(57)【要約】  緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドとそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。また、前記ポリヌクレオチド及び／または本明細書中に提供されるポリペプチドを１つ以上含む形質転換細胞及びトランスジェニック植物も提供する。
2019518461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑藻Ｃｉａ８タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ｃＤＮＡ分子は、配列番号３と１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ｃＤＮＡ分子は、配列番号３のいずれか１つと約９０％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記緑藻Ｃｉａ８タンパク質は、重炭酸に結合及び／又は重炭酸を輸送する、請求項１から３のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記ｃＤＮＡ分子は、配列番号４のいずれか１つと約９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項１から３のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記ｃＤＮＡ分子は、調節配列に機能的に結合している、請求項１から５のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ分子を含む組み換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
緑藻からのＣｉａ８ポリペプチドに対応する単離ポリペプチド分子。
【請求項８】
前記ポリペプチド分子は、配列番号４のいずれか１つと１００％の配列同一性を有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド分子。
【請求項９】
前記ポリペプチド分子は、配列番号４のいずれか１つと約９０％以上の配列同一性を有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド分子。
【請求項１０】
前記ポリペプチド分子は、配列番号４のいずれか１つと約７０％以上の配列同一性を有する、請求項７に記載の単離ポリペプチド分子。
【請求項１１】
前記ポリペプチド分子は、重炭酸に結合及び／又は重炭酸を輸送する、請求項７から１０のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド分子。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか１項に記載のｃＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１３】
請求項６に記載の組み換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
ｃＤＮＡ分子を含むベクターであって、前記ｃＤＮＡ分子は配列番号４のいずれか１つと約９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、ベクター。
【請求項１５】
少なくとも１つの選択可能なマーカー配列をさらに含む、請求項１２から１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１７】
前記細胞は、植物、細菌、酵母、又は真菌の細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
少なくとも１つの細胞が請求項１２から１５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのベクターを含む細胞集団。
【請求項１９】
タンパク質の生成、タンパク質の回復、又は翻訳後のタンパク質の修飾を最適化する少なくとも１つのベクターをさらに含む、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２０】
前記細胞はすべて同種由来である、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２１】
１つ以上の細胞が異なる種に由来する、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２２】
前記集団内の前記細胞の約１％から約１００％が、同じ種類のベクターを含む、請求項１８から２１に記載の細胞集団。
【請求項２３】
組み換えポリヌクレオチドを含む複数の細胞を含むトランスジェニック植物であって、前記組み換えポリヌクレオチドは、緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子であって、配列番号１から３のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ分子と、前記緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドが植物細胞の中で発現するように前記ＤＮＡ分子と機能的に結合された少なくとも１つの調節配列とを含む、トランスジェニック植物。
【請求項２４】
前記緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドは、重炭酸に結合及び／又は重炭酸を輸送できる、請求項２３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ分子は、配列番号１から３のいずれか１つと同一である、請求項２３から２４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２６】
前記ＤＮＡ分子は、配列番号１から３のいずれか１つと約９０％以上の配列同一性を有する、請求項２３から２４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ分子は、配列番号４と同一の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２３から２４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ分子は、配列番号４と約９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、請求項２３から２４のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２９】
植物における緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドの発現を、野生型植物に比較して増加させる方法であって、
前記緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドが植物細胞の中で発現するように、緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と、前記ＤＮＡ分子に機能的に結合した少なくとも１つの調節配列とを、前記植物の少なくとも１つの細胞のゲノムに組み込むことであって、前記ＤＮＡ分子は配列番号１から３のいずれか１つと少なくとも約９０％の配列同一性を有する、組み込むことと、前記植物を成長させることと、を含み、こうして野生型の植物細胞に比較して緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドが過剰発現する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、「緑藻重炭酸輸送体およびその用途」と題する、２０１６年６月２０日に出題された、同時係属中の米国仮特許出願第62/352,278号の利益と優先権を主張し、その内容の全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
［配列表］
本出願は、２０１６年６月１６日に作成され、222220-2080_ST25.txtと題する、ASCII.txtファイルとして電子的様式で提出された配列表を含む。その配列表の内容の全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０００３】
［背景技術］
緑藻とその他の光合成水棲生物は、自然環境において、しばしばＣＯ２が低い状況やＣＯ２が変動する状況に晒される。これらの生物に対するＣＯ２利用性は、数ある要因の中、水におけるガスの遅い拡散、２つの無機質カーボン形状（ＣＯ２およびＨＣＯ３−）の遅い相互変換、及びｐＨの変動に制限される。したがって、ほとんど全ての水棲光合成生物は、ルビスコ（Rubisco）で固定する無機質炭素（Ｃｉ）を有効に濃縮するために、ＣＯ２制限条件下で誘導可能な二酸化炭素濃縮メカニズム（ＣＣＭ：carbon dioxide concentrating mechanism）を進化した（Giordanoほか、２００５）。緑藻のChlamydomonas reinhardtiiに関して現在使用されているＣＣＭモデル（Jungnickほか、２０１４；Wang及びSpalding、２０１４）では、細胞膜と葉緑体包膜上の重炭酸輸送体は、Ｃｉを移動させる、とりわけＨＣＯ３−を膜を通して移動させるＣＣＭの重要な要素であると考えられている。ＣＣＭの他の要素は、ＣＯ２とＨＣＯ３−を相互変換する炭酸脱水酵素を含む（Mitraほか、２００５；Moroneyほか、２０１１）。C. reinhartiiには、葉緑体の底にピレノイドと呼ばれるコンパートメントがある。そのピレノイドが、ＣＯ２制限条件下でルビスコが隔離される場所である（Kuchitsuほか、１９８８；Rawatほか、１９９６；Borkhseniousほか、１９９８）。おそらくＨＣＯ３−がピレノイドに入る経路を提供するために、ピレノイドにはチラコイド細管や微細管の広いネットワークが関係している（Engelほか、２０１５）。それらの細管に炭酸脱水酵素ＣＡＨ３が存在し、ＣＡＨ３が内腔の中でＨＣＯ３−を固定用のＣＯ２に変換することが仮定されている（Moroney及びYnalvez、２００７）。
【０００４】
高ＣＯ２条件（５％ v/v）下で培養されたC. reinhardtii細胞は、Ｃｉに対して低い親和性を示す。高ＣＯ２に馴化（acclimate）した細胞が低ＣＯ２状態（０．０３％ v/v）に暴露された際に、高親和性輸送体が誘導されたことが報告されている。ＣＯ２は細胞内で容易に膜をわたって拡散する一方（Gutknechtほか、１９７７）、それ以来の多数の研究によって、低ＣＯ２細胞においてはルビスコによって固定される場所へのＣｉ（特にＨＣＯ３−）の移動を容易化する能動的輸送系が必要であることが確立されている（Moroneyほか、１９８７；Sultemeyerほか、１９８８；Badgerほか、１９９４；Ohnishiほか、２０１０）。また、細胞の形質膜と葉緑体膜に複数の形態のＣｉ輸送体が生じることは、分子的研究や生理学的研究によって確認されている（Amorosoほか、１９９８；Duanmuほか、２００９；Atkinsonほか、２０１５；Gaoほか、２０１５；Yamanoほか、２０１５）。海洋シアノバクテリアについて、形質膜におけるＨＣＯ３−の輸送は、しばしば高い外部のＮａ＋イオン濃度に結合している。クラミドモナス（Chlamydomonas）が見られる淡水環境ではＮａ＋の濃度が低いため、輸送はＨ＋に結合していると考えられている（Morthほか、２０１１；Taylorほか、２０１２）。したがって、C. reinhardtiiとVolvox carteriを用いたゲノム研究によって、少なくとも硫酸とリン酸について、Ｈ＋共役輸送体とＮａ＋共役輸送体の存在が判明されている（Pootakhamほか、２０１０）。重炭酸の取り込みについてもこのような分子的要素が存在するかはまだ不明である。
【０００５】
現在までのところ、C. reinhardtiiにおける２つの高親和性重炭酸輸送タンパク質と１つの低親和性重炭酸輸送タンパク質が特徴づけられ、低ＣＯ２条件下で機能可能であることが知られている。１つ目のタンパク質、強光誘導タンパク質（ＨＬＡ３：high light activated protein 3）は、形質膜に局在する多剤耐性タンパク質ファミリーに属するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ：ATP-binding cassette）式の輸送体である（Im及びGrossman、２００２）。Ｈｌａ３転写体は、強光条件と低ＣＯ２条件の両方に誘導され、Ｃｉａ５遺伝子にコードされるＣＣＭ１「マスターレギュレーター」に制御される。Duanmuら（２００９）は、ＨＬＡ３  ＲＮＡｉノックダウン変異体において、Ｃｉ親和性とＣｉ取り込みが顕著に低下していることを示し、このことはＨＣＯ３−輸送における前記タンパク質の役割を裏付ける。２つ目のタンパク質、ＬＣＩ１輸送体は、データベースにおける他の膜貫通タンパク質に対して低い相同性を示す、比較的に小さいタンパク質である。ＬＣＩ１は、低ＣＯ２条件下で強く発現増加され、形質膜に局在している（Ohnishiほか、２０１０）。ＬＣＩ１を用いた研究で著者はさらに、Ｌｃｒ１（ＭＹＢ転写因子を欠失するクラミドモナス株）のバックグラウンドでＬＣＩ１タンパク質を過剰発現させることでＣｉ取り込みの増加を確認した。よって、ＨＬＡ３とＬＣＩ１は、形質膜に位置するＣｉ輸送体であると考えられている。
【０００６】
３つ目の輸送体、ＮＡＲ１．２（ＬＣＩＡとも呼ばれる）は、ギ酸・亜硝酸輸送体ファミリーに属する葉緑体包膜のタンパク質である。ＮＡＲ１．２タンパク質は、ｍＭ範囲に収まるＫ（０．５）値から明らかであるように、重炭酸に対してより低い親和性を有するが、ＮＡＲ１．２がXenopus laevisの卵母細胞で過剰発現された際に、ＨＣＯ３−取り込みの増加が観察された（Mariscalほか、２００６；Atkinsonほか、２０１５）。これまでは、直接的な証拠はなかったにも関わらず、ＮＡＲ１．２は葉緑体包膜におけるＣｉの取り込みに関連付けられてきた。ＮＡＲ１．２タンパク質は、Ｃｉの取り込みに重要な役割を果たすが、制御機能も果たし得る。このことは、ＮＡＲ１．２タンパク質不在下でＨｌａ３転写体が蓄積されなかった最近の研究の結論であり、したがって著者らは、このタンパク質は重炭酸の蓄積に協力することを提案した（Yamanoほか、２０１５）。重炭酸が葉緑体に入るまた別の提案経路としては、ＮＡＲ１．２は可溶性タンパク質ＬＣＩＢとも会合するように見える（Wang及びSpalding、２０１４）。
【０００７】
２つの可溶性タンパク質（ＬＣＩＢ／ＬＣＩＣ）は複合体を形成し、細胞が低ＣＯ２に馴化されるとそれらタンパク質がピレノイドと密接して会合することが観察された以上、ピレノイドから漏れるＣＯ２を再び捕らえるプロセスに関与していると考えられている（Yamanoほか、２０１０；Wangほか、２０１１）。別の推定輸送体であるＣＣＰ１とＣＣＰ２も、現在はミトコンドリアのものであることが確認されている（Atkinsonほか、２０１５）が、まだ解決されていない。以上のことを考慮すると、ＣＣＭをよりはっきり理解するためには、クラミドモナスのＣｉ輸送システムを解明する必要があることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本開示の更なる側面は、下記の様々な実施態様の詳細な説明を、添付の図面と併せて検討する上で容易に認識するであろう。
【０００９】
【図１Ａ】、
【図１Ｂ】、
【図１Ｃ】ｐＨ７．３で（図１Ａ）高ＣＯ２（空気中で５％ＣＯ２）と（図１Ｂ）低ＣＯ２（空気中で０．０１％ＣＯ２）におけるC. reinhardtii株の増殖のスポット試験から得た結果を示す図である。株は野生型Ｄ６６と、Ｃｉａ８変異体と、対照群（コントロール）として使用される３つの既知ＣＣＭ変異体Ｃｉａ６、Ｃｉａ５、及びＣｉａ３を含む。左の数値は、０．１５（〜１．５×１０６細胞）と２回の段階希釈の初期ＯＤ７３０を示す。図１Ｃは、液体培養における野生型株Ｄ６６とｃｉａ８変異体（ＭＩＮ：mutant in liquid）の増殖を示すグラフを表示する。カルチャーは、低ＣＯ２（０．０１〜０．０２５％）を吹き込みながら、エルレンマイアーフラスコにおいて増殖させた。数値は平均（mean）±ＳＥ（ｎ＝４）で表している。
【図２Ａ】、
【図２Ｂ】ＡｐｈＶＩＩＩ挿入の位置を表す、Ｃｉａ８遺伝子座位（ID:Cre09.g395700）のゲノム構造を示す（図２Ａ）。緑色の棒、間隔、及びオレンジ色の棒は、それぞれエクソン、イントロン、及び非翻訳領域を表す。図２Ｂは、ｃｉａ８遺伝子の第１０エクソンにおけるＡｐｈＶＩＩＩの挿入を確証する、代表的なゲルの画像を示す。レーン１  Ｄ６６は、カセットなしの対照ゲノムＤＮＡであり、他３つのレーンはｃｉａ８ゲノムＤＮＡである。レーン２は、挿入の３’末端を示し、レーン３は挿入の５’末端を示す。レーン４は、遺伝子におけるプライマー対を使用してカセットに隣接するゲノム領域を含み、挿入領域の全体を表す。
【図３】逆転写ＰＣＲ（Reverse Transcriptase PCR）のテンプレートとして高ＣＯ２と低ＣＯ２で増殖させた細胞からのポリ（Ａ）ＲＮＡを用いた、Ｄ６６とＣｉａ８変異体株のＲＴ−ＰＣＲ解析を表示する。Ｃｉａ８に関しては、表２に示されるプライマーは、ｃＤＮＡから１５００ｂｐの産物を増幅する。ローディングコントロールとしてβアクチンが用いられた。
【図４】Yersinia frederikseniiＳＬＣ４とのアラインメントに基づくＣＩＡ８のトポロジーモデルの予測を示す。グレーの四角は、可変長のループで繋がっている推定膜貫通ヘリックスである。残基の６２％は、＞９０％の信頼水準でモデルされた。予測はＰＨＹＲＥ２（Kelleyほか、２０１５）によって生成された。
【図５Ａ】、
【図５Ｂ】、
【図５Ｃ】野生型C. reinhardtiiとＣｉａ８変異体におけるＣｉ依存性光合成酸素発生を示す。Ａ，高ＣＯ２で増殖させた細胞と、Ｂ，低ＣＯ２で増殖させた細胞はｐＨ７．３でアッセイされ、Ｃ，低ＣＯ２で増殖させた細胞はｐＨ９．０でアッセイされた。細胞は高ＣＯ２で増殖され、４時間低ＣＯ２に移動された。図５Ａと図５Ｂの中にある挿入図は、Ｋ（０．５）を確定するために用いられた、５００μＭより低い濃度を表す。図５Ｃは、低ＣＯ２増殖細胞をｐＨ９．０でアッセイした結果を示すグラフを表示する。細胞は高ＣＯ２で増殖させられ、４時間低ＣＯ２に移動された。各点は、３つの別々の試験の平均と標準誤差を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｇは、キメラタンパク質の局在化を示す、ＣＩＡ−ＧＦＰ形質転換細胞のライブイメージングを表示する（図６Ａ〜図６Ｆ）。上のパネルは野生型Ｄ６６株であり、下のパネルはＣＩＡ８：ＣｒＧＦＰで形質転換されたＤ６６株である。細胞はＭＩＮプレートで増殖され、共焦点顕微鏡を使用して次の光波長で観察された：微分干渉観察（Differential Interference Contrast）−４１０〜４７０ｎｍでＧＦＰ蛍光；６００〜７００ｎｍで葉緑素自家蛍光。棒は４．６９μｍに対応する。図６Ｇは、融合ＣＩＡ８：ＣｒＧＦＰタンパク質で形質転換されたＣｉａ８変異体株のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。解析は、逆転写ＰＣＲのテンプレートとして低ＣＯ２増殖細胞からのポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて行われた。表２に示されるプライマーは、ｃＤＮＡからのＧＦＰ転写物（７１０ｂｐ）を増幅する。
【図７Ａ】、
【図７Ｂ】、
【図７Ｃ】野生型（図７Ａ）とｃｉａ８変異体（図７Ｂ）株について、高ＣＯ２条件と低ＣＯ２条件下のＣｉ輸送体遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果を表すグラフを表示する。野生型Ｄ６６細胞は、４８時間高ＣＯ２で増殖させ、それから低ＣＯ２で４時間馴化させた。Ｃｉａ８遺伝子の欠如は、他のＣＣＭ輸送体とＳＢＦファミリーに属する２つの別の遺伝子の発現低下の原因となる（図７Ｃ）。内部のコントロールとしてはｃｂｌｐ遺伝子が使用された。相対発現量は、１０００／２ΔＣｔとして表現され、その中ΔＣｔ＝Ｃｔｇｅｎｅ−Ｃｔｃｂｌｐである。
【図８Ａ】、
【図８Ｂ】、
【図８Ｃ】、
【図８Ｄ】相補性Ｃｉａ８株であるｃｏｍ１とｃｏｍ２の増殖表現型を表す画像のパネル（図８Ａ）を表示する。これらの株は、ここで記載するように、Ｃｉａ８変異体に野生型Ｃｉａ８遺伝子が再導入された株である。図８Ｂは、相補性株におけるＣｉａ８転写物の回復を示すＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を表すグラフを表示する。ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨが使用された。図８Ｃは、ｐＨ９．０での、野生型Ｄ６６と１つの相補性株ｃｏｍ１の酸素発生量（図８Ｃ）を示すグラフを表示する。各点は、３つの別々の試験の平均と標準誤差を示す。図８Ｄは、図８Ｃに表示されるデータのうちの、重炭酸濃度の低い方（０から５００μＭ）を拡大表示した図である。
【図９Ａ】、
【図９Ｂ】、
【図９Ｃ】ＣＩＡ８一次タンパク質配列と、より高等の植物や他の緑藻植物由来の他のＳＢＦ輸送体とのClustal Omegaアラインメントを表示する。種とそれらのＮＣＢＩ又はPhytozome受託番号の一覧：Monoraphidium neglectum XP 013904301.1; Monoraphidium neglectum, XP 013896513.1 Coccomyxa subellipsoidea C-169] XP 005649764.1 Picea sitchensis, ABR16540.1 Musa acuminata subsp. Malaccensis, XP 009404829.1 Nelumbo nucifera, XP 010271688.1 Vitis vinifera, XP 002266805.1 Citrus sinensis, XP 006485208.1 Sorghum bicolor, XP 002440278.1, Populus euphratica XP 011032852.1, Volvox carteri f. nagariensis, XP 002955170.1 Volvox carteri, locus Name Vocar.0008s0179; Ostreococcus lucimarinus locus name gwEuk.2.273.1。
【図１０】１００ｍＭのＮａＣｌ有りと無しの両方で、ＭＩＮプレート上のクラミドモナスの野生型Ｄ６６とＣＩＡ８変異体の細胞の増殖を示す。活発に増殖している細胞培養物を１５μＬ各箇所に植え付け、７日間増殖させた（ＯＤ７３０＝０．１５〜１．５×１０６細胞）。Ｎａ＋が添加された場合、どちらの株についても増殖における変化は観察されなかった。
【図１１Ａ】、
【図１１Ｂ】野生型（WT: wild-type）Ｄ６６と、ｃｉａ８変異体と、相補性細胞株ｃｏｍ１における１４Ｃ  １４Ｃの蓄積を表すグラフを表示する。細胞は、高ＣＯ２（３％  v/v  ＣＯ２）で増殖され、低ＣＯ２に馴化された。解析はｐＨ９．０で行われた。（図１１Ｂ）固定されたＣＯ２と（図１１Ａ）プールに残存するＣＯ２。統計解析は、TukeyのＨＳＤテストによって行われた。異なる文字は、Ｐ＝０．０１で平均が有意に異なることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示をより詳細に記載する前に、本開示はここに記載される特定の実施形態に限定されないこと、そして当然に変わり得ることは理解されよう。また、ここで使用される用語は、特定の実施形態を記載するために使用された用語であり、限定的に使用された用語ではないことも理解されよう。
【００１１】
数値について範囲が提供される場合、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、下限の単位の１０分の１を刻みに、その範囲の上限と下限の間に介在する各数値、及び記載された範囲内にある他の記載された値または介在する値が本開示に含まれることは理解されよう。これらより狭い範囲の上限および下限は、独立してその狭い範囲に含まれてもよく、また、本開示に含まれ、記載の範囲から特に除外された範囲に従う。記載の範囲が限度の片方もしくは両方を含む場合、その含まれる限度の片方もしくは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
【００１２】
別途定義されている場合を除き、ここに記載するすべての専門用語および科学用語は、本開示が属している技術分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味をもつ。本開示を実施または試験するために、本書に記載する方法と材料の代わりに類似または同等の方法と材料を使用することもできるが、好ましい方法と材料を以下に述べる。
【００１３】
本明細書で引用される全ての刊行物および特許は、各個別の刊行物または特許が具体的に、そして個別に参考として組み込まれると示されたかのように参考として組み込まれ、その刊行物が引用される理由の方法及び／または材料を開示し記載するためにここに参考として組み込まれる。刊行物は出願日前の開示について引用されているため、刊行物を引用することで、事前開示のために本開示についてはその刊行物よりも前の日から権利を主張できないと認めたとは受け取られない。さらに、ここに記載する公表日は、実際の公表日とは異なる可能性もあり、独立して確認する必要もあり得る。
【００１４】
本開示を読む当業者にとって明らかになるように、ここに記載し例示する各個別の実施形態は別個の構成要素または特徴を有し、本開示の範囲と精神とから外れることなく、その要素や特徴は、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から分離または組み合わせてもよい。ここに記載する方法のいずれも、ここに記載する工程の順に、もしくは任意の他の論理的に可能な順に実施できる。
【００１５】
本開示の実施形態は、別段の指示がない限り、当業者が備えている技能の範囲内にある、分子生物学、微生物学、ナノテクノロジー、有機化学、生化学、および植物学等の技術を応用する。このような技術は文献に十分に説明されている。
【００１６】
定義
ここに開示する内容は、以下の用語を以下に説明する定義にしたがって使用しながら説明される。
【００１７】
ここに記載する「約（about）」、「およそ（aproximately）」等は、数値変数に関して用いられる場合は、一般にその変数の値と、実験誤差（例えば、平均の９５％信頼区間内）の内にある変数値全てと、示された値の＋−１０％の内にある変数値のいずれか高い方を意味する。
【００１８】
ここにいう「核酸」と「ポリヌクレオチド」は、一般に、少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせの列を意味し、いくつかある中で、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域が混同するＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖と二本鎖の領域が混同するＲＮＡ、および一本鎖の、又はより典型的には二本鎖もしくは一本鎖と二本鎖の領域が混同するＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。ここにいうポリヌクレオチドはさらに、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡを両方含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同じ分子又は異なる分子からのものであってもよい。領域は１つ以上の分子全体を含んでもよいが、より典型的には一部の分子の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、多くの場合、オリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」と「核酸」は、このような化学的、酵素的、又は代謝的に修飾されたポリヌクレオチドも包含し、また、特に単純型細胞、複雑型細胞を含むウィルスと細胞特有のＤＮＡとＲＮＡの化学形も包含する。例えば、ポリヌクレオチドという用語は、１つ以上の修飾された塩基を含む上述のようなＤＮＡとＲＮＡを含む。したがって、２つの例を挙げるとしたら、イノシン等の異常な塩基を含むＤＮＡやＲＮＡ、またはトリチル化された塩基等の修飾された塩基を含むＤＮＡやＲＮＡはここにいうポリヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」と「核酸」は、ペプチド核酸（ＰＮＡ：peptide nucleic acid）、ホスホロチオエート、およびネイティブの核酸のリン酸骨格の他の変種も含む。自然の核酸はリン酸骨格を有し、人工核酸は他の種類の骨格を含み得るが、同じ塩基を含む。したがって、安定のためもしくは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡとＲＮＡは、ここで意図する「核酸」または「ポリヌクレオチド」に含まれる。
【００１９】
ここにいう「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」と「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、一般に、無修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ、もしくは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、ポリリボ核酸またはポリデオキシリボ核酸を指す。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（transfer RNA：移転ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（small nuclear RNA：低分子核内ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（ribosomal RNA：リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（messenger RNA：伝令ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（anti-sense RNA）、ＲＮＡｉ（RNA interference construct：ＲＮＡ干渉コンストラクト）、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA：低分子干渉ＲＮＡ）、又はリボザイムの形式をとってもよい。
【００２０】
ここにいう「核酸配列」と、「オリゴヌクレオチド」は、上に定義するような核酸とポリヌクレオチドをも包含する。
【００２１】
ここにいう「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」と「リボ核酸（ＲＮＡ）」は、一般に、無修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ、もしくは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい、ポリリボ核酸またはポリデオキシリボ核酸を指す。ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（transfer RNA：移転ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（small nuclear RNA：低分子核内ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（ribosomal RNA：リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（messenger RNA：伝令ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（anti-sense RNA）、ＲＮＡｉ（RNA interference construct：ＲＮＡ干渉コンストラクト）、ｓｉＲＮＡ（short interfering RNA：低分子干渉ＲＮＡ）、又はリボザイムの形式をとってもよい。
【００２２】
ここにいう「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を独占するＤＮＡ配列に対応し、生物の性質または特質のための遺伝的指令を含む遺伝的単位を指す。
【００２３】
ここにいう「座位（locus）」は、特定の遺伝子またはその一部が占める、特定の生物種の染色体上の位置を指す。
【００２４】
ここにいう「対立遺伝子（allele）」は、対立遺伝子が少なくとも１つの特質または特性に関するものであるところ、遺伝子の１つ以上の代替形のいずれかを指す。二倍体の細胞または生物では、特定の遺伝子の２つの対立遺伝子は、１対の相同染色体上で対応する座位を占める。ここにいう「ヘテロ接合（heterozygous）」は、生物または細胞が、相同染色体上の対応する座位で異なる対立遺伝子を有する遺伝的状態を指す。
【００２５】
ここにいう「ホモ接合（homozygous）」は、生物または細胞が、相同染色体上の対応する座位で同一の対立遺伝子を有する遺伝的状態を指す。
【００２６】
ここにいう、「外来性ＤＮＡ」または「外来性核酸配列」または「外来性ポリヌクレオチド」との用語は、トランスフェクションを介して細胞、生物、または細胞小器官に導入された核酸配列を指す。外来性核酸は外部から生じるものであり、例えば、別の細胞または生物からの核酸、及び／または合成核酸及び／または組み換え核酸であり得る。時には外来性核酸は別の生物または生物種から生じることはあるものの、同じ生物種から生じてもよい（例えば、自然に生じる核酸に追加して、もしくはその代わりとして細胞または生物に導入される、核酸の余分のコピーまたは組み換え形態物）。典型的には、導入された外来性配列は組み換え配列である。
【００２７】
ここにいう「組み換え」との用語は、一般に非天然的に生じる核酸、核酸コンストラクト、またはポリペプチドを指す。このような、非天然的に生じる核酸は、修飾された天然核酸を含み得、例えば欠失、置換、逆位、挿入等を有する核酸、及び／または分子生物学技術を用いて結合された異なる由来の核酸配列の組み合わせ（例えば、「融合タンパク質」（例えば、２つの異なるタンパク質またはタンパク質断片の組み合わせからなるタンパク質またはポリペプチド）をコードする核酸配列、ポリペプチドをコードする核酸とプロモーター配列の組み合わせであって、コード配列とプロモーター配列は異なるソースに由来する、あるいは通常は自然に一緒に生じないものである組み合わせ（例えば、核酸と構成的プロモーター）等）を含み得る。組み換えは、組み換え核酸にコードされるポリペプチドも指す。非天然的に生じる核酸またはポリペプチドは、人に修飾された核酸とポリペプチドを含む。
【００２８】
ここにいう、「トランスフェクション」との用語は、生きている細胞の膜包囲空間の内部への外来性核酸配列及び／または組み換え核酸配列の導入を指し、細胞のサイトゾルに加え、ミトコンドリア、核、または葉緑体の内部空間への核酸配列の導入を含む。核酸は裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってもよく、種々のタンパク質または調節エレメント（例えば、プロモーター及び／またはシグナルエレメント）に関連していてもよく、または核酸はベクターまたは染色体に組み込まれてもよい。
【００２９】
ここにいう「形質転換」または「形質転換した」とは、導入された核酸のコード部分の発現を可能にするように核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に導入することを指す。
【００３０】
ここにいう「形質転換された細胞」とは、核酸でトランスフェクションされた細胞である。
【００３１】
ここにいう「導入遺伝子（transgene）」は、細菌または植物等の生物の細胞を形質転換するために使用される人工遺伝子を指す。
【００３２】
ここにいう「トランスジェニック」は、導入遺伝子を含む細胞、組織、または生物を指す。
【００３３】
ここにいう「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸残基配列として表記される。その配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、左から右へ記載される。標準命名法に従って、アミノ酸残基配列は、次のように、３文字または１文字のコードで称される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【００３４】
ここにいう「ペプチド」は、タンパク質またはポリペプチドに比べては短い、少なくとも２つのアミノ酸の鎖を指す。
【００３５】
ここにいう「変異体」は、基準ポリペプチドに異なるポリペプチドであるものの、基本の性質を維持するポリペプチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、別のポリペプチドである基準ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する。一般に、基準ポリペプチドと変異体の配列は全体的に酷似し、多くの領域においてはまったく同じであるように、違いは限られる。変異体と基準ポリペプチドは、１つ以上の修飾（例えば置換、付加、及び／または欠失）によってアミノ酸配列が異なり得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝的コードにコードされたもの、またはされていないものであってもよい。ポリペプチドの変異体は対立遺伝子変異体等の天然に存在するものであってもよく、もしくは天然発生が知られていない変異体であってもよい。
【００３６】
ここにいう「機能的な変異体」は、元のタンパク質またはポリペプチドと同じ機能または活性を実行できるタンパク質またはポリペプチドの変異体（例えばＣｉａ８タンパク質の変異体）を指すが、必ずしも同程度にそれらを実行するとは限らない（例えば、変異体は、基本的機能を維持する限り、向上した機能性、低下した機能性、または変化した機能性を有してもよい）。
【００３７】
ここにいう「同一性（identity）」は、2つ以上のポリペプチド配列またはヌクレオチドの関係を指し、配列を比較することによって決定される。当該技術分野において、「同一性」は、ポリペプチド間の配列関連性の程度であって、そのような配列の文字列間の一致性によって決定される関連性の程度も指す。「同一性」は、（Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., Eds., M Stockton Press, New York, 1991 ; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 1988, 48: 1073）に記載される方法を非限定的に含む既知の方法で容易に算出可能である。同一性を決定する好ましい方法は、試験された配列間の最大の一致を提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、一般に入手可能なコンピュータープログラムにおいてコード化されている。２つの配列間の同一性パーセントは、Needelman及びWunsch（J. Mol. Biol., 1970, 48: 443-453）のアルゴリズム（例えばNBLAST及びXBLAST）を導入する解析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, Madison Wis.）を使用して決定できる。本開示のポリペプチドの同一性を決定するためには、デフォルトのパラメータを使用する。
【００３８】
ここにいう「耐性のある」または「耐性」は、植物が完全にまたはある程度環境ストレスまたはその他の制限要因の悪影響を克服できる能力を指す。
【００３９】
ここにいう「発現」は、ポリペプチドを生成するために構造遺伝子が実行するプロセスを表す。転写（transcription）と翻訳（translation）の組み合わせである。発現は、ＲＮＡ分子を産生するための核酸の「発現」を指すが、それはポリペプチドの「発現」を指し、つまり対応する核酸の発現を介してポリペプチドが産生されることを表す。
【００４０】
ここにいう「過剰発現」と「発現増加（up-regulation）」は、実質的に同一の条件下で、ポリペプチドをコードする核酸（例えば、遺伝子）を、形質転換された植物細胞で、「野生型」の植物細胞（例えば、遺伝子でトランスフェクションされていない実質的に同等な細胞）よりも高いレベルで発現すること（よって、遺伝子にコードされるポリペプチドのより多い量を産生すること）を指す。
【００４１】
ここにいう「過小発現」と「発現低下（down-regulation）」は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）を、野生型植物細胞よりも低いレベルで発現すること（ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドのより少ない量を産生すること）を指す。
【００４２】
ここにいう遺伝子発現の「阻害」または「阻害する」は、あるもの（例えば、アンチセンスヌクレオチド、抑制因子、アンタゴニスト、等）が、転写、翻訳、及び／または遺伝子の発現における他の処理工程を（完全に及び／または部分的に）低減または防止するように作用すること、そしてそれによって、野生型に比較して、遺伝子にコードされる活性タンパク質の少ない量が産生されるように遺伝子発現が低下することを示す。
【００４３】
ここにいう「プラスミド」は、プラスミドがホスト細胞で複製されるように、未変化の「レプリコン」を含む非染色体性二本鎖ＤＮＡ配列を指してもよい。
【００４４】
ここにいう「ベクター」との用語は、細胞に外来性核酸配列を導入するために使用される輸送手段を指すように使用できる。ベクターは、宿主細胞または宿主細胞小器官への導入の際に目的ポリペプチドの転写と翻訳を提供する追加のセグメントに機能的に結合した目的ポリペプチドをコードするセグメントを含む、直鎖または環状（例えばプラスミド）のＤＮＡ分子を含んでもよい。そのような追加セグメントは、プロモーター配列とターミネーター配列を含み得、また、１つ以上の複製起点、１つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等も含んでもよい。発現ベクターは、一般に酵母または細菌のゲノムまたはプラスミドのＤＮＡ、またはウィルスＤＮＡ、またはその両方の要素を含んでもよい。
【００４５】
ここにいう「プロモーター」は、コード配列の転写を駆動できるすべての配列を含む。特に、ここにいう「プロモーター」との用語は、開始コドン近位に位置する遺伝子の５’調節領域として一般に記載されるＤＮＡ配列を指す。隣接するコード配列の転写は、プロモーター領域で開始する。「プロモーター」との用語は、遺伝子の転写を開始させるように機能するプロモーターの断片も含む。
【００４６】
ここにいう「機能的に結合した」とは、核酸のコード配列を発現するために有用である調節配列が、コード配列の発現をもたらすように、コード配列に対して適切な位置に核酸分子内に配置されることを意味し得る。同じ定義をコード配列と転写制御エレメント（例えばプロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、及びターミネーターエレメント）、及び／または選択可能なマーカー、及び／または発現ベクター、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドにおける他の機能的配列の配置にも適用することがある。
【００４７】
ここにいう「選択可能なマーカー」は、発現によって、マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換またはトランスフェクションされた細胞を識別可能にする遺伝子を指す。例えば、組み換え核酸は、目的遺伝子で細胞の形質転換に成功したことが選択的なマーカーの発現によって示されるように、目的遺伝子に機能的に結合した選択可能なマーカーを含み得る。
【００４８】
ここにいう「構成的プロモーター」は、関連する遺伝子またはポリヌクレオチドの連続転写またはユビキタス転写を可能にするプロモーターである。構成的プロモーターは、一般に細胞、もしくは組織型、時間、または環境によって調節されない。
【００４９】
ここにいう「誘導可能プロモーター」は、ある物質または化合物（例えば、抗生物質または金属）、環境条件（例えば、温度）、発達段階、または組織型に応じて関連する遺伝子またはポリヌクレオチドの転写を可能にするプロモーターである。
【００５０】
ここにいう「野生型」は、自然界または定義された集団において生じるようなある生物、変種、株、遺伝子、タンパク質、または性質の典型的な形態または平均的な形態であり、自然選択または人為選択、もしくは導入遺伝子で形質転換することによって生じる変異体形態とは区別される形態である。
【００５１】
ここにいう「電気穿孔」は、高濃度のプラスミドＤＮＡ（外来性ＤＮＡを含む）が宿主細胞プロトプラストの懸濁液に加えられ、混合液を２００〜６００Ｖ／ｃｍの電場でショックすることを含む形質転換法である。
【００５２】
ここにいう「単離」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が、自然界で通常関連付けられる細胞構成物またはその他の構成物から単離されることを意味する。本開示の１つの側面において、ネイティブまたは自然の環境、例えば染色体上で、通常関連している３’および５’の連続ヌクレオチドから、単離ポリヌクレオチドが分離される。当業者にとって明らかであるように、非天然的に生じるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片を、自然に生じる相対物と区別するために「単離」する必要はない。また、「濃縮」、「分離」、または「希釈」したポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、濃度または体積当たりの分子数が自然に生じる相対物の「濃縮した」場合よりも高い、または「分離した」場合よりも低いことで、天然に生じる相対物と区別できる。一次配列または例えばグリコシル化パターンにおいて天然に生じる相対物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、一次配列、もしくはグリコシル化パターン等の別の特性で天然的に生じる相対物から区別可能であるため、単離した状態で存在する必要はない。各実施形態について明記されていないが、本開示には、適切な条件下で、かつ下記で開示する組成物それぞれに関して上記すべての実施形態が提供される。よって、非天然的に生じるポリヌクレオチドは、単離された天然的に生じるポリヌクレオチドとは別の実施形態として提供される。細菌細胞で産生されるタンパク質は、自然界で産生される真核細胞から単離される天然に生じるタンパク質とは別の実施形態として提供される。
【００５３】
ここにいう「ｃＤＮＡ」は、細胞におけるＲＮＡ転写物に相補するＤＮＡ配列を指す。人工分子である。ｃＤＮＡは、典型的には、ＲＮＡ転写物をテンプレートとして使用して、逆転写酵素と呼ばれる酵素によって、インビトロで合成される。
【００５４】
ここにいう「精製された」は、自然環境に比べて高い純度を有する核酸配列、ペプチド、またはポリペプチドを指して使用される。
【００５５】
ここにいう「対照物（コントロール）」は、試験において比較用に用いられる代替の試験物またはサンプルであり、独立変数以外の変数の影響を最小化または識別するために含まれるものである。「コントロール」は陽性または陰性であってもよい。
【００５６】
化学化合物、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片を非限定的に含むある分子、化合物、または組成物の量に関して使用されるここにいう「濃縮された」は、濃度または体積当たりの分子数が天然に生じる相対物よりも高いこと、及び／または１回投与当たりの効率及び／または機能性がネイティブ状態の天然に生じる相対物に比較して高いことによって、天然に生じる相対物からサンプルが区別可能であることを示す。
【００５７】
化学化合物、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片を非限定的に含むある分子、化合物、または組成物の量に関して使用されるここにいう「希釈された」は、濃度または体積当たりの分子数が天然に生じる相対物よりも低いことによって、天然に生じる相対物からサンプルが区別可能であることを示す。
【００５８】
ここにいう「分離した」は、分離された化合物、作用剤、粒子、化学化合物、または分子が原始的由来または原始的集団の一部として考えられなくなったように原始的由来または原始的集団から物理的に分離された状態を指す。
【００５９】
ここにいう「合成物（synthetic）」は、ある化合物が自然に存在する自然界の生物の外で独立して起こる化学的または生物学的な合成プロセスによって生成される化合物を指す。
【００６０】
考察
緑藻やその他の光合成水棲生物は、自然環境において、しばしば低ＣＯ２やＣＯ２が変動する状況に晒される。この生物に対するＣＯ２利用性は、数ある要因の中、水におけるガスの遅い拡散、２つの無機質カーボン形状（ＣＯ２およびＨＣＯ３−）の遅い相互変換、及びｐＨの変動に制限される。したがって、ほとんど全ての水棲光合成生物は、ルビスコ（Rubisco）で固定するための無機質炭素（Ｃｉ）を有効に濃縮するために、ＣＯ２制限条件下で誘導可能な二酸化炭素濃縮メカニズム（ＣＣＭ：carbon dioxide concentrating mechanism）を進化した（Giordanoほか、２００５）。現在までのところ、C. reinhardtiiにおける２つの高親和性重炭酸輸送タンパク質と１つの低親和性重炭酸輸送タンパク質が特徴づけられ、低ＣＯ２条件下で機能できることが知られている。ＨＬＡ３とＬＣＩ１は、形質膜に位置するＣｉ輸送体であると考えられている。３つ目の輸送体、ＮＡＲ１．２（ＬＣＩＡとも呼ばれる）は、ギ酸・亜硝酸輸送体ファミリーに属する葉緑体包膜のタンパク質である。これまでは、直接な証拠はないものの、ＮＡＲ１．２は葉緑体包膜におけるＣｉの取り込みによるものとされてきた。
【００６１】
また、２つの可溶性タンパク質（ＬＣＩＢ／ＬＣＩＣ）は複合体を形成し、細胞が低ＣＯ２に馴化されるとそれらタンパク質がピレノイドと密接して会合することが観察された以上、ピレノイドから漏れるＣＯ２を再び捕らえるプロセスに関与していると考えられている（Yamanoほか、２０１０；Wangほか、２０１１）。別の推定輸送体であるＣＣＰ１とＣＣＰ２も、現在はミトコンドリアのものであることが確認されている（Atkinsonほか、２０１５）が、まだ解決されていない。以上のことを考慮すると、ＣＣＭをよりはっきり理解するためには、クラミドモナスのＣｉ輸送システムを解明する必要があることが明らかである。
【００６２】
したがって、Ｃｉａ８と呼ばれ、重炭酸の輸送に関与できる緑藻からの溶質担体タンパク質と、そのポリペプチドと、それらをコードする核酸をここに記載する。Ｃｉａ８ポリペプチド及び／またはＣｉａ８ポリペプチドをコードする核酸を含む及び／または発現する修飾細胞とトランスジェニック植物もここに提供する。以下の図面、詳細な説明、及び例を検討するうえで、本開示の他の組成物、化合物、方法、特徴、及び利点は当業者にとって明確になる。そのような追加の組成物、化合物、方法、特徴、及び利点もすべて、本記載に含み、本開示の範囲内に含むことを意図する。
【００６３】
核酸配列
単離ヌクレオチド及びｃＤＮＡの配列
本開示は、緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドの全部または一部をコードできる単離ヌクレオチド及びｃＤＮＡ配列を記載する。いくつかの実施形態では、ここに提供する単離または合成のヌクレオチドまたはｃＤＮＡ配列にコードされる緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドは、重炭酸を結合、及び／または輸送できる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、配列番号１〜３のいずれか１つと１００％一致する単離ヌクレオチド配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、緑藻Ｃｉａ８をコードするｃＤＮＡは、配列番号３と１００％一致する配列をもつことができる。ｃＤＮＡは、配列番号３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有する配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有する配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、ｃＤＮＡは、配列番号３のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、または少なくとも５０％の配列同一性を有する配列をもつことができる。さらなる実施形態では、ｃＤＮＡ配列は、配列番号３のいずれか１つと約７０％から約８０％、または約８０％から約９０％、または約９０％から約１００％の同一性を有する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、緑藻Ｃｉａ８ｃＤＮＡは、配列番号４のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有する配列をもつポリペプチドをコードする。追加の実施形態では、緑藻Ｃｉａ８ｃＤＮＡは、配列番号４のいずれか１つと約９０％から約１００％の配列同一性を有する配列をもつポリペプチドをコードする。他の実施形態では、緑藻Ｃｉａ８ｃＤＮＡは、配列番号４のいずれか１つと約５０％から約１００％の配列同一性を有する配列をもつポリペプチドをコードする。
【００６６】
本開示は、合成ヌクレオチド断片とｃＤＮＡ断片を含む単離ヌクレオチド断片も提供し、それらは、配列番号１〜３のいずれか１つに含まれる少なくとも６個のヌクレオチド配列からなる任意の配列と約９０％から約１００％、約９５％から約１００％、または約９９％から１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、単離ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチド断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに約５０％から約１００％の配列同一性を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、単離または合成ヌクレオチド断片は、膜をわたって重炭酸を結合及び／または輸送できるペプチドまたはポリペプチドをコードできる。
【００６８】
組み換えポリヌクレオチド配列
また、上記の単離ヌクレオチドまたはｃＤＮＡ配列またはその断片と、その単離ヌクレオチドまたはｃＤＮＡ配列またはその断片に機能的に結合された追加のポリヌクレオチド配列との任意のものを有する組み換えヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、非コードヌクレオチドを、分子の機能的性質を影響せずに、緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端及び／または３’末端に配置することができる。ポリヌクレオチドのコード領域の３’末端にポリアデニル化領域を含むことができる。ポリアデニル化領域は、内在性遺伝子、各種の他の植物遺伝子、Ｔ−ＤＮＡ、または化学合成に由来できる。さらなる実施形態では、緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、翻訳と同時または翻訳後に緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドの移動を指示する緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドの（例えば）Ｎ末端におけるシグナルまたはトランジット（またはリーダー）配列をコードする核酸に結合されてもよい。また、ポリヌクレオチド配列は、コードされた緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドがリンカー、選択可能なマーカー、またはタンパク質の合成、精製、及び／または識別を容易化する他の配列に結合されるように変更できる。１つの実施形態では、組み換えポリヌクレオチド配列は、単離ヌクレオチドまたはｃＤＮＡ配列、またはその断片に機能的に結合されている少なくとも１つの調節配列を含む。
【００６９】
細胞の中で外来性緑藻Ｃｉａ８の遺伝子、その断片、またはアンチセンスヌクレオチドを発現するために、外来性ヌクレオチドを、細胞の中のコードされたタンパク質の遺伝子の転写及び／または翻訳を指示する転写及び／または翻訳の開始調節配列、つまりプロモーターと（例えばベクターにおいて）組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターを使用してもよい。植物細胞に適する構成的プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写開始領域、Agrobacterium tumefaciensのＴ−ＤＮＡに由来する１’−または２’−プロモーター、ArabidopsisからのＡＣＴ１１及びＣａｔ３プロモーター（Huangほか、Plant Mol. Biol. 1996, 33:125-139、およびZhongほか、Mol. Gen. Genet. 1996, 251:196-203）、Brassica napusからのステアロイル−アシル担体タンパク質不飽和化酵素遺伝子のプロモーター（Solocombeほか、Plant Physiol. 1994, 104:1167-1176）、及びトウモロコシからのＧＰｃ１およびＧＰｃ２プロモーター（Martinezほか、J. Mol. Biol. 1989, 208:551-565、及びManjunathほか、Plant Mol. Biol. 1997, 33:97-112）を非限定的に含む。細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞に適する構成的プロモーターは当業界で周知であり、例えば細菌発現のためのＴ−７プロモーターと、酵母における発現のためのアルコール脱水素酵素プロモーターがある。
【００７０】
他の実施形態では、特定の細胞型の中で、特定の環境条件下で、及び／または特定の発達状態中に外来性核酸の発現を指示するために、組織特異性のプロモーターまたは誘導性プロモーターを使用してもよい。誘導性プロモーターによる転写を影響し得る環境条件の例としては、嫌気的条件、高温度、光の存在、薬剤やホルモンとの接触、または病原体の感染を挙げられる。適切な植物誘導性プロモーターは、根特異的なＡＮＲＩプロモーター（Zhang及びForde、Science, 1998, 279:407）、臓器特異的な光合成ＲＢＣＳプロモーター（Khoudiほか、Gene. 1997, 197:343）、及びトマト果実熟成特異的なＥ８プロモーター（Deikman, J.ほか、Plant Physiol 1992, 100:2013-2017）を含む。
【００７１】
植物細胞に選択可能な表現型を与えるために、組み換え核酸に選択可能なマーカーも含ませることができる。例えば、選択可能なマーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する抵抗性）、または除草剤抵抗性（例えば、クロロスルフロンまたはバスタ（Basta）に対する抵抗性）を与えるタンパク質をコードしてもよい。したがって、選択可能な表現型の存在は、宿主細胞の形質転換の成功を示す。例示的な選択可能なマーカーは、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のレポーター遺伝子を含む。
【００７２】
適切な組み換えポリヌクレオチドは、制限酵素消化、ＰＣＲ、ライゲーション、及びクローニング技術を非限定的に含む、当業者にとって周知である標準方法を使用して得られる。いくつかの実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、膜をわたって重炭酸を結合及び／または輸送できるペプチドまたはポリペプチドをコードする。
【００７３】
単離タンパク質（ポリペプチド）及びペプチドの配列
本開示は、Ｃｉａ８等の、緑藻からの溶質担体に対応する単離または合成タンパク質（ポリペプチド）も記載する。いくつかの実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号４に対応するアミノ酸配列を有することができる。単離または合成ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、単離または合成ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも約９８％の同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。他の実施形態では、単離ポリペプチドは、配列番号４と少なくとも約９５％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をもつことができる。いくつかの実施形態では、単離または合成ポリペプチドは、配列番号４と約７０％超、または約７０％から約９０％、または約９０％から約１００％の同一性を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、単離または合成のポリペプチドは、膜をわたって重炭酸を結合及び／または輸送できる。いくつかの実施形態では、単離または合成ペプチドは、低ＣＯ２条件で増殖の向上を可能にする。いくつかの実施形態では、低ＣＯ２条件は、大気中のＣＯ２レベルであってよい。いくつかの実施形態では、低ＣＯ２条件は、約３％ＣＯ２よりも少なくてもよい。
【００７５】
未修飾ポリペプチドと同様の性質を有する分子をもたらすように本開示のポリペプチドの構造を修飾及び変更（例えば、アミノ酸の保存的置換）してもよい。修飾技術は、当業界において一般に知られている。例えば、活性の明らかな損失を示さずに、特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することができる。ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのは、ポリペプチドの相互作用能力と性質であるため、ポリペプチドの配列において特定のアミノ酸配列を置換しても機能的な変種を得ることができる。アミノ酸配列置換を有するポリペプチドであって、緑藻Ｃｉａ８に対応するポリペプチドと実質的に同様な性質を維持するものは、本開示の範囲に含まれる。
【００７６】
本開示は、緑藻Ｃｉａ８に対応するポリペプチドの断片に対応する単離及び合成ペプチドも含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号４の一部に対応する。単離または合成ペプチドは、配列番号４のいかなる部分と少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性をもつことができる。いくつかの実施形態では、単離または合成ペプチドは、配列番号４内の配列と約９０％から約９５％、または約９５％から約９９％、または約９９％から約１００％の同一性を有することができる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、単離または合成ポリペプチドは、膜をわたって重炭酸を結合及び／または輸送できる。いくつかの実施形態では、単離または合成ペプチドは、低ＣＯ２条件で増殖の向上を可能にする。いくつかの実施形態では、低ＣＯ２条件は、大気中のＣＯ２レベルであってよい。いくつかの実施形態では、低ＣＯ２条件は、約３％ＣＯ２よりも少なくてもよい。
【００７８】
他の実施形態では、ここに記載する単離または合成ペプチド、またはその断片は、緑藻Ｃｉａ８に対する抗体の生産に適している。言い換えれば、ここに記載する単離または合成ペプチドは抗原となり、その抗原に対して抗体が惹起される。また、いくつかの実施形態では、単離または合成ペプチド配列、またはその断片は、抗体のエピトープである。緑藻Ｃｉａ８に対して惹起される抗体は、少なくとも緑藻Ｃｉａ８の検出方法、定量化方法、及び精製方法において使用することに適している。緑藻Ｃｉａ８抗体の他の用途は、当業界において一般に知られている。
【００７９】
ベクター
ここに記載されるポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを１つ以上を有するベクターは、様々なレベルの緑藻Ｃｉａ８を発現するトランスジェニックの細菌、真菌、酵母、及び植物の細胞と、トランスジェニック植物の生産において有用となり得る。本開示の範囲内には、ここに記載するポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むベクターが含まれる。
【００８０】
１つの実施形態では、ベクターは、緑藻Ｃｉａ８をコードするポリペプチドを含むことができるところ、ＤＮＡ分子は配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも約９０％、または約９０％から約９５％、または約９５％から約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ベクターは緑藻Ｃｉａ８をコードするＤＮＡ分子を含み、ＤＮＡ分子は配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも約９０％、または約９０％から約９５％、または約９５％から約１００％の配列同一性を有し、緑藻Ｃｉａ８は重炭酸を結合及び／または輸送でき、及び／または低ＣＯ２条件において藻の成長を向上させることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号３と少なくとも約９０％、または約９０％から約９５％、または約９５％から約１００％の配列同一性をもつ配列を有するポリペプチドをコードするｃＤＮＡ分子を有する。
【００８１】
１つの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ分子に機能的に結合した１つ以上の調節配列、または緑藻Ｃｉａ８を導入した細菌、真菌、酵母、植物、またはその他の細胞に緑藻Ｃｉａ８が発現されるように緑藻Ｃｉａ８をコードする１つ以上の調節配列を含むことができる。他の実施形態では、ベクターは、緑藻Ｃｉａ８が導入された形質転換植物細胞において、緑藻Ｃｉａ８が野生型の細菌、真菌、酵母、または植物細胞に比較して過剰に発現されるように、緑藻Ｃｉａ８の発現を開始させるように作用するプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、緑藻Ｃｉａ８と選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ分子に機能的に結合している少なくとも１つの調節配列を有することができる。
【００８２】
トランスジェニック植物
上記のポリヌクレオチド配列とベクターは、トランスジェニック植物を生成するために使用できる。本開示は、１つ以上の細胞を有するトランスジェニック植物であって、当該１つ以上の細胞は、緑藻Ｃｉａ８をコードするＤＮＡ配列を有する上述の組み換えポリヌクレオチドまたはベクターのうち任意のものを含む植物を含む。１つの実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも約９０％、または約９０％から約９５％、または約９５％から約１００％の配列同一性を有する緑藻Ｃｉａ８ＤＮＡ配列に機能的に結合している少なくとも１つの調節エレメントを含む。
【００８３】
また、上記のヌクレオチド配列のいずれか１つ以上を含むベクターで、及び／または本開示の緑藻Ｃｉａ８タンパク質をコードする核酸の断片で形質転換された１つ以上の細胞を有するトランスジェニック植物もここに記載される。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも約９０％、または約９０％から約９５％、または約９５％から約１００％の配列同一性を有する緑藻Ｃｉａ８ＤＮＡ配列を含む。トランスジェニック植物は、Arabidopsis、イネ、コムギ、コーン（corn）、メイズ（maize）、タバコ、大豆、アブラナ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウキビ、及びソルガム（sorghum）を非限定的に含む、いかなる適切な植物種または変種から作られてもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、緑藻Ｃｉａ８をコードするヌクレオチド配列を有するトランスジェニック植物は、野生型の植物に比較して増加した遺伝子及び／またはタンパク質の発現を示す。他の実施形態では、トランスジェニック植物は、緑藻Ｃｉａ８をコードするヌクレオチド配列を有し、そして野生型の植物に比較して増加した緑藻Ｃｉａ８の発現を示し、緑藻Ｃｉａ８のポリペプチドを産生する。緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドは、膜をわたって重炭酸を結合及び／または輸送することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、重炭酸を結合及び／または輸送することができる緑藻Ｃｉａ８を産生する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、緑藻Ｃｉａ８タンパク質を産生でき、及び低ＣＯ２条件で向上した増殖性を有することができる。いくつかの実施形態では、低ＣＯ２条件は、大気中のＣＯ２レベルであってよい。いくつかの実施形態では、低ＣＯ２条件は、約３％ＣＯ２よりも少なくてもよい。
【００８６】
本開示の形質転換植物細胞は、前述のように、植物細胞に１つ以上のベクターを導入することで生成できる。１つの実施形態では、本開示のトランスジェニック植物は、１つ以上の前述のベクターで形質転換したトランスジェニック植物細胞から育成できる。１つの実施形態では、細胞は配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも約９０％、または約９０％から約９５％、または約９５％から約１００％の配列同一性を有する緑藻Ｃｉａ８をコードする組み換えポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの調節配列がＤＮＡ分子に機能的に結合されていてもよい。
【００８７】
ベクターまたは裸の核酸で多種多様の植物を形質転換する技術は、当業界において周知であり、技術文献や科学文献において記載されている。例えば、Weisingほか、Ann. Rev. Genet. 1988, 22:421-477を参照のこと。例えば、ベクターまたは裸の核酸は、電気穿孔と植物プロトプラストのマイクロインジェクションを非限定的に含む技術を用いて直接植物細胞のゲノムＤＮＡに導入されてもよく、または組み換え核酸は、ＤＮＡパーティクルガン法（DNA particle bombardment）などのバリスティック法を利用して直接導入できる。
【００８８】
マイクロインジェクション技術は、当業界において知られている技術であり、科学文献や特許文献において十分に記載されている。ポリエチレングリコール沈殿液を用いた組み換え核酸の導入は、Paszkowskiほか、EMBO J, 1984, 3:2717-2722に記載されている。電気穿孔技術はFrommほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985, 82:5824に記載されている。バリスティック形質転換技術はKleinほか、Nature. 1987, 327:70-73に記載されている。また、組み換え核酸は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わせ、従来のAgrobacterium tumefaciens宿主ベクター又は他の適切なベクターに導入してもよい。Agrobacterium tumefaciens宿主の毒性機能（virulence function）は、細胞が細菌に感染した際に、植物細胞のＤＮＡへ外来性核酸と隣接するマーカーを含む組み換え核酸の挿入を指示する。無害化（disarming）およびバイナリーベクターの使用を含むAgrobacterium tumefaciens媒介性形質転換技術は、当業者に知られている技術であり、科学文献において十分に記載されている。例えば、Horschほか、Science. 1984, 233:496-498；Fraleyほか、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983, 80:4803；およびGene Transfer to Plants、Potrykus編、Springer-Verlag, Berlin, 1995を参照のこと。
【００８９】
ベクターまたは組み換え核酸を植物細胞に導入するさらなる方法は、（安定性または一過性の）植物細胞プロトプラストの形質転換による方法である。植物プロトプラストは、形質膜のみに包囲され、したがって外来性ＤＮＡ等の高分子をより容易に取り込む。これらの改変プロトプラストは、植物をまるごと再生できる。外来性ＤＮＡを植物細胞プロトプラストに導入する適切な方法は、電気穿孔法とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）形質転換を含む。電気穿孔法に続き、形質転換された細胞は、選択剤を含む適切な培地上の増殖によって識別される。
【００９０】
トランスジェニック植物における外来性核酸の存在とコピー数は、例えばサザンブロット解析（Southern blotting analysis）、ＰＣＲ、及び配列決定（シークエンシング）等の、当業界によく知られている方法で決定できる。トランスジェニック植物における外来性緑藻Ｃｉａ８核酸の発現は、トランスジェニック植物の中で緑藻Ｃｉａ８ｍＲＮＡ及び／または緑藻Ｃｉａ８ポリペプチドの増加を検出することで確認できる。ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出方法及び定量化法は、当業界において周知である。
【００９１】
上記形質転換技術のいずれかによって作られた形質転換植物細胞、もしくは現在知られている他の技術またはその後に開発された他の技術で作られた形質転換植物細胞は、植物をまるごと再生するように培養できる。実施形態では、このような再生技術は組織培養の増殖培地において特定の植物ホルモンを操作することに依存し得、典型的には外来性核酸と併せて導入された殺生物剤または除草剤の選択可能なマーカーに依存する。培養プロトプラストからの植物再生はEvansほか、Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176. MacMillilan Publishing Company, New York, 1983、及びBinding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に記載されている。再生は植物のカルス、外植片、器官、またはその一部からも得られる。そのような再生技術は、Kleeほか、Ann. Rev. Plant Phys. 1987, 38:467-486に一般に記載されている。
【００９２】
いったん外来性緑藻Ｃｉａ８がトランスジェニック植物のゲノムに安定に導入されたことが確認されれば、性的交雑によって他の植物に導入することができる。交雑する生物種によって、数々の標準繁殖方法のいずれかを使用できる。
【００９３】
形質転換した細胞
本開示は、前述のように１つ以上の単離ヌクレオチドまたはｃＤＮＡ配列、及び／またはベクターで形質転換した１つ以上の細胞も包含する。いくつかの実施形態では、形質転換した細胞は、植物、細菌、真菌、または酵母の細胞である。１つの実施形態では、前述のように、植物、細菌、真菌、または酵母の細胞は、１つ以上のベクターを含む。また、集団の細胞のうち約１％から１００％、または５０％から７５％、または７５％から１００％が前述のようにベクターを含む細胞の集団も本開示の範囲に含まれる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、集団内の１つ以上の細胞は、１つより多くのベクター種類を含む。いくつかの実施形態では、ベクターを含む細胞のすべて（約１００％）は、同じ種類のベクターを有する。他の実施形態では、ベクターを含む細胞のすべては、同じ種類のベクターまたは複数のベクターを有さない。いくつかの実施形態では、集団の細胞のうち約１％から１００％、または５０％から７５％、または７５％から１００％が同じベクターまたは複数のベクターを含む。一部の細胞集団では、すべての細胞は同種由来である。他の細胞集団は、異なる生物種の細胞を含む。形質転換した（トランスジェニック）細胞を確立するためのトランスフェクション方法は、当業界において周知である。
【００９５】
１つの実施形態では、形質転換した細胞は、膜をわたって重炭酸を結合及び／または輸送できるペプチドまたはポリペプチドを産生及び／または発現する。
【００９６】
実施例
さて、本開示の実施形態を概して記載した上で、以下の例は本開示の追加の実施形態を説明する。本開示の実施形態は、以下の例とそれに対応するテキスト及び図面に関連して記載されるが、本開示の実施形態をその記載に限定する意図はない。むしろ、本開示の趣旨及び範囲に属するすべての代案、変更、及び同等物が含まれることを意図する。
【００９７】
実施例１
はじめに
この例は、ここでＣｉａ８と呼ばれ（Phytozome ID: Cre09.g395700）、溶質担体タンパク質をコードし、変異誘発スクリーニング（mutagenesis screening）で識別された遺伝子の識別と特徴づけを示す。Ｃｉａ８遺伝子は、溶質担体タンパク質（SLC: solute carrier）スーパーファミリーに属する保存された膜貫通タンパク質の群（Pushkin及びKurtz、２００６）であるＮａ＋／胆汁酸共輸送体（symporter）ファミリー（ＳＢＦ）に属する膜貫通タンパク質をコードする。結果によって、Ｃｉａ８遺伝子の産物は、C. reinhardtiiにおける重炭酸の取り込みに関与し得ること、及び／または低ＣＯ２条件で増殖を向上させることができることが示される。
【００９８】
結果
Ｃｉａ８変異体は、よく増殖するためには高ＣＯ２条件が必要である
Ｃｉａ８変異体は、パロモマイシン抵抗性を与えるStreptomyces rimosusに由来するアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ・タイプＶＩＩＩをコードする遺伝子（ＡｐｈＶＩＩＩ）を含む１．８ｋｂ  ＡｐｈＶＩＩＩ  ｐａｒａＲカセットを用いた挿入性変異誘発スクリーンに続いて識別された（Sizovaほか、２００１）。変異体は、ＭＩＮプレート上で高ＣＯ２（約５％）及び低ＣＯ２（約０．０１％）で増殖させることによってスクリーンされ、そこでＣＣＭ変異体の可能性のあるものは、低ＣＯ２で増殖される場合に遅い増殖を示す（Jungnickほか、２０１４）。Ｃｉａ８変異体は高ＣＯ２条件で良好に増殖した（図１Ａ）が、低ＣＯ２ではそれほど増殖しなかった（図１Ｂ）ため、更なる研究を行った。細胞を０．０１％ＣＯ２で液体（ＭＩＮ）培養において増殖したときにも増殖の遅い表現型が見られ、そこでｃｉａ８変異体の倍加時間は、Ｄ６６の２０時間に比較して、３０時間であった（図１Ｃ）。
【００９９】
挿入の確認
Ｃｉａ８遺伝子におけるＡｐｈＶＩＩＩインサートの位置は、Pollockほか（２０１６）が記載したアダプターＰＣＲで決定された。インサートは、図２Ａの遺伝子モデルに示されるように、Ｃｉａ８遺伝子の第１０エクソンに位置している。インサートの存在を確認するために、インサートの５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを増幅する２つのプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行った。表２は、本研究において使用されたプライマーの一覧を示す。この変異体において挿入部位に隣接するゲノムＤＮＡは単離され、配列決定された。配列決定されたゲノムＤＮＡの解析によって、（インサートの末端で）カセットの５’ＵＴＲで遺伝子配列の１６個の塩基が欠失され、１９個の塩基の新しい領域が挿入されていることが明らかになった。インサートの３’ＵＴＲはそのままの状態で、欠失も挿入もなかった。この解析によって、目的の遺伝子配列が第１０エクソンにおいて破壊され、他に大きなＤＮＡ欠失または挿入が生じなかったことが確認された。
【０１００】
遺伝子発現
遺伝子における転写の中断も、挿入部位にまたがる遺伝子特異的プライマー対を使用した逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確認された。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、Ｃｉａ８変異体においてそのままの状態のＣｉａ８転写物の検出可能な発現が存在しなかったことを示し（図３）、したがって、転写物が破壊され、変異体において遺伝子生産物は検出可能なレベルより少なく存在することが確認された。野生型の高ＣＯ２細胞に、Ｌｉｃｉ８  ｍＲＮＡが検知された。低ＣＯ２細胞で著しい転写体の発現増加（upregulation）が観察され（図３）、したがって、Ｃｉａ８遺伝子は低ＣＯ２条件下で誘導可能であることが示唆される。このＲＴ−ＰＣＲの結果は、転写物がＣｉａ５変異体と野生型において同等に発現されたため、ＣＩＡ８をコードする遺伝子は、ほとんどのＣＣＭ遺伝子のマスター調節因子であるＣｉａ５遺伝子に調節されないようであることを示す。
【０１０１】
Ｃｉａ８変異体と野生型株の遺伝的交雑の結果、１：１のパロモマイシン抵抗性子孫対パロモマイシン感受性子孫の分離比が示され（データ非表示）、よって変異体は単一の挿入を有することが表される。ＰＣＲによるさらなる研究によって、パロモマイシン抵抗性の株は、カセットを担持していることが示された。表現型解析の結果、パロモマイシン抵抗性の４分子（tetrad）は一貫して低ＣＯ２条件で病的であったことが示された。この結果をまとめると、Ｃｉａ８遺伝子の座位は、低ＣＯ２条件下で観察された低増殖表現型と分離（segregate）し、かつしたがってそれに関与するという結論に至る。
【０１０２】
Ｃｉａ８遺伝子の構造と膜貫通ドメインの予測
ｃＤＮＡとゲノムの配列を比較すると、ゲノムにおける９番染色体に位置するＣｉａ８は、１２のエクソンを有することが示される。ヌクレオチド配列に基づくと、Ｃｉａ８は５２９個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードし、ナトリウム／胆汁酸（ＳＢＦに似た）溶質担体タンパク質群と最もよくアラインメントする。タンパク質の構造を予測するためにＰＨＹＲＥ２ソフトウェア（Kelleyほか、２０１５）を使用した。３７０個のアミノ酸（アミノ酸１６０〜５２９）を含むタンパク質の中心の膜間部分を使用すると、最も高い相同性スコアが得られた。予測の結果は、図４に示されるように、１５〜２４個のアミノ酸を備える推定膜間ドメインと、膜貫通ヘリックスの間にある８〜３０個のアミノ酸からなる細胞外ループを明らかにする。ＴＭ５と６の間にある３番目のループは他のループよりも長く、それはＳＬＣ４タンパク質の特性である。このたんぱく質は、細菌（Yersinia frederikseni）のＮａ＋／代謝物共輸送体に対して最もよく（８２％）スレッドしたが、いくつかの細菌からのＨａｐＡタンパク質（Ｎａ＋／Ｈ＋交換輸送体）にもよくスレッドした（５６〜９８％）。
【０１０３】
他のアニオン輸送体に対するＣＩＡ８の類似性
ＰＦＡＭデータベースで検索した結果、ＣＩＡ８に類似する予測タンパク質が８つ見つかった：Cre02.g147450；Cre06.g250450；Cre09.g393250；Cre12.g521950；Cre10.g448350；Cre12.g532500；Cre02.g095085；およびCre02.g095086、全てＮａ＋／胆汁酸輸送体として注記されている。これらのタンパク質とＣＩＡ８の配列同一性は、１９〜３１％の間で異なる。C. reinhardtiiにおけるＮａ＋／胆汁酸輸送体遺伝子の数については、Arabidopsisにおいて６つ（Sawadaほか、２００９）、ヒトにおいて７つ（Heほか、２００９）、及び海洋性珪藻Phaeodactylum tricornutumにおいて５つ（Ashworthほか、２０１６）が報告されているため、ほかの種に相当する。この種類のタンパク質によって輸送されるイオンの数を考慮すると、この数値は驚きではない。また、ＣＩＡ８タンパク質は、多くの場合はまだ特徴づけられていない、高等植物に由来するいくつかのＳＢＦクローンに対して相当な配列類似性を示す（図９）。最も近い藻の相同物は、７６％の同一性を示したVolvox carteriにおいて見出された。ＣＩＡ８に類似性を示す別のタンパク質は、２３％の同一性を示す酵母タンパク質ＹＮＬ２７５ｗであった。この酵母タンパク質は、ＨＣＯ３−輸送体のスーパーファミリーに属し、潜在的基質（substrate）として、ＨＣＯ３−を含むいくつかのアニオンを受けることが示された（Zhao及びReithmeier、２００１）。この解析によって、Ｃｉａ８遺伝子の生産物は、保存ドメインによって特徴づけられる保存膜輸送タンパク質のファミリーに属することが示唆され、Ｃｉの輸送に関与し得ることも示唆される。
【０１０４】
ＣＩＡ８は、Ｃｉに対して低い親和性を示す
ＣＩＡ８の発現はＣＯ２制限に強く応答するため、ＣＣＭにおける潜在的機能を生理学的アッセイで評価した。ＣＩＡ８を欠く株は、高いＫ（０．５）（Ｃｉ）を示し、よって野生型の細胞よりも無機質炭素に対する親和性が低いことが示された（図５Ａ〜５Ｂ）。ｐＨ（７．３）で、野生型細胞のＫ（０．５）（Ｃｉ）は２５μＭであった。それに対してＣｉａ８変異体細胞は、９０μＭの著しく高いＫ（０．５）（Ｃｉ）を有し（表１）、よって変異体においては低いＣｉ親和性が示唆された。媒質における主要なＣｉ種類は重炭酸であり、よって酸素発生は重炭酸の能動的取り込みにより強く依存することを前提に、ｐＨ９．０でも酸素の発生を測定した。Ｋ（０．５）の変化は、高いｐＨでも有意であり、野生型細胞の１００μＭに比較してＣｉａ８変異体細胞は３５０μＭのより高いＫ０．５（Ｃｉ）を示した（図５Ｃ、表１）。この結果は、変異体における低い重炭酸親和性を確証し、したがって、Ｃｉの取り込みにおけるＣｉａ８遺伝子生産物の役割を確証する。
【０１０５】
C. reinhardtii内の葉緑体へのＣＩＡ８の局在化
TargetP/ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）を用いた解析の結果、ＣＩＡ８ペプチドは葉緑体膜のタンパク質であることが示唆された（スコア８１％）。Ｎ末端の別のアラインメントをSCLpred-Bologna Biocomputing Group (scholor.biocomp.unibio.it）で実行した。このソフトウェアは、ＣＩＡ８が葉緑体輸送ペプチド（ｃＴＰ；スコア０．７９）とチラコイド（０．８１）を有することを予測した。また、チラコイド膜としてある位置を予測した（０．６）。Arabidopsisチラコイドの交換輸送体であるＫｅａ３．３がコントロールとして使用され、ソフトウェアはｃＴＰ（スコア０．７７）とチラコイド膜としての割り当てを予測した。この予測は、ＣＩＡ８が葉緑体タンパク質である強いしるしである。
【０１０６】
この亜細胞局在化を確認するために、ＰｓａＤプロモーターの制御下でＣｉａ８をコードする配列をＧＦＰに融合して（CIA8:CrGFP）発現するC. reinhardtii株が生成された。ＰｓａＤプロモーターは、高発現プロモーターであり、C. reinhardtiiの光化学系Ｉのストロマ側に位置する豊富な葉緑体タンパク質をコードする核遺伝子を駆動する（Fischer及びRochaix、２００１）。ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、この株にはＧＦＰ転写物が検出可能であることが明らかになった（図６Ｇ）。
【０１０７】
共焦点顕微鏡のライブイメージングで融合タンパク質CIA8:CrGFPの緑色蛍光が葉緑体に検知された。この結果は、ＣＩＡ８タンパク質が主にC. reinhardtii細胞の葉緑体に蓄積されることを示す（図６Ａ〜６Ｆ）。しかし、シグナルは葉緑体包膜に限定されていないようであり、葉緑体の全体に拡散しているため、チラコイドにおける局在化が示唆される。
【０１０８】
ＣＩＡ８輸送はＮａ＋に依存しない
シアノバクテリアにおける低親和性重炭酸輸送体であるＢｉｃＡを含み、いくつかの溶質輸送体はＮａ＋依存性であることが知られている（Priceほか、２００４；Price及びHowitt、２０１１）。Ｃｉａ８遺伝子機能がＮａ＋に依存し得るか否かを決定するために、異なるＮａ＋濃度（＜１０μＭ〜２００μＭ）で野生型細胞と変異体細胞を培養した。両方がｐＨ６．８のプレート上で低Ｎａ＋濃度（＜１０μＭ）から１００ｍＭにおいてよく増殖した（図１０）。しかし、２００ｍＭ  Ｎａ＋で細胞の増殖が阻害された。野生型細胞とＣｉａ８細胞が低Ｎａ＋濃度でよく増殖した観察は、C. reinhardtiiにおいてＨＣＯ３−を取得するためにＮａ＋イオンは不必要であることを示し得、淡水において外部のＮａ＋濃度が一般に低い（＜１ｍＭ）ことを反映し得る（Pootakhamほか、２０１０）。しかし、Ｃｉａ８を含む一部の輸送体は内部の輸送体であるため、外部のＮａ＋濃度を変えることで内部の濃度が変化することは明らかではない。
【０１０９】
Ｃｉａ８の発現は低ＣＯ２条件で増加される
ChlamydomonasのＣｉａ８変異体と野生型における他の既知の輸送体の発現を定量化及び比較するために、Ｈｌａ３、Ｎａｒ１．２、Ｌｃｉ１、及びＣｉａ８に加え、他２つのＳＬＣ遺伝子（遺伝子ＩＤ：Cre02.g147450及びCre09.g393250）の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析で調べた。ＲＮＡのサンプルは、高ＣＯ２馴化及び低ＣＯ２馴化の培養から取得した。結果は、野生型（図７Ａ）とＣｉａ８変異体（図７Ｂ）における、これらの輸送体遺伝子の発現レベルを示す。この結果は、通常は４時間を超えると発現が増加するＨｌａ３を除き、低ＣＯ２条件に馴化した場合にＣｉａ８遺伝子と他の輸送体の発現が増加することを確認する（Duanmuほか、２００９）。野生型においては、低ＣＯ２条件に馴化した際に、Ｃｉａ８遺伝子の４倍の発現増加が見られた。また、野生型細胞において、２つのＳＢＦ遺伝子の発現増加も見られた。また、この２つのＳＢＦ遺伝子の相対的な発現レベルは、野生型に比べてｃｉａ８変異体細胞においては多少低かった（図７Ｃ）。このデータによって、Ｃｉａ８遺伝子生産物はＣＣＭに関与していることが確認されるが、ＣＩＡ８の損失は、低ＣＯ２条件では通常発現増加される他の遺伝子の転写的制御を影響し得ることも示唆される。
【０１１０】
重炭酸輸送体の相対的な発現レベルは、野生型に比べてＣｉａ８変異体細胞において低かった。この発現低下は、他の輸送体に対するＣｉａ８遺伝子の調節的役割を示唆し得る。野生型細胞において、他２つのＳＬＣ遺伝子の顕著な発現増加も見られた。このデータは、Ｃｉａ８遺伝子生産物がＣＣＭに関与し、発現が転写レベルで制御される前提と一致している。
【０１１１】
Ｃｉａ８遺伝子は補足できる
５’ＵＴＲと３’ＵＴＲをすべて含むＣｉａ８  ｃＤＮＡ（１８６９ｂｐ）を、自身のプロモーターとターミネーターの制御下で、ｐＳＰ１２４ベクターへ導入し、Ｃｉａ８変異体で発現させることでＣＩＡ８の補足（complementation）が達成された。形質転換された細胞は、ブレオマイシンによって選択された。１０個の形質転換細胞が選択され、さらなる増殖試験と光合成アッセイにさらされた。増殖の結果は、補足株（com1及びcom2と呼ぶ）においては、低ＣＯ２条件の野生表現型が回復されたことを示す（図８Ａ）。この２つの補足株からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。結果のＲＴ−ＰＣＲ解析は、Ｃｉａ８転写物が回復されたことを示した（図８Ｂ）。さらに、ｐＨ９．０で行ったｃｏｍ１のＣｉ依存性酸素発生アッセイによって、補足株におけるＫ（０．５）（Ｃｉ）は野生型のものと同じであったことが示された。また、最大の酸素発生（Ｖｍａｘ）は、野生型とは大きく変わらなかった（図８Ｃ〜８Ｄ）。まとめてこの結果は、このCre09.g395700コード配列が、Ｃｉａ８変異体の増殖を補足し、転写物の発現とＣｉ取り込みにおける機能性を回復させたことを確証する。
【０１１２】
Ｃｉ取り込みアッセイ
Ｃｉ取り込み作用に対するＣＩＡ８の貢献を評価するために、同位体分別、例えば、Ｄ６６、ＣＩＡ８、及び補足細胞株ｃｏｍ１における１４Ｃの蓄積を測定するためにシリコーン油層遠心分離（silicone oil layer centrifugation）を使用した（図１１Ａ〜１１Ｂ）。主要なＣｉ種類が重炭酸であることを保証するために、高ＣＯ２（空気中約３％  ｖ／ｖ  ＣＯ２）または空気（低ＣＯ２）のセルで培養された細胞を用いてｐＨ９．０で解析を行った。すべてのケースにおいて、低ＣＯ２に馴化した細胞は、高ＣＯ２で培養された細胞よりも多い量の蓄積Ｃｉを有した（図１１Ａ）。Ｃｉ取り込みと光合成速度を比較すると、野生型細胞はＣｉａ８細胞よりも多量のＣｉ蓄積とＣｉ固定を有した（図１１Ｂ）。さらに、ｃｏｍ１細胞株において、Ｃｉ蓄積は完全に回復しなかったものの、光合成は野生型に近いレベルまで回復した。このデータは、重炭酸の形で取り込まれる可能性が高いＣｉの取り込みがＣｉａ８細胞において低下している仮定を裏付ける。
【０１１３】
考察
重炭酸輸送体とそれが果たす取り込み及び蓄積の必要性は、C. reinhardtiiのＣＣＭの重要な特徴である。C. reinhardtiiにおける推定重炭酸輸送体は、一般に制限的ＣＯ２条件によって誘導される。また、輸送体の機能は重なるようである。１つだけの輸送体の発現が低下すれば、通常は強い増殖の表現型は生じなくなり、Ｃｉ取り込みに対して多少の影響が見られる。しかし、２つ以上の輸送体を減少すると、Ｃｉの取り込みが影響され、低ＣＯ２における増殖も低下する。本研究では、挿入変異によって新しい変異体を生成し、（低ＣＯ２誘導可能な場合は）Ｃｉａ８または（Ｃｉ蓄積の場合は）Ｃｉａ８（この文書ではその名前は同じ意味で使用されている）と名付けた遺伝子（Phytozome ID：Cre09.g395700）において挿入を有する変異体を識別した。この例の最大の目的は、ＣＩＡ８タンパク質がC. reinhardtiiのＣＣＭに参加するか否かを決定することであった。この遺伝子における挿入は、低ＣＯ２におけるより低い増殖を引き起こし、細胞が制限されたＣＯ２条件で増殖されたときにＣｉ親和性の顕著な低下を引き起こしたことが、特徴づけられ、示された。補足性試験において、光合成アッセイで、野生型遺伝子からのＣｉａ８コード領域を発現することによって、正常の増殖表現型と機能を回復できた（図８Ａ〜８Ｄ）。
【０１１４】
ＣＩＡ８タンパク質は、約５５のサブファミリーに属する膜結合性輸送体をコードするＳＬＣスーパーファミリーに属する。これらのＳＬＣタンパク質は、多様で多数の基質を輸送する。いくつかのＳＬＣアニオン輸送体が重炭酸取り込みに関与していることは、複数の研究によって示されている。これまで２つのサブファミリー、すなわちＮａ＋依存性Ｃｌ−／ＨＣＯ３−交換輸送体（ＳＬＣ４）と硫酸輸送体（ＳＬＣ２６）が海洋性珪藻、シアノバクテリア、及び哺乳類において重炭酸輸送に関連付けられ、ＢＡＮＤ３はヒトにおけるプロトタイプである（Priceほか、２００４；Romeroほか、２００５；Price及びHowitt、２０１１；Nakajimaほか、２０１３；Romeroほか、２０１３）。他の真核生物種において重要な重炭酸輸送体であるにも関わらず、C. reinhardtiiにおいてはＳＬＣ遺伝子のこのサブファミリーの機能は未知のままである。
【０１１５】
ＣＩＡ８タンパク質は、胆汁酸輸送体とされた膜結合性輸送体を含むＳＢＦ／ＢＡＳＳサブファミリーに属する。これらのタンパク質は、多様で多数の基質を輸送する。Arabidopsisにおいては、これらの遺伝子の２つが特徴づけられ、ＢＡＳＳ２はメチルエリトリトール  ４−リン酸（ＭＥＰ）経路における葉緑体包膜をわたるピルビン酸の輸送に関与する一方、ＢＡＳＳ４はグルコシノレート代謝中に２−ケト酸を輸送する（Gigolashviliほか、２００９；Furumotoほか、２０１１）。ＰＦＡＭデータベースにおける生物情報学サーチの結果、いくつかのＳＢＦ及びＳＢＦに似ているアニオン輸送体は、重炭酸の取り込みに関与し得ることが明らかになった。他の真核生物種において重要な輸送体であるにも関わらず、C. reinhardtiiにおいてはＳＢＦ／ＢＡＳＳ遺伝子生産物のこのサブファミリーの機能は未知のままである。
【０１１６】
本研究におけるＣＩＡ８の生理学的特徴づけは、制限的ＣＯ２条件下でＣＣＭ機能及びＣｉ取り込みに関与しているアイデアを支持する。ＣＩＡ８輸送体は、今まで唯一、単一ノックアウト変異体で明瞭な表現型を示した輸送体であるため、ＣＣＭ機能に有意な貢献をするようである（図１）。他の既知の輸送体ＨＬＡ３とＮＡＲ１．２は、単一ノックアウト変異体として決定的な増殖表現型を示さなく（Yamanoほか、２０１５）、ＬＣＩ１形質転換物に関しても増殖の差異は報告されなかった（Ohnishiほか、２０１０）。ｐＨ７．３とｐＨ９．０でＣｉａ８変異体におけるＣｉ依存性光合成速度の低下とＣｉ親和性の低下（図５Ａ〜５Ｃ）は、ＣＩＡ８がＣｉの取り込みに関与している証拠である。
【０１１７】
いくつかの動物タンパク質において表されたように、ＳＢＦ輸送体はしばしばＮａ＋イオンの共輸送と関連付けられるものの（Romeroほか、２０１３）、この例における結果によると、Ｎａ＋イオンはＣＩＡ８タンパク質の機能性にとって必然的なものではない可能性が示唆される（図９）。低Ｎａ＋イオン濃度（例えば、＜１０μＭから１００ｍＭ）は、変異体と野生型における細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。これは、細胞が培養されたＴＡＰ及びＭＩＮ培地に添加ナトリウムが含まれていないためである可能性がある。したがって、C. reinhardtii細胞は、低濃度のナトリウムでよく増殖する。海藻類に関してはＮａ＋共役輸送体の十分なサポートはあるものの、淡水藻に関してはＨ＋共役輸送体が役割を果たすと思われてきた。しかし、重炭酸の移動にＮａ＋またはＫ＋等の他のイオンが関与している可能性がある。また別の可能性として、重炭酸と塩化物等のアニオンとの交換（対向輸送、antiport）が関与している可能性がある。
【０１１８】
変異体における遺伝子転写物の解析によって、ＣＩＡ８変異体はノックアウトであることが示された。野生型において、高ＣＯ２細胞が低ＣＯ２に馴化された際にＣｉａ８転写体が（４倍）発現増加され、この誘導は、一部のＣＣＭタンパク質ほどは高くないものの、他の輸送体と一致する（図３及び図１１Ａ〜１１Ｂ）。C. reinhardtiiにおける多量の転写物による輸送体の制御は、明確に文書化されている（Ohnishiほか、２０１０；Gaoほか、２０１５；Yamanoほか、２０１５）。このタイプの制御は、ＣＣＭが機能的でないために必要でない高ＣＯ２条件下でＨＣＯ３−輸送体の発現を妨げるという議論もある。興味深いことに、これら他の輸送体の相対的な発現量は、野生型に比較してＣｉａ８変異体において減少している。これは、ＣＩＡ８タンパク質の損失がサイトゾルにおけるＨＣＯ３−の蓄積に至り、それが２つの細胞膜輸送体（ＨＬＡ３とＬＣＩ１）に、そして後にはＮＡＲ１．２にも悪影響を与える負のフィードバックメカニズムで説明できる。あるいは、最近Ｎａｒ１．２遺伝子の転写物がＨｌａ３の発現を調節することが示されたように（Yamanoほか、２０１５）、Ｃｉａ８遺伝子がこれらの他の遺伝子をなんらかの形で調節制御できることも可能である。
【０１１９】
過去のいくつかの研究は、藻類ＣＣＭのチラコイド膜上に推定ＨＣＯ３−チャネルまたは輸送体が発生することを仮定した（Raven、１９９７；Wangほか、２０１１；Jungnickほか、２０１４）。本研究においては、ＣＩＡ８に融合した緑色蛍光タンパク質のシグナルは葉緑体の全体に均等に拡散していた（図７）。この細胞小器官の全体にわたる局在化は、そのタンパク質がチラコイド膜にあり得ることを示し、それもチラコイドの内腔へ直接ＨＣＯ３−をポンプするには戦略的に良い位置である。この時点では、ＣＩＡ８は共輸送体であるか交換輸送体であるかは不明である。しかし、チラコイド膜上にあるとしたら、光の中で設定される膜間Ｈ＋勾配を用いてイオンを輸送する可能性がある。ＣＩＡ８がチラコイド膜上にあるのであれば、葉緑体包膜に局在化されたＮＡＲ１．２タンパク質はＣＩＡ８の損失を補うことができず、この点は本研究の結果に一致する。また、この局在化結果によれば、Ｃｉａ８遺伝子生産物はＣＣＭ機能に有意な貢献をし、Ｃｉ取り込みにも貢献する可能性がある。
【０１２０】
植物、真菌、及び動物におけるほぼすべてのＳＬＣ４に似たタンパク質は、原始的な機能としてこのホウ酸輸送能力を有する（Parker及びBoron、２０１３）。ホウ酸輸送機能を備えるＳＬＣ４に似たタンパク質の遍在的発生は、これらタンパク質の最初の機能はホウ酸輸送であったことを示し、よって重炭酸と他のイオンに関する機能はより最近に取得したものであることが示唆される（Parker及びBoron、２０１３）。タンパク質の系統発生（phylogeny）と結合メカニズムに基づいて、ホウ酸とＨＣＯ３−の輸送システムの間に興味深い類似点が存在する。Chara Carolinaの細胞を対象にした生物物理学研究では、ホウ酸が細胞への重炭酸流入を阻害したこと、つまり同じ結合部位に対して競合することが示された（Lucas、１９７５）。この類似性を裏付けるために、Frommer及びvon Wiren（２００２）は、腎臓におけるＨＣＯ３−輸送と木部におけるホウ酸輸送を比較した。また、高等植物において唯一特徴づけられたＳＬＣタンパク質ＢＯＲ１は、Arabidopsisでホウ酸を輸送することを示した研究もある（Takanoほか、２００２）。その研究によれば、ＢＯＲ１は、酵母膜タンパク質ＹＮＬ２７５ｗと２７％の同一性を有する。ＹＮＬ２７５ｗタンパク質は主にホウ酸輸送体であるが、ＨＣＯ３−を含み、いくつかのアニオンを基質として取り込める能力を結合アッセイで示した研究もある（Zhao及びReithmeier、２００１）。したがって、ＣＩＡ８タンパク質と酵母ＹＮＬ２７５ｗが同一性を示し、よって共通の起源、もしくは生理学的機能の類似性を有することが示唆されることは興味深い。これらの機能的関係を解析すれば、おそらくC. reinhardtiiの重炭酸輸送におけるＳＬＣタンパク質の役割の理解を深めることができる。
【０１２１】
結論として、ＣＩＡ８タンパク質は、C. reinhardtiiのＣＣＭにおいて役割を果たす輸送体である。遺伝子をノックアウトすると、変異体はＣｉ取り込みに障害を示し、制限されたＣＯ２条件で増殖されると増殖阻害を示す。Ｃｉａ８遺伝子は、ＣＯ２固定のためにＨＣＯ３−をチラコイド内腔に直接取り込むプロセスに関与する推定重炭酸輸送体をコードすることが見られた。ＣＩＡ８タンパク質は疎水性であり、予測プログラムによっては、ＳＢＦ／ＢＡＳＳサブファミリーにおける他の既知の輸送体に類似するトポロジーを有する。
【０１２２】
材料及び方法
細胞培養及び増殖
Chlamydomonas reinhardtiiの培養条件は、Maほか（２０１１）に記載された条件と同一であった。Ｄ６６株（nit2-, cw15, mt+）はDr. Rogene Schnell（University of Arkansas, Little Rock）から取得し、ｃｃ１２４株（nit-, nit2-; mt-）はC. Reinhardtii Duke University Center （http://www.chlamy.org/）から取得した。Tris-Acetate-Phosphate（ＴＡＰ）とMinimal（ＭＩＮ）培地（無酢酸）は、Sueoka（１９６０）にしたがって作製した。増殖培地用のＴＡＰとＭＩＮプレートの両方は、寒天（agar）を約１．２％（ｗ／ｖ）添加して作成された。細胞培養は、ＴＡＰプレートからエルレンマイヤーフラスコにおける１００ｍＬのＴＡＰ液体培地にコロニーを植え付けることによって開始された。培養は連続照明下で初期対数期まで増殖させ（約１００μｍｏｌ  ｍ−２  ｓ−２）、及び４８時間振動した。ＴＡＰ増殖培養は収穫され、ＭＩＮ培地で洗浄され、ＭＩＮ培地において再懸濁され、そして０．２から０．３（約２〜３×１０６細胞  ｍＬ−１）の細胞密度ＯＤ７３０に達するために約４８時間高ＣＯ２（空気中約５％［ｖ／ｖ］ＣＯ２）を泡立てながら接続した。ＣＣＭ誘導のためには、細胞を低ＣＯ２（空気中約０．０１％［ｖ／ｖ］ＣＯ２）に移動し、４時間泡立てた。
【０１２３】
変異誘発、低ＣＯ２で病的な変異体の単離、表現型スクリーン
変異体は、Jungnickほか（２０１４）による変異誘発スクリーンで生成された。パロモマイシン抵抗性（ｐａｒａＲ）を与えるＡｐｈＶＩＩＩ遺伝子を保有する直線状プラスミド（ｐＳＬ１８）で、電気穿孔法を用いてC. reinhardtiiのＤ６６株を形質転換した（Shimogawaraほか、１９９８）。形質転換された細胞は、抗生物質パロモマイシン（約７．５μｇ  ｍＬ−１、インビトロゲン）を含むＴＡＰプレート上で選択された。抗生物質抵抗性の株は、上記と同様の光条件下で高ＣＯ２チャンバ（空気中約５％［ｖ／ｖ］ＣＯ２）及び低ＣＯ２チャンバ（空気中約０．０１％［ｖ／ｖ］ＣＯ２）で増殖についてスクリーニングされた。細胞はＭＩＮプレート上にストリークされ、増殖チャンバに配置された。活発に増殖していた細胞を同じ細胞密度（ＯＤ７３０＝０．１５、０．０７、及び０．０３）で液体ＭＩＮ培地に懸濁し、各懸濁液の約１５μＬをＭＩＮプレートにスポットすることによってスポット試験を行った。それらは７日間、高ＣＯ２、周囲ＣＯ２、及び低ＣＯ２のチャンバに置かれた。増殖チャンバにおけるＣＯ２濃度はEnvironmental Gas Monitor（EGM-4, PP systems, Massachusetts）を用いて測定された。
【０１２４】
隣接領域の識別
ＡｐｈＶＩＩＩ挿入を隣接するＤＮＡ領域を識別するためにはアダプター依存性ＰＣＲ法を用いた（Pollockほか、２０１６）。相同性サーチは、Phytozomeデータベースのバージョン１０．３におけるJoint Genome Institute C. reinhardtiiを用いて行われた（Merchantほか、２００７；Blabyほか、２０１４）。
【０１２５】
連鎖解析
遺伝子交雑と四分子解析は、前述の通りに行われた（Moroneyほか、１９８６；Harris、２００９）。対数期にあるＣｉａ８（mt+）とｃｃ１２４（mt-）細胞培養を一時的に光の下で低窒素のＴＡＰ培地に移動し、配偶子形成を誘導するために一夜置かれた。翌朝、受精させるために各培養の３ｍＬを光の下で３時間混ぜた。寒天を約４％含み、窒素を除いたＴＡＰ培地上に一定分量（約０．５ｍＬ）プレートした。接合子を熟成させるために、プレートは２週間暗い所に保存された。約１４日間後に、減数分裂性発芽（meiotic germination）させるために接合子は約１．２％寒天のＴＡＰ培地プレートに移動された。四分子解析（tetrad dissection）が行われ、パロモマイシン抵抗遺伝子を低ＣＯ２でよく増殖しなかった子孫と関連づけることで連鎖を決定した。
【０１２６】
光合成アッセイ
従属栄養性のC. reinhardtiiの培養を約１００ｍＬのＴＡＰ培地において開始し、４８時間培養させ、対数期に達成させた。細胞は遠心分離され、２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに移動され、ＭＩＮ培地に再懸濁され、ＯＤ７３０＝０．２〜０．３（約３×１０６細胞  ｍＬ−１）の細胞密度を達成するまで５％のＣＯ２で泡立てられた。その後、ＣＣＭを誘導させるために培養は4時間低ＣＯ２（約０．０１％）に移動された。外部Ｃｉ（Ｋ０．５［ＤＩＣ：dissolved inorganic carbon、溶存無機炭素］）に対する親和性は、Maほか（２０１１）にしたがって予測された。この方法において、約１００μｇの葉緑素の均等物を有する細胞は、不活性窒素（つまりＣＯ２フリー）ガスで泡立てられた２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファー（約７．３のｐＨ）または２５ｍＭのＣＨＥＳ−ＫＯＨバッファー（約９．０のｐＨ）の中に懸濁された。その細胞は、約３００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１で照明されたＯ２電極チャンバ（Rank Brothers, Cambridge Uk）に移動され、バッファーや細胞内に残存するＤＩＣが使い尽くされるまで放置される。内因的ＣＯ２が無くなると、正味のＯ２発生は観察されなかった。既知濃度のＮａＨＣＯ３をチャンバに注入し、Ｏ２の発生速度を測定した。Ｋ０．５［ＤＩＣ］は、酸素発生の最大半分の速度に必要であるＤＩＣ濃度として計算された（Badger、１９８５）。葉緑素含有量は葉緑素ａとｂを組み合わせることによって測定された。葉緑素は１００％メタノールで抽出され、分光光度計を用いて測定された。Ｋ０．５（ＣＯ２）は、酸素発生Ｖｍａｘの半分に達するために必要なＣＯ２濃度とした。
【０１２７】
細胞内局在化
Cre09.395700遺伝子の全体（４８４６ｂｐ）が増幅され、ＥｃｏＲ１とＮｄｅｌ制限部位を用いて修飾されたpSL18CrGFPベクターに導入された。Cre09.395700遺伝子は、既にベクターに存在するChlamydomonasコドン最適化ＧＦＰ遺伝子と同フレームにあるように挿入された（Fuhrmannほか、１９９９）。ベクターは、Ｋｐｎ１切断で直鎖化された。Ｃｉａ８遺伝子断片を用いた野生型株Ｄ６６の形質転換は、直鎖化されたベクターで電気穿孔を行うことによって達成され、パロモマイシン抵抗性のコロニーはＰＣＲを用いて解析された。ＧＦＰタグ付きのタンパク質をイメージするために、約５μＬの細胞を約１．５％低融点アガロースと併せてスライドに載せた。細胞はLeica Sp2共焦点顕微鏡でイメージした。Ｋｒ／Ａｒレーザーは、eGFPと葉緑素を両方励起させるために約４８８ｎｍの波長に設定され、光電子増倍管は、ｅＧＦＰ蛍光を検知するために約５００〜５２０ｎｍ、そして葉緑素自己蛍光を検知するために約６６０〜７００ｎｍに設定された。細胞をイメージするために２０×のレンズを使用した。
【０１２８】
遺伝子発現解析
提供ガイドライン（インビトロゲン）に従って、トリアゾル試薬を用いてＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡを合成するテンプレートとして総ＲＮＡの約１μｇを使用した。製造者の指示に従ってｃＤＮＡを合成するために、高ＧＣ含有量の転写物用のSuperscript First Strand Synthesis System（Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用した。製造者の指示（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従ってABI Prism 7000配列検出システムにおいて定量的ＰＣＲを行うために、SYBR Select（Applied Biosystems, Foster City, CA）で使用するテンプレートとして、約１００ｎｇのｃＤＮＡのアリコートを用いた。正規化されたプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲ用のＧＡＰＦＨ遺伝子特有のプライマーであった。ｑ−ＲＴＰＣＲには、コントロールとしてＣＢＬＰ遺伝子が使用された（Musほか、２００７）。それぞれのｃＤＮＡに対して使用されたプライマーは、表ににリストされている。
【０１２９】
ＣＩＡの補足
Ｃｉａ変異体の補足は、Ｃｉａ８細胞を、Ｃｉａ８遺伝子の野生型コピーを含むコンストラクトで形質転換することによって達成された。コンストラクトは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲ領域（２９４９ｂｐ）とプロモーター領域の１０８０ｂｐ断片を含むＣｉａ８  ＣＤＳ断片からなるコンストラクトであった。これらの断片は、Ｎｏｔ１制限部位を用いて連結され、その部位はそれからｐＧＥＭ−Ｔに連結された。配列決定した断片は、ＢａｍＨＩとＳａｃＩ制限部位を用いてシャトルベクターpSP124sにクローン化された。配列はPhytozomeバージョン１０．２（phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal/html）から取得した。Ｃｉａ８ゲノム断片を増幅するために使用されたプライマーは表２に表示されている。細胞形質転換には電気穿孔法が使用され、株はブレオマイシン抵抗性によって選択された（Shimogawaraほか、１９９８）。選択されたChlamydomonas株における補足ＤＮＡの存在は、ＰＣＲを用いて確認された。
【０１３０】
Ｃｉ取り込みアッセイ
Ｈ１４ＣＯ３の活性種取り込みは、約９．０のｐＨ（約２５℃）で、シリコーン油遠心分離・ろ過で終了する約１５秒の複数の取り込み期間で実行された（Priceほか、２００４）。２５ｍＭストックからＫＨＣＯ３アリコートが添加された（約９．５のｐＨ）。約９．０のｐＨでＨＣＯ３−から得られるＣＯ２供給速度は、実験的に決定された速度定数を適用することによって算出された。表１は、野生型Ｄ６６とＣｉａ８変異体細胞について、最高酸素発生活性（Ｖｍａｘ）とＣｉ親和性、Ｋ（０．５）値を表す。細胞は４８時間高ＣＯ２で増殖され、４時間低ＣＯ２に馴化された。カッコ内：±ＳＥ；ｎ＝３。
【０１３１】
【表１】
2019518461.tif 000003
【０１３２】
【表２】
2019518461.tif 000004
【０１３３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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