(57)【要約】  本発明は、１つの方向において第１の導入遺伝子に、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターと、この双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含む組換えベクターおよび組換えウイルスとを提供する。本発明は、そのような組換えベクターおよび組換えウイルスを作製および使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つの方向において第１の導入遺伝子に、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結された双方向性プロモーター（ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーター）を含む組換え核酸分子であって、前記ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、
（ｉ）エンハンサーと、その両側に配置されている、
（ｉｉ）前記エンハンサーの一方の側のヒトサイトメガロウイルス主要最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）と、
（ｉｉｉ）前記エンハンサーの他方の側のアカゲザルサイトメガロウイルス主要最初期プロモーター（ｒｈＣＭＶプロモーター）と
を含み、
（ｉｖ）前記第１の導入遺伝子は、前記ｈＣＭＶプロモーターの下流に位置し、および
（ｖ）前記第２の導入遺伝子は、前記ｒｈＣＭＶプロモーターの下流に位置する、組換え核酸分子。
【請求項２】
前記エンハンサーは、ヒトサイトメガロウイルス主要最初期エンハンサー（ｈＣＭＶエンハンサー）である、請求項１に記載の組換え核酸分子。
【請求項３】
前記第１および第２の導入遺伝子は、異なり、およびそれらの少なくとも１つは、抗原をコードする、請求項１または２に記載の組換え核酸分子。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え核酸分子を含む組換えベクターまたは組換えウイルス。
【請求項５】
プラスミドベクターである、請求項４に記載の組換えベクター。
【請求項６】
アデノウイルスである、請求項４に記載の組換えウイルス。
【請求項７】
前記アデノウイルスは、Ｅ１領域に欠失を有する、請求項６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である、請求項６または７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
遺伝的に安定な組換えアデノウイルスであって、前記アデノウイルスが標的細胞に感染すると、それぞれが強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含む遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法であって、
ａ）１つの方向において第１の導入遺伝子に、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結された請求項１に記載の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、
ｂ）前記コンストラクトを前記組換えアデノウイルスのゲノムに組み込む工程と
を含む方法。
【請求項１０】
前記エンハンサーは、ｈＣＭＶエンハンサーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組換えアデノウイルスは、そのゲノムのＥ１領域に欠失を有する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および第２の導入遺伝子は、異なり、およびそれらの少なくとも１つは、抗原をコードする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型３５またはヒトアデノウイルス血清型２６である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法であって、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターまたは組換えウイルスを細胞に提供する工程を含む方法。
【請求項１５】
少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターまたは組換えウイルスを対象に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項４〜８のいずれか一項に記載の組換えベクターまたは組換えウイルスと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種および遺伝子治療における用途のための医薬分野および遺伝子送達分野に関する。より詳細には、本発明は、プラスミドベクター、ウイルスベクターおよび組換えウイルスなどの組換えベクターによる２つの導入遺伝子の発現のための強力でバランスのとれた双方向性プロモーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えベクターは、異種タンパク質の発現のための種々の分子生物学的用途（例えば、遺伝子治療およびワクチン接種におけるそれらの適用を含む）において広く使用されている。これらの遺伝子治療およびワクチン接種の用途では、ウイルスベクターなどのベクターは、宿主細胞に導入すべき目的の１つまたは複数の遺伝子のキャリアとして使用される。例えば、ウイルスベクターは、所望の抗原をコードする遺伝子またはその一部を発現させて、免疫応答を惹起するために使用され得る。
【０００３】
最も初期のウイルスベクターは、一般に１つの導入遺伝子のみを含み、および多くのストラテジーが初期世代ベクターについて発表されている。例えば、発表されたストラテジーは、様々な異なるアデノウイルス（ｒＡｄ）ベクターの使用を報告しており、導入遺伝子発現カセットがｒＡｄの異なる領域、例えばＥ１領域、Ｅ３領域、またはＥ４と右ＩＴＲとの間などに配置され得ることを示している。しかし、ワクチンの目的では、保護および広いカバー範囲を達成するために、２つ以上の抗原または異なる株からの同じ抗原が必要であることが多い。したがって、場合により、１つのベクターから少なくとも２つの抗原を発現させることが望ましい。１つのウイルスベクターに２つの抗原をコードさせるための様々な方法が記載されている。
【０００４】
ｒＡｄを用いる最初の２抗原法では、１つの抗原発現カセットがＥ１領域に配置され、第２のカセットがＥ３領域に配置された（例えば、（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。ｒＡｄを用いる異なる２抗原法では、１つの抗原発現カセットがＥ１に配置され、第２のカセットがＥ４と右ＩＴＲとの間に配置された（例えば、（Ｈｏｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｓｃｈｅｐｐ−Ｂｅｒｇｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。ｒＡｄを用いる別の２抗原法は、組換えによる遺伝的不安定性を防止するために、２つの異なるプロモーター配列を用いてヘッドトゥーテール方式でＥ１領域に配置された２つの抗原発現カセットを使用することである（例えば、（Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｃ．Ｄ．Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９））。
【０００５】
２抗原法の別の例は、プラス鎖ＲＮＡウイルスの配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するものを使用して、２つのタンパク質に翻訳される単一の転写物を産生することである（例えば、（Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｂｉｆｆｉ，Ｖｉｇｎａ，＆Ｎａｌｄｉｎｉ，２００５；Ｎａ＆Ｆａｎ，２０１０））。他の例としては、宿主細胞スプライシング機構の利用、または口蹄疫２Ａ配列などのプラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する「切断」ペプチドもしくは他のウイルスに由来する均等物の使用による、２つのタンパク質に切断されるポリタンパク質の産生が挙げられる。発表された報告によると、これらのストラテジーは、全て等しく有用でありかつ成功し得る。
【０００６】
代替的に、双方向性プロモーターの使用は、ウイルスベクターを用いて２つの抗原を発現するための別の方法である。例えば、レンチウイルスベクター（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ＆Ｗｅｇｅｒ．２０１０）およびアデノウイルスベクター（Ｎａ＆Ｆａｎ，２０１０；Ｐｏｓｔ＆Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ，２０１０；Ｒｏｂｂｉｎｓ＆Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，１９９８；Ｗａｌｔｅｒ＆Ｓｔｅｉｎ，２０００）について異なる双方向性プロモーターが記載されている。
【０００７】
一般に、２つの異なるタイプの双方向性プロモーター、双方向特性を有する天然に存在する配列、および合成的に設計された双方向性プロモーターが使用のために知られている。双方向特性を有する天然に存在する配列は、ウイルス、植物または哺乳動物ゲノムにおいて見出すことができる（Ａｎｄｒｉａｎａｋｉ，Ｓｉａｐａｔｉ，Ｈｉｒａｔａ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，＆Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，２０１０；Ｂａｒｓｋｉ，Ｓｉｌｌｅｒ−Ｌｏｐｅｚ，Ｂｏｈｒｅｎ，Ｇａｂｂａｙ，＆Ａｇｕｉｌａｒ−Ｃｏｒｄｏｖａ，２００４）。例えば、ヒトゲノム中の多くのプロモーターがいくつかの双方向特性を有することが報告されている。双方向特性を有するヒトプロモーターは、ＧＡＢＰ部位の過剰提示によって特徴付けられる（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ，＆Ｍｙｅｒｓ，２００７）。
【０００８】
天然に存在する配列とは対照的に、合成による双方向性プロモーターは、異なる一方向性プロモーターの望ましい特性を利用するように設計することができる。例えば、Ａｍｅｎｄｏｌａらは、ヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーター（ｍｉｎＣＭＶ）をヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＩ  Ｃ）と組み合わせることにより、レンチウイルスベクターにおいて使用するための２つの異なる合成双方向性プロモーターを作製した（Ａｍｅｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。双方向性プロモーターを構築するために、１つのエンハンサーのみを使用して、一方向性プロモーターが逆向き（ヘッドトゥーヘッド）に構成された。Ａｍｅｎｄｏｌａらによれば、強力な最小プロモーターをこの構成で完全な哺乳動物プロモーターと組み合わせると、両側からの協調発現がもたらされた。新たに作製された多価ベクターの重要な特徴としては、例えば、アップスケーリング中の遺伝的安定性、大規模でのベクターの生産性、両方の抗原の強力な発現、両方の抗原のバランスのとれた発現、および挿入された発現カセットから発現された両方の抗原のサイズ制限が挙げられる。
【０００９】
以前に開示された方法と比較して特に良好な結果が得られた、最近記載されたストラテジーでは、双方向性マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）プロモーターを使用して２つの導入遺伝子を発現した（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレット）。そこでは、第１の導入遺伝子は、１つの方向において双方向性ｍＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、第２の導入遺伝子は、逆方向において双方向性ｍＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された。双方向性ｍＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄは、遺伝的に安定であると決定され、単一の導入遺伝子のみを有するｒＡｄに匹敵する遺伝的安定性を提供した。さらに、Ｔ細胞およびＢ細胞応答に関する発現抗原の免疫原性のＥＬＩＳＰＯＴおよびＥＬＩＳＡ分析に基づいて、両方の導入遺伝子は、両方の抗原に対する免疫原性応答を生成するのに十分に発現することがわかった。したがって、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターは、以前に記載されたいくつかの他のストラテジーよりも優れていることが記載された。しかし、ｍＣＭＶプロモーターの両側の発現レベルのバランスをさらに改善し得ることがわかった。双方向性ｍＣＭＶプロモーターの右側（３’末端）に位置する抗原の発現は、プロモーターの左側（５’末端）に位置する抗原と比較して約１０倍高かった。２つのコードされた抗原の発現における不均衡は、より低く発現された抗原と比較して、高度に発現された抗原に対してより強い免疫応答をもたらす。この種の差次的発現は、特定の用途では有用であり得るが、他の用途では、ｍＣＭＶプロモーターのいくつかの利点を、よりバランスのとれた発現、すなわち双方向性ｍＣＭＶプロモーターおよび文献に記載されている他の双方向性プロモーターよりも強力でかつバランスのとれた双方向性プロモーターと組み合わせるストラテジーを有することも望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、強力であり、比較的短く、同一配列の長い内部ストレッチを有さないかまたはそれが限定されている、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターと比較して両側の発現バランスが改善された双方向性プロモーターを特定し、かつ２つの導入遺伝子の強力でバランスのとれた発現により、遺伝的に安定な組換えウイルスを提供することが依然として要望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含む組換え核酸分子と、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むベクター、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクターおよびウイルスとを提供する。本発明の組換えベクターは、２つの導入遺伝子を含み、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびｒｈＣＭＶ部分の転写方向（５’から３’へ）は、互いから離れる方向に向かい（ヘッドトゥーヘッド配置）、第１の導入遺伝子は、左側で１つの方向において作動可能に連結され、発現は、双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分によって制御され、および第２の導入遺伝子は、右側で逆方向において作動可能に連結され、発現は、双方向性プロモーターのｒｈＣＭＶ部分によって制御される。ｈＣＭＶエンハンサーは、２つの異なるプロモーター間の中間において、ｈＣＭＶプロモーター部分の方向を向いて配置される。エンハンサーは，配向非依存性であり得るため、このエンハンサーは、双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびｒｈＣＭＶ部分に作動可能に連結された両方の導入遺伝子の協調発現を提供する。例えば、図１Ｄを参照されたい。図１Ｄは、代表的なｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの異なる構築ブロックの同一性および配向を示す。好ましくは、本発明によるｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、配列番号４に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最大１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、組換えウイルスおよび組換えウイルスベクターは、組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）およびｒＡｄベクターである。本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターで生成されたｒＡｄは、遺伝的に安定しており、継代１３（ｐ１３）に至るまでＰＣＲ分析によって欠失バンドは検出されず、したがって単一導入遺伝子のみを有するウイルスに匹敵する遺伝的安定性を提供する。さらに、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、わずかに９４３個のヌクレオチドを有する比較的短い双方向性プロモーターであり、２つの導入遺伝子の強力で非常にバランスのとれた発現を提供する。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、組換え（ウイルス）ベクターを用いた遺伝子治療およびワクチン用途における使用に好適であり、特に非常にバランスのとれた強力な発現が重要である場合、および／または小サイズの双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターが有用である場合に好適である。
【００１３】
一般的なかつ好ましい実施形態は、本明細書に添付の独立請求項および従属請求項によってそれぞれ定義され、簡潔にするために、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の様々な態様の他の好ましい実施形態、特徴および利点は、下の詳細な説明と添付の図面とから明らかになるであろう。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、左側のｈＣＭＶプロモーターおよび右側のｒｈＣＭＶプロモーターを含む双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを提供し、この双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、左側で１つの方向において第１の導入遺伝子に作動可能に連結され、およびこの双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、右側で逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結されている。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、第１および第２の導入遺伝子を含む組換えウイルスを製造する方法であって、１つの方向において第１の導入遺伝子に、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、前記コンストラクトを組換えウイルスのゲノムに組み込む工程とを含む方法も提供する。
【００１６】
特定の実施形態では、組換えウイルスは、組換えアデノウイルスである。
【００１７】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１領域に欠失を有し、かつ特定の実施形態では、このＥ１領域に双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターと第１および第２の導入遺伝子とを含む。代替的に、組換えアデノウイルスの他の領域も使用され得る。例えば、双方向性プロモーター発現カセットはまた、組換えアデノウイルスのＥ４領域と右ＩＴＲとの間のゲノムの右端に配置され得る。
【００１８】
特定の実施形態では、第１および第２の導入遺伝子は、異なり、およびそれらの少なくとも１つは、抗原をコードする。特定の実施形態では、両方は、異なる抗原をコードする。
【００１９】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型２６またはヒトアデノウイルス血清型３５である。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法であって、本発明による組換えベクターを細胞に提供する工程を含む方法も提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明による組換えベクターを対象に投与する工程を含む方法も提供する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、本発明による組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子も提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、本発明による組換えアデノウイルスなどの組換えベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、ワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】試験した双方向性プロモーターコンストラクトの概略図（異なる双方向性プロモーター配列の構築ブロックの同一性および配向についての注釈を含む）である。Ｐ：プロモーター、Ｅｎｈ：エンハンサー、Ｉ：イントロン。
【図１−２】（上記の通り。）
【図１−３】（上記の通り。）
【図１−４】（上記の通り。）
【図１−５】（上記の通り。）
【図２】ＨＥＫ２９３細胞における一過性トランスフェクションで評価した、異なる双方向性プロモーターコンストラクトによるルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの発現である。ルシフェラーゼ発現は、相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現は、ＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるプロモーターコンストラクトをスクリーニングする３つの異なる実験の結果を示す。異なる双方向性プロモーターの左側からのルシフェラーゼ発現および右側からのｅＧＦＰ発現の結果の棒グラフを示す。陽性対照：一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下のルシフェラーゼまたはｅＧＦＰ；非トランスフェクト細胞を陰性対照として使用する。
【図３】（Ａ）ｐｓｈｕｔｔｌｅ２６における双方向性プロモーターｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ用の双方向性発現カセットの構成（双方向性プロモーターコンストラクトの両側に導入遺伝子を挿入するために使用される制限部位の同一性および位置を含む）である。Ｐ：プロモーター、Ｅｎｈ：エンハンサー、ＴＧ：導入遺伝子、ｐＡ：ＳＶ４０（右側）または牛成長ホルモン（ＢＧＨ）（左側）に由来するポリアデニル化シグナル。プラスミドベクターｐｓｈｕｔｔｌｅ２６における表示。同じ双方向性発現カセット構成をｐＡｄａｐｔ３５で使用した。（Ｂ）ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターを示す概略図（構築ブロックのヌクレオチド位置を含む）である。矢印は、転写の方向を表す。
【図４】Ａ５４９細胞に１０００ＶＰ／細胞で感染させたＡｄ２６ｒＡｄベクター（Ａ）およびＡｄ３５ｒＡｄベクター（Ｂ）における双方向性プロモーターコンストラクトの左側または右側におけるルシフェラーゼおよびｅＧＦＰ導入遺伝子の発現である。ルシフェラーゼ発現は、相対発光量（ＲＬＵ）として測定し、ｅＧＦＰ発現は、ＦＡＣＳにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定する。異なるｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターコンストラクトについての結果を、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でのルシフェラーゼまたはｅＧＦＰについての１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞の陽性対照ならびにエンプティベクターに感染させた細胞と比較する。Ａｄ２６ｒＡｄベクターについて、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶを双方向性ｍＣＭＶプロモーターとさらに比較する。
【図５】Ｅ１領域に双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを保有し、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの右側または左側にｅＧＦＰおよびルシフェラーゼをコードするＡｄ２６ベクターゲノム上での、連続増殖とそれに続くＰＣＲによる遺伝的安定性試験である。パネルの上から下に、ＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＰ５、Ｐ１０、およびＰ１３での連続増殖後の１ベクター当たり５つのプラークについてのＰＣＲ産物を示す。各パネルのレーン１〜５は、左側にルシフェラーゼ、右側にｅＧＦＰを有する双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを示す。各パネルのレーン６〜１０は、左側にｅＧＦＰ、右側にルシフェラーゼを有する双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを示す。レーン１１は、ｋＢマーカーを示す。レーン１２は、Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰのプラスミド陽性対照を示す。レーン１３は、ｒＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．Ｌｕｃのプラスミド陽性対照を示す。レーン１４は、導入遺伝子を含まない発現カセットのＰＣＲ産物サイズのプラスミド対照を示す。レーン１５は、陰性水ＰＣＲ対照を示す。ラベル表示：Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１３：ウイルス継代数。予想されるＰＣＲ産物以外の追加のバンドは、非特異的ＰＣＲ産物である。注：欠失バンドの欠如は露出過多の画像で確認された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
新しい双方向性プロモーターコンストラクトの強度およびバランスを比較した実験結果を本明細書に記載する。結果は、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターが、ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＡｄＡｐｔプラスミドベクターによる一過性トランスフェクション、ならびに１つの方向において双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された第１の導入遺伝子、および逆方向において双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された第２の導入遺伝子を有する双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５によるウイルス感染に基づいて、２つの導入遺伝子の強力かつバランスのとれた発現を提供することを示す。双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターはまた、わずかに９４３個のヌクレオチドを有する比較的短い双方向性プロモーターである。さらに、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄは、遺伝的に安定しており、継代１３（ｐ１３）に至るまでＰＣＲ分析によって欠失バンドは検出されず、したがって単一導入遺伝子のみを有するウイルスに匹敵する遺伝的安定性を提供する。したがって、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄは、非常にバランスのとれた強力な発現が重要である場合、および／または小サイズの双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターが、例えばサイズが限られたベクターまたはウイルスゲノム中に導入遺伝子のための空間をより多く空けておくために他のより長い双方向性プロモーターと比較して有用である場合の遺伝子治療およびワクチン用途における使用に好適である。
【００２６】
したがって、本発明は、１つの方向において第１の導入遺伝子に作動可能に連結され、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターを含む組換え核酸分子であって、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびｒｈＣＭＶ部分の転写方向（５’から３’へ）は、互いから離れる方向に向かい、左側からの発現は、双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分によって制御され、および右側からの発現は、双方向性プロモーターのｒｈＣＭＶ部分によって制御される、組換え核酸分子に関する。特定の実施形態では、本発明は、細胞において２つの導入遺伝子を発現するための、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むベクター、ウイルスベクター、およびウイルスの使用に関する。
【００２７】
特定の実施形態では、本発明は、宿主細胞による異種タンパク質の産生を可能にするために使用するプラスミドベクターに関する。例えば、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むプラスミドベクターは、異種多サブユニットタンパク質複合体の２つの異なる成分を発現するために使用され得る。このようなプラスミドベクターは、例えば、（１）双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーター、（２）各導入遺伝子のリボソーム結合部位をｍＲＮＡに提供する配列、（３）各導入遺伝子のコード領域、すなわち所望のポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、（４）翻訳開始のための各導入遺伝子のコザックコンセンサス配列、（５）各導入遺伝子のコード全体が読み取られたときに翻訳を終結させる各導入遺伝子の終止配列、および（６）ベクターがゲノムに直接挿入されない場合、ベクター全体が細胞内に一旦再生されることを可能にする複製起点を含むＤＮＡ配列であり得る。その後、例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより、ベクターを組み込むように宿主細胞を誘導し、宿主細胞の機能の一部として２つの導入遺伝子を発現するように宿主細胞を増殖させる。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明は、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むｒＡｄおよびｒＡｄベクター、ならびにｒＡｄおよびｒＡｄベクターを作製および使用する方法に関し、ここで、ｒＡｄおよびｒＡｄベクターは、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターおよび２つの導入遺伝子を含み、第１の導入遺伝子は、１つの方向において双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターに作動可能に連結され、および第２の導入遺伝子は、逆方向において双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２９】
本発明のｒＡｄは、大規模な量またはバッチで製造され得る。ｒＡｄの「バッチ」は、単一製造容器において１回の製造工程で製造される組成物であり、または代替的に単一容器（例えば、バイオリアクター、バッグ、フラスコ、ボトル、複数回投与バイアル、単回投与バイアル、シリンジなど）に含まれる組成物中の複数のｒＡｄ粒子を指し得る。本発明によるｒＡｄのバッチまたは本発明によるｒＡｄを含む組成物は、好ましくは、少なくとも１０７個のｒＡｄ粒子を含み、特定の実施形態では、少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個またはそれを超えるｒＡｄ粒子、最大で１０２０個のｒＡｄ粒子を含む（例えば、単回製造工程において大規模バイオリアクター内で製造される場合）。バッチまたは組成物は、ｒＡｄ以外のさらなる関連する成分を含んでもよく、または含まなくてもよい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、組換えアデノウイルスの「組換え」という用語は、野生型アデノウイルスとは対照的に、人の手によって改変されていることを意味し、例えば異種遺伝子、遺伝子群、またはその一部、および双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含む。
【００３１】
本明細書中の配列は、当該技術分野で慣用されているように５’から３’の方向で示される。
【００３２】
「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型および／または向性の決定に関与する、アデノウイルスのカプシドのタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、一般に、繊維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含む。本発明による特定の血清型の（または「それをベースとする」）ｒＡｄは、通常、その特定の血清型の繊維、ペントンおよび／またはヘキソンタンパク質を含み、好ましくはその特定の血清型の繊維、ペントンおよびヘキソンタンパク質を含む。これらのタンパク質は、一般に、ｒＡｄのゲノムによってコードされる。特定の血清型のｒＡｄは、任意選択的に、他のアデノウイルス血清型に由来する他のタンパク質を含有し、かつ／またはコードし得る。
【００３３】
本明細書で使用される場合、ｒＡｄは、少なくとも配列において野生型からの誘導によってアデノウイルスを「ベースとする」。この誘導は、出発物質として野生型ゲノムまたはその一部を使用した分子クローニングにより達成することができる。野生型アデノウイルスゲノムの既知の配列を使用して、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野のビジネスを有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ，ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）による日常的手順を用いて実施され得るＤＮＡ合成により、ゲノム（の一部）を新規に作製することも可能である。したがって、非限定的な例として、Ａｄ３５のヘキソン、ペントン、および繊維を含むｒＡｄは、Ａｄ３５をベースとするｒＡｄなどと見なされる。
【００３４】
本発明のアデノウイルスベクターは、ｒＡｄベクターと称される。ｒＡｄベクターの調製は、当該技術分野でよく知られている。
【００３５】
特定の実施形態では、本発明によるｒＡｄベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とが欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これは、アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損またはＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子および／またはＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域および／またはＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子がさらに欠損していることができる。
【００３６】
アデノウイルスベクター、それらを構築する方法、およびそれらを増殖させる方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，９８１，２２５号明細書、米国特許第６，０４０，１７４号明細書、米国特許第６，０２０，１９１号明細書、米国特許第６，１１３，９１３号明細書、および米国特許第８，９３２，６０７号明細書、ならびにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、および本明細書で言及している他の参考文献に記載されている。一般に、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、ならびに本明細書で言及している他の参考文献に記載されているものなど、当該技術分野でよく知られている標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
【００３７】
本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）に属し、好ましくはマストアデノウイルス属（Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）に属するものである。それは、ヒトアデノウイルスであり得るが、他の種に感染するアデノウイルス、例えば、限定はされないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３または５）、またはシミアンアデノウイルス（チンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスなどのサルアデノウイルスおよび類人猿アデノウイルスを含む）でもあり得る。好ましくは、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶまたはＡｄＨｕ；本発明では、種の指示なしにＡｄに言及される場合にはヒトアデノウイルスを意味し、例えば、簡略表記の「Ａｄ５」は、ヒトアデノウイルス血清型５であるＨＡｄＶ５と同じものを意味する）、またはチンパンジーもしくはゴリラアデノウイルスなどのシミアンアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、またはＳＡｄＶ）である。
【００３８】
最も進んだ研究は、ヒトアデノウイルスを用いて実施されており、本発明の特定の態様ではヒトアデノウイルスが好ましい。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスをベースとする。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９または５０をベースとする。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６および３５の１つのヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点は、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよび（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に記載されている。Ａｄ２６のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製は、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレットおよび（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）に記載されている。Ａｄ３５のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿００００１９、および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６に見出される。
【００３９】
シミアンアデノウイルスも、一般に、ヒト集団における低い血清陽性率および／または低い既存の中和抗体力価を有し、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用した相当量の研究が報告されている（例えば、米国特許第６，０８３，７１６号明細書；ならびに国際公開第２００５／０７１０９３号パンフレット；国際公開第２０１０／０８６１８９号パンフレット；および国際公開第２０１００８５９８４号パンフレット；（Ｂａｎｇａｒｉ＆Ｍｉｔｔａｌ，２００６；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｆａｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｌａｓａｒｏ＆Ｅｒｔｌ，２００９；Ｔａｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスをベースとする。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、シミアンアデノウイルス１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０またはＳＡ７Ｐ型をベースとする。アカゲザルアデノウイルスベクターも有用な候補ベクターとして記載されている（例えば、（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）；国際公開第２０１４／０７８６８８号パンフレット）。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、アカゲザルアデノウイルス、例えば、非限定的な例であるＲｈＡｄ５１、ＲｈＡｄ５２もしくはＲｈＡｄ５３（またはｓＡｄ４２８７、ｓＡｄ４３１０ＡもしくはｓＡｄ４３１２；例えば、（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）および国際公開第２０１４／０７８６８８号パンフレットを参照されたい）の１つをべーすとする。
【００４０】
当業者であれば、アデノウイルスに加えて、他のウイルスも、本発明の双方向性プロモーターを使用するウイルスベクターとしての使用に好適であることを認識するであろう。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルスおよびレンチウイルスも本発明の双方向性プロモーターを含むように設計することができる。例えば、（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ＆Ｗｅｇｅｒ，２０１０；Ｒｏｂｂｉｎｓ＆Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，１９９８；Ｗａｌｔｈｅｒ＆Ｓｔｅｉｎ，２０００）で論じられているような異なるベクターについての総説を参照されたい。
【００４１】
上記のヒトおよび非ヒトアデノウイルスの大多数の配列は、知られており、その他については日常的な手順を用いて得ることができる。
【００４２】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
【００４３】
特定の実施形態では、アデノウイルスは、複製欠損であり、例えば、これは、このアデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。「Ｅ１領域における欠失」は、野生型アデノウイルスと比較したときのこの領域における欠失を意味し、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５ＫまたはＥ１Ｂ  ２１Ｋコード領域の少なくとも１つの欠失、好ましくはＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ、およびＥ１Ｂ２１Ｋコード領域の欠失を意味する。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの必須領域が欠失している場合、これらの領域でコードされる機能は、好ましくは、プロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわち、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらは、プロデューサー細胞内、例えばそのゲノムに組み込まれ、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内にも欠失を有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失が補完される必要はない。
【００４４】
使用し得るプロデューサー細胞（ときに当該技術分野および本明細書において「パッケージング細胞」、または「補完細胞」、または「宿主細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖できる任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくは、それらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１によって不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１またはＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照されたい）、Ｅ１−形質転換羊膜細胞（例えば、欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照されたい）、Ｅ１−形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照されたい）、ＧＨ３２９：ヒーラ細胞（Ｇａｏ，Ｅｎｇｄａｈｌ，＆Ｗｉｌｓｏｎ，２０００）、２９３細胞など、任意のＥ１−補完プロデューサー細胞を使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。
【００４５】
亜群ＣまたはＥアデノウイルスに由来しないＥ１欠損アデノウイルスでは、非亜群ＣまたはＥアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列をＡｄ５などのアデノウイルス亜群ＣのＥ４−ｏｒｆ６で交換することが好ましい。これにより、例えば、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞などのＡｄ５のＥ１遺伝子を発現する、よく知られている相補的な細胞株におけるこのようなアデノウイルスの増殖が可能になる（例えば、（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレットを参照されたい。これらは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４６】
代替の実施形態では、アデノウイルスベクターに（例えば、Ａｄ５の）異種Ｅ４ｏｒｆ６領域を入れる必要はないが、代わりにＥ１欠損非亜群ＣまたはＥベクターを、例えばＡｄ５からのＥ１とＥ４ｏｒｆ６との両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株などのＥ１および適合性Ｅ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞株において増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載している（Ｂｒｏｕｇｈ，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ｈｓｕ，Ｋｕｌｅｓａ，＆Ｋｏｖｅｓｄｉ，１９９６）；そのような細胞株を使用したＥ１欠失非亜群Ｃアデノウイルスベクターの生成についてそれぞれ記載している（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７：Ｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を参照されたい）。
【００４７】
代替的に、増殖させる血清型由来のＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照されたい）。
【００４８】
Ｅ１領域に欠失を有するＡｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスでは、例えば、ｐＩＸ開始コドンの直接上流の２４３ｂｐ断片（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端で標識される）などのｐＩＸオープンリーディングフレームの直接上流の１６６ｂｐまたはこれを含む断片など、アデノウイルスのＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端を保持することが好ましく、これは、ｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に部分的に存在するため、アデノウイルスの安定性を高めるからである（例えば、（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；国際公開第２００４／００１０３２号パンフレットを参照されたい。これらは、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
本発明のベクターまたは（アデノ）ウイルスにおける「異種核酸」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、ベクターまたは（アデノ）ウイルスに天然に存在しない核酸である。それは、例えば、標準的な分子生物学的手法によりベクターまたは（アデノ）ウイルス中に導入される。それは、特定の実施形態では、目的タンパク質またはその一部をコードし得る。それは、例えば、アデノウイルスベクターのＥ１またはＥ３欠失領域にクローニングされ得る。本発明の好ましい実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーター制御下にある２つの導入遺伝子を有する発現カセットがアデノウイルスゲノムのＥ１領域に配置される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで行われ得る。導入遺伝子の発現のために多数のプロモーターを使用することができ、それらは、当業者に知られている。
【００５０】
核酸の相同ストレッチが不安定性をもたらし得ることが知られている。例えば、１つのアデノウイルスベクターにおいて２つの同一の（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用することが可能であると以前に報告されており、より広範な試験により、アデノウイルスの遺伝的不安定性につながるようであった（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレット）。したがって、本発明者らは、アデノウイルスベクターにおける相同組換えによる欠失を防ぐために、双方向性プロモーターを設計する際、配列同一性の広範なストレッチを有するプロモーター構築ブロックの使用を最小限に抑えようとした。重要なことに、本発明のｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターによって調節される導入遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、本明細書において遺伝的に安定であることが示された。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」、または「プロモーター領域」、または「プロモーターエレメント」という用語は、同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を制御する核酸配列断片（典型的にはＤＮＡであるが、これに限定されるものではない）を指す。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始に十分な特異的配列を含む。さらに、プロモーター領域は、任意選択的に、このＲＮＡポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列を含み得る。これらの配列は、シス作用性であるかまたはトランス作用因子応答性であり得る。さらに、プロモーターは、調節の性質により、構成的であるかまたは調節的であり得る。
【００５２】
プロモーターが核酸配列のストレッチから構築され、多くの場合、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ＴＡＴＡボックスなどの一般的転写因子結合部位、特異的転写因子結合部位などのエレメントまたは機能単位を核酸配列のストレッチ中に含むことを当業者は認識するであろう。エンハンサー、ときにプロモーター配列の末端のイントロンなどのさらなる調節配列も存在し得る。以下、本明細書では、このような機能単位を「構築ブロック」と称し、これらは、核酸のストレッチ中で組み合わされて機能的プロモーター配列を構築し得る。構築ブロックは、互いに直接隣接し得るが、プロモーター機能において直接的な役割を有さない核酸のストレッチによって分離され得る。当業者は、核酸ストレッチ中のヌクレオチドがプロモーター機能に関係しているか否かを試験する方法、および標準的な分子生物学的方法により、例えば、プロモーター活性を保持しながらその長さを最小化するためにまたは活性を最適化するために、構築ブロックおよび／またはヌクレオチドを所与のプロモーター配列から除去または付加する方法を知っている。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「エンハンサー」または「エンハンサー構築ブロック」という用語は、遺伝子またはいくつかの遺伝子の転写を刺激または増強するためにタンパク質（アクチベータータンパク質）によって結合され得る調節ＤＮＡ配列（例えば、５０〜１５００ｂｐ）を指す。これらのアクチベータータンパク質（別名、転写因子）は、メディエータ複合体と相互作用し、ポリメラーゼＩＩおよび基本転写因子を動員し、次に遺伝子の転写を開始する。エンハンサーは、一般にシス作用性であるが、それらが調節する１つまたは複数の遺伝子の開始部位の上流または下流に位置し得る。さらに、エンハンサーは、前方向または後方向であり得、かつ転写に影響を及ぼすために転写開始部位の近くに位置する必要はなく、いくつかは、開始部位の数十万塩基対上流または下流に位置することが見出されている。エンハンサーは、イントロン内に見出すこともできる。
【００５４】
「双方向性プロモーター」という用語は、プロモーターエレメントの他にエンハンサーエレメントおよびイントロンエレメントを含み得、かつ本明細書中に記載される構築ブロックによって定義される連続遺伝子調節配列を指す。これらの双方向性プロモーターは、双方向性プロモーター配列の両側に配置された導入遺伝子の発現を制御する双方向様式で遺伝子を発現させる。例えば、本発明の双方向性プロモーターは、２つの異なる導入遺伝子の転写を双方向様式で指向し、かつ一方の側に第１のプロモーター構築ブロックが隣接し、他方の側に第２のプロモーター構築ブロックが隣接したエンハンサー構築ブロックを含み、その結果、導入遺伝子は、それぞれのプロモーター構築ブロックの下流に存在する。隣接するとは、構築ブロック間にいくつかの追加ヌクレオチドが存在し得るため、必ずしも直接的に接することを意味しないが、双方向性プロモーターがコンパクトなサイズを維持するように、あまり多くの追加配列が付加されないことが好ましいことに留意されたい。また、「上流」および「下流」という用語は、当該技術分野で一般に使用されている転写の方向に関するものであることにも留意されたい。例えば、慣例により、上流および下流という用語は、ＲＮＡ転写が起こる５’から３’の方向に関する。上流は、ＲＮＡ分子の５’末端方向であり、下流は、３’末端方向である。二本鎖ＤＮＡを考えると、上流は、対象の遺伝子のコード鎖の５’末端方向であり、下流は、３’末端方向である。ＤＮＡの逆平行性により、これは、鋳型鎖の３’末端が遺伝子の上流にあり、５’末端が下流にあることを意味する。例えば、図１Ｄを参照されたい。図１Ｄは、ヒトサイトメガロウイルス主要最初期エンハンサー（ｈＣＭＶエンハンサー）をエンハンサー構築ブロックとして含み、その一方の側に第１プロモーター構築ブロックとしてヒトサイトメガロウイルス主要最初期プロモーター（ｈＣＭＶ）が隣接し、他方の側に第２のプロモーター構築ブロックとしてアカゲザルＣＭＶプロモーター（ｒｈＣＭＶ）が隣接している、好ましい双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを示す。本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、２つの導入遺伝子に作動可能に連結されており、第１の導入遺伝子は、ｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに作動可能に連結され、および第２の導入遺伝子は、ｒｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに作動可能に連結され、それにより、第１および第２の導入遺伝子のそれぞれは、それぞれのプロモーターの下流に位置し、かつ第１および第２の導入遺伝子は、ｈＣＭＶエンハンサーから外側の方向に転写される。
【００５５】
本発明の好ましい双方向性プロモーターは、図３Ｂに示すような異なるエレメントの配列位置を有する、配列番号４を含む双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターであるが、当業者は、異なる構築ブロックの配列および介在配列の長さまたは同一性が、実質的に同様の結果が得られる程度まで変化され得ることを認識するであろう。例えば、異なるエンハンサーを置換について試験し、かつ／または実質的に同様の発現が得られ得るようにエンハンサー配列を微調整することができるであろう。同様に、イントロンをプロモーター構築ブロックの一方または両方の下流に隣接して付加することができ、かつ双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターが依然として活性であると予想される。場合により、これは、発現の増強をもたらし得るが、いずれの場合にも、イントロンがベクターまたはウイルスの空間を占めるため、導入遺伝子の空間を犠牲にし得るであろう。本明細書中に示すエンハンサーは、好ましいものであり、好適なサイズであり、バランスのとれた発現を生じ、アデノウイルスベクター環境において安定なコンストラクトを生じる。本発明の双方向性プロモーターの構築ブロック自体は、個々に既知であり得るが、一連の発明において組み合わされたことも、組み合わされることを示唆されたこともない。組み合わされることで、強力で非常にバランスがとれ、かつ比較的短いた双方向性プロモーターがもたらされる。本明細書中に示されるように、わずかに９４３個のヌクレオチドからなる比較的短い配列を有するにもかかわらず、ｈＣＭＶエンハンサーとｈＣＭＶおよびｒｈＣＭＶプロモーターとのこの新規な双方向性組合せは、驚くべきことに、２つの作動可能に連結された導入遺伝子の強力かつバランスのとれた転写を指向し得、さらに同時に、アデノウイルスベクターの複雑な環境において関連した導入遺伝子を有する双方向性プロモーターの安定な配置を維持することがわかった。本明細書中に提示したデータは、いくつかの他の同様に設計された双方向性プロモーターが強力なプロモーター活性を欠き、かつ／または不均衡な発現をもたらし、それにより、双方向性プロモーターの一方に作動可能に連結された導入遺伝子の発現が、そのような双方向性プロモーターの他方に作動可能に連結された導入遺伝子と比較して有意に強く（例えば、少なくとも５倍の差）発現されるという点において、既知の同様の構築ブロックに基づいてこのような双方向性プロモーターを作製することが予測不可能であったことを示す。両側からの類似の発現レベル（例えば、両側からの発現の差が２倍未満）およびアデノウイルスベクターの環境における安定性の要件を満たすプロモーターが達成可能であるか否かさえも、先験的に予測不可能であった。本発明は、驚くべきことに、これらの要件を満たし、かつ小さいサイズを有する双方向性プロモーターを提供し、これは、導入遺伝子を有するベクターのサイズ制限との関連で非常に有利であり得る（すなわちより大きい導入遺伝子を収容することができ、かつ／またはベクターがより安定であり得る）。
【００５６】
さらなる調節配列も、本発明の双方向性プロモーターを含むコンストラクトに付加し得る。「調節配列」という用語は、本明細書では「調節エレメント」と同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を調節し、したがって転写調節因子としての役割を果たす核酸断片（典型的にはＤＮＡであるが、これに限定されるものではない）を指す。調節配列は、多くの場合、転写タンパク質および／または転写因子の核酸結合ドメインによって認識される転写結合ドメインである核酸配列、エンハンサーまたはリプレッサーなどを含む。例えば、調節配列は、テトラサイクリンオペロンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で発現が阻害されるように、１つ以上のテトラサイクリンオペロンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得る。テトラサイクリンの不在下において、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合し、ｔｅｔＯ部位に作動可能に連結される遺伝子の転写を抑制することができる。しかし、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔＲタンパク質は、体構造が変化し、オペレーター配列への結合が妨げられ、作動可能に連結された遺伝子の転写を生じさせる。特定の実施形態では、本発明のｒＡｄは、ｔｅｔＲタンパク質が発現するプロデューサー細胞株で産生されるベクター中で１つ以上の導入遺伝子の発現が阻害されるように、任意選択的に、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されたｔｅｔＯを含み得る。その後、ｔｅｔＲタンパク質を発現しない対象または細胞にベクターが導入されると、発現は阻害されない（例えば、国際公開第０７／０７３５１３号パンフレットを参照されたい）。特定の他の実施形態では、本発明のベクターは、任意選択的に、クマート遺伝子スイッチ系を含み得る。そこでは、発現の調節が、プロモーター下流に配置されたオペレーター部位（ＣｕＯ）へリプレッサー（ＣｙｍＲ）が結合することによって媒介される（例えば、（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を参照されたい）。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「リプレッサー」という用語は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の生成に対して阻害し、干渉し、遅延させ、かつ／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質または他の分子）を指す。例えば、発現カセット内などの発現ベクターに沿う適切な位置での結合部位との干渉によるものである。リプレッサーの例としては、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、ラムダリプレッサー、および当該技術分野で知られている他の適切なリプレッサーが挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の組換えベクター、ウイルスまたはアデノウイルスは、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターを含み、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターのｈＣＭＶ部分およびｒｈＣＭＶ部分の転写方向（５’から３’へ）は、互いから離れる方向に向かい、およびｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性プロモーターは、１つの方向において第１の導入遺伝子に作動可能に連結され、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結されている。したがって、双方向性プロモーターは、ベクターまたは（アデノ）ウイルスゲノムの第１の末端に向けて第１の導入遺伝子の発現を駆動し、ベクターまたは（アデノ）ウイルスゲノムのもう一方の末端に向けて第２の導入遺伝子の発現を駆動する。当業者であれば、提示された配列を変異させることができ、また日常的な方法によってプロモーター活性を試験し得ることを認識するであろう。一般的に、示されたプロモーター配列（エンハンサー配列を含まない）と少なくとも９０％の同一性を有する配列は、依然として機能的活性を有し、したがって双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターと考えられる。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、好ましくは、示されたプロモーター配列（エンハンサー配列以外）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、好ましくは、配列番号４に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。特定の好ましい実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、図１Ｄに示すような構築ブロックを含み、ここで、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、一方の側に第１のプロモーター構築ブロックとしてｈＣＭＶプロモーターが隣接し、他方の側に第２のプロモーター構築ブロックとしてアカゲザルＣＭＶ（ｒｈＣＭＶ）プロモーターが隣接しているｈＣＭＶエンハンサーをエンハンサー構築ブロックとして含む。特定の好ましい実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、図３に示すような異なるエレメントの配列位置を有する、配列番号４に対して１００％の同一性を有するが、当業者は、異なる構築ブロックの配列および介在配列の長さがある程度まで変わり得、また、エンハンサーエレメントおよびイントロンエレメントの同一性も実質的に同様の結果が得られる程度まで変化され得ることを認識するであろう。
【００５９】
「作動可能に連結された」または「作動的に連結された」という用語は、本明細書では同義的に使用され、核酸配列と、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終結部位、ならびに他のシグナル配列などのヌクレオチド制御配列との機能的関係を指し、２つ以上のＤＮＡ断片がそれらの意図した目的のために協力して機能するように結合することを意味する。例えば、典型的にはＤＮＡである核酸配列と、調節配列またはプロモーター領域との作動可能な連結は、ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、それを転写するＲＮＡポリメラーゼにより、そのようなＤＮＡの転写が調節配列またはプロモーターから開始されるような、ＤＮＡと調節配列またはプロモーターとの間の物理的かつ機能的な関係を指す。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、それが発現される細胞型における核酸またはＤＮＡの発現のための調節配列の改変が必要であり得る。そのような改変の望ましさまたは必要性は、経験的に判定され得る。
【００６０】
導入遺伝子の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターのいずれかの部分で制御される発現は、強力に発現される。本明細書中で使用される場合、「強力に発現される」または「強力な発現」は、例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、または発光もしくは蛍光を使用する他のアッセイなどの異なるタンパク質検出技術によって測定される、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターのいずれかの部分からの発現が、一方向ｈＣＭＶプロモーター（配列番号９を有する）の制御下で単一の導入遺伝子を発現する一価ベクターからの発現の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％であることを意味する。注目すべきことに、一方向性ｈＣＭＶプロモーターは、ＰＧＫ、ＵＢＩＣまたはＲＳＶ  ＬＴＲプロモーターなどの他の一般に使用される一方向性プロモーターと比較して、はるかに強力である（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｒｉｖｅｒａ−Ｓｏｔｏ，＆Ｇｒａｙ，２０１５）。したがって、ｈＣＭＶプロモーターより強くない双方向性プロモーター（例えば、そのような一方向性ｈＣＭＶプロモーターの少なくとも１０％の発現レベルをもたらす）は、依然として強力であると考えられ得る。ｈＣＭＶプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期（ｍＩＥ）領域に由来し、ワクチンおよび遺伝子治療ベクターにおける強力な一方向性遺伝子発現のために頻繁に使用される。例えば、ｈＣＭＶプロモーター配列は、ｈＣＭＶ  ＡＤ１６９株ｍＩＥ遺伝子座（Ｘ０３９２２）に由来し得、かつＮＦ１結合部位、エンハンサー領域、ＴＡＴＡボックスおよび第１のエキソンの一部を含み得る。より短い（例えば、エンハンサーおよびプロモーター領域のみを含み、ＮＦ１結合部位を欠く）またはより長い（例えば、追加の細胞因子結合部位および第１のイントロン配列を含む）他のｈＣＭＶプロモーター配列が知られている。長さが異なるこれらのｈＣＭＶプロモーターの全ては、強力な遍在的に活性なプロモーターであることがわかった。本明細書に記載の発現レベルの比較のために、ｈＣＭＶプロモーター配列は、配列番号９であった。例えば、ｒＡｄにおける本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターのいずれかの部分からの発現レベルは、好ましくは、導入遺伝子が配列番号９の一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下にあるｒＡｄからの発現レベルの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターのいずれかの部分からの発現レベルは、導入遺伝子が配列番号９の一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下にあるｒＡｄからの発現レベルの約１０〜６０％、例えば２０〜５０％、例えば約３０％である。さらに、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一の抗原を発現するｒＡｄから、発現が、有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせるのに十分であることは知られている。同様に、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターによって発現される２つの導入遺伝子の発現は、両方の導入遺伝子に対して有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせると予測される。例えば、２つの導入遺伝子が対象に投与された際に��疫応答を誘発する抗原をコードする場合、２つの導入遺伝子の強力な発現は、両方の抗原に対して測定可能な免疫応答を生じさせると予測される。
【００６１】
双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの両側からの発現はまた、非常にバランスがとれている。本明細書で使用される場合、「バランスのとれた発現」、「発現のバランス」、「発現バランス」、または発現に言及したときの「バランスのとれた」は、例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、または発光もしくは蛍光を使用する他のアッセイなどの異なるタンパク質発現検出手法による測定で、双方向性プロモーターの一方の側からの発現が双方向性プロモーターの他方の側からの発現と同等であることを意味する。例えば、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの一方の側からの発現レベルは、この双方向性プロモーターの他方の側からの発現レベルの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％であることが好ましい。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの一方の側からの発現レベルは、この双方向性プロモーターの他方の側からの発現レベルの約７０〜１３０％、例えば８０〜１２０％、例えば９０〜１１０％、例えば約１００％である。別の例では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの２つの側からの発現の比は、１／１、１．１／１、１．２／１、１．３／１、１．４／１、１．５／１、１．６／１、１．７／１、１．８／１、１．９／１、および２／１の範囲である。さらに、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で単一の抗原を発現するｒＡｄから、発現が、有意なＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生じさせるのに十分であることは知られている。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターによって発現される２つの抗原のバランスのとれた発現は、経時的な抗原の発現、および特定の型の免疫応答を生成する抗原自体の固有の能力にもよるが、両方の抗原に対して同等のＴ細胞およびＢ細胞免疫応答を生成し得るであろう。このように、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターと比較して発現のバランスが改善されている。比較すると、双方向性ｍＣＭＶプロモーターの右側（３’末端）に位置する抗原の発現は、双方向性ｍＣＭＶプロモーターの左側（５’末端）に位置する抗原と比較して約１０倍高く（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレットに記載されている）、これは、既に比較的バランスがとれていると考えられているが、本発明の双方向性プロモーターよりもはるかにバランスがとれていないことが明らかである。
【００６２】
ベクターの重要な側面は、プラスミドベクターなどのＤＮＡベクターであれ、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであれ、所望の導入遺伝子配列を収容するこれらのベクターの能力である。このような能力は、ベクターのサイズ制約によって制限されることがあり、例えば、あるサイズ限界を超えた場合、不安定になるかまたは生成が不可能になることさえあり得る。したがって、プロモーター、特に２つ以上の導入遺伝子の発現を制御できる双方向性プロモーターが占める空間は、そのようなプロモーターが有するであろう機能的能力とは別に、新しいベクターを設計する際の重要な考慮事項である。本発明の双方向性プロモーターは、比較的短いという利点を有し、これは、ベクターの特定のサイズ限界において、導入遺伝子のためにより多くの空間が残ることを意味し、例えば導入遺伝子が免疫原である場合、より多くのエピトープが含まれることを可能にし、またはより大きいサイズの他の双方向性プロモーターと比較してより大きいタンパク質の発現を可能にする。
【００６３】
「コード配列」、「コードする配列」、または「コードする」という用語は、本明細書では同義的に使用され、適切な調節配列に作動可能に連結されると、インビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡ）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡ）、核酸配列を指す。
【００６４】
例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）などのポリアデニル化シグナルが導入遺伝子の後方に存在し得る。各導入遺伝子は、ポリＡシグナルを有することが好ましく、また第１の導入遺伝子のポリＡシグナルは、第２の導入遺伝子のポリＡシグナルと異なることが好ましい。一実施形態では、第１のポリＡシグナルは、ＳＶ４０ポリＡシグナルであり、第２のポリＡシグナルは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである。
【００６５】
イントロンを含む配列も本発明の双方向性プロモーターの一方または両方の末端に配置し得る。例えば、イントロンは、特にインビボでタンパク質の発現を増大させ得ることが知られている。本明細書で使用されるイントロンは、当該技術分野で知られている正常な機能と構造を有し、タンパク質合成の情報をコードせず、スプライシングとして知られているプロセスにより、メッセンジャーＲＮＡの翻訳前に除去される核酸中のポリヌクレオチド配列である。イントロンは、スプライス供与部位（イントロンの５’末端、通常、ＧＵ配列）およびスプライス受容部位（イントロンの３’末端、通常、ＧＡ配列）を含む。組換えアデノウイルス中に導入遺伝子のための空間がより多く残るよう、ウイルスベクターにおいてあまり多くの空間を占めないようにするために、比較的短いイントロンおよびより短いイントロンに改変されたイントロンを使用することが好ましいものの、本発明では、種々の異なるイントロンを潜在的に使用することができる。双方向性プロモーターの一方の側で第１のイントロンを、双方向性プロモーターの他方の側で第２の異なるイントロンを使用する、すなわち各導入遺伝子の前に異なるイントロン配列が置かれることが好ましい。特定の実施形態では、イントロンは、キメライントロンであり得る。当業者は、多くの異なるイントロンが入手可能であり、使用され得ることを認識している。しかし、本発明のプロモーターの利点は、適切な発現のためにそのようなイントロンを必要としないことであり、したがって、好ましい実施形態では、双方向性プロモーターのプロモーター構築ブロックと、両側のそれぞれの導入遺伝子との間にイントロンが存在しない。
【００６６】
本発明の双方向性プロモーターは、特定の実施形態では、例えば、ワクチンの適用においてこれらの抗原に対する免疫応答を生成する目的で、２つの抗原の発現を駆動するために使用することができる。しかし、バランスのとれた導入遺伝子発現レベルがまた、免疫応答が主要な目的ではない導入遺伝子、例えば遺伝子治療目的、異種タンパク質複合体の発現、または２つの抗体鎖の比例発現に使用される２つの異なる導入遺伝子にも関連し得ることは当業者に直ちに明らかであろう。したがって、本発明は、単一組換えベクター、例えばアデノウイルスベクターからの発現が所望される、任意の組み合わせの導入遺伝子を用いて実施され得る。そのため、導入遺伝子の同一性は、本発明では重要でなく、それは、例えば、任意の導入遺伝子を含むベクターまたはアデノウイルスに適している。好適な導入遺伝子は、当業者によく知られており、例えば、遺伝子治療目的などで治療効果を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、またはワクチン接種目的でｒＡｄベクターが使用される場合に免疫応答が所望されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームなどの導入遺伝子オープンリーディングフレームを含み得る。特に好ましい異種核酸は、免疫応答を生じさせる必要がある抗原決定基をコードする目的遺伝子である。このような抗原決定基も、通常、抗原と称される。組換えアデノウイルスが対象に投与されると、抗原に対する免疫応答が生じる。任意の所望の抗原がアデノウイルスベクターによってコードされ得る。本発明による典型的な実施形態では、抗原は、疾患または病態を引き起こし得る生物に由来するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。したがって、好ましいさらなる実施形態では、前記目的異種核酸は、免疫原性（または抗原性）決定因子をコードする。より好ましくは、前記免疫原性決定因子は、細菌、ウイルス、酵母または寄生生物に由来する抗原である。このような生物によって引き起こされる疾患は、一般に「感染症」と称される（したがって、疾患は、「感染する」生物に限定されず、宿主に侵入して疾患を引き起こすものも含む）。例えば、腫瘍抗原などのいわゆる「自己抗原」も最新技術の一部を形成し、本発明による組換えアデノウイルス中の異種核酸によってコードされ得る。抗原決定基（または抗原）を取得する非限定的な例は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）などのマラリアを引き起こす生物、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などの結核を引き起こす生物、酵母、またはウイルスである。他の好ましい実施形態では、フラビウイルス（例えば、西ナイルウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、エボラウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびマールブルグウイルスなどのウイルスに由来する抗原が本発明による組成物で使用され得る。一実施形態では、前記抗原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に由来するＣＳタンパク質またはその免疫原性部である（ＣＳをコードするアデノウイルスベクターの例については、例えば、（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２���０６；Ｏｐｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；国際公開第２００４／０５５１８７号パンフレットを参照されたい。これらは、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、抗原決定基は、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂおよび／もしくはＴＢ１０．４タンパク質またはそれらの免疫原性部分などのＭ・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する１つの抗原のタンパク質またはいくつかの抗原の融合タンパク質である（このようなＴＢワクチンウイルスの構築および製造については、例えば、国際公開第２００６／０５３８７１号パンフレットを参照されたい。これは、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに別の実施形態では、前記抗原決定基は、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスなどのフィロウイルス由来のＧＰなどのウイルス糖タンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。またさらなる実施形態では、前記免疫原性決定因子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、またはそれらの変異体などのＨＩＶタンパク質に由来する（アデノウイルスベースのＨＩＶワクチンの例については、例えば、国際公開第２００９／０２６１８３号パンフレット、国際公開第２０１０／０９６５６１号パンフレット、国際公開第２００６／１２００３４号パンフレット、国際公開第０２／２２０８０号パンフレット、国際公開第０１／０２６０７号パンフレットを参照されたい）。他の実施形態では、前記抗原決定基は、インフルエンザウイルスに由来するＨＡ、ＮＡ、ＭもしくはＮＰタンパク質またはこれらのいずれかの免疫原性部分である（例えば、（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）；（Ｖｅｍｕｌａ＆Ｍｉｔｔａｌ，２０１０）による総説）。他の実施形態では、抗原決定基は、麻疹ウイルスに由来するＨＡタンパク質またはその免疫原性部分である（例えば、国際公開第２００４／０３７２９４号パンフレット）。他の実施形態では、抗原決定基は、狂犬病ウイルス糖タンパク質である（例えば、（Ｚｈｏｕ，Ｃｕｎ，Ｌｉ，Ｘｉａｎｇ，＆Ｅｒｔｌ，２００６））。さらなる実施形態では、抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する、例えばＲＳＶ  Ｆタンパク質（例えば、国際公開第２０１３／１３９９１１号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１３９９１６号パンフレットを参照されたい）もしくはＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその両方、あるいは他のＲＳＶタンパク質である。他の実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルスまたは他のウイルスなどの別のウイルス由来である。組換えアデノウイルスは、同じ生物由来の２つの異なる抗原をコードし得る。組換えアデノウイルスはまた、異なる生物に由来する抗原の組み合わせ、例えば第１の生物に由来する第１の抗原と第２の生物に由来する第２の抗原とをコードし得る。例えば、抗原およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、例えばｄｓＲＮＡまたはその模倣剤などのＴＬＲ３アゴニストなど、抗原および例えばアジュバントを同じアデノウイルス中にコードすることも可能である（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレット）。特定の実施形態では、組換えベクター、例えば組換えアデノウイルスは、それぞれ双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの制御下にある２つの異なる抗原をコードする。他の実施形態では、ベクターまたは組換え（アデノ）ウイルスは、それぞれ双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの制御下にある抗原と免疫モジュレーターとをコードする。特定の実施形態では、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの制御下にある第１および第２の導入遺伝子以外に、さらなる異種配列または導入遺伝子がベクターまたは組換え（アデノ）ウイルス中に存在し得る。
【００６７】
本発明は、遺伝的に安定な組換えアデノウイルスであって、アデノウイルスが標的細胞に感染すると、それぞれが強力に発現される第１および第２の導入遺伝子を含む遺伝的に安定な組換えアデノウイルスを製造する方法であって、１つの方向において第１の導入遺伝子に、かつ逆方向において第２の導入遺伝子に作動可能に連結された双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを含むコンストラクトを調製する工程と、前記コンストラクトを組換えアデノウイルスのゲノムに組み込む工程とを含む方法も提供する。コンストラクト自体の調製は、当業者に知られ、組換えアデノウイルス技術の分野において日常的に行われており、本明細書中に例示されている、よく知られた標準的な分子クローニング方法の使用を包含する（例えば、（Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｅｍｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５を参照されたい）。双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、上記のような特徴を有し、日常的な方法によって得ることができる。便宜のため、当業者は、例えば、プラスミド形態の導入遺伝子の容易な操作と導入のために、Ｅ１領域までのゲノムの左部分のための第１の部分、および第１の部分との再結合時に完全なアデノウイルスゲノムをもたらすゲノムの残部のためのより大きい第２の部分など、より小型の断片にクローニングすることでアデノウイルスゲノムを操作し得る（例えば、国際公開第９９／５５１３２号パンフレットを参照されたい）。
【００６８】
本発明のｒＡｄは、先行技術で示された２つの導入遺伝子を発現するための種々の代替方法によって調製されるアデノウイルスと異なり、２つの導入遺伝子を発現することができ、かつ遺伝的に安定であり、さらに双方向性プロモーターによって駆動される２つの導入遺伝子のバランスのとれた発現も提供するという利点を有する。したがって、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、２つの導入遺伝子を発現するアデノウイルスの遺伝的不安定性および２つの導入遺伝子の不均衡な発現の問題を解決し、また、その比較的小さいサイズのために、より大きいサイズを有する特定の他の双方向性プロモーターよりも有意に多くの導入遺伝子配列のための空間を可能にする（例えば、それは、ｍＣＭＶ双方向性プロモーターよりも約１ｋｂ短く、したがって、理論的にはサイズ容量の制約を有する所与のベクターは、導入遺伝子がｍＣＭＶプロモーターによって駆動される同じベクターよりも全体で約１ｋｂ長い導入遺伝子を収容し得る）。
【００６９】
遺伝的安定性を試験するために、適切な細胞株、例えばヘルパー細胞株ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）においてｒＡｄをレスキューし、継代する。ウイルスＤＮＡを特定の継代数で単離し、ｒＡｄゲノムの完全性を以下の１つ以上によって分析し得る：導入遺伝子領域の存在、または欠失バンドが存在しないことに関するＰＣＲ分析、制限断片における差異の有無に関するｒＡｄゲノムの制限消化、および／またはｒＡｄ配列における変異の有無に関するｒＡｄゲノムまたはｒＡｄゲノムのＰＣＲ産物の配列決定。本発明のｒＡｄに関して、「遺伝的に安定な」とは、ヌクレオチド配列が、ｒＡｄの作製のために使用されたプラスミドからその後のｒＡｄ生産段階まで変化せず、その結果、２つの導入遺伝子を発現するｒＡｄが、大規模バッチ生産に適するように、（例えば、ｈＣＭＶプロモーター後方に）単一導入遺伝子を有する同等のｒＡｄと同じ遺伝的安定性を有することを意味する。例えば、発現カセット側方のプライマーを使用したＰＣＲ分析が、ｒＡｄまたは出発原料のより初期の継代数と比較して欠失断片（バンド）を示さず、かつ／またはＥ１、Ｅ３、およびＥ４領域のＰＣＲ産物の配列決定が、ヌクレオチド配列に変化がないことを裏付ける。双方向性プロモーターを有する発現カセットを含む領域の配列を決定することにより、発現カセットを含む領域においてヌクレオチド配列に変化がないことを確認することが好ましい。
【００７０】
単一製造ウイルスバッチの試験消化などの他の試験法と比較して、この試験では遺伝的安定性が完全に評価される。アッセイ感度は、以下の手段、すなわちいくつかのウイルス集団（プラーク）を単離し、拡張継代に供することによって増大する。拡張継代を、発現カセット側方のプライマーを用いたＰＣＲ分析と組み合わせることにより、他の方法では見過ごされるおそれのあるｒＡｄ集団中の少ない割合の欠失変異体の検出が可能になる。さらに、配列解析の実施により、導入遺伝子のオープンリーディングフレーム中の停止コドンの導入などの点変異の発生が排除される。より具体的には、ウイルス変異は、常に偶発事象を呈するため、１つのプラークが安定であっても、別のものは欠失バンドを提示することがある。したがって、遺伝的安定性を正しく評価するために、いくつかのウイルス集団（プラーク）を試験する必要がある。ベクターが親ベクターよりも効率的に複製できる変異が生じた場合、これは、変異体バージョンの増生をもたらし得るが、これは、本研究で説明されているように拡張継代後にのみ観察されることが多い。本発明のｒＡｄは、ウイルスが大規模生産活動中に十分に安定しているように、用いられる試験系において少なくとも１０継代まで遺伝的に安定していることが好ましく、少なくとも１３継代まで遺伝的に安定していることがより一層好ましい。最近、双方向性ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある２つの導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスが遺伝的に安定であることが見出された。例えば、国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレットを参照されたい（これにはまた、１つのベクターからの２つの抗原の発現について当該技術分野で記載されてきた種々の他の解決策が、安定なｒＡｄまたは強力な発現をもたらさなかったと記載されており、したがって、ｍＣＭＶプロモーターがこの問題の最も好ましい解決策であるとその中に記載されていた）。本願は、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの制御下にある２つの導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスも遺伝的に安定であり、さらに、２つの導入遺伝子が双方向ｍＣＭＶプロモーターの制御下にある状況と比較して、２つの導入遺伝子のよりバランスのとれた発現を有することを示す。
【００７１】
本発明の方法により作製される組換えアデノウイルスは、組換えアデノウイルスについて上で記載した実施形態に従って調製することができる。
【００７２】
本発明は、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現させる方法であって、本発明によるベクターまたは組換えウイルス、例えば組換えアデノウイルスを細胞に提供する工程を含む方法も提供する。組換えアデノウイルスを細胞に提供する工程は、アデノウイルスを対象へ投与することにより、またはインビトロもしくはエクスビボでアデノウイルスを細胞へ導入（例えば、感染）することにより行われ得る。特定の実施形態では、本発明は、例えば、組換えアデノウイルスを対象に投与することにより、細胞内で少なくとも２つの導入遺伝子を発現するために使用する組換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００７３】
本発明は、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明によるベクター、例えば組換え（アデノ）ウイルスを対象に投与する工程を含む方法も提供する。本発明は、少なくとも２つの抗原に対する免疫応答を誘導するために使用する、本発明によるベクターまたは組換え（アデノ）ウイルスも提供する。
【００７４】
本発明は、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターまたは本発明の組換えアデノウイルスのゲノムを含む組換えＤＮＡ分子も提供する。当業者は、これが、一緒になって本発明の単一組換えＤＮＡ分子を形成し得る、少なくとも２つの異なる組換えＤＮＡ分子の組み合わせであり得ることを認識するであろう。そのような分子は、ゲノムを操作し、新規の組換えアデノウイルスを作製する上で有用である。ゲノムは、許容細胞におけるアデノウイルスの複製およびパッケージングに必要なタンパク質をコードする。
【００７５】
本開示で使用される数値に関する「約」という用語は、値±１０％を意味する。
【００７６】
プロデューサー細胞は、細胞およびウイルスの数、ならびに／またはウイルス力価を増大させるために培養される。細胞の培養は、本発明による目的ウイルスの代謝、および／または成長、および／または分裂、および／または生成を可能にするために行われる。これは、当業者によく知られた方法によって行うことができ、例えば、限定はされないが、適切な培地中で細胞に栄養素を提供することが挙げられる。好適な培地は、当業者によく知られており、一般に、商業的供給源から大量に得られ、または標準的なプロトコルに従ってカスタムメイドすることができる。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養するための好適な条件が知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９を参照されたい）。
【００７７】
通常、アデノウイルスは、培養物中の適切なプロデューサー細胞に暴露され、ウイルスが取り込まれる。通常、最適な撹拌は、約５０〜３００ｒｐｍ、典型的には約１００〜２００、例えば約１５０であり、ＤＯは、典型的には、２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは、６．７〜７．７であり、最適温度は、３０〜３９℃、例えば３４〜３７℃であり、最適ＭＯＩは、５〜１０００、例えば約５０〜３００である。通常、アデノウイルスは、プロデューサー細胞に自然に感染し、細胞を感染させるにはプロデューサー細胞をｒＡｄ粒子と接触させれば十分である。一般に、アデノウイルスのシードストックを培養液に加えて感染を開始させ、その後、アデノウイルスは、プロデューサー細胞内で増殖する。これは、全て当業者にとって日常的である。
【００７８】
アデノウイルスの感染後、ウイルスは、細胞内で複製し、それにより増幅される。このプロセスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称する。アデノウイルス感染は、最終的に、感染した細胞の溶解をもたらす。したがって、アデノウイルスの溶解特性は、ウイルス産生の２つの異なるモードを可能にする。第１のモードは、細胞溶解前にウイルスを回収し、外部因子を使用して細胞を溶解するものである。第２のモードは、生成されたウイルスによって（殆ど）完全に細胞が溶解した後、ウイルス上清を回収するものである（例えば、米国特許第６，４８５，９５８号明細書を参照されたい。これには、宿主細胞を溶解せず、外部因子によってアデノウイルスを回収することが記載されている）。外部因子を使用して細胞を能動的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
【００７９】
能動的な細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に知られており、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８−３５で論じられている。これに関する有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張および／または低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせなどである。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１種の洗浄剤を使用して溶解する。洗浄剤の使用による溶解は、方法が容易であり、かつ容易に拡大可能であるという利点を有する。
【００８０】
使用できる洗浄剤およびその使用方法は、当業者に一般に知られている。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ２９−３３で論じられている。洗浄剤としては、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性および非イオン性洗浄剤を挙げることができる。洗浄剤の濃度は、例えば、約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変えることができる。一実施形態では、使用する洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００８１】
ヌクレアーゼを使用して、汚染核酸、すなわち殆どがプロデューサー細胞由来の核酸を除去することができる。本発明での使用に好適なヌクレアーゼの例としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、または当該技術分野で一般に使用されている任意の他のＤＮａｓｅおよび／もしくはＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、これは、特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することによって核酸を迅速に加水分解し、それにより細胞溶解産物の粘度を低下させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから商業的に入手し得る（コードＷ２１４９５０）。ヌクレアーゼの使用濃度は、好ましくは、１〜１００単位／ｍｌの範囲である。ヌクレアーゼ処理に代えてまたはヌクレアーゼ処理に加えて、臭化ドミフェンなどの選択的沈殿剤を使用して、アデノウイルス精製中、アデノウイルス調製物から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿除去することも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；（Ｇｏｅｒｋｅ，Ｔｏ，Ｌｅｅ，Ｓａｇａｒ，＆Ｋｏｎｚ，２００５）；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照されたい）。
【００８２】
プロデューサー細胞の培養物からアデノウイルスを回収する方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範に記載されている。
【００８３】
特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスは、さらに精製される。アデノウイルスの精製は、例えば、国際公開第０５／０８０５５６号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーションまたはクロマトグラフィを用いた分離を含む数工程で行うことができる。清澄化は、ろ過工程により行うことができ、細胞溶解物から細胞残屑および他の不純物を除去する。限外ろ過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用するダイアフィルトレーションまたは緩衝液交換は、塩、糖などの除去および交換のための一方法である。当業者は、各精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。また、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）にもアデノウイルスベクターの生成および精製方法が記載されている。これらの方法は、宿主細胞を増殖させ、この宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、この宿主細胞を回収および溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、この溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフィを用いてウイルスをさらに精製することを含む。
【００８４】
好ましくは、精製には、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１−７０に論じられているように少なくとも１つのクロマトグラフィ工程が使用される。アデノウイルスのさらなる精製に関して、クロマトグラフィ工程を含む多数のプロセスが記載されている。当業者は、これらのプロセスを知っており、プロセスを最適化するためにクロマトグラフィ工程の厳密な使用法を変更することができる。例えば、アニオン交換クロマトグラフィ工程によってアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットを参照されたい。多くの他のアデノウイルス精製方法が記載されており、これらは、当業者の実現可能な範囲内にある。アデノウイルスを生成し精製するさらなる方法は、例えば、国際公開第００／３２７５４号パンフレット、国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット、国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレット、ならびに米国特許第５，８３７，５２０号明細書および同第６，２６１，８２３号明細書に開示されており、これらは、全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
ヒトに投与するために、本発明は、ベクターまたは組換えウイルス、例えばｒＡｄと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を用いることができる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する用量および濃度において、それらが投与される対象に望ましくないまたは有害な影響を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照されたい）。精製されたｒＡｄは、好ましくは、滅菌溶液として処方されて投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は、凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ｒＡｄは、通常、好適な緩衝液を含む溶液中にあり、ｒＡｄの溶液は、塩も含有し得る。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれ得る。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ｒＡｄは、注射用製剤に製剤化され得る。これらの製剤は、有効量のｒＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液または凍結乾燥バージョンであり、任意選択により安定剤または賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエアロゾル化され得る（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照されたい）。
【００８６】
例えば、アデノウイルスは、アデノウイルス世界標準にも使用されている緩衝液（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）：２０ｍＭトリスｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール中に保存することができる。ヒトへの投与に好適な他の有用な調合緩衝液は、２０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖスクロース、０．０２％ｗ／ｖポリソルベート８０である。組換えアデノウイルスに好適な別の調合緩衝液は、１０〜２５ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ５．９〜６．２、４〜６％（ｗ／ｗ）ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）ポリソルベート−８０、および任意選択的に０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）エタノールを含む。明らかに、他の多くの緩衝液を使用することができ、例えば欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、および国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見出され得るものをはじめとする、精製（アデノ）ウイルス製剤の保存および医薬品投与に好適ないくつかの配合例が知られている。
【００８７】
特定の実施形態では、アデノウイルスを含む組成物は、１種以上のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増大させるアジュバントは、当該技術分野で知られており、アデノウイルスおよび好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば、国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質と定義される。この場合、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターの免疫応答を増強させるために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルションをはじめとする油エマルション組成物（または水中油型組成物）（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照されたい）；例えば、ＱＳ２１および免疫賦活性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；および国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照されたい）；細菌または微生物の派生物（その例として、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボース化細菌毒素またはそれらの変異体（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなど）がある）が挙げられる。例えば、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの目的抗原への融合物をコードする異種核酸（Ｏｇｕｎ，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｈｏｌｄｅｒ，＆Ｈｉｌｌ，２００８）、またはｄｓＲＮＡなどのＴＬＲ３アゴニストなどのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストをコードする異種核酸（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照されたい）などを使用して、ベクターでコードされたアジュバントを使用することも可能である。本発明によるこのようなｒＡｄは、例えば、双方向性プロモーターの一方の側の目的抗原と、双方向性プロモーターの他方の側のＴＬＲ３アゴニストとをコードし得る。このようなｒＡｄは、特に、例えば経口投与などの粘膜経路を介した投与に適している（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号パンフレットを参照されたい）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムをアジュバントとして１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量の濃度で含む。
【００８８】
他の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。
【００８９】
本発明による医薬組成物は、特定の実施形態では、ワクチンであり得る。
【００９０】
アデノウイルス組成物は、対象、例えばヒト対象に投与され得る。１回の投与で対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、当業者に知られているように様々であり得、一般に１×１０７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐ、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐ、例えば３×１０８〜５×１０１０ｖｐ、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐである。
【００９１】
アデノウイルス組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて行うことができる。非限定的実施形態としては、例えば、皮内、筋肉内などの注射、または皮下もしくは経皮、または例えば鼻腔内、口腔などの粘膜投与などによる非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は、例えば、腕の三角筋または大腿の外側広筋への筋肉内注射によって投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与する様々な可能性を認識している。
【００９２】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは、哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００９３】
１つ以上のアデノウイルスワクチンの１回以上の追加免疫投与を提供することも可能である。追加ワクチン接種を行う場合、一般に、そのような追加ワクチン接種は、組成物を対象に最初に投与（これは、こうした場合、「初回ワクチン接種」と称される）した後、１週間〜１年、好ましくは２週間〜４カ月の時点で同じ対象に投与されるであろう。代替の追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質を初回ワクチン接種または追加免疫ワクチン接種として対象に投与することも可能である。
【００９４】
本明細書全体にわたり、特許、公開公報、技術論文および学術論文などの各種刊行物が括弧に入れて引用されており、それぞれの完全引用は、本明細書の最後に見出し得る。これらの引用刊行物のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９５】
さらなる説明なしに、当業者であれば、ここまでの説明ならびに次の具体的な方法および実施例により、本発明を作成して使用し、かつ請求項に記載された方法を実施することができるであろう。したがって、次の実施例は、本発明のいくつかの実施形態、特徴および利点を具体的に示すが、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈されるべきではない。実施例は、単に本発明を明確にするに過ぎない。
【００９６】
方法
細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００９７】
ｐＡｄＡｐｔ３５プラスミドおよびｐｓｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドにおけるアデノウイルスベクターの構築
異なる双方向性プロモーター構築物をｐＡｄＡｐｔ３５プラスミド（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７）またはｐｓｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドにクローニングした。Ｐｓｈｕｔｔｌｅ２６は、以前に記載されたｐＡｄａｐｔ２６プラスミド（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に基づいて構築した。Ａｄ２６ベクターゲノムの右側部分を含む２−Ｋｂ断片を合成し、ＣＭＶプロモーターのＳｐｅＩ部位が最初に単一ｂｐ置換の導入によって破壊されたｐＡｄＡｐｔ２６．Ｌｕｃにサブクローニングした。結果として、ｐｓｈｕｔｔｌｅ２６は、Ａｄ２６コスミドとの相同組換えにより、またはＡｄ２６完全長ゲノムプラスミドとの相同組換えにより、アデノウイルスベクターを構築するために使用され得る。
【００９８】
ｐＡｄａｐｔ３５プラスミドおよびｐｓｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドは、１つのプロモーターおよび１つのＳＶ４０由来ポリＡシグナルを有する標準的な一方向性発現カセットのみを有するため、別の導入遺伝子とＢＧＨポリＡシグナルを配置するための制限部位を融合ＰＣＲによって付加した。ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ−ＢＧＨポリＡ−ＥｃｏＲＩ−ルシフェラーゼ−ＫｐｎＩ、ＳａｌＩ、ＡｖｒＩＩを含む融合ＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位を介した分子クローニングによって正しい配向でプラスミドに挿入した。結果として、一方向性ｈＣＭＶプロモーターは、隣接制限部位ＡｖｒＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて双方向性プロモーター配列によって置換され得る。導入遺伝子を双方向性プロモーターの両側に、一方の側はＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を使用して、他方の側はＡｖｒＩＩ、ＳａｌＩまたはＫｐｎＩを使用して配置した（図３Ａ）。ＡｖｒＩＩ、ＳａｌＩまたはＫｐｎＩの選択は、プラスミド配列における制限部位の独自性に依存した。異なる双方向性プロモーターコンストラクトを有する完全な双方向性発現カセットをｐＳｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドにクローニングし、ＳｐｅＩまたはＮｏｔＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いてｐＡｄａｐｔ３５プラスミドに移した。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）が各ＡＴＧ開始コドンの直前に含まれ、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）が各コード配列末端に付加された。本明細書に記載のように、組換えアデノウイルスおよびベクターは、一般に、ｒＡｄまたはｒＡｄベクターと称され、より具体的にはｒＡｄ３５またはｒＡｄ２６および関連ベクターと称される。
【００９９】
アデノウイルスの生成、感染および増殖
全てのアデノウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞中で相同組換えにより生成し、以前に記載されているようにして生成した（ｒＡｄ３５では（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）；ｒＡｄ２６では（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。簡単に記載すると、ＰＥＲ．Ｃ６細胞を、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって提供された使用説明書に従ってリポフェクタミンを使用して、プラスミドをコードするｒＡｄベクターでトランスフェクトした。ｒＡｄ３５ベクターをレスキューするために、ｐＡｄＡｐｔ３５プラスミドおよびｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用し、一方、ｒＡｄ２６ベクターのためにｐＳｈｕｔｔｌｅ２６プラスミドおよびｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用した。十分な細胞変性効果（ＣＰＥ）に達した１日後に細胞を収集し、凍結解凍させ、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。次いで、ウイルスを、マルチウェル２４組織培養プレートの単一ウェルで培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でプラーク精製し、増幅させた。Ｔ２５組織培養フラスコを使用して培養されたＰＥＲ．Ｃ６細胞において、さらに増幅させた。
【０１００】
発現の分析
発現の強度および発現バランスを評価するために、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰタンパク質アクセッション番号ＡＡＢ０２５７２．１）およびホタルルシフェラーゼ（ルシフェラーゼタンパク質アクセッション番号ＡＣＨ５３１６６）をコードするレポーター遺伝子を用いてウイルスベクターを作製した。相対ｅＧＦＰ平均蛍光強度（ＭＦＩ）およびルシフェラーゼ相対発光量（ＲＬＵ）を、ＨＥＫ２９３細胞（ｐＡｄＡｐｔベクターまたはｐｓｈｕｔｔｌｅベクターによる一過性トランスフェクション）またはＡ５４９細胞（ウイルス感染）との各プロモーターおよびレポーター遺伝子の組み合わせについて記録した。ルシフェラーゼ活性は、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計において、０．１％ＤＴＴ（１Ｍ）の存在下、細胞溶解物中で測定した。ｅＧＦＰ蛍光は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）において、トリプシン処理、遠心分離、およびＰＢＳ／１％ＦＢＳ（非ウイルス物質）またはＣｅｌｌＦｉｘ（ウイルス物質）における細胞ペレットの再懸濁により測定した。
【０１０１】
ＰＥＲ．Ｃ６細胞内のアデノウイルスベクターの遺伝的安定性試験
ＰＥＲ．Ｃ６細胞内にいくつかの継代を含む生産工程における遺伝的安定性を確実にするために、ワクチンベクターの遺伝的安定性試験を実施した。組換えワクチンベクターの作製、プラーク精製、およびＴ２５形態への増殖を上述のように行った。簡単に記載すると、組換えウイルスをＥ１相補細胞株ＰＥＲ．Ｃ６においてプラスミドトランスフェクションによって作製し、プラーク精製した。マルチウェル２４（ＭＷ２４）からＴ２５フラスコへの規模拡大のために５つのプラークを選択した。続いて、新しいＰＥＲ．Ｃ６細胞をウイルス継代数１３までＴ２５形態で感染させた。感染の２日後に完全細胞変性効果を与える所定の感染性容積（ｒＡｄ３５では５０、ｒＡｄ２６では９００のウイルス粒子／細胞比の範囲内にあることが遡及的に判定された）を使用してウイルスを増殖させた。ウイルスＤＮＡをｐ１３材料から単離し、ＰＣＲ分析により、完全導入遺伝子発現カセットの存在を試験した。ワクチンベクターをＰＥＲ．Ｃ６細胞内で継代数１３まで増殖させた。感染の２日後に完全なＣＰＥを与える方法で増殖を行った。ｒＡｄ３５ウイルスは、完全ＣＰＥの２日後に回収し、一方、ｒＡｄ２６ウイルスは、完全ＣＰＥの１日後に回収した。ウイルスＤＮＡを継代２、継代５、継代１０、および継代１３で単離し、導入遺伝子発現カセットの両側に位置するプライマーを使用したＰＣＲ分析により、欠失が存在しないことを試験した。欠失変異体の欠如は、以下のパラメータによって定義した：ＰＣＲ産物のバンドサイズは、陽性対照（ウイルスレスキューのために使用されたプラスミドのＰＣＲ産物）に一致し、予測されたＰＣＲ産物を下回るバンドはなく（追加的なバンドが非特異的なＰＣＲ産物であることが示されない限り、それらは、陽性対照にも存在するため）、承認されたアッセイ：ＰＣＲ  Ｈ２Ｏ対照においてバンドがない。遺伝的安定性をさらに確認するために、発現カセットおよびいくつかのプラーク隣接領域のＰＣＲ産物の配列を決定した。
【０１０２】
実施例１：双方向性プロモーターコンストラクトの設計
強力な双方向マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーターを、以前の研究（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレット）の、アデノウイルスベクターのＥ１領域における双方向性発現カセットからの２つの抗原の発現に有用なプロモーターとして同定した。ｍＣＭＶ双方向性プロモーターを有するベクターは、抗原を発現し、遺伝的に安定であり、コードされた抗原の両方に対する免疫応答を誘導したが、抗原発現および誘導された免疫応答は、以下に説明するようにバランスがとれていなかった。双方向性プロモーターの右側に置かれた抗原の発現は、双方向性プロモーターの左側に置かれた抗原よりも高く、双方向性プロモーターの右側に置かれた抗原に対してより高い免疫応答を生じた。ｍＣＭＶの発現レベルの双方向の差は、約１０倍であった。しかし、１つの抗原のみを発現する２つのベクターの混合物を置換するために、特定の用途では、両方の抗原の同等レベルの抗原発現を誘導するバランスのとれた双方向性プロモーターが望ましい。さらに、双方向性プロモーターのサイズが比較的小さい場合に有益であろう。
【０１０３】
強力でよりバランスのとれた双方向性プロモーターを特定するために、新しい双方向性プロモーターのパネルを設計した。アデノウイルスベクターの全体的なサイズ制限のため、抗原のための十分な空間を保持するために最大サイズ２ｋＢを有する小さいサイズの双方向性プロモーターの設計が好ましかった。さらに、アデノウイルスベクターにおける相同組換えによる欠失を防ぐために、配列同一性の広範なストレッチのない（＜１５ヌクレオチド）構築ブロックが好ましかった。本発明の双方向性プロモーターは、双方向性プロモーター配列の両側に配置された遺伝子の発現を制御する双方向様式で遺伝子を発現させる。これらの双方向性プロモーターは、プロモーターエレメントの他にエンハンサーエレメントおよびイントロンエレメントを含み、本明細書中に記載される構築ブロックによって定義される連続遺伝子調節配列である。合成双方向性プロモーターの設計に使用される構築ブロックは、既知の強力な一方向性プロモーター、エンハンサーおよびイントロン配列に由来する。プロモーターは、プロモーター配列の下流に配置された１つの遺伝子の発現を駆動し、通常、ＴＡＴＡボックス配列および転写開始部位（ＴＳＳ）を含む。エンハンサー配列は、プロモーターからの遺伝子発現を増強することができる。イントロン配列は、インビトロ、および特にインビボでの遺伝子発現を増加させると記載されている。
【０１０４】
双方向性プロモーターコンストラクトの以下のパネルを設計し、試験した。
１．ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  Ｉ（図１Ａ、配列番号１）
２．ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩ（図１Ｂ、配列番号２）
３．ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１（図１Ｃ、配列番号３）
４．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ（図１Ｄ、配列番号４）
５．ｒＣＭＶ−ＣＡＧ（図１Ｅ、配列番号５）
６．ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２（図１Ｆ、配列番号６）
７．ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １（図１Ｇ、配列番号１０）
８．ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  ２（図１Ｈ、配列番号８）
９．ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １．１（図１Ｉ、配列番号７）
１０．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４（図１Ｊ、配列番号１１）
【０１０５】
以前の特許出願（国際出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１６／０５７９８２号明細書）中の他の双方向性プロモーターコンストラクトも試験した。
１．ｍＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．
２．ｈＣＭＶ−ＣＡＧ
３．ｍＣＭＶ−ＣＡＧ
【０１０６】
双方向性プロモーター設計およびそれらの構築ブロックの概略図を図１に示し、以下により詳細に説明する。
【０１０７】
異なる設計で使用されるプロモーターおよびエンハンサー構築ブロックは、サイトメガロウイルス最初期（ＩＥ）領域（本明細書中では、通常、ｈＣＭＶプロモーターおよびｈＣＭＶエンハンサーと称され、ときにｈＣＭＶ  ＩＥとも称される）、ニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンプロモーター配列、およびヒト伸長因子１αプロモーター（ｈＥＦ１αプロモーター）配列に由来する。イントロンは、キメラニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビン配列、ｈＥＦ１α第１イントロンおよびヒトアポリポタンパク質Ａ−１イントロン（ｈＡｐｏＡ１イントロン）に由来する。
【０１０８】
ヒトサイトメガロウイルス主要最初期プロモーターは、種々の哺乳動物細胞株における強力なプロモーターとして知られている（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ｈＣＭＶおよび他のヘルペスウイルスは、３期、すなわち最初期（ＩＥ）、初期および後期において遺伝子を発現する。主要最初期プロモーターは、種々の哺乳動物細胞株において高レベルで異種遺伝子を活性化する。
【０１０９】
ヒトサイトメガロウイルスの主要最初期プロモーターおよびエンハンサーは、導入遺伝子発現カセットの設計において最も頻繁に使用される（Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｈｉｔｔ，Ｋｕｎｓｋｅｎ，＆Ｇｒａｈａｍ，１９９７；Ｃ．Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）が、マウス（ｍＣＭＶ）（Ａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｃ．Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ラット（ｒＣＭＶ）（Ｓａｎｄｆｏｒｄ＆Ｂｕｒｎｓ，１９９６；Ｖｏｉｇｔ，Ｓａｎｄｆｏｒｄ，Ｈａｙｗａｒｄ，＆Ｂｕｒｎｓ，２００５）およびアカゲザル（ｒｈＣＭＶ）（Ｂａｒｒｙ，Ａｌｃｅｎｄｏｒ，Ｐｏｗｅｒ，Ｋｅｒｒ，＆Ｌｕｃｉｗ，１９９６；Ｃｈａｎ，Ｃｈｉｏｕ，Ｈｕａｎｇ，＆Ｈａｙｗａｒｄ，１９９６；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｈａｎｓｅｎ，Ｓｔｒｅｌｏｗ，Ｆｒａｎｃｈｉ，Ａｎｄｅｒｓ，＆Ｗｏｎｇ，２００３）などの他の種に感染するサイトメガロウイルスの主要最初期プロモーターおよびエンハンサーも知られており、強力な発現カセットの設計に使用され得る。具体的には、アカゲザルＣＭＶ配列は、オナガザルヘルペスウイルス５型（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ５）の主要最初期領域に由来する。アカゲザルＣＭＶショートプロモーター部分をｈＣＭＶおよびチンパンジーＣＭＶショートプロモーターとのアラインメントによって同定した。ｈＥＦ１αプロモーターも哺乳動物細胞における異種遺伝子発現のための強力なプロモーター配列であると記載されている（Ｋｉｍ，Ｕｅｔｓｕｋｉ，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，＆Ｓｕｇａｎｏ，１９９０）。
【０１１０】
ｈＣＭＶエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター（Ａ）およびハイブリッドニワトリベータアクチン／ウサギベータグロビンイントロン（Ｇ）配列からなるキメラプロモーターＣＡＧは、異種遺伝子の発現のための強力なプロモーターであると記載され、短縮することができ、抗原の発現に利用することができる（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎらによる研究は、ハイブリッドイントロンが有意に短縮されたΔ８２９ＣＡＧプロモーターバージョンを生じるＣＡＧプロモーターの改変を記載している。このｈＣＭＶエンハンサーを含まないΔ８２９ＣＡＧプロモーターバージョン（Δ８２９ＡＧ）を双方向性プロモーターの設計のためのビルディングブロックとして使用した（図面ではＡＧ部分として示すが、双方向性プロモーターの名称ではＣＡＧと称し、本明細書全体を通してＣＡＧまたはＡＧと称する）。
【０１１１】
以下では、双方向性プロモーター配列を設計するための構築ブロックの配置を記載する。
【０１１２】
短縮されたＡＧプロモーターおよびｈＥＦ１αプロモーターは、記載された強力な調節配列の重要な部分としてイントロンを有する。ＡＧプロモーターまたはｈＥＦ１αプロモーターが双方向性プロモーター設計において使用された場合、本発明者らはまた、双方向性プロモーター設計の反対側に異種イントロン配列を配置した。ｒＣＭＶ最初期プロモーターの異なる潜在的な双方向性プロモーター設計をマウスＣＭＶプロモーターの天然の双方向性に基づいて作製した。
【０１１３】
ｈＥＦ１α由来のイントロンおよびｍＣＭＶプロモーター配列の合成組み合わせにより、強力な調節配列が得られることは以前から記載されている。したがって、ｈＥＦ１α配列をｒＣＭＶプロモーター（ｍＣＭＶのようなムロメガロウイルスに由来する別のプロモーター）およびエンハンサーのエレメントと組み合わせて、双方向性プロモーター配列ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１αＩおよびｒＣＭＶ−ｈＥＦ１αＩＩを設計した（例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照されたい）。ｈＥＦ１αイントロンは、発現レベルを増加させると記載されているが、非常に長い配列であるため、本発明者らの設計では、ＣＡＧプロモーターについての実験的方法（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によって記載されるように、ｈＥＦ１αイントロン配列を有意に短縮することを試みた。この目的のために、記載されたスプライスドナー、スプライスアクセプターおよび推定分岐点部位、さらに記載された細胞因子結合部位を保存しながら、イントロン配列の一部を除去した。プロモーター／イントロン組み合わせｈＥＦ１α  Ｉがプロモーター／イントロン組み合わせｈＥＦ１α  ＩＩよりも多くの部位を保存し、双方向性プロモーターｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩおよびｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩが得られる、２種の異なるバージョンの短縮イントロンを設計した。
【０１１４】
さらなる双方向性プロモーターの設計は、アカゲザルＣＭＶ（ｒｈＣＭＶ）、ラットＣＭＶ（ｒＣＭＶ）およびヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）を含む、異なる種に由来するサイトメガロウイルス主要最初期プロモーターのエンハンサーおよびプロモーター配列と組み合わせた、短縮されたＡＧプロモーターに基づく。これらの双方向性プロモーターは、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４およびｒＣＭＶ−ＣＡＧと呼ばれる。ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１とｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２との間の差異は、ｒｈＣＭＶエンハンサー配列の配向である。
【０１１５】
さらなる双方向性プロモーター設計は、ｈＣＭＶエンハンサー、ヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ）、およびアカゲザルＣＭＶプロモーター（ｒｈＣＭＶ）の組み合わせに基づいて行った。得られた双方向性プロモーターコンストラクトは、本文全体を通してｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶと呼ばれる。
【０１１６】
２つのプロモーターが隣接した１つのエンハンサーの配置が２つの目的遺伝子の協調発現をもたらすことが以前に記載されている（Ａｍｅｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）ため、強力なプロモーターおよびエンハンサー構築ブロックの使用は、理論的には同等の強度およびバランスの双方向性プロモーターをもたらす。
【０１１７】
合成双方向性プロモーター設計に加えて、ｒＣＭＶ  ｍＩＥ領域に由来する潜在的に天然の双方向性プロモーターを双方向性プロモーター配列ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １およびｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  ２およびｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ  １．１のベースとして使用した。３つの双方向性プロモーターの設計の全ては、ｒＣＭＶエンハンサー配列の両側に推定最小ｒＣＭＶプロモーターおよび推定最小ｒＣＭＶ  ｖＯＸ２プロモーターを有するが、設計は、エンハンサー断片の長さおよびエンハンサー断片の配向が異なる。ｖＯＸ２プロモーターは、ＭＩＥ領域の直接右側のラット細胞ＣＤ２００（ｖＯＸ２）遺伝子の転写を駆動している（Ｖｏｉｇｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０１１８】
実施例２：レポーター遺伝子の強力でバランスのとれた発現のための異なるプロモーターコンストラクトのスクリーニング
第１のスクリーニング実験において、異なる双方向性プロモーターコンストラクトからの発現を、レポーター遺伝子ルシフェラーゼおよびｅＧＦＰを使用して、ＨＥＫ２９３における一過性トランスフェクションにより、定量的強度読み出しについて評価した。ｐＡｄａｐｔ３５プラスミドの一過性トランスフェクションでは、双方向性プロモーターは、双方向性プロモーターの左側にルシフェラーゼ導入遺伝子を、右側にｅＧＦＰ導入遺伝子を有した。
【０１１９】
異なる双方向性プロモーター設計を有するプラスミドを用いて、３つの独立したトランスフェクション実験を行った。実験１（図２Ａ）では、プロモーターｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．２、ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  ＩＩ、ｒｈＣＭＶ−ｈＥＦ１α  Ｉ、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１およびｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶを試験した。ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．２、ｒＣＭＶ−ＥＦ１α  ＩＩおよびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１は、一方向制御のｈＣＭＶプロモーター（配列番号９）よりも効力が低いものの、常に双方向性プロモーター機能を示すが、ｒＣＭＶ−ｈＥＦ１α  Ｉは、ｅＧＦＰ発現について陰性対照を上回るプロモーター強度を示さず、ルシフェラーゼ発現についてそれほど低いプロモーター強度を示さない。実験１では、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶが最も強力な双方向性プロモーターである。驚くべきことに、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶは、一方向性ｈＣＭＶプロモーターより発現レベルがわずかに低いものの、非常にバランスのとれた導入遺伝子発現を有する強力な双方向性プロモーターである。スクリーニング実験２（図２Ｂ）では、プロモーターｈＣＭＶ−ＣＡＧ４、ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．１．１、ｒＣＭＶ−ＣＡＧを試験した。ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４プロモーターは、両側で強力なプロモーター活性を示し、それは、この実験における一方向性ｈＣＭＶ対照と同等であるか、またはそれよりもさらに高かった。ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．１．１プロモーターは、予想に反して両側で低いプロモーター強度を示した。双方向性ｒＣＭＶ−ＣＡＧプロモーターは、ｈＣＭＶ一方向性対照の強度と比較して両側からより低く、また双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーター（このデータは図２Ａに示されている）と比較しても両側でより低く、かつバランスがとれていない双方向性プロモーター強度を示す。第３のスクリーニング実験では、２つの新しい双方向性プロモーターｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２、ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．１、および２つの既に試験した双方向性プロモーターｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶおよびｈＣＭＶ−ＣＡＧ４を試験した。ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２は、一方向性ｈＣＭＶ対照と比較して弱いものの、双方向性プロモーター強度を示したが、ｒＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ１は、プロモーターの右側に配置されたｅＧＦＰの発現のみを誘導し、ルシフェラーゼ活性は、非トランスフェクト細胞対照の範囲であった。この実験３では、双方向性プロモーターｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶおよびｈＣＭＶ−ＣＡＧ４を再び試験し、それらの有望な強度およびバランスを確認した。このような細胞に基づく生物学的トランスフェクション実験において予想されるように、実験１と実験３との間にいくらかの変動が観察される。ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶおよびｈＣＭＶ−ＣＡＧ４の両方は、一方向性ｈＣＭＶプロモーター対照と比較して実験１よりも実験３において低い強度を示す。ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶは、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４よりも効力が低いが、ｅＧＦＰおよびルシフェラーゼ発現に関してよりバランスがとれている。したがって、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶは、非常にバランスのとれた導入遺伝子発現を有する強力な双方向性プロモーターであり、かつまた比較的短いという利点を有する。
【０１２０】
驚くべきことに、構築ブロックの全ての組み合わせが、強力でバランスのとれた双方向性プロモーターをもたらしたわけではない。例えば、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４、およびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１、およびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２は、それらの構築ブロックに関して類似している。３つの異なる設計は、全て異なる種に由来するが、記載された強力なＣＭＶ由来のエンハンサーおよびプロモーターと、以前に記載された同一の強力なＣＡＧプロモーターとを使用する。しかし、驚くべきことに、ｈＣＭＶ−ＣＡＧ４は、ｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ１およびｒｈＣＭＶ−ＣＡＧ２よりも強力である。さらに、ＣＡＧプロモーター部分は、ｈＣＭＶプロモーターより強力であると記載されているが、双方向性の設定では、ｈＣＭＶプロモーター構築ブロックに結合した導入遺伝子の発現は、ＣＡＧプロモーター構築ブロックに結合した導入遺伝子の発現を超えていた。これは、他のコンステレーションにおいて使用された場合、以前から知られている構築ブロックから新たな双方向性プロモーターを作製することの予測が不可能であることを明確に示している。試験した双方向性プロモーターコンストラクトのセットから、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶは、強力な双方向性プロモーターコンストラクトの最もバランスのとれた候補として特定された。記載された強力なプロモーターおよびエンハンサーの構築ブロックからのｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの設計から、このプロモーターが強力であり（他の新規なｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターよりもやや弱いが）、かつ非常にバランスがとれている（国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレットに記載されたｍＣＭＶ双方向性プロモーターよりもはるかにバランスがとれており、さらにｈＣＭＶ−ＣＡＧ４双方向性プロモーターよりもいくぶんバランスがとれている）ことは予測できなかった。さらに、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、他のプロモーター設計よりもかなり短い（１ｋＢ未満の長さを有する）という利点を有する。これは、この双方向性プロモーターの使用が他の双方向性プロモーターと比較して、ｒＡｄｓなどの空間制限を有するベクターにおいて、導入遺伝子のためのより多くの空間を残す（すなわちより長い導入遺伝子を可能にする）ことを意味する。異なる一方向性プロモーター構築ブロックからなる残りの試験された合成双方向性プロモーター設計は、主に良好な双方向性プロモーター機能を示したが、それらは、一般に、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターよりも強力でなく、かつバランスがとれていなかった。
【０１２１】
ｒＣＭＶ最初期プロモーターを、マウスＣＭＶ双方向性プロモーターに匹敵するが、それほど強力ではない双方向性プロモーターとして設計することができる。これらの結果は、構築ブロックのいずれの組合せが双方向性プロモーターの良好な機能（両方向における強力な発現、すなわちｈＣＭＶ一方向性プロモーターの制御下で少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％の発現）を提供するかを予測することは不可能であることを示している。
【０１２２】
構築ブロックの同一性および配向についての注釈を含むｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶの概略図を図３に示す。双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの右側は、アカゲザルＣＭＶプロモーター構築ブロック（ｒｈＣＭＶ）を含み、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターの左側は、ｈＣＭＶプロモーター構築ブロックと、ｈＣＭＶプロモーターと同じ方向の双方向性プロモーターの左側を指すように逆向きのｈＣＭＶエンハンサー構築ブロックとを含む。ここでの「左」および「右」という用語は、説明を容易にするために用いられているが、当業者は、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターコンストラクトも向きを変え、逆向きで用いられ得ることを直ちに認識するであろう。ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、１ｋｂ未満の比較的小さいサイズであり、組換えアデノウイルスベクターにおける双方向性プロモーターとしての使用によく適していることにも留意されたい。
【０１２３】
実施例３：ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ発現カセットを有するアデノウイルスベクターからの導入遺伝子発現の強度およびバランス
アデノウイルスベクターのＥ１領域からの発現の強度およびバランスをさらに評価するために、本発明者らは、Ｅ１領域にｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性発現カセットを有するＡｄ２６ベクターおよびＡｄ３５ベクターを生成した。４つの異なるベクトル、すなわちＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．Ｌｕｃ、Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰ、Ａｄ３５．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ＬｕｃおよびＡｄ３５．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰを作成し、非相補性Ａ５４９細胞の形質導入時のレポーター遺伝子発現の強度およびバランスを評価した。形質導入は、１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞で行った。両方のＶＰ／細胞比での結果は、類似していたため、１０００ＶＰ／細胞での形質導入の結果のみを図４に示す。１００ＶＰ／細胞および１０００ＶＰ／細胞での発現の１０倍の差異を推定するために、一方向性ｈＣＭＶプロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する陽性対照ベクターＡｄ．ＬｕｃおよびＡｄ．ｅＧＦＰの形質導入を示す。パネル４Ａは、ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶが、１０００ＶＰ／細胞でのＡｄ２６．ＬｕｃおよびＡｄ２６．ｅＧＦＰ対照ベクターよりわずかに低い発現レベルにおいて、Ａｄ２６  Ｅ１双方向性発現カセットからの両方のレポーター遺伝子の強力な発現を誘導することを示す。Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰをＡｄ２６．Ｌｕｃ．ｍＣＭＶ  ｂｉｄｉｒ．ｅＧＦＰとさらに直接比較すると、Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰは、ｍＣＭＶ  ｂｉｄｉｒと比べてｅＧＦＰ導入遺伝子の発現の低下を示すが、全体的によりバランスのとれた導入遺伝子の発現も示している。パネル４Ｂは、Ａｄ３５ベクターにおけるｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性発現カセットからの導入遺伝子の発現を示す。興味深いことに、Ａｄ３５ベクターにおける発現プロフィールは、Ａｄ２６ベクターにおける発現プロフィールとわずかに異なっていた。したがって、強力な双方向性プロモーターは、異なる血清型に由来するｒＡｄＶにおいて使用され得るが、異なるプロモーターは、１つのｒＡｄＶにおける使用が他のものよりも最適であり得、さらに、プロモーターおよび発現カセットの複雑な設計が最適なウイルスベクターのために必要とされることを例示する。
【０１２４】
実施例４：Ｅ１領域にｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ双方向性発現カセットを有するアデノウイルスベクターの遺伝的安定性試験
導入遺伝子の発現に加えて、ＡｄＶを産生している間の遺伝的安定性は、２つの抗原を発現する有用なＡｄＶにとって重要なパラメータである。したがって、先行出願の国際公開第２０１６／１６６０８８号パンフレットに記載のように遺伝的安定性を試験した。簡潔に記載すると、ベクターＡｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰおよびＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ＬｕｃをＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるプラスミドトランスフェクションによって生成し、ウイルス集団をプラークピッキングによって単離した。１ベクター当たり１０個のプラークをウイルス継代数（ｖｐｎ）３まで増殖させた。その後、５つのプラークを選択し、ｖｐｎ１３まで継代を延長した。遺伝的安定性をＥ１発現カセット領域（図５）ならびにＥ３およびＥ４領域（Ｅ３およびＥ４ＰＣＲのデータは示さず）の同一性ＰＣＲによって評価した。小さい欠失または点変異の欠如をｖｐｎ１３のＥ１  ＰＣＲ産物の標準的なサンガーシーケンシングによって確認した。Ａｄ２６．Ｌｕｃ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．ｅＧＦＰおよびＡｄ２６．ｅＧＦＰ．ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶ．Ｌｕｃの両方の５つのプラークのうちの５つがｖｐｎ１３まで遺伝的に安定なままであった。
【０１２５】
結論
上記のように、新しい双方向性プロモーターコンストラクトのパネルをスクリーニングすることにより、いずれの双方向性プロモーターコンストラクトが所望のプロモーター特性を与えるかを予測することは不可能であることがわかった。実際、非常に類似しているように思われる双方向性プロモーターコンストラクトでさえ、必ずしも同じ結果を与えない。例えば、左側にヒトＣＭＶプロモーター（ｈＣＭＶ）および右側に短いアカゲザルＣＭＶプロモーター（ｒｈＣＭＶ）を有する双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、特にｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５ベクターのＥ１領域からの２つの異なる導入遺伝子のバランスのとれた発現を示した。驚くべきことに、双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、導入遺伝子発現の強度およびバランスを兼ね備え、かつまた長さが１ｋＢ未満と非常に小さい。双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターを有するｒＡｄは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞においてＰ１３に連続継代した後でさえも遺伝的に安定であることがわかった。したがって、本発明の双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターは、遺伝子治療およびワクチンに使用することができる組換えウイルスベクターでの使用、特にバランスのとれた強力な発現が重要である場合、および／または小サイズの双方向性ｈＣＭＶ−ｒｈＣＭＶプロモーターが有用である場合の使用に驚くほど好ましい特性を備えたプロモーターである。
【０１２６】
【表１】
2019521679.tif 000002
【０１２７】
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ＵＳ６０２０１９１Ａ（２／１／２０００）．“Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”．Ｓｃａｒｉａ，Ａｂｒａｈａｍ；Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．；Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｓａｍｕｅｌ  Ｃ．
ＵＳ６０４０１７４Ａ（３／２１／２０００）．“Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅｓ”．Ｉｍｌｅｒ，Ｊｅａｎ  Ｌｕｃ；Ｍｅｈｔａｌｉ，Ｍａｊｉｄ；Ｐａｖｉｒａｎｉ，Ａｎｄｒｅａ
ＵＳ６０８３７１６Ａ（７／４／２０００）．“Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｍ．；Ｆａｒｉｎａ，Ｓｔｅｖｅｎ  Ｆ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｋｒｉｓｈｎａ  Ｊ．
ＵＳ６１１３９１３Ａ（９／５／２０００）．“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ”．Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｅ．；Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉｍｒｅ
ＵＳ６２２５２８９Ｂ１（５／１／２００１）．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ”．Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉｍｒｅ；Ｒａｎｓｏｍ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｃ．
ＵＳ６２６１８２３Ｂ１（７／１７／２００１）．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ”．Ｔａｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｃｈｕ  Ｔａｙ；Ｖｅｌｌｅｋａｍｐ，Ｇａｒｙ；Ｂｏｎｄｏｃ，Ｊｒ．，Ｌａｕｒｅａｎｏ  Ｌ．
ＵＳ６４８５９５８Ｂ２（１１／２６／２００２）．“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ”．Ｂｌａｎｃｈｅ，Ｆｒａｎｃｉｓ；Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｊｅａｎ  Ｍａｒｃ
ＵＳ７３２６５５５Ｂ２（２／５／２００８）．“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”．Ｋｏｎｚ，Ｊｒ．，Ｊｏｈｎ  Ｏ．；Ｌｅｅ，Ａｎｎ  Ｌ．；Ｔｏ，Ｃｈｉ  Ｓｈｕｎｇ  Ｂｒｉａｎ；Ｇｏｅｒｋｅ，Ａａｒｏｎ  Ｒ
ＵＳ８９３２６０７Ｂ２（１／１３／２０１５）．“Ｂａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄｓ”．Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；Ｖｅｌｌｉｎｇａ，Ｊｏｒｔ
欧州特許文献：
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ＥＰ１６０１７７６Ｂ１（７／２／２００８）．“ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＣＭＶ  ＩＥ２  ＰＲＯＭＯＴＥＲ”．ＣＨＡＴＥＬＬＡＲＤ，Ｐｈｉｌｉｐｐｅ；ＩＭＨＯＦ，Ｍａｒｋｕｓ
ＥＰ８５３６６０Ｂ１（１／２２／２００３）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＰＲＥＳＥＲＶＩＮＧ  ＩＮＦＥＣＴＩＯＵＳ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＶＩＲＵＳＥＳ，ＡＱＵＥＯＵＳ  ＶＩＲＡＬ  ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＡＳ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ”．ＳＥＮＥ，Ｃｌａｕｄｅ
国際特許出願公報：
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ＷＯ２００３０６１７０８Ａ１（７／３１／２００３）．“ＳＴＡＢＩＬＩＺＥＤ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ”．ＰＵＮＧＯＲ，Ｅｒｎｏ
ＷＯ２００３０７８５９２Ａ２（９／２５／２００３）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＹＴＩＣ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ”．ＭＥＭＡＲＺＡＤＥＨ，Ｂａｈｒａｍ；ＰＥＮＮＡＴＨＵＲ−ＤＡＳ，Ｒｕｋｍｉｎｉ；ＷＹＰＹＣＨ，Ｊｏｓｅｐｈ；ＹＵ，Ｄｅ  Ｃｈａｏ
ＷＯ２００３１０４４６７Ａ１（１２／１８／２００３）．“ＭＥＡＮＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＶＥＣＴＯＲＳ”．ＶＯＧＥＬＳ，Ｒｏｎａｌｄ；ＢＯＵＴ，Ａｂｒａｈａｍ
ＷＯ２００４００１０３２Ａ２（１２／３１／２００３）．“ＳＴＡＢＬＥ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＰＡＧＡＴＩＯＮ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＶＯＧＥＬＳ，Ｒｏｎａｌｄ；ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ，Ｊａｎｓ，Ｅｍｃｏ；ＺＵＩＪＤＧＥＥＳＴ，Ｄａｖｉｄ，Ａｄｒｉａｎｕｓ，Ｔｈｅｏｄｏｒｕｓ
ＷＯ２００４００４７６２Ａ１（１／１５／２００４）．“ＩＳＣＯＭ  ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＭＯＲＥＩＮ，Ｂｒｏｒ；ＬＯｅＶＧＲＥＮ  ＢＥＮＧＴＳＳＯＮ，Ｋａｒｉｎ
ＷＯ２００４０２０９７１Ａ２（３／１１／２００４）．“ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ”．ＳＥＮＥＳＡＣ，Ｊｏｓｅｐｈ
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ＷＯ２００５００２６２０Ａ１（１／１３／２００５）．“ＱＵＩＬ  Ａ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＷＩＴＨ  ＬＯＷ  ＴＯＸＩＣＩＴＹ  ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＭＯＲＥＩＮ，Ｂｒｏｒ；ＬＯｅＶＧＲＥＮ  ＢＥＮＧＴＳＳＯＮ，Ｋａｒｉｎ；ＥＫＳＴＲＯｅＭ，Ｊｉｌｌ；ＲＡＮＬＵＮＤ，Ｋａｔａｒｉｎａ
ＷＯ２００５０７１０９３Ａ２（８／４／２００５）．“ＣＨＩＭＰＡＮＺＥＥ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥ  ＣＡＲＲＩＥＲＳ”．ＣＩＲＩＬＬＯ，Ａｇｏｓｔｉｎｏ；ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＥＲＣＯＬＥ，Ｂｒｕｎｏ，Ｂｒｕｎｉ；ＭＥＯＬＡ，Ａｎｎａｌｉｓａ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＳＰＯＲＥＮＯ，Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ
ＷＯ２００５０８０５５６Ａ２（９／１／２００５）．“ＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤＳ”．ＷＥＧＧＥＭＡＮ，Ｍｉｒａｎｄａ；ＶＡＮ  ＣＯＲＶＥＮ，Ｅｍｉｌｅ  Ｊｏａｎｎｅｓ  Ｊｏｓｅｐｈｕｓ  Ｍａｒｉａ
ＷＯ２００６０５３８７１Ａ２（５／２６／２００６）．“ＭＵＬＴＩＶＡＬＥＮＴ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ”．ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ，Ｊａｎｓ，Ｅｍｃｏ；ＶＯＧＥＬＳ，Ｒｏｎａｌｄ；ＳＡＤＯＦＦ，Ｊｅｒａｌｄ；ＨＯＮＥ，Ｄａｖｉｄ；ＳＫＥＩＫＹ，Ｙａｓｉｒ  Ａｂｄｕｌ  Ｗａｈｉｄ；ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ
ＷＯ２００６１０８７０７Ａ１（１０／１９／２００６）．“ＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＵＳＩＮＧ  ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ”．ＷＥＧＧＥＭＡＮ，Ｍｉｒａｎｄａ
ＷＯ２００６１２００３４Ａ１（１１／１６／２００６）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ”．ＥＲＴＬ，Ｐｅｔｅｒ，Ｆｒａｎｚ；ＴＩＴＥ，Ｊｏｈｎ，Ｐｈｉｌｉｐ；ＶＡＮ  ＷＥＬＹ，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ａｎｎ
ＷＯ２００７０７３５１３Ａ２（６／２８／２００７）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＰＲＯＰＡＧＡＴＩＮＧ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＥＮＣＯＤＩＮＧ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＹ  ＧＥＮＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ”．ＧＡＬＬ，Ｊａｓｏｎ，Ｇ．，Ｄ．；ＢＲＯＵＧＨ，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｅ．；ＲＩＣＨＴＥＲ，Ｋｉｎｇ，Ｃ．
ＷＯ２００７１００９０８Ａ２（９／７／２００７）．“ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＡＬ  ＶＥＣＴＯＲＳ”．ＴＵＣＫＥＲ，Ｓｅａｎ，Ｎ．
ＷＯ２００７１０４７９２Ａ２（９／２０／２００７）．“ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳＥＳ  ＢＡＳＥＤ  ＯＮ  ＳＥＲＯＴＹＰＥ  ２６  ＡＮＤ  ４８，ＡＮＤ  ＵＳＥ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ  Ｈ．；ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ
ＷＯ２００７１１０４０９Ａ１（１０／４／２００７）．“ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＣＯＭＰＲＩＳＩＮＧ  Ａ  ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＡＮＤ  ＡＮ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ”．ＨＡＶＥＮＧＡ，Ｍｅｎｚｏ  Ｊａｎｓ  Ｅｍｋｏ；ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ
ＷＯ２００９０２６１８３Ａ１（２／２６／２００９）．“ＵＳＥ  ＯＦ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＴＯ  ＯＰＴＩＭＩＺＥ  ＶＡＣＣＩＮＥ−ＩＮＤＵＣＥＤ  Ｔ  ＣＥＬＬ  ＲＥＳＰＯＮＳＥＳ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＨＩＶ  ＧＡＧ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−Ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ，Ｈ．
ＷＯ２００９１１７１３４Ａ２（９／２４／２００９）．“ＡＥＲＯＳＯＬＩＺＥＤ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＵＳＥ”．ＲＯＥＤＥＲＥＲ，Ｍａｒｉｏ；ＲＡＯ，Ｓｒｉｎｉｖａｓ；ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ，Ｊ．；ＡＮＤＲＥＷＳ，Ｃｈａｒｌａ，Ａｎｎｅ
ＷＯ２０１００８５９８４Ａ１（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−  ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００８６１８９Ａ２（８／５／２０１０）．“ＳＩＭＩＡＮ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ−  ＡＮＤ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤ−ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ，ＶＥＣＴＯＲＳ  ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＳＡＭＥ，ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＣＯＬＬＯＣＡ，Ｓｔｅｆａｎｏ；ＮＩＣＯＳＩＡ，Ａｌｆｒｅｄｏ；ＣＯＲＴＥＳＥ，Ｒｉｃｃａｒｄｏ；ＡＭＭＥＮＤＯＬＡ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；ＡＭＢＲＯＳＩＯ，Ｍａｒｉａ
ＷＯ２０１００９６５６１Ａ１（８／２６／２０１０）．“ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＨＩＶ／ＳＩＶ  ＧＡＧ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ”．ＮＡＢＥＬ，Ｇａｒｙ  Ｊ．；ＹＡＮＧ，Ｚｈｉ−ｙｏｎｇ；ＳＨＩ，Ｗｅｉ；ＢＡＲＯＵＣＨ，Ｄａｎ  Ｈ．
ＷＯ２０１１０４５３７８Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１１０４５３８１Ａ１（４／２１／２０１１）．“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＦＯＲ  ＡＤＥＮＯＶＩＲＵＳ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＨＩＧＨ  ＣＥＬＬ  ＤＥＮＳＩＴＹ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ”．ＤＥ  ＶＯＣＨＴ，Ｍａｒｃｅｌ，Ｌｅｏ；ＶＥＥＮＳＴＲＡ，Ｍａｒｌｏｅｓ
ＷＯ２０１３１３９９１１Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ  Ｎ．
ＷＯ２０１３１３９９１６Ａ１（９／２６／２０１３）．“ＶＡＣＣＩＮＥ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＲＳＶ”．ＲＡＤＯＳＥＶＩＣ，Ｋａｔａｒｉｎａ；ＣＵＳＴＥＲＳ，Ｊｅｒｏｍｅ  Ｈ．Ｈ．Ｖ．；ＶＥＬＬＩＮＧＡ，Ｊｏｒｔ；ＷＩＤＪＯＪＯＡＴＭＯＤＪＯ，Ｍｙｒａ，Ｎ．
他の参考文献：
書籍
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Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）
Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９（２０００）
Ｆｒｏｋｊａｅｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｈｏｖｇａａｒｄ  Ｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）
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Ｋｉｂｂｅ  Ａ．（ｅｄｉｔｏｒ），Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）
Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．（１９７３）
ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  Ｍ．Ｊ．，Ｈａｍｓ  Ｂ．Ｄ．，Ｔａｙｌｏｒ  Ｇ．Ｒ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９８９）
Ｓｈｅｎｋ，Ｔｈｏｍａｓ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ６７，ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）．，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）
Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ．（１９９２）
学術誌
Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．，Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｅｗａｌｄ，Ｂ．Ａ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｅｎｈｏｌｔｚ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，．．．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２００７）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｒａｒｅ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８１（９），４６５４−４６６３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２６９６−０６
Ａｂｂｉｎｋ，Ｐ．，Ｍａｘｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｆ．，Ｎｇ’ａｎｇ’ａ，Ｄ．，Ｂｏｒｄｕｃｃｈｉ，Ｅ．Ｎ．，Ｉａｍｐｉｅｔｒｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｒｉｃａｕｌｔ，Ｃ．Ａ．，．．．Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．（２０１５）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８９（３），１５１２−１５２２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２９５０−１４
Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ，Ｋ．，Ｋｏｎｇ，Ｈ．Ｌ．，Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ，Ａ．，Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，＆Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｅ．（１９９７）．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ７ａ  Ｅ１Ａ−ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７１（１１），８９４６−８９５１．
Ａｄｄｉｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｈｉｔｔ，Ｍ．，Ｋｕｎｓｋｅｎ，Ｄ．，＆Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９７）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７８（Ｐｔ  ７），１６５３−１６６１．ｄｏｉ：１０．１０９９／００２２−１３１７−７８−７−１６５３
Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ．，Ｖｅｎｎｅｒｉ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｆｆｉ，Ａ．，Ｖｉｇｎａ，Ｅ．，＆Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．（２００５）．Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｄｕａｌ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３（１），１０８−１１６．
Ａｎｄｒｉａｎａｋｉ，Ａ．，Ｓｉａｐａｔｉ，Ｅ．Ｋ．，Ｈｉｒａｔａ，Ｒ．Ｋ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，＆Ｖａｓｓｉｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．（２０１０）．Ｄｕａｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１７（３），３８０−３８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２００９．１４７
Ｂａｎｇａｒｉ，Ｄ．Ｓ．，＆Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．（２００６）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２４（７），８４９−８６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２００５．０８．１０１
Ｂａｒｒｙ，Ｐ．Ａ．，Ａｌｃｅｎｄｏｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｏｗｅｒ，Ｍ．Ｄ．，Ｋｅｒｒ，Ｈ．，＆Ｌｕｃｉｗ，Ｐ．Ａ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｓｕｓ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＵＬ１２１−１１７  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１５（１），６１−７２．ｄｏｉ：１０．１００６／ｖｉｒｏ．１９９６．０００７
Ｂａｒｓｋｉ，Ｏ．Ａ．，Ｓｉｌｌｅｒ−Ｌｏｐｅｚ，Ｆ．，Ｂｏｈｒｅｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｇａｂｂａｙ，Ｋ．Ｈ．，＆Ａｇｕｉｌａｒ−Ｃｏｒｄｏｖａ，Ｅ．（２００４）．Ｈｕｍａｎ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｌｌｏｗｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３６（３），３８２−３８４，３８６，３８８．
Ｂｅｌｏｕｓｏｖａ，Ｎ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｒ．，Ｚｉｎｎ，Ｋ．，Ｒｈｏｄｅｓ−Ｓｅｌｓｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｋｏｔｏｖ，Ａ．，Ｋｏｔｏｖａ，Ｏ．，．．．Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．Ｄ．（２００６）．Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７０（５），１４８８−１４９３．
Ｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｈｓｕ，Ｃ．，Ｋｕｌｅｓａ，Ｖ．Ａ．，＆Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．（１９９６）．Ａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ  Ｅ１  ａｎｄ  Ｅ４．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（９），６４９７−６５０１．
Ｃｈａｎ，Ｙ．Ｊ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，＆Ｈａｙｗａｒｄ，Ｇ．Ｓ．（１９９６）．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ＥＬＫ−１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｂｏｔｈ  ｂａｓａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｉｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７０（１２），８５９０−８６０５．
Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｎ．，Ｊｅａｎｇ，Ｋ．Ｔ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｈａｎ，Ｙ．Ｊ．，Ｐｉｚｚｏｒｎｏ，Ｍ．，＆Ｈａｙｗａｒｄ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｂｅｎｔ  ＤＮＡ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＮＦＩ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ＩＥ９４  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｒｏｍ  ｓｉｍｉａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，６７（１），５１６−５２９．
Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ，Ｐ．，Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｒ．，Ｍｅｉｅｒ，Ｅ．，Ｄｕｒｒｅｒ，Ｌ．，Ｓａｕｖａｇｅ，Ｃ．，＆Ｉｍｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．（２００７）．Ｔｈｅ  ＩＥ２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ＣＭＶ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９６（１），１０６−１１７．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２１１７２
Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，＆Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００２）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＣＶ−６８  ａｄａｐｔｅｄ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８３（Ｐｔ  １），１５１−１５５．
Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．，Ｔｒｉｎｋｌｅｉｎ，Ｎ．Ｄ．，＆Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．（２００７）．Ｔｈｅ  ｅｔｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＢＰ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ，３（１１），ｅ２０８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．００３０２０８
Ｆａｌｌａｕｘ，Ｆ．Ｊ．，Ｂｏｕｔ，Ａ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ，Ｉ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｅｈｉｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｋｅｅｇａｎ，Ｊ．，．．．Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．（１９９８）．Ｎｅｗ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，９（１３），１９０９−１９１７．
Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆ．，Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．Ｑ．，Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｕｒｎｅｔｔ，Ｒ．Ｍ．，Ａｌｖｉｒａ，Ｍ．Ｒ．，．．．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００１）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７５（２３），１１６０３−１１６１３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７５．２３．１１６０３−１１６１３．２００１
Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，Ｅｎｇｄａｈｌ，Ｒ．Ｋ．，＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０００）．Ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ１−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１１（１），２１３−２１９．ｄｏｉ：１０．１０８９／１０４３０３４００５００１６２８３
Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｌ．，Ａｓｉｅｄｕ，Ｃ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｄ．，．．．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．（２０１１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２６（Ａｄ２６）ａｎｄ  Ａｄ３５  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙｐａｓｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ａｄ５  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８５（９），４２２２−４２３３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２４０７−１０
Ｇｏｅｒｋｅ，Ａ．Ｒ．，Ｔｏ，Ｂ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ａ．Ｌ．，Ｓａｇａｒ，Ｓ．Ｌ．，＆Ｋｏｎｚ，Ｊ．Ｏ．（２００５）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＤＮＡ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，９１（１），１２−２１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｉｔ．２０４０６
Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｇ．，Ｓｔｒｅｌｏｗ，Ｌ．Ｉ．，Ｆｒａｎｃｈｉ，Ｄ．Ｃ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｇ．，＆Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｗ．（２００３）．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｈｅｓｕｓ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７７（１２），６６２０−６６３６．
Ｈａｒｒｏ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｎ．，Ｌａｌｌｙ，Ｍ．Ａ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ｄ．，Ｅｄｕｐｕｇａｎｔｉ，Ｓ．，Ｇｏｅｐｆｅｒｔ，Ｐ．Ａ．，．．．Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｄ．Ｖ．（２００９）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｎｅａｒ−ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  １  ｃｌａｄｅ  Ｂ  ｇａｇ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ．ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，２５（１），１０３−１１４．
Ｈａｒｒｏ，Ｃ．，Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｓｔｅｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｌｅａｖｉｔｔ，Ｒ．Ｙ．，Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｄ．Ｖ．，Ｗａｎｇ，Ｆ．，．．．Ｍｅｒｃｋ，Ｖ．Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．（２００９）．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５（ＭＲＫＡｄ５）ａｎｄ  ＭＲＫＡｄ６  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｔｒｉｇｅｎｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６（９），１２８５−１２９２．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＣＶＩ．００１４４−０９
Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｓ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，．．．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．（２００６）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  ８），２１３５−２１４３．
Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ，Ｒ．，＆Ｗｅｇｅｒ，Ｓ．（２０１０）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（１９７），１４３−１７０．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−３−６４２−００４７７−３＿５
Ｈｏｇａｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｍａ，Ｊ．Ｃ．，Ａｓａｔｏ，Ｌ．，Ｏｎｇ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．，．．．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｍ．Ｊ．（２００２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ．，１（１），４３−４８．
Ｈｏｌｍａｎ，Ｄ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｒａｖｉｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．，Ｒａｊａ，Ｎ．Ｕ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，．．．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２００７）．Ｔｗｏ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｌｌ  ｆｏｕｒ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（２），１８２−１８９．
Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ，Ｒ．，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ，Ｍ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｋａｓｐｅｒｓ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００４）．Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １１（Ａｄ１１）ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｌｏｗ  ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ａｄ５．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７８（２３），１３２０７−１３２１５．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７８．２３．１３２０７−１３２１５．２００４
Ｈｕ，Ｘ．，Ｍｅｎｇ，Ｗ．，Ｄｏｎｇ，Ｚ．，Ｐａｎ，Ｗ．，Ｓｕｎ，Ｃ．，＆Ｃｈｅｎ，Ｌ．（２０１１）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈ５  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ，１５５（１），１５６−１６２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｕｓｒｅｓ．２０１０．０９．０１４
Ｋｉｍ，Ｄ．Ｗ．，Ｕｅｔｓｕｋｉ，Ｔ．，Ｋａｚｉｒｏ，Ｙ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，＆Ｓｕｇａｎｏ，Ｓ．（１９９０）．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ，９１（２），２１７−２２３．
Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．，Ｚｈｉ，Ｙ．，Ｓｃｈｕｍｅｒ，Ｇ．，Ｇａｏ，Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｆ．，．．．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００６）．Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｚａｉｒｅ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３４６（２），３９４−４０１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖｉｒｏｌ．２００５．１０．０４２
Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，＆Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００９）．Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１７（８），１３３３−１３３９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２００９．１３０
Ｌｅｍｃｋｅｒｔ，Ａ．Ａ．，Ｇｒｉｍｂｅｒｇｅｎ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｓ，Ｓ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００６）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ４９：ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ，ｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８７（Ｐｔ  １０），２８９１−２８９９．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８２０７９−０
Ｍｕｌｌｉｃｋ，Ａ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．，Ｋｏｕｔｒｏｕｍａｎｉｓ，Ｍ．，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，Ｃ．，Ｂｒｏｕｓｓａｕ，Ｓ．，．．．Ｍａｓｓｉｅ，Ｂ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６，４３．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−６−４３
Ｎａ，Ｍ．，＆Ｆａｎ，Ｘ．（２０１０）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ａｄ５Ｆ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｄｕａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ，３８（６），４４６−４５２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１０．０３．００７
Ｎａｎ，Ｘ．，Ｐｅｎｇ，Ｂ．，Ｈａｈｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｅ．，Ｌｉｚｏｎｏｖａ，Ａ．，Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．，＆Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ，Ｍ．（２００３）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄ７  ｃｏｓｍｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｄ７ｄｅｌｔａＥ１ｄｅｌｔａＥ３ＨＩＶ（ＭＮ）ｅｎｖ／ｒｅｖ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，１０（４），３２６−３３６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０１９０３
Ｏｇｕｎ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ，Ｌ．，Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．，＆Ｈｉｌｌ，Ｆ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ｂｐ）ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ４ｂｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７６（８），３８１７−３８２３．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＩＡＩ．０１３６９−０７
Ｏｐｈｏｒｓｔ，Ｏ．Ｊ．，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ，Ｋ．，Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｕ，Ｍ．Ｇ．，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，Ｂ．，．．．Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５−ｂａｓｅｄ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，７４（１），３１３−３２０．
Ｐｈａｍ，Ｌ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｒｏｓａｌｅｓ，Ａ．，Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｂａｉｌｅｙ，Ｋ．Ｒ．，Ｐｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．，＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．（２００９）．Ｃｏｎｃｏｒｄａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｉｎｓｅｒｔｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｅ１，Ｅ３  ａｎｄ  Ｅ４  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，１１（３），１９７−２０６．
Ｐｏｓｔ，Ｄ．Ｅ．，＆Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ，Ｅ．Ｇ．（２００１）．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｈｙｐｏｘｉａ／ＨＩＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８（２３），１８０１−１８０７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｇｔ．３３０１６０５
Ｐｏｗｅｌｌ，Ｓ．Ｋ．，Ｒｉｖｅｒａ−Ｓｏｔｏ，Ｒ．，＆Ｇｒａｙ，Ｓ．Ｊ．（２０１５）．Ｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｅｄ，１９（１０２），４９−５７．
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｙａｏ，Ｍ．Ｋ．，Ｔｒａｎ，Ｋ．Ｎ．，Ｃｒｏｙｌｅ，Ｍ．Ａ．，Ｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｈ．，＆Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．Ｐ．（２００９）．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，４（４），ｅ５３０８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００５３０８
Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｄ．，＆Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉ，Ｓ．Ｃ．（１９９８）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ，８０（１），３５−４７．
Ｓａｎｄｆｏｒｄ，Ｇ．Ｒ．，＆Ｂｕｒｎｓ，Ｗ．Ｈ．（１９９６）．Ｒａｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｈａｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２２（２），３１０−３１７．ｄｏｉ：１０．１００６／ｖｉｒｏ．１９９６．０４２８
Ｓｃｈｅｐｐ−Ｂｅｒｇｌｉｎｄ，Ｊ．，Ｌｕｏ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｗｉｃｋｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｒａｊａ，Ｎ．Ｕ．，Ｈｏｅｌ，Ｂ．Ｄ．，．．．Ｄｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．（２００７）．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｖｉｒｕｓ  Ｃ，ＰｒｅＭ，Ｅ，ａｎｄ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｂｏｔｈ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（９），１１１７−１１２６．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｈｅｄｌｏｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｌ．，．．．Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２００６）．Ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＧＰｓ．ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ，３（６），ｅ１７７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｍｅｄ．００３０１７７
Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．，Ｇｅｉｓｂｅｒｔ，Ｊ．Ｂ．，Ｘｕ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｙ．，Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．，．．．Ｎａｂｅｌ，Ｇ．Ｊ．（２００３）．Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４２４（６９４９），６８１−６８４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０１８７６
Ｔａｔｓｉｓ，Ｎ．，Ｂｌｅｊｅｒ，Ａ．，Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｃｕｎ，Ａ．，Ｔｅｓｅｍａ，Ｌ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００７）．Ａ  ＣＤ４６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｒｒｉｅｒ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１５（３），６０８−６１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｍｔ．６３０００７８
Ｖｅｍｕｌａ，Ｓ．Ｖ．，＆Ｍｉｔｔａｌ，Ｓ．Ｋ．（２０１０）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ，１０（１０），１４６９−１４８７．ｄｏｉ：１０．１５１７／１４７１２５９８．２０１０．５１９３３２
Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｍｅｅｒｅｎｄｏｎｋ，Ｍ．，Ｃｏｍｐａｎｊｅｎ，Ａ．，Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ，Ｇ．，Ｓｉｊｔｓｍａ，Ｊ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．Ｊ．（２００７）．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８８（Ｐｔ  １１），２９１５−２９２４．
Ｖｏｇｅｌｓ，Ｒ．，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ，Ｄ．，ｖａｎ  Ｒｉｊｎｓｏｅｖｅｒ，Ｒ．，Ｈａｒｔｋｏｏｒｎ，Ｅ．，Ｄａｍｅｎ，Ｉ．，ｄｅ  Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｐ．，．．．Ｈａｖｅｎｇａ，Ｍ．（２００３）．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，７７（１５），８２６３−８２７１．
Ｖｏｉｇｔ，Ｓ．，Ｓａｎｄｆｏｒｄ，Ｇ．Ｒ．，Ｈａｙｗａｒｄ，Ｇ．Ｓ．，＆Ｂｕｒｎｓ，Ｗ．Ｈ．（２００５）．Ｔｈｅ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ）ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｐｔｕｒｅｄ  ＣＤ２００（ｖＯＸ２）ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ａ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ：ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈａｔ  ｏｆ  ｒａｔ  ＣＭＶ  Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８６（Ｐｔ  ２），２６３−２７４．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｖｉｒ．０．８０５３９−０
Ｗａｌｔｈｅｒ，Ｗ．，＆Ｓｔｅｉｎ，Ｕ．（２０００）．Ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｄｒｕｇｓ，６０（２），２４９−２７１．
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｃｕｎ，Ａ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｘｉａｎｇ，Ｚ．，＆Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２００６）．Ａ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ−ｏｒｉｇｉｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１４（５），６６２−６７２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２００６．０３．０２７
Ｚｈｏｕ，Ｄ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｌ．，Ｌａｓａｒｏ，Ｍ．Ｏ．，Ｌａｔｉｍｅｒ，Ｂ．Ｐ．，Ｐａｒｚｙｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉａｎ，Ａ．，．．．Ｅｒｔｌ，Ｈ．Ｃ．（２０１０）．Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ−２  ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，１８（１２），２１８２−２１８９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２０２
【図１−１】
2019521679.tif 000003
【図１−２】
2019521679.tif 000004
【図１−３】
2019521679.tif 000005
【図１−４】
2019521679.tif 000006
【図１−５】
2019521679.tif 000007
【図２】
2019521679.tif 000008
【図３】
2019521679.tif 000009
【図４】
2019521679.tif 000010
【図５】
2019521679.tif 000011
【配列表】
2019521679000001.app
【国際調査報告】
2019521679.tif 000012
2019521679.tif 000013
2019521679.tif 000014