(57)【要約】本発明は、ＳＬＣ６Ａ６又はその細胞外領域に結合する新規なモノクローナル抗体の提供を目的とする。本発明は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６、又はＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体。
【請求項３】
細胞外領域のポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるものである請求項２に記載のモノクローナル抗体。
（ａ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
【請求項４】
受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８５又はＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８６であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項４に記載のモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
【請求項７】
受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８５又はＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８６である、ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体を産生する細胞株。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、ＳＬＣ６Ａ６の検出用試薬。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、がんの検出又は診断用キット。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、請求項８に記載の試薬又は請求項９に記載のキットを用いて、がんを検出する方法。
【請求項１１】
生体試料と、前記抗体又は前記試薬若しくはキット中の抗体とを接触させる工程を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料が糞便である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記がんが大腸がんである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＬＣ６Ａ６又はその細胞外領域に結合する新規なモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞、および該抗体を用いた、がんの検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界の死因において上位にあり、なかでも大腸がんは、がんの死亡率において上位に位置する疾患である。日本でも大腸がんの患者数は近年急激に増加しており、年間約６万人が大腸がんに罹患し、臓器別の死亡数でも、胃がん、肺がんに続く３番目の多さとなっている。大腸がんは他のがんとは異なり、早期がんであれば手術により１００％近く完治できることが知られている。従って、大腸がんは早期がん検診の対象となり、数多くの検査法が考案されてきた。
現在、負担の少ない大腸がんの一次スクリーニング法として、便潜血反応が普及している。この手法では、ヒトヘモグロビンの存在を調べることにより、腸内の出血の有無を診断し、間接的に大腸がんの発生を予測する。
便潜血反応は、簡単に受けられる検査であるため広く利用されているが、検査の有用性について疑問もある。例えば、ヘモカルトＩＩ（アステラス製薬）を利用した試験で陽性判定になるには、大腸内で１日あたり２０ｍｇの出血が必要だが、実際の大腸がん患者の出血は１０ｍｇ以下であると考えられている。そのため、便潜血反応の感度は２６％程度で、実際の大腸がん患者のおよそ１／４しか発見できず、３／４を見逃しているとの報告がある（非特許文献１）。さらに、陽性判定がなされた被験者の中で、実際に大腸がんであったのは８．３％に過ぎず、多くの偽陽性を含む検査方法である。
このほか、負担の少ない大腸がんの一次スクリーニング法として、糞便から直接核酸を抽出し、遺伝子の変異を調べる遺伝子診断法の開発が試みられている。しかし、糞便に含まれる核酸は様々な細菌や正常細胞に由来する核酸が大部分であり、がん細胞由来の核酸は約０．０５％と極微量である。そのため、がん細胞に由来する遺伝子の変異や発現パターンの微妙な変化の検出が困難であり、遺伝子診断の実用化は難しい。
がん検出の精度向上のため、糞便からがん細胞を効率良く回収する方法が開発された。代表的な技術として、糞便の懸濁から細胞の回収までを室温で行い、がん細胞を生きたまま回収する方法がある（特許文献１）。
この方法により、糞便に含まれる生きたがん細胞の回収が簡便になった。ただし、当該方法で用いるＢｅｒ−ＥＰ４抗体は、上皮細胞に広範に発現する上皮性細胞結合分子（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｌｅ、ＥｐＣＡＭ）を認識する（非特許文献２）ことから、得られた細胞集団に、糞便に含まれる大腸などの正常腺上皮細胞が混入する可能性がある。そのため、がんを診断するには、回収した細胞を、がんに特異的な特徴を検出するような、別の検査方法で分析する必要がある。
一般的に、特定の細胞を特異的に検出するには、その細胞に特異的に発現する分子と抗体やアプタマーを用いる手法が取られる。そこで、本発明者らは、がん細胞において発現が亢進している遺伝子を絞り込み、がん細胞を特異的に検出するためのマーカー分子として、ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ  ６）に着目した。
ＳＬＣ６Ａ６は、６２０アミノ酸からなる１２回膜貫通型の膜タンパク質であり、ＮＣＢＩ（米国生物工学情報センター）Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［ＲｅｆＳｅｑ］ＩＤ：ＮＭ＿００３０４３、ＮＰ＿００３０３４．２として登録されている（配列番号１：塩基配列、配列番号２：アミノ酸配列）。ＳＬＣ６Ａ６はタウリンの細胞内への取り込みに関与しており、ナトリウムイオン及びクロライドイオンとともにタウリンを共輸送する。ＳＬＣ６Ａ６には、スプライスバリアントによる変異体として、全長のうち、Ｎ末端から２００番目までのアミノ酸からなるタンパク質およびその遺伝子（配列番号３、４）や、Ｎ末端から３５９番目までのアミノ酸からなるタンパク質およびその遺伝子（配列番号５、６）などが存在する。
ＳＬＣ６Ａ６遺伝子は、正常組織に対し結腸癌組織において発現が上昇する遺伝子の一つとして開示されている（特許文献２）。特許文献２では、１０種類の原発結腸腫瘍と、１０種類の正常結腸を用いて、ＤＮＡマイクロアレイにより、ｓｌｃ６ａ６を含む、結腸癌組織と正常組織との間で発現に差がある３０個以上の遺伝子が同定されており、開示された全ての遺伝子について、抗体、抗体によるポリペプチドの検出方法、がんの診断方法、抗体を含む医薬組成物への適用が示唆されている。しかしながら、ｓｌｃ６ａ６に対する抗体の作製例はなく、診断または治療目的における、タンパク質レベルでの適正、実用性又は実施可能性についても実証されていない。また、特許文献２には、定量ＰＣＲ法による詳細な発現パターンの解析結果が記載されているが、発現比にばらつきがあり、正常組織において結腸癌組織よりも高い発現を示す場合がある（表７）。また、定量ＰＣＲに使用されたプライマー（表６）はタンパク質のコード領域外である。ＳＬＣ６Ａ６には複数のスプライスバリアントが存在するため、このプライマーにより増幅される領域を測定に用いても、ＳＬＣ６Ａ６タンパクの発現量を正確に反映しない場合がある。よって、遺伝子レベルではなくタンパク質レベルで標的分子を検出する必要があり、そのためには特異的なアミノ酸配列と立体構造を認識するモノクローナル抗体が不可欠である。そして、バリアントの存在も考慮し、タンパク質レベルでの検査への有用性を詳細に検討しなければならない。
ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体として、ＨＰＡ０１５０２８（ＡＴＬＡＳ社）、ｓｃ−１６６６４０（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）が公知である。
ｓｃ−１６６６４０抗体はモノクローナル抗体であり、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基３９７〜４２４の領域に結合する。この領域は、膜貫通領域から細胞内にわたっているため、この抗体を用いて生きたがん細胞を検出することはできない。また、免疫染色を行う場合、細胞の固定化と細胞膜の透過処理により、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質が変性するため、抗体の検出感度が低下する。加えて、Ｎ末端側から数えて２０１番目、あるいは３６０番目以降を欠損しているＳＬＣ６Ａ６のバリアントを検出することが出来ないという問題がある。
ＨＰＡ０１５０２８はポリクローナル抗体であり、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域であるアミノ酸残基１４５〜２１３を大腸菌で発現させて精製し、得られた精製ポリペプチドを用いてウサギを免疫し、その後アフィニティー精製により得られた抗体である。
しかし、膜タンパク質は、細胞膜上で機能を果たすために膜上で特徴的な立体構造を形成しており、細胞外領域の一部分を作製しても本来の立体構造を形成しないことが一般的に知られている。そのため、このような膜タンパク質の一部分を抗原としてポリクローナル抗体を作製した場合、本来の立体構造に反応する抗体が得られる割合が低く、抗体の力価も低いという問題がある。
抗体を目的タンパク質の検出や疾患の検査ツールとして利用するには、継続的かつ均質な生産と供給が必須であるため、モノクローナル抗体であることが望まれる。一般的に、ＳＬＣ６Ａ６のような膜タンパク質、特に複数回膜タンパク質は、可溶化することが難しい、細胞外領域が小さいなどの理由から、抗体を作製することが困難である。免疫した動物の末梢血等からポリクローナル抗体を得られたとしても、抗体産生細胞を単離できる確率は非常に少ないことが現状である。
以上の理由から、これらの従来の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を検出する抗体としては十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−４６０６５号公報
【特許文献２】特表２００６−５１５３１８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｍａ，Ｖｏｌ．２６９，１２６２−７，１９９３
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１２５，４３７−４６，１９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、ＳＬＣ６Ａ６を検出でき、がんの検査ツールとして安定的に再現性良く供給し得るようなモノクローナル抗体、および、そのような抗体を用いた、がんの診断のための簡易で精度の高い検査方法が望まれていた。
従って、本発明の目的は、試料中のＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に結合するモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供すること、そして、当該抗体を用いたがんの検出方法を確立することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６を認識するモノクローナル抗体を作製し、当該モノクローナル抗体を用いたがんの診断用のキットを開発することに成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識するモノクローナル抗体。
（２）ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域のポリペプチドを認識するモノクローナル抗体。
（３）細胞外領域のポリペプチドが、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１つに示されるものである（２）に記載のモノクローナル抗体。
（ａ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（ｃ）配列番号８に示されるアミノ酸配列に７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域として機能するポリペプチド
（４）受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８５又はＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８６であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体。
（５）前記（４）に記載のモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する、ＳＬ７Ｃ６Ａ６に対するモノクローナル抗体。
（６）前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
（７）受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８５又はＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８６である、ＳＬＣ６Ａ６に対する抗体を産生する細胞株。
（８）前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、ＳＬＣ６Ａ６の検出用試薬。
（９）前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、がんの検出又は診断用キット。
（１０）前記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、前記（８）に記載の試薬又は前記（９）に記載のキットを用いて、がんを検出する方法。
（１１）生体試料と、前記抗体又は前記試薬若しくはキット中の抗体とを接触させる工程を包含する、（１０）に記載の方法。
（１２）前記生体試料が糞便である、（１１）に記載の方法。
（１３）前記がんが大腸がんである、（１０）に記載の方法
【発明の効果】
【０００７】
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、ＳＬＣ６Ａ６を有意に高く発現するがん細胞を、様々な手段により高い感度で検出することができる。特に、大腸がんの診断において、ＳＬＣ６Ａ６の発現を指標に、糞便などの生体由来試料に含まれる生きたがん細胞を簡便かつ効率的に検出することができる。また、そのような抗体を継続して製造できるため、早期に大腸がんを発見するような検査キットの普及を可能にする。そして、当該キットを利用することにより、検診等におけるがん患者の高精度スクリーニング、がんの早期発見、がんの進行度合いの特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報を得ることができるため、がんによる死亡率を低下させることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
図１は、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質の細胞外領域に対応する塩基配列をプローブ（ｐｒｏｂｅ）とし、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により組織を染色した写真である。
図２は、ＳＬＣ６Ａ６タンパク質の発現をウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）により解析した結果である。
図３は、ＳＬＣ６Ａ６発現細胞を移植したマウスの抗血清中の力価をＥＬＩＳＡにより解析した結果である。
図４は、４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体の力価をＥＬＩＳＡにより解析した結果である。
図５は、がん細胞抽出液に対する各種抗体の反応性を解析した結果を示す図である。
Ａ：がん細胞抽出液に対する５Ｈ１２ｄ抗体の反応性の解析結果
Ｂ：がん細胞抽出液に対する４Ｂ９ｂ抗体の反応性の解析結果
Ｃ：がん細胞抽出液に対するポリクローナル抗体の反応性の解析結果
図６は、３種類のがん細胞を、４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体で染色した写真である。
図７は、４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体を用いて、大腸がん組織の免疫染色を行った写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。なお。本発明は、以下の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で適宜変形して実施することができる。
本発明は、ＳＬＣ６Ａ６（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ），ｍｅｍｂｅｒ  ６）と呼ばれる分子またはその細胞外領域を認識するモノクローナル抗体であり、この抗体は、特に大腸がんを検出するために用いることができるものである。
本発明のモノクローナル抗体を取得するには、免疫原として、本来の立体構造を有する状態にある、ヒトＳＬＣ６Ａ６の全長タンパク質、あるいは細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６（配列番号８）（配列番号７に示される塩基配列でコードされる）を含む部分タンパク質（以下、総称してタンパク質と表現する場合がある）を用いる。本来の立体構造を有する形で得るために、好ましくは、全長のタンパク質を細胞膜に発現させた細胞を調製する。
ところで、一般には、抗体を作製するには抗原にアジュバント等を混合したものを投与して動物を免疫するが、本発明では、免疫効率を高めるために転移性がん細胞を動物内に移植して免疫することとした。すなわち、目的抗原であるヒトＳＬＣ６Ａ６を発現する転移性がん細胞を非ヒト実験動物に移植して生着させ、目的抗原により前記実験動物を免疫する。転移性がん細胞とは、実験動物に移植した場合に遠隔転移が見られるようながん細胞であり、例えば、骨、肺、リンパ節、皮膚、肝臓、胸膜、脳、乳房、乳腺、膀胱、大腸、または結腸から樹立された転移性を有するがん細胞などが挙げられる。また、転移性がん細胞を直接免疫に用いることで、機能的な立体構造や翻訳後修飾を保持したまま抗原を免疫することが可能であり、これまで取得が困難であったタンパク質に対する抗体を誘導することができる。本発明ではがん細胞が抗原を発現する役割を担っており、本来の立体構造（生体環境で有する構造を意味する）を有する抗原に対する抗体を得ることができる。このため、単離されたタンパク質を立体的に再構築させる等の処理を行なう必要がなく、抗原に対して十分な中和能力を持つ抗体を誘導することができる。
細胞は、実験動物に移植した場合に遠隔転移が見られるような、転移性を有する細胞を用いることが好ましく、例えば、ヒトの乳がんより樹立されたＭＣＦ７由来のＭＣＦ７−１４（国際公開第２００８／０９３８８６号公報、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４）を使用する。転移性が細胞に本来備わっているもののほか、当業者が想到する手段により、後天的や人為的に転移性を持つよう調製した細胞を用いることもできる。
細胞への抗原の発現は、当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、抗原タンパク質をコートするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを構築し、得られた発現ベクターを細胞に導入することで、細胞に目的の抗原タンパク質を発現させることができる。
上記のような免疫原を、マウス、ラット等の実験動物に投与する。好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕをはじめとするＢＡＬＢ／ｃ系統やＣ５７ＢＬ／６、ＩＣＲ系統の免疫不全マウスが適している。
投与の方法は、免疫原が長期間実験動物の体内に留まり、免疫応答が引き起こされるような手段により行う。例えば、タンパク質を発現させた細胞を用いた場合には、その細胞を実験動物に移植する。細胞を移植する部位については、移植した細胞が生着しやすい器官や組織であればよい。ＭＣＦ７−１４を用いた場合は、当該細胞が由来するＭＣＦ７の原発巣に属する乳腺や、乳がんの転移が多発するリンパ節、肝臓、肺、骨、脳などの部位、リンパ節の近傍の組織、脂肪組織などが好ましい。このとき、移植した細胞が生着しやすいよう、マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）などの足場材料を利用することが好ましい。
免疫原を投与後は実験動物を飼育し、血液中の抗体価の上昇や脾臓の増大などを指標に、免疫が進行したことを確認する。血液中の抗体の解析方法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を利用するとよい。
免疫後は、当業者周知の方法に従い、モノクローナル抗体を取得する。例えば、免疫した実験動物の脾臓やリンパ節などから抗体産生細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を作る。目的の特異性および親和性をもった抗体を産生しているクローンを選別して培養し、上清中の抗体を精製する。このほか、マウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞を投与し、マウスの腹水を出発材料として抗体を精製してもよい。
ハイブリドーマ細胞を作製しない方法により、抗体を取得することも可能である。例えば、脾臓やリンパ節などから採取した抗体産生細胞に、遺伝子（テロメラーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ＨＰＶのＥ６やＥ７、アデノウイルスのＥ１Ａ、ｈＴＥＲＴ、ｂｍｉ−１、ｃ−ｍｙｃ）を導入する、ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＳＶ４０）を感染させる、などを行うことにより抗体産生細胞を不死化して、上述の方法と同様にクローンの選別から抗体の精製を行う。このほか、免疫した動物の脾臓やリンパ節から、タンパク質を認識するＨ鎖、Ｌ鎖などの抗体遺伝子をクローニングし、目的の抗体様分子をコードするよう遺伝子を組み換え、動物細胞やウイルス、酵母、バクテリアなどの宿主にて発現させ、選別を経ることにより、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に結合する抗体及び抗体様分子を作製することも出来る。本発明は、本発明の抗体を産生する細胞株も提供する。
一方、免疫した実験動物の脾臓やリンパ節などから採取した抗体産生細胞または作製したハイブリドーマ細胞から、抗体遺伝子を抽出して、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的な抗体様分子を作製することもできる。具体的には、上述した方法と同様に、抗体遺伝子を単離し、公知の技術により適宜遺伝子を組換え、他の細胞へ導入して発現させればよい。
本発明においては、種々の遺伝子工学的およびタンパク質工学的な手法により、モノクローナル抗体の一部である抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子を作製することができる。具体的には、例えば、Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、（ｓｃＦｖ）２、ＤｉＡｂｏｄｙ、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、標識抗体などが挙げられる。いずれも、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、本発明のモノクローナル抗体に含まれる。
本発明のモノクローナル抗体は、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。「ネイティブな」とは、そのタンパク質が生体内の環境で有する立体構造の状態にあることをいう。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域を認識することができる。特に、細胞外領域として、ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸残基１４３〜２１６の領域（配列番号８）を認識することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれる範囲、すなわち結合対象のポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有する限りにおいて、配列番号８に記載のアミノ酸配列の１個もしくは数個（例えば２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入が行われている変異型ポリペプチド、配列番号８のアミノ酸配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上、９９％以上の相同性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。また、本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドであって、配列番号７に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号７に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、配列番号７に記載の塩基配列に７０％以上、好ましくは８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドまたは配列番号７に記載の塩基配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドにコードされる変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。ここで、ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に従って行うことができる。高ストリンジェントな条件は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ナトリウム濃度が１０ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜１００ｍＭであり、温度が２５℃〜７０℃、好ましくは４２℃〜５５℃での条件をいう。
ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、タウリンとの結合及びタウリンの細胞内部への輸送を担っていることが推測される。変異型ポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、動物細胞などで変異型ポリペプチドを強制発現させ、タウリンの取り込みをａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ（Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ  Ｖｏｌ．７６，１−１５，１９８３記載の方法）で解析することにより確認することができると考えられる。
あるいは、本発明のモノクローナル抗体はＳＬＣ６Ａ６に結合するものであるから、上記変異型ポリペプチドにおいて、本発明のモノクローナル抗体が結合することができるものは、抗体の配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性が保たれることを示し、すなわちＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域としての機能を有するポリペプチドに含まれる。
変異型ポリペプチド等のポリペプチドと本発明のモノクローナル抗体との結合は、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
また、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域は、がん細胞において発現が上昇するマーカータンパク質の細胞表面部位である。変異型ポリペプチド等のポリペプチドがＳＬＣ６Ａ６の細胞外ドメインとしての機能を有しているかどうかは、正常細胞とがん細胞における当該ポリペプチドの発現を、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、ウエスタンブロッティングなどで比較することにより確認することができる。本発明のモノクローナル抗体がネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することも、上記方法を利用することにより確認することができるが、生体内における立体構造を有するＳＬＣ６Ａ６と本発明のモノクローナル抗体との結合を検出できる方法であれば、上記方法に限定されるわけではない。
本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６に対し、従来の抗体よりも高い親和性を有する。
従来の抗体は、細胞外領域を認識しないために、生きた細胞に結合できない、検出シグナルが非常に弱い、均質な抗体を安定して生産することができない、など利用しにくい点があった。これに対し、本発明のモノクローナル抗体は、従来の抗体と異なり細胞外領域を認識するとともに、従来の抗体よりも高い親和性を有するため、がん細胞表面に存在するＳＬＣ６Ａ６をより高い感度で検出できるようになり、試料中に僅かに含まれるがん細胞を捉えることができる。これにより、がんを早期に発見することが可能である（図５参照）。
本発明のモノクローナル抗体は、ｓｌｃ６ａ６のｍＲＮＡバリアントがコードするタンパク質をも認識する（図５参照）。全長のＳＬＣ６Ａ６だけでなく、一部を欠損した変異体にも結合することができるため、従来の抗体と比較して、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞を広範に検出することが可能である。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株（ハイブリドーマ）として、「４Ｂ９ｂ」及び「５Ｈ１２ｄ」がある。どちらも、株式会社バイオマトリックス研究所（〒２７０−０１０１  千葉県流山市東深井１０５番地）が、２０１０年７月２１日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託した。その受託番号は、「４Ｂ９ｂ」については「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８５」であり、５Ｈ１２ｄについては「ＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８６」である。本発明は、当該ハイブリドーマおよびこれらが産生する抗体を提供する。当該ハイブリドーマを培養することにより、均質なモノクローナル抗体を製造することができる。
これらの特徴を有する本発明のモノクローナル抗体は、通常のモノクローナル抗体の製法とは異なる、上述のようなタンパク質を発現する細胞を生着させる免疫法を用いて、効率よく得られるものである。ＳＬＣ６Ａ６のような膜タンパク質、特に複数回膜貫通型のタンパク質に対する抗体は、当業者において一般的に実施されている製法では作製が困難である。それは、
（１）抗原として膜タンパク質を調製する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れ、その一方、界面活性剤を使用しない場合は膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する、
（２）細胞表面の発現量が低い、または細胞外領域が小さいために免疫応答が起こらない、
などの理由による。
本発明のモノクローナル抗体は、本発明者らが抗体の製法（特に免疫方法）に工夫を施した結果、従来の抗体に対して優れた特徴を獲得したものである。
本発明のモノクローナル抗体は、以下の特徴を有する。
本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６が本来有する立体構造をもとに作製された故に、ネイティブなＳＬＣ６Ａ６を認識することができる。そのため、同じエピトープを認識する従来の抗体（ＨＰＡ０１５０２８）と比較して検出感度が非常に高く、従来の抗体では検出が困難であった微量のＳＬＣ６Ａ６を十分に検出することができる。また、ＳＬＣ６Ａ６の膜内および細胞内の領域を認識する従来のモノクローナル抗体（ｓｃ−１６６６４０）に対して、本発明の抗体の認識部位は細胞外であるため、生きた細胞に結合することができ、簡便な前処理によって試料中のがん細胞を検出することが可能である。さらに、本発明の抗体は、免疫染色、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡなど様々な検出方法において、定性的または／および定量的にＳＬＣ６Ａ６またはがん細胞を検出でき、細胞や組織などにおいては、発現する部位を明瞭に区別することができる。加えて、従来の抗体はポリクローナル抗体であり、均質な抗体を継続的に生産することが困難であったが、本発明の抗体はモノクローナル抗体であるため、抗体を再現性よく量産することが可能である。これらの特徴から、本発明の抗体はがんの検出に有用であり、検査キットなどの形態で診断に利用することにより、がんの早期発見を実現することができる。
また、本発明は、受託番号がＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８５又はＦＥＲＭ  Ｐ−２１９８６であるハイブリドーマにより産生される、ＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明のＳＬＣ６Ａ６に対するモノクローナル抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープ（ＳＬＣ６Ａ６のアミノ酸配列のうち、第１４３番目から第２１６番目までのアミノ酸残基のほか、これらの領域の一部であってもよい。）を指す。
本発明のモノクローナル抗体を用いれば、従来の抗体とは異なり、試料中の細胞の形態や性質を変えることなく、生きた細胞や懸濁液に浮遊した細胞において、ＳＬＣ６Ａ６の発現を検出することが可能である。
タンパク質の検出において、膜貫通領域や細胞内領域を認識する抗体を用いる場合は、ホルマリンやメタノールなどにより、組織切片や細胞などの試料を固定化し、界面活性剤で細胞膜の透過処理を行うのが一般的である。しかしながら、このような処理では、タンパク質は変性して本来の立体構造が崩れるため、検出感度が低下する。また、抗原の賦活化や、固定化条件の厳密なコントロールによる検出感度の向上が必要になり、抗体の染色条件が制限されてしまう。それに対し、本発明の抗体は、従来の抗体と同様に固定化した組織切片や細胞膜を破壊した試料においてもＳＬＣ６Ａ６を検出できるうえ、そのような処理をしない細胞の膜上にあるＳＬＣ６Ａ６をも、高い感度で検出することができる。そのため、抗体を適用できる検出手段の範囲が広い。
本発明のモノクローナル抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現するがん細胞の検出に用いることができる。本発明は、本発明のモノクローナル抗体を用いた、がんの検出方法、本発明のモノクローナル抗体を含むＳＬＣ６Ａ６の検出用試薬、および本発明のモノクローナル抗体を含む、がんの検出又は診断用キットを提供する。対象となるがんは、正常組織と比較して腫瘍細胞におけるＳＣＬ６Ａ６が有意に高く発現するがんであればよく、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんが適している。
本発明の検出方法において被検対象となる試料は、検査対象のがんと密接に関係のある生体試料であれば特に限定されない。例えば、大腸がん、胃がんを検査する場合、がん組織、体液、排泄物などが挙げられ、特に糞便であることが好ましい。膀胱がん、腎がんの場合はがん組織や尿など、子宮がんや乳がんの場合は生理用品や母乳なども利用可能である。いずれの生体材料も適切な前処理を行うことによって適応可能である。
糞便を試料とする場合、特許文献１に記載の方法で調製することが好ましい。当該方法は、糞便からがん細胞を効率よく回収できる方法である。具体的には、ストマッカーバックに便とバッファーを入れ、糞便の懸濁液を作製する。この懸濁液を、多段式フィルタ装置でろ過し、最終フィルタの口径を１０μｍ以下にすることで、細胞を最終フィルタ上に捕らえる。その中から、Ｂｅｒ−ＥＰ４抗体結合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈ、ダイナル社）を用いて細胞を回収する。この他、パーコール遠心分離法（特表平１１−５１１９８２号公報）をはじめとする、当業者が通常用いている細胞の効率的な回収方法を利用すればよい。
大腸がんをはじめとする様々ながんにおいて、体液を用いて早期に発見できる腫瘍マーカーはまだ確立されていない。一般的なマーカーでは、ステージの進んだがんであっても擬陰性を示すことがある。これに対し、本発明の抗体を用いれば、がんが進行する前に、体液や排泄物に含まれる、マーカーとしてのＳＬＣ６Ａ６を発現する微量な細胞を検出および／または測定することができる。
本発明の検出方法は、本発明のモノクローナル抗体を用いるものであり、生体試料と、本発明のモノクローナル抗体（ハイブリドーマから産生されたもの、あるいは本発明の試薬又はキット中に含まれる抗体）とを接触させる工程を包含する。そして、「接触」とは、本発明の抗体と被験対象である生体試料（必要に応じて適切な前処理をしたもの）とが反応する環境下に置くことを意味し、反応用ウェルに抗体と生体試料とを混合すること、被検試料である組織や細胞に抗体を添加すること、被検試料または抗体のいずれか一方を吸着させたメンブレンに他方を添加すること、被検試料または抗体のいずれか一方を固定した樹脂などの担体に他方を添加することのいずれも「接触」に含まれる。
そして、検出手法は、抗原抗体反応の特異性を利用してＳＬＣ６Ａ６を測定または検出する手法であればいずれの方法でもよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡなどを利用できる。
このような検出に用いるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。このようなデバイスを用いたときは、発色量、蛍光量、発光量などのシグナルを検出の指標とし、がんであるか、がんが進行しているか等について関連づけることができる。
本発明の検出方法を、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法により実施する場合は、例えば、糞便より回収したがん細胞を含む細胞や患者より採取した組織から作製した切片など、上述した試料を適切に前処理したサンプルをマイクロウェルプレートやスライドガラスなどの固相に固定化して、免疫学的反応を行う。あるいは、チューブ内で細胞懸濁液を抗体と反応させることもできる。また、本発明のモノクローナル抗体をビーズやマイクロウェルプレートに固定化し、細胞と反応する方法も利用できる。
この場合、本発明のモノクローナル抗体を酵素や蛍光物質で標識することにより該反応を蛍光シグナルとして直接検出してもよく、または本発明のモノクローナル抗体に結合する標識された二次抗体を用いることによりシグナルを間接的に検出しても良い。標識物質としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ビオチン−アビジン複合体など、当業者が通常用いる物質を利用できる。また、検出方法は、競合法、サンドイッチ法または直接吸着法など、いずれの方法を用いてもよい。そして、反応の強さや、反応させたサンプル中の全体の細胞の中で、抗体と結合した細胞の割合を測定し、予め設定した基準値や指標と比較することによって、がんに罹患している可能性を判定する。
検出に使用する抗体は、通常のモノクローナル抗体でもよく、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域への結合能を有している分子であれば、パパイン処理によって得られるＦａｂ、またはペプシン処理によって得られるＦ（ａｂ′）２もしくはＦ（ａｂ′）などの、抗体断片、低分子化抗体、遺伝子組換え抗体、抗体修飾物などの抗体様分子の形態であってもよい。
本発明の検出方法により、健常者に由来する試料とがん患者に由来する試料とを区別することができるため、特定の試料において、がんに罹患している可能性を判定することができる。
また、本発明は、本発明の検出方法を用いてがんの検出を実施するための、本発明の抗体を含むがんを検出又は診断するためのキットを提供する。
本発明のキットを用いて、被験者から採取した試料中に含まれるＳＬＣ６Ａ６を検出することにより、がんの罹患を診断することができる。診断対象のがんとしては、正常組織と比較して腫瘍細胞におけるＳＬＣ６Ａ６が有意に高く発現するがんであればよく、例えば、大腸がん、胃がん、膀胱がん、腎がん、子宮がん、乳がんが挙げられ、特に大腸がんが適している。
本発明のキットは、本発明のモノクローナル抗体を含むものであれば、それを構成する材料は特に限定されない。例えば、酵素免疫測定法により検出する場合には、本発明のモノクローナル抗体のほか、酵素および基質、各種緩衝液、反応液、標準物質などを具備すればよい。試薬は、固定化された状態、水溶液、凍結乾燥状態などにて提供され、使用前に適切な状態に調製されるものであってもよい。
本発明のキットを用いることにより、検診時等でのがん患者のスクリーニング、がんの進行度合いの特定、治療時の治療効果モニタリング、転移・再発の予見等に有用な情報が得られる。
【実施例】
【００１０】
実施例１．ＳＬＣ６Ａ６遺伝子の発現解析
新たながん細胞特異的な膜タンパク質を同定し、診断等に使用する抗体を作製する目的で、新たな膜タンパク質マーカーの同定を行った。５種類の大腸がん培養細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ１、ＬＯＶＯ、ＳＷ４８０）で共通して発現し、２種類の正常細胞（大腸内視鏡検査を受けた健常者２名由来の正常大腸剥離細胞）では発現していない遺伝子をＤＮＡマイクロアレイによって同定した。
１８０個得られた候補遺伝子の中から、定量性ＰＣＲ法により５症例のがん患部と健常部とで、２倍以上の差のみられる遺伝子２５個を絞り込んだ。さらにその遺伝子群の中から、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法により、がん部特異的に転写がみられる遺伝子を複数同定した。その中で、東京大学システム生物医学ラボラトリーのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｍ．ｏｒｇ／）上で公開されている３９種類の正常組織すべてで発現が見られない遺伝子を調べたところ、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ６（ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，ｔａｕｒｉｎｅ，ＳＬＣ６Ａ６）遺伝子を同定した。
ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のがん部、健常部での発現を確認するために、ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００３０４３）の５４６１−５８７８（４１８ｂｐ）に位置する配列に対してプローブを作製し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｙｚａｔｉｏｎ法により組織を分析した。
大腸がん組織パラフィン切片（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）をキシレン処理後、エタノール、ＰＢＳの順で水和を行い、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。７μｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｒｅｉｎａｓｅ  Ｋ（Ｒｏｃｈｅ）で３０分間処理し、４％パラホルムアルデヒド溶液で再固定した。０．２５％無水酢酸０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で１０分間アセチル化し、エタノールで脱水した。３００ｎｇ／ｍｌプローブ（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を含むｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ反応液（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）に６０℃で１６時間反応させた後、５×洗浄液（Ｇｅｎｏｓｔｑａｆｆ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）で６０℃２０分間、５０％ホルムアミド・２×洗浄液で６０℃２０分間洗浄し、ＲＮａｓｅＡで３７℃３０分間処理した。
２×洗浄液、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、０．５％ブロッキング反応液（Ｒｏｃｈｅ）、２０％熱処理羊血清（Ｓｉｇｍａ）と順次反応させた。ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体（Ｒｏｃｈｅ）と２時間の反応を行い、ＰＢＳで洗浄後にＮＢＴ／ＢＣＩＰ液（Ｒｏｃｈｅ）中で発色させた。ケルネヒトロート液（Ｍｕｔｏｈ）で対比染色後、脱水処理し、マリノール（Ｍｕｔｏｈ）で封入した後に顕微鏡で観察を行った。
図１に結果を示した。図１に示されるように、大腸がんのがん部は、健常部と比べ特異的に染色された。
実施例２．モノクローナル抗体の作製とがん細胞の検出
（１）細胞
ＭＣＦ７−１４は、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９４４を継代したものを用いた。ＨＴ−２９、ＳＷ４８０、ＬＯＶＯは、国立がん研究センター東病院より入手した。
ＭＣＦ７−１４を、１０％（ｖ／ｖ）の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）で、残りの細胞はＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ社）で、それぞれ８０％コンフルエントを越えないよう３７℃、５％ＣＯ２下で４８〜７２時間培養および継代を行った。
（２）ＳＬＣ６Ａ６遺伝子のクローニング
ＭＣＦ７−１４を培養し、Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットを用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写（ＲＴ）反応を５０℃で１時間行ってｃＤＮＡを合成し、８５℃、５分間の加熱により、反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いてＰＣＲ反応を行なった。
プライマー配列
2012029990.tif 000002
ＰＣＲ反応は、９５℃、１０分間のプレインキュベーションを行ない、次に９５℃、１５秒間のデナチュレーション、および６０℃、１分間のアニーリング／エロンゲーションのサイクルを４０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）を用いて、ｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ組み込んだ。増幅断片をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にｃ−ｍｙｃ  ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。
（３）ＳＬＣ６Ａ６過剰発現株の作製
上記（２）で作製したプラスミドを、ＦＵＧＥＮＥ６（ロシュアプライドサイエンス社製）を用いてＭＣＦ７−１４細胞へ導入した。操作は当該キットに添付された資料に基づいて行った。
ブラストサイジンＳ塩酸塩が１０μｇ／ｍＬとなるよう添加した実施例２（１）記載の培地で細胞を培養し、３〜５日毎に培地を交換して薬剤耐性を持つ細胞を選択した。得られた耐性株の中からＳＬＣ６Ａ６を過剰発現している細胞を選び出すため、培養したＭＣＦ７−１４及び遺伝子導入した細胞それぞれを８０％コンフルエントとなるよう９６ウエルプレートに植え、３７℃、５％ＣＯ２下で１６時間培養した。
培養上清を除去後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液（ＷＡＫＯ社製）を１００μＬ添加し、１０分間室温で反応させた。ホルマリン溶液を除去後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、風乾させることで各々の細胞を固定化したプレートを作製した。
抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社、クローン９Ｅ１０）をＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈し、一次抗体として固定化プレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、シグナルを観察し、ＭＣＦ７−１４よりもシグナルの高い株を３種類選択した。
（４）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ
上記（３）で得られた３種類の細胞を１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。細胞に２×ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２％（ｗ／ｖ）Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．２％（ｗ／ｖ）ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）を２００μＬ添加し１分間氷上に放置した後、スクレーパーで細胞溶液を回収した。超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ社）で３０秒間細胞を破砕し、抽出液を得た。それぞれの細胞について抽出液を作製し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定後、同じタンパク質量となるよう調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後、トランスブロットＳＤセル（バイオラッド社）を用い、メーカー推奨のプロトコールに従いＰＶＤＦメンブレン（ＰＩＥＲＣＥ社）にタンパク質を転写した。ＴＢＳ−Ｔに５％（ｗ／ｖ）となるよう溶解したスキムミルクを用いて、室温で３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで２回洗浄を行った。ｃ−ｍｙｃ抗体をＴＢＳ−Ｔで１μｇ／ｍＬに希釈し、メンブレンと１時間、室温で反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄後、二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで１万倍に希釈した。メンブレンと室温で３０分反応させた後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。メンブレンをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸したのち、ラップしてＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）でシグナルを検出した。
結果を図２に示す。
図２は、ＳＬＣ６Ａ６遺伝子を導入した細胞（１〜３）、および遺伝子を導入していない細胞（４）に関して、タンパク質発現を解析した結果である。最も発現が顕著であったクローン１を以下の実験に用いた。
（５）細胞の移植
１０ｃｍシャーレに９０％コンフルエントになるまで培養した細胞を、トリプシン（ＧＩＢＣＯ社）を用いて回収し、ＰＢＳ（−）（０．０１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、０．１３８Ｍ  ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で２回洗浄した。洗浄後の細胞を最終濃度が８．６×１０７細胞／ｍＬとなるようグロースファクターリデューストマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に懸濁し、移植するまで氷上で保存した。
生理食塩水に３．５％（ｗ／ｖ）となるよう抱水クロラール（Ｓｉｇｍａ社製）を溶解して、３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を調製した。６〜８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＬｃｌ−ｎｕ／ｎｕ系統（日本クレア社製））の腹腔内に３．５％抱水クロラール生理食塩水溶液を０．２ｍＬ投与して麻酔した。マウスの第４乳腺に、マトリゲルに懸濁した細胞を１乳腺あたり１×１０６個、２４Ｇの注射針を用いて乳腺からはみ出さないよう移植した。１匹のマウスに対して、２箇所の移植となるように、胴体左右両方の第４乳腺にそれぞれ移植を行った。
（６）スクリーニング用ＳＬＣ６Ａ６部分タンパク質の発現と精製
実施例２（３）に記載のｐＥＦ６ベクターに導入したＳＬＣ６Ａ６全長遺伝子から、細胞外領域であるアミノ酸残基１４３〜２１６の領域（配列番号８）をｐＥＴ３２ベクターにサブクローニングした。以下のｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲを行なった。
プライマー配列
2012029990.tif 000003
ＰＣＲ反応は、９４℃、２分間のプレインキュベーションを行なった後、９８℃、１０秒間のデナチュレーション、５８℃、３０秒間のアニーリング、および６８℃、３０秒間のエロンゲーションのサイクルを３０サイクル行い、遺伝子断片を増幅した。
得られた増幅断片は、Ｐｒｉｍｅｒ上に配置した制限酵素（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ）を用いて、ｐＥＴ３２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）へ組み込んだ。
増幅断片の塩基配列をＤＮＡシーケンスにより確認したところ、データベースと同じ細胞外領域の遺伝子配列が組み込まれ、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇ配列が付加されていることを確認した。
このベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し、１％（ｗ／ｖ）のグルコースを含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）トリプトン（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｉｇｍａ社）、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ社））で培養した。培地の濁度が６００ｎｍの波長で０．６となった後、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ＷＡＫＯ社）を加え、１６時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収後、超音波破砕を行い、ＳＬＣ６Ａ６細胞外領域を含む分画を不溶性タンパク質として得た。
約１０ｍｇのサンプルをＢｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ塩酸グアニジン（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社））に溶解し、３７℃で１時間反応させた。反応液を１ＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．４ｍＭ酸化型グルタチオン（Ｓｉｇｍａ社）、ｐＨ８．５）に緩やかに加え、４℃で１８時間撹拌した。溶解したサンプルをＮｉ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ社）に供し、Ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ８．０）で溶出した。Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含まないＢｕｆｆｅｒ  Ｃに透析して、精製したＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域部分タンパク質を得た。
（７）抗血清の解析
上記（６）で得た組換えタンパク質を１０μｇ／ｍｌまたはＰＢＳを１００μＬずつ、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ｗｅｌｌプレート（ヌンク社）に入れ、室温で１時間プレートに吸着させた。吸着後、ウエルをＴＢＳ−Ｔ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄した後、５％となるようＴＢＳ−Ｔで希釈したスキムミルク（ＧＩＢＣＯ社）を入れ、３０分室温でブロッキングを行った。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、上記（５）で移植したマウスの尾静脈より回収した血漿をＴＢＳ−Ｔで１／２０００倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートへ１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で１時間反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
二次抗体として、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識（ＢＥＴＨＹＬ社製）をＴＢＳ−Ｔで５千倍に希釈した。前記抗体の希釈液を１ウエルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。各ウエルを２００μＬのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるようオルソフェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０ｍＭの炭酸−クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）に希釈し、この溶液の１万分の１量の３５％（ｗ／ｗ）過酸化水素水（ＷＡＫＯ社製）を添加した混合液を基質溶液として各ウエルに１００μＬ入れ、室温で１０分間反応させた。２５μＬの３Ｎ硫酸（ＷＡＫＯ社製）を添加することで反応を停止させた。４９２ｎｍの吸収をプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＰｕｒｅ３８４、モレキュラーデバイス社製）で測定して、抗体の力価を解析した（図３）。
（８）細胞融合
上記（７）で抗血清中の力価を確認できたマウスの脾臓由来のリンパ球を、５０％（ｖ／ｗ）ポリエチレングリコール４０００（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、従来法でマウス骨髄腫株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８（ＡＴＣＣ受託番号  ＣＲＬ−１５８０）と融合させた。
融合後の細胞をＨＡＴ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、各ウエル１００μＬとなるよう２０枚の９６ウエルプレートに散布した。途中、ＨＡＴ培地を２００μＬ添加し、１１〜１６日間培養後に顕微鏡下で観察すると、１ウエルあたり１〜６個のコロニーが形成された。
（９）モノクローナル抗体の取得
移植７ヶ月後に脾臓細胞を取り出し、上記（８）に記載の方法でハイブリドーマ細胞を作製した。ＳＬＣ６Ａ６を認識する抗体を選択するために、上記（３）及び（７）記載の方法を用いてクローンの選択を行った。一次抗体としては、細胞の培養上清を用い、二次抗体としては、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体−ＨＲＰ標識を用いた。
結果を図４に示す。
図４は、得られたクローンを上記（７）と同様の方法で解析した結果である。以下の解析では、クローン４Ｂ９ｂと５Ｈ１２ｄの２つのハイブリドーマ細胞が生産する抗体を用いて解析を進めた。以下では、それぞれのハイブリドーマ細胞が作る抗体を４Ｂ９ｂ抗体、５Ｈ１２ｄ抗体と記載することがある。
（１０）Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ
４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体の特性を解析するために、３種類の大腸がん細胞（ＨＴ２９、ＳＷ４８０、ＬＯＶＯ）を用いて、上記（４）と同様のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法によりＳＬＣ６Ａ６の検出を行った。比較対象として、ポリクローナル抗体であるＨＰＡ０１５０２８（Ａｔｌａｓ社）を用いた。抗体は、それぞれ１μｇ／ｍＬに精製したものを用いた。
図５に結果を示す。ＳＬＣ６Ａ６は、全長タンパク質の場合、（ｉ）の付近にバンドが現れる。ＨＰＡ０１５０２８（図５Ｃ）は、ＳＬＣ６Ａ６をＳＷ４８０およびＬＯＶＯにおいて検出できたものの、ＳＷ４８０は弱く、ＬＯＶＯは非常に弱いシグナルであった。ＨＴ２９ではＳＬＣ６Ａ６のシグナルを検出できなかった。４Ｂ９ｂ（図５Ｂ）及び５Ｈ１２ｄ抗体（図５Ａ）は、いずれの大腸がん細胞においてもＳＬＣ６Ａ６を検出でき、また、ポリクローナル抗体であるＨＰＡ０１５０２８よりも明らかに検出感度が高いことがわかる。実際に、ＨＰＡ０１５０２８では見られなかったＨＴ２９のシグナルも明瞭に検出できた。加えて、ＨＰＡ０１５０２８とは異なり、Ｃ末端側が欠けた分子量の小さいバリアントのバンド（主に（ｉｉ）の付近）も複数観察されていた。これにより、ポリクローナル抗体ＨＰＡ０１５０２８では検出感度が低いが、本発明のモノクローナル抗体は高い感度を有することが明確に示された。
（１１）免疫染色
４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体を用い、３種類の大腸がん細胞（ＨＴ−２９、ＳＷ４８０、ＬＯＶＯ）の免疫染色を行った。細胞をガラストに培養し、上記（３）に記載の方法で抗体を細胞と反応させた。一次抗体としては、４Ｂ９ｂ及び５Ｈ１２ｄの培養上清を一次抗体として用い、Ａｌｅｘａ４８８標識したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を１／２５００希釈したものを二次抗体として用い、蛍光顕微鏡により観察を行った（図６Ａ〜Ｃ）。図６Ａ〜Ｃは上から、蛍光シグナル（抗体特異的な反応）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色（核）、ｍｅｒｇｅ（重ね合わせ）、可視光を示す。
図６の結果から、本発明のモノクローナル抗体は、がん細胞の免疫染色においてもＳＬＣ６Ａ６を認識し、免疫染色によるＳＬＣ６Ａ６またはＳＬＣ６Ａ６を有するがん細胞の検出に使用できることが示された。
（１２）組織染色
４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体を用いて免疫染色を行った。パラフィン固定後、薄切したヒト大腸がん組織（Ｂｉｏｃｈａｉｎ）をキシレンで脱パラフィン処理、エタノールで親水化した。０．３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水で２０分間処理した後、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、加圧水蒸気下（１２０度）で１０分間処理し、抗原賦活化を行った。３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで処理した後、４Ｂ９ｂ抗体および５Ｈ１２ｄ抗体それぞれと４℃、１６時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、パーオキシダーゼ標識抗マウス２次抗体（ＤＡＫＯ社）で室温１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＤＡＢ試薬（ＤＡＫＯ社）で５分間発色させた。蒸留水で水洗後、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（ＷＡＫＯ）を用いて核を染色し、流水洗浄後、エタノール、キシレンの順に処理して、封入した。
図７に２症例についての免疫染色の結果（図７ＡおよびＢ）、およびがん組織と正常組織についての免疫染色の結果（図７Ｃ）を示した。がん部が特異的に染色されていることが示された。
なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、２０１０年９月１日に出願し、本願優先権主張の基礎となる特願ＪＰ２０１０−１９５９２６号の特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の開示内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明により、ＳＬＣ６Ａ６の細胞外領域に特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。本発明の抗体は、ＳＬＣ６Ａ６を発現する細胞の特異的な検出、測定に用いることができる。
本発明の検出方法は、ＳＬＣ６Ａ６の発現量に反映される、大腸がんを含む各種がんの診断に利用することができる。
本発明の検出方法、検査キットを用いて、被験者から採取された生体試料中のＳＬＣ６Ａ６を検出または定量することにより、がんへの罹患が疑われる患者のスクリーニング、がんの予知、状態、経過の判断を行うことが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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