(57)【要約】  遺伝子部位特異的変異導入法により人工的に得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ変異体およびその応用に関する、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ変異体およびその応用。本発明の目的は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの触媒活性が低く、産業上の利用価値が低いという従来技術の問題を解決することである。本発明は、一連のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ変異体および対応するヌクレオチド配列、発現ベクターおよび生細胞を提供する。基質ニコチンアミドおよびＰＲＰＰに対する変異体の酵素触媒活性はそれらの親のそれの１．２〜６．９倍であり、そして変異体はニコチンアミドモノヌクレオチドを調製するプロセスにおいて適用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）又は（b）の蛋白質であることを特徴とするニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体。
（a）そのアミノ酸配列がSEQ ID NO：3に示される蛋白質。
（b）（a）で限定されるアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠失又は付加してニコチンアミドとPRPPを基質とする、アミノ酸配列、例えばSEQ ID NO：2に示される親より高いニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ触媒活性を有する（a）から誘導される蛋白質。
【請求項２】
前記突然変異体が、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列と比べて、第180位、第182位、第231位、第298位、第338位及び第377位から選ばれる少なくとも一つのサイトで少なくとも一つの突然変異を有することを特徴とする請求項１に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体。
【請求項３】
前記突然変異体が、F180A、F180W、A182Y、E231A、E231Q、D298A、D298N、D298E、D338N、D338E、D377A、D377N及びD377Eからの少なくとも一つの突然変異を有することを特徴とする請求項２に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項４に記載のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項６】
細胞に請求項４に記載のヌクレオチド配列が導入され、請求項１、２又は３に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体を発現分泌できることを特徴とする生体細胞。
【請求項７】
前記突然変異体をニコチンアミドモノヌクレオチドの製造プロセスに応用することを特徴とする請求項１、２又は３に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の応用。
【請求項８】
前記突然変異体が酵素液、酵素冷凍乾燥粉末、酵素含有細胞、固定化酵素又は固定化酵素含有細胞として使用されることを特徴とする請求項７に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の応用。
【請求項９】
前記プロセスが生物触媒プロセスであることを特徴とする請求項７に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の応用。
【請求項１０】
前記プロセスが発酵プロセスであることを特徴とする請求項７に記載のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び生物技術の分野に関し、特に、遺伝子の部位特異的変異導入により人工的に得られるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Nicotinamide phosphoribosyltransferase。Namptと略称する）は、ビスファチンまたは前駆B細胞コロニー増殖因子PBEFとも呼ばれ、哺乳動物の生命活動に不可欠な蛋白であり、組織に遍在的に分布するが、主に人の脂肪組織、肝臓、筋肉及び骨髄に存在する。
【０００３】
現在、Namptは、以下の三つの機能を有すると考えられている。一つは、酵素活性を有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼとしての機能である。ニコチンアミドと5'-ホスホリボシル-1'-ピロリン酸（PRPP）がニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）とピロリン酸に転換することを触媒でき、次いでNMNがニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（Nmnat）によって細胞内に必須のエネルギー物質であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）に転化される。哺乳動物細胞における80%のNADが当該生合成経路によって合成され、またNamptが当該経路の律速酵素であるため、それにより細胞内のNADレベルが制御される。また一つは、前駆B細胞コロニー増殖因子（PBEF）としてリンパ球から分泌され、インターロイキン7（IL-7）と幹細胞因子（SCF）を調整し、前駆B細胞の形成を刺激する。もう一つは、脂肪細胞から分泌されるアディポカインとして様々な生物学的機能に関与する。2005年にFukuharaらは、Namptがインスリン受容体と直接相互作用することでインスリン受容体のシグナルを活性化できることを見出し、内臓脂肪細胞中に高発現するため、Visfatin（ビスファチン）と名付けられた。
【０００４】
NMNの医薬用や健康効果に対する認知の増加に伴い、市場でのNMNに対する需要量が日々増加しているが、現在最も環境保全で公害のないNMNの生産方法は、Namptによりニコチンアミドと5'-ホスホリボシル-1'-ピロリン酸（PRPP）をNMNに転換させることを触媒する生物的触媒方法である。しかしながら、既存の野生型Namptの酵素活性が低いため、それを大規模工業化に適用してNMNの生産を触媒する場合は、収率が低いため、生産コストが高すぎ、製品に市場競争力が欠いており、NMNの生物触媒技術の工業的応用が制限される。
【０００５】
したがって、NMNの生物触媒合成のコストの低下、Namptの工業的応用価値の向上、生物触媒技術のNMNの工業的生産への応用の促進に重要なのは、Namptの触媒活性を向上させることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の背景技術で開示された、既存のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの触媒活性が低い、工業的応用価値が低いという問題に対して、本発明は、触媒活性が既存の野生型親より高いニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体を提供することを目的とし、当該突然変異体が、ニコチンアミドとPRPPをNMNに転換させることを効率よく触媒でき、工業上で生物触媒技術によるNMNの生産コストを極めて低下させ、高い工業的応用価値を有する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を実現するため、発明者は、ヌクレオチド配列、例えばSEQ ID NO：1に示される親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子に対して部位特異的変異導入を行い、PCR増幅後に適切なベクターに挿入し、その後LB培地でスクリーニングすることにより、一連の高い触媒活性を有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体を得る。したがって、本発明は、以下の（a）又は（b）の蛋白質であることを特徴とするニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体を提供する。
【０００８】
（a）そのアミノ酸配列がSEQ ID NO：3に示される蛋白質。
【０００９】
（b）（a）で限定されるアミノ酸配列において一つ又は複数のアミノ酸を置換、欠失又は付加してニコチンアミドとPRPPを基質とする、アミノ酸配列、例えばSEQ ID NO：2に示される親より高いニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ触媒活性を有する（a）から誘導される蛋白質。
【００１０】
本発明における親とは、Meiothermus ruber DSM 1279由来のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Nampt）をいい、そのヌクレオチド配列がSEQ ID NO：1に示され、アミノ酸配列がSEQ ID NO：2に示される。
【００１１】
好ましくは、前記突然変異体は、SEQ ID NO：2に示されるアミノ酸配列と比べて、第180位、第182位、第231位、第298位、第338位及び第377位から選ばれる少なくとも一つのサイトで少なくとも一つの突然変異を有する。
【００１２】
前記突然変異体は、F180A、F180W、A182Y、E231A、E231Q、D298A、D298N、D298E、D338N、D338E、D377A、D377N及びD377Eからの少なくとも一つの突然変異を有することがより好ましい。
【００１３】
本発明は、前記ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体をコードするヌクレオチド配列をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクターをさらに提供する。
【００１５】
本発明は、細胞に前記ヌクレオチド配列が導入され、前記ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体を発現分泌できる生体細胞をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、前記突然変異体を、生物触媒プロセスや発酵プロセスといったニコチンアミドモノヌクレオチドの製造プロセスに応用することを特徴とする、前記ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の応用をさらに提供する。
【００１７】
前記ニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）を調製するための生物触媒プロセスとは、具体的には生物酵素により基質をNMNに転化させることを触媒するプロセスであり、そのうち、生物酵素は、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体、又は、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体と一種或いは多種のほかの酵素との共同使用であり、また、基質は、PRPPとニコチンアミドでも、PRPP又はニコチンアミドに転化できる前駆体物質でもよく、例えば、
【００１８】
ニコチンアミドとPRPPを原料とし、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の触媒作用でNMNを調製する；
【００１９】
ニコチンアミド、ATP及びキシロースを原料とし、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-3-リン酸イソメラーゼ、キシルロキナーゼ及びキシロースイソメラーゼの触媒作用でNMNを調製する；
【００２０】
ニコチンアミド、ATP及びリボースを原料とし、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ及びリボキナーゼの触媒作用でNMNを調製する；
【００２１】
ニコチンアミド、ピロリン酸又はその塩、及びAMPを原料とし、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼの触媒作用でNMNを調製する；
【００２２】
ニコチンアミド、ATP及びAMPを原料とし、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ及びAMPヌクレオシダーゼの触媒作用でNMNを調製する；
【００２３】
ニコチンアミド、ピロリン酸又はその塩、及びイノシン酸又はその塩を原料とし、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びキサンチンオキシダーゼの触媒作用でNMNを調製する。
【００２４】
好ましくは、本発明に係るニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体は、酵素液、酵素冷凍乾燥粉末、酵素含有細胞、固定化酵素又は固定化酵素含有細胞として使用される。
【発明の効果】
【００２５】
既存の野生型ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼと比べて、本発明で提供されるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体は、酵素活性が大幅に向上し、酵素活性測定により、ニコチンアミドとPRPPを基質として本発明で提供されるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体は、酵素触媒活性が親の1.2-6.9倍と高いため、精製せず粗酵素として、或いは一部精製して使用でき、そのため、本発明で提供されるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体によりNMNの生産を触媒するコストを大幅に低下でき、市場競争力が高くなり、NMNの生物触媒方法を大規模工業化生産に応用する需要を満たせる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、以下の実施例は、本発明を解釈するためのものであり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、実施例において具体的な条件を説明していない場合は、通常の条件又はメーカーの推奨条件に従う。
【００２７】
本発明で提供されるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の調製過程は大体以下のようである。まず、親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクタープラスミドを構築し、次に部位特異的変異導入のサイト及び突然変異後のアミノ酸種類を設定し、さらに適切なプライマーを合成し、親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクタープラスミドをテンプレートとし、DNA断片をPCR増幅し、増幅されたDNA断片を組み立てて全長の突然変異遺伝子をPCR増幅する。その後、当該全長突然変異遺伝子を適切なベクター上にクローンして適切な宿主細胞を転化させ、培養を経てニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する陽性クローンをスクリーニングする。最後に陽性クローンからプラスミドDNAを抽出し、導入された突然変異を確認するためにDNA配列決定分析を行い、標的断片がベクター上に挿入されたことを確認した後、LB＋カナマイシン培地によるスクリーニングで、一連の高い触媒活性を有するニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体を得る。
【００２８】
上述した調製方法においては、いかなる適宜のベクターを採用でき、たとえば、pRSETやpES21などのような原核発現ベクターでも、pUC18/19やpBluscript-SKなどのようなクローニングベクターでもいい。本発明ではpRSET-Aをベクターとして優先的に使用し、ベクターの宿主細胞が大腸菌を含む原核細胞でも、出芽酵母及びピキア酵母を含む真核細胞でもいい。
【００２９】
以下の実施例で使用される酵素は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体がMeiothermus ruber DSM 1279由来のヌクレオチド配列、例えばSEQ ID NO：1に示される親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼから人工誘導による部位特異的変異導入によって得られる以外、ほかの酵素がいずれも市場から直接購入した酵素冷凍乾燥粉末である。
【００３０】
［実施例１］
【００３１】
親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクタープラスミドの構築
【００３２】
ジーンバンクに開示されたMeiothermus ruber DSM 1279由来の親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子配列（GenBank登録番号：CP001743.1）について全配列を人工的に合成した（商業的合成会社に任せた）。合成された生成物を、制限エンドヌクレアーゼであるNdeIとBamHIにより酵素切断した後、同様に制限エンドヌクレアーゼであるNdeIとBamHIにより酵素切断されたベクターpRSET-A（Invitrogen, USAから入手）と結合させ、プラスミドpRSET-namptを得た。DNAシーケンシングにより、当該クローンされた親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼのヌクレオチド配列がSEQ ID NO：1に示され、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO：2に示されることを確定した。
【００３３】
［実施例２］
【００３４】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の調製
【００３５】
PCR増幅反応系：20mM Tris-HCl（pH 8.8）、10mM KCl、10mM （NH4）2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100、50mM dATP、50mM dTTP、50mM dCTP、50mM dGTP、1.5U Pfu DNAポリメラーゼ（Promega、USA）、20ng DNAテンプレート、ならびに400nM上流プライマー及び400nM下流プライマー。無菌水で反応体積を50マイクロリットルに調整した。
【００３６】
PCR増幅反応条件：95℃で3分間。95℃で50秒、52℃で30秒及び72℃で3分間を35回繰り返した。最後72℃で5分間。
【００３７】
１．F180A突然変異体の調製
【００３８】
以下のプライマー対F180A-F：5' GTTCAAACTGCACGACGCGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3'とF180A-R：5' GAAACACCACGAGCACCCGCGTCGTGCAGTTTGAAC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってF180A突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-F180Aが得られた。プラスミドpRSET-F180Aによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-F180AのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、F180A突然変異体のアミノ酸配列は第180位でPhe（F）からAla（A）に突然変異し、そのアミノ酸配列がSEQ ID NO：3に示される。
【００３９】
２．F180W突然変異体の調製
【００４０】
以下のプライマー対F180W-F：5' GTTCAAACTGCACGACTGGGGTGCTCGTGGTGTTTC 3'とF180W-R：5' GAAACACCACGAGCACCCCAGTCGTGCAGTTTGAAC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってF180W突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-F180Wが得られた。プラスミドpRSET-F180Wによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-F180WのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、F180W突然変異体のアミノ酸配列は第180位でPhe（F）からTrp（W）に突然変異した。
【００４１】
３．A182Y突然変異体の調製
【００４２】
以下のプライマー対A182Y-F：5' CAAACTGCACGACTTCGGTTATCGTGGTGTTTCTTCTCTG 3'とA182Y-R：5' CAGAGAAGAAACACCACGATAACCGAAGTCGTGCAGTTTG 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってA182Y突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-A182Yが得られた。プラスミドpRSET-A182Yによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-A182YのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、A182Y突然変異体のアミノ酸配列は第182位でAla（A）からTyr（Y）に突然変異した。
【００４３】
４．E231A突然変異体の調製
【００４４】
以下のプライマー対E231A-F：5' CTATCCCGGCTATGGCGCACTCTACCGTTAC 3'とE231A-R：5' GTAACGGTAGAGTGCGCCATAGCCGGGATAG 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってE231A突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-E231Aが得られた。プラスミドpRSET-E231Aによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-E231AのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、E231A突然変異体のアミノ酸配列は第231位でGlu（E）からAla（A）に突然変異した。
【００４５】
５．E231Q突然変異体の調製
【００４６】
以下のプライマー対E231Q-F：5' CTCTATCCCGGCTATGCAGCACTCTACCGTTACC 3'とE231Q-R：5' GGTAACGGTAGAGTGCTGCATAGCCGGGATAGAG 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってE231Q突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-E231Qが得られた。プラスミドpRSET-E231Qによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-E231QのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、E231Q突然変異体のアミノ酸配列は第231位でGlu（E）からGln（Q）に突然変異した。
【００４７】
６．D298A突然変異体の調製
【００４８】
以下のプライマー対D298A-F：5' TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3'とD298A-R：5' GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD298A突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D298Aが得られた。プラスミドpRSET-D298Aによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D298AのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D298A突然変異体のアミノ酸配列は第298位でAsp（D）からAla（A）に突然変異した。
【００４９】
７．D298N突然変異体の調製
【００５０】
以下のプライマー対D298N-F：5' GTTGTTATCCGTCCGAATTCTGGTGACCCGCCG 3'とD298N-R：5' CGGCGGGTCACCAGAATTCGGACGGATAACAAC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD298N突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D298Nが得られた。プラスミドpRSET-D298Nによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D298NのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D298N突然変異体のアミノ酸配列は第298位でAsp（D）からAsn（N）に突然変異した。
【００５１】
８．D298E突然変異体の調製
【００５２】
以下のプライマー対D298E-F：5' GTTGTTATCCGTCCGGAATCTGGTGACCCGCCGTTC 3'とD298E-R：5' GAACGGCGGGTCACCAGATTCCGGACGGATAACAAC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD298E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D298Eが得られた。プラスミドpRSET-D298Eによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D298EのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D298E突然変異体のアミノ酸配列は第298位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００５３】
９．D338N突然変異体の調製
【００５４】
以下のプライマー対D338N-F：5' GTTCGTGTTATCCAGGGTAATGGTGTTAACGCTGACTC 3'とD338N-R：5' GAGTCAGCGTTAACACCATTACCCTGGATAACACGAAC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD338N突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D338Nが得られた。プラスミドpRSET-D338Nによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D338NのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D338N突然変異体のアミノ酸配列は第338位でAsp（D）からAsn（N）に突然変異した。
【００５５】
１０．D338E突然変異体の調製
【００５６】
以下のプライマー対D338E-F：5' GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3'とD338E-R：5' GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD338E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D338Eが得られた。プラスミドpRSET-D338Eによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D338EのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D338E突然変異体のアミノ酸配列は第338位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００５７】
１１．D377A突然変異体の調製
【００５８】
以下のプライマー対D377A-F：5' CACCCGCACCGTGCGACCCAGAAATTC 3'とD377A-R：5' GAATTTCTGGGTCGCACGGTGCGGGTG 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD377A突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D377Aが得られた。プラスミドpRSET-D377Aによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D377AのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D377A突然変異体のアミノ酸配列は第377位でAsp（D）からAla（A）に突然変異した。
【００５９】
１２．D377N突然変異体の調製
【００６０】
以下のプライマー対D377N-F：5' GCAACACCCGCACCGTAATACCCAGAAATTCGCTC 3'とD377N-R：5' GAGCGAATTTCTGGGTATTACGGTGCGGGTGTTGC 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD377N突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D377Nが得られた。プラスミドpRSET-D377Nによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D377NのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D377N突然変異体のアミノ酸配列は第377位でAsp（D）からAsn（N）に突然変異した。
【００６１】
１３．D377E突然変異体の調製
【００６２】
以下のプライマー対D377E-F：5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3'とD377E-R：5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3'を用いて、実施例１で構築されたプラスミドpRSET-namptをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD377E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-D377Eが得られた。プラスミドpRSET-D377Eによりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-D377EのDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D377E突然変異体のアミノ酸配列は第377位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００６３】
１４．E231Q/D338E突然変異体の調製
【００６４】
以下のプライマー対D338E-F：5' GTTATCCAGGGTGAAGGTGTTAACGCTGAC 3'とD338E-R：5' GTCAGCGTTAACACCTTCACCCTGGATAAC 3'を用いて、実施例２の第5部分で構築されたプラスミドpRSET-E231Qをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってE231Q/D338E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-21が得られた。プラスミドpRSET-21によりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-21のDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、E231Q/D338E突然変異体のアミノ酸配列は第231位でGlu（E）からGln（Q）に突然変異し、第338位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００６５】
１５．E231Q/D377E突然変異体の調製
【００６６】
以下のプライマー対D377E-F：5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3'とD377E-R：5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3'を用いて、実施例２の第5部分で構築されたプラスミドpRSET-E231Qをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってE231Q/D377E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-22が得られた。プラスミドpRSET-22によりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-22のDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、E231Q/D377E突然変異体のアミノ酸配列は第231位でGlu（E）からGln（Q）に突然変異し、第377位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００６７】
１６．D338E/D377E突然変異体の調製
【００６８】
以下のプライマー対D377E-F：5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3'とD377E-R：5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3'を用いて、実施例２の第10部分で構築されたプラスミドpRSET-D338Eをテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってD338E/D377E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-23が得られた。プラスミドpRSET-23によりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-23のDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、D338E/D377E突然変異体のアミノ酸配列は第338位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異し、第377位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００６９】
１７．E231Q/D338E/D377E突然変異体の調製
【００７０】
以下のプライマー対D377E-F：5' CCCGCACCGTGAAACCCAGAAATTCG 3'とD377E-R：5' CGAATTTCTGGGTTTCACGGTGCGGG 3'を用いて、実施例２の第14部分で構築されたプラスミドpRSET-21をテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってE231Q/D338E/D377E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-31が得られた。プラスミドpRSET-31によりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-31のDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、E231Q/D338E/D377E突然変異体のアミノ酸配列は第231位でGlu（E）からGln（Q）に突然変異し、第338位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異し、第377位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００７１】
１８．E231Q/D298A/D338E/D377E突然変異体の調製
【００７２】
以下のプライマー対D298A-F：5' TATCCGTCCGGCGTCTGGTGACCC 3'とD298A-R：5' GGGTCACCAGACGCCGGACGGATA 3'を用いて、実施例２の第17部分で構築されたプラスミドpRSET-31をテンプレートとし、上記のPCR増幅反応系とPCR増幅反応条件でハイフィデリティPCRを行ってE231Q/D298A/D338E/D377E突然変異体遺伝子を増幅し、1%アガロースゲル電気泳動により分離して商業的キットを使用して増幅生成物を回収し、さらに増幅生成物をベクターpRSET-Aで結合し（具体的には実施例１を参照）、プラスミドpRSET-41が得られた。プラスミドpRSET-41によりコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上でニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングし、クローンからプラスミドpRSET-41のDNAを抽出し、導入されたサイトが突然変異したことをDNAシーケンシングにより確認した。SEQ ID NO：2に示される親アミノ酸配列と比べて、E231Q/D298A/D338E/D377E突然変異体のアミノ酸配列は第231位でGlu（E）からGln（Q）に突然変異し、第298位でAsp（D）からAla（A）に突然変異し、第338位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異し、第377位でAsp（D）からGlu（E）に突然変異した。
【００７３】
［実施例３］
【００７４】
酵素の抽出
【００７５】
親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドpRSET-nampt、ならびに、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体遺伝子を含むプラスミドpRSET-F180A、pRSET-F180W、pRSET-A182Y、pRSET-E231A、pRSET-E231Q、pRSET-D298A、pRSET-D298N、pRSET-D298E、pRSET-D338N、pRSET-D338E、pRSET-D377A、pRSET-D377N、pRSET-D377E、pRSET-21、pRSET-22、pRSET-23、pRSET-31及びpRSET-41によりそれぞれコンピテント細菌細胞E. coli BL21を形質転換し、Luria broth（LB）プレート（50mg/Lカナマイシン含有）上で37℃、24時間培養した。単一のクローンをLB液体培地（50mg/Lカナマイシン含有）50ミリリットルに播種して30℃で16-20時間培養した。菌体を遠心回収し、相同量の菌体を秤量して1：4の比で細菌破砕液（pH 7.5）に懸濁させた。そして、超音波にて細菌細胞を分解した。遠心（4-10℃、12000rpm、10分間）して上澄みを回収し、それぞれ親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ及び一連のニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の上澄み蛋白溶液を得、酵素活性の測定及びニコチンアミドモノヌクレオチドの生物触媒による調製に用いられる。
【００７６】
［実施例４］
【００７７】
酵素活性の測定
【００７８】
基質溶液の配合：60mMのニコチンアミド、25mMのPRPP、18mMのMgCl2、15mMのKCl及び100mMのTris buffer緩衝液を含有し、pH7.5に調整した。基質溶液を900マイクロリットルずつで19グループ準備し、そして同じ濃度の実施例３で得られた親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ及び各ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体の上澄み蛋白溶液をそれぞれ100マイクロリットル添加し、37℃で10分間反応させ、25%トリクロロ酢酸を100μL加えて反応を停止した。高速液体クロマトグラフ（HPLC）にて反応液中のニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）の含有量を測定し、各酵素の相対的酵素活性を算出し、親ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの相対的酵素活性を100とし、親及び各突然変異体の相対的活性を表１に示した。
【００７９】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼの酵素活性
【表１】
2019525760.tif 000002
【００８０】
［実施例５］
【００８１】
ニコチンアミドモノヌクレオチドの調製
【００８２】
反応釜に、30mMのニコチンアミド、20mMのATP、30mMのキシロース、12mMのMgCl2、10mMのKCl、10mMのZnCl2、及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量は、基質溶液に対して、実施例３で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ6g/L、リボース-5-リン酸イソメラーゼ10g/L、リブロース-3-リン酸イソメラーゼ11g/L、キシルロキナーゼ10g/L、キシロースイソメラーゼ10g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。6h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチドの粗製品溶液（NMN10mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチドが得られた。
【００８３】
［実施例６］
【００８４】
ニコチンアミドモノヌクレオチドの調製
【００８５】
反応釜に、30mMのニコチンアミド、20mMのATP、30mMのリボース、15mMのMgCl2、15mMのKCl及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後基質溶液に、触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量はそれぞれ、基質溶液に対して、実施例６の第三部分で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ20g/L、リボキナーゼ20g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。4h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN10mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【００８６】
［実施例７］
【００８７】
ニコチンアミドモノヌクレオチドの調製
【００８８】
反応釜に、75mMのニコチンアミド、75mMのピロリン酸二ナトリウム、50mMのAMP、15mMのMgCl2、10mMのKCl及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後、基質溶液に対して、実施例６の第三部分で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ20g/L、という触媒用酵素を加えた。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-8.0に保持した。5h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN49.6mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【００８９】
［実施例８］
【００９０】
ニコチンアミドモノヌクレオチドの調製
【００９１】
反応釜に、60mMのニコチンアミド、10mMのATP、20mMのAMP、15mMのMgCl2、15mMのKCl及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後基質溶液に、触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量はそれぞれ、基質溶液に対して、実施例６の第三部分で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ15g/L、AMPヌクレオシダーゼ15g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。3h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN9.8mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【００９２】
［実施例９］
【００９３】
ニコチンアミドモノヌクレオチドの調製
【００９４】
反応釜に、60mMのニコチンアミド、30mMのピロリン酸二ナトリウム、20mMのイノシン酸二ナトリウム、20mMのMgCl2、20mMのZnCl2、35mMの亜硫酸水素ナトリウム及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後基質溶液に、触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量はそれぞれ、基質溶液に対して、実施例６の第三部分で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ10g/L、キサンチンオキシダーゼ20g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。5h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN19.8mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【配列表】
2019525760000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月15日(2019.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
反応釜に、30mMのニコチンアミド、20mMのATP、30mMのリボース、15mMのMgCl2、15mMのKCl及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後基質溶液に、触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量はそれぞれ、基質溶液に対して、実施例３で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ20g/L、リボキナーゼ20g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。4h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN10mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
反応釜に、75mMのニコチンアミド、75mMのピロリン酸二ナトリウム、50mMのAMP、15mMのMgCl2、10mMのKCl及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後、基質溶液に対して、実施例３で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ20g/L、という触媒用酵素を加えた。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-8.0に保持した。5h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN49.6mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
反応釜に、60mMのニコチンアミド、10mMのATP、20mMのAMP、15mMのMgCl2、15mMのKCl及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後基質溶液に、触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量はそれぞれ、基質溶液に対して、実施例３で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、リボースリン酸ピロホスホキナーゼ15g/L、AMPヌクレオシダーゼ15g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。3h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN9.8mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
反応釜に、60mMのニコチンアミド、30mMのピロリン酸二ナトリウム、20mMのイノシン酸二ナトリウム、20mMのMgCl2、20mMのZnCl2、35mMの亜硫酸水素ナトリウム及び100mMのTris-HCl緩衝液を含有し、pH7.0-7.5に調整した基質溶液を加えた。その後基質溶液に、触媒に使用される各種類の酵素を加え、各種類の酵素の仕込み量はそれぞれ、基質溶液に対して、実施例３で得られたニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ突然変異体（F180A）の上澄み蛋白溶液10ml/L、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ10g/L、キサンチンオキシダーゼ20g/Lであった。均一に撹拌した後反応を行い、反応中で撹拌し続き（撹拌速度50rpm）、反応温度を37℃に制御し、pH7.0-7.5に保持した。5h反応後、ニコチンアミドモノヌクレオチド粗製品溶液（NMN19.8mM含有）が得られ、さらにろ過、精製、乾燥を行った後、ニコチンアミドモノヌクレオチド完成品が得られた。
【国際調査報告】
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