(57)【要約】  本開示は、抗ＳＴＡＴ３抗体、およびその抗原結合部分を提供する。ある特定の実施形態では、抗体またはその断片は、癌の治療のために使用される。
2019515955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）抗体、またはその抗原結合断片であって、
配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変ドメインと、
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変ドメインと、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
単離された抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片であって、
配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインと、を含む重鎖可変ドメインと、
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインと、を含む軽鎖可変ドメインと、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
単離された抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片であって、
配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインと、
配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインと、を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記重鎖可変ドメインが、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記抗体が、１×１０−６Ｍ以下のＫＤを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
細胞内送達化合物に複合した、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
癌に罹患している対象を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
【請求項１７】
前記癌が、固体腫瘍である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が、黒色腫、膠腫、髄芽腫、腎細胞癌、膵臓腺癌、卵巣癌腫、横紋筋腫、骨肉腫、膠芽腫、乳房、膵臓、卵巣、前立腺、肺、肝臓、結腸、結腸直腸、胃、頭部、首、および腎臓からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が血液癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記血液癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、巨核球性白血病、および大顆粒リンパ球性白血病からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫疾患に罹患している対象を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、クローン病、ある特定の細菌性大腸炎、関節炎、狼瘡、糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、強皮症、および血管炎からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体または抗体断片と、薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、各々の全内容が、参照により本明細書にそれらの全体が援用される、２０１６年１１月９日出願の米国仮特許出願第６２／４１９，７７８号、および２０１６年４月２５日出願の米国仮特許出願第６２／３２７，１７８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出されている配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に援用される。２０１７年４月１８日に作成されたこのＡＳＣＩＩ複写は、１２６０３６−０６２２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、８，２７３バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
発癌および癌進行に重要なシグナル伝達タンパク質は、新規の抗癌医薬の開発のための魅力的な標的を提示する。タンパク質のＳＴＡＴ（シグナル伝達兼転写活性化因子）ファミリーは、シグナル伝達および転写の活性化において２つの役割を果たすＤＮＡ結合タンパク質である。ＳＴＡＴファミリーの６つの異なる要素としては、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、および状態が挙げられる。
【０００４】
ＳＴＡＴの活性は、様々なサイトカインおよび増殖刺激によって調節される。サイトカインのその受容体への結合は、これらの受容体に関連するヤーヌスプロテインチロシンキナーゼ（ＪＡＫ）の活性化をもたらす。これは、ＳＴＡＴをリン酸化し、細胞核への移行およびＳＴＡＴ応答遺伝子の転写活性化をもたらす。ＳＴＡＴ上の特定のチロシン残基のリン酸化は、それらの活性化をもたらし、特定の遺伝子プロモーター配列に結合するＳＴＡＴのホモ二量体および／またはヘテロ二量体の形成をもたらす。ＳＴＡＴ活性化を介してサイトカインによって仲介される事象としては、細胞増殖および分化、ならびにアポトーシスの阻害が挙げられる。
【０００５】
ＳＴＡＴ３は、ほとんどの細胞型で発現し（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１，４８０６−４８１０）、組織傷害および炎症への応答に関連する遺伝子の発現を誘導する。ＳＴＡＴ３は、ｂｃｌ−２の発現を介してアポトーシスを阻害することが示されている（Ｆｕｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９６，５，４４９−４６０）。ＳＴＡＴ３は、細胞増殖、生存、移動、および免疫抑制を制御する遺伝子のマスター調節因子である。ＳＴＡＴ３の異常発現または構成的発現は、多くの疾患過程に関連している。ＳＴＡＴ３の構成的活性化は、多種多様な癌に見られ、ＳＴＡＴ３は、腫瘍細胞ならびに腫瘍微小環境における非形質転換細胞に、持続的に活性化されて見られる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヒトＳＴＡＴ３を含むＳＴＡＴ３に結合する、単離されたヒト抗体を含む抗体を含む。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、および配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変ドメインと、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、および配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変ドメインと、を含む、単離された抗シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）抗体、またはその抗原結合断片を特徴とする。
【０００８】
一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変ドメインと、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３ドメイン、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメイン、および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変ドメインと、を含む、単離された抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片を特徴とする。
【００１０】
一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
別の態様では、本発明は、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、を含む、単離された抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片を特徴とする。
【００１２】
一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
別の実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
さらなる実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別のさらなる実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
一実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
ある特定の実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体は、本明細書に記載のＣＤＲまたは可変アミノ酸配列を含むインタクト抗体である。
【００１８】
一実施形態では、抗体複合体は、図１Ｂに示される構造体である。図１Ｂは、本発明の抗体複合体、化合物９０１ａの例示的な図であり、抗体（ＡＴ）が、ＳＴ３Ｇ１２であり、図１Ａの１つのＲ１が、アルキルフルオロフォア（ａｌｋｙｌｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）部分である。
【００１９】
一実施形態では、抗体複合体は、図１Ｃに示される構造体である。図１Ｃは、本発明の抗体複合体、化合物９０１の例示的な図であり、抗体（ＡＴ）が、ＳＴ３Ｇ１２であり、図１Ａの各Ｒ１が、水素である。
【００２０】
上記の態様のうちのいずれか１つの別の実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片は、少なくとも１×１０−６ＭのＫＤを有する。
【００２１】
上記の態様のうちのいずれか１つの別の実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片は、１×１０−６Ｍ以下のＫＤを有する。
【００２２】
上記の態様のうちのいずれか１つの別の実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片は、ヒト抗体である。
【００２３】
上記の態様のうちのいずれか１つのさらなる実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである。
【００２４】
上記の態様のうちのいずれか１つの別のさらなる実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗原結合断片は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖである。
【００２５】
上記態様のうちのいずれか１つの一実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片は、細胞内送達化合物に複合されている。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、癌に罹患している対象を治療するための方法であって、対象に、有効量の上記の態様のうちのいずれか１つの抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法を特徴とする。
【００２７】
さらなる実施形態では、癌は、固体腫瘍である。
【００２８】
別のさらなる実施形態では、癌は、黒色腫、膠腫、髄芽腫、腎細胞癌、膵臓腺癌、卵巣癌腫、横紋筋腫、骨肉腫、膠芽腫、乳房、膵臓、卵巣、前立腺、肺、肝臓、結腸、結腸直腸、胃、頭部、首、および腎臓からなる群から選択される。さらなる関連実施形態では、癌は、血液癌である。関連実施形態では、血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、巨核球性白血病、および大顆粒リンパ球性白血病から選択される。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、自己免疫疾患に罹患している対象を治療するための方法であって、対象に、有効量の上記の態様のうちのいずれか１つの抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法を特徴とする。
【００３０】
さらなる実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症、クローン病、ある特定の細菌性大腸炎、関節炎、狼瘡、糖尿病、喘息、炎症性腸疾患、強皮症、および血管炎から選択される。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、上記の態様のうちのいずれか１つの抗ＳＴＡＴ３抗体または抗体断片、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】式（Ｉ）、またはその薬学的に許容可能な塩を含む本発明の抗体複合体の例示的な図であり、Ｘ、ｑ、Ｂａ、Ｒ１、ｒ、ｔ、Ｌ、およびＡＴの各々が、以下で定義され、かつ参照により本明細書にその全体が援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７５７６に記載されている。
【図１Ｂ】本発明の抗体複合体、化合物９０１ａの例示的な図であり、抗体（ＡＴ）が、ＳＴ３Ｇ１２であり、図１Ａの１つのＲ１が、アルキルフルオロフォア部分であり、これは実施例５において試験される。図１Ｂは、構造体のオリゴヌクレオチド上の塩基に対応する配列番号１９（ｔｃｃａｔｇａｇｃｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ）について開示している。
【図１Ｃ】本発明の抗体複合体、化合物９０１の例示的な図であり、抗体（ＡＴ）が、ＳＴ３Ｇ１２であり、図１Ａの各Ｒ１が水素であり、実施例２〜１０で試験される。図１Ｃは、構造体のオリゴヌクレオチド上の塩基に対応する配列番号１９（ｔｃｃａｔｇａｇｃｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ）について開示している。
【図２Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体クローンＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、およびＳＴ５Ｇ１２の、Ｕ２５１悪性膠芽腫細胞の細胞性抗原への結合を評価するために使用されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。ベバシズマブ（アバスチン）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を阻害するモノクローナル抗体を陰性対照として使用した。
【図２Ｂ】抗原（組み換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質）への完全ヒト抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体の結合を評価するために使用されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。Ａｂ＃１は、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ３Ｇ１２に対応し、Ａｂ＃２は、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ１Ａ５に対応し、Ａｂ＃３は、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ５Ｇ１２に対応する。
【図３Ａ】抗体濃度（ｎＭ）を増加して、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、およびＳＴ５Ｇ１２の、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の細胞抗原への結合を評価するための細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。ＭＦＩは、検出された平均蛍光強度を指す。ベバシズマブ（アバスチン）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を阻害するモノクローナル抗体を陰性対照として使用した。
【図３Ｂ】抗体濃度（ｎＭ）を増加して、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、およびＳＴ５Ｇ１２の、Ｕ２５１細胞の抗原への結合を評価するための細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。ベバシズマブ（アバスチン）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を阻害するモノクローナル抗体を陰性対照として使用した。
【図３Ｃ】抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体の、ヒト細胞株ＨｅＬａおよびＵ２５１、ならびにマウス細胞株ＣＴ−２６およびＭＣ−３８への結合を示すグラフである。アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。
【図４】抗体濃度（ｎＭ）を増加して、裸抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体（ＳＴ３Ｇ１２）およびオリゴ糖（ＰＳ）複合抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体（「ＰＳ−ＳＴＡＴ３」として示される）の、Ｕ２５１細胞中の細胞抗原への結合を評価するための細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図５】非修飾である抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体（ＳＴ３Ｇ１２−非修飾）、および修飾抗体複合体（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）の、ヒトＩｇＧへの結合を評価するために使用されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。抗ｃＭｅｔ非修飾抗体（（Ｈ８Ａ２）−非修飾）および修飾抗体複合体（（Ｈ８Ａ２）−ＰＳ）を対照として使用した。
【図６】非修飾である抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体（「ＳＴ３Ｇ１２−非修飾」）、およびＰＳ修飾ＳＴ３Ｇ１２抗体複合体（「ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ」）の、組み換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質への結合を評価するために使用されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図７Ａ】ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）、正常結腸線維芽細胞（ＣＣＤ−１８ＣＯ）、正常乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）、膠芽腫（Ｕ２５１）、トリプルネガティブ乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、トリプルネガティブ乳癌（ＨＣＣ１９５４）、およびＥＲ＋乳癌（ＭＣＦ−７）のＳＴＡＴ３の合計レベルおよびリン酸化ＳＴＡＴ３（ホスホ−ＳＴＡＴ３）のレベルを測定するために実行されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルを、ホスポ（ｐｈｏｓｐｏ）−ＳＴＡＴ３に対する抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって測定した。使用された対照は、一次抗体単独、二次抗体単独、および対照ＩｇＧと一致するアイソタイプであった。
【図７Ｂ】図７Ａで試験された細胞における、リン酸化ＳＴＡＴ３対合計ＳＴＡＴ３の比（Ｐ／Ｔ  ＳＴＡＴ３比）を示すグラフである。
【図７Ｃ】ＨｅＬａ細胞中の点状抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｕｎｃｔａｔｅ）の数による、内在化した抗ＳＴＡＴ３抗体複合体「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」（化合物９０１）の定量化を示すグラフである。対照として、Ａｌｅｘａ５４９−ヤギ抗ヒトＩｇＧ、または細胞単独（処理なし）を使用した。
【図８Ａ】ＭＣＦ−１０Ａ細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化への、修飾ＳＴＡＴ３抗体複合体（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）の効果を測定するための実験の結果を示すグラフである。細胞を抗体で一晩前処理し、次いで、様々な濃度のＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌまたは４０ｎｇ／ｍｌ）で２０分間刺激し、ＳＴＡＴ３を活性化した。次いで、細胞を溶解し、タンパク質溶解物をＥＬＩＳＡにかけて、リン酸化状態を測定した。「ＯＳ−ＡＩＰ」とは、対照として使用されるオリゴ糖複合抗細菌ＡＩＰ（ブドウ球菌自己誘導ペプチド）抗体を指す。「ＳＴＡＴ３」とは、抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体を指す。「ＯＳ−ＳＴＡＴ３」とは、抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体複合体（化合物９０１）を指す。ＩＬ−６は、ＳＴＡＴ３活性化剤である。「（＋）」の表記を有するバーは、示される濃度で、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌまたは４０ｎｇ／ｍｌ）、および抗ＳＴＡＴｅ  ＳＴ３Ｇ１２抗体（「（＋）ＳＴＡＴ３」）、またはｎｔｉ−ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体複合体（化合物９０１）「（＋）ＯＳ−ＳＴＡＴ３」）のいずれかを用いて処理された細胞を示す。
【図８Ｂ】ＭＣＦ７細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化への、ＳＴ３Ｇ１２およびＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の効果を測定するための実験の結果を示すグラフである。実験手順は、図８Ａに記載のものと同じであった。
【図９Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体蓄積を示す時系列実験の結果を示すグラフである。細胞を、９６ウェルプレートで一晩播種した。２０ｕｇ／ｍｌの抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ−Ａｌｅｘａ４８８を、０．５、２、４、６、８、および２４時間の表示時間の間添加し、細胞を固定し、撮像した。緑色の物体数は、緑色の蛍光発光している細胞の数を指す。図９パネル（ｉ）およびパネル（ｉｉ）は、時間が増加すると抗体の蓄積が増加したことを示している。図９Ａ、パネル（ｉｉ）は、細胞数に対して正規化された図９Ａ、パネル（ｉ）からのデータを示している。結果は、腫瘍細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体の長期的な蓄積を示している。
【図９Ｂ】ＭＣＦ−１０Ａ細胞に実施された図９Ａに記載のものと同じ実験を示すグラフである。結果は、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体の蓄積が、６時間後に減少したことを示している。
【図９Ｃ】実行されたＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフであり、ＰＳオリゴを用いたＳＴ３Ｇ１２抗体の修飾が、ヒトＩｇＧに対するその結合親和性に影響しなかったことを示している。「ＳＴ３Ｇ１２−非修飾」とは、非修飾ＳＴ３Ｇ１２抗ＳＴＡＴ３抗体を指し、「ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ」とは、修飾ＳＴ３Ｇ１２抗ＳＴＡＴ３抗体複合体を指す。スーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）とは、ＥＬＩＳＡアッセイで使用されるブロッキング緩衝液を指す。
【図９Ｄ】実行されたＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフであり、ＳＴ３Ｇ１２抗体の修飾が、その結合親和性に影響しなかったことを示している。「ＳＴ３Ｇ１２−非修飾」とは、非修飾ＳＴ３Ｇ１２抗ＳＴＡＴ３抗体を指し、「ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ」とは、修飾ＳＴ３Ｇ１２抗ＳＴＡＴ３抗体複合体を指す。スーパーブロック（Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ）とは、ＥＬＩＳＡアッセイで使用されるブロッキング緩衝液を指す。
【図１０Ａ】ヒト血清の割合を増加した（１％、５％、１０％および２０％）、１０ｕｇ／ｍｌの抗ＳＴＡＴ３複合体ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳを用いてＭＤＡ−ＭＢ−４６８トリプルネガティブ乳癌細胞を処理した実験からの、免疫蛍光染色法による顕微鏡画像を示す。次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５４６を用いて染色した。蛍光は、図１０Ａに白色で示され、抗体の蓄積を示し、血清の濃度の増加に伴って蓄積の増加が見られた。
【図１０Ｂ】Ｕ２５１細胞内に蓄積されたＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の、免疫蛍光染色法による顕微鏡画像である。蛍光は、図１０Ｂに白色で示され、抗体の蓄積を示し、血清の濃度の増加に伴って蓄積の増加が見られた。
【図１０Ｃ】ＭＣＦ１０Ａヒト正常乳房上皮細胞へのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の取り込みの、免疫蛍光染色法による顕微鏡画像である。蛍光は、図１０Ｃに白色で示され、抗体の蓄積を示し、血清の濃度の増加に伴って蓄積の増加が見られた。
【図１０Ｄ】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体（化合物９０１ａ）の、共焦点顕微鏡画像である。０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌで、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳを試験した。図１０Ｄに示されるように、５μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの濃度で、細胞内にＳＴ３Ｇ１２−ＰＳが蓄積された。
【図１０Ｅ】Ｕ２５１細胞中のＳＴ３Ｇ１２およびＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の内在化の共焦点顕微鏡画像である。図１０Ｅに示される結果は、ＳＴ３Ｇ１２抗体複合体（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）が細胞に浸透することができることを示している。
【図１１Ａ】Ｕ２５１細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の内在化への温度効果を示すグラフである。Ｕ２５１細胞を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ＮＨＳ４８８標識を含む１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２で培養した。結果は、４℃および３７℃で抗体複合体が内在化した経時的な細胞数に相当する、緑色の物体数として数えたものである。
【図１１Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の内在化への温度効果を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ＮＨＳ４８８標識を含む１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳで培養した。結果は、４℃および３７℃で抗体複合体が内在化した経時的な細胞数に相当する、緑色の物体数として数えたものである。
【図１２Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の細胞取り込みを測定するために実行された時系列分析の結果を示すグラフである。Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＳＴ３Ｇ１２−ＰＳを、以下の時間：０．５時間、２時間、４時間、６時間、８時間、および２４時間の間、細胞に添加した。次いで細胞を固定し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用して撮像した。細胞中の抗体の蓄積は、６時間でピークが現れた。
【図１２Ｂ】ＭＣＦ−１０Ａ細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の細胞取り込みを測定するために実行された時系列分析の結果を示すグラフである。Ａｌｅｘａ４８８で標識されたＳＴ３Ｇ１２−ＰＳを、以下の時間：０．５時間、２時間、４時間、６時間、８時間、および２４時間の間、細胞に添加した。次いで細胞を固定し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用して撮像した。ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳの蓄積は、６時間でピークが現れた。
【図１３】ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳが、エンドサイトーシスの非依存性機構を使用してＭＤＡ−ＭＢ−４６８（高ＳＴＡＴ３）腫瘍細胞に入ることを示すグラフである。正常乳房上皮細胞株、ＭＣＦ−１０Ａ（低ＳＴＡＴ３）も試験した。ビヒクル単独を、対照として使用した。結果は、細胞への抗体進入の阻害パーセントとして測定した。
【図１４】ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳのＭＣＦ−１０Ａ細胞内への仲介取り込みへの、クラスリン阻害剤Ｐｉｔｓｔｏｐ２（ＰＳ２；３０ｕＭまたは６０ｕＭ）、またはカベオリン阻害剤フィリピン（０．５ｕｇ／ｍｌまたは１．０ｕｇ／ｍｌ）の効果を示すグラフである。図１４パネル（ｉ）に示されるように、３０ｕＭおよび６０ｕＭの濃度でのクラスリン阻害剤ＰＳ２を用いた処理は、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳの取り込みを阻害し、一方で、カベオリン阻害剤フィリピンを用いた処理は、０．５ｕｇ／ｍｌの濃度でほとんど効果なく、１．０ｕｇ／ｍｌではより大きい効果を有した。「緑色の物体数」とは、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳが内在化した細胞を指し、それらの緑色蛍光によって検出される。図１４パネル（ｉｉ）は、細胞数に正規化された図１４パネル（ｉ）からのデータを示している。
【図１５】図１４（ｉ）および（ｉｉ）で行われた、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞内における同じ実験の結果を示すグラフである。
【図１６Ａ】ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の進入が温度に依存しているかを測定するために実行された実験の結果を示すグラフである。図１６Ａは、緑色の物体数／ｍｍ２によって測定される、４℃でのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳの阻害を示す。緑色の物体数は、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳを内在化した細胞を指す。図１６Ａに示されるように、時間が増加しても、緑色の物体数は増加しなかった。３７℃で試験されたＳＴ３Ｇ１２−ＰＳでは、緑色の物体数は２４０分まで増加した。２４０分後、徐々に減るか、または横ばいのいずれかであった。
【図１６Ｂ】ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の進入が温度に依存しているかを測定するために実行された実験の結果を示すグラフである。図１６Ｂは、図１６Ａに記載の実験からの２４０分の時点（「３７℃１」および「４℃１」）を、第２の同一実験の２４０分の時点（「３７℃２」および「４℃２」））と比較している。４℃でのシグナルは、ほぼ同じく維持されたが、３７℃でのシグナルは大きく増加した。
【図１７Ａ】ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳが、ＩＬ−２６誘導ＩＬ−１０サイトカイン、ならびに抗アポトーシス遺伝子ＢＣＬ２Ｌ１およびＢＩＲＣ５のｍＲＮＡ発現をブロックすることができるかどうかを試験するために実行された実験の結果を示すグラフである。５０ｕｇ／ｍＬのＰＳ−ＯＰＲＦ（オリゴ複合ＯＰＲＦ抗体）、非修飾ＳＴＡＴ３−３Ｇ１２、およびＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体、または１ｕＭのＪＡＫ阻害剤トファシチニブを用いて、細胞を事前に培養した。ＯＰＲＦは、対照として使用される細菌タンパク質である。ＩＬ−１０、ＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬ−ＸＬ）、およびＢＩＲＣ５（サバイビン）の遺伝子発現レベルの倍率変化を測定した。
【図１７Ｂ】Ｃｏｌｏ２０５細胞のＳＴＡＴ３下流遺伝子の発現への、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」（化合物９０１）の効果を測定するために実行された実験の結果を示すグラフである。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図１７Ｃ】使用した２つの構造体の概略図であり、一方はＴＡＴＡボックスのＳＩＥ上流のタンデムリピートを有し、他方は、ＳＩＥタンデムリピートを有さず対照として機能する。
【図１７Ｄ】ＨｅＬａ細胞中のＳＴＡＴ３レポーターアッセイの結果を示すグラフである。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図１７Ｅ】Ｕ２５１細胞中のＳＴＡＴ３レポーターアッセイの結果を示すグラフである。
【図１８Ａ】２次元（２Ｄ）腫瘍成長アッセイでの、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を増加したＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞の殺傷パーセントを示すグラフである。３連ウェル中で、ＭＴＳアッセイによって成長を監視した。誤差バーは、１つの標準偏差を示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図１８Ｂ】２Ｄアッセイでの、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を増加したＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞の殺傷パーセントを示すグラフである。３連ウェル中で、ＣＴＧアッセイによって成長を監視した。誤差バーは、１つの標準偏差を示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図１８Ｃ】顕微鏡によるＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒの検出を示している。図１８Ｃに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（例えば、化合物９０１）は、腫瘍スフェロイドに浸透することができたが（ｉｉ）、一方で抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体は浸透しなかった（ｉ）。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図１９Ａ】３Ｄ腫瘍スフェロイドの成長への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を示している。３連ウェル中での、３Ｄ腫瘍スフェロイドアッセイにおけるＤＵ１４５ヒト前立腺癌の細胞成長を、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  ＨＣＳ共焦点顕微鏡によって監視した。抗体なし、抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体、対照複合体（「対照ｉＴＡｂ」）、または抗ＳＴＡＴ３抗体複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２（「ＳＴＡＴ３ｉＴＡｂ」）を用いて、細胞を処理した。
【図１９Ｂ】３Ｄ腫瘍スフェロイド（３Ｄ  ＴＧＡ、腫瘍成長アッセイ）の成長への、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を示すグラフである。３連ウェル中での、３Ｄ腫瘍スフェロイドアッセイでのＤＵ１４５ヒト前立腺癌の細胞成長を、ＣＴＧアッセイによって監視した。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図１９Ｃ】３Ｄ腫瘍スフェロイドの成長への、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を示すグラフである。細胞の殺傷パーセントを図１９Ｃに示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２０Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体が、スフェロイドのサイズを低減することができ、また、分化した表現型も生じ得ることも示す画像である。抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体、対照抗体複合体（ＰＳ複合抗細菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩ）抗体）、または抗ＳＴＡＴ３抗体複合体を用いて細胞を処理した。カルセインＡＭ生細胞色素を用いて、生細胞を染色した。生細胞中で非蛍光カルセインＡＭは、緑色蛍光カルセインに変換される。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２０Ｂ】患者由来の典型的な膠芽腫（ＧＢＭ）間葉系細胞における、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）に対する薬剤感受性を３Ｄ腫瘍成長アッセイで試験するための実験の結果を示す画像である。図２０Ｂの高含量スクリーニング（ＨＣＳ）共焦点画像は、生細胞にカルセインＡＭ（緑色）、死細胞にエチジウムホモ二量体−１（赤色）、および核細胞にＨｏｅｃｈｓｔ（青色）の、蛍光マーカーを用いて染色したスフェロイドを示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２０Ｃ】ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂ」、（化合物９０１）を用いた処理後の腫瘍スフェロイドの平均合計面積を示すグラフである。
【図２０Ｄ】患者由来の典型的な膠芽腫（ＧＢＭ）における、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）に対する薬剤感受性を３Ｄ腫瘍成長アッセイで試験するための実験の結果を示すグラフである。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図２０Ｅ】患者由来の典型的な膠芽腫（ＧＢＭ）における、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）に対する薬剤感受性を３Ｄ腫瘍成長アッセイで試験するための実験の結果を示すグラフである。図２０Ｅは、抗体濃度を増加した、細胞の生存パーセントを示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図２０Ｆ】遺伝子発現レベルでの各試料の組（ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）での処理対対照抗体複合体での処理）のシグナル強度の散布図を示すグラフである。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。「対照ｉＴＡｂ」は、対照抗体複合体を示す。
【図２０Ｇ】対照抗体複合体（ＰＳ複合抗細菌外膜タンパク質Ｉ（ＯｐｒＩ）抗体）と比較して、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１ａ）によって減少した癌幹細胞遺伝子を示すグラフである。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２１Ａ】胸腺欠損ヌードマウスにおける、ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２およびＳＴＡＴ３抗体複合体（「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂ」と称される）の、薬物動態学的プロファイリングを示すグラフである。
【図２１Ｂ】ＥＬＩＳＡによって測定された、ヒト血清中での抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の安定性を評価するための実験の結果を示すグラフである。ヒト血清中に添加された抗体量を、ＨＲＰで標識された抗ヒトＩｇＧを使用して測定した。ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２（化合物９０１）に結合したＰＳオリゴの検出では、ＰＳオリゴに相補的なビオチン−オリゴは、まず、抗体複合体を添加された血清を用いてハイブリダイズされ、その後、抗ストレプトビジンＨＲＰを検出抗体として使用したことを除いて、上記で述べたように、ＥＬＩＳＡによって、抗体結合オリゴの量を評価した。データを、オリゴからのシグナル対抗体からのシグナルの比としてプロットし、抗体結合オリゴ量の経時的な変化を示すオリゴ／Ａｂ比として示した。
【図２２Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−２の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。ＩＬ−２の量をｐｇ／ｍＬで示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２２Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−６の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。ＩＬ−６の量をｐｇ／ｍＬで示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２２Ｃ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−８の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。ＩＬ−８の量をｐｇ／ｍＬで示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＳＴ３Ｇ１２を指す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２２Ｄ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＦＮ−γの放出を刺激しなかったことを示すグラフである。ＩＦＮ−γの量をｐｇ／ｍＬで示す。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【図２３】（ｉ）ＴＮＦα、（ｉｉ）ＩＬ−６、（ｉｉｉ）ＩＬ−８、（ｉｖ）ＣＣＬ５、（ｖ）ＣＣＬ４、および（ｖｉ）ＩＦＮαのＭｕｌｔｉＣｙｔ  Ｑｂｅａｄｓ  ｐｌｅｘｓｃｒｅｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍでの検出範囲を示す標準曲線を報告する、グラフ（（ｉ）〜（ｖｉ））のパネルである。
【図２４Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＴＮＦαの放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＴＮＦα（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２４Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＴＮＦαの放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＴＮＦα（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２５Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−６の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２５Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−６の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２６Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−８の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＩＬ−８（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２６Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−８の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＩＬ−８（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２７Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＣＣＬ５の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＣＣＬ５（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２７Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＣＣＬ５の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＣＣＬ５（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２８Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＣＣＬ７の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＣＣＬ７（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２８Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＣＣＬ７の放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＣＣＬ７（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２９Ａ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＦＮαの放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＩＦＮα（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図２９Ｂ】抗ＳＴＡＴ３抗体複合体、「修飾ＳＴＡＴ３  ｍＡｂｓ」（化合物９０１）が、ヒトＰＭＢＣからのＩＦＮαの放出を刺激しなかったことを示すグラフである。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されたＩＦＮα（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【図３０】ＰＳ修飾ＳＴ３Ｇ１２抗体複合体（ＳＴＡＴ３−ｉＴＡｂｓ（化合物９０１））、および抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体の、組み換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質への結合を評価するために使用されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。「ＳＴＡＴ３  ｉＴＡｂ」とは、抗ＳＴＡＴ３複合体ＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２を指す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分と、所望により、抗原結合部分が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進する確認を受け入れることを可能にする骨格またはフレームワーク部分と、を含む、タンパク質である。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、抗体断片（すなわち、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体類似体が挙げられる。抗原結合タンパク質は、例えば、移植ＣＤＲまたはＣＤＲ誘導体を含む代替タンパク質骨格または人工骨格を含み得る。このような骨格としては、例えば、抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化するために導入された変異を含む抗体由来骨格、ならびに、例えば、生体適合性ポリマーを含む、完全合成骨格が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５３，Ｉｓｓｕｅ  １：１２１−１２９、Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４を参照されたい。加えて、ペプチド抗体模倣体（「ＰＡＭ」）、ならびに骨格としてフィブロネクチン成分を利用する抗体模倣体に基づく骨格を使用することができる。
【００３４】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質の抗原に対する特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する、抗原結合タンパク質の一部分である。その抗原に特異的に結合する抗体では、これは、そのＣＤＲドメインのうちの少なくとも１つのうちの少なくとも一部を含むであろう。
【００３５】
「エピトープ」とは、抗原結合タンパク質によって（例えば、抗体によって）結合される分子の一部分である。エピトープは、分子の非連続部分を含み得る（例えば、ポリペプチドでは、ポリペプチドの一次配列では連続的ではないが、ポリペプチドの三次および四次構造との関係においては、抗原結合タンパク質によって結合されるのに互いに十分に近い、アミノ酸残基）。一般に、抗体の可変領域、特にＣＤＲは、エピトープと相互作用する。
【００３６】
用語「抗体」とは、４つのポリペプチド鎖と、２つの重鎖（Ｈ）および、２つの軽鎖（Ｌ）、または任意の機能的な断片、突然変異、変異型、またはそれらの誘導体で構成されている免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指し、これはＩｇ分子の基本的なエピトープ結合特徴を保持する。
【００３７】
一般に、各抗体鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、例えばエフェクター機能を担う定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内で、可変および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はさらに約１０個多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。概して、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００３８】
抗体重鎖および軽鎖の可変領域（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を呈する。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１（本明細書では「Ｋａｂａｔナンバリング」と称される）に記載のような定義を含む。例えば、抗体のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングに従って決定されることができる。
【００３９】
用語「Ｆｃポリペプチド」は、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然形態および突然変異形態が挙げられる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそれから形成されたオリゴマー）は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでの親和性クロマトグラフィーによって、精製が容易であるという利益を提供する。
【００４０】
用語「抗ＳＴＡＴ３抗体」および「ＳＴＡＴ３に結合する抗体」とは、抗体がヒトＳＴＡＴ３を含むＳＴＡＴ３を標的とする診断用薬および／または治療薬として有用であるように、十分な親和性でＳＴＡＴ３を結合することができる抗体を指す。
【００４１】
用語「インタクト抗体」または「完全長抗体」とは、Ｆｃ領域を各々含有する、２つの抗体軽鎖と２つの抗体重鎖とで構成される抗体を指す。
【００４２】
用語「単一特異性」とは、本明細書で使用される場合、１つの特定のエピトープに対して親和性を示す抗体、またはその抗原結合断片を指す。対照的に、二重特異性抗体、またはその抗原結合断片は、２つの異なるエピトープに対して親和性を示す。一実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物は、単一特異性抗体、またはその抗原結合断片の細胞内送達に有用である。
【００４３】
「多特異性抗体」とは、１つ以上の抗原の２つ以上のエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体のサブクラスは、同じ抗原または異なる抗原の２つの異なるエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。
【００４４】
抗体との関係において本明細書で使用される場合、用語「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」または「特異的に結合している（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」とは、他の分子または部分と比較して、抗体の抗原への非共有的または共有的な優先結合を指す（例えば、抗体が他の可能な抗原と比較して特定の抗原に特異的に結合する）。一実施形態では、抗体は、１０−５以下（例えば、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下）の解離定数ＫＤを有する抗原に結合する場合、抗原（例えば、ＳＴＡＴ３）に特異的に結合する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン配列由来の重鎖および軽鎖を含む抗体の抗体、または抗体の抗原結合断片を指す。ヒト抗体は、ヒト重鎖および／または軽鎖コード遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝子修飾された対象のマウスの抗原を用いた免疫付与を含む、種々の方法で、以下に記載されている例で特定され得る。一実施形態では、ヒト抗体は、抗体のグリコシル化パターンが、天然に存在する場合と同じ配列を有する抗体とは異なるように、組み換え方法を使用して作製される。
【００４６】
用語「キメラ抗体」とは、特定の源または種に由来する１つ以上の領域と、異なる源または種に由来する１つ以上の領域とを含有する抗体を指す。
【００４７】
用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト種（例えば、マウス）からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列の少なくとも一部分が、より「ヒト状」、すなわち、ヒト生殖細胞系可変配列に、より類似するように変更されている抗体を指す。「ヒト化抗体」は、対象の抗原に免疫特異的に結合し、かつヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補的決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体、またはその変異型、誘導体、類似体、もしくは断片である。ヒト化抗体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有する。一般に、ヒト化抗体は、例えば、それがヒト対象に投与されるとき、マウス抗体またはキメラ化抗体などの非ヒト種抗体と比較して、免疫応答を誘導しにくく、かつ／または重篤な免疫応答を誘発しにくい。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン内のある特定のアミノ酸は、ヒト化抗体を産生するように変異される。ヒト化抗体の作製方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、および同第５，８７７，２９３号に見られ得る。
【００４８】
「抗体断片」、「抗体部分」、「抗体の抗原結合断片」、または「抗体の抗原結合部分」とは、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｄ；およびＦｖ断片、ならびにｄＡｂ；二重特異性抗体；直鎖抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；ポリペプチドへの特異的な抗原結合を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト抗体の酵素的切断または化学的切断によって産生され得る。抗原結合部分としては、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、キメラ抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、および四重特異性抗体が挙げられる。
【００４９】
一実施形態では、抗体断片は、ｓｃＦｖである。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域が、リンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結されて、連続したタンパク質鎖を形成する抗体である（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３）参照）。
【００５０】
Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価の断片であり、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合されている２つのＦａｂ断片を有する二価の断片であり、Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し、Ｆｖ断片は、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有し、ならびにｄＡｂ断片は、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合断片を有する（米国特許第６，８４６，６３４号、同第６，６９６，２４５号、米国特許出願公開第２０／０２０２５１２号、同第２００４／０２０２９９５号、同第２００４／００３８２９１号、同第２００４／０００９５０７号、同第２００３／００３９９５８号、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６，１９８９）。
【００５１】
二重特異性抗体は、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体であり、各ポリペプチド鎖が、同じ鎖上の２つのドメイン間を対合させるには短すぎるリンカーによって連結されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、したがって、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対合することを可能にする（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−４８、およびＰｏｌｊａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−２３参照）。二重特異性抗体の２つのポリペプチド鎖が同一である場合、それらの対合から生じる二重特異性抗体は、２つの同一の抗原結合部位を有するであろう。異なる配列を有するポリペプチド鎖は、２つの異なる抗原結合部位を有する二重特異性抗体を作製するために使用され得る。同様に、三重特異性抗体および四重特異性抗体は、それぞれ３つおよび４つのポリペプチド鎖を含み、それぞれ、同じかまたは異なり得る３つおよび４つの抗原結合部位を形成する、抗体である。
【００５２】
２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の「同一性パーセント」または「相同性パーセント」は、そのデフォルトパラメータを使用する、ＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ１０．３（Ａｃｃｅｌｒｙｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）の一部）を使用して、配列を比較することによって測定される。
【００５３】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」は、全体を通して互換的に使用され、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体（例えば、ペプチド核酸および非天然型ヌクレオチド類似体）、およびそのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一実施形態では、本発明の核酸分子は、抗体またはその断片、誘導体、突然変異タンパク質、または変異型をコードする連続したオープンリーディングフレームを含む。
【００５４】
２つの一本鎖ポリヌクレオチドは、それらの配列が、ギャップの導入がなく、かつどちらの配列にも５’または３’末端に不対ヌクレオチドがなく、一方のポリヌクレオチド中の全てのヌクレオチドが、対向する他方のポリヌクレオチド中のその相補的ヌクレオチドであるように、逆平行配向に整列されることができる場合、互いの「補体」である。中程度のストリンジェントな条件下で、２つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドにハイブリダイズされることができる場合、ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに「相補的」である。したがって、１つのポリヌクレオチドは、その補体であることなく、別のポリヌクレオチドに相補的であることができる。
【００５５】
「ベクター」は、それに結合された別の核酸を細胞に導入するために使用され得る核酸である。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、これは、追加の核酸セグメントがライゲーションされ得る直鎖または円形の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに導入され得る、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）である。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点およびエピソーム哺乳動物ベクターを含む細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。「発現ベクター」は、選択されるポリヌクレオチドの発現を指示することができるベクターのタイプである。
【００５６】
ヌクレオチド配列は、制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、時期または位置）に影響する場合、制御配列と「操作可能に結合」されている。「制御配列」は、操作可能に結合されている核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミング、または位置）に影響する核酸である。制御配列は、例えば、制御される核酸に直接または１つ以上の他の分子（例えば、制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その効果を発揮することができる。制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。制御配列のさらなる例は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ａｎｄＢａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３６０５−０６に記載されている。
【００５７】
「宿主細胞」は、例えば、本発明の核酸などの、核酸を発現するために使用され得る細胞である。宿主細胞は、原核生物、例えば、大腸菌であってよく、または真核生物、例えば、単一細胞真核生物（例えば、酵母または他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）、またはハイブリドーマであり得る。宿主細胞の例は、サル腎細胞のＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ２３：１７５参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯおよび無血清培地で成長する関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３１参照）もしくはＤＨＦＲを欠損するＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０参照）などのそれらの誘導体、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞株、アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１由来ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）（ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１参照）、２９３，２９３  ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他のトランスフォーム霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養由来の細胞株、一次外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞であるが、ヒト宿主細胞ではない。一般に、宿主細胞は、その後に宿主細胞で発現され得る、ポリペプチドコード核酸で形質転換またはトランスフェクトされ得る培養細胞である。語句「組み換え宿主細胞」とは、発現された核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を表すために使用され得る。宿主細胞はまた、核酸を含むが、制御配列が核酸に動作可能に結合されるように宿主細胞に導入されない限り、所望のレベルで発現しない、細胞であり得る。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫をも指すことが理解される。ある特定の修飾は、例えば、変異または環境的な影響により、次の世代に生じ得るため、このような子孫は、実際には親細胞と同一でない場合があるが、依然として、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００５８】
用語「組み換え抗体」とは、抗体のコード配列、またはその一部分（例えば、重鎖また軽鎖をコードするＤＮＡ配列）を含む発現ベクター（または２つ以上の表現ベクターであり得る）でトランスフェクトされた細胞または細胞株から発現する抗体を指す。一実施形態では、このコード配列は、その細胞と天然では関連がない。一実施形態では、天然で存在する場合、組み換え抗体は、同じ配列を有する抗体のグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する。一実施形態では、組み換え抗体は、ヒト宿主細胞ではない哺乳動物宿主細胞内で発現される。特に、個々の哺乳動物宿主細胞は、特有のグリコシル化パターンを有する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、本明細書に記載のように、対象に投与されるとき、ＳＴＡＴ３シグナル伝達に関連する疾患の治療に効果をもたらすのに十分である、ＳＴＡＴ３に結合する抗体またはその抗原結合部分の量を指す。単独でまたは組み合わせて使用される場合、本明細書で提供される抗体の治療有効量は、抗体および組み合わせの相対活性（例えば、細胞成長の阻害における）に応じて、ならびに当業者によって容易に決定され得る、治療される対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重篤度、投与様式などに応じて、異なる。
【００６０】
用語「単離された」とは、他の細胞物質を実質的に含まないタンパク質（例えば、抗体）を指す。一実施形態では、単離された抗体は、同じ種からの他のタンパク質を実質的に含まない。一実施形態では、単離された抗体は、異なる種からの細胞によって発現され、異なる種からの他のタンパク質を実質的に含まない。タンパク質は、当該技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用して、天然では関連のない成分（または抗体を産生するために使用される細胞発現系と関連のある成分）を実質的に含まないようにすることができる。一実施形態では、本発明の抗体、または抗原結合断片は、単離されている。
【００６１】
「中和抗体」または「阻害抗体」は、過剰量の抗ＳＴＡＴ３抗体が、本明細書の実施例に記載されるようなアッセイを使用して少なくとも約２０％活性化量を低減すると、ＳＴＡＴ３のタンパク質分解活性化を阻害する抗体である。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、および９９．９％ＳＴＡＴ３のタンパク質分解活性化量の量を低減する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「細胞内送達化合物」とは、抗原結合タンパク質を細胞に内在化することができる、抗原結合タンパク質（例えば、抗体または抗体断片）に（共有的にまたは非共有的に）複合されている化合物を指す。細胞内送達化合物（抗体に複合している）の例を、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃに提供する。
【００６３】
ＳＴＡＴ３抗原結合タンパク質
本発明は、抗ＳＴＡＴ３抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその断片、ならびにその使用方法、およびその作製方法を提供する。シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、細胞質転写因子のＳＴＡＴファミリーのメンバーである。ＳＴＡＴ３は、ヒト遺伝子地図の１７ｑ２１座を有するＳＴＡＴ３遺伝子によってコードされる転写因子である。ヒトＳＴＡＴ３は、７７０個のアミノ酸タンパク質であり、約８８ｋＤａの分子量を有する。
【００６４】
本発明は、ＳＴＡＴ３結合タンパク質、特にＳＴＡＴ３（例えば、ヒトＳＴＡＴ３）を結合する抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合部分、およびその使用に関する。本発明の様々な態様は、抗体および抗体断片、医薬組成物、核酸、組み換え発現ベクター、ならびにこのような抗体および断片を作製するための宿主細胞に関する。ヒトＳＴＡＴ３を検知し、インビトロまたはインビボのいずれかで、ＳＴＡＴ３活性を阻害し、癌などの疾病を予防または治療するために、本発明の抗体を使用する方法も、本発明に包含される。
【００６５】
以下の表４に記載されるように、ＳＴＡＴ３に特異的である新規の抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、本発明に含まれる。一実施形態では、本発明は、配列番号１および３のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２および４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２および４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する軽鎖と、配列番号１および３のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する重鎖と、を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、ＩｇＧであり、重鎖可変ドメイン、ならびに重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を各々含む２つの重鎖と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（ＣＬ）を各々含む２つの軽鎖と、を含む４つのポリペプチド鎖を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。重鎖および軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号１、２、３、および／または４で本明細書に記載のものから選択され得る。
【００６７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方における超可変領域として知られている。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、上記Ｋａｂａｔら、上記Ｌｅｆｒａｎｃら、ならびに／または上記ＨｏｎｅｇｇｅｒおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎによって記載のシステムを使用して、特定され得る。また、当業者には周知である、Ｋａｂａｔら（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）に記載のナンバリングシステムである。この点について、Ｋａｂａｔらは、いかなる抗体にも適用可能である、ＣＤＲの特定を含む可変ドメイン配列用のナンバリングシステムを定義した。
【００６８】
１つ以上のＣＤＲは、共有的に、または非共有的にのいずれかで分子に組み込まれ、抗原結合タンパク質となり得る。
【００６９】
抗原結合タンパク質は、より大きいポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲ（複数可）を組み込み得るか、またはＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖に共有結合させ得るか、またはＣＤＲ（複数可）を非共有結合して組み込み得る。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が特定の対象の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【００７０】
ある特定の実施形態では、本発明は、表４に記載される重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのＣＤＲを含む抗ＳＴＡＴ３抗体を提供する（配列番号１〜４）。例えば、本発明は、配列番号１および配列番号３のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２および配列番号４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２および配列番号４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを有する軽鎖可変領域と、配列番号１および配列番号３のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列に記載されるＣＤＲを有する重鎖可変領域と、を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００７１】
一実施形態では、本開示は、１０−６Ｍ以下の結合親和性を有するＳＴＡＴ３エピトープに結合し、ＳＴＡＴ３エピトープが、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である重鎖可変ドメイン配列を有し、かつ配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または１００％同一である軽鎖可変ドメイン配列を有する、ＩｇＧクラスの完全ヒト抗体を提供する。
【００７２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１または３のいずれか１つに記載のＣＤＲ３ドメインを含む重鎖を含み、かつ配列番号１または３のいずれか１つに記載の配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一を有するアミノ酸配列を含む可変ドメインを含む、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号２または４のいずれか１つに記載のＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖を含み、かつ配列番号２または４のいずれか１つに記載の配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、ＣＤＲ３ドメインは、変動性が、重鎖および／または軽鎖の残りのＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域に導入され得ながら、一方で抗体またはその抗原結合断片は、ＳＴＡＴ３への結合能力を保持し、かつ親の機能的な特徴、例えば結合親和性を保持しながら、一定に保持される。
【００７３】
一実施形態では、少なくとも９５％同一（または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一）である重鎖または軽鎖内でなされる置換は、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、荷電または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは類似の度合いは、置換の保存的性質を補正するために上向きに調節され得る。この調節を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパルテートおよびグルタメート、ならびに（７）イオウ含有側鎖はシステインおよびメチオニンである、が挙げられる。
【００７４】
一実施形態では、本発明は、表４に記載の抗体のうちのいずれかの抗原結合領域を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。表４に記載のものを含む本発明の抗体は、ヒトＳＴＡＴ３に結合する。一実施形態では、完全ヒト抗体は、重鎖および軽鎖の両方を有し、その抗体が、配列番号１／配列番号２（本明細書でＳＴ１Ａ５と呼ばれる）、または配列番号３／配列番号４（本明細書ではＳＴ３Ｇ１２と呼ばれる）から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００７５】
一実施形態では、本発明は、抗体ＳＴ１Ａ５の抗原結合領域を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１に記載の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号２に記載の軽鎖可変ドメイン配列と、を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号２のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインと、を有する抗体に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号１に記載の配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２に記載の配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片を特徴とする。一実施形態では、本発明は、配列番号９に記載のアミノ酸を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１２に記載のアミノ酸を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。抗体はさらに、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプであり得る。
【００７６】
一実施形態では、本発明は、抗体ＳＴ３Ｇ１２の抗原結合領域を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３に記載の重鎖可変ドメイン配列と、配列番号４に記載の軽鎖可変ドメイン配列と、を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号３のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号４のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインと、を有する抗体に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３に記載の配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、かつ配列番号４に記載の配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、単離されたヒト抗体またはその抗原結合断片を特徴とする。一実施形態では、本発明は、配列番号１５に記載のアミノ酸を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１８に記載のアミノ酸を含むＣＤＲ３ドメインと、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインと、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む、抗ＳＴＡＴ３抗体またはその抗原結合部分を特徴とする。抗体はさらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプであり得る。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである。
【００７７】
全体を通して、抗体（および対応する配列）は、名前の前の「ＳＴ」の有無にかかわらず、互換的に称されることに留意すべきである。例えば、抗体名「ＳＴ１Ａ５」は、本明細書で「１Ａ５」とも称される。
【００７８】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合断片は、従来技術によって産生され得る。このような断片の例としては、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
ある特定の実施形態では、本開示は、重鎖からの可変ドメイン領域と、軽鎖からの可変ドメイン領域と、を有するＦａｂ完全ヒト抗体断片を提供し、配列番号１または３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン配列、および配列番号２または４からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメイン配列。
【００８０】
好ましくは、完全ヒト抗体Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメインの両方を有し、その抗体が、配列番号１／配列番号２または配列番号３／配列番号４から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００８１】
一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片を、アミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して結合することによって形成され得、単一のポリペプチド鎖を生じる。このような一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することによって調製されている。結果として生じるポリペプチドは、それら自体に折り返されて抗原結合モノマーを形成することができるか、または２つの可変ドメイン間の可撓性リンカーの長さに応じて多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３、Ｋｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。ポリペプチドを含む異なるＶＬおよびＶＨを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多重結合ｓｃＦｖｓを形成することができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体の産生のために開発された技術としては、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３３４：５４４、ｄｅ  Ｇｒａａｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載のものが挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、本開示は、重鎖からの可変ドメイン領域と、軽鎖からの可変ドメイン領域と、重鎖および軽鎖可変ドメイン領域を接続するペプチドリンカーとを有する一本鎖ヒト抗体を提供し、配列番号１または配列番号３から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である重鎖可変ドメイン配列、および配列番号２または配列番号４から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である軽鎖可変ドメイン配列。一実施形態では、完全ヒト一本鎖抗体は、重鎖可変ドメイン領域および軽鎖可変ドメイン領域の両方を有し、その一本鎖完全ヒト抗体が、配列番号１／配列番号２または配列番号３／配列番号４から選択される重鎖／軽鎖可変ドメイン配列を有する。
【００８３】
対象の抗体からの異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を誘導するための技術、すなわち、サブクラススイッチングが知られている。従って、ＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体から誘導され得、例えば逆もまた同様である。このような技術は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有する新たな抗体の調製を可能にするがまた、親抗体のものとは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスと関連する生物学的特性も呈する。組み換えＤＮＡ技術が、採用され得る。例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡなど、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡは、このような手順に採用され得る（Ｌａｎｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６）。さらに、ＩｇＧ４が所望される場合、ヒンジ領域に点突然変異（ＣＰＳＣＰ−＞ＣＰＰＣＰ）（それぞれ配列番号５および６）を導入して（Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７）、ＩｇＧ４抗体における不均質性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を緩和することが望ましい場合もある。このように、一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。このように、一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ４抗体である。
【００８４】
本開示は、それらの可変ドメイン領域のアミノ酸配列によって、構造的に特徴のある多数の抗体を提供する。しかしながら、アミノ酸配列は、特定の標的へのそれらの高度の結合を保持しながら、いくつかの変化を受け得る。より具体的には、可変ドメイン領域内の多くのアミノ酸は、保存的置換により変化され得、結果として生じる抗体の結合特徴が、野生型抗体配列の結合特性とは異ならないであろうことが予想可能である。抗原と直接相互作用せず、または抗原の結合に影響を及ぼさず、かつ抗体構造の決定に重要ではない多くのアミノ酸が抗体可変ドメイン内にある。例えば、開示の抗体のうちのいずれかの予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスから別のアミノ酸残基と置き換えられる。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換を特定する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）、およびＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：４１２−４１７（１９９７）参照）。Ｎｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：３６９−３７７，１９９３は、部位特異的突然変異誘発を介して、結合にどのように影響を及ぼすのか、または及ぼさないのか、について説明している。Ｎｅａｒらは、抗原結合を変化する可能性が高いと思った残基のみを、変異させた。ほとんどは、結合親和性に、およびジゴキシンの異なる形態への結合に緩やかな効果（Ｎｅａｒら表２）か、またはマイナス効果（Ｎｅａｒら表３）を有した。
【００８５】
したがって、本発明はまた、ある特定の実施形態では、本明細書に開示の配列のものと、少なくとも９５％の同一性を有する可変配列も含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体、またはその抗原結合断片は、１×１０−６Ｍ以下、５×１０−７Ｍ以下’１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、５×１０−９Ｍ以下、または１×１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を有する。一実施形態では、１×１０−７Ｍ〜１×１０−１０ＭのＫＤとしての、本発明の抗体、またはその抗原結合断片。一実施形態では、１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０ＭのＫＤとしての、本発明の抗体、またはその抗原結合断片。
【００８７】
当業者は、抗体またはその断片のＫＤを測定するために知られている標準的な方法を理解するであろう。例えば、一実施形態では、ＫＤは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態では、ＲＩＡは、対象の抗体のＦａｂ型、およびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の非標識抗原滴定の存在下で、（１２５Ｉ）で標識された抗原の最低濃度を有するＦａｂを平衡化し、次いで抗Ｆａｂ抗体でコーティングされたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）参照）。
【００８８】
別の実施形態によると、ＫＤは、ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。用語「表面プラズモン共鳴」とは、本明細書で使用される場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度における変化の検出による、リアルタイム相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、少なくとも１０６Ｍ−１のＳＴＡＴ３への結合親和性（Ｋａ）を有する。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、または少なくとも１０１０Ｍ−１のＫａを呈する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書の実施例に記載の抗体のものと実質的に同じＫａを呈する。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、１０６Ｍ−１以下のＳＴＡＴ３への結合親和性（Ｋａ）を有する。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、１０７Ｍ−１以下、１０８Ｍ−１以下、１０９Ｍ−１以下、１０１０Ｍ−１以下のＫａを呈する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書の実施例に記載の抗体のものと実質的に同じＫａを呈する。
【００９１】
別の実施形態では、本開示は、ＳＴＡＴ３からの低い解離速度を有する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、１×１０−４〜−１秒−１以下のＫｏｆｆを有する。別の実施形態では、５×１０−５〜−１秒−１以下のＫｏｆｆである。別の実施形態では、Ｋｏｆｆは、本明細書に記載の抗体と実質的に同じである。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＳＴＡＴ３に結合する。
【００９２】
別の態様では、本開示は、ＳＴＡＴ３の活性を阻害する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。別の実施形態では、ＩＣ５０は、１００ｎＭ以下であり、別の実施形態では、ＩＣ５０は、１０ｎＭ以下である。別の実施形態では、ＩＣ５０は、本明細書の実施例に記載の抗体と実質的に同じである。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗体と実質的に同じＩＣ５０でＳＴＡＴ３の活性を阻害する。
【００９３】
別の態様では、本開示は、インビトロまたはインビボ（例えば、ヒト対象に投与されるとき）で、少なくとも１日間の半減期を有する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、少なくとも３日間の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４日間以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、８日間以上の半減期を有する。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、非誘導体化または非修飾抗原結合タンパク質と比較して、より長い半減期を有するように誘導体化または修飾される。別の実施形態では、抗原結合タンパク質は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０００／０９５６０に記載のように、１つ以上の点突然変異を含有して、血清の半減期を増大する。
【００９４】
本開示は、多特異性抗原結合タンパク質、例えば二重特異性抗原結合タンパク質、例えば２つの異なる抗原結合部位または領域を介して、ＳＴＡＴ３の２つの異なるエピトープ、またはＳＴＡＴ３の１つのエピトープ、および別の分子のエピトープに結合する抗原結合タンパク質をさらに提供する。さらに、本明細書に開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、他の公報を参照して本明細書に記載されているものを含む、本明細書に記載の抗体のうちの１つからのＳＴＡＴ３結合部位と、本明細書に記載の抗体のうちの別のものからの第２のＳＴＡＴ３結合領域と、を含み得る。あるいは、二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗体のうちの１つからの抗原結合部位、および当該技術分野において既知の別のＳＴＡＴ３抗体からの、または既知の方法もしくは本明細書に記載の方法によって調製される抗体からの、第２の抗原結合部位を含み得る。
【００９５】
二重特異性抗体を調製する多数の方法が、当該技術分野において知られている。このような方法は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７によって記載されるようなハイブリッドハイブリドーマ、および抗体断片の化学的結合（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１、Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７、米国特許第６，０１０，９０２号）の使用を含む。さらに、二重特異性抗体は、組み換え手段を介して、例えばロイシンジッパー部分（すなわち、ヘテロ二量体を優先的に形成するＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からの、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７）、または米国特許第５，５８２，９９６号に記載のような他の鍵穴と鍵の相互作用的なドメイン構造を使用することによって産生され得る。追加の有用な技術としては、米国特許第５，９５９，０８３号、および同第５，８０７，７０６号に記載のものが挙げられる。
【００９６】
別の態様では、抗原結合タンパク質は、抗体の誘導体を含む。誘導体化された抗体は、特定の使用における増加した半減期などの、所望の特性を抗体に付与する任意の分子または物質を含み得る。誘導体化抗体は、例えば、検出可能な（または標識）部分（例えば放射性、比色、抗原または酵素分子、検出可能なビーズ（磁性または高電子密度の（例えば金）ビーズなど）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン）、治療的もしくは診断的部分（例えば放射性、細胞毒性、または薬学的活性部分）、または特定の使用のための抗体の適合性を増大する分子（例えばヒト対象などの対象への投与、または他のインビボもしくはインビトロでの使用）を含み得る。抗体を誘導体化するために使用され得る分子の例としては、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗体のアルブミン結合およびＰＥＧ化誘導体は、当該技術分野において周知の技術を使用して調製され得る。一実施形態では、抗体は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異型に複合しているか、または結合されている。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異型は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群から選択される化学物質を用いて、化学的に修飾され得る。
【００９７】
ある特定の実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合断片は、細胞内送達化合物に複合している。一実施形態では、本発明は、図１Ａまたは図１Ｂの化合物を提供する。図１Ａは、式（Ｉ）、またはその薬学的に許容可能な塩を含む本発明の抗体複合体の例示的な図であり、Ｘ、ｑ、Ｂａ、Ｒ１、ｒ、ｔ、Ｌ、およびＡＴの各々が、参照により本明細書にその全体が援用されるＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７５７６に定義され、かつ記載されている通りである。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、式Ｉを有する化合物であって、
【００９９】
【化１】
2019515955.tif 000003
式中、
各Ｂａが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）から独立して選択され、
Ｘが、ＯまたはＳであり、
各Ｒ１が、水素、およびフルオロフォアで置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択され、
ｑが、１２〜３５の整数であり、
ｒが、１〜１０の整数であり、
ｔが、１〜１０の整数であり、
Ｌが、−ＣＨ２−Ｒ２−＊であり、
Ｒ２が、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、＝ＮＯＲｅ、−ＮＲａ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＲｂ、−Ｓ（Ｏ）ｋＲｂ、−ＮＲａＳ（Ｏ）２Ｒｂ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲａＲｂ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、ｐｈｅｎｙｌ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ、−ＮＲａ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲａＲｂ、−ＮＲａ（Ｃ＝Ｓ）ＮＲａ、および−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｂから選択される１または２基で置換された−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
ｋが、０、１、または２であり、
各Ｒａが、独立して、水素、またはＲｆで任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルであり、
各Ｒｂが、独立して、Ｒｆまたは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｆで任意選択的に置換された（Ｃ１〜Ｃ６）であり、
Ｒｄが、［（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］ｖＣ（＝Ｏ）ＮＨであり、
Ｒｅが、［（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］ｐＣ（＝Ｏ）であり、
各Ｒｆが、独立して、
【０１００】
【化２】
2019515955.tif 000004
または
【０１０１】
【化３】
2019515955.tif 000005
であり、波形の結合が、Ｒａによって定義される（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または、Ｒｂによって各々定義される（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルもしくはカルボニルへの結合箇所を示し、
Ｒｇが、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または−［（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル］ｗＣ（＝Ｏ）ＮＨであり、
リングＡが、
【０１０２】
【化４】
2019515955.tif 000006
または
【０１０３】
【化５】
2019515955.tif 000007
であり、破線の結合が、Ｒｆのトリアゾリルへの結合箇所を示し、かつ波形の結合が、Ｒａによって定義される（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはＲｂによって各々定義される（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルもしくはカルボニルへの結合箇所を示し、
ｐが、１〜１０の整数であり、
ｖが、１〜１０の整数であり、
ｗが、２〜１２の整数であり、
＊が、ＡＴへの結合箇所を示し、
ＡＴが、抗体である、化合物を提供する。
【０１０４】
一実施形態では、抗体複合体は、図１Ｂに示される構造体である。図１Ｂは、本発明の抗体複合体、化合物９０１ａの例示的な図であり、抗体（ＡＴ）が、ＳＴ３Ｇ１２であり、図１Ａの１つのＲ１が、アルキルフルオロフォア部分である。化合物９０１ａは、実施例５で試験される。
【０１０５】
一実施形態では、抗体複合体は、図１Ｃに示される構造体である。図１Ｃは、本発明の抗体複合体、化合物９０１の例示的な図であり、抗体（ＡＴ）が、ＳＴ３Ｇ１２であり、図１Ａの各Ｒ１が、水素である。化合物９０１は、実施例２〜１０で試験される。
【０１０６】
１つ以上の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーは、ＳＴＡＴ３拮抗物質として採用され得る。オリゴマーは、共有結合または非共結合した、二量体、三量体、またはより高級オリゴマーの形態であり得る。２つ以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーは、一例としてホモ二量体の使用が考慮される。他のオリゴマーとしては、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【０１０７】
一実施形態は、抗原結合タンパク質に融合されたペプチド部分の間の共有結合相互作用または非共有結合相互作用を介して連結された、複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパー、および抗体に由来するある特定のポリペプチドは、以下より詳細に記載されるように、それに結合した抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進することができるペプチドの類である。
【０１０８】
特定の実施形態では、オリゴマーは、２〜４つの抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、例えば変異型または断片などの上述の形態のいずれかなどの任意の形態であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、ＳＴＡＴ３結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
【０１０９】
オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用と関連する。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元来、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において特定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、以来種々の異なるタンパク質において見出された。既知のロイシンジッパーの中では、天然型ペプチド、および二量体化または三量体化されたそれらの誘導体である。可溶性オリゴマータンパク質を産生するのに好適なロイシンジッパードメインの例は、ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、Ｈｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載の肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来のロイシンジッパーである。そこへ融合されている異種タンパク質の安定した三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。１つの手法では、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗ＳＴＡＴ３抗体断片または誘導体を含む組み換え融合タンパク質が、好適な宿主細胞で発現され、それが形成する可溶性オリゴマー抗ＳＴＡＴ３抗体断片または誘導体が、培養液上清から回収される。
【０１１０】
ＳＴＡＴ３を対象とする抗原結合タンパク質は、例えば、ＳＴＡＴ３ポリペプチドの存在を検出するためのアッセイにおいて、インビトロまたはインビボのいずれかで使用され得る。抗原結合タンパク質はまた、免疫親和性クロマトグラフィーによるＳＴＡＴ３タンパク質の精製に採用されてもよい。ブロッキング抗原結合タンパク質は、本明細書に開示の方法に使用され得る。ＳＴＡＴ３拮抗物質として機能するこのような抗原結合タンパク質は、様々な癌を含むがこれらに限定されない任意のＳＴＡＴ３誘導性の症状の治療に採用され得る。
【０１１１】
抗原結合タンパク質は、ＳＴＡＴ３誘導性生物活性を阻害するために、インビトロ手順、またはインビボ投与に採用され得る。したがって、本明細書で例示されている、ＳＴＡＴ３の活性化から（直接的にまたは間接的に）利益を受けるであろう疾病は、治療され得る。一実施形態では、本発明は、ＳＴＡＴ３誘導性生物活性を低減するための有効量で、ＳＴＡＴ３ブロッキング抗原結合タンパク質をその必要のある哺乳動物に対してインビボ投与することを含む、治療方法を提供する。
【０１１２】
本発明のある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＳＴＡＴ３の生物活性を阻害する完全ヒトモノクローナル抗体を含む。
【０１１３】
本明細書に記載の抗体および抗体断片を含む抗原結合タンパク質は、多数の従来技術のうちのいずれかによって調製され得る。例えば、それらを天然に発現する細胞から精製されてもよく（例えば、抗体はそれを産生するハイブリドーマから精製され得る）、または当該技術分野において既知の任意の技術を使用して、組み換え発現系で産生されてもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｄ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）を参照されたい。
【０１１４】
当該技術分野において既知の任意の発現系を使用して、本明細書に記載の抗体および抗体断片を含む、本発明の組み換えポリペプチドを作製することができる。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターを用いて形質転換される。採用され得る宿主細胞の類は、原核細胞、酵母、または高等真核細胞である。原核生物としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば大腸菌または桿菌が挙げられる。高等真核細胞には、昆虫細胞、および哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。好適な哺乳動物宿主の細胞株の例としては、サル腎細胞のＣＯＳ−７系統（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１によって記載されているように、アフリカミドリザル腎細胞株ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）が挙げられる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するために適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓらによって記載されている（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）。
【０１１５】
形質転換された細胞は、ポリペプチド、および従来のタンパク質精製手順によって回収されるポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得る。１つのこのような精製手順は、例えば、そこに結合されているＳＴＡＴ３の全てまたは一部分を有するマトリックス（例えば、細胞外ドメイン）への、親和性クロマトグラフィーの使用が挙げられる。本明細書での使用を考慮されるポリペプチドとしては、内在性物質汚染を実質的に含まない、実質的に均質な組み換え哺乳動物抗ＳＴＡＴ３抗体ポリペプチドが挙げられる。
【０１１６】
多数の既知の技術のうちのいずれかによって、抗原結合タンパク質は調製され、所望の特性についてスクリーニングされ得る。ある特定の技術は、対象の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＳＴＡＴ３抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部分）をコードする核酸を単離することと、組み換えＤＮＡ技術を介して核酸を操作することとに関連する。核酸は、対象の別の核酸に融合されるか、または例えば、（例えば突然変異生成または他の従来技術によって）１つ以上のアミノ酸残基を添加、削除、または置換するように改変されてもよい。
【０１１７】
本開示のポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の標準的な方法を使用して産生され得る。一例では、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸配列（ｃＤＮＡ）を組み換え発現ベクターに挿入することと、および発現を促進する状況下でＤＮＡ配列を発現することとによる、ＤＮＡ組み換え方法によって産生される。
【０１１８】
本明細書に開示の様々なポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用は、細胞内の発現を改善するように選択され得る。このようなコドン使用は、選択される細胞型に依存するであろう。特殊化されたコドン使用パターンは、大腸菌、および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞に関して開発されてきた。
【０１１９】
核酸操作のための一般技術は、例えば、参照として本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２  ｅｄ．，１９８９，またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、および最新情報に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルス、または昆虫遺伝子由来の好適な転写または翻訳制御要素に動作可能に結合される。このような制御要素としては、転写プロモーター、転写を制御するための任意選択的なオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列が挙げられる。宿主の複製能力は、通常、複製起点によって付与され、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が、さらに組み込まれる。
【０１２０】
組み換えＤＮＡはまた、タンパク質の精製に有用であり得る任意のタイプのタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例としては、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）に見出され得る。
【０１２１】
発現構築物は、宿主細胞に適切な方法を使用して、宿主細胞に導入される。核酸を宿主細胞に導入するための種々の方法が、当該技術分野において既知であり、これらに限定されないが、電気穿孔法；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を採用するトランスフェクション；微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション；および感染（ベクターが感染因子である）が挙げられる。好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が挙げられる。
【０１２２】
好適な細菌としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば大腸菌またはバチルス種が挙げられる。好ましくは、Ｓ．セレビジエなどのサッカロマイセス種からの酵母はまた、ポリペプチドの産生に使用され得る。様々な哺乳動物細胞または昆虫細胞培養系はまた、組み換えタンパク質を発現させるためにも採用される。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８）によって調査されている。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製されたポリペプチドは、組み換えタンパク質を発現するように好適な宿主／ベクター系を培養することによって調製される。多くの用途では、本明細書に開示のポリペプチドの多くはサイズが小さいため、発現に好ましい方法として大腸菌中で発現されるであろう。次いで、タンパク質は、培養基または細胞抽出物から精製される。
【０１２３】
タンパク質はまた、細胞翻訳系を使用して産生され得る。このような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロでの転写を可能にしてｍＲＮＡを産生し、利用される特定の無細胞系（哺乳動物または酵母などの真核生物の無細胞翻訳系、または細菌などの原核生物の無細胞翻訳系でのｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されなければならない。
【０１２４】
ＳＴＡＴ３−結合ポリペプチドはまた、化学合成によっても（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌに記載の方法などによって）産生され得る。タンパク質への修飾もまた、化学合成によって産生され得る。
【０１２５】
本開示のポリペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に既知のタンパク質の単離／精製方法によって、精製され得る。非限定的な例としては、抽出、再結晶化、（例えば硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）塩析、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動、向流分配法、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、ポリペプチドは、これらに限定されないが、濾過および透析を含む、当該技術分野において既知の種々の方法のうちのいずれかによって、異なる緩衝液に交換および／または濃縮され得る。
【０１２６】
精製されたポリペプチドは、少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、および最も好ましくは少なくとも純度９８％であることが好ましい。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬製品として使用するために十分に純粋である。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＴＡＴ３に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して、例えば、免疫計画完了後のトランスジェニック動物から採取された脾臓細胞の不死化によって産生され得る。脾臓細胞は、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して、例えば、骨髄腫と融合させて、ハイブリドーマを産出することによって不死化され得る。ハイブリドーマ産生融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体産生であり、これは、高い融合効率、および所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持するある特定の選択的培地で成長することができないようにする酵素欠損を有する。マウス融合に使用するために好適な細胞株の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが挙げられ、ウサギ融合に使用される細胞株の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４８２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６である。
【０１２８】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合断片は、当該技術分野において既知の従来技術によって産生され得る。
【０１２９】
ポリペプチドの翻訳後修飾
ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチドの結合は、翻訳後修飾をさらに含み得る。例示的な翻訳後タンパク質修飾としては、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、炭素化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖の添加、もしくは疎水基の添加が挙げられる。結果として、修飾された可溶性ポリペプチドは、脂質、多糖または単糖、およびリン酸などの非アミノ酸要素を含有し得る。グリコシル化の好ましい形態は、１つ以上のシアル酸部分をポリペプチドへ複合する、シアル化である。シアル酸部分は、タンパク質の可能性のある免疫原性を低減しながらも、可溶性および血清半減期を改善する。Ｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００１  ３１；４０（３０）：８８６８−７６を参照されたい。
【０１３０】
一実施形態では、対象の可溶性ポリペプチドの修飾形態は、対象の可溶性ポリペプチドを非タンパク質ポリマーへ結合することを含む。一実施形態では、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号に記載の様式の、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンである。
【０１３１】
ＰＥＧは、市販されている水溶性ポリマーであるか、または、当該技術分野において周知の方法（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  １３８−１６１）に従ったエチレングリコールの開環重合によって調製され得る。用語「ＰＥＧ」とは、サイズまたはＰＥＧの末端での修飾に関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、これは、式：Ｘ−−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）によって表されることができ、式中ｎが、２０〜２３００であり、Ｘが、Ｈ、または例えばＣ１〜４アルキルなどの末端修飾である。一実施形態では、本発明のＰＥＧは、１つの末端をヒドロキシまたはメトキシで末端処理する、すなわち、Ｘは、Ｈ、またはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要であるか、分子の化学合成から生じるか、または分子の一部の最適な距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含有することができる。加えて、このようなＰＥＧは、共に結合されている１つ以上のＰＥＧ側鎖からなることができる。２つ以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、多分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリストロール、およびソルビトールを含む、様々なポリオールへのポリエチレンオキサイドの添加によって調製され得る。例えば、４分岐ＰＥＧは、ペンタエリストリールおよびエチレンオキシドから調整され得る。分岐ＰＥＧは、例えば、ＥＰ−Ａ  ０  ４７３  ０８４および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの１つの形態としては、リジンの一級アミノ基を介して結合された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６（１９９５）６２−６９）。
【０１３２】
ＰＥＧ修飾ポリペプチドの血清クリアランス率は、非修飾結合ポリペプチドのクリアランス率と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらに９０％減少され得る。ＰＥＧ修飾ポリペプチドは、非修飾タンパク質の半減期と比較して、向上した半減期（ｔ１／２）を有し得る。ＰＥＧ結合ポリペプチドの半減期は、非修飾結合ポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％、またはさらに１０００％向上され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期は、緩衝食塩水または血清中などのインビトロで測定される。他の実施形態では、タンパク質半減期は、血清または動物の他の体液中のタンパク質の半減期など、インビボ半減期である。
【０１３３】
治療方法、製剤、および投与モード
本明細書に開示の抗体または抗原結合断片のいずれかは、このような治療方法に使用され得る。
【０１３４】
本開示は、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性を有するＳＴＡＴ３エピトープに結合するＩｇＧクラスの完全ヒト抗体、配列番号１〜４に記載の重鎖および軽鎖可変領域または表４の配列番号７〜１８に記載のＣＤＲドメインを含む、重鎖からの可変ドメイン領域と軽鎖からの可変ドメイン領域とを有するＦａｂ完全ヒト抗体断片、重鎖からの可変ドメイン領域、および軽鎖からの可変ドメイン領域、および重鎖可変ドメイン領域と軽鎖可変ドメイン領域とを結合するペプチドリンカーを有する、一本鎖ヒト抗体、からなる群から選択される抗ＳＴＡＴ３抗原結合タンパク質を投与することを含む、癌などの異常な細胞増殖を特徴とし得る疾患または症状を治療するための方法をさらに提供する。
【０１３５】
本発明の治療方法および組成物に使用され得る抗ＳＴＡＴ３抗体および抗原結合断片の例が上述されている。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、癌を治療するために使用される。上述のように、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、例えば、癌などの異常な細胞増殖を特徴とし得る任意の疾患または症状の治療または予防に使用することができる。多くのヒト固体腫瘍および血液腫瘍は、構成的ＳＴＡＴ３活性を持っている（Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２００９  Ｊａｎ：１８（１）：４５〜５６）。したがって、構成的ＳＴＡＴ３活性を有するいかなる癌も、本発明の抗体および抗原結合断片によって治療され得る。ある特定の実施形態では、癌は、固体腫瘍である。他の実施形態では、癌は、黒色腫、膠腫、髄芽腫、腎細胞癌、膵臓腺癌、卵巣癌腫、横紋筋腫、骨肉腫、膠芽腫、乳房、膵臓、卵巣、前立腺、肺、肝臓、結腸、結腸直腸、胃、頭部、首、および腎臓からなる群から選択される。一実施形態では、癌は、血液癌である。別の実施形態では、血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、毛様細胞性白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、巨核球性白血病、および大顆粒リンパ球性白血病から選択される。
【０１３７】
一実施形態では、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、単独で、または化学療法  放射線療法、免疫療法、外科的介入、またはこれらの任意の組み合わせなどの１つ以上の追加の治療法と組み合わせて、投与され得る。長期的な治療法は、上述のような他の治療戦略との関係においては、補助療法と同等に可能である。
【０１３８】
このような方法のある特定の実施形態では、本発明の１つ以上の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、共に（同時に）、または異なるときに（連続的に）投与され得る。加えて、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、癌を治療するためか、または血管新生を阻害するために、別のタイプの化合物と共に投与され得る。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、単独で使用することができる。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、診断目的のために標識されているか、または非標識であり得る。典型的には、診断アッセイは、ＳＴＡＴ３への結合ポリペプチドの結合から生じる複合体の形成を検出することを伴う。本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体および抗体断片は、抗体と同様に直接標識され得る。これらに限定されないが、放射性核種、蛍光発光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、およびリガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）などを含む種々の標識が、採用され得る。多数の適切な免疫学的検定は、当業者に既知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９０１，６５４号、および同第４，０９８，８７６号参照）。非標識のとき、結合タンパク質は、凝集アッセイなどのアッセイに使用され得る。非標識結合タンパク質はまた、結合タンパク質または他の好適な試薬（例えば、標識タンパク質Ａ）と反応性の標識抗体など、結合ポリペプチドを検出するために使用され得る別の（１つ以上の）好適な試薬と組み合わせて使用され得る。
【０１４１】
投与のための技術および用量は、特定の結合タンパク質のタイプに応じて異なり、治療される特定の症状は、当業者によって容易に決定され得る。一般に、監督官庁は、治療薬として使用されるタンパク質試薬が、許容可能に低いレベルの発熱性を有するように製剤化されることを要求している。したがって、治療製剤は、一般に、適切な監督官庁（例えば、ＦＤＡ）によって決定されるように、それらが実質的に発熱物質を含まないか、または少なくとも許容可能なレベル以下の発熱物質を含有する他の製剤とは区別されるであろう。
【０１４２】
本開示の抗原結合タンパク質を含む治療組成物は、単位投与量形態中に、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤と共に投与され得る。投与は、非限定的な例として、非経口（例えば、静脈内、皮下）、経口、または局所的であってもよい。加えて、本発明のポリペプチドをコードする核酸を使用する、裸ＤＮＡ送達、組み換え遺伝子およびベクター、患者細胞のエクスビボ操作を含む細胞系送達などの任意の遺伝子治療技術が、採用され得る。
【０１４３】
したがって、本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合部分は、非経口投与に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。好ましくは、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合部分は、０．１〜２５０ｍｇ／ｍｌの抗体を含有する注射液として調製されるであろう。注射液は、透明バイアルまたはアンバーバイアル、アンプルまたは事前に充填された注射器中の液体または凍結乾燥された剤形のいずれかで構成され得る。緩衝液は、最適には、ｐＨ５．０〜７．０（最適にはｐＨ６．０）で５〜１０ｍＭのＬ−ヒスチジン（１〜５０ｍＭ）であり得る。他の好適な緩衝液としては、これらに限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、またはリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、０〜３００ｍＭ（最適には、液体剤形では１５０ｍＭ）の濃度で溶液の毒性を調整するために使用され得る。凍結乾燥剤形では、凍結保護物質としては、主に０〜１０％（最適には０．５〜１．０％）のスクロースが含まれ得る。他の好適な凍結保護物質としては、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。凍結乾燥剤形では、充填剤としては、主に１〜１０％（最適には２〜４％）のマンニトールが含まれ得る。液体および凍結乾燥剤形の両方で、安定剤としては、主に１〜５０ｍＭ（最適には５〜１０ｍＭ）のＬ−メチオニンが使用され得る。他の好適な充填剤としては、グリシン、アルギニンが挙げられ、０〜０．０５％（最適には０．００５〜０．０１％）のポリソルベート−８０として挙げられ得る。追加の界面活性剤としては、これらに限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。
【０１４４】
本発明の組成物は、種々の形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体、および溶液（例えば、注射液および注入液）などの固体剤形、分散液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム、および坐剤が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与モードおよび治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体を用いたヒトの受動免疫のため使用されるものと同様の組成物などの、注射液または注入液の形態である。好ましい投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合部分は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい実施形態では、抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合部分は、筋肉内注射または皮下注射によって投与される。
【０１４５】
治療用組成物は、典型的には、製造および保管条件下で滅菌であり、安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の規則的な構造体として配合され得る。滅菌注射液は、活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）を、上に列挙された成分のうちの１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に必要な量で組み込み、続いて必要に応じて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒質および上に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のために滅菌され凍結乾燥された粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分に任意の追加の所望の成分を足した事前に滅菌濾過されたその溶液から、その粉末を得る、真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１４６】
本発明の抗ＳＴＡＴ３抗体、またはその抗原結合部分は、当該技術分野において既知の種々の方法によって投与され得るが、多くの治療用途では、好ましい投与経路／モードは、皮下注射、静脈内注射、または注入である。当業者には理解されるように、投与経路および／または投与モードは、所望の結果に応じて異なるであろう。ある特定の実施形態では、活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、急速な放出から化合物を保護することになる担体と共に調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製のための多くの方法は、特許取得されているか、または当業者に一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８）を参照されたい。
【０１４７】
治療有効用量とは、投与される医薬効果を生成する用量を指す。正確な用量は、治療される疾病に依存し、既知の技術を使用して当業者によって確認され得る。一般に、ポリペプチドは、一日当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは一日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは一日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば、毎日１回、２回、３回、または４回）、または好ましくはより少ない頻度で（例えば毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、または３か月に１回）与えられ得る。加えて、当該技術分野において既知であるように、年齢、ならびに体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時期、薬物相互作用、および疾患の重症度に応じた調節が必要であり得る。
【０１４８】
他の実施形態は、以下の非限定的な実施例に記載されている。
【実施例】
【０１４９】
実施例１．抗ＳＴＡＴ３抗体配列
ヒトＳＴＡＴ３に特異的な組み換えヒト抗体を、ヒトＳＴＡＴ３への特異性、およびＳＴＡＴ３への高い親和性（例えば、１０−６Ｍ以下のＫＤ）を含む、治療特徴で特定および選択した。特定した抗ＳＴＡＴ３抗体（抗体ＳＴ１Ａ５およびＳＴ３Ｇ１２と称される）の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列、およびそれらの相補的決定領域（ＣＤＲ）を、表１に記載する。
【０１５０】
【表１】
2019515955.tif 000008
【０１５１】
実施例２．ＳＴＡＴ３抗体結合
３つの抗ＳＴＡＴ３抗体、すなわち、ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、ＳＴ５Ｇ１２を発現させ、精製した。表記１Ａ５、３Ｇ１２、および５Ｇ１２とは、それぞれ、ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２およびＳＴ５Ｇ１２を指し、全体を通して互換的に使用される。
【０１５２】
抗体クローンＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、ＳＴ５Ｇ１２の結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおいて試験して、組み換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質の抗ＳＴＡＴ３抗体候補の結合を評価した。Ｕ２５１悪性膠芽腫細胞を９６ウェルプレートで一晩播種した。細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、Ｔｒｉｔｏｎ試薬で透過処理し、次いで、抗体候補の段階希釈液で１時間培養した。培養に続いて、細胞を洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合抗ヒトＩｇＧで３０分間培養した。プレートリーダーで、化学発光を測定した。ベバシズマブ（アバスチン）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を阻害するモノクローナル抗体を陰性対照として使用した。結果を図２Ａに示す。図２Ｂは、抗原（組み換えヒトＳＴＡＴ３タンパク質）への完全ヒト抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体の結合を評価するために実施されたＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。Ａｂ＃１、＃２、および＃３は、それぞれＳＴＡＴ３クローンＳＴ３Ｇ１２、ＳＴ１Ａ５およびＳＴ５Ｇ１２を示す。図２Ｂは、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２およびＳＴ５Ｇ１２の、ＳＴＡＴ３に対する感受性および特異性を示す。
【０１５３】
次に、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞およびＵ２５１細胞を使用する細胞結合アッセイで、抗ＳＴＡＴ３抗体候補の細胞標的への結合を試験した。細胞を９６ウェルプレートで一晩播種し、次いでＰＦＡで固定し、メタノールで透過処理した。細胞を、抗ＳＴＡＴ３抗体候補ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、およびＳＴ５Ｇ１２の段階希釈液で、１時間３０分間培養した。培養に続いて、細胞を洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）複合抗ヒトＩｇＧで３０分間培養した。蛍光を、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ高スループットフローサイトメトリー分析器で測定した。図３Ａおよび図３Ｂに示される結果は、このアッセイがＳＴＡＴ３に対して特異的であり、感受性があったことを示している。図３Ａは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（乳癌細胞株）における抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、およびＳＴ５Ｇ１２の結合を示し、図３Ｂは、Ｕ２５１細胞（膠芽腫）中における抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ１Ａ５、ＳＴ３Ｇ１２、およびＳＴ５Ｇ１２の結合を示す。ベバシズマブ（アバスチン）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を阻害するモノクローナル抗体を陰性対照として使用した。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体ＳＴ５Ｇ１２およびＳＴ３Ｇ１２は両方とも、ＳＴＡＴ３を結合し、ＳＴ５Ｇ１２は、特に強い結合剤である。ＳＴ１Ａ５抗体は、抗体ＳＴ５Ｇ１２およびＳＴ３Ｇ１２と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＵ２５１細胞とのＳＴＡＴ３の強力な結合を示さなかった。
【０１５４】
図３Ｃは、抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体ＳＴ３Ｇ１２の、ヒト細胞株ＨｅＬａおよびＵ２５１ならびにマウス細胞株ＣＴ−２６およびＭＣ−３８への結合を示す。アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。実験手順は、図３Ａおよび３Ｂについて上述のものと同じであった。図３Ｃに示されるように、抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体は、ヒトＨｅＬａおよびＵ２５１細胞株への強力な結合を示し、かつＣＴ−２６およびＭＣ−３８マウス細胞株にマウスＳＴＡＴ３を認識することができた。
【０１５５】
裸抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２抗体（ＳＴ３Ｇ１２）対化合物９０１（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）の細胞結合をＵ２５１細胞中で評価した。細胞を持ち上げ、透過処理し、ＰＢＳ＋／−２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、増加量の裸抗ＳＴＡＴ抗体およびＰＳ抗ＳＴＡＴ抗体（化合物９０１）を培養した。室温で４５分後、細胞を２回洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）複合抗ヒトＩｇＧで２０分間、室温暗所で培養した。次いで細胞を洗浄し、高スループットフローサイトメトリー（ＨＴＦＣ）によって分析した。Ｕ２５１細胞への抗体結合の評価の結果を、図４に示す。図４に記載されるように、裸抗ＳＴＡＴ３抗体、ＳＴ３Ｇ１２の結合は、複合抗ＳＴＡＴ３抗体、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）のものよりも大幅に低い。ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体（化合物９０１）では、ＳＴＡＴ３発現レベルとは関係なく、裸抗体に対して各細胞株中により高い結合が検出された。
【０１５６】
次に、抗ＳＴＡＴ３抗体（裸抗ＳＴＡＴ３抗体、および抗ＳＴＡＴ３−ＰＳとして以下で標識されるＰＳ複合化合物９０１）の結合親和性を測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用して、抗ＳＴＡＴおよび抗ヒトＳＴＡＴ−チオリン酸塩（ＰＳ）抗体（化合物９０１）のヒトＳＴＡＴ３に対する親和性を測定した。標準ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング法を使用して、抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９）をＣＭ５センサチップ上に、およそ１０００ＲＵに固定化した。抗体（およそ１０ｕｇ／ｍｌ）を、１０ｕｌ／分の流速で６０秒間捕捉した。組み換えヒトＳＴＡＴ３−ＧＳＴを２倍に段階希釈して、泳動用緩衝液（ＨＢＳ−ＥＰ＋、１００ｎｍから開始）とした。全ての測定を、流速３０ｕｌ／分で行った。表面を３Ｍ  ＭｇＣｌ２（ヒト抗体キットから）で６０秒間再生した。１：１（ラングミュア）結合モデルを使用してデータを適合させた。抗ＳＴＡＴ３抗体、ＳＴ３Ｇ１２、および複合抗ＳＴＡＴ３抗体、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）の結果を、以下の表２に示す。
【０１５７】
【表２】
2019515955.tif 000009
【０１５８】
表２に記載されるように、裸抗ＳＴＡＴ３抗体の複合体（化合物９０１）は、抗体のＳＴＡＴ３への親和性を改善した。表２のデータは、非修飾抗ＳＴＡＴ３抗体と比較すると、複合抗体化合物９０１（「抗ＳＴＡＴ３−ＰＳ」）が、より高い親和性で抗原を結合すること（ＫＤが小さいほど、その抗原に対する抗体の親和性が高くなる）を示している。非修飾抗ＳＴＡＴ３抗体またはＰＳ修飾抗体のいずれかのＧＳＴタンパク質への結合は、アッセイで観察されず、抗原−抗体の相互作用速度の差が結合親和性の差に寄与することを示唆している。
【０１５９】
非修飾抗体および修飾抗体（化合物９０１）の結合もまた、上述のＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて試験した。結果を図５および図６に示す。ＳＴ３Ｇ１２抗体のＰＳ修飾化合物９０１バージョン（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）は、非修飾ＳＴ３Ｇ１２抗体よりもわずかに低い結合を示した。しかしながら、ＥＣ５０は同じであった。これらの結果を考慮すると、ＰＳ修飾が検出に干渉した可能性がある。非修飾ｃ−ｍｅｔ抗体（ｃＭｅｔ（Ｈ８Ａ２））、および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を有する化合物９０１である、ＰＳ修飾ｃ−ｍｅｔ抗体（ｃＭｅｔ（Ｈ８Ａ２）−ＰＳ）を、対照として使用した。抗ｃＭｅｔクローンＨ８Ａ２は、参照によりその全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１３１９２５９４に記載されている。図３０はまた、上述のようにＳＴＡＴ３  ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて試験した、ＰＳ修飾抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）および抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体の結合を比較する実験からの結果を示す図３０に示されるように、修飾は、抗体とその抗原との間の結合親和性に実質的に影響しない。
【０１６０】
実施例３．抗ＳＴＡＴ３抗体蓄積および内在化
様々な試験細胞株における相対的なＳＴＡＴ３レベルを、図７Ａおよび図７Ｂに示す。ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）、正常ヒト星状細胞（ＮＨＡ）、正常結腸線維芽細胞（ＣＣＤ−１８ＣＯ）、正常乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）、膠芽腫（Ｕ２５１）、トリプルネガティブ乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、トリプルネガティブ乳癌（ＨＣＣ１９５４）、およびＥＲ＋乳癌（ＭＣＦ−７）のＳＴＡＴ３の合計レベルおよびリン酸化ＳＴＡＴ３（ホスホ−ＳＴＡＴ３）のレベルが、図７Ａに示されている。リン酸化ＳＴＡＴ３のレベルを、ホスポ−ＳＴＡＴ３に対する抗体を使用して、フローサイトメトリーによって測定した。使用された対照は、一次抗体単独、二次抗体単独、および対照ＩｇＧと一致するアイソタイプであった。図７Ｂは、これらの細胞のリン酸化ＳＴＡＴ３対合計ＳＴＡＴ３の比（Ｐ／Ｔ  ＳＴＡＴ３比）を示す。
【０１６１】
正常乳房上皮細胞（ＭＣＦ−１０Ａ）およびＥＲ＋乳癌細胞（ＭＣＦ−７）を、裸ＳＴ３Ｇ１２抗体および複合ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体（化合物９０１）（図８Ａおよび８Ｂに「ＯＳ−ＳＴＡＴ３」として示さる）で処理し、ＳＴＡＴ３リン酸化への効果を測定した。細胞を抗体で一晩前処理し、次いで、様々な濃度のＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌまたは４０ｎｇ／ｍｌ）で２０分間刺激した。ＩＬ−６は、ＳＴＡＴ３活性化剤である。次いで、細胞を溶解し、タンパク質溶解物をＥＬＩＳＡにかけて、リン酸化状態を測定した。ＭＣＦ−１０細胞について図８Ａに示される結果、およびＭＣＦ−７細胞について図８Ｂに示される結果は、裸ＳＴ３Ｇ１２抗体またはＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１のＳＴＡＴ３リン酸化への効果がほとんどないことを示している。これらの結果は、ＳＴ３Ｇ１２抗体エピトープが、ＳＴＡＴ３リン酸化部位と干渉していないことを示唆している。「ＯＳ−ＡＩＰ」とは、対照として使用されるオリゴ糖複合細菌ＡＩＰタンパク質を指す。
【０１６２】
ヒト血清の割合を増加して（１％、５％、１０％、および２０％）、高レベルのＳＴＡＴ３活性（高ＳＴＡＴ３）（図７Ａ参照）を有するＭＤＡ−ＭＢ−４６８トリプルネガティブ乳癌細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）を用いて３７℃で９０分間処理し、ＳＴＡＴ３活性化を誘導した。次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５４６を用いて染色した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞内でＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）が蓄積され、血清濃度が増加すると蓄積増加が見られることが見出された。
【０１６３】
図７Ａに記載されるように高レベルのＳＴＡＴ３活性を有するＵ２５１膠芽腫細胞株内でも、同じ実験を繰り返した。ヒト血清の割合を増加して（１％、５％、１０％、および２０％）、Ｕ２５１細胞を、１０ｕｇ／ｍｌのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１を用いて３７℃で９０分間処理した。次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５４６を用いて染色した。Ｕ２５１細胞内でＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）が蓄積し、血清濃度が増加すると蓄積増加が見られることが見出された（データは示さず）。低いレベルのＳＴＡＴ３活性（低ＳＴＡＴ３）を有するＭＣＦ−１０Ａ、正常ヒト乳房上皮細胞株が、図７Ａおよび７Ｂに記載されている。この細胞株もまた、上記のプロトコルに従って試験した。血清濃度が増加すると（１％、５％、１０％、および２０％血清）、ＭＣＦ−１０Ａ細胞内でＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）が蓄積することが見出された（データは示さず）。抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（例えば化合物９０１）の蓄積を測定するために実施された別の実験の結果を、図７Ｃに示す。図７Ｃは、ＨｅＬａ細胞の点状抗体の数による内在化抗体の定量化を示す。
【０１６４】
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（高ＳＴＡＴ３）内の抗ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）の蓄積を示す時系列実験を実行した。細胞を、９６ウェルプレートで一晩播種した。２０ｕｇ／ｍｌのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ−Ａｌｅｘａ４８８抗体（化合物９０１−Ａｌｅｘａ４８８）を、０．５、２、４、６、８、および２４時間の表示時間の間添加した。表示時間の間抗体で培養した後、細胞を固定し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用して撮像した。図９Ａ（ｉ）および（ｉｉ）は、時間が増加すると抗体の蓄積が増加したことを示している。パネル（ｉｉ）は、細胞数に正規化されたパネル（ｉ）からのデータを示している。図９Ｂ（ｉ）および（ｉｉ）は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞（低ＳＴＡＴ３）で実施された同じ実験を示している。低ＳＴＡＴ３  ＭＣＦ−１０Ａ細胞を用いて行われた実験からの結果は、高ＳＴＡＴ３  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞からのものと同様であり、これはＰＳ−ＳＴ３Ｇ１２（化合物９０１）の蓄積が、時間の増加に伴って増加したことを示している。
【０１６５】
図９Ｃおよび９Ｄは、実行されたＥＬＩＳＡ実験の結果を示し、ＰＳオリゴマーを用いたＳＴ３Ｇ１２抗体の修飾が、その結合親和性に影響しなかったことを示している。ＳＴ３Ｇ１２−非修飾とは、非修飾ＳＴ３Ｇ１２抗体を指し、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳとは、ＰＳ修飾ＳＴ３Ｇ１２抗体を指す（図９Ｃ）。図９Ｄは、実行されたＥＬＩＳＡ実験の結果を示し、抗体の修飾が、その結合親和性に影響しなかったことを示している。ＳＴ３Ｇ１２−非修飾とは、非修飾抗ＳＴＡＴ３抗体を指し、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳとは、ＰＳ修飾抗ＳＴＡＴ３抗体（化合物９０１）を指す。
【０１６６】
高レベルのＳＴＡＴ３活性（高ＳＴＡＴ３）を有するＭＤＡ−ＭＢ−４６８トリプルネガティブ乳癌細胞を、ヒト血清の割合を増加して（１％、５％、１０％、および２０％）、１０ｕｇ／ｍｌのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳを用いて３７℃で９０分間処理し、ＳＴＡＴ３活性化を誘導した。次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗ヒトＩｇＧ  Ａｌｅｘａ５４６を用いて染色した。１０Ａの結果は、ＳＴ３Ｇ１２複合体が、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞内で蓄積し、血清濃度が増加すると蓄積増加が見られることを示している。
【０１６７】
実施例５．抗ＳＴＡＴ３−ＰＳの細胞取り込み
ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体（化合物９０１）が細胞に浸透したことを確認するための実験を実行した。要約すると、事前に洗浄したガラスカバースリップを、３７℃で２時間コラーゲンを用いてコーティングした。１００，０００個のＵ２５１細胞をカバースリップに播種した。培地を除去し、細胞をフルオロブライト（ｆｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ）で一回すすいだ。次に、２０ｕｇ／ｍＬの特定の抗体を、３７℃で２時間添加した。細胞を４％ＰＦＡ中で１５分間固定し、次いで０．１％ＴｒｉｔｏｎＸで１５分間透過処理した。細胞を３％ＢＳＡで３０分間ブロックし、１：２５０のＧＡＨ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８を１時間添加した。次に、２００倍の小麦胚凝集素Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ５５５（ＷＧＡ５５５）および１：１０００ＤＡＰＩを、３０分間添加した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、プロロング金褪色防止剤（ｐｒｏｌｏｎｇ  ｇｏｌｄ  ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）で封入した。顕微鏡法を使用して、全ての化合物９０１ａおよび化合物９０１で処理した試料から細胞浸透が観察されることが見出された。陰性対照、非修飾ＳＴ３Ｇ１２抗体は、内在化を示さなかった。（化合物９０１ａについての）結果を図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｅに示し、これらは、蛍光染色検出を使用して、（図１０Ａおよび１０Ｂに示される）もの、および化合物９０１ａ（図１０Ｅに示される）が細胞に浸透したことを示す。図１０Ｂでは、Ｕ２５１細胞を、ヒト血清の割合を増加して（１％、５％、１０％、および２０％）、１０ｕｇ／ｍｌのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体（複合化合物９０１）を用いて３７℃で９０分間処理した。図１０Ｂに示されるように、化合物９０１は細胞に浸透した。図１０Ｅは、Ｕ２５１細胞中のＳＴ３Ｇ１２およびＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の内在化の共焦点顕微鏡画像である。図１０Ｅに示される結果は、ＳＴ３Ｇ１２抗体複合体（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）が細胞に浸透することができることを示している。図１０Ｃは、血清濃度をさらに増加したＭＣＦ−１０Ａヒト正常乳房上皮細胞中での、図１０Ａに記載のものと同じ実験の結果を示す。図１０Ｃに示されるように、化合物９０１は細胞に浸透した。図１０Ｄは、５ｕｇ／ｍＬおよび１０ｕｇ／ｍＬのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１ａ）で処理したＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞の顕微鏡画像を示す。
【０１６８】
別個の実験（図示せず）では、抗ＳＴＡＴ３−ＰＳ抗体（化合物９０１）が細胞に内在化し、ＳＴＡＴ３活性化の際に細胞核周囲に再分配されたことが示された。ＭＣＦ−１０Ａ細胞（５，０００個細胞／ウェル）を、血清なしまたは２０％ヒト血清で一晩培養し、ＳＴＡＴ３活性化を誘導した。１０ｕｇ／ｍｌの修飾抗ＳＴＡＴ３抗体（ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ）を、２時間細胞に添加した。Ａｌｅｘａ５４６に複合した抗ヒトＩｇＧを用いて染色した細胞の細胞内抗体を、ＥＶＯＳ顕微鏡によって視覚化した。
【０１６９】
図１１Ａおよび１１Ｂは、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の内在化への効果を示す。図１１Ａは、Ｕ２５１細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体の内在化への温度効果を示す。Ｕ２５１細胞を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ＮＨＳ４８８標識を含む１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗ＳＴＡＴ３抗体化合物９０１で培養した。結果は、４℃および３７℃で抗体複合体が内在化した経時的な細胞数に相当する、緑色の物体数／ｍｍ２として示される。図１１Ａでは、Ｕ２５１細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳの内在化が、３７℃の場合約４５〜６０分で、４℃の場合約３００分でピークが現れた。図１１Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１の内在化への温度効果を示すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を、Ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ  ＮＨＳ４８８標識を含む１０ｕｇ／ｍｌの濃度のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体（化合物９０１  Ａｌｅｘａ４８８）で培養した。結果を、４℃および３７℃で抗体複合体が内在化した経時的な細胞数に相当する、緑色の物体数として示す。図１１Ｂでは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞中のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳの内在化が、３７℃の場合約２４０分で、４℃の場合約１２０分でピークが現れた。
【０１７０】
ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１の細胞取り込みを測定するために、時系列分析も実行した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（高ＳＴＡＴ３）およびＭＣＦ−１０Ａ（低ＳＴＡＴ３）細胞を、５０００個細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、Ａｌｅｘａ４８８で標識された２０ｕｇ／ｍｌの修飾抗ＳＴＡＴ３抗体化合物９０１を、以下の時間：０．５時間、２時間、４時間、６時間、８時間、および２４時間の間、細胞に添加した。次いで細胞を固定し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを使用して撮像した。図１２Ａは、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）が、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞内で蓄積したことを示している。図１２Ｂは、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）が、ＭＣＦ−１０Ａ細胞内で蓄積したことを示している。両方の細胞株では、６時間で蓄積のピークが現れた。次に、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１が細胞に進入した機構を調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（高ＳＴＡＴ３）およびＭＣＦ−１０Ａ（低ＳＴＡＴ３）細胞を、ウェル当たり５，０００個の細胞で、９６ウェルプレートで一晩播種した。クラスリン阻害物質Ｐｉｔｓｔｏｐ２（６０ｕＭ）またはカベオリン阻害物質フィリピン（１ｕｇ／ｍｌ）を用いて、細胞を３０分間処理した。２０ｕｇ／ｍｌのＯＳ−ＳＴＡＴ３−Ａｌｅｘａ４８８（化合物９０１−Ａｌｅｘａ４８８）抗体を、さらに３０分間添加した。ビヒクル単独を、対照として使用した。次いで細胞を固定し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅを用いて撮像した。図１３は、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体化合物９０１が、エンドサイトーシス非依存性機構を使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８（高ＳＴＡＴ３）腫瘍細胞に進入したことを示している。
【０１７１】
カベオリンおよびクラスリン依存性ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合体（化合物９０１）の仲介取り込みを、ＭＣＦ−１０Ａ細胞において調べた。クラストリン介在性エンドサイトーシスは、細胞質ゾルタンパク質クラスリンと主に関連するタンパク質の複合体で構成される、形質学的に特性のあるコーティングを有する小さなビヒクルによって仲介される。カベオラは、最も一般的な、報告されている非クラスリンコーティング原形質膜の芽状突起であり、全てではないが多くの細胞型の表面に存在する。それらは、コレステロール結合タンパク質カベオリン（Ｖｉｐ２１）からなり、コレステロールおよびグリコピドに富んだ二重層を有する。両者とも、クラスリンがエンドサイトーシスを仲介し、かつカベオラが細胞外の分子を細胞内に輸送する。ウェル当たり５，０００個の細胞を、９６個のウェルプレートで一晩播種した。細胞を、クラスリン阻害物質Ｐｉｔｓｔｏｐ２（３０ｕＭまたは６０ｕＭ）、またはカベオリン阻害物質フィリピン（０．５ｕｇ／ｍｌまたは１．０ｕｇ／ｍｌ）で、３０分間前処理した。２０ｕｇ／ｍｌのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ−Ａｌｅｘａ４８８（化合物９０１−Ａｌｅｘａ４８８）抗体を、さらに３０分間添加した。細胞を固定し、ＩｎｃｕＣｙｔｅを用いて撮像した。ＤＭＳＯおよび抗体のみを対照として使用した。図１４に示されるように、３０ｕＭおよび６０ｕＭの濃度でのクラスリン阻害剤ＰＳ２を用いた処理は、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）の取り込みを阻害し、一方で、カベオリン阻害剤、フィリピンを用いた処理は、０．５ｕｇ／ｍｌの濃度でほとんど効果なく、１．０ｕｇ／ｍｌの濃度ではより大きい効果があった。図１４パネル（ｉｉ）は、細胞数に正規化されたデータを示している。図１５は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（高ＳＴＡＴ３）細胞で実施された同じ実験の結果を示す。
【０１７２】
実施例６．抗ＳＴＡＴ３抗体の細胞進入の温度依存性
ＰＳで修飾された抗ＳＴＡＴ３抗体の進入が、温度に依存しているかを測定するための実験を実行した。１０，０００個のＵ２５１細胞を播種した。２０ｕｇ／ｍＬの濃度のＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ複合体（化合物９０１）を、３７℃または４℃で選択された時間の間培養し、次いで４％ＰＦＡ中で固定した。細胞を、０．１％のｔｒｉｔｏｎＸで透過処理し、次いで３％のＢＳＡでロックし、１：２５０  Ａｌｅｘａ４８８  ＧＡＨ  ＩｇＧで処理した。次いで細胞を洗浄し、撮像した。結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。図１６Ａは、時間の増加に伴って緑色の物体数が増加しなかった、４℃でのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）の阻害を示している。３７℃でのＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）では、緑色の物体数は２４０分まで増加した。２４０分後は、徐々に減少または横ばい状態のいずれかであった。図１６Ｂは、図１６Ａに記載の実験からの２４０分の時点（「３７℃１」および「４℃１」）を、第２の実験の２４０分の時点（「３７℃２」および「４℃２」）と比較している。４Ｃでのシグナルは、ほぼ同じく維持されたが、３７℃でのシグナルは大きく増加したことが観察された。
【０１７３】
実施例７．ＣＯＬＯ２０５におけるＩＬ−２６−ＳＴＡＴ３経路のブロッキング
ＳＴＡＴ３下流遺伝子の発現への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を調べた。ＳＴＡＴ３は、ＳＩＥ（ｓｉｓ−誘導性要素）と相互作用し、それにより遺伝子の転写を誘導する。一方はＴＡＴＡボックスのＳＩＥ上流のタンデムリピートを有し、他方は、ＳＩＥタンデムリピートを有さず対照として機能する、２つの構造体を使用した。これらの構造体の概略を図１７Ｃに示す。まず、ＨｅＬａまたはＵ２５１細胞中のレポーター活性への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を試験した。図１７Ｄは、ＨｅＬａ細胞中のＳＴＡＴ３レポーターアッセイの結果を示す。図１７Ｅは、Ｕ２５１細胞中のＳＴＡＴ３レポーターアッセイの結果を示す。ビヒクルと比較したレポーター活性の誘導パーセントを報告した。オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＪＡＫ活性化剤を使用して、ＪＡＫを活性化した。活性化されたＪＡＫは、受容体および主要基質の両方を含むさらなる標的、ＳＴＡＴをリン酸化する。ＳＴＡＴ３  ＳＨ２ドメイン阻害剤５、１５−ＤＰＰも使用した。細胞を図１７Ｃに示す構築物でトランスフェクトし、次いで、活性化剤または阻害剤の存在下で示される抗体を用いて処理した。ルシフェラーゼレポーターアッセイによってＳＴＡＴ３−下流転写活性を測定した。図１７Ｄおよび図１７Ｅに示されるように、対照抗体複合体、抗体無し、および抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体と比較して、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体は、ＳＴＡＴ３レポーター活性を減少させた。
【０１７４】
次に、抗ＳＴＡＴ３−ＰＳ抗体（例えば、化合物９０１）が、ＩＬ−２６誘導ＩＬ−１０サイトカインおよび抗アポトーシス遺伝子ＢＣＬ２Ｌ１およびＢＩＲＣ５の発現をブロックすることができるかどうかを試験するための実験を実行した。要約すると、ＣＯＬＯ２０５細胞を、１２ウェルプレートに１００ｋ／ウェルで播種した。５０ｕｇ／ｍＬのＰＳ−ＯＰＲＦ（対照として使用された、ＰＳに複合されたＯＰＲＦ細菌タンパク質に対する抗体）、非修飾ＳＴ３Ｇ１２、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ（化合物９０１）、または１ｕＭのＪＡＫ阻害剤トファシチニブを用いて、細胞を３７℃で９０分間事前に培養した。細胞を、２．５ｕｇ／ｍＬのＩＬ−２６（０．１％ヒト血清担体タンパク質）で一晩刺激した。一晩刺激後、ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、続いてｒｔＰＣＲを行った。結果を図１７Ａに示す。図１７Ａに示されるように、ＩＬ−２６は、ＩＬ−１０、ＢＣＬ２Ｌ１（ＢＣＬ−ＸＬ、ＳＴＡＴ３下流増殖／生残遺伝子）、およびＢＩＲＣ５（サバイビン）の発現を刺激し、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１によって顕著に逆転された。図１７Ｂは、上述のものと同じ方法を使用して、化合物９０１で処理されたＣｏｌｏ２０５細胞における、ＳＴＡＴ３下流遺伝子の発現を評価するために実施された実験の別の設定を示す。図１７Ｂに示されるように、ＩＬ−２６はＩＬ−１０の発現を刺激し、ＢＣＬ２Ｌ１は、ＳＴ３Ｇ１２−ＰＳ抗体複合化合物９０１によって顕著に逆転された。
【０１７５】
実施例８．２次元および３次元腫瘍細胞成長への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体の効果
２次元（２Ｄ）腫瘍成長アッセイにおける、抗ＳＴＡＴ３複合体（化合物９０１）に対する腫瘍細胞の薬剤感受性を測定するための実験を実行した。図１８Ａは、２Ｄアッセイでの、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を増加して生じるＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞の殺傷パーセントを示す。３連ウェル中で、ＭＴＳアッセイによって成長を監視した。誤差バーは、１つの標準偏差を示す。９６ウェルプレートで、４×１０３／ウェルの密度で細胞をプレートした。細胞を示される抗体で７２時間処理した。図１８Ｂは、２Ｄアッセイでの、抗体濃度（μｇ／ｍｌ）を増加して生じるＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞の殺傷パーセントを示す。細胞の処理後３日間のＡｂｓを示す、細胞生存率アッセイをＣＴＧによって測定した。
【０１７６】
細胞の処理後７２日間の抗体を示す、細胞生存率をＣＴＧによって測定した。誤差バーは、１つの標準偏差を示す。図１８Ａおよび１８Ｂに示されるように、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、ヒト癌細胞の細胞生存率を低減した。
【０１７７】
次に、腫瘍細胞の浸透および３次元（３Ｄ）モデルにおける腫瘍細胞の成長への、ＳＴＡＴ３抗体複合体の効果を測定するための実験を実行した。腫瘍スフェロイドモデルなどの３Ｄインビトロモデルは、インビトロ癌細胞株培養物とインビボ腫瘍との間の中間モデルとして癌研究に使用されてきた。ヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞を、ＵＬＡ（超低接着表面）プレート内の３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルで成長させ、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ４８８色素で標識された抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体、またはａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒで標識された抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）を用いて１時間処理して、取り込みを開始させた。その後、ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓを用いて、１０分毎に次の８０時間の間球体を撮像した。図１８Ｃ（ｉ）および（ｉｉ）は、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒの検出を示す画像である。図１８Ｃに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、腫瘍スフェロイドに浸透することができたが（ｉｉ）、一方で抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体は浸透しなかった（ｉ）。図１８Ｃ（ｉｉ）の矢印は、ａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒの検出を示している。次に、３Ｄ腫瘍スフェロイドの成長への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を調べた。ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞を、ＵＬＡプレートに播種した。球体を７２時間形成させ、次いで、さらに５日間示された抗体で処理した。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  ＨＣＳ共焦点顕微鏡によって、成長を監視した（図１９Ａ）。ＣＴＧアッセイを使用して、図１９Ｂの生存パーセント、および図１９Ｃの殺傷パーセントを測定した。３連ウェル中で、実験を行った。誤差バーは、１つの標準偏差を表す。図１９Ａに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、３Ｄ腫瘍スフェロイドの成長を低減した。図１９Ｂは、抗体複合体（化合物９０１）が、細胞生存パーセントを減少することを示している。図１９Ｃは、抗体複合体（化合物９０１）が細胞の殺傷パーセントを増加することを示している。
【０１７８】
３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルでの膠芽腫の成長への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を試験した。膠芽腫細胞を、上述のように３Ｄ培養で成長させた。抗ＳＴＡＴ３モノクローナル抗体、対照抗体複合体（抗ＯｐｒＩ−ＰＳ）、または抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（例えば化合物９０１）を用いて、細胞を処理した。カルセインＡＭ生細胞染料、細胞生存率を測定するために使用され得る細胞透過性色素を用いて、生細胞を染色した。生細胞中で非蛍光カルセインＡＭは、緑色蛍光カルセインに変換される。図２０Ａに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、スフェロイドのサイズを低減することができる。図２０Ａに示される結果はまた、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、形質学的特徴によって示されるように分化した表現型を誘導し得ることを示す。膠芽腫および神経芽細胞腫では、臨床挙動と腫瘍細胞分化の段階との間での緊密な関係が認識されてきており、より高度の分化は、低度の分化よりもより良好な予後を示す。したがって、図２０Ａに示される結果はまた、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が分化を誘導し、それにより、より良好な予後をもたらし得ることを示している。
【０１７９】
３Ｄ腫瘍成長アッセイで、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）に対する薬剤感受性を、患者由来の典型的な膠芽腫（ＧＢＭ）間葉系細胞で試験した。図２０Ｂは、生細胞にカルセインＡＭ（緑色）、死細胞にエチジウムホモ二量体−１（赤色）、および核細胞にＨｏｅｃｈｓｔ（青色）の、蛍光マーカーを用いて染色したスフェロイドのＨＣＳ共焦点画像を示す。スフェロイドの２Ｄ直径に基づいて、ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアによって平均合計面積を計算した。図２０Ｃは、それぞれ、修飾された対照ＩｇＧ（抗ＯｐｒＩ−ＰＳ）、および修飾されたＳＴＡＴ３ｍＡｂｓ（化合物９０１）を用いた処理後の、腫瘍スフェロイドの平均合計面積を示す。ＡＺＤ１４８０は、ＪＡＫ阻害剤である。３Ｄ腫瘍成長アッセイで、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）に対する薬剤感受性を、患者由来の典型的な膠芽腫（ＧＢＭ）で試験した。図２０Ｄは、３Ｄスフェロイド培養物の生存細胞の指標として、細胞内のＡＴＰレベルを示す。このために、細胞を９６ウェルプレートに播種し、スフェロイドを４日間形成させた。ＧＢＭスフェロイドを、さらに７日間示された抗体の増加量で処理し、ＣＴＧ３Ｄアッセイを使用して、細胞生存率を分析した。図２０Ｄおよび図２０Ｅは、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（例えば化合物９０１）が、腫瘍スフェロイドのサイズを低減することができることを示している。
【０１８０】
典型的なＧＢＭの癌幹細胞遺伝子への抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果の機能評価を実施した。結果を図２０Ｆおよび図２０Ｇに示す。図２０Ｆは、各試料の組（ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）での処理対対照抗体複合体（例えば抗ＯｐｒＩ−ＰＳ処理）からの遺伝子発現のレベルでのシグナル強度の散布図が示されている図２０Ｇは、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）によって減少された癌幹細胞遺伝子を示す。図２０Ｇに示されるように、ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）または対照抗体複合体（抗ＯｐｒＩ−ＰＳ）で処理したスフェロイドから、ＲＮＡを抽出した。次いで、合計ＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、リアルタイム定量ＰＣＲによってＳＴＡＴ３下流ステムネス（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）遺伝子の転写レベルを測定した。図２０Ｆおよび図２０Ｇに示される結果は、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、ＧＢＭスフェロイド中のステムネス遺伝子発現を減少することができることを示している。
【０１８１】
実施例９．マウスにおける抗ＳＴＡＴ３抗体複合体の薬物動態学
抗ＳＴＡＴ３抗体複合体の薬物動態特性を、胸腺欠損ヌードマウスで調べた。結果を図２１Ａおよび以下の表３に示す。図２１Ａに示されるように、マウスに静脈投与された抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、許容可能な薬物動態を呈した。
【０１８２】
【表３】
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【０１８３】
ヒト血清中の抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の安定性を試験した。結果を図２１Ｂに示す。図２１Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、７日間の培養期間中に高い血清安定性を有した。ＰＳオリゴのおよそ６０％は、抗体に結合して維持されている。
【０１８４】
実施例１０．抗ＳＴＡＴ３抗体複合体の炎症性サイトカインまたはケモカイン応答への効果
６人のドナーのコホートのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からの炎症性サイトカインおよびＴＬＲ下流サイトカイン／ケモカインの放出への、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）の効果を調べた。以下の化合物：サイトカイン活性化剤の陽性対照としてＡＮＣ２８．１（抗ＣＤ２８）およびＯＫＴ３（抗ＣＤ３）、対照ＩｇＧ、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）、ＰＳオリゴ、および抗ＳＴＡＴ３  ＳＴ３Ｇ１２モノクローナル抗体を試験した。ＰＭＢＣを、示される抗体またはオリオで２４時間培養した。２４時間後、サイトカイン検出のために、条件培地を収集した。０．１、１、１０、および１００μｇ／ｍｌで、化合物を試験した。モノクローナル抗体では、６２５ｎＭは１００μｇ／ｍＬに等しく、６２．５ｎＭは１０μｇ／ｍＬに等しく、６．２５ｎＭは１μｇ／ｍＬに等しく、０．６２５ｎＭは０．１μｇ／ｍＬに等しい。図２２Ａに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−２の放出を刺激しなかった。図２２Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−６の放出を刺激しなかった。図２２Ｃに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−８の放出を刺激しなかった。図２２Ｄに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、ヒトＰＭＢＣからのＩＦＮ−γの放出を刺激しなかった。示されていないが、試験した他のサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＴＮＦαを含む。これらの結果を総合すると、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）が、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からの炎症性サイトカインおよびＴＬＲ下流サイトカイン／ケモカインの放出を刺激しないことを示す。
【０１８５】
２人のドナーのコホートからのＴｏｌｌ様受容体下流サイトカインおよびケモカイン応答の効果を試験した。定量化の限度を測定するために、サイトカイン標準物質を希釈して１２種の標準濃度を生成した。各サイトカイン標準物質を使用して、１２点の標準曲線を生成した。ＭｕｌｔｉＣｙｔ  Ｑｂｅａｄｓ  ＰｌｅｘＳｃｒｅｅｎプラットホームを使用して、標準物質の既知の濃度を４種で測定した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）として、未加工のデータを測定した。１２種の標準物質から生成された４−ＰＬＬ曲線を用いて、試料の濃度を補間した。実際の添加濃度のパーセンテージとして表される、回収された濃度として、精度を測定した。精度の許容基準を、実際の添加濃度の±３０％回収で設定した。定量化の下限値（ＬＬＯＱ）を、精度の許容基準内の最低濃度を少なくとも超える最低標準を使用して測定した。統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、ｐ≦０．００１；＊＊＊＊、ｐ≦０．０００１）を使用する、ＡＮＯＶＡ（単一の合併分散でのダネットの多重比較試験）によって行った。図２３（ｉ）〜（ｖｉ）は、（ｉ）ＴＮＦα、（ｉｉ）ＩＬ−６、（ｉｉｉ）ＩＬ−８、（ｉｖ）ＣＣＬ５、（ｖ）ＣＣＬ４、および（ｖｉ）ＩＦＮαのＭｕｌｔｉＣｙｔ  Ｑｂｅａｄｓ  ｐｌｅｘｓｃｒｅｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍでの検出範囲を示す標準曲線示す。
【０１８６】
２人のドナーのコホートからのＴｏｌｌ様受容体下流サイトカインおよびケモカイン応答の効果を試験した。ＰＭＢＣを、示される抗体またはオリゴで２４時間培養した。２４時間後、サイトカイン検出のために、条件培地を収集した。上述のＭｕｌｔｉＣｙｔ  Ｑｂｅａｄｓアッセイを、ＴＬＲ下流サイトカイン、およびケモカイン：ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、およびＩＦＮαの検出のために使用した。以下の化合物：ＯＤＮ２３９５、ＯＤＮ５３２８、ＰＳオリゴ、および抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）を試験した。ＯＤＮ２３９５は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬であり、陽性対照として機能する。ＯＤＮ５３２８は、ＧｐＣ対照である。両方とも、チオリン酸塩骨格を有する。１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、および３１．２５ｎＭで、化合物を試験した。化合物濃度（ｎＭ）をｘ軸上に示し、条件培地で検出されサイトカイン／ケモカイン（ｐｇ／ｍＬ）をｙ軸上に示す。
【０１８７】
図２４Ａおよび図２４Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体（化合物９０１）は、ヒトＰＭＢＣからのＴＮＦαの放出を刺激しなかった。図２５Ａおよび図２５Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体は、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−６の放出を刺激しなかった。図２６Ａおよび図２６Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体は、ヒトＰＭＢＣからのＩＬ−８の放出を刺激しなかった。図２７Ａおよび図２７Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体は、ヒトＰＭＢＣからのＣＣＬ５の放出を刺激しなかった。図２８Ａおよび図２８Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体は、ヒトＰＭＢＣからのＣＣＬ７の放出を刺激しなかった。図２９Ａおよび図２９Ｂに示されるように、抗ＳＴＡＴ３抗体複合体は、ヒトＰＭＢＣからのＩＦＮαの放出を刺激しなかった。
【０１８８】
参照による援用
本出願全体を通して引用される全ての参考文献（参考文献、交付済み特許、公開特許出願、および同時係属特許出願を含む）の内容は、ここで参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に援用される。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般的に知られている意味と一致する。
【０１８９】
【表４】
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【図１Ａ】
2019515955.tif 000012
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019515955.tif 000085
2019515955.tif 000086
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