(57)【要約】  本発明は、新規な化合物、それを産生する方法、およびそれを抗菌剤として使用すること、ならびにそれを含む医薬組成物を提供する。化合物を産生するための放線菌の使用も開示されている。
2019521078.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩＩによる構造を有する化合物ならびにその誘導体、塩および溶媒和物。
【化１】
2019521078.tif 000010
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の化合物の産生方法：
ａ）以下からなる群から選択される細菌を、海水を含む適切な培地中で培養する工程と：
ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；および
ｉｉ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などのｉ）の細菌単離株と密接に関連した細菌；
ｂ）前記培養物から前記化合物を抽出する工程。
【請求項３】
前記細菌が、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）が、培養細菌を遠心分離して化合物を抽出する細胞ペレットを得る工程を含む、請求項２および３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて細胞ペレットから抽出される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、ＰＭ６であり、任意に人工海水を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を産生するための単離された細菌の使用であって、
前記細菌が、以下からなる群から選択される細菌である、使用：
ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ  ３２２８で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；および
ｂ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などの、ａ）の細菌単離株と密接に関連した細菌。
【請求項８】
前記密接に関連した細菌が、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される１つ以上の担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
治療に使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
抗微生物剤としての使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記抗微生物剤が抗菌剤である、請求項１１に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物または請求項９に記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者における細菌感染症を治療する方法。
【請求項１４】
前記細菌感染症が多剤耐性細菌によって引き起こされる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌感染症がグラム陽性および／またはグラム陰性細菌によって引き起こされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の化合物または請求項９に記載の組成物を、死滅または阻害すべき細菌と接触させる工程を含む、細菌を死滅させる、またはその増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな化合物、それを産生する方法、および抗菌剤としての使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
天然産物は新たな抗菌剤の最も多量の供給源であり続けており、天然化合物の化学的多様性はいまだにコンビナトリアルケミストリーのアプローチ（Ｎｅｗｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｒａｇｇ、２０１２）とは比べものにならない。後者はリード化合物の最適化にうまく適用されている一方、純粋に新たなファーマコフォアを特に抗菌剤の分野で産出することに基本的に失敗した。これは、主にコンビナトリアルライブラリーに代表される化合物の構造的多様性の限界のためである。現在、臨床で使用されている抗生物質の大半は、細菌および真菌から単離された化合物から開発されており、放線菌類のメンバーが主要な源である（Ｐｅｌaｅｚ  Ｆ、２００６）。薬剤に重要な放線菌類由来の抗生物質としては、アミノグリコシド、アントラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド、テトラサイクリンなどが挙げられる。伝統的に、これらの抗菌剤の大半は、ストレプトミセス属の土壌由来の放線菌から単離されてきた。
【０００３】
しかし、近年の単離戦略は、海洋資源などの未開拓の環境に向けられている。海洋生息地からの放線菌類の分離およびスクリーニングに焦点を当てた生物資源調査の努力は、放線菌目に新たな生物多様性を加え、潜在的な薬理学的価値のある一連の新規天然産物を明らかにした（Ｍｉｎｃｅｒ、２００１）。その陸生の近縁種と生理的かつ系統的に異なる海洋放線菌類の存在は、現在、広く受け入れられており、海洋放線菌の新たな分類群が放線菌目の中で少なくとも６種の系統について記載されている（Ｆｅｎｉｃａｌら、２００６）。
【０００４】
海洋単離株は、その陸生の近縁種と系統的に異なっていることは別として、海洋環境に対して（例えば、高い塩分／浸透圧および圧力に対して）特定の生理学的適応があることが示されている。この生息地の広範な多様性とその不十分な開発は、それに向けて新規代謝産物産生者を発見するために研究者を引きつける根本的な理由である。海洋生態系には種々の珍しい属の発生があり、多くは新しく化学的に多様な二次代謝産物を産生することがわかった（非特許文献１８、非特許文献２２、（Ｍａｎｉｖａｓａｇａｎら、２０１４）。
【０００５】
ほとんどのストレプトミセス菌やその他の糸状放線菌は、二次代謝産物の生合成のための多数の遺伝子クラスターを所有しており（非特許文献３）、ゲノム配列の研究により、ゲノムの大部分が二次代謝産物の生合成に寄与していることが明らかにされている。既知のまたは予測された二次代謝産物をコードするいくつかの遺伝子クラスターが、種々のストレプトミセス菌株（非特許文献３）および海洋放線菌サリニスポラ（非特許文献５）のゲノムにおいて同定されている。抗菌薬や抗真菌薬を含む薬理学的に重要な多くの天然産物は、これらのマルチモジュール組立ラインによって合成され、二次代謝産物の遺伝子クラスターのゲノムマイニングは、新規生理活性化合物を産生する細菌の遺伝的能力を評価するための一般的なツールとなっている（非特許文献６）。
【０００６】
しかし、Streptomyces coelicolor A3(2)などのよく研究されたモデルの抗生物質産生菌についてさえ、一方では既知の代謝産物の数と他方ではゲノムデータから同定された経路の数との間の相違は非常に大きい（非特許文献３）。これらの相違は、二次代謝産物のほとんどの遺伝子クラスターが標準的な実験室培養条件下でサイレンシングされ、これらの経路の発現またはアップレギュレーションが、ある環境シグナルに応答してのみ引き起こされるという事実によってのみ説明することができる。一連の条件下で細菌を培養することによって、これらの「オーファン」生合成経路の多くの産物を得ることが可能であることが示されている（非特許文献５）。
【０００７】
非特許文献１０では、分子分類学を用いて２７種の海洋堆積物および海綿由来放線菌を属レベルで分類した。記載の通り、ポリケチドおよび非リボソームペプチド性抗生物質の合成に関与する遺伝子のＰＣＲスクリーニングを、生理活性二次代謝産物を産生する可能性のある放線菌を分析するために使用した。
【０００８】
現在、臨床で使用されている抗生物質の大半は、５０年以上前に発見された。最後の１０年の間は、新たな作用機序を有する２種の新たな抗菌剤（合成オキサゾリジノン・リネゾリドおよび天然産物ベースのリポペプチド・ダプトマイシン）が承認されたにすぎない。出現する多剤耐性病原体による既存の薬剤の有効性の喪失は、新たな抗菌剤の開発を上回りそうである。すべての抗感染症薬の大部分は、天然産物に由来するか、または天然産物に誘発されている。したがって、ゲノミクス由来の標的ベースの研究もコンビナトリアルケミストリーも、いまのところ実際に市場に参入した医薬品を提供していないため、新たな抗生物質は天然産物ベースの研究から得られる可能性が最も高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Behal, V. 著、“Bioactive products from Streptomyces”、 Advances in Applied Microbiology、47巻、113-156頁(2000)
【非特許文献２】Bennett, J.W., and R. Bentley著、“Whats in a Name - Microbial Secondary Metabolism”、Adv Appl Microbiol.、 34巻、1-28頁(1989)
【非特許文献３】Bentley, S. D., K. F. Chater, A. M. Cerdeno-Tarraga, G. L. Challis, N. R.Thomson, K. D. James, D. E. Harris, M. A. Quail, H. Kieser, D. Harper, A. Bateman, S. Brown, G. Chandra, C. W. Chen, M. Collins, A. Cronin, A. Fraser, A. Goble, J. Hidalgo, T. Hornsby, S. Howarth, C. H. Huang, T. Kieser, L. Larke, L. Murphy, K. Oliver, S. O'Neil, E. Rabbinowitsch, M. A. Rajandream, K. Rutherford, S. Rutter, K. Seeger, D. Saunders, S. Sharp, R. Squares, S. Squares, K. Taylor, T. Warren, A. Wietzorrek, J. Woodward, B. G. Barrell, J. Parkhill, and D. A. Hopwood.著、“Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2)”、 Nature、417巻、141-147頁(2002)
【非特許文献４】Berge SM, Bighley LD, Monkhouse DC.著、 “Pharmaceutical salts”、 J Pharm Sci.、66巻、1号、1-19頁 (1977)1月
【非特許文献５】Bode, H. B., B. Bethe, R. Hofs, and A. Zeeck.著、“Big effects from small changes: possible ways to explore nature’s chemical diversity”、Chembiochem、3巻、619-627頁(2002)
【非特許文献６】Brautaset, Trygve; Borgos, Sven Even F.; Sletta, Havard; Ellingsen, Trond Erling; Zotchev, Sergey. 著、 “Site-specific mutagenesis and domain substitutions in the loading module of the nystatin polyketide synthase, and their effects on nystatin synthesis in Streptomyces noursei. ” Journal of Biological Chemistry.、278巻(2003)
【非特許文献７】Cragg, G. M., P. G. Grothaus, and D. J. Newman. 著、“Impact of natural products on developing new anti-cancer agents.” Chem. Rev. 109巻、3012-3043頁(2009)
【非特許文献８】Fenical, W., and P. R. Jensen. 著、“Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria.” Nat. Chem. Biol. 2巻、666-673頁(2006)
【非特許文献９】Fischbach, M. A., and C. T. Walsh. 著、“Assembly-line enzymology for polyketide and nonribosomal peptide antibiotics: logic, machinery, and mechanisms.” Chem. Rev. 106巻、3468-3496頁(2006)
【非特許文献１０】Engelhardt, K., K.F. Degnes, M. Kemmler, H. Bredholt, E. Fjaervik, G. Klinkenberg, H. Sletta, T.E. Ellingsen, and S.B. Zotchev.著、 "Production of a New Thiopeptide Antibiotic, TP-1161, by a Marine Nocardiopsis Species. " Appl Environ Microb. 76巻、4969-4976頁(2010)
【非特許文献１１】Illing, G.T., I.D. Normansell, and J.F. Peberdy. 著、“Protoplast isolation and regeneration in Streptomyces clavuligerus.”、J. Gen. Microbiol. 135巻、2289-2297頁(1989)
【非特許文献１２】Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, Kim SK 著、Pharmaceutically active secondary metabolites of marine actinobacteria."、Microbiol Res. 2014 Apr;169巻、4号、262-78頁、 doi: 10.1016/j.micres.2013.07.014.
【非特許文献１３】Magarvey, N. A., J. M. Keller, V. Bernan, M. Dworkin, and D. H. Sherman. 著、Isolation and characterization of novel marine-derived actinomycetetaxa rich in bioactive metabolites." Appl. Environ. Microbiol. 70巻、7520-7529頁(2004)
【非特許文献１４】Mincer, T. J., P. R. Jensen, C. A. Kauffman, and W. Fenical. 著、"Widespread and persistent populations of a major new marine actinomycete taxon in ocean sediments." Appl. Environ. Microbiol. 68巻、5005-5011頁(2002)
【非特許文献１５】ela´ez, F. 著、 "The historical delivery of antibiotics from microbial natural products- can history repeat?" Biochem. Pharmacol.、 71巻、981-990頁(2006)
【非特許文献１６】Newman, D. J., and G. M. Cragg. 著、 "Natural products as sources of new drugs over the last 25 years." J. Nat. Prod. 70巻、461-477頁(2007)
【非特許文献１７】Peak KK, Duncan KE, Luna VA, King DS, McCarthy PJ, Cannons AC. 著、“Bacillus Strains Most Closely Related to Bacillus nealsonii Are Not Effectively Circumscribed within the Taxonomic Species Definition.” Int J Microbiol. 2011;2011:673136. doi: 10.1155/2011/673136. Epub 2011 Oct 20
【非特許文献１８】Riedlinger, J., A. Reicke, H. Zahner, B. Krismer, A. T. Bull, L. A. Maldonado, A. C. Ward, M. Goodfellow, B. Bister, D. Bischoff, R. D. Sussmuth, and H. P. Fiedler. 著、 “Abyssomicins, inhibitors of the para-aminobenzoic acidpathway produced by the marine Verrucosispora strain AB-18-032.” J. Antibiot.(Tokyo) 57巻、271-279頁(2004)
【非特許文献１９】Sekurova, O, Sletta H, T.E.E., Valla S, Zotchev S. 著、 “Molecular cloning and analysis of a pleiotropic regulatory genelocus from the nystatin producer Streptomyces nourseiATCC11455.” FEMS Microbiology Letters. 177巻、 297-304頁(1999)
【非特許文献２０】Thompson, C.J., J.M. Ward, and D.A. Hopwood. 著、 “DNA cloning in Streptomyces: resistance genes from antibiotic-producing species.” Nature、286巻、525-527頁(1980)
【非特許文献２１】Wendt-Pienkowski, E., Y. Huang, J. Zhang, B. Li, H. Jiang, H. Kwon, C.R. Hutchinson, and B. Shen.著、 “Cloning, sequencing, analysis, and heterologous expression of the fredericamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces griseus.” J. Am. Chem. Soc. 127巻、16442-16452頁(2005)
【非特許文献２２】Zotchev, Sergey. 著、 “Marine actinomycetes as an emerging resource for the drug development pipelines.”、Journal of Biotechnology. vol.、 158巻、4号 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このように、微生物の多様性を掘り起こすことは、出現する多剤耐性の課題に立ち向かうために、新規かつ多様な抗菌剤のリードを得るための最も有望な源を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、式ＩＩＩによる構造を有する新たな化合物ならびにその誘導体、塩および溶媒和物を提供する。
【００１２】
【化１】
2019521078.tif 000003
【００１３】
以下の工程を含む、本化合物を産生するための方法も提供される：
ａ）以下からなる群から選択される細菌を、海水を含む適切な培地中で培養する工程：
ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；および
ｉｉ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する菌株などのｉ）の細菌単離株と密接に関連した細菌；
ｂ）培養液から請求項１に記載の化合物を抽出する工程。
【００１４】
化合物を産生するための方法の一実施形態では、細菌は、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む細菌である。
【００１５】
さらに、本方法の工程ｂ）は、培養細菌を遠心分離して、化合物を抽出する細胞ペレットを得る工程と、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて細胞ペレットから化合物を抽出する工程とを含むことができると明示される。
【００１６】
一実施形態では、培地はＰＭ６であり、任意に人工海水を有する。
【００１７】
請求項１に記載の化合物を産生するための単離された細菌の使用も提供され、細菌は、
ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；および
ｂ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などのａ）の細菌単離株と密接に関連した細菌からなる群から選択される。
【００１８】
密接に関連した細菌が、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含むと明示される、単離された細菌の使用がさらに提供される。
【００１９】
本発明の別の態様は、本発明の化合物と、薬学的に許容される１つ以上の担体および／または賦形剤と、抗微生物剤、より具体的には抗菌剤など、治療に使用するための化合物とを含む医薬組成物である。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、本発明の化合物または医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者における細菌感染症を治療するための方法である。
【００２１】
さらに別の実施形態によれば、細菌感染症は、グラム陽性および／またはグラム陰性細菌の多耐性細菌などの多剤耐性細菌によって引き起こされる。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、本発明の化合物または医薬組成物を死滅または阻害すべき細菌と接触させる工程を含む、細菌を死滅させる、またはその増殖を阻害する方法である。
【００２３】
本発明は、抗菌剤としての化合物の非医学的使用も含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＨＰＬＣで分画したＭＰ１２７−ｉｇ１７抽出物の活性画分のＬＣ−ＤＡＤ−イソプロット（上のスペクトル）およびＥＳＩ＋（中央）のＭＳスペクトルおよびＥＳＩ−（下）のＭＳスペクトルである。
【図２】構造を支持する重要なＮＭＲおよびＭＳデータを伴うＭＢＬ−ＡＢ０１の構造である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、新たな抗菌剤を提供する。本発明者らは、海洋堆積物由来の放線菌単離株を分析し、それによって、抗菌性二次代謝産物を産生することができる新たな細菌を同定した。
【００２６】
マイクロウェル、振盪フラスコおよび発酵槽培養を使用することによって、本発明者らは、抗菌および抗真菌化合物の産生のための培養条件を同定することができた。本アプローチにより、新規抗菌化合物ＭＢＬ−ＡＢ０１を同定した。
【００２７】
したがって、本発明は、ＭＢＬ−ＡＢ０１などの新規抗菌化合物を提供する。
【００２８】
ＭＢＬ−ＡＢ０１などの化合物は、二次代謝産物と呼ばれることが多い、微生物によって産生される化合物群に属する。
【００２９】
「二次代謝産物」とは、微生物が合成できる化合物を意味する。それらは、増殖および再生などの基本的な代謝過程に必須ではない。二次代謝産物は、抗癌および／または抗真菌および抗菌活性などの抗菌活性などの他の有用な特性を有し得る（非特許文献１、非特許文献２）。
【００３０】
化合物ＭＢＬ−ＡＢ０１の構造解明は、化合物がキサントンの種類の化合物に属する新たな化合物であることを明らかにした。分子式は式Ｉに示す通りである：
【００３１】
【化２】
2019521078.tif 000004
【００３２】
本化合物の一般的な分子構造を式ＩＩに示す：
【００３３】
【化３】
2019521078.tif 000005
【００３４】
Ｒ1は、塩素、臭素およびヨウ素から選択されるハロゲン原子であり得、Ｒ2およびＲ3は、−Ｏ−ＣＨ3であり得る。Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ1および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ1Ｒ2であり、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、Ｃ2−Ｃ4−アルケニル基、Ｃ2−Ｃ4アルキニル基およびフェニル基である。
【００３５】
本発明による化合物は、一般構造式ＩＩを有するキサントン化合物である。
【００３６】
一実施形態では、本発明は分子式Ｉおよび式ＩＩＩに示す構造、ならびにその誘導体、溶媒和物および／または水和物を有する。
【００３７】
【化４】
2019521078.tif 000006
【００３８】
公知化合物であるキサントリピンは、式Ｉに示したのと同じ分子式を有する。しかし、構造の比較により、キサントリピン分子と本発明のＭＢＬ−ＡＢ０１分子との間に有意差が明らかになった。以下、その差異について要約する。
【００３９】
【表１】
2019521078.tif 000007
【００４０】
本発明は、式ＩＩＩに示される構造を有する化合物、およびその誘導体、溶媒和物および／または水和物である。本発明によって提供されるように、誘導体は式ＩＩに示される構造を有する化合物であり、式中、Ｒ1は塩素、臭素およびヨウ素から選択されるハロゲン原子であり、Ｒ2およびＲ3は−Ｏ−ＣＨ3である。Ｒ4は−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ1および−Ｃ（Ｏ）ＮＲ1Ｒ2であり、Ｒ1およびＲ2は、独立して水素、Ｃ1−Ｃ4−アルキル基、Ｃ2−Ｃ4−アルケニル基、Ｃ2−Ｃ4アルキニル基フェニル基である。
【００４１】
用語「溶媒和物」は、その固体構造に関連した１つ以上の溶媒分子を有する固体化合物を指す。溶媒和物は、固体化合物が溶媒から結晶化するときに形成し得、１つ以上の溶媒分子が固体結晶マトリックスの不可欠な部分になる。本明細書に記載の式の化合物は溶媒和物であり得る。別のタイプの溶媒和物は水和物である。「水和物」は、同様に、分子レベルでその固体または結晶構造に密接に関連した１つ以上の水分子を有する固体化合物を指す。水和物は特定のタイプの溶媒和物である。水和物は、化合物が水中で凝固または結晶化するときに形成し得、１つ以上の水分子が固体結晶マトリックスの不可欠な部分になる。本明細書に記載の式の化合物は水和物であり得る。
【００４２】
本発明による新たな抗菌化合物は、放線菌（Actinalloteichus）属の菌株などの放線菌によって産生される。特定の一実施形態では、本発明の抗菌化合物は、海洋堆積物由来細菌単離株ＭＰ１２７−ｉｇ１７または密接に関連した菌株の培養によって産生される。
【００４３】
「密接に関連した菌株」とは、単離された菌株と類似の遺伝子型および／または表現型の特性を共有する菌株を意味する。特に、この語句は、実質的に同じ機能活性を保持するわずかに改変された形態の菌株を包含する。したがって、例えば、いくつかのアミノ酸またはヌクレオチドの付加、欠失または変更は、ほとんど効果がない。存在する場合には、本発明による化合物を産生する機能的能力に依存する。「密接に関連した菌株」という用語の定義は、本明細書中で使用され得るＰｅａｋらに提供される。
【００４４】
さらに、本発明は、放線菌（Actinalloteichus）属の菌株などの放線菌を培養する工程を含む、ＭＢＬ−ＡＢ０１などの抗菌剤を産生するための方法を提供する。特定の一実施形態では、化合物は、ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；およびｉｉ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などのｉ）の細菌単離株と密接に関連した細菌からなる群から選択された細菌によって産生される。
【００４５】
本明細書に記載の化合物産生細菌は、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に記載の配列と少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８２％、８３％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９８．７％、９８．８％、または９９％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む細菌であり得る。
【００４６】
当業者は、その全体構造、機能および特性を有意に変更することなく、配列番号１に定義された配列およびそのサブ配列にかなりの変更を導入することができると予想する。
【００４７】
「表現型特性」とは、本発明による二次代謝産物、すなわち式ＩＩおよび／またはＩＩＩのいずれか１つによる分子構造を有する化合物を産生する能力を意味する。
【００４８】
「遺伝子型特性」とは、例えば配列同一性として知られている１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子などの核酸およびアミノ酸などの遺伝分子の特徴を意味する。本明細書で「類似の遺伝子型特性を有する菌株」としては、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に記載の配列と少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８２％、８３％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９８．７％、９８．８％または９８．９％または９９％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む細菌が挙げられる。
【００４９】
「細菌単離物」という表現は、１つの細菌株の培養物を定義するために使用されることが多い。単離物は、当業者に公知の種々の手段によって精製および単離することができる。本明細書で使用する「細菌単離物」または「細菌株」は、精製されたサンプルを適切な培地にブロットすることから典型的な誘導可能なコロニーへ戻って追跡可能な、遺伝子型および表現型の独特の微生物を指す。単離物、菌株および細菌の表現は互換的に使用される。
【００５０】
本発明の方法によれば、細菌は、当業者に公知の適切な培地を用いた微生物培養で培養される。一実施形態では、培地は海水を含む。
【００５１】
「微生物培養」または微生物培養は、制御された実験室条件下で所定の培養培地中で微生物を再生させることによって微生物を増殖させる方法である。「培養」という用語は、より一般的には、実験室で特定の微生物を細菌として「選択的に増殖させること」を指すために非公式に使用される。
【００５２】
本発明による化合物は、本明細書に記載の細菌培養物から得られる。
【００５３】
したがって、本発明は、本明細書に記載の細菌を適切な培地で培養することによって、式ＩＩＩの化合物およびその誘導体、溶媒和物および／または水和物を産生するための方法を提供する。
【００５４】
一実施形態では、培地は、細菌を培養するために一般に使用される市販の増殖培地、例えばトリプトン大豆ブロス（Ｏｘｏｉｄ）である。別の実施形態では、培地は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地などの標準培地である。さらに別の実施形態は、非特許文献１０に記載のＰＭ６などの放線菌による二次代謝産物の産生のために設計された複合培地である。さらに別の実施形態では、培地が人工海水で補充される。一実施形態では、化合物を産生する細菌株との接種培養物が、海水を伴うトリプトン大豆ブロス培地で充填されたフラスコ内で産生される。
【００５５】
培養された細菌を含む培養物は、任意に産生培養物であってもよい。産生培養物は、種培養物から接種することができる。産生培養物は、人工海水を伴うＰＭ６培地などの適切な培地で充填されたフラスコ内で産生され得る。
【００５６】
「適切な培地」とは、問題の細菌を増殖させるのに適した当業者に公知の任意の培地を意味する。本明細書で使用される場合、表現「培地」または「発酵培地」または「細胞培養」は、増殖のために使用される栄養液を指し、単離株を培養する状況で使用されるすべての種類の培地を指す。典型的には、培地は、糖、デンプン、小麦粉または酵母の抽出物などの炭素源、タンパク質およびアミノ酸または硫酸アンモニウムを含む小麦粉などの窒素源、および無機塩などの無機物を含む。
【００５７】
培地は、ＭＲ６（非特許文献１１）、非特許文献１０に記載のＰＭ４、ＰＭ５およびＰＭ６などの複合培地またはＩＳＰ２などの標準培地など、化学的に定義することができる。抗生物質の化合物の産生のための培地の他の典型的な例は、Ｒ２ＹＥ（非特許文献２０）、Ｒ５（非特許文献１１）およびＡＭＰ（非特許文献２１）である。
【００５８】
本発明の方法は、培養物から抗菌化合物を単離する工程をさらに含む。培養された細菌からの化合物の単離は、当業者に周知の手段によって行うことができる。
【００５９】
化合物を得る１つの方法は、それを産生培養物および／または産生培養物の遠心分離によって集める細胞ペレットから抽出することによる。これは、培養物の遠心分離によって集めた乾燥物質を回収することによって行うことができる。任意に、乾燥物質をメタノールで洗浄して、活性化合物に関連しない化合物を抽出することができる。
【００６０】
化合物は、当業者に公知の適切な溶媒によって抽出することができる。
【００６１】
特定の一実施形態では、産生培養物からの乾燥物質を遠心分離によって集め、任意に、例えば細胞ペレットを凍結乾燥させることによって、当業者によく知られた手段によって分画または溶解することができる。
【００６２】
さらに、ＤＭＳＯまたはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）０．１％まで添加ＤＭＳＯなどの適切な溶媒によって化合物を抽出することができる。化合物は、アルコールおよびアルカンなどの他の有機溶媒によって抽出することもできる。任意に、濾過によって不溶解物質を除去する。一実施形態では、化合物は、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーによってさらに分離される。一実施形態では、分離は塩基性条件のＨＰＬＣによって行われる。
【００６３】
任意に化合物の分解を回避するために、画分のｐＨを、例えば分画前にフラクションコレクターのバイアルの各々にｐＨ＝４の酢酸アンモニウム緩衝液のような緩衝液を添加することによって調整することができる。画分中の活性化合物は、固相カラムにさらに結合され、任意にｐＨ＝４の酢酸アンモニウム緩衝液で酸性化されたメタノールのようなアルコールで調整される。化合物をカラムに結合させた後、メタノールなどの酸性化アルコールで不純物をカラムから洗い流す。
【００６４】
化合物を、メタノールなどのアルコールを用いてカラムからさらに溶出させ、任意にｐＨをｐＨ＝８．０に調整した酢酸アンモニウム緩衝液も添加する。さらに、化合物を単離する方法は、化合物に水を添加して凍結乾燥する前に、アルコールまたは他の溶媒を真空遠心分離機によって除去する工程を含むことができる。
【００６５】
本発明の化合物を同定するための方法は、ＨＰＬＣ−ＭＳまたはＨＰＬＣ−ＵＶなどの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および高分解能質量分析（ＭＳ）の使用による。
【００６６】
非特許文献１０には、海洋放線菌の単離プロセスが記載されている。本研究は、２７種の放線菌の分子分類学および系統発生分析を提供した。表１には、海綿由来のＴＳＩ１２７−１７と呼ばれる１つの単離株が記載されている。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列分析は、ＴＳＩ１２７−ｉｇ１７が、遺伝子アクセッション番号ＤＱ１４４２２２のＡｃｔｉｎｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｙｍｅｎｉａｃｉｄｏｎｉｓＨＰＡ１７７と９８．９７％の遺伝子類似性を有することを明らかにした。非特許文献１０は、ＰＫＳ／ＮＲＰＳ遺伝子についてのＰＣＲスクリーニングを使用して、これらの放線菌単離株がポリケチドおよび非リボソーム性ペプチド由来二次代謝産物を合成する可能性を調べ、これらの放線菌単離株が二次代謝産物を合成する可能性を示した。
【００６７】
ここで、寄託された細菌（ＤＳＭ  ３２２８７）は、そのゲノム中に、配列番号１に示される配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子を含む。
【００６８】
本発明の態様は、ＭＢＬ−ＡＢ０１として抗菌化合物を産生する放線菌の新規細菌単離株の使用である。
【００６９】
したがって、本発明は、抗菌化合物ＭＢＬ−ＡＢ０１などの二次代謝産物を産生するＡｃｔｉｎａｌｌｏｔｅｃｈｕｓ属の細菌の使用である。使用される細菌は、抗菌化合物産生菌株Ａｃｔｉｎａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｙｍｅｎｉａｃｉｄｏｎｉｓであってもよい。
【００７０】
特定の実施形態では、本発明のこの態様による細菌は、ＭＰ１２７−ｉｇ１７と命名された細菌単離株（ＤＳＭ３２２８７）、または本明細書で定義される密接に関連した菌株である。別の特定の実施形態では、本発明は、ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；およびｉｉ）ＭＢＬ−ＡＢ０１と同じ機能的特性を有する、式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩのいずれか１つによる構造を有する化合物、ならびにそれらの誘導体、溶媒和物および／または水和物などの二次代謝産物を産生する、単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などのｉ）の細菌単離株と密接に関連した細菌からなる群から選択される細菌の使用である。
【００７１】
本明細書に記載の化合物産生細菌は、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示す配列と少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８２％、８３％、８５％、８６％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９８．７％、９８．８％または９８．９％または９９％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む細菌であり得る。新たな抗菌化合物であるＭＢＬ−ＡＢ０１の構造および生物学的特徴が特徴づけられた。本発明の化合物は、多剤耐性細菌を含む種々の細菌株の増殖を阻害することが示された強力な抗菌剤であることが示された。
【００７２】
実施例５に記載のようなインビトロの研究によって抗菌活性を測定した。
【００７３】
実施例６に記載のように、ＭＢＬ−ＡＢ０１は、キサントリピンなどの同等化合物よりも細胞傷害性が小さいこともin vitroで実証されている。したがって、ＭＢＬ−ＡＢ０１は、種々の医薬組成物において有用な抗菌剤として非常に魅力的な候補である。
【００７４】
したがって、本発明は、治療などの医療用途における本発明の化合物の使用も提供する。本発明は、治療、特に細菌感染症の治療に使用するための、式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【００７５】
用語「治療すること」、「治療する」および「治療」は、（ｉ）疾患、病理的または医学的状態の発生を防ぐこと（例えば、予防）；（ｉｉ）疾患、病理的または医学的状態を阻害するか、またはその進展を阻止すること；（ｉｉｉ）疾患、病理的または医学的状態を緩和すること；および／または（ｉｖ）疾患、病理学的または医学的状態に関連した症状を減らすことを含む。したがって、用語「治療する」、「治療」および「治療すること」は、予防にまで及ぶことができ、治療される状態または症状の進行または重症度を防止する、防止、防止すること、低下させること、停止させること、または逆転させることを含むことができる。このように、「治療」という用語は、適宜、医学的、治療的および／または予防的投与を含むことができる。
【００７６】
用語「阻害する」、「阻害すること」および「阻害」は、疾患、感染症、状態、または細胞群の増殖または進行を遅らせること、停止させること、または逆転させることを指す。阻害は、例えば、治療または接触がない場合に発生する増殖または進行と比べて、約２０％、４０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９９％よりも大きくすることができる。
【００７７】
本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩または溶媒和物は、それ自体を使用することができるが、一般に、化合物／塩／溶媒和物（活性成分）が、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を伴っている医薬組成物の形態で投与することができる。このような医薬組成物が本発明によって提供される。
【００７８】
本明細書に記載の化合物は、例えば、本化合物を薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体と組み合わせることによって、治療的医薬組成物を調製するために使用することができる。本化合物は、塩または溶媒和物の形態で担体に添加することができる。例えば、化合物が安定な毒性のない酸または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、塩としての化合物の投与が適切であり得る。薬学的に許容される塩の例は、生理学的に許容されるアニオンを形成する酸、例えばトシレート、メタンスルホネート、アセテート、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩およびＯ−グリセロリン酸塩から形成される有機酸付加塩である。塩酸塩、ハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、および炭酸塩（非特許文献７）を含む適切な無機塩も形成され得る。
【００７９】
したがって、本発明は、式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、種々の微生物感染症の治療に有用である。
【００８０】
本発明はさらに、菌株、培養液、培地、接種物、抽出物、細胞ペレット、または式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物およびそれらの塩を含む組成物、ならびに有害な微生物による感染症に対する保護のためのそれらの使用、および菌株、培養液、培地、接種物、抽出物、細胞ペレット、または式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物およびそれらの塩を含む組成物の有効量で微生物感染症に対してヒトを含む動物を治療することを含む対応する方法に関する。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、本発明の産物（微生物菌株、薬剤、化合物または製剤）に関する「組成物」は、成分の組み合わせを指し、「処方すること」とは、製剤を形成するために添加する成分の組み合わせのための処方箋などの処方を使用するプロセスである。このような組成物は、製剤とも呼ばれ得る。菌株、培養液、培地、接種物、抽出物、細胞ペレット、または式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物、および本発明の組成物は、それぞれ抗菌剤または抗生物質として適切である。
【００８２】
本発明は、受託番号ＤＳＭ３２２８７を有する単離された細菌の培養物、菌株、培養液、培地、接種物、抽出物、細胞ペレット、または式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物および本発明のそれらの塩を含むキットをさらに含む。単離された細菌の培養物、菌株、培養液、抽出物、無細胞抽出物、培地、接種物、または式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの化合物および本発明のそれらの塩を含むキットは、広域スペクトルの細菌の感染症を治療するために有用である。
【００８３】
本発明は、式Ｉ、ＩＩおよび／またはＩＩＩのいずれか１つの化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を薬学的に許容される希釈剤、賦形剤または担体と混合することを含む、本発明の医薬組成物の調製のためのプロセスを尚さらに提供する。当業者は、投与経路に依存する適切な薬学的賦形剤を同定することができるであろう。
【００８４】
抗微生物剤、より具体的には抗菌剤などの薬剤として使用するための化合物が提供される。
【００８５】
本発明のin vitro抗菌活性を、細菌株のパネルに対して測定した。実施例に示されるように、本発明による化合物は、バンコマイシン耐性腸球菌属フェシウム菌を含む多耐性グラム陽性細菌に対して有効である。
【００８６】
化合物を産生するための、寄託された細菌単離株または密接に関連した菌株などの細菌の使用も提供される。
【００８７】
本発明は、感染症を有する哺乳動物に有効量の本明細書に記載の化合物または組成物を投与することを含む、哺乳動物における感染症を治療する治療方法を提供する。哺乳類としては、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギなどが挙げられる。感染症は、細菌感染症、例えば、本明細書に記載の細菌によって引き起こされる感染症であり得る。本発明による化合物を死滅させる細菌と接触させる工程を含む、細菌の殺滅または増殖を阻害する方法も提供される。この方法は、細菌を本明細書に記載の医薬組成物と接触させる工程をさらに含むことができる。
【００８８】
細菌感染症を治療するための本発明の化合物の能力は、当該分野に周知のアッセイを使用することによって測定され得る。例えば、治療プロトコールの設計、毒性評価、データ分析、細胞死滅の定量、および抗菌スクリーニングの使用の生物学的意義が知られている。さらに、化合物が細菌感染症を治療する能力または細菌を死滅させる、または阻害する能力は、本明細書に記載のアッセイを用いて測定され得る。
【００８９】
「一実施形態」、「ある実施形態」などの明細書における言及は、記載された実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分または特性を含むことができるが、必ずしもすべての実施形態がその態様、特徴、構造、部分または特性を含むとは限らない。さらに、このような語句は、必ずしもそうする必要はないが、本明細書の他の部分で言及された同じ実施形態に言及してもよい。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分または特性がある実施形態に関連して記載されている場合、明示的に記載されているか否か問わず、このような態様、特徴、構造、部分または特性に影響を及ぼすか、または結びつけることは当業者の知識の範囲内である。
【００９０】
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば、「化合物」への言及は複数のこのような化合物を含み、そのため化合物Ｘは複数の化合物Ｘを含む。さらに、任意のオプションの要素を除外するようにクレームを起草することができることに留意されたい。このように、この記載は、請求項の要素の列挙または「否定的」限定の使用に関連して、「専ら」、「単に」などの排他的な用語の使用の先行する基礎として役立つことを意図している。
【００９１】
「および／または」という用語は、項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、またはこの用語が関連するすべての項目を意味する。
【００９２】
「約」という用語は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指すことができる。例えば、「約５０パーセント」は、いくつかの実施形態では、４５パーセントから５５パーセントの変動を有することができる。
【００９３】
当業者には理解されるように、成分の量、分子量、反応条件などの性質を表すすべての数は近似値であり、すべての場合において任意に「約」という用語によって修飾されるものとして理解される。これらの値は、本明細書の記載の教示を利用する当業者によって得られることが求められる所望の性質に応じて変化し得る。このような値は、それぞれの試験の測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる変動性を本質的に含むことも理解される。
【００９４】
［実施例］
実施例１：ＭＰ１２７−ｉｇ１７の単離
ＭＰ１２７−ｉｇ１７の分離および分類
Ａｃｔｉｎｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｙｍｅｎｉａｃｉｄｏｎｉｓ（ＴＳＩ１２７−１７）に属する細菌単離株の単離が以前に記載されている（非特許文献１０）。
【００９５】
まもなく、海綿サンプルを、６０ｍの深さで、Ｔａｕｔｒａ尾根（６３°３６’５３”Ｎ、１０°３１’２２”Ｅ、トロンハイム・フィヨルド、ノルウェー）から集めた。ホモジナイズした材料を種々の寒天培地に播種し、ＭＰ１２７−ｉｇ１７と称する単離株を、０．５×天然海水と１ｍｌ／ｌビタミンＢ溶液（各５ｍｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、リボフラビン、ナイアシン、ピリドキシン−ＨＣｌ、イノシトール、Ｃａ−パントテン酸塩、ｐ−アミノ安息香酸、および２．５ｍｇ／ｌのビオチン）とで調製した寒天培地ＩＭ１８：３ｇ／ｌのカニ粉、２ｇ／ｌの海藻粉、２０ｇ／ｌの寒天、ｐＨ８．０から単離した。ＭＰ１２７−ｉｇ１７は、海水がない場合この培地上で増殖しなかった。
【００９６】
１６Ｓ  ｒＤＮＡのシーケンシングは、Ａｃｔｉｎａｌｌｏｔｏｔｅｃｈｕｓ  ｈｙｍｅｎｉａｃｉｄｏｎｉｓ  ＨＰＡ１７７と９８．９７％の遺伝子類似性を示した。
【００９７】
ＭＰ１２７−ｉｇ１７は、ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された。
【００９８】
生理活性スクリーニング
海綿サンプルからの単離物を２５℃で種々の産生培地で培養し、抽出物を以前に記載された寒天拡散アッセイを用いてスクリーニングした（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、２０１０）。ＭＰ１２７−ｉｇ１７と命名された単離物を、２５％の２×人工海水を伴うＰＭ６培地（可溶性デンプン１０ｇ／ｌ；酵母エキス２ｇ／ｌ；グルコース１０ｇ／ｌ；グリセロール１０ｇ／ｌ；コーンスティープパウダー２．５ｇ／ｌ；ペプトン２．０ｇ／ｌ；ＣａＣＯ３  ３．０ｇ／ｌ）で培養した。２×人工海水は次のように調製した：１．３４ｇ／ｌのＫＣｌ、２．７２ｇ／ｌのＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ、１２．５８ｇ／ｌのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、９．３２ｇ／ｌのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．３６ｇ／ｌの重炭酸ナトリウム、ｐＨ＝７．８。溶液を濾過滅菌した。
【００９９】
ＭＰ１２７−ｉｇ１７の抽出物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＡＴＣＣ９３４１、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＣＣＵＧ３７８３２、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＣＵＧ３９４３４の増殖を阻害することができることが示された。
【０１００】
実施例２：生理活性化合物、ＭＢＬ−ＡＢ０１の同定
ＭＰ１２７−ｉｇ１７の接種物を、０．５×人工海水を含む１００ｍｌのトリプトン大豆ブロス培地（Ｏｘｏｉｄ）で充填した５００ｍｌの振とうフラスコ中で産生した。培養物を３０℃で５日間培養した。産生培養物を種培養物から接種した（３％、ｖｏｌ／ｖｏｌ）。産生は、０．５×人工海水を含むＰＭ６培地１２５ｍｌを充填した５００ｍｌの振盪フラスコ中で行った。培養物を２５℃で１２日間培養した。培養物を凍結乾燥させ、ＤＭＳＯで抽出した。
【０１０１】
ＤＭＳＯ抽出物を、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）およびフラクションコレクタシステムに接続されたＺｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰカラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムで分画した。メタノールおよび１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４）を移動相として使用し、メタノール勾配を２４分間１０％から９０％まで直線的に増大させた。全実行のために毎分画分を採取した。画分を真空遠心分離機で乾燥させ、ＤＭＳＯに再溶解させた。
【０１０２】
本画分を、指標微生物としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＡＴＣＣ９３４１およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＣＣＵＧ３７８３２を用いたロボット液体ベースバイオアッセイで活性について試験した。活性画分を、ＤＡＤおよび飛行時間型（ＴＯＦ）装置に接続されたＺｏｒｂａｘ  Ｂｏｎｕｓ−ＲＰカラム（２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムで分析して、生理活性化合物の精密質量を測定した。１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７）およびアセトニトリルを移動相として使用し、エレクトロスプレーイオン化は陰性モードで行った。
【０１０３】
活性画分の３９５ｎｍにおけるＵＶ吸収ピークは、ＭＢＬ−ＡＢ０１の分子量と矛盾しない陽性および陰性のエレクトロスプレーイオン化を伴うＬＣＭＳ  Ｑ−Ｔｏｆクロマトグラムのピークと相関した。正しい分子構造を得た後、分子量は５５１．０６１９２７と計算された。スペクトルを図１に示す。
【０１０４】
実施例３：活性化合物、ＭＢＬ−ＡＢ０１の特徴づけ
同位体標識および分子式の決定
ＭＢＬ−ＡＢ０１の分子式は、13Ｃ、15Ｎまたは13Ｃおよび15Ｎ標識化合物を含む培地中での産生によって決定した。シードは、２段階培養で産生された。まず、ＭＰ１２７−ｉｇ１７を５０％海水で補充したＴＳＢブロスに接種し、４日間培養し、次いでシードを５０％の海水で補充した13Ｃ、15Ｎまたは13Ｃ＋15Ｎ標識（Ｓｉｌａｎｔｅｓ）を含む大腸菌−ＯＤ２培地に再接種し、６日間培養した。シードを以下の組成: 13Ｃ、15Ｎまたは13Ｃ＋15Ｎ標識（Ｓｉｌａｎｔｅｓ）を用いた大腸菌−ＯＤ２培地；５３７ｍｌ／ｌ、非標識または15Ｎ標識（ＮＨ4）2ＳＯ4；０．３４ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ；０．１７ｇ／ｌ、ＣａＣＯ3；２．１ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4；０．０８６ｇ／ｌ、非標識または13Ｃ標識グルコース；１０ｇ／ｌ、ＴＭＳ１（Ｏｌｇａ  Ｓｅｋｕｒｏｖａ  Ｈaｖａｒｄ  Ｓｌｅｔｔａ  １９９９）；１．３ｍｌ／ｌを含む産生培地に移し、１１日間培養した。培養物を凍結乾燥させ、ＤＭＳＯで抽出し、上記のように分析した。非標識、13Ｃ標識、15Ｎ標識および13Ｃかつ15Ｎ標識ＭＢＬ−ＡＢ０１の陰性モードの質量は、それぞれ５５０．０５、５７７．０５、５５１．０５および５７８．１４であった。したがって、13Ｃおよび15Ｎ標識化による増大した原子量は、ＭＢＬ−ＡＢ０１が２７の炭素および１つの窒素を有することを示す。
【０１０５】
ＦＴ−ＩＣＲを用いた分子式の決定と構造解明
ＭＢＬ−ＡＢ０１の特徴づけを、ＥＳＩ源を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｓｏｌａｒｉｘ１２Ｔ  ＦＴ  ＩＣＲ  ＭＳへの直接注入によって行った。ＭＳスペクトルを、陽性および陰性ＥＳＩモードで記録した。スペクトル中の最も豊富なイオンを単離し、ＣＩＤによって断片化した。質量較正を、ＮａＴＦＡ標準を用いて外部から行った。サンプルをメタノール／水で希釈した。
【０１０６】
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｍｐａｓｓデータ解析ソフトウェアを使用して、検出されたイオンの可能な分子式組成を予測した。すべてのイオンについてＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏの存在を考慮して予測を行った。さらに、同位体パターンがＣ、Ｈ、Ｎ、およびＯ以外の原子の存在を示唆する調査で、他の元素；Ｓ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｐなどが含まれていた。示唆された分子式の理論同位体パターンをＭＳスペクトルの信号と比較した。ｄ４−メタノール中のＭＢＬ−ＡＢ０１のサンプルを希釈することによってＨＤＸ分析を行い、６０、１２０分および２４０時間後にＣＩＤスペクトルを記録した。
【０１０７】
同位体パターンはＣｌの存在を示す。分子式をＣ27Ｈ18ＣｌＮＯ10として同定し、この式は、発酵標識実験と、ＬＣ−ＱＴＯＦおよびＦＴ−ＩＣＲの両方で観察された同位体分布の結果とは矛盾しない。断片化実験は、示唆された分子イオンからのＣＯ2に続いて水の欠失を示す。ＨＤＸ分析は、最大５つの交換可能なプロトンの存在を示す。
【０１０８】
ＮＭＲを用いた構造解明
本目的は、５５１．０６１９２７Ｄａの質量およびＣ27Ｈ18ＣｌＮＯ10の化学式を有する、実施例２の活性化合物として同定された分子の化学構造を同定することであった。キサントリピンは、この化学式についてパブリック・ドメインとして開示されている唯一の分子であるが、データは、ＭＢＬ−ＡＢ０１がキサントリピンと同一ではないことを明確に示している。
【０１０９】
０．７ミリグラムの精製ＭＰ１２７−ｉｇ１７のバイアルを得た。固体材料を、ＮＭＲ実験が行われるまで−１８℃で保存した。
【０１１０】
サンプルをバイアル中の１２０μｌのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した。本溶液を３ｍｍのＮＭＲサンプルＰＮ０２７−２０−０２に移した。追加の６０μｌのＤＭＳＯ−ｄ６を用いてバイアルをすすぎ、この洗浄液をＮＭＲチューブに移した。キャップをはめる前にチューブを窒素ガスでフラッシュした。ＴＣＯクライオプローブ（13Ｃ内部コイル、すなわち炭素検出に最適化された）を備えた８００ＭＨｚ分光計でＮＭＲ実験を行った。
【０１１１】
１Ｄ1Ｈスペクトルにより、ＭＢＬ−ＡＢ０１の非常に純粋なサンプルが明らかになった。サンプルを多数の追加ＮＭＲスペクトルで分析した（図２参照）。
【０１１２】
ＭＢＬ−ＡＢ０１（式ＩＩＩ参照）の提案された構造は、入手可能なすべてのＮＭＲおよびＭＳデータによって支持され、矛盾しない。この構造はまた、関連する化合物（例えば、キサントリピン）の生合成経路についてのデータおよび刊行物に関して合理的ならびに一般的な有機化学の観点から完全に現実的であると考えられている。
【０１１３】
【化５】
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【０１１４】
実施例４：０．５×人工海水を含む細菌培養物からの活性化合物の単離
ＭＢＬ−ＡＢ０１の産生のためのＭＰ１２７−ｉｇ１７の培養を、バッチ発酵（使用したＰＭ６＿ＭＯＤ３培地の組成：可溶性デンプン３０ｇ／ｌ；酵母抽出物２ｇ／ｌ；コーンスティープリカー２．５ｇ／ｌ；ペプトン２．０ｇ／ｌ；ＣａＣＯ3  ３．０ｇ／ｌ）で１．６５リットルのＰＭ６＿ＭＯＤ３培地を含む３リットルのＡｐｐｌｉｃｏｎ発酵槽で行った。発酵は２５℃で８日間、開始から０．２５ｖｖｍの通気（分あたりの単位液体体積あたりの気体体積流量）で行い、その後、培養および攪拌の残りの間、１５ｖｖｍに減少させた。溶存酸素は３０％超であった。発酵のための種培養物を、１００ｍｌのトリプトン大豆ブロス培地（Ｏｘｏｉｄ）を含む５００ｍｌのバッフル付き振とうフラスコ中で調製した。
【０１１５】
ＰＭ６＿ＭＯＤ３発酵ブロスからの乾燥物質を遠心分離によって集め、次いで凍結乾燥させた。次いで得られた粉末を５０ｍｌメタノール／ｇ粉末で洗浄し、５および１０ｍｌのＤＭＳＯ／ｇ粉末でそれぞれ２回抽出した。２つのＤＭＳＯ抽出物を混合し、次いで凍結乾燥させた。乾燥抽出物を少量のＤＭＳＯに再懸濁させ、不溶解物質を濾過によって除去した。
【０１１６】
この抽出物を、ダイオードアレイ検出器およびフラクションコレクターに接続されたＺｏｒｂａｘ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＢＤ−Ｃ１８、５μｍ、９．４×２５０ｍｍカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣシステムで分離した。０．４％２５％ＮＨ３／ｌ［Ａ］およびメタノールを添加した２０ｍＭ酢酸アンモニウムを移動相として使用した。ＨＰＬＣを、最初の７．５分間７６％均一濃度［Ｂ］で行った。７．６〜９．０分で１００％［Ｂ］を適用した。活性化合物は約５．５分で溶出した。化合物の分解を回避するために、０．０１×画分容量の５０ｇ／ｌの酢酸アンモニウムｐＨ＝４を分画前にフラクションコレクターバイアルの各々に添加した。画分中の活性化合物を、１００％メタノール、次いで０．１％の５０ｇ／ｌ酢酸アンモニウムｐＨ４を添加した７６％メタノールで調整した固相カラム（６０ｍｇ  Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ）に結合させた。化合物をカラムに結合させた後、カラムを１．５ｍｌの８５％メタノールｐＨ＝４で、次いで５ｍｌの７６％メタノールｐＨ＝４で洗浄した。本化合物を、０．１％の５０ｇ／ｌ酢酸アンモニウムｐＨ＝８を添加したメタノールでカラムから溶出させた。メタノールを真空遠心分離機で除去し、化合物に水を添加して凍結乾燥させた。
【０１１７】
実施例５：ＭＢＬ−ＡＢ０１のin vitro抗菌活性（ＭＩＣ測定）、他の公知の抗菌化合物との比較
グラム陰性およびグラム陽性の病原体のパネルに対してＭＢＬ−ＡＢ０１を試験した。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Ａｃｕｍｅｄｉａ）を用いた標準化された微量希釈試験によって、すべてのグラム陽性およびグラム陰性の細菌株のＭＩＣsを測定した。５×１０5ＣＦＵ／ｍｌを含む細菌接種物を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのプロトコールに従って種々の抗生物質濃度の存在下、３５℃で１９時間培養した。細菌株は、培養コレクションＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）およびＣＣＵＧ（培養コレクション、Ｇｏｔｔｅｂｏｒｇ大学、Ｓｗｅｄｅｎ）から得た。
【０１１８】
ほとんどのグラム陽性株について、０．０３２〜０．５μｇ／ｍｌの範囲のＭＢＬ−ＡＢ０１のＭＩＣは、参照抗生物質バンコマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシンおよびダプトマイシンのＭＩＣと同等または未満であった（表１）。ＭＢＬ−ＡＢ０１は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＣＣＵＧ  ３７８３２およびＥ．  ｆａｅｃｉｕｍ  ＣＴＣ  ４９２によって代表されるバンコマイシン耐性細菌株の増殖もそれぞれ０．２５および０．５μｇ／ｍｌのＭＩＣで阻害した。
【０１１９】
【表２】
2019521078.tif 000009
【０１２０】
実施例６：ＩＭＲ９０線維芽細胞についてのＭＢＬ−ＡＢ０１およびキサントリピンのインビトロ細胞傷害性の測定
ＭＢＬ−ＡＢ０１およびキサントリピンの細胞傷害性を、ＩＭＲ９０ヒト肺線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８６）細胞を用いたインビトロアッセイで評価した。上記の実施例５に記載のようにＭＢＬ−ＡＢ０１を単離した。キサントリピンはＳｈａｇｈａｉ  Ｊｉａｏ  Ｔｏｎｇ大学、Ｃｈｉｎａから得た。キサントリピンのストック溶液をメタノール中に設定し、化合物が３９５ｎｍで類似の吸光係数を有すると仮定することによって、ＵＶ／ｖｉｓ吸収に基づいてキサントリピンのストック溶液の濃度をＭＢＬ−ＡＢ０１と関連づけた。
【０１２１】
ＩＭＲ９０細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１００Ｕ／ｍＬ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐで補充したＤＭＥＭ低グルコース（Ｓｉｇｍａ）中で増殖させた。培養密度に応じて、１：２〜１：８の比率で細胞を週に２回または３回継代した。細胞の化合物への暴露の前日に、１ｍｌあたり１．２×１０5のＩＭＲ９０細胞を含む３０μｌの細胞懸濁液を、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  Ｐｌａｔｅ、３７１２）に、ディスポーザブルチップ（Ｔｅｃａｎ  ＭＣＡ１２５μｌ、３００５１  ８０８）を用いたＭＣＡ３８４ピペッティングユニットを備えたＴｅｃａｎ  ＥＶＯロボットワークステーションを用いて播種した。播種後、細胞懸濁液を含むマイクロプレートを振幅２．５ｍｍでもって１６００ｒｐｍ（Ｂｉｏｓｈａｋｅ）で２０秒間振盪した。Ｔｅｃａｎ  ＥＶＯ上に配置された３５０ｒｐｍで撹拌している滅菌磁気攪拌子（１５×４．５ｍｍ、ＶＷＲ  ４４２−４５２２）を備えた撹拌リザーバ（リザーバ平底３００ｍＬ  １０７２３３６３）からマイクロプレートに移した。ＩＭＲ９０細胞を含むマイクロプレートを３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。細胞の曝露の日に、ＭＢＬ−ＡＢ０１およびキサントリピンの希釈系列をＤＭＳＯ中で作製した。化合物を有する希釈系列をさらに細胞培養培地に希釈し、アッセイウェルに移し、アッセイウェル中の全ＤＭＳＯ濃度を０．６％とした。曝露後、ＩＭＲ９０細胞を有するアッセイプレートをさらに３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で２４時間インキュベートした。インキュベーション後の細胞の生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧＬＯ  ２．０生存率アッセイを用いて測定した。ＭＢＬ−ＡＢ０１およびキサントリピンのＥＣ５０値は、類似のＤＭＳＯ濃度を有する増殖培地を添加した対照ウェルに対する曝露細胞の生存率に基づいて評価した。このアッセイにおいて、ＩＭＲ９０細胞について、ＭＢＬ−ＡＢ０１のＥＣ５０値は２０μｇ／ｍｌと評価され、キサントリピンのＥＣ５０値は１μｇ／ｍｌと推定された。
【０１２２】
寄託とエキスパート・ソリューション
出願人は、ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された寄託微生物のサンプルは、特許が付与される日まで、エキスパートのみが入手可能であることを要求する。
【図１】
2019521078.tif 000011
【図２】
2019521078.tif 000012
【配列表】
2019521078000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月21日(2018.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩＩによる構造を有する化合物ならびにその塩および溶媒和物。
【化１】
2019521078.tif 000013
【請求項２】
以下の工程を含む、請求項１に記載の化合物の産生方法：
ａ）以下からなる群から選択される細菌を、海水を含む適切な培地中で培養する工程と：
ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８７で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株；および
ｉｉ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などのｉ）の細菌単離株と密接に関連した細菌；
ｂ）前記培養物から前記化合物を抽出する工程。
【請求項３】
前記細菌が、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）が、培養細菌を遠心分離して化合物を抽出する細胞ペレットを得る工程を含む、請求項２および３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて細胞ペレットから抽出される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、ＰＭ６であり、任意に人工海水を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物を産生するための単離された細菌の使用であって、
前記細菌が、以下からなる群から選択される細菌である、使用：
ｉ）ブダペスト条約に基づいて寄託番号ＤＳＭ３２２８で２０１６年４月７日にＤＳＭＺに寄託された細菌単離株。および
ｂ）単離された細菌と類似の遺伝子型および／または表現型特性を有する細菌などの、ａ）の細菌単離株と密接に関連した細菌。
【請求項８】
前記密接に関連した細菌が、そのゲノム中に、逆転写および第２鎖の合成によって配列番号１に示される配列と少なくとも８０％同一である配列を提供する１６Ｓ  ｒＲＮＡを含む、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される１つ以上の担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１０】
治療に使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
抗微生物剤としての使用のための、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
前記使用が、患者における細菌感染症を治療するための使用であって、請求項１に記載の化合物または請求項９に記載の医薬組成物を前記患者に投与する工程を含む、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記細菌感染症が多剤耐性細菌によって引き起こされる、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記細菌感染症がグラム陽性および／またはグラム陰性細菌によって引き起こされる、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
細菌を死滅させる、またはその増殖を阻害するための非医学的方法であって、請求項１に記載の化合物または請求項９に記載の組成物を、死滅または阻害すべき細菌と接触させる工程を含む、方法。
【国際調査報告】
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