(57)【要約】  少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドであって、１つのマイコバクテリウム抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つのマイコバクテリウム抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である融合ポリペプチドが本明細書で提供される。哺乳動物における二次性結核菌（Mycobacterium tuberculosis）感染症の予防または治療および非結核性マイコバクテリウム感染症の予防または治療のためにそのような融合ポリペプチドを製造および使用する方法も本明細書で提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドであって、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である、融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原が、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８ｂ、Ｒｖ２３８９−ｂ、またはＲｖ１８８６−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原が、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８ｂ、Ｒｖ２３８９−ｂ、またはＲｖ１８８６−ｂの配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原が、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原が、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０の配列を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
第３の抗原をさらに含み、前記第３の抗原が、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
第３の抗原をさらに含み、前記第３の抗原が、強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ２３８９−ｂ、およびＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する抗原を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ２３８９−ｂ、およびＲｖ２６０８−ｂを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記融合ポリペプチドが、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記融合ポリペプチドが、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１に記載の融合ポリペプチドのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
対象においてマイコバクテリウムへの強いセントラルメモリーＴ細胞応答およびマイコバクテリウムへの強いエフェクターメモリーＴ細胞応答を活性化させる方法であって、有効量の、請求項１〜１１に記載の融合ポリペプチドのいずれか１つまたは請求項１２に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
対象において二次性結核感染症を予防または治療する方法であって、有効量の、請求項１〜１１に記載の融合ポリペプチドのいずれか１つまたは請求項１２に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
対象において二次性結核感染症を予防するために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象において二次性結核感染症を治療するために使用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記結核感染症が、ＮＴＭによる二次感染症である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記結核感染症が、潜伏ＭｔｂまたはＮＴＭ感染症の再活性化である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療する方法であって、有効量の、請求項１〜１１に記載の融合ポリペプチドのいずれか１つまたは請求項１２に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
対象においてＮＴＭ感染症を予防するために使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象においてＮＴＭ感染症を治療するために使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＴＭ感染症が一次感染症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＴＭ感染症が二次感染症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
対象において活動性ＴＢ疾患の徴候または症状を減少させる方法であって、有効量の、請求項１〜１１に記載の融合ポリペプチドのいずれか１つまたは請求項１２に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
前記対象がクォンティフェロン陽性である、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象がクォンティフェロン陰性である、請求項１３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療する方法であって、有効量の、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、またはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチドを対象に投与することを含む、方法。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドが、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７、またはＩＤ９１である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象においてＮＴＭ細菌負荷を減少させる方法であって、前記対象の細胞を、（ｉ）ＴＬＲ４アゴニスト、（ｉｉ）ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、もしくはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチド、または（ｉｉｉ）これらの組合せと接触させることを含む、方法。
【請求項３０】
前記ＴＬＲ４アゴニストがＧＬＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＬＲ４がＳＬＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記融合ポリペプチドが、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、またはＩＤ９１である、請求項２９、３０、または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月２１日に出願された米国仮出願第６２／３３９，８５８号の利益を主張し、該仮出願は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータで読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：712192003940SEQLIST.txt、記録日：２０１７年５月１９日、サイズ：２２９ＫＢ）。
【背景技術】
【０００３】
結核（ＴＢ）は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis (Ｍｔｂ）)の感染によって引き起こされる慢性の感染性疾患である。ＴＢは発展途上国において主要な流行性疾患であると共に、世界の先進地域においても問題が増加しており、年間で１７０万人から２００万人の生命を奪っている。感染はかなりの期間にわたって無症候性の場合もあるが、疾患は最も一般的には肺の急性炎症として現れ、発熱および乾性咳を生じさせる。治療しない場合、通常、深刻な合併症および死に至る。多剤耐性ＴＢ（ＭＤＲ−ＴＢ）の増加がこの脅威をさらに高めている（Dye, Nat Rev Microbiol 2009;7:81-7）。
【０００４】
非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）の種は、肺疾患（ＴＢ様）、リンパ系、皮膚、軟組織、骨の感染症、および全身性疾患などの広範な疾患を引き起こす。ＮＴＭ感染症が増加している。そのような感染症、特に免疫不全患者におけるそのような感染症は、以前に感染し、薬物治療を受けたＭｔｂ感染個体における二次感染症の保有者の増加に繋がっている。現在、１５０を超える異なる種のＮＴＭが存在するが、より一般的な感染種は、Mycobacterium avium complex（ＭＡＣ）、Mycobacterium kansasii、およびMycobacterium abscessusである（Nontuberculous mycobacterial pulmonary infections., Margaret M. Johnson and John A. Odell Journal of Thoracic Disease, Vol 6, No 3 March 2014に総説されている）。ＣＤＣ（http://www.cdc.gov/nczved/divisions/dfbmd/diseases/nontb_mycobacterium/technical.html）には、M. malmoense、M. simiae、M. szulgai、M. xenopi（肺炎に関連する）；M. scrofulaceum（リンパ節炎に関連する）；およびM. abscessus、M. chelonae、M. haemophilum、M. ulcerans（皮膚および軟組織感染症）などの、様々な疾患の原因とされることがある多くのＮＴＭの種が述べられている。一部の熱帯地域では、M. ulceransの感染によって引き起こされるブルーリ潰瘍疾患は、重篤な病的状態および疾病の一般的な原因である。
【０００５】
ＴＢの経過は、本質的に３つの段階を通じて進む。急性期または活動期には、細菌は器官内で指数、対数、または半対数速度で増殖または活発に倍化し、免疫応答が増大して感染を制御できるようになると細菌負荷はピークに達し、減退が始まる。機序は完全には理解されていないが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮγ）と協調した増感ＣＤ４＋  Ｔ細胞が感染の制御を媒介すると考えられている。活動性の免疫応答が細菌負荷を低下させ、それを安定かつ低レベルで支配下に維持すると、潜伏期が確立される。以前の研究では、Ｍｔｂは潜伏の間に活動性の倍化から休止に進み、本質的に非複製状態となり、肉芽腫の内部に残ることが報告されている。しかしながら、最近の研究では、潜伏においてさえ、細菌集団の少なくとも一部は活動性の代謝状態のままであることが実証されている。（Talaat et al. 2007, J of Bact 189, 4265-74）。
【０００６】
したがって、これらの細菌は、生き残り、活動性の代謝を維持し、かつ強い免疫応答を受けて最小限に複製する。したがって、潜伏の間の感染個体では、非複製性の細菌（細胞内に位置するため、免疫系による検出が非常に困難なことがある）とゆっくりと複製する細菌との間で均衡が存在する。場合によっては、潜伏感染は再活性化に入り、初期感染よりいくぶん低い速度ではあるが、活動休止中の細菌が再び複製を開始する。一次感染症から潜伏へのＭｔｂの遷移は遺伝子発現の変化を伴うことが示唆されている（Honerzu Bentrup, 2001）。また、活動性の複製から休止への遷移の間に細菌は遺伝子発現を調節するので、免疫応答の抗原特異性の変化が起こる可能性もある。潜伏感染を制御する免疫応答の全体的性質および再活性化に繋がる因子の大部分は未知である。しかしながら、関与する優勢な細胞種の移行についていくつかの証拠が存在する。急性期の感染の制御にはＣＤ４＋  Ｔ細胞が必須かつ十分であるが、いくつかの研究は、潜伏期にはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答がより重要であることを示唆している。従来の予防ワクチンを潜伏感染の実験動物に与えた時の活性の欠如によって例示されるように、この段階の細胞は、通常、ＴＢ分野において現在開発されているほとんどの予防ワクチンによって標的化されない（Turner et al. 2000 Infect Immun. 68:6:3674-9)。
【０００７】
Ｍｔｂの種によって引き起こされるＴＢの診断では臨床検体における細菌の単離が疾患の診断であるが、それとは異なり、臨床分離菌におけるＮＴＭの種の存在は疾患と相関しない。ＮＴＭはＭｔｂの種と多くの特徴を共有し、それがリソースの乏しい状況において細菌の区別を困難にする。ＴＢを診断する（diagnosting）ための標準的な方法は痰スメアの顕微鏡検査によるものであるが、このアプローチを使用する場合、ＮＴＭはＭｔｂと同一に見える。分子的方法なしでは、これらの生物体は区別が困難である。多くのＮＴＭの臨床症状はＴＢの臨床症状を模倣できるので、多くの場合に患者はＭｔｂ感染症を有するものとみなされる。American Thoracic Society（ＡＴＳ）およびInfectious Disease Society of America（ＩＤＳＡ）が２００７年に共同で刊行したガイドラインでは、ＮＴＭ肺感染症を診断するために、症状、放射線学的な異常、および微生物学的培養物の存在がその他の潜在的な病因の排除と組み合わせて必要とされている（M. Johnson and John A. Odell Journal of Thoracic Disease, Vol 6, No 3 March 2014）。多くのＮＴＭの種は、飲用水、家内の配管、ピートに富んだ土壌、汽水性湿地、排水、病院内の水系統、血液透析センター、および歯科医院に見られることから、それらは環境中に特に遍在するものとなっている。
【０００８】
通常、Ｍｔｂは長期の抗生物質治療を使用することで制御できるが、そのような治療は疾患の拡散の防止には十分でない。感染個体は、しばらくの間、無症候性ではあるが伝染性なことがある。潜伏性ＴＢ（無症候性かつ非伝染性）に対する現在の臨床プラクティスは、６〜９ヶ月のイソニアジドもしくはその他の抗生物質での治療、または代替的に４ヶ月のリファンピンでの治療である。活動性のＭｔｂ感染症は、４つの薬剤の組合せを６〜８週間（この間に大部分の桿菌は殺傷されるものと思われる）、それに続いて合計で６〜９ヶ月の継続期間の２つの薬物により治療される。治療の継続期間は、各週に与える投薬回数に依存する。加えて、治療レジメンへのコンプライアンスが決定的に重要であるが、患者の行動をモニターすることは難しい。治療の副作用または過度の継続期間（６〜９ヶ月）のいずれかに起因して一部の患者は治療過程を完了せず、それにより、効果的でない治療および薬物耐性の発生に繋がる場合があることを研究は示している。加えて、Ｍｔｂの種の抗生物質耐性株、特に多剤耐性（ＭＤＲ）株の増加は、薬物耐性ＮＴＭ種の出現の増加に繋がる可能性があるという懸念が増している。多くの場合、標準的なＴＢ治療はＮＴＭ感染症に対して効果的でない。抗ＴＢ薬剤は約５０％の奏効率である。ＮＴＭ関連疾患において。
【０００９】
二次性結核疾患およびＮＴＭ感染症の原因の年代学にかかわらず、ＴＢ疾患の発生ならびにＭｔｂの種およびＮＴＭの種のＭＤＲ株の出現の増加のリスクは、発展途上国および先進国にとって深刻な健康上の問題である。したがって、世界中でＴＢの伝染を減少させるため、ならびに薬物耐性および多剤耐性のＭｔｂおよびＮＴＭの種の出現を減少させるために、二次性Ｍｔｂ感染症およびＮＴＭの種による感染症のより効果的な予防および治療的処置に対する緊急の必要性が存在する。本明細書で提供する方法および組成物は、二次性Ｍｔｂ感染症の治療および予防ならびにＮＴＭ感染症の予防および治療に有用である。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、以前から存在する構造的肺疾患を有する対象（例えば、以前のＴＢ、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性繊維症の歴史を有する対象）の治療などの、対象においてＭｔｂによって引き起こされる二次性結核（ＴＢ）を予防または治療するための組成物および方法ならびに対象においてＮＴＭによって引き起こされる感染症を予防または治療するための組成物および方法を提供する。
【００１１】
ＴＢを治療するための本明細書に記載する組成物および方法は、強いセントラルメモリーＴ細胞応答および強いエフェクターメモリーＴ細胞応答の両方を引き出すことができる。本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれか１つを投与する方法が本明細書で提供される。そのような融合ポリペプチドは少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含み、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である。
【００１２】
一態様では、少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドが本明細書で提供され、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である。一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８ｂ、Ｒｖ２３８９−ｂ、またはＲｖ１８８６−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８ｂ、Ｒｖ２３８９−ｂ、またはＲｖ１８８６−ｂの配列を含む。一部の実施形態では、強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９、またはＲｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０の配列を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは第３の抗原をさらに含み、第３の抗原は強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子である。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは第３の抗原をさらに含み、第３の抗原は強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ２３８９−ｂ、およびＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する抗原を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ２３８９−ｂ、およびＲｖ２６０８−ｂを含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７である。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＩＤ９１である。
【００１３】
別の態様では、本明細書で提供する融合ポリペプチドのいずれか１つ、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
【００１４】
別の態様では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチドのいずれか１つまたは該融合ポリペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてマイコバクテリウムへの強いセントラルメモリーＴ細胞応答およびマイコバクテリウムへの強いエフェクターメモリーＴ細胞応答を活性化させる方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。
【００１５】
別の態様では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチドのいずれか１つまたは該融合ポリペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において二次性結核感染症を予防または治療する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、対象において二次性結核感染症を予防するために使用される。一部の実施形態では、方法は、対象において二次性結核感染症を治療するために使用される。一部の実施形態では、結核感染症は潜伏性Ｍｔｂ感染症の再活性化である。一部の実施形態では、肺感染症は潜伏性ＮＴＭ感染症の再活性化である。対象はクォンティフェロン陽性またはクォンティフェロン陰性であり得る。
【００１６】
別の態様では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチドのいずれか１つまたは該融合ポリペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、対象においてＮＴＭ感染症を予防するために使用される。一部の実施形態では、方法は、対象においてＮＴＭ感染症を治療するために使用される。一部の実施形態では、ＮＴＭ感染症は一次感染症である。一部の実施形態では、ＮＴＭ感染症は二次感染症である。対象はクォンティフェロン陽性またはクォンティフェロン陰性であり得る。
【００１７】
別の態様では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチドのいずれか１つまたは該融合ポリペプチドを含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象において活動性ＴＢ疾患の徴候または症状を減少させる方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。
【００１８】
別の態様では、有効量の、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、もしくはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチドまたはＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、もしくはＩＤ９１である融合ポリペプチドを対象に投与することを含む、対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療する方法が本明細書で提供される。
【００１９】
別の態様では、対象の細胞を、（ｉ）ＴＬＲ４アゴニスト、（ｉｉ）ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、もしくはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチド、または（ｉｉｉ）これらの組合せと接触させることを含む、対象においてＮＴＭ細菌負荷を減少させる方法が本明細書で提供される。
【００２０】
本明細書に記載する様々な実施形態の特性の一つ、一部、または全てを組み合わせて本発明のその他の実施形態を形成してもよいことを理解するべきである。本発明のこれらのおよびその他の態様は当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ベースラインおよびワクチン接種の２週間後に測定されたＩＤ９３抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のキネティクスを示す。抗原（ペプチドプール）刺激ＰＢＭＣの細胞内サイトカイン染色から非刺激の値を引いたものとして測定される任意の抗原特異的マーカー（ＩＦＮｇ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＣＤ１５４、ＩＬ−２２、および／またはＩＬ−１７）について陽性のＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度である。ワクチンは０日目、２８日目、および５６日目に投与した。
【００２２】
【図２】図２は、Ｒｖ１８１３（Ｒｖ１８１３−ａまたはＲｖ１８１３−ｂのいずれか）、Ｒｖ２６０８（Ｒｖ２６０８−ａまたはＲｖ２６０８−ｂのいずれか）、Ｒｖ３６１９、またはＲｖ３６２０ペプチド／抗原を含有するプールでの刺激に対する全血のＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の中央値の全量的変化を示す。エラーバーは各刺激についての四分位範囲（ＩＱＲ）を表す。ＩＤ９３−２ワクチン接種およびプラセボ対象をコホートによって層化し、また応答を試験日によって縦方向に層化した。バックグラウンド値（非刺激）を引いた。データは、ＩＤ９３−２での免疫化がワクチン接種対象において免疫応答を生成し、それは総じて免疫化の１４〜４２日後にピークとなることを実証する。Ｒｖ２６０８（上から３つ目の積み上げたバー）およびＲｖ３６１９（上から２つ目の積み上げたバー）は、ＩＤ９３−２の抗原サブユニットタンパク質に対して定量的に最も大きい免疫応答を生成する。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種後の各特定抗原に対する応答の大きさおよびキネティクスはコホート間でばらつきがあった。ワクチン接種はＲｖ２６０８特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘発し、それはコホートによらず、全てのＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種の参加者においてベースラインより高かった。全てのコホートにおいて、Ｒｖ１８１３およびＲｖ２６０８に対する最大のＣＤ４  Ｔ細胞応答は、投与量によらず２回のワクチンの投与の後に見られた。３回目のワクチン投与は、２回目の投与によって見られたものよりもはっきりと高く応答を増強することはなかった。コホート２、３、および４において、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥの単回投与はＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０に対するＣＤ４  Ｔ細胞応答を迅速に誘発し、これは、背景となる潜伏Ｍ．ｔｂ感染症に対する増強効果である可能性が最も高い。しかしながら、ＱＦＴ陰性のコホート１の参加者において、ワクチン接種後のＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０の応答は、ベースライン（例えば、４２日目にＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０のピークの測定された応答のウィルコクソンｐ値はそれぞれ０．９４５３および０．６８７５であった）またはプラセボ（マン・ホイットニー）の応答と統計的に差がなく、Ｒｖ３６１９およびＲｖ３６２０への応答は、Ｍ．ｔｂによる天然の感染によって他にプライムされていない個体においてはＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥによって誘発され得なかったことを示唆する。
【００２３】
【図３】図３は、ＦＤＳ解析を行うための一般的方法を示す。
【００２４】
【図４】図４Ａ〜Ｂは、ＩＤ９３−２（Ｒｖ１８１３（ａまたはｂ）、Ｒｖ２６０８（ａまたはｂ）、Ｒｖ３６１９、およびＲｖ３６２０）の抗原サブユニットタンパク質で刺激されたＰＢＭＣの細胞内染色解析後のＱＦＴ＋（ＴＢを引き起こす病原体に以前に感染した対象、図４Ａ、クォンティフェロン陽性）対象およびＱＦＴ−（ＴＢナイーブ、図４Ｂ、クォンティフェロン陰性）対象の両方における臨床研究のコホート２および４からのＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥをワクチン接種した対象におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞集団のＦＤＳの定性的解析を示す。データは、Ｒｖ１８１３および２６０８は強いセントラルメモリーＣＤ４＋抗原であり、ＩＤ９３−２でのナイーブ結核対象のワクチン接種は、これらの抗原に対する強いセントラルメモリー応答（１またはそれ未満のＦＤＳスコア）へのＴ細胞プロファイルの分化を推進できることを示す。反対に、Ｒｖ３６１９およびＲｖ３６２０は強いエフェクターメモリーＣＤ４＋抗原（３またはそれより高いＦＤＳスコア）であり、ＩＤ９３−２でのナイーブ結核対象のワクチン接種は、これらの抗原に対する強いエフェクターメモリー応答へのＣＤ４＋  Ｔ細胞プロファイルの分化を推進できる。
【００２５】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、臨床試験のコホート２および４からのＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥで免疫化した対象におけるＩＤ９３−２での最終のワクチン接種の６ヶ月後のＦＤＳプロファイルを示す。図５Ａのデータは、異なるＴＢ集団でのＩＤ９３−２サブユニットタンパク質に対するＦＤＳスコアの解析を示す。ＱＦＴ＋およびＱＦＴ−の両方の対象におけるＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの３回の投薬でのワクチン接種の６ヶ月後に、データは、ＩＤ９３−２のＲｖ２６０８およびＲｖ１８１３タンパク質は強いＣＤ４＋  Ｔ細胞セントラルメモリー抗原であり、ＩＤ９３−２のＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０タンパク質は強いＣＤ４＋  Ｔ細胞エフェクターメモリー抗原であることを示す。図５Ｂは全体として、集団の結核状態にかかわらず、Ｒｖ２６０８およびＲｖ１８１３は強いＣＤ４＋  Ｔ細胞セントラルメモリー抗原であり、Ｒｖ３６１９およびＲｖ３６２０は共に強いＣＤ４＋  Ｔ細胞エフェクターメモリー抗原であることを示す。
【００２６】
【図６】図６は、ＧＬＡ−ＡＦおよびＱＳ２１によるＮＴＭ  M. aviumの増殖阻害を示す。ＴＬＲ４製剤はＮＴＭ  M. aviumマイコバクテリアの増殖を阻害する。
【００２７】
【図７】図７は、ＩＤ９１−ＧＬＡ−ＳＥまたはＩＤ９１によるＮＴＭ  M.Aviumの増殖阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は、Ｍｔｂによって引き起こされる二次性結核（ＴＢ）を予防または治療するための組成物および方法を提供する。本開示はまた、ＴＢを模倣する肺感染症などのＮＴＭによって引き起こされる一次および二次感染症を予防または治療するための組成物および方法も提供する。例示的な実施形態では、そのようなＴＢおよびＮＴＭ感染症を治療するための組成物および方法は、本明細書で提供する融合ポリペプチドのいずれか１つの投与によって強いセントラルメモリーＴ細胞応答および強いエフェクターメモリーＴ細胞応答の両方を引き出すことができ、該融合ポリペプチドは、少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含み、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である。
【００２９】
本開示はとりわけ、ある特定のマイコバクテリウム抗原がマイコバクテリウムへの強いセントラルメモリーＴ細胞応答を活性化でき、かつある特定のマイコバクテリウム抗原がマイコバクテリウムへの強いエフェクターメモリーＴ細胞応答を活性化できるという驚くべき発見に基づく。同様に、少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドであって、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である融合ポリペプチドの対象への投与がマイコバクテリウムへの強いセントラルメモリーＴ細胞応答およびマイコバクテリウムへの強いエフェクターメモリーＴ細胞応答の両方を引き出すことは驚くべき発見であった。
【００３０】
また、本開示はとりわけ、記載するマイコバクテリウム抗原は、既にＴＢを有しておりかつＴＢの治療に成功した対象（例えば、以前に感染した対象）においてＴＢを予防または治療できるという発見にも基づく。
【００３１】
本明細書に記載するように、本開示は、概しては、対象において二次性結核疾患（ＴＢ）を予防または治療するためおよび対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療するための組成物および方法に関し、該方法は、有効量の、少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドを対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である。
【００３２】
本明細書に記載するように、ＴＬＲ４アゴニストは、対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療するためにも使用することができる。ＮＴＭ感染症の治療のために有効量のＴＬＲ４アゴニストを対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。また、対象の細胞を、（ｉ）ＴＬＲ４アゴニスト、（ｉｉ）本明細書に記載する融合ポリエプチド（polyeptides）のいずれか、または（ｉｉｉ）これらの組合せと接触させることを含む、対象においてＮＴＭ細菌負荷を減少させる方法も提供される。対象の細胞は対象中にあってよく、かつ接触は、ＴＲＬ４アゴニストおよび／または本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれかを対象に投与することにより為される。
【００３３】
定義
本明細書において、「約」および「〜から本質的になる」という用語は、別段の記載がなければ、示した範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される「ａ」および「ａｎ」という用語は、数えられる構成成分の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の一つ、両方、または任意のこれらの組合せのいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書で使用する場合、「〜を含む（include）」、「〜を有する」、および「〜を含む（comprise）」という用語は同義に使用され、これらの用語およびその変形は、非限定的なものとして解されることが意図される。
【００３４】
「個体」または「対象」は哺乳動物、例えばヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては、農用動物（畜牛、豚、馬など）、競技動物、愛玩動物（猫、犬、馬など）、霊長目動物、マウス、およびラットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「M. tuberculosis」および「Ｍｔｂ」は、哺乳動物においてＴＢ疾患を引き起こすことがある種類の細菌、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を指す。
【００３６】
本明細書で交換可能に使用される「非結核性マイコバクテリウム」または「ＮＴＭ」には、肺感染症（例えば、ＴＢを模倣する肺感染症）などのＮＴＭに関連する感染症を哺乳動物において引き起こすことがある細菌種が含まれる。ＮＴＭは、ＭｔｂまたはMycobcterium leprae以外の任意のマイコバクテリウム病原体として定義される。ＮＴＭは広範な疾患を引き起こし、該疾患としては、肺感染症（例えば、ＴＢ様肺疾患）、リンパ系、皮膚、軟組織、または骨の感染症、および全身性疾患（systemic disaease）が挙げられる。ＮＴＭは、例えば、以前から存在する疾患を有しない対象、以前から存在する構造的肺疾患を有する対象（例えば、以前のＴＢ、慢性閉塞性肺疾患、または嚢胞性繊維症の歴史を有する対象）、ならびにＡＩＤＳ患者などの免疫不全患者、および一次性Ｍｔｂ感染症を有していた患者に感染することがある。ＮＴＭとしては、以下に限定されないが、M. bovis、またはM. africanum、ＢＣＧ、M. avium、M. intracellulare、M. celatum、M. genavense、M. haemophilum、M. kansasii、M. abscessus、M. simiae、M. vaccae、M. fortuitum、およびM. scrofulaceumの種が挙げられる（例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (16th ed., Braunwald, et al., eds., 2005を参照）。多くのＮＴＭの種は、飲用水、家内の配管、ピートに富んだ土壌、汽水性湿地、排水、病院内の水系統、血液透析センター、および歯科医院に見られることから、それらは環境中に特に遍在するものとなっている。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「マイコバクテリウム感染症」または「マイコバクテリウムによる感染」は、Ｍｔｂおよび／またはＮＴＭによる感染症を指す。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「マイコバクテリウム抗原」は、ＭｔｂまたはＮＴＭに由来する抗原を指す。本明細書で使用する場合、「Ｍｔｂ抗原」は、Ｍｔｂに由来する抗原を指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「ＮＴＭ抗原」は、ＮＴＭに由来する抗原、例えば、M. avium、M. kansasii、M. bovis、M. intracellulare、M. celatum、M. malmoense、M. simiae、M. szulgai、M. xenopi（肺炎に関連する）；M. scrofulaceum（リンパ節炎に関連する）；およびM. abscessus、M. chelonae、またはM. haemophilum、またはM. ulceransに由来する抗原を指す。
【００４０】
本明細書で使用される「一次性結核」または「一次性ＴＢ」または「一次性ＴＢ感染症」または「一次性結核感染症」または「一次感染症」または「一次性マイコバクテリウム感染症」は、宿主の免疫系が初期感染を十分に阻止できないことにより結核菌（Mycobacterium tuberculosis）への最初の曝露および感染後の最初の数年以内に発症するＴＢ疾患を指す。一部の一次感染症は全く治療されない。
【００４１】
本明細書で使用される「二次性結核」または「二次性ＴＢ」または「二次性ＴＢ感染症」または「二次性結核感染症」または「二次感染症」または「二次性マイコバクテリウム感染症」は、（ｉ）一次性Ｍｔｂ感染症からの潜伏株の再活性化により起こるＴＢ疾患、（ｉｉ）第２のＭｔｂ株（一次性Ｍｔｂ感染症に関与する株と二次性Ｍｔｂ感染症に関与する株は同じ株ではない）による第２のその後の再感染により起こるＴＢ疾患、または（ｉｉｉ）一次性Ｍｔｂ感染症からの潜伏株の再活性化および第２のＭｔｂ株による第２のその後の再感染の両方により特徴付けられるＴＢ疾患を指す。
【００４２】
二次性ＴＢには、一次性臨床分離株において同定されない二次性マイコバクテリウム株による宿主の感染症が包含される。二次性ＴＢにはまた、一次性ＴＢ分離株と比べて二次性臨床分離菌において増加した頻度で存在する分離株も包含される。二次性ＴＢは、例えば潜伏性ＴＢ感染症を有する宿主において起こることがある。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「ＮＴＭ感染症」は、ＮＴＭによる一次または二次感染症のいずれかを指す。
【００４４】
「薬物耐性」マイコバクテリウム感染症は、Ｍｔｂ感染症または非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）による感染症であって、感染株が、ＭｔｂまたはＮＴＭ感染症の治療に効果的ないわゆる「フロントライン」の化学療法剤（例えば、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン、およびピラジナミド）の１つまたは複数によって静止状態に保持または殺傷されない（該化学療法剤に耐性）ものを指す。
【００４５】
「多剤耐性」感染症は、ＭｔｂまたはＮＴＭ感染症であって、感染株が、ＭｔｂまたはＮＴＭ感染症の治療に効果的な「フロントライン」の化学療法剤の２つまたはそれより多くに対して耐性であるものを指す。本明細書で使用される多剤耐性感染症はまた、フルオロキノロン類（ＦＱ）のいずれか１つならびにカナマイシン、アミカシン、およびカプレオマイシンなどの注射用薬物の少なくとも１つへの抵抗性を有する多剤耐性ＴＢとして２００６年１０月にWorld Health Global task Forceによって定義された「超多剤耐性結核（extensively drug-resistant tuberculosis）」（「ＸＤＲ−ＴＢ」）も指す。
【００４６】
本明細書で使用される「活動性結核」、「活動性ＴＢ」、「ＴＢ疾患」、「ＴＢ」、または「活動性ＴＢ感染症」は、哺乳動物（例えば、ヒトなどの霊長類動物）における病気、状態、または容態であって、Ｍｔｂ細菌が、活発に倍化し、哺乳動物の器官に侵入し、そして最も頻繁には肺（肺活動性ＴＢ）において、症状を引き起こしているまたは徴候、症状、もしくはその他の臨床症状を引き起こそうとしているものを指す。活動性ＴＢの臨床症状としては、虚弱、疲労、熱、悪寒、体重減少、食欲減退、無食欲、または寝汗を挙げることができる。肺活動性ＴＢの症状としては、数週（例えば、少なくとも３週）にわたって持続する咳、濃い粘液、胸部の痛み、および喀血が挙げられる。本明細書で使用される「再活性化した結核」は、ＬＴＢＩを有する個体において発症する活動性ＴＢであって、該個体において感染の休止状態の病巣の活性化がＭｔｂ細菌の活発な倍化を生じさせるものを指す。本明細書で使用される「活発に倍化する」は、Ｍｔｂ細菌が、感染した宿主の器官において指数、対数、または半対数速度で増幅、複製、増殖、または活発に倍化することを指す。ある特定の実施形態では、感染した哺乳動物（例えば、ヒト）は、抑制された免疫系を有する。免疫抑制は、年齢（例えば、非常に若年または高齢）によるもの、またはその他の要因（例えば、物質の乱用、臓器移植）もしくはその他の条件（例えば、別の感染症（例えば、ＨＩＶ感染症）、糖尿病（diabetes）（例えば、糖尿病（diabetes mellitus））、珪肺症、頭頸部がん、白血病、ホジキン病、腎臓病、体重低下、コルチコステロイド治療、または関節炎（例えば、関節リウマチ）もしくはクローン病の治療など）によるものであり得る。
【００４７】
ＭｔｂまたはＮＴＭ細菌によって引き起こされる肺疾患または活発に倍化するＭｔｂまたはＮＴＭ細菌によって引き起こされる状態の存在を決定する試験は当該技術分野で公知であり、以下に限定されないが、痰、気管支肺胞洗浄液、胸水、組織生検、脳脊髄浸出液のAcid Fast Staining（ＡＦＳ）および直接的な顕微鏡検査；BACTEC MGIT 960（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA）などの細菌培養；QFT（登録商標）-GoldまたはQFT（登録商標）-Gold In-tube T SPOTT M.TBなどのＩＧＲ試験、TST The Mantoux skin test（ＴＳＴ）などの皮膚試験；および抗原刺激後の全血または単離されたＰＢＭＣの細胞内サイトカイン染色が挙げられる。American Thoracic Society（ＡＴＳ）およびInfectious Disease Society of America（ＩＤＳＡ）が２００７年に共同で刊行したガイドラインでは、ＮＴＭ肺感染症を診断するために、症状、放射線学的な異常、および微生物学的培養物の存在がその他の潜在的な病因の排除と組み合わせて必要とされている（M. Johnson and John A. Odell Journal of Thoracic Disease, Vol 6, No 3 March 2014）。
【００４８】
本明細書で使用される「潜伏感染」、「潜伏」、または「潜伏疾患」、「休眠感染」は、ＭｔｂまたはＮＴＭによる感染であって、宿主の免疫系によって阻止されて、一定の低い細菌数によって特徴付けられる休止を生じているが、安定維持状態での複製などの活動性代謝状態に留まる少なくとも一部分の細菌集団も含有し得るものを指す。潜伏性ＴＢ感染症は、活動性ＴＢ疾患の徴候、症状、または放射線写真による証拠がないＴＳＴまたはＩＧＲＡ陽性によって臨床的に決定される。潜伏感染した哺乳動物は「伝染性」ではなく、潜伏感染に関連する非常に低い細菌数に起因して疾患を拡散させることはできない。潜伏性結核感染（ＬＴＢＩ）は、活動休止中の細菌を殺傷する医薬または薬物により治療される。ＬＴＢＩの治療は、人生において後に活動性結核（ＴＢ）に進行する感染症のリスクを大きく減少させる（例えば、それは再活性化を予防するために与えられる）。
【００４９】
本明細書に開示する「予防方法」または「予防する方法」は、一般に、予防用組成物（例えば、予防ワクチン）を使用して哺乳動物において二次性ＴＢまたはＮＴＭ感染症を予防するための方法を指す。通常、予防用組成物を投与する最初のステップは、対象がＭｔｂまたはＮＴＭに感染する前、および／または対象が感染症に関連する任意の臨床症状もしくは陽性のアッセイ結果を呈する前に行われる。
【００５０】
本明細書に開示する「治療方法」または「治療する方法」は、一般に、治療用組成物（例えば、治療ワクチン）を単独でまたは化学療法治療レジームと組み合わせて使用して対象において二次性ＴＢまたはＮＴＭ感染症（一次性ＮＴＭ感染症または二次性ＮＴＭ感染症）を治療する方法を指す。本開示のこの方法および関連方法において、治療用組成物を投与する少なくとも１つのステップ（通常、治療用組成物を投与する最初のステップ）は、哺乳動物が、活動的なＭｔｂまたはＮＴＭに感染した時および／または活動性感染症に関連する少なくとも１つの臨床症状または陽性のアッセイ結果を呈した時に行われることが理解されるであろう。また、本開示の方法は、化学療法レジメンの有効性を向上させるために、その活動性感染症または症状がまだ対象中に存在するかどうかにかかわらず、および活動性感染症に関連するアッセイ結果がまだ陽性であるかどうかにかかわらず、本開示の同じまたは別の治療用組成物を１つまたは複数のその後の追加の時点に投与する追加のステップをさらに含んでもよいことも理解されるであろう。また、本開示の方法は、治療用組成物を単独でまたはその他の剤と組み合わせて投与することを含んでよく、そのため治療用組成物は、より広い治療処置レジームの部分として複数の治療成分の一つであってもよいことも理解されるであろう。
【００５１】
「化学療法薬」、「化学療法剤」、または「化学療法レジーム」は、ＴＢをひきおこす任意のマイコバクテリウムに感染したまたは曝露された患者を治療するためにまたはその治療において使用される薬物または薬物の組合せであり、以下に限定されないが、アミカシン、アミノサリチル酸、カプレオマイシン、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド（ＩＮＨ）、カナマイシン、ピラジナミド、リファマイシン（すなわち、リファンピン、リファペンチン、およびリファブチン）、ストレプトマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、およびフルオロキノロン、ならびに当該技術分野におけるその他の誘導体アナログまたはバイオシミラーが挙げられる。「ファーストライン」の化学療法剤は、薬物耐性でないマイコバクテリウム感染症を治療するために使用される化学療法剤であり、以下に限定されないが、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン、およびピラジナミド、ならびに当該技術分野におけるその他の誘導体アナログまたはバイオシミラーが挙げられる。１つまたは複数の「ファーストライン」の薬物に対して薬物耐性が実証されたマイコバクテリウム感染症を治療するために使用される「セカンドライン」の化学療法剤としては、非限定的に、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、シクロセリン、アミカシン、カナマイシン、およびカプレオマイシン、ならびに当該技術分野におけるその他の誘導体アナログまたはバイオシミラーが挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される「化学療法レジメンの有効性を向上させる」とは、望ましい臨床アウトカムを達成するために必要とされる治療期間を短縮すること、望ましい臨床アウトカムを達成するために必要とされる異なる化学療法薬の数を減少させること、望ましい臨床アウトカムを達成するために必要とされる化学療法薬の投与量を減少させること、活動性の臨床的感染症に関連する宿主または宿主器官の病理を減少させること、方法によって治療される宿主または宿主器官の生存能力を向上させること、ＭＤＲ−ＴＢ株の成長または発生を減少させること、およびまたは化学療法レジメンに対する患者のコンプライアンスを増加させることを指す。
【００５３】
本明細書で提供する治療用ＴＢ組成物は、活動性ＴＢ感染症を有する宿主に投与された時にマイコバクテリウム感染症に対して有益な免疫応答を引き出すことができる組成物を指す。「有益な免疫応答」は、活動性ＴＢ疾患の徴候または症状を軽減し、桿菌数を減少させ、活動性ＴＢ疾患に関連する病理を減少させ、疾患の解消に関連する適切なサイトカインプロファイルを引き出し、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を増殖させ、または化学療法レジメンの有効性を向上させる免疫応答である。本明細書で提供する治療用ＴＢ組成物は、本発明の方法によってまたは有益な免疫応答の生成（例えば、症状の徴候の減少）によって経験的に測定できる、抗原特異的Ｔ細胞の全体的な定量的数の増加または対象のＴ細胞の分化状態の定性的変化など、対象において免疫応答を引き出すことができる組成物を指す。
【００５４】
本開示の治療用ＴＢ組成物としては、非限定的に、当該技術分野で公知の方法によって薬学的に許容される製剤中で送達される抗原、融合ポリペプチド、ならびに抗原および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される「ＦＤＳ」は機能的分化スコアを指す。ＦＤＳは以下の式によって算出される：［ＩＦＮ−γ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の％／ＩＦＮ−γ−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の％］。
【００５６】
「ＩＦＮ−γ＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞」は、ＩＦＮ−γを産生するＣＤ４＋  Ｔ細胞である。例えば、そのような細胞は、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）などの当該技術分野で公知の方法による測定でＩＦＮ−γの細胞内染色を示し、またはＥＬＩＳＡなどの当該技術分野で公知の方法による測定でＩＦＮ−γを分泌する。
【００５７】
「ＩＦＮ−γ−  ＣＤ４＋  Ｔ細胞」は、ＩＦＮ−γを産生しないＣＤ４＋  Ｔ細胞である。例えば、そのような細胞は、ＩＣＳなどの当該技術分野で公知の方法による測定でＩＦＮ−γの細胞内染色を示さず、かつＥＬＩＳＡなどの当該技術分野で公知の方法による測定でＩＦＮ−γを分泌しない。
【００５８】
ＦＤＳは以下のために使用することができる：（１）１つまたは複数の抗原（例えば、抗原を含む組成物、製剤、またはワクチン）に対する対象のＣＤ４＋  Ｔ細胞プロファイル状態の定性的変化の測定；（２）ベースライン（ｔ＝０）または１つまたは複数の抗原（例えば、抗原を含む組成物、製剤、またはワクチン）の投与後のＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセントの量的変化の定性化；および（３）集団全体（ＴＢの状態によらない；例えば、ＴＢを引き起こす細菌に以前に感染したもしくは曝露された個体またはＴＢを引き起こす細菌に感染したことがないナイーブ個体；あるいは、例えば、ＱＦＴ−もしくはＱＦＴ＋または混合集団）における１つまたは複数の抗原（例えば、抗原を含む組成物、製剤、またはワクチン）に対するＣＤ４＋  Ｔ細胞プロファイル状態の定性的変化の分析。
【００５９】
本明細書で使用される「強いセントラルメモリーＴ細胞応答」は、１回または複数回の免疫化の後に対象のＦＤＳが約１．０未満または約１．０に等しい時に引き出されている。
【００６０】
本明細書で使用される「強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子応答」は、１回または複数回の免疫化の後に対象のＦＤＳが約１．０未満または約１．０に等しい時に引き出されている。
【００６１】
低いＦＤＳは、セントラルメモリーＴ細胞のＴ細胞分化または増殖の初期にある細胞を表し、高いＦＤＳは、エフェクターＴ細胞のより大きな分化または増殖を示す。
【００６２】
融合ポリペプチド組成物
強いセントラルメモリーＴ細胞応答を引き出すことができるマイコバクテリウム抗原および強いエフェクターメモリーＴ細胞応答を引き出すことができるマイコバクテリウム抗原が本明細書で提供される。少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドであって、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子であり、二次性ＴＢ感染症およびＮＴＭ感染症を治療するためのものである、融合ポリペプチドも本明細書で提供される。
【００６３】
本明細書で提供する融合ポリペプチドは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０のマイコバクテリウム抗原を含んでよく、融合ポリペプチドは、投与されると強いセントラルメモリーおよびエフェクターメモリーＴ細胞応答を引き出すことができる。
【００６４】
融合ポリペプチドおよびマイコバクテリウム抗原は、従来の組換えおよび／または合成技術を使用して調製することができる。
【００６５】
強いセントラルメモリーＴ細胞応答および強いエフェクターメモリーＴ細胞応答の両方を引き出すことができるマイコバクテリウム抗原の選択のスクリーニングのためのアッセイおよび方法も本明細書で提供される。
【００６６】
Ｍｔｂ抗原およびＮＴＭ抗原ならびに少なくとも２つの抗原を含む融合ポリペプチドが本明細書で提供される。Ｍｔｂ抗原および／またはＮＴＭ抗原などの少なくとも２つの異種マイコバクテリウム抗原を有するポリペプチドへの融合ポリペプチド。本明細書で提供する融合ポリペプチドにおいて、個々の抗原は、直接的にまたはアミノ酸リンカーを介して間接的に共有結合的に連結されてよい。リンカーは、１アミノ酸長から１００アミノ酸長に及び得る。融合ポリペプチドを形成する個々の抗原は、通常、Ｃ末端からＮ末端へと連結されているが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端へと連結されていてもよい。抗原は、提示または記載にかかわらず、任意の順序で連結されてよい。
【００６７】
融合ポリペプチドはまた、融合タンパク質を作る抗原の保存的に改変されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、種間ホモログ、および免疫原性断片を含むことができる。Ｍｔｂ抗原は、Cole et al., Nature 393:537 (1998)に記載されており、該文献には結核菌（Mycobacterium tuberculosis）の全ゲノムが開示されている。その他のＮＴＭの種由来の抗原は、例えば、本明細書に記載する配列比較アルゴリズム、交差反応性アッセイ、または例えば、ハイブリダイゼーションアッセイおよび抗体結合アッセイといった当業者に公知のその他の方法を使用して同定することができる。
【００６８】
本開示の融合ポリペプチドは、一般に、本明細書に記載する少なくとも２つの抗原ポリペプチドを含み、かつ、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープの提供を補助する配列、または元々の組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質を発現するのを補助する配列（発現エンハンサー）などのその他の無関連配列をさらに含んでもよい。ある特定の例示的な融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増進融合パートナーの両方である。その他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加させるようにまたはタンパク質が所望の細胞内区画に標的化されるのを可能とするように選択され得る。またさらなる融合パートナーは、タンパク質の精製を促進する親和性タグをさらに含む。
【００６９】
融合タンパク質は、一般に、標準技術を使用して調製することができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、組換えタンパク質として発現される。例えば、所望の融合のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列は、別々に集められて、適切な発現ベクターにライゲートされてよい。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、配列のリーディングフレームが合うように第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端にライゲートされる。これにより、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質に翻訳されることが可能となる。
【００７０】
ペプチドリンカー配列を用いて、所望により各抗原がその二次構造および三次構造にフォールディングするのを確実にするのに十分な距離だけ第１の抗原と第２の抗原（またはさらなる抗原）とを分離することができる。そのようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野で周知の標準技術を使用して融合タンパク質に組み込まれる。ある特定のペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択することができる：（１）柔軟な伸長コンホメーションをとり得ること；（２）第１のポリペプチド上および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造をとり得ないこと；および（３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応する可能性がある疎水性または荷電残基がないこと。一部の実施形態では、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどのその他の中性付近のアミノ酸もリンカー配列に使用することができる。リンカーとして用いるのに有用であり得るアミノ酸配列としては、Maratea et al., Gene 40:39 46 (1985)；Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986)；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されたものが挙げられる。リンカー配列は、通常、１から約１００アミノ酸長であり得る。機能ドメインを分離して立体障害を防止するために使用できる非必須のＮ末端アミノ酸領域を第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが有する時にはリンカー配列は必要とされない。
【００７１】
ライゲートされたＤＮＡ配列は、好適な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現に関与する調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’にのみ位置する。同様に、翻訳を終了させるために必要な終止コドンおよび転写終結シグナルは、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’にのみ存在する。
【００７２】
一部の実施形態において、本開示の融合ポリペプチドに使用するための免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌Haemophilus influenza Bの表面タンパク質であるプロテインＤに由来する（ＷＯ  ９１／１８９２６）。一部の実施形態では、プロテインＤ誘導体は、該タンパク質のおおよそ最初の三分の一（例えば、Ｎ末の最初の１００  １１０アミノ酸）を含み、またプロテインＤ誘導体は脂質化されていてもよい。ある特定の一部の実施形態では、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基がＮ末端に含まれて、融合ポリペプチドに追加の外因性Ｔ細胞エピトープを提供し、Ｅ．  ｃｏｌｉでの発現レベルを増加させる（したがって発現エンハンサーとして機能する）。脂質尾部は、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にする。その他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質ＮＳ  １（ヘマグルチニン）を含む。通常、Ｎ末の８１アミノ酸が使用されるが、Ｔ−ヘルパーエピトープを含む異なる断片を使用してもよい。
【００７３】
別の実施形態では、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質由来のアミノ酸配列またはその部分（例えば、Ｃ末部分）を含む。ＬＹＴＡは肺炎レンサ球菌に由来し、アミダーゼＬＹＴＡとして公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する（ＬｙｔＡ遺伝子によってコードされる；Gene 43:265-292(1986)）。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中のある特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはＤＥＡＥなどの一部のコリンアナログへの親和性に関与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なＥ．  ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発に利用されてきた。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡ断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製が記載されている（Biotechnology 10:795-798(1992)を参照）。１つの例示的な実施形態では、ＬＹＴＡのリピート部分を融合タンパク質に組み込んでもよい。リピート部分は、残基１７８に始まるＣ末端領域に見出される。例示的なリピート部分は、残基１８８〜３０５を組み込んでいる。
【００７４】
一般に、抗原および融合ポリペプチド（ならびにそれらをコードするポリヌクレオチド）は単離されている。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元々の環境から取り出されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、天然に存在するタンパク質は、天然の系において一緒に存在する物質の一部または全てから分離されている場合に、単離されている。一部の実施形態では、そのようなポリペプチドは、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、またはさらには約９９％の純度である。ポリヌクレオチドは、例えば、天然の環境の一部分ではないベクター中にクローニングされている場合に、単離されていると考えられる。
【００７５】
例示的なマイコバクテリウム抗原の配列を表１に与える。例示的な融合ポリペプチドの配列を表２に与える。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載する配列のバリアントを提供する。本開示によって一般に包含されるポリペプチドのバリアントは、典型的には、本明細書に記載するポリペプチド配列に対して、その長さに沿って少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれより高い配列同一性を呈する。ポリペプチドの「バリアント」という用語が本明細書で使用される場合、これは、典型的には、１つまたは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入において本明細書に具体的に開示するポリペプチドとは異なるポリペプチドである。そのようなバリアントは、天然に存在するものであってもよいし、または、例えば、本開示の上記ポリペプチド配列の１つまたは複数を改変し、かつ当該技術分野で周知の多数の技術のいずれかを使用して本明細書に記載する免疫原性活性を評価することによって、合成により生成されたものであってもよい。
【００７６】
例えば、本開示のポリペプチドのある特定の例示的なバリアントとしては、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメインなどの１つまたは複数の部分が除去されているものが挙げられる。その他の例示的なバリアントとしては、小部分（例えば、約１〜３０アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去されているバリアントが挙げられる。
【００７７】
多くの場合、バリアントは保存的置換を含有する。「保存的置換」は、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないとペプチド化学の当業者が予期するようにアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換されているものである。例えば、相互結合能の顕著な損失なしにある特定のアミノ酸でタンパク質構造中のその他のアミノ酸を置換することができる。そのような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することができる。アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒的性質の類似性に基づいて行うことができる。
【００７８】
バリアントはさらに、または代替的に、非保存的変更を含有してもよい。１つの例示的な実施形態では、バリアントポリペプチドは、５アミノ酸またはそれ未満のアミノ酸の置換、欠失、または付加によって天然配列とは異なっている。バリアントはさらに（または代替的に）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、およびヒドロパシーの性質に対する最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって改変されていてもよい。
【００７９】
上記の通り、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（またはリーダー）配列を含んでもよく、これは、翻訳時にまたは翻訳後にタンパク質の移行を指示する。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製、もしくは同定を容易にするため（例えば、ポリＨｉｓ）または固体支持体へのポリペプチドの結合を増進するためにリンカーまたはその他の配列にコンジュゲート化されていてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域にコンジュゲート化されていてもよい。
【００８０】
ポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列中のアミノ酸配列が以下に記載するように最大の一致となるようにアライメントした時に同一となる場合に２つの配列は「同一」であるとされる。
【００８１】
比較用の配列の最適なアライメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（DNASTAR, Inc., Madison, WI）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムをデフォルトのパラメーターで使用して実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されるいくつかのアライメントスキームを実装している：Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (197 1) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Nat’l Acad., Sci. USA 80:726-730.
【００８２】
あるいは、比較用の配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482の局所同一性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の同一性アライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444の類似検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetic Computer Group(GCG), 575 Science Dr., Madison, WIに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または検査によって実行することができる。
【００８３】
配列同一性パーセントおよび配列類似度を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を例えば本明細書に記載するパラメーターを用いて使用して、本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列同一性パーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは米国国立生物工学情報センターを通じて公開されている。
【００８４】
１つのアプローチでは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて２０パーセントもしくはそれ未満、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一のアミノ酸残基が両方の配列中で起こる位置の個数を決定してマッチした位置の個数を得、マッチした位置の個数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、そして結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【００８５】
例示的な融合ポリペプチド
とりわけ、少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドであって、１つの抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つの抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である、融合ポリペプチドが本明細書で提供される。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、追加のマイコバクテリウム抗原をさらに含み、例えば、融合ポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のマイコバクテリウム（ＭｔｂまたはＮＴＭのいずれか）抗原を含む。
【００８６】
例示的なマイコバクテリウム抗原を表１に与える。なお、図面、実施例、および特許請求の範囲を含めて本開示の全体を通じて、本発明の抗原に言及する際に特定の接尾辞が使用されていない場合、例えば単に「Ｒｖ１８１３」と言及されている場合、そのような使用は１８１３−ａおよび１８１３−ｂのいずれかまたは両方を指す。
【００８７】
例示的な融合ポリペプチドを表２に与える。なお、図面、実施例、および特許請求の範囲を含めて本開示の全体を通じて、本発明の融合ポリペプチドに言及する際に特定の接尾辞が使用されていない場合、例えば単に「ＩＤ９３」と言及されている場合、そのような使用はＩＤ９３−１およびＩＤ９３−２のいずれかまたは両方を指す。
【００８８】
一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、ＮＴＭ抗原との交差反応性を有する配列を含む。
【００８９】
一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、ＮＴＭ抗原との交差反応性を有する配列を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ１８８６−ａ、Ｒｖ１８８６−ｂ、Ｒｖ２３８９−ａ、Ｒｖ２３８９−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２３８９−ｂ、Ｒｖ１８８６ｂ、またはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂまたはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ１８８６−ａ、Ｒｖ１８８６−ｂ、Ｒｖ２３８９−ａ、Ｒｖ２３８９−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂの配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２３８９−ｂ、Ｒｖ１８８６ｂ、またはＲｖ２６０８−ｂの配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂの配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂまたはＲｖ２６０８−ｂの配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂの配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ２６０８−ｂの配列を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０の配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９の配列を含む。一部の実施形態では、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６２０の配列を含む。
【００９４】
一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂの配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９またはＲｖ３６２０の配列を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂの配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９の配列を含む。一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ａ、Ｒｖ１８１３−ｂ、Ｒｖ２６０８−ａ、またはＲｖ２６０８−ｂの配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６２０の配列を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂまたはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂまたはＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂまたはＲｖ２６０８−ｂの配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６１９の配列を含む。一部の実施形態では、強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ１８１３−ｂまたはＲｖ２６０８−ｂの配列を含み、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は、Ｒｖ３６２０の配列を含む。
【０１００】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）抗原である。
【０１０１】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原は結核菌（Mycobacterium tuberculosis（Ｍｔｂ））抗原である。
【０１０２】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＮＴＭ抗原である。
【０１０３】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＭｔｂ抗原である。
【０１０４】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＭｔｂ抗原であり、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＭｔｂ抗原である。
【０１０５】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＮＴＭ抗原であり、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＭｔｂ抗原である。
【０１０６】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＭｔｂ抗原であり、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＮＴＭ抗原である。
【０１０７】
本明細書で提供する一部の融合ポリペプチドでは、強いマイコバクテリウムセントラルメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＮＴＭ抗原であり、かつ強いマイコバクテリウムエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子の抗原はＮＴＭ抗原である。
【０１０８】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ２３８９−ｂ、およびＲｖ２６０８−ｂに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する抗原を含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、Ｒｖ２３８９−ｂ、およびＲｖ２６０８−ｂ。
【０１１０】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、表２に与える融合ポリペプチドのいずれかの配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、表２に与える融合ポリペプチドのいずれか１つである。
【０１１１】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１またはＩＤ９３−２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＩＤ９３−１またはＩＤ９３−２である。
【０１１２】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１またはＩＤ９３−２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＩＤ９３−１またはＩＤ９３−２である。
【０１１３】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１またはＩＤ９３−２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＩＤ９３−１またはＩＤ９３−２である。
【０１１４】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ８３−１またはＩＤ８３−２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＩＤ８３−１またはＩＤ８３−２である。
【０１１５】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＩＤ９７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＩＤ９７である。
【表１−１】
2019521095.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
2019521095.tif 000011
【０１１６】
ポリヌクレオチド組成物
本開示は、別の態様では、本明細書で提供する融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、特定の種の全ゲノムＤＮＡから単離されたＤＮＡ分子を指す。したがって、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、１つまたは複数のコーディング配列を含有するが、そのＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離または精製されたＤＮＡセグメントを指す。ＤＮＡセグメントおよびそのようなセグメントのより小さい断片、および、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどの組換えベクターも「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」という用語に包含される。
【０１１８】
当業者によって理解されるように、本開示のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、ゲノム外配列、プラスミドにコードされた配列、および、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するまたは発現するように適合され得るより小さい遺伝子操作された遺伝子セグメントを含むことができる。そのようなセグメントは、天然に単離されたものであってもよいし、または人間の手によって合成的に改変されたものであってもよい。
【０１１９】
当業者によって認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）または二本鎖であってよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）またはＲＮＡ分子であってもよい。追加のコーディング配列または非コーディング配列が、その必要はないが、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよく、また、ポリヌクレオチドは、その必要はないが、その他の分子および／または支持体材料に連結されていてもよい。ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、Ｍｔｂ抗原、ＮＴＭ抗原、またはこれらの部分をコードする内因性配列）を含んでもよいし、またはそのような配列のバリアントまたは生物学的なもしくは抗原の機能的同等物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドのバリアントは、さらに下記するように、コードされたポリペプチドの免疫原性が天然タンパク質と比べて減少しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有してもよい。コードされたポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般に、本明細書に記載する通りに評価することができる。「バリアント」という用語は、異種起源の同種遺伝子も包含する。
【０１２０】
追加の実施形態では、本開示は、本明細書に開示する配列の１つまたは複数に同一または相補的な配列の様々な長さの連続したストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、本明細書に開示する配列の１つまたは複数の少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、もしくは１０００、またはそれより多くの連続したヌクレオチド、またはこれらの間の全ての中間的長さを含むポリヌクレオチドが本開示によって提供される。この文脈における「中間的長さ」は、言及した値の間の任意の長さ、例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００  ５００；５００  １，０００などを通じての全ての整数などを意味することが容易に理解されるであろう。
【０１２１】
本開示のポリヌクレオチドまたはこれらの断片は、コード配列自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、その他のコーディングセグメントなどのその他のＤＮＡ配列と組み合わせられてもよく、それらの全長長さは大幅に不定であり得る。したがって、ほとんどの任意の長さのポリヌクレオチド断片を用いてもよいことが想定されるが、全長は、調製の容易さおよび意図する組換えＤＮＡプロトコールでの使用によって制限されることがある。
【０１２２】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載するポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン用法の違いによって異なるポリヌクレオチドが本開示によって具体的に想定され、該ポリヌクレオチドとしては、例えば、ヒトおよび／または霊長類のコドン選択のために最適化されたポリヌクレオチドがある。さらに、本明細書で提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本開示の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つまたは複数の突然変異の結果として変化した内因性遺伝子である。結果得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、その必要はないが、変化した構造または機能を有することがある。対立遺伝子は、標準技術（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベースの配列の比較など）を使用して同定することができる。
【０１２３】
Ｍｔｂ抗原およびＮＴＭ抗原をコードするポリヌクレオチド、および本明細書で提供する融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野において公知かつ利用可能な様々なよく確立された技術のいずれかを使用して調製し、取り扱い、かつ／または発現させることができる。
【０１２４】
例えば、明細書で提供する融合ポリペプチドまたはそれらの機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列またはそれらの断片は、適切な宿主細胞でのポリペプチドの発現を導くための組換えＤＮＡ分子において使用することができる。遺伝コードの生来的な縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードするその他のＤＮＡ配列を製造することができ、そしてこれらの配列を使用して所与のポリペプチドをクローニングおよび発現することができる。
【０１２５】
当業者によって理解されるように、一部の例では、天然に存在しないコドンを有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を製造することが有利なことがある。例えば、特定の原核性または真核性の宿主によって選好されるコドンを選択して、タンパク質発現速度を増加させること、または、天然に存在する配列から生成された転写物よりも長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を産生することができる。
【０１２６】
さらに、本開示のポリヌクレオチド配列は、様々な理由からポリペプチドをコードする配列を改変するために当該技術分野で一般に公知の方法を使用して遺伝子操作することができ、該改変としては、以下に限定されないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、発現、および／または免疫原性を変更する改変が挙げられる。
【０１２７】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドまたは機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクターに挿入することができる。当業者に周知の方法を使用して、目的のポリペプチドならびに適切な転写および翻訳制御エレメントをコードする配列を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989)に記載されている。様々な発現ベクター／宿主系が公知であり、それらを利用してポリヌクレオチド配列を含有させ、発現させることができる。これらとしては、以下に限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系などの微生物が挙げられる。
【０１２８】
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは強度および特異性において様々であり得る。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導型プロモーターなどのいくつもの好適な転写および翻訳エレメントを使用することができる。例えば、細菌系でのクローニングの場合、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Stratagene, La Jolla, Calif.）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Gibco BRL, Gaithersburg, Md.）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導型プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを使用することができる。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含有する細胞株を生成することが必要な場合、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に使用することが有利なことがある。
【０１２９】
細菌系では、発現されるポリペプチドについて意図する用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、多くの量が必要な場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を導くベクターを使用することができる。そのようなベクターとしては、以下に限定されないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Stratagene）（該ベクターでは、目的のポリペプチドをコードする配列が、（３−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびその後の７残基のための配列と揃ったフレームでベクターにライゲートされていてもよく、これによりハイブリッドタンパク質が産生される）などの多機能Ｅ．  ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター；ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 5509(1989)）などが挙げられる。ｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）を使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着とその後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解された細胞から容易に精製することができる。そのような系で作られるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されてもよく、それにより目的のクローニングされたポリペプチドを随意にＧＳＴ部分から解放させることができる。
【０１３０】
酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的または誘導型プロモーターを含有する多数のベクターを使用することができる。総説としては、Ausubel et al.（上掲）およびGrant et al., Methods Enzymol. 153:516-544 (1987)を参照されたい。
【０１３１】
植物発現ベクターを使用する場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかによって推進することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独でまたはＴＭＶのオメガリーダー配列と組み合わせて使用することができる（Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを使用してもよい（Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984)；Broglie et al., Science 224:838-843 (1984)；およびWinter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)）。これらのコンストラクトは、直接的なＤＮＡ形質転換または病原体媒介性のトランスフェクションによって植物細胞に導入することができる。そのような技術は、多数の一般に利用可能な総説に記載されている（例えば、Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)を参照）。
【０１３２】
目的のポリペプチドを発現するために昆虫系を使用することもできる。例えば、１つのそのようなシステムでは、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia larvae中で外来遺伝子を発現するためのベクターとしてオートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域にクローニングされて、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の挿入の成功はポリヘドリン遺伝子を不活性にさせ、コートタンパク質を欠いた組換えウイルスを産生させる。次いで、組換えウイルスを例えばS. frugiperda細胞またはTrichoplusia larvaeに感染させることができ、そこで目的のポリペプチドが発現され得る（Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)）。
【０１３３】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のポリペプチドをコードする配列を後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲートすることができる。ウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現できる生存可能なウイルスを得ることができる（Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して哺乳動物宿主細胞での発現を増加させることができる。
【０１３４】
目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために特定の開始シグナルを使用してもよい。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の転写または翻訳制御シグナルは必要とされないことがある。しかしながら、コード配列またはその部分のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンなどの外因性の翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらには、挿入物全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは正しいリーディングフレームにあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは様々な起源のものであってよく、天然および合成の両方であってよい。文献（Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)）に記載されているものなどの、使用される特定の細胞系のために適切なエンハンサーを含めることによって、発現効率を増進してもよい。
【０１３５】
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望の様式でプロセシングする能力に基づいて選択することができる。ポリペプチドのそのような修飾としては、以下に限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」形態を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正しい挿入、フォールディング、および／または機能を促進することもできる。外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために、そのような翻訳後作用のための特定の細胞機構および特徴的な機序を持つＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷ１３８などの異なる宿主細胞を選択することができる。
【０１３６】
組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のために、安定発現が望まれることが多い。例えば、ウイルス起源の複製および／または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同じまたは別々のベクターに含有し得る発現ベクターを使用して、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株を形質転換することができる。ベクターの導入後、細胞を濃縮培地中で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在により、導入された配列の発現に成功している細胞の増殖および回収が可能となる。細胞種にとって適切な組織培養技術を使用して、安定形質転換細胞の抵抗性クローンを増幅することができる。
【０１３７】
形質転換細胞株を回収するためにいくつもの選択系を使用することができる。これらとしては、以下に限定されないが、ｔｋ細胞またはａｐｒｔ細胞でそれぞれ用いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977)）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22:817-823 (1990)）遺伝子が挙げられる。選択の基礎として、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤抵抗性を使用することもでき、例えば、メトトレキサートへの抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980)）；アミノグリコシド、ネオマイシン、およびＧ−４１８への抵抗性を付与するｎｐｔ（ColbereGarapin et al., J. Mol. Biol. 150:1-14 (1981)）；クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）への抵抗性をそれぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔ（上掲のMurry）である。追加の選択遺伝子が記載されており、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能とするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能とするｈｉｓＤがある（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988)）。可視化マーカーの使用は、アントシアニン、（３−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンなどのマーカーで普及しており、形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性のまたは安定なタンパク質発現の量を定量化するためにも広く使用されている（Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995)）。
【０１３８】
ポリヌクレオチドにコードされた産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該産物の発現を検出および測定するための様々なプロトコールが当該技術分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらおよびその他のアッセイは、その他の場所の中で特にHampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)およびMaddox et al., J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)に記載されている。
【０１３９】
多様な標識およびコンジュゲート技術が当業者に公知であり、それらを様々な核酸およびアミノ酸のアッセイにおいて使用することができる。ポリヌクレオチドに関する配列を検出するための標識化されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを製造するための手段としては、オリゴラベリング、ニック翻訳、末端標識化、または標識ヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの製造のために配列またはその任意の部分をベクターにクローニングしてもよい。そのようなベクターは当該技術分野で公知かつ市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドの付加によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために使用することができる。これらの手順は、様々な市販されているキットを使用して実行することができる。使用され得る好適なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光物質、化学発光物質、または色原体物質、ならびに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
【０１４０】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのタンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することができる。組換え細胞によって製造されたタンパク質は、使用した配列および／またはベクターに応じて分泌されることもあるし、または細胞内に含有されることもある。当業者によって理解されるように、本開示のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通ってコードされたポリペプチドが分泌されるのを導くシグナル配列を含有するように設計されてもよい。その他の組換えの構築を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に連結してもよい。
【０１４１】
組換えの製造法に加えて、本開示のポリペプチドおよびこれらの断片は、固相技術を使用して直接的なペプチド合成によって製造してもよい（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)）。タンパク質合成は手動技術を使用してまたは自動化によって行われ得る。自動合成は、例えばApplied Biosystems 43 1 A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer）を使用して達成することができる。あるいは、様々な断片を別々に化学合成し、全長分子を製造する化学的方法を使用してそれらを合わせてもよい。
【０１４２】
表３は、本明細書で提供する融合ポリペプチドを構築するために使用される例示的なＭｔｂ抗原をコードする例示的なヌクレオチド配列を提供する。同様に、表４は、本発明の例示的な融合ポリペプチドをコードする例示的なヌクレオチド配列を提供する。
【表３−１】
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【表３−２】
2019521095.tif 000013
【表３−３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【０１４３】
予防用および治療用組成物
別の態様では、本開示は、単独または１つまたは複数のその他の治療モダリティとの組合せのいずれかで細胞または対象に投与するための薬学的に許容されるまたは生理的に許容される溶液中の本明細書に開示するポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはその他の組成物の１つまたは複数の製剤に関する。そのような医薬組成物は、予防的または治療的な実施形態のために使用することができる。製剤は、好適な免疫刺激剤／アジュバント系と共に製剤化された時にさらなる用途のワクチンとなり得る。
【０１４４】
所望であれば、本開示の組成物は、例えば、その他のタンパク質またはポリペプチドまたは様々な医薬活性剤などのその他の剤と組み合わせて投与してもよいことも理解されるであろう。追加の剤が本開示の目的に対して重大な悪影響を引き起こさない限り、含めることができるその他の成分に実質的に制限はない。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、１つまたは複数の免疫刺激剤と組み合わせて製剤化される。免疫刺激剤は、外因性の抗原に対する（抗体および／または細胞媒介性の）免疫応答を増進または増強するあらゆる物質であってよい。免疫刺激剤の例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド）およびリポソーム（それに化合物が組み込まれる；例えば、Fullertonの米国特許第４，２３５，８７７号を参照）が挙げられる。ワクチンの調製は、例えば、Powell & Newman, eds., Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach) (1995)に一般に記載されている。
【０１４６】
様々な免疫刺激剤のうちの任意のものを本開示の組成物において用いることができる。例えば、アジュバントを含めてもよい。多くのアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは鉱油などの迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質、および、（天然または合成の）リピドＡ、Bordetella pertussisまたはマイコバクテリウムの種またはマイコバクテリウム由来タンパク質などの免疫応答の刺激物質を含有する。例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Mich.）；メルクアジュバント６５（Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.）；ＡＳ−２およびその誘導体（SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.）；ＣＷＳ、ＴＤＭ、Ｌｅｉｆ、水酸化アルミニウムゲル（ａｌｕｍ）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄、または亜鉛の塩；アシル化チロシンの非可溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン性またはアニオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａのような好適なアジュバントが市販されている。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、−７、もしくは−１２などのサイトカインもアジュバントとして使用され得る。
【０１４７】
本開示の文脈で有用なその他の例示的なアジュバントとしては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９アゴニストなどのＴｏｌｌ様受容体アゴニストが挙げられる。また他の例示的なアジュバントとしては、イミキモド、ガルジキモド、レシキモド、および関連化合物が挙げられる。
【０１４８】
ある特定の例示的な組成物は、主にＴｈ１型の免疫応答を誘発するように設計されたアジュバント系を用いる。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞媒介性の免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）は、液性免疫応答の誘導に有利に働く傾向がある。本明細書で提供する組成物の適用後、患者は、Ｔｈ１型およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を維持することがある。応答が主にＴｈ１型である１つの例示的な実施形態では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルがＴｈ２型サイトカインのレベルよりも大きい程度で増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを使用して容易に評価することができる。サイトカインのファミリーの総説については、Mossman & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989)を参照されたい。
【０１４９】
主にＴｈ１型の応答を引き出すのに使用するためのある特定のアジュバントは、アルミニウム塩と共にモノホスホリルリピドＡ（例えば、３−脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬＴＭ））の組合せを含む（米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，８７７，６１１号、同第４，８６６，０３４号、および同第４，９１２，０９４号）。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、主にＴｈ１応答を誘発する。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ  ９６／０２５５５、ＷＯ  ９９／３３４８８、および米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列も、例えばSato et al., Science 273:352 (1996)に記載されている。別の例示的なアジュバントは、Ｑｕｉｌ  Ａなどのサポニン、またはＱＳ２１およびＱＳ７などのその誘導体（Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.）；エスシン；ジギトニン；またはジプソフィラもしくはChenopodium quinoaのサポニンを含む。その他の例示的な製剤は、本開示のアジュバントの組合せ中、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、０−エスシン、またはジギトニンを含む群の少なくとも２つの組合せ中に、１つより多くのサポニンを含む。
【０１５０】
その他の実施形態では、アジュバントは、米国特許出願公開第２００８／０１３１４６６号（その開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているグルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）アジュバントである。
【０１５１】
具体的な実施形態では、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組合せを含み、それは例えば、ＷＯ  ９４／００１５３に記載されているＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬＴＭアジュバントとの組合せ、またはＷＯ  ９６／３３７３９に記載されている、ＱＳ２１がコレステロールで抑制されているより低い反応惹起性の組成物である。その他の製剤は、Ｏ／Ｗエマルションおよびトコフェロールを含む。Ｏ／Ｗエマルション中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬＴＭアジュバント、およびトコフェロールを用いる別のアジュバント製剤がＷＯ  ９５／１７２１０に記載されている。
【０１５２】
別の増強されたアジュバント系は、ＷＯ  ００／０９１５９に開示されるように、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体との組合せを伴う。その他の例示的なアジュバントとしては、モンタニドＩＳＡ  ７２０（Seppic, France）、ＳＡＦ（Chiron, Calif., United States）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳ系のアジュバント（例えば、SmithKline Beecham, Rixensart, Belgiumより入手できるＳＢＡＳ−２、ＡＳ２’、ＡＳ２”、ＳＢＡＳ−４、またはＳＢＡＳ６）、Ｄｅｔｏｘ、ＲＣ−５２９（Corixa, Hamilton, Mont.）、および係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（それらの開示は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどのその他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）、およびＷＯ  ９９／５２５４９Ａ１に記載されているものなどのポリオキシエチレンエーテルアジュバントが挙げられる。
【０１５３】
本開示の組成物はさらに、または代替的に、マイコバクテリウム抗原に特異的なＴ細胞を含んでもよい。そのような細胞は、一般に、標準的な手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｅｘ  ｖｉｖｏで調製することができる。例えば、Ｔ細胞を、患者の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分から単離し得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連するまたは無関連のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株、または培養物に由来するものであってもよい。
【０１５４】
Ｔ細胞は、本開示のポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激され得る。そのような刺激は、該ポリペプチドに特異的なＴ細胞の生成を可能とするのに十分な条件および期間で行われる。一部の実施形態（embodimetns）では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、特異的なＴ細胞の生成を促進するために、ミクロスフェアなどの送達ビヒクル内に存在する。
【０１５５】
Ｔ細胞は、特異的に増幅し、サイトカインを分泌し、または本開示のポリペプチドでコートしたまたは該ポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、該ポリペプチドに特異的であると考えられる。Ｔ細胞の特異性は、様々な標準技術のいずれかを使用して評価することができる。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、陰性対照と比べて溶解および／または増殖の２倍より大きい刺激指数の増加は、Ｔ細胞の特異性を指し示す。そのようなアッセイは、例えば、Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)に記載されるように行うことができる。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、様々な公知技術によって達成することができる。例えば、Ｔ細胞増殖は、（例えば、Ｔ細胞の培養物をトリチウム化チミジンでパルスラベルし、ＤＮＡに組み込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）ＤＮＡ合成の増加率を測定することによって検出することができる。３〜７日間の本開示のポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、または２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖の少なくとも２倍の増加を生じさせ得る。２〜３時間の上記するような接触は、サイトカイン放出レベル（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）の２倍の増加がＴ細胞活性化の指標となる標準的なサイトカインアッセイを使用した測定でＴ細胞の活性化を生じさせるはずである（Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1 (1998)を参照）。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。タンパク質特異的Ｔ細胞は、標準技術を使用して増殖させることができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、患者、関連するドナー、または無関連のドナーに由来し、刺激および増殖後に患者に投与される。
【０１５６】
本開示の医薬組成物において、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤化は当業者に周知であり、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および製剤などの様々な治療レジメンで本明細書に記載する特定の組成物を使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発についても同様である。
【０１５７】
ある特定の応用では、本明細書に開示する医薬組成物は、経口投与により対象に送達され得る。そのため、これらの組成物は、不活性希釈剤または吸収可能な可食担体を用いて製剤化されてもよいし、またはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに包まれてもよいし、または錠剤に圧縮されてもよいし、または食事の際の食品に直接的に組み込まれてもよい。
【０１５８】
ある特定の状況では、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（それぞれは、参照することによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されるように、本明細書に開示する医薬組成物を非経口的に、静脈内に、筋肉内に、鼻腔内に、皮下に、膣内に（intrvaginally）、直腸内に、またはさらには腹腔内に送達することが望ましいことがある。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、好適にはヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混合された水中で調製することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中、および油中で分散液を調製することができる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有する。
【０１５９】
注射用途に好適な医薬剤形としては、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用の滅菌粉末が挙げられる（米国特許第５，４６６，４６８号、参照することによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）。全ての場合に、剤形は滅菌されていなければならず、また容易な注射針通過性が存在する程度に流動的でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、好適なこれらの混合物、および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は要求される粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適当な流動性が維持され得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって促進することができる。一部の実施形態では、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが望ましいことがある。注射用組成物の持続吸収は、組成物中で吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによってもたらすことができる。
【０１６０】
例えば、水溶液での非経口投与のために、必要であれば溶液を好適に緩衝化することができ、そして液体希釈剤を最初に十分な食塩水またはグルコースで等張にすることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与のために特に好適である。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は本開示に照らせば当業者に明らかであろう。例えば、１投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注射液に加えるか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038および1570-1580を参照）。治療されている対照の状態に応じて、投与量の何らかの変動が必然的に起こるであろう。いかなる事象においても、投与に関与する人間が個々の対象にとって適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のための調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって要求される無菌性、発熱原性、および全般的安全性および純度基準を満たすべきである。
【０１６１】
滅菌注射溶液は、必要に応じて上に列挙した様々なその他の成分と共に必要量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および上に列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌されたビヒクル中に様々な無菌化された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製の例示的な方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を事前に滅菌濾過されたそれらの溶液から生じさせる。
【０１６２】
本明細書に開示する組成物は、中和または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）酸付加塩が挙げられ、これらは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される。また、遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来するものであってよい。製剤化されたら、溶液は、投与製剤に適合する様式および治療的に効果的な量で投与され得る。製剤は、注射溶液、薬物放出カプセルなどの様々な投与形態で容易に投与される。
【０１６３】
本明細書で使用する場合、「担体」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを包含する。医薬活性物質のためのそのような媒体および剤の使用は当該技術分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が活性成分に適合しない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が想定される。補足的活性成分も組成物中に組み込むことができる。
【０１６４】
「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与された時にアレルギー性のまたは類似の不都合な反応を生じさせない分子的実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は当該技術分野においてよく理解されている。通常、そのような組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射用製剤として調製され、注射前に液体中の溶液または懸濁液とするのに好適な固体形態も調製することができる。調製物は乳化されてもよい。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／またはその他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達されてもよい。鼻エアロゾルスプレーを通じて直接的に肺に遺伝子、ポリヌクレオチド、およびペプチド組成物を送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（それぞれは参照することによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Takenaga et al., 1998）およびリソホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、参照することによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）を使用する薬物の送達も医薬分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態の経粘膜薬物送達が米国特許第５，７８０，０４５号（参照することによりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されている。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、送達は、好適な宿主細胞への本開示の組成物の導入のために、リポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などを使用することによって行われ得る。具体的には、本開示の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化された送達のために製剤化され得る。そのような送達ビヒクルの製剤化および使用は、公知かつ従来の技術を使用して実行することができる。
【０１６７】
使用方法
本発明者らは、ある特定のマイコバクテリウム抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞応答を引き出すことができること、およびある特定のマイコバクテリウム抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞応答を引き出すことができることを見出した。単一の組成物に含有されるＴ細胞の表現型のそのような二重の機能性は、二次性ＴＢまたは一次性もしくは二次性ＮＴＭ感染症を予防または治療するための予防用または治療用組成物の両方の有効性の向上において大いに有益であり得る。したがって、少なくとも２つのマイコバクテリウム抗原を含む融合ポリペプチドであって、１つのマイコバクテリウム抗原が強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子であり、かつ１つのマイコバクテリウム抗原が強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子である融合ポリペプチドが本明細書で提供される。例示的な融合ポリペプチドを表２に与えている。
【０１６８】
強いセントラルメモリーＴ細胞活性化因子応答は、単回の免疫化後３００日以内に対象のＦＤＳが約１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２５、０．２、０．１２５、０．１、または約０．０６２５より低いまたは等しい場合に引き出されている。
【０１６９】
強いエフェクターメモリーＴ細胞活性化因子応答は、単回または複数回の免疫化後に対象のＦＤＳが約３．０、４、５、６、７、８、９、１０、１６、または約３２より大きいまたは等しい場合に引き出されている。
【０１７０】
融合ポリペプチド（および融合ポリペプチドを含む組成物、例えば医薬組成物）のいくつかの用途が本明細書で提供される。
【０１７１】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象においてマイコバクテリウムへの強いセントラルメモリーＴ細胞応答およびマイコバクテリウムへの強いエフェクターメモリーＴ細胞応答を活性化させる方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。
【０１７２】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、二次性結核感染症（例えば、潜伏性Ｍｔｂ感染症の再活性化）を治療する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、潜伏性Ｍｔｂ感染症の再活性化を治療するためのものである。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。一部の実施形態では、対象は１回目の再活性化を起こしている。一部の実施形態では、対象は、３回目、４回目、または５回目の再活性化事象を起こしている。
【０１７３】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象において二次性結核感染症を予防する（例えば、潜伏性Ｍｔｂ感染症の再活性化を予防する）方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、潜伏性Ｍｔｂ感染症の再活性化を予防するためのものである。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。一部の実施形態では、対象は１回目の再活性化を起こしている。一部の実施形態では、対象は、３回目、４回目、または５回目の再活性化事象を起こしている。
【０１７４】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象において二次性結核感染症（例えば、Ｍｔｂによる二次感染症）を治療する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、Ｍｔｂによる二次感染症を予防するためのものであり、一次感染症は異なる株（異なる臨床分離菌）のＭｔｂによるものである。一部の実施形態では、二次感染症は、多剤耐性（ＭＤＲ）Ｍｔｂ株によるものである。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。
【０１７５】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象において二次性結核感染症を予防する（Ｍｔｂによる二次感染症を予防する）方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、方法は、Ｍｔｂによる二次感染症を予防するためのものであり、一次感染症は異なる株（異なる臨床分離菌）のＭｔｂによるものである。一部の実施形態では、二次感染症は、多剤耐性（ＭＤＲ）Ｍｔｂ株によるものである。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。
【０１７６】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を治療する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。これらの実施形態のいずれにおいても、ＮＴＭ感染症は、ＮＴＭ感染症の一次的事象またはＮＴＭ感染症の二次的事象（例えば、二次感染症）であり得る。ＮＴＭは、例えば、M. bovis、M. africanum、BCG、M. avium、M. intracellulare、M. celatum、M. genavense、M. haemophilum、M. kansasii、M. ulcerans、M. marinum、M. canitelli、M. abscessus、M. lilandii、M. simiae、M. vaccae、M. fortuitum、およびM. scrofulaceumの種などのＮＴＭの種のいずれか１つであり得る。融合ポリペプチドは、例えば、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、またはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチドなどの本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれか１つであり得る。融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７、またはＩＤ９１であり得る。
【０１７７】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。これらの実施形態のいずれにおいても、ＮＴＭ感染症は、ＮＴＭ感染症の一次的事象またはＮＴＭ感染症の二次的事象（例えば、二次感染症）であり得る。ＮＴＭは、例えば、M. bovis、M. africanum、BCG、M. avium、M. intracellulare、M. celatum、M. genavense、M. haemophilum、M. kansasii、M. ulcerans、M. marinum、M. canitelli、M. abscessus、M. lilandii、M. simiae、M. vaccae、M. fortuitum、およびM. scrofulaceumの種などのＮＴＭの種のいずれか１つであり得る。融合ポリペプチドは、例えば、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、またはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチドなどの本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれか１つであり得る。融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７、またはＩＤ９１であり得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、ＭｔｂまたはＮＴＭによる感染によって引き起こされる肺感染症を治療または予防する方法であって、肺疾患が、一次性ＮＴＭ感染症、二次性ＮＴＭ感染症、または潜伏性ＮＴＭ感染症の再活性化の結果である、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。一部の実施形態では、対象は、ＴＢ感染症について以前に治療されており、かつ治療時に活動性の疾患（例えば、ＴＢまたはＮＴＭ疾患）を有しない。一部の実施形態では、対象は、ＮＴＭ感染症について以前に治療されており、かつ治療時に活動性疾患（例えば、ＴＢまたはＮＴＭ疾患）を有しない。ＮＴＭは、例えば、M. bovis、M. africanum、BCG、M. avium、M. intracellulare、M. celatum、M. genavense、M. haemophilum、M. kansasii、M. ulcerans、M. marinum、M. canitelli、M. abscessus、M. lilandii、M. simiae、M. vaccae、M. fortuitum、およびM. scrofulaceumの種などのＮＴＭの種のいずれか１つであり得る。
【０１７９】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つを対象に投与することを含む、対象において活動性疾患（例えば、活動性肺感染症）の徴候または症状を減少させる方法が本明細書で提供される。活動性疾患は、二次性ＭｔｂまたはＮＴＭ感染症に関連するものであり得る。活動性疾患は、ＮＴＭ感染症に関連するものであり得る。活動性疾患は、ＴＢであり、かつ二次性Ｍｔｂ感染症に関連するものであり得る。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陽性である。一部の実施形態では、対象はクォンティフェロン陰性である。
【０１８０】
一部の実施形態では、有効量の、本明細書で提供する融合ポリペプチド、または該融合ポリペプチドを含む医薬組成物のいずれか１つは、化学療法剤の投与（adminstiration）の前に、同時に、または後に投与される。
【０１８１】
キットおよび製品
ある特定の実施形態では、例えば、本明細書で提供する融合ポリペプチド、Ｍｔｂ抗原、ＮＴＭ抗原、および医薬組成物；本明細書で提供する融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、Ｍｔｂ抗原、およびＮＴＭ抗原；および本明細書で提供する免疫学的アジュバントを含むキットも想定され、これらは１つまたは複数の容器中に提供され得る。一実施形態では、組成物の全ての成分は、単一の容器中に一緒に存在するが、本発明の実施形態はそのように限定されることを意図するものではなく、２またはそれより多くの容器であって、その中で例えば、免疫学的アジュバントが融合ポリペプチド組成物成分から分離されて接触しないものも想定する。
【０１８２】
本発明のキットは、本明細書に記載する使用のための説明書またはバイアル中に含有される材料を混合するための説明書をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、バイアル中の材料は、乾燥または凍結乾燥されている。一部の実施形態では、バイアル中の材料は液体である。
【０１８３】
そのようなキットの実施形態による容器は、任意の好適な容器、入れ物、バイアル、アンプル、チューブ、カップ、箱、ボトル、フラスコ、壺、皿、単一ウェルもしくはマルチウェル装置のウェル、リザーバ、タンクなどであってよく、または、本明細書に開示する組成物を入れ、貯蔵し、かつ／または輸送し、かつ内容物を取り出すために利用できるその他のデバイスであってよい。通常、そのような容器は、意図する用途に適合し、かつ含有される内容物の回収が容易に達成できる材料から作られたものであってよい。そのような容器の非限定的な例としては、密封されたガラスおよび／またはプラスチック、または、ゴムの隔壁または針およびシリンジを使用する内容物の取出しに適合するその他の密封手段を有するものなどの、再密封可能なチューブおよびアンプルが挙げられる。そのような容器は、例えば、ガラスまたは化学的に適合性のプラスチックもしくは樹脂から作られていてもよく、これらは、容器からの材料の効率的な回収を可能とする、かつ／または、例えば、紫外光もしくは極端な温度などの分解条件からまたは微生物汚染物質などの望ましくない汚染物質が混入から材料を保護する材料で作られていてもよく、または該材料でコーティングされていてもよい。容器は、好ましくは、滅菌されているか、または滅菌可能なものであり、かつ任意の担体、賦形剤、溶媒、ビヒクルなどに適合し得る材料から作られており、それにより本明細書に記載する融合ポリペプチド、抗原、および医薬組成物を懸濁または溶解するために使用できる。
【０１８４】
ＴＬＲ４アゴニスト
本明細書に記載する組成物および方法において使用できるＴＬＲ４アゴニスト（Ｔｏｌｌ様受容体４アゴニスト）が本明細書で提供される。ＴＬＲ４アゴニストは、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２１０１７号、同第ＵＳ２００９／０４５０３３号、同第ＵＳ２０１０／０３７４６６、および同第ＵＳ  ２０１０／０３１０６０２号（これらの内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）を含み得る。
【０１８５】
例えば、ＴＬＲ４アゴニストは、下記式（ＩＶ）：
【化１】
2019521095.tif 000027
の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント、またはその薬学的に許容される塩であってよく、ここで
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、同一または異なって、独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−、または−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同一または異なって、独立して、欠失しているかまたは−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は、酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同一または異なって、独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、同一または異なって、独立して、Ｃ８〜１３アルキルであり、かつ
Ｒ２およびＲ４は、同一または異なって、独立して、Ｃ６〜１１アルキルである。
【０１８６】
合成ＧＬＡ構造の一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０１８７】
例えば、ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、下記式（Ｖ）：
【化２】
2019521095.tif 000028
の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０１８８】
特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０アルキルである。
【０１８９】
別の特定の実施形態では、ＧＬＡは上記式を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ１３アルキルである。
【０１９０】
別の特定の実施形態では、ＧＬＡは上記式を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ８アルキルである。
【０１９１】
別の特定の実施形態では、ＧＬＡは上記式を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、下記式（Ｖ）：
【化３】
2019521095.tif 000029
の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０１９３】
上記ＧＬＡ構造のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、下記式（ＶＩ）：
【化４】
2019521095.tif 000030
の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０１９５】
上記ＧＬＡ構造のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、下記式（ＶＩＩ）：
【化５】
2019521095.tif 000031
の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０１９７】
上記ＧＬＡ構造のある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６はＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造（ＳＬＡ）：
【化６】
2019521095.tif 000032
を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：
【化７】
2019521095.tif 000033
を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０２００】
ある特定の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造：
【化８】
2019521095.tif 000034
を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【０２０１】
別の実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、本明細書に記載する組成物中に組み込まれた弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）である。ＡＬＤは、リピドＡの悪影響がより小さくまたは異なるものになるように改変または構築されたリピドＡ様分子である。これらの悪影響としては、発熱原性、局所シュワルツマン反応性（local Shwarzman reactivity）、および鶏胚５０％致死用量アッセイ（ＣＥＬＤ５０）で評価される毒性が挙げられる。本開示にしたがって有用なＡＬＤとしては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）および３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）が挙げられる。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは公知であり、本明細書に詳細に説明する必要はない。例えば、モノホスホリルリピドＡおよびその製造を開示する、Ribi ImmunoChem Research, Inc.を譲受人とする１９８４年３月１３日に発行された米国特許第４，４３６，７２７号を参照。同様にRibi ImmunoChem Research, Inc.を譲受人とするMyers, et al.の米国特許第４，９１２，０９４号および再審査証明書Ｂ１米国特許第４，９１２，０９４号には、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびその製造方法が具体化されている。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡに関するこれらの特許のそれぞれの開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
上記ＴＬＲ４アゴニスト化合物において、全体的な変化は、分子中の官能基にしたがって決定することができる。例えば、リン酸基は、リン酸基のイオン化状態に応じて、負帯電または中性であり得る。
【０２０３】
ＴＬＲ４アゴニストは、例えば、水性ナノ懸濁液、Ｏ／Ｗエマルション、リポソーム、およびミョウバン吸着製剤といった当該技術分野で公知の方法を使用して製剤化することができる（例えば、GLA-AF, GLA-SE, GLA-LS and GLA-Alum in Misquith et al., Colloids Surf B Biointerfaces. 2014 Jan 1; 113を参照）。
【０２０４】
有効量のＴＬＲ４アゴニスト（すなわち、本明細書に記載するＴＬＲアゴニストのいずれか）を単独でまたは本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれか１つと組み合わせて対象に投与することを含む、対象において非結核性マイコバクテリウム（ＮＴＭ）感染症を予防または治療する方法が本明細書において提供される。対象は、クォンティフェロン陽性または陰性であり得る。これらの実施形態のいずれにおいても、ＮＴＭ感染症は、ＮＴＭ感染症の一次的事象またはＮＴＭ感染症の二次的事象（例えば、二次感染症）であってよい。ＮＴＭは、例えば、M. bovis、M. africanum、BCG、M. avium、M. intracellulare、M. celatum、M. genavense、M. haemophilum、M. kansasii、M. ulcerans、M. marinum、M. canitelli、M. abscessus、M. lilandii、M. simiae、M. vaccae、M. fortuitum、およびM. scrofulaceumの種などのＮＴＭの種のいずれか１つであってよい。融合ポリペプチドは、例えば、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、またはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチドなどの本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれか１つであってよい。融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７、またはＩＤ９１であってよい。例示的な実施形態では、ＴＬＲは、式（ＩＶ）の構造を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４がＣ１３アルキルである、ＳＬＡまたはＧＬＡである。
【０２０５】
対象の細胞を、（ｉ）ＴＬＲ４アゴニスト（すなわち、本明細書に記載するＴＬＲ４アゴニストのいずれか）、（ｉｉ）本明細書に記載する融合ポリペプチド（fusion polyeptides）のいずれか、または（ｉｉｉ）これらの組合せと接触させることを含む、対象においてＮＴＭ細菌負荷を減少させる方法も本明細書で提供される。対象の細胞は、対象中にあってよく、かつ接触は、ＴＲＬ４アゴニストおよび／または本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれかを対象に投与することにより為される。ＮＴＭは、例えば、M. bovis、M. africanum、BCG、M. avium、M. intracellulare、M. celatum、M. genavense、M. haemophilum、M. kansasii、M. ulcerans、M. marinum、M. canitelli、M. abscessus、M. lilandii、M. simiae、M. vaccae、M. fortuitum、およびM. scrofulaceumの種などのＮＴＭの種のいずれか１つであってよい。融合ポリペプチドは、例えば、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、ＩＤ９７、またはＩＤ９１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合ポリペプチドなどの本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれか１つであってよい。融合ポリペプチドは、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７、またはＩＤ９１であってよい。例示的な実施形態では、ＴＬＲは、式（ＩＶ）の構造を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４がＣ１３アルキルである、ＳＬＡまたはＧＬＡである。
【０２０６】
本明細書に記載するＴＬＲ４アゴニストを含む医薬組成物（例えば、製剤化されたＧＬＡ）も提供され、これは、例えば、抗原、追加のＴＬＲアゴニスト、およびコアジュバントから選択される本明細書で提供する１つまたは複数の成分を薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせてさらに含んでもよい。
【０２０７】
例えば、ＩＤ９３−１、ＩＤ９３−２、ＩＤ８３−１、ＩＤ８３−２、またはＩＤ９７、またはＩＤ９１などの本明細書に記載する融合ポリペプチドのいずれかと組み合わせて本明細書に記載するＴＬＲ４アゴニストを含む医薬組成物（例えば、製剤化されたＧＬＡ）も提供される。
【０２０８】
疾患の治療のためにＧＬＡなどのＴＬＲ４アゴニストを対象に投与する一般的方法は当該技術分野で公知であり、対象においてＮＴＭを治療するためおよび対象において細菌負荷を減少させるための最適化された製剤を決定するために本発明で使用することができる。例えば、通常、約０．００１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重が、典型的には、皮内、皮下、筋肉内、もしくは静脈内の経路で、またはその他の経路で投与される。より具体的な実施形態では、投与量は、約０．００１μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇである。別の具体的な実施形態では、投与量は、約０．００１から約５０μｇ／ｋｇである。別の具体的な実施形態では、投与量は、約０．００１から約１５μｇ／ｋｇである。別の具体的な実施形態では、投与されるＧＬＡの量は、約０．０１μｇ／用量から約５ｍｇ／用量である。別の具体的な実施形態では、投与されるＧＬＡの量は、約０．１μｇ／用量から約１ｍｇ／用量である。別の具体的な実施形態では、投与されるＧＬＡの量は、約０．１μｇ／用量から約１００μｇ／用量である。別の具体的な実施形態では、投与されるＧＬＡは、約０．１μｇ／用量から約１０μｇ／用量である。
【０２０９】
投与の回数および頻度は宿主の応答に依存することは当業者に自明であろう。治療用途のための「薬学的に許容される担体」は医薬分野において周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。例えば、生理的ｐＨの滅菌食塩水およびリン酸緩衝食塩水を使用することができる。防腐剤、安定化剤、着色剤、さらには香味料さえも医薬組成物中に提供することができる。医薬組成物は、該組成物を患者に投与することを可能にする当該技術分野で公知の任意の形態であってよい。医薬組成物は、組成物が患者に投与されるとそれに含有される活性成分が吸収されるように製剤化される。
【実施例】
【０２１０】
以下の実施例は、限定としてではなく、実例による説明として与えるものである。
実施例において使用したＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１アルキルであり、かつＲ２およびＲ４がＣ１３アルキルである式（ＩＶ）の構造を有する。
【０２１１】
実施例１：ＩＤ９３−２発現ベクターの構築
ＩＤ９３−２の研究ロットの精製のために利用したＮ末端の６×Ｈｉｓタグを産生するクローニング戦略を使用して、選択したＭｔｂ抗原をＭｔｂ  ＨＲｖ３７ゲノムＤＮＡからｐＥＴ−２８ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に個々にクローニングした（Bertholet et al., 2008; Identification of human T cell antigens for the development of vaccines against Mycobacterium tuberculosis）。適切な制限部位を導入してディレクショナルクローニングを可能とするためにクローニングプライマーを設計した。４つの抗原の増幅のために使用したプライマーの配列を表５に列記する。
表５：ＩＤ９３−２成分抗原用のクローニングプライマー
【表５】
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【０２１２】
臨床用の製造のために、いかなるアミノ酸タグも付加せずに発現するように設計された戦略を使用して、ＩＤ９３−２の全配列をｐＥＴ−２９ａベクターにサブクローニングした。分子生物学の標準技術を使用して、ＩＤ９３−２／ｐＥＴ−２９ａ発現ベクターを以下の通りに構築した。Ｒｖ１８１３をＨＲｖ３７ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩ／ＳａｃＩで消化し、エンプティーｐＥＴ−２８ａベクターにライゲートしてｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３コンストラクトを作製した。次に、Ｒｖ３６２０をＨＲｖ３７ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＳａｃＩ／ＳａｌＩで消化し、ｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３コンストラクトにライゲートしてｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３／Ｒｖ３６２０コンストラクトを作製した。Ｒｖ２６０８をＨＲｖ３７ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３／Ｒｖ３６２０コンストラクトにライゲートしてｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３／Ｒｖ３６２０／Ｒｖ２６０８コンストラクトを作製した。Ｒｖ３６１９をＨＲｖ３７ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩで消化し、ｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３／Ｒｖ３６２０／Ｒｖ２６０８コンストラクトにライゲートしてｐＥＴ−２８ａ／Ｒｖ１８１３／Ｒｖ３６２０／Ｒｖ２６０８／Ｒｖ３６１９コンストラクトを作製した。結果生じた４抗原融合コンストラクト（ＩＤ９３−２）をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＤ９３−２配列をイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導型ｐＥＴ−２９ａ発現ベクターにサブクローニングした。ｐＥＴ−２９ａベクターはＴ７プロモーターを有し、カナマイシン抵抗性を付与する。ＩＤ９３−２発現コンストラクトは、シークエンシングおよび制限断片分析によって確認した。ＩＤ９３−２／ｐＥＴ−２９ａ発現ベクターでEscherichia coli（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ＨＭＳ１７４細胞を形質転換し、Master Cell Bank（ＭＣＢ）を製造した。
【０２１３】
ＩＤ９３−２は、当該技術分野で公知の方法にしたがって標準的な発酵によって製造した。細胞培養物を回収し、ペレット化する。細胞ペレットをLysis Buffer（２５ｍＭトリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）中に再懸濁し、M-110Y Microfluidizer（登録商標）を使用して細胞を破砕する。細胞を２回、１５，０００〜１８，０００ｐｓｉの圧力でMicrofluidizerに通す。懸濁液を１６，０００ｇで２時間遠心分離する。これらの条件下、ＩＤ９３−２タンパク質を含有する封入体（ＩＢ）はペレット化される一方、ほとんどの細胞破片は上清に残る。ＩＤ９３−２タンパク質を陰イオン交換カラムへの結合によってカラムクロマトグラフィーにより精製し、DEAE Elution Bufferで溶出する。DEAE Sepharose FFの溶出液を別の平衡化した陰イオン交換カラムQ Sepharose FF anion exchange columnに流す。タンパク質を含有するフロースルーを単一容器中に回収する。５％グリセロールアンモニウムスルフェートをQ Sepharose FFのフロースルー（ＩＤ９３タンパク質を含有する）に加え、１時間インキュベートする。グリセロールを含有するタンパク質プールを平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに流し、カラムをElution Buffer for Phenyl Sepharose HPで溶出する。β−メルカプト−エタノールを最終濃度５ｍＭまで溶出液プールに加え、タンパク質試料を還元するために３０分間インキュベートし、プールを２０ｍＭトリス  ｐＨ  ８．０に対して透析濾過し、タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２２μｍのフィルター膜でフィルター滅菌し、６５℃未満で貯蔵する。
【０２１４】
実施例２：ＢＣＧワクチンを接種され、成人の８０％が結核菌（M. Tuberculosis）に潜伏感染しているＴＢ流行地域で生存している成人への投与でＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥが免疫原性かどうかを評価するためのＩＤ９３−２  ＧＬＡ−ＳＥの臨床試験
ＢＣＧはヒトでの使用が現在認可されている唯一のＴＢワクチンであり、新生児および幼児での重篤な播種性疾患の予防に効果的なようであるが、成人における肺のＴＢを保護しない（Andersen P, Doherty TM. The success and failure of BCG - implications for a novel tuberculosis vaccine. Nat Rev Microbiol 2005; 3:656-662）。ヒト試験においてＢＣＧワクチン接種での有効性のばらつきが示されているが、ＢＣＧが近い将来取って代わられる可能性は低く、全てのその他の実験を比較する参照標準とする。米国などのＴＢの発生が低い多数の国では、ＢＣＧワクチン接種を採用していないか、または慣例とすることを止めており、ＴＢのスクリーニングおよび抗生物質での治療を優先している。
【０２１５】
臨床試験
第１ｂ相の無作為二重盲検プラセボ対照用量漸増評価試験を２つの用量レベルのＩＤ９３−２組成物で実行し、コホート１、２、および３（それぞれ１０μｇ、２μｇ、および１０μｇ）に２μｇのＧＬＡ−ＳＥアジュバントの投薬と組み合わせて０日目、２８日目、および１１２日目に筋肉内投与（ＩＭ）した。コホート４は、０日目に５μｇのＧＬＡ−ＳＥアジュバントの投薬と組み合わせた１０μｇのＩＤ９３−２組成物のＩＭで免疫化した。本研究は、以前にＢＣＧワクチン接種を受けた６６人のＨＩＶ陰性の健常な南アフリカの対象において実行した。南アフリカの対象を免疫化するために使用したＢＣＧワクチンは、ＩＤ９３−２タンパク質に見出される抗原成分ＲＶ  ３６１９およびＲＶ  ３６２０を欠いていた。ＱＦＴ−（コホート１〜４）（結核菌（M. Tuberculosis）に潜伏感染していない対象の示唆としてのＱＦＴ陰性）の対象およびＱＦＴ＋陽性コホート２、３、４）の参加者の両方が本研究に参加した。
【０２１６】
対象を３：１の比（コホート１）または５：１の比（コホート２〜４）でプラセボ群または治療群に無作為化し、ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥまたは食塩水プラセボを０日目、２８日目、および１１２日目に与えた。
【０２１７】
血液検体に対して行った免疫学アッセイの要約を表６に示す。
表６：行った免疫学的分析の要約
【表６】
2019521095.tif 000036
【０２１８】
対象試料の分析のための免疫学的方法
短期間の全血刺激および凍結保存の方法．  １μｇ／ｍｌ／ペプチドのＲｖ１８１３（ａまたはｂ）、Ｒｖ２６０８（ａまたはｂ）、Ｒｖ３６１９、またはＲｖ３６２０のプールを使用して７５分の静脈切開の間に各試験対象からの１ｍＬの新鮮な全血を刺激した。各参加者および時点について、５μｇ／ｍｌのＰＨＡを陽性対照として使用し、刺激しなかったチューブを陰性対照として使用した。共刺激抗体として抗ＣＤ２８および抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１μｇ／ｍＬ）を全てのアッセイ条件に含めた。全血を３７℃で１２時間インキュベートし、インキュベーションの最後の５時間にはＢｒｅｆｅｌｄｉｎ−Ａ（Ｓｉｇｍａ、１０μｇ／ｍＬ）を加えた。次いで、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、２μＭ）を用いて血液を回収し、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて赤血球細胞を溶解し、白血球細胞を固定した。白血球細胞をペレット化し、４０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）中の１０％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を用いて凍結保存した。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のための方法。
【０２１９】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）は、抗原刺激に応答した細胞の小胞体内のサイトカインの発現および蓄積を検出する、広く使用されているフローサイトメトリーベースのアッセイである。ＩＣＳは、末梢血などの複合細胞集団内の単一細胞の綿密な表現型および機能解析を行うために、サイトカインおよび細胞マーカーに結合する様々な抗体と組み合わせて使用してもよい。本研究では、フォローアップ研究期間の完了後のＩＣＳ抗体染色のための各個体からの凍結保存された刺激された白血球細胞の分析を一まとめにして、結果における技術的なアッセイのばらつきをより小さくすることを確実にした。本研究のための固定された白血球細胞のこれらの分析の前に、以下を評価する最適化処理を行った：最適な抗体濃度、最適な抗体−蛍光色素の組合せ、最適な光電子増倍管チューブ（ＰＭＴ）の電圧、fluorescence minus one（ＦＭＯ）対照、および最適なゲーティング戦略。染色した細胞の捕捉は、４つのレーザーおよび１８の検出器について構成されたＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩサイトメーターで行った。
【０２２０】
全血からの刺激され、固定および凍結された白血球細胞を短期間の３７μＣの水浴で解凍した。次いで、解凍した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を含有する標識化されたチューブに移し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して洗浄および透過処理を行った。次いで、細胞を以下の抗ヒト抗体で染色した：ＣＤ３−ＢＶ４２１（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４−ＢＶ７８６（ＳＫ３）、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＳＫ１）、ＣＣＲ７−ＰＥ（１５０５０３）、ＣＤ４５ＲＡ−ＢＶ６０５（ＨＩ１００）、ＣＤ１４−ＢＶ６５０（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ１６ＰＥ−ＣＦ５９４（３Ｇ８）、ＩＦＮ−ｇ−ＡＦ７００（Ｂ２７）、ＩＬ−２−ＦＩＴＣ（５３４４．１１１）、ＩＬ−１７−ＡＦ６４７（ＳＣＰＬ１３６２）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＴＮＦ−α−ＰＥ−Ｃｙ７（ＭＡｂ１１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０２２１】
試料を染色し、捕捉し、バッチ分析した。全てのＩＣＳアッセイ実験について、補正対照（単一染色の陽性および陰性マウスカッパ補正ビーズ）を含めた。染色および捕捉処理の間にこれらの対照を試験試料と並行して処理して、捕捉後のデータ補正を可能にした。
【０２２２】
フローデータ解析の方法．  試料をＢＤ  ＬＳＲＩＩサイトメーターに流し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ．９．９、ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータ解析を行った。データファイルを予め設計された解析テンプレートにアップロードした。目的の結果を与えるように予め規定した細胞集団のみを含むように個々のゲートを調整した。以下の選択／除外基準を適用して、どのデータを最終解析に含めるかを決定した。
【０２２３】
１．試験日の試料の各セットについて陰性（非刺激）対照が存在して、解釈可能である必要がある。
【０２２４】
２．ＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＰＨＡ誘発性（陽性対照）の全サイトカイン応答は、試験の全参加者の陰性（非刺激）対照のＣＤ４＋  Ｔ細胞による全サイトカイン応答の中央値プラス３平均絶対偏差（３ＭＡＤ）より大きい必要がある。
【０２２５】
３．各試料について、ＣＤ４＋  Ｔ細胞でのＰＨＡ誘発性全サイトカイン応答は、その陰性（非刺激）対照のＣＤ４＋  Ｔ細胞での全サイトカイン応答より大きい必要がある。
【０２２６】
データ解析および統計．  ＰＢＭＣを使用したＩＣＳアッセイにおけるＴ細胞応答のパーセンテージを、中央値のＤＭＳＯを引いたサイトカイン／機能（ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、インターロイキン［ＩＬ］−２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、または腫瘍壊死因子［ＴＮＦ］を単独または任意の組合せ［ＣＤ１０７ａ単一の陽性事象を除外］）の応答および順序統計量に基づく関連する９５％信頼区画（ＣＩ）を使用して、治療レジメン、Ｔ細胞の種類（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）、および刺激抗原（Ｒｖ１８１３（ａまたはｂ）、Ｒｖ２６０８（ａまたはｂ）、Ｒｖ３６１９、およびＲｖ３６２０）によって要約した。
【０２２７】
また、ＩＣＳ応答を以下の通りに解析した：ワクチンの「ｔａｋｅ」を評価するためにThe Statistical Center for HIV/AIDS Research & Prevention（ＳＣＨＡＲＰ）によって開発された暫定陽転者の定義（本明細書においてＳＣＨＡＲＰ法と称する）を使用して決定される各治療レジメンでの陽転者の数（パーセンテージ）をＴ細胞の種類および刺激抗原によって要約した。ホルムの方法によって多重度調整したフィッシャーの正確確率検定を使用して、陽転者の数（パーセンテージ）についての治療レジメン間の一対比較を実行した。各参加者についての陽転者状態を決定するためのＳＣＨＡＲＰ法は、機能（ＩＦＮ−ｇ  ＴＮＦα、ＩＬ−２、および／またはＣＤ１５４）の１つまたは複数の陽性の組合せであるこれらの機能のサブセットに対する多重度調整（ホルムの方法）したフィッシャーの正確確率検定に基づき、かつベースラインの陽転者状態を考慮に入れた。
【０２２８】
中央値のＤＭＳＯを引いた機能応答を訪問毎にクラスカル・ウォリス検定に基づいて治療レジメンにわたって比較して、４つの治療レジメンの間のあらゆる差異を特定した。有意差が特定された場合、治療レジメン間の一対比較のためにウィルコクソン・マン・ホイットニー検定を行った。ウィルコクソン・マン・ホイットニーのｐ値をホルムの方法によって多重度について調整した。結果をＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、および／またはＣＤ１５４の機能の１つまたは複数の陽性の組合せ、およびＣＤ１５４単独について要約した。
【０２２９】
ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる免疫応答の評価は、４つの抗原ペプチドのプール（Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、およびＲｖ３６２０）の１つでの刺激に応答しての１０６のＰＢＭＣあたりのＩＦＮ−γスポット形成単位（ＳＦＵ）の数に基づいた。中央値および９５％  ＣＩ（ＣＩは順序統計量に基づく）を使用して、ＤＭＳＯを引いた抗原特異的な結果を提示した。
【０２３０】
ＩＦＮ−ｇＥＬＩＳｐｏｔ応答を以下の通りに解析した：ＳＣＨＡＲＰ法を使用して決定された各治療レジメンでの陽転者の数（パーセンテージ）を刺激抗原によって要約した。ホルムの方法によって多重度調整したフィッシャーの正確確率検定を使用して、陽転者の数（パーセンテージ）についての治療レジメン間の一対比較を実行した。各参加者についての陽転者状態を決定するためのＳＣＨＡＲＰ法は、多重度調整（ホルムの方法）したフィッシャーの正確確率検定に基づき、かつベースラインの陽転者状態を考慮に入れた。
【０２３１】
ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡデータを９５％  ＣＩと共にエンドポイント滴定（ｌｏｇ１０）の幾何平均として提示し、かつベースラインからの平均倍率変化を（注射後の訪問時のエンドポイント滴定［ｌｏｇ１０］の結果  −  ベースラインでのエンドポイント滴定［ｌｏｇ１０］の結果）の真数として提示した。
【０２３２】
陰性対照、すなわち共刺激抗体単独とインキュベートした血液でのサイトカイン発現Ｔ細胞の頻度を、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、ＲＶ３６２０ペプチドプールおよびＰＨＡ刺激試料でのサイトカイン発現頻度から引いた後に特定のサイトカイン発現Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を報告した。比較解析が２つより多くの群およびいくつかの時点を伴う場合、クラスカル・ウォリス（群間）またはフリードマン（群内）検定のいずれかを使用した。これらの検定で有意性が示された場合、マン・ホイットニーのＵ検定（群間）またはウィルコクソンのマッチドペア検定（群内）を用いて事後検定解析を行った。全ての統計的検定において、＜０．０５のｐ値を有意とみなした。
【０２３３】
実施例３：ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種後のＱＦＴ−およびＱＦＴ＋の両方の参加者におけるＩＤ９３−２特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の多様な機能的分化プロファイル：融合タンパク質中の強いセントラルメモリーおよび強いエフェクターメモリーの両方のＴ細胞抗原
図１は、ＩＤ９３の各個々の抗原成分に特異的なＩＤ９３特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＴＨ１細胞）の％を示す。本研究では、異なる用量のＩＤ９３またはＩＤ９３＋ＧＬＡ−ＳＥを０日目、２８日目、および５６日目に投与した。末梢血単核球（Peripheral bood monocytes）を各注射の２週後に回収し、ＩＤ９３を構成する抗原サブユニット：Ｒｖ２６０８（Ｒｖ２６０８−ａまたはＲｖ２６０８−ｂ、全ての実施例）、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３６１９、またはＲｖ３６２０で刺激した（図１）。実施例２に挙げたＩＣＳアッセイおよび試験パネルを使用して、いずれかのＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７）を分泌する能力についてＣＤ４＋  Ｔ細胞を分析する。データは、ワクチンは免疫原性であり、所望のＴｈ１型応答を引き出すこと、および応答はＧＬＡ−ＳＥを含めた時により大きいことを指し示す。図２のデータは、実施例２に記載の通りに行ったＩＣＳアッセイにおけるＩＤ９３−２融合ポリペプチドの各抗原成分に対するワクチン接種後の免疫応答を分析したものである。以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１４−、ＣＤ１６のいずれか１つを発現し、かつＩＣＳによってＴｈ１サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７）について陽性であるＣＤ４＋  Ｔ細胞（CD4+ Tells）の％を積み上げた棒グラフとしてデータを提示する。各バーは、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、またはＲｖ３６２０ペプチドを含有するプールでの刺激に対する全血の全ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の中央値を表す。エラーバーは、各刺激についての四分位範囲（ＩＱＲ）を表す。ワクチンおよびプラセボレシピエントをコホートによって層化し、かつ応答を試験日によって縦方向に層化している。コホート１はＱＦＴ−個体のみからなり、その他のコホートは主にＱＦＴ＋個体（indivduals）からなる。バックグラウンド値（非刺激）を引いた。積み上げたバーは、Ｒｖ３６２０（一番上または上部の四角）、次いで順次Ｒｖ３６１９、Ｒｖ２６０８、およびＲｖ１８１３（一番下の四角）のいずれかで刺激した時のサイトカイン陽転者として示している（一番上から一番下）。個々の部分の成分の累積としての全ての抗原に対するピークの中央値の測定された全ＣＤ４  Ｔｈ１サイトカイン応答が４２日目に全てのワクチン接種群で見られたことをデータは実証する。しかしながら、４つの個々の抗原のそれぞれに対するピークの応答はコホートにわたってばらつきがあり、コホート２およびコホート４におけるＲｖ３６１９への応答は１４日目に最も高く、コホート２におけるＲｖ３６２０への応答は１４日目に最も高かった。コホート２、３、および４では特にロバストなＣＤ４  Ｔ細胞応答がＲｖ２６０８に対して見られ、続いてＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０に対してほぼ同等の応答であった。コホート１では、全てのワクチン接種後の時点でＲｖ２６０８に対するＣＤ４  Ｔ細胞応答はより小さいものであったが、コホート３の主にＱＦＴ＋個体のＩＤ９３−２およびＧＬＡ−ＳＥの用量をマッチさせた群での応答と統計的に異ならなかった（１４日目、４２日目、および１２６日目におけるマン・ホイットニーのＰ値はそれぞれ０．３４７２、��．２１５２、および０．８０７８であった）。しかしながら、コホート１のクォンティフェロン陰性群では、Ｒｖ３６２０およびＲｖ３６１９への応答（それぞれ一番上および上から２つ目のバー）は、一般に、与えた投与の回数によらず、小さいものに過ぎなかった。加えて、ＣＤ４  Ｔ細胞応答は、群によらず、Ｒｖ１８１３（Ｒｖ１８１３−ａまたはＲｖ１８１３−ｂのいずれか、全ての実施例）（積み上げたバーの底部または一番下）で刺激した時に最低であった。プラセボワクチンを接種した参加者において投与後にＩＤ９３−２特異的抗原に対する統計的に有意なＣＤ４  Ｔ細胞応答は見られなかった。ワクチンは、感染個体において免疫応答をより高いレベルに増強することができる。
【０２３４】
ワクチン誘発性の応答をＰＢＭＣからも分析した。抗原特異的なＣＤ４＋のＤＭＳＯを引いたＩＣＳ応答（すなわち、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、またはＴＮＦを単独または任意の組合せ［ＣＤ１０７ａ単一の陽性事象を除外］で発現する細胞）が３つ全てのＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥレジメンで見られ、試験の４２日目（２回目の注射の１４日後）にピークの中央値の応答であった。４つ全てのワクチン抗原にわたって試験の４２日目に最も強い中央値の応答がＩＤ９３−２  ２μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量において見られた（任意のサイトカインについて０．２７８％の全応答）。最終の試験注射の６ヶ月後（試験の２９４日目）にＣＤ４＋抗原特異的な応答が検出され、４つ全てのワクチン抗原にわたっての中央値の応答は再び、ＩＤ９３−２  ２μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量において最も高かった（任意のサイトカインについて０．１４８％の全応答）。Ｒｖ２６０８は最も免疫優性の抗原であり、類似の応答が見られたＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０がそれに続き、Ｒｖ１８１３への応答は全般的により低かった。全血ＩＣＳアッセイの結果は、中央値の応答の大きさが全血アッセイにおいてより大きかったことを除いて、ＰＢＭＣを使用したこれらのＩＣＳアッセイの結果と全般的に合致した。加えて、全血ＩＣＳアッセイの結果は、ロバストな、持続的な、かつ多機能のＣＤ４  Ｔ細胞応答を明らかにした。このアッセイの結果はまた、ＱＦＴによって測定される天然の感染を通じた以前のＭｔｂ感作は、ＩＤ９３−２ワクチンの個々の抗原に対するＣＤ４  Ｔ細胞応答のキネティクス、大きさ、および質を変化させるという証拠を提供するものであった。
【０２３５】
プラセボと比べて統計的に有意に異なるＣＤ４＋全陽転者率（ＳＣＨＡＲＰ法に基づいて４つのワクチン抗原の少なくとも１つについて陽転者と考えられた参加者を含む）は全ての時点でＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種群で見られた：プラセボ投薬での４１．７％に対して、９３．３％（２μｇ  ＩＤ９３−２＋２μｇ  ＧＬＡ−ＳＥ）、１００％（１０μｇ  ＩＤ９３−２＋２μｇ  ＧＬＡ−ＳＥ）、および９３．３％（１０μｇ  ＩＤ９３−２＋５μｇ  ＧＬＡ−ＳＥ）。一般に、個々の抗原について任意の時点において３つの異なるＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの投与量の間の一対比較についてＣＤ４＋陽転者率において統計的に有意な差はなかった。試験の４２日目および２９４日目での最も高い中央値のＣＤ４＋（ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、および／またはＣＤ１５４）応答は、ＩＤ９３−２  ２μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量の抗原Ｒｖ２６０８（それぞれ０．１２５９％および０．０４９６％）についてであった。プラセボと比べて統計的に有意により高い（ウィルコクソン・マン・ホイットニー検定に基づく）中央値のＣＤ４＋（ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、および／またはＣＤ１５４）応答は、その他の２つのＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの用量よりもＩＤ９３−２  ２μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量についてより頻繁に見られた。ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの用量の間の一対比較について、統計的に有意により高い中央値のＣＤ４＋（ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、および／またはＣＤ１５４）応答は、ＩＤ９３−２の２μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量についてのみ見られた。中央値のＣＤ４＋（ＣＤ１５４単独）応答の解析は、ＣＤ４＋（ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、および／またはＣＤ１５４）応答についてと類似の傾向を示した。
【０２３６】
次に、抗原特異的なＣＤ４＋のＤＭＳＯを引いたＩＣＳデータをＩＦＮ−γのＤＭＳＯを引いたＥＬＩＳｐｏｔからのデータと比較した。ＩＦＮ−γのＤＭＳＯを引いたＥＬＩＳｐｏｔの応答は３つ全てのＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの用量で見られ、４つ全てのワクチン抗原にわたってのピークの中央値の応答は試験の４２日目にＩＤ９３−２の２μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量（１１５６．７細胞／１０６のＰＢＭＣ）においてであった。ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答は最終の試験注射の６ヶ月後（試験の２９４日目）に検出され、４つ全てのワクチン抗原にわたっての中央値の応答は、ＩＤ９３−２の１０μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ５μｇの用量（８３０細胞／１０６のＰＢＭＣ）において最も高かった。最も強い応答は、抗原Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、およびＲｖ３６２０に対してであり、Ｒｖ１８１３への応答は最小であった。ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの用量において任意の時点での全陽転者率（４つのワクチン抗原の少なくとも１つについて陽転者と考えられた参加者を含むは、プラセボと比べて統計的に有意に異ならなかった（プラセボ投薬での７５．０％と対比して、９２．９％［２μｇ  ＩＤ９３−２＋２μｇ  ＧＬＡ−ＳＥ］、９１．３％［１０μｇ  ＩＤ９３−２＋２μｇ  ＧＬＡ−ＳＥ］、および１００．０％［１０μｇ  ＩＤ９３−２＋５μｇ  ＧＬＡ−ＳＥ］）。ＱＦＴ−の応答に対するＱＦＴ＋の比較は、ＩＤ９３−２＋１０μｇ＋ＧＬＡ−ＳＥ  ２μｇの用量においてＱＦＴ−（陰性）対象と対比したＱＦＴ＋（陽性）対象でのより強い中央値のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔ応答の傾向を実証した。１０μｇ  ＩＤ９３−２＋５μｇ  ＧＬＡ−ＳＥおよび２μｇ  ＩＤ９３−２＋２μｇ  ＧＬＡ−ＳＥの用量は不釣り合いにより大きい数のＱＦＴ＋対象を有したため統計解析に意味がないが、同じパターンが実証された。加えて、全血ＩＣＳアッセイは、ＱＦＴ陰性参加者と対比してＱＦＴ陽性参加者においてＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥでの単回のワクチン接種後に著しいＣＤ４＋  Ｔ細胞応答の上昇を示し、以前の結核疾患を有する患者において免疫応答を引き出すＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥの能力を反映していた。ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥは、プラセボと比べて、以前に結核菌（M. tuberculosis）に感染していなかったＱＦＴ−コホート１の対象においてＲｖ３６１９またはＲｖ３６２０に対する高い数の特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を誘発せず、これらの抗原について、ワクチンは、以前に結核に感染した対象において免疫応答を増強するのに特に良好であり得ることを示唆した。
【０２３７】
以上を合わせると、データは、ＱＦＴ陽性によって測定される天然の感染を通じた以前の結核感作は、ＣＤ４  Ｔ細胞免疫応答のキネティクス、大きさ、および質を変化させること、および、ＩＤ９３−２ワクチンは結核ナイーブおよび感染対象の両方において強い免疫応答性を実証することを実証した。興味深いことに、試験の間の対象の１人は、試験の間にＱＦＴ状態を陽性から陰性に変化させた。
【０２３８】
ＩＦＮ−γの細胞内発現は本研究においてＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＡによって測定した分化レベルと相関したので、セントラルメモリー細胞およびエフェクターメモリー細胞へのＴ細胞分化の程度の単純な測定の開発を試みた。抗原特異的Ｔｈ１細胞の中で、ＩＦＮｇ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２の発現パターンは、初期セントラルメモリー細胞からエフェクターメモリー、そして最終分化したエフェクター細胞へと、Ｔ細胞分化の間に発展する（Nat Rev Immunol. 2008 Apr;8(4):247-58.T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Seder RA1, Darrah PA, Roederer M）。これらの原理に基づいて、ＩＦＮγを発現しないＣＤ４＋  Ｔ細胞（ＩＦＮγ−；すなわち、ＴＮＦ−αおよび／またはＩＬ−２を発現する）の割合に対するＩＦＮγ＋発現ＣＤ４＋  Ｔ細胞の割合の比として「機能的分化スコア」（ＦＤＳ）を算出した。
【０２３９】
図３は、ＦＤＳによってＩＣＳデータを解析する一般的方法を示す。円グラフの個々のセグメントは、様々なその他のマーカーを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を表し、これはＩＦＮγの状態によってさらにグループ化できる（丸で囲った太線）。次いで、ＩＦＮ−ｇ＋細胞のパーセンテージをＩＦＮγ細胞のパーセンテージで割ることによってＦＤＳスコアが単純に算出される。低いＦＤＳスコア（１またはそれ未満）は、Ｔ細胞分化の初期段階の細胞である強いセントラルメモリー集団を表し、高いＦＤＳスコア（＞３）は、強いエフェクターメモリー集団へのより大きい分化を指し示す。＞１であるが＜３であるＦＤＳスコアは、中間の表現型を有する細胞を表す。先行する研究は、新規の融合タンパク質に対する免疫応答を評価するためにＦＤＳスコアを使用できるかどうかを評価することを試みたが、融合抗原の個々のサブユニットタンパク質の寄与に関する研究はこれまで発表されていない。（J Immunol Methods. 2004 Aug; 291(1-2):185-95.Novel application of a whole blood intracellular cytokine detection assay to quantitate specific T-cell frequency in field studies. Hanekom WA1, Hughes J, Mavinkurve M, Mendillo M, Watkins M, Gamieldien H, Gelderbloem SJ, Sidibana M, Mansoor N, Davids V, Murray RA, Hawkridge A, Haslett PA, Ress S, Hussey GD, Kaplan G)l、（J Immunol Methods. 2015 Feb;417:22-33.  Qualification of a whole blood intracellular cytokine staining assay to measure mycobacteria-specific CD4 and CD8 T cell immunity by flow cytometry.  Kagina BM1, Mansoor, Kpamegan, Penn-Nicholson, Nemes, Smit, Gelderbloem, Soares, Abel, Keyser, Sidibana, Hughes, Kaplan, Hussey, Hanekom, Scriba）。
【０２４０】
ＦＤＳ解析は、ベースラインの応答と比べた免疫化後のＦＤＳスコアの任意の変化（図４、線グラフ）を解析することによって経時的なＣＤ４＋  Ｔ細胞のプロファイル状態の定性的変化を解析するため、および、様々な集団における所与の抗原決定基（図５Ａ）、または一般に任意の抗原決定基（図５Ｂ）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞集団の応答の全表現型解析を評価するために使用することができる。図４は、最終のワクチン接種の６ヶ月後などの研究期間にわたってのコホート１およびコホート３（各群は１０μｇのＩＤ９３−２＋２μｇのＧＬＡ−ＳＥを与えられた）のＱＦＴ−およびＱＦＴ＋ワクチン接種対象について分離されたＩＤ９３−２融合タンパク質の各抗原（Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２６０８、Ｒｖ３６１９、およびＲｖ３６２０）についてのサイトカイン共発現データのＦＤＳ解析からの免疫応答データの定量的解析の線グラフを表す。データ全体は、定性的に、Ｒｖ２６０８またはＲｖ１８１３に特異的なＣＤ４  Ｔ細胞は、ベースラインのＱＦＴ状態（ＱＦＴ＋またはＱＦＴ−）にかかわらず、ワクチン接種後に強いセントラルメモリーＣＤ４＋  Ｔ細胞（１またはそれ未満のＦＤＳスコア）として分類できることを実証する（図４および図５Ｂ）。定量的には、ＩＤ９３−２サブユニットペプチド抗原Ｒｖ３６１９およびＲｖ３６２０での刺激によって検出されたＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージは、ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥワクチン接種ＱＦＴ−対象において低かったが、Ｒｖ３６２０のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団は、以前に未感染またはナイーブの結核対象（ＱＦＴ−）および以前に感染したＱＦＴ＋対象の両方において、この抗原サブユニットに対してより分化した強いエフェクターメモリーＴ細胞応答プロファイルを有する（図５Ａ、四角（ＱＦＴ−）を丸（ＱＦＴ＋）に対して比較されたい）。対照的に、Ｒｖ３６１９のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団は、未感染またはナイーブ結核対象（ＱＦＴ−）においてこの抗原サブユニットに対するより多くのセントラルメモリーＴ細胞応答プロファイル応答を実証するが、以前に感染したＱＦＴ＋対象（図５Ａ、四角（ＱＦＴ−）を丸（ＱＦＴ＋）に対して比較されたいについて、応答は強いエフェクターメモリー集団への分化を推進する。
【０２４１】
背景にある結核菌（M. tuberculosis）感染症は、Ｒｖ１８１３およびＲｖ２６０８特異的ＣＤ４  Ｔ細胞よりも大きい程度でＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の分化を推進し得ることをデータは実証する。このよりエフェクター様の表現型は、ＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥのワクチン接種後および最後の投与の６ヶ月後に維持され、ワクチン接種は、結核による天然の感染症によって誘発された既によく分化したＲｖ３６１９およびＲｖ３６２０特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を顕著に調節しないことを示唆する。図中のデータは、ＩＤ９３−２サブユニット抗原Ｒｖ２６０８およびＲｖ１８１３について、以前に結核に感染した対象（ＱＦＴ＋）または結核ナイーブ対象（ＱＦＴ−）の両方においてこれらの抗原に対する定性的な免疫応答は強いセントラルメモリー応答のものであることを実証する。ＱＦＴ＋対象において、ＩＤ９３−２での免疫化は、各その後のワクチン接種または経時的にのいずれかで強いセントラルメモリーのプロファイルを著しく変化させない。しかしながら、結核ナイーブ個体においては、免疫化後に、ＩＤ９３−２融合ポリペプチドでの免疫化後に強いセントラルメモリーエフェクター表現型へのＣＤ４  Ｔ細胞の成熟に向かう傾向が存在する（図４ＢのＱＦＴ−および図５Ａの四角を丸と比較されたい）。全体として、背景となる結核菌（M. tuberculosis）感染症を有する対象および有しない対象の両方において各抗原に対するＩＤ９３−２＋ＧＬＡ−ＳＥ誘発ＣＤ４  Ｔ細胞応答の分化の多様性が見られた。
【０２４２】
実施例４．  M. aviumに対するＩＤ９１およびＩＤ９３−２ワクチン（およびアジュバント製剤）の予防的有効性
Ｒｖ３６１９−Ｒｖ２３８９−Ｒｖ３４７８−Ｒｖ１８８６の配列）を含有するＩＤ９１融合タンパク質は、M.tuberculosisからマウスを保護することが示されている（Orr MT, Ireton GC, Beebe EA, Huang PW, Reese VA, Argilla D, Coler RN, Reed SG. 2014. Immune subdominant antigens as vaccine candidates against Mycobacterium tuberculosis. J Immunol 193: 2911-8）。
【０２４３】
ＮＴＭ、M. aviumの増殖阻害についてのアジュバントのｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングにおいて、１００μｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）での終夜の処理によってＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させた。分化したマクロファージをＭＯＩ  ５で２４時間M. aviumに感染させた（ソースM avium）。感染したマクロファージを示された通りにパターン認識受容体アゴニストで３日間処理した。図６に提示するデータは、サポニン（ＱＳ２１）およびＧＬＡ−ＡＦとのインキュベーションの２４時間後にM. aviumの増殖が阻害されたことを実証する。その他のＴＬＲアゴニスト（例えば、ＳＬＡ−ＡＦ）もM. aviumの増殖阻害を実証した（データ示さず）。
【０２４４】
ＧＬＡ−ＳＥと組み合わせたＩＤ９１および単独のＧＬＡ−ＳＥをＣ５７ＢＬ／６マウスでスクリーニングした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３週間離してＧＬＡ−ＳＥまたはＩＤ９１＋ＧＬＡ−ＳＥ（ｉ．ｍ）のいずれかで３回免疫化した。エアロゾルのM aviumによって１×１０８ＣＦＵでマウスにエアロゾルチャレンジを与えた。図７は、感染の２０日後または４０日後のいずれかの肺におけるｃｆｕ（Ｌｏｇ１０）を示す。アステリスク（asteriks）は、有意性＊＊ｐ＜０．０５を表す。
【０２４５】
下記の表７は、本発明の融合ポリペプチドにおいて使用されるマイコバクテリウム抗原とのＮＴＭのコンセンサス配列を示す。
【表７】
2019521095.tif 000037
【０２４６】
以上より、本発明の特定の実施形態を例証の目的で本明細書に記載したが、本発明の精神および範囲から離れることなく様々な変更を行い得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲以外によっては限定されない。
【図１】
2019521095.tif 000038
【図２】
2019521095.tif 000039
【図３】
2019521095.tif 000040
【図４】
2019521095.tif 000041
【図５】
2019521095.tif 000042
【図６】
2019521095.tif 000043
【図７】
2019521095.tif 000044
【配列表】
2019521095000001.app
【国際調査報告】
2019521095.tif 000045
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