(57)【要約】  本願発明は、いくつかの遺伝子の発現が阻害されている組換えワクシニアウイルスおよびその使用に関する。本願発明の組換えワクシニアウイルスは、癌細胞を選択的に殺し、癌細胞において優れた再現性を有する。また、ウイルスは正常細胞に対する毒性が低く、したがって人体に対して安全であるという利点を有する。したがって、本願発明の組換えワクシニアウイルスは、癌を処置するための組成物として有効に使用することができる。
2019520846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｋ３Ｌ、ＴＫ、およびＶＧＦ遺伝子の発現が抑制されている、組換えワクシニアウイルス。
【請求項２】
遺伝子の発現が、遺伝子の部分的もしくは全体的な欠失、または遺伝子への外来遺伝子の挿入によって抑制されている、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項３】
ＶＧＦ遺伝子が配列番号：６６の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項４】
ＴＫ遺伝子が配列番号：６８の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項５】
Ｋ３Ｌ遺伝子が配列番号：７０の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項６】
ワクシニアウイルスが、ウエスタンリザーブ（Western Reserve）（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（New York Vaccinia Virus）（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Wyeth）（ニューヨーク市衛生委員会）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Lister）、コペンハーゲン（Copenhagen）、天壇（Tian Tan）、ＵＳＳＲ、タシュケント（TashKent）、エバンス（Evans）、国際保健課（International Health Division）−Ｊ（ＩＨＤ−Ｊ）、国際保健課−ホワイト（ＩＨＤ−Ｗ）、およびそれらの変異体からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項７】
ワクシニアウイルスがＩＨＤ−Ｗである、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルス。
【請求項８】
活性成分として、請求項１に記載の組換えワクシニアウイルスを含む、癌を予防または処置するための医薬組成物。
【請求項９】
癌が固形癌または血液癌である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
固形癌が、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳の癌、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、胸腺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
血液癌が、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換えワクシニアウイルスを個体に投与することを含む、癌を予防または処置するための方法。
【請求項１３】
癌が、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳癌、脳の癌、頭頸部癌、食道癌、皮膚癌、肝臓癌、卵巣癌、膵臓癌、およびそれらの組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
癌の予防または処置のための請求項１に記載の組換えワクシニアウイルスの使用。
【請求項１５】
癌を予防または処置するための医薬組成物の製造のための請求項１に記載の組換えワクシニアウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本願発明は、いくつかの遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
最近、種々のウイルスを遺伝的に操作することによって改変された腫瘍溶解性ウイルスに関する研究が、癌治療剤を開発する目的のために積極的に行われている。しかしながら、腫瘍溶解性ウイルスの制限はまだ完全には解決されていない。例えば、抗癌剤に開発されるために、腫瘍選択的複製能を有するウイルスが、遺伝子操作により生産された。しかしながら、ウイルスが癌細胞だけでなく正常細胞においても複製され、それにより正常細胞を殺す、または不十分な抗癌効果を有するという制限がある。したがって、腫瘍溶解性ウイルスが、癌細胞に対して高い選択性および有効性を有するが、正常細胞に対する影響を最小限にすることができる技術の開発に対する継続的な要求がある。
【０００３】
他方では、ワクシニアウイルスは、約２００個の独立した遺伝子をコードする約２００ｋｂｐの二本鎖直鎖ゲノムＤＮＡを有するエンベロープＤＮＡウイルスである。ワクシニアウイルスは、天然痘に対する予防ワクチンとして１８世紀にエドワード・ジェンナー（Ｅｄｗａｒｄ  Ｊｅｎｎｅｒ）によって最初に使用された。それ以来、ワクシニアウイルスは種々の予防ワクチンに開発されている。初期のワクシニアウイルスワクチンにおいて、野生型ウイルスが使用され、そして全身感染症または進行性感染症のような重篤な副作用がワクチン接種患者に見られた。したがって、副作用を軽減するために、改変されたワクシニアアンカラ（vaccinia Ankara）（ＭＶＡ）、ＬＣ１６ｍ８（リスター（Lister）株由来）、およびニューヨークワクシニアウイルス（ＮＹＶＡＣ、コペンハーゲンワクシニア株由来）のような弱毒化した毒性を有する改変されたワクシニアウイルスが開発された。種々の疾患を標的とするワクチンが、これらのワクシニアウイルスに基づいて、開発されている。ウエスタンリザーブ（Western Reserve）（ＷＲ）、ＮＹＶＡＣ、ワイス（Wyeth）、およびリスター（Lister）のようなワクシニアウイルス株も腫瘍溶解性ウイルスとして開発されている。
【発明の概要】
【０００４】
技術的問題
本願発明の目的は、いくつかの遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルス、および活性成分として組換えワクシニアウイルスを含む抗癌組成物を提供することである。
【０００５】
課題の解決
上記目的をなし遂げるために、本願発明は、Ｋ３Ｌ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスを提供する。
【０００６】
加えて、本願発明は、活性成分として組換えワクシニアウイルスを含む癌を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【０００７】
さらに、本願発明は、組換えワクシニアウイルスを個体に投与する工程を含む、癌を予防または処置するための方法を提供する。
【０００８】
発明の有利な効果
本願発明の組換えワクシニアウイルスは、癌細胞を選択的に殺し、癌細胞において優れた複製能を示す。加えて、優れた癌細胞選択的殺傷能力を有するため、組換えワクシニアウイルスは人体における使用のために安全であるという利点を有する。したがって、本願発明の組換えワクシニアウイルスは、癌を処置するための組成物として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本願発明のＶＧＦ遺伝子の発現を抑制するシャトルプラスミドの構築物の一部を示す模式図である。
【図２】図２は、本願発明のＴＫ遺伝子の発現を抑制するシャトルプラスミドの構築物の一部を示す模式図である。
【図３】図３は、本願発明のＫ３Ｌ遺伝子の発現を抑制するシャトルプラスミドの構築物の一部を示す模式図である。
【００１０】
【図４Ａ】図４Ａは、表１−１に示される種々の癌細胞系が、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が抑制されている組換えウイルスによって殺されることを同定する結果を示す。
【表１−１】
2019520846.tif 000003
【００１１】
【図４Ｂ】図４Ｂは、表１−２に示される種々の癌細胞系が、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が抑制されている組換えウイルスによって殺されることを同定する結果を示す。
【表１−２】
2019520846.tif 000004
【００１２】
【図５】図５は、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されており、または不活性化されており、遺伝子の発現が抑制されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスが、結腸直腸癌細胞系の死を誘導することを同定する結果を示す。欠失された遺伝子についての略語の意味は表２に示されるとおりである：
【表２】
2019520846.tif 000005
【００１３】
【図６】図６は、正常細胞と比較して癌細胞に対する、Ｋ、ＶＴ、またはＶＴＫ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの殺傷能力を同定するグラフである：（ａ）は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫ値に基づいて、正常細胞と比較して癌細胞に対する組換えＩＨＤ−Ｗ−Ｋ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの殺傷能力について比較させることによって得られたグラフである；（ｂ）は、ＷＲ−ＶｉＴｉＫｉ値に基づいて、正常細胞と比較して癌細胞に対する組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの殺傷能力について比較させることによって得られたグラフである。
【００１４】
【図７】図７は、ＶＴまたはＶＴＫ遺伝子の両方の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の腫瘍サイズにおける変化を観察することによって得られたグラフである：（ａ）は、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の腫瘍サイズにおける変化を観察することによって得られたグラフである；（ｂ）は、組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の腫瘍サイズにおける変化を観察することによって得られたグラフである。
【００１５】
【図８】図８は、ＶＴまたはＶＴＫ遺伝子の両方の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の個々でのマウスの体重における変化を同定するグラフである：（ａ）は、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の個々でのマウスの体重における変化を同定するグラフである；（ｂ）は、組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の個々でのマウスの体重における変化を同定するグラフである。
【００１６】
【図９】図９は、ＶＴまたはＶＴＫ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの死亡率を同定するグラフである：（ａ）は、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの死亡率を同定するグラフである；（ｂ）は、組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの死亡率を同定するグラフである。
【００１７】
【図１０】図１０は、ＶＴまたはＶＴＫ遺伝子の両方の発現が抑制されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの尾における炎症反応を同定する結果を示す：（ａ）組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴワクシニアウイルスが投与されたマウスの尾における炎症性応答を同定する結果を示す、（ｂ）組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスが投与されたマウスの尾における炎症性反応を確認する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
以下に、本願発明は、詳細に記載されている。
【００１９】
本願発明の１つの局面において、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスが提供される。
【００２０】
本願明細書において使用される「ＶＧＦ」なる用語は、ワクシニア増殖因子を意味する。ワクシニア増殖因子は、上皮性増殖因子と同様の活性を示す酵素である。ＶＧＦ遺伝子によってコードされるワクシニア増殖因子は、ウイルスに感染した場合の増殖因子活性を示し、ウイルスによって引き起こされる感染の初期段階で合成することができる。ＶＧＦは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８９２８８．１、ＡＢＤ５２４５５．１、またはＡＩＸ９８９２７．１の配列であってよいが、これらに限定されない。具体的には、ＶＧＦは配列番号：６７によって示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であり得、ＶＧＦ遺伝子は配列番号：６６によって示される塩基配列であり得る。ＶＧＦまたはその遺伝子は、配列番号：６７のアミノ酸配列または配列番号：６６の塩基配列と約７０％または７５％またはそれ以上、および好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％またはそれ以上の相同性を有してもよい。加えて、ＶＧＦまたはその遺伝子は、配列番号：６７のアミノ酸配列または配列番号：６６の塩基配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはそれ以上、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上の、およびより好ましくは約９９％またはそれ以上の相同性を有してもよい。
【００２１】
本願明細書において使用される「ＴＫ」なる用語は、チミジンキナーゼを意味する。チミジンキナーゼは、ヌクレオチドの生合成に関与する酵素である。ＴＫ遺伝子によってコードされるチミジンキナーゼは、ＡＴＰのγ位でのリン酸をチミジンに結合させ、ウイルスＤＮＡを構成するヌクレオチドを生産することができる。ＴＫは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８９３７３．１、ＡＢＤ５２５６０．１、またはＡＩＸ９９０１１．１の配列であってよいが、これらに限定されない。具体的には、ＴＫは配列番号：６９によって示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であり得、ＴＫ遺伝子は配列番号：６８によって示される塩基配列であり得る。ＴＫまたはその遺伝子は、配列番号：６９のアミノ酸配列または配列番号：６８の塩基配列と約７０％または７５％またはそれ以上、および好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％またはそれ以上の相同性を有してもよい。加えて、ＴＫまたはその遺伝子は、配列番号：６９のアミノ酸配列または配列番号：６８の塩基配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはそれ以上、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上の、およびより好ましくは約９９％またはそれ以上の相同性を有してもよい。
【００２２】
本願明細書において使用される「Ｋ３Ｌ」なる用語は、Ｋ３Ｌタンパク質を意味する。Ｋ３Ｌ遺伝子によってコードされるＫ３Ｌタンパク質は、翻訳開始因子−２α（ｅＩＦ−２α）と相同性を有するタンパク質であり、インターフェロンアクチベーターであるタンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）の作用を抑制することができる。Ｋ３Ｌは、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８９３１３．１、ＡＢＤ５２４８３．１、またはＡＧＢ７５７５４．１の配列であってよいが、これらに限定されない。具体的には、Ｋ３Ｌは配列番号：７１によって示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有し得、Ｋ３Ｌ遺伝子は、配列番号：７０によって示される塩基配列であり得る。Ｋ３Ｌまたはその遺伝子は、配列番号：７１のアミノ酸配列または配列番号：７０の塩基配列と約７０％または７５％またはそれ以上、および好ましくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％またはそれ以上の相同性を有してもよい。加えて、Ｋ３Ｌまたはその遺伝子は、配列番号：７１のアミノ酸配列または配列番号：７０の塩基配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％またはそれ以上、好ましくは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上の、およびより好ましくは約９９％またはそれ以上の相同性を有してもよい。
【００２３】
本願発明による遺伝子の抑制された発現は、遺伝子の部分的もしくは全体的な欠失または遺伝子への外来遺伝子の挿入によって、遺伝子が発現されないか、または遺伝子の一部だけが発現され、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性が示されないことを意味する。遺伝子を欠失させる、または外来遺伝子を挿入するための方法は、当分野でよく知られている方法によって行うことができる。例えば、これは、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro (1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors、およびCurrent Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son (1998), Chapter 16に記載されている外来遺伝子を挿入するための方法によって行うことができる。具体的には、本願発明の１つの態様において、外来遺伝子は、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  Ａ１３６０）またはｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  Ａ３６００）ベクター系を使用して挿入された。
【００２４】
ワクシニアウイルスは、ウエスタンリザーブ（Western Reserve）（ＷＲ）、ニューヨークワクシニアウイルス（New York Vaccinia Virus）（ＮＹＶＡＣ）、ワイス（Wyeth）（ニューヨーク市衛生委員会）、ＬＣ１６ｍ８、リスター（Lister）、コペンハーゲン（Copenhagen）、天壇（Tian Tan）、ＵＳＳＲ、タシュケント（TashKent）、エバンス（Evans）、国際保健課（International Health Division）−Ｊ（ＩＨＤ−Ｊ）、国際保健課−ホワイト（ＩＨＤ−Ｗ）、およびそれらの変異体からなる群から選択されてよいが、これらに限定されない。具体的には、ワクシニアウイルスはＷＲ、リスター、またはＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスであり得、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４３３１２．１、ＤＱ１２１３９４．１、またはＡＩＸ９８９５１．１の配列を有してよい。本願発明の１つの態様において、ワクシニアウイルスはＩＨＤ−Ｗであり得る。
【００２５】
本願明細書において使用される「Ｖ」または「ウイルスＶ」なる用語は、ワクシニア増殖因子遺伝子であるＶＧＦが欠失されており、ウイルスがＶＧＦ遺伝子の欠失によってＶＧＦ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを意味する。
【００２６】
加えて、本願明細書において使用される「Ｖｉ」または「ウイルスＶｉ」なる用語は、ワクシニア増殖因子の発現が不活性化され、ウイルスがＶＧＦ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを意味する。ワクシニア増殖因子の発現は、外来遺伝子をＶＧＦ遺伝子に挿入することによって抑制することができる。
【００２７】
加えて、本願明細書において使用される「Ｔ」または「ウイルスＴ」なる用語は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）が欠失されており、ウイルスがＴＫ遺伝子の欠失によってＴＫ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを意味する。
【００２８】
加えて、本願明細書において使用される「Ｔｉ」または「ウイルスＴｉ」なる用語は、チミジンキナーゼの発現が不活性化され、ウイルスがＴＫ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを意味する。チミジンキナーゼの発現は、外来遺伝子をＴＫ遺伝子に挿入することによって抑制することができる。
【００２９】
加えて、本願明細書において使用される「Ｋ」または「ウイルスＫ」なる用語は、Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されており、ウイルスがＫ３Ｌ遺伝子の欠失によってＫ３Ｌ遺伝子を発現しない組換えワクシニアウイルスを意味する。
【００３０】
加えて、本願明細書において使用される「Ｋｉ」または「ウイルスＫｉ」なる用語は、Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化され、ウイルスがＫ３Ｌを発現しない組換えワクシニアウイルスを意味する。Ｋ３Ｌタンパク質の発現は、外来遺伝子をＫ３Ｌ遺伝子に挿入することによって抑制することができる。
【００３１】
加えて、本願明細書において使用される「ＶＴ」または「ウイルスＶＴ」なる用語は、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスを意味する。加えて、本願明細書において使用される「ＶｉＴｉ」または「ウイルスＶｉＴｉ」なる用語は、ワクシニア増殖因子およびチミジンキナーゼの発現が不活性化されている組換えワクシニアウイルスを意味する。ワクシニア増殖因子およびチミジンキナーゼの発現を不活性化するための方法は上記されている。
【００３２】
加えて、本願明細書において使用される「ＶＴＫ」または「ウイルスＶＴＫ」なる用語は、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスを意味する。加えて、本願明細書において使用される「ＶｉＴｉＫｉ」または「ウイルスＶｉＴｉＫｉ」なる用語は、ワクシニア増殖因子、チミジンキナーゼ、およびＫ３Ｌタンパク質の発現が不活性化されている組換えワクシニアウイルスを意味する。ワクシニア増殖因子、チミジンキナーゼ、およびＫ３Ｌタンパク質の発現を不活性化するための方法は上記されている。
【００３３】
加えて、本願明細書において使用される「ＶｉＴＫ」または「ウイルスＶｉＴＫ」なる用語は、ワクシニア増殖因子の発現が不活性化され、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスを意味する。加えて、本願明細書において使用される「ＶＴｉＫ」または「ウイルスＶＴｉＫ」なる用語は、チミジンキナーゼの発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスを意味する。加えて、本願明細書において使用される「ＶＴＫｉ」または「ウイルスＶＴＫｉ」なる用語は、Ｋ３Ｌタンパク質の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスを意味する。
【００３４】
加えて、本願発明の１つの局面は、活性成分として組換えワクシニアウイルスを含む癌を予防または処置するための医薬組成物を提供する。
【００３５】
ここで、組換えワクシニアウイルスは、上記のように、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が抑制されているものであってよい。ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子は上記のとおりである。
【００３６】
組換えワクシニアウイルスの１つの例としては、以下のものを挙げることができる。ＷＲワクシニアウイルスの変異体は、ＷＲ−ＶＴＫ、ＷＲ−ＶｉＴｉＫｉ、ＷＲ−ＶｉＴＫ、ＷＲ−ＶＴｉＫ、またはＷＲ−ＶＴＫｉであってよい。加えて、ＮＹＶＡＣワクシニアウイルスの変異体は、ＮＹＶＡＣ−ＶＴＫ、ＮＹＶＡＣ−ＶｉＴｉＫｉ、ＮＹＶＡＣ−ＶｉＴＫ、ＮＹＶＡＣ−ＶＴｉＫ、またはＮＹＶＡＣ−ＶＴＫｉであってよい。さらに、ワイスワクシニアウイルスの変異体は、ワイス−ＶＴＫ、ワイス−ＶｉＴｉＫｉ、ワイス−ＶｉＴＫ、ワイス−ＶＴｉＫ、またはワイス−ＶＴＫｉであってよい。加えて、ＬＣ１６ｍ８ワクシニアウイルスの変異体は、ＬＣ１６ｍ８−ＶＴＫ、ＬＣ１６ｍ８−ＶｉＴｉＫｉ、ＬＣ１６ｍ８−ＶｉＴＫ、ＬＣ１６ｍ８−ＶＴｉＫ、またはＬＣ１６ｍ８−ＶＴＫｉであってよい。さらに、リスターワクシニアウイルスの変異体は、リスター−ＶＴＫ、リスター−ＶｉＴｉＫｉ、リスター−ＶｉＴＫ、リスター−ＶＴｉＫ、またはリスター−ＶＴＫｉであってよい。加えて、コペンハーゲンワクシニアウイルスの変異体は、コペンハーゲン−ＶＴＫ、コペンハーゲン−ＶｉＴｉＫｉ、コペンハーゲン−ＶｉＴＫ、コペンハーゲン−ＶＴｉＫ、またはコペンハーゲン−ＶＴＫｉであってよい。さらに、天壇ワクシニアウイルスの変異体は、天壇−ＶＴＫ、天壇−ＶｉＴｉＫｉ、天壇−ＶｉＴＫ、天壇−ＶＴｉＫ、または天壇−ＶＴＫｉであってよい。加えて、ＵＳＳＲワクシニアウイルスの変異体は、ＵＳＳＲ−ＶＴＫ、ＵＳＳＲ−ＶｉＴｉＫｉ、ＵＳＳＲ−ＶｉＴＫ、ＵＳＳＲ−ＶＴｉＫ、またはＵＳＳＲ−ＶＴＫｉであってよい。さらに、タシュケントワクシニアウイルスの変異体は、タシュケント−ＶＴＫ、タシュケント−ＶｉＴｉＫｉ、タシュケント−ＶｉＴＫ、タシュケント−ＶＴｉＫ、またはタシュケント−ＶＴＫｉであってよい。加えて、エバンスワクシニアウイルスの変異体は、エバンス−ＶＴＫ、エバンス−ＶｉＴｉＫｉ、エバンス−ＶｉＴＫ、エバンス−ＶＴｉＫ、またはエバンス−ＶＴＫｉであってよい。さらに、ＩＨＤ−Ｊワクシニアウイルスの変異体は、ＩＨＤ−Ｊ−ＶＴＫ、ＩＨＤ−Ｊ−ＶｉＴｉＫｉ、ＩＨＤ−Ｊ−ＶｉＴＫ、ＩＨＤ−Ｊ−ＶＴｉＫ、またはＩＨＤ−Ｊ−ＶＴＫｉであってよい。さらに、ＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの変異体は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶｉＴｉＫｉ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶｉＴＫ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴｉＫ、またはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫｉであってよい。
【００３７】
１つの態様によると、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失している組換えワクシニアウイルスが、種々の癌細胞に対して殺傷能力を有することが同定された（図４Ａおよび４Ｂ）。加えて、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶｉＴＫ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴｉＫ、およびＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫｉワクシニアウイルスで結腸直腸癌細胞系を処理することによって、癌細胞殺傷能力の比較を行った。結果として、ワクシニアウイルスの全てが優れた殺傷能力を示したことが同定された。したがって、遺伝子が欠失しているか、または不活性化されているかにかかわらず、ＶＴＫ遺伝子の発現が抑制されているワクシニアウイルスの全てが抗癌活性を有することが同定された（図５）。加えて、正常細胞および癌細胞を組換えＩＨＤ−Ｗ−Ｋ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫ、ＷＲ−Ｋ、ＷＲ−ＶｉＴｉ、およびＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスで処理する場合、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が同時に抑制されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスが、Ｋ３Ｌ遺伝子の発現のみが抑制されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＫまたはＷＲ−ＫワクシニアウイルスまたはＶＧＦおよびＴＫ遺伝子の発現が同時に抑制されている組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＷＲ−ＶｉＴｉワクシニアウイルスと比較して、正常細胞と比較して癌細胞に対する比較的優れた殺傷能力を示すことが確認された（図６）。
【００３８】
加えて、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴおよびＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスおよび組換えＷＲ−ＶｉＴｉおよびＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスを、腫瘍マウスモデルに投与した。結果として、ウイルスの全てが癌増殖を抑制したことが同定された（図７）。
【００３９】
加えて、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスが投与された腫瘍マウスモデルが、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＷＲ−ＶｉＴｉワクシニアウイルスが投与された腫瘍マウスモデルよりも低い体重減少および死亡率を示したことが同定された（図８および９）。加えて、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスが投与されたマウスが、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴワクシニアウイルスが投与されたマウスよりも尾領域において少ない炎症性応答を示したことが同定された。
【００４０】
したがって、活性成分として、Ｋ３Ｌ、ＴＫ、およびＶＧＦ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスを含む癌を予防または処置するための本願発明の医薬組成物は、癌を予防または処置するために有用に使用することができる。
【００４１】
本願明細書において使用される「癌」なる用語は、固形癌または血液癌であってよい。ここで、固形腫瘍は、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、甲状腺癌、乳癌、脳の癌、頭頸部癌、線維肉腫、食道癌、皮膚癌、胸腺癌、胃癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌、直腸癌、胆嚢癌、胆道癌、膵臓癌、およびそれらの組合せからなる群から選択されてよい。本願発明の１つの態様によると、癌は、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、線維肉腫、脳の癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、または結腸直腸癌であってよい。加えて、血液癌は、リンパ腫、急性白血病、多発性骨髄腫、およびそれらの組合せからなる群から選択されてよい。
【００４２】
本願発明の医薬組成物は、賦形剤、滑剤、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、および防腐剤からなる群から選択される１つ以上の薬学的に許容される添加剤をさらに含み得る。
【００４３】
本願発明の組成物は、慣用の方法によって製剤化されてよい。本願発明の組成物は、特に哺乳動物に投与された後に、活性成分の迅速な、持続的な、または遅延された放出を提供するように当分野で知られている方法を用いて製剤化することができる。製剤にしたがって、本願発明の組成物は、個体に適切に投与することができる。かかる投与は非経口投与であってよく、その例は癌内組織、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むことができる。非経口投与用の調製形態は注射可能な調製であってよい。
【００４４】
本願発明の別の局面において、組換えワクシニアウイルスを個体に投与する工程を含む、癌を予防または処置するための方法を提供する。
【００４５】
個体は、哺乳動物、特にヒトであってよい。本願発明の組成物は、患者の年齢、性別、体重、疾患症状の重症度、および投与経路に依存して当業者によって適切に投与されることができる。投与は、１日に１回または１日に数回であってよい。
【００４６】
本願発明の組換えワクシニアウイルスの好ましい用量は、個体の状態および体重、疾患の重症度、薬物形態、投与経路、および期間に依存して変化し、当業者によって適切に選択することができる。具体的には、用量は、患者が、１×１０５から１×１０１８、および好ましくは１×１０５、２×１０５、５×１０５、１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、５×１０９、１×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７またはそれ以上の、それらの間の種々の値および範囲を含むことができる、ウイルス粒子、感染性を有するウイルス単位（ＴＣＩＤ５０）、またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）を受ける用量であってよい。加えて、ウイルスの用量は、０．１ｍｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌまたはそれ以上であってよく、それらの間の全ての値および範囲を含むことができる。
【００４７】
以下、本願発明は、以下の実施例によって詳細に記載されている。しかしながら、以下の実施例は本願発明を説明することを意図し、本願発明はそれに限定されない。
【実施例】
【００４８】
Ｉ．組換えワクシニアウイルスの生産
本願発明者らは、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されているか、またはそれらの発現が不活性化されている組換えワクシニアウイルスベクターを構築した。これらのベクターを使用して、上記遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスを生産し、抗癌物質としてのそれらの特性について比較を行った。
【００４９】
実施例１．  組換えＷＲワクシニアウイルスの生産
実施例１．１．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
実施例１．１．１．  ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
ＷＲワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＶＲ−１３５４）のゲノムＤＮＡの両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、それぞれをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する相同塩基配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表３に示される。
【００５０】
【表３】
2019520846.tif 000006
【００５１】
発現がｐ１１プロモーターによって調節されるＬａｃＺを、組換えがＶＧＦ遺伝子の位置で起こったウイルスについてスクリーニングするためのマーカーとして使用した。ＷＲ  ｇＤＮＡにおけるｐ１１プロモーター部位をＰＣＲによって増幅し、ｐＡＡＶ−ＬａｃＺ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ２４００７１−５２）におけるＬａｃＺ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。次に、結果物をｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙおよびｐＧＥＭ−Ｔそれぞれに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ１１およびｐＧＥＭ−Ｔ−ＬａｃＺそれぞれを構築した。ｐ１１プロモーターおよびＬａｃＺの増幅のために使用されたプライマーの情報は、表３に示される。
【００５２】
ＶＧＦ遺伝子の機能が部分的に欠失されているシャトルプラスミドを構築するために、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）をＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩで処理し、ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  Ｐ２１９１）をＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）を構築した。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理し、上記構築されたｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を得た。ＬａｃＺ発現カセットを導入するために、ＰＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ１１をＳａｌＩおよびＮｈｅＩで処理し、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）をＳａｌＩおよびＮｈｅＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩで処理し、次に上記構築されたｐＧＥＭ−Ｔ−ＬａｃＺをＥｃｏＲＩおよびＰａｃＩで切断した。結果物をライゲートし、ＶＧＦシャトルプラスミドであるｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミド」と称される）を完成させた。
【００５３】
実施例１．１．２．  ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
ＷＲワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの両側のＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子を得るために、ＷＲのｇＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、次に、左側および右側にＴＫ遺伝子に隣接し、互いに相同である塩基配列セグメントを、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。ＴＫ遺伝子の両側に相同である塩基配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表４に示される。
【００５４】
【表４】
2019520846.tif 000007
【００５５】
発現がｐＳＥ／Ｌプロモーターによって調節されるＥＧＦＰおよび発現がｐ７．５プロモーターによって調節されるＧｐｔを、組換えがＴＫ遺伝子の位置で起こったウイルスについてスクリーニングするためのマーカーとして使用した。鋳型としてＷＲ  ｇＤＮＡを使用してｐ７．５プロモーター部位をＰＣＲによって増幅し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ６０８０−１）におけるＥＧＦＰ遺伝子およびＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ９０５７）におけるＧｐｔ遺伝子もＰＣＲによって増幅した。次に、結果物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙにそれぞれ挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰ、およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｇｐｔそれぞれを構築した。加えて、ｐＳＥ／ＬプロモーターおよびＴＦをプライマーアニーリングを介して構築した。実験において使用されたプライマーの配列は、表４に示される。
【００５６】
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５およびアニールされたｐＳＥ／ＬプロモーターをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩでそれぞれ処理し、ライゲートし、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５を構築した。構築されたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰをそれぞれＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで処理し、ライゲートし、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５を構築した。
【００５７】
ＴＫ遺伝子の機能が部分的に欠失されているシャトルプラスミドを構築するために、ｐＳＰ７２をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理した。次に、結果物をライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）をＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで処理し、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで処理することによって得られたｐＳＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＴＫ−Ｌとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。ＥＧＦＰ発現カセットを導入するために、構築されたｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。
【００５８】
加えて、構築されたｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）およびアニールされたＴＦオリゴマーをそれぞれＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。Ｇｐｔ発現カセットを導入するために、構築されたｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＧｐｔをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで処理し、ライゲートし、最終的にＴＫシャトルプラスミドであるｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ−ＴＫ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００５９】
実施例１．１．３．  Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
ＷＲワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの両側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子を、ＰＣＲにより増幅した。ここで、両側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する相同である塩基配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表５に示される。増幅された遺伝子をそれぞれｐＧＥＭ−Ｔに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｋ３Ｌ−Ｌ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。
【００６０】
【表５】
2019520846.tif 000008
【００６１】
Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されているシャトルプラスミドを構築するために、表５に示されるＴＦプライマーをアニールし、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで処理し、ｐＳＰ７２をＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＦを構築した。加えて、ｐＤｓＲｅｄ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ６３２４０４）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＳＰ７２−ＴＦをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＤｓＲｅｄ−ＴＦを構築した。上記構築されたｐＧＥＭ−Ｔ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＳＰ７２−ＤｓＲｅｄ−ＴＦをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。次に、上記構築されたｐＧＥＭ−Ｔ−Ｋ３Ｌ−Ｌ（ＷＲ）をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＳＰ７２−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。最終的に、鋳型としてＷＲ  ｇＤＮＡを使用してｐ７．５プロモーターをＰＣＲによって増幅し、次にｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５を構築した。ＰＣＲ増幅において使用されたプライマーの情報は、表５に示される。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで処理することによって得られたベクターとライゲートし、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  Ｋ３Ｌ  シャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００６２】
実施例１．１．４．  Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
ＷＲワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの左側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子およびＫ３Ｌ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅した。ここで、増幅はＫ３Ｌ−Ｌ配列の直後に置かれているＫ３Ｌ遺伝子の開始コドンで行い、Ｋ３Ｌ遺伝子の左側の相同である配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表６に示される。ここで、増幅され、Ｋ３Ｌ遺伝子の開始コドンを除き、それに続く部分を含むＫ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＷＲ）フラグメントを得て、次にｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターとライゲートし、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＷＲ）を構築した。
【００６３】
【表６】
2019520846.tif 000009
【００６４】
実施例１．１．３において構築されたＷＲ  Ｋ３ＬシャトルプラスミドおよびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＷＲ）をＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。Ｋ３Ｌの開始コドンを構築されたｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）に導入するために、点突然変異を表６に示されるプライマーを使用して行い、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３ＬＡＴＧ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＷＲ）（以下、「ＷＲ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミド」と称される）を最終的に構築した。
【００６５】
実施例１．２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＷＲワクシニアウイルスの生産
実施例１．２．１．  Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されているＷＲワクシニアウイルスの生産
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件で６−ウェルプレートにおいて、および２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地の条件においてＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＣＣＬ−２）細胞を調製した。次に、ＨｅＬａ細胞をｊｅｔＰＲＩＭＥ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  １１４−０７）を使用して実施例１．１．３において構築された２μｇのＷＲ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドでトランスフェクトし、０．０５ＭＯＩのＷＲ野生型ワクシニアウイルスで同時に処理した。２時間のインキュベーション後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地と置き換え、次に細胞をさらに４８時間インキュベートした。最終的に、感染した細胞を５００μｌの培地で回収し、次に細胞を３回の凍結および解凍を繰り返すことによって溶解した。細胞溶解物を粗ウイルスと称した。生産された粗ウイルスを使用して、６回プラーク単離に付し、純粋に単離された組換えＷＲワクシニアウイルスＫを得た。
【００６６】
実施例１．２．２．  ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスの生産
最初に、ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉを、ＷＲ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミドが使用されたことを除いて、実施例１．２．１と同じ条件および方法において得た。その後、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＴｉを、ＷＲ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【００６７】
実施例１．２．３．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスの生産
最初に、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクチンウイルスＶｉＴｉＫｉを、ＷＲ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＴｉが使用されたことを除いて、実施例１．２．１と同じ条件および方法において得た。
【００６８】
実施例２．  組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
実施例２．１．１．  ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
ＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＶＲ−１４４１）のゲノムＤＮＡの両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子を、ＰＣＲにより増幅した。ここで、両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する相同である塩基配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表７に示される。かかる方法において、ＶＧＦ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントを得て、次にｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターとライゲートし、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）またはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００６９】
【表７】
2019520846.tif 000010
【００７０】
上記ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理し、Ｐｓｐ７２をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで処理した。次に、結果物をライゲートし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００７１】
次に、ｐ１１プロモーターおよびＬａｃＺ遺伝子をｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）に導入するために、実施例１．１．１のＷＲ  ＶＧＦシャトルプラスミドにおけるｐ１１−ＬａｃＺ発現カセットおよびｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＮｈｅＩおよびＰａｃＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００７２】
実施例２．１．２．  ＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの両側のＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子を得るために、ＰＣＲを行い、結果として、ＴＫ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントを得た。ここで、使用されたプライマーは表８に示される。得られたＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントおよびｐＳＰ７２ベクターをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。加えて、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＴＫ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをそれぞれＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで処理し、ライゲートし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００７３】
構築されたｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）ベクターおよび実施例１．１．２において構築されたＷＲ  ＴＫシャトルプラスミドをそれぞれＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理し、ライゲートし、最終的にｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００７４】
【表８】
2019520846.tif 000011
【００７５】
実施例２．１．３．  Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの両側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。ここで、使用されたプライマーは表９に示される。
【００７６】
Ｋ３Ｌシャトルプラスミド内部で遺伝子発現カセットを構築するために、鋳型として実施例１．１．３において構築されたＷＲ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドを使用してｐ７．５−ＤｓＲｅｄ遺伝子カセットをＰＣＲにより増幅し、次にｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄを構築した。ｐ７．５プロモーターおよびＤｓＲｅｄ遺伝子の増幅のために使用されたプライマーの配列は表９に示される。
【００７７】
【表９】
2019520846.tif 000012
【００７８】
構築されたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄおよびｐＳＰ７２ベクターをそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで処理し、次にライゲートし、ｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄを完成させた。加えて、構築されたｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄをＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで処理し、上記で構築されたｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで処理した。次に、結果物をライゲートし、ｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｋ３Ｌ−Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）をＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理した。次に、結果物をライゲートし、最終的にｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００７９】
実施例２．１．４．  ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化された組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子およびＶＧＦ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。ここで、増幅はＶＧＦ−Ｌ配列の直後に置かれているＶＧＦ遺伝子の開始コドンおよびＶＧＦ−Ｒ配列の前に置かれているＶＧＦ遺伝子の他の配列で行った。両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する相同である配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表１０に示される。かかる方法において、ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧ（ＩＨＤ−Ｗ）およびＶＧＦｉ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントを得て、次にＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドへのそのＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングを行った。
【００８０】
【表１０】
2019520846.tif 000013
【００８１】
ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、増幅されたＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＲ−Ｗ）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＰａｃＩおよびＢｇｌＩＩで処理し、増幅されたＶＧＦｉ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦｉ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。
【００８２】
次に、ＶＧＦの開始コドン後に終始コドンをｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦ−Ｒｉ（ＩＨＤ−Ｗ）に導入するために、点突然変異を表１０に示されるプライマーを使用して行い、ｐＳＰ７２−ＶＧＦ−Ｌ−ＶＧＦＡＴＧＴＡＡ−ｐ１１−ＬａｃＺ−ＶＧＦｉ−ＶＧＦ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００８３】
実施例２．１．５．  ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡおよびＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドの両側のＴＫ遺伝子に隣接する遺伝子およびＴＫ遺伝子を得るために、ＰＣＲを行い、使用されたプライマーは表１１に示される。ここで、増幅はＴＫ−Ｌ配列の直後に置かれているＴＫ遺伝子の開始コドンおよびＴＫ−Ｒ配列の前に置かれているＴＫ遺伝子の他の配列で行った。かかる方法において、ＴＫ−Ｌ−ＴＫＡＴＧ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドから得て、ＴＫ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをＩＨＤ−ＷワクシニアゲノムＤＮＡから得た。次に、ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドへの結果物のＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングを行った。
【００８４】
【表１１】
2019520846.tif 000014
【００８５】
ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドをＥａｇＩで処理し、増幅されたＴＫｉ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫｉ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫｉ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）をＮｏｔＩおよびＳａｌＩで処理し、増幅されたＴＫ−Ｌ−ＴＫＡＴＧ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、ｐＳＰ７２−ＴＫ−Ｌ−ＴＫＡＴＧ−ＴＦ−ＥＧＦＰ−ｐＳＥ／Ｌ−ｐ７．５−Ｇｐｔ−ＴＫｉ−ＴＫ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【００８６】
実施例２．１．６．  Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスベクターの構築
ＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡの左側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子およびＫ３Ｌ遺伝子の一部をＰＣＲを介して得た。使用されたプライマーは表１２に示される。ここで、増幅され、Ｋ３Ｌ遺伝子の開始コドンを除き、それに続く部分を含むＫ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントを得て、次にＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３ＬシャトルプラスミドへのそのＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングを行った。
【００８７】
【表１２】
2019520846.tif 000015
【００８８】
ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３ＬシャトルプラスミドをＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、増幅されたＫ３Ｌｉ−Ｌ−Ｋ３Ｌ（ＩＨＤ−Ｗ）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ（ＩＨＤ−Ｗ）を構築した。Ｋ３Ｌの開始コドンを構築されたｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）に導入するために、点突然変異を表１２に示されるプライマーを使用して行い、ｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−Ｋ３Ｌｉ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−ＴＦ−Ｋ３ＬＡＴＧ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（ＩＨＤ−Ｗ）（以下、「ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミド」と称される）を最終的に構築した。
【００８９】
実施例２．２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの構築
実施例２．２．１．  Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．３．において構築されたＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドを使用して、Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されているワクシニアウイルスを以下の方法によって生産した。
【００９０】
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件で６−ウェルプレートにおいて、および２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地の条件においてＨｅＬａ細胞を調製した。次に、ＨｅＬａ細胞をｊｅｔＰＲＩＭＥを使用して２μｇのＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドでトランスフェクトし、０．０５ＭＯＩのＩＨＤ−Ｗ野生型ワクシニアウイルスで同時に処理した。２時間のインキュベーション後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地と置き換え、次に細胞をさらに４８時間インキュベートした。最終的に、感染した細胞を５００μｌの培地で回収し、次に細胞を３回の凍結および解凍を繰り返すことによって溶解した。細胞溶解物を３回の凍結および解凍に繰り返し付し、粗ウイルスを得た。粗ウイルスを使用して、慣用の方法によるプラーク単離に繰り返し付し、純粋に単離された組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＫを得た。
【００９１】
実施例２．２．２．  ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．１．および２．１．２のそれぞれにおいて構築されたＶＧＦおよびＴＫシャトルプラスミドを使用して、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されているワクシニアウイルスを生産した。
【００９２】
最初に、ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶを、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドが使用されたことを除いて、実施例２．２．１と同じ条件および方法において得た。その後、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴを、ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【００９３】
実施例２．２．３．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．３．において構築されたＫ３Ｌシャトルプラスミドを使用して、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを生産した。
【００９４】
ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴＫを、ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴが使用されたことを除いて、実施例２．２．１．と同じ条件および方法において得た。
【００９５】
実施例２．２．４．  ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されており、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．４．、２．１．２．、および２．１．３のそれぞれにおいて構築されたＶＧＦ（ｉ）、ＴＫ、およびＫ３Ｌシャトルプラスミドを使用して、ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されており、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを生産した。
【００９６】
最初に、ＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＴを、ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドが使用されたことを除いて、実施例２．２．１と同じ条件および方法において得た。次に、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＴＫを、ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＴが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【００９７】
加えて、ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されており、ＴＫおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶｉＴＫを、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＴＫが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【００９８】
実施例２．２．５．  ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．５．、２．１．１．、および２．１．３のそれぞれにおいて構築されたＴＫ（ｉ）、ＶＧＦ、およびＫ３Ｌシャトルプラスミドを使用して、ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを生産した。
【００９９】
最初に、ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶを、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドが使用されたことを除いて、実施例２．２．１．と同じ条件および方法において得た。その後、ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＫを、ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【０１００】
加えて、ＴＫ遺伝子の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴｉＫを、ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＫが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【０１０１】
実施例２．２．６．  Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの生産
実施例２．１．６．、２．１．１．、および実施例２．１．２．のそれぞれにおいて構築されたＫ３Ｌ（ｉ）、ＶＧＦ、およびＴＫシャトルプラスミドを使用して、Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスを生産した。
【０１０２】
最初に、ＶＧＦ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶを、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＧＦシャトルプラスミドが使用されたことを除いて、実施例２．２．１．と同じ条件および方法において得た。その後、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴを、ＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【０１０３】
加えて、Ｋ３Ｌ遺伝子の発現が不活性化されており、ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴＫｉを、ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌ（ｉ）シャトルプラスミドおよび組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴが使用されたことを除いて、上記と同じ方法において得た。
【０１０４】
実施例３．  組換えリスターワクシニアウイルスの生産
実施例３．１．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスベクターの構築
実施例３．１．１  Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスベクターの構築
リスターワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１５４９）のゲノムＤＮＡの両側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する遺伝子を、ＰＣＲにより増幅した。ここで、両側のＫ３Ｌ遺伝子に隣接する相同である塩基配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表１３に示される。かかる方法において、Ｋ３Ｌ−Ｌ（リスター）およびＫ３Ｌ−Ｒ（リスター）フラグメントを得て、次にそのＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングを、ＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドの構築プロセスにおいて産生されたｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄを使用して行った。
【０１０５】
【表１３】
2019520846.tif 000016
【０１０６】
ｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄをＥｃｏＲＶおよびＢｇｌＩＩで処理し、増幅されたＫ３Ｌ−Ｒ（リスター）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、ｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）を構築した。構築されたｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理し、増幅されたＫ３Ｌ−Ｌ（リスター）フラグメントをそれにＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングし、Ｋ３ＬシャトルプラスミドであるｐＳＰ７２−Ｋ３Ｌ−Ｌ−ｐ７．５−ＤｓＲｅｄ−Ｋ３Ｌ−Ｒ（リスター）（以下、「リスターＫ３Ｌシャトルプラスミド」と称される）を構築した。
【０１０７】
実施例３．２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの生産
実施例３．２．１．  ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの生産
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件で６−ウェルプレートにおいて、および２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地の条件においてＨｅＬａ細胞を調製した。次に、ＨｅＬａ細胞をｊｅｔＰＲＩＭＥを使用して２μｇの実施例２．１．１．において構築されたＩＨＤ  ＶＧＦシャトルプラスミドでトランスフェクトし、０．０５ＭＯＩのリスター野生型ワクシニアウイルスで同時に処理した。２時間のインキュベーション後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地と置き換え、次に細胞をさらに４８時間インキュベートした。最終的に、感染した細胞を５００μｌの培地で回収し、次に細胞を３回の凍結および解凍を繰り返すことによって溶解した。細胞溶解物を粗ウイルスと称した。生産された粗ウイルスを使用して、６回プラーク単離に付し、純粋に単離された組換えリスターワクシニアウイルスＶを得た。
【０１０８】
ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスＶＴを、組換えリスターワクシニアウイルスＶおよび実施例２．１．２．において構築されたＩＨＤ−Ｗ  ＴＫシャトルプラスミドが使用されたことを除いて、上記と同じ条件および方法において得た。
【０１０９】
実施例３．２．２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの生産
組換えウイルスを得るために、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスＴＫを、リスターＫ３Ｌシャトルプラスミドおよび組換えリスターワクシニアウイルスＶＴが使用されたことを除いて、実施例３．２．１と同じ条件および方法において得た。
【０１１０】
ＩＩ．  インビトロでの組換えワクシニアウイルスの腫瘍殺傷能力の同定
実験的実施例１．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスの癌細胞殺傷能力の同定
実施例Ｉ．において生産された組換えワクシニアウイルスＶＴＫが癌細胞の種々の型に対する殺傷能力を有するか否かを同定するために、ＣＣＫ−８分析を行った。
【０１１１】
種々のヒト癌細胞系において組換えウイルスの殺細胞能力を同定するために、癌細胞系を表１４に示されるように調製し、３７℃および５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーターにおいてインキュベートし、次に９６−ウェルプレートにアリコートした。
【０１１２】
【表１４】
2019520846.tif 000017
【０１１３】
ここで、ウェルあたりの細胞の数がＳＷ６２０について５×１０４、Ａ２７８０、Ａ５４９、ＤＵ１４５、Ｔ−４７Ｄ、およびＦａＤｕについて２×１０４、Ｈｅｐ３ＢおよびＨＴ−１０８０について１×１０４、およびＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＵ−８７  ＭＧについて５×１０３であるように、アリコートを行った。２４時間のインキュベーション後、各ウイルスについて０．５ＭＯＩがなし遂げられるように、細胞系を組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴＫ、組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＴｉＫｉ、または組換えリスターワクシニアウイルスＶＴＫに感染させた。ここで、ウイルスで処理されなかった細胞をコントロールグループとして使用した。３から５日後、細胞をＣＣＫ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＣＫ０４）溶液で染色し、癌細胞系の生存率を同定した。結果は図４Ａおよび４Ｂに示される。
【０１１４】
図４に示されるとおり、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されているか、またはそれらの発現が不活性化されている場合において、ワクシニアの株にかかわらず、癌細胞の種々の型に対する殺傷能力を示したことを同定した。
【０１１５】
実験的実施例２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されているか、またはそれらの発現が不活性化されている組換えワクシニアウイルスの癌細胞殺傷能力の同定
組換えワクシニアウイルスにおいて発現が抑制されている本願発明の遺伝子が、それらの発現を抑制する方法に依存して、癌細胞に対する異なる殺傷能力を示すか否かを同定するために、実施例１．２．９．から１．２．１２．において生産された組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴＫ、ＶｉＴＫ、ＶＴｉＫ、およびＶＴＫｉによって引き起こされる結腸直腸癌細胞系ＳＷ６２０の死の程度を同定した。
【０１１６】
最初に、ヒト結腸直腸癌細胞系ＳＷ６２０を１０％  ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地を使用して３７℃および５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーターにおいてインキュベートし、９６−ウェルプレートにアリコートした。ここで、ＳＷ６２０細胞をウェルあたり５ｘ１０４個にアリコートした。２４時間のインキュベーション後、０．００１、０．０１、０．１、または１ＭＯＩがなし遂げられるように、細胞系を組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴＫ、ＶｉＴＫ、ＶＴｉＫ、およびＶＴＫｉにそれぞれ感染させた。３日後、細胞をＣＣＫ−８溶液で染色し、ＥＤ５０を同定した。結果は図５に示される。
【０１１７】
結果から見ることができるとおり、ＶＴＫ遺伝子が欠失されており、その発現が完全に抑制されているウイルスおよびＶＴＫ遺伝子の発現が遺伝子の構造的な破壊によって不活性化されているウイルスの両方が、統計的に有意な差異なしで優れた癌細胞殺傷能力を示した。
【０１１８】
実験的実施例３．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えワクシニアウイルスの癌細胞選択的な殺傷能力の同定
細胞においてワクシニアウイルスの増殖のために必要とされるＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌの３つの遺伝子の発現が同時に抑制されている組換えワクシニアウイルスが、ＶＧＦおよびＴＫの２つの遺伝子の発現が同時に抑制されている組換えワクシニアウイルスまたはＫ３Ｌの１つの遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの場合と比較して、正常細胞と比較して癌細胞に対する殺傷能力を選択的に増加させるか否かについて同定した。
【０１１９】
最初に、正常ヒト細胞系であるＮＨＢＥ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−２５４０）およびヒト結腸直腸癌細胞系であるＳＷ６２０をＮＨＢＥについてＢＥＧＭ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ  Ｓｕｐｐｌ．  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−４１７５）を含むＢＥＢＭ基礎培地（Ｌｏｎｚａ、３１７１）およびＳＷ６２０について１０％  ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地を使用して３７℃および５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーターにおいてインキュベートし、９６−ウェルプレートにアリコートした。ここで、ＮＨＢＥおよびＳＷ６２０細胞をそれぞれウェルあたり５×１０３および５×１０４個にアリコートした。２４時間のインキュベーション後、０．００１、０．０１、０．１、または１ＭＯＩがなし遂げられるように、細胞系を組換えワクシニアウイルスＩＨＤ−Ｗ  Ｋ、ＶＴ、ＶＴＫ、またはＷＲ  Ｋ、ＶｉＴｉ、ＶｉＴｉＫｉにそれぞれ感染させた。３日後、細胞をＣＣＫ−８溶液で染色し、ＥＤ５０を得た。癌細胞に対するＥＤ５０を正常細胞のＥＤ５０によって割り、次に正常細胞と比較して癌細胞に対する選択的な殺傷能力の比較を、それぞれのウイルスグループにおいてＶＴＫ（ＩＨＤ−Ｗ）またはＶｉＴｉＫｉ（ＷＲ）に対応する値に基づいて作成した。結果は図６に示される。
【０１２０】
図６に示されるとおり、組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの場合、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＴまたはＶＴＫウイルスが、Ｋ３Ｌの１つの遺伝子の発現が抑制されているＩＨＤ−Ｗ  Ｋウイルスと比較して、正常細胞と比較して癌細胞に対する優れた殺傷能力を示すことを同定することができる。加えて、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＴＫウイルスが、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＴウイルスと比較して、優れた癌細胞選択的な殺傷能力を示すことを同定することができる。組換えＷＲワクシニアウイルスの場合、３つの遺伝子の発現が抑制されているＷＲ  ＶｉＴｉＫｉの殺傷能力がＷＲ  ＶｉＴｉと比較して優れていることを同定することができる。ここで、ＥＤ５０は、正常細胞および癌細胞に対する非常に低い殺傷能力によって、Ｋ３Ｌの１つの遺伝子の発現が抑制されているＷＲ  Ｋについて得ることができなかった。
【０１２１】
結論として、ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌの３つの遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスが、Ｋ３Ｌ遺伝子またはＶＧＦおよびＴＫ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスと比較して、優れた癌細胞選択的な殺傷能力を示すことを同定することができる。
【０１２２】
ＩＩＩ．  インビボでの組換えワクシニアウイルスの抗癌効果の同定
実験的実施例４．  腫瘍動物モデルにおいてＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの抗癌効果の同定
実施例Ｉにおいて生産された組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴおよびＶＴＫ、または組換えＷＲワクシニアウイルスＶｉＴｉおよびＶｉＴｉＫｉの抗腫瘍効果を、マウスモデルにおいて同定した。
【０１２３】
最初に、結腸直腸癌細胞系であるＳＷ６２０細胞系を、１０％  ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地においてインキュベートすることによって調製した。３７℃および５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーターにおいてインキュベートされた細胞が皿(dish)の７０％から８０％を占有した場合、細胞を癌細胞接種のために調製した。調製されたそれぞれの癌細胞を４℃で１，５００ｒｐｍで５分間遠心し、全ての上清を除去し、賦形剤（ＲＰＭＩ培地）それに加えることによって細胞を調製した。そのように調製された５ｘ１０６個の細胞を、ｎｕｄｅマウス（ｎｕ／ｎｕ  ＢＡＬＢ／ｃマウス；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ（Ｙｏｋｏｈａｍａ））の右脇腹において皮下に注射し、結腸直腸癌マウスモデルを調製した。１週間後、腫瘍が約７０から１００ｍｍ３のサイズまで増殖した場合、調製されたマウスモデルをグループあたり６匹のマウスにてＰＢＳ、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＴ、ＩＨＤ−Ｗ  ＶＴＫ、ＷＲ  ＶｉＴｉ、およびＷＲ  ＶｉＴｉＫｉで処理されるグループに分け、次にウイルスを５×１０６  ＴＣＩＤ５０で腫瘍に１回投与した。ウイルスの投与後の癌細胞のサイズを同定している結果は図７に示される。
【０１２４】
図７に示されるとおり、癌細胞の増殖が、コントロールグループであるＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＬＢ００１−０２）処理グループと比較して、組換えＩＨＤ−ＷまたはＷＲワクシニアウイルス処理グループにおいて抑制された。しかしながら、組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスおよびＷＲワクシニアウイルス間で抗癌効果において有意な差異がなかったことを同定した。
【０１２５】
実験的実施例５．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの安全性の同定
実施例Ｉにおいて生産されたＩＨＤ−ＷおよびＷＲ株の組換えワクシニアウイルスＶＴ（ＶｉＴｉ）およびＶＴＫ（ＶｉＴｉＫｉ）の安全性を評価するために、ウイルスを受けるマウスの体重変化、死亡率、および炎症性応答を同定し、図８から１０に示されている。
【０１２６】
図８に示されるとおり、組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの投与の４９日後に、ＶＴ投与グループは２５％の体重減少率を示したが、ＶＴＫ投与グループは約５％の体重減少率を示した。加えて、組換えＷＲワクシニアウイルスの投与の４４日後に、いくつかの個体はＶｉＴｉ処理グループにおいて４５％の体重減少率を示したが、個体はＶｉＴｉＫｉ処理グループにおいて体重減少率を示さなかった。加えて、図９に示されるとおり、組換えワクシニアウイルスの投与後の４９日後で、ＩＨＤ−ＷおよびＷＲ株の両方について、ＶＴ（ＶｉＴｉ）投与グループは３４％の死亡率を示したが、全ての個体はＶＴＫ（ＶｉＴｉＫｉ）投与グループにおいて生存した。
【０１２７】
加えて、図１０に示されるとおり、ＩＨＤ−Ｗ株のＶＴの投与後に生存したマウスが、ＩＨＤ−Ｗ株のＶＴＫを受けているマウスよりも尾領域においてより良い炎症性応答を示したことを同定することができた。
【０１２８】
上記結果から、組換えワクシニアウイルスにおいてＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌの３つの遺伝子の発現が抑制されている場合が、組換えワクシニアウイルスにおいてＶＧＦおよびＴＫの２つの遺伝子の発現が抑制されている場合と比較して、インビボでの安全性に関して非常に優れていることを見ることができる。
【図１】
2019520846.tif 000018
【図２】
2019520846.tif 000019
【図３】
2019520846.tif 000020
【図４Ａ】
2019520846.tif 000021
【図４Ｂ】
2019520846.tif 000022
【図５】
2019520846.tif 000023
【図６】
2019520846.tif 000024
【図７】
2019520846.tif 000025
【図８】
2019520846.tif 000026
【図９】
2019520846.tif 000027
【図１０】
2019520846.tif 000028
【配列表】
2019520846000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月15日(2019.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図６】図６は、正常細胞と比較して癌細胞に対する、Ｋ３Ｌのみ、またはＶＧＦおよびＴＫの両方、またはＶＧＦおよびＴＫおよびＫ３Ｌの全て、の遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの殺傷能力を同定するグラフである：（ａ）は、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫ値に基づいて、正常細胞と比較して癌細胞に対する組換えＩＨＤ−Ｗ−Ｋ、ＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの殺傷能力について比較させることによって得られたグラフである；（ｂ）は、ＷＲ−ＶｉＴｉＫｉ値に基づいて、正常細胞と比較して癌細胞に対する組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの殺傷能力について比較させることによって得られたグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図７】図７は、ＶＧＦおよびＴＫの両方、またはＶＧＦおよびＴＫおよびＫ３Ｌの全て、の遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の腫瘍サイズにおける変化を観察することによって得られたグラフである：（ａ）は、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の腫瘍サイズにおける変化を観察することによって得られたグラフである；（ｂ）は、組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の腫瘍サイズにおける変化を観察することによって得られたグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図８】図８は、ＶＧＦおよびＴＫの両方、またはＶＧＦおよびＴＫおよびＫ３Ｌの全て、の遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の個々でのマウスの体重における変化を同定するグラフである：（ａ）は、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の個々でのマウスの体重における変化を同定するグラフである；（ｂ）は、組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後の個々でのマウスの体重における変化を同定するグラフである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図９】図９は、ＶＧＦおよびＴＫの両方、またはＶＧＦおよびＴＫおよびＫ３Ｌの全て、の遺伝子の発現が抑制されている組換えワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの死亡率を同定するグラフである：（ａ）は、組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴまたはＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの死亡率を同定するグラフである；（ｂ）は、組換えＷＲ−ＶｉＴｉまたはＷＲ−ＶｉＴｉＫｉワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの死亡率を同定するグラフである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１０】図１０は、ＶＧＦおよびＴＫの両方、またはＶＧＦおよびＴＫおよびＫ３Ｌの全て、の遺伝子の発現が抑制されている組換えＩＨＤ−Ｗワクシニアウイルスの結腸直腸癌マウスモデルへの投与後のマウスの尾における炎症反応を同定する結果を示す：（ａ）組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴワクシニアウイルスが投与されたマウスの尾における炎症性応答を同定する結果を示す、（ｂ）組換えＩＨＤ−Ｗ−ＶＴＫワクシニアウイルスが投与されたマウスの尾における炎症性反応を確認する結果を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
実施例１．  組換えＷＲワクシニアウイルスの生産
実施例１．１．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が不活性化されているか、または欠失されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
実施例１．１．１．  ＶＧＦ遺伝子の発現が不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスベクターの構築
ＷＲワクシニアウイルス（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＶＲ−１３５４）のゲノムＤＮＡの両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する遺伝子を、ＰＣＲにより増幅し、それぞれをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙに挿入し、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｌ（ＷＲ）およびｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−ＶＧＦ−Ｒ（ＷＲ）を構築した。両側のＶＧＦ遺伝子に隣接する相同塩基配列の増幅のために使用されたプライマーの情報は、表３に示される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例１．２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されているか、または不活性化されている組換えＷＲワクシニアウイルスの生産
実施例１．２．１．  Ｋ３Ｌ遺伝子が欠失されているＷＲワクシニアウイルスの生産
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件で６−ウェルプレートにおいて、および２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地の条件においてＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  ＣＣＬ−２）細胞を調製した。次に、ＨｅＬａ細胞をｊｅｔＰＲＩＭＥ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｃａｔ  Ｎｏ．  １１４−０７）を使用して実施例１．１．３において構築された２μｇのＷＲ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドでトランスフェクトし、０．０５ＭＯＩのＷＲ野生型ワクシニアウイルスで同時に処理した。４時間のインキュベーション後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地と置き換え、次に細胞をさらに４８時間インキュベートした。最終的に、感染した細胞を５００μｌの培地で回収し、次に細胞を３回の凍結および解凍を繰り返すことによって溶解した。細胞溶解物を粗ウイルスと称した。生産された粗ウイルスを使用して、６回プラーク単離に付し、純粋に単離された組換えＷＲワクシニアウイルスＫを得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件で６−ウェルプレートにおいて、および２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地の条件においてＨｅＬａ細胞を調製した。次に、ＨｅＬａ細胞をｊｅｔＰＲＩＭＥを使用して２μｇのＩＨＤ−Ｗ  Ｋ３Ｌシャトルプラスミドでトランスフェクトし、０．０５ＭＯＩのＩＨＤ−Ｗ野生型ワクシニアウイルスで同時に処理した。４時間のインキュベーション後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地と置き換え、次に細胞をさらに４８時間インキュベートした。最終的に、感染した細胞を５００μｌの培地で回収し、次に細胞を３回の凍結および解凍を繰り返すことによって溶解した。細胞溶解物を３回の凍結および解凍に繰り返し付し、粗ウイルスを得た。粗ウイルスを使用して、慣用の方法によるプラーク単離に繰り返し付し、純粋に単離された組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＫを得た。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
実施例３．２．  ＶＧＦ、ＴＫ、およびＫ３Ｌ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの生産
実施例３．２．１．  ＶＧＦおよびＴＫ遺伝子が欠失されている組換えリスターワクシニアウイルスの生産
組換えウイルスを得るために、３×１０５細胞／ウェルの条件で６−ウェルプレートにおいて、および２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地の条件においてＨｅＬａ細胞を調製した。次に、ＨｅＬａ細胞をｊｅｔＰＲＩＭＥを使用して２μｇの実施例２．１．１．において構築されたＩＨＤ  ＶＧＦシャトルプラスミドでトランスフェクトし、０．０５ＭＯＩのリスター野生型ワクシニアウイルスで同時に処理した。４時間のインキュベーション後、培地を５％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地と置き換え、次に細胞をさらに４８時間インキュベートした。最終的に、感染した細胞を５００μｌの培地で回収し、次に細胞を３回の凍結および解凍を繰り返すことによって溶解した。細胞溶解物を粗ウイルスと称した。生産された粗ウイルスを使用して、６回プラーク単離に付し、純粋に単離された組換えリスターワクシニアウイルスＶを得た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
【表１４】
2019520846.tif 000029
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
最初に、ヒト結腸直腸癌細胞系ＳＷ６２０を２％  ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地を使用して３７℃および５％  ＣＯ２の条件下でインキュベーターにおいてインキュベートし、９６−ウェルプレートにアリコートした。ここで、ＳＷ６２０細胞をウェルあたり５ｘ１０４個にアリコートした。２４時間のインキュベーション後、０．００１、０．０１、０．１、または１ＭＯＩがなし遂げられるように、細胞系を組換えＩＨＤ−ＷワクシニアウイルスＶＴＫ、ＶｉＴＫ、ＶＴｉＫ、およびＶＴＫｉにそれぞれ感染させた。３日後、細胞をＣＣＫ−８溶液で染色し、ＥＤ５０を同定した。結果は図５に示される。
【国際調査報告】
2019520846.tif 000030
2019520846.tif 000031
2019520846.tif 000032
2019520846.tif 000033
2019520846.tif 000034
2019520846.tif 000035