(57)【要約】  検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを測定することにより、非アルコール性脂肪肝炎患者を検出することができ、また健常人と非アルコール性脂肪肝炎患者とを正確に鑑別することができる。
2011158769.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼからなる非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカー。
【請求項２】
検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを測定することにより、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法。
【請求項３】
検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼのレベルと健常人由来検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼのレベルとを比較して、そのレベルが高い場合に非アルコール性脂肪肝炎と判定する、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法。
【請求項４】
アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼに特異的に結合する抗体を用いた免疫測定法により、またはアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼの酵素活性の測定により、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを測定する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
検体が血液由来検体である、請求項２から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼに特異的に結合する抗体、またはアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定するための試薬を含む、非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用キット。
【請求項７】
アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼの非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーとしての使用。
【請求項８】
非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーとして使用するためのアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカー、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法およびそれらに用いるキットに関する発明である。詳細には、本発明は、従来、肝生検以外では診断が困難であった非アルコール性脂肪肝炎の検出並びに脂肪肝との鑑別診断に好適な非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカー、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法およびそれらに用いるキットに関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
近年食生活の変化にともないアルコールを飲まないのに肝臓病理組織学検査上、脂肪肝や、アルコール性肝炎に類似した脂肪肝に炎症を伴った所見を示す脂肪性肝炎に罹患する患者が急増している。このような新しいカテゴリーの疾患は併せて非アルコール性脂肪性肝疾患（Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＡＦＬＤ）と呼ばれている。非アルコール性脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪肝（単純脂肪肝）と、肝線維化を伴い肝硬変、肝癌へと進行する非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：以下ＮＡＳＨという場合もある）とからなる。ＮＡＳＨは、１９８０年代に入りＬｕｄｗｉｇらによって提唱された比較的新しい疾患概念である（非特許文献１）。
従来、単純脂肪肝は予後が良好な疾患とされてきた。一方、３５１例のアルコール摂取歴の無い献体の死後解剖の解析においては６．３％の頻度で、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が存在することが報告されており、ＮＡＦＬＤのなかでＮＡＳＨの存在が明らかになってきた（非特許文献２）。
ＮＡＳＨは、米国においては最も一般的な慢性肝臓疾患である。日本でも１９９０年代に入って、肥満や糖尿病が増加し、飲酒歴や肝炎ウイルスが陰性であるにもかかわらず肝脂肪蓄積や肝障害が進むこの疾患が取り上げられるようになってきた。この疾患は、肥満者に多く、インスリン抵抗性との関連も強いが、近年、糖尿病などほかの生活習慣病とは明らかに独立して進行する肝臓病とされている。【０００３】
ＮＡＳＨは、肝炎から肝硬変に至る進行性の疾患であり、可逆性に乏しい肝硬変に至るより以前の早期の段階での医療の介入が必要とされる。一方、ＮＡＦＬＤの多くを占める単純脂肪肝は可逆性に富み良性といってよい。ＮＡＦＬＤは従来の臨床検査、たとえば血中肝臓関連酵素の測定、腹部エコー、腹部ＣＴといった検査の組み合わせで診断が概ね可能である。しかしＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤと異なりそのような方法では検出の難しい疾患とされている。
他の肝疾患、たとえばウイルス性肝炎の場合、患者検体中のウイルス抗原、抗ウイルス抗体有無で検出または鑑別でき、診断基準が確立されている。それに比べＮＡＳＨの場合、現在では肝生検を基に評価される肝臓病理組織学検査だけが、ＮＡＳＨの確定診断に際しての唯一明確な検査で臨床上受容されている方法である。
しかし、肝生検は肝臓そのものの一部を切除して検査を行うため、通常入院が必要であり患者にとって経済的な負担も出血などリスク負担も高くルーチンには実施しにくい。一方、ＮＡＳＨと鑑別診断が必要な単純脂肪肝は非常にありふれた疾患でしかも良性であり経過観察で済まされる事もしばしばである。にもかかわらず現在、日常的な臨床設定において医師にとってＮＡＦＬＤと診断し、さらにＮＡＳＨを疑った場合に肝生検をいつ実行すべきかについての確固たる提言は未だ展開されていないのが実情である。医学上の必要性と限界の故とはいえ、肝生検まで行って診断が単純脂肪肝であった場合、患者にとっての負担感は一層大きい場合があり医師にとってこのような現状は肝生検を行うに当たっての判断に苦しむ場合が多い。【０００４】
一方、患者の負担を軽くするため、ＮＡＳＨの検出または鑑別法として肝生検以外の方法も種々、試みられている。
それにもかかわらず、従来の血清アミノトランスフェラーゼ等の肝臓関連酵素の上昇を用いる診断法はＮＡＳＨと単純脂肪肝等のＮＡＳＨ以外の肝疾患を区別するには不十分である。すなわち、ＮＡＳＨの指標であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などのアミノトランスフェラーゼの検査値は、ほとんど他の生活習慣病、肝臓病、血液疾患、悪性腫瘍といった多くの疾患の検査値異常と重なり、高感度でも特有のものではなく、また、これらの酵素が正常範囲の場合にもＮＡＳＨがしばしば発見されるからである。【０００５】
一方、従来の診断マーカー（血液診断マーカーＡＬＴ、ＡＳＴの他、人種や糖尿病の有無など）を組み合わせてスコア化し、ＮＡＳＨを診断する方法も検討されている（非特許文献３）。しかし、この方法では、各種マーカーを組み合わせてスコア化しても、リスク（Ｒｉｓｋ）が「高い（Ｈｉｇｈ）」と判定されたグループでさえほぼ半分はＮＡＳＨでは無かった。また、リスクが「中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」、「低い（ｌｏｗ）」判定では非ＮＡＳＨの割合はより高い一方、逆にこれらの判定においても３割近くはＮＡＳＨ患者が含まれているなどの問題がありＮＡＳＨ診断の精度には問題がある。
また、超音波診断によりＮＡＳＨを鑑別する方法も検討されている（非特許文献４）。この場合、脂肪肝とされた３４症例のうち９症例は従来の血液診断マーカー（ＡＬＴ、ＡＳＴの他にγグルタミルトランスペプチダーゼ（γＧＴＰ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を含む）は正常範囲であったが、肝生検まで行うとその９症例のうち７症例はＮＡＳＨを持っていた例が紹介されており、従来の診断マーカーによるＮＡＳＨ診断の難しさが示されている。
このように、ＮＡＳＨ患者を早期に発見し、治療を早期に行うことが必要にもかかわらず、その検出や鑑別には、患者に大きな負担を与える肝生検以外の確定診断法がないのが実情である。従って血液のような採取の容易な検体で、その疾患を検出または鑑別する方法が強く望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，５５：４３４−４３８，１９８０
【非特許文献２】Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２１，７１０−７２３（２００１）
【非特許文献３】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４７，１９１６−１９２３（２００８）
【非特許文献４】Ｗｏｒｌｄ J．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１５（１５），１８６３−１８６８（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、このような事情のもと、従来、肝生検以外では鑑別が困難であった非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカー、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法およびそれらに用いるキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記した課題を解決するために鋭意研究した結果、非アルコール性脂肪肝炎患者由来の血清中にはアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ−ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（本明細書においてはＡＧＸＴと略すこともある）が健常人由来の血清に比べてそのレベルが有意に高く、従って、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼが非アルコール性脂肪肝炎の検出および／または鑑別のマーカーと成り得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
［１］．アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼからなる非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカー；
［２］．検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを測定することにより、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法；
［３］．検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼのレベルと健常人由来検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼのレベルとを比較して、そのレベルが高い場合に非アルコール性脂肪肝炎と判定する、非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法；
［４］．アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼに特異的に結合する抗体を用いた免疫測定法により、またはアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼの酵素活性の測定により、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを測定する、上記［２］または［３］に記載の方法；
［５］．検体が血液由来検体である、上記［２］から［４］のいずれかに記載の方法；
［６］．アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼに特異的に結合する抗体、またはアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定するための試薬を含む、非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用キット；
［７］．アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼの非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーとしての使用；
および
［８］．非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーとして使用するためのアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ
に関するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、患者由来検体中のアラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを測定することにより、ＮＡＳＨと健常人および単純脂肪肝患者を鑑別し区別することができる。検体は、血清のように簡便に患者から採取できるものでよい。従前より、通常入院を伴う肝生検がＮＡＳＨの確定診断に必須とされていたが、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ測定により簡便な血液検査による精度のよいＮＡＳＨ診断が可能になるので、診断薬を含む診断分野における用途に適用できる。良性の単純脂肪肝と異なり、ＮＡＳＨは肝炎から肝硬変と進行性の経過をたどり発癌との関係も指摘されているため、ＮＡＳＨの確定診断のニーズは高い。本発明の非アルコール性脂肪肝炎用検出および／または鑑別マーカーを用いることにより、非アルコール性脂肪肝炎を精度よく、検出および／または鑑別することができる。特に従来、肝生検以外では鑑別が困難であった非アルコール性脂肪肝炎と単純脂肪肝との判別、ひいては健常人と非アルコール性脂肪肝炎患者を判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１で行った、男性における健常人（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）患者、単純脂肪肝（ＦＬ）患者からの血清についてのウェスタンブロッティングとその定量化の結果を示す。
【図２】実施例１で行った、女性における健常人（Ｃｏｎｔｏｒｏｌ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）患者、単純脂肪肝（ＦＬ）患者からの血清についてのウェスタンブロッティングとその定量化の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーは、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼである。本発明において、非アルコール性脂肪肝炎の検出とは、非アルコール性脂肪肝炎それ自体の存否を調べ判定することを指し、非アルコール性脂肪肝炎の鑑別とは、非アルコール性脂肪肝炎とそれ以外の疾患、例えば単純脂肪肝などとを区別し判別することを指す。ＡＧＸＴは、ＥＣ２．６．１．４４で表される、アラニンとグリオキシル酸をピルビン酸とグリシンに変換するアミノ基転移酵素の一つである。ＡＧＸＴは生体中で肝臓にきわめて限局した発現を示すことが知られている（Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１８，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８５，３１１−３１６）。
本発明においては、例えば、ＮＡＳＨが疑われる患者から得た検体中の、上記ＮＡＳＨ検出および／または鑑別用マーカータンパク質であるＡＧＸＴの存否を検出しあるいはその量を測定して、ＮＡＳＨ発症を検出、あるいは、単純脂肪肝等のＮＡＳＨ以外の肝臓疾患とＮＡＳＨとを鑑別することができる。
本発明の非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法では、検体中のＡＧＸＴのレベルと健常人由来検体中のＡＧＸＴのレベルとを比較して、そのレベルが高い場合に非アルコール性脂肪肝炎と判定することができる。より具体的には、本発明の方法は、例えば、（ｉ）診断すべき個人由来の適当な試料中のＡＧＸＴのレベルを測定し、ついで（ｉｉ）測定値レベルと、明らかに健康な個人（正常個人）について対応するレベル（正常レベル、正常濃度範囲）とを比較する工程よりなることを特徴とする。ＡＧＸＴの測定値レベルが正常レベルから逸脱して高い場合、ＮＡＳＨと疑われる。
前述のように、本発明においては、アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼを非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーとして使用することができる。
【００１２】
本発明で用いることができる検体としては、ＮＡＳＨ疾患が疑われる患者から採取した血液由来検体、例えば血清、血漿、血液など、あるいは尿などが挙げられる。検体としては血液由来検体が好ましい。検体としては、特に、ウイルス性肝炎でないことが判明した患者の検体で一般的な単純脂肪肝患者かＮＡＳＨ患者か判明しない患者の検体が好ましい。
【００１３】
本発明において、ＡＧＸＴの存否の検出あるいはその量の測定は、原則的に、満足すべき感度、精度、特異性ほかを供する現在既知のあらゆる方法を採用することができる。例えば、免疫測定法によるタンパク質としてのＡＧＸＴの測定、酵素法による酵素としてのＡＧＸＴ活性の測定を例示することができる。測定感度の高さ、特異的な測定が可能であるなどの点から免疫測定法が好ましい。
免疫測定法は、ＡＧＸＴおよびＡＧＸＴに特異的に結合する抗体（抗ＡＧＸＴ抗体）よりなる免疫複合体を形成し得る条件下、ＡＧＸＴを含む可能性のある検体を、抗ＡＧＸＴ抗体と接触させることを特徴とする。その後に、形成した複合体を公知の方法によって測定して、検体中のＡＧＸＴレベルの定量的または定性的測定値、換言すると、検体中のＡＧＸＴレベルの測定値を得ることができる。
これらの形態のアッセイにおいては、免疫複合体をそのままで測定でき、あるいは、それを分析的に検出可能な物質（標識物）で標識することによって測定でき、標識物は当該免疫複合体に特異的に取り込まれるようにすることができる。
【００１４】
免疫測定法としては、本発明の非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカータンパク質であるＡＧＸＴに対するポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた、従来知られているタンパク質を測定する方法を挙げることができる。そのような免疫測定法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、免疫比濁測定法（ＴＩＡ法）、ラテックス免疫凝集法（ＬＡＴＥＸ法）、電気化学発光法、蛍光法、ウェスタンブロッティング法などを例示することができる。またイムノクロマト法、試験紙を利用した方法も有効である。これらの方法自体は、いずれも当業者に周知の方法でありこれら周知の方法をそのまま採用することができる。
上記免疫測定法に使用できる抗体としては、市販の抗体（例えば、ＡＢＧＥＮＴ社のウサギ抗ヒトＡＧＸＴ抗体）を用いることができる。また、既に汎用されている方法により作製されるポリクローナル抗体やモノクローナル抗体が挙げられる。抗体を作成するためのＡＧＸＴ抗原は、ヒト血液から精製して入手してもよいが、ＡＧＸＴの公知のアミノ酸配列やそれをコードする遺伝子配列（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１７６（３）：１０９３−１０９９，Ｊｕｌｙ  １９９１；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１０（１）：３４−４２，Ｊｕｌｙ  １９９１）に基づいて遺伝子工学技術により合成してもよく、また公知のペプチド合成技術を用い、化学合成して入手してもよい。
【００１５】
以下に、酵素免疫測定法の例を挙げて説明する。初めにポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、ポリメタクリレートなどのそれ自体公知である固相に直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用してＡＧＸＴに対するモノクローナル抗体を結合させる。感作抗体量は通常１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲である。物理結合や化学結合、アフィニティーなどによって固相に結合したモノクローナル抗体に検体を加えて反応させる。一定時間反応させた後、固相を洗浄し対応する二次標識抗体（例えば、抗ＡＧＸＴ２次標識抗体）を加えて更に２次反応させる。固相を再度洗浄し、ＤＡＢ発色基質などを加え反応させる。標識物質にＨＲＰを用いた場合、基質には既知のＤＡＢ、ＴＭＢなどを用いることができ、標識物質はこれに限定されるものではない。例えば酵素だけではなく金コロイド、ユーロピウムなどの標識金属やＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰなどの化学的、生物的各種蛍光物質、３２Ｐ、５１Ｃｒなどの放射性物質など識別可能なあらゆる物質が挙げられる。
【００１６】
ＡＧＸＴをウェスタンブロッティング法で測定するときには、ゲル電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組み合わせて、検体中の様々な物質からＡＧＸＴを分離し、検出またはその量を測定する。具体的には、まず、検体をＳＤＳ−ＰＡＧＥや等電点電気泳動、二次元電気泳動に付し、次いで、ゲルからＡＧＸＴを電気的にメンブランに移動・固定化してブロット（メンブラン）を作製する。メンブランには、タンパク質が結合しやすい疎水性の高いニトロセルロースやさらに疎水性に優れたＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  Ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を用いることが好ましい。次いで、ブロットを抗ＡＧＸＴ抗体と反応させて検出する。検出法には酵素を用いる系、蛍光を用いる系などがある。酵素を用いる系では、ＡＬＰやＨＲＰなどで標識した二次抗体を一次抗体に反応させて、酵素活性による発色や化学発光により検出する。また、化学発光による検出には、Ｘ線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を、スキャナーによりＡＧＸＴを検出またはそのレベルを測定できる。蛍光法を用いる時には、Ｃｙ３やＣｙ５で標識した二次抗体を用いて定量することも可能である。
【００１７】
酵素法による酵素としてのＡＧＸＴ活性を測定する方法としては、例えば、ＡＧＸＴをその基質と反応させ、生成する生成物を測定することによりＡＧＸＴ活性を測定する方法が挙げられる。具体的には、基質としてアラニンとグリオキシル酸を必須成分として用い、場合によりピリドキサールリン酸の存在下で酵素反応させ、生成するピルビン酸を測定する方法が挙げられる。生成するピルビン酸を測定する方法としては、そのピルビン酸に、乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを作用させ、ＮＡＤＨの減少量を測定してピルビン酸を測定する還元法、ピルビン酸にリン酸とピルビン酸オキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定してピルビン酸を測定する酸化法などが挙げられる。
【００１８】
還元法の場合には、ピルビン酸に、乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを作用させ、反応液にＮＡＤＨが吸収する波長３４０ｎｍの紫外線を照射して吸光度の減少割合に基づきＮＡＤＨの減少量を測定してピルビン酸を測定することができる。
【００１９】
酸化法の場合、過酸化水素量の測定は、ペルオキシダーゼと酸化により発色する基質とを用い、生成する色素を測定することが好ましい。この場合、酸化により発色する基質としては、酸化により発色する単一化合物の基質、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリン等とを組み合せた基質等が挙げられる。酸化により発色する単一化合物としては、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンナトリウム塩（ＤＡ−６７）等のロイコ色素、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”，−トリアミノ−トリフェニルメタン６ナトリウム塩（ＴＰＭ−ＰＳ）、またはオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）が例示できる。トリンダー試薬としては、例えば、フェノール誘導体、アニリン誘導体等が挙げられる。トリンダー試薬の具体例としては、２，４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＨＡＬＰＳ）等が挙げられる。
また、前記４−アミノアンチピリンに対応する化合物としては、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。
【００２０】
本発明の非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別する方法は、例えば、試薬成分として少なくともＡＧＸＴに特異的に結合する抗体（抗ＡＧＸＴ抗体）、またはＡＧＸＴの酵素活性を測定するための試薬を含む非アルコール性脂肪肝炎を検出および／または鑑別用キットにより実施することができる。
抗ＡＧＸＴ抗体は、例えば、マイクロプレートなどの水不溶性担体に結合させた形態で、キットの試薬成分とすることができる。キットの他の試薬成分としては、例えば抗ヒトイムノグロブリン抗体などの二次抗体が挙げられ、この二次抗体は、採用する酵素免疫測定方法、放射免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、化学発光免疫測定方法などの測定方法に応じて、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質などの標識物で標識されたものが用いられる。その他の試薬成分として、界面活性剤、緩衝剤などを適宜、加えてもよい。
【００２１】
ＡＧＸＴの酵素活性を測定するための試薬としては、例えばＡＧＸＴの基質、その基質との反応により生成する生成物を測定するための試薬などが挙げられる。そのような試薬としては、例えば、基質としてアラニンとグリオキシル酸、生成するピルビン酸を測定するための成分を必須成分として、場合によりピリドキサールリン酸を含む試薬を用いることができる。ピルビン酸を測定するための成分としては、還元法の場合、乳酸脱水素酵素とＮＡＤＨを含み、酸化法の場合、リン酸、ピルビン酸オキシダーゼと、過酸化水素を測定するための成分を含むことができる。過酸化水素を測定するための成分としては、ペルオキシダーゼと酸化により発色する基質とを含むことができる。酸化により発色する基質は、前記に例示した酸化により発色する単一化合物の基質、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリン等が例示できる。
【００２２】
以上に説明した方法により、ＮＡＳＨが疑われる患者から得た検体中のＡＧＸＴの存否を検出しあるいはその量を測定することにより、ＮＡＳＨの検出および／または鑑別をすることができる。
本発明の方法は、健常者とＮＡＳＨ患者との鑑別ができるほか、従来、肝生検以外では困難であったＦＬ患者とＮＡＳＨ患者との鑑別ができる。
【実施例】
【００２３】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１
ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）患者とＦＬ（単純脂肪肝）患者、健常人血清中のＡＧＸＴ（Ａｌａｎｉｎｅ−ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ  ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，アラニン−グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ）値の測定
健常人１８名（男性１０人と女性８人）、ＦＬ患者９名（男性４人と女性５人）、ＮＡＳＨ患者１７名（男性８人と女性９人）、の各血清について、以下に記載する方法によって血清中ＡＧＸＴ値を測定した。健常人、ＮＡＳＨ患者、ＦＬ患者の比較に当たっては性別、年齢、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ）に統計学的に大きな偏りの無い比較を行っている。
健常人血清は、健康診断受診者のうち文書による同意を得られたボランティアより空腹時血清を採取したものである。ＮＡＳＨ患者は全例が検査入院患者の肝生検による確定診断例であり、その際に同意と空腹時血清を得たものである。ＦＬ患者は肝生検または肝エコー検査にて肝臓に脂肪肝の所見が見られた患者であり、その際に同意と空腹時血清を得たものである。【００２４】
１．方法
血清中ＡＧＸＴ測定のため、無処理の血清０．２μＬ相当に２×ＳＤＳ−サンプルバッファー（０．１２５Ｍトリス−Ｃｌ、２．０％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）、１０％  グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を５０μＬと純水を加え懸濁し、うち１０μＬ相当を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用したゲルは１０〜２０％のアクリルアミド濃度勾配をつけた、縦８ｃｍ、横１４ｃｍ、厚さ１ｍｍのポリアクリルアミドゲル（ＤＲＣ社）を用い行った。次いで、公知の方法に従いウェスタンブロッティングを行った。つまり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したタンパク質をＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を所定の大きさに切り、ポンソーＳ染色に供し転写ムラがないか確認した。次いで、ＰＶＤＦ膜を０．０５％スキムミルク−ＰＢＳ−Ｔ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ２０）に４℃で一晩浸してブロッキンクし、続いてＰＢＳ−Ｔに室温で１０分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のＰＶＤＦ膜を、ウサギ抗ヒトＡＧＸＴ抗体（ＡＢＧＥＮＴ社）を溶解させたＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ−Ｔに室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のＰＶＤＦ膜を、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社）を含有するＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートし、続いてＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）に室温で５分間浸し洗浄する操作を３回繰り返した。洗浄後のＰＶＤＦ膜より、ＦＥＭＴＯＧＬＯＷウェスタンブロッティング発光試薬（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて添付のプロトコルに従い発光シグナルを検出した。シグナル検出及び画像解析機器はＬｕｍｉＶｉｓｉｏｎ  ＰＲＯ  ４００ＥＸ（アイシン精機）を使用し、発光シグナルの撮影及び数値化を行った。【００２５】
２．結果
ウェスタンブロッティングによって得られたシグナルの画像解析の結果について男性の場合を図１、女性の場合を図２に示した。また、男女合わせて、画像解析結果における各バンドのシグナル強度を数値化しＡＧＸＴ値を求めたところ表１の結果となった。【００２６】
【表１】
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【００２７】
以上の結果より、ＡＧＸＴ測定により健常者やＦＬ患者と、ＮＡＳＨ患者を高精度に鑑別できることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
ＧＯＴ（ＡＳＴ）、ＧＰＴ（ＡＬＴ）といった既存の肝機能マーカーでは、単純脂肪肝、ＮＡＳＨ以外の肝臓疾患や肝臓疾患以外の他の疾患によってその値が容易に上昇してしまうが、これらに比しＡＧＸＴでは、ＮＡＳＨについて特異的であり、誤診のリスクがはるかに少なく、診断分野に寄与すること大である。従って、ＡＧＸＴを非アルコール性脂肪肝炎検出および／または鑑別用マーカーとして、ＡＧＸＴ測定により健常者や単純脂肪肝患者と、ＮＡＳＨ患者を高精度に検出または鑑別できる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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