(57)【要約】本出願は、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の一級アルケンの一段階直接発酵生成において有用であるデヒドラターゼを発現する組換え微生物に関する。再生可能原料を使用する公知の十分に開発された高収量経路を組換え微生物に導入して、アルコール前駆体を得ることができる。また、前記組換え微生物を使用して1種類または複数種類の一級アルケンを生成する方法、ならびに、前記組換え微生物および/または任意で一級アルケン生成物を含む組成物も提供される。2019520832.tif 000068
2019520832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成する能力を有する組換え微生物であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒する、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を発現する、前記組換え微生物：
2019520832.tif 000066
式中、R1＝CnH2n+1、1≦n≦11；R2＝CmH2m+1、0≦m≦10かつn+m≦11である。
【請求項２】
再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子をさらに発現する、請求項1に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記再生可能原料が、1種類または複数種類の糖である、請求項2に記載の組換え微生物。
【請求項４】
外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
DHAPが該微生物の内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換され、かつMEGおよびイソプロパノールが同時生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
DHAPが該微生物の内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換され、かつMEGおよびイソプロパノールが同時生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
内在性D-キシロースイソメラーゼが、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1種類の外来性核酸分子を発現する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する、請求項7に記載の組換え微生物。
【請求項９】
外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のD-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、さらに、以下の（d）〜（j）：
（d）（b）もしくは（c）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
MEGおよびイソプロパノールが同時生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（c）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（d）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ、もしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（d）もしくは（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオールデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
DHAPおよびピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
アセトン、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
イソプロパノール、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
イソブタノールを生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
（i）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（ii）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（iii）ブチリルリン酸からブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（iv）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、請求項11〜15のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
対応する一級アルケンがプロペンであり、一級アルコールが1-プロパノールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
対応する一級アルケンがプロペンであり、二級アルコールが2-プロパノールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが1-ブタノールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
対応する一級アルケンがブテンであり、二級アルコールが2-ブタノールである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
1種類または複数種類の一級アルケンが、単一の酵素的段階を介して、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成が、脱水段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記脱水段階が、基質活性化非依存性である、請求項22に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記脱水段階が、補助因子非依存性である、請求項22に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）の種からなる群より選択される微生物から得られる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、LinDである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
1種類もしくは複数種類の一級アルケン、1種類もしくは複数種類の飽和一級アルコールもしくは飽和二級アルコール、またはそれらの組み合わせを生成する方法であって、1種類もしくは複数種類の一級アルケン、1種類もしくは複数種類の飽和一級アルコールもしくは飽和二級アルコール、またはそれらの組み合わせが生成されるまで炭素源を提供する原料を含有する培養培地中で前記請求項のいずれか一項に記載の組換え微生物を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項３０】
構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成または蓄積する組換え微生物を作製する方法であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒するリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を、組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程を含む、前記方法：
2019520832.tif 000067
式中、R1＝CnH2n+1、1≦n≦11；R2＝CmH2m+1、0≦m≦10かつn+m≦11である。
【請求項３１】
再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を、組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記再生可能原料が、1種類または複数種類の糖である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、
1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程が、
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、
1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程が、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含み、
DHAPが該微生物の内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換され、かつ
MEGおよびイソプロパノールが同時生成される、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
内在性D-キシロースイソメラーゼが、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1種類の外来性核酸分子を、組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程をさらに含む、請求項30〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組換え微生物が、外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、
1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程が、
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のD-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法であって、
以下の（d）〜（j）：
（d）（b）もしくは（c）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることをさらに含み、
MEGおよびイソプロパノールが同時生成される、
前記方法。
【請求項３９】
（i）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（ii）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（iii）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（iv）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程をさらに含む、請求項30〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組換え微生物が、イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組換え微生物が、n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ、もしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（d）もしくは（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオールデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
DHAPおよびピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組換え微生物が、アセトン、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換え微生物が、イソプロパノール、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組換え微生物が、イソブタノールを生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（i）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（ii）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（iii）ブチリルリン酸からブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（iv）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、請求項40〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
対応する一級アルケンがプロペンであり、一級アルコールが1-プロパノールである、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
対応する一級アルケンがプロペンであり、二級アルコールが2-プロパノールである、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが1-ブタノールである、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが2-ブタノールである、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
1種類または複数種類の一級アルケンが、単一の酵素的段階を介して、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成が、脱水段階を含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記脱水段階が、基質活性化非依存性である、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
前記脱水段階が、補助因子非依存性である、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、カステラニエラ・デフラグランスの種からなる群より選択される微生物から得られる、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、LinDである、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、2016年7月12日に出願された米国特許仮出願第62/361,109号からの優先権の恩典を主張し、その内容は、全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表に関する陳述
本願に付随する配列表は、紙のコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、参照により本明細書中に組み入れられる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、BRAS-002_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは、約416 KBであり、2017年7月12日に作成されて、EFS-Webを介して電子的に提出されている。
【０００３】
技術分野
本願は、一段階酵素的脱水による、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の一級アルケンの生合成に有用な組換え微生物に関する。本願はさらに、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼを発現させる工程により、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の一級アルケンを生成する方法、ならびにこれらの一級アルケンのうちの1種類もしくは複数種類および/または組換え微生物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
プロペン（プロピレン）およびブテン（1-ブテン、1-ブチレン）などの一級アルケンは、多様な生成物のための出発化合物として価値がある。プロペンは、フィルム、パッケージング、キャップ、およびクロージャーの生成のため、ならびに他の適用のために必要とされる。プロペンはまた、プロピレンオキシド、アクリロニトリル、クメン、ブチルアルデヒド、およびアクリル酸などの重要な化学物質の生成のためにも使用される。8500万トンを超えるプロペンが、世界中で加工処理されている。ブテンは、直鎖低密度ポリエチレン（LLDPE）などのある特定の種類のポリエチレンの生成において、コモノマーとして働くことができる。ブテンはまた、ポリプロピレン樹脂、ブチレンオキシド、およびブタノンの前駆物質としても使用されている。
【０００５】
しかし、これらの一級アルケンは現在、気候の変化に影響する、再生可能でない化石原料を用いた化学的多段階合成から得られている。加えて、化学合成は、酸性条件、高温、および/または高圧などの苛酷な条件を含み、多くの場合に困難な、基質からの生成物の分離を必要とする可能性がある。より環境に優しいプロセスを開発するために、研究者らは、これらの一級アルケンを生成するように生合成経路を有する微生物を操作してきた。しかし、これらの経路は、実現が困難である。生成物の収率の低下、ならびに活性化基質およびエネルギー性補助因子の必要が、克服すべきいくつかの主な障害である。
【０００６】
このように、プロペンおよびブテンなどの一級アルケンの生成のための改善された生合成経路が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の概要
本願は、一段階酵素的脱水による、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の一級アルケンの生合成に有用な組換え微生物に関する。いくつかの態様において、脱水段階は、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼによって触媒される。さらなる態様において、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼを微生物において発現させる工程により、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の一級アルケンを生成する方法、ならびにこれらの一級アルケンのうちの1種類もしくは複数種類および/または組換え微生物を含む組成物が提供される。
【０００８】
1つの局面において、本願は、
構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成する能力を有する組換え微生物であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒する、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を発現する、前記組換え微生物に関する：
2019520832.tif 000003
式中、R1＝CnH2n+1、1≦n≦11；R2＝CmH2m+1、0≦m≦10かつn+m≦11である。
【０００９】
1つの態様において、組換え微生物は、再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子をさらに発現する。別の態様において、再生可能原料は、1種類または複数種類の糖である。
【００１０】
1つの態様において、対応する一級アルケンはプロペンであり、一級アルコールは1-プロパノールである。別の態様において、対応する一級アルケンはプロペンであり、二級アルコールは2-プロパノールである。いくつかの態様において、対応する一級アルケンはブテンであり、一級アルコールは1-ブタノールである。さらなる態様において、対応する一級アルケンはブテンであり、二級アルコールは2-ブタノールである。
【００１１】
1つの態様において、1種類または複数種類の一級アルケンは、単一の酵素的段階を介して、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される。いくつかの態様において、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成は、脱水段階を含む。さらなる態様において、脱水段階は、基質活性化非依存性である。なおさらなる態様において、脱水段階は、補助因子非依存性である。
【００１２】
1つの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）の種からなる群より選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。さらなる態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、LinDである。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:64、65、66、67、および68からなる群より選択されるアミノ酸配列から構成されない。
【００１３】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【００１４】
1つの態様において、D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種（Pseudomonas sp.）、メソリゾビウム属の種（Mesorhizobium sp.）、およびロドバクター属の種（Rhodobacter sp.）から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シュードモナス・シコリイ（Pseudomonas cichorii）、シュードモナス属種ST-24、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、およびロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、dte、C1KKR1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、1種類または複数種類の核酸分子は、FJ851309.1またはそのホモログである。さらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:71および73からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:69、70、および72からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００１５】
1つの態様において、D-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌（E. coli）から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucKまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:76に示されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:74および75からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００１６】
1つの態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucAまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:79に示されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:77および78からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００１７】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【００１８】
1つの態様において、D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）から得られる核酸分子によってコードされる。1つの態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有するホモ・サピエンス酵素は、ケトヘキソキナーゼCである。いくつかの態様において、ヒトケトヘキソキナーゼCをコードする核酸分子は、khk-Cまたはそのホモログである。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:123に示されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:121および122からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００１９】
1つの態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。さらなる態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、この酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされるD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。1つの態様において、ホモ・サピエンスD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼは、アルドラーゼBである。いくつかの態様において、ヒトアルドラーゼBをコードする核酸分子は、ALDOBまたはそのホモログである。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:126に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:124および125からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００２０】
1つの態様において、組換え微生物は、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【００２１】
いくつかの態様において、内在性D-キシロースイソメラーゼは、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する。
【００２２】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（g）（f）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（i）（h）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【００２３】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【００２４】
1つの態様において、D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種（Caulobacter sp.）、ハロアーキュラ属の種（Haloarcula sp.）、ハロフェラックス属の種（Haloferax sp.）、ハロルブラム属の種（Halorubrum sp.）、およびトリコデルマ属の種（Trichoderma sp.）から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）、ハロアーキュラ・マリスモーツイ（Haloarcula marismortui）、ハロフェラックス・ボルカニイ（Haloferax volcanii）、ハロルブラム・ラクスプロファンディ（Halorubrum lacusprofundi）、およびトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylB、xdh（HVO_B0028）、xyd1、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:129、131、および133からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:127、128、130、および132からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００２５】
1つの態様において、D-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種およびハロフェラックス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイ、およびハロフェラックス・ギボンシイ（Haloferax gibbonsii）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylCまたはそのホモログである。さらなる態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:135に示されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:134に示される核酸配列によってコードされる。
【００２６】
1つの態様において、D-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロフェラックス属の種、スルホロブス属の種（Sulfolobus sp.）、および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイ、大腸菌、およびスルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylD、yjhG、yagF、xad、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:137、140、および143からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:136、138、139、141、および142からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００２７】
1つの態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、yjhH、yagE、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:146および149からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:144、145、147、および148からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００２８】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【００２９】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロマノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからキリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（b）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、さらに
（c）（a）もしくは（b）由来のD-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼもしくはメチルグリオキサールレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（i）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【００３０】
一態様において、D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素は、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素は、ヒポクレア属の種(Hypocrea sp.)、シェフェルソミセス属の種(Scheffersomyces sp.)、サッカロミセス属の種(Saccharomyces sp.)、パチソレン属の種(Pachysolen sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、カンジダ属の種(Candida sp.)、アスペルギルス属の種(Aspergillus sp.)、ニューロスポラ属の種（Neurospora sp.)、およびクリプトコッカス属の種(Cryptococcus sp.)から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、ヒポクレア・ジェコリナ(Hypocrea jecorina)、シェフェルソミセス・スチピチス(Scheffersomyces stipitis)、S. セレビシエ(S. cerevisiae)、パチソレン・タノフィルス(Pachysolen tannophilus)、ピキア・スチピチス(Pichia stipitis)、ピキア・クエルカム(Pichia quercuum)、カンジダ・シェハタエ(Candida shehatae)、カンジダ・テヌイス(Candida tenuis)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)およびクリプトコッカス・ラクタチボラス(Cryptococcus lactativorus)から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xyl1、GRE3、またはそのホモログである。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:152および155からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:150、151、153および154からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００３１】
一態様において、キシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、キシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、キシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、シェフェルソミセス属の種、トリコデルマ属の種、ピキア属の種、サッカロミセス属の種、グルコノバクター属の種(Gluconobacter sp.)、ガラクトカンジダ属の種(Galactocandida sp.)、ニューロスポラ属の種、およびセラチア属の種(Serratia sp.)から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シェフェルソミセス・スチピチス、トリコデルマ・リーゼイ、ピキア・スチピチス、S. セレビシエ、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans)、ガラクトカンジダ・マストテルミシチス（Galactocandida mastotermitis)、ニューロスポラ・クラッサおよびセラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、xyl2、xdh1、またはそのホモログである。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:158および160からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:156、157および159からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００３２】
一態様において、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、ピロマイセス属の種(Pyromyces sp.)から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylA、またはそのホモログである。なお別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:163および190から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:161、162および189から選択される核酸配列によってコードされる。
【００３３】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）D-キシルロース-5-リン酸からD-キシルロースへの変換を触媒するアルカリホスファターゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【００３４】
上記態様のいずれかにおいて、DHAPは、微生物における内在性解糖経路を通じてアセチルCoAへと変換される。
【００３５】
上記態様のいずれかにおいて、グリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドレダクターゼまたはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、グリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、グリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼまたはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌またはS. セレビシエから選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼまたはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucO、yqhD、dkgA（yqhE)、dkgB（yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2、またはそのホモログから選択される。別の態様において、1種類または複数種類の核酸分子は、yqhDである。いくつかの態様において、yqhDは、G149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:81、83、85、88、91、93、96、98および100からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:80、82、84、86、87、89、90、92、94、95、97および99からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００３６】
上記態様のいずれかにおいて、アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、該酵素は、クロストリジウム属の種(Clostridium sp.)、バチルス属の種(Bacillus sp.)、大腸菌、サッカロミセス属の種およびマリノバクター属の種(Marinobacter sp.)から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム(Clostridium thermosaccharolyticum)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびマリノバクター・ヒドロカルボノクラスチクス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、thlA、atoBおよび/もしくはERG10、またはそのホモログである。さらなる態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:103、105および108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、チオラーゼまたはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:101、102、104、106および107からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００３７】
上記態様のいずれかにおいて、アセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、トランスフェラーゼ活性を有する酵素は、アセチルCoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、アセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカムから得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、大腸菌から得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、atoAおよびatoD、またはそのホモログである。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、ctfAおよびctfB、またはそのホモログである。さらなる態様において、アセチルCoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:111、114、165、167、169および171からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、アセチルCoA:アセト酢酸-CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:109、110、112、113、164、166、168および170からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００３８】
上記態様のいずれかにおいて、アセト酢酸からアセトンへの変換を触媒する酵素は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセト酢酸からアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代わりの態様において、アセト酢酸からアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、クロモバクテリウム属の種(Chromobacterium sp.)およびシュードモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキィ（Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・セルロリチカム（Clostridium cellulolyticum)、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymyxa)、クロモバクテリウム・ビオラセム（Chromobacterium violaceum)およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、adc、またはそのホモログである。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:117および120からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なお別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:115、116、118および119からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００３９】
上記態様のいずれかにおいて、組換え微生物はさらに、アセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1種類の核酸分子を含み得る。1つの態様において、アセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。1つの態様において、アセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（S-ADH）である。別の態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、バークホルデリア属の種（Burkholderia sp.）、アルカリゲネス属の種（Alcaligenes sp.）、クロストリジウム属の種、サーモアナエロバクター属の種（Thermoanaerobacter sp.）、フィトモナス属の種（Phytomonas sp.）、ロドコッカス属の種（Rhodococcus sp.）、メタノバクテリウム属の種（Methanobacterium sp.）、メタノゲニウム属の種（Methanogenium sp.）、エントアメーバ属の種（Entamoeba sp.）、トリコモナス属の種（Trichomonas sp.）およびトリトリコモナス属の種（Tritrichomonas sp.）から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、バークホルデリア属種AIU652、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）、クロストリジウム・ラグスダレイ（Clostridium ragsdalei）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）、サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）（クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム（Clostridium thermohydrosulfuricum））、ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）、メタノバクテリウム・パルストレ（Methanobacterium palustre）、メタン生成古細菌メタノゲニウム・リミナタンス（Methanogenium liminatans）、寄生性原生生物エントアメーバ・ヒストリティカ、（Entamoeba histolytica）、寄生性原生動物トリトリコモナス・フィータス（Tritrichomonas foetus）およびヒト寄生生物トリコモナス・バギナリス（Trichomonas vaginalis）から選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、adh、adhB、EhAdh1またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、S-ADHは、相同性から予測され、サーモアナエロバクター・マスラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、ノカルディオプシス・アルバ（Nocardiopsis alba）、マイコバクテリウム・ハッシアカム（Mycobacterium hassiacum）、ヘリコバクター・スイス（Helicobacter suis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・オルトプシローシス（Candida orthopsilosis）、カンジダ・メタプシローシス（Candida metapsilosis）、グロスマンニア・クラビゲラ（Grosmannia clavigera）およびシェフェルソミセス・スチピチス由来であり得る。さらなる態様において、このアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:174および176からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、このアルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO:172、173および175からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【００４０】
上記態様のいずれかにおいて、D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-5-キナーゼである。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、大腸菌(Escherichia coli)由来である。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、xylB遺伝子、またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を妨げ、代わりに、D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【００４１】
上記態様のいずれかにおいて、グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子、またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、グリコールアルデヒドからMEGへの変換に向けて反応を切り替えるために、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【００４２】
上記態様のいずれかにおいて、ピルベートからラクテートへの変換を触媒する酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の態様において、該酵素は、ピルベートをラクテートへと変換する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子、またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、ピルベートからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、イソプロパノールの生成に向けて反応に切り替えるために、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【００４３】
上記態様のいずれかにおいて、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼである。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、xylA遺伝子、またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を妨げ、代わりに、D-キシロースからD-キシロン酸への変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【００４４】
一態様において、組換え微生物は、イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1または複数を発現する。
【００４５】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【００４６】
一態様において、組換え微生物は、n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）または（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオール-デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、DHAPおよびピルベートは、該微生物における解糖から生成される。
【００４７】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【００４８】
一態様において、組換え微生物は、アセトン、ブタノールおよびエタノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリル-CoAから2-ブテノイル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイル-CoAからブチリル-CoAへの変換を触媒するブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリル-CoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへのまたは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【００４９】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【００５０】
一態様において、組換え微生物は、イソプロパノール、ブタノールおよびエタノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリル-CoAから2-ブテノイル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイル-CoAからブチリル-CoAへの変換を触媒するブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリル-CoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、または（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【００５１】
いくつかの態様において、組換え微生物は、リン酸ブチリルからブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【００５２】
一態様において、組換え微生物は、イソブタノールを生成する能力を有し、かつ
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【００５３】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【００５４】
なお別の局面において、本出願は、上記の通りの組換え微生物を使用した、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の一級アルケンを生成する方法を提供し、ここで、該方法は、組換え微生物を、炭素源を提供する供給原料を含有する培養培地中で、1種類または複数種類の一級アルケンが生成されるまで培養する工程を含む。一態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはプロペンであり、1種類または複数種類の飽和一級アルコールは1-プロパノールである。別の態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはプロペンであり、1種類または複数種類の飽和二級アルコールは2-プロパノールである。いくつかの態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはブテンであり、1種類または複数種類の飽和一級アルコールは1-ブタノールである。さらなる態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはブテンであり、1種類または複数種類の飽和二級アルコールは2-ブタノールである。
【００５５】
なお別の局面において、本出願は、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の一級アルケンを生成または蓄積する組換え微生物を作製する方法を提供する。一態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはプロペンであり、1種類または複数種類の飽和一級アルコールは1-プロパノールである。別の態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはプロペンであり、1種類または複数種類の飽和二級アルコールは2-プロパノールである。いくつかの態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはブテンであり、1種類または複数種類の飽和一級アルコールは、1-ブタノールである。さらなる態様において、1種類または複数種類の一級アルケンはブテンであり、1種類または複数種類の飽和二級アルコールは2-ブタノールである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
本開示の例示的態様を以下の図面で説明する。
【００５７】
【図１】リブロース-1-リン酸を介したMEGおよびイソプロパノール同時生成経路を説明する。
【図２】キシルロース-1-リン酸を介したMEGおよびイソプロパノール同時生成経路を説明する。
【図３】キシロン酸を介したMEGおよびイソプロパノール同時生成経路を説明する。
【図４】アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)およびリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ(linD)の活性を通じたアセト酢酸からプロペンへの変換を説明する。
【図５】S. セレビシエにおけるリブロース-1-リン酸を介したキシロースおよびグルコースからのMEGおよびイソプロパノール同時生成経路を説明する。
【図６】リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼを発現する大腸菌によって生成されたプロピレンと、マスフラグメンテーションのデータベースとの間での、プロピレンマスフラグメンテーションの比較を示す。
【図７】実施例1に記載の酵素アッセイおよび酵素フリーアッセイ(2-プロパノールを使用した全細胞アッセイ)について得られたGC-MSクロマトグラムを示す。
【図８】2-プロパノールを使用した全細胞酵素アッセイについてのリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼ(LinD)および対照(LinDインサートなしのpET-28および無細胞)からのプロピレン生成の比較を示す。
【図９】リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼを発現する大腸菌によって生成されたブチレンと、マスフラグメンテーションのデータベースとの間での、ブチレンマスフラグメンテーションの比較を示す。
【図１０】全細胞アッセイについての実施例3に記載の酵素アッセイおよび酵素フリーアッセイについて得られたGC-MSクロマトグラムを示す。
【図１１】実施例5に記載されるアッセイ（a）〜（e）の可溶性画分のSDS-PAGEを示している。矢印は、（b）、（c）、（d）および（e）におけるLinD発現を示している。
【図１２】アッセイ（d）および（e）がIPA + LinD候補においてプロピレンおよびイソプロパノールの生成を示したことを示している。アッセイ（a）は、pZs*13_IPAのイソプロパノール生成および少量のプロピレンを示した。アッセイ（b）および（c）は、それぞれ、炭素源としてグリセロールおよびグルコースを用いた、3.0 g/Lイソプロパノールを補充した培地中でのプロピレン生成を示した。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
詳細な説明
定義
以下の定義および略語が、本開示の解釈のために使用されるべきである。
【００５９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、そうでないことを前後関係が明白に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「3炭素化合物」への言及には、複数のそのような3炭素化合物が含まれ、「微生物」への言及には、1種類または複数種類の微生物への言及が含まれ、他も同様である。
【００６０】
本明細書において使用される、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有している（contains）」、「含有している（containing）」という用語、またはそれらの他の語尾変化は、非排他的な包含をカバーするものとする。要素のリストを含む組成物、混合物、過程、方法、物体、または装置は、必ずしも、それらの要素のみに限定されず、明示的にリストされていない、またはそのような組成物、混合物、過程、方法、物体、もしくは装置に固有でない他の要素を含んでいてもよい。さらに、反対のことが明示されない限り、「または」とは、包括的な「または」をさし、排他的な「または」をさすのではない。
【００６１】
数値を修飾するために本明細書において使用される、「約」および「およそ」という用語は、その明示的な値の周りの近い範囲を示す。「X」が値である場合、「約X」または「およそX」は、0.9X〜1.1Xの値、または、いくつかの態様において、0.95X〜1.05Xの値を示すであろう。「約X」または「およそX」への言及は、具体的には、値X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、および1.05Xを少なくとも示す。従って、「約X」および「およそX」とは、例えば、「0.98X」の、特許請求の範囲の限定のための記載サポートを教示し提供するものとする。
【００６２】
本明細書において使用される、「微生物の」、「微生物（microbial organism）」、および「微生物（microorganism）」という用語には、古細菌、細菌、または真核生物のドメインに含まれる微視的な細胞として存在する任意の生物が含まれ、後者には、酵母および糸状菌、原虫、藻類、または高等原生生物が含まれる。従って、その用語には、微視的なサイズを有する原核細胞もしくは真核細胞、または原核生物もしくは真核生物が包含されるものとし、全ての種の細菌、古細菌、および真正細菌が含まれ、酵母および真菌のような真核微生物も含まれる。化学物質の生成のために培養され得る任意の種の細胞培養物も含まれる。
【００６３】
本明細書中に記載されるように、いくつかの態様において、組換え微生物は、原核微生物である。いくつかの態様において、原核微生物は、細菌である。「細菌」または「真正細菌」とは、原核生物のドメインをさす。細菌には、以下のような少なくとも11の別個の群が含まれる：（１）次の2つの主要な亜群が存在するグラム陽性（グラム+）菌：(1)高G+C群（放線菌（Actinomycetes）、マイコバクテリア（Mycobacteria）、ミクロコッカス（Micrococcus）他）、(2)低G+C群（バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Streptococci）、マイコプラズマ（Mycoplasmas））；（２）プロテオバクテリア（Proteobacteria）、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（大部分の「一般的な」グラム陰性菌を含む）；（３）シアノバクテリア（Cyanobacteria）、例えば、酸素発生型光栄養生物；（４）スピロヘータ（Spirochetes）および近縁種；（５）プランクトマイセス（Planctomyces）；（６）バクテロイデス（Bacteroides）、フラボバクテリア（Flavobacteria）；（７）クラミジア（Chlamydia）；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光栄養生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび近縁種；（１１）サーモトガ（Thermotoga）およびサーモシホ・サーモフィレス（Thermosipho thermophiles）。
【００６４】
「グラム陰性菌」には、球菌、非腸内桿菌、および腸内桿菌が含まれる。グラム陰性菌の属には、例えば、ナイセリア（Neisseria）、スピリルム（Spirillum）、パスツレラ（Pasteurella）、ブルセラ（Brucella）、エルシニア（Yersinia）、フランシセラ（Francisella）、ヘモフィルス（Haemophilus）、ボルデテラ（Bordetella）、エシェリキア（Escherichia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クレブシエラ（Klebsiella）、プロテウス（Proteus）、ビブリオ（Vibrio）、シュードモナス（Pseudomonas）、バクテロイデス（Bacteroides）、アセトバクタ-（Acetobacter）、アエロバクター（Aerobacter）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アゾトバクター（Azotobacter）、スピリルム（Spirilla）、セラチア（Serratia）、ビブリオ（Vibrio）、リゾビウム（Rhizobium）、クラミジア（Chlamydia）、リケッチア（Rickettsia）、トレポネーマ（Treponema）、およびフソバクテリウム（Fusobacterium）が含まれる。
【００６５】
「グラム陽性菌」には、球菌、非胞子形成桿菌、および胞子形成桿菌が含まれる。グラム陽性菌の属には、例えば、アクチノマイセス（Actinomyces）、バチルス、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、エリシペロスリクス（Erysipelothrix）、ラクトバチルス、リステリア（Listeria）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ミキソコッカス（Myxococcus）、ノカルジア（Nocardia）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、およびストレプトマイセス（Streptomyces）が含まれる。
【００６６】
「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、内在性酵素を発現するかもしくは過剰発現するよう遺伝学的に改変された微生物、ベクターに含まれるもの、組み込み構築物に含まれるもののような異種酵素を発現するよう遺伝学的に改変された微生物、または内在性遺伝子の発現の変化を有する微生物をさす。「変化」とは、発現、レベル、または活性が、変化の非存在下で観察されるものより大きくまたは小さくなるよう、遺伝子の発現、または1種類もしくは複数種類のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットをコードするRNA分子もしくは等しいRNA分子のレベル、または1種類もしくは複数種類のポリペプチドもしくはポリペプチドサブユニットの活性が、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされることを意味する。例えば、「変化する」という用語は、「阻害する」を意味することができるが、「変化する」という単語の使用は、この定義に限定されない。「組換え微生物」および「組換え宿主細胞」という用語は、特定の組換え微生物のみならず、そのような微生物の子孫または可能性のある子孫もさすことが理解される。変異または環境的影響のいずれかによって、ある特定の改変が、後続世代において起こり得るため、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でない場合もあるが、それでも、本明細書において使用されるその用語の範囲内に含まれる。
【００６７】
遺伝子配列に関する「発現」という用語は、遺伝子の転写をさし、適宜、得られたmRNA転写物のタンパク質への翻訳もさす。従って、前後関係から明らかであるように、タンパク質の発現は、オープンリーディングフレーム配列の転写および翻訳に起因する。宿主細胞における所望の産物の発現のレベルは、細胞内に存在する対応するmRNAの量または選択された配列によってコードされた所望の産物の量のいずれかに基づき決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたmRNAは、qRT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化され得る（Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照すること）。選択された配列によってコードされたタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはタンパク質を認識しそれに結合する抗体を使用したウエスタンブロットもしくはラジオイムノアッセイのようなそのような活性に依存しないアッセイを利用することによって定量化され得る。Sambrook et al.,1989（前記）を参照すること。
【００６８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸」という用語と交換可能に本明細書において使用され、任意の長さの一本鎖または二本鎖のセンスまたはアンチセンスのデオキシリボ核酸（DNA）を含み、適宜、siRNAを含む任意の長さの一本鎖または二本鎖のセンスまたはアンチセンスのリボ核酸（RNA）も含むが、これらに限定されるわけではない、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはそれらの類似体を含む、2個以上の単量体から構成された有機ポリマーをさす。「ヌクレオチド」という用語は、プリン塩基またはピリミジン塩基およびリン酸基に接合されたリボース糖またはデオキシリボース糖からなり、核酸の基本的な構造単位である数個の化合物のうちのいずれかをさす。「ヌクレオシド」という用語は、デオキシリボースまたはリボースと化合したプリン塩基またはピリミジン塩基からなり、特に、核酸に見出される（グアノシンまたはアデノシンとしての）化合物をさす。「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオシド類似体」という用語は、それぞれ、1個または複数個の個々の原子が異なる原子または異なる官能基に交換されたヌクレオチドまたはヌクレオシドをさす。従って、ポリヌクレオチドという用語には、任意の長さの核酸、DNA、RNA、それらの類似体および断片が含まれる。3ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドは、ヌクレオチドオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【００６９】
本明細書中に記載されたポリヌクレオチドには、「遺伝子」が含まれ、本明細書中に記載された核酸分子には、「ベクター」または「プラスミド」が含まれることが理解される。従って、「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」という用語は、1種類または複数種類のタンパク質または酵素の全部または一部を含み、例えば、遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列のような制御性（非転写）DNA配列を含んでいてもよい、アミノ酸の特定の配列をコードするポリヌクレオチドをさす。遺伝子の転写される領域には、コード配列のみならず、イントロン、5'非翻訳領域（UTR）、および3'-UTRを含む非翻訳領域も含まれ得る。
【００７０】
本明細書において使用される、「酵素」という用語は、1種類または複数種類の化学的または生化学的な反応を触媒するかまたは促進する任意の物質をさし、一般的には、完全にまたは部分的にポリペプチドから構成された酵素を含むが、ポリヌクレオチドを含む異なる分子から構成された酵素も含み得る。
【００７１】
本明細書において使用される、「天然に存在しない」という用語は、本開示の微生物または酵素活性に関して使用される時、言及された種の野生型株を含む言及された種の天然に存在する株に通常見出されない少なくとも1つの遺伝的変化を、微生物または酵素が有することを意味するものとする。遺伝的変化には、例えば、代謝ポリペプチドをコードする発現可能核酸を導入する改変、その他の核酸付加、核酸欠失、および/または微生物の遺伝材料のその他の機能的破壊が含まれる。そのような改変には、例えば、言及された種についての、異種ポリペプチド、相同ポリペプチド、または異種ポリペプチドおよび相同ポリペプチドの両方についての、コード領域およびその機能性断片が含まれる。さらなる改変には、例えば、改変が遺伝子またはオペロンの発現を変化させる非コード制御領域が含まれる。例示的な天然に存在しない微生物または酵素活性には、前記のヒドロキシル化活性が含まれる。
【００７２】
様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関して本明細書において使用される、「外来性」という用語は、自然界の所定の酵母、細菌、生物、微生物、または細胞において、通常または天然には見出されずかつ/または生成されない分子をさす。
【００７３】
他方、様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等に関して本明細書において使用される、「内在性」または「ネイティブ」という用語は、自然界の所定の酵母、細菌、生物、微生物、または細胞において、通常または天然に見出されかつ/または生成される分子をさす。
【００７４】
改変された宿主細胞に関して本明細書において使用される、「異種」という用語は、以下の少なくとも一つに当てはまる様々な分子、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、酵素等をさす：（a）分子が、宿主細胞に対して外来（「外来性」）である（即ち、天然に見出されない）；（b）分子が、所定の宿主微生物もしくは宿主細胞において天然に見出される（例えば、「内在性」である）が、細胞内で非天然の位置においてもしくは非天然の量で生成される；および/または（c）分子が、内在性のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列と、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が異なっており、そのため、内在性に見出される内在性のヌクレオチドもしくはアミノ酸と、ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列が異なる分子が、細胞内で非天然の（例えば、天然に見出されるより大きい）量で産生される。
【００７５】
第1の科または種の最初の酵素または遺伝子に関して本明細書において使用される、「ホモログ」という用語は、機能的分析、構造的分析、またはゲノム分析によって、第1の科または種の最初の酵素または遺伝子に相当する第2の科または種の酵素または遺伝子であると決定された第2の科または種の別個の酵素または遺伝子をさす。ホモログは、最も多くの場合、機能、構造、またはゲノムの類似性を有する。酵素または遺伝子のホモログを、遺伝子プローブおよびPCRを使用して容易にクローニングすることができる技術が、公知である。クローニングされた配列のホモログとしての同一性は、機能的アッセイを使用して、かつ/または遺伝子のゲノムマッピングによって、確認され得る。
【００７６】
遺伝子によってコードされたアミノ酸配列が、第2の遺伝子のものと類似のアミノ酸配列を有する場合、そのタンパク質は、第2のタンパク質との「相同性」を有するかまたは第2のタンパク質と「相同」である。あるいは、2種類のタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合、そのタンパク質は、第2のタンパク質との相同性を有する。従って、「相同タンパク質」という用語は、2種類のタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味するものとする。ある特定の場合において、2種類のタンパク質の間の相同性は、進化によって関連しているその共通の祖先を示す。「相同配列」または「ホモログ」という用語は、機能的に関連していると考えられているか、信じられているか、または公知である。機能的関係は、（a）配列同一性の程度、および/または（b）同一もしくは類似の生物学的機能を含むが、これらに限定されるわけではない、多数の方式のうちのいずれかで示され得る。好ましくは、（a）および（b）の両方が示される。配列同一性の程度は、変動し得るが、一つの態様において、（当技術分野において公知の標準的な配列アライメントプログラムを使用した時）少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも98.5％、または少なくとも約99％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.8％、または少なくとも99.9％である。相同性は、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)Supplement 30,section 7.718,Table 7.71に記述されたもののような当技術分野において容易に入手可能なソフトウェアプログラムを使用して決定され得る。いくつかのアライメントプログラムは、MacVector（Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.）およびALIGN Plus（Scientific and Educational Software,Pennsylvania）である。他の非限定的なアライメントプログラムには、Sequencher（Gene Codes,Ann Arbor,Michigan）、AlignX、およびVector NTI（Invitrogen,Carlsbad,CA）が含まれる。
【００７７】
「バリアント」という用語は、本明細書中に記載された任意のポリペプチドまたは酵素をさす。バリアントには、多量体の1種類または複数種類の成分、個々の成分を含む多量体、複数の個々の成分を含む多量体（例えば、参照分子の多量体）、化学的分解生成物、および生物学的分解生成物も包含される。具体的な非限定的な態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素は、参照リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素をコードするポリペプチド配列の任意の部分における変化によって、参照リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素に対して「バリアント」であり得る。参照リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素のバリアントは、参照リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素の調製物の酵素活性を測定するために使用された標準的なアッセイにおいて、少なくとも10％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも105％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも130％、またはそれ以上の酵素活性を有していてよい。いくつかの態様において、バリアントとは、本開示の全長のまたはプロセシングを受けていないリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素との少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドもさすことができる。いくつかの態様において、バリアントとは、本開示の成熟型のまたはプロセシングを受けたリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ酵素との少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドもさすことができる。
【００７８】
本明細書において使用される、「シグナル配列」という用語は、細胞内の位置へ、または細胞外環境へ、ペプチドおよびポリペプチドをターゲティングするアミノ酸配列をさす。シグナル配列は、典型的には、ポリペプチドのN末端部分にあり、典型的には、酵素的に除去される。シグナル配列を有するポリペプチドは、全長でありかつ/またはプロセシングを受けていないと呼ばれる。シグナル配列が除去されたポリペプチドは、成熟型でありかつ/またはプロセシングを受けていると呼ばれる。
【００７９】
本明細書において使用される、「生産力」という用語は、生合成経路からの生成物の収率をさす。一つの態様において、生産力は、出発化合物の重量当たりの最終生成物の重量パーセントとして表され得る。
【００８０】
本明細書において使用される、「熱力学的最大収率」という用語は、原料と比較した生成物のエネルギー値に基づく、グルコースのような所定の原料の発酵から入手される生成物の最大収率をさす。例えば、光、水素ガスまたはメタンまたは電気のような付加的なエネルギー源を使用しない、通常の発酵において、生成物は、原料より多くのエネルギーを含有し得ない。熱力学的最大収率とは、原料からの全てのエネルギーおよび質量が生成物へ変換される生成物収率を意味する。この収率は、計算可能であり、具体的な経路に依存しない。生成物への特定の経路が、熱力学的最大収率より低い収率を有する場合、それは質量を失っており、生成物へのより効率的な経路によって改善され得るか、または該経路に置き換えられ得る可能性が最も高い。
【００８１】
「酸化還元バランスがとれている」という用語は、それらが消費するのと同量の酸化還元補助因子を全体として生成する1セットの反応をさす。酸化還元補助因子のバランスがとれているかまたはほぼとれているよう、代謝経路を設計し、生物を操作することによって、一般的には、所望の化合物のより効率的なより高い収率での生成がもたらされる。酸化還元反応は、一方が酸化反応であり、他方が還元反応である、同時に起こる2種類の半反応として常に共に起こる。酸化還元過程においては、還元体が酸化体に電子を移す。従って、反応中、還元体または還元剤は、電子を失い酸化され、酸化体または酸化剤は、電子を獲得し還元される。一つの態様において、酸化還元反応は、生物系において起こる。生物学的エネルギーは、酸化還元反応によって、保管され、放出される場合が多い。光合成は、二酸化炭素の糖への還元および水の分子状酸素への酸化を含む。逆反応である呼吸は、糖を酸化して二酸化炭素および水を生成する。中間段階として、還元された炭素化合物が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を還元するために使用され、次いで、それが、アデノシン三リン酸（ATP）の合成を駆動し、酸素の還元によって維持される、プロトン勾配の作出に寄与する。酸化還元状態という用語は、細胞または器官のような生物系におけるGSH/GSSG、NAD+/NADH、およびNADP+/NADPHのバランスを記載するためにしばしば使用される。酸化還元状態は、相互変換がこれらの比に依存する、代謝物のいくつかのセット（例えば、ラクテートおよびピルベート、βヒドロキシ酪酸およびアセト酢酸）のバランスに反映される。異常な酸化還元状態は、低酸素、ショック、および敗血症のような多様な有害な状況において発生し得る。
【００８２】
本明細書において使用される、「C2経路」、「C2分枝経路」、または「C2ストリーム」という用語は、MEGがグリコールアルデヒドを介して生成され得る生化学的経路をさす。
【００８３】
本明細書において使用される、「C3経路」、「C3分枝経路」、または「C3ストリーム」という用語は、MEGまたは1種類もしくは複数種類の3炭素化合物、例えばイソプロパノールが、ピルベートまたはジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）を介して生成され得る生化学的経路をさす。
【００８４】
本明細書において使用される、「オレフィン」という用語は、「アルケン」と交換可能であり、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含有する不飽和炭化水素を指す。
【００８５】
序論
本開示は、グルコースのような再生可能資源からのプロピレン(プロペン)またはブチレン(ブテン)の一段階直接発酵生成を可能にする、直鎖の一級または二級アルカノールの酵素的脱水を介した、プロピレン(プロペン)およびブチレン(ブテン)などの重要な一級アルケンのバルクケミカルの製造に関する。
【００８６】
本開示の発明者らは、1-プロパノール、2-プロパノール、および1-ブタノールなどの活性化されていない飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールをプロペンまたは1-ブテンなどの一級アルケンへと直接脱水できることを予想外にも見出した。
【００８７】
いくつかの態様において、各一級アルケンは、構造Bに示される構造を有し、かつ、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成され、各一級または二級アルコールは、構造Aに示される構造を有し、
2019520832.tif 000004
式中、R1=CnH2n+1(1≦n≦11)；R2=CmH2m+1(0≦m≦10およびn+m≦11)である。いくつかの態様において、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換は、1種類または複数種類の核酸分子がコードする1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼによって触媒される。
【００８８】
リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼを使用して対応するアルケン(CnH2n)へと変換することができる例示的なアルコール基質(CnH2n+2O)(3≦n≦12)を表1に列挙する。他の態様において、可能なアルコール基質は、さらに、表1に挙げた全てのアルコール基質の全ての可能な分岐鎖異性体である。ブタノールおよびペンタノールについての分岐鎖異性体ならびにそれらの適切なLinD脱水生成物を表1に挙げる。
【００８９】
（表１）LinD基質CnH2n+2O(3≦n≦12)および酵素的脱水後のそれらの適切な生成物CnH2nの例(異性体例は、斜体である)
2019520832.tif 000005
【００９０】
一級アルケンの生成のための化学合成および/または生合成経路に関する先の研究では、以下にまとめる課題および欠点が生じる。
【００９１】
WO2008067627A2は、リグノセルロース材料または他の有機物質のガス化と、それに続く、メタノールの形成およびその後の直接的な、または中間体ジメチルエーテルからの間接的な、プロピレンへのその転換のいずれかから、オレフィンを得ることができることを記載している。この反応段階は、同時生成物としてエチレンおよび/またはブチレンをさらに生成し得る。
【００９２】
WO2010099201A10100は、ナフサおよびガス油留分の水蒸気分解、または、n-ブタンもしくはn-ブテン(それら自体は水蒸気分解によって得られる)の触媒的脱水素化による生成の際に、ブタジエンを調製するための慣用の石油化学プロセスを記載している。粗1,3-ブタジエン含有留分は、プロセスおよび条件の詳細に応じて、プロピレン、プロパン、イソブチレン、1-ブテン、n-ブタン、trans-2-ブテン、cis-2-ブテン、C4アセチレン、1,2-ブタジエン、種々のC5炭化水素などをはじめとする種々のC3〜C5炭化水素を含む。
【００９３】
他の慣用のアルケン生成プロセスでは、アルコールの脱水は、気相および液相の両方で、不均一触媒系および均一触媒系の両方を用いて、多くの異なる反応器構成で行われる。典型的には、使用される触媒は、反応の生成物である水に対して安定である。得られたアルケンは、条件に応じて気相または液相のいずれかで反応器から流出し、下流の精製プロセスによって捕捉されるかまたは反応器内で他の化合物へとさらに変換される。典型的な脱水触媒は、リン酸、硫酸または中性アルミナおよびゼオライトを使用した酸処理を必要とし、一般に、これらの触媒の酸性型よりも高い温度および圧力で働く。脱水素化触媒は、有機分子中の飽和炭素-炭素結合を不飽和二重結合へと変換する。典型的な脱水素化触媒は、特定のオレフィンに対して種々の程度の選択性を有する金属酸化物の混合物である(例えば、Jung JC, et al, Catalysis Letters 2008, 123, p. 239)。
【００９４】
例えば、1-ブタノール、2-ブタノール、またはイソブタノールが脱水される時、4つのC4オレフィン(1-ブテン、cis-2-ブテン、trans-2-ブテン、およびイソブテン)の混合物が形成される。出発材料が、熱力学によってならびに使用される反応条件および触媒によって各オレフィンの正確な濃度を決める。これらの因子が最終生成物中のオレフィンの分布にどのように影響するかを理解し、この知識を使用して特定のオレフィンが富化された混合物を得ることが可能である。しかしながら、これらのアルコールの1つの脱水による単一オレフィンの生成は、一般に困難である。
【００９５】
プロピレンは主に、石油の接触分解もしくは熱分解の副生成物として、または天然ガスからのエチレン生成の同時生成物として得られる(Propylene, Jamie G. Lacson, CEH Marketing Research Report-2004, Chemical Economics Handbook-SRI International)。また、エチレンの二量体化によるブチレンの生成とそれに続く追加のエチレンとのメタセシスによるプロピレンの生成によっても、プロピレンを生成することができる。別の経路は、糖発酵とそれに続く脱水およびエチレンとのメタセシスによる、バイオブタノール生成である。また、バイオマスのガス化による合成ガスの生成とそれに続くメタノールの合成、次いで、メタノールからオレフィンへの転換(methanol-to-olefin)技術を介してグリーンプロピレンを生成するなどのいくつかの熱による経路も評価されている。
【００９６】
プロピレン、ブチレンおよび他のジエンの生成のための代替経路の使用が多種多様な再生可能原材料を使用して調査されている。いくつかの刊行物は、(デ)ヒドラターゼの使用によってアルコールをアルケンへと酵素的に変換する可能性について言及している。オレイン酸ヒドラターゼ(EC 4.2.1.53)は、その天然基質である10-ヒドロキシ-ステアリン酸を脱水すると記載されている。しかしながら、そのヒドロキシル基は、分子の中央にあり、よって、脱水に必要な活性化エネルギーは末端基またはα-もしくはβ-サブ末端基よりもはるかに低い。EP2336341A1は、プロパノール(1-または2-プロパノール)またはブタノールの脱水にオレイン酸ヒドラターゼを使用して、それぞれプロペンおよびブタンを生成することを記載している。
【００９７】
US20110165644A1、WO2014064198A1およびWO2015082447A1は、メバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼ(MDD)(EC 4.1.1.33)の系統学的スーパーファミリーのメンバーを使用した、3-ヒドロキシアルカノアート類のそれぞれの末端アルケンへの脱炭酸に基づいた末端アルケン生成のための有望な生合成経路を記載している。
【００９８】
デヒドラターゼによって利用される別の一般的な活性化基質のタイプは、CoA活性化α-またはβ-ヒドロキシアルカノアートである。例えば、3-ヒドロキシブチリル-CoAは、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼによってクロトニル-CoAへと脱水される(n-ブタノールの生成の中間段階)。
【００９９】
エン酸(アルケノアート)デカルボキシラーゼ酵素は、エン酸のアルケンへの脱炭酸反応を触媒することができる。ソルビン酸デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ、4-オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼおよびケイ皮酸デカルボキシラーゼなどの異なるクラスのエン酸デカルボキシラーゼが記載されている。US2013010906A1は、クロトン酸からプロピレンへ変換するためのそのようなエン酸デカルボキシラーゼの先見的使用を記載している。WO2013090915A1は、リナロールデヒドラターゼによるクロチル-OHからブタジエンへの変換を記載しており、そして、WO2014184345A1は、クロチル-OHからブタジエンへの変換を触媒するだけでなく、3-メチルブタ-2-エン1-オールからイソプレンへの変換も触媒する点で改善された活性を有する、リナロールデヒドラターゼイソメラーゼのバリアントを記載しており、このことは、該酵素が小さな基質を許容できることを示唆している。Brodkorb等(2010)(Brodkorb D et al. (2010) Linalool Dehydratase-Isomerase, a Bifunctional Enzyme in the Anaerobic Degradation of Monoterpenes. The Journal of Biological Chemistry 285(40): 30436-30442)に記載されている通り、リナロールデヒドラターゼイソメラーゼは、一級アリル-アルコールのゲラニオールからその立体異性体リナロールへの異性化およびその後の、この第三級アルコールから対応する非環式モノテルペンのミルセンへの脱水をインビトロで触媒する酵素である。
【０１００】
ソルビン酸デカルボキシラーゼは、ソルビン酸を1,3-ペンタジエンへと変換する。脱炭酸には3つの遺伝子:padAl、ohbAl、およびsdrAが必要である(Plumridge et al. (2010) Fung. Genet. Bio, 47:683-692)。
【０１０１】
本開示は、酵素的脱水を使用した飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからそれぞれの一級アルケンへの脱水に基づいている。この方法によるオレフィンの生成は、既存の化学経路または記載の生物工学経路のいくつかの欠点を回避する:
生物変換によって、化学触媒作用が必要であることはない。厳しい条件、酸添加、高い温度または圧力が必要とされることもない。
【０１０２】
本開示は、一段階発酵生成を記載する。これは、複数の精製および別々の反応設備を必要とする、複雑な多段階合成または発酵と化学誘導体化(すなわち、脱水)との組み合わせとは対照的である。
【０１０３】
本開示の発酵プロセスは、再生可能でない化石原料を必要とすることが多い多くの化学合成法とは対照的に、再生可能資源の使用を可能にする。
【０１０４】
ガス状生成物プロペンの場合、これは液相中の基質(すなわち、グルコースまたは2-プロパノール)および生物触媒(すなわち、細胞または酵素)から容易に分離し；このことは、困難な分離を必要とすることが多い、ガス状基質を使用してガス状生成物を生成する化学プロセスや、最終変換(プロペンへの脱水)が可能となる前に、同様に可溶化基質からの精製を必要とする、液体中間体(プロパノール)を用いたプロセスとは対照的である。
【０１０５】
エン酸デカルボキシラーゼを使用した生物工学経路とは対照的に、炭素(CO2)が反応で喪失されることはない；炭素の喪失は、前駆体/基質当たりの生成物の収量の低下を意味する。
【０１０６】
3-ヒドロキシアルカノアート類に対してメバロン酸二リン酸デカルボキシラーゼを使用した生物工学経路(すなわち、3-ヒドロキシ酪酸+ATP→プロペン+CO2+ADP+Pi)とは対照的に、活性化エネルギー(ATP)は必要なく、そして、炭素(CO2)が反応で喪失されることはない。
【０１０７】
例えば、前駆体生成のための高性能経路が最初に開発されなければならないエン酸に基づくアルケン生合成とは対照的に、n-ブタノール、1-または2-プロパノールなどの前駆体の生成のための公知の十分に開発された高収量経路が存在しており、これを利用することができる。
【０１０８】
驚くべきことに、ATP、NAD(P)Hまたは基質のCoA活性化を必要とする他のデヒドラターゼとは対照的に、脱水にアルコール基質の活性化もエネルギー補因子の使用も必要ない。
【０１０９】
驚くべきことに、今までに記載された天然の10炭素長鎖基質または中鎖長の4炭素非天然基質(クロチルアルコール)とは対照的に、短鎖の三炭素分子がリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ(LinD)によって基質として許容される。
【０１１０】
驚くべきことに、一級または二級アルカノールがLinDによって基質として許容された；これは、今までに記載されたLinDの全ての天然または非天然基質と比較して、明らかに異なるクラスの化合物(エノールである)である。これらのエノールは、活性機序に電子供与体として関与すると推測される、標的アルコール基に隣接する不飽和の炭素-炭素二重結合を有する。Brodkorb等(2010)に記載されている通り、C2-炭素原子における二重結合の存在は、基質に対する高度に特異的な結合部位を示唆する。ゲラニオールと比較してシトロネロールは、その二重結合を欠いており、異性化できない。
【０１１１】
いくつかの態様において、一段階発酵で糖から直接アルケンを生成することができる。ある特定の態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼファミリーの酵素によって媒介されるアルコールからそれぞれのアルケンへの直接変換(脱水)を、再生可能資源からアルコール基質を生成する経路と併せて行うことができる。糖から1-もしくは2-プロパノールまたは1-ブタノールの生成のための高収量経路および適切な生産株が開発されており、かつ/または文献に記載されている。
【０１１２】
アルコールを生成する例示的な経路
1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現する微生物における、再生可能原料からのアルコールの生成のための経路が公知である。例示的な経路を表2に列挙し、以下に記載する。記載のアルコール経路は、例示であり、本開示のためのアルコール基質を生成するために使用できるアルコール経路を限定することを意図するものではない。表1および本開示に記載の、アルコールを生成する任意の経路が、1種類または複数種類の一級アルケンへのデヒドラターゼ/イソメラーゼを用いた脱水のための1種類または複数種類のアルコール基質を得るために使用され得る。
【０１１３】
（表２）1種類または複数種類の再生可能原料から1種類または複数種類のアルコールを生成する経路
2019520832.tif 000006
2019520832.tif 000007
aこの表の参考文献の各々の内容は、参照によってそれらの全体が全ての目的のために本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
モノエチレングリコール(MEG)およびイソプロパノール(IPA)の同時生成のための経路
いくつかの態様において、イソプロパノール（IPA）基質を生成するための経路は、キシロースからのモノエチレングリコール（MEG）生成のための実行が容易な3種類の高収率C2ストリームのうちの1種類を、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）経路を介した実行が容易なIPA生成ストリームと組み合わせる。IPA経路の問題である過剰のNADHの生成は、NADHを必要とするMEG生成のC2部分を補完する。これらの経路の組み合わせは、61wt％という高い総生産力をもたらし、それは、これらの生成物が2:1比で生成されると仮定した場合のキシロースのMEGおよびIPAへの分解についての65wt％という最大エネルギー収率に近い。この高い生産力は、キシロースからのMEG生成のC2ブランチとのIPA経路のカップリングの相乗作用に起因する。
【０１１５】
提唱された経路は、その基本的な形態においては、酸化還元中性でないが、消費されるキシロース1mol当たり0.5molという小過剰のNADHを有する。好気的発酵において、NADHの酸化は、生成物形成に有意に負の影響を及ぼすことなく、生成期の間の増殖および維持のために必要とされる、十分であるが過剰でないATPを入手するため、ちょうど十分なATPを送達することができる。
【０１１６】
キシロースからのMEGおよびIPAの同時生成のための経路は、MEGおよび/またはIPAの生成に関連した多数の問題を解決する。一つの態様において、キシロースからのMEGの生成におけるC3経路の実行が困難であるという問題が、解決される。もう一つの態様において、キシロースからのMEGの生成におけるATP不足の問題が、解決される。もう一つの態様において、グルコースからのMEGの生成における生産力の損失の問題が、解決される。もう一つの態様において、グルコースからのMEGの生成におけるATP不足の問題が、解決される。もう一つの態様において、グルコースからのMEGの生成における過剰のNADHの生成の問題が、解決される。もう一つの態様において、グルコースからのIPAの生成における生産力の損失の問題が、解決される。もう一つの態様において、グルコースからのIPAの生成における過剰のNADHの生成の問題が、解決される。
【０１１７】
いくつかの態様において、キシロースからのMEGおよびIPAの同時生成は、リブロース-1-リン酸を介して進行する。一つの態様において、大腸菌におけるMEG+IPA同時生成のための経路は、IPA生成のための以下の酵素を含む：チオラーゼ、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ。リブロース-1-リン酸を介したMEG経路は、以下の酵素を含む：D-タガトース3-エピメラーゼ、D-リブロキナーゼ、D-リブロースリン酸アルドラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼ。所望の経路への炭素フラックスを増加させるため、炭素フラックスを転向させることができる3種類の特定の遺伝子を同定し欠失させた：キシルロキナーゼ（この酵素は炭素フラックスをペントースリン酸経路へ転向させることができる）をコードするxylB遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼA（グリコールアルデヒドからの炭素フラックスをMEGの代わりにグリコレートへ転向させることができる）をコードするaldA遺伝子、および乳酸デヒドロゲナーゼ（この酵素はピルベートからの炭素フラックスをアセチルCoAの代わりにラクテートへ転向させることができる）をコードするldhA遺伝子。
【０１１８】
経路（図1）の第1段階は、D-キシロースのD-キシルロースへの自然変換である。D-キシルロースは、通常、エネルギーおよびバイオマスの生成のためにペントースリン酸経路に入るが、それは、xylB遺伝子の欠失によって阻害される。操作された経路においては、全ての炭素が、D-タガトース3-エピメラーゼ酵素によって、D-リブロースへ向け直されるであろう。次いで、D-リブロースは、ネイティブの大腸菌酵素D-リブロキナーゼによってD-リブロース-1-リン酸へ変換される。D-リブロース-1-リン酸は、D-リブロースリン酸アルドラーゼによってグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）に切断される。DHAPのさらなる分解は、C3ブランチと呼ばれ、IPA生成をもたらす。C2ブランチと呼ばれるグリコールアルデヒドの分解は、エチレングリコールまたはグリコレートの形成をもたらし得る。グリコレートは、aldA遺伝子産物によって生成され得る望まれない副生成物である。エチレングリコールは、酵素グリコールアルデヒドレダクターゼを使用して、グリコールアルデヒドから生成され得る。（グリセルアルデヒド-3Pおよびピルベートを通した）DHAPのアセチルCoAへの変換は、天然の大腸菌代謝の一部である。1個のアセチルCoA分子が、酵素チオラーゼによって、もう1個のアセチルCoA分子と縮合し、アセトアセチルCoAが生成される。アセトアセチルCoA由来のCoAは、アセチルCoAおよびアセト酢酸を生成する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼによって、酢酸分子に再利用される。アセト酢酸は、アセト酢酸デカルボキシラーゼによってアセトンへ脱カルボキシルされ、それが、二級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によってIPAへさらに還元される。IPAは、本開示のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼによってさらにプロペンへ変換され得る（図4）。
【０１１９】
いくつかの態様において、キシロースからのMEGおよびIPAの同時生成は、D-キシルロース-1-リン酸を介して進行する。いくつかの態様において、大腸菌におけるMEG+IPA同時生成のための経路は、IPA生成のための以下の酵素を含む：チオラーゼ、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ。D-キシルロース-1-リン酸を介したMEG経路は、以下の酵素を含む：D-キシルロース1-キナーゼ、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼ。所望の経路への炭素フラックスを増加させるため、炭素フラックスを転向させることができる3種類の特定の遺伝子を同定し欠失させた：キシルロキナーゼ（この酵素は炭素フラックスをペントースリン酸経路へ転向させることができる）をコードするxylB遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼA（グリコールアルデヒドからの炭素フラックスをMEGの代わりにグリコレートへ転向させることができる）をコードするaldA遺伝子、および乳酸デヒドロゲナーゼ（この酵素はピルベートからの炭素フラックスをアセチルCoAの代わりにラクテートへ転向させることができる）をコードするldhA遺伝子。
【０１２０】
経路（図2）の第1段階は、D-キシロースのD-キシルロースへの自然変換である。D-キシルロースは、通常、エネルギーおよびバイオマスの生成のためにペントースリン酸経路に入るが、それはxylB遺伝子の欠失によって阻害される。操作された経路においては、全ての炭素が、D-キシルロース1-キナーゼ酵素によってD-キシルロース-1-リン酸に向け直されるであろう。次いで、D-キシルロース-1-リン酸は、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼによってグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）へ切断される。グリコールアルデヒドからのMEGの生成、ならびにDHAPからの3炭素化合物（例えば、アセトン、IPA、および/またはプロペン）の生成は、図1について記載されたように進行する。
【０１２１】
いくつかの態様において、キシロースからのMEGおよびIPAの同時生成は、D-キシロネートを介して進行する。いくつかの態様において、大腸菌におけるMEG+IPA同時生成のための経路は、IPA生成のための以下の酵素を含む：チオラーゼ、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ。D-キシロネートを介したMEG経路は、以下の酵素を含む：キシロースデヒドロゲナーゼ、任意で、キシロノラクトナーゼ、キシロン酸デヒドラターゼ、2-ケト-3-デオキシ-D-キシロン酸アルドラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼ。所望の経路への炭素フラックスを増加させるため、炭素フラックスを転向させることができる3種類の特定の遺伝子を同定し欠失させた：D-キシロースイソメラーゼ（この酵素はD-キシロースからの炭素フラックスをD-キシロネートまたはD-キシロノラクトンの代わりにD-キシルロースへ転向させることができる）をコードするxylA遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼA（グリコールアルデヒドからの炭素フラックスをMEGの代わりにグリコレートへ転向させることができる）をコードするaldA遺伝子、および乳酸デヒドロゲナーゼ（この酵素はピルベートからの炭素フラックスをアセチルCoAの代わりにラクテートへ転向させることができる）をコードするldhA遺伝子。
【０１２２】
経路（図3）の第1段階は、D-キシロースをD-キシロノラクトンへ変換するためにキシロースデヒドロゲナーゼを使用し、続いて、D-キシロノラクトンをキシロノラクトナーゼ酵素によってD-キシロネートへ変換する2段階過程、またはD-キシロースを直接D-キシロネートへ変換するためにキシロースデヒドロゲナーゼを使用する1段階過程のいずれかによる、D-キシロースのD-キシロネートへの変換である。D-キシロースのD-キシルロースへの変換は、xylA遺伝子の欠失によって阻害される。次いで、D-キシロネートは、キシロン酸デヒドラターゼによって2-ケト-3-デオキシキシロネートへ変換される。次いで、2-ケト-3-デオキシキシロネートは、2-ケト-3-デオキシ-D-キシロン酸アルドラーゼによってグリコールアルデヒドおよびピルベートへ切断される。グリコールアルデヒドからのMEGの生成、ならびにピルベートからの3炭素化合物（例えば、アセトン、IPA、および/またはプロペン）の生成は、図1について記載されたように進行する。
【０１２３】
S. セレビシエにおけるMEG+IPA同時生成のための経路（図5）は、IPA生成のための以下の酵素を含む：チオラーゼ、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、および二級アルコールデヒドロゲナーゼ。D-リブロース-1-リン酸を介したMEG経路は、以下の酵素を含む：D-タガトース3-エピメラーゼ、D-リブロキナーゼ、D-リブロースリン酸アルドラーゼ、およびグリコールアルデヒドレダクターゼ。2種類の主要な経路の他に、S. セレビシエはキシロースを消費することができない。従って、2種類の異なる経路を、キシロース消費について試験した。経路1は、2種類の遺伝子を含み：Xyl1は、D-キシロースをキシリトールへ変換し、Xyl2は、キシリトールをD-キシルロースへ変換する。経路2は、1種類の遺伝子：D-キシロースを直接D-キシルロースへ変換するXylAのみを含む。所望の経路への炭素フラックスを増加させるため、炭素フラックスを転向させることができる2種類の特定の遺伝子を同定し欠失させた：キシルロキナーゼ（この酵素は炭素フラックスをペントースリン酸経路に転向させることができる）をコードするXKS1遺伝子およびアルカリホスファターゼ（ペントースリン酸経路からの炭素を転向させることができる）をコードするPHO13遺伝子。
【０１２４】
経路の第1段階は、直接の、または中間体キシリトールを介した、D-キシロースのD-キシルロースへの変換である。D-キシルロースは、D-タガトース3-エピメラーゼ酵素によってD-リブロースへ変換される。次いで、D-リブロースは、D-リブロキナーゼによってD-リブロース-1-リン酸へ変換される。D-リブロース-1-リン酸は、D-リブロースリン酸アルドラーゼによってグリコールアルデヒドおよびDHAPへ切断される。DHAPは、IPA生成のためのC3ブランチに入り、グリコールアルデヒドは、グリコールアルデヒドレダクターゼを使用して、エチレングリコールへ変換され得る。（グリセルアルデヒド-3Pおよびピルベートを通した）DHAPのアセチルCoAへの変換は、天然S. セレビシエ代謝の一部である。1個のアセチルCoA分子が、チオラーゼによって、別のアセチルCoA分子と縮合し、アセトアセチルCoAが生成される。アセトアセチルCoA由来のCoAは、1個のアセチルCoA分子および1個のアセト酢酸分子を生成する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼによって、酢酸の分子に再利用される。アセト酢酸は、アセト酢酸デカルボキシラーゼによってさらにアセトンへ脱カルボキシルされ、それが、二級アルコールデヒドロゲナーゼ酵素によってさらにIPAへ変換される。IPAは、本開示のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼによってさらにプロペンへ変換され得る（図4）。
【０１２５】
IPA経路の主要な問題である過剰のNADHの生成は、過剰のATPを生成することなく、好気過程において必要されるATPを作成するためにちょうど十分なNADHを残しながら、C2ブランチのNADHの必要性を補完するため、MEG生成のためのC2ストリームと高度に相乗的である。
【０１２６】
IPA生成のMEG生成とのカップリングの相乗作用は、CO2固定の必要なしに、組み合わせられた生成物の61wt％という生産力が、65wt％というエネルギー的（＝理論上の、経路に依存しない）最大生産力に極めて近くなる（94％）ようなものである。
【０１２７】
MEGおよびIPA同時生成経路はまた、MEGおよびIPAの両発酵プロセスの最大の代謝工学的課題および技術的課題であるC3-流MEG発酵およびIPAプロセスのための炭素固定を回避する。
【０１２８】
一態様において、MEGは、C2分岐経路におけるグリコールアルデヒドの変換を通じて生成され、そして、IPAは、C3分岐経路におけるDHAPまたはピルベートの変換を通じて生成される。さらなる態様において、IPAは、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼによってプロペンへと変換される。
【０１２９】
一態様において、C3分岐において生成された過剰なNADHの少なくとも一部が、C2分岐において還元等価体の供給源として使用される。別の態様において、C3分岐において生成された過剰なNADHの少なくとも一部が、ATPを生成するために使用される。
【０１３０】
一態様において、同時生成されたMEGおよびIPAは、炭素固定なしで理論上の最大生産力の90%を超える生産力を含む。別の態様において、過剰なバイオマス形成が最小限に抑えられ、そして、MEGおよびIPAの生成が最大化される。
【０１３１】
再生可能原料からのイソプロパノール
一態様において、イソプロパノール基質を、Mitsui等(WO 2009/008377)の開示に従って微生物において生成することができる。いくつかの態様において、イソプロパノール基質を、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性およびチオラーゼ活性が付与された微生物において生成することができる。いくつかの態様において、再生可能原料からイソプロパノールを生成することができる組換え微生物は、
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【０１３２】
さらなる態様において、組換え微生物は、ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０１３３】
いくつかの態様において、再生可能原料は、グルコースである。
【０１３４】
4種類のイソプロパノール生成酵素、すなわち、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼおよびチオラーゼの全てがイソプロパノール生成微生物に付与されている。このイソプロパノール生成微生物を使用したイソプロパノールの生成は、ブタノールおよびエタノールなどのアルコールを副生成物として生成しない。それによって、イソプロパノールの収集を、慣用のイソプロパノール生成微生物の使用と比較して極めて簡単に行うことができる。
【０１３５】
いくつかの態様において、イソプロパノールの生成のための出発材料は、1種類または複数種類の再生可能原料由来であってよい。いくつかの態様において、イソプロパノールの生成のための出発材料は、根、茎、幹、枝、葉、花もしくは種子などの植物器官、これらを含有する植物体、またはこれらの植物器官の各々の分解産物であってよく、そして、加えて、植物体または植物器官またはその分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として使用できるものも材料に含まれる。
【０１３６】
イソプロパノールの生成のための出発材料として使用され得る炭素源の例は、一般に、デンプン、グルコース、フルクトース、スクロース、キシロースおよびアラビノースなどの糖類；大量のこれらの成分を含有する植物分解産物；ならびにセルロースの加水分解物を含む。他の態様において、グリセリンおよび脂肪酸もまた炭素源であることができる。
【０１３７】
イソプロパノールの生成に使用される出発材料の好ましい態様は、穀類、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、テンサイおよび綿花などの作物を含む。原材料としてのそれらの使用形態の例は、限定されないが、粗生成物、汁および粉砕物を含む。
【０１３８】
イソプロパノール生成微生物は、1種類または複数種類の再生可能原料からイソプロパノールを生成する能力を有する限りどんなものでもよく、そして、その例は、培養された時に植物由来材料を利用してある特定の期間の後に培養培地にイソプロパノールを分泌する細菌を含む。
【０１３９】
4種類のイソプロパノール生成活性、すなわち、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性およびチオラーゼ活性がイソプロパノール生成微生物に付与される。
【０１４０】
本開示において、活性を「付与する(こと)」は、ある酵素をコードするある遺伝子を宿主微生物の外部からその内部へ導入すること(ある酵素をコードする外来性核酸配列を導入すること)に加えて、宿主微生物のゲノムにおいてある酵素をコードする内在性遺伝子のプロモーターの活性を増強すること、プロモーターを別のプロモーターと交換してある酵素をコードする内在性遺伝子の過剰発現を引き起こすことも含む。
【０１４１】
本開示において言及されるアセト酢酸デカルボキシラーゼは、International Union of Biochemistry (I.U.B.) Enzyme Commissionによる報告に従って酵素コード4.1.1.4で分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称である。
【０１４２】
そのような酵素の例は、クロストリジウム・アセトブチリカムおよびクロストリジウム・ベエイジェリンキィなどのクロストリジウム属の細菌に由来するもの；ならびにバチルス・ポリミキサなどのバチルス属の細菌に由来するものを含む。
【０１４３】
いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、微生物にとって外来性である。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする核酸配列を上に挙げた生物の各々から得ることもできるし、アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の公知の核酸配列に基づいて合成核酸配列を合成することもできる。該遺伝子の好ましい例は、クロストリジウム属の細菌またはバチルス属の細菌に由来するものを含み、そして、その例は、クロストリジウム・アセトブチリカムまたはバチルス・ポリミキサに由来する遺伝子の核酸配列を含む。クロストリジウム・アセトブチリカムに由来する遺伝子の核酸配列がとりわけ好ましい。
【０１４４】
本開示において言及されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼは、International Union of Biochemistry (I.U.B.) Enzyme Commissionによる報告に従って酵素コード1.1.1.80で分類され、アセトンからイソプロパノールを生成する反応を触媒する酵素の総称である。
【０１４５】
そのような酵素の例は、クロストリジウム・ベエイジェリンキィなどのクロストリジウム属の細菌に由来するものを含む。
【０１４６】
いくつかの態様において、イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、微生物にとって外来性である。いくつかの態様において、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を上に挙げた生物の各々から得ることもできるし、イソプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の公知の核酸配列に基づいて合成核酸配列を合成することもできる。該遺伝子の好ましい例は、クロストリジウム属の細菌に由来するものを含み、そして、その例は、クロストリジウム・ベエイジェリンキィに由来する遺伝子の核酸配列を含む。
【０１４７】
本開示において言及されるCoAトランスフェラーゼは、International Union of Biochemistry (I.U.B.) Enzyme Commissionによる報告に従って酵素コード2.8.3.8で分類され、アセトアセチルCoAからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称である。
【０１４８】
そのような酵素の例は、クロストリジウム・アセトブチリカムおよびクロストリジウム・ベエイジェリンキィなどのクロストリジウム属の細菌、ロゼブリア・インテスチナリス(Roseburia intestinalis)などのロゼブリア属の細菌、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ(Faecalibacterium prausnitzii)などのフィーカリバクテリウム属の細菌、コプロコッカス属の細菌、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)などのトリパノソーマおよび大腸菌などのエシェリキア属の細菌に由来するものを含む。
【０１４９】
いくつかの態様において、CoAトランスフェラーゼは、微生物にとって外来性である。いくつかの態様において、CoAトランスフェラーゼをコードする核酸配列を上に挙げた生物の各々から得ることもできるし、CoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子の公知の核酸配列に基づいて合成核酸配列を合成することもできる。該遺伝子の好ましい例は、クロストリジウム・アセトブチリカムなどのクロストリジウム属の細菌、ロゼブリア・インテスチナリスなどのロゼブリア属の細菌、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィなどのフィーカリバクテリウム属の細菌、コプロコッカス属の細菌、トリパノソーマ・ブルセイなどのトリパノソーマおよび大腸菌などのエシェリキア属の細菌に由来する遺伝子の核酸配列を含む。そのより好ましい例は、クロストリジウム属の細菌およびエシェリキア属の細菌に由来するものを含む。クロストリジウム・アセトブチリカムまたは大腸菌に由来する遺伝子の核酸配列がとりわけ好ましい。
【０１５０】
いくつかの態様において、本開示において言及されるチオラーゼは、International Union of Biochemistry (I.U.B.) Enzyme Commissionによる報告に従って酵素コード2.3.1.9で分類され、アセチルCoAからアセトアセチルCoAを生成する反応を触媒する酵素の総称である。
【０１５１】
チオラーゼの例は、クロストリジウム・アセトブチリカムおよびクロストリジウム・ベエイジェリンキィなどのクロストリジウム属の細菌、大腸菌などのエシェリキア属の細菌、ハロバクテリウム属の種(Halobacterium sp.)の細菌、ズーグレア・ラミゲラ(Zoogloea ramigera)などのズーグレア属の細菌、リゾビウム属の種(Rhizobium sp.)の細菌、ブラジリゾビウム・ジャポニカム(Bradyrhizobium japonicum)などのブラジリゾビウム属の細菌、カウロバクター・クレセンタスなどのカウロバクター属の細菌、ストレプトマイセス・コリナス(Streptomyces collinus)などのストレプトマイセス属の細菌、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)などのエンテロコッカス属の細菌、カンジダ・トロピカリスなどのカンジダ属の酵母、ヘリアンサス・アナス(Helianthus annuus)などのヒマワリ属(キク科)、ガラス・ガラス(Gallus gallus)などのヤケイ属(キジ科)、ラタス・ノルベギカス(Rattus norvegicus)などのクマネズミ属(ネズミ科)、サス・スクローファ(Sus scrofa)などのイノシシ属(イノシシ科)ならびにボス・タウラス(Bos taurus)などのウシ属(ウシ科)に由来するものを含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、チオラーゼは、微生物にとって外来性である。いくつかの態様において、チオラーゼをコードする核酸配列を上に挙げた生物の各々から得ることもできるし、チオラーゼをコードする遺伝子の公知の核酸配列に基づいて合成核酸配列を合成することもできる。該遺伝子の好ましい例は、クロストリジウム・アセトブチリカムおよびクロストリジウム・ベエイジェリンキィなどのクロストリジウム属の細菌、大腸菌などのエシェリキア属の細菌、ハロバクテリウム属の種の細菌、ズーグレア・ラミゲラなどのズーグレア属の細菌、リゾビウム属の種の細菌、ブラジリゾビウム・ジャポニカムなどのブラジリゾビウム属の細菌、カウロバクター・クレセンタスなどのカウロバクター属の細菌、ストレプトマイセス・コリナスなどのストレプトマイセス属の細菌、エンテロコッカス・フェカリスなどのエンテロコッカス属の細菌、カンジダ・トロピカリスなどのカンジダ属の酵母、ヘリアンサス・アナスなどのヒマワリ属(キク科)、ガラス・ガラスなどのヤケイ属(キジ科)、ラタス・ノルベギカスなどのクマネズミ属(ネズミ科)、サス・スクローファなどのイノシシ属(イノシシ科)ならびにボス・タウラスなどのウシ属(ウシ科)に由来する遺伝子の核酸配列を含む。そのより好ましい例は、クロストリジウム属の細菌およびエシェリキア属の細菌に由来するものを含み;そして、クロストリジウム・アセトブチリカムまたは大腸菌に由来する遺伝子の核酸配列がとりわけ好ましい。
【０１５３】
上の4種類の酵素の各々は、好ましくは、酵素活性の観点からクロストリジウム属の細菌、バチルス属の細菌およびエシェリキア属の細菌からなる群より選択される少なくとも1つの種に由来し、そして、特に、より好ましいのは、アセト酢酸デカルボキシラーゼおよびイソプロパノールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属の細菌に由来し、かつ、CoAトランスフェラーゼ活性およびチオラーゼ活性がエシェリキア属の細菌に由来する場合、ならびに、これらの4種類の酵素の全てがクロストリジウム属の細菌に由来する場合である。
【０１５４】
ある特定の態様において、本開示に係る4種類の酵素の各々は、好ましくは、酵素活性の観点からクロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベエイジェリンキィおよび大腸菌のいずれかに由来する。より好ましくは、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカムに由来する酵素であり;CoAトランスフェラーゼおよびチオラーゼの各々は、クロストリジウム・アセトブチリカムまたは大腸菌に由来する酵素であり;そして、イソプロパノールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・ベエイジェリンキィに由来する酵素である。とりわけ好ましくは、上記の4種類の酵素の酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性は、クロストリジウム・アセトブチリカムに由来し;イソプロパノールデヒドロゲナーゼ活性は、クロストリジウム・ベエイジェリンキィに由来し;そして、CoAトランスフェラーゼ活性およびチオラーゼ活性は、大腸菌に由来する。
【０１５５】
本開示のこれらの酵素の各々の活性を、これらの酵素の1種類または複数種類をコードする1種類または複数種類の外来性核酸配列として宿主微生物へ導入しても、代替的に、本開示のこれらの酵素の各々の活性を、宿主微生物におけるこれらの酵素の各々をコードする内在性遺伝子の過剰発現によって実現してもよい。内在性遺伝子の過剰発現は、宿主微生物の内在性遺伝子のプロモーターの活性の増強によることもでき、プロモーターを別のプロモーターと交換して内在性遺伝子の過剰発現を引き起こすこともできる。
【０１５６】
酵素活性の導入を、例えば、遺伝子組換え技術を使用した、宿主微生物へのこれらの4種類の酵素をコードする外来性核酸配列の導入によって行ってよい。この場合、導入された核酸配列は、宿主微生物の種と同じであっても異なっていてもよい。核酸配列の調製、DNA分子の切断およびライゲーション、形質転換、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計および合成などを当業者に周知の慣用の方法によって行ってよい。これらの方法は、例えば、Sambrook, J., et al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【０１５７】
宿主微生物において発現できる限り、あらゆるプロモーターを、プロモーター活性の増強または酵素をコードする核酸配列の過剰発現に使用されるプロモーターとして使用してよい。例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーターおよびPRプロモーターなどの大腸菌またはファージに由来するプロモーターが使用される。また、tacプロモーターなどの人工的に設計または改変されたプロモーターを使用してもよい。いくつかの態様において、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(gadA)プロモーターおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(glyA)プロモーターを使用してもよい。これらは使用される酵素の起源および種類に応じて適切に選択され得る。
【０１５８】
例えば、大腸菌に由来するチオラーゼまたはCoAトランスフェラーゼの活性の増強のために、大腸菌などの宿主において酵素の発現を可能にする限り任意のプロモーターを使用してよく、そして、プロモーターの1つまたは複数は、trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、tacプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(gadA)プロモーターおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(glyA)プロモーターからなる例示的なプロモーターの群より適切に選択され得る。trpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、tacプロモーター、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(gadA)プロモーターおよびセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(glyA)プロモーターなどのプロモーターを使用して、大腸菌に由来するチオラーゼまたはCoAトランスフェラーゼのプロモーターと交換してよい。
【０１５９】
これらのプロモーターを、ある酵素をコードする標的遺伝子が発現され得るような慣用の方法に従って、例えば、標的遺伝子を含有するベクターにプロモーターをライゲーションし、続いて、該ベクターを宿主微生物へ導入することによって、宿主細胞へ導入してよい。
【０１６０】
いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼおよびチオラーゼの4種類の酵素をコードする遺伝子の導入に使用される宿主微生物は、原核生物である。いくつかの態様において、原核生物は、これらの酵素のプロモーターの活性の増強またはプロモーターの交換のいずれかの標的である。ある特定の態様において、原核生物は、細菌である。そのような細菌の例は、エシェリキア属の細菌、バチルス属の細菌およびコリネバクテリウム属の細菌を含み;そして、とりわけ簡便でありかつ工業的用途において十分な結果をもたらす大腸菌が好んで使用される。
【０１６１】
イソプロパノールおよびn-プロパノールの同時生成
一態様において、n-プロパノールおよびイソプロパノール基質を、McBride等(WO 2011/022651)の開示に従って微生物において生成することができる。1種類または複数種類の天然および/または異種の酵素を発現する組換え微生物; 1種類または複数種類の酵素が1種類または複数種類の操作された代謝経路において機能して炭水化物源からn-プロパノールおよびイソプロパノールへの変換を達成する組換え微生物が記載されている。
【０１６２】
いくつかの態様において、再生可能原料からn-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成することができる組換え微生物は、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（f）（d）または（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオール-デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、DHAPおよびピルベートは、該微生物における解糖から生成される。
【０１６３】
さらなる態様において、組換え微生物は、
（a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異;および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０１６４】
いくつかの態様において、再生可能原料は、1種類または複数種類のペントース糖および/またはヘキソース糖である。
【０１６５】
いくつかの態様において、微生物でのイソプロパノールおよびn-プロパノールの同時生成のための経路を使用して、一級アルケンへの脱水のためのアルコール基質を生成する。ある特定の態様において、イソプロパノール生成は、ATP生成能に役立ち、一方で、n-プロパノール生成は、嫌気性発酵の均衡をとる電子溜として役立つ。この経路は、熱力学的に適切な、均衡のとれた発酵均衡を可能にする。一態様において、該微生物を統合型バイオプロセシングで使用することができる。統合型バイオプロセシング(CBP)は、単一容器内で、安価なセルロースを使用可能な糖に分解し、同時にこれらを付加価値のある生成物へ発酵することができる酵素が、生体触媒によって生成される、作業様式のことを言う。
【０１６６】
両生成物を、蒸留を介して発酵ブロスから回収することができ、これによって下流プロセシングの複雑さが低下する。イソプロパノールは、溶媒生成能のある(solventogenic)クロストリジウムによって天然に生成される生成物であり、アセトンを供給したときにサーモアナエロバクター属の種(Thermoanaerobacter species)によって急速に生成されるが、このことは、所望の反応に高活性を有する天然アルコールデヒドロゲナーゼの存在を示している(Lamed RJ and Zeikus JG (1981) The Biochemical J 195(1):183-190)。アセトン生成は幅広く研究されており、そして、クロストリジウムの経路は大腸菌において異種発現されている(Bermejo LL et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64(3): 1079-85)。n-プロパノールは、プロパンジオール分解の天然生成物であり、多くの微生物が嫌気性条件下でこの触媒作用を示すと報告されている。最近、この変換に関与する遺伝子が、リステリア・イノキュラ(Listeria innocula)という種において同定されており、これは、細菌であるCBP生物においてこの経路の発現を容易にする(Xue J et al. (2008) Applied and Environmental Microbiol. 74(22):7073-7079)。n-プロパノール経路の重要な中間体であるプロパンジオールは、好熱性細菌の天然の発酵生成物である。最高濃度のプロパンジオールを生成することが報告されている生物であるT. サーモサッカロリチカム(T. thermosaccharolyticum)HG-8を、n-プロパノールの生成のために操作することができる。
【０１６７】
グルコースまたはキシロースからのn-プロパノールおよびイソプロパノールの組み合わせ生成は、いくつかの別個の酵素の活性を必要とする(表3)。
【０１６８】
（表３）CBP細菌プラットフォームにおけるn-プロパノールおよびイソプロパノールの操作に関する天然および非天然遺伝子候補の一覧
2019520832.tif 000008
【０１６９】
細菌による代謝中の3つのグルコース分子からのn-プロパノールおよびイソプロパノールの組み合わせ生成は、以下の全体化学量論式によって支配される:
3 C6H12O6→2 (n-)C3H8O+2 (イソ-)C3H8O+6 CO2+2 H2O+4 ATP
【０１７０】
上の経路についてのヘキソース糖に対するプロパノール類の理論的収量は、ヘキソース1g当たりプロパノール0.44gである。
【０１７１】
細菌による代謝中の9つのキシロース分子からのn-プロパノールおよびイソプロパノールの組み合わせ生成は、以下の全体化学量論式によって支配される:
9 C5H10O5→5 (n-)C3H8O+5 (イソ-)C3H8O+15 CO2+5 H2O+12 ATP
【０１７２】
上の経路についてのペントース糖に対するプロパノール類の理論的収量は、ヘキソース1g当たりプロパノール0.44gである。
【０１７３】
この代謝経路について、生成物収量は、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpi)(E.C. 5.3.1.1)の活性に起因して、ヘキソース(例えばグルコース)およびペントース(例えばキシロース)炭水化物で同一である。ペントース発酵は、ヘキソース発酵(2つの化合物を等モル比で生成する)と比較して、ジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)よりも異性体グリセルアルデヒド3-リン酸(GAP)をより多く生成する。しかしながら、tpiは、GAPからDHAPへの変換(逆もまた同様)を可能にし、両炭水化物で等しい生成物収量をもたらす。
【０１７４】
n-プロパノールおよびイソプロパノールの生成のための代謝経路を、2つの別個の生成経路:（i）ジヒドロキシアセトンリン酸からn-プロパノールへの変換;および(ii)ピルベートからイソプロパノールへの変換、に分割することができる。
【０１７５】
n-プロパノール経路である経路（i）では、ジヒドロキシアセトンリン酸は、メチルグリオキサールシンターゼ(E.C. 4.2.3.3)によってメチルグリオキサールへと変換される。メチルグリオキサールは、その後、オキシドレダクターゼ(E.C. 1.1.1.-)によってアセトールへと変換されるか、またはケト-レダクターゼ(1.1.1.79または1.1.1.-)によってラクトアルデヒドへと変換される。これらの中間体は、次いで、(E.C. 1.1.1.-)の酵素によってプロパンジオールへとさらに還元される。プロパンジオールは、次いで、ジオール-ヒドロラーゼ(E.C. 4.2.1.28)によってプロパナールへと脱水され、デヒドロゲナーゼ(E.C. 1.1.1.202)によってn-プロパノールへと還元される。
【０１７６】
プロパンジオールの生成のための必要な酵素活性の全てが、遺伝子操作することができる株であるC. サーモサッカロリチカム(C. thermosaccharolyticum)において実証されている(Cameron DC et al. (1998) Biotechnol. Prog. 14: 116-125)。所望の酵素ドメインと高レベルの相同性を示す細菌のCBPプラットフォーム生産株における関連する内在性酵素も同定されている(表3)。細菌のCBPプラットフォーム生産株においてプロパンジオールを導く酵素を、経路（i）での遂行のために特性決定することができる。
【０１７７】
イソプロパノール経路である経路(ii)では、グリセルアルデヒド3-リン酸は、標準的な解糖反応を通じてピルベートへとさらに代謝され、細胞反応を作動させるATPおよび嫌気性発酵中のn-プロパノール生成の均衡をとるのに必要な還元等価体を生成する。ピルベートは、次いで、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ(E.C. 1.2.7.1)によって、アセチルCoA、還元型フェレドキシン、およびCO2へと代謝される。その後、NADHおよびH2がフェレドキシンの酸化中に生成される。
【０１７８】
アセチルCoAは、次いで、ATP生成反応においてリン酸アセチルトランスフェラーゼ(EC 2.3.1.8)および酢酸キナーゼ(E.C. 2.7.2.1)によって酢酸へと変換される。2つのアセチルCoA分子は、チオラーゼ(E.C. 2.3.1.9)によってアセトアセチルCoAへと変換される。アセトアセチルCoAは、次いで、補酵素Aトランスフェラーゼ(E.C. 2.8.3.8)によってアセト酢酸へと変換され、ここで、CoA種は、アセトアセチルCoAから酢酸へと移行し、チオラーゼ反応中に消費されたアセチルCoAを補充する。アセト酢酸は、次いで、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(E.C. 4.1.1.4)によってアセトンへと変換される。アセトンからイソプロパノールへの還元を、アルコールデヒドロゲナーゼ(E.C. 1.1.1.80)によって達成することができる。
【０１７９】
アセチルCoAからのアセトンの生成を触媒する酵素が、文献でC. アセトブチリカム(C. acetobutylicum)から同定されている(Bermejo LL et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 64(3): 1079-85)。アセトンからイソプロパノールへの変換が複数のアルコールデヒドロゲナーゼによって示されており、そして、基質としてアセトンを許容する能力について内在性の細菌酵素をスクリーニングすることができる。
【０１８０】
また、遺伝子欠失も高収量のプロパノール生成を達成するために必要であろう。これらは、L-乳酸デヒドロゲナーゼldh(E.C. 1.1.1.27);ヒドロゲナーゼhyd(E.C. 1.12.7.2);およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼacdh(E.C. 1.2.1.10)の欠失を含む。
【０１８１】
「メチルグリオキサールシンターゼ」または「mgs」という用語は、化学反応
グリセロンリン酸メチルグリオキサール+リン酸
を触媒する酵素を指す。
【０１８２】
「アルド-ケトレダクターゼ」という用語は、任意の数の関連する単量体NADPH依存性オキシドレダクターゼ、例えば、アルドースレダクターゼ、プロスタグランジンFシンターゼ、キシロースレダクターゼおよびその他多くを指すことができる。
【０１８３】
「オキシドレダクターゼ」という用語は、ある分子(還元剤、水素または電子供与体とも呼ばれる)から別の分子(酸化剤、水素または電子受容体とも呼ばれる)への電子の移動を触媒する酵素を指す。
【０１８４】
「グリオキシル酸レダクターゼ」という用語は、化学反応
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を触媒する酵素を指す。この酵素は、オキシドレダクターゼのファミリー、具体的には、受容体としてNAD+またはNADP+を用いて供与体のCH-OH基に作用するものに属する。
【０１８５】
「メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ」という用語は、メチルグリオキサールをピルベートへと酸化する酵素を指す。
【０１８６】
「CoAトランスフェラーゼ」という用語は、例えば、化学反応
アシル-CoA+酢酸  脂肪酸アニオン+アセチルCoA
を触媒するアセチルCoAトランスフェラーゼなどの酵素である。「CoAトランスフェラーゼ」という用語はまた、化学反応
2019520832.tif 000010
を触媒する酵素を指す。
【０１８７】
「アセト酢酸デカルボキシラーゼ」または「ADC」という用語は、ヒトおよび他の動物のケトン体生成経路と、ある特定の細菌における溶媒生成能、の両方に関与する酵素を指す。その反応は、アセトンおよび二酸化炭素を形成するアセト酢酸の脱炭酸を伴う。
【０１８８】
「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、アルデヒドの酸化(脱水素化)を触媒する酵素を指す。
【０１８９】
「デヒドロゲナーゼ」という用語は、1種類または複数種類の水素化物(H-)を受容体、通常NAD+/NADP+へ移動させることによって基質を酸化する酵素を指す。
【０１９０】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」または「ADH」という用語は、アルデヒド類(アセトアルデヒドおよびプロピオンアルデヒドなど)およびケトン類(アセトンなど)をアルコール(エタノール、n-プロパノール、またはイソプロパノールなど)へと変換することができる酵素を含むことを意図する。
【０１９１】
「ホスホトランスアセチラーゼ」または「PTA」という用語は、アセチルCoAをアセチルリン酸へと変換することができる酵素を含むことを意図する。
【０１９２】
「ジオールデヒドラターゼ」という用語は、プロパンジオールをプロパナールへと変換することができる酵素を含むことを意図する。
【０１９３】
アセトン、ブタノール、エタノール(ABE)発酵
一態様において、ブタノールおよびエタノール基質を、JonesおよびWoods(Jones DT and Woods DR (1986) Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiol Rev. 50(4): 484-524)に記載されているアセトン、ブタノール、エタノール(ABE)発酵プロセスに従って、微生物において生成することができる。
【０１９４】
溶媒生成能のあるクロストリジウム株を使用した糖のアセトン-ブタノール-エタノール(ABE)発酵は、周知の工業用プロセスであり、それは、20世紀初期および中期に溶媒の生成に使用されていた。ヘキソース糖(単糖、二糖、三糖、および多糖を含む)は、エムデン-マイヤーホフ経路を介して代謝され、1molのヘキソースから2molのピルベートへ変換され、純生産量は2molのアデノシン三リン酸(ATP)および2molの還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)である。溶媒生成クロストリジウムは、ペントースリン酸経路を経由してペントース糖を代謝する。発酵されたペントースは、ペントース5-リン酸へと変換され、トランスケトラーゼ-トランスアルドラーゼシーケンスによって異化されて、フルクトース6-リン酸およびグリセルアルデヒド3-リン酸の生成をもたらし、それらが解糖経路へ入る。3molのペントースの発酵は、5molのATPおよび5molのNADHを生成する。
【０１９５】
解糖から生じたピルベートは、補酵素A(CoA)の存在下でピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼによって切断され、二酸化炭素、アセチルCoA、および還元型フェレドキシンを生成する。ホスホロ開裂切断によって生成されたアセチルCoAは、酸および溶媒の両方の生成を導く分岐した発酵経路における中心的な中間体である。
【０１９６】
溶媒生成の開始は、酸生成経路から溶媒生成経路への炭素流の切り替えを伴う。溶媒生成中、アセチルCoAおよびブチリル-CoAは、エタノールおよびブタノール生成のための重要な中間体として機能する。これらの経路は、アセチルアルデヒドおよびブチルアルデヒドをそれぞれ中間体として生成し、そして、この経路は、エタノールおよびブタノールを生成する必要な還元を達成するために、2組のデヒドロゲナーゼの機能を必要とする。
【０１９７】
ブチリル-CoAのブタノールへの還元は、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびブタノールデヒドロゲナーゼによって媒介される。C. アセトブチリカムおよびC. ベイジェリンキィ(C. beijerinckii)の両方において、ブタノールデヒドロゲナーゼの活性は、NADH依存性ではなくNADPH依存性であると報告されている。類似のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼおよびエタノールデヒドロゲナーゼは、アセチルCoAからのエタノール生成に関与する。ある特定の培養条件下でC. アセトブチリカムによってアセトンおよびブタノールから独立してエタノールを生成することができる。
【０１９８】
いくつかの態様において、再生可能原料からアセトン、ブタノールおよびエタノールを同時生成することができる組換え微生物は、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリル-CoAから2-ブテノイル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（h）（g）由来の2-ブテノイル-CoAからブチリル-CoAへの変換を触媒するブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（i）（h）由来のブチリル-CoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへのまたは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０１９９】
さらなる態様において、組換え微生物は、ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０２００】
いくつかの態様において、再生可能原料は、1種類または複数種類のペントース糖および/またはヘキソース糖である。
【０２０１】
イソプロパノール、ブタノール、エタノール(IBE)発酵
C. アセトブチリカムおよび他の溶媒生成能のある株が、アセトン-ブタノール-エタノール(ABE)発酵プロセスでの大規模ブタノール生成に使用されている。生物の経路化学量論および細胞のエネルギー需要の理論解析ならびにいくつかの実験結果は、糖基質の大部分をブタノール単独へと変換することが可能であることを示唆している。しかしながら、代謝工学によってアセトン生成を低下させる試みは、減少したブタノール生成ならびに酢酸および酪酸の蓄積をもたらした。
【０２０２】
ABE発酵プロセス中にアセトンの代わりにイソプロパノールを生成するよう微生物を操作することができる。アセトンがイソプロパノールへと変換されるプロセスは、IBE(イソプロパノール-ブタノール-エタノール)発酵と呼ばれ、ここに記載している。IBE発酵戦略では、アセトン生成経路は妨害されず、よって、ブタノール生成が損なわれることがないと予想される。
【０２０３】
一態様において、イソプロパノール、ブタノールおよびエタノール基質を、Lee等(Lee J et al. (2012) Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 for isopropanol-butanol-ethanol fermentation. Applied and Environmental Microbiology 78(5): 1416-1423)によって記載されているイソプロパノール、ブタノール、エタノール(IBE)発酵プロセスに従って微生物において生成することができる。
【０２０４】
いくつかの態様において、微生物に二級アルコールデヒドロゲナーゼ(SADH)を導入することによって、イソプロパノール-ブタノール-エタノール(IBE)を生成するよう微生物を操作することができる。ある特定の態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼは、クロストリジウム・ベエイジェリンキィNRRL B-593のadhB-593遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、該微生物は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ(adc)および補酵素Aトランスフェラーゼ遺伝子(ctfAおよびctfB)からなる合成アセトンオペロンをさらに含む。ある特定の態様において、合成アセトンオペロンは、イソプロパノール形成へ向かう流れを増加させる。いくつかの態様において、該微生物は、リン酸ブチリルからブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子(buk) における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。いくつかの態様において、該微生物は、クロストリジウム・アセトブチリカムである。
【０２０５】
いくつかの態様において、再生可能原料からイソプロパノール、ブタノールおよびエタノールを同時生成することができる組換え微生物は、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリル-CoAから2-ブテノイル-CoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（h）（g）由来の2-ブテノイル-CoAからブチリル-CoAへの変換を触媒するブチリル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;
（i）（h）由来のブチリル-CoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子;および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、または（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０２０６】
さらなる態様において、組換え微生物は、リン酸ブチリルのブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０２０７】
いくつかの態様において、再生可能原料は1種類または複数種類のペントース糖および/またはヘキソース糖である。
【０２０８】
発酵的イソブタノールの生成
1つの態様において、イソブタノール基質は、Liao et al.（US 2009/0081746)および/またはDonaldson et al.（US 2007/0092957)によって記載されるイソブタノール発酵プロセスに従って微生物において生成することができる。
【０２０９】
1つの態様において、微生物は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ活性、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ活性、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性、2-ケト酸デカルボキシラーゼ活性、およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含むポリペプチドをコードする1種類または複数種類の核酸分子を微生物に導入することによって、適した基質または代謝中間体からイソブタノールを生成するように操作することができる。
【０２１０】
本開示には、微生物のネイティブなアミノ酸経路を利用する代謝的に操作された生合成経路が含まれる。生物のネイティブなアミノ酸経路を利用するアルコール生成は複数の利点をもたらす。それは、多数の外来遺伝子のセットを発現する難しさを避けるだけでなく、毒性中間体の蓄積の可能性を最小化し、酸素感受性酵素およびCoA依存性中間体を伴う必要性を回避する。本開示は、アミノ酸生合成経路において微生物のネイティブな代謝物を利用して、イソブタノールを生成するシステムを提供する。
【０２１１】
したがって、本明細書において、イソブタノールを生成する組換え微生物が提供され、いくつかの局面では、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えば、ilvIHオペロン)、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ilvC)、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ilvD)、2-ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、PDC6、ARO10、THI3、kivd、またはpdc)、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ADH2)などの標的酵素の発現の上昇を含んでもよい。微生物は、ピルベートの利用可能性を増加させるために、または望ましい生合成経路において代謝物について競合する酵素を減少させるために、エタノールデヒドロゲナーゼ（例えば、adhE)、ldh（例えば、ldhA)、frd（例えば、frdB、frdCまたはfrdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB、もしくはpta遺伝子、またはそれらの任意の組み合わせの発現の欠失または阻害をさらに含んでもよい。いくつかの局面では、組換え微生物は、アセト乳酸シンターゼ（例えば、alsS)、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（例えば、ilvC)、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（例えば、ilvD)、2-ケト酸デカルボキシラーゼ（例えば、PDC6、ARO10、TH13、kivd、またはpdc)、およびアルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ADH2)の発現の上昇を含んでもよい。アルコールデヒドロゲナーゼに関して、エタノールデヒドロゲナーゼはアルコールデヒドロゲナーゼであるが、エタノールの合成は、発酵的イソブタノール生成における副生成物として望ましくない。したがって、微生物におけるアルコールデヒドロゲナーゼ活性または発現の増加への言及には、エタノールデヒドロゲナーゼ活性は特に排除される。
【０２１２】
いくつかの態様において、アセトヒドロキシ酸シンターゼは、ilvIHオペロンに由来するポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの態様において、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、ilvC遺伝子に由来するポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの態様において、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、ilvD遺伝子に由来するポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの態様において、2-ケト酸デカルボキシラーゼは、PDC6、ARO10、THI3、kivd、および/またはpdc遺伝子に由来するポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、ADH2遺伝子に由来するポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【０２１３】
「オペロン」という用語は、共通プロモーターから1つの転写単位として転写される2つ以上の遺伝子を指す。いくつかの態様において、オペロンを含む遺伝子は隣接遺伝子である。オペロン全体の転写は、共通プロモーターを改変することによって改変（すなわち、増加、減少、または除去）できることが理解される。あるいは、オペロン中の任意の遺伝子または遺伝子の組み合わせは、コードされたポリペプチドの機能または活性を変更するために改変することができる。改変は、コードされたポリペプチドの活性の増加をもたらすことができる。さらに、改変は、コードされたポリペプチドに新規活性を授けることができる。例示的な新規活性には、代替の基質の使用および/または代替の環境条件で機能する能力が含まれる。
【０２１４】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（例えばilvH)およびアセト乳酸シンターゼ（例えば、alsS、ilvB、ilvI)は、分岐鎖アミノ酸（バリン、ロイシン、およびイソロイシン）の合成を触媒する。IlvHは、大腸菌においてアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、アセトヒドロキシ酸シンターゼAHAS III（IlvH)（大腸菌) gi|40846|emb|CAA38855.1|(40846)を参照すること）。ilvHを含むホモログおよびバリアントならびにオペロンは公知であり、これらには、例えば、ilvH（ミクロキスティス・エルギノーザ（Microcystis aeruginosa）PCC 7806)gi|159026908|emb|CAO89159.1|(159026908)；IlvH（バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）FZB42）gi|154686966|ref|YP.sub.--001422127.1|(154686966)；IlvH（バチルス・アミロリクエファシエンスFZB42）gi|154352817|gb|ABS74896.1|(154352817)； IlvH（ゼノラブダス・ネマトフィラ（Xenorhabdus nematophila））gi|131054140|gb|ABO32787.1|(131054140)；IlvH（サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium））gi|7631124|gb|AAF65177.1|AF117227.sub.--2(7631124)、ilvN（リステリア・イノキュア（Listeria innocua））gi|16414606|emb|CAC97322.1|(16414606)；ilvN（リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes））gi|16411438|emb|CADO0063.1|(16411438); アセトヒドロキシ酸シンターゼ（カウロバクター・クレセンタス)gi|408939|gb|AAA23048.1|(408939); アセトヒドロキシ酸シンターゼ I、小サブユニット（サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカチフス菌（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi））gi|16504830|emb|CAD03199.1|(16504830); アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニット（トロフェリマ・ホイップレイ（Tropheryma whipplei）TW08/27）gi|28572714|ref|NP.sub.--789494.1|(28572714); アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニット（トロフェリマ・ホイップレイTW08/27）gi|28410846|emb|CAD67232.1|(28410846); アセトヒドロキシ酸シンターゼ I、小サブユニット（サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカパラチフスA菌株（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str.）ATCC 9150）gi|56129933|gb|AAV79439.1|(56129933); アセトヒドロキシ酸シンターゼ小サブユニット;アセトヒドロキシ酸シンターゼ、小サブユニット gi|551779|gb|AAA62430.1|(551779); アセトヒドロキシ酸シンターゼ I、小サブユニット（サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカチフス菌Ty2）gi|29139650|gb|AA071216.1|(29139650); アセトヒドロキシ酸シンターゼ小サブユニット（ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis））gi|5733116|gb|AAD49432.1|AF175526.sub.--1(5733116); アセトヒドロキシ酸シンターゼ大サブユニット；およびアセトヒドロキシ酸シンターゼ、大サブユニット gi|400334|gb|AAA62429.1|(400334)が含まれ、これらのアクセッション番号に関連する配列は参照により本明細書に組み入れられる。アセト乳酸シンターゼ遺伝子には、alsSおよびilvIが含まれる。ilvIおよびalsSのホモログは公知であり、これらには、例えば、アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）NCC2705）gi|23325489|gb|AAN24137.1|(23325489); アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus））gi|19918933|gb|AAL99357.1|(19918933); アセト乳酸シンターゼ（アゾアルカス属種（Azoarcus sp.）BH72）gi|119671178|emb|CAL95091.1|(119671178); アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（コリネバクテリウム・ジフテリ���エ（Corynebacterium diphtheriae））gi|38199954|emb|CAE49622.1|(38199954); アセト乳酸シンターゼ（アゾアルカス属種BH72）gi|119669739|emb|CAL93652.1|(119669739); アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（コリネバクテリウム・ジェイケイウム（Corynebacterium jeikeium）K411）gi|68263981|emb|CAI37469.1|(68263981); アセト乳酸シンターゼ小サブユニット（バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis））gi|1770067|emb|CAA99562.1|(1770067); アセト乳酸シンターゼアイソザイム1小サブユニット（AHAS-I)（アセトヒドロキシ酸シンターゼI小サブユニット)（ALS-I）gi|83309006|sp|P0ADF8.1|ILVN_ECOLI(83309006); アセト乳酸シンターゼ大サブユニット（ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス）gi|19918932|gb|AAL99356.1|(19918932)；およびアセト乳酸シンターゼ、小サブユニット（サーモアナエロバクター・テンコジェネシス（Thermoanaerobacter tengcongensis）MB4）gi|20806556|ref|NP.sub.--621727.1|(20806556)が含まれ、これらのアクセッション番号に関連する配列は参照により本明細書に組み入れられる。NCBIには、およそ1120種類のilvBホモログおよびバリアントが列記されている。
【０２１５】
アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、イソロイシンおよびバリンの生合成のための並行経路における第2の酵素である。IlvCは、大腸菌においてアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする。ilvCのホモログおよびバリアントは公知であり、これらには、例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）972h-）gi|162312317|ref|NP.sub.--001018845.2|(162312317)；アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（シゾサッカロミセス・ポンベ）gi|3116142|emb|CAA18891.1|(3116142)；アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（サッカロミセス・セレビシエYJM789）gi|151940879|gb|EDN59261.1|(151940879)；Ilv5p：アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ（サッカロミセス・セレビシエ）gi|609403|gb|AAB67753.1|(609403)；ACL198Wp（アシュビア・ゴシッピイ（Ashbya gossypii）ATCC 10895）gi|45185490|ref|NP.sub.--983206.1|(45185490)；ACL198Wp（アシュビア・ゴシッピイATCC 10895）gi|44981208|gb|AAS51030.1|(44981208)；アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ；Ilv5x（サッカロミセス・セレビシエ）gi|957238|gb|AAB33579.1.parallel.bbm|369068|bbs|165406(957238)；アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ；Ilv5g（サッカロミセス・セレビシエ）gi|957236|gb|AAB33578.1.parallel.bbm|369064|bbs|165405(957236)；およびケトール酸レダクトイソメラーゼ（シゾサッカロミセス・ポンベ）gi|2696654|dbj|BAA24000.1|(2696654)が含まれ、このアクセッション番号に関連する各配列は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１６】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼは、イソロイシンおよびバリンの生合成における第4段階、2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸のα-ケトイソ吉草酸への脱水を触媒する。IlvDおよびilv3はジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼのホモログおよびバリアントは公知であり、これらには、例えば、IlvD（マイコバクテリウム・レプラエ（Mycobacterium leprae））gi|2104594|emb|CAB08798.1|(2104594); ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（トロフェリマ・ホイップレイTWO8/27）gi|28410848|emb|CAD67234.1|(28410848); ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（マイコバクテリウム・レプラエ）gi|13093837|emb|CAC32140.1|(13093837); ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ロドピレルラ・バルチカ（Rhodopirellula baltica）SH 1）gi|32447871|emb|CAD77389.1|(32447871)；および推定ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）亜種アウレウスMRSA252）gi|49242408|emb|CAG41121.1|(49242408)が含まれ、これらのアクセッション番号に関連する各配列は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１７】
2-ケト酸デカルボキシラーゼは、2-ケト酸の各々のアルデヒドへの変換を触媒する。例えば、2-ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼは、2-ケトイソ吉草酸のイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する。複数の2-ケト酸デカルボキシラーゼが公知であり、pdc、pdc1、pdc5、pdc6、aro10、thI3、kdcAおよびkivd遺伝子によって例示される。2-ケト酸の各々のアルデヒドへの変換に有用な例示的なホモログおよびバリアントは、以下のアクセッション番号によって表される配列および特定された酵素活性を含む：gi|44921617|gb|AAS49166.1|分岐鎖α-ケト酸デカルボキシラーゼ（ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）)；gi|15004729|ref|NP.sub.--149189.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ（クロストリジウム・アセトブチリカムATCC 824)；gi|82749898|ref|YP.sub.--415639.1|高可能性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（スタフィロコッカス・アウレウスRF122)；gi|77961217|ref|ZP.sub.--00825060.1|COG3961:ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび関連するチアミンピロリン酸要求酵素（エルシニア・モラレッティイ（Yersinia mollaretii）ATCC 43969)；gi|71065418|ref|YP.sub.--264145.1|推定ピルビン酸デカルボキシラーゼ（サイクロバクター・アルクチクス（Psychrobacter arcticus）273-4)；gi|16761331|ref|NP.sub.--456948.1|推定デカルボキシラーゼ（サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカチフス菌株CT18)；gi|93005792|ref|YP.sub.--580229.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ（サイクロバクター・クリオハロレティス（Psychrobacter cryohalolentis）K5)；gi|23129016|ref|ZP.sub.--00110850.1| COG3961:ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび関連するチアミンピロリン酸要求酵素（ノストック ・パンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）PCC 73102)；gi|16417060|gb|AAL18557.1|AF354297.sub.--1ピルビン酸デカルボキシラーゼ（サルシナ・ベントリクリ（Sarcina ventriculi）)；gi|15607993|ref|NP.sub.--215368.1|高可能性ピルビン酸またはインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ PDC（マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv)；gi|41406881|ref|NP.sub.--959717.1| Pdc（マイコバクテリウム・アビウム亜種パラツベルクローシス（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis）K-10)；gi|91779968|ref|YP.sub.--555176.1|推定ピルビン酸デカルボキシラーゼ（バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）LB400)；gi|15828161|ref|NP.sub.--302424.1|ピルビン酸（またはインドールピルビン酸)デカルボキシラーゼ（マイコバクテリウム・レプラエ TN)；gi|118616174|ref|YP.sub.--904506.1|ピルビン酸またはインドール-3-ピルビン酸デカルボキシラーゼ Pdc（マイコバクテリウム・アルセランス（Mycobacterium ulcerans）Agy99)；gi|67989660|ref|NP.sub.--001018185.1|仮想的タンパク質SPAC3H8.01（シゾサッカロミセス・ポンベ972h-)；gi|21666011|gb|AAM73540.1|AF282847.sub.--1ピルビン酸デカルボキシラーゼ PdcB（リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）)；gi|69291130|ref|ZP.sub.--00619161.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ:ピルビン酸デカルボキシラーゼ（キネオコッカス・ラジオトレランス（Kineococcus radiotolerans）SRS30216)；gi|66363022|ref|XP.sub.--628477.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ（小形クリプトスポリジウム（Cryptosporidium parvum）Iowa II)；gi|70981398|ref|XP.sub.--731481.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ（アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）Af293)；gi|121704274|ref|XP.sub.--001270401.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ、推定（アスペルギルス・クラバタス（Aspergillus clavatus）NRRL 1)��gi|119467089|ref|XP.sub.--001257351.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ、推定（ネオサルトリア・フィシェリ（Neosartorya fischeri）NRRL 181)；gi|26554143|ref|NP.sub.--758077.1|ピルビン酸デカルボキシラーゼ（マイコプラズマ・ペネトランス（Mycoplasma penetrans）HF-2)；gi|21666009|gb|AAM73539.1|AF282846.sub.--1ピルビン酸デカルボキシラーゼ PdcA（リゾプス・オリゼ)。
【０２１８】
アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）は、アミノ酸異化反応の最終段階、アルデヒドの長鎖または複合アルコールへの変換を触媒する。種々のadh遺伝子が当技術分野において公知である。本明細書に示すように、adh1ホモログおよびバリアントには、例えば、adh2、adh3、adh4、adh5、adh6およびsfa1が含まれる（例えば、SFA（サッカロミセス・セレビシエ）gi|288591|emb|CAA48161.1|(288591)を参照すること；このアクセッション番号に関連する配列は、参照により本明細書に組み入れられる)。
【０２１９】
いくつかの態様において、再生可能原料からイソブタノールを生成する能力を有する組換え微生物は、以下：
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちのの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０２２０】
さらなる態様において、組換え微生物は、
（a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０２２１】
いくつかの態様において、再生可能原料は、1種類または複数種類のペントース糖および/またはヘキソース糖である。
【０２２２】
酵素
デヒドラターゼ-イソメラーゼ（EC 4.2.1.-)
本開示は、以下の反応を触媒できる酵素を記載する：
2019520832.tif 000011
【０２２３】
1つの態様において、酵素は、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒できる、デヒドラターゼ/イソメラーゼである。いくつかの態様において、各一級アルケンは、構造Bに示す構造を有し、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成され、各一級アルコールまたは二級アルコールは構造Aに示す構造を有する。
2019520832.tif 000012
式中、R1＝CnH2n＋1、1≦n≦11；R2＝CmH2m＋1、0≦m≦10かつn＋m≦11である。
【０２２４】
リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、カステラニエラ・デフラグランスから均一に精製されており、ホモ四量体であることがわかっている。酵素は、モノテルペン上で成長した細胞において存在するが、酢酸上で成長した細胞では存在しない。酵素は酸素により不活性化されるが、嫌気条件下で還元剤によって再活性化することができる。
【０２２５】
この二機能性酵素は、2つの反応、すなわちゲラニオールから（3S)-リナロールへの異性化およびβ-ミルセンからリナロール（3,7-ジメチル-1,6-オクタジエン-3-オール)への水和を触媒することができる。
【０２２６】
酵素をコードする遺伝子は、単離および配列決定され、ペリプラズム内への輸送のためのシグナルペプチドを含有する前駆体タンパク質をコードすることが示された。
【０２２７】
いくつかの態様において、デヒドラターゼ/イソメラーゼはリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼである。1つの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、カステラニエラ・デフラグランスの種からなる群より選択される微生物から得られる。
【０２２８】
いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61および63からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、およびさらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、およびさらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【０２２９】
いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。さらなる態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼはLinDである。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:64、65、66、67および68からなる群より選択されるアミノ酸配列で構成されない。
【０２３０】
1つの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、表1に列記されるアルコールから表1に列記される対応するアルケンへの変換を触媒する。1つの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、1-プロパノールからプロペンへの変換を触媒する。別の態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、2-プロパノールからプロペンへの変換を触媒する。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、1-ブタノールからブテンへの変換を触媒する。さらなる態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、2-ブタノールからブテンへの変換を触媒する。
【０２３１】
D-タガトース3-エピメラーゼ（EC 5.1.3.31）
本開示は、様々なケトースのC3位のエピマー化を触媒し、DフルクトースとD-プシコース、D-タガトースとD-ソルボース、D-リブロースとD-キシルロース、およびL-リブロースとL-キシルロースを相互変換することができる酵素を記載する。特異性は種に依る。シュードモナス・シコリイおよびロドバクター・スフェロイデスに由来する酵素は、Mn2+を必要とする。一つの態様において、酵素は、D-タガトース3-エピメラーゼ（dte）である。もう一つの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼは、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する。
2019520832.tif 000013
【０２３２】
いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼは、シュードモナス属の種に由来する。もう一つの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼは、シュードモナス・シコリイに由来する。もう一つの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼは、シュードモナス属種ST-24に由来する。もう一つの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼは、メソリゾビウム・ロティに由来する。もう一つの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼは、ロドバクター・スフェロイデス（C1KKR1）に由来する。
【０２３３】
D-タガトース3-エピメラーゼは、L-リブロース3-エピメラーゼまたはケトース3-エピメラーゼとしても公知であり得る。
【０２３４】
1つの態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種、メソリゾビウム属の種およびロドバクター属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シュードモナス・シコリイ、シュードモナス属種ST-24、メソリゾビウム・ロティおよびロドバクター・スフェロイデスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、dte、C1KKR1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、1種類または複数種類の核酸分子は、FJ851309.1またはそのホモログである。さらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:71および73からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:69、70および72からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０２３５】
D-リブロキナーゼ（EC 2.7.1.16）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
L-フクロース＋ATP→L-フクロース1-リン酸＋ADP＋H+
D-リブロース＋ATP→D-リブロース1-リン酸＋ADP＋H+
【０２３６】
D-リブロキナーゼは、L-フクロキナーゼ、フクロキナーゼ、ATP:L-フクロース1-ホスホトランスフェラーゼ、またはL-フクロースキナーゼとしても公知であり得る。
【０２３７】
従って、いくつかの態様において、本開示は、フコース分解経路、フコースおよびラムノースの分解のスーパーパスウェイ、ならびに/またはD-アラビノース分解I経路において役割を果たす酵素を提供する。
【０２３８】
いくつかの態様において、酵素は、それぞれ、L-フコースおよびD-アラビノースの分解経路の第2の酵素であるL-フクロキナーゼおよびD-リブロキナーゼの両方として機能することができる。
【０２３９】
具体的な態様において、酵素は、D-リブロースをD-リブロース-1-リン酸へ変換する。いくつかの態様において、D-リブロキナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-リブロキナーゼは、fucK遺伝子によってコードされる。
【０２４０】
1つの態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucKまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:76に示されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:74および75からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０２４１】
D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ（EC 4.1.2.17）
本開示は、以下の可逆反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000014
【０２４２】
D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼは、L-フクロースリン酸アルドラーゼ、L-フクロース1-リン酸アルドラーゼ、またはL-フクロース-1-リン酸(S)-ラクトアルデヒドリアーゼとしても公知であり得る。
【０２４３】
従って、いくつかの態様において、本開示は、フコース分解経路、フコースおよびラムノースの分解のスーパーパスウェイ、ならびに/またはD-アラビノース分解I経路において役割を果たす酵素を提供する。一つの態様において、酵素は、補助因子としてZn2+を使用し得る。もう一つの態様において、この酵素の阻害剤は、ホスホグリコロヒドロキサム酸であり得る。
【０２４４】
いくつかの態様において、酵素は、それぞれ、L-フコースおよびD-アラビノースの分解経路の第3の酵素、L-フクロースリン酸アルドラーゼおよびD-リブロースリン酸アルドラーゼの両方として機能することができる。
【０２４５】
酵素の基質特異性は、大腸菌株から部分精製された調製物によって試験されている。
【０２４６】
酵素および多数の点変異体の結晶構造が解析されている。変異体の構造データおよび酵素活性の組み合わせは、酵素の触媒機序のモデリングおよび改良を可能にした。酵素の鏡像異性体選択性が研究されている。
【０２４７】
具体的な態様において、酵素は、D-リブロース-1-リン酸をグリコールアルデヒドおよびDHAPへ変換する。いくつかの態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼは、fucA遺伝子によってコードされる。
【０２４８】
1つの態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucAまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:79に示されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:77および78からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０２４９】
グリコールアルデヒドレダクターゼ（EC 1.1.1.77）
本開示は、以下の可逆反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000015
【０２５０】
グリコールアルデヒドレダクターゼは、ラクトアルデヒドレダクターゼ、プロパンジオールオキシドレダクターゼ、(R)[もしくは(S)]-プロパン-1,2-ジオール:NAD+オキシドレダクターゼ、またはL-1,2-プロパンジオールオキシドレダクターゼとしても公知であり得る。
【０２５１】
従って、いくつかの態様において、本開示は、エチレングリコール分解経路、グリコールの代謝および分解のスーパーパスウェイ、嫌気的L-ラクトアルデヒド分解経路、ならびに/またはフコースおよびラムノースの分解のスーパーパスウェイにおいて役割を果たす酵素を提供する。一つの態様において、酵素は、補助因子としてFe2+を使用し得る。
【０２５２】
L-1,2-プロパンジオールオキシドレダクターゼは、鉄依存性III群デヒドロゲナーゼである。それは、L-フコースおよびL-ラムノースの両方の異化経路の生成物、L-ラクトアルデヒドを、L-1,2-プロパンジオールへ嫌気的に還元し、次いで、それは細胞から排出される。
【０２５３】
酵素の結晶構造が解析され、金属、補助因子、および基質の結合部位が位置し得るドメインスワッピングによる二量体（domain-swapped dimer）が示されている。1個のアスパラギン酸残基および3個の保存されたヒスチジン残基が、Fe2+結合および酵素活性のために必要とされる。
【０２５４】
インビトロで、酵素は、高濃度のNAD+によって不活化され、Fe3+およびアスコビル酸またはFe2+およびH2O2の混合物によって効率的に再活性化され得る。保存されたHis277残基の金属によって触媒される酸化は、不活化の原因となることが提唱されている。
【０２５５】
FucOの発現は、β酸化サイクルの操作された1回転の逆転を可能にする。FucO活性は、操作された株において、イソブチルアルデヒドのイソブタノールへの変換に寄与する。
【０２５６】
具体的な態様において、酵素は、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、fucO遺伝子によってコードされる。
【０２５７】
いくつかの態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ 活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌またはS. セレビシエから選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucO、yqhD、dkgA（yqhE）、dkgB（yafB）、yeaE、yghZ、gldA、GRE2、またはそれらのホモログから選択される。別の態様において、1種類または複数種類の核酸分子はyqhDである。いくつかの態様において、yqhDはG149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:81、83、85、88、91、93、96、98および100からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:80、82、84、86、87、89、90、92、94、95、97および99からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０２５８】
アルデヒドレダクターゼ
多数のアルデヒドレダクターゼが、グリコールアルデヒドをMEGへ変換するために使用され得る。
【０２５９】
NADPH依存性アルデヒドレダクターゼ（YqhD）は、以下の反応を触媒することができる：
2019520832.tif 000016
アルデヒド＋NADP+＋H2O→カルボン酸＋NADPH＋2H+（EC 1.2.1.4）
2019520832.tif 000017
【０２６０】
YqhDは、グリオキサール解毒に関与することができ、かつ/または脂質過酸化に対するグルタチオン非依存性応答の一部である、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼである。
【０２６１】
様々なアルコール、アルデヒド、アミノ酸、糖、およびαヒドロキシ酸が、YqhDの基質として試験されたことが報告されている。精製されたタンパク質のみが、C(3)より長いアルコールを好み、NADP依存性アルコールデヒドロゲナーゼ活性を示すが、Km値はミリモル範囲であり、そのことから、それらが生理学的基質ではないことが示唆される。対照的に、YqhDは、プロパンアルデヒド、アセトアルデヒド、およびブタンアルデヒド、ならびにアクロレインおよびマロンジアルデヒドのような基質で短鎖アルデヒドレダクターゼ活性を示す。代謝的に操作された株において、フェニルアセトアルデヒドおよび4-ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドは、内在性アルデヒドレダクターゼYqhD、YjgB、およびYahKによって、2-フェニルエタノールおよび2-(4-ヒドロキシフェニル)エタノールへ還元される。
【０２６２】
YqhDの過剰発現は、細胞の1,3-プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を増加させる。1,3-プロパンジオールの産業的生成のため、YqhDを発現するよう大腸菌が操作されている。YqhD活性は、イソブタノール、1,2-プロパンジオール、1,2,4-ブタントリオール、およびアセトールの生成にも同様に寄与する。yqhDの変異は、β酸化サイクルの操作された1回転の逆転によるブタノールの生成を可能にする。
【０２６３】
YqhDは、フルフラールレダクターゼ活性を有し、リグノセルロースバイオマスからアルコールを生成する代謝的に操作された株において、NADPHの枯渇による増殖阻害を引き起こすようである。
【０２６４】
YqhDの結晶構造は、2Åの解像度で解析された。YqhDは、二量体の非対称二量体であり、活性部位はZn2+イオンを含有している。NADPH補助因子は、ニコチンアミド環の5位および6位においてヒドロキシル基によって修飾される。
【０２６５】
yqhDの過剰発現は、過酸化水素、パラコート、クロム酸、およびテルル酸カリウムのような活性酸素発生化合物に対する増加した耐性をもたらす。yqhD欠失変異株は、これらの化合物およびグリオキサールに対する増加した感受性を示し、脂質過酸化において作成される反応性アルデヒドの増加したレベルを含有している。反対に、yqhD欠失は、増加したフルフラール耐性をもたらす。
【０２６６】
具体的な態様において、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、NADPH依存性アルデヒドレダクターゼは、yqhD遺伝子によってコードされる。
【０２６７】
多機能性メチルグリオキサールレダクターゼ（DkgA）は、以下の反応を触媒することができる：
2019520832.tif 000018
2-ケト-L-グロン酸＋NADP+←2,5-ジデヒドロ-D-グルコン酸＋NADPH＋H+（反応は逆方向が有利である、EC 1.1.1.346）
【０２６８】
DkgA（YqhE）は、アルド・ケトレダクターゼ（AKR）ファミリーに属し、メチルグリオキサールレダクターゼ活性およびβケトエステルレダクターゼ活性を有することが示されている。
【０２６９】
dkgAは、大腸菌における2種類の25DKGレダクターゼのうちの1種類、2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ（25DKGR）Aをコードすることが報告されている。酵素は、好ましい電子ドナーとしてNADPHを使用し、ケトグルコン酸代謝に関与していると考えられる。2,5-ジケト-D-グルコン酸に対する酵素の比活性は、メチルグリオキサールに対する活性よりほぼ1000倍低いことが報告されている。
【０２７０】
NADPHに対する低いKmのため、DkgAによるフランの還元は、NADPHプールを枯渇させ、それによって、細胞の生合成を制限することができる。アルデヒドレダクターゼの広範な調査は、DkgAが、代謝工学の所望のアルデヒド最終生成物の分解に寄与する数種類の内在性アルデヒドレダクターゼのうちの1種類であることを示した。
【０２７１】
DkgAの結晶構造は、2.16Åの解像度で解析された。
【０２７２】
具体的な態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、dkgA遺伝子によってコードされる。
【０２７３】
多機能性メチルグリオキサールレダクターゼ（DkgB）は、以下の反応を触媒することができる：
2019520832.tif 000019
2-ケト-L-グロン酸＋NADP+←2,5-ジデヒドロ-D-グルコン酸＋NADPH＋H+（反応は逆方向が有利である、EC 1.1.1.346）
【０２７４】
DkgB（YafB）は、アルド・ケトレダクターゼ（AKR）サブファミリー3Fのメンバーである。DkgBは、2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ活性、メチルグリオキサールレダクターゼ活性、および4-ニトロベンズアルデヒドレダクターゼ活性を有することが示された。
【０２７５】
dkgBは、大腸菌における2種類の25DKGレダクターゼのうちの1種類、2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ（25DKGR）Bをコードすることが報告されている。酵素は、好ましい電子ドナーとしてNADPHを使用し、ケトグルコン酸代謝に関与すると考えられている。しかしながら、2,5-ジケト-D-グルコン酸に対する酵素の比活性は、メチルグリオキサールに対する活性よりほぼ1000倍低いことが報告されている。
【０２７６】
具体的な態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、多機能性メチルグリオキサールレダクターゼは、dkgB遺伝子によってコードされる。
【０２７７】
メチルグリオキサールレダクターゼ（YeaE）は、以下の反応を触媒することができる：
2019520832.tif 000020
【０２７８】
YeaEは、メチルグリオキサールレダクターゼ活性を有することが示されている。
【０２７９】
YeaEのサブユニット構造は決定されていないが、アルド・ケトレダクターゼDkgA（YqhE）およびDkgB（YafB）とのアミノ酸配列類似性は、それが単量体であることを示唆する。
【０２８０】
具体的な態様において、メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、メチルグリオキサールレダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、メチルグリオキサールレダクターゼは、yeaE遺伝子によってコードされる。
【０２８１】
L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼ（yghZ）は、以下の反応を触媒することができる：
L-グリセルアルデヒド3-リン酸＋NADPH＋H+→sn-グリセロール3-リン酸＋NADP+（EC 1.1.1.-）
2019520832.tif 000021
【０２８２】
YghZは、L-グリセルアルデヒド3-リン酸（L-GAP）レダクターゼである。酵素は、低い速度でメチルグリオキサールを解毒することもできる。YghZは、AKR14（アルド・ケトレダクターゼ14）タンパク質ファミリーを定義する。
【０２８３】
L-GAPは、天然の代謝物でなく、大腸菌に対して毒性である。L-GAPは、大腸菌K-12のグリセロール-3-リン酸輸送系およびヘキソースリン酸輸送系の両方の基質である。YghZの生理学的役割は、GAPの非酵素的ラセミ化または未知の細胞過程によって形成され得るL-GAPの解毒であると仮定されている。
【０２８４】
大腸菌酵素の結晶構造は、決定されており、四量体であることが示唆されている。しかしながら、他の者は、ゲルろ過および電子顕微鏡研究に基づき、タンパク質が八量体を形成することを見出している。
【０２８５】
具体的な態様において、L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、L-グリセルアルデヒド3-リン酸レダクターゼは、yghZ遺伝子によってコードされる。
【０２８６】
L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼ（GldA）は、以下の反応を触媒することができる：
2019520832.tif 000022
アミノアセトン＋NADH＋H+→(R)-1-アミノプロパン-2-オール＋NAD+（EC 1.1.1.75）
2019520832.tif 000023
【０２８７】
GldA酵素の生理学的機能は、長い間、不明であった。酵素は、グリセロールデヒドロゲナーゼおよびD-1-アミノ-2-プロパノール：NAD+オキシドレダクターゼとして無関係に単離された。当時、D-1-アミノ-2-プロパノールは、ビタミンB12の生合成の中間体であると考えられおり、大腸菌は新たにビタミンB12を合成することができないが、この化合物の合成を触媒する酵素が求められた。その後、GldAは両方の活性を担うことが見出された。
【０２８８】
GldAの主なインビボの役割は、グリセロールへの変換によるジヒドロキシアセトンの除去であることが最近提唱された。しかしながら、グリセロールの発酵における二重の役割も最近確立された。大腸菌におけるグリセロール異化は、2種類の異なる経路によって達成され得る。グリセロールおよびグリセロホスホジエステルの分解経路は、終末電子アクセプターの存在を必要とし、グリセロールをグリセロール-3-リン酸へリン酸化するGlp系のATP依存性キナーゼを利用する。しかしながら、キナーゼの不活化およびグリセロールでの増殖についての選択によって、NAD+関連デヒドロゲナーゼGldAが、グリセロール発酵を支持し得ることが見出された。最近、GldAは、ジヒドロキシアセトンを生成するグリセロールデヒドロゲナーゼとしても、アセトールから1,2-プロパンジオールを生成することによってNAD+を再生させる1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼとしても、グリセロール発酵に関与していることが示された。
【０２８９】
酵素は、2種類の触媒活性形態、8サブユニットの大きい形態および2サブユニットの小さい形態で見出される。大きい形態が、主要な種であるようである。
【０２９０】
具体的な態様において、L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、L-1,2-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ/グリセロールデヒドロゲナーゼは、gldA遺伝子によってコードされる。
【０２９１】
サッカロミセス・セレビシエに由来するNADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼ（GRE2）は、以下の反応を触媒することができる：
2019520832.tif 000024
【０２９２】
Gre2は、補助因子としてNADPHを使用して、脂肪族および芳香族のケトン、ジケトン、およびアルデヒドを含む広範囲の基質の立体選択的な還元を触媒する多用途の酵素である。
【０２９３】
S. セレビシエに由来するGre2の結晶構造は、アポ型については2.00Å、NADPH複合体化型については2.40Åの解像度で解析されている。Gre2は、同種二量体を形成し、そのサブユニットは、各々、N末端ロスマンフォールドドメインおよび基質認識に関与する可変性のC末端ドメインを含有している。補助因子NADPHとの結合時に誘導される適合は、2個のドメインを相互に向かってシフトさせ、基質によりよく適合するドメイン間間隙を生成する。部位特異的変異誘発および酵素活性分析と組み合わせられた計算的シミュレーションは、触媒作用のためのストリンジェントな基質立体選択性を決定する、可能性のある基質結合ポケットの特徴決定を可能にした。
【０２９４】
Gre2は、グリオキサラーゼI GLO1によるMGの解毒の代わりに、細胞傷害性化合物メチルグリオキサール（MG）の(S)-ラクトアルデヒドへの不可逆的還元を触媒する。MGは、ジヒドロキシアセトンリン酸から解糖のバイパスを介して合成され、細胞周期制御およびストレス適応において役割を果たすと信じられている。GRE2は、イソバレルアルデヒドのイソアミルアルコールへの還元も触媒する。酵素は、細胞がフィラメント形成によって応答するシグナル、イソバレルアルデヒドのレベルをモジュレートすることによって、イソアミルアルコールによって誘導されるフィラメント形成を抑制するよう機能する。GRE2は、エルゴステロール代謝にも関与している。
【０２９５】
具体的な態様において、NADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼは、グリコールアルデヒドをMEGへ変換する。いくつかの態様において、NADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼは、S. セレビシエに由来する。いくつかの態様において、NADPH依存性メチルグリオキサールレダクターゼは、GRE2遺伝子によってコードされる。
【０２９６】
チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ（EC 2.3.1.9）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000025
【０２９７】
チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、アセチルCoA-C-アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチルCoAチオラーゼ、アセチルCoA:アセチルCoA C-アセチルトランスフェラーゼ、またはチオラーゼIIとしても公知であり得る。
【０２９８】
従って、いくつかの態様において、本開示は、（アセチルCoAへの）アセト酢酸分解において役割を果たす酵素を提供する。一つの態様において、この酵素の阻害剤は、アセトアセチルCoAである。
【０２９９】
具体的な態様において、酵素は、アセチルCoAをアセトアセチルCoAへ変換する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカムに由来する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、クロストリジウム・サーモサッカロリチカムに由来する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、バチルス・セレウスに由来する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、マリノバクター・ヒドロカルボノクラスチカスATCC 49840に由来する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、thlA遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、チオラーゼ/アセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼは、atoB遺伝子によってコードされる。
【０３００】
いくつかの態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、大腸菌、サッカロミセス属の種およびマリノバクター属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされるチオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム、バチルス・セレウス、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエおよびマリノバクター・ヒドロカルボノクラスチカスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、thlA、atoBおよび/もしくはERG10、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:103、105および108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:101、102、104、106 および107からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３０１】
酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ（EC 2.8.3.-）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000026
【０３０２】
酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはアセチルCoA: アセト酢酸CoAトランスフェラーゼとしても公知であり得る。
【０３０３】
従って、いくつかの態様において、本開示は、（アセチルCoAへの）アセト酢酸分解において役割を果たす酵素を提供する。一つの態様において、この酵素の阻害剤には、アセチルCoAおよび補酵素Aが含まれ得る。
【０３０４】
短鎖脂肪酸（C3〜C6）での大腸菌の増殖は、それぞれのチオエステルへの酸の活性化を必要とする。この活性化は、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼによって触媒される。その反応は、共有結合性の酵素-CoAを含む2種類の半反応において起こる。酵素は、反応中に2個の検出可能なコンフォメーション変化を受ける。反応はピンポン機序によって進行する可能性が高いと考えられる。酵素は、多様な短鎖アシルCoA基質およびカルボン酸基質を利用することができるが、直鎖状の基質および3-ケト基質で最大活性を示す。
【０３０５】
具体的な態様において、酵素は、アセトアセチルCoAをアセト酢酸へ変換する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカムに由来する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、atoA遺伝子およびatoD遺伝子によってコードされる。もう一つの態様において、アセトアセチルCoAトランスフェラーゼのサブユニット組成は、[(AtoA)2][(AtoD)2]であり、(AtoA)2がβ複合体であり、(AtoD)2がα複合体である。一つの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、融合酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ：αサブユニット/βサブユニットである。もう一つの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼは、ydiF遺伝子によってコードされる。
【０３０６】
上記態様のいずれかにおいて、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性またはヒドロラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、トランスフェラーゼ活性を有する酵素は、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性またはヒドロラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカムから得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、大腸菌から得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、atoAおよびatoD、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、ctfAおよびctfB、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:111、114、165、167、169および171からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:109、110、112、113、164、166、168および170からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３０７】
酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ（EC 3.1.2.11）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000027
【０３０８】
アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、アセトアセチル補酵素Aヒドロラーゼ、アセトアセチルCoAデアシラーゼ、またはアセトアセチル補酵素Aデアシラーゼとしても公知であり得る。
【０３０９】
この酵素は、ヒドロラーゼのファミリー、具体的には、チオエステル結合に作用するものに属している。
【０３１０】
具体的な態様において、酵素は、アセトアセチルCoAをアセト酢酸へ変換する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカムに由来する。もう一つの態様において、アセトアセチルCoAヒドロラーゼは、ctfA（サブユニットA）遺伝子および/またはctfB（サブユニットB）遺伝子によってコードされる。
【０３１１】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.4）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
アセト酢酸＋H+→アセトン＋CO2
【０３１２】
アセト酢酸デカルボキシラーゼは、ADC、AADC、またはアセト酢酸カルボキシリアーゼとしても公知であり得る。
【０３１３】
従って、いくつかの態様において、本開示は、イソプロパノール生合成、ピルベートのアセトンへの発酵、クロストリジウム・アセトブチリカムの酸生成発酵およびソルベント生成発酵のスーパーパスウェイ、ならびに/またはクロストリジウム・アセトブチリカムのソルベント生成発酵のスーパーパスウェイにおいて役割を果たす酵素を提供する。
【０３１４】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ（ADC）は、クロストリジウム・アセトブチリカムにおけるソルベント生成において重要な役割を果たす。増殖の酸生成期においては、酸が蓄積し、ソルベント生成への代謝シフトを引き起こす。この期においては、酸が、再同化され、代謝され、アセトン、ブタノール、およびエタノールが生成される。
【０３１５】
酵素の予備精製および結晶化は、リジン残基が活性部位に関与することを明らかにした。酵素は、単一の型のサブユニットの12コピーから構成される大きい複合体である。
【０３１６】
クロストリジウム・アセトブチリカムATCC 824の酵素が精製され、それをコードするadc遺伝子がクローニングされている。関連株クロストリジウム・アセトブチリカムDSM 792からも酵素が精製され、遺伝子がクローニングされ配列決定されている。脱カルボキシル反応は、シッフ塩基中間体の形成によって進行する。
【０３１７】
ADCは、CoAトランスフェラーゼ反応をアセト酢酸形成の方向に効果的に引き寄せる、酸取り込みにおいて重要な酵素である。
【０３１８】
具体的な態様において、酵素は、アセト酢酸をアセトンへ変換する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリカムに由来する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・ベイジェリンキイに由来する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロストリジウム・セルロリティカムに由来する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、バチルス・ポリミキサに由来する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、クロモバクテリウム・ビオラセウムに由来する。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、シュードモナス・プチダに由来する。もう一つの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼは、adc遺伝子によってコードされる。
【０３１９】
いくつかの態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、クロモバクテリウム属の種、およびシュードモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・セルロリティカム、バチルス・ポリミキサ、クロモバクテリウム・ビオラセウム、およびシュードモナス・プチダから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、adcまたはそのホモログである。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:117および120からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:115、116、118および119からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３２０】
アルコールデヒドロゲナーゼ（EC 1.1.1.-）
本開示は、一級アルコールまたは二級アルコールの、それぞれ、アルデヒドまたはケトンへの可逆的酸化を触媒することができる酵素を記載する。一つの態様において、酵素は、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（S-ADH）であり、アセトンのようなケトンの、2-プロパノール（イソプロパノール）のような二級アルコールへの還元を触媒する。
【０３２１】
いくつかの態様において、S-ADHは、バークホルデリア属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、バークホルデリア属種AIU 652に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、アルカリゲネス属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、アルカリゲネス・ユートロファスに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、クロストリジウム属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、クロストリジウム・ラグスダレイに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、クロストリジウム・ベイジェリンキイに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、サーモアナエロバクター属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、サーモアナエロバクター・ブロッキイに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、サーモアナエロバクター・エタノリカス（クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム）に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、adhB遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、S-ADHは、トリパノソーマ、フィトモナス属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、ロドコッカス属の種に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、ロドコッカス・ルーバーに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、メタノバクテリウム・パルストレに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、メタン生成古細菌メタノゲニウム・リミナタンスに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、寄生性原生生物エントアメーバ・ヒストリティカ、（EhAdh1）に由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、寄生性原生動物トリトリコモナス・フィータスに由来する。いくつかの態様において、S-ADHは、ヒト寄生虫トリコモナス・バギナリスに由来する。
【０３２２】
いくつかの態様において、S-ADHは、相同性から予測され、サーモアナエロバクター・マスラニイ、ミクロコッカス・ルテウス、ノカルディオプシス・アルバ、マイコバクテリウム・ハッシアカム、ヘリコバクター・スイス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・オルトプシローシス、カンジダ・メタプシローシス、グロスマンニア・クラビゲラ、およびシェフェルソミセス・スチピチスに由来し得る。
【０３２３】
いくつかの態様において、組換え微生物は、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1種類の核酸分子を含んでもよい。1つの態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。1つの態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（S-ADH）である。別の態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、バークホルデリア属の種、アルカリゲネス属の種、クロストリジウム属の種、サーモアナエロバクター属の種、フィトモナス属の種、ロドコッカス属の種、メタノバクテリウム属の種、メタノゲニウム属の種、エントアメーバ属の種、トリコモナス属の種、およびトリトリコモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、バークホルデリア属種AIU 652、アルカリゲネス・ユートロファス、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、サーモアナエロバクター・ブロッキイ、サーモアナエロバクター・エタノリカス（クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム)、ロドコッカス・ルーバー、メタノバクテリウム・パルストレ、メタン生成古細菌メタノゲニウム・リミナタンス、寄生性原生生物エントアメーバ・ヒストリティカ、寄生性原生動物トリトリコモナス・フィータス、およびヒト寄生生物トリコモナス・バギナリスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、adh、adhB、EhAdh1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、S-ADHは、相同性から予測され、サーモアナエロバクター・マスラニイ、ミクロコッカス・ルテウス、ノカルディオプシス・アルバ、マイコバクテリウム・ハッシアカム、ヘリコバクター・スイス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・オルトプシローシス、カンジダ・メタプシローシス、グロスマンニア・クラビゲラ、およびシェフェルソミセス・スチピチス由来であり得る。さらなる態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:174および176からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO:172、173および175からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３２４】
D-キシルロース1-キナーゼ（EC 2.7.1.-）
本開示は、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒することができる酵素を記載する。いくつかの態様において、変換は、フルクトキナーゼとしても公知のヒトケトヘキソキナーゼC（khk-C）によって触媒され得る。
【０３２５】
ケトヘキソキナーゼまたはフルクトキナーゼは、フルクトースをフルクトース-1-リン酸へリン酸化する。酵素は、炭水化物代謝の一部であるフルクトース代謝に関与する。それは、肝臓、腸、および腎皮質に見出される。
【０３２６】
ヒト肝臓において、精製されたフルクトキナーゼは、アルドラーゼと共役した時に、キシリトールからシュウ酸を生成する代替機序に寄与することが発見された。共役したシーケンスにおいて、フルクトキナーゼおよびアルドラーゼは、D-キシルロースから、D-キシルロース1-リン酸を介して、シュウ酸の前駆物質であるグリコールアルデヒドを生成する。
【０３２７】
具体的な態様において、酵素は、D-キシルロースをD-キシルロース-1-リン酸へ変換する。いくつかの態様において、D-キシルロース1-キナーゼは、ケトヘキソキナーゼCである。いくつかの態様において、ケトヘキソキナーゼCは、ホモ・サピエンスに由来する。いくつかの態様において、ヒトケトヘキソキナーゼCは、khk-C遺伝子によってコードされる。
【０３２８】
1つの態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされる。1つの態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有するホモ・サピエンスの酵素は、ケトヘキソキナーゼCである。いくつかの態様において、ヒトケトヘキソキナーゼCをコードする核酸分子は、khk-Cまたはそのホモログである。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:123に示されたアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:121および122からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３２９】
D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼ
本開示は、D-キシルロース-1-リン酸のグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒することができる酵素を記載する。いくつかの態様において、変換は、フルクトースビスリン酸アルドラーゼBまたは肝臓型アルドラーゼとしても公知であるヒトアルドラーゼBによって触媒され得る。
【０３３０】
アルドラーゼBは、クラスIフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ酵素（EC 4.1.2.13）の3種類のアイソザイム（A、B、およびC）のうちの1種類であり、解糖および糖新生の両方において重要な役割を果たす。一般的なフルクトース1,6-ビスリン酸アルドラーゼ酵素は、フルクトース1,6-ビスリン酸（FBP）のグリセルアルデヒド3-リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への可逆的な切断を触媒し、フルクトース1-リン酸（F1P）のグリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸への可逆的な切断も触媒する。哺乳動物において、アルドラーゼBは、肝臓において優先的に発現されるが、アルドラーゼAは、筋肉および赤血球において発現され、アルドラーゼCは、脳において表現される。アイソザイム構造のわずかな違いは、2種類の基質分子：FBPおよびフルクトース1-リン酸に対する異なる活性をもたらす。アルドラーゼBは、好みを示さず、従って、両方の反応を触媒するが、アルドラーゼAおよびCは、FBPを好む。
【０３３１】
アルドラーゼBは、4個のサブユニットから構成される同種四量体酵素である。各サブユニットは、36kDaの分子量を有し、リジン229（触媒作用のために重要であるシッフ塩基形成アミノ酸）を囲む8本鎖α/βバレルを含有している。
【０３３２】
具体的な態様において、酵素は、D-キシルロース-1-リン酸をグリコールアルデヒドおよびDHAPへ変換する。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼは、アルドラーゼBである。いくつかの態様において、アルドラーゼBは、ホモ・サピエンスに由来する。いくつかの態様において、ヒトアルドラーゼBは、ALDOB遺伝子によってコードされる。
【０３３３】
1つの態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。さらなる態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされるD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。1つの態様において、ホモ・サピエンスのD-キシルロース 1-リン酸アルドラーゼは、アルドラーゼ Bである。いくつかの態様において、ヒトアルドラーゼ Bをコードする核酸分子は、ALDOBまたはそのホモログである。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:126に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:124および125からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３３４】
D-キシロースイソメラーゼ（EC 5.3.1.5）
本開示は、以下の可逆反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000028
【０３３５】
D-キシロースイソメラーゼは、キシロースイソメラーゼまたはD-キシロースケトールイソメラーゼとしても公知であり得る。
【０３３６】
従って、いくつかの態様において、本開示は、キシロース分解において役割を果たす酵素を提供する。
【０３３７】
キシロースイソメラーゼは、D-キシロースの異化における最初の反応を触媒する。
【０３３８】
2個の保存されたヒスチジン残基H101およびH271が、触媒作用のために必須であることが示された。2個の保存されたトリプトファン残基W49およびW188の蛍光は、キシロースの結合において消光され、W49が触媒作用のために必須であることが示された。Mg2+、Mn2+、またはCo2+の存在は、熱変性から酵素を保護する。
【０３３９】
サブユニット組成は、実験的に確立されていない。
【０３４０】
具体的な態様において、酵素は、D-キシロースをD-キシルロースへ変換する。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、xylA遺伝子によってコードされる。
【０３４１】
いくつかの態様において、MEGおよびアルコールを生成する組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を妨げ、代わりに、D-キシロースのD-キシロネートへの変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０３４２】
1つの態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、ピロマイセス属の種から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylAまたはそのホモログである。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:163および190から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:161、162および189から選択される核酸配列によってコードされる。
【０３４３】
いくつかの態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼである。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、xylA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースの変換を妨げ、代わりに、D-キシロースのD-キシロネートへの変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０３４４】
D-キシルロース-5-キナーゼ/キシルロキナーゼ
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
D-キシルロース＋ATP→D-キシルロース5-リン酸＋ADP＋H+（EC 2.7.1.17）
ATP＋1-デオキシ-D-キシルロース→1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸＋ADP＋H+（EC 2.7.1.-）
【０３４５】
D-キシルロース-5-キナーゼは、キシルロースキナーゼまたはキシルロキナーゼとしても公知であり得る。
【０３４６】
キシルロキナーゼは、キシロース分解経路の第2段階、D-キシルロースのリン酸化を触媒して、ペントースリン酸経路の中間体、D-キシルロース-5-リン酸を生成する。
【０３４７】
基質の非存在下で、キシルロキナーゼは、弱いATPアーゼ活性を有する。キシルロキナーゼは、1-デオキシ-D-キシルロースのリン酸化も触媒することができる。これは、テルペノイド、チアミン、およびピリドキサールの生合成において使用するための1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸の生成のための可能性のあるサルベージ経路を可能にするであろう。1-デオキシ-D-キシルロースのリン酸化の速度は、D-キシルロースのリン酸化の速度より32倍低い。
【０３４８】
細菌酵素の動力学的機序が研究されており、主に秩序のある反応機序が示唆された。酵素は、基質およびATPの結合時に有意なコンフォメーション変化を受ける。2個の保存されたアスパラギン酸残基D6およびD233が、触媒活性のために必須であることが見出され、触媒機序が提唱された。
【０３４９】
細菌キシルロキナーゼのアポ型およびD-キシルロース結合型の結晶構造は、それぞれ、2.7Åおよび2.1Åの解像度で決定されている。
【０３５０】
具体的な態様において、酵素は、D-キシルロースをD-キシルロース-5-リン酸へ変換する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、xylB遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、サッカロミセス・セレビシエに由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、XKS1遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、ピキア・スチピチスに由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、XYL3遺伝子によってコードされる。
【０３５１】
いくつかの態様において、MEGおよびアルコールを生成する組換え微生物は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を妨げ、代わりに、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０３５２】
キシロースデヒドロゲナーゼ
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
アルデヒド-D-キシロース＋NAD+＋H2O→D-キシロネート＋NADH＋2H+
2019520832.tif 000029
【０３５３】
キシロースデヒドロゲナーゼは、D-キシロースデヒドロゲナーゼ、D-キシロース1-デヒドロゲナーゼ、(NAD+)関連D-キシロースデヒドロゲナーゼ、NAD+-D-キシロースデヒドロゲナーゼ、D-キシロース:NAD+ 1-オキシドレダクターゼとしても公知であり得る。
【０３５４】
D-キシロースデヒドロゲナーゼは、D-キシロースのD-キシロノラクトンへのNAD+依存的な酸化を触媒する。これは、カウロバクター・クレセンタスにおけるD-キシロースの分解のための酸化的非リン酸化経路の最初の反応である。この経路は、アゾスピリルム・ブラジレンス（Azospirillum brasilense）におけるL-アラビノース分解のための経路と類似している。C.クレセンタス酵素のアミノ酸配列は、古細菌ハロアーキュラ・マリスモーツイに由来するキシロースデヒドロゲナーゼまたはアゾスピリルム・ブラジレンスのL-アラビノース1-デヒドロゲナーゼのものに関連していない。
【０３５５】
D-キシロースは、カウロバクター・クレセンタスに由来する組換えD-キシロースデヒドロゲナーゼのための好ましい基質である。酵素は、L-アラビノースを使用することができるが、それは不十分な基質である。L-アラビノースに対するKmは166mMである。D-アラビノース、L-キシロース、D-リボース、D-ガラクトース、D-グルコース、およびD-グルコース-6-リン酸のような他の基質は、NADH生成によって測定されるように、アッセイにおいてほとんどまたは全く活性を示さなかった。C.クレセンタスD-キシロースデヒドロゲナーゼは、D-キシロースを直接D-キシロネートへ変換することができる。
【０３５６】
C.クレセンタスから部分精製されたネイティブのD-キシロースデヒドロゲナーゼは、D-キシロースに対して70μMというKmを有していた。この値は、組換えのHisタグ付き酵素に対する760μMというKmより低かった。
【０３５７】
いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、好塩性古細菌ハロフェラックス・ボルカニイに由来する。ハロフェラックス・ボルカニイD-キシロースデヒドロゲナーゼは、好塩性古細菌ハロフェラックス・ボルカニイの酸化的キシロース分解経路の最初の反応を触媒する。H.ボルカニイD-キシロースデヒドロゲナーゼは、ハロアーキュラ・マリスモーツイに由来する機能的に特徴決定されたキシロースデヒドロゲナーゼとの59％のアミノ酸配列同一性を示し、ハロルブラム・ラクスプロファンディにおけるオルソログとの56％の同一性を示すが、カウロバクター・クレセンタスCB15に由来する細菌NAD+依存性キシロースデヒドロゲナーゼとは11％しか同一でない。
【０３５８】
具体的な態様において、酵素は、D-キシロースをD-キシロノラクトンへ変換する。いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、カウロバクター・クレセンタスに由来する。いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、xylB遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、ハロフェラックス・ボルカニイに由来する。いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、ハロアーキュラ・マリスモーツイに由来する。いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、ハロルブラム・ラクスプロファンディに由来する。いくつかの態様において、D-キシロースデヒドロゲナーゼは、xdh遺伝子によってコードされる。
【０３５９】
1つの態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロアーキュラ属の種、ハロフェラックス属の種、ハロルブラム属の種、およびトリコデルマ属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロアーキュラ・マリスモーツイ、ハロフェラックス・ボルカニイ、ハロルブラム・ラクスプロファンディ、およびトリコデルマ・リーゼイから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylB、xdh（HVO_B0028）、xyd1、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:129、131および133からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:127、128、130 および132からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３６０】
キシロノラクトナーゼ（3.1.1.68）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000030
【０３６１】
この酵素は、ヒドロラーゼ、具体的には、カルボン酸エステル結合に作用するもののファミリーに属する。この酵素は、ペントースおよびグルクロン酸の相互変換に関与する。
【０３６２】
キシロノラクトナーゼは、D-キシロノラクトナーゼ、キシロノ-1,4-ラクトナーゼ、キシロノ-γ-ラクトナーゼ、またはD-キシロノ-1,4-ラクトンラクトノヒドロラーゼとしても公知であり得る。
【０３６３】
具体的な態様において、酵素は、D-キシロノラクトンをD-キシロネートへ変換する。いくつかの態様において、D-キシロノラクトナーゼは、ハロフェラックス属の種に由来する。いくつかの態様において、D-キシロノラクトナーゼは、ハロフェラックス・ボルカニイに由来する。いくつかの態様において、D-キシロノラクトナーゼは、ハロフェラックス・ギボンシイに由来する。いくつかの態様において、D-キシロノラクトナーゼは、カウロバクター・クレセンタスに由来する。いくつかの態様において、D-キシロノラクトナーゼは、xylC遺伝子によってコードされる。
【０３６４】
1つの態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、およびハロフェラックス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス, ハロフェラックス・ボルカニイおよびハロフェラックス・ギボンシイから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylCまたはそのホモログである。さらなる態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:135に示されたアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:134に示された核酸配列によってコードされる。
【０３６５】
キシロン酸デヒドラターゼ（EC 4.2.1.82）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000031
【０３６６】
この酵素は、炭素-酸素結合を切断するリアーゼ、具体的には、ヒドロリアーゼのファミリーに属する。この酵素は、ペントースおよびグルクロン酸の相互変換に関与する。
【０３６７】
キシロン酸デヒドラターゼは、D-キシロン酸ヒドロリアーゼ、D-キシロアルドン酸デヒドラターゼ、またはD-キシロン酸デヒドラターゼとしても公知であり得る。
【０３６８】
具体的な態様において、酵素は、D-キシロネートを2-ケト-3-デオキシD-キシロネートへ変換する。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、カウロバクター・クレセンタスに由来する。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、xylD遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、yjhG遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、yagF遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、ハロフェラックス・ボルカニイに由来する、いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、xad遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼは、スルホロブス・ソルファタリカスに由来する。
【０３６９】
1つの態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロフェラックス属の種、スルホロブス属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイ、大腸菌およびスルホロブス・ソルファタリカスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylD、yjhG、yagF、xad、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:137、140および143からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:136、138、139、141および142からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３７０】
2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ（4.1.2.28）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000032
【０３７１】
この酵素は、炭素-炭素結合を切断するリアーゼ、具体的には、アルデヒドリアーゼのファミリーに属する。この酵素は、ペントースおよびグルクロン酸の相互変換に関与する。
【０３７２】
2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼは、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-ペントン酸グリコールアルデヒドリアーゼ（ピルベート形成）、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ、3-デオキシ-D-ペンツロソン酸アルドラーゼ、および2-デヒドロ-3-デオキシ-D-ペントン酸グリコールアルデヒドリアーゼとしても公知であり得る。
【０３７３】
YjhHは、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼであるようである。遺伝学的証拠は、YagEも、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼとして機能し得ることを示唆する。yagEは、プロファージCP4-6の一部である。
【０３７４】
yjhH yagE二重変異体は、唯一の炭素源としてD-キシロネートを使用することができず、粗細胞抽出物は、2-デヒドロ-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を含有していない。両方の表現型が、プラスミド上のyjhHを提供することによって補完される。
【０３７５】
ArcAは、嫌気生活下でのyjhH遺伝子発現を活性化するようである。この遺伝子の211bp上流および597bp上流に2個の推定ArcA結合部位が同定されたが、その上流にプロモーターは同定されていない。
【０３７６】
YagEの結晶構造は、タンパク質が同種四量体であることを示唆する。ピルベートおよび2-ケト-3-デオキシガラクトン酸の存在下でのYagEの共結晶構造が解析されている。
【０３７７】
具体的な態様において、酵素は、2-ケト-3-デオキシキシロネートをグリコールアルデヒドおよびピルベートへ変換する。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼは、シュードモナス属の種に由来する。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼは、yjhH遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼは、yagE遺伝子によってコードされる。
【０３７８】
1つの態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、yjhH、yagE、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:146および149からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:144、145、147および148からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０３７９】
グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（1.2.1.21）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000033
【０３８０】
この酵素は、オキシドレダクターゼ、具体的には、NAD+またはNADP+をアクセプターとして、ドナーのアルデヒド基またはオキソ基に作用するもののファミリーに属する。この酵素は、グリオキシル酸およびジカルボン酸の代謝に関与する。
【０３８１】
グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、グリコールアルデヒド:NAD+オキシドレダクターゼまたはグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼとしても公知であり得る。
【０３８２】
大腸菌において、アルデヒドデヒドロゲナーゼA（AldA）は、小さいαヒドロキシアルデヒド基質に対する比較的広い基質特異性を有する酵素である。従って、それは、いくつかの代謝経路において利用される。
【０３８３】
L-フコースおよびL-ラムノースは、平行な経路を通して代謝されるが、対応するアルドラーゼ反応の後に収束して、同一の生成物：ジヒドロキシアセトンリン酸およびL-ラクトアルデヒドを与える。好気的に、アルデヒドデヒドロゲナーゼAは、L-ラクトアルデヒドをL-ラクテートへ酸化する。
【０３８４】
同一の酵素を利用する平行な経路において、D-アラビノースおよびL-キシロースは、ジヒドロキシアセトンリン酸およびグリコールアルデヒドへ代謝され、それが、アルデヒドデヒドロゲナーゼAによってグリコレートへ酸化される。
【０３８５】
単独の酵素、三元複合体、および二元複合体の結晶構造が解析されている。
【０３８６】
アルデヒドデヒドロゲナーゼAは、好気条件下でのみ存在し、フコース、ラムノース、またはグルタミン酸の存在によって最も高度に誘導される。酵素は、ラクトアルデヒドの酸化から、プロパンジオールオキシドレダクターゼによる還元へシフトするためのスイッチとして機能し得るNADHによって阻害される。AldAは、グルコース制限への短期順応においてアップレギュレートされる。
【０３８７】
配列類似性に基づき、AldAは、コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼであると予測された。
【０３８８】
aldA発現の制御は、調査されている。遺伝子は、異化産物抑制、ArcAを介した嫌気条件下での抑制、および炭素源による誘導によって制御される。
【０３８９】
具体的な態様において、酵素は、グリコールアルデヒドをグリコレートへ変換する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子によってコードされる。
【０３９０】
いくつかの態様において、MEGおよびアルコールを生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、グリコールアルデヒドのMEGへの変換に向けて反応を切り替えるために、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０３９１】
乳酸デヒドロゲナーゼ（1.1.1.28）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
(R)-ラクテート＋NAD+←ピルベート＋NADH＋H+
【０３９２】
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）は、動物、植物、および原核生物のようなほぼ全ての生細胞に見出される酵素である。LDHは、NADHからNAD+へおよびその逆の変換と同様に、ラクテートからピルビン酸へおよびその逆の変換を触媒する。デヒドロゲナーゼは、ある分子からもう一つの分子へ水素化物を移す酵素である。
【０３９３】
LDHは4種類の別個の酵素クラスに存在する。最も一般的なものは、NAD(P)依存性L-乳酸デヒドロゲナーゼである。他のLDHは、D-ラクテートに作用し、かつ/またはシトクロムc:D-乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロム）およびL-乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロム）に対して依存性である。
【０３９４】
LDHは、血球および心筋のような身体組織に広範に見出されるため、医学的に重要である。それは、組織傷害において放出されるため、一般的な損傷および心不全のような疾患のマーカーである。
【０３９５】
ラクテートデヒドロゲナーゼは、乳酸デヒドロゲナーゼ、(R)-ラクテート:NAD+オキシドレダクターゼ、またはD-乳酸デヒドロゲナーゼ（発酵的）としても公知であり得る。
【０３９６】
大腸菌において、乳酸デヒドロゲナーゼ（LdhA）は、D-ラクテートの生成に特異的な可溶性NAD関連乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）である。LdhAは、同種四量体であり、より高いpH条件の下で正のホモトロピック協同性を示す。
【０３９７】
大腸菌は、2種類の他の乳酸デヒドロゲナーゼ：D-乳酸デヒドロゲナーゼおよびL-乳酸デヒドロゲナーゼを含有している。いずれも、ラクテートでの好気増殖のために必要とされる膜結合型黄色酵素である。
【０３９８】
LdhAは、好気条件下で存在するが、大腸菌が、酸性pHで嫌気条件下で多様な糖で増殖する時に誘導される。無気呼吸に関与する遺伝子の大部分と異なり、ldhAは、Fnrによって活性化されず；むしろ、ArcAB系ならびに炭水化物代謝の調節に関与する数種類の遺伝子（csrABおよびmlc）が、発現を制御するようである。ldhAの発現は、転写制御因子ArcAによって負の影響を受ける。ldhAはσ32レギュロンに属する。
【０３９９】
ldhA遺伝子は、しばしば、代謝工学における変異の標的となり、それは、望ましくない発酵副生成物の生成を排除するためである場合が最も多いが、D-ラクテートを特異的に生成するためでもあり得る。
【０４００】
具体的な態様において、酵素は、ピルベートをラクテートへ変換する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子によってコードされる。
【０４０１】
いくつかの態様において、MEGおよびアルコールを生成する組換え微生物は、ピルベートからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、アルコールの生成に向けて反応を切り替えるために、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０４０２】
キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼ（EC 1.1.1.21）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000034
【０４０３】
アルドースレダクターゼは、アルジトール:NAD(P)+ 1-オキシドレダクターゼ、ポリオールデヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドレダクターゼとしても公知であり得る。
【０４０４】
アルドースレダクターゼは、単糖を含む多様なアルデヒドおよびカルボニルの還元を触媒するサイトゾルオキシドレダクターゼである。
【０４０５】
アルドースレダクターゼは、アルド・ケトレダクターゼ酵素スーパーファミリーの原型酵素と見なされ得る。酵素は、315アミノ酸残基を含み、8本の平行なβ鎖から構成されるβ/αバレル構造モチーフに折り畳まれている。隣接した鎖は、逆平行向きの8個の外側αヘリカルセグメントによってβシートに接続されている。触媒活性部位は、バレルコアに位置している。NADPH補助因子は、β/αバレルの最上部に位置しており、ニコチンアミド環がバレルの中心において下へ突き出し、ピロリン酸がバレルリップにまたがっている。
【０４０６】
アルデヒド還元の方向におけるアルドースレダクターゼの反応機序は、NADPHが結合し、続いて、基質が結合する、連続的な秩序のあるパスに従う。NADPHの結合は、安全ベルトと同様にNADPHの一部をカバーするための表面ループ（残基213〜217）のヒンジ様移動を含むコンフォメーション変化（酵素・NADPH→酵素*・NADPH）を誘導する。基質のカルボニル炭素の面への、NADPHのプロR水素化物の転移を介して、アルコール生成物が形成される。アルコール生成物の放出の後、NADP+を放出するため、もう一つのコンフォメーション変化が起こる（E*・NAD(P)+→E・NAD(P)+）。動力学的研究は、NADP+の放出を可能にするこのループの再配向が、アルデヒド還元の方向における律速段階を表すようであることを示した。補酵素放出の速度が触媒速度を制限するため、補酵素結合を安定化する相互作用の妨害は、最大速度（Vmax）に対して劇的な効果を及ぼし得ることが分かる。
【０４０７】
D-キシロース発酵性のピキア・スチピチスおよびカンジダ・シェハテは、NADPHおよびNADHの両方で活性を有する単一のアルドースレダクターゼ（ALR）を産生することが示された。パキソレン・タンノフィルスおよびC.トロピカリスのようなその他の酵母は、異なる補酵素特異性を有するALRの複数の型を合成する。有意な二重補酵素特異性は、哺乳動物または微生物の起源からこれまでに単離された大部分の他のALRと、P.スチピチスおよびC.シェハテの酵素を区別する。酵母カンジダ・テヌイスCBS 4435は、D-キシロースでの増殖中に、比較可能なNADHおよびNADPHに関連したアルデヒド還元活性を生成する。
【０４０８】
具体的な態様において、酵素は、D-キシロースをキシリトールへ変換する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、ヒポクレア・ジェコリナに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、xyl1遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、サッカロミセス・セレビシエに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、GRE3遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、パキソレン・タンノフィルスに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、ピキア属の種に由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、ピキア・スチピチスに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、ピキア・クエルカムに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、カンジダ属の種に由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、カンジダ・シェハテに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、カンジダ・テヌイスに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、カンジダ・トロピカリスに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、アスペルギルス・ニガーに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、ニューロスポラ・クラッサに由来する。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼは、クリプトコッカス・ラクタチボルスに由来する。
【０４０９】
1つの態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素は、ヒポクレア属の種、シェフェルソミセス属の種、サッカロミセス属の種、パキソレン属の種、ピキア属の種、カンジダ属の種、アスペルギルス属の種、ニューロスポラ属の種、およびクリプトコッカス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、ヒポクレア・ジェコリナ、シェフェルソミセス・スチピチス、S. セレビシエ、パキソレン・タンノフィルス、ピキア・スチピチス、ピキア・クエルカム、カンジダ・シェハテ、カンジダ・テヌイス、カンジダ・トロピカリス、アスペルギルス・ニガー、ニューロスポラ・クラッサ、およびクリプトコッカス・ラクタチボルスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xyl1、GRE3、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:152および155からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:150、151、153および154からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４１０】
キシリトールデヒドロゲナーゼ（1.1.1.9）
本開示は、以下の反応を触媒することができる酵素を記載する：
2019520832.tif 000035
【０４１１】
キシリトールデヒドロゲナーゼは、D-キシルロースレダクターゼ、NAD+依存性キシリトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、2,3-cis-ポリオール（DPN）デヒドロゲナーゼ（C3-5）、ペンチトール-DPNデヒドロゲナーゼ、キシリトール-2-デヒドロゲナーゼ、またはキシリトール:NAD+ 2-オキシドレダクターゼ（D-キシルロース形成）としても公知であり得る。
【０４１２】
キシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH）は、真核生物代謝へのキシロースの同化を担う数種類の酵素のうちの1種類であり、エタノールを生成するための、農業副生成物に含有されているキシロースの発酵のために有用である。高いフラックス速度での効率的なキシロース利用のためには、NAD+特異的XDHと、経路のもう一つの酵素であるNADPHを好むキシロースレダクターゼとの間で、共基質が再利用されるべきである。
【０４１３】
具体的な態様において、酵素は、キシリトールをD-キシルロースへ変換する。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼは、酵母に由来する。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼは、ピキア属の種、サッカロミセス属の種、グルコノバクター属の種、ガラクトカンジダ属の種、ニューロスポラ属の種、またはセラチア属の種に由来する。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼは、ピキア・スチピチス、S. セレビシエ、グルコノバクター・オキシダンス、ガラクトカンジダ・マストターミチス、ニューロスポラ・クラッサ、またはセラチア・マルセッセンスに由来する。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼは、xyl2またはxdhlによってコードされる。
【０４１４】
1つの態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、シェフェルソミセス属の種、トリコデルマ属の種、ピキア属の種、サッカロミセス属の種、グルコノバクター属の種、ガラクトカンジダ属の種、ニューロスポラ属の種、およびセラチア属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シェフェルソミセス・スチピチス、トリコデルマ・リーゼイ、ピキア・スチピチス、S. セレビシエ、グルコノバクター・オキシダンス、ガラクトカンジダ・マストターミチス、ニューロスポラ・クラッサ、およびセラチア・マルセッセンスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、xyl2、xdh1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:158および160からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:156、157および159からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４１５】
アルカリホスファターゼ（EC 3.1.3.1）
アルカリホスファターゼは、ヌクレオチド、タンパク質、およびアルカロイドを含む多くのタイプの分子からのリン酸基の除去を担うヒドロラーゼ酵素である。その名称が示唆するように、アルカリホスファターゼは、アルカリ環境において最も有効である。それは、時に、塩基性ホスファターゼと同義に使用される。
【０４１６】
S. セレビシエPho13アルカリホスファターゼ酵素は、60kDaの分子量を有する単量体タンパク質であり、p-ニトロフェニルリン酸を加水分解し、pH 8.2における最大活性は、Mg2+イオンに強く依存し、3.6×10(-5)Mという見かけのKmを有する。リン酸化されたヒストンII-Aおよびカゼイン以外の試験された他の基質は、有意な速度で加水分解されなかった。これらのデータは、p-ニトロフェニルリン酸に特異的なホスファターゼの生理学的役割が、可逆的なタンパク質リン酸化への関与を含み得ることを示唆する。
【０４１７】
具体的な態様において、酵素は、D-キシルロース-5-リン酸をD-キシルロースへ変換する。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼは、酵母に由来する。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼは、サッカロミセス属の種に由来する。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼは、S. セレビシエに由来する。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼは、PHO13遺伝子によってコードされる。
【０４１８】
いくつかの態様において、MEGおよびアルコールを生成する組換え微生物は、D-キシルロース-5-リン酸のD-キシルロースへの変換を防止するため、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子に欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０４１９】
組換え微生物を用いる1種類または複数種類の一級アルケンの生成
上述のように、第1の局面において、本開示は、
構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成する能力を有する組換え微生物であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒する1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を発現する、前記組換え微生物に関する：
2019520832.tif 000036
式中、R1＝CnH2n＋1、1≦n≦11；R2＝CmH2m＋1、0≦m≦10かつn＋m≦11である。
【０４２０】
1つの態様において、組換え微生物は、再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子をさらに発現する。
【０４２１】
1つの態様において、対応する一級アルケンはプロペンであり、一級アルコールは1-プロパノールである。別の態様において、対応する一級アルケンはプロペンであり、二級アルコールは2-プロパノールである。いくつかの態様において、対応する一級アルケンはブテンであり、一級アルコールは1-ブタノールである。さらなる態様において、対応する一級アルケンはブテンであり、二級アルコールは2-ブタノールである。
【０４２２】
1つの態様において、1種類または複数種類の一級アルケンは、一段階の酵素的段階を介して1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される。いくつかの態様において、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成は、脱水段階を含む。さらなる態様において、脱水段階は基質活性化非依存性である。一層さらなる態様において、脱水段階は補助因子非依存性である。
【０４２３】
1つの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、カステラニエラ・デフラグランスの種からなる群より選択される微生物から得られる。
【０４２４】
いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61および63からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、およびさらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、およびさらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【０４２５】
いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60および62かならる群より選択される核酸配列によってコードされる。さらなる態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼはLinDである。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:64、65、66、67および68からなる群より選択されるアミノ酸配列で構成されない。
【０４２６】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【０４２７】
1つの態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種、メソリゾビウム属の種、およびロドバクター属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シュードモナス・シコリイ、シュードモナス属種 ST-24、メソリゾビウム・ロティ、およびロドバクター・スフェロイデスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、dte、C1KKR1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、1種類または複数種類の核酸分子は、FJ851309.1またはそのホモログである。さらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:71および73からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:69、70および72からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４２８】
1つの態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucKまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:76に示されたアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:74および75からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４２９】
1つの態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucAまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:79に示されたアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:77および78からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４３０】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【０４３１】
1つの態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされる。1つの態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有するホモ・サピエンス酵素は、ケトヘキソキナーゼCである。いくつかの態様において、ヒトケトヘキソキナーゼCをコードする核酸分子は、khk-Cまたはそのホモログである。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:123に示されたアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:121および122からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４３２】
1つの態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。さらなる態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされるD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。1つの態様において、ホモ・サピエンスD-キシルロース 1-リン酸アルドラーゼは、アルドラーゼ Bである。いくつかの態様において、ヒトアルドラーゼ Bをコードする核酸分子は、ALDOBまたはそのホモログである。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:126に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:124および125からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４３３】
1つの態様において、組換え微生物は、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０４３４】
いくつかの態様において、内在性D-キシロースイソメラーゼは、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する。
【０４３５】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（g）（f）由来のアセトアセチルCoA からアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；および/または
（i）（h）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【０４３６】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；および/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【０４３７】
1つの態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロアーキュラ属の種、ハロフェラックス属の種、ハロルブラム属の種、およびトリコデルマ属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロアーキュラ・マリスモーツイ、ハロフェラックス・ボルカニイ、ハロルブラム・ラクスプロファンディ、およびトリコデルマ・リーゼイから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylB、xdh（HVO_B0028)、xyd1、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:129、131および133からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:127、128、130および132からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４３８】
1つの態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種およびハロフェラックス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイおよびハロフェラックス・ギボンシイから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylCまたはそのホモログである。さらなる態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:135に示されたアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:134に示された核酸配列によってコードされる。
【０４３９】
1つの態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロフェラックス属の種、スルホロブス属の種、および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイ、大腸菌、およびスルホロブス・ソルファタリカスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylD、yjhG、yagF、xad、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:137、140および143からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:136、138、139、141および142からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４４０】
1つの態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、yjhH、yagE、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:146および149からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:144、145、147および148からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４４１】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートのラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０４４２】
1つの態様において、組換え微生物は、外来性のD-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼもしくはアルドースレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性の核酸分子、およびキシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性の核酸分子；
（b）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性の核酸分子、
のうちの一つまたは複数を発現し、さらに
（c）（a）もしくは（b）由来のD-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のD-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のD-リブロース-1-リン酸のグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼもしくはメチルグリオキサールレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸のアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの一つまたは複数を発現する。
【０４４３】
1つの態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素は、ヒポクレア属の種、シェフェルソミセス属の種、サッカロミセス属の種、パキソレン属の種、ピキア属の種、カンジダ属の種、アスペルギルス属の種、ニューロスポラ属の種、およびクリプトコッカス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、ヒポクレア・ジェコリナ、シェフェルソミセス・スチピチス、S. セレビシエ、パキソレン・タンノフィルス、ピキア・スチピチス、ピキア・クエルカム、カンジダ・シェハテ、カンジダ・テヌイス、カンジダ・トロピカリス、アスペルギルス・ニガー、ニューロスポラ・クラッサ、およびクリプトコッカス・ラクタチボルスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xyl1、GRE3、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:152および155からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:150、151、153および154からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４４４】
1つの態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、シェフェルソミセス属の種、トリコデルマ属の種、ピキア属の種、サッカロミセス属の種、グルコノバクター属の種、ガラクトカンジダ属の種、ニューロスポラ属の種、およびセラチア属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シェフェルソミセス・スチピチス、トリコデルマ・リーゼイ、ピキア・スチピチス、S. セレビシエ、グルコノバクター・オキシダンス、ガラクトカンジダ・マストターミチス、ニューロスポラ・クラッサ、およびセラチア・マルセッセンスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、xyl2、xdh1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:158および160からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:156、157および159からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４４５】
1つの態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、ピロマイセス属の種から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylAまたはそのホモログである。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:163および190から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:161、162および189から選択される核酸によってコードされる。
【０４４６】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）D-キシルロース-5-リン酸のD-キシルロースへの変換を触媒するアルカリホスファターゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０４４７】
上記態様のいずれかにおいて、DHAPは、微生物における内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換される。
【０４４８】
上記態様のいずれかにおいて、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌またはS. セレビシエから選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucO、yqhD、dkgA（yqhE)、dkgB（yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2、またはそれらのホモログから選択される。別の態様において、1種類または複数種類の核酸分子はyqhDである。いくつかの態様において、yqhDはG149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:81、83、85、88、91、93、96、98および100からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:80、82、84、86、87、89、90、92、94、95、97および99からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４４９】
上記態様のいずれかにおいて、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性有する酵素である。さらなる態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、大腸菌、サッカロミセス属の種、およびマリノバクター属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされるチオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム、バチルス・セレウス、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、およびマリノバクター・ヒドロカルボノクラスチカスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、thlA、atoBおよび/もしくはERG10、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:103、105および108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:101、102、104、106および107からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４５０】
上記態様のいずれかにおいて、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性またはヒドロラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、トランスフェラーゼ活性を有する酵素は、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性またはヒドロラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカムから得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、大腸菌から得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、atoAおよびatoD、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、ctfAおよびctfB、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:111、114、165、167、169および171からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:109、110、112、113、164、166、168および170からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４５１】
上記態様のいずれかにおいて、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、クロモバクテリウム属の種、およびシュードモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・セルロリティカム、バチルス・ポリミキサ、クロモバクテリウム・ビオラセウム、およびシュードモナス・プチダから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、adcまたはそのホモログである。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:117および120からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:115、116、118および119からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４５２】
上記態様のいずれかにおいて、組換え微生物は、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1種類の核酸分子を含んでもよい。1つの態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。1つの態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（S-ADH）である。別の態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、バークホルデリア属の種、アルカリゲネス属の種、クロストリジウム属の種、サーモアナエロバクター属の種、フィトモナス属の種、ロドコッカス属の種、メタノバクテリウム属の種、メタノゲニウム属の種、エントアメーバ属の種、トリコモナス属の種、およびトリトリコモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、バークホルデリア属種AIU 652、アルカリゲネス・ユートロファス、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、サーモアナエロバクター・ブロッキイ、サーモアナエロバクター・エタノリカス（クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム)、ロドコッカス・ルーバー、メタノバクテリウム・パルストレ、メタン生成古細菌メタノゲニウム・リミナタンス、寄生性原生生物エントアメーバ・ヒストリティカ、寄生性原生動物トリトリコモナス・フィータス、およびヒト寄生生物トリコモナス・バギナリスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、adh、adhB、EhAdh1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、S-ADHは、相同性から予測され、サーモアナエロバクター・マスラニイ、ミクロコッカス・ルテウス、ノカルディオプシス・アルバ、マイコバクテリウム・ハッシアカム、ヘリコバクター・スイス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・オルトプシローシス、カンジダ・メタプシローシス、グロスマンニア・クラビゲラ、およびシェフェルソミセス・スチピチス由来であり得る。さらなる態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:174および176からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO:172、173および175からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４５３】
上記態様のいずれかにおいて、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-5-キナーゼである。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、大腸菌由来である。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、xylB遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を妨げ、代わりに、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０４５４】
上記態様のいずれかにおいて、グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、グリコールアルデヒドのへの変換に向けて反応を切り替えるために、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０４５５】
上記態様のいずれかにおいて、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の態様において、酵素は、ピルベートをラクテートに変換する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、ピルベートからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、イソプロパノールの生成に向けて反応を切り替えるために、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０４５６】
上記態様のいずれかにおいて、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼである。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、xylA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を妨げ、代わりに、D-キシロースのD-キシロネートへの変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０４５７】
1つの態様において、組換え微生物は、イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する。
【０４５８】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０４５９】
1つの態様において、組換え微生物は、n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼまたはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）または（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオール-デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、DHAPおよびピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０４６０】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０４６１】
1つの態様において、組換え微生物は、アセトン、ブタノールおよびエタノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへまたは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０４６２】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０４６３】
1つの態様において、組換え微生物は、イソプロパノール 、ブタノールおよびエタノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへ、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへ、または（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０４６４】
いくつかの態様において、組換え微生物は、リン酸ブチリルのブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０４６５】
1つの態様において、組換え微生物は、イソブタノールを生成する能力を有し、かつ
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2、3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2、3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０４６６】
いくつかの態様において、組換え微生物は、
（a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０４６７】
さらなる別の局面において、本開示は、いずれかの態様において上述されているように、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の一級アルケンを生成する組換え微生物を生成する方法を提供する。
【０４６８】
組換え微生物
本開示は、様々な内在性または外来性の酵素を発現するよう操作され得る微生物を提供する。
【０４６９】
本明細書中に記載された様々な態様において、組換え微生物は、真核微生物である。いくつかの態様において、真核微生物は、酵母である。例示的な態様において、酵母は、ヤロウイア（Yarrowia）、カンジダ、サッカロミセス、ピキア、ハンゼヌラ（Hansenula）、クリベロミセス（Kluyveromyces）、イサチェンキア（Issatchenkia）、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）、デバリオミセス（Debaryomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）、パキソレン、クリプトコッカス、トリコスポロン（Trichosporon）、ロドトルラ（Rhodotorula）、およびミキソザイマ（Myxozyma）からなる群より選択される属のメンバーである。
【０４７０】
いくつかの態様において、組換え微生物は、原核微生物である。例示的な態様において、原核微生物は、エシェリキア、クロストリジウム、ザイモモナス（Zymomonas）、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、ラクトバチルス、エンテロコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス（Paenibacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウム（Brevibacterium）からなる群より選択される属のメンバーである。
【０４７１】
いくつかの態様において、組換え微生物は、本明細書において開示された1種類または複数種類の一級アルケンを生成するために用いられる。いくつかの態様において、組換え微生物は、1種類または複数種類の一級アルケンに変換される1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールを生成するために用いられる。
【０４７２】
したがって、別の局面において、本発明は、本明細書に記載の組換え微生物を用いて1種類または複数種類の一級アルケンを生成する方法を提供する。1つの態様において、方法は、1種類または複数種類の一級アルケンが生成されるまで、炭素源を供給する原料を含有する培養培地において組換え微生物を培養する工程を含む。さらなる態様において、1種類または複数種類の一級アルケンが回収される。回収は、蒸留、膜に基づく分離、ガスストリッピング、溶媒抽出、および膨張床（expanded bed）吸着など、当技術分野において公知の方法による回収であり得る。例示的な態様において、1種類または複数種類の一級アルケンは、表1に列記したプロペン、ブテン、および任意のアルケンから選択される。
【０４７３】
いくつかの態様において、原料は炭素源を含む。本明細書に記載された種々の態様において、炭素源は、糖、グリセロール、アルコール、有機酸、アルカン、脂肪酸、リグノセルロース、タンパク質、二酸化炭素、および一酸化炭素よから選択されてもよい。例示的な態様において、炭素源は糖である。さらなる例示的な態様において、糖はグルコースである。代替の態様において、糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、およびスクロールからなる群より選択される。
【０４７４】
1種類または複数種類の一級アルケンを生成する方法
上述のように、別の局面において、本開示は、
構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成する方法であって、
1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒する1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を組換え微生物において発現させる工程を含む、前記方法に関する：
2019520832.tif 000037
式中、R1＝CnH2n＋1、1≦n≦11；R2＝CmH2m＋1、0≦m≦10かつn＋m≦11である。
【０４７５】
1つの態様において、方法は、再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を組換え微生物において発現させる工程をさらに含む。さらなる態様において、再生可能原料は1種類または複数種類の糖である。
【０４７６】
1つの態様において、対応する一級アルケンはプロペンであり、一級アルコールは1-プロパノールである。別の態様において、対応する一級アルケンはプロペンであり、二級アルコールは2-プロパノールである。いくつかの態様において、対応する一級アルケンはブテンであり、一級アルコールは1-ブタノールである。さらなる態様において、対応する一級アルケンはブテンであり、二級アルコールは2-ブタノールである。
【０４７７】
1つの態様において、1種類または複数種類の一級アルケンは、一段階の酵素的段階を介して1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される。いくつかの態様において、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成は、脱水段階を含む。さらなる態様において、脱水段階は基質活性化非依存性である。一層さらなる態様において、脱水段階は補助因子非依存性である。
【０４７８】
1つの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、カステラニエラ・デフラグランス種からなる群より選択される微生物から得られる。
【０４７９】
いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61および63から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、およびさらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする核酸配列は、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される核酸配列に対して、少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、およびさらに最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【０４８０】
いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。さらなる態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼはLinDである。いくつかの態様において、リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼは、SEQ ID NO:64、65、66、67および68からなる群より選択されるアミノ酸配列で構成されない。
【０４８１】
1つの態様において、方法は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含む。
【０４８２】
1つの態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースのD-リブロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種、メソリゾビウム属の種、およびロドバクター属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シュードモナス・シコリイ、シュードモナス属種 ST-24、メソリゾビウム・ロティ、およびロドバクター・スフェロイデスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、dte、C1KKR1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、1種類または複数種類の核酸分子は、FJ851309.1またはそのホモログである。さらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:71および73からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-タガトース3-エピメラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:69、70および72からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４８３】
1つの態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロースのD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucKまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:76に示されたアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロキナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:74および75からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４８４】
1つの態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucAまたはそのホモログである。さらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:79に示されたアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、D-リブロース-1-リン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:77および78からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４８５】
1つの態様において、方法は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含む。
【０４８６】
1つの態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされる。1つの態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有するホモ・サピエンスの酵素は、ケトヘキソキナーゼCである。いくつかの態様において、ヒトケトヘキソキナーゼCをコードする核酸分子は、khk-Cまたはそのホモログである。別の態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:123に示されたアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、D-キシルロース1-キナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:121および122からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４８７】
1つの態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。さらなる態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびDHAPへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酵素は、ホモ・サピエンスから得られる核酸分子によってコードされるD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼである。1つの態様において、ホモ・サピエンスの D-キシルロース 1-リン酸アルドラーゼは、アルドラーゼ Bである。いくつかの態様において、ヒトアルドラーゼ Bをコードする核酸分子は、ALDOBまたはそのホモログである。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:126に示されたアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、D-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:124および125からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４８８】
1つの態様において、方法は、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。
【０４８９】
いくつかの態様において、内在性D-キシロースイソメラーゼは、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する。
【０４９０】
1つの態様において、方法は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（g）（f）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；および/または
（i）（h）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含む。
【０４９１】
1つの態様において、方法は、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）D-キシロースのD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；および/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含む。
【０４９２】
1つの態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのD-キシロノラクトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロアーキュラ属の種、ハロフェラックス属の種、ハロルブラム属の種、およびトリコデルマ属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロアーキュラ・マリスモーツイ、ハロフェラックス・ボルカニイ、ハロルブラム・ラクスプロファンディ、およびトリコデルマ・リーゼイから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylB、xdh（HVO_B0028)、xyd1、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:129、131および133からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロースデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:127、128、130および132からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４９３】
1つの態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロノラクトンのD-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性有する酵素は、カウロバクター属の種およびハロフェラックス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイ、およびハロフェラックス・ギボンシイから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylCまたはそのホモログである。さらなる態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:135に示されたアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロノラクトナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:134に示された核酸配列によってコードされる。
【０４９４】
1つの態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロネートの2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素は、カウロバクター属の種、ハロフェラックス属の種、スルホロブス属の種、および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、カウロバクター・クレセンタス、ハロフェラックス・ボルカニイ、大腸菌、およびスルホロブス・ソルファタリカスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylD、yjhG、yagF、xad、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:137、140および143からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、キシロン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:136、138、139、141および142からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４９５】
1つの態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、yjhH、yagE、またはそれらのホモログから選択される。さらなる態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:146および149からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、2-ケト-3-デオキシ-D-ペントン酸アルドラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:144、145、147および148からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４９６】
いくつかの態様において、方法は、
（a）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。
【０４９７】
1つの態様において、方法は、外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；および
（b）D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含み、かつ微生物は、
（c）（a）または（b）由来のD-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼまたはメチルグリオキサールレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数をさらに発現する。
【０４９８】
1つの態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのキシリトールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素は、ヒポクレア属の種、シェフェルソミセス属の種、サッカロミセス属の種、パキソレン属の種、ピキア属の種、カンジダ属の種、アスペルギルス属の種、ニューロスポラ属の種、およびクリプトコッカス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、ヒポクレア・ジェコリナ、シェフェルソミセス・スチピチス、S. セレビシエ、パキソレン・タンノフィルス、ピキア・スチピチス、ピキア・クエルカム、カンジダ・シェハテ、カンジダ・テヌイス、カンジダ・トロピカリス、アスペルギルス・ニガー、ニューロスポラ・クラッサ、およびクリプトコッカス・ラクタチボルスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xyl1、GRE3、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:152および155からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシロースレダクターゼ活性またはアルドースレダクターゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:150、151、153および154からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０４９９】
1つの態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、キシリトールのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、シェフェルソミセス属の種、トリコデルマ属の種、ピキア属の種、サッカロミセス属の種、グルコノバクター属の種、ガラクトカンジダ属の種、ニューロスポラ属の種、およびセラチア属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、シェフェルソミセス・スチピチス、トリコデルマ・リーゼイ、ピキア・スチピチス、S. セレビシエ、グルコノバクター・オキシダンス、ガラクトカンジダ・マストターミチス、ニューロスポラ・クラッサ、およびセラチア・マルセッセンスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、xyl2、xdh1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:158および160からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:156、157および159からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０５００】
1つの態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、大腸菌から得られる核酸分子によってコードされる。別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素は、ピロマイセス属の種から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、xylAまたはそのホモログである。さらに別の態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:163および190から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、キシロースイソメラーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、SEQ ID NO:161、162および189から選択される核酸配列によってコードされる。
【０５０１】
いくつかの態様において、方法は、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）D-キシルロース-5-リン酸からD-キシルロースへの変換を触媒するアルカリホスファターゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。
【０５０２】
上記態様のいずれかにおいて、DHAPは、微生物における内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換される。
【０５０３】
上記態様のいずれかにおいて、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、グリコールアルデヒドのMEGへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素は、大腸菌またはS. セレビシエから選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼ活性またはアルデヒドレダクターゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、fucO、yqhD、dkgA（yqhE)、dkgB（yafB)、yeaE、yghZ、gldA、GRE2、またはそれらのホモログから選択される。別の態様において、1種類または複数種類の核酸分子はyqhDである。いくつかの態様において、yqhDはG149E変異を含む。さらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:81、83、85、88、91、93、96、98および100からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、グリコールアルデヒドレダクターゼは、SEQ ID NO:80、82、84、86、87、89、90、92、94、95、97および99からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０５０４】
上記態様のいずれかにおいて、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセチルCoAのアセトアセチルCoAへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、大腸菌、サッカロミセス属の種、およびマリノバクター属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされるチオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・サーモサッカロリチカム、バチルス・セレウス、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、およびマリノバクター・ヒドロカルボノクラスチカスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、thlA、atoBおよび/もしくはERG10、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:103、105および108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、チオラーゼ活性またはアセチル補酵素Aアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:101、102、104、106および107からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０５０５】
上記態様のいずれかにおいて、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性またはヒドロラーゼ活性を有する酵素である。いくつかの態様において、トランスフェラーゼ活性を有する酵素は、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトアセチルCoAのアセト酢酸への変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性またはヒドロラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種および大腸菌から選択される微生物から得られる1種類または複数種類の核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカムから得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、大腸菌から得られる。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、atoAおよびatoD、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼサブユニットをコードする核酸分子は、ctfAおよびctfB、またはそれらのホモログである。さらなる態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:111、114、165、167、169および171からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。なおさらなる態様において、アセチルCoA：アセト酢酸CoAトランスフェラーゼ活性または酢酸:アセトアセチルCoAヒドロラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:109、110、112、113、164、166、168および170からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０５０６】
上記態様のいずれかにおいて、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素である。さらなる態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセト酢酸のアセトンへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、クロストリジウム属の種、バチルス属の種、クロモバクテリウム属の種、およびシュードモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・セルロリティカム、バチルス・ポリミキサ、クロモバクテリウム・ビオラセウム、およびシュードモナス・プチダから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、adcまたはそのホモログである。さらなる態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:117および120からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:115、116、118および119からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０５０７】
上記態様のいずれかにおいて、組換え微生物は、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素をコードする少なくとも1種類の核酸分子を含んでもよい。1つの態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の内在性核酸分子によってコードされる。代替の態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、1種類または複数種類の外来性核酸分子によってコードされる。1つの態様において、アセトンのイソプロパノールへの変換を触媒する酵素は、二級アルコールデヒドロゲナーゼ（S-ADH）である。別の態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、バークホルデリア属の種、アルカリゲネス属の種、クロストリジウム属の種、サーモアナエロバクター属の種、フィトモナス属の種、ロドコッカス属の種、メタノバクテリウム属の種、メタノゲニウム属の種、エントアメーバ属の種、トリコモナス属の種、およびトリトリコモナス属の種から選択される微生物から得られる核酸分子によってコードされる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする核酸分子は、バークホルデリア属種AIU 652、アルカリゲネス・ユートロファス、クロストリジウム・ラグスダレイ、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、クロストリジウム・カルボキシジボランス、サーモアナエロバクター・ブロッキイ、サーモアナエロバクター・エタノリカス（クロストリジウム・サーモヒドロスルフリカム)、ロドコッカス・ルーバー、メタノバクテリウム・パルストレ、メタン生成古細菌メタノゲニウム・リミナタンス、寄生性原生生物エントアメーバ・ヒストリティカ、寄生性原生動物トリトリコモナス・フィータス、およびヒト寄生生物トリコモナス・バギナリスから選択される微生物から得られる。いくつかの態様において、二級アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする1種類または複数種類の核酸分子は、adh、adhB、EhAdh1、またはそれらのホモログである。いくつかの態様において、S-ADHは、相同性から予測され、サーモアナエロバクター・マスラニイ、ミクロコッカス・ルテウス、ノカルディオプシス・アルバ、マイコバクテリウム・ハッシアカム、ヘリコバクター・スイス、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・オルトプシローシス、カンジダ・メタプシローシス、グロスマンニア・クラビゲラ、およびシェフェルソミセス・スチピチス由来であり得る。さらなる態様において、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、SEQ ID NO:174および176からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに別の態様において、アルコールデヒドロゲナーゼは、SEQ ID NO:172、173および175からなる群より選択される核酸配列によってコードされる。
【０５０８】
上記態様のいずれかにおいて、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-5-キナーゼである。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、xylB遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を妨げ、代わりに、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０５０９】
上記態様のいずれかにおいて、グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、グリコールアルデヒドのMEGへの変換に向けて反応を切り替えるために、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０５１０】
上記態様のいずれかにおいて、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼである。特定の態様において、酵素は、ピルベートをラクテートに変換する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、ピルベートからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、イソプロパノールの生成に向けて反応を切り替えるために、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０５１１】
上記態様のいずれかにおいて、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼである。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは大腸菌由来である。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、xylA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、MEGおよびイソプロパノールを生成する組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を妨げ、代わりに、D-キシロースのD-キシロネートへの変換に向けて反応を切り替えるために、D-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子において欠失、挿入、または機能喪失変異を含む。
【０５１２】
1つの態様において、方法は、イソプロパノールを生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含む。
【０５１３】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０５１４】
1つの態様において、方法は、n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド-ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（d）または（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオール-デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含み、
ここで、DHAPおよびピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０５１５】
いくつかの態様において、方法は、
（a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む。
【０５１６】
1つの態様において、方法は、アセトン、ブタノールおよびエタノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへまたは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含み、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０５１７】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０５１８】
1つの態様において、方法は、イソプロパノール、ブタノールおよびエタノールを同時生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼまたはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへ、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへ、または（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含み、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０５１９】
いくつかの態様において、方法は、リン酸ブチリルのブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む。
【０５２０】
1つの態様において、方法は、イソブタノールを生成する能力を有する組換え微生物において、
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性または外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させる工程を含み、
ここで、ピルベートは該微生物における解糖から生成される。
【０５２１】
いくつかの態様において、方法は、
（a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む。
【０５２２】
酵素工学
組換え微生物の酵素は、基質から生成物への変換の1種類または複数種類の局面を改善するため、操作されていてよい。本開示の方法において使用するためにさらに操作され得る酵素の非限定的な例には、アルドラーゼ、アルデヒドレダクターゼ、アセトアセチル補酵素Aヒドロラーゼ、キシロースイソメラーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせが含まれる。これらの酵素は、改善された触媒活性、改善された選択性、改善された安定性、様々な発酵条件（温度、pH等）に対する改善された耐性、または様々な代謝基質、生成物、副生成物、中間体等に対する改善された耐性のために操作され得る。特定の酵素活性に関して、本明細書において使用される、「改善された触媒活性」という用語は、比較可能な操作されていない酵素について測定されたものより高レベルの酵素活性をさす。
【０５２３】
例えば、アルドラーゼの安定性、基質特異性、および立体特異性を変化させて、生体触媒プロセス用の優れた酵素を作製するために、操作手法が使用されてきた。フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ（FBP-アルドラーゼ）の耐熱性および溶媒耐性は、大腸菌およびエドワージエラ・イクタルリ（Edwardsiella ictaluri）に由来するfda遺伝子のファミリーDNAシャフリングの使用により増加した。53℃においていずれの親よりも平均280倍高い半減期を示す第4世代のバリアントが同定された。同バリアントは、様々な極性および非極性の有機溶媒においても増強された活性を示した（Hao and Berry 2004 Protein Eng Des Sel 17:689-697）。
【０５２４】
もう一つの例として、アセトアセチル補酵素Aヒドロラーゼは、アセトアセチルCoAをアセト酢酸へ変換することができる。しかしながら、ヒドロラーゼは、酵素チオラーゼによるアセトアセチルCoA形成のために必要とされる基質であるアセチルCoAともほぼ同じ大きさで反応するという点で非特異的である。従って、より効率的なアセトアセチルCoAヒドロラーゼを作出するため、触媒作用のために重要な酵素βサブユニット内の数個のグルタミン酸残基を交換することによって、アセチルCoA基質より少なくとも10倍高い活性をアセトアセチルCoA基質に対して有するよう、これらの酵素は操作された（WO 2015/042588）。
【０５２５】
もう一つの例として、大腸菌YqhD酵素は、10種を超えるアルデヒド基質に対してNADPH依存性レダクターゼ活性を有する広基質アルデヒドレダクターゼであって、再生可能バイオ燃料および化学物質を生成するための有用な酵素である（Jarboe 2010 Applied Microbiology and Biotechnology 89:249）。YqhD酵素活性は、毒性アルデヒドの除去を通して有益であるが、酵素は、NADPH依存性でもあり、NADPH枯渇および生物の増殖阻害に寄与する。3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド（3-HPA）からの1,3-プロパンジオール生成を改善するため、YqhDのエラープローンPCRが実施された。この定方向の操作は、ある特定のアルデヒド、具体的には、3-HPAに対する減少したKmおよび増加したkcatを有する2種類の変異体、D99QN147HおよびQ202Aを与えた（Li et al.2008 Prog.Nat.Sci.18(12):1519-1524）。残基Asp99およびAsn147は両方ともNADPHと相互作用するため、D99QN147H変異体の改善された触媒活性は、YqhDの構造について公知のものと一致している（Sulzenbacher et al.2004 J.Mol.Biol.342(2):489-502）。D99QN147H変異体の使用は、3-HPAからの1,3-プロパンジオール生成を2倍増加させた。
【０５２６】
もう一つの例として、キシロースイソメラーゼは、アルドース糖とケトース糖、主として、キシロースとキシルロースおよびグルコースとフルクトースの間の相互変換を触媒する金属依存性酵素である。それは、リキソース糖、アラビノース糖、およびマンノース糖に対してより低い親和性を有する。糖のヒドロキシル基が、糖イソメラーゼの基質の好みを定義し得る。サームス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）キシロースイソメラーゼの残基256のアスパラギン酸が、アルギニンに交換された（Patel et al.2012 Protein Engineering,Design & Selection vol.25 no.7 pp.331-336）。この変異体キシロースイソメラーゼは、D-リキソース、L-アラビノース、およびD-マンノースに対する特異性の増加を示した。D256Rキシロースイソメラーゼ変異体の、これらの3種類の基質に対する触媒効率も、野生型酵素と比較して高かった。変異体酵素における残基256のアルギニンは、触媒反応において役割を果たすか、または基質配向の変化に影響する可能性があると仮定された。
【０５２７】
もう一つの例として、酵素キシリトールデヒドロゲナーゼは、キシロースレダクターゼと共に、キシロースの利用において役割を果たす。キシロースレダクターゼ（XR）が、キシロースをキシリトールに還元し、次いで、キシリトールデヒドロゲナーゼ（XDH）が、キシリトールを再酸化してキシルロースを形成させる。しかしながら、XRは共基質としてNADPHを好むが、XDHは共基質として排他的にNAD+を使用するため、共基質再利用問題に遭遇する。一つの解決策は、共基質特異性がNAD+からNADP+へ変化するよう、XDHを操作することである（Ehrensberger et al.,2006 Structure 14:567-575）。グルコノバクター・オキシダンスのホロ酵素の結晶構造は、Asp38がXDHのNAD+特異性を概して担うことを明らかにした。Asp38が、アデノシンリボースのヒドロキシルと相互作用し、Met39が、プリン環下に積み重なり、2'ヒドロキシルの近くにも位置する。酵素活性を失うことなく、NADP+を排他的に使用する二重変異体（D38S/M39R）XDHが構築された。
【０５２８】
代謝工学−経路フラックスの増加のための酵素過剰発現または酵素ダウンレギュレーション/欠失
本明細書中に記載された様々な態様において、本明細書中に記載された生合成経路に関与する外来性および内在性の酵素を、組換え微生物において過剰発現させることができる。
【０５２９】
「過剰発現された」または「過剰発現」という用語は、基底レベルのmRNAを発現するかまたは基底レベルのタンパク質を有する類似の対応する未改変細胞と比較した、タンパク質をコードするmRNAのレベルの上昇（例えば、異常レベル）、および/または細胞内のタンパク質のレベルの上昇をさす。具体的な態様において、mRNAまたはタンパク質は、遺伝子、mRNA、タンパク質、および/または活性の増加を示すよう操作された微生物において、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍、またはそれ以上、過剰発現され得る。
【０５３０】
いくつかの態様において、本開示の組換え微生物は、飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールなどの基質を合成する酵素能力を含有する宿主から作製される。いくつかの態様において、対応する一級アルケンの生成を増加させるために、例えば1-プロパノール、2-プロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール、または表1に列記される任意のアルコールの合成または蓄積を増加させることが有用であり得る。
【０５３１】
いくつかの態様において、飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生合成に関与する内在性または外来性の酵素の発現を増加させ、それによって、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼによって触媒される一段階脱水反応用の基質を増加させ、1種類または複数種類の一級アルケンを生成することが有用であり得る。いくつかの態様において、飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの対応する一級アルケンへの脱水に関与する1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼの発現を増加させることが有用であり得る。
【０５３２】
合成または蓄積の増加は、例えば、上記のアルコール生合成経路酵素の1つまたは複数をコードする核酸の過剰発現、および/または1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする核酸の過剰発現によって達成することができる。1種類もしくは複数種類のアルコール生合成経路酵素および/または1種類もしくは複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼの過剰発現は、例えば、内在性遺伝子の発現の増加を通じて、または外来性遺伝子の発現もしくは発現の増加を通じて、起こすことができる。したがって、天然に生じる生物は、1種類もしくは複数種類のアルコール生合成経路酵素および/または1種類もしくは複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸分子の過剰発現を通じて、非天然の一級アルケン生成微生物を作製するよう容易に改変することができる。加えて、非天然に生じる生物は、上記の1種類または複数種類のアルコール生合成経路酵素の活性の増加をもたらす内在性遺伝子の変異誘発によって作製することができる。
【０５３３】
本開示の組換え生物は、1種類または複数種類の一級アルケンを生成するのに十分な量で、1種類もしくは複数種類のアルコール生合成経路酵素および/または1種類もしくは複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸を外因的に発現するように、上記例示したような当技術分野において周知の方法を用いて構築することができることから、本開示を与えられた当業者は、本明細書において記載された組換え微生物を容易に構築することができる。
【０５３４】
天然に存在しない、一級アルケンを生成する宿主を構築し、その発現レベルを試験する方法は、例えば、当技術分野において周知の組換えおよび検出の方法によって実施され得る。そのような方法は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)Ausubo et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1999)に見出され得る。
【０５３５】
外来性または内在性の遺伝子を発現させるかまたは過剰発現させるため、当技術分野において公知の多様な機序を使用することができる。例えば、宿主生物において機能性の発現調節配列に機能的に連結された、本明細書中に例示される1種類もしくは複数種類の生合成経路酵素および/または1種類もしくは複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼをコードする1種類または複数種類の核酸を保有するよう、発現ベクターを構築することができる。本発明の微生物宿主生物において使用するために適用可能な発現ベクターには、例えば、宿主染色体への安定的な組み込みのために機能性のベクターおよび選択配列またはマーカーを含む、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、および人工染色体が含まれる。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求欠損を補完するか、または培養培地中に存在しない重要栄養素を供給する選択可能マーカー遺伝子も、含まれ得る。発現調節配列には、当技術分野において周知の構成性プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター等が含まれ得る。2種以上の外来性のコード核酸を共発現させたい時には、例えば、単一の発現ベクターに、または別々の発現ベクターに、両核酸を挿入することができる。単一ベクター発現の場合、コード核酸は、1個の共通の発現調節配列に機能的に連結されていてもよいし、または1個の誘導性プロモーターおよび1個の構成性プロモーターのような異なる発現調節配列に連結されていてもよい。代謝経路または合成経路に関与する外来性の核酸配列の形質転換は、当技術分野において周知の方法を使用して確認され得る。
【０５３６】
当業者によって理解されるように、特定の宿主における発現を増強するため、コード配列を改変することは有利であり得る。遺伝暗号は64種類の可能なコドンを含み重複しているが、大部分の生物は、典型的には、これらのコドンのサブセットを使用する。種において最も高頻度に利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、さほど高頻度に利用されないものは、希少または低頻度使用コドンとして分類される。宿主の好ましいコドン使用頻度を反映するため、コドンを置換することができ、その過程は、時に、「コドン最適化」または「種コドンバイアスの調節」と呼ばれる。
【０５３７】
例えば、翻訳の速度を増加させるか、または最適化されていない配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期のような、望ましい特性を有する組換えRNA転写物を生成するため、特定の原核生物または真核生物の宿主にとって好ましいコドンを含有している最適化されたコード配列（Murray et al.(1989)Nucl.Acids Res.17:477-508を参照すること）を調製することができる。翻訳終止コドンも、宿主の好みを反映するために改変され得る。例えば、S. セレビシエおよび哺乳動物のための典型的な終止コドンは、それぞれ、UAAおよびUGAである。単子葉植物のための典型的な終止コドンは、UGAであるが、昆虫および大腸菌は、一般的に、UAAを終止コドンとして使用する（Dalphin et al.(1996)Nucl.Acids Res.24:216-218）。
【０５３８】
当業者は、遺伝暗号の縮重性のため、多様な核酸配列が、本開示の所定の酵素をコードするために使用され得ることを認識するであろう。生合成酵素をコードする核酸配列は、本開示の態様を例示するために本明細書中に参照されるに過ぎず、本開示は、本開示の酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を含む。同様に、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性を失うことなくまたは有意に失うことなく、アミノ酸配列内の1個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、および挿入を許容することができる。本開示は、改変されたポリペプチドまたはバリアントポリペプチドが、参照ポリペプチドの酵素的な同化活性または異化活性を有する限り、本明細書中に記載された特定のタンパク質と異なるアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを含む。さらに、本明細書に示された核酸配列によってコードされたアミノ酸配列は、本開示の態様を例示するものに過ぎない。
【０５３９】
発現調節配列は、当技術分野において公知であり、例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、配列内リボソーム進入部位（IRES）等を含む。発現調節配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する（Maniatis et al.,Science,236:1237-1245(1987)）。例示的な発現調節配列は、例えば、Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)に記載されている。
【０５４０】
様々な態様において、発現調節配列は、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されていてよい。「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が発現調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能になるような方式で、ポリヌクレオチド配列と発現調節配列とが接続されていることを意味する。機能的に連結されたプロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。機能的に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部、または下流に位置し得る。
【０５４１】
いくつかの態様において、組換え微生物は、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼによって対応する一級アルケンへ変換される1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール基質の生成のための生合成経路と競合する経路における反応を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。
【０５４２】
いくつかの態様において、組換え微生物は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-5-キナーゼである。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、xylB遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を妨げ、代わりに、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換に向けて反応を切り替える。
【０５４３】
いくつかの態様において、組換え微生物は、グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、グリコールアルデヒドのグリコール酸への変換を触媒する酵素は、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、グリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、グリコールアルデヒドからのグリコール酸の生成を妨げ、代わりに、グリコールアルデヒドのMEGへの変換に向けて反応を切り替える。
【０５４４】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ラクトアルデヒドのラクテートへの変換を触媒する1種類または複数種類の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性低下させるよう操作される。いくつかの態様において、ラクトアルデヒドのラクテートへの変換を触媒する酵素は、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、aldA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、ラクトアルデヒドからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、ラクトアルデヒドの1,2-プロパンジオールへの変換に向けて反応を切り替える。
【０５４５】
いくつかの態様において、組換え微生物は、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、ピルベートのラクテートへの変換を触媒する酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、乳酸デヒドロゲナーゼは、ldhA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、ピルベートからのラクテートの生成を妨げ、代わりに、アルコールの生成に向けて反応を切り替える。
【０５４６】
いくつかの態様において、組換え微生物は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒する酵素は、D-キシルロース-5-キナーゼである。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、サッカロミセス・セレビシエに由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、XKS1遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、ピキア・スチピチスに由来する。いくつかの態様において、D-キシルロース-5-キナーゼは、XYL3遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、D-キシルロースのD-キシルロース-5-リン酸への変換を妨げ、代わりに、D-キシルロースのD-キシルロース-1-リン酸への変換に向けて反応を切り替える。
【０５４７】
いくつかの態様において、組換え微生物は、D-キシルロース-5-リン酸のD-キシルロースへの変換を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、D-キシルロース-5-リン酸のD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、アルカリホスファターゼである。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼは、S. セレビシエに由来する。いくつかの態様において、アルカリホスファターゼは、PHO13遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、D-キシルロース-5-リン酸のD-キシルロースへの変換を防止する。
【０５４８】
いくつかの態様において、組換え微生物は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する1種類または複数種類の内在性の酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかのそのような態様において、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を触媒する酵素は、D-キシロースイソメラーゼである。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、大腸菌に由来する。いくつかの態様において、D-キシロースイソメラーゼは、xylA遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、D-キシロースのD-キシルロースへの変換を妨げ、代わりに、D-キシロースのD-キシロネートへの変換に向けて反応を切り替える。
【０５４９】
いくつかの態様において、組換え微生物は、リン酸ブチリルのブチレートへの変換を触媒する1種類または複数種類の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性低下させるように操作される。いくつかの態様において、リン酸ブチリルのブチレートへの変換を触媒する酵素は酪酸キナーゼである。いくつかの態様において、酪酸キナーゼは、buk遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、リン酸ブチリルからのブチレートを妨げ、代わりに、リン酸ブチリルのブチリルCoAへの変換に向けて反応を切り替える。
【０５５０】
いくつかの態様において、組換え微生物は、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を触媒する1種類または複数種類の内在性酵素を欠失させる、破壊する、変異させる、かつ/またはその活性を低下させるように操作される。いくつかの態様において、アセトアルデヒドのエタノールへの変換を触媒する酵素は、エタノールデヒドロゲナーゼである。いくつかの態様において、エタノールデヒドロゲナーゼは、adhE遺伝子またはそのホモログによってコードされる。いくつかの態様において、操作は、アセトアルデヒドからのエタノール生成を妨げ、代わりに、アセトアルデヒドのアセチルCoAへの変換に向けて反応を切り替える。
【実施例】
【０５５１】
実施例1：全細胞アッセイによるプロパノールからのプロピレン生成
リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼの合成遺伝子（SEQ ID NO:63）をpET28a(+)発現ベクター中にクローニングし、次いで、ヒートショックプロトコールを用いてコンピテント大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させた。このアッセイで用いられる陰性対照は、空のベクターを大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させることによって調製した。
【０５５２】
全細胞による酵素アッセイを以下の条件下で実行した。
【０５５３】
組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを発現する細胞を含有する、1 mLのOD 2の培養物を、2 mM DTT、1 mM IPTGおよび0〜50 mM 1-プロパノールまたは2-プロパノールと一緒に2 mL密閉ガラスバイアル中で37℃にて24時間、振とうしながらインキュベートした。対照として、組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを含まない、1 mLのOD 2の培養物もまた、上記と同じ条件を用いてインキュベートした。
【０５５４】
0.5 mLのヘッドスペース相を、電子衝撃質量分析検出装置（ISQ - Thermo）を装備したガスクロマトグラフ（Focus GC - Thermo）に注入した。ヘリウムをキャリアガスとして1.5 mL/分の流速で使用した；使用したスプリット比は15 mL/分のスプリットフローで10であった。揮発性化合物を、初期温度を60℃で1.5分間維持し、続いて、15℃/分で150℃へ昇温（ramp）し1分間維持することによって、HP-Plot/Qカラム（Agilent）で分離した。このような条件下でのプロピレンの保持時間は、4.82分であった。生成物反応を、プロピレン標準物質との比較および質量断片化のデータベースとの比較の両方によって特定した（図6）。
【０５５５】
プロピレンの有意な生成が、リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを用いるアッセイにおいて観察された。少量のプロピレンが、リナロール酵素を含まない培養を含有した対照反応において観察された（図7および図8、表4）。
【０５５６】
（表４）プロパノールによる全細胞アッセイでの24時間インキュベーション後のプロピレン生成
2019520832.tif 000038
【０５５７】
実施例2. 溶解物を用いるプロパノールからのプロピレン生成
リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼの合成遺伝子（SEQ ID NO:63）をpET28a(+)発現ベクター内にクローニングし、次いで、ヒートショックプロトコールを用いてコンピテント大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させた。このアッセイで用いられる陰性対照は、空のベクターを大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させることによって調製した。
【０５５８】
単一の形質転換体のプレ接種材料（pre-inoculum）をTB培地中で37℃および220 rpmにて一晩成長させた。18℃および220 rpmでのオーバーナイト発現のために1 mMのIPTGを添加した場合も、接種材料を、OD 0.1で開始し、OD 0.9に到達するまでTB培地中で37℃および220 rpmにて成長させた。
【０５５９】
細胞を、5000 rpmおよび4℃で20分間の遠心分離によって回収した。ペレットを−80℃で1時間維持し、次いで、氷上で解凍し、Tris-HCl 50mM pH 7.5で当初量の10％に再懸濁した。溶解を超音波処理（3〜5サイクル、10秒ON/10秒OFF、500W機械、25％振幅）により氷上で行った。その後、可溶性画分を分離するために、懸濁物を4℃にて30分間5000 rpmで遠心分離した。タンパク質濃度をBradford法を用いて決定した。
【０５６０】
プラスミドpET-28+LinDを含有する大腸菌 BL21（DE3）からの溶解物を用いる酵素アッセイを、以下の条件下で実行した。
【０５６１】
組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを含有する1 mLの溶解物（総タンパク質量によって正規化）を、2 mM DTTおよび0〜50 mMプロパノールと一緒に2 mL密閉ガラスバイアル中で37℃にて24時間、振とうしながらインキュベートした。対照として、組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを含まない、1 mLの溶解物もまた、上記と同じ条件を用いてインキュベートした。
【０５６２】
0.5 mLのヘッドスペース相を、電子衝撃質量分析検出装置（ISQ - Thermo）を装備したガスクロマトグラフ（Focus GC - Thermo）に注入した。ヘリウムをキャリアガスとして1.5 mL/分の流速で使用した；使用したスプリット比は15 mL/分のスプリットフローで10であった。揮発性化合物を、初期温度を60℃で1.5分間維持し、続いて、15℃/分で150℃へ昇温し1分間維持することによって、HP-Plot/Qカラム（Agilent）で分離した。このような条件下でのプロピレンの保持時間は、4.82分であった。生成物反応を、プロピレン標準物質との比較および質量断片化のデータベースとの比較の両方によって特定した。
【０５６３】
プロピレンの有意な生成がリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを用いるアッセイで観察された。少量のプロピレンが、リナロール酵素を含まない培養を含有した対照反応において観察された（表5）。
【０５６４】
（表５）1-プロパノールおよび2-プロパノールによる溶解物アッセイでの24時間インキュベーション後のプロピレン生成
2019520832.tif 000039
【０５６５】
実施例3：全細胞アッセイによるブタノールからのブチレン生成
リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼの合成遺伝子（SEQ ID NO:63）をpET28a(+)発現ベクター内にクローニングし、次いで、ヒートショックプロトコールを用いてコンピテント大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させた。このアッセイで用いられる陰性対照は、空のベクターを大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させることによって調製した。
【０５６６】
全細胞を用いる酵素アッセイを以下の条件下で実行した。
【０５６７】
組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼ含有する、1 mLのOD 2の培養物を、2 mM DTT、1 mM IPTGおよび0〜50 mMブタノールと一緒に2 mL密閉ガラスバイアル中で37℃にて24時間、振とうしながらインキュベートした。対照として、組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを含まない、1 mLのOD 2の培養物もまた、上記と同じ条件を用いてインキュベートした。
【０５６８】
0.5 mLのヘッドスペース相を、電子衝撃質量分析検出装置（ISQ - Thermo）を装備したガスクロマトグラフ（Focus GC - Thermo）に注入した。ヘリウムをキャリアガスとして1.5 mL/分の流速で使用した；使用したスプリット比は15 mL/分のスプリットフローで10であった。揮発性化合物を、初期温度を60℃で0.5分間維持し、続いて、50℃/分で250℃へ昇温し2分間維持することによって、HP-Plot/Qカラム（Agilent）で分離した。このような条件下でのブチレンの保持時間は、3.9分であった。生成物反応を、ブチレン標準物質との比較および質量断片化のデータベースとの比較の両方によって特定した（図9）。
【０５６９】
ブチレンの有意な生成が、リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを用いるアッセイで観察された。少量のブチレンが、酵素を含まない培養を含有した対照反応において観察された（図10、表6）。
【０５７０】
（表６）ブタノールとの24時間インキュベーション後の全細胞アッセイでのブチレン生成
2019520832.tif 000040
【０５７１】
実施例4：溶解物を用いるブタノールからのブチレン生成
リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼの合成遺伝子（SEQ ID NO:63）をpET28a(+)発現ベクター内にクローニングし、次いで、ヒートショックプロトコールを用いてコンピテント大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させた。このアッセイで用いられる陰性対照は、空のベクターを大腸菌 BL21（DE3）細胞中に形質転換させることによって調製した。
【０５７２】
細胞のプレ接種材料をTB培地中で37℃および220 rpmにて一晩成長させ、18℃および220 rpmでのオーバーナイト発現のために1 mMのIPTGを添加した場合も、接種材料を、OD 0.1で開始し、OD 0.9に到達するまでTB培地中で37℃および220 rpmにて成長させた。
【０５７３】
細胞を、4℃で20分間5000 rpmでの遠心分離によって回収した。ペレットを−80℃で1時間維持し、次いで、氷上で解凍し、Tris-HCl 50mM pH 7.5で当初量の10％に再懸濁した。溶解を超音波処理（3〜5サイクル、10秒ON/10秒OFF、25％振幅、500W）により氷上で行った。その後、可溶性画分を分離するために、懸濁物を4℃にて30分間5000 rpmで遠心分離した。タンパク質濃度をBradford法を用いて決定した。
【０５７４】
プラスミドpET-28+LinDを含有する大腸菌 BL21（DE3）からの溶解物を用いる酵素アッセイを以下の条件下で実行した。
【０５７５】
組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを含有する1 mLの溶解物（総タンパク質量によって正規化）を、2 mM DTTおよび0〜50 mMブタノールと一緒に2 mL密閉ガラスバイアル中で37℃にて24時間、振とうしながらインキュベートした。対照として、組換えリナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを含まない、1 mLの溶解物もまた、上記と同じ条件を用いてインキュベートした。
【０５７６】
0.5 mLのヘッドスペース相を、電子衝撃質量分析検出装置（ISQ - Thermo）を装備したガスクロマトグラフ（Focus GC - Thermo）に注入した。ヘリウムをキャリアガスとして1.5 mL/分の流速で使用した；使用したスプリット比は15 mL/分のスプリットフローで10であった。揮発性化合物を、初期温度を60℃で0.5分間維持し、続いて、50℃/分で250℃へ昇温し2分間維持することによって、HP-Plot/Qカラム（Agilent）で分離した。このような条件下でのブチレンの保持時間は、3.9分であった。生成物反応を、ブチレン標準物質との比較および質量断片化のデータベースとの比較の両方によって特定した。
【０５７７】
ブチレンの有意な生成が、リナロールデヒドラターゼ-イソメラーゼを用いるアッセイにおいて観察された。少量のブチレンが、リナロール酵素を含まない培養を含有した対照反応において観察された（表7）。
【０５７８】
（表７）ブタノールとの24時間インキュベーション後の溶解物アッセイでのブチレン生成
2019520832.tif 000041
【０５７９】
驚くべきことに、酵素リナロールデヒドラターゼ イソメラーゼ（EC 4.2.1.127）は、予想どおり、基質中に二重結合（エノール基）を必要としない。天然の反応は、ゲラニオールのリナロールへの異性化、次いでミルセン（3-メチル-2-エン-1-オール基)への脱水である。非天然の基質について、クロチルアルコールのメチルビニルカルビノールへの異性化、および1,3ブタジエンへの脱水が記載されている（2-エン-1-オール基）。非常に類似する、3-メチル-3-ブテン-1-オール（イソプレノール）の3-メチル-3-ブテン-2-オールへの異性化およびイソプレンへの脱水が記載されている。
【０５８０】
一級アルコールの脱水に関連して本明細書において得られた結果は、1-プロパノールまたは2-プロパノールからプロペンへおよび1-ブタノールからブテンへの反応について実証したものであり、以下の、いくつかの予想外の特徴を示す：
基質中に三級メチル基を必要としない。
今までの全ての報告された基質とは対照的に、基質中に二重結合を必要としない。
公知の天然基質（C10）および報告された最小の非天然基質（C5、C4)をはるかに下回る、非常に短い基質が受容される（C3）。
【０５８１】
実施例5. グルコースからのプロピレンの直接生成
plLacOプロモーター下のオペロン中にIPA経路を含有するベクターpZs*13およびLinD遺伝子を含有するベクターpET28aを、エレクトロポレーションを用いてBL21Star（DE3）に同時形質転換した。イソプロパノールの生成は以下の5つの遺伝子の発現を必要とする：thl（チオラーゼ)、atoA/D（酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ)、adc（アセト酢酸デカルボキシラーゼ）、およびadh（二級アルコールデヒドロゲナーゼ)。atoA/D遺伝子は、大腸菌由来のネイティブな遺伝子であり、かつPCR増幅された（フォワードプライマー：
2019520832.tif 000042
およびリバースプライマー：
2019520832.tif 000043
）。thl（SEQ ID NO:103に示されたThlアミノ酸配列)、adc（SEQ ID NO:117に示されたAdcアミノ酸配列）、およびadh（SEQ ID NO:174に示されたAdhアミノ酸配列）は大腸菌に対してコドン最適化され、合成された。誘導性プロモーターpLLacOの制御下にthl（チオラーゼ)遺伝子、adh（二級アルコールデヒドロゲナーゼ)遺伝子、adc（アセト酢酸デカルボキシラーゼ)遺伝子、atoA/D（酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼ）遺伝子、および T1ターミネーターを含有するオペロンは、pZS*13骨格中に構築された。候補の選択は、LB培地中でカナマイシンおよびアンピシリンを用いて行われた。本明細書においてこの菌株をIPA＋LinDと呼んだ。このプラスミドの組み合わせは、グルコースからイソプロパノールを生成する能力を有し、かつリナロールイソメラーゼデヒドラターゼ酵素を発現する能力も有する菌株を提供する。
【０５８２】
IPA＋LinD、pZs*13_IPAおよびpET28a_LinDの1個の単一コロニーを、カナマイシン（50 μg/mL）およびアンピシリン（100 μg/mL）を補充した10 g/Lグリセロールを含有するTB培地中に37℃、220 rpmにて播種した。20時間後、0.2の光学密度を用いて、適切な抗生物質を補充した1.5 g/Lグリセロールを含有するTB培地中で、新たな播種を37℃、220 rpmにて行った。3時間後、ODは600 nmで1.0を達成し、IPTGを1 mMの最終濃度まで添加した。フラスコを18℃、220 rpmでインキュベートした。
【０５８３】
16時間後、ODを測定し、各アッセイについて記載されるように以下の培地を用いて、培養物をOD 20に達するように濃縮した：
（a）pZs*13_IPAをTB 20 g/Lグルコースで（イソプロパノール生成の対照)、
（b）IPA＋LinDをTB 10 g/Lグリセロールおよび3 g/Lイソプロパノールで（プロピレン生成の対照)、
（c）IPA＋LinDをTB 20 g/Lグルコースおよび3 g/Lイソプロパノールで（プロピレン生成の対照)、
（d）IPA＋LinDをTB 20 g/Lグルコースで（プロピレン生成の候補1)、
（e）IPA＋LinDをTB 20 g/Lグルコースで（プロピレン生成の候補2)。
【０５８４】
全ての培養物の1つのアリコートを発現分析のための溶解物とし、細胞を4℃、5000 rpmで20分間の遠心分離によって収集した。ペレットを-80℃で1時間維持し、次いで、氷上で解凍し、Tris-HCl 50mM pH 7.5で当初量の10％で再懸濁した。溶解を超音波処理（3〜5サイクル、10 /10分、25％振幅）により氷上で行い、その後、可溶性画分を分離するために、4℃にて30分間5000 rpmで遠心分離した。サンプルを95℃にて10分間加熱し、SDS-PAGEで分析した（図11）。
【０５８５】
各培養物の1.0 mLアリコートを、三連にして、2 mLヘッドスペースバイアルに入れ、37℃、225 rpmでインキュベートした。116時間のインキュベートの終了時に、バイアルを振とうインキュベーターから取り出し、プロピレンおよびイソプロパノール濃度をGC-MSで分析した。インキュベーション期間終了時の混入を検証するために、TB培地20g/Lグルコースのみを含有する対照を行った。1.0 mLのヘッドスペース相を、電子衝撃質量分析検出装置（ISQ - Thermo）を装備したガスクロマトグラフ（Focus GC - Thermo）に注入した。ヘリウムをキャリアガスとして1.5 mL/分の流速で使用した；使用したスプリット比は15 mL/分のスプリットフローで10であった。揮発性化合物を、初期温度を90℃で1.0分間維持し、続いて、13.3℃/分で130℃への第1の昇温および45℃/分で200℃への第2の昇温を行い1分間維持することによって、HP-Plot/Qカラム（Agilent）で分離した。このような条件下でのプロピレンの保持時間は1.51分であり、イソプロパノールの保持時間は4.3分であった。生成物反応を、プロピレンおよびイソプロパノールの標準物質との比較および質量断片化のデータベースとの比較の両方によって特定した。
【０５８６】
予想されたように、アッセイ（a)、（d）および（e）におけるイソプロパノールの生成は0.5 g/Lであり、（b）および（c）では3.0g/Lであった。プロピレンの陽性対照であるアッセイ（b）において、4 10-5 mMのプロピレンの生成が観察され、IPA＋LinDが同時形質転換されている候補であるアッセイ（d）および（e)において有意な生成が観察された（図12)。TB培地のみを含有した対照反応では、いずれの量のプロピレンも観察されなかった。
【０５８７】
例示的配列の概要：
カステラニエラ・デフラグランス65Phen由来のリナロールデヒドラターゼ（LinD）（LinD-1と表示）
SEQ ID NO:1：野生型（WT）リナロールデヒドラターゼポリペプチドSEQ ID NO:2をコードするネイティブな核酸配列；シグナルペプチドコード配列を含む。
SEQ ID NO:2：ネイティブな全長野生型リナロールデヒドラターゼポリペプチドであり、LinD-1と表示される。
SEQ ID NO:3：SEQ ID NO:2をコードするコドン最適化核酸。
SEQ ID NO:4：LinD-1のプロセシングされた（成熟）形態をコードするネイティブな核酸。
SEQ ID NO:5：SEQ ID NO:2野生型リナロールデヒドラターゼの成熟（プロセシングされた）形態。
SEQ ID NO:6： SEQ ID NO:7をコードする核酸；SEQ ID NO:3と12コドンの置換を有する点で相違する。
SEQ ID NO:7：LinD-1の全長ポリペプチドバリアントであり、LinD-1Nと表示され、12個の置換（A18I、F20L、Y70F、G73S、G132M、R170K、I181L、V195F、D199N、F324S、G364S、L367F)を有する。
【０５８８】
カステラニエラ・デフラグランス62Car由来のリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-2と表示
SEQ ID NO:8：SEQ ID NO:9をコードするネイティブな核酸；シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:9：シグナルペプチドを伴うC.デフラグランス（C. defragrans）62Car由来の全長野生型 LinD、LinD-2と表示される。
SEQ ID NO:10：全長LinD-2をコードするコドン最適化核酸。
SEQ ID NO:11：SEQ ID NO 12のプロセシングされた（成熟）形態をコードするネイティブな核酸。
SEQ ID NO:12: LinDポリペプチドLinD-2の成熟な、プロセシングされた形態。
SEQ ID NO:13：全長バリアントSEQ ID NO:14をコードする核酸；11コドンの置換を有する点で野生型SED ID NO：10と相違する。
SEQ ID NO:14：11アミノ酸置換（V19I、Y71F、G74S、G133M、R171K、I182L、V196F、D200N、F325S、G365S、L368F； LinD-2Cと表示される）を有する全長変異体LinD-2。
【０５８９】
ミルセンに対して濃縮したPadre Dam由来の活性汚泥に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-3と表示
SEQ ID NO:15：SEQ ID NO:16をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、かつそのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:16：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、シグナルペプチドを含み、LinD-3と表示される。
SEQ ID NO:17：プロセシングされたSEQ ID NO:18 LinDをコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:18: プロセシングされた LinD-3 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
全長SEQ ID NO:16ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:2に対して99％の配列同一性を有し；かつ成熟またはプロセシングされたGNM SEQ ID NO:18ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:5に対して99％の配列同一性を有する。
全長SEQ ID NO:16ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:9に対して94％の配列同一性を有し；かつ成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:18ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:12に対して96％の配列同一性を有する。
【０５９０】
ミルセンに対して濃縮した（二次濃縮）Camp Pendleton由来の活性汚泥に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-4と表示
SEQ ID NO:19：SEQ ID NO:20をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:20：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、シグナルペプチドを含み、LinD-4と表示される。
SEQ ID NO:21：プロセシングされたSEQ ID NO:22 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:22： プロセシングされた LinD-4 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
全長SEQ ID NO:20ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:2に対して75％の配列同一性を有し；成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:22ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:5に対して79％の配列同一性を有する。
全長SEQ ID NO:20ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:9に対して75％の配列同一性を有し；成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:22ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:12に対して79％の配列同一性を有する。
【０５９１】
ミルセンに対して濃縮した（一次濃縮）Camp Pendleton由来の活性汚泥に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-5と表示
SEQ ID NO:23：SEQ ID NO:24をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:24：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、シグナルペプチドを含み、LinD-5と表示される。
SEQ ID NO:25：プロセシングされたSEQ ID NO:26 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:26: プロセシングされたLinD-5 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
全長SEQ ID NO:24ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:2に対して78％の配列同一性を有し；成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:26ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:5に対して82％の配列同一性を有する。
全長SEQ ID NO:24ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:9に対して78％の配列同一性を有する；成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:26ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:12に対して81％の配列同一性を有する。
【０５９２】
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-6と表示
SEQ ID NO:27：SEQ ID NO:28をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:28：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、シグナルペプチドを含み、LinD-6と表示される。
SEQ ID NO:29：プロセシングされたSEQ ID NO:30 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:30: プロセシングされたLinD-6 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
全長SEQ ID NO:28ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:2に対して78％の配列同一性を有し；成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:30ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:5に対して81％の配列同一性を有する。
全長SEQ ID NO:28ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:9に対して78％の配列同一性を有し；成熟またはプロセシングされたSEQ ID NO:30ポリペプチドは、プロセシングされたSEQ ID NO:12に対して81％の配列同一性を有する。
【０５９３】
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-7と表示
SEQ ID NO:31：SEQ ID NO:32をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、特定されたシグナルペプチド切断部位を有さないそのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:32：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、特定されたシグナルペプチド切断部位を有さないシグナルペプチドを含み、LinD-7と表示される。
SEQ ID NO:33：A196F改変を有するLinD酵素 LinD-7；LinD-7Bと表示される。
全長SEQ ID NO:32ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:2に対して66％の配列同一性を有する。
全長SEQ ID NO:32ポリペプチドは、全長SEQ ID NO:9に対して65％の配列同一性を有する。
【０５９４】
リナロールデヒドラターゼ（LinD) （7個の変異（アミノ酸変化)：G74S、G133Q、R171K、I182K、V196F、D200G、G365Sを有する、 LinD-2、SEQ ID NO:9の操作されたバリアント)；LinD-2Tと表示
SEQ ID NO:34：SEQ ID NO:35コードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:35：ネイティブなまたはプロセシングされていない、操作されたLinD-2酵素であり、シグナルペプチドを含み、7個の変異G74S、G133Q、R171K、I182K、V196F、D200G、G365S）を有し、LinD-2Tと表示される。
【０５９５】
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-8と表示
SEQ ID NO:36：SEQ ID NO:37をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:37：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-8と表示され、シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:38：プロセシングされた（成熟）SEQ ID NO:39 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:39: プロセシングされた（成熟）LinD-8 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
【０５９６】
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-9と表示
SEQ ID NO:40：SEQ ID NO:41をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、特定されたシグナルペプチド切断部位を有さないそのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:41：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-9と表示され、特定されたシグナルペプチド切断部位を有さないシグナルペプチドを含む。
【０５９７】
土壌サンプル（Cottonwood river）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-10と表示
SEQ ID NO:42：SEQ ID NO:43をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:43：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-10と表示され、シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:44：プロセシングされた（成熟）SEQ ID NO:45 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:45:プロセシングされた（成熟）LinD-10 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
【０５９８】
土壌サンプルに対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-11と表示
SEQ ID NO:46：SEQ ID NO:47をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:47：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-11と表示され、シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:48：プロセシングされた（成熟）SEQ ID NO:49 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:49:プロセシングされた（成熟）LinD-11 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
【０５９９】
土壌サンプル（Cottonwood river）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-12と表示
SEQ ID NO 50：SEQ ID NO:51をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:51：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-12と表示され、シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:52：プロセシングされた（成熟）SEQ ID NO:53 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:53:プロセシングされた（成熟）LinD-12 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
【０６００】
活性汚泥（Sierra Nevada）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-13と表示
SEQ ID NO:54：SEQ ID NO:55をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:55：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-13と表示され、シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:56：プロセシングされた（成熟）SEQ ID NO:57 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:57:プロセシングされた（成熟）LinD-13 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
【０６０１】
土壌サンプル（Cottonwood river）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-14と表示
SEQ ID NO:58：SEQ ID NO:59をコードするネイティブな核酸であり、プロセシングされておらず、そのシグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:59：ネイティブなまたはプロセシングされていないLinD酵素であり、LinD-14と表示され、シグナルペプチドを含む。
SEQ ID NO:60：プロセシングされた（成熟）SEQ ID NO:61 LinD酵素をコードする核酸であり、シグナルペプチドはない。
SEQ ID NO:61:プロセシングされた（成熟）LinD-14 LinD酵素であり、シグナルペプチドはない。
【０６０２】
N末端Hisタグおよびリンカーを有するリナロールデヒドラターゼLinD-1
SEQ ID NO:62：N末端Hisタグおよびリンカーを有するネイティブなLinD-1 LinD酵素（SEQ ID NO:63）をコードする核酸。
SEQ ID NO:63：N末端Hisタグおよびリンカーを有するネイティブな全長 LinD-1 LinD酵素。
【０６０３】
例示的な核酸配列およびポリペプチド配列
2019520832.tif 000044
2019520832.tif 000045
2019520832.tif 000046
2019520832.tif 000047
ミルセンに対して濃縮したPadre Dam由来の活性汚泥に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-3と表示
2019520832.tif 000048
ミルセンに対して濃縮した（二次濃縮）Camp Pendleton由来の活性汚泥に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-4と表示
2019520832.tif 000049
ミルセンに対して濃縮した（一次濃縮）Camp Pendleton由来の活性汚泥に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-5と表示
2019520832.tif 000050
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-6と表示
2019520832.tif 000051
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-7と表示
2019520832.tif 000052
リナロールデヒドラターゼ（LinD)（7個の変異（アミノ酸変化）：G74S、G133Q、R171K、I182K、V196F、D200G、G365Sを有するLinD-2の操作されたバリアント)：LinD-2Tと表示
2019520832.tif 000053
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-8と表示
2019520832.tif 000054
活性汚泥（Camp Pendleton）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-9と表示
2019520832.tif 000055
土壌サンプル（Cottonwood river）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-10と表示
2019520832.tif 000056
土壌サンプルに対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-11と表示
2019520832.tif 000057
土壌サンプル（Cottonwood river）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-12と表示される
2019520832.tif 000058
活性汚泥（Sierra Nevada）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-13と表示
2019520832.tif 000059
土壌サンプル（Cottonwood river）に対するメタゲノム解析からのリナロールデヒドラターゼ（LinD）；LinD-14と表示。
2019520832.tif 000060
2019520832.tif 000061
2019520832.tif 000062
【０６０４】
本開示の番号が付された態様
本開示により企図される特定の対象を、以下の番号が付された態様において示す。
1.  構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成する能力を有する組換え微生物であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒する、1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を発現する、前記組換え微生物：
2019520832.tif 000063
式中、R1＝CnH2n+1、1≦n≦11；R2＝CmH2m+1、0≦m≦10かつn+m≦11である。
2.  再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子をさらに発現する、態様1に記載の組換え微生物。
3.  前記再生可能原料が、1種類または複数種類の糖である、態様2に記載の組換え微生物。
4.  外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、
態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
5.  外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、
態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
6.  （a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様1〜5のいずれか一つに記載の組換え微生物。
7.  内在性D-キシロースイソメラーゼが、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する、態様1〜6のいずれか一つに記載の組換え微生物。
8.  外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（g）（f）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（i）（h）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
9.  外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ
（a）D-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
10.  （a）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様1〜3、または8〜9のいずれか一つに記載の組換え微生物。
11.  外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（b）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、かつ、さらに、
（c）（a）もしくは（b）由来のD-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼもしくはメチルグリオキサールレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
12.  （a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）D-キシルロース-5-リン酸からD-キシルロースへの変換を触媒するアルカリホスファターゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様11に記載の組換え微生物。
13.  前記DHAPが、前記微生物の内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換される、態様1〜12のいずれか一つに記載の組換え微生物。
14.  イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
15.  ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様14に記載の組換え微生物。
16.  n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ、もしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（d）もしくは（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオールデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
DHAPおよびピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
17.  （a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様16に記載の組換え微生物。
18.  アセトン、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
19.  ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様18に記載の組換え微生物。
20.  イソプロパノール、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
21.  ブチリルリン酸からブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様20に記載の組換え微生物。
22.  イソブタノールを生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する組換え微生物であって、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
23.  （a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様22に記載の組換え微生物。
24.  対応する一級アルケンがプロペンであり、一級アルコールが1-プロパノールである、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
25.  対応する一級アルケンがプロペンであり、二級アルコールが2-プロパノールである、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
26.  対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが1-ブタノールである、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
27.  対応する一級アルケンがブテンであり、二級アルコールが2-ブタノールである、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
28.  1種類または複数種類の一級アルケンが、単一の酵素的段階を介して、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
29.  1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成が、脱水段階を含む、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
30.  前記脱水段階が、基質活性化非依存性である、態様29に記載の組換え微生物。
31.  前記脱水段階が、補助因子非依存性である、態様29に記載の組換え微生物。
32.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、カステラニエラ・デフラグランスの種からなる群より選択される微生物から得られる、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
33.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
34.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
35.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、LinDである、態様1〜3のいずれか一つに記載の組換え微生物。
36.  構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成する方法であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒する1種類または複数種類のリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を、組換え微生物において発現させる工程を含む、前記方法：
2019520832.tif 000064
式中、R1＝CnH2n+1、1≦n≦11；R2＝CmH2m+1、0≦m≦10かつn+m≦11である。
37.  再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を、組換え微生物において発現させる工程をさらに含む、態様36に記載の方法。
38.  前記再生可能原料が、1種類または複数種類の糖である、態様37に記載の方法。
39.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、態様36〜38のいずれか1つに記載の方法。
40.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
41.  （a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、態様36〜40のいずれか一つに記載の方法。
42.  内在性D-キシロースイソメラーゼが、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する、態様36〜41のいずれか一つに記載の方法。
43.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（g）（f）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（i）（h）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
44.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
45.  （a）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、態様36〜38または43〜44のいずれか一つに記載の方法。
46.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（b）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、かつ、さらに、
（c）（a）もしくは（b）由来のD-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼもしくはメチルグリオキサールレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
47.  前記組換え微生物が、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）D-キシルロース-5-リン酸からD-キシルロースへの変換を触媒するアルカリホスファターゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様46に記載の方法。
48.  前記DHAPが、前記微生物の内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換される、態様36〜47のいずれか一つに記載の方法。
49.  前記組換え微生物が、イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
50.  ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様49に記載の方法。
51.  前記組換え微生物が、n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ、もしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（d）もしくは（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオールデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
DHAPおよびピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
52.  （a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様51に記載の方法。
53.  前記組換え微生物が、アセトン、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
54.  ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様53に記載の方法。
55.  前記組換え微生物が、イソプロパノール、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
56.  ブチリルリン酸からブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様55に記載の方法。
57.  前記組換え微生物が、イソブタノールを生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
58.  （a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様57に記載の方法。
59.  対応する一級アルケンがプロペンであり、一級アルコールが1-プロパノールである、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
60.  対応する一級アルケンがプロペンであり、二級アルコールが2-プロパノールである、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
61.  対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが1-ブタノールである、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
62.  対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが2-ブタノールである、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
63.  1種類または複数種類の一級アルケンが、単一の酵素的段階を介して、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
64.  1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成が、脱水段階を含む、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
65.  前記脱水段階が、基質活性化非依存性である、態様64に記載の方法。
66.  前記脱水段階が、補助因子非依存性である、態様64に記載の方法。
67.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、カステラニエラ・デフラグランスの種からなる群より選択される微生物から得られる、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
68.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
69.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
70.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、LinDである、態様36〜38のいずれか一つに記載の方法。
71.  構造Aに示す構造を各飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールが有する、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコール
から、
構造Bに示す構造を各一級アルケンが有する、1種類または複数種類の一級アルケン
を生成または蓄積する組換え微生物を作製する方法であって、
該1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから1種類または複数種類の対応する一級アルケンへの変換を触媒するリナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼ
をコードする1種類または複数種類の外来性核酸分子を、組換え微生物に導入する工程を含む、前記方法：
2019520832.tif 000065
式中、R1＝CnH2n+1、1≦n≦11；R2＝CmH2m+1、0≦m≦10かつn+m≦11である。
72.  再生可能原料からの1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールの生成のための1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を、組換え微生物に導入する工程および/または組換え微生物において発現させる工程をさらに含む、態様73に記載の方法。
73.  前記再生可能原料が、1種類または複数種類の糖である、態様72に記載の方法。
74.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、
1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからモノエチレングリコール（MEG）への変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、
態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
75.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、
1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-1-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース1-キナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシルロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-キシルロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（g）（f）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、
態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
76.  （a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、態様71〜75のいずれか一つに記載の方法。
77.  内在性D-キシロースイソメラーゼが、D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒する、態様71〜76のいずれか一つに記載の方法。
78.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシロースからD-キシロノラクトンへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロノラクトンからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロノラクトナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（g）（f）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（i）（h）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
79.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、かつ、1種類または複数種類の酵素をコードする1種類または複数種類の内在性または外来性の核酸分子を発現させる工程が、
（a）D-キシロースからD-キシロネートへの変換を触媒するキシロースデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のD-キシロネートから2-ケト-3-デオキシ-キシロネートへの変換を触媒するキシロン酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2-ケト-3-デオキシ-キシロネートからグリコールアルデヒドおよびピルベートへの変換を触媒する2-ケト-3-デオキシ-D-吉草酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（e）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（f）（e）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；ならびに/または
（h）（g）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現させることを含む、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
80.  （a）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；
（b）グリコールアルデヒドからグリコール酸への変換を触媒するグリコールアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（c）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変を組換え微生物に導入する工程をさらに含む、態様71〜73または78〜79のいずれか一つに記載の方法。
81.  前記組換え微生物が、外来性D-キシロースおよびグルコースからモノエチレングリコール（MEG）およびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）D-キシロースからキシリトールへの変換を触媒するキシロースレダクターゼまたはアルドースレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子、およびキシリトールからD-キシルロースへの変換を触媒するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子；
（b）D-キシロースからD-キシルロースへの変換を触媒するD-キシロースイソメラーゼをコードする、少なくとも1種類の外来性核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、かつ、さらに、
（c）（a）もしくは（b）由来のD-キシルロースからD-リブロースへの変換を触媒するD-タガトース3-エピメラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のD-リブロースからD-リブロース-1-リン酸への変換を触媒するD-リブロキナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（d）由来のD-リブロース-1-リン酸からグリコールアルデヒドおよびジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）への変換を触媒するD-リブロース-1-リン酸アルドラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（e）由来のグリコールアルデヒドからMEGへの変換を触媒するグリコールアルデヒドレダクターゼもしくはメチルグリオキサールレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；ならびに/または
（j）（i）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
82.  前記組換え微生物が、
（a）D-キシルロースからD-キシルロース-5-リン酸への変換を触媒するD-キシルロース-5-キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）D-キシルロース-5-リン酸からD-キシルロースへの変換を触媒するアルカリホスファターゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様81に記載の方法。
83.  前記DHAPが、前記微生物の内在性解糖経路を通じてアセチルCoAに変換される、態様71〜82のいずれか一つに記載の方法。
84.  前記組換え微生物が、イソプロパノールを生成する能力を有し、かつ
（a）アセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（d）（c）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現する、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
85.  ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様84に記載の方法。
86.  前記組換え微生物が、n-プロパノールおよびイソプロパノールを同時生成する能力を有し、
（a）ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）からメチルグリオキサールへの変換を触媒するメチルグリオキサールシンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のメチルグリオキサールからアセトールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（a）由来のメチルグリオキサールからラクトアルデヒドへの変換を触媒するグリオキシル酸レダクターゼ、メチルグリオキサールデヒドロゲナーゼ、もしくはアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（b）由来のアセトールから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルド・ケトレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（c）由来のラクトアルデヒドから1,2-プロパンジオールへの変換を触媒するアルデヒドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（d）もしくは（e）由来の1,2-プロパンジオールからプロパナールへの変換を触媒するジオールデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来のプロパナールからn-プロパノールへの変換を触媒するデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（j）（i）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（k）（j）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（l）（k）由来のアセトンからイソプロパノールへの変換を触媒する二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
DHAPおよびピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
87.  （a）ラクトアルデヒドからラクテートへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（b）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様86に記載の方法。
88.  前記組換え微生物が、アセトン、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
89.  ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様88に記載の方法。
90.  前記組換え微生物が、イソプロパノール、ブタノール、およびエタノールを同時生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセチルCoAへの変換を触媒するピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子； 
（b）（a）由来のアセチルCoAからアセトアセチルCoAへの変換を触媒するチオラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来のアセトアセチルCoAからアセト酢酸への変換を触媒する酢酸:アセトアセチルCoAトランスフェラーゼもしくはヒドロラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のアセト酢酸からアセトンへの変換を触媒するアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（e）（a）由来のアセチルCoAからアセトアルデヒドへの変換を触媒するアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（f）（b）由来のアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシブチリルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（g）（f）由来の3-ヒドロキシブチリルCoAから2-ブテノイルCoAへの変換を触媒する3-ヒドロキシブチリルCoAデヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（h）（g）由来の2-ブテノイルCoAからブチリルCoAへの変換を触媒するブチリルCoAデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（i）（h）由来のブチリルCoAからブチルアルデヒドへの変換を触媒するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（j）（d）由来のアセトンからイソプロパノールへの、（e）由来のアセトアルデヒドからエタノールへの、もしくは（i）由来のブチルアルデヒドからブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
91.  ブチリルリン酸からブチレートへの変換を触媒する酪酸キナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異をさらに含む、態様90に記載の方法。
92.  前記組換え微生物が、イソブタノールを生成する能力を有し、
（a）ピルベートからアセト乳酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（b）（a）由来のアセト乳酸から2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸への変換を触媒するアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（c）（b）由来の2,3-ジヒドロキシ-イソ吉草酸からα-ケト-イソ吉草酸への変換を触媒するジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；
（d）（c）由来のα-ケト-イソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換を触媒する2-ケト酸デカルボキシラーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子；および/または
（e）（d）由来のイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼをコードする、少なくとも1種類の内在性もしくは外来性の核酸分子
のうちの1つまたは複数を発現し、
ピルベートが該微生物における解糖から生成される、
態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
93.  （a）アセトアルデヒドからエタノールへの変換を触媒するエタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異；および
（ｂ）ピルベートからラクテートへの変換を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子における欠失、挿入、または機能喪失変異
からなる群より選択される1種類または複数種類の改変をさらに含む、態様92に記載の方法。
94.  対応する一級アルケンがプロペンであり、一級アルコールが1-プロパノールである、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
95.  対応する一級アルケンがプロペンであり、二級アルコールが2-プロパノールである、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
96.  対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが1-ブタノールである、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
97.  対応する一級アルケンがブテンであり、一級アルコールが2-ブタノールである、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
98.  1種類または複数種類の一級アルケンが、単一の酵素的段階を介して、1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールから生成される、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
99.  1種類または複数種類の飽和一級アルコールまたは飽和二級アルコールからの1種類または複数種類の対応する一級アルケンの生成が、脱水段階を含む、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
100.  前記脱水段階が、基質活性化非依存性である、態様99に記載の方法。
101.  前記脱水段階が、補助因子非依存性である、態様99に記載の方法。
102.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、カステラニエラ・デフラグランスの種からなる群より選択される微生物から得られる、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
103.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:2、5、7、9、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、および63からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
104.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、および62からなる群より選択される核酸配列によってコードされる、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
105.  前記リナロールデヒドラターゼ/イソメラーゼが、LinDである、態様71〜73のいずれか一つに記載の方法。
【０６０５】
上記の詳細な説明は、理解を明確にするために提供されるものにすぎず、その改変物は当業者に明らかであろうから、そこからいかなる不必要な制約も導かれるべきでない。
【０６０６】
本開示は、その具体的態様に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であること、および本願は、概ね本開示の原理にしたがう、および本開示の属する技術分野における公知または慣習的な実務の中で可能であり、本明細書に示される本質的特徴に適用され得、添付の特許請求の範囲にしたがうそのような本開示からの逸脱を含む、本開示のあらゆる派生物、用法または適用を網羅することが意図されていることが理解されるであろう。
【０６０７】
本明細書で引用されている特許、特許出願および公報の各々の特許請求の範囲、表図および/または図面を含む開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019520832.tif 000077
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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