(57)【要約】  本発明は、癌、特に、癌、特に転移性疾患を治療、予防、または改善するための新規医薬組成物、療法および方法に関する。また、本発明は、癌および転移性疾患のための診断および予測の方法、ならびにこれらの状態のためのバイオマーカーにも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌または転移性疾患を患う個体もしくはこれらの傾向がある個体を診断する方法、または個体の状態の予測を提供する方法であって、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在について、個体から得たサンプルにおいて検出することを含み、前記配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在は、前記個体が癌または転移性疾患を患っている、もしくはこれらの傾向がある、または、個体の状態がネガティブな予測を有することを意味する、方法。
【請求項２】
癌または転移性疾患を患う対象もしくはこれらの傾向がある対象を診断するキット、または対象の状態の予測を提供するキットであって、試験対象から得たサンプルに存在する、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の濃度を測定するための検出手段を含み、前記サンプルにおける、前記配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在は、前記対象が癌もしくは転移性疾患を患っている、またはこれらの傾向があることを示唆する、キット。
【請求項３】
前記サンプルは、血液、血漿、血清、脊髄液、尿、汗、唾液、涙、胸部吸引液、前立腺液、精液、膣液、糞便、子宮頸部掻爬、細胞、羊水、眼内液、粘液、息切れの水分、動物組織、細胞溶解物、腫瘍組織、毛髪、皮膚、頬側掻爬、リンパ、間質液、爪、骨髄、軟骨、プリオン、骨粉、イヤーワックス、またはそれらの組み合わせであり、好ましくは、前記サンプルは血液サンプルを含む、請求項１の方法または請求項２のキット。
【請求項４】
前記検出手段は、前記サンプル中のＴ１４陽性細胞の存在および／または不存在を検出するように適合されたアッセイ、好ましくは、イムノアッセイベースの試験を含み、より好ましくは、前記アッセイが抗体を含む、請求項１〜３のいずれかの方法。
【請求項５】
前記アッセイは、ウエスタンブロットの使用を含む、請求項４の方法またはキット。
【請求項６】
癌または転移性疾患についての診断または予測バイオマーカーとしての、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の使用。
【請求項７】
癌または転移性疾患を治療、改善、または予防することにおける使用のための、配列番号３のペプチドの合成および／または活性の阻害剤。
【請求項８】
前記癌は、白血病、リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、骨髄性白血病、または急性骨髄性白血病である、請求項７の使用のための阻害剤。
【請求項９】
前記癌は、多発性骨髄腫、乳癌、または形質細胞腫である、請求項７の使用のための阻害剤。
【請求項１０】
前記阻害剤は、転移性疾患または転移を治療、改善、または予防するために使用される、請求項７の使用のための阻害剤。
【請求項１１】
前記阻害剤は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2019511701.tif 000068
を含み、
ここで、
Ｒ１は−ＮＲ９Ｒ１０または−ＯＨであり、
Ｒ２は
【化２】
2019511701.tif 000069
であり、
Ｒ３は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は
【化３】
2019511701.tif 000070
であり、
Ｒ５は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は
【化４】
2019511701.tif 000071
であり、
Ｒ７は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ８は−Ｈ、Ｃ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニル、または
【化５】
2019511701.tif 000072
であり、
Ｘ１は−ＮＲ９Ｒ１０、−ＯＨ、または
【化６】
2019511701.tif 000073
であり、
前記または各Ｒ９およびＲ１０は独立して−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ１１は−ＮＨ２、−ＯＨ、またはアリール基であり、
前記または各ｍは独立して０〜５の間であり、
各ｎは独立して０〜１０の間である、請求項７〜１０のいずれかの使用のための阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体もしくは多形体。
【請求項１２】
前記阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は
【化７】
2019511701.tif 000074
であり、
Ｒ３はＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は
【化８】
2019511701.tif 000075
であり、
Ｒ５はＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は
【化９】
2019511701.tif 000076
であり、
Ｒ７はＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである、請求項１１の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
前記阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は
【化１０】
2019511701.tif 000077
であり、
Ｒ３はＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は
【化１１】
2019511701.tif 000078
であり、
Ｒ５はＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は
【化１２】
2019511701.tif 000079
であり、
Ｒ７はＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである、請求項１１または１２の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
前記阻害剤は、式（１０１）または（１０３）の化合物
【化１３】
2019511701.tif 000080
を含む、請求項１１〜１３のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項１５】
前記阻害剤は式（１０１ａ）または（１０３ａ）の化合物
【化１４】
2019511701.tif 000081
を含む、請求項１１〜１４のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項１６】
前記阻害剤は抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項７〜１０のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項１７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、アルファ７受容体でのアロステリック部位とのＴ１４相互作用をブロックし、任意に、前記抗体はＴ１４に結合し、これにより、毒性を生じさせる受容体に結合できない複合体を形成する、請求項１６の使用のための阻害剤。
【請求項１８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項１６または１７の使用のための阻害剤。
【請求項１９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３に、任意に、配列番号３のＣ末端における１つまたは複数のアミノ酸と特異的に結合する、請求項１６〜１８のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項２０】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５（つまり、ＳＹＭＶＨＷＫ）または配列番号６（つまり、ＶＨＷＫ）における１つまたは複数のアミノ酸と特異的に結合する、請求項１６〜１９のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項２１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２と結合しない、または、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４と結合しない、請求項９〜１５のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項２２】
前記阻害剤は、内因性Ｔ１４と競合し、それによってその活性を低下させるＴ１４ペプチドの不活性のペプチドフラグメントである、請求項７〜２１のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項２３】
前記阻害剤は、Ｔ１４ペプチドを形成するアセチルコリンエステラーゼ酵素の翻訳後開裂を防止または低減する、請求項７〜２２のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項２４】
前記阻害剤は、アセチルコリンエステラーゼポリペプチドのＴ１４への酵素的切断をブロックするように構成された遺伝子サイレンシング分子であり、任意に、前記遺伝子サイレンシング分子は、Ｔ３０（配列番号２）からＴ１５（配列番号４）を切断してＴ１４（配列番号３）を生成するプロテアーゼの発現を減少させるまたは防止する、請求項２３の使用のための阻害剤。
【請求項２５】
前記阻害剤は、アルファ７受容体へのＴ１４転位を阻害する、請求項７〜２４のいずれかの使用のための阻害剤。
【請求項２６】
請求項７〜２５のいずれかに記載の、阻害剤の治療上有効な量、および場合により薬学的に許容されるビヒクルを含む抗癌または抗転移性医薬組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の抗癌または抗転移性医薬組成物を製造する方法であって、請求項７〜２５のいずれかに記載の治療上有効な量の阻害剤を薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせることを含む、方法。
【請求項２８】
候補化合物が癌または転移性疾患を治療、予防、または改善するための有効性を有するかどうかを試験するために、前記候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）生物システムに前記候補化合物を暴露することと、
（ｉｉ）前記生物システムにおける、配列番号３のＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を検出することと、
（ｉｉｉ）前記化合物で処置されていない対照生物システムでみられる濃度、発現、または活性と、前記化合物で処置された前記生物システムにおけるＴ１４ペプチドの濃度、発現、活性とを比較することを含み、
癌または転移性疾患を治療、予防、または改善する有効性を有する化合物が、前記対照に対して、Ｔ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を低下させる、方法。
【請求項２９】
化合物が癌を生じさせるかどうかを試験するために、前記化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）生物システムに試験化合物を暴露することと、
（ｉｉ）前記生物システムにおける、配列番号３のＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を検出することと、
（ｉｉｉ）前記化合物で処置されていない対照生物システムでみられるＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性と、前記化合物で処置された前記生物システムにおけるＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性とを比較することを含み、
発癌性であるまたは転移を増進させる化合物が、前記対照に対して、Ｔ１４ペプチドの濃度、発現、活性を増加させる、方法。
【請求項３０】
前記システムは、（ａ）インビボでの試験を実施する際の実験的試験対象、（ｂ）試験対照由来の生物サンプル、（ｃ）細胞株モデル、または（ｄ）Ｔ１４またはその遺伝子を含み、Ｔ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を測定することができるように生理環境を刺激するインビトロシステムを含む、請求項２８または２９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌、特に、癌、特に転移性疾患を治療、予防、または改善するための新規医薬組成物、療法および方法に関する。また、本発明は、癌および転移性疾患のための診断法および予後診断方法、ならびにこれらの状態のためのバイオマーカーにも関する。
【背景技術】
【０００２】
癌および悪性腫瘍は、身体の他の部分に侵入または浸潤する、すなわち転移の可能性を有する異常な細胞増殖を伴う疾患群を形成する。２０１２年には、世界中で約１４００万人の新たな癌が発生した。したがって、癌および転移の治療のための改善された診断および治療法を提供する必要がある。
【０００３】
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、様々な形態の異なる発達段階で発現され、これらはすべて同一の酵素活性を有するが、分子組成が非常に異なる。「尾部」（Ｔ−ＡＣｈＥ−配列番号１）はシナプスにおいて発現され、本発明者らは、Ｃ末端から切断することができる２つのペプチドをこれまでに同定しており、１つは「Ｔ１４」と呼ばれるもの（配列番号３）であり、他方は「Ｔ３０」（配列番号２）として知られており、両方ともβ−アミロイドの同等の領域に対して強い配列相同性を有する。ＡＣｈＥのＣ末端ペプチド「Ｔ１４」は、その非加水分解作用の範囲に関与するＡＣｈＥ分子の顕著な部分であると同定されている。合成１４アミノ酸ペプチド類似体（すなわち、「Ｔ１４」）、およびその後、それが包埋されているより大きく、より安定でより強力なアミノ酸配列（すなわち、「Ｔ３０」−配列番号３）は、「非コリン作動性」ＡＣｈＥについて報告されたものに匹敵する作用を示すが、Ｔ３０配列内の不活性残基（すなわち「Ｔ１５」−配列番号４）は効果がない。
【０００４】
Ｔ１４ペプチドは、α７ニコチン受容体上のアロステリック部位に結合し、それ自体は効果がない。しかしながら、アセチルコリンまたは食餌性コリンのような一次リガンドの存在下では、Ｔ１４はこれらの主要薬剤によって誘導されるカルシウム流入を増強する。過剰なカルシウムはミトコンドリア内に取り込まれ、酸化的リン酸化を犠牲にし、電子の漏出を引き起こす。その結果、フリーラジカルが形成されて膜を不安定にし、細胞が死滅する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、細胞溶解物および７つの癌細胞株（ＭＥＣ−１、ＫＧ１ａ、Ｈ９２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＣＬＬ、およびＪＮＮ３）の細胞培養培地中のウエスタンブロッティングを用いて、毒性Ｔ１４ペプチド、α７ニコチン性受容体およびアセチルコリンエステラーゼタンパク質のレベルを調べた。彼らは、毒性のＴ１４ペプチドのみが癌細胞から放出され、Ｔ１４濃度は、癌細胞内のＴ１４レベルよりも細胞外で高いことを見出した。次に、本発明者らは、癌細胞株の膜および細胞質画分における既知の転移性マーカーＣＤ４４と毒性Ｔ１４ペプチド、ＡＣｈＥおよびα７ニコチン性受容体との関係を調べた。彼らはＣＤ４４が毒性分子Ｔ１４と有意かつ正の相関があることを観察して驚いた。集合的に、これらのデータは、その生合成および代謝経路を含む毒性Ｔ１４ペプチドが癌および転移を治療するための良好な標的であり、さらにＴ１４自体が癌転移の強力なバイオマーカーとして作用することを強く示唆する。
【０００６】
したがって、本発明の第１の態様において、癌または転移性疾患の治療、改善または予防に用いるための、配列番号３のペプチドの合成および／または活性の阻害剤が提供される。
【０００７】
第２の態様では、対象の癌または転移性疾患を治療、改善または予防する方法であって、このような治療を必要とする対象に、配列番号３のペプチドの合成および／または活性の阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。
【０００８】
実施例１に記載したように、本発明者らは、細胞溶解物中のウエスタンブロッティング、並びに、７つの癌細胞株（ＭＥＣ−１、ＫＧ１ａ、Ｈ９２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＣＬＬ、およびＪＪＮ３）および対照として作用する正常なＢリンパ球の細胞培養培地を用いて、毒性Ｔ１４ペプチド（配列番号３）、ニコチン性アルファ７受容体およびアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）タンパク質のレベルを検出した。Ｈ９２９、ＪＪＮ３、ＣＬＬおよびＭＣＦ−７は移動性が低い癌細胞株であり、Ｂリンパ球は正常な非癌性細胞であるのに対し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＫＧ１ａおよびＭＥＣ−１細胞は高度に移動する癌細胞株である。Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥはすべて癌細胞内で検出された。驚くべきことに、３つのタンパク質はすべて同様の移動性を有し、それらのレベルは互いに正の相関があり、それらが互いに複合体化していることが示唆される。しかしながら、外部の癌細胞（すなわち、細胞培養培地内）では、毒性のＴ１４ペプチドのみが検出された。さらに驚くべきことに、Ｔ１４レベルは、７つの癌細胞株のうち６つの内部よりも細胞外で高かったことから、Ｔ１４が細胞から放出されるように産生されることが示唆された。本発明者らはまた、癌細胞の外側のＴ１４のレベルが、癌細胞内のアルファ７受容体レベルと有意に負に相関していることに驚いた。
【０００９】
実施例２は、６つの癌細胞株（ＪＪＮ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ−７、ＫＧ１ａ、ＭＥＣ−１、およびＨ９２９）および１つの癌由来細胞株（ＰＣ１２）の膜およびサイトゾル画分における周知の転移性マーカーＣＤ４４と毒性Ｔ１４ペプチド、ＡＣｈＥ、およびアルファ７受容体との関係を示すウエスタンブロッティングの使用を記載する。全ての癌細胞株において、転移性マーカー（ＣＤ４４）は毒性分子Ｔ１４と有意かつ正の相関があり、癌細胞膜内および癌細胞のサイトゾル内でこの相関関係が成り立つ。これらの所見は、Ｔ１４が癌および転移の程度、すなわち腫瘍細胞移動の良好な予測因子であることを強く示唆している。
【００１０】
第１または第２の態様に従って治療される癌は、白血病であり得る。例えば、癌は、リンパ球性白血病または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）であり得る。癌は、骨髄性白血病または急性骨髄性白血病であり得る。癌は多発性骨髄腫であり得る。癌は乳癌であり得る。癌は形質細胞腫であり得る。
【００１１】
最も好ましくは、Ｔ１４ペプチドの阻害剤（配列番号３）の合成および／または活性は、転移性疾患または転移の治療、改善または予防に用いるためのものである。
【００１２】
アセチルコリンエステラーゼは、アセチルコリンを加水分解するセリンプロテアーゼであり、当業者に周知である。脳に見られるアセチルコリンエステラーゼの主要な形態は、尾部アセチルコリンエステラーゼ（Ｔ−ＡＣｈＥ）として知られている。ヒト尾部アセチルコリンエステラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ６８１５１．１）の一実施形態のタンパク質配列は、６１４アミノ酸の長さであり、以下のように配列番号１として本明細書に提供される：
【００１３】
【化１】
2019511701.tif 000003
【００１４】
配列番号１の最初の３１アミノ酸残基が除去され、タンパク質が放出され、それによって５８３アミノ酸配列が残ることが理解されるであろう。
【００１５】
Ｔ３０のアミノ酸配列（配列番号１の最後の３０個のアミノ酸残基に相当する）は、以下のように配列番号２として本明細書に提供される：
【００１６】
【化２】
2019511701.tif 000004
【００１７】
毒性のＴ１４ペプチドのアミノ酸配列（配列番号１の末端に向かって位置する１４アミノ酸残基に対応し、Ｔ３０に見出される最後の１５アミノ酸を欠く）は、配列番号３として、次のように本明細書に提供される：
【００１８】
【化３】
2019511701.tif 000005
【００１９】
Ｔ１５のアミノ酸配列（配列番号１の最後の１５個のアミノ酸残基に対応する）は、以下のように配列番号４として本明細書に提供される：
【００２０】
【化４】
2019511701.tif 000006
【００２１】
本発明者らは、毒性のＴ１４ペプチドの阻害が癌または転移の有効な治療のために必要であることを見出した。本発明の阻害剤は、癌の発症または転移の発症および広がりを予防するために使用され得る。例えば、阻害剤は、癌または転移を発症する危険性がある対象（例えば、遺伝的素因又は不都合な環境曝露）に与えることができる。阻害剤はまた、対象における癌の再確立を防止するために、手術、放射線療法または化学療法の後に使用され得る。
【００２２】
本発明者らは、毒性Ｔ１４ペプチドがα７ニコチン受容体上のアロステリック部位に結合することを示したが、それ自体は細胞に影響を及ぼさない。しかし、アセチルコリンまたは食餌性コリンのような一次リガンドの存在下では、Ｔ１４は、これらの主要薬剤によって誘導された細胞へのカルシウム流入を増強する。過剰なカルシウムはミトコンドリアに取り込まれ、そこで酸化的リン酸化が譲歩され、電子の漏出を引き起こす。その結果、フリーラジカルが形成されて膜を不安定にし、細胞が死滅する。
【００２３】
上記の理解に基づいて、本発明者らは、毒性Ｔ１４ペプチドの合成または生物学的活性を低下させることができる阻害剤を設計することができ、いくつかの生合成および／または代謝手段によってそれらの効果を達成し得る。好ましくは、阻害剤はＴ１４に結合し、それがα７ニコチン受容体に結合するのを防ぐことができる。本発明者らは、アロステリック部位に到達することができた任意のＴ１４ペプチドが受容体との相互作用を維持し、この相互作用が２４時間以内により多くの受容体のアップレギュレーションを引き起こし得ること、すなわちＴ１４がそれ自身の標的を増加させることができることを見出した。したがって、アロステリック部位とのＴ１４相互作用の防止が最も好ましい。
【００２４】
例えば、そのような阻害剤は、
（ａ）Ｔ１４ペプチドとアルファ７受容体上のアロステリック部位との間の相互作用を減少させる、
（ｂ）アルファ７受容体上のアロステリック部位の内因性Ｔ１４ペプチドと競合する、
（ｃ）その生物活性を低下させるためにＴ１４ペプチドに結合する、
（ｄ）アセチルコリンエステラーゼポリペプチドの翻訳後開裂を減少させてＴ１４ペプチドを生成する、または
（ｅ）アルファ７受容体上のアロステリック部位へのＴ１４転座を阻害する、こととしてもよい。
【００２５】
本発明の好ましい第１の実施形態において、阻害剤は、Ｔ１４の生化学的および／または代謝活性、したがってＴ１４の毒性を対象の細胞において低下させるために、Ｔ１４ペプチド（例えば、上記の（ａ）〜（ｃ））と直接相互作用することができる。好ましくは、阻害剤は、アルファ７受容体上のアロステリック部位とのＴ１４相互作用の減少をもたらす。
【００２６】
好ましい阻害剤は、小分子阻害剤を含む。このような阻害剤は、小分子ライブラリーのハイスループットスクリーニングの一部として同定することができる。例えば、本発明の第５の態様によるスクリーニング方法（下記参照）は、癌または転移を処置するために使用され得るそのような阻害剤を同定する適切な手段を表す。
【００２７】
好ましい実施形態では、阻害剤は式（Ｉ）の化合物：
【００２８】
【化５】
2019511701.tif 000007
【００２９】
ここで、
Ｒ１は−ＮＲ９Ｒ１０または−ＯＨであり、
Ｒ２は
【００３０】
【化６】
2019511701.tif 000008
【００３１】
Ｒ３は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は
【００３２】
【化７】
2019511701.tif 000009
【００３３】
Ｒ５は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は
【００３４】
【化８】
2019511701.tif 000010
【００３５】
Ｒ７は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ８は−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルまたは
【００３６】
【化９】
2019511701.tif 000011
【００３７】
Ｘ１は−ＮＲ９Ｒ１０、−ＯＨ、または
【００３８】
【化１０】
2019511701.tif 000012
【００３９】
前記または各Ｒ９およびＲ１０は独立して−ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ１１は−ＮＨ２、−ＯＨ、またはアリール基であり、
前記または各ｍは独立して０〜５の間であり、
各ｎは独立して０〜１０の間である、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、互変異性体もしくは多形体を含む。
【００４０】
「塩」という用語は、その生物学的特性を保持し、毒性でないかまたは薬学的使用のために望ましくない本明細書で提供される化合物の任意の塩を意味することが理解されよう。そのような塩は、当該技術分野において周知の種々の有機および無機対イオンから誘導され得る。このような塩としては、限定されるものではないが、（１）有機酸または無機酸を有する酸付加塩であって、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンチルプロピオン酸、グリコール酸、グルタル酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、ソルビン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ピクリン酸、ケイ皮酸、マンデル酸、フタル酸、ラウリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタン−ジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−トルエンスルホン酸、樟脳、樟脳スルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、安息香酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナ酸、ムコン酸などの酸；または（２）親化合物中に酸性プロトンが存在するときに形成される塩基付加塩であって、（ａ）金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオンまたはアルミニウムイオン、もしくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、リチウム、亜鉛および水酸化バリウム、アンモニアのような、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物で置換されているか、または、（ｂ）有機塩基、例えば、脂肪族、脂環式、もしくは、芳香族有機アミン、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン、リジン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレン−ジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、Ｎ−メチルグルカミンピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド等と配位されているものが挙げられる。
【００４１】
塩はさらに、限定ではなく例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどを含むことができ、化合物が塩基性官能基を含む場合、非毒性の有機酸または無機酸の塩、例えば塩酸塩および臭化水素酸塩のようなハロゲン化水素、硫酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリクロロアセテート、プロピオネート、ヘキサノエート、シクロペンチルプロピオネート、グリコラート、グルタレート、ピルビン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、ソルビン酸塩、アスコルビン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）ベンゾエート、ピクレート、シンナメート、マンデル酸塩、フタル酸塩、ラウリン酸塩、メタンスルホン酸塩（メシル酸塩）、エタンスルホン酸塩、１，２−エタン−ジスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホネート（ベシレート）、４−クロロベンゼンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、４−トルエンスルホン酸塩、樟脳酸塩、ショウノウスルホン酸塩、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクト−２−エン−１−カルボキシレート、グルコヘプタン酸、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、ｔｅｒｔ−ブチルアセテート、ラウリル硫酸塩、グルコン酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、キネート、ムコン酸塩等を含む。
【００４２】
用語「溶媒和物」は、非共有結合分子間力によって結合された化学量論的または非化学量論的量の溶媒をさらに含む、本明細書で提供される化合物またはその塩を指すことが理解されよう。溶媒が水である場合、溶媒和物は水和物である。
【００４３】
アリール基は、芳香族環に由来する置換基を指すことが理解されよう。アリール基はＣ６−Ｃ１２アリール基であってもよい。好ましくは、アリール基はフェニル、ビフェニルまたはナフチルである。
【００４４】
より好ましくは、化合物は、式（Ｉａ）：
【００４５】
【化１１】
2019511701.tif 000013
【００４６】
Ｒ１は−ＯＨであってもよい。しかし、好ましくは、Ｒ１は−ＮＲ９Ｒ１０であり、より好ましくはＲ１は−ＮＲ９Ｈであり、最も好ましくはＲ１は−ＮＨ２である。
【００４７】
好ましくは、Ｒ２は、
【００４８】
【化１２】
2019511701.tif 000014
【００４９】
ｎは好ましくは１〜５の間である。従って、ｎは１、２、３、４、または５であり得、最も好ましくはｎは１である。
【００５０】
実施形態では、Ｒ２は、
【００５１】
【化１３】
2019511701.tif 000015
【００５２】
そのとき、ｍは、０、１、２、３、４、または５であり得る。好ましくは、ｍは１である。好ましくは、Ｘ１はパラ位にある。
【００５３】
好ましい実施形態では、Ｒ２は、
【００５４】
【化１４】
2019511701.tif 000016
【００５５】
好ましくは、実施形態では、Ｒ２は、
【００５６】
【化１５】
2019511701.tif 000017
【００５７】
好ましい実施形態では、Ｒ２は、
【００５８】
【化１６】
2019511701.tif 000018
【００５９】
もっとも好ましい実施形態では、Ｒ２は、
【００６０】
【化１７】
2019511701.tif 000019
【００６１】
Ｒ３は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基であってもよいことが理解されよう。好ましくは、Ｒ３はメチルである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ３は−Ｈである。
【００６２】
一実施形態では、Ｒ４は、
【００６３】
【化１８】
2019511701.tif 000020
【００６４】
ｎは、好ましくは１〜５の間である。したがって、ｎは、１、２、３、４、または５であり、好ましくはｎは１である。
【００６５】
実施形態では、Ｒ４は、
【００６６】
【化１９】
2019511701.tif 000021
【００６７】
このとき、ｎは、好ましくは１〜７の間であり、より好ましくは２〜６の間である。
【００６８】
したがって、ｎは、２、３、４、５、または６であり、好ましくは、ｎは３または４である。
【００６９】
一実施形態では、Ｒ４は、好ましくは、
【００７０】
【化２０】
2019511701.tif 000022
【００７１】
より好ましくは、Ｒ４は、
【００７２】
【化２１】
2019511701.tif 000023
【００７３】
実施形態において、Ｒ４は、
【００７４】
【化２２】
2019511701.tif 000024
【００７５】
そのとき、ｍは、０、１、２、３、４、または５であり得る。好ましくは、ｍは１である。好ましくは、Ｘ１はパラ位にある。
【００７６】
好ましくは、Ｒ４は、
【００７７】
【化２３】
2019511701.tif 000025
【００７８】
より好ましくは、Ｒ４は、
【００７９】
【化２４】
2019511701.tif 000026
【００８０】
好ましくは、実施形態において、Ｒ４は、
【００８１】
【化２５】
2019511701.tif 000027
【００８２】
そのとき、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つが−Ｈであり、最も好ましくは、Ｒ９またはＲ１０の両方が−Ｈである。
【００８３】
したがって、Ｒ４は、好ましくは、
【００８４】
【化２６】
2019511701.tif 000028
【００８５】
より好ましくは、Ｒ４は、
【００８６】
【化２７】
2019511701.tif 000029
【００８７】
最も好ましくは、Ｒ４は、
【００８８】
【化２８】
2019511701.tif 000030
【００８９】
Ｒ５は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基であってもよいことが理解されよう。好ましくは、Ｒ５はメチルである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ５は−Ｈである。
【００９０】
Ｒ６では、
【００９１】
【化２９】
2019511701.tif 000031
【００９２】
ｎは、１〜５の間である。したがって、ｎは、１、２、３、４、または５であり、好ましくは、ｎは１である。
【００９３】
好ましくは、Ｒ６は、
【００９４】
【化３０】
2019511701.tif 000032
【００９５】
実施形態では、Ｒ６は、
【００９６】
【化３１】
2019511701.tif 000033
【００９７】
そのとき、ｍは、０、１、２、３、４、または５であり得る。好ましくは、ｍは０である。より好ましくは、ｍは１である。好ましくは、Ｘ１はパラ位にある。
【００９８】
好ましい実施形態では、Ｒ６は、
【００９９】
【化３２】
2019511701.tif 000034
【０１００】
好ましくは、実施形態では、Ｒ６は、
【０１０１】
【化３３】
2019511701.tif 000035
【０１０２】
そのとき、Ｒ９またはＲ１０の少なくとも１つが−Ｈであり、最も好ましくは、Ｒ９またはＲ１０の両方が−Ｈである。
【０１０３】
好ましくは、実施形態では、Ｒ６は、
【０１０４】
【化３４】
2019511701.tif 000036
【０１０５】
そのとき、Ｒ１１はアリールであり、最も好ましくはフェニルである。
【０１０６】
好ましい実施形態では、Ｒ６は、
【０１０７】
【化３５】
2019511701.tif 000037
【０１０８】
最も好ましい実施形態では、Ｒ６は、
【０１０９】
【化３６】
2019511701.tif 000038
【０１１０】
Ｒ７は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基またはペンチル基であってもよいことが理解されよう。好ましくは、Ｒ７はメチルである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ７は−Ｈである。
【０１１１】
１つの好ましい実施形態では、Ｒ８は−Ｈである。しかしながら、より好ましい実施形態では、Ｒ８は、
【０１１２】
【化３７】
2019511701.tif 000039
【０１１３】
好ましい実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は、
【０１１４】
【化３８】
2019511701.tif 000040
【０１１５】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は、
【０１１６】
【化３９】
2019511701.tif 000041
【０１１７】
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は、
【０１１８】
【化４０】
2019511701.tif 000042
【０１１９】
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである。
【０１２０】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、Ｒ７はＨである。
【０１２１】
より好ましい実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は、
【０１２２】
【化４１】
2019511701.tif 000043
【０１２３】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は、
【０１２４】
【化４２】
2019511701.tif 000044
【０１２５】
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、または
Ｒ６は、
【０１２６】
【化４３】
2019511701.tif 000045
【０１２７】
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである。
【０１２８】
好ましくは、阻害剤は、式（Ｉａ）の化合物を含む。好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、かつＲ７はＨである。
【０１２９】
好ましくは、Ｒ１は−ＯＨ、およびＲ８はＨである。より好ましくは、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ８は、
【０１３０】
【化４４】
2019511701.tif 000046
【０１３１】
代替的に、より好ましい実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は、
【０１３２】
【化４５】
2019511701.tif 000047
【０１３３】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は、
【０１３４】
【化４６】
2019511701.tif 000048
【０１３５】
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、または、
Ｒ６は、
【０１３６】
【化４７】
2019511701.tif 000049
【０１３７】
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである。
【０１３８】
好ましくは、阻害剤は、式（Ｉａ）の化合物を含む。好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、かつＲ７はＨである。
【０１３９】
好ましくは、Ｒ１は−ＯＨであり、Ｒ８はＨである。より好ましくは、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ８は、
【０１４０】
【化４８】
2019511701.tif 000050
【０１４１】
さらにより好ましい実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は、
【０１４２】
【化４９】
2019511701.tif 000051
【０１４３】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は、
【０１４４】
【化５０】
2019511701.tif 000052
【０１４５】
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は、
【０１４６】
【化５１】
2019511701.tif 000053
【０１４７】
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである。
【０１４８】
好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、かつ、Ｒ７はＨである。
【０１４９】
より好ましい実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は、
【０１５０】
【化５２】
2019511701.tif 000054
【０１５１】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は、
【０１５２】
【化５３】
2019511701.tif 000055
【０１５３】
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ６は、
【０１５４】
【化５４】
2019511701.tif 000056
【０１５５】
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである。
【０１５６】
好ましくは、阻害剤は、式（Ｉａ）の化合物を含む。好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、かつＲ７はＨである。
【０１５７】
好ましくは、Ｒ１は−ＯＨ、かつＲ８はＨである。より好ましくは、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ８は、
【０１５８】
【化５５】
2019511701.tif 000057
【０１５９】
代替的に、より好ましい実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物を含み、
ここで、
Ｒ２は、
【０１６０】
【化５６】
2019511701.tif 000058
【０１６１】
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、
Ｒ４は、
【０１６２】
【化５７】
2019511701.tif 000059
【０１６３】
Ｒ５は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルであり、または
Ｒ６は、
【０１６４】
【化５８】
2019511701.tif 000060
【０１６５】
Ｒ７は、ＨまたはＣ１−５直鎖状または分岐状アルキルまたはアルケニルである。
【０１６６】
好ましくは、阻害剤は、式（Ｉａ）の化合物を含む。好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ５はＨであり、かつＲ７はＨである。
【０１６７】
好ましくは、Ｒ１は−ＯＨ、かつＲ８はＨである。より好ましくは、Ｒ１はＮＨ２であり、Ｒ８は、
【０１６８】
【化５９】
2019511701.tif 000061
【０１６９】
好ましくは、阻害剤は、式（１０１）または（１０３）の化合物を含む。
【０１７０】
【化６０】
2019511701.tif 000062
【０１７１】
より好ましくは、阻害剤は、式（１０１ａ）または（１０３ａ）の化合物を含む。
【０１７２】
【化６１】
2019511701.tif 000063
【０１７３】
式（１０１ａ）および（１０３ａ）の化合物は、それぞれ実施例で論じられる化合物Ｔｒｉ０２およびＴｒｉ０４に対応することが理解されるであろう。
【０１７４】
したがって、さらなる態様において、好ましくは阻害剤が式（１０１ａ）または（１０３ａ）である、癌または転移性疾患の治療、改善または予防に用いるための、本明細書で定義される阻害剤が提供される。
【０１７５】
１つの好ましい実施形態において、阻害剤は、抗体またはその抗原結合フラグメント、すなわちＴ１４中和抗体を含む。抗体またはその抗原結合フラグメントは、好ましくは、Ｔ１４相互作用をアルファ７受容体上のアロステリック部位でブロックする。好ましくは、抗体はＴ１４に結合し、それにより受容体に結合して毒性を引き起こすことができない複合体を形成する。
【０１７６】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。抗体またはその抗原結合フラグメントは、ウサギ、マウスまたはラットにおいて生成され得る。
【０１７７】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３に特異的に結合する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３のＣ末端の１つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号５の１つまたは複数のアミノ酸（すなわち、配列番号３のＣ末端アミノ酸番号７〜１４であるＳＹＭＶＨＷＫ）に特異的に結合する。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、エピトープのＣ末端リジン（Ｋ）残基に特異的に結合する。
【０１７８】
本発明者らは、驚くべきことに、配列番号６（すなわち、配列番号３のＣ末端アミノ酸番号１０〜１４）として本明細書に記載されている配列番号３のＣ末端アミノ酸配列ＶＨＷＫが、抗体またはその抗原結合フラグメントのためのエピトープとして作用することを観察した。したがって、より好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６の１つまたは複数のアミノ酸に特異的に結合する。最も好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号６に特異的に結合する。したがって、抗体が結合するエピトープは、配列番号６を含むか、または、それからなることが理解される。
【０１７９】
Ｔ１４ペプチド内のＶＨＷＫエピトープ（配列番号６）の発見に基づいて、本発明者らは、これらの配列が有用な抗体の産生のための抗原として使用できると考えている。実施例に記載されるように、Ｔ１４ペプチド（配列番号３）は、宿主における免疫応答を刺激する担体タンパク質として作用するキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にシステイン架橋された。Ｔ１４に架橋されたＫＬＨタンパク質は、本明細書では配列番号７、すなわちＣＡＥＦＨＲＷＳＳＹＭＶＨＷＫ（Ｃは、ＫＬＨをＴ１４ペプチドのＮ末端のＡに連結するために添加された）と称される。
【０１８０】
好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号２に結合しない。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４に結合しない。
【０１８１】
ポリクローナル抗体は、動物に抗原を注入することによってポリクローナル血清として産生され得る。好ましいポリクローナル抗体は、当該分野で公知の技術を用いて動物（例えば、ウサギ）に抗原（例えば、Ｔ１４またはそのＣ末端を含むそのフラグメント）を接種することによって惹起され得る。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、宿主動物を配列番号３で免疫化し、次いで抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することによって得ることができる。宿主動物はウサギであることが最も好ましい。
【０１８２】
別の好ましい実施形態では、阻害剤は、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。好ましいモノクローナル抗体は、抗原としてＴ１４またはそのフラグメントを使用するハイブリドーマ技術を用いて惹起され得る。好ましくは、本発明の抗体はヒト抗体である。本明細書中で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、配列番号３に対して免疫特異性を示す特定のヒト抗体において見出されるものと実質的に同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む抗体、例えばモノクローナル抗体を意味し得る。重鎖または軽鎖のＣＤＲと実質的に同一であるアミノ酸配列は、参照配列と比較して相当量の配列同一性を示す。そのような同一性は、特定のヒト抗体のアミノ酸配列を表すものとして決定的に知られているかまたは認識可能である。実質的に同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は、例えばアミノ酸のわずかな修飾または保存的置換を有することができる。そのようなヒト抗体は、配列番号３に選択的に結合するその機能を維持する。
【０１８３】
従来のハイブリドーマ技術を用いて抗体を産生することができる。モノクローナル抗体を生成するために使用される抗原は、Ｔ１４タンパク質全体またはそのフラグメントであり得る。抗体を産生するための好ましいフラグメントはまた、上記のペプチド、特にＳＹＭＶＨＷＫ（配列番号５）またはＶＨＷＫ（配列番号６）であってもよい。抗体は、γ免疫グロブリン（ＩｇＧ）であることが好ましい。
【０１８４】
本発明による別の好ましい阻害剤は、内因性Ｔ１４と競合し、それによりその活性を低下させるＴ１４ペプチドの不活性ペプチドフラグメントである。例えば、アルファ７受容体上のアロステリック部位に結合せず、アルファ７受容体上のアロステリック部位と相互作用するＴ１４の能力を阻害するＴ１４のトランケーション突然変異体も、本発明の阻害剤として使用することができる。
【０１８５】
別の実施形態において、阻害剤は、Ｔ１４ペプチドを形成するためのアセチルコリンエステラーゼ酵素の翻訳後切断、すなわち上記（ｄ）を防止または低減し得る。例えば、本発明による阻害剤は、アセチルコリンエステラーゼポリペプチドのＴ１４への酵素的切断をブロックまたは破壊するように構成された遺伝子サイレンシング分子であってもよい。
【０１８６】
「遺伝子サイレンシング分子」という用語は、Ｔ１４ペプチドの発現を妨害する任意の分子を意味し得る。そのような分子には、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子を含むＲＮＡｉ分子が含まれるが、これに限定されない。
【０１８７】
上述のように、アセチルコリンエステラーゼをコードする遺伝子は、発現され、配列番号１として示されるタンパク質に翻訳される。配列番号１の翻訳後修飾は、プロテアーゼによる切断を含み、Ｔ１４（配列番号３）を生成することができる。したがって、好ましい実施形態では、阻害剤は、Ｔ３０からＴ１５（配列番号４）を切断してＴ１４を生成することに関与するプロテアーゼの発現を低減または防止する遺伝子サイレンシング分子を含む。
【０１８８】
別の実施形態において、阻害剤は、アルファ７受容体へのＴ１４転座を阻害し得る（すなわち、上記（ｅ））。
【０１８９】
本発明の阻害剤は、癌または転移の治療、改善または予防のための単剤療法（すなわち、Ｔ１４阻害剤単独の使用）として使用することができる医薬に用いることができることが理解されよう。あるいは、Ｔ１４阻害剤は、放射線療法もしくは化学療法、または既知の抗癌剤（例えば、ラパチニブ）などの癌または転移の治療、改善または予防のための既知の療法の補助として、またはそれと併用して使用することができる。
【０１９０】
本発明による阻害剤は、特に、組成物が使用される方法に応じて、多数の異なる形態を有する組成物中で組み合わせることができる。したがって、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液の形態、または治療を必要とするヒトまたは動物に投与することができる他の適切な形態であり得る。本発明による薬剤ビヒクルは、それが与えられる対象に十分に耐容され、好ましくは、例えば、脳腫瘍を治療するときに、血液脳関門を越えて標的部位への阻害剤の送達を可能にするものでなければならないことが理解されよう。
【０１９１】
本発明による阻害剤はまた、遅効性または遅延放出性の装置内に組み込むこともできる。このようなデバイスは、例えば、皮膚の上または下に挿入することができ、薬剤は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。装置は、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。このような装置は、本発明により使用される阻害剤による長期治療が必要であり、頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を通常必要とする場合に特に有利であり得る。
【０１９２】
好ましい実施形態では、本発明による医薬は、血流への注射によって、または治療を必要とする部位へ直接的に、対象に投与することができる。例えば、薬物は、血流への注射によって投与され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは輸液）または皮下（ボーラスまたは輸液）または皮内（ボーラスまたは輸液）であり得る。
【０１９３】
必要とされる阻害剤の量は、その生物学的活性および生物学的利用能によって決定され、これは、投与様式、阻害剤の物理化学的特性、および単独療法としてまたは併用療法として使用されるかどうかに依存することが理解されるであろう。投与頻度はまた、治療される対象内の阻害剤の半減期によって影響される。投与されるべき最適用量は、当業者によって決定され得、そして使用される特定の阻害剤、医薬組成物の強度、投与様式、および癌または転移の進展によって変化するであろう。治療される特定の対象に依存するさらなる因子は、対象の年齢、体重、性別、食事および投与時間を含め、投与量を調整する必要が生じる。
【０１９４】
一般に、体重１ｋｇあたり０．００１μｇ〜１０ｍｇ、または、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１ｍｇの、本発明による阻害剤の日用量は、どの阻害剤が使用されるかに依存して、癌または転移を治療、改善または予防するために使用され得る。
【０１９５】
阻害剤は、癌の発症前、発症中または発症後に投与することができる。
１日投与量は、単回投与（例えば、１日１回の注射または鼻スプレーの吸入）として与えられ得る。あるいは、阻害剤は、１日の間に２回以上投与する必要があり得る。一例として、阻害剤は、０．０７μｇ〜７００ｍｇの間の１日用量（すなわち、体重７０ｋｇを想定）の２つ（または、治療される癌または転移の重症度に応じてそれより多く）として投与され得る。治療を受けている患者は、起床時には第１の用量を、その後は夕方（２回投与の場合）またはその後３または４時間間隔で第２の用量をとることができる。あるいは、徐放デバイスを使用して、反復投与を投与する必要なく、本発明による阻害剤の最適用量を患者に提供することができる。
【０１９６】
製薬業界で従来使用されているもの（例えば、インビボ実験、臨床試験など）のような既知の手順を用いて、本発明による阻害剤の特定の製剤および正確な治療レジメン（例えば、１日用量の薬剤および投与の頻度）を形成することができる。本発明者らは、それらが、本発明の阻害剤の使用に基づいて、抗癌治療組成物を示唆する最初のものであると考えている。
【０１９７】
したがって、本発明の第３の態様では、第１の態様に記載の阻害剤の治療上有効な量および場合により薬学的に許容されるビヒクルを含む、抗癌または抗転移性医薬組成物が提供される。
【０１９８】
本発明はまた、第４の態様において、第３の態様による抗癌または抗転移性医薬組成物の製造方法であって、第１の態様による治療上有効な量の阻害剤と、薬学的に許容されるビヒクルを組み合わせることを含む、方法を提供する。
【０１９９】
第１の態様の阻害剤は、上記のように、配列番号３のペプチドの合成および／または活性を阻害する。
【０２００】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による医薬は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用されてもよく、または他の獣医学の用途で使用されてもよい。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。
【０２０１】
阻害剤の「治療上有効な量」は、対象に投与された場合に、癌または転移を処置するために、または所望の効果を生じるのに必要な活性剤の量である任意の量である。阻害剤は、固形腫瘍または転移性腫瘍の治療のためのアジュバント、例えば化学療法または放射線療法で使用することができる。これは、化学療法および／または放射線療法のより低い用量および曝露時間が必要であることを意味する。
【０２０２】
例えば、使用される阻害剤の治療上有効な量は、約０．００１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。
【０２０３】
本明細書で言及する「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【０２０４】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。しかし、医薬ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内および特に皮下注射によって利用することができる。
【０２０５】
本発明の阻害剤および組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはブドウ糖）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（ソルビトールのオレイン酸エステルおよびそのエチレンオキシドと共重合されたその無水物）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与することができる。本発明に従って使用される阻害剤は、液体または固体の組成物の形態で経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤および散剤などの固体形態、および液剤、シロップ剤、エリキシル剤および懸濁剤などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。
【０２０６】
実施例２のＣＤ４４データによって証明されるように、Ｔ１４が癌、特に転移性疾患において果たしている驚くべき役割についての知識は、試験化合物が、癌または転移を治療、予防、または改善のための推定阻害剤であるかどうかを同定するためのスクリーニングを開発することを可能にした。
【０２０７】
したがって、本発明の第５の態様によれば、候補化合物をスクリーニングして、化合物が癌または転移性疾患の治療、予防または改善に有効であるかどうかを試験する方法が提供され、
（ｉ）生物システムに前記候補化合物を暴露することと、
（ｉｉ）前記生物システムにおける、配列番号３のＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を検出することと、
（ｉｉｉ）前記化合物で処置されていない対照生物システムでみられる濃度、発現、または活性と、前記化合物で処置された前記生物システムにおけるＴ１４ペプチドの濃度、発現、活性とを比較することを含み、
癌または転移性疾患を治療、予防、または改善する有効性を有する化合物が、対照に対して、Ｔ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を低下させる、方法が提供される。
【０２０８】
本発明の第５の態様による方法は、化合物が実際に癌または転移を引き起こすか否かを試験するために使用できるように適合され得ることが理解されるであろう。
【０２０９】
したがって、第６の態様によれば、化合物が癌を引き起こすか否かを試験するための化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）生物システムに前記候補化合物を暴露することと、
（ｉｉ）前記生物システムにおける、配列番号３のＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を検出することと、
（ｉｉｉ）前記化合物で処置されていない対照生物システムでみられるＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性と、前記化合物で処置された前記生物システムにおけるＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性とを比較することを含み、
発癌性であるまたは転移を増進させる化合物が、対照に対して、Ｔ１４ペプチドの濃度、発現、活性を増加させる、方法が提供される。
【０２１０】
本発明のスクリーニング方法またはアッセイは、Ｔ１４の発現および／または活性の程度が癌および転移の発達と密接に関連しているという本発明者の認識に基づく。本発明の第５の態様のスクリーニング方法は、本発明の第１の態様に従って使用される抗癌剤または抗転移剤として使用され得る化合物を同定するための化合物のライブラリーをスクリーニングするのに特に有用である。本発明の第６の態様は、発癌性であり避けるべき化合物を同定するために使用することができる。したがって、本発明の第６の態様によるスクリーニングは、環境モニタリング（例えば、工場からの流出液の試験）または毒性試験（例えば、推定医薬品、化粧品、食料品等の安全性の試験）に使用することができる。
【０２１１】
「生物システム」という用語は、化合物が生理環境中のＴ１４ペプチドの濃度、発現または活性に及ぼす影響についての洞察を提供するために当業者によって理解される任意の実験系を意味することができる。システムは、（ａ）インビボでの試験を実施する際の実験的試験対象、（ｂ）試験対照由来の生物サンプル（例えば：血液または血液画分（例えば、血清または血漿）、リンパまたは細胞／生検サンプル）、（ｃ）細胞株モデル（例えば、Ｔ１４ペプチドを天然に発現する細胞またはＴ１４を発現するように操作された細胞）、または（ｄ）Ｔ１４またはその遺伝子を含み、Ｔ１４ペプチドの濃度、発現、または活性を測定することができるように生理環境を刺激するインビトロシステムを含む。
【０２１２】
スクリーニングは、好ましくは、生物学的細胞またはその溶解物をアッセイする。スクリーニングが細胞のアッセイを含む場合、方法がインビボベースの試験であるときは、それらは実験動物（例えば、マウスまたはラット）内に含まれ得る。あるいは、細胞は、組織サンプル中に存在してもよく（エクスビボベースの試験について）、または細胞を培養で増殖させてもよい。このような細胞は、機能的（すなわち、毒性）Ｔ１４を発現するか、または発現するように誘導され得ることが理解される。このような細胞が発現ベクターで形質転換されていれば、Ｔ１４を産生する傾向が自然にない細胞を使用することも可能である。そのような細胞は、本発明の第５または第６の態様による使用のための好ましい試験細胞である。これは、動物細胞または原核細胞であっても、ヒトＴ１４ペプチドを発現するように形質転換され得るためであり、したがって、ヒト治療における使用のための候補薬物の有効性を試験するための良好な細胞モデルを示す。
【０２１３】
本発明のスクリーニング方法に従って使用される生物学的細胞は、対象、特に癌の異種移植モデル（例えば、マウス異種移植片）から誘導されることが最も好ましい。
【０２１４】
本発明のスクリーニング方法による「Ｔ１４ペプチドの濃度、発現または活性の検出」に関して、「活性」という用語は、アルファ７受容体上のアロステリック部位とのＴ１４相互作用の検出またはエンドポイントの生理学的効果の測定を意味し得る。「発現」という用語は、細胞の任意の区画における（例えば、サイトゾル、小胞体またはゴルジ装置における）Ｔ１４タンパク質の検出を意味し得る。
【０２１５】
生物システムにおけるＴ１４の発現は、ウエスタンブロット、免疫沈降（ＩＰ）またはｃｏ−ＩＰ、または免疫組織化学によって検出することができる。
【０２１６】
スクリーニング方法はまた、Ｔ１４ペプチドを含む細胞抽出物の使用に基づいてもよい。そのような抽出物は、好ましくは、上記の細胞に由来する。
【０２１７】
Ｔ１４ペプチドの濃度、発現または活性は、多くの従来技術を用いて測定することができる。試験はイムノアッセイベースの試験であってもよい。例えば、サンプル中のＴ１４に対する化合物の結合を評価するために、標識された抗体をイムノアッセイに使用することができる。Ｔ１４ペプチドを単離し、それに結合した標識の量を検出することができる。結合した標識の減少（対照と比較して）は、試験化合物がＴ１４への結合のための標識と競合し、それがまた、推定上の抗癌剤または抗転移剤であることを示唆するであろう。あるいは、Ｔ１４ペプチド活性を測定する機能的活性を使用してもよい。
【０２１８】
さらに、分子生物学技術を用いて、Ｔ１４ペプチドをスクリーニングで検出することができる。例えば、ｃＤＮＡは、試験された細胞または対象から抽出されたｍＲＮＡおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応で使用される試験配列を増幅してｃＤＮＡから増幅するように設計されたプライマーから生成され得る。対象（例えば、動物モデルまたはヒトＴ１４を発現するように操作された動物モデル）を使用する場合、試験化合物を対象に所定の時間投与し、次いでＴ１４ペプチドの濃度、発現、または活性をアッセイするためのサンプルを対象から採取する。サンプルは、例えば、血液または生検組織であり得る。
【０２１９】
実施例で考察したように、本発明者らは、癌細胞外（すなわち、細胞培養培地内）で毒性Ｔ１４ペプチドが容易に検出可能であり、一方、ＡＣｈＥおよびアルファ７ニコチン性受容体は存在しなかったことを明らかに示した。さらに、本発明者らは、転移性マーカー（ＣＤ４４）と毒性分子Ｔ１４ペプチドとの間に強い相関があることを実証した。この相関は、癌細胞膜内および癌細胞のサイトゾル内の両方に当てはまる。したがって、本発明者らは、Ｔ１４が、癌それ自体についての、特に転移についての頑強なバイオマーカーであると考える。
【０２２０】
したがって、本発明の第７の態様によれば、癌または転移性疾患の診断または予知バイオマーカーとしての、配列番号３のペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体の使用が提供される。
【０２２１】
最も好ましくは、本発明は、転移性疾患の診断または予測のバイオマーカーとしての、配列番号3のペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体の使用を提供する。
【０２２２】
第８の態様によれば、癌または転移性疾患に罹患しているか、もしくはこれらの傾向を有するか個体を診断するための方法、または個体の状態の予測を提供するための方法が提供され、方法は、個体から得られたサンプルにおける、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在を検出することを含み、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在は、個体が癌または転移性疾患を患っている、またはこれらの傾向がある、または、個体の状態がネガティブな予測であることを意味する。
【０２２３】
本発明の第９の態様によれば、癌または転移性疾患に罹患しているもしくはこれらの傾向がある対象診断するための、または対象の状態の予測を提供するためのキットが提供され、キットは試験対象から得たサンプルに存在する、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の濃度を測定するための検出手段を含み、サンプルにおける、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在は、対象が癌もしくは転移性疾患を患っている、またはこれらの傾向があることを示唆する。
【０２２４】
有利には、本発明の使用、方法およびキットは、癌もしくは転移性疾患に罹患しているか、または、これらの傾向、最も好ましくは転移の傾向がある個体の診断または予測を可能にする。本発明者らは、毒性のＴ１４ペプチドが癌または転移性疾患を患っている個体を同定するための頑強なバイオマーカーであることを見出した。したがって、本発明の使用、方法およびキットに従って、癌もしくは転移性疾患と診断されたか、またはその素因を有するか、またはネガティブな予測を有する個体は、癌または転移性疾患の発症を予防するために早期治療処置の恩恵を受けることができる。
【０２２５】
個体は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であってもよい。しかし、最も好ましくは、個体はヒトである。個体は子供でも大人でもよい。好ましくは、方法はインビトロで実施される。
【０２２６】
好ましくは、試料は生物学的サンプルを含む。サンプルは、タンパク質が得られる個体から得ることができる任意の物質であり得る。さらに、サンプルは、血液、血漿、血清、脊髄液、尿、汗、唾液、涙、胸部吸引液、前立腺液、精液、膣液、糞便、子宮頸部掻爬、細胞、羊水、眼内液、粘液、息切れの水分、動物組織、細胞溶解物、腫瘍組織、毛髪、皮膚、頬側掻爬、リンパ、間質液、爪、骨髄、軟骨、プリオン、骨粉、イヤーワックス、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２２７】
サンプルは、血液、尿、組織などを含むことができる。最も好ましくは、サンプルは、血液サンプルを含む。血液は、静脈血または動脈血であり得る。
【０２２８】
キットは、抽出されたサンプルを受け取るためのサンプル収集容器を含むことができる。血液サンプルはすぐにＴ１４レベルについてアッセイすることができる。あるいは、血液サンプルは、Ｔ１４アッセイが実施されるまで、例えば冷蔵庫などの低温でまたは凍結でも保存され得る。Ｔ１４の検出は全血に対して行うことができる。しかしながら、好ましくは、血液サンプルは血清を含む。好ましくは、血液サンプルは血漿を含む。
【０２２９】
Ｔ１４アッセイを行う前に、血液をさらに処理してもよい。例えば、クエン酸塩（クエン酸ナトリウムなど）、ヒルジン、ヘパリン、ＰＰＡＣＫ、フッ化ナトリウムなどの抗凝固剤を添加してもよい。従って、血液サンプルが凝固するのを防止するために、サンプル採取容器は抗凝固剤を含むことができる。あるいは、血液サンプルを遠心分離または濾過して、血漿または血清画分を調製することができ、これを分析に使用することができる。したがって、Ｔ１４は、血漿または血清サンプル中で分析またはアッセイされることが好ましい。Ｔ１４濃度は、個体から採取した血清サンプルまたは血漿サンプルからインビトロで測定することが好ましい。
【０２３０】
好ましくは、キットまたは方法は、サンプル中のＴ１４陽性細胞（すなわち、配列番号３を含む細胞）の存在または非存在を同定するため、またはサンプル中のその濃度を測定するために使用される。検出手段は、サンプル中のＴ１４陽性細胞の存在および／または非存在を検出するように適合されたアッセイを含み得る。キットまたは方法は、アッセイを比較することができる陽性対照および／または陰性対照の使用を含み得る。例えば、キットは、好ましくは、癌または転移性疾患に罹患している（すなわち、陽性対照）個体由来のサンプル中のＴ１４陽性細胞の濃度についての参照、および／または癌または転移性疾患に罹患していない（すなわち、陰性対照）個体由来のサンプル中のＴ１４陰性細胞の濃度についての参照を含む。
【０２３１】
Ｔ１４ペプチド（配列番号３）は、当業者に公知の多くの方法によってアッセイすることができる。例えば、好ましくは、イムノアッセイを用いてＴ１４ペプチドレベルを測定することができる。しかし、非免疫ベースのアッセイ、例えばＴ１４ペプチド分子のリガンドと親和性を有する化合物を標識し、次いでその標識についてアッセイすることができることは理解されよう。
【０２３２】
Ｔ１４ペプチドはまた、ウエスタンブロット分析で決定することもできる。したがって、イムノアッセイおよびウエスタンブロット分析を用いて、Ｔ１４ペプチドの総タンパク質レベルを決定することができる。Ｔ１４ペプチド濃度はまた、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光定量アッセイ、化学発光アッセイ、またはラジオイムノアッセイ分析によっても検出され得る。
【０２３３】
キットは、検出され得る標識をさらに含み得る。用語「標識」は、検出手段またはその断片に結合することができる部分を意味し得る。部分は、例えば、治療または診断処置に使用することができる。治療用標識には、例えば、本発明の抗体またはそのフラグメントに結合され、Ｔ１４ペプチド（すなわち、配列番号３）に対する抗体の結合をモニターするために使用される部分が含まれる。本明細書に記載されるように、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３またはそのフラグメントもしくはその変異体に特異的に結合し、検出手段として、または検出手段において、使用することができる。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号２（すなわち、Ｔ３０）に結合しない。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは配列番号４（すなわち、Ｔ１５）には結合しない。
【０２３４】
診断標識には、例えば、分析方法によって検出され得る部分が含まれる。分析方法は、例えば、定性的および定量的手順を含む。定性的分析方法には、例えば、免疫組織化学および間接免疫蛍光が含まれる。定量分析法には、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの免疫親和性手順が含まれる。分析方法はまた、インビトロおよびインビボ画像化手順の両方を含む。分析手段によって検出され得る診断用標識の特定の例には、酵素、放射性同位体、蛍光色素、化学発光マーカー、およびビオチンが含まれる。
【０２３５】
実施例３および４は、ある範囲の癌患者におけるＴ１４についてのＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットデータを記載する。癌患者におけるＴ１４ペプチドの濃度は、例えば癌がどれだけ進行したかなどの多くの要因に大きく依存することが理解されよう。癌に罹患していない個体におけるＴ１４ペプチドの濃度は、ある程度変動する可能性があるが、所与の期間にわたって平均すると、濃度は実質的に一定である傾向があることも理解されよう。さらに、癌に罹患していない一群の個体におけるＴ１４ペプチドの濃度は、癌に罹患していない別の個体の群におけるＴ１４ペプチドの濃度と異なる可能性があることを理解されたい。しかしながら、当業者は、癌に罹患していない個体におけるＴ１４ペプチドの平均濃度を測定する方法を知っており、これはＴ１４ペプチドの「正常」濃度を指す。正常濃度は、上述の基準値に対応する。
【０２３６】
Ｔ１４ペプチド血清またはＴ１４ペプチド血漿濃度は、当業者に知られている二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定することができる。ＥＬＩＳＡは、マイクロタイタープレートをコーティングするのに適した抗体を使用することを含み得る。例えば、このような適切な抗体は、親和性精製ポリクローナルウサギ抗ヒトＴ１４ペプチド抗体を含み得る。さらに、ＥＬＩＳＡは、検出に適した抗体を使用することを含み得る。例えば、そのような適切な抗体は、ペルオキシダーゼ標識モノクローナルマウス抗ヒトＴ１４ペプチド抗体を含み得る。血漿から精製され得、次いでアミノ酸分析によって定量され得るヒトＴ１４ペプチドは、当業者に公知の標準的な技術を用いて血漿標準を較正するために使用され得る。
【０２３７】
標識は、抗体に直接結合することができ、またはＴ１４に特異的に結合する二次結合剤に結合することができる。そのような二次結合剤は、例えば、二次抗体であり得る。二次抗体は、ヒト、げっ歯類またはキメラ起源の、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。
【０２３８】
アッセイ（ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡの両方）の現在の制限のため、両方の場合のすべての値は、現在、相対的に異なるグループと考えることができる。しかしながら、ＥＬＩＳＡデータは完全に決定的なものではないかもしれないが、最初の治療までのより長い期間での低い生存率は、Ｔ１４のより低いレベルに対応した（Ｐ＝０．０１）ウエスタンブロット分析を用いたグループ間で、驚くほど明確で有意差があった。ウエスタンブロットはペプチドの凝集体を測定するので、これらのデータは、治療されていないそれらの循環におけるシグナル伝達分子としてより多くの遊離モノマーが存在し、したがって不十分な予測がより多くなることを示唆している。ＥＬＩＳＡを用いたデータが現時点では決定的ではないという事実は、それが測定する遊離モノマーが取り込まれた、および／または細胞の移動を媒介してそれぞれの標的に結合していることであり得る。
【０２３９】
したがって、好ましくは、ウエスタンブロットを使用してＴ１４を検出し、および／またはＴ１４レベルを定量する。
【０２４０】
本発明はさらに、治療方法にも及ぶ。
【０２４１】
したがって、本発明の第10の態様によれば、癌または転移性疾患を発症する感受性を有する個体を治療する方法が提供され、方法は以下を含む。
【０２４２】
（ｉ）試験対象由来のサンプルに存在する、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の濃度を測定し、サンプルにおける、配列番号３のペプチド、またはフラグメントもしくはその変異体の存在は、対象が癌もしくは転移性疾患を患っている、またはこれらの傾向があることを示唆する。
【０２４３】
（ｉｉ）癌または転移性疾患の発症を予防、軽減、または遅延させる治療剤または治療レジメンを個体に投与する。
【０２４４】
投与することができる適切な治療剤の例には、ハーセプチンが含まれるが、これに限定されない。適切な治療レジメンの例には、放射線療法または化学療法が含まれる。
【０２４５】
本発明は、本明細書で言及される、その機能的変異体または機能的断片を含む、アミノ酸または核酸配列の任意の配列をを実質的に含む、任意の核酸またはペプチドまたは変異体、その誘導体または類似体に拡張することが理解されよう。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能的変異体」および「機能的フラグメント」は、本明細書中で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する、例えば、配列番号１〜７等と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であり得る。
【０２４６】
参照される配列のいずれかと６５％を超える、より好ましくは７０％を超える、さらにより好ましくは７５％を超える、さらにより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書で参照される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９２％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９７％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは参照される配列のいずれかと少なくとも９９％の同一性を有する。
【０２４７】
当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の割合をどのように計算するかを理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性の百分率を計算するために、２つの配列のアラインメントを最初に調製し、次に配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列の同一性の割合は、（i）ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman（異なるプログラムで実施）、または３次元比較からの構造的整列など、配列を整列させるために使用される方法、（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアラインメント、使用されるペアスコアマトリックス（例えば、BLOSUM62、PAM250、Gonnet等）、に応じて異なる値をとり得る。
【０２４８】
アライメントを行った後、２つの配列間の同一性の割合を計算する多くの異なる方法がある。例えば、アイデンティティの数を、（ｉ）最短シーケンスの長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）ギャップのない位置の数、（ｉｖ）オーバーハングを除く等価ポジションの数で除算することができる。さらに、同一性のパーセンテージもまた、かなり長さに依存することが理解されよう。したがって、対の配列が短いほど、偶然に起こることが予想される配列同一性が高くなる。
【０２４９】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確な整列は複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアラインメントプログラムClustalW（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）は、本発明に従ってタンパク質またはＤＮＡの複数のアライメントを生成するための好ましい方法である。ClustalWに適したパラメータは以下の通りである：ＤＮＡアライメントの場合：ギャップオープンペナルティー（Gap Open Penalty）＝１５．０、ギャップ拡張ペナルティー（Gap Extension Penalty）＝６．６６、およびマトリックス（Matrix）=アイデンティティ（Identity）。タンパク質アライメントの場合：ギャップオープンペナルティー＝１０．０、ギャップ拡張ペナルティー＝０．２、およびマトリックス＝ゴネット（Gonnet）。ＤＮＡおよびタンパク質のアラインメントについては、ENDGAP＝−１およびGAPDIST＝４。当業者は、最適な配列アライメントのためにこれらおよび他のパラメーターを変更することが必要であり得ることを認識するであろう。
【０２５０】
好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間のパーセント同一性の計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアラインメントから計算され、ここで、Ｎは配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除く位置の総数である。従って、２つの配列間の同一性の百分率を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上記のような適切なパラメータのセットを用いてＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して配列アライメントを調製すること；（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：−配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することを含む。
【０２５１】
類似の配列を同定するための別の方法は、当業者に公知であろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下でＤＮＡ配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件では、約４５℃で３倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でフィルターに結合したＤＮＡまたはＲＮＡにヌクレオチドがハイブリダイズした後、約２０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで少なくとも１回洗浄する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、配列番号１〜４に示される配列と少なくとも１個、しかし５、１０、２０、５０、または１００個未満のアミノ酸が異なっていてもよい。
【０２５２】
遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載される任意の核酸配列は、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、その機能的変異体を提供するために、変更または変化され得ることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化した配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生じる。他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変化する配列の全部または一部を含むものであり、保守的な変化を生み出す。例えば、小さな非極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性の）アミノ酸には、リシン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換されてもよいか、当業者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知ることができることは理解されるであろう。
【０２５３】
本明細書（添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に記載される全ての特徴、および／または開示された方法またはプロセスのすべてのステップは、上記の態様のいずれかと任意の組み合わせで組み合わせることができるが、組み合わせ以外に、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかは相互に排他的である。
【０２５４】
本発明をよりよく理解し、同じものの実施形態がどのように実施されるかを示すために、ここでは例として添付図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】７つの癌細胞株、つまり、ＭＥＣ−１、ＫＧ１ａ、Ｈ９２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＬＬ、およびＪＪＮ３、並びに対照として作用する正常なＢリンパ球の細胞溶解物におけるＴ１４（Ａ）、アルファ７受容体（Ｂ）およびＡＣｈＥ（Ｃ）の間の類似の移動度を示すウエスタンブロットデータである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＫＧ１ａ、およびＭＥＣ−１細胞は、高度に移動する癌細胞株である。Ｈ９２９、ＪＪＮ３、ＣＬＬおよびＭＣＦ−７は、移動性が低い癌細胞株である。Ｂリンパ球は正常な非癌性細胞である。ペプチド／タンパク質レベルを全タンパク質（ＴＰ）に対して標準化し、各細胞株について一緒にプロットした。Ｔ１４レベルがより低いＭＣＦ−７細胞を除いて、ペプチド／タンパク質レベルは各細胞株内で類似していた。細胞株の間で、ペプチド／タンパク質レベルは可変であった。次いで、図２および図５に示すように、上記のタンパク質レベルを定量した。
【図２】癌細胞株間の細胞溶解物中の可変レベルのＴ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥを示すウエスタンブロットデータのグラフであるが、各細胞株内の類似のレベルである。
【図３】図１に示すウエスタンブロットデータに基づくグラフである。Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥレベルを総タンパク質（ＴＰ）に対して正規化し、各ペプチド／タンパク質のレベルをｘｙプロットで相関させ、線形回帰分析を行い、９５％信頼区間（点線）に沿って、最良適合線（実線）を表示した。Ａ）：Ｔ１４およびアルファ７受容体、Ｒ２＝０．６２６２、Ｐ＝０．０１９３。Ｂ）：アルファ７受容体およびＡＣｈＥ、Ｒ２＝０．６７０５、Ｐ＝０．０１２９。Ｃ）：Ｔ１４およびＡＣｈＥ。（Ｃ）の円は異常データポイントを強調表示し、除外すると有意な正の相関を示す（Ｒ２＝０．７０３２、Ｐ＝０．０１８４）。すべての相関が著しく直線的であったという事実は、ペプチド／タンパク質が１：１：１（Ｄ）の比を有する複合体として存在することを示唆している。
【図４】Ｔ１４が７つの癌細胞株すべての癌細胞培養培地で検出されたが、ＡＣｈＥおよびアルファ７は検出されなかったことを示すウエスタンブロットデータを示す。細胞培地中のＴ１４移動度は、細胞溶解物中のＴ１４移動度とわずかに異なる。次いで、図５に示すように、上記のタンパク質レベルを定量した。
【図５】癌細胞培養培地内のＴ１４濃度が、ＭＥＣ−１、ＫＧ１ａ、正常Ｂリンパ球およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における細胞Ｔ１４ペプチド／タンパク質レベルの濃度よりも有意に高いことを示すウエスタンブロットデータのグラフである。癌培養培地では、アルファ７およびＡＣｈＥシグナルは検出されなかった。ペプチド／タンパク質レベルを全タンパク質（ＴＰ）に対して正規化し、それらを各細胞株について一緒にプロットした。
【図６】図１および図４に示されるウエスタンブロットデータに基づくグラフである。Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥレベルを総タンパク質（ＴＰ）に対して正規化し、癌培養培地（細胞外Ｔ１４）内のＴ１４レベルをｘ−ｙプロット内の各細胞内ペプチド／タンパク質と相関させ、線形回帰分析を行い、９５％信頼区間（点線）に沿って、最良適合線（実線）を表示した。Ａ）：細胞外Ｔ１４および細胞内アルファ７受容体、Ｒ２＝０．６５１８、Ｐ＝０．０１５４。Ｂ）：細胞外Ｔ１４および細胞内Ｔ１４。細胞株を２つの群に分けた（ダークグレーおよびライトグレーの円）。濃い灰色はそれ自体Ｒ２＝０．９７９４、Ｐ＝０．０１０５を示した。Ｃ）：細胞外Ｔ１４および細胞内ＡＣｈＥ。
【図７】Ｔ１４レベルが細胞株間およびＥＬＩＳＡによって検出された細胞培地と細胞溶解物との間で有意に変化することを示すグラフである。
【図８】癌細胞株における細胞培地および細胞溶解物のＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット測定におけるＴ１４レベル間の有意な逆相関を示すグラフである。
【図９−１】６つの癌細胞株および１つの癌由来細胞株の細胞膜および細胞質画分におけるＣＤ４４、Ｔ１４およびＡＣｈＥ間の類似の移動度を示すウエスタンブロットデータを示す。アルファ７受容体は、ＣＤ４４、Ｔ１４およびＡＣｈＥと異なる移動度を示した。左から右へのレーンの順番は、ＪＪＮ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ−７、ＫＧ１ａ、ＭＥＣ−１、Ｈ９２９、およびＰＣ１２である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＫＧ１ａ、およびＭＥＣ−１細胞は高度に移動する癌細胞株であるが、Ｈ９２９、ＪＪＮ３、ＭＣＦ−７およびＰＣ１２は移動性が低い癌細胞株である。
【図９−２】同上。
【図１０】総タンパク質（ＴＰ）レベルに対するＣＤ４４、Ｔ１４、ＡＣｈＥおよびアルファ７受容体の相対的発現を示す。強く転移する癌は、サイトゾルと比較して膜でより多くのタンパク質を有するが、この関係は弱い転移性癌では変わる。
【図１１−１】ＣＤ４４、Ｔ１４およびＡＣｈＥ間の有意な正相関を示し、Ｔ１４およびＡＣｈＥが癌転移の程度の良好な予測因子であることを強く示唆している。
【図１１−２】同上。
【図１２】ペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）の細胞培養データ（すなわち、アセチルコリンエステラーゼ活性）を示す。
【図１３】ペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）の細胞培養データ（すなわち、カルシウムイオン流入）を示す。
【図１４−１】コントロール環状ペプチドＮＢＰ−１４の脳切片上の電圧感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）の結果を示す図である。
【図１４−２】同上。
【図１５−１】ペプチド模倣化合物１（すなわち、Ｔｒｉ０２）の脳切片上の電圧感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）の結果を示す。
【図１５−２】同上。
【図１６−１】脳切片上の電圧感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いたベースライン応答振幅に対するペプチドの添加によって誘導された変化の相関分析を示す。Ｔ３０によって誘発された応答振幅の変化は、それぞれのベースライン（Ａ）の振幅と負の相関があることが判明した。したがって、外因性ペプチドが灌流された各実験について、その後の相関分析を実施した：Ｂ）Ｔ１５、Ｃ）ＮＢＰ１４、Ｄ）Ｔｒｉ０２、Ｅ）ＮＢＰ１４の存在下でＴ３０、Ｆ）Ｔｒｉ０２の存在下でＴ３０。ｙ軸上の単位＝ΔＦ／Ｆ０；ｘ軸＝ΣΔＦ／Ｆ０。
【図１６−２】同上。
【図１７】Ｔｒｉ０２およびＴ３０の添加によって媒介される効果の定量化を示す。
【図１８】Ｔ３０が基底前脳内の活性に及ぼす影響を遮断して、Ｔ３０およびＮＢＰ１４の同時適用をＴｒｉ０２およびＴ３０の同時適用と比較したグラフを示す。ＮＢＰ１４同時適用は、Ｔ３０誘導効果を完全にブロックすることができたが、Ｔ３０ｗ／Ｔｒｉ０２は、類似しているが調節不能な調節応答を引き起こした。
【図１９】ペプチド模倣化合物２（すなわち、Ｔｒｉ０４）についてのＰＣ１２細胞培養データ（すなわち、カルシウムイオン流入）を示す。
【図２０】脳切片上の電位感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いたベースライン応答振幅に対するペプチド（Ｔ３０およびＴｒｉ０４）の添加によって誘導された基底前脳活動変化の（Ａ）空間−時間マップを示す。（Ｂ）は、Ｔ３０とＴｒｉ０４（２μＭ）との記録のための基底前脳誘発活性と、Ｔ３０単独のそれとを基底前脳で比較したグラフである。
【図２１】Ｔ３０のみの存在下またはＴ３０とそのブロッカーＴｒｉ０４の共適用後に、ベースライン条件と比較して作製した記録の蛍光分画変化（応答時間系列、ｎ＝２９）を示す。
【図２２】４μＭ濃度のブロッカーＴｒｉ０４を用いた基底前脳活動の棒グラフを示す。Ｔｒｉ０４同時適用は、ラットの基底前脳におけるＴ３０誘発作用を完全にブロックすることができた。
【図２３】既知の濃度の外因性Ｔ１４に対するＥＬＩＳＡによって測定されたＴ１４レベルの範囲の棒グラフを示す。患者は、試験したＣＬＬ患者コホートにおける相対的なＴ１４濃度によって順位付けされている。
【図２４−１】試験したＣＬＬ患者コホートにおける既知の濃度の外因性Ｔ１４および統計的グループ化と比較した、ＥＬＩＳＡによって測定されたＴ１４の値の表を示す図である。
【図２４−２】同上。
【図２４−３】同上。
【図２５】中央値より上の暗灰色グループ（上の曲線）と中央値より下の明るい灰色のグループ（下の曲線）に分離した１００のＣＬＬ血清サンプルに対して行ったKaplan Meier推定を示す。ハザード比、Ｐ値および予測中央値ＴＴＦＴは上記に示されている。
【図２６】４群の非異なる群に分けられた１００のＣＬＬ血清サンプルに対して実施されたKaplan Meier推定を示す。ハザード比、Ｐ値および予測中央値ＴＴＦＴは上記に示されている。
【図２７−１】試験したＣＬＬ患者コホートからのＴ１４の値の表および統計的グループ化を示す図である。
【図２７−２】試験したＣＬＬ患者コホートからのＴ１４の値の表および統計的グループ化を示す図である。
【図２８】中央値より上の暗灰色グループ（上の曲線）および中央値より下の明るい灰色のグループ（下の曲線）に分離した、１００ＣＬＬ血清サンプルに対して行ったKaplan Meier推定を示す。ハザード比、Ｐ値および予測中央値ＴＴＦＴは上記に示されている。
【図２９】細胞増殖アッセイの結果を示す。Ｔ１４およびＴ３０の両方が高濃度（１０μＭ）で同等の毒性効果を示し、アストログリアの低濃度での栄養効果は、Ｔ３０（１ｐＭで１２０±４％および１０ｐＭで１３５±９％）よりもＴ１４（１ｐＭで９６±５％および１０ｐＭで１２１±８％）よりも大きい。
【発明を実施するための形態】
【０２５６】
実施例
材料と方法
ポリクローナル抗体の合成
抗体は、Genosphere Biotechnologies（Paris、France）によってオーダーで合成された。２匹のニュージーランドウサギを、７０日間にわたって免疫原としてＫＬＨ−ペプチド（「Ｐｅｐ４」：Ｔ１４−ハプテンCAEFHRWSSYMVHWK−配列番号７）を４回免疫して使用した。免疫原として作用するＫＬＨにＴ１４ペプチドを連結するためにＣを含めた。動物を４回出血させ、出血をプールした。次いで、抗血清を、洗浄後に共有結合したペプチド−支持体を有する重力カラムに通し、抗体を酸性緩衝液中で溶出させ、溶液を中和した。ＰＢＳ緩衝液に対するさらなる透析および凍結乾燥により、このプロセスが完了した。
【０２５７】
Ｔ１４抗体条件の最適化
最適条件でＥＬＩＳＡの実験を行うために、抗体に関する製造業者の報告書を使用した。報告書では、製造業者は、抗体の濃度（以下の表参照）およびこの手順に使用されるＥＬＩＳＡプロトコル（下記のプロトコルを参照）に関連する光学濃度を指定する。
【０２５８】
製造元からのプロトコル：
抗原を１０μｇ／ウェルでＥＩＡストリップ上にコーティングした。ウェルを２００ｕｌのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。
【０２５９】
【表１】
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【０２６０】
抗血清を連続希釈し、別々のウェルに加え、２時間インキュベートした。非結合抗体を洗浄し、抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲートを添加した。プレートを洗浄し、発色現像をＴＭＢ基質で１５分間行った。４０５ｎｍ（２．００ＡＵＦＳ）で吸光度を読み取った。色の強さは抗体の量に正比例した。抗体は、免疫前血清の吸光度より２倍を超えて大きい場合に陽性であった。免疫前血清のバックグラウンド吸光度は、０．１〜０．３に達する可能性がある。
【０２６１】
結論：
本明細書に記載される全ての実験について、１：１０００は抗体の選択された希釈液であった。
【０２６２】
ウエスタンブロッティング
細胞分画
癌細胞株（ＪＪＮ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ−７、ＫＧ１ａ、ＭＥＣ−１、Ｈ９２９、ＰＣ１２）からの全細胞ペレットを３００μｌの細胞下分画緩衝液（Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ １０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍＭ、ＫＣｌ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＤＴＴ １ｍＭ、１×Proteinase Inhibitor Cocktail、Nonidet P-40 ０．０５％）で再懸濁し、氷上で１０分間放置した。その後、細胞溶解を確実にするためにポリトロンを用いて混合物をホモジナイズした。次いで、混合物を５００ｇで５分間遠心分離した。得られた上清は細胞質ゾル部分を含み、保持された。得られたペレットは、膜画分を含有し、次いでこれをさらに３００μｌの細胞下分画緩衝液に再懸濁し、保持した。
【０２６３】
細胞ライセートの調製
７つの癌細胞株（ＭＥＣ−１、ＣＬＬ、ＫＧ１ａ、ＪＪＮ３、Ｈ９２９、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ）および正常なＢリンパ球由来の全細胞ペレットをChris Pepper教授（Cardio University Bioscience School）から寄贈された。全細胞ペレットを、１７％ｖ／ｖ比のプロテアーゼ阻害剤カクテル（ホスファターゼ１：１、ＰＭＳＦ １：１、アプロチニン１：１）を含有する１×溶解緩衝液（２０ｍＭトリス塩基、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０，２ｍＭ ＥＤＴＡ）に可溶化した。続いて、混合物をPolytronを用いて１０秒間粉砕し、４℃で２時間振とうした。次に、試料を４℃で１３，０００ｇで３０分間遠心分離し、上清を採取し、−８０℃で保存した。
【０２６４】
タンパク質サンプル濃度の測定
Pierce（商標）660nm Protein Assay（Thermo Scientific）を使用して、上記サンプルからのタンパク質濃度を測定した。要するに、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ストックから連続希釈（０〜２ｍｇ／ｍｌ）を行った。１０μｌのタンパク質を透明な９６ウェルプレート（Greiner）に移すことによって各ＢＳＡ濃度の３つの複製物を調製した。次いで、サンプルを３つの濃度（１：１、１：２、１：１０）で希釈し、それぞれの濃度の３つの複製物を同じ９６ウェルプレートに入れ、各複製物は１０μｌのサンプルを含有した。続いて、１５０μｌのPearce Reagentを標準物質に添加し、すべてのサンプルおよび混合物を穏やかに振盪しながら５分間インキュベートした。最後に、プレートを分光光度計（Molecular Devices）で６６０ｎｍで読み取った。サンプルのタンパク質濃度は、ＢＳＡ標準曲線からの傾きおよびy切片を使用して決定され、両方ともMicrosoft Excelを介して算出された。
【０２６５】
タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動
ポリアクリルアミドゲル（mini-PROTEAN（登録商標）TGX stain free（商標）ゲル、BIO-RAD）を電気泳動タンク（BIO-RAD、mini-PROTEANテトラシステム）に入れ、ランニングバッファー（２５ｍＭ トリス塩基、ｐＨ８．６、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）にゲルおよびタンクリザーバー（BioRad）を加えた。蒸留水および4×Laemmliサンプル緩衝液（最終濃度：６９．５ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１．１％ＬＤＳ、１１．１％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．００５％ブロモフェノールブルー、BIO-RAD）および２．５％メルカプトエタノール（BIO-RAD）と混合することによって、タンパク質試料を調製した。混合物を９５℃で５分間加熱した後、氷上で冷却した。サンプルおよび陽性対照をゲルに充填し、分子量マーカー（Precision Plus Protein（商標）Dual Xtra Standards、BIO-RAD）と共に３５ｍＶで９０分間電気泳動した。過熱を防ぐため、氷塊をランニングタンクの中に入れた。
【０２６６】
タンパク質サンプルのＰＶＤＦ膜への転写
スタッキングゲルを切り取り、分離したゲルをMini Transblot Cell（BIO-RAD）のPVDF移動膜（Thermo Scientific）に移した。簡単に説明すると、ＰＶＤＦ移動膜をメタノールで１分間浸漬し、次いで蒸留水で２分間浸漬することによって活性化した。その後、全ての層をトランスファーバッファー（２０ｍＭトリス塩基ｐＨ８．６、１５４ｍＭグリシン、０．８％ｗ／ｖ ＳＤＳおよび２０％メタノール）で飽和させた。トランスファーサンドイッチは、下から上の順に、トランスファースポンジ、ブロッティングペーパー、ゲル、ＰＶＤＦ移動膜、ブロッティングペーパー、トランスファースポンジで構成され、トランスファーカセットに配置され、トランスファーバッファーで満たされたMini Transblot Cellに挿入された。最後に、電気泳動転写を２００ｍＡで９０分間行った。過熱を防ぐため、氷塊を移送タンクの中に入れた。
【０２６７】
ＰＶＤＦ膜の染色
BLOT-Faststain（商標）（G-Biosciences、USA）を用いて、ローディングコントロールとして作用する全タンパク質を染色した。電気泳動転写の直後に、穏やかに振盪させながら、ＰＶＤＦ移動膜を希釈BLOT-Faststain（商標）固定溶液（１０倍）で２分間染色した。次いで、膜を、穏やかに振盪しながら、希釈BLOT-Faststain（商標）現像液（４倍）と共に１分間インキュベートした。続いて、膜を暗所で４℃で現像液中に３０分間保存して、タンパク質バンドが最大強度に達するようにした。最後に、膜を冷水で洗浄してバックグラウンド染色を除去し、Ｇボックス（Syngene）を用いて画像化した。次いで、膜を温脱イオン水（４０〜４５℃）を用いて脱色し、ブロッキング段階に備えることができる。
【０２６８】
タンパク質バンドの検出
ＰＶＤＦ移動膜を、５％スキムミルク粉末を含むＴＢＳ（ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水、２０ｍＭトリス塩基ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＮａＣｌ）中で１時間ブロックし、次にＴＴＢＳ（０．０５％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を補充したＴＢＳ）中でそれぞれ７分間２回洗浄した。膜を１％脱脂粉乳を含むＴＴＢＳで希釈した一次抗体で４℃で一晩インキュベートした。翌日、一次抗体を除去した。膜をＴＴＢＳ中でそれぞれ５分間３回洗浄し、次いで室温で１時間、二次抗体と共にインキュベートした。選択される二次抗体は、使用される一次抗体のタイプに依存する。それは、ＨＲＰに結合したヤギ抗マウス二次抗体を（a9309、Sigma、１％脱脂粉乳を含むＴＴＢＳで希釈したもの（作用濃度：１：１０００）またはＨＲＰ（ab6721、abcam）に結合したヤギ抗ウサギ二次抗体を１％脱脂粉乳を含むＴＴＢＳ（作用濃度：１：５０００）で希釈したものであり得る。二次抗体インキュベーション後、膜をＴＴＢＳ中で５分間３回洗浄した後、ＴＢＳ中で最後に１０分間洗浄した。Ｇ ｂｏｘ（Syngene）を用いてタンパク質バンドを検出した。
【０２６９】
【表２】
2019511701.tif 000065
【０２７０】
タンパク質バンドイメージングおよびデータ解析
ＰＶＤＦ膜をＧボックス（Syngene）に入れた。フォーカスとズームの設定は、膜が画面の中央で最大になるように調整された。Clarity（商標）Western ECL基質（BIO-Rad）からのルミノールおよび過酸化物溶液を等量混合し、膜にアプライした。１分間のインターバルで５分間暗所で撮像し、タンパク質バンドの最適なシグナルを得た。その後、膜は、分子ラダーの画像を得るために、自動設定を用いて白色光で露光された。次いで、ブロット画像を、画像Ｊを用いて分析した。各レーンのタンパク質バンドの周りに等しいサイズのＢｏｘを配置し、タンパク質バンド強度の測定を可能にした。その後、バックグラウンドをバンド強度から差し引き、結果をMicrosoft ExcelおよびGraphpadソフトウェアで分析した。
【０２７１】
再プローブのための抗体ストリッピング
ＰＶＤＦ移動膜からのタンパク質シグナルは、別のタンパク質についてストリップして再プローブすることができる。簡単に述べると、膜を穏やかなストリッピング緩衝液（２００ｍＭグリシン、３．５ｍＭ ＳＤＳ、１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ２．２）でそれぞれ１０分間２回洗浄した。続いて、膜をＰＢＳでそれぞれ１０分間２回洗浄し、次いでＴＴＢＳで５分間それぞれ２回洗浄した。Clarity（商標）Western ECL基質（BIO-Rad）を膜に添加し、Ｇ ｂｏｘ（Syngene）を用いて画像化し、残留タンパク質シグナルを調べた。残留信号が強すぎる場合は、全ストリッピング工程を繰り返した。その後、膜は、その後のブロッキング段階および一次抗体プロービングの準備が整った（上記参照）。
【０２７２】
Ｔ１４ペプチド抗体のＥＬＩＳＡ
標準曲線およびサンプルは三重反復で試験した。細胞培養培地および細胞溶解物サンプルをＰＢＳ緩衝液で１：１０に希釈した。脳組織サンプル中のＴ１４ペプチドの測定のための標準曲線をＰＢＳ緩衝液で希釈した。標準曲線はＴ１４の８〜１００ｎＭの範囲であり、ブランクはＰＢＳ緩衝液のみであった。簡潔には、９６ウェルイムノプレート（ＮＵＮＣ）を１００μｌ／ウェルのサンプルまたは標準Ｔ１４でコーティングし、パラフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートした。翌日、水を流しながらシンク上でプレートをフリックすることによってサンプルを除去し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むトリス緩衝化生理食塩水およびＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含むブロッキング溶液２００μｌを添加し、室温で４時間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液で１μｇ／ｍｌに希釈した１００μｌの抗体を添加し、４℃で一晩インキュベートした。次の日に一次抗体を除去し、ウェルを２００μｌのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ブロッキング溶液で０．１μｇ／ｍｌに希釈した二次酵素結合抗体１００μｌを加え、室温で２時間インキュベートした後、すべてのインキュベーションの間、プレートをパラフィルムで覆った。２時間後、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジンの添加により発色反応が開始した。２０分後、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を含む停止溶液で反応を停止させ、吸光度をＶｍａｘプレートリーダー（Molecular Devices、Wokingham、UK）で４５０ｎｍで測定した。
【０２７３】
実施例１
本発明者らは、ウエスタンブロッティングを用いて、７つの癌細胞株（ＭＥＣ−１、ＫＧ１ａ、Ｈ９２９、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＣＬＬ、ＪＪＮ３）および対照として作用する正常Ｂリンパ球の細胞溶解物および細胞培養培地における、毒性Ｔ１４ペプチド（AEFHRWSSYMVHWK−配列番号３）、ニコチン性アルファ−７受容体、およびアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）タンパク質のレベルを検出することに着手した。さらに、彼らはＥＬＩＳＡを用いてＴ１４ペプチドのレベルを検出した。
【０２７４】
ウエスタンブロッティングの結果
７種の異なる癌細胞株の細胞溶解物（ＣＬ）および対照としての正常Ｂリンパ球におけるＴ１４、ＡＣｈＥおよびアルファ７ニコチン性アセチルコリン受容体のレベルを検出するために、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）を行った。定性的データにより、Ｔ１４、ＡＣｈＥおよびα７受容体はすべての細胞株のＣＬにおいてすべて検出されたことが示された。驚くべきことに、３つのタンパク質はすべて実質的に同一の移動度を有する（図１Ａ、ＢおよびＣ参照）。本発明者らは、３種のタンパク質がヒト脳ホモジネートにおいて異なる移動度を示したので、これを抗体交差反応性であるとは考えない（データ示さず）。続いて、Ｔ１４、ＡＣｈＥおよびアルファ７受容体レベルを総タンパク質レベルに対して定量化および正規化した（Colins et al 2015）。
【０２７５】
定量的データにより、各細胞株内のＴ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥのレベルは、細胞Ｔ１４レベルが低いＭＣＦ−７系統を除いて同様であることが示された（図２参照）。しかしながら、Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥのレベルは細胞株間で可変であった（図２参照）。
【０２７６】
興味深いことに、細胞溶解物内で、Ｔ１４およびアルファ７受容体（図３Ａ参照）、アルファ７受容体およびＡＣｈＥ（図３Ｂ参照）、Ｔ１４およびＡＣｈＥレベル（図３Ｃ参照）のレベル間に有意な正の相関が見出された。これらの相関およびタンパク質バンドの同一の移動度は、Ｔ１４、ＡＣｈＥおよびα７受容体が１：１：１の比で癌細胞内にタンパク質複合体として存在することを示唆している。
【０２７７】
続いて、上記細胞株の癌細胞培養培地（ＣＣＭ）に放出されたＴ１４、おそらくはアルファ７受容体およびＡＣｈＥのレベルを検出するために、ウエスタンブロッティングを行った。定性的データは、細胞培養培地（図４参照）に放出されたＴ１４のみであるが、ＡＣｈＥは存在しないことを示した（図４参照）。細胞培養培地に放出された微量のアルファ７受容体があり（図４参照）、死滅した浮遊癌細胞に由来する可能性があることが示唆された。
【０２７８】
定量的データは、細胞培養培地に放出されたＴ１４が、ＭＥＣ−１、ＫＧ１ａ、正常Ｂリンパ球およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（図５参照）において、細胞Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥよりも大きいことを示した。しかし、細胞培養培地に放出されたＴ１４は、初代ＣＬＬ、ＪＪＮ３、Ｈ９２９、およびＭＣＦ−７細胞株において、Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥレベルと同様であった（図５参照）。
【０２７９】
続いて、細胞培養培地内のＴ１４レベルを、細胞溶解物内のＴ１４、ＡＣｈＥおよびアルファ７受容体レベルと相関させた。細胞培養培地中の放出されたＴ１４レベルと細胞溶解物中のアルファ７受容体レベルとの間に有意な逆相関が見られた（図６ａ参照）。本発明者らは、この効果は、アルツハイマー病患者の大脳皮質および脳脊髄液にも起こるため、これが一般的な病理学的メカニズムであり得ると考えている（データは示さず）。細胞培養培地中のＴ１４と細胞溶解物内のＴ１４レベルとの間には明らかな相関は見られなかったが、分析に４つの細胞株しか含まれていない場合には有意な逆相関があった（図６Ｂ、濃い灰色群参照）。さらに、細胞培養液中のＴ１４と細胞溶解物内のＡＣｈＥレベルとの間には、細胞集団を別々に分析しても明らかな相関は見られなかった（図６Ｃ参照）。
【０２８０】
ＥＬＩＳＡの結果
細胞溶解物および細胞培養培地中のＴ１４レベル
目的は、溶解細胞から回収された細胞内物質および細胞の増殖培地（ＣＣＭ）に放出されたＴ１４のレベルの両方において、カーディフ大学のクリス・ペッパー教授が親切に提供した様々な転移性傾向の癌細胞におけるＴ１４の内因性レベルを、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定することであった。この方法は、サンプル中のタンパク質１ｍｇあたりについての、μｇのＴ１４の測定値を提供するために、総タンパク質（ピアスアッセイ）からの結果を組み合わせて使用した。結果は、図７に示すように、細胞株間、および細胞株内の細胞溶解物と細胞培地との間のＴ１４レベルの高度の差異を示す。
【０２８１】
Ｔ１４は、ＭＤＡ−ＭＢ細胞株の細胞溶解物中で最高であったが、同じ細胞株は、細胞培地中で比較的低いレベルのＴ１４を示した。Ｔ１４のレベルは、ＭＣＦ−７細胞株において最高であることが示されたが、この細胞株はまた、細胞溶解物中のＴ１４の最低濃度の１つを有し、Ｔ１４はこの細胞株で高度に発現するが、細胞内よりも細胞の外に約５倍多く存在することを示唆している。ＪＪＮ３およびＫＧ１ａのみが、細胞内および細胞外レベルを比較すると有意に異なるレベルのＴ１４を有した。ＪＪＮ３では、ＭＤＡ−ＭＢ細胞株と同じプロファイルが見られ、Ｔ１４の細胞外レベルは細胞内レベルよりも有意に高い。ＫＧ１ａ細胞株は、培地と比較した場合、細胞溶解物中のＴ１４の有意により高いレベルを実証する唯一の細胞株である。ＣＬＬ細胞株の培地中のＴ１４は、このアッセイの検出限界以下であった。
【０２８２】
癌細胞株ＥＬＩＳＡ  Ｔ１４データとＷＢ癌細胞株データとの比較
ＥＬＩＳＡから得られた結果およびウエスタンブロットから回収した結果を用いて、本発明者らは、細胞溶解物および細胞培地の両方において、Ｔ１４／ｍｇタンパク質のμｇおよびＴ１４／総タンパク質のμｇを比較した。図８に見られるように、細胞培地および細胞溶解物中で測定されたＷＢ Ｔ１４とＥＬＩＳＡ Ｔ１４レベルとの間に有意な逆相関が見られた。
【０２８３】
細胞培地および細胞溶解物の両方は、線形回帰分析を行った後、ＷＢおよびＥＬＩＳＡによって測定したＴ１４のレベル間の逆相関を示し（それぞれＰ＜０．０００１、Ｒ２＝０．４９５６およびＰ＝０．０３１５、Ｒ２＝０．１４５１）、９５％の信頼区間（点線）と共に最善適合の線（実線）を表示する。
【０２８４】
概要
１）癌細胞内では、Ｔ１４、アルファ７受容体およびＡＣｈＥは、様々な量ではあるが、すべて検出された。驚くべきことに、３つのタンパク質はすべて同様の移動性を有し、それらのレベルは互いに正の相関があり、それらが互いに複合体化していることが示唆される。
【０２８５】
２）癌細胞の外側（すなわち、細胞培養培地内）では、毒性Ｔ１４ペプチドのみが検出されたが、ＡＣｈＥおよびアルファ７は外部培地に放出されなかった。さらに、Ｔ１４レベルは、７つの癌細胞株のうち６つについて、細胞内よりも細胞外が高値であり、Ｔ１４が細胞から放出されるように産生されることを示唆している。さらに、細胞外のＴ１４の移動度は、細胞内のそれと比較して異なっていた。
【０２８６】
３）興味深いことに、癌細胞外のＴ１４のレベルは、癌細胞内のアルファ７受容体レベルと有意に負の相関があった。本発明者らは、これが、Ｔ１４とアルファ７との間に正の相関が存在するアルツハイマー病患者（対照患者ではない）の大脳皮質および座骨髄のホモジネートの場合も同様であるので、これが一般的な疾患メカニズムの基礎をなす可能性があると仮定する。本発明者らは、これが、罹患個体においてその標的レセプターを下方制御する、高濃度のＴ１４ペプチドに起因すると考えている。
【０２８７】
４）癌細胞の内部および外部のＴ１４レベルもＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡによって測定された癌細胞培地および細胞溶解物中のＴ１４レベルは、ウエスタンブロットのものと有意に逆相関した。これは、ＥＬＩＳＡがＴ１４単量体を測定しているのに対して、ウエスタンブロットはＴ１４凝集レベルを測定していることを示唆しているので、レベルは相補的である。
【０２８８】
実施例２
この実施例の目的は、６つの癌細胞株（ＪＪＮ３、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ−７、ＫＧ１ａ、ＭＥＣ−１、Ｈ９２９）および１つの癌由来細胞株（ＰＣ１２）の膜およびサイトゾル画分における転移性マーカーＣＤ４４と毒性Ｔ１４ペプチド（ＡＣｈＥ）およびアルファ７受容体との関係をウエスタンブロッティングを用いて調べることであった。
【０２８９】
ウエスタンブロッティングの結果
定性的データは、すべての細胞株の膜画分において、ＣＤ４４、ＡＣｈＥおよびＴ１４は全て同様の移動度を有するが（図９Ａ、Ｃ、Ｅに示されるように）、アルファ７は異なるタンパク質移動度を示したことを示した（図９Ｇ参照）。すべての細胞株（図９Ｂ、Ｄ、Ｆ参照）のサイトゾル部分にＣＤ４４、ＡＣｈＥおよびＴ１４の同じ関係が見られ、アルファ７も再び例外であった（図９Ｈ参照）。
【０２９０】
その後、全タンパク質レベルに対して４つのペプチド／タンパク質レベル（ＣＤ４４、ＡＣｈＥ、アルファ７およびＴ１４）のすべてを定量化し、正規化した（Colins et al 2015）。定量的データは、強転移性癌細胞株（ＫＧ１ａ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＥＣ−１）が、それらの膜において、サイトゾルに比べてより多くのペプチドタンパク質を有することを示し、一方、弱転移性癌細胞株／癌由来細胞株（ＪＪＮ３、Ｈ９２９、ＭＣＦ−７およびＰＣ１２）は、膜とサイトゾルペプチド／タンパク質との間の可変の関係を示した（図１０参照）。
【０２９１】
最も重要なことに、転移性マーカーＣＤ４４のレベルは、膜（図１１Ａ参照）およびサイトゾル画分（図１１Ｂ参照）の両方におけるＡＣｈＥ、ならびに膜（図１１Ｃ）およびサイトゾル画分（図１１Ｄ）の両方におけるＴ１４と有意かつ正に相関する。さらに、ＡＣｈＥおよびＴ１４レベルは、膜（図１１Ｅ）およびサイトゾル画分（図１１Ｆ）の両方において、互いに有意かつ正に相関している。この知見は、ＡＣｈＥおよびＴ１４が、癌転移の程度の良好な予測因子であり、おそらく中心的な分子仲介因子であることを強く示唆している。したがって、ＡＣｈＥおよびＴ１４のシグナル伝達作用をブロックすることは、抗癌治療薬として利用することができる。
【０２９２】
概要
１）６つの癌細胞株およびＰＣ１２細胞において、転移性マーカー（ＣＤ４４）は、ＡＣｈＥと同様に、毒性分子Ｔ１４と有意かつ正の相関がある。
【０２９３】
２）この相関は、癌細胞膜内および癌細胞のサイトゾル内の両方に当てはまる。
【０２９４】
３）この知見は、Ｔ１４およびＡＣｈＥが癌転移の程度の良好な予測因子であり、おそらく中心的な分子仲介因子であることを強く示唆している。
【０２９５】
実施例３−Ｔ１４  ＥＬＩＳＡ−ＣＬＬコホート
癌転移における所与のＴ１４の明確な役割を考えると、本発明者らは、ＥＬＩＳＡを用いて、癌バイオマーカーとしてのＴ１４の可能性と患者の生存率との関係を探究した。
【０２９６】
材料と方法
Ｔ１４抗体：抗体は、Genosphere Biotechnologies（Paris、France）によって合成された。２匹のニュージーランドウサギを、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）−ペプチド（Ｔ１４−ハプテン：CAEFHRWSSYMVHWK（配列番号７）の４回の免疫化と共に使用し；７０日間にわたってＣは免疫原としてＫＬＨに連結するために含まれた）。動物を４回出血させ、出血をプールした。次いで、抗血清を、共有結合したペプチド−支持体を有する重力カラムに通し、洗浄後、抗体を酸性緩衝液中で溶出させ、溶液を中和した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液に対するさらなる透析および凍結乾燥により、このプロセスが完了した。
【０２９７】
Ｔ１４ペプチド抗体のＥＬＩＳＡ：標準曲線およびサンプルは三重反復で試験した。ヒト血清サンプルを１：１０，０００に希釈し、サンプル中の相対的なＴ１４含有量を決定するための標準曲線をＰＢＳ緩衝液で希釈した。標準曲線は、３．３〜４０ｎＭのＴ１４の範囲であった。簡潔には、９６ウェルイムノプレート（ＮＵＮＣ）を１００μｌ／ウェルのサンプルまたは標準Ｔ１４でコーティングし、パラフィルムで覆い、４℃で一晩インキュベートした。翌日、水を流しながらシンク上でプレートをフリックすることによってサンプルを除去し、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水およびＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含む２００ｍｌのブロッキング溶液を添加し、室温で４時間インキュベートした。次いで、ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液で１μｇ／ｍｌに希釈した１００μｌの抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。次の日に一次抗体を除去し、ウェルを２００μｌのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ブロッキング溶液で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した二次酵素コンジュゲート抗体１００ｍｌを添加し、室温で２時間インキュベートした後、すべてのインキュベーションの間、プレートをパラフィルムで覆った。２時間後、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。３，３，５，５−テトラメチルベンジジンの添加により発色反応が開始した。３０分後、２ＭＨ２ＳＯ４を含む停止溶液で反応を停止させ、Versamaxプレートリーダー（Molecular Devices、Wokingham、UK）で４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２９８】
分析：アッセイの結果を光学濃度（ＯＤ）の任意の単位で記録する。ブランクのＯＤを、分析前に各サンプルのシグナルから差し引いた。アッセイにおける各サンプルのＯＤを、標準曲線におけるＴ１４の最も低い既知濃度のベースラインと比較した。次いで、光学濃度を既知の信号に関連して表すことができ、この信号の割合として記録することができる。現在の方法では、ヒトの血液サンプルでは標準曲線から直接読み取ることができないため、すべてのサンプルをＴ１４の相対レベルで比較した。「高」、「中−高」、「中−低」および「低」のグループへのサンプルのグループ分けは、コホート全体の平均値からの相対値の距離によって定義される。値が正常に分布しているので、平均の１標準偏差内のすべての値は中程度の範囲にあり、平均より高い場合は「中−高」であり、平均よりも低い場合は「中−低」である。「低い」Ｔ１４値は、平均の標準偏差を下回る、およびそれを超える値である。逆に「高い」とは、平均値の標準偏差を上回る、またそれを超える値である。
【０２９９】
結果と考察
図２３を参照すると、既知の濃度の外因性Ｔ１４に対するＥＬＩＳＡによって測定されたＴ１４のレベルの範囲の棒グラフが示されている。患者は、検査されたＣＬＬ患者コホートにおける相対的なＴ１４濃度によって順位が付けられている。
【０３００】
図２４を参照すると、試験したＣＬＬ患者コホートにおける既知の濃度の外因性Ｔ１４および統計的グループ化と比較した、ＥＬＩＳＡによって測定されたＴ１４の値の表が示されている。
【０３０１】
図２５を参照すると、１００のＣＬＬ血清サンプルに対して行ったＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ推定を用いて統計的に分析した相対Ｔ１４濃度で割った２つの異なる群のＥＬＩＳＡ値が示されている。
【０３０２】
図２６を参照すると、１００のＣＬＬ血清サンプルに対して行ったＫａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ推定を用いて統計的に分析した相対Ｔ１４濃度で割った４つの異なる群のＥＬＩＳＡ値が示されている。
【０３０３】
実施例４−癌試料（ＣＬＬコホート）に関するウエスタンブロットデータ
癌転移におけるＴ１４の役割を考えると、本発明者らは、ウエスタンブロッティングを用いて、癌バイオマーカーとしてのＴ１４の可能性と患者の生存率との関係を探究した。
【０３０４】
材料および方法
サンプル：全部で１００人のＣＬＬ患者が、治療前に血清を採取し、その後１６年間治療およびモニタリングした。
【０３０５】
ウエスタンブロッティング：Pierce（商標）660 nm Protein Assay（Thermo Scientific、22660）を使用して、上記の血清サンプルでタンパク質濃度を測定した。続いて、以前に確立された方法を用いてサンプルについてウエスタンブロット分析を行った（Garcia Rates et al 2016 - Garcia-Rates, S., Morrill, P., Tu, H., Pottiez, G., Badin, A., Tormo-Garcia, C., Heffner, C., Coen, C. and Greenfield, S. (2016) ‘(I) pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains’, Neuropharmacology. doi: 10.1016/j.neuropharm.2016.02.006.）。使用した一次抗体は抗Ｔ１４抗体（１：１０００）であった[Garcia Rates et al 2016]。使用した二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体であった（Abcam, ab6721, 1:5000）。細胞溶解物由来のタンパク質バンドを、全光学強度を測定するImage Jを用いて定量し、続いて、ローディングエラーを制御するためにBlot FastStainを用いて全タンパク質レベルに正規化した。
【０３０６】
データ解析：Ｔ１４ ５０ＫＤａ／ＴＰ値を低から高にランク付けし、中央値を計算した。その後、値を中央値より下の値を含む明るい灰色のグループと中央値より上の値を含む暗い灰色のグループとに２つのグループに分けた（図２８）。最後にKaplan Meier推定を上記の２つのグループについて実施した。分析は、一定期間（ＴＴＦＴ：最初の治療までの時間）にわたってその治療後に生存または保存された対象の数に対する治療の効果を評価することができる。生存曲線は、ある時点での事象の発生の確率を計算し、これらの連続する確率に任意の初期の計算された確率を掛けて最終的な推定を得ることによって計算される。
【０３０７】
結果
図２７を参照すると、ＷＢによって検出された白血病患者からの１００の血清試料からの全タンパク質に対して正規化されたＴ１４ ５０ＫＤａの生値、中央値の下および上の分離された群を有する表が示されている。
【０３０８】
図２８を参照すると、２つの群について実施されたKaplan Meier推定は、このコホートにおいて高い予後の有意性を示した。中央値（薄灰色群）よりも低い血清Ｔ１４ ５０ＫＤａ／ＴＰ値を有する患者は、ハザード比によって示されるように、血清Ｔ１４／ＴＰ値が中央値（暗灰色群）より高い患者よりも単位時間で治療を必要とする可能性が２．３７倍高い（ＨＲ＝２．３７、Ｐ＝０．０１、図４２）。さらに、この生存分析は、Ｔ１４ ５０ＫＤａ／ＴＰ値が叙述的ＴＴＦＴであることを示した。推定された中央生存期間は、低リスク群では達成されず、高リスク群では８．０５年に達した。
【０３０９】
討論
本発明者らは、Ｔ１４が癌のメカニズムに関与し、良好な癌バイオマーカーであることを以前に示した。したがって、Ｔ１４は、従来の予後診断ツールと共に、患者の生存および最初の治療までの時間を予測することができる。
【０３１０】
結論
結論として、ウエスタンブロットは、白血病の状態を検出するための驚くほど信頼できる方法である。現時点では、ＥＬＩＳＡデータは現在、臨床的適応症として信頼性をもって使用されていないかもしれないが、それにもかかわらず、細胞移動を媒介する根本的なメカニズムを示す可能性がある。
【０３１１】
実施例５−ペプチド模倣体Ｔ１４阻害剤の設計および製造
本発明者らは、Ｔ１４活性を阻害するペプチド模倣化合物を設計し、合成し、それによりＴ３０をニコチン性受容体のアロステリック活性部位と競合させた。
【０３１２】
化合物１−Ｔｒｉ０２（スコア：−１０．２）
【０３１３】
【化６２】
2019511701.tif 000066
【０３１４】
化合物２−Ｔｒｉ０４（スコア：−９．４）
【０３１５】
【化６３】
2019511701.tif 000067
【０３１６】
実施例６−同定された化合物の合成
材料および方法
実施例５のＴ１４阻害剤化合物１および２（Ｔｒｉ０２およびＴｒｉ０４）は、Genosphere Biotechnologiesによって合成され、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて純度について（＞９９％純度）および質量分析によって質量について分析した（Ｔｒｉ０２については平均ＭＳ６０４．７９、Ｔｒｉ０４については６２８．８３）。
【０３１７】
ＴＲＩ０２の合成の簡単な段階的記述−配列：［アセチル］−［２Ｎａｌ］［４ｎｈ２−Ｆ］−Ｔｒｐ−［アミド］
１）Boc-Trp-OH+ClooEt+NH3.H2O------Boc-Trp-NH2、THF中で反応させ、酢酸エチルで抽出する。
【０３１８】
２）Boc-Trp-NH2,4NHcl、Boc-を除去し、H-Trp-NH2.Hclを得、ジエチルエーテルによる沈殿反応。
【０３１９】
３）（2-ナフチル）-Ala+酢酸無水物----Ac-(2-Naphtyl)-Ala-OH、反応THF/H2O、酢酸エーテルで抽出した。
【０３２０】
４）Boc-(4-NH2)-Phe-OH+H-Trp-NH2.Hcl-Boc-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2、DMF中で反応させ、酢酸エーテルで抽出した。
【０３２１】
５）Boc-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2,4NHclを除去し、Boc-を除去し、H-(4-NH2)-Phe-Trp-NH2.Hclを得、ジエチルエーテルによる沈殿反応。
【０３２２】
６）DMF中のAc-（2-ナフチル）-Ala-OH+H-（4-NH2）-Phe-Trp-NH2・HCl-Ac2-ナフチル）-Ala-（4-NH2）-Phe-Trp-NH2反応、酢酸エチルで抽出した。
【０３２３】
７）精製
ＴＲＩ０４の合成の簡単な段階的記述−配列：［アセチル］−［ｂｐａ］Ｒ［４ＮＨ２−Ｆ］−［アミド］
１）Rink Amide MBHA.Resin DCMに30分間浸漬し、ポンプで乾燥させ、ＤＭＦで３回洗浄し、ポンプで乾燥させる。
【０３２４】
２）Fmoc-（4-NH2）Phe-OH、DIEA、HBTU、DMF、N2を反応に30分間添加し、ポンプで乾燥させ、DMFで6回洗浄し、ポンプで乾燥させる。
【０３２５】
３）ピペリジン/DMFを加えてFmoc-を除去し、20分間反応させ、ポンプで乾燥させ、DMFで3回洗浄し、ポンプで乾燥させる。
【０３２６】
４）Fmoc-Arg（Pbf）-OH、DIEA、HBTU、DMF、N2を30分間反応させ、ポンプで乾燥させ、DMFで6回洗浄し、ポンプで乾燥させる。
【０３２７】
５）手順3を繰り返す。
【０３２８】
６）Fmoc-Bpa-OH、DIEA、HBTU、DMF、N2を反応に30分間添加し、ポンプで乾燥させ、DMFで6回洗浄し、ポンプで乾燥させる。
【０３２９】
７）手順3を繰り返す。
【０３３０】
８）酢酸無水物を加え、/DMF、N2を30分間反応させ、ポンプで乾燥させ、DMFで3回洗浄し、ポンプで乾燥させ、DCMで3回洗浄し、ポンプで乾燥させ、MeOHで3回洗浄し、ポンプで乾燥させる。
【０３３１】
９）ペプチドを樹脂から切断し、ポンプで乾燥し、ジエチルエーテルで沈殿反応させ、粗ペプチドを得、遠心乾燥する。
【０３３２】
１０）精製
実施例７−Ｔ３０対Ｔ１４：
図４３を参照すると、本発明者らの最初の研究は１４ｍｅｒ Ｔ１４を用いて実施され、様々な調製物において栄養毒性であることが判明した。ＡＣｈＥペプチドの活性配列は、ＡＣｈＥ（Ｔ１４）のＣ末端尾部に由来する特定の１４アミノ酸配列に起因し得（Greenfield, 2013 -Greenfield, S.A. (2013) ‘Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the c-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the c-terminal and their relevance to neurodegeneration’, Chemico-biological interactions. 203(3), pp. 543-6. doi: 10.1016/j.cbi.2013.03.015）、一方、研究中の外因性AChEペプチド処理は、より最近になって、活性T14モチーフを含む30アミノ酸ペプチド（T30）を含む：より大きいT30は溶液中でフィブリルを形成しにくく、それによりT14よりも高い安定性およびより高い有効性を有する（Bond et al., 2009Bond, C., Zimmermann, M. and Greenfield, S. (2009) ‘Upregulation of alpha7 Nicotinic receptors by Acetylcholinesterase c-terminal peptides’, PloS one., 4(3). doi: 0.1371/journal.pone.0004846）。
【０３３３】
したがって、T30ペプチドは、この研究を通じて使用された（Badin, A.S., Morrill, P., Devonshire, I., Greenfield, S.A., 2016 Jan 7. (II) Physiological profiling of an endogenous acetylcholinesterase-derived peptide in the basal forebrain: age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47e60）。Ｔ３０のＣ末端の１５個のアミノ酸残基、「Ｔ１５」は、それ自体は不活性であることが証明され、したがってＴ１４の生物活性に寄与しないので対照として使用されている。さらに、Ｔ１４自体の有効性は、より長いＴ３０配列内に露出しないであろうＣ末端上の末端リジンに抗体が結合する必要があることが示されている。したがって、Ｔ３０は、外因性ペプチドまたはその内因性対応物の効果を探索するのに有用である。
【０３３４】
要約すると、Ｔ３０は、栄養毒性効果の探索、不活性制御の提供、および外因性（Ｔ３０）ペプチドプローブとの交差汚染なしに抗体が内因性Ｔ１４を検出することを可能にする便利な実験的ツールである。したがって、Ｔ３０活性が阻害されていることを示す任意のデータは、Ｔ１４活性も阻害されることを示す。
【０３３５】
実施例８−細胞培養における化合物１（Ｔｒｉ０２）および化合物３（Ｔｒｉ０４）の評価
本発明者らは、アセチルコリンエステラーゼ活性およびカルシウム流入への影響、およびカルシウム流入に対するＴｒｉ０４の効果を決定するために、細胞培養研究においてＴ３０、ＮＢＰ−１４およびＴｒｉ０２を試験した。
【０３３６】
材料および方法
１．ＡＣｈＥ活性アッセイ
ＡＣｈＥ活性は、ＡＣｈＥ活性の結果としてチオール基の存在を測定するＥｌｌｍａｎ試薬を用いて測定した。Ｇ４実験の場合、ＡＣｈＥ（Ｇ４）活性は単独で、またＮＢＰ１４またはＴｒｉペプチドのいずれかとともに試験した。ＰＣ１２細胞を、細胞生存アッセイのために実験の前日にプレートした。細胞をＴ３０（１μＭ）単独で、またはＮＢＰ１４またはＴｒｉペプチド（０．５μＭ）と組み合わせて処理した。処理後、各処理の上清（灌流液）を回収し、各条件から２５μＬを新しい平底９６ウェルプレートに加え、続いて１７５μｌのＥｌｌｍａｎ試薬を加えた（溶液Ａ：ＫＨ２Ｐ４ １３９ｍＭおよびＫ２ＨＰＯ４ ７９．６６ｍＭ、ｐＨ７．０；溶液Ｂ（基質）：アセチルチオコリンヨージド１１．５ｍＭ；溶液Ｃ（試薬）：５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）８ｍＭおよびＮａＨＣＯ３ １５ｍＭ。Ellman試薬は、３３（Ａ）：３（Ｂ）：４（Ｃ）の比で３つの溶液の混合物として調製した。吸光度測定は、Ｖｍａｘプレートリーダー（Molecular devices、Wokingham、UK）中、４０５ｎｍでの実験に亘って６０分間の間隔で行った。
【０３３７】
２．カルシウム蛍光定量法
９６ウェルプレート中の実験の前日に、ＰＣ１２細胞を２００μｌのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン培地に播種した。実験の日に、Ｆｌｕｏ−８溶液（Abcam）を、９ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）および１ｍｌのプルロニックＦ１２７プラスを含むアッセイ緩衝液に２０μｌのＦｌｕｏ−８を添加することにより、プロバイダーにより記載されているように調製した。続いて、１００μｌの増殖培地を除去し、１００μｌのＦｌｕｏ−８溶液を添加した。Ｔ３０を用いたＮＢＰ１４またはＴｒｉペプチドとの処理を加え、インキュベーター内で３０分間、室温で３０分間インキュベートした。１時間後、プレートを蛍光プレートリーダー（Fluostar, Optima, BMG Labtech, Ortenberg, Germany）に置いた。蛍光を読み取る前に、ニコチンレセプターのアルファ7特異的アゴニストであるPNU2829871μMを調製し、Fluostarインジェクターに入れた。各ウェルについて、ニコチン性受容体を介してカルシウムの増加を誘導するPNU282987注射が続く基礎蛍光の読み取りによってリーディングが形成された。
【０３３８】
３．データ分析
異なる細胞技術のそれぞれにおいて、統計解析は、３回以上の実験の百分率値の平均を用いて行った。GraphPAD Instat（GraphPADソフトウェア、San Diego、CA）を用いて、一元配置分散分析（ANOVA）およびTukeyの事後検定により、複数の治療群と同じ対照間の比較を行った。統計的有意性はp値＜0.05で得られた。
【０３３９】
結果
Ｔｒｉ０２の結果を図１２および図１３に示し、後のグラフに示されるｎ値は反復実験の回数を示す。見られるように、１μＭのＴ３０は、カルシウム流入およびＡＣｈＥ活性を増加させ、そして先の研究（WO 2005/004430参照）に示されるように、１μＭのＮＢＰ１４は、これらの毒性作用に対して保護する。
【０３４０】
さらに、図からわかるように、Ｔｒｉ０２は、カルシウム流入およびＡＣｈＥ活性の両方を低下させることによって、Ｔ３０の毒性作用に対しても明らかに保護する。したがって、本発明者らは、Ｔｒｉ０２がＴ１４活性阻害剤として作用し、癌または転移を治療するために使用できると確信している。
【０３４１】
ＰＣ１２細胞培養におけるＴｒｉ０４の結果を図１９に示す。この細胞は、副腎の腫瘍に由来し、ニューロンとして働くPC12細胞株由来であった（Bornstein et al., Mol. Psychiatry (2012), 17, 354-358）。見られるように、Ｔｒｉ０４はまた、これらの細胞におけるカルシウム流入を減少させることによってＴ３０の毒性効果を保護し、Ｔ１４阻害剤として作用し、したがって癌または転移の治療に使用できることを示している。
【０３４２】
実施例９−脳切片における化合物１の評価
本発明者らは、電圧感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いた脳切片研究において、ＮＢＰ−１４およびＴｒｉ０２を試験した。
【０３４３】
材料と方法
１．脳切片調製
雄Wistarラット（１４日齢）をイソフルラン（約１５ｍｌ、１００％ｗ／ｗ）を用いて麻酔した。完全麻酔に達するまでラットを約４５秒間置いた麻酔室（ガラス箱２０×１５×１５ｃｍ）の底にある綿床にイソフルランを塗布した。適切な麻酔深度を確認するために、各麻酔ラットの後肢を挟んだ。麻酔が確認されるとすぐに、脳を素早く切除し、氷冷した酸素添加した「スライシング」人工脳脊髄液（mmolでのaCFS：120NaCl、5KCl、20NaHCO3、2.4 CaCl2 2MgSO4、1.2 KH2PO4、10グルコース、6.7HEPES塩および3.3HEPES酸;pH=7.1）に浸した。次いで、基底前脳、すなわちＭＳ−ｄＢＢ複合体（＋９．２０〜＋９．４８ｍｍの両耳間および＋０．４８および＋０．２ｍｍのブレグマ、図４Ａ）および体液感受性胴部皮質（Ｓ１ＢＦ、＋８．０８〜＋７．２０ｍｍ両耳間および−０．９２ｍｍおよび−１．８０ｍｍブレグマ）を含む脳ブロックから冠状切片（厚さ４００μｍ）（Paxinos and Watson、1998）を、Vibratome（Leica VT1000S）を用いて、採取した。次いで切片を、VSDI（電圧感受性色素像形成）記録に使用されたものと同一の室温（aCSFをmmol：124NaCl、5KCl、20NaHCO3、2.4 CaCl2 2MgSO4、1.3 KH2PO4、１０グルコースで記録；ｐＨ＝７．４）で酸素添加ａＣＳＦを含有するバブラーポットに移した。次いで、切片を約１〜１．５時間放置してから、それらをＶＳＤ染色のために調製した。
【０３４４】
２．ＶＳＤセットアップ
切片を、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２で泡立てたＣＳＦで満たした暗く高湿度のチャンバーに入れた。色素溶液（４％ ０．２ｍＭスチリル色素ピリジニウム４−［２−（６−（ジブチルアミノ）−２−ナフタレニル］−エテニル］−１−（３−スルホプロピル）水酸化物（Di-4-NEPPS）Invitrogen、Paisley、ＵＫ、４８％ａＣＳＦ、４８％ウシ胎児血清、３．５％ＤＭＳＯおよび０．４％クレモフォアＥＬ中）(Tominaga et al., 2000)を切片に２０〜２５分間適用した後、酸素化ａＣＳＦを含有するバブラーポットに室温で３０分間保持して戻した。
【０３４５】
ＶＳＤＩ記録を開始するとき、薄切りの濾紙上の記録浴に切片を入れて切片の下側に酸素含有ａＣＳＦを流し、それを生きたままにした。次いで、切片は、切片の上に置かれた自家製のプラスチックグリッドによって秤量された。灌流浴溶液をステージヒーターにより３０±１℃に加熱した。同心バイポーラ刺激電極（ＦＨＣ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）を刺激を３０Ｖに設定して基底前脳の腹側対角線帯に配置した。ＶＳＤデータの取得のために、BV_Analyzeイメージングソフトウェアを備えたＭｉＣａｍ０２高解像度カメラ（Brain Vision、Japan）を用いて、８８×６０画素に相当する２次元画像を記録した。Micro 1401 MkIIを介して画像捕捉を刺激プロトコール（３０秒反復で２８秒ごと）に合わせるために、画像の取得をSpike2 V4.23ソフトウェア（CED Ltd, Cambridge, UK）に結合して、画像キャプチャを整列させた。オスラムハロゲンキセノフォート64634 HLX EFRディスプレイ/オプティクスランプを用いて光を発生させ、MiCam02高解像度イメージングシステムに結合したMHF-G150LR（Moritex Corporation）を用いて緑色（530±10nm）光を放出させ、590nm以上のハイパスフィルタを通した。
【０３４６】
３．薬剤の調製と応用
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）Ｃ末端３０アミノ酸ペプチド（Ｔ３０；配列：「Ｎ」−KAEFHRWSSYMVHWKNQFDHYSKQDRCSDL -配列番号２）、Ｔ３０の活性型１４アミノ酸領域の環状バージョン（ＮＢＰ１４；配列：C[AEFHRWSSYMVHWK]−配列番号３；ｃ［］＝サイクリックＮ末端からＣ末端）、Ｔ３０配列内に含まれる不活性１５アミノ酸ペプチド（Ｔ１５；配列：N−NQFDHYSKQDRCSDL−配列番号４）は、Genosphere Biotechnologies（Paris、France）から純度９９％以上でカスタム合成し購入した。線状ペプチド模倣体Ｔｒｉ０２は、Iproteos（Barcelona、Spain）によってin silicoで設計され、９９％以上の純度でGenosphere Biotechnologiesから合成および購入された。すべての薬物およびペプチドストックを実験前に凍結アリコート中で調製した。灌流溶液の製造のために、ストック溶液を解凍し、必要に応じてａＣＳＦを記録するために添加し、Minipulse 3蠕動ポンプ（Gilson Scientific Ltd.、Bedfordshire、UK）を用いて１．５ｍｌ／分の灌流の一定速度で浴を適用した。実験の各試験は、ベースライン記録（ａＣＳＦのみを記録した灌流）を確立するために２０分間、薬物溶液を浴に灌流させるだけでなく、色素分子を細胞膜に再付着させるために１２分、および最後に、薬物溶液の存在下での応答を測定する２０分間の記録期間で、５２分間続いた。
【０３４７】
４．データ分析と統計
各薬剤状態で生成された2次元画像から、蛍光シグナル全体の活性化、強度および拡散の時間経過などの重要なデータを抽出した。これらのデータはカスタムスクリプトを使用して処理され、使用可能なMatLab（Mathworks Inc. Massachusetts, US）のファイルに変換され、ＶＳＤＩデータ解析用に特別に作成されたMatlabツールボックスを使用して解析された（Bourgeois et al., 2014）。このツールボックスを使用すると、各切片に適用できる固定された関心領域（ＲＯＩ）ジオメトリを選択し、各実験で使用されるすべての切片にわたって同じＲＯＩからデータを抽出および照合することができる。基底前脳切片の場合、使用されるＲＯＩは、ＭＳ（内側中隔核）、ＶＤＢ（腹側対角線バンド）およびＨＤＢ（水平対角線バンド）を包含するように選択されるＭＳｄＢＢ複合体である。より重要なことに、このＲＯＩは誘発された反応の全体を含めるために選択された。この応答は、データの定性的な記述を提供するために、「時空間マップ」内の単一の平均化された時系列として、または空間および時間にわたってプロットすることができる。しかし、定量化可能な値を生成するために、刺激の時点（ｔ＝０）とその後の１５６ｍｓとの間で、時系列の下の領域が計算された（蛍光の分数変化の合計）。個々の切片間で見られる応答のばらつきのために、各実験から生成された生データを、それ自身のベースラインに関して正規化して、正規化蛍光値を得た。この定量方法は、VSDI（Chemla and Chavane、2010）によって生成されたシグナルの複数の成分、すなわち即時ピークと長い潜伏反応（Badin et al., 2016）を説明するために選択された。統計はPrism Graphpad 6で行った。
【０３４８】
５．調節ペプチドの分析
Ｔ３０を使用した実験を通して、シグナルの増加または減少が観察された。従って、これらの結果を平均すると、変化は検出されなかった。しかしながら、種々の調製物におけるこのペプチドの過去に観察された調節効果と(Bon and Greenfield, 2003, Day and Greenfield, 2004, Greenfield et al., 2004, Badin et al., 2013)、このタイプの調製物におけるＴ３０の適用によって誘導される変化がベースライン応答振幅と適度に負の相関を有する（r=-0.4286、p=0.0257、スピアマン順位相関、ｎ＝２７、図１３Ａ）という事実を考慮すると、これらの結果は、増減が見られるかどうかによって二分されるべきであると決定された。
【０３４９】
続いて、外因性化合物を添加した各実験について同様の相関分析を行った（図１６）。有意な相関が判定されると、それが増減したかどうかでデータを分類した。
【０３５０】
結果
図１４および１５を参照すると、４μＭのＴｒｉ０２を添加すると、４μＭのＮＢＰ１４の適用で見られる結果が再現される。
【０３５１】
図１４を参照すると、ＮＢＰ１４（４μＭ）を灌流液に添加すると、誘発された応答の大きさ（合計蛍光）に対する小さな、有意でない変化が誘発された。有意ではないが、これらの小さな誘発変化はベースライン応答の大きさと逆相関していることが判明した。その結果、データは実数（上）と正規化（下）のデータ形式の両方でわずかな減少（左のヒストグラム）と増加（右のヒストグラム）を引き起こした試行に分割された。一緒に考えると、データセットはベースラインからの変化を示さず（増減が相殺するので）、蛍光変化を別々に考慮したとしてもＮＢＰ１４によって有意な効果が誘導されなかったことを確認することが重要であった。
【０３５２】
図１５に示すように、灌流液にＴｒｉ０２（４μＭ）を添加すると、誘発された応答の大きさ（合計蛍光）がわずかに変化し、誘導下の減少（ｎ＝８／１１合計）は、基準化されたベースラインレベルからの有意な逸脱を示した（左下のヒストグラム、ｐ＜０．０５）。これらの変化はまた、ベースライン応答の大きさと逆相関することが見出された。その結果、データは実際の（上の）データ形式と標準化された（下の）データ形式の両方で減少（左のヒストグラム）および増加（右のヒストグラム）を引き起こした試行に分割された。一緒に考えると、データセットはベースラインからの変化を示さず（増減が相殺するので）、蛍光変化を別々に考慮したとしてもＮＢＰ１４によって有意な効果が誘導されなかったことを確認することが重要であった。
【０３５３】
調節性ペプチド模倣物の分析
図１６を参照すると、Ｔｒｉ０２（４μＭ）およびＴ３０（２ｕＭ）データ（ｎ＝１５）の相関分析が示されており、これらの同時灌流が誘発反応の大きさの変化を誘発することを示しており、いくつかの切片は活性のわずかな増加（ｎ＝６）を特徴とし、ほとんどがわずかな減少（ｎ＝９）を示した。この相関は有意であり（ｐ＝０．０４０５；ｒ２＝−０．５３４）、ＮＢＰ１４およびＴｒｉ０２の添加のために行われたのと同様にＴｒｉ０２およびＴ３０適用の結果として誘発された活性の増加および減少を示したデータにデータを分割することを正当化した（それぞれ図１４および図１５）。
【０３５４】
図１７を参照すると、Ｔｒｉ０２およびＴ３０の添加によって媒介される効果の定量化が示されている：誘発された増加および減少の両方において、Ｔｒｉ０２は、ベースラインからのＴ３０誘発偏差に対して保護することは見出されず、全体的な効果で有意な減少（左パネル、ｐ＜０．０１、ｎ＝９）および増加（右パネル、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）が報告された。
【０３５５】
図１８に示すように、正規化された効果の全体的な線グラフは、正常なａＣＳＦ（黒線）、２μＭのＴ３０（赤色の線）、Ｔ３０（２μＭ）および４μＭのＮＢＰ１４（青色の線）、Ｔ３０（２μＭ）および４μＭＴｒｉ０２、対照ＮＢＰ１４（４μＭ）実験（図１１、オレンジ色の線）、対照Ｔｒｉ０２（４μＭ）実験（図１５、紫色線）の効果を試験する実験のベースラインにそれぞれ対応する。このグラフは、ベースラインおよび互いに対しての正規化された減少を示し、Ｔ３０のみが最大偏差を誘発し、Ｔｒｉ０２は、それらのＴ３０誘発偏差をブロックするいくつかの効力を示すが、まだそれらの同時灌流（緑色の線）において有意な変化が起こっている。
【０３５６】
実施例１０−脳切片における化合物２の評価
本発明者らは、電圧感受性色素イメージング（ＶＳＤＩ）を用いた脳切片研究においてＴｒｉ０４を試験した。
【０３５７】
材料と方法
１．脳切片調製
実施例８と同様に脳切片を調製した。
【０３５８】
２．ＶＳＤセットアップ
切片を、９５％Ｏ２ｅ ５％ＣＯ２を含むＣＳＦバブリングを充填した暗く高湿度のチャンバーに入れた。いったんそこに、色素溶液（ａＣＳＦ４８％、ウシ胎児血清４８％、ＤＭＳＯ３．５％およびクレモフォアＥＬ０．４％）中、４％ ０．２ｍＭスチリル色素ピリジニウム４−［２−（６−（ジブチルアミノ）−２−アフェタニル］−エテニル］−１−（３−スルホプロピル）水酸化物（Di-4-ANEPPS、Invitrogen、Paisley、UK）(Tominaga et al., 2000)）を切片に２０〜２５分間かけてから、ａＣＳＦバブラーポット（室温、２２℃±１．５℃）に１時間移して過剰の色素を洗い流して回収した。
【０３５９】
ＶＳＤ記録を開始するとき、切片を小さな濾紙上の記録浴に入れ、切片を生かしたままにし、切片の頂部に置かれた自家製プラスチックグリッドを用いて適切に秤量した。灌流浴溶液をステージヒーターにより３０±１℃に加熱した。同心バイポーラ刺激電極（ＦＨＣ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳ）を、刺激を３０Ｖに設定して、基底前脳の腹側対角線帯に配置した。ＶＳＤデータを取得するために、Ultima 2004/08イメージングソフトウェア（Brain Vision）を、適切なＩＳＩに関して刺激を引き起こすために使用されたSpike 2 V6.0（CED Ltd, Cambridge, UK）に連結したデジタルカメラ（Brain Vision MiCAM Ultima R3- V20 Master）を用いて、１６ビット画像を１ｍｓ分解能で記録した。Osramハロゲンxenophot 64634 HLX EFR Display/Opticランプを用いて光を発生させ、MiCAM Ultima超高速イメージングシステムに連結されたMHF-G150LR（Moritex Corporation）を用いて緑色（５３０＋／−１０ｎｍ）光を放射するように濾過され、＞５９０ｎｍハイパスフィルタにより、放射された蛍光を濾過した。
【０３６０】
３．薬剤の調製と適用
線状ペプチド模倣体Ｔｒｉ０４は、Iproteos（Barcelona、Spain）によってインシリコで設計され、９９％以上の純度でGenosphere Biotechnologiesから合成および購入された。すべての薬物およびペプチドストックを実験前に凍結アリコートに調製した。灌流溶液の製造のために、ストック溶液を解凍し、必要に応じてａＣＳＦを記録するために添加し、Minipulse 3蠕動ポンプ（Gilson Scientific Ltd.、Bedfordshire、UK）を用いて１．５ｍｌ／分の灌流の一定速度で浴を適用した。実験の各試験は、ベースライン記録（ａＣＳＦのみを記録した灌流）を確立するために２０分間、薬物溶液を浴に灌流させ、細胞膜に色素分子を再付着させるために１２分間、最後に、薬物溶液の存在下で応答を測定する１５分間の記録期間により、５２分間続いた。
【０３６１】
５．調節ペプチドの分析
Ｔ３０を使用した大多数の実験を通じて、シグナルの減少が観察された。Ｔ３０は、ｐ１４ラットの基底前脳に記録されたＶＳＤＩシグナルにおいて正味の阻害（ｎ＝２１）を誘導したが、この値には、Ｔ３０灌流中に無視できるまたはわずかに陽性の影響が見られた少数の例が実際に含まれる（Badin et al., 2016）。
【０３６２】
結果と考察
図２０、２１および２２を参照すると、４μＭのＴｒｉ０４の添加は、４μＭのＮＢＰ１４の適用で以前に見られた結果を再現し、一方、灌流溶液中の２μＭのＴｒｉ０４は、基底前脳集団活性に対する有意な効果を決定する。
【０３６３】
調節性ペプチド模倣物の分析
図２０Ａを参照すると、２μＭのＴ３０（ｎ＝２９）を含有する灌流液中の２μＭのＴｒｉ０４の存在のために、空間時間マップが基底前脳活動の回復を示すことが示されている。より具体的には、２μＭのＴｒｉ０４は、ラット基底前脳の直接刺激によって測定した活性に対するＴ３０の阻害効果の逆転を決定する。
【０３６４】
図２０Ｂを参照すると、３つの記録期に関する棒グラフは、Ｔｒｉ０４適用後の誘発反応の変化を示し、２μＭのＴｒｉ０４同時灌流が、Ｔ３０の効果を誘導することによって引き起こされるネットワーク活性の増加を誘発することを確認した（ｎ＝２９、ｐ＝０．０６、両側対ｔ検定）。
【０３６５】
図２１を参照すると、３つの記録条件（ベースライン、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）へのＴ３０適用、およびａＣＳＦへのＴ３０およびＴｒｉ０４の同時適用）における応答時系列は、Ｔ３０記録およびＴ３０＋Ｔｒｉ０４についても同様の活性化プロファイルを最初の１００ミリ秒間示しているが、Ｔｒｉ０４の存在下で作製された記録におけるより高い活性がその後検出可能であることを示し、Ｔ３０よりもＴｒｉ０４の保護的役割を確認する。
【０３６６】
図２２を参照すると、３つの記録条件に対する棒グラフが示されている。２μＭＴ３０を含む人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）における４μＭＴｒｉ０４の同時灌流は、Ｔ３０活性を逆転させる有意な効果を決定する。特に、Ｔｒｉ０４は、基底前脳活動における有意な増加（ｎ＝２０、ｐ＜０．０５、両側対のｔ検定）を伴うベースラインからのＴ３０誘導性の逸脱に対して、Ｔ３０だけの存在下での記録と比較して防御的であることが見出されている。したがって、Ｔｒｉ０４は、メソスケールのネットワーク活性に対するＴ３０毒性効果をブロックするいくつかの有効性を示す。
【０３６７】
結論
癌の治療
本発明者らは、本明細書中に示されたデータにおけるＴ３０に対する明確な阻害効果のために、抗体および２つのペプチド模倣剤、Ｔｒｉ０２およびＴｒｉ０４がＴ１４ペプチドの活性の阻害剤として作用することを本明細書において実証した。したがって、これらの化合物は、癌、特に転移性疾患を治療、改善または予防するために使用することができる。
【０３６８】
癌の診断／予測
本発明者らはまた、Ｔ１４またはそのトランケーションなどのその変異体が、癌、特に転移性疾患の診断マーカーまたは予測マーカーとして使用され得ることを示した。血液中のウエスタンブロットによって測定される低Ｔ１４レベルは、生存率がより低く、最初の治療（すなわち、臨床状態）に対応するより長い時間を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019511701.tif 000120
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