(57)【要約】（Ｉ）細胞処理ステーションと；（ＩＩ）複数の細胞処理モジュールとを含む、複数の細胞調製物の独立並行処理を実行するのに適切な細胞処理装置であって、複数の細胞処理モジュールは、細胞処理ステーションと係合および連通し；複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、その内部に定義された別個の処理コンパートメントを含み、処理コンパートメントは：（ｉ）１つまたは複数の試薬容器を含む試薬パックと；（ｉｉ）それぞれが１つまたは複数の細胞処理コンパートメントおよび細胞インキュベーションコンパートメントを含む、１つまたは複数の流体カートリッジとを含み、処理コンパートメントのそれぞれは互いに流体連通している、細胞処理装置を提供する。細胞処理装置の使用方法と同様に、流体カートリッジも提供する。タ装置。
2019521715.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞調製物の独立並行処理を実行するのに適切な細胞処理装置であって：
（Ｉ）細胞処理ステーションと；
（ＩＩ）複数の細胞処理モジュールとを含み、
前記複数の細胞処理モジュールは、前記細胞処理ステーションと係合および連通し；
前記複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、その内部に定義された別個の処理コンパートメントを含み、前記処理コンパートメントは：
ｉ．１つまたは複数の試薬容器を含む試薬パックと；
ｉｉ．それぞれが１つまたは複数の細胞処理コンパートメントおよび細胞インキュベーションコンパートメントを含む、１つまたは複数の流体カートリッジとを含み、
前記処理コンパートメントのそれぞれは互いに流体連通している、細胞処理装置。
【請求項２】
前記複数の細胞調製物のそれぞれが、物理的および／または時間的に、処理の全てにわたって分離されているように構成される、請求項１の細胞処理装置。
【請求項３】
前記複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、単一の細胞調製物を一度に処理するように適合される、請求項１または請求項２の細胞処理装置。
【請求項４】
前記細胞処理モジュールは、閉鎖された、実質的に無菌性の環境を細胞処理用に含む、請求項１〜３の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項５】
前記閉鎖された、実質的に無菌性の環境は、前記試薬パックおよび／または前記流体カートリッジ内で提供される、請求項４の細胞処理装置。
【請求項６】
前記細胞処理モジュールの少なくとも一部が、使い捨てコンポーネントである、請求項１〜５の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項７】
前記細胞処理モジュールの実質的に全てが使い捨てコンポーネントである、請求項６の細胞処理装置。
【請求項８】
前記細胞処理モジュールの使い捨てコンポーネントは：前記流体カートリッジ；前記試薬パック；前記流体カートリッジと前記試薬パックの両方からなる群から選択される、請求項７の細胞処理装置。
【請求項９】
前記細胞処理ステーションは、前記複数の細胞処理モジュールの１つまたは複数により使用され得る、集約設備を含む、請求項１〜８の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１０】
前記集約設備は：
ｉ．プラットフォームシャーシ；
ｉｉ．ユーザーインターフェースディスプレイ；
ｉｉｉ．ソフトウェアおよび操作システムライセンス；
ｉｖ．中央処理装置（ＣＰＵ）；
ｖ．組み込みコントローラとプログラムロジックコントローラ（ＰＬＣ）を含むメインコントロールシステム；
ｖｉ．電源装置と配電システム；
ｖｉｉ．前記細胞処理モジュールまたはその一部の温度を制御するのに必要な、熱管理装備；
ｖｉｉｉ．インキュベータガス混合物供給設備；
ｉｘ．ｉｎ  ｓｉｔｕでの測定および／またはテストに使用される１つまたは複数のシステム；ならびに
ｘ．遠心分離駆動システムからなる群から選択される、請求項９の細胞処理装置。
【請求項１１】
前記ｉｎ  ｓｉｔｕ測定および／テストは：細胞計数；細胞特定；純度；均質性；力価；特徴付け；および品質管理用手段からなる群から選択される、請求項１０の細胞処理装置。
【請求項１２】
前記細胞処理モジュールは、細胞処理の全てにわたって前記細胞調製物を含むように適合される、請求項１〜１１の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１３】
前記複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、前記細胞処理システム上の集約設備との接続に適切な１つまたは複数のコネクタを含む、請求項９〜１２の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１４】
前記試薬パックの１つまたは複数の試薬容器は、細胞処理に必要な１つまたは複数の非細胞流体を含むように適合される、請求項１〜１３の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１５】
前記試薬パックは、前記試薬パックを前記流体カートリッジに接続する、１つまたは複数の着脱可能なコネクタを含む、請求項１〜１４の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１６】
各流体カートリッジは、細胞処理の全てにわたって単一の細胞調製物を含み、操作するように構成される、請求項１〜１５の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１７】
各細胞処理モジュールは、単一の流体カートリッジを含む、請求項１〜１６の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１８】
前記流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含む、請求項１〜１７の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項１９】
前記流体カートリッジは、さらに：
ｉ．前記細胞調製物を別個の構成成分に分離するためのフィルタ、遠心機、および他の活性表面；
ｉｉ．細胞をインキュベートし、活性試薬を導入するための反応容器、フラスコ、およびビーカー；ならびに、
ｉｉｉ．流体の流れを、前記流体カートリッジの周囲、中、および外に方向づけるためのギャラリー、チャネル、および流体回路
からなる群から選択されるエレメントを含む、請求項１〜１８の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項２０】
前記流体カートリッジは、さらに、流体の流れを少なくとも部分的に制御する少なくとも１つのポンプと少なくとも１つの弁を含み、流体の流れは：前記流体カートリッジの流体回路を通る流れ；前記流体カートリッジに入る流れ；および前記流体カートリッジから出る流れからなる群から選択される、請求項１〜１９の何れか一項の細胞処理装置。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのポンプは、容積式ポンプ、ダイアフラム、プランジャースタイルポンプ、インペラーポンプ、蠕動ポンプからなる群から選択され；前記弁は、ダイアフラム弁；回転弁；およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項２０の細胞処理装置。
【請求項２２】
中で細胞処理用の閉鎖無菌環境を提供するのに適切であり、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含む、流体カートリッジ。
【請求項２３】
さらに：
ｉ．前記細胞調製物を別個の構成成分に分離するためのフィルタ、遠心機、および他の活性表面；
ｉｉ．細胞をインキュベートし、活性試薬を導入するための反応容器、フラスコ、およびビーカー；ならびに、
ｉｉｉ．流体の流れを、前記流体カートリッジの周囲、中、および外に方向づけるためのギャラリー、チャネル、および流体回路
からなる群から選択されるエレメントを含む、請求項２２の流体カートリッジ。
【請求項２４】
流体の流れを少なくとも部分的に制御する少なくとも１つのポンプと少なくとも１つの弁をさらに含み、流体の流れは、前記流体カートリッジの流体回路を通る流体の流れ、前記流体カートリッジに入る流れ、および前記流体カートリッジから出る流れを含む、請求項２２または２３の流体カートリッジ。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのポンプは、容積式ポンプ、ダイアフラム、プランジャースタイルポンプ、インペラーポンプ、蠕動ポンプ、およびその組み合わせからなる群から選択され；前記弁は、ダイアフラム弁；回転弁；およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項２４の流体カートリッジ。
【請求項２６】
使い捨てコンポーネントである、請求項２２〜２５の何れか一項の流体カートリッジ。
【請求項２７】
１つまたは複数の流体カートリッジと試薬パックとを含む細胞処理ユニットであって、前記流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含み、前記試薬パックは、１つまたは複数の試薬容器を含み、前記試薬パック内の１つまたは複数の試薬容器は、細胞処理に必要な１つまたは複数の非細胞流体を含みように適合される、細胞処理ユニット。
【請求項２８】
前記流体カートリッジと前記試薬パックは、統合された単一の実体である、請求項２７の細胞処理ユニット。
【請求項２９】
前記細胞処理ユニットは、使い捨てコンポーネントである、請求項２７または請求項２８の細胞処理ユニット。
【請求項３０】
前記流体カートリッジは、請求項２２〜２６の何れか一項の流体カートリッジである、請求項２７〜２９の何れか一項の細胞処理ユニット。
【請求項３１】
ｉ．流体カートリッジと試薬パックとを含む細胞処理ユニットであって、前記流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含み、前記試薬パックは、１つまたは複数の試薬容器を含み、前記試薬パック内の１つまたは複数の試薬容器は、細胞処理に必要な１つまたは複数の非細胞流体を含みように適合される、細胞処理ユニットと；
ｉｉ．前記流体カートリッジと前記試薬パックの流体接続点が結合して、前記流体カートリッジと前記試薬パックの間に流体連通を提供するように、前記流体カートリッジと前記試薬パックを保持および係合する手段とを含む、
細胞処理ステーションとの統合に適した細胞処理モジュール。
【請求項３２】
−前記細胞処理モジュールまたはそのコンポーネントを前記細胞処理ステーションに接続するための少なくとも１つのコネクタ；
−少なくとも１つのセンサ；
−前記細胞処理モジュールに温度制御環境を提供するインキュベータ筐体；
−前記細胞処理モジュールに熱エネルギーを与えるヒーターパッドおよびコントローラ；
−前記流体カートリッジ内のエレメントを作動させる、前記細胞処理モジュール内に収容された１つまたは複数の機械式アクチュエータ；
−前記試薬パック内のエレメントを作動させる、前記細胞処理モジュール内に収容された１つまたは複数の機械式アクチュエータ；
−遠心力設備のうち、１つまたは複数をさらに含む、
請求項３１の細胞処理モジュール。
【請求項３３】
存在する場合、前記少なくとも１つのセンサは、温度を測定するための熱電対／サーミスター；流体圧力を測定するための圧力変換器；流体流速を測定するためのフローメータ；および処理に必要なバイオセンサからなる群から選択される、請求項３２の細胞処理モジュール。
【請求項３４】
前記細胞処理ユニットは、使い捨てコンポーネントである、請求項３１〜３３の何れか一項の細胞処理モジュール。
【請求項３５】
前記流体カートリッジは、請求項２１〜２６の何れか一項の流体カートリッジである、請求項３１〜３４の何れか一項の細胞処理モジュール。
【請求項３６】
前記細胞処理ユニットは、請求項２７〜３０の何れか一項の細胞処理ユニットである、請求項３１〜３５の何れか一項の細胞処理モジュール。
【請求項３７】
１）細胞調製物を提供するステップと；
２）１つまたは複数の細胞処理コンパートメントと細胞インキュベーションコンパートメントとを含む流体カートリッジを提供するステップと；
３）前記流体カートリッジに前記細胞調製物を置くステップと；
４）前記流体カートリッジと試薬パックとを含む細胞処理モジュールを組み立てるステップと；
５）前記細胞処理モジュールを、細胞処理ステーション上の利用可能な受け点に係合させるステップと；
６）前記細胞処理ステーションを操作して、前記細胞調製物の自動細胞処理を実行して、処理細胞調製物を提供するステップと；
７）少なくとも２つの細胞調製物が、前記細胞処理ステーションにおいて、独立かつ並行に処理されるように、さらなる細胞調製物を用いてステップ１〜６を繰り返すステップと；
８）前記細胞処理ステーション上の全ての利用可能な受け点が、細胞処理モジュールで占有されるまで、任意選択的にステップ７を繰り返すステップと；
９）その細胞調製物の自動細胞処理が完了した際に、前記細胞処理ステーションから前記細胞処理モジュールを除去するステップと、
１０）前記細胞処理ステーション上の各細胞処理モジュールに対しステップ９を繰り返すステップとを含む、
少なくとも２つの細胞調製物の独立並行処理を実行する方法であって、
前記方法のステップ（３）、（４）、および（５）は、ステップ（２）とステップ（６）の間で任意の順で実行される、方法。
【請求項３８】
各細胞調製物の細胞処理は、他の細胞調製物それぞれから空間的および／または時間的に分離される、請求項３７の方法。
【請求項３９】
閉鎖無菌環境で実行される、請求項３７または請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記閉鎖無菌環境は、１つまたは複数の前記流体カートリッジおよび前記試薬パックの内部にある、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記細胞調製物は、前記細胞処理ステーションから前記細胞処理モジュールが除去される前に、さらに処理される、請求項３７〜４０の何れか一項の方法。
【請求項４２】
前記さらなる処理は、凍結保存用の凍結および前記処理細胞調製物を含む組成物への製剤化からなる群から選択される、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記自動化細胞処理は：
ａ．細胞の選択；
ｂ．細胞の富化；
ｃ．ステップ（ａ）の選択細胞および／またはステップ（ｂ）の富化細胞の活性化；
ｄ．遺伝子修飾細胞を提供するための細胞の遺伝子修飾；
ｅ．増殖細胞を提供するためのステップ（ｄ）の遺伝子修飾細胞の増殖；
ｆ．ステップ（ｅ）の増殖細胞の洗浄；
ｇ．ステップ（ｅ）の増殖細胞の濃縮；
ｈ．保存および／または直接注射用の細胞製剤を提供するための、ステップ（ｅ）の増殖細胞の製剤化からなる群から選択される、１つまたは複数のステップを含む、請求項３７〜４２の何れか一項の方法。
【請求項４４】
前記細胞はＴ細胞である、請求項３７〜４３の何れか一項の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｄ）における遺伝子修飾は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いた遺伝子修飾である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記ＣＡＲは：ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲおよびＢ７Ｈ６  ＣＡＲからなる群から選択される、請求項４５の方法。
【請求項４７】
請求項１〜２１の何れか一項の細胞処理装置において実行される、請求項３７〜４６の何れか一項の方法。
【請求項４８】
前記流体カートリッジは、請求項２２〜２６の何れか一項の流体カートリッジである、請求項３７〜４７の何れか一項の方法。
【請求項４９】
前記細胞処理モジュールは、請求項３１〜３６の何れか一項の細胞処理モジュールである、請求項３７〜４８の何れか一項の方法。
【請求項５０】
プロセッサと、前記プロセッサに結合した１つまたは複数の非ニューラルネットワークプログラムをコードしたメモリーとを含む、コンピュータ装置であって、前記プログラムは、前記プロセッサに、請求項３７〜４９の何れか一項の方法を実行させる、コンピュータ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、細胞サンプルを自動的にバッチ処理するための新規の方法および装置に関する。特に、本出願は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法製剤などの先端医療医薬品（ＡＴＭＰ）の並列バッチ処理に関する。
【背景技術】
【０００２】
ここ数年、細胞療法分野への関心が高まっている。細胞療法は、再生医療においてだけでなく、がんを含む種々の病気の治療のために、細胞材料、一般的にはインタクトな生細胞を患者に導入することを伴う。
【０００３】
細胞療法は、先端医療医薬品（ＡＴＭＰ）としても知られる、治療に使用される細胞の生成を伴う。全身の免疫応答および感染症伝播の潜在的リスクに対処するため、ＡＴＭＰは、自己細胞療法（ＡＣＴ）または自己再生療法として知られるプロセスでは、しばしば、患者自身の細胞に由来する。
【０００４】
最も広い形態の自己細胞療法は、患者からの適切な細胞材料の取り出し、細胞の選択および増殖、任意選択的に細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ修飾、それに続く適切な品質管理対策、その後の同一患者への処理済み細胞材料の再導入を伴う。斯かるプロセスの適切な例は、がんを治療するための、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法製剤の生成である。
【０００５】
療法用のＣＡＲ−Ｔ細胞を生成する典型的な手順では、細胞材料は、血液などの体液の形態で患者から取り出される。次に、Ｔ−細胞は単離され、患者が罹患している特定のがん形態に特異的な細胞表面において、受容体を発現するように修飾される。患者への再導入時には、細胞は、がんを標的し死滅させる能力を持つ。さらに、その細胞は、増殖することにより、免疫応答を増強させる能力を持つ。自己ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、ある場合には、応答速度を劇的に改善する、がん治療における強力で新しい技法である。
【０００６】
ＡＴＭＰの生成コストは、一般的に、複雑さと、採用しなければならない取扱いプロセスの厳しさにより、高止まりしている。必要な修飾細胞材料を生成するためのワークフローは、再導入前に、適切な細胞型の単離、修飾、濃縮、および／または培養による増殖を含む。また、厳格な安全性と規制要件を確実に満たすために、プロセス中の無菌状態と、プロセスの間と終わりの厳しい品質管理手順を必要とする。自己手順では、各患者サンプルはその完全性を維持しなければならず、かつ、他の患者サンプルとの如何なる程度の相互汚染も、患者自身の細胞に完全には由来しない細胞に患者が晒されることを防ぐために、避けるべきであるという追加の要件がある。
【０００７】
歴史的に、ＡＴＭＰは、従来型のオープンラボラトリ環境で生成されてきた。ここで、患者サンプルの無菌性と完全性は、サンプルの相互汚染リスクが、適切な操作条件および装備（例えば、ラミナエアフローキャビネットおよび適切な滅菌技法など）の利用により減少する、いわゆる「クリーンルーム」施設の使用により維持される。これは、しばしば、その施設が、連続の「逐次」プロセスで稼働することを必要とする。これらの条件下にある生成プロセスのスループットを高める努力は、サンプルの相互汚染の可能性を高め得る。また、試薬の取扱い／投薬などの物質の取扱いと、特定のサンプルトラッキングにおいて、克服すべき物流および安全上の困難がある。
【０００８】
連続様式でスループットを高めることの代替案は、細胞処理に対し並列アプローチを採用することである。これまでの細胞サンプルを並列処理する方法およびシステムは、多数の別個の機器を利用する。しかしながら、これらのプロセスは、なお、「機器ごとに１サンプル」という一般原則の下で動作する。設備を操作するための余分な装備およびスタッフの追加は、能力を本質的には高めるが、このアプローチも、資本支出と人件費の著しい増加を招く。さらに、個々の患者サンプルの相互汚染のリスクを低減させる一般的な方法は、サンプルを物理的に分離すること、たいていの場合部屋を分けることだが、これも、設備または医療環境を作る際に、たいてい高価格であるクリーンルームスペースの必要性を高める結果となる。さらに、このアプローチでは、品質管理システム、電源装置、および入力ガス入力マニフォールドなどの共有設備である各機器からの共通リソースを集約化させることによる節減は難しい。
【０００９】
統合プロセスシステムにおける細胞調製の中央処理も試みられたが、成果は乏しかった。また、手動操作での中央処理も試みられた。今までに開発されたシステムは複雑で、結果として、非常に高いコストおよび十分な数のオペレータを訓練する必要性に起因する困難にぶつかった。斯かる設備の例は、米国特許出願公開第２００９／０１２６２８５号明細書に記載されている。
【００１０】
細胞療法用の細胞材料の並列処理は、国際公開第２０１６／０１２４５９号に記載されている。このアプローチでは、サンプルは、使い捨ての閉鎖処理プレート内の無菌コンパートメントに単離される。各プレート内のサンプルは、処理ステーション内に置かれた処理ユニットにより、１つとして、処理される。処理ステーションは、より時間がかかるユニット処理時のプレートに対し、より高い能力を持つことにより、サンプルが可能な限り効率的に、遅れを最小限にして、完全プロセスを経ることを保証するように構成される。国際公開第２０１６／０１２４５９号に記載される装備は、バルク処理システムにおける能力を拡大するという問題には対処しているが、個々のサンプルを並列に完全に独立して処理する必要性には応えていない。そのため、国際公開第２０１６／０１２４５９号のシステムは、資本支出の減少とクリーンルームスペース要件の減少という点では、同じコスト削減を実現するが、真に独立した並列様式でサンプルを処理する柔軟性を提供することはできない。
【００１１】
そのため、既知のシステムの欠点のない、細胞調製物、特に、細胞療法用の細胞調製物の自動的な独立並列処理を提供するシステムに対するニーズが残っている。
【発明の概要】
【００１２】
先行技術のシステムの上記短所の少なくとも１つを克服もしくは減少させる、または、関連技術システムの有用な代替物を少なくとも提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
本発明の第１態様は、複数の細胞調製物の独立並行処理を実行するのに適切な細胞処理装置を提供し、該細胞処理装置は：
（Ｉ）細胞処理ステーションと；
（ＩＩ）複数の細胞処理モジュールとを含み、
前記複数の細胞処理モジュールは、前記細胞処理ステーションと係合および連通し；
前記複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、その内部に定義された別個の処理コンパートメントを含み、前記処理コンパートメントは：
ｉ．１つまたは複数の試薬容器を含む試薬パックと；
ｉｉ．それぞれが１つまたは複数の細胞処理コンパートメントおよび細胞インキュベーションコンパートメントを含む、１つまたは複数の流体カートリッジとを含み、
前記処理コンパートメントのそれぞれは互いに流体連通している。
【００１４】
適切には、装置は、複数の細胞調製物のそれぞれが、物理的および／または時間的に、処理の全てにわたって分離されているように構成される。
【００１５】
一実施形態では、複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、単一の細胞調製物を一度に処理するように適合される。適切には、細胞処理モジュールは、閉鎖された、実質的に無菌性の環境を細胞処理用に含む。典型的には、その閉鎖された、実質的に無菌性の環境は、試薬パックおよび／または流体カートリッジ内で提供される。
【００１６】
一実施形態では、細胞処理モジュールの少なくとも一部が、使い捨てコンポーネントである。適切には、細胞処理モジュールの実質的に全てが使い捨てコンポーネントである。実施形態では、細胞処理モジュールの使い捨てコンポーネントは、流体カートリッジ；試薬パック；流体カートリッジと試薬パックの両方（細胞処理ユニット）からなる群から選択される。
【００１７】
一実施形態では、細胞処理ステーションは、複数の細胞処理モジュールの１つまたは複数により使用され得る、集約設備を含む。適切には、集約設備は：
ｉ．プラットフォームシャーシ；
ｉｉ．ユーザーインターフェースディスプレイ；
ｉｉｉ．ソフトウェアおよび操作システムライセンス；
ｉｖ．中央処理装置（ＣＰＵ）；
ｖ．組み込みコントローラとプログラムロジックコントローラ（ＰＬＣ）を含むメインコントロールシステム；
ｖｉ．電源装置と配電システム；
ｖｉｉ．細胞処理モジュールまたはその一部の温度を制御するのに必要な、熱管理装備；
ｖｉｉｉ．インキュベータガス混合物供給設備；
ｉｘ．ｉｎ  ｓｉｔｕ測定および／またはテストに使用される１つまたは複数のシステム；ならびに
ｘ．遠心分離駆動システムからなる群から選択される。
【００１８】
ｉｎ  ｓｉｔｕ測定および／テストが細胞処理ステーションの集約設備に存在する、本発明の第１態様に従う装置の実施形態では、それらは、細胞計数；細胞特定；純度；均質性；力価；特徴付け；および品質管理用手段からなる群から選択される。
【００１９】
一実施形態では、細胞処理モジュールは、細胞処理の全てにわたって細胞調製物を含むように適合される。
【００２０】
さらなる実施形態では、複数の細胞処理モジュールのそれぞれは、細胞処理システム上の集約設備との接続に適切な１つまたは複数のコネクタを含む。
【００２１】
実施形態では、試薬パックの１つまたは複数の試薬容器は、細胞処理に必要な１つまたは複数の非細胞流体を含むように適合される。適切には、試薬パックは、試薬パックを流体カートリッジに接続する、１つまたは複数の着脱可能なコネクタを含む。典型的には、各流体カートリッジは、細胞処理の全てにわたって単一の細胞調製物を含み、操作するように構成される。一実施形態では、各細胞処理モジュールは、単一の流体カートリッジを含む。
【００２２】
本発明の第１態様の一実施形態では、流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含む。適切には、流体カートリッジは、さらに：
ｉ．細胞調製物を別個の構成成分に分離するためのフィルタ、遠心機、および他の活性表面；
ｉｉ．細胞をインキュベートし、活性試薬を導入するための反応容器、フラスコ、およびビーカー；ならびに、
ｉｉｉ．流体の流れを、流体カートリッジの周囲、中、および外に方向づけるためのギャラリー、チャネル、および流体回路からなる群から選択されるエレメントを含む。
【００２３】
一実施形態では、流体カートリッジは、さらに、流体の流れを少なくとも部分的に制御する少なくとも１つのポンプと少なくとも１つの弁を含み、流体の流れは：流体カートリッジの流体回路を通る流れ；流体カートリッジに入る流れ；および流体カートリッジから出る流れからなる群から選択される。適切には、少なくとも１つのポンプは、容積式ポンプ、ダイアフラム、プランジャースタイルポンプ、インペラーポンプ、蠕動ポンプからなる群から選択され；弁は、ダイアフラム弁；回転弁；およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
本発明の第２態様では、中で細胞処理用の閉鎖無菌環境を提供するのに適切な流体カートリッジが提供され、その流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含む。
【００２５】
実施形態では、流体カートリッジは、さらに：
ｉ．細胞調製物を別個の構成成分に分離するためのフィルタ、遠心機、および他の活性表面；
ｉｉ．細胞をインキュベートし、活性試薬を導入するための反応容器、フラスコ、およびビーカー；ならびに、
ｉｉｉ．流体の流れを、流体カートリッジの周囲、中、および外に方向づけるためのギャラリー、チャネル、および流体回路からなる群から選択されるエレメントを含む。
【００２６】
一実施形態では、流体カートリッジは、さらに、流体の流れを少なくとも部分的に制御する少なくとも１つのポンプと少なくとも１つの弁を含み、流体の流れは、流体カートリッジの流体回路を通る流体の流れ、流体カートリッジに入る流れ、および流体カートリッジから出る流れを含む。適切には、少なくとも１つのポンプは、容積式ポンプ、ダイアフラム、プランジャースタイルポンプ、インペラーポンプ、蠕動ポンプ、およびその組み合わせからなる群から選択され；弁は、ダイアフラム弁；回転弁；およびその組み合わせからなる群から選択される。
【００２７】
本発明の第２態様の実施形態では、流体カートリッジは、使い捨てコンポーネントである。
【００２８】
本発明の第３態様は、細胞処理ユニットを提供し、前記細胞処理ユニットは、１つまたは複数の流体カートリッジと試薬パックとを含み、前記流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含み、前記試薬パックは、１つまたは複数の試薬容器を含み、前記試薬パック内の１つまたは複数の試薬容器は、細胞処理に必要な１つまたは複数の非細胞流体を含みように適合される。適切には、流体カートリッジと試薬パックは、統合された単一の実体である。典型的には、細胞処理ユニットは、使い捨てコンポーネントである。
【００２９】
本発明の第３態様の実施形態において、流体カートリッジは、本発明の第２態様の流体カートリッジである。
【００３０】
本発明の第４態様では、細胞処理ステーションとの統合に適した細胞処理モジュールが提供され、前記細胞処理モジュールは：
−流体カートリッジと試薬パックとを含む細胞処理ユニットであって、前記流体カートリッジは、少なくとも１つの入力ポート、分離チャンバ、活性化チャンバ、形質導入チャンバ、細胞培養チャンバ、および少なくとも１つの出力ポートを含み、前記試薬パックは、１つまたは複数の試薬容器を含み、前記試薬パック内の１つまたは複数の試薬容器は、細胞処理に必要な１つまたは複数の非細胞流体を含みように適合される、細胞処理ユニットと；
−前記流体カートリッジと前記試薬パックの流体接続点が結合して、前記流体カートリッジと前記試薬パックの間に流体連通を提供するように、前記流体カートリッジと前記試薬パックを保持および係合する手段とを含む。
【００３１】
本発明の第４態様の実施形態では、請求項３１の細胞処理モジュールが提供され、前記細胞処理モジュールは、さらに：
−前記細胞処理モジュールまたはそのコンポーネントを前記細胞処理ステーションに接続するための少なくとも１つのコネクタ；
−少なくとも１つのセンサ；
−前記細胞処理モジュールに温度制御環境を提供するインキュベータ筐体；
−前記細胞処理モジュールに熱エネルギーを与えるヒータパッドおよびコントローラ；
−前記流体カートリッジ内のエレメントを作動させる、前記細胞処理モジュール内に収容された１つまたは複数の機械式アクチュエータ；
−前記試薬パック内のエレメントを作動させる、前記細胞処理モジュール内に収容された１つまたは複数の機械式アクチュエータ；
−遠心力設備のうち、１つまたは複数を含む。
【００３２】
適切には、前記少なくとも１つのセンサは、温度を測定するための熱電対／サーミスター；流体圧力を測定するための圧力変換器；流体流速を測定するためのフローメータ；および処理に必要なバイオセンサからなる群から選択される。
【００３３】
一実施形態では、細胞処理ユニットは、使い捨てコンポーネントである。
【００３４】
さらなる実施形態では、流体カートリッジは、本発明の第２態様の流体カートリッジであり；および／または、細胞処理ユニットは、本発明の第３態様の細胞処理ユニットである。
【００３５】
本発明の第５態様は：
１）細胞調製物を提供するステップと；
２）１つまたは複数の細胞処理コンパートメントと細胞インキュベーションコンパートメントとを含む流体カートリッジを提供するステップと；
３）前記流体カートリッジに前記細胞調製物を置くステップと；
４）前記流体カートリッジと試薬パックとを含む細胞処理モジュールを組み立てるステップと；
５）前記細胞処理モジュールを、細胞処理ステーション上の利用可能な受け点に係合させるステップと；
６）前記細胞処理ステーションを操作して、前記細胞調製物の自動細胞処理を実行して、処理細胞調製物を提供するステップと；
７）少なくとも２つの細胞調製物が、前記細胞処理ステーションにおいて、独立かつ並行に処理されるように、さらなる細胞調製物を用いてステップ１〜６を繰り返すステップと；
８）前記細胞処理ステーション上の全ての利用可能な受け点が、細胞処理モジュールで占有されるまで、任意選択的にステップ７を繰り返すステップと；
９）その細胞調製物の自動細胞処理が完了した際に、前記細胞処理ステーションから前記細胞処理モジュールを除去するステップと、
１０）前記細胞処理ステーション上の各細胞処理モジュールに対しステップ９を繰り返すステップとを含む、少なくとも２つの細胞調製物の独立並行処理を実行する方法であって、
前記方法のステップ（３）、（４）、および（５）は、ステップ（２）とステップ（６）の間で任意の順で実行される、方法を提供する。
【００３６】
本発明の第５態様の実施形態では、各細胞調製物の細胞処理は、他の細胞調製物それぞれから空間的および／または時間的に分離される。
【００３７】
さらなる実施形態では、本方法は、閉鎖無菌環境で実行される。適切には、閉鎖無菌環境は、１つまたは複数の流体カートリッジおよび試薬パックの内部にある。
【００３８】
実施形態では、細胞調製物は、細胞処理ステーションから細胞処理モジュールが除去される前に、さらに処理される。適切には、さらなる処理は、凍結保存用の凍結および処理細胞調製物を含む組成物への製剤化からなる群から選択される。
【００３９】
本発明の第５態様の実施形態では、自動化細胞処理は：
ａ．細胞の選択；
ｂ．細胞の富化；
ｃ．ステップ（ａ）の選択細胞および／またはステップ（ｂ）の富化細胞の活性化；
ｄ．遺伝子修飾細胞を提供するための細胞の遺伝子修飾；
ｅ．増殖細胞を提供するためのステップ（ｄ）の遺伝子修飾細胞の増殖；
ｆ．ステップ（ｅ）の増殖細胞の洗浄；
ｇ．ステップ（ｅ）の増殖細胞の濃縮；
ｈ．保存および／または直接注射用の細胞製剤を提供するための、ステップ（ｅ）の増殖細胞の製剤化からなる群から選択される、１つまたは複数のステップを含む。
【００４０】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。適切には、ステップ（ｄ）における遺伝子修飾は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いた遺伝子修飾である。典型的には、ＣＡＲは：ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲおよびＢ７Ｈ６  ＣＡＲからなる群から選択される。
【００４１】
さらなる実施形態では、本方法は、本発明の第１態様の細胞処理装置において実行され；流体カートリッジは、本発明の第２態様の流体カートリッジであり；および／または、細胞処理モジュールは、本発明の第４態様の細胞処理モジュールである。
【００４２】
本発明の第６態様は、プロセッサと、該プロセッサに結合した１つまたは複数の非ニューラルネットワークプログラムをコードしたメモリーとを含む、コンピュータ装置を提供し、前記プログラムは、プロセッサに、本発明の第５態様の方法を実行させる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】４つの細胞処理モジュールが係合した、本発明の細胞処理装置の略図である。
【図２ａ】トロリーに乗せた２つの細胞処理モジュールを収容するように適合された、本発明の細胞処理装置の実施形態の、コンピュータ生成図である。一方の細胞処理モジュールを、流体カートリッジと試薬パックが見えるように、細胞処理装置から外して示す。
【図２ｂ】トロリーに乗っていない４つの細胞処理モジュールを収容するように適合された、本発明の細胞処理装置の実施形態の略図である。１つの細胞処理モジュールを、流体カートリッジと試薬パックが見えるように、細胞処理装置から外して示す。
【図２ｃ】トロリーに乗っていない細胞処理モジュールの実施形態の略図である。
【図３】組み立て形態の流体カートリッジと試薬パックを含む、本発明の細胞処理ユニットの実施形態を示す図である。
【図４】分解形態の流体カートリッジと試薬パックを含む、細胞処理ユニットを示す図である。
【図５】流体カートリッジ内での活性化、形質導入、および増殖エリアの実施形態の横断透視図である。
【図６】試薬パックと流体カートリッジをすでに含んだＣＰＭに、患者由来の材料が如何に接続され、含まれるかの実施形態を示す図である。
【図７】本発明の装置内で細胞を処理するための基本的プロセスフロー例を示す図である。
【図８】本発明の装置内で細胞を処理するための、詳細なプロセスフロー例を示す図である。
【図９】本発明の実施形態のＴ細胞生成自動化プロセスにおける、品質管理と解析のためのプロセスフローの実施形態を示す図である。
【図１０】本発明の装置の実施形態において生成されたＴ細胞についての増殖データ（図１０ａ）と生存率データ（図１０ｂ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明を記載する前に、いくつかの定義を、本発明の理解を助けるためにのみ提供する。本明細書で引用する全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれるものとする。別途定義がない限り、本明細書で使用する全ての専門用語および科学技術用語は本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４５】
本発明は、特定の実施形態について、ある特定の図を参照して記載するが、本発明は、それらに限定されず、請求項によってのみ限定される。請求項における任意の参照符号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載の図面は概略にすぎず、非限定的である。図面では、いくつかのエレメントのサイズは、例示を目的として、誇張され、縮尺どおりではない場合もある。
【００４６】
本明細書に使用する場合、用語「含む」は、言及するエレメントのいずれかが必ず含まれ、任意選択的に、他のエレメントが含まれる場合もあることを意味する。「〜から本質的になる」は、言及する何れのエレメントも必ず含まれ、列挙するエレメントの基本的で新規の特徴に実質的な影響を及ぼすことになる要素は排除され、任意選択的に、他の要素が含まれる場合もあることを意味する。「〜からなる」は、列挙するもの以外のすべての要素が除外されることを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００４７】
単数名詞（例えば、「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」）に言及する際に不定冠詞または定冠詞を使用する場合、これは他のものが具体的に記載されない限り、その名詞の複数を含む。さらに、明細書および請求項における、第１、第２、第３等の用語は、類似のエレメントを区別するために使用され、逐次順または時系列順で記載される必要はない。このように使用される用語は適切な状況下で互換性があり、本明細書で記載される発明の実施形態は、本明細書に記載または例示する以外の他の順序で操作可能であることを理解されたい。
【００４８】
別段の指示がない限り、本発明の実施には、化学反応、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、および化学的手法の従来技術が利用され、これは、当業者の能力の範囲内である。斯かる技法は、文献、例えば、M.R. Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressにも説明されている。これらの一般的文章のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「細胞」は、典型的には真核細胞を、より具体的には哺乳類細胞を、最も具体的にはヒト細胞を指す。
【００５０】
用語「独立した」は、細胞サンプルの並行、同時、または並列的な処理に関連して本明細書で使用する場合、各サンプルが、同じ装置において処理されているまたは処理予定である任意の他のサンプルの処理から、空間的（物理的）および時間的（時間）の両方で分離される方法で、処理されることと定義する。疑義を避けるため、用語「独立した」は、特に、一時的な独立に対し適用される場合は、複数のサンプルが共有設備を使用する必要がある際にタイミングが重なる場合に、これに対応するように１つまたは複数のサンプルの処理が遅れてよいか、または別ルートに切り替えられ得る限り、サンプルの相互作用を含む。
【００５１】
句「流体連通して」は、コンパートメントの処理に関連して本明細書で使用する場合、直接的な流体連通（つまり、両方のコンパートメントがじかに隣接している）または間接的な連通（流体は、処理コンパートメントに到達する前に、例えば、容器、チューブ、または他のコンパートメントを通る必要があり得る）を指し得る（ただし、流体は、コンパートメント間を流れることを永久的に妨げられるわけではない）。流れは、二方向、一方向、または、２つ以上の方向である。
【００５２】
用語「自己の」は、本明細書で使用する場合、同一の個体を指す。用語「同種の」は、本明細書で使用する場合、同じ種だが異なる個体を指す。
【００５３】
用語「アフェレーシス」は、本明細書で使用する場合、対象の血液を、ある特定の構成物を分離し、残りを循環に戻す装置に通す、医療技術として定義する。そのため、アフェレーシスの手順は体外プロセスである。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞である。この細胞型は、円形核を有する任意の末梢血細胞を指す。これらの細胞は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球からなる。
【００５５】
用語「Ｔ細胞」は、本明細書で使用する場合、その細胞表面にＴ細胞受容体を有するリンパ球細胞を指す。該用語は、全てのタイプのＴ細胞（エフェクター、ヘルパー、細胞毒性またはキラー、メモリー、制御性またはサプレッサー、ナチュラルキラー、粘膜関連インバリアント、およびγδ）も、Ｔ細胞サブセットおよび／またはＴ細胞前駆体も指す。いくつかの同種異系間の適用では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体を欠損させられている場合があるが、これらのＴＣＲ欠損Ｔ細胞も、本明細書のＴ細胞として想定することに注意されたい。
【００５６】
細胞生成物、特に先端医療医薬品（ＡＴＭＰ）の生成の柔軟性およびスループットを高めるシステムおよび該システムの使用法を提供することが本発明の目的である。ＡＴＭＰの例は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法製剤である。
【００５７】
本発明のシステムは、血液などの患者より取り出した生体材料またはサンプルにおいて、ある範囲の製造プロセスステップを実行する。全プロセスは、閉鎖無菌環境内で実行される。装置は、サンプル間の相互汚染なしに、多数の患者からの材料またはサンプルを並行して処理することを目的とする。所与のサンプルの処理は、装置で予め処理されたまたは続いて処理される他のサンプルと並列し、該サンプルから完全に独立した方法である。
【００５８】
本発明のシステムは、１つの装置で並行して、独立した方法で複数の患者のサンプルを処理する能力を有する。本システムは、オペレータの介入を最小化し、サンプルおよび試薬の取扱いの正確性を向上させ、サンプルトラッキングにおける過失を最小化するために、自動化され得る。
【００５９】
並行処理に斯かるシステムを使用することは、待ち時間を著しく減少させる：多数の細胞バッチを処理可能な典型的な装置では、これらの細胞バッチを同時に搭載する必要があり、プロセスが完了するまで、新しいバッチを加えることはできない。これは、細胞製造システムの操作の開始の遅れ（十分な細胞バッチが、装置を操作する前に存在する必要がある。さもなければ該装置は最大限に使用されない）と、新しい細胞バッチの処置の開始の遅れ（典型的な細胞製造装置が使用中である場合、新しいバッチを搭載し得る前に、操作は終了している必要がある）の両方を引き起こす。細胞療法は、特に、緊急治療を必要とする重症の患者を想定しているため、斯かる遅れの減少が非常に有益である。
【００６０】
より詳細には、本発明のシステムは、１つまたは複数の細胞処理モジュール（ＣＰＭ）を収容する、細胞処理ステーション（ＣＰＳ）を含む。各ＣＰＭは、いったん組み立てたら外部環境およびシステム内の他のＣＰＭからの汚染から隔離される、処理用単一細胞サンプル用閉鎖システムである。
【００６１】
各ＣＰＭは、中に細胞サンプルが搭載される１つまたは複数の流体カートリッジ（ＦＣ）を含む。典型的には、各ＣＰＭは、単一のＦＣを含む。ＦＣは、ＣＰＭから着脱可能である場合もあるし、ＣＰＭに永久的に取り付けられる場合もあり、サンプルはそこに直接搭載される。適切には、ＦＣはＣＰＭから着脱可能である。適切には、ＦＣは、搭載細胞の汚染を防ぐため、細胞サンプルが搭載される前に、実質的に滅菌または無菌の状態で提供される。典型的には、ＦＣは、新しいサンプル各々に対し無菌状態で新たに提供される使い捨てカートリッジである。適切には、ＦＣは、必要な細胞処理が完了した後に処分され、再使用されない。
【００６２】
各ＣＰＭは、さらに、１つまたは複数の試薬パック（ＲＰ）を含む。ＲＰは、対応するＣＰＭ内に含まれるサンプルの細胞処理に必要な種々の流体を含む。ＲＰは、ＣＰＭから着脱可能である場合もあるし、ＣＰＭに永久的に取り付けられる場合もあり、試薬はそこに直接搭載される。適切には、ＲＰはＣＰＭから着脱可能である。適切には、ＲＰは、試薬が搭載される前に、実質的に無菌の状態で提供される。ＲＰは、搭載試薬との汚染を防ぐため、清潔な無菌状態で提供され得る。典型的には、ＲＰは、新しいサンプル各々に対し無菌状態で新たに提供される使い捨てカートリッジである。適切は、ＲＰは、必要な細胞処理が完了した後に処分され、再使用されない。
【００６３】
ＣＰＳ、ＣＰＭ、ＦＣ、およびＲＰのそれぞれの具体的な実施形態についてのより詳細な説明を以下で提供する：
【００６４】
細胞処理ステーション（ＣＰＳ）
ＣＰＳは、中に１つまたは複数のＣＰＭが着脱可能に設置され得る、中央サポートプラットフォームを提供する。ＣＰＳは、１つまたは複数のＣＰＭを同時に収容し得る。ＣＰＳは、該ＣＰＳを操作した設備により望まれる数のＣＰＭを収容するように、適合され得る。典型的には、ＣＰＳは、少なくとも２つのＣＰＭを同時に収容する収容力を有する。適切には、ＣＰＳは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のＣＰＭを同時に収容する収容力を有する。一実施形態では、ＣＰＳは、４つのＣＰＭを同時に収容し得る。
【００６５】
ＣＰＳは、さらに、設置された少なくとも２つのＣＰＭにより使用され得る、１つまたは複数の共通または共有の設備（以後、「プラットフォーム設備」）を含み得る。実施形態では、プラットフォーム設備には、共通の電源装置、制御システム、およびユーザーインターフェース、中央インキュベータおよび冷却設備、ならびにプラットフォームＱＣシステムが含まれ得る。
【００６６】
１つまたは複数のＣＰＭにより共有され得る、ＣＰＳ内に提供される典型的な装置フィーチャおよび技術には：
−プラットフォームシャーシ；
−ユーザーインターフェースディスプレイ；
−ソフトウェアおよび操作システムライセンス；
−中央処理装置（ＣＰＵ）；
−組み込みコントローラとプログラムロジックコントローラ（ＰＬＣ）を含むメインコントロールシステム；
−電源装置と配電システム；
−例えば凍結保存のための凍結など、加熱および冷却に必要な熱管理装備；
−細胞計数、細胞特定、力価、細胞純度（または、不純物の特徴付け／測定）、均質性、細胞の特徴付け、エンドトキシン検出、安全性モニタリング（例えば、ウイルスコピー数または複製コンピテントレトロウイルスの検出による）、マイコプラズマ検出を潜在的に含む、ｉｎ  ｓｉｔｕ測定に使用されるシステム；
−遠心分離駆動システムが含まれる。
【００６７】
ある場合では、多数のＣＰＭに共有される設備を使用することにより、各細胞プロセスの一部または部分のみに使用される設備の重複を減らすことができる。この例は、細胞処理内の設定点において、品質管理の目的でのみ使用される分光測光器、または、集約化されたユーザーコントロールパネルであり得る。あるいは、共有設備は、温度管理された混合供給ガスまたは電力などの、より正確なまたはよりばらつきのない供給を提供し得る。
【００６８】
本発明のアプローチは、細胞がインキュベーション操作時に製造時間全体のかなりの部分を使用することから、実行可能であり；インキュベーション時には、流体取扱い技術と細胞取扱い技術のほとんどが機能しない。したがって、バッチ開始時間に適切に適度に差を設けることにより、細胞処理モジュール間でこれらの技術を共有することで、高額な技術の利用を改善させることができる。
【００６９】
本発明の実施形態では、ＣＰＳは、さらに、以下のうち１つまたは複数を含み得る：
【００７０】
−プラットフォームに搭載された１つまたは複数のＣＰＭ各々に配管されたインキュベータガス混合物供給設備。インキュベータの共通化には、インキュベータ供給設備およびガス混合物制御システムを１つのみ有することによるコスト削減と、１つまたは複数のＣＰＭおよび中に含まれるＦＣの各々に、温度的および化学量論的により安定したインキュベーション環境を提供するという利点がある。個々のＣＰＭインキュベータ筐体が統合されて、単一ＣＰＵインキュベータ筐体設備になることにより、ＦＣに対するＣＰＭの閉鎖支持構造は、共通のインキュベータ筐体にＦＣを直接受け入れることが可能になる。
【００７１】
−ＣＰＭ各々と、ある共通のプラットフォーム設備用の、制御システム、モニタリング、およびユーザー操作手順のための単一ユーザーインターフェースポイント。このユーザーインターフェースは、また、プログラマブル・ロジック・コントローラ（ＰＬＣ）環境およびハードウェアと連動するインタラクティブなタッチスクリーンに表示される、グラフィカルなユーザーインターフェースを含み得る；
【００７２】
−種々のプラットフォームおよびＣＰＭの電気部品に対する電力供給インフラおよび配電ネットワーク。
【００７３】
−重要な細胞パラメータおよび各ＣＰＭとその中に含まれるサンプルの品質をプロセス中にモニタリングするための品質管理システム。ＱＣシステムをプラットフォーム設備として有する利点は、所与のＣＰＭ間で、プロセス全体で比較的利用が少ない高額な装備品を共有することによるコスト節減である。
【００７４】
実施形態では、ＱＣシステムは、細胞計数、細胞生存率、細胞特徴づけの１つまたは複数によるサンプル状態のモニタリング、またはフローサイトメーター、光学細胞カウンターなどの分析機器の使用による他の細胞／生物モニタリングを含む。非限定的例として、ＱＣシステムは、顕微鏡、蛍光、トリパンブルー、もしくはフローサイトメトリーによる細胞計数および細胞生存率についてのモニタリング；フローサイトメトリーもしくは他の方法による細胞の同一性、純度、もしくは均質性についてのモニタリング；エンドトキシンの検出（例えば、ＬＡＬテストによる）；安全性についてのモニタリング（例えば、ウイルスコピー数（ＶＣＮ）のＰＣＲおよび／もしくは複製可能レトロウイルスの検出（ＲＣＲテスト）による）；マイコプラズマ検出（例えば、ＰＣＲもしくはＧｒａｍ染色による）；力価についてのモニタリング（例えば、細胞株との共培養による）を含み得る。
【００７５】
ＣＰＭ間でのＱＣ設備の共有は、ＱＣシステムを、ロボット的手段もしくは他の機械的手段により各ＣＰＭの基準位置に置くことか、または、各ＰＣＭ  ＱＣ基準場所からの出力を、光学的、電気的、もしくは他の伝達手段によりプラットフォームＱＣシステムに伝達することか、または、ＱＣ装置がＣＰＭ間で共有され得る他の方法により、達成され得る。ＱＣプロセスは、プロセス後に、ＣＰＵ自体の外側で起き得ることに留意されたい。同様に、各ＣＰＭは、それ自体の個別のＱＣシステムを持ち得ることにも留意されたい。
【００７６】
−細胞のエレクトロポレーション、融合、または遺伝子導入それぞれのためのエレクトロポレーション装置、電気融合装置、または遺伝子導入装置。同様に、各ＣＰＭは、それ自体の個別のエレクトロポレーションシステム、電気融合システム、または遺伝子導入システムを持ち得ることにも留意されたい。また、本明細書では、核酸を細胞に送達するために、ソノポレーション、マグネットフェクション、または遺伝子銃の使用も想定される。
【００７７】
−プロセス中に使用される種々の試薬に必要な温度環境を提供する、個々のＣＰＭ冷却筐体に配管された冷却供給設備。個々のＣＰＭインキュベータ筐体が統合されて、単一ＣＰＳインキュベータ冷却筐体設備になることにより、ＲＰに対するＣＰＭの閉鎖支持構造は、共通の冷却筐体にＲＰを直接受け入れることが可能になる。
【００７８】
システムは、さらに、得られた細胞の保存のための保存手段を含み得る。具体的な実施形態では、保存手段は凍結保存手段であり得る。特に、細胞は、凍結保存用に製剤化され、適切な容器（例えば、バッグ）で提供され、その容器内の細胞は、所望の温度まで、典型的には凍結するまで、即時に冷却される。典型的には、凍結保存は、−２０℃以下、−６０℃以下、−８０℃以下、または−１９６℃以下の温度で起きる。斯かる実施形態では、ＣＰＳは、適切な凍結供給設備を備えているだろう。保存または凍結保存のプロセスは、ヒトの介入を必要とせずに達成され得、これは、人員を必要としない（これは、プロセスの終了時間と、熟練オペレータの利用可能性を一致させる必要がないことから、細胞処理方法が任意の時間に開始され得ることを含意する）、時間遅延なし（つまり、即時に冷凍保存され、最適な状態での製剤保存につながる）という点で、利点につながる。細胞は、原則としてはこのようにシステム内に保存され得るが、典型的には、バッグがいったん適切に凍結されたら、より長期保存に適した保存スペースに送られ得、システムの保存手段は、細胞の新しいバッチの保存のために解放されると想定する。
【００７９】
特定の実施形態では、得られた細胞の保存のための保存手段または保存チャンバが、システム内に含まれる。斯かる保存手段または保存チャンバは、典型的には凍結保存に適しており、そのため、適切に製剤化された細胞を凍結することが可能である。典型的には、保存チャンバは、初期の凍結と場合により短期保存とを目的とする。長期保存は本システムにおいて実行可能であり得るが、これは別の場所で起こり、そのため、システムはより多くのバッチの保存に解放されることを特に想定する。
【００８０】
−プロセス中に使用される種々の試薬に必要な温度環境を提供する、個々のＣＰＭ加熱筐体に配管された加熱供給設備。個々のＣＰＭ加熱筐体が統合されて、単一ＣＰＳ加熱筐体設備になることにより、ＲＰに対するＣＰＭの閉鎖支持構造は、共通の加熱筐体にＲＰを直接受け入れることが可能になることに留意されたい。
【００８１】
典型的には、加熱供給設備は、適切な温度、特に３７℃以上、３５℃以上、３２℃以上、３０℃以上、２５℃以上で細胞を保存することを目的としている。しかしながら、例えば、加熱供給を使用して、ＱＣをベースとした方法に正しい温度を提供することもでき、一部の実施形態では、より高温が必要とされる場合もある（例えば、ＰＣＲをベースとした方法は、使用される酵素に応じて、９４−９８℃、４８−７２℃、６８−７２℃の温度サイクルを必要とする）。
【００８２】
細胞処理モジュール（ＣＰＭ）
ＣＰＭは、ＣＰＳに着脱可能に取り付けられ得る、ドッキングされ得る、統合され得る、またはＣＰＳに設置され得る、別個のモジュールである。ＣＰＭは特定の患者および細胞プロセス用のＦＣおよびＲＰを受け入れる。１つまたは複数のＣＰＭがＣＰＳプラットフォームに設置されると、すぐに、多数の患者サンプルを同時に処理することが可能になる。第２のまたはさらなるＣＰＭを、ＣＰＳに設置するまたは取り出すタイミングが、１つまたは複数の先行のＣＰＭが設置された時間に応じて、限定されることはない。適切には、任意の新しいＣＰＭは、オペレータの必要によって指示される時間に設置され、ＣＰＳは、プロセスの開始および後続の操作を、全プロセスにとって最も時間効率のよい方法で順序づけ、並行して実行する。
【００８３】
ＣＰＭは、該ＣＰＭが想定される細胞処理に適切な任意のサイズであり得る。一実施形態では、ＣＰＭは、ＣＰＳへの設置の前に、プロセスに必要なコンポーネント、例えば、試薬パックおよび処理用の細胞サンプルを含む流体カートリッジを構成するコンポーネントを集めた製造設備の周りを上手く移動できるように、トロリーに置かれる。斯かる実施形態の図解は、図２ａで提供する。
【００８４】
大量投与細胞療法は、試薬パックに組み込まれた際に、高重量過ぎて安全に運べない場合がある、使い捨て全重量を生じさせ得る大量の培地および支持試薬を必要とする。ＣＰＭをトロリーに乗せるように適合させることは、試薬保存設備をＣＰＳの近くに置く必要をなくし、設置コストおよび潜在的なオペレータの被害を低減させる。
【００８５】
ＣＰＭを、車輪または他の移動手段（例えば、トロリーなど）に乗せることにより、他の利点も可能になり：ＣＰＭのＣＰＳへのドッキングが誘導され（例えば、レールによって）、自動化または半自動化され得る（例えば、ＣＰＭのＣＰＳへのぞんざいな結合を避けるブレーキシステムを用いて）。正しいドッキングのための水平器または留め具が組み込まれ得、その結果、ＣＰＳは、相応の肯定的メッセージまたは過失メッセージを表示し得る。
【００８６】
一実施形態では、トロリーは、ベッドサイドで患者から細胞サンプルを直接収集するために使用され得る。実施形態では、トロリーは、ＣＰＳにドッキングまたは設置され、適切に所定位置に運ばれ得るように適合される。
【００８７】
ＣＰＭを容易に移動可能な形態で有する（例えば、ホイールを加えることにより）という利点はあるものの、これは必要条件ではなく、他の設計も考えられ得る（例えば、スペースの節約のため）。図２ｂは、手動で搭載し得る４つのＣＰＭを有するＣＰＳ例を示す。図２ｃは、より詳細にこの実施形態のＣＰＭを示す。
【００８８】
実施形態において、ＣＰＭは以下のうち１つまたは複数を含む：
【００８９】
−ＦＣおよび／またはＲＰがいったんそれぞれの筺体内に封入されたら、ＦＣおよび／またはＲＰの接合流体連通点が結合するように、ＦＣおよび／またはＲＰを係合させる手段。斯かる係合手段は、適切には、それぞれの筺体の熱完全性を損なわない。ＦＣおよびＲＰを係合させる、可能性のある一つの方法は、ＦＣおよびＲＰの支持構造の一方または両方を変形させて、２つの実体が一つになるようにすることである。これは、ユーザーに操作されるか、または、自動的に動作が開始される、何れかの筺体に取り付けられた持ち上げ機構を含み得る。あるいは、ＦＣとＲＰの係合は機械の外側で生じ、さらに、オペレータによりプロセスが実行される可能性があることに留意されたい。ＦＣおよびＲＰが統合実体である場合、係合手段は必要でない場合もあることにも留意されたい。
【００９０】
−電力供給装置、制御システム、およびユーザーインターフェースへの電気的接続およびデータ接続、インキュベータおよび冷却設備への配管、プラットフォームＱＣシステムへの物理的接続を含む、必要なＣＰＳプラットフォーム設備へのある範囲の接続。別の実施形態では、各個別のＣＰＭがそれ自身の専用設備を有することが確認されることに留意されたい。
【００９１】
−種々の異なるパラメータをモニタリングするプロセスに必要な、ＦＣおよび試薬パックに提供されるある範囲のセンサ。これらのセンサには、温度を測定するための熱電対またはサーミスター、流体圧力を測定するための圧力変換器、流体流速を測定するためのフローメータ、グルコースモニタ、酸素センサ、およびプロセスに必要な他のセンサなどのバイオセンサが含まれ得る。さらに、センサは、プロセスの種々の段階で変数を最適化する、クローズドフィードバック制御ループを提供し得る。
【００９２】
実施形態では、ＣＰＭは、プロセス中に温度制御環境をＲＰに提供する、インキュベータ筐体を含む。適切には、筺体は、冷却（つまり、環境温度を下回る）環境を提供する。典型的には、冷却筐体内で維持される温度は、約１５℃未満である。適切には、温度は、約１０℃、８℃、６℃、４℃、２℃、０℃未満である。実施形態では、筺体は冷却されて、約４℃の環境を提供する。冷却筐体の利点は、温度感受性試薬に、全プロセスを通して残存するための適した環境を提供し、それにより、プロセス中に時間および温度感受性試薬を搭載する追加のオペレータの労力と、プロセスを停滞または妨げる可能性をなくすことである。一実施形態では、冷却筐体は、ＲＰが挿入、維持、および封止される閉鎖支持構造を有するＣＰＭ内で、封止および隔離されたコンパートメントである。代替の実施形態では、冷却筐体は、ＲＰの一部のみに冷却設備を提供する、より小さいコンパートメントである。
【００９３】
一実施形態では、ＣＰＭは、さらに、ＦＣおよび／または試薬パックに追加の熱エネルギーを与えるためのヒーターパッドおよびコントローラを含み得る。適切には、ヒーターパッドは、ＦＣのみに熱を与える。インキュベータ筐体に加えてヒーターパッドを有する利点は、試薬流体がＦＣに入る前または入る際に素早く加熱する手段であることであり、これは、周囲の熱により試薬流体の温度を上昇させる際の遅れを減少させる。同様に、ヒーターパッドは、インキュベータ内の試薬流体の温度により優れた制御をもたらす。実施形態では、ヒーターパッドは、必要な加熱特徴を提供するのに適した任意の形態であり得る。適切には、ヒーターパッドは、ペルチェ熱コンポーネント、シリコンベースの熱ウェハ、電気的に加熱された金属ブロック、または熱エネルギーを与えるための他の手段である。実施形態では、ヒーターパッドは、プロセス用の初期熱供給源として、インキュベータ筐体に取って代わる。典型的には、加熱パッドは、細胞処理時に適切な温度、特に、３７℃以上、３５℃以上、３２℃以上、３０℃以上、２５℃以上を維持するために構成される。しかしながら、同じまたは異なる加熱パッドを使用して、ＱＣをベースとした方法に正しい温度を提供することもでき、一部の実施形態では、より高温が必要とされる場合がある（例えば、ＰＣＲをベースとした方法は、使用される酵素に応じて、９４−９８℃、４８−７２℃、６８−７２℃の温度サイクルを必要とする）。
【００９４】
実施形態では、ＣＰＭは、さらに、ＣＰＭ内に収容された機械式アクチュエータと、ポンプ、弁、または他の動的コンポーネントなどのＦＣ内の作動エレメントを含む。例えば、ダイアフラムポンプが使用され得る。このポンプ技術は、空気圧によりまたは機械的に駆動されて、シリンダー内のピストンによく似た各振動で流体チャンバ（ダイアフラム下にある）の体積を変化させる、振動ダイアフラムを利用する。このポンプアプローチは、心臓の動きを真似ており、そのため、最も自然で細胞に優しいと考えられる。この技術の使用により、製造コストが低く、組み立てが容易なチューブなし溶液が提供される。吸い込みおよび排出ストロークにおいてダイアフラムを作動させるため、ＣＰＭ内のポンプモータを、クランク式配置で使用する場合がある。同様に、ポンプは、圧力および吸引源からの空気圧で駆動され得る。あるいは、または、さらに、弁ダイアフラムを使用し、内側に力を加えたエラストマーダイアフラムを利用して、活性化時に流体を止める堰に対する流体シールを作成する。想定される別の動的コンポーネントは、非常に正確で少量の流体の反復分注を制御し得る、高精度の流体投与ユニットである。ＣＰＭ内に収容されている機械式アクチュエータの利点は、特に、ＦＣが使い捨ての単回使用コンポーネントである場合、機械式アクチュエータによりＦＣのコストおよび複雑度が低減することである。これは、より低コストのポンプと弁ヘッドのみが処理後に処分され、作動手段は残され再度使用されるからである。
【００９５】
実施形態において、ＣＰＭは、ＦＣが、分離、活性化、形質導入、増殖、またはプロセスの他の段階の一部として利用し得る、遠心分離設備を含む。
【００９６】
流体カートリッジ（ＦＣ）
ＦＣは、細胞処理の全てにわたり、細胞を含み操作する個々のＣＰＭのコンポーネント部分である。各ＣＰＭは、実行する細胞プロセスに適切な任意の数の流体カートリッジを含み得る。典型的には、各ＣＰＭは、１つまたは複数のＦＣを含む。一実施形態では、各ＣＰＭは、１つのＦＣを含む。１つまたは複数のＦＣは、ＣＰＭに装着された際に、他のサンプルおよび環境からの相互汚染より封止された閉鎖構造を提供する。
【００９７】
滅菌、無菌状態を保つため、ＦＣを無菌状態で新たに使用され、単回使用後（つまり、単一細胞の処理手順後）に処分され得る。あるいは、ＦＣは、使用後に適切に処理されて、反復使用の前に滅菌、無菌状態に戻される場合もある。
【００９８】
ＦＣは、細胞材料を収容し、異なるプロセスステップに使用され得るエレメントを提供する。本発明の実施形態では、これらのエレメントとしては以下のものが挙げられる：
−親材料を分離するためのフィルタ、遠心機、または他の活性表面（分離）
−細胞をインキュベートし、活性試薬を導入するための反応容器、フラスコ、またはビーカー（活性化、形質導入、増殖）；
−１つまたは複数の廃棄物処理用容器；
−ＦＣのある領域から別の領域へ流体を方向づけるためのギャラリー、チャネル、および流体回路。
【００９９】
実施形態において、ＦＣは、また、流体および細胞を、プロセスの種々のステップに割り当てられたＦＣ内で別の位置に移動させるのに必要なポンプおよび弁を含む。使用ポンプの種類は、任意の適切な種類のポンプが使用可能であると考えられるものの、適切には、ダイアフラムまたはプランジャー式ポンプなどの容積式ポンプである。同様に、弁は、任意の適切な種類の弁が使用可能であるものの、適切には、ダイアフラム弁または回転弁であり得る。
【０１００】
ポンプおよび弁は、また、プロセス時の必要に応じてＲＰからＦＰへの流体の移動を可能にする。これらの流体には、親入力材料、試薬培地、活性化試薬、および／または他の必要な流体が含まれ得る。
【０１０１】
実施形態において、ＦＣは、また、ＦＣとＲＰの間の流体連通を可能にして、その２つが、別々のアイテムとして製造され、供給され、搭載されながら、ＣＰＭにいったん設置されたら閉鎖システムを提供することを可能にする、流体接続点を含む。接続は、プロセスを通してＦＣの無菌完全性を維持する必要があり、これは、例えば、その２つのアイテムを流体接続する、はぎ取り式で密閉封止されたコネクタ、または他の滅菌もしくは無菌性のコネクタを使用することにより達成され得る。
【０１０２】
流体カートリッジにおける少なくともいくつかの流体回路は、細胞を含む、しばらくの間培養されていた細胞を含む可能性もある、流体を運ぶ。これらの細胞は凝集しやすいことから、特定の実施形態では、試薬パック内の流体の流れを方向づける流体回路は、細胞生成物が流れる際に細胞凝集を破壊するように設計される。これは、管の直径の変化させることと、急旋回（９０°旋回を含む）と組み込むことにより達成され得る。このように、細胞流体の流れは線形ではなく、ヒトの介入を必要とせず、例えば、ピペッティングの上下などにより達成される効果を模倣する。
【０１０３】
本システムの実施形態において、ＲＰは、ＦＣに統合されて、単一ユニット式コンポーネントとしてＲＰとＦＣを提供し得る。斯かるアプローチは、オペレータの労力、廃棄物排出量を減少させ得るか、または、他の利点が統合組み合わせにより提供される。
【０１０４】
実施形態において、ＦＣ構造は、成型されたおよび／または溶接された、ポンプまたは弁フィーチャを有する外側被覆されたエラストマー領域を備える、実質的に剛性のポリマーアセンブリである。成型パーツ間にカプセル化された別個のフィルタエレメントがあってよい。ある実施形態では、ＦＣの設計およびレイアウトは、埋め込まれた流体ギャラリーを使用して、適切な流体を移動させる原動力を提供する一体型のダイアフラムポンプを用いて流体をプロセスのステップに導き得る。あるいは、ＦＣ構造は、インペラーポンプ、蠕動ポンプ、フィルタ、または合成フレームに保持された遠心機などの別個の流体コンポーネントを有する、可動性のチューブネットワークを含む。さらなる代替として、ＦＣ構造は、別個の流体エレメントを有する可動性チューブ部分を備える一体型成型アセンブリの組み合わせであり得る。
【０１０５】
試薬パック（ＲＰ）
ＲＰは、プロセスに必要な種々の非細胞流体を含む、患者特異的な消耗品である。流体は、液体、水溶液、ガス混合物、ゲル、凍結乾燥物の懸濁液、または他の流体組成物であり得る。適切には、流体は、患者投入材料、バルク培地、有効成分、および必要な他の試薬であり得る。適切には、試薬としては：患者の全血、アフェレーシス、単離した患者の細胞材料、細胞増殖培地、例えば、Ｘ  Ｖｉｖｏなど、細胞分離培地、例えばＦｉｃｏｌｌなど、成熟化薬、細胞活性化因子または阻害剤、サイトカイン、酵素、抗体または類似のタンパク質、タンパク質、ペプチド、ウイルスまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、もしくはそれに基づくベクター）トランスポゾン（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）、他の核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、ｌｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、合成分子（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ステープルペプチド）緩衝液、再構成培地が挙げられる。
【０１０６】
典型的には、実用的な理由から、患者由来の材料と他の材料は区別されよう。例えば、適切な保存条件下で、非患者由来の材料は、ＲＰに予め集められ得る。患者由来の材料は、細胞処理を行う必要がある際に、ＲＰに含まれるまたは接続されるだけであろう。したがって、ある実施形態では、非患者由来の材料のみを含むＲＰがすでにＦＣに接続している、および／または、ＣＰＭ内に組み込まれており、患者由来の材料は後で含まれるだけである。患者由来の材料はＲＰに組み込まれてもよいし、接続されてもよい。
【０１０７】
如何に患者由来の材料が、すでにＲＰおよびＦＣを含んだＣＰＭに接続され、含まれるかについての非限定的例については、以下のステップを描く図５ａ−ｅを参照されたい：
−ステップ１：チューブ溶接機を細胞処理モジュールに位置付け、割り当てられた容器にアフェレーシスを搭載する（図６ａ）；
−ステップ２：細胞処理モジュールからの入力チューブと、アフェレーシスバッグからの出力チューブをチューブ溶接機に装着し、溶接する（図６ｂ）；
−ステップ３：チューブ溶接機から溶接したチューブを外し、チューブの末端を始末する（図６ｃ）；
−ステップ４：チューブ溶接機を細胞処理モジュールの上部から取り除き、溶接チューブ接続を、アフェレーシスバッグの上部に置く（図６ｄ）；
−ステップ５：ここで、ＣＰＭおよび患者の細胞生成物を、処理のためにＣＰＳに搭載することが可能になる（図６ｅ）。
【０１０８】
ＲＰは、また、ＦＣとＲＰの間の接続を可能にして、その２つが、別々のアイテムとして製造され、供給され、搭載されることを可能にする、流体接続点を含む（接続法に関するより細部については、ＦＣを参照されたい）。
【０１０９】
ＲＰが、中にチャンバを有するＦＣに統合され、チャンバの構造は、前記流体で予め充填されていることにも留意されたい。
【０１１０】
ＲＰの構造およびレイアウトは、１つまたは複数の試薬容器とＦＣに接続した流体接続点を収容する、剛性構造を含む。剛性構造は、挿入される別個の試薬容器に対し特異的な領域を有する、成型され溶接されたポリマーアセンブリからなり得る。個別の試薬容器は、成型された無菌コネクタが中に溶接された、可撓制で柔軟なポリマーフィルム構造であり得る。
【０１１１】
ＲＰは、また、成型されたコネクタハードウェア挿入物を有する外側被覆されたエラストマー領域を備える剛性ポリマーアセンブリを含み得、それにより、剛性物中に成型された間隙が、流体材料が中に含まれる容器を形成する。
【０１１２】
試薬パックは、あるいは、個別に搭載される、統合流体接続点を有する一連の別個の試薬容器を含み得る。いくつかの特異的な実施形態では、廃棄物処理用の空の容器が試薬パック内に予測される。
【０１１３】
１つまたは複数の個別にパッケージ化された試薬流体パックを収容する剛性試薬構造の利点は：他の利点に加え、多数の試薬製造供給者および製造所を可能にすること；治療プロトコルに従って試薬パックが設定可能であること；多数の充填ステップでの汚染を防ぐことである。
【０１１４】
非限定的例として：特定の実施形態では、設定可能な試薬パックが、該試薬パックの一部のみが細胞プロセスの開始時に組み込まれる一方、試薬パックの別の部分は、プロセスの進行中に細胞処理モジュールに接続または組み込まれることを必要とし得る。当然、接続は、装置またはプロセスの閉鎖的な性質を損なうことなく、無菌で行われる必要がある。これが使用され得る例は、例えば、ウイルスベクターの提供であり、これは、形質導入ステップの直前に行われ得る。
【０１１５】
実施形態において、ＲＰ構造は、プロセス中に、ＲＰをＣＰＭから完全に取り外すことも、ＦＣへの流体接続を切り離すこともなく、ＲＰにさらなる試薬の付加を提供する。実施形態において、斯かる構造は、ＲＰ構造内のコンパートメントを晒すために開く、適切な滅菌バリアを有するラッチ可能なハッチからなり、これにより、追加の試薬が挿入され、ＦＣに流体接続することが可能である。
【０１１６】
方法
本発明の装置および方法を使用して、治療に使用する、特に細胞療法に使用するための多種多様の細胞を生成することができる。細胞療法は、疾患の治療のために、全生細胞を投与すること、または、患者の特異的な細胞集団を成熟化させることと定義される。これには、限定するわけではないが、輸血、骨髄移植、幹細胞療法（造血幹細胞（ＨＳＣ）療法または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）療法を含む）、および臍帯血療法が含まれる。最近は、免疫系に含まれる細胞を修飾して患者に投与し、例えば、がんまたは感染症に対する免疫反応を改善する、細胞をベースとした免疫療法が多くの注目を集めている。斯かる細胞をベースとした免疫療法としては、例えば、樹状細胞をベースとした免疫療法、ＮＫ細胞免疫療法、Ｂ細胞免疫療法、Ｔ細胞免疫療法―限定するわけではないが、ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）をベースとした療法、ＴＣＲ療法（Ｔ細胞が修飾ＴＣＲを備えている）、または、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法が含まれる―が挙げられる。本明細書に記載の細胞処理装置は、これらの方法のうち何れかで使用される細胞の処理に使用され得るが、特に、細胞の修飾（細胞の培養または増殖の冒頭での）を伴う方法に適している。これは、斯かる方法が、複数の異なる行為をサンプルに対し行う必要があるためである。言い換えると、装置および方法は、特に、細胞をベースとした免疫療法に適している。
【０１１７】
細胞をベースにした免疫療法は、自家性（細胞処理に患者自身の細胞を使用し、その後、その細胞を再点滴または再注射する）である場合も、同種（細胞処理にドナー細胞を使用し、これを次に患者に投与する）である場合もある。本装置および方法は両方の種類の療法に使用することが可能であるが、得られる時間的な利点が、自家免疫療法にとって最も重要であり、自家免疫療法を特に想定する。これは、この療法が患者材料より始まるため−ドナー材料から開始する場合は、細胞調製物は予め調製可能であるためである。
【０１１８】
想定される方法は、典型的には、本明細書に記載する流体カートリッジにおいて実行されよう。このカートリッジは、操作中である場合、試薬パックと流体連通し、細胞処理に対し閉鎖システムを提供することから、本方法は、適切な試薬パックに接続したカートリッジ内で（つまり、本明細書で記載する細胞処理ユニットにおいて）実行されるということも可能である。さらに、カートリッジおよび試薬パックは、典型的には、細胞処理モジュールの一部を形成することから、本方法は、典型的には、本明細書で記載する細胞処理モジュールにおいて実行される。これらの細胞モジュールは、細胞処理ステーションでの使用のために提供され、したがって、本方法は、本明細書で記載する細胞処理装置での実行に特に適している。
【０１１９】
本装置が、細胞サンプルに対し、自動化処理を伴う完全に閉鎖された環境を提供するという事実の利点は、本方法が、通常の細胞製造方法とは対照的に、機密扱いされない領域で実行され得るということである。
【０１２０】
本明細書で記載する方法は、典型的には、細胞サンプルの提供を第１ステップとして含む。サンプルは、健康な対象か、または、治療の必要な患者から採取され得る（典型的には、自家方法での場合）。開始材料は、適切な細胞を含むだろう。細胞をベースとする免疫療法では、細胞サンプルは、典型的には、免疫系の細胞を含むだろう。特に、細胞サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含むだろう。さらにより具体的には、細胞サンプルは、リンパ球を含むだろう。最も具体的には、細胞サンプルはＴ細胞を含むだろう。
【０１２１】
細胞サンプルの非限定的例としては、血液、アフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス生成物、骨髄、またはリンパが挙げられる。血液およびアフェレーシスは、収集するのに最も浸潤が少なく、十分な数の適切な細胞を容易に含むことから、血液およびアフェレーシスが特に想定される。
【０１２２】
細胞サンプルは、次に、本明細書で記載する細胞処理モジュールに置かれ得る。これは、細胞サンプルを試薬パックに組み込むことか（つまり、試薬パックは、いくつかの容器、つまり、患者由来の材料を有する容器と、非患者由来の材料を有する少なくとも１つの容器を含む）、または、細胞サンプルを流体カートリッジに滅菌的な方法で接続するか、または、細胞サンプルを流体カートリッジに置くことにより、なされ得る。また、細胞処理モジュールがすでに組み立てられており、試薬パックと接続した流体カートリッジ（つまり、細胞処理ユニット）を含むこと、および、細胞サンプルが細胞処理モジュールに搭載されること（例えば、細胞サンプルを滅菌的な方法で流体カートリッジまたは試薬パックに接続することにより）も可能である。したがって、細胞サンプル、流体カートリッジ、および試薬パックが提供され、互いに接続される順は、典型的には、交換可能であり、装置のレイアウトまたは実行されるプロセスの性質に左右され得る。細胞処理モジュールがいったん組み立てられ、細胞サンプルを含んだら、細胞処理モジュールは、次に、細胞処理ステーション上の利用可能な受け点に係合させられ得、細胞処理ステーションは、細胞サンプルの自動細胞処理を実行するように操作され得る。一部の実施形態では、患者材料は、細胞処理ステーションとすでに係合している細胞処理モジュールに搭載され得る。しかしながら、細胞処理方法は、細胞サンプルが細胞処理モジュール内にあって（または、接続されて）初めて、開始されよう。一部の特定の実施形態では、細胞処理方法は、試薬パックの一部のみが提供された場合に開始することが可能であり、試薬パックの残りは後の時点で提供されることに留意されたい。これは、例えば、材料が特別な方法で最適に保存された場合、または、材料が慣行に従い機密扱いの環境で取り扱われる場合であり得る。
【０１２３】
本明細書で記載する装置で実行される方法の特別な利点は、２つ以上の細胞処理方法が、同じ装置の異なるサンプルに対し、互いに独立して、ただし本質的には並行して（つまり、少なくとも部分的に時間的に重複して）、行われ得るということである。したがって、新しい細胞サンプルに対する方法は、先行するサンプルの処理方法が終わる前に、同じ装置上で（異なる細胞処理モジュールにおいて）開始されて得る。言い換えると、細胞サンプルを提供するステップ、流体カートリッジと試薬パックを提供するステップ、細胞サンプルを流体カートリッジに接続する（または、細胞サンプルを細胞処理モジュールに搭載する）ステップ、および細胞処理モジュールを係合させるステップが、連続的ではない、ただし並行した（または、部分的に並列した）方法で、繰り返され得る。並行プロセス数は、典型的には、細胞処理ステーションにおいて同時に係合され得る細胞処理モジュールの数によって決定される。
【０１２４】
本方法は、同じ装置上で、互いに独立して、実行され得る。これは、異なる細胞処理が、同じ装置の異なる細胞サンプルに対し並行して実行されることを含意するが、典型的には、並行して実行されるのは、同じ細胞プロセスである。
【０１２５】
特定の実施形態では、装置は、同じ患者の異なる細胞サンプルに対し、並行かつ独立して、同じ細胞プロセスを実行する。こうして、同じ患者の複数回分の投与量が、同じ装置で作成され得る。
【０１２６】
特に想定される一態様は、自動化細胞処理方法が、細胞をベースとした免疫療法薬の製造に使用されることである。これは、典型的には、幹細胞、ＰＢＭＣ、リンパ球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞の修飾を必要とする。いくつかの実施形態では、修飾は、遺伝子修飾である。さらなる実施形態では、修飾は、例えば、ＴＣＲ修飾Ｔ細胞またはＣＡＲ修飾Ｔ細胞を作成することなどによる、Ｔ細胞の遺伝子修飾である。
【０１２７】
本発明の装置で適切に実行され得るプロセスの例として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の調製での典型的な手順を、実施例３で提供する。
【０１２８】
本明細書で記載する自動化細胞処理方法は、典型的には、以下から選択される１つまたは複数のステップを含む：
・関心の細胞の選択および／または富化
・細胞の活性化
・例えば、形質導入による、細胞の遺伝子修飾
・細胞の増殖
・細胞の濃縮
・保存（凍結保存を含む）および／または直接注入のための、細胞の製剤化。
【０１２９】
これらのステップの間では、細胞は、典型的には、過剰な試薬を取り除くため、または、培地を変えるために、適切な緩衝液で洗浄される。これらの異なるステップについては、以下でより詳細に記載する。
【０１３０】
細胞の選択および／または富化
典型的には、細胞サンプル出発物質は、処理される細胞の純粋集団ではないだろう。むしろ、全血などの患者材料またはアフェレーシス生成物などの部分的に処理された患者材料が、出発物質として使用される。これらの材料は、多数の細胞型を含み、処理すべき特定の細胞型を選択しおよび／または富化させるために、異なる方法が使用され得る（細胞型にも左右される）。細胞をベースとした免疫療法で使用される細胞型の多くが何らかのＰＢＭＣであることから、細胞の富化は、また、ＰＢＭＣを富化または選択する（それにより、複数の細胞型を富化する）ことによりなされ得、この後に、特定の細胞型（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、単球、リンパ球）の富化または選択が続く場合も続かない場合もある。
【０１３１】
サンプルにおけるＰＢＭＣの選択は、最も典型的には、Ｂｏｅｙｕｍにより元々開発された、当技術分野で周知の方法に基づいた単純で迅速な遠心分離手順を使用する、Ｆｉｃｏｌｌ手順を使用して、実行される（Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood(Paper IV). Boeyum, A., Scand. J., Clin. Lab. Invest. 21 Suppl, 97, 77-89 (1968); Isolation of leucocytes from human blood - further observations.(Paper II). Boeyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 Suppl, 97, 31-50 (1968); Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Boeyum, A., Scand. J., Immunol. 5 Suppl, 5, 9-15 (1976))。
【０１３２】
本明細書で提供する方法では、細胞処理装置または流体カートリッジの設計に応じて、ＰＢＭＣの富化または選択（または、すなわち、非ＰＢＭＣからのＰＢＭＣの選択）は、以下によっても達成可能である：
−細胞を凍結し、赤血球（ＲＢＣ）および顆粒球を死滅させ、Ｔ細胞と単球を生存させる；
−マイクロ流体チャネルを使用して、ＲＢＣを血液サンプルから除去することが可能である（典型的には、その異なる表現型に基づいて：異なるサイズ、重さ、体積、光散乱、またはマーカーを使用して、異なる細胞をマイクロ流体回路に導くことが可能である）；
−ハイドロサイクロンまたはハイドロサイクロンのいくつかのステージの使用により、ＲＢＣを、その流体抵抗に対する向心力が異なる比率であることにより、血液サンプルから取り除くことが可能である；
−フィルタサイズの多数の層を使用して、Ｔ細胞を、サンプルより積極的に選択し、ＲＢＣおよび顆粒球を取り除くことが可能である。追加のフィルタを使用して、他の洗浄ステップを実行することが可能である；
−磁性ビーズ／クラウドを使用し、ＲＢＣ／顆粒球を取り除く負の選択と（溶解およびｍａｇビーズ）、Ｔ細胞および単球の正の選択を使用して、ＰＭＢＣを単離することが可能である；
−異なる濃度のＲＢＣおよびＰＢＭＣを使用し、遠心分離を使用して、全血からＰＢＭＣのみを収集することが可能である；
−対向流遠心法（ＣＦＣ）を使用することにより、ＲＢＣと顆粒球をＴ細胞から選び出し、いくつかの洗浄ステップを実行することが可能である；
−繊維濾過を使用し、培地交換を行って、洗浄ステップ時に細胞を濃縮することが可能である。タンジェンシャルフロー中空線維フィルタが、これに有用である；
−赤血球細胞を、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）溶液などのＲＢＣ溶解緩衝液を使用して、溶解することが可能である；
−ヘタスターチを、ＲＢＣ用の沈殿薬として使用することが可能である；
−ビオチン共役ＣＤ３抗体と組み合わせて使用される、ストレプトアビジンでコーティングされたＭａｇｃｌｏｕｄｚ（商標）ゲルを、Ｔ細胞の正の選択に使用することが可能である；
−音響技術を使用して、多次元定常波を生成して、ＲＢＣ細胞を分離する。
【０１３３】
また、特異的な細胞に対する正または負の選択ステップ（典型的には、マーカーを使用する）が、細胞の選択または富化を達成するために、本方法で使用され得る。例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８マーカーを使用して、Ｔ細胞を富化することが可能であり、ヒトＢ細胞に対してはＣＤ１９およびＣＤ２０が、樹状細胞に対してはＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３、ＢＤＣＡ−２、ＢＤＣＡ−４が、ヒトＮＫ細胞に対してはＣＤ５６が、造血幹細胞に対してはＣＤ３４が、ヒト単球またはマクロファージに対してはＣＤ１４およびＣＤ３３が、ヒト顆粒球に対してはＣＤ６６ｂが、ヒト血小板に対してはＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２が、赤血球に対してはＣＤ２３５ａが使用される。後者の３つの細胞型は、典型的には、負の選択をされる（つまり、サンプルから取り除かれる）だろう。これらのマーカーに対する抗体は周知であり、商業的に入手可能であり、これらの細胞型の選択または富化に決まって使用される。抗体は、これらの抗体でコーティングされた表面（例えば、流体カートリッジにおける）を使用する方法において、斯かる抗体を有するカラムを使用して、これらの抗体を有する（常）磁性ビーズを使用して（操作を楽にするために）、これらの抗体に結合し得る（常）磁性ビーズを使用する（例えば、ＭａｇＣｌｏｕｄｚ（商標）キット；Ｑｕａｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）を使用する）などして、使用され得る。
【０１３４】
細胞の活性化
いったん適切な細胞集団が達成されたら（細胞サンプルとして直接的に、または、適切な細胞の選択および／もしくは富化ステップの後で）、本方法は、さらに、細胞を活性化するステップを含み得る。このステップは、ほとんどの場合任意選択的であるが、本方法が、（γ−）レトロウイルスまたは（γ−）レトロウイルスベクターを使用する、細胞の修飾を必要する場合は、特に有用である。これは、レトロウイルスが（株に応じて）優先的にまたは排他的に分裂細胞に形質導入を生じさせるためである。レンチウイルスおよびアデノウイルス（およびそれらに基づくベクター）は、典型的には、分裂細胞および非分裂細胞の両方に影響を及ぼし、そのため、細胞の活性化は、必要条件ではない。同じことが非ウイルス方法（例えば、エレクトロポレーション、ソノポレーション、遺伝子導入、マグネットフェクション、遺伝子銃）にも当てはまる。
【０１３５】
細胞の活性化は、当技術分野で記載されている通りに行う。典型的には、ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）が、活性化シグナルとして使用される。第２活性化シグナル、例えば、抗ＣＤ２８抗体も、使用され得る。抗ＣＤ３に基づいた活性化が、当技術分野で最も一般的であるが、斯かる活性化の第２シグナルは、唯一の活性化シグナルとしても使用され得る。他の活性化シグナルは、例えば、抗ＣＤ２抗体、抗４−１ＢＢ抗体である。細胞を活性化させるために使用可能なサイトカインとしては、限定するわけではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１の何れか単独または組み合わせが挙げられる。
【０１３６】
細胞の遺伝子修飾
本明細書に記載する方法は、しばしば、細胞の遺伝子修飾のステップを含む。遺伝子修飾は、限定するわけではないが、遺伝子導入、エレクトロポレーション、電気融合、ソノポレーション、マグネットフェクション、または遺伝子銃を含む、当技術分野で標準的な手順を使用してなされ得る。特定の実施形態では、遺伝子修飾は、ウイルスベクターを用いた形質導入によりなされる。ウイルスベクターとしては、限定するわけではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターが挙げられる。
【０１３７】
遺伝子修飾プロトコルは、当技術分野で周知であり、本明細書に記載する方法と互換性があり、本明細書に記載する細胞処理装置内に適応され得る（ただし、適切なハードウェアが、装置、細胞処理モジュール、または流体カートリッジに統合されることを条件とする）。いくつかのウイルス形質導入プロトコル（特に、レトロウイルス、ただし、レンチウイルスも含まれる）の効率は、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（フィブロネクチン断片）ポリブレン（臭化ヘキサジメトリン）、またはｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ−１（登録商標）などの、カチオン剤を使用する場合に高まる。したがって、遺伝子修飾方法は、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）でコーティングされたプレートまたはバッグを使用するなどの、これらの試薬の使用を必要とし得る。遺伝子修飾ステップが本方法で実施され得る他の例示的な方法は、以下を使用することによる：
−ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（または類似の製品）でコーティングされ、ＣＦＣコーンに懸濁されたＭａｇｃｌｏｕｄｚ（商標）；
−形質導入は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（または類似の製品）でコーティングされたＣＦＣコーンを用いて達成され得る；
−形質導入は、細胞およびウイルスベクターが相互作用する流動層を作るＣＦＣコーンを用いて達成され得る；
−形質導入は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）などの適切なプライマーで予備刺激された、または予備刺激ステップなしのフィルタに細胞およびウイルスベクターを導入することにより達成され得る；
−形質導入は、音響技術を使用し、ウイルスベクターを用いて細胞を濃縮することにより達成され得る。
【０１３８】
遺伝子修飾（つまり、その構造が導入される、または、そのタンパク質の発現が変えられる）の種類は、本発明を限定するものではなく：任意の遺伝子修飾がなされ得る。しかしながら、細胞免疫療法で特に想定されるのは、ＴＣＲ修飾Ｔ細胞（遺伝子修飾により修飾ＴＣＲを導入することによる）またはＣＡＲ修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞等の作成である。
【０１３９】
遺伝子修飾プロトコルで導入され得るＣＡＲ構造の例としては、限定するわけではないが、以下の標的に対して作られたＣＡＲが挙げられる：ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＳ１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＲＢ２、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ、ＧＤ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、Ｌ１−ＣＡＭ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、およびＢ７Ｈ６。ＣＡＲは、第１世代構造物（一刺激ドメイン、典型的にはＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩを有する）、第２世代構造物（追加の刺激ドメイン、典型的にはＣＤ２８または４−１ＢＢを有する）、または第３世代構造物（追加の２つの刺激ドメイン、典型的には、すでに上記した群と、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、または類似の鎖から選択されるもの）であり得る。それらは、また、さらに修飾され得る（阻害性ＣＡＲ、ゲートＣＡＲ、サイドＣＡＲ、ＴＲＵＣＫ、ａｒｍｏｒｅｄ  ＣＡＲ等）。また、特に想定されるのは、２つの異なる標的に対し特異性を有する二重特異性ＣＡＲである。
【０１４０】
特に想定されるのは、ＮＫＧ２Ｄ  ＣＡＲ（国際公開第２００６０３６４４５号に記載されている）、Ｂ７Ｈ６  ＣＡＲ（国際公開第２０１３１６９６９１号に記載されている）、またはＮＫｐ３０  ＣＡＲ（国際公開第２０１３０３３６２６号に記載されている）の使用である。
【０１４１】
修飾ＴＣＲは、細胞内タンパク質も標的し得るという、ＣＡＲを上回る利点を有する。ＣＡＲにより想定される標的に加え、修飾ＴＣＲにより想定される標的の例としては、限定するわけではないが：ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＲＯＲ−１、ＷＴ−１が挙げられる。
【０１４２】
増殖
プロセスの異なるステージにおいて、細胞は、処理方法の終わりに得られる処理細胞の数を増加させるように、培養または増殖され得る。例えば、細胞は、活性化前後、または修飾後、または濃縮もしくは製剤化の前に増殖され得る。典型的には、細胞の増殖は、Ｇ−ＲＥＸ（商標）システム（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ（登録商標））などのガス透過性迅速増殖装置においてなされ得る。
【０１４３】
しかしながら、本方法は、Ｇ−ＲＥＸ（商標）の使用に限定されず、以下の代替物も想定され、当業者は、細胞を増殖する類似の方法を見つけることが可能である。
−中空線維：細胞は、活性化および／または増殖用フィルタチューブの中空線維の中心に搭載される。増殖培地およびサイトカインが繊維の外側を囲み、そのため、繊維を通して細胞に供給／接触し得る；
−カスタムフラスコ：フラスコの底は、ガス透過のためＧ−Ｒｅｘフラスコに類似した物質で構築されていよう；
−振動しない細胞培養バッグ；
−例えば、使い捨てＷＡＶＥ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標）などにおける、振動付き細胞培養バッグ；
−抗体が付着したヒドロゲル：これは、活性および増殖される細胞用の、効果的で大きい表面積を形成する。必要であれば、追加のゲルが加えられ得る。ヒドロゲルは、フラスコ、バッグ、またはＣＦＣ容器に入れられ得る。
−足場依存性細胞が培養される任意の用途では、マイクロキャリアビーズが使用され得る。
【０１４４】
細胞増殖に使用される表面は、また、他のプロセスステップ用の容器でも使用され得る（例えば、活性化ステップも、中空線維またはマイクロキャリアビーズを使用して起こり得る）ことに留意されたい。
【０１４５】
洗浄、濃縮、製剤化
本方法は、細胞を洗浄する、および／または、細胞を濃縮する、１つまたは複数のステップを含み得る。これらは、既知の手順に従って想定され得る。非限定的に、実施例３はこれらのステップのいくつかを特定する。
【０１４６】
細胞の洗浄に想定される典型的な緩衝液としては、限定するわけではないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）が挙げられる。
【０１４７】
濃縮ステップは、典型的には、体積を減らすために実行され、細胞をサンプル中に保持しながら、流体の選択的移動を必要する。濃縮ステップは、プロセスの全てにわたって実行され得るが、最も典型的には、濃縮ステップは、プロセスの終わり、製剤化の前に想定される。細胞を濃縮する（または、サンプル体積を減らす）ために使用され得る適切な技術としては、限定するわけではないが、向流遠心分離（ＣＦＣ）、中空線維フィルタ（ＨＦＦ）、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）、音響技術が挙げられる。
【０１４８】
本方法の最終結果は、典型的には、適切に製剤化される細胞数の増殖であろう。製剤化が、患者への直接投与（典型的には、直接注射または直接点滴）のためである場合、新規の生成物は、典型的には、食塩緩衝液および血清を含む適切な培地において、当技術分野で詳述されるように、製剤化されよう。「直接投与」は、本明細書で使用する場合、生成物が、典型的には、２４時間以内に投与され（つまり、長期保存も安定化剤の付加も必要ではない）、生成物が投与前に凍結されることはないことを指す。生成物が、細胞処理装置から即時に患者に取り込まれることを必ずしも含意しない。
【０１４９】
細胞の製剤化が、保存のためである場合、特に低温保存のために、典型的には、保存溶液が使用されるか、または製剤に加えられる。製剤化が、凍結保存のためになされる場合、典型的には、ＤＭＳＯまたはグリセロールなどの凍結防止剤が細胞に加えられる。凍結保存のための製剤化は当技術分野で周知であり、トレハロース、デキストラン、エチレングリコール、プロピレングリコール等も含んでよい。
【０１５０】
ＱＣテスト
処理細胞を製造する全ての方法ステップ（細胞サンプルの提供から細胞修飾を経て保存または直接投与ために細胞を製剤化するまで）に加え、本方法は、さらに、プロセスの異なるステージで品質管理のためのステップを含み得る。他のステップと同様に、ＱＣサンプリングおよびＱＣテストは、完全に閉鎖システムにおいて自動的になされる。例示的な細胞処理方法（ここでは、Ｔ細胞レトロウイルス形質導入法）での異なるＱＣサンプリングステップについての図式的概略を図９で提供する。
【０１５１】
本明細書に記載する細胞処理方法に組み込むことが可能なＱＣ法ステップは、例えば、顕微鏡、蛍光、トリパンブルー、もしくはフローサイトメトリーによる細胞計数および生存率のモニタリング；フローサイトメトリーもしくは他の方法による細胞の同一性、純度、もしくは均質性のモニタリング；エンドトキシンの検出（例えば、ＬＡＬテストによる）；安全性のモニタリング（例えば、ウイルスコピー数（ＶＣＮ）のＰＣＲおよび／もしくは複製可能レトロウイルスの検出（ＲＣＲテスト）による）；マイコプラズマ検出（例えば、ＰＣＲもしくはＧｒａｍ染色による）；力価のモニタリング（例えば、細胞株との共生培養による）を含み得る。
【０１５２】
本発明はいくつかの問題に対処する。まず、本明細書に記載するシステムでは、細胞療法薬を製造する機械の高い資本コストが、ＣＰＭを統合して、ＣＰＳ内の高価なコンポーネントの共有および再使用を可能にするという利点でシステムコストを削減することにより対処される。
【０１５３】
ＣＰＳにおける多数のＣＰＭが共通設備を共有することには、また、多数の患者サンプルを処理するのに必要な機械の占有面積を減らすことにおいても利点がある。クリーンルームの床面積は、斯かる面積を取得し、使用開始し、操作する際の費用により限定されやすく、そのため、この環境における床面積の必要性の低減は、設備コストの節減につながる。
【０１５４】
さらに、閉鎖滅菌システムを提供することにより、細胞製造を、指定のクリーンルームではなく機密扱いではない環境で実行することが可能になる。したがって、本装置は、異なる細胞処理ステップを１つの装置に組み込むことにより、よりコンパクトである（そのため、必要な空間が少ない）だけではなく、空間の性格に依存することが少ない。本発明の装置では、ラミナーフローカップボードおよび個人用防護具などの、制御無菌状態の必要がないまたは最小限である。これは、これらの高価な資源の必要性およびメンテナンスを無くす。これは、また、無菌状態での作動に必要な技法および装備に精通している必要があったオペレータの訓練の強化の必要性を低減させるか、または無くす。
【０１５５】
装備のサイズおよびコストの低減、ならびに、クリーンルーム空間の必要性の低減または排除は、本発明のシステムを、例えば、病院において、患者の近くに置くことを容易にする。この患者と製造場所が近接していることは、製造場所までの患者材料のトレーサビリティに起因する過失の可能性を低減させる。トレーサビリティの管理は、単一の場所ではより容易に達成され得る（例えば、サンプルの収集から、療法薬が患者に戻される後までのトレーサビリティが維持されるように、患者のリストバンドのＩＤと合致する使い捨てカートリッジのＩＤを使用して）。これは、従来のシステムにおける、ロジスティクスの失敗に典型的に関連する、情報の授受に関連するリスクを低減させるか、または無くす。
【０１５６】
患者とサンプル処理の場所が近接していることのさらなる利点は、以下に要約され得る：
−製造場所への輸送時の、温度管理を含む、患者材料の面倒なロジスティクスの減少；
−患者材料を製造場所へ輸送するコストの節減。患者材料の輸送は、患者材料収集標準操作手順（ＳＯＰ）で実行され得る。これは、輸送を手配する第３者のコストがなくなることを意味する。また、これにより、追加の潜在的な過失／不正表示の要因が回避される。
【０１５７】
本発明のシステムにより対処されるさらなる問題は、手動プロセスにおけるオペレータの過失に起因する、不注意な患者材料の破壊または紛失の減少または回避である。装置内の製造プロセスは、自動化されて、オペレータの介入と、複雑で巧みな手動操作の必要をなくす。オペレータの干渉が、プロセスの全自動化により最小限まで減らされることにより、オペレータの過失例を減少させる。
【０１５８】
同様に、システムのプロセスの最適化は、自動化システムにより実行される、ｉｎ  ｓｉｔｕでのリアルタイム測定（例えば、細胞計数など）およびテスト（例えば、力価など）により達成され得る。斯かる解析の結果は、そのサンプルについて懸案中の製造決定事項に直接送られ得る（つまり、より長い間増殖される）。これには、オペレータの干渉が、プロセスの全自動化により最小限まで減らされることにより、オペレータの過失例を減少させるという利点がある。
【０１５９】
従来の実験状況におけるオープン処理により引き起こされる汚染に起因した患者材料の紛失は、自動化システムによりテストされる、完全体であり得るＦＣ内の「機能的に閉鎖された」滅菌または無菌処理環境を提供することにより、本発明により対処される。こうして、汚染リスクは本質的になくなる。
【０１６０】
さらに、自動化品質管理と生成物解析の統合は、実験室ベースの解析を使用する高いコスト、および、サンプルを手動で取り扱うことにより生じるオペレータの過失の可能性という短所に対処する。
【０１６１】
給与コスト、訓練コスト、資質訓練を実証するコストを含む、専門のオペレータが複雑な手動作業を行う必要に起因するコストも、最適化された自動化システムが、プロセスの複雑な作業を担うことにより、対処される。この自動化アプローチは、熟練のオペレータおよびそれに関連する訓練コストの必要を否定する。理想的には、ＣＰＳは、最大にユーザーフレンドリーであるように設計され、ユーザーインターフェースディスプレイに表示されるメッセージは、理解するために専門のオペレータを必要としない。装置の場所における専門オペレータの必要性は、さらに、装置の製造業者または供給者が補助する（例えば、病院が技術者を雇用するのではなく）ことができるように、潜在的過失のメッセージを製造業者または供給者に送ることによりさらに減少させることが可能である。
【０１６２】
最終的に、本発明のシステムは、患者サンプルの独立並列処理を提供するという柔軟性において、非常な利点をもたらす。各ＣＰＭは、必要に応じて、個別に調製され、ＣＰＳに搭載され得る。これは、システムの操作状態または同じ機械の近くのＣＰＭにおいて、先行して処理され始めていた任意のサンプルの状態を考慮することなく、行うことができる。システムは、資源を、ＣＰＭがそれを必要とする際に、各ＣＰＭにそのまま配分する。細胞処理全てではなくとも、大部分が各ＣＰＭ内の個々のＦＣ内で実行されることが想定されることから、共有資源を待つことに起因する遅延リスクは低減され、機械のランタイム効率は高レベルで維持される。これは、細胞処理のスループットが不規則である環境、例えば、患者サンプルが患者の必要のタイミングに応じて移動され、さらに、効率的で迅速な細胞処理の所要時間が、患者のケアの最適化に必要である臨床環境において、著しい利点となる。効率的なサンプル処理、最小限の必要空間、および、上記で概略した他のコスト利点は、療法用品の低コスト化に全体的な利益をもたらす。
【実施例】
【０１６３】
実施形態１：本発明による細胞処理システム
図１に最良に示されるように、本発明の細胞処理装置１００の実施形態は、１つまたは複数の細胞処理モジュール１０２と統合した、細胞処理ステーション１０１を含む。図２ａには、製造設備の周りを旋回して、試薬およびプロセスに必要な他の品目を集めるか、または、患者からサンプルを収集することができるようにトロリーに乗せられた細胞処理モジュール１０２を有する、細胞処理装置１００の一実施形態を示す。この実施形態では、流体カートリッジ１０３の重さは１５ｋｇであると想定し、試薬パックの重さは４０ｋｇであると想定する。
【０１６４】
細胞処理モジュールをトロリーに乗せることにより、収集に必要な手作業と、手で安全にまたは楽に運ぶには大きすぎるまたは重すぎる使い捨てコンポーネントの搭載に対する解決策を提供する。トロリーは、細胞処理モジュール１０２の種々のコンポーネントに正確かつ特異的に接続するように設計し、コンポーネントを予め互いに接続してから、細胞処理ステーション１０１に搭載することを可能にする。このようにして、オペレータは、プロセスに必要な種々のコンポーネントをそれぞれの保管設備から集め、一方で、それらをトロリーに搭載し、同時にそれらを互いに接続することが可能である。いったん全てのコンポーネントをトロリーに搭載したら、オペレータは、トロリーを、細胞処理ステーションをトロリーおよび細胞処理モジュールと接続する場所であるトロリードックに誘導する。
【０１６５】
トロリーは、トロリーと細胞処理ステーション１０１をドッキングさせた際に、細胞処理モジュール１０２と細胞処理ステーションインターフェースの位置揃えが正しいように、細胞処理モジュール１０２を正確な場所で保持する設置フィーチャを備えた、金属構造により作られた剛性構造を有する。トロリーと細胞処理ステーション１０１のドッキングは、バンパーを使用した適切な誘導により、まず達成される（図示せず）。いったんトロリーが係合したら、細胞処理モジュール１０２と係合する線形ガイド（図示せず）があり；これらのガイドは、最終的に、細胞処理モジュール１０２の細胞処理ステーション１０１に対する正確な位置合わせを担う。この位置合わせは、使い捨て物質を関節天秤で支え、細胞処理モジュール１０２を上下させて、ドッキング中にオペレータに抵抗を与えることなく最終的な位置合わせを達成可能にすることにより、可能になる。関節と物質の平衡は、細胞処理モジュール１０２が安全な方法で確実に輸送されるようにするために、トロリーのドッキング前は静止している。いったんトロリーの最前部が細胞処理ステーション１０１と係合したら、物質平衡ロックが解かれ、細胞処理モジュール１０２は位置合わせレールにより最終的に位置付けられ得る。
【０１６６】
集約されたユーザーインターフェース１０５を有する細胞処理ステーション１０１を示す。
【０１６７】
細胞処理モジュール１０２は、流体カートリッジ１０３と試薬パック１０４を含む。組み立て形態の典型的な細胞処理モジュールを図３に示す。試薬パック１０４は、流体カートリッジ１０３の上部に置かれる。試薬を設置した際に、滅菌流体接続が、試薬パック１０４と流体カートリッジ１０３の間に設けられる。
【０１６８】
図４は、分解形態の細胞処理モジュール１０２を示す。バルク試薬は、試薬パック１０４を共に形成するいくつかのボックス２０２内のバッグ２００に貯蔵される。ボックス２０２は、外殻として機能し、空のまたは予め充填されたバッグが搭載されており、ボックスは次に、システムアプリケーションのオペレータが並はずれた力またはツールを使用しなければ容易には開けられないいくつかの機械的手段により、製造プロセスの一部として閉鎖される。ボックス２０２は、また、バッグ２００に対する流体の入口およびまたは出口用の接続点を配置および支持する手段を提供する。ボックス２０２の別の機能は、配置手段を提供すること（これは、ＦＣに対するＲＰの接続プロセスのためである）、または、単に、ＲＰを大量貯蔵と輸送のために積み重ねを可能にすることである。ボックスの構造は、折りたたみ式プラスチック構造でもよいし、第２のまたは蝶番付きの蓋と共に完全に成型されていてもよい。ボックスは、気密シールを提供してはならない。これは、気密シールが、流体がバッグの外に出ることを妨げるためである。別個のユニットに分割された試薬パック１０４は、試薬の貯蔵に対応し、手作業のしやすさを高める。
【０１６９】
中空線維フィルタ２０４は、流体回路層２０６に入れられている。流体回路層２０６は、底部のシリコン膜２１０およびポリカーボネート（ＰＣ）キャッピングフィルム２１２で封止された、２つの成型品２０８、２０８’を含む。出力（ｃｒｙｏ）バッグ２１３は、流体回路層２０６の一部であり、プロセスの終わりに取り外される。ＱＣおよびＩＰＣサンプル２１４は、プロセス中は保管され、オフラインテストが必要な場合に外部からアクセス可能である。
【０１７０】
３つのシリコン膜をベースとする容器を含む増殖チャンバ２１６を、形質導入容器２１８、活性化容器２２０、ならびに、撹拌インペラ２２４および多数のサイフォンチューブ２２６を含む混合容器２２２と共に、示す。サイフォンチューブ２２６は、材料を加え、取り出すために、また、より良好な細胞回収のためにチャンバをすすぐためにも使用される。
【０１７１】
下部桶２２８は、流体カートリッジ１０３の外殻を形成する。
【０１７２】
図５は、増殖チャンバ２１６、形質導入容器２１８、および活性化容器２２０を含む、流体カートリッジ１０３の培養容器のレイアウトを示す。活性容器２２０と形質導入容器２１８の構造は、上部と底部にＦＥＰフィルムを接着したフレームを使用する。容器２２０、２１８は積み重ねられて、プロセスに応じた必要領域を達成し、これを増やすまたは減らす必要がある場合は、設計の自由度をもたらす。増殖チャンバ２１６の構造は、シリコンフィルムが接着された上部と底部を使用する。設計は、膜をまたいだ良好な交換を可能にする、気体Ｇの階層間の通過を可能にする。
【０１７３】
実施例２：本発明の装置におけるプロセスワークフローの詳細な説明
本発明の特定の実施形態では、図７および８に示すプロセスフローに従って作動する、細胞処理装置１００が提供される。
【０１７４】
ヒトまたは動物対象から得た細胞材料を含むサンプル２０を、入手する。サンプルは、当技術分野で既知であるアフェレーシス技法により得ることができる。サンプル２０を、サンプル２０に含まれる特定の細胞型の選択および単離を可能にする一連のプロセスステップと、所望の出力細胞生成物９０を生成するためにその材料の適切な処理とを含む、ワークフロー１０に導入する。
【０１７５】
一実施形態では、アフェレーシス細胞サンプル材料２０を、ワークフロー１０に導入する。材料は、細胞材料が、所望の細胞サブタイプ―例えば、Ｔ細胞を特定するために分別または処理される、選択ステップ３０を進む。単離された細胞材料のサブタイプは、所望の細胞サブタイプが、該細胞タイプに適切である場合に活性化され得る、任意選択的な活性化ステップ４０に進む。細胞材料は、１つもしくは複数の増殖因子への暴露、および／または、１つまたは複数の組換えベクターを用いた細胞材料の形質導入が起こり得る、形質導入ステップ５０にかけられる。結果として生じる細胞材料は、細胞の継代培養および所望の処理細胞材料の増殖の促進を可能にする増殖ステップ６０に進められる。所望の増殖に対する所定の閾値ベンチマークに達すると同時に、細胞は、該細胞が処理されて最終細胞生成物９０をもたらす、製剤化ステップ７０に移される。製剤化７９は、細胞材料の濃縮、保存溶液との組み合わせ、および必要な場合は凍結保存を含み得る。プロセス１０の全てにわたって、フィードバック制御と統合され、前記プロセスステップそれぞれにおいてフィードバック制御を実行することが可能な解析ステップ８０により、品質管理およびプロセスパラメータのモニタリングが行われる。
【０１７６】
本発明の一実施形態において、プロセス１０は、細胞処理装置１００内で実行される。装置１００は、プロセス１０の実行に適切なシステムの形成に共に寄与する、多数の試薬を含み、それらを組み込む試薬パック１０４と、液体の取扱い装置および処理装置を組み込んだ流体カートリッジ１０３とを含む、細胞処理モジュール１０１を含む。つまり、細胞処理モジュール１０１は、いったん組み立てられたら、入力ポートと出力ポートを除いて外部環境に対し閉鎖され、手順の全てにわたって細胞材料の汚染リスクを最小限に、細胞材料の同一性の完全性のレベルを高くして細胞処理が実行されることを可能にする、携帯型システムを定義する。
【０１７７】
細胞処理モジュール１０１内で、対象、適切には患者に由来する細胞材料は、入力容器１２５を介して流体カートリッジ１０３に導入される。典型的には、入力容器１２５は、アフェレーシス手順の生成物を保持するように構成され、適切な生体適合性ポリマー材料を含むバッグまたはパウチを含む。入力容器１２５の体積は異なり得るが、少なくとも５０ｍＬ〜最大３０００ｍＬの範囲である可能性があり、ただし、ほとんどのアフェレーシス手順では、体積は、典型的には１００〜３００ｍＬの間で変化し、容器１２５は、従って、この範囲の体積の、液体またはゲル状のアフェレーシス細胞材料を収容する。入力容器１２５は、滅菌チューブ溶接機を使用して作られた流体接続により流体カートリッジ１０３に係合し、ここで、容器１２５からのチューブが、流体カートリッジ１０３から突き出た入力チューブに接合し得る。代わりの接続手段が、機械式滅菌流体コネクタを使用して作製され得、容器１２５は、サードパーティのチューブセットから入手され得るため、かみ合うコネクタが、それが流体カートリッジ１０３に接続される前に装着される必要がある。細胞材料は、弁１２６の作動により流体カートリッジ１０３に導入され、弁は、次に、細胞材料の流れを、流体カートリッジ１０３に位置する投薬チャンバ１２７に誘導する。システムの全てにわたって、流体の流れは、外圧、機械式ポンプ（蠕動ポンプを含む）、または、毛管流を適切に適用することにより作動させることができる。
【０１７８】
試薬パック１０４内では、複数の試薬容器１１０により、プロセス１０を実行するのに必要なある範囲の試薬を提供する。試薬容器１１０は、適切には、細胞培養、活性化、および増殖の種々の段階用の適切な増殖培地；溶解薬（例えば、塩化アンモニウム）；成長因子；栄養分；ウイルスベクターを含む遺伝子導入試薬；ならびに保存液を含む。試薬容器１１０は、流体カートリッジ１０３内に位置する処理チャンバ１４０との流体連通において維持される。試薬は、試薬容器１１０の何れか１つより、個別に作動する供給ライン１１１を介して処理チャンバ１４０に導入され得る。各試薬に対して適切に、供給ライン１１１は、さらに、介入混合チャンバ１１２と投薬容器１１３とを含み得る。こうして、試薬容器１１０内で濃縮形態、凍結乾燥形態、または別の保存形態で保たれている試薬は、適切に、予め定義された標準濃度に再構成されるか、または、許容可能な剤形に組み合わされてから、処理チャンバ１４０に導入され得る。処理チャンバ１４０は、任意選択的に、平坦なステージまたはゾーン内に物理的に含まれる。平坦ステージは、互いに、かつ、重要なことに処理チャンバ１４０とも流体連通している、種々の補足細胞処理システムを含み得る。
【０１７９】
処理チャンバ１４０は、細胞材料と試薬を含む溶液の十分な混合を保証するため、十分な体積を定義する。さらに、処理チャンバ１４０は、磁性インペラまたは他の回転機械式ミキサーを含み得る、混合装置を含む。
【０１８０】
投薬チャンバ１２７に含まれる細胞材料は、処理チャンバ１４０に導入され得、そこで、細胞材料は、プロセス１０の最初の選択ステップ３０のために保持される。細胞材料（アフェレーシス手順に由来する）内に含まれる不所望の赤血球を溶解させるために、塩化アンモニウムが試薬容器１１０から処理チャンバ１４０に導入されて、約０．８％の濃度を達成する。混合およびインキュベーションに続き、処理された細胞材料は、処理チャンバ１４０から、流体カートリッジ１０３内に位置する一連のタンジェンシャルフロー濾過回路１７０の1つ目にポンプでくみ上げられる。適切には、タンジェンシャルフロー濾過回路は、細胞濃縮水を、廃棄物容器１９７に行く不所望の余分な溶液体積、試薬、および溶解細胞材料から分離することを可能にする、中空線維フィルタを含む。プロセス１０の任意の箇所で、廃棄物容器１９７に集められた廃棄物は、封止された廃棄物貯蔵チャンバ１９８に放出され得る。濃縮水流内に含まれる細胞材料は、定義された体積の培地が試薬容器１１０に導入されている処理チャンバ１４０に戻される。処理チャンバ１４０内に含まれる濃縮水−培地混合物は、濾過回路１７０に１回以上再循環され得、続いて、追加の培地で洗浄して、不所望の試薬または選択ステップ３０による廃棄材料が確実に除去されるようにする。選択ステップ３０の生成物は、処理チャンバ１４０に戻される。
【０１８１】
プロセス１０の任意の箇所で、ただし、典型的には定義した処理ステップの終わりまたは始まりに、制御体積、つまり一定分量の処理細胞材料は吸引され、処理チャンバ１４０と解析モジュール１９０の間の流体連通を維持する解析供給ライン１９１を介して解析モジュール１９０に移動し得る。制御体積の処理細胞材料は、供給ライン１９１を通って解析モジュール１９０に行き、そこで、投薬容器１９２内に保持され得る。プロセスにおいて、細胞計数が、細胞カウンター１９３によって、投薬容器１９２に含まれる体積に対して行われ得る。細胞カウンター１９３は、装置１００（図示せず）内に含まれるＣＰＵと電子的に通信している。解析ステップ８０の結果は、全体として、プロセス１０内の決定事項を通知する。つまり、インプロセス細胞計数の結果は、細胞濃度を制御するために、追加の培地が試薬容器１１０から処理チャンバに１４０に導入されるか否かを決定し得る。あるいは、この段階またはプロセス１０の任意の段階で失敗がある場合、プロセスは中止される場合もあるし、装置１００のオペレータが注意喚起される場合もある。
【０１８２】
本発明の実施形態のＴ細胞生成の自動化プロセスにおける、品質管理と解析のためのプロセスフローの非限定的例を図９に提供する。
【０１８３】
活性化ステップ４０を開始するため、細胞培地は、試薬混合チャンバ１１２において、試薬容器１１０内に含まれる凍結乾燥サイトカインと組み合わせられ得る。再構成サイトカイン溶液の制御投与量が、供給ライン１１１を介して、処理チャンバ１４０に移され、そこで、選択ステップ３０の細胞生成物と組み合わされ、混ぜられて、活性化細胞製剤を生成する。活性化細胞製剤の一連の制御投与量は、供給ライン１４１を介して、複数の活性化表面１４１に順次移される。活性化表面は、細胞吸着とガス透過を容易にする水平表面を含む、軟性または剛性の製造容器である。活性化表面１５１は、個別に充填され、流体回路により空にされ得る、１つまたは複数の個別コンパートメントである。活性化表面１５１は、処理チャンバ１４０を含む平坦処理ゾーンから分離した、流体カートリッジ１０３内の別個のコンパートメント１５０内に含まれる。活性化表面１５１の分離により、活性化ステップ４０が完了するために必要であり得る、増殖期間、つまり、インキュベーションの環境条件を独立して制御することが可能になる。任意の過剰な活性化細胞製剤は、廃棄物容器１９７に排出され、上記のように処分され得る。処理チャンバ１４０から活性化細胞製剤が排出された後、チャンバは、試薬容器１１０からの追加の培地でパージされ、結果として生じる廃棄物も廃棄物容器１９７に送られる。
【０１８４】
活性化ステップ４０が完了するとすぐ、活性化細胞は、活性化細胞生成物が活性化表面１５１各々から供給ライン１４１を通って処理チャンバ１４０に戻されることにより、収集される。組み合わされた活性化細胞生成物は、均質性を確保するために、処理チャンバ１４０内で混ぜられる。次に、活性化細胞生成物は、処理チャンバ１４０から第２タンジェンシャルフロー濾過回路１７０’にポンプでくみ上げられ、それにより細胞濃縮水の濃縮および不所望の使用済み培地の廃棄物容器１９７への除去を容易にする。濃縮された活性化細胞生成物は、処理チャンバ１４０に戻される。制御体積の濃縮活性化細胞生成物が吸引され、上記のように、解析モジュール１９０内のインプロセス細胞計数にかけられる。インプロセス細胞計数の結果は、細胞濃度を制御するために、追加の培地が試薬容器１１０から処理チャンバに１４０に導入されるか否かを決定し得る。
【０１８５】
形質導入ステップ５０の開始は、制御投与量のウイルスベクターが、試薬パック１０４内の試薬容器１１０から、供給ライン１１１を介して処理チャンバ１４０に移された際に起こり、そこで、ウイルスベクターは、活性化ステップ４０の細胞生成物と組み合わされ、混ぜられて、形質導入細胞製剤を生成する。形質導入細胞製剤の一連の制御投与量が、供給ライン１４１を介して、複数の形質導入表面１５２に順次移される。形質導入表面１５２は、ガス透過をもたらす水平表面を含む、軟性または剛性の製造容器である。形質導入は下方の表面で起こり、ここでは、細胞吸着に最適化された表面が必要というわけではないが、本発明の記載から除外されるわけでもない。形質導入表面１５２は、個別に充填され、流体回路により空にされ得る、１つまたは複数の積み重ね可能な個別コンパートメントである。形質導入表面１５２も、平坦処理ゾーンから分離した、流体カートリッジ１０３内のコンパートメント１５０内に含まれる。任意の過剰な形質導入細胞製剤は、廃棄物容器１９７に排出され、上記のように処分され得る。処理チャンバ１４０から形質導入細胞製剤が排出された後、チャンバは、試薬容器１１０からの追加の培地でパージされ、結果として生じる廃棄物も廃棄物容器１９７に送られる。
【０１８６】
形質導入ステップ５０が完了するとすぐ、形質導入細胞は、形質導入細胞生成物が形質導入表面１５２各々から供給ライン１４１を通って処理チャンバ１４０に戻されることにより、収集される。組み合わされた形質導入細胞生成物は、均質性を確保するために、処理チャンバ１４０内で混ぜられる。次に、形質導入細胞生成物が、処理チャンバ１４０から第３タンジェンシャルフロー濾過回路１７０’’にポンプでくみ上げられ、それにより、細胞濃縮水の濃縮および不所望の使用済み培地の廃棄物容器１９７への除去を容易にする。濃縮された形質導入細胞生成物は、処理チャンバ１４０に戻される。制御体積の濃縮形質導入細胞生成物が吸引され、上記のように、解析モジュール１９０内のインプロセス細胞計数にかけられる。インプロセス細胞計数の結果は、濃縮形質導入細胞生成物内の細胞濃度を制御するために、追加の培地が試薬容器１１０から処理チャンバに１４０に導入されるか否かを決定し得る。
【０１８７】
増殖ステップ６０の開始は、細胞培地が、試薬混合チャンバ１１２の試薬容器１１０内に含まれる凍結乾燥成長因子と適切なシグナル伝達／増殖促進分子と組み合わされて、増殖細胞培地が生成された際に起きる。制御投与量の増殖細胞培地が、供給ライン１１１を介して、プロセスチャンバ１４０に移され、そこで、増殖細胞培地は、形質導入ステップ５０の細胞生成物と組み合わされ、混ぜられて、細胞増殖製剤を生成する。細胞増殖製剤の一連の制御投与量は、供給ライン１４１を介して、複数の増殖表面１５３に順次移される。増殖表面１５３も、平坦処理ゾーンから分離した、流体カートリッジ１０３内の別個のコンパートメント１５０内に含まれる。過剰な増殖細胞製剤は、破棄物容器１９７に排出され、上記のように処分され得る。処理チャンバ１４０から増殖細胞製剤が排出された後、チャンバは、試薬容器１１０からの追加の培地でパージされ、結果として生じる廃棄物も廃棄物容器１９７に送られる。
【０１８８】
増殖ステップ６０が完了するとすぐ、増殖細胞は、細胞生成物が増殖表面１５３各々から製剤供給ライン１４２を通って製剤化チャンバ１９５に移されることにより、収集される。組み合わされた細胞生成物は、均質性を確保するために、製剤化チャンバ１４０内で混ぜられる。次に、活性化細胞生成物が、処理チャンバ１４０からタンジェンシャルフロー濾過回路１７０にポンプでくみ上げられることにより、濃縮水内の細胞生成物製剤の濃縮および不所望の使用済み培地の廃棄物容器１９７への除去を容易にする。濃縮された細胞生成物製剤は、製剤化チャンバ１９５に戻される。制御体積の濃縮細胞生成物が吸引され、上記のように、解析モジュール１９０内のインプロセス細胞計数にかけられる。インプロセス細胞計数の結果は、品質管理と、保存または対象への投与のための細胞生成物９０の最終製剤の調整に必要なパラメータを決定し得る。適切な製剤溶液と、限定するわけではないが、ヒト血清アルブミン、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）溶液、および抗体などの試薬が、所望の最終細胞生成物９０を生成するために、試薬容器１１０から製剤化チャンバ１９５に導入される。細胞生成物９０は、製剤化チャンバ１９５から、生成物出力ライン１４３を介して、１つまたは複数の滅菌細胞生成物出力容器１９６に移される。
【０１８９】
本発明の一実施形態では、プロセス１０は、増殖ステップ６０の後で、細胞の周期的収集ステップを含み得る。例えば、細胞増殖をモニタリングするか、または、装置１００内で実行される細胞培養プロセスの性質に応じて異なる時点で収集することが必要であり得る。こうした場合、細胞を、同時ではなく、バッチの１つまたは複数の増殖表面１５３から周期的に収集することが可能である。
【０１９０】
本発明のさらなる実施形態では、プロセス１０は、増殖ステップ６０の後で、細胞の周期的収集ステップを含み得るが、その場合、細胞が１つまたは複数の増殖表面１５３から細胞処理チャンバ１４０に戻され、その結果、解析８０および増殖６０の追加プロセスステップが起き得る。例えば、培養下の細胞型に応じて、増殖ステップ６０の間での細胞増殖が予想より遅い場合、使用済みの増殖培地を取り換えるまたは補充する必要がある場合がある。つまり、典型的には、カートリッジ１０１は、プロセス１０に組み込まれている濾過および濃縮ステップの反復を可能にするように、処理チャンバ１４０と流体連通した追加の濾過回路１７０を含む。これらの追加ステップは、オペレータにより、または、解析ステップ８０の何れか１つの間で集められたデータに応じて自動的に所望され得る、つまり、装置１００内で不必要な余剰を作成するのではなく、追加の処理、試薬、および解析機能を含めることにより、可変の量および質の種々の開始材料を取り扱うことが可能であるように、装置１００の柔軟性を高めることが可能である。
【０１９１】
実施例３：細胞療法で使用するためのＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するための自動化プロセスと手動プロセスの比較
概要
自動化細胞処理の可能性を評価するため、明細書に従う細胞処理装置の試作機を組み立て、Ｃｅｌｙａｄでテストした。ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するために装置を最適化し、プログラミングした。細胞処理装置の性能を評価するため、手動プロセスを並列し実行し、生成細胞の異なる基準を比較した。以下で詳述するように、自動化製造プロセスは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成について首尾よくテストされ、キメラ抗原の増殖および力価を含め、手動プロセスとほぼ同等の品質パラメータを達成した。自動化プロセスは、より高い細胞回収率（０日目−２日目）およびより高い細胞増殖（２日目−８日目）をもたらすようである。想定されるさらなる改善は、細胞洗浄および濃縮ステップを最適化して、タンジェンシャルフロー処理後のより高い細胞回収率を保証することである。
【０１９２】
序論
一般的なキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）製造プロセスは、以下のステップからなる：
−単核細胞の富化
−Ｔ細胞の活性化
−Ｔ細胞の形質導入
−Ｔ細胞の増殖
−Ｔ細胞の製剤化
【０１９３】
典型的には、これらのステップは、特定の試薬または容器を使用して行われる。臨床プロトコルのある例（例えば、ＮＫＲ−２を用いた治療用遺伝子療法（ＴＨＩＮＫ）治験で使用される）は、単核細胞の富化用のＦｉｃｏｌｌ、Ｔ細胞活性化ステップ用のフラスコ、Ｔ細胞形質導入ステップ用のバッグ、Ｔ細胞増殖用のガス透過性迅速細胞増殖装置（ＧＲＥＸ（商標）、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ（登録商標）、ミネソタ州セントポール）を使用し、Ｔ細胞製剤化は、通常の遠心機を使用して、緩衝液交換によりなされる。
【０１９４】
斯かる製造プロセスを自動化するため、細胞処理装置試作機は、類似の単回使用使い捨て品に依拠した。
【０１９５】
プロセス概要
即時細胞処理装置試作機（ＣＤＰ）は、操作制御用のタッチスクリーンインターフェースを有する、自動化流体取扱いシステムである。ＣＤＰは、蠕動ポンプ、弁、および処理バッグ用のバッグミキサーからなる。ＣＤＰは、また、圧力および流体センサも含む。流体の動きは、ＣＰＳのコンピュータ制御システムにより管理され、ＣＰＳは、ポンプと弁を同期させて、指定の作業を達成する。参照しやすいように、細胞処理ステーション（ＣＰＳ）は、コンピュータ制御システムと、タッチスクリーンインターフェースを含む一方、細胞処理モジュール（ＣＰＭ）は、ポンプ、弁、およびバッグミキサーを含む。処理バッグは、流体カートリッジの一部である。１つのＣＰＭだけを、この比較テストのために使用した。ＣＰＭにさらに含まれるのは、試薬パックであり、異なるプロセスステップ用の使い捨て品を含む。ここで、４つの異なる単回使用使い捨てセットを作って、必要な製造ステップ全てを実行した：１つは単核細胞富化とＴ細胞活性化用、１つはＴ細胞形質導入用、１つはＴ細胞増殖用、１つはＴ細胞製剤化用とした。
【０１９６】
各使い捨てセットは、以下の接続を可能とする、入口／出口ラインを含む：
−試薬および／または細胞を含んだバッグ（試薬パックの一部）
−細胞培養容器（バッグまたはＧＲＥＸ（商標））（流体カートリッジの一部）
【０１９７】
全ての接続を、滅菌溶接技術を使用して実行することにより、システムの機能的閉鎖性を維持する。
【０１９８】
全ての緩衝液交換プロセス（細胞洗浄、細胞濃縮、および試薬交換）を、中空線維フィルタを使用するタンジェンシャルフロー濾過手順に依拠して行った。総体積交換は、プロセス中は細胞体積の３倍、収集中の最終洗浄時は６倍に固定した。
【０１９９】
各製造ステップにおいて、細胞（プロセスの開始時にアフェレーシス生成物として提供されるか、または、プロセス中にインプロセス培養細胞として提供される）は、細胞容器（入口）から細胞処理バッグに自動的に移される。培養細胞に対し、細胞容器から細胞処理バッグへの接続は、一連の９０°チューブエルボーを含み、連続チューブ径が変化する。この特定の設計は、細胞処理バッグの前に細胞凝集塊を破壊し（斯かるチューブを通る細胞の流れは、ヒトの介入なしに、そっと上下にピペッティングして細胞凝集塊を破壊するのと同じ効果を達成する）、単一細胞からなるサンプルを得ることを補助する。
【０２００】
細胞処理バッグは、システムの機能的閉鎖性を損なうことなく、計数、生存率、および他の特徴をテストするための細胞収集を可能にする、３つのサンプリングバルブを備える。バッグミキサーは、処理バッグにおける細胞濃度均一化を保証する。処理バッグは、プロセス中の体積モニタリングを可能にする目盛りに接続されている。参照しやすいように、サンプリングバルブおよび目盛りは、ｉｎ  ｓｉｔｕ測定およびテストに使用されるシステムの例である。
【０２０１】
細胞計数、下流の容器の数およびサイズに基づき（ＣＰＳへの入力）、装置は、正しい緩衝液中で、正しい濃度で細胞を自動的に製剤化し、適切な細胞播種を行うことが可能である。試作機では、処理バッグに加え、ＣＰＭで使用される流体カートリッジは、予め必要な時間の間に細胞の培養を可能にする、異なる性質のいくつかの容器を含んだ。以下の表は、各ステップで使用した容器を表す。これらの容器は、適切な使い捨てセットに滅菌接続されている。
【０２０２】
【表１】
2019521715.tif 000003
テーブル３．１  細胞処理装置試作機により各ステップで使用される流体カートリッジ容器
【０２０３】
播種された培養容器は、３７℃で、５％ＣＯ２で維持した。
【０２０４】
実験プロトコルおよび結果
開始材料および活性化（０日目−２日目）
健康なドナーから収集した白血球アフェレーシス生成物を室温で保存し、収集から４８時間以内に処理した。製造プロセスは、以下のように、白血球アフェレーシス生成物をＮＨ４Ｃｌ（ＲＢＣ溶解緩衝液）で処理することによる、活性化用細胞の生成で始まる：
【０２０５】
０日目
アーム１−ＣＤＰ
−４０ｍＬの白血球アフェレーシス生成物を、細胞処理バッグに移した；
−選択した体積の白血球アフェレーシスを、ＮＨ４Ｃｌ（赤血球溶解緩衝液）３体積に混ぜた；
−室温で９分後、ＲＴの３２０ｍＬのＨＢＳＳを加えることにより溶解反応を停止させた。タンジェンシャルフローをベースにした、中空線維フィルタ（ＨＦＦ）を使用する戦略を用いて、緩衝液交換を行い、細胞を計数のためにＸ−Ｖｉｖｏ（商標）に再懸濁した；
−次に、細胞を、活性化緩衝液中で製剤化し、４つのＡＣ１９７  ＶｕｅＬｉｆｅ（商標）バッグ（Ｓａｉｎｔ  Ｇｏｂａｉｎ（登録商標））に、全部で１９７ｍＬ／バッグに対し、１Ｍ細胞／ｍＬで播種した。
【０２０６】
アーム２−手動
−３５ｍＬの白血球アフェレーシス生成物を、細胞処理バッグに移した；
−選択体積の白血球アフェレーシスを、ＮＨ４Ｃｌ（赤血球溶解緩衝液）３体積に混ぜた；
−室温で５分後、ＲＴのＨＢＳＳ８Ｘ体積を加えることにより、溶解ステップを停止させた；
−２００ｇで１０分間遠心分離（このステップは、血小板の除去を助ける）；
−上清を取り除き、細胞計数のために細胞をＸ−Ｖｉｖｏ（商標）に再懸濁した。
−次に、細胞を、活性化緩衝液中で製剤化し、６つのＴ１７５フラスコに、全部で９２ｍＬ／フラスコに対し、１Ｍ細胞／ｍＬで播種した。
【０２０７】
活性化緩衝液は、５％ヒトＡｂ血清プラス２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地（完全Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）培地）中に、４０ｎｇ／ｍＬの可溶性抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂｓ（ＯＫＴ３クローン）と、１００Ｕ／ＭＬのＩＬ−２とを含む。活性化ステップは２日間続く。
【０２０８】
テーブル３．２は、ＮＨ４Ｃｌを用いた細胞操作を要約する。アーム１（ＣＤＰ）でのＮＨ４Ｃｌ後の細胞回収率は、手動プロセスよりも１０％高かった（７７％対６８％）。
【０２０９】
テーブル３．３は、活性化／容器タイプ（および使用した容器の数）で播種した総細胞と、活性化プロセスの終わりの収集細胞、および活性化ステップ後の細胞回収率について要約する。収集率は、ＣＤＰにおいて１３％高かった（５７％対４４％）。
【０２１０】
【表２】
2019521715.tif 000004
テーブル３．２  異なるアームでのＮＨ４Ｃｌを用いた細胞操作についての要約
【０２１１】
【表３】
2019521715.tif 000005
テーブル３．３  異なるアームでの細胞活性化についての要約
【０２１２】
形質導入（２日目−４日目）
２日目
形質導入では、活性化細胞を、両アームにおいて、ＰＬ２４０バッグ内で、レトロウイルスベクターを用いて形質導入した。レトロウイルス構築物として、Ｂ７−Ｈ６対して作られたＣＡＲ−Ｔを使用した（国際公開第２０１３１６９６９１号に記載されている）。
【０２１３】
第２手動対照アームを、ＣＤＰにおいて活性化した細胞から始めて２日目に生成した：これは、ＣＤＰに駆動される活性化の影響を評価するためである。これを、アーム３という。
【０２１４】
プロトコルは以下に記載する通りである：
【０２１５】
形質導入を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）で予めコーティングしたバッグを用いて行った。
【０２１６】
８μｇ／ｍＬの濃度のＰＢＳ中で、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）で一晩コーティングすることにより、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）で予めコーティングしたバッグを用意した。その翌日に、少なくとも３０分の遮断ステップを、ＲＴでＰＢＳ＋ＨＳＡ１％を用いて行った。
【０２１７】
上記の全てのステップを手動で行った。ＣＤＰで使用したバッグは、遮断溶液を取り除いた後、滅菌接続する。
【０２１８】
形質導入に使用した容器は、Ｏｒｉｇｅｎ（商標）によるＰＬ３０またはＰＬ２４０の何れかであり、ＰＬ３０／２９ｍＬおよびＰＬ２４０／１４２ＭＬでの播種を有する細胞培養バッグだった。播種時の濃度は、手動プロセスでは１Ｍ／ＭＬ、ＣＤＰ駆動プロセスでは０．７Ｍ／ＭＬとした。
【０２１９】
概要：
アーム１−ＣＤＰ
−活性化バッグ（ＡＣ１９７）を、形質導入セットに滅菌接続した。
−細胞を処理バッグに移した；
−細胞計数の後、細胞を形質導入培地において製剤化し、タンジェンシャルフローをベースにした、ＨＦＦを使用する戦略を用いて、緩衝液交換を行った；
−次に、細胞を、形質導入緩衝液中で製剤化し、２つのＰＬ２４０バッグに、全部で１４２ｍｌ／バッグに対し０．７Ｍ細胞／ｍＬで播種した。
【０２２０】
アーム２−手動
−活性化細胞をＴ１７５から収集した；
−回転後、細胞をＸ−Ｖｉｖｏ（商標）に再懸濁し、計数し、最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬの完全形質導入緩衝液中で製剤化した；
−細胞を、１つのＰＬ２４０バッグに１Ｍ／ｍＬで播種した。
【０２２１】
アーム３−手動、ＣＤＰ活性化細胞より開始
ＣＤＰをベースにした活性化をさらに評価および検証することを目的に、細胞をアーム１形質導入細胞の残りから収集し、手動で製剤化して（遠心機を用いて）、ＰＬ３０バッグに、濃度１Ｍ／ｍＬで播種した。
【０２２２】
形質導入緩衝液：細胞を、５％ヒトＡＢ血清、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＸ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地に再懸濁し、細胞をレトロウイルス上清（ベクター）と共培養することにより形質導入し、キメラ抗原Ｂ７Ｈ６および切断型ＣＤ１９（ｔＣＤ１９）の発現を可能にした。ベクターは、最終体積の５０％である。ｔＣＤ１９を使用して、形質導入効率をモニタリングする。使用したベクターは、Ｃｅｌｙａｄの研究開発チームにより製造されたｍＴＺ４７．２．１（インハウス名）で、物理的粒子力価は１．９．１０１０だった。
【０２２３】
培養培地中の追加試薬は、−最終濃度で−１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２、４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３だった。
【０２２４】
テーブル３．４は、各アームでの、形質導入に使用した容器タイプ、使用したベクターおよび力価、４日目の細胞回収、生存率、増殖倍率を要約する。
【０２２５】
４日目の、ＣＤＰで操作した細胞の増殖倍率が最も高かった。２．６アーム１対１．５アーム２または１．８アーム３
【０２２６】
【表４】
2019521715.tif 000006
テーブル３．４  形質導入ステップについての要約
【０２２７】
増殖（４日目−８日目）
４日目に、全てのアームにおいて、形質導入細胞をガス透過性細胞培養装置で培養することにより、形質導入細胞の増殖を開始した。
【０２２８】
アーム１
形質導入後のＰＬ２４０バッグを、増殖のために試薬バッグに滅菌接続し、ＩＬ−２およびＸ−Ｖｉｖｏ（商標）において製剤化した。タンジェンシャルフローをベースにした、ＨＦＦを使用する戦略を用いて、緩衝液交換と体積濃縮を行った。
【０２２９】
プロセスの終わりに、Ｇ−ＲＥＸ（商標）１００Ｍ−ＣＳ（予め、滅菌コネクタを介して流体カートリッジに接続されている）に、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充した、完全Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地６００ｍＬを、装置により自動的に播種した。
【０２３０】
Ｇ−ＲＥＸ（商標）１００Ｍ−ＣＳは、ＧＲＥＸ（商標）１００Ｍと同等のＧ−ＲＥＸ（商標）容器である。頭字語ＣＳは、閉鎖システムを表し、それは、容器の閉鎖性を維持しながら流体交換を可能にする、ピグテールの存在を含意する。
【０２３１】
アーム２および３
形質導入後、Ｔ細胞をＨＢＳＳで一度洗浄し、次に、増殖ステップのために播種した。
【０２３２】
次に、形質導入細胞を、Ｇ−ＲＥＡ（商標）の表面に対し１×１０６細胞／ｃｍ２で、以下のものに播種した：
−アーム２−Ｇ−ＲＥＸ  １００Ｍ−ＣＳの、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充した完全Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地６００ｍＬ
−アーム３−Ｇ−ＲＥＸ（商標）１０Ｍの、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を補充した完全Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５培地６０ｍＬ
【０２３３】
約４８時間後、さらに５０％の新しい完全Ｘ−Ｖｉｖｏ（商標）−１５プラス１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を、各Ｇ−ＲＥＸ（商標）フラスコに加えた。さらに２日の培養の後、細胞を８日目に収集した。
【０２３４】
アーム１
−細胞を、冷却ＨＢＳＳで洗浄し、中空線維を使用したタンジェンシャルフロー戦略により濃縮した；
−計数後、細胞を、冷却ＨＢＳＳにおいて、２．７Ｍ／ｍＬで装置により製剤化し、次に、３００Ｍの細胞を、収集バッグに回収した；
−品質評価用の細胞を、手順の終わりに採取した。
【０２３５】
同じ方法で生成物を比較することができるように、オペレータにより、収集バッグから、遠心分離および定義された凍結保存緩衝液中での製剤化により、凍結保存細胞サンプルが生成されたことに留意されたい。したがって、試作機では、収集はせいぜい半自動的である一方、他のステップは全て装置により管理された。これは、試作機の設計に起因するもので、装置固有の限界には起因せず、細胞の再懸濁／収集は、完全に自動的に行われ得る。
【０２３６】
アーム２および３
実験室の遠心機を使用して、冷却ＨＢＳＳで細胞を一度洗浄した。細胞を計数した後、細胞を手順の終わりのサンプル収集のために製剤化した。
【０２３７】
テーブル３．５は、細胞収集率Ｇ−ＲＥＸ（商標）１０Ｍ／Ｇ−ＲＥＸ（商標）１００Ｍ／Ｇ−ＲＥＸ（商標）１００Ｍ−ＣＳにおける、収集時の細胞収率および生存率を要約する。増殖倍率は、アーム１とアーム２の両方で２７倍、アーム３で２１倍だった。
【０２３８】
【表５】
2019521715.tif 000007
テーブル３．５  ＧＲＥＸ（商標）１０ＭまたはＧＲＥ（商標）１００Ｍにおける、収集時の細胞収率および生存率
【０２３９】
同等性テストの結果
プロセス中およびプロセス後に、手順の同等性を評価するためにサンプルを採取した。同等性を、以下に基づいて評価した：
−プロセスパラメータ
・各ステップでの細胞計数および生存率（回収率または増殖の評価）
・２日目−フローによる細胞活性化
・４日目−ベクターコピー数
・４日目−キメラ抗原受容体の発現レベル
−最終生成物の特徴
・細胞計数および生存率
・キメラ抗原受容体の発現レベル
・ＶＣＮ
・がん細胞株と共に培養した場合の、インターフェロン−γ分泌およびキリングアッセイ
・Ｔ細胞成熟プロファイル
・Ｔ細胞の増殖
【０２４０】
注：ＣＤＰにおける細胞計数および生存率は、常に、洗浄と濃色ステップの前に実行した一方、手動ステップでは、必ず細胞を回転させ、一度再懸濁した。
【０２４１】
テスト：細胞活性化（２日目）
方法：ＣＤ６９およびＣＤ２５マーカーについてのフローモニタリング
結果：
【０２４２】
【表６】
2019521715.tif 000008
【０２４３】
結論：ＣＤ６９は、初期の活性化マーカーである一方、ＣＤ２５は２４時間後に上昇する。結果は、ＣＤ６９＋細胞の欠如、および、ＣＤ２５マーカーの対照に対する活性化アームの約５０％（４４％−５２％）のシフトにより示されるように、全てのアームが適切に活性化され、同等だった。
【０２４４】
テスト：形質導入（４日目）
方法：ｔＣＤ１９のフローモニタリングおよび平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）／細胞を評価するｑＰＣＲ
結果：
【０２４５】
【表７】
2019521715.tif 000009
【０２４６】
結論：３つのアーム全てのセルの形質導入が成功し、ＶＣＮは、テストした３つのアームで同等だった。また、形質導入段階の終わりにｔＣＤ１９の発現を検出することもできた。陽性ｔＣＤ１９の細胞が、完全手動条件で４日目に１０％多く検出された（５０％対４０％） 
【０２４７】
テスト：製造プロセスの終わりでの形質導入（８日目）
方法：ｔＣＤ１９でのフローおよびベクターコピー数（ＶＣＮ）／細胞を評価するｑＰＣＲによる検証
結果
【０２４８】
【表８】
2019521715.tif 000010
【０２４９】
結論：３つのアーム全てのセルの形質導入が成功し、３つのアームでのＶＣＮの同等性が確認された。ｔＣＤ１９発現は、３つのアーム全てで、アーム１の５１％（ＣＤＰアーム）およびアーム２の５７％（手動アーム）の範囲で検出可能である。
【０２５０】
テスト：製造プロセスの終わりでのＴ細胞成熟プロファイル
方法：ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌのフローモニタリング
結果
【０２５１】
【表９】
2019521715.tif 000011
【０２５２】
結論：製造プロセスの終わりには、大部分の細胞がセントラルメモリーまたはエフェクターメモリー表現型を提示し、手動プロセスは、プロセスの終わりのＴ細胞プロファイルに影響を与えなかった。
【０２５３】
テスト：製造プロセスに終わりでのＴ細胞消耗
方法：ＰＤ１およびＬａｇ３のフローモニタリング
結果
【０２５４】
【表１０】
2019521715.tif 000012
【０２５５】
結論：製造プロセスの終わりで、大部分の細胞（≧８０％）が、消耗マーカーＰＤ１とＬＡＧ３の両方について陰性であり、細胞の８−１４％のみが、ＰＤ１マーカーについて陽性だった。興味深いことに、自動化プロセスは、ＰＤ１の発現が最も低いものだった。
【０２５６】
対照アームは、ＣＤＰ装置または手動プロセスの何れかにより、０日目に生成したＰＢＭＣ細胞であり、ＰＢＭＣ細胞は、ＲＢＣ溶解ステップの後すぐに凍結保存した。
【０２５７】
テスト：製造プロセスの終わりでのＴ細胞力価
方法：標的細胞株（ＨｅＬａ細胞）におけるＣＡＲ−Ｔ細胞溶解活性（キリングアッセイ）および標的細胞（Ｋ５６２）におけるＩＦＮ−γ分泌
結果：
【０２５８】
【表１１】
2019521715.tif 000013
ＬＯＤ：検出の限界；ＬＯＱ：定量化の限界
【０２５９】
【表１２】
2019521715.tif 000014
ＬＯＤ検出の限界；ＬＯＱ：定量化の限界
【０２６０】
結論：関連のがん細胞株モデルにさらした際、３つのアーム条件で製造したＣＡＲ−Ｔ細胞は、キリングアッセイおよびＩＦＮγ分泌の両方において、等しく強力であることが分かった。結論は定性的で、ＰＢＭＣ対照との比較に基づく。
【０２６１】
対照アームは、ＣＤＰ装置または手動プロセスの何れかにより、０日目に生成したＰＢＭＣ細胞であり、ＰＢＭＣ細胞は、ＲＢＣ溶解ステップの後すぐに凍結保存した。
【０２６２】
結論
ＣＤＰは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を製造するのに必要な全ての製造ステップを維持するのに適切な装置であることが分かった。
【０２６３】
細胞回収率７７％で、（Ｆｉｃｏｌｌ手順ではなく）白血球アフェレーシス生成物のＲＢＣ溶解が、ＰＢＭＣ様集団を得るのに効率的な方法であることが分かった。活性化後の回収率は５７％だった。これらのデータは、他のＣＡＲ−Ｔプロトコルでの製造についての検証データの範囲内にある。
【０２６４】
興味深いことに、単核細胞の計数を見ると、ＣＤＰを使用した細胞の自動化処理は、手動方法に対しより高い回収率をもたらし：ＲＢＣ溶解後の回収率では７７％対６８％、活性化後の回収率では５７％対４４％だった。
【０２６５】
２日目での生存率は、８８％（自動化アーム）および７６％（手動アーム）だった。これらの結果は、ｆｉｃｏｌｌ選択で始まるプロセスで通常観察されるもの（典型的には、約９０％）よりも低かった。ＲＢＣ溶解処理で生じる生成物は、ｆｉｃｏｌｌプロセスで得られる生成物ほどクリーンではないことから、観察されるより高い細胞死は、ｆｉｃｏｌｌで通常観察されるよりも非Ｔ細胞の数が多く、これらの細胞が、最初の２日で自然に死ぬことに起因すると考える。
【０２６６】
２日目の活性化プロファイルを見て、細胞が、全てのアームで適切に活性化されていることが観察された。
【０２６７】
これは、ＡＣバッグが、Ｔフラスコよりも活性化を同様に維持し得ることを示す、以前の内部研究と一致する。ＣＤＰ評価における活性化の文脈では、活性化ステップ時に異なる播種密度を使用することにした。１Ｍ／ｍＬを全ての条件において使用したが、結果として生じる播種密度／ｃｍ２は異なり：Ｔフラスコ活性化では０．５Ｍ細胞／ｃｍ２であるのに対し、ＡＣバッグでは０．７Ｍ細胞／ｃｍ２だった。
【０２６８】
生細胞計数に基づいて、形質導入（２日目−４日目）と増殖（４日目−８日目）の両ステップ時の細胞増殖をモニタリングする。
【０２６９】
以下のテーブル３．６に要約するように、生存率は、完全自動化プロセス（アーム１）と完全手動プロセス（アーム２）を比較した際に、常に非常に似ている。
【０２７０】
Ｇ−ＲＥＸ（商標）における増殖倍率は、これらの２つのアームを比較した際、同じだった。より高い増殖倍率が、アーム１の形質導入時に得られ（２．６対１．５）、組み合わせ増殖は、完全手動（アーム２）よりも自動化プロセス（アーム１）が有利であり：それぞれ、７０．５対４１．２だった。組み合わせた２日目と８日目の増殖は図１０ａに、収集時の生存率は図１０ｂに示す。
【０２７１】
追加の対照（アーム３）では、プロセスの実行は成功した；しかしながら、形質導入時に中間体の増殖を観察し、アーム１との観察の違いは、おそらく、生存率の低さに起因する（８６％対９０％）。増殖段階時に、アーム３の細胞は、他の２つのアームと比較して、実行した集団倍加も少なかった。違いは、異なる種類のＧＲＥＸ（商標）：ＧＲＥＸ（商標）１０Ｍ対ＧＲＥＸ（商標）１００Ｍ−ＣＳの使用に起因する可能性がある。
【０２７２】
【表１３】
2019521715.tif 000015
テーブル３．６  異なるアームにわたるＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖率および生存率についての要約
【０２７３】
形質導入に使用したベクターは、３つのアーム全ての形質導入時に使用した最終培養体積の５０％だった。次世代の使い捨て品では、処理バッグサイズとＨＦＦ容量の両方を再考し、形質導入体積の最大９０％のベクターの使用を可能にする。
【０２７４】
記載したように、細胞洗浄、濃縮化、緩衝液交換、および培養培地調製の各ステップは、中空線維（ＨＦＦ）を使用したタンジェンシャルフローにより行った。プロセスの実行は成功し、標的の全緩衝液交換はプロセス中では３体積、最終の製剤化では６体積とした。ＨＦＦ前／後の細胞回収率を評価することにより（テーブル３．７）、回収率範囲が３９％〜８６％であることから（以下の表参照）、別の可能性のある改善領域を特定する。過去に、当社は、細胞凝集が細胞回収率に負の影響を与えることを観察した。ＣＤＰと共に使用した使い捨てセットは、細胞を含む流体を培養容器から処理バッグに移動させる一方で、全ての細胞塊を分解し、単一細胞懸濁液を生じさせるように設計した。サンプルを収集し、手動計数を実行するのに必要な時間により、細胞は再凝集し始め、処理時間内に目に見える塊を生成した。当社は、細胞塊がＨＦＦ前にも分解されるように使い捨て設計を再考することにより、回収率を上げることは可能であると考える。
【０２７５】
【表１４】
2019521715.tif 000016
テーブル３．７  異なる段階でのＣＤＰにおける細胞回収率
【０２７６】
手動プロセスの終わりには、全ての細胞を、成熟プロファイル、消耗、および力価についてテストした。全てのテストにより、使用したプロセスが同質の細胞をもたらし：細胞は消耗されておらず、細胞を死滅させることが可能であり、同様にインターフェロンγを生成することが確認された。細胞の約９０％が、ほぼ等しく分裂した、セントラルメモリーまたはエフェクターメモリーＴ細胞のようである。
【０２７７】
結論として、自動化プロセスと手動プロセスの両方が、似たようなＶＣＮ／細胞（範囲２．４３−２．８０）と抗原発現（範囲５１％−５７％）のＣＡＲ−Ｔ生成を可能にした。自動化プロセスは、回収時の細胞生存率が似ていると同時に、より高い細胞回収率（０日目−２日目）およびより高い細胞増殖（２日目−８日目）をもたらすようである。細胞洗浄と濃縮化ステップのさらなる最適化により、タンジェンシャルフロー処理後のより高い細胞回収率が保証されると予想される。
【０２７８】
実施例４：同じ装置において、細胞療法ランで使用するためのＣＡＲ−Ｔ細胞を生成する、独立並行自動化プロセス
実施例３において、細胞の自動化処理と手動処理を比較した。これにより、細胞処理装置試作機を使用した自動化処理は、類似の細胞生成物を産生することが確認された。試作機の細胞処理モジュールを１つのみ、比較のために使用した。この実施例では、実施例３に記載した自動化プロセスが、２つの処理モジュールを使用して繰り返される。処理モジュールは、同じ装置において、ただし、開始時間は異ならせて操作される（ただし。連続的な方法ではなく：第２バッチの処理は、第１バッチが完了する前に開始される）。こうして、ＣＡＲ−Ｔ細胞の２つのバッチが、並行かつ独立的な方法で作成される：両方の処理が同じ装置上で同時に（または、少なくとも、プロセスにかなりの重複時間を設けて）実行されることから、並行であり、第２バッチの処理が、細胞の第１バッチの処理とは無関係に開始され得ることから、独立である。細胞の両方のバッチの製造には、同じコンピュータ制御システムとタッチスクリーンインターフェースが利用されるが、両バッチは、個別の試薬パックおよび流体カートリッジに依拠する（つまり、各バッチは、それ自身の細胞処理モジュールにおいて作成される）ことを理解されたい。
【０２７９】
特定の実施形態、特定の構成、ならびに材料および／または分子について、本発明の細胞および方法のために本明細書で論じてきたが、形態および詳細における種々の変更または修正が、本発明の範囲および趣旨から外れることなくなされ得ることを理解されたい。例は、特定の実施形態をより良好に例示するために提供するものであり、適用を限定するもの考えるべきではない。適用は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2019521715.tif 000017
【図２ａ】
2019521715.tif 000018
【図２ｂ】
2019521715.tif 000019
【図２ｃ】
2019521715.tif 000020
【図３】
2019521715.tif 000021
【図４】
2019521715.tif 000022
【図５】
2019521715.tif 000023
【図６ａ】
2019521715.tif 000024
【図６ｂ】
2019521715.tif 000025
【図６ｃ】
2019521715.tif 000026
【図６ｄ】
2019521715.tif 000027
【図６ｅ】
2019521715.tif 000028
【図７】
2019521715.tif 000029
【図８】
2019521715.tif 000030
【図９】
2019521715.tif 000031
【図１０】
2019521715.tif 000032
【国際調査報告】
2019521715.tif 000033
2019521715.tif 000034
2019521715.tif 000035