(57)【要約】  トリプトファンの分解は、免疫反応を制御する重要な代謝経路であり、エビデンスは、癌の進行中にトリプトファン代謝産物が免疫逃避の基礎であり得、自己分泌様式で癌細胞の悪性表現型を促進することを示唆する。本発明は、質量タグにより標識されたトリプトファンおよびその代謝産物を測定する方法、ならびに対象において処置の有効性および処置後の疾患の再発をモニタリングする、患者を層別化する、かつ対象における免疫応答の抑制を診断するために標識された分子を用いる方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグで標識されたトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物。
【請求項２】
前記トリプトファンおよび／またはその代謝産物が、
ｉｘ．Ｌ−トリプトファン、
ｘ．Ｄ−トリプトファン、
ｘｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｘｉｉ．１−Ｄ−メチルトリプトファン、
ｘｉｉｉ．Ｌ−キヌレニン、
ｘｉｖ．Ｄ−キヌレニン、
ｘｖ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｘｖｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン
を含む、請求項１に記載のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物。
【請求項３】
前記質量タグが同重体タグである、請求項１または２に記載のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物。
【請求項４】
前記質量タグが同位体質量タグである、請求項１または２に記載のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物。
【請求項５】
前記質量タグが水素、炭素、窒素および／または酸素の１つ以上の重同位体置換を含むジメチルピペリジン−ベータ−アラニン誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物。
【請求項６】
トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を測定する方法であって、
ａ）１つ以上の質量タグで１種以上の試験試料を標識することと、
ｂ）標準試料を形成するために１つ以上の追加の質量タグでトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の精製または合成調製物を標識することであって、前記追加の質量タグがステップａ）で使用される同じ質量タグの同重体または同位体の変形である、前記標識することと、
ｃ）１種以上の分析混合物を形成するために所定の比でステップａ）の前記１種以上の標識された試験試料とステップｂ）の標準試料とを混合することと、
ｄ）質量分析によって前記１種以上の分析混合物を分析することであって、前記試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量がトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の所望の質量対電荷比での前記信号強度を前記標準試料中のトリプトファンまたはその代謝産物の前記質量対電荷比での対応する信号強度と比較することによって決定される、前記分析すること
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記標準試料が請求項１〜５のいずれかに記載のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法がトリプトファンおよび／またはその代謝産物の１つ以上の遷移を用いる選択反応モニタリングによって実施され、
ｉ．前記１種以上の試験試料中のトリプトファンおよび／またはその代謝産物の量を事前に決定された量と比較すること、または
ｉｉ．前記１種以上の試験試料中のトリプトファンの２種以上の代謝産物の量に対するトリプトファンの量の比を比較すること
を含み、
トリプトファン代謝の速度および／または程度を前記１種以上の試験試料において決定することをさらに含み、前記遷移が好ましくは表１および／または表２に定義されるとおりである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップｉ）が前記１種以上の試験試料中に存在するものと同一であるが異なる同重体または同位体の質量タグを有する対応する合成トリプトファンおよび／またはその代謝産物の既知の量を用いて前記１種以上の試験試料中のトリプトファンおよび／またはその代謝産物の量を決定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記異なる質量タグが構造において異なっているか水素、炭素、窒素および／または酸素の異なる重同位体置換を含むかのいずれかである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物についてアッセイする方法であって、
ａ）トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の少なくとも２つの異なるアリコートを含む較正試料と、試験試料を組み合わせることであって、
前記試験試料はトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を含んでよく、前記較正試料の各アリコートは異なる既知の量のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を有し、前記試験試料および前記較正試料の各アリコートがそれぞれ質量分析的に異なる質量マーカー群を有する１つ以上の同重体質量標識で示差的に標識され、これにより前記試験試料および前記較正試料の各アリコートが質量分析によって区別され得る、前記組み合わせること、
ｂ）前記試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量ならびに前記較正試料中の各アリコート中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量を質量分析により決定すること、および前記較正試料中の前記アリコート中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の既知の決定された量に対して前記試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝物の量を較正すること
を含む、前記方法。
【請求項１２】
トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物が、
ｉｘ．Ｌ−トリプトファン、
ｘ．Ｄ−トリプトファン、
ｘｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｘｉｉ．１−Ｄ−メチルトリプトファン、
ｘｉｉｉ．Ｌ−キヌレニン、
ｘｉｖ．Ｄ−キヌレニン、
ｘｖ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｘｖｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試験試料がトリプトファンおよびその１種以上の代謝産物を含みかつ較正試料がトリプトファンおよびその１種以上の前記代謝産物について提供され、かつステップ（ｂ）がトリプトファンおよびその１種以上の前記代謝産物の各々について繰り返される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法がステップ（ａ）の前に１つ以上の同重体質量標識で各試験試料または前記較正試料の各アリコートを示差的に標識するさらなるステップを含み、好ましくはステップ（ａ）の前に較正試料を生成するために前記示差的に標識されたアリコートを組み合わせるさらなるステップを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項６〜１４のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって対象における処置の有効性をモニタリングする方法。
【請求項１６】
前記処置が癌処置である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項６〜１４のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって対象を層別化する方法。
【請求項１８】
前記対象が臨床試験のために層別化される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項６〜１４のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって処置後の癌の再発を対象においてモニタリングする方法。
【請求項２０】
６ヶ月の間隔で、好ましくは３ヶ月の間隔で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項６〜１４のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって対象における免疫応答の抑制を診断する方法。
【請求項２２】
前記免疫応答の抑制が癌に罹患している対象においてである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象がヒト対象である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、組織（例えば生検）またはそれらの組み合わせから選択される、請求項６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記質量タグまたは質量標識が質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグまたは質量標識である、請求項６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象における処置の有効性をモニタリングする、対象を層別化する、対象における免疫応答の抑制を診断する、および／または対象における癌の再発をモニタリングするための請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のインビトロでの使用。
【請求項２７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物を含むキットであって、請求項６〜２５に記載の方法を実施するための１種以上の試薬をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、質量タグにより標識されたトリプトファンおよびその代謝産物を測定する方法、ならびに標識された分子を用いて、対象における処置の有効性および処置後の疾患の再発をモニタリングするための、患者を層別化するための、および対象における免疫応答の抑制の診断を行うための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
悪性腫瘍の新たな特徴として近年の定義である「免疫破壊の回避」は、悪性腫瘍の重大な形質としての免疫抑制および逃避の認識の高まりを反映する（１）。過去数年間、トリプトファンの分解は、免疫反応を制御する重要な代謝経路として浮上してきた。新たなエビデンスは、癌の進行中に、トリプトファン−異化酵素であるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）および／またはトリプトファン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）によるキヌレニンの生成は、免疫逃避の中心的経路である一方で、自己分泌様式で癌細胞の悪性表現型を促進する（２，３）ことを示唆する。癌におけるＴＤＯの役割は最近発見されたばかりである（３）が、ＩＤＯ阻害剤である１−メチル−トリプトファンは現在、癌のマウスモデルでの前臨床試験（５）に基づき従来の化学療法または免疫療法（４）と組み合わせて臨床試験で研究されている。
【０００３】
ＩＤＯ阻害剤およびＴＤＯ阻害剤は、癌の処置のために開発されており、化学療法または免疫療法の補助剤として、固形腫瘍においてＩＤＯ阻害剤を用いた臨床試験が現在行われている。さらに、トリプトファンの分解は、いくつかの標的療法の効果に関係している。近年のエビデンスは、チロシンキナーゼ阻害剤イマチニブがＩＤＯの発現を減少させる一方、ＩＤＯは、イピリムマブによるＣＴＬＡ−４遮断に対する抵抗機構を表すことを示唆する。
【０００４】
トリプトファンの分解の阻害は、癌の免疫逃避を阻害する手段として研究されているが、トリプトファンの分解の誘導は、自己免疫疾患（６）、過剰な炎症疾患耐性（７）、慢性感染症、およびアレルギーの制御に関与している。
【０００５】
トリプトファンの分解を調節する処置が利用可能になりつつあるので、トリプトファンの分解を効率的にかつ正確に測定する方法が、処置に対する患者の層別化および処置効果の評価の両者にとってますます重要になりつつある。
【０００６】
トリプトファンおよびその代謝産物の測定は、ＨＰＬＣ、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳによって日常的に行われる。ＵＶ吸収に基づくＨＰＬＣ法、ならびに特異的に修飾された物質の蛍光ベースの方法が存在する（１１−１４）。これらの方法のそれぞれは、本明細書では詳細に記載されない固有の長所および短所を有する。しかし、質量分析法が適用される場合、ＬＣ−分離および例えばＭＳ２モードでの特定の断片の検出に加えて、サブｐｐｍの精度での正確な質量の測定により、一般により高い特異性が予想され得る。このようなＬＣ−ＭＳに基づく方法は、トリプトファンおよび連結された分析物の検出について記載されている（１５−１８）。選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）に基づく方法が確立されて同位体標識された標準物質を用いる高感度かつ高精度でのトリプトファンおよびいくつかの代謝産物の測定を可能にしたが、ＳＩＭスキャンをベースにしたＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ法も記載されている（１８）。
【０００７】
従って、優れた特異性、感度および処理能力で実施できるトリプトファンおよびその代謝産物を測定する方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
（本発明の概要）
第１の態様において本発明は、したがって、質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグで標識されたトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を提供する。
【０００９】
本発明の第１の態様の１つの実施形態において、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物は、
ｉ．Ｌ−トリプトファン、
ｉｉ．Ｄ−トリプトファン、
ｉｉｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｉｖ．１−Ｄ−メチルトリプトファン、
ｖ．Ｌ−キヌレニン、
ｖｉ．Ｄ−キヌレニン、
ｖｉｉ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｖｉｉｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン、
を含む。
【００１０】
質量タグは、同重体タグまたは同位体質量タグであってよい。好ましくは、質量タグは、水素、炭素、窒素および／または酸素の１つ以上の重同位体置換を含むジメチルピペリジン−ベータ−アラニン誘導体である。
【００１１】
第２の態様において、本発明は、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を測定する方法を提供し、この方法は
ａ）１種以上の試験試料を１つ以上の質量タグで標識することと、
ｂ）標準試料を形成するために１つ以上の追加の質量タグでトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の精製または合成調製物を標識することであって、
追加の質量タグはステップａ）で使用される同じ質量タグの同重体または同位体の変形である、前記標識することと、
ｃ）ステップａ）の１種以上の標識された試験試料とステップｂ）の標準試料とを所定の比で混合して１種以上の分析混合物を形成することと、
ｄ）質量分析によって１種以上の分析混合物を分析することであって、試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量が、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の所望の質量対電荷比での信号強度を、標準試料中のトリプトファンまたはその代謝産物の質量対電荷比での対応する信号強度と比較することによって決定される、前記分析すること、
を含む。
【００１２】
この第２の態様の一実施形態では、標準試料は、本発明の第１の態様およびその実施形態で定義されるトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を含む。
【００１３】
いくつかの他の実施形態では、本方法は、トリプトファンおよび／またはその代謝産物の１つ以上の遷移を用いる選択反応モニタリングによって実施され、この方法は、
ｉ．１種以上の試験試料中のトリプトファンおよび／またはその代謝産物の量を事前に決定された量と比較すること、
または、
ｉｉ．１種以上の試験試料中のトリプトファンの２種以上の代謝産物の量に対するトリプトファンの量の比を比較すること
を含み、
この方法は、トリプトファン代謝の速度および／または程度を１種以上の試験試料中で決定することをさらに含み、ここで遷移は好ましくは表１および／または表２に定義されているとおりである。
【００１４】
好ましくは、ステップｉ）は、１種以上の試験試料中に存在するものと同一であるが異なる同重体または同位体の質量タグを有する、対応する合成トリプトファンおよび／またはその代謝産物の既知の量を用いて、１種以上の試験試料中のトリプトファンおよび／またはその代謝産物の量を決定することを含む。
【００１５】
より好ましくは、異なる質量タグは、構造が異なるか、または水素、炭素、窒素および／または酸素の異なる重同位体置換を含むかのいずれかである。
【００１６】
第３の態様では、本発明は、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を分析する方法を提供し、この方法は、
ａ）トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の少なくとも２つの異なるアリコートを含む較正試料と、試験試料を組み合わせることであって、試験試料はトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を含んでよく、較正試料の各アリコートは異なる既知の量のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を有し、試験試料および較正試料の各アリコートはそれぞれ質量分析的に異なる質量マーカー群を有する１つ以上の同重体質量標識で示差的に標識され、これにより試験試料および較正試料の各アリコートを質量分析によって区別され得る、前記組み合わせることと、
ｂ）試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量および較正試料中の各アリコート中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量を質量分析により決定すること、および較正試料中のアリコート中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の既知の決定された量に対して、試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝物の量を較正すること、
を含む。
【００１７】
好ましくは、本発明のこの第３の態様におけるトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物は、
ｉ．Ｌ−トリプトファン、
ｉｉ．Ｄ−トリプトファン、
ｉｉｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｉｖ．１−Ｄ−メチル−トリプトファン、
ｖ．Ｌ−キヌレニン、
ｖｉ．Ｄ−キヌレニン、
ｖｉｉ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｖｉｉｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン
を含む。
【００１８】
この第３の態様のいくつかの実施形態では、試験試料はトリプトファンおよびその１種以上の代謝産物を含み、トリプトファンおよびその１種以上の代謝産物の較正試料が提供され、トリプトファンおよびその１種以上の代謝産物の各々についてステップ（ｂ）が繰り返される。
【００１９】
この第３の態様のいくつかの他の実施形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、各試験試料または較正試料の各アリコートを１つ以上の同重体質量標識で示差的に標識するさらなるステップを含み、好ましくは、本方法は、ステップ（ａ）の前に較正試料を生成するために示差的に標識されたアリコートを組み合わせるさらなるステップを含む。
【００２０】
第４の態様では、本発明は、本発明の第２および第３の態様およびそれらの実施形態によるトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって、対象における処置の有効性をモニタリングする方法を提供する。好ましくは、処置は癌処置である。
【００２１】
第５の態様では、本発明は、本発明の第２および第３の態様およびそれらの実施形態によるトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって対象を層別化する方法を提供する。好ましくは、対象は臨床試験のために層別化される。
【００２２】
第６の態様では、本発明は、本発明の第２および第３の態様およびそれらの実施形態によるトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって、対象において処置後の癌の再発をモニタリングする方法を提供する。好ましくは、この方法は、６ヶ月の間隔で、好ましくは３ヶ月の間隔で行われる。
【００２３】
第７の態様では、本発明は、本発明の第２および第３の態様およびそれらの実施形態によるトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって、対象における免疫応答の抑制を診断する方法を提供する。好ましくは、免疫応答の抑制は、癌に罹患している対象においてである。
【００２４】
本発明の第４、第５、第６および第７の態様のいくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。
【００２５】
本発明の第３、第４、第５、第６および第７の態様のいくつかの実施形態において、試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織（例えば生検）またはそれらの組み合わせから選択される。
【００２６】
本発明の第２、第３、第４、第５、第６および第７の態様のいくつかの実施形態では、質量タグまたは質量標識は、質量分析において信号強度を高めるアミン反応性質量タグまたは質量標識である。
【００２７】
さらに、本発明は、第８の態様において、対象における処置の有効性をモニタリングする、対象を層別化する、対象における免疫応答の抑制を診断する、および／または対象における癌の再発のモニタリングするインビトロ使用のための、本発明の第１の態様およびその実施形態で定義されたトリプトファンおよび／またはその代謝産物を提供する。あるいは、この第８の態様は、対象における処置の有効性のモニタリングする、対象を層別化する、対象における免疫応答の抑制を診断する、および／または対象における癌の再発のモニタリングするための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のインビトロ使用として配合され得る。
【００２８】
最後に、第９の態様では、本発明は、本発明の第１の態様およびその実施形態で定義されるトリプトファンおよび／またはその代謝産物を含むキットを提供し、ここでキットは、本発明の第３〜８の態様のいずれかで定義される方法およびそれらの実施形態を実施するための１種以上の試薬をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
（図面の簡単な説明）
【図１】ＳＫＯＶ−３細胞の細胞培養培地中のＬ−Ｔｒｐ（左）およびＫｙｎ（右）の３つの独立したＭＳ／ＭＳレポータースペクトル測定の平均レポーターイオン強度。測定された試料は、異なるインキュベーション時間、０日目（細胞と接触する前の培地）および６日目（上パネル）および０〜５日目（下パネル）での３つの独立した生物学的試料由来の６つの試料からなる。
【図２】ＳＫＯＶ−３細胞の細胞培養培地中のＤ−Ｔｒｐ（左）およびＫｙｎ（右）の３つの独立したＭＳ／ＭＳレポータースペクトル測定の平均レポーターイオン強度。  測定された試料は、異なるインキュベーション時間、０日目（細胞と接触する前の培地）および６日目（上パネル）および０〜５日目（下パネル）での３つの独立した生物学的試料由来の６つの試料からなる。
【図３】ＳＫＯＶ−３細胞中でのメチル−キヌレニン（Ｍ−Ｋｙｎ）への１−Ｌ−メチル−トリプトファン（Ｌ−ＭＴ）の代謝を示すＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ標識ＳＫＯＶ−３細胞培養上清試料混合物のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ−ＭＳ分析の平均レポーターイオン強度。Ｌ−ＭＴとの異なるインキュベーション時間、０日目（細胞との接触前の培地）および６日目（ｎ＝３）での３つの独立した生物学的試料由来の６つの試料を使用した。
【図４】ＳＫＯＶ−３細胞中でのメチル−キヌレニン（Ｍ−Ｋｙｎ）への１−Ｌ−メチル−トリプトファン（Ｌ−ＭＴ）および１−Ｄ−メチル−トリプトファン（Ｄ−ＭＴ）の代謝。７０μＭのＴｒｐの存在下で１０００μＭの１−Ｌ−ＭＴ（上パネル）または１０００μＭの１−Ｄ−ＭＴ（下パネル）とインキュベートしたＳＫＯＶ−３細胞の細胞培養培地の独立した経時実験の平均レポーター強度。Ｔｒｐ、Ｋｙｎ、Ｌ−ＭＴおよびＭ−Ｋｙｎ（ｎ＝３）またはＴｒｐ、Ｋｙｎ、Ｄ−ＭＴおよびＭ−Ｋｙｎ（ｎ＝２）の平均強度を示す。
【図５】ＳＫＯＶ−３細胞中でのメチル−キヌレニン（Ｍ−Ｋｙｎ）への１−Ｌ−メチル−トリプトファン（Ｌ−ＭＴ）および１−Ｄ−メチル−トリプトファン（Ｄ−ＭＴ）の代謝。血清に含まれるものに加え外因性トリプトファンの非存在下で、２００μＭの１−Ｌ−ＭＴ（上パネル）または２００μＭの１−Ｄ−ＭＴ（下パネル）とインキュベートしたＳＫＯＶ−３細胞の細胞培養培地の独立した経時実験の平均レポーター強度：Ｔｒｐ、Ｋｙｎ、Ｌ−ＭＴおよびＭ−Ｋｙｎの平均強度を示す（ｎ＝３）。
【図６】メチル−キヌレニンはアリール炭化水素受容体を活性化する。トリプトファン非含有条件下でのＳＫＯＶ−３細胞の１−Ｄ／Ｌ−ＭＴ処置はＡＨＲ標的遺伝子ＣＹＰ１Ａ１（Ａ）およびＴＩＰＡＲＰ（Ｂ）を誘導することを示すＱＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図７】１−Ｌ−ＭＴ（上パネル）または１−Ｄ−ＭＴ（下パネル）で処置した後のＴＤＯ２発現ＨＥＫ細胞からのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ標識細胞培養上清のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ−ＭＳ分析。０日目（細胞との接触前の培地）および１−Ｌ−ＭＴおよび１−Ｄ−ＭＴとのインキュベーションの６日後での、それぞれ、３つの独立した生物学的試料由来の６つの試料を使用した。Ｌ−ＭＴまたはＤ−ＭＴとインキュベートした細胞培養上清の独立した実験の平均レポーター強度（ｎ＝３）。
【図８】ＩＤＯ１は１−ＭＴをメチル−キヌレニンに分解する。ＩＤＯ１を過剰発現するＨＥＫ細胞のＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ標識上清の分析。０日目（細胞との接触前の培地）および、１−Ｌ−ＭＴ（上パネル）または１−Ｄ−ＭＴ（下パネル）とインキュベートした６日後での、３つの独立した生物学的試料由来の６つの試料を使用した。Ｌ−ＭＴまたはＤ−ＭＴとインキュベートした細胞培養上清の独立した実験の平均レポーター強度を示す（ｎ＝３）。
【図９】１−ＭＴは免疫細胞によっても分解される。インターフェロンγ（１０００Ｕ／ｍｌ、ｎ＝３）で刺激した後Ｌ−ＭＴ（上パネル）またはＤ−ＭＴ（下パネル）とインキュベートした樹状細胞培養上清（供与体１由来）の独立した実験の平均レポーター強度（Ｂ）。０日目（細胞との接触前の培地）およびＬ−ＭＴまたはＤ−ＭＴとのインキュベーションの６日後での、３つの独立した生物学的試料由来の６つの試料を使用した。
【図１０】１−Ｌ−ＭＴは、炎症誘発ＩＤＯ発現を有するマウスモデルにおいてメチル−キヌレニンに分解される。４つの選択された分析物の経時的な相対変化を示すＴｒｐ、Ｋｙｎ、１−Ｌ−ＭＴおよびＭｅｔｈｙｌ−ｋｙｎの相対存在量グラフ。「＋」：ＬＰＳで刺激し、Ｌ−ＭＴを注射したマウス。ＬＰＳでの刺激は、Ｋｙｎ産生の増加およびｔｒｐの減少によって実証されるようにＩＤＯを誘導した。この刺激はまた、ＬＰＳで刺激されＬ−ＭＴを注射されたマウスでのより高いレポーターイオンによって示されるように、Ｍ−Ｋｙｎの産生を導いた。
【図１１】トリプトファンおよびキヌレニンは、グリア芽細胞腫（ＧＢＭ）患者の血清中で減少する。トリプル四重極ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍで測定した年齢および性別が一致した健常な対照およびグリア芽腫患者の血清中のキヌレニン（左）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の相対的存在量。存在量は、４名の対照および４名のグリア芽細胞腫患者の等量の血清を含む標準プール混合物と比較して計算した。
【００３０】
（定義）
用語「濃度または量」は、例えば、標準の既知の濃度を参照することによって、または共通の参照標準と比較して決定される、試料中のバイオマーカーの絶対濃度もしくは量、または相対濃度もしくは量を指す。
【００３１】
用語「比較する（ｃｏｍｐａｒｉｎｇ）」または「比較する（ｃｏｍｐａｒｅ）」またはその文法的等価物は、他の試料（例えば、専有データベースまたは公開データベースに保存されたタンパク質の濃度または量）に対して、試料中のバイオマーカーの相対濃度または量を測定することを意味する。
【００３２】
用語「基準濃度または量」は、これらに限定されないが、専有または公開データベースに保存されたタンパク質濃度または量を指す。「基準濃度または量」は、患者の大規模スクリーニングから、または対照患者におけるそのような決定と臨床情報との間の既知の、または事前に決定された相関関係を参照することによって得られたものであってもよい。例えば、基準値は、対象と同様の年齢および性別の健常者（すなわち、認知症を伴わない）などの対照対象における物質またはタンパク質の濃度または量との比較によって決定できる。さらに、基準値は、試験時点に先行する１つ以上の時点で同じ対象から得られたものであってもよい。このような早期の試料は、試験時点の日付の１週間前、１ヶ月以上、３ヶ月以上、最も好ましくは６ヶ月以上前に採取してもよい。
【００３３】
用語「対照」は、関連する疾患で診断されていないか、またはその症状を呈さない、ヒトまたは非ヒト対象から採取された組織試料または体液試料を指す。代わりに、対照は、処置前に同じ患者から採取された試料であってもよい。
【００３４】
用語「選択反応モニタリング」、「ＳＲＭ」および「ＭＲＭ」は、質量分析アッセイを意味し、これにより、既知のバイオマーカーを表す既知の質量電荷比の前駆イオンが、イオントラップまたはトリプル四重極におけるタンデム質量分析による分析のために優先的に標的とされる。分析中に親イオンが断片化され、第２の所定の質量電荷比の娘イオン数がカウントされる。典型的には、予め定められた数の安定同位体置換を有するが、そうでなければ標的イオンと化学的に同一である等価な前駆イオンが方法に含まれて定量的内部標準として作用する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、げっ歯類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの、哺乳類および非哺乳動物を含む。
【００３６】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」もしくは「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、またはそれらの文法的同等物は、治療的処置、予防的処置および対象が障害を発現させるリスクまたは他のリスク因子を低減する適用を含む。処置は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または根底にあるリスク因子の低減を包含する。
【００３７】
本明細書で使用される用語「診断」またはその文法上等価物は、患者における障害の実在または存在、非実在または不在または可能性に関するあらゆる情報の提供を含む。それは、障害またはそれに関連して経験するまたは経験する可能性のある症状のタイプまたは分類に関する情報の提供をさらに含む。これは、例えば、障害の重篤度の診断を含み得る。
【００３８】
用語「効力」は、所与の介入（例えば、薬物、医療機器、外科手術など）の有益な変化の能力を示す。効力が確立されている場合、その介入は、それが比較される他の利用可能な介入と少なくとも同程度に良好である可能性が高い。用語「効力」および「有効性」は、本明細書では同義で使用される。
【００３９】
用語「層別化する」またはその文法的等価物は、本明細書において、分子生物学的、生化学的およびイメージング診断試験を用いることによって個別化される共通の生物学的特徴を有する対象の群の同定を示す。層別化は、対象を同定するために使用される特定の特性に応じて、特定の対象群の最適な管理を選択し、リスク評価および予防（疾患を発症する可能性）または最適な処置の達成結果（疾患の管理）に関して最適な考えられ得る結果を達成することを目的とする。
【００４０】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、対象は列挙されたすべての要素を含むが、任意で追加の不特定の要素（すなわち、オープン）も含み得ることを示す。
【００４１】
本明細書で使用される用語「および／または」は、２つの指定された特徴または構成要素の各々が、他の特徴または構成要素を有するか否かの具体的な開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、それぞれが本明細書において個別に記載されているように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示として解釈されるものとする。
【００４２】
文脈が他に指示しない限り、上記の特徴／用語の定義は、本発明の特定の態様または実施形態に限定されるものではなく、本明細書に記載されるすべての態様および実施形態に等しく適用される。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
（詳細な説明）
トリプトファンの分解は、抗腫瘍免疫応答、自己免疫疾患および慢性感染を制御する強力な免疫抑制機構である。本発明者らは、Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｔａｇ（登録商標）（ＴＭＴ（登録商標）；米国特許明細書第９０２３６５６号）試薬を使用して、タンデム質量分析法を用いる多重アプローチにおいて、トリプトファンおよびそのアミン含有代謝物／誘導体を測定した。この方法により、６つの異なる試料におけるトリプトファンの分解の同時の定量的比較が可能になった。細胞培養モデルにおいてこの方法論を適用することにより、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ阻害剤１−メチル−トリプトファンのメチル−キヌレニンへの分解が明らかになる。ヒト血清試料に適用された多重分析は、健常対照と比較して、グリア芽細胞腫患者におけるトリプトファンレベルの減少を示し、これにより、新規方法が前臨床および臨床研究の両方において有用であることが立証され得ることを示している。
【００４４】
特定の官能基を有する分子の化学的標識は、ＬＣ−ＭＳ分析（８）の間に高められた感度およびクロマトグラフ分離を提供するために使用される。標識分子は、より高いｍ／ｚ値および異なるクロマトグラフィー分離を示す。アミン基を含む分析物は、ＮＨＳエステル化学を用いて質量タグで一般に標識される。好ましい質量タグは、アミン反応性ＮＨＳエステル基、スペーサーアームおよび質量レポーター部分（または質量マーカー基）を含む市販のＴＭＴ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。異なるＴＭＴ（登録商標）試薬は同じ質量および構造を有するが、質量レポーター部分に異なる数の重同位体を含む。これらの試薬は、多重化定量的プロテオミクスにおいて最も頻繁に使用され、これにより、分子へのＴＭＴ（登録商標）−分子の結合が、複数の試料からの標識された分子について同じ公称質量を生成する。ＴＭＴ（登録商標）標識分子の断片化は、多重試料定量に使用される固有のレポーターイオンを生成する。試薬は様々なセットで入手可能であり、これは最大１０の多重化速度を可能にする。ＴＭＴ（登録商標）試薬は、近年、ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ分析（９）によるアミノ酸および他の代謝産物の分析のために使用された。本発明者らは、この技術を適合して、アミノ酸トリプトファンおよびその代謝産物／誘導体の多重相対的定量を可能にした。これは、細胞培養上清、ならびにマウスおよびヒト血清試料中のトリプトファンおよびその代謝産物の高感度検出および再現性の高い相対的定量を可能にする（例えば、経時的分析、生物学的複製またはインビトロおよびインビボでの複数の試料の比較など）。
【００４５】
トリプトファン類似体である臨床的に研究されたＩＤＯ阻害剤１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）もまた、アミン同重体標識およびタンデム質量分析を用いる多重分析に適している。本発明者らは、したがって、トリプトファンの代謝のみでなく、その最も一般的に使用される競合阻害剤１−ＭＴの分析も行った。
【００４６】
本発明は、質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグで標識されたトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を提供する。好ましくは、トリプトファンおよび／またはその代謝物は、
ｉ．Ｌ−トリプトファン、
ｉｉ．Ｄ−トリプトファン、
ｉｉｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｉｖ．１−Ｄ−メチルトリプトファン、
ｖ．Ｌ−キヌレニン、
ｖｉ．Ｄ−キヌレニン、
ｖｉｉ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｖｉｉｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン
を含む。
【００４７】
質量タグは、同重体タグまたは同位体質量タグであってよい。好ましくは、質量タグは、水素、炭素、窒素および／または酸素の１つ以上の重同位体置換を含むジメチルピペリジン−ベータ−アラニン誘導体である。
【００４８】
本発明によれば、４つのトリプトファン分析物、すなわちトリプトファン、メチルトリプトファン、キヌレニンおよびメチル−キヌレニンの比較は、アミノ反応性同重体標識試薬を使用することにより行われる１つのＬＣ−ＭＳ分析で最大１０の試料中で同時に調査できる。
【００４９】
トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物は、
ａ）１種以上の試験試料を１つ以上の質量タグで標識することと、
ｂ）標準試料を形成するためにトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の精製または合成調製物を、１つ以上の追加の質量タグで標識することであって、
ここで追加の質量タグは、ステップａ）で使用される同じ質量タグの同重体または同位体の変形である、前記標識することと、
ｃ）ステップａ）の１種以上の標識された試験試料とステップｂ）の標準試料とを所定の比で混合して、１種以上の分析混合物を形成することと、
ｄ）質量分析によって１種以上の分析混合物を分析することであって、ここで試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量が、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の所望の質量対電荷比での信号強度を、標準試料中のトリプトファンまたはその代謝産物の質量対電荷比での対応する信号強度と比較することによって決定される、前記分析すること
を含む方法によって測定され得る。
【００５０】
好ましくは、標準試料は、質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグで標識されたトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を含む。また好ましくは、トリプトファンおよび／またはその代謝産物は、
ｉ．Ｌ−トリプトファン、
ｉｉ．Ｄ−トリプトファン、
ｉｉｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｉｖ．１−Ｄ−メチル−トリプトファン、
ｖ．Ｌ−キヌレニン、
ｖｉ．Ｄ−キヌレニン、
ｖｉｉ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｖｉｉｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン
を含む。
【００５１】
質量タグは、同重体タグまたは同位体質量タグであってよい。好ましくは、質量タグは、水素、炭素、窒素および／または酸素の１つ以上の重同位体置換を含むジメチルピペリジン−ベータ−アラニン誘導体である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、方法は、トリプトファンおよび／またはその代謝産物についての１つ以上の遷移を用いる選択反応モニタリングによって実施され、この方法は、
ｉ．１種以上の試験試料中のトリプトファンおよび／またはその代謝産物の量を事前に決定された量と比較すること、
または、
ｉｉ．１種以上の試験試料中のトリプトファンの２種以上の代謝産物の量に対するトリプトファンの量の比を比較すること
を含み、
この方法は、トリプトファン代謝の速度および／または程度を１種以上の試験試料中で決定することをさらに含み、ここで遷移は好ましくは表１および／または表２に定義されているとおりである。
【００５３】
好ましくは、ステップｉ）は、１種以上の試験試料中に存在するものと同一であるが異なる同重体または同位体の質量タグを有する、対応する合成トリプトファンおよび／またはその代謝産物の既知の量を用いて、１種以上の試験試料中のトリプトファンおよび／またはその代謝産物の量を決定することを含む。より好ましくは、異なる質量タグは、構造が異なっているか、水素、炭素、窒素および／または酸素の異なる重同位体置換を含むかのいずれかである。
【００５４】
このアプローチは、例えば、アミノ基を担持するトリプトファン分解経路の他の分析物（２，３５〜３９）に拡張できる。
【００５５】
さらに、本方法は、絶対定量が望ましい場合には、内部標準との使用にも一般に適用可能である。
【００５６】
したがって、本発明は、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物のための分析方法を提供し、この方法は、
ａ）トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の少なくとも２つの異なるアリコートを含む較正試料と、試験試料を組み合わせることであって、試験試料はトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を含んでよく、較正試料の各アリコートは異なる既知の量のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物を有し、試験試料および較正試料の各アリコートはそれぞれ質量分析的に異なる質量マーカー群を有する１つ以上の同重体質量標識で示差的に標識され、これにより試験試料および較正試料の各アリコートを質量分析によって区別され得る、前記組み合わせることと、
ｂ）試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量ならびに較正試料中の各アリコート中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の量を質量分析により決定すること、および較正試料中のアリコート中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物の既知の決定された量に対して、試験試料中のトリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝物の量を較正すること、
を含む。
【００５７】
好ましくは、トリプトファンおよび／またはその１種以上の代謝産物は、
ｉ．Ｌ−トリプトファン、
ｉｉ．Ｄ−トリプトファン、
ｉｉｉ．１−Ｌ−メチル−トリプトファン、
ｉｖ．１−Ｄ−メチル−トリプトファン、
ｖ．Ｌ−キヌレニン、
ｖｉ．Ｄ−キヌレニン、
ｖｉｉ．１−Ｌ−メチル−キヌレニン、
ｖｉｉｉ．１−Ｄ−メチル−キヌレニン
を含む。
【００５８】
試験試料はトリプトファンおよびその１種以上の代謝産物を含み得、較正試料はトリプトファンおよびその１種以上の代謝産物に対して提供され得、ステップ（ｂ）はトリプトファンおよびその１種以上の代謝産物の各々について繰り返される。
【００５９】
さらに、この方法は、ステップ（ａ）の前に、各試験試料または較正試料の各アリコートを１つ以上の同重体質量標識で示差的に標識する追加のステップを含んでもよく、好ましくは、方法は、ステップ（ａ）の前に、較正試料を生成するために示差的に標識されたアリコートを組み合わせるさらなるステップを含んでもよい。
【００６０】
使用される特定の質量分析プラットフォームは、限定的でなく、イオントラップ、四重極、飛行時間型およびｏｒｂｉｔｒａｐシステムなどを含むが、これらに限定されない。生物学的試料由来のＴＭＴ（登録商標）標識代謝産物の測定は、異なる質量分析プラットフォーム、すなわちＵＰＬＣ  ｎａｎｏＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に連結されたＱＴｏｆ  ＩＩ（Ｗａｔｅｒｓ）質量分析計またはＰｒｏｘｅｏｎ  ｎａｎｏＬＣ−ＩＩに連結されたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ、またｎａｎｏＬＣに連結されたトリプル四重極機器（ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ）で成功している。本発明者らは、Ｑ  ＴｏＦ  ＩＩおよびＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏで半標的化質量分析法を使用することによって、試料中に存在すると予想される分析物（標的化）を測定できただけでなく、定義されたより広い質量範囲で他の分析物を測定することもでき、このため、１−ＭＴがメチル−キヌレニンに代謝されることを発見できた。これは、本明細書で使用されるように非標的様式で代謝産物を分析することもできるＭＳ法の設定の１つの利点を実証する。
【００６１】
非常に時間効率的である一方で、これは分析される試料の正確な比較も可能にし、この方法が前臨床および臨床設定にも使用され得ることを示唆している。特に、種々のタイプの癌、炎症性および自己免疫疾患（９、４２、４３）を含む広範囲の状態において、低減されたトリプトファン血清濃度が報告されているため、本発明による方法は、トリプトファンの分解を調節する化合物による処置に対して患者を層別化することおよびそれらの効力をモニタリングすることに有用であることが判明し得る。
【００６２】
したがって、本明細書で定義されるトリプトファンおよび／またはその代謝産物は、対象における処置の有効性をモニタリングするため、対象を層別化するため、対象における免疫応答の抑制を診断するため、および／または対象における癌の再発をモニタリングするためにインビトロで用いられ得る。
【００６３】
特に、本発明は、本明細書に記載の方法でトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって、対象における処置の有効性をモニタリングする方法を提供する。好ましくは、処置は癌処置である。
【００６４】
また、本発明は、本明細書に記載の方法でトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって対象を層別化する方法を提供する。本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、対象は臨床試験のために層別化される。
【００６５】
さらに、本発明は、本明細書に記載の方法でトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって、処置後に対象において癌の再発をモニタリングする方法を提供する。モニタリングは、６ヶ月の間隔で、好ましくは３ヶ月の間隔で、最も好ましくは１ヶ月の間隔で行われてよい。
【００６６】
さらに、本発明は、本明細書に記載の方法でトリプトファンおよび／またはその代謝産物のレベルを測定することによって、対象における免疫応答の抑制を診断する方法を提供する。好ましくは、免疫応答の抑制は、癌に罹患している対象においてである。
【００６７】
これらの方法の対象は、好ましくはヒト対象である。試料は、血液、血漿、血清、唾液、尿、組織（例えば生検）またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【００６８】
これらの方法の質量タグまたは質量標識は、質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグまたは質量標識であり得る。本発明の文脈において、用語「質量タグ」および「質量標識」は同義的である。
【００６９】
本発明はまた、対象における処置の有効性をモニタリングする、対象を層別化する、対象における免疫応答の抑制を診断する、および／または対象における癌の再発をモニタリングするインビトロ使用のために本発明の第１の態様、およびその実施形態において定義されるトリプトファンおよび／またはその代謝産物を提供する。あるいは、この第８の態様は、対象における処置の有効性をモニタリングする、対象を層別化する、対象における免疫応答の抑制を診断する、および／または対象における癌の再発をモニタリングするために、請求項１〜５のいずれか一項に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物のインビトロ使用として配合され得る。
【００７０】
本発明はまた、質量分析での信号強度を高めるアミン反応性質量タグで標識されたトリプトファンおよび／またはその代謝産物を含むキットを提供し、このキットは、本明細書に記載の方法を実施するための１種以上の試薬をさらに含む。
【００７１】
好ましくは、キットは、対象における治療の有効性のインビトロでのモニタリング、対象の層別化、対象における免疫応答の抑制の診断、および／または対象における癌の再発のモニタリングを可能にする。
【００７２】
本発明のキットの試薬は、
ａ）試料中でタンパク質を沈殿させるための１種以上の試薬、
ｂ）試料を取り扱うためのチューブ、バイアル、容器フラスコなど、
ｃ）試料調製用の緩衝液、
ｄ）アミン反応性質量タグ、好ましくはＴＭＴ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、
ｅ）合成または精製された、アミン反応性質量タグで標識されたトリプトファンおよび／またはその代謝産物の１種以上の標準試料、
ｆ）本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための指示、
の任意の組み合わせを含んでもよい。
【００７３】
好ましくは、キットは、本明細書に記載のトリプトファンおよび／またはその代謝産物を標識するためのアミン反応性同重体質量タグを含む。好ましくは、同重体質量タグは、水素、炭素、窒素および／または酸素の重同位体を取り込むことによって標識される。
【００７４】
（実施例）
ここで、本発明の特定の態様および実施形態を、一例として、ならびに上記の図および表を参照して例解する。本明細書で言及されている全ての文書は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
（材料と方法）
細胞培養および試薬
ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、指示されたとおりＬ−トリプトファン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、３００ｍｇ／ｌグルタミン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を補充したＭｃＣｏｙの５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ，Ａｌｌｓｃｈｗｉｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養した。ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞を、ＤＭＥＭ（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンパ球分離培地ＬＳＡ  １０７７（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いる密度勾配遠心分離によって健常な非関連血液供与体から単離し、１０％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）および１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で培養した。樹状細胞（ＤＣ）を生成するために、ＣＤ１４＋細胞を、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ．  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分離し、７日間、１０％ＦＢＳ、２００ＩＵ／ｍＬインターロイキン−４および１０００ＩＵ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ、Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）中でプレート培養した。すべての細胞を、マルチプレックス細胞コンタミネーション試験（４４）によりコンタミネーションについて定期的に試験した。培養物を３７℃にて、５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。１−メチル−Ｄ−トリプトファン（１−Ｄ−ＭＴ、ロット番号：０９３１５ＢＨ、０８００７ＥＪ）および１−メチル−Ｌ−トリプトファン（１−Ｌ−ＭＴ、ロット番号：０８０２３ＨＥ、１５３９９ＭＪ）の２０ｍＭ原液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中にこれらの阻害剤を溶解することによって調製した。塩酸を用いてｐＨを７．５に調整した。細胞培養物の混入を避けるために、原液を０．２μｍフィルターで濾過した。インターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）をＩｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ（Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００７６】
定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣ
全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  ＲＮＡ単離キット（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離し、ｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｋｉｔ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従って合成した。ＱＲＴ−ＰＣＲを、標準的なプロトコールに従って、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えるＡＢＩ  ７０００サーマルサイクラーで実施した。ＰＣＲ反応を、ＲＴ対照を含まないことにより、鋳型の省略により、かつ融解曲線およびゲル分析の両方によって確認した。アンプリコンのサイズを、２％アガロースゲルに試料と１００ｂｐのラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｅｅｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を装填することによって分析し、これを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光下で分析した。各遺伝子について標準曲線を生成し、増幅は９０〜１００％効率的であった。遺伝子発現の相対的定量を、閾値を比較することによって決定した。ＧＡＰＤＨ偽遺伝子の増幅を排除するために、ＧＡＰＤＨプライマー配列をＣａｒｒａｒｏら、２００５（２５）から誘導した。遺伝子発現の相対的定量を、閾値を比較することによって決定した。全ての結果をＧＡＰＤＨに対して標準化した。
プライマー配列は、（５’−３’フォワード、リバース）：
ＣＹＰ１Ａ１：CTTGGACCTCTTTGGAGCT（配列番号１）、GACCTGCCAATCACTGTG（配列番号２）、
ＧＡＰＤＨ：CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC（配列番号３）、TGAGCGATGTGGCTCGGCT（配列番号４）、
ＩＤＯ１：TTCAGTGCTTTGACGTCCTG（配列番号５）、TGGAGGAACTGAGCAGCAT（配列番号６）、
ＴＤＯ２：GGTTCCTCAGGCTATCACTACC（配列番号７）、CAGTGTCGGGGAATCAGGT（配列番号８）、
ＴＩＰＡＲＰ：CACCCTCTAGCAATGTCAACTC（配列番号９）、CAGACTCGGGATACTCTCTCC（配列番号１０）であった。
【００７７】
ＨＥＫ細胞におけるＩＤＯおよびＴＤＯの過剰発現
ＩＤＯ１およびＴＤＯの全長ｃＤＮＡ配列を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングにより、単一のＣ末端ＦＬＡＧタグを含むＧａｔｅｗａｙ（登録商標）適合性過剰発現ベクターであるｐＤＥＳＴ−Ｆｌａｇ−Ｃ中にクローニングし、その結果ｐＤＥＳＴ−ＴＤＯ−ＦＬＡＧ−ＣおよびｐＤＥＳＴ−ＩＤＯ１−ＦＬＡＧ−Ｃを得た。
ｐＤＥＳＴ−ＦＬＡＧ−Ｃの基礎はｐＤＥＳＴ２６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であった。部位特異的突然変異誘発ＰＣＲでｐＤＥＳＴ２６の６ｘＨｉｓタグを除去し、ｐＤＥＳＴを得た。単一のＣ末端Ｆｌａｇタグを部位特異的突然変異誘発ＰＣＲによってｐＤＥＳＴ中に導入し、Ｆｌａｇ−Ｃを得た。２×１０６個のＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間培養し、ＦＵＧＥＮＥ  ＨＤ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して２μｇのｐＤＥＳＴ−ＴＤＯ−ＦＬＡＧ−Ｃ、ｐＤＥＳＴ−ＩＤＯ１−ＦＬＡＧ−Ｃまたは空の対照ベクターでトランスフェクトした。１．５ｍｇ／ｍｌのネオマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞を選択した。
【００７８】
ＬＰＳおよび／または１−ＬＭでのマウスの処置
動物実験は、国立衛生研究所の検査動物ガイドライン（実験動物のケアと使用：ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って、研究機関内の動物保護委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌｓ）によって監督された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｓ．チフィ由来の８０μｇ／マウスＬＰＳを腹腔内注射した。１ｍｇ／マウスの１−Ｌ−ＭＴをＬＰＳ注射の１時間前に腹腔内注射した。６時間後、１２時間後および２４時間後にマウスを屠殺し、血液を心臓から採取した。血液を遠心分離して血清を得て、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定のために最終的に調製した。
【００７９】
純粋な対照物質の標識
Ｌ−トリプトファン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１−メチル−Ｌ−リプトファン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ−キヌレニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびメチル−Ｌ−キヌレニン（独自の合成、以下参照）を、ＴＭＴ（登録商標）ｚｅｒｏまたはＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手可能）を用いて対照として標識した。物質５００μｇを１００ｍＭトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μＬ中にそれぞれ溶解し、次にＡＣＮ  （ＬｉｃｈｒｏＳｏｌｖ、ＶＷＲ）中の６０ｍＭのＴＭＴ（登録商標）試薬原液１６８μＬを添加した。反応物を室温で１時間インキュベートし、最後に５％ヒドロキシルアミン水溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）７０μＬを添加して反応を停止させた。試料を乾燥させて、さらなる分析のために０．１％トリフルオロ酢酸を含む水：アセトニトリル９５：５の５００μＬ中で再構成した。
【００８０】
メチル−キヌレニンの合成
（Ｓ）−Ｎ−メチル−キヌレニンの合成
【化１】
2019504329.tif 000002
（Ｓ）−４−（２−アミノフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−オキソブタン酸（Ｓ１）：室温でＮａＨＣＯ３（１８９ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）およびジ−ｔ−ブチルジカーボネート（２１６ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を、２：１ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（４ｍＬ）混合物中のＬ−キヌレニン（１９４ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の懸濁液に添加した。２分以内に、反応混合物は清澄化した。２．５時間後に、ＴＨＦをロータリーエバポレーターで除去し、残りの水溶液を３Ｍ  ＨＣｌ（５滴）で酸性化し、次いでＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮し、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）、２７９ｍｇ（９７％）のＳ１を黄色発泡体として得た。
Ｒｆ０．２７（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３０９
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−４−（２−（メチルアミノ）フェニル）−４−オキソブタン酸（Ｓ２）：アセトニトリル（１０ｍＬ）中のＳ１（２２５ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ホルムアルデヒド（１００□Ｌ、３７％ｍｍｏｌ）を添加した。酢酸（５０μＬ）の添加によりｐＨを約６に調整した。室温で４０分後に、ＮａＣＮＢＨ３（１６２ｍｇ、２．５８ｍｍｏｌ）を添加した。さらに９０分後に、反応混合物をＨ２Ｏで希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ１１に塩基性化し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物をブライン（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮し、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）により精製して、Ｓ２（７５ｍｇ、３２％）を黄色発泡体として得た。
Ｒｆ０．３３（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝３２３
（Ｓ）−Ｎ−メチル−キヌレニン：ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中のＳ２（１１２ｍｇ、０．３４７ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を添加した。９０分後に、溶媒をロータリーエバポレーターで除去した。得られた固体をＭｅＯＨ中に溶解し、連続して３回濃縮して過剰のＴＦＡを除去した。生成物をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏの混合物からの結晶化により精製して、（Ｓ）−Ｎ−メチル−キヌレニン（４５ｍｇ、５８％）を黄色粉末として得た。
［α］Ｄ２２−４４°（ｃ０．５０、ＭｅＯＨ）
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ７．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．６，７．０，１．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．７８（ｄ，Ｊ＝８．７，１Ｈ）、６．６２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，７．０，１．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．１７（ｄｄ，Ｊ＝７．７，３．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．７３（ｄｄ，Ｊ＝１８．５，３．３Ｈｚ、１Ｈ）、３．６４（ｄｄ，Ｊ＝１８．５，７．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ１９９．４，１７２．９，１５３．６，１３７．０，１３２．７，１１７．４，１１５．３，１１２．６，５１．３，３９．９，２９．３ｐｐｍ。
１９Ｆ  ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ−７９．４ｐｐｍ。
ＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝２２３
【００８１】
細胞培養上清のＴＭＴ（登録商標）標識
各単細胞培養上清５０μＬを、ＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。上清を５μＬの１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で希釈し、次いでＡＣＮ（ＬｉｃｈｒｏＳｏｌｖ、ＶＷＲ）中の６０ｍＭ  ＴＭＴ（登録商標）試薬原液溶液１７μＬを添加した。反応物を１時間、室温でインキュベートし、２．５％ヒドロキシルアミン水溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）８μＬを加えることにより最終的に反応を停止させた。比較する６つの試料を混合し、乾燥させた。
【００８２】
Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏでの測定のためのマウス血清試料の試料調製
血清試料５０μＬを、ＴＣＡ溶液（６０ｇ／ｌ）５０μＬを用いて４℃で一晩沈殿させた。懸濁液を４℃にて、６０００ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、上清を１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７〜８に中和した後、さらなる実験に使用した。
それぞれ沈殿させ中和したマウス血清試料６６μＬを、１Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＥＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）６μＬで希釈し、次いでＡＣＮ（ＬｉｃｈｒｏＳｏｌｖ、ＶＷＲ）中の６０ｍＭ  ＴＭＴ試薬原液２４μＬを添加した。反応物を室温で１時間インキュベートし、２．５％ヒドロキシルアミン水溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１２μＬを加えることにより最終的に反応を停止させた。比較するそれぞれの６つの標識血清試料を混合し、乾燥させた。
【００８３】
ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍでの測定のためのヒト血清試料の試料調製
インフォームドコンセント後に、ヒト血清を４名のグリア芽細胞腫患者と４名の年齢および性別が一致した健常対照から得た。血清を、直ちに遠心沈殿し、さらに分析するまで−８０℃で保存した。ＥＡＳＹ−ｎＬＣ  ＩＩ  ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での分析のために、８つのヒト血清試料（対照用の４つの血清およびグリア芽細胞腫の４つの血清）を用いて２つのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ混合物を調製した。ここでは、研究デザインは、４つの対照用の血清および４つのグリア芽腫例の標準プール混合物を含んだ。この標準試料は、等量のそれぞれ個々の試料を含んだ。各ＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ混合物はしたがって、対照混合物、対照患者からの２つの血清および腫瘍患者からの２つの血清を含み、第６のチャネルはブランクのままであった。試料調製を、上記のように行った。ＴＭＴ（登録商標）標識試料を混合し、乾燥させた。
【００８４】
混合試料の逆相精製
乾燥したＴＭＴ（登録商標）混合物を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む３００μＬの水：アセトニトリル９５：５（緩衝液Ａ）中で再構成した。１５０μＬを、２１４ｎｍでのＵＶ検出を伴うＷａｔｅｒｓ  ２６９５  ＨＰＬＣを使用する逆相クロマトグラフィー（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １２０−５  Ｃ１８カラム、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ）によって分画した。装填後、試料を緩衝液Ａで４分間洗浄した。次に、アセトニトリル含量を４０分以内に５５％に増加させることによって、物質を溶出した。流速を全勾配にわたって１．５ｍＬ／分に維持した。１８〜３０分からの画分を集め、乾燥させた。
【００８５】
細胞培養上清および血清試料の質量分析測定
試料を、Ｐｒｏｘｅｏｎ  ｎａｎｏＬＣ−ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上のＵＰＬＣ  ｎａｎｏＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に連結されたＱＴｏｆ  ＩＩ（Ｗａｔｅｒｓ）質量分析計またはｎａｎｏＬＣ−ＩＩ（ＥＡＳＹ−ｎＬＣ  ＩＩ  ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ）に連結されたトリプル四重極システムのいずれかで測定した。試料を、２％ＡＣＮ、０．１％ギ酸１５０μＬ中に溶解した（１μＬ試料＝１μＬ混合上清同等物）。
ＱＴｏｆ  ＭＳを実施するため、細胞上清試料混合物を２％ＡＣＮおよび０．１％ギ酸中で１：２０に希釈し、３μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために注入した。
Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳを実施するために、細胞培養上清試料混合物を２％ＡＣＮおよび０．１％ギ酸中で１：１００に希釈し、２μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に適用した（約０．０２μＬの混合試料）。
Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳを実施するために、混合マウス血清試料を２％ＡＣＮ、０．１％ギ酸中に溶解し、混合血清等価物の約０．８８μＬをカラムに装填した。ＬＣ分離のために、２５分勾配を用いて選択分析物を分離した（１５％〜３０％ＡＣＮ）。調製したヒト血清試料混合物を２％ＡＣＮ、０．１％ギ酸中に溶解し、１μＬの混合血清同等物をＭＳ実施ごとに使用した。
ＱＴｏｆでのＭＳ分析のために、全走査ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ３５０〜５００）を１０００ｍｓの走査時間および１００ｍｓの走査間遅延で取得した。各全走査後に、２０００ｍｓの走査時間および１００ｍｓの走査間遅延での衝突誘起解離（ＣＩＤ）−ＭＳ／ＭＳ分析のために２つの最も強いイオンを選択した。さらなるＭＳ／ＭＳ獲得のために、単電荷前駆体のみを選択した。ＭＳ／ＭＳを、ｍ／ｚ４３４．２７、４３８．２７、４４８．２７、４５２．２７（±５００ｍＤａ）についてデータ依存的に誘発した。
Ｏｒｂｉｔｒａｐでの高分解能ＭＳ分析用に、選択イオン検出（ＳＩＭ）Ｔｏｐ１０  ＨＣＤ（高衝突解離）法を用いて選択分析物をモニタリングした。
ＳＩＭのｍ／ｚ範囲は３５０〜５００Ｔｈであり、分解能は６００００であり、最大走査時間５００ｍｓでＡＧＣ設定は５ｅ４であった。ＭＳ／ＭＳを、ＨＣＤモードで、分解能７５００、最大スキャン時間５００ｍｓにてＡＧＣ設定５ｅ４でＴＯＰ１０として取得した。絶縁幅は１．５ａｍｕであり、正規化された衝突エネルギーは６０であった。前駆体のデフォルト電荷状態をｚ＝１に設定した。他のすべての電荷状態を拒否した。対象の分析物を、包含リストのみのモード（±５０ｐｐｍ）を使用してＭＳＭＳモードで獲得し、リストに含まれない他のすべての分析物を廃棄した。
分析物を次いで、それらのｍ／ｚ、保持時間および典型的な断片ならびに社内適合バージョンのＭＺｍｉｎｅを使用してエクスポートされたそれらのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘレポーターの強度によって同定した。包括リストは、ＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ試薬で標識された、トリプトファン、メチル−トリプトファン、キヌレニンおよびメチル−キヌレニンの４つの分析物の計算質量を含んだ。
抽出されたイオンクロマトグラムを、ＱＴｏｆデータ用のＭａｓｓＬｙｎｘ  ４．１（Ｗａｔｅｒｓ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐデータ用のＸｃａｌｉｂｕｒ２．１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のいずれかを使用して可視化し、およびレポーターイオン強度ならびにプロダクトイオンを、対応する分析物の累積ＭＳ／ＭＳスペクトルからエクスポートした。
【００８６】
トリプル四重極ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍでのＭＳ分析のために、ヒト血清試料の２つのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ混合物を、２％ＡＣＮ／０．１％ＦＡ１５０μＬ中に再懸濁し、１：２０希釈し、２μＬ（０．１μＬ血清等価物）をＥＡＳＹ−ｎＬＣ  ＩＩ  ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入した。
最初の試料を、トラッピングおよびクリーンアップのために、５μｍのＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ（Ｄｒ．  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ）を満たした長さ２ｃｍの（ＯＤ３６０μｍ、ＩＤ１００μｍ）キャピラリーカラムに装填した。次に、分析物を、３００ｎＬ／分で０．１％ＦＡ中の１５〜３０％アセトニトリルの２５分勾配を用いてＲｅｐｒｏＳｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ）３μｍを充填した長さ１５ｃｍの（ＯＤ３６０μｍ、ＩＤ７５μｍ）キャピラリーカラムにより分離した。
溶出分析物を、１．６ｋＶのナノエレクトロスプレーによってイオン化した。トリプル四重極機器を、正およびＳＲＭモードで操作した。キャピラリー温度を２２０℃に設定した。遷移パラメータは、それぞれトリプトファンおよびキヌレニンについて表１および表２に記載した通りであった。
遷移走査時間を２４ｍｓで計算した。Ｑ１およびＱ３についてピーク幅（ＦＷＨＭ）を、それぞれ０．５および０．７に設定した。衝突ガス圧力を１．８ｍＴｏｒｒに、クロムフィルタのピーク幅を６．０ｓに、デクラスタリング電圧を５Ｖに設定した。
【表１】
2019504329.tif 000003
【表２】
2019504329.tif 000004
【００８７】
ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅデータの処理
データを、その小分子の能力を用いてＳｋｙｌｉｎｅ  ３．１（skyline.gs.washington.edu）で分析した。断片のイオン信号を同定検証に使用した。ＴＭＴ（登録商標）レポーターチャネルのピーク積分を手動で編集し、さらなる解析のために領域をエクスポートした。
【００８８】
免疫組織化学
免疫組織化学のために、ウサギ抗ＴＤＯ２Ａ抗体（１：４００）を用いた（２０）。３μｍに切った切片をインキュベートし、Ｖｅｎｔａｎａ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＸＴ（登録商標）ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ、ＵＳＡ）を用いてＴＤＯ２抗体で処理した。Ｖｅｎｔａｎａ染色手順は、Ｖｅｎｔａｎａ細胞コンディショナー１（ｐＨ８）で１時間の抗原回収前処理、続いて３７℃で３２分間のＴＤＯ２抗体とのインキュベーションを含んだ。インキュベーションに続いて、Ｖｅｎｔａｎａ標準信号増幅、ＵｌｔｒａＷａｓｈ、ヘマトキシリンおよび青化試薬での４分間の対比染色を行った。可視化のために、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＦａｓｔＲｅｄ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００８９】
統計分析
データを中央値として示す。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。有意性の分析を、スチューデントｔ検定（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ、Ｓｙｓｔａｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【００９０】
（結果）
トリプトファン、１−Ｌ−メチル−トリプトファン、キヌレニンおよびメチル−キヌレニンのＴＭＴ（登録商標）標識
ＴＭＴ（登録商標）試薬での純物質Ｌ−トリプトファン、１−Ｌ−メチル−トリプトファン、Ｌ−キヌレニンおよびメチル−キヌレニンの標識によりＨＰＬＣ保持時間がシフトし、分析物が上手く完全に標識されていることを示す。非標識物質と比較した、様々な量のＴＭＴ（登録商標）標識されたＬ−トリプトファン、１−Ｌ−メチル−トリプトファン、Ｌ−キヌレニンおよび１−Ｌ−メチル−キヌレニンを直接注入するＱＴｏｆ  ＩＩ（Ｗａｔｅｒｓ）機器でのＭＳ測定は、ＴＭＴ（登録商標）標識された分析物は、非標識物質よりも明らかに高い信号を生成したことを明らかにした。ＴＭＴ（登録商標）標識トリプトファンの質量分析応答は、非標識トリプトファンの１００倍を超えた。１−Ｌ−メチル−トリプトファンおよびメチル−キヌレニンは、ＴＭＴ（登録商標）試薬で標識された場合、２００倍高いＭＳ信号を生じたが、キヌレニンについては、２倍を超える信号であり、効果はより低かった。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、ＴＭＴ（登録商標）レポーターイオン断片が測定可能であり、さらに信号強度が構造的断片よりも明らかに高かったことを示し、効率的な断片化が達成されたこと、およびＴＭＴ（登録商標）レポーターイオンが定量の目的に理想的であることを証明する（データで示さず）。
【００９１】
同重体標識は、１回の実験で６つの細胞培養上清試料中のトリプトファンの分解の多重測定を可能にする。
ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞は、ＩＤＯ１媒介性様式（１０）でトリプトファンをキヌレニンへと構造的に分解し、このため、それらをモデル細胞株として使用して、新規のＭＳ／ＭＳベースのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘアプローチを用いてキヌレニンへのＬ−およびＤ−トリプトファンの分解を分析した。
【００９２】
培養上清中のトリプトファンおよびキヌレニンの濃度は、細胞のＩＤＯ１活性の良好な読み取り値として役立ち、従って、ＳＫＯＶ−３細胞培養上清試料を実験に使用した。６つの異なるＳＫＯＶ−３細胞培養上清試料のそれぞれを、６つの異なるＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ試薬のうちの１つで標識した（表３）。
【表３】
2019504329.tif 000005
【００９３】
比較する６つの試料を混合し、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析に供し、ここで、分析物は保持時間および質量によって分離される。ＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ試薬での物質の標識は、モノアイソトピック質量［Ｍ＋Ｈ］をトリプトファンでは２０５．０９６９から４３４．２５９８に増加し、キヌレニンでは２０９．０９１８〜４３８．２５４７に増加する。標識された分析物（それらの正確な質量に基づいて選択される）のＭＳ／ＭＳ断片化は、６つの試料の各々における分析物の相対定量を可能にするレポーターイオンを生成する。分析されたＭＳ信号の同一性を、純物質のＭＳ／ＭＳスペクトルと同一の物質関連断片の存在によって確認した（データ示さず）。
ＳＫＯＶ−３細胞の細胞培養上清中のトリプトファンおよびキヌレニンを、０日目（細胞との接触前）および６日目（０日目、６日目、０日目、６日目、０日目、６日目）で、または経時実験（０日目、１日目、２日目、３日目、４日目および５日目）での３つの独立した生物学的試料のいずれかのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ混合物中で測定した。結果は、インキュベーションの６日後に、Ｌ−トリプトファンが培地から完全に枯渇されており、キヌレニンの著しい増加が観察されたことを示す（図１上パネル：左Ｌ−トリプトファンおよび右Ｌ−キヌレニン）。経時分析は、ＳＫＯＶ−３細胞の培地からのＬ−トリプトファン枯渇がインキュベーションの２日目と３日目の間に起こり、３日目に最大キヌレニン濃度に達したことを明らかにした（図１、下パネル：左Ｌ−トリプトファンおよび右Ｌ−キヌレニン）。対照的に、Ｄ−トリプトファンは、インキュベーションの６日後に培地から完全に枯渇されず（図２、上パネル：左Ｄ−トリプトファンおよび右Ｄ−キヌレニン）、５日目にＤ−キヌレニンの最大濃度に到達し（図２、下パネル：左Ｄ−トリプトファンおよび右Ｄ−キヌレニン）、Ｄ−トリプトファンの分解がＬ−トリプトファンの分解よりも遅いことを反映す。
【００９４】
多重実験は、１−ＭＴがヒト癌細胞によってメチル−キヌレニンに分解されることを明らかにする。
ＩＤＯ阻害薬１−Ｌ−ＭＴによる処置後のトリプトファン分解の動態を研究するために、０日目およびＳＫＯＶ−３細胞の１−Ｌ−ＭＴとのインキュベーションの６日目の細胞培養上清の３つの独立した生物学的試料を分析した。驚くべきことに、１−Ｌ−ＭＴとインキュベートしたＳＫＯＶ−３細胞の上清は、ｍ／ｚ４５２．２７０６Ｔｈでピークをもたらした。この質量は、ＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ標識メチル−キヌレニンに相当する。これは、トリプトファンのキヌレニンへの代謝に類似して、１−Ｌ−ＭＴがメチル−キヌレニンに代謝されることを示す。メチル−キヌレニンの存在を、正しく測定された正確な質量、メチル−キヌレニン標準に等しいその保持時間およびＭＳ／ＭＳスペクトル由来の２つの断片（データは示されていない）によって確認した。メチル−キヌレニンの断片のうちの１つを、ｍ／ｚ１２０．０４Ｔｈでの既知のキヌレニン断片と比較して、１４Ｔｈ（挿入メチレン基）のより高い質量に対応するｍ／ｚ１３４．０６で観察した。第２の断片を、キヌレニンからのｍ／ｚ１４６．０６Ｔｈプラス挿入されたメチレン基からの１４Ｔｈでのピークに相当するｍ／ｚ１６０．０７Ｔｈで検出した。
６日目に、１−Ｌ−ＭＴは細胞培養培地から完全に枯渇され、同時に平行してメチル−キヌレニンの著しい増加が観察された（図３；左１−Ｌ−ＭＴ、右Ｍ−Ｋｙｎ）。１−ＭＴ分解の動態をさらに研究するために、１−ＭＴおよびトリプトファンの２つの異なる濃度でそれぞれ経時分析を行った。４種の異なる分析物、トリプトファン、キヌレニン、１−ＭＴおよびメチル−キヌレニンを、０日目、１日目、３日目、４日目、５日目および６日目にＳＫＯＶ−３細胞の細胞培養上清から測定した（図４および図５）。１−ＭＴの２つのエナンチオマーの代謝における推定上の差異に関する情報を得るために、細胞を１−ＭＴのＬ−またはＤ−エナンチオマー（１−Ｌ−ＭＴまたは１−Ｄ−ＭＴ）とインキュベートした。２つの異なる実験設定：ｉ）トリプトファンを含まない培地に加えた７０μＭのトリプトファンと１０００μＭの１−ＭＴ（図４；上パネル１−Ｌ−ＭＴ；下パネル１−Ｄ−ＭＴ）、およびｉｉ）血清中に存在するものに加えてトリプトファンを含まない２００μＭの１−ＭＴ（図５；上パネル１−Ｌ−ＭＴ；下パネル１−Ｄ−ＭＴ）で処置した細胞からの上清、を分析した。１−ＭＴの両方のエナンチオマーはメチル−キヌレニンに分解されたが、１−Ｌ−ＭＴは１−Ｄ−ＭＴよりも速く分解され、より高いレベルのメチル−キヌレニンに達した（図４および図５）。トリプトファンは、Ｄ−ＭＴで処置した試料中でＬ−ＭＴで処置した試料中よりも、キヌレニンへとより速く代謝されより高いキヌレニンレベルに達した（図４および図５）。これは、Ｄ−ＭＴよりも分解酵素に対するＬ−ＭＴのより高い親和性を反映しており、トリプトファンなどの競合基質がＤ−ＭＴ試料中でより迅速に代謝されるようにするのかもしれない。
キヌレニンは、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）を活性化することによって免疫応答を抑制することが示されている（３）。驚くべきことに、１−Ｄ／Ｌ−ＭＴの分解によって生成されたメチル−キヌレニンは、ＡＨＲを活性化し得る。トリプトファン非含有条件下で１−Ｄ／Ｌ−ＭＴでのＳＫＯＶ−３細胞の処置は、ＡＨＲ標的遺伝子ＣＹＰ１Ａ１およびＴＩＰＡＲＰを誘導し（図６（Ａ）および（Ｂ））、１−Ｄ／Ｌ−ＭＴの分解を介して生成されるメチル−キヌレニンがＡＨＲを活性化することを示唆する。
【００９５】
ＩＤＯは、１−ＭＴからメチル−キヌレニンへの分解に関連する酵素である。
どの酵素が１−ＭＴをメチル−キヌレニンに分解するかを分析するために、トリプトファンを構成的に分解しないヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞の上清およびＩＤＯまたはＴＤＯのいずれかを発現するＨＥＫ細胞の上清の多重測定を行った。予想通り、ＨＥＫコントロール細胞（ＷＴ）はトリプトファン、１−ＭＴのいずれも分解しなかった（データは示さず）。ＴＤＯを発現するＨＥＫ細胞はトリプトファンをキヌレニンに分解したが、細胞上清中で１−ＭＴのいかなる減少も検出されなかった（図７；上パネル１−Ｌ−ＴＭ、下パネル１−Ｄ−ＴＭ）。メチル−キヌレニンのほんのごくわずかな増加が、１−Ｌ−ＭＴで細胞を処置した後に検出されたが、１−Ｄ−ＭＴでは検出されず１−Ｌ−ＭＴの弱い分解を反映しており、これは基質が比較的多量であるために１−Ｌ−ＭＴの減少として検出可能ではなかった。
対照的に、ＩＤＯを発現するＨＥＫ細胞は、１−Ｌ−ＭＴ（図８、上パネル）および１−Ｄ−ＭＴ（図８、下パネル）の両方からメチル−キヌレニンを産生した。
これに沿って、ここでもおそらく多量の基質のために、１−Ｌ−ＭＴの量はわずかに減少したが、１−Ｄ−ＭＴの減少は検出できなかった。これらのデータは、ＴＤＯ発現細胞は微量の１−Ｌ−ＭＴを分解できるが、ＩＤＯ発現細胞は１−ＭＴの両方のエナンチオマーをメチル−キヌレニンに分解できることを示している。
【００９６】
ヒト樹状細胞における１−ＭＴ分解
免疫細胞もまたトリプトファン分解酵素を発現でき、トリプトファンの分解が強力な免疫抑制効果を発揮することは公知である（９）。樹状細胞などの免疫細胞も１−ＭＴをメチル−キヌレニンに分解するかどうかを評価するために、２つの異なるドナー由来のヒト樹状細胞の上清の３つの独立した生物学的試料を分析した（ドナー１のみを示す）。樹状細胞をインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で刺激してＩＤＯ活性を誘導した。０日目および１−Ｌ−ＭＴ（図９上パネル）または１−Ｄ−ＭＴ（図９下パネル）のいずれかとのインキュベーションの６日後に３つの試料を比較した。インキュベーションの６日後に、両方のドナー由来の樹状細胞の培地中で１−Ｌ−ＭＴの減少およびメチル−キヌレニンの増加が検出され（図９上パネル）、１−Ｌ−ＭＴがヒト樹状細胞によってメチル−キヌレニンに代謝されることを示唆する。１−Ｄ−ＭＴとインキュベートした樹状細胞を用いた実験は、メチル−キヌレニンの増加を示した。しかし、おそらくここでも、基質の量が比較的多いために、１−Ｄ−ＭＴレベルの明らかな減少は測定されなかった（図９下パネル）。要約すると、ヒト樹状細胞は１−ＭＴをメチル−キヌレニンに代謝し、１−Ｌ−ＭＴは１−Ｄ−ＭＴよりも効率的に代謝される。
【００９７】
同重体標識は、炎症誘発ＩＤＯ発現を有するマウスの血清中のメチル−キヌレニンの検出を可能にする
１−ＭＴの分解がインビボでも起こるかどうかを調べるために、１−Ｌ−ＭＴの存在下および非存在下で、ＬＰＳ誘発ＩＤＯ活性を有するマウスの血清を分析した。２つの群のマウスを使用し、３つの異なる時点（ＬＰＳ投与の６、１２および２４時間後）で分析した。両方の群をＬＰＳで刺激してＩＤＯ活性を誘導した。さらに、１−Ｌ−ＭＴの代謝を評価するために、第２の群に１−Ｌ−ＭＴを投与した。ＬＰＳでの処置がトリプトファン分解を誘導したのでＬＰＳ刺激はマウスにおいてＩＤＯを上手く活性化すると考えられた。マウス血清中のキヌレニンレベルは、ＬＰＳ投与後６時間〜２４時間に増加した（図１０）。トリプトファンの濃度は、ＬＰＳ投与後１２時間で最も低かった。しかし、その濃度は２４時間で再び増加し、おそらくこれは全身のトリプトファン枯渇に対抗する機構を反映している。１−Ｌ−ＭＴを注射されたマウス群（図１０中「＋」で示される）は、対照群よりも有意に高い１−Ｌ−ＭＴ濃度を示した。投与後２４時間に、１−Ｌ−ＭＴの最大濃度に達し、これは腹腔内注射後の血清中への１−Ｌ−ＭＴの吸収が遅いためであり得る。ＩＤＯ活性がＬＰＳによって誘導されかつ基質として１−Ｌ−ＭＴが提供されたマウスでは、ＬＰＳ単独で処置されたマウスと比較して有意に高いメチル−キヌレニン濃度が観察され、これはインビボでのメチル−キヌレニンへの１−Ｌ−ＭＴの代謝を示唆する。より高いメチル−キヌレニン濃度が６時間ですでに測定され、１−Ｌ−ＭＴの注射後１２時間までさらに上昇した。
【００９８】
多重分析は、グリア芽細胞腫患者における低減されたトリプトファン血清濃度を明らかにする。
トリプトファン代謝は癌免疫療法の標的であり、ＩＤＯ１阻害剤による臨床試験が現在進行中である。グリア芽細胞腫は高レベルのトリプトファン分解酵素ＴＤＯを発現し、健常対照と比較してこれらの患者の血清トリプトファン濃度を減少させる（３）。血液中のトリプトファンおよびキヌレニンレベルの効果的な測定は、これらの処置に患者を層別化し処置効力をモニターするために必要である。現在の研究では、血清が収集された患者のグリア芽細胞腫組織中でＴＤＯ２の高発現が検出され、それらが低減された血清トリプトファンレベルも示すであろうことを示唆する。４名のグリア芽細胞腫患者および４名の年齢および性別が一致した対照からの血清中のトリプトファンおよびキヌレニンの存在量を、２つのＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ混合物および参照に基づくデザインを用いて比較した。この目的のために、等量の各個々の試料からなる混合標準試料を調製した。この標準試料は、この研究ですべての試料の比較を可能にする。各ＴＭＴ（登録商標）ｓｉｘｐｌｅｘ混合物は、標準混合物、対照からの２つの血清およびグリア芽細胞腫患者からの２つの血清を含有した。トリプル四重極機器が高スループットおよび臨床設定において一層使用されているため、ｎＬＣ  ＩＩ  ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ  ｓｙｓｔｅｍでのトリプトファンとキヌレニンの多重測定を確立した。トリプトファンおよびキヌレニンは、混合試料の０．１μｌ血清当量から測定し、これは測定あたり個々の血清試料の０．０１７μｌに相当する。トリプトファンおよびキヌレニンレベルは、年齢および性別が一致した健常対照と比較して、グリア芽細胞腫患者の血清において有意に減少した（図１１は、２つの群における分析物トリプトファンおよびキヌレニンの混合標準試料に対して計算された平均相対比を示す）。トリプトファンおよびキヌレニンの平均レベルは、それぞれ、１．８倍および２倍減少する。これまでの結果（３）との良好な一致は、本発明者らの設定が、血清などの体液中のトリプトファンおよびその代謝産物の測定に有用であることを示す。
【００９９】
結果の要約
本発明者らは、癌細胞の例としてＳＫＯＶ−３細胞において、および免疫系の細胞の例として樹状細胞においての両方で、１−ＭＴの両方のエナンチオマーがメチル−キヌレニンに代謝されることを実証した。多重測定は、ＩＤＯが１−ＭＴの両方のエナンチオマーの分解を触媒し得ることを示唆する。ＴＤＯは微量の１−Ｌ−ＭＴをおそらく分解できるが、ＴＤＯによる１−Ｄ−ＭＴの分解は検出できなかった。マウス血清の多重測定は、メチル−キヌレニンがまた、インビボでのＬＰＳ刺激後に１Ｌ−ＭＴから産生されることを示す。ＳＫＯＶ−３細胞が１−ＭＴで処置される実験は、生成物メチル−キヌレニンがアリール炭化水素受容体を活性化し、したがってキヌレニンについて示されたように免疫応答を抑制し得ることを示唆する（３）。メチル−キヌレニンの形成はしたがって、１−ＭＴによるＩＤＯの阻害に対抗し、これは、それら自体がアリール炭化水素受容体リガンドへと分解されない他の阻害剤が、所望の効果を媒介する上でより効率的であり得ることを示唆している。
重要なことに、ヒト血清試料中のトリプトファンの多重測定は、グリア芽細胞腫患者と健常対照の血清トリプトファン濃度の比較を可能にした。グリア芽細胞腫は、高レベルのＴＤＯの発現のためトリプトファンを効率的に分解することが知られており、血清トリプトファン濃度の減少をもたらす（３）。多重測定は、グリア芽細胞腫患者の血清中の低減されたトリプトファン濃度を明らかにし、この方法が例えば臨床設定において、ヒト血清中のトリプトファンおよびキヌレニンの測定に実際に適していることを示唆する。血清トリプトファンのこの減少は、様々な種類の癌、炎症性疾患および自己免疫疾患を含む多種多様な疾患でトリプトファンの減少した血清濃度が報告されているように、グリア芽細胞腫に特異的なものではないが（９）、それでも、トリプトファン分解を調節する化合物による処置への患者の層別化、およびそれらの効力のモニタリングのために有用であることを証明する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2019504329.tif 000016
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月10日(2018.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019504329000001.app
【国際調査報告】
2019504329.tif 000017
2019504329.tif 000018
2019504329.tif 000019