(57)【要約】本発明は、がんのための養子細胞療法用の改善された組成物を提供する。本発明は概して、Ｔ細胞療法をもたらすための改善されたベクターおよびそれを使用する方法を提供する。より具体的には、本発明は、サルベージＣＡＲ、二量体化可能なサルベージ受容体、ならびにがん、ならびに特に好ましい実施形態において、再発性または難治性がんの治療、予防、または寛解におけるその使用を提供する。様々な実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを含む、サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ａ）細胞外抗原結合ドメイン、
ｂ）多量体化ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｃ）１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または
ｄ）一次シグナル伝達ドメインを含む、サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
ａ）細胞外抗原結合ドメイン、
ｂ）膜貫通ドメイン、
ｂ）多量体化ドメイン、
ｃ）１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または
ｄ）一次シグナル伝達ドメインを含む、サルベージ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３】
前記細胞外抗原結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１または請求項２に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項４】
前記抗体または抗原結合断片が、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項３に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項５】
前記抗体または抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項３または請求項４に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項６】
前記細胞外抗原結合ドメインが、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項７】
前記細胞外抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項８】
前記細胞外抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項９】
前記細胞外抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９に結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１０】
前記細胞外抗原結合ドメインが、がん細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１１】
前記細胞外抗原結合ドメインが、固形がん細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１２】
前記細胞外抗原結合ドメインが、液性がん細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１３】
前記細胞外抗原結合ドメインが、悪性Ｂ細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１４】
前記細胞外抗原結合ドメインが、悪性形質細胞上に発現する抗原に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１５】
前記多量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１６】
前記多量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１７】
前記多量体化ドメインが、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドおよびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１８】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項１９】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２０】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αから単離される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２１】
前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインが、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２２】
前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２３】
前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２４】
前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７から単離される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２５】
前記一次シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２６】
前記一次シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζから単離される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２７】
ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２８】
前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項２７に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項２９】
スペーサー領域をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項３０】
シグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項３１】
前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む、請求項３０に記載のサルベージＣＡＲ。
【請求項３２】
シグナルペプチド、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、リンカー、ＦＲＢ（Ｔ８２Ｌ）多量体化ドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む、サルベージＣＡＲ。
【請求項３３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、サルベージＣＡＲ。
【請求項３４】
二量体化可能なサルベージ受容体であって、
ａ）抗原結合ドメイン、および
ｂ）多量体化ドメインを含む、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項３５】
二量体化可能なサルベージ受容体であって、
ａ）抗原結合ドメイン、
ｂ）多量体化ドメイン、および
ｃ）アンカードメインを含む、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項３６】
二量体化可能なサルベージ受容体であって、
ａ）抗原結合ドメイン、
ｂ）リンカー、および
ｃ）多量体化ドメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項３７】
二量体化可能なサルベージ受容体であって、
ａ）シグナルペプチド、
ｂ）抗原結合ドメイン、
ｃ）リンカー、および
ｄ）多量体化ドメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項３８】
二量体化可能なサルベージ受容体であって、
ａ）抗原結合ドメイン、
ｂ）リンカー、
ｃ）多量体化ドメイン、
ｄ）ヒンジドメイン、および
ｅ）アンカードメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項３９】
二量体化可能なサルベージ受容体であって、
ａ）シグナルペプチド、
ｂ）抗原結合ドメイン、
ｃ）リンカー、
ｄ）多量体化ドメイン、
ｅ）ヒンジドメイン、および
ｆ）アンカードメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４０】
前記抗原結合ドメインが、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４１】
前記抗体または抗原結合断片が、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項４０に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４２】
前記抗体または抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項４０または請求項４１に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４３】
前記抗原結合ドメインが、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４４】
前記抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４５】
前記抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原に結合する、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４６】
前記抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９に結合する、請求項３４〜４５のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４７】
前記抗原結合ドメインが、がん細胞上に発現する抗原に結合する、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４８】
前記抗原結合ドメインが、固形がん細胞上に発現する抗原に結合する、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項４９】
前記抗原結合ドメインが、液性がん細胞上に発現する抗原に結合する、請求項３４〜４８のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５０】
前記抗原結合ドメインが、悪性Ｂ細胞上に発現する抗原に結合する、請求項３４〜４９のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５１】
前記抗原結合ドメインが、悪性形質細胞上に発現する抗原に結合する、請求項３４〜４７のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５２】
前記多量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項３４〜５１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５３】
前記多量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５４】
前記多量体化ドメインが、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドおよびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドからなる群から選択される、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５５】
前記ヒンジドメインが、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、ＰＤ−１ヒンジ、およびＣＤ１５２ヒンジから本質的になる群から選択される、請求項３６〜５４のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５６】
前記アンカードメインが、ＧＰＩ分子および膜貫通ドメインからなる群から選択される、請求項３６〜５５のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５７】
前記アンカードメインが、前記Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの膜貫通領域であるを含む、請求項３６〜５６のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５８】
シグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、リンカー、およびＦＫＢＰ１２多量体化ドメインを含む、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項５９】
シグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、リンカー、および架橋因子に結合したＦＫＢＰ１２多量体化ドメインを含む、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項６０】
配列番号３〜５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド配列を含む、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項６１】
架橋因子に結合した、配列番号３〜５のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド配列を含む、二量体化可能なサルベージ受容体。
【請求項６２】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６３】
請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項６４】
請求項６２または請求項６３に記載のポリヌクレオチドをコードする、ベクター。
【請求項６５】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項６４に記載のベクター。
【請求項６６】
前記ベクターが、エピソームベクターである、請求項６４または請求項６５に記載のベクター。
【請求項６７】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６８】
前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６９】
前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７０】
前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７１】
左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス排出エレメント、請求項６２または請求項６３に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項７２】
前記５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーターに置き換えられている、請求項７１に記載のベクター。
【請求項７３】
前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項７２に記載のベクター。
【請求項７４】
前記３’ＬＴＲが、自己不活性化型（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項７１に記載のベクター。
【請求項７５】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ、請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体、請求項６２もしくは請求項６３に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項６４〜７４のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項７６】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ、および請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体を含む、細胞。
【請求項７７】
請求項６２または請求項６３に記載の１つ以上のポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項７８】
請求項６４〜７４のいずれか１項に記載の１つ以上のベクターを含む、細胞。
【請求項７９】
前記細胞が、造血細胞である、請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８０】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項７５〜７９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８１】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはこれらの組み合わせである、請求項７５〜８０のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８２】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項７５〜８１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８３】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項７５〜８２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８４】
前記細胞源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項７５〜８３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８５】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ、請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体、請求項６２もしくは６３に記載のポリヌクレオチド、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項８６】
生理学的に許容される担体、および請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲ、請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体、請求項６２もしくは６３に記載のポリヌクレオチド、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項８７】
サルベージＣＡＲシステムであって、
ａ）第１の抗原に結合する請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞と、
ｂ）第２の抗原に結合する請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体と、
ｃ）架橋因子と、を含む、サルベージＣＡＲシステム。
【請求項８８】
サルベージＣＡＲシステムであって、
ａ）第１の抗原に結合する請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含むＣＡＲ  Ｔ細胞と、
ｂ）第２の抗原に結合する請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体と、を含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、架橋因子に結合している、サルベージＣＡＲシステム。
【請求項８９】
サルベージＣＡＲシステムであって、
ａ）第１の抗原に結合する請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲおよび第２の抗原に結合する請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体を含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞と、
ｃ）架橋因子と、を含む、サルベージＣＡＲシステム。
【請求項９０】
前記二量体化可能なサルベージ受容体が、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドによってコードされる、請求項８９に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９１】
前記第１の抗原が、前記第２の抗原と異なる、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９２】
前記第１の抗原および第２の抗原が、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される、請求項８７〜９１のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９３】
前記第１の抗原および第２の抗原が、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９からなる群から選択される、請求項８７〜９２のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９４】
前記第１の抗原がＢＣＭＡであり、第２の抗原がＣＤ１９である、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９５】
前記第１の抗原がＣＤ１９であり、第２の抗原がＢＣＭＡである、請求項８７〜９４のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９６】
前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインおよび二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインが、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびサイクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびサイクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、またはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそのバリアントから選択される対である、請求項８７〜９５のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９７】
前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチドまたはそのバリアントを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインが、ＦＲＢポリペプチドまたはそのバリアントを含む、請求項８７〜９６のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９８】
前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインが、ＦＲＢポリペプチドまたはそのバリアントを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインが、ＦＫＢＰポリペプチドまたはそのバリアントを含む、請求項８７〜９６のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項９９】
前記架橋因子が、ＡＰ２１９６７、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１００】
前記サルベージＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ＡＰ２１９６７である、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０１】
前記サルベージＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ＡＰ２１９６７である、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０２】
前記サルベージＣＡＲが、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ＡＰ２１９６７である、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０３】
前記サルベージＣＡＲが、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ＡＰ２１９６７である、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０４】
前記サルベージＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０５】
前記サルベージＣＡＲが、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０６】
前記サルベージＣＡＲが、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖおよびＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０７】
前記サルベージＣＡＲが、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、前記二量体化可能なサルベージ受容体が、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖおよびＦＲＢ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、前記架橋因子が、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである、請求項８７〜９８のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲシステム。
【請求項１０８】
対象における再発性／難治性がん細胞の数を減少させるための方法であって、前記対象に、
ａ）請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の有効量の二量体化可能なサルベージ受容体であって、前記対象が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある、二量体化可能なサルベージ受容体と、
ｂ）前記二量体化可能なサルベージ受容体および前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する有効量の架橋因子と、を投与することを含む、方法。
【請求項１０９】
対象における再発性／難治性がん細胞の数を減少させるための方法であって、前記対象に、
ａ）架橋因子に結合した請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の有効量の二量体化可能なサルベージ受容体であって、前記対象が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある、二量体化可能なサルベージ受容体を投与することを含む、方法。
【請求項１１０】
対象における再発性／難治性がん細胞の数を減少させるための方法であって、前記対象に、
ａ）請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体を含む有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞と、
ｂ）前記二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発させるための誘導物質剤と、
ｃ）前記二量体化可能なサルベージ受容体および前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する有効量の架橋因子と、を投与することを含む、方法。
【請求項１１１】
がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、
ａ）請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の有効量の二量体化可能なサルベージ受容体であって、前記対象が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある、二量体化可能なサルベージ受容体と、
ｂ）前記二量体化可能なサルベージ受容体および前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する有効量の架橋因子と、を投与することを含む、方法。
【請求項１１２】
がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、
ａ）架橋因子に結合した請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の有効量の二量体化可能なサルベージ受容体であって、前記対象が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある、二量体化可能なサルベージ受容体を投与することを含む、方法。
【請求項１１３】
がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、前記対象に、
ａ）請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体を含む有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞と、
ｂ）前記二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発させるための誘導物質剤と、
ｃ）前記二量体化可能なサルベージ受容体および前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する有効量の架橋因子と、を投与することを含む、方法。
【請求項１１４】
前記がんが、固形がんである、請求項１０８〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記がんが、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項１０８〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記がんが、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項１０８〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記がんが、液性がんまたは血液がんである、請求項１０８〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記血液学的悪性腫瘍が、Ｂ細胞悪性腫瘍である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫からなる群から選択される、請求項１１８または請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、多発性骨髄腫である、請求項１１８〜１２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
対象におけるがんと関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法であって、前記対象に、
ａ）請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の有効量の二量体化可能なサルベージ受容体であって、前記対象が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある、二量体化可能なサルベージ受容体と、
ｂ）前記二量体化可能なサルベージ受容体および前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する有効量の架橋因子と、を投与することを含む、方法。
【請求項１２３】
対象におけるがんと関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法であって、前記対象に、
ａ）架橋因子に結合した請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の有効量の二量体化可能なサルベージ受容体であって、前記対象が、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のサルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある、二量体化可能なサルベージ受容体を投与することを含む、方法。
【請求項１２４】
対象におけるがんと関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法であって、前記対象に、
ａ）請求項３４〜６１のいずれか１項に記載の二量体化可能なサルベージ受容体を含む有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞と、
ｂ）前記二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発させるための誘導物質剤と、
ｃ）前記二量体化可能なサルベージ受容体および前記サルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する有効量の架橋因子と、を投与することを含む、方法。
【請求項１２５】
寛解される前記１つ以上の症状が、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性および易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、ならびに排尿減少からなる群から選択される、請求項１２２〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年６月２９日出願の米国仮特許出願第６２／３５６，３３５号、２０１６年４月１４日出願の米国仮特許出願第６２／３２２，６３４号の優先権を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照することによって本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿０６８＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは４２ＫＢであり、２０１７年４月１４日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、がんを治療するための改善された組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、がんを治療するための細胞免疫療法組成物およびそれを使用する方法に関する。
【０００４】
がんは、世界中で深刻な健康問題である。２００８〜２０１０年の割合に基づくと、現在出生している男女のうちの４０．７６％が、生存期間中のある時点である種のがんであると診断されるであろう。男性の２０．３７％は、女性においての１５．３０％と比較して、５０歳〜７０歳の間にがんを発症するであろう。２０１０年１月１日時点で、米国では、がん歴を有し、生存している人々は、およそ１３，０２７，９１４人であり、男性が６，０７８，９７４人であり、女性が６，９４８，９４０人であった。米国では、１，６６０，２９０人の人々（男性８５４，７９０人および女性８０５，５００人）が、全ての部位のがんであると診断され、５８０，３５０人の人々が、２０１３年には、全ての部位のがんで死亡するであろう。Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３。
【０００５】
がんの検出、予防、および治療において進歩してきたが、万人に成功する治療戦略は依然として実現していない。様々な形態へのがん治療の応答は、混合している。化学療法および放射線療法を含むがんを治療する従来の方法は、毒性副作用により有用性を制限されていた。治療抗体による免疫療法はまた、一部分において、不良な薬物動態プロファイル、糸球体での血清プロテアーゼおよび濾過による抗体の迅速排除、ならびに腫瘍部位への限られた浸透および腫瘍細胞上の標的抗原の発現レベルのため、限られた成功しか提供していない。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変された細胞を使用する試みもまた、ＣＡＲ  Ｔ細胞の不良なインビボ増殖、注入後の細胞の迅速な消失、期待外れの臨床活性、および再発性または難治性がんのために、限られた成功のみ満たした。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は概して、Ｔ細胞療法をもたらすための改善されたベクターおよびそれを使用する方法を提供する。より具体的には、本発明は、サルベージＣＡＲ、二量体化可能なサルベージ受容体、ならびにがん、ならびに特に好ましい実施形態において、再発性または難治性がんの治療、予防、または寛解におけるその使用を提供する。
【０００７】
様々な実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを含む、サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、提供される。
【０００８】
様々な実施形態において、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、多量体化ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを含む、サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が、提供される。
【０００９】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外抗原結合ドメインをさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲは、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される抗体または抗原結合断片をさらに含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
【００１２】
ある特定の実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する。
【００１３】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインをさらに含む。
【００１４】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインをさらに含む。
【００１５】
ある特定の実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９に結合する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、癌細胞上に発現する抗原に結合する。
【００１７】
さらなる実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、固形癌細胞上に発現する抗原に結合する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、液性癌細胞上に発現する抗原に結合する。
【００１９】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、悪性Ｂ細胞上に発現する抗原に結合する細胞外抗原結合ドメインをさらに含む。
【００２０】
さらなる実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、悪性形質細胞上に発現する抗原に結合する。
【００２１】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、およびそれらのバリアントからなる群から選択される多量体化ドメインをさらに含む。
【００２２】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、およびそのバリアントからなる群から選択される多量体化ドメインをさらに含む。
【００２３】
さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドおよびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドからなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
【００２５】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドから単離される膜貫通ドメインをさらに含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αから単離される。
【００２７】
ある特定の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
【００２８】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８からなる群から選択される共刺激分子から単離される。
【００３０】
さらなる実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７から単離される。
【００３１】
さらなる実施形態において、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される一次シグナル伝達ドメイン。
【００３２】
特定の実施形態において、ＣＤ３ζから単離される一次シグナル伝達ドメイン。
【００３３】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む。
【００３４】
特定の実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲは、スペーサー領域をさらに含む。
【００３６】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。
【００３７】
さらなる実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む。
【００３８】
様々な実施形態において、シグナルペプチド、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、リンカー、ＦＲＢ（Ｔ８２Ｌ）多量体化ドメイン、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含むサルベージＣＡＲが、提供される。
【００３９】
様々な実施形態において、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むサルベージＣＡＲが提供される。
【００４０】
様々な実施形態において、抗原結合ドメインおよび多量体化ドメインを含む、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００４１】
様々な他の実施形態において、ａ）抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、およびアンカードメインを含む、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００４２】
様々な特定の実施形態において、抗原結合ドメイン、リンカー、および多量体化ドメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００４３】
様々なある特定の実施形態において、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、リンカー、および多量体化ドメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００４４】
様々な追加の実施形態において、抗原結合ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン、ヒンジドメイン、およびアンカードメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００４５】
様々なさらなる実施形態において、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、リンカー、多量体化ドメイン、ヒンジドメイン、およびアンカードメインから本質的になる、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００４６】
さらなる実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００４７】
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
【００４９】
さらなる実施形態において、抗原結合ドメインは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する。
【００５０】
ある特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する。
【００５１】
特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原に結合する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９に結合する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、がん細胞上に発現する抗原に結合する。
【００５４】
さらなる実施形態において、抗原結合ドメインは、固形がん細胞上に発現する抗原に結合する。
【００５５】
特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、液性癌細胞上に発現する抗原に結合する。
【００５６】
ある特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、悪性Ｂ細胞上に発現する抗原に結合する。
【００５７】
特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、悪性形質細胞上に発現する抗原に結合する。
【００５８】
特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、およびそのバリアントからなる群から選択される。
【００６０】
さらなる実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドおよびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドからなる群から選択される。
【００６１】
さらなる実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、ＰＤ−１ヒンジ、およびＣＤ１５２ヒンジから本質的になる群から選択される。
【００６２】
特定の実施形態において、アンカードメインは、ＧＰＩ分子および膜貫通ドメインからなる群から選択される。
【００６３】
さらなる実施形態において、アンカードメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドの膜貫通領域であるを含む。
【００６４】
様々な実施形態において、シグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、リンカー、およびＦＫＢＰ１２多量体化ドメインを含む二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００６５】
様々な実施形態において、シグナルペプチド、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、リンカー、および架橋因子に結合したＦＫＢＰ１２多量体化ドメインを含む二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００６６】
様々な実施形態において、配列番号３〜５のうちの１つに記載されるポリペプチド配列を含む二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００６７】
様々な実施形態において、架橋因子に結合した、配列番号３〜５のうちの１つに記載されるポリペプチド配列を含む二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。
【００６８】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６９】
特定の実施形態において、本明細書において企図される二量体化可能なサルベージ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００７０】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドをコードするベクターが提供される。
【００７１】
ある特定の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
【００７２】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクターである。
【００７３】
特定の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００７５】
さらなる実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００７６】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される。
【００７７】
ある特定の実施形態において、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス排出エレメント、本明細書において企図されるポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、および右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
【００７８】
さらなる実施形態において、５’ＬＴＲのプロモーターは、異種プロモーターに置き換えられている。
【００７９】
特定の実施形態において、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
【００８０】
さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、自己不活性化型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
【００８１】
様々な実施形態において、本明細書において企図される、サルベージＣＡＲ、二量体化可能なサルベージ受容体、ポリヌクレオチド、および／またはベクターを含む細胞が提供される。
【００８２】
様々な実施形態において、本明細書において企図される、サルベージＣＡＲおよび二量体化可能なサルベージ受容体を含む細胞が提供される。
【００８３】
様々な実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。
【００８４】
様々な実施形態において、本明細書において企図される１つ以上のベクターを含む細胞が提供される。
【００８５】
いくつかの実施形態において、細胞は、造血細胞である。
【００８６】
さらなる実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【００８７】
特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはこれらの組み合わせである。
【００８８】
ある特定の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。
【００８９】
さらなる実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【００９０】
いくつかの実施形態において、細胞源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【００９１】
様々な実施形態において、本明細書において企図される、サルベージＣＡＲ、二量体化可能なサルベージ受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を含む組成物が提供される。
【００９２】
様々な実施形態において、本明細書において企図される、生理学的に許容される賦形剤、サルベージＣＡＲ、二量体化可能なサルベージ受容体、ポリヌクレオチド、ベクター、および／または細胞を含む組成物が提供される。
【００９３】
様々な実施形態において、第１の抗原に結合するサルベージＣＡＲ、第２の抗原に結合する二量体化可能なサルベージ受容体、および架橋因子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含むサルベージＣＡＲシステムが提供される。様々な実施形態において、第１の抗原に結合するサルベージＣＡＲ、および架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含むサルベージＣＡＲシステムが提供される。
【００９４】
様々な実施形態において、第１の抗原に結合するサルベージＣＡＲ、第２の抗原に結合する二量体化可能なサルベージ受容体、および架橋因子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含むサルベージＣＡＲシステムが提供される。
【００９５】
さらなる実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、誘導性プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９６】
特定の実施形態において、第１の抗原は、第２の抗原とは異なる。
【００９７】
ある特定の実施形態において、第１の抗原および第２の抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。
【００９８】
特定の実施形態において、第１の抗原および第２の抗原は、ＢＣＭＡまたはＣＤ１９からなる群から選択される。
【００９９】
さらなる実施形態において、第１の抗原はＢＣＭＡであり、第２の抗原はＣＤ１９である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、第１の抗原はＣＤ１９であり、第２の抗原はＢＣＭＡである。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインおよび二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびサイクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびサイクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、またはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそのバリアントから選択される対である。
【０１０２】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドまたはそのバリアントを含み、二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインは、ＦＲＢポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインは、ＦＲＢポリペプチドまたはそのバリアントを含み、二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
【０１０４】
さらなる実施形態において、架橋因子は、ＡＰ２１９６７、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである。
【０１０５】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０１０６】
さらなる実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０１０８】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖおよびＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、ならびに任意に、アンカードメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０１１２】
さらなる実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを含み、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖおよびＦＲＢ多量体化ドメイン、ならびに任意に、アンカードメインを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０１１３】
様々な実施形態において、対象における再発性／難治性癌細胞の数を減少させるための方法が提供され、本方法は、サルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある対象に、有効量の二量体化可能なサルベージ受容体、ならびに有効量の、二量体化可能なサルベージ受容体およびサルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する架橋因子を投与することを含む。
【０１１４】
様々な実施形態において、対象における再発性／難治性癌細胞の数を減少させるための方法が提供され、本方法は、サルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある対象に、有効量の、架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を投与することを含む。
【０１１５】
様々な実施形態において、対象における再発性／難治性がん細胞の数を減少させるための方法が提供され、本方法は、対象に、有効量の二量体化可能なサルベージ受容体を含むサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発させるための誘導物質剤、ならびに有効量の、二量体化可能なサルベージ受容体およびサルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する架橋因子を投与することを含む。
【０１１６】
様々な実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法が提供され、本方法は、サルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある対象に、有効量の二量体化可能なサルベージ受容体、ならびに有効量の、二量体化可能なサルベージ受容体およびサルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する架橋因子を投与することを含む。
【０１１７】
様々な実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法が提供され、本方法は、サルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与されたことがある対象に、有効量の、架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を投与することを含む。
【０１１８】
様々な実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法が提供され、本方法は、対象に、有効量の二量体化可能なサルベージ受容体を含むサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発させるための誘導物質剤、ならびに有効量の、二量体化可能なサルベージ受容体およびサルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する架橋因子を投与することを含む。
【０１１９】
さらなる実施形態において、がんは、固形がんである。
【０１２０】
特定の実施形態において、がんは、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【０１２１】
さらなる実施形態において、がんは、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、および皮膚癌からなる群から選択される。
【０１２２】
さらなる実施形態において、がんは、液性がんまたは血液がんである。
【０１２３】
特定の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、Ｂ細胞悪性腫瘍である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫からなる群から選択される。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫からなる群から選択される。
【０１２６】
特定の実施形態において、Ｂ細胞悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である。
【０１２７】
様々な実施形態において、対象におけるがんと関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法が提供され、本方法は、サルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与したことがある対象に、有効量の二量体化可能なサルベージ受容体、ならびに有効量の、二量体化可能なサルベージ受容体およびサルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する架橋因子を投与することを含む。
【０１２８】
様々な実施形態において、対象におけるがんと関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法が提供され、本方法は、サルベージＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞をこれまでに投与したことがある対象に、有効量の、架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を投与することを含む。
【０１２９】
様々な実施形態において、対象におけるがんと関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法が提供され、本方法は、対象に、有効量の二量体化可能なサルベージ受容体を含むサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発させるための誘導物質剤、ならびに有効量の、二量体化可能なサルベージ受容体およびサルベージＣＡＲの多量体化ドメインに結合する架橋因子を投与することを含む。
【０１３０】
特定の実施形態において、寛解される１つ以上の症状は、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性および易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、ならびに排尿減少からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】サルベージＣＡＲシステムと比較して、ＣＡＲ  Ｔ細胞（左パネル）の図を示す。サルベージＣＡＲシステムは、サルベージＣＡＲ（中央パネル）および二量体化可能なサルベージ受容体（右上パネル）を含む。右下パネルは、分泌された二量体化可能なサルベージ受容体を発現するように操作された２９３Ｔ細胞株を示す。
【図２Ａ】細胞傷害性アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を５：１でＫ５６２−ＢＣＭＡ（＋）細胞およびＫ５６２−ＢＣＭＡ（−）細胞と２４時間共培養した。共培養物を、ビヒクルまたはＡＰ２１９６７で処理した。
【図２Ｂ】インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）放出アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を１：１でＫ５６２  ＢＣＭＡ（＋）細胞と２４時間共培養した。共培養物を、ビヒクルまたはＡＰ２１９６７で処理した。
【図３Ａ】サルベージＣＡＲシステムの図を示す。抗ＢＣＭＡ  サルベージＣＡＲおよび二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体は、架橋因子ＡＰ２１９６７の存在下でヘテロ二量体化する。
【図３Ｂ】細胞傷害性アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡ  サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を２：１でＮａｌｍ−６−ＣＤ１９（＋）細胞およびＫ５６２  ＣＤ１９（−）細胞と２４時間共培養した。共培養物を、ビヒクルまたは１００ｎＭのＡＰ２１９６７で、および０μＬ、１０μＬ、または３０μＬの、二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体を含有する２９３Ｔ−７１０細胞上清で処理した。
【図３Ｃ】インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）放出アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を１：１でＮａｌｍ−６−ＣＤ１９（＋）細胞と２４時間共培養した。共培養を、１００ｎＭのＡＰ２１９６７、および０μＬまたは１００μＬの、二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体を含有する２９３Ｔ−７１０細胞上清で処理した。
【図４Ａ】二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体のための精製スキームを示す。
【図４Ｂ】精製した二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体がリガンドで予め充填されていることを示す。
【図５】細胞傷害性アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞または抗ＢＣＭＡ  サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、２５０ｎｇの予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体の存在または不在下で、１００ｎＭのＡＰ２１９６７を用いてまたは用いずに、Ｅ：Ｔ比を２：１でＮａｌｍ−６−ＣＤ１９（＋）細胞およびＫ５６２  ＣＤ１９（−）細胞と２４時間共培養した。
【図６】予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体の滴定アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を２：１でＮａｌｍ−６−ＣＤ１９（＋）細胞およびＫ５６２  ＣＤ１９（−）細胞と、減少した量（１２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．３ｎｇ、１５．６ｎｇ、７．８ｎｇ、３．９ｎｇ、２．０ｎｇ）の予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体とで２４時間共培養した。
【図７】サイトカイン放出アッセイからの結果を示す。抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質転換Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を１：１でＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ−６細胞と、減少した量（１２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．３ｎｇ、１５．６ｎｇ、７．８ｎｇ、３．９ｎｇ、２．０ｎｇ）の予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体とで２４時間共培養した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ、およびＩＦＮγの量を測定した。
【図８Ａ】抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣおよび二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体システムの図を示す。
【図８Ｂ】抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞が、抗ＣＤ１９サルベージ受容体でＣＤ１９を発現するＮａｌｍ−６細胞に再指向され得ることを示す。
【図８Ｃ】抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞のみが、抗ＣＤ１９サルベージ受容体の存在下で、ＣＤ１９を発現するＮａｌｍ−６細胞で共培養したときに、検出可能なレベルのＩＦＮγを分泌することを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲのポリペプチド配列を示す。
配列番号２は、抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲのポリペプチド配列を示す。
配列番号３は、二量体化可能なサルベージ受容体のポリペプチド配列を示す。
配列番号４は、二量体化可能なサルベージ受容体−Ｔ２Ａ−蛍光レポーターのポリペプチド配列を示す。
配列番号５は、二量体化可能なサルベージ受容体−Ｔ２Ａ−蛍光レポーターのポリペプチド配列を示す。
配列番号６は、抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣのポリペプチド配列を示す。
配列番号７〜１７は、様々なリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８〜４２は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を示す。
【０１３３】
Ａ．概要
がんは、多くの場合、異なるレベルの様々な抗原を発現する細胞の異種プールである。概して、免疫療法は、最初に、がん細胞の大部分で発現され、正常細胞の発現を実質的に欠いている抗原を標的化するように選択される。有効な標的免疫療法は、標的抗原を発現するがん細胞の大部分を死滅させ、部分的または完全寛解をもたらす。しかしながら、ほとんどのがんが、実際に異種であるため、標的抗原を発現しないか、低レベルの標的抗原を発現する残りのがん細胞を、回避し、初期免疫療法によって効率よく標的化されないがん細胞を潜在的に生じさせ得る。
【０１３４】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性を依然として制限する１つの主な障害は、「抗原陰性」がんの再発である。例えば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、最初に、再発性および難治性急性ＡＬＬの優れた寛解率をもたらすが、ＣＤ１９陰性白血病芽細胞の再発が、約１０〜２０％の症例で生じる。驚くほど高速な抗原陰性再発は、依然として、ＣＡＲ  Ｔ免疫療法の取り組まれていない欠点を表す。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、再発性または難治性抗原陰性がん細胞上で発現される事実上限定されない数のさらなる抗原を再標的化し得るように、ＣＡＲを再操作することによって問題を解決した。したがって、本明細書において企図される組成物および方法は、ＣＡＲ  Ｔ細胞免疫療法における重要な進歩を表す。
【０１３５】
様々な実施形態において、サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。サルベージＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲに多量体化ドメインを組み込むことによってサルベージＣＡＲに適合され得る。多量体化ドメインは、細胞内または細胞外に位置付けられ得る。
【０１３６】
様々な実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。二量体化サルベージＣＡＲ受容体は、１つ以上の抗原結合ドメインおよび多量体化ドメイン、ならびに任意に、リンカードメイン、ヒンジドメイン、および／またはアンカードメインのうちの１つ以上を含み得る。
【０１３７】
様々な他の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムが提供される。サルベージＣＡＲシステムは、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体、および架橋因子を含み得る。架橋因子は、サルベージＣＡＲおよび二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインに結合し、これは、機能的ＣＡＲシグナル伝達複合体の形成をもたらす。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、誘導性二量体化可能なサルベージ受容体をさらに含む。
【０１３９】
特定の実施形態において、架橋因子で予め充填された二量体化可能なサルベージ受容体を精製するための方法が提供される。
【０１４０】
別段の指示が具体的にない限り、特定の実施形態の実践には、当該技術分野の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来法が用いられ、これらの多くは、例証の目的で以下に記載される。このような技法は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  ｊｏｕｒｎａｌｓ  ｓｕｃｈ  ａｓ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌中の研究論文を参照されたい。
【０１４１】
Ｂ．定義
別様に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実践および試験には、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が使用され得るが、好ましい実施形態の組成物、方法、および材料を本明細書に記載する。本開示において、以下の用語は、以下の定義の通りである。
【０１４２】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように使用される。例として、「あるエレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【０１４３】
代替物（例えば、「または（ｏｒ）」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するよう理解されるものとする。
【０１４４】
「および／または」という用語は、代替物のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するよう理解されるものとする。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほど異なる分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の範囲の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【０１４６】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の包含を暗示するが、いかなる他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の除外を暗示するものではないと理解される。「からなる」とは、「からなる」という表現に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という表現は、列記される要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、句の後に列記される任意の要素を含み、列記された要素の開示において指定された活性または作用に干渉しない、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。よって、「から本質的になる」という句は、列記される要素が必要であるか、または必須であるが、列記された要素の活性または作用に物質的に影響を及ぼす他の要素が存在しないことを示す。
【０１４７】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「付加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通した様々な箇所に前述の表現が存在しても、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わされてもよい。一実施形態の特徴の積極的な記載が特定の実施形態における特徴を除外する根拠とならないことも理解される。
【０１４８】
「抗原（Ａｇ）」とは、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することのできる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（例えば、がん特異的タンパク質を含むものなど）を含む。例示的な抗原としては、脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されない。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘発されたものを含む、特定の体液性または細胞性免疫の産物と反応する。
【０１４９】
「標的抗原」または「目的となる標的抗原」は、本明細書において企図される結合ドメインが結合するように設計される、抗原である。特定の実施形態において、標的抗原は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＳＴｎ、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される。
【０１５０】
一実施形態において、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「細胞外抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、同義に使用され、目的となる標的抗原に特異的に結合する能力を有するポリペプチドを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。
【０１５２】
本明細書で使用される「特異的結合親和性」、または「特異的に結合する」、または「特異的に結合している」、または「特異的結合」、または「特異的に標的化する」という用語は、抗体またはその抗原結合断片が標的抗原にバックグラウンド結合よりも高い結合親和性で結合することを説明する。結合ドメインは、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡結合定数）を有する抗原に結合するまたはそれと関連する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）とは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
【０１５３】
あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ以下）の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。結合ドメインポリペプチドの親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または結合会合（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、もしくは標識リガンドを使用した置換アッセイによって、あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能であるＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサ技術を使用して、容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、またはその均等物も参照されたい）。
【０１５４】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍高いか、バックグラウンド結合より約５倍高いか、バックグラウンド結合より約１０倍高いか、バックグラウンド結合より約２０倍高いか、バックグラウンド結合より約５０倍高いか、バックグラウンド結合より約１００倍高いか、またはバックグラウンド結合より約１０００倍以上高い。
【０１５５】
「抗体」とは、免疫細胞により認識されるものなどの抗原決定基を含む脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸といった抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。
【０１５６】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
【０１５７】
抗体には、その抗原結合断片、例えばラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ならびに抗原結合に関与する全長抗体の一部分などが含まれる。この用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ接合抗体（例えば二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片といった、遺伝子操作された形態も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０１５８】
当業者には理解されるように、また本明細書の他の箇所に記載されるように、完全抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は、１つの可変領域と、第１、第２、および第３の定常領域とからなり、一方で各軽鎖は、１つの可変領域と１つの定常領域とからなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、およびμに分類される。哺乳動物の軽鎖は、λまたはκに分類される。α、δ、ε、γ、およびμの重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭに分類される。完全抗体は「Ｙ」形状を形成する。Ｙのステムは、一緒に結合した２本の重鎖の第２および第３の定常領域（そしてＩｇＥおよびＩｇＭに関しては第４の定常領域）からなり、ジスルフィド結合（鎖間）がヒンジに形成される。重鎖γ、α、およびδは、３つのタンデム（一列）のＩｇドメインと柔軟性を高めるためのヒンジ領域とから構成された定常領域を有し、重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成された定常領域を有する。第２および第３の定常領域は、それぞれ「ＣＨ２ドメイン」および「ＣＨ３ドメイン」と称される。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変領域および定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。
【０１５９】
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断されている「フレームワーク」を含む。ＣＤＲは、従来の方法によって、例えばＫａｂａｔらによる配列（Ｗｕ，ＴＴ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  “Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）、Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０−２４４３（１９８７）（参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）、またはＣｈｏｔｈｉａらによる構造（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））などによって、定義または特定することができる。
【０１６０】
軽鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示的な例としては、次のものが挙げられる：ＣＤＲ−Ｌ１は、約残基２４で開始し、Ｃｙｓが先行し、約１０〜１７残基であり、Ｔｒｐが続く（通常はＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎであるが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕも続く）；ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の端部の後の約１６残基で開始し、概してＩｌｅ−Ｔｙｒが先行するが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅも先行し、７残基である；そしてＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の端部の後の約３３残基で開始し、Ｃｙｓが先行し、７〜１１残基であり、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが続く（配列番号４４）（ＸＸＸは任意のアミノ酸である）。
【０１６１】
重鎖ＣＤＲを予測するための規則の例示的な例としては、次のものが挙げられる：ＣＤＲ−Ｈ１は、約残基２６で開始し、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（配列番号４５）が先行し、１０〜１２残基であり、Ｔｒｐが続く（通常はＴｒｐ−Ｖａｌであるが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａも続く）；ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の端部の後の約１５残基で開始し、概してＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号４６）またはいくつかの変形形態が先行し、１６〜１９残基であり、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く；そしてＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の端部の後の約３３残基で開始し、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（配列番号４５）（通常はＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が先行し、３〜２５残基であり、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号４７）が続く。
【０１６２】
一実施形態において、軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法に従って決定される。
【０１６３】
一実施形態において、軽鎖ＣＤＲならびに重鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ法に従って決定され、重鎖ＣＤＲ１は、ＡｂＭ法に従って決定され、これは、Ｋａｂａｔ法とＣｈｏｔｈｉａ法との間の含むである。例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ  Ｎ＆Ｒｅｅｓ  ＡＲ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２０００  Ｄｅｃ；１３（１２）：８１９−２４およびＭｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：５１−９１を参照されたい。例えばＡｂＹｓｉｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）などの、ＣＤＲを予測するためのプログラムが公的に利用可能である。
【０１６４】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内で比較的保存されている。構成物である軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、三次元空間におけるＣＤＲの位置決定およびアライメントに役立つ。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは通常、Ｎ末端から開始して順次付番されてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また通常は、特定のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称され、一方で、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称される。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体間で異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置しか、抗原結合に直接関与しない。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
【０１６５】
「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示される他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【０１６６】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示される他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。
【０１６７】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖および重鎖の遺伝子が形質導入されている細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られる方法によって、例えば骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体を形成する細胞を作製することによって産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
【０１６８】
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種に由来するフレームワーク残基、およびマウスなどの別の種に由来するＣＤＲ（これが一般的に抗原結合をもたらす）を有する。特定の好ましい実施形態において、抗原特異的な結合ドメインは、キメラ抗体またはその抗原結合断片である。
【０１６９】
特定の実施形態において、抗体は、標的抗原に特異的に結合するヒト抗体（ヒトモノクローナル抗体など）またはその抗原結合断片である。ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を、上述のような既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞株が、例えば、ＫｏｚｂｏｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって説明されている。加えて、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体が、起点となる非ヒト抗体と同様の親和性および特異性を有する場合、遺伝子シャフリングを使用して、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得ることもできる。１９９３年４月１日に刊行されたＰＣＴ  ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全ヒト抗体をもたらす。
【０１７０】
「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えばマウス、ラット、または合成）の免疫グロブリンからの１つ以上のＣＤＲとを含む、免疫グロブリンである。ＣＤＲをもたらす非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークをもたらすヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態において、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンからのものである。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％以上同一でなければならない。したがって、場合によりＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない、付加的な保存的アミノ酸置換を有し得る。ヒト化抗体は、遺伝子操作の手段によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【０１７１】
本明細書で使用される「ラクダＩｇ」または「ラクダ科ＶＨＨ」は、重鎖抗体の最小の既知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２１：３４９０−３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科抗体」は、２つのＶＨドメインを含み、軽鎖を含まない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８（１９９９）、ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１、米国特許第６，００５，０７９号）。
【０１７２】
「免疫グロブリン新抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」は、１つの可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインと、５つの定常新抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインとのホモ二量体からなる、サメ免疫レパートリー由来の抗体のクラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最小の既知の免疫グロブリンベースのタンパク質の足場の一部であり、高度に安定であり、効率的な結合特性を有する。この本質的な安定性は、（ｉ）マウス抗体に見られる従来の抗体のＶＨおよびＶＬドメインと比較して相当数の荷電した親水性の表面露出残基を提示する、基礎となるＩｇ足場と、（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋、およびループ内水素結合のパターンを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ内の安定化構造特徴との両方に起因し得る。
【０１７３】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映した名称である残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しながらも抗原に架橋結合することのできるＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
【０１７４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、密接な非共有性会合状態にある、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で会合することができるように、可動性ペプチドリンカーによって共有結合していてもよい。各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）がＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのは、この構成においてである。集合的に、６つのＨＶＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるにせよ、抗原を認識しそれに結合する能力を有する。
【０１７５】
Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する、本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、ヒンジシステインを間に有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【０１７６】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続したもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より詳細に記載されている。トリアボディおよびテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１７７】
「単一ドメイン抗体」すなわち「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」は、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。
【０１７８】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に、いずれかの配向（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【０１７９】
一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされ得る。このようなハイブリドーマの産生は日常的となっている。可変領域重鎖（ＶＨ）および可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用することのできる技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
【０１８０】
「リンカー」とは、様々なポリペプチドドメイン間に、例えば、分子の適切な空間配置および立体構造のために付加されたＶＨドメインとＶＬドメインとの間の複数のアミノ酸残基を指す。特定の実施形態において、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」とは、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖の可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、ＶＨドメインとＶＬドメインとを接続し、２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、リンカーは、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、ヒンジドメイン、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを分離する。
【０１８１】
本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適なリンカーの例示的な例としては、次のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号７）；ＴＧＥＫＰ（配列番号８）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号９）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４または５である）（配列番号１０）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１１）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１２）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１３）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１４）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１５）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１６）。代替的に、柔軟なリンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）、またはファージディスプレイ法により、合理的に設計され得る。一実施形態において、リンカーは、次のアミノ酸配列：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１７）を含む（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７−１６４４（２００３））。
【０１８２】
「スペーサードメイン」とは、２つのドメインを分離するポリペプチドを指す。一実施形態において、スペーサードメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化が可能となるように抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から離して移動させる（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを分離する。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの一部である。スペーサードメインは、天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０１８３】
「ヒンジドメイン」とは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化が可能となるように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置付ける機能を果たすポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ポリペプチドは、結合ドメインと多量体化ドメインとの間、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間、または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０１８４】
「変更されたヒンジ領域」とは、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換もしくは欠失）を有する天然起源のヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換もしくは欠失）を有する、少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４、または１５アミノ酸長）の天然起源のヒンジ領域の一部分、または（ｃ）（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸長であり得る）コアヒンジ領域を含む天然起源のヒンジ領域の一部分を指す。ある特定の実施形態において、天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域内の１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）で置換されていてもよい。変更された免疫グロブリンヒンジ領域では、代替的または付加的に、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換されていてもよい。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「多量体化ドメイン」とは、別の異なるポリペプチドと、直接または架橋分子を介して、優先的に相互作用または会合するポリペプチドを指し、異なる多量体化ドメインの相互作用は、多量体化（すなわち、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ多量体、ヘテロ多量体であり得る、二量体、三量体、または多部分複合体の形成）に実質的に寄与するか、またはこれを効率的に促進する。多量体化ドメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。
【０１８６】
本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適な多量体化ドメインの例示的な例としては、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、またはそのバリアントが挙げられる。
【０１８７】
「架橋因子」とは、２つ以上の多量体化ドメインと会合し、その間に配置される分子を指す。特定の実施形態において、多量体化ドメインは、架橋因子の存在下でのみポリペプチド複合体の形成に実質的に寄与するか、またはこれを効率的に促進する。特定の実施形態において、多量体化ドメインは、架橋因子の不在下でポリペプチド複合体の形成に寄与しないか、またはこれを効率的に促進しない。本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適な架橋因子の例示的な例としては、ラパマイシン（シロリムス）もしくはそのラパログ、クーママイシンもしくはその誘導体、ジベレリンもしくはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）もしくはその誘導体、メトトレキサートもしくはその誘導体、シクロスポリンＡもしくはその誘導体、ＦＫＣｓＡもしくはその誘導体、ＦＫＢＰ（ＳＬＦ）のトリメトプリム（Ｔｍｐ）−合成リガンドもしくはその誘導体、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
ラパマイシン類似体（ラパログ）としては、米国特許第６，６４９，５９５号において開示されているものが挙げられるが、これらに限定されず、このラパログ構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、実質的に低減された免疫抑制効果のあるラパログである。好ましい一実施形態において、ラパログは、ＡＰ２１９６７誘導体（Ｃ−１６−（Ｓ）−７−メチルインドールラパマイシンとしても知られており、ＩＣ５０＝１０ｎＭ、化学的に修飾された免疫抑制効果のないラパマイシン類似体）である。
【０１８９】
「実質的に低減された免疫抑制効果」とは、臨床的に測定されるか、またはヒト免疫抑制活性についての、適切なインビトロにおけるサロゲート（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）、もしくはインビボにおけるサロゲートにおいて測定される免疫抑制効果が、当モル量のラパマイシンについて観察または予測される少なくとも０．１〜０．００５倍未満の免疫抑制効果を有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減された免疫抑制効果」とは、このようなインビトロアッセイにおけるＥＣ５０値が、同じアッセイにおいてラパマイシンについて観察されるＥＣ５０値よりも少なくとも１０〜２５０倍大きいラパログを指す。ラパログの他の例示的な例としては、ＡＰ２１９６７、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、「アンカードメイン」とは、二量体化可能なサルベージ受容体の、細胞表面への係留、アンカリング、またはこれとの会合を促進する、アミノ酸配列または他の分子を指す。例示的なアンカードメインは、細胞膜内で安定な構造を伴うアミノ酸配列、または糖脂質（グリコシルホスファチジルイノシトールまたはＧＰＩとしてもまた既知である）などの付加を促進するアミノ酸配列を含む。背景として、ＧＰＩ分子は、カルボキシ末端のＧＰＩシグナル配列の切断（例えば、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１３：７２１，２０００を参照されたい）、および既に合成されたＧＰＩアンカー分子の、新たに形成されたカルボキシ末端のアミノ酸への同時的な移動（例示的なＧＰＩアンカーであって、参照によりそれらの全体が組み込まれるＧＰＩアンカーについては、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２０７１１を参照されたい）を結果としてもたらす、アミノ基転移反応により、タンパク質標的に翻訳後に付着される。ある特定の実施形態において、アンカードメインは、疎水性ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン）またはＧＰＩシグナル配列である。いくつかの実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドをコードする核酸分子は、アンカードメインを含み、任意に、アンカードメインはＧＰＩ分子である。
【０１９１】
「膜貫通ドメイン」は、細胞の細胞膜にポリペプチドを固定するドメインである。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
【０１９２】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、免疫エフェクター細胞上に発現された受容体によって標的抗原の効果的な結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に形質導入して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害性因子の放出を含む細胞傷害活性、または免疫エフェクター細胞上に発現された受容体に抗原結合より誘発される他の細胞応答を誘発することに関与する、ポリペプチドを指す。
【０１９３】
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の特殊機能を指す。例えばＴ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含む補助もしくは活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊機能を行わせる、タンパク質の一部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用され得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮化部分が使用される範囲内では、そのような短縮化部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる短縮化部分をも含むよう意図される。
【０１９４】
ＴＣＲによって生成されたシグナル単独ではＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的または共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの明確に異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的または共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。
【０１９５】
「一次シグナル伝達ドメイン」とは、刺激方法または阻害方法のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節するシグナル伝達ドメインを指す。刺激様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。特定の実施形態での使用に好適な一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要とされる第２のシグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。共刺激ドメインが単離され得るような共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、一般に、異常な細胞が制御されずに分裂し、近くの組織に浸潤し得る、疾患または状態のクラスに関する。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が、制御されていない成長（すなわち、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、近接組織への侵入およびその破壊）、ならびに転移（すなわち、リンパ液または血液を介した、体内の他の場所への拡散）のうちの１つ以上を示すがんを指す。本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分へとがんが拡散することを指す。拡散した細胞により形成された腫瘍は「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元々（原発）の腫瘍の細胞と同様の細胞を含む。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長し得るが、身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己限定的であり、通常は浸潤または転移しない。
【０２００】
「がん細胞」は、がん性腫瘍または組織の個々の細胞を指す。がん細胞は、固形がんと液性がんとの両方を含む。「腫瘍」または「腫瘍細胞」とは、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常増殖により形成された腫脹または病変を指す。ほとんどのがんは腫瘍を形成するが、液性がん、例えば白血病は、必ずしも腫瘍を形成するわけではない。腫瘍を形成するがんに関しては、がん（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は互換的に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
【０２０１】
「再発」という用語は、改善または寛解後のがんの戻り、または戻りの兆候および症状の診断を指す。
【０２０２】
「寛解」はまた、「臨床的寛解」と称され、部分的および完全寛解の両方を含む。部分的寛解において、がんの一部ではあるが、全てではない、兆候および症状が、消失する。完全寛解において、がんが依然として体内に存在し得るが、がんの全ての兆候および症状が、消失する。
【０２０３】
「難治性」とは、特定の治療剤を有する治療法に耐性を示すか、またはそれに応答しないがんを指す。がんは、第１の治療期間の経過にわたってまたはその後の治療期間中のいずれかで、治療の開始から、または治療剤への耐性を生じる結果として難治性であり得る（すなわち、治療剤への初期曝露への非応答性）。
【０２０４】
「抗原陰性」とは、抗原を発現しない、または検出できない無視できる量の抗原を発現する、細胞を指す。一実施形態において、抗原陰性細胞は、抗原に指向される受容体に結合しない。一実施形態において、抗原陰性細胞は、抗原に指向される受容体に実質的に結合しない。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書において企図される組成物および方法を用いて治療され得る特定の疾患、障害、または状態と診断されたことのある対象を指す。
【０２０６】
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい作用を含み、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療は、任意に、疾患もしくは状態の低減、または疾患もしくは状態の進行の遅延、例えば、腫瘍成長の遅延のいずれかを伴ってもよい。「治療」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶、あるいは治癒を必ずしも示さない。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」および「予防される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などの同様の用語は、疾患もしくは状態の発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するための手法を示す。疾患もしくは状態の開始または再発を遅延する、あるいは疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅延することも指す。本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および類似する用語も、疾患もしくは状態の開始または再発前の疾患もしくは状態の強度、作用、症状、および／または負荷を減少させることも含む。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、「の少なくとも１つの症状を寛解させる」という表現は、対象が治療を受けている疾患または状態の１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療される疾患または状態はがんであり、寛解される１つ以上の症状としては、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性および易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または（腹部器官の肥大による）痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、および（腎機能不全による）排尿減少が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
「増強する」または「促進する」または「増加する」または「増幅する」とは、概して、本明細書において企図される組成物が、ビヒクルもしくは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより大きな生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理学的応答は、当該技術分野における理解および本明細書の説明から明らかであるものの中でもとりわけ、Ｔ細胞の増幅、活性化、持続性の増加、および／またはがん細胞殺滅能力の増加を含み得る。「増加した」または「増強された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（その間および１を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増加を含み得る。
【０２１０】
「減少する」、または「低下する」、または「減らす」、または「低減する」、または「軽減する」とは、概して、本明細書において企図される組成物が、ビヒクルもしくは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより小さな生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。「減少した」または「低減した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によりもたらされる応答（参照応答）または特定の細胞系列における応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（その間および１を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含み得る。
【０２１１】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化しない」、または「実質的に変化しない」、または「実質的に減少しない」とは、概して、本明細書において企図される組成物が、細胞において、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較した場合に実質的に同様もしくは比較可能な生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。比較可能な応答は、参照応答と大幅に異ならないか、または測定可能な差がないものである。
【０２１２】
Ｃ．サルベージキメラ抗原受容体
様々な実施形態において、標的抗原を発現するがん細胞に免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を再指向させる遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体は、本明細書において、サルベージキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される。サルベージＣＡＲは、抗原特異的な細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するために、所望の抗原に対する抗体ベースの特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。サルベージＣＡＲはまた、抗原特異的なＣＡＲを別の抗原に再指向させることができる、多量体化ドメインも含む。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源からの異なるタンパク質またはＤＮＡの一部で構成されることを説明する。サルベージＣＡＲを含むＴ細胞は、サルベージＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞またはサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞と称される。
【０２１３】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。他の特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、細胞外抗原特異的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、多量体化ドメイン、および１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。サルベージＣＡＲの抗原結合ドメインと、標的細胞の表面上の標的抗原との会合は、サルベージＣＡＲのクラスター化をもたらし、サルベージＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。サルベージＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向させ、それにより、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を利用して、主要組織適合性（ＭＨＣ）依存様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することのできる分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を誘発するそれらの能力である。
【０２１４】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲは、がん、任意に、サルベージＣＡＲによって標的とされる初期抗原に対して陰性である抗原である再発性または難治性がんの増加した標的とする柔軟性および再標的化を提供する。
【０２１５】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１６】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、多量体化ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、および／または一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１７】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン、１つ以上のスペーサードメインおよび／もしくはリンカー、多量体化ドメイン、１つ以上のヒンジドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む膜貫通ドメイン、および一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１８】
特定の実施形態において企図されるサルベージＣＡＲは、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される抗原結合ドメインを含む。いくつかの好ましい実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体である。
【０２１９】
特定の実施形態において、抗原結合ドメインは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される標的抗原に結合する。
【０２２０】
特定の実施形態において、標的抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される。
【０２２１】
特定の実施形態において、標的抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される。
【０２２２】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲは、サルベージＣＡＲの様々なドメイン間に、場合によっては、サルベージＣＡＲドメインの適切な空間配置および立体構造を提供するために１つ以上のリンカーまたはスペーサーポリペプチドを含む。特定の実施形態において、リンカーは、サルベージＣＡＲの抗原結合ドメインにおいてｓｃＦｖの重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間に配置されている。特定の実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（式中、ｎ＝１、２、３、４、または５である）である（配列番号１０）。
【０２２３】
ある特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むスペーサードメインを含む。
【０２２４】
サルベージＣＡＲはまた、特定の実施形態においてヒンジドメインも含むことができる。本明細書に記載されるサルベージＣＡＲで使用するのに好適な例示的なヒンジドメインとしては、ＣＤ８αおよびＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよいし、変更されていてもよい。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【０２２５】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、１つ以上の多量体化ドメインを含む。特定の実施形態において、多量体化ドメインは、細胞外である。多量体化ドメインは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間、抗原結合ドメインとヒンジドメインとの間、またはヒンジドメインと膜貫通ドメインとの間に配置され得る。本明細書において企図される特定の実施形態での使用に好適な多量体化ドメインの例示的な例としては、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、またはそのバリアントが挙げられる。
【０２２６】
一実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、およびそのバリアントからなる群から選択される。
【０２２７】
一実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドおよびＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドからなる群から選択される。
【０２２８】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＴＭドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１に由来し得る（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域（複数可）を含む）を含む。特定の実施形態において、ＴＭドメインは合成的であり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。
【０２２９】
一実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、もしくはＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、サルベージＣＡＲのＴＭドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを連結させる、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の間のアミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンベースのリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
【０２３０】
本明細書において企図されるサルベージＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、サルベージＣＡＲは、１つ以上の共刺激細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
【０２３１】
特定の実施形態での使用に好適な一次シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例示的な例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインおよび１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に、任意の順序でタンデムに連結していてもよい。
【０２３２】
そのような共刺激分子の例示的な例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一実施形態において、サルベージＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０２３３】
Ｄ．二量体化可能なサルベージ受容体
様々な実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲは、再発性または難治性がん細胞への免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を再指向するように操作されている。再発性または難治性がん細胞へのＣＡＲ  Ｔ細胞（サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞）を再指向されるまたは再標的化する分子は、本明細書において二量体性サルベージ受容体と称される。二量体化可能なサルベージ受容体は、架橋因子の存在下で、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインと相互作用する多量体化ドメインと再発性または難治性がん細胞上で発現される抗原に対する抗原に基づいた特異性を組み合わせる分子である。架橋因子の存在下で、二量体化可能なサルベージ受容体は、再発性または難治性がん細胞に対する免疫エフェクター細胞活性を再開始するようにサルベージＣＡＲ分子に係合する。いずれの特定の理論によって拘束されるものではないが、初期がん抗原に対するＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、寛解をもたらすことが企図される。しかしながら、がんが、戻り、初期がん抗原の発現を欠いているまたはほとんど発現しない場合、がんに対する免疫エフェクター細胞活性を再開始するように再発性または難治性がん細胞上に発現する抗原を標的化する二量体化可能なサルベージ受容体が選択される。
【０２３４】
様々な実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体ポリペプチドは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けたことがある対象に投与される。
【０２３５】
様々な実施形態において、架橋因子で予め充填された二量体化可能なサルベージ受容体ポリペプチドは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けたことがある対象に投与される。
【０２３６】
様々な実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、二量体化可能なサルベージ受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む。
【０２３７】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、結合した架橋因子を含む。
【０２３８】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、抗原結合ドメインおよび多量体化ドメインを含む。
【０２３９】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、およびアンカードメインを含む。
【０２４０】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、抗原結合ドメイン、多量体化ドメイン、ヒンジドメイン、およびアンカードメインを含む。
【０２４１】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、リンカードメイン、および多量体化ドメインから本質的になる。
【０２４２】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、リンカードメイン、多量体化ドメイン、ヒンジドメイン、およびアンカードメインから本質的になる。
【０２４３】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、抗原結合ドメイン、リンカードメイン、および多量体化ドメインから本質的になる。
【０２４４】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、抗原結合ドメイン、リンカードメイン、多量体化ドメイン、ヒンジドメイン、およびアンカードメインから本質的になる。
【０２４５】
特定の実施形態において企図される二量体化可能なサルベージ受容体は、抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、ラクダＩｇ、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、ｓｃＦｖ抗原結合ドメインを含む。
【０２４６】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。
【０２４７】
一実施形態において、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群、またはＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される抗原。
【０２４８】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、１つ以上のリンカーを含む。リンカーは、抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間、および／または抗原結合ドメインと多量体化ドメインとの間に配置され得る。一実施形態において、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（式中、ｎ＝１、２、３、４、または５である）である（配列番号１０）。
【０２４９】
一実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、カルシニューリンポリペプチド、サイクロフィリンポリペプチド、細菌ＤＨＦＲポリペプチド、ＰＹＬ１ポリペプチド、ＡＢＩ１ポリペプチド、ＧＩＢ１ポリペプチド、ＧＡＩポリペプチド、およびそれらのバリアントからなる群から選択される多量体化ドメインを含む。
【０２５０】
一実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチド、ＦＲＢポリペプチド、またはそれらのバリアントを含む。
【０２５１】
一実施形態において、多量体化ドメインは、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドまたはＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌポリペプチドを含む。
【０２５２】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、ヒンジドメインを含む。一実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ４ヒンジ、ＣＤ８αヒンジ、ＰＤ−１ヒンジ、およびＣＤ１５２ヒンジから本質的になる群から選択される。
【０２５３】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＴＭドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ７１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ１に由来し得る（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域（複数可）を含む）を含む。特定の実施形態において、ＴＭドメインは合成的であり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。
【０２５４】
特定の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、ＧＰＩアンカー分子を含む。
【０２５５】
Ｅ．サルベージＣＡＲシステム
再発性または難治性がんは、細胞免疫療法分野を悩ませている一般的な問題である。本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、再発性／難治性がん、特に、最初に標的化された抗原（初期標的抗原）をもはや発現しないものを治療するために高効率的解法を提供する。例えば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞によりＣＤ１９を発現する白血病に対して治療された患者は、最初に、改善およびがんの退縮を示し得るが、最終的に、ＣＤ１９発現を欠いている白血病が再発する場合がある。このシナリオは、患者に存在するＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ１９に対して特異的であり、したがって、再発性または難治性ＣＤ１９陰性がん細胞が、免疫系では探知されず、さらなる治療的介入することなく確認されないまま成長するため、深刻な問題を示す。サルベージＣＡＲシステムは、本明細書において、二量体化可能なサルベージ受容体と称される、さらなる標的受容体の形での介入を提供する。
【０２５６】
様々な実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、がん、およびある特定の好ましい実施形態において、再発性または難治性がんを治療するために、対象に提供される。サルベージＣＡＲシステムは、がん細胞上に発現する第１の抗原に対するサルベージＣＡＲ、がん細胞上に発現する第２の抗原に対する二量体化可能なサルベージ受容体、および架橋因子を含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０２５７】
様々な実施形態において、架橋因子を予め充填または結合した二量体化可能なサルベージ受容体が、提供され得るかまたは対象に投与され得る。
【０２５８】
様々な他の実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、提供されるかまたは対象に投与されるとき、架橋因子を予め充填または結合しない。
【０２５９】
任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、再発性／難治性がんが、再発性／難治性がん上にもはや発現しないまたは実質的にもはや発現しない第１の抗原を対象にするサルベージＣＡＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞で治療されたことがある対象においてそれ自体が現れると、再発性または難治性がん細胞上に発現するまたは実質的に発現する第２の抗原を対象にする二量体化可能なサルベージ受容体が、対象に投与されることが企図される。対象に、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインおよび二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインに結合する架橋因子をさらに投与し、それによってサルベージＣＡＲとサルベージ受容体との間に会合を促進する。この会合は、ＣＡＲシグナル伝達経路を再係合し、第２の抗原を発現する再発性／難治性がん細胞に対する免疫エフェクター細胞活性を促進する。
【０２６０】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、第１の抗原に結合するＣＡＲ；第２の抗原に結合する二量体化可能なサルベージ受容体；ならびに第２の抗原を発現するがん細胞に対して機能的に活性なサルベージＣＡＲを形成するために、サルベージＣＡＲおよび二量体化可能なサルベージ受容体に結合する架橋因子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞（サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞）を含む。
【０２６１】
一実施形態において、二量体化可能なサルベージ受容体は、対象に投与される。
【０２６２】
一実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、誘導性プロモーター、および二量体化可能なサルベージ受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸を含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲおよび二量体化可能なサルベージ受容体は、同じ抗原上で異なるエピトープに結合するように設計される。
【０２６４】
好ましい実施形態において、第１の抗原は、第２の抗原とは異なる。
【０２６５】
特定の実施形態において、第１の抗原および第２の抗原は、独立して、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲファミリー、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される。
【０２６６】
一実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、Ｂ細胞悪性腫瘍を標的とする。
【０２６７】
特定の実施形態において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される第１の抗原を標的化するサルベージＣＡＲ、ならびにＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される第２の抗原を標的化する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０２６８】
特定の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡを標的化するサルベージＣＡＲ、ならびにＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される第２の抗原を標的化する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０２６９】
ある特定の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＣＤ１９を標的化するサルベージＣＡＲ、ならびにＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８０、およびＨＬＡ−ＤＲからなる群から選択される第２の抗原を標的化する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０２７０】
一実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡを標的化するサルベージＣＡＲ、およびＣＤ１９を標的化する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０２７１】
別の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＣＤ１９を標的化するサルベージＣＡＲおよびＢＣＭＡを標的化する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。
【０２７２】
サルベージＣＡＲシステムは、１つの標的抗原に対する初期特異性を有するサルベージＣＡＲを同時に選択して、サルベージＣＡＲおよび二量体化可能なサルベージ受容体における多量体化ドメインの架橋因子を媒介される会合によって第２の標的抗原を認識する、柔軟ながん標的システムである。
【０２７３】
様々な実施形態において、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインおよび二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびサイクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびサイクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、またはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそれらのバリアントから選択される対である。
【０２７４】
一実施形態において、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドまたはそのバリアントを含み、二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインは、ＦＲＢポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
【０２７５】
一実施形態において、サルベージＣＡＲの多量体化ドメインは、ＦＲＢポリペプチドまたはそのバリアントを含み、二量体化可能なサルベージ受容体の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰポリペプチドまたはそのバリアントを含む。
【０２７６】
一実施形態において、架橋因子は、ＡＰ２１９６７、シロリムス、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、またはゾタロリムスである。
【０２７７】
特定の一実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０２７８】
一実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０２７９】
特定の一実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０２８０】
一実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子はＡＰ２１９６７である。
【０２８１】
別の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０２８２】
別の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０２８３】
別の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０２８４】
別の実施形態において、サルベージＣＡＲシステムは、ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ、ＦＫＢＰ１２多量体化ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＩＴＡＭまたはＣＤ３ζの一次シグナル伝達ドメインを有するサルベージＣＡＲ、ならびにＢＣＭＡに特異的なｓｃＦｖ、ＦＲＢ多量体化ドメイン、および任意に、アンカードメインを有する二量体化可能なサルベージ受容体を含むＣＡＲ  Ｔ細胞を含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０２８５】
Ｆ．ポリペプチド
サルベージＣＡＲポリペプチド、二量体化可能なサルベージ受容体ポリペプチドおよびそれらの断片、細胞およびそれを含む組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターが挙げられるが、これらに限定されない、様々なポリペプチドが、本明細書において企図される。
【０２８６】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として同義に使用される。ポリペプチドは、合成されても、組換え産生されてもよい。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含み得、かつ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野で知られる天然起源と非天然起源との両方の他の修飾を含み得る。様々な実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質の移動を同時翻訳によってか翻訳後かに指向するシグナル（またはリーダー）配列を、タンパク質のＮ末端に含む。本明細書において企図されるポリペプチドにおいて有用な好適なシグナル配列の例示的な例としては、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技法のいずれかを使用して調製され得る。本明細書において企図されるポリペプチドは、具体的には、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲまたは二量体化可能なサルベージ受容体の１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換を有する配列を包含する。
【０２８７】
本明細書で使用される「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、また細胞の他の成分との会合から、ペプチドもしくはポリペプチド分子をインビトロで単離および／または精製することを指す（すなわち、それは、インビボの物質と著しく会合していない）。同様に、「単離された細胞」とは、インビボ組織または器官から得られ、細胞外基質を実質的に含まない細胞を指す。
【０２８８】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において天然起源のポリペプチドと異なり得る。そのようなバリアントは、天然起源であっても、または、例えば、上記のポリペプチド配列のうちの１つ以上を改変することによって合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチドに、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入を導入することによって、ポリペプチドの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善させることが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、典型的にはバリアントが参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する場合、本明細書において企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
【０２８９】
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片は、天然起源または組換え産生のポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失もしくは置換を有する、単量体であっても多量体であってもよいポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることは理解されよう。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは断片を含む機能性ドメインを含む。
【０２９０】
ポリペプチドはまた、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製、もしくは特定を容易にするため、または固体担体へのポリペプチドの結合を増強するために、インフレームで融合されるか、またはリンカーもしくは他の配列に接合されてもよい。
【０２９１】
上記のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮化、および挿入を含む、様々な方法で変更され得る。このような操作方法は、当該技術分野で一般に既知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける突然変異により調製され得る。突然変異誘発およびヌクレオチド配列の変更方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびこれらの文献中に引用される参考文献を参照されたい。目的とするタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０２９２】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドバリアントは、１つ以上の保存的置換を含む。「保存置換」とは、ペプチド化学分野における当業者がポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化しないことを予想するように、アミノ酸が類似する性質を有する別のアミノ酸に置換されるものである。特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を行いながらも、依然として、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体のポリペプチドをコードする機能性分子を得ることができる。同等の、またはさらには改善されたバリアントポリペプチドを作り出すために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は、例として、例えば表１によるコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させることができる。
【表１】
2019518425.tif 000003
【０２９３】
生物学的活性を消失することなく置換、挿入、または欠失させることのできるアミノ酸残基がどれかを決定する指針は、当該技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアなどを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然起源のアミノ酸は一般に、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は、本技術分野における当業者に既知であり、一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく作製され得る。当業者は、全般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が実質的に生物学的活性を変更しないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
【０２９４】
そのような変更を行う際、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮される場合がある。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与するアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている（参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。各アミノ酸には、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。それらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【０２９５】
ある特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置き換え、依然として同様の生物活性を有するタンパク質をもたらすこと、すなわち、依然として生物学機能的に同等のタンパク質を得ることができることは、当該技術分野で知られている。そのような変更を行う際、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。親水性に基づいて同様のアミノ酸の置換が効果的に行われ得ることも、当該技術分野では理解される。
【０２９６】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を同様の親水性値を有する別のものに置換し、依然として生物学的に同等な、特に免疫学的に同等なタンパク質を得ることができることが理解されている。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【０２９７】
上記に概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズに基づいてもよい。
【０２９８】
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集接合体、および無関係の化学部分との共有結合接合体（例えば、ＰＥＧ化分子）をさらに含む。共有結合バリアントは、当該技術分野で既知であるように、アミノ酸鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見出される基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントには、対立遺伝子バリアント、種バリアント、およびムテインも含まれる。タンパク質の機能活性に影響を及ぼさない領域の短縮化または欠失もバリアントである。
【０２９９】
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において他の箇所に論じられるように、ＩＲＥＳ配列によって分離され得る。別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドが、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現し得る。
【０３００】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態において、融合ポリペプチド、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、サルベージＣＡＲまたは二量体化可能なサルベージ受容体が提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質とは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは通常Ｃ末端とＮ末端で連結しているが、それらは、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端で連結していてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であっても指定の順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存される限り、保存的に改変されたバリアント、多形性バリアント、対立遺伝子、変異体、サブ配列、および種間相同体も含み得る。融合ポリペプチドは、化学合成方法もしくは２つの部分間の化学連結により産生され得るか、または他の標準的な技法を使用して一般的に調製され得る。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で詳解される好適な転写または翻訳の制御エレメントに作動可能に連結される。
【０３０１】
一実施形態において、融合パートナーは、未変性組換えタンパク質よりも高い収率でのタンパク質の発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーが、タンパク質の溶解度を増加させるように、タンパク質を所望の細胞内区画に標的化することを可能にするように、または細胞膜を通した融合タンパク質の輸送を促進するように選択されてもよい。
【０３０２】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでもよい。加えて、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０３０３】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドは当業者に既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位は、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルスＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、因子Ｘａ、およびエンテロキナーゼを含むが、これらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１８）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１９）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号２０）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断はＱとＧとの間またはＱとＳとの間で生じる）が一実施形態において好ましい。
【０３０４】
特定の一実施形態において、自己切断型ペプチドは、ポティウイルスおよびカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス、ならびにブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。
【０３０５】
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａもしくは２Ａ様の部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。例示的な２Ａ部位を表２に示す。
【表２】
2019518425.tif 000004
【０３０６】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、サルベージＣＡＲポリペプチドまたは二量体化可能なサルベージ受容体ポリペプチドを含む。
【０３０７】
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含む。様々な例示的な実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクター、ウイルスベクター、および移入プラスミド、ならびにそれらを含む組成物および細胞を含む。
【０３０８】
特定の実施形態において、ポリペプチドの少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、もしくは２０００個、またはそれ以上、ならびに全ての中間の長さの隣接アミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」が、引用された値の間の任意の長さ、例えば６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することは、容易に理解されるであろう。
【０３０９】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下文に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つ以上のヌクレオチドが付加されているか、もしくは欠失しているか、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドが含まれる。この点において、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持するような、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更を参照ポリヌクレオチドに行うことができることは、当該技術分野で十分に理解されている。
【０３１０】
本明細書で使用される「配列同一性」または例えば「に対して５０％同一の配列」を含む記述は、配列が比較枠にわたってヌクレオチド単位基準またはアミノ酸単位基準で同一である程度を指す。よって、「配列同一性の割合」は、比較枠にわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列で生じる位置数を決定して対応位置数を得ること、比較枠の総位置数（すなわち、枠のサイズ）で対応位置数を除すること、およびその結果を１００で乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算され得る。典型的にはポリペプチドバリアントが参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する場合、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【０３１１】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２であるが、頻繁に１５〜１８、多くの場合、少なくとも２５の単量体単位である。２つのポリヌクレオチドは、各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様である配列を含み得るため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較枠」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所的な領域を特定および比較することにより行われる。「比較枠」は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、ある配列が同じ数の隣接位置の参照配列と比較される、少なくとも６つの隣接位置、一般的には約５０〜約１００、より一般的には約１００〜約１５０の概念的セグメントを指す。比較枠は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較した場合に約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較枠をアライメントするための配列の最適なアライメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって、または検査および選択された様々な方法のいずれかにより生成された最良のアライメント（すなわち、比較枠にわたって最高率の相同性をもたらすもの）によって実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５のユニット１９．３に見出すことができる。
【０３１２】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、ある断片に通常隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または実際に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
【０３１３】
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語は、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。ポリヌクレオチド配列は、５’〜３’配向または３’〜５’配向で注釈が付けられ得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、５’〜３’の鎖は、その配列がプレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と同一であるため［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりにＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除く］、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と呼称される。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写された鎖である相補３’〜５’鎖は、「テンプレート」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、３’〜５’配向で書かれた５’〜３’配列、または５’〜３’配向で書かれた３’〜５’配列を指す。
【０３１４】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係が表されるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３’の相補鎖は、３’Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５’である。後者の配列は、左側に５’端、そして右側に３’端の５’Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  ３’の逆相補として書かれることが多い。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は「部分的」であり、核酸の塩基のうちのいくつかのみが塩基対合規則に従い一致する。または、核酸間で「完全な」もしくは「全」相補性が存在し得る。
【０３１５】
さらに、本明細書に記載されるように、遺伝コードの縮重の結果として、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の未変性遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。とはいえ、コドン利用の差により異なるポリヌクレオチド、例えばヒトおよび／または霊長類のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態において特に想定される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現および／または安定性のために最適化されたコドンである。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の変異の結果として変更されている内在性遺伝子である。
【０３１６】
本明細書で使用される「核酸カセット」という用語は、ＲＮＡ、そして後にタンパク質を発現することのできるベクター内の遺伝子配列を指す。核酸カセットは、目的となる遺伝子を含む。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要に応じてタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換細胞における活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物活性のために適切な区画に転位置され得るように、ベクター内に位置的かつ順次的に配向される。好ましくは、カセットは、その３’末端および５’末端が、ベクターに容易に挿入できるように適合されており、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。
【０３１７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、目的となる少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、発現が所望される発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、目的となるポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の目的となるポリヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、疾患もしくは障害の治療または予防において治療効果をもたらすポリペプチドをコードする。目的となるポリヌクレオチドおよびそれからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能的バリアントおよび断片の両方を含む。特定の実施形態において、機能的バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態において、機能的バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の生物活性を有する。
【０３１８】
一実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、リボザイム、または他の阻害性ＲＮＡを転写するためのテンプレートである。様々な他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、サルベージＣＡＲをコードする目的となるポリヌクレオチド、ならびに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびリボザイムを含むがこれらに限定されない阻害性核酸配列を含むがこれに限定されない、１つ以上の付加的な目的となるポリヌクレオチドを含む。
【０３１９】
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」という用語は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９、Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１、およびＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、同じ数のヌクレオシドを有する第１の鎖および第２の鎖を含むが、第１および第２の鎖は、第１および第２の鎖上の２つの末端ヌクレオシドが相補鎖上の残基と対合しないようにオフセットである。ある特定の事例において、対合しない２つのヌクレオシドは、チミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはその断片が標的遺伝子の下方制御を媒介し得るように、標的遺伝子に対して十分な相同性のある領域を含み、かつヌクレオチド単位で十分な長さであるべきである。したがって、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である領域を含む。ｓｉＲＮＡと標的との間に完全な相補性が存在する必要はないが、その対応関係は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などにより配列特異的サイレンシングを指向できるように、十分である必要がある。標的鎖との相補性すなわち相同性の程度は、アンチセンス鎖で最も重要である。完全な相補性は特にアンチセンス鎖において所望されるが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して、１個以上であるが好ましくは１０個、８個、６個、５個、４個、３個、２個、またはそれ以下のミスマッチを含む。ミスマッチは末端領域において最も許容され、存在する場合、例えば５’末端および／もしくは３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内の末端領域（複数可）にあることが好ましい。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖の特徴を維持するのに十分にアンチセンス鎖と相補的であれば十分である。
【０３２０】
加えて、ｓｉＲＮＡは、改変されても、またはヌクレオシド類似体を含んでもよい。ｓｉＲＮＡの一本鎖領域は、改変されても、またはヌクレオシド類似体を含んでもよく、例えば、ヘアピン構造の不対領域（複数可）、例えば、２つの相補領域を連結する領域は、改変またはヌクレオシド類似体を有し得る。ｓｉＲＮＡの１つ以上の３’末端もしくは５’末端を、例えばエキソヌクレアーゼに対して安定化させるため、またはＲＩＳＣに侵入するようにアンチセンスｓｉＲＮＡ剤を優先するための改変も有用である。改変は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊なビオチン、または、ホスホラミダイトをもたらし、かつ別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成中に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含み得る。ｓｉＲＮＡの各鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド長以下であり得る。この鎖は、好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、２１〜２５ヌクレオチド長であり得る。好ましいｓｉＲＮＡは、１７個、１８個、１９個、２９個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のヌクレオチド対の二本鎖領域、および２〜３ヌクレオチドの１つ以上のオーバーハング、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’オーバーハングを有する。
【０３２１】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、通常はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドのフォールドバック（ｆｏｌｄｂａｃｋ）ＲＮＡ前駆体構造から切除された、２０〜２２ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的との間の相補性の程度により、２つの方法のうちの１つでそれらの標的を負に調節する。第１に、タンパク質コードｍＲＮＡ配列に完全またはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。ｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全相補部位に結合することによって調節作用を及ぼすｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと同様または場合により同一であるＲＩＳＣ複合体を通して、転写後に、見かけ上は翻訳のレベルで、標的遺伝子発現を抑制する。翻訳制御と一致して、この機序を使用するｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限の影響しか受けない。ｍｉＲＮＡは、天然起源のｍｉＲＮＡ、ならびに任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的化し得る人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態において、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現する短いヘアピンＲＮＡ構築物を設計することができる。この設計は、ヘアピン構築物にドローシャプロセシング部位を付加するものであり、ノックダウン効率を大幅に増加させることが示されている（Ｐｕｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。このヘアピンのステムは、２２−ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的に対して完全な相補性を有する）およびヒトｍｉＲ由来の１５−１９−ｎｔのループからなる。ヘアピンの片側または両側にｍｉＲループおよびｍｉＲ３０フランキング配列を付加すると、発現したヘアピンのドローシャおよびダイサープロセシングにおいて、マイクロＲＮＡを含まない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較したときに１０倍超の増加がもたらされる。ドローシャおよびダイサープロセシングの増加は、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産生の増加、および発現したヘアピンの効力の増加につながる。
【０３２２】
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を指す。標的遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかの一部分と同一のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ構築物は、阻害のために好ましい。標的配列に対して挿入、欠失、および一点変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが見出されている。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の一部分との間で９０％超の配列同一性、またはさらには１００％の配列同一性が好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡの二本鎖形成部分の長さは、例えば、ダイサー依存切断により産生されたＲＮＡ産物と相当するサイズの、少なくとも２０、２１、または２２ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基長である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築物は、４００〜８００塩基長である。ｓｈＲＮＡ構築物は、ループ配列およびループサイズの変化に対する耐性が高い。
【０３２３】
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断が可能な触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。例えば、ハンマーヘッド型およびヘアピン型のリボザイムといった、いくつかのサブタイプが説明されている。リボザイムの触媒活性および安定性は、非触媒性塩基でデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換することによって改善させることができる。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域によって決められた位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、２つの塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を標的ｍＲＮＡが有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および産生は、当該技術分野で周知である。
【０３２４】
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムを含む目的となるポリヌクレオチドの好ましい送達方法は、例えば、本明細書の他の箇所に記載される、強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、ならびにヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構成的ｐｏｌ  ＩＩプロモーターといった、１つ以上の調節配列を含む。
【０３２５】
本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で知られている、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片が用いられ得ることが企図され、その全長は、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さにより限定される。
【０３２６】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、利用可能である十分に確立された種々の技術のいずれを使用して、調製、操作、発現、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が適切なベクターに挿入され得る。
【０３２７】
ベクターの例示的な例としては、プラスミド、自己複製配列、および転位因子、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２８】
ベクターのさらなる例示的な例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１誘導人工染色体（ＰＡＣ）など、バクテリオファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２９】
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３０】
発現ベクターの例示的な例としては、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列が、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のために、このような発現ベクターに連結され得る。
【０３３１】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外に維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込むことなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に失われることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、アルファ、ベータ、もしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母からのＤＮＡ複製起源、または「ｏｒｉ」をコードする配列を保有するように操作される。典型的には、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。アルファヘルペスウイルスは、比較的短い生殖周期、可変宿主範囲を有し、感染細胞を効率的に破壊し、主に感覚神経節において潜伏感染を確立する。アルファヘルペスウイルスの例示的な例としては、ＨＳＶ  １、ＨＳＶ  ２、およびＶＺＶが挙げられる。ベータヘルペスウイルスは、長い生殖周期および制限された宿主範囲を有する。感染細胞は、多くの場合、増大する。潜在性は、血液、腎臓、分泌腺、および他の組織の白血球に維持され得る。ベータヘルペスウイルスの例示的な例としては、ＣＭＶ、ＨＨＶ−６、およびＨＨＶ−７が挙げられる。ガンマ−ヘルペスウイルスは、Ｔリンパ球またはＢリンパ球のいずれかに対して特異的であり、潜在性は、多くの場合、リンパ組織組織において示されている。ガンマヘルペスウイルスの例示的な例としては、ＥＢＶおよびＨＨＶ−８が挙げられる。
【０３３２】
発現ベクター内に存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行う、ベクター複製起点の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域である。このようなエレメントは、それらの強度および特異性が異なり得る。用いられるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む任意の数の好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。
【０３３３】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これらに限定されず、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、もしくは異種の制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に連結しているものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターにより指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）により遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
【０３３４】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴ豊富領域、および／またはＮが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域の、転写の開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列を含む。
【０３３５】
「エンハンサー」という用語は、転写を増強することができ、いくつかの事例では別の制御配列に対するそれらの配向に関係なく機能することができる配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／もしくは他のエンハンサー要素と協同的または追加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサー両方の機能を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０３３６】
「作動可能に連結される」という用語は、説明されている成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。一実施形態において、本用語は、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指向する、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指す。
【０３３７】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結された配列の転写を構成的もしくは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、それぞれ、多種多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、または限定された様々な細胞および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであり得る。
【０３３８】
特定の実施形態で使用するのに好適な例示的な遍在性発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３９】
一実施形態において、ベクターは、ＭＮＤプロモーターを含む。
【０３４０】
一実施形態において、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１イントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０３４１】
一実施形態において、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１イントロンを欠いているＥＦ１ａプロモーターを含む。
【０３４２】
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系統特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、細胞型、細胞系統、もしくは組織のサブセットのみまたは発達の特定の段階の間ポリペプチドをコードする特定の核酸を発現するために）、細胞、細胞型、細胞系統、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましくあり得る。
【０３４３】
特定の一実施形態において、Ｔ細胞特異的プロモーターにポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。
【０３４４】
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含むが、これらに限定されない、あらゆる種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、目的となるポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、ポリヌクレオチドを発現させる、または目的となるポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現を増加もしくは減少させる処理または条件に、細胞、組織、生物などを供することによって、発現が制御される。
【０３４５】
誘導性プロモーター／系の例示的な例としては、グルココルチコイドもしくはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理によって誘導可能）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（様々な重金属での処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能な系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４６】
誘導物質剤としては、グルココルチコイド、エストロゲン、ミフェプリストン（ＲＵ４８６）、金属、インターフェロン、小分子、クミン酸塩、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、およびそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４７】
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）を伴う組換え反応に関与する、切除性（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）もしくは組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）のタンパク質、酵素、補助因子、または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態で使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４８】
ポリヌクレオチドは、多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位（複数可）に加えてであることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
【０３４９】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの組換え部位の１つはｌｏｘＰであり、これは、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５０】
ＦＬＰリコンビナーゼの好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５１】
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１により認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列である。φＣ３１  ＳＳＲは、異型部位ａｔｔＢ（長さが３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さが３９ｂｐ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。それぞれ、細菌およびファージゲノム上のファージインテグラーゼの結合部位に名前が由来するａｔｔＢおよびａｔｔＰは両方とも、φＣ３１ホモ二量体により結合される可能性がある不完全な逆方向反復を含入する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産生部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、φＣ３１媒介組換えを進めるために（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、効果的に不活性であり、反応を不可逆にする。挿入を触媒するために、ａｔｔＢ保有ＤＮＡが、ａｔｔＰ部位をゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりも容易にゲノムａｔｔＰ部位内に容易に挿入されることが分かった（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。よって、典型的な戦略は、相同組換えにより、ａｔｔＰ保有「ドッキング部位」を、定義された座位に位置付け、次に、挿入のためにこれをａｔｔＢ保有入来配列と組み合わせる。
【０３５２】
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野で既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ならびにウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇ、ならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）およびＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８（１１）：６１７８−９０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、Ｆｒｉｅｎｄマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。
【０３５３】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドに使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０３５４】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスコザック配列を有し、かつ所望のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、リボソームの小さいサブ単位へのｍＲＮＡの初期結合を大幅に容易にし、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号４３）であり、式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０３５５】
効率的な終止および異種核酸転写物のポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’端へのポリＡ尾部の付加により、ｍＲＮＡの安定性を促進し、よって、転写効率の増加に寄与し得る。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、迅速に分解されるため、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。ベクターにおいて使用され得るポリＡシグナルの例示的な例としては、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列が挙げられる。
【０３５６】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性および／または未制御の増殖のリスクを低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を用いる。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９もしくはカスパーゼ−８、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量体化の特定の化学誘導物資（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
【０３５７】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に、インビボで負の選択を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。「負の選択」とは、注入された細胞が、個々のインビボ条件の変化の結果として排除され得ることを意味する。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対して感受性を付与する遺伝子の挿入により生じ得る。負の選択可能な遺伝子は当該技術分野で知られており、とりわけ、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １１：２２３，１９７７）、細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌性シトシンデアミナーゼを含む（Ｍｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））。
【０３５８】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、負の選択可能な表現型の細胞のインビトロでの選択を可能にする正のマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。正の選択マーカーは、宿主細胞に導入されると、その遺伝子を有する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種類の遺伝子は当該技術分野で知られており、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。
【０３５９】
一実施形態において、正の選択可能なマーカーおよび負の選択可能エレメントは、負の選択可能エレメントの損失が正の選択可能なマーカーの損失も必然的に伴うように連結されている。特定の実施形態において、正の選択可能なマーカーおよび負の選択可能なマーカーは、一方の損失が他方の損失に義務的につながるように融合されている。上述される所望の正負両方の選択の特徴を付与するポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。優性の正の選択可能なマーカーと負の選択可能なマーカーとの融合に由来する二機能性選択可能な融合遺伝子の使用を説明する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
【０３６０】
好ましい正の選択可能なマーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される例示的な二機能性選択可能融合遺伝子としては、正の選択可能なマーカーは、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、負の選択可能なマーカーは、シトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子、または選択可能マーカーに由来する。
【０３６１】
特定の実施形態において、１つ以上のサルベージＣＡＲ、二量体化可能なサルベージ受容体、治療ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入され得る。特定の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドの送達は、同じ方法もしくは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
【０３６２】
「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移入または輸送することのできる核酸分子を指すように使用される。移入された核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば、挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を指向する配列を含んでもよいし、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。
【０３６３】
非ウイルスベクターの例示的な例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６４】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸抱合体、裸ＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥデキストラン介在転移、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６５】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なポリヌクレオチド送達システムの例示的な例としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供されるものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識のために好適なカチオン性および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体標的バクテリア由来の生命体ではない（ｎｏｎ−ｌｉｖｉｎｇ）ナノ細胞ベースの送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【０３６６】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、個々の患者に、典型的には、以下に記載されるように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用による投与によってインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植される細胞（例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など）または万能ドナー造血幹細胞などのエクスビボで細胞に送達され、続いて、細胞の患者に再移植され得る。
【０３６７】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸ＤＮＡが、投与され得る。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。かかる核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知であり、１つを超える経路が、特定の組成物を投与するために使用することができるが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時かつより効果的な反応を提供することができる。
【０３６８】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態で用いるのに好適なウイルスベクターシステムの例示的な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペス、アデノウイルス、遺伝子導入のためのワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６９】
様々な実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入ことによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
【０３７０】
ＡＡＶは、主なエピソーム、非エンベロープウイルスである小規模（約２６ｎｍ）の複製欠損である。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最小で、トランス遺伝子およびその調節配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されるカプシド配列を含む。
【０３７１】
いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列が、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列が、異なるＡＡＶ血清型から単離される、キメラｒＡＡＶが使用される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のうちのいずれか１つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列と、ＡＡＶ６に由来するカプシド配列とを含む。
【０３７２】
いくつかの実施形態において、操作および選択方法は、目的となる細胞を形質導入する可能性が高いＡＡＶカプシドに適用され得る。
【０３７３】
ｒＡＡＶベクターの構築、その生成、および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、および同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７４】
様々な実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスで細胞を形質導入ことによって、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
【０３７５】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡのコピーに逆転写し、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７６】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作動性配列要素）が好ましい。
【０３７７】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、１つ以上のＬＴＲ、ならびにアクセサリーエレメント：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、輸出エレメント、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意に、本明細書において他の箇所に論じられるように、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体エレメント、選択可能なメーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
【０３７８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、組み込みまたは非組み込みまたは組み込み欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノム内に組み込む能力を欠くインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み能力のないウイルスベクターは、ＷＯ２００６／０１０８３４に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７９】
インテグラーゼ活性を減少させるのに好適なＨＩＶ−１遺伝子における例示的な変異としては、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８０】
「長い末端反復（ＬＴＲ）」という用語は、それらの天然の配列関係において、直接反復であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含有するレトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指す。
【０３８１】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、レトロウイルス、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクトおよび中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）が配列に含まれる核酸を指す。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。
【０３８２】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシドまたは粒子内に挿入するために必要なレトロウイルスゲノム内に位置するプサイ［Ψ］配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０３８３】
「輸出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ輸出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８４】
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクター内に組み込むことにより増加する。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同類のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）など、種々の転写後調節エレメントが、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができる。
【０３８５】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲを改変する結果としていくつかの安全性の強化をもたらす。「自己不活性化型」（ＳＩＮ）ベクターとは、Ｕ３領域として知られている右（３’）ＬＴＲエンハンサープロモーター領域が１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように（例えば欠失または置換によって）改変されている、複製欠損ベクターを指す。５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置き換えてウイルス粒子の産生中のウイルスゲノムの転写を推進することによって、さらなる安全性の強化がもたらされる。使用することのできる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。
【０３８６】
本明細書で使用される「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特性を保有する別のウイルスのもので置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が通常ウイルスをＣＤ４＋提示細胞に標的化するため、ＨＩＶがより広範囲の細胞を感染させることを可能にする、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイピングされ得る。
【０３８７】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って生成される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０３８８】
本明細書において企図されるある特定の具体的な実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全てが、レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルスの多くの異なる配列源を使用することまたは組み合わせることができ、レンチウイルス配列のうちある特定のものにおいて、本明細書に記載の機能を行う移入ベクターの能力を損なうことなく多数の置換および変更が適応され得ることを理解されたい。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当該技術分野で既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、それらの多くが、本明細書において企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するように適合され得る。
【０３８９】
様々な実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む、アデノウイルスで細胞を形質導入ことによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０３９０】
アデノウイルス系ベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、相対的に簡単な系で大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子を、Ａｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子に置き換え、その後、複製欠損ベクターが、トランスで欠失遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中で増殖されるように、操作される。Ａｄベクターは、非分裂中の分化細胞、例えば肝臓、腎臓、および筋肉中に見出されるものを含む多数の型の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、大きな輸送能力を有する。
【０３９１】
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成および伝播は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換された２９３と指定された特有のヘルパー細胞株を利用し得、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域がアデノウイルスゲノムに不必要である（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）ため、２９３細胞の支援を受ける現行のアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域、Ｄ３領域のいずれか、または両方の領域に外来ＤＮＡを保持する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子の発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）で使用されている。組み換えアデノウイルスを異なる組織に投与する研究には、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳への定位接種（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験中のＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化に対するポリヌクレオチド療法を含んだ（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０３９２】
様々な実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、免疫エフェクター細胞を、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で形質導入することによって、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０３９３】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する包まれた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子に欠けている。一実施形態において、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、複製欠損である。最も複製欠損であるＨＳＶベクターは、複製を妨げるために、１つ以上の最初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期のＤＮＡ発現、および２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡインサートを収容するその大型ウイルスＤＮＡゲノムをもたらすことができる、潜伏段階へ入る能力である。ＨＳＶ系ベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、同第ＷＯ９６／０４３９４号、同第ＷＯ９８／１５６３７号、および同第ＷＯ９９／０６５８３号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３９４】
Ｈ．遺伝子改変細胞
様々な実施形態において、がんの治療において使用するための、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体を発現するように遺伝子改変された細胞が提供される。細胞は、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体を発現するように非遺伝子改変され得るか、または特定の好ましい実施形態において、細胞は、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体を発現するように遺伝子改変され得る。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝子材料にＤＮＡまたはＲＮＡの形態における追加の遺伝子材料を付加することを指す。特定の実施形態において、「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、および「再指向された細胞」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する、またはサルベージＣＡＲポリペプチドおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体ポリペプチドを発現する目的で、細胞内の全遺伝子材料にＤＮＡまたはＲＮＡの形態における追加の遺伝子材料を導入することを指す。
【０３９５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲは、目的となる標的抗原にそれらの特異性を再指向させるために、免疫エフェクター細胞に導入され、発現する。特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲは、目的となる一次標的抗原にそれらの特異性を再指向させるために、免疫エフェクター細胞に導入され、発現し、二量体化可能なサルベージ受容体は、架橋因子の存在下で目的となる二次標的抗原にそれらの特異性を再指向させるために、導入され、誘導的に発現される。
【０３９６】
「免疫エフェクター細胞」とは、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。免疫エフェクター細胞は、自家性／自律性（「自己」）であっても、非自家性（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であってもよい。
【０３９７】
本明細書で使用される「自家性」とは、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、比較する際に細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較する際に細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、比較する際に細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は自家である。
【０３９８】
本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体と共に使用される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むよう意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであってもよい。特定の実施形態で使用するのに好適な他の例示的なＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む。
【０３９９】
当業者には理解されるように、他の細胞を免疫エフェクター細胞として本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体と共に使用してもよい。特に、免疫エフェクター細胞はまた、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、およびマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞にはエフェクター細胞の前駆細胞も含まれ、そのような前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するよう誘導され得る。したがって、特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、臍帯血、骨髄、または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆細胞を含み、これは、対象に投与されると成熟免疫エフェクター細胞に分化するか、または成熟免疫エフェクター細胞に分化するようにインビトロで誘導され得る。
【０４００】
本明細書で使用される場合、特異的サルベージＣＡＲを含むように遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、「抗原特異的な再指向された免疫エフェクター細胞」と称され得る。
【０４０１】
本明細書で使用される「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上でＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される「ＣＤ３４」は、多くの場合、細胞−細胞接着因子として作用し、かつリンパ節へのＴ細胞進入に関与する、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団には、患者に投与されると分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、および単球／マクロファージ系列の細胞を含む全ての造血系に寄与する、造血幹細胞（ＨＳＣ）が含まれる。
【０４０２】
本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体を発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法が、特定の実施形態において提供される。一実施形態において、本方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書において企図される１つ以上のサルベージＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクションまたは形質導入を行うことを含む。一実施形態において、本方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書において企図される１つ以上のサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体を発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクションまたは形質導入を行うことを含む。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、インビトロで個体から単離され、さらなる操作を行うことなく遺伝子改変される。このような細胞は次に、個体に直接再投与され得る。さらなる実施形態において、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前に、まずインビトロで増殖するよう活性化され、刺激される。この点において、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前および／または後に培養されてもよい。
【０４０３】
特定の実施形態において、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のインビトロでの操作または遺伝子改変の前に、細胞源が対象から得られる。特定の実施形態において、改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０４０４】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むが、これらに限定されない、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当業者に知られる任意の数の技術、例えば遠心沈降、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などを使用して、対象から収集された血液単位から得ることができる。
【０４０５】
他の実施形態において、単離または精製されたＴ細胞集団が、使用される。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球との両方が、活性化、増幅、および／または遺伝子改変の前または後のいずれかに、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、およびエフェクターＴ細胞の亜集団に分別され得る。
【０４０６】
マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、およびＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法によりさらに単離され得る。一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、またはＣＤ３８もしくはＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定のサブ集団は、正または負の選択技法によりさらに単離され得る。様々な実施形態において、製造されたＴ細胞組成物は、マーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しない、または実質的に発現しない。
【０４０７】
一実施形態において、単離または精製されたＴ細胞集団は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない、マーカーのうちの１つ以上発現する。
【０４０８】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、サルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体を発現するように改変される前に、まず個体から単離され、インビトロで増殖するよう活性化され、刺激される。
【０４０９】
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は、多くの場合、１つ以上の刺激、活性化、および／または拡大させる。Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、および同第６，８６７，０４１号（それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して、活性化および増幅させ得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、活性化し、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体をコードするベクターまたはｍＲＮＡの導入前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、または約２４時間増幅させる。
【０４１０】
一実施形態において、Ｔ細胞は、改変されると同時に活性化される。
【０４１１】
様々な実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法は、Ｔ細胞を含む細胞の集団を活性化させること、およびＴ細胞の集団を増幅させることを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって、一次刺激シグナルを提供すること、およびアクセサリー分子、例えばＣＤ２８によって二次共刺激シグナルを提供することによって達成され得る。
【０４１２】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、好適なＣＤ３結合剤、例えばＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体とＴ細胞を接触させることによって刺激され得る。ＣＤ３抗体の例示的な例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、および６４．１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１３】
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘導は、第２の共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態において、ＣＤ２８結合剤は、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。ＣＤ２８結合剤の例示的な例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）などのタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー；ＣＤ２８分子を架橋することができる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、およびＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４１４】
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、同じ表面に結合する。
【０４１５】
ある特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面上でのその発現に好適な形態における結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクトもしくは形質導入することによって、あるいは結合剤を細胞表面に結合させることによって達成することができる。
【０４１６】
別の実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、抗原提示細胞で提示される。
【０４１７】
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって刺激を提供する分子、および共刺激分子は、別々の表面上に提供される。
【０４１８】
ある特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの１つは、可溶性であり（溶液で提供され）、他の薬剤（複数可）は、１つ以上の表面上に提供される。
【０４１９】
特定の実施形態において、刺激シグナルおよび共刺激シグナルを提供する結合剤は、両方とも可溶形態で提供される（溶液で提供される）。
【０４２０】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を作製するための方法は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体でＴ細胞を活性化させることを含む。
【０４２１】
一実施形態において、本明細書において企図される方法によって活性化されたＴ細胞の増幅は、Ｔ細胞を含む細胞の集団を、数時間（約３時間）から約７日間〜約２８日間、またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養することをさらに含む。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、約２１日間培養される。別の実施形態において、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日間以上になり得るように、数サイクルの刺激／活性化／増幅が望ましい場合もある。
【０４２２】
特定の実施形態において、Ｔ細胞培養に適切な条件としては、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉａ  １６４０もしくはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｌｏｎｚａ））、ならびに、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または当業者に既知の細胞の増殖に好適な任意の他の添加剤を含むが、これらに限定されない、増殖および生存能に必要な１つ以上の要素が挙げられる。
【０４２３】
細胞培養培地のさらなる例示的な例としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加され、血清不含であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または定義されたホルモン一式、ならびに／またはＴ細胞の増殖および増幅に十分な量のサイトカイン（複数可）が補充された、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５、およびＸ−Ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４２４】
抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験用培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖の支持に必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）に維持される。
【０４２５】
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、概してビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤および共刺激剤と接触させられる。
【０４２６】
他の実施形態において、種々の共刺激分子およびサイトカインの安定した発現および分泌を指向するようにＫ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、およびＣ１Ｒ細胞を操作することにより作製された人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）。特定の実施形態において、Ｋ３２またはＵ３２  ａＡＰＣは、ＡＡＰＣ細胞表面上に１つ以上の抗体ベースの刺激分子の表示を指向するために使用される。Ｔ細胞集団は、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、および／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含むが、これらに限定されない、様々な共刺激分子を発現するａＡＰＣにより増幅され得る。最後に、ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増幅し、ＣＤ８  Ｔ細胞上のＣＤ２８発現を維持するために、効率的なプラットホームを提供する。ＷＯ０３／０５７１７１およびＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２７】
特定の一実施形態において、サルベージＣＡＲおよび／または二量体化可能なサルベージ受容体をコードするポリヌクレオチドを、Ｔ細胞の集団に導入される。ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクション、トランスフェクション、リポフェクション、熱ショック、電気穿孔、形質導入、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介移動などによってＴ細胞に導入され得る。
【０４２８】
様々な実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、二量体化可能なサルベージ受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む核酸を導入することによって、さらに遺伝子改変される。
【０４２９】
好ましい一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３０】
免疫エフェクター細胞またはＣＤ３４＋細胞にポリヌクレオチドを導入するのに好適なウイルスベクターシステムの例示的な例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペス、アデノウイルス、遺伝子導入のためのワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４３１】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＡＡＶ形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３２】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、レトロウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３３】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、レンチウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３４】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、アデノウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３５】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、単純ヘルペスウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ワクシニアウイルス形質導入によりＴ細胞に導入される。
【０４３７】
様々な実施形態において、本明細書において企図される遺伝子改変された細胞は、１つ以上の改変されたＴＣＲα対立遺伝子をさらに含む。特定の実施形態において、ＴＣＲα遺伝子座で二本鎖切断を作製するように設計された１つ以上の操作されたヌクレアーゼを、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞に導入される。特定の実施形態において、ＴＣＲα遺伝子座で二本鎖切断を作製するように設計された１つ以上の操作されたヌクレアーゼを、二量体化可能なサルベージ受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む核酸を含むサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞に導入される。
【０４３８】
特定の実施形態において、遺伝子改変されたＴ細胞を生成する方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、および／もしくはＩＬ−１５などの適切なサイトカイン、ならびに／またはＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤を含む細胞培地中で、細胞を、刺激剤および共刺激剤、例えば、可溶性抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体と接触させることを含む。
【０４３９】
本明細書で使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋに結合し、その少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、およびクラス３のＰＩ３Ｋの３つのクラスに分けることができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブ単位（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ）のうちの１つ、ならびに調節サブ単位の２つのファミリーのうちの１つからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を標的化する。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のアイソフォームに選択性（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）を示すであろう。別の態様では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はアイソフォーム選択性を提示せず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされるであろう。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインとの結合に関してＡＴＰと競合するであろう。
【０４４０】
特定の実施形態で使用するのに好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例示的な例としては、ＢＫＭ１２０（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、およびＰＸ−８６６（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４１】
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例示的な例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、およびＩＰＩ−１４５が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４２】
汎ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらに例示的な例としては、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、およびＧＤＣ−０９４１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４３】
好ましい実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
【０４４４】
Ｉ．組成物および製剤
本明細書において企図される組成物は、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、遺伝子改変免疫エフェクター細胞などを含み得る。組成物は、薬学的組成物を含むが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、あるいは１つ以上の他の治療様式と組み合わせてのいずれかで細胞もしくは動物に投与するための、薬学的に許容される溶液または生理学的に許容される溶液において製剤化される組成物を指す。また、所望される場合、組成物が、例えばサイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性剤といった他の薬剤と組み合わせて投与されてもよいことが理解されよう。本組成物に同様に含まれ得る他の構成成分に実質的に制限はないが、但し、追加の薬剤が、本組成物が意図される療法を送達する能力に悪影響を及ぼさないものとする。
【０４４５】
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
【０４４６】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」としては、ヒトまたは飼育動物に使用するのに許容可能なものとして米国食品医薬品局によって承認されている任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な薬学的に許容される担体としては、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバター、ワックス、動物脂および植物脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；落花生油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液、ならびに薬学的製剤において採用される任意の他の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４７】
特定の実施形態において、組成物は、本明細書において企図される、ある量のサルベージＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を含む。他の特定の実施形態において、組成物は、ある量の二量体化可能なサルベージ受容体を含む。他の特定の実施形態において、組成物は、ある量の架橋因子を含む。他の特定の実施形態において、組成物は、架橋因子に結合したある量の二量体化可能なサルベージ受容体を含む。
【０４４８】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、臨床結果を含む、有益なもしくは所望の予防または治療結果を達成するために、治療細胞、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体、または架橋因子などの「有効な量」または「有効量」を指す。
【０４４９】
「予防的に有効な量」とは、所望の予防結果を達成するために有効な、治療細胞、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体、または架橋因子などの量を指す。必ずしもそうではないが典型的には、予防的用量は疾患の発生前または初期段階で対象に使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量未満である。
【０４５０】
治療細胞、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体、または架橋因子などの「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する組成物の能力などの要因によって異なり得る。治療上有効量はまた、治療細胞、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体、または架橋因子などのいかなる毒性もしくは有害な作用をも治療に有益な効果が上回るものである。「治療上有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を治療するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与されるべき組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染もしくは転移の範囲、および状態の個々の差を考慮して医師により決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む薬学的組成物は、１０２〜１０１０個の細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重の投薬量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得ると概説することができる。細胞数は、その中に含まれる細胞の型のように、組成物が意図される最終用途に依存する。本明細書に提供される用途において、細胞は、概して１リットル以下の容量であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であってもよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には１０６個の細胞／ｍｌ超であり、概して１０７個の細胞／ｍｌ超、概して１０８個の細胞／ｍｌまたはそれ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、累積的に１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個の細胞と等しいかまたはそれを超える複数回の注入に分配され得る。いくつかの実施形態において、特に、注入された細胞の全てが特定の標的抗原に再指向されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲内の低い細胞数が投与され得る。サルベージＣＡＲを発現するＴ細胞を含むＴ細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受ける患者に対して同種、同系、異種、または自家であり得る。所望される場合、治療は、免疫応答の誘導を増強するために、本明細書に記載されるマイトジェン（例えばＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、および／もしくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、およびＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含んでもよい。
【０４５１】
概して、本明細書に記載されるように活性化および増幅された細胞を含む組成物は、免疫不全の個体において生じる疾患の治療および予防に用いられ得る。具体的には、本明細書において企図される組成物は、がんの治療に使用される。特定の実施形態において、サルベージＣＡＲ改変Ｔ細胞、二量体化可能なサルベージ受容体、および架橋因子は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、および／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた薬学的組成物としてのいずれかで投与されてもよい。
【０４５２】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を含む。
【０４５３】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、ある量の二量体化可能なサルベージ受容体を含む。
【０４５４】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、ある量の二量体化可能なサルベージ受容体を含む。
【０４５５】
Ｔ細胞などのサルベージＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団、二量体化可能なサルベージ受容体、または架橋因子を含む薬学的組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。特定の実施形態において、組成物は、好ましくは、経鼻、経口、腸内、または非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与のために製剤化される。
【０４５６】
液体薬学的組成物は、それらが溶液であるか、懸濁液であるか、または他の同様の形態であるかにかかわらず、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水などの無菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒として機能し得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤のうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックで作製された多用量バイアルに封入され得る。注射可能な薬学的組成物は、好ましくは減菌である。
【０４５７】
一実施形態において、本明細書において企図されるＴ細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地において製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、血清不含培地である。
【０４５８】
血清不含培地は、簡素かつより明確に定義された組成物、低い程度の混入物、感染因子源の可能性の排除、およびコストの低下を含め、血清含有培地に比べていくつかの利点を有する。様々な実施形態において、血清不含培地は動物質不含であり、任意にタンパク質不含であってもよい。任意に、培地は、生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含んでもよい。「動物質不含」培地とは、成分が非動物源に由来する培地を指す。動物質不含培地では、組換えタンパク質が天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質不含」培地は、タンパク質を実質的に含まないものと定義される。
【０４５９】
特定の組成物に使用される血清不含培地の例示的な例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ  １０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６０】
好ましい一実施形態において、本明細書において企図されるＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含む溶液において製剤化される。
【０４６１】
別の好ましい実施形態において、本明細書において企図されるＴ細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液において製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、解凍後の高い細胞生存成績を維持することができる。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例示的な例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６２】
より好ましい実施形態において、本明細書において企図されるＴ細胞を含む組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  ＡとＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０とを含む溶液において製剤化される。
【０４６３】
特定の一実施形態において、組成物は、有効量のサルベージＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を、単独で、または１つ以上の治療剤との組み合わせで含む。したがって、サルベージＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で、または二量体化可能なサルベージ受容体、架橋因子、もしくは他の既知のがん治療、例えば、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法などと組み合わせて投与されてもよい。組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。このような治療薬は、特定のがんなど、本明細書に記載される特定の疾患状態の標準的な治療として、当該技術分野において認められていてもよい。企図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性剤および補助剤が挙げられる。
【０４６４】
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるサルベージＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与されてもよい。化学療法剤の例示的な例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミンレジューム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ  ｒｅｓｕｍｅ）を含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシロマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌア���ン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義には、がんに対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン薬など；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン薬；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【０４６５】
種々の他の治療剤が、本明細書に記載の組成物と併せて使用され得る。一実施形態において、サルベージＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または薬物は、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）（アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬物、シクロホスファミド、およびミコフェノレートを含む）を含むが、これらに限定されない。
【０４６６】
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）およびＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害剤、ならびにシアリレート（ｓｉａｌｙｌａｔｅ）からなる群から選択される。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）塩酸塩のトラマドールからなる群から選択される。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選択される。例示的な生物学的応答修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に対して指向される分子、ＴＮＦ拮抗薬（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤、ならびに接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答修飾物質は、モノクローナル抗体ならびに分子の組換え形態を含む。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシリラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）、およびミノサイクリンが挙げられる。
【０４６７】
本明細書において企図されるサルベージＣＡＲ改変Ｔ細胞との組み合わせに好適な治療抗体の例示的な例としては、単独で、または二量体化可能なサルベージ受容体の一部としてのいずれかの、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドゥリゴツマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、およびウブリツキシマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６８】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書で使用される場合、「サイトカイン」とは、細胞間の介在物質として別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の一般的な用語を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータ、および−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養物からのタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０４６９】
Ｊ．治療方法
本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、がんの予防、治療、および寛解に使用するための、またはがんに関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、もしくは寛解するための、改善された養子免疫療法の方法を提供する。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、再発性または難治性がんの予防、治療、および寛解に使用するための改善された養子免疫療法の方法を提供する。
【０４７０】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、再発性または難治性がん細胞における細胞傷害性を増加させるのに使用するための、または再発性または難治性がん細胞の数を減少させるのに使用するための、改善された養子免疫療法の方法を提供する。
【０４７１】
特定の実施形態において、一次Ｔ細胞の特異性は、がん細胞上に発現する第１の抗原に指向されるサルベージＣＡＲで一次Ｔ細胞を遺伝子改変することによって、腫瘍またはがん細胞に再指向される。一実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、それを必要とするレシピエントに注入される。注入された細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を殺滅することができる。抗体療法とは異なり、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、インビボで複製することができ、そのため、さらに持続したがん療法をもたらし得る長期持続性に貢献する。しかしながら、寛解またはがんの退縮が不完全であり、がんが再発し、治療が効かなくなる場合、二量体化可能なサルベージ受容体は、再発性または難治性がん細胞上に発現する第２の抗原に対してサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞療法を再標的化するために架橋因子の存在下で提供される。
【０４７２】
一実施形態において、サルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、がんがあると診断された対象に投与される。再発性または難治性がん細胞が成長した時点で、対象に、再発性または難治性細胞にＣＡＲ  Ｔ細胞療法を再開始するために、二量体化可能なサルベージ受容体および架橋因子を投与する。二次腫瘍も再発する場合、異なるサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、異なる二量体化可能なサルベージ受容体のいずれか、またはその両方が、対象に提供され得る。このサイクルは、対象におけるがんを根絶するために必要に応じて何度も繰り返され得る。
【０４７３】
一実施形態において、誘導性二量体化可能なサルベージ受容体を含むサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、がんがあると診断された対象に投与される。再発性または難治性がん細胞が成長した時点で、対象に、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発する薬剤を投与し、再発性または難治性細胞にＣＡＲ  Ｔ細胞療法を再開始するために、架橋因子も投与する。二次腫瘍も再発する場合、異なるサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞、異なる二量体化可能なサルベージ受容体のいずれか、またはその両方が、対象に提供され得る。異なるサルベージ受容体は、同じサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞中の異なる誘導性プロモーターの制御下であり得るか、または二量体化可能なサルベージ受容体ポリペプチドの直接投与によって提供され得る。このサイクルは、対象におけるがんを根絶するために必要に応じて何度も繰り返され得る。
【０４７４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
【０４７５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維組織腫（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭癌、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃の癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍のものが挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
【０４７６】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が挙げられるが、これらに限定されない、固形腫瘍またはがんの治療で使用される。
【０４７７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、膵臓、膀胱、および肺が挙げられるが、これらに限定されない、様々ながんの治療で使用される。
【０４７８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、液性がんまたは血液がんの治療に使用される。
【０４７９】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療で使用される。
【０４８０】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるサルベージＣＡＲシステムは、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性，前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない、液性がんの治療で使用される。
【０４８１】
特定の実施形態において、方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、治療上有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することと、続いて、二量体化可能なサルベージ受容体および架橋因子を対象に投与することと、を含む。
【０４８２】
特定の実施形態において、方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、治療上有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することと、続いて、架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を対象に投与することと、を含む。
【０４８３】
特定の実施形態において、方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、治療上有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することと、続いて、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発することと、架橋因子を対象に投与することと、を含む。
【０４８４】
ある特定の実施形態において、細胞は、がんを発症するリスクがある患者の治療で使用される。それ故に、特定の実施形態は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、治療上有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することと、続いて、二量体化可能なサルベージ受容体および架橋因子を対象に投与することと、を含む、がんの少なくとも１つの症状の治療または予防または寛解を含む。
【０４８５】
ある特定の実施形態において、細胞は、がんを発症するリスクがある患者の治療で使用される。それ故に、特定の実施形態は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、治療上有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することと、続いて、架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を対象に投与することと、を含む、がんの少なくとも１つの症状の治療または予防または寛解を含む。
【０４８６】
特定の実施形態において、がんを発症するリスクがある患者を治療する方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、治療上有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、それを必要とする患者に投与することと、続いて、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発することと、架橋因子を対象に投与することと、を含む。
【０４８７】
一実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を投与することと、続いて、二量体化可能なサルベージ受容体および架橋因子を対象に投与することと、を含む。
【０４８８】
一実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を投与することと、続いて、架橋因子に結合した二量体化可能なサルベージ受容体を対象に投与することと、を含む。
【０４８９】
一実施形態において、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法は、再発性または難治性がん細胞が成長したときに、有効量のサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞をそれを必要とする患者に投与することと、続いて、二量体化可能なサルベージ受容体の発現を誘発することと、架橋因子を対象に投与することと、を含む。
【０４９０】
適切な投薬量は臨床治験によって決定され得るが、投与の分量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるであろう。
【０４９１】
一実施形態において、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも０．５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも０．５×１０８個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも０．５×１０９個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、または少なくとも１×１０１０個の細胞である。
【０４９２】
特定の実施形態において、約１×１０７個のＴ細胞〜約１×１０９個のＴ細胞、約２×１０７個のＴ細胞〜約０．９×１０９個のＴ細胞、約３×１０７個のＴ細胞〜約０．８×１０９個のＴ細胞、約４×１０７個のＴ細胞〜約０．７×１０９個のＴ細胞、約５×１０７個のＴ細胞〜約０．６×１０９個のＴ細胞、または約５×１０７個のＴ細胞〜約０．５×１０９個のＴ細胞が対象に投与される。
【０４９３】
一実施形態において、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０４個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０５個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０６個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０６個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０７個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０７個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも１×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも２×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも３×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも４×１０８個の細胞／ｋｇ体重、少なくとも５×１０８個の細胞／ｋｇ体重、または少なくとも１×１０９個の細胞／ｋｇ体重である。
【０４９４】
特定の実施形態において、約１×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約１×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約２×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．９×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約３×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．８×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約４×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．７×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、約５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．６×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重、または約５×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重〜約０．５×１０８個のＴ細胞／ｋｇ体重が対象に投与される。
【０４９５】
所望の療法をもたらすために、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が必要とされる場合があることは、当業者であれば認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回もしくはそれ以上投与され得る。
【０４９６】
ある特定の実施形態において、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、次いで再採血し（またはアフェレーシスを行い）、そこからＴ細胞を活性化させ、これらの活性化および増幅したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われてもよい。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃもしくはそれ以上の採血から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数回採血／複数回再注入プロトコルの使用は、ある特定のＴ細胞集団を選出することに役立ち得る。
【０４９７】
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、または移植を含む、任意の簡便な様式で行われ得る。好ましい一実施形態において、組成物は、経鼻、経口、腸内、または非経口投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、腸内および局所投与以外、通常、注射による投与モードを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、ならびに胸骨内注射および注入を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書において企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射により対象に投与される。
【０４９８】
一実施形態において、それを必要とする対象は、対象のがんに対する細胞免疫応答を増加させるために有効量の組成物を投与される。免疫応答は、感染細胞、調節性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞応答を死滅させることができる細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される細胞免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化することができるヘルパーＴ細胞によって主に媒介され、よって抗体産生につながる体液性免疫応答も誘発され得る。組成物により誘導される免疫応答の種類を分析するには種々の技術を使用することができ、これらは、当該技術分野において、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．に詳しく記載されている。
【０４９９】
一実施形態において、がんと診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を取り出すことと、免疫エフェクター細胞を改変し、改変された免疫エフェクター細胞の集団を生成することと、改変された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０５００】
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法は、エクスビボの改変された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の前駆細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含む。１つの方法は、エクスビボで末梢血Ｔ細胞に改変し、改変された細胞を対象に戻すことを含む。
【０５０１】
本明細書に引用される公開文献、特許出願、および交付済み特許は全て、個々の公開文献、特許出願、または交付済み特許それぞれが参照により組み込まれるよう明確かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０５０２】
前述の実施形態は、理解を明確にするために図示および例によりいくらか詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示の観点から、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および改変がそれに対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、限定ではなく、単なる例示として提供されるものである。当業者であれば、変更または改変しても本質的に同様の結果を得ることができる必須ではない種々のパラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０５０３】
実施例１
サルベージＣＡＲシステム
機能的なサルベージＣＡＲシステムは、二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体および架橋因子ＡＰ２１９６７を用いて、ＣＤ１９陽性、ＢＣＭＡ陰性Ｎａｌｍ−６細胞株に抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲを再指向した。
【０５０４】
対照抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む（図１、左パネル、配列番号１）。抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、Ｇ４Ｓリンカー配列、ＦＲＢバリアント（Ｔ８２Ｌ）、ＣＤ８α由来のヒンジ領域、および膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む（図１、中央パネル、配列番号２）。二量体化可能なサルベージ受容体は、ＩｇＫ由来のシグナルペプチド、ＦＬＡＧタグ、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、およびＦＫＢＰ１２ドメインを含む（配列番号３）。この実験で使用されるポリペプチドは、Ｔ２Ａ．１配列およびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質も含んだポリタンパク質であった（配列番号４）。全ての構築物を、レンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスは、構築されたプロトコルを用いて調製した。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０５０５】
二量体化ドメインの存在は、ＣＡＲ機能に影響しない。
ヒトＰＢＭＣ（１×１０６個の細胞／ｍＬ）を、可溶性抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（５０ｎｇ／ｍＬ）で０日目に活性化した。２４時間のインキュベーション後、１×１０６個の細胞を、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入した細胞を、３日目に、洗浄し、０．３×１０６個の細胞／ｍＬの成長培地で再懸濁した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、一日おきに変化したＩＬ−２（２５０ＩＵ／ｍＬ）を含有する培地で７日間培養した。
【０５０６】
抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害能は、ＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅ、エフェクター細胞）を、Ｅ：Ｔ比を５：１でＫ５６２−ＢＣＭＡ陽性細胞（ＧＦＰ陽性）（Ｔ、標的細胞）とＫ５６２−ＢＣＭＡ陰性細胞（ＢＦＰ陽性）との５０：５０の混合物と１０日目に２４時間共培養することによって分析した。細胞を、２０ｎＭのＡＰ２１９６７（非免疫抑制ラパマイシン類似体）を用いて共培養したか、またはそれを用いずに培養した。Ｋ５６２−ＢＣＭＡ陽性細胞対Ｋ５６２−ＢＣＭＡ陰性細胞の比は、ＣＡＲ  Ｔ細胞傷害性の直接読み出しである。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞との間でＢＣＭＡ特異的な細胞傷害性の有意な差はなかった。（図２Ａ）。ＡＰ２１９６７はまた、細胞傷害性への影響を与えなかった。
【０５０７】
抗原依存性サイトカイン分泌を、Ｅ：Ｔ比を１：１でＣＡＲ  Ｔ細胞をＫ５６２−ＢＣＭＡ陽性細胞と（ＡＰ２１９６７を用いてまたは用いずに）１０日目に２４時間共培養することによって分析した。培養上清を収集し、ＩＦＮγの産出を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。同様レベルのＩＦＮγの分泌が、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞との間で観察された（図２Ｂ）。ＡＰ２１９６７は、実質的には、細胞傷害性に影響を与えなかった。
【０５０８】
抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９サルベージ受容体およびＡＰ２１９６７の存在下で、ＣＤ１９を発現するＮａｌｍ−６細胞に再指向され得る
２９３  Ｔ細胞を、二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体をコードするレンチウイルスで形質導入して、分泌した抗ＣＤ１９−ｓｃＦｖ−ＦＫＢＰ１２タンパク質の安定した源を生成した（図１、右パネル）。可溶性抗ＣＤ１９サルベージ受容体ポリペプチド（抗ＣＤ１９  ｓｃＦＶ  ＦＫＢＰ１２）を含有する上清を、安定した２９３Ｔ−７１０細胞から収集し、濾過した。
【０５０９】
抗ＣＤ１９サルベージ受容体は、ＡＰ２１９６７の存在下で、抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲを用いてヘテロ二量体を形成する（図３Ａ）。ＢＣＭＡ陰性に対する抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞（Ｅ）およびＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ−６細胞（Ｔ）の細胞傷害能は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を２：１でＮａｌｍ−６−ＣＤ１９陽性細胞（ＧＦＰ陽性）とＫ５６２−ＣＤ１９陰性細胞（ＢＦＰ陽性）との５０：５０の混合物と２４時間共培養することによって分析した。共培養物を、ビヒクルまたは１００ｎＭ  ＡＰ２１９６７で、異なる容量の２９３Ｔ−７１０細胞上清（０μｌ、１０μｌ、または３０μｌ）で処理した。抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＡＰ２１９６７および２９３Ｔ−７１０細胞上清の存在下で、Ｎａｌｍ−６細胞に対してＣＤ１９特異的細胞傷害性を示した。図３Ｂ。
【０５１０】
抗原依存性サイトカイン分泌は、抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を１：１でＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ−６細胞と２４時間共培養することによって分析した。共培養物を、ビヒクルまたは１００μＬの２９３Ｔ−７１０細胞上清で、および１００ｎＭのＡＰ２１９６７で処理した。培養上清を収集し、ＩＦＮγの分泌は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。ＩＦＮγの分泌は、１００μＬの２９３Ｔ−７１０細胞上清および１００ｎＭのＡＰ２１９６７の存在下で、抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲの共培養で有意に増加した。図３Ｃ。
【０５１１】
実施例２
予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体
ヒトリポカリン−２由来のシグナルペプチド、ＣＤ１９抗原を標的化するｓｃＦＶ、ＦＫＢＰ１２ドメイン、Ｔ２Ａ．１配列、ｍＣｈｅｒｒｙ配列、およびウッドチャック転写後調節領域（ＷＰＲＥ）を含む二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体をコードするレンチウイルス（配列番号５）を使用して、二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体を発現する安定した２９３Ｔ細胞株（２９３Ｔ−７０７）を生成した。
【０５１２】
二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体を、収集し、５００ｍＬの２９３Ｔ−７０７細胞培養上清を濾過し（０．２２μｍのフィルタ）、ＦＫＢＰ１２特異的親和性カラムに結合することによって精製した。カラムは、一定の回転で、４００μｇのビオチン−ＦＫ５０６を用いて２ｍＬのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を室温で３０分間インキュベートすることによって生成した。カラムを、ＰＢＳで洗浄して、非共役ビオチン−ＦＫ５０６を除去した。濾過した２９３Ｔ−７０７上清を、重力によってカラムを通過させた。Ａ２８０の流入が約０になるまで、カラムを、ＰＢＳで洗浄した。二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体を、５ｍＬの８μＭ  ラパマイシンで溶出し、続いて、１５ｍＬのＰＢＳで溶出した（図４Ａ）。ＶｉｖａＳｐｉｎ−２０遠心分離濃縮器（１０ｋＤ  ＭＷＣＯ）を用いて、溶出したタンパク質を、濃縮した（１００倍）。濃縮したタンパク質画分を、２０ｍＬのＰＢＳ中で再希釈し、続いて、さらなる一連のＶｉｖａＳｐｉｎ−２０濃縮で再希釈した。タンパク質画分を、ＰＢＳへのＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  ７Ｋカラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で脱塩して、残りの非結合ラパマイシンを除去した。精製したタンパク質溶液を濾過し（０．２２μｍ）、滅菌し、４℃で保存した。精製した二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体を、ウサギ抗ＦＫＢＰ１２抗体を用いたＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を使用して結合したラパマイシンの存在についてアッセイした。
【０５１３】
これらのアッセイは、精製した二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体がラパマイシンに結合したことを確認した（図４Ｂ）。
【０５１４】
実施例３
予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体は、抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲを再指向する
Ｔ細胞を、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲまたは抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を、２５０ｎｇの予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体の存在または不在下で、１００ｎＭ  ＡＰ２１９６７を用いてまたは用いずに、Ｅ：Ｔ比を２：１でＧＦＰを発現するＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ−６細胞とＢＦＰを発現するＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞との５０：５０の混合物と２４時間共培養した。抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞は、ラパマイシンで予め充填された二量体化可能なＣＤ１９サルベージ受容体の存在下で、Ｎａｌｍ−６に対してＣＤ１９に特異的な細胞傷害性を示した。図５。ＡＰ２１９６７は、ＣＤ１９に特異的な細胞傷害性を誘発する必要がなかった。
【０５１５】
抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を２：１でＧＦＰを発現するＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ−６細胞とＢＦＰを発現するＣＤ１９陰性Ｋ５６２細胞との５０：５０の混合物と、減少した量（１２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．３ｎｇ、１５．６ｎｇ、７．８ｎｇ、３．９ｎｇ、２．０ｎｇ）の予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体とで２４時間共培養した。わずか２ｎｇの予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体は、ＣＤ１９に特異的な細胞傷害性を誘発するのに十分であった。図６。
【０５１６】
抗ＢＣＭＡサルベージＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、Ｅ：Ｔ比を１：１でＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ−６細胞と、減少した量（１２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．３ｎｇ、１５．６ｎｇ、７．８ｎｇ、３．９ｎｇ、２．０ｎｇ）の予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体とで２４時間共培養した。共培養上清（ｓｕｐｅｒａｎｔａｎｔ）上で実施されるサイトカイン放出アッセイは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ、およびＩＦＮγを産生し、産生したサイトカインの量が共培養液中で予め充填された二量体化可能な抗ＣＤ１９サルベージ受容体の量に相関したことを示した。図７。
【０５１７】
実施例４
抗ＣＤ１９サルベージ受容体は、抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞を再指向する
抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたＭＮＤプロモーターを含むレンチウイルスを、設計し、構築し、検証した。ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣは、ＣＤ８α由来のシグナルペプチド、ＦＲＢバリアント（Ｔ８２Ｌ）、ＣＤ８α由来の膜貫通ドメイン、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、Ｐ２Ａ配列、Ｉｇκ由来のシグナルペプチド、ＢＣＭＡ抗原を標的化する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｇ４Ｓリンカー配列、ＦＫＢＰ１２ドメイン、およびアムニオンレス（ＡＭＮ）由来の膜貫通ドメインを含む（配列番号６）。
【０５１８】
抗ＣＤ１９サルベージ受容体を用いてＣＤ１９を発現するＮａｌｍ−６細胞に抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞を再指向する能力を評価した。抗ＢＣＭＡ−ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞を、２５０ｎｇの抗ＣＤ１９サルベージ受容体の存在または不在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比を２：１でＣＤ１９＋Ｎａｌｍ−６（ＧＦＰ）とＫ５６２（ＢＦＰ）標的細胞との５０：５０の混合物と共培養した。抗ＣＤ１９サルベージ受容体は、ＣＤ１９＋Ｎａｌｍ−６細胞に対して抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞の細胞傷害性を再指向することができた。図８Ｂ。サイトカイン放出アッセイも行った。抗ＢＣＭＡ  ＤＡＲＩＣ  Ｔ細胞を、２５０ｎｇの抗ＣＤ１９サルベージ受容体の存在または不在下で、Ｅ：Ｔ比を１：１でＮａｌｍ−６細胞と２４時間共培養した。ＩＦＮγは、抗ＣＤ１９サルベージ受容体を含有する共培養物からのみ生成した。図８Ｃ。
【０５１９】
概して、続く特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある全ての実施形態を、かかる特許請求の範囲が権利を有する同等物の全範囲と共に含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示により制限されない。
【図１】
2019518425.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
2019518425000001.app
【国際調査報告】
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