(57)【要約】  本開示は、一般に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来の新規な遺伝子操作されたハイブリッドリボソームプロモーターに関する。所定の実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結された前記遺伝子操作されたプロモーターを含む１つ以上の核酸組成物に関する。したがって、本明細書に示した本開示は、本開示の１つ以上の前記新規な遺伝子操作されたハイブリッドリボソームプロモーターを使用して、関心対象のタンパク質を生成するための方法および組成物について記載した。【選択図】  図１
2019511218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む単離された核酸であって、前記ハイブリッドプロモーターは、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列、プロモーター活性を保持する配列番号６５〜８０および９０〜９７の部分配列、配列番号６５〜８０および９０〜９７のいずれか１つと少なくとも６０％相同である核酸または中ストリンジェンシー条件下で配列番号６５〜８０および９０〜９７のいずれか１つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含む単離された核酸。
【請求項２】
前記ＰＯＩは酵素である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される、請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
関心対象のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作された完全プロモーターを含む単離された核酸であって：
（Ｉ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（ＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
（ＩＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（ＩＶ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
（Ｖ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＵＴＲ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
（ＶＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−３ｒｄＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（ＶＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−３ｒｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；および
（ＶＩＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−３ｒｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’（式中、ＵＰは、プロモーター上流要素を含む核酸であり、１ｓｔＰｒｏ、２ｎｄＰｒｏおよび３ｒｄＰｒｏは少なくとも−３５／−１０コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、ＵＴＲは未翻訳領域を含む核酸であり、ＯＲＦは関心対象のタンパク質をコードする核酸オープンリーディングフレームであり、前記ＵＰ要素は、配列番号４５〜６１のいずれか１つ、プロモーター活性を保持する配列番号４５〜６１の部分配列、プロモーター活性を保持する配列番号４５〜６１のいずれか１つと少なくとも６０％相同である核酸、または中ストリンジェンシー条件下で配列番号４５〜６１のいずれか１つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含み、前記１ｓｔＰｒｏ、２ｎｄＰｒｏおよび３ｒｄＰｒｏは、配列番号１〜３９および１０１〜１５４のいずれか１つ、プロモーター活性を保持する配列番号１〜３９および１０１〜１５４の部分配列、配列番号１〜３９および１０１〜１５４のいずれか１つと少なくとも６０％相同である核酸または中ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜３９および１０１〜１５４のいずれか１つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含む）から選択される式を含む、単離された核酸。
【請求項５】
前記ＯＲＦによってコードされた前記ＰＯＩは、酵素である、請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
前記ベクターは、発現ベクターもしくは染色体組込みベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターを含む細菌宿主細胞。
【請求項９】
前記宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選択されるバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の前記核酸は、前記宿主細胞の染色体遺伝子座と相同である核酸配列に５’および３’の両方で隣接されている、請求項１に記載の核酸を含む組込みベクター。
【請求項１１】
前記宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり、前記５’および３’核酸配列は配列番号８７の核酸を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ染色体座ｙｈｆＯおよび配列番号８８の核酸を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ染色体座ｙｈｆＮと相同である、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項８の宿主細胞から単離された関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）。
【請求項１３】
ＰＯＩの発現の増加について形質転換宿主細胞をスクリーニングするための方法であって：
（ｉ）関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸に操作可能に連結された非相同遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む単離された核酸を用いて宿主細胞を形質転換させる工程であって：前記ハイブリッドプロモーターが配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）と同一の前記ＰＯＩをコードする核酸に操作可能に連結されたその天然プロモーターを含む単離された核酸を用いて宿主細胞を形質転換させる工程であって、工程（ｉ）および（ｉｉ）において形質転換される前記宿主細胞が同一の属種および遺伝的背景を備える宿主細胞である工程、および
（ｉｉｉ）前記ＰＯＩが発現するような条件下で前記改変細胞を培養する工程を含み、
ここで、工程（ｉｉ）における同一の前記ＰＯＩコーディング配列の発現と比較した工程（ｉ）における前記ＰＯＩコーディング配列の発現の増加が前記ＰＯＩの発現の増加を示す方法。
【請求項１４】
宿主細胞におけるＰＯＩの発現を増加させるための方法であって：
（ｉ）関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む核酸を宿主細胞に導入することによって宿主細胞を改変する工程であって、前記ハイブリッドプロモーターが配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列、プロモーター活性を保持する配列番号６５〜８０および９０〜９７の部分配列を含む工程、および
（ｉｉ）前記ＰＯＩが発現するような条件下で前記改変宿主細胞を培養する工程
を含む方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、プルラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
産生した前記ＰＯＩを単離する工程および精製する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に分子生物学および遺伝子操作の分野に関する。所定の実施形態では、本発明は、遺伝子操作されたプロモーターの、およびより特別には、宿主微生物における関心対象の１種以上のタンパク質の発現および産生のための遺伝子操作されたハイブリッドリボソームプロモーターの使用に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、２０１６年３月４日に出願された米国仮特許出願第６２／３０４，０６１号明細書の利益を主張するものである。
【０００３】
配列表の参照
２０１７年３月６日に作成され、サイズが７２ＫＢである、「ＮＢ４０９２８ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子操作は、工業用バイオリアクターもしくは細胞工場として使用される宿主微生物において、様々な改良を促進してきた。例えば、グラム陽性バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｕ）種は、極めて多数の有用なタンパク質および代謝産物を産生および分泌する。工業で使用される最も一般的なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。それらは（一般に安全と認められる）ＧＲＡＳのステータスが与えられているため、これらのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の菌株は、食品工業や医薬品工業で利用されるタンパク質を製造するための天然の候補である。例えば、重要な産生酵素には、α−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ（もしくはセリン）プロテアーゼなどが含まれる。しかし、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞におけるタンパク質産生に関する知識は伸展しているにもかかわらず、依然として微生物によるこれらのタンパク質の発現および産生を改良する方法およびそれらの組成物が必要とされている。
【０００５】
関心対象の遺伝子（もしくはＯＲＦ）によってコードされる関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）の組換え産生は、典型的には、所望の宿主細胞において使用するために好適な発現ベクターを構築することによって遂行されるが、このとき所望のＰＯＩをコードする核酸はプロモーターの発現制御下に置かれる。したがって、発現ベクターは、様々な技術によって（例えば、形質転換によって）宿主細胞に導入され、所望のタンパク質産物の産生は、タンパク質産物の発現および産生のために好適な条件下で形質転換宿主細胞を培養する工程によって達成される。例えば、機能性ポリペプチドの相同および／または非相同発現のためのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター（およびそれらの結び付いた要素）については、当技術分野において記載されている（例えば、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２０１３０８６２１９号パンフレット；米国特許第４，５５９，３００号明細書；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８などを参照）。
【０００６】
数多くのプロモーターが知られているが、当技術分野においては、関心対象のタンパク質をコードする相同および／または非相同核酸の発現を改良する新規なプロモーターに対する必要が依然としてある。例えば、工業バイオテクノロジー分野では、工業的に重要なタンパク質（例えば、酵素、抗体、受容体など）の発現レベルにおける小さな増加さえ、産生されるＰＯＩの重大なコスト、エネルギーおよび時間の節約に変換される。本発明の新規の驚くほど効果的な、遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターは、当技術分野におけるそうした長年にわたる切実な必要を解決する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
所定の実施形態では、本発明は、遺伝子操作されたプロモーターの、およびより特別には、宿主微生物における関心対象の１種以上のタンパク質の発現および産生のための遺伝子操作されたハイブリッドリボソームプロモーターの使用に関する。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明は、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む単離された核酸であって、ハイブリッドプロモーターが配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む単離された核酸に関する。他の実施形態では、本発明の核酸は、プロモーター活性を保持する配列番号６５〜８０および９０〜９７の部分配列を含む。他の実施形態では、本発明の核酸配列は、配列番号６５〜８０および９０〜９７のいずれか１つと少なくとも６０％相同である核酸、または中ストリンジェンシー条件下で配列番号６５〜８０および９０〜９７のいずれか１つ（もしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列）とハイブリダイズする核酸である。
【０００９】
所定の実施形態では、ハイブリッドプロモーターは、配列番号６５もしくは配列番号７１のヌクレオチド配列を含む。所定の他の実施形態では、単離された核酸によってコードされる関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）は、酵素である。特定の実施形態では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、マンナナーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼおよびヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される。
【００１０】
所定の他の実施形態では、本発明は、関心対象のタンパク質をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作された完全プロモーターを含む単離された核酸であって：
（Ｉ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（ＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
（ＩＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（ＩＶ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
（Ｖ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＵＴＲ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
（ＶＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−３ｒｄＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（ＶＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−３ｒｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；および
（ＶＩＩＩ）  ５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−３ｒｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’
（式中、ＵＰは、プロモーター上流要素を含む核酸であり、１ｓｔＰｒｏ、２ｎｄＰｒｏおよび３ｒｄＰｒｏは少なくとも−３５／−１０コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、ＵＴＲは未翻訳領域を含む核酸であり、ＯＲＦは関心対象のタンパク質をコードする核酸オープンリーディングフレームであり、ＵＰ要素は、配列番号４５〜６１のいずれか１つ、プロモーター活性を保持する配列番号４５〜６１の部分配列、プロモーター活性を保持する配列番号４５〜６１のいずれか１つと少なくとも６０％相同である核酸、または中ストリンジェンシー条件下で配列番号４５〜６１のいずれか１つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含み、１ｓｔＰｒｏ、２ｎｄＰｒｏおよび３ｒｄＰｒｏは、配列番号１〜３９および１０１〜１５４のいずれか１つ、プロモーター活性を保持する配列番号１〜３９および１０１〜１５４の部分配列、プロモーター活性を保持する配列番号１〜３９および１０１〜１５４のいずれか１つと少なくとも６０％相同である核酸または中ストリンジェンシー条件下で配列番号１〜３９および１０１〜１５４のいずれか１つもしくはプロモーター活性を保持するそれらの部分配列とハイブリダイズする核酸を含む）から選択される式を含む単離された核酸に関する。
【００１１】
特定の実施形態では、ＵＴＲは、配列番号１５５のヌクレオチド配列を含む。所定の他の実施形態では、ＵＰ要素は、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７もしくは配列番号５８のヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
他の実施形態では、１ｓｔＰｒｏは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号８５、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４もしくは配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
所定の他の実施形態では、２ｎｄＰｒｏは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号８５、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４もしくは配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
さらに他の実施形態では、３ｒｄＰｒｏは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号８５、配列番号８９、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４もしくは配列番号１０５のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、ＯＲＦによってコードされるＰＯＩは、酵素である。所定の他の実施形態では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、マンナナーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される。
【００１６】
また別の実施形態では、本発明は、本開示の核酸を含む発現ベクターに関する。他の実施形態では、本発明は、本開示の核酸を含む発現を含む細菌宿主細胞に関する。
【００１７】
所定の実施形態では、本開示の細菌宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のメンバーである。特定の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選択される。また別の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。
【００１８】
所定の他の実施形態では、本発明は、本開示の核酸の少なくとも１つのコピーを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞であって、核酸の少なくとも１つのコピーが組込みベクターに含まれているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に関する。所定の実施形態では、核酸の少なくとも１つのコピーは、宿主細胞の染色体もしくはゲノムに組み込まれる。
【００１９】
所定の他の実施形態では、本開示の核酸を含む組込みベクターは、５’末端および３’末端の両方で宿主細胞の染色体座に相同である核酸配列に隣接される。１つの特定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり、５’および３’核酸配列は配列番号８７の核酸を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ染色体座ｙｈｆＯおよび配列番号８８の核酸を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ染色体座ｙｈｆＮと相同である。したがって、特定の実施形態では、本開示の核酸の少なくとも１つのコピーを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の染色体もしくはエピソームに組み込まれる。
【００２０】
他の実施形態では、本開示の宿主細胞によって産生される関心対象のタンパク質は、宿主細胞から単離される。他の実施形態では、単離されたＰＯＩは、精製される。
【００２１】
特定の実施形態では、本開示のＰＯＩは、酵素である。所定の実施形態では、酵素は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、プルラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、マンナナーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼからなる群から選択される。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、ＰＯＩの発現の増加について形質転換（改変）宿主細胞をスクリーニングするための方法であって：（ｉ）関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸に操作可能に連結された非相同遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む単離された核酸を用いて宿主細胞を形質転換させる工程であって、ハイブリッドプロモーターが配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む工程、（ｉｉ）工程（ｉ）と同一ＰＯＩをコードする核酸に操作可能に連結されたその天然（野生型）プロモーターを含む単離された核酸を用いて宿主細胞を形質転換させる工程であって、工程（ｉ）および（ｉｉ）において形質転換される宿主細胞が同一の属種および遺伝的背景を備える宿主細胞である工程、および（ｉｉｉ）ＰＯＩが発現するような条件下で改変細胞を培養する工程であって、工程（ｉｉ）における同一のＰＯＩコーディング配列の発現と比較した工程（ｉ）におけるＰＯＩコーディング配列の発現の増加がＰＯＩの発現の増加を示す工程を含む方法に関する。
【００２３】
所定の他の実施形態では、本発明は、ＰＯＩの発現の増加について形質転換（改変）宿主細胞をスクリーニングするための方法であって：（ｉ）本開示の単離された核酸を用いて第１宿主細胞を形質転換させる工程、（ｉｉ）工程（ｉ）と同一ＰＯＩをコードする核酸に操作可能に連結されたその天然（野生型）プロモーターを含む単離された核酸を用いて第２宿主細胞を形質転換させる工程であって、工程（ｉ）および（ｉｉ）で形質転換された宿主細胞は同一の属種および遺伝的背景の宿主細胞である工程、および（ｉｉｉ）ＰＯＩが発現するような条件下で改変細胞を培養する工程であって、工程（ｉｉ）における同一のＰＯＩコーディング配列の発現と比較した工程（ｉ）におけるＰＯＩコーディング配列の発現の増加がＰＯＩの発現の増加を示す工程を含む方法に関する。
【００２４】
また別の実施形態では、本発明は、宿主細胞におけるＰＯＩの発現を増加させるための方法であって：（ｉ）関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたハイブリッドプロモーターを含む核酸を宿主細胞に導入することによって宿主細胞を改変する工程であって、ハイブリッドプロモーターが配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６および配列番号９７のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む工程、および（ｉｉ）ＰＯＩが発現するような条件下で改変宿主細胞を培養する工程を含む方法に関する。
【００２５】
所定の他の実施形態では、本発明は、宿主細胞におけるＰＯＩの発現を増加させるための方法であって：（ｉ）本開示の核酸を宿主細胞に導入することによって宿主細胞を改変する工程、および（ｉｉ）ＰＯＩが発現するような条件下で改変宿主細胞を培養する工程を含む方法に関する。
【００２６】
これらの方法の特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本開示の相同プロモーター（図１；プロモータータイプ１）、単一（遺伝子操作）ハイブリッドプロモーター（図１；プロモータータイプ２）および二重（遺伝子操作）ハイブリッドプロモーター（図１；プロモータータイプ３）を略図で示す図である。図１に示すように、プロモータータイプ１は、「Ｐｘ」と指定されたプロモーター領域および「（プロモーター）Ｐｘの上流（ＵＰ）要素」と指定された上流（ＵＰ）要素を含み、プロモーターＰｘおよび（プロモーター）ＰｘのＵＰ要素は、同一（相同）天然プロモーターに由来する。対照的に、図１に示すように、プロモータータイプ２（単一ハイブリッド）は「Ｐｙ」と指定されたプロモーター領域および「（プロモーター）ＰｘのＵＰ要素」と指定された上流（ＵＰ）要素を含み、プロモーターＰｙおよび（プロモーター）ＰｘのＵＰ要素は同一（相同）天然プロモーターに由来しないので、したがって、異なる（非相同）プロモーターに由来するＵＰ要素およびプロモーターのハイブリッド（組み合わせ）である。同様に、図１に示したように、プロモータータイプ３（二重ハイブリッド）は「Ｐｙ」および「Ｐｚ」と指定された２つのプロモーター領域ならびに「（プロモーター）ＰｘのＵＰ要素」と指定された上流（ＵＰ）要素を含み、２つの（二重）プロモーターＰｙおよびＰｚは、（ｉ）同一ヌクレオチド配列（すなわち、２つの同一プロモーター核酸配列；すなわち、Ｐｙ＝Ｐｚ）もしくは（ｉｉ）２つの異なるヌクレオチド配列（すなわち、２種のプロモーターは異なる核酸配列を含む異なるプロモーター源に由来する、すなわち、Ｐｙ≠Ｐｚ）を含み得るが、ここでプロモーターＰｙおよびＰｚは（プロモーター）ＰｘのＵＰ要素と同一の（相同）天然プロモーターに由来しない。
【図２】プロテアーゼＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ）を発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の細胞密度を示す図であり、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞の発現は、下記の天然（野生型）および遺伝子操作された（ハイブリッド）プロモーター：ＰａｐｒＥ（配列番号２８）、ＰｓｓｒＡ（配列番号２５）、Ｐｓｃｒ（配列番号２６）、ＰｓｐｏＶＧ（配列番号２８）、ＰｒｒｎＩ−２（配列番号１５）、ハイブリッドプロモーター１（配列番号６５）およびハイブリッドプロモーター７（配列番号７１）により駆動される。
【図３】下記の天然（野生型）および遺伝子操作された（ハイブリッド）プロモーター：ＰａｐｒＥ（配列番号２８）、ＰｓｓｒＡ（配列番号２５）、Ｐｓｃｒ（配列番号２６）、ＰｓｐｏＶＧ（配列番号２８）、ＰｒｒｎＩ−２（配列番号１５）、ハイブリッドプロモーター１（配列番号６５）およびハイブリッドプロモーター７（配列番号７１）の制御下でサブチリシンＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ）を発現するＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養のプロテアーゼ活性プロファイルを示す図である。
【図４】下記の天然（野生型）および遺伝子操作された（ハイブリッド）プロモーター：ＰｒｒｎＩ−２（野生型；配列番号１５）；変異体２（ハイブリッドプロモーター１；配列番号６５）；変異体３（ハイブリッドプロモーター２３；配列番号９６）；変異体４（ハイブリッドプロモーター２４；配列番号９７）；変異体６（ハイブリッドプロモーター２０；配列番号９３）；変異体１０（ハイブリッドプロモーター２２；配列番号９５）変異体１１（ハイブリッドプロモーター１９；配列番号９２）；変異体１２（ハイブリッドプロモーター１８；配列番号９１）および変異体１３（ハイブリッドプロモーター１７；配列番号９０）を使用してＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）において発現したサイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種変異アミラーゼの相対発現を示す図である。
【図５】Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼＬの内在性ＰａｍｙＬプロモーターに比較して様々な天然リボソームプロモーターを使用してＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における３種の細菌アミラーゼ（すなわち、Ａｍｙ１、Ａｍｙ３およびＡｍｙ４）の産生を示す図である。図５に示すように、Ａｍｙ１は、天然Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アメイラーゼ（配列番号４３）であり；Ａｍｙ３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ変異体（配列番号６４）であり、Ａｍｙ４は、サイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種α−アミラーゼ変異体（配列番号６３）である。
【図６】様々なＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎ）プロモーターの複数の配列アラインメントを示す図であり、配列ロゴバナーおよびｒｒｎプロモーターのアラインメントに由来する「コンセンサス」配列を示している。
【図７】様々なＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームＲＮＡ（ｒｒｎ）プロモーターの複数の配列アラインメントを示す図であり、上流要素およびプロモーター配列についての配列ロゴならびにｒｒｎプロモーターのアラインメントに由来する「コンセンサス」配列を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、微生物宿主細胞における１種以上の関心対象のタンパク質の発現および産生のための新規な組成物（およびそれらの方法）を提供する。所定の実施形態では、本組成物（およびそれらの方法）は、遺伝子操作された（改変）プロモーターを含み、それらに関する。特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作された（改変）プロモーターは、本明細書ではまとめてバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種「リボソームプロモーター」と呼ぶ、１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種リボソームＲＮＡプロモーター前駆体および／または１種以上のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種リボソームタンパク質プロモーター前駆体に由来する。所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたリボソームプロモーターは、さらにリボソームＲＮＡプロモーターもしくはリボソームタンパク質プロモーターではないバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロモーター由来のプロモーター核酸配列断片を含み得る。
【００２９】
所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたリボソームプロモーターには、遺伝子操作された（ハイブリッド）リボソームＲＮＡプロモーター、遺伝子操作された（ハイブリッド）リボソームタンパク質プロモーターおよびそれらの遺伝子操作された（ハイブリッド）組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。さらに別の実施形態では、１種以上の遺伝子操作された（ハイブリッド）リボソームプロモーターを使用して１種以上の関心対象のタンパク質を産生するための新規な産生微生物宿主細胞および方法が開示される。
【００３０】
Ａ．定義
他に特に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，１９９１を参照）。本発明の実施もしくは試験においては、本明細書に記載するものと同様もしくは同等である任意の方法および材料を使用できるが、好ましい方法および材料について記載する。
【００３１】
全ての特許、公開特許出願および科学文献は、本明細書で言及したそのような特許および刊行物の中に開示された全ての配列を含めて、明示的に参照により組み込まれる。
【００３２】
数値範囲には、範囲を定義する数字が含まれる。他に特に指示しない限り、それぞれ、核酸は５’から３’への方向で左から右へと記載され、アミノ酸配列はアミノからカルボキシへの方向で左から右へと記載される。
【００３３】
本明細書に提供した見出しは、本発明の様々な態様もしくは実施形態を限定するものではない。したがって、直下に定義した用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【００３４】
本明細書で使用する用語「核酸」および「核酸配列」は、ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド配列およびそれらの断片もしくは部分、ならびに、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれを表す場合でも、二本鎖もしくは一本鎖であり得るゲノム起源もしくは合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを指す。遺伝子コードの縮重の結果として、多くのヌクレオチド配列が所与のタンパク質をコードし得ることは理解されよう。
【００３５】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーについての言及も含まれる。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工的な化学的アナログであるアミノ酸ポリマーならびに天然型アミノ酸ポリマーに当てはまる。これらの用語は、さらにポリペプチドが機能的のままであるように保存的アミノ酸置換を含有するポリマーにも当てはまる。
【００３６】
本明細書で使用する語句「関心対象の遺伝子」は「ＧＯＩ」と略記することができ、これら２つの用語は互換性がある。本明細書で使用する語句「関心対象のタンパク質」は「ＰＯＩ」と略記することができ、これら２つの用語は互換性がある。本明細書で使用する語句「オープンリーディングフレーム」は「ＯＲＦ」と略記することができ、これら２つの用語は互換性がある。
【００３７】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、本明細書で記載するように入来配列（すなわち、細胞に導入される配列）のための宿主および発現ビヒクルとして作用する能力を有する細胞を指す。所定の実施形態では、宿主細胞は、微生物である。所定の実施形態では、微生物（宿主細胞）は、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）ファミリーメンバーであるグラム陽性細菌細胞である。所定の他の実施形態では、微生物（宿主細胞）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）メンバーであるグラム陽性細菌細胞である。特定の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ．ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードフィルムス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から選択される。
【００３８】
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ構築物」もしくは「発現構築物」は、少なくとも２個のＤＮＡ（ポリヌクレオチド）断片を含む核酸配列を指す。ＤＮＡもしくは発現構築物は、宿主細胞に核酸配列を導入するために使用できる。ＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、ＰＣＲによって）または任意の他の好適な技術によって生成できる。所定の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、関心対象のタンパク質をコードする関心対象の核酸配列（例えば、ＧＯＩもしくはＯＲＦ）を含む。特定の実施形態では、ＧＯＩもしくはＯＲＦを含むＤＮＡ構築物は、本開示の遺伝子操作されたプロモーターに操作可能に連結されている。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、さらに少なくとも１種の選択可能なマーカーを含む。また別の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体に相同である配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡ構築物には、非相同配列が含まれる。
【００３９】
本明細書で使用する用語「関心対象のタンパク質をコードする核酸」もしくは「関心対象のコーディング配列」は、互換的に使用され、タンパク質に翻訳されると関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を意味する。一部の実施形態では、コーディング領域はｃＤＮＡ形もしくはＯＲＦ中に存在するが、他の実施形態では、ゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ形中に存在する。ＤＮＡ形中に存在する場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖（すなわち、センス鎖）もしくは二本鎖であってよい。一部の実施形態では、好適な制御要素（例えば、エンハンサー、プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなど）は、転写の適正な開始および／または一次ＲＮＡ転写産物の正確なプロセッシングを許容するために必要とされる場合は、遺伝子のコーディング領域に近接近して配置される。または、一部の実施形態では、本発明の発現ベクター内で利用されるコーディング領域は、内在性エンハンサー、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルまたは内在性および外来性の制御要素両方の組み合わせを含有する。
【００４０】
本明細書で定義する「内在性の遺伝子」は、生物のゲノム中の自然な位置にある遺伝子を指す。
【００４１】
本明細書で定義する「非相同」遺伝子、「非内在性の」遺伝子、「外来性の」遺伝子もしくは「外来」遺伝子は、通常は宿主生物中では見いだされず、むしろ遺伝子導入によって宿主生物に導入された遺伝子（もしくはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を指す。外来（非相同）遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子（もしくはＯＲＦ）および／または天然もしくは非天然生物に挿入されたキメラ遺伝子を含む。したがって、本明細書で使用する用語「非相同」は、一般に宿主細胞内で自然には発生しない（すなわち、宿主細胞にとって外来性である）ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを指す、または宿主細胞と同一の遺伝源もしくは種に由来するが、非相同配列にとって自然ではない位置にあるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを指す。一部の実施形態では、非相同配列は非宿主細胞配列であるが、他の実施形態では、非相同配列は、改変配列、異なる宿主細胞菌株由来の配列または宿主細胞の異なる染色体位置由来の相同配列である。
【００４２】
本明細書で使用する用語「プロモーター」、「プロモーター要素」、「プロモーター配列」および「プロモーター領域」は、プロモーターがオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド（コーディング）配列の５’末端に配置されている（すなわち、先行している）場合に、ｍＲＮＡ内へのオリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド配列の転写を制御できるＤＮＡ配列を指す。したがって、プロモーターは、典型的にはｍＲＮＡへの転写をそれが制御するオリゴヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置しており、ＲＮＡポリメラーゼによる特異的結合および転写開始のための位置を提供する。
【００４３】
用語「操作可能に連結された」は、複数の要素が、これらの要素が機能的に関連することを可能にする配置にある並置を指す。例えば、プロモーターは、関心対象のコーディング配列が配列の転写を制御する場合、関心対象のコーディング配列に操作可能に連結されている。
【００４４】
本明細書で定義する語句「プロモーター」、「プロモーター要素」、「プロモーター領域」および／または「プロモーター配列」は、転写を開始するために必要とされる（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む）プロモーター核酸配列の最小部分を指す。例えば、本開示のプロモーターは、翻訳対象の遺伝子もしくはＯＲＦの上流（５’）で＋１転写開始部位に相対的である−１０（コンセンサス配列）要素および−３５（コンセンサス配列）要素を含む。コアプロモーターである−１０要素および−３５要素は、当技術分野では一般に、それぞれ「ＴＡＴＡＡＴ」（プリブノウボックス）コンセンサス領域および「ＴＴＧＡＣＡ」コンセンサス領域と呼ばれる。コアプロモーターである−１０配列領域と−３５配列領域との間隔は、一般に１５〜２０介在塩基対（ヌクレオチド）離れている（すなわち、空いている）。
【００４５】
本明細書でまた別に定義する本開示の「プロモーター」配列は、５’（すなわち、上流）であり、自然に見いだされるプロモーター（例えば、プロモーター配列に対して５’である自然に結び付いているＵＰ要素配列と自然に結び付いているヌクレオチドを追加して含み得る。例えば、下記の表３〜１０に示した所定のプロモーターは、（−１０／−３５最小プロモーター領域に加えて）自然に結び付いているＵＰ要素配列を含む。したがって、本明細書で定義する本開示の「プロモーター」は、自然に見いだされるプロモーター配列に対して５’であるＵＰ要素配列の１つ以上のヌクレオチドを含み得る。
【００４６】
本明細書で使用する「上流要素」、「プロモーター上流要素」、「ＵＰ要素」および「ＵＰ配列」は、互換的に使用され、−３５コアプロモーター領域の上流（５’）に位置する「Ａ＋Ｔ」リッチ核酸配列領域を指す。ＵＰ要素は、さらにＲＮＡポリメラーゼのα−サブユニットのＣ末端ドメインと直接的に相互作用する−３５コアプロモーター要素の上流（５’）に位置する核酸配列領域であると定義することもできる。表２において下記に示したのは、本発明の１種以上の遺伝子操作されたハイブリッド「完全」プロモーターを形成するために、（表３〜１０に示した）１種以上の非相同プロモーター配列と組み合わされているＵＰ要素配列である。
【００４７】
本明細書で使用する「リボソームプロモーター」には、例えば、リボソームＲＮＡプロモーターもしくはリボソームタンパク質プロモーターが含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「完全プロモーター」もしくは「ハイブリッドプロモーター」は、少なくとも「ＵＰ要素」および「プロモーター」を含む遺伝子操作されたプロモーターを指すが、ここでＵＰ要素はプロモーターの上流（５’）に位置し、プロモーターは、ＵＰ要素の下流（３’）および＋１転写開始部位の上流（５’）に位置する。本開示のハイブリッド（完全）プロモーターは、一般にバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーター配列に由来するが、ここでハイブリッド（完全）プロモーターのＵＰ要素配列およびプロモーター配列は、操作可能に連結されている。例えば、所定の実施形態では、本開示のハイブリッド（完全）プロモーターは、表２に示したＵＰ要素配列を表３〜１０に示した１つ以上の非相同プロモーター要素と組み合わせることによって遺伝子操作される。所定の他の実施形態では、これらの１つ以上の非相同プロモーター要素（配列）には最小プロモーター（−１０／−３５）要素の上流（５’）にある自然に結び付いているＵＰ要素配列の１つ以上のヌクレオチドが含まれる。例えば、所定の実施形態では、本開示のハイブリッド（完全）プロモーターは、表２に示したＵＰ要素配列を表３〜１０に示した１つ以上の非相同プロモーター要素と組み合わせることによって遺伝子操作される（ここで１つ以上の非相同プロモーター要素は、任意選択的に自然に結び付いていて操作可能に連結されているＵＰ要素配列の１つ以上のヌクレオチドを含む）。
【００４９】
本明細書でまた別に定義する「ハイブリッド（完全）プロモーター」は、遺伝子操作された（すなわち、ＵＰ要素配列およびプロモーター要素配列の両方を含む）プロモーターであるが、ここでハイブリッドプロモーターのＵＰ要素およびプロモーター要素は、自然には操作可能に連結された状態もしくは相互に結び付いている状態では見いだされない異なる核酸配列から構築される、またはそれらに由来する。例として、非ハイブリッド「完全プロモーター」は、天然（野生型）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リボソームプロモーター（例えば、Ｐ１−ｒｒｎＩ（プロモーター要素））および天然（野生型）ＵＰ要素（例えば、ＵＰ−ｒｒｎＩ要素）に由来する、もしくはそれらから構築されるが、ここでプロモーター要素（Ｐ１−ｒｒｎＩ）およびＵＰ要素（ＵＰ−ｒｒｎＩ）は自然に見いだされるように操作可能に連結されている（すなわち、プロモーター要素およびＵＰ要素は、ゲノムＤＮＡ源から単離もしくは同定されるように操作可能に連結されている）。
【００５０】
対照的に、本開示の遺伝子操作された「ハイブリッド（完全）プロモーター」は、自然に見いだされるように操作可能に連結された状態もしくは相互に結び付いている状態では見いだされない（すなわち、プロモーター要素およびＵＰ要素は、ゲノムＤＮＡ源から単離もしくは同定されるように操作可能に連結されていない、もしくは結び付いていない）。したがって、例として、本開示の遺伝子操作された「ハイブリッド（完全）プロモーター」は、天然（野生型）バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）リボソームプロモーター（例えば、Ｐ１−ｒｒｎＩ（プロモーター要素））および天然（野生型）ＵＰ要素（例えば、ＵＰ−ｒｒｎＯ要素）に由来する、もしくはそれらから構築されるが、ここでプロモーター要素（Ｐ１−ｒｒｎＩ）およびＵＰ要素（ＵＰ−ｒｒｎＯ）は自然に見いだされるように操作可能に連結されていない（すなわち、プロモーター要素およびＵＰ要素は、ゲノムＤＮＡ源から単離もしくは同定されるように操作可能に連結されていない）。本明細書で使用する用語「プロモーター活性」は、核酸配列を参照すると、ｍＲＮＡ内へのオリゴヌクレオチド配列の転写を開始する核酸配列の能力を指す。
【００５１】
用語「ベクター」は、本明細書では１つ以上の細胞タイプに導入すべき核酸配列を運ぶために設計されたポリヌクレオチドであると定義されている。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子もしくはウイルス粒子、ＤＮＡ構築物、カセットなどが含まれる。さらにプラスミドも含む典型的な発現ベクターには、例えばプロモーターなどの調節配列、シグナル配列、関心対象の遺伝子および転写ターミネーターが含まれる。
【００５２】
本明細書で定義する用語「単離（された）」は、少なくとも１つの他の化合物、タンパク質、細胞、核酸配列、アミノ酸から分離されている化合物、タンパク質、細胞、核酸配列もしくはアミノ酸または通常はその天然源に結び付いている他の生物学的物質を指す。
【００５３】
本明細書で使用する用語「コーディング領域」は、本明細書では、プロモーターを含む適切な制御配列の制御下に置かれた場合にポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡ内に転写される核酸配列であると定義されている。コーディング配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび組換えＤＮＡを含み得る。
【００５４】
本明細書で使用する５’未翻訳領域（以下では、「５’ＵＴＲ」）は、ｍＲＮＡの鎖上のコーディング配列にとって５’である（すなわち、先行する）核酸配列を指す。本明細書で使用する３’未翻訳領域（以下では、「３’ＵＴＲ」）は、ｍＲＮＡの鎖上のコーディング配列にとって３’である（すなわち、後に続く）核酸配列を指す。したがって、転写されたｍＲＮＡの未翻訳領域（ＵＴＲ）は、非タンパク質コーディング核酸配列である。
【００５５】
本明細書で使用する用語「野生型」の遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞は、天然型起源において見いだされた場合にその遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞の特徴を有する遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞を指す。野生型遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞は、集団において最も頻回に観察される、したがって「天然」形もしくは「野生型」形と指定される遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞である。本明細書で使用する用語「野生型配列」および「野生型遺伝子」は、互換的に使用され、宿主細胞内で天然もしくは天然型である配列を指す。
【００５６】
対照的に、用語「改変（された）」、「突然変異体」もしくは「変異体」遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞は、野生型形と比較した場合に配列および／または機能的特性における修飾（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子、遺伝子産物もしくは細胞を指す。配列修飾は、例えば、変化した配列もしくは特徴を生じさせる置換、挿入、欠失もしくは任意の他の修飾によって発生し得る。天然型突然変異体は単離できることに留意されたい；これらは、野生型遺伝子もしくは遺伝子産物と比較すると変化した特徴を有するという事実によって同定される。
【００５７】
本明細書で使用する用語「改変配列」および「改変遺伝子」は、互換的に使用され、天然型核酸配列の置換、挿入、欠失、分断または任意の他の修飾を指す。一部の実施形態では、改変配列の発現産物は、（例えば、修飾が配列の欠失もしくは分断である場合は）切断タンパク質である。一部の実施形態では、切断タンパク質は、生物学的活性を保持する。他の実施形態では、改変配列の発現産物は、（例えば、修飾が核酸配列内への挿入である場合は）細長いタンパク質である。他の実施形態では、挿入は、（例えば、挿入が終止コドンの形成を生じさせる場合は）発現産物としての切断タンパク質の産生を生じさせる。
【００５８】
本明細書で使用する「入来配列」は、宿主細胞の染色体もしくはゲノムに導入されるＤＮＡ配列を意味する。この配列は、１種以上の関心対象のタンパク質をコードし得る。入来配列は、関心対象のタンパク質をコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含み得る。一部の実施形態では、入来配列は、形質転換すべき細胞のゲノムに既に存在する配列を含むが、他の実施形態では、それは形質転換すべき細胞のゲノムに既に存在していない（すなわち、一部の実施形態では、それは相同配列であるが、他方他の実施形態では、それは非相同配列である）。
【００５９】
一部の実施形態では、入来配列は、ホルモン、酵素、成長因子もしくはサイトカインを含むがそれらに限定されない少なくとも１種の相同もしくは非相同タンパク質をコードする。所定の実施形態では、入来配列は、アセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼおよびそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない少なくとも１種の酵素をコードする。
【００６０】
一部の実施形態では、入来配列は、機能的野生型遺伝子もしくはオペロン、機能的な突然変異体遺伝子もしくはオペロンまたは非機能的遺伝子もしくはオペロンをコードする。
【００６１】
本明細書で使用する用語「レポーター遺伝子」は、細胞内で発現できるヌクレオチド配列を指し、このときレポーターの発現は発現した遺伝子を含有する細胞に、容易に検出および測定される能力を付与する。
【００６２】
本明細書で使用する用語「フランキング配列」は、検討対象の配列の上流もしくは下流いずれかにある任意の配列を指す（例えば、配列ＡＢＣについては、配列ＢはＡ配列およびＣ配列に隣接されている）。一部の実施形態では、入来配列は両側で相同ボックスに隣接されている。
【００６３】
本明細書で使用する用語「相同ボックス」は、また別の核酸配列に相同である配列を指す。例えば、相同ボックスは、ゲノムＤＮＡ内の核酸配列に相同であり得る。そのような場合、相同ボックスは、新規な構築物内のどこでゲノムＤＮＡに組み込むのかを指示するために有用である。
【００６４】
本明細書で使用する用語「相同組換え」は、同一ヌクレオチド配列の位置で２つのＤＮＡ分子間もしくは対の染色体間（すなわち、クロスオーバー中）のＤＮＡ断片の交換を指す。１つの実施形態では、染色体への組込みは、相同組換えによって遂行される。
【００６５】
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」および「形質転換」は、どちらも細胞にＤＮＡを導入するための方法を指す。
【００６６】
本明細書で使用する用語「相補的」もしくは「相補性」は、塩基対合則によって関連付けられた「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（ヌクレオチドの配列を指す互換可能な用語である）に関して使用される。例えば、配列「５’−ＣＡＧＴ−３’」は、配列「５’−ＡＣＴＧ−３’」に相補的である。相補性は、「部分的」もしくは「全体的」であってよい。「部分的」相補性は、１つ以上の核酸塩基が塩基対合則にしたがって一致しない場合である。核酸間の「全体的」もしくは「完全」相補性は、塩基対合則下で１つ１つの核酸塩基全部が別の塩基と一致する場合である。
【００６７】
本明細書で使用する用語「染色体組込み」は、それにより入来配列が宿主細胞の染色体（すなわち、ゲノム）に導入されるプロセスを意味する。
【００６８】
本明細書で使用する用語「選択可能なマーカー」は、関心対象のタンパク質もしくは遺伝子の存在もしくは非存在を示す任意の「マーカー」（すなわち、インジケーター）の使用を指す。一部の実施形態では、この用語は、他の場合には必須であろうものが欠如している培地中で成長する能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子を包含する。他の実施形態では、選択可能なマーカーは、その中で選択可能なマーカーが発現する細胞に抗生物質耐性もしくは薬剤耐性を付与する。
【００６９】
本明細書で使用する用語「シグナル配列」もしくは「シグナルペプチド」は、細胞外のタンパク質の成熟形の分泌を促進する、タンパク質のＮ末端部分におけるアミノ酸の配列を指す。細胞外タンパク質の「成熟形」は、分泌プロセス中に切断されるシグナル配列を有していない。
【００７０】
「増幅」は、一般に核酸配列の追加のコピーの産生であると本明細書に定義されている。核酸の増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応もしくは当技術分野において周知である他の技術によって実施することができる。本明細書で使用する用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、クローニングもしくは精製を実施せずにＤＮＡサンプル（例えば、ゲノムＤＮＡ）中の標的配列の断片の濃度を増加させるための方法を記載している、その全部が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書および同第４，９６５，１８８号明細書に記載の方法を指す。
【００７１】
所定の他の実施形態では、本開示の核酸（ポリヌクレオチド）配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏで増幅させられる。特定の実施形態では、（ｉ）関心対象のタンパク質をコードする遺伝子（もしくはＯＲＦ）および（ｉｉ）抗生物質耐性マーカーを含む核酸（ポリヌクレオチド）配列がｉｎ  ｖｉｖｏで増幅させられる。
【００７２】
ＰＣＲを用いると、ゲノムＤＮＡ中の特定の標的配列の単一コピーを、数種の異なる方法（例えば、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの組込み後のアビジン−酵素結合の検出；または、例えばｄＣＴＰもしくはｄＡＴＰなどの３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅断片への組込み）によって検出可能なレベルまで増幅させることができる。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド配列は、適切なプライマー分子セットを用いて増幅させることができる。特に、ＰＣＲプロセス自体によって作成された増幅断片は、それら自体がその後のＰＣＲ増幅の効率的な鋳型となる。
【００７３】
本明細書で使用する用語「プライマー」は、精製制限消化におけるように自然に発生しようと合成的に生成されようと、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に合成開始点として作用できるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅効率を最大にするためには一本鎖であることが好ましいが、または二本鎖であってもよい。
【００７４】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、精製制限消化におけるように自然に発生しようと合成的に生成されようと、関心対象のまた別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離において有用である。本発明において使用する任意のプローブは、任意の「レポーター分子」で標識されるので、例えば、限定はされないが、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡならびに酵素に基づく組織化学的分析）、蛍光、放射性システムおよび発光性システムを含むがそれらに限定されない任意の検出システムで検出可能であることが企図されている。本発明を任意の特定の検出システムもしくは標識に限定することは意図されていない。
【００７５】
本明細書で使用する用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、それぞれが特定ヌクレオチド配列もしくはその近位で二本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。
【００７６】
本明細書で使用する語句「ＡｍｙＬアミラーゼ」は、「ＬＡＴアミラーゼ」と互換的に使用され得る。
【００７７】
Ｂ．リボソームプロモーター
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）合成は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるリボソーム合成の律速工程である。リボソームＲＮＡプロモーターからのリボソームＲＮＡ転写の調節は、以前に研究されている（Ｓａｍａｒｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｎａｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｔｕｒｎｂｏｕｇｈ，２００８；Ｋｒａｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｋｒａｓｎｙ  ａｎｄ  Ｇｏｕｒｓｅ，２００４）。リボゾームＲＮＡプロモーターは栄養状態によって厳密に調節されるので、リボソームＲＮＡおよびリボソームは、翻訳要件がより低い場合には過剰産生されない。
【００７８】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）には、それぞれがＰ１およびＰ２と指定された２種のプロモーターを含む７個のｒＲＮＡ（ｒｒｎ）オペロンがある。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｒｎ  Ｐ１プロモーター内のコア−１０／−３５プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼに結合することによってプロモーター活性を２０〜５０倍まで増加させるプロモーター上流（ＵＰ）要素が先行する。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、プロモーター活性を増加させるプロモーター上流（ＵＰ）要素が同様に先行する１０個のｒＲＮＡ（ｒｒｎ）オペロンを含有する（Ｋｒａｓｎｙ  ａｎｄ  Ｇｏｕｒｓｅ，２００４）。
【００７９】
リボソームタンパク質をコードする遺伝子の調節は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において以前に研究されている（Ｇｒｕｎｄｙ  ａｎｄ  Ｈｅｎｋｉｎ，１９９１）。多くの場合、リボソームタンパク質は、その中でリボソームタンパク質がコードされるオペロンの発現を制御する自己リプレッサーとして作用することが見いだされている。
【００８０】
リボソームＲＮＡプロモーターの調節は、天然リボソームＲＮＡの産生について研究されてきたが、より最近では、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）プロモーターを使用した場合の関心対象の非相同タンパク質をコードする核酸配列の発現レベルについて記載されてきた（例えば、国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレットを参照）。
【００８１】
本明細書で説明するように、本発明は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種プロモーター要素とＵＰ要素とのハイブリッド組み合わせを含む新規な遺伝子操作されたリボソームプロモーターが、宿主微生物において発現した場合に関心対象の非相同タンパク質を産生することに予想外にも効果的であることを証明する。例えば、実施例２において説明するように、天然（非相同）プロモーター（例えば、ＰａｐｒＥ、ＰｓｓｒＡ、Ｐｓｃｒ、ＰｓｐｏＶＧ）、天然（非相同）リボソームプロモーター（例えば、ＰｒｒｎＩ−２）および遺伝子操作された（非相同）リボソームプロモーター（例えば、ハイブリッドプロモーター１およびハイブリッドプロモーター７）からのサブチリシンプロテアーゼＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ）の発現をＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞において試験した。結果（図３を参照）は、ＰｓｓｒＡプロモーター、Ｐｓｃｒプロモーター、ＰｒｒｎＩ−２プロモーター、ハイブリッドプロモーター１およびハイブリッドプロモーター７は、ＰａｐｒＥプロモーターおよびＰｓｐｏＶＧプロモーターより高いタンパク質（ＢＰＮ’）生産性を生じさせることを証明している。特に、図３に示したように、ハイブリッドプロモーター１（配列番号６５）およびハイブリッドプロモーター７（配列番号７１）は、試験した条件下でサブチリシンＢＰＮ’産生レベルが最高であることを明確に証明している。
【００８２】
同様に、実施例３において説明するように、天然（非相同）プロモーターＰｒｒｎＩ−２（配列番号１５）およびその遺伝子操作された（非相同）変異体ＰｒｒｎＩ−２プロモーター（すなわち、変異体２（ハイブリッドプロモーター１）；変異体３（ハイブリッドプロモーター２３）；変異体４（ハイブリッドプロモーター２４）；変異体６（ハイブリッドプロモーター２０）；変異体１０（ハイブリッドプロモーター２２）；変異体１１（ハイブリッドプロモーター１９）；変異体１２（ハイブリッドプロモーター１８）および変異体１３（ハイブリッドプロモーター１７））からのサイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼ変異体（配列番号６３）の発現をＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞において試験した。特に、図４に示したように、遺伝子操作された（変異体）ＰｒｎＩ−２プロモーター（すなわち、図４；変異体２、変異体３、変異体１０、変異体１１、変異体１２および変異体１３）からのアミラーゼ発現／生産性は、天然（非相同）ＰｒｒｎＩ−２プロモーターと比較した場合にアミラーゼタンパク質の産生の増加を生じさせた。
【００８３】
さらに、実施例４において説明するように、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの一連の天然（野生型）プロモーターをＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主における３種の異なる細菌アミラーゼの発現について評価した。アミラーゼタンパク質の発現を駆動するための下記のプロモーター：ａｍｙＬバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）天然アミラーゼ遺伝子のＰａｍｙＬプロモーター（配列番号１１６）；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームＲＮＡ  ｒｒｎＩのＰｒｒｎＩ−２プロモーター（配列番号１５）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ１プロモーター（配列番号１０１）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ２プロモーター（配列番号１０２）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ４プロモーター（配列番号１０３）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ５プロモーター（配列番号１０４）およびバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ６プロモーター（配列番号１０５）について評価した。
【００８４】
配列番号１５、１０１、１０２、１０３、１０４および１０５に示した天然（野生型）リボソームプロモーター核酸配列は、それぞれ自然において見いだされるか単離されているように、操作可能に連結された天然（−３５／−１０）リボソームプロモーター核酸配列および天然プロモーター上流（ＵＰ）要素核酸配列を含む。３種の細菌アミラーゼ（すなわち、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ）α−アミラーゼＬ（配列番号４３；Ａｍｙ１）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ変異体（配列番号６４；Ａｍｙ３）およびサイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼ変異体（配列番号６３；Ａｍｙ４））をコードするポリヌクレオチドの発現／生産性は、上記に参照したプロモーター（すなわち、配列番号１５および１０１〜１０５のプロモーター）に操作可能に連結された（３’）。図５に示したように、様々な天然（野生型）プロモーター（すなわち、ＰａｍｙＬ、ＰｒｒｎＩ−２、Ｐｒｒｎ１、Ｐｒｒｎ２、Ｐｒｒｎ４、Ｐｒｒｎ５およびＰｒｒｎ６）によって駆動された３種の細菌アミラーゼ（すなわち、Ａｍｙ１、Ａｍｙ３およびＡｍｙ４）の相対発現は、内在性天然Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼプロモーター（ＰａｍｙＬ）に代わるこれらの非相同リボソームプロモーターの使用が大多数の場合にタンパク質の発現／生産性の増加を提供することを証明している。
【００８５】
したがって、所定の実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸配列（もしくはＯＲＦ）を発現させる際に使用するための遺伝子操作された（改変）非相同プロモーターに関する。所定の実施形態では、遺伝子操作されたプロモーターは、プロモーター核酸配列に操作可能に連結された少なくとも１つのプロモーター上流（ＵＰ）要素核酸配列を含むが、ここでＵＰ要素およびプロモーター要素の操作可能に連結された組み合わせは本明細書では非相同「完全プロモーター」もしくは非相同ハイブリッド「完全プロモーター」と呼ぶ。より特別には、上記のセクションＡで定義したように、非相同ハイブリッド「完全プロモーター」は遺伝子操作されたプロモーター（すなわち、ＵＰ要素配列およびプロモーター要素配列の両方を含む）であるが、ここで非相同ハイブリッド「完全プロモーター」のＵＰ要素およびプロモーター要素は、自然（例えば、ゲノム／染色体ＤＮＡ）において操作可能に連結されて、もしくは相互に関連して見いだされない異なる核酸配列から構築される、またはそれらに由来する。
【００８６】
したがって、所定の実施形態では、本開示の非相同ハイブリッド完全プロモーターは、下記の表１に配列番号６５〜９７として説明した核酸配列を含む。
【００８７】
【表１】
2019511218.tif 000003
【００８８】
【表２】
2019511218.tif 000004
【００８９】
【表３】
2019511218.tif 000005
【００９０】
所定の他の実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸配列（もしくはＯＲＦ）を発現させる際に使用するための遺伝子操作された（改変）非相同ハイブリッド完全プロモーターであって、表２に示した核酸配列を含むプロモーターＵＰ要素を：（１）表３に示した核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームＲＮＡプロモーター要素、（２）表４に示した核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームタンパク質プロモーター、（３）表５に示した核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）トランスファーメッセージＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）プロモーター、（４）表６に示した核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞質低分子ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）プロモーター、（５）表７に示した核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）タンパク質プロモーター、（６）表８に示した核酸配列を含むＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームＲＮＡプロモーター要素、（７）表９に示したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＰｒｒｎリボソームＲＮＡプロモーターコンセンサス配列および／または（８）表１０に示したＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰｒｒｎリボソームＲＮＡプロモーターコンセンサス配列と組み合わせて操作可能に連結する工程によって構築もしくは引き出される非相同ハイブリッド完全プロモーターに関する。
【００９１】
【表４】
2019511218.tif 000006
【００９２】
【表５】
2019511218.tif 000007
【００９３】
【表６】
2019511218.tif 000008
【００９４】
【表７】
2019511218.tif 000009
【００９５】
【表８】
2019511218.tif 000010
【００９６】
【表９】
2019511218.tif 000011
【００９７】
【表１０】
2019511218.tif 000012
【００９８】
【表１１】
2019511218.tif 000013
【００９９】
【表１２】
2019511218.tif 000014
【０１００】
【表１３】
2019511218.tif 000015
【０１０１】
【表１４】
2019511218.tif 000016
【０１０２】
【表１５】
2019511218.tif 000017
【０１０３】
【表１６】
2019511218.tif 000018
【０１０４】
したがって、所定の実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸配列を発現させる際に使用するための遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターであって、少なくとも１つのプロモーター要素（表３〜１０）に操作可能に連結された少なくとも１つのＵＰ要素（表２）を含む遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターを提供する。例えば、所定の実施形態では、遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターは、次の一般式：５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（式中、ＵＰはプロモーター上流要素を含む核酸であり、１ｓｔＰｒｏは少なくとも１つの−３５／−１０コアプロモーター配列を含む核酸であり、ＯＲＦはＰＯＩをコードする核酸配列である）を含む。
【０１０５】
他の実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸配列（もしくはＯＲＦ）を発現させる際に使用するための遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターであって、少なくとも２つのプロモーター要素（表３〜１０）に操作可能に連結された少なくとも１つのＵＰ要素（表２）を含む遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターに関する。例えば、所定の実施形態では、遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターは、次の一般式：５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＯＲＦ−３’；
（式中、ＵＰはプロモーター上流要素を含む核酸であり、１ｓｔＰｒｏおよび２ｎｄＰｒｏは少なくとも１つの−３５／−１０コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、ＯＲＦはＰＯＩをコードする核酸である）を含む。
【０１０６】
他の実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸配列（もしくはＯＲＦ）を発現させる際に使用するための遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターであって、少なくとも１つもしくは２つのプロモーター要素（表３〜１０）に操作可能に連結された少なくとも１つのＵＰ要素（表２）を含む遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターに関する。例えば、所定の実施形態では、遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターは、次の一般式：
５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’；
５’−ＵＰ−１ｓｔＰｒｏ−ＵＴＲ−２ｎｄＰｒｏ−ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’
（式中、ＵＰはプロモーター上流要素を含む核酸であり、１ｓｔＰｒｏおよび２ｎｄＰｒｏは少なくとも１つの−３５／−１０コアプロモーター配列を含む同一もしくは異なる核酸であり、ＵＴＲは５’未翻訳領域を含む核酸であり、およびＯＲＦはＰＯＩをコードする核酸である）を含む。
【０１０７】
本開示の遺伝子操作されたプロモーターを使用した場合に非相同ＰＯＩをコードする核酸配列の発現によって得られる予想外に高いタンパク質生産性レベルには、いくつかの利点がある。例えば、本開示の遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターを用いて関心対象のコーディング配列（例えば、ＰＯＩをコードする関心対象のＯＲＦ）を発現させる工程は、その天然プロモーターから発現させられる同一ＯＲＦの発現もしくはタンパク質生産性と比較すると、ＯＲＦコーディング配列の増加した発現および／または産生するＰＯＩの増加を提供する。特定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたプロモーターは、ｍＲＮＡ発現のレベル増加を提供するが、これは不安定な転写産物のために特に有用である。
【０１０８】
また別の実施形態では、遺伝子操作されたプロモーターを用いた関心対象のコーディング配列を発現させる工程は、遺伝子操作されたプロモーターを含む発現構築物を増幅させずに関心対象のコーディング配列の発現レベルの増加を可能にする。関心対象のコーディング配列の高い発現レベルを達成するために当技術分野における他の発現構築物を使用する場合には、発現構築物の増幅が頻回に必要とされる。しかし、本明細書に記載した遺伝子操作されたプロモーターを用いて達成される発現レベルは、発現構築物の増幅が一般に不要であるほど十分に高い。その代わりに、高い発現レベルは、いくつかの利点を提供する遺伝子操作されたプロモーターを含む発現構築物の単一構成要素を用いて達成され得る。第一に、宿主細胞は、それらが増幅させた発現構築物の消失を経験することがないために、典型的にはより安定性である。さらに、発現構築物を増幅させる必要がなければ宿主細胞構築はより効率的であるので、したがって時間、金銭および物質の節約となる。
【０１０９】
所定の他の実施形態では、本明細書に記載した遺伝子操作されたプロモーターの＋１転写開始部位に位置するヌクレオチドは、グアニンからアデニンへ改変される。例えば、本発明の所定の実施形態は、＋１転写開始部位での修飾（例えば、＋１でのＡからＧへの置換）部位は、本明細書に記載したプロモーターからの一貫した産生を許容し、このため、プロモーターからのより良好な総合生産性を生じさせる（例えば、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレットを参照）。
【０１１０】
所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターは、配列番号６５〜９７に示した核酸配列もしくはそれらの部分配列を含む。部分配列は、プロモーター活性を保持し、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド；少なくとも約３０ヌクレオチド；少なくとも約４０ヌクレオチド；少なくとも約５０ヌクレオチド；少なくとも約６０ヌクレオチド；少なくとも約７０ヌクレオチド；少なくとも約８０ヌクレオチド；少なくとも約９０ヌクレオチドもしくは少なくとも約１００ヌクレオチドを含むであろう。配列番号６５〜９７のいずれか１つの部分配列は、少なくとも−３５および−１０コンセンサス領域（すなわち、コアプロモーター要素）およびＵＰ要素を含むはずである。
【０１１１】
所定の他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された非相同ハイブリッド完全プロモーターは、表３〜１０のいずれか１つに示したプロモーター要素もしくはそれらの部分配列と組み合わされて操作可能に連結されている、表２に示した少なくとも１つのＵＰ要素から構築される、もしくはそれらに由来する。部分配列は、プロモーター活性を保持し、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド；少なくとも約３０ヌクレオチド；少なくとも約４０ヌクレオチド；少なくとも約５０ヌクレオチド；少なくとも約６０ヌクレオチド；少なくとも約７０ヌクレオチド；少なくとも約８０ヌクレオチド；少なくとも約９０ヌクレオチドもしくは少なくとも約１００ヌクレオチドを含むであろう。表３〜１０に示したプロモーター要素核酸配列のいずれか１つの部分配列は、少なくとも−３５および−１０コンセンサス領域（すなわち、コアプロモーター要素）を含むはずである。
【０１１２】
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたプロモーターは、その対応する親プロモーター核酸配列のプロモーター活性の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％および少なくとも約１００％の活性を有するであろう表１〜１０に示した核酸配列のいずれか１つとハイブリダイズする核酸配列（もしくはそれらの部分配列）を含む。一部の実施形態では、プロモーター活性は、例えば、約１００％より高い、約１５０％より高い、約２００％より高い、および約２５０％より高いであろう。一部の実施形態では、プロモーターは、中、高もしくは超高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列を含むであろう。
【０１１３】
特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、所要の核酸断片が本明細書に記載したプロモーター核酸配列に対応するかどうかを分析するために使用されるので、そこで本発明の範囲内に含まれる（一般的ハイブリダイゼーション法について記載している、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。
【０１１４】
「ハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」度を指す。ハイブリダイゼーション条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）において教示されたように、核酸結合錯体の融解温度（Ｔｍ）に基づくことができる。ハイブリダイゼーション条件は、さらに当技術分野において公知のようにハイブリダイゼーション後に使用される洗浄条件に基づくことができる。単に例示するためであるが、「低ストリンジェンシー」条件は、１５分間にわたる２０℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの溶液を用いた洗浄を指すことができる。「中ストリンジェンシー」条件は、３０分間にわたる３７℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの溶液を用いた洗浄を指すことができる。「高ストリンジェンシー」条件は、４５分間にわたる３７℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの溶液を用いた洗浄を指すことができる。「超高ストリンジェンシー」条件は、６０分間にわたる３７℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳの溶液を用いた洗浄を指すことができる。しかし、特定の溶液の成分、温度および洗浄時間に結び付いたストリンジェンシーは、特定の核酸および包含される他の条件に依存して変動し得る。当業者であれば、所望のストリンジェンシー度と結び付いたハイブリダイゼーション条件を決定できよう。
【０１１５】
本発明のまた別の態様は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７）において教示された核酸結合錯体の融解温度（Ｔｍ）に基づくハイブリダイゼーション条件の使用である。例示するためであるが、「超高ストリンジェンシー」は、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍの５℃下方）で発生する；「高ストリンジェンシー」は、典型的にはＴｍの約５℃〜１０℃下方で発生する；「中ストリンジェンシー」はＴｍの約１０℃〜２０℃下方で発生する；および「低ストリンジェンシー」は、Ｔｍの約２０℃〜２５℃下方で発生する。
【０１１６】
２つの核酸配列もしくは２つのポリペプチドの状況における用語「同一性」は、下記の「配列比較アルゴリズム」の１つを使用して測定した場合に、最大一致のために整列させた場合に同一である２つの配列内のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基に関する。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１のローカルホモロジーアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０のホモロジーアラインメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）または視覚的検査によって実施することができる。
【０１１７】
所定の他の実施形態では、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーターＰｒｒｎＯ＿Ｐ１（配列番号８５）、ＰｒｒｎＯ＿Ｐ２（配列番号８９）、ＰｒｒｎＡ＿Ｐ１（配列番号１４２）、ＰｒｒｎＡ＿Ｐ２（配列番号１４３）、ＰｒｒｎＪ＿Ｐ１（配列番号１４４）、ＰｒｒｎＪ＿Ｐ２（配列番号１４５）、ＰｒｒｎＩ＿Ｐ１（配列番号１４６）、ＰｒｒｎＥ＿Ｐ２（配列番号１４７）、ＰｒｒｎＥ＿Ｐ３（配列番号１４８）、ＰｒｒｎＤ＿Ｐ１（配列番号１４９）、ＰｒｒｎＤ＿Ｐ２（配列番号１５０）、ＰｒｒｎＧ＿Ｐ１（配列番号１５１）およびＰｒｒｎＷ＿Ｐ１（配列番号１５２）の配列は、図６に示したＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ．）を使用してデフォルトパラメーターを用いて整列させた。このアラインメントを使用して、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎプロモーターについてのコンセンサス配列を生成し（配列番号１５３）、図６の一番上に示した。配列番号１５３のコンセンサス配列は、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／ＴおよびＶ＝Ａ／Ｃ／Ｇと規定されたＩＵＰＡＣ命名法を使用した。
【０１１８】
所定の他の実施形態では、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーターｒｒｎ１−Ｐ１（配列番号１０６）、ｒｒｎ２−Ｐ１（配列番号１０７）、ｒｒｎ２−Ｐ２（配列番号１０８）、ｒｒｎ３−Ｐ１（配列番号１０９）、ｒｒｎ４−Ｐ１（配列番号１１０）、ｒｒｎ４−Ｐ２（配列番号１１１）、ｒｒｎ５−Ｐ１（配列番号１１２）、ｒｒｎ５−Ｐ２（配列番号１１３）、ｒｒｎ６−Ｐ１（配列番号１１４）およびｒｒｎ６−Ｐ２（配列番号１１５）のプロモーター配列および上流要素配列は、図７に示したようにＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用してデフォルトパラメーターを用いて整列させた。このアラインメントを使用して、コンセンサス配列（配列番号１５４）は、コンセンサスを生成するために７５％の閾値（全配列の少なくとも７５％一致する塩基対）を使用して生成した。配列番号１５４のコンセンサス配列は、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／ＴおよびＶ＝Ａ／Ｃ／Ｇと規定されたＩＵＰＡＣ命名法を使用した。
【０１１９】
所定の他の実施形態では、本開示の１種以上の遺伝子操作されたプロモーター（例えば、遺伝子操作された二重プロモーター、遺伝子操作された三重プロモーター、遺伝子操作された四重プロモーターなど）は、さらに宿主細胞内で活性を備える他のプロモーターを含むことができ、および宿主細胞にとって天然であっても天然でなくてもよい突然変異プロモーター、切断プロモーターなどを含む。本発明のハイブリッドプロモーターにおいて有用であり得る他のプロモーターの例としては、真菌プロモーターおよび細菌プロモーターが挙げられる。
【０１２０】
一部の特定の非限定的例としては；ａｐｒＥプロモーターもしくは突然変異ａｐｒＥプロモーター（ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）；ストレプトミセス・フラジアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子のａｐｈプロモーター；アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）プロモーター；アクチノプラネス・ミズーリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）のグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーターおよびその誘導体ＧＩ（ＧＩＴ）プロモーター（米国特許第６，５６２，６１２号明細書および欧州特許第３５１０２９号明細書）；ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）由来のグルコースイソメラーゼ（ＧＩ）プロモーター、短鎖野生型ＧＩプロモーター、１．５ＧＩプロモーター、１．２０ＧＩプロモーターもしくは国際公開第２０３０３／０８９６２１号パンフレットに開示された変異型ＧＩプロモーターのいずれか；糸状菌由来のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇ１１およびｅｇ１２プロモーターおよび特にトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ８６２３５）；ｌａｃＺおよびｔａｃプロモーター（Ｂａｇｄａｓａｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）；ｅｒｍＥプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６およびＳｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）；ならびにバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ファージｏ２９プロモーター（Ｐｕｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）が挙げられる。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）において効果的なプロモーターは、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６に列挙されている。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ファージプロモーターは、さらにＬａｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７にも開示されている。本明細書のハイブリッドプロモーターにおいて使用するために効果的であり得る他のプロモーターは、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６および国際公開第１９９６／００７８７号パンフレットに列挙されたプロモーターである。
【０１２１】
Ｃ．関心対象のタンパク質
所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたプロモーターは、関心対象のタンパク質（ＰＯＩ）をコードする核酸（例えば、ポリヌクレオチドもしくはＯＲＦ）に操作可能に連結されている。１つ以上の実施形態では、ＰＯＩは、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体もしくはその断片、受容体もしくはその部分、レポーター遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）または他の二次代謝産物である。
【０１２２】
所定の実施形態では、酵素は、細菌もしくは真菌由来のアセチルエステラーゼ、アリールエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼなどである。
【０１２３】
所定の実施形態では、酵素は、プロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールもしくは酸性プロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ（例えば、サブチリシン）であろう。セリンプロテアーゼは、Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｄｒｅｎｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２；米国特許第４，７６０，０２５号明細書（再発行特許第３４，６０６号明細書）、同第５，１８２，２０４号明細書および同第６，３１２，９３６号明細書ならびに欧州特許第３２３，２９９号明細書に記載されている）。使用するために企図されるプロテアーゼは、さらに米国特許公開第２０１０／０１５２０８８号明細書およびＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２０１０／０５６６３５号パンフレット、同第２００／８０１０９２５号パンフレット、同第２００３／６２３８０号パンフレット、同第２０１０／５６６４０号パンフレット、同第２０１１／７２０９９号パンフレットなどにも記載されている。タンパク分解活性を測定するための手段は、Ｋａｌｉｓｚ，１９８８に開示されている。
【０１２４】
また別の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたプロモーターによって発現させられるプロテアーゼは、配列番号４０のアミノ酸配列を含む成熟ＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ変異体）プロテアーゼもしくは配列番号４１のアミノ酸配列を含む前駆体（全長）ＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ変異体）プロテアーゼである。
【０１２５】
他の実施形態では、酵素は、アミラーゼ、例えばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））由来のアミラーゼ、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））由来のアミラーゼもしくはゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｇ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））由来のアミラーゼである。細菌および真菌アミラーゼは、例えば、米国特許第８，０５８，０３３号明細書、米国特許公開第２０１０／００１５６８６号明細書、同第２００９／０３１４２８６号明細書、英国特許出願第１０１１５１３．７号明細書、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５３０１８号明細書および国際公開番号の国際公開第２００８／１１２４５９号パンフレット、同第２００８／１１８３７７号パンフレット、同第２００８／１５３８０５号パンフレット、同第２００８／１５３８１５号パンフレット、同第２０１０／１３３６４４号パンフレット、同第２０１４／９９５２号パンフレット、同第２０１４９９５２５号パンフレットなどに記載されている。
【０１２６】
所定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたプロモーターによって発現させられるアミラーゼは、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｍｙＥアミラーゼ、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬアミラーゼ、配列番号６４のアミノ酸配列を含むゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＡｍｙＳアミラーゼもしくは配列番号６３のアミノ酸配列を含むサイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼである。
【０１２７】
他の実施形態では、酵素は、キシラナーゼである。所定の実施形態では、キシラナーゼは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））由来である。細菌および真菌キシラナーゼは、一般に、米国特許第７，７１８，４１１号明細書およびＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２００１／０２７２５２号パンフレット、同第２００１／６６７１１号パンフレット、同第２００４／９７００１号パンフレット、同第２０１０／７２２２５号パンフレット、同第２０１３／１２７０６９号パンフレット、同第２０１３／３７９３３号パンフレット、同第２０１５／１１４１０８号パンフレットなどに記載されている。
【０１２８】
他の実施形態では、酵素は、フィターゼである。所定の実施形態では、フィターゼは、シトロバクター属（例えば、Ｃ．フロインジイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ））もしくはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する。他の実施形態では、フィターゼは、例えばブティアウクセラ・アグレスチス（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ａｇｒｅｓｔｉｓ）フィターゼなどのブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼであってよい。フィターゼは、例えば、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第００６／０４３１７８号パンフレット、同第２００６／０３８０６２号パンフレット、同第２００８／０９７６１９号パンフレット、同第２００９／１２９４８９号パンフレット、同第２００６／０３８１２８号パンフレット、同第２００８／０９２９０１号パンフレット、同第２００９／１２９４８９号パンフレット、同第２０１０／１２２５３２号パンフレット、同第２００３／３８０３５号パンフレット、同第２００４／１５０８４号パンフレット、同第２００３／３８１１１号パンフレットなどに記載されている。
【０１２９】
所定の他の実施形態では、酵素は、セルラーゼである。セルラーゼは、セルロース中のβ−Ｄ−グルコシド結合を加水分解する（セルロース分解性）酵素である。セルロース分解酵素は、伝統的に３つの主要クラス：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ（もしくはセロビオヒドロラーゼ）およびβ−グルコシダーゼに分類されてきた（Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０１３０】
科学文献では数多くのセルラーゼが記載されてきたが、その例には、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に由来する、ＣＢＨＩを開示しているＳｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；ＣＢＨＩＩを開示しているＴｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；ＥＧＩを開示しているＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；ＥＧＩＩを開示しているＳａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；ＥＧＩＩＩを開示しているＯｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；ＥＧＩＶを開示しているＳａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；およびＥＧＶを開示しているＳａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４が含まれる。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）以外の種に由来するエキソ−セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼについても当技術分野において記載されている。
【０１３１】
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたプロモーターによって発現させられるセルラーゼは、米国特許第６，２，８７，８３９号明細書および同第６，５６２，６１２号明細書に開示されたセルラーゼである。所定の実施形態では、発現させられるセルラーゼは、米国特許第６，５６２，６１２号明細書の配列番号１のアミノ酸配列またはセルロース分解活性および米国特許第６，５６２，６１２号明細書の配列番号１の活性部分と７０％超の配列同一性を有するその断片もしくは誘導体を含むセルラーゼである。セルラーゼは、一般に、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２００４／９７００１号パンフレット、同第２００５／９３０５０号パンフレット、同第２００４／９９３７０号パンフレット、同第２００４／９９３６９号パンフレット、同第２００９／１４９２０２号パンフレット、同第２００８／４５２１４号パンフレット、同第２００６／７１５９８号パンフレット、同第２００９／３５５３７号パンフレット、同第２０１３／３７９３３号パンフレット、同第２０１０／１４１７７９号パンフレット、同第２００８／１５３９０３号パンフレット、同第２０００／３７６１４号パンフレットおよび米国特許公開第２０１０／００４８４１７号明細書に開示されている。
【０１３２】
他の実施形態では、酵素は、マンナナーゼ（β−マンノシダーゼ）である。マンナナーゼ酵素は、β−Ｄ−マンノシド内の末端非還元型β−Ｄ−マンノース残基を加水分解する（例えば、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２００１９８４６２号パンフレット、同第２０１２１４９３２５号パンフレット、同第２０１２１４９３３３号パンフレット、カナダ国特許出願第２８９１５１９号明細書などを参照）。
【０１３３】
他の実施形態では、酵素は、プルラナーゼである。プルラナーゼ酵素は、プルランを分解する特別な種類のグルカナーゼ酵素（すなわち、デンプン分解外酵素）である（例えば、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２００８０２４３７２号パンフレット、同第２００１５１６２０号パンフレット、同第９４１９４６８号パンフレットなどを参照）。例えば、所定の実施形態では、プルラナーゼは、グラム陰性細菌（例えば、クレベシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ））によって細胞外細胞表面固定リポタンパク質として産生する。所定の実施形態では、プルラナーゼは、α−１，６−結合を特異的に攻撃する「Ｉ型プルラナーゼ」である。他の実施形態では、プルラナーゼは、α−１，６結合を切断することに加えて、さらにα−１，４結合を加水分解（切断）できる「ＩＩ型プルラナーゼ」である。
【０１３４】
本開示のＰＯＩをコードする核酸（例えば、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、抗体など）は、その中でＰＯＩが発現させられる宿主細胞に比較して天然（内在性）ＰＯＩもしくは非相同（外来性）ＰＯＩのいずれかであってよい。所定の実施形態では、ＰＯＩをコードする核酸は、全長タンパク質もしくは全長タンパク質の切断形をコードすることができる。他の実施形態では、ＰＯＩをコードする核酸は、ＰＯＩの全長「成熟」形（すなわち、シグナルもしくはリーダーペプチド配列が欠如するＰＯＩの成熟形）をコードする。他の実施形態では、ＰＯＩをコードする核酸は、Ｎ末端リーダーもしくはシグナル配列５’をコードする、およびＰＯＩの成熟形をコードする核酸に操作可能に連結された核酸を含む全長プレタンパク質をコードする（例えば、下記のセクションＤを参照）。本発明は、特定のコーディング配列には限定されないが、本発明のプロモーターに操作可能に連結された数多くのコーディング配列を含む。
【０１３５】
したがって、所定の実施形態では、改変宿主細胞は、増加したレベルのＰＯＩを産生するが、産生したＰＯＩの増加したレベルは、様々なスクリーニング法を適用して決定することができる。例えば、ＰＯＩは、ポリペプチド融合としてコードすることができ、検出可能な標識として機能することができる、または標的タンパク質自体が選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーとして機能することができる。標識タンパク質もまた、ウエスタンブロット法、ドットブロット法（このような方法の詳細な説明は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓのウェブサイトで入手可能である）、ＥＬＩＳＡ、または、標識がＧＦＰであれば、全細胞蛍光法もしくはＦＡＣＳを用いて検出することができる。
【０１３６】
例えば、標的タンパク質と融合させるために６−ヒスチジンタグを含むことができ、ウエスタンブロット法を使用するとそのようなタグを検出することができる。さらに、標的タンパク質が十分に高いレベルで発現する場合は、クマシー／銀染色を組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、野生型と比較して増大した変異体の発現を適切に検出することができるが、そのような場合は任意の分子の標識化は必要とされないであろう。
【０１３７】
他の実施形態では、非改変（親）細胞と比較した改変（宿主）細胞におけるＰＯＩの発現は、ｍＲＮＡの転写レベルと相関する。例えば、所定の実施形態は、ＰＯＩをコードする遺伝子もしくはＯＲＦの分子特性解析に関連するが、それには、通常は、ＲＮＡ発現の時間的および空間的分布の徹底した分析が含まれる。完全もしくはポリ（Ａ）ＲＮＡサンプルにおける特定ｍＲＮＡを検出してその存在度を決定するためには、多数の広く用いられている手順があり、当技術分野において公知である。非限定的な例としては、ノーザンブロット分析、ヌクレアーゼ保護アッセイ（ＮＰＡ）、インサイチュー・ハイブリダイゼーションおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの方法が挙げられる。
【０１３８】
関心対象のタンパク質のレベルの改善を確認するためには、培養もしくは発酵がより長期間にわたり効率的に持続することを可能にする、例えば、細胞１個当たりのタンパク質活性もしくは量の増加または培地１ｍＬ（ミリリットル）当たりのタンパク質活性もしくは量の増加の検出などの他の方法、またはこれらの方法の組み合わせを使用することができる。
【０１３９】
比生産性の検出は、タンパク質産生を評価するためのまた別の好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」は、タンク内で産生するタンパク質のグラム数であり；「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は、産生時間ならびに増殖時間を含む接種時点からの発酵時間（時間）である）を使用して決定することができる。
所定の実施形態では、本開示の改変宿主細胞は、非改変（親）細胞と比較して、ＰＯＩを少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％もしくは少なくとも約１０％以上産生する。
【０１４０】
Ｄ．シグナル配列
所定の実施形態では、特にＰＯＩをコードする核酸が細胞外酵素、例えばセルラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼなどをコードする場合は、シグナル配列はコーディング配列のＮ末端部分に連結させることができる。シグナルは、本開示のＰＯＩの細胞外分泌を促進するために使用されてよい。シグナル配列は、その中でＰＯＩが発現させられる宿主生物にとって内在性であってよい、またはその中でＰＯＩが発現させられる宿主生物に外来性（非相同）であってよい。
【０１４１】
所定の実施形態では、本開示のＰＯＩをコードする遺伝子（もしくはＯＲＦ）はさらに、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）サブチリシンａｐｒＥ遺伝子シグナル配列に由来するＮ末端シグナル配列もしくはその変異シグナル配列を含む（およびそれに操作可能に連結されている）。他の実施形態では、シグナル配列は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ａｍｙＥ）α−アミラーゼ遺伝子シグナル配列もしくはＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢｇｌＣ（すなわち、アリール−ホスホ−β−Ｄ−グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．８６））シグナル配列もしくはそれらの変異体に由来する。
【０１４２】
所定の他の実施形態では、本開示のＰＯＩをコードする遺伝子（もしくはＯＲＦ）は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ａｍｙＬ）α−アミラーゼ遺伝子シグナル配列に由来するＮ末端シグナル配列もしくはそれらの変異シグナル配列を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、シグナル配列は、ＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２０１１／０１４２７８号パンフレットおよび同第２０１０／１２３７５４号パンフレットに記載されたように改変もしくは修飾することができる。所定の他の実施形態では、シグナル配列は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）セルラーゼ遺伝子由来のシグナル配列を含む。１つの実施形態では、好ましいシグナル配列は、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）セルラーゼ、ｃｅｌＡである（Ｂｅｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかし、当業者であれば、数多くのシグナルペプチドについて承知しており、それらはどれも使用するために企図されており、前記宿主細胞中で発現させられる宿主細胞およびポリペプチド（ＰＯＩ）にしたがって選択される。
【０１４４】
Ｅ．ＤＮＡ構築物およびベクター
ＰＯＩをコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたプロモーターを含む本発明の核酸構築物は、当技術分野において確立された標準方法によって合成的に調製することができる（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，１９８１によって記載されたホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４によって記載された方法）。核酸構築物は、混合合成およびゲノム起源の構築物であってよく、合成もしくはゲノムＤＮＡの断片をライゲートする工程によって調製することができる。核酸構築物は、さらに、例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書またはＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８に記載されたように、特定プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって調製することができる。
【０１４５】
本発明のＤＮＡ構築物は、例えば発現ベクターなどのベクターに挿入することができる。真菌、酵母および細菌内でのポリペプチドのクローニング、形質転換および発現のために好適な様々なベクターは、当業者には公知である。典型的には、ベクターもしくはカセットは、本発明の遺伝子操作されたプロモーター、任意選択的にシグナル配列、関心対象のコーディング領域およびターミネーター配列を含むであろう。
【０１４６】
所定の実施形態では、好適なベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を可能とする核酸配列をさらに含むことができる。そのようなことを可能にする配列の例としては、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、ｐＩＪ７０２などの複製起点が挙げられる。
【０１４７】
他の実施形態では、ベクターはさらに、選択可能なマーカー（例えば、その産物が単離された宿主細胞内の欠陥を補完する遺伝子）、例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のｄａｌ遺伝子；または（例えば、アンピシリン耐性、スペクチノマイシン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性、テトラサイクリン耐性など）の抗生物質耐性を付与する遺伝子を含み得る。
【０１４８】
所定の実施形態では、発現ベクターには、クローニングベクターの成分、例えば、選択された宿主生物中でのベクターの自己複製を許容する要素および選択のための表現型により検出可能な１種以上のマーカーなどが含まれる。発現ベクターはまた、典型的には、制御ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および任意選択的に、リプレッサー遺伝子、１種以上の活性化遺伝子配列などを含む。
【０１４９】
関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ構築物、プロモーター、ターミネーターおよび／または他の要素をライゲートし、それらを複製のために必要な情報を含有する好適なベクターに挿入するために使用される、例えば本明細書に記載したようなプロトコールは、当業者であれば周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００１を参照）。
【０１５０】
ポリヌクレオチド構築物もしくは発現ベクターのいずれかを含む単離された細胞は、有益にもＰＯＩの組換え産生における宿主細胞として使用される。細胞は、ＰＯＩをコードするＤＮＡ構築物を用いて、便宜的にはその構築物を宿主染色体に（１つ以上のコピー数で）組み込むことによって形質転換させることができる。組込みは、そのようにして導入されたＤＮＡ配列は細胞内で安定性に保持される可能性が高いので、一般的には利点であると考えられる。宿主染色体へのＤＮＡ構築物の組込みは、従来方法によって、例えば、相同組換えもしくは非相同組換えを用いて実施することができる。または、細胞は、異なるタイプの宿主細胞と関連した上述の発現ベクターを用いて形質転換させることができる。
【０１５１】
他の実施形態では、遺伝子の欠損を発現ベクターによって修復できれば、発現宿主から遺伝子を欠失させるために有利である。１つ以上の不活化された遺伝子を有する宿主細胞を得るためには、公知の方法を使用することができる。遺伝子の不活化は、遺伝子が機能性タンパク質の発現を防止するように、完全もしくは部分欠失によって、挿入不活化によってまたは本来の目的で遺伝子を非機能的にさせる任意の他の手段によって実施することができる。
【０１５２】
Ｆ．形質転換
本発明のベクターは、宿主細胞内に形質転換させられるであろう。一般的形質転換技術は、当技術分野において公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。これらの一般的技術の一部には、粒子銃もしくは遺伝子銃の使用（バイオリスティクス）、形質転換プロセス前の糸状菌細胞の透過化（例えば、高濃度のアルカリ、例えば０．０５Ｍ〜０．４ＭのＣａＣｌ２もしくは酢酸リチウムの使用によって）、プロトプラスト融合、エレクトロポレーションもしくはアグロバクテリウム属（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換（米国特許第６，２５５，１１５号明細書）およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９およびＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８に記載されたプロトプラストもしくはスフェロプラストのポリエチレングリコールおよびＣａＣｌ２による処理が含まれるがそれらに限定されない。
【０１５３】
細菌のための形質転換法および発現法は、Ｂｒｉｇｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９０に開示されている。プロテアーゼ欠失バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株のための好ましい一般的形質転換および発現プロトコールは、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２６４，３６６号明細書に提供されている。ＰＯＩをコードする核酸を含んで発現させるためにルーチン技術で改変することができる代表的なベクターは、ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩである（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，２００７）。
【０１５４】
一般に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）コンピテント細胞のＤＮＡ媒介性形質転換は、当技術分野において公知である。例えば、遺伝子交換のこのプロセスに関するほとんどの情報は、形質転換細胞を生じさせる下記の一連の事象：（１）ドナーＤＮＡの二本鎖断片化を生じさせた、形質転換ＤＮＡのコンピテント細胞への結合、（２）相補鎖の同時の分解によって実施された、結合ＤＮＡの１本の鎖の移入、（３）レシピエントＤＮＡ内への一本鎖ＤＮＡの断片の組込み、（４）新規に獲得した情報の発現（例えば、Ｄｕｂｎａｕ，１９７６；Ｖｅｎｅｍａ，１９７９を参照）の確立を生じさせた物理化学的研究に由来した。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）形質転換法は、さらにＰＣＴ国際公開番号の国際公開第２００２１４４９０号パンフレットに開示されている。
【０１５５】
Ｇ．宿主細胞
本発明にしたがって使用できる宿主細胞には、細菌細胞および真菌細胞の両方が含まれる。好ましい真菌宿主細胞には、糸状菌細胞、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞が含まれる。好ましい細菌宿主細胞には、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）宿主細胞を含むグラム陽性細胞およびグラム陰性細胞の両方が含まれる。宿主細胞にはさらに、制限なく、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）シュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）（例えば、Ｐ．エルギノア（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏａ）およびＰ．アルカリゲネス（Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ））、ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）（例えば、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ））、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）およびＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が含まれる。
【０１５６】
Ｈ．細胞培養
本開示の宿主細胞および形質転換細胞は、一般に従来型の栄養培地中で培養される。形質転換宿主細胞のための培養培地は、プロモーターを活性化するため、および形質転換体を選択するために適宜改変されてよい。例えば温度、ｐＨなどの特定の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のために使用される条件であってよく、当業者には明らかであろう。
【０１５７】
さらに、好ましい培養条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，１９８９；Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００およびＨａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０の中に、および／またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）などの科学文献から見いだすことができる。例えばトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞などの真菌宿主細胞の安定性形質転換体は、一般に、それらのより高速の増殖速度もしくは固体培養培地上のギザギザではなくむしろ平滑な輪郭を備える環状コロニーの形成による不安定な形質転換体から識別することができる。
【０１５８】
Ｉ．発現した関心対象のポリペプチドの回収
本開示の形質転換宿主細胞により産生した関心対象のポリペプチドは、当業者には公知の、遠心分離もしくは濾過によって培地から宿主細胞を分離する工程、または必要であれば、細胞を崩壊させて細胞分画および細胞破片から上清を除去する工程を含む従来型手技によって培養培地から回収することができる。典型的には、清浄化後、上清もしくは濾液のタンパク性成分は、塩析法（例えば、硫酸アンモニム）によって沈澱させられる。沈殿したタンパク質は、その後に可溶化され、様々なクロマトグラフィー手技、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよびその他の当技術分野で認識された手技によって精製することができる。したがって、所定の実施形態では、本開示の遺伝子操作されたプロモーターから発現したＰＯＩは、単離されたＰＯＩ、回収されたＰＯＩおよび／または精製されたＰＯＩである。
【０１５９】
Ｊ．構築物の組立て
所定の一般的実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸構築物を組み立てる（構築する）工程、その後に構築物が宿主ゲノムに組み込まれるようにコンピテント宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞）内へそのような構築物を直接的にクローニングする工程を包含する。例えば、所定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ構築物を組み立てるために、ＰＣＲ融合、ギブソン・アッセンブリーおよび／またはライゲーションが使用される。所定の他の実施形態では、ＤＮＡ（核酸）構築物は、非プラスミドＤＮＡ構築物である。他の実施形態では、ＤＮＡ構築物は、突然変異がその中に導入されているＤＮＡを含む。この構築物は、次に宿主細胞を形質転換させるために使用される。これに関連して、宿主細胞（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））の高度にコンピテントな変異体は、好ましくは、細胞内への構築物の直接的クローニングを促進するために使用される。例えば、キシロース誘導性プロモーター（Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫ）の制御下でｃｏｍＫ遺伝子を運搬するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、極めて高い効率で確実に形質転換させることができる。
【０１６０】
細胞を形質転換させるためには、当技術分野において公知である任意の好適な方法を使用できる。ＤＮＡ構築物は、形質転換の前にベクター（すなわち、プラスミド）に挿入することができる。一部の実施形態では、環状プラスミドは、適切な制限酵素（すなわち、ＤＮＡ構築物を崩壊させない制限酵素）を使用して切断される。したがって、一部の実施形態では、環状プラスミドは本発明とともに使用される。しかし、また別の実施形態では、線状プラスミドが使用される。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物（すなわち、ＰＣＲ産物）は、プラスミドＤＮＡの存在を伴わずに使用される。
【実施例】
【０１６１】
本発明およびその利点を詳細に例示するために、下記の特定の実施例は、それらが本発明を例示するために提供されており、決してその範囲を限定するものであると見なすべきではないという理解の下で与えられる。
【０１６２】
実施例１
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現のためのハイブリッドプロモーターもしくは非相同プロモーターを用いたＤＮＡ構築物の生成
Ａ．ハイブリッドプロモーターを用いたＤＮＡ構築物
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現宿主における関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を転写させるために、単一非相同プロモーター、単一ハイブリッドプロモーター、複数（２種以上）の非相同プロモーター、複数（２種以上）のハイブリッドプロモーターおよびそれらの組み合わせを生成した。これらの単一非相同プロモーター、単一ハイブリッドプロモーター、複数の非相同プロモーター、複数のハイブリッドプロモーターおよびそれらの組み合わせは、さらに少なくとも１つの上流プロモーター要素（ＵＰ要素）５’を有すると定義され、少なくとも１つのプロモーター要素に操作可能に連結されており、ここで少なくとも１つのＵＰ要素および少なくとも１つのプロモーター要素は天然では相互に結び付いて（すなわち、操作可能に連結されて）おらず、それらは同一天然「完全」プロモーターにも由来しない。
【０１６３】
例えば、核酸を配列番号６５の単一ハイブリッドプロモーター（ハイブリッドプロモーター１）もしくは配列番号７１の二重ハイブリッドプロモーター（二重ハイブリッドプロモーター７）と合成し、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ）サブチリシン（配列番号４１）をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。生じたＤＮＡ構築物は、配列番号８１（ハイブリッドプロモーター１＋ＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ））および８２（ハイブリッドプロモーター７＋ＢＰＮ’（Ｙ２１７Ｌ））それぞれのヌクレオチド配列を有する。さらに配列番号６５（ハイブリッドプロモーター１）、配列番号９６（ハイブリッドプロモーター２３）および配列番号９７（ハイブリッドプロモーター２４）の配列を備える単一ハイブリッドプロモーターまたは配列番号７１（二重ハイブリッドプロモーター７）、配列番号９０（二重ハイブリッドプロモーター１７）、配列番号９１（二重ハイブリッドプロモーター１８）、配列番号９２（二重ハイブリッドプロモーター１９）、配列番号９３（二重ハイブリッドプロモーター２０）、配列番号９４（二重ハイブリッドプロモーター２１）もしくは配列番号９５（二重ハイブリッドプロモーター２２）の配列を備える二重ハイブリッドプロモーターを備える核酸を合成し、サイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種成熟アミラーゼ変異体（配列番号６３）をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。上記の表２に示したのは、本開示において試験したハイブリッドプロモーターである。
【０１６４】
所望のプロモーター配列を包含するＤＮＡ断片をｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として合成的に生成し、例えばＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌなどの関心対象の遺伝子に、当技術分野において公知の方法によってライゲートさせた。これらの核酸構築物は、当技術分野において公知の方法によって好適なＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）もしくはＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株を形質転換させるためにＤＮＡカセットに挿入した、または増幅させた。好適なＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、Ｓｐｉｚｉｚｅｎのプロトコール（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１）を使用して結果として生じたＤＮＡカセットを用いて形質転換させた。例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換のために使用されるＤＮＡカセットは、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）染色体のａｐｒＥ遺伝子座での組込みのためのスペクチノマイシン耐性マーカー（ｓｐｃＲ、配列番号８６）および２つのａｐｒＥ相同領域（配列番号８７および８８）ならびに野生型ａｐｒＥ  ＵＴＲ（配列番号６２）を含有する。配列番号６５（ハイブリッドプロモーター１）、６６（ハイブリッドプロモーター２）、７１（ハイブリッドプロモーター７）、７５（ハイブリッドプロモーター１１）、７６（ハイブリッドプロモーター１２）、７７（ハイブリッドプロモーター１３）、７８（ハイブリッドプロモーター１４）、７９（ハイブリッドプロモーター１５）、８０（ハイブリッドプロモーター１６）、９０（ハイブリッドプロモーター１７）、９１（ハイブリッドプロモーター１８）、９２（ハイブリッドプロモーター１９）、９３（ハイブリッドプロモーター２０）、９４（ハイブリッドプロモーター２１）、９５（ハイブリッドプロモーター２２）、９６（ハイブリッドプロモーター２３）もしくは９７（ハイブリッドプロモーター２４）の配列を備えるハイブリッドプロモーターを合成し、（１）配列番号４２のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミラーゼＥ（ＡｍｙＥ）変異体に操作可能に連結された配列番号１５６のＡｐｒＥシグナル配列、（２）配列番号４３のＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＡｍｙＬ）に操作可能に連結された配列番号１５６のＡｐｒＥシグナル配列、（３）Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬ成熟配列に操作可能に連結されたＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬシグナル配列であって、ここでＡｍｙＬシグナル配列およびＡｍｙＬ成熟配列は、配列番号４４に示したように操作可能に連結されているＡｍｙＬシグナル配列、（４）配列番号６４のゲオバチルス・サーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ（ＡｍｙＳ）変異体に操作可能に連結された配列番号１５６のＡｐｒＥシグナル配列、および（５）配列番号６３のサイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼ変異体に操作可能に連結された配列番号１５６のＡｐｒＥシグナル配列をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。上記���先行する段落において示したように、所定の実施形態では、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡｍｙＥおよびＡｍｙＬの発現は、天然ＡｍｙＥおよびＡｍｙＬシグナル配列の代わりに、配列番号１５６のＡｐｒＥシグナル配列を利用した。
【０１６５】
さらに、配列番号４５〜６１から選択されたＵＰ要素配列を含む他のハイブリッドプロモーターならびに配列番号１〜８、１５〜１８、３７、１０５〜１１５および１１８〜１４０から選択された１つ、２つもしくは３つのプロモーター配列を備える核酸構築物もまた合成し、上述の関心対象の遺伝子もしくは関心対象の他の遺伝子にライゲートさせた。配列番号１〜８、１５〜１８、３７、１０５〜１１５および１１８〜１４０のプロモーター配列は、上記の表３〜１０に提示した。
【０１６６】
これらの核酸構築物は、ＤＮＡカセット内もしくは発現ベクター内で作成し、増幅させた、または様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の形質転換のために直接的に使用した。これらの核酸構築物、カセットもしくは増副産物の一部は、ｓｐｃＲマーカー、クロラムフェニコール耐性マーカーまたは他の選択可能なマーカーを含有する。一部は、アラニンラセマーゼ遺伝子を含有する。所定の実施形態では、核酸構築物は、非組込み構築物もしくはカセットである。他の実施形態では、核酸構築物は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の染色体上の様々な位置で組み込まれるための特異的相同領域によって染色体に組み込まれる。他の実施形態では、核酸構築物は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の天然型プラスミドに組み込まれるための特異的相同領域によってプラスミドに組み込まれる。
【０１６７】
他の実施形態では、配列番号６７（ハイブリッドプロモーター３）、６８（ハイブリッドプロモーター４）、６９（ハイブリッドプロモーター５）、７０（ハイブリッドプロモーター６）、７２（ハイブリッドプロモーター８）、７３（ハイブリッドプロモーター９）および７４（ハイブリッドプロモーター１０）の追加のハイブリッドプロモーターの核酸構築物を合成してＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌサブチリシン（配列番号４０もしくは４１を含む）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミラーゼＥ（ＡｍｙＥ、配列番号４２を含む）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＡｍｙＬ、配列番号４３もしくは４４）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ（ＡｍｙＳ、配列番号６４）変異体、サイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼ（配列番号６３）変異体、または他のアミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼもしくはプロテアーゼ、野生型もしくはそれらの変異体をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。これらの核酸構築物は、ＤＮＡカセット内もしくは発現ベクター内で作成し、増幅させた、または様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の形質転換のために直接的に使用した。所定の実施形態では、これらの核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、ｓｐｃＲマーカー、クロラムフェニコール耐性マーカーもしくは他の選択可能なマーカーを含有する。所定の他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、アラニンラセマーゼ遺伝子を含む。所定の他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、非組込み核酸構築物、カセットもしくはそれらの増副産物である。他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の染色体上の様々な位置で組み込まれるための特異的相同領域によって染色体に組み込まれる。また別の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の天然型プラスミドに組み込まれるための特異的相同領域によってプラスミドに組み込まれる。他の実施形態では、配列番号１５、６５、７１、９６、９７および１０１〜１０５のプロモーター配列は、プロモーター配列の３’末端で操作可能に連結された配列番号６２のａｐｒＥ野生型ＵＴＲを有するが、配列番号９０、９１、９２、９３、９４および９５のプロモーター配列は、プロモーター配列の３’末端で操作可能に連結されたＬＡＴ野生型ＵＴＲ（配列番号１５５）を有する。
【０１６８】
Ｂ．非相同もしくは相同完全プロモーターを備える核酸構築物
本実施例では、非相同もしくは相同バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーターを備える核酸構築物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現宿主における関心対象のタンパク質をコードする遺伝子を転写させるために生成した。これらのプロモーターは、それぞれＵＰ要素５’を含んでプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１つの天然（野生型）「完全プロモーター」を有するが、ＵＰ要素および天然（野生型）「完全プロモーター」のプロモーターは、自然に結び付いていて同一の天然「完全プロモーター」と一緒に操作可能に連結されている、またはそれに由来する。
【０１６９】
例えば、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩ（配列番号１５）、ｓｓｒＡ（配列番号２５）、ｓｃｒ（配列番号２６）、ｓｐｏＶＧ（配列番号２７）、ａｐｒＥ（配列番号２８）、ｖｐｒ（配列番号２９）、ｍｐｒ（配列番号３０）、ｂｐｒ（配列番号３１）もしくはｉｓｐＡ（配列番号３２）の完全プロモーター配列を備える相同プロモーターの核酸を合成し、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌサブチリシン（配列番号４１）をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。結果として生じた核酸構築物は、好適なＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株を形質転換させるためのＤＮＡカセットに挿入した。配列番号１５のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩの（上述した）完全プロモーター配列は、上記の表３に示した。（上述した）配列番号２５〜３２の「完全」プロモーター配列は、表５、６および７に提示した。
【０１７０】
さらに、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩ（配列番号１５）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰａｍｙＬ（配列番号１１６）もしくはＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーターＰｒｒｎ１（配列番号１０１）、Ｐｒｒｎ２（配列番号１０２）、Ｐｒｒｎ４（配列番号１０３）、Ｐｒｒｎ５（配列番号１０４）もしくはＰｒｒｎ６（配列番号１０５）の「完全プロモーター」配列を備える非相同もしくは相同プロモーターの核酸を合成し、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡｍｙＬ（配列番号４３もしくは４４）またはＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＡｍｙＳ（配列番号６４）変異体をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。結果として生じた核酸構築物は、好適なＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）菌株を形質転換させるために使用した。配列番号１５のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎＩの（上述した）完全プロモーター配列は、表３に示した。上述したＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＰａｍｙＬおよびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーターＰｒｒｎ１、Ｐｒｒｎ２、Ｐｒｒｎ４、Ｐｒｒｎ５およびＰｒｒｎ６の「完全な」プロモーター配列は、表８の下方に示した。
【０１７１】
非相同プロモーターの核酸を配列番号５、９〜１５、１８〜３２、１００〜１１７および１４１からの１つ、２つもしくは３つの「完全」プロモーター配列と合成し、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌサブチリシン（配列番号４０を含む）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アミラーゼＥ（ＡｍｙＥ、配列番号４２を含む）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼＬ（ＡｍｙＬ、配列番号４３を含む）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ（ＡｍｙＳ、配列番号６４を含む）Ｓ変異体もしくはその他のアミラーゼもしくはプロテアーゼ変異体をコードする関心対象の遺伝子にライゲートさせた。配列番号５、配列番号１５、配列番号１８および配列番号１０５〜１１５の非相同「完全」プロモーター配列は、上記の表３〜１０に提示した。配列番号９〜１４、１９〜３２、１００〜１０４、１１６、１１７および１４１の非相同完全プロモーターは、上記の表３〜１０に提示した。
【０１７２】
さらに、配列番号１〜４、６〜８、１６〜１７、３３〜３９、１１８〜１４０から選択された配列を含む他の完全天然非相同プロモーターを備える核酸構築物もまた合成し、上述した関心対象の遺伝子もしくは他の関心対象の遺伝子にライゲートさせた。配列番号１〜４、６〜８、１６〜１７、３３〜３９および１１８〜１４０のプロモーター配列は、上記の表３〜１０に提示した。構築物中に存在する追加の配列は、ＡｍｙＬシグナル配列（配列番号８３）およびＡｍｙＬターミネーター配列（配列番号８４）を含んでいた。
【０１７３】
これらの核酸構築物は、ＤＮＡカセット内もしくは発現ベクター内で作成し、増幅させた、または様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の形質転換のために直接的に使用した。所定の実施形態では、これらの核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、ｓｐｃＲマーカー、クロラムフェニコール耐性マーカーもしくは他の選択可能なマーカーを含有する。
【０１７４】
他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、非抗生物質耐性マーカーとしてのアラニンラセマーゼ遺伝子を含有する。所定の他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、非染色体組込み構築物もしくはカセットである。他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の染色体上の様々な位置で組み込まれるために特異的相同領域によって染色体に組み込まれる。所定の実施形態では、本開示の核酸構築物もしくはそのベクター（すなわち、ＰＯＩをコードする核酸に操作可能に連結された遺伝子操作されたプロモーターを含む核酸）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の相同染色体領域に組み込まれる。１つの特定の実施例では、本開示の核酸構築物は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子座であるｙｈｆＯおよびｙｈｆＮに組み込まれる。
【０１７５】
したがって、所定の実施形態では、宿主細胞ゲノムに組み込むべき核酸構築物（もしくはそのベクター）は、配列番号８７の核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子座のｙｈｆＯおよび配列番号８８の核酸配列を含むＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥ遺伝子座のｙｈｆＮを含む５’および３’核酸配列によって隣接されている。
【０１７６】
所定の他の実施形態では、核酸構築物、カセットもしくは増副産物は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の天然型プラスミドに組み込まれるための特異的相同領域によってプラスミドに組み込まれる。
【０１７７】
本開示の図１は、これらの試験において設計および試験した様々なタイプのプロモーター立体配置：プロモータータイプ１（相同プロモーター）、プロモータータイプ２（単一ハイブリッドプロモーター）、プロモータータイプ３（二重ハイブリッドプロモーター）の組成を示す略図である。プロモータータイプ１は、ＵＰ要素およびプロモーター領域が同一のオリジナル（完全）プロモーター（「Ｐｘ」と指名した）を起源とする任意の相同プロモーターである。プロモータータイプ２は、ＵＰ要素が１種のプロモーター由来であり（「Ｐｘ」と指定される、プロモーターが任意の他のプロモーター由来である（「Ｐｙ」と指定される）任意のハイブリッドプロモーターである。プロモータータイプ３は、ＵＰ要素が１種のプロモーター由来であり（「Ｐｘ」と指定される）、２つのプロモーター領域が「Ｐｙ」および「Ｐｚ」と指定された２つの異なるプロモーター由来である任意の（二重）ハイブリッドプロモーターであるが、ここで「Ｐｙ」および「Ｐｚ」プロモーターは、介入ＵＴＲ（すなわち、ＵＴＲは「Ｐｙ」および「Ｐｘ」プロモーターの間に置かれる、またはその逆である）および任意選択的に３’末端で追加のＵＴＲと操作可能に連結されている。
【０１７８】
上記に示したように、「Ｐｘ」、「Ｐｙ」および「Ｐｚ」プロモーター配列の３つの立体配置は、特に配列番号３〜２０、配列番号２６、配列番号３７におけるプロモーターおよび／または配列番号１０１〜１０５におけるプロモーターから選択することができる。１つの上流（ＵＰ）要素は、配列番号４５〜６１における上流要素配列から選択することができる。上流（ＵＰ）要素およびプロモーター配列は、配列番号６５、配列番号６７および配列番号７１の核酸配列に対応するハイブリッドプロモーターなどの構成的人工プロモーターを作成するために、当技術分野において公知の方法を使用して組み合わせることができる。
【０１７９】
実施例２
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における天然プロモーターおよび遺伝子操作されたプロモーターからのタンパク質発現
サブチリシンＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌの発現を駆動する天然プロモーターおよび合成プロモーターを振とうフラスコ培養中で試験した。試験したプロモーター配列は、以下のとおりであった：（１）ＰａｐｒＥ（配列番号２８）、（２）ＰｓｓｒＡ（配列番号２５）、（３）Ｐｓｃｒ（配列番号２６）、（４）ＰｓｐｏＶＧ（配列番号２７）、（５）ＰｒｒｎＩ−２（配列番号１５）、（６）ハイブリッド単一プロモーター１（Ｐ１；配列番号６５）および（７）ハイブリッド二重プロモーター７（Ｐ７；配列番号７１）。上述した構築物のそれぞれを用いて形質転換させたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を５ｍＬのルリアブロス中で一晩増殖させた。１ｍＬの各前培養を使用して、２５０ｒｐｍに設定した振とう器速度を用いて１２時間インキュベートしながら振とうフラスコ中の２５ｍＬの脳心臓滲出物（ＢＨＩ）培地を接種した。全ブロスを１時間毎に収集し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して６００ｎｍでの吸光度を測定するために１０倍に希釈した。６００ｎｍでの吸光度を各サンプルについて時間の関数としてプロットし、結果は図２に示した。図２に示したように、経時的に観察された細胞密度の増加は全菌株について類似であったが、これはサブチリシンＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌの発現における差の原因がサンプル間の培養密度の差ではないことを示していた（例えば、図２を参照）。同時に、相対タンパク質発現は、国際公開第２０１０／１４４２８３号パンフレットに記載されたＮ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用して、以下のプロモーター配列：（１）ＰａｐｒＥ（配列番号：２８）、（２）ＰｓｓｒＡ（配列番号：２５）、（３）Ｐｓｃｒ（配列番号：２６）、（４）ＰｓｐｏＶＧ（配列番号：２７）、（５）ＰｒｒｎＩ−２（配列番号：１５）、（６）ハイブリッド単一プロモーター１（Ｐ１；配列番号６５）および（７）ハイブリッド二重プロモーター７（Ｐ７；配列番号７１）の１つを運ぶＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞から監視した。この基質は、ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌなどのサブチリスプロテアーゼの活性を監視するために日常的に使用されている。手短には、培養期間中に培養ブロスを収集し、アッセイ用バッファー（１００ｍＭのトリス、０．００５％のＴｗｅｅｎ８０、ｐＨ８．６）中で４０倍に希釈し、希釈サンプル１０μＬをマイクロタイタープレートに配置した。ＡＡＰＦ基質ストックを希釈し、アッセイバッファー（ＤＭＳＯ中の１００ｍｇ／ｍＬのＡＡＰＦストックの１００×希釈液）および１９０μＬのこの溶液をマイクロタイタープレートに加えた。この溶液の増加する吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計を使用して４０５ｎｍで２５℃で５分間まで２０秒間の増分で測定した。４０５ｎｍでの吸光度を時間の関数としてプロットし、結果を図３に示した。これらの結果は、配列番号２５（２；ＰｓｓｒＡ）、配列番号２６（３；Ｐｓｃｒ）、配列番号１５（５；ＰｒｒｎＩ−２）、配列番号６５（６；ハイブリッド単一プロモーター１）および配列番号７１（７；ハイブリッド二重プロモーター）にプロモーターが配列番号２８（１；ＰａｐｒＥ）および配列番号２７（４；ＰｓｐｏＶＧ）のプロモーターより高い生産性を生じさせることを示している。特に、図３に示したように、ハイブリッドプロモーター１（６；配列番号６５）およびハイブリッドプロモーター７（７；配列番号７１）は、試験した条件下でサブチリシンＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ産生レベルが最高であることを証明している。
【０１８０】
実施例３
バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における非相同プロモーターおよび遺伝子操作されたプロモーターからのタンパク質発現
Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）におけるサイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼ変異体（配列番号６３）の発現を駆動するために、非相同プロモーターＰｒｒｎＩ−２（配列番号１５）およびその遺伝子操作された変異体プロモーター、すなわち、変異体２（ハイブリッドプロモーター１、配列番号６５）；変異体３（ハイブリッドプロモーター２３、配列番号９６）；変異体１０（ハイブリッドプロモーター２２、配列番号９５）；変異体１１（ハイブリッドプロモーター１９、配列番号９２）；変異体１２（ハイブリッドプロモーター１８、配列番号９１）および変異体１３（ハイブリッドプロモーター１７、配列番号９０）を使用した。Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）形質転換後に、当技術分野において公知の方法を使用して、細胞培養をソイトンおよびＣａＣｌ２が補給されたＭＯＰＳ塩基性培地（ｐＨ６．８）中で増殖させた。３７℃で強力に振とうしながらＩｎｆｏｒｓインキュベーター内で６４時間増殖させた後、アミラーゼ活性は、Ｃｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼアッセイキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して培養ブロスサンプル中で測定した。Ｃｅｒａｌｐｈａ基質は、規定のオリゴ糖非還元型末端ブロック化ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタオシド（ＢＰＮＰＧ７）および過剰レベルのグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ（ブロック基の存在に起因して天然基質には作用を有していない）の混合物である。エンド作用性α−アミラーゼによりオリゴ糖が加水分解されると、混合物中に存在する過剰量のα−グルコシダーゼおよびグルコアミラーゼは、ｐ−ニトロフェニルマルト糖分画からグルコースおよび遊離ｐ−ニトロフェノールへの瞬間的および定量的加水分解を生じさせる。
【０１８１】
したがって、基質および培養上清のサンプルを２５℃で８分間にわたりインキュベートした。反応を停止させ、吸光度はＭＴＰ分光光度計を使用して４０５ｎｍで測定した。非酵素コントロールを使用して、バックグラウンド吸光度について補正した。ｐ−ニトロフェノールの遊離は、分析されるサンプル中のアミラーゼ活性のレベルと直接的に関連する、４０５ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。本試験からサンプル中で検出された相対アミラーゼ活性は、図４に示した。このグラフ上で示したように、遺伝子操作された（変異体）ｒｒｎプロモーター（すなわち、変異体２（ハイブリッドプロモーター１；配列番号６５）；変異体３（ハイブリッドプロモーター２３；配列番号９６）；変異体１０（ハイブリッドプロモーター２２；配列番号９５）；変異体１１（ハイブリッドプロモーター１９；配列番号９２）；変異体１２（ハイブリッドプロモーター１８；配列番号９１）および変異体１３（ハイブリッドプロモーター１７；配列番号９０））のいずれかからのアミラーゼ（配列番号６３）発現は、非相同の遺伝子操作されていないｒｒｎＩ−２プロモーター（配列番号１５）と比較した場合にアミラーゼタンパク質の産生増加を生じさせた。
【０１８２】
実施例４
天然のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーターを使用した様々なアミラーゼの発現
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からの一連の天然（野生型）プロモーターをＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主における数種の細菌アミラーゼの発現について評価した。評価したプロモーターは：ａｍｙＬバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）天然アミラーゼ遺伝子のＰａｍｙＬ（配列番号１１６）プロモーター；バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リボソームＲＮＡ  ｒｒｎＩのＰｒｒｎＩ−２  Ｂｓｕ（配列番号１５）第２プロモーター；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ１（配列番号１０１）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ２（配列番号１０２）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ４（配列番号１０３）；バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ５（配列番号１０４）およびバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）Ｐｒｒｎ６（配列番号１０５）であった。
【０１８３】
配列番号１５、１０１、１０２、１０３、１０４および１０５のリボソーム配列は、プロモーターおよび天然上流（ＵＰ）要素配列を含有する。したがって、本実施例では、細菌アミラーゼＡｍｙ１、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｍｉｓ）α−アミラーゼＬ（配列番号４３）；Ａｍｙ３、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼＳ変異体（配列番号６４）およびＡｍｙ４、サイトファガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）種アミラーゼ変異体（配列番号６３）をコードするポリヌクレオチドは、上記に挙げたプロモーター（すなわち、配列番号１５および１０１〜１０５のプロモーター）に融合（３’）させた。好適なＢ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞は、当技術分野において公知の方法を使用してこれらの様々な構築物を用いて形質転換させた。引き続いて、細菌培養は、ソイトンおよびＣａＣｌ２が補給されたＭＯＰＳ塩基性培地（ｐＨ６．８）中で増殖させた。培養は強力に撹拌しながら３７℃でＩｎｆｏｒｓインキュベーター内で６４時間インキュベートした。培養中のアミラーゼ活性は、次に本質的には実施例３に記載したように製造業者の取扱説明書にしたがってＣｅｒａｌｐｈａ  α−アミラーゼアッセイキット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を使用して測定した。様々な天然（野生型）プロモーター（すなわち、ＰａｍｙＬ（配列番号１１６）；ＰｒｒｎＩ−２  Ｂｓｕ（配列番号１５）；Ｐｒｒｎ１（配列番号１０１）；Ｐｒｒｎ２（配列番号１０２）；Ｐｒｒｎ４（配列番号１０３）；Ｐｒｒｎ５（配列番号１０４）およびＰｒｒｎ６（配列番号１０５）によって駆動された３種の細菌アミラーゼ（すなわち、Ａｍｙ１、Ａｍｙ２およびＡｍｙ３）の相対発現を決定した。図５に示したように、相対アミラーゼ産生は、参照物質としてプロモーター「ＰＡｍｙＬ」を使用した場合に観察される総量の百分率として報告した。このグラフから明らかなように、内在性バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼプロモーター（ＰａｍｙＬ）に代えたリボソームプロモーターの使用は、大多数の場合に増加したタンパク質発現を生じさせた。
【０１８４】
実施例５
様々なバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーター配列の比較
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーターＰｒｒｎＯ＿Ｐ１（配列番号８５）、ＰｒｒｎＯ＿Ｐ２（配列番号８９）、ＰｒｒｎＡ＿Ｐ１（配列番号１４２）、ＰｒｒｎＡ＿Ｐ２（配列番号１４３）、ＰｒｒｎＪ＿Ｐ１（配列番号１４４）、ＰｒｒｎＪ＿Ｐ２（配列番号１４５）、ＰｒｒｎＩ＿Ｐ１（配列番号１４６）、ＰｒｒｎＥ＿Ｐ２（配列番号１４７）、ＰｒｒｎＥ＿Ｐ３（配列番号１４８）、ＰｒｒｎＤ＿Ｐ１（配列番号１４９）、ＰｒｒｎＤ＿Ｐ２（配列番号１５０）、ＰｒｒｎＧ＿Ｐ１（配列番号１５１）およびＰｒｒｎＷ＿Ｐ１（配列番号１５２）の配列は、図６に示したＧｅｎｅｉｏｕｓソフトウェア（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ．）を使用してデフォルトパラメーターを用いて整列させた。コンセンサス配列および配列ロゴを提示するための選択肢を選択した。配列ロゴは、各位置でのヌクレオチドの相対頻度の表示であり、配列ロゴは、上記の図７における複数の配列アラインメントに示した、各位値の上方の１文字コードのサイズによって表される。このアラインメントを使用して、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｒｒｎプロモーターについてのコンセンサス配列を生成し（配列番号１５３）、図２の一番上に示した。コンセンサス配列は、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／ＴおよびＶ＝Ａ／Ｃ／Ｇと規定されたＩＵＰＡＣ命名法を使用する。
【０１８５】
プロモーターおよびバチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）リボソームプロモーターｒｒｎ１−Ｐ１（配列番号１０６）、ｒｒｎ２−Ｐ１（配列番号１０７）、ｒｒｎ２−Ｐ２（配列番号１０８）、ｒｒｎ３−Ｐ１（配列番号１０９）、ｒｒｎ４−Ｐ１（配列番号１１０）、ｒｒｎ４−Ｐ２（配列番号１１１）、ｒｒｎ５−Ｐ１（配列番号１１２）、ｒｒｎ５−Ｐ２（配列番号１１３）、ｒｒｎ６−Ｐ１（配列番号１１４）およびｒｒｎ６−Ｐ２（配列番号１１５）の上流要素配列は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウェアを使用してデフォルトパラメーターを用いて整列させた。コンセンサス配列および配列ロゴを提示するための選択肢を選択した。図７から明らかなように、ヌクレオチドの相対頻度は、各位値の上方の１文字コードのサイズによって表される。
【０１８６】
このアラインメントを使用して、コンセンサス配列（配列番号１５４）は、コンセンサスを生成するための７５％の閾値（全配列の少なくとも７５％一致する塩基対）を使用して生成した。コンセンサス配列は、Ｎ＝任意のヌクレオチド、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／ＴおよびＶ＝Ａ／Ｃ／Ｇと規定されたＩＵＰＡＣ命名法を使用した。
【０１８７】
参考文献
カナダ国特許出願第２８９１５１９号明細書
欧州特許公開第３２３２９９号明細書
欧州特許公開第３５１０２９Ａ号明細書
ＰＣＴ国際出願番号  ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５３０１８号明細書
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第１９９６／００７８７号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０００／３７６１４号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００１／０２７２５２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００１／０２７２５２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００１５１６２０号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００１９８４６２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００３／０８９６２１号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００４／９７００１号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００４／９９３６９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００４／９９３７０号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００５／９３０５０号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００６／０３８０６２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００６／０３８１２８号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００６／０４３１７８号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００６／７１５９８号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００８／０９２９０１号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００８／０９７６１９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００８／１５３９０３号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００８／４５２１４号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００８０２４３７２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００９／１２９４８９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００９／１２９４８９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００９／１４９２０２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００９／３５５３７号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１０／０５６６３５号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１０／１２２５３２号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１０／１２３７５４号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１０／１４１７７９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１１／０１４２７８号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１２１４９３２５号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１２１４９３３３号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１３／０８６２１９号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２０１３／３７９３３号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第９４１９４６８号パンフレット
ＰＣＴ国際公開番号  国際公開第２００２１４４９０号パンフレット
米国特許第４，６８３，１９５号明細書
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
米国特許第４，７６０，０２５号明細書（再発行特許第３４，６０６号明細書）
米国特許第４，９６５，１８８号明細書
米国特許第５，１８２，２０４号明細書
米国特許第５，２６４，３６６号明細書
米国特許第５，３６４，７７０号明細書
米国特許第６，０２２，７２５号明細書
米国特許第６，２，８７，８３９号明細書
米国特許第６，２５５，１１５号明細書
米国特許第６，３１２，９３６号明細書
米国特許第６，５６２，６１２号明細書
米国特許第７，７１８，４１１号明細書
米国特許第８，０５８，０３３号明細書
米国特許公開第２００９／０３１４２８６号明細書
米国特許公開第２０１０／００１５６８６号明細書
米国特許公開第２０１０／００４８４１７号明細書
米国特許公開第２０１０／０１５２０８８号明細書
英国特許出願第１０１１５１３．７号明細書
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０．Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  ＆  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，‘‘Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ’’．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：７４１−７４６，１９６１．
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，１９９４．
Ｂａｇｄａｓａｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２６：２７３−２８２，１９８３．
Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６９，１９８１．
Ｂｅｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７：１４１−１４７，２００２．
Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ  １５２，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．
Ｂｒｉｇｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８，１９９０．
Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ  １６：５３−５６，１９８９．
Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２９８７−２９９４，１９８６．
Ｄｒｅｎｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１７７−１８１，１９７２．
Ｄｕｂｎａｕ  ，‘‘Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ’’，Ｉｎ：Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  Ｄ（ｅｄ）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９７６，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，ｐａｇｅｓ  １４−２７，１９７６．
Ｅｄｇａｒ，‘‘ＭＵＳＣＬＥ：ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｉｍｅ  ａｎｄ  ｓｐａｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９（５）：１１３，２００４．
Ｇｒｕｎｄｙ  ａｎｄ  Ｈｅｎｋｉｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３：４５９５−４６０２，１９９１．
Ｈａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）．
Ｈａｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＢＡＣＩＬＬＵＳ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９９０．
Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥＴＩＣ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ，１９８５．
Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．Ｉｎ  Ｂｏｏｔｈ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｃ．（Ｅｄｓ），ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ  ２５１−２７６，１９８６．
Ｋａｌｉｓｚ，‘‘Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ’’  ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，Ａ．Ｆｉｅｃｈｔ  Ｅｄ．，１９８８．
Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７，１９９３．
Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＳＴＲＥＰＴＯＭＹＣＥＳ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ．Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ，２０００．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｐ  ａｐｒＥ，Ｐ  ａｍｙＥ，ａｎｄ  Ｐ  Ｐ４３  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｆｏｒ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ’’，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３：３１３，２００８．
Ｋｎｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  ５：２５５−２６１，１９８７．
Ｋｒａｓｎｙ  ａｎｄ  Ｇｏｕｒｓｅ，ＥＭＢＯ  ２３：４４７３−４４８３，２００４．
Ｋｒａｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：４２−５４，２００８．
Ｌａｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１５０３−１５１２，１９９７．
Ｍａｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｎｎｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６４：１５３７−１５４０，１９８３．
Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：８０１−８０５，１９８４．
Ｎａｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９１：４５５５−４５６１，２００９．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０．
Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅ’’，ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｅｄｓ．Ｌｅｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．ｐｐ．１２９−１４８，１９９２．
Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４：５５５−５６３，１９８８．
Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４，１９８８．
Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：２５３−２６３，１９８６．
Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６３：１１−２２，１９８８．
Ｐｕｌｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４９：３７７−３８２，１９８６．
Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｅｄｇａｒ，‘‘ＭＵＳＣＬＥ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ’’，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２（５）：１７９２−１７９７，２００４．
Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１，１９８８．
Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４９：５８４−５９１，１９９７．
Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，６３：１１−２２，１９８８．
Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：２１９−２２８，１９９４．
Ｓａｍａｒｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９３：７２３−７３３，２０１１．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ；２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９．Ｓｃｈｍｉｔｔ−Ｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：４９３−４９８，１９９２．
Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：６９１−６９６，１９８３．
Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４．
Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，２：４８２，１９８１．
Ｔｅｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，５１：４３−５２，１９８７．
Ｔｕｒｎｂｏｕｇｈ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６９：１０−１４，２００８．
Ｖｅｎｅｍａ，‘‘Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ’’，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９：２４５  ３３１，１９７９．
Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，‘‘Ａ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｏｙｂｅａｎ  Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ’’，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．５５（１）：４０−５２，２００７．
Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８−４７８，１９８６．
【図１】
2019511218.tif 000019
【図２】
2019511218.tif 000020
【図３】
2019511218.tif 000021
【図４】
2019511218.tif 000022
【図５】
2019511218.tif 000023
【図６】
2019511218.tif 000024
【図７】
2019511218.tif 000025
【配列表】
2019511218000001.app
【国際調査報告】
2019511218.tif 000026
2019511218.tif 000027
2019511218.tif 000028
2019511218.tif 000029
2019511218.tif 000030