(57)【要約】  本発明は、未反応粉末形態のハイドロゲル前駆体配合物に関する。ハイドロゲル前駆体配合物は、活性化酵素、好ましくはトロンビン、架橋化酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼであって、緩衝液を含むかまたは含まない水中で活性化酵素によって活性化可能である、架橋化酵素、および少なくとも１つの構造化合物Ａを含む。構造化合物は、架橋化酵素を介する選択的反応によって架橋可能であり、ハイドロゲルを形成し、ここで架橋化酵素は活性化される。
2019521690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  活性化酵素、好ましくはトロンビン、
−  架橋化酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼであって、緩衝液を含むかまたは含まない水中で、好ましくは緩衝液を含むかまたは含まない、導電率が５μＳ／ｃｍ未満であり、かつ／または好ましくはｐＨが５〜８、より好ましくは６〜８、最も好ましくは６．５〜８の範囲である水中で、前記活性化酵素によって活性化可能である、架橋化酵素、
−  少なくとも１つの構造化合物Ａ、好ましくは２つの異なる構造化合物ＡおよびＢ
を含む未反応粉末形態のハイドロゲル前駆体配合物であって、
前記構造化合物は、前記架橋化酵素を介する選択的反応によって架橋可能であり、ハイドロゲルを形成し、前記架橋化酵素は、好ましくは５０〜１００％、好ましくは７５〜１００％、より好ましくは実質的に１００％の活性化度で活性化される、ハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項２】
二価イオン、好ましくはカルシウムイオンが実質的に前記前駆体配合物から除去され、前記二価イオンの濃度が、好ましくは１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、最も好ましくは１０ｐｐｍ未満である、請求項１に記載のハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの構造化合物は、少なくとも２つの異なる反応性基を含む、請求項１または２のいずれかに記載のハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの構造化合物は、アシル部分、好ましくは２つのアシル部分、およびアミン部分、好ましくは２つのアミン部分を含む、請求項１から３のいずれかに記載のハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項５】
前記ハイドロゲル前駆体配合物は、少なくとも１つのさらなるハイドロゲル化合物、好ましくは少なくとも１つの架橋性生物活性化合物を含む、請求項１から４のいずれかに記載のハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項６】
前記構造化合物は、多分岐ポリエチレングリコール、好ましくは８アーム型ポリエチレングリコールである、請求項１から５のいずれかに記載のハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項７】
未反応粉末形態のハイドロゲル前駆体配合物、好ましくは請求項１から６に記載のハイドロゲル前駆体配合物の製造方法であって、
ａ）
−  活性化酵素、好ましくはトロンビン、
−  架橋化酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼであって、前記活性化酵素によって水中で活性化可能である、架橋化酵素、
−  少なくとも１つの構造化合物Ａ、好ましくは２つの異なる構造化合物ＡおよびＢ
を、緩衝液を含むかまたは含まない水中で、好ましくは緩衝液を含むかまたは含まない、導電率が５μＳ／ｃｍ未満であり、かつ／または好ましくはｐＨが５〜８、より好ましくは６〜８、最も好ましくは６．５〜８の範囲である水中で、混合する工程、
ｂ）工程ａ）の前または後に、ゲル特性が、製造時間の期間に依存せず実質的に一定に維持されるのに十分な時間、前記架橋化酵素および前記活性化酵素をインキュベートする工程、
ｃ）工程ａ）またはｂ）のうちの後の工程の後に、任意で混合物を凍結乾燥する工程を含み、
前記構造化合物が、前記架橋化酵素を介する選択的反応によって架橋可能であり、工程ａ）において、成分が、前記架橋化酵素が介する架橋反応を阻害する条件下で混合される、方法。
【請求項８】
工程ａ）で得られた前記混合物のインキュベートは、４〜３７℃、好ましくは１０〜２５℃の範囲の温度、より好ましくは室温で、少なくとも０．５時間、好ましくは２４時間未満、好ましくは２〜４時間実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記架橋化酵素は、工程ｂ）の後に５０〜１００％、好ましくは７５〜１００％、より好ましくは実質的に１００％の活性化度を有する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）において、少なくとも１つのさらなるハイドロゲル化合物、好ましくは少なくとも１つの架橋性生物活性化合物が添加される、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれかに記載の方法によって得られるかまたは得られたハイドロゲル前駆体配合物。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載のハイドロゲル前駆体配合物で満たされた少なくとも１つの容器、反応緩衝液を含む容器、および任意で取扱説明書を含むキット。
【請求項１３】
前記反応緩衝液は、１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭ、より好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンを含有する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記反応緩衝液のｐＨは、５〜８、好ましくは６〜８、より好ましくは７〜８である、請求項１２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
ａ）請求項１から６に記載のハイドロゲル前駆体配合物を、反応緩衝液中、好ましくはカルシウムイオンを含む反応緩衝液中に再懸濁する工程、
ｂ）任意で細胞懸濁液を添加する工程
を含むハイドロゲルの製造方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのゲルがハイドロゲル前駆体溶液で成型される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲル前駆体溶液のゲル化時間は、４〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは１５〜２５℃の範囲の温度で、１〜２０分間、好ましくは２〜１０分間、より好ましくは２〜７分間の範囲である、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ハイドロゲル前駆体配合物、ハイドロゲル前駆体配合物の製造方法、独立請求項のプリアンブルに記載のハイドロゲルを製造するためのキットおよび方法に関する。
【０００２】
三次元細胞培養の足場は、従来の皿での二次元細胞培養と比べて生体組織をより近く再現する遺伝子発現パターンおよび他の細胞活動をもたらすとして認識されている。
【０００３】
このことは、合成高分子ハイドロゲルの新規ファミリーの開発につながっており、これらの合成高分子ハイドロゲルは、細胞外基質の多くの特徴を再現するため多くの場合人工ＥＣＭ（ａＥＣＭ）と呼ばれる。主要な課題の１つは、細胞または生体分子が存在する中で基質の架橋をもたらすだけでなく、基質そのものへの生体分子の安定な結合をもたらす化学組成を提供することである。
【０００４】
近年、細胞または生体分子が存在する中でゲルを形成させる様々な機構が開発された。例えば、ペプチド（Ｅｓｔｒｏｆｆら：Ｗａｔｅｒ  ｇｅｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．２００４、１０４巻（３号）、１２０１〜１８ページ）またはウレイドピリミジノン（Ｚｈａｎｇ  Ｓ．：Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｎａｔ．Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌ．２００３、２１巻（１０号）、１１７１〜８ページ）といった低分子量ビルディングブロック、および中分子量両親媒性ブロック共重合体（例えば、Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋら：Ｐｅｐｔｉｄｅ−ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ  ｎｏｎｏｆｉｂｅｒｓ：Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、アメリカ合衆国、２００２、９９巻（８号）、５１３３〜８ページ参照）の自己組織化に基づく機構が提案されている。
【０００５】
ハイドロゲルは、非酵素的機構または酵素的機構のいずれかによる、ハイドロゲル前駆体分子内に位置する官能基の共有結合架橋に基づいて製造され得る。酵素的機構は、官能基間の架橋反応を触媒する架橋化酵素を介する共有結合架橋であると定義される。血液凝固系で知られる架橋化酵素は、例えば、タンパク質／ペプチド結合リジンといったアミン基とタンパク質／ペプチド結合グルタミンのアシル基との間のイソペプチド結合形成を、カルシウムイオンの存在中で触媒する、トランスグルタミナーゼ群に属す。トランスグルタミナーゼの使用は、これまでにハイドロゲルの製造に適応された。
【０００６】
当分野で知られるハイドロゲルは、例えば、Ｓａｎｂｏｒｎらによって「Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＥＧ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｖｉａ  ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩＩ」（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２３巻（２００２）、２７０３〜２７１０ページ）に開示される。Ｓａｎｂｏｒｎらは、ヒト組み換え第ＸＩＩＩ因子の活性化に、カルシウムを担持させたリポソームの熱誘発によって放出制御されるカルシウムイオンを利用する。カルシウムが放出されると、ゲル成分はヒト組み換え第ＸＩＩＩ因子によって架橋される。したがって、早期にゲル化させることなく、ゲル化系全体を室温で水溶液中に保管することができる。
【０００７】
ＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１は、ＰＥＧ系前駆体分子、およびトロンビンで活性化された第ＸＩＩＩａ因子を使用するハイドロゲルの製造を開示する。第ＸＩＩＩ因子は、凍結乾燥粉末から再構成され、トロンビンを用いて３７℃、３０分間で活性化される。活性化された第ＸＩＩＩａ因子のアリコートは、後で使用するために−８０℃で保管される。ハイドロゲルを形成する前駆体溶液は、５０ｍＭの塩化カルシウムを含有するトリス緩衝液（ＴＢＳ、５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で調製される。架橋反応は、トロンビンで活性化された第ＸＩＩａ因子を添加し、激しく混合することによって開始される。この方法の１つの欠点は、第ＸＩＩＩａ因子の活性化がゲル形成工程前に独立して行われることである。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、既知のハイドロゲル前駆体配合物に起因する不利益を回避することであり、具体的には、ハイドロゲルを再現性よく形成するハイドロゲル前駆体配合物を提供することである。この課題は、請求項１に記載のハイドロゲル前駆体配合物によって解決される。
【０００９】
本発明は、未反応粉末形態のハイドロゲル前駆体配合物に関する。未反応粉末は、活性化酵素、好ましくはトロンビン、および架橋化酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼを含む。架橋化酵素は、緩衝液を含むかまたは含まない水中で、好ましくは緩衝液を含むかまたは含まない、導電率が５μＳ／ｃｍ未満であり、かつ／または好ましくはｐＨが５〜８、より好ましくは６〜８、最も好ましくは６．５〜８の範囲である水中で、活性化酵素によって活性化可能である。さらに、粉末は、少なくとも１つの構造化合物Ａ、好ましくは２つの異なる構造化合物ＡおよびＢを含む。前述の構造化合物は、架橋化酵素を介する選択的反応によって架橋可能であり、ハイドロゲルを形成し、ここで架橋化酵素は、５０〜１００％、好ましくは７５〜１００％、より好ましくは実質的に１００％の活性化度で好ましくは活性化される。１００％の活性化とは、１００％の第ＸＩＩＩ因子が第ＸＩＩＩａ因子に活性化されることを意味し、７５％の活性化とは、第ＸＩＩＩ因子の７５％が第ＸＩＩＩａ因子に活性化されることを意味する。５０％の活性化とは、第ＸＩＩＩ因子の５０％が第ＸＩＩＩａ因子に活性化され、５０％は第ＸＩＩＩ因子のままであることを意味する。
【００１０】
したがって、ハイドロゲル前駆体配合物は、ハイドロゲルの製造に必要とされる本質的な成分を含む。これは、最終利用者が個々の成分を秤量および／または混合する必要がないため、有益である。秤量および混合は、本発明の配合物によって低減される誤差原因である。最終利用者は、ハイドロゲルを形成するための条件（例えばｐＨおよび／またはイオン強度）を与える適切な緩衝液中にハイドロゲル前駆体配合物を再懸濁させる。したがって、ハイドロゲル前駆体配合物から製造されるハイドロゲルの再現性は向上し、ハイドロゲルの製造は簡略化される。
【００１１】
驚くべきことに、活性化された第ＸＩＩＩ因子は、製造用混合物中で少なくとも２４時間安定である。これは、ハイドロゲルを生じさせる（活性化された第ＸＩＩＩ因子を含有する）製造用混合物が、ハイドロゲルの調製、または凍結乾燥（以下、「製造時間」）前に、例えば室温で、そのままの状態であった期間にかかわらず、結果として得られるハイドロゲルの物理化学的特性（例えば、ゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’、膨潤率Ｑ）は変化しなかったことを意味する。したがって、ハイドロゲルの最終的な物理化学的ゲル特性の安定性は、製造用混合物の製造時間に依存しない。これは、これらの条件下で架橋化酵素および／または活性化酵素の活性に損失が認められないことを表す。
【００１２】
「室温」という用語は、２０〜２５℃の範囲の温度に関する。しかし、上昇した温度、例えば熱帯地方の国における空調設備のない実験室内の温度も室温であると考えられ得る。
【００１３】
より好ましくは、架橋化酵素は、緩衝液を含むかまたは含まない、導電率が５μＳ／ｃｍ以下、ならびに／またはカルシウムイオンが１０ｐｐｍ未満でありかつ／もしくはマグネシウムイオンが１０ｐｐｍ未満である水中で、活性化酵素によって活性化可能である。
【００１４】
ハイドロゲル前駆体配合物の未反応粉末は、任意の大きさおよび形状の粒子を含んでもよい。または、粉末は、加圧タブレットまたは錠剤として与えられてもよい。最も好ましくは、粉末は、例えば容器の底部に、安定な固形成型体の形態で与えられる。これは、粉末が容器の底部に位置するため、前駆体配合物の取り扱いを簡略化する。粉末を底部に集めるために、粉末を溶解させる前に遠心分離する必要はない。これは、ゲル形成の再現性を高める。
【００１５】
粉末は未反応であり、少なくとも１つの構造化合物Ａのほとんどは、架橋を形成する選択的反応に関与する反応物質と反応していないことを意味する。好ましくは、７０％を超える、より好ましくは８５％を超える、最も好ましくは９５％を超える化合物が選択的反応を起こしていない。
【００１６】
好ましくは、構造化合物Ａは、少なくとも３つの官能性、好ましくは４つ以上の官能性を有する。「官能性」は、分子上の反応性部位、例えば反応性基の数を意味する。
【００１７】
一価イオンは前駆体配合物から実質的に除去され得、最終利用者によって一価イオンが添加されなければ、一価イオンの濃度は、好ましくは１〜６０ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭの範囲であり得る。一価イオンが除去されたハイドロゲル前駆体配合物を用いてハイドロゲルが製造される場合、形成されたハイドロゲル中の一価イオンの量は、最小限に抑えられる。したがって、最終用途に従って最終利用者が添加する緩衝液によって、形成されたハイドロゲル中の一価イオンの量を調整することができる。一価イオンは、最終利用者によってハイドロゲルに包埋される細胞に影響を与える可能性がある。細胞増殖または生存能といった特性は、一価イオンの存在による悪影響を受けない。したがって、ハイドロゲル前駆体配合物は、包埋される細胞に対する悪影響が低減されたハイドロゲルをもたらす。
【００１８】
二価イオン、好ましくはカルシウムイオンは、前駆体配合物から実質的に除去され得、二価イオンの濃度は、好ましくは１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、最も好ましくは１０ｐｐｍ未満であり得る。ハイドロゲル前駆体配合物中に存在する二価イオン、特にカルシウムイオンの低減により、二価イオン添加前にハイドロゲルを形成しない配合物がもたらされる。カルシウムイオンは、トロンビンで活性化された第ＸＩＩＩ因子の触媒作用に必要である。したがって、トロンビンで活性化された第ＸＩＩＩ因子を含む前駆体配合物の早期ゲル化は、カルシウムイオン添加前に起こらない。既知のハイドロゲル前駆体配合物と比較し、早期ゲル化が大幅に低減される。したがって、ハイドロゲルのゲル化は、二価イオン、好ましくはカルシウムイオンが実質的に除去されたハイドロゲル前駆体配合物を使用することによって制御されるか、または制御可能である。カルシウムイオンの量は、第ＸＩＩＩ因子２０Ｕ／ｍｌ、トロンビン０．２Ｕ／ｍｌおよび５％ｗ／ｖの構造化合物がトリス緩衝生理食塩水（トリス０．６５ｍＭ、ＮａＣｌ１．５ｍＭ、ｐＨ７．５）中に存在する中で、室温で３０時間まで、好ましくは１００時間までゲル化が達成されないよう選択され得る。
【００１９】
さらに、少なくとも１つの構造化合物Ａは、少なくとも２つの異なる反応性基を含み得る。異なる反応性基は、活性化された架橋化酵素によって触媒される化学反応を通してハイドロゲルを形成するよう互いに結合、例えば架橋することを意味する、親和性のある基であり得る。または、前駆体配合物は、構造化合物Ａおよび構造化合物Ｂを含み、構造化合物Ａおよび構造化合物Ｂは、大きさならびに／または官能性および／もしくは官能基／反応性基が異なる。ハイドロゲル前駆体配合物は、構造化合物Ａおよびリンカー化合物を含んでもよい。「リンカー化合物」は、当該化合物が構造化合物の２つの分子間、または２つの構造化合物の２つの分子間に、それぞれリンカーを形成することを意味する。リンカー化合物は、直鎖／非分岐分子であるため、ハイドロゲルの３Ｄ構成に寄与しない。「構造化合物」は、分岐分子であると規定され、したがってハイドロゲルの３Ｄ構造に寄与する。
【００２０】
少なくとも１つの構造化合物Ａは、アシル部分、好ましくは２つのアシル部分、より好ましくは３つのアシル部分、およびアミン部分、好ましくは２つのアミン部分、好ましくは３つのアミン部分を含み得る。アシル部分はグルタミンであり得、アミン部分はリジンであり得る。
【００２１】
配合物中に２つの構造化合物ＡおよびＢが配合される場合、両方が少なくとも１つのグルタミンおよび少なくとも１つのリジンを含んでもよい。または、２つの構造化合物ＡおよびＢの一方が、少なくとも１つのグルタミンおよび少なくとも１つのリジンを含み、もう一方の構造化合物は、少なくとも１つのグルタミンまたは少なくとも１つのリジンのいずれかをそれぞれ含むことによって親和性のある反応性基を含む。
【００２２】
ハイドロゲル前駆体配合物は、少なくとも１つのさらなるハイドロゲル化合物、好ましくは少なくとも１つの架橋性生物活性化合物を含み得る。少なくとも１つのさらなるハイドロゲル化合物、好ましくは少なくとも１つの架橋性生物活性化合物は、ハイドロゲルの２つのサブユニットへの架橋反応によってハイドロゲル網目構造に共有結合的に組み込まれ得る。さらなるハイドロゲル化合物は、グルタミンおよび／またはリジンを含み得る。さらなる化合物が１つのグルタミンまたは１つのリジンのみを含む場合、さらなる化合物は、いわゆるぶら下がり分子としてゲルに組み込まれ、さらなる化合物の組み込みが鎖の末端を決定することを意味する。ここで、追加のサブユニットは付着できない。
【００２３】
生物活性化合物は、ＲＧＤペプチド配列、例えばＮＱＥＱＶＳＰＬＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ２といったＴＧ−ＲＧＤＧｌｎペプチド、もしくはＡｃ−ＦＫＧＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ２といったＴＧ−ＲＧＤＬｙｓペプチド、またはフィブロネクチン由来のＲＧＤ配列もしくはラミニン由来のＹＩＳＧ配列、ヘパリン結合部位といった成長因子結合部分、プロテアーゼ結合部位または治療的活性化合物を含み得る。生物活性化合物は、好ましくは細胞接着部位、最も好ましくはＲＧＤ配列を含む。
【００２４】
生物活性化合物は、選択的反応を起こす活性基を少なくとも１つ含む。好ましくは、生物活性化合物は、少なくとも１つのリジンおよび／または１つのグルタミンを含む。
【００２５】
生物活性化合物は、選択的反応を通して構造化合物と結合可能であり得る。好ましくは、この選択的反応は、ハイドロゲルの形成に用いられる選択的反応と同一の反応である。または、生物活性化合物は、選択的反応を通してハイドロゲルの形成前に構造化合物と結合してもよい。
【００２６】
構造化合物は、多分岐ポリエチレングリコール、好ましくは８アーム型ポリエチレングリコールであり得る。好ましくは、８アーム型ポリエチレングリコールは、３０〜５０ｋＤａ、好ましくは３５〜４５ｋＤａの範囲、より好ましくは４０ｋＤａの大きさを有する。構造化合物の各枝は、好ましくは官能基を含む。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、未反応粉末形態のハイドロゲル前駆体配合物の製造方法に関する。製造方法は、工程ａ）、ｂ）および任意でｃ）を含む。
【００２８】
工程ａ）は、緩衝液を含むかまたは含まない水中で、好ましくは緩衝液を含むかまたは含まない、導電率が５μＳ／ｃｍ未満であり、かつ／または好ましくはｐＨが５〜８、より好ましくは６〜８、最も好ましくは６．５〜８の範囲である水中で、活性化酵素、架橋化酵素および少なくとも１つの構造化合物Ａを混合する工程を含む。架橋化酵素は、前述の水中で、活性化酵素によって活性化可能である。
【００２９】
活性化酵素は、好ましくはトロンビンである。架橋化酵素は、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼである。好ましくは、２つの異なる構造化合物ＡおよびＢは、工程ａ）で混合される。
【００３０】
工程ｂ）は、工程ａ）の前または後に実施され得る。工程ｂ）は、ハイドロゲル前駆体配合物から製造されたゲルのゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’および膨潤率Ｑといったゲル特性が、製造時間の期間にかかわらず実質的に一定のままとなるのに十分な時間、架橋化酵素および活性化酵素をインキュベートすることを含む。実質的に一定とは、ゲル特性の経時変化が１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満であることを意味する。十分にインキュベートすることにより前述の特性のプラトーが達成される（下記参照）ことが実験により示されており、これは、製造時間にかかわらず特性が変化しないことを意味する。以下、選択肢ｉ）は、工程ｂ）が工程ａ）の後に実施されることに関する。以下、選択肢ｉｉ）は、工程ｂ）が工程ａ）の前に実施されることに関する。
【００３１】
好ましくは、１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンを含む、ｐＨが６．５〜８．５の範囲の緩衝液中で、１〜２０％ｗ／ｖの構造化合物、０．１〜１００Ｕ／ｍｌの架橋化酵素、および０．００１〜２０Ｕ／ｍｌの活性化酵素が４〜３７℃の温度で使用される場合に、前駆体配合物を用いて製造可能であるかまたは製造されるハイドロゲルのゲル化時間が、好ましくは０．５〜３０分間、より好ましくは１〜２０分間、最も好ましくは２〜１０分間の範囲となるような条件下で、十分な時間、架橋化酵素および活性化酵素はインキュベートされる。
【００３２】
好ましくは、１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンを含む、ｐＨが６．５〜８．５の範囲の緩衝液中で、１〜２０％ｗ／ｖの構造化合物、０．１〜１００Ｕ／ｍｌの架橋化酵素、および０．００１〜２０Ｕ／ｍｌの活性化酵素が４〜３７℃の温度で使用される場合に、前駆体配合物を用いて製造可能であるかまたは製造されるハイドロゲルのせん断弾性率Ｇ’が、好ましくは１００〜１５’０００Ｐａ、より好ましくは２００〜５’０００Ｐａの範囲となるような条件下で、十分な時間、架橋化酵素および活性化酵素はインキュベートされる。
【００３３】
好ましくは、１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭの範囲のカルシウムイオンを含む、ｐＨが６．５〜８．５の範囲の緩衝液中で、１〜２０％ｗ／ｖの構造化合物、０．１〜１００Ｕ／ｍｌの架橋化酵素、および０．００１〜２０Ｕ／ｍｌの活性化酵素が４〜３７℃の温度で使用される場合に、前駆体配合物を用いて製造可能であるかまたは製造されるハイドロゲルの膨潤率Ｑが、好ましくは１０〜１００、より好ましくは２０〜８０の範囲となるような条件下で、十分な時間、架橋化酵素および活性化酵素はインキュベートされる。
【００３４】
任意の工程ｃ）は、工程ａ）またはｂ）のうちの後の工程の後に混合物の凍結乾燥を含む。
【００３５】
構造化合物は、架橋化酵素を介する選択的反応によって架橋可能である。工程ａ）において、成分は、架橋化酵素が介する架橋反応を阻害する条件下で混合される。
【００３６】
本発明のハイドロゲル前駆体配合物の製造方法は、ｉ）架橋化酵素、活性化酵素および構造化合物といった成分が、全て即時使用可能な粉末として混合および調製される（選択肢ｉ）に準じ、工程ａ）の後に工程ｂ））か、またはｉｉ）架橋化酵素が、好ましくは緩衝液を含むかもしくは含まない、示される最低限の導電率の水中で、残りのゲル化合物と混合する前に活性化される（選択肢ｉｉ）に準じ、工程ａ）の前に工程ｂ））ため、有利である。
【００３７】
選択肢ｉ）は、ゲル成分の混合が１つの工程のみで行われるため、ハイドロゲル前駆体配合物の製造方法を簡略化する。即時使用可能な粉末が緩衝液中に再懸濁され、ハイドロゲル前駆体へ架橋化酵素を添加する必要がないことも、ハイドロゲルの形成を簡略化する。全体を通して、前述の方法の再現性は向上する。選択肢ｉ）において、インキュベートする時間は、製造時間に相当する。
【００３８】
ハイドロゲルを形成するための架橋化酵素の最終濃度を自由に選択することができるため、選択肢ｉｉ）は、ハイドロゲル系を最終利用者の需要に適合させることができる。ここで、活性化された架橋化酵素はハイドロゲル形成前にハイドロゲル化合物に添加され得るため、架橋化酵素の最終濃度はハイドロゲル前駆体の乾燥質量に依存しない。選択肢ｉｉ）において、ハイドロゲル前駆体および活性化された架橋化酵素は、予め混合されてまたは別個の容器内で凍結乾燥され得る。
【００３９】
例として、選択肢ｉｉ）によると、架橋化酵素第ＸＩＩＩ因子は、導電率が５μＳ／ｃｍ未満、ｐＨが６〜８の範囲の水中で、またはトリス緩衝生理食塩水（例えば、トリス０．９ｍＭ、ＮａＣｌ１３ｍＭ、ｐＨ７．６）中で、活性化酵素トロンビンによって、カルシウムイオンの非存在中、３７℃、３０分間で活性化される。興味深いことに、活性化された第ＸＩＩＩ因子は、製造用混合物に混合された際、室温で２４時間まで安定である。これは、そこからハイドロゲルを生じさせる（活性化された第ＸＩＩＩ因子およびハイドロゲル前駆体を含有する）製造用混合物が凍結乾燥前に室温でそのままの状態であった期間にかかわらず、結果として得られるハイドロゲルの物理化学的特性（ゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’、膨潤率Ｑ）は変化しなかったことを意味する。したがって、最終的なゲルの物理化学的特性の安定性は、製造時間に依存しない。これは、これらの条件下で架橋化酵素および／または活性化酵素の活性に損失が認められないことを表す。
【００４０】
工程ａ）で得られる混合物のインキュベーションは、４〜３７℃、好ましくは１０〜２５℃の範囲の温度、より好ましくは室温で、少なくとも０．５時間、好ましくは２４時間未満、より好ましくは２〜４時間実施され得る。
【００４１】
選択肢ｉｉ）に準じ、工程ｂ）が工程ａ）の前に実施される場合、工程ｂ）における混合物のインキュベーションは、３７℃で好ましくは１５分間〜１時間、特に３０分間実施される。選択肢ｉ）に準じ、工程ｂ）が工程ａ）の後に実施される場合、工程ｂ）における混合物のインキュベーションは、ハイドロゲル前駆体配合物から製造されるハイドロゲルのゲル特性（ゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’、膨潤率Ｑ）が実質的に一定となるプラトーを達成するために、好ましくは２０℃で２〜４時間、または３７℃で１〜２時間実施される。選択肢ｉ）において、基本的にインキュベートする時間は製造時間に相当する。
【００４２】
架橋化酵素は、工程ｂ）の後、５０〜１００％、好ましくは７５％〜１００％、より好ましくは実質的に１００％の活性化度を有し得る。
【００４３】
さらに、工程ａ）において、少なくとも１つのさらなるハイドロゲル化合物、好ましくは少なくとも１つの架橋性生物活性化合物が添加され得る。少なくとも１つのさらなるハイドロゲル化合物、好ましくは少なくとも１つの架橋性生物活性化合物は、ハイドロゲルの少なくとも１つのサブユニットへの選択的架橋反応によってハイドロゲル網目構造に共有結合的に組み込まれ得る。さらなるハイドロゲル化合物は、グルタミンおよび／またはリジンを含み得る。さらなる化合物が１つのグルタミンまたは１つのリジンのみを含む場合、さらなる化合物は、いわゆるぶら下がり分子としてゲルに組み込まれ、さらなる化合物の組み込みが結合したサブユニット鎖の末端を決定することを意味する。ここで追加のサブユニットは付着できない。
【００４４】
ハイドロゲル前駆体配合物の製造方法は、工程ａ）において、１〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは２〜５０Ｕ／ｍｌ、より好ましくは４〜２５Ｕ／ｍｌの架橋化酵素および／または０．０１〜１０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０２〜５Ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．０４〜０．７Ｕ／ｍｌの活性化酵素を含む混合物を使用し得る。
【００４５】
工程ａ）において、方法は、少なくとも１つの構造化合物Ａを、０．５〜２５％ｗ／ｖ、好ましくは１〜２０％ｗ／ｖ、より好ましくは２〜１０％ｗ／ｖ含む混合物を使用し得る。
【００４６】
工程ａ）において、方法は、ペプチドといった架橋性生物活性化合物を０．００５〜１０％ｗ／ｖ、好ましくは０．０１〜２％ｗ／ｖ含む混合物を使用し得る。または、工程ａ）における混合物は、組み換えタンパク質またはヒトもしくは動物組織から精製されたタンパク質といった架橋性生物活性化合物を０．００５〜５％ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２〜２．５％ｍｇ／ｍｌ含み得る。タンパク質としてラミニンが例示される。
【００４７】
本発明のハイドロゲル前駆体配合物の製造方法に使用される緩衝液組成物は、遊離二価イオン、特に遊離カルシウムイオンの濃度を最小限に抑える手段を含み得る。これらの手段は、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡといったキレート剤である。細胞の種類および曝される時間に依存し、１００〜５００μＭの範囲の濃度のＥＤＴＡは、細胞に有毒であり得る。しかし、細胞がハイドロゲル中に包埋され、培地中に置かれる場合、ＥＤＴＡ濃度は、３〜１０倍に希釈される。ＥＤＴＡは、培地の交換、例えば洗い流されることによって除去され得る。
【００４８】
さらに、本発明のハイドロゲルの製造方法におけるハイドロゲル前駆体を含む混合物は、凍結乾燥前に混合物のろ過、好ましくは滅菌ろ過を含み得る。これは、汚染し害を及ぼす可能性のある成分、例えば細菌が除去された前駆体配合物をもたらす。
【００４９】
工程ａ）で得られる混合物は、下流の工程に有用な量を取り扱うために、滅菌ろ過および／または分取され得る。
【００５０】
凍結乾燥後、前駆体配合物の酸素含有量は、窒素といった不活性気体環境中で配合物を保管することによって低減され得る。これにより、前駆体配合物中の酸素によって誘発される酸化過程が最小限に抑えられ、配合物の保存性は向上する。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、説明される本発明の方法によって得られるかまたは得られたハイドロゲル前駆体配合物に関する。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、説明されるハイドロゲル前駆体配合物で満たされた少なくとも１つの容器、反応緩衝液を含む容器、および任意で取扱説明書を含むキットに関する。キットは、ハイドロゲルを製造するための本質的な成分を全て提供し、最終利用者による迅速で単純なハイドロゲルの製造を助長する。
【００５３】
キットの反応緩衝液は、１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭ、より好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲でカルシウムイオンを含有し得る。架橋化酵素、好ましくはトランスグルタミナーゼ、より好ましくは第ＸＩＩＩ因子トランスグルタミナーゼの作用に重要なカルシウムイオンは、反応緩衝液から供給され、したがってハイドロゲルの形成は、ハイドロゲル前駆体配合物の粉末を反応緩衝液中に再懸濁させることによって引き起こされる。反応緩衝液は、好ましくは生理食塩水緩衝溶液、より好ましくはトリス緩衝生理食塩水溶液（ＴＢＳ）である。
【００５４】
さらに、反応緩衝液のｐＨは、５〜８、好ましくは６〜８、より好ましくは６．５〜８の範囲であり得る。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、説明されるハイドロゲル前駆体配合物を、好ましくはカルシウムイオンを含む反応緩衝液中に再懸濁する工程、および任意で細胞培養懸濁液を添加する工程を含むハイドロゲルの製造方法に関する。
【００５６】
ハイドロゲル製造方法において、少なくとも１つのゲルがハイドロゲル前駆体溶液で成型され得る。
【００５７】
ゲル前駆体溶液のゲル化時間は、４〜３７℃、好ましくは１０〜３０℃、より好ましくは１５〜２５℃の範囲の温度で、１〜２０分間、好ましくは２〜１０分間、より好ましくは２〜７分間の範囲であり得る。ゲル化時間は、ゲル化が起こる前の、ゲル前駆体溶液が液体である時間である。
【００５８】
ゲル前駆体溶液の重合時間は、４〜３７℃の範囲、好ましくは３７℃の温度で、１０〜６０分間、好ましくは１５〜４５分間の範囲であり得る。重合時間は、ゲル化時間の終了と共に開始し、ゲルの重合が完了するまで持続する時間である。
【００５９】
ゲル前駆体溶液の重合は、細胞培養のために好ましくは３７℃で、かつ／または加湿環境中で実施される。
細胞培養培地または緩衝液は、重合後に添加され得る。
【００６０】
化合物
構造化合物は、好ましくはオリゴマー、ポリマー、生合成または天然のタンパク質またはペプチド、および多糖からなる群から選択される。好ましくは、構造化合物は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−アクリル酸）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルピロリドン）、ポリ（マレイン酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−マレイン酸）、ポリ（アクリルアミド）もしくはポリ（エチレンオキシド）−ｃｏ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマーまたはそれらの混合物からなる群から選択されるポリマーである。構造化合物は、３、４または５以上のアームを有する分岐ポリ（エチレングリコール）であることがより好ましく、８アーム型ポリ（エチレングリコール）であることが最も好ましい。
【００６１】
本発明のさらなる態様および詳細は、以下に与えられる図面および実施例から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ゲル前駆体溶液、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを含む製造用混合物が凍結および凍結乾燥前に処理された時間（製造時間）の関数としてのハイドロゲルの特性、粉末は、その後再懸濁されてハイドロゲルを形成し、それらの特性が測定された。
【図２】ＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１に記載されるハイドロゲルと比較した本発明のハイドロゲル前駆体配合物から製造されたハイドロゲルの特性。
【図３】ゲル前駆体溶液、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを異なる濃度で含む、凍結および凍結乾燥前の製造用混合物の製造時間に依存するハイドロゲルの特性、粉末は、その後再懸濁されてハイドロゲルを形成し、それらの特性が測定された。
【図４】単一成分ゲル（Ｃ；Ｄ）および二成分ゲル（Ａ；Ｂ）に使用するためのハイドロゲル前駆体。
【図５】ＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１に記載されるハイドロゲルと比較した、増加させた製造時間を経過した本発明のハイドロゲル前駆体配合物から製造されたハイドロゲルの特性。
【図６】本発明に従って時間を経過した製造用混合物中の第ＶＩＩＩ因子の活性範囲。
【図７】ゲル化時間終了時の液体ゲル滴の写真である。
【００６３】
図１は、ゲル前駆体溶液、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを含む混合物が凍結および凍結乾燥前に室温で保持された時間（「製造工程の時間」である製造時間）の関数としてのハイドロゲルの特性を表すグラフを示す。
【００６４】
本発明のハイドロゲルは、図６に関して概説されるように製造された（選択肢ｉ）に準じ、工程ａ）に次いで工程ｂ）および工程ｃ））。これらの特性は、ゲル化時間（Ａ）、せん断弾性率Ｇ’（Ｂ）および膨潤率Ｑ（Ｃ）に関する。５％ｗ／ｖの構造化合物Ａ（グルタミン含有基質で官能化）およびＢ（リジン含有基質で官能化）、２０Ｕ／ｍｌの第ＸＩＩＩ因子、ならびに０．２Ｕ／ｍｌのトロンビンを含み、カルシウムイオンを含まない混合物を調製し、室温（２０〜２５℃）で放置した。様々な時点で混合物を使用してバイアルを満たし、−８０℃で凍結させ、その後凍結乾燥した。凍結乾燥後、バイアルを密封し、蓋を被せ、−２０℃で保管した。その後、バイアルを使用し、５０ｍＭのカルシウムイオンを含有する適切な緩衝液（トリス緩衝液５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中に凍結乾燥させた混合物を再懸濁させ、最終濃度１０Ｕ／ｍｌの活性化された第ＸＩＩＩ因子によって触媒されるゲル化を引き起こすことにより、２．５％ｗ／ｖの構造化合物でゲルを形成させた。図１のグラフＡ、ＢおよびＣは、最終的なハイドロゲル特性の水平なプラトーが約２〜４時間の製造時間後に達成されることを示す。これは、２時間を超える製造工程が最終的なハイドロゲル特性に影響を与えないことを意味する。ハイドロゲルの性質（ハイドロゲル特性）は、製造時間が２時間を超える場合、実質的に一定に維持される。
【００６５】
図２は、本発明の方法によって選択肢ｉ）に準じて製造されたハイドロゲル（Ａ、ＢおよびＣにおける左の棒）とＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１の従来技術の方法に従って製造されたハイドロゲル（Ａ、ＢおよびＣにおける右の棒）との特性の比較を示す。本発明の混合物は図１に関して記載されるように調製されたものであり、製造時間は、最終的なハイドロゲル特性の水平なプラトーをもたらす（ここでハイドロゲル特性は、実質的に一定に維持される）。ＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１は、活性化された第ＸＩＩＩ因子を凍結させる前に、カルシウム含有緩衝液中、３７℃、３０分間でトロンビンによって第ＸＩＩＩ因子を別個に活性化し、その後ハイドロゲル前駆体溶液に添加してハイドロゲルを形成させることを開示する。驚くべきことに、第ＸＩＩＩ因子を別個に予め活性化させない本発明の方法によって製造されたハイドロゲルは、当分野で知られるハイドロゲルと同様のゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’および膨潤率Ｑを示すことがデータの比較により示された。しかし、秤量を行うことなく、より少ない混合工程で（これらは誤差の原因となり得る）、適切な緩衝液を添加して架橋反応を起こすことによって凍結乾燥粉末を直接使用することができるため、本発明の方法から得られる製造物の取り扱いは、最終利用者にとってより容易である。
【００６６】
図３は、製造時間に依存するハイドロゲル特性の比較を示し、ここでゲル前駆体溶液、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンを異なる濃度で含む混合物は、凍結および凍結乾燥前に室温で保持された。混合物中に存在するトロンビンの、結果として得られるゲル中における最終濃度は、０．１Ｕ／ｍｌ、０．３Ｕ／ｍｌおよび１Ｕ／ｍｌに達した。グラフＡ、ＢおよびＣは、混合物中でより高濃度のトロンビンを使用することにより、最終的なゲル特性（ゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’、膨潤率Ｑ）を示す水平なプラトーはより速く達成されることを表す。混合物は、各トロンビン濃度についてグラフの横軸（Ｘ軸）に示される製造時間で、図１に関して示されるように（選択肢ｉ）に準じて）調製された。
【００６７】
図４は、本発明のハイドロゲル前駆体配合物またはハイドロゲル前駆体配合物の製造方法に使用され得るゲル成分を示す。単一成分ゲル（Ｃ、Ｄ）および二成分ゲル（Ａ、Ｂ）の構造化合物が示される。第ＸＩＩＩ因子を架橋するためのＸと称されるＧｌｎ含有基質、および第ＸＩＩＩ因子を架橋するためのＹと称されるＬｙｓ含有基質といった官能性分子は、ポリ（エチレングリコール）のアームに結合する。図４のＣは、２つのグルタミン残渣および２つのリジン残渣を含む構造成分としての４アーム型ポリ（エチレングリコール）を示す。図４のＤは、４つのグルタミン残渣および４つのリジン残渣を含む構造成分としての８アーム型ポリ（エチレングリコール）を示す。したがって、図４のＣおよび図４のＤの構造成分は、高分子網目構造、例えばカルシウムイオンの存在中で第ＸＩＩＩ因子によって触媒される架橋に基づくハイドロゲルを形成する。
【００６８】
二成分ゲルは、２つの異なる種類の分子を必要とし、ここで例えば構造成分は、少なくとも３つのグルタミン残渣を含むマルチアーム型ポリ（エチレングリコール）および２つのリジン残渣を含むリンカー化合物である（図４のＡ）。リンカー化合物は、カルシウムイオンの存在中で第ＸＩＩＩ因子によって触媒される架橋によって構造化合物の個々の分子を共有結合的に連結する。しかし、リンカー化合物は、分岐構造化合物によってもたらされるハイドロゲルの３Ｄ構成に直接寄与しない。
【００６９】
２つの構造化合物ＡおよびＢの概要を図４のＢに示す。構造化合物ＡおよびＢは、グルタミン含有基質（構造化合物Ａ）およびリジン含有基質（構造化合物Ｂ）で官能化される８アーム型ポリ（エチレングリコール）に基づく。いずれの構造化合物も、カルシウムイオンの存在中で第ＸＩＩＩ因子によって触媒される架橋によって形成されるハイドロゲルの３Ｄ構成に寄与する。
【００７０】
図５
図５は、ＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１に記載されるハイドロゲルと比較した、増加させた製造時間を経過した本発明のハイドロゲル前駆体配合物、すなわち選択肢ｉｉ）（工程ａ）の前に工程ｂ）、続いて工程ｃ））から製造されるハイドロゲルの特性（すなわちゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’、膨潤率Ｑ）を示す。
【００７１】
本発明のハイドロゲル前駆体配合物から製造されるハイドロゲルを以下のように製造した：
既に記載されるように（Ｅｈｒｂａｒ  Ｍ、Ｒｉｚｚｉ  ＳＣ、Ｈｌｕｓｈｃｈｕｋ  Ｒ、Ｄｊｏｎｏｖ  Ｖ、Ｚｉｓｃｈ  ＡＨら（２００７）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｅｌｌ−ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２８巻、３８５６〜３８６６ページ；Ｂｏｔｔ  Ｋ、Ｕｐｔｏｎ  Ｚ、Ｓｃｈｒｏｂｂａｃｋ  Ｋ、Ｅｈｒｂａｒ  Ｍ、Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ、Ｌｕｔｏｌｆ  ＭＰ、Ｒｉｚｚｉ  ＳＣ、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ３Ｄ  ｇｅｌｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１０年１１月、３１巻（３２号）、８４５４〜６４ページ）、マルチアーム型ＰＥＧ（８アーム型ＰＥＧ−ＯＨ、Ｍｎ＝４０ｋＤａ、Ｎｅｋｔａｒ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州、アメリカ合衆国）をビニルスルホン基（８アーム型ＰＥＧ−ＶＳ）で官能化した。簡潔に述べると、ＦＸＩＩＩで触媒される架橋のための相補的基質、ＮＱＥＱＶＳＰＬＥＲＣＧ−ＮＨ２（ＴＧ−Ｇｌｎ）またはＡｃ−ＦＫＧＧＧＰＱＧＩＷＧＱＥＲＣＧ−ＮＨ２（Ｗ−Ｌｙｓ）を含有するペプチド（Ｂａｃｈｅｍ、スイス）を、末端官能化ＰＥＧのビニルスルホン基とペプチドシステイン残渣のチオールとの間のマイケル型共役付加を介して８アーム型ＰＥＧ−ＶＳに結合させ、ハイドロゲル前駆体８アーム型ＴＧ−ＰＥＧ（構造化合物Ａ）および８アーム型Ｌｙｓ−ＰＥＧ（構造化合物Ｂ）をそれぞれ生成した。カップリング反応の後、溶液を超純ｄｄＨ２Ｏで広範に透析し、その後凍結乾燥した。Ｗ−Ｌｙｓペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）基質も含んでおり、最終的なハイドロゲルのタンパク質分解に対する感受性を高める。アミノ酸配列を適切に改変することで、他の種の動態および／または他のタンパク質分解酵素に対する感受性によってゲルを作製することも可能である。
【００７２】
図５に関して試験されたハイドロゲルは、選択肢ｉｉ）に準じ、工程ａ）、工程ａ）の前の工程ｂ）、および工程ｃ）の工程を含む本発明の方法に従って製造された。
使用された化合物は、上述されるように調製された。簡潔に述べると、水または緩衝液（Ｃａ２＋の非存在中、１５ｍＭのＮａＣｌを含む１ｍＭトリス緩衝液）中のＦＸＩＩＩ（最終的に１７２または２００Ｕ／ｍＬ）およびトロンビン（最終的に１．７２または２Ｕ／ｍＬ）を混合し、３７Ｃで３０分間プレインキュベートした（工程ｂ）。したがって第ＸＩＩＩ因子は、工程ａ）に使用される前に十分に活性化された。その後、このＦＸＩＩＩ／トロンビン溶液を、反応基が化学量論的に釣り合う状態で、水（導電率５μＳ／ｃｍ未満）中に構造化合物ＡおよびＢの両方を含有する溶液と室温で混合した（工程ａ）。必要に応じ、架橋性生物活性化合物、例えばＴＧ−ＲＧＤＧＩｎも製造用混合物に添加され得る。必要に応じ、架橋性生物活性化合物、例えばＴＧ−ＲＧＤＧＩｎも製造用混合物に添加され得る。工程ａ）の後、（グラフのｘ軸に示される）特定の時点で、試料を分取して凍結させ、工程ｃ）を実施した。未反応粉末プレミックス（活性化酵素、トロンビン、架橋化酵素、ＦＸＩＩＩ、ならびに構造化合物ＡおよびＢ、ならびに任意で生体活性化合物ＴＧ−ＲＧＤＧＩｎを含む）を適切な緩衝液（下記参照）で再懸濁した後、結果として得られるゲルの最終的な組成および特性は、以下の従来技術に関して記載されるものと同じである。
【００７３】
従来技術の方法−従来技術の方法を使用して形成され、本出願に記載される新規方法で製造されたハイドロゲルの基準として使用されるＦＸＩＩＩ触媒ＰＥＧ系ハイドロゲル（ゲル）
第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）をＦＸＩＩＩａへ予め活性化するため、従来技術に記載されるようにＦＸＩＩＩ（Ｂｅｈｒｉｎｇ、スイス）を活性化してＦＸＩＩＩａを形成した（Ｅｈｒｂａｒ  Ｍ、Ｒｉｚｚｉ  ＳＣ、Ｈｌｕｓｈｃｈｕｋ  Ｒ、Ｄｊｏｎｏｖ  Ｖ、Ｚｉｓｃｈ  ＡＨら（２００７）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｅｌｌ−ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｆｉｂｒｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ２８巻、３８５６〜３８６６ページ；ＷＯ２０１４／１８０９７０Ａ１；Ｂｏｔｔ  Ｋ、Ｕｐｔｏｎ  Ｚ、Ｓｃｈｒｏｂｂａｃｋ  Ｋ、Ｅｈｒｂａｒ  Ｍ、Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ、Ｌｕｔｏｌｆ  ＭＰ、Ｒｉｚｚｉ  ＳＣ、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ３Ｄ  ｇｅｌｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１０年１１月、３１巻（３２号）、８４５４〜６４ページ）。簡潔に述べると、凍結乾燥粉末由来の再構成ＦＸＩＩＩ（１７２．４１または２００Ｕ／ｍＬ）を、１５ｍＭのＮａＣＬおよび２．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む１ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６）中で、ヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ、１．７２または２Ｕ／ｍＬ）を用いて３７℃で３０分間活性化した。その後、分取したＦＸＩＩＩａを−８０℃で保管し、以下に記載されるようにゲルの形成に使用する。
【００７４】
簡潔に述べると、ゲルは、前述のとおりに製造された、化学量論的に釣り合いのとれた８アーム型ＴＧ−ＰＥＧ（構造化合物Ａ）と８アーム型Ｌｙｓ−ＰＥＧ（構造化合物Ｂ）のＦＸＩＩＩで触媒される架橋によって形成された。例えば、１００μＬのゲル（乾燥質量２．５％ｗ／ｖ）は、１．２２ｍｇの構造化合物Ａおよび１．２８ｍｇの構造化合物Ｂを含有する。ゲル形成反応は、通常、５０ｍＭの塩化カルシウムを含有し、ＦＸＩＩＩａの最終濃度が１０Ｕ／ｍＬであるトリス緩衝液（ＴＢＳ、５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で起き、トリス緩衝液は、構造化合物ＡおよびＢを混合した後に最終工程として添加される。必要に応じ、ＦＸＩＩＩａ添加前に、細胞接着ペプチドＲＧＤ（ＴＧ−ＲＧＥＧＩｎ、アミノ酸配列：ＮＱＥＱＶＳＰＬ−ＧＲＧＤＳＰＧ−ＮＨ２、Ｂａｃｈｅｍ、スイス）が例示される架橋性生物活性化合物もゲル形成反応に添加される（ゲル中での最終濃度５０μＭ）。架橋反応混合物は、次いで５％ＣＯ２加湿環境中、３７℃で３０〜４５分間インキュベートされる。
【００７５】
ハイドロゲルの機械的および膨潤試験
ゲル化時間は、最終利用者によって操作されるゲルを形成するゲル前駆体溶液が、固体になり、液体操作装置によって操作することができなくなるゲルになり始める前に液体のままである時間である。簡潔に述べると、（本発明に記載されるように製造され、ゲルを作製する全ての化合物を含有する）未反応粉末プレミックスが、最終利用者によって適切な緩衝液に再懸濁され、架橋反応（すなわちゲル化）が開始し、図７に示されるように液体溶液１がピペットの先端３に付着する「小フィラメント」２を形成するまでの時間が測定される。フィラメント２は、最終利用者が液体操作装置でこの硬化ゲル溶液１を操作することができなくなる指標である。最終的なゲルを形成する重合反応は、次いで反応基が消費されるまで継続する。従来技術の方法を用いて調製されるゲルについて同じ測定を実施し、この場合、ゲル化時間の測定は、予め活性化されたＦＸＩＩＩ（ＦＸＩＩＩａ）が最終利用者によって最後の成分として全てのゲル化合物を含有する溶液に添加され、架橋反応が開始する時点で開始される。
【００７６】
前述のように、異なる製造手順でゲル（例えば、乾燥質量２．５％ｗ／ｖ）を調製した。硬化前のゲルの液滴（体積８０μＬ）を、厚さ１ｍｍのスペーサと共に滅菌した疎水性スライドガラス（ＳｉｇｍａＣｏｔｅで被覆、Ｓｉｇｍａ、アメリカ合衆国）の間に挟み、５％ＣＯ２加湿環境で、３７℃で４５分間ゲル化させた。ゲル化が完了し、ＰＢＳ中で２４時間膨潤させた後、生検パンチを使用して直径８ｍｍのゲルディスクを製造し、次いで機械的測定の前に同じ緩衝液中で保管した。
【００７７】
（ＭＣＲ３０２、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ）を使用し、レオロジー測定を実施した。ゲルを、レオメータの２枚の平行なプレート間に置き、滑りを防ぐため当初の厚さの８０％まで圧縮した。ハイドロゲルの線形粘弾性挙動の範囲内で確実に測定を実施するため、一定の周波数でひずみ掃引を行った。一定のひずみで、周波数の関数としてずれ弾性率（Ｇ’）を記録した。膨潤したディスク試料それぞれのＧ’値を、０．１〜０．２Ｈｚの間で測定されたＧ’値の平均値として算出した。全ての測定は、室温（２２℃）で実施された。膨潤率Ｑ（＝Ｗｓ／Ｗｄ）を、ＰＢＳ中で膨潤平衡状態にあるハイドロゲル（Ｗｓ）とその理論乾燥質量（Ｗｄ）の重量比として算出した（Ｂｏｔｔ  Ｋ、Ｕｐｔｏｎ  Ｚ、Ｓｃｈｒｏｂｂａｃｋ  Ｋ、Ｅｈｒｂａｒ  Ｍ、Ｈｕｂｂｅｌｌ  ＪＡ、Ｌｕｔｏｌｆ  ＭＰ、Ｒｉｚｚｉ  ＳＣ、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ３Ｄ  ｇｅｌｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１０年１１月、３１巻（３２号）、８４５４〜６４ページ）。
【００７８】
図５は、前述の従来技術の方法と比較した、本発明の方法（選択性ｉｉ）を使用して得られた結果を示す。
【００７９】
選択肢ｉｉ）に準ずる方法は、工程ｂ）の次に工程ａ）および工程ｃ）を含む製造方法に対応する。簡潔に述べると、架橋化酵素および活性化酵素を予め混合して、３７℃で３０分間プレインキュベートした（工程ｂ））。その後、室温で酵素プレミックスに構造化合物を添加し（製造用混合物開始）（工程ａ））、滅菌ろ過し、次いで０．６時間、１時間、２時間、４時間、６時間および２１．８時間で分取した製造用混合物を凍結乾燥した（工程ｃ））。
【００８０】
前駆体溶液の他の成分（構造化合物を含む）と混合する前に、Ｃａ２＋の非存在中、３７℃で３０分間トロンビンと共にＦＸＩＩＩのプレインキュベートを実施し、製造用混合物を作製した。このプレインキュベート方法は、ＦＸＩＩＩが既に１００％（および／または従来技術と同様に）活性化されていると思われるため、有益である。その後、凍結乾燥前に製造用混合物が室温に置かれた期間（製造時間）にかかわらず、最終的なゲル特性は変化しなかった。図５におけるグラフＡ、ＢおよびＣは、最終的なゲル特性（ゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’、膨潤率Ｑ）は、製造時間、すなわち製造用混合物が凍結乾燥前に室温に留まった時間を経過して安定であることを示す。さらに、最終的なゲル特性は、従来技術の方法で得られるものと同様であった。
【００８１】
図６
図６は、本発明（選択肢ｉ）に従う、製造用混合物中における第ＸＩＩＩ因子の、時間の経過に伴う活性化を示す。
【００８２】
選択肢ｉ）に準じ、工程ａ）、工程ａ）の後の工程ｂ）、および工程ｃ）を含む本発明の方法に従って製造されるハイドロゲル
以下、活性化酵素（トロンビン）、架橋化酵素（ＦＸＩＩＩ）、構造化合物ＡおよびＢ、ならびに任意で生体活性化合物ＴＧ−ＲＧＤＧＩｎを含む未反応粉末プレミックスの製造方法を例示する。これらの凍結乾燥プレミックスは、次いで最終利用者に使用され、乾燥質量２．５％ｗ／ｖのゲルを形成する。最終的な２．５％ｗ／ｖゲルは、図５に関して概略される従来技術の方法で製造される２．５％ｗ／ｖゲルと同一の構造（および生体活性）化合物、ＦＸＩＩＩ濃度およびトロンビン濃度を含有する。
【００８３】
（上記で概略されるように製造された）構造化合物ＡおよびＢの両方の５％ｗ／ｖ溶液を、導電率が５μＳ／ｃｍ未満の水中で作製し、化学量論的に釣り合いのとれた反応基と混合した。最終濃度がそれぞれ約２０Ｕ／ｍＬおよび約０．２Ｕ／ｍＬに達するよう、ＦＸＩＩＩおよびトロンビン（いずれも個別の容器内で水中に溶解される）を５％ｗ／ｖの構造化合物混合物と混合した。ＦＸＩＩＩユニットのトロンビンユニットに対する比は、従来技術の条件における架橋化酵素と活性化酵素の比を再現するよう１００〜１に保持された。
【００８４】
必要に応じて、架橋性生体活性化合物、例えばＴＧ−ＲＧＤＧＩｎも製造用混合物に添加され得る。製造用混合物の調製はＣａ２＋の非存在中で実施され、工程は室温で実施された。製造用混合物のｐＨは、６．５〜８の範囲である。
【００８５】
前述のとおりに全ての化合物を混合した後、次いで、例えば従来の孔径が０．２２μｍのシリンジフィルタを使用して製造用混合物を滅菌ろ過した。その後、凍結乾燥用に製造される容器に滅菌溶液を満たし、即時使用可能な未反応粉末を得た。
【００８６】
一般的に、特定の時点で（製造用混合物を室温でインキュベートする０．２５から２５時間の間、図１および図６参照）、分取したものを凍結および凍結乾燥させ、ゲルの作製に必要とされる化合物を全て含む未反応粉末を（容器の底に）生成させた。そのような２〜４時間を超えて室温に置かれた製造用混合物から製造されるゲルのゲル特性（ゲル化時間、せん断弾性率Ｇ’）は、安定なままであった（下記参照）。
【００８７】
ゲルの作製に必要とされる化合物を全て含有する凍結乾燥未反応粉末の再懸濁によるゲルの調製
（異なる時間でインキュベートした後に製造用混合物を凍結乾燥することによって製造された、工程ｃ））未反応粉末を、５０ｍＭの塩化カルシウムを含有するトリス緩衝液（トリス５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中に再懸濁させ、第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンの最終濃度が（図５について概説される従来技術の方法で製造されるゲルと同様）それぞれ１０Ｕ／ｍＬおよび０．１Ｕ／ｍＬである、構造化合物乾燥質量２．５％ｗ／ｖのゲルを形成させた。典型的な再懸濁液の体積は、５０〜１０００μＬの範囲である。これらのゲルの物理化学的特性を下記のとおりに測定し、下記に示すように従来技術の方法を使用して製造されたゲルを基準として評価した。
【００８８】
図５に関して概説されるように従来技術のゲルを製造し、試験した。試験に用いられた十分に活性化されたＦＸＩＩＩ（従来技術の方法に従うとＦＸＩＩＩａ）の濃度は、１０Ｕ／ｍＬ（１００％活性化の基準として）および５Ｕ／ｍＬ（５０％活性化の基準として）であった。図６のＡを作成するために、次いでゲル化時間を製造時間（図１に関して示されるように与えられた）の関数として示す図１のＡの値と共にこれらのデータをプロットした。ゲル化時間に基づき（図６のＡ）、製造用混合物中のＦＸＩＩＩは、約１時間および４時間の製造時間の後に、それぞれ活性化の基準の５０％および１００％に相当する活性を有すると思われる。
【００８９】
同じ試料のＧ’を図６のＢにプロットし、約２時間の製造時間の後、既に従来技術のゲル（１００％活性化の基準）と同様のＧ’が得られていた。凍結乾燥粉末を適切な緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液、５０ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７．６）に再懸濁させた際にＦＸＩＩＩの活性化が継続する、および／またはゲル化工程中に完了する可能性があるため、これは、凍結乾燥前の製造用混合物中のＦＸＩＩＩが、十分に活性化されていなかった（すなわち、１００％活性化の基準と比較して）ことを示す。しかし、製造用混合物におけるＦＸＩＩＩの活性化は、ほぼ１００％であることが好ましい。
【００９０】
好ましい実施形態
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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