここでかかる環は、３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子は有さず、並びにかかる環は、完全に飽和されていることが意図され、並びに用語「シクロアルケニレン」は、任意の安定した単環又は多環の環系の一部である二価の環を指し、ここでかかる環は、３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子は有さず、並びにかかる環は、少なくとも部分的に不飽和である（しかしアリーレン環は除く）ことが意図される。シクロアルキレンの例は、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、及びシクロヘプチレンを含むが、これらに限定されるものではない。シクロアルケニレンの例は、シクロペンテニレン及びシクロヘキセニレンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本明細書において使用される用語「ヘテロシクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルケニレン」は、任意の安定した単環又は多環の環系の一部である二価の環を指し、ここでかかる環は、３〜約１２個の原子を有し、並びにかかる環は、炭素原子、並びに少なくとも１個のヘテロ原子、特にＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立して選択された少なくとも１個のヘテロ原子からなることが意図され、ヘテロシクロアルキレンは、完全に飽和されているかかる環を指し、及びヘテロシクロアルケニレンは、少なくとも部分的に不飽和である環（しかし任意のアリーレン環又はヘテロアリーレン環は除く）を指す。
【００４６】
用語「アリーレン」は、任意の安定した単環又は多環の環系の一部である二価の環又は環系を意味し、ここでかかる環又は環系は、３〜２０個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、その環又は環系は、「４ｎ＋２」π電子則により規定される芳香族部分からなり、フェニレンを含むことが意図される。
【００４７】
本明細書において使用される用語「ヘテロアリーレン」は、任意の安定した単環又は多環の環系の一部である二価の環又は環系を意味し、ここでかかる環又は環系は、３〜２０個の炭素原子を有し、その環又は環系は、「４ｎ＋２」π電子則により規定される芳香族部分からなり、且つ炭素原子、及び１又は複数の窒素、イオウ、及び／又は酸素ヘテロ原子を含む。
【００４８】
本発明の文脈において用語「置換された」は、指定された通常の原子の価数、又は置換される基の好適な原子の価数を超えず、並びにその置換が安定した化合物を生じることを条件として、リンカーの骨格に存在する１又は複数の水素が、指定された基（複数可）から選択された基により、置き換えられていることを示すことが意図される。用語「任意に置換された」とは、リンカーは、本明細書において規定されたように非置換であるか、又は本明細書に規定されたような１又は複数の置換基により置換されているかのいずれかであることを意味することが意図される。置換基がケト（又はオキソ、すなわち＝Ｏ）基、チオ又はイミノ基などである場合、リンカー骨格原子上の２個の水素は、置換されている。例証的置換基としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ハロアルキルが挙げられ、ペルフルオロアルキル（トリフルオロメチルなど）、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ（任意に、例えばアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールにより、一又は二置換された）、イミノ、カルボキサミド、カルバモイル（任意に、例えばアルキル、アリール、もしくはヘテロアリールにより、一又は二置換された）、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、又は−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ、−（ＣＨ２）ｎＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、又は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ（式中、ｎは１〜４であり、及びＲは、水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ−連結した−ヘテロシクロアルキル、−（Ｃ−結合した−ヘテロシクロアルケニル）、−アリール、及び−ヘテロアリールから独立して選択され、多置換が可能である）を含む。当業者により、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキルなどの置換基、又は−ＯＨ、−ＮＨＲなどの官能基は、適しているならば、それら自身置換され得ることは、理解されるであろう。置換された部分それら自身も、適しているならば、さらに置換され得ることも、当業者により理解されるであろう。
【００４９】
特定の実施態様において、リンカーＬは、以下の部分の一つから選択された部分を含む：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）。
【００５０】
本発明の特定の実施態様において、リンカーＬは、以下のリストから選択された数多くのｍ基を含み：アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、及びヘテロアラルキレン基：ここで各基は、任意に独立して置換されてよく、このリンカーはさらに、以下の部分の一つから独立して選択された数多くのｎ部分を含み：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）：ここで、ｍ＝ｎ＋１である。特定の実施態様において、ｍは２であり及びｎは１であるか、又はｍは３であり及びｎは２である。特定の実施態様において、リンカーは、２又は３個の非置換のアルキレン基、及び非置換のアルキレン基に結合している１又は２個のジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン又は尿素部分を、各々含む。
【００５１】
特定の実施態様において、リンカーＬは、ヘテロアリーレン基を含まない。
【００５２】
特定の実施態様において、直鎖中のＣ原子は、独立して任意に置換されたメチレン基（−ＣＨ２−）の一部である。特定のかかる実施態様において、任意の置換基は、ハロゲン及びＣ１−６−アルキルから、独立して選択され、特にメチルである。
【００５３】
特定の実施態様において、リンカーＬは、安定したリンカーである。
【００５４】
本発明の文脈において用語「安定したリンカー」とは、（ｉ）酵素の存在下、及び（ｉｉ）細胞内還元環境において、安定しているリンカーを指す。
【００５５】
特定の実施態様において、安定したリンカーは、（ｉ）酵素−切断可能な部分構造、及び／又は（ｉｉ）ジスルフィド基を含まない。特定のかかる実施態様において、リンカーは、長さが、最大１２個の原子、特に２〜１０個、より特定すると４〜９個、及びより特定すると６〜８個の原子である。
【００５６】
特定の他の実施態様において、リンカーは、切断可能なリンカーである。
【００５７】
本発明の文脈において用語「切断可能なリンカー」とは、（ｉ）酵素により切断可能な、又は（ｉｉ）還元可能なリンカーであるリンカーを指す。特定の実施態様において、この用語は、酵素により切断可能であるリンカー（還元可能なリンカーではない）のみを指す。
【００５８】
本発明の文脈において用語「酵素により切断可能なリンカー」とは、酵素により、特にリソソームペプチダーゼ、例えばカテプシンＢにより、切断され、内部移行後、標的化抗体へコンジュゲートされた毒素カーゴ(toxin cargo)の細胞内放出を生じることができるリンカーを指す(Dubowchikら、Bioconjug Chem. 13 (2002) 855-69参照)。特定の実施態様において、切断可能なリンカーは、以下から選択されたジペプチドを含み：Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ及びＶａｌ−Ｃｉｔ、特に切断可能なリンカーはさらに、ジペプチドとアマトキシンの間にｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）スペーサーを含む。
【００５９】
特定のかかる実施態様において、切断可能なリンカーは、下記構造Ｌ１−Ｌ＊−Ｌ２を含み：
【化２】
2019511484.tif 000004
式中、Ｌ１は、Ｌ＊をアマトキシンへ結合するリンカーの一部であり、特に、Ｌ１は、−ＮＨ−基又は−Ｏ−基を介して、特に−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−基、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｏ−基、又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基を介して、Ｌ＊へ結合され、並びに
Ｌ２は、Ｌ＊を標的結合部分へ結合するリンカーの一部であり、
特に、Ｌ１は、−（ＣＨ２）ｍ−部分を介して（ｍは、１〜８から、特に１〜５から選択された整数である）、又は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−部分（ｎは、１〜３から、特に１〜２から選択された整数である）を介して、Ｌ＊へ結合される。
【００６０】
特定の他のかかる実施態様において、Ｌ＊は、下記構造を有する：
【化３】
2019511484.tif 000005
【００６１】
特定の実施態様において、リンカーＬ１は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択された１〜４個の原子の、特に１〜３個の原子、より特定すると１〜２個の原子、さらにはただ１個の原子の直鎖である。特定の実施態様において、直鎖の原子の少なくとも５０％は、Ｃ原子である。特定の実施態様において、直鎖の原子は、単結合により連結されている。
【００６２】
本発明の文脈において用語「還元可能なリンカー」とは、細胞内還元環境において切断することができるリンカー、特にジスルフィド基を含み、細胞内還元環境による内部移行後、標的結合部分へコンジュゲートされた毒素カーゴの細胞内放出を生じるリンカーを指す(Shenら、J. Biol. Chem. 260 (1985) 10905−10908参照)。特定の実施態様において、還元可能なリンカーは、下記部分を含む：
【化４】
2019511484.tif 000006
（式中、Ｒ１からＲ４は、Ｈ及びメチルから独立して選択される）。
【００６３】
特定のかかる実施態様において、かかる切断可能なリンカーは、長さが、最大２０個の原子、特に６〜１８個、より特定すると８〜１６個、及び最も特定すると１０〜１５個の原子である。特定のかかる実施態様において、本発明のアマトキシンと切断可能なジスルフィド基を連結するリンカーの一部は、３又は４個のＣ原子、特に３個のＣ原子の直鎖である。特定の実施態様において、直鎖の３又は４個のＣ原子は、単結合により連結されている。特定の実施態様において、このリンカーは、ｎ−プロピレン基である。
【００６４】
特定の実施態様において、該リンカーは、以下から選択された式Ｉのアマトキシン中に、存在し、且つその中の位置に片方側上で結合されている：
（ｉ）Ｒ３＝−ＮＨＲ５の式Ｉのコンジュゲートの場合、アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子にアミド基の窒素原子（アミドリンケージ）；
（ｉｉ）Ｒ３＝−ＯＲ５の式Ｉのコンジュゲートの場合、アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子に酸性基の酸素原子（エステルリンケージ）；
（ｉｉｉ）Ｒ３＝−ＮＨＯＲ５の式Ｉのコンジュゲートの場合、アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子にヒドロキサム酸基の酸素原子；
（ｉｖ）特にエステルリンケージ、エーテルリンケージ又はウレタンリンケージを介して、アマトキシンアミノ酸３のδＣ−原子にヒドロキシル基の酸素原子；又は
（ｖ）アミノ酸４の環窒素。
【００６５】
特定のかかる実施態様において、該リンカーは、先に示された（ｉｉ）〜（ｖ）から選択された式Ｉのアマトキシン中に、存在し、且つその中の位置に片方側上で結合されている。特定の実施態様において、該リンカーは、先に示された（ｉｖ）〜（ｖ）から選択された式Ｉのアマトキシン中に、存在し、且つその中の位置に片方側上で結合されている。
【００６６】
このリンカーの標的結合部分へのカップリングは、当業者に周知の、特に抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の分野の、様々な方法により実現することができる。
【００６７】
特定の実施態様において、該リンカーは、尿素部分を介して、標的結合部分へ結合される（・・・−リンカー−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−標的結合部分）。特定のかかる実施態様において、尿素部分は、リジン側鎖のアミノ基などの、当初標的結合部分に存在する第一級アミンの、カルバミン酸誘導体・・・−リンカー−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｚ（式中、Ｚは、第一級アミンにより置き換えることができる脱離基である）との反応から生じる。
【００６８】
特定の他の実施態様において、該リンカーは、チオエーテル部分を介した標的結合部分中に、存在し、且つそれに結合されている（・・・−リンカー−Ｓ−標的結合部分）。従ってかかる実施態様において、本発明は、下記一般式のコンジュゲートに関する：
ジデオキシキサマトキシン(dideoxyxamatoxin)−Ｌ−Ｘ＊−Ｓ−Ｔｂｍ
ここで、ジデオキシキサマトキシンは、本発明のアマトキシンであり、Ｌは、リンカーであり、Ｘ＊は、チオール基のチオール反応基へのカップリングから生じる部分であり、Ｓは、該チオール基の、特にシステインアミノ酸残基のチオール基の硫黄原子であり、並びにＴｂｍは、標的結合部分、特に該システインアミノ酸残基を含む、抗体又は機能性抗体断片である。特定の実施態様において、該システインアミノ酸残基は、（ｉ）ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択された抗体ドメインに位置し；（ｉｉ）該抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す生殖系列配列が、システインとは異なるアミノ酸残基を含む位置に配置され；並びに、（ｉｉｉ）溶媒に曝される位置に位置する。
【００６９】
本発明の文脈において用語「チオール反応基」は、６．０〜８．０の範囲の特定のｐＨ値において、より特定すると６．５〜７．５の範囲のｐＨ値において、例えば抗体の遊離システインのチオール基と選択的に反応する基を指す。特に用語「選択的」は、チオール反応基を含む分子の、少なくとも１個の遊離システイン残基を含む抗体とのカップリング反応の１０％未満が、特に５％未満、より特定すると２％未満が、リジン残基などの、抗体の非−システイン残基とのカップリング反応であることを意味する。特定の実施態様において、チオール反応基は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、マレイミド、位置３に脱離基、特に−Ｂｒ及び置換チオールから選択された脱離基を有するマレイミド（例えばＵＳ９，２９５，７２９参照）、位置４に脱離基、特に−Ｂｒ及び置換チオールから選択された脱離基を有する１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン（例えば、ＵＳ９，２９５，７２９参照）、メチルスルホニルベンゾチアゾール、メチルスルホニルフェニルテトラテトラゾール、メチルスルホニルフェニルオキサジアゾール(Todaら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52 (2013) 12592-6参照)、３−アリールプロピオニトリル(Kolodychら、Bioconjugate Chem. 2015, 26, 197-200参照)、及び５−ニトロ−ピリジン−２−イル−ジスルフィド（・・・−Ｌ−Ｓ−Ｓ−（５−ニトロ−ピリジン−２−イル）から選択される。
【００７０】
特定の実施態様において、該位置又は官能基は、リンカーに結合された片側上に存在し、且つ標的結合部分に存在する位置又は官能基に直接又は間接に結合され得るが、これらは、一つの標的結合部分又は２つの標的結合部分に存在する２個のチオール基と反応することができる部分である。特定の実施態様において、チオール反応基は、位置３及び４に２個の脱離基を有するマレイミドであり、特に、３，４−ジブロモマレイミド、３，４−ビス（アリールチオ）−マレイミド、特に３，４−ジフェニルチオ−マレイミド、及び３，４−ビス（ヘテロアリールチオ）−マレイミド、特に３，４−ビス（２−ピリジニル−スルファニル）−マレイミドから選択される。特定の他の実施態様において、チオール反応基は、位置４及び５に２個の脱離基を有する１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオンであり、特に、４，５−ブロモ−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、４，５−ビス（アリールチオ）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に４，５−ジフェニルチオ−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、及び４，５−ビス（アリールヘテロアリールチオ）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオン、特に４，５−ビス（２−ピリジニル−スルファニル）−１，２−ジヒドロピリダジン−３，６−ジオンから選択される。
【００７１】
特定の実施態様において、チオール基のチオール反応基へのカップリングから生じる部分は、以下から選択される：チオール−置換アセトアミド；チオール−置換スクシンイミド；チオール−置換コハク酸(succinamic acid)；チオール−置換ヘテロアリール、特にチオール−置換ベンゾチアゾール、チオール−置換フェニルテトラゾール及びチオール−置換フェニルオキサジアゾール；及び、１個の硫黄原子が、抗体のシステイン残基に由来するジスルフィド。特定の実施態様において、チオール基のチオール反応基へのカップリングから生じる部分は、チオール−置換スクシンイミドである。
【００７２】
特定の実施態様において、段落［００５８］（［００７０］）の一般式に存在する部分Ｌ−Ｘ＊−Ｓ中のリンカーＬは、以下の部分の群から選択される：
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)2-S-S-(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)3-S-S-(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)2-S-S-(CH2)3-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)3-S-S-(CH2)3-X-S-  （Tbm 側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)4-S-S-(CH2)4-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)2-CMe2-S-S-(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)2-S-S-CMe2-(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -(CH2)3-S-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Cit-Val-CO(CH2)5-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)5-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Ala-Val-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Ala-Phe-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Lys-Phe-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Cit-Phe-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Val-Val-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Ile-Val-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-His-Val-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Met-Val-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
（ジデオキシアマトキシン側）  -CH2-C6H4-NH-Asn-Lys-CO(CH2)2-X-S-  （Tbm側）；
そしてここで、ジペプチド配列の側方に位置する−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、各々ジペプチドのカルボキシ末端及びアミノ末端とのアミド結合を形成する、リンカーのアミノ部分及びカルボニル部分を表す。
【００７３】
本発明の文脈において用語「チオール基のチオール反応基へのカップリングから生じる部分」は、（ｉ）例えば、ブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ基、アルキルスルホン又はヘテロアリールスルホンなどの、システイン残基の硫黄原子による、チオール反応基に存在する脱離基Ｙの求核置換；（ｉｉ）システイン残基のＨＳ−基の、例えば、マレイミドなどの、チオール反応基の活性化された二重結合への付加、あるいは、（ｉｉｉ）活性化されたジスルフィド又はメタンチオスルホネートの、脱離基としての、例えば、ピリジン−２−チオール、５−ニトロピリジン−２−チオール又はメタンスルフィネートなどの、システイン残基の硫黄原子との、ジスルフィド交換；あるいは、（ｉｖ）システイン残基の硫黄原子とチオール反応基の一部である反応性部分の間の安定した結合を生じる任意の他の化学反応：から生じる構造を指す。
【００７４】
チオール基のカップリングから生じる主要部分は、任意にさらに、誘導体化されてよく、例えば、マレイミドから生じるスクシンイミジルチオエーテルは、下記一般構造のコハク酸チオエーテルへ加水分解され得る：
【化５】
2019511484.tif 000007
【００７５】
特定の他の実施態様において、部位特異的カップリングは、標的結合部分に存在するジスルフィド橋を還元し、２個のシステイン残基を、ジデオキシキサマトキシン−Ｌ−Ｘ＊構築体に存在する架橋部分Ｘ＊と反応させることにより、実行され得る(Badescuら、「安定し且つ規定された抗体薬物コンジュゲートのためのジスルフィド架橋」、Bioconjugate Chemistry. 25 (2014) 1124-1136)。
【００７６】
類似の実施態様において、部位特異的カップリングは、標的結合部分に存在するジスルフィド橋を還元し、２個のシステイン残基を、シデオキシキサマトキシン−Ｌ−Ｘ＊構築体に存在する架橋部分Ｘ＊と、特に下記のＸ＊と反応させることにより、実現することができる：
【化６】
2019511484.tif 000008
(Brydenら、Bioconjug Chem, 25 (2014) 611-617；Schumacherら、Org Biomol Chem, 2014, 7261-7269参照)。
【００７７】
特定の他の実施態様において、カップリングは、トランスアミナーゼを介したリンカーに存在するアミノ基の、標的結合部分に存在するグルタミン残基への、位置特異的(regiospecific)カップリング、特に抗体のグルタミンＱ２９５へのカップリングにより達成される：
【化７】
2019511484.tif 000009
【００７８】
特定の実施態様において、カップリングは、Ｎ−グリカン側鎖を含む標的結合部分への、部位−特異的コンジュゲーションにより実現される。特に、Ｎ−グリカン側鎖は、酵素により、引き続きアジド−ガラクトースによるｔｒａｎｓ−グリコシル化により、分解することができる。クリックケミストリーを使用し、かかる修飾された標的結合部分は、好適に修飾された構築体ジデオキシキサマトキシン−Ｌ−Ｘ＊へカップリングすることができる（式中、Ｘ＊は、例えば、ジベンゾ−シクロオクチン（ＤＩＢＯ）又はＣ−Ｃ三重結合を含む類似部分である）。例えば、構築体ジデオキシキサマトキシン−Ｌ−ＮＨ２は、ヒドロキシスクシンイミド部分の求核置換により、ＤＩＢＯ−ＳＥにカップリングすることができる：
【化８】
2019511484.tif 000010
その後生じたＤＩＢＯ−修飾されたリンカー構築体は、先に言及したアジド誘導体へカップリングすることができる。別の実施態様において、標的結合部分は、クリックケミストリーを可能にする非天然アミノ酸の組込みにより、特にパラ−アジドメチル−Ｌ−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）の組込みにより、修飾することができる。
【００７９】
特定の実施態様において、−Ｌ−Ｘ＊におけるリンカーＬは、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択された、少なくとも５個、特に少なくとも１０個、より特定すると１０〜２０個の原子の、特に１０〜１８個の原子、より特定すると１０〜１６個の原子、及びさらにより特定すると１０〜１５個の原子の直鎖である。特定の実施態様において、直鎖の原子の少なくとも６０％は、Ｃ原子である。特定の実施態様において、直鎖の原子は、単結合により連結される。
【００８０】
別の実施態様において、標的結合部分に存在する位置又は官能基へ直接又は間接に結合され得る、位置又は官能基は、エチニル基ではなく、より一般的には、アルキニル基ではなく、又は１，３−双極子付加環化における１，３双極子と反応することができる基（クリックケミストリー）ではない。
【００８１】
特定の他の実施態様において、ジデオキシキサマトキシン−Ｌ−Ｘ＊構築体の標的結合部分への部位−特異的カップリングは、ケト基を含む非天然アミノ酸、特にｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）の、標的結合部分への組込み、及びそのような修飾された標的結合部分のジデオキシキサマトキシン−Ｌ−Ｘ＊構築体（式中、Ｘ＊は、ヒドロキシルアミン部分である）との反応により実行され得る。
【００８２】
更なる実施態様において、ホルミル基は、アルデヒドタグを作製するために、配列ＣｘＰｘＲの認識におけるシステイン基に対し高度の選択性がある、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）により導入することができる。かかるアルデヒドタグは、特にＸ＊が下記である場合、ジデオキシキサマトキシン−Ｌ−Ｘ＊構築体中に存在する好適な基Ｘ＊と反応させることができる：
【化９】
2019511484.tif 000011
(Agarwalら、Bioconjugate Chem 24 (2013) 846−851参照)。
【００８３】
第二の態様において、本発明は、本発明のコンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。
【００８４】
第三の態様において、本発明は、患者における癌の治療に使用するための本発明のコンジュゲートに関し、ここで癌は、特に乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、及び悪性リンパ腫からなる群から選択される。
【００８５】
本明細書で使用される疾患又は障害を「治療する(treat)」、「治療している(treating)」又は「治療(treatment)」は、以下の１又は複数を達成することを意味する：（ａ）該障害の重症度を軽減すること；（ｂ）治療される該障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限又は予防すること；（ｃ）治療される該障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を阻止すること；（ｄ）該障害（複数可）に過去に罹患していた患者における該障害の再発を制限又は予防すること；並びに、（ｅ）過去に該障害（複数可）の症状を示した患者における症状の再発を制限又は予防すること。
【００８６】
本明細書において使用される治療は、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物を患者へ投与することを含んでよく、ここで「投与する」とは、インビボ投与、並びにエクスビボで、例えば静脈移植片での組織への直接的投与を含む。
【００８７】
特定の実施態様において、本発明のコンジュゲートの治療的有効量が使用される。
【００８８】
「治療的有効量」とは、意図した目的を達成するのに十分な治療薬の量である。所定の治療薬の有効量は、薬剤の性質、投与経路、治療薬を受け取る動物の大きさ及び種、並びに投与目的等の要因により変動する。各々の個別の症例における有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って当業者が経験的に決定することができる。
【００８９】
別の態様において、本発明は、本発明のアマトキシン、標的結合部分とのアマトキシンの本発明のコンジュゲートを含有し、さらに１又は複数の医薬として許容し得る希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤、及び／又は保存剤を含んでなる、医薬組成物に関する。
【００９０】
「医薬として許容し得る」とは、連邦政府若しくは州政府の規制当局により承認されていること、又は米国薬局方、若しくは動物、より具体的にはヒトにおける使用のための他の一般的に認められた薬局方に収載されていることを意味する。
【００９１】
特定の実施態様において、医薬組成物は、全身的に投与される医薬品の形態で用いられる。これは、他の注射剤及び注入剤を含む非経口剤を含む。注射剤は、アンプルの形態で、又はいわゆる即用可能な（ready-for-use）注射剤、例えば即用可能（ready-to-use）な注射器若しくは使い捨ての注射器として、及びこれに加えて複数回の抜取りを行うための穿刺用フラスコ内に製剤化される。注射剤の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮内（ｉ．ｃ．）の適用の形態であってもよい。特にそれぞれ好適な注射製剤を、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子、又は例えばヒドロゾルのようなコロイド分散系として製造することが可能である。
【００９２】
注射用製剤はさらに、水性等張希釈剤を用いて溶解又は分散させることができる濃縮物として製造することができる。注入剤を、等張溶液、脂肪性エマルション、リポソーム製剤及びマイクロエマルションの形態で調製することもできる。注射剤と同様に、注入製剤を、希釈用濃縮物の形態で調製することもできる。注射用製剤を、例えばミニポンプにより、入院療法及び通院療法の双方において持続性注入剤の形態で適用することもできる。
【００９３】
非経口薬物製剤に例えばアルブミン、血漿、増量剤、界面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調節物質、錯体形成物質若しくはポリマー物質を、特にタンパク質若しくはポリマーに対する本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの吸着に影響を与えるための物質として、添加することが可能であり、あるいは本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの吸着を低減させる目的で、注射機器のような材料、若しくは包装用材料、例えばプラスチック若しくはガラスにこれらを添加することもできる。
【００９４】
標的結合部分を含有する本発明のアマトキシンを、非経口剤におけるマイクロ担体又はナノ粒子と、例えば、ポリ（メタ）アクリレート、ポリラクテート、ポリグリコレート、ポリアミノ酸又はポリエーテルウレタンベースの微細分散された粒子等に結合させることができる。非経口製剤はまた、例えば、本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートをそれぞれ微細分散形態、分散形態及び懸濁形態で、又は医薬品中の結晶の懸濁液として、導入する場合、例えば「複数単位原理（multiple unit principle）」に基づき持続性製剤として、又は本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートを後に埋植される製剤中に、例えば錠剤若しくは棒剤（rod）中に封入する場合、「単一単位原理（single unit principle）」に基づき、デポー調製品として修飾することができる。単一単位製剤及び複数単位製剤のこれらの埋め込み剤又はデポー医薬品は多くの場合、いわゆる生分解性ポリマー、例えば乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリレート、又は多糖等からなることが多い。
【００９５】
非経口剤として製剤化される本発明の医薬組成物の製造時に添加される補助剤及び担体は、特に滅菌水(Aqua sterilisata)、ｐＨ値調節物質、例えば有機酸若しくは無機酸若しくは有機塩基若しくは無機塩基及びこれらの塩等、ｐＨ値調節用の緩衝物質、等張化用物質、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース等、それぞれ界面活性剤(tensides)及び界面活性剤(surfactants)、並びに乳化剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標））、若しくは例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））等、脂肪油、例えば落花生油、大豆油若しくはヒマシ油等、脂肪酸の合成エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標））等、並びに高分子補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン等、有機溶媒の溶解度を増大させる添加剤、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ-ジメチルアセトアミド、プロピレングリコール等、又は錯体形成物質、例えばクエン酸エステル及び尿素等、保存料、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコール等、抗酸化剤、例えば亜硫酸ナトリウム等、並びに安定化剤、例えばＥＤＴＡ等である。
【００９６】
好ましい実施態様において懸濁剤として本発明の医薬組成物を製剤化する場合、本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートの沈殿を防止するための増粘剤、又は堆積物の再懸濁能を確保するための界面活性剤及び多価電解質、及び／又は錯体形成剤、例えばＥＤＴＡ等を添加する。様々な高分子との活性成分の複合体を得ることも可能である。かかる高分子の例としては、ポリエチレングリコール、ポリスチロール、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）又はポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステルが挙げられる。本発明の標的結合部分毒素コンジュゲートを、包接化合物の形態で、例えばシクロデキストリンと共に、液体製剤中に組み込むこともできる。特定の実施態様において、分散剤を、さらなる補助剤として添加することができる。凍結乾燥物の製造のために、スキャフォールド剤、例えばマンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ、又は様々なゼラチンを用いることができる。
【００９７】
第四の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）６’−デオキシ位置を持つアミノ酸４；及び、（ｉｉ）Ｓ−デオキシ位置を持つアミノ酸８：を有するアマトキシン；並びに、（ｃ）該アマトキシンを標的結合部分へ連結するための反応基を保有するリンカー部分：を含む、構築体に関する。
【００９８】
特定の実施態様において、本発明は、下記の構造ＩＩを有する構築体に関する：
【化１０】
2019511484.tif 000012
（式中：
Ｒ２は、Ｓであり；
Ｒ３は、−ＮＨＲ５、−ＮＨ−ＯＲ５、及び−ＯＲ５から選択され；
Ｒ４は、Ｈであり；並びに
ここでＲ５の１つは、−Ｌ−Ｙであり、ここでＬは、リンカーであり、Ｙは、該構築体を標的結合部分へ連結する反応基である）。
【実施例】
【００９９】
以下において、非限定的な実施例により、本発明をより詳細に説明する。
【０１００】
１．  合成ジデオキシ前駆体分子Ｋの合成
ジデオキシ前駆体分子Ｋの合成は、実施例５．５において、ＷＯ２０１４／００９０２５で詳述されている。
【化１１】
2019511484.tif 000013
【０１０１】
化合物Ｋは、７Ｎメタノール性ＮＨ３溶液（３．０ｍｌ）による処理、及び一晩撹拌されることにより、脱保護され得る。
【０１０２】
２．  合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ３０．２１０５の合成
アミノ酸１でのカルボキサミド基の代わりに−ＣＯＯＨ基を含む代替ジデオキシ前駆体分子は、合成され（ＨＤＰ  ３０．１８９５）且つ脱保護され、ＨＤＰ  ３０．２１０５を生じる。
【化１２】
2019511484.tif 000014
【０１０３】
工程１：４−ヒドロキシ−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アリルエステル１−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル）エステル（ＨＤＰ  ３０．００１３）
【化１３】
2019511484.tif 000015
ＦｍｏｃＨｙｐＯＨ（１０．０ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）を、８０％ＭｅＯＨの１００ｍｌ中に懸濁し、Ｃｓ２ＣＯ３（４．６ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）を添加した。この懸濁液を、完全に溶解するまで、５０℃で３０分間攪拌した。この反応混合物を、濃縮乾固させ、ＤＭＦ  １００ｍｌ中に溶解した。臭化アリル（１．６ｍｌ、３．６ｇ、２９．７ｍｍｏｌ）を滴加し、反応液を、ＲＴで一晩撹拌した。ＤＭＦを蒸発させ、残基を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル中に溶解した。沈殿を濾過し、透明な溶液を、セライト上に吸着させ、その後カラムクロマトグラフィーにかけた。本化合物は、２２０ｇシリカゲル上で、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル勾配で精製した。
収量：１１．５ｇ、１００％。
【０１０４】
工程２：樹脂負荷（ＨＤＰ  ３０．０４００）
【化１４】
2019511484.tif 000016
ＨＤＰ  ３０．００１３（５．０ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）、４−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１．３３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を、ジクロロエタン４０ｍｌ中の１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル−メトキシメチル樹脂（５．０ｇ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ  ＴＨＰ樹脂）の懸濁液に添加した。この反応液を、８０℃で一晩撹拌した。冷却した後、樹脂を濾過し、ジクロロエタン、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ジクロロメタン及びｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにより十分に洗浄した。負荷は、０．６２ｍｍｏｌ／ｇであった（脱保護後のフルオレンメチル基のＵＶ分光法により測定）。
【０１０５】
工程３：固相前駆体合成（ＨＤＰ  ３０．１８９４）
【化１５】
2019511484.tif 000017
樹脂の前処理：
ＨＤＰ  ３０．０４００（０．５ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルバルビツール酸（４８３ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（６９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）により処理した。樹脂を、一晩、ＲＴで振盪させた。その後樹脂を、ジクロロエタン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、アセトニトリル、ジクロロメタン及びｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルにより十分に洗浄し、減圧下で乾燥させた。
【０１０６】
カップリング手順：
全ての反応物及び試薬を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含有するジクロロメタン／Ｎ−メチル−２−ピロリドン（溶媒Ａ）中に溶解した。
ＨＤＰ  ３０．０４７７（２５７ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、３．０ｍｌの溶媒Ａ中に溶解し、０．２Ｎ  ＰｙＢＯＰ溶液（３３３ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．０当量）の３．０ｍｌ、０．２Ｎ  ＨＯＢｔ溶液（１３０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．０当量）の３．０ｍｌ、及びＤＩＥＡ（４．０当量）の４３９μｌで処理した。この反応物を、マイクロウェーブ放射線照射（２０Ｗ、ＣＥＭマイクロウェーブ反応器）により、５０℃で８分間加熱し、カップリング後、Ｎ−メチル−２−ピロリドンにより洗浄した。
【０１０７】
脱保護：
脱保護は、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中２０％ピペリジン６．０ｍｌの添加により、５０℃で８分間行った。樹脂を、Ｎ−メチル−２−ピロリドンにより洗浄した。（注記：最終アミノ酸のカップリング後には脱保護しない）。
【０１０８】
全ての他のアミノ酸は、先のプロトコールに従いカップリングさせ、重量は以下に示した：
０．６３ｍｍｏｌ、４９８ｍｇ  Ｆｍｏｃ  Ａｓｐ（ＯＡｌｌ）ＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、７３８ｍｇ  Ｆｍｏｃ  Ｃｙｓ（Ｔｒｉ）ＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、３７５ｍｇ  Ｆｍｏｃ  ＧｌｙＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、４４５ｍｇ  Ｆｍｏｃ  ＩｌｅＯＨ
０．６３ｍｍｏｌ、３７５ｍｇ  Ｆｍｏｃ  ＧｌｙＯＨ
０．３８ｍｍｏｌ、ｍｇ  Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＰＩＯＨ  （ＨＤＰ  ３０．００７９）。
【０１０９】
４，５−ジアセトキシ−２−アミノ−３−メチル−ペンタン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル；塩酸塩（ＨＤＰ  ３０．０４７７）は、ＷＯ２０１４／００９０２５に説明されたように合成した。
【０１１０】
Ｎ−Ｂｏｃ−ＨＰＩＯＨ（ＨＤＰ  ３０．００７９）は、Zanotti Giancarlo；Birr Christian; Wieland Theodorの文献(International Journal of Peptide & Protein Research 18 (1981) 162-8)に従い、調製した。
【０１１１】
工程４：ＨＤＰ  ３０．１８９５
【化１６】
2019511484.tif 000018
樹脂からの脱離及びＢ環形成
前記樹脂は、５％トリイソプロピルシランを含有するトリフルオロ酢酸１０ｍｌと共に、３０分間振盪させ、最後に、５０ｍｌフラスコへ溶出した。樹脂を、メタノールにより２回洗浄した（各１０ｍｌ）。一緒にした溶出液を、真空下で濃縮させ、メタノール２〜４ｍｌ中に再懸濁した。ペプチド沈殿のために、メタノール性溶液を、５０ｍｌの冷ジエチルエーテルへ、２回滴加した。遠心分離後、沈殿物を、ジエチルエーテルにより洗浄し（２回）、減圧下で乾燥させた。白色沈殿物を、およそ４〜５ｍｌのメタノール中に溶解し（０．５ｍｌ／１００ｍｇ）、分取逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。およそ１００ｍｇの粗沈殿物を、試行に従い精製した。画分を、質量分析により分析し、一緒にし、減圧下でメタノール除去した。水相を凍結乾燥させた。
収量：２４．４ｍｇ、２３．７μｍｏｌ
質量分析：［Ｍ＋Ｈ］＋、１０３０．５。
【０１１２】
Ａ−環形成
先の凍結乾燥させた中間体を、ジメチルアミドホルムアミド２５ｍｌに溶解し、ジフェニルホスホリルアジド（６３μｌ、１１８５μｍｏｌ、５当量）及びジイソプロピルエチルアミン（２０１μｌ、１１８５μｍｏｌ、５当量）により処理した。この反応物を、一晩撹拌した（２０時間）。変換は、逆相クロマトグラフィーによりモニタリングし、最後に水１００μｌによりクエンチした。混合物を、減圧下で濃縮し、メタノール１〜２ｍｌ中に再溶解した。生成物の沈殿を、ジエチルエーテル２０ｍｌの滴加により行った。沈殿物を、ジエチルエーテルにより２回洗浄し、減圧下で乾燥させた。次工程を、さらに精製することなく行った。
質量分析：［Ｍ＋Ｎａ］＋、１０３４．６。
【０１１３】
エステル脱保護：
この粗環化生成物へ、ジクロロメタン２．５ｍｌ、ジエチルバルビツール酸（２２．３ｍｇ、１１８．５μｍｏｌ）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（２７ｍｇ、２３．７μｍｏｌ）を添加した。反応物を、ＲＴで一晩撹拌した。反応は、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングすることができる。完全に変換した後、混合物を、冷却したジエチルエーテル２０ｍｌへ滴加し、沈殿物をジエチルエーテルにより２回洗浄した。減圧で乾燥させた後、沈殿物を、メタノール（１．０ｍｌ）中に溶解し、分取逆相クロマトグラフィーにより精製した。
収量：１５．０ｍｇ
質量分析：［Ｍ＋Ｈ］＋、９７２，３；［Ｍ＋Ｎａ］＋、９９４．５。
【０１１４】
工程５：ＨＤＰ  ３０．２１０５
【化１７】
2019511484.tif 000019
ＨＤＰ  ３０．１８９５（１５．０ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）を、７Ｎメタノール性ＮＨ３溶液（３．０ｍｌ）中に溶解し、一晩撹拌した。変換は、質量分析によりチェックした。変換が完了した後、反応物を真空で濃縮し、８０％ｔｅｒｔ−ブタノール中に懸濁し、凍結乾燥させた。生成物を、分取ＨＰＬＣにより精製した。
収量：１２．１ｍｇ
質量分析：［Ｍ＋Ｈ］＋、８８８．０；［Ｍ＋Ｎａ］＋、９１０．２。
【０１１５】
３．  合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ  ３０．２１１５の合成
【化１８】
2019511484.tif 000020
切断可能なリンカーを伴うチオール反応基を含むジデオキシ前駆体分子は、以下のように７工程で、実施例２の生成物から合成することができる：
【０１１６】
工程１：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（ＨＤＰ  ３０．１３４３）
【化１９】
2019511484.tif 000021
【０１１７】
この化合物は、R. A. FirestoneらのＵＳ６，２１４，３４５に従い調製する。テトラヒドロフラン（２００ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（２０．２４ｇ；５９．６４ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．８６ｇ＝１．０当量）を０℃で、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１２．３０ｇ；１．０当量）により処理した。この混合物を、アルゴン大気下、ＲＴで６時間撹拌し、その後固形物ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）副産物を、濾過除去し、ＴＨＦで洗浄し、溶媒を、回転蒸発により除去した。残渣を、ジクロロメタン３００ｍｌ中に溶解し、氷浴で１時間冷却し、再度濾過して、追加のＤＣＵを除去した。ジクロロメタンを蒸発させ、固形泡状物（２６．５１ｇ）を、さらに精製することなく次工程で使用した。
【０１１８】
工程２：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＯＨ（ＨＤＰ  ３０．１４１４）
【化２０】
2019511484.tif 000022
工程２の生成物は、P.W. HowardらのＵＳ２０１１／０２５６１５７と同様に調製する。水１５０ｍｌ中のＬ−アラニン（５．５８ｇ；１．０５当量）及び炭酸水素ナトリウム（５．５１ｇ；１．１当量）の溶液を調製し、テトラヒドロフラン２２５ｍｌ中のＨＤＰ  ３０．１３４３（２６．５１ｇ；最大５９．６ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この混合物を、ＲＴで５０時間撹拌した。出発材料の消費後、この溶液を、０．２Ｍクエン酸２４０ｍｌと酢酸エチル２００ｍｌの間で分配した。水層を分離し、酢酸エチル（３×２００ｍｌ）により抽出した。一緒にした有機層を、水及びブライン（各３００ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、溶媒をおよそ２００ｍｌまで蒸発させた。この時点で純粋な生成物が沈殿し、これを濾過した。母液を蒸発乾固させ、残渣を、１００ｍｌ  ＭＴＢＥと共に１時間撹拌し、追加の結晶性物質を生じた。これらの２種の生成物の塊を一緒にし、白色粉末１８．０１ｇ（７４％）とした。（ｍ．ｐ．：２０３〜２０７℃）。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：４１０．９４；理論値：４１１．１９  （Ｃ２３Ｈ２７Ｎ２Ｏ５）
［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：４３３．１４；理論値：４３３．１７  （Ｃ２３Ｈ２７Ｎ２Ｏ５）
［２Ｍ＋Ｈ］＋  実測値：８４２．７０；理論値：８４３．３６  （Ｃ４６Ｈ５２Ｎ４ＮａＯ１０）。
【０１１９】
工程３：Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨＢｏｃ（ＨＤＰ  ３０．１７１３）
【化２１】
2019511484.tif 000023
工程２の生成物ＨＤＰ  ３０．１４１４（１．７６ｇ；４．２８ｍｍｏｌ）及び４−［（Ｎ−Ｂｏｃ）アミノメチル］アニリン（１．００ｇ；１．０５当量）を、無水テトラヒドロフラン２６ｍｌ中に溶解した。２−エトキシ−Ｎ−（エトキシカルボニル）−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ  １．１１ｇ；１．０５当量）を添加し、この混合物をＲＴで撹拌し、光から保護した。反応が進行するにつれて、ゼラチン状の物質が、最初の透明な溶液から形成された。４０時間後、この反応混合物を、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）２５ｍｌにより希釈し、１時間撹拌した。引き続き沈殿物を吸引濾過し、ＭＴＢＥで洗浄し、真空で乾燥させ、白色固形物２．３０ｇ（収率８５％）とした。
【０１２０】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.87 (s, 1H), 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.74 (q, J = 8.4, 7.9 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.45 − 7.23 (m, 7H), 7.17 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.44 (p, J = 7.0 Hz, 1H), 4.36 − 4.17 (m, 3H), 3.96 − 3.89 (m, 1H), 2.01 (hept, J = 6.9 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.31 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 170.84, 170.76, 156.04, 155.63, 143.77, 143.69, 140.60, 137.41, 134.99, 127.50, 127.26, 126.93, 125.22, 119.95, 118.97, 77.60, 65.62, 59.95, 48.86, 46.62, 42.93, 30.28, 28.16, 19.06, 18.10, 18.03。
【０１２１】
工程４：Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨＢｏｃ（ＨＤＰ  ３０．１７４７）
【化２２】
2019511484.tif 000024
工程３の化合物ＨＤＰ  ３０．１７１３（１．２３０ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌのフラスコ中に配置し、ジメチルアミドホルムアミド（ＤＭＦ）４０ｍｌ中に溶解した。ジエチルアミン（７．５ｍｌ）を添加し、混合物をＲＴで撹拌した。反応は、ＴＬＣ（クロロホルム／メタノール／ＨＯＡｃ  ９０：８：２）によりモニタリングした。出発材料が消費された後（３０分）、揮発物を蒸発させ、残渣を、４０ｍｌの新鮮なＤＭＦと共蒸発させ、微量のジエチルアミンを除去した。粗生成物を、さらに精製することなく次工程に使用した。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ［ＭＨ］＋  実測値：３９３．２６；理論値：３９３．２５  （Ｃ２０Ｈ３３Ｎ４Ｏ４）
［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：   ４１５．３５；理論値：４１５．２３  （Ｃ２０Ｈ３２Ｎ４ＮａＯ４）
［２Ｍ＋Ｈ］＋  実測値：７８５．３７；理論値：７８５．４９  （Ｃ４０Ｈ６５Ｎ８Ｏ８）。
【０１２２】
工程５：ＢＭＰ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨＢｏｃ（ＨＤＰ  ３０．２１０８）
【化２３】
2019511484.tif 000025
工程４の粗生成物ＨＤＰ  ３０．１７４７（最大２．００ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ  ４０ｍｌ中に溶解し、３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ  ５３２ｍｇ；１．０当量）及びＮ−エチルジイソプロピルアミン（５１０μｌ、１．５当量）を添加し、この混合物をＲＴで３時間撹拌した。出発材料ＨＤＰ  ３０．１７４７の消費後（ＴＬＣ：クロロホルム／メタノール／ＨＯＡｃ  ９０：８：２）、揮発物を蒸発させ、残渣を、細かい懸濁液が形成されるまで、５０ｍｌ  ＭＴＢＥと共に撹拌した（１時間）。沈殿物を吸引濾過し、ＭＴＢＥで洗浄し、乾燥させた。粗生成物（１．１０ｇ）を、ジクロロメタン／メタノール１：１の２０ｍｌ中に溶解し、珪藻土（１５ｇ）を添加し、溶媒を除去した。この固形物質を、８０ｇのシリカゲルカラムの表面に配置し、ジクロロメタン中の０〜１０％メタノールの直線勾配により溶出した。生成物画分を一緒にし、蒸発させ、非晶質固形物７９３ｍｇ（２工程を通じて７３％）とした。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：５６６．２４；理論値：５６６．２６  （Ｃ２７Ｈ３７Ｎ５ＮａＯ７）。
【０１２３】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.75 (s, 1H), 8.09 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.29 − 7.23 (m, 1H), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.98 (s, 2H), 4.39 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.13 (dd, J = 8.4, 6.7 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.67 − 3.56 (m, 2H), 2.49 − 2.41 (m, 2H), 1.96 (h, J = 6.8 Hz, 1H), 1.39 (s, 9H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.82 (d, J = 6.8 Hz, 3H)。
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 170.80, 170.63, 170.60, 169.72, 155.65, 137.45, 134.94, 134.44, 127.26, 118.95, 77.62, 57.71, 48.92, 42.95, 33.96, 33.64, 30.17, 28.17, 19.02, 18.06, 17.82。
【０１２４】
工程６：ＢＭＰ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＮＨ２（ＨＤＰ  ３０．２１０９）
【化２４】
2019511484.tif 000026
工程５の生成物ＨＤＰ  ３０．２１０８（４００ｍｇ、７３６μｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸４，０００μｌ中に溶解し、２分間攪拌した。引き続き、揮発物をＲＴで蒸発させ、残留物を、トルエン４，０００μｌと２回共蒸発させた。残渣を、１，４−ジオキサン／水４：１の５，０００μｌ中に溶解し、液体窒素中で固化させ、凍結乾燥させた：無色の粉末４１０ｍｇ（定量的）。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：４１５．３５；理論値：４６６．２１  （Ｃ２２Ｈ２９Ｎ５ＮａＯ５）
［２Ｍ＋Ｈ］＋  実測値：８８７．１３；理論値：８８７．４４  （Ｃ４４Ｈ５９Ｎ１０Ｏ１０）。
【０１２５】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (s, 1H), 8.13 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.66 − 7.60 (m, 2H), 7.41 − 7.34 (m, 2H), 6.98 (s, 2H), 4.39 (p, J = 7.1 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 8.2, 6.6 Hz, 1H), 3.97 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.69 − 3.58 (m, 2H), 2.49 − 2.40 (m, 2H), 1.96 (h, J = 6.8 Hz, 1H), 1.32 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.7 Hz, 3H)。
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 171.24, 170.78, 170.72, 169.85, 158.12 (q, J = 33.2 Hz, TFA), 158.25, 157.99, 157.73, 139.19, 134.53, 129.45, 128.52, 119.02, 116.57 (q, J = 296.7 Hz, TFA), 57.78, 49.08, 41.90, 34.00, 33.68, 30.21, 19.07, 18.16, 17.76。
【０１２６】
工程６：ＨＤＰ  ３０．２１１５
【化２５】
2019511484.tif 000027
ＨＤＰ  ３０．２１０５（１５．０ｍｇ、１６．５μｍｏｌ）を、ＨＤＰ  ３０．２１０９（２５．２μｍｏｌ、１．５当量）の０．１Ｍ溶液４２９μｌ、０．１Ｍ  ＴＢＴＵ（２５．２μｍｏｌ、１．５当量）の４９２μｌ、及び０．２Ｍ  ＤＩＥＡ（４９．１μｍｏｌ、３．０当量）の４９２μｌにより、ＲＴで処理した。この反応を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングした。完了後、反応を１００μｌ  Ｈ２Ｏによりクエンチし、１５分間攪拌し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ上に注入した。
収量：１２．２ｍｇ、５６％、
質量分析：１３１３．２  ［Ｍ＋Ｈ］＋、１３３５．５  ［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０１２７】
４．  合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ  ２１７９の合成
４．１  ＨＤＰ  ３０．２１７９の合成
【化２６】
2019511484.tif 000028
【０１２８】
４．２  ＨＤＰ  ３０．２００７の合成
【化２７】
2019511484.tif 000029
ＥＰ  １５０００６８１．５に従い調製したＨＤＰ  ３０．１９６０の７７０．０ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド３１９．２ｍｇ（１．９６ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン５１３．３（１．９６ｍｍｏｌ）を、無水テトラヒドロフラン４０ｍｌ中に溶解した。アルゴン下で、トルエン（４０％）中のジアゾカルボン酸エチル溶液８８９．２μｌ（１．９６ｍｍｏｌ）を、３０分間かけて添加した。反応混合物を、ＲＴで２４時間撹拌し、蒸発乾固させた。固形残渣を、シリカ−ゲル−カラム上で、溶出液としてのＣＨＣｌ３からＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（３０／１）までの勾配により精製した。粗ＨＤＰ  ３０．２００７を、黄色固形物として得た。粗生成物をさらに、シリカ−ゲル−カラム上で、溶出液としてのｎ−ヘキサンからｎ−ヘキサン／酢酸エチル／メタノール（１０／１０／１）までの勾配により精製した。ＨＤＰ  ３０．２００７を、白色固形物として得た。収量：２７０．０ｍｇ（２２％）。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）  実測値：５６１．１４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；理論値：５６１．２４  （Ｃ２８Ｈ３４Ｎ４ＮａＯ７）
ＭＳ（ＥＳＩ＋）  実測値：１０９９．７０  ［２Ｍ＋Ｎａ］＋；理論値：１０９９．４８（Ｃ５６Ｈ６８Ｎ８ＮａＯ１４）。
【０１２９】
４．３  ＨＤＰ  ３０．２０１１の合成
【化２８】
2019511484.tif 000030
ＨＤＰ  ３０．２００７の２７０．０ｍｇ（０．５０ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン１６ｍｌ中に懸濁した。アルゴン下で、ヒドラジン水和物５０．３μｌ（１．０４ｍｍｏｌ）を一気に添加し、反応混合物を、アルゴン下ＲＴで２４時間撹拌した。懸濁液を濾過し、固形物を、ジクロロメタンにより洗浄した。濾液を蒸発させ、残渣を、高真空において乾燥させた。ＨＤＰ  ３０．２０１１を、白色固形物として得、これをさらに精製することなく次工程で使用した。収量：１９９．０ｍｇ（９７％）。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  実測値：４３１．５０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；理論値：４３１．２４  （Ｃ２０Ｈ３２Ｎ４ＮａＯ５）。
【０１３０】
４．４  ＨＤＰ  ３０．２１７７の合成
【化２９】
2019511484.tif 000031
ＨＤＰ  ３０．２１０５の２０．５９ｍｇ（２３．１７μｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１，２００ｍｌ中に溶解した。この溶液を、アルゴンでパージし、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解したＨＤＰ  ３０．２０１１の１８．８５ｍｇ（４６．１０μｍｏｌ）、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４５０ｍｌ中に溶解したＰｙＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸）２４．０５ｍｇ（４６．１０μｍｏｌ）、及びＤＭＦ中のＮ−エチル−ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ）溶液（ＤＭＦ  ５００μｌ中に溶解したＤＩＰＥＡ  １００μｌ）８６．２０μｌ（８２．３０ｍｍｏｌ）で処理した。この反応混合物を、アルゴン下、ＲＴで撹拌した。５時間後、この反応容積を、冷メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）により希釈した。白色沈殿物を遠心分離し、且つ冷ＭＴＢＥで洗浄した。粗固形物を、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ（商標）１０μ、２５０×２１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）、２９０ｎｍ）により、９５％Ｈ２Ｏ／５％ＭｅＯＨから９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ２Ｏまでの勾配及び流量１５ｍｌ／分で精製した。１７．５分の生成物画分を、水中で、収集し、蒸発させ、凍結乾燥させ、ＨＤＰ  ３０．２１７７の１３．８４ｍｇ（４７％）を白色の非晶質固形物として生じた。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  実測値：１２７８．４５  ［ＭＨ］＋；理論値：１２７７．５８  （Ｃ５９Ｈ８３Ｎ１３Ｏ１７Ｓ）
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  実測値：１３００．８４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；理論値：１３００．５８  （Ｃ５９Ｈ８３Ｎ１３ＮａＯ１７Ｓ）。
【０１３１】
４．５  ＨＤＰ  ３０．２１７９の合成
【化３０】
2019511484.tif 000032
ＨＤＰ  ３０．２１７７の１３．８４ｍｇ（１０．８２μｍｏｌ）を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）２，０００μｌ中に溶解し、ＲＴで５分間攪拌した。過剰なＴＦＡを、３３℃の水浴温度の、回転蒸発器で除去し、残留する残渣を、メタノール５ｍｌで処理し、蒸発乾固させた。油性の残渣を、高真空中で乾燥させ、白色固形物を形成した。この固形物を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１，７００μｌ中に溶解し、Ｎ−スクシンイミジル−３−マレイミドプロピオン酸（ＢＭＰＳ）５．７７ｍｇ（２１．６７μｍｏｌ）で処理した。  ＤＩＰＥＡ  溶液（無水ＤＭＦ  ４５０μｌ中に溶解したＤＩＰＥＡ  ５０μｌ）７５．４０μｌを添加した。反応混合物を、アルゴン下で５時間撹拌し、冷ＭＴＢＥ  ２０ｍｌで処理した。沈殿物を遠心分離し、冷ＭＴＢＥで洗浄し、乾燥させた。粗生成物を、ＲＰ１８  ＨＰＬＣ（Ｌｕｎａ（商標）１０μ、２５０×２１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）、２９０ｎｍ）により、９５％Ｈ２Ｏ／５％ＭｅＯＨから９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ２Ｏまでの勾配及び流量１５ｍｌ／分で精製した。１４．５分の生成物画分を、水中で、収集し、蒸発させ、凍結乾燥させ、ＨＤＰ  ３０．２１７９の７．４０ｍｇ（５１％）を白色の非晶質固形物として生じた。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  実測値：１３５１．５０  ［Ｍ＋Ｎａ］＋；理論値：１３５１．５５  （Ｃ６１Ｈ８０Ｎ１４ＮａＯ１８Ｓ）。
【０１３２】
さらに、アミノ酸１にカルボキサミド基の代わりに−ＣＯ−ＮＨＯＨ基を含む代わりのジデオキシ前駆体分子を、例えば、カルボン酸塩前駆体ＨＤＰ  ３０．２１０５を、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンと、標準の濃縮条件下（ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣ、混合アンヒドリドなど）で反応させることにより合成することができる。そのように得られたＨＤＰ  ３０．２１０５のＯ−ベンジルヒドロキサム酸誘導体のベンジル基は、触媒的水素分解条件（Ｐｄ／Ｈ２）下で容易に除去することができ、遊離の−ＣＯ−ＮＨＯＨ基を形成する。次にこの酸性ヒドロキサム画分は、−ＣＯ−ＮＨＯＲへ、様々なハロゲン化された又はＯ−トシル化されたアルキル−リンカービルディングブロックによりアルキル化される。このアルキル化は、ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯ−ｔ−Ｂｕ又は他の好適な塩基による、塩基性条件下で生じる。
【０１３３】
５．  合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ  ３０．２１９１の合成
【化３１】
2019511484.tif 000033
安定したリンカーを伴うチオール反応基を含むジデオキシ前駆体分子は、下記のように実施例２の生成物から合成した：
【０１３４】
実施例２の生成物（ＨＤＰ  ３０．２１０５）の１１．００ｍｇ（１２．３９μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ  １２３．９μｌに溶解した。引き続きＤＭＦ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びジイソプロピルカルボジイミド（各１２３．９μｌ、１０当量）の１Ｍ溶液を添加した。ＲＴで１時間後、ＤＭＦ中のＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩の１Ｍ溶液を添加し、この反応混合物を、さらに４時間撹拌した。次に反応混合物を、ＭＴＢＥの１０ｍｌ中に、０℃で滴加した。生じた沈殿物を、遠心分離により収集し、追加の１０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄した。残渣を、５から１００％メタノール勾配による、Ｃ１８カラム上の分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含有する画分を蒸発させ、ｔ−ブタノール／水から凍結乾燥させ、表題化合物９．２７ｍｇ（５４％）を無色の粉末として生じた。
ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ［ＭＨ］＋  実測値：１０１０．３；理論値：１０１０．４  （Ｃ４５Ｈ６０Ｎ１１Ｏ１４Ｓ）
［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：   １０３２．５；理論値：１０３２．３９  （Ｃ４５Ｈ５９Ｎ１１ＮａＯ１４Ｓ）。
【０１３５】
６．  合成ジデオキシ前駆体ＨＤＰ  ３０．２１５７の合成
還元可能なリンカーと共にチオール反応基を含むジデオキシ前駆体分子は、下記のように実施例２の生成物から合成した：
工程１：
【化３２】
2019511484.tif 000034
実施例２の生成物（ＨＤＰ  ３０．２１０５）の１１．３６ｍｇ（１２．９７μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦの５１２μｌ中に溶解した。引き続きＤＭＦ中のＰｙＢＯＰの０．１Ｍ溶液（５１２μｌ、４当量）及びＤＩＰＥＡの８．７０μｌ（４当量）を添加した。１分後、ジクロロメタン中の３−［（トリフェニルメチル）スルファニル］プロパン−１−アミンの０．１Ｍ溶液を、添加し、この反応混合物をさらに３．５時間撹拌した。次に反応混合物を、０℃で、ＭＴＢＥ  １０ｍｌ中に滴下した。生じた沈殿物を、遠心分離により収集し、追加の１０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄した。残渣を、５から１００％メタノール勾配による、Ｃ１８カラム上の分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物を含む画分を蒸発させ、ｔ−ブタノール／水４：１から凍結乾燥させ、生成物９．５２ｍｇ（６２％）を非晶質固形物として生じた。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  ［Ｍ＋Ｎａ］＋  実測値：１２２５．３０；理論値：１２２５．４８  （Ｃ６１Ｈ７４Ｎ１０ＮａＯ１２Ｓ２）。
【０１３６】
工程２：
【化３３】
2019511484.tif 000035
工程１の生成物（９．５２ｍｇ，  ７．９１μｍｏｌ）へ、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）の０．５Ｍ溶液、トリフルオロ酢酸中のＤＴＮＰ（７９，１μｌ、５当量）を添加した。４分後に、反応混合物を、０℃の、ＭＴＢＥ  １０ｍｌ中に沈殿させた。生じた固形物を、遠心分離により収集し、追加のＭＴＢＥの１０ｍｌで洗浄した。粗生成物を、０．０５  ＴＦＡを含む５から１００％メタノール勾配による、Ｃ１８カラム上の分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を蒸発させ、残渣を、ｔ−ブタノール／水４：１の２ｍｌから凍結乾燥させ、ＨＤＰ  ３０．２１５７の７．４８ｍｇ（８５％）をわずかに黄味がかった粉末として得た。
ＭＳ  （ＥＳＩ＋）  １１４６．９７  ［Ｍ＋Ｈ］＋  １１６９．１７  ［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０１３７】
７．  コンジュゲートｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１１５の合成
ＨＤＰ  ３０．２１１５  の１０ｍｇのｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃへのコンジュゲート
ＰＢＳ緩衝液中のＴｈｉｏｍａｂ  ｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃの１０ｍｇを、ＨＤＰ  ３０．２１１５へのコンジュゲートに使用した。
抗体溶液を１ｍＭ  ＥＤＴＡに調節した：
２ｍｌの抗体溶液（１０．０ｍｇ）＋２０μｌの１００  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０：
抗体の量：１０ｍｇ＝６．８×１０−８ｍｏｌ。
【０１３８】
抗体の４０当量ＴＣＥＰとの反応によるシステインのキャップ除去：
−２ｍｌの抗体溶液（６．８×１０−８ｍｏｌ）＋５４．５μｌの５０ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（２．７２×１０−６ｍｏｌ）
−振盪機上で、３７℃で３時間インキュベーション
−Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ２０’０００  ＭＷＣＯにおける、１×ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の２．０Ｌ中、４℃で２回の連続する透析、初回透析約４時間、２回目透析一晩
−Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０’０００  ＭＷＣＯを使用する、約４．０ｍｌへの濃縮。
【０１３９】
抗体の２０当量デヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）との反応による酸化：
−約２ｍｌの抗体溶液（６．８×１０−８ｍｏｌ）＋２７．２μｌの新鮮な５０ｍＭ  ｄｈＡＡ溶液（１．３６×１０−６ｍｏｌ）
−振盪機上で、ＲＴで３時間インキュベーション
【０１４０】
６当量のＨＤＰ  ３０．２１１５を使用し、及び２５当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインによりクエンチする、アマンチンとのコンジュゲーション。
７０μｌ  ＤＭＳＯ中の０．７ｍｇのＨＤＰ  ３０．２１１５の可溶化＝１０μｇ／μｌ
−約２ｍｌ抗体溶液（＝９．５ｍｇ；６．４６×１０−８ｍｏｌ）＋５０．９μｌのＨＤＰ  ３０．２１１５（＝５０９μｇ；３．８８×１０−７ｍｏｌ）。
−ＲＴで１時間のインキュベーション
−１６μｌの１００ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（１．６２×１０−６ｍｏｌ）の添加によるクエンチ。
−ＲＴで１５分間のインキュベーション（又は４℃で一晩）。
−各反応混合物の、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡としたＰＤ−１０カラムによる精製。タンパク質−含有画分の、パラフィルム上のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬による同定、及びタンパク質−含有画分のとりまとめ。
−各抗体溶液の、２．０ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中、及びＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ２０’０００  ＭＷＣＯにおける、４℃で一晩の透析。
【０１４１】
ＵＶ−スペクトル（吸収２８０ｎｍ及び３１０ｎｍ）による、裸の抗体、対、同一タンパク質濃度に調節したＡＤＣを使用する、タンパク質濃度及び薬物−抗体比（ＤＡＲ）の決定。
タンパク質濃度を５．０ｍｇ／ｍｌ（３．４×１０−５Ｍ）に調節し、濾過により滅菌状態とした。４℃で貯蔵。
【０１４２】
８．  コンジュゲートｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃ−３０．２１７９の合成
ＨＤＰ  ３０．２１７９の１０ｍｇ  ｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃへのコンジュゲート
ＰＢＳ緩衝液中のＴｈｉｏｍａｂ  ｃｈｉＢＣＥ１９−Ｄ２６５Ｃの１０ｍｇを、ＨＤＰ  ３０．２１７９へのコンジュゲートに使用した。  
抗体溶液を１ｍＭ  ＥＤＴＡに調節した：
２ｍｌの抗体溶液（１０．０ｍｇ）＋２０μｌの１００  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０：
抗体の量：１０ｍｇ＝６．８×１０−８ｍｏｌ。
【０１４３】
抗体の４０当量ＴＣＥＰとの反応によるシステインのキャップ除去：
−２ｍｌの抗体溶液（６．８×１０−８ｍｏｌ）＋５４．５μｌの５０ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（２．７２×１０−６ｍｏｌ）
−振盪機上で、３７℃で３時間インキュベーション
−Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ２０’０００  ＭＷＣＯにおける、１×ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の２．０Ｌ中、４℃で、２回の連続する透析、初回透析約４時間、２回目透析一晩
−Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  ５０’０００  ＭＷＣＯを使用する、約４．０ｍｌへの濃縮。
【０１４４】
抗体の２０当量デヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）との反応による酸化：
−約２ｍｌの抗体溶液（６．８×１０−８ｍｏｌ）＋２７．２μｌの新鮮な５０ｍＭ  ｄｈＡＡ溶液（１．３６×１０−６ｍｏｌ）
−振盪機上で、ＲＴで３時間インキュベーション。
【０１４５】
６当量のＨＤＰ  ３０．２１７９を使用し、及び２５当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインによりクエンチする、アマンチンとのコンジュゲーション。
７０μｌ  ＤＭＳＯ中の０．７ｍｇのＨＤＰ  ３０．２１７９の可溶化＝１０μｇ／μｌ
−約２ｍｌ抗体溶液（＝９．５ｍｇ；６．４６×１０−８ｍｏｌ）＋５１．５μｌのＨＤＰ  ３０．２１７９  （＝５１５μｇ；３．８８×１０−７  ｍｏｌ）。
−ＲＴで１時間のインキュベーション
−１６μｌの１００ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（１．６２×１０−６ｍｏｌ）の添加によるクエンチ。
−ＲＴで１５分間のインキュベーション（又は４℃で一晩）。
−各反応混合物の、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡としたＰＤ−１０カラムによる精製。タンパク質−含有画分の、パラフィルム上のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬による同定、及びタンパク質−含有画分のとりまとめ。
−各抗体溶液の、２．０ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中、及びＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ２０’０００  ＭＷＣＯにおける、４℃で一晩の透析。
【０１４６】
ＵＶ−スペクトル（吸収２８０ｎｍ及び３１０ｎｍ）による、裸の抗体、対、同一タンパク質濃度に調節したＡＤＣを使用する、タンパク質濃度及び薬物−抗体比（ＤＡＲ）の決定。
タンパク質濃度を５．０ｍｇ／ｍｌ（３．４×１０−５Ｍ）に調節し、濾過により滅菌状態とした。４℃で貯蔵。
【０１４７】
９．  ＨＤＰ  ３０．２１１５の３０ｍｇ  ＤＩＧ−Ｄ２６５Ｃへのコンジュゲート
ＰＢＳ中５．０ｍｇ／ｍｌのシステイン操作した抗体の３０ｍｇを、ＨＤＰ  ３０．２１１５へのコンジュゲートに使用した。
−抗体溶液を１ｍＭ  ＥＤＴＡに調節した：
６ｍｌの抗体溶液（３０ｍｇ）＋６０μｌの１００  ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０：
抗体の量：２．０５×１０−７ｍｏｌ。
【０１４８】
抗体の４０当量ＴＣＥＰとの反応によるシステインのキャップ除去：
−６ｍｌの抗体溶液（２．０５×１０−７ｍｏｌ）＋１６４μｌの５０ｍＭ  ＴＣＥＰ溶液（８．２１×１０−６ｍｏｌ）
−３７℃で３時間インキュベーション
−Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ２０’０００  ＭＷＣＯにおける、１×ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の２．０Ｌ中、４℃で、２回の連続する透析による、ＴＣＥＰからの各抗体の精製。初回透析約４時間、２回目透析一晩。
【０１４９】
抗体の２０当量デヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）との反応による酸化：
−約６ｍｌの抗体溶液（２．０５×１０−７ｍｏｌ）＋８２μｌの新鮮な５０ｍＭ  ｄｈＡＡ溶液（４．１×１０−６ｍｏｌ）
−ＲＴで３時間インキュベーション。
【０１５０】
６当量のＨＤＰ  ３０．２１１５を使用し、及び２５当量のＮ−アセチル−Ｌ−システインによりクエンチする、アマンチンとのコンジュゲーション。
２００μｌ  ＤＭＳＯ中の２．０ｍｇ  ＨＤＰ  ３０．２１１５の可溶化＝１０μｇ／μｌ
−約６ｍｌの抗体溶液（＝約２９ｍｇ；１．９８×１０−７  ｍｏｌ）＋１５６μｌのＨＤＰ  ３０．２１１５（＝１５６３μｇ；１．１９×１０−６ｍｏｌ）。
−ＲＴで１時間のインキュベーション
−４９．６μｌの１００ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（４．９６×１０−６ｍｏｌ）の添加によるクエンチ。
−ＲＴで１５分間のインキュベーション（又は４℃で一晩）。
−最高速度で約３分間遠心分離し、上清を採取し、分取ＦＰＬＣのために正確に容積を測定した。
−各反応混合物の、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡とした、ＨｉＬｏａｄ  １６／６００−Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ及びＸＫ−１６カラムを使用する、分取ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ）による精製（１．０ｍｌ／分）；ＵＶ吸収２８０ｎｍによる画分の収集。
−抗体溶液の、１×３．０ＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４中、及びＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ２０’０００  ＭＷＣＯにおける、４℃で一晩の透析。
【０１５１】
裸の抗体、対、同一タンパク質濃度に調節したＡＤＣを使用する、タンパク質濃度の決定。
タンパク質濃度を５．０ｍｇ／ｍｌ（＝３．４２×１０−５Ｍ）に調節し、濾過により滅菌状態とした。４℃で貯蔵。
【図１】
2019511484.tif 000038
【図２】
2019511484.tif 000039
【図３】
2019511484.tif 000040
【図４】
2019511484.tif 000041
【図５】
2019511484.tif 000042
【図６】
2019511484.tif 000043
【図７】
2019511484.tif 000044
【図８】
2019511484.tif 000045
【図９】
2019511484.tif 000046
【図１０】
2019511484.tif 000047
【図１１】
2019511484.tif 000048
【図１２】
2019511484.tif 000049
【図１３】
2019511484.tif 000050
【図１４】
2019511484.tif 000051
【国際調査報告】
2019511484.tif 000052