(57)【要約】結合体化免疫グロブリンおよび微生物のトランスグルタミナーゼを使用して結合体化免疫グロブリンを生成するための方法が、本明細書に提供される。結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質を含む機能的作用物質とを接触させるステップであって、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、アシルドナー基質は、グルタミン残基を含み、機能的作用物質は、治療剤または診断剤である、ステップを包含し、微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基を、機能的作用物質上のアシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する、方法が本明細書に開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、該方法は、
免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質を含む機能的作用物質とを接触させるステップであって、
ａ）ここで該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで該操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、
ｂ）ここで該アシルドナー基質は、グルタミン残基を含み、そして
ｃ）ここで該機能的作用物質は、治療剤または診断剤である、
ステップを包含し、
ここで該微生物のトランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の該操作されたリジン残基を、該機能的作用物質上の該アシルドナー基質の該グルタミン残基に結合体化し、それによって該結合体化免疫グロブリンを生成する、方法。
【請求項２】
結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、該方法は、
ｉ）免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質とを接触させるステップであって、
ａ）ここで該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで該操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、そして
ｂ）ここで該アシルドナー基質は、グルタミン残基および反応性基を含み、ここで該微生物のトランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の該操作されたリジン残基を、該アシルドナー基質の該グルタミン残基に結合体化する、
ステップ、ならびに
ｉｉ）機能的作用物質を該アシルドナー基質の該反応性基に結合体化するステップであって、ここで該機能的作用物質は、治療剤または診断剤であり、それによって該結合体化免疫グロブリンを生成する、ステップ、
を包含する方法。
【請求項３】
前記アシルドナー基質の前記反応性基は、クリックケミストリーによって前記機能的作用物質に結合体化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
リジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、以下：
前記免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分の重鎖上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）、セリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）、ロイシン１９３（Ｌ１９３Ｋ）、アスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、メチオニン２５２（Ｍ２５２Ｋ）、アスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）、もしくはプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）、
該免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のκ軽鎖上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）もしくはセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）、または
該免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のλ軽鎖上のグルタミン酸２１３（Ｅ２１３Ｋ）、
からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基をさらに含み、ここで該アミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ末端に４４８位において付加された前記アミノ酸残基は、ロイシンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記リジン残基挿入は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１９１とセリン１９２との間、またはセリン１９２とロイシン１９３との間に挿入されたリジン残基である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）であり、ここで、リジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、プロリン２２８（Ｐ２２８Ｋ）、プロリン２３０（Ｐ２３０Ｋ）、およびグルタミン酸２３３（Ｅ２３３Ｋ）からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｆａｂは、ヒンジ領域全体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｆａｂは、短縮型ヒンジ領域を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第２の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで該第２の操作されたリジン残基は、第２のリジン残基挿入または第２のリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで前記微生物のトランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の該第２の操作されたリジン残基を、前記アシルドナー基質の前記グルタミン残基に結合体化する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、そして前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基をさらに含み、ここで該アミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃ末端に４４８位において付加された前記アミノ酸残基は、ロイシンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第３の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで該第３の操作されたリジン残基は、第３のリジン残基挿入または第３のリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで前記微生物のトランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の該第３の操作されたリジン残基を、前記アシルドナー基質の前記グルタミン残基に結合体化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、そして前記第３の操作されたリジン残基に変異された前記第３の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第４の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで該第４の操作されたリジン残基は、第４のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第４の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで前記微生物のトランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の該第４の操作されたリジン残基を、前記アシルドナー基質の前記グルタミン残基に結合体化する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、前記第３の操作されたリジン残基に変異された前記第３の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）であり、前記第４の操作されたリジン残基に変異された前記第４の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基ではない、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、
非酸性アミノ酸残基挿入、または
非酸性アミノ酸残基に変異された天然酸性アミノ酸残基
である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、
アミノ酸残基挿入であって、ここで該アミノ酸残基挿入は、非酸性アミノ酸残基挿入および非プロリン残基挿入であるアミノ酸残基挿入、または
非酸性アミノ酸残基および非プロリン残基挿入に変異された、天然酸性アミノ酸残基または天然プロリン残基
である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記非酸性アミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記非酸性アミノ酸残基挿入は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン挿入である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記非酸性アミノ酸および非プロリン残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記天然酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、そのＣ末端に４４８位において付加された少なくとも１個のアミノ酸残基をさらに含む重鎖を含み、ここで該少なくとも１個のアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｃ末端に４４８位において付加された前記少なくとも１個のアミノ酸残基は、ロイシンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、システイン２１４の後ろに１〜４個のさらなるアミノ酸の挿入を含む軽鎖を含み、ここで、前記リジン残基挿入は、該１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されたリジン残基であり、ここで、ロイシン残基は、該リジン残基の後ろに挿入されている、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
システイン２１４の後ろの１〜４個のさらなるアミノ酸の前記挿入、該１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されている前記リジン残基、および該リジン残基の後ろに挿入されている前記ロイシン残基は、ＧＫＬ、ＧＧＫＬ、ＧＧＳＫＬ、およびＧＧＳＧＫＬからなる群より選択される配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、１つの式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｙ）        （Ｉ）
（Ｙ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＩ）
に従い、ここで
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そしてここで各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０〜５の整数であり；
ｎは、０〜５の整数であり；そして
Ｙは、機能的作用物質である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；ｎは、０、１、２、３、４または５である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、０である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（ＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記機能的作用物質Ｙは、オーリスタチンＦである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記アシルドナー基質は、１つの式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）        （ＩＩＩ）
（Ｘ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＶ）
に従い、ここで
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そして各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されていてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０〜５の整数であり；
ｎは、０〜５の整数であり；そして
Ｘは、反応性基である、
請求項２に記載の方法。
【請求項４１】
前記アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ここで各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；そしてｎは、０、１、２、３、４、または５である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、１個またはこれより多くのＬは、アミノ酸である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ｍは、１であり；そしてｎは、０である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記アシルドナー基質は、式（ＩＶ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）、
【化５】
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（ジベンゾシクロオクチン；ＤＢＣＯ）、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジン、およびアルデヒドからなる群より選択される反応性基である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療剤は、抗体またはその抗原結合部分、化学療法剤、薬物剤、放射性薬剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質、低分子、核酸、またはポリペプチドである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４８】
前記診断剤は、発蛍光団、蛍光色素、放射性核種、または酵素である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４９】
前記微生物のトランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ微生物のトランスグルタミナーゼである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＤもしくはＩｇＥ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分、またはヒト化免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、キメラ免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分、または非ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記機能的作用物質  対  免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の比は、１：１〜１００：１または１：１〜２００：１である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、機能的作用物質とを含む結合体化免疫グロブリンであって、
ａ）ここで該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで該操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、
ｂ）該機能的作用物質はアシルドナー基質を含み、ここで該アシルドナー基質は、グルタミン残基を含み、そして
ｃ）該機能的作用物質は、治療剤または診断剤であり、
ここで該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の該操作されたリジン残基は、該機能的作用物質の該アシルドナー基質の該グルタミン残基に結合体化されている、結合体化免疫グロブリン。
【請求項６０】
免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、機能的作用物質とを含む結合体化免疫グロブリンであって、
ａ）ここで該免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで該操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、そして
ｂ）該操作されたリジン残基はアシルドナー基質上のグルタミン残基に結合体化されており、ここで該アシルドナー基質は、さらに反応性基を含み、
ｃ）該反応性基は機能的作用物質に結合体化されており、ここで該機能的作用物質は、治療剤または診断剤である、
結合体化免疫グロブリン。
【請求項６１】
リジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、以下：
前記免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分の重鎖上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）、セリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）、ロイシン１９３（Ｌ１９３Ｋ）、アスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、メチオニン２５２（Ｍ２５２Ｋ）、アスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）、もしくはプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）、
該免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のκ軽鎖上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）もしくはセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）、または
該免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のλ軽鎖上のグルタミン酸２１３（Ｅ２１３Ｋ）、
からなる群より選択される、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６２】
前記重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基をさらに含み、ここで該アミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項６１に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６３】
前記Ｃ末端に４４８位において付加された少なくとも１つのアミノ酸残基は、ロイシンである、請求項６２に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６４】
前記リジン残基挿入は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１９１とセリン１９２との間、またはセリン１９２とロイシン１９３との間に挿入されたリジン残基である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６５】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）であり、ここで、リジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、プロリン２２８（Ｐ２２８Ｋ）、プロリン２３０（Ｐ２３０Ｋ）、およびグルタミン酸２３３（Ｅ２３３Ｋ）からなる群より選択される、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６６】
前記Ｆａｂは、ヒンジ領域全体を含む、請求項６５に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６７】
前記Ｆａｂは、短縮型ヒンジ領域を含む、請求項６５に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６８】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第２の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで該第２の操作されたリジン残基は、第２のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで該第２の操作されたリジン残基は、前記アシルドナー基質の前記グルタミン残基に結合体化されている、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項６９】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である、請求項６８に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７０】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、そして前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）である、請求項６８に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７１】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である、請求項６８に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７２】
前記重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加された少なくとも１つのアミノ酸残基をさらに含み、ここで該救案くとも１つのアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項７０または請求項７１に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７３】
前記Ｃ末端に４４８位において付加された前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、ロイシンである、請求項７２に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７４】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第３の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで該第３の操作されたリジン残基は、第３のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで該第３の操作されたリジン残基は、前記アシルドナー基質の前記グルタミン残基に結合体化されている、請求項６９に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７５】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、そして前記第３の操作されたリジン残基に変異された前記第３の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である、請求項７４に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７６】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第４の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで該第４の操作されたリジン残基は、第４のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第４の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで該第４の操作されたリジン残基は、前記アシルドナー基質の前記グルタミン残基に結合体化されている、請求項７４に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７７】
前記操作されたリジン残基に変異された前記天然アミノ酸残基は、前記免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、前記第２の操作されたリジン残基に変異された前記第２の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、前記第３の操作されたリジン残基に変異された前記第３の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）であり、前記第４の操作されたリジン残基に変異された前記第４の天然アミノ酸残基は、該免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）である、請求項７６に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７８】
前記操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項７９】
前記操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基ではない、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８０】
前記操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、
非酸性アミノ酸残基挿入、または
非酸性アミノ酸残基に変異された天然酸性アミノ酸残基
である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８１】
前記操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、
アミノ酸残基挿入であって、ここで該アミノ酸残基挿入は、非酸性アミノ酸残基挿入および非プロリン残基挿入であるアミノ酸残基挿入、または
非酸性アミノ酸残基および非プロリン残基挿入に変異された、天然酸性アミノ酸残基または天然プロリン残基
である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８２】
前記非酸性アミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである、請求項８０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８３】
前記非酸性アミノ酸残基挿入は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン挿入である、請求項８０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８４】
前記非酸性アミノ酸および非プロリン残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである、請求項８１に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８５】
前記天然酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項８０または請求項８１に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８６】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、そのＣ末端に４４８位において付加された少なくとも１個のアミノ酸残基をさらに含む重鎖を含み、ここで該少なくとも１個のアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない、請求項５９または６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８７】
前記Ｃ末端に４４８位において付加された前記少なくとも１個のアミノ酸残基は、ロイシンである、請求項８６に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８８】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、システイン２１４の後ろに１〜４個のさらなるアミノ酸の挿入を含む軽鎖を含み、ここで、前記リジン残基挿入は、該１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されたリジン残基であり、ここで、ロイシン残基は、該リジン残基の後ろに挿入されている、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項８９】
システイン２１４の後ろの１〜４個のさらなるアミノ酸の前記挿入、該１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されている前記リジン残基、および該リジン残基の後ろに挿入されている前記ロイシン残基は、ＧＫＬ、ＧＧＫＬ、ＧＧＳＫＬ、およびＧＧＳＧＫＬからなる群より選択される配列を含む、請求項８８に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９０】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、１つの式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｙ）        （Ｉ）
（Ｙ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＩ）
に従い、ここで
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そしてここで各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０〜５の整数であり；
ｎは、０〜５の整数であり；そして
Ｙは、機能的作用物質である、
請求項５９に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９１】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；ｎは、０、１、２、３、４または５である、請求項９０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９２】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である、請求項９０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９３】
Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、０である、請求項９２に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９４】
Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である、請求項９２に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９５】
前記アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（ＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである、請求項９０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９６】
前記機能的作用物質Ｙは、オーリスタチンＦである、請求項９０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９７】
前記アシルドナー基質は、１つの式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）        （ＩＩＩ）
（Ｘ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＶ）
に従い、ここで
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そして各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されていてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０〜５の整数であり；
ｎは、０〜５の整数であり；そして
Ｘは、反応性基である、
請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９８】
前記アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ここで各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；そしてｎは、０、１、２、３、４、または５である、請求項９７に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項９９】
前記アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、１個またはこれより多くのＬは、アミノ酸である、請求項９７に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１００】
Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である、請求項９９に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０１】
ｍは、１であり；そしてｎは、０である、請求項９９に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０２】
前記アシルドナー基質は、式（ＩＶ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである、請求項９７に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０３】
Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）、
【化６】
2019525897.tif 000061
（ジベンゾシクロオクチン；ＤＢＣＯ）、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジン、およびアルデヒドからなる群より選択される反応性基である、請求項９７に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０４】
前記治療剤は、抗体またはその抗原結合部分、化学療法剤、薬物剤、放射性薬剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質、低分子、核酸、またはポリペプチドである、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０５】
前記診断剤は、発蛍光団、蛍光色素、放射性核種、または酵素である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０６】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０７】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０８】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１０９】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＤもしくはＩｇＥ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１０】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）である、請求項５９または請求項６０に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１１】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分、またはヒト化免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である、請求項５９〜１１０のいずれか１項に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１２】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、キメラ免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分、または非ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である、請求項５９〜１１０のいずれか１項に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１３】
前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、請求項５９〜１１０のいずれか１項に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１４】
前記機能的作用物質  対  免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の比は、１：１〜１００：１または１：１〜２００：１である、請求項５９〜１１０のいずれかに記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１５】
前記機能的作用物質は、抗体またはその抗原結合部分であり、そしてここで前記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分、および該機能的作用物質は、同じ抗原に結合するか、または異なる抗原に結合する、請求項５８または請求項５９に記載の結合体化免疫グロブリン。
【請求項１１６】
請求項５９〜１１５のいずれか１項に記載の結合体化免疫グロブリン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、医薬組成物。
【請求項１１７】
請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法によって生成される、結合体化免疫グロブリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年６月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／３４８，４１０号に対する優先権を主張し、その内容全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、本出願とともに現在提出されている配列表を含み、そしてこの配列表は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【０００３】
技術分野
リジン結合体化免疫グロブリンおよびその作製法が本明細書で提供される。
【背景技術】
【０００４】
モノクローナル抗体の有用性は、基礎研究から治療適用および診断適用まで拡がっている。抗体を機能的作用物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）に結合体化する能力は、それらの機能性をさらに大きく拡げる。結合体化抗体の製造は通常、リンカー、薬物、または機能的作用物質を、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）上の反応性リジンシステイン残基に結合体化することを含む。Ｄｅｏｎａｒａｉｎ，ら、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｏｒｍａｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （２０１５），  １０（５）：  ４６３−４８１を参照のこと。リジン結合体化は、代表的には、スクシンイミド（ＮＨＳ）ベースのまたはイソチオシアネートベースの化学反応によって媒介される。システインベースの結合体化は、鎖間ジスルフィド結合のうちのいくつかを破壊するために抗体の部分的還元を要し、それによって遊離チオール側鎖が作られる。次いで、チオール反応性機能的作用物質が、その抗体上の遊離チオール基と反応して、抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）を生成し得る。これらの方法は両方とも、薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）の分布およびランダムな位置での薬物改変を有するＡＤＣの不均一な混合物をもたらす複数のリジンまたはシステインの改変を生じる。
【０００５】
規定のＤＡＲを有する均一なＡＤＣ生成物を生成する方法として部位特異的結合体化技術を利用する近年の推奨は、不対システインの操作、非天然アミノ酸の組み込み、および酵素による部位特異的改変を含むいくつかの方法をもたらした。これらの方法は、均一な生成物を生成する一方で、それらには各それぞれの欠点がある。システインベースの結合体化は、キャップ形成システイン、グルタチオン、またはさらには不対システインから軽鎖を除去する追加のステップを要する。例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａら、「Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｄｒｕｇ  ｔｏ  ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｄｅｘ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （２００８）  ２６：９２５−９３２；Ｃｈｅｎら、「Ｃｈａｒｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ」、ＭＡｂｓ  （２００９）  １（６）：  ５６３−５７１；  Ｇｏｍｅｚら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，  ｐＨ，  ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ，  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  （２０１０），  ２６：  １４３８−１４４５を参照のこと。さらに、システインベースの結合体に現在使用されるマレイミドベースの化学的性質の血清不安定性は、有効性の喪失またはオフターゲット毒性に関する高まりつつある懸念を示した。Ａｌｌｅｙら、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００８）  １９（３）：  ７５９−７６５；  Ｓｈｅｎら、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （２０１２）  ３０：  １８４−１８９。非天然アミノ酸の組み込みは、遺伝的に改変された細胞ベースの系または無細胞系のいずれかにおける発現を要する。Ｈａｌｌａｍ，ら、「Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （２０１４）  ６（１１）：  １３０９−１３２４。さらに、異常なアミノ酸の存在は、患者における免疫原性応答を誘発し得る。しかし、酵素による部位特異的改変は、抗体配列の中の天然の野生型アミノ酸を潜在的に利用し得、それによって、免疫原性の機会を最小限にし得る。さらに、タンパク質改変酵素によって代表的には形成される翻訳後結合は、非常に安定である。
【０００６】
タンパク質の酵素による部位特異的改変は、グルタミンのγ−カルボキシアミド基（アシルドナー）とリジンのε−アミノ基（アシルアクセプター）との間の安定なイソペプチド結合の形成を触媒するトランスグルタミナーゼといわれるタンパク質のファミリーを使用して調査された（図１を参照のこと）（例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  （２００４）  ６４：  ４７−４５４；  Ｓｔｒｏｐ，  「Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （２０１４）  ２５（５）：  ８５５−８６２；  Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋら、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ」、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （２０１４）  ５９：２４１−２５０を参照のこと）。近年になって、いくつかのグループが、ＡＤＣを生成する手段としてトランスグルタミナーゼの利用を調査している（例えば、Ｊｏｓｔｅｎら、「Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  （２０００）  ２４０：４７−５４；  Ｍｉｎｄｔ  ら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＩｇＧ１  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｉａ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００８）  １９（１）：  ２７１−２７８）；  Ｊｅｇｅｒら、「Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ」、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  （２０１０）  ４９：  ９９９５−９９９７；  Ｓｔｒｏｐら、「Ｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｍａｔｔｅｒｓ：  Ｓｉｔｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  （２０１３）  ２０（２）：１６１−１６７；  Ｄｅｎｎｌｅｒら、「Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｈｅｍｏ−Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｙｉｅｌｄｓ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０１４）  ２５（３）：  ５６９−５７８；  Ｓｉｅｇｍｕｎｄら、「Ｌｏｃｋｅｄ  ｂｙ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ａ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  Ｔａｇ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉ���  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  （２０１５）  ５４（４５）：１３４２０−１３４２４を参照のこと）。トランスグルタミナーゼは細菌からヒトまでの範囲に及ぶ生物において見出され、その酵素は、構造的にかつ機能的に関連するが、その各々は、特異的細胞プロセスに関与する。細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓから単離された微生物のトランスグルタミナーゼ（微生物のトランスグルタミナーゼ）は、種々の用途のためタンパク質を一緒に架橋するために食品産業全体にわたって広く使用されてきた。その低製造コストの他に、広い範囲のｐＨ、塩、および温度条件下で機能するその能力に起因して、それは、魅力的な結合体化技術である。
【０００７】
２０年を超える研究にも拘わらず、微生物のトランスグルタミナーゼの基質特異性は、明らかに規定されていない。一般に、疎水性または正に荷電した隣接する残基を有する露出したループ上のグルタミンまたはリジンは、好まれる傾向にある。Ｔａｇｕｃｈｉら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０００）  １２８：４１５−４２５；  Ｓｕｇｉｍｕｒａら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｙ」、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  （２００８）  ４７７：３７９−３８３；  Ｔａｇａｍｉら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  Ｓｅｌ．  （２００９）  ２２：７４７−７５２を参照のこと。アシルドナーグルタミンの状況は、アシルアクセプターリジンより重要であることが見出されている。例えば、Ｏｈｔｓｕｋａら、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｍｉｎｅｓ」、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  （２０００）  ４８：  ６２３０−６２３３；  Ｏｈｔｓｕｋａら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａｃｙｌ  ｄｏｎｏｒｓ」、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （２０００）  ６４：  ２６０８−２６１３；  Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｂｒｏａｄ  ａｃｙｌ−ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０１３）  ９８：２１９−２３０を参照のこと。実際に、最小限のアシルドナー基質は、Ｎ末端Ｎ−カルボキシベンジルオキシ（ｃａｒｂｏｘｙｂｅｎｚｙｌｏｘｌ）（ＣＢＺ）基、続いて、グルタミンおよびＣ末端グリシン（ＣＢＺ−Ｌ−グルタミニルグリシンまたはＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ）を要する一方で、最小限のアシルアクセプターは、アンモニアである。
【０００８】
微生物のトランスグルタミナーゼによるアシルアクセプターアミンに対するより低い特異性に起因して、研究は、これまでのところ、抗体グルタミン残基のアミド基転移に主に焦点が当てられてきた。上記で言及されるＪｏｓｔｅｎら、Ｍｉｎｄｔら、Ｊｅｇｅｒら、Ｓｔｒｏｐら、Ｄｅｎｎｌｅｒら、およびＳｉｅｇｍｕｎｄらを参照のこと。アシルアクセプター基質を使用する抗体のｍＴＧａｓｅ媒介性ビオチン化を記載する先の報告（Ｊｏｓｔｅｎら  ２０００）とは対照的に、いくつかのグループは近年、同じまたは類似の基質による野生型抗体のｍＴＧａｓｅ改変がほとんどまたは全くないことを示した。これらのデータにより、溶媒に露出されたグルタミンの量にも拘わらず、適切な状況においてｍＴＧａｓｅによってアミド基転移されなかったことが確認された（Ｍｉｎｄｔら  ２００８；  Ｊｅｇｅｒら  ２０１０；  Ｓｔｒｏｐら  ２０１３）。
【０００９】
アミンドナーベースの基質を利用して、リジンをアミド基転移することは、ＩｇＧの表面上の複数の反応性リジンに起因して、不均一なＡＤＣ生成物を生じ得ることも推測された（Ｊｏｓｔｅｎら  ２０００；  Ｊｅｇｅｒら  ２０１０）。ヒトＩｇＧは、平均８０個のリジンから構成され、そのうちの８０〜９０％は、溶媒に露出されると推測され（Ｇａｕｔｉｅｒら，  「Ｌｙｓｉｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧｓ  Ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｏｍ−Ｕｐ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  （２０１５）  １５（１６）：２７５６−２７６５；データは示さず）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のＣ末端コドンはリジンである（Ｅｌｌｉｓｏｎら，  ＤＮＡ  （１９８１）  １：１１−１８；  Ｅｌｌｉｓｏｎら  （「Ｅｌｌｉｓｏｎら  ２」），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８２）  ７９：１９８４−１９８８；  Ｅｌｌｉｓｏｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  （１９８２）  １０：４０７１−４０７９）。しかし、血清由来ＩｇＧは、リジンを欠く（Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９８０）  １２５：１０４８−１０５４；  Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９６９）  ６３：７８−８５；  Ｆｒａｎｇｉｏｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９８０）  １９：４３０４−４３０８；  Ｐｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （１９７０）  １１７：３３−４７）．    同じことが、ＩｇＤについて観察されている（Ｗｈｉｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８５）  ２２８：７３３−７３７；  Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８１）  ７８：５０４−５０８；  Ｓｈｉｎｏｄａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８１）  ７８：７８５−７８９）。ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ１の組換え発現はまた、Ｃ末端Ｌｙｓ４４７を欠くタンパク質を生じる（Ｅｌｌｉｓｏｎら；  Ｈａｒｒｉｓら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９９０）  １９４：６１１−６２０；  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ａ  （１９９５）  ７０５：１２９−１３４；  Ｄｉｃｋら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  （２００８）  １００：１１３２−１１４３）。
【００１０】
今日まで、当業者は、アミンドナーベースの基質を利用して、リジンをアミド基転移することが、ＩｇＧの表面上の反応性リジンの過剰に起因して不均一なＡＤＣ生成物を生じ得ると考え（ＪｏｓｔｅｎらおよびＪｅｇｅｒら）、従って、アミンドナーベースの基質を使用して、免疫グロブリン上のリジン残基をアミド基転移させることが発見された。
【００１１】
従って、推定可能な結合体化率を有する結合体を作製するために、免疫グロブリンの酵素による部位特異的改変が必要である。これは、比較的一致する（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ＤＡＲを有するＡＤＣの作製を可能にする。
引用リスト
非特許文献
【表Ａ−１】
2019525897.tif 000002
【表Ａ−２】
2019525897.tif 000003
【表Ａ−３】
2019525897.tif 000004
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｄｅｏｎａｒａｉｎ，ら、「Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｏｒｍａｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  （２０１５），  １０（５）：  ４６３−４８１
【非特許文献２】Ｊｕｎｕｔｕｌａら、「Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｄｒｕｇ  ｔｏ  ａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｄｅｘ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  （２００８）  ２６：９２５−９３２
【非特許文献３】Ｃｈｅｎら、「Ｃｈａｒｇｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ」、ＭＡｂｓ  （２００９）  １（６）：  ５６３−５７１
【非特許文献４】Ｇｏｍｅｚら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，  ｐＨ，  ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ，  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  （２０１０），  ２６：  １４３８−１４４５
【非特許文献５】Ａｌｌｅｙら、「Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２００８）  １９（３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は驚くべきことに、操作されたリジン残基が免疫グロブリンまたはその抗原結合部分へと導入された場合に、微生物のトランスグルタミナーゼによる野生型免疫グロブリンのリジンの改変が観察されなかったが、微生物のトランスグルタミナーゼは、アシルアクセプターとして操作されたリジン残基を利用できたことを開示する。驚くべきことに、微生物のトランスグルタミナーゼを使用する、操作されたリジン残基の結合体化は、結合体化された機能的作用物質の部位特異的かつ推定可能な組み込みをもたらす。さらに、定常領域へのリジン残基の操作は、その可変領域および結合特異性にも拘わらず、任意の免疫グロブリンまたはその抗原結合部分への広い適用可能性を有する。
【００１４】
一局面において、結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、方法は、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質を含む機能的作用物質とを接触させるステップであって、ここで免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、ここでアシルドナー基質は、グルタミン残基を含み、そしてここで機能的作用物質は、治療剤または診断剤である、ステップを包含し、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基を、機能的作用物質上のアシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化し、それによって結合体化免疫グロブリンを生成する、方法が本明細書に開示される。
【００１５】
別の一局面において、結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、方法は、  ｉ）免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質とを接触させるステップであって、ここで免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、そしてここでアシルドナー基質は、グルタミン残基および反応性基を含み、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する、ステップ、ならびにｉｉ）機能的作用物質をアシルドナー基質の反応性基に結合体化するステップであって、ここで機能的作用物質は、治療剤または診断剤であり、それによって結合体化免疫グロブリンを生成する、ステップ、を包含する方法が、本明細書に開示される。一実施形態において、操作されたリジン残基は、重鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、重鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、軽鎖に存在する。別の実施形態において、操作されたリジン残基は、軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、κ軽鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、κ軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、λ軽鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、λ軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、可変領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、可変領域に存在しない。
【００１６】
一実施形態において、アシルドナー基質の反応性基は、クリックケミストリーによって機能的作用物質に結合体化される。
【００１７】
一実施形態において、リジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、以下：免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分の重鎖上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）、セリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）、ロイシン１９３（Ｌ１９３Ｋ）、アスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、メチオニン２５２（Ｍ２５２Ｋ）、アスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）、もしくはプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）、免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のκ軽鎖上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）もしくはセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）、または免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のλ軽鎖上のグルタミン酸２１３（Ｅ２１３Ｋ）、からなる群より選択される。一実施形態において、重鎖（変異前）は、配列番号１８として示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、κ軽鎖（変異前）は、配列番号１９として示されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、λ軽鎖（変異前）は、配列番号２０として示される配列を含む。
【００１８】
一実施形態において、重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基をさらに含み、ここでアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。さらなる実施形態において、Ｃ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００１９】
一実施形態において、リジン残基挿入は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１９１とセリン１９２との間、またはセリン１９２とロイシン１９３との間に挿入されたリジン残基である。
【００２０】
一実施形態において、免疫グロブリンは、抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）であり、ここで、リジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、プロリン２２８（Ｐ２２８Ｋ）、プロリン２３０（Ｐ２３０Ｋ）、およびグルタミン酸２３３（Ｅ２３３Ｋ）からなる群より選択される。別の実施形態において、Ｆａｂ’は、ヒンジ領域全体を含む。別の実施形態において、Ｆａｂ’は、短縮型ヒンジ領域を含む。
【００２１】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第２の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで第２の操作されたリジン残基は、第２のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の第２の操作されたリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する。別の実施形態において、操作されたリジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である。別の実施形態において、操作されたリジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、そして第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）である。さらに別の実施形態において、操作されたリジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である。さらなる実施形態において、重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基をさらに含み、ここでアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。さらなる一局面において、Ｃ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００２２】
一実施形態において、免疫グロブリンは、第３の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで第３の操作されたリジン残基は、第３のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の第３の操作されたリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する。一実施形態において、操作されたリジン残基に変異された第１の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、そして第３の操作されたリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である。
【００２３】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第４の操作されたリジン残基をさらに含み、ここで第４の操作されたリジン残基は、第４のリジン残基挿入またはリジン残基に変異された第４の天然アミノ酸残基であり、そして、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の第４の操作されたリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する。別の実施形態において、操作されたリジン残基に変異された第１の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、第３の操作されたリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）であり、第４の操作されたリジン残基に変異された第４の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）である。
【００２４】
一実施形態において、操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。別の実施形態において、操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基ではない。別の実施形態において、操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基を、プロリンまたは酸性アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸へと変異させることおよび操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基を、酸性アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸へと変異させることにより、操作されたアシルアクセプターのリジン部位に関する最適な配列が提供される。
【００２５】
一実施形態において、操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、非酸性アミノ酸残基挿入、または非酸性アミノ酸残基に変異された天然酸性アミノ酸残基である。一実施形態において、操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、アミノ酸残基挿入であって、ここでアミノ酸残基挿入は、非酸性アミノ酸残基挿入および非プロリン残基挿入であるアミノ酸残基挿入、または非酸性アミノ酸残基および非プロリン残基挿入に変異された、天然酸性アミノ酸残基または天然プロリン残基である。一実施形態において、非酸性アミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである。一実施形態において、非酸性アミノ酸残基挿入は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン挿入である。一実施形態において、非酸性アミノ酸および非プロリン残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである。一実施形態において、天然酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【００２６】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、そのＣ末端に４４８位において付加された少なくとも１個のアミノ酸残基をさらに含む重鎖を含み、ここで少なくとも１個のアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。さらなる実施形態において、Ｃ末端に４４８位において付加された少なくとも１個のアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００２７】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、システイン２１４の後ろに１〜４個のさらなるアミノ酸の挿入を含む軽鎖を含み、ここで、リジン残基挿入は、１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されたリジン残基であり、ここで、ロイシン残基は、リジン残基の後ろに挿入されている。さらなる実施形態において、システイン２１４の後ろの１〜４個のさらなるアミノ酸の挿入、１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されているリジン残基、およびリジン残基の後ろに挿入されているロイシン残基は、ＧＫＬ、ＧＧＫＬ、ＧＧＳＫＬ、およびＧＧＳＧＫＬからなる群より選択される配列を含む。一実施形態において、上記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、システイン２１４の後ろに配列ＧＧＳＧＫＬの挿入を含む軽鎖を含む。
【００２８】
一実施形態において、アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、１つの式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｙ）        （Ｉ）
（Ｙ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＩ）
に従い、
【００２９】
ここで、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そしてここで各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０〜５の整数であり；ｎは、０〜５の整数であり；そしてＹは、機能的作用物質である。
【００３０】
一実施形態において、アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；ｎは、０、１、２または３である。一実施形態において、Ｌはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、Ｌは、１つまたはこれより多くのアミノ酸およびポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。別の実施形態において、アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。一実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である。別の実施形態において、上記アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（ＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、２、３または４であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙであり；そして少なくとも１個のＬは、ＰＥＧ部分である。さらなる実施形態において、上記アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（ＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、４であり；１個のＬは、Ｇｌｙであり、その残りの３個のＬ基は、各々ＰＥＧ部分である。別の実施形態において、上記機能的作用物質Ｙは、オーリスタチンＦである。
【００３１】
一実施形態において、アシルドナー基質は、１つの式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）        （ＩＩＩ）
（Ｘ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＶ）
に従い、ここでＺは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そして各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されていてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０〜５の整数であり；ｎは、０〜５の整数であり；そしてＸは、反応性基である。
【００３２】
一実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、ｎが２〜５である場合、少なくとも１つのＬは１つまたはこれより多くのアミノ酸を含み、他のＬはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。一実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ここで各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；そしてｎは、０、１、２または３である。別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、１個またはこれより多くのＬは、アミノ酸である。一実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｎは、１であり；そしてｍは、１である。。別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＶ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである。
【００３３】
別の実施形態において、Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）、
【化１】
2019525897.tif 000005
（ジベンゾシクロオクチン；ＤＢＣＯ）、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジン、およびアルデヒドからなる群より選択される反応性基である。
【００３４】
一実施形態において、治療剤は、抗体またはその抗原結合部分、化学療法剤、薬物剤、放射性薬剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質、低分子、核酸、またはポリペプチドである。別の実施形態において、診断剤は、発蛍光団、蛍光色素、放射性核種、または酵素である。
【００３５】
一実施形態において、微生物のトランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来である。
【００３６】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である。別の実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である。一実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＭ免疫グロブリンである。一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＤもしくはＩｇＥ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【００３７】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分、またはヒト化免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である。一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、キメラ免疫グロブリン、または非ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である。
【００３８】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。一実施形態において、免疫グロブリンの２個の重鎖、またはその抗原結合部分の間に分子内架橋、すなわち、ジスルフィド結合（複数可）は存在しない。
【００３９】
一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の比は、１：１〜２００：１または１：１〜１００：１である。
【００４０】
別の局面において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、機能的作用物質とを含む結合体化免疫グロブリンであって、ここで免疫グロブリンは、操作されたリジン残基を含み、ここで操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、機能的作用物質はアシルドナー基質を含み、ここでアシルドナー基質は、グルタミン残基を含み、そして機能的作用物質は、治療剤または診断剤であり、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基は、機能的作用物質のアシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化されている、結合体化免疫グロブリンが本明細書に記載される。一実施形態において、操作されたリジン残基は、重鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、重鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、軽鎖に存在する。別の実施形態において、操作されたリジン残基は、軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、κ軽鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、κ軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、λ軽鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、λ軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、可変領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、可変領域に存在しない。
【００４１】
別の局面において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、機能的作用物質とを含む結合体化免疫グロブリンであって、ここで免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、操作されたリジン残基は、アシルドナー基質上のグルタミン残基に結合体化されており、アシルドナー基質は反応性基をさらに含み、反応性基は機能的作用物質に結合体化されており、ここで機能的作用物質は、治療剤または診断剤である、結合体化免疫グロブリンが本明細書に記載される。一実施形態において、操作されたリジン残基は、重鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、重鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、軽鎖に存在する。別の実施形態において、操作されたリジン残基は、軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、κ軽鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、κ軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、λ軽鎖に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、λ軽鎖定常領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、可変領域に存在する。一実施形態において、操作されたリジン残基は、可変領域に存在しない。
【００４２】
一実施形態において、リジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、以下：免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分の重鎖上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）、セリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）、ロイシン１９３（Ｌ１９３Ｋ）、アスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、メチオニン２５２（Ｍ２５２Ｋ）、アスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）、もしくはプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）、免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のκ軽鎖上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）もしくはセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）、または免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分のλ軽鎖上のグルタミン酸２１３（Ｅ２１３Ｋ）、からなる群より選択される。一実施形態において、重鎖（変異前）は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、κ軽鎖（変異前）は、配列番号１９の示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、λ軽鎖（変異前）は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００４３】
一実施形態において、重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加されたアミノ酸残基をさらに含み、ここでアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。さらなる実施形態において、Ｃ末端に４４８位において付加された少なくとも１つのアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００４４】
別の実施形態において、上記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、２１４位の後ろでＣ末端に付加された少なくとも１個のアミノ酸残基を含む軽鎖を含み、ここで上記少なくとも１個のアミノ酸残基は、ＧＧＳＧＫＬ（グリシン  グリシン  セリン  グリシン  リジン  ロイシン）である。別の実施形態において、上記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、２１４位の後ろでＣ末端に付加された少なくとも１個のアミノ酸残基をさらに含む軽鎖を含み、ここで上記少なくとも１個のアミノ酸残基は、ＧＧＳＧＫＬである。一実施形態において、上記免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、システイン２１４の後ろで配列ＧＧＳＧＫＬの挿入を含む軽鎖を含む。
【００４５】
一実施形態において、リジン残基挿入は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１９１とセリン１９２との間、またはセリン１９２とロイシン１９３との間に挿入されたリジン残基である。
【００４６】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、抗原結合性フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）（Ｆａｂ）であり、ここで、リジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン酸２２１（Ｄ２２１Ｋ）、スレオニン２２３（Ｔ２２３Ｋ）、ヒスチジン２２４（Ｈ２２４Ｋ）、スレオニン２２５（Ｔ２２５Ｋ）、プロリン２２８（Ｐ２２８Ｋ）、プロリン２３０（Ｐ２３０Ｋ）、およびグルタミン酸２３３（Ｅ２３３Ｋ）からなる群より選択される。別の実施形態において、Ｆａｂ’は、ヒンジ領域全体を含む。別の実施形態において、Ｆａｂ’は、短縮型ヒンジ領域を含む。
【００４７】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第２のリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基をさらに含み、そして、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の第２のリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する。別の実施形態において、リジン残基に変異された第１の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、第２のリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、セリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である。別の実施形態において、操作されたリジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、そして第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のロイシン２０１（Ｌ２０１Ｋ）である。さらに別の実施形態において、操作されたリジン残基に変異された天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のスレオニン１３５（Ｔ１３５Ｋ）であり、第２の操作されたリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である。
【００４８】
さらなる実施形態において、重鎖は、そのＣ末端に４４８位において付加された少なくとも１つのアミノ酸残基をさらに含み、ここで少なくとも１つのアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。一実施形態において、Ｃ末端に４４８位において付加された少なくとも１つのアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００４９】
一実施形態において、免疫グロブリンは、第３のリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基をさらに含み、そして、ここで前記微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の第３リジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する。別の実施形態において、リジン残基に変異された第１の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、第２のリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、そして第３のリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）である。
【００５０】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、第４のリジン残基に変異された第４の天然アミノ酸残基をさらに含み、そして、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の第４のリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する。別の実施形態において、リジン残基に変異された第１の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のセリン１３６（Ｓ１３６Ｋ）であり、第２のリジン残基に変異された第２の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のアスパラギン２９７（Ｎ２９７Ｋ）であり、第３のリジン残基に変異された第３の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンのκ軽鎖またはその抗原結合部分上のセリン２０２（Ｓ２０２Ｋ）であり、第４のリジン残基に変異された第４の天然アミノ酸残基は、免疫グロブリンの重鎖またはその抗原結合部分上のプロリン４４５（Ｐ４４５Ｋ）である。
【００５１】
一実施形態において、操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。別の実施形態において、操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、酸性アミノ酸残基ではない。別の実施形態において、操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基を、プロリンまたは酸性アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸へと変異させることおよび操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基を、酸性アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸へと変異させることにより、操作されたアシルアクセプターのリジン部位に関する最適な配列が提供される。
【００５２】
一実施形態において、操作されたリジン残基の前にあるアミノ酸残基は、非酸性アミノ酸残基挿入、または非酸性アミノ酸残基に変異された天然酸性アミノ酸残基である。一実施形態において、操作されたリジン残基の後ろにあるアミノ酸残基は、アミノ酸残基挿入であって、ここでアミノ酸残基挿入は、非酸性アミノ酸残基挿入および非プロリン残基挿入であるアミノ酸残基挿入、または非酸性アミノ酸残基および非プロリン残基挿入に変異された、天然酸性アミノ酸残基または天然プロリン残基である。さらなる実施形態において、非酸性アミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである。別のさらなる実施形態において、非酸性アミノ酸残基挿入は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン挿入である。なお別のさらなる実施形態において、非酸性アミノ酸および非プロリン残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンである。なお別のさらなる実施形態において、天然酸性アミノ酸残基は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【００５３】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、そのＣ末端に４４８位において付加された少なくとも１個のアミノ酸残基をさらに含む重鎖を含み、ここで少なくとも１個のアミノ酸残基は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基でない。さらなる実施形態において、Ｃ末端に４４８位において付加された少なくとも１個のアミノ酸残基は、ロイシンである。
【００５４】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、システイン２１４の後ろに１〜４個のさらなるアミノ酸の挿入を含む軽鎖を含み、ここで、リジン残基挿入は、１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されたリジン残基であり、ここで、ロイシン残基は、リジン残基の後ろに挿入されている。さらなる実施形態において、システイン２１４の後ろの１〜４個のさらなるアミノ酸の挿入、１〜４個のさらなるアミノ酸の後ろに挿入されているリジン残基、およびリジン残基の後ろに挿入されているロイシン残基は、ＧＫＬ、ＧＧＫＬ、ＧＧＳＫＬ、およびＧＧＳＧＫＬからなる群より選択される配列を含む。
【００５５】
一実施形態において、アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、１つの式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｙ）        （Ｉ）
（Ｙ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＩ）
に従い、
【００５６】
ここで、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そしてここで各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０〜５の整数であり；ｎは、０〜５の整数であり；そしてＹは、機能的作用物質である。
【００５７】
一実施形態において、アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；ｎは、０、１、２または３である。別の実施形態において、アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。一実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である。一実施形態において、アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、式（ＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである。一実施形態において、Ｌはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、Ｌは、１つまたはこれより多くのアミノ酸およびポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。別の実施形態において、上記機能的作用物質Ｙは、オーリスタチンＦである。
【００５８】
一実施形態において、アシルドナー基質は、１つの式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）        （ＩＩＩ）
（Ｘ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＶ）
に従い、
【００５９】
ここでＺは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そして各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されていてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０〜５の整数であり；ｎは、０〜５の整数であり；そしてＸは、反応性基である。
【００６０】
一実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ここで各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；そしてｎは、０、１、２または３である。別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、１個またはこれより多くのＬは、アミノ酸である。一実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；そしてｎは、１である。。別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＶ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである。一実施形態において、Ｌはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、ｎが２〜５である場合、少なくとも１つのＬは１つまたはこれより多くのアミノ酸を含み、１つまたはこれより多くのＬはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。
【００６１】
別の実施形態において、Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）、
【化２】
2019525897.tif 000006
（ジベンゾシクロオクチン；ＤＢＣＯ）、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジン、およびアルデヒドからなる群より選択される反応性基である。
【００６２】
一実施形態において、治療剤は、抗体またはその抗原結合部分、化学療法剤、薬物剤、放射性薬剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質、低分子、核酸、またはポリペプチドである。別の実施形態において、診断剤は、発蛍光団、蛍光色素、放射性核種、または酵素である。
【００６３】
一実施形態において、微生物のトランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ由来である。
【００６４】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ１免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である。別の実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である。一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、もしくはＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である。一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ＩｇＤもしくはＩｇＥ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分である。
【００６５】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分、またはヒト化免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である。一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、キメラ免疫グロブリン、または非ヒト免疫グロブリンもしくはその抗原結合部分である。
【００６６】
一実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。一実施形態において、免疫グロブリンの２個の重鎖、またはその抗原結合部分の間に分子内架橋は存在しない。
【００６７】
一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の比は、１：１〜２００：１または１：１〜１００：１である。
【００６８】
一実施形態において、機能的作用物質は、抗体またはその抗原結合部分であり、そしてここで免疫グロブリンまたはその抗原結合部分、および機能的作用物質は、同じ抗原に結合するか、または異なる抗原に結合する。
【００６９】
別の局面において、本明細書で記載されるのは、結合体化可能な免疫グロブリンをコードする核酸である。別の局面において、本明細書で記載されるのは、核酸を含むプラスミドである。別の実施形態において、本明細書で記載されるのは、プラスミドを含む単離された細胞である。
【００７０】
別の局面において、結合体化免疫グロブリン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【００７１】
一局面において、本明細書で記載されるのは、本明細書で記載される方法のうちのいずれかによって生成される結合体化免疫グロブリンである。一実施形態において、上記方法は、機能的作用物質をアシルドナー基質の反応性基に結合体化する前に、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化した免疫グロブリンを精製するステップをさらに包含する。一実施形態において、上記精製するステップは、サイズベースの方法（例えば、クロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーション）を含む。別の実施形態において、上記精製するステップは、電荷ベースの分離（例えば、アニオン交換またはカチオン交換クロマトグラフィー）を含む。別の実施形態において、上記精製するステップは、アフィニティーベースのステップ（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ））を含む。
【００７２】
要旨、および以下の詳細な説明は、添付の図面とともに読まれる場合にさらに理解される。開示される方法、および結合体化免疫グロブリンを例証する目的で、例示的な実施形態が図面に示される；しかし、上記方法および結合体化免疫グロブリンは、開示される具体的実施形態に限定されない。図面において：
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、トランスグルタミナーゼ反応を示し、ここで上記トランスグルタミナーゼは、アンモニア分子の放出とともに、アシルドナーグルタミンとアシルアクセプターリジンとの間のイソペプチド結合の形成を触媒する。
【図２】図２は、例示的なＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙアシルドナー基質の構造を示す。
【図３】図３は、例示的なＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙアシルドナー基質を合成するための可能な経路を示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、ヒトＩｇＧ１  ＦａｂおよびＦｃ結晶構造における溶媒に露出されたリジンを示す（スティック表示）；（図４Ａ）Ｆａｂ  ＶＨ−ＣＨ１およびＶκ−Ｃκ、（図４Ｂ）Ｆａｂ  ＶＨ−ＣＨ１およびＶλ−Ｃλ、ならびに（図４Ｃ）Ｆｃ  ＣＨ２およびＣＨ３を、１．４Åプローブ半径でＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ４．５を使用して決定した。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、および図５Ｆは、アシルドナーおよび微生物のトランスグルタミナーゼと接触した抗体のＥＳＩ−ＭＳ分析を示す。抗体を、５０倍モル過剰のＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよび１Ｕ／ｍＬ  微生物のトランスグルタミナーゼと一晩、３７℃において接触させた。ＩｄｅＳ消化および還元の後に、ＬＣ、Ｆｄ、およびＦｃ質量をＥＳＩ−ＭＳによって決定した。
【図６】図６は、ヒトＩｇＧ１、κ、およびλ定常ドメインの配列を示す。結晶構造１ＦＣ１（Ｆｃγ）、４Ｆ３Ｆ（ＣＨ１およびＣκ）、および４ＨＫ０（Ｃλ）に基づく溶媒に露出された定常ドメインのリジンは、太字である；ループ内のリジンには、下線が付される。上記定常ドメインは、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされる。
【図７−１】図７−１および図７−２は、ｍＴＧａｓｅをＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートすることによって、アミド基転移に関してスクリーニングされた精製ＣＨ１およびヒンジ変異体ｍＡｂの結合体化レベルを示す。ビオチン化ｍＡｂを、材料および方法において詳述されるとおりのＥＬＩＳＡによって検出し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を分析した。ＨＣおよびＬＣの質量を、ＥＳＩ−ＭＳによって分析し（データは示さず）、結合体化のパーセンテージを決定した。
【図７−２】図７−１および図７−２は、ｍＴＧａｓｅをＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートすることによって、アミド基転移に関してスクリーニングされた精製ＣＨ１およびヒンジ変異体ｍＡｂの結合体化レベルを示す。ビオチン化ｍＡｂを、材料および方法において詳述されるとおりのＥＬＩＳＡによって検出し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を分析した。ＨＣおよびＬＣの質量を、ＥＳＩ−ＭＳによって分析し（データは示さず）、結合体化のパーセンテージを決定した。
【図８】図８は、最高の結合体化効率を有すると以前に同定されたＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ変異体ｍＡｂの結合体化レベルを示す。ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。サンプルを、ＩｄｅＳで消化し、還元し、ＥＳＩ−ＭＳによって分析し、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を、決定した。そのＤＡＲを、Δ質量をＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンの質量で除算することによって決定した。
【図９】図９は、種々のアシルドナーでの複数のアシルアクセプター部位（ｃｙｔｅ）を有するｍＡｂの結合体化効率を示す。ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮ、またはＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。還元したＬＣの質量を、ＬＣ−ＭＳによって分析し（データは示さず）、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を決定した。
【図１０】図１０は、ＩｇＧ  Ｆｃアイソタイプのアラインメントを示す。ヒトＩｇＧ１、２、３、および４のＦｃの一次アミノ酸配列を整列させ、差異を強調する。ＩｇＧ１残基Ｍｅｔ２５２、Ａｓｎ２９７、およびＰｒｏ４４５を、Ｘによって示す。
【図１１】図１１は、アシルアクセプターを有するＦａｂ’がｍＡｂ変異体におけるＱ２９５および／またはＱ２９７アシルドナー部位に結合体化されたことを示す。抗体０１−Ｎ２９７Ｑを、Ｆａｂ’リジン変異体およびｍＴＧａｓｅとともに、一晩、３７℃においてインキュベートした。そのサンプルを還元し、４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＦａｂＣＨ１−ＨＣダイマーの質量は、およそ７５ｋＤａであり、ＦａｂＣＨ１−ＨＣ−ＦａｂＣＨ１トリマーは、およそ１００ｋＤａである。
【図１２】図１２は、ｍＡｂを通じて位置決定した操作されたアシルアクセプター部位を図示する。アシルアクセプター部位（ｃｉｔｅ）で操作された残基の位置を、（Ａ）Ｆａｂ（４Ｆ３Ｆ）ＨＣおよびＬＣ、ならびに（Ｂ）Ｆｃ（１ＦＣ１）において強調した。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
詳細な説明
開示される方法および結合体化免疫グロブリンは、添付の図面（これは、本開示の一部を形成する）と関連して行われる、以下の詳細な説明を参照することによってより容易に理解され得る。開示される方法および結合体化免疫グロブリンが、本明細書で記載されるおよび／または示される具体的実施形態に限定されず、本明細書で使用される用語法が、特定の実施形態を例示によって記載する目的に過ぎず、その特許請求される方法または結合体化免疫グロブリンの限定であることを意図しないことは、理解されるべきである。
【００７５】
別段具体的に述べられなければ、可能な機構もしくは作用様式、または改善の理由に関するいかなる説明も、例証であるに過ぎないことが意味され、開示される方法および結合体化免疫グロブリンは、任意のこのような示唆される機構もしくは作用様式、または改善の理由の正確さまたは不正確さによって拘束されるべきではない。
【００７６】
本文全体を通じて、説明は、結合体化免疫グロブリンおよびその生成法に言及する。本開示が、結合体化免疫グロブリンと関連する特徴または実施形態を記載または特許請求する場合、このような特徴または実施形態は、これらを生成するための方法に等しく適用可能である。同様に、本開示が、結合体化免疫グロブリンを生成するための方法と関連する特徴または実施形態を記載または特許請求する場合、このような特徴または実施形態は、結合体化免疫グロブリンに等しく適用可能である。
【００７７】
特定の数値への言及は、文脈が別段明らかに規定しなければ、少なくともその特定の数値を含む。値の範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。さらに、範囲において述べられた値への言及は、その範囲内の各々のおよびあらゆる値を含む。全ての範囲は、包括的でありかつ組み合わせ可能である。
【００７８】
値が先行詞「約」に使用によって近似値として表される場合、その特定の値が別の実施形態を形成することは理解される。
【００７９】
明瞭性のために、別個の実施形態との関連において本明細書で記載される、開示される方法および結合体化免疫グロブリンのある種の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることは、理解されるべきである。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態との関連において記載される、開示される方法および結合体化免疫グロブリンの種々の特徴はまた、別個にまたは任意の部分組み合わせにおいて提供され得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は複数形を含む。
【００８１】
記載の局面に関する種々の用語が、本明細書および特許請求の範囲全体を通じて使用される。このような用語は、別段示されなければ、当該分野でそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義される用語は、本明細書で提供される定義と一致する様式で解釈されるべきである。
【００８２】
用語「約」とは、数値範囲、カットオフ、または具体的値に言及して使用される場合、その記載される値が列挙された値から１０％程度まで変動し得ることを示すために使用される。従って、用語「約」は、その特定された値から±１０％もしくはこれより小さい変動、±５％もしくはこれより小さい変動、±１％もしくはこれより小さい変動、０．５％もしくはこれより小さい変動、または±０．１％もしくはこれより小さい変動を包含するために使用される。
【００８３】
一般に、用語「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」とは、合成手段による（例えば、組み換え技術による、インビトロペプチド合成で、ペプチドの酵素カップリングもしくは化学的カップリングによる、または当該分野で一般に使用される他の方法による）核酸またはポリペプチド分子の操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）に言及する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「操作されたアミノ酸残基」とは、配列の文脈の範囲内で天然に存在しないアミノ酸残基に言及する。本明細書で使用される場合、用語「操作された核酸残基」とは、配列の文脈の範囲内で天然に存在しない核酸残基に言及する。これらの用語は、例えば、相当する天然に存在するポリペプチド配列または核酸配列に対して１またはこれより多くのアミノ酸またはヌクレオチドの変化（付加、欠失または置換を含む）を含むポリペプチド配列または核酸配列を含み、ここでこのような変化は、組換えＤＮＡ技術によって導入された。例えば、「操作されたリジン残基」とは、野生型およびその操作されたバージョン（ｔｈｅ  ｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）の配列が整列される場合に、その相当する天然に存在するか、または野生型のポリペプチド配列に存在せず、そのポリペプチドの中に、既存のアミノ酸残基を変異させるか、またはリジン残基の挿入のいずれかによって、導入されたリジン残基である。操作されたアミノ酸残基は、合成アミノ酸残基ではない。例えば、操作されたリジン残基は、合成リジン残基ではない。
【００８５】
一実施形態において、「操作されたアミノ酸残基」は、アミノ酸残基挿入である。例えば、単数または複数のアミノ酸残基は、２個の天然に存在するアミノ酸残基の間に挿入され得る。別の実施形態において、「操作されたアミノ酸残基」は、異なるアミノ酸残基に変異された天然に存在するアミノ酸残基である。例えば、操作されたリジン残基は、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用してリジン残基へと変異された天然に存在するアミノ酸残基（例えば、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、またはチロシン）であり得る。当業者は、本発明のこの局面に従って有用な操作されたポリペプチド配列を容易に生成し得る。操作されたポリペプチド配列は、任意の手段（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質合成を含む）によって生成され得る。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「挿入」または「付加」は、天然に存在する分子（例えば、野生型配列）と比較して、１個またはこれより多くのアミノ酸残基またはヌクレオチドの付加をそれぞれ生じるアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化に言及する。１個またはこれより多くのアミノ酸残基の挿入または付加は、内部アミノ酸残基の中間で起こり得る。あるいは、挿入は、アミノ酸配列のＮ末端で起こり得る。あるいは、挿入は、アミノ酸配列のＣ末端で起こり得る。
【００８７】
用語「天然アミノ酸」、「天然アミノ酸残基」、「天然に存在するアミノ酸」または「天然に存在するアミノ酸残基」とは、代表的には野生型ポリペプチド配列の文脈の範囲内で起こる天然に存在するアミノ酸に言及する。言い換えると、「天然アミノ酸」は、親配列（例えば、天然に存在する配列）に存在するアミノ酸残基とは異なるようにいかなる方法でも変異または変化していない。「天然アミノ酸」は、ポリペプチド配列内の任意の位置でのアミノ酸（例えば、内部のアミノ酸残基）、およびポリペプチド配列のＮ末端またはＣ末端における任意のアミノ酸も含む。
【００８８】
用語「アシルドナー基質」とは、そこに末端アシル基を有する基に言及する。好ましくは、「アシルドナー基質」は、グルタミン残基を含む。アシルドナー基質は、さらなる反応性基を必要に応じて含み得る。第１の実施形態において、アシルドナー基質は、機能的作用物質に共有結合的に接続される。第２の実施形態において、アシルドナー基質は、機能的作用物質に接続されない。一実施形態において、アシルドナー基質は、グルタミン残基および反応性基を含む。別の実施形態において、アシルドナー基質は、本明細書でさらに記載されるように、１またはこれより多くのリンカーを含む。上記の実施形態のうちのいずれかにおいて、アシルドナー基質と機能的作用物質との間、またはアシルドナー基質と反応性基との間には、必要に応じてリンカーが存在する。
【００８９】
用語「抗体」とは、本明細書で使用される場合、広くは、４個のポリペプチド鎖、２個の重鎖（Ｈ）および２個の軽鎖（Ｌ）から構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子に言及する。用語「抗体」はまた、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子の任意の抗原結合部分、変異体、バリアント、または誘導体であって、Ｉｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するものに言及する。このような変異体、バリアント、または誘導体の抗体形式は、当該分野で公知であり、その非限定的な実施形態は、本明細書で考察される。一実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。別の実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。別の実施形態において、抗体は、キメラ抗体である。別の実施形態において、抗体は、非ヒト抗体である。
【００９０】
全長の抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）といわれる領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）といわれる超可変性の領域へとさらに細別され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【００９１】
用語抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）とは、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはこれより多くのフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示されている。このような抗体の実施形態はまた、２種またはこれより多くの抗原に特異的に結合する、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、二重特異的（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、または多重特異的（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）な形式であり得る。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合フラグメントの例としては、以下が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメント）；（ｉｉ）Ｆａｂ’フラグメント（温和な還元を介するかまたはシステインを変異もしくは欠失させることによるかのいずれかによって、ジスルフィドによって連結されないヒンジ領域を含むＦａｂ）；（ｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメント）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら，  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，  Ｗｉｎｔｅｒら，  ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／０５１４４  Ａ１（本明細書に参考として援用される））；ならびに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、合成リンカー（ＶＬおよびＶＨ領域が対になって、一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら  （１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする）によって、繋げられ得る。このような一本鎖抗体はまた、用語抗体の「抗原結合部分」の範囲内に包含されることが意図される。一本鎖抗体の他の形態（例えば、ダイアボディー）もまた、包含される。ダイアボディーは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本のポリペプチド鎖上で発現されるが、その同じ鎖上の２つのドメインの間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成するように強いて、２つの抗原結合部位を作り出す二価の二重特異的抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．，ら  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ，  Ｒ．  Ｊ．，ら  （１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照のこと）。このような抗体結合部分は、当該分野で公知である（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （２００１）  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．  ７９０  ｐｐ．  （ＩＳＢＮ  ３−５４０−４１３５４−５）。
【００９２】
「酸性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて負電荷を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）が挙げられる。
【００９３】
「非酸性アミノ酸」とは、酸性アミノ酸ではないアミノ酸をいう。非酸性アミノ酸としては、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）が挙げられる。
【００９４】
「塩基性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて正電荷を示すアミノ酸をいう。遺伝的にコートされた塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、リジン（Ｌｙｓ，Ｋ）、およびアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）が挙げられる。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「生物学的サンプル」とは、被験体から得られたサンプル（インビボまたはインビトロで得られた生物学的組織または流体起源のサンプルが挙げられる）をいう。このようなサンプルは、ヒトを含む哺乳動物から単離された体液（例えば、血液、血漿、血清、乳、脊髄液、腹水、または尿）、器官、組織、断片（ｆｒａｃｔｉｏｎ）、および細胞であり得るが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、組織を含む生物学的サンプルの切片（例えば、器官または組織の切除部分）を含み得る。生物学的サンプルはまた、生物学的サンプルに由来する抽出物（例えば、生物学的流体（例えば、血液または尿）に由来する抗原）を含み得る。
【００９６】
用語「クリックケミストリー」とは、高収量、高選択性の、信頼性のあるかつ巧みな（ｃｌｅａｎ）タンパク質合成および／または結合体化のための特定の反応に言及する。例えば、Ｋｉｎｇら，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｂｉｏｏｒｔｈａｇｏｎａｌ  Ｂｏｎｄ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  −  Ｐａｓｔ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ」，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  （２０１４）  ２５（５）：  ８２５−８３９；  ＭｃＫａｙら，「Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ：  Ｂｉｏｏｒｔｈａｇｏｎａｌ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  （２０１４）  ２１（９）：  １０７５−１１０１を参照のこと。
【００９７】
用語「キメラ化」、「キメラの」、「キメラ抗体」および類似の用語は、１つの供給源または種に由来する重鎖可変領域および軽鎖可変領域（すなわち、抗原結合領域）、ならびに異なる供給源または種に由来する重鎖定常領域および軽鎖定常領域のうちの少なくとも一部を含む免疫グロブリンに言及する。これらの部分は、従来技術（例えば、合成）によって化学的に一緒に繋がれてもよいし、遺伝子操作技術を使用して連続ポリペプチドとして調製されてもよい（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡが、連続ポリペプチド鎖を生成するために発現されてもよい）。本開示によって包含される「キメラ免疫グロブリン」の他の形態は、クラスまたはサブクラスが元の免疫グロブリンのものから改変または変化しているもの（「クラススイッチ免疫グロブリン」ともいわれる）である。本開示全体を通じて、キメラ免疫グロブリンは、「ｘｉ」と称される。本明細書において、「キメラ免疫グロブリン」および類似の用語は、抗体を生成するために使用されるプロセスよりむしろ免疫グロブリンの配列に言及する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「機能的作用物質」とは、治療特性（複数可）、診断特性（複数可）、または他の機能的特性（複数可）を有する作用物質に言及する。一実施形態において、機能的作用物質は、治療剤であり得る。別の実施形態において、機能的作用物質は、診断剤であり得る。機能的作用物質は、高分子または低分子であり得る。高分子の機能的作用物質としては、抗体およびその抗原結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。低分子の機能的作用物質としては、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質、生物学的プロセスを調節し得る他の有機化合物（例えば、薬物）、およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
用語「ヒト化」、「ヒト化免疫グロブリン」および類似の用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が親の免疫グロブリンのものと比較して、異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された免疫グロブリンに言及する。大部分は、ヒト化免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン（レシピエント免疫グロブリン）であって、ここでレシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）の超可変領域（ドナー免疫グロブリン）に由来する残基によって置き換えられるものである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、相当する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化免疫グロブリンは、レシピエント免疫グロブリンにおいてもドナー免疫グロブリンにおいても見出されない残基を含み得る。これらの改変は、免疫グロブリンの性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化免疫グロブリンは、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１個、および代表的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化免疫グロブリンはまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の、代表的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含み得る。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．，ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２  （１９８８）  ３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．，ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４  （１９８５）  ２６８−２７０を参照のこと。本明細書において、「ヒト化免疫グロブリン」および類似の用語は、免疫グロブリンを生成するために使用されるプロセスよりむしろ、免疫グロブリンの配列に言及する。
【０１００】
用語「診断剤」とは、ＣＴ、ＭＲＩおよびＸ線のようなインビボ画像化研究ならびに／またはインビトロ画像化研究に有用であり得る化合物に言及する。診断剤の非限定的な例としては、発蛍光団、蛍光色素、放射性核種、および酵素が挙げられる。
【０１０１】
用語「ドナー免疫グロブリン」とは、その可変領域、ＣＤＲ、または他の機能的フラグメントもしくはそのアナログのアミノ酸配列をヒト化免疫グロブリンに与え、それによって、ドナー免疫グロブリンに特徴的な抗原特異性および中和活性を有するヒト化免疫グロブリンを提供する非ヒト免疫グロブリンに言及する。
【０１０２】
用語「レシピエント免疫グロブリン」とは、その重鎖および／もしくは軽鎖フレームワーク領域ならびに／またはその重鎖および／もしくは軽鎖定常領域のアミノ酸配列をヒト化免疫グロブリンに提供する、ドナー免疫グロブリンに対して異種の免疫グロブリンに言及する。そのレシピエント免疫グロブリンは、任意の哺乳動物に由来し得る。好ましい実施形態において、レシピエント免疫グロブリンは、ヒトにおいて非免疫原性である。好ましくは、レシピエント免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。
【０１０３】
「ヒト化する」とは、ヒト化免疫グロブリンを生成するプロセスに言及し、上記の特徴を有するヒト化免疫グロブリンを生成するための任意のプロセス（インシリコヒト化、種／宿主ＣＤＲをヒト免疫グロブリンに操作すること、相当するヒトフレームワーク領域にマッチするように、キメラ免疫グロブリンのフレームワーク領域残基を置き換えることなどが挙げられるが、これらに限定されない）を含む。
【０１０４】
「免疫グロブリン」とは、本明細書で使用される場合、κおよびλ軽鎖、ならびにα、γ、δ、εおよびμ重鎖を含む、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１またはこれより多くのポリペプチドからなるタンパク質に言及する。全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端において可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）、ＣＯＯＨ−末端においてκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸ｓ）は、同様に、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の前述の定常領域遺伝子のうちの１つ、例えば、γ（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされる。「免疫グロブリン」は、以下を含む：（ａ）免疫グロブリンポリペプチド、すなわち、特異的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む免疫グロブリンファミリーのポリペプチド（別段特定されなければ、全ての免疫グロブリンアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、サブクラス、ならびに種々のモノマーおよびポリマー形態の各アイソタイプを含む）；ならびに（ｂ）抗原に免疫特異的に結合するこのような免疫グロブリンポリペプチドの保存的に置換されたバリアント。免疫グロブリンは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８）の中で広く記載される。
【０１０５】
用語「微生物のトランスグルタミナーゼ」とは、アシル転移反応を触媒するトランスフェラーゼの１タイプに言及する。好ましい実施形態は、グルタミン残基を含む第１の部分（アシルドナー）と、一級アミン基を含む第２の部分（アシルアクセプター）との間のアシル転移反応を触媒する微生物のトランスグルタミナーゼの使用を含む。反応性グルタミン残基が溶媒に露出されることが好ましい。
【０１０６】
本明細書で開示される免疫グロブリンの一形態は、抗体の基本的構造単位を構成する。例えば、抗体は、テトラマーを含み得、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対（各対は、１本の軽鎖および１本の重鎖を有する）からなり得る。一般に、各対において、軽鎖および重鎖可変領域は、抗原への結合を一緒になって担い、定常領域は、抗体エフェクター機能を担う。
【０１０７】
抗体に加えて、免疫グロブリンは、例えば、以下を含む種々の他の形態において存在し得る：全長の免疫グロブリンの抗原結合フラグメントまたは部分（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ならびに代替の抗体形式（例えば、いくつか例を挙げると、一本鎖免疫グロブリン（ｓｃＦＶおよびｓｃＦａｂ）、ダイアボディー、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、直鎖状抗体、および多重特異的抗体。例えば、Ｊａｍｅｓ  Ｄ．  Ｍａｒｋｓ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  第２章，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）  （Ｃａｒｌ  Ｋ．  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編，）を参照のこと。
【０１０８】
一実施形態において、免疫グロブリンは、Ｆａｂフラグメントを含み得る。別の実施形態において、免疫グロブリンは、ＣＨ３ドメインを含み得る。別の実施形態において、免疫グロブリンは、重鎖を含み得る。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「免疫特異的に」とは、免疫グロブリンの、抗原（その抗原に対してその免疫グロブリンが生成された）に対して特異的に結合し、他のペプチドもしくはタンパク質には特異的に結合しない、能力に言及する。免疫グロブリンであって、抗原（その抗原に対してその免疫グロブリンが生成された）に対して免疫特異的に結合する免疫グロブリンは、他のポリペプチドまたはタンパク質に結合し得ないか、または例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、もしくは当該分野で公知の他のアッセイによって決定される場合に、他のポリペプチドまたはタンパク質に、免疫グロブリンが抗原に対して生成されたその抗原より低い結合親和性で結合し得る。免疫グロブリンは、実験技術（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるが、これらに限定されない）を使用して決定される場合に、任意の交差反応性抗原に対してよりも高い結合親和性で抗原に結合する場合に、その免疫グロブリンが抗原に対して生成されたその抗原に免疫特異的に結合する（抗体特異性に関する考察については、例えば、Ｐａｕｌ編，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  第２版，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  第３３２〜３３６頁（１９８９）を参照のこと）。
【０１１０】
「リンカー」とは、本明細書で使用される場合、免疫グロブリンを（アシルドナー基質を通じて）機能的作用物質または反応性基へと接続するためのスペーサー（これは、直鎖状の鎖であっても分枝状の鎖であってもよい）に言及する。このようなリンカーは、切断可能（例えば、酸不安定性またはプロテアーゼ切断可能）であっても、切断不能であってもよい。一実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。別の実施形態において、リンカーは、１個またはこれより多くのアミノ酸およびポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。
【０１１１】
用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物細胞もしくは原核生物細胞のクローン、またはファージクローンを含む単一の細胞クローンに由来する抗体に言及し、この抗体が生成される方法に言及するのではない。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通じて生成される抗体に限定されない。
【０１１２】
「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」とは、免疫グロブリンが由来する種からの野生型免疫グロブリン配列に言及する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「％同一性」および類似の用語は、２種またはこれより多くの核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドの間の配列関連性を記載するために使用され、以下を含む用語の文脈でおよびその用語とともに理解される：（ａ）参照配列、（ｂ）比較ウインドウ、（ｃ）配列同一性および（ｄ）配列同一性のパーセンテージ。
（ａ）「参照配列」とは、配列比較のための基準として使用される規定の配列である。参照配列は、特定された配列の部分セットまたは全体であり得る；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の例示的な長さとしては、少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約３５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸、または少なくとも約１００アミノ酸が挙げられる。核酸に関しては、参照核酸配列の例示的な長さとしては、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、もしくは少なくとも約３００ヌクレオチド、またはその程度もしくはそれらの間の任意の整数が挙げられる。
（ｂ）「比較ウインドウ」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の連続の特定されたセグメントへの言及を含み、ここでそのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、参照配列に対して比較され得、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、その２つの配列の最適アラインメントのために、参照配列（これは、付加、置換、または欠失を含まない）と比較して、付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。例示的な比較ウインドウは、長さが少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸であり得、および必要に応じて、３０個、４０個、５０個、１００個、またはこれより長くてもよい。当業者は、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列にギャップを含めることに起因して、参照配列に対する誤解を招くような高い類似性を回避するために、ギャップペナルティーを代表的には導入し、マッチの数から差し引くことを理解する。
（ｃ）比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：  ４８２，  １９８１の局所的相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：  ４４３，  １９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８：  ２４４４，  １９８８の類似性検索法によって；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ），  ７  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．，  ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されないこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によって行われ得る；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ，  ７３：  ２３７−２４４，  １９８８；  Ｃｏｒｐｅｔ，ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １６：８８１−９０，  １９８８；  Ｈｕａｎｇ，ら，  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ８：１−６，  １９９２；およびＰｅａｒｓｏｎ，ら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２４：７−３３１，  １９９４によって十分に記載される。データベース類似性検索のために使用され得るプログラムのＢＬＡＳＴファミリーは、以下を含む：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第１９章，  Ａｕｓｕｂｅｌら編，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９５を参照のこと。上記のプログラムの新しいバージョンまたは新しいプログラムは全体として、将来的に確実に利用可能になり、本開示とともに使用され得る。
（ｄ）「％同一性」とは、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を意味し、ここでその比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、その２つの配列の最適アラインメントのために、参照配列（これは、付加、置換、または欠失を含まない）と比較して、付加、置換、または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、そのマッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１１４】
「薬学的に有効な量」とは、被験体を処置する免疫グロブリンの量をいう。
【０１１５】
「薬学的に受容可能なキャリア」とは、被験体への投与のための本明細書で記載されるとおりの免疫グロブリンに関する医薬製剤の構成要素をいう。例えば、薬学的に受容可能なキャリアは、リポソームベース、脂質ベース、および／またはナノ粒子ベースであり得る。
【０１１６】
用語「反応性基」とは、本明細書で使用される場合、他の化合物（例えば、機能的作用物質）に反応して、少なくとも１個の共有結合を形成し得る化学官能基をいう。一実施形態において、反応性基は、クリックケミストリーカップリング反応において反応性である。反応性基の非限定的な例としては、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）、
【化３】
2019525897.tif 000007
（ジベンゾシクロオクチン；ＤＢＣＯ）、トランス−シクロオクチン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジン、およびアルデヒドが挙げられる。
【０１１７】
用語「被験体」とは、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒト生物に言及する。従って、本明細書で記載される方法、免疫グロブリン、および結合体化免疫グロブリンは、ヒトおよび獣医学的な疾患および状態の両方に適用可能である。被験体は、「患者」、すなわち、疾患もしくは状態のための医療的ケアを受けている、生きているヒトもしくは非ヒト生物、または病状の徴候もしくは特定の状態の存在／非存在に関して調査されている最中である、未確定の病気を有するヒトもしくは非ヒト生物であり得る。
【０１１８】
「置換する」とは、１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸で置き換えることに言及する。「置換する」は、例えば、アミノ酸残基をコードするか、または１つのアミノ酸を別のアミノ酸で交換するためにタンパク質を操作する１またはこれより多くのＤＮＡ塩基対におけるミスセンス変異を含む。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「処置する」および類似の用語は、疾患症状の重篤度および／もしくは頻度を低減すること、疾患症状および／もしくは上記症状の根底にある原因を排除すること、疾患症状および／もしくはそれらの根底にある原因の頻度もしくは尤度を低下させること、ならびに疾患によって直接的もしくは間接的に引き起こされる損傷を改善もしくは治療することに言及する。
【０１２０】
用語「治療剤」とは、状態を処置する必要性がある被験体に投与され得る高分子または低分子を意味する。治療剤は、医学的状態の１またはこれより多くの症状を、その医学的状態に罹患している被験体において処置するか、もしくはその開始を防止するか、その進行を遅らせるか、または改善するために投与され得る。治療剤としては、抗体またはその抗原結合部分、化学療法剤、放射性薬剤、細胞傷害性薬剤、抗生物質などが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、治療剤は、低分子である。別の実施形態において、治療剤  は、ポリペプチドである。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「〜に９０％同一」とは、参照項目（例えば、生物学的配列）に少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一、または１００％同一を包含する。
【０１２２】
以下の略語は、本開示全体を通じて使用される：抗体薬物結合体（ＡＤＣ）；薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）；フレームワーク領域（ＦＲ）；相補性決定領域（ＣＤＲ）；オーリスタチンＦ（ＡｕＦ）；重鎖可変領域（ＶＨ）；軽鎖可変領域（ＶＬ）；可変性κ（Ｖκ）；γ定常領域（Ｃγ）；κ定常領域（Ｃκ）；モノクローナル抗体（ｍＡｂ）；ＥＵ番号付けシステムを使用して番号付けされる場合、免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸４４７位におけるリジン（Ｌｙｓ４４７）。
結合体化免疫グロブリンの生成
【０１２３】
本明細書に開示されるのは、結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、方法は、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質を含む機能的作用物質とを接触させるステップであって、ａ）ここで免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、ｂ）ここでアシルドナー基質は、グルタミン残基を含み、そしてｃ）ここで機能的作用物質は、治療剤または診断剤である、ステップを包含し、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基を、機能的作用物質上のアシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化し、それによって結合体化免疫グロブリンを生成する、方法である。
【０１２４】
また本明細書に開示されるのは、結合体化免疫グロブリンを生成するための方法であって、方法は、ｉ）免疫グロブリンまたはその抗原結合部分と、微生物のトランスグルタミナーゼおよびアシルドナー基質とを接触させるステップであって、ａ）ここで免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、操作されたリジン残基を含み、ここで操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、ｂ）ここでアシルドナー基質は、グルタミン残基および反応性基を含み、ここで微生物のトランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基を、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化する、ステップ、ならびにｉｉ）機能的作用物質をアシルドナー基質の反応性基に結合体化するステップであって、ここで機能的作用物質は、治療剤または診断剤であり、それによって結合体化免疫グロブリンを生成する、ステップ、を包含する方法である。
【０１２５】
結合体化は、アシルドナー基質を含む機能的作用物質を溶解溶液中に溶解し、その溶解した機能的作用物質と、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分、および微生物のトランスグルタミナーゼとを、結合体化緩衝剤中で接触させることによって行われ得る。結合体化はまた、アシルドナー基質を溶解溶液中に溶解し、そのアシルドナー基質と、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分、および微生物のトランスグルタミナーゼとを、結合体化緩衝剤中で接触させることによって行われ得る。
【０１２６】
水不溶性の（ａｑｕｅｏｕｓ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）機能的作用物質およびアシルドナー基質に関しては、適切な溶解溶液は、有機性の水混和性の溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を含む。水溶性の（ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｏｌｕｂｌｅ）機能的作用物質およびアシルドナー基質に関しては、適切な溶解溶液としては、水または緩衝化水性溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２（１×ＰＢＳ）またはＤＰＢＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
機能的作用物質またはアシルドナー基質の好適な濃度として、約１０μＭ〜約８００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭが挙げられる。
【０１２８】
一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約１０μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約２５μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約５０μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約１００μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約２５０μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約５００μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約７５０μＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約１ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約１０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約２０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約３０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約４０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約６０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約７０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約８０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約９０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約１００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約１５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約２００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約２５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約３００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約３５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約４００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約４５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約５００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約５５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約６００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約６５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物���またはアシルドナー基質の濃度は、約７００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約７５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質の濃度は、約８００ｍＭであり得る。
【０１２９】
免疫グロブリンの好適な濃度として、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、または約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ〜約４５ｍｇ／ｍｌ、約３５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ〜約７５ｍｇ／ｍｌ、約６０ｍｇ／ｍｌ〜約８５ｍｇ／ｍｌまたは約８０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌが挙げられる。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約２ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約２５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約３０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約３５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約４５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約５５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約６０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約６５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約７０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約７５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約８０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約８５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約９０ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約９５ｍｇ／ｍｌであり得る。一部の実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１００ｍｇ／ｍｌであり得る。
【０１３０】
機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの好適な比として、約１：１〜１００：１が挙げられる。一実施形態において、機能的作用物質〜アシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、約２５：１〜約７５：１である。別の実施形態において、機能的作用物質〜アシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、約４０：１〜約６０：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、２：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、３：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、４：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、５：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、６：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、７：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、８：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、９：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１１：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１２：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１３：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１４：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１５：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１６：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１７：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１８：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１９：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、２０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、２５：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、３０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、３５：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、４０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、４５：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、５０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、６０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、７０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、８０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、９０：１であり得る。一部の実施形態において、機能的作用物質またはアシルドナー基質：免疫グロブリンの比は、１００：１であり得る。
【０１３１】
接触させるステップは、いくつかの適切な結合体化緩衝剤（いくつか例を挙げると、例えば、ＤＰＢＳ、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、およびＨＥＰＥＳが挙げられる）の中で行われ得る。結合体化緩衝剤の濃度として、約５ｍＭ〜約２Ｍ、約５ｍＭ〜約１Ｍ、約５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約６０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約９０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭが挙げられる。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約１０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約２０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約３０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約４０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約６０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約７０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約８０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約９０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約１００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約２５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約５００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約７５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約１Ｍであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約１．２５Ｍであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約１．５Ｍであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約１．７５Ｍであり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤の濃度は、約２Ｍであり得る。
【０１３２】
結合体化緩衝剤は、塩化ナトリウムをさらに含み得る。塩化ナトリウムの好適な濃度として、約０ｍＭ〜約２Ｍ、約０ｍＭ〜約１Ｍ、約１Ｍ〜約２Ｍ、約５００ｍＭ〜約１．５Ｍ、約２５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約０ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約０ｍＭ〜約２５ｍＭが挙げられる。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約２５ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約７５ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約２００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約２５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約３００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約３５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約４００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約５００ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約７５０ｍＭであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１Ｍであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１．２５Ｍであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１．５Ｍであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約１．７５Ｍであり得る。一部の実施形態において、塩化ナトリウムの濃度は、約２Ｍであり得る。
【０１３３】
結合体化緩衝剤のｐＨは、約４〜約９であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約５〜約８であり得る。別の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６〜約７であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約４であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約４．５であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約５であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約５．５であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６．０であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６．５であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６．６であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６．７であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６．８であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約６．９であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．０であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．１であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．２であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．３であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．４であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．５であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．６であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．７であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．８であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約７．９であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約８．０であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約８．１であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約８．２であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約８．３であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約８．４であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約８．５であり得る。一部の実施形態において、結合体化緩衝剤のｐＨは、約９であり得る。
【０１３４】
結合体化緩衝剤中の機能的作用物質またはアシルドナー基質の溶解性を促進するため、結合体化緩衝剤中の有機性の水混和性の溶媒の最終濃度は、約０％〜約２０％、約２％〜約２０％、約５％〜約２０％、約８％〜約２０％、約１１％〜約２０％、約１６％〜約２０％、約０％〜約１８％、約０％〜約１５％、約０％〜約１２％、約０％〜約１０％、約０％〜約８％、約０％〜約６％、または約０％〜約２％であり得る。
【０１３５】
結合体化緩衝剤は、結合体化緩衝剤中でのチオール反応性化合物の溶解性を促進するためにプロピレングリコールをさらに含み得る。プロピレングリコールの好適な濃度として、約１％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約１０％〜約３０％、または約１０％〜約２０％が挙げられる。一部の実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約１％または約５％であり得る。一部の実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約１０％であり得る。一部の実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約２０％であり得る。一部の実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約３０％であり得る。一部の実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約４０％であり得る。一部の実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約５０％であり得る。
【０１３６】
結合体化緩衝剤は、結合体化緩衝剤中での結合体化免疫グロブリンの溶解性を促進するために非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。例示的な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート−２０またはポリソルベート−８０が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の好適な濃度として、約０％〜約１％、約０．１％〜約１％、約０．３％〜約１％、約０．５％〜約１％、約０．７％〜約１％、約０％〜約０．８％、約０％〜約０．６％、約０％〜約０．４％、または約０％〜約０．２％が挙げられる。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．１％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．２％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．３％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．４％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．５％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．６％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．７％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．８％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．９％であり得る。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約１．０％であり得る。
【０１３７】
接触させるステップは、約３０分間〜約４８時間、約１時間〜約４８時間、約２時間〜約２４時間、約２４時間〜約４８時間、約３０時間〜約４８時間、約３６時間〜約４８時間、約４２時間〜約４８時間、約２時間〜約４２時間、約２時間〜約３６時間、約２時間〜約３０時間、約２時間〜約２４時間、約２時間〜約１８時間、約２時間〜約１２時間、約３０分間〜約１時間、約３０分間〜約２時間、または約２時間〜約６時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、約３０分間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、約１時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、約１．５時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、６時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、１２時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、１８時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２４時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、３０時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、３６時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、４２時間実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、４８時間実施され得る。
【０１３８】
接触させるステップの温度は、約４℃〜約５０℃、約１８℃〜約３７℃、約２０℃〜約３７℃、約２２℃〜約３７℃、約２４℃〜約３７℃、約２６℃〜約３７℃、約２８℃〜約３７℃、約３０℃〜約３７℃、約３２℃〜約３７℃、約３４℃〜約３７℃、約１８℃〜約３４℃、約１８℃〜約３２℃、約１８℃〜約３０℃、約１８℃〜約２８℃、約１８℃〜約２６℃、または約１８℃〜約２４℃であり得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、４℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、１８℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２０℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２２℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２４℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２６℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、２８℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、３０℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、３２℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、３４℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、３７℃で実施され得る。一部の実施形態において、接触させるステップは、５０℃で実施され得る。
【０１３９】
組み込まれていない機能的作用物質またはアシルドナー基質は、いくつかの適切な樹脂（Ｇ−２５樹脂、Ｇ−５０樹脂、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ１０、または５，０００〜１０，０００Ｄａの範囲の排除限界を有する他の樹脂が挙げられるが、これらに限定されない）を使用する脱塩クロマトグラフィーによって、結合体化免疫グロブリンから分離され得る。クロマトグラフィーは、スケールに依存して、カラム形式またはスピンカラム形式で行われ得る。脱塩に適切な緩衝剤としては、例えば、ＤＰＢＳ、１×ＰＢＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、Ｔｒｉｓが挙げられるか、またはＨＥＰＥＳベースの緩衝剤が、１×ＰＢＳの代わりに使用され得る。
【０１４０】
第１の実施形態において、アシルドナー基質を含む機能的作用物質は、操作されたリジン残基にアシルドナー基質を介して結合体化されるグルタミン残基を含む。この第１の実施形態において、機能的作用物質は、アシルドナー基質上の反応性基を機能的作用物質と反応させることによって免疫グロブリンと結合体化する前に、アシルドナー基質と合わせられる。第２の実施形態において、グルタミン残基および反応性基を含むアシルドナー基質は、免疫グロブリンに先ず結合体化され、次いで、その反応性基は、機能的作用物質に繋がれる。
【０１４１】
アシルドナー基質は、リンカー「Ｌ」を含み得る。リンカーは、切断不能なリンカーまたは切断可能なリンカーであり得る。例示的なリンカーとしては、例えば、ジスルフィド含有リンカー、アセタールベースのリンカー、およびケタールベースのリンカーが挙げられる。いくつかの局面において、リンカーは、切断不能なリンカーであり得る。適切な切断不能なリンカーとしては、１またはこれより多くのアミノ酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧを含み得る。いくつかの局面において、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。適切な切断可能なリンカーとしては、例えば、バリン−シトルリン−パラアミノベンジルが挙げられる。いくつかの局面において、リンカーは、ジスルフィド含有リンカーであり得る。いくつかの局面において、リンカーは、アセタールベースのリンカーであり得る。いくつかの局面において、リンカーは、ケタールベースのリンカーであり得る。リンカーはまた、１もしくはこれより多くのアミノ酸（単独で、または１もしくはこれより多くのＰＥＧ基のような別のリンカーと組み合わせて）であり得る。
【０１４２】
グルタミン残基を含むアシルドナー基質は、機能的作用物質の中に存在し得るか、その一部であり得るか、またはそれに結合され得る。適切な機能的作用物質としては、例えば、発蛍光団、蛍光色素、ポリペプチド、免疫グロブリン、抗生物質、核酸、放射性核種、化学リンカー、低分子、キレート化剤、脂質、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）および薬物が挙げられる。いくつかの局面において、機能的作用物質は、発蛍光団を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、蛍光色素を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、ポリペプチドを含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、免疫グロブリンを含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、抗生物質を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、放射性核種を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、低分子を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、キレート化剤（とりわけ、例えば、ＤＯＴＡ、ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ）を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、脂質を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、薬物を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、上記に列挙された機能的作用物質のうちのいずれかの組み合わせを含み得る。
【０１４３】
アシルドナー基質（すなわち、第１のアシルドナー基質）は、第２のアシルドナー基質またはリンカーに結合され得、第２のアシルドナー基質またはリンカーは、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を有する第２の免疫グロブリン（第２の重鎖可変領域は、操作されたリジン残基を有する）に結合される。例えば、第１のアシルドナー基質および第２のアシルドナー基質は、それぞれ、第１のおよび第２の機能的作用物質として、第１のおよび第２の化学リンカーを有し得る。第１のおよび第２の化学リンカーは、いくつかの適切な手段（例えば、クリックケミストリーが挙げられる）によって、互いに結合され得る。
【０１４４】
一実施形態において、アシルドナー基質を含む前記機能的作用物質は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｙ）        （Ｉ）
（Ｙ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＩ）
の１つに従い、ここで、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そしてここで各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０〜５の整数であり；ｎは、０〜５の整数であり；そしてＹは、機能的作用物質である。
【０１４５】
別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）：
（Ｚ）ｍ−Ｇｌｎ−（Ｌ）ｎ−（Ｘ）        （ＩＩＩ）
（Ｘ）−（Ｌ）ｎ−Ｇｌｎ−（Ｚ）ｍ        （ＩＶ）
の１つに従い、ここでＺは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここで該炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられてもよく、そして各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換されていてもよいか；または各Ｌは、必要に応じてかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０〜５の整数であり；ｎは、０〜５の整数であり；そしてＸは、反応性基である。
【０１４６】
一実施形態において、Ｚは、ＣＢＺ基である。別の実施形態において、Ｚは、アミノ酸残基である。
【０１４７】
一実施形態において、Ｌは、アミノ酸残基である。一実施形態において、ｎは、２〜５であり、各Ｌは、独立して、アミノ酸残基である。別の実施形態において、Ｌは、１〜２０個の炭素原子の直鎖状または分枝状のリンカーであり、ここでその炭素原子のうちの１個またはこれより多くは、必要に応じてかつ独立して、窒素、酸素または硫黄原子で置き換えられ、そしてここで各炭素および窒素原子は、必要に応じて置換され得る。別の実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。別の実施形態において、ｎは、２〜５であり、そして１個またはこれより多くのＬは、１個またはこれより多くのアミノ酸を含み、１個またはこれより多くのさらなるＬ基は、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。
【０１４８】
一実施形態において、ｍは、０である。別の実施形態において、ｍは、１である。別の実施形態において、ｍは、２である。別の実施形態において、ｍは、３である。別の実施形態において、ｍは、４である。別の実施形態において、ｍは、５である。
【０１４９】
一実施形態において、ｎは、０である。別の実施形態において、ｎは、１である。別の実施形態において、ｎは、２である。別の実施形態において、ｎは、３である。別の実施形態において、ｎは、４である。別の実施形態において、ｎは、５である。
【０１５０】
一実施形態において、Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメタノール（ＢＣＮ）である。別の実施形態において、Ｘは、
【化４】
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（ジベンゾシクロオクチン；ＤＢＣＯ）である。別の実施形態において、Ｘは、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）である。別の実施形態において、Ｘは、アジド（Ｎ３）である。別の実施形態において、Ｘは、アルキンである。別の実施形態において、Ｘは、テトラジンメチルシクロプロペンである。別の実施形態において、Ｘは、ノルボルネンである。別の実施形態において、Ｘは、ヒドラジド／ヒドラジンである。別の実施形態において、Ｘは、アルデヒドである。
【０１５１】
一実施形態において、式（Ｉ）に従うアシルドナー基質に関して、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；そしてｎは、０、１、２または３である。
【０１５２】
別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（Ｉ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。一実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙである。この実施形態の一局面において、ｍは、１であり、ｎは、１である。
【０１５３】
一実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである。
【０１５４】
別の実施形態において、機能的作用物質Ｙは、オーリスタチンＦである。
【０１５５】
一実施形態において、式（ＩＩＩ）に従うアシルドナー基質に関して、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（−Ｏ（（ＣＨ２）２）−）、エチルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）２）−）またはプロピルアミン（−ＮＨ（（ＣＨ２）３）−）であり；そしてｎは、０、１、２または３である。
【０１５６】
別の実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＩＩ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。一実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙである。この実施形態の一局面において、ｍは、１であり、ｎは、１である。
【０１５７】
一実施形態において、アシルドナー基質は、式（ＩＶ）に従い、ここでＺは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；そして少なくとも１個のＬは、Ｇｌｙである。別の実施形態において、機能的作用物質Ｙは、オーリスタチンＦである。
【０１５８】
開示の方法は、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行うことができる。したがって、一部の実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合部分であり得る。
【０１５９】
開示の方法は、ヒト免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行うことができる。したがって、一部の実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリンまたはその抗原結合部分であり得る。別の実施形態において、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、非ヒト免疫グロブリンまたはその抗原結合部分であり得る。
【０１６０】
一実施形態において、開示の方法は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行うことができる。一実施形態において、方法は、ＩｇＧ１免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＧ２免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＧ３免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＧ４免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。
【０１６１】
一実施形態において、開示の方法は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行うことができる。一実施形態において、方法は、ＩｇＡ１免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＡ２免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、ＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、尾部分（ｔａｉｌ  ｐｉｅｃｅ）を有する。別の実施形態において、ＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分は、尾部分が除去されている。
【０１６２】
一実施形態において、方法は、ＩｇＤまたはＩｇＥ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＤ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。一実施形態において、方法は、ＩｇＥ免疫グロブリンまたはその抗原結合部分に対して行われる。
【０１６３】
本明細書で記載される方法に関して、一実施形態において、微生物のトランスグルタミナーゼは、以下に由来する：Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｓｐ．  Ｔ−２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ  ＢＬ３２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ芽胞、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｃ２３６１、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐ．  Ｃ１１１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ（別名Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  Ｍ５２１８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＪＴ４６／ｐＡＥ０５３、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｙｄｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｉｏｙａｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｌａｄａｋａｎｕｍ  ＮＲＲＬ−３１９１、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．ｓ−８１１２、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ。一実施形態において、微生物のトランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓに由来する。
【０１６４】
本明細書で記載される方法に関して、一実施形態において、トランスグルタミナーゼは、以下から単離される：Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓａｌｉｎａ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ、およびＲｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌからなる群より選択される植物。
【０１６５】
本明細書で記載される方法に関して、一実施形態において、トランスグルタミナーゼは、哺乳動物のものであり、トランスグルタミナーゼ１〜７および第ＸＩＩＩ因子から単離される。
【０１６６】
一実施形態において、トランスグルタミナーゼは、本明細書で記載される微生物のトランスグルタミナーゼと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。一実施形態において、トランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓに由来する微生物のトランスグルタミナーゼと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。トランスグルタミナーゼ酵素は、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ（登録商標）またはＺｅｄｉｒａ（製品番号Ｔ００１）から購入され得る。別の実施形態において、トランスグルタミナーゼは、精製される。別の実施形態において、トランスグルタミナーゼは組換え発現され、その後、当業者に公知の方法を使用して精製される。
【０１６７】
一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約０．１ユニット／ｍＬ〜約２５０ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１ユニット／ｍＬ〜約２５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１ユニット／ｍＬ〜約２５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約０．１ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約０．５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１０ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約２０ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約２５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約５０ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約７５ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１００ユニット／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書に記載の方法において約１５０ユニット／ｍＬ、２００ユニット／ｍＬ、または２５０ユニット／ｍＬの濃度で存在する。
【０１６８】
本明細書において提供される方法について、一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約２００：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約１００：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約２５：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約２０：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約１５：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約１０：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約９：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約８：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約７：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約６：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約５：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約４：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約３：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約２：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１０：１〜約１００：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約５０：１〜約２００：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約５０：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約１００：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１：１〜約１５０：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約５０：１〜約１００：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約１００：１〜約２００：１である。
【０１６９】
一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、約２０：１である。一実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、公知であり、本明細書に開示される方法に従って一貫して再現性がある。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約２：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約３：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約４：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約５：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約６：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約７：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約８：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約９：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１０：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１１：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１２：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１３：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１４：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１５：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１６：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１７：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１８：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約１９：１である。一部の実施形態において、機能的作用物質：免疫グロブリンの比は、約２０：１である。機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、本明細書で使用される場合、組成物中の抗体のプールにおいて機能的作用物質  対  免疫グロブリンの結合体化比の平均に基づいて計算される。
【０１７０】
本発明の実施形態において、アシルアクセプター部位は、２個の天然アミノ酸残基の間のリジンの挿入、または天然アミノ酸のリジン置換による置換のいずれかによって、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分において操作される。操作されたリジン残基は、免疫グロブリンの配列全体を通じて１またはこれより多くの位置に位置し得る。アシルアクセプター部位に関する最適な状況は、位置依存性であるのみならず、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にあるアミノ酸残基が酸性アミノ酸残基ではないこと；およびその操作されたリジンに隣接しかつ直後にあるアミノ酸残基が酸性アミノ酸残基またはプロリン残基でないことをも要求する。ＭＴＧａｓｅ結合体化技術は、これらの操作された部位を利用して、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）、二重特異的抗体、免疫毒素、または他のｍＡｂ−タンパク質複合体を作製するため、種々のアシルドナー含有機能的作用物質を結合体化することができる。別の実施形態において、複数の操作されたアシルアクセプター部位を組み合わせると、理論的薬物−対−抗体比（ＤＡＲ）は、各操作されたアシルアクセプター部位に対して増加する。ＡＤＣのＤＡＲを増加させると、モノクローナル抗体あたり、被験体により多くの機能的作用物質の送達が生じる。これは、規定されたＤＡＲ、より良好な生成物均一化、およびより少ない患者投与を可能にする。
【０１７１】
少なくとも２個のさらなる操作されたリジン残基が存在する本明細書で記載される実施形態において、機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比は、さらなる操作されたリジン残基の数に基づいて増加される。例えば、２個の操作されたリジン残基が存在する場合、４個のアミド基転移部位を有する抗体および約２：１〜約４：１の機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比が生じる。別の例として、３個の操作されたリジン残基が存在する場合、６個のアミド基転移部位および約２：１〜約６：１の機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比を有する抗体が生じる。
【０１７２】
結合体化免疫グロブリン
本明細書で開示されるのはまた、本明細書で開示される免疫グロブリンまたはその抗原結合部分のうちのいずれかを含む結合体化免疫グロブリンであり、ここでその操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、そしてアシルドナー基質を含む機能的作用物質に結合体化され、ここでアシルドナー基質は、グルタミン残基を含む。さらなる実施形態は、本明細書で開示される免疫グロブリンまたはその抗原結合部分のうちのいずれかを含む結合体化免疫グロブリンを含み、ここでその操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基であり、そしてアシルドナー基質に結合体化され、ここでそのアシルドナー基質は、グルタミン残基および反応性基を含み、ここでその反応性基は、免疫グロブリンまたはその抗原結合部分へのアシルドナー基質の結合体化の後に、機能的作用物質と反応され得る。
【０１７３】
一実施形態において、操作されたリジンに隣接するアミノ酸残基はまた、操作される、例えば、免疫グロブリン上の操作されたアシルアクセプターリジン部位のために配列を最適化するように変異される。例えば、操作されたリジン残基に隣接しかつ直後にあるアミノ酸残基（例えば、アミノ酸＋１位）は、プロリン残基または酸性アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基に変異され得る。操作されたリジン残基に隣接しかつ直前にあるアミノ酸残基（例えば、アミノ酸−１位）は、酸性アミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基に変異され得る。
【０１７４】
一実施形態において、操作されたリジンに隣接しかつ直後にあるアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに変異され得る。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、グリシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、リジンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、アラニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、バリンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、ロイシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、イソロイシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、メチオニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、フェニルアラニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、チロシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、トリプトファンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、セリンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、スレオニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、システインである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、アスパラギンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、グルタミンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、ヒスチジンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、アルギニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直後にあるアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、プロリン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸ではない。
【０１７５】
一実施形態において、操作されたリジンに隣接しかつ直前にあるアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンに変異され得る。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、グリシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、リジンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、アラニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、バリンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、ロイシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、イソロイシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、メチオニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、フェニルアラニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、チロシンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、トリプトファンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、セリンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、スレオニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、システインである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、アスパラギンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、グルタミンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、ヒスチジンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、プロリンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にある変異したアミノ酸残基（アミノ酸−１位）は、アルギニンである。一実施形態において、その操作されたリジンに隣接しかつ直前にあるアミノ酸残基（アミノ酸＋１位）は、アスパラギン酸またはグルタミン酸ではない。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト化され得る。他の実施形態において、免疫グロブリンは、ヒトである。別の実施形態において、免疫グロブリンは、キメラである。
【０１７７】
グルタミン残基および反応性基を含むアシルドナー基質はまた、リンカー「Ｌ」を含み得る。同様に、グルタミン残基を含むアシルドナー基質を含む機能的作用物質は、機能的作用物質と分子のアシルドナー基質部分との間にリンカーを有し得る。リンカーは、切断不能なリンカーまたは切断可能なリンカーであり得る。例示的なリンカーとしては、例えば、ジスルフィド含有リンカー、アセタールベースのリンカー、およびケタールベースのリンカーが挙げられる。いくつかの局面において、リンカーは、切断不能なリンカーであり得る。適切な切断不能なリンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧを含み得る。いくつかの局面において、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。適切な切断可能なリンカーとしては、例えば、バリン−シトルリン−パラアミノベンジルが挙げられる。いくつかの局面において、リンカーは、ジスルフィド含有リンカーであり得る。いくつかの局面において、リンカーは、アセタールベースのリンカーであり得る。いくつかの局面において、リンカーは、ケタールベースのリンカーであり得る。
【０１７８】
本発明の結合体化免疫グロブリンは、機能的作用物質を含む。適切な機能的作用物質としては、例えば、治療剤または診断剤が挙げられる。適切な機能的作用物質としては、例えば、発蛍光団、蛍光色素、ポリペプチド、免疫グロブリン、抗生物質、核酸、放射性核種、化学リンカー、低分子、キレート化剤、脂質および薬物が挙げられる。いくつかの局面において、機能的作用物質は、発蛍光団を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、蛍光色素を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、ポリペプチドを含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、免疫グロブリンを含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、抗生物質を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、放射性核種を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、低分子を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、キレート化剤（とりわけ、例えば、ＤＯＴＡ、ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ）を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、脂質を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、薬物を含み得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、上記に列挙された機能的作用物質のうちのいずれかの組み合わせを含み得る。
【０１７９】
よって、開示される結合体化免疫グロブリンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：免疫グロブリン−発蛍光団結合体、免疫グロブリン−蛍光色素結合体、免疫グロブリン−ポリペプチド結合体、免疫グロブリン−免疫グロブリン結合体、免疫グロブリン−抗生物質結合体、免疫グロブリン−核酸結合体、免疫グロブリン−放射性核種結合体、免疫グロブリン−化学リンカー結合体、免疫グロブリン−低分子結合体、免疫グロブリン−キレート化剤結合体、免疫グロブリン−脂質結合体、および免疫グロブリン−薬物結合体。
【０１８０】
本明細書で開示される免疫グロブリンのうちのいずれかは、本明細書で開示される機能的作用物質のうちのいずれかに結合体化され得る。例えば、結合体化免疫グロブリンは、発蛍光団、蛍光色素、ポリペプチド、免疫グロブリン、抗生物質、核酸、放射性核種、化学リンカー、低分子、キレート化剤、脂質、または薬物を含み得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、低分子抗腫瘍薬剤（例えば、オーリスタチン）に結合体化され得る。いくつかの局面において、機能的作用物質は、オーリスタチンＦ（ＡｕＦ）であり得る。従って、開示される結合体化免疫グロブリンは、オーリスタチンＦに結合体化された上記で開示される免疫グロブリンのうちのいずれかを含む（ＡｕＦ−Ｔ１３５Ｋ結合体）。
【０１８２】
医薬組成物
本明細書で提供されるのはまた、医薬組成物である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書で開示される免疫グロブリンのうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書で開示される結合体化免疫グロブリンのうちのいずれかを含み得る。一実施形態において、医薬組成物は、結合体化免疫グロブリンおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１８３】
結合体化可能な免疫グロブリンをコードする核酸分子およびこれを含む宿主細胞
本明細書で開示される結合体化可能な免疫グロブリンまたはその抗原結合部分のうちのいずれかをコードする核酸分子もまた、本明細書で提供される。例として、一実施形態において、核酸分子は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む結合体化可能な免疫グロブリンをコードし、ここでそのコードされた結合体化可能な免疫グロブリンは、操作されたリジン残基を含み、ここでその操作されたリジン残基は、リジン残基挿入またはリジン残基に変異された天然アミノ酸残基である。免疫グロブリンまたはその抗原結合部分の操作されたリジン残基は、アシルドナー基質のグルタミン残基に結合体化され、それによって、結合体化免疫グロブリンを生成する。
【０１８４】
結合体化可能な免疫グロブリンまたはその抗原結合部分をコードする、開示される核酸分子またはプラスミドのうちのいずれかを含む宿主細胞もまた、開示される。適切な宿主細胞としては、いくつか例を挙げると、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
以下の実施例は、本明細書で開示される実施形態のうちのいくつかをさらに説明するために提供される。実施例は、開示される実施形態を例証することが意図されるのであって、限定することは意図されない。
【実施例】
【０１８６】
実施例１：材料および方法
【０１８７】
部位特異的変異誘発
【０１８８】
変異を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬを使用して、製造業者のプロトコルに従って生成した。望ましい変異を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１８９】
欠失変異誘発
Ｆａｂ発現のためのＨＣフラグメントを、種々の３’コドンにおいて終結するヒンジを通じてＨＣリーダー配列をＰＣＲ増幅することによって作製した。そのＰＣＲフラグメントを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキットを使用して、製造業者のプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に従って、ｐｃＤＮＡ３．１ベースの哺乳動物発現プラスミドへとクローニングした。
【０１９０】
トランスフェクションおよび安定な細胞株生成
ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅでトランスフェクトされる予定の細胞の各ミリリットルについて、３３３．３ｎｇ  ＨＣプラスミドおよび３３３．３ｎｇ  ＬＣプラスミドを、５〜１０分間、５０μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）中で接触させた。同様に、２．６７μＬ  ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを、５０μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭの中で接触させた。そのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液をＤＮＡ混合物に添加し、２０〜３０分間、室温においてインキュベートした。そのＤＮＡ：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を、細胞を回転させながらその細胞に添加し、３７℃において、８％  ＣＯ２で１２５ｒｐｍにおいて振盪しながらインキュベートした。翌日、細胞１ｍＬあたり５μＬのエンハンサー１および５０μＬのエンハンサー２をそのトランスフェクション（ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）に添加して、さらに７〜１０日間インキュベーションを継続した。
【０１９１】
抗体を発現する安定なプールを、トランスフェクションの１〜３日後に、１ｍＬのトランスフェクタントを５μｇ／ｍＬ  ブラストサイジンおよび４００μｇ／ｍＬ  ゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を有するＴ７５フラスコ中の１４ｍＬ  ＤＭＥＭ  に添加することによって選択した。薬物耐性細胞をコンフルエントになるまで成長させた後、その培地を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地で２４〜４８時間、置き換えた。フラスコを軽くたたくことによって細胞を物理的に移動させ（ｄｉｓｌｏｄｇｅｄ）（トリプシン処理は、低い生存性を生じた。データは示さず）、次いで、６×１０５  細胞／ｍＬで、１２５−ｍＬ振盪フラスコ中の３０ｍＬ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地に播種した。培養物を、３７℃において８％  ＣＯ２中、１２５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。
【０１９２】
ＭＡｂおよびＦａｂ生成
安定してトランスフェクトした細胞株プールを、０．６〜１×１０６  細胞／ｍＬでＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地に播種した。細胞を、３７℃、８％  ＣＯ２において、１２５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。培養物が１×１０６  細胞／ｍＬの密度に達して２日後に、培養物に、最終濃度１０ｇ／Ｌ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｏｙｔｏｎｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）、５ｍＭ  吉草酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）、および１：１００  ＣＤ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を供給した。細胞生存性が５０％未満（７〜１０日間）であった場合、培養物を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＬＡ８．１０００ローターで１時間、８０００ｒｐｍにおいて遠心分離した。次いで、その上清を、０．２μｍ  ＰＥＳフィルタを通して濾過し、４℃または−２０℃において、精製するまで貯蔵した。
【０１９３】
ＭＡｂおよびＦａｂ精製
ＭＡｂを、２つの方法のうちの１つを使用して精製した。１０ｍＬ未満のｍＡｂおよびＦａｂ上清に関しては、アフィニティークロマトグラフィーを、それぞれ、プロテインＡ樹脂または抗κ樹脂でのバッチ精製法を使用して行った。２５ｍＬより多いＭＡｂおよびＦａｂ上清は、それぞれ、プレパックプロテインＡまたは抗κカラムを使用して精製した。
【０１９４】
バッチ精製
Ｐｒｏｓｅｐ−ｖＡ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）をＤＰＢＳで平衡化し、１００μＬを、３〜６ｍＬのサンプルに添加した。４℃において１時間から一晩インキュベートした後に、その樹脂を１ｍＬ  ＤＰＢＳで３回洗浄し、１８，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。そのサンプルを、４００μＬ  ０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ２．９の添加によって樹脂から溶離し、続いて、１８，０００×ｇにおいて３０秒間遠心分離した。そのサンプルを、４０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。、０．５ｍＬ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、１０ｋカットオフフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を使用して、サンプルを、１８，０００×ｇにおいて３〜５分間遠心分離することによって約１００μＬへと濃縮することによって、その緩衝剤を交換した。その濃縮したサンプルを、４００μＬ  ＤＰＢＳ中で希釈し、続いて遠心分離した。そのプロセスを合計で４回反復した。
【０１９５】
カラム精製
プロテインＡまたはＨｉＴｒａｐ  ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  ＵＫ）を、１０カラム容積（ＣＶ）の２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２で平衡化した。次いで、サンプルを載せ、続いて、結合していない物質を、１０ＣＶの平衡化緩衝剤で洗浄した。そのサンプルを、５ＣＶの０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ２．９を使用して溶離した。ｍＡｂを含む画分をプールし、ＤＰＢＳ中、ＭＷＣＯ  ２０Ｋ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を使用して透析した。
【０１９６】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ基質合成
Ｚ−Ｇｌｎ−ＧｌｙをＢａｃｈｅｍから購入し、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンをＺＥＤＩＲＡから購入した（図２）。
【０１９７】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ペンタフルオロフェニルエステル（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＦＰ）
合成は、改変を加えたが、Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ（Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋら  １９９７）によって記載されるとおりであった（図３）。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（３２８．８ｍｇ，  ０．９７５ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（Ｓｉｇｍａ，  １８３．３ｍｇ，  ０．９９６ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬ  Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した。次いで、ＥＤＡＣ−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，  ２０１ｍｇ，  １．０４ｍｍｏｌ）を添加し、その反応物を、室温においてＮ２の下で２時間インキュベートした。１００ｍＬの冷ジエチルエーテルをその反応物に添加し、一晩、−８０℃において沈殿させた。その粗製生成物を遠心分離によって集め、２０ｍＬ  ６０℃  メタノールから再結晶化した。その最終生成物を、冷ジエチルエーテルですすぎ、Ｎ２の流れで乾燥させた。最終収量は、２１９．０４ｍｇ（４４．７％）であった。エレクトロスプレーイオン化−質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）（０．１％  ギ酸中の５０％  アセトニトリルの中で直接注入）  ｍ／ｚ  ５０４．０  （［Ｍ＋Ｈ］，  ８６％），  ５２６．０  （［Ｍ＋Ｎａ］，  １００％），  ５４２．０  （［Ｍ＋Ｋ］，  ２２％）。
【０１９８】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−プロピルアジド（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３）
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＦＰ（２１．２４ｍｇ，  ４．２２×１０−５ｍｏｌ）およびアジドプロピルアミン（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，  ＤＭＦ中の４２．２μＬの０．９１Ｍ  ストック溶液、３．８４×１０−５ｍｏｌ）を０．４２ｍＬ  最終容積のＤＭＦ中に溶解した。反応物を、Ｎ２下で一晩、室温において撹拌した。生成物を、Ｈ２Ｏ中０．１％  ギ酸／アセトニトリル中０．１％  ギ酸の移動相を使用して、ＨＰＬＣによって精製した。生成物を、真空中で乾燥させた。最終収量は、１０．７ｍｇ（６０．４％）であった。ＥＳＩ−ＭＳ（勾配精製）  ｍ／ｚ  ４２０．２  （［Ｍ＋Ｈ］，  １００％），  ４４２．１  （［Ｍ＋Ｎａ］，  ３２％）。
【０１９９】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ビシクロノニン（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮ）
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＦＰ（１８．４ｍｇ，  ３．６６×１０−５ｍｏｌ）およびＮ−［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルオキシカルボニル］−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、０．３７ｍＬ最終容積のＤＭＦ中に溶解した。反応物を、Ｎ２下で一晩、室温において撹拌した。生成物を、Ｈ２Ｏ中０．１％  ギ酸／アセトニトリル中０．１％  ギ酸の移動相を使用するＨＰＬＣによって精製した。生成物を、真空中で乾燥させた。最終収量は、０．６ｍｇ（２％）であった。ＥＳＩ−ＭＳ（勾配精製）  ｍ／ｚ  ６８８．２  （［Ｍ＋Ｈ］，  １００％），  ７１０．２  （［Ｍ＋Ｎａ］，  ６９％）。
【０２００】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−オーリスタチンＦ（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦ）
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＦＰ（２２．２ｍｇ，  ４．３７×１０−５ｍｏｌ）を０．８５ｍＬ  ＤＭＦ中に溶解し、１，２−エチレンジアミン（２．３×１０−５Ｌ，  ３．５×１０−４ｍｏｌ）を添加し、混合した。反応物をＮ２下で一晩、室温において撹拌した。生成物を、Ｈ２Ｏ中０．１％  ギ酸／アセトニトリル中０．１％  ギ酸の移動相を使用するＨＰＬＣによって精製した。生成物を真空中で乾燥させた。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ２の最終収量は、３．８ｍｇ（２３％）であった。ＥＳＩ−ＭＳ（勾配精製）  ｍ／ｚ  ３８０．１  （［Ｍ＋Ｈ］，  １００％）。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（３．８ｍｇ，  １．０１×１０−５ｍｏｌ）およびＮＨＳ−ＰＥＧ２−ＡｕＦ（１０．３ｍｇ，  １．０３×１０−５ｍｏｌ）を、０．２ｍＬ  ＤＭＦ中に溶解した。トリエチルアミン（１４μＬ，  １×１０−４ｍｏｌ）を添加し、反応物をＮ２下で一晩、室温においてインキュベートした。その反応物の半分を、Ｈ２Ｏ中０．１％  ギ酸／アセトニトリル中０．１％  ギ酸の移動相を使用するＨＰＬＣによって精製した。生成物を真空中で乾燥させた。ＣＢＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦの最終収量は、３．８ｍｇ（６０％）であった。ＥＳＩ−ＭＳ（勾配精製）  ｍ／ｚ  ６３４．０  （［Ｍ＋Ｈ］２＋，１００％），  ６４５．１（［Ｍ＋Ｎａ］２＋，４５％）。  １２６７．０  （［Ｍ＋Ｈ］，  １６％）。
【０２０１】
微生物のトランスグルタミナーゼ反応
１００μｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬの濃度の範囲に及ぶＭＡｂを、７８５μＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ビオチン（Ｚｅｄｉｒａ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮ、またはＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦと、１Ｕ／ｍＬ  微生物のトランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）とを、ＤＰＢＳ中で少なくとも１６時間にわたって３７℃において接触させた。
【０２０２】
ハイスループットｍＴＧａｓｅアッセイ
５００ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度の範囲に及ぶＭＡｂを、ＤＰＢＳ中の６０μＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ビオチンおよび０．１Ｕ／ｍＬ  ｍＴＧａｓｅ（Ｚｅｄｉｒａ）とともに、少なくとも１６時間、３７℃においてインキュベートした。９６ウェルプレートを、１μｇ／ｍＬ  ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ  ｍＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｓｅａｒｃｈ）で一晩、４℃においてコーティングした。そのプレートを洗浄した後、一晩のｍＴＧａｓｅ反応物を、５０μＬ  ＤＰＢＳ中で１：１０希釈し、プレートに添加し、１時間、２２℃においてインキュベートした。次いで、そのプレートを洗浄し、０．１μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｓｅａｒｃｈ）を、そのウェルに添加した。そのプレートを再び洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ結合ビオチン化サンプルを、ＱｕａｎｔａＢｌｕｅ基質（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して製造業者のプロトコルに従って、相対蛍光単位（ＲＦＵ）において定量した。
【０２０３】
ｍＡｂ結合体化の超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）／ＥＳＩ−ＭＳ分析
精製抗体を、ＤＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬへと希釈した（１．０ｍｇ／ｍＬ未満であれば、サンプルを、元の濃度のままにしておいた）。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む反応物を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用して脱塩した。次いで、そのｍＡｂを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（ＮＥＢ）を使用して脱グリコシル化するか、またはＩｄｅＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＦａｂ’２およびＦｃフラグメントへと消化するかのいずれかであった。ｍＡｂを脱グリコシル化するために、Ｇ７緩衝剤（５または１０μＬ）およびＰＮＧａｓｅ  Ｆ（１または２μＬ）をそのｍＡｂ（５０または１００μＬ）に添加した。その反応物を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波（ＣＥＭ）で２サイクル、インキュベートした：１．）マイクロ波出力１０Ｗ、３７℃、１０分間、およびその後、３〜５分間待機；２．）マイクロ波出力２Ｗ、３７℃、１０分間。その脱グリコシル化したサンプルのうちの一部を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度２０ｍＭまで添加し、続いて、６０℃において３分間インキュベートすることによって還元した。Ｆａｂ’２およびＦｃフラグメントを生成するために、５０Ｕ／μＬのＩｄｅＳを０．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂへと添加し、３７℃において０．５〜１時間インキュベートした。そのＩｄｅＳサンプルを、還元したかまたは還元しなかった。
【０２０４】
次いで、サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣおよびＱ−Ｔｏｆ  Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計を使用して分析した。サンプル（各０．５〜２μｇ）を、ＭａｓｓＰｒｅｐマイクロ脱塩カラムに６５℃で注入し、９５％の移動相Ａで５分間の平衡化、１０分間の勾配（５−９０％  Ｂ）および９５％の移動相Ａで１０分間の再平衡化を行う、そのカラムから、０．０５ｍＬ／分で溶離した。移動相Ａは、水中０．１％  ギ酸であった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％  ギ酸であった。Ｑ−Ｔｏｆ質量分析計を、陽イオン、５００〜４０００ｍ／ｚの範囲の検出を伴うＶモードで実行した。ソースパラメーターは、以下のとおりであった：キャピラリー電圧、２．２５ｋＶ（無傷の抗体）〜２．５０ｋＶ（還元した抗体）；サンプリングコーン電圧、６５．０Ｖ（無傷の抗体）または５０．０Ｖ（還元した抗体）；ソース温度、１００℃；脱溶媒温度、２５０℃；脱溶媒ガスフロー、５５０Ｌ／時間。タンパク質ピークを、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ＭａｘＥｎｔ  １関数を使用してデコンボリューションした。
【０２０５】
逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ
サンプルを、逆相液体クロマトグラフィーを使用して分析した。１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で１００μＬのＡＤＣを含むサンプルを２０ｍＭ  ＤＴＴで６０℃において３分間還元した。そのサンプルを、ＳＱＤおよびＰＤＡ検出器を備えるＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣを使用して分析した。各サンプルを、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ  ＲＰ−１０００カラム（５μ、４．６×１５０ｍｍ、Ｓｅｐａｘ）に６５℃において注入した。ＬＣ変異体およびＨＣ変異体に関しては、そのＬＣおよびＨＣの分離は、７５％の移動相Ａ（水中０．１％  ＴＦＡ）中での３．０分間の平衡化、および２７分間の勾配（２５−５５％  移動相Ｂ［水中０．１％  ＴＦＡ］）で、流速１ｍＬ／分で行った。
【０２０６】
ＳＱＤ質量分析計を、陽イオン、２００〜２０００ｍ／ｚの範囲の検出を伴うＶ−モードで実行した。ソースパラメーターは、以下のとおりであった：キャピラリー電圧、３．２０ｋＶ；サンプリングコーン電圧、４０℃；ソース温度、１５０℃；脱溶媒温度、２５０℃；脱溶媒ガスフロー、７００Ｌ／時間。スキャン時間、１秒。タンパク質ピークを、ＭａｓｓＬｙｎｘ  ＭａｘＥｎｔ  １関数によってデコンボリューションした。ＰＤＡ検出器は、２８０ｎｍであった。
【０２０７】
ＤＡＲを、非結合体化および結合体化ＬＣ、ならびに非結合体化および結合体化ＨＣの相対的シグナル強度に基づいて計算した。全ＤＡＲを、以下の式を使用して計算した：全ＤＡＲ＝（ＤＡＲ  ＬＣ＋ＤＡＲ  ＨＣ）×２。
【０２０８】
実施例２：ＩｇＧ抗体上の溶媒に露出されたリジンの分析
【０２０９】
ＩｇＧ抗体上の溶媒に露出されたリジンの利用可能性をさらに研究するために、ＩｇＧ１−κＦａｂ（４Ｆ３Ｆ）、ＩｇＧ１−λＦａｂ（４ＨＫ０）、およびＩｇＧ１  Ｆｃ（１ＦＣ１）の結晶構造は、潜在的アシルアクセプター部位について試験した。ｍＴＧａｓｅは、ループ内の溶媒に露出された基質グルタミンおよびリジンを好む傾向にある（Ｓｐｏｌａｏｒｅら  ２０１２）ので、溶媒に露出されたリジンは、１．４Åプローブ半径でＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｖ４．５を使用して強調した（図４）。抗体０１のＶＨ中には、７個の溶媒に露出されたリジンが存在し、ターンまたはループの中には３個がある。リジンの数は、異なる生殖系列可変領域ファミリーおよび体細胞超変異の利用に起因して、ｍＡｂ間で変動し得るので、５種の他の抗体のＶＨ領域におけるリジンの溶媒露出をまた、４Ｆ３Ｆ構造における残基の類似位置に基づいて分析した。これらのＶＨ領域は、１〜５個の溶媒に露出されたリジンを潜在的に含み、ターンまたはループの中には１個または２個が存在する。抗体０１のＶκには、６個の溶媒に露出されたリジンが存在し、ループまたはターンの中には４個が存在する。４種の他の抗体に由来するＶＫ領域は、潜在的に３〜５個の溶媒に露出されたリジンを含み、ループまたはターンの中には、２個が存在する。抗体０５は、λ鎖を利用し、リジンの溶媒露出は、軽鎖の配列類似性に基づいて４ＨＫ０の結晶構造を使用して決定した。抗体０５は、Ｖλドメインにおいて２個の溶媒に露出されたリジンを潜在的に有し、ループの中には、１個のみが存在する。ＩｇＧ１定常ドメインは、２３個の溶媒に露出されたリジンを有し、ループまたはターンの中には１３個が存在する（図６）。κ定常領域は、８個のリジンを有し、ターンまたはループの中には５個が存在する。λは、６個の溶媒に露出されたリジンを有し、ループまたはターンの中には半数が存在する。全体では、その分析した抗体は、ｍＡｂ１個あたりループまたはターンの中には４２〜５０個の溶媒に露出されたリジンに及ぶ。
【０２１０】
微生物のトランスグルタミナーゼがＩｇＧ抗体上の天然のリジン残基をアミド基転移し得るかどうかを決定するために、抗体を、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。そのサンプルをＩｄｅＳで消化し、ＤＴＴで還元し、ＬＣフラグメント、Ｆｄフラグメント、およびＦｃフラグメントの質量を質量分析によって分析した。Ｇ０Ｆ（＋１４４５Ｄａ）およびＧ１Ｆ（＋１６０８Ｄａ）糖形態に相当する２個の質量ピークを、各Ｆｃに関して観察した。抗体０４はまた、ＶＨにおいてＮ結合型グリコシル化部位を含み、２種のグリカン種、Ｇ２ＦＳグリカンおよびＧ２ＦＳ２グリカンが観察された。全てのサンプルは、Ｆｃの観察された質量と理論的質量との間で、−１３０〜−１３２Ｄａの差異によって明らかにされるように、Ｃ末端リジン（１２８Ｄａ）を欠いた。種々の抗体において４２〜５０個の潜在的アシルアクセプターリジンが存在するが、驚くべきことに、ＨＣもＬＣも、アシルドナー基質によって改変されなかった（図７；表１）。
【表１】
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表１：ＬＣ、Ｆｄ、およびＦｃの質量を、ＥＳＩ−ＭＳによって決定した。各フラグメントの理論的質量をアミノ酸配列によって決定し、実測した質量から差し引いて、質量の変化（Δ質量）を決定した。−１２８ＤａというΔ質量は、Ｌｙｓ４４７の切断に起因する。Ｆｃは、１または２個のオリゴサッカリド、Ｇ０ＦまたはＧ１Ｆでグリコシル化される。
【０２１１】
実施例３：アシルアクセプター部位を作製するための、リジンへの天然アミノ酸残基の変異
【０２１２】
ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂにアシルアクセプター部位は存在しないので、リジンスキャニング変異誘発を、抗体０１に対して行って、アシルアクセプター部位（複数可）を導入するように操作され得る領域を同定した。新規アシルアクセプター部位を同定する機会を増加させるために、変異誘発を、ヒトＩｇＧ１  ＨＣの定常領域ならびにκＬＣおよびλＬＣのループまたはターン内の溶媒に露出された残基に限定した（図６）。変異体ｍＡｂを、変異体を、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートすることによって、ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用してアミド基転移に関して最初にスクリーニングした。ＭＡｂを、抗Ｆｃγコーティングプレート上で捕捉し、ビオチン化ｍＡｂを、ＨＲＰ結合体化ストレプトアビジンによって検出した。野生型抗体０１および抗体０１−Ｌ（これはＬｙｓ４４７においてアミド基転移される）を、それぞれ、陰性コントロールおよび陽性コントロールとして含めた。陽性コントロール抗体０１−Ｌのシグナルは、１２，０００  ＲＦＵより大きく、変異体ｍＡｂは、約１１００  ＲＦＵ〜約１１，０００  ＲＦＵの範囲に及んだ（図７）。
【０２１３】
Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙへの全てのＣＨ１および上部ヒンジ変異体のアミド基転移を、ＥＳＩ−ＭＳによって分析して、結合体化のパーセンテージがＥＬＩＳＡアッセイにおいて認められたＲＦＵシグナルと相関するかどうかを決定した。サンプルを、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙとともに一晩、３７℃においてインキュベートし、それらの質量を、ＥＳＩ−ＭＳによって分析した。ＥＬＩＳＡからのＲＦＵシグナルは、ＥＳＩ−ＭＳデータと大部分は相関し、この場合、７０００より大きなＲＦＵは、変異体Ｓ１３６Ｋ、Ｄ２２１Ｋ、Ｔ２２３Ｋ、およびＨ２２４Ｋの＞７０％  結合体化に相当した（図７）。Ｔ１３５ＫおよびＴ２２５ＫのＲＦＵシグナルは、７０００未満であったが、それら変異体は、それぞれ、８０．４％および１００％が結合体化された。対照的に、変異体Ｇ１３７Ｋは、８６１６というＲＦＵを有したが、３８．９％しか結合体化されなかった。従って、ＲＦＵシグナル＞７０００は、アミド基転移の高いパーセンテージに相当する一方で、少数の偽陽性および偽陰性が存在した。残りの変異体のロースループットＥＳＩ−ＭＳスクリーニングを行うよりむしろ、カットオフ＞４０００ＲＦＵを使用して、分析用のＣＨ２およびＣＨ３サンプルを選び出した。４０００ＲＦＵより大きなものは、２種のκサンプルのみでλサンプルはそうではなかったので、３０００ＲＦＵより大きなサンプルも分析した。
【０２１４】
アミド基転移反応は、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅを一晩、３７℃において、ＣＨ２変異体Ｍ２５２Ｋ、Ｅ２８３Ｋ、Ａ２８７Ｋ、およびＮ２９７Ｋ；ＣＨ３変異体Ｐ３４３Ｋ、Ｇ３８５Ｋ、Ｇ４２０Ｋ、Ｈ４３３Ｋ、Ｌ４４３Ｋ、Ｓ４４４Ｋ、およびＰ４４５Ｋ；κ変異体Ｄ１５１Ｋ、Ｌ２０１Ｋ、Ｓ２０２Ｋ、およびＥ２１３Ｋ；ならびにλ変異体Ｖ１４７Ｋ、Ｑ１８７Ｋ、およびＥ２１３Ｋとともにインキュベートすることによって行い、その後の分析を、ＥＳＩ−ＭＳによって行った（図７）。３種のさらなるＣＨ１変異体、Ｓ１９１Ｋ、Ｓ１９２Ｋ、およびＬ１９３Ｋを、ＥＳＩ−ＭＳによって分析したが、最初のＥＬＩＳＡスクリーニングには含まれていなかった。これらの変異体のうち、ＣＨ１変異体Ｌ１９３Ｋ、ＣＨ２変異体Ｍ２５２Ｋ、ＣＨ３変異体Ｐ４４５Ｋ、κ変異体Ｌ２０１ＫおよびＳ２０２Ｋ、ならびにλ変異体Ｅ２１３Ｋは、７０％より多くが結合体化された（図７）。ＣＨ２変異体Ｎ２９７Ｋの結果は、非常に低いシグナルに起因して、結論に達しなかった。
【０２１５】
最高の結合体化効率を有すると同定された変異体を、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチン基質を使用して単一のの実験において再分析した。ＥＳＩ−ＭＳ分析の前にそのサンプルをＩｄｅＳで消化し、還元して、Ｆｄフラグメント（ＣＨ１およびヒンジ）、Ｆｃフラグメント（ＣＨ２およびＣＨ３）、およびＬＣフラグメントを生成することによって、結合体化の領域を確認した。Ｎ２９７Ｋへの結合体化は、繰り返しになるが、高Ｆｄシグナルおよび高ＬＣシグナルにも拘わらず、低いＦｃシグナルに起因して、結論に達しなかった。サンプルのアミド基転移は、リジン変異を含むドメインに全て相関した。Ｔ１３５Ｋ変異体およびＰ４４５Ｋ変異体は、１００％結合体化され、Ｍ２５２Ｋへの結合体化は、ほぼ１００％であった（図８）。Ｓ１３６Ｋ変異およびＳ２２１Ｋ変異は、８０％より多くが結合体化された。他の３種のヒンジ変異体は、５０％未満という結合体化効率を有した。両方のＬＣ変異体が、８０％より多くが結合体化した。
【０２１６】
実施例４：アシルアクセプター部位を作製するリジン残基の挿入
【０２１７】
残基Ｓｅｒ１９０からＴｈｒ１９５までは、β鎖ＥおよびＦを接続するβターンを形成する。この露出された領域を通じてのリジンスキャニングは、唯一の部位−１９３位−が、受容可能なアシルドナー部位であることを示した。この領域は、αヘリックスを形成し、この二次構造がこの領域におけるアミド基転移を防止する可能性があった。この領域における構造を潜在的に破壊するために、リジンを、Ｓｅｒ１９１とＳｅｒ１９２との間、Ｓｅｒ１９２とＬｅｕ１９３との間、またはＬｅｕ１９３とＧｌｙ１９４との間に挿入した。サンプルを、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートし、それらの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析した。Ｓｅｒ１９１とＳｅｒ１９２との間、またはＳｅｒ１９２とＬｅｕ１９３との間のリジンの挿入は、１００％がアミド基転移したが、Ｌｅｕ１９３とＧｌｙ１９４との間に挿入された場合には、アミド基転移しなかった（表２）。
【表２】
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ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。還元しなかったｍＡｂの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析し（データは示さず）、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を、上記のように決定した。ＤＡＲを、そのΔ質量を、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンの質量で除算することによって決定した。
【０２１８】
実施例５：ＬＣ  Ｃ末端へのリジンの付加から生じるアミド基転移
【０２１９】
Ｌｙｓ４４７の切断が、４４８位でのさらなるＣ末端残基によってブロックされる場合に、ＨＣ  Ｃ末端Ｌｙｓ４４７残基がアミド基転移の部位であることは、以前に示された（米国仮特許出願第６２／２６９，１３８号（２０１５年１２月１８日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７１６５（２０１６年１２月１６日出願）を参照のこと。これらの各々の内容全体が、本明細書に参考として明示的に援用される）。１個のＣ末端リジン伸長がアシルアクセプター部位として作用するために十分であるかどうかを決定するために、リジンをＬＣのＣ末端に操作した。ＨＣにおける天然のＣ末端リジンとは対照的に、ＬＣ上のＣ末端リジンは、カルボキシペプチダーゼによって切断されなかった（表３）。しかし、この操作されたリジンは、アシルアクセプター部位ではなかった。ＨＣのＣ末端のＬｙｓ−Ｌｅｕモチーフが効率的にアミド基転移されるので、さらなるロイシンをその操作されたリジンのＣ末端に操作した（ＬＣ−ＫＬ）。しかし、ＬＣ−ＫＬは、アミド基転移されなかった。ＬＣにおける天然のＣ末端システイン（Ｃｙｓ２１４）は、ＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、この領域は、この領域の結晶構造に埋まっている（データは示さず）。立体障害または溶媒露出の欠如がアミド基転移を防止することは、あり得る。単一ののロイシンを、リジンをＭＴＧａｓｅによりアクセス可能にする試みで、Ｃｙｓ２１４とそのリジンとの間に付加した。繰り返すと、切断はＣ末端リジンに対して認められず、アミド基転移はＬＫモチーフに対して観察されなかった。しかし、ＬＫＬモチーフを有するＬＣの９．１％が、アミド基転移した。リジンを、ＬＣ−ＨＣ界面からさらに離れて伸長するために、Ｃｙｓ２１４とそのリジンとの間にＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを挿入した。この伸長は、Ｃ末端リジン（ＧＧＳＧＫ）の切断を生じた。Ｃ末端ロイシンの付加（ＧＧＳＧＫＬ）によるリジンの切断の防御は、７７．８％がアミド基転移されているＬＣを生じた。
【表３】
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ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。還元したＬＣの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析し、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を（表１）にあるように決定した。
【０２２０】
実施例６：さらなるアシルドナーの分析
【０２２１】
ｍＡｂ上のアシルアクセプターへの結合体化の１つの有用性は、部位特異的ＡＤＣの製造に関するものである。ｍＡｂへの機能的作用物質の結合体化は、２つの方法のうちの１つによって達成できた。第１に、２ステップ方法は、反応性基（例えば、ＢＣＮ、ＤＢＣＯ、ＴＣＯ、アジド（Ｎ３）、アルキン、テトラジン、またはマレイミド）を用いて合成したアシルドナーへのリジンのｍＴＧａｓｅ結合体化を要求する。その第２のステップは、例えば、銅を含まないクリックケミストリーまたはチオール反応性化学的作用を使用して、反応性基への機能的作用物質の結合体化を含む。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３は、市販されていない；従って、アミノプロピル−Ｎ３を、方法の節に詳述されるようにＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙのヒドロキシル基に付加した。ＨＣまたはＬＣにおいてリジン変異を有する抗体０１を、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３またはＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮおよびｍＴＧａｓｅとともに上記のようにインキュベートした。そのサンプルを脱塩し、ＬＣ−ＭＳによって分析して、ｍＡｂへの基質の付加を決定した。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３を、大部分のリジン置換に関して効率的に（＞７５％  結合体化またはＤＡＲ  １．５）付加した（表４）。アミド基転移の最も許容される部位は、ＨＣ−Ｓ１３５Ｋ、ＨＣ−Ｌ１９３Ｋ、ＨＣ−Ｄ２２１Ｋ、ＨＣ−Ｍ２５２Ｋ、ＨＣ−Ｎ２９７Ｋ、ＨＣ−Ｐ４４５Ｋ、およびＬＣ−Ｌ２０１Ｋであった。変異体ＨＣ−Ｔ１３６Ｋ、ＨＣ−Ｔ２２３Ｋ、ＨＣ−Ｔ２２５Ｋ、ＬＣ−Ｓ２０２Ｋ、およびＬＣ−ＧＧＳＧＫＬは全て、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンで＞７５％がアミド基転移された（図７）が、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３ではアミド基転移されなかった。従って、全てのアシルドナーがその同じアシルアクセプター部位を等しくアミド基転移するわけではない。これはまた、アシルアクセプター部位が効率的にアミド基転移されなかったＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮによって実証された（表４）。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３とは対照的に、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮによるアミド基転移のパーセンテージは、アシルアクセプター部位の間では広く変動しなかった。例えば、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３によるＴ１３５ＫおよびＳ１３６Ｋのアミド基転移において３２％の差異が存在したが、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮでは、差異はわずか４％であった。
【表４】
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ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮ、またはＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。還元したｍＡｂの質量をＬＣ−ＭＳ分析し（データは示さず）、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を（表１）にあるように決定した。
【０２２２】
興味深いことに、Ｄ２２１ＫおよびＮ２９７Ｋへの結合体化は、ＨＣにおいて複数の結合体化部位を生じた。Ｄ２２１Ｋ変異は、Ｌｙｓ２２２に隣接しているが、Ｌｙｓ２２２は、代表的にはアシルアクセプター部位ではない。おそらく、隣接するリジンの存在が、Ｌｙｓ２２２の低レベルのアミド基転移を促進する。注目すべきは、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３基質のみが、Ｄ２２１Ｋ変異体において１個より多くの部位で結合体化される。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３という構造は、試験した他の基質より小さく（図２）、そして第２の結合体化部位の立体障害が、他の基質によるそのアミド基転移をブロックする可能性がある。
【０２２３】
Ｎ２９７Ｋ変異は、Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化部位を除去する。非グリコシル化ｍＡｂは、グリコシル化形態とは異なる構造をとる。Ｎ２９７Ｑ変異はまた、非グリコシル化ｍＡｂを生じ、Ｇｌｎ２９５が次いで種々のアシルアクセプター基質によってアミド基転移されるような様式で、その構造を混乱させる（ｐｅｒｔｕｒｂ）（Ｍｉｎｄｔ，  Ｔ．Ｌ．ら，  ２００８，  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｉａ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ  １９：２７１−２７８；  Ｊｅｇｅｒ，Ｓ．ら，  ２０１０，  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４９：９９９５−９９９７；  Ｄｅｎｎｌｅｒ，  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｙｉｅｌｄｓ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ  ２５：５６９−５７８）。Ｎ２９７Ｋは、天然リジンを生じるＣＨ２領域がＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３のアシルアクセプター部位に現在なっているという確認をおそらく変化させる。
【０２２４】
第２の結合体化法は、単一の結合体化ステップを含み、それによって、機能的作用物質は、アシルドナー基を用いて合成される。この方法は、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ基をＰＥＧ２−オーリスタチンＦ上に合成する（Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦ）ことによって試験した。そのＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦを、抗体０１  ＨＣおよびＬＣリジン変異体ならびにｍＴＧａｓｅとともに一晩、３７℃においてインキュベートした。そのサンプルを脱塩し、ＬＣ−ＭＳによって分析して、ｍＡｂへの基質の付加を決定した。試験した全てのＨＣ変異体は、結合体化の種々の量を示した（表４）。ある種の部位での結合体化の効率は、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３で認められる結合体化の効率と一致しなかった。Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦへの結合体化は、Ｔ１３５Ｋ、Ｌ１９３Ｋ、およびＤ２２１Ｋに関しては低かったが、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３に対しては高かった。Ｌ２０１Ｋは、最も効率的であり、ＬＣの９２％が、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦに結合体化した。Ｎ２９７Ｋは、繰り返しになるが、複数の結合体化部位を示したが、その効率は、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３ほど高くなかった。
【０２２５】
実施例７：単一の抗体上での複数のアシルアクセプター部位の生成
【０２２６】
１個の操作されたアシルアクセプター部位を有する変異体ｍＡｂは、２という理論的ＤＡＲを生じる。複数の操作されたアシルアクセプター部位を組み合わせることによって、その理論的ＤＡＲは、各部位に対して２増加する。ＡＤＣの薬物負荷を増加させると、ｍＡｂあたりの標的細胞へのより多くの細胞傷害性薬物の送達が生じ、これは、より低い患者投与を可能にし得る。複数のアシルアクセプター部位が、２より大きな機能的作用物質  対  免疫グロブリンの比を有するｍＡｂを生じ得るかどうかを決定するために、ｍＡｂを操作して、それぞれ、４個、６個、８個または６個のアシルアクセプター部位を有するｍＡｂを生じるように、ＣＨ１変異Ｔ１３５ＫまたはＳ１３６Ｋ、ＣＨ１−ＣＨ２変異Ｓ１３６Ｋ−Ｎ２９７Ｋ、ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３変異Ｓ１３６Ｋ−Ｎ２９７Ｋ−Ｐ４４５Ｋ、またはＣＨ１−ＣＨ３変異Ｔ１３５Ｋ−Ｌ４４８と組み合わせて、ＬＣ変異体Ｌ２０１ＫまたはＳ２０２Ｋを含めた。
【０２２７】
Ｔ１３５Ｋベースのサンプルを、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートし、それらの質量を、還元後にＬＣ−ＭＳによって分析した。Ｌ２０１Ｋ  ＬＣは、全てのサンプルにおいて１００％が結合体化された（表５）。単一Ｔ１３５ＫＨＣ変異体におけるＳ２０２Ｋ  ＬＣは、二重Ｔ１３５Ｋ−Ｌ４４８ＨＣ変異体の効率の２倍より大きかった（６９．８％  対  ３１．８％）。Ｔ１３５Ｋは、Ｌ２０１ＫＬＣ変異のみと組み合わせた場合に１００％が結合体化され、４．０というＤＡＲを生じた。Ｓ２０２ＫＬＣ変異との組み合わせにおいて、結合体化は、３．１７という平均ＤＡＲを有して８８．７％へと低下した。Ｔ１３５ＫとＬ４４８ＨＣ変異とを組み合わせると、ｍＡｂへの１００％  結合体化が生じた。しかし、そのＤＡＲは、７７．１％がＨＣあたり２個のビオチンを含み、２２．９％が１個のみのビオチンを含むゆえに不均一であり、３．５４という平均ＤＡＲを生じた。二重ＨＣ変異をＬＣ変異と組み合わせた場合、ＨＣへの結合体化効率は低下した。ＤＡＲ  １である種の量は、２倍より高く、ＤＡＲ  ２である種は、２．３倍〜６．５倍低下した。６という潜在的ＤＡＲを有するこれら２種のｍＡｂにも拘わらず、その平均ＤＡＲは、４未満であった。
【表５】
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ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートした。還元したＴ１３５Ｋ変異体の質量をＬＣ−ＭＳによって分析し、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を上記のように決定した。Ｓ１３６Ｋ変異体ｍＡｂをＩｄｅＳで消化し、還元し、ＥＳＩ−ＭＳによって分析した。Ｆｃフラグメントのシグナルは、低すぎて分析できなかった。
【０２２８】
Ｓ１３６ＫＨＣ変異を含むサンプルを、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートし、それらの質量を、ＩｄｅＳ消化および還元後にＥＳＩ−ＭＳによって分析した。全てのサンプルのＣＨ１および軽鎖を、アミド基転移した（表５）。Ｓ１３６Ｋは、全サンプルに関して８４．５％〜８８．１％が結合体化された。Ｓ２０２Ｋアミド基転移は、二重および三重ＨＣ変異体に対して単一Ｓ１３６Ｋ変異体においてより高かった。（５６％または５９．７％に対して７２．５％）。Ｓ１３６ＫＨＣ／Ｓ２０２ＫＬＣのＤＡＲは、４個の潜在的部位のうちで、３．１６であった。Ｎ２９７Ｋ変異を含むＦｃフラグメントのＥＳＩ−ＭＳシグナルは非常に低く、結合体化効率は、決定できなかった。従って、二重および三重ＨＣ変異体のＤＡＲは、少なくとも２．９５および２．８であった。
【０２２９】
他のアシルドナー基質による複数の部位のアミド基転移もまた、試験した。Ｔ１３５Ｋベースの変異体を、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮ、またはＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＡｕＦおよびｍＴＧａｓｅとともに一晩、３７℃においてインキュベートした。その基質の各々によるＬＣ  Ｌ２０１ＫおよびＳ２０２Ｋ部位への結合体化は、これらの複数の変異体ｍＡｂと表４に示される単一のＬ２０１ＫおよびＳ２０２Ｋ変異との間で類似であったが、ただし、ＬＣ変異へのＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰＥＧ２−ＢＣＮの結合体化は観察されなかった（図１１）。単一のＴ１３５Ｋ変異と単一のＬＣ変異を含む２種の変異体は、全てのアシルドナー基質に関して、表４における単一のＴ１３５Ｋに類似であるＴ１３５Ｋへの結合体化効率を示した。第２の変異を付加すると、Ｌ４４８変異は、ＨＣに関してＤＡＲ  １およびＤＡＲ  ２を有するサンプルの混合物を生じた。最も効率的にアミド基転移したサンプルは、Ｔ１３５ＫＨＣ／Ｌ２０１ＫＬＣ＋Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３（４のうち、ＤＡＲ  ３．５７）、Ｔ１３５Ｋ−Ｌ４４８ＨＣ＋Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３（４のうち、ＤＡＲ  ３．１）、およびＴ１３５Ｋ−Ｌ４４８ＨＣ／Ｌ２０１ＫＬＣ＋Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｎ３（６のうち、ＤＡＲ  ５．０４）であった。
【０２３０】
実施例８：他のＩｇＧアイソタイプにおけるリジン置換の分析
【０２３１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のＦｃは、８９．２％同一である（図１０，アラインメント配列）ので、ＩｇＧ１に類似のＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４における位置でのリジン挿入または置換は、ｍＴＧａｓｅのための操作されたアシルアクセプター部位であり得ることが、考えられた。第１に、野生型ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を分析して、これらのアイソタイプに特異的な任意の天然のアシルアクセプター部位が存在するかどうかを決定した。ＭＡｂを、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートした。そのサンプルを、ＩｄｅＳで消化し、そのＦｃの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析した。ＩｇＧ１と同様に、野生型ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のアミド基転移は存在しなかった（表６）。
【表６】
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ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートし、続いて、ＩｄｅＳで消化して、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃフラグメントを生成した。ＩｄｅＳで生成したＦｃフラグメントの質量を、ＥＳＩ−ＭＳによって上記のように分析し、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンへの％結合体化（Δ質量＝６３１Ｄａ）を、本明細書で開示されるように決定した。
【０２３２】
リジン置換を、ＩｇＧ１に類似の位置（Ｍ２５２、Ｎ２９７、およびＰ４４５）において行った。４４５位においてロイシンをコードするＩｇＧ４を除いて、これらの残基における差異は、アイソタイプ間で存在しない（図１０）。変異体ｍＡｂを、ｍＴＧａｓｅおよびＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートした。そのサンプルを、ＩｄｅＳで消化し、Ｆｃの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析した。変異体Ｎ２９７ＫおよびＭ２５２Ｋを効率的にアミド基転移したところ、Ｎ２９７Ｋ変異体は、ＩｇＧ１と同様に、ＨＣあたり１個より多くの結合体化部位を生じた（表７）。ＩｇＧ２−Ｎ２９７ＫおよびＩｇＧ４−Ｎ２９７Ｋは、２個のアシルアクセプター部位を含んだ一方で、ＩｇＧ３は、３個を含んだ。変異体Ｐ４４５Ｋは、ＩｇＧ２アイソタイプに関してのみ効率的にアミド基転移した。Ｐ４４５Ｋアミド基転移は、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に関しては、それぞれ、６２．６％および５０．６であるに過ぎなかった。
【表７】
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ＭＡｂを、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンおよびｍＴＧａｓｅとともに、３７℃において一晩インキュベートし、続いて、ＩｄｅＳで消化して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｃフラグメントを生成した。ＩｄｅＳで生成したＦｃフラグメントの質量を、ＥＳＩ−ＭＳによって上記のように分析し、Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチン（Δｍａｓｓ＝６３１Ｄａ）への％結合体化を、本明細書で開示されるとおりに決定した。
【０２３３】
実施例９：Ｆａｂ’領域におけるアミド基転移部位
【０２３４】
ＩｇＧのヒンジは、ＣＨ１とＣＨ２との間の可撓性リンカーであり、従って、この可撓性がこの領域におけるアシルアクセプターのアミド基転移を可能にすることは考えられる。Ｚｈａｎｇら，  ３Ｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，  （２０１５）  ５：９８０３。実際に、上側ヒンジ変異体Ｄ２２１Ｋ、Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｋ、およびＴ２２５Ｋは、効率的にアミド基転移される；しかし、中間または下側のヒンジ変異体のアミド基転移は存在しなかった。アミド基転移のこの欠如は、それぞれ、鎖間ジスルフィド結合の構造的制約およびＣＨ２に近位であることに起因し得る。これらの残基が任意の構造的制約から解放される場合にアミド基転移され得るかどうかを決定するために、リジン変異を、Ｃｙｓ２２６およびＣｙｓ２２９をアラニンに変異させたヒンジ領域全体（ＤＴＨＴＡＰＰＡＰＡＰＥＬＬ）を含むＦａｂ’の状況において作製した。
【０２３５】
変異体Ｆａｂのアミド基転移を、ＥＳＩ−ＭＳによって上記のようにＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンをアシルドナーとして使用して決定した。ＦａｂのＨＣ部分の質量は、変異体Ｌ２３５Ｋを除いて予測のとおりであった。この変異は、全長のＩｇＧと同様に、カルボキシペプチダーゼＢにおそらく起因して、切断されたＣ末端リジン残基を生じる。Ｈａｒｒｉｓら，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＤ４−ＩｇＧ  ｈｙｂｒｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  （１９９０）  １９４：６１１−６２０；  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｃ−ｔｅｒｅｍｉｎａｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，  （１９９５）  ７０５：１２９−１３４；  Ｄｉｃｋ，  Ｊｒ．ら，  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｕｓｅｓ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  （２００８）  １００：１１３２−１１４３。全長のＩｇＧのアミド基転移は認められなかった一方で、少量のアミド基転移（４．７％）が、野生型Ｆａｂ’において、おそらくＬｙｓ２２２において認められた（図９）。Ｆａｂ’のリジンスキャニング変異誘発により、Ｄ２２１位、Ｔ２２３位、Ｈ２２４位、Ｔ２２５位、Ｐ２３０位、およびＥ２３３位においていくつかのアシルアクセプター部位が明らかになった。これらのＦａｂ’を、１個または２個のビオチンでアミド基転移したところ、１個は、操作されたリジン上にあり、第２のものは、天然のリジン上にあった。
【０２３６】
二次構造は、リジンがアミド基転移されるかどうかを決定するにあたって大きな役割を果たし、そしてＦａｂ’変異体間でのヒンジの二次構造が大きく変化する可能性は低いので、天然のＬｙｓ２２２ならびに変異体Ｃ２２６Ｋ、Ｐ２２７Ｋ、Ｃ２２９Ｋ、Ａ２３１Ｋ、Ｐ２３２Ｋ、Ｌ２３４Ｋ、およびＬ２３５Ｋはアミド基転移されていないことは予測外であった。リジン変異の周りの一次配列を分析した。アシルアクセプターに対してＣ末端側（＋１）の残基が、アミド基転移に影響を及ぼすことは、以前示された；具体的には、＋１酸性残基またはプロリン残基は、ほとんど〜全くアミド基転移を生じない。例えば、米国仮特許出願第６２／２６９，１３８号（２０１５年１２月１８日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６７１６５（２０１６年１２月１６日出願）を参照のこと（これらの各々の内容全体が、本明細書に参考として明示的に援用される）。変異体Ｃ２２６Ｋ、Ｐ２２７Ｋ、Ｃ２２９Ｋ、およびＡ２３１Ｋはすべて、＋１プロリンを有し、Ｐ２３２Ｋは、＋１グルタミン酸を有する。さらに、Ｌｙｓ２２２およびＬ２３４Ｋは、−１酸性残基を有する。アシルアクセプターに隣接する任意の酸性残基がアミド基転移を阻害することは、考えられる。従って、アラニン変異は、−１もしくは＋１の酸性残基、または＋１プロリンのいずれかを変異するように行われた。実際に、その酸性残基およびプロリン残基を変異させると、リジン置換の効率的なアミド基転移が生じた（表８）。Ｄ２２１Ａ変異は、アミド基転移を５％から６６％へと増加した。同様に、Ｐ２３２Ｋ，Ｅ２３３ＡおよびＥ２３３Ａ，Ｌ２３４Ｋ  Ｆａｂ’において−１または＋１酸性残基を変異させると、それぞれ、４６％から９３％へ、および６２％から８６％へのアミド基転移の増加がもたらされた。＋１プロリンの変異は、リジン変異体Ｃ２２６Ｋ（５２％から７１％へ）、Ｐ２２７Ｋ（５７％から８１％へ）、Ｃ２２９Ｋ（３３％から９１％へ）、およびＡ２３１Ｋ（２２％から９３％へ）に関して同様の結果を有した。
【０２３７】
変異体Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｋ、Ｔ２２５Ｋ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２３０Ｋ、およびＥ２３３Ｋのアミド基転移に対するヒンジの長さの効果を、隣接する＋１残基を除いて全てを欠失させることによって分析した。Ｃ末端ヒンジ残基の除去は、変異体Ｔ２２３Ｋ、Ｈ２２４Ｋ、およびＴ２２５Ｋに関しては、操作されたアシルアクセプター部位のアミド基転移に対して負の影響を全く有さず、変異体Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２３０Ｋ、およびＥ２３３Ｋのアミド基転移を増加させた（表８）。
【表８】
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精製した変異体ヒンジ変異体Ｆａｂ’を、ｍＴＧａｓｅをＺ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＣＡＤ−ビオチンとともに一晩、３７℃においてインキュベートすることによって、アミド基転移に関してスクリーニングした。ＨＣの質量をＥＳＩ−ＭＳによって分析し、結合体化のパーセンテージを決定した。
【０２３８】
実施例１０：ダイマー抗体分子の生成
【０２３９】
低分子アシルドナーと高分子アシルアクセプターとの間のアミド基転移を媒介するｍＴＧａｓｅに加えて、アシルドナーを含むｍＡｂでの変異体Ｆａｂのアミド基転移を分析した。ｍＡｂ変異体Ｎ２９７Ｑは、２９５位および２９７位において２個のアシルドナー部位を含む。Ｊｅｇｅｒら，  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  （２０１０）  ４９：９９９５−９９９７。Ｆａｂ’変異体Ｄ２２１Ｋ、Ｈ２２４Ｋ、Ｔ２２５Ｋ、Ｐ２２８Ｋ、Ｐ２３０Ｋ、およびＥ２３３Ｋを、Ｎ２９７ＱおよびｍＴＧａｓｅとともに一晩、３７℃においてインキュベートした。そのサンプルを還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結合体化していないｍＡｂおよびＦａｂ’は、２３ｋＤａ（ＬＣ）、２５ｋＤａ（Ｆａｂ−Ｖｈ−ＣＨ１）、３８ｋＤａ（ｍＴＧａｓｅ）、および４９ｋＤａ（ＨＣ）においてバンドを生じる。単一のｍＡｂ−Ｆａｂ’結合体化は、７３ｋＤａにおいてバンドを生じ、ｍＡｂへの２個のＦａｂ’の結合体化は、９８ｋＤａにおいてバンドを生じる。実際に、全てのサンプルは、約７５ｋＤａおよび約１００ｋＤａの両方においてバンドを含む（図１１）。
【０２４０】
実施例への結論
抗体内での露出したループおよびターンの中の天然のリジンの数を考慮すると、試験した任意の抗体の上に適切なアシルアクセプターが全く見出されないことは、予測外であった。これらの結果は、Ｍｉｎｄｔら，  ２００８（彼らは、抗体ｃｈＣＥ７上の天然のリジン残基へ平均０．３分子の蛍光色素が結合体化したとして示した）によって報告されたものを含め、当該分野での以前の見解とは正反対である。Ｍｉｎｄｔはまた、低レベル（０．１分子／抗体）の、その同じ抗体ｃｈＣＥ７へのアシルアクセプター基質のアミド基転移を真偽は別として報告した。しかし、多くの後の刊行物は、Ｍｉｎｄｔの知見を反復することはできなかった（Ｓｔｒｏｐら，  ２０１３；  Ｊｅｇｅｒら，  ２０１０；およびＳｉｅｇｍｕｎｄら，  ２０１５を参照のこと）。具体的には、Ｊｅｇｅｒは、「天然のｃｈＣＥ７またはＲＴＸの改変は、基質のうちのいずれでも観察されなかった」と注記した（Ｊｅｇｅｒら，  ２０１０を参照のこと）。従って、Ｍｉｎｄｔで開示された知見は、アッセイのバックグラウンド蛍光に起因するか、またはｃｈＣＥ７の可変領域に位置しているアシルアクセプターもしくはドナーに特異的であるかのいずれかの可能性があった。
【０２４１】
アシルアクセプターは、野生型モノクローナル抗体上で見出されなかった一方で、単一のアミノ酸リジン置換は驚くべきことに、アシルアクセプターであるように操作され得る、抗体全体にわたるいくつかの位置を明らかにした。少なくとも１個の部位が、ＨＣおよびＬＣの定常領域ドメインのうちの各々において同定された（図１２）。溶媒に露出されたループまたはターンの中のそれらの位置の他に、アシルアクセプター部位の周りの明確なコンセンサス配列は存在しなかった。７０％より高くアミド基転移された部位の配列の例は、ＫＳＫ１３５ＳＧ、ＳＴＫ１３６ＧＧ、ＳＳＫ１９３ＧＴ、ＴＬＫ２５２ＩＳ、ＱＹＫ２９７ＳＴ、ＬＳＫ４４５Ｇ＊、ＱＧＫ２０１ＳＳ、ＧＬＫ２０２ＳＰ、ＰＴＫ２１３ＣＳであった。類似の配列は、ＣＨ１（ＳＳＫ１３３ＳＴ）、ＣＨ３（ＬＴＫ３６０ＮＱ）、およびκ（ＱＬＫ１２６ＳＧ、ＬＳＫ１８３ＡＤ）におけるように、アミド基転移されなかったリジンの周りで見出された。
【０２４２】
リジンに隣接する酸性残基またはプロリン残基は、Ｆａｂのヒンジにおける変異によって示されるように、アミド基転移の効率を妨げた。残基をリジンへと変異させることに加えて、アシルアクセプター部位は、既存のリジンに隣接する残基を変異させることによって操作され得る。Ｆａｂ変異体Ｄ２２１ＡにおけるＬｙｓ２２２のアミド基転移に基づいて、ｍＡｂ全体にわたる天然のリジンに隣接する他のプロリン残基または酸性残基の変異は、可能である。例えば、ＩｇＧ１リジンＰＫ２４６Ｐ、ＰＫ２４８Ｄ、ＴＫ２９０Ｐ、ＧＫ３１７Ｅ、およびＤＫ４１４Ｓ、κリジンＳＫ１６９ＤおよびＥＫ１８８Ｈ、ならびにλリジンＥＫ２０７Ｔは、酸性残基およびプロリン残基に隣接し、酸性残基またはプロリン残基以外のあるものへの変異は、その特定のリジンにおいてアシルアクセプター部位を作り得る。さらに、いくつかのＦａｂヒンジ変異体に関する場合がそうであったように、いくつかの部位を、酸性残基またはプロリン残基に隣接している変異体リジンに起因して、リジンスキャニング変異誘発において失ったことが考えられ得る。
【０２４３】
その残基の周りにある構造はまた、アミド基転移に影響を及ぼすことが示された。Ｆａｂフラグメントの生成を通じて、ＣＨ２および／または鎖間ジスルフィド結合によって与えられる任意の構造のコアおよび下側ヒンジ領域を解放することによって、ｍＡｂの状況でアミド基転移されなかったリジンを、Ｆａｂにおいてアミド基転移した。システイン２２６および２２９において鎖間ジスルフィド結合を有する全長ｍＡｂの状況では、Ｐ２３０ＫおよびＥ２３３Ｋは、アミド基転移されなかった。しかし、Ｆａｂフラグメントおよび鎖間ジスルフィド結合のない状況では、これらの残基はアミド基転移された。それ自体の中でアシルアクセプター部位に隣接するジスルフィド結合は、アミド基転移を妨げない。なぜならλ変異体Ｅ２１３Ｋにおける＋１位は、鎖間ジスルフィド結合であり、その変異体はアミド基転移されたからである。従って、鎖間ジスルフィド結合を除去することによってヒンジ領域の三次元構造を変化させるおよび／または近くのＣＨ２ドメインの考えられる立体的拘束を除去するかのいずれかを行うと、これらの部位でのリジンのアミド基転移が可能になった。
【０２４４】
ＭＴＧａｓｅは、ｍＡｂを２つの方法のうちの１つによって操作することによって、グルタミンをアミド基転移する手段として以前に調査された。Ｊｏｓｔｅｎら，  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，  （２０００）  ２４０：４７−５４；  Ｍｉｎｄｔら，  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｉａ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ，  （２００８）  １９：２７１−２７８；  Ｊｅｇｅｒら，  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  （２０１０）  ４９：９９９５−９９９７；  Ｓｔｒｏｐら，  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍａｔｔｅｒｓ：  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  （２０１３）  ２０：１６１−１６７。ｍＡｂ上のアミンベースの基質を結合体化するにあたって有効であるが、両方の方法には、欠点がある。第１のアプローチは、酵素によるかまたは変異誘発によるかのいずれかで、ｍＡｂの脱グリコシル化を要求する。Ｍｉｎｄｔら，  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｉａ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｕｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ，  （２００８）  １９：２７１−２７８；  Ｊｅｇｅｒら，  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ，  （２０１０）  ４９：９９９５−９９９７。非グリコシル化ｍＡｂは、熱安定性を低下させ、プロテアーゼ感受性を増加させ、そして凝集速度を増加させるコンホメーション変化を受ける。Ｍｉｍｕｒａら，  Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１−Ｆｃ：  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （２０００）  ３７：６９７−７０６；  Ｋｗｏｎら，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  ｔｏｗａｒｄ  ｕｒｅａ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｄｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，  （１９９７）  １３３５：２６５−２７２；  Ｗａｎｇら，  ｐＨ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，  （２００８）  ３３：１２０−１２７；  Ｙａｍａｇｕｃｈｉら，  Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ１  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，  （２００６）  １７６０：６９３−７００；  Ａｒｎｏｌｄら，  Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  （２００７）  ２５：２１−５０；  Ｚｈｅｎｇら，  Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，  ＭＡｂｓ．，  （２０１１）  ３：５６８−５７６。置換Ｎ２９７Ｋは、アミド基転移の部位を生じ、この部位の利用はまた、Ｎ２９７Ｑ変異と同じ欠点を有する。
【０２４５】
第２のアプローチは、ｍＡｂの末端、または溶媒に露出された領域内のいずれかで、４アミノ酸であるＬＬＱＧグルタミンタグを操作することを含む。Ｓｔｒｏｐら，  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｍａｔｔｅｒｓ：  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  （２０１３）  ２０：１６１−１６７。４アミノ酸の付加は、患者において、ＡＤＣの効力を低減する免疫原性応答の可能性を増加させる。対照的に、本明細書で記載される改変は、結合体化部位として単一のアミノ酸置換または単一のアミノ酸（例えば、リジン）挿入を利用し、それによって、患者における免疫応答を誘発する機会を低減する。さらに、ＩｇＧ、κ、およびλ定常ドメイン全体にわたる複数の部位は、１つの部位が、凝集または免疫原性の増加などのｍＡｂに望ましくない特性を付与することが見出された場合に、使用され得る。
【０２４６】
まとめると、アシルアクセプター部位は、２個の天然の残基の間のリジン挿入、またはＩｇＧ１−４、κ、もしくはλ全体にわたる種々の位置でのリジン置換のいずれかによって、抗体または抗原結合フラグメントにおいて操作され得る。アシルアクセプター部位の最適な状況は、位置依存性のみならず、−１位もしくは＋１位において酸性残基を要求しないか、または＋１位においてプロリンを要求しない。微生物のトランスグルタミナーゼの結合体化技術は、これらの操作された部位を利用して、ＡＤＣ、二重特異的抗体、免疫毒素、または他のｍＡｂ−タンパク質複合体を作製するために種々のアシルドナー含有機能的作用物質を結合体化し得る。
【０２４７】
当業者は、多くの変更および改変が本発明の好ましい実施形態に対して行われ得ること、ならびにこのような変更および改変が本発明の趣旨から逸脱することなく行われ得ることを認識する。従って、添付の特許請求の範囲は、全てのこのような均等なバリエーションを本発明の真の趣旨および範囲内に入るとして網羅することが意図される。
略式の配列表
【０２４８】
【表９−１】
2019525897.tif 000017
【表９−２】
2019525897.tif 000018
【表９−３】
2019525897.tif 000019
【表９−４】
2019525897.tif 000020
【表９−５】
2019525897.tif 000021
【表９−６】
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【表９−７】
2019525897.tif 000023
【表９−８】
2019525897.tif 000024
【表９−９】
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【表９−１０】
2019525897.tif 000026
【表９−１１】
2019525897.tif 000027
【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
2019525897.tif 000031
【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
2019525897.tif 000035
【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【表９−２４】
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【表９−２５】
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【表９−２６】
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【表９−２７】
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【表９−２８】
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【表９−２９】
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【表９−３０】
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【表９−３１】
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【表９−３２】
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【表９−３３】
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【表９−３４】
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【表９−３５】
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【表９−３６】
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【表９−３７】
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【表９−３８】
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【表９−３９】
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【表９−４０】
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【表９−４１】
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【表９−４２】
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【表９−４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2019525897000001.app
【国際調査報告】
2019525897.tif 000075
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