(57)【要約】  本発明は、対象における腫瘍を処置するための併用療法を提供する。この併用は、2つの要素を含む。第1の要素は、抗体に連結されている減弱I型インターフェロン(IFN)を含むポリペプチド構築物であって、前記抗体が、腫瘍細胞上に発現される細胞表面関連抗原と結合し且つ機能的Fc領域を含む、ポリペプチド構築物である。第2の要素は、CD47とSIRPα受容体の相互作用を阻害する、CD47アンタゴニストである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腫瘍を処置するための併用療法であって、(i)抗体に連結されている減弱I型インターフェロン(IFN)を含み、前記抗体が、腫瘍細胞上に発現される細胞表面関連抗原と結合し且つ機能的Fc領域を含む、ポリペプチド構築物と、(ii)SIRPα受容体とCD47の相互作用を阻害するCD47アンタゴニストとの投与を含む、併用療法。
【請求項２】
前記減弱I型IFNが、ペプチド結合によって前記抗体に連結されている、請求項1に記載の併用療法。
【請求項３】
前記減弱I型IFNが、直接、又は長さが1〜20アミノ酸のリンカーを介して、前記抗体に連結されている、請求項1又は請求項2に記載の併用療法。
【請求項４】
ペプチド又はポリペプチドシグナル伝達リガンドが、前記抗体の軽鎖又は重鎖定常領域のC末端に連結されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項５】
前記減弱I型IFNが、減弱IFNαである、請求項1から4のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項６】
前記IFNαのアミノ酸配列が、配列番号1〜3、80〜90、391及び392から選択され、前記IFNαが、IFNα活性を減弱させる少なくとも1つのアミノ酸置換又は欠失を含む、請求項5に記載の併用療法。
【請求項７】
前記減弱IFNαが、減弱IFNα2bである、請求項5又は請求項6に記載の併用療法。
【請求項８】
前記IFNα2b配列が、配列番号3と比較して、L15A、R22A、R23A、S25A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33A、R33K、R33Q、H34A、Q40A、D114R、L117A、R120A、R120E、R125A、R125E、K131A、E132A、K133A、K134A、M148A、R149A、S152A、L153A、N156A、(L30A、H57Y、E58N及びQ61S)、(R33A、H57Y、E58N及びQ61S)、(M148A、H57Y、E58N及びQ61S)、(L153A、H57Y、E58N及びQ61S)、(R144A、H57Y、E58N及びQ61S)、(N65A、L80A、Y85A及びY89A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びD114A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びL117A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びR120A)、(Y85A、Y89A及びD114A)、(D114A及びR120A)、(L117A及びR120A)、(L117A、R120A及びK121A)、(R120A及びK121A)、(R120E及びK121E)、144位におけるRのA、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、S、T、V又はYでの置換、145位におけるAのD、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V又はYでの置換、残基L161〜E165の欠失、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換又は欠失を含む配列を有する、請求項7に記載の併用療法。
【請求項９】
前記減弱IFNα2bが、グリコシル化されていない減弱IFNα2bである、請求項7から9のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１０】
前記グリコシル化されていない減弱IFNα2bのT106が、欠失されているか、又はT以外のアミノ酸で置換されている、請求項10に記載の併用療法。
【請求項１１】
前記グリコシル化されていない減弱IFNα2bのT106が、Aで置換されている、請求項11に記載の併用療法。
【請求項１２】
前記グリコシル化されていない減弱IFNα2bのT106が、欠失されている、請求項11に記載の併用療法。
【請求項１３】
前記減弱IFNα2bの配列が、配列番号44又は配列番号536である、請求項7又は請求項8に記載の併用療法。
【請求項１４】
前記細胞表面関連抗原が、CD38、CD138、RANK-リガンド、HM1.24、CD56、CS1、CD20、CD74、IL-6R、Blys (BAFF)、BCMA、キニノーゲン、ベータ2ミクログロブリン、FGFR3、ICAM-1、マトリプターゼ、CD52、EGFR、GM2、アルファ4-インテグリン、IFG-1R、KIR、CD3、CD4、CD8、CD24、CD30、CD37、CD44、CD69、CD71、CD79、CD83、CD86、CD96、HLA、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD19、CD52、CD14、FSP1、FAP、PDGFRアルファ、PDGFRベータ、ASGR1、ASGR2、FSP1、LyPD3、RTI140/Ti-アルファ、HTI56、VEGF受容体、RCHE遺伝子の産物CD241、CD117 (c-kit)、CD71(トランスフェリン受容体)、CD36(トロンボスポンジン受容体)、CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240、TROP2、CD70、CCR2、HER2、EGFR及びCCR3からなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１５】
前記細胞表面関連抗原が、CD38、CD138、EpCAM、TROP2、CD19、CD20、CD79b、CD22及びCD52からなる群から選択される、請求項1から14のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項１６】
前記細胞表面関連抗原が、CD38である、請求項15に記載の併用療法。
【請求項１７】
前記抗体のVH配列が、配列番号342、344、346、504及び511からなる群から選択される、請求項16に記載の併用療法。
【請求項１８】
前記抗体のVL配列が、配列番号341、343、345、505、512、535及び538からなる群から選択される、請求項16又は請求項17に記載の併用療法。
【請求項１９】
前記ポリペプチド構築物の配列が、配列番号508及び配列番号507又は配列番号532及び配列番号533である、請求項1から18のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２０】
前記CD47アンタゴニストが、CD47に結合し、SIRPα受容体とのその相互作用を阻害する、請求項1から19のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項２１】
前記CD47アンタゴニストが、抗CD47抗体である、請求項20に記載の併用療法。
【請求項２２】
前記抗CD47抗体が、ヒト抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項21に記載の併用療法。
【請求項２３】
前記抗CD47抗体が、グリコシル化されていない、請求項21又は請求項22に記載の併用療法。
【請求項２４】
前記軽鎖の配列が、配列番号509であり、前記重鎖の配列が、配列番号510又は配列番号534である、請求項21に記載の併用療法。
【請求項２５】
前記CD47アンタゴニストが、抗SIRPα抗体である、請求項20に記載の併用療法。
【請求項２６】
前記抗SIRPα抗体が、ヒト抗体又はヒト化モノクローナル抗体である、請求項25に記載の併用療法。
【請求項２７】
前記CD47アンタゴニストが、SIRPαの細胞外ドメインである、請求項20に記載の併用療法。
【請求項２８】
SIRPαの前記細胞外ドメインが、Fcに結合される、請求項27に記載の併用療法。
【請求項２９】
成分(i)及び(ii)が、逐次的に又は同時に投与される、請求項1から28のいずれか一項に記載の併用療法。
【請求項３０】
対象における腫瘍を処置する方法であって、請求項1から29のいずれか一項に記載の併用療法を含む方法。
【請求項３１】
前記腫瘍が、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫から選択される、請求項30に記載の対象における腫瘍を処置する方法。
【請求項３２】
(i)抗体に連結されている減弱I型インターフェロン(IFN)を含み、前記抗体が、腫瘍細胞上に発現される細胞表面関連抗原と結合し且つ機能的Fc領域を含む、ポリペプチド構築物と、(ii)SIRPα受容体とCD47の相互作用を阻害するCD47アンタゴニストとを、混合物で含む、組成物。
【請求項３３】
腫瘍の処置のための医薬品の調製における、請求項1から28のいずれか一項に記載の併用療法の成分(i)及び(ii)の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2016年7月19日に出願した米国特許仮出願62/363,982号に基づく優先権を主張するものであり、該仮出願の全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、腫瘍の処置のための併用療法に関する。この併用は、第1の部分と第2の部分を含み、これら2つの部分が協力して機能して抗腫瘍応答増強をもたらす。第1の部分は、腫瘍細胞上に発現された細胞表面関連抗原(cell surface-associated antigen)と結合する抗体に連結されている減弱I型インターフェロンを含む、ポリペプチド構築物であり、第2の部分は、CD47シグナル伝達を低減させる薬剤である。
【背景技術】
【０００３】
非常に多くのペプチド及びポリペプチド分子が、細胞表面の受容体と相互作用すること、及びその結果、前記受容体を有する細胞内のシグナル伝達経路が通常は関与して、生物学的応答を刺激、阻害又は調節することによって、機能すると記載されている。そのような分子の例としては、ペプチド及びポリペプチドホルモン、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、アポトーシス誘導因子等が挙げられる。これらの分子は、可溶性であることもあり、又は別の細胞の表面に結合していることもある。
【０００４】
そのような分子の生物学的活性のため、治療薬として使用できる可能性があるものもある。例えば、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターフェロンIFNα2b、IFNα2a、IFNβ、IFNγ、エリスロポエチン、G-CSF及びGM-CSFをはじめとする、幾つかのペプチド又はポリペプチド分子は、規制機関により治療製品として承認されている。これら及び他のペプチドの多くは、治療への応用の可能性が実証されてきたが、ヒト患者に投与されたとき毒性も示した。これらの分子の大部分が、所望の治療効果を媒介する細胞以外の細胞を含む様々な細胞上の受容体を誘発することが、毒性の1つの理由である。例えば、IFNα2bが、多発性骨髄腫を処置するために使用される場合、その有用性は、少なくとも一部は、骨髄腫細胞上のI型インターフェロン受容体とのその結合に存在し、この結合は、結果として増殖低減を誘発し、それ故に疾患の進行を制限する。しかし、残念なことに、このIFNは、体内の他の正常な細胞とも結合して、治療状況において望ましくない様々な他の細胞応答を誘発し、その一部は有害である(例えば、インフルエンザ様症状、好中球減少症、うつ状態)。ペプチドのそのような「オフターゲット活性」から、多くのペプチドが薬物候補として適していないということになる。この文脈での「オフターゲット活性」は、ペプチドの天然受容体だが、治療に有益な効果を媒介する細胞以外の細胞の表面にある受容体に対する活性を指す。
【０００５】
IFNα2b等の一部のペプチドが病状の処置に承認されているとはいえ、それらのペプチドは、それらの「オフターゲット」生物学的活性のために忍容性が低い。オフターゲット活性及び付随する不良な忍容性は、これらのペプチドに基づく薬物の一部を、治療効果を媒介する標的細胞に対して最適な治療効果を生じさせるのに十分な高用量で投与することができないことも意味する。
【０００６】
同様に、インターフェロン、特にIFNαが、ある特定のがん細胞のアポトーシスを増加させ、増殖を減少させることは、1980年代半ばから公知である。これらの生物学的活性は、がん細胞の表面のI型インターフェロン受容体により媒介され、該受容体は、刺激を受けたとき、増殖低減、及び/又は最終分化若しくはアポトーシスの誘導につながる、様々なシグナル伝達経路を開始させる。IFNαは、FDAにより、メラノーマ、腎細胞癌、B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病(CML)及びヘアリー細胞白血病をはじめとする幾つかのがんの処置に承認されている。腫瘍細胞に対するIFNαの「直接的」効果は、IFNαがそれらの細胞上のI型IFNα受容体と直接結合してアポトーシス、最終分化又は増殖低減を刺激することにより媒介される。非がん細胞に対するIFNαの1つの「間接的」効果は、免疫系を刺激することであり、これは、免疫系に腫瘍を拒絶させることにより更なる抗がん効果をもたらすことができる。
【０００７】
残念なことに、I型インターフェロン受容体は、殆どの非がん性細胞上にも存在する。IFNαによる非がん性細胞上のこの受容体の活性化は、非常に多くの炎症性サイトカイン及びケモカインの発現を引き起こし、その結果、毒性をもたらす。そのような毒性は、がん細胞に対して最大の抗増殖活性及びアポトーシス促進活性を発揮するレベルでのIFNαの対象への投与を妨げる。
【０００８】
Ozzelloら(Breast Cancer Research and Treatment 25:265〜76頁、1993)は、腫瘍増殖率を低下させる方法として、ヒトIFNαを腫瘍標的化抗体に共有結合させることによってIFNαの直接的阻害活性を腫瘍に限局化させることを記載しており、そのようなコンジュゲートがヒトのがんの異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を有することを実証した。実験に使用されたヒトIFNαが、直接的抗がん効果をもたらすことができるマウスI型IFN受容体と、認識できるほどに相互作用しなかったので、観察された抗がん活性の機序は、がん細胞に対するIFNαの直接的効果によるものであった。しかし、ヒトIFNαのマウス細胞とのこの結合の欠如のため、著者らは、抗体-IFNαコンジュゲートの毒性を遊離IFNαと比較して評価することができなかった。これらの著者は、IFNαを抗体と結合させるために化学的方法を使用した。
【０００９】
Alkanら(Journal of Interferon Research、4巻、3号、355〜63頁、1984)は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)膜抗原(MA)と結合する抗体へのヒトIFNαの結合が、EBV-MA抗原を発現する細胞に向けてのその抗増殖活性を増加させることを実証した。この効力増加は、標的細胞による抗原の発現と、抗体の結合特異性の両方に依存していた。試験された細胞株は、がん細胞株QIMR-WIL、骨髄芽球性白血病であった。著者らは、IFNαの抗体への結合が、腫瘍増殖を低減させることになるので、がんの処置として使用することができることを提案した。Alkanらは、これらの抗体-IFNαコンジュゲートについての、正常な、抗原陰性細胞と該コンジュゲートの相互作用から生じる、潜在的毒性には取り組まなかった。
【００１０】
融合タンパク質構築物を作製することにより抗体とIFNα間の連結を果すことができることも公知である。例えば、IDEC社(WO 01/97844)は、腫瘍抗原DC20を標的とするIgGの重鎖のC末端とのヒトIFNαの直接融合を開示している。他のグループは、IgG重鎖のC末端とIFNα間における様々なリンカーの使用を開示している。例えば、米国特許第7,456,257号には、抗体重鎖定常領域のC末端を配列(GGGGS)n(この配列中のnは、1、2又は3でありうる)の介在セリン-グリシンリッチ(S/G)リンカーによってIFNαに接続することができること、及びリンカーの長さにかかわらず融合タンパク質構築物のIFNα活性に有意な差がないことが開示されている。
【００１１】
Morrisonら(米国特許第8,563,692号;及びXuan C、Steward KK、Timmerman JM、Morrison SL、Targeted delivery of interferon-a via fusion to anti-CD20 results in potent antitumor activity against B-cell lymphoma、Blood 2010;115:2864〜71頁)も、がんを標的とするIgG抗体の重鎖のC末端に介在S/Gリンカーで連結されたIFNαを開示しており、IgG及びリンカーのIFNαとの融合が、細胞表面で対応する抗原を発現しない細胞に対するIFNα活性を低下させることを観察した。この融合タンパク質構築物のIFN活性の低下は、ヒト細胞に対して作用するヒト非融合タンパク質IFNα(遊離IFNα)と比較すると小規模であったが、マウス細胞に対するマウスIFNαについてはより有意であるように見えた。Morrisonらにより及び米国特許第7,456,257号において観察されたように、ヒトIFNαと抗体のC末端との融合の結果として生ずる該IFNαの活性の低下は、小規模ではあるが、一般に、IFNの効力を低下させるので不都合であると考えられる。この不都合は、例えば、腫瘍標的化抗体に、IFNαを、IFNα活性の損失が観察されないような方法で結合させる代替戦略を使用した、Rossiら(Blood 114巻、18号、3864〜71頁)によって指摘された。
【００１２】
一般に、この先行技術は、強力なIFNを使用すること、及びこのIFNをがん細胞に標的化することを教示している。このアプローチは、がん細胞に対するIFNの活性を増加される結果となるが、正常な「オフターゲット」細胞に対するIFNの活性の問題には取り組んでいない。上で言及した先行技術例では、抗体-IFNα融合タンパク質のヒトIFNα部分は、その細胞表面で対応する抗原を発現しないヒト細胞に曝露されたとき、主に、天然のIFNα活性を維持した。この活性維持は、融合タンパク質のIFNα部分による非がん性の正常な(「オフターゲット」)細胞の活性化から生じる毒性をもたらしうる。
【００１３】
したがって、IFNに基づく薬物の「オフターゲット」活性を低下させる一方でそのような薬物の「オンターゲット」の治療効果を保持する必要がある。これらのタイプの治療剤の標的特異的活性の維持及び同時に非標的毒性の低減は、治療に有用なペプチドのより大きな治療濃度域を生じさせることになる。例えば、正常ヒト細胞に対するその効果を最小限にしつつがん細胞にその活性を指向させることができるような形でヒトIFNαを使用することが、望ましいであろう。理想的には、がん細胞上のI型インターフェロン受容体は、最大限に刺激されることになるが、非がん性細胞上の同じ受容体は、最小限の刺激しか経験しないことになる。ヒトIFNαが、抗原を提示しない正常細胞に対してより、抗原を提示するがん細胞に対して、劇的に大きい活性を有するような方法で、ヒトIFNαをがん細胞に標的化する必要がある。同じ理論が、他の潜在的治療分子、例えば、他のサイトカイン、ペプチド及びポリペプチドホルモン、ケモカイン、増殖因子、アポトーシス誘導因子等に当てはまる。
【００１４】
このアプローチの理論は、WO 2013/059885、WO 2014/178820及びWO 2016/065409において実証されており、これらの特許文献各々の開示は、相互参照により本明細書に組み込まれる。
【００１５】
マクロファージは、全ての組織に存在する自然免疫細胞である。がんの場合、マクロファージは、細胞のシグナルに依存して腫瘍増殖を促進又は阻害することができる。マクロファージのサブセットの特性解析により、少なくとも2つのサブセットが明らかにされており、一方のサブセットであるM2マクロファージは、アルギナーゼを産生し、腫瘍増殖を促進するが、もう一方のサブセットであるM1マクロファージは、亜酸化窒素シンテターゼを産生し、腫瘍殺滅を媒介する。マクロファージは、抗体依存性細胞貪食(ADCP)等の抗体依存性機序、又は抗体非依存性機序によって、殺滅することができる。
【００１６】
健常細胞とは異なり、望ましくない老齢又は瀕死細胞は、「私を食べて」シグナルと呼ばれるマーカー又はリガンド、すなわち「異常な自己(altered self)」を提示し、その結果として、好中球、単球及びマクロファージ等の貪食細胞上の受容体により認識されうる。健常細胞は、貪食を積極的に阻害する「私を食べないで」シグナルを提示することができ、これらのシグナルは、瀕死細胞では下方制御され、変化した構造で存在するか、又は「私を食べて」シグナル若しくは貪食促進シグナルの上方制御に取って代わられる。健常細胞上の細胞表面タンパク質CD47、及び貪食細胞受容体であるシグナル調節タンパク質α(SIRPα)とのその会合は、アポトーシス細胞クリアランス及びFcR媒介貪食をはじめとする複数の様式により媒介される飲み込みをオフにすることができる、重要な「私を食べないで」シグナルを構成する。貪食細胞上のSIRPαのCD47媒介会合の遮断、又はノックアウトマウスにおけるCD47発現の喪失は、生細胞及び非老齢赤血球の除去を引き起こすことができる。前貪食シグナル(pre-phagocytic signal)も存在する細胞については、SIRPαを遮断することにより、通常は貪食されない標的の飲み込みも可能になる。
【００１７】
CD47は、単一のIg様ドメインと5つの膜貫通領域とを有する広範に発現される膜貫通糖タンパク質である。CD47は、SIRPαの細胞リガンドとして機能し、結合は、SIRPαのNH2末端V様ドメインによって媒介される。SIRPαは、マクロファージ、顆粒球、骨髄樹状細胞(DC)、マスト細胞及びそれらの前駆体(造血幹細胞を含む)をはじめとする、骨髄腫細胞上に主として発現される。CD47結合を媒介するSIRPα上の構造決定因子は、Leeら(2007) J. Immunol. 179:7741〜7750頁; Hatherleyら(2007) J.B.C. 282:14567〜75頁により論じられており、CD47結合におけるSIRPαシス二量体形成の役割は、Leeら(2010) J.B.C. 285:37953〜63頁により論じられている。正常細胞の貪食を阻害するCD47の役割と一致して、CD47は、造血幹細胞(HSC)及び前駆細胞上でそれらの移行期前及び中に一過性に上方制御されるという、及びこれらの細胞上のCD47のレベルにより、それらがin vivoで飲み込まれる尤度が決まるという証拠がある。
【００１８】
損傷、前がん性又は感染細胞を除去するために生物が応答する方法には、プログラム細胞死((PCD)及び貪食細胞除去等がある。したがって、この生物応答を切り抜けて生き残る細胞(例えば、がん性細胞、慢性感染細胞等)には、PCD及び貪食細胞除去から逃れるために考え出された方法がある。「私を食べないで」シグナルであるCD47は、多種多様な罹病細胞、がん細胞及び感染細胞上で構成的に上方制御され、これにより、これらの細胞は貪食を回避することができる。ある細胞(例えば、がん細胞、感染細胞等)上のCD47と別の細胞(例えば、貪食細胞)上のSIRPαとの相互作用を遮断する抗CD47剤は、CD47発現の増加を弱め、がん細胞及び/又は感染細胞の貪食を助長する。したがって、抗CD47剤は、多種多様な状態/障害を処置するために、及び/又はそれらから保護するために、使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】WO 01/97844
【特許文献２】米国特許第7,456,257号
【特許文献３】米国特許第8,563,692号
【特許文献４】WO 2013/059885
【特許文献５】WO 2014/178820
【特許文献６】WO 2016/065409
【特許文献７】WO 2017/053423
【特許文献８】米国特許出願公開第2013/0224188号
【特許文献９】PCT公開WO 90/05144 A1
【特許文献１０】米国特許第5,225,539号
【特許文献１１】米国特許第6,054,297号
【特許文献１２】米国特許第7,566,771号
【特許文献１３】米国特許第5,585,089号
【特許文献１４】米国特許第7,732,578号
【特許文献１５】米国特許第5,565,332号
【特許文献１６】米国特許第6,300,064号
【特許文献１７】米国特許第6,248,516号
【特許文献１８】米国特許第5,837,821号
【特許文献１９】米国特許出願公開第20080181892号
【特許文献２０】米国特許出願公開第20080227958号
【特許文献２１】米国特許第6,180,370号
【特許文献２２】WO 2008/006554
【特許文献２３】米国特許第6,277,375号
【特許文献２４】米国特許第6,821,505号
【特許文献２５】米国特許第7,083,784号
【特許文献２６】米国特許第7,217,797号
【特許文献２７】WO 2000/42072
【特許文献２８】米国特許出願公開第20090142340号
【特許文献２９】米国特許出願公開第20090068175号
【特許文献３０】米国特許出願公開第20090092599号
【特許文献３１】米国特許第6,602,684号
【特許文献３２】米国特許第7,326,681号
【特許文献３３】米国特許第7,388,081号
【特許文献３４】米国特許第7,282,556号
【特許文献３５】米国特許第8,101,719号
【特許文献３６】米国特許第8,562,997号
【特許文献３７】米国特許第8,758,750号
【特許文献３８】米国特許第9,017,675号
【特許文献３９】米国特許第9,045,541号
【特許文献４０】米国特許第9,221,908号
【特許文献４１】米国特許出願公開第2012/0189625号
【特許文献４２】米国特許出願公開第2012/0282174号
【特許文献４３】米国特許出願公開第2014/0140989号
【特許文献４４】米国特許出願公開第2014/0161805号
【特許文献４５】米国特許出願公開第2014/0199308号
【特許文献４６】米国特許出願公開第2015/0274826号
【特許文献４７】米国特許出願公開第2015/0329616号
【特許文献４８】米国特許出願公開第2015/0353642号
【特許文献４９】米国特許出願公開第2016/0008429号
【特許文献５０】米国特許出願公開第2016/0009814号
【特許文献５１】米国特許出願公開第2016/0009815号
【特許文献５２】米国特許出願公開第2010/0297076号
【特許文献５３】米国特許第7829672号
【特許文献５４】米国特許出願公開第2009/0123950号
【特許文献５５】米国特許出願公開第2009/304710号
【特許文献５６】WO 2012/092612
【特許文献５７】米国特許出願公開第2002/0164788号
【特許文献５８】米国特許第7,202,346号
【特許文献５９】米国特許第7,723,485号
【特許文献６０】米国特許第8,039,593号
【特許文献６１】米国特許出願公開第2003-0211100号
【特許文献６２】米国特許出願公開第2002-0142358号
【特許文献６３】米国特許出願公開第2004-0006215号
【特許文献６４】米国特許出願公開第2006-0083736号
【特許文献６５】米国特許第8,124,738号
【特許文献６６】米国特許第5693761号
【特許文献６７】米国特許第5,976,531号
【特許文献６８】米国特許第5,772,997号
【特許文献６９】米国特許第5,770,195号
【特許文献７０】米国特許第5,677,171号
【特許文献７１】米国特許第6,512,097号
【特許文献７２】米国特許第5,977,322号
【特許文献７３】PCT公開WO 97/00271
【特許文献７４】米国特許第5,844,093号
【特許文献７５】米国特許第5,558,864号
【特許文献７６】欧州特許出願公開第706,799号A
【特許文献７７】米国特許出願公開第2006/0099205号A1
【特許文献７８】米国特許出願公開第2004/0071696号A1
【非特許文献】
【００２０】
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
第1の態様では、本発明は、対象における腫瘍を処置するための併用療法であって、(i)抗体に連結されている減弱I型インターフェロン(IFN)を含み、前記抗体が、腫瘍細胞上に発現される細胞表面関連抗原と結合し且つ機能的Fc領域を含む、ポリペプチド構築物と、(ii)SIRPα受容体とCD47の相互作用を阻害するCD47アンタゴニストとの投与を含む、併用療法を提供する。
【００２２】
本発明の併用療法では、成分(i)及び(ii)を別々に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。
【００２３】
第2の態様では、本発明は、対象における腫瘍を処置する方法であって、本発明の併用療法を使用することを含む方法を提供する。
【００２４】
第3の態様では、本発明は、本発明の併用療法の成分(i)及び(ii)を混合物で含む組成物を提供する。
【００２５】
第4の態様では、本発明は、腫瘍の処置のための医薬品の調製における、本発明の併用療法の成分(i)及び(ii)の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】アイソタイプ対照-減弱IFNα2b抗体(無関係抗体-減弱IFNα2b)での処置と比較して抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、NCI-H929骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。抗CD38-IFNα2b融合タンパク質での処置は、10匹のマウスのうちの10匹においてNCI-H929腫瘍を除去したが、対照の標的化されていない減弱IFNα2b融合タンパク質の活性は、殆ど又は全く効果を示さなかった。
【図２Ａ】アイソタイプ対照-減弱IFNα2b抗体での処置と比較して抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、NCI-H929骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。黒矢印は、処置の時点を示し、灰色矢印は、組織学的分析のための腫瘍試料採取時点を示す。
【図２Ｂ】図2Aに示されている実験から取った腫瘍試料の組織学的分析からのスコア化のグラフ。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質で処置されたNCI-H929骨髄腫異種移植片は、対照と比較して経時的に末梢腫瘍CD45+細胞動員の増加を示した。各々の棒は、単一のマウスを代表するものである。2匹のマウスが各時点で試験された。
【図３Ａ】媒体投与での処置と比較して抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、786-0腎癌異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。黒矢印は、投与処置の時点を示し、灰色矢印は、組織学的分析のための腫瘍試料採取時点を示す。抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質は、このモデルにおいて腫瘍阻害に対する効果を示さなかった。
【図３Ｂ】図3Aに示されている実験から取った腫瘍試料の組織学的分析からのスコア化のグラフ。このモデルでのCD45+細胞の動員は、NCI-H929骨髄腫異種移植片モデル(図2A及び2B)における抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質で得られた結果と比較してはるかに顕著さに欠けていた。各々の棒は、単一のマウスを代表するものである。
【図４】NCI-H929骨髄腫異種移植片モデルにおいてこれらの異なる免疫細胞欠損マウス株を使用する実験の結果に関するグラフを提供する図である。これらのグラフは、媒体と比較して抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置後のNCI-H929腫瘍体積を示す。処置の結果として、SCIDマウス株では10匹の動物のうちの10匹、NOD-SCID株では10匹の動物のうちの2匹、及びNSG株では10匹のうちの0匹が治癒した。
【図５】単独での媒体又はクロンドロン酸内包リポソーム前処置と比較して、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、又はクロンドロン酸内包リポソームで前処置された動物における抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、NCI-H929骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。マクロファージ殺滅剤であるクロンドロン酸内包リポソームの追加は、このモデルにおける抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質による腫瘍破壊を大幅に阻害した。
【図６】媒体単独での処置と比較して、N297における抗体Fcグリコシル化部位が置換突然変異N297Aにより除去された、非グリコシル化抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置と比較した、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、NCI-H929骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。Fcグリコシル化の除去は、このモデルにおける融合タンパク質による腫瘍崩壊を大幅に低減させた。これは、腫瘍根絶の機序が、抗体依存性細胞貪食(ADCP)からの多大な寄与を含む可能性が高いことを示す。
【図７】抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(最適以下の用量で)単独での処置、非グリコシル化抗CD47抗体単独での処置、これら2つの薬剤の組合せでの処置、又は対照での処置の結果を示す、腫瘍体積のグラフ。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(最適以下の用量)と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せでの処置は、10匹のマウスのうちの10匹においてNCI-H929腫瘍を完全に除去したが、単独での最適以下の用量での抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質は、腫瘍増殖をある程度遅延させただけであり、治癒的ではなかった。
【図８】媒体又は対照での処置と比較して、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(最適以下の用量で)での処置、非グリコシル化抗CD47抗体を使用するCD47遮断での処置、又は抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(最適以下の用量)と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せでの処置の結果を示す、RPMI 8226多発性骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。このモデルでは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と、非グリコシル化抗CD47抗体によるCD47遮断との組合せは、腫瘍を根絶する点で、個々の薬剤での又は対照薬剤の組合せでの処置より有効であった(10匹の動物のうちの8匹が治癒した)。
【図９】媒体又は対照と比較して、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、非グリコシル化抗CD47抗体を使用するCD47遮断での処置、又は抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せでの処置の結果を示す、OPM-2骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。このモデルでは、抗CD38-減弱IFNα2bと、非グリコシル化抗CD47抗体によるCD47遮断との組合せは、腫瘍を根絶する点で、個々の薬剤での又は対照薬剤の組合せでの処置より有効であった(10匹の動物のうちの5匹が治癒した)。
【図１０】媒体での処置と比較して、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、非グリコシル化抗CD47抗体を使用するCD47遮断での処置、又は抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せでの処置の結果を示す、A375メラノーマ異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。このモデルでは、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質と、非グリコシル化抗CD47抗体の組合せは、A375腫瘍の増殖を遅延させる点で、個々の薬剤での処置より有効であった。
【図１１】媒体又は対照での処置と比較して、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、非グリコシル化抗CD47抗体を使用するCD47遮断での処置、又は抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せでの処置の結果を示す、ARP-1難治性骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。このモデルでは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と、非グリコシル化抗CD47抗体によるCD47遮断との組合せは、腫瘍を根絶する点で、個々の薬剤での又は対照薬剤の組合せでの処置より有意に有効であった(8匹の動物のうちの7匹が治癒した)。
【図１２】図11で使用された抗CD47抗体からの2つの異なる非グリコシル化抗CD47抗体クローン(2A1及び5F9)によりCD47遮断がもたらされたARP-1難治性骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。このモデルの結果は、2つの非グリコシル化抗CD47抗体クローン(2A1及び5F9)のどちらかと併用された抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置が、他の処置による腫瘍増殖に対するある程度の効果又は無効果と比較して、全ての動物(群当たり10匹のマウスのうちの10匹)において完全な腫瘍根絶に至ったことを示す。
【図１３Ａ】抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、抗ヒトHLA-減弱IFNα2b融合タンパク質(普遍的標的抗体)での処置、又は無関係抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、ヘアリー細胞(HC-1)白血病異種移植片モデルにおける無腫瘍生存率(TFS)のグラフ。この白血病モデルでは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(単剤として)が生存率に与えた影響(33日まで10%TFS)は、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質(33日目まで100%TFS)と比較して最小であった。
【図１３Ｂ】抗ヒトHLA-減弱IFNα2b融合タンパク質(普遍的標的抗体)での処置、単独での、若しくは非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗CD20-減弱IFNα2b融合タンパク質、又は媒体での処置と比較して、非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、ヘアリー細胞(HC-1)白血病異種移植片モデルにおける無腫瘍生存率(TFS)のグラフ。このモデルでの結果は、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と抗CD47抗体の組合せが、前の実験(図13A)における単独での抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と比較して生存率を有意に改善した(50日目まで40%TFS)ことを示す。
【図１４】対照抗体又は媒体での処置と比較して、単独での、又は非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗CD52-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、CCRF-CEM T ALL異種移植片モデルにおける無腫瘍生存率(TFS)のグラフ。このモデルでの結果は、非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗CD52-減弱IFNα2b融合タンパク質の組合せが、個々の薬剤、又は対照抗体の組合せと比較して、生存率の向上及び生存期間の延長(90日目まで30%TFS)をもたらしたことを示す。
【図１５】対照抗体又は媒体での処置と比較して、単独での、若しくは非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、又は単独での、若しくは非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗CD19-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、全身性B細胞慢性リンパ球性白血病(B-CLL)腫瘍MEC1 B CLL異種移植片モデルにおける無腫瘍生存率(TFS)のグラフ。このモデルでの結果は、単独での、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質治療が、生存率を改善した(90日目に50%TFS)が、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質を非グリコシル化抗CD47抗体と併用されたとき、生存率が大いに向上された(90日目に100%TES)ことを示す。生存率は、抗CD19-減弱IFNα2b融合タンパク質が非グリコシル化抗CD47抗体と併用されたときにも、単独での抗CD19-減弱IFNα2b融合タンパク質と比較して、ある程度向上された。
【図１６】抗CD47抗体処置単独又は媒体処置と比較して、単独での、又は非グリコシル化抗CD47抗体との組合せでの、抗EpCAM-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置の結果を示す、NSCLC(H820)異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。このモデルでは、抗EpCAM-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せは、単独でのヒトEpCAM-減弱IFNα2b融合タンパク質又は単独での抗CD47抗体での腫瘍阻害より増強された腫瘍阻害をもたらした。
【図１７Ａ】単独での、若しくは非グリコシル化抗CD47抗体を伴う、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、単独での非グリコシル化抗CD47抗体での処置、又は媒体での処置の結果を示す、OPM2骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。黒矢印は、処置の時点を示し、灰色矢印は、組織学的分析のための腫瘍試料採取時点を示す。このモデルでは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の併用療法で処置された動物においてのみ、腫瘍阻害増強が観察された。
【図１７Ｂ】図17Aに示されている実験から取った腫瘍試料の組織学的分析からのスコア化のグラフ。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せで処置された腫瘍では、どちららの薬剤単独又は媒体による弱いCD45+細胞動員と比較して、CD45+細胞の強い動員が観察された。各々の棒は、単一のマウスを代表するものである。
【図１８Ａ】単独での、若しくは非グリコシル化抗CD47抗体を伴う、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置、単独での非グリコシル化抗CD47抗体での処置、又は媒体での処置の結果を示す、NOD SCIDマウスを使用するH929骨髄腫異種移植片モデルにおける腫瘍体積のグラフ。黒矢印は、処置の時点を示し、灰色矢印は、組織学的分析のための腫瘍試料採取時点を示す。このモデルでは、単独での、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質が、小さい抗腫瘍応答をもたらした一方で、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の併用療法に伴って確固たる腫瘍阻害が観察された。
【図１８Ｂ】図18Aに示されている実験から取った腫瘍試料の組織学的分析からのスコア化のグラフ。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せで処置された腫瘍では、どちらかの薬剤単独又は媒体による弱いCD45+細胞動員と比較して、CD45+細胞の強い動員が観察された。各々の棒は、単一のマウスを代表するものである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」という語、又は「含む(comprises)」若しくは「含む(comprising)」等の語尾変化形は、述べられている要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の包含を含意するが、他のいずれの要素若しくは整数又は要素若しくは整数の群の除外も含意しないと、解されるものとする。
【００２８】
本明細書中でのいずれの先行刊行物(若しくはそれから得られる情報)への又は公知であるいずれの事項への言及も、先行刊行物(若しくはそれから得られる情報)又は公知の事項が、本明細書が関係する取組み分野での共通一般知識の一部を構成することの、是認とも、容認とも、いかなる形の示唆ともされず、またされるべきでない。
【００２９】
本明細書中で言及する全ての刊行物は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本明細書で使用される単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈による別段の明白な指図がない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「薬剤(an agent)」への言及は、単一の薬剤は勿論、2つ以上の薬剤を含み、「分子(a molecule)」への言及は、単一の分子は勿論、2つ以上の分子を含む。
【００３１】
第1の態様では、本発明は、対象における腫瘍を処置するための併用療法であって、(i)抗体に連結されている減弱I型インターフェロン(IFN)を含み、前記抗体が、腫瘍細胞上に発現される細胞表面関連抗原と結合し且つ機能的Fc領域を含む、ポリペプチド構築物と、(ii)SIRPα受容体とCD47の相互作用を阻害するCD47アンタゴニストとの投与を含む、併用療法を提供する。
【００３２】
本発明の併用療法では、成分(i)及び(ii)を別々に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。
【００３３】
第2の態様では、本発明は、対象における腫瘍を処置する方法であって、本発明の併用療法を使用することを含む方法を提供する。
【００３４】
第3の態様では、本発明は、本発明の併用療法の成分(i)及び(ii)を混合物で含む組成物を提供する。
【００３５】
第4の態様では、本発明は、腫瘍の処置のための医薬品の調製における、本発明の併用療法の成分(i)及び(ii)の使用を提供する。これらの成分を混合物で投与してもよく、又はいずれかの順序で逐次的に投与してもよい。本発明は、腫瘍の処置において成分(ii)とともに使用するための医薬品の調製における成分(i)の使用、及び腫瘍の処置において成分(i)とともに使用するための医薬品の調製における成分(ii)の使用にまで及ぶ。
【００３６】
明らかであろうが、腫瘍細胞上に発現される細胞表面関連抗原と結合する抗体が機能的Fc領域を含むことが、本発明の特徴である。本明細書で使用される用語「機能的Fc領域」は、Fc領域が、マクロファージ上のFcγ受容体と相互作用することによりエフェクター機能を惹起する能力を有することを意味する。詳細には、機能的Fcには、抗体依存性細胞貪食(ADCP)によってマクロファージによる貪食を促進する能力があり、及び/又は抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)による細胞殺滅能力がある。補体結合もまたFc受容体の機能である。
【００３７】
同様に明らかであろうが、I型インターフェロンが減弱されていることが、本発明の特徴である。本明細書で使用される用語「減弱I型IFN」は、I型IFNの配列が、IFN受容体を有する細胞に対するI型インターフェロンの効力を野生型I型インターフェロンと比較して低下させるように変えられている(突然変異されている)ことを意味する。この効力低下は、野生型I型IFNと比較して減弱1型IFNのIFN受容体に対する親和性低下に起因しうる。I型IFNの効力は、用量応答曲線の数学的な中点であるEC50値により定量的に表すことができ、この場合、用量は、アッセイにおけるI型IFN抗体-I型IFN構築物の濃度を指し、応答は、特定の用量でのIFNのシグナル伝達活性に対する細胞の定量的応答を指す。I型IFNについては、例えば効力を判定するために、細胞に基づくインターフェロン応答エレメント(IRE)レポーターアッセイ、カスパーゼ又は細胞増殖応答を使用することができる。
【００３８】
ある特定の実施形態では、減弱I型IFNは、ペプチド結合によって抗体に連結されている。この連結は、直接であってもよく、又は長さが1〜20アミノ酸のリンカーを介してであってもよい。典型的に、減弱I型IFNは、抗体の軽鎖又は重鎖定常領域のC末端に連結されることになる。
【００３９】
減弱I型IFNは、減弱IFNαであることが好ましい。
【００４０】
減弱IFNαは、配列番号1〜3、80〜90、391及び392から選択されるアミノ酸配列を含みうる。この配列は、IFNα活性を減弱させる少なくとも1つのアミノ酸置換又は欠失も含むことになる。
【００４１】
ある特定の実施形態では、減弱IFNαは、減弱IFNα2bである。例示的な野生型IFNα2b配列は、配列番号3で示され、ある特定の実施形態では、減弱IFNα2bは、野生型と比較して、L15A、R22A、R23A、S25A、L26A、F27A、L30A、L30V、K31A、D32A、R33A、R33K、R33Q、H34A、Q40A、D114R、L117A、R120A、R120E、R125A、R125E、K131A、E132A、K133A、K134A、M148A、R149A、S152A、L153A、N156A、(L30A、H57Y、E58N及びQ61S)、(R33A、H57Y、E58N及びQ61S)、(M148A、H57Y、E58N及びQ61S)、(L153A、H57Y、E58N及びQ61S)、(R144A、H57Y、E58N及びQ61S)、(N65A、L80A、Y85A及びY89A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びD114A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びL117A)、(N65A、L80A、Y85A、Y89A及びR120A)、(Y85A、Y89A及びD114A)、(D114A及びR120A)、(L117A及びR120A)、(L117A、R120A及びK121A)、(R120A及びK121A)、(R120E及びK121E)、144位におけるRのA、D、E、G、H、I、K、L、N、Q、S、T、V又はYでの置換、145位におけるAのD、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V又はYでの置換、残基L161〜E165の欠失、並びにこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換又は欠失を含む。好ましい突然変異は、野生型と比較して、A145Dであり、そのような減弱IFNα2bの例は、配列番号44及び配列番号536で示される。
【００４２】
当業者には分かるが、異なるIFNα2b配列が使用される場合、上述の突然変異は、野生型IFNα2b配列からの対応する位置でなされることになる。
【００４３】
減弱IFNα2bはまた、グリコシル化されていない減弱IFNα2bであってもよい。グリコシル化されていない減弱IFNα2bの残基T106を欠失させて、又はT以外のアミノ酸で置換して、IFNα2bが哺乳動物細胞において産生されるときにグリコシル化部位を除去することができる。
【００４４】
別の実施形態では、細胞表面関連抗原は、CD38、CD138、RANK-リガンド、HM1.24、CD56、CS1、CD20、CD74、IL-6R、Blys (BAFF)、BCMA、キニノーゲン、ベータ2ミクログロブリン、FGFR3、ICAM-1、マトリプターゼ、CD52、EGFR、GM2、アルファ4-インテグリン、IFG-1R、KIR、CD3、CD4、CD8、CD24、CD30、CD37、CD44、CD69、CD71、CD79、CD83、CD86、CD96、HLA、PD-1、ICOS、CD33、CD115、CD11c、CD19、CD52、CD14、FSP1、FAP、PDGFRアルファ、PDGFRベータ、ASGR1、ASGR2、FSP1、LyPD3、RTI140/Ti-アルファ、HTI56、VEGF受容体、RCHE遺伝子の産物CD241、CD117 (c-kit)、CD71(トランスフェリン受容体)、CD36(トロンボスポンジン受容体)、CD34、CD45RO、CD45RA、CD115、CD168、CD235、CD236、CD237、CD238、CD239、CD240 TROP2、CD70、CCR2、HER2、EGFR、IGF1R、CEA及びCCR3からなる群から選択される。
【００４５】
一部の実施形態では、細胞表面関連抗原は、CD38、CD138、EpCAM、TROP2、CD19、CD20、CD79b、CD22及びCD52を含む。
【００４６】
より特別な実施形態では、細胞表面関連抗原は、CD38である。ある特定の実施形態では、抗体のVH配列は、配列番号342、344、346、504及び511からなる群から選択され、抗体のVL配列は、配列番号341、343、345、505、512及び533からなる群から選択される;並びに前述のVH及びVL配列の任意の組合せの関連抗体。参照抗体の「関連抗体」(これは「関連抗原結合断片」を包含する)である抗体は、標的抗原への結合について参照抗体と競合(例えば、一部の実施形態では、その標的抗原のエピトープ、オーバーラップエピトープ又は隣接エピトープについて競合)する抗体(及びそれらの抗原結合断片)、参照抗体のエピトープ特異性を有する抗体(及びそれらの抗原結合断片)、参照抗体の相補性決定領域(CDR)を含む(一部の実施形態では、CDR全体に1、2、3、4若しくは5つ以下の保存的アミノ酸置換があることもあり、又は各々のCDRに1若しくは2つ以下の保存的アミノ酸置換があることもある)抗体(及びそれらの抗原結合断片)、又は参照抗体の可変重鎖及び軽鎖ドメインを含む(又は前記可変ドメインと少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%の、若しくはそれを超える、アミノ酸同一性を有することができ、その場合、いずれのアミノ酸変化もフレームワーク領域内にあり、保存的であって若しくは非保存的であってもよい)抗体(及びそれらの抗原結合断片)を包含する。一部の実施形態では、保存的置換は、BLASTpのデフォルトパラメータにより決定されるが、他の実施形態では、保存的突然変異は、クラス内での置換であり、この場合のクラスは、脂肪族(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン)、ヒドロキシル又は硫黄/セレン含有(セリン、システイン、セレノシステイン、スレオニン、メチオニン)、環状(プロリン)、芳香族(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)、塩基性(ヒスチジン、リシン、アルギニン)、並びに酸性及びアミド(アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン)である。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している(例えば、Watsonら(1987) Molecular Biology of the Gene、The Benjamin/Cummings Pub.社、224頁(第4版)を参照されたい)。加えて、構造的又は機能的に類似しているアミノ酸の置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。
【００４７】
特定の実施形態では、VH配列は、配列番号504であり、VL配列は、配列番号538である。
【００４８】
ある特定の特別な実施形態では、ポリペプチド構築物の配列は、配列番号532及び配列番号533であるか、又は好ましくは上述の突然変異を含む、配列番号532及び配列番号533と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%、若しくはそれを超えて同一のアミノ酸配列である。
【００４９】
ある特定の実施形態では、CD47アンタゴニストは、CD47に結合し、SIRPα受容体とのその相互作用を阻害する。これらの実施形態では、CD47アンタゴニストは、抗CD47抗体、好ましくは、ヒト抗体又はヒト化モノクローナル抗体でありうる。抗CD47抗体の例としては、WO2017/053423、米国特許出願公開第2013/0224188号に開示されているもの、並びに5F9として公知の抗体(Wangら、2015、PLoS ONE、10巻(9号): e0137345)、ZF1として公知の抗体(Zengら、Oncotarget、2016、7巻、83040〜8350頁)、INBRX-103として公知の抗体(CC-90002) (Celgene社)、Hu5f9-G4として公知の抗体(Forty Seven社)、NI-1701として公知の抗体(Novimmune社)、NI-1801として公知の抗体(Novimmune社)、及びSRF231として公知の抗体(Surface Oncology社)が挙げられる。
【００５０】
ある特定の実施形態では、抗CD47抗体の配列は、配列番号509/510、513/514、515/516、517/518、519/520及び509/534で提供され、また、その関連抗体である。
【００５１】
CD47アンタゴニストはまた、抗SIRPα抗体であってもよい。そのような抗SIRPα抗体はまた、ヒト抗体であってもよく、又はヒト化モノクローナル抗体であってもよい。そのような抗体の例は、Effi-DEM(OSE Immunotherapeutics社)である。
【００５２】
別の選択肢では、CD47アンタゴニストは、SIRPαの細胞外ドメインであってもよい。SIRPαの細胞外ドメインをFcに結合させてもよい。そのような融合タンパク質の例は、TTI-621(Petrovaら、Clin Cancer Res、2016; DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-16-1700)である。
【００５３】
SIRPα受容体とCD47の相互作用を阻害する公知アンタゴニストの更なる論述は、Weiskopf、European Journal of Cancer、2017、76:100〜109頁、Sockoloskyら、PNAS、2016、10.1073、E2646〜E2654、及びSickら、2012、167、1415〜1430頁に提供されている。これらの参考文献の開示は、相互参照により本明細書に含まれる。
【００５４】
併用療法の成分(i)及び(ii)を逐次的に投与してもよく、又は同時に投与してもよい。投与が逐次的である場合、成分(i)を成分(ii)の前に投与してもよく、又は成分(ii)を成分(i)の前に投与してもよい。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明の構築物は、抗体と減弱された、グリコシル化されていないIFNα2bとの融合構築物であって、目的の細胞上の細胞表面受容体に標的化する抗体と、細胞表面IFN受容体への親和性が低下した減弱IFNα2bの、両方の作用のため、シグナル伝達経路を活性化することに関して抗原選択指数の上昇を示す構築物である。これらの構築物は、WO 2013/059885に概要が示されている発見に基づくものであり、より十分にWO 2016/065409に開示されている。これらの文献で説明されているように、抗体-IFN融合構築物中のIFN部分は、抗原陰性細胞に対するIFN活性が劇的に減弱される一方で、抗原陽性細胞に対するIFN活性が、仮に減弱されたとしてもわずかにしか減弱されないように、突然変異される。そのような構築物は、抗原陰性細胞と比較して抗原陽性細胞に対して1、2、3、4又は5桁大きい効力を示す。一実施形態では、抗体-減弱IFN構築物は、減弱されていない遊離(すなわち、抗体に結合していない)IFNの場合の抗原陽性細胞に対する効力の少なくとも1%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は少なくとも50%を保持する。加えて、一実施形態では、抗体-減弱IFN構築物は、減弱されていない遊離(すなわち、抗体に結合していない)IFNの最大活性の少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも75%又は少なくとも90%を保持し、この文脈での「最大活性」は、薬剤の更なる増加が応答の量を更に増加させない用量応答曲線の高いプラトー部分でのシグナル伝達活性(又はその下流効果)の量を意味すると解されたい。
【００５６】
WO 2016/065409で説明されているような利点は、本発明の構築物において減弱された、グリコシル化されていないIFNα2bを使用することにより得られる。したがって、ある特定の実施形態では、これらの減弱サイトカインが好ましい。
【００５７】
当然のことながら、I型インターフェロンの例は、様々な形態(IFN-α1、IFN-α2、IFN-α4、IFN-α5、IFN-α6、IFN-α7、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α13、IFN-α14、IFN-α16、IFN-α17及びIFN-α21)があるIFN-α(アルファ)、IFN-β(ベータ)、IFN-κ(カッパ)、IFN-δ(デルタ)、IFN-ε(イプシロン)、IFN-τ(タウ)、IFN-ω(オメガ)、及びIFN-ζ(ゼータ、別名リミチン)である。
【００５８】
本発明は、他の薬物を伴う、及び/又は他の処置レジメン若しくは様式、例えば放射線療法若しくは外科手術に加えての、本発明の併用療法も企図している。本発明の構築物が、公知の治療剤と組み合わせて使用される場合、その組合せを順次(継続的に、若しくは無処置期間により中断して)投与してもよく、又は同時に投与してもよく、又は混合物として投与してもよい。がんの場合、これに関連して使用することができる非常に多くの公知抗がん剤がある。本発明の構築物での処置に続いての公知の処置、又は公知の薬剤での処置に続いての本発明の構築物での例えば維持療法としての処置を包含する組合せでの処置も、企図される。例えば、がんの処置において、本発明の構築物を、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミドシスプラチン、又は白金含有アルキル化様薬剤、例えばシスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン)、代謝拮抗薬(例えば、プリン若しくはピリミジン類似体又は葉酸代謝拮抗剤、例えば、アザチオプリン及びメルカプトプリン)、アントラサイクリン系薬剤(例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロン、又はアントラサイクリン類似体)、植物アルカロイド(例えば、ビンカアルカロイド又はタキサン、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、パクリタキセル又はドセタキセル)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、I型又はII型トポイソメラーゼ阻害剤)、ポドフィロトキシン(例えば、エトポシド又はテニポシド)、又はチロシンキナーゼ阻害剤(例えば、イマチニブメシル酸塩、ニロチニブ、又はダサチニブ)と組み合わせて投与することができることが、企図される。特に、アントラサイクリン系薬剤は、乳腺腫瘍細胞においてインターフェロン応答を開始させて、CXCL5産生並びにマクロファージ化学遊走及び活性化を誘導することが公知である。CD47遮断と組み合わせてのIFNの腫瘍限局投与は、これらの薬剤の有効性を増大させると予想される。
【００５９】
多発性骨髄腫の処置の場合、本発明の組合せを、他の化学療法剤、例えばメルファラン塩酸塩、又は上に列挙した化学療法剤とともに、又はそれらなしで、現行の治療、例えば、ステロイド剤、例えばデキサメタゾン、プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ若しくはカルフィルゾミブ)、免疫調節薬(例えば、サリドマイド、レナリドミド若しくはポマリドミド)と組み合わせて投与することができることが、企図される。
【００６０】
ホジキンリンパ腫の処置の場合、本発明の組合せを、現行の治療アプローチ、例えば、ABVD(アドリアマイシン(ドキソルビシン)、ブレオマイシン、ビンブラスチン、及びダカルバジン)、又はスタンフォードV(ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、メクロレタミン、エトポシド、プレドニゾン)、又はBEACOPP(ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、プロカルバジン、エトポシド、プレドニゾン)と組み合わせて投与することができることが、企図される。
【００６１】
非ホジキンリンパ腫又は他のリンパ腫の場合、本発明の組合せを現行の治療アプローチと組み合わせて投与することができることが、企図される。非ホジキンリンパ腫用に承認されている薬物の例としては、アビトレキサート(メトトレキサート)、アドリアマイシンPFS(ドキソルビシン塩酸塩)、アドリアマイシンRDF(ドキソルビシン塩酸塩)、アンボクロリン(Ambochlorin)(クロラムブシル)、アンボクロリン(Amboclorin)(クロラムブシル)、アラノン(ネララビン)、ベンダムスチン塩酸塩、ベキサール(トシツモマブ及びヨードI 131トシツモマブ)、ブレノキサン(ブレオマイシン)、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、クロラムブシル、クラフェン(シクロホスファミド)、シクロホスファミド、シトキサン(シクロホスファミド)、デニロイキンジフチトクス、DepoCyt(シタラビン内包リポソーム)、ドキソルビシン塩酸塩、DTIC-Dome(ダカルバジン)、フォレックス(メトトレキサート)、フォレックスPFS(メトトレキサート)、フォロチン(プララトレキサート)、イブリツモマブチウキセタン、イストダックス(ロミデプシン)、ロイケラン(クロラムブシル)、リンホリジン(Linfolizin)(クロラムブシル)、シタラビン内包リポソーム、マチュレーン(プロカルバジン塩酸塩)、メトトレキサート、メトトレキサートLPF (メトトレキサート)、メキサート(メトトレキサート)、メキサート-AQ(メトトレキサート)、モゾビル(プレリキサフォル)、ネララビン、ネオサール(シクロホスファミド)、オンタック(デニロイキンジフチトクス)、プレリキサフォル、プララトレキサート、リツキサン(リツキシマブ)、リツキシマブ、ロミデプシン、トシツモマブ及びヨードI 131トシツモマブ、トレアンダ(ベンダムスチン塩酸塩)、ベルバン(ビンブラスチン硫酸塩)、ベルケイド(ボルテゾミブ)、及びベルサール(ビンブラスチン硫酸塩)、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサールPFS(ビンクリスチン硫酸塩)、ビンクリスチン硫酸塩、ボリノスタット、ゼヴァリン(イブリツモマブチウキセタン)、ゾリンザ(ボリノスタット)が挙げられる。非ホジキンリンパ腫の処置に使用される複合薬の例としては、CHOP(C=シクロホスファミド、H=ドキソルビシン塩酸塩(ヒドロキシダウノマイシン)、O=ビンクリスチン硫酸塩(オンコビン)、P=プレドニゾン); COPP(C=シクロホスファミド、O=ビンクリスチン硫酸塩(オンコビン)、P=プロカルバジン塩酸塩、P=プレドニゾン); CVP(C=シクロホスファミド、V=ビンクリスチン硫酸塩、P=プレドニゾン); EPOCH(E=エトポシド、P=プレドニゾン、O=ビンクリスチン硫酸塩(オンコビン)、C=シクロホスファミド、H=ドキソルビシン塩酸塩(ヒドロキシダウノマイシン)); ICE(I=イホスファミド、C=カルボプラチン、E=エトポシド)及びR-CHOP(R=リツキシマブ、C=シクロホスファミド、H=ドキソルビシン塩酸塩(ヒドロキシダウノマイシン)、O=ビンクリスチン硫酸塩(オンコビン)、P=プレドニゾン)が挙げられる。
【００６２】
本発明の組合せとレチノイドとの組合せも企図される。レチノイドは、成長、視覚、生殖、上皮細胞分化及び免疫機能をはじめとする多くの生体機能において主要な役割を果す分子のファミリーである(Meyskens, F.ら、Crit Rev Oncol Hematol 3:75頁、1987、Herold, M.ら、Acta Dermatovener 74:29頁、1975)。レチノール、全トランス型レチノイン酸すなわちATRAを、いずれか単独で又は他の薬剤と組み合わせて用いる初期前臨床研究により、急性前骨髄球性白血病(APL)、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病(CML)、菌状息肉症及び多発性骨髄腫に対する活性が実証された(Smith, M.、J. Clin. Oncol.、10:839頁、1992において総説されている)。これらの研究は、APLの処置のためのATRAの承認につながった。現在、100件を超える治験により、血液悪性腫瘍、腎がん、肺がん、扁平上皮癌及びその他の処置のために他の治療と組み合わせてATRAの活性が評価されている。ATRAとの併用時のインターフェロン-α処置の有効性増強を実証する研究は、特に興味深く、本発明に直接関係する。これは、マントル細胞リンパ腫(Col, J.ら、Cancer Res. 72:1825頁、2012)、腎細胞癌(Aass, N.ら、J. Clin. Oncol. 23:4172頁、2005; Motzer, R.、J. Clin. Oncol. 18:2972頁、2000)、CML、メラノーマ、骨髄腫及び腎細胞癌(Kast, R.、Cancer Biology and Therapy、7:1515頁、2008)並びに乳がん(Recchia, F.ら、J. Interferon Cytokine Res. 15:605頁、1995)について言える。それ故、本発明者らは、診療所でのATRAの治療的投与と併用時の、本発明者らの標的化された減弱IFNとCD47遮断の組合せについての、活性増強を予測する。加えて、Mehta(Mol Cancer Ther 3(3):345〜52頁、2004)により、白血病細胞のレチノイン酸でのin vitro処置がCD38抗原の発現を誘導することが実証された。かくして、インターフェロンの有効性増強プラス標的CD38の発現誘導が、CD38を発現する、又はATRAによりCD38を発現するように誘導することができるIFN感受性のがんの処置における、ATRAと本発明者らの抗CD38抗体-減弱IFNαとの併用療法を指し示すことになった。そのようながんの例は、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、CML及びAMLである。
【００６３】
I型IFNは、がん細胞上のI型IFN受容体の直接的刺激に基づいて抗がん活性を有することができる。これは、多発性骨髄腫、メラノーマ、B細胞リンパ腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、卵巣がん、線維肉腫、子宮頸がん、膀胱がん、星細胞腫、膵がん等を含む、非常に多くのタイプのがんについて証明されている(Borden、Cancer Research 42:4948〜53頁、1982; Chawla-Sarkar、Clinical Cancer Research 7: 1821〜31頁、2001; Morgensen、Int J. Cancer 28:575〜82頁、1981; Otsuka、British Journal of Haematology 103:518〜529頁、1998; Lindner、J of Interferon and Cytokine Research 17:681〜693頁、1997; Caraglia、Cell Death and Differentiation 6:773〜80頁、1999; Ma、World J Gastroenterol 11(10):1521〜8頁、2005)。当業者には、本発明が、減弱I型インターフェロンと融合している、腫瘍関連抗原に対する抗体と、CD47遮断との組合せの結果として得られる、多くの態様を有すること、及び結果として得られる融合タンパク質構築物を使用して、対応する腫瘍関連抗原を発現する様々なインターフェロン感受性がんの増殖を低減させることができることが分かる。
【００６４】
シグナル伝達リガンドの多くのその他の例も、当技術分野において公知であり、上記の非限定的な例に記載のように、それらを減弱させ、特異的標的細胞上の抗原と結合する抗体と結合させることができ、それによって、リガンドは、それらの標的細胞上でその生物学的シグナルを、該リガンドが抗原陰性細胞上でそのシグナルを生成するよりはるかに大きい程度に生成することができる。腫瘍形成性マクロファージ誘導又は刺激活性を有するリガンドの例としては、TNFα、Fasリガンド、IFNβ、IFNγ又はIFNλが挙げられ、これらを、IFNαについて上で論じたように様々な腫瘍細胞表面抗原に標的化することができ、CD47遮断と併用することができる。
【００６５】
本明細書で使用される用語「抗体」は、広義には、4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖で構成されている任意の免疫グロブリン(Ig)分子、又はIg分子の必須エピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的断片、突然変異体、変異体若しくは誘導体を指す。そのような突然変異体、変異体又は誘導体抗体形式は、当技術分野において公知であり、これらの非限定的な実施形態は、下記で論じられる。
【００６６】
完全長抗体における各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではHCVR又はVHと略記される)及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、CH1、CH2及びCH3という、3つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではLCVR又はVLと略記される)及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、CLという1つのドメインで構成され、このドメインは、ヒトの場合、κ又はλクラスのどちらかでありうる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存される領域が散在している、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に、更に細分されうる。各VH及びVLは、3つのCDR及び4つのFRで構成され、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で配置されている。免疫グロブリン分子は、いずれのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスのものであってもよい。
【００６７】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部分」という用語は、抗原(例えば、CD38)と特異的に結合する能力を保持する、抗体又はタンパク質の1つ又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能を完全長抗体の断片が果すことができることは証明されている。そのような抗体実施形態は、2つ以上の異なる抗原と特異的に結合する、二重特異性、デュアルスペシフィック又は多重特異性形式であることもある。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価断片である、Fab断片;(ii)ヒンジ領域の一部に加えて、該ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている2つのFab断片を含む、二価断片である、F(ab')2断片;(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなる、Fv断片;(v)単一の可変ドメインを含む、ドメイン抗体(dAb) (参照により本明細書に組み込まれている、Wardら、1989 Nature 341 544〜6頁、Winterら、PCT公開WO 90/05144 A1);及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。更に、Fv断片の2つのドメインであるVL及びVHは、別々の遺伝子によりコードされているが、それら2つのドメインを、VL領域とVH領域が対合して一価の分子(一本鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Birdら、1988 Science 242 423〜6頁; Hustonら、1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879〜83頁を参照されたい)を形成している単一のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーにより、組換え法を使用して、連結させることができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。ダイアボディ等の、一本鎖抗体のその他の形態も、包含される。ダイアボディは、VH及びVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、短すぎて同じ鎖上のこれら2つのドメイン間の対合を可能ならしめることができないリンカーを使用し、その結果、それらのドメインが別の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、2つの抗原結合部位が生成される、二価の二重特異性抗体である(例えば、Holliger, P.ら、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁; Poljak, R. J.ら、1994、Structure 2:1121〜1123頁を参照されたい)。そのような抗体結合部分は、当技術分野において公知である(Kontermann及びDubel編、Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag社、New York、790頁、ISBN 3-540-41354-5)。ある実施形態では、抗体結合部分は、Fab断片である。
【００６８】
本明細書に記載の抗体は、ヒト化抗体であってもよい。用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からのFRにグラフト結合しているか又は挿入された非ヒト種(例えば、マウス又はラット又は非ヒト霊長類)からの抗体からのCDRを含むヒト様可変領域を含むタンパク質を指すと解されるものとする(このタイプの抗体は、「CDRグラフト抗体」とも称される)。ヒト化抗体は、ヒトタンパク質の1つ又は複数の残基が、1つ若しくは複数のアミノ酸置換により修飾されている、及び/又はヒトタンパク質の1つ若しくは複数のFR残基が、対応する非ヒト残基により置換されている、タンパク質も含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体にも非ヒト抗体にも見られない残基を含むこともある。タンパク質の任意の追加領域(例えば、Fc領域)は、一般にヒトのものである。ヒト化は、当技術分野において公知の方法、例えば、米国特許5,225,539号、米国特許6,054,297号、米国特許7,566,771号、又は米国特許5,585,089号を使用して、行うことができる。用語「ヒト化抗体」は、例えば米国特許第7,732,578号に記載されているような、超ヒト化抗体も包含する。
【００６９】
本明細書に記載の抗体は、ヒトのものであってもよい。本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、ヒトに見られる、例えば、ヒト生殖系列若しくは体細胞に見られる、可変及び任意選択で定常抗体領域を有するタンパク質、又はそのような領域を使用して生成されたライブラリーからのタンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によりコードされていないアミノ酸残基、例えば、in vitroでのランダム又は部位特異的突然変異により導入された突然変異(特に、タンパク質の少数の残基、例えば、タンパク質の1、2、3、4又は5つの残基における保存的置換又は突然変異を含む、突然変異)を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は、必ずしもヒトの免疫応答の結果として生成される必要はなく、むしろ、組換え手段(例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング)を使用して、並びに/又はヒト抗体定常及び/若しくは可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物(例えば、マウス)により、並びに/又は誘導選択(guided selection)(例えば、米国特許5,565,332号に記載されているような)を使用して、それらを産生することができる。この用語は、そのような抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示では、ヒトタンパク質はまた、ヒト抗体からのFRを含むか又はヒトFRのコンセンサス配列からの配列を含むFRを含むタンパク質であって、CDRの1つ又は複数がランダム又はセミランダムである、例えば、米国特許第6,300,064号及び/又は米国特許第6,248,516号に記載されているような、タンパク質を含むと考えるものとする。
【００７０】
本発明のポリペプチドの抗体部分は、いずれの抗体クラスの、好ましくはIgG1、IgG2又はIgG4の、完全長抗体であってもよい。そのような抗体の定常ドメインは、好ましくはヒトのものである。そのような抗体の可変領域は、非ヒト由来のものであってもよく、又は好ましくは、ヒト由来のものであってもよく若しくはヒト化されていてもよい。抗体断片を完全長抗体の代わりに使用することもできる。
【００７１】
用語「抗体」は、改変抗体も含む。分かるであろうが、改変抗体の多くの異型がある(例えば、マウスモノクローナル、キメラ、ヒト化及びヒトモノクローナル抗体、一本鎖可変抗体断片(scFv)、ミニボディ、アプタマー、並びに上記の二重特異性抗体及びダイアボディ)。
【００７２】
単一可変領域ドメイン(dAbと呼ばれる)は、例えば、(Wardら、1989、Nature 341: 544〜546頁; Hamers-Castermanら、1993、Nature 363: 446〜448頁; Davies及びRiechmann、1994、FEBS Lett. 339: 285〜290頁)に開示されている。
【００７３】
ミニボディは、一本鎖に全抗体の必須要素をコードしている、全抗体の小型バージョンである。好適には、ミニボディは、例えば米国特許第5,837,821号に開示されているように、免疫グロブリン分子のヒンジ領域及びCH3ドメインと融合している、天然抗体のVH及びVLドメインで構成される。
【００７４】
代替実施形態では、本発明により提供されるポリペプチド構造の抗体部分は、非免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークを含むこともある。例えば、抗原結合のために選択された、CDRを生成するためにランダムに選ばれた2つのループを有する、4ヘリックスバンドルシトクロムb562を開示している、(Ku及びSchutz、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6552〜6556頁)を参照してもよい。当技術分野において公知の、更なる非免疫グロブリン足場としては、小モジュール免疫薬(small modular immunopharmaceuticals)(例えば、米国特許出願公開第20080181892号及び同第20080227958号を参照されたい)、テトラネクチン、フィブロネクチンドメイン、プロテインA、リポカリン、アンキリンリピート、及びチオレドキシンが挙げられる。非免疫グロブリン足場に基づく分子は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、又は高親和性結合配列を同定するための当技術分野において公知のその他の技術による、ライブラリーのin vitro選択によって、一般に産生される。
【００７５】
当技術分野において周知の方法を使用して、結合を例えば親和性成熟により増加させること、又は予測MHCクラスII結合モチーフの除去により免疫原性を低下させることが可能である。本明細書に記載の抗体の治療的有用性は、それらの機能特性、例えば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞貪食(ADCP)、血清半減期、生体内分布及びFc受容体への結合、又はこれらのいずれかについての組合せを調節することにより、更に向上させることができる。この調節は、タンパク質工学、糖鎖工学又は化学的方法により達成することができる。要求される治療応用に依存して、これらの活性のいずれかを増加させることが有利であることもあり、減少させることが有利であることもあるだろう。
【００７６】
糖鎖工学の一例は、Shinkawa T.ら、2003 (J Biol Chem 278: 3466〜73頁)に記載されているようなPotelligent(登録商標)法を使用する。
【００７７】
非常に多くの抗体親和性成熟方法が、当技術分野において公知である。これらの多くは、突然変異誘発により変異タンパク質のパネル又はライブラリーを生成し、その後、改善された親和性について選択及び/又はスクリーニングする、一般な方策に基づく。突然変異誘発は、例えば、エラープローンPCR(Thie、Voedischら、2009、Methods Mol Biol 525: 309〜322頁)により、遺伝子シャフリング(Kolkman及びStemmer 2001、Nat Biotechnol. 5月; 19(5):423〜8頁)により、変異誘発化学剤若しくは照射の使用により、エラープローン複製機構を有するミューテーター株(Greener 1996、In Vitro Mutagenesis Protocols.、Humana press社、NJ)の使用により、又は天然の親和性成熟機構を利用する体細胞高頻度突然変異アプローチ(Peled、Kuangら、2008、Annu Rev Immunol. 26:481〜511頁)により、DNAレベルで行われることが多い。突然変異誘発を、例えばQβレプリカーゼの使用により、RNAレベルで行うこともできる(Kopsidas、Robertsら、2006、Immunol Lett. 2006年11月15日; 107(2):163〜8頁)。改善された変異タンパク質のスクリーニングを可能にする、ライブラリーに基づく方法は、ファージ、酵母、リボソーム、細菌又は哺乳動物細胞等の様々なディスプレイ技術に基づくものでありえ、そのような方法は、当技術分野において周知である(Benhar 2007、Expert Opin Biol Ther. 5月; 7(5): 763〜79頁)。親和性成熟は、より指向性の高い/予測的な方法によって、例えば、部位特異的突然変異誘発、又は3Dタンパク質モデリングからの研究結果により導かれる遺伝子合成によって、達成することができる(例えば、Queen、Schneiderら、1989、PNAS、86(24): 10029〜33頁、又は米国特許第6,180,370号、又は米国特許第5,225,539号を参照されたい)。
【００７８】
ADCCを増加させる方法は、Ferrara、Brunkerら、2006、Biotechnol Bioeng; 93:851〜61頁; Li、Sethuramanら、2006、Nat Biotechnol; 24:210〜5頁; Stavenhagen、Gorlatovら、2007、Cancer Res; 67:8882〜90頁; Shields、Namenukら、2001、J Biol Chem; 276:6591〜604頁; Shinkawa、Nakamuraら、2003、J Biol Chem; 278:3466〜73頁;及びWO 2008/006554により記載されている。
【００７９】
腫瘍細胞のマクロファージ貪食を増強するFcγRIIaとの結合を増強する、Fc領域における突然変異を行うこともできる。これらには、S239D、I332E及びG236Aが含まれる。(Richards, J.ら、2008 Mol. Canc. Ther.、8巻、2517頁)。
【００８０】
CDCを増加させる方法は、Idusogie、Wongら、2001、J Immunol; 176:346〜56頁; Dall'Acqua、Cookら、2006, J Biol Chem; 281:23514〜24頁; Michaelsen、Aaseら、1990、Scand J Immunol; 32:517〜28頁; Brekke、Bremnesら、1993、Mol Immunol; 30:1419〜25頁; Tan、Shopesら、1990、PNAS; 87:162〜6頁;及びNorderhaug、Brekkeら、1991、Eur J Immunol; 21:2379〜84頁により記載されている。
【００８１】
ADCPを増加させる方法は、Braster、O'Tooleら、2014、Methods; 65:28〜37頁、Gul及びEgmond、2015、Cancer Res; 75:5008〜5013頁に記載されている。
【００８２】
ADCC及びCDCを増加させる方法を記載している参考文献としては、Natsume、Inら、2008、Cancer Res; 68:3863〜72頁が挙げられる。これらの参考文献の各々についての開示は、相互参照により本明細書に含まれる。
【００８３】
抗体血清半減期及び生体内分布を調節するための多数の方法は、抗体と、IgGを異化しないように保護すること及び高い血清抗体濃度を維持することに肝要な役割を有する受容体である新生児型Fc受容体(FcRn)との間の相互作用を調節することに基づく。Dall'Acquaらは、FcRnへの結合親和性を増強することによって血清半減期を増加させる、IgG1のFc領域における置換を記載し(Dall'Acqua、Woodsら、2002、J Immunol; 169:5171〜80頁)、M252Y/S254T/T256E(EUインデックスによる残基番号付けで)又はM265Y/S267T/T269 (Kabat番号付けシステムによる残基番号付けで)の三重置換でのバイオアベイラビリティの向上及びADCC活性の調節を更に実証している(Dall'Acqua、Kienerら、2006、J Biol Chem; 279:6213〜6頁)。米国特許第6,277,375号、同第6,821,505号及び同第7,083,784号も参照されたい。Hintonらは、in vivo半減期の増加をもたらす、250及び428位における定常ドメインアミノ酸置換を記載した(Hinton、Johlfsら、2004、J Biol Chem; 279:6213〜6頁; Hinton、Xiongら、2006、J Immunol; 176:346〜56頁)。米国特許第7,217,797号も参照されたい。Petkovaらは、in vivo半減期増加をもたらす、307、380及び434位における定常ドメインアミノ酸置換を記載した(Petkova、Akileshら、2006、Int Immunol; 18:1759〜69頁)。Shieldsら、2001、J Biol Chem; 276:6591〜604頁、及びWO 2000/42072も参照されたい。Fc受容体への結合、及びこれらの受容体により媒介されるその後の機能(FcRn結合及び血清半減期を含む)を調節する、定常ドメインアミノ酸置換の他の例は、米国特許出願公開第20090142340号、同第20090068175号及び同第20090092599号に記載されている。Kabatの場合と同様にEUインデックスに従って番号付けされる「S228P」と本明細書で称される置換は、Kabatら(1987 Sequences of proteins of immunological interest、United States Department of Health and Human Services、Washington DC.)に従って「S241P」とも称されている。この置換は、IgG4分子のヒンジ領域を安定させ、これには、IgG1又はIgG2アイソタイプ抗体のものと同じヒンジ領域のコアの配列を作製する効果がある。この置換により、結果として、ヘテロ二量体IgG4抗体の産生に至ることが多い重鎖の自然解離及び再会合が低減されることになる。
【００８４】
抗体分子に連結されたグリカンが、抗体とFc受容体及びグリカン受容体との相互作用に影響を及ぼし、それによって、血清半減期をはじめとする抗体活性に影響を及ぼすことは、公知である(Kaneko、Nimmerjahnら、2006、Science; 313:670〜3頁; Jones、Papacら、2007、Glycobiology; 17:529〜40頁;及びKanda、Yamadaら、2007、Glycobiology; 17:104〜18頁)。それ故、所望の抗体活性を調節するある特定のグリコフォームは、治療上の利点をもたらすことができる。改変グリコフォームを生成する方法は、当技術分野において公知であり、これらに限定されないが、米国特許第6,602,684号、米国特許第7,326,681号、米国特許第7,388,081号及びWO 2008/006554に記載されているものを含む。
【００８５】
ポリエチレングリコール(PEG)の付加による半減期の延長は、例えば、Fishburn 2008、J Pharm Sci; 97:4167〜83頁により総説されているように、タンパク質の血清半減期を延長するために広範に使用されている。
【００８６】
分かるであろうが、本発明の配列内で保存的アミノ酸置換を行うことが可能である。「保存的置換」とは、類似の特性を有するアミノ酸を意味する。本明細書で使用される、次のアミノ酸群は、保存的置換と見なすことができる: H、R及びK; D、E、N及びQ; V、I及びL; C及びM; S、T、P、A及びG;並びにF、Y及びW。しかし、具体的に挙げられているもの以外の置換が減弱及び/グリコシル化部位で行われることは、意図されない。
【００８７】
本明細書で使用される用語「細胞表面関連抗原」は、限定ではないが悪性細胞又は感染細胞又は外来細胞を含む、細胞の表面に発現される任意の抗原を広く指す。
【００８８】
本発明の組合せは、CD47アンタゴニストを含む。CD47アンタゴニストは、CD47のSIRPαとの結合を抑制する。CD47のSIRPαとの結合を弱めることが公知である多数の分子がある。多数のこれらの分子は、相互参照により本明細書に含まれる次の参考文献に開示されている:
米国特許第7,282,556号、米国特許第8,101,719号、米国特許第8,562,997号、米国特許第8,758,750号、米国特許第9,017,675号、米国特許第9,045,541号、米国特許第9,221,908号、米国特許出願公開第2012/0189625号、米国特許出願公開第2012/0282174号、米国特許出願公開第2014/0140989号、米国特許出願公開第2014/0161805号、米国特許出願公開第2014/0199308号、米国特許出願公開第2015/0274826号、米国特許出願公開第2015/0329616号、米国特許出願公開第2015/0353642号、米国特許出願公開第2016/0008429号、米国特許出願公開第2016/0009814号、及び米国特許出願公開第2016/0009815号。
【００８９】
一部の実施形態では、CD47アンタゴニストは、抗体、好ましくはモノクローナル抗体であることが好ましい。一部の実施形態では、抗CD47抗体は、エフェクター機能を欠く。
【００９０】
エフェクター機能を除去するための、当技術分野において公知の様々な方法がある。1つは、残基N297におけるN結合型グリコシル化部位の、アラニン等の別の残基への置換である(実施例において示されるような置換であり、「非グリコシル化」と称される)。他の方法としては、N297をグリコシル化しない細胞宿主における(例えば、大腸菌(E. coli)における)抗体(N297を含む)の作製が挙げられる。別の方法は、Fcの関連エフェクター機能部分が除去されている抗原結合抗体断片(Fab、Fab'2、scFv、Fv等)の使用である。別の方法は、ペプチド:N-グリカーゼF (PNGase F)等のグリコシダーゼでの残基N297のグリコシル化を除去することである。エフェクター機能を除去する他の方法は、様々なFcγ受容体との結合を消失させる様々な公知のFc突然変異の1つ又は複数を含めることである。
【００９１】
ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号510又は534の重鎖と、配列番号509の軽鎖とを含む。上記の通り、一部の特定の実施形態では、抗CD47抗体は、非グリコシル化状態である。例示的な非グリコシル化抗体配列は、配列番号509及び534で示される。
【００９２】
本発明のある特定の態様では、本発明の組合せ又は組成物は、がんを有する患者を処置するために使用される。本明細書で企図されるがんは、それらの細胞の特異化した異なる細胞への分化が一切ない無制御細胞増殖(例えば、腫瘍の形成)を特徴とする、疾患及び障害群を含む。そのような疾患及び障害には、ABL1癌原遺伝子、AIDS関連がん、聴神経腫瘍、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、副腎皮質がん、血管新生骨髄化生、脱毛症、胞巣状軟部肉腫、肛門がん、血管肉腫、再生不良性貧血、星細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、基底細胞癌(皮膚)、膀胱がん、骨がん、腸がん、脳幹神経膠腫、脳及びCNS腫瘍、乳がん、カルチノイド腫瘍、子宮頸がん、小児脳腫瘍、小児がん、小児白血病、小児軟部組織肉腫、軟骨肉腫、絨毛癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸がん、皮膚T細胞リンパ腫、隆起性皮膚線維肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、腺管癌、内分泌がん、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん(esophageal cancer)、ユーイング肉腫、肝外胆管がん、眼のがん、眼:メラノーマ、網膜芽細胞腫、卵管がん、ファンコニ貧血、線維肉腫、胆嚢がん、胃がん、胃腸がん、胃腸カルチノイド腫瘍、尿生殖器がん、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、婦人科がん、血液悪性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、肝細胞がん、遺伝性乳がん、組織球増殖症、ホジキン病、ヒトパピローマウイルス、胞状奇胎、高カルシウム血症、下咽頭がん、眼内メラノーマ、膵島細胞がん、カポジ肉腫、腎がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、平滑筋肉腫、白血病、リ・フラウメニ症候群、口唇がん、脂肪肉腫、肝がん、肺がん、リンパ浮腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、男性乳がん、悪性腎ラブドイド腫瘍、髄芽腫、メラノーマ、メルケル細胞がん、中皮腫、転移がん、口のがん、多発性内分泌腺腫症、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害、鼻腔がん、上咽頭がん、腎芽腫、神経芽腫、神経線維腫症、ナイミーヘン染色体不安定症候群、非メラノーマ皮膚がん、非小細胞肺がん-(NSCLC)、眼がん、食道がん(oesophageal cancer)、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、オストミー卵巣がん(ostomy ovarian cancer)、膵がん、
副鼻腔がん、副甲状腺がん、耳下腺がん、陰茎がん、末梢性神経外胚葉性腫瘍、下垂体がん、真正赤血球増加症、前立腺がん、希少がん及び関連障害、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ロスムンド・トムソン症候群、唾液腺がん、肉腫、シュワン腫、セザリー症候群、皮膚がん、小細胞肺がん(SCLC)、小腸がん、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、有棘細胞癌(皮膚)、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、移行上皮がん(膀胱)、移行上皮がん(腎盂/尿管)、絨毛性がん、尿道がん、泌尿器系がん、ウロプラキン、子宮肉腫、子宮癌、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症並びにウィルムス腫瘍が含まれる。ある実施形態では、腫瘍は、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫の群から選択される。
【００９３】
がんの処置が企図される場合の本発明の組合せのポリペプチド構築物の抗体部分は、腫瘍関連抗原、すなわち、がん細胞により選択的に発現される又はがん細胞において大部分の正常な細胞と比較して過剰発現される細胞表面抗原と、結合することができる。当技術分野において公知の多くの腫瘍関連抗原(TAA)がある。TAAの非限定的な例としては、酵素チロシナーゼ;メラノーマ抗原GM2;アルファフェトプロテイン(AFP);癌胎児抗原(CEA);ムチン1(MUC1);ヒト上皮増殖因子受容体(Her2/Neu); T細胞白血病/リンパ腫1(TCL1)腫瘍性タンパク質が挙げられる。多数の異なるがんと関連する例示的なTAAは、テロメラーゼ(hTERT);前立腺特異的膜抗原(PSMA);ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びその受容体(uPA/uPAR);血管内皮増殖因子及びその受容体(VEGF/VEGFR);細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質(EMMPRIN/CD147)上皮増殖因子(EGFR);血小板由来増殖因子及びその受容体(PDGF/PDGFR)並びにc-kit (CD117)である。
【００９４】
他のTAAのリストは、米国特許出願公開第2010/0297076号において提供されており、前記特許文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれている。特に興味深いのは、これらに限定されないが、CD38、CD138、CD79、CS1及びHM1.24を含む、多発性骨髄腫、白血病又はリンパ腫細胞に関連する細胞表面抗原である。一実施形態では、リガンド-減弱IFN構築物、例えば、抗体-減弱インターフェロン構築物の抗原は、CD38である。
【００９５】
CD38は、46kDaのII型膜貫通糖タンパク質である。CD38は、20アミノ酸の短いN末端細胞質側テールと、一回膜貫通ヘリックスと、256アミノ酸の長い細胞外ドメインとを有する(Bergsagel, P.、Blood; 85:436頁、1995、及びLiu, Q.、Structure、13:1331頁、2005)。CD38は、CD4及びCD8陽性T細胞、B細胞、NK細胞、単球、形質細胞を含む、多くの免疫細胞の表面で、及びかなりの割合の正常骨髄前駆細胞上に発現される(Malavasi, F.、Hum. Immunol. 9:9頁、1984)。しかし、リンパ球では、その発現が細胞の分化及び活性化状態に依存するように見える。休止T及びB細胞は、CD38発現について陰性であるが、未熟及び活性化リンパ球は、主として陽性である(Funaro, A.、J. Immunol. 145:2390頁、1990)。更なる研究は、非造血器官、例えば、膵臓、脳、脾臓及び肝臓におけるmRNA発現を示している(Koguma, T.、Biochim. Biophys. Acta 1223:160頁、1994)。
【００９６】
CD38は、膜貫通シグナル伝達及び細胞接着に関与する多機能的エクト型酵素である。CD38は、NAD+及びNADP+を細胞外pHに依存してcADPR、ADPR及びNAADPに変換することができるため、サイクリックADPリボースヒドロラーゼとしても公知である。これらの産物は、細胞内へのCa2+動員を誘導し、この動員は、チロシンリン酸化及び細胞の活性化につながりうる。CD38は、リガンドと相互作用することができる受容体、CD31でもある。CD31による受容体の活性化は、Ca2+動員、細胞活性化、増殖、分化及び遊走をはじめとする、細胞内事象につながる(Deaglio, S.、Trends in Mol. Med. 14:210頁、2008において総説されている)。
【００９７】
CD38は、多発性骨髄腫細胞上に、T及びB細胞系急性リンパ芽球性白血病の殆どの症例、一部の急性骨髄球性白血病、濾胞中心細胞リンパ腫及びTリンパ芽球性リンパ腫において、高レベルで発現される。(Malavasi, F.、J. Clin Lab Res. 22:73頁、1992)。つい最近、CD38発現は、B細胞系慢性リンパ芽球性白血病(B-CLL)における信頼性の高い予後マーカーになった(Ibrahim, S.、Blood. 98:181頁、2001及びDurig, J.、Leuk. Res. 25:927頁、2002)。独立したグループにより、CD38+クローンを提示するB-CLL患者は、病期の進行を伴う好ましくない臨床経過、化学療法への応答性不良及びより短い生存期間を特徴とすることが実証された(Morabito, F.、Haematologica. 87:217頁、2002)。リンパ系腫瘍におけるCD38の一貫した増強発現により、このCD38は治療用抗体技術の魅力的な標的になる。
【００９８】
CD38を標的とする抗体の例は、米国特許第7829672号、米国特許出願公開第2009/0123950号、米国特許出願公開第2009/304710号、WO 2012/092612、WO 2014/178820、及び米国特許出願公開第2002/0164788号に提供されている。これらの参考特許文献各々についての開示は、相互参照により本明細書に含まれる。本発明は、これらの参考特許文献に開示されている抗CD38抗体を、対象における腫瘍の処置において、減弱ポリペプチドシグナル伝達リガンドとともに又はそれなしで、CD47アンタゴニストと一緒に使用することにまで及ぶ。特に興味深いのは、WO 2014/178820に開示されている範囲の抗CD38抗体である。
【００９９】
CD38以外の抗原は、当技術分野において周知であり、そのような抗原の非タンパク質の例としては、スフィンゴ脂質、ガングリオシドGD2(Salehら、1993、J. Immunol.、151、3390〜3398頁)、ガングリオシドGD3(Shitaraら、1993、Cancer Immunol. Immunother. 36:373〜380頁)、ガングリオシドGM2(Livingstonら、1994、J. Clin. Oncol. 12:1036〜1044頁)、ガングリオシドGM3(Hoonら、1993、Cancer Res. 53:5244〜5250頁)、並びにタンパク質又は糖脂質上に提示されうるルイスx、ルイスy及びルイスxy糖鎖抗原が挙げられる。タンパク質抗原の例は、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6又は-E7、MUC-1; KS1/4汎癌抗原(Perez及びWalker、1990、J. Immunol. 142:3662〜3667頁; Bumal、1988、Hybridoma 7(4):407〜415頁);卵巣癌抗原CA125(Yuら、1991、Cancer Res. 51(2):468〜475頁);前立腺性酸性ホスファターゼ(Tailorら、1990、Nucl. Acids Res. 18(16):4928頁);前立腺特異的抗原(Henttu及びVihko、1989、Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903〜910頁; Israeliら、1993、Cancer Res. 53:227〜230頁);メラノーマ関連抗原p97 (Estinら、1989、J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445〜446頁);メラノーマ抗原gp75(Vijayasardahlら、1990、J. Exp. Med. 171(4):1375〜1380頁);前立腺特異的膜抗原;癌胎児抗原(CEA) (Foonら、1994、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294頁)、MUC16(抗体は、MJ-170、MJ-171、MJ-172及びMJ-173[米国特許第7,202,346号]、3A5[米国特許第7,723,485号]を含む)、NMB(米国特許第8,039,593号)、悪性ヒトリンパ球抗
原-APO-1(Bernhardら、1989、Science 245:301〜304頁);高分子量メラノーマ抗原(HMW-MAA)(Nataliら、1987、Cancer 59:55〜63頁; Mittelmanら、1990、J. Clin. Invest. 86:2136〜2144頁);バーキットリンパ腫抗原-38.13; CD19(Ghetieら、1994、Blood 83:1329〜1336頁);ヒトBリンパ球抗原-CD20(Reffら、1994、Blood 83:435〜445頁); GICA 19-9(Herlynら、1982、J. Clin. Immunol. 2:135頁)、CTA-1及びLEA; CD33(Sgourosら、1993、J. Nucl. Med. 34:422〜430頁);腫瘍胎児抗原、例えば、肝がんのアルファ-フェトプロテイン、又は膀胱腫瘍胎児抗原(Hellstromら、1985、Cancer. Res. 45:2210〜2188頁);分化抗原抗原、例えば、ヒト肺癌抗原L6又はL20(Hellstromら、1986、Cancer Res. 46:3917〜3923頁);線維肉腫の抗原;ヒト白血病T細胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjeeら、1988、J. Immunol. 141:1398〜1403頁);腫瘍特異的移植型細胞表面抗原(TSTA)、例えばウイルス誘発移植抗原(T抗原、DNA腫瘍ウイルス、及びRNA腫瘍ウイルス外被抗原を含む);ネオ糖タンパク質、乳がん抗原、例えば、EGFR(上皮増殖因子受容体)、多形性上皮ムチン(PEM) (Hilkensら、1992、Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359頁);多形性上皮ムチン抗原;ヒト乳脂肪球抗原;結腸直腸腫瘍関連抗原、例えば、TAG-72(Yokataら、1992、Cancer Res. 52:3402〜3408頁)、CO 17-1A(Ragnhammarら、1993、Int. J. Cancer 53:751〜758頁);分化抗原(Feizi、1985、Nature 314:53〜57頁)、例えば、異腺癌に見られるI(Ma)、骨髄腫細胞に見られるSSEA-1、乳腺上皮がんに見られるVEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、M18及びM39、結腸直腸がんに見られるD156-22、TRA-1-85(血液型H)、結腸腺癌に見られるC14、肺腺癌に見られるF3、胃がんに見られるAH6、胎児性癌細胞に見られるYハプテン、TL5(血液型A)、膵がんに見られるE1系列(血液型B)抗原、胎児性癌細胞に見られるFC10.2、胃腺癌抗原、腺癌に見られるCO-514(血液型Lea)、腺癌に見られるNS-10、CO-43(血液型Leb)、A431細胞に見られるG49、結腸がんに見られる19.9;胃がんムチン;メラノーマに見られるR24、結腸腺癌に見られるMH2(血液型ALeb/Ley)、胎児性癌細胞に見られる4.2、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2及びM1:22:25:8、並びにSSEA-3及びSSEA-4である。HMW-MAA(配列番号390)、別名メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンは、外科手術により除去された良性母斑及びメラノーマ病変の90%より多くに過剰発現される、2322残基の膜結合タンパク質である(Camploiら、Crit Rev Immunol.;24:267頁、2004)。したがって、このHMW-MAAは、標的細胞表面関連抗原である可能性がありうる。
【０１００】
本発明の組合せの融合タンパク質構築物での標的化の対象となるがん抗原の他の例としては次のものが挙げられる(例示的ながんをカッコ内に示す): CD5(T細胞白血病/リンパ腫)、CA15-3(癌腫)、CA19-9(癌腫)、L6(癌腫)、CA 242(結腸直腸)、胎盤アルカリホスファターゼ(癌腫)、前立腺性酸性ホスファターゼ(前立腺)、MAGE-1(癌腫)、MAGE-2(癌腫)、MAGE-3(癌腫)、MAGE -4(癌腫)、トランスフェリン受容体(癌腫)、p97(メラノーマ)、MUC1(乳がん)、MART1(メラノーマ)、CD20(非ホジキンリンパ腫)、CD52(白血病)、CD33(白血病)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(癌腫)、CD38(多発性骨髄腫)、CD21(B細胞リンパ腫)、CD22(リンパ腫)、CD25(B細胞リンパ腫)、CD37(B細胞リンパ腫)、CD45(急性骨髄芽球性白血病)、HLA-DR(B細胞リンパ腫)、IL-2受容体(T細胞白血病及びリンパ腫)、CD40(リンパ腫)、CD79(B細胞白血病又はリンパ腫、ホジキンリンパ腫)、様々なムチン(癌腫)、P21(癌腫)、MPG(メラノーマ)、Ep-CAM(上皮腫瘍)、葉酸受容体アルファ(卵巣)、A33(結腸直腸)、G250(腎)、フェリチン(ホジキンリンパ腫)、de2-7 EGFR(膠芽腫、乳房及び肺)、線維芽細胞活性化タンパク質(上皮)及びテネイシンメタロプロテイナーゼ(膠芽腫)。一部の特異的な、有用な抗体には、BR64(Trailら、1997、Cancer Research 57:100 105頁)、BR96 mAb(Trailら、1993、Science 261:212〜215頁)、CD40抗原に対するmAb、例えば、S2C6 mAb(Franciscoら、2000、Cancer Res. 60:3225〜3231頁)又は他の抗CD40抗体、例えば、米国特許出願公開第2003-0211100号及び同第2002-0142358号に開示されているもの; CD30抗原に対するmAb、例えば、AC10(Bowenら、1993、J. Immunol. 151:5896〜5906頁; Wahlら、2002 Cancer Res. 62(13):3736〜42頁)又はMDX-0060(米国特許出願公開第2004-0006215号)、並びにCD70に対するmAb、例えば、1F6 mAb及び2F2 mAb(例えば、米国特許出願公開第2006-0083736号を参照されたい)又は抗体2H5、10B4、8B5、18E7、69A7(米国特許第8,124,738号)が含まれるが、これらに限定されない。他の抗体は、他の所で総説されている(Frankeら、2000、Cancer Biother. Radiopharm. 15:459 76頁; Murray、2000、Semin. Oncol. 27:64 70頁; Breitling, F.及びDubel, S.、Recombinant Antibodies, John Wiley, and Sons社、New York、1998)。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、有用な抗体は、標的細胞上に発現される受容体又は受容体の複合体と結合することができる。これらの受容体又は受容体複合体は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー、主要組織適合性タンパク質、サイトカイン受容体、TNF受容体スーパーファミリーメンバー、ケモカイン受容体、インテグリン、レクチン、補体制御タンパク質、増殖因子受容体、ホルモン受容体又は神経伝達物質受容体を含みうる。適切な免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、CD22、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1、B7-H4、B7-H3、及びICOSである。好適なTNF受容体スーパーファミリーメンバーの非限定的な例は、TACI、BCMA、CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/0X40、CD137/4-1BB、TNFR1、TNFR2、RANK、破骨細胞分化抑制因子、APO 3、Apo2/TRAIL R1、TRAIL R2、TRAIL R3、及びTRAIL R4である。好適なインテグリンの非限定的な例は、CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD103及びCD104である。好適なレクチンの非限定的な例は、S型、C型及びI型レクチンである。CEAに対する抗体の例を、Table 1(表1)に示す。
【０１０２】
【表１】
2019521169.tif 000002
【０１０３】
ヒトB細胞上に発現されるCD22抗原に結合する抗体には、例えば、HD6、RFB4、UV22-2、To15、4KB128及びヒト化抗CD22抗体(hLL2)が含まれる(例えば、Liら(1989) Cell. Immunol. 111: 85〜99頁; Masonら(1987) Blood 69: 836〜40頁; Behrら(1999) Clin. Cancer Res. 5: 3304s〜3314s頁; Bonardiら(1993) Cancer Res. 53: 3015〜3021頁を参照されたい)。
【０１０４】
CD33に対する抗体には、例えば、HuM195(例えば、Kossmanら(1999) Clin. Cancer Res. 5: 2748〜2755頁;米国特許第5693761号を参照されたい)及びCMA-676(例えば、Sieversら(1999) Blood 93: 3678〜3684頁を参照されたい)が含まれる。
【０１０５】
実例となる抗MUC-1抗体としては、Mc5(例えば、Petersonら(1997) Cancer Res. 57: 1103〜1108頁; Ozzelloら(1993) Breast Cancer Res. Treat. 25: 265〜276頁を参照されたい)、及びhCTMO1(例えば、Van Hofら(1996) Cancer Res. 56: 5179〜5185頁を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
実例となる抗TAG-72抗体としては、CC49(例えば、Pavlinkovaら(1999) Clin. Cancer Res. 5: 2613〜2619頁を参照されたい)、B72.3(例えば、Divgiら(1994) Nucl. Med. Biol. 21: 9〜15頁を参照されたい)、及び米国特許第5,976,531号に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
実例となる抗HM1.24抗体としては、マウスモノクローナル抗HM1.24及びヒト化抗HM1.24 IgG1カッパ抗体(例えば、Onoら(1999) Mol. Immuno. 36: 387〜395頁を参照されたい)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、標的化部分は、抗Her2抗体を含む。erBB 2遺伝子は、より一般的には(Her-2/neu)として知られており、膜貫通受容体をコードする癌遺伝子である。Her-2/neuに対する幾つかの抗体が開発されており、これらの一部は、臨床使用されている。これらには、トラスツズマブ(例えば、HERCEPTIN(商標)、Fornirら(1999) Oncology (Huntingt) 13: 647〜58頁)、TAB-250(Rosenblumら(1999) Clin. Cancer Res. 5: 865〜874頁)、BACH-250(同書)、TA1(Maierら(1991) Cancer Res. 51: 5361〜5369頁)、並びに米国特許第5,772,997号、同第5,770,195号(mAb 4D5; ATCC CRL 10463)、及び米国特許第5,677,171号に記載されているmAbが含まれる。
【０１０９】
他の完全ヒト抗Her-2/neu抗体は、当業者に周知である。そのような抗体には、C6抗体、例えば、C6.5、DPL5、G98A、C6MH3-B1、B1D2、C6VLB、C6VLD、C6VLE、C6VLF、C6MH3-D7、C6MH3-D6、C6MH3-D5、C6MH3-D3、C6MH3-D2、C6MH3-D1、C6MH3-C4、C6MH3-C3、C6MH3-B9、C6MH3-B5、C6MH3-B48、C6MH3-B47、C6MH3-B46、C6MH3-B43、C6MH3-B41、C6MH3-B39、C6MH3-B34、C6MH3-B33、C6MH3-B31、C6MH3-B27、C6MH3-B25、C6MH3-B21、C6MH3-B20、C6MH3-B2、C6MH3-B16、C6MH3-B15、C6MH3-B11、C6MH3-B1、C6MH3-A3、C6MH3-A2、及びC6ML3-9が含まれるが、これらに限定されない。これら及び他の抗HER2/neu抗体は、米国特許第6,512,097号及び同第5,977,322号に、PCT公開WO 97/00271に、Schierら(1996) J Mol Biol 255: 28〜43頁、Schierら(1996) J Mol Biol 263: 551〜567頁等に記載されている。
【０１１０】
より一般的には、上皮増殖因子受容体ファミリーの様々なメンバーに対する抗体は、本発明の構築物における標的化抗体又は抗原結合部分としての使用によく適している。そのような抗体には、米国特許第5,844,093号及び同第5,558,864号に、並びに欧州特許第706,799号Aに記載されているような抗EGFR抗体が含まれるが、これらに限定されない。他の実例となる抗EGFRファミリー抗体としては、C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8及びHER4.C7等のような抗体が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2006/0099205号A1及び同第2004/0071696号A1を参照されたい)。
【０１１１】
CD38は、本発明の融合タンパク質構築物の抗体標的として特に興味深い。CD38に対する抗体には、例えば、ダラツムマブ、AT13/5(例えば、Ellisら(1995) J. Immunol. 155: 925〜937頁を参照されたい)、HB7、WO 2014/178820に開示されている抗体(この開示は、参照により本明細書に組み込まれている)等が含まれる。好ましい抗CD38抗体の配列は、配列番号506及び507として提供される。
【０１１２】
本発明は、本発明の組合せを含む1つ又は複数の組成物も提供する。これらの組成物は、任意の好適な助剤の少なくとも1つ、例えば、これらに限定されないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存薬、アジュバント等を更に含むことができる。薬学的に許容される助剤が好ましい。そのような滅菌溶液及びそれらの調製方法の非限定的な例は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、Gennaro編、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing社(Easton、Pa.) 1990等がある。当技術分野において周知であるような又は本明細書に記載されるような抗体組成物の投与方法、溶解度及び/又は安定性に好適な、薬学的に許容される担体を、通常通り選択することができる。
【０１１３】
本組成物に有用な医薬品賦形剤及び添加剤には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質及び炭水化物(例えば、単糖類、二、三、四及びオリゴ糖類;誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖等;並びに多糖類又は糖ポリマーを含む、糖)が含まれるが、これらに限定されず、これらは、個々に又は組合せで存在し、単独で又は組合せで1〜99.99質量%又は体積%を構成しうる。例示的なタンパク質賦形剤としては、血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA)、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。緩衝能力の点も機能することができる代表的なアミノ酸には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテーム、これらの組合せ、例えばアルギニン-ヒスチジン緩衝剤等が含まれる。1つの好ましいアミノ酸は、ヒスチジンである。第2の好ましいアミノ酸は、アルギニンである。
【０１１４】
本発明での使用に好適な炭水化物賦形剤には、例えば、単糖類、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボース等;二糖類、例えば、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース等;多糖類、例えば、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン類、デキストラン類、デンプン類等;及びアルジトール類、例えば、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール(グルシトール)、ミオイノシトール等が含まれる。本発明での使用に好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース及びラフィノースである。
【０１１５】
抗体組成物は、緩衝剤又はpH調整剤も含むことができ、典型的に、緩衝剤は、有機酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤には、有機酸塩、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸又はフタル酸の塩; Tris、トロメタミン塩酸塩、リン酸緩衝液又はアミノ酸緩衝剤が含まれる。本組成物での使用に好ましい緩衝剤は、有機酸塩、例えばクエン酸塩、又はアミノ酸である。
【０１１６】
加えて、本発明の組成物は、高分子賦形剤/添加剤、例えば、ポリビニルピロリドン、フィコール(ポリマー糖)、デキストレート類(例えば、シクロデキストリン、例えば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン)、ポリエチレングリコール、着香剤、抗菌薬、甘味料、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤(例えば、ポリソルベート、例えば「TWEEN(登録商標) 20」及び「TWEEN(登録商標) 80」)、脂質類(例えば、リン脂質、脂肪酸)、ステロイド類(例えば、コレステロール)、及びキレート剤(例えば、EDTA)を含むことができる。
【０１１７】
本発明による抗体組成物での使用に好適なこれらの及び更なる公知医薬品賦形剤及び/又は添加剤は、例えば、「Remington: The Science & Practice of Pharmacy」、第19版、Williams & Williams社、(1995)、及び「Physician's Desk Reference」、第52版、Medical Economics社、Montvale、N.J. (1998)に挙げられているように、当技術分野において公知であり、これらの開示は、全てが参照により本明細書に組み込まれる。好ましい担体又は賦形剤材料は、炭水化物(例えば、糖類及びアルジトール類)及び緩衝剤(例えば、クエン酸塩)又は高分子剤である。
【０１１８】
本明細書に記載の本発明には具体的に記載のもの以外の変更形態及び修飾形態を受け入れる余地があることは、当業者には理解される。本発明が、その趣旨及び範囲に入る、全てのそのような変更形態及び修飾形態を含むことは、理解されるはずである。本発明は、本明細書において個々に又は集合的に言及する又は示すステップ、特徴、組成物及び化合物の全ては勿論、前記ステップ又は特徴のいずれか2つ以上の任意の又は全ての組合せも含む。
【０１１９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は均等の任意の材料及び方法を使用して本発明を実施又は試験することができるが、好ましい材料及び方法を次に説明する。
【実施例】
【０１２０】
(実施例1)
骨髄腫異種移植片モデルにおける、CD38-減弱IFNα2bの確固たる永続的な抗腫瘍活性
NCI-H929形質細胞性骨髄腫細胞を、標準増殖培地及び条件で対数増殖期浮遊培養物として維持した。移植に使用する腫瘍細胞を対数期増殖中に採取し、50%マトリゲル(BD Biosciences社)に細胞1x108個/mLの濃度で再浮遊させた。腫瘍細胞1x107個(0.1mLの細胞浮遊液)を、8〜9週齢メス重症複合免疫不全(SCID)マウスの左側腹部に皮下移植した。このモデルでは、CD38+骨髄腫腫瘍細胞は、血管が新生された皮下腫瘤として増殖する。処置を開始する前に、腫瘍を平均体積150mm3に増殖させた。ノギスを用いて二次元で腫瘍を測定してサイズをモニターした。マウス(10匹/コホート)に、5mg/kgの、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(配列番号507/508)、若しくは減弱IFNα2bと融合している無関係抗体からなるアイソタイプ対照融合タンパク質、又は0.2mLの固定体積の媒体での、週2回、4週間の腹腔内処置を施した。腫瘍体積をモニターした。平均(+/- SEM)腫瘍体積を図1に提示する。結果は、このモデルにおける抗CD38-減弱インターフェロンα2b融合タンパク質の確固たる抗腫瘍活性を示し、10匹のマウスのうち10匹が、腫瘍の消失、及び処置中止後にその後の再出現がないこと(「治癒」応答)を示した。減弱IFNα2bと融合している無関係抗体で処置した動物も、媒体対照で処置した動物も、治癒しなかった。
【０１２１】
(実施例2)
応答性骨髄腫モデルH929における、抗CD38-減弱インターフェロンα2b融合タンパク質活性へのマクロファージの関与
実施例1で例証した抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)の確固たる抗腫瘍活性を媒介する機序を分析するために、未処置又は対照処置マウスに対して処置マウスから腫瘍を切除し、免疫組織化学的検査により評価した。実施例1で説明したように細胞を増殖させ、調製し、マウスに移植した。処置を開始する前に、腫瘍を平均体積600〜750mm3に増殖させた。マウス(12匹/コホート)に、PBS、10mg/kgの、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(配列番号507/508)、又は減弱IFNα2bと融合している無関係抗体からなるアイソタイプ対照融合タンパク質での腹腔内処置を、1及び4日目に施した(図2A中のx軸の上に示されている黒矢印)。腫瘍サイズを毎日測定し、平均(+/-SEM)腫瘍体積を図2Aにプロットした。選択した時点(灰色矢印)で、各群からの3匹のマウスから腫瘍を切除し、下で詳細に説明する免疫組織化学評価のために凍結した。切除した腫瘍からの断面(各群から2つ)を腫瘍サイズ比較のためにマウントし、ヘマトキシリンで染色した。
【０１２２】
切除した腫瘍切片を用いて免疫組織化学分析(図2B)を行った。使用したマーカーは、マウス白血球のためのCD45(ラット抗マウスCD45、abcam社#ab25386、5.0μg/ml)、マウスマクロファージのためのF4/80(ラット抗マウスF4/80、abcam社#ab6640、10.0μg/ml)、ラットIgG2bアイソタイプ対照(ラットIgG2b、abcam社#ab18531、10μg/ml)、M1マクロファージマーカーとしての誘導性一酸化窒素シンテターゼ(iNOS)(ウサギ抗マウスiNOS、novus社#NBP1-33780、1:1,000)、及びウサギIgG対照(invitrogen社#086199)であった。染色したスライドを光学顕微鏡で検査し、CD45+、F4/80+、及びiNOS+浸潤物の定量を行った。
【０１２３】
CD45及びF4/80染色は、全ての腫瘍において非常に類似したパターンを示した。これは、CD45+浸潤細胞が主としてマウスマクロファージからなることを示す。3つの処置群からのex vivo腫瘍の比較は、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質で処置されたマウスの腫瘍への大量のマクロファージ浸潤を示したが、対照処置腫瘍へのそのような浸潤を示さなかった(今はデータを示さない)。このモデルでは、マクロファージ浸潤が処置の開始後24時間の時点で観察され、5日目にピークに達した。
【０１２４】
マクロファージ浸潤を示す腫瘍周径の百分率、腫瘍表面から腫瘍内へのマクロファージ浸透の深さ、並びにマクロファージ浸潤物及び間質に置き換えられた腫瘍細胞塊の破壊又は喪失を含む、複数の基準に基づいて、マクロファージ浸潤及び侵入性の程度を視覚的に評定し、スコア化した。スコア「0」は、腫瘍塊全体にわたって均一に点在するCD45+(残留マクロファージ)浸潤並びに無傷の明確な腫瘍周縁及び嚢を示した。スコア「10」は、腫瘍境界に沿った高密度のマクロファージ浸潤、腫瘍径の10%超えて外側の腫瘍辺縁部を超えるマクロファージの深い浸透、腫瘍細胞塊の有意な分解、並びにマクロファージ及び/又は間質に置き換えられた腫瘍の高い割合(≧50%)を示した。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質で処置したマウスの腫瘍は、図2Bに示されているように、3、5及び7日目に、媒体又は減弱IFNα2bと融合している無関係抗体の対照マウスよりかなり高いスコアを示した。これは、腫瘍の崩壊に関連した、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質により媒介されるマクロファージ侵入を示唆する。各々の棒は、単一のマウスを代表するものである。腫瘍切片のiNOS免疫組織化学的検査は、浸潤するマクロファージが、主として、殺腫瘍活性を示すことが公知であるM1マクロファージサブタイプのものであることを示した。これは、マクロファージ浸潤が、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質で観察された確固たる抗腫瘍有効性に関与したことを示唆する。
【０１２５】
(実施例3)
非応答性腎細胞がんモデル786-0における、抗ヒトHLA-減弱インターフェロンα2b融合タンパク質活性へのマクロファージの関与
非応答性異種移植片腫瘍モデルにおけるマクロファージ浸潤の役割を調査した。この研究は、実施例1及び実施例2で説明した多発性骨髄腫異種移植片モデルと同様の方法で行った。ヒトHLA発現786-0腎細胞癌細胞10,000,000個をマトリゲルとともにSCIDマウスに移植し、腫瘍を平均体積500mm3まで増殖させた。マウスを、PBS、又は10mg/kgの抗HLA-減弱IFNα2b(HB95-IgG4)融合タンパク質(配列番号521若しくは522)で、図3Aに黒矢印により示されている時点で処置した。この融合タンパク質に使用した抗HLA抗体は、ヒト特異的であり、したがって、ヒト腫瘍細胞と結合したが、いずれのマウス細胞とも結合しなかった。1群当たり3匹のマウスから腫瘍を、灰色矢印により示されている時点で切除した。マクロファージ浸潤の免疫組織化学分析及び定量を上記の通りに行った。このモデルは、非応答性異種移植片腫瘍を使用するので、抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質で処置したこれらのヒト腫瘍を移植したマウスは、図3A及び図3Bでそれぞれ例証されるように、抗腫瘍応答を示さず、マクロファージの浸潤増加を示さなかった。抗腫瘍応答の欠如及びマクロファージ浸潤の欠如は、標的化された抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質への腫瘍の曝露後のマクロファージ浸潤度と抗腫瘍応答度の関連性と一致している。
【０１２６】
(実施例4)
マクロファージ欠損マウス株でのin vivo実験は、永続的な抗腫瘍応答のためのマクロファージの必要性を暗示する
NCI-H929多発性骨髄腫細胞株を使用する追加のモデルを検査して、確固たる抗腫瘍応答におけるマクロファージ活性の役割を更に評価した。これらのモデルでは、各々が異なる免疫系欠損を有する3つのマウス株(Table 2(表2)に要約する)を、骨髄腫腫瘍の宿主として使用した。SCID株は、適応免疫系のT及びB細胞成分が欠けているが、樹状細胞、マクロファージ、NK細胞及び補体をなお有する。NOD-SCID株は、樹状細胞、マクロファージ及びNK細胞が欠損しており、機能的補体系が欠けている。NSG細胞株は、樹状細胞及びマクロファージが欠損しており、NK細胞と機能的補体の両方が欠けている。
【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
この研究では、CD38発現NCI-H929細胞107個を、各マウスの左側腹部に皮下移植した。処置を開始する前に、腫瘍を平均体積150mm3に増殖させた。マウス(10匹/コホート)を、5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b (h10A2-IgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)又は媒体で、週2回、4週間処置した。腫瘍体積を毎日モニターし、図4にプロットした。SCIDマウスでは10匹のマウスのうちの10匹が治癒した(処置中止後に腫瘍の再増殖が見られなかった)が、NOD-SCIDでは10匹のマウスのうちの2匹のみが治癒し、いずれのNSCマウスも治癒しなかった。
【０１２９】
無傷のマクロファージを有するSCIDマウスは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質の投与後に確固たる治癒応答を示したが、NOD-SCID及びNSGは、単球/マクロファージ欠損を有し、かなり弱い確固たる応答を示した。これは、マクロファージ及び樹状細胞が、確固たる治癒有効性を媒介するのに役立ったことを裏付ける。マクロファージ区画欠損のあるマウス株において観察された、完全な応答ではなく遅延した応答は、腫瘍細胞に対するヒトIFNαの直接的な抗増殖活性を表す可能性が高い。この効果は、腫瘍増殖を遅延させるが、完全な治癒応答をもたらすことは殆どなかった。
【０１３０】
(実施例5)
in vivoでのマクロファージの枯渇
機能的マクロファージ活性が、CD38抗体により標的化された減弱I型インターフェロン融合タンパク質への永続的な応答に必要であるかどうかを更に詳しく調査するために、クロンドロン酸内包リポソームを使用してマクロファージを化学的に枯渇させたSCIDマウスにおいて、CD38発現NCI-H929異種移植片モデルを実施した。
【０１３１】
遊離クロドロン酸は、リポソームのリン脂質二重層又は無傷の細胞膜を容易に通過しないが、クロドロン酸を充填したリポソームは、マクロファージにより貪食される。媒体としてリポソームを使用してクロンドロン酸を貪食マクロファージに送達すると、リポソームのリン脂質二重層が、リソソームホスホリパーゼの影響を受けて破壊され、薬物が細胞質に放出され、そこに蓄積する。細胞内のクロンドロン酸が閾値濃度を超えると、細胞は、不可逆的に損傷され、アポトーシスにより死滅する(J. Immunol. Meth. 193: 93〜99頁、1996)。死滅したマクロファージ又は溶解したリポソームから放出された一切の遊離クロンドロン酸は、腎臓系により循環血から迅速に除去されるので、循環血中で極度に短い半減期を有する。
【０１３２】
実施例1で説明したようにNCI-H929腫瘍細胞を増殖させ、調製し、移植した。処置を開始する前に、腫瘍を平均体積150mm3に増殖させた。マウス(10匹/コホート)に、クロンドロン酸内包リポソーム処置とともに、又はそれなしで、5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10a2-IgG4)融合タンパク質(配列番号507及び配列番号508)での週2回、4週間の静脈内処置を施した。クロンドロン酸内包リポソーム(Encapsula Nano Sciences LLC社から5mg/mLの懸濁液として購入した)を懸濁させ、-2、0、1、3、6、10及び17日目に(抗CD38-減弱IFNα2bの投与濃度に対して)0.1mLをi.v.投与した。腫瘍体積を週2回、定期的にモニターし、図5に示されている通り平均(+/-SEM)腫瘍体積をプロットした。
【０１３３】
クロンドロン酸内包リポソーム処置なしの全てのマウスは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質での処置後に治癒したが、クロンドロン酸内包リポソームの投与により、腫瘍は遅れた速度でではあるが増殖し続ける結果となった。前の研究結果と一致して、クロンドロン酸内包リポソームを使用するマクロファージの枯渇は、完全腫瘍根絶を(4/10匹の動物において)妨げた。これは、マクロファージが、完全腫瘍除去をもたらす応答における重要な成分であることを示す。
【０１３４】
(実施例6)
Fcガンマ受容体(FcγR)結合の重要性についてのin vivoでの評価:
マクロファージは、抗体依存性細胞貪食(ADCP)若しくは抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)等の様々な抗体依存性機序によって、又は抗体非依存性機序(Int.J.Cancer、46、682〜686頁、1990)によって、腫瘍細胞を殺滅することができる。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質処置に伴って起こる、マクロファージに基づく腫瘍細胞殺滅が、抗体依存性であるのか、又は非依存性であるのかを判定するために、本発明者らは、この融合タンパク質のヒトIgG4 Fc領域内のグリコシル化部位を除去するN297A置換を有する、修飾された抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質を利用した。このグリコシル化部位の除去は、融合タンパク質の免疫グロブリン部分が、マクロファージ等のエフェクター細胞上のFcγRに結合できないようにし、それ故、Fcは、ADCCもADCPも媒介することができない。
【０１３５】
この研究では、NCI-H929骨髄腫細胞を、前に実施例1で説明したように増殖させ、調製し、移植した。腫瘍が150mm3に達したときに処置(合計4週間、週2回)を開始した。PBS、又は5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、又は5mg/kgの、抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質の非グリコシル化変異体(N297A)(配列番号531及び507)のいずれかで、群を処置した。腫瘍サイズを定期的に測定し、平均腫瘍体積を図6にプロットした。結果は、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質が、確固たる治癒的抗腫瘍応答のために機能的FcγR相互作用を必要とすることを示した。これは、ADCP及び/又はADCCを、確固たる腫瘍排除の作用機序と関係付ける。
【０１３６】
(実施例7)
マクロファージ活性の増強
CD47:SIRPα系は、マクロファージのADCP媒介抗腫瘍活性に関与することが記載されている。抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質を使用して抗腫瘍活性へのこの系の寄与を評定するために、下記の通り、他者(Liuら、2015、Nature Medicine)により報告されたような有効性モデルの処置期中に市販の抗ヒトCD47遮断抗体(B6H12.2 Bio X cell、0019-1)を投与した。一部の例では、グリコシル化された市販抗体(配列番号513/514)を使用し、他の例では、非グリコシル化変異体(配列番号515/516)を使用した。
【０１３７】
血液悪性腫瘍モデル: NCI-H92骨髄腫
抗CD38-減弱IFNa2b融合タンパク質(最適以下の用量で)と非グリコシル化抗CD47抗体の併用療法の有効性を、実施例1に記載のものに類似したNCI-H929メラノーマ異種移植片モデルで評価した。50%マトリゲル中のH929細胞10,000,000個を、8〜9週齢メスSCIDマウスの側腹部に皮下(s.c.)接種した。腫瘍が平均サイズ150mm3に達したときに処置を開始した。マウス(各群中n=10)に、(a)媒体(PBS)、(b)2mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、(c)5mg/kgの非グリコシル化(エフェクター機能を除去するために)抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体(配列番号515/516)、(d)2mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体、又は(e)2mg/kgの抗CD38(h10A2-hIgG4)抗体プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体、のいずれかでの腹腔内(i.p.)処置を施した。全ての融合タンパク質及び抗CD38抗体を、週2回、4週間投与した。非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体は、1日おきに14日間投与した。腫瘍体積をモニターした。平均(+/- SEM)腫瘍体積を図7に提示する。この研究では、最適以下の用量での抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質構築物は、ある程度の腫瘍阻害を示し、治癒的ではなかったが、CD47遮断と併用したとき、その確固たる抗腫瘍退縮が回復され、治癒的であった(10/10匹の動物が治癒した)。
【０１３８】
血液悪性腫瘍モデル: RPMI-8226メラノーマ
CD38発現RPMI-8226細胞10,000,000個を、SCIDマウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍が平均サイズ130〜170mm3に達したときに処置を開始した。マウスを、(a)媒体、(b)週2回、4週間、最適以下の用量(3mg/kg)の抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、又は(c)1日おきに14日間、5mg/kgの非グリコシル化抗CD47抗体(B6H12、IgG1)(配列番号515/516)、又は(d)個々の薬剤と同じ投与レジメンで別々に投与される、3mg/kgの抗CD38抗体(h10A2-IgG4)(配列番号506/507)及び非グリコシル化抗CD47抗体のレジメン、又は(e)個々の薬剤と同じ投与レジメンで別々に投与される、3mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質及び非グリコシル化抗CD47抗体、のいずれかのi.p.注射で処置した。腫瘍体積(+/- SEM)を週2回測定し、図8に示されている通り平均腫瘍体積をプロットした。
【０１３９】
単独での抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質療法、及び抗CD38抗体と非グリコシル化抗CD47の組合せは、RPMI-8226骨髄腫異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖のある程度の阻害を発揮したが、腫瘍は、薬剤のこの組合せでは完全に消散されなかった。単独での非グリコシル化抗CD47抗体での処置にも効果がなかった。抗CD47抗体と抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質の組合せは、確固たる相乗的応答を誘導し、研究終了時には8/10匹のマウスが治癒した。
【０１４０】
血液悪性腫瘍モデル: OPM2骨髄腫
多発性骨髄腫のCD38発現OPM2骨髄腫細胞株モデルは、概して、抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質での処置に対して弱くしか応答しなかった。本発明者らは、抗CD47抗体との併用処置が抗腫瘍活性を強化するかどうかを調査した。OPM-2細胞1x107個を、SCIDマウスの側腹部に皮下移植した。腫瘍が平均サイズ130〜170mm3に達したときに処置を開始した。マウスを、(a)媒体、又は(b)週2回、4週間、5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(h10A2-IgG4)(配列番号507/508)、又は(c)週2回、4週間、抗CD38抗体(h10A2-IgG4)(配列番号506/507)、又は(d)1日おきに14日間、5mg/kgの非グリコシル化(エフェクター機能の寄与を排除するために)抗CD47抗体(配列番号515/516)、又は単剤について記載した投薬量での(e)抗CD38抗体と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せレジメン若しくは(f)抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せレジメン、のいずれかのi.p.注射で処置した。平均腫瘍体積(+/- SEM)を週2回モニターし、図9に示されている通りプロットした。
【０１４１】
抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質のみ又は単独での抗CD38抗体又は単独での抗CD47抗体の投与により治癒したマウスは、いなかった。抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と抗CD47の組合せは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質の活性を強化し、この併用レジメンで処置した10匹のマウスのうち5匹が、処置停止後に腫瘍がない状態を維持した。
【０１４２】
固形腫瘍悪性病変モデル: A375メラノーマ
本発明者らは、メラノーマ固形腫瘍モデルにおいて、抗体により標的化された減弱IFNα2b活性へのCD47:SIRPα系の寄与も評価した。ヒトHLAと結合するがマウスHLAとは結合しないHB95抗体(Barnstableら、1978、Cell 14:9〜20頁)を使用してA375ヒトメラノーマ細胞株から生成した腫瘍を用いて胸腺欠損ヌードマウスにおいて異種移植片研究を行った。マトリゲルと混合したA375細胞10,000,000個を、胸腺欠損ヌードマウスに移植した。腫瘍が、1000mm3に達したら、腫瘍を切除し、断片化し、小さい断片を新たな宿主に再移植した。第3継代で断片を胸腺欠損ヌードマウスに移植した。腫瘍が、平均体積170〜200mm3に達したときに処置を開始した(0日目)。マウスを、(a)媒体、又は(b)週2回、4週間、5mg/kgの、抗ヒトHLA(HB95-IgG4)抗体により標的化された減弱IFNα2b融合タンパク質(配列番号567/568)、又は(c)1日おきに14日間、5mg/kgでの抗CD47抗体(配列番号513/514)、又は(d)抗ヒトHLA抗体により標的化された減弱IFNα2b融合タンパク質と抗CD47抗体との組合せ、又は(e)アイソタイプ対照無関係抗体-減弱インターフェロンα2b融合タンパク質構築物と抗CD47抗体との組合せ、のいずれかのi.p.投与によって処置した。腫瘍体積(平均+/- SEM)を週2回モニターし、図10に示されている通り平均腫瘍体積をプロットした。
【０１４３】
ヒトHLAに標的化された抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質は、ヒトHLAと結合するがマウスHLAと結合しないHB95抗体(Barnstableら、1978、Cell 14:9〜20頁)に基づくものであり、したがって、これらの研究の「普遍的」代理標的としての役割を果す。この異種移植片モデルでは、単独での抗HLA抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質処置でも、単独での抗CD47抗体でも、活性は見られなかった。しかし、これら2種の処置を併用したとき、有意な腫瘍増殖遅延が観察された。アイソタイプ対照無関係抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質を使用して、腫瘍増殖の阻害は観察されなかった。
【０１４４】
血液悪性腫瘍モデル: ARP-1骨髄腫
抗CD38抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質構築物と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せを、難治性骨髄腫モデルにおいて調査した。ARP-1形質細胞性骨髄腫細胞を、標準増殖培地及び条件で対数増殖期浮遊培養物として維持した。移植に使用した腫瘍細胞は、対数期増殖中に採取した。50%マトリゲル中のARP-1細胞5,000,000個を、SCIDマウスの側腹部にs.c.接種した。腫瘍が平均サイズ150mm3に達したときに処置を開始した。マウス(各群中n=8)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、(c)単独での5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)(配列番号515/516)抗体、(d)5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体(配列番号515/516)、又は(e)5mg/kgの抗CD38(h10A2-hIgG4)抗体(配列番号506/507)プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体、のいずれかのi.p.注射で処置した。全ての融合タンパク質及びCD38抗体を、週2回、4週間、与えた。抗CD47抗体は、1日おきに14日間、与えた。腫瘍体積を週2回モニターし、図11に示されている通り平均腫瘍体積(SEM)をプロットした。このモデルでは、CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体(B6H12-mIgG1)の併用処置のみが、腫瘍を消散させることができた(7/8匹の動物が治癒した)。
【０１４５】
血液悪性腫瘍モデル: ARP-1骨髄腫(CD47の2つの個々のクローン)
抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と2つの異なる抗CD47抗体(クローン2A1及びクローン5F9)の組合せ(それぞれ、配列番号517/518及び配列番号519/520)を、難治性骨髄腫モデルARP-1において調査した。このARP-1難治性骨髄腫異種移植片モデルを、上記の通り実施した。腫瘍が平均サイズ150mm3に達したときに処置を開始した。マウス(各群中n=10)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、(c)単独での5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(2A1-mIgG1)(配列番号517/518)抗体、(d)単独での5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(5F9-IgG-mIgG1)(配列番号519/520)抗体、(e)5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(2A1-mIgG1)抗体、又は(f)5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質と5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(5F9-mIgG1)抗体、のいずれかのi.p.注射で処置を施した。全ての抗CD38抗体融合タンパク質を、週2回、4週間投与した。抗CD47抗体は、1日おきに14日間投与した。平均腫瘍体積を週2回モニターし、図12に示されている通り平均腫瘍体積(+/-SEM)をプロットした。抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体クローン2A1又は5F9(mIgG1)のいずれかとの併用処置は、このモデルにおいて骨髄腫異種移植片を完全に消散させることができた(10/10匹の動物が治癒した)。
【０１４６】
血液悪性腫瘍モデル:ヘアリー細胞白血病
ヒトヘアリー細胞白血病モデルに対する抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質の影響を調査した。HC-1ヘアリー細胞白血病細胞を、標準増殖培地及び条件で対数増殖期浮遊培養物として維持した。腫瘍細胞を対数期増殖中に採取し、食塩水に細胞1x107個/mLの濃度で再浮遊させた。生理食塩水中のHC-1細胞1,000,000個を、各SCIDマウスにi.v.注射した。処置を接種の5日後に開始し、生存率を週2回モニターした(図13A)。マウス(各群中n=10)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗HLA-減弱IFNα2b(HB95-hIgG4)融合タンパク質(配列番号521/522)、(c)単独での5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、又は(d)単独での5mg/kgのアイソタイプ対照無関係抗体-減弱IFNα2b(hIgG4)融合タンパク質の、いずれかのi.p.注射で処置した。全ての融合タンパク質を、週2回、4週間投与した。この白血病モデルでは、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(単剤として)は、陽性対照抗ヒトHLA-減弱IFNα2b抗体融合タンパク質(33日まで100%TFS)と比較して生存率に対して殆ど影響を与えなかった(33日目まで10%の無腫瘍生存率(TFS))。特筆すべきこととして、CD38は、この細胞株上にHLAより有意に低いレベルで発現され、このことにより、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質の小規模な活性を説明することができる。
【０１４７】
抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質構築物と非グリコシル化抗CD47抗体の併用療法の影響について、HC-1ヘアリー細胞白血病モデルを調査した。生理食塩水中のHC-1細胞1,000,000個を、各SCIDマウスにi.v.注射した。処置を接種の5日後に開始し、生存率を週2回モニターした(図12B)。マウス(各群中n=10)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗HLA-減弱IFNα2b(HB95-hIgG4)融合タンパク質(配列番号521/522)、(c)5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)と5mg/kgの非グリコシル化抗CD47抗体(B6H12-mIgG1)(配列番号515/516)の組合せ、(d)5mg/kgのアイソタイプ対照無関係抗体-減弱IFNα2b(IgG4)融合タンパク質と5mg/kgの非グリコシル化抗CD47抗体(B6H12-mIgG1)の組合せ、又は(e)単独での5mg/kgの抗CD20-減弱IFNα2b(抗CD20-hIgG4)融合タンパク質(配列番号525/526)、又は(f)5mg/kgの抗CD20-減弱IFNα2b(抗CD20-hIgG4)融合タンパク質(配列番号525/526)と非グリコシル化抗CD47抗体(B6H12-mIgG4)の組合せの、いずれかのi.p.注射で処置した。全ての融合タンパク質を、週2回、4週間与えた。抗CD47抗体は、1日おきに14日間、与えた。
【０１４８】
このモデルでは、単独での抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質が10%のTFSしかもたらさなかった、図13Aに提示した結果と比較して、抗ヒトCD38-減弱IFNα2b(h10A2-hIgG4)融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体の組合せで動物の生存率向上(40% TFS)が観察された。抗CD20-減弱IFNα2b(抗CD20-hIgG4)融合タンパク質と非グリコシル化CD47の組合せでも生存率向上(20% TFS)が観察された。(図13B)。
【０１４９】
血液悪性腫瘍モデル: CCRF CEM、T細胞急性リンパ芽球様白血病
抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と抗CD47ネイキッド抗体の組合せは、細胞株CCRF CEMに基づくT細胞急性リンパ芽球様白血病モデルにおいて抗腫瘍応答増強をもたらした。CCRF CEM、T細胞急性リンパ芽球様白血病細胞を、標準増殖培地及び条件で対数増殖期浮遊培養物として維持した。移植に使用した腫瘍細胞は、対数期増殖中に採取した。生理食塩水中のCCRF CEM細胞5,000,000個を、SCIDマウスにi.v.接種した。処置を接種の7日後に開始し、生存率をモニターした(図14)。マウス(各群中n=10)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗CD52-減弱IFNα2b(抗CD52-hIgG4)融合タンパク質(配列番号523/524)、(c)抗CD52-減弱IFNα2b(抗CD52-hIgG4)融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-IgG1)抗体(配列番号515/516)、又は(d)5mg/kgの抗CD52(抗CD52-hIgG1)抗体(配列番号523/537)と5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体、のいずれかのi.p.注射で処置した。全ての融合タンパク質及び抗CD52抗体を、週2回、4週間投与した。抗CD47抗体は、1日おきに14日間投与した。
【０１５０】
このモデルでは、ネイキッド抗CD52抗体又は抗CD52-減弱IFNα2b融合タンパク質のいずれかとの組合せでの抗CD47抗体は、媒体又は単独での抗CD52-減弱IFNα2b融合タンパク質と比較して生存率向上を示した。この研究の終了時に、抗CD52-減弱IFNα2b融合タンパク質と併用した抗CD47抗体は、抗CD52抗体と併用した抗CD47抗体(生存なし)と比較して生存率向上(30%TFS)をもたらした。
【０１５１】
血液悪性腫瘍モデル: MEC-1、慢性B細胞白血病
融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の併用処置を、MEC-1慢性B細胞白血病細胞において試験した。MEC-1慢性B細胞白血病細胞を、標準増殖培地及び条件で対数増殖期浮遊培養物として維持した。生理食塩水中のMEC-1細胞5,000,000個を、各SCIDマウスにi.v.接種した。処置を接種の8日後に開始し、生存率をモニターした(図14)。マウス(各群中n=10)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗HLA-減弱IFNα2b(HB95-hIgG4)融合タンパク質(配列番号521/522)、(c)5mg/kgの抗HLA-減弱IFNα2b(HB95-hIgG4)融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12、mIgG1)抗体(配列番号515/516)、(d)5mg/kgのアイソタイプ対照無関係抗体-減弱IFNα2b(hIgG4アイソタイプ)融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47(B6H12、mIgG1)抗体、(e)単独での5mg/kgの抗CD19-減弱IFNα2b(16C4-hIgG4)融合タンパク質(配列番号527/528)、又は(f)5mg/kgの抗CD19-減弱IFNα2b(16C4-hIgG4)融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47(B6H12、mIgG1)抗体の、いずれかのi.p.注射で処置した。全ての融合タンパク質及び抗CD19抗体を、週2回、4週間、与えた。非グリコシル化抗CD47抗体は、1日おきに14日間、与えた。
【０１５２】
このモデルでは、抗CD47遮断と抗HLA-減弱IFNα2b融合タンパク質の組合せは、動物の生存を促進するのに有効であった(図15)。抗CD19抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質プラス5mg/kgの非グリコシル化抗CD47抗体は、単剤と比較して腫瘍増殖遅延を示したが、抗ヒトCD47抗体とアイソタイプ対照無関係抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質の組合せで見られた効果と同様であった。
【０１５３】
固形腫瘍悪性病変モデル: H820非小細胞肺がん(NSCLC)
融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の組合せでの処置を、細胞株H820に基づく非小細胞肺がんモデルにおいて試験した。H820肺非小がん細胞を、標準増殖培地及び条件で対数増殖期浮遊培養物として維持した。マトリゲルと混合したH820細胞10,000,000個を、胸腺欠損ヌードマウスに移植した。腫瘍が、1000mm3に達したら、腫瘍を切除し、断片化し、小さい断片を新たな宿主に再移植した。第3継代で断片を胸腺欠損ヌードマウスに移植した。腫瘍が平均体積150mm3に達したときに処置を開始した(0日目)。マウス(各群中n=10)を、(a)媒体、(b)単独での5mg/kgの抗EpCAM-減弱IFNα2b(EpAb 2-6-hIgG4)融合タンパク質(配列番号529/530)、(c)5mg/kgの抗EpCAM-減弱IFNα2b(EpAb 2-6-hIgG4)融合タンパク質(配列番号529/530)プラス5mg/kgの抗CD47(B6H12-mIgG1)(配列番号515/516)抗体、又は(d)単独での5mg/kgの抗CD47(B6H12-mIgG1)抗体、のいずれかのi.p.注射で処置した。全ての融合タンパク質構築物を、週2回、4週間投与した。抗CD47抗体は、1日おきに14日間投与した。腫瘍体積を週2回モニターし、図16に示されている通り平均腫瘍体積(+/-SEM)をプロットした。
【０１５４】
抗EpCAM-減弱IFNα2b融合タンパク質と抗CD47抗体の併用療法は、単独での抗EpCAM-減弱IFNα2b融合タンパク質のものを超えて増強されたH820腫瘍阻害をもたらした。
【０１５５】
(実施例8)
弱応答性モデル、OPM2における、抗CD38-減弱インターフェロンα2b融合タンパク質活性へのマクロファージの関与
OPM-2、弱応答性多発性骨髄腫異種移植片腫瘍モデルにおいてマクロファージ浸潤の役割を調査した。この研究は、上の実施例2で説明した骨髄腫異種移植片モデルと同様の方法で行った。実施例1で説明したように細胞を増殖させ、調製し、SCIDマウスに移植した。処置を開始する前に、腫瘍を平均体積600〜750mm3に増殖させた。マウス(12匹/コホート)に、(a)PBS媒体、(b)1及び4日目(図17中Aのx軸の上に示されている濃灰色矢印)における単独での5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、又は(c)1、3、5及び7日目(図17A中のx軸の上に示されている薄灰色矢印)における5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質プラス5mg/kgの抗CD47抗体(B6H12-mIgG1) (配列番号513/514)の、いずれかでの腹腔内処置を施した。腫瘍サイズを毎日測定し、平均(+/-SEM)腫瘍体積を図17Aにプロットした。選択した時点(黒矢印)で、各群からの3匹のマウスから腫瘍を切除し、下で説明する免疫組織化学評価のために凍結した。切除した腫瘍からの断面(各群から2つ)を腫瘍サイズ比較のためにマウントし、ヘマトキシリンで染色した。
【０１５６】
弱応答性異種移植片腫瘍モデルでは、抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質で処置したこれらのヒト腫瘍を有するマウスは、図18Bで例証されるように、マクロファージの浸潤増加のない、小さい抗腫瘍応答を示した。抗腫瘍応答の欠如及びマクロファージ浸潤の欠如は、標的化された抗体-減弱IFNα2b融合タンパク質への腫瘍の曝露後のマクロファージ浸潤と抗腫瘍応答の関係関連性と一致している。しかし、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と抗CD47抗体での二重処置は、強い抗腫瘍活性をもたらし、したがって、マクロファージ浸潤増加をもたらした(図17B)。これは、腫瘍標的化抗体-減弱IFNα融合タンパク質による腫瘍根絶の機序におけるマクロファージの役割を更に裏付け、CD47遮断とそのような融合タンパク質を併用することの有用性を裏付ける。
【０１５７】
(実施例9)
NOD SCID異種移植片モデルでの応答性骨髄腫H929における抗CD38-減弱インターフェロンα2b融合タンパク質活性へのマクロファージの関与
応答性MM異種移植片モデルであるNCI-H929におけるマクロファージ浸潤の役割を、NOD SCIDマウスを使用して更に調査した。NOD SCIDは、欠損したマクロファージ(SIRPα系)、樹状細胞、NK細胞を有し、補体系を有さないことを特徴とする、マウス株である。
【０１５８】
NCI-H929細胞を、実施例1で説明したように増殖させ、調製し、マウスに移植した。この研究は、SCIDマウスではなくNOD SCIDマウスを使用したことを除いて、実施例2で説明した骨髄腫異種移植片モデルと同様の方法で行った。処置を開始する前に、腫瘍を平均体積600〜750mm3に増殖させた。マウス(各群中n=12)に、(a)PBS媒体、(b)1及び4日目(図19A中のx軸の上に示されている濃灰色矢印)における単独での5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b(h10A2-IgG4)融合タンパク質(配列番号507/508)、又は(c)1、3、5及び7日目(図18A中のx軸の上に示されている薄灰色矢印)における5mg/kgの抗CD47抗体(B6H12-mIgG1) (配列番号515/516)と併用した5mg/kgの抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質の、いずれかでの腹腔内処置を施した。腫瘍サイズを毎日測定し、平均(+/-SEM)腫瘍体積を図18Aにプロットした。選択した時点(黒矢印)で、各群からの3匹のマウスから腫瘍を切除し、下で詳細に説明する免疫組織化学評価のために凍結した。切除した腫瘍からの断面(各群から2つ)を腫瘍サイズ比較のためにマウントし、ヘマトキシリンで染色した。
【０１５９】
この研究では、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質で処置したマウスは、図18Bで例証されるように、限られた抗腫瘍応答しか示さず、したがって、マクロファージの浸潤増加を示さなかった。対照的に、抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質と非グリコシル化抗CD47抗体の併用処置は、抗腫瘍活性は勿論、マクロファージ浸潤も、単独での抗CD38-減弱IFNα2b融合タンパク質(図18B)で処置したSCIDマウスで観察されたものに匹敵するレベルに回復させた(図18A)。これは、腫瘍標的化抗体-減弱IFNα融合タンパク質による腫瘍根絶の機序におけるマクロファージの役割を更に裏付け、CD47遮断とそのような融合タンパク質を併用することの有用性を裏付ける。
【符号の説明】
【０１６０】
ADCC  抗体依存性細胞介在性細胞傷害
ADCP  抗体依存性細胞貪食
AFP  アルファフェトプロテイン
APL  急性前骨髄球性白血病
ATRA  全トランス型レチノイン酸
B-CLL B細胞慢性リンパ球性白血病、B細胞系慢性リンパ球性白血病
CDC  補体依存性細胞傷害
CDR  相補性決定領域
CEA  癌胎児抗原
CML  慢性骨髄性白血病
dAb  ドメイン抗体
DC  骨髄樹状細胞
EBV  エプスタイン・バーウイルス
EGFR  上皮増殖因子受容体
EMMPRIN  細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質
FcγR Fcガンマ受容体
FR  フレームワーク領域
Her2/Neu  ヒト上皮増殖因子受容体
HC  ヘアリー細胞
HCVR  重鎖可変領域
HMW-MAA  高分子量メラノーマ抗原
HSA  ヒト血清アルブミン
hTERT  テロメラーゼ
IFN  インターフェロン
iNOS  誘導性一酸化窒素シンテターゼ
IRE  インターフェロン応答エレメント
i.p.    腹腔内
LCVR  軽鎖可変領域
MA  膜抗原
MUC1  ムチン1
NSCLC  非小細胞肺がん
PDC  プログラム細胞死
PDGF  血小板由来増殖因子
PDGFR  血小板由来増殖因子受容体
PEM  多形性上皮ムチン
PNGase F  ペプチド:N-グリカーゼ  F
PSMA  前立腺特異的膜抗原
rHA  組換えヒトアルブミン
s.c.    皮下
scFv  一本鎖Fv、一本鎖可変抗体断片
SCID  重症複合免疫不全
SCLC  小細胞肺がん
SIRPα  シグナル調節タンパク質
SHC  造血幹細胞
TCL1  T細胞白血病/リンパ腫1
TAA  腫瘍関連抗原
TFS  無腫瘍生存率
TSTA  移植型細胞表面抗原
uPA  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
uPAR  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体
VEGF  血管内皮増殖因子
VEGFR  血管内皮増殖因子受容体
VH  重鎖可変領域
VL  軽鎖可変領域
【０１６１】
【表３Ａ】
2019521169.tif 000004
【０１６２】
【表３Ｂ】
2019521169.tif 000005
【０１６３】
【表３Ｃ】
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【０１６４】
【表４Ａ】
2019521169.tif 000007
【０１６５】
【表４Ｂ】
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【０１６６】
【表４Ｃ】
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【０１６７】
【表４Ｄ】
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【０１６８】
【表４Ｅ】
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【０１６９】
【表４Ｆ】
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【０１７０】
【表４Ｇ】
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【０１７１】
【表４Ｈ】
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【０１７２】
【表４Ｉ】
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【０１７３】
【表４Ｊ】
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【０１７４】
【表５Ａ】
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【０１７５】
【表５Ｂ】
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【０１７６】
【表６】
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【０１７７】
【表７Ａ】
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【０１７８】
【表７Ｂ】
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【０１７９】
【表７Ｃ】
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【０１８０】
【表７Ｄ】
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【０１８１】
【表７Ｅ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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