(57)【要約】  本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＴＩＭ−３の機能に拮抗する抗体を提供する。提供されるのはまた、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作るための発現ベクター及び宿主細胞、ならびにこれらの抗体を用いて対象を治療する方法である。
2019520809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、その際、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含み、
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２はＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１はＸ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳであり；
（ｅ）ＣＤＲＬ２はＸ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり； 
（ｆ）ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＬまたはＩである、前記単離された抗体。
【請求項２】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
前記抗体はヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行し、
ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
【請求項３】
（ａ）ＣＤＲＨ１が、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含み、
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２がＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＬ１がＸ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳであり；
（ｄ）ＣＤＲＬ２がＸ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり； 
（ｅ）ＣＤＲＬ３がＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＬまたはＩである、請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＣＤＲＨ１がＸ１Ｘ２ＮＡＷＳ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、配列中：Ｘ１はＲまたはＡであり；Ｘ２はＱまたはＲである請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＣＤＲＨ１がＸ１Ｘ２ＧＱＸ３Ｓ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、配列中：Ｘ１はＫ、Ｍ、またはＧであり；Ｘ２はＡまたはＳであり；Ｘ３はＳまたはＴである請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
ＣＤＲＨ１がＸ１Ｘ２ＱＱＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含み、配列中：Ｘ１はＳ、Ｒ、Ｔ、またはＧであり；Ｘ２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＧである請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
ＣＤＲＨ１が、配列番号１及び４〜１２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ＣＤＲＬ１が、配列番号１３〜１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項９】
ＣＤＲＬ２が、配列番号１７〜２１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
ＣＤＲＬ３が、配列番号２２及び２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３がそれぞれ配列番号１、２、及び３；４、２、及び３；５、２、及び３；６、２、及び３；７、２、及び３；８、２、及び３；９、２、及び３；１０、２、及び３；１１、２、及び３；または１２、２、及び３に記述されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３がそれぞれ、配列番号１３、１７、及び２２；１４、１７、及び２２；１５、１８、及び２２；１４、１９、及び２２；１４、２０、及び２２；１４、２１、及び２２；１６、２０、及び２２；または１４、１７、及び２３に記述されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３がそれぞれ、配列番号１、２、３、１４、２１、及び２２；４、２、３、１４、２１、及び２２；５、２、３、１４、２１、及び２２；６、２、３、１４、２１、及び２２；７、２、３、１４、２１、及び２２；８、２、３、１４、２１、及び２２；９、２、３、１４、２１、及び２２；１０、２、３、１４、２１、及び２２；１１、２、３、１４、２１、及び２２；または１２、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号１、２、３、１４、２１及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
【請求項１５】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号５、２、３、１４、２１及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
【請求項１６】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号９、２、３、１４、２１及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
【請求項１７】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３がそれぞれ配列番号１、２、３、１５、１８及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
【請求項１８】
前記抗体がヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行する請求項１〜１７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体がヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行する、前記単離された抗体。
【請求項２０】
以下の工程：
（ａ）ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞をウェル当たり２×１０４個にて組織培養プレートに入れることと、
（ｂ）１００μｌ／ウェルの最終容量で１１１１ｎｇ／ｍｌのαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び１１１１ｎｇ／ｍｌの抗体またはｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）を加えることと、
（ｃ）３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートすることと、
（ｄ）前記ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞の生存率を測定することと、
（ｅ）未処理のヒトＴＩＭ−３発現細胞に比べた細胞生存の比率を算出すること
とを含むアッセイにて
前記ｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）の存在下よりも前記抗体の存在下で低い比率の前記ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞が生き残る、請求項１８または１９に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
前記抗体の存在下での細胞生存の前記比率がｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）の存在下での細胞生存の前記比率よりも少なくとも５０％低い請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
以下の工程：
（ａ）ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞をウェル当たり２×１０４個にて組織培養プレートに入れることと、
（ｂ）１００μｌ／ウェルの最終容量で１１１１ｎｇ／ｍｌのαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び１１１１ｎｇ／ｍｌの抗体またはＨｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）を加えることと、
（ｃ）３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートすることと、
（ｄ）前記ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞の生存率を測定することと、
（ｅ）未処理のヒトＴＩＭ−３発現細胞に比べた細胞生存の比率を算出すること
とを含むアッセイにて
前記Ｈｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）の存在下よりも前記抗体の存在下で低い比率の前記ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞が生き残る、請求項１８または１９に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
前記抗体の存在下での細胞生存の前記比率がＨｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）の存在下での細胞生存の前記比率よりも少なくとも５０％低い請求項２２に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
前記ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞がＫａｓｕｍｉ−３細胞である請求項２〜２３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
前記ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞が、ヒトＴＩＭ−３を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞である請求項２〜２３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
前記抗体が配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
前記抗体が、配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む請求項１〜２５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２８】
前記重鎖可変領域が、配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項２７に記載の単離された抗体。
【請求項２９】
前記重鎖可変領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む請求項２８に記載の単離された抗体。
【請求項３０】
前記重鎖可変領域が配列番号２８のアミノ酸配列を含む請求項２８に記載の単離された抗体。
【請求項３１】
前記重鎖可変領域が配列番号３２のアミノ酸配列を含む請求項２８に記載の単離された抗体。
【請求項３２】
前記抗体が、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項１〜３１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３３】
前記抗体が、配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項１〜３１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３４】
前記軽鎖可変領域が配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項３３に記載の単離された抗体。
【請求項３５】
前記軽鎖可変領域が配列番号４６のアミノ酸配列を含む請求項３４に記載の単離された抗体。
【請求項３６】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、前記単離された抗体。
【請求項３７】
前記重鎖可変領域が配列番号２５のアミノ酸配列を含む請求項３６に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
前記重鎖可変領域が配列番号２８のアミノ酸配列を含む請求項３６に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
前記重鎖可変領域が配列番号３２のアミノ酸配列を含む請求項３６に記載の単離された抗体。
【請求項４０】
前記抗体が配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む請求項３７に記載の単離された抗体。
【請求項４１】
前記抗体が配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む請求項３８に記載の単離された抗体。
【請求項４２】
前記抗体が配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む請求項３９に記載の単離された抗体。
【請求項４３】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記抗体が、配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、前記単離された抗体。
【請求項４４】
前記軽鎖可変領域が配列番号４６のアミノ酸配列を含む請求項４３に記載の単離された抗体。
【請求項４５】
前記抗体が配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む請求項４４に記載の単離された抗体。
【請求項４６】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記抗体が重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域がそれぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む、前記単離された抗体。
【請求項４７】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域がそれぞれ、配列番号２５及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む請求項４６に記載の単離された抗体。
【請求項４８】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域がそれぞれ、配列番号２８及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む請求項４６に記載の単離された抗体。
【請求項４９】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域がそれぞれ、配列番号３２及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む請求項４６に記載の単離された抗体。
【請求項５０】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記抗体が、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、前記単離された抗体。
【請求項５１】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記抗体が、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、前記単離された抗体。
【請求項５２】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記抗体が、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、前記単離された抗体。
【請求項５３】
前記抗体が、ヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５４】
前記抗体が、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−２０、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５５】
ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する単離された抗体であって、
前記抗体が、ヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−２０、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、前記単離された抗体。
【請求項５６】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２から成る群から選択される重鎖定常領域を含む請求項１〜３９、４３〜４９及び５３〜５５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５７】
前記重鎖定常領域がＩｇＧ１である請求項１〜３９、４３〜４９及び５３〜５５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５８】
ＩｇＧ１のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７Ａの変異を含む請求項５７に記載の単離された抗体。
【請求項５９】
前記抗体が、配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む請求項５８に記載の単離された抗体。
【請求項６０】
ＩｇＧ１のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７Ｑの変異を含む請求項５７に記載の単離された抗体。
【請求項６１】
前記ＩｇＧ１が非フコシル化ＩｇＧ１である請求項５７に記載の単離された抗体。
【請求項６２】
前記重鎖定常領域がＩｇＧ４である請求項１〜３９、４３〜４９及び５３〜５５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６３】
ＩｇＧ４のアミノ酸配列が、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＳ２２８Ｐの変異を含む請求項６２に記載の単離された抗体。
【請求項６４】
前記抗体が、配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む請求項６３に記載の単離された抗体。
【請求項６５】
前記抗体が、ヒトＩｇＧκ及びＩｇＧλから成る群から選択される軽鎖定常領域を含む請求項１〜４４、４６〜４９及び５３〜６４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６６】
前記軽鎖定常領域がＩｇＧκである請求項１〜４４、４６〜４９及び５３〜６４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６７】
前記抗体が、配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む請求項６６に記載の単離された抗体。
【請求項６８】
ヒトＴＩＭ−３への結合について先行請求項のいずれか１項に記載の抗体と交差競合する単離された抗体。
【請求項６９】
先行請求項のいずれか１項に記載の抗体と同じヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項７０】
前記抗体が、配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質に対するよりも低い親和性で配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３に特異的に結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７１】
前記抗体が、配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３に特異的に結合しない先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７２】
前記抗体が、配列番号７９の残基４０に結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７３】
前記抗体が、配列番号９３のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７４】
前記抗体が、配列番号９４のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７５】
前記抗体が、配列番号９５のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７６】
前記抗体が、配列番号９６のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７７】
前記抗体が、配列番号９７のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７８】
前記抗体が、配列番号９８のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７９】
前記抗体が、配列番号９９のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８０】
前記抗体が、配列番号１００のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８１】
前記抗体が、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域の変異体であるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、前記変異体ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、前記野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に結合するよりも低い親和性で前記ヒトＦｃガンマ受容体に結合する請求項６８〜８０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８２】
前記ヒトＦｃガンマ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩから成る群から選択される請求項８１に記載の単離された抗体。
【請求項８３】
前記変異体ヒトＩｇＧ重鎖定常領域が、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７Ａの変異を含むＩｇＧ１の定常領域である請求項８１に記載の単離された抗体。
【請求項８４】
前記抗体がヒト抗体である先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８５】
前記抗体が、ヒトＴＩＭ−３に対して拮抗性である先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８６】
前記抗体が、ヒトＴＩＭ−３の活性を失活させる、低減するまたは阻害する請求項８５に記載の単離された抗体。
【請求項８７】
前記抗体が、ヒトＴＩＭ−３のホスファチジルセリンへの結合を阻害する請求項８５に記載の単離された抗体。
【請求項８８】
前記抗体が、ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）によって刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮγの産生を誘導する請求項８５に記載の単離された抗体。
【請求項８９】
前記抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によるＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生を誘導する請求項８５に記載の単離された抗体。
【請求項９０】
前記抗体が、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行する先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項９１】
細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、毒素、放射性核種、または検出可能な標識に結合される先行請求項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項９２】
先行請求項のいずれか１項に記載の抗体と、薬学上許容できるキャリアまたは賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項９３】
請求項１〜９１のいずれか１項に記載の抗体の重鎖及び／または軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９４】
請求項９３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９５】
請求項９３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項９４に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項９６】
ヒトＴＩＭ−３に結合する抗体を作製する方法であって、前記方法は、前記ポリヌクレオチドが発現され、前記抗体が産生されるように請求項９６に記載の宿主細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項９７】
対象にて抗原に応答したＴ細胞の活性化を高める方法であって、前記方法は請求項１〜９２のいずれか１項に記載の、有効量の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項９８】
対象にてがんを治療する方法であって、前記方法は請求項１〜９２のいずれか１項に記載の、有効量の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項９９】
前記抗体または医薬組成物が皮下に、または静脈内に投与される請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗体または医薬組成物が腫瘍内に投与される請求項９７または９８に記載の方法。
【請求項１０１】
さらに、前記対象に追加の治療剤を投与することを含む請求項９７〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記追加の治療剤が、化学療法剤、放射線治療剤、またはチェックポイント標的化剤である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記チェックポイント標的化剤が、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ−３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、及びアゴニスト抗ＯＸ４０抗体から成る群から選択される請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記追加の治療剤が抗ＰＤ−１抗体であり、任意でその際、前記抗ＰＤ−１抗体がペムブロリズマブまたはニボルマブである請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記追加の治療剤がインドールアミン−２,３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記阻害剤が、エパカドスタット、Ｆ００１２８７、インドキシモド及びＮＬＧ９１９から成る群から選択される請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記阻害剤がエパカドスタットである請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記追加の治療剤がワクチンである請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ワクチンが抗原性ペプチドと複合体形成した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記熱ショックタンパク質がｈｓｃ７０であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体形成する請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記熱ショックタンパク質がｇｐ９６であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体形成し、前記ＨＳＰＰＣは対象の腫瘍に由来する請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
がんまたは感染性疾患の治療にて使用するための請求項１〜９２のいずれか１項に記載の単離された抗体または医薬組成物。
【請求項１１３】
がんまたは感染性疾患を治療するために薬物を調製するための請求項１〜９２のいずれか１項に記載の単離された抗体または医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年５月２７日に出願された米国仮特許出願番号６２／３４２，６１０；及び２０１６年１１月１０日に出願された米国仮特許出願番号６２／４２０，２７６の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン−３（ＴＩＭ−３）は免疫グロブリン（Ｉｇ）のスーパーファミリーにおけるＩ型膜タンパク質である。それは、細胞外可変Ｉｇ様（ＩｇＶ）ドメインと、細胞外ムチン様ドメインと、６つの保存されたチロシン残基を伴う細胞質ドメインとを有する（Ｍｏｎｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３６−４１）。ＴＩＭ−３は活性化されたＴヘルパー１型（Ｔｈ１）及びＣＤ８＋Ｔ（Ｔｃ１）リンパ球、一部のマクロファージ（Ｍｏｎｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３６−４１）、活性化されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（Ｎｄｈｌｏｖｕ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｂｌｏｏｄ，１１９（１６）：３７３４−４３）及びＩＬ−１７産生Ｔｈ１７細胞（Ｎａｋａｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．８１：１２５８−６８）で発現されている。
【０００４】
研究は、ＴＩＭ−３が、Ｔ細胞、骨髄細胞及びＮＫ細胞が介在する応答を阻害し、免疫寛容を促進するように機能することを示している。たとえば、ＴＩＭ−３リガンドに結合し、中和する、免疫グロブリンドメインに融合させたＴＩＭ−３  ＩｇＶペプチドは免疫したマウスにてＴｈ１細胞の過剰増殖及びＴｈ１サイトカインの放出を引き起こした（Ｓａｂａｔｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１１０２−１０）。実際、抗ＴＩＭ−３抗体の生体内投与は多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫脳脊髄炎の病理学的重症度を高めた（Ｍｏｎｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１５：５３６−４１）。さらに、ＴＩＭ−３の発現はがん患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞にて上方調節される。たとえば、進行した黒色腫の患者におけるＮＹ−ＥＳＯ−１に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のおよそ３０％はＴＩＭ−３発現の上方調節を示す（Ｆｏｕｒｃａｄｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２１７５−８６）。
【０００５】
免疫応答を調節することにおけるヒトＴＩＭ−３の見かけの役割を考えると、ＴＩＭ−３のシグナル伝達に拮抗するように設計された治療剤は、ＴＩＭ−３が介在する免疫抑制を伴う疾患の治療にかなり有望である。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＴＩＭ−３の機能、たとえば、ＴＩＭ−３が介在する免疫抑制に拮抗する抗体を提供する。提供されるのはまた、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作るための発現ベクター及び宿主細胞、ならびにこれらの抗体を用いて対象を治療する方法である。本明細書で開示されている抗体は、抗原（たとえば、腫瘍抗原または感染症抗原）に応答したＴ細胞の活性化を高めるのに及び／またはＴｒｅｇが介在する免疫抑制を減らすのに特に有用であるので、対象にてがんを治療するのにまたは対象にて感染性疾患を治療するのに特に有用である。
【０００７】
従って、態様の１つでは、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含み、
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２はＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１はＸ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳであり；
（ｅ）ＣＤＲＬ２はＸ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり； 
（ｆ）ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＬまたはＩである。
【０００８】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含み、その際、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含み、
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２はＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１はＸ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳであり；
（ｅ）ＣＤＲＬ２はＸ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり； 
（ｆ）ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＬまたはＩである。
【０００９】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、該抗体はヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行し、ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域とを含み、その際、該抗体はヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行し、ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
特定の実施形態では、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含み、
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２はＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＬ１はＸ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳであり；
（ｄ）ＣＤＲＬ２はＸ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり； 
（ｅ）ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＬまたはＩである。
【００１２】
特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１はＸ１Ｘ２ＮＡＷＳ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、配列中：Ｘ１はＲまたはＡであり；Ｘ２はＱまたはＲである。特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１はＸ１Ｘ２ＧＱＸ３Ｓ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、配列中：Ｘ１はＫ、Ｍ、またはＧであり；Ｘ２はＡまたはＳであり；Ｘ３はＳまたはＴである。特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１はＸ１Ｘ２ＱＱＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含み、配列中：Ｘ１はＳ、Ｒ、Ｔ、またはＧであり；Ｘ２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＧである。特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１及び４〜１２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号１３〜１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲＬ２は配列番号１７〜２１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲＬ３は配列番号２２及び２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は、それぞれ配列番号１、２、及び３；４、２、及び３；５、２、及び３；６、２、及び３；７、２、及び３；８、２、及び３；９、２、及び３；１０、２、及び３；１１、２、及び３；または１２、２、及び３に記述されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１３、１７、及び２２；１４、１７、及び２２；１５、１８、及び２２；１４、１９、及び２２；１４、２０、及び２２；１４、２１、及び２２；１６、２０、及び２２；または１４、１７、及び２３に記述されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、２、３、１４、２１、及び２２；４、２、３、１４、２１、及び２２；５、２、３、１４、２１、及び２２；６、２、３、１４、２１、及び２２；７、２、３、１４、２１、及び２２；８、２、３、１４、２１、及び２２；９、２、３、１４、２１、及び２２；１０、２、３、１４、２１、及び２２；１１、２、３、１４、２１、及び２２；または１２、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００１７】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００１９】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００２０】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号５、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００２１】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号９、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号９、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ１、２、３、１５、１８、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の態様では、本開示は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域と相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号１、２、３、１５、１８、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、抗体はヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、抗体はヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行する。
【００２７】
特定の実施形態では、以下の工程（ａ）ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞をウェル当たり２×１０４個にて組織培養プレートに入れることと、（ｂ）１００μｌ／ウェルの最終容量で１１１１ｎｇ／ｍｌのαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び１１１１ｎｇ／ｍｌの抗体またはｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）を加えることと、（ｃ）３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートすることと、（ｄ）ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞の生存を測定することと、（ｅ）未処理のヒトＴＩＭ−３発現細胞に比べた細胞生存の比率を算出することとを含むアッセイにて、ｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）の存在下よりも抗体の存在下の方で低い比率のヒトＴＩＭ−３発現細胞が生き残る。特定の実施形態では、抗体の存在下での細胞生存の比率はｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）の存在下での細胞生存の比率より少なくとも５０％低い。特定の実施形態では、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞はＫａｓｕｍｉ−３細胞である。特定の実施形態では、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞はＫａｓｕｍｉ−３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２７２５（商標））である。特定の実施形態では、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞は、ヒトＴＩＭ−３を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞である。
【００２８】
特定の実施形態では、以下の工程（ａ）ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞をウェル当たり２×１０４個にて組織培養プレートに入れることと、（ｂ）１００μｌ／ウェルの最終容量で１１１１ｎｇ／ｍｌのαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び１１１１ｎｇ／ｍｌの抗体またはＨｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）を加えることと、（ｃ）３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートすることと、（ｄ）ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞の生存を測定することと、（ｅ）未処理のヒトＴＩＭ−３発現細胞に比べた細胞生存の比率を算出することとを含むアッセイにて、Ｈｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）の存在下よりも抗体の存在下の方で低い比率のヒトＴＩＭ−３発現細胞が生き残る。特定の実施形態では、抗体の存在下での細胞生存の比率はＨｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）の存在下での細胞生存の比率より少なくとも５０％低い。特定の実施形態では、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞はＫａｓｕｍｉ−３細胞である。特定の実施形態では、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞はＫａｓｕｍｉ−３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２７２５（商標））である。特定の実施形態では、ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞は、ヒトＴＩＭ−３を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞である。
【００２９】
特定の実施形態では、抗体は配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は、配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【００３０】
特定の実施形態では、抗体は配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号４６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の軽鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【００３１】
別の態様では、本開示は、配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号７０、７１、７２、７３、７４または７５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【００３２】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号２４〜３５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２５のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号３２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号７０、７１、７２、７３、７４または７５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００３３】
別の態様では、本開示は、配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号４６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の軽鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【００３４】
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号３６〜４７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号４６のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３５】
別の態様では、本開示は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号２５及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号２８及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３２及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられ、及び／または抗体の軽鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【００３６】
別の態様では、本開示は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む抗体または単離された抗体を提供し、その際、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２８及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３２及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。
【００３７】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、その際、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号２５及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号２８及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はそれぞれ配列番号３２及び４６に記述されているアミノ酸配列を含む。
【００３８】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、その際、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２８及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。特定の実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３２及び４６に記述されているアミノ酸配列から成る。
【００３９】
別の態様では、本開示は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体または単離された抗体を提供する。
【００４０】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００４１】
別の態様では、本開示は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体または単離された抗体を提供する。
【００４２】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００４３】
別の態様では、本開示は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体または単離された抗体を提供する。
【００４４】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００４５】
特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられ、及び／または抗体の軽鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【００４６】
特定の実施形態では、抗体はヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−２０、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４７】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、該抗体は、ヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−２０、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２から成る群から選択される重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、重鎖定常領域はＩｇＧ１である。特定の実施形態では、ＩｇＧ１のアミノ酸配列はＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７Ａの変異を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ１のアミノ酸配列はＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７Ｑの変異を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧ１は非フコシル化ＩｇＧ１である。特定の実施形態では、重鎖定常領域はＩｇＧ４である。特定の実施形態では、ＩｇＧ４のアミノ酸配列はＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＳ２２８Ｐの変異を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、抗体はヒトのＩｇＧκ及びＩｇＧλから成る群から選択される軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、軽鎖定常領域はＩｇＧκである。特定の実施形態では、抗体は配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、軽鎖定常領域はＩｇＧλである。
【００５０】
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３への結合について本明細書で開示されているような抗体と交差競合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３への結合についてそれぞれ配列番号５５及び５６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と交差競合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３への結合についてそれぞれ配列番号２５及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と交差競合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３への結合についてそれぞれ配列番号２８及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と交差競合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３への結合についてそれぞれ配列番号３２及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と交差競合する抗体または単離された抗体を提供する。
【００５１】
別の態様では、本開示は、本明細書で開示されている抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、それぞれ配列番号５５及び５６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、それぞれ配列番号２５及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、それぞれ配列番号２８及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、それぞれ配列番号３２及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに結合する抗体または単離された抗体を提供する。
【００５２】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、該抗体は配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質に対するよりも低い親和性で配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質に特異的に結合する。
【００５３】
別の態様では、本開示は、本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。一実施形態では、抗体は配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質に対するよりも低い親和性で配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質に特異的に結合する。
【００５４】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、該抗体は配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質に特異的に結合しない。
【００５５】
別の態様では、本開示は、本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。一実施形態では、抗体は配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質に特異的に結合しない。
【００５６】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、抗体と配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質との間の結合は、抗体と配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質との間の結合に比べて実質的に弱められる。
【００５７】
別の態様では、本開示は本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。一実施形態では、抗体と配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質との間の結合は、抗体と配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質との間の結合に比べて実質的に弱められる。
【００５８】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質への結合に比べて配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質への結合の低下または結合がないことを示す。
【００５９】
別の態様では、本開示は本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、配列番号７９のアミノ酸配列を有する野生型ＴＩＭ−３タンパク質への結合に比べて配列番号１０１のアミノ酸配列を有する変異体ＴＩＭ−３タンパク質への結合の低下または結合がないことを示す。
【００６０】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する、たとえば、特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は配列番号７９の残基４０に結合する。
【００６１】
別の態様では、本開示は本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は配列番号７９の残基４０に結合する。
【００６２】
別の態様では、本開示はヒトＴＩＭ−３のエピトープに結合する、たとえば、特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９３のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９４のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９５のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９６のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９７のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９８のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９９のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号１００のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。
【００６３】
別の態様では、本開示は本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９３のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９４のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９５のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９６のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９７のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９８のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号９９のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。特定の実施形態では、抗体は配列番号１００のアミノ酸配列から成るヒトＴＩＭ−３の領域の範囲内に位置するエピトープに結合する。
【００６４】
別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９３に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９３に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９４に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９４に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９５に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９５に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９６に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９６に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９７に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９７に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる抗体を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９８に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９８に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる抗体を提供する。一部の実施形態では、水素／重水素交換の低下は、たとえば、実施例にて本明細書に記載されているような水素／重水素交換（ＨＤＸ）を用いて測定される。
【００６５】
別の態様では、本開示は本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９３に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９３に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９４に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９４に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９５に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９５に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９６に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９６に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９７に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９７に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３タンパク質または配列番号１０２のアミノ酸配列を含むその断片に結合するとき、水素／重水素アッセイによって判定されるように、抗体の非存在下での配列番号９８に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換に比べて配列番号９８に記述されているアミノ酸配列から成る領域における水素／重水素交換を低下させる。一部の実施形態では、水素／重水素交換の低下は、たとえば、実施例にて本明細書に記載されているような水素／重水素交換（ＨＤＸ）を用いて測定される。
【００６６】
別の態様では、本開示は本発明の抗体とヒトＴＩＭ−３の同じエピトープに結合する、たとえば、特異的に結合する抗体または単離された抗体を提供し、その際、該エピトープは、たとえば、実施例に記載されているような水素／重水素交換（ＨＤＸ）によって、たとえば、実施例に記載されているようなＰｅｐｓｃａｎ解析によって、またはたとえば、実施例に記載されているようなアラニン走査によって決定される。
【００６７】
特定の実施形態では、抗体は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域の変異体であるヒトＩｇＧ重鎖定常領域を含み、その際、変異体ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に結合するよりも低い親和性でヒトＦｃガンマ受容体に結合する。特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩから成る群から選択される。特定の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧ重鎖定常領域はＮ２９７Ａの変異を含むＩｇＧ１の定常領域である。
【００６８】
特定の実施形態では、抗体はヒト抗体である。特定の実施形態では、抗体はヒトＴＩＭ−３に対して拮抗する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＴＩＭ−３の活性を失活させる、低下させるまたは阻害する。特定の実施形態では、抗体はヒトＴＩＭ−３のホスファチジルセリンへの結合を阻害する。特定の実施形態では、抗体はブドウ球菌腸毒素（ＳＥＡ）によって刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＦＮγの産生を誘導する。特定の実施形態では、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によるＩＦＮγまたはＴＮＦαの産生を誘導する。
【００６９】
特定の実施形態では、抗体はヒトＴＩＭ−３を発現している細胞に結合する際、内部移行する。
【００７０】
別の態様では、本開示は細胞傷害剤に結合された本明細書で開示されているような抗体または単離された抗体を提供する。
【００７１】
別の態様では、本開示は細胞増殖抑制剤に結合された本明細書で開示されているような抗体または単離された抗体を提供する。
【００７２】
別の態様では、本開示は毒素に結合された本明細書で開示されているような抗体または単離された抗体を提供する。
【００７３】
別の態様では、本開示は放射線核種に結合された本明細書で開示されているような抗体または単離された抗体を提供する。
【００７４】
別の態様では、本開示は検出可能な標識に結合された本明細書で開示されているような抗体または単離された抗体を提供する。
【００７５】
別の態様では、本開示は本明細書で開示されているような抗体と薬学上許容できるキャリアまたは賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００７６】
別の態様では、本開示は本明細書で開示されているような抗体の重鎖及び／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の態様では、本開示はポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を提供する。別の態様では、本開示はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。別の態様では、本開示は本明細書で開示されているような抗体を作製する方法を提供し、該方法はポリヌクレオチドが発現され、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む。一実施形態では、方法は試験管内の方法である。
【００７７】
一実施形態では、本発明は、薬物として使用するための本発明の抗体、または本発明の医薬組成物、または本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクター、または本発明の組換え宿主細胞に関する。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、診断剤として使用するための本発明の抗体、また本は発明の医薬組成物、または本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクター、または本発明の組換え宿主細胞に関する。
【００７９】
別の態様では、本開示は対象にて抗原に応答したＴ細胞の活性化を高める方法を提供し、該方法は本明細書で開示されているような有効量の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本開示は対象にてがんを治療する方法を提供し、該方法は本明細書で開示されているような有効量の抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。前述の方法の特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は皮下に投与される。前述の方法の特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は静脈内に投与される。前述の方法の特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は腫瘍内に投与される。前述の方法の特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は腫瘍流入領域リンパ節に送達される。前述の方法の特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は動脈内に投与される。
【００８０】
態様の１つでは、本発明は抗原に応答したＴ細胞の活性化を高める方法で使用するための本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物に関する。
【００８１】
態様の１つでは、本発明は対象にて抗原に応答したＴ細胞の活性化を高める方法で使用するための本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物に関する。
【００８２】
態様の１つでは、本発明は、有効量の本発明のポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物を対象に投与することを含む、対象にて抗原に応答したＴ細胞の活性化を高める方法で使用するための本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物に関する。
【００８３】
態様の１つでは、本発明は、がんの治療方法で使用するための本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物に関する。
【００８４】
態様の１つでは、本発明は、対象におけるがんの治療方法で使用するための本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物に関する。
【００８５】
態様の１つでは、本発明は、有効量の本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療方法で使用するための本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物に関する。
【００８６】
本発明の使用のための抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物の一実施形態では、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物は皮下にまたは静脈内に投与される。本発明の使用のための抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物の別の実施形態では、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物は腫瘍内または動脈内に投与される。
【００８７】
特定の実施形態では、前述の方法はさらに、対象に追加の治療剤を投与することを含む。従って、本発明の方法での使用のための抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物の一実施形態では、方法はさらに、対象に追加の治療剤を投与することを含む。
【００８８】
態様の１つでは、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物、及び（ｂ）薬物として使用するための追加の治療剤に関する。
【００８９】
態様の１つでは、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物、及び（ｂ）がんの治療方法で使用するための追加の治療剤に関する。
【００９０】
態様の１つでは、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物と、（ｂ）追加の治療剤とを含む医薬組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。
【００９１】
特定の実施形態では、追加の治療剤は化学療法剤である。特定の実施形態では、追加の治療剤は放射線治療剤である。
【００９２】
特定の実施形態では、追加の治療剤はチェックポイント標的化剤である。特定の実施形態では、チェックポイント標的化剤は、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ−３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体、アンタゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、及びアゴニスト抗ＯＸ４０抗体から成る群から選択される。特定の実施形態では、追加の治療剤は抗ＰＤ−１抗体である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はペムブロリズマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブである。
【００９３】
特定の実施形態では、追加の治療剤はインドールアミン−２,３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。特定の実施形態では、阻害剤は、エパカドスタット、Ｆ００１２８７、インドキシモド及びＮＬＧ９１９から成る群から選択される。特定の実施形態では、阻害剤はエパカドスタットである。特定の実施形態では、阻害剤はＦ００１２８７である。特定の実施形態では、阻害剤はインドキシモドである。特定の実施形態では、阻害剤はＮＬＧ９１９である。
【００９４】
特定の実施形態では、追加の治療剤はワクチンである。特定の実施形態では、ワクチンは、抗原ペプチドと複合体形成した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質はｈｓｃ７０であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体形成する。特定の実施形態では、熱ショックタンパク質はｇｐ９６タンパク質であり、腫瘍関連抗原性ペプチドと複合体形成し、その際、ＨＳＰＰＣは対象から得られた腫瘍に由来する。特定の実施形態では、追加の治療剤はＴＣＲを含む。特定の実施形態では、追加の治療剤は可溶性ＴＣＲである。特定の実施形態では、追加の治療剤はＴＣＲを発現している細胞である。特定の実施形態では、追加の治療剤はキメラ抗原受容体を発現している細胞である。特定の実施形態では、追加の治療剤はペプチド・ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体である。特定の実施形態では、追加の治療剤はアジュバントである。態様の１つでは、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物、及び（ｂ）たとえば、がんの治療方法で使用するための薬物として使用するためのワクチンに関するものであり、その際、任意で、ワクチンは抗原性ペプチドと複合体形成した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。態様の１つでは、本発明は、（ａ）本発明の抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、組換え宿主細胞及び／または医薬組成物と、（ｂ）ワクチンとを含む医薬組成物、キットまたはキットオブパーツに関するものであり、その際、任意で、ワクチンは抗原性ペプチドと複合体形成した熱ショックタンパク質を含む熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】フローサイトメトリーで測定したときの、野生型マウス１６２４−５細胞またはヒトＴＩＭ−３を発現するように操作した１６２４−５細胞への抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２０８５（ＩｇＧ１）及びｐａｂ２０８８（ＩｇＧ１）またはアイソタイプ対照抗体の結合を示すヒストグラムのセットである。
【図２】Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで測定したときの、組換えヒトＴＩＭ−１  Ｈｉｓ（ｒｈＴＩＭ−１  Ｈｉｓ）、組換えヒトＴＩＭ−４  Ｈｉｓ（ｒｈＴＩＭ−４  Ｈｉｓ）、組換えヒトＴＩＭ−３  Ｈｉｓ（ｒｈＴＩＭ−３  Ｈｉｓ）、組換えヒトＴＩＭ−３  Ｆｃ（ｒｈＴＩＭ−３  Ｆｃ）、及び組換えカニクイザルＴＩＭ−３  Ｆｃ（ｒｃｍＴＩＭ−３  Ｆｃ）に対する抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２０８５（ＩｇＧ１）（図２Ａ）及びｐａｂ２０８８（ＩｇＧ１）（図２Ｂ）の結合を示す一対のグラフである。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値は抗体濃度に対してプロットする。
【図３】フローサイトメトリーで測定したときの、ヒトＴＩＭ−３（図３Ａ及び図３Ｂ）またはカニクイザルＴＩＭ−３（図３Ｃ及び図３Ｄ）を発現するように操作したマウス１６２４−５細胞への抗ＴＩＭ抗体またはアイソタイプ対照抗体の結合を示すヒストグラムのセットである。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１７３、ｐａｂ２１７４、ｐａｂ２１７５、ｐａｂ２１７６、ｐａｂ２１７７、ｐａｂ２１７８、ｐａｂ２１７９、ｐａｂ２１８０、ｐａｂ２１８１、ｐａｂ２１８２、ｐａｂ２１８３、ｐａｂ２１８４、ｐａｂ２１８５、ｐａｂ２１８６、ｐａｂ２１８７、ｐａｂ２１８８、ｐａｂ２１８９、  ｐａｂ２１９０、ｐａｂ２１９１、及びｐａｂ２１９２が挙げられ、そのすべてはＩｇＧ１のＦｃ領域を含有する。
【図４】フローサイトメトリーで測定した、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で活性化した初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２０８５、軽鎖最適化変異体（ｐａｂ２１８４、ｐａｂ２１８６、ｐａｂ２１８７、ｐａｂ２１８８、ｐａｂ２１８９、ｐａｂ２１９０、ｐａｂ２１９１、及びｐａｂ２１９２）、またはアイソタイプ対照抗体の結合を示すグラフである。軽鎖最適化変異体はＩｇＧ１変異体Ｆｃ領域を含有する。調べた一連の抗体濃度に対してＭＦＩ値をプロットする。
【図５】フローサイトメトリーで測定した、初代カニクイザルＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞に対する抗ＴＩＭ−３抗体、ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）またはアイソタイプ対照抗体の結合を示すグラフである。ＭＦＩ値は調べた一連の抗体濃度に対してプロットする。
【図６】用量設定した抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の存在下での放射線照射したホスファチジルセリン発現ＷＲ１９Ｌマウスリンパ腫細胞と組換えヒトＴＩＭ−３  Ｆｃ（図６Ａ）または組換えカニクイザルＴＩＭ−３  Ｆｃ（図６Ｂ）との間の結合のパーセントを示すグラフである。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体はｐａｂ２０８５（ＩｇＧ１）及びｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）である。
【図７】ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）の刺激の際にヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にて抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブと組み合わせた抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体によって誘導されたＩＦＮγの産生を示す棒グラフである。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、軽鎖最適化変異体ｐａｂ２１７５（ＩｇＧ１）、ｐａｂ２１７６（ＩｇＧ１）、ｐａｂ２１８０（ＩｇＧ１）、ｐａｂ２１８２（ＩｇＧ１）、ｐａｂ２１８３（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１８４（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１８６（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１８９（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１９０（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１９１（ＩｇＧ１変異体）、及びｐａｂ２１９２（ＩｇＧ１変異体）が挙げられる。
【図８】ＳＥＡ刺激の際にヒトＰＢＭＣにて抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａ）またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の単独、または抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとの組み合わせによって誘導されたＩＦＮγの産生を示す一連の棒グラフである。図８Ａ〜８Ｆで示された試験で使用したプロトコールは図７で示された試験で使用したプロトコールから改変した。
【図９】ＴＩＭ−３を発現している細胞に対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合を示すグラフまたはヒストグラムである。図９Ａ、９Ｂ、９Ｅ及び９Ｆでは、調べた抗体の一連の濃度に対してＭＦＩ値をプロットする。図９Ｃ及び図９ＤはＴＩＭ−３を発現している細胞に対する抗ＴＩＭ−３抗体の結合を示すヒストグラムのセットである。調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−１（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−３（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−４（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−５（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−７（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−８（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、及びＡＭ−９（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）が含まれる。調べた細胞は、異所性にＴＩＭ−３を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞（図９Ａ）、内在性にＴＩＭ−３を発現しているヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＫａｓｕｍｉ−３（図９Ｂ）、ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）で刺激したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｃ）、ＳＥＡで刺激したカニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｄ）、及びヒト初代（図９Ｅ）及びカニクイザル（図９Ｆ）のＣＤ１４＋骨髄細胞だった。
【図１０】Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで測定した、組換えヒトＴＩＭ−３  Ｈｉｓ（ｒｈＴＩＭ−３  Ｈｉｓ）、組換えカニクイザルＴＩＭ−３  Ｆｃ（ｒｃｍＴＩＭ−３  Ｆｃ）、組換えマウスＴＩＭ−３  Ｆｃ（ｒｍＴＩＭ−３  Ｆｃ）、組換えヒトＴＩＭ−１  Ｈｉｓ（ｒｈＴＩＭ−１  Ｈｉｓ）、組換えヒトＴＩＭ−４  Ｈｉｓ（ｒｈＴＩＭ−４  Ｈｉｓ）、組換えヒトＯＸ４０  Ｈｉｓ（ｒｈＯＸ４０  Ｈｉｓ）、組換えヒトＧＩＴＲ  Ｆｃ（ｒｈＧＩＴＲ  Ｆｃ）、組換えヒトＤＲ３  Ｆｃ（ｒｈＤＲ３  Ｆｃ）、及び組換えヒトＣＤ１３７  Ｆｃ（ｒｈＣＤ１３７  Ｆｃ）に対する抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａアイソタイプ対照抗体の結合を示すグラフである。抗体濃度に対してＭＦＩ値をプロットする。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）（図１０Ｂ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）（図１０Ｃ）、及びＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）（図１０Ｄ）が含まれる。
【図１１】用量設定した抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａアイソタイプ対照抗体の存在下でのホスファチジルセリンを発現しているＷＲ１９Ｌ細胞に対する組換えヒトＴＩＭ−３  Ｆｃ（図１１Ａ）または組換えカニクイザルＴＩＭ−３  Ｆｃ（図１１Ｂ）の結合のパーセントを示すグラフである。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）及びＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）が含まれる。
【図１２】ＳＥＡ刺激の際に異なる２人のドナーに由来するヒトＰＢＭＣにて抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａアイソタイプ対照抗体の単独、または抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとの組み合わせによって誘導されたＩＦＮγの産生を示す棒グラフである。調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−１（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−３（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−４（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−５（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−７（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、及びＡＭ−８（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）が含まれる。
【図１３】抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａアイソタイプ対照抗体の単独、または抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとの組み合わせによって誘導された初代腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によるＩＦＮγまたはＴＮＦαの産生を示すグラフである。ＴＩＬは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（図１３Ａ及び図１３Ｂ）、胆嚢腺癌（図１３Ｃ及び図１３Ｄ）または乳癌（１３Ｅ及び１３Ｆ）から単離し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズで活性化した。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、及びＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）が含まれる。
【図１４】抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧ１  Ｎ２９７Ａアイソタイプ対照抗体とのインキュベートの後、未処理の対照群と比べた細胞生存のパーセントを示すグラフである。図１４Ａ及び１４Ｂは二次抗体薬剤コンジュゲートαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１との組み合わせでの示した抗体による処理を示す。調べた細胞は、ＴＩＭ−３を過剰発現するように操作したＪｕｒｋａｔ細胞（図１４Ａ）または内在性にＴＩＭ−３を発現している急性骨髄性白血病細胞株であるＫａｓｕｍｉ−３細胞（図１４Ｂ）だった。図１４ＣはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）とのコンジュゲートとして示された抗体による処理を示す。この試験で調べた抗ＴＩＭ−３抗体には、ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、及び参照抗体Ｈｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）及びｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）が含まれる。
【図１５】種々の時点（すなわち、０〜３．５時間）で生細胞の共焦点蛍光顕微鏡によって判定したとき、１０μｇ／ｍＬの抗ＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２またはアイソタイプ対照抗体と共にインキュベートした場合のＨａｌｏタグ−ＴＩＭ−３融合タンパク質を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞におけるＴＩＭ−３の内部移行を示す一連のグラフである。黒い点は所与の時点で各条件について観察された平均蛍光レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＴＩＭ−３の機能、たとえば、ＴＩＭ−３が介在する免疫抑制に拮抗する抗体を提供する。提供されるのはまた、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作るための発現ベクター及び宿主、ならびにこれらの抗体を用いて対象を治療する方法である。本明細書で開示されている抗体は、抗原（たとえば、腫瘍抗原または感染症抗原）に応答したＴ細胞の活性化を高めるのに特に有用であり、従って対象にてがんを治療するまたは対象にて感染性疾患を治療するもしくは予防するのに特に有用である。本明細書で開示されている「単離された抗体」の例はすべて、単離されてもよいが、単離される必要はない抗体としてさらに熟考される。本明細書で開示されている「単離されたポリヌクレオチド」の例はすべて、単離されてもよいが、単離される必要はないポリヌクレオチドとしてさらに熟考される。本明細書で開示されている「抗体」の例はすべて、単離されてもよいが、単離される必要はない抗体としてさらに熟考される。本明細書で開示されている「ポリヌクレオチド」の例はすべて、単離されてもよいが、単離される必要はないポリヌクレオチドとしてさらに熟考される。
【００９７】
６．１  定義
本明細書で使用されるとき、用語「約」及び「およそ」は数値または数的範囲を修正するのに使用される場合、値または範囲を５％〜１０％上回る（たとえば、５％〜１０％まで上回る）及び５％〜１０％下回る（たとえば、５％〜１０％まで下回る）逸脱が引用された値または範囲の意図される意味の範囲内のままであることを示す。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、用語「ＴＩＭ−３」は、ヒトではＨＡＶＣＲ２遺伝子によってコードされているＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン−３（Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有−３タンパク質またはＡ型肝炎ウイルス細胞性受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても知られる）を指す。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号Ｑ８ＴＤＱ０−１は例となるヒトＴＩＭ−３のアミノ酸配列を提供している。ヒトＴＩＭ−３の未成熟のアミノ酸配列は配列番号７８として提供されている。ヒトＴＩＭ−３の成熟アミノ酸配列は配列番号７９として提供されている。本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＴＩＭ−３」は配列番号７９のアミノ酸配列を含むＴＩＭ−３を指す。
【００９９】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体（単数）」及び「抗体（複数）」には、完全長の抗体、完全長の抗体の抗原結合断片、及び抗体のＣＤＲ、ＶＨ領域またはＶＬ領域を含む分子が含まれる。抗体の例には、モノクローナル抗体、組換えで生産した抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖と２つの軽鎖の分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖と抗体重鎖のペア、イントラボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、抗体・薬剤コンジュゲート、単一ドメイン抗体、一価の抗体、単鎖抗体または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、抗抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のいずれかの抗原結合断片が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体はポリクローナル抗体の集団を指す。抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹ）、任意のクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（たとえば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）であることができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体はＩｇＧ抗体またはそのクラス（たとえば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）またはサブクラスである。具体的な実施形態では、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。別の具体的な実施形態では、抗体はヒトモノクローナル抗体である。
【０１００】
本明細書で使用されるとき、用語「ＶＨ領域」及び「ＶＬ領域」はそれぞれ、ＦＲ（フレームワーク領域）１、２、３、及び４ならびにＣＤＲ（相補性決定領域）１、２及び３を含む単一抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を指す（全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）を参照のこと）。
【０１０１】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は重鎖及び軽鎖のポリペプチド双方の可変領域内に見いだされる不連続な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１），ｂｙ  Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７），及びＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載されており、そのすべては全体として参照によって本明細書に組み入れられ、その際、定義には、互いに対して比べた場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットが含まれる。特定の実施形態では、用語「ＣＤＲ」はＭａｃＣａｌｌｕｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）及びＭａｒｔｉｎ，Ａ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，”ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，ｐｐ．４２２−４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）にて定義されたようなＣＤＲである。特定の実施形態では、用語「ＣＤＲ」はＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ,ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって定義されたようなＣＤＲである。特定の実施形態では、抗体の重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲは異なる慣例を用いて定義される。たとえば、特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って定義され、軽鎖ＣＤＲはＫａｂａｔ（上記）に従って定義される。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３は重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３は軽鎖ＣＤＲを示す。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、用語「フレームワーク（ＦＲ）のアミノ酸残基」は免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域におけるそれらのアミノ酸を指す。用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」は本明細書で使用されるとき、可変領域の一部であるが、ＣＤＲ（たとえば、ＣＤＲのＫａｂａｔまたはＭａｃＣａｌｌｕｍの定義を用いた）の部分ではないアミノ酸残基を含む。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、用語「可変領域」及び「可変ドメイン」は相互交換可能に使用され、当該技術で共通である。可変領域は通常、抗体の一部、一般に軽鎖及び重鎖の一部、通常成熟重鎖におけるアミノ末端のおよそ１１０〜１２０のアミノ酸または１１０〜１２５のアミノ酸及び成熟軽鎖におけるおよそ９０〜１１５アミノ酸を指し、それは抗体間で配列が広範に異なり、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合及び特異性に使用される。配列の多様性は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるそれらの領域に集中する一方で、可変領域におけるさらに高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。特定のメカニズムまたは理論に束縛されるのを望まないで、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは抗体の抗原との相互作用及び特異性に主として関与すると考えられている。特定の実施形態では、可変領域はヒト可変領域である。特定の実施形態では、可変領域は齧歯類またはマウスのＣＤＲとヒトのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。特定の実施形態では、可変領域は霊長類（たとえば、非ヒト霊長類）の可変領域である。特定の実施形態では、可変領域は齧歯類またはマウスのＣＤＲと霊長類（たとえば、非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。
【０１０４】
用語「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」は抗体の軽鎖可変領域を指すのに相互交換可能に使用される。
【０１０５】
用語「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」は抗体の重鎖可変領域を指すのに相互交換可能に使用される。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、用語「定常領域」及び「定常ドメイン」は相互交換可能であり、当該技術で共通である。定常領域は、抗体の一部であり、たとえば、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、たとえば、Ｆｃ受容体（たとえば、Ｆｃガンマ受容体）との相互作用のような種々のエフェクター機能を示すことができる軽鎖及び／または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は一般に免疫グロブリンの可変ドメインに比べてさらに保存されたアミノ酸配列を有する。
【０１０７】
本明細書で使用されるとき、抗体を参照して使用される場合、用語「重鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいた任意の異なる型、たとえば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）を指すことができ、それは、ＩｇＧのサブクラス、たとえば、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、それぞれ抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのクラスを生じる。
【０１０８】
本明細書で使用されるとき、抗体を参照して使用される場合、用語「軽鎖」は定常ドメインのアミノ酸配列に基づいた任意の異なる型、たとえば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）を指すことができる。軽鎖のアミノ酸配列は当該技術で周知である。具体的な実施形態では、軽鎖はヒト軽鎖である。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、「ＥＵ番号付け方式」は、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＥｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５（１９６９）及びＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１に記載されたような抗体の定常領域についてのＥＵ番号付けの慣例を指す。
【０１１０】
「結合親和性」は一般に、分子（たとえば、抗体）の単結合部位とその結合相手（たとえば、抗原）との間での非共有結合の相互作用の合計の強度を指す。特に指示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は結合ペア（たとえば、抗体と抗原）のメンバー間での１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙについての親和性は一般に解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡会合定数（ＫＡ）を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の多数の方法によって測定することができ、及び／または表現することができる。ＫＤは、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの商から算出され、ＫＡはＫｏｎ／Ｋｏｆｆの商から算出される。Ｋｏｎは、たとえば、抗体の抗原への会合速度の定数を指し、Ｋｏｆｆは抗体の抗原に対する解離速度の定数を指す。Ｋｏｎ及びＫｏｆｆは、当業者に既知の技法、たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはＫｉｎＥｘＡによって決定することができる。本明細書で使用されるとき、「低親和性」は大きなＫＤを指す。
【０１１１】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、「免疫特異的に結合する」及び「免疫特異的に認識する」は抗体の文脈で類似する用語であり、そのような結合は当業者によって理解されているので、抗原（たとえば、エピトープまたは免疫複合体）に結合する分子を指す。たとえば、抗原に特異的に結合する分子は、たとえば、免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）またはＫｉｎＥｘＡ３０００機器（Ｓａｏｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）、または当該技術で既知の他のアッセイによって測定されたとき、一般に低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドに結合することができる。具体的な実施形態では、抗原に特異的に結合する分子は、分子が別の抗原に非特異的に結合する場合のＫＡよりも少なくとも２ｌｏｇ（たとえば、１０の倍数）、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ以上のＫＡで抗原に結合する。
【０１１２】
別の具体的な実施形態では、抗原に特異的に結合する分子は、類似の結合条件下では他のタンパク質と交差反応しない。別の具体的な実施形態では、ＴＩＭ−３に特異的に結合する分子は他の非ＴＩＭ−３タンパク質と交差反応しない。具体的な実施形態では、本明細書で提供されるのは、別の無関係な抗原よりも高い親和性でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に結合する抗体である。特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、たとえば、放射性免疫アッセイ、表面プラスモン共鳴または結合平衡除外アッセイによって測定されるとき、別の無関係な抗原よりも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上高い親和性でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に結合する抗体である。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３抗体の無関係な非ＴＩＭ−３タンパク質に対する結合の程度は、たとえば、放射性免疫アッセイによって測定されるとき、ＴＩＭ−３タンパク質に対する抗体の結合の１０％、１５％または２０％未満である。
【０１１３】
本明細書で使用されるとき、Ｆｃの文脈における用語「アフコシル化」または「アフコシル化された」は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、または非ＩｇＧ１もしくは非ヒトＩｇＧ１の免疫グロブリンにおける残基に相当するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域の残基２９７に直接または間接的に共有結合されるフコースの実質的な欠如を指す。従って、複数のアフコシル化された抗体を含む組成物では、抗体の少なくとも７０％は抗体のＦｃ領域の残基２９７にて直接または間接的に（たとえば、介在糖を介して）フコシル化されないであろうし、一部の実施形態では、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％がＦｃ領域の残基２９７にて直接または間接的にフコシル化されないであろう。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき、「エピトープ」は当該技術における用語であり、抗体が特異的に結合することができる抗原の局所領域を指す。エピトープは、たとえば、ポリペプチドの隣接するアミノ酸であることができ（線状のまたは連続するエピトープ）、またはエピトープは、たとえば、ポリペプチド（単数）もしくはポリペプチド（複数）の２以上の不連続の領域から集まることができる（立体構造の、非線状の、非連続的な、または不連続のエピトープ）。特定の実施形態では、抗体が結合するエピトープは、たとえば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分光分析と合わせた水素／重水素交換（たとえば、液体クロマトグラフィエレクトロスプレー質量分光分析）、アレイに基づくオリゴ・ペプチド走査アッセイ（たとえば、不連続なまたは立体構造のエピトープをマッピングするためのＣＬＩＰＳ（足場へのペプチドの化学結合）を用いてペプチドを制限すること）、及び／または変異誘発マッピング（たとえば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。Ｘ線結晶学については、結晶化は当該技術で既知の方法のいずれかを用いて達成されてもよい（たとえば、ＧｉｅｇｅＲ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，５０（Ｐｔ  ４）：３３９−３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９９０），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２３；Ｃｈａｙｅｎ．ＮＥ，（１９９７），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：１２６９−１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９７６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００−６３０３、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。抗体：抗原の結晶は周知のＸ線回折法を用いて研究されてもよいし、たとえば、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．；たとえば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８５），ｖｏｌｕｍｅｓ  １１４  ＆  １１５，ｅｄｓ，Ｗｙｃｋｏｆｆ，ＨＷ．ｅｔ  ａｌ．，；Ｕ．Ｓ．２００４／００１４１９４），及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  Ｇ（１９９３），Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４９（Ｐｔ  １）：３７−６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  Ｇ（１９９７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６Ａ：３６１−４２３，ｅｄ．Ｃａｒｔｅｒ，ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５６（Ｐｔ  １０）：１３１６−１３２３を参照のこと、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）のようなコンピュータソフトウエアを用いて精緻化してもよい。変異誘発マッピングの研究は当業者に既知の方法を用いて達成されてもよい。アラニン走査変異誘発法を含む変異誘発法の記載については、たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＣｈａｍｐｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＢＣ．＆  Ｗｅｌｌｓ，ＪＡ．（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５を参照のこと。ＣＬＩＰＳ（足場へのペプチドの化学結合）は、複合体タンパク質ドメインの機能的模倣体として挙動するように構造的に制約された構成で１以上のペプチドを提示する技術である。たとえば、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国公開番号ＵＳ２００８／０１３９４０７Ａ１及びＵＳ２００７／０９９２４０Ａ１、及び米国特許第７，９７２，９９３号を参照のこと。具体的な実施形態では、抗体のエピトープはアラニン走査変異誘発試験を用いて決定される。具体的な実施形態では、抗体のエピトープは質量分光法と合わせた水素／重水素交換を用いて決定される。具体的な実施形態では、抗体のエピトープはＰｅｐｓｃａｎ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＣＬＩＰＳエピトープマッピング技術を用いて決定される。
【０１１５】
本明細書で使用されるとき、特定のアミノ酸配列またはアミノ酸残基のセットから成る「ヒトＴＩＭ−３の領域内に位置するエピトープ」は特定された領域のアミノ酸残基の１以上を含むエピトープを指し、その際、特定された領域はヒトＴＩＭ−３の領域の最初の特定されたアミノ酸残基と最後の特定されたアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、エピトープは特定された領域内に位置するアミノ酸残基の各１つを含む。特定の実施形態では、特定された領域の外側のヒトＴＩＭ−３の１以上の追加のアミノ酸残基は特定された領域内に位置するエピトープと一緒に抗体に結合する。
【０１１６】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｔ細胞受容体」及び「ＴＣＲ」は相互交換可能に使用され、完全長のヘテロ二量体αβまたはγδＴＣＲ、完全長ＴＣＲの抗原結合断片、及びＴＣＲのＣＤＲまたは可変領域を含む分子を指す。ＴＣＲの例には、完全長ＴＣＲ、完全長ＴＣＲの抗原結合断片、膜貫通及び細胞質の領域を欠く可溶性ＴＣＲ、柔軟なリンカーによって連結されたＴＣＲの可変領域を含有する単鎖ＴＣＲ、操作されたジスルフィド結合によって連結されたＴＣＲ鎖、単一特異性ＴＣＲ、多重特異性ＴＣＲ（二重特異性ＴＣＲを含む）、ＴＣＲ融合体、ヒトＴＣＲ、ヒト化ＴＣＲ、キメラＴＣＲ、組換えで産生されたＴＣＲ、及び合成のＴＣＲが挙げられるが、これらに限定されない。その用語は野生型ＴＣＲ及び遺伝的に操作されたＴＣＲ（たとえば、第１の種のＴＣＲに由来する第１の部分と第２の種のＴＣＲに由来する第２の部分とを含むキメラＴＣＲ鎖を含むキメラＴＣＲ）を包含する。
【０１１７】
本明細書で使用されるとき、用語「主要組織適合性複合体」及び「ＭＨＣ」は相互交換可能に使用され、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子を指す。
【０１１８】
本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド・ＭＨＣ複合体」はＭＨＣの当該技術で認識されたペプチド結合ポケットにて結合したペプチドを伴ったＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ）を指す。
【０１１９】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」及び「治療」は本明細書に記載されている治療上または予防上の処置を指す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害または再発している疾患もしくは障害を予防する、治癒させる、遅延させる、その重症度を軽減する、またはその１以上の症状を改善するために、またはそのような治療の非存在下で予想されるものを超えて対象の生存を延長するために、疾患もしくは障害を有する対象、またはそのような疾患もしくは障害を有する素養がある対象への抗体の投与を採用する。
【０１２０】
本明細書で使用されるとき、対象への治療法の投与の文脈における用語「有効量」は所望の予防効果または治療効果を達成する治療法の量を指す。
【０１２１】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」には任意のヒトまたは非ヒト動物を含まれる。一実施形態では、対象はヒトまたは非ヒト哺乳類である。一実施形態では、対象はヒトである。
【０１２２】
２つの配列（たとえば、アミノ酸配列または核酸配列）の間での「パーセント同一性」の決定は数学的なアルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの具体的な非限定例は、それぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫａｒｌｉｎ，Ｓ．及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．（１９９３），ＰＮＡＳ，９０：５８７３−５８７７にあるように修正されたＫａｒｌｉｎ，Ｓ．及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．（１９９０），ＰＮＡＳ，８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴのプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴのヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴのヌクレオチドプログラムのパラメータ設定、たとえば、本明細書に記載されている核酸分子に相同性のヌクレオチド配列を得るためのスコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴのタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴのプログラムのパラメータ設定、たとえば、本明細書に記載されているタンパク質分子に相同性のアミノ酸配列を得るためのスコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較目的でギャップのある配列比較を得るには、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＡｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２に記載されたようにギャップのあるＢＬＡＳＴを利用することができる。或いは、ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴを使用して分子間の距離関係（Ｉｄ.）を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップがあるＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ  Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラムの（たとえば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）初期設定パラメータを使用することができる（たとえば、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）を参照のこと）。配列の比較について利用される数学的アルゴリズムの別の具体的な非限定例は、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＭｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列の配列比較ソフトウエアのパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するのにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用することができる。
【０１２３】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップがあるかどうかにかかわらず、上記に記載されているものに類似する技法を用いて決定することができる。パーセント同一性を算出することにおいて、通常正確な一致のみがカウントされる。
【０１２４】
本明細書で使用されるとき、用語「内部移行」または「内部移行される」は、細胞の表面で発現されている抗原に抗体が結合する際の、細胞の細胞内区画への抗体の取り込みを指す。
【０１２５】
６．２  抗ＴＩＭ−３抗体
態様の１つでは、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＴＩＭ−３の機能に拮抗する抗体を提供する。例となる抗体のアミノ酸配列を本明細書での表１〜４に記述する。
【表１】
2019520809.tif 000003
2019520809.tif 000004
2019520809.tif 000005
2019520809.tif 000006
2019520809.tif 000007
2019520809.tif 000008
2019520809.tif 000009
2019520809.tif 000010
2019520809.tif 000011
2019520809.tif 000012
2019520809.tif 000013
【表２】
2019520809.tif 000014
【表３】
2019520809.tif 000015
【表４】
2019520809.tif 000016
【表５】
2019520809.tif 000017
【表６】
2019520809.tif 000018
【０１２６】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は本明細書の表１に記述されているＶＨドメインのＣＤＲの１、２または３すべてを含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は表１に記述されているＶＨドメインの１つのＣＤＲＨ１を含む。特定の実施形態では、抗体は表１に記述されているＶＨドメインの１つのＣＤＲＨ２を含む。特定の実施形態では、抗体は表１に記述されているＶＨドメインの１つのＣＤＲＨ３を含む。
【０１２７】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は本明細書の表１に記述されているＶＬドメインのＣＤＲの１、２または３すべてを含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、抗体は表１に記述されているＶＬドメインの１つのＣＤＲＬ１を含む。特定の実施形態では、抗体は表１に記述されているＶＬドメインの１つのＣＤＲＬ２を含む。特定の実施形態では、抗体は表１に記述されているＶＬドメインの１つのＣＤＲＬ３を含む。
【０１２８】
特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＭａｃＣａｌｌｕｍ，ＲＭ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５に従って決定することができる。たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＭａｒｔｉｎ，Ａ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ，”ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，ｐｐ．４２２−４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）も参照のこと。特定の実施形態では、抗体の重鎖ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍに従って決定され、抗体の軽鎖ＣＤＲは異なる方法に従って決定される。
【０１２９】
特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）に従って決定することができる。特定の実施形態では、抗体の軽鎖ＣＤＲはＫａｂａｔに従って決定され、抗体の重鎖ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って決定される。
【０１３０】
特定の実施形態では、抗体のＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａの番号付けスキームに従って決定することができ、それは免疫グロブリンの構造ループの位置を参照する（たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，ＡＭ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１）：１７５−８２；ならびに米国特許第７，７０９，２２６号を参照のこと）。通常、Ｋａｂａｔの番号付けの慣例を使用する場合、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ１のループは重鎖アミノ酸２６〜３２、３３または３４に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ２のループは重鎖アミノ酸５２〜５６に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ３のループは重鎖アミノ酸９５〜１０２に存在する一方で、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＬ１のループは軽鎖アミノ酸２４〜３４に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＬ２のループは軽鎖アミノ酸５０〜５６に存在し、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＬ３のループは軽鎖アミノ酸８９〜９７に存在する。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲＨ１のループの末端はＫａｂａｔの番号付けの慣例を用いて番号を付ける場合、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変化する（これは、Ｋａｂａｔの番号付けスキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂにて挿入を配置し：３５Ａも３５Ｂも存在しなければ、ループは３２で終了し、３５Ａだけが存在すればループは３３で終了し、３５Ａ及び３５Ｂの双方が存在すればループは３４で終了するためである）。
【０１３１】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は本明細書の表１で開示されているＶＨのＣｈｏｔｈｉａＶＨのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は本明細書の表１で開示されているＶＬのＣｈｏｔｈｉａＶＬのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は本明細書の表１で開示されている抗体のＣｈｏｔｈｉａＶＨのＣＤＲ及びＣｈｏｔｈｉａＶＬのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体は１以上のＣＤＲを含み、その際、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＫａｂａｔのＣＤＲは同一のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組み合わせを含む単離された抗体を提供する。
【０１３２】
特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ，（１９９９），Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７：１３２−１３６及びＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２に記載されているようなＩＭＧＴ番号付け方式に従って決定することができる。ＩＭＧＴ番号付けスキームによれば、ＣＤＲＨ１は２６位〜３５位にあり、ＣＤＲＨ２は５１位〜５７位にあり、ＣＤＲＨ３は９３位〜１０２位にあり、ＣＤＲＬ１は２７位〜３２位にあり、ＣＤＲＬ２は５０位〜５２位にあり、ＣＤＲＬ３は８９位〜９７位にある。
【０１３３】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ、たとえば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ−Ｐ，（１９９９）上記及びＬｅｆｒａｎｃ，Ｍ−Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）上記に記載されているようなＩＭＧＴ番号付け方式によって決定されるような、表１で開示されている抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【０１３４】
特定の実施形態では、抗体のＣＤＲはＡｂＭ番号付けスキームに従って決定することができ、それはＡｂＭ超可変領域を参照し、それはＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間での妥協を表し、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウエア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）によって使用されている。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ、ＡｂＭ番号付けスキームによって決定されるような、本明細書の表１で開示されている抗体のＣＤＲを含む抗体を提供する。
【０１３５】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５に記述されているＶＨドメインのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記述されているＶＬドメインのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、各ＣＤＲはＭａｃＣａｌｌｕｍの定義、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせ、ＩＭＧＴの番号付け方式、またはＣＤＲのＡｂＭの定義に従って定義される。
【０１３６】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は以下を含む：
（ａ）ＣＤＲＨ１は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含み、
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
（ｂ）ＣＤＲＨ２はＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＣＤＲＨ３はＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＣＤＲＬ１はＸ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳであり；
（ｅ）ＣＤＲＬ２はＸ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含み
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり； 
（ｆ）ＣＤＲＬ３はＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＬまたはＩである。
【０１３７】
特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１はＸ１Ｘ２ＮＡＷＳ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＲまたはＡであり；Ｘ２はＱまたはＲである。特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１はＸ１Ｘ２ＧＱＸ３Ｓ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＫ、Ｍ、またはＧであり；Ｘ２はＡまたはＳであり；Ｘ３はＳまたはＴである。特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１はＸ１Ｘ２ＱＱＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含み、配列中、Ｘ１はＳ、Ｒ、Ｔ、またはＧであり；Ｘ２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＧである。特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号１及び４〜１２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号１３〜１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲＬ２は配列番号１７〜２１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲＬ３は配列番号２２及び２３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、それぞれ配列番号１、２、及び３；４、２、及び３；５、２、及び３；６、２、及び３；７、２、及び３；８、２、及び３；９、２、及び３；１０、２、及び３；１１、２、及び３；または１２、２、及び３に記述されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、それぞれ配列番号１、２、及び３に記述されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、それぞれ配列番号５、２、及び３に記述されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、それぞれ配列番号９、２、及び３に記述されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。
【０１３９】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、それぞれ配列番号１３、１７、及び２２；１４、１７、及び２２；１５、１８、及び２２；１４、１９、及び２２；１４、２０、及び２２；１４、２１、及び２２；１６、２０、及び２２；または１４、１７、及び２３に記述されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、それぞれ配列番号１４、２１及び２２に記述されているＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【０１４０】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域を含む軽鎖可変領域とを含み、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域はそれぞれ、配列番号１、２、３、１４、２１、及び２２；４、２、３、１４、２１、及び２２；５、２、３、１４、２１、及び２２；６、２、３、１４、２１、及び２２；７、２、３、１４、２１、及び２２；８、２、３、１４、２１、及び２２；９、２、３、１４、２１、及び２２；１０、２、３、１４、２１、及び２２；１１、２、３、１４、２１、及び２２；または１２、２、３、１４、２１、及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域を含む軽鎖可変領域とを含み、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域はそれぞれ配列番号１、２、３、１４、２１及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域を含む軽鎖可変領域とを含み、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域はそれぞれ配列番号５、２、３、１４、２１及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域を含む軽鎖可変領域とを含み、その際、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の領域は配列番号９、２、３、１４、２１及び２２に記述されているアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
特定の実施形態では、本開示は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（たとえば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号２４に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号２５に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号２６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号２７に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号２８に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号２９に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号３０に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号３１に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号３２に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号３３に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号３４に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号３５に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【０１４２】
特定の実施形態では、本開示は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（たとえば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３６に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３７に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３８に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号３９に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４０に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４１に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４２に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４３に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４４に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４５に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４６に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、配列番号４７に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の軽鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【０１４３】
特定の実施形態では、本開示は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号５６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（たとえば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記述されているアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（たとえば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記述されているアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び３６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び３８に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２６及び４２に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び４２に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び４３に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２６及び４３に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２６及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２６及び４１に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び４１に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び３９に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２４及び４７に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４０に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２６及び４７に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び３７に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４５に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４４に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４２に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４１に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４３に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２５及び４７に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２７及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２８及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号２９及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号３０及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号３１及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号３２及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号３３及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号３４及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号３５及び４６に記述されているアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられ、及び／または抗体の軽鎖可変領域のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【０１４４】
特定の実施形態では、本開示は、ヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列（たとえば、配列番号８４のアミノ酸配列を有するＩＧＨＶ３−２３＊０４）に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２から選択される１以上の領域（たとえば、これらの領域の２、３、４または５）はヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列（たとえば、配列番号８４のアミノ酸配列を有するＩＧＨＶ３−２３＊０４）に由来することができる。一実施形態では、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２はすべてヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列（たとえば、配列番号８４のアミノ酸配列を有するＩＧＨＶ３−２３＊０４）に由来する。
【０１４５】
特定の実施形態では、本開示は、ＩＧＫＶ１−２７（たとえば、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ１−２７＊０１）、ＩＧＫＶ３−１１（たとえば、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、ＩＧＫＶ３−２０（たとえば、配列番号８７のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１）、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０（たとえば、配列番号８８のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０＊０１）から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＬ１及びＣＤＲＬ２から選択される１以上の領域（たとえば、これらの領域の２、３、４または５）は、ＩＧＫＶ１−２７（たとえば、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ１−２７＊０１）、ＩＧＫＶ３−１１（たとえば、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、ＩＧＫＶ３−２０（たとえば、配列番号８７のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１）、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０（たとえば、配列番号８８のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０＊０１）から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来することができる。一実施形態では、フレームワーク１、フレームワーク２、フレームワーク３、ＣＤＲＬ１及びＣＤＲＬ２はすべてＩＧＫＶ１−２７（たとえば、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ１−２７＊０１）、ＩＧＫＶ３−１１（たとえば、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、ＩＧＫＶ３−２０（たとえば、配列番号８７のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１）、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０（たとえば、配列番号８８のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０＊０１）から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来する。
【０１４６】
特定の実施形態では、本開示は、ヒトＩＧＨＶ３−２３生殖細胞系列の配列（たとえば、配列番号８４のアミノ酸配列を有するＩＧＨＶ３−２３＊０４）に由来するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、ＩＧＫＶ１−２７（たとえば、配列番号８５のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ１−２７＊０１）、ＩＧＫＶ３−１１（たとえば、配列番号８６のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−１１＊０１）、ＩＧＫＶ３−２０（たとえば、配列番号８７のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３−２０＊０１）、及びＩＧＫＶ３Ｄ−２０（たとえば、配列番号８８のアミノ酸配列を有する、たとえば、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０＊０１）から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列の配列に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
【０１４７】
特定の実施形態では、本開示は、それぞれ配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体とＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）への結合について交差競合する単離された抗体を提供する。
【０１４８】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている抗体、たとえば、それぞれ配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と同じＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）のエピトープまたはＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）のそれと重複するエピトープに結合する単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、抗体のエピトープは、たとえば、ＮＭＲ分光法、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分光分析と合わせた水素／重水素交換（たとえば、液体クロマトグラフィエレクトロスプレー質量分光分析）、アレイに基づくオリゴ・ペプチド走査アッセイ、及び／または変異誘発マッピング（たとえば、部位特異的変異誘発マッピング）によって決定することができる。Ｘ線結晶学については、結晶化は当該技術で既知の方法のいずれかを用いて達成されてもよい（たとえば、Ｇｉｅｇｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，５０（Ｐｔ  ４）：３３９−３５０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９９０），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２３；Ｃｈａｙｅｎ．ＮＥ，（１９９７），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：１２６９−１２７４；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．（１９７６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００−６３０３、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）。抗体：抗原の結晶は周知のＸ線回折法を用いて研究されてもよいし、たとえば、Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９２，ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．；たとえば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８５），ｖｏｌｕｍｅｓ  １１４  ＆  １１５，ｅｄｓ，Ｗｙｃｋｏｆｆ，ＨＷ．ｅｔ  ａｌ．，；Ｕ．Ｓ．２００４／００１４１９４），及びＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  Ｇ（１９９３），Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．４９（Ｐｔ  １）：３７−６０；Ｂｒｉｃｏｇｎｅ  Ｇ（１９９７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６Ａ：３６１−４２３，ｅｄ．Ｃａｒｔｅｒ，ＣＷ；Ｒｏｖｅｒｓｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５６（Ｐｔ  １０）：１３１６−１３２３を参照のこと、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる）のようなコンピュータソフトウエアを用いて精緻化してもよい。変異誘発マッピングの研究は当業者に既知の方法を用いて達成されてもよい。アラニン走査変異誘発法を含���変異誘発法の記載については、たとえば、Ｃｈａｍｐｅ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），上記ならびのＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＢＣ．及びＷｅｌｌｓ，ＪＡ．（１９８９），上記を参照のこと。具体的な実施形態では、抗体のエピトープはアラニン走査変異誘発試験を用いて決定する。加えて、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の同じエピトープまたは重複するエピトープを認識し、結合する抗体は、免疫アッセイのような日常の技法を用いて、たとえば、別の抗体の標的抗原への結合を阻止する抗体の能力を示すことによって、すなわち、競合結合アッセイによって特定することができる。競合結合アッセイを用いて２つの抗体がエピトープについて類似の結合特異性を有するかどうかを判定することができる。競合結合は、たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）のような共通の抗原に対する参照抗体の特異的な結合を試験のもとでの免疫グロブリンが阻害するアッセイにて判定することができる。多数の競合結合アッセイ、たとえば、すべて全体として参照によって本明細書に組み入れられる、固相の直接または間接放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．、（１９８３），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９：２４２−２５３を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＴＮ．ｅｔ  ａｌ．、（１９８６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−９を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ.（１９８８），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌ，ＧＡ．ｅｔ  ａｌ．、（１９８８），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１）：７−１５を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇ，ＲＣ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７６：５４６−５２を参照のこと）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２を参照のこと）が知られている。通常、そのようなアッセイには、これらのいずれかを持つ固体表面または細胞に結合させた精製抗原（たとえば、ヒトＴＩＭ−３のようなＴＩＭ−３）、未標識の試験免疫グロブリン、及び標識した参照免疫グロブリンの使用が関与する。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合する標識の量を割り出すことによって測定することができる。普通、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。普通、競合抗体が過剰に存在する場合、それは共通抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％以上阻害するであろう。競合結合アッセイは、標識した抗原または標識した抗体のいずれかを用いて多数の異なる形式で構成することができる。このアッセイの共通版では、抗原を９６穴プレートに不動化する。次いで、放射活性がある標識または酵素の標識を��いて、標識した抗体の抗原への結合を阻止する未標識の抗体の能力を測定する。さらなる詳細については、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、Ｗａｇｅｎｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：２３０８−２３１５；Ｗａｇｅｎｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８４），ＪＩｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６８：２６９−２７４；Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：４８７２−４８７９；Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２１：５２３−５３８；Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１１：３９１−４０７及びＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ  ＆  Ｌａｎｅ  Ｄ  ｅｄｉｔｏｒｓ，上記，ｐｐ．３８６−３８９を参照のこと。
【０１４９】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、または６８に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号５７に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号５８に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号５９に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６０に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６１に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６２に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６３に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６４に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６５に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６６に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６７に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、抗体は配列番号６８に記述されているアミノ酸配列を含む重鎖を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【０１５０】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６９に記述されているアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の軽鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【０１５１】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号５７のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号６８のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗体の重鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられ、及び／または抗体の軽鎖のＮ末端グルタミン酸（Ｅ）残基はピログルタミン酸（ｐＥ）残基で置き換えられる。
【０１５２】
本明細書で開示されている抗体にて任意のＩｇ定常領域を使用することができる。特定の実施形態では、Ｉｇ領域はヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の任意のクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（たとえば、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ）である。
【０１５３】
特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号７０、７１、７２、７３、７４または７５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本開示は、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号７６または７７のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【０１５４】
特定の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、本明細書に記載されている抗体のＦｃ領域（たとえば、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１〜３４０）及び／またはＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１〜４４７）及び／またはヒンジ領域に１、２以上の変異（たとえば、アミノ酸置換）を導入して、たとえば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体の結合及び／または抗原依存性細胞傷害のような抗体の１以上の機能的特性を変える。
【０１５５】
特定の実施形態では、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，６７７，４２５号に記載されているように、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変える（たとえば、増やすまたは減らす）ように１、２以上の変異（たとえば、アミノ酸置換）をＦｃ領域（ＣＨ１ドメイン）のヒンジ領域に導入する。ＣＨ１ドメインのヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変えて、たとえば、軽鎖及び重鎖の構築を促してもよいし、または抗体の安定性を変えて（たとえば、高めてまたは低めて）もよい。
【０１５６】
具体的な実施形態では、１、２以上のアミノ酸の変異（たとえば、置換、挿入または欠失）をＩｇＧの定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃまたはヒンジ・Ｆｃドメインの断片）に導入して生体内での抗体の半減期を変える（たとえば、減らすまたは増やす）。たとえば、生体内での抗体の半減期を変える（たとえば、減らすまたは増やす）変異の例については、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ０２／０６０９１９；ＷＯ９８／２３２８９；及びＷＯ９７／３４６３１；及び米国特許第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第６，２７７，３７５号、及び同第６，１６５，７４５を参照のこと。一部の実施形態では、１、２以上のアミノ酸の変異（たとえば、置換、挿入または欠失）をＩｇＧの定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃまたはヒンジ・Ｆｃドメインの断片）に導入して生体内での抗体の半減期を減らす。他の実施形態では、１、２以上のアミノ酸の変異（たとえば、置換、挿入または欠失）をＩｇＧの定常領域またはそのＦｃＲｎ結合断片（好ましくはＦｃまたはヒンジ・Ｆｃドメインの断片）に導入して生体内での抗体の半減期を増やす。具体的な実施形態では、抗体は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、第２の定常（ＣＨ２）ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１〜３４０）及び／または第３の定常（ＣＨ３）ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１〜４４７）にて１以上のアミノ酸の変異（たとえば、置換）を有してもよい。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体のＩｇＧ１の定常領域は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、２５２位でのメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換、２５４位でのセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への置換、及び２５６位でのスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への置換を含む。全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，６５８，９２１号を参照のこと。「ＹＴＥ突然変異体」と呼ばれるこの型の突然変異体は同じ抗体の野生型と比べると４倍長い半減期を呈することが示されている（全体として参照によって本明細書に組み入れられているＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ＷＦ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４を参照のこと）。特定の実施形態では、抗体は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、２５１〜２５７位、２８５〜２９０位、３０８〜３１４位、３８５〜３８９位、及び４２８〜４３６位にてアミノ酸残基の１、２、３以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧの定常ドメインを含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、本明細書に記載されている抗体のＦｃ領域（たとえば、ＣＨ２ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１〜３４０）及び／またはＣＨ３ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１〜４４７）及び／またはヒンジ領域に１、２以上の変異（たとえば、アミノ酸置換）を導入して、エフェクター細胞の表面にてＦｃ受容体（たとえば、活性化Ｆｃ受容体）についての抗体の親和性を高めるまたは低下させる。Ｆｃ受容体についての抗体の親和性を低下させるまたは高める抗体のＦｃ領域における変異及びそのような変異をＦｃ受容体またはその断片に導入する技法は当業者に既知である。Ｆｃ受容体についての抗体の親和性を変えるように作ることができる抗体のＦｃ受容体における変異の例は、たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＳｍｉｔｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），ＰＮＡＳ，１０９：６１８１−６１８６，米国特許第６，７３７，０５６号及び国際公開番号ＷＯ０２／０６０９１９；ＷＯ９８／２３２８９；及びＷＯ９７／３４６３１に記載されている。
【０１５８】
さらなる実施形態では、１、２以上のアミノ酸置換をＩｇＧの定常ドメインのＦｃ領域に導入して抗体のエフェクター機能（複数可）を変える。たとえば、抗体がエフェクターリガンドについて変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたアミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２から選択される１以上のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。親和性が変化するエフェクターリガンドは、たとえば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分であることができる。このアプローチは、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。一部の実施形態では、定常領域ドメインの欠失または不活化（点突然変異または他の手段を介した）は循環している抗体のＦｃ受容体結合を減らし、それによって腫瘍の局在化を増やしてもよい。たとえば、定常ドメインを欠失させ、または不活化し、それによって腫瘍の局在化を増やす変異の記載については、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，５８５，０９７号及び同第８，５９１，８８６号を参照のこと。特定の実施形態では、１以上のアミノ酸置換を、本明細書に記載されている抗体のＦｃ領域に導入してＦｃ領域における潜在的なグリコシル化部位を取り除いてもよく、それはＦｃ受容体の結合を減らしてもよい（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＳｈｉｅｌｄｓ，ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，  （２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６０４を参照のこと）。種々の実施形態では、本明細書に記載されている抗体の定常領域における以下の変異：ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、Ｎ２９７Ａ置換；Ｎ２９７Ｑ置換；Ｌ２３５Ａ置換及びＬ２３７Ａ置換；Ｌ２３４Ａ置換及びＬ２３５Ａ置換；Ｅ２３３Ｐ置換；Ｌ２３４Ｖ置換；Ｌ２３５Ａ置換；Ｃ２３６の欠失；Ｐ２３８Ａ置換；Ｄ２６５Ａ置換；Ａ３２７Ｑ置換；またはＰ３２９Ａ置換の１以上が行われてもよい。特定の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異が、本明細書に記載されている抗体の定常領域で作り出されてもよい。
【０１５９】
具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７ＱまたはＮ２９７Ａのアミノ酸置換を伴うＩｇＧ１の定常ドメインを含む。一実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＤ２６５Ａ、Ｐ３２９Ａ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を伴うＩｇＧ１の定常ドメインを含む。別の実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される変異を伴うＩｇＧ１の定常ドメインを含む。特定の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４位、Ｌ２３５位及びＤ２６５位に相当する位置での本明細書に記載されている抗体の定常領域のアミノ酸残基はそれぞれ、Ｌ、Ｌ及びＤではない。このアプローチは、全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ１４／１０８４８３に詳細に記載されている。特定の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４位、Ｌ２３５位及びＤ２６５位に相当するアミノ酸はそれぞれ、Ｆ、Ｅ及びＡまたはＡ、Ａ及びＡである。
【０１６０】
特定の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、本明細書に記載されている抗体の定常領域におけるアミノ酸残基３２９,３３１及び３２２から選択される１以上のアミノ酸は、抗体が変化したＣ１ｑの結合及び／または低下したもしくは破壊された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように、異なるアミノ酸残基で置き換えることができる。このアプローチは、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９４，５５１号（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，ｅｔ  ａｌ．）にさらに詳細に記載されている。一部の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた、本明細書に記載されている抗体のＣＨ２ドメインのＮ末端領域におけるアミノ酸の２３１位〜２３８位の範囲内での１以上のアミノ酸残基を変え、それによって補体を結合する抗体の能力を変える。このアプローチは、全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。特定の実施形態では、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９で１以上のアミノ酸を変異させる（たとえば、アミノ酸置換を導入する）ことによって、本明細書に記載されている抗体のＦｃ領域を修飾し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に介在する抗体の能力を高め、及び／またはＦｃγ受容体についての抗体の親和性を高める。このアプローチは、全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。
【０１６１】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体はＩｇＧ４抗体の定常領域を含み、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けた重鎖のアミノ酸残基２２８でのセリンはプロリンで置換される。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号７４のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、該抗体は配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０１６２】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている定常領域の変異または修飾のいずれかを、２つの重鎖定常領域を有する本明細書に記載されている抗体の一方または双方の重鎖定常領域に導入することができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つアンタゴニストとして機能する単離された抗体を提供する。
【０１６４】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ本明細書に記載されている方法及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性に比べて、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低下させる単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ本明細書に記載されている方法及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性に比べて、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低下させる単離された抗体を提供する。ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性の非限定例には、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）のシグナル伝達、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）リガンド（たとえば、ホスファチジルセリン）へのＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の結合、及びサイトカイン（たとえば、ＩＦＮ−γ及び／またはＴＮＦ−α）産生の阻害を挙げることができる。特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性を失活させる、低下させるまたは阻害する単離された抗体を提供する。具体的な実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の活性の低下は以下の実施例に記載されているように評価される。
【０１６５】
具体的な実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったそのリガンド（たとえば、ホスファチジルセリン）に対するＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の結合に比べて、そのリガンドに対するＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の結合を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低下させる単離された抗体を提供する。具体的な実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったそのリガンド（たとえば、ホスファチジルセリン）に対するＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の結合に比べて、そのリガンドに対するＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の結合を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低下させる単離された抗体を提供する。
【０１６６】
具体的な実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったサイトカイン（たとえば、ＩＦＮγ及び／またはＴＮＦα）の産生に比べて、サイトカインの産生を少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％高める単離された抗体を提供する。具体的な実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったサイトカイン（たとえば、ＩＦＮγ及び／またはＴＮＦα）の産生に比べて、サイトカインの産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍高める単離された抗体を提供する。
【０１６７】
具体的な実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ単独でまたは抗ＰＤ−１抗体（たとえば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）との併用で、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴った、ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）の刺激に応答したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮγの産生に比べてＩＦＮγの産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍高める単離された抗体を提供する。
【０１６８】
特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する本明細書に記載されている抗体の存在下にてブドウ球菌腸毒素（ＳＥＡ）で刺激されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、抗体を伴わないまたは無関係な抗体（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合しない抗体）を伴ったＳＥＡのみで刺激されたＰＢＭＣに比べてＩＦＮγの産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍高めている。
【０１６９】
具体的な実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つ単独でまたは抗ＰＤ−１抗体（たとえば、ペムブロリズマブまたはニボルマブ）との併用で、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体を伴わない、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の刺激に応答した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）におけるＩＦＮγ及び／またはＴＮＦαの産生に比べて少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍ＩＦＮγ及び／またはＴＮＦαの産生を高める。一実施形態では、ＴＩＬは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の腫瘍に由来する。別の実施形態では、ＴＩＬは胆嚢腺癌の腫瘍に由来する。別の実施形態では、ＴＩＬは乳癌の腫瘍に由来する。
【０１７０】
特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する本明細書に記載されている抗体の存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で刺激された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体を伴わずに抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体だけで刺激されたＴＩＬに比べてＩＦＮγ及び／またはＴＮＦαの産生を少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍高めている。一実施形態では、ＴＩＬは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の腫瘍に由来する。別の実施形態では、ＴＩＬは胆嚢腺癌の腫瘍に由来する。別の実施形態では、ＴＩＬは乳癌の腫瘍に由来する。
【０１７１】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合し、且つＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、内部移行する単離された抗体を提供する。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）または当業者に既知の方法によって評価されたとき、本明細書に記載されている抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、内部移行する。特定の実施形態では、以下の工程：
（ａ）組織培養プレートにてウェル当たり２×１０４個の細胞でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞を播くことと、
（ｂ）１００μｌ／ウェルの最終容量にて同じ濃度のαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び本明細書に記載されている抗体または参照の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体（たとえば、１．５ｎｇ／ｍｌ、４．６ｎｇ／ｍｌ、１３．７ｎｇ／ｍｌ、４１．２ｎｇ／ｍｌ、１２３．５ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、１１１１ｎｇ／ｍｌ、または３３３３ｎｇ／ｍｌ）を加えることと、
（ｃ）３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートすることと、
（ｄ）ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の生存を測定することと、
（ｅ）ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している未処理の細胞と比べた細胞の生存の比率を算出することとを含むアッセイにて、
参照の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の存在下よりも本明細書に記載されている抗体の存在下の方がＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の低い比率が生き残る。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体の存在下での細胞存在の比率は、参照の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の存在下での細胞存在の比率よりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低い。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体の存在下での細胞存在の比率は、参照の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の存在下での細胞存在の比率よりも少なくとも約１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低い。特定の実施形態では、参照の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体はｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）である。特定の実施形態では、参照の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体はＨｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）である。特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞はＫａｓｕｍｉ−３細胞である。特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞はＫａｓｕｍｉ−３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２７２５（商標））である。特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞である。
【０１７２】
特定の実施形態では、以下の工程：
（ａ）組織培養プレートにてウェル当たり２×１０４個の細胞でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞を播くことと、
（ｂ）１００μｌ／ウェルの最終容量にて同じ濃度のαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び本明細書に記載されている抗体（たとえば、１．５ｎｇ／ｍｌ、４．６ｎｇ／ｍｌ、１３．７ｎｇ／ｍｌ、４１．２ｎｇ／ｍｌ、１２３．５ｎｇ／ｍｌ、３７０ｎｇ／ｍｌ、１１１１ｎｇ／ｍｌ、または３３３３ｎｇ／ｍｌ）を加えることと、
（ｃ）３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートすることと、
（ｄ）ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の生存を測定することと、
（ｅ）ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している未処理の細胞と比べた細胞の生存の比率を算出することとを含むアッセイにて、
ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している未処理の細胞と比べて、本明細書に記載されている抗体の存在下でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の多くても５０％が生き残る。特定の実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している未処理の細胞と比べて、本明細書に記載されている抗体の存在下でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の多くても１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％が生き残る。特定の実施形態では、１１１１ｎｇ／ｍｌの濃度でαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び本明細書に記載されている抗体が添加され、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している未処理の細胞と比べて、本明細書に記載されている抗体の存在下でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の多くても１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％が生き残る。特定の実施形態では、１１１１ｎｇ／ｍｌの濃度でαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１及び本明細書に記載されている抗体が添加され、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している未処理の細胞と比べて、本明細書に記載されている抗体の存在下でＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞の多くても５０％が生き残る。
【０１７３】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｓ（配列番号４８）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１を含み
配列中、
Ｘ１はＲ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘ２はＱ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｒ、またはＴであり、
Ｘ３はＮ、Ｙ、Ｇ、またはＱであり、
Ｘ４はＡまたはＱであり、
Ｘ５はＷ、Ｍ、Ａ、Ｓ、またはＴである。
【０１７４】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、Ｘ１Ｘ２ＮＡＷＳ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１を含み、
配列中、
Ｘ１はＲまたはＡであり；
Ｘ２はＱまたはＲである。
【０１７５】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、Ｘ１Ｘ２ＧＱＸ３Ｓ（配列番号５０）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１を含み、
配列中：
Ｘ１はＫ、Ｍ、またはＧであり；
Ｘ２はＡまたはＳであり；
Ｘ３はＳまたはＴである。
【０１７６】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、抗体は、Ｘ１Ｘ２ＱＱＡＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１を含み、
配列中：
Ｘ１はＳ、Ｒ、Ｔ、またはＧであり；
Ｘ２はＡ、Ｓ、Ｔ、またはＧである。
【０１７７】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、ＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２を含む。
【０１７８】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、ＡＫＧＧＤＹＧＧＮＹＦＤ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
【０１７９】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、Ｘ１ＡＳＱＳＶＸ２ＳＳＹＬＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１を含み、
配列中、
Ｘ１はＲまたはＧであり、
Ｘ２は非存在またはＳである。
【０１８０】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、Ｘ１ＡＳＸ２ＲＡＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２を含み、
配列中、
Ｘ１はＤまたはＧであり
Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴである。
【０１８１】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、ＱＱＹＧＳＳＰＸ１Ｔ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３を含み、
配列中、Ｘ１はＬまたはＩである。
【０１８２】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）への結合について、それぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と交差競合する。
【０１８３】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は、本明細書に記載されている抗体、たとえば、それぞれ、配列番号２４及び３６；２４及び３８；２６及び４２；２４及び４２；２４及び４６；２４及び４３；２６及び４３；２６及び４６；２６及び４１；２４及び４１；２５及び３９；２４及び４７；２５及び４０；２６及び４７；２５及び３７；２５及び４５；２５及び４４；２５及び４６；２５及び４２；２５及び４１；２５及び４３；２５及び４７；２７及び４６；２８及び４６；２９及び４６；３０及び４６；３１及び４６；３２及び４６；３３及び４６；３４及び４６；または３５及び４６に記述されている重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を含む抗体と同じまたは重複する、ＴＩＭ−３のエピトープ（たとえば、ヒトＴＩＭ−３のエピトープ）に結合する。
【０１８４】
特定の実施形態では、本開示はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、その際、本明細書に記載されている方法（以下の実施例を参照）及び／または当業者に既知の方法によって評価されたとき、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している細胞に結合する際、抗体の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が内部移行し、その際、抗体は野生型ヒトＩｇＧの重鎖定常領域の変異体であるヒトＩｇＧの重鎖定常領域を含み、変異体ヒトＩｇＧの重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧの重鎖定常領域がヒトＦｃガンマ受容体に結合するより低い親和性でヒトＦｃガンマ受容体に結合する。特定の実施形態では、ヒトＦｃガンマ受容体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩから成る群から選択される。特定の実施形態では、変異体ヒトＩｇＧの重鎖定常領域は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＮ２９７Ａ変異を含むＩｇＧ１定常領域である。
【０１８５】
６．３  医薬組成物
本明細書で提供されているのは、生理的に許容できるキャリア、賦形剤または安定剤にて所望の程度の純度を有する本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を含む組成物である（ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９９０），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）。許容できるキャリア、賦形剤または安定剤は採用される投与量及び濃度にてレシピエントにとって非毒性であり、それには、たとえば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（たとえば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；たとえば、メチルパラベンまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール及びｍ−クレゾール）；低分子量（１０残基未満）ポリペプチド；たとえば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；たとえば、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の糖質；たとえば、ＥＤＴＡのようなキレート剤；たとえば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールのような糖；たとえば、ナトリウムのような塩形成性の対イオン；金属錯体（たとえば、Ｚｎ・タンパク質錯体）；及び／またはたとえば、ＴＷＥＥＮ（標識）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（標識）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１８６】
具体的な実施形態では、医薬組成物は薬学上許容できるキャリアにて本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体と、任意で１以上の追加の予防剤または治療剤とを含む。具体的な実施形態では、医薬組成物は薬学上許容できるキャリアにて有効量の本明細書に記載されている抗体と、任意で１以上の追加の予防剤または治療剤とを含む。一部の実施形態では、抗体は医薬組成物に含まれる唯一の有効成分である。本明細書に記載されている医薬組成物はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）活性を阻害し、がんまたは感染性疾患のような状態を治療するのに有用であることができる。一実施形態では、本発明は薬物として使用するための本発明の抗ＴＩＭ−３抗体を含む本発明の医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明はがんまたは感染性疾患の治療方法で使用するための本発明の医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明はがんまたは感染性疾患を治療するために薬物を調製するための本発明の医薬組成物の使用に関する。
【０１８７】
非経口製剤で使用される薬学上許容できるキャリアには、水性溶剤、非水性溶剤、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤、及び他の薬学上許容できる物質が挙げられる。水性溶剤の例には、塩化ナトリウム注射剤、リンガー注射剤、等張デキストロース注射剤、無菌水注射剤、デキストロース及び乳酸加リンガー注射剤が挙げられる。非水性非経口溶剤には、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油及びピーナツ油が挙げられる。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム及び塩化ベンゼトニウムを含む静菌または静真菌の濃度での抗菌剤を複数回用量の容器に包装される非経口製剤に加えることができる。等張剤には塩化ナトリウム及びデキストロースが挙げられる。緩衝液にはリン酸塩及びクエン酸塩が挙げられる。抗酸化剤には重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤にはプロカイン塩酸塩が挙げられる。懸濁剤及び分散剤にはナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤にはポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。金属イオン封鎖剤または金属イオンのキレート剤にはＥＤＴＡが挙げられる。医薬キャリアにはまた、水混和性溶剤用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール；ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も挙げられる。
【０１８８】
医薬組成物は対象への投与の経路のために製剤化されてもよい。投与の経路の具体例には、鼻内、経口、肺、経皮、皮内及び非経口が挙げられる。皮下、筋肉内または静脈内の注射を特徴とする非経口投与も本明細書で熟考される。注射剤は、液体の溶液または懸濁液としての従来の形態で、注射に先立つ液体での溶液または懸濁液に好適な固体形態で、またはエマルションとして調製することができる。注射剤、溶液及びエマルションも１以上の賦形剤を含有する。好適な賦形剤には、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールが挙げられる。加えて、所望であれば、投与される医薬組成物は、軽微な量の非毒性補助剤物質、たとえば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、可溶性増強剤、及び他のそのような作用物質、たとえば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノオレイン酸、オレイン酸トリエタノールアミン及びシクロデキストリンも含有することができる。
【０１８９】
抗体の非経口投与用の製剤には、注射の準備済みの無菌溶液、たとえば、皮下の錠剤を含む、使用直前に溶媒と組み合わせる準備ができている凍結乾燥粉剤のような無菌の無水可溶性製品、注射の準備済みの無菌の懸濁液、使用直前に溶剤と組み合わせる準備ができている無菌の無水不溶性製品及び無菌のエマルションが挙げられる。溶液は水性であってもまたは非水性であってもよい。
【０１９０】
静脈内に投与されるのであれば、好適なキャリアには、生理的な生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびに、たとえば、グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール及びそれらの混合物のような増粘剤と可溶化剤を含有する溶液が挙げられる。
【０１９１】
抗体を含む局所混合物は局所投与及び全身性投与について記載されているように調製される。得られる混合物は溶液、懸濁液、エマルション等であることができ、クリーム、ジェル、軟膏、エマルション、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、泡状物、エアロゾル、洗浄剤、スプレー、坐薬、包帯剤、皮膚貼付剤、または局所投与に好適な任意の他の製剤として製剤化することができる。
【０１９２】
本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、吸入によるような局所投与のためにエアロゾルとして製剤化することができる（たとえば、炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイドの送達のためのエアロゾルを記載し、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第４，０４４，１２６号、同第４，４１４，２０９号及び同第４，３６４，９２３号を参照のこと）。気道への投与のためのこれらの製剤は、単独でまたはラクトースのような不活性キャリアとの併用で、吸入器用のエアロゾルもしくは溶液の形態で、または吹送用の微細粉末としての形態であることができる。そのような場合、製剤の粒子は、一実施形態では、５０ミクロン未満の直径を有し、一実施形態では、１０ミクロン未満の直径を有する。
【０１９３】
本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、部分的適用または局所適用のために、たとえば、ジェル、クリーム及びローションの形態で、たとえば、皮膚及び粘膜への、たとえば、眼における局所適用のために、ならびに眼への適用のために、または嚢内のもしくは脊髄内の適用のために製剤化することができる。局所投与は、経皮送達のために、及び眼もしくは粘膜への投与のために、または吸入療法のために熟考される。単独での、または他の薬学上許容できる賦形剤との組み合わせでの抗体の点鼻液も投与することができる。
【０１９４】
イオン導入装置及び電気泳動装置を含む経皮貼付剤は当業者に周知であり、抗体を投与するのに使用することができる。たとえば、そのような貼付剤は、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，２６７，９８３号、同第６，２６１，５９５号、同第６，２５６，５３３号、同第６，１６７，３０１号、同第６，０２４，９７５号、同第６，０１０，７１５号、同第５，９８５，３１７号、同第５，９８３，１３４号、同第５，９４８，４３３号、及び同第５，８６０，９５７にて開示されている。
【０１９５】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体を含む医薬組成物は凍結乾燥した粉末であり、それは溶液、エマルション及び他の混合物として投与するために再構成することができる。それはまた再構成され、固体またはゲルとして製剤化されてもよい。凍結乾燥した粉末は、本明細書に記載されている抗体または薬学上許容できるその誘導体を好適な溶媒に溶解することによって調製される。一部の実施形態では、凍結乾燥した粉末は無菌である。溶媒は、粉末または粉末から調製される再構成溶液の安定性または他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含有してもよい。使用されてもよい賦形剤には、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の好適な作用物質が挙げられるが、これらに限定されない。溶媒は、一実施形態では、ほぼ中性のｐＨでの、たとえば、クエン酸塩、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムのような緩衝液、または当業者に既知の他のそのような緩衝液も含有してもよい。当業者に既知の標準条件下での溶液のその後の無菌濾過とそれに続く凍結乾燥によって所望の製剤が提供される。一実施形態では、得られた溶液は凍結乾燥のためのバイアルに分配されるであろう。各バイアルは単回投与量または複数回投与量の化合物を含有するであろう。凍結乾燥した粉末は、たとえば、約４℃〜室温のような適当な条件下で保存することができる。この凍結乾燥した粉末の注射用水による再構成によって非経口投与で使用する製剤が提供される。再構成については、凍結乾燥した粉末を無菌水または他の好適なキャリアに加える。正確な量は選択した化合物に左右される。そのような量は経験的に決定することができる。
【０１９６】
本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体及び本明細書に記載されている他の組成物が治療される対象の特定の組織、受容体または身体の他の領域を標的とするようにそれらを製剤化することもできる。多数のそのような標的化する方法は当業者に周知である。そのような標的化する方法はすべて本組成物での使用のために本明細書で熟考される。標的化する方法の非限定例については、たとえば、それらのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、及び同第５，７０９，８７４号を参照のこと。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は腫瘍に対して標的指向化される。
【０１９７】
生体内投与のために使用される組成物は無菌であることができる。これは、たとえば、無菌の濾過膜を介した濾過によって容易に達成される。
【０１９８】
６．４  使用方法及び使用
別の態様では、本開示は本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を用いて対象を治療する方法を提供する。ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）機能の阻害から利益が得られる対象における任意の疾患または障害は、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を用いて治療することができる。本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は腫瘍に対する免疫系の寛容を阻害するのに特に有用であるので、がんを伴う対象に免疫療法として使用することができる。たとえば、特定の実施形態では、本開示は対象にて抗原に応答したＴ細胞の活性化を高める方法を提供し、該方法は本明細書で開示されているような、有効量の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその医薬組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本開示は対象にてがんを治療する方法を提供し、該方法は本明細書で開示されているような、有効量の抗体またはその医薬組成物を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、本開示はがんまたは感染性疾患の治療方法で使用するための本明細書で開示されているような抗体またはその医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、本開示は薬物として使用するための本明細書で開示されているような抗体またはその医薬組成物を提供する。別の実施形態では、本開示はがんまたは感染性疾患を治療するための薬物を調製するために本明細書で開示されているような抗体またはその医薬組成物を提供する。
【０１９９】
本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体または医薬組成物で治療することができるがんには限定しないで、固形腫瘍、血液癌（たとえば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、たとえば、多発性骨髄腫）及び転移病変が挙げられる。一実施形態では、がんは固形腫瘍である。固形腫瘍に例には、種々の臓器系の悪性腫瘍、たとえば、肉腫及び癌腫、たとえば、腺癌、たとえば、肺、乳腺、卵巣、リンパ、消化管（たとえば、結腸）、肛門、生殖器及び尿生殖路（たとえば、腎臓、尿路上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（たとえば、脳、神経またはグリア細胞）、頭頚部、皮膚（たとえば、黒色腫）及び膵臓を冒すもの、と同様に、たとえば、結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺癌（たとえば、非小細胞肺癌または小細胞肺癌）、小腸の癌及び食道の癌のような悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。がんは、早期、中期、末期または転移癌であってもよい。特定の実施形態では、がんは上昇したＰＤ−１活性（たとえば、上昇したＰＤ−１の発現）に関連する。
【０２００】
一実施形態では、がんは、肺癌（たとえば、肺腺癌または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（たとえば、扁平上皮組織構造及び／または非扁平上皮組織構造を伴うＮＳＣＬＣ、またはＮＳＣＬＣ腺癌））、黒色腫（たとえば、進行した黒色腫）、腎臓癌（たとえば、腎細胞癌）、肝臓癌（たとえば、肝細胞癌腫）、骨髄腫（たとえば、多発性骨髄腫）、前立腺癌、乳癌（たとえば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体またはＨｅｒ２／ｎｅｕの１、２またはすべてを発現しない乳癌、たとえば、トリプルネガティブ乳癌）、卵巣癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頚部の癌（たとえば、頭頚部の扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、肛門癌、胃食道癌（たとえば、食道扁平上皮癌腫）、中皮腫、鼻咽頭癌、甲状腺癌、子宮頸癌、上皮癌、腹膜癌、またはリンパ増殖性疾患（たとえば、移植後リンパ増殖性疾患）から選択される。一実施形態では、がんはＮＳＣＬＣである。一実施形態では、がんは腎細胞癌である。一実施形態では、がんは卵巣癌である。具体的な実施形態では、卵巣癌はプラチナ製剤不応性の卵巣癌である。
【０２０１】
一実施形態では、がんは血液癌、たとえば、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。一実施形態では、がんは白血病、たとえば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）またはヘアリー細胞白血病である。一実施形態では、がんはリンパ腫、たとえば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、再発性非ホジキンリンパ腫、難治性非ホジキンリンパ腫、再発性濾胞性非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、または節外性辺縁帯リンパ腫である。一実施形態では、がんは骨髄腫、たとえば、多発性骨髄腫である。
【０２０２】
別の実施形態では、がんは癌腫（たとえば、進行したまたは転移した癌腫）、黒色腫または肺癌腫、たとえば、非小細胞肺癌腫から選択される。
【０２０３】
一実施形態では、がんは肺癌、たとえば、肺腺癌、非小細胞肺癌または小細胞肺癌である。
【０２０４】
一実施形態では、がんは、黒色腫、たとえば、進行した黒色腫である。一実施形態では、がんは他の治療法に応答しない進行したまたは切除不能の黒色腫である。他の実施形態では、がんはＢＲＡＦ変異（たとえば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００変異）を持つ黒色腫である。さらに他の実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤（たとえば、ベムラフェニブまたはダブラフェニブ）の有無にかかわらず抗ＣＴＬＡ−４抗体（たとえば、イピリムマブ）で治療した後に本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体または医薬組成物が投与される。
【０２０５】
別の実施形態では、がんは肝細胞癌、たとえば、ウイルス感染、たとえば、慢性ウイルス性肝炎の有無にかかわらず、進行した肝細胞癌である。
【０２０６】
別の実施形態では、がんは前立腺癌、たとえば、進行した前立腺癌である。
【０２０７】
さらに別の実施形態では、がんは骨髄腫、たとえば、多発性骨髄腫である。
【０２０８】
さらに別の実施形態では、がんは腎臓癌、たとえば、腎細胞癌（ＲＣＣ）（たとえば、転移ＲＣＣ、明細胞腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）または腎乳頭細胞癌）である。
【０２０９】
さらに別の実施形態では、がんは肺癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、白血病、またはがんの転移病変から選択される。
【０２１０】
特定の実施形態では、本開示は、対象における感染性疾患を予防するまたは治療する方法を提供し、該方法は本明細書で開示されているような、有効量の抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその医薬組成物を対象に投与することを含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、感染（たとえば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、原虫感染または寄生虫感染）を防ぐ及び／または治療する方法である。方法に従って予防される及び／または治療される感染は本明細書で特定される感染性因子によって引き起こされ得る。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその組成物は対象に投与される唯一の活性剤である。一部の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその組成物は感染性疾患の治療のために抗感染性介入（たとえば、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、または抗蠕虫剤）との併用で使用される。従って、一実施形態では、本発明は、感染性疾患を予防する及び／または治療する方法で使用するための本発明の抗体及び／または医薬組成物に関するものであり、任意でその際、抗体もしくは医薬組成物は対象に投与される唯一の活性剤であり、または抗体もしくは医薬組成物は抗感染性介入との併用で使用される。
【０２１１】
本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体または医薬組成物によって治療する及び／または予防することができる感染性疾患は、細菌、寄生虫、真菌、原虫及びウイルスを含む感染性因子が原因で生じる。具体的な実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体または医薬組成物によって治療され及び／または予防すされる感染性疾患はウイルスが原因で生じる。本明細書に記載されている方法に従って予防する及び／または治療することができるウイルス性疾患またはウイルス性感染症には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ（たとえば、Ａ型インフルエンザまたはＢ型インフルエンザ）、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、リノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンターウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘、エプスタインバーウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ＨＩＶ−ＩＩ）、及び、たとえば、ウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘のようなウイルス性疾患の病原体によって引き起こされるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
予防する、及び／または治療することができる細菌性感染症には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって引き起こされる感染症が挙げられる。本明細書に記載されている方法に従って予防し、及び／または治療することができる細菌（たとえば、Eｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）によって引き起こされる細菌性疾患には、マイコバクテリウムリケッチア症、マイコプラズマ、ナイセリア、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ライム病）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ（炭疽病）、破傷風、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、マイコバクテリウム、百日咳、コレラ、腺ペスト、ジフテリア、クラミジア、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びレジオネラが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１３】
本明細書に記載されている方法に従って予防する、及び／または治療することができる原虫によって引き起こされる原虫性疾患または原虫感染症には、リーシュマニア、コクシジウム症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、またはマラリアが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されている方法に従って予防する、及び／または治療することができる寄生虫によって引き起こされる寄生虫性疾患または寄生虫感染症には、クラミジア症及びリケッチア症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１４】
本明細書に記載されている方法に従って予防する、及び／または治療することができる真菌によって引き起こされる真菌性疾患または真菌感染症には、Ｃａｎｄｉｄａ感染、接合菌症、Ｃａｎｄｉｄａ乳腺炎、潜在的トリコスポロン血症を伴った進行性播種性トリコスポロン症、播種性カンジダ症、肺パラコクシジオイデス症、肺アスペルギルス症、 Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ肺炎、クリプトコックス髄膜炎、コクシジオイデス髄膜脳炎及び脳脊髄血管炎、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ感染、 Ｆｕｓａｒｉｕｍ角膜炎、副鼻腔真菌症、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ心内膜炎、脛骨の軟骨発育不全症、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ膣炎、口腔咽頭カンジダ症、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、足白癬、皮膚カンジダ症、真菌性胎盤炎、播種性トリコスポロン症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、真菌性角膜炎、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ感染、真菌性腹膜炎、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ感染、ブドウ球菌性眼内炎、スポロトリクム症、及び皮膚糸状菌症によって引き起こされるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
特定の実施形態では、これらの方法はさらに、対象に追加の治療剤を投与することを含む。特定の実施形態では、追加の治療剤は化学療法剤、放射線治療剤、またはチェックポイント標的化剤である。特定の実施形態では、化学療法剤は低メチル化剤（たとえば、アザシチジン）である。特定の実施形態では、チェックポイント標的化剤は、アンタゴニスト抗ＣＴＬＡ−４抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ１抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−Ｌ２抗体、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＭ−３抗体、アンタゴニスト抗ＬＡＧ−３抗体、アンタゴニスト抗ＣＥＡＣＡＭ１抗体、アゴニスト抗ＣＤ１３７抗体、アンタゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体、アンタゴニスト抗ＶＩＳＴＡ抗体、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体、及びアゴニスト抗ＯＸ４０抗体から成る群から選択される。
【０２１６】
一実施形態では、本発明は本発明の方法で使用するための本発明の抗体及び／または医薬組成物に関するものであり、その際、該方法は対象に追加の治療剤を投与することを含む。一実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の抗体及び／または医薬組成物と（ｂ）薬物として使用するための追加の治療剤とに関する。一実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の抗体及び／または医薬組成物と（ｂ）がんの治療方法で使用するための追加の治療剤とに関する。さらなる実施形態では、本発明は（ａ）本発明の抗体及び／または医薬組成物と（ｂ）追加の治療剤とを含む医薬組成物、キットまたはキットインパーツに関する。一実施形態では、追加の治療剤は化学療法剤、放射線治療剤、またはチェックポイント標的化剤である。
【０２１７】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法にて抗ＰＤ−１抗体が使用される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６としても知られるニボルマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＭｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏによって開発されたラムブロリズマブまたはＭＫ−３４７５としても知られるペムブロリズマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＣｕｒｅＴｅｃｈによって開発されたＣＴ−０１１としても知られるピジリズマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＭｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４としても知られている）である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＮｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたＰＤＲ００１である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発されたＲＥＧＮ２８１０である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＰｆｉｚｅｒによって開発されたＰＦ−０６８０１５９１である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＢｅｉＧｅｎｅによって開発されたＢＧＢ−Ａ３１７である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＡｎａｐｔｙｓＢｉｏ  ａｎｄ  Ｔｅｓａｒｏによって開発されたＴＳＲ−０４２である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はＨｅｎｇｒｕｉによって開発されたＳＨＲ−１２１０である。
【０２１８】
本明細書で開示されている治療方法で使用されてもよい抗ＰＤ−１抗体のさらなる非限定例は、そのすべてがあらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる以下の特許及び特許出願：米国特許第６，８０８，７１０号；米国特許第７，３３２，５８２号；米国特許第７，４８８，８０２号；米国特許第８，００８，４４９号；米国特許第８，１１４，８４５号；米国特許第８，１６８，７５７号；米国特許第８，３５４，５０９号；米国特許第８，６８６，１１９号；米国特許第８，７３５，５５３号；米国特許第８，７４７，８４７号；米国特許第８，７７９，１０５号；米国特許第８，９２７，６９７号；米国特許第８，９９３，７３１号；米国特許第９，１０２，７２７号；米国特許第９，２０５，１４８号；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１３／０２０２６２３Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１３／０２９１１３６Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１４／００４４７３８Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ０１４／０３５６３６３Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１６／００７５７８３Ａ１；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０３３０９１Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０３６３９４Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１７９６６４Ａ２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／２０９８０４Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／２０６１０７Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０５８５７３Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０８５８４７Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／２００１１９Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０１５６８５Ａ１；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０２０８５６Ａ１にて開示されている。
【０２１９】
特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は本明細書で開示されている方法にて使用される。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＧｅｎｅｎｔｅｃｈによって開発されたアテゾリズマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｃｅｌｇｅｎｅ及びＭｅｄｉｍｍｕｎｅによって開発されたデュルバルマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ及びＰｆｉｚｅｒによって開発されたＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても知られるアベルマブである。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって開発されたＭＤＸ−１１０５である。特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＡｍｐｌｉｍｍｕｎｅ及びＧＳＫによって開発されたＡＭＰ−２２４である。
【０２２０】
本明細書で開示されている治療方法で使用されてもよい抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非限定例は、そのすべてがあらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる以下の特許及び特許出願：米国特許第７，９４３，７４３号；米国特許第８，１６８，１７９号；米国特許第８，２１７，１４９号；米国特許第８，５５２，１５４号；米国特許第８，７７９，１０８号；米国特許第８，９８１，０６３号；米国特許第９，１７５，０８２号；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１０／０２０３０５６Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２００３／０２３２３２３Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１３／０３２３２４９Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１４／０３４１９１７Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１４／００４４７３８Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１５／０２０３５８０Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１５／０２２５４８３Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１５／０３４６２０８Ａ１；Ｕ．Ｓ．公開番号ＵＳ２０１５／０３５５１８４Ａ１；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１０００７９Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０２２７５８Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０５５８９７Ａ２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０６１６６８Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１０９１２４Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１９５１６３Ａ１；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０００６１９Ａ１；及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０３０３５０Ａ１にて開示されている。
【０２２１】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、たとえば、ＩＤＯ（インドールアミン−（２,３）−ジオキシゲナーゼ）及び／またはＴＤＯ（トリプトファン２,３−ジオキシゲナーゼ）のような免疫調節酵素（複数可）を標的とする化合物との併用で対象に投与される。従って、一実施形態では、追加の治療剤は免疫調節酵素（複数可）を標的とする化合物、たとえば、インドールアミン−（２,３）−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤である。特定の実施形態では、そのような化合物は、エパカドスタット（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐ；たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１０／００５９５８を参照のこと）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及びＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）から成る群から選択される。一実施形態では、化合物はエパカドスタットである。別の実施形態では、化合物はＦ００１２８７である。別の実施形態では、化合物はインドキシモドである。別の実施形態では、化合物はＮＬＧ９１９である。具体的な実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体はがんを治療するためにＩＤＯ阻害剤との併用で対象に投与される。がんを治療するのに使用するために本明細書に記載されているＩＤＯ阻害剤は、たとえば、錠剤、丸薬またはカプセル剤のような、医薬組成物の固形剤形で存在し、その際、医薬組成物はＩＤＯ阻害剤及び薬学上許容できる賦形剤を含む。そのようなものとして、本明細書に記載されているような抗体及び本明細書に記載されているようなＩＤＯ阻害剤は、別々の剤形として別々に、順次、または同時に投与することができる。一実施形態では、抗体は非経口で投与され、ＩＤＯ阻害剤は経口で投与される。特定の実施形態では、阻害剤は、エパカドスタット（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｃｏｒｐ）、Ｆ００１２８７（Ｆｌｅｘｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、インドキシモド（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、及びＮＬＧ９１９（ＮｅｗＬｉｎｋ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）から成る群から選択される。エパカドスタットは、あらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／００５９５８に記載されている。一実施形態では、阻害剤はエパカドスタットである。別の実施形態では、阻害剤はＦ００１２８７である。別の実施形態では、阻害剤はインドキシモドである。別の実施形態では、阻害剤はＮＬＧ９１９である。
【０２２２】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体はワクチンとの併用で対象に投与される。ワクチンは、たとえば、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチンであることができる。特定の実施形態では、ワクチンは熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンまたは熱ショックタンパク質に基づく病原体ワクチンである。特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／１８３４８６に記載されたようなワクチン（たとえば、対象に由来するがんに存在するがん特異的な変異を含む少なくとも１つの合成ペプチドを含むワクチン）との併用で対象に投与される。特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンとの併用で対象に投与される。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）はあらゆる種にわたって普遍的に見いだされる高度に保存されたタンパク質のファミリーである。その発現は、熱ショックまたは毒素への曝露、酸化的ストレスまたはグルコース枯渇を含む他の形態のストレスの結果、はるかに高いレベルに強力に誘導することができる。分子量に従って５つのファミリー：ＨＳＰ−１１０、−９０、−７０、−６０及び−２８が分類されている。ＨＳＰはマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）における交差提示経路を介して免疫原性のペプチドを送達し、Ｔ細胞の活性化をもたらす。ＨＳＰは腫瘍特異的な免疫を誘導することができる複合体を形成する腫瘍関連抗原ペプチドのシャペロンキャリアとして機能する。死にかけている腫瘍細胞からの放出の際、ＨＳＰ・抗原複合体は抗原提示細胞（ＡＰＣ）に取り込まれ、抗原はＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩの分子に結合するペプチドに処理され、抗腫瘍ＣＤ８＋及びＣＤ４＋のＴ細胞の活性化をもたらす。腫瘍調製物に由来するＨＳＰ複合体によって引き出される免疫は各対象のがんが発現する独特の抗原ペプチドのレパトアに特異的に向けられる。従って、一実施形態では、本発明は（ａ）本発明の抗体及び／または医薬組成物と、（ｂ）薬物として使用するための、たとえば、がんの治療方法で使用するためのワクチンとに関する。一実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の抗体及び／または医薬組成物と、（ｂ）ワクチンとを含む医薬組成物、キットまたはキットオブパーツに関する。一実施形態では、ワクチンは熱ショックタンパク質に基づく腫瘍ワクチンである。一実施形態では、ワクチンは熱ショックタンパク質に基づく病原体ワクチンである。
【０２２３】
熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）は抗原ペプチドと非共有結合で複合体形成した熱ショックタンパク質から成るタンパク質ペプチド複合体である。ＨＳＰＰＣは先天性の及び適応的な免疫応答の双方を引き出す。具体的な実施形態では、抗原ペプチド（複数可）は治療されるがんに対して抗原性を示す。ＨＳＰＰＣは膜受容体（主としてＣＤ９１）またはＴｏｌｌ様受容体を介して効率的にＡＰＣによって捕捉される。ＨＳＰＰＣの内部移行はケモカイン及びサイトカインの産生を伴うＡＰＣの機能的成熟を生じ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、単球及びＴｈ１及びＴｈ２が介在する免疫応答をもたらす。特定の実施形態では、本明細書で開示されている方法にて使用されるＨＳＰＰＣは抗原ペプチドと複合体形成したストレスタンパク質のｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０またはｈｓｐ９０ファミリーに由来する１以上の熱ショックタンパク質を含む。特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣはｈｓｃ７０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１１０、ｇｒｐ１７０、ｇｐ９６、カルレチクリンまたはそれらの２以上の組み合わせを含む。
【０２２４】
具体的な実施形態では、熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）は組換え抗原ペプチドと複合体形成した組換え熱ショックタンパク質（たとえば、ｈｓｐ７０またはｈｓｃ７０）またはそのペプチド結合ドメインを含む。組換え熱ショックタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって、たとえば、それぞれ全体として参照によって本明細書に組み入れられるＤｗｏｒｎｉｃｚａｋ及びＭｉｒａｕｌｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５１８１−５１９７（１９８７）ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１１１４２及び／またはＹ００３７１に記載されているヒトｈｓｃ７０を用いて作製することができる。特定の実施形態では、Ｈｓｐ７０の配列は、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＨｕｎｔ及びＭｏｒｉｍｏｔｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２（１９），６４５５−６４５９（１９８５）ならびにＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０ＤＭＶ８及び／またはＭ１１７１７に記載されたとおりである。抗原性ペプチドも当該技術で既知の組換えＤＮＡ法によって調製することができる。
【０２２５】
特定の実施形態では、抗原性ペプチドは修飾されたアミノ酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸は翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸は翻訳後修飾の模倣体を含む。特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸は側鎖のヒドロキシルまたはアミンでリン酸化されているＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓである。特定の実施形態では、修飾されたアミノ酸は側鎖のヒドロキシルまたはアミンでリン酸化されているＴｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓの模倣体である。
【０２２６】
具体的な実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体はがんを治療するために熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）、たとえば、熱ショックタンパク質ペプチド複合体−９６（ＨＳＰＰＣ−９６）との併用で対象に投与される。ＨＳＰＰＣ−９６は抗原性ペプチドと複合体形成した９６ｋＤａの熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）であるｇｐ９６を含む。ＨＳＰＰＣ−９６は対象の腫瘍から製造されるがんの免疫療法であり、がんの抗原性「指紋」を含有する。特定の実施形態では、この指紋は特定の対象の特有のがん細胞にのみ存在する独特の抗原を含有し、ワクチンの注射は特有のがんの指紋を持つ細胞を認識し、攻撃するように対象の免疫系を刺激するように意図される。従って、一実施形態では、本発明は、薬物として使用するための及び／またはがんの治療方法で使用するための熱ショックタンパク質ペプチド複合体（ＨＳＰＰＣ）との併用での本発明の抗体及び／または医薬組成物に関する。
【０２２７】
特定の実施形態では、ＨＳＰＰＣ、たとえば、ＨＳＰＰＣ−９６は対象の腫瘍組織から作製される。具体的な実施形態では、ＨＳＰＰＣ（たとえば、ＨＳＰＰＣ−９６）は治療されるがんの種類またはその転移の腫瘍から作製される。別の具体的な実施形態では、ＨＳＰＰＣ（たとえば、ＨＳＰＰＣ−９６）は治療される対象にとって自己である。特定の実施形態では、腫瘍組織は壊死性ではない腫瘍組織である。特定の実施形態では、少なくとも１グラム（たとえば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０グラム）の壊死性ではない腫瘍組織を使用してワクチン投与計画を作製する。特定の実施形態では、外科的切除の後、ワクチン調製で使用するのに先立って壊死性ではない腫瘍組織を凍結する。一部の実施形態では、ＨＳＰＰＣ、たとえば、ＨＳＰＰＣ−９６は精製法によって腫瘍組織から単離され、濾過され、注射用ワクチンに調製される。特定の実施形態では、対象は６〜１２用量のＨＳＰＰＣ、たとえば、ＨＳＰＰＣ−９６を投与される。そのような実施形態では、ＨＳＰＰＣ、たとえば、ＨＳＰＰＣ−９６は最初の４用量については毎週投与され、次いで追加の２〜８用量については２週に１回投与される。
【０２２８】
本明細書に記載されている方法に従って使用されてもよいＨＳＰＰＣのさらなる例は、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる以下の特許及び特許出願：米国特許第６，３９１，３０６号、同第６，３８３，４９２号、同第６，４０３，０９５号、同第６，４１０，０２６号、同第６，４３６，４０４号、同第６，４４７，７８０号、同第６，４４７，７８１号、及び同第６，６１０，６５９号にて開示されている。
【０２２９】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３抗体はアジュバントとの併用で対象に投与される。治療の背景に応じて種々のアジュバントを使用することができる。適当なアジュバントの非限定例には、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、モンタニドＩＳＡ（不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント）、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）、Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ、ムラミルペプチド、  Ｓｙｎｔｅｘアジュバント製剤（ＳＡＦ）、カリミョウバン（水酸化アルミニウム及び／またはリン酸アルミニウム）、アルミニウム塩アジュバント、Ｇｅｒｂｕ（登録商標）アジュバント、ニトロセルロース吸収抗原、内包または封入抗原、３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３  Ｄ−ＭＰＬ）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、トール様受容体（ＴＬＲ）リガンド、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）リガンド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サポニンのような免疫刺激複合体、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−７、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、等が挙げられるが、これらに限定されない。他のアジュバントには、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及びポリ（Ａ）やポリ（Ｃ）のような二本鎖ＲＮＡ分子が挙げられる。上記アジュバントの組み合わせが使用されてもよい。たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，６４５，４９５号；同第７，０２９，６７８号；及び同第７，８５８，５８９号を参照のこと。一実施形態では、本明細書で使用されるアジュバントはＱＳ２１ＳＴＩＭＵＬＯＮである。
【０２３０】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３抗体は、ＴＣＲを含む追加の治療剤との併用で対象に投与される。特定の実施形態では、追加の治療剤は可溶性ＴＣＲである。特定の実施形態では、追加の治療剤はＴＣＲを発現している細胞である。従って、一実施形態では、本発明は、薬物として使用するための及び／またはがんの治療方法で使用するためのＴＣＲを含む追加の治療剤との併用での本発明の抗体及び／または医薬組成物に関する。
【０２３１】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現している細胞との併用で対象に投与される。特定の実施形態では、細胞はＴ細胞である。
【０２３２】
特定の実施形態では、本明細書で開示されている抗ＴＩＭ−３抗体は、ＴＣＲ模倣抗体との併用で対象に投与される。特定の実施形態では、ＴＣＲ模倣抗体はペプチド・ＭＨＣ複合体に特異的に結合する抗体である。ＴＣＲ模倣抗体の非限定例については、たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第９，０７４，０００号及び米国公開番号ＵＳ２００９／０３０４６７９Ａ１及びＵＳ２０１４／０１３４１９１Ａ１を参照のこと。
【０２３３】
抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体及び追加の治療剤（たとえば、化学療法剤、放射線治療剤、チェックポイント標的化剤、ＩＤＯ阻害剤、ワクチン、アジュバント、可溶性ＴＣＲ、ＴＣＲを発現している細胞、キメラ抗原受容体を発現している細胞、及び／またはＴＣＲ模倣抗体）は、別の剤形として別々に、順次、または同時に投与することができる。一実施形態では、抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は非経口で投与され、ＩＤＯ阻害剤は経口で投与される。
【０２３４】
本明細書に記載されている抗体または医薬組成物は種々の経路によって対象に送達されてもよい。これらには、非経口、鼻内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、クモ膜下、腫瘍内、結膜、動脈内、及び皮下の経路が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体または医薬組成物は静脈内に送達される。たとえば、吸入具または吸入器、及びスプレーとしての使用のためのエアロゾル化剤による製剤の使用によって肺への投与を採用することもできる。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体または医薬組成物は皮下にまたは静脈内に送達される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体または医薬組成物は動脈内に送達される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体または医薬組成物は腫瘍内に送達される。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体または医薬組成物は腫瘍流入領域リンパ節に送達される。
【０２３５】
状態の治療及び／または予防に有効であろう抗体または組成物の量は疾患の性質に左右されるであろうが、標準の臨床的な技法によって決定することができる。
【０２３６】
組成物で採用される正確な用量は、投与の経路及びそれが原因で生じる感染または疾患の重症度にも左右されるであろうが、主治医の判断及び各対象の環境に従って決定されるべきである。たとえば、有効な用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的な状況（年齢、体重及び身体の状態を含む）、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の薬物、または処置が予防上であるか、または治療上であるかに応じても変化してもよい。普通、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療することができる。治療の投与量は安全性及び有効性を最適化するように最適に用量設定される。
【０２３７】
たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、またはウエスタンブロットのような免疫アッセイを含む、当業者に既知の従来の免疫組織学的な方法を用いて生体試料にてＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質のレベルをアッセイするのに本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を使用することができる。好適な抗体アッセイの標識は当該技術で既知であり、それには、たとえば、グルコースオキシダーゼのような酵素標識、たとえば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）のような放射性同位元素、たとえば、ルミノールのような発光標識、及び、たとえば、フルオレセイン及びローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンが挙げられる。そのような標識を用いて本明細書に記載されている抗体を標識することができる。或いは、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を認識する二次抗体を標識し、抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体と組み合わせて使用してＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質のレベルを検出することができる。従って、一実施形態では、本発明は生体試料におけるＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質の試験管内検出のための本発明の抗体の使用に関する。さらなる実施形態では、本発明は、試験管内での生体試料にてＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質のレベルをアッセイし、及び／または検出するための本発明の抗ＴＩＭ−３抗体の使用に関するものであり、任意でその際、抗ＴＩＭ−３抗体は放射性核種または検出可能な標識に結合され、及び／または本明細書に記載されている標識を持ち、及び／または免疫組織学的な方法が使用される。
【０２３８】
ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質の発現レベルをアッセイすることは、第１の生体試料にて直接（たとえば、絶対的なタンパク質レベルを測定するまたは推定することによって）または相対的に（たとえば、第２の生体試料における疾患関連のタンパク質レベルと比較することによって）ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質のレベルを質的にまたは量的に測定するまたは推定することを含むように意図される。第１の生体試料におけるＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）ポリペプチドの発現レベルを測定し、または推定し、及び標準のＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）タンパク質のレベルと比較することができ、標準は、疾病を有していない個体から得られる第２の生体試料から取り出され、または疾病を有していない個体の集団に由来するレベルを平均することによって決定される。当該技術で十分に理解されるように、いったん「標準」のＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）ポリペプチドのレベルが知られると、それを比較のための標準として繰り返し使用することができる。従って、さらなる実施形態では、本発明は、免疫組織学的な方法によって生体試料におけるＴＩＭ−３タンパク質、たとえば、ヒトＴＩＭ−３タンパク質のレベルを質的にまたは量的に測定するまたは推定することを含む、生体試料にてＴＩＭ−３タンパク質のレベル、たとえば、ヒトＴＩＭ−３タンパク質のレベルをアッセイする及び／または検出する試験管内の方法に関する。
【０２３９】
本明細書で使用されるとき、用語「生体試料」は、潜在的にＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を発現している対象、細胞株、組織または細胞の他の供給源から得られる生体試料を指す。動物（たとえば、ヒト）から組織生検及び体液を得る方法は当該技術で周知である。生体試料には末梢血単核細胞が含まれる。
【０２４０】
本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、技量のある熟練者に周知であり、標準である、且つ本記載に基づいた試験管内及び生体内での適用を含む、予後診断、診断、モニタリング及びスクリーニングの適用に使用することができる。免疫系の状況及び／または免疫応答の試験管内でのアセスメント及び評価のための予後診断、診断、モニタリング及びスクリーニングのアッセイ及びキットを利用して、免疫系の機能障害を有することが知られているもしくは有すると疑われるものを含む、または予想されるもしくは所望の免疫系の応答、抗原反応もしくはワクチン反応に関して患者試料を評価するように予測し、診断し、且つモニターしてもよい。免疫系の状況及び／または免疫応答のアセスメント及び評価は、薬剤の臨床試験について、または異なる作用物質または抗体に対比させてその組み合わせを含む、特定の化学療法剤、放射線治療剤もしくは抗体の投与について、患者の好適性を判定することにおいても有用である。この種の予後診断上及び診断上のモニタリング及びアセスメントは乳癌におけるＨＥＲ２タンパク質に対する抗体を利用してすでに実践中であり（ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）、Ｄａｋｏ）、アッセイも用いてＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）を用いた抗体療法について患者を評価する。生体内の適用には、有向細胞療法及び免疫系の調節及び免疫応答の放射線画像解析が挙げられる。従って、一実施形態では、本発明は、診断剤として使用するための本発明の抗ＴＩＭ−３抗体及び／または医薬組成物に関する。一実施形態では、本発明は、免疫系の機能障害を有するまたは有すると疑われる対象を、及び／または予想されるまたは所望の免疫系の応答、抗原反応またはワクチン反応に関して対象を予測する、診断する及び／またはモニタリングする方法で使用するための本発明の抗ＴＩＭ−３抗体及び／または医薬組成物に関する。別の実施形態では、本発明は、試験管内で対象の生体試料にてヒトＴＩＭ−３タンパク質のレベルをアッセイする及び／または検出することによって免疫系の機能障害を有するまたは有すると疑われる対象を、及び／または予想されるまたは所望の免疫系の応答、抗原反応またはワクチン反応に関して対象を予測する、診断する及び／またはモニタリングするための本発明の抗ＴＩＭ−３抗体の使用に関する。
【０２４１】
一実施形態では、抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は生検試料の免疫組織化学法で使用することができる。一実施形態では、方法は試験管内の方法である。別の実施形態では、抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を用いてＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）のレベルまたはその膜表面上にＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を含有する細胞のレベルを検出することができ、次いでそのレベルを特定の疾患の症状に結び付けることができる。本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３抗体は検出可能なまたは機能的な標識を持ってもよく、及び／または放射性核種または検出可能な標識に結合されてもよい。蛍光標識が使用される場合、当該技術で既知の現在利用できる顕微鏡及び蛍光活性化細胞選別解析（ＦＡＣＳ）、または双方の方法手順の組み合わせを利用して特異的な結合メンバーを特定し、定量してもよい。本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３抗体は蛍光標識を持ってもよく、またはそれに結合されてもよい。例となる蛍光標識には、たとえば、反応性で且つ結合されるプローブ、たとえば、アミノクマリン、フルオレセイン及びテキサスレッド、アレクサフルオル色素、Ｃｙ色素及びＤｙＬｉｇｈｔ色素が挙げられる。抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、放射活性標識または放射性核種、たとえば、同位元素３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１７Ｌｕ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ及び１８６Ｒｅを持ってもよいし、またはそれに結合されてもよい。放射活性標識が使用される場合、現在利用可能な当該技術で既知の計数手段を利用してＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）への抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の特異的な結合を特定し、定量してもよい。標識が酵素である場合、現在利用されている当該技術で知られるような比色法、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法、または気体定量法のいずれかによって検出が達成されてもよい。これは、抗体とＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）との間で複合体の形成が可能である条件下で試料または対照試料を抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体と接触させることによって達成することができる。抗体とＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）との間で形成される複合体を検出し、試料及び対照にて比較する。ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）について本明細書に記載されている抗体の特異的な結合という観点から、抗体を用いて細胞の表面上におけるＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）の発現を特異的に検出することができる。本明細書に記載されている抗体を用いて免疫親和性精製を介してＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を精製することができる。本明細書に含められるのはまた、たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）またはＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）／ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）リガンドの複合体の存在の程度の定量的解析のために試験キット、キットまたはキットオブパーツの形態で調製されてもよいアッセイシステムである。システム、試験キット、キットまたはキットオブパーツは標識された成分、たとえば、標識された抗体と１以上の追加の免疫化学試薬とを含んでもよい。
【０２４２】
６．５  ポリヌクレオチド、ベクター及び抗ＴＩＭ−３抗体を作製する方法
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原に特異的に結合する本明細書に記載されている抗体またはその断片（たとえば、軽鎖可変領域及び／または重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びベクター、たとえば、宿主細胞（たとえば、Ｅ.ｃｏｌｉ及び哺乳類細胞）での組換え発現のためにそのようなポリヌクレオチドを含むベクターである。本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される抗体のいずれかの重鎖及び／または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、と同様にそのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、たとえば、宿主細胞、たとえば、哺乳類細胞での効率的な発現のための発現ベクターである。
【０２４３】
本明細書で使用されるとき、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然の供給源にて（たとえば、マウスまたはヒトにて）存在する他の核酸分子から分離されるものである。さらに、「単離された」核酸分子、たとえば、ｃＤＮＡ分子は、組換え法で生産された場合、他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含まなくてもよく、または化学合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。たとえば、言語「実質的に含まない」は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％または０．１％未満の（特に約１０％未満の）他の物質、たとえば、細胞性物質、培養培地、化学的前駆体及び／または他の化学物質を有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体をコードする核酸分子（複数可）は単離され、精製される。
【０２４４】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）ポリペプチドに特異的に結合し、且つ本明細書に記載されているようなアミノ酸配列を含む抗体、と同様にＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）ポリペプチドへの結合についてそのような抗体と競合する（たとえば、用量依存性に）、またはそのような抗体と同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。
【０２４５】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されている抗体のＶＬのＦＲ及びＣＤＲを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列（たとえば、表１を参照のこと）、または本明細書に記載されている抗体のＶＨのＦＲ及びＣＤＲを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列（たとえば、表１を参照のこと）を含むことができる。
【０２４６】
本明細書で提供されるのはまた、たとえば、コドン／ＲＮＡの最適化、異種シグナル配列による置き換え及びｍＲＮＡ不安定要素の除去によって最適化される抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体をコードするポリヌクレオチドである。コドンの変更を導入し、及び／またはｍＲＮＡにて阻害領域を除去することによって組換え発現のために最適化された、抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体をコードする核酸またはその断片（たとえば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン）を生成する方法は、適切に、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許第５，９６５，７２６号；同第６，１７４，６６６号；同第６，２９１，６６４号；同第６，４１４，１３２号；及び同第６，７９４，４９８号に記載された最適化法を適応させることによって実施することができる。たとえば、核酸配列によってコードされているアミノ酸を変化させることなくＲＮＡ内での潜在的なスプライス部位及び不安定要素（たとえば、Ａ／ＴまたはＡ／Ｕが豊富な要素）を変異させて組換え発現についてのＲＮＡの安定性を高めることができる。変化は、たとえば、同一アミノ酸についての代替コドンを用いる遺伝子コードの縮重を利用する。一部の実施形態では、保存的変異、たとえば、元々のアミノ酸と類似の化学構造及び特性及び／または機能を持つ類似のアミノ酸をコードするように１以上のコドンを変化させることが望ましい可能性がある。そのような方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによってコードされる抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の発現に比べて抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片の発現を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍以上高めることができる。
【０２４７】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片（たとえば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列を、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片（たとえば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（たとえば、相補性の）ポリヌクレオチドとハイブリッド形成させることができる。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は高度にストリンジェントな条件下で本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、高度に、中程度に、または低度にストリンジェントな条件下で本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。ハイブリッド形成の条件に関する情報は記載されており、たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号ＵＳ２００５／００４８５４９（段落７２〜７３）を参照のこと。
【０２４８】
当該技術で既知の方法によってポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドの配列を決定することができる。本明細書に記載されている抗体、たとえば、表１に記載されている抗体及びこれら抗体の修飾型をコードするヌクレオチド配列は当該技術で周知の方法を用いて決定することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られるヌクレオチドのコドンは、抗体をコードする核酸を生成するような方法で構築される。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫｕｔｍｅｉｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７：２４２−６に記載されたような）から構築することができ、手短には、それには抗体をコードする配列の部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、その後ライゲーションしたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が関与する。
【０２４９】
或いは、本明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドは当該技術で周知の方法（たとえば、ＰＣＲ及び他の分子クローニング法）を用いて好適な供給源（たとえば、ハイブリドーマ）に由来する核酸から生成することができる。たとえば、既知の配列の３’及び５’末端にハイブリッド形成可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅は対象とする抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られるゲノムＤＮＡを用いて実施することができる。そのようなＰＣＲ増幅法を用いて抗体の軽鎖及び／または重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。そのようなＰＣＲ増幅法を用いて抗体の軽鎖可変領域及び／または重鎖可変領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅した核酸を宿主細胞における発現のために及びさらなるクローニングのためにベクターにクローニングし、たとえば、キメラ抗体及びヒト化抗体を生成することができる。
【０２５０】
特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子の配列が分かっているのであれば、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成することができ、または配列の３’及び５’末端にハイブリッド形成可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、もしくは特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングして、たとえば、抗体をコードするｃＤＮＡクローンをｃＤＮＡライブラリから特定することによって、好適な供給源（たとえば、本明細書に記載されている抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞のような抗体を発現している組織または細胞から生成される抗体ｃＤＮＡライブラリまたはｃＤＮＡライブラリ、またはそれから単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得ることができる。ＰＣＲによって生成された増幅した核酸は、次いで当該技術で周知の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【０２５１】
本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（たとえば、抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を用いて容易に単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの供給源として役立つことができる。いったん単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（たとえば、ＣＨＯ  ＧＳシステム（商標）（Ｌｏｎｚａ）に由来するＣＨＯ細胞）、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞に形質移入し、組換え宿主細胞にて抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の合成を得る。
【０２５２】
全抗体を生成するには、ＶＨ及びＶＬのヌクレオチド配列、制限部位及び制限部位を保護する隣接配列を含むＰＣＲプライマーを用いてｓｃＦｖクローンにてＶＨ及びＶＬの配列を増幅することができる。当業者に既知のクローニング法を利用して、ＰＣＲで増幅したＶＨドメインを重鎖定常領域、たとえば、ヒトガンマ４定常領域を発現しているベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲで増幅したＶＬドメインを軽鎖定常領域、たとえば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現しているベクターにクローニングすることができる。特定の実施形態では、ＶＨまたはＶＬのドメインを発現するためのベクターはＥＦ−１αプロモータと分泌シグナルと可変領域のためのクローニング部位と、定常ドメインとネオマイシンのような選択マーカーとを含む。ＶＨ及びＶＬのドメインは必要な定常領域を発現している１つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に既知の技法を用いて、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを細胞株に同時形質移入し、完全長の抗体、たとえば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一時的な細胞株を生成する。
【０２５３】
たとえば、マウスの配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖の定常領域のコーディング配列を代用することによって、または非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全部または一部を免疫グロブリンのコーディング配列に共有結合することによってＤＮＡを修飾することもできる。
【０２５４】
提供されるのはまた、高度に、中程度にまたは低度にストリンジェントなハイブリッド形成の条件下で、本明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドである。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているポリヌクレオチドは、高度に、中程度にまたは低度にストリンジェントなハイブリッド形成の条件下で、本明細書で提供されるＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成する。
【０２５５】
ハイブリッド形成の条件は当該技術に記載されており、当業者に既知である。たとえば、ストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成には、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるフィルター結合のＤＮＡへのハイブリッド形成、その後の約５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける１回以上の洗浄が関与することができ；高度にストリンジェントな条件下でのハイブリッド形成には、約４５℃での６×ＳＣＣにおけるフィルター結合の核酸へのハイブリッド形成、その後の約６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳにおける１回以上の洗浄が関与することができる。他のストリンジェントなハイブリッド形成の条件下でのハイブリッド形成は当業者に既知であり、記載されており、たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＡｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの６．３．１−６．３．６ページ及び２．１０．３を参照のこと。
【０２５６】
特定の態様では、本明細書で提供されるのは、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する本明細書に記載されている抗体を発現している（たとえば、組換えで）細胞（たとえば、宿主細胞）、及び関連するポリヌクレオチド及び発現ベクターである。本明細書で提供されるのは、宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞での組換え発現のための抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（たとえば、発現ベクター）である。本明細書で提供されるのはまた、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体（たとえば、ヒト抗体またはヒト化抗体）を組換えで発現するためのそのようなベクターを含む宿主細胞である。特定の態様では、本明細書で提供されるのは、宿主細胞から本明細書に記載されている抗体を発現させることを含む、そのような抗体を作製する方法である。
【０２５７】
ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する本明細書に記載されている抗体（たとえば、本明細書に記載されている完全長の抗体、抗体の重鎖及び／または軽鎖、または単鎖抗体）の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が関与する。抗体分子をコードするポリヌクレオチド、抗体の重鎖及び／または軽鎖、または本明細書に記載されているその断片（たとえば、重鎖及び／または軽鎖の可変領域）がいったん得られていると、当該技術で周知の技法を用いた組換えＤＮＡ技術によって抗体分子の作製のためのベクターを作製することができる。従って、抗体または抗体断片（たとえば、軽鎖または重鎖）をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が本明細書に記載されている。当業者に周知である方法を用いて抗体または抗体断片（たとえば、軽鎖または重鎖）のコーディング配列ならびに適当な転写及び翻訳の制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえば、試験管内の組換えＤＮＡ法、合成法及び生体内の遺伝子組換えが挙げられる。提供されるのはまた、プロモータに操作可能に連結された、本明細書に記載されている抗体分子、抗体の重鎖または軽鎖、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域またはその断片、または重鎖または軽鎖のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターである。そのようなベクターには、たとえば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を挙げることができ（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、抗体の可変領域は、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖及び軽鎖双方の全体の発現のためにそのようなベクターにクローニングすることができる。
【０２５８】
発現ベクターは従来の技法によって細胞（たとえば、宿主細胞）に移すことができ、得られた細胞を次いで従来の技法によって培養し、本明細書に記載されている抗体またはその断片を産生させることができる。従って、本明細書で提供されるのは、宿主細胞でそのような配列を発現させるためにプロモータに操作可能に連結された、本明細書に記載されている抗体またはその断片、またはその重鎖または軽鎖またはその断片、または本明細書に記載されている単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞である。特定の実施形態では、二本鎖抗体の発現については、重鎖及び軽鎖の双方を個々にコードするベクターを、以下で詳述するように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞にて同時発現させることができる。特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載されている抗体の重鎖及び軽鎖の双方またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。具体的な実施形態では、宿主細胞は、２つの異なるベクター、本明細書に記載されている抗体の重鎖または重鎖可変領域またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載されている抗体の軽鎖または軽鎖可変領域またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含有する。他の実施形態では、第１の宿主細胞は本明細書に記載されている抗体の重鎖または重鎖可変領域またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は本明細書に記載されている抗体の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。具体的な実施形態では、第１の細胞によって発現された重鎖／重鎖可変領域は第２の細胞の軽鎖／軽鎖の可変領域と会合して本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を形成する。特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、そのような第１の宿主細胞とそのような第２の宿主細胞を含む宿主細胞の集団である。
【０２５９】
特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の軽鎖／軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体の重鎖／重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含むベクターの集団である。
【０２６０】
種々の宿主・発現ベクター系を利用して本明細書に記載されている抗体分子を発現させることができる（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。そのような宿主・発現ベクター系は、対象とするコーディング配列が産生され、その後精製され得る媒介物を表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換または形質移入されると、その場で本明細書に記載されている抗体分子を発現することができる細胞も表す。これらには、抗体のコーディング配列を含有する組換えのバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターによって形質転換される細菌（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体のコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターによって形質転換される酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ）のような微生物；抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させる昆虫細胞系；抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させる、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換される植物細胞系（たとえば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのような緑藻類）；または哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモータ（たとえば、メタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳類のウイルスに由来するプロモータ（たとえば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築物を内部に持つ哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ（たとえば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、及びＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０及びＢＭＴ１０細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体を発現させるための細胞はＣＨＯ細胞、たとえば、ＣＨＯ  ＧＳシステム（商標）（Ｌｏｎｚａ）に由来するＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体を発現させるための細胞はヒト細胞、たとえば、ヒト細胞株である。具体的な実施形態では、哺乳類の発現ベクターはｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、特に組換えの全抗体分子の発現のためのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞または真核細胞（たとえば、哺乳類細胞）は組換え抗体分子の発現に使用される。たとえば、ヒトのサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期遺伝子プロモータ要素のようなベクターを併せたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞は抗体のための効果的な発現系である（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＦｏｅｃｋｉｎｇ，ＭＫ．及びＨｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，Ｈ.（１９８６），Ｇｅｎｅ，４５：１０１−５；ならびにＣｏｃｋｅｔｔ，ＭＩ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８（７）：６６２−７）。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体はＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞によって産生される。具体的な実施形態では、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する本明細書に記載されている抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモータ、誘導性プロモータまたは組織特異的プロモータによって調節される。
【０２６１】
細菌の系では、発現される抗体分子について意図される使用に応じて多数の発現ベクターを有利に選択することができる。たとえば、大量のそのような抗体が作製されるべきである場合、抗体分子の医薬組成物の生成については、精製しやすい高レベルの融合タンパク質生成物を指向するベクターが望ましい可能性がある。そのようなベクターには、融合タンパク質が生産されるようにｌａｃＺコーディング領域とのインフレームで抗体のコーディング配列を個々にベクターにライゲーションすることができるＥ.ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ，Ｕ．及びＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，Ｂ．（１９８３），ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１−１７９４）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ，Ｓ．及びＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．（１９８５），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．及びＳｃｈｕｓｔｅｒ，ＳＭ．（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）、等が挙げられるが、これらに限定されず、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。たとえば、ｐＧＥＸベクターを使用してグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオンアガロースビーズへの吸着及び結合とその後の遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビンまたは第Ｘａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２６２】
昆虫の系では、たとえば、核多角体病ウイルスであるＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて外来遺伝子を発現させることができる。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞にて増殖する。抗体のコーディング配列をウイルスの非必須領域（たとえば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモータ（たとえば、ポリヘドリンプロモータ）の制御下に置くことができる。
【０２６３】
哺乳類の宿主細胞では、多数のウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、対象とする抗体のコーディング配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、たとえば、後期プロモータ及び３分節リーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、試験管内のまたは生体内の組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、領域Ｅ１またはＥ３）での挿入は感染させた宿主にて生存でき、抗体分子を発現することができる組換えウイルスを生じるであろう（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＬｏｇａｎ，Ｊ．及びＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４），ＰＮＡＳ，８１（１２）：３６５５−９を参照のこと）。挿入された抗体のコーディング配列の効率的な翻訳には特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドンは所望のコーディング配列のリーディングフレームと同相であって挿入物全体の翻訳を保証しなければならない。これらの外来性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは種々の起源のものであることができ、天然及び合成双方であることができる。発現の効率は適当な転写エンハンサ要素、転写ターミネータを含むことによって高めることができる（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＢｉｔｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと）。
【０２６４】
加えて、挿入した配列の発現を調節し、または所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質生成物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）及びプロセシング（たとえば、切断）はタンパク質の機能に重要であり得る。様々な宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾について特徴的で且つ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株または宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを保証することができる。この目的で、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化について細胞機構を持つ真核宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳類宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（どの免疫グロブリン鎖も内在性に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＣＯＳ（たとえば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体は、たとえば、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞にて産生される。
【０２６５】
具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は低いフコース含量を有するまたはフコース含量を有さない。そのような抗体は当業者に既知の技法を用いて作製することができる。たとえば、抗体はフコシル化する能力を欠損するまたは欠く細胞にて発現させることができる。具体例では、α１,６−フコシルトランスフェラーゼの双方の対立遺伝子をノックアウトした細胞株を用いてフコース含量が低下した抗体を作製することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、フコース含量が低下した抗体を作製するのに使用することができるそのようなシステムの例である。
【０２６６】
組換えタンパク質の長期間で高収率の生産について、安定的な発現細胞を生成することができる。たとえば、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体を安定して発現する細胞株を操作することができる。具体的な実施形態では、本明細書で提供される細胞は、会合して本明細書に記載されている抗体を形成する軽鎖／軽鎖可変領域及び重鎖／重鎖可変領域を安定して発現する。
【０２６７】
特定の態様では、ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御要素（たとえば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ及び選択可能なマーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来性のＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入に続いて、操作された細胞を強化培地にて１〜２日間増殖させ、次いで選択培地に交換することができる。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドを安定して染色体に組み込むようにし、その後クローン化し、細胞株に増殖することができる増殖巣に増殖させる。この方法を有利に使用して本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体またはその断片を発現する細胞株を操作することができる。そのような操作された細胞株は抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価で特に有用であることができる。
【０２６８】
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞における単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９７７），Ｃｅｌｌ，１１（１）：２２３−３２）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ，ＥＨ．及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｗ．（１９６２），ＰＮＡＳ，４８（１２）：２０２６−２０３４）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８０），Ｃｅｌｌ，２２（３）：８１７−２３）の遺伝子を含むが、これらに限定されない多数の選択系を使用することができ、そのすべては全体として参照によって本明細書に組み入れられる。また、以下の遺伝子：メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８０），ＰＮＡＳ，７７（６）：３５６７−７０；Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）ＰＮＡＳ，７８：１５２７−３１）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ＲＣ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．（１９８１），ＰＮＡＳ，７８（４）：２０７２−６）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ，ＧＹ．及びＷｕ，ＣＨ．（１９９１），Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ｐ，（１９９３），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ，（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２；及びＭｏｒｇａｎ，ＲＡ．及びＡｎｄｅｒｓｏｎ，ＷＦ．（１９９３），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２：１９１−２１７；Ｎａｂｅｌ，ＧＪ．及びＦｅｌｇｎｅｒ，ＰＬ．（１９９３），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１１（５）：２１１−５）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，ＲＦ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８４），Ｇｅｎｅ，３０（１−３）：１４７−５６）について選択の基礎として代謝拮抗物質耐性も使用することができ、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。組換えＤＮＡ技術の技術分野で一般に知られる方法を日常的に適用して所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ.，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ならびにｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２及び１３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ,ＮＣ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ,Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８１）,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４に記載されており、そのすべては全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
【０２６９】
抗体分子の発現レベルはベクターの増幅によって高めることができる（概説については、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，ＣＲ．及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ，ＣＣＧ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルの上昇はマーカー遺伝子のコピー数を増やすであろう。増幅される領域は抗体遺伝子に関連するので、抗体の産生も増えるであろう（全体として参照によって本明細書に組み入れられるＣｒｏｕｓｅ，ＧＦ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８３），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２５７−６６）。
【０２７０】
宿主細胞は本明細書に記載されている２以上の発現ベクターで同時形質移入することができ、第１のベクターは重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第２のベクターは軽鎖に由来するポリペプチドをコードする。２つのベクターは、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの均等な発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有することができる。宿主細胞は異なる量の２以上の発現ベクターで同時形質移入することができる。たとえば、以下：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、または１：５０の第１の発現ベクターと第２の発現ベクターの比率のいずれか１つで形質移入することができる。
【０２７１】
或いは、重鎖及び軽鎖のポリペプチド双方をコードし、且つ発現することができる単一のベクターを使用することができる。そのような状況では、軽鎖を重鎖の前に配置して過度の毒性の遊離の重鎖を回避するべきである（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰｒｏｕｄｆｏｏｔ，ＮＪ．（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３２２：５６２−５６５；及びＫｏｈｌｅｒ，Ｇ．（１９８０），ＰＮＡＳ，７７：２１９７−２１９９）。重鎖及び軽鎖のコーディング配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。発現ベクターは、モノシストロン性またはマルチシストロン性であることができる。マルチシストロン性の核酸構築物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の、または２〜５、５〜１０もしくは１０〜２０の範囲での遺伝子／ヌクレオチド配列をコードすることができる。たとえば、２シストロン性の核酸構築物は以下の順で、プロモータ、第１の遺伝子（たとえば、本明細書に記載されている抗体の重鎖）、及び第２の遺伝子（たとえば、本明細書に記載されている抗体の軽鎖）を含むことができる。そのような発現ベクターでは、双方の遺伝子の転写はプロモータによって推進することができるのに対して、第１の遺伝子に由来するｍＲＮＡの翻訳はキャップ依存性の走査メカニズムによることができ、第２の遺伝子に由来するｍＲＮＡの翻訳はキャップ非依存性のメカニズム、たとえば、ＩＲＥＳによることができる。
【０２７２】
いったん、本明細書に記載されている抗体が組換え発現によって産生されると、免疫グロブリン分子の精製について当該技術で既知の方法によって、たとえば、クロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、アフィニティ、特にプロテインＡの後での特異抗原についてのアフィニティ、及びサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、差次的溶解性、またはタンパク質の精製についての他の標準的な技法によってそれを精製することができる。さらに、本明細書に記載されている抗体を本明細書に記載されているまたはさもなければ当該技術で既知の異種ポリペプチド配列に融合させて精製を円滑にすることができる。
【０２７３】
具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は単離され、精製される。一般に、単離された抗体は、単離された抗体とは異なる抗原特異性を持つ他の抗体を実質的に含まないものである。たとえば、特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体の調製物は細胞性の物質及び／または化学的前駆体を実質的に含まない。言語「細胞性の物質を実質的に含まない」には、それが単離されるまたは組換えで産生される細胞の細胞成分から抗体が分離されている抗体の調製物が含まれる。従って、細胞性の物質を実質的に含まない抗体には、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％または０．１％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる）及び／または抗体の変異体、たとえば、抗体の様々な翻訳後修飾形態または抗体の他の様々な型（たとえば、抗体断片）を有する抗体の調製物が含まれる。抗体が組換えで産生される場合、それも一般に培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％または０．１％未満を表す。抗体が化学合成で作製される場合、それは一般に、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、それはタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。従って、抗体のそのような調製物は、対象とする抗体以外の約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満の化学的前駆体または成分を有する。具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は単離され、精製される。
【０２７４】
ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体またはその断片は抗体の合成について当該技術で既知の方法によって、たとえば、化学合成によって、または組換え発現法によって作製することができる。本明細書に記載されている方法は、指示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドの合成及び修飾、核酸のハイブリッド形成、及び当該技術の技量の範囲内での関連する分野における従来の技法を採用している。これらの技法は、たとえば、本明細書で引用されている参考文献に記載されており、文献にて十分に説明されている。たとえば、そのすべては全体として参照によって本明細書に組み入れられるＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ.ｅｔ  ａｌ．，（１９８２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ.ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ.ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ.ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７  ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７  ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ），Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ，Ｂ.ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．）（１９９９），Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【０２７５】
具体的な実施形態では、本明細書に記載されている抗体は、たとえば、ＤＮＡ配列の合成、遺伝子操作を介した創製が関与する手段によって調製され、発現され、作り出され、または単離される抗体（たとえば、組換え抗体）である。特定の実施形態では、そのような抗体は動物または哺乳類（たとえば、ヒト）の生体内での抗体の生殖細胞系列のレパトアの範囲内に天然に存在しない配列（たとえば、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列）を含む。
【０２７６】
態様の１つでは、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている細胞または宿主細胞を培養することを含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体を作る方法である。一実施形態では、方法は試験管内で実施される。特定の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されている細胞または宿主細胞（たとえば、本明細書に記載されている抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を用いて抗体を発現させること（たとえば、組換えで発現させること）を含む、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する抗体を作る方法である。特定の実施形態では、細胞は単離された細胞である。特定の実施形態では、外来性のポリヌクレオチドが細胞に導入されている。特定の実施形態では、方法はさらに、細胞または宿主細胞から得られた抗体を精製する工程を含む。
【０２７７】
ポリクローナル抗体を作製する方法は当該技術で既知である（たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＣｈａｐｔｅｒ  １１  ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２），５ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０２７８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術及びファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組み合わせを含む当該技術で既知の多種多様な技法を用いて調製することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当該技術で既知のもの、及び、たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，Ｅ.及びＬａｎｅ，Ｄ.，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ＧＪ．ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５６３  ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）にて教示されたものを含むハイブリドーマ法を用いて作製することができる。用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、ハイブリドーマ技術を介して作製される抗体に限定されない。たとえば、モノクローナル抗体は、本明細書に記載されている抗体またはその断片、たとえば、そのような抗体の軽鎖及び／または重鎖を外来性に発現している宿主細胞から組換えで作製することができる。
【０２７９】
具体的な実施形態では、「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、単一細胞（たとえば、ハイブリドーマまたは組換え抗体を産生している宿主細胞）によって産生される抗体であり、その際、抗体は、たとえば、当該技術で既知のＥＬＩＳＡまたは他の抗原結合または競合結合アッセイによって、または本明細書で提供される実施例にて判定されるように、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合する。特定の実施形態では、モノクローナル抗体はキメラ抗体またはヒト化抗体であることができる。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は一価の抗体または多価（たとえば、二価）の抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は単一特異的なまたは多重特異的な抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。本明細書に記載されているモノクローナル抗体は、たとえば、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫｏｈｌｅｒ，Ｇ．及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５），Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されたようなハイブリドーマ法によって作ることができ、または、たとえば、本明細書に記載されているような技法を用いてファージライブラリから単離することができる。クローン性細胞株及びそれによって発現されるモノクローナル抗体の調製のための他の方法は当該技術で周知である（たとえば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  ｉｎ：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２），５ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ．ｅｔ  ａｌ．，上記を参照のこと）。
【０２８０】
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を作製し、それについてスクリーニングする方法は当該技術で日常的であり、既知である。たとえば、ハイブリドーマ法では、マウス、または、たとえば、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラットもしくはマカクザルのような適当な宿主動物を免疫し、免疫に用いたタンパク質（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を導き出す。或いは、リンパ球は試験管内で免疫されてもよい。次いで、たとえば、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する（全体として参照によって本明細書に組み入れられるＧｏｄｉｎｇ，ＪＷ．（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。さらに、ＲＩＭＭＳ（反復免疫多重部位）法を用いて動物を免疫することができる（全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫｉｌｐａｔｒｉｃｋ，ＫＥ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６：３８１−９）。
【０２８１】
一部の実施形態では、マウス（または、たとえば、ラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスターまたはイヌのような他の動物）を抗原（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３））で免疫することができ、いったん免疫応答が検出されると、たとえば、マウスの血清にて抗原に特異的な抗体が検出されると、マウスの脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次いで周知の技法によって脾細胞を、好適な骨髄腫細胞、たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手できる細胞株ＳＰ２０に由来する細胞と融合させてハイブリドーマを形成する。限界希釈によってハイブリドーマを選択し、クローニングする。特定の実施形態では、免疫したマウスのリンパ節を採取し、ＮＳ０骨髄腫細胞と融合させる。
【０２８２】
好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含有する好適な培養培地にて、こうして調製されたハイブリドーマ細胞を播き、増殖させる。たとえば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠くのであれば、ハイブリドーマ用の培養培地は通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう（ＨＡＴ培地）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠損の細胞の増殖を妨げる。
【０２８３】
具体的な実施形態は、効率的に融合し、選択される抗体産生細胞による抗体の安定で高レベルの産生を支え、ＨＡＴ培地のような培地に感応性である骨髄腫細胞を採用する。これらの骨髄腫細胞株の中では、たとえば、ＮＳ０細胞株またはＭＯＰＣ−２１に由来するもの及びＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手できるＭＰＣ−１１マウス腫瘍、及びアメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手できるＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８．６５３細胞のようなマウスの骨髄腫株である。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス・ヒトのヘテロ骨髄腫細胞株もヒトのモノクローナル抗体の産生について記載されている（そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＫｏｚｂｏｒ，Ｄ.（１９８４），Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１３３：３００１−５；Ｂｒｏｄｅｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２８４】
ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に対して向けられたモノクローナル抗体の産生について、ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地をアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、当該技術で既知の方法、たとえば、免疫沈降によって、または、たとえば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような試験管内結合アッセイによって判定される。
【０２８５】
所望の特異性、親和性及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、常法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，ＪＷ.（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，上記）。この目的に好適な培養培地には、たとえば、Ｄ−ＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は動物における腹水腫瘍として生体内で増殖させてもよい。
【０２８６】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製法、たとえば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティクロマトグラフィによって培養培地、腹水液、または血清から好適に分離される。
【０２８７】
本明細書に記載されている抗体はＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を特異的に認識する抗体断片を含み、当業者に既知の技法によって生成することができる。たとえば、本明細書に記載されているＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２の断片は、たとえば、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するための）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）ような酵素を用いた免疫グロブリンのタンパク分解切断によって作製することができる。Ｆａｂ断片は、抗体分子の２つの同一のアームの一方に相当し、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと対合した完全な軽鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片はヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって連結された抗体分子の２つの抗原結合アームを含有する。
【０２８８】
さらに、本明細書に記載されている抗体は当該技術で既知の種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインがそれをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面上で提示される。特に、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を動物のｃＤＮＡライブラリ（たとえば、冒された組織のヒトまたはマウスのｃＤＮＡライブラリ）から増幅する。ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡはＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に組み換えられ、ファージミドベクターにクローニングされる。ベクターをエレクトロポレーションでＥ．ｃｏｌｉに導入し、Ｅ．ｃｏｌｉにヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは通常、ｆｄ及びＭ１３を含む線状ファージであり、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは普通、組換えでファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩに融合される。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現しているファージは、抗原によって、たとえば、標識された抗原または固形表面もしくはビーズに結合されたもしくは捕捉された抗原を用いて選択し、特定することができる。本明細書に記載されている抗体を作るのに使用することができるファージディスプレイ法の例には、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＢｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ.ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１−５０；Ａｍｅｓ，ＲＳ.ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，ＣＡ.ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ.ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｇｅｎｅ，１８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ，ＤＲ．及びＢａｒｂａｓ，ＣＦ．（１９９４），Ａｄｖａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４；国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９，ＷＯ９１／１０７３７，ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／１８６１９，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９５／１５９８２，ＷＯ９５／２０４０１，及びＷＯ９７／１３８４４；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、及び同第５，９６９，１０８号にて開示されたものが挙げられる。
【０２８９】
上記の参考文献に記載されているように、ファージの選択の後、ファージに由来する抗体のコーディング領域を単離することができ、それを用いてヒト抗体、または他の所望の抗原結合断片を含む全抗体を生成することができ、たとえば、以下に記載されているような哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含む所望の宿主にてそれを発現させることができる。そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ，ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４−９；Ｓａｗａｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：２６−３４；及びＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３にて開示されたもののような当該技術で既知の方法を用いて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２の断片のような抗体断片を組換えで作製する技法も採用することができる。
【０２９０】
特定の実施形態では、全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬのヌクレオチド配列、制限部位及び制限部位を保護するための隣接配列を含むＰＣＲプライマーを用いて鋳型、たとえば、ｓｃＦｖのクローンからＶＨまたはＶＬの配列を増幅することができる。当業者に既知のクローニング法を利用して、ＰＣＲで増幅したＶＨドメインを、ＶＨ定常領域を発現しているベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲで増幅したＶＬドメインを、ＶＬ定常領域、たとえば、ヒトのカッパまたはラムダの定常領域を発現しているベクターにクローニングすることができる。必要な定常領域を発現している１つのベクターにＶＨドメイン及びＶＬドメインをクローニングすることもできる。次いで、当業者に既知の技法を用いて、重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを細胞株に同時形質移入して完全長の抗体、たとえば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一時的な細胞株を生成する。
【０２９１】
キメラ抗体は抗体の様々な部分が様々な免疫グロブリン分子に由来する分子である。たとえば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合されたマウスまたはラットのモノクローナル抗体の可変領域を含有することができる。キメラ抗体を作製する方法は当該技術で既知である。たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＭｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＬ．（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１２０２−７；Ｏｉ，ＶＴ．及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＬ．（１９８６），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ，ＳＤ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２５：１９１−２０２；及び米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、及び同第６，３３１，４１５号を参照のこと。
【０２９２】
ヒト化抗体は所定の抗原に結合することができ、且つヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、非ヒト免疫グロブリン（たとえば、マウスの免疫グロブリン）のアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲとを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンのそれも含む。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４の領域も含むことができる。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意のクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、ＣＤＲ−移植（欧州特許第ＥＰ２３９４００号；国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７；及び米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニア化または再表面化（欧州特許第ＥＰ５９２１０６号、及び同第ＥＰ５１９５９６号；Ｐａｄｌａｎ，ＥＡ．（１９９１），Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ，ＧＭ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；及びＲｏｇｕｓｋａ，ＭＡ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３）、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、及び、たとえば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開番号ＷＯ９３／１７１０５；Ｔａｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−２５；Ｃａｌｄａｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３５３−６０；Ｍｏｒｅａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９；Ｂａｃａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−８４；Ｒｏｇｕｓｋａ，ＭＡ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（１０）：８９５，９０４；Ｃｏｕｔｏ，ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３，Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ；Ｃｏｕｔｏ，ＪＲ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９５），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７−２２；Ｓａｎｄｈｕ，ＪＳ．（１９９４），Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０及びＰｅｄｅｒｓｅｎ，ＪＴ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９−７３にて開示された技法を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の種々の技法を用いて作製することができ、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる。全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国出願公開番号ＵＳ２００５／００４２６６４Ａ１（２００５年２月２４日）も参照のこと。
【０２９３】
多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）を作る方法は記載されており、たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第７，９５１，９１７号；同第７，１８３，０７６号；同第８，２２７，５７７号；同第５，８３７，２４２号；同第５，９８９，８３０号；同第５，８６９，６２０号；同第６，１３２，９９２号；及び同第８，５８６，７１３号を参照のこと。
【０２９４】
単一ドメイン抗体、たとえば、軽鎖を欠く抗体は当該技術で周知の方法によって作製することができる。そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．（１９９９），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３１：２５−３８；Ｎｕｔｔａｌｌ，ＳＤ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００），Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（３）：２５３−２６３；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４（４）：２７７−３０２；米国特許第６，００５，０７９；及び国際公開番号ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１及びＷＯ０１／４４３０１を参照のこと。
【０２９５】
さらに、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原に特異的に結合する抗体を同様にして利用して当業者に周知の技法を用いて抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成することができる。たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＧｒｅｅｎｓｐａｎ，ＮＳ．及びＢｏｎａ，ＣＡ．（１９８９），ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ａ．（１９９１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８を参照のこと。
【０２９６】
特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗体と同じＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）のエピトープに結合する本明細書に記載されている抗体はヒト抗体である。特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗体のいずれか１つをＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）への結合から競合的に阻止する（たとえば、用量依存性に）本明細書に記載されている抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は当該技術で既知の方法を用いて作製することができる。たとえば、機能的な内在性の免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒトの重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子の複合体を無作為にまたは相同組換えによってマウスの胚性幹細胞に導入することができる。或いは、ヒトの重鎖及び軽鎖の遺伝子に加えて、ヒトの可変領域、定常領域及び多様性領域をマウスの胚性幹細胞に導入することができる。相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別にまたはそれと同時に、マウスの重鎖及び軽鎖の免疫グロブリン遺伝子を非機能性にすることができる。特にＪＨ領域のホモ接合体欠失は内在性の抗体産生を妨げる。修飾した胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入してキメラマウスを作製する。次いでキメラマウスを交配してヒト抗体を発現するホモ接合体の子孫を生じる。通常の方法にてトランスジェニックマウスを選択した抗原、たとえば、抗原（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３））の全部または一部で免疫する。抗原に対して向けられたモノクローナル抗体は、免疫したトランスジェニックマウスから従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが内部に持つヒトの免疫グロブリンの導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成し、その後クラススイッチ及び体細胞変異を受ける。従って、そのような技法を用いて治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥの抗体を作製することが可能である。ヒト抗体を作製するためのこの技術の概説については、全体として参照によって本明細書に組み入れられるＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．及びＨｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５），Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコールの詳細な考察については、たとえば、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際公開番号ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６及びＷＯ９６／３３７３５；及び米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、及び同第５，９３９，５９８を参照のこと。ヒト抗体を産生することができるマウスの例には、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．；米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍ；米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ  Ｃｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）及びＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｋｉｒｉｎ）が挙げられる。
【０２９７】
ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いた上述のファージディスプレイ法を含む当該技術で既知の種々の方法によって作ることができる。そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，８８５，７９３号；及び国際公開番号ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、及びＷＯ９１／１０７４１も参照のこと。
【０２９８】
一部の実施形態では、ヒト抗体はマウス・ヒトハイブリドーマを用いて作製することができる。たとえば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させてヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス・ヒトハイブリドーマを作製することができ、これらのるマウス・ヒトハイブリドーマをスクリーニングして標的抗原（たとえば、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを決定することができる。そのような方法は既知であり、当該技術で記載されており、たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられるＳｈｉｎｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４），Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４６：１９−２３；Ｎａｇａｎａｗａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１４：２７−３１を参照のこと。
【０２９９】
６．６  キット
提供されるのはまた、本明細書に記載されている１以上の抗体、またはその医薬組成物またはコンジュゲートを含むキットである。具体的な実施形態では、本明細書で提供されるのは、たとえば、本明細書で提供される１以上の抗体のような、本明細書に記載されている医薬組成物の成分の１以上で満たされる１以上の容器を含む医薬パックまたはキットである。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されている医薬組成物と、本明細書に記載されているもののような任意の予防剤または治療剤とを含有する。特定の実施形態では、キットは、たとえば、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）及び／またはホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）のようなＴ細胞分裂促進因子、または、たとえば、抗ＣＤ３抗体や抗ＣＤ２８抗体のようなＴＣＲ複合体を刺激する抗体を含有してもよい。任意で、そのような容器（複数可）に関連付けられるのは、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形態での通知書であり、その通知書はヒトへの投与についての製造、使用または販売の当局による認可を反映する。
【０３００】
提供されるのはまた、上記方法で使用することができるキットである。一実施形態では、キットは１以上の容器にて本明細書に記載されている抗体、好ましくは精製された抗体を含む。具体的な実施形態では、本明細書に記載されているキットは対照として実質的に単離されているＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原を含有する。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されているキットはさらに、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原と反応しない対照抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本明細書に記載されているキットは、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原への抗体の結合を検出するための１以上の要素を含有する（たとえば、抗体は、たとえば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光性化合物のような検出可能な基質に結合することができ、または一次抗体を認識する二次抗体を検出可能な基質に結合するこことができる）。具体的な実施形態では、本明細書で提供されるキットは、組換えで作製されたまたは化学的に合成されたＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原を含むことができる。キットにて提供されるＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原を固体支持体に結合することもできる。さらに具体的な実施形態では、上記に記載されているキットの検出手段には、ＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原が結合されている固体支持体が含まれる。そのようなキットは、非結合性のレポーター標識した抗ヒト抗体または抗マウス・ラット抗体を含むことができる。この実施形態では、抗体のＴＩＭ−３（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）抗原への結合は前記レポーター標識した抗体の結合によって検出することができる。一実施形態では、本発明は生体試料にてＴＩＭ−３抗原（たとえば、ヒトＴＩＭ−３）を試験管内でアッセイする及び／または検出するための本発明のキットの使用に関する。
【実施例】
【０３０１】
このセクション（すなわち、セクション７）における実施例は限定の目的ではなく、説明の目的で提供されている。
【０３０２】
７．１  実施例１：ヒトＴＩＭ−３に対する新規の抗体の生成及び性状分析
この実施例はヒトのＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン−３（ＴＩＭ−３）に結合する抗体の生成及び性状分析を記載している。特に、この実施例はヒトＴＩＭ−３に特異的に結合し、且つヒトＴＩＭ−３の機能を阻害するヒト抗体の生成を記載している。
【０３０３】
以下に記載されている試験の一部では、本発明の抗ＴＩＭ−３抗体の活性を参照抗ＴＩＭ−３抗体、ｐａｂ１９４４ｗまたはＨｕｍ１１の活性と比較した。抗体ｐａｂ１９４４ｗは米国特許第８，５５２，１５６号（全体として参照によって本明細書に組み入れられる）にて提供された抗体８２１３ＨＶ０ＬＶ０の可変領域に基づいて生成された。ｐａｂ１９４４ｗの配列を表７に示す。抗体ｐａｂ１９４４ｗは、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＦｃ領域におけるＮ２９７Ａの変異を含むＩｇＧ１抗体として発現された。抗体Ｈｕｍ１１は、米国特許公開番号ＵＳ２０１５／０２１８２７４（全体として参照によって本明細書に組み入れられる）で提供された抗体ＡＢＴＩＭ３−ｈｕｍ１１の可変領域に基づいて生成された。Ｈｕｍ１１の配列を表７に示す。抗体Ｈｕｍ１１は、ＥＵ番号付け方式に従って番号を付けたＦｃ領域におけるＳ２２８Ｐの変異を含むＩｇＧ４抗体として発現された。
【表７】
2019520809.tif 000019
2019520809.tif 000020
【０３０４】
７．１．１  Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いた抗ＴＩＭ−３抗体の生成
Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）ライブラリの生成は本明細書に記載されている。ライブラリ挿入物の生成については、ＦＡＣＳで選別したＣＤ１９陽性ヒトＢリンパ球からフェノール／クロロホルムを介して全ＲＮＡを抽出した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（カタログ番号（Ｃａｔ＃）Ｋ１６２１及びＫ１６２２）に由来するＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットを用いて第１の鎖のｃＤＮＡの合成に全ＲＮＡを使用した。抗体の可変領域をｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、レトロウイルス発現ベクター（ｐＣＭＡ）にクローニングした。続いてこれらの構築物を使用し、Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いてマウス前Ｂ細胞に形質導入し、表面上で抗体を発現させた。
【０３０５】
上記に記載されているように生成したＲｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）ライブラリを組換えヒトＴＩＭ−３及び組換えカニクイザルＴＩＭ−３に対してスクリーニングし、ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８と名付けた２つの抗体の特定に至った。ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８の可変領域の配列情報を表４にて要約する。抗体ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８はＩｇＧ１抗体として発現され、以下に記載されているアッセイで解析された。
【０３０６】
７．１．２  ＴＩＭ−３を発現している細胞への抗ＴＩＭ−３抗体の結合
フローサイトメトリーを用いて、ＴＩＭ−３を発現している細胞への結合について抗体ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８を調べた。手短には、野生型マウス１６２４−５細胞またはヒトＴＩＭ−３を発現するように操作した１６２４−５細胞をマウスのＦｃ受容体ブロック（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ＃５５３１４２）と共にインキュベートして非特異的な結合を減らした。洗浄の後、細胞を抗ＴＩＭ−３抗体またはアイソタイプ対照抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８は双方ともヒトＴＩＭ−３を発現している１６２４−５細胞への結合を示したが、野生型１６２４−５細胞への結合を示さなかった（図１）。
【０３０７】
７．１．３  抗ＴＩＭ−３抗体についての選択性アッセイ
サスペンションアレイ技術を用いてＴＩＭ−３についてのｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８の選択性をファミリーメンバーＴＩＭ−１及びＴＩＭ−４に対して評価した。ＣＯＯＨビーズ表面とのアミンカップリングを介して、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ミクロスフェアを、組換えヒトＴＩＭ−３のＦｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃２３６５−ＴＭ）、組換えヒトＴＩＭ−３のＨｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｃａｔ＃１０３９０−Ｈ０８Ｈ）、組換えカニクイザルＴＩＭ−３のＦｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃７９１４−ＴＭ）、組換えヒトＴＩＭ−１のＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃１７５０−ＴＭ）、または組換えヒトＴＩＭ−４のＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ＃２９２９−ＴＭ）にカップリングした。精製したｐａｂ２０８５、ｐａｂ２０８８及びＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体をアッセイ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ＃１１１１２５８９００１）で１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１０００ｎｇ／ｍｌに希釈した。９６ハーフウェルのフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ＃ＭＡＢＶＮ１２５０）にて５μｌのアッセイ緩衝液中の１５００Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ミクロスフェアと共に各希釈液（２５μｌ）を暗所（２０℃、６５０ｒｐｍ）で１時間インキュベートした。１：３の連続希釈（０．０８〜５４０ｎｇ／ｍｌ）によるヒトＩｇＧ１カッパ標準（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃１５１５４）の２５μｌの２つ組を用いて標準曲線を生成した。Ｒ−ＰＥ（２．５μｇ／ｍｌ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃１０９−１１６−０９７）で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２６０μｌ及びさらに１時間のインキュベート時間（２０℃、６５０ｒｐｍ）を用いて検出を行った。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてプレートを解析した。４８μｌの試料容量にてウェル当たり合計１００のビーズを計数した。ＰＥのＭＦＩ値を用いて、上記で言及した組換えタンパク質への特異的なまたは非特異的な結合を判定した。
【０３０８】
ｐａｂ２０８５（図２Ａ）及びｐａｂ２０８８（図２Ｂ）は双方ともヒト及びカニクイザルのＴＩＭ−３への特異的な結合を示し、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４への有意な結合は調べた濃度では観察されなかった。
【０３０９】
７．１．４  Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いた抗ＴＩＭ−３抗体の最適化
抗体ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８は同じ重鎖を共有している。追加の抗ＴＩＭ−３抗体を得るために、ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２０８８の重鎖に基づいて重鎖Ｒｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）サブライブラリを生成し、さらに多様な軽鎖ライブラリと組み合わせた。この新しいＲｅｔｒｏｃｙｔｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ（商標）ライブラリを組換えヒトＴＩＭ−３及び組換えカニクイザルＴＩＭ−３に対してさらにスクリーニングして軽鎖を最適化した変異体：ｐａｂ２１７３、ｐａｂ２１７４、ｐａｂ２１７５、ｐａｂ２１７６、ｐａｂ２１７７、ｐａｂ２１７８、ｐａｂ２１７９、ｐａｂ２１８０、ｐａｂ２１８１、ｐａｂ２１８２、ｐａｂ２１８３、ｐａｂ２１８４、ｐａｂ２１８５、ｐａｂ２１８６、ｐａｂ２１８７、ｐａｂ２１８８、ｐａｂ２１８９、ｐａｂ２１９０、ｐａｂ２１９１、及びｐａｂ２１９２の特定に至った。これらの軽鎖を最適化した変異体の可変領域の配列情報を表４にてリストにする。軽鎖を最適化した変異体は野生型ＩｇＧ１のＦｃ領域またはＩｇＧ１変異体のＦｃ領域を含有する抗体として発現された。このＩｇＧ１変異体のＦｃ領域はＦｃ領域のエフェクター機能に影響を及ぼさない。
【０３１０】
軽鎖を最適化した抗体ｐａｂ２１８８は、軽鎖定常ドメインにてＫａｂａｔに従って番号を付けたＴ１０９Ｓ置換（野生型配列に比べて１０９位でスレオニンのセリンによる置換）を含有する抗体であり、それはインフレームでの可変領域の定常領域へのクローニングを円滑にする。この変異は抗体の結合または機能に影響を及ぼさない保存的な修飾である。ｐａｂ２１８８ｗと名付けられ、Ｋａｂａｔに従って番号を付けた軽鎖の１０９位にてスレオニンを含有する野生型対応物も生成した。抗体ｐａｂ２１８８ｗはＩｇＧ１  Ｎ２９７ＡのＦｃ領域を含有する抗体として発現された。
【０３１１】
７．１．５  ＴＩＭ−３を発現している細胞への抗ＴＩＭ−３抗体の結合
上記に記載されているものに類似するフローサイトメトリーアッセイにてヒトまたはカニクイザルのＴＩＭ−３を発現している細胞への結合について軽鎖を最適化した変異体を評価した。変異体はすべてヒトＴＩＭ−３（図３Ａ及び３Ｂ）またはカニクイザルＴＩＭ−３（図３Ｃ及び３Ｄ）を発現するように操作されたマウス１６２４−５細胞への結合を示したが、野生型のマウス１６２４−５細胞への結合は示さなかった（データは示さず）。
【０３１２】
軽鎖を最適化した変異体の初代ヒトＴ細胞への結合を親抗体ｐａｂ２０８５のそれと比較した。手短には、健常ドナーのバフィーコート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ）からフィコール勾配によって単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて接触していない汎Ｔ細胞について濃縮した。次いで、１０％熱非働化ＦＢＳで補完したＲＰＭＩ培地にてＴリンパ球の濃縮した集団をプレートに結合した抗ＣＤ３抗体（ＳＰ３４、３μｇ／ｍｌ）及び可溶性抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８.１、２μｇ／ｍｌ）によって３７℃及び５％ＣＯ２で３日間活性化した。活性化に続いて、細胞をヒトＦｃ受容体ブロックと共に室温で１５分間インキュベートして非特異的な結合を低減した（ＦｃＲブロック、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体（１２点の用量設定、１０，０００ｎｇ／ｍｌ〜０．０６ｎｇ／ｍｌ）を個々の試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。試料を２回洗浄し、すべて２．５μｇ／ｍｌでＦＩＴＣを結合した抗カッパ抗体と同様に抗ＣＤ３（ＢＶ７１１、ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４（ＢＶ６０５、ＯＫＴ４）及び抗ＣＤ８ａ（ＰＥ、ＲＰＡ−Ｔ８）を含有する抗体カクテルを緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）で希釈し、各試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。試料を２回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡのＷＥＨＩ  Ｗｅａｓｅｌソフトウエアとの組み合わせを用いてフローサイトメトリーのプロットを解析した。
【０３１３】
図４に示すように、この試験で調べた軽鎖を最適化した変異体はすべて親抗体ｐａｂ２０８５よりも活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞への強力な結合を示した。
【０３１４】
次に、初代カニクイザル細胞への結合について抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８を調べた。カニクイザルから単離された凍結保存したＰＢＭＣ（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を解凍し、洗浄し、次いでフローサイトメトリー解析に供した。抗体のインキュベートに先立って、室温にて１０％カニクイザル血清（Ａｂｃａｍ）で細胞を１５分間処理して非特異的な結合を低減した。抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体（１０点の用量設定、２０，０００ｎｇ／ｍｌ〜０．６ｎｇ／ｍｌ）を個々の試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。試料を２回洗浄し、緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）で希釈した２．５μｇ／ｍｌでのＦＩＴＣを結合した抗カッパ抗体と同様に抗ＣＤ１１ｂ（ＢＶ７８５，Ｍ１／７０）を含有する抗体カクテルを各試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。試料を２回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡのＷＥＨＩ  Ｗｅａｓｅｌソフトウエアとの組み合わせを用いてフローサイトメトリーのプロットを解析した。
【０３１５】
図５に示すように、抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８は用量依存性に初代カニクイザル骨髄細胞を結合した。
【０３１６】
７．１．６  抗ＴＩＭ−３抗体のリガンド阻止活性
放射線照射したＷＲ１９Ｌマウスリンパ腫細胞によって発現されるホスファチジルセリンへの組換えヒトまたはカニクイザルＴＩＭ−３の結合を阻止する能力について抗ＴＩＭ−３抗体を調べた。抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体（ヒトについての９点の用量設定、２０，０００ｎｇ／ｍｌ〜７０ｎｇ／ｍｌ；またはカニクイザルについての６点の用量設定、２０，０００ｎｇ／ｍｌ〜６２５ｎｇ／ｍｌ）を、１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液（ｐＨ７．４に調整した１０ｍＭのＨｅｐｅｓ，１４０ｍＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＣａＣｌ２）にて調製した組換えヒトＴＩＭ−３  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２３６５−ＴＭ）または組換えカニクイザルＴＩＭ−３  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃７９１４−ＴＭ）（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に室温にて３０分間インキュベートした。２０Ｇｙで放射線照射し、１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液に再浮遊させたＷＲ１９Ｌ細胞を１×１０６個／ｍｌの最終密度で抗ＴＩＭ−３：ＴＩＭ−３−Ｆｃのカクテルに加え、室温で４５分間インキュベートした。試料を１回洗浄し、１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液で希釈したＰＥ結合の抗Ｆｃ抗体（１：１００希釈）と同様に生存染色（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＮＩＲチャンネル；１：１０００希釈）を含有する抗体カクテルを各試料に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液で試料を１回洗浄し、１５０μｌの緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）に再浮遊させ、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡを用いてフローサイトメトリーのプロットを解析した。
【０３１７】
抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２０８５及びｐａｂ２１８８は、組換えヒトＴＩＭ−３（図６Ａ）及び組換えカニクイザルＴＩＭ−３（図６Ｂ）のホスファチジルセリンへの結合を阻止した。
【０３１８】
７．１．７  ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）の刺激の際のヒトＰＢＭＣに対する抗ＴＩＭ−３抗体の効果
初代ヒトＰＢＭＣに対する軽鎖を最適化した変異体の機能的な活性をブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）の刺激に続いて評価した。手短には、９６穴ＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））にてＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ＃ａｎｔ−ｎｒ）及び１０％熱非働化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で補完したＲＰＭＩ１６４０に凍結保存したヒトＰＢＭＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を１×１０５個／ウェルで入れた。５μｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブ（ロット７００２６８８３００、Ｍｙｏｄｅｒｍ）、抗ＴＩＭ−３抗体（１０μｇ／ｍｌ）、及びＳＥＡスーパー抗原（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で３７℃及び５％ＣＯ２にて細胞を６日間培養した。細胞を含まない上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＩＦＮγのレベルを測定した。
【０３１９】
抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブと組み合わせた場合、軽鎖を最適化した変異体はこの初代ヒトＰＢＭＣアッセイにてＩＦＮγの産生を高めた（図７）。
【０３２０】
改変したプロトコールを用いてＳＥＡ刺激アッセイにてｐａｂ２１８８ｗの機能的な活性を解析した。９６穴ＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））にてＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ＃ａｎｔ−ｎｒ）及び１０％熱非働化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で補完したＲＰＭＩ１６４０に凍結保存したヒトＰＢＭＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を１×１０５個／ウェルで入れた。５μｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブ（ロット７００２６８８３００、Ｍｙｏｄｅｒｍ）、抗ＴＩＭ−３抗体（１０μｇ／ｍｌ）、及びＳＥＡスーパー抗原（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で３７℃及び５％ＣＯ２にて細胞を９日間培養した。次いで細胞を１回洗浄し、新しいＳＥＡと抗体で２日間再刺激した。細胞を含まない上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＩＦＮγのレベルを測定した。
【０３２１】
図８Ａ〜８Ｆに示すように、抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）は単独でまたは抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとの併用で、このＳＥＡ刺激アッセイにおける複数のドナーに由来するヒトＰＢＭＣにてＩＦＮγの産生を高めた。
【０３２２】
７．２  実施例２：ＣＤＲ変異誘発を用いた抗ＴＩＭ−３抗体の最適化
結合親和性を改善するために、重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲ残基の定方向変異誘発を用いて抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗを修飾した。手短には、それぞれＮＮＫ縮重コドン無作為化を用いて修飾したＣＤＲＨまたはＣＤＲＬの領域を含有する６つのＦａｂファージディスプレイライブラリを親抗体ｐａｂ２１８８ｗに基づいて生成した。Ｆａｂファージライブラリを組換えヒトＴＩＭ−３及び組換えカニクイザルＴＩＭ−３抗原に対する親和性駆動選択に供した。ＡＭ−１、ＡＭ−２、ＡＭ−３、ＡＭ−４、ＡＭ−５、ＡＭ−６、ＡＭ−７、ＡＭ−８、及びＡＭ−９と名付けられた９つのクローンを結合及び解離速度の測定に基づいて選択した。これら９つのクローンの可変領域の配列情報を表４にて要約する。これらの変異体はすべてｐａｂ２１８８ｗの軽鎖を共有するが、重鎖ＣＤＲ１に変異を含有する。ＡＭ−１〜ＡＭ−９はＩｇＧ１、Ｎ２９７ＡのＦｃ領域を含有する完全長の抗体として発現され、以下に記載されている実験で解析された。
【０３２３】
７．２．１  ＴＩＭ−３を発現している細胞への抗ＴＩＭ−３抗体の結合
ヒトＴＩＭ−３を異所性に発現しているＪｕｒｋａｔ細胞への抗体ＡＭ−１〜ＡＭ−９の結合をフローサイトメトリー解析にて親抗体ｐａｂ２１８８ｗのそれと比較した。図９Ａに示すように、変異体はすべてＴＩＭ−３を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞に結合し、ＡＭ−２及びＡＭ−６は親抗体ｐａｂ２１８８ｗよりも強力な結合を示した。内在性にＴＩＭ−３を発現しているヒト急性骨髄性白血病細胞株であるＫａｓｕｍｉ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２７２５（商標）（図９Ｂ）と同様にブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）で刺激したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｃ）及びＳＥＡで刺激したカニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｄ）を用いたフローサイトメトリーによってＡＭ−２及びＡＭ−６の結合をさらに解析した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞への結合については、健常ドナーのバフィーコート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ＬＬＣ）からフィコール勾配によって単離したヒトＰＢＭＣを、１０％熱非働化ＦＢＳで補完したＲＰＭＩ培地にて３７℃及び５％ＣＯ２でＳＥＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）により８日間活性化した。活性化に続いて、細胞をヒトＦｃ受容体ブロックと共に室温で１５分間インキュベートして非特異的な結合を低減した（ＦｃＲブロック、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体（１２点の用量設定、１０，０００ｎｇ／ｍｌ〜０．０６ｎｇ／ｍｌ）を個々の試料に加え、４℃で３０分間インキュベートした。同様に、カニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞への結合については、単離したカニクイザルＰＢＭＣを凍結ストック（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ  Ｉｎｃ．）から解凍し、１０％熱非働化ＦＢＳによって補完したＲＰＭＩ培地にて３７℃及び５％ＣＯ２でＳＥＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）により５日間活性化した。活性化したカニクイザルＰＢＭＣをヒトＦｃ受容体ブロック（ＦｃＲブロック、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）とカニクイザル血清（Ａｂｃａｍ）の組み合わせと共に室温で１５分間インキュベートして非特異的な結合を低減した。それぞれ２．５μｇ／ｍｌでの、フィコエリスリンを結合したＡＭ−２抗体またはアイソタイプ対照抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＰＥ結合、６点の用量設定、１０，０００ｎｇ／ｍｌ〜４１ｎｇ／ｍｌ）と、抗ＣＤ４抗体（ＢＶ６０５、ＯＫＴ４）及び抗ＣＤ８ａ抗体（ＰＥ、ＳＫ１）のカクテルとを緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）で希釈し、各試料に加え、４℃にて３０分間インキュベートした。試料を２回洗浄し、すべて２．５μｇ／ｍｌでＦＩＴＣを結合した抗カッパ抗体と同様に抗ＣＤ３（ＢＶ７１１，ＯＫＴ３）、抗ＣＤ４（ＢＶ６０５，ＯＫＴ４）及び抗ＣＤ８ａ（ＰＥ，ＲＰＡ−Ｔ８）を含有する抗体カクテルを緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ７．２）で希釈し、各試料に加え、４℃にて３０分間インキュベートした。試料を２回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡのＷＥＨＩ  Ｗｅａｓｅｌソフトウエアとの組み合わせを用いてフローサイトメトリーのプロットを解析した。ＡＭ−２及びＡＭ−６は双方ともＫａｓｕｍｉ−３細胞（図９Ｂ）及び活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｃ）への結合を示した。ＡＭ−２は活性化カニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞（図９Ｃ）への結合も示した（図９Ｄ）。
【０３２４】
次に、類似のアッセイにて、フィコエリスリン（ＰＥ）を結合したｐａｂ２１８８ｗ抗体、ＡＭ−２抗体、またはアイソタイプ対照抗体を用いたフローサイトメトリーによってヒト及びカニクイザルの初代ＣＤ１４＋骨髄細胞への結合を解析した。手短には、ヒトまたはカニクイザル（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ  Ｉｎｃ．）から単離した凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、次いでフローサイトメトリー解析に供した。抗体とのインキュベートに先立って、細胞を１０％カニクイザル血清（Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ＃ａｂ１５５１０９）によって室温で１５分間処理し、非特異的な結合を低減した。ＰＥを結合した抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体（１２点の用量設定、ヒトＰＢＭＣについては１０，０００ｎｇ／ｍｌ〜０．０５ｎｇ／ｍｌ及びカニクイザルＰＢＭＣについては１００，０００ｎｇ／ｍｌ〜０．５ｎｇ／ｍｌ）を、抗ＣＤ１４抗体（ＡＰＣ，Ｍ５Ｅ２）及びＺｏｍｂｉｅ  Ｇｒｅｅｎ（商標）固定できる生存能力マーカーを含有する抗体カクテルにおける個々の試料に加え、次いで４℃で３０分間インキュベートした。追加の試料は、単染色補償対照（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５−ＰＥ、及びＣＤ４５−ＡＰＣ；クローンＭＢ４−６Ｄ６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）のために取っておいた。試料を緩衝液で２回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡのＷＥＨＩ  Ｗｅａｓｅｌソフトウエアとの組み合わせを用いてフローサイトメトリーのプロットを解析した。ＡＭ−２は親抗体ｐａｂ２１８８ｗよりも強い、ヒト（図９Ｅ）及びカニクイザル（図９Ｆ）のＣＤ１４＋骨髄細胞に対する結合を示した。
【０３２５】
７．２．２  抗ＴＩＭ−３抗体についての選択性アッセイ
サスペンションアレイ技術を用いてＴＩＭ−３についてのＡＭ−２及びＡＭ−６の選択性を評価した。ＣＯＯＨビーズ表面とのアミンカップリングを介してＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ミクロスフェアを組換えヒトＴＩＭ−３のＨｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１０３９０−Ｈ０８Ｈ）、組換えカニクイザルＴＩＭ−３のＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃９０３１２−Ｃ０２Ｈ）、組換えマウスＴＩＭ−３のＦｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１５２９−ＴＭ）、組換えヒトＴＩＭ−１のＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１７５０−ＴＭ）、組換えヒトＴＩＭ−４のＨｉｓ（Ｒ＆Ｄ、＃２９２９−ＴＭ）、組換えヒトＯＸ４０のＨｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１０４８１−Ｈ０８Ｈ）、組換えヒトＧＩＴＲのＦｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃６８９−ＧＲ）、組換えヒトＤＲ３のＦｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃９４３−Ｄ３）、及び組換えヒトＣＤ１３７のＦｃ（社内製造物質）とカップリングさせた。精製したｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、及びＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａアイソタイプ対照抗体をアッセイ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  １１１１２５８９００１）で１００００ｎｇ／ｍｌ〜０．１ｎｇ／ｍｌの用量設定に希釈した。９６ハーフウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢＶＮ１２５０）にて各希釈物（２５μｌ）を暗所（２０℃、６５０ｒｐｍ）で５μｌのアッセイ緩衝液中の１５００Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ミクロスフェアと共に１時間インキュベートした。検出は、Ｒ−ＰＥ（２．５μｇ／ｍｌ；ＪＩＲ１０９−１１６−０９７）で標識した６０μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ）２及びさらに１時間のインキュベート時間（２０℃、６５０ｒｐｍ）を用いて実施した。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）２００システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてプレートを解析した。４８μｌでの試料容量でのウェル当たり合計１００のビーズを数えた。ＰＥのＭＦＩ値を用いて組換えタンパク質への特異的なまたは非特異的な結合を判定した。
【０３２６】
抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗ（図１０Ｂ）、ＡＭ−２（図１０Ｃ）、及びＡＭ−６（図１０Ｄ）は、  ｓｈｏｗｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ヒト及びカニクイザルのＴＩＭ−３に対する特異的な結合を示したが、マウスＴＩＭ−３、ヒトＴＩＭ−１、ヒトＴＩＭ−４、ヒトＯＸ４０、ヒトＧＩＴＲ、ヒトＤＲ３、またはヒトＣＤ１３７に対しては調べた濃度で有意な結合を検出しなかった。
【０３２７】
７．２．３  抗ＴＩＭ−３抗体のリガンド阻止活性
ホスファチジルセリンのヒトまたはカニクイザルＴＩＭ−３への結合を阻止する能力について抗ＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２及びＡＭ−６をさらに解析した。手短には、抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体（１０点の用量設定、４０，０００ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を、１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液（ｐＨ７．４に調整した１０ｍＭのＨｅｐｅｓ，１４０ｍＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＣａＣｌ２）にて調製した組換えヒトＴＩＭ−３  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２３６５−ＴＭ）または組換えカニクイザルＴＩＭ−３  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃７９１４−ＴＭ）（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）と共に室温にて３０分間インキュベートした。２０Ｇｙで放射線照射し、１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液に再浮遊させたＷＲ１９Ｌ細胞を１×１０６個／ｍｌの最終密度で抗ＴＩＭ−３：ＴＩＭ−３−Ｆｃのカクテルに加え、室温で４５分間インキュベートした。試料を１回洗浄し、１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液で希釈したＰＥ結合の抗Ｆｃ抗体（１：１００希釈）と同様に生存染色（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＮＩＲチャンネル；１：１０００希釈）を含有する抗体カクテルを各試料に加え、室温で２０分間インキュベートした。次いで１×アネキシン−Ｖ結合緩衝液で試料を１回洗浄し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。ＦＡＣＳ  ＤＩＶＡを用いてフローサイトメトリーのプロットを解析した。
【０３２８】
図１１Ａ及び１１Ｂに示すように、抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗ、ＡＭ−２及びＡＭ−６はホスファチジルセリンを発現している細胞へのヒトまたはカニクイザルのＴＩＭ−３の結合を効果的に阻止した。
【０３２９】
７．２．４．  ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）の刺激の際のヒトＰＢＭＣに対する抗ＴＩＭ−３抗体の効果
ブドウ球菌腸毒素Ａ（ＳＥＡ）によって刺激した初代ヒトＰＢＭＣを用いてｐａｂ２１８８ｗの変異体の機能的活性を解析した。手短には、９６穴ＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））にてＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ＃ａｎｔ−ｎｒ）及び１０％熱非働化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で補完したＲＰＭＩ１６４０に凍結保存したヒトＰＢＭＣ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を１×１０５個／ウェルで入れた。５μｇ／ｍｌの抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブ（ロット７００２６８８３００、Ｍｙｏｄｅｒｍ）、抗ＴＩＭ−３抗体（１０μｇ／ｍｌ）、及びＳＥＡスーパー抗原（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｔｏｘｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で３７℃及び５％ＣＯ２にて細胞を９日間培養した。次いで細胞を１回洗浄し、新しいＳＥＡと抗体とで２日間再刺激した。細胞を含まない上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＩＦＮγのレベルを測定した。
【０３３０】
図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、ｐａｂ２１８８ｗの多数の変異体は単独で、または抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとの併用で２人の異なるドナーに由来するヒトＰＢＭＣにてＩＦＮγの産生を高めた。
【０３３１】
７．２．５  腫瘍浸潤リンパ球のサイトカイン産生に対する抗ＴＩＭ−３抗体の効果
活性化した初代腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のサイトカイン産生を刺激する能力について、抗ＴＩＭ−３抗体を単独で、または抗ＰＤ−１抗体との併用でさらに評価した。新鮮な非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ステージＩＩ）、胆嚢腺癌（ステージＩＶ）または乳癌（ステージＩＩ）の腫瘍（ＵＭａｓｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から機械的な顕微切断を介して単個細胞浮遊液を分離した。場合によっては、線維化のレベルに応じて酵素消化が必要だった（リベラーゼ及びＤＮＡ分解酵素Ｉ，Ｒｏｃｈｅ）。９６穴ＮＵＮＣＬＯＮデルタ表面プレート（ＮＵＮＣ（商標））にてＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ  ＃ａｎｔ−ｎｒ）、組換えヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０％熱非働化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で補完したＲＰＭＩ１６４０に５×１０４個／ウェルで細胞を１日間置いた。翌日、試料を遠心分離し、対象とする抗体（２０μｇ／ｍｌでの抗ＴＩＭ−３抗体及び５μｇ／ｍｌでの抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブ）及び抗ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（１：１のビーズ：細胞の比）を含有する新しい培養培地を１００μｌの最終容量で加え、３７℃及び５％ＣＯ２にて３日間インキュベートした。細胞を含まない上清を回収し、分析まで−８０℃で保存した。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＩＦＮγ及びＴＮＦαのレベルを測定した。
【０３３２】
図１３Ａ〜１３Ｆに示すように、抗ＴＩＭ−３抗体は、ＮＳＣＬＣ、胆嚢腺癌または乳癌の腫瘍に由来する活性化した初代ＴＩＬによるＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生を高めた。
【０３３３】
７．２．６  結合の際の抗ＴＩＭ−３抗体の内部移行
この実施例では、抗ＴＩＭ−３抗体の細胞内への内部移行を解析した。第１の設定の実験では、αＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１(非切断性リンカーによってメイタンシノイドＤＭ１に結合された抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体、Ｍｏｒａｄｅｃ  ＬＬＣ）を用いて抗ＴＩＭ−３抗体の内部移行を評価した。この二次抗体薬剤のコンジュゲートαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１は試験抗体（たとえば、抗ＴＩＭ−３抗体）に結合し、内部移行の際、細胞の細胞質への細胞傷害性ペイロードＤＭ１の放出を生じる。第２の設定の実験では、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に直接結合させた抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）及びＨｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）を用いて内部移行を評価した。各抗体が類似の薬剤・抗体の比（ＤＡＲ；アイソタイプ対照＝３．５、ｐａｂ２１８８ｗ＝４．０、Ｈｕｍ１１＝３．０）を示したということは、内部移行の際の同等レベルの薬剤・抗体のコンジュゲート（ＡＤＣ）の送達を支持している。第３の設定の実験では、細胞不浸透性の蛍光色素で標識したＴＩＭ−３タンパク質の細胞内局在によって内部移行を評価した。
【０３３４】
手短には、内在性にＴＩＭ−３を発現している急性骨髄性白血病細胞株であるＫａｓｕｍｉ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＣＲＬ−２７２５（商標））及びＴＩＭ−３を発現するように操作したＪｕｒｋａｔ細胞株をウェル当たり２×１０４個の密度で白底組織培養プレートに入れた。二次抗体薬剤のコンジュゲートαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１を用いた第１の設定の実験については、αＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１（一次抗体との１：１）と協調して８点用量設定（３，３３３ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ）の抗ＴＩＭ−３抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照抗体を１００μｌ／ウェルの最終容量で細胞に加えた。一次抗体及び二次抗体薬剤のコンジュゲートと共に細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にて７２時間インキュベートした。
【０３３５】
広い範囲の抗体濃度にわたる細胞生存の大きな低下によって証拠付けられたように、抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）、及びＡＭ−６（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）はαＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１実験にて、参照の抗ＴＩＭ−３抗体Ｈｕｍ１１（ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）及びｐａｂ１９４４ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）よりも効果的に、Ｊｕｒｋａｔ細胞（図１４Ａ）及びＫａｓｕｍｉ−３細胞（図１４Ｂ）で発現されたＴＩＭ−３を内部移行させた。
【０３３６】
第２の設定の実験については、抗体ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）及びＨｕｍ１１（参照、ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）を類似の濃度のＭＭＡＥに直接結合させ、抗体の異なるＦｃ領域に結合する二次薬剤コンジュゲート（αＨＦｃ−ＮＣ−ＤＭ１）の傾向での潜在的な差異を説明した。９点の用量設定（６，６６６ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌ）のＭＭＡＥを結合した抗ＴＩＭ−３抗体またはＭＭＡＥを結合したＩｇＧアイソタイプ対照抗体を１００μｌ／ウェルの最終濃度で細胞に加えた。結合した抗体と共に３７℃及び５％ＣＯ２で細胞を７２時間インキュベートした。インキュベートに続いて９０μｌの再構成したＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、細胞を室温で５分間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、得られた発光を記録した。
【０３３７】
図１４Ｃに示すように、抗体ｐａｂ２１８８ｗ（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）が抗体Ｈｕｍ１１（参照、ＩｇＧ４、Ｓ２２８Ｐ）よりも細胞生存の大きな低下を誘導したということは、二次抗体薬剤コンジュゲートによって観察された効果（図１４Ａに示すような）は各ＴＩＭ−３抗体の内部移行能に起因し得たことを示している。
【０３３８】
第３の設定の実験では、抗ＴＩＭ−３抗体の内部移行は生細胞の共焦点蛍光顕微鏡によって解析した。Ｈａｌｏタグ−ＴＩＭ−３融合タンパク質を発現しているＪｕｒｋａｔ細胞を先ず、１μＭのバイオレット増殖色素４５０（ＢＤ）と共に３７℃及び５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベートの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞培養培地に再浮遊させた。ＴＩＭ−３の細胞外ドメインを検出するために、Ｊｕｒｋａｔ  Ｈａｌｏタグ−ＴＩＭ−３細胞を膜不浸透性Ｈａｌｏタグアレクサフルオル４８８リガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ、１μＭ）によって３７℃及び５％ＣＯ２で１５分間染色した。次いで細胞を新しい培養培地に再浮遊させ、抗ＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）またはアイソタイプ対照（１０μｇ／ｍｌでの各抗体）と共に３８４穴顕微鏡プレート（１５，０００個／ウェル）に入れた。環境制御下（３７℃及び５％ＣＯ２）にてＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ微細共焦点ハイコンテンツ顕微鏡（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてライブ画像を収集し、３．５時間の経過の間３０分ごとに画像を取得した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ解析ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて画像解析を行った。Ｊｕｒｋａｔ細胞はＤＡＰＩチャンネル（バイオレット増殖色素４５０）から特定され、内部移行したＴＩＭ−３シグナルの量はＦＩＴＣチャンネル（Ｈａｌｏタグアレクサフルオル４８８）から定量した。
【０３３９】
図１５に示すように、ＴＩＭ−３の内部移行の経時的な増加は、アイソタイプ対照抗体と共にインキュベートした細胞に比べて抗ＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２と共にインキュベートした細胞について観察された。特に、３．５時間後、ＡＭ−２抗体処理は、アイソタイプ対照抗体で処理したＴＩＭ−３陽性細胞に比べてＴＩＭ−３内部移行を示すＴＩＭ−３陽性細胞の比率の２倍を生じた（すなわち、それぞれ１５．１％の内部移行に対して７．２％の内部移行）。さらに、ＡＭ−２抗体で処理した細胞について観察された内部移行シグナルはアイソタイプ対照抗体で処理した細胞よりも３．５時間で有意に高かった（ｐ＝０．０００２７、片側ｔ検定）。０時間の時点では統計的な有意差はなかった（ｐ＝０．９１、片側ｔ検定）。
【０３４０】
７．３  実施例３：抗ＴＩＭ−３抗体のエピトープマッピング
この実施例では、抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）、ｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体）、及びＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）のエピトープを特徴付けた。
【０３４１】
７．３．１  アラニン走査を用いた抗ＴＩＭ−３抗体のエピトープマッピング
抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）及びｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体）の結合特性をアラニン走査によって評価した。手短には、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｔ＃Ｇ５９０１Ａ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＨＴタンパク質操作システムを用いて細胞外ドメインにアラニン置換を持つヒトＴＩＭ−３の突然変異体を生成した。レトロウイルス形質導入を用いてマウス１６２４−５プレＢ細胞の表面にヒトＴＩＭ−３突然変異体を発現させた。ヒトＴＩＭ−３を発現している細胞の形質導入効率または比率を５％未満に保ってほとんどの細胞が２以上の異なるＴＩＭ−３突然変異体を発現しないことを保証した。
【０３４２】
フローサイトメトリーにてポリクローナル抗ＴＩＭ−３抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃ＡＦ２３６５）への結合によって証拠付けられたように、正しく折り畳まれたヒトＴＩＭ−３突然変異体を発現している細胞は、モノクローナル抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）またはｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体）に結合しないヒトＴＩＭ−３突然変異体を発現している亜集団についてさらに選択された。特異的な抗体結合を示す細胞を分離用高速ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって非結合細胞集団から分離した。抗体反応性または非反応性の細胞プールを組織培養で再び増殖させ、明瞭に検出可能な抗ＴＩＭ−３抗体（ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）またはｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体））非反応性細胞集団が得られるまで抗体指向の細胞選別及び組織培養増殖のサイクルを繰り返した。この抗ＴＩＭ−３抗体（ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）またはｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体））非反応性細胞集団を最終的な単個細胞選別工程またはバルク選別工程に供した。細胞増殖の数日後、単個細胞選別した細胞またはバルク選別した細胞を再びポリクローナル抗ＴＩＭ−３抗体への結合及びモノクローナル抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）またはｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体）への非結合についてフローサイトメトリーによって調べた。
【０３４３】
表現型を遺伝子型と結び付けるために、ヒトＴＩＭ−３突然変異体を発現しているバルク選別した細胞でＮＧＳ配列決定を行った。配列解析は、ポリクローナル抗ＴＩＭ−３抗体に反応性であるが、モノクローナル抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）またはｐａｂ２１８７（ＩｇＧ１変異体）に反応性ではない細胞は配列番号７９に従って番号付けした４０位がＰｈｅからＡｌａに変異したヒトＴＩＭ−３突然変異体を発現していることを示した。
【０３４４】
７．３．２  水素・重水素交換（ＨＤＸ）質量分光分析を用いた抗ＴＩＭ−３抗体のエピトープマッピング
第１の試験では、水素・重水素交換（ＨＤＸ）質量分光分析を用いてｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）のヒトＴＩＭ−３との相互作用を検討した。
【０３４５】
脱グリコシル化処理については、２５０μｇの組換えヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ＃２３６５−ＴＭ）を４μｌのＰＮＧａｓｅＦと共に３７℃で３時間インキュベートした。ヒトＴＩＭ−３／ＦｃキメラはヒトＩｇＧ１に融合した配列番号１０２のアミノ酸配列を含む。
【０３４６】
ペプシン消化については、１１５μｌの４Ｍの塩酸グアニジン、０．８５ＭのＴＣＥＰ緩衝液（最終ｐＨ２．５）を加え、混合物を１０℃で３分間インキュベートすることによって、１１５μｌの対照緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）における６．９μｇのネイティブの、または脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラを変性させた。次いで社内で詰めたペプシンカラムを用いたオンカラムでのペプシン消化に混合物を供し、得られたペプチドを、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）に繋いだＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで構成されるＵＰＬＣ−ＭＳシステムを用いて解析した。ペプチドを、２〜３２％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％ギ酸）の２０．５分の勾配によって５０ｍｍ×１ｍｍのＣ８カラムで分離した。ペプチドの特定は、ＭａｓｃｏｔソフトウエアによるヒトＴＩＭ−３配列に対するＭＳ／ＭＳデータを検索することを介して行った。前駆体の質量許容差及び生成物イオンはそれぞれ２０ｐｐｍ及び０．０５Ｄａだった。
【０３４７】
１０μｌのネイティブのまたは脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラ（６．９μｇ）、１０μｌのネイティブのヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラと抗体との混合物（６．９μｇ：１２．９μｇ）、または１０μｌの脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラと抗体との混合物（６．９μｇ：１２．９μｇ）を１０５μｌの酸化重水素標識緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＤ７．４）と共に０秒間、６０秒間、３００秒間、１８００秒間、７２００秒間、１４４００秒間、及び２８８００秒間インキュベートした。重水素交換は、ネイティブヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラ及び抗体とのその複合体については１０℃にて、または脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラ及び抗体とのその複合体については４℃にて行った。１１５μｌの４Ｍの塩酸グアニジン、０．８５ＭのＴＣＥＰ緩衝液（最終ｐＨ２．５）を加えることによって重水素交換を止めた。それに続いて、反応を止めた試料を上述のようなオンカラムのペプシン消化及びＬＣ−ＭＳ解析に供した。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。重水素の取り込みの算出については、所与のペプチドについての質量スペクトルを抽出されたイオンクロマトグラムのピークにわたって組み合わせ、加重平均ｍ／ｚを算出した。ネイティブペプチド（０分）の質量から加重平均された質量までの質量の増加は重水素取り込みのレベルに相当する。
【０３４８】
ネイティブの及び脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３について達成された配列包括度はそれぞれ７１．６％及び９８．４％だった。ほとんどのヒトＴＩＭ−３ペプチドは抗ヒトＴＩＭ−３抗体の有無にかかわらず同一のまたは類似する重水素レベルを示した一方で、幾つかのペプチド断片は抗体結合の際、有意に低い重水素の取り込みを有することが見いだされた。ネイティブの及び脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３は双方とも配列番号９４（ＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶＦＥＣＧＮＶＶＬ）のアミノ酸配列から成る領域及び配列番号９５（ＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤ）のアミノ酸配列から成る領域にて抗ヒトＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１変異体）に結合する際、重水素取り込みの有意な低下を示した。重水素取り込みの最強の低下は配列番号９３（ＰＶＦＥＣＧＮ）のアミノ酸配列から成る領域で観察された。
【０３４９】
次に、ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）のヒトＴＩＭ−３との相互作用を上記に記載されているものに類似するＨＤＸ質量分光分析試験にて検討した。手短には、脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３／Ｆｃキメラを酸化重水素にて単独で、または抗ヒトＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）との複合体でインキュベートした。重水素交換を１０℃にて０秒間、６０秒間、３００秒間、１８００秒間、７２００秒間、及び１４４００秒間行った。交換反応を低ｐＨによって止め、反応を止めた試料を、上記に記載されているようなオンカラムのペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩまたはプロテアーゼＸＶＩＩＩの消化及びＬＣ−ＭＳ解析に供した。Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータの解析のためのＨＤＸ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈソフトウエア（全体として参照によって本明細書に組み入れられるＪ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２−１５２１）を用いて生のＭＳデータを処理した。重水素化ペプチドとそのネイティブな形態（ｔ０）との間での平均質量の差異を用いて重水素のレベルを算出した。
【０３５０】
脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３について１００％の配列包括度が達成された。抗ＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）はｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１、変異体）によって示されるものと類似する結合パターンを示した。２つの領域、配列番号９４（ＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶＦＥＣＧＮＶＶＬ）のアミノ酸配列から成る一方と配列番号９６（ＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤＥＫＦＮＬＫＬ）のアミノ酸配列から成る他方は、脱グリコシル化したヒトＴＩＭ−３が抗ＴＩＭ−３抗体ＡＭ−２（ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ａ）に結合した場合、強力な重水素保護を経験した。最強の低下は配列番号９３（ＰＶＦＥＣＧＮ）のアミノ酸配列から成る領域で観察された。
【０３５１】
７．３．３  Ｐｅｐｓｃａｎ解析を用いた抗ＴＩＭ−３抗体のエピトープマッピング
抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１、変異体）の結合は、チップに結合するペプチドアレイとして調製された合成のＴＩＭ−３関連のペプチド断片に対して測定した。オランダ、ＬｅｌｙｓｔａｄのＰｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ  ＢＶによって解析を行った。手短には、ヒトＴＩＭ−３のエピトープを再構築するために、ペプチドのライブラリを合成した。アミノ官能化ポリプロピレン支持体は、独自仕様の親水性ポリマー製剤でグラフトすること、その後のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と共にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いたｔ−ブチルオキシカルボニル−ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）との反応、及びそれに続くトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いたＢｏｃ基の切断によって得られた。標準のＦｍｏｃペプチド合成を用いてアミノ官能化固体支持体にて特注改変したＪＡＮＵＳ液体処理ステーション（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によってペプチドを合成した。構造的模倣体の合成は、足場上のＰｅｐｓｃａｎの独自仕様の化学結合したペプチド（ＣＬＩＰＳ）の技術を用いて行った。ＣＬＩＰＳの技術によってペプチドを単一ループ、二重ループ、三重ループ、シート様の折り畳み、らせん様の折り畳み、及びそれらの組み合わせに構造化することが可能になる。合成したペプチドそれぞれに対する抗体の結合はＰＥＰＳＣＡＮに基づいたＥＬＩＳＡで調べた。ペプチドアレイを一次抗体の溶液と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄した後、ペプチドアレイをヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃２０１０−０５）と共に２５℃にて１時間インキュベートした。洗浄した後、ペルオキシダーゼの基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２μｌ／ｍｌの３％Ｈ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定し、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラ及び画像処理システムによって定量した。
【０３５２】
Ｐｅｐｓｃａｎ試験は、抗ＴＩＭ−３抗体ｐａｂ２１８８（ＩｇＧ１、変異体）が配列番号９９（ＧＫＧＡＣＰＶＦＥ）のアミノ酸配列から成る領域及び配列番号１００（ＤＦＴＡＡＦＰＲ）のアミノ酸配列から成る領域を含むヒトＴＩＭ−３の区間を認識することを示した。
【０３５３】
本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態による範囲にて限定されるべきではない。実際、記載されているものに加えて本発明の種々の改変が前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は添付のクレームの範囲内に入るように意図される。
【０３５４】
本明細書で引用されている参考文献（たとえば、出版物または特許または特許出願）はすべて各個々の参考文献（たとえば、出版物または特許または特許出願）が具体的に且つ個々にあらゆる目的で全体として参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度にあらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
【０３５５】
他の実施形態は以下のクレームの範囲内にある。
【図１】
2019520809.tif 000021
【図２】
2019520809.tif 000022
【図３Ａ】
2019520809.tif 000023
【図３Ｂ】
2019520809.tif 000024
【図３Ｃ】
2019520809.tif 000025
【図３Ｄ】
2019520809.tif 000026
【図４】
2019520809.tif 000027
【図５】
2019520809.tif 000028
【図６】
2019520809.tif 000029
【図７】
2019520809.tif 000030
【図８−１】
2019520809.tif 000031
【図８−２】
2019520809.tif 000032
【図８−３】
2019520809.tif 000033
【図９−１】
2019520809.tif 000034
【図９−２】
2019520809.tif 000035
【図９−３】
2019520809.tif 000036
【図１０】
2019520809.tif 000037
【図１１】
2019520809.tif 000038
【図１２Ａ】
2019520809.tif 000039
【図１２Ｂ】
2019520809.tif 000040
【図１３−１】
2019520809.tif 000041
【図１３−２】
2019520809.tif 000042
【図１３−３】
2019520809.tif 000043
【図１４−１】
2019520809.tif 000044
【図１４−２】
2019520809.tif 000045
【図１５】
2019520809.tif 000046
【配列表】
2019520809000001.app
【国際調査報告】
2019520809.tif 000047
2019520809.tif 000048
2019520809.tif 000049
2019520809.tif 000050
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