(57)【要約】  本発明は一般に、ミクロ流体および標識された核酸に関する。特定の態様は一般に、アガロースゲルなどのゲル中に細胞を含めること、および例えばゲル内に含まれたままで、細胞内の核酸を決定することに関する。核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、トランスクリプトームなどであり得る。一部の実施形態では、例えば、細胞由来のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、トランスクリプトームにおけるものとして）の両方が決定され得る。一部の場合には、核酸は、配列決定または他の目的のためにビーズに結合され得る。かかるシステムは、例えば、ハイスループット配列決定または他の適用のために有用であり得る。
2019515674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル液滴内の細胞を溶解させて、前記細胞からＤＮＡおよびＲＮＡを放出させること；
前記ＤＮＡを、第１のセットのオリゴヌクレオチドに結合させること；ならびに
前記ＲＮＡを、第２のセットのオリゴヌクレオチドに結合させること
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、約１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、約０．１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、約０．０１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも約９０％が、１つの細胞を含むかまたは細胞を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも一部が、アガロースを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アガロースが、約６０℃未満のゲル化温度を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アガロースが、約４０℃未満のゲル化温度を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲル液滴が、約１ｍｍ以下の平均直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも一部が、ミクロ流体チャネル内に含まれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞のうちの少なくとも一部を、細胞溶解試薬を使用して溶解させることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞溶解試薬が、プロテイナーゼＫを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞のうちの少なくとも一部がヒト細胞である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞からの放出後に、前記ゲノムＤＮＡを断片化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲノムＤＮＡを断片化することが、制限エンドヌクレアーゼに前記ゲノムＤＮＡを曝露することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを形成することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
逆転写酵素を使用して、前記ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを形成することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｃＤＮＡを、前記ゲル液滴内のオリゴヌクレオチドに結合させることをさらに含む、請求項１８または１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡを前記第１のセットのオリゴヌクレオチドに結合させることが、前記ＤＮＡのうちの少なくとも一部を前記オリゴヌクレオチドにライゲーションさせることを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡを前記第１のセットのオリゴヌクレオチドに結合させることが、前記ＲＮＡのうちの少なくとも一部を前記オリゴヌクレオチドにライゲーションさせることを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドが粒子に結合されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子がヒドロゲル粒子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記粒子が、約１ｍｍ以下の平均直径を有する、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記粒子が、約５００マイクロメートル以下の平均直径を有する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記粒子が、約１マイクロメートル以下の平均直径を有する、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドが、第１のセットのバーコード配列をさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のセットのオリゴヌクレオチドが、第２のセットのバーコード配列をさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のセットのバーコード配列および前記第２のセットのバーコード配列が、少なくとも１つのバーコード配列を共通して有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記粒子の実質的に各々が識別可能なバーコード配列を含むように、前記第１のセットのバーコード配列および／または前記第２のセットのバーコード配列が、第１のバーコードの予め規定されたプールから選択される第１のバーコード、および第２のバーコードの予め規定されたプールから選択される第２のバーコードを含む、請求項２９または３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
第１のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３００の識別可能なバーコードを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第１のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約１，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項３１または３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３００の識別可能なバーコードを含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約１，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記識別可能なバーコード配列が、少なくとも１０，０００の識別可能なバーコード配列を含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記識別可能なバーコード配列が、少なくとも１００，０００の識別可能なバーコード配列を含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部が、前記粒子に共有結合されている、請求項２３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、アクリルホスホルアミダイト連結を介して前記粒子に共有結合されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、アミノ連結を介して前記粒子に共有結合されている、請求項３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、ビオチン−ストレプトアビジン連結を介して前記粒子に結合されている、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、切断可能なリンカーを含む、請求項２３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記切断可能なリンカーが、化学的に切断可能なリンカーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記切断可能なリンカーが、酵素的に切断可能なリンカーである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドを増幅することをさらに含む、請求項２３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＣＲを使用して前記オリゴヌクレオチドを増幅することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドを増幅する前に、前記ゲル液滴を流体液滴内にカプセル化することをさらに含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記流体液滴が前記粒子を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記粒子が、約１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記粒子が、約０．１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項５０または５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記粒子が、約０．０１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記流体液滴のうちの少なくとも約９０％が、１つの粒子を含むかまたは粒子を含まない、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドの前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を、前記粒子から放出させることをさらに含む、請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を前記粒子から切断することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を前記粒子から光切断することを含む、請求項５５または５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記オリゴヌクレオチドを増幅する前に、前記粒子から前記オリゴヌクレオチドを放出させることを含む、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチドを増幅した後に、前記流体液滴を破裂させることをさらに含む、請求項４７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ゲル液滴内の細胞を溶解させて、前記細胞からＲＮＡを放出させること；
前記ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを形成すること；および
前記ｃＤＮＡを、前記ゲル液滴内のオリゴヌクレオチドに結合させること
を含む方法。
【請求項６２】
リガーゼを使用して前記ｃＤＮＡを前記オリゴヌクレオチドに結合させることを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
線状ポリアクリルアミドに前記ＲＮＡを曝露することを含む、請求項６１または６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
逆転写酵素に前記ＲＮＡを曝露することによって、前記ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを形成することを含む、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記逆転写酵素が、前記ｃＤＮＡに３つの未対合のＡ塩基を付加する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ｃＤＮＡを前記オリゴヌクレオチドに結合させることが、前記ｃＤＮＡへの前記３つの未対合のＡ塩基を、３つの未対合のＴ塩基を含むオリゴヌクレオチドとマッチさせることを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞が、約１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、約０．１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項６１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が、約０．０１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも約９０％が、１つの細胞を含むかまたは細胞を含まない、請求項６１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも一部が、アガロースを含む、請求項６１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記アガロースが、約６０℃未満のゲル化温度を有する、請求項６１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記アガロースが、約４０℃未満のゲル化温度を有する、請求項６１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ゲル液滴が、約１ｍｍ以下の平均直径を有する、請求項６１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞のうちの少なくとも一部を、細胞溶解試薬を使用して溶解させることを含む、請求項６１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞溶解試薬が、プロテイナーゼＫを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞のうちの少なくとも一部がヒト細胞である、請求項６１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＲＮＡがｍｉＲＮＡを含む、請求項６１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡを含む、請求項６１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部が粒子に結合されている、請求項６１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記粒子がヒドロゲル粒子を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記粒子が、約１ｍｍ以下の平均直径を有する、請求項８０または８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記粒子が、約５００マイクロメートル以下の平均直径を有する、請求項８０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記粒子が、約１マイクロメートル以下の平均直径を有する、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部が、前記粒子に共有結合されている、請求項８０〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、アクリルホスホルアミダイト連結を介して前記粒子に共有結合されている、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、アミノ連結を介して前記粒子に共有結合されている、請求項８５または８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記オリゴヌクレオチドが、ビオチン−ストレプトアビジン連結を介して前記粒子に結合されている、請求項８０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記オリゴヌクレオチドが、切断可能なリンカーを含む、請求項８０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカーである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記切断可能なリンカーが、化学的に切断可能なリンカーである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記切断可能なリンカーが、酵素的に切断可能なリンカーである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９３】
前記オリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含む、請求項８０〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記粒子の実質的に各々が識別可能なバーコード配列を含むように、前記バーコード配列が、第１のバーコードの予め規定されたプールから選択される第１のバーコードおよび第２のバーコードの予め規定されたプールから選択される第２のバーコードを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
第１のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３００の識別可能なバーコードを含む、請求項９３または９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
第１のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約１，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３００の識別可能なバーコードを含む、請求項９５または９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約１，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記識別可能なバーコード配列が、少なくとも１０，０００の識別可能なバーコード配列を含む、請求項９５〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記識別可能なバーコード配列が、少なくとも１００，０００の識別可能なバーコード配列を含む、請求項９５〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を増幅することをさらに含む、請求項８０〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
ＰＣＲを使用して前記オリゴヌクレオチドを増幅することを含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記オリゴヌクレオチドを増幅する前に、前記ゲル液滴を流体液滴内にカプセル化することをさらに含む、請求項６１〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記流体液滴が前記粒子を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記粒子が、約１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記粒子が、約０．１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項１０５または１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記粒子が、約０．０１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項１０５〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記流体液滴のうちの少なくとも約９０％が、１つの粒子を含むかまたは粒子を含まない、請求項１０５〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を、前記粒子から放出させることをさらに含む、請求項１０５〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を前記粒子から切断することを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を前記粒子から光切断することを含む、請求項１１０または１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記オリゴヌクレオチドを増幅する前に、前記粒子から前記オリゴヌクレオチドを放出させることを含む、請求項１１０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記オリゴヌクレオチドを増幅した後に、前記流体液滴を破裂させることをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、請求項１１３または１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
溶解された細胞、第１のセットのオリゴヌクレオチドに結合したＤＮＡ、および第２のセットのオリゴヌクレオチドに結合したＲＮＡ、を含むゲル液滴
を含む物品。
【請求項１１７】
前記細胞が、約１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記細胞が、約０．１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項１１６または１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記細胞が、約０．０１細胞／ゲル液滴以下で前記ゲル液滴内に含まれる、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも約９０％が、１つの細胞を含むかまたは細胞を含まない、請求項１１６〜１１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも一部が、アガロースを含む、請求項１１６〜１２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記アガロースが、約６０℃未満のゲル化温度を有する、請求項１１６〜１２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記アガロースが、約４０℃未満のゲル化温度を有する、請求項１１６〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記ゲル液滴が、約１ｍｍ以下の平均直径を有する、請求項１１６〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２５】
前記ゲル液滴のうちの少なくとも一部が、ミクロ流体チャネル内に含まれる、請求項１１６〜１２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記細胞のうちの少なくとも一部がヒト細胞である、請求項１１６〜１２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡを含む、請求項１１６〜１２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記ＲＮＡがｍＲＮＡを含む、請求項１１６〜１２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２９】
第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドが粒子に結合されている、請求項１１６〜１２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記粒子がヒドロゲル粒子を含む、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記粒子が、約１ｍｍ以下の平均直径を有する、請求項１２９または１３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記粒子が、約５００マイクロメートル以下の平均直径を有する、請求項１２９〜１３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記粒子が、約１マイクロメートル以下の平均直径を有する、請求項１２９〜１３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３４】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドが、第１のセットのバーコード配列をさらに含む、請求項１２９〜１３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記第２のセットのオリゴヌクレオチドが、第２のセットのバーコード配列をさらに含む、請求項１２９〜１３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３６】
前記第１のセットのバーコード配列および前記第２のセットのバーコード配列が、少なくとも１つのバーコード配列を共通して有する、請求項１３５に記載の組成物。
【請求項１３７】
前記粒子の実質的に各々が識別可能なバーコード配列を含むように、前記第１のセットのバーコード配列および／または前記第２のセットのバーコード配列が、第１のバーコードの予め規定されたプールから選択される第１のバーコードおよび第２のバーコードの予め規定されたプールから選択される第２のバーコードを含む、請求項１３５または１３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３８】
第１のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３００の識別可能なバーコードを含む、請求項１３７に記載の組成物。
【請求項１３９】
第１のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約１，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項１３７または１３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４０】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３００の識別可能なバーコードを含む、請求項１３７〜１３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４１】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約１，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４２】
第２のバーコードの前記予め規定されたプールが、少なくとも約３，０００の識別可能なバーコードを含む、請求項１３７〜１４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４３】
前記識別可能なバーコード配列が、少なくとも１０，０００の識別可能なバーコード配列を含む、請求項１３７〜１４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４４】
前記識別可能なバーコード配列が、少なくとも１００，０００の識別可能なバーコード配列を含む、請求項１３７〜１４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４５】
前記オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部が、前記粒子に共有結合されている、請求項１２９〜１４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４６】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、アクリルホスホルアミダイト連結を介して前記粒子に共有結合されている、請求項１４５に記載の組成物。
【請求項１４７】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、アミノ連結を介して前記粒子に共有結合されている、請求項１４５または１４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４８】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、ビオチン−ストレプトアビジン連結を介して前記粒子に結合されている、請求項１２９〜１４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４９】
前記第１のセットのオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のセットのオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも一部のオリゴヌクレオチドが、切断可能なリンカーを含む、請求項１２９〜１４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５０】
前記切断可能なリンカーが、光切断可能なリンカーである、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５１】
前記切断可能なリンカーが、化学的に切断可能なリンカーである、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５２】
前記切断可能なリンカーが、酵素的に切断可能なリンカーである、請求項１４９に記載の組成物。
【請求項１５３】
前記ゲル液滴が、流体液滴内にカプセル化される、請求項１１６〜１５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５４】
前記流体液滴が前記粒子を含む、請求項１５３に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記粒子が、約１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項１５４に記載の組成物。
【請求項１５６】
前記粒子が、約０．１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項１５４または１５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５７】
前記粒子が、約０．０１粒子／液滴以下で前記流体液滴内に含まれる、請求項１５４〜１５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５８】
前記流体液滴のうちの少なくとも約９０％が、１つの粒子を含むかまたは粒子を含まない、請求項１５４〜１５７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｔｚらによる表題「遺伝的解析および他の適用のための固定化ベースのシステムおよび方法（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」の、２０１６年４月１９日出願の米国仮特許出願第６２／３２４，４０７号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は全般に、ミクロ流体および標識された核酸に関する。
【背景技術】
【０００３】
単一細胞トランスクリプトームおよびゲノム解析は、集中的に調査されており、種々の生物学的プロセスの理解を後押しした。これは、顕著な品質改善または医療過誤の低減など、ヒト医療を改革し得る。しかし、トランスクリプトームおよびゲノムは、異なる細胞内空間中に位置し、それら独自の特性を有するので、それらをプロファイリングする場合には、異なる解析手順が通常必要とされる。従って、単一細胞における両方同時のプロファイリングには、なおも課題がある。かかるツールは、細胞不均一性のより包括的な洞察を提供し、より有効な個々の治療をもたらし得る。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は全般に、ミクロ流体および標識された核酸に関する。本発明の主題は、一部の場合には、相互関係のある製品、特定の問題に対する代替的解法、ならびに／または１もしくは複数のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる使用を伴う。
【０００５】
第１の態様によれば、本発明は全般に、物品に関する。１セットの実施形態では、この物品は、溶解された細胞、第１のセットのオリゴヌクレオチドに結合したＤＮＡ、および第２のセットのオリゴヌクレオチドに結合したＲＮＡ、を含むゲル液滴を含む。
【０００６】
別の一態様によれば、本発明は全般に、方法に関する。１セットの実施形態では、この方法は、ゲル液滴内の細胞を溶解させて、細胞からＤＮＡおよびＲＮＡを放出させること、該ＤＮＡを第１のセットのオリゴヌクレオチドに結合させること、ならびに該ＲＮＡを第２のセットのオリゴヌクレオチドに結合させることを含む。
【０００７】
別のセットの実施形態では、本発明の方法は、ゲル液滴内の細胞を溶解させて、細胞からＲＮＡを放出させること、該ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを形成すること、および該ｃＤＮＡをゲル液滴内でオリゴヌクレオチドに結合させることを含む。
【０００８】
別の一態様では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちの１または複数を行う方法を包含する。なお別の一態様では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のうちの１または複数を使用する方法を包含する。
【０００９】
本発明の他の利点および新規特徴は、添付の図面と併せて、本発明の種々の非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から、明らかとなる。本明細書および参照によって組み込まれる文書が、矛盾する開示および／または一致しない開示を含む場合、本明細書の開示が支配するものとする。参照によって組み込まれる２以上の文書が、互いに対して矛盾する開示および／または一致しない開示を含む場合、有効日付が新しい文書の開示が支配するものとする。
【００１０】
本発明の非限定的な実施形態は、模式的であって正確な縮尺を意図していない添付の図面を参照して、例として記載される。図中、示された各同一またはほぼ同一の構成要素は、典型的には、単一の数字によって示される。明確さを目的として、当業者に本発明を理解させるために例示が必要でない場合、全ての構成要素が全ての図において表示されるわけでも、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されるわけでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、核酸を標的化することに関する本発明の一実施形態を示す。
【図２】図２は、核酸を標的化することに関する本発明の別の一実施形態を示す。
【図３】図３は、核酸を標的化することに関する本発明のなお別の一実施形態を示す。
【図４】図４は、アダプター配列を含む本発明のなお別の一実施形態を示す。
【図５】図５は、１セットの実施形態における、標識された核酸の例を示す。
【図６】図６は、本発明の一部の実施形態における、光切断可能なスペーサーまたはリンカーを含む部分を示す。配列は配列番号１３によって与えられる。
【図７】図７は、なお別の一実施形態における、標識された核酸の生成を示す。
【図８】図８は、本発明のなお別の一実施形態における、カプセル化された細胞を解析するための実験を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は全般に、ミクロ流体および標識された核酸に関する。特定の態様は全般に、アガロースゲルなどのゲル中に細胞を含めること、および、例えばゲル内に含まれたままで、細胞内の核酸を決定することに関する。核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、トランスクリプトームなどであり得る。一部の実施形態では、例えば、細胞由来のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、トランスクリプトームにおけるものとして）の両方が決定され得る。一部の場合には、核酸は、配列決定または他の目的のためにビーズに結合され得る。かかるシステムは、例えば、ハイスループット配列決定または他の適用のために有用であり得る。
【００１３】
本発明の一態様は全般に、ゲル中に細胞をカプセル化し、細胞を溶解させてその核酸にアクセスするためのシステムおよび方法に関する。一部の場合には、細胞によって放出された核酸は、例えば種々の配列決定技術を使用する、後に行う決定または解析のために、オリゴヌクレオチドにタグ化または結合され得る。決定される核酸には、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）もしくはｍＲＮＡが含まれ得るか、または一部の場合には、単一細胞由来の両方が決定され得る。一部の場合には、１つの細胞（または１つよりも多い細胞）を含むミクロ流体液滴を調製し、該液滴に、細胞をカプセル化するゲルを形成させることによって、ゲルは調製され得る。細胞は、ゲル内で溶解されて核酸を放出し得る；しかし、ゲルの存在は、溶解された細胞によって放出された核酸がゲルを出る能力を阻害または少なくとも低減させ得、それによって、ゲル内に留まるようにすることができる。他の化合物が、例えば種々の目的のために、ゲル内に含まれる核酸と相互作用するために使用され得る。例えば、種々のオリゴヌクレオチドが、例えば後に行う解析のために、核酸のうちの少なくとも一部に結合され得る。
【００１４】
かかるシステムの非限定的な一例は、図１中で見ることができる。この図では、複数の細胞が複数の液滴内に含まれる。一部の場合には、細胞は、液滴のほとんどまたは全てで、その中に０または１つのみの細胞が存在することを確実にするために、１細胞／液滴未満の密度（および、一部の場合には、例えば、本明細書で議論するように、１細胞／液滴よりもはるかに小さい密度）でカプセル化され得る。液滴は、ゲルを形成するために使用され得る構成要素、例えば、液体状態のアガロースもまた含み、ゲルのゲル化または凝固温度を下回る温度まで液滴を冷却することにより、アガロースに、ゲルを形成させ得る。他のゲルは、以下でさらに詳細に議論される。当業者は、ミクロ流体液滴内に細胞をカプセル化するための種々の技術を認識する；例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７０８，９４９号、同第８，３３７，７７８号、同第８，７６５，４８５号または国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３およびＷＯ２００６／０９６５７１を参照のこと。
【００１５】
液滴内での細胞のカプセル化後に、液滴は、ゲル（またはゲル「液滴」）を形成するために凝固され得る。次いで、細胞は、例えば、プロテイナーゼＫなどの適切な細胞溶解試薬への曝露によって（または本明細書で議論されるものなどの他の技術を使用して）溶解され得る。ゲルの存在の故に、細胞によって放出された核酸は、ゲル内に留まり得る。一部の実施形態では、細胞によって放出されたゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの両方が決定され得る。ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡを捕捉および標識するための技術は、一部の場合には、例えばＤＮＡおよびＲＮＡの同定を促進するために、異なり得る。ＲＮＡは、例えば、以下でより詳細に議論されるように、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであり得る。一部の場合には、細胞のトランスクリプトームは、例えば、トランスクリプトームを決定するために十分なｍＲＮＡを適切に決定することによって、決定され得る。
【００１６】
しかし、一部の実施形態では、両方とも、独自の「バーコード」（ランダムに決定され得るかまたは本明細書で議論するように決定され得る）を含むオリゴヌクレオチドで標識され得、それによって、一部の場合には、数百、数千、数万もしくはさらには数十万またはそれよりも多い異なる細胞が、単一の実験でバーコード化されるかまたは他の方法で標識されることが可能になり得る。従って、１つのゲル液滴由来（または１つの細胞由来）の核酸は、オリゴヌクレオチドタグを使用して、他の液滴（または他の細胞）由来の核酸からなおも識別され得る。従って、核酸の組み合わされたプールの解析（例えば、配列決定）が実施され得、各核酸の供給源（例えば、個々の細胞）が、存在する異なるオリゴヌクレオチドを決定することによって決定され得る。オリゴヌクレオチドは、液滴からのゲルの形成前に液滴内に存在し得るか、またはゲル液滴が形成された後にそれに添加され得る。オリゴヌクレオチドは、細胞溶解の前またはその後に添加され得る。
【００１７】
一部の場合には、細胞によって放出されるＲＮＡが決定され得る。１セットの実施形態では、ＲＮＡは、例えばゲル内に存在する、オリゴヌクレオチド（例えば、上述のようなバーコードで）にライゲーションされ得るかまたは酵素的に結合され得る。核酸を一緒に結合するかまたは繋ぐことの他の例は、以下でより詳細に議論される。しかし、別のセットの実施形態では、ＲＮＡは、ｃＤＮＡに最初に変換され（即ち、ｃＤＮＡを生成するために使用され）、次いで、ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドにライゲーションされるかまたは酵素的に結合される。
【００１８】
リガーゼの非限定的な例には、ＤＮＡリガーゼ、例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼなどが含まれる。多くのかかるリガーゼは、市販されるものであり得る。さらに、一部の実施形態では、２以上の核酸が、アニーリングまたはプライマー伸長法を使用して、一緒にライゲーションされ得る。さらに、一部の場合には、核酸には、例えばトランスポゾンなどを使用して、オリゴヌクレオチドが内部に付加され得る。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願第６２／０７２，９５０号を参照のこと。
【００１９】
一部の場合には、全てのＲＮＡ（例えば、全てのｍＲＮＡ）が、ｃＤＮＡに変換され得るが（例えば、トランスクリプトームの研究のため）、他の場合には、特定のＲＮＡのみが、ｃＤＮＡに変換され得る。ｃＤＮＡは、用途に応じて、適切なオリゴヌクレオチドでタグ化され得る。
【００２０】
逆転写酵素への曝露などの種々の技術が、ｃＤＮＡを形成するために使用され得る。例えば、細胞内にあると推測される特定のＲＮＡ（または他の核酸）は、例えば特定のＲＮＡを認識できる配列を含む、捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、標的化され得る。かかる方法で、放出されるＲＮＡの一部のみが、ｃＤＮＡに変換され得る。しかし、他の実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮＡに非特異的に適用され得、それによって、全てのＲＮＡに対応するｃＤＮＡの生成を生じる。さらに、一部の場合には、ＤＮＡポリメラーゼが、一本鎖ｃＤＮＡ（例えば、逆転写酵素によって生成される）を二本鎖ｃＤＮＡに変換するために使用され得る。
【００２１】
非限定的な例として、図１に示されるように、ＲＮＡ配列（またはＲＮＡ配列の一部分）を認識できるオリゴヌクレオチド配列を含む線状ポリアクリルアミドが、ＲＮＡと相互作用または会合させられ得、例えば逆転写酵素反応によって、対応するｃＤＮＡ配列を形成するために使用され得る。線状ポリアクリルアミドは、例えばｃＤＮＡ配列の、核酸を沈殿させるために使用され得る。かかる様式で、線状ポリアクリルアミドと相互作用することができるＲＮＡのみが、例えばｃＤＮＡの形成およびその後の適切なオリゴヌクレオチドの結合を経て、決定され得る。
【００２２】
従って、１セットの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、細胞によって放出される）は、逆転写酵素を使用してＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）に変換され得る。次いで、ＤＮＡは、アダプター配列に結合され得る。逆転写酵素の例には、ＡＭＶ、Ｍ−ＭＬＶ、テロメラーゼ逆転写酵素などが含まれるがこれらに限定されない。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩまたはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの多くのかかる逆転写酵素が、市販品として入手され得る。
【００２３】
図２は、ｃＤＮＡの末端に３つの鋳型なし（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）（または未対合の）Ａ塩基を含むオーバーハング領域を生成する逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）が使用される別の一例を示す。オーバーハング領域（例えば、この例ではアデニンを含む）は、相補的オーバーハング領域（例えば、チミンを含む）を含む配列にマッチされ得る。オーバーハングする領域は、例えば１、２、３、４、５などの、任意の適切な数のヌクレオチドを含み得る。末端の鋳型なしまたは未対合の塩基は、一部の実施形態では、例えばライゲーションまたは他の技術による、適切なオリゴヌクレオチド配列の結合を可能にするために、有利に使用され得る。細胞によって放出されたＲＮＡは、逆転写酵素を使用してｃＤＮＡを生成するために使用され得、オーバーハングの存在は、相補的オーバーハングを含むオリゴヌクレオチドがｃＤＮＡにライゲーションまたは結合されるのを可能にする。これは、例えば、オリゴヌクレオチドを結合することを目的として、ｃＤＮＡ（オーバーハングを含む）を、ゲノムＤＮＡ（かかるオーバーハングを含まない、および／または異なるオーバーハングを含む）から区別するために使用され得る。従って、１セットのオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）がｃＤＮＡに結合され得、異なるセットのオリゴヌクレオチドがゲノムＤＮＡに結合され得る。
【００２４】
なお別の例として、一部のＲＮＡは、ポリＡ領域（例えば、ポリＡテイル）を含むかたちで生成される。例えば、逆転写酵素は、例えば逆転写酵素プロセスの間に、ｃＤＮＡの末端に鋳型なしまたは未対合の塩基を含め得る。例えば、一部の逆転写酵素は、逆転写酵素プロセスの間に、ｃＤＮＡの３’末端に３つのＡ塩基を付加する。これは、一部の実施形態では、図３に示されるように、ＲＮＡのポリＡ領域と相互作用し得る相補的ポリＴ領域を含む配列にＲＮＡを曝露することによって、有利に使用され得る。他の配列は、ポリＴ領域を含む配列、例えば、（例えばライゲーションまたは酵素的結合によって）適切なオリゴヌクレオチドに結合または繋がれ得る「ライゲーション」配列中に存在し得る。
【００２５】
ライゲーション配列の使用の非限定的な例は、図４に関して示される。粒子に結合されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを粒子から放出させるために切断される（例えば、光切断される）。ｍＲＮＡ（例えば、ポリＡテイルを有する）などの核酸は、ライゲーション配列（例えば、ゲルから生じる）に繋がれる。オリゴヌクレオチドの一部分は、相補的領域を有する相補鎖（ＣＳ）と相互作用または会合することができるアダプター配列を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに任意のさらなる所望される配列（例えば、別の実体を認識するために使用され得る認識配列、例えば、相補的配列）を結合させるかまたはそれを含むために使用され得る「ユニバーサル配列」またはアダプター配列を含み得る。これらは、バルク（ｂｕｌｋ）相中もしくはミクロ流体液滴などの液滴内に存在し得るかまたはそこで調製され得る。
【００２６】
相補鎖は、例えば核酸（例えば、ＲＮＡ）に結合された、ライゲーション配列と、相補的である一部分もまた含み得る。従って、これらの相互作用とその後のライゲーション（例えば、適切なリガーゼを用いる）が起きると、オリゴヌクレオチドに核酸が繋がれ得る。
【００２７】
さらに、一部の場合には、ＲＮＡに加えて、またはＲＮＡの代わりに、細胞によって放出されるＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｇＤＮＡ）が決定され得る。一部の場合には、例えばゲノム核酸の長さの故に、ゲノム核酸は、例えば制限エンドヌクレアーゼまたは核酸をカットすることができる他の酵素（例えば、ＭＮａｓｅ（小球菌ヌクレアーゼ）酵素）を使用して、より小さい断片へとカットされ得る。多くのかかる酵素が市販されている；１つのかかる例は、ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）である。これらの酵素は、使用される酵素に依存して、特異的または非特異的に、より小さい断片へとＤＮＡを切断し得る。一部の場合には、ＤＮＡは、超音波処理、噴霧化、剪断力への曝露を介して機械的に、または適切な化学物質への曝露によって、断片化または消化され得る。
【００２８】
１セットの実施形態では、ＤＮＡは、例えばＤＮＡについてのエピジェネティック情報を決定するために、バイサルファイト処理に供され得る。バイサルファイト（または亜硫酸水素塩）によるＤＮＡの処理は、シトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は影響されないままにする。従って、バイサルファイト処理は、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存する特異的変異をＤＮＡ配列中に導入し、例えばエピジェネティック情報のための、ＤＮＡのメチル化状態についての単一ヌクレオチド解析情報が得られる。
【００２９】
一部の場合には、ゲノムＤＮＡ断片などの核酸のうち１または複数は、本明細書で議論されるものなどのオリゴヌクレオチドに結合され得るアダプター配列に結合され得る。アダプター配列は、リガーゼまたは本明細書に記載されるものなどの他の技術を使用して、核酸に結合され得る。例えば、一部の場合には、アダプター配列は、オーバーハング配列、例えば、制限エンドヌクレアーゼまたはゲノムＤＮＡを切断もしくは断片化するために使用される他の酵素と相補的である配列を含み得る。アダプター配列はまた、例えば本明細書で議論されるように、オリゴヌクレオチドに結合され得る配列であり得る。例えば、アダプター配列は、オリゴヌクレオチドへの結合のために使用され得る、ポリＡ領域または上記のものなどの他のオーバーハング配列を含み得る。
【００３０】
一部の場合には、アダプター配列は、１または複数の独自の領域、例えば、本明細書に記載されるものなどのバーコードもまた含み得る。これらは、例えば、ゲノムＤＮＡから生じる核酸が、細胞由来のｍＲＮＡなどのＲＮＡから生じる核酸から区別されるのを可能にするために有用であり得る。
【００３１】
アダプター配列の非限定的な一例は、図７中で見ることができる。この図は、粒子（例えば、ヒドロゲル粒子）、１または複数のバーコード、およびオリゴヌクレオチドに任意のさらなる所望される配列（例えば、別の実体を認識するために使用され得る認識配列、例えば、相補的配列）を結合させるかまたはそれを含むために使用され得る「ユニバーサル配列」またはアダプター配列を示す。これらは、バルク相中もしくはミクロ流体液滴などの液滴内に存在し得るかまたはそこで調製され得る。さらに、他の要素、例えば、プロモーターまたはエンハンサーもまた、例えば図７に示されるように、オリゴヌクレオチド内に存在し得る。
【００３２】
アダプター配列は、一部の実施形態では、アダプターと相補的である配列を含む相補的配列に曝露され得る。他の配列、例えば、プライマー、プロモーターなどもまた存在し得る。プライマー、プロモーターなどの例は、本明細書で議論される。相補的配列は、例えば図７に示されるように、アダプター配列の少なくとも一部分と結合するかまたは他の方法で会合することが可能であり得る。相補的配列は、アダプター配列に対して、完全に相補的であり得るか、または１、２、３もしくはそれよりも多いミスマッチを含み得る。アダプター配列（およびその相補体）は、任意の適切な長さ、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５またはそれよりも長いヌクレオチドのものであり得る。
【００３３】
例えば、図７に示されるように、相補的配列には、プライマー、例えば、遺伝子特異的内部フォワードプライマーもしくは遺伝子特異的リバースプライマー配列、または本明細書で議論する他の配列が含まれ得る。これらは、例えば、後で行う核酸の増幅、またはオリゴヌクレオチド（例えば粒子に結合したもの）への核酸の取り込みを促進するために、有用であり得る。図７では、これは、「鋳型」鎖として示される。従って、鋳型鎖は、例えば、溶解された細胞由来のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）から生じる核酸を含み得る。
【００３４】
プライマーは、例えば特異的に（例えば、遺伝子特異的内部フォワードプライマーの場合）または非特異的に、鋳型と相互作用できるプライマーであり得る。引き続く増幅または取り込みは、図７に示されるように、粒子に結合したオリゴヌクレオチド中に、鋳型（またはその少なくとも一部分）の配列を取り込み、それによって、１または複数のバーコード配列と鋳型の少なくとも一部分に対応する配列とを含むオリゴヌクレオチドを含む粒子を生成するために使用され得る。
【００３５】
従って、生成される核酸（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡなど）は、１または複数のオリゴヌクレオチドに結合され得る。これは、一部の実施形態では、ゲル自体内で実施され得る。一部の場合には、ゲルは、流体液滴内に含まれ得、流体液滴内に存在するオリゴヌクレオチドは、例えば、上記のような種々の核酸への結合のために、ゲル中に拡散され得る。一部の場合には、ゲルは、オリゴヌクレオチドへの結合のために核酸を（例えば、取り囲む流体液滴中に）放出させるために、最初に融解され得る。
【００３６】
一緒にされた後に、核酸は、オリゴヌクレオチドに、例えば共有結合、プライマー伸長、ライゲーションなどによって、結合され得る。広範な種々の異なる技術のいずれかが使用され得、当業者は、多くのかかる技術を認識する。どの連結または結合技術が使用されるかは、必ずしも重要ではなく、実施形態間で変動し得る。非限定的な例には、リガーゼ、または参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／９８１，１２３号で議論するものなどの他の適切な技術が含まれる。一部の実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチドタグに連結もしくは結合され得、および／またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）もしくは他の増幅技術を使用して増幅され得る。典型的には、ＰＣＲ反応では、核酸は、単鎖への核酸の解離を引き起こすために加熱され得、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）が、核酸を増幅するために使用される。このプロセスは、核酸を増幅するために複数回反復される場合が多い。
【００３７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを粒子（例えば、ヒドロゲルまたはポリマー粒子）に最初に連結または結合させ、次いで、粒子が液滴中またはゲル中に取り込まれた後に粒子からオリゴヌクレオチドを放出させることによって導入される。例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」の、２０１４年１０月３０日出願の米国特許出願第６２／０７２，９４４号または２０１５年４月１７日出願のＰＣＴ出願を参照のこと。例えば、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドはまた、切断可能な配列もしくはリンカーを含み得るか（例えば、図６に示されるとおり）、または粒子から他の方法で放出可能であり得る。
【００３８】
粒子は、一部の場合には、粒子のほとんどまたは全てが、他の識別可能なオリゴヌクレオチドを有する他の粒子と比較して、独自に識別可能なオリゴヌクレオチドを有するように、調製され得る。粒子が１粒子／ゲル液滴（またはそれ未満）の密度で液滴内に存在する場合、オリゴヌクレオチドが粒子から放出されると、ゲル液滴のほとんどまたは全ては、１つの独自のオリゴヌクレオチドを含み（または独自のオリゴヌクレオチドを含まず）、従って、各ゲル液滴（およびその中に含まれる核酸）が独自に同定されるのを可能にする。
【００３９】
従って、一部の実施形態では、粒子は、ミクロ流体液滴などの液滴中にカプセル化され得る。当業者は、ミクロ流体液滴内に粒子をカプセル化するための技術を認識する；例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７０８，９４９号、同第８，３３７，７７８号、同第８，７６５，４８５号または国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３およびＷＯ２００６／０９６５７１を参照のこと。一部の場合には、粒子は、液滴のほとんどまたは全てで、その中に０または１つのみの粒子が存在することを確実にするために、１粒子／液滴未満の密度（および、一部の場合には、１粒子／液滴よりもはるかに小さい密度）でカプセル化され得る。
【００４０】
一部の実施形態では、細胞（または他のサンプル）から生じる核酸を決定もしくは配列決定するため、または他の適用のために、オリゴヌクレオチド（粒子の表面に結合され得るか、または粒子内に他の方法で含まれ得るかもしくは取り込まれ得るものなど）を含む粒子が使用され得る。例えば、図５の非限定的な例では、細胞１０の集団は、例えば、それらのＤＮＡを配列決定すること、細胞のうちの少なくとも一部中に存在すると推測され得る特定のタンパク質または遺伝子を同定すること、それらのｍＲＮＡまたはトランスクリプトームを決定すること、などによって分析されることが所望される。この例では、細胞が核酸材料の供給源として使用されるが、これは例であり、他の実施形態では、核酸は、他の供給源から、または他の技術を使用して、ゲル中に導入され得る。
【００４１】
細胞は、例えば、当業者に公知の技術を使用して、ミクロ流体液滴４０内に最初にカプセル化され得る。液滴は、先に議論したように、細胞をカプセル化するゲルを形成するために使用され得る。一部の場合には、細胞は、ゲル液滴のほとんどまたは全てで、その中に０または１つのみの細胞が存在することを確実にするために、１細胞／液滴未満の密度（および、一部の場合には、１細胞／液滴よりもはるかに小さい密度）でカプセル化され得る。従って、図１Ｂに示されるように、ゲル液滴４１、４２、４３、……の各々で、その中に０または１つのいずれかの細胞が存在する。
【００４２】
粒子３０上に存在するオリゴヌクレオチド２０もまた、ゲル液滴中にカプセル化される。上述のように、粒子３０は、例えば微粒子であり得、ヒドロゲルもしくはポリマー粒子、または本明細書に記載されるものなどの他のタイプの粒子であり得る。粒子および細胞は、任意の適切な順序で、同時にまたは連続的に、ゲル内にカプセル化され得る。１セットの実施形態では、各粒子は、独自のオリゴヌクレオチドを含むが、１個の粒子上に複数コピーのオリゴヌクレオチドが存在し得る。例えば、オリゴヌクレオチドの各々は、１または複数のバーコードを有し得る。従って、例えば、粒子３１は、オリゴヌクレオチド２１のコピーのみを含み、粒子３２は、オリゴヌクレオチド２２のコピーのみを含み、粒子３３は、オリゴヌクレオチド３３のコピーのみを含む、といった例が挙げられる。
【００４３】
本発明の特定の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、図５に示されるように、各ゲルへのただ１つの独自のオリゴヌクレオチドの導入を促進するために、粒子に最初に結合されることに留意すべきである。（しかし、他の実施形態では、例えば同じ独自のバーコードを含む、複数のオリゴヌクレオチドおよび／または粒子が、１つのゲル中に存在し得る）。例えば、粒子が１粒子／ゲル未満の密度でゲル中に存在する場合、ゲルのほとんどまたは全ては、各々単一の粒子のみを有し、従って、単一の種類のオリゴヌクレオチドのみが存在する。従って、図５に示されるように、オリゴヌクレオチドは、例えば、各ゲル４１、４２、４３、……が、他のゲル中に存在し得る他のオリゴヌクレオチドとは異なる独自のオリゴヌクレオチド２１、２２、２３、……を含むように、粒子から切断または他の方法で放出され得る。従って、ゲル内に存在する各オリゴヌクレオチドは、他のゲル中に存在するオリゴヌクレオチドから識別可能である。光（ｈν）が、粒子からオリゴヌクレオチドを切断するために図５で使用されているが、これは例に過ぎず、切断または放出の他の方法もまた、例えば、本明細書で議論するように使用され得ることを理解すべきである。例えば、１セットの実施形態では、オリゴヌクレオチドを（例えば、物理的に）含むアガロース粒子が使用され得、オリゴヌクレオチドは、例えばアガロースが少なくとも部分的に液化または軟化するまで、アガロースを加熱することによって放出され得る。
【００４４】
一部の場合には、細胞は、細胞から例えばゲル中に、核酸または他の材料５１、５２、５３、……を放出するために溶解される。例えば、細胞は、化学物質または超音波を使用して溶解され得る。細胞は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、酵素などを放出し得る。一部の場合には、放出される核酸は、例えば増幅法に特異的な適切な試薬を含めることによって、増幅に付してもよい。当業者に公知の増幅法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲ増幅、インビトロ転写増幅（ＩＶＴ）、多置換増幅（ＭＤＡ）または定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００４５】
核酸または他の材料５１、５２、５３、……のうちの一部または全ては、例えば共有結合によって、ゲル中に存在するオリゴヌクレオチドと会合し得る。例えば、核酸または他の材料５１、５２、５３は、ゲル中に存在するオリゴヌクレオチドとライゲーションされ得るかまたは酵素的に結合され得る。従って、図１Ｂに示されるように、例えば、ゲル４１は、オリゴヌクレオチド２１に結合した核酸５１を示し、ゲル４２は、オリゴヌクレオチド２２に結合した核酸５２を示し、ゲル４３は、オリゴヌクレオチド２３に結合した核酸５３を示す。従って、各ゲル内の核酸は、この例では、各ゲルに独自のオリゴヌクレオチドによって、複数のゲル５０の他のゲル内の核酸から識別可能である。
【００４６】
図５は、粒子からのオリゴヌクレオチドの切断とその後の細胞の溶解を示すが、他の実施形態では、これらは、必ずしもこの順序で生じる必要はないこともまた理解すべきである。例えば、細胞溶解は、切断後に生じ得るか、または両方が同時に生じ得る。
【００４７】
次いで、図５に示されるように、一部の実施形態では、ゲル４１、４２、４３、……は、それらの内容物を放出するために、液化されるかまたは他の方法で破裂もしくは破壊され得、一部の場合には、各ゲル中に存在する核酸は、一緒に組み合わされ得るかまたはプールされ得る。しかし、核酸は、異なるオリゴヌクレオチドによって標識されるので、１つのゲル由来（即ち、１つの細胞由来）の核酸は、オリゴヌクレオチドを使用して（例えば、オリゴヌクレオチド上のバーコードを決定することによって）、他のゲル（または他の細胞）由来の核酸からなおも識別され得る。従って、核酸の組み合わされたプールの解析（例えば、配列決定）が実施され得、各核酸の供給源（例えば、個々の細胞）が、異なるオリゴヌクレオチドを決定することによって決定され得る。
【００４８】
従って、例えば、正常細胞および癌細胞の集団（例えば、組織サンプルまたは生検から生じる）は、かかる様式で解析され得、癌細胞は、正常細胞の大きいプール中に存在する場合であっても、異常なＤＮＡを有すると同定され得る。例えば、オリゴヌクレオチドを使用して細胞レベルでＤＮＡを追跡する能力に起因して、異常なＤＮＡは、大量の正常ＤＮＡが数において勝る場合であっても、なおも同定され得る。他の非限定的な例として、幹細胞が正常細胞から単離され得るか、またはある集団中の稀な細胞型の単離が実施され得る。
【００４９】
上記議論は、限定を意図しない；本発明の他の実施形態もまた、核酸（例えば細胞から生じるもの）の標識のために可能である。例えば、特定の態様では、本発明は一般に、ゲル内に細胞をカプセル化するためのシステムおよび方法に関する。従って、一部の場合には、細胞は、例えば細胞の操作中に細胞を保護するために、ゲル内に含まれ得る。例えば、１または複数の細胞がゲル粒子内に含まれ得、次いでそれらは、本明細書で議論するように、種々の条件、核酸またはオリゴヌクレオチドなどに曝露され得る。
【００５０】
一部の実施形態では、さらなる薬剤もまた、ゲルに添加され得る。例えば磁性粒子が、例えば後の選別を促進するために、ゲルのうちの一部または全てに添加され得る。別の例として、蛍光薬剤が、例えばゲル内に含まれる特定の細胞（または決定される他のもの）の同定を促進するために、ゲルのうちの一部または全てに添加され得る。非限定的な例として、１セットの実施形態では、１または複数の細胞が、液滴内に含まれていてもよいゲル粒子内に含まれ得る。
【００５１】
１セットの実施形態では、ゲルはアガロースゲルである。しかし、他のゲルもまた、他の実施形態において可能である。細胞をカプセル化するゲルの他の例は、参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２００８／１０９１７６中で見ることができる。ヒドロゲルのさらなる例には、アクリルアミドベースのゲル、例えば、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドまたはポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミドが含まれるがこれらに限定されない。例えば、モノマーの水溶液が、液滴中に分散され得、次いで、例えばゲルを形成するために、重合され得る。別の例は、カルシウムイオンの添加によってゲル化され得るアルギン酸などのヒドロゲルである。一部の場合には、ゲル化イニシエーター（アクリルアミドについては過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤ、またはアルギン酸塩についてはＣａ２＋）は、例えば、各々それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００７年１月４日に米国特許出願公開第２００７／０００３４２号として公開された、Ｌｉｎｋらによる表題「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」の、２００６年２月２３日出願の米国特許出願第１１／３６０，８４５号；またはＡｈｎらによる表題「Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ」の、２００７年１月２４日出願の米国特許出願第１１／６９８，２９８号で議論するように、例えば、水相との並行流（ｃｏ−ｆｌｏｗ）、油相による並行流、または２つの異なる小滴の合体によって、液滴に添加され得る。
【００５２】
一部の実施形態では、ゲルは、低融点（ｌｏｗ−ｍｅｌｔ）であるゲルであり得、例えば、ゲルは、一部の場合には、約１００℃未満、約８０℃未満、約７０℃未満または約６０℃未満の温度で融解し得る。一部の場合には、ゲルは、比較的低い温度、例えば、約６０℃未満、約５０℃未満、約４０℃未満、約３５℃未満、３０℃未満、約２５℃未満または約２０℃未満の温度への曝露の際に凝固することができるように選択され得る。例えば、低融点アガロースゲルは、市販品として容易に入手され得る。
【００５３】
一部の実施形態では、非限定的な例として、ゲルの平均直径は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約３００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約３０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約２０マイクロメートル未満、約１５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、約５マイクロメートル未満、約３マイクロメートル未満、約２マイクロメートル未満、約１マイクロメートル未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満または約５０ｎｍ未満であり得る。ゲルの平均直径はまた、特定の場合には、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートルまたは少なくとも約２０マイクロメートルであり得る。これらの組み合わせもまた可能であり、例えば、ゲルは、約２５マイクロメートルと約１００マイクロメートルとの間の平均直径を有し得る。一部の実施形態では、ゲルは、ゲル前駆体と共にミクロ流体液滴内に細胞（または他の適切な材料）を含めることによって調製され得る。例えば、ゲルは、適切な温度への曝露の際にゲルを形成し得るアガロースを含み得るか、または一部のゲルは、本明細書に開示されるような前駆体を含み、この前駆体を適切なゲル化イニシエーターに曝露することによって調製され得る。
【００５４】
細胞が使用される場合、細胞は、任意の適切な供給源から生じ得る。例えば、細胞は、その細胞由来の核酸が研究または配列決定などされることが所望される任意の細胞であり得、１つまたは１つよりも多い細胞型を含み得る。それらの細胞は、例えば、細胞の特定の集団、例えば、特定の臓器または組織由来の細胞（例えば、心臓細胞、免疫細胞、筋肉細胞、癌細胞など）、特定の個体または種由来の細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、細菌など）、異なる生物由来の細胞、天然に存在するサンプル（例えば、池の水、土壌など）由来の細胞などであり得る。一部の場合には、細胞は、組織から解離され得る。
【００５５】
一部の場合には、１つの細胞（または１つよりも多い細胞）をカプセル化するゲルは、細胞を含むミクロ流体液滴などの液滴を調製し、次いで、液滴をゲルへと凝固または硬化させることによって調製され得る。例えば、アガロースゲルは、適切な温度まで冷却することによって硬化され得る。
【００５６】
ゲル（または液滴）は、例えば、約１ｍｌ未満、約３００マイクロリットル未満、約１００マイクロリットル未満、約３０マイクロリットル未満、約１０マイクロリットル未満、約３マイクロリットル未満、約１マイクロリットル未満、約５００ｎｌ未満、約３００ｎｌ未満、約１００ｎｌ未満、約５０ｎｌ未満、約３０ｎｌ未満または約１０ｎｌ未満の体積を有し得る。
【００５７】
１セットの実施形態では、ゲルまたは液滴は、その中に平均して１つ未満の細胞を含み得る。例えば、平均担持率は、約１粒子／ゲル（または液滴）未満、約０．９細胞／ゲル未満、約０．８細胞／ゲル未満、約０．７細胞／ゲル未満、約０．６細胞／ゲル未満、約０．５細胞／ゲル未満、約０．４細胞／ゲル未満、約０．３細胞／ゲル未満、約０．２細胞／ゲル未満、約０．１細胞／ゲル未満、約０．０５細胞／ゲル未満、約０．０３細胞／ゲル未満、約０．０２細胞／ゲル未満または約０．０１細胞／ゲル未満であり得る。議論するように、細胞を含む液滴が生成され得、次いで、細胞を含むゲル液滴へと変換され得る；従って、ゲルおよび液滴についての平均担持率は、実質的に同じであり得る。一部の場合には、より低い担持率が、その中に２以上の細胞を有するゲル（または液滴）が生成される確率を最小化するために選択され得る。従って、例えば、ゲル（または液滴）のうちの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、細胞を含まないかまたはただ１つの細胞を含むかのいずれかであり得る。
【００５８】
一部の場合には、例えば、少なくとも約１０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、少なくとも約３，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約３０，０００、少なくとも約５０，０００、少なくとも約１００，０００のゲルまたは液滴などの、比較的多数のゲルまたは液滴が作製され得る。
【００５９】
一部の実施形態では、細胞は、ゲル内で溶解され得る。細胞は、溶解の際に、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを放出し得る。ＤＮＡは、一部の場合には、ゲノムＤＮＡであり得る。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどであり得る。１セットの実施形態では、細胞は、例えば、細胞からＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡを放出させるため、ならびに／または細胞溶解物を生成するために、液滴内で溶解され得る。例えば、細胞は、溶解性の化学物質もしくは細胞溶解試薬（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−ＸまたはＳＤＳなどの界面活性物質、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）、セルラーゼ、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）、グリカナーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼ（ｍａｎｎａｓｅ）、プロテイナーゼＫなどの酵素）、または物理条件（例えば、超音波、紫外線、機械的撹拌など）への曝露によって溶解され得る。溶解性の化学物質が使用される場合、溶解性の化学物質は、ゲルの形成の前またはその後に、例えば、ピコインジェクション（ｐｉｃｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、もしくはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１２年５月３１日に米国特許出願公開第２０１２／０１３２２８８号として公開された表題「Ｆｌｕｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」の、２０１１年１２月２１日出願の米国特許出願第１３／３７９，７８２号で議論されるものなどの他の方法により、ある液滴と化学物質もしくは酵素を含む液滴との融合によって、または当業者に公知の他の技術によって、ゲル中に導入され得る。一部の場合には、細胞を溶解させることは、その細胞に、その内容物、例えば、細胞の核酸、タンパク質、酵素、糖などを、放出させることになる。
【００６０】
上で議論したように、本発明の特定の態様は全般に、本明細書に記載されるものなどのオリゴヌクレオチドに核酸（例えば、細胞から放出されるか、またはゲルもしくは液滴内に他の方法で存在する）を結合させるためのシステムおよび方法に関する。オリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、粒子に結合され得るが、他の実施形態ではその必要はない。一部の場合には、ゲルおよびオリゴヌクレオチドが、流体液滴内に含まれ得る。先に議論したように、一部の場合には、１つの液滴のオリゴヌクレオチドが、例えば１または複数のバーコードの存在に起因して、他の液滴中のオリゴヌクレオチドから識別可能であるように、種々のオリゴヌクレオチドを含む複数の液滴が存在し得る。一部の実施形態では、核酸をオリゴヌクレオチドに結合させた後に、それらは、配列決定され得るかまたは他の方法で解析され得る。一部の場合には、これらはまた、例えば液滴を破裂させるかまたは他の方法で破壊することによって、一緒に組み合わされ得るかまたは統合され得、次いで、一緒に配列決定され得るかまたは他の方法で解析され得る。
【００６１】
例えば、本明細書で議論するように、細胞（例えば、ゲル液滴内の）から生じる核酸は、例えば後の配列決定または解析のために、オリゴヌクレオチドに結合され得る。以下で議論するように、オリゴヌクレオチドは、粒子に結合されていても、または粒子内に他の方法で取り込まれ、もしくは含まれていてもよい。１セットの実施形態では、核酸は、リガーゼ、または核酸を、オリゴヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドの遊離末端に直接結合させることができる他の適切な酵素を使用して、オリゴヌクレオチドに付加され得る。例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」の、２０１４年１０月３０日出願の米国特許出願第６２／０７２，９４４号または２０１５年４月１７日出願のＰＣＴ出願を参照のこと。
【００６２】
一部の実施形態では、核酸およびオリゴヌクレオチドは、例えば相補的であり得る未対合のヌクレオチドのオーバーハングを含む、直線状末端または「粘着性」末端を有し得る。一部の場合には、制限酵素が、連結前に核酸の末端を調製するために使用され得る。
【００６３】
従って、例えば、核酸は、未対合のヌクレオチドの一部分を含み得、オリゴヌクレオチドは、未対合のヌクレオチドの相補的な一部分を含み得る。非限定的な例として、オーバーハングはＡであり得、相補体はＴであり得る。オーバーハングする領域は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などの、任意の適切な数のヌクレオチドを含み得る。オーバーハング領域は、単一のヌクレオチドのみ（例えば、Ａ、ＡＡ、ＡＡＡなど）または適切なヌクレオチドのランダムもしくは任意の他の配列を含み得る。一部の場合には、オーバーハングは、適切な酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼまたは逆転写酵素を使用して作製され得る。
【００６４】
例えば、非限定的な一実施形態では、バーコード化されたプライマーの３’末端は、ホール（whole）トランスクリプトームプロファイリングのために細胞ｍＲＮＡを捕捉するために使用され得るポリＴ配列で終結する。全ての細胞を合するライブラリーは、例えば目的の遺伝子のサブセットのみの配列決定を可能にするために、ＰＣＲベースの方法またはハイブリダイゼーション捕捉ベースの方法（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）を使用して富化されてもよい。別の一実施形態では、バーコード化されたプライマーの３’末端は、細胞中のＲＮＡを捕捉するために使用され得るランダムＤＮＡ配列で終結し得る。別の一実施形態では、バーコード化されたプライマーの３’末端は、例えば、目的のＤＮＡもしくはＲＮＡ種（「遺伝子」）を捕捉するため、または例えば酵素試薬と一緒に、粒子もしくはミクロスフェアに加えて液滴中にデリバーされるＤＮＡプローブにハイブリダイズするために使用され得る、特定のＤＮＡ配列で終結し得る。別の一実施形態では、粒子またはミクロスフェアは、複数の目的遺伝子を標的化するために、複数の異なるプライマーを保有し得る。なお別の一実施形態は、液滴バーコード化のために必要な、液滴サイズおよび反応成分濃度の最適化に関する。
【００６５】
別のセットの実施形態では、核酸は、オリゴヌクレオチド上のアダプター配列と相補的である配列を使用してオリゴヌクレオチドに結合され得、この相補的配列は、所望もしくは任意の配列（例えば、鋳型）を増幅するかまたはオリゴヌクレオチドに取り込むために使用され得るプライマーを含む。
【００６６】
例えば、一部の実施形態では、鋳型が液滴中に導入され得、液滴内で増幅され得る。液滴がオリゴヌクレオチドを含む場合、増幅プロセスは、例えば鋳型の少なくとも一部分を認識することができるプライマーを含む相補的配列を介して、鋳型をオリゴヌクレオチドに結合させるためにも使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、アダプター配列と相補的な部分と鋳型の少なくとも一部分を認識できるプライマーとを含む相補的配列と相補的な、「ユニバーサル」またはアダプター配列を含み得る。従って、液滴内での増幅の際に、オリゴヌクレオチドは、例えば鋳型を含むように、伸長され得る。従って、増幅の際に、鋳型配列は、例えば図１に示されるように、オリゴヌクレオチド中に取り込まれ得、プライマーは、鋳型鎖もしくは他の配列の増幅またはオリゴヌクレオチドへの連結を促進するために使用され得る。例えば、このプロセスは、相補的配列内の遺伝子特異的プライマー（フォワードまたはリバース）などのプライマーを使用して促進され得る。
【００６７】
核酸が結合されるオリゴヌクレオチドは、例えば、バーコード配列、認識配列、切断可能な連結、ランダム配列または他の配列、例えば、本明細書で議論されるもののいずれかを含み得る。例えば、１セットの実施形態では、核酸は、１つの供給源由来（例えば、液滴内に含まれる１つの細胞由来）の核酸を、他の供給源由来（例えば、他の細胞由来）の核酸から識別するために使用され得る特定のオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）に結合され得る。１または複数のバーコードが、１つのオリゴヌクレオチド上に存在し得る。
【００６８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、「バーコード」または独自の配列を含み得る。この配列は、オリゴヌクレオチド（例えば、粒子上および／または液滴中に存在する）のうちの一部またはほとんどが独自の配列（または独自の配列の組み合わせ）を有するが、他のオリゴヌクレオチド（例えば、他の粒子または液滴上の）が独自の配列または配列の組み合わせを有さないように、選択され得る。従って、例えば、この配列は、１つの液滴もしくは液滴から（例えば、溶解された細胞から）生じる含まれる核酸を、独自に同定するか、または、他の液滴もしくは他の液滴から生じる他の核酸（例えば、他の細胞から放出される）から独自に識別するために使用され得る。
【００６９】
配列は、任意の適切な長さの配列であり得る。バーコード配列の長さは重要ではなく、バーコード配列を他のバーコード配列から識別するのに十分な任意の長さのものであり得る。１、２またはそれよりも多い「バーコード」配列が、上で議論したように、１つのオリゴヌクレオチド中に存在し得る。バーコード配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ｎｔの長さを有し得る。一部の場合には、２５よりも多いヌクレオチドもまた存在し得る。
【００７０】
一部の場合には、独自のまたはバーコード配列は、潜在的バーコード配列の「プール」から取得され得る。１つよりも多いバーコード配列がオリゴヌクレオチド中に存在する場合、バーコード配列は、潜在的バーコード配列の同じまたは異なるプールから取得され得る。配列のプールは、任意の適切な技術を使用して、例えば、ランダムに、または、例えば（バーコード配列の読取り誤差が検出され、一部の場合には補正され得るように）特定の距離（例えば、ハミング距離）隔てられることによって、それらの配列が誤差の検出および／または補正を可能にするように、選択され得る。プールは、任意の数の潜在的バーコード配列、例えば、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも５００，０００または少なくとも１，０００，０００のバーコード配列を有し得る。
【００７１】
従って、本発明の一部の実施形態は全般に、粒子またはミクロスフェアに結合したバーコード化された核酸に関する。例えば、１セットの実施形態は全般に、核酸断片（各々が、バーコード、プライマー、ならびに／または核酸の捕捉、増幅および／もしくは配列決定のために場合により使用される他の配列をコードする）を保有する粒子またはミクロスフェアに関する。ミクロスフェアは、ヒドロゲル粒子（ポリアクリルアミド、アガロースなど）、またはコロイド粒子（ポリスチレン、磁性またはポリマー粒子など）を指し得、１〜５００マイクロメートルのサイズ、もしくは本明細書に記載されるものなどの他の寸法を有し得る。ミクロスフェアは、一部の実施形態では、多孔性であり得る。使用され得る他の適切な粒子またはミクロスフェアは、本明細書でさらに詳細に議論される。
【００７２】
粒子またはミクロスフェアの調製は、一部の場合には、粒子またはミクロスフェアへの、初期ＤＮＡオリゴヌクレオチドの共有結合または他の技術による取り込みと、その後の、予め規定されたプールから選択（例えばランダムに選択）された１または複数のバーコードによる各オリゴヌクレオチドの酵素的伸長とに依存し得る。可能な独自のバーコードの最終的な数は、一部の場合には、予め規定されたバーコードプールのサイズおよび／または伸長工程の回数に依存し得る。例えば、３８４の予め規定されたバーコードのプールおよび２回の伸長工程を使用すると、各粒子またはミクロスフェアは、３８４２＝１４７，４５６の可能なバーコードのうちの１つを保有する；３回の伸長工程を使用すると、各粒子またはミクロスフェアは、３８４３＝５６，６２３，１０４の可能なバーコードのうちの１つを保有する。他の回数の工程もまた、一部の場合には実施され得る；さらに、各プールは、（３８４に限らない）種々の数の予め規定されたバーコードを有し得、複数のプールは、同じまたは異なる数の予め規定されたバーコードを有し得る。これらのプールは、同じおよび／または異なる配列を含み得る。
【００７３】
従って、一部の実施形態では、使用される可能なバーコードは、例えばスプリット−アンド−プール・アプローチを使用して、１または複数の別々の「プール」のバーコード要素（これは、連結されて最終バーコードを生成する）から形成される。プールは、例えば、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、少なくとも約３，０００、少なくとも約５，０００または少なくとも約１０，０００の識別可能なバーコードを含み得る。例えば、第１のプールはｘ１個の要素を含み得、第２のプールはｘ２個の要素を含み得る；第１のプール由来の要素および第２のプール由来の要素を含むバーコードを形成すると、例えば、使用され得るｘ１ｘ２個の可能なバーコードが生じ得る。ｘ１およびｘ２は、等しくても等しくなくてもよいことに留意すべきである。このプロセスは、任意の回数反復され得る；例えば、バーコードは、第１のプール、第２のプールおよび第３のプール由来の要素を含み得（例えば、ｘ１ｘ２ｘ３個の可能なバーコードを生成する）、または第１のプール、第２のプール、第３のプールおよび第４のプール由来の要素（例えば、ｘ１ｘ２ｘ３ｘ４個の可能なバーコードを生成する）を含み得る。５、６、７、８または任意の他の適切な数のプールもまた存在し得る。従って、組み合わせの潜在的な数に起因して、比較的少数のバーコード要素であっても、かなり多数の識別可能なバーコードを生成するために使用され得る。
【００７４】
一部の場合には、かかる複数のプールの組み合わせ使用は、多数のバーコードの各々を個別に調製および合成する必要なしに、かなり多数の使用可能なバーコードを作製するために使用され得る。例えば、多くの先行技術のシステムでは、１００または１，０００のバーコードを必要とすることは、１００または１，０００のバーコードの個別の合成を必要とする。しかし、例えばより多数の細胞を研究するために、より多数のバーコードが必要とされる場合、対応して、より多数のバーコードが合成される必要がある。かかるシステムは、より多数、例えば、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００のバーコードでは、非実用的で役に立たなくなる。しかし、バーコードの別々の「プール」を使用することによって、より多数のバーコードが、各バーコードの個別合成を必ずしも必要とせずに達成され得る。非限定的な例として、１，０００（または任意の他の適切な数）の識別可能なバーコードの第１のプール、および１，０００の識別可能なバーコードの第２のプールが、２，０００のバーコード（またはバーコードが各プールにおいて再使用される場合には１，０００のみ）の合成を要して合成され得るが、それらは組み合わされて、１，０００×１，０００＝１，０００，０００の識別可能なバーコードを生成し得る（例えば、このとき、各識別可能なバーコードは、第１のプールから取った第１のバーコード、および第２のプールから取った第２のバーコードを含む）。バーコードを組み立てるために３、４またはそれよりも多くのプールを使用すると、合成する必要がある識別可能なバーコードの総数を実質的に増加させることなく、さらにより多数のバーコードを調製することができる。
【００７５】
従って、一部の場合には、ゲルのうちの一部または全ては、例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、１または複数の独自の配列またはバーコードを含み得る）に基づいて識別可能であり得る。一部の場合には、ゲルのうちの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％が識別可能であり得る。
【００７６】
オリゴヌクレオチドは、任意の適切な長さのものであり得るか、または任意の適切な数のヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／もしくはＰＮＡなどの他の核酸、ならびに／または、これらおよび／もしくは他の核酸の組み合わせを含み得る。一部の場合には、オリゴヌクレオチドは一本鎖であるが、他の場合には二本鎖であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約３００ｎｔ、少なくとも約５００ｎｔ、少なくとも約１０００ｎｔ、少なくとも約３０００ｎｔ、少なくとも約５０００ｎｔ、少なくとも約１０，０００ｎｔなどの長さを有し得る。一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、約１０，０００ｎｔ以下、約５０００ｎｔ以下、約３０００ｎｔ以下、約１０００ｎｔ以下、約５００ｎｔ以下、約３００ｎｔ以下、約１００ｎｔ以下、約５０ｎｔ以下などの長さを有し得る。これらのいずれかの組み合わせもまた可能であり、例えば、オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔと約１００ｎｔとの間であり得る。オリゴヌクレオチドの長さは重要ではなく、種々の長さが種々の実施形態で使用され得る。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、種々の配列もまた含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、１または複数のプライマー配列、本明細書で議論する１または複数の独自のまたは「バーコード」配列、１または複数のプロモーター配列、１または複数のスペーサー配列などを含み得る。オリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、１または複数の切断可能なスペーサー、例えば、光切断可能なリンカーもまた含み得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば切断によって粒子から外され得るように、化学的に（例えば、リンカーを介して）または物理的に（例えば、リンカーを必ずしも必要とせずに）粒子に結合され得る。他の例には、オリゴヌクレオチドの嵩（または長さ）を増加させるため（例えば、特定の配列またはナンセンス配列を使用する）、取り扱いを容易にするため（例えば、オリゴヌクレオチドは、ポリＡテイルを含み得る）、結合の選択性を増加させるため（例えば、以下で議論される）、酵素（例えば、適切なリガーゼ）による認識を促進するため、同定を促進するためなどに使用され得る部分が含まれる。これらおよび／または他の配列の例は、本明細書でさらに詳細に記載される。
【００７８】
１セットの実施形態では、オリゴヌクレオチドタグは、抗体、例えば細胞（または液滴）中に存在すると推測されるタンパク質に特異的に結合し得る抗体を含み得る。例えば、液滴は、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドタグでタグ化された１または複数の抗体を含み得る。
【００７９】
一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの生成を可能にするため、酵素的増幅を可能にするためなどに、１または複数のプロモーター配列を含み得る。当業者は、プライマー配列、例えば、Ｐ５またはＰ７を認識する。多くのかかるプライマー配列は市販されている。プロモーターの例には、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【００８０】
一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、１または複数のプライマー配列を含み得る。典型的には、プライマーは、核酸合成のための出発点として機能する一本鎖または部分的に二本鎖の核酸（例えば、ＤＮＡ）であり、核酸ポリメラーゼなどのポリメラーゼ酵素がプライマーを伸長し相補鎖を複製するのを可能にする。プライマーは、標的核酸と相補的であり得、それにハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、プライマーは合成プライマーである。一部の実施形態では、プライマーは、天然に存在しないプライマーである。プライマーは、典型的には、１０〜５０ヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマーは、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、プライマーは、１８〜２４ヌクレオチドの長さを有する。プライマーの例には、Ｐ５プライマー、Ｐ７プライマー、ＰＥ１プライマー、ＰＥ２プライマー、Ａ１９プライマー、または本明細書で議論される他のプライマーが含まれるがこれらに限定されない。
【００８１】
一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、例えばオリゴヌクレオチドの質量またはサイズを増加させるために、ナンセンスまたはランダム配列を含み得る。ランダム配列は、任意の適切な長さのものであり得、１または複数が存在し得る。非限定的な例として、ランダム配列は、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２５〜５０、１５〜４０、１５〜３０、２０〜５０、２０〜４０または２０〜３０ヌクレオチドの長さを有し得る。
【００８２】
他の配列、例えば、プライマー、例えばＰＥ−１、または遺伝子特異的内部フォワードプライマーもしくは遺伝子特異的リバースプライマー配列、または本明細書で議論される他の配列も同様に存在し得る。プライマーのさらなる例には、Ｐ５プライマー、Ｐ７プライマー、ＰＥ１プライマー、ＰＥ２プライマー、Ａ１９プライマー、または本明細書で議論する他のプライマーが含まれるがこれらに限定されない。これらは、例えば、核酸の増幅を促進するため、または他の用途のために有用であり得る。さらに、上述のように、オリゴヌクレオチドはまた、切断可能な配列もしくはリンカーを含み得るか、または粒子から他の方法で放出可能であり得る。
【００８３】
一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、遺伝子または他の実体を特異的に結合することができる１または複数の配列を含み得る。例えば、１セットの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを認識することができる配列、例えば、ポリＴ配列（例えば、連続する複数のＴ、例えば４、５、６、７、８またはそれよりも多くのＴを有する）を含む配列を含み得る。
【００８４】
１セットの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば適切な刺激の適用の際に切断され得る、１または複数の切断可能なリンカーを含み得る。例えば、切断可能な配列は、光または適切な化学物質もしくは酵素を適用することによって切断され得る、光切断可能なリンカーであり得る。光切断可能なリンカーの非限定的な例は、図４中で見ることができる。一部の場合には、例えば複数の粒子（それらの表面上にオリゴヌクレオチドを含む）が、調製され得、例えば一部の場合には各液滴が平均して１つまたは１つよりも少ない（または１つよりも多い）粒子を含むように、液滴に添加され得る。液滴に添加された後に、オリゴヌクレオチドは、例えば光または他の適切な切断技術を使用して、オリゴヌクレオチドが溶液中、即ち、液滴内部の中に存在することを可能にするために、粒子から切断され得る。かかる様式で、オリゴヌクレオチドは、液滴中への粒子の導入によって液滴中に容易に導入され得、次いで、例えば本明細書で議論されるようにヌクレオチドまたは他の物質と相互作用するために、溶液中にあることを可能にするために切り離され得る。
【００８５】
本明細書で議論されるものなどの種々の技術が、オリゴヌクレオチドを調製するために使用され得る。これらは、一まとめに（ｉｎ  ｂｕｌｋ）、および／または１もしくは複数の液滴中、例えばミクロ流体液滴中で調製され得る。一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、例えば、各液滴内のバーコードおよび／またはオリゴヌクレオチドが独自であることを確実にするために、液滴中で調製され得る。さらに、一部の実施形態では、種々のバーコードを有するオリゴヌクレオチドを含む粒子が別々の液滴中に調製され得、次いで、これらの粒子はユーザーに提供または販売され得、ユーザーが、例えば上記のように、オリゴヌクレオチドに核酸を付加する。
【００８６】
一部の場合には、ＤＮＡおよび／または他の核酸を含むオリゴヌクレオチドは、粒子に結合され得、液滴にデリバーされ得る。一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、（例えば、液滴が典型的にはその中に多くても１つの粒子を有するように）液滴中へのそれらのデリバリーを制御するために粒子に結合される。一部の場合には、液滴中へのデリバリーの際に、オリゴヌクレオチドは、例えば切断、粒子の分解などによって、粒子から外され得る。しかし、他の実施形態では、液滴は、同じまたは異なるオリゴヌクレオチドを有し得る２、３または任意の他の数の粒子を含み得ることを理解すべきである。
【００８７】
オリゴヌクレオチドは、例えば本明細書で議論するように、粒子に結合され得る。一部の実施形態では、１つの粒子は、ただ１つのオリゴヌクレオチドを含み得るが、複数コピーのオリゴヌクレオチドが粒子上に存在し得る；他の粒子は、（例えば、本明細書に記載されるバーコード配列を使用して）識別可能な異なるオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００８８】
任意の適切な方法が、オリゴヌクレオチドを粒子に結合させるために使用され得る。どの結合方法を用いるかは重要ではなく、例えば、化学的または物理的であり得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、ビオチン−ストレプトアビジン連結、アミノ連結またはアクリルホスホルアミダイト（ａｃｒｙｌｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）連結を介して、粒子に共有結合され得る。例えば、アクリルホスホルアミダイト連結の一例については、図６を参照のこと。別のセットの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、粒子中に、例えば、物理的に取り込まれ得、ここで、オリゴヌクレオチドは、粒子を変化させることによって放出され得る。従って、一部の場合には、オリゴヌクレオチドは、切断可能な連結を有する必要はない。例えば、１セットの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、粒子の形成の際に、アガロース粒子などの粒子中に取り込まれ得る。粒子の分解（例えば、軟化、分解または液化し始めるまで粒子を加熱することによる）によって、オリゴヌクレオチドは、粒子から放出され得る。
【００８９】
粒子は、本発明の特定の態様では、微粒子である。粒子は、広範な種々のタイプのいずれかのものであり得る；議論するように、粒子は、特定のオリゴヌクレオチドを液滴中に導入するために使用され得、オリゴヌクレオチドが会合し得る（例えば、物理的にまたは化学的に）任意の適切な粒子が使用され得る。粒子がどのような形態かは重要ではない。粒子は、球状または非球状であり得、任意の適切な材料で形成され得る。一部の場合には、実質的に同じ組成および／または実質的に同じ平均直径を有する複数の粒子が使用される。複数のまたは一連の粒子の「平均直径」は、粒子の各々の平均直径の算術平均である。当業者は、例えば、レーザー光散乱、顕微鏡試験または他の公知の技術を使用して、複数のまたは一連の粒子の平均直径（または他の特徴的寸法）を決定できる。非球状粒子である単一の粒子の平均直径は、その非球状粒子と同じ体積を有する完全な球の直径である。１つの粒子（および／または複数もしくは一連の粒子）の平均直径は、一部の場合には、例えば、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満または約５マイクロメートル未満であり得る。平均直径はまた、特定の場合には、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートルまたは少なくとも約２０マイクロメートルであり得る。
【００９０】
粒子は、１セットの実施形態では、ヒドロゲル粒子であり得る。ＤＮＡを含むヒドロゲル粒子を包含するヒドロゲル粒子の例については、例えば、国際特許出願公開ＷＯ２００８／１０９１７６、表題「Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ」（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ヒドロゲルの例には、アガロースまたはアクリルアミドベースのゲル、例えば、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドもしくはポリＮ−イソプロピルポリアクリルアミドが含まれるがこれらに限定されない。例えば、モノマーの水溶液が、液滴中に分散され得、次いで、例えばゲルを形成するために、重合され得る。別の例は、カルシウムイオンの添加によってゲル化され得るアルギン酸などのヒドロゲルである。一部の場合には、ゲル化イニシエーター（アクリルアミドについては過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤ、またはアルギン酸塩についてはＣａ２＋）は、例えば、各々それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００７年１月４日に米国特許出願公開第２００７／０００３４２号として公開された、Ｌｉｎｋらによる表題「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」の、２００６年２月２３日出願の米国特許出願第１１／３６０，８４５号；またはＡｈｎらによる表題「Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ」の、２００７年１月２４日出願の米国特許出願第１１／６９８，２９８号で議論するように、例えば、水相との並行流、油相による並行流、または２つの異なる小滴の合体によって、液滴に添加され得る。
【００９１】
別のセットの実施形態では、粒子は、１または複数のポリマーを含み得る。例示的なポリマーには、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイソプレン（ＰＩＰ）、ポリ（乳酸）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリアミド、ならびに／または、これらおよび／もしくは他のポリマーの混合物および／もしくはコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。さらに、一部の場合には、粒子は磁性であり得、それによって、粒子の磁気操作が可能になり得る。例えば、粒子は、鉄または他の磁性材料を含み得る。粒子はまた、他の分子、例えば、タンパク質、核酸または小分子が結合したものであり得るように、官能化され得る。従って、本発明の一部の実施形態は、ライブラリー、例えば、核酸、タンパク質、小分子または本明細書に記載されるものなどの他の物質のライブラリーを規定する粒子のセットに関する。一部の実施形態では、粒子は蛍光性であり得る。
【００９２】
一部の態様では、オリゴヌクレオチドを含む、本明細書で議論されるものなどの粒子は、液滴内に含まれ得、オリゴヌクレオチドは、粒子から液滴の内部中に放出され得る。液滴は、オリゴヌクレオチドに結合し得るかまたはオリゴヌクレオチドによって認識され得る核酸（例えば、細胞を溶解することによって生成される）もまた含み得る。粒子および細胞は、液滴の形成の間および／またはその後に、液滴内に導入され得、同時にまたは連続的に（任意の適切な順序で）添加され得る。上述のように、一部の実施形態では、粒子および細胞は、液滴が、典型的には、平均して、１つ以下の粒子および１つ以下の細胞を含むように、液滴内に配置され得る。さらに、一部の場合には、液滴に、ゲル、例えば、細胞および／または粒子（これもまた、上述のように、ゲルであり得る）をカプセル化するゲルを形成させ得る。
【００９３】
１セットの実施形態では、細胞または核酸の他の供給源と、粒子、例えば上記のようなオリゴヌクレオチドを含む粒子を含む液滴が形成される。任意の適切な方法が液滴を作製するために選択され得、液滴を形成するための広範な種々の異なる技術が当業者に公知である。例えば、チャネルの分岐合流点（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が、液滴を作製するために使用され得る。分岐合流点は、例えば、Ｔ−分岐合流点、Ｙ−分岐合流点、チャネル内チャネル分岐合流点（ａ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｗｉｔｈｉｎ−ａ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）（例えば、同軸配置であるか、または内側チャネルと、内側チャネルの少なくとも一部分を取り囲む外側チャネルとを含む）、交差（または「Ｘ」）分岐合流点、流れ集中（ｆｌｏｗ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）分岐合流点、または液滴を作製するための任意の他の適切な分岐合流点であり得る。例えば、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００４年１０月２８日にＷＯ２００４／０９１７６３として公開された、Ｌｉｎｋらによる表題「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」の、２００４年４月９日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３、または２００４年１月８日にＷＯ２００４／００２６２７として公開された、Ｓｔｏｎｅらによる表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｉｄ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ」の、２００３年６月３０日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２０５４２を参照のこと。一部の実施形態では、分岐合流点は、実質的に単分散の液滴を生成するために、構成および配置され得る。液滴はまた、流体デバイス上で作製され得、および／または液滴は、別に作製され、次いで該デバイスにもたらされ得る。
【００９４】
特定の場合には、ゲルまたは他の粒子は、流体液滴内に含まれ得る。流体液滴は、他の物質、例えば、オリゴヌクレオチドまたは酵素（例えば、ｃＤＮＡを生成するため、核酸を切断するため、ライゲーションするためなどに使用されるもの）もまた含み得る。一部の場合には、流体液滴は、ミクロ流体である。流体液滴は、以下でさらに詳細に議論される。一部の場合には、ゲルまたは他の粒子およびオリゴヌクレオチドは、例えば連続的におよび／または同時に、流体液滴中にカプセル化され得る。ゲルまたは他の粒子およびオリゴヌクレオチドは、流体液滴の形成時に、および／または流体液滴が形成された後に、例えばピコインジェクション、もしくはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１２年５月３１日に米国特許出願公開第２０１２／０１３２２８８号として公開された表題「Ｆｌｕｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」の、２０１１年１２月２１日出願の米国特許出願第１３／３７９，７８２号で議論されるものなどの他の方法によって、流体液滴の融合によって、または当業者に公知の他の技術によって、流体液滴中にカプセル化され得る。
【００９５】
一部の実施形態では、流体液滴内に含まれるオリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、液滴内で増幅され得る。一部の場合には、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸は、例えば流体液滴内で、繋ぎ合わされ得、および／またはＰＣＲもしくは他の増幅技術を使用して増幅され得る。
【００９６】
１セットの実施形態では、ＰＣＲは、流体液滴内で実施され得る。例えば、液滴は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）およびＤＮＡヌクレオチドを含み得、液滴は、液滴内で核酸を増幅するために、処理（例えば、加熱および冷却の反復による）され得る。ポリメラーゼおよびヌクレオチドは、任意の適切な時点で液滴に添加され得る。当業者は、一部の実施形態で増幅された核酸を生成するために使用され得る、適切なＰＣＲ技術およびバリエーション、例えばアセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリーを認識する。
【００９７】
１セットの実施形態では、ＰＣＲまたは核酸増幅は、流体液滴内で実施され得る。例えば、流体液滴は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）およびＤＮＡヌクレオチドを含み得、流体液滴は、液滴内で核酸またはオリゴヌクレオチドを増幅するために、処理（例えば、加熱および冷却の反復による）され得る。ポリメラーゼおよびヌクレオチドは、任意の適切な時点で、例えば、種々の条件をコードする種々の核酸が流体液滴に添加される前、その間またはその後に、添加され得る。例えば、液滴がポリメラーゼおよびＤＮＡヌクレオチドを含み得、増幅を生じさせるために流体液滴に融合される。当業者は、一部の実施形態で増幅された核酸を生成するために使用され得る、適切なＰＣＲ技術およびバリエーション、例えばアセンブリーＰＣＲまたはポリメラーゼサイクリングアセンブリーを認識する。かかる手順の非限定的な例は、以下でも議論される。さらに、一部の場合には、適切なプライマー、例えば、Ｐ５およびＰ７、または当業者に公知の他のプライマーが、重合を開始するために使用され得る。一部の実施形態では、プライマーは、液滴に添加され得るか、またはプライマーは、液滴内の核酸のうちの１または複数上に存在し得る。当業者は、適切なプライマーを認識し、その多くは、市販品として容易に入手され得る。
【００９８】
一部の場合には、流体液滴は、破裂され、破壊され、または他の方法で壊され得る。液滴を「破壊する」ための広範な種々の方法が当業者に利用可能であり、どの方法が選択されるかは重要ではない。例えば、流体中に含まれた液滴は、機械的破壊または超音波などの技術を使用して、破壊され得る。
【００９９】
次いで、異なる液滴由来の核酸（オリゴヌクレオチドタグで標識された）は、一緒にプールもしくは組み合わされ得るか、または解析、例えば配列決定、増幅などされ得る。しかし、異なる液滴由来の核酸は、破壊前に各液滴中に存在した異なるオリゴヌクレオチドタグ（例えば、異なるバーコードを含む）の存在の故に、識別可能なままであり得る。
【０１００】
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、バーコードを含む）を結合させた後に、異なる液滴由来の核酸は、解析（例えば、ハイスループット配列決定などの配列決定による）のために一緒にプールされ得る。一部の場合には、液滴は、核酸を放出させるために破裂され得る。
【０１０１】
例えば、核酸は、種々の技術および機器（その多くは、商業的に容易に入手可能である）を使用して配列決定され得る。かかる技術の例には、鎖終結配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、ダイターミネーター配列決定、鎖終結法、Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ配列決定（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）配列決定、ピロシーケンス、ライゲーションによる配列決定、イオン半導体配列決定、ＤＮＡナノボール配列決定、単一分子リアルタイム配列決定、ナノポア配列決定、ミクロ流体Ｓａｎｇｅｒ配列決定、デジタルＲＮＡ配列決定（「デジタルＲＮＡ−ｓｅｑ」）などが含まれるがこれらに限定されない。どの配列決定法が選択されるかは重要ではない。
【０１０２】
さらに、一部の場合には、液滴は、例えばＤＮＡによる適切なタグ化による、例えば細胞中のタンパク質を決定するための、１または複数のＤＮＡタグ化抗体もまた含み得る。従って、例えば、タンパク質は、タンパク質に特異的なＤＮＡタグ化抗体を使用して、本明細書で議論するように複数の細胞において検出され得る。
【０１０３】
例えば液滴（または液滴内の物質）を決定する、液滴を選別するなどのための、本発明の種々の態様に従いミクロ流体システムにおいて液滴を操作するためのシステムおよび方法に関するさらなる詳細を、次に記載する。例えば、液滴をスクリーニングおよび／または選別するための種々のシステムおよび方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、２００７年１月４日に米国特許出願公開第２００７／０００３４２号として公開された、Ｌｉｎｋらによる表題「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」の、２００６年２月２３日出願の米国特許出願第１１／３６０，８４５号に記載されている。非限定的な例として、第１の電場（またはその一部分）を適用（または除去）することによって、液滴は、第１の領域またはチャネルに導かれ得る；デバイス（またはその一部分）に第２の電場を適用（または除去）することによって、液滴は、第２の領域またはチャネルに導かれ得る；デバイス（またはその一部分）に第３の電場を適用することによって、液滴は、第３の領域またはチャネルに導かれ得る；などであり、ここで、これらの電場は、何らかの点で、例えば強度、方向、周波数、持続時間などにおいて、異なり得る。
【０１０４】
本発明の特定の実施形態では、流体液滴の１もしくは複数の特徴、および／または、流体液滴を含む流体システム（例えば、流体液滴を取り囲む液体）の一部分の特徴を、流体液滴の１または複数の特徴の決定を可能にするような様式で、感知および／または決定できるセンサーが、提供される。液滴に関して決定可能であり、本発明において利用可能な特徴は、当業者によって同定され得る。かかる特徴の非限定的な例には、蛍光性、分光学（例えば、光学、赤外、紫外など）、放射活性、質量、体積量、密度、温度、粘度、ｐＨ、生物学的物質（例えば、タンパク質、核酸など）などの物質の濃度、などが含まれる。
【０１０５】
一部の場合には、このセンサーは、プロセッサーに接続され得、このプロセッサーは、例えば先に記載したように、例えば、液滴を選別し、電荷を付加しまたは液滴から電荷を除去し、液滴を別の液滴に融合させ、液滴を分裂させ、液滴内で混合を生じさせる、などによって、流体液滴に対してオペレーションが実施されるようにする。例えば、流体液滴のセンサー測定に応答して、プロセッサーは、流体液滴を分裂させ、第２の流体液滴と統合されるようにし得る。
【０１０６】
１または複数のセンサーおよび／またはプロセッサーは、流体液滴と感知連絡するように配置させることができる。「感知連絡」とは、本明細書で使用する場合、流体システム内（例えば、チャネル内）の流体液滴、／または流体液滴を含む流体システムの一部分が、何らかの様式で感知および／または決定され得るように、センサーを任意の場所に位置させ得ることを意味する。例えば、センサーは、流体液滴、および／または流体液滴を含む流体システムの部分と、流体的、光学的または視覚的に、熱的、気体力学的、電子工学的などで感知連絡し得る。センサーは、流体システムに接近して位置させることができ、例えば、チャネルの壁内に包埋されもしくはチャネルの壁と一体的に接続され得、または流体システムと離れてではあるが、流体液滴および／もしくは流体液滴を含む流体システム（例えば、チャネルまたはマイクロチャネル、流体液滴含有液体など）の一部分を感知および／もしくは決定できるように、流体システムと物理的、電気的および／もしくは光学的に連絡するように位置させることができる。例えば、センサーは、液滴を含むチャネルとの物理的接続が全くなくてもよいが、赤外線、紫外線または可視光などの、液滴または流体システムから生じる電磁放射線を検出するように位置させることができる。この電磁放射線は、液滴によって生成され得、および／または流体システムの他の部分から（もしくは流体システムの外部から）生じ得、（例えば、吸収、反射、回折、屈折、蛍光、リン光、極性変化、相変化、時間に関する変化などにより）流体液滴の１または複数の特徴を示すような様式で、流体液滴、および／または流体液滴を含む流体システムの部分と相互作用し得る。一例として、レーザーが、流体液滴および／または流体液滴を取り囲む液体に向けて当てられ、流体液滴および／または取り囲む液体の蛍光性が決定され得る。「感知連絡」はまた、本明細書で使用する場合、直接的または間接的であり得る。一例として、流体液滴からの光は、センサーに導かれ得るか、または最初に光ファイバーシステム、導波管などに導かれ、それを経由してセンサーに導かれ得る。
【０１０７】
本発明において有用なセンサーの非限定的な例には、光学または電磁気ベースのシステムが含まれる。例えば、このセンサーは、蛍光センサー（例えば、レーザーによって励起される）、顕微鏡システム（カメラまたは他の記録デバイスを含み得る）などであり得る。別の例として、このセンサーは、電子センサー、例えば、電場または他の電気的特徴を決定することができるセンサーであり得る。例えば、このセンサーは、流体液滴および／または流体液滴を含む流体システムの部分の、キャパシタンス、インダクタンスなどを検出し得る。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「プロセッサー」または「マイクロプロセッサー」は、例えば数式または電子回路もしくは計算回路を使用することによって、１もしくは複数のセンサーからのシグナルを受信し、シグナルを保存し、および／または１もしくは複数の応答を導く（例えば、上記のように）ことができる、任意の構成要素またはデバイスである。このシグナルは、センサーによって決定される環境因子を示す任意の適切なシグナル、例えば、気体力学的シグナル、電子シグナル、光学シグナル、機械的シグナルなどであり得る。
【０１０９】
１セットの実施形態では、流体液滴は、液滴上に電荷および／または電気双極子を生じさせ、ＡＣ場、ＤＣ場などであり得る適用された電場を使用して液滴を操向することによって、導かれ得る。一例として、電場は、特定の領域に流体液滴を導く必要に応じて、選択的に適用および除去され得る（または異なる電場、例えば、逆電場が適用され得る）。この電場は、一部の実施形態では、流体液滴を含む液体の流れを実質的に変更することなしに、必要に応じて選択的に適用および除去され得る。例えば、液体は、実質的に定常状態を基準にして（即ち、流体液滴を含む液体の平均流速は、定常状態の流れ、または時間に対する液体の流れの期待値からの逸脱が、２０％未満または１５％未満であり、一部の場合には、この平均流速の逸脱は、１０％未満または５％未満であり得る）、または他の所定の基準で、本発明の流体システム中（例えば、チャネルまたはマイクロチャネル中）を流れ得、この液体内に含まれる流体液滴は、例えば電場を利用して、流体システム中の液体の流れを実質的に変えることなく、種々の領域に導かれ得る。
【０１１０】
一部の実施形態では、流体液滴は、液滴を含む液体の流れを変化させることによって、本発明の流体システム内でスクリーニングまたは選別され得る。例えば、１セットの実施形態では、流体液滴は、第１のチャネル、第２のチャネルなどの中に、流体液滴を取り囲む液体を導くことによって、操向または選別され得る。
【０１１１】
別の１セットの実施形態では、流体システム内、例えば、異なるチャネル内またはチャネルの異なる部分内の圧力が、流体液滴の流れを導くために制御され得る。例えば、液滴は、さらなる流れの方向の複数の選択肢を含むチャネル分岐合流点に向けて導かれ得る（例えば、下流の流れのチャネルの選択肢を規定するチャネル中の分枝またはフォークに向けて導かれる）。下流の流れのチャネルの選択肢うちの１または複数内の圧力は、チャネルのうちの１つへと液滴を選択的に導くために制御され得、圧力変化が、連続的な液滴それぞれの下流の流路が独立して制御され得るように、連続的な液滴が分岐合流点に達するのに必要な時間のオーダーでもたらされ得る。１つの方法では、液体リザーバの拡張および／または収縮が、（例えば、流体液滴を含む液体の導かれた動きを引き起こすことによって）チャネル中への流体液滴の操向または選別のために使用され得る。これらの液体リザーバは、起動された場合に、起動されたリザーバによって引き起こされる液体の動きが、液体を好ましい方向に流れさせ、流体液滴を該好ましい方向に運搬するように、位置させることができる。例えば、液体リザーバの拡張は、リザーバに向かう液体の流れを引き起こし得、液体リザーバの収縮は、リザーバから離れる液体の流れを引き起こし得る。一部の場合には、この液体リザーバの拡張および／または収縮は、例えば本明細書に記載されるような、他の流れ制御デバイスおよび方法と組み合わされ得る。液体リザーバの拡張および／または収縮を引き起こすことができるデバイスの非限定的な例には、ピストンおよび圧電性構成要素が含まれる。一部の場合には、圧電性構成要素は、例えば電気的シグナルに応答する、その比較的迅速な応答時間の故に、特に有用であり得る。一部の実施形態では、流体液滴は、２つよりも多いチャネル中に選別され得る。
【０１１２】
上述のように、特定の実施形態は全般に、液体中の流体液滴を選別するためのシステムおよび方法に関し、一部の場合には、比較的高速度での該システムおよび方法に関する。例えば、液滴の特性は、何らかの様式（例えば、本明細書にさらに記載されるとおり）で感知および／または決定され得、次いで、この液滴は、例えば選別目的のために、ミクロ流体チャネルなどのデバイスの、特定の領域に向けて導かれ得る。一部の場合には、速い選別スピードは、本発明の特定のシステムおよび方法を使用して達成可能であり得る。例えば、一部の場合には、少なくとも約１０液滴／秒が決定および／または選別され得、他の場合には、少なくとも約２０液滴／秒、少なくとも約３０液滴／秒、少なくとも約１００液滴／秒、少なくとも約２００液滴／秒、少なくとも約３００液滴／秒、少なくとも約５００液滴／秒、少なくとも約７５０液滴／秒、少なくとも約１，０００液滴／秒、少なくとも約１，５００液滴／秒、少なくとも約２，０００液滴／秒、少なくとも約３，０００液滴／秒、少なくとも約５，０００液滴／秒、少なくとも約７，５００液滴／秒、少なくとも約１０，０００液滴／秒、少なくとも約１５，０００液滴／秒、少なくとも約２０，０００液滴／秒、少なくとも約３０，０００液滴／秒、少なくとも約５０，０００液滴／秒、少なくとも約７５，０００液滴／秒、少なくとも約１００，０００液滴／秒、少なくとも約１５０，０００液滴／秒、少なくとも約２００，０００液滴／秒、少なくとも約３００，０００液滴／秒、少なくとも約５００，０００液滴／秒、少なくとも約７５０，０００液滴／秒、少なくとも約１，０００，０００液滴／秒、少なくとも約１，５００，０００液滴／秒、少なくとも約２，０００，０００もしくはそれ超の液滴／秒、または少なくとも約３，０００，０００もしくはそれを超える液滴／秒が、決定および／または選別され得る。
【０１１３】
一部の態様では、比較的小さい液滴の集団が使用され得る。特定の実施形態では、非限定的な例として、液滴の平均直径は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約３００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約３０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約２０マイクロメートル未満、約１５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、約５マイクロメートル未満、約３マイクロメートル未満、約２マイクロメートル未満、約１マイクロメートル未満、約５００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満または約５０ｎｍ未満であり得る。液滴の平均直径はまた、特定の場合には、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約３００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートルまたは少なくとも約２０マイクロメートルであり得る。液滴の集団の「平均直径」は、液滴の直径の算術平均である。
【０１１４】
一部の実施形態では、液滴は、特定の用途に応じて、実質的に同じ形状および／もしくはサイズ（即ち、「単分散」）のもの、または異なる形状および／もしくはサイズのものであり得る。一部の場合には、液滴は、断面直径の均一な分布を有し得、即ち、液滴は、複数の液滴の全体的平均直径の約９０％未満（または約９５％未満または約９９％未満）の直径および／または約１１０％よりも大きい（または約１０５％よりも大きい、または約１０１％よりも大きい）直径を有する液滴の割合が、約５％以下、約２％以下または約１％以下であるといった直径分布を有し得る。液滴の断面直径の均一な分布を生じるためのいくつかの技術は、参照によって本明細書に組み込まれる、２００４年１０月２８日にＷＯ２００４／０９１７６３として公開された、Ｌｉｎｋらによる表題「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」の、２００４年４月９日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３に開示されている。
【０１１５】
当業者は、例えばレーザー光散乱または他の公知の技術を使用して、液滴の集団の平均直径を決定することができる。そうして形成された液滴は、球状、または特定の場合には非球状であり得る。非球状液滴における液滴の直径は、該非球状液滴と同じ体積を有する数学的に完全な球の直径と解釈され得る。
【０１１６】
一部の実施形態では、１または複数の液滴は、液体によって取り囲まれた流体に、液体内で流体を個々の液滴に分離させ得る電荷を生じさせることによって、チャネル内で作製され得る。一部の実施形態では、電場を流体に適用して、液滴形成を引き起こすことができる。流体は、液体内に、一連の個々の荷電した液滴および／または電気的に誘導可能な液滴として存在し得る。電荷は、任意の適切な技術を使用して、例えば、電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）内に流体を配置すること、および／または流体が電荷を有するようにする反応を引き起こすことによって、液体内の流体において生じさせることができる。
【０１１７】
電場は、一部の実施形態では、電場ジェネレーター、即ち、流体に適用され得る電場を生じさせることができるデバイスまたはシステムから生成される。この電場ジェネレーターは、ＡＣ場（即ち、時間に対して周期的に変動するもの、例えば、正弦波、のこぎり波、矩形波など）、ＤＣ場（即ち、時間に対して一定であるもの）、パルス場などを生成し得る。適切な電場（ＡＣ、ＤＣなどであり得る）を生成するための技術は、当業者に公知である。例えば、一実施形態では、電場は、電場の少なくとも一部分がチャネルと相互作用するようにチャネルに接近して位置させることができる一対の電極間に、電圧を適用することによって生成される。電極は、銀、金、銅、炭素、白金、銅、タングステン、スズ、カドミウム、ニッケル、酸化インジウムスズ（「ＩＴＯ」）など、ならびにそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の任意の適切な電極材料（単数または複数）から作られ得る。
【０１１８】
別の１セットの実施形態では、流体の液滴は、チャネル内で液体によって取り囲まれた流体から、流体からの個々の液滴形成の誘導を可能にするようなチャネル寸法の変更によって作製され得る。このチャネルは、例えば、（例えば、流体がチャネル壁に付着せず、その代わりに個々の液滴を形成するように）流れの方向に対して拡張するチャネル、または（例えば、流体が個々の液滴へと合体するように仕向けられるように）流れの方向に対して狭まるチャネルであり得る。一部の場合には、チャネル寸法は、個々の液滴の形成を引き起こすような様式で、時間に対して変更され得る（例えば、機械的にまたは電気機械的に、気体力学的に、など）。例えば、チャネルは、液滴形成を引き起こすために機械的に収縮（「圧搾」）され得、または流体流は、液滴形成を引き起こすために、（例えば、可動バッフル、回転刃などの使用により）機械的に分断され得る。液滴を作製する他の技術には、例えば、流体の混合またはボルテックスが含まれる。
【０１１９】
特定の実施形態は全般に、１つの液滴を２以上の液滴へと分裂させるためのシステムおよび方法に関する。例えば、液滴は、適用された電場を利用して分裂され得る。液滴は、取り囲む液体よりも高い電気伝導率を有し得、一部の場合には、液滴は、中性に荷電され得る。特定の実施形態では、適用された電場中で、電荷は、液滴の内部から表面へと移動して、その上に分布するように促され得、それによって、液滴内部の電場を相殺し得る。一部の実施形態では、液滴の表面上の電荷はまた、反対の極性を有する電荷を反対方向に移動させる、適用された電場による力を受け得る。この電荷移動は、一部の場合には、滴の、２つの別個の液滴への分割を引き起こし得る。
【０１２０】
本発明の一部の実施形態は全般に、例えば、（例えば、組成、表面張力、液滴サイズ、界面活性物質の存在または非存在などに起因して）２以上の液滴が通常は融合または合体することができない場合に、２以上の液滴を１つの液滴に融合または合体させるためのシステムおよび方法に関する。特定の場合には、液滴のサイズに対する液滴の表面張力もまた、液滴の融合または合体が生じるのを妨げ得る。
【０１２１】
非限定的な例として、２つの液滴に、（液滴の融合または合体が反対の電荷に起因して生じ得るように）２つの液滴の電気的相互作用を増加させ得る反対の電荷（即ち、同じ大きさである必要はない、正および負の電荷）が与えられ得る。例えば、液滴に電場が適用され得、液滴にコンデンサーを通過させ得、液滴の荷電を化学反応によって引き起こし得る、などの例が挙げられる。液滴は、一部の場合には、界面活性物質の適用により液滴の表面張力を低下させても、融合することができない場合がある。しかし、液滴が反対の電荷（同じ大きさであってよいが、必ずしも同じ大きさである必要はない）で荷電している場合、これらの液滴は、融合または合体できる可能性がある。別の例として、液滴には、反対の電荷が必ずしも与えられる必要はなく（および、一部の場合には、いずれの電荷も与えられない可能性がある）、液滴の合体を引き起こす、液滴中で誘導された双極子の利用によって融合される。また、合体される２以上の液滴は、「真正面から」ぶつかる必要は必ずしもない。液滴の少なくともいくらかの融合が最初に生じる限り、どのような接触の角度でも十分である。例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２００７年８月２３日に米国特許出願公開第２００７／０１９５１２７号として公開された、Ａｈｎらによる表題「Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ」の、２００７年１月２４日出願の米国特許出願第１１／６９８，２９８号もまた参照のこと。
【０１２２】
１セットの実施形態では、流体が、液滴中に注入され得る。流体は、一部の場合には、例えば、マイクロニードルまたは他のかかるデバイスを使用して、液滴中にマイクロ注入され得る。他の場合には、流体は、液滴が流体チャネルと接触するときに、その流体チャネルを利用して液滴中に直接注入され得る。流体注入の他の技術は、例えば、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１０年１２月２９日にＷＯ２０１０／１５１７７６として公開された、Ｗｅｉｔｚらによる表題「Ｆｌｕｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」の、２０１０年６月２５日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４０００６；または２０１０年７月１５日にＷＯ２０１０／０８０１３４として公開された、Ｗｅｉｔｚらによる表題「Ｐａｒｔｉｃｌｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の、２００９年１２月１８日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００６６４９に開示されている。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態に従い、種々の材料および方法が、本明細書に記載されるような物品または構成要素、例えば、ミクロ流体チャネルなどのチャネル、チャンバーなど、を形成するために使用され得る。例えば、種々の物品または構成要素は、固体材料から形成され得、ここで、チャネルは、微細加工、フィルム蒸着プロセス、例えば、スピンコーティングおよび化学的蒸着、レーザー加工、フォトリソグラフィー技術、湿式化学プロセスまたはプラズマプロセスを含むエッチング法などを用いて形成され得る。例えば、Scientific American, 248:44-55, 1983 (Angell, et al)を参照のこと。
【０１２４】
１セットの実施形態では、本明細書に記載される物品の種々の構造または構成要素は、ポリマー、例えば弾性ポリマー、例えばポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）、ポリテトラフルオロエチレン（「ＰＴＦＥ」またはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））など、で形成され得る。例えば、一実施形態によれば、ミクロ流体チャネルは、該流体システムを個別にＰＤＭＳまたは他のソフトリソグラフィー技術を用いて製作することによって、実現され得る（この実施形態に適切なソフトリソグラフィー技術の詳細は、Annual Review of Material Science, 1998、第２８巻、１５３〜１８４頁で公開された、Younan Xia and George M. Whitesidesによる表題"Soft Lithography"、ならびにAnnual Review of Biomedical Engineering, 2001、第３巻、３３５〜３７３頁で公開された、George M. Whitesides, Emanuele Ostuni, Shuichi Takayama, Xingyu Jiang and Donald E. Ingberによる表題"Soft Lithography in Biology and Biochemistry"の参考文献において議論されている；これらの参考文献の各々は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１２５】
潜在的に適切なポリマーの他の例には、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化ポリマー、シリコーン、例えばポリジメチルシロキサン、ポリ塩化ビニリデン、ビス−ベンゾシクロブテン（「ＢＣＢ」）、ポリイミド、ポリイミドのフッ素化誘導体などが含まれるがこれらに限定されない。上記のものを含むポリマーを伴う組み合わせ、コポリマーまたはブレンドもまた、想定される。デバイスは、複合材料、例えば、ポリマーおよび半導体材料の複合物からも形成され得る。
【０１２６】
一部の実施形態では、物品の種々の構造または構成要素は、ポリマー材料および／または可撓性材料および／またはエラストマー材料から製作され、硬化可能な流体から簡便に形成されて、成形（例えば、レプリカ成型、射出成型、鋳造成型など）による製作を促進し得る。硬化可能な流体は、流体ネットワーク中および流体ネットワークとの使用のために企図される流体を含むおよび／または輸送することが可能な固体へと、凝固するように誘導され得る、または自発的に凝固する、本質的に任意の流体であり得る。一実施形態では、硬化可能な流体は、ポリマー液体または液体ポリマー前駆体（即ち、「プレポリマー」）を含む。適切なポリマー液体には、例えば、熱可塑性ポリマー、熱硬化性ポリマー、ワックス、金属、またはそれらの混合物もしくは複合物を、それらの融点を上回って加熱したものが含まれ得る。別の例として、適切なポリマー液体には、適切な溶媒中の１または複数のポリマーの溶液が含まれ得、この溶液は、例えば蒸発による溶媒の除去の際に、固体ポリマー性材料を形成する。例えば融解状態から、または溶媒蒸発によって、凝固され得るかかるポリマー性材料は、当業者に周知である。その多くがエラストマー性である種々のポリマー材料が適切であり、鋳型マスターの一方または両方がエラストマー材料から構成される実施形態について、鋳型または鋳型マスターを形成するのにも適切である。かかるポリマーの例の非限定的なリストは、シリコーンポリマー、エポキシポリマーおよびアクリレートポリマーの一般的なクラスのポリマーを含む。エポキシポリマーは、エポキシ基、１，２−エポキシドまたはオキシランと一般に称される３員環式エーテル基の存在を特徴とする。例えば、芳香族アミン、トリアジンおよび脂環式骨格に基づく化合物に加えて、ビスフェノールＡのジグリシジルエーテルが使用され得る。別の例には、周知のＮｏｖｏｌａｃポリマーが含まれる。本発明に従う使用に適切なシリコーンエラストマーの非限定的な例には、クロロシラン、例えば、メチルクロロシラン、エチルクロロシラン、フェニルクロロシラン、ドデシルトリクロロシランなどを含む前駆体から形成されるものが含まれる。
【０１２７】
特定の実施形態では、シリコーンエラストマーのポリジメチルシロキサンなどのシリコーンポリマーが使用される。ＰＤＭＳポリマーの非限定的な例には、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）によって商標Ｓｙｌｇａｒｄで販売されているもの、特に、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８２、Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４およびＳｙｌｇａｒｄ  １８６が含まれる。ＰＤＭＳを包含するシリコーンポリマーは、本発明の種々の構造の製作を単純化するいくつかの有益な特性を有する。例えば、かかる材料は、安価であり、容易に入手可能であり、熱による硬化によってプレポリマー液体から凝固され得る。例えば、ＰＤＭＳは典型的には、プレポリマー液体を、例えば約６５℃〜約７５℃の温度に、例えば約１時間の曝露時間にわたり、曝露することによって、硬化させることができる。また、ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーは、エラストマー性であり得、従って、本発明の特定の実施形態において必要な比較的高いアスペクト比を有する非常に小さい構造特徴を形成するために有用であり得る。可撓性（例えば、エラストマー性）の鋳型またはマスターは、これに関して有利であり得る。
【０１２８】
ＰＤＭＳなどのシリコーンポリマーから、ミクロ流体構造またはチャネルなどの構造を形成することの１つの利点は、（例えば、空気プラズマなどの酸素含有プラズマへの曝露によって）酸化されて、その酸化構造がその表面に、他の酸化シリコーンポリマー表面と、または種々の他のポリマー材料および非ポリマー材料の酸化表面と架橋可能な化学基を含む、という該ポリマーの能力にある。従って、構造が、製作され、次いで酸化され、他のシリコーンポリマー表面、または酸化シリコーンポリマー表面と反応性の他の基材表面に、別に接着剤または他のシーリング手段を必要とすることなく本質的に不可逆的にシールされ得る。ほとんどの場合、シーリングは、シール形成のために補助的な圧力を適用する必要なく、単に酸化シリコーン表面を別の表面に接触させることによって、完了され得る。即ち、予め酸化されたシリコーン表面は、適切なあわせ面に対するコンタクト接着剤として作用する。具体的には、酸化シリコーン、例えば酸化ＰＤＭＳは、それ自体に対して不可逆的にシール可能であることに加えて、それ自体以外の、ＰＤＭＳ表面と類似の様式で（例えば、酸素含有プラズマへの曝露によって）酸化された広範な酸化材料（例えば、ガラス、ケイ素、酸化ケイ素、石英、窒化ケイ素、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス状炭素およびエポキシポリマーを包含する）にも、不可逆的にシールされ得る。本発明に関して有用な酸化およびシールの方法、ならびに全般的成型技術は、当該分野において、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、表題"Rapid Prototyping of Microfluidic Systems and Polydimethylsiloxane"の、Anal. Chem.、７０：４７４〜４８０、１９９８（Duffy et al.）の論文中で記載されている。
【０１２９】
従って、特定の実施形態では、物品の設計および／または製作は、例えば、比較的よく知られているソフトリソグラフィーおよび本明細書に記載されるものなどの他の技術を使用することによって、比較的簡単に行い得る。さらに、一部の実施形態では、物品の迅速なおよび／またはカスタマイズされた設計が、例えばジオメトリーに関して可能である。１セットの実施形態では、物品は、例えば、物品が、放射活性、毒性、有毒、反応性、バイオハザード性などである物質と共に使用される実施形態、および／または物質のプロファイル（例えば、毒物学プロファイル、放射活性プロファイルなど）が未知である実施形態では、使い捨てであるように製造され得る。酸化シリコーンポリマーからチャネルまたは他の構造（または内部の流体接触表面）を形成することの別の利点は、これらの表面が、典型的な弾性ポリマーの表面よりもかなり高い親水性になり得ることにある（親水性内部表面が所望される場合）。従って、かかる親水性チャネル表面は、典型的な未酸化弾性ポリマーまたは他の疎水性材料から構成された構造よりも容易に、水溶液で占められ湿潤され得る。
【０１３０】
以下の文書はあらゆる点で、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：米国特許出願第６１／９８０，５４１号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｗｅｉｔｚら；米国特許出願第６１／９８１，１２３号、表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔａｇｇｉｎｇ」、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら；国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３、表題「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」、Ｌｉｎｋら；国際特許出願公開ＷＯ２００４／００２６２７、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｉｄ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ」、Ｓｔｏｎｅら；国際特許出願公開ＷＯ２００６／０９６５７１、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、Ｗｅｉｔｚら；国際特許出願公開ＷＯ２００５／０２１１５１、表題「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」、Ｌｉｎｋら；国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０５６５４６、表題「Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｗｅｉｔｚら；国際特許出願公開ＷＯ２０１０／０３３２００、表題「Ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｐｅｃｉｅｓ」、Ｗｅｉｔｚら；米国特許出願公開第２０１２−０１３２２８８号、表題「Ｆｌｕｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」、Ｗｅｉｔｚら；国際特許出願公開ＷＯ２００８／１０９１７６、表題「Ａｓｓａｙ  Ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ」、Ａｇｒｅｓｔｉら；および国際特許出願公開ＷＯ２０１０／１５１７７６、表題「Ｆｌｕｉｄ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」、Ｗｅｉｔｚら；および米国特許出願第６２／０７２，９４４号、表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」、Ｗｅｉｔｚら。
【０１３１】
さらに、以下は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる：２０１４年４月１７日出願の米国特許出願第６１／９８１，１２３号；表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔａｇｇｉｎｇ」の、２０１５年４月１７日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１５／０２６３３８；２０１４年４月１７日出願の米国特許出願第６１／９８１，１０８号；表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」の、２０１５年４月１７日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１５／２６４２２；表題「Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」の、２０１６年４月１５日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／０２７７３４；２０１４年１０月３０日出願の米国特許出願第６２／０７２，９４４号；および表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」の、２０１５年４月１７日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１５／２６４４３。Ｗｅｉｔｚらによる表題「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」の、２０１６年４月１９日出願の米国仮特許出願第６２／３２４，４０７号もまた、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するためのものであり、本発明の全範囲を例証するわけではない。
【実施例１】
【０１３３】
この実施例は、単一細胞由来のＲＮＡおよびＤＮＡの同時の解析のための、ハイスループットかつコスト効率のよい方法を示す。単一細胞を、ミクロ流体滴メーカーを使用して、液体低融解温度アガロース中に溶解緩衝液と共に最初に共カプセル化し、アガロースを冷却して固（またはゲル）相、例えばゲル粒子を形成することによって、細胞をゲル内に固定化する。アガロースゲル中に、オリゴｄ（Ｔ）または遺伝子特異的プライマーのいずれかにコンジュゲートされた線状ポリマーを添加して、細胞ＲＮＡを捕捉し、その後逆転写（ＲＴ）して、アガロースゲル粒子上にｍＲＮＡ情報をコピーする。ゲノムＤＮＡ情報を得るために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を処理し、さらなるカプセル化および増幅を、ゲル小滴内で実施する。アガロースゲル粒子の孔サイズは比較的小さいので、単一細胞由来の遺伝子断片は、種々の処理の間に同じアガロースゲル粒子中に維持され得る。一方で、大きいサイズの単クローン性のＤＮＡベースのバーコード化ビーズライブラリーが調製される；各ビーズ上に約１０８の同じバーコード化配列が存在する。バーコード化ビーズを、細胞ＲＮＡおよびＤＮＡ由来の生成物を含む小滴と統合し、ビーズ上のバーコードとライゲーションさせ、それによって、単一細胞由来の全ての遺伝子情報を含むバーコード化ビーズのライブラリーを生成する。次いで、次世代遺伝子配列決定（next-gene sequencing）が、例えば何千もの単一細胞からの情報を得るために利用され得る。
【０１３４】
１．ミクロ流体デバイスの製作。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）ミクロ流体デバイスを、標準的なソフトリソグラフィー法を使用して製作した。ミクロ流体チャネル壁を、それらをＡｑｕａｐｅｌで処理することによって疎水性にした。ピコインジェクション実験のためのＰＤＭＳデバイスにおいて、電極をチャネルとして設計した。これらのチャネルに、Ｉｎｄａｌｌｏｙ  １９（５１  Ｉｎ、３２．５  Ｂｉ、１６．５  Ｓｎ；直径０．０２０インチ）低融点金属合金を、そのワイヤをパンチ穴に、８０℃のホットプレート上で押し込むことによって、入れた。電気的接続を、８ピンターミナルブロックを使用して作製した。例えば、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開ＷＯ２００４／０９１７６３、ＷＯ２００４／００２６２７、ＷＯ２００５／０２１１５１またはＷＯ２０１０／１５１７７６を参照のこと。
【０１３５】
２．単クローン性のバーコード化されたビーズの合成。バーコード配列の全長は、Ｔ−３’で終わる５’−／５Ａｃｒｙｄ／ｉＳｐＰＣ／−ＰＥ１  ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター−バーコード１−リンカー配列−バーコード２−ユニバーサル配列である。単クローン性のバーコード化されたビーズを合成するために、米国特許出願第６２／０７２，９４４号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるプロトコールを、さらなるハイブリダイゼーション工程と共に使用した。簡潔に述べると、ミクロ流体滴メーカーを使用して、ミクロンサイズの油中水型小滴中に、アクリルアミド：ビス−アクリルアミド溶液、アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）改変ＤＮＡプライマーおよび過硫酸アンモニウムをカプセル化した。アクリルアミド重合を触媒するために、ＴＥＭＥＤを連続油相中に添加した。次いで、生成された小滴を、６５℃で終夜インキュベートし、次いで、油を洗浄して除去した。得られたアクリルアミドゲルビーズ中には、何百万もの取り込まれた５’−／５Ａｃｒｙｄ／ｉＳｐＰＣ／−ＰＥ１  Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターが存在した。
【０１３６】
次の工程では、組み合わせバーコード−１およびバーコード−２を、伸長およびスプリット−プール法によって、ゲルビーズ上に連続的に合成した。最後に、ＤＮＡ断片を、ユニバーサル配列に対する相補的配列とハイブリダイズさせて、３’末端にオーバーハングするＴを有する部分的二本鎖ＤＮＡを形成した。
【０１３７】
３．同時の標的ＲＮＡ（少数）およびゲノムＤＮＡ配列決定（図１を参照のこと）。
３．１．溶解緩衝液および標的ＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドと共に細胞を共カプセル化する：アクリダイト化（ａｃｒｙｄｉｔｅｄ）標的ＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドを、アクリルアミドとの共重合によって、線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）上にグラフトした。合計１０マイクロリットルの１ｍＭアクリダイト化標的ＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドを、８０マイクロリットルのＤＩ水中４０％のアクリルアミド１０マイクロリットルと混合した。次いで、１．４マイクロリットルの１０％ＡＰＳおよび１．４マイクロリットルの１０％ＴＥＭＥＤを、溶液に添加した。溶液を、即座に十分に混合し、空気を除去するために真空中に維持する。重合反応は、完了するのに約１２分間かかった。
【０１３８】
細胞溶解カクテル溶液を、以下の最終濃度で調製した：２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、４％のＴｗｅｅｎ  ２０、１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫおよび１％の低融解温度アガロースゲル。細胞を、１：１の比で２％の低融解温度アガロースゲルと混合した。アガロースゲル中で、２マイクロモル濃度の、ＬＰＡ上の標的ＲＮＡ捕捉オリゴヌクレオチドを使用した。ゲノムＤＮＡの増幅を回避するために、リバースおよびフォワードプライマーを、ＲＮＡの２つの隣接エクソンにわたるように設計した。細胞−アガロース溶液および溶解緩衝液を、共カプセル化小滴メーカーの２つの入口中に注入した。生成された小滴を、氷上で収集し、引き続いて、３７℃で１０分間および５０℃で３０分間インキュベートして、細胞を溶解させた。標的ＲＮＡを捕捉するために、温度を、０．１℃／分で２５℃まで低下させ、次いで、小滴を氷上に置いて、アガロースゲルを凝固させた。
【０１３９】
３．２  エマルションを壊し、ＲＴして、第１鎖ｃＤＮＡを生成する：エマルションを壊すために、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−１−オクタノール（ＰＦＯ）をエマルションに添加し、遠心分離してアガロースゲル粒子を収集した。ゲル粒子を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌで２回洗浄し、１：１の比で２×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素カクテルと混合した。２×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素カクテルを、以下の最終濃度で調製した：２×ＲＴ緩衝液、２０ｍＭのＤＴＴ、４単位／マイクロリットルのＲＮａｓｉｎおよび２０単位／マイクロリットルのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素。混合物を、４２℃で４０分間インキュベートし、その後、ゲルを、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌで２回洗浄した。
【０１４０】
３．３  ＲＮＡを消化する：ＲＮａｓｅ  Ｈを使用して、ＲＮＡと第１鎖ｃＤＮＡとのハイブリッド上のＲＮＡ分子を消化した。
【０１４１】
３．４  二本鎖ゲノムＤＮＡ（ｄｓｇＤＮＡ）を消化する：ＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（登録商標）を使用して、ゲノムＤＮＡを消化して、およそ３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。２０マイクロリットルの反応溶液は、１×反応緩衝液、２マイクロリットルのｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ、および細胞を含むアガロースゲル粒子１０マイクロリットルを含んだ。これらを、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、５マイクロリットルの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加して、消化反応を停止させた。
【０１４２】
３．５．片側にユニバーサルアダプターを付加する：得られたビーズは、末端修復およびｄＡテイリング（ｔａｉｌｉｎｇ）を実施し、次いで、Ｍｉｓｅｑ共通オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作製されるユニバーサルアダプターとライゲーションした。
【０１４３】
３．６  ゲル粒子を再乳化し、増幅する：再乳化ミクロ流体デバイスを使用して、ゲル粒子を、ＰＣＲ混合物と共に再カプセル化した。このスキームを使用して、何百ものｇＤＮＡ遺伝子を、フォワードプライマーおよびユニバーサルアダプター配列を用いて増幅でき、少量のｃＤＮＡ（５未満）を、遺伝子特異的フォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅できた。
【０１４４】
３．７  バーコード化されたゲルビーズでアンプリコンを標識する：バーコード化されたゲルビーズで各小滴中のアンプリコンを標識するために、サーモサイクリングした小滴を、ミクロ流体ピコインジェクションデバイスに流し、バーコード化されたゲルビーズを、電気的な合体によって小滴に注入した。小滴をチップ上で、１％ｗ／ｗの界面活性物質を含む油によって小滴間隔を取らせた。デバイス電極を、２５ｋＨｚの周波数で１００Ｖの正弦波を供給する高電圧ＴＲＥＫ２２１０増幅器に接続した。１つのバーコード小滴とバーコード化されたゲルビーズとが１：１の比で融合することを確実にするために、小滴を注入するための流速を選択した。この要件を満たす典型的な流速は、油については１５０マイクロリットル／時、サーモサイクリングした小滴については４０マイクロリットル／時、バーコード化されたゲルビーズについては４０マイクロリットル／時であった。バーコード化されたゲルビーズの溶液中に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよび２×ライゲーション緩衝液を添加した。小滴を収集し、１６℃で終夜インキュベートして、ライゲーションを実施した。
【０１４５】
３．８．サーモサイクリングした小滴を壊す：ライゲーションの間に、各統合された小滴中のゲルビーズ上のバーコード配列を、単一の鋳型由来のアンプリコンとライゲーションさせた。従って、あらゆるバーコード化された断片に付随するｇＤＮＡに関する情報を喪失することなしに、エマルションを壊すことができた。配列決定のために各チューブ中でエマルション小滴を壊すために、ＰＦＯをエマルションに添加し、穏やかに遠心分離して相分離した。ＰＣＲ生成物は、液相中にあった。
【０１４６】
３．９．ライブラリー調製および第２世代配列決定（２ｎｄＧＳ）：ＰＣＲ生成物を、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  Ｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して浄化し、１０マイクロリットルの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ中に溶出した。Ｍｉｓｅｑ配列決定のための全長アダプターを付加するために、精製されたＰＣＲ生成物を、２５マイクロリットルのＰＣＲカクテル中の全長プライマー対で増幅した。このカクテルは、０．２マイクロリットルのＫＡＰＡ２Ｇ  Ｆａｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、１×ＫＡＰＡ２Ｇ緩衝液、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１マイクロリットルのフォワードおよびリバースプライマーならびに２マイクロリットルのライゲーション生成物を含んだ。サーモサイクリング条件は、９５℃で２分間、９５℃で１５秒間を１０サイクル、５６℃で１５秒間、および７２℃で２秒間、その後７２℃で５分間であった。ＰＣＲ生成物を、ビーズを使用して再度浄化し、Ｑｕｂｉｔを使用して定量化した。次いで、濃度を調整し、ＭｉＳｅｑシステムを使用して配列をサンプリングした。
【実施例２】
【０１４７】
この実施例は、同時の標的ＲＮＡ（多数）およびゲノムＤＮＡ配列決定を示す。図２を参照のこと。
【０１４８】
４．１．細胞および溶解緩衝液を共カプセル化し、ホールトランスクリプトームを捕捉する：アクリダイト化オリゴｄＴを、アクリルアミドとの共重合によって、ＬＰＡ上にグラフトした。包埋法は、セクション３．１．と同じであった。
【０１４９】
４．２．エマルションを壊し、ＲＴして、第１鎖ｃＤＮＡを生成する：エマルションを壊し、遠心分離して、アガロースゲル粒子を収集した。ゲル粒子を洗浄し、１：１の比で２×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素カクテルと混合し、その後、４２℃で４０分間インキュベートした。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写の間に、鋳型なしの３つのＡ塩基が、ｃＤＮＡの３’末端に付加された。
【０１５０】
４．３．ＲＮＡを消化する：セクション３．３．と同じ。
【０１５１】
４．４．ｄｓｇＤＮＡを消化する：セクション３．４．と同じ。
【０１５２】
４．５．ｄｓｇＤＮＡおよびｓｓｃＤＮＡの片側にユニバーサルアダプターを付加する：セクション３．５に記載したのと同じ方法を使用して、ｄｓｇＤＮＡの片側にユニバーサルアダプターを付加した。ｓｓｃＤＮＡの片側にユニバーサルアダプターを付加するために、第１鎖ｃＤＮＡの３’末端の３つのＡと対合できる３つのＴのオーバーハングを有する別のアダプターを作製した。このアダプターは、発現レベルの計算のためのＵＭＩ配列もまた含んだ。
【０１５３】
４．６．ゲル粒子を再乳化し、増幅する：このスキームを使用して、何百ものｇＤＮＡ遺伝子をフォワードプライマーおよびユニバーサルアダプター配列を用いて増幅でき、また何百ものｃＤＮＡをフォワードプライマーおよびそれらのユニバーサルアダプター配列を用いて増幅できた。
【０１５４】
４．７〜４．９．セクション３．７〜３．９．と同じ。
【実施例３】
【０１５５】
この実施例は、細胞および溶解緩衝液を共カプセル化し、ホールトランスクリプトームを捕捉することを示す。図３を参照のこと。
【０１５６】
５．１．アクリダイト化オリゴｄＴを、アクリルアミドとの共重合によって、ＬＰＡ上にグラフトした。包埋法は、セクション３．１．と同じであった。オリゴｄＴの上流に、ライゲーション配列（ＬＳ）を付加した。
【０１５７】
５．２．エマルションを壊し、ＲＴして、第１鎖ｃＤＮＡを生成する：セクション４．２．と同じ。
【０１５８】
５．３．ＲＮＡを消化する：セクション３．３．と同じ。
【０１５９】
５．５．ゲノムＤＮＡを消化し、一方の末端上で配列決定アダプターとライゲーションさせる：セクション３．４．と同じ。
【０１６０】
５．６．ゲル粒子を再乳化し、増幅する：再乳化ミクロ流体デバイスを使用して、ゲル粒子を、ＰＣＲ混合物と共に再カプセル化した。このＰＣＲ混合物中に、標的ｇＤＮＡの増幅のための遺伝子特異的フォワードプライマーおよび異なるユニバーサルプライマーを添加した。
【０１６１】
５．７．バーコード化されたゲルビーズでアンプリコンを標識する：（１）ｇＤＮＡ由来のアンプリコンを、バーコード化されたゲルビーズとライゲーションさせる。セクション３．７．と同じ。（２）第１鎖ｃＤＮＡを、バーコード化されたゲルビーズとライゲーションさせる。これらをインキュベートして、ｃＤＮＡ上のライゲーション配列（ＬＳ）を、バーコード化ＤＮＡ配列にアニーリングされた対応する相補的配列（ＣＳ）にライゲーションさせた。
【０１６２】
５．８．次の工程は、サーモサイクリングした小滴を壊すこと、ならびに逆転写酵素ミックス、および配列：３’−ＴＴＴ−ＰＥ２−Ｔ７  ＲＮＡｐｏｌ結合部位を有するオリゴを添加することを含んだ。オリゴヌクレオチドは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写の間にｃＤＮＡの３’末端に付加された鋳型なしＡ塩基と対合し得、逆転写酵素は、最終的な鋳型なしＡ塩基から伸長して、オリゴ相補体を付け足し得る。ｍＲＮＡのＴ７増幅およびＲＴ、ｇＤＮＡおよびｍＲＮＡの両方のＰＣＲ増幅を実施した。
【０１６３】
５．９．ライブラリー調製および第２世代配列決定：セクション３．９．と同じ。
【実施例４】
【０１６４】
この実施例では、細胞を、アガロースを含む液滴中に最初にカプセル化し、氷への曝露によって液滴を凝固させて、ゲル粒子を形成した。次いで、多置換増幅を使用してホールゲノム増幅（ＷＧＡ）を実施した。増幅の成功を実証するために、ゲル粒子を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。ＷＧＡに曝露していないサンプルと比較して、非常に濃い染色が、細胞が存在した場所において観察された。図８を参照のこと。
【０１６５】
１０分間消化された後に、ＷＧＡ生成物は、２００〜４００ｂｐの範囲内であり、増幅のための次の手順のために有用であった。ゲル粒子は、末端修復およびアダプターライゲーションを経て、液滴中に再度カプセル化され、その後、小滴中でＰＣＲを行った。図８中で見ることができるように、強い増幅が観察された。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施形態が、本明細書で記載および説明されているが、当業者は、本明細書に記載される機能を果たすため、ならびに／または結果および／もしくは１もしくは複数の利点を得るための、種々の他の手段および／または構造を容易に想定し、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本発明の範囲内であると判断される。より一般的には、当業者は、本明細書に記載される全てのパラメーター、寸法、材料および構成が、例示を意味すること、ならびに実際のパラメーター、寸法、材料および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途に応じることを、容易に理解する。当業者は、慣用的に過ぎない実験によって、本明細書に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、認識または確認できる。従って、上述の実施形態が、例として提示されているに過ぎないこと、ならびに添付の特許請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内で、具体的に記載および特許請求されたものとは別の様式で本発明が実施され得ることを、理解すべきである。本発明は、本明細書に記載される各個々の特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法に関する。さらに、２以上のかかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、キットおよび／または方法が相互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。
【０１６７】
本明細書で定義および使用される全ての定義は、辞書的定義、参照によって組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味よりも支配的であると理解すべきである。
【０１６８】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、それに反することが明らかに示されない限り「少なくとも１つ」を意味すると理解すべきである。
【０１６９】
語句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、それにより結び付けられる要素の「いずれかまたは両方」を意味する、即ち、要素は、ある場合には共存するが、他の場合には択一的に存在すると理解すべきである。「および／または」を伴って列挙される複数の要素は、同じ様式で、即ち、そのように結び付けられる要素の「１または複数」と解釈され得る。「および／または」節によって具体的に指定される要素以外の他の要素が、具体的に指定された要素と関連するかしないかに関わらず、存在してもよい。従って、非限定的な例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドの語と関連して「Ａおよび／またはＢ」と言う場合、一実施形態ではＡのみ（Ｂ以外の要素を含んでもよい）を指し；別の一実施形態ではＢのみ（Ａ以外の要素を含んでもよい）を指し；なお別の一実施形態ではＡおよびＢの両方（他の要素を含んでもよい）を指す；等であり得る。
【０１７０】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上に定義したような「および／または」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、リスト中の項目を区切っている場合、「または」または「および／または」は、包括的に解釈され、即ち、複数の要素または要素のリストのうちの、少なくとも１つを含み、または１つよりも多くを含み、さらに、列挙されていないさらなる要素も含んでよいと解釈されるものとする。それに反することを明確に示す用語、例えば、「〜のうちの１つだけ」もしくは「〜のうちの厳密に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合の「〜からなる」だけが、複数の要素または要素のリストのうちの要素を厳密に１つ含むことを指す。一般に、用語「または」は、本願で使用する場合、排他性の用語、例えば、「〜のいずれか」、「〜のうちの１つ」、「〜のうちの１つだけ」または「〜のうちの厳密に１つ」を伴う場合にのみ、排他的選択肢（即ち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すと解釈するものとする。「〜から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１７１】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、１または複数の要素のリストに関連する語句「少なくとも１つ」とは、要素のリスト中の任意の１または複数の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解すべきであるが、必ずしも、要素のリスト中に具体的に列挙される個々の要素である少なくとも１つである必要はなく、要素のリスト中の要素の任意の組み合わせを排除しない。この定義はまた、語句「少なくとも１つ」が係る要素のリスト中に具体的に指定された要素以外の要素が、具体的に指定される要素と関連するかしないかに関わらず、適宜存在し得ることを許容する。従って、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に、「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）とは、一実施形態では、Ｂの存在を伴わない、少なくとも１つ（１よりも多い、を包含してよい）のＡ（Ｂ以外の要素を含んでもよい）を意味し；別の一実施形態では、Ａの存在を伴わない、少なくとも１つ（１よりも多い、を包含してよい）のＢ（Ａ以外の要素を含んでもよい）を意味し；なお別の一実施形態では、少なくとも１つ（１よりも多い、を包含してよい）のＡ、および少なくとも１つ（１よりも多い、を包含してよい）のＢ（他の要素を含んでもよい）を意味する；等であり得る。
【０１７２】
単語「約」が数字に係って本願で使用される場合、本発明のなお別の一実施形態は、単語「約」の存在によって修飾されていないその数を含むことを理解すべきである。
【０１７３】
それに反することが明確に示されない限り、１つよりも多いステップまたは行為を含む本願で特許請求される任意の方法において、この方法のステップまたは行為の順序は、この方法のステップまたは行為が記載される順序に必ずしも限定されないこともまた、理解すべきである。
【０１７４】
特許請求の範囲ならびに本明細書において、全ての移行句、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「関与する（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「〜から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などは、オープンエンド、即ち、〜を含むがそれらに限定されないことを意味すると理解すべきである。移行句「〜からなる」および「〜から本質的になる」のみが、米国特許庁の審査基準のセクション２１１１．０３に示されるように、それぞれ、クローズまたは半クローズの移行句とされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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