(57)【要約】本明細書で開示されるのは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）タンパク質またはＢｏＮＴの受容体結合ドメインを含むポリペプチドを溶液から単離及び精製する方法である。本方法は、タンパク質またはポリペプチドを含む溶液を、非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合したマトリックスに、結合に適した条件下で接触させること、マトリックスを洗浄することにより非結合物質を除去すること、及び結合したタンパク質をＮＴＮＨＡから解離させる溶液でタンパク質またはポリペプチドを溶出させることを含む。結合に適した条件は、７．５未満（例えば６）のｐＨである。解離に適した条件は、７．５以上（例えば８）のｐＨである。本方法に特有の組成物もまた開示される。2019518447.tif 000007
2019518447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種親和性部分に共有結合した、非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）ポリペプチド
を含む、分子。
【請求項２】
前記ＮＴＮＨＡ及び親和性部分が融合タンパク質として発現される、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記親和性部分が、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＮ末端、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＣ末端、及び前記ＮＴＮＨＡアミノ酸配列の内部から成る群から選択される位置に位置する、請求項１〜２のいずれかに記載の分子。
【請求項４】
前記親和性部分が、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の条件下で結合標的に効果的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
前記親和性部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
前記ＮＴＮＨＡが、血清型Ｂ、Ａ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ由来である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
前記ＮＴＮＨＡが血清型Ｂ由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項８】
前記分子が、適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）またはその受容体結合ドメインを含むポリペプチドと複合体を形成している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項９】
前記ＢｏＮＴまたは前記ポリペプチドが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項８に記載の分子。
【請求項１０】
前記親和性部分を介して結合標的にさらに結合している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分子。
【請求項１１】
前記結合標的がマトリックスに安定的に結合している、請求項９に記載の分子。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分子を含む、水溶液。
【請求項１３】
請求項２〜７のいずれか１項に記載の機能性ＮＴＮＨＡ及び親和性部分の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３〜１４のいずれか１項に記載の核酸を含みかつ発現する、宿主細胞。
【請求項１６】
適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）をさらに発現する、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記ＢｏＮＴが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
原核生物または真核生物である、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生類細胞である、請求項１５〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）ＢｏＮＴを適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）に、前記ＢｏＮＴと前記ＮＴＮＨＡの結合に適した条件下で接触させることによって、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項２１】
前記ＢｏＮＴが溶液中に存在し、前記ＮＴＮＨＡがマトリックスに結合していることにより、前記溶液を前記マトリックスに接触させることで前記ＢｏＮＴが前記ＮＴＮＨＡに接触する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して、非結合物質を除去する工程、及び
（ｃ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から前記ＢｏＮＴを解離する水溶液と接触させることによって、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出する工程
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程、
（ｃ）前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を保存し、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内の前記ＢｏＮＴを切断するのに適切な条件下で、前記マトリックスをプロテアーゼと接触させる工程、
（ｄ）前記マトリックスを洗浄して前記プロテアーゼ及び非結合物質を除去する工程、ならびに
（ｅ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から前記ＢｏＮＴを解離させる水溶液と接触させることにより、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出する工程
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＴＮＨＡが親和性部分に共有結合しており、前記マトリックスが前記親和性部分の結合標的に連結され、かつ前記ＮＴＮＨＡが、前記親和性部分と前記結合標的との相互作用を介して前記マトリックスに非共有結合している、請求項２１〜２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＢｏＮＴが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項２０〜２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記水溶液が≧７．５のｐＨを有する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＢｏＮＴを含む前記溶液が、ＢｏＮＴ発現細胞に由来する清澄化細胞抽出物である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記清澄化細胞抽出物が、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
結合に適切な条件が、生理学的イオン強度及び＜７．５のｐＨを有する結合緩衝液という環境下で前記ＢｏＮＴを接触させることを含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
洗浄が、＜７．５のｐＨを有する生理学的イオン強度の洗浄緩衝液による、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、１００〜２００ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌである、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が約６のｐＨを有する、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６を含む、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記水溶液が、約５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶出緩衝液である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記水溶液が約ｐＨ８の溶出緩衝液である、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記親和性部分が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記親和性部分がＧＳＴであり、前記結合標的がグルタチオンである、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記プロテアーゼがトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである、請求項２４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記プロテアーゼが、前記ＮＴＮＨＡに対して約１：２〜約１：１０００のモル比で添加される、請求項２４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記プロテアーゼを室温でマトリックスに接触させる、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記プロテアーゼを前記マトリックスに約１０分間〜１８時間接触させる、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）前記ＢｏＮＴを含有する清澄化細胞抽出物を、約６のｐＨを有する結合緩衝液中で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合した適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合しているグルタチオン被覆マトリックスと接触させ、それによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程、
（ｂ）約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄し、それによって非結合物質を除去する工程、
（ｃ）ｐＨが≧７．５である溶出緩衝液と前記マトリックスを接触させることにより、前記マトリックスから前記ＢｏＮＴを溶出し、それにより、前記ＢｏＮＴを前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させる工程
を含む、前記方法。
【請求項４３】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法であって、
（ａ）前記ＢｏＮＴを含有する清澄化細胞抽出物を、約６のｐＨを有する結合緩衝液中で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合した適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合しているグルタチオン被覆マトリックスと接触させ、それによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成する工程、
（ｂ）約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄し、それによって非結合物質を除去する工程、
（ｃ）約６のｐＨを有する緩衝液中で前記マトリックスをプロテアーゼと接触させることにより、前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内の前記ＢｏＮＴを切断する工程、
（ｄ）約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で前記マトリックスを洗浄することによって前記プロテアーゼ及び非結合物質を除去する工程、
（ｅ）ｐＨが≧７．５である溶出緩衝液と前記マトリックスを接触させることにより、前記ＢｏＮＴを前記マトリックスから溶出し、それにより、前記ＢｏＮＴを前記ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させる工程
を含む、前記方法。
【請求項４４】
前記ＢｏＮＴが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む、請求項４２または４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液が、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項４２または４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合緩衝液が、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶出緩衝液が５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、約８のｐＨを有する、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記グルタチオン被覆マトリックスがグルタチオン結合アガロースビーズである、請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記グルタチオン被覆マトリックスがカラムである、請求項４２〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記グルタチオン被覆マトリックスが、約５ｍｇ／ｍｌの結合ＮＴＮＨＡを有する、請求項４２〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記プロテアーゼがトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ボツリヌス神経毒素の受容体結合ドメイン（Ｈｃポリペプチド）を含むポリペプチドを精製する方法であって、
（ａ）前記Ｈｃポリペプチドを含む溶液を、前記ＮＴＮＨＡを前記Ｈｃポリペプチドに結合させてＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体を形成するのに適した条件下で、それに適合する非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合したマトリックスに接触させる工程、
（ｂ）前記マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程、
（ｃ）前記マトリックスを、前記ＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体から前記Ｈｃポリペプチドを解離させる水溶液と接触させることによって、前記マトリックスから前記Ｈｃポリペプチドを溶出する工程
を含む、前記方法。
【請求項５３】
前記Ｈｃポリペプチドの受容体結合ドメインが、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｈｃポリペプチドが、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである、請求項５２〜５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｈｃポリペプチドが、キメラボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである、請求項５２〜５３に記載の方法。
【請求項５６】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドを精製する方法における、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／３３６，９５８号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（２０１７年５月１６日に「０３４２９４１−０５８４＿ＳＬ．ＴＸＴ」と命名された．ｔｘｔファイルとして電子的に提出される）を参照する。ｔｘｔファイルは２０１７年５月１６日に生成され、９６，１５３バイトのサイズである。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、神経毒素の治療的使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、ヒトに知られている最も有毒な物質である。ＢｏＮＴ（Ａ〜Ｇ）の７つの血清型が同定されており、各血清型の中に多くのサブタイプがある。ＢｏＮＴは、細菌クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の様々な株によって産生される約１５０ｋＤａのタンパク質である（Ｍｏｎｔａｌ  ２０１０）。これらの毒素は動物でボツリヌス中毒を引き起こし、これは重度の弛緩性麻痺及び死亡の可能性という形で現れる重度の神経系疾患である。この毒性の分子的基盤は、ＢｏＮＴが運動ニューロンに結合して入り込み、酵素ドメインを細胞質基質に放出し、これが神経筋接合部（ＮＭＪ）におけるシナプス小胞融合を担う細胞機構を切断し、アセチルコリン放出を阻止することによって神経伝達を阻害するという能力にある。
【０００５】
ＢｏＮＴの神経抑制機能は、斜視から多様なジストニアの管理に及ぶ、多くの筋肉疾患の治療戦略として検討されており（Ｍａｓｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）、顔の筋肉の弛緩性麻痺を誘発してしわを伸ばすためのＢｏＮＴ（Ａ）の美容用途の急激な増加は、言うまでもない。ＢｏＮＴの市場は２０億ドルに達しており、依然として速いペースで成長している。
【０００６】
現在、ＢｏＮＴの生産においていくつかの課題が存在する。ＢｏＮＴは細菌で産生され、細菌溶解物から単離される必要がある。現在の治療用ＢｏＮＴは、依然として実験室で調製されたＢｏＮＴ／Ａの最初のバッチが記載された５０年以上前の方法論に類似した、古い方法論を利用して生産及び単離されている（Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ＆Ｋｅｍｐｅ  １９５９、Ｐｉｃｋｅｔｔ  ２０１４）。これらの方法は、典型的には、これらの毒素を産生する天然の細菌株（芽胞形成クロストリジウム株）の長期間のインキュベーション／発酵、及びそれに続いて労力を要する多くのクロマトグラフィー工程が含まれる。エンジニアリングや封じ込めの課題とは別に、これらの方法はＢｏＮＴ製剤の最終的な収量、有効性、及び再現性を損ない得る。
【０００７】
近年、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び昆虫細胞など、製造業でのタンパク質生産に用いられる典型的な宿主系から、組換え的にＢｏＮＴを発現させることが検討されている。Ｈｉｓ−６（配列番号１）またはＧＳＴなどのアフィニティータグは、通常、ＢｏＮＴに融合されてアフィニティー精製による精製を容易にする。アフィニティータグを用いた組換えＢｏＮＴの単離は精製工程を単純化するが、それは新たな問題をもたらす。このタグは、毒素の生物学的活性に悪影響を及ぼし、及び／または望ましくない抗原性を有し得る。その結果、タグは精製後に除去されていなければならず、これにはさらなる酵素処理及び精製工程が必要となる。さらに多くの場合、切断されたタグ由来の毒素に結合した余分な残基が残され、これは活性に影響を及ぼし得るか、または患者において免疫学的帰結を促進し得る非天然のＮ末端またはＣ末端を生成する。
【０００８】
天然型のＢｏＮＴの単離は非常に好ましいが、労力と時間を要するプロセスである。
【０００９】
精製されたＢｏＮＴは、使用する前に、限定されたタンパク質分解によってさらに活性化されなければならない。組換えＢｏＮＴは通常、精製後にトリプシンなどのエンドプロテイナーゼとのインキュベーションによって活性化される。このような活性化により、非特異的分解が生じ、そして活性化エンドプロテイナーゼを除去するための追加の精製工程が必要となり、その両方によって毒素活性及び収量が損なわれる。
【発明の概要】
【００１０】
本開示を読む当業者には明らかであるように、本発明は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）またはその一部もしくは断片の産生、精製及び／または活性化のための組成物及び方法に関する問題の認識を包含する。とりわけ、本発明は、所望の特性（例えば、比較的妥協のない生物学的活性、望ましくない抗原性の限定された導入、望ましくないエンドプロテイナーゼ及び／または分解産物などの限定された夾雑物、ならびに所望のＢｏＮＴの高い品質、力価、及び／または再現性）を有するＢｏＮＴの産生、精製及び／または活性化を促進する材料及び手順を提供する際の課題を特定すると同時に、以前のアプローチの限界（例えば、限定される生産効率、時間のかかる及び／または面倒な工程、及び／または過酷な条件）を低減させる。
【００１１】
本発明の一態様は、異種親和性部分に共有結合した非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）ポリペプチドを含む分子に関する。一実施形態では、ＮＴＮＨＡ及び親和性部分は、融合タンパク質として発現される。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、親和性部分は、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＮ末端、ＮＴＮＨＡアミノ酸配列のＣ末端、及びＮＴＮＨＡアミノ酸配列の内部から成る群から選択される位置にある。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、親和性部分は、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の条件下で結合標的に効果的に結合する。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、親和性部分は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、ＮＴＮＨＡは血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ由来である。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、ＮＴＮＨＡは血清型Ｂ由来である。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、分子は、適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）またはその受容体結合ドメインを含むポリペプチドと複合体を形成する。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、ＢｏＮＴまたはポリペプチドは、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、分子は、親和性部分を介して結合標的にさらに結合される。本明細書に開示される組成物の一実施形態において、結合標的はマトリックスに安定的に結合する。
【００１２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の分子の１つを含む水溶液に関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の機能性ＮＴＮＨＡ及び親和性部分融合タンパク質の１つをコードする核酸に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の機能性ＮＴＮＨＡ及び親和性部分融合タンパク質の１つをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【００１５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の機能性ＮＴＮＨＡ及び親和性部分融合タンパク質の１つをコードする核酸を含み、発現する宿主細胞に関する。一実施形態において、宿主細胞は、適合性のボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）をさらに発現する。本明細書に記載の宿主細胞の一実施形態において、ＢｏＮＴは、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む。本明細書に記載の宿主細胞の一実施形態において、宿主細胞は原核生物または真核生物である。本明細書に記載の宿主細胞の一実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、または両生類細胞である。
【００１６】
本発明の別の態様は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法に関し、ＢｏＮＴを適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）に対して、ＢｏＮＴとＮＴＮＨＡの結合に適した条件下で接触させることによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成させることを含む。一実施形態において、ＢｏＮＴは溶液中に存在し、ＮＴＮＨＡはマトリックスに結合されており、それにより溶液をマトリックスに接触させることでＢｏＮＴはＮＴＮＨＡに接触する。本明細書に記載の方法の一実施形態において、この方法は、マトリックスを洗浄して非結合物質を除去することと、マトリックスをＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体からＢｏＮＴを解離する水溶液と接触させることによって、マトリックスからＢｏＮＴを溶出することを更に含む。本明細書に記載の方法の１つの代替実施形態において、ＢｏＮＴ溶液をＮＴＮＨＡマトリックスに接触させた後、本方法は、マトリックスを洗浄して非結合物質を除去すること、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を維持してＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内のＢｏＮＴの切断に適切である条件下で上記マトリックスをプロテアーゼと接触させること、マトリックスを洗浄することによってプロテアーゼ及び非結合物質を除去すること、ならびにマトリックスをＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体からＢｏＮＴを解離する水溶液と接触させることにより、マトリックスからＢｏＮＴを溶出することを含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡは親和性部分と共有結合しており、マトリックスは親和性部分の結合標的に結合しており、及びＮＴＮＨＡは、親和性部分と結合標的との相互作用を介してマトリックスに非共有結合している。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡはマトリックスに共有結合している。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＢｏＮＴは、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体からＢｏＮＴを解離する水溶液は、≧７．５のｐＨを有する。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＢｏＮＴを含む溶液は、ＢｏＮＴ発現細胞に由来する清澄化細胞抽出物である。本明細書に記載の方法の一実施形態において、清澄化細胞抽出物は、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、結合に適した条件には、生理学的イオン強度及び＜７．５のｐＨを有する結合緩衝液の環境下でＢｏＮＴを接触させることを含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、洗浄には、＜７．５のｐＨを有する生理的イオン強度の洗浄緩衝液を用いる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液は、１００〜２００ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌである。本明細書に記載される方法の一実施形態において、結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液は、約６のｐＨを有する。本明細書に記載される方法の一実施形態において、結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液は、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６で構成される。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体からＢｏＮＴを解離する水溶液は、約５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの溶出緩衝液である。本明細書に記載の方法の一実施形態において、水溶液は約ｐＨ８の溶出緩衝液である。本明細書に記載の方法の一実施形態において、親和性部分は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）から成る群から選択される。
【００１７】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、親和性部分はＧＳＴであり、結合標的はグルタチオンである。
【００１８】
本明細書に記載される方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡは、ＢｏＮＴに対して約１：１〜約１０：１のモル比、例えばＢｏＮＴに対して約２：１、３：１、４：１または５：１である。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡは、同じ宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉで同時発現される。本明細書に記載される方法の一実施形態において、ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡは、異なる宿主細胞で発現される。本明細書に記載される方法の一実施形態において、ＢｏＮＴは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの異種宿主細胞において組換え方法で産生される。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＢｏＮＴは、その天然のクロストリジウム細胞において産生される。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの異種宿主細胞において組換え方法で産生される。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡはその天然のクロストリジウム細胞で産生される。
【００１９】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは、トリプシン、ペプシン、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ、Ｌｙｓ−Ｎエンドプロテイナーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、プラスミン、オンプチン及びＥＰ２５２４９６３に記載されるようなクロストリジウムプロテアーゼから選択される。好ましい実施形態において、プロテアーゼはトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは、ＢｏＮＴの非天然（すなわち、外因性）切断部位を切断するプロテアーゼである。そのようなクロストリジウム毒素において、天然プロテアーゼ切断部位（活性化部位としても知られる）は、クロストリジウム毒素にとって天然ではないプロテアーゼ切断部位に改変または置換される。使用され得る変性プロテアーゼには、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ↓（配列番号２））、第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ↓（配列番号３）／ＩＤＧＲ↓（配列番号４））、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ（配列番号５））、トロンビン（ＬＶＰＲ↓ＧＳ（配列番号６））及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号７））が含まれる。
【００２０】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは、ＮＴＮＨＡに対して約１：２〜約１：１０００、好ましくはＮＴＮＨＡに対して約１：５〜約１：１００、例えば約１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０のモル比で添加される。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは、ＢｏＮＴに対して約１：２〜約１：１０００、好ましくはＢｏＮＴに対して約１：５〜約１：１００、例えば約１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０のモル比で添加される。使用される特定のプロテアーゼのための適切な条件は、当業者によって決定される。プロテアーゼへの曝露時間の長さもまた、プロテアーゼ、使用される濃度、及び温度によって異なる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは約２℃〜約４０℃、好ましくは約４℃〜約３７℃、例えば４℃、１６℃、２０℃または３７℃の温度でマトリックスに接触させる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは室温（約２０〜２２℃）でマトリックスに接触させる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは約１０分〜約１８時間、好ましくは約３０分〜約５時間、例えば約３０分、１時間、２時間、３時間、４時間または５時間マトリックスに接触させる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは約５．５〜約８．５、好ましくは約６〜８のｐＨ、例えば約６、７または８のｐＨでマトリックスに接触させる。一実施形態において、プロテアーゼはプロテアーゼであるトリプシン及びＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼから選択され、室温で約３０分〜２時間、６〜７のｐＨでマトリックスに接触させる。
【００２１】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼは、ＮＴＮＨＡに対して約１：１０のモル比で添加される。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼはマトリックスに室温で接触させる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼはマトリックスに約３０分〜１２時間接触させる。
【００２２】
本発明の別の態様は、ＢｏＮＴを含む清澄化細胞抽出物を、ｐＨが約６の結合緩衝液中で、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合した適合性の非毒性非血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合しているグルタチオン被覆マトリックスに接触させて、ＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体を形成させること、約６のｐＨを有する洗浄緩衝液でマトリックスを洗浄することで非結合物質を除去すること、マトリックスを約６のｐＨを有する緩衝液中のプロテアーゼと接触させることによってＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体内のＢｏＮＴを切断すること、マトリックスを約６のｐＨを有する洗浄緩衝液で洗浄することによってプロテアーゼ及び非結合物質を除去すること、及びマトリックスをｐＨ≧７．５を有する溶出緩衝液と接触させることによりＢｏＮＴをマトリックスから溶出させ、それにより、ＢｏＮＴをＮＴＮＨＡ−ＢｏＮＴ複合体から解離させること、を含むボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）を精製する方法に関する。本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＢｏＮＴは、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインを含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液は、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、結合緩衝液は、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）をさらに含む。本明細書に記載の方法の一実施形態において、溶出緩衝液は５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約８のｐＨを有する。本明細書に記載の方法の一実施形態において、グルタチオン被覆マトリックスは、グルタチオン結合アガロースビーズである。本明細書に記載の方法の一実施形態において、グルタチオン被覆マトリックスはカラムである。本明細書に記載の方法の一実施形態において、グルタチオン被覆マトリックスは、約５ｍｇ／ｍｌの結合ＮＴＮＨＡを有する。本明細書に記載の方法の一実施形態において、プロテアーゼはトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである。
【００２３】
本発明の別の態様は、ボツリヌス神経毒素の受容体結合ドメイン（Ｈｃポリペプチド）を含むポリペプチドを精製する方法に関し、これには、Ｈｃポリペプチドを含む溶液を適合性の非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）が結合したマトリックスに、ＮＴＮＨＡとＨｃポリペプチドの結合に適した条件下で接触させることにより、ＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体を形成させる工程、マトリックスを洗浄して非結合物質を除去する工程、及びＮＴＮＨＡ−Ｈｃポリペプチド複合体からＨｃポリペプチドを解離させる水溶液とマトリックスを接触させることにより、マトリックスからＨｃポリペプチドを溶出させる工程が含まれる。本明細書に記載の方法の一実施形態において、Ｈｃポリペプチドの受容体結合ドメインは、クロストリジアル・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）血清型Ｂ（Ｂ−Ｈｃ）の改変受容体結合ドメインである。本明細書に記載の方法の一実施形態において、Ｈｃポリペプチドは、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである。本明細書に記載の方法の一実施形態において、Ｈｃポリペプチドは、キメラボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドである。
【００２４】
本発明の別の態様は、方法またはボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）ポリペプチドの精製において、本明細書に記載される分子の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
本特許または出願書類には、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれる。本特許または特許出願の刊行物のカラー図面（複数可）の写しは、請求及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁により提供される。
【００２６】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、本明細書に記載のＢｏＮＴの精製原理及びプロトコルの実施形態を示す図である。図１Ａ）ＢｏＮＴとＮＴＮＨＡのｐＨ依存性の二分子複合体形成の模式図。ＬＣ：軽鎖、ＨＮ：転位置ドメイン、ＨＣＮ、ＨＣＣ：それぞれ、受容体結合ドメインのＮ末端及びＣ末端部分。ＮＴＮＨＡは、ＢｏＮＴと同じドメイン含有量を有し、グルタチオン−アガロース樹脂上に固定化されたＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として示される。図１Ｂ）天然結合パートナーであるＮＴＮＨＡを用いたＢｏＮＴの包括的な精製、活性化、及び溶出プロトコルを説明するフローチャートである。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ゲル分画されたタンパク質の画像である。実験結果は、ＢｏＮＴのモデル複合体としてＮＴＮＨＡ／Ｂを用いたＢｏＮＴ／Ｂの良好な精製を示す。２Ａ）ＢｏＮＴ／Ｂに対するモノクローナル抗体を用いて、図１Ｂに記載の各精製工程に沿ってＢｏＮＴ／Ｂの存在をモニターする（但し、ここでのサンプルはトリプシンで処理されなかった）。図２Ｂ）クーマシーで染色した選択サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、パネルＡに記載のように精製したＢｏＮＴ／Ｂの純度を示す。ＢｏＮＴ／Ｂに対応する主要バンド（約１５０ｋＤａ）が溶出画分に観察される。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ゲル分画したタンパク質の２組の画像である。実験結果は、ＮＴＮＨＡ／Ｂ・ＢｏＮＴ／Ｂ複合体においてＢｏＮＴ／Ｂが効率的に活性化されることを示している。図３Ａ）ＢｏＮＴ／Ｂを２つの断片（それぞれ１００ｋＤａ及び５０ｋＤａ）に分離させるトリプシンによる、ＮＴＮＨＡ結合ＢｏＮＴ／Ｂ活性化の代表的なイムノブロット。ＢｏＮＴ／Ｂの２つの断片は、単一のジスルフィド結合によって互いに結合したままである。ジスルフィド結合を減少させるためにＤＴＴを添加すると、それらは互いに分離する。図３Ｂ）クーマシー染色された溶出画分は、切断された毒素断片（それぞれ１００及び５０ｋＤａ）に対応する毒素バンドを示す。１５０ｋＤａバンドは、切断されないままである完全長の毒素の部分である。
【図４】図４は、ゲル分画されたタンパク質の画像である。実験結果は、ＮＴＮＨＡ／Ｂを用いたキメラＢｏＮＴ／Ａ１Ｂ毒素の良好な精製を証明する。ＢｏＮＴ／Ａに対するポリクローナル抗体を使用して、ＢｏＮＴ／Ｂ由来の受容体結合ドメインを有するＢｏＮＴ／Ａ１軽鎖及び転位置ドメインから成るキメラ毒素ＢｏＮＴ／Ａ１Ｂの精製工程を追跡した。完全長ＢｏＮＴ／Ａ１Ｂ（溶出画分中の１５０ｋＤａバンド）は、ＮＴＮＨＡ／Ｂを用いて良好に精製及び溶出された。本発明者らは、１００ｋＤａの顕著なバンドは、このキメラ毒素の分解産物であり、Ｅ．ｃｏｌｉの内因性プロテアーゼによって切断される可能性が高いことに注目した。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｃ（配列番号２２〜２４）は、ＮＴＮＨＡの種々の血清型及びその変異体のアミノ酸配列表である。
【図５−２】図５Ｃ〜５Ｄ（配列番号２４〜２５）は、ＮＴＮＨＡの種々の血清型及びその変異体のアミノ酸配列表である。
【図５−３】図５Ｅ〜５Ｆ（配列番号２６〜２７）は、ＮＴＮＨＡの種々の血清型及びその変異体のアミノ酸配列表である。
【図５−４】図５Ｇ（配列番号２８）は、ＮＴＮＨＡの種々の血清型及びその変異体のアミノ酸配列表である。
【図５−５】図５Ｈ〜５Ｉ（配列番号２９〜３０）は、ＮＴＮＨＡの種々の血清型及びその変異体のアミノ酸配列表である。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、本明細書に記載のＢｏＮＴの精製原理及びプロトコルの実施形態を示す図である。図６Ａ）ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡのｐＨ依存性の二分子複合体の模式図。ＬＣ：軽鎖、ＨＮ：転位置ドメイン、ＨＣＮ、ＨＣＣ：それぞれ、受容体結合ドメインのＮ末端及びＣ末端部分。ＮＴＮＨＡは、ＢｏＮＴと同じドメイン含有量を有し、かつグルタチオン−アガロース樹脂上に固定化され得るＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合タンパク質として示される。弱酸性条件（例えば、約ｐＨ６）下でのＢｏＮＴとＮＴＮＨＡとの相互作用は、緩衝液条件を中性〜アルカリ性ｐＨの方へ操作することによって妨害することができる。図６Ｂ）ＢｏＮＴ単離及び活性化プロトコル。ＮＴＮＨＡを用いた粗溶解物に由来する標識ＢｏＮＴ及び非標識ＢｏＮＴの精製、活性化、及び溶出のための戦略を説明する流れ図。図６Ｃ）グルタチオンアガロースビーズ上に固定化したＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂを用いた、清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物からの不活性ＢｏＮＴ（ＢｏＮＴ／Ｂ（ＲＹ））の典型的な単離法であるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。結合工程及び洗浄工程はｐＨ６で行い、緩衝液をｐＨ８に交換することによって溶出した。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、固定化されたＮＴＮＨＡを用いて単離されたＢｏＮＴ／Ｂが純粋であり、その標準的な神経受容体に結合することを示す。図７Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（左）は、３つの溶出画分がプールされ濃縮された画分（レーン５）を示す。全工程における毒素を検出するためのＢｏＮＴ／Ｂに対するモノクローナル抗体（ＷＢ、右）。溶出された画分には、約１５０ｋＤａの主要バンドとして非活性化ＢｏＮＴ／Ｂが含まれ、これは一本鎖ＢｏＮＴ／Ｂ（ＲＹ）毒素に相当する。図７Ｂ）偏光により検出される結合、すなわち溶出された完全長毒素は、その標準的な小胞受容体であるシナプトタグミン１（Ｓｙｔ  １）のＦＩＴＣ標識断片に対して、その組換えＨＣドメインと類似の親和性を示したが、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＣは、Ｓｙｔに結合しない。エラーバーは、３つのサンプルの平均＋ＳＥＭを表す。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、複合体形成したＢｏＮＴが効率的に活性化されているが、非特異的切断から保護されていることを示す。図８Ａ）トリプシンにより媒介されるＢｏＮＴ／Ｂ（ＲＹ）の活性化（切断）を、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で可視化する。一本鎖（ＳＣ）毒素の経時的切断により、単一のジスルフィド結合で連結した重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）が２つの断片となる。図８Ｂ）ＷＢ分析は、ＢｏＮＴ／Ｂの活性化は、ＢｏＮＴ／ＢがＮＴＮＨＡ／Ｂと複合体形成している間は、非特異的なトリプシン処理から保護されると同時に、効率的な洗浄やエンドプロテイナーゼの除去を可能にすることを示す。図８Ｃ）Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼは、特異的な活性化剤として使用することもでき、この方法を用いて活性型の二本鎖毒素が産生される。
【図９】図９は、ＮＴＮＨＡ／Ｂを用いたキメラＢｏＮＴ／Ａ１Ｂ１毒素の単離を示す。ＢｏＮＴ／Ａに対するポリクローナル抗体を使用してＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣドメインに融合したＢｏＮＴ／Ａ（ＬＣ（ＲＹ）、ＨＮ）で作製したキメラ毒素の精製を追跡する。溶出画分は、約１５０ｋＤａの非活性化ＢｏＮＴ／Ａ１Ｂ１タンパク質を含む。約７０ｋＤａの顕著なバンドは、ポリクローナル抗体によって認識されるＮＴＮＨＡ／Ｂの断片と思われる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明のある態様の詳細な説明
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、芽胞形成クロストリジウム・ボツリヌムによって産生される非常に強力なタンパク質毒素である。過去数十年間で、これらの致死性の薬剤は、多くの神経筋障害の治療及び注射した筋肉での神経伝達物質放出の阻止による美容用途において有用であることが見出されている。現在確立されている治療薬であるＢｏＮＴは、世界中のいくつかの製造業者によって広く大規模に生産されている。利用可能なデータから、製造手順は数十年前の方法論に依拠していることを示唆しており、これは胞子形成株を利用しており、そして毒素の単離は多くの面倒で非効率なバルク精製工程によって達成される。治療用ＢｏＮＴの直接的な精製及び活性化のための改善された方法が必要である。
【００２８】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、ヒトに知られている最も有毒な物質である。ＢｏＮＴ（Ａ〜Ｇ）タンパク質の７つの血清型は、細菌クロストリジウム・ボツリヌムの異なる株の約１５０ｋＤａの産物として同定されている（Ｍｏｎｔａｌ  ２０１０）。これらの毒素は、動物でボツリヌス中毒を引き起こし、重度の神経筋疾患が重度の弛緩性麻痺という形で現れる。この毒性の分子的基盤は、神経筋接合部（ＮＭＪ）で運動ニューロン上の受容体に強力に結合し、エンドサイトーシスによって内部移行し、エンドソーム膜を通り抜けて酵素鎖を細胞質基質に放出させる毒素の能力にある。その後、放出されたプロテアーゼは、ＮＭＪにおいてシナプス小胞融合を担う細胞機構（ＳＮＡＲＥタンパク質）を断つことで、アセチルコリン放出を阻止することによって神経伝達を阻害する（Ｂｌａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｂｏｒｄｅｎ  Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｒｏｓｓｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【００２９】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、筋肉活動、とりわけ制御されていない活動または筋痙攣による異常を局所的に制御するためのツールとして使用することもできる（Ｍａｓｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ＢｏＮＴのこの神経抑制機能は、斜視ならびに多様なジストニア及び下部尿路機能障害（ＬＵＴＤ）の管理を含む、多くの筋肉疾患の治療戦略として検討された（Ｊａｎｋｏｖｉｃ＆Ｂｒｉｎ  １９９１、Ｔｒｕｏｎｇ＆Ｊｏｓｔ  ２００６、Ｖｉｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。治療薬及び／または美容剤として、ＢｏＮＴは、しわを伸ばす目的で顔の筋肉を麻痺させるために使用され得る（Ｈｅｘｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。毒素のさらなる用途は、うつ病を緩和及び片頭痛の予防的に治療することを目的としている（Ｆｉｎｚｉ＆Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ２０１４、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。毒素の臨床的利用は多くの社会的関心を得ている（Ｓｉｆｆｅｒｌｉｎ  ２０１７）。
【００３０】
ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、芽胞形成クロストリジウム株の培養から単離し、続いて最終産物まで精製することができる（Ｐｉｃｋｅｔｔ  ２０１４）。ＢｏＮＴの生産プロセスと単離に関する利用可能なデータは、製造業者が数十年前のものと同じ未変性株の培養及び増殖条件の方法論を利用していることを示唆している（Ｐｉｃｋｅｔｔ＆Ｐｅｒｒｏｗ  ２００９、Ｓｎｉｐｅ＆Ｓｏｍｍｅｒ  １９２８、Ｄｕｆｆ，Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．１９５７、Ｄｕｆｆ，Ｋｌｅｒｅｒ，ｅｔ  ａｌ．１９５７、Ｂｏｎｖｅｎｔｒｅ＆Ｋｅｍｐｅ  １９５９、Ｓｃｈａｎｔｚ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  １９９２、Ｐｉｃｋｅｔｔ  ２０１４）。このような方法は、毒素を産生することができ、そして典型的には毒素の天然供給源（芽胞形成クロストリジウム株）の長い発酵期間の後に、多くの場合、いくつかの酸／アルコール沈殿、結晶化及び／または複数のクロマトグラフィー工程を含む厳しい条件下での面倒な毒素単離手順が含まれる、天然のクロストリジウム株の効率により制限される（ＤａｓＧｕｐｔａ＆Ｂｏｒｏｆｆ  １９６７、Ｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８２、Ｓｃｈａｎｔｚ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  １９９２、Ｍａｌｉｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００３１】
アフィニティークロマトグラフィーを用いた毒素精製を促進するために、アフィニティータグ（例えば、Ｈｉｓ６ＸまたはＧＳＴ−融合物）を含むことにより、標識ＢｏＮＴを組換え的に産生することは可能である。しかしながら、このようなアプローチは、例えば治療用生物製剤としてＢｏＮＴを使用する際に、不利益となる。例えば、アフィニティータグは、毒素の生物学的活性に悪影響を及ぼし、及び／または望ましくない抗原性を有し得る。精製後のタグの除去により、さらなる酵素及び精製工程も必要になると同時に、最終産物中に非天然のＮ末端またはＣ末端が生成する。さらに、組換えＢｏＮＴは、機能的かつ強力な二本鎖毒素を得るために、精製後にエンドプロテイナーゼにより活性化される必要がある。このタンパク質分解工程は、非特異的分解をもたらし、これはエンドプロテイナーゼ及び／または分解産物を除去するためのさらなる精製工程を必要とする。芽胞形成株からの毒素産生、及びその後の精製のためのエンジニアリング及び封じ込めの課題とは別に、（Ｍａｌｉｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｐｉｃｋｅｔｔ  ２０１４）、これらの組換えアプローチは、品質及び効力から効率的な再現性に至るまで、最終産物のほとんどの特性を損なう可能性がある。活性な治療用ＢｏＮＴを安全かつ効率的に単離するための新しい戦略は、ＢｏＮＴの大規模生産及び容易な単離にとって有益となろう。
【００３２】
クロストリジウム神経毒素が神経の細胞質基質に入り込む生化学的性質と細胞機構に関する研究により、クロストリジウム神経毒素の構造的、分子的及び機構的機能の理解が幾分もたらされた（Ｂｌａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｂｏｒｄｅｎ  Ｌａｃｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｒｏｓｓｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。食物媒介性のボツリヌス中毒は、細菌のインタクトな毒素及び他の産物が宿主の消化管を介して通過することを必要とする。分解を回避するこの能力の分子的及び構造的基盤は、標的生物が遭遇する完全な毒性剤を構成するために、「前駆毒素複合体」（ＰＴＣ）と呼ばれるより大きな複合体が特性決定された最近まで、謎のままであった。タンパク質分解活性の毒素に加えて、これらの複数のタンパク質複合体は、典型的には、血清型特異的非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）タンパク質及び３つの赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）から成る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。以前は毒素機能を補助すると考えられていた（Ｓｃｈａｎｔｚ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ  １９９２）、ＰＴＣは、今では過酷な胃腸環境からＢｏＮＴを物理的に遮蔽し、保護することで無事にその目的地に到達させることが知られている（最初は上皮性関門に、そしてその後ＮＭＪに移行させ、そこでＢｏＮＴはシナプス小胞の再循環機構を介して細胞質基質に内部移行され得る）。構造研究において（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）Ｇｕ及び共同研究者は原子の詳細において、非共有複合体のＢｏＮＴ／Ａ：ＮＴＮＨＡ／Ａに、僅かに有効なＰＴＣ（ｍ−ＰＴＣ）を示した。毒素：ＮＴＮＨＡ複合体の共結晶構造は、ｐＨ依存性の複合体形成を示した。ＢｏＮＴ／Ａ及びＮＴＮＨＡ／Ａは、わずかに酸性の条件下（約ｐＨ６）でナノモルレベルの親和性を有する緊密な複合体を形成することができると報告されている。しかしながら、そのような複合体形成は中性〜アルカリ性のｐＨでは生じないと言われている。
【００３３】
本明細書では、非毒性非赤血球凝集素（ＮＴＮＨＡ）タンパク質に対するＢｏＮＴ分子の本来の親和性を利用するＢｏＮＴの精製に関する組成物及び方法が開示される。ＢｏＮＴは、ＮＴＮＨＡシャペロンタンパク質と二量体複合体を自然に形成し、これは胃腸管のプロテアーゼ及び酸性分解から保護される。結合は可逆的であり、ｐＨに依存する（ｐＨ＜７で結合かつｐＨ＞７．４で解離する）。ＮＴＮＨＡタンパク質は、ＢｏＮＴを含む混合物に結合を促進するｐＨで添加される。ＢｏＮＴ：ＮＴＮＨＡ複合体は、複合体内のＮＴＮＨＡの固定化によって混合物の他の成分から単離される。洗浄後、解離を促進するためにｐＨを上げることによってＢｏＮＴを複合体から放出させる。この方法はＢｏＮＴの親和性修飾によるものではないので、毒素の非標識形態を精製することができる。
【００３４】
本明細書に記載の精製方法はまた、ＢｏＮＴ：ＮＴＮＨＡ複合体でいる間のＢｏＮＴの活性化も可能にする。活性化の後、ＢｏＮＴは複合体から放出され、それにより精製された毒素の活性化形態がもたらされ得る。
【００３５】
本発明の態様は、ＢｏＮＴを精製する方法に関する。典型的には、ＢｏＮＴは、細胞抽出物などの夾雑成分を含む水溶液の環境下にある。本方法は、ＢｏＮＴのＮＴＮＨＡへの結合に適した条件下で溶液をＮＴＮＨＡ分子と混合することを含む。実際に、これには、ＮＴＮＨＡ分子を水溶液（例えば、細胞抽出物または清澄化細胞抽出物）と混合させることを含めることができる。ＢｏＮＴは、ＮＴＮＨＡ分子によって単離することができる。一般に、これはＮＴＮＨＡをマトリックスに固定することによって達成される。非結合物質は、例えばマトリックスを洗浄することによって複合体から除去される（例えば、マトリックスの３〜４容量の洗浄緩衝液量を用いて）。洗浄後、ＢｏＮＴは複合体から放出され、例えば、マトリックスに結合したＮＴＮＨＡからの溶出により精製されたポリペプチドが生成する。
【００３６】
ＢｏＮＴは、プロテアーゼによる消化によって活性化された後に複合体から放出されることができる。これは、ＢｏＮＴの切断に適しており、その他には複合体を破壊しない（例えば、必要なｐＨを維持する）条件下で、マトリックス結合複合体をプロテアーゼと接触させることによって達成することができる。プロテアーゼは、マトリックスを洗浄することによって（例えば、洗浄緩衝液を用いて）他の非結合物質と共に除去される。次いで活性化され精製されたＢｏＮＴは、ＮＴＮＨＡ複合体からＢｏＮＴを解離する水溶液（例えば、溶出緩衝液）をマトリックスと接触させることによって溶出することができる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドの活性化は必要ではないか、望ましくない。
【００３７】
その方法で使用されるＮＴＮＨＡは、ＢｏＮＴと適合性でなければならない。適合性という用語は、ＮＴＮＨＡ及びＢｏＮＴに関して使用される場合、互いに緊密で安定な複合体を形成することができる分子を指す。一実施形態において、ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡは、同一の自然に生じるＢｏＮＴ血清型タンパク質複合体の成分である。これは、ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡのコード配列が同じオペロンに由来する場合に生じる。用語「血清型」は、ＮＴＮＨＡ分子を記載するために本明細書で使用される場合「血清型由来」となり、これは、ＢｏＮＴの特定の血清型をコードするオペロンに由来するＮＴＮＨＡ分子を指す。適合性とは、ＮＴＮＨＡと適合性のある領域（例えば、Ｈｃ領域）を有するＢｏＮＴまたはキメラポリペプチドも指し得る。一実施形態において、ＮＴＮＨＡ及びＢｏＮＴのＨｃ領域は両方とも、同一の自然に生じるＢｏＮＴ血清型複合体に由来する。
【００３８】
マトリックスへのＮＴＮＨＡの固定化は、ＢｏＮＴの結合の前後で行うことができる。一実施形態において、ＮＴＮＨＡをマトリックスに結合させ、そしてＢｏＮＴを含む溶液をマトリックスに添加することで、ＨｃポリペプチドをＮＴＮＨＡと接触させて複合体形成を促進させる。一実施形態において、ＮＴＮＨＡ及びＢｏＮＴは複合体になった後に、ＮＴＮＨＡをマトリックスに結合させる。
【００３９】
一実施形態において、親和性部分をＮＴＮＨＡタンパク質に導入し（例えば、融合タンパク質としての発現により）、その標識タンパク質を用いてＢｏＮＴ：ＮＴＮＨＡ結合を促進する条件下でＢｏＮＴを結合及び単離させる。ＢｏＮＴ：ＮＴＮＨＡ複合体は、複合体内のＮＴＮＨＡのアフィニティー精製によって単離される。
【００４０】
結合緩衝液、インキュベーション緩衝液、洗浄緩衝液、及びプロテアーゼ消化緩衝液は、Ｈｃ−ＮＴＮＨＡ複合体の形成及び保存に適した条件を促進する。これには、複合体形成を促進するｐＨを有するものが含まれるが、これに限定されない。典型的には、これは７．５未満、例えば６未満のｐＨである。一実施形態において、緩衝液のｐＨは２〜８である。一実施形態において、緩衝液のｐＨは５〜７である。一実施形態において、ｐＨは約５、約６、または約７である。結合緩衝液、インキュベーション緩衝液及び洗浄緩衝液は、全て非常に似ているか、同じであってもよい。緩衝液は、本明細書に明記した成分以外の追加の成分をさらに含み得る。一実施形態において、緩衝液は、ＢｏＮＴポリペプチドのための安定化剤をさらに含有する（例えば、血清アルブミン、多糖類、トレハロース、または界面活性剤）。緩衝液のｐＨは、種々の成分について指定された範囲内で最適化することができる。当業者は、緩衝液のｐＨは、タンパク質を沈殿させ得るタンパク質のＰＩに近いｐＨになることを避けて、全体のタンパク質構造を保存させなければならないことを理解するであろう。
【００４１】
緩衝液は、生理的イオン強度（例えば、１００〜２００ｍＭ  ＫＣｌまたはＮａＣｌの範囲内）を有することが好ましい。必要なイオン強度を作り出すために様々な塩が利用可能である。高すぎる塩濃度は、極性／イオン干渉による相互作用を乱す可能性がある。一実施形態において、塩濃度は４００ｍＭ以下である。低い塩条件でも十分に機能すると予想される。一実施形態において、塩濃度は１５０ｍＭである。一実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ６を有する。一実施形態において、結合が生じる緩衝液（結合緩衝液）は、さらに１つ以上のプロテアーゼ阻害剤（例えば、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ））を含む。一実施形態において、結合緩衝液は、約０．１〜１ｍＭの濃度のＰＭＳＦを含む。一実施形態において、ＰＭＦＳは約１ｍＭである。
【００４２】
洗浄は、例えば洗浄緩衝液を用いて行うことができる。洗浄のための典型的な量はマトリックスの３〜４倍量である。
【００４３】
ＢｏＮＴ分子はいくつかのドメインを含み、その受容体結合ドメイン（その他にはＨｃドメインとも呼ばれる）を介してＮＴＮＨＡ分子に結合する。このように、本明細書に記載の方法は、ボツリヌス神経毒素の受容体結合ドメイン（Ｈｃポリペプチド）を含む任意のポリペプチド（例えば、完全長ＢｏＮＴまたはＨｃポリペプチドを含むその断片、またはＨｃドメインを含むキメラポリペプチド）の精製に適用可能である。
【００４４】
本明細書に記載の方法の一実施形態において、ＮＴＮＨＡは、ＢｏＮＴまたはその受容体結合ドメインに対して約１：１〜約１０：１のモル比、例えばＢｏＮＴまたはその受容体結合ドメインに対して約２：１、３：１、４：１または５：１で存在する。
【００４５】
結合したＢｏＮＴまたはその断片の活性化は、ＢｏＮＴ：ＮＴＮＨＡ複合体（例えば、マトリックスに結合した場合）を適切なプロテアーゼと接触させることによって達成される。一実施形態において、プロテアーゼは、リジン残基の後ろでタンパク質を切断する。一実施形態において、プロテアーゼはトリプシン、ペプシン、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ−Ｎエンドプロテイナーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、プラスミン、オンプチン、またはＥＰ２５２４９６３に記載されるようなクロストリジウムプロテアーゼであるが、これらに限定されない。好ましい条件では、ＮＴＮＨＡ、任意の関連する親和性部分、またはそれらの結合標的の実質的な分解を生じないであろう。切断に適切な条件には、プロテアーゼの適切な濃度、及びプロテアーゼの活性のための適切な条件（例えば、温度、インキュベーション時間、緩衝液成分など）が含まれる。そのような条件は、適切なプロテアーゼ消化緩衝液の使用によって達成することができる。使用されるプロテアーゼの量は、ＮＴＮＨＡ分子の量またはＢｏＮＴ分子の量によって決定することができる。一実施形態において、プロテアーゼは、ＮＴＮＨＡ分子に対して約１：２〜約１：１０００のモル比で存在する。一実施形態において、プロテアーゼは、ＮＴＮＨＡ分子に対して約１：５〜約１：１００、例えば約１：１０、１：２０、１：３０、１：４０または１：５０のモル比で存在する。本明細書中に記載される方法の一実施形態において、プロテアーゼは、ＢｏＮＴに対して約１：２〜約１：１０００（例えば、ＢｏＮＴに対して約１：５〜約１：１００）または約１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、または１：５０のモル比で添加される。
【００４６】
使用される特定のプロテアーゼのための適切な条件は、当業者によって決定される。プロテアーゼへの曝露時間の長さもまた、プロテアーゼ、使用される濃度、及び温度によって異なる。一実施形態において、プロテアーゼは、２℃〜４０℃、好ましくは４℃〜３７℃（例えば、４℃、１６℃、２０℃または３７℃）の温度で接触させる。一実施形態において、プロテアーゼは室温（約２０〜２２℃）で接触させる。
【００４７】
一実施形態において、プロテアーゼは約１０分〜約１８時間、好ましくは３０分〜５時間（例えば約３０分、１時間、２時間、３時間、４時間または５時間）接触させる。一実施形態において、プロテアーゼは約４時間接触させる。一実施形態において、プロテアーゼはＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼであり、インキュベーション時間は約３０分である。
【００４８】
一実施形態において、プロテアーゼは、約５．５〜約８．５のｐＨでマトリックスに接触させる。一実施形態において、プロテアーゼは、約６〜約８（例えば、約６、７または８）のｐＨでマトリックスに接触させる。
【００４９】
一実施形態において、プロテアーゼは、プロテアーゼのトリプシン及びＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼから選択され、６〜７のｐＨで約３０分〜２時間、室温にてマトリックスに接触させる。
【００５０】
ＢｏＮＴ−ＮＴＮＨＡ複合体からのＢｏＮＴの溶出は、複合体の解離を促進するｐＨを有する水溶液（本明細書において溶出緩衝液と称する）を用いて達成される。好ましくは、溶出緩衝液は、適切なｐＨであることと同時に、その他にＨｃポリペプチドの完全性を実質的に保存すること、及びＮＴＮＨＡの固定化を実質的に維持すること（例えば、ＮＴＮＨＡのマトリックスへの結合を維持する）により、ＢｏＮＴ−ＮＴＮＨＡ複合体を分裂させる。溶出緩衝液は、生理学的イオン強度を有することがさらに好ましい。利用可能な様々な緩衝液（例えば、トリス、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液など）が使用に適している。一実施形態において、溶出緩衝液は、結合緩衝液及び／または洗浄緩衝液と同じであり、ｐＨのみが異なる。一実施形態において、溶出緩衝液は、本明細書で論じられる適切なｐＨ（例えば、ｐＨ８）を有する約５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌである。
【００５１】
使用される溶出緩衝液（例えば、本明細書に記載の溶出緩衝液）は、約ｐＨ７〜約ｐＨ１１であり得る。一実施形態において、ｐＨは７．５以上である。一実施形態において、ｐＨは約８である。溶出緩衝液は、本明細書に明記された成分以外の追加の成分をさらに含み得る。溶出緩衝液のｐＨは、その中の様々な成分に対して最適化することができる。
【００５２】
典型的には、ＢｏＮＴは細胞抽出物から精製される。一実施形態において、細胞抽出物は清澄化細胞抽出物である。「清澄化細胞抽出物」という用語は、遠心分離及び／または濾過によって除去される場合など、全ての粒子状物質を実質的に含まない抽出物を指す。
【００５３】
ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡは、同じ宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉにおいて共発現され得る。本方法は、ＢｏＮＴと共にそこで発現するＮＴＮＨＡを利用することができる。代替的には、ＢｏＮＴ及びＮＴＮＨＡを異なる宿主細胞で発現させることができる。それぞれの細胞抽出物を用いて、それぞれのタンパク質を産生／単離することができる。ＢｏＮＴは、Ｅ．ｃｏｌｉのような異種宿主細胞において組換え法で産生され得るか、またはその天然のクロストリジウム細胞で産生され得る。ＮＴＮＨＡは、Ｅ．ｃｏｌｉのような異種宿主細胞またはその天然のクロストリジウム細胞において組換え法で産生され得る。
【００５４】
「精製」または「精製された」は、本明細書で使用される場合、調製物の他の成分（例えば、他のポリペプチド）に対して「実質的に純粋」であるＢｏＮＴまたはその断片を指す。これは、ＢｏＮＴまたはその断片が他の成分に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、または７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％純粋であることを意味し得る。ＢｏＮＴまたは断片に関して「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語の書き換えは、１つ以上の成分（例えば、他のポリペプチドまたは細胞成分）の約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満、または１％未満を含む調製物を指す。
【００５５】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の方法で使用される成分に関する。本発明の一態様は、ＢｏＮＴを結合させるために使用する、ＮＴＮＨＡポリペプチドに関する。ＮＴＮＨＡポリペプチドは、完全長のＮＴＮＨＡまたはその機能的断片であり得る。ＮＴＮＨＡの機能的断片は、適合性のＢｏＮＴ  Ｈｃドメインへの結合特性を保持し、そしてＢｏＮＴを分解から保護すると同時に活性化を可能にすると考えられている。ＮＴＮＨＡポリペプチドは、付加的な異種アミノ酸をさらに含み得る。この用語が本明細書で使用される場合、異種とは異なる起源の分子を指す。例えば、異種親和性部分は、ＮＴＮＨＡ分子に元々存在する任意の内在的な親和性部分とは異なる。
【００５６】
異種配列は、ＮＴＮＨＡに共有結合していてもよい（例えば、融合タンパク質としての発現により、またはＮＴＮＨＡ分子の翻訳後修飾により）。一実施形態では、付加的な異種アミノ酸配列は、異種親和性部分である。
【００５７】
異種アミノ酸配列は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部に存在し得る。そのような配列が存在する場合、ＮＴＮＨＡとＢｏＮＴ  Ｈｃドメインとの相互作用を保存するように設計されるべきである。一実施形態において、異種配列は親和性部分であり、親和性部分とＮＴＮＨＡ配列との間に介在配列は存在しない。一実施形態において、異種アミノ酸は、ＮＴＮＨＡのＮ末端に位置する。
【００５８】
一実施形態において、異種アミノ酸は、融合タンパク質からアフィニティータグを除去するために典型的に使用されるような機能的タンパク質切断部位を欠いている。一実施形態において、本発明は、Ｎ末端に融合されたｍｙｃタグを含むＮＴＮＨＡポリペプチド、例えば、ＮＴＮＨＡ−Ａ１を除外する（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：９７７−９８１（２０１２））。
【００５９】
本発明の一態様において、ＮＴＮＨＡポリペプチドは、マトリックスに安定的に結合する。安定した結合とは、本明細書に記載される様々な緩衝液の条件によって崩壊されない結合を指す。マトリックスへの結合は、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介することができる。一実施形態において、マトリックスへの結合は、ＮＴＮＨＡポリペプチド上の異種親和性部分とマトリックス上の対応する結合部分（例えば、マトリックス上に存在するグルタチオンを含むＮＴＮＨＡ上のＧＳＴ親和性部分）との相互作用を介する。
【００６０】
一実施形態において、本明細書に記載される様々な形態のＮＴＮＨＡポリペプチド（例えば、親和性部分に連結、及び／またはマトリックスに安定的に結合される）は、適合性のＢｏＮＴまたはその受容体結合ドメイン（Ｈｃ）を含むポリペプチドとさらに複合体を形成している。一実施形態において、ＢｏＮＴまたはＨｃは天然のタンパク質である。一実施形態において、ＢｏＮＴまたはＨｃは、遺伝子改変した受容体結合ドメイン（例えば、特異的な受容体に対して結合の増加を有する）である。
【００６１】
一実施形態において、親和性部分を含むＮＴＮＨＡポリペプチドは、親和性部分の結合を介して結合標的にさらに結合する。結合標的は、さらにマトリックスに安定的に結合し得る。
【００６２】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＮＴＮＨＡポリペプチドを含有する水溶液に関する。溶液中のＮＴＮＨＡポリペプチドは、例えば親和性部分に連結されるような、マトリックスに安定的に結合されるような、及び／または親和性部分を介して結合標的に結合されるような本明細書に記載される任意の形態であり得、これらのいずれもが適合性のＢｏＮＴにさらに結合されていてもよい。
【００６３】
本明細書に記載のＮＴＮＨＡ及び親和性部分融合タンパク質をコードする核酸配列も本発明に包含される。タンパク質をコードする核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現のために最適化することができる。一実施形態において、核酸配列はベクターの環境下（例えば、発現ベクター）にある。ベクターは、核酸を増殖及び／または発現させることが意図される宿主細胞と適合性がなければならない。
【００６４】
ＮＴＮＨＡ
ＮＴＮＨＡは、クロストリジウム・ボツリヌムによって合成される、１４０ｋＤａのタンパク質である。ＮＴＮＨＡ遺伝子は、特定の血清型ＢｏＮＴタンパク質をコードするオペロン内で生じる。ＢｏＮＴと同じオペロンから産生されたＮＴＮＨＡは、同一の自然に生じるＢｏＮＴタンパク質複合体の成分であり、互いに緊密で安定した複合体を形成する。ＮＴＮＨＡはＢｏＮＴと約３０．８ｎＭのＫｄで１：１の化学量論にて結合する（Ｓｈｅｎｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３５：９７７−９８１（２０１２））。好ましくは、ＮＴＮＨＡは、精製されるＢｏＮＴまたはＨｃ断片の血清型（及びサブタイプ）（Ａ、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４−Ａ、Ａ４−Ｂ、タイプＢ、Ｃ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、Ｆ、またはＧ）を産生する同じクロストリジウム・ボツリヌム株に由来する。血清型間には、いくつかの結合の重複が予想される。異なるＮＴＮＨＡタンパク質のアミノ酸配列は、当業者に利用可能であり、ＢｏＮＴ血清型をコードするオペロン由来のＮＴＮＨＡタンパク質などのコード核酸配列（Ａ１（ＹＰ＿００１２５３３４１．１）、Ａ２（ＷＰ＿０１２７０４９０５）、Ｂ（ＷＰ＿００３４０４１９２．１）、Ｃ１（ＹＰ＿３９８５１５．１）、Ｄ（ＢＡＡ７５０８３．１）、Ｅ（ＷＰ＿００３４０９８４２）、Ｆ（ＹＰ＿００１３９０１２２．１）、及びＧ（ＣＡＡ６１２２８．１））も当業者に利用可能である。一実施形態では、本発明は、ＮＴＮＨＡ／Ａ（ＮＴＮＨＡ／Ａ１）分子及びコード核酸の使用を除外する。
【００６５】
ＢｏＮＴ
当技術分野で公知の様々な血清型のボツリヌス神経毒素（Ａ〜Ｇ）には、多くのサブタイプも存在する（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４−Ａ、Ａ４−Ｂ）。本明細書中に記載される方法は、天然ＢｏＮＴ（クロストリジウム細菌によって産生される）または組換えタンパク質を精製するために使用され得る。組換えＢｏＮＴは、他の原核細胞、真核細胞、組織または生物などの別の種の宿主で産生することができる。
【００６６】
ＢｏＮＴの変異型変異体（例えば、アミノ酸置換、挿入または欠失から生じる）もまた単離され得る。一実施形態において、変異体は、（例えば、細胞受容体への結合の増加により）増大した毒性を有する。このような変異型変異体には、「改変受容体結合ドメイン」または「改変ＨＣ」を含めることができる。その用語が本明細書で使用される場合、改変Ｈｃは、それが含まれるＣ．ボツリヌム（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒素分子の、標的細胞の表面上に位置するＣ．ボツリヌム神経毒素の受容体に対する結合を増強させる、１つ以上の自然に生じない置換変異を有する。そのような分子は、典型的には、遺伝子組換え技術によって産生される。改変ＨＣは、その野生型のものより強いＣ．ボツリヌム神経毒素と受容体の結合活性を有する。改変受容体結合ドメインの例は、米国特許出願第２０１５／１６６９７２号に開示されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明はさらに、ボツリヌス毒素の生物学的活性を保有または保持する任意の分子、例えば、融合（またはキメラ）タンパク質、切断型タンパク質、タンパク質断片、または付加、欠失もしくは置換された１つ以上のアミノ酸を有するタンパク質などのボツリヌス毒素の変異型変異体を単離するのに更に有用である。
【００６７】
一実施形態において、本明細書に記載の方法によって単離されたＢｏＮＴは毒性活性を有する。ＢｏＮＴの活性は、適切な基質でタンパク質分解活性を測定することによって決定することができる。ボツリヌス毒素Ａ型及びＥ型毒素は、タンパク質ＳＮＡＰ−２５を切断する。ボツリヌス毒素のＢ型、Ｄ型、Ｆ型及びＧ型は、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ、シナプトブレビンと呼ばれる）を切断する。ボツリヌス毒素Ｃ１型は、ＳＮＡＰ２５とタンパク質のシンタキシンの両方を切断する。この活性を決定するために用いることができるアッセイは、ＷＯ９５／３３８５０に記載されるように当分野で公知であり、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
親和性部分
ＮＴＮＨＡは、親和性部分に結合することができる。親和性部分は、本明細書に記載の方法の条件下（例えば、約ｐＨ６〜約ｐＨ８）で結合標的に特異的に結合する。様々な親和性部分が当分野で公知であり、本発明での使用に利用できる。親和性部分は、抗体によって特異的に認識されるエピトープなどの特異的結合対のメンバーであり得る。エピトープが親和性部分として使用される場合、抗体は結合標的として使用される。このような多くの親和性部分：抗体の組み合わせは、当技術分野で公知であり、市販されている。例として、ｃ−ｍｙｃ（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１５：５８７−５９６）、ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号８）、Ｅｖａｎ  Ｇ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６、Ｍｕｎｒｏ  Ｓ．ａｎｄ  Ｐｅｌｈａｍ  Ｈ  Ｒ  Ｂ，（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：８９９−９０７、Ｂｏｒｊｉｇｉｎ  Ｊ．ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ  Ｊ．，（１９９４）２６９：１４７１５−１４７２７、Ｓｍｉｔｈ  Ｄ  Ｊ，（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１１６−１２０）ＦＬＡＧ．ＲＴＭ．（米国特許第４，７０３，００４号、第４，８５１，３４１号及び第５，０１１，９１２号）、インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質に由来するＨＡ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｃｅｌｌ，３７：７６７、Ｆｉｅｌｄ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８８）８：２１５９−２１６５、Ｘｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：２１３８−２１４６）、ＩＲＳ（ＲＹＩＲＳ（配列番号９）、Ｌｉａｎｇ  Ｔ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）３２９：２０８−２１４、Ｌｕｏ  Ｗ  ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３２９：２１５−２２０）、ＡＵ１及びＡＵ５（（ＤＴＹＲＹＩ（配列番号１０）及びＴＤＦＬＹＫ（配列番号１１））、Ｌｉｍ  Ｐ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１２６３−１２６９、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｄ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）１９０：８８９−８９３、Ｋｏｒａｌｎｉｋ  Ｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２３６０−２３６６）、ｇｌｕ−ｇｌｕ（ポリオーマウイルス培地Ｔ抗原由来の９アミノ酸のエピトープ（ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ  配列番号１２））、Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＰＮＡＳ．ＵＳＡ  ８２：７９５２−７９５４、Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５：１０３３−１０４２）、ＫＴ３（ＳＶ４０ラージＴ抗原由来の１１アミノ酸のエピトープ（ＫＰＰＴＰＰＰＥＰＥＴ（配列番号１３））、ＭａｃＡｒｔｈｕｒ  Ｈ．ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｇ．（１９８４）Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．５２：４８３−４９１、Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）６３：８４３−８４９、Ｄｉ  Ｐａｏｌｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）２７２：５１７５−５１８２）、Ｔ７（Ｔ７の主要なカプシドタンパク質由来の１１アミノ酸リーダーペプチド（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ（配列番号１４）））、Ｓ−ＴＡＧ、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ由来の１１アミノ酸ペプチド（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤＣ（配列番号１５）））、ＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質のカルボキシ末端由来の１１アミノ酸のエピトープ、（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ（配列番号１６））、Ｋｒｅｉｓ  Ｔ．（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：９３１−９４１、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｊ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）２７１：７７３８−７７４４）、Ａｎｔｉ−Ｘｐｒｅｓｓ（８アミノ酸のエピトープ、（ＤＬＹＤＤＤＫ（配列番号１７）））、及びＶＳ（パラモキシウイルスＳＶ５由来の１４アミノ酸のエピトープ、（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号１８）））が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
親和性部分として一般に使用される別のエピトープは、ＦＬＡＧ（登録商標）である。この配列は、典型的には、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１９）であるが、３〜６個のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基の任意の組み合わせもＦＬＡＧ（登録商標）配列とみなされる。ＦＬＡＧ（登録商標）アフィニティータグは、種々の発現系において組換え融合タンパク質の精製のために効果的に使用されている（Ｂｒｉｚｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １６：７３０−７３５、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：７３９−７４６、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１７：１２２３−１２３７、Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４１２５−４１３５、Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＢｉｏＣｈｅｍ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３８：３０５−１０．）。
【００７０】
エピトープをベースとしない多くの親和性部分も存在し、これらもまた本発明に使用することができる。ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）は、本発明での使用が想定される親和性部分である（米国特許第５，６５４，１７６号、第６，３０３，１２８号及び第６，０１３，４６２号）。ポリヒスチジン親和性部分は、米国特許第５，２８４，９３３号及び第５，３１０，６６３号に開示される任意の対応するペプチドを含む、ヒスチジンアミノ酸残基の自然にはない連続配列である。典型的には、そのような配列は４〜１０のヒスチジン残基（配列番号２０）を含む。
【００７１】
一実施形態において、親和性部分は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ヒスチジンアフィニティータグ（ＨＡＴ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）である。一実施形態において、親和性部分はＧＳＴ、Ｃ−ｍｙｃタグ、キチン結合ドメイン、ＳＢＰ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド、Ｓ−ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ、ＦＬＡ、プロテインＡ、プロテインＧ、ＨＡＴ、ポリ−ＨｉｓまたはＭＢＰではない。一実施形態において、親和性部分はＡｖｉＴａｇ（商標）、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、ポリＨｉｓ（典型的にはＨｉｓ６（配列番号１））、ビオチン、またはＳＴＲＥＰ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２１））である。一実施形態において、親和性部分はＡｖｉＴａｇ（商標）、Ｖ５、Ｍｙｃ、Ｔ７、ＦＬＡＧ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、ポリＨｉｓ、ビオチン、またはＳＴＲＥＰではない。
【００７２】
ＮＴＮＨＡに自然に結合する抗体、または肝臓及び／または腎臓のトランスポーターによって認識される分子などの哺乳類動物（ヒト）の体と相互作用する、または哺乳類動物（ヒト）の体内で自然に見出される結合対のメンバーは、本明細書に記載の組成物から除外される。
【００７３】
親和性部分に対する結合標的
結合標的は、親和性部分の結合を介してＮＴＮＨＡポリペプチドを固定化するために使用される。結合標的は、典型的には、所定の親和性部分に対して特異的である。結合標的は、親和性部分に対するそれらの結合親和性が保存されるようにマトリックスに結合する。例えば、エピトープタグの結合標的は、エピトープタグに特異的に結合する抗体である。ＧＳＴの結合標的はグルタチオンである。ビオチンの結合標的は、アビジンまたはストレプトアビジンである。ＳＴＲＥＰの結合標的はＳｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎである。ポリヒスチジンの結合標的は、二価のニッケルまたはコバルトイオンである。プロテインＧの結合標的は、ＩｇＧのＦｃ部分である。プロテインＡの結合標的は、様々な種の免疫グロブリンのＦｃ部分である。
【００７４】
マトリックス
物理的結合を介して分子を固定化するために典型的に使用される種々の不活性物質は、本発明においてマトリックスとして使用することができる。マトリックスは、その他には基材とも呼ばれ、多種多様な材料から作製することができ、様々な形態を取ることができる。材料には、金属、金属合金、ポリマー、プラスチック、紙、ガラス、布、包装材料、細胞、組織、ヒドロゲル、タンパク質、ペプチド、核酸、及びそれらの任意の組み合わせなどの生物学的材料が含まれるが、これらに限定されない。マトリックスがとることのできる形態には、ビーズ（ポリマーマイクロビーズ、磁気マイクロビーズなどを含む）、フィルター、繊維、スクリーン、メッシュ、チューブ、中空繊維、足場、プレート、チャネル、及びこれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で公知の基材マトリックスの他の例には、核酸足場、タンパク質足場、脂質足場、デンドリマー、微粒子またはマイクロビーズ、ナノチューブ、及びマイクロタイタープレートが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、マトリックス成分はカラムの形態である。
【００７５】
一実施形態において、ＮＴＮＨＡポリペプチドは、ＮＴＮＨＡ上に存在する親和性部分をマトリックス表面上に存在する結合標的にカップリングさせることによってマトリックスに結合する。様々な親和性部分及び結合標的が使用可能であり、その例は本明細書で論じられる。一実施形態において、マトリックスは、結合標的としてのグルタチオン（例えば、グルタチオン結合アガロースビーズ）で覆われる。一実施形態において、グルタチオンで覆われたマトリックスは、カラムの形態である。
【００７６】
一実施形態において、ＮＴＮＨＡポリペプチドは、共有結合性または非共有結合性の相互作用を介してマトリックス表面に直接的に結合する。これは、Ｎ末端、Ｃ末端またはその分子の内部を通して起こり得る。基材への結合を容易にするために、ＮＴＮＨＡポリペプチド上にリンカーを含むことは、さらに有用であり得る。
【００７７】
基材への結合は、当技術分野の様々な方法を用いて達成することができる。共有結合の例としては、シランカップリング（Ｗｅｅｔａｌｌ，１５  Ａｄｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．１６１（２００８）、Ｗｅｅｔａｌｌ，４４  Ｍｅｔｈｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３４（１９７６））、及びＮＨＳ反応または抱合剤の使用が挙げられる。非共有結合は、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子−双極子相互作用、水素結合、静電相互作用、及び／または形状認識相互作用に基づくことができる。コンジュゲーションには、安定な結合もしくは不安定な結合または抱合剤のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。例示的なコンジュゲーションには、共有結合、アミド結合、炭素−炭素多重結合への付加、アジドアルキンのヒュスゲン環付加、ディールス−アルダー反応、ジスルフィド結合、エステル結合、マイケル付加、シラン結合、ウレタン、求核開環反応（エポキシド）、非アルドールカルボニル化学反応、環付加反応（１，３−双極子環付加）、温度感受性、放射線（ＩＲ、近ＩＲ、ＵＶ）感受性結合または抱合剤、ｐＨ感受性結合剤または抱合剤、非共有結合（例えば、イオン電荷複合体形成、水素結合、π−π相互作用、シクロデキストリン／強固なホストゲスト相互作用）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「抱合剤」は、化合物の２つの部分を連結する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは原子の鎖などの単位を含み、式中１つ以上のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、ＮＨ、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な連結基、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換の複素環で割り込みされるか終結され、式中Ｒ１は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
【００７８】
様々な抱合化学反応が、２つの分子を共に抱合させるために利用可能であり、ＮＴＮＨＡポリペプチドをマトリックスに連結するために使用することができる。少なくとも１つの操作された微生物の標的化分子を基材に結合させるための例示的なカップリング分子及び／または官能基には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、種々の長さＸのＰＥＧスペーサーアームを有することができるＮＨ２−ＰＥＧＸ−ＣＯＯＨ、ここで、１＜Ｘ＜１００、例えばＰＥＧ−２Ｋ、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋなど）、マレイミド共役剤、ＰＡＳ化、ＨＥＳ化、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸共役剤、ＤＮＡ結合剤、ペプチド結合剤、シラン結合剤、多糖共役剤、加水分解性共役剤、及びこれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
マトリックスに結合したＮＴＮＨＡの量は、当業者によって決定され最適化され得る。一実施形態において、マトリックスは約２０ｍｇ／ｍｌのＮＴＮＨＡポリペプチドを有する。一実施形態において、マトリックスは、約５ｍｇ／ｍｌのポリペプチド、または約２ｍｇ／ｍｌのポリペプチドを有する。
【００８０】
プロテアーゼ
ＢｏＮＴを切断する任意のプロテアーゼは、本明細書に記載の方法において使用することができる。そのようなプロテアーゼには、トリプシン、ペプシン、Ｌｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ、Ｌｙｓ−Ｎエンドプロテイナーゼ、アルギニルエンドペプチダーゼ、プラスミン、オンプチン及びＥＰ２５２４９６３に記載のクロストリジウムプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、プロテアーゼはトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼである。一実施形態において、プロテアーゼは、ＢｏＮＴの非天然（すなわち、外因性）切断部位を切断するプロテアーゼである。そのようなクロストリジウム毒素において、天然プロテアーゼ切断部位（活性化部位としても知られる）は、クロストリジウム毒素に固有でないプロテアーゼ切断部位に改変または置換される。使用され得る非天然プロテアーゼには、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ↓（配列番号２））、第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ↓（配列番号３）／ＩＤＧＲ↓（配列番号４））、ＴＥＶ（Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ（配列番号５））、トロンビン（ＬＶＰＲ↓ＧＳ（配列番号６））及びＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ（配列番号７））、（↓は、切断部位を示す）。
【００８１】
核酸ベクター
本発明の別の態様は、本明細書に記載のＮＴＮＨＡポリペプチドをコードする、核酸分子を含む核酸ベクターに関する。このベクターは、生物または細胞における核酸配列の伝播のためだけのベクターであってもよく、またはその生物もしくは細胞におけるポリペプチドなどの核酸配列の発現用であってもよい。
【００８２】
一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクターは、本明細書では発現構築物と呼ばれ、細胞または無細胞抽出物の核酸分子の発現に有用な発現ベクターに作動可能に連結された、本明細書に開示される核酸分子を含む。本明細書に記載のＮＴＮＨＡポリペプチドをコードする核酸分子を発現させるために使用することができる多種多様な発現ベクターには、ウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルス）、原核生物発現ベクター、例えば、酵母発現ベクター、昆虫発現ベクター、哺乳動物発現ベクター、及び無細胞抽出物発現ベクターのような真核生物発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。適切な発現ベクターには、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）もしくはｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはバキュロウイルス由来ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ウイルス由来の発現ベクターは、本発明の核酸を標的細胞集団に送達するために使用され得る。本明細書に記載されるような、親和性部分を有する融合体を産生するための多数の発現ベクターが、当分野で利用可能である。適切な発現ベクターの選択、作製及び使用は、当業者によって行われる慣例的な手順である。
【００８３】
宿主細胞
本発明の別の態様は、本明細書に記載の分子（例えば、ＮＴＮＨＡポリペプチド及び／またはＢｏＮＴポリペプチド）の１つ以上が伝播及び／または発現される細胞に関する。そのような細胞は、宿主細胞と呼ばれる。宿主細胞は、タンパク質をコードするベクターを用いたトランスフェクションなどにより、本明細書に記載の分子を発現するように遺伝子改変され得、及び／または１つ以上の分子（例えば、ＢｏＮＴ）を自然に発現し得る。一実施形態において、宿主細胞は、ＮＴＮＨＡポリペプチドをコードする核酸を含む（例えば、ベクターの環境内に）。一実施形態において、宿主細胞は核酸を発現する（例えば、発現ベクターから）。いくつかの実施形態において、本発明に従って使用される細胞には、原核細胞及び真核細胞が含まれる。原核細胞の非限定的な例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞、クロストリジウム・ボツリヌム細胞、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）細胞、クロストリジウム・ベラッティ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｒａｔｔｉ）細胞、クロストリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）細胞、またはクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）細胞である。真核細胞の非限定的な例は、昆虫細胞、酵母細胞、両生類細胞、哺乳動物細胞、植物細胞である。昆虫細胞の非限定的な例は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）細胞、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞、キシタゴマダラヒトリ（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ  ａｃｒｅａ）細胞、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）細胞及びキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞である。酵母細胞の非限定的な例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）細胞、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）細胞、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
【００８４】
本明細書において別に定義されない限り、本出願と関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００８５】
本発明は、本明細書に記述される特定の手順、慣習、及び試薬等に制限されず、したがって変化し得ることを理解するべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、請求項によってのみ定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００８６】
操作の実施例、または他に指示がある場合を除き、本明細書で使用される成分量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。百分率に関して、本発明を説明するために使用される場合、「約」という用語は、±１％、±５％、または±１０％を意味し得る。
【００８７】
一態様において、本発明は、本明細書に記載された組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素（複数可）に関して、本発明に必須である場合、さらに、明記されていない必須または必須ではない要素を包含することに解放的である（「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）。いくつかの実施形態において、組成物、方法またはそのそれぞれの構成要素の説明に含まれる他の要素は、本発明の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えない要素に限定される（「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」）。これは、記載された方法の範囲内の工程ならびにその中の組成物及び成分に等しく適用される。他の実施形態において、本明細書に記載された発明、組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素は、構成要素、組成物または方法に必須の要素とみなされない任意の要素を排除することを意図する（「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」）。
【００８８】
全ての特許及び特許出願、及び出版物は、例えば、本発明と関連して使用され得る、かかる出版物などに記載される方法論を説明及び開示する目的で参照することにより、明白に本明細書に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日以前のそれらの開示にのみ提供される。この点のいかなる内容も、先行発明、または任意の他の理由によって、発明者らがかかる開示に先行する権利がないことを承認すると、解釈するべきではない。日付に関する記載、または、これらの文書の内容に関する表現の全ては、出願人が利用可能な情報に基づき、日付または、これらの文書の内容の正確性に関していずれも承認とみなされない。
【００８９】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これはさらなる限定と解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９０】
実施例１
ＢｏＮＴの精製及び活性化のための新しい方法
本明細書では、簡単な工程のアフィニティー精製により、非標識の天然形態のＢｏＮＴを精製及び活性化するための新しい方法が提案される。この方法は、ＢｏＮＴの独特な特性に基づいており、これらの毒素は、ＮＴＮＨＡとして知られるそのシャペロンタンパク質と自然に二量体の複合体を形成する。この二量体の生物学的目的は、プロテアーゼ及び胃腸（ＧＩ）管における過酷な酸性環境から毒素を保護することである。ＢｏＮＴとＮＴＮＨＡ間の相互作用はｐＨ依存性であり、ｐＨ＜７で結合し、ｐＨ＞７．４で互いに解離する。したがって、ＮＴＮＨＡ上にアフィニティータグを導入することにより、ｐＨ＜７の溶液中で天然型のＢｏＮＴを単離するのに利用することができる。その後、ただ溶液のｐＨを＞ｐＨ７．４に上げるだけで結合したＢｏＮＴを放出させることができる。つまり、ＢｏＮＴにアフィニティータグを付ける代わりに、その結合パートナーを標識することができる。これにより、簡便なアフィニティー精製法を通してＢｏＮＴの天然形態の産生が可能となる。
【００９１】
精製に加えて、ＢｏＮＴは、限定したタンパク質分解によって活性化される必要がある。組換えＢｏＮＴは、通常、精製後にエンドプロテイナーゼ（トリプシンなど）で活性化される。この方法は、１）毒素の活性及び収量を損なわせるエンドプロテイナーゼによる非特異的切断の可能性がある、２）エンドプロテイナーゼは、反応が完了した後に除去する必要があり、毒素の収量及び活性を損なう追加の分離工程を必要とする、といういくつかの欠点を有する。
【００９２】
ＢｏＮＴ上の活性化部位は、依然としてＢｏＮＴ−ＮＴＮＨＡ複合体の表面上に露出しているが、ＢｏＮＴの他の感受性部位は、多くの場合、複合体内で保護される。これにより、毒素が依然としてＮＴＮＨＡと複合体を形成していながらも、エンドプロテイナーゼで毒素を処理する機会がもたらされる。このアプローチは、これまでの方法の両方の問題に対処しており、すなわち、１）ＮＴＮＨＡは、エンドプロテイナーゼによる非特異的切断から毒素を保護し得、２）エンドプロテイナーゼは、ＮＴＮＨＡに結合しない他の全ての非毒素タンパク質とともに、単一の洗浄工程で容易に除去され得る。
【００９３】
結果
自然に存在する各ＢｏＮＴは、自然に存在するＮＴＮＨＡそれぞれのパートナーを有する。ＢｏＮＴ／Ｂ及びＮＴＮＨＡ／Ｂは、本発明者らのアプローチの実行可能性を証明するためのプロトタイプとして使用した。要約すると、ＮＴＮＨＡ／Ｂは、一般に使用されるＧＳＴタグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）との融合タンパク質として発現させた。ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂを精製し、グルタチオンビーズ上に固定化し、続いて毒素結合緩衝液（ｐＨ＝６）で平衡化した。次いで、この樹脂を組換えで発現させたＢｏＮＴ／Ｂを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞溶解物に加え、ｐＨ６の条件下で複合体形成させるために４℃で１時間インキュベートした。続いて、ビーズ結合複合体を結合緩衝液で洗浄して、非特異的な夾雑物及び非結合タンパク質を除去した。結合したＢｏＮＴ／Ｂは、ｐＨ８溶出緩衝液を用いてビーズから溶出させるか、またはトリプシン処理に供して活性化させた。
【００９４】
精製の原理及び工程は図１Ａ及び図１Ｂに図式的に示される。結果から、ＢｏＮＴ／Ｂは、粗細菌溶解物からこの方法を用いて効率的に精製することができ（図２Ａ）、最終タンパク質が高収量及び高純度であることを示した（図２Ｂ）。ＮＴＮＨＡ／Ｂ：ＢｏＮＴ／Ｂ複合体を含有する樹脂の画分をトリプシンにより媒介される切断に供した。図３Ａ及び図３Ｂに示される結果は、複合体のビーズにおいてＢｏＮＴを数時間以内で効率的に活性化させることができ、続いてビーズから溶出させて天然の活性型毒素を生成することができることを示す。
【００９５】
１つの血清型に特異的なＮＴＮＨＡを、その毒素の部分、特に受容体結合ドメインを含むキメラ毒素を精製するために使用できるかどうか検討した。受容体結合ドメインは、ＮＴＮＨＡとＢｏＮＴ間の相互作用の大部分を媒介する。図４に示される結果は、ＢｏＮＴ／Ｂ受容体結合ドメインを含有するハイブリッド毒素（ＢｏＮＴ／Ａ１Ｂ）を精製するための成功したＮＴＮＨＡ／Ｂの使用を示す。
【００９６】
これらの実験結果は、広く使用されている治療用毒素である、ＢｏＮＴ／Ａ（ＮＴＮＨＡ／Ａを用いて）及びＢｏＮＴ／Ｂを（ＮＴＮＨＡ／Ｂを用いて）精製するため、ＢｏＮＴの他の血清型を（適切なＮＴＮＨＡを用いて）精製するため、変異を含む組換えＢｏＮＴを精製するため、キメラＢｏＮＴを（受容体結合ドメインに結合するＮＴＮＨＡまたは設計された特異的なキメラＮＴＮＨＡタンパク質を用いて）精製するために使用することができる方法の概念の証明として役立つ。この方法の利点は、１）簡便なアフィニティー精製によって組換えで発現される天然のＮ末端及びＣ末端を有するＢｏＮＴを精製する能力、２）穏やかな緩衝液条件（ｐＨ６〜８）により毒素への任意の潜在的ダメージが最小限に抑えられる、３）特定のｐＨに依存する結合及び溶出により高純度の毒素が容易に得られ、さらなる精製の必要性が低くなること、４）ＮＴＮＨＡによる保護作用が、活性化工程中の活性化プロテアーゼによる非特異的切断を減少させること、及び５）プロテアーゼによる活性化後の毒素の溶出によりプロテアーゼを別々に除去する必要性が排除されること、である。
【００９７】
材料及び方法
タンパク質の発現及び精製。ＮＴＮＨＡ／Ｂは、ＧＳＴがＮＴＮＨＡ／Ｂタンパク質のＮ末端に融合されたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂ）としてＥ．Ｃｏｌｉで発現させ、ＢｏＮＴ／Ｂは、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグ（配列番号１）を有するＥ．Ｃｏｌｉで発現させた。細菌培養物（１Ｌ）を３７℃で増殖させ、６００ｎｍ（ＯＤ６００）での培養物の吸光度が約０．６ＡＵに達したときにイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（２５０μＭ）を添加してタンパク質発現を誘導した。次いで、培養物を一晩の発現（約１６時間）のために２０度の振盪培養器に移した。細菌を５５００×ｇでの遠心分離によって回収し、得られたペレットを精製まで凍結させた。
【００９８】
ＢｏＮＴ／Ｂペレットを解凍し、乾燥バクテリアペレット１ｇグラムあたり５ｍｌの結合緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に可溶化した。ＮＴＮＨＡ／Ｂペレットを解凍し、異なる結合緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に可溶化した。１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加してから、１５分間（３×５分、５０％出力）の氷上での超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）により溶解させた。次いで、粗溶解物を遠心分離（３０，０００×ｇ、１５分）により清澄化し、上清は０．４５μｍシリンジフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いて濾過した。
【００９９】
ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂの精製。結合緩衝液で平衡化した６００μＬのＰｉｅｒｃｅ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ａｇａｒｏｓｅビーズ（５０％スラリー、Ｔｈｅｒｍｏ）を約２０ｍＬのＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂ上清に添加し、４℃で１時間バッチ結合させた。ビーズを遠心分離（７００×ｇ）により回収し、３倍樹脂床容量の結合緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で２回洗浄した。精製したＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂの推定濃度は約０．６ｍｇ／ｍＬであった（ＢＣＡアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）。
【０１００】
ｐＨ依存性複合体形成、プロテアーゼ活性化、及び精製したＢｏＮＴの溶出。ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂを保有するアガロースビーズを、約５ｍＬの清澄化Ｅ．Ｃｏｌｉ溶解物のＢｏＮＴ／Ｂに添加し、揺動させているコニカルチューブ内で、４℃にて２時間バッチ結合させた。ビーズを（７００×ｇ）で回収し、３倍樹脂床容量の結合緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）で２回洗浄した。
【０１０１】
トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：１０のモル比でｐＨ６（ビーズ上で）にて添加し、ＮＴＮＨＡ結合毒素を最終容量５００μＬで活性化した。反応は室温にて回転プラットフォーム上で進行させ、その後の分析のために少量のアリコートをサンプリングすることにより４時間モニターした。樹脂を結合緩衝液で２回洗浄して、プロテアーゼ及び未結合の不純物を除去した。精製され活性化されたＢｏＮＴは、２倍樹脂容量の高ｐＨ緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶出された。
【０１０２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢ分析。全てのサンプル（還元剤のＤＴＴ有りまたは無し）１０μＬを９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。分離後、ゲルをクーマシー染色で染色するか、または標準的な免疫ブロッティング分析に供した。ヒトモノクローナル抗体を用いてＢｏＮＴ／Ｂを検出し、ポリクローナルウサギ抗体を用いてＢｏＮＴ／Ａ１Ｂキメラ毒素を検出した。
【０１０３】
実施例２
粗製細菌溶解物由来の組換えＢｏＮＴの容易で直接的な単離
ＢｏＮＴとＮＴＮＨＡ間の結合は、特異的な表面認識を形成する２つの分子上の多数のｐＨセンサーによって促進される（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。この結合複合体は、活性毒素を過酷な酸性環境から保護し、それによって活性毒素を目的地の細胞に到達させる。
【０１０４】
本実施例は、本明細書に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉで発現される組換え完全長ＢｏＮＴ（不活性ＢｏＮＴ／Ｂ、以後ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝と称する）を単離することの実行可能性を確認する。毒素単離を促進する複合体パートナーは、ＧＳＴ標識された、適合性の血清型のその組換え複合体パートナーであるＮＴＮＨＡ／Ｂである。ＧＳＴ標識ＮＴＮＨＡ−Ｂ分子及びＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝をＥ．ｃｏｌｉ宿主中で別々に発現させ、標準的な自動誘導法（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ２００５）を用いてタンパク質産生を達成した。ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ−Ｂ単離については、アガロース−グルタチオンビーズを用いた一工程のバッチ精製を、方法に記載されるように実施した。固定化されたＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ−Ｂは、約１週間４℃での短期〜中期間の貯蔵に対して安定であったが、以前に報告されているように（Ｓａｇａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、より長期間の貯蔵では自発的なニッキングが起こり得る。続いて、この試薬を、ＢｏＮＴ／ＢＲＹ及びキメラＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１をシンプルなワークフローで単離するために用いた（図６Ｂ）。ここで、アガロースビーズは、好ましい条件（例えば、ｐＨ６．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）下で粗溶解物から組換え毒素を引き離すためのベイトであった。精製スキームからの関連画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を図６Ｃに示す。溶出後の再生ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂは、別の精製サイクルで容易に使用することができ、新たなまたは代替の抽出物に由来する、より多くの適合性の毒素を単離する。溶出された完全長毒素は、ビーズ上の緩衝液交換時に複合体から選択的に放出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロット（ＷＢ）分析によって視覚化することができる（図７Ａ）。さらに、完全長（ＦＬ）毒素を単離するためのそのような穏やかな条件は、そのプロテアーゼ活性及びその細胞標的との結合における機能的役割をより保存しやすい。ＢｏＮＴ／Ｂに対する通常の神経受容体として、シナプトタグミン由来の標識ペプチドは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ蛍光異方性結合アッセイにおいて単離された完全長毒素と相互作用することが示されている（図７Ｂ）。
【０１０５】
外因性プロテアーゼによって効率的に活性化できる複合体化毒素
二本鎖（ＡＢ）毒素として、ＢｏＮＴは単一のポリペプチド鎖として発現され、これは活性化を受けて重鎖と軽鎖との間の１つのジスルフィド架橋によって連結される１つの機能的分子を生成する。外因性または内在性のプロテアーゼによる「ニッキング」は、ＬＣとＨＣ間の共有結合の架橋を維持する、２つの保存されたシステイン間のポリペプチド鎖を切断することで力価を改善することができ、最大力価に必要とされ得る（図６Ａ）。本実施例では、このようなプロテアーゼ（例えば、具体的には外因性プロテアーゼ）の添加を本明細書に記載の精製プロトコルワークフローに組み込むことができ、そしていくつかの実施形態において、活性毒素の回収を最大にすることを実証する。例えば、複合体化ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂ：ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝は、室温での穏やかな条件下で触媒量のトリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼによって切断され得、ニックの入った毒素は高ｐＨ緩衝液中で選択的に放出され得る。図８Ａ〜８Ｃは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する試料における、約５０ｋＤのプロテアーゼドメイン（ＬＣ）及び約１００ｋＤａのＨＣを放出する複合体化一本鎖ＢｏＮＴ／／Ｂ｛ＲＹ｝の活性化の経時変化を示す。より低いｐＨの結合条件及びより低いプロテアーゼ活性（Ｋａｓｓｅｒｒａ＆Ｌａｉｄｌｅｒ  １９６９、Ｊｅｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）は、毒素及び／またはＮＴＮＨＡの非特異的／過剰な分解からの保護的役割を果たす（図８Ｂ）。毒素のニッキングの純度及び量はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で視覚化することができるか、またはＷＢ分析によって検出することができる（図８Ａ及び図８Ｃ）。
【０１０６】
一般的なＮＴＮＨＡ血清型を用いて単離することができるキメラ組換え毒素
本実施例は、キメラ組換えボツリヌス神経毒素が、将来の生物製剤のための治療的土台として貢献し得る種々の標的を使用して、本明細書に記載されるような複合体をベースとした精製プロトコルを用いて精製されることを確認する。ＢｏＮＴの受容体結合ドメインは、ＮＴＮＨＡと最大の極性接触を媒介する（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。本実施例は、組換えボツリヌス神経毒素がＮＴＮＨＡとの複合体形成を介して精製され得ることを確認する。不活性ＢｏＮＴ／Ａ  ＬＣ、ＢｏＮＴ／Ａ  ＨＮ及びＢｏＮＴ／Ｂ  ＨＣから構築されたキメラ組換えタンパク質（ＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１）を実証実験に使用した。上記の同じ組換えＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂを用いて、ＮＴＮＨＡビーズ上のキメラ毒素の複合体化及び濃縮を、毒素の発現レベルが低いにもかかわらず検出することができた（図９）。キメラ毒素の清澄化溶解物は、多くの場合、固定化されたＮＴＮＨＡとの効率的な複合体形成を妨げる分解産物及び大きな不純物を含有した。そのため、ＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１溶解物を１回通過させてＮｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出させた後、アガロース樹脂上の固定化されたＮＴＮＨＡに曝露した。このキメラ毒素を用いたその後の活性化特性は、ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝の活性化特性と類似している可能性があるが、おそらく効率が異なる。
【０１０７】
考察
本実施例は、ＮＴＮＨＡ／Ｂを非共有結合性の前駆体複合体のパートナーとして使用する、組換えで発現したＢｏＮＴの単離を説明する。ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝及びＮＴＮＨＡ／Ｂはともに、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主で別々に過剰発現させた。ＮＴＮＨＡ／Ｂは、固体アガロース−グルタチオン樹脂に対する親和性部分として、そのＮ末端に付加されたＧＳＴタグを有する融合タンパク質として発現させた。ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝（及びキメラＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１）を、不活性化変異及びＣ末端Ｈｉｓ６Ｘタグを除いた野生型配列として発現させた。低ｐＨ緩衝液中での細菌溶解により、ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂを保有するアガロースビーズと共にインキュベートされた溶解物中に、これらの毒素は放出された。複合体形成後、固形媒体を何度も洗浄して不純物を除去し、その後、毒素を高ｐＨ緩衝液置換によって溶出するか、または外因性エンドプロテアーゼが樹脂結合複合体に用いられる追加の工程を介して活性化することができる。
【０１０８】
本実施例で実証された知見によって確認されるように、本開示は、穏やかな条件下で様々な供給源から活性型の治療用ＢｏＮＴを効率的に単離するための解決策を提供する。精製されたＢｏＮＴを単離、活性化及び溶出するために高められた方法論は、治療用ＢｏＮＴの大規模生産など、非常に有用であり得る。潜在的な利点には以下のこと、すなわち１）現行の条件と異なる穏やかな条件下での粗溶解物からの組換えＢｏＮＴの効率的な単離（Ｍａｌｉｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｄｏｎｏｖａｎ  ２００７）、２）不純物の大規模な洗浄及び複数のクロマトグラフィー工程を回避することが可能であるため、単一の精製スキームを使用して高純度の活性化毒素を製造することができること、３）固定化されたＮＴＮＨＡは、（一般的な精製後活性化とは対照的に）精製プロトコルに容易に組み込むことができる活性化工程において、毒素の非特異的切断から適切に保護することができること、が挙げられる。これにより、最終の活性化毒素の最終収量及び均一性を高めることができ、そして４）固定化されたＧＳＴ−ＮＴＮＨＡは、各サイクルの終わりにほとんど損失を伴わずに再生されるので、複数回の連続的な精製を行うことができ、そして５）このような方法論は、適合性の受容体結合ドメインを有するキメラ治療用毒素の単離に発展させることができる。
【０１０９】
材料及び方法
タンパク質の発現及び精製
ＮＴＮＨＡ／Ｂは、ｐＧＥＸベクター中でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂ）として発現させ、ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝及びＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１ＤＥ３）のｐＥＴ３２−ａベクターにＣ末端（Ｈｉｓ６ｘ）タグを用いて発現させた。細胞培養物（典型的には３００ｍＬ）は、３７℃でバッフル付き２Ｌフラスコにおいて、自己誘導培地（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ（商標）、ＵＫ）中で激しく振盪（＞２５０ＲＰＭ）させながら増殖させた。培養物が約０．６のＯＤに達したとき、細胞培養物を一晩発現（約１６時間）のために２０℃の振盪インキュベーターに移した。細胞を５５００×ｇでの遠心分離によって回収し、得られたペレットを精製まで−２０℃で凍結させた。
【０１１０】
ＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝細胞ペレットを解凍し、５ｍｌ／ｇ乾燥細胞ペレットを有する結合緩衝液（５０ｍＭ  ＭＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）に可溶化した。ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂ細胞を解凍し、ＴＢＳ結合緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に可溶化した。可溶化細胞に０．１ｍＭの最終濃度でフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加した後に、氷上での１５分間（３×５分）、３０％出力の超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）により溶解させた。次いで、粗溶解物を遠心分離（３０，０００×ｇ、１５分間）により清澄化し、上清は０．４５μｍシリンジフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いて濾過した。
【０１１１】
ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂの精製
６００μＬのＰｉｅｒｃｅ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ａｇａｒｏｓｅビーズ（５０％スラリー、Ｔｈｅｒｍｏ）を結合緩衝液で平衡化し、約２０ｍＬのＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂ上清に添加して穏やかなロッキングプラットフォーム上で４℃にて１時間バッチ結合させた。ビーズを遠心分離（７００×ｇ）によって回収し、３倍樹脂床容量の結合緩衝液（１×ＴＢＳ）で２回洗浄した。精製されたＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂの推定濃度は、典型的に約０．５ｍｇ／ｍＬであった（ＢＣＡアッセイ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）。
【０１１２】
精製されたＢｏＮＴの結合、活性化、及び溶出
ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂを保有するアガロースビーズを、１０〜２５ｍＬのＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝またはＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１清澄化溶解物（ＭＥＳ、ｐＨ６中）緩衝液に添加することにより、ロッキングプラットフォーム上の５０ｍＬコニカルチューブの中で４℃にて２時間バッチ結合を進行させた。ビーズを（７００×ｇ）で回収し、３倍樹脂床容量の結合緩衝液（ＭＥＳ、ｐＨ６）で２回洗浄した。活性化が望ましくない場合、結合した精製毒素は以下に記載されるように、この段階で溶出されても良い。
【０１１３】
トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ｐＨ６（ビーズ上）で１：１０のエンドプロテイナーゼ：ＧＳＴ−ＮＴＮＨＡ／Ｂのモル比にて添加し、結合した毒素を５００〜１０００μＬの最終容量で活性化した。反応は室温にて、回転（転回）プラットフォーム上で進行させ、その後の分析のために少量の一定分量をサンプリングすることにより、（図８Ａ及び図８Ｃのように２〜４時間、または図８Ｂのように４℃で一晩）モニターした。樹脂を結合緩衝液で２回洗浄して、プロテアーゼ及び不純物を除去した。精製及び活性化したＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝は、高ｐＨ緩衝液（ＴＢＳ：５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）の２つの樹脂容量の画分で溶出させた。
【０１１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢ分析
（還元剤ＤＴＴまたはβＭＥを含むまたは含まない）全てのサンプル１０μＬを８〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。分離後、ゲルはクーマシー染色で染色するか、または標準的なウエスタンブロッティング手順に供した。モノクローナルウサギ抗体（１：５０００）を用いてＢｏＮＴ／Ｂ｛ＲＹ｝を検出し、そして、ＢｏＮＴ／Ａに対して産生させたポリクローナルウサギ抗体（１：２０００）を用いてＢｏＮＴ／Ａ１｛ＲＹ｝Ｂ１を検出した。
【０１１５】
蛍光偏光測定
ヒトシナプトタグミン１（Ｓｙｔ１）由来ペプチド（ＡＡ３３〜５３）を、Ｎ末端ＦＩＴＣ標識（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を用いて合成し、結合実験における受容体として５０〜１００ｎＭで使用した。溶出された完全長毒素をＶｉｖａｓｐｉｎ６ろ過ユニット（１０Ｋ  ＭＷＣＯ、ＧＥ）で濃縮した。結合実験（５０μＬ）は、フィルターベースのプレートリーダー（励起４８５ｎｍ／発光５２０ｎｍ）を用いて黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で測定した。ＢｏＮＴ／Ａ及びＢｏＮＴ／Ｂ  Ｈｃを別々に発現させて精製し、それぞれ陰性対照及び陽性対照として供した。
【０１１６】
参考文献
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2019518447.tif 000005
2019518447.tif 000006
【図１】
2019518447.tif 000008
【図２】
2019518447.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019518447.tif 000022
2019518447.tif 000023
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