(57)【要約】【課題】短い相補鎖とのみ結合し、長い相補鎖ＲＮＡや相補ＤＮＡとは結合しないオリゴヌクレオチド誘導体を提供すること。【解決手段】本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は下記一般式（１）で表わされる。  本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、短いＲＮＡには強い結合力を示すのに対し、長いＲＮＡとは弱い結合しか示さない。これらの性質は細胞内で長い前駆体ＲＮＡから短く切りだされた後に活性体ＲＮＡとして作用するＲＮＡ、たとえばｍｉｃｒｏＲＮＡなどの活性体を選択的に検出する手法におけるプローブ核酸として有用である。また、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸検出用プローブ、オリゴヌクレオチドアレイ、医薬組成物として用いられる。一般式（１）2011102414.tif 000041
2011102414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体及びそれらの塩。
【化１】
2011102414.tif 000034
（式中、Ｒ１は、水酸基、又は下記一般式（２）で表わされる基であり、Ｗ１は、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基を表わし；Ｙ１は、水酸基、水素原子、フッ素原子又は置換基を有していてもよいアルコキシ基を表し；Ｙ２は、水酸基、水素原子、フッ素原子、置換基を有していてもよいアルコキシ基又は下記一般式（２）で表わされる基であり；Ｘｋは、各ｋの値に対し、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水酸基、水素原子、フッ素原子又は置換基を有していてもよいアルコキシ基を表し；Ｂｋは、各ｋの値に対し同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然もしくは非天然型の核酸塩基を表し；ｋは１〜５０の整数を表し；Ｗ２は、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基を表わし；Ｑ１及びＱ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表し；Ｔ１及びＴ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表し；Ｒ２は水酸基又は一般式（２）で表わされる基である（ただし、Ｒ１、Ｒ２又はＹ２のうち少なくとも１個は、一般式（２）で表わされる基であり；Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ１は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかであり；Ｒ２又はＹ２が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ２は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかである））
【化２】
2011102414.tif 000035
（式中、Ｑ３及びＴ３は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す）
【化３】
2011102414.tif 000036
（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化４】
2011102414.tif 000037
（式中、Ｑ４及びＴ４は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す）
【化５】
2011102414.tif 000038
（式中、Ｒ４は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｚは水素原子もしくは炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ５はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化６】
2011102414.tif 000039
（式中、Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化７】
2011102414.tif 000040
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ８、Ｒ９は互いに同一であっても異なっていてもよくカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【請求項２】
Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であり、一般式（２）中のＱ３及びＴ３が酸素原子であり、Ｗ１が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項３】
Ｒ１がリン酸基であり、Ｗ１が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項４】
Ｒ２及び／又はＹ２が一般式（２）で表わされる基であり、一般式（２）中のＱ３及びＴ３が酸素原子であり、Ｗ２が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項５】
Ｒ２及び／又はＹ２がリン酸基であり、Ｗ２が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項６】
Ｒ２及び／又はＹ２がリン酸基であり、Ｗ２が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子である、請求項３又は４記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項７】
核酸検出用プローブとして用いられる、請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体を固体担体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
逆転写酵素反応のプライマーとして用いられる請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼ反応のプライマーとして用いられる請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼ反応のテンプレートとして用いられる請求項１〜６のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴヌクレオチド誘導体に関し、特には、分子の5'末端もしくは3'末端にアニオンに解離することが可能な置換基を２個以上有するオリゴヌクレオチドに関する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、自身と相補的な配列を末端にもつRNAとは強い結合力を示すのに対し、自身と相補的な配列を非末端部にもつRNAとは弱い結合しか示さない。すなわち短いRNAには強い結合力を示すのに対し、長いRNAとは弱い結合しか示さないという短鎖ＲＮＡ選択的結合能を有する。これらの性質は細胞内で長い前駆体RNAから短く切りだされた後に活性体RNAとして作用するRNA、たとえばmicroRNAなどの活性体を選択的に検出する手法におけるプローブ核酸として有用である。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は生物のゲノムから転写された、タンパク質をコードしない通常１９〜２３塩基程度、場合によっては１５〜３０塩基程度の鎖長のＲＮＡである。最近の研究により、ｍｉＲＮＡが細胞の発生、分化、癌化などの過程やウイルスの感染プロセスなどに重要な役割を果たしていることが示唆されている。活性な成熟ｍｉＲＮＡの生成機構は以下のとおりである。【０００３】
まず、ゲノムより転写された１０００塩基程度のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが切断され７０−１００塩基のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが生成する。このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが更に切断され、１９〜２３塩基程度の活性な成熟ｍｉＲＮＡが生成する。この成熟ｍｉＲＮＡは標的のメッセンジャーＲＮＡに結合しその翻訳を制御することで、そのメッセンジャーＲＮＡの情報をもとに合成されるタンパク質の発現量の調節を行っている。これらのｍｉＲＮＡの機能を解明し、それらの情報を疾患の診断や治療に応用するためには細胞内に存在する多数のＲＮＡの中から成熟ｍｉＲＮＡを迅速かつ網羅的に検出する技術の開発が必要である。【０００４】
現在使用されている手法としては、生体内の全ＲＮＡをカラムクロマトグラフィーやゲル電気泳動で鎖長にしたがって分離し、短鎖ＲＮＡのみを含む画分を溶出した後、ハイブリダイゼーション技術により、短鎖ＲＮＡのみを検出する方法が知られている（非特許文献１）。この方法によれば、サンプル中に長鎖核酸が含まれていないため、短鎖核酸のみを分析することができるが、カラムクロマトグラフィーや電気泳動を行うのに時間やコストがかかること、操作が煩雑なため熟練した技術者でなければ実施が困難であるなどの問題点がある。【０００５】
また、短鎖ＲＮＡの分子工程を省略するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて短鎖ＲＮＡをプライマーとした場合のみ鎖伸長が可能な酵素反応を用いた核酸の蛍光ラベルを用いる方法が報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法は、複数の酵素反応を用いる方法であるため、操作が煩雑になるという問題がある。【０００６】
また、非特許文献３には、短いＲＮＡのみに結合するヘアピンプライマーを用いた成熟ｍｉＲＮＡ選択的なＲＴ−ＰＣＲ法が開示されている。しかし、ヘアピンプライマーはそのヘアピン構造の熱力学的安定性を精密にデザインする必要があり、かならずしも汎用的かつ容易に用いることができるものではない。またＲＴ−ＰＣＲでは細胞内に多数存在するｍｉＲＮＡを網羅的に検出することが困難であるためスループットの点では最適な方法ではない。【０００７】
上記問題の根本原因は、これまでに存在する天然型および非天然型のオリゴヌクレオチドは核酸分子の配列を選択的に認識することはできるが、そのサイズを認識することができない点にある。すなわち、ある配列に相補的なオリゴヌクレオチドはそのターゲットとする配列を一部として含む長い核酸分子にも結合してしまうため、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのように成熟ｍｉＲＮＡの配列をその一部に含むＲＮＡと成熟ＲＮＡとをハイブリダイゼーションにより区別することが困難である。これらの問題点に関する解決法がいくつか提唱されている。【０００８】
例えば、マイクロアレイ上にヘアピン型のプローブを固定化した成熟ＲＮＡ選択的マイクロアレイが報告されている（非特許文献４）。該文献には、このヘアピンプローブにより短くプロセッシングされた成熟ｍｉＲＮＡのみを認識できると記載されているが、プローーブにヘアピン構造を形成するためには、プローブの鎖長を必要以上に長くしなければならないため、プローブの合成コストを考えた場合最適な手法ではない。また、ヘアピンプライマーが実際にどのくらい成熟ｍｉＲＮＡに選択的に結合するのかといった定量的評価も充分ではない。
また、オリゴヌクレオチドプローブの両末端に立体的に嵩高い置換基を導入して短鎖ＲＮＡのみを検出する方法も報告されている（非特許文献５）が、短鎖ＲＮＡに対する結合の選択性が低く実用的な方法ではない。【０００９】
また、特許文献１には、オリゴヌクレオチドプローブの両末端に立体的に嵩高い置換基を導入して短鎖RNAのみを検出する方法も報告されているが短鎖RNAに対する結合の選択性が低く実用的ではない。
更に、特許文献２には、末端の核酸塩基部分にリン酸基を有する置換基を導入したオリゴヌクレオチド誘導体が開示されている。このオリゴヌクレオチド誘導体を用いれば、短鎖RNAのみを検出することができる。しかしながら、更に短鎖RNAに対する選択性の高いオリゴヌクレオチド誘導体が望まれている。【００１０】
【特許文献１】特開２００７−２３８５５０号公報
【特許文献２】特開２００９−１９０９８３号公報
【非特許文献１】Ｓ．Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ，Ｖｏｌ  １１，２４１−２４７，２００５年
【非特許文献２】Ｐ．Ｔ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｌ．Ｍ．Ｓｃｅａｒｃｅ，Ｊ．Ｃ．Ｏｂｅｒｈｏｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｔｏｂｉａｓ，Ｚ．Ｍｏｕｒｅｌａｔｏｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ  １．ｐ１５５−１６１，２００４年
【非特許文献３】Ｃ，Ｃｈｅｎ， Ｄ．Ａ．Ｒｉｄｚｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｂｒｏｏｍｅｒ，Ｚ，Ｚｈｏｕ，Ｄ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｔ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｂａｒｂｉｓｉｎ，Ｎ．Ｌ．Ｘｕ，Ｖ．Ｒ．Ｍａｈｕｖａｋａｒ，Ｍ．Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｑ．Ｌａｏ，Ｋ．Ｊ．Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．Ｇｕｅｇｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ  ３３，ｅ１７９．
【非特許文献４】Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ａ．Ａｃｈ，Ｂ．Ｃｕｒｒｙ，ＲＮＡ，Ｖｏｌ  １３，ｐ１−９，２００７．
【非特許文献５】オリゴヌクレオチド誘導体、特開２００７−２３８５５０、出願人  国立大学法人東京工業大学、発明者  清尾康志  関根光雄  高久悠介  平成１９年９月２０日  公開
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、より効果的な分子デザインにより、簡素な化学修飾のみで優れた短鎖ＲＮＡ選択性を示すことのできる、生産コスト的にも優れた人工オリゴヌクレオチドプローブの開発と、それらを用いた信頼性の高いＲＮＡ検出デバイスの開発が望まれている。本発明の目的は、短い相補鎖とのみ結合し、長い相補鎖ＲＮＡや相補ＤＮＡとは結合しないオリゴヌクレオチド誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、オリゴヌクレオチドの末端にアニオンに解離することが可能な置換基を２個以上有するオリゴヌクレオチド誘導体を用いることにより、上記課題を解決し得るという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、一般式（１）で表わされるオリゴヌクレオチド誘導体及びそれらの塩を提供するものである。
【化１】
2011102414.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水酸基又は下記一般式（２）で表わされる基であり、Ｗ１は、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基を表わし；Ｙ１は、水酸基、水素原子、フッ素原子又は置換基を有していてもよいアルコキシ基を表し；Ｙ２は、水酸基、水素原子、フッ素原子置換基を有していてもよいアルコキシ基又は下記一般式（２）で表わされる基であり；Ｘｋは、各ｋの値に対し、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ水酸基、水素原子、フッ素原子又は置換基を有していてもよいアルコキシ基を表し；Ｂｋは、各ｋの値に対し同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然もしくは非天然型の核酸塩基を表し；ｋは１〜５０の整数を表し；Ｗ２は、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基を表わし； Ｑ１及びＱ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表し；Ｔ１及びＴ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表し；Ｒ２は水酸基又は一般式（２）で表わされる基である（ただし、Ｒ１、Ｒ２又はＹ２のうち少なくとも１個は、一般式（２）で表わされる基であり；Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ１は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかであり；Ｒ２又はＹ２が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ２は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかである））
【化２】
2011102414.tif 000004
（式中、Ｑ３及びＴ３は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す）
【化３】
2011102414.tif 000005
（式中、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化４】
2011102414.tif 000006
（式中、Ｑ４及びＴ４は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す）
【化５】
2011102414.tif 000007
（式中、Ｒ４は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｚは水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ５はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化６】
2011102414.tif 000008
（式中、Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わし、Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）
【化７】
2011102414.tif 000009
（式中、Ｌ４、Ｌ５は互いに同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わし、Ｒ８、Ｒ９は互いに同一であっても異なっていてもよくカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。）【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体としては、Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であり、一般式（２）中のＱ３及びＴ３が酸素原子であり、Ｗ１が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子であるものが挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体としては、Ｒ２及び／又はＹ２が一般式（２）で表わされる基であり、一般式（２）中のＱ３及びＴ３が酸素原子であり、Ｗ２が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子であるものが挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体としては、Ｒ１がリン酸基であり、Ｗ１が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子であるものが挙げられる。
本発明のヌクレオチド誘導体としては、Ｒ２及び／又はＹ２がリン酸基であり、Ｗ２が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子であるものが挙げられる。
また、本発明のヌクレオチド誘導体としては、Ｒ２及び／又はＹ２がリン酸基であり、Ｗ２が一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）で表わされる基であり、一般式（４）中のＱ４及びＴ４が酸素原子であるものが挙げられる。【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、好ましくは核酸検出用プローブとして用いられる。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体を固体担体上に固定化してなるオリゴヌクレオチドアレイを提供する。
また、本発明は、上記オリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明はＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲに有用な、逆転写酵素のプライマー、DNAポリメラーゼのプライマー、DNAポリメラーゼのテンプレートを提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を２個以上有しているので、適当な反応条件を設定することにより、短い相補鎖とのみ結合し、長い相補鎖ＲＮＡや相補ＤＮＡとは結合しないオリゴヌクレオチド誘導体である。その結果、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と細胞から抽出した様々な鎖長及び配列を有する核酸を反応させることにより、加えたオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、鎖長の短い核酸とのみ結合させ、鎖長の短い核酸の単離、検出、機能制御に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法を模式的に示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、まず本発明のオリゴヌクレオチド誘導体について説明する。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、下記一般式（１）で表わされる。
【化８】
2011102414.tif 000010
【００１８】
上記一般式（１）において、Ｒ１は水酸基又は下記一般式（２）で表わされる基である。【００１９】
【化９】
2011102414.tif 000011
【００２０】
上記一般式（２）において、Ｑ３及びＴ３は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す。本発明においては、Ｑ３及びＴ３が酸素原子であるものが挙げられる。すなわち、一般式（１）におけるＲ１がリン酸基であるものが挙げられる。【００２１】
上記一般式（１）において、Ｗ１は、天然型もしくは非天然型の核酸塩基又は下記一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基を表わす。天然型の核酸塩基としては、例えば、チミン−１−イル、シトシン−１−イル、５−メチル−シトシン−１−イル、ウラシル−１−イル、ウラシル−５−イル、アデニン−９−イル、グアニン−９−イルなどが挙げられる。また、非天然型の核酸塩基とは、天然型の核酸塩基の環外酸素原子や環外窒素原子や環内窒素原子や環内炭素原子に置換基を有するなどの化学修飾、または環外酸素原子や環内窒素原子や環内炭素原子が他の原子に置換されるなどの化学修飾、もしくはこれらの化学修飾をともに有する核酸塩基の誘導体を表わし特に限定はされないが、好ましくは２−チオチミン−１−イル、２−チオウラシル−１−イル、Ｎ２−アシル−３−デアザグアニン−９−イル、Ｎ２−カルバモイルグアニン−９−イル、Ｎ４−アシルシトシン−１−イル、Ｎ６−アシル−７−デアザアデニン−９−イル、Ｎ６−アシル−７−デアザ−８‐アザアデニン−９−イルなどがあげられ、特に好ましくは２−チオチミン−１−イル、２−チオウラシル−１−イル、Ｎ２−アセチル−３−デアザグアニン−９−イル、Ｎ２−カルバモイルグアニン−９−イル、Ｎ４−アセチルシトシン−１−イル、Ｎ６−アセチル−７−デアザアデニン−９−イル、Ｎ６−アセチル−７−デアザ−８‐アザアデニン−９−イルなどがあげられる。また、これらの互変異性体であってもよい。【００２２】
【化１０】
2011102414.tif 000012
【００２３】
上記一般式（３）において、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌ１は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。
Ｒ４はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基としては、上述したものが挙げられる。【００２４】
【化１１】
2011102414.tif 000013
【００２５】
上記一般式（４）において、Ｑ４及びＴ４は、互いに同一であっても異なっていてもよく、酸素原子又は硫黄原子を表わす。【００２６】
【化１２】
2011102414.tif 000014
【００２７】
上記一般式（５）において、Ｒ４は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。Ｚは水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌ２は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。
Ｒ５はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基としては、上述したものが挙げられる。【００２８】
【化１３】
2011102414.tif 000015
【００２９】
上記一般式（６）において、Ｒ６は水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ブタン−２−イル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｌ３は炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。
Ｒ７はカルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基としては、上述したものが挙げられる。【００３０】
【化１４】
2011102414.tif 000016
【００３１】
上記一般式（７）において、Ｌ４、Ｌ５は同一であっても異なっていてもよく炭素数２〜６個のアルカン−ジイル基、炭素数４〜８個のシクロアルカン−ジイル基、フェニレン基、又はナフチリデン基を表わす。アルカン−ジイル基としては、例えば、炭素数２〜６個のアルカンジイル基を表わし、エチレン、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル等が挙げられる。また、ブタン−１，３−ジイルなどの分岐した基も含まれる。シクロアルカン−ジイル基とは、例えば、炭素数４〜８個のシクロアルカンから導かれる二価の基を意味し、シクロブタン−１，３−ジイル、シクロブタン−１，２−ジイル、シクロペンタン−１，３−ジイル、シクロペンタン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，２−ジイル、シクロヘキサン−１，３−ジイル、シクロヘキサン−１，４−ジイル等が含まれ、シス、トランスの区別が可能な基についてはその双方が含まれる。フェニレン基はベンゼンから導かれる二価の基を意味し、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン等が含まれる。ナフチリデン基とはナフタレンから導かれる二価の基を意味し、１，２−ナフチリデン、１，３−ナフチリデン、１，４−ナフチリデン、１，５−ナフチリデン、１，６−ナフチリデン、１，７−ナフチリデン、１，８−ナフチリデン、２，３−ナフチリデン、２，６−ナフチリデン、２，７−ナフチリデン等が挙げられる。
Ｒ８、Ｒ９は同一であっても異なっていてもよく、カルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（３）で表わされる基、又は末端に一般式（３）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基を表わす。ここで、アルキル基とは、上述したものが挙げられる。【００３２】
上記一般式（１）において、Ｙ１は、水酸基、水素原子,フッ素原子、又は置換基を有していてもよいアルコキシ基を表す。アルコキシ基としては、炭素数が１〜６個のアルコキシ基が好ましく、このようなアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、プロパン−１−イルオキシ基、ブタン−１−イルオキシ基、１−ブチルオキシ基、１−ペンチルオキシ基、１−ヘキシルオキシ基等が挙げられ、また、２−プロピルオキシ基、イソブチルオキシ基等のように分枝したアルコキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルメチルオキシ基等の、側鎖の一部もしくは全部が環化したアルコキシ基も含む。また、上記置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。【００３３】
上記一般式（１）において、Ｙ２は、水酸基、水素原子、フッ素原子、置換基を有していてもよいアルコキシ基又は一般式（２）で表わされる基である。アルコキシ基としては、上述したものが挙げられる。一般式（２）については上述した通りである。また、上記置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。【００３４】
上記一般式（１）において、Ｘｋは、各ｋの値に対し、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、水酸基、水素原子、フッ素原子又は置換基を有していてもよいアルコキシ基を表す。アルコキシ基としては、上述したものが挙げられる。また、上記置換基としては、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリール、ヘテロアリール等が挙げられる。【００３５】
上記一般式（１）において、Ｂｋは、各ｋの値に対し同一であっても異なっていてもよく、それぞれ天然もしくは非天然型の核酸塩基を表わす。天然もしくは非天然型の核酸塩基としては、Ｗ１において説明したものが挙げられる。
上記一般式（１）におけるＢｋは、検出しようとする核酸に相補的な配列となるなど、適当な結合力を有する配列となるように選択することができる。【００３６】
上記一般式（１）において、ｋは１〜５０の整数であり、好ましくは５〜３０である。ｋは、検出しようとするＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ等）の鎖長によって変えることができる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を２個以上有しており、この置換基がアニオンに解離することにより相補鎖ＲＮＡ又は相補鎖ＤＮＡと静電反発が起こり、長い鎖長のものは結合できなくなり、末端部のアニオンとアニオンとの長さのものよりも短いＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖のみが、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合することができるようになる。従って、検出しようとするｍｉＲＮＡ等の長さによって、ｋの範囲を変動させることが可能である。【００３７】
上記一般式（１）において、Ｗ２は、天然型もしくは非天然型の核酸塩基、又は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基を表わす。天然型もしくは非天然型の核酸塩基、一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）、又は一般式（７）については、Ｗ１において説明したものと同様である。【００３８】
上記一般式（１）において、Ｑ１及びＱ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す。また、上記一般式（１）において、Ｔ１及びＴ２は同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、酸素原子又は硫黄原子を表す。【００３９】
上記一般式（１）において、Ｒ２は水酸基又は一般式（２）で表わされる基である。一般式（２）については上述した通りである。【００４０】
上記一般式（１）において、Ｒ１、Ｒ２又はＹ２のうち少なくとも１個は、一般式（２）で表わされる基である。また、上記一般式（１）において、Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ１は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基であり；Ｒ２又はＹ２が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ２は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基である。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、分子の５’末端若しくは３’末端にアニオンに解離することが可能な置換基を２個以上有するものである。【００４１】
例えば、Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ１は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基である。すなわち、Ｒ１が一般式（２）で表わされる基であるときに、Ｗ１には、カルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基が含まれる。この場合には、オリゴヌクレオチド誘導体分子は、その５’末端に、リン酸基を２個有するか、又はリン酸基とカルボン酸基とを有するので、５’末端にアニオンに解離することが可能な置換基が２個含まれることとなる。【００４２】
また、Ｒ２又はＹ２が一般式（２）で表わされる基であるときには、Ｗ２は一般式（３）、一般式（５）、一般式（６）又は一般式（７）のいずれかで表わされる基であるので、この場合には、Ｒ２が一般式（２）で表わされる基であるときに、Ｗ１には、カルボキシル基、末端にカルボキシル基を有する炭素数１〜６個のアルキル基、一般式（４）で表わされる基、又は末端に一般式（４）で表わされる基を有する炭素数１〜６個のアルキル基が含まれ、オリゴヌクレオチド誘導体分子の３’末端に、アニオンに解離することが可能な置換基が２個以上含まれる。Ｒ２及びＹ２の両方が一般式（２）で表わされる基である場合には、オリゴヌクレオチド誘導体分子の３’末端に、アニオンに解離することが可能な置換基が３個含まれることとなる。
なお、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体においては、一般式（２）におけるＱ３及びＴ３、一般式（４）におけるＱ４及びＴ４が酸素原子であるもの、すなわち、一般式（２）で表わされる基がリン酸基であるものが挙げられる。また、上記一般式（１）においては、Ｒ１及びＲ２の両方が一般式（２）で表わされる基（又はリン酸基）であってもよい。【００４３】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その塩の形態であってもよい。本明細書で用いられる塩とは、本発明のヌクレオチド誘導体中に含まれる一部もしくは全てのリン酸基及びカルボキシル基のプロトンが陽イオンに置き換わった化合物を意味する。陽イオンとしては、例えば、アンモニウム、モノアルキルアンモニウム、ジアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどのアンモニウムイオン類および、ナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオンなどの金属イオン類が挙げられる。【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、その５’末端又は３’末端、若しくはその両方の末端部にアニオンに解離することが可能な置換基を２個以上有しているので、適当な反応条件を設定することにより、末端部にアニオンが生成する。本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法について図面を参照しつつ説明する。図１は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を用いて、短い相補鎖のみを検出する方法を模式的に示した図である。【００４５】
図１に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、適当な反応条件下では、その末端部にアニオンが生成する。ここに、長い相補鎖と短い相補鎖を混合すると、短い相補鎖（ここで、短い相補鎖とは、、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と相補的な配列を末端にもつ相補鎖を意味し、長い相補鎖とは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と相補的な配列を非末端部にもつ相補鎖を意味する。）は、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合する。一方、長い相補鎖においては、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合する相補的な部分を有しているにもかかわらず、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の末端部にアニオンが２個以上存在するため、この部分で静電反発が起こり、長い相補鎖は本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と結合することができない。【００４６】
このような性質を利用することにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体と細胞から抽出した様々な鎖長及び配列を有する核酸とを反応させることにより、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有し、かつ鎖長の短い核酸のみと結合させ、鎖長の短い核酸を単離、検出、機能制御することが可能となる。例えば、細胞内に存在する成熟ｍｉＲＮＡをＰｒｅ−ｍＲＮＡと区別して検出することが可能となる。すなわち、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、核酸検出プローブとして用いることができる。
なお、適当な反応条件とは、当該技術分野において公知であり、プローブとオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズするための条件を意味する。【００４７】
なお、上記適当な条件とは、検出しようとするオリゴヌクレオチド、また、本発明のヌクレオチドの塩基配列や塩基組成等により異なるため、一概には規定できないが、一般的な条件としては下記の通りである。
ハイブリダイゼーションは、９６穴又は３８４穴のプラスチックプレート中で実施してもよい。このようなプレートの穴に、本発明のオリゴヌクレオチドを点着させ、次いで、試料を添加してハイブリダイゼーションを行う。又は、後述する、本発明のオリゴヌクレオチドアレイを用いてもよい。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃程度の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応のオリゴヌクレオチドを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。ハイブリダイゼーションを実施する緩衝液としては、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、当業者に公知の方法、例えばホスホロアミダイト法を用いて製造することができる。ホスホロアミダイト法を実施する際には、公知のホスホロアミダイト化合物を用いることにより、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を製造することができる。具体的には、本明細書の実施例に記載されている方法に従って合成することができる。【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、逆転写酵素反応のプライマーとして用いることができる。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法に応用することができる。例えば、ＲＮＡを含む試料について、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体の存在下に逆転写を行うことにより、ｍｉＲＮＡのみが逆転写され、ｃＤＮＡが合成される、得られたｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲにて合成することにより、ｍｉＲＮＡにのみ相補的な部分を有するＤＮＡを得ることができる。逆転写、ＲＴ−ＰＣＲの条件等については従来公知の方法を用いることができる。【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、更に、以下に説明するような、オリゴヌクレオチドアレイ、医薬品等に用いることができる。更に、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、ＰＣＲやＲＴ−ＰＣＲに有用な、逆転写酵素のプライマー、DNAポリメラーゼのプライマー、DNAポリメラーゼのテンプレートとしても用いることができる。【００５０】
次に、本発明のオリゴヌクレオチドアレイについて説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドアレイは、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を固相担体上に固定化してなる。本発明のオリゴヌクレオチドアレイは、特定の塩基配列を有する、短い鎖長（通常、５０塩基以下）のオリゴヌクレオチドを検出するために用いられる。従って、固相担体に固定するオリゴヌクレオチド誘導体の塩基配列は、検出しようとする配列の相補的配列を有するものなど、適当な結合力を有する配列となる。一般に、固相担体に固定化されているオリゴヌクレオチド誘導体は、検出しようとするオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションにより特異的結合により結合する。【００５１】
なお、本明細書において、オリゴヌクレオチドアレイを製造する方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチド を合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。本発明におけるオリゴヌクレオチドアレイは、このいずれの方法でも製造することができる。オン・チップ法としては、例えば光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７，１９９１）等によって行うことができるが、この方法に限定されるものではない。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１２１−２１２５，１９９４；Ｇｕｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５４５６−５４６５，１９９４）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチド を共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９１３，１９９６）。
また、ポーラスガラス、ポリスチレンなどの固相担体にあらかじめオリゴヌクレオチドを固相合成法で合成しておき、その固相担体を接着剤などの適当な方法や物理的手法によりガラス基板上に固定化する方法も含まれる。【００５２】
用いられる固相担体としては、従来よりＤＮＡチップ及び遺伝子検出用マイクロアレイを製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができる。用いられる固相担体としては、例えば、シリコン；微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス；金属；フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ；プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）等が挙げられる。担体の形状としては、板状（基板状）、ビーズ状、糸状、球状、多角形状、粉末状等、どのような形状のものであってもよい。【００５３】
上記固相担体は、ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成したものであってもよい。ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ、Diamond Like Carbon）とは、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体の総称であり、その混合割合は特に限定されない。ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を形成する場合、その層の厚みは好ましくは１ｎｍ〜１０μｍである。【００５４】
また、本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に共有結合させるためには、固相担体表面にアミノ基が結合しているものを用いてもよい。従って、担体としては、表面にアミノ基が結合しているか、又はアミノ基を結合することのできるものを用いることが好ましい。【００５５】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明の医薬組成物は、上述した本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体は、上述したように、短い鎖長の相補鎖とのみ結合し、このような短鎖長の相補鎖の機能を制御するために用いることができ、例えば、細胞内に存在する成熟ｍｉＲＮＡの制御か可能となり、がん、腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、ウイルス感染症、細菌感染症、ヘルペス感染症、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、高血圧、アレルギー性疾患、パーキンソン病、、筋ジストロフィー、神経変性疾患、自己免疫疾患、炎症、ダウン症、アルツハイマー病、筋萎縮症、 ＡＬＳ、 頸髄損傷、 脊髄損傷、 ギランバレー症、ベーチェット病、 膠原病、リウマチなどの治療薬に用いることができる。従って、本発明は、上述した、本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物を提供する。【００５６】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容できる担体の混合などの公知の方法によって製造することができる。本発明の医薬組成物は、それ自体又は適宜の薬理学的に許容される、賦形剤、希釈剤等と混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤等として、又は注射剤、坐剤、貼付剤、若しくは外用剤等として製造することが出来る。
上記医薬組成物は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、αデンプン、デキストリン等のデンプン類；結晶セルロース；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムの等のケイ酸塩誘導体；燐酸水素カルシウム；炭酸カルシウム；硫酸カルシウム、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイドシリカ、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤）、安定剤（メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、チメロサール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸）、矯味矯臭剤（甘味料、酸味料、香料等）、希釈剤等の添加剤を用いて周知の方法により製造することができる。【００５７】
本発明の医薬組成物を被験者に導入する方法については、コロイド分散系を用いてもよい。コロイド分散系は化合物の生体内の安定性を高める効果や、特定の臓器、組織又は細胞へ化合物を効率的に輸送する効果を奏する。コロイド分散系は、通常用いられるものであれば特に制限はなく、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質をベースとする分散系が挙げられる。また、０．２〜０．４μｍのサイズの単膜リポソームは、巨大分子を含有する水性緩衝液のかなりの割合を被包化することができ、オリゴヌクレオチド誘導体がこの水性内膜に被胞化され、生物学的に活性な形態で脳細胞へ輸送される。リポソームの組成は、通常、脂質、特にリン脂質（相転移温度の高いリン脂質が好ましい）を、ステロイド、特にコレステロールと通常複合したものである。リポソームの製造に有用な脂質の具体れとしては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド及びガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチド誘導体を含む医薬組成物の投与量は症状や年齢等により異なるが、経口投与の場合には、１回当り下限１mg（好適には、３０mg）、上限２０００mg（好適には、１５００mg）を、注射の場合には、１回当り下限０．１mg（好適には、５mg）、上限１０００mg（好適には、５００mg）を皮下注射、筋肉注射または静脈注射によって投与することができる。【００５９】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
原料合成例１
３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−６−Ｎ−［Ｎ−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）カルバモイル］−２’−Ｏ−メチルアデノシンの合成
３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−Ｏ−メチルアデノシン（１．６ｇ，３．１ミリモル）をピリジン４０ｍＬに溶解し、ここにクロロギ酸フェニル（０．８５ｍＬ，６．８ミリモル）を加え、室温で２．５時間攪拌した。続いて、トランス−４−アミノシクロヘキサノール（１．８ｇ，１６ミリモル）を加え、８５℃で２．５時間攪拌した。反応系をクロロホルム（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去し、下記式で表される標題の化合物を得た。本化合物についてはこれ以上の精製は行わずに、以下の原料合成例２の合成に用いた。【００６０】
【化１５】
2011102414.tif 000017
【００６１】
原料合成例２
３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−６−Ｎ−［Ｎ−［トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル］カルバモイル］−２’−Ｏ−メチルアデノシン
原料合成例１で得られた化合物（２．１ｇ，３．２ミリモル）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、ここにレブリン酸（０．７２ｍＬ，６．３ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．３ｇ，６．３ミリモル）、４−ジメチルアミノピリジン（４０ｍｇ，０．３２ミリモル）を加え、室温で２１時間攪拌した。反応系をクロロホルム（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝４：１，ｖ／ｖ）で精製し、下記式で表される標題の化合物（１．５６ｇ，６５％）を得た。【００６２】
【化１６】
2011102414.tif 000018
【００６３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．１０−０．１１（１２Ｈ，ｍ），０．９３−０．９４（１８Ｈ，ｍ），１．４５−１．５３（４Ｈ，ｍ），２．０１−２．０３（２Ｈ，ｍ），２．１５−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．１９（３Ｈ，ｍ），２．５７−２．５８（２Ｈ，ｍ），２．７４−２．７６（２Ｈ，ｍ），３．４８（３Ｈ，ｓ），３．７７−３．８０（１Ｈ，ｍ）３．８４（１Ｈ，ｍ），３．９８−４．０１（１Ｈ，ｍ），４．１２−４．１５（２Ｈ，ｍ），４．５２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．９  Ｈｚ），４．７７−４．８１（１Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９  Ｈｚ），７．８４（１Ｈ，ｓ），８．３１（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｓ），９．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６  Ｈｚ）【００６４】
原料合成例３
６−Ｎ−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル］カルバモイル］−２’−Ｏ−メチルアデノシン
原料合成例２で得られた化合物（１．６ｇ，２．１ミリモル）をピリジン２０ｍＬに溶解し、ここにトリエチルアミントリヒドロフルオリド（１．８ｍＬ，１１ミリモル）、トリエチルアミン（１．５ｍＬ，１１ミリモル）を加え、室温で３日間攪拌した。反応系をクロロホルム（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール＝９８：２，ｖ／ｖ）で精製し、下記式で表される標題の化合物（０．９８  ｇ，９１％）を得た。【００６５】
【化１７】
2011102414.tif 000019
【００６６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４８−１．５５（４Ｈ，ｍ），２．０２−２．０４（２Ｈ，ｍ），２．１５−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．１９（３Ｈ，ｍ），２．５６−２．５８（２Ｈ，ｍ），２．７０（１Ｈ，ｓ），２．７４−２．７６（２Ｈ，ｍ），３．３５（３Ｈ，ｓ），３．７６−３．８１（１Ｈ，ｍ），３．８５（１Ｈ，ｍ），３．９６−３．９８（１Ｈ，ｍ），４．３７（１Ｈ，ｓ），４．５８−４．５９（１Ｈ，ｍ），４．６７（１Ｈ，ｔ，Ｊ  ＝  ４．９  Ｈｚ），４．６９−４．７８（１Ｈ，ｍ），５．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ＝  １０．０  Ｈｚ），８．０１（１Ｈ，ｓ），８．０２（１Ｈ，ｓ），８．５１（１Ｈ，ｓ），９．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ）【００６７】
原料合成例４
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］−２’−Ｏ−メチルアデノシ
原料合成例３で得られた化合物（０．９８ｇ，１．９ミリモル）をピリジン１０ｍＬに溶解し、ここに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７７ｇ，２．３ミリモル）を加え、室温で３時間攪拌した。反応系をクロロホルム（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−クロロホルム＝１：４，ｖ／ｖ）で精製し、下記式で表される標題の化合物（１．１ｇ，７０％）を得た。【００６８】
【化１８】
2011102414.tif 000020
【００６９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４７−１．５３（４Ｈ，ｍ），２．０１−２．０３（２Ｈ，ｍ），２．１５−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．５６−２．６１（３Ｈ，ｍ），２．７４−２．７７（２Ｈ，ｍ），３．４２−３．４４（１Ｈ，ｍ），３．５１−３．５２（１Ｈ，ｍ），３．５７（３Ｈ，ｓ），３．７９（６Ｈ，ｓ），４．２０（１Ｈ，ｓ），４．３９−４．４０（１Ｈ，ｍ），４．５０−４．５１（１Ｈ，ｍ），４．７９（１Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４  Ｈｚ），６．８１（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３  Ｈｚ），７．２２−７．４３（９Ｈ，ｍ），７．８７（１Ｈ，ｓ），８．１４（１Ｈ，ｓ），８．４５（１Ｈ，ｓ），９．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６  Ｈｚ）【００７０】
原料合成例５
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−６−Ｎ−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］−２’−Ｏ−メチルアデノシ  ３’−（２−シアノエチル  Ｎ，  Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）
原料合成例４で得られた化合物（２５０ｍｇ，０．３０ミリモル）をジクロロメタン４．４ｍＬに溶解し、ここにジイソプロピルエチルアミン（２６１μＬ，１．５ミリモル）、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト（１７７ｍｇ，０．７５ミリモル）を加え、室温で６時間攪拌した。反応系をクロロホルム（５０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で３回洗浄した。濃縮後、さらにジイソプロピルエーテル−ジエチルエーテル＝１：２，ｖ／ｖの溶液５０ｍＬに溶解させ、２％炭酸ナトリウム水溶液で１０回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下留去した。続いてゲル濾過カラムを用いて精製を行い、下記式で表される標題の化合物（２２３  ｍｇ，７３％）を得た。【００７１】
【化１９】
2011102414.tif 000021
【００７２】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．０６−１．２５（１２Ｈ，ｍ），１．４５−１．５６（４Ｈ，ｍ），２．０１−２．０３（２Ｈ，ｍ），２．１５−２．１７（２Ｈ，ｍ），２．２０（３Ｈ，ｍ），２．３８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１  Ｈｚ），２．５６−２．５７（２Ｈ，ｍ），２．６４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４  Ｈｚ），２．７４−２．７６（２Ｈ，ｍ），２．３３−２．３６（１Ｈ，ｍ），２．３７−２．５１（３Ｈ，ｍ），３．５４−３．６７（４Ｈ，ｍ），３．７８−３．７９（６Ｈ，ｍ），３．８５−３．９２（１Ｈ，ｍ），４．３４−４．４０（１Ｈ，ｍ），４．５６−４．５７（１Ｈ，ｍ），４．６０−４．６４（１Ｈ，ｍ），４．７９（１Ｈ，ｍ），６．１１−６．１３（１Ｈ，ｍ），６．７８−６．８１（４Ｈ，ｍ），７．２２−７．４４（９Ｈ，ｍ），７．８４（１Ｈ，ｓ），８．０８−８．１３（１Ｈ，ｍ），８．４２−８．４３（１Ｈ，ｍ），９．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１  Ｈｚ）【００７３】
実施例１
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’（配列番号：１）の合成
標題の化合物において、下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基を表し、ｄＡ＊は下記式で表されるヌクレオチド残基を表す。【００７４】
【化２０】
2011102414.tif 000022
【００７５】
グレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルウリジンを担持した固相担体（１μｍｏｌ）およびグレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルＲＮＡ  ホスホロアミダイト試薬を用い、ＡＢＩ−３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機の標準的な１．０μｍｏｌスケールＲＮＡ合成プロトコールにて固相担体上に５’末端の水酸基にＤＭＴｒ基を有し、核酸塩基部およびリン酸部が保護された２’−Ｏ−メチルＲＮＡ：ＣＡＡＣＣＵＡＣＵを合成した。次いで、固相担体をグラスフィルターに移し、固相担体を塩化メチレンで希釈した３％トリクロロ酢酸で洗浄することによりＤＭＴｒ基を除去した。次いで、後述するホスホロアミダイト化合物５（４０ｍｇ，４０μｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解した０．２５Ｍアクチベーター４２（４００μＬ，１００μｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下室温で１５分反応させた。溶液を除去し、グラスフィルター上に残った固相担体を乾燥アセトニトリルで洗浄した。次いで、固相担体を０．０２Ｍヨウ素／ＴＨＦ−ピリジン-水溶液を用いて処理し、引き続き、固相担体を塩化メチレンで希釈した３％トリクロロ酢酸で処理してＤＭＴｒ基を除去し、オリゴヌクレオチドを得た。【００７６】
次いで、得られたオリゴヌクレオチドに対して、５０当量のヒドラジン（ピリジン−酢酸、３：２，Ｖ／Ｖ  溶液）を加え、室温で１５分間放置することにより、Ｌｅｖ基を除去した。溶液を除去し、グラスフィルター上に残った固相担体を塩化メチレンで洗浄した。ついで、グレンリサーチ社より購入したホスファリンク試薬（５０当量）を１Ｈ−テトラゾール（１００当量)の存在下に２分間反応させた。ホスファリンク試薬との反応を更に１度繰り返した後、常法によるヨウ素酸化を行い、固相担体を塩化メチレンで希釈した３％トリクロロ酢酸で処理してＤＭＴｒ基を除去し、ついで濃アンモニア水を加え、室温で１７時間攪拌した。アンモニア水を留去した後、得られた目的物の粗精製物を陰イオン交換ＨＰＬＣで精製して標題の化合物を得た。標題の化合物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析により確認した。
５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’ （配列番号：１）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３４９８．６３  Ｆｏｕｎｄ  ３５００．０３【００７７】
実施例２
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：２）の合成
ここで下線部のヌクレオチド残基はデオキシリボヌクレオチド残基を表す。
２’−Ｏ−メチルＲＮＡホスホロアミダイトに代え、ＤＮＡホスホロアミダイトを用いた以外は実施例１と同様に操作を行い、標題の化合物を合成した。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析により確認した。
５’−（ｄＡ＊）ＣＡＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：２）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２５６．５７１１  Ｆｏｕｎｄ  ３２５８．８１【００７８】
実施例３
オリゴヌクレオチド５’−（Ａｍ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’（配列番号：３）の合成
ここで下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基を表す。Ａｍ＊は下図で示すヌクレオチド残基を表す。【００７９】
【化２１】
2011102414.tif 000023
【００８０】
グレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルウリジンを担持した固相担体（１．０  μｍｏｌ）およびグレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルＲＮＡ  ホスホロアミダイト試薬を用い、ＡＢＩ−３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機の標準的な１．０μｍｏｌスケールＲＮＡ合成プロトコールにて固相担体上に５’末端の水酸基にＤＭＴｒ基を有し、核酸塩基部およびリン酸部が保護された５’−ＣＡＡＣＣＵＡＣＵを合成した。次いで、固相担体の半分（０．５μｍｏｌ）をグラスフィルターに移し、固相担体を塩化メチレンで希釈した３％トリクロロ酢酸で洗浄することによりＤＭＴｒ基を除去した。次いで、原料合成例５で得られた化合物（２５  ｍｇ，２５μｍｏｌ）および、アセトニトリルに溶解した０．２５Ｍアクチベーター４２（２５０μＬ，６２．５μｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下室温で１５分反応させた。溶液を除去し、グラスフィルター上に残った固相担体を乾燥アセトニトリルで洗浄した。次いで、固相担体を０．０２Ｍヨウ素／ＴＨＦ−ピリジン-水溶液を用いて処理し、引き続き、固相担体を塩化メチレンで希釈した３％トリクロロ酢酸で処理してＤＭＴｒ基を除去し、オリゴヌクレオチドを得た。【００８１】
次いで、得られたオリゴヌクレオチドに対して、５０当量のヒドラジン（ピリジン−酢酸、３：２，Ｖ／Ｖ  溶液）を加え、室温で１５分間放置することにより、Ｌｅｖ基を除去した。溶液を除去し、グラスフィルター上に残った固相担体を塩化メチレンで洗浄した。次いで、グレンリサーチ社より購入したホスファリンク試薬（５０当量）を１Ｈ−テトラゾール（１００当量)の存在下２分間反応させた。ホスファリンク試薬との反応を更に１度繰り返した後、常法によるヨウ素酸化を行い、固相担体を塩化メチレンで希釈した３％トリクロロ酢酸で処理してＤＭＴｒ基を除去し、次いで濃アンモニア水を加え、室温で１７時間攪拌した。アンモニア水を留去した後、得られた目的物の粗精製物を陰イオン交換ＨＰＬＣで精製して目的物を得た。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析により確認した。
５’−（Ａｍ＊）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’（配列番号：３）  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３５２８．６４５５  Ｆｏｕｎｄ  ３５３０．３１６【００８２】
比較例１
オリゴヌクレオチド５’−（ｄＡ＃）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’（配列番号：４）の合成
標記化合物においては、ここで下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基を表し、ｄＡ＃は下記式で表されるヌクレオチド残基を表す。【００８３】
【化２２】
2011102414.tif 000024
【００８４】
上記オリゴヌクレオチドを合成するために、以下に示す化合物１〜４を合成した。
化合物１（３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−  Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−ヒドロキシシクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）デオキシアデノシン（３．０ｇ，６．２５ミリモル）をピリジン６３ｍｌに溶解させた後、クロロ炭酸フェニル（１．７２ｍｌ，１３．８ミリモル）を加え、室温で２時間反応させた。次いで、抽出操作を行わずにトランス−４−アミノシクロヘキサノール（３．６ｇ，３１．３ミリモル）を加え、８５℃で３０分間反応させた。反応終了後、溶媒を減圧下留去してクロロホルムに溶解させた後、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め、硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、下記式で表される標題の化合物（２．９５ｇ，７６％）を得た。【００８５】
【化２３】
2011102414.tif 000025
【００８６】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ，  ５００  ＭＨｚ）  δ  ０．０８−０．１１  （１２Ｈ，  ｍ），  ０．７９−０．９３  （１８Ｈ，  ｍ），  １．２６−１．３４  （４Ｈ，  ｍ），  １．８２−１．８４  （２Ｈ，  ｂｒ），  １．９４−１．９６  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．３３−２．３８  （１Ｈ，  ｍ），  ２．９１−２．９６  （１Ｈ，  ｍ），  ３．４６−３．４８  （１Ｈ，  ｍ），  ３．５５−３．５７  （１Ｈ，  ｍ），  ３．６５  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  Ｊ  ＝  １１．０  Ｈｚ），  ３．７９  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  Ｊ  ＝  １１．０  Ｈｚ），  ３．８５−３．８８  （１Ｈ，  ｍ），  ４．５７  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ），  ４．６３−４．６６  （１Ｈ，  ｍ），  ６．４０  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ）；  ８．５２  （１Ｈ，  ｓ），  ８．５７  （１Ｈ，  ｓ），  ９．３５  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ），  ９．５４  （１Ｈ，  ｓ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＤＭＳＯ）  δ  −５．５，  −５．０，  −４．８，  １７．７，  １７．９，  ２５．７，  ３０．４，  ３３．５，  ３８．５，  ４８．０，  ６２．４，  ６７．８，  ７１．８，  ８３．５，  ８７．１，  １２０．３，  １４２．１，  １５０．０，  １５０．３，  １５０．７，  １５２．６。【００８７】
化合物２（３’−５’−Ｏ−ビス−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−  Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物１（２．２ｇ，３．５５ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ジクロロメタン（脱水）３６ｍｌに溶解させた。ここに、レブリン酸（７２９μｇ，７．０９ミリモル）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．４６ｇ，７．０９ミリモル）、４−ジメチルアミノピリジン（４３ｍｇ，０．３４ミリモル）を加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、吸引濾過により析出物を除去して、ジクロロメタンで洗いこみを行った。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行い、有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記式で表される標題の化合物（１．６２ｇ，６４％）を得た。【００８８】
【化２４】
2011102414.tif 000026
【００８９】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）  δ  ０．０５−０．０９  （１２Ｈ，  ｍ），  ０．８４−０．９０  （１８Ｈ，  ｍ），  １．４６−１．５７  （４Ｈ，  ｍ），  １．９９−２．０１  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．１３−２．１５  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．１８  （３Ｈ，  ｍ），  ２．４２−２．４６  （１Ｈ，  ｍ），  ２．５４−２．５６  （２Ｈ，  ｍ），  ２．６１−２．６６  （１Ｈ，  ｍ），  ２．７２−２．７５  （２Ｈ，  ｍ），  ３．７３−３．７６  （１Ｈ，  ｍ），  ３．８３−３．８６  （２Ｈ，  ｍ），  ４．００−４．０１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．６１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．７５−４．７９  （１Ｈ，  ｍ），  ６．４４−６．４７  （１Ｈ，  ｍ），  ８．３３  （１Ｈ，  ｓ），  ８．４９  （１Ｈ，  ｓ），  ９．４５−９．４６  （１Ｈ，  ｍ）。【００９０】
化合物３（Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物２（１．５  ｇ，２．０８ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水）  ２１  ｍｌに溶解させた。ここにトリエチルアミントリヒドロフルオリド（１．７０  ｍｌ，１０．４ミリモル）及びトリエチルアミン（１．４４ｍｌ，１０．４ミリモル）を加え、室温で１２時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去してクロロホルムに溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を展開溶媒としてクロロホルム／メタノールを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記式で表される標題の化合物（７３０ｍｇ，７２％）を得た。【００９１】
【化２５】
2011102414.tif 000027
【００９２】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）  δ  １．４５−１．５９  （４Ｈ，  ｍ）  ２．０１−２．０２  （２Ｈ，  ｍ），  ２．１４−２．１６  （２Ｈ，  ｍ），  ２．１９  （３Ｈ，  ｓ），  ２．３９−２．４３  （１Ｈ，  ｍ），  ２．５５−２．５７  （２Ｈ，  ｍ），  ２．７４−２．７６  （２Ｈ，  ｍ），  ２．９６−３．００  （２Ｈ，  ｍ），  ３．８０−３．８４  （２Ｈ，  ｍ），  ３．９６−３．９９  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２３  （１Ｈ，  ｓ），  ４．７６−４．８０  （２Ｈ，  ｍ），  ５．７４−５．７６  （１Ｈ，  ｍ），  ６．４３−６．４５  （１Ｈ，  ｍ），  ７．２６  （１Ｈ，  ｓ），  ８．２６  （１Ｈ，  ｍ），  ８．４８  （１Ｈ，  ｓ），  ８．７５  （１Ｈ，  ｓ），  ９．４４−９．４８  （１Ｈ，  ｍ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ  ２８．４，  ２９．８，  ３０．０，  ３０．４，  ３８．１，  ４１．１，  ４８．３，  ６３．３，  ７２．１，  ７３．１，  ８７．５，  ８９．５，  １２１．９，  １４２．８，  １４９．４，  １５０．７，  １５１．０，  １５３．５，  １７２．４，  ２０７．０。【００９３】
化合物４（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−  Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン）の合成
化合物３（６００ｍｇ，１．２２ミリモル）にピリジン（脱水）を加えて共沸した後、ピリジン（脱水）１２  ｍｌに溶解させた。ここに４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４９７ｍｇ，１．４７ミリモル）を加え、室温で４時間反応させた。メタノールでクエンチした後、クロロホルムで反応溶媒を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで抽出操作を行った。有機層を集め硫酸ナトリウムを加え乾燥させた後、濾過し溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてヘキサン／クロロホルムを用いてＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、下記式で表される標題の化合物（７４１ｍｇ，７７％）  を得た。【００９４】
【化２６】
2011102414.tif 000028
【００９５】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）  δ  １．４５−１．６０  （４Ｈ，  ｍ），  ２．０１−２．０３  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．１４−２．１８  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．２０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．５４−２．５８  （３Ｈ，  ｍ），  ２．７５  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ），  ２．８２−２．８７  （１Ｈ，  ｍ），  ３．３６−３．４３  （２Ｈ，  ｍ），  ３．７６  （６Ｈ，  ｓ），  ３．８４−３．８６  （１Ｈ，  ｍ），  ４．１５−４．１８  （１Ｈ，  ｄｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ），  ４．６８−４．７１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．７７−４．８１  （１Ｈ，  ｍ），  ６．４７  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ），  ６．７８  （４Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ），  ７．１９−７．３９  （９Ｈ，  ｍ），  ８．０９  （１Ｈ，  ｓ），  ８．１３  （１Ｈ，  ｂｒ），  ８．４３  （１Ｈ，  ｓ），  ９．３８  （１Ｈ，  ｄ  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ  ２８．５，  ２９．８，  ３０．０，  ３０．４，  ３８．１，  ４０．３，  ４８．２，  ５５．３，  ６３．８，  ７２．２，  ７２．５，  ８４．６，  ８６．３，  ８６．７，  １１３．３，  １２０．９，  １２７．１，  １２８．０，  １２８．２，  １３０．１，  １３５．７，  １４１．１，  １４４．６，  １５０．０，  １５０．４，  １５１．１，  １５３．３，  １５８．７，  １７２．４，  ２０６．９。【００９６】
ホスホロアミダイト化合物５（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−  Ｎ６−［Ｎ−（トランス−４−（４−オキソペンタノイルオキシ）シクロヘキシル）カルバモイル］デオキシアデノシン３’−（２−シアノエチルＮ，  Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
化合物４（３５０ｍｇ，０．４４１ミリモル）をピリジン（脱水）、トルエン（脱水）、ジクロロメタン（脱水）の順で各々３回ずつ共沸した後、ジクロロメタン（脱水）４．４  ｍｌに溶解させた。これにテトラゾール（１９ｍｇ，０．２６４ミリモル）、ジイソプロピルアミン（３７  μｌ，０．２６４ミリモル）及び２−シアノエチル−ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（１５４μｌ，０．４８６ミリモル）を加え、室温で４時間反応させた。水でクエンチした後、溶媒を減圧下留去した後、酢酸エチル−ジエチルエーテルの混合溶媒に溶解させ、０．２  Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で３回抽出操作を行い、有機層を集め溶媒を減圧下留去した。得られた残渣を、展開溶媒としてクロロホルムを用いてリサイクルＨＰＬＣで精製し、下記式で表される標題の化合物（３０３ｍｇ，７７％）を得た。【００９７】
【化２７】
2011102414.tif 000029
【００９８】
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３，  ５００  ＭＨｚ）  δ  １．１２−１．２１  （１２Ｈ，  ｍ），  １．４８−１．６０  （４Ｈ，  ｍ），  ２．０２−２．０４  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．１５−２．１７  （２Ｈ，  ｂｒ），  ２．２０  （３Ｈ，  ｓ），  ２．４６−２．４８  （１Ｈ，  ｍ），  ２．５６−２．６３  （３Ｈ，  ｍ），  ２．７４−２．７７  （２Ｈ，  ｍ），  ２．９３−２．９８  （１Ｈ，  ｍ），  ３．３５−３．４３  （２Ｈ，  ｍ），  ３．６０−３．７５  （４Ｈ，  ｍ），  ３．７７  （６Ｈ，  ｓ），  ３．８０−３．８６  （１Ｈ，  ｍ），  ４．２９−４．３２  （１Ｈ，  ｍ），  ４．７８−４．８１  （２Ｈ，  ｍ），  ６．４３−６．４６  （１Ｈ，  ｍ），  ６．７６−６．７９  （４Ｈ，  ｍ），  ７．１８−７．４０  （９Ｈ，  ｍ），  ８．２１−８．２４  （１Ｈ，  ｍ），  ８．３４−８．３６  （１Ｈ，  ｂｒ），  ８．４３  （１Ｈ，  ｓ），  ９．４８  （１Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ  ２０．２，  ２０．３，  ２０．４，  ２０．５，  ２４．５，  ２４．６，  ２４．７，  ２８．４，  ２９．７，  ２９．９，  ３０．３，  ３８．０，  ３９．３，  ４３．３，  ４３．４，  ４８．０，  ４８．２，  ５５．２，  ５５．３，  ５８．２，  ５８．３，  ５８．５，  ６３．３，  ６３．５，  ７２．１，  ７３．３，  ７３．４，  ７４．０，  ８４．８，  ８６．０，  ８６．５，  １１３．１，  １１７．５，  １１７．６，  １２１．０，  １２６．９，  １２７．９，  １２８．１，  １２８．２，  １３０．１，  １３５．７，  １４１．６，  １４４．６，  １５０．０，  １５０．４，  １５１．０，  １５３．３，  １５８．６，  １７２．３，  ２０６．７；３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）  δ  １４９．７，  １４９．８。【００９９】
グレンリサーチ社より購入したユニバーサルサポートＩＩ（１μｍｏｌ）を固相担体として用い、上記で得られたホスホロアミダイト化合物、およびグレンリサーチ社より購入した２’−Ｏ−メチルＲＮＡ  ホスホロアミダイト試薬を用い、ＡＢＩ−３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機の標準的な１．０μｍｏｌスケールＲＮＡ合成プロトコールにて合成を行った。５’末端のヌクレオチド残基を結合後、オリゴヌクレオチドに対して、５０当量のヒドラジン（ピリジン−酢酸、３：２，Ｖ／Ｖ  溶液）を加え、室温で１５分間放置することにより、Ｌｅｖ基を除去した。【０１００】
次いで、グレンリサーチ社より購入したホスファリンク試薬（５０当量）を１Ｈ−テトラゾール（５０当量）の存在下反応させ、次いで、常法によりヨウ素酸化と２Ｍ  アンモニア／メタノールによる切り出しついで、濃アンモニア水で室温１８時間攪拌した。このアンモニア溶液をＣ１８カートリッジカラムに担持し、副生物を洗浄した後、２％トリフルオロ酢酸水溶液で処理した後、目的物を溶出した。得られた目的物の粗精製物を陰イオン交換ＨＰＬＣで精製して標題の化合物を得た。目的物の構造はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  質量分析により確認した。【０１０１】
実施例４
Ｔｍ測定による鎖長依存的ハイブリダイゼーションの解析
実施例１、実施例２、実施例３及び比較例１で得られたオリゴヌクレオチドを１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に、濃度が１．０  μＭになるように調製した。この溶液に、下記長鎖ＲＮＡ（配列番号：５）又は短鎖ＲＮＡ（配列番号：６）を同じく濃度１．０μＭになるように溶解し、２６０ｎｍでの吸光度の温度依存性を５℃から９０℃まで測定した。得られたＵＶ融解曲線を微分し、その一次微分係数が極大となる温度をＴｍとした。また、比較として、下記天然型プローブ及び非アニオン性プローブのＴｍも測定した。結果を表１に示す。【０１０２】
長鎖ＲＮＡ（配列番号：５）：３’−ＡＵＵＡＵＡＵＧＵＵＧＧＡＵＧＡＵＧＧＵＵＡ−５’
短鎖ＲＮＡ（配列番号：６）：３’−ＧＵＵＧＧＡＵＧＡ−５’
モノリン酸プローブ（配列番号：４、比較例１）：５’−（ｄＡ＃）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ−３’
天然型プローブ（配列番号：７）：５’−（ｄＣ）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＣ）−３’
非アニオン性プローブ（（配列番号：８）：５’−（ｄＡ＃＃）ＣＡＡＣＣＵＡＣＵ（ｄＡ＃＃＃）の３’
ここで、Ａ，Ｕ、Ｇ、Ｃはリボヌクレオチド残基である。下線部のヌクレオチド残基は２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド残基である。ｄＡ＃＃、ｄＡ＃＃＃はそれぞれ下記式に表すヌクレオチド残基を表わす。【０１０３】
【化２８】
2011102414.tif 000030
【０１０４】
【表１】
2011102414.tif 000031
【０１０５】
表１より、以下のことが明らかになった。
プローブ５’末端のヌクレオシド残基の塩基部と５’水酸基にともにリン酸基を導入した実施例１、実施例２、実施例３のオリゴヌクレオチドは長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡに強く結合し、高いΔＴｍ値を示した。５’ 末端のヌクレオシド残基の塩基部のみにリン酸基を導入した比較例１のオリゴヌクレオチドは長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡに強く結合したが、そのΔＴｍ値は実施例１〜３のものよりも小さかった。
天然型プローブは、逆に短鎖ＲＮＡよりも長鎖ＲＮＡに強く結合した。
末端にアニオンに解離することが可能な置換基を有しない、非アニオン性プローブは長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡにより強く結合したが、その選択性の指標であるΔＴｍ＝＋４
は、実施例１〜３のオリゴヌクレオチド誘導体の値よりも小さかった。【０１０６】
実施例５〜１０
実施例２と同様に操作を行い、下記オリゴヌクレオチドを合成した。
５’−（ｄＡ＊）ＴＡＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：９、実施例５）：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２７１．５７  Ｆｏｕｎｄ  ３２７７．２９
５’−（ｄＡ＊）ＣＴＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：１０、実施例６）：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２４７．５６  Ｆｏｕｎｄ  ３２４７．５６
５’−（ｄＡ＊）ＣＧＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：１１、実施例７）：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２７２．５７  Ｆｏｕｎｄ  ３２７４．４８
５’−（ｄＡ＊）ＣＣＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：１２、実施例８）：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２３２．５６  Ｆｏｕｎｄ  ３２３４．８８
５’−（ｄＡ＊）ＴＴＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：１３、実施例９）：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２６２．５６  Ｆｏｕｎｄ  ３２６２．４５
５’−（ｄＡ＊）ＴＧＡＣＣＴＡＣＴ−３’（配列番号：１４、実施例１０）：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス  Ｃａｌｃｄ  ３２８７．５７  Ｆｏｕｎｄ  ３２８９．１１【０１０７】
実施例１１
Ｔｍ測定による鎖長依存的ハイブリダイゼーションの解析
実施例５〜１１で得られたオリゴヌクレオチドを１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．０）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ中に、濃度が１．０  μＭになるように調製した。この溶液に、下記長鎖ＲＮＡ又は短鎖ＲＮＡを同じく濃度１．０μＭになるように溶解し、２６０ｎｍでの吸光度の温度依存性を５℃から９０℃まで測定した。得られたＵＶ融解曲線を微分し、その一次微分係数が極大となる温度をＴｍとした。用いた長鎖ＲＮＡ又は短鎖ＲＮＡを表２に、結果を表３に示す。【０１０８】
【表２】
2011102414.tif 000032
【０１０９】
【表３】
2011102414.tif 000033
【０１１０】
表３より、以下のことが明らかになった。
プローブ５’末端のヌクレオシド残基の塩基部と５’水酸基にともにリン酸基を導入した実施例６〜１０のオリゴヌクレオチドは長鎖ＲＮＡよりも短鎖ＲＮＡに強く結合し、高いΔＴｍ値を示した。
【図１】
2011102414.tif 000042
【配列表】
2011102414000001.app
【国際調査報告】
2011102414.tif 000043
2011102414.tif 000044