(57)【要約】  標的物質の検出方法は、被検用試料中の標的物質（５）が特異的に結合する第１のアプタマー（１）と標的物質（５）以外の第２のリガンド６が特異的に結合する第２のアプタマー（２）とを備え、第１のアプタマー（１）は１以上の二本鎖が形成する二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー（２）は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質（５）が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド（６）が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー（２）の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体（４）を用意する工程と、標的物質（５）と第１のアプタマー（１）とを結合させる工程と、第２のリガンド（６）と第２のアプタマー２とを結合させる工程と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。
2012029224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖が形成される二本鎖形成部位を有しており、
前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体を用意する工程と、
前記標的物質と前記第１のアプタマーとを結合させる工程と、
前記標的外物質と前記第２のアプタマーとを結合させる工程と、
前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む、標的物質の検出方法。
【請求項２】
前記第１のアプタマーまたは前記第２のアプタマーが、前記二本鎖形成部位において核酸断片と二本鎖を形成して前記複合体を構成している、請求項１に記載の標的物質の検出方法。
【請求項３】
前記第２のアプタマーが、前記二本鎖形成部位において、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズしている、請求項１または２に記載の標的物質の検出方法。
【請求項４】
前記第１のアプタマーと前記第２のアプタマーとが連結している、請求項１から３のいずれか１項に記載の標的物質の検出方法。
【請求項５】
前記第１のアプタマーと結合した前記標的物質が、前記標的外物質と前記第２のアプタマーとの結合により、前記第１のアプタマーから離れ、別の前記第１のアプタマーと結合する、請求項４に記載の標的物質の検出方法。
【請求項６】
前記複合体が部材に固定されている、請求項１から５のいずれか１項に記載の標的物質の検出方法。
【請求項７】
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる、標的物質の検出に用いるアプタマーセット。
【請求項８】
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、
前記複合体が固定されている部材と、を有する、標的物質の検出に用いるセンサ。
【請求項９】
前記部材が導電性を有する、請求項８に記載のセンサ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のセンサと、
標的物質を第１のアプタマーに結合させる手段と、
前記標的物質と異なる物質を第２のアプタマーに結合させる手段と、
前記第１のアプタマーの二本鎖形成部位の開裂を検出する手段と、を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーとは、特定の物質と結合する能力を有する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）およびペプチドを指す。このようなアプタマーは、非特許文献１に記載されたＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  （ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる方法を用いて、核酸ライブラリから有意な結合力を有する配列が選別される。【０００３】
アプタマーとアプタマーの結合対象物質（以下、標的物質と呼ぶ）の特異的な結合能力を利用したセンサが、疾病診断、環境モニタリングおよび所持品検査等の種々の目的のために研究され、開発されている。このようなセンサの多くは、アプタマーと標的物質の結合によってアプタマーおよび標的物質に生じる物理的および化学的変化を検知することによって標的物質を検出している。【０００４】
このようなセンサとして、非特許文献２および３では、アプタマーのハイブリダイズを利用したセンサが提案されている。具体的には、非特許文献２では、図１（ａ）に示すように、電極２３上にアプタマー２０の相補鎖２１（相補な配列を有する核酸２１。ただし、アプタマーではない）を固定する。この相補鎖２１に、電極反応物質２２が修飾されたアプタマー２０をハイブリダイズさせる。続いて、標的物質２４が添加されると、アプタマー２０と標的物質２４が結合する（図１（ｂ））。これにより、アプタマー２０と相補鎖２１とが開裂して、アプタマー２０が電極２３の表面から遊離する（図１（ｃ））。図１（ｃ）の状態と比較して、図１（ａ）の状態の方では、アプタマー２０に修飾された電極反応物質２２の反応電流が大きい。従って、電流値の大小を指標として標的物質の有無を検出することができることが記載されている。【０００５】
また、非特許文献３では、アプタマースイッチプローブが開示されている。この方法では、蛍光分子で標識されたアプタマーとクエンチャーで修飾された相補鎖がハイブリダイズしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５０５６４１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃ．Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ｖｏｌ．２４９  （１９９０），  ｐ５０５−ｐ５１０
【非特許文献２】Ａｎａｌｙｓｔ，  ２００８，  １３３  ｐ３２３−３２５
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ｖｏｌ．１３０  （２００８），  ｐ  １１２６８−１１２６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、本発明者が検討したところ、このようなハイブリダイズの開裂を利用する方法では、以下の課題があることが判明した。すなわち、ハイブリダイズの開裂においては、アプタマーに対して標的物質と相補鎖とが競争反応を起こしている。そして、この競争反応は平衡反応である。このため、開裂しているアプタマーから標的物質が分離して、再度、相補鎖とアプタマーがハイブリダイズすることがある。これにより、標的物質が低濃度の場合には、開裂量が少なくなり充分なシグナル変化が得られないことがあった。従って、標的物質が低濃度な場合で、高感度な検出方法が求められていた。【０００９】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、標的物質が低濃度な場合でも高感度な、標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖が形成される二本鎖形成部位を有しており、
前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体を用意する工程と、
前記標的物質と前記第１のアプタマーとを結合させる工程と、
前記標的外物質と前記第２のアプタマーとを結合させる工程と、
前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む、標的物質の検出方法が提供される。【００１１】
本発明によれば、
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる、標的物質の検出に用いるアプタマーセットが提供される。【００１２】
本発明によれば、
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第１のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第２のアプタマーと、を備え、
前記第１のアプタマーは１以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第１のアプタマーの塩基配列は、前記第１のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第２のアプタマーの塩基配列は、前記第２のアプタマーの２以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、
前記複合体が固定されている部材と、を有する、標的物質の検出に用いるセンサが提供される。【００１３】
本発明によれば、
上記センサと、
標的物質を第１のアプタマーに結合させる手段と、
前記標的物質と異なる物質を第２のアプタマーに結合させる手段と、
前記第１のアプタマーの二本鎖形成部位の開裂を検出する手段と、を含む、装置が提供される。【００１４】
なお、以上の構成要素の任意の組合せ、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた、本発明の態様として有効である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、標的物質が低濃度な場合でも高感度な、標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１７】
【図１】従来の標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図２】第１の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図３】第２の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図４】第３の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図５】第４の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図６】第５の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図７】第６の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図８】第７の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【図９】第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。
【図１０】第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。
【図１１】第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。
【図１２】第６の実施の形態における標的物質の検出方法の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１９】
［第１の実施の形態］
第１の実施の形態について、図２を用いて説明する。図２は、第１の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
第１の実施の形態の標的物質５の検出方法は、被検用試料中（検査対象物）の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖が形成する二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体４を用意する工程と、標的物質５と前記第１のアプタマー１とを結合させる工程と、第２のリガンド６と第２のアプタマー２とを結合させる工程と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。すなわち、この標的物質の検出方法は、被検用試料（検査対象物）中の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖形成部位を有しており、前記第２のアプタマーは２以上の二本鎖形成部位を有している、複合体４を用意する工程と、標的物質５と第１のアプタマー１との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位を開裂させる工程と、物質（第２のリガンド６）と第２のアプタマー２との結合により、第１のアプタマー１と共に二本鎖核酸部位を形成する第２のアプタマー２の構造体（第２のアプタマー２の一部の構造体）を変形させる、または二本鎖形成部位に相当する第１のアプタマー１の構造体を変形させる工程と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。
【００２０】
まず、複合体４を用意する。この複合体４は、第２のアプタマー２の一部と相補的な配列を有する核酸断片３を有する。ここで、複合体４においては、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と少なくとも１カ所が二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は第１のアプタマー１との二本鎖形成部位に加えて、核酸断片３と二本鎖形成部位を有している（図２（ａ））。第１の実施の形態において、アプタマーの二本鎖形成部位とは、アプタマーとその相補的な配列を有する相補鎖（他のアプタマーや核酸断片）とが核酸の二本鎖を形成している部位を意味する（以下、単に二本鎖核酸部位と称する）。また、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位は、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と共通（同じ塩基配列の部分を共有する）であるか、または、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と相補的な塩基配列を有する部位となる。
【００２１】
第１の実施の形態では、標的物質５は第１のリガンドであり、標的物質５と別の物質は第２のリガンド６である。また、被検用試料（検査対象物）中には、あらかじめ第２のリガンド６が添加されている。
【００２２】
続いて、複合体４を用意する工程から標的物質５を検出する工程を、下記の第１の工程から第４の工程に分けて説明する。第１の実施の形態の第１の工程では、標的物質５が第１のアプタマー１に結合する（図２（ｂ））。複合体４において、第１のアプタマー１は一端が二本鎖核酸部位を形成しているが、別の一端は一本鎖状態である。すなわち、第１のアプタマー１の一端の構造が自在に変形できる。従って、第１のアプタマー１はアプタマーとしての立体構造をとることができ、検査対象物中の標的物質５と結合することができる。
【００２３】
続いて、第１の実施の形態の第２の工程では、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における二本鎖が開裂する。すなわち、第１の工程で第１のアプタマー１と標的物質５とが結合すると、ブランチマイグレーションによって二本鎖核酸部位が解消する。このブランチマイグレーションは、標的物質５と第１のアプタマー１との結合が、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位を形成していた核酸同士の結合よりも強い場合に起こる。このようにして第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消えると、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２から離れる（図２（ｃ））。ここで、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、標的物質５が第１のアプタマー１に結合すると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位における構造が変形し、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２とが開裂する。
【００２４】
続いて、第１の実施の形態の第３の工程では、第２のアプタマー２に第２のリガンド６が結合する（図２（ｄ））。第２の工程以前では、第２のアプタマー２は、２カ所が二本鎖核酸部位を形成している。すなわち、第２のアプタマー２の両端の構造が自在に変形できない。このため、第２のアプタマー２は、アプタマーとしての立体構造をとることができず、第２のリガンド６と結合することはない。一方、第２の工程で第１のアプタマー１の第２のアプタマー２が開裂すると、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が１カ所になる。すなわち、第２のアプタマー２の一端の構造が自在に変形できる。このため、第２のアプタマー２がアプタマーとしての立体構造を形成できるようになる。従って、第２のアプタマー２は、被検用試料中に存在する第２のリガンド６と結合することができる。そして、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２つの二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、第２のリガンド６が第２のアプタマー２に結合すると、第２のアプタマー２の２つの二本鎖核酸部位の構造体が変形する。第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と対応する第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位の構造体が変形すると、第１のアプタマー１が二本鎖核酸部位を形成しにくくなる。一方、核酸断片３との二本鎖核酸部位に対応する第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位の構造体が変形すると、後述のように、第２のアプタマー２と核酸断片３とが開裂する。
【００２５】
続いて、第１の実施の形態の第４の工程では、第２のアプタマー２と核酸断片３との間で形成された二本鎖が開裂する。第３の工程において第２のアプタマー２と第２のリガンド６とが結合すると、第２の工程と同様に、ブランチマイグレーションによって二本鎖核酸部位が解消する。この第２のアプタマー２が開裂すると、第２のアプタマー２は、相補な核酸断片３から離れる（図２（ｅ））。この後、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する。ここで、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位における開裂を検出するとは、二本鎖核酸部位における二本鎖の開裂によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化を検出することを意味する。
【００２６】
ここで、第１の実施の形態の作用効果について、特許文献に記載の技術と比較しつつ説明する。
上記の特許文献に記載のハイブリダイズの開裂においては、アプタマーに対して標的物質と相補鎖とが競争反応を起こしている。そして、この競争反応は平衡反応であるため、標的物質の濃度が低いと、開裂したアプタマーは、再度相補鎖と二本鎖を形成することがあった。このため、アプタマーの開裂量が低下して、充分なシグナル変化量を得ることが困難であった。
【００２７】
これに対して、第１の実施の形態においては、物質（第２のリガンド６）と第２のアプタマー２との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位と相補的な塩基配列を有する第２のアプタマー２の一部の構造を変形させている。このため、第１のアプタマー１は、このような変形構造の塩基配列部分と、二本鎖を形成しにくくなる。これにより、第１のアプタマー１から標的物質５が脱離したとしても、第１のアプタマー１が、第２のアプタマー２と、再度二本鎖核酸部位を形成することを抑制できる。これにより、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位における二本鎖の開裂を維持することができる。従って、標的物質５の濃度が低濃度である場合においても、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位の開裂のシグナル変化量を、上記特許文献に記載の技術と比較して大きくすることができる。よって、第１の実施の形態によれば、高感度に標準物質を検出することができる。
【００２８】
また、第１の実施の形態において、検査対象物が第１のアプタマー１と結合する物質を含まない場合、第１のアプタマーは、検査対象物中の物質と結合せず、第２のアプタマー２との間の二本鎖核酸部位における二本鎖は解消されない。そのため、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間の二本鎖核酸部位における二本鎖も開裂しない。したがって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における開裂および第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂、またはその両方を検出することによって、検査対象物に標的物質５が含まれるかどうかを検知することができる。
【００２９】
第１の実施の形態において、検査対象物中の第２のリガンド６の濃度は、第２のアプタマー２と第２のリガンド６の間の解離定数（Ｋｄ２）以上であり、かつ、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２及び核酸断片３を含む複合体４の濃度以上であることが好ましい。これにより、第４の工程で核酸断片３から解離した第２のアプタマー２は、その約半数以上が第２のリガンド６と結合した状態となる。すると、第２の工程で第２のアプタマー２から離れた第１のアプタマー１が、平衡反応に従って標的物質５を放出して一本鎖状態となっても、第２のアプタマー２との再結合が阻害される。したがって、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナルを得ることが可能となる。
【００３０】
また、第１のアプタマー１の解離が進行することから、第２のリガンド６が充分量添加されているため、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３の解離も進行する。このため、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂を検出することによっても、大きなシグナルを得ることが可能となる。
【００３１】
また、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における開裂と、第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂との両方を検出することにより、二重検査をおこなうことができる。これにより、測定の信頼性が向上する。そのためには、例えば、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が開裂した場合と核酸断片３の二本鎖核酸部位が開裂した場合とで、異なる波長の蛍光が発せられるように、蛍光分子を使い分けるなどして、それぞれの二本鎖核酸部位の開裂により生じるシグナル変化を区別可能にすればよい。
【００３２】
なお、第２のリガンド６の濃度が高いほど第２のアプタマー２と第２のリガンド６の結合体の存在比率が高まる。このため、第２のリガンド６の濃度は、好ましくは第２のアプタマーと第２のリガンドの解離定数（Ｋｄ２）の５倍以上、さらに好ましくは５０倍以上である。
【００３３】
なお、図２（ａ）において、第２のリガンド６は、第１の工程に先立ち測定溶液である検査対象物に添加されているが、その添加タイミングは特に限定されないが、第２のリガンド６は第２のアプタマー２がアプタマーとしての結合能力を回復したときに存在していれば良く、第１〜第３の工程と同時または各工程の間で添加しても良い。
【００３４】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１のアプタマー１は、標的物質５と特異的に結合できる核酸であり、第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な相補な塩基配列を持っていればよい。この第１のアプタマー１としては、例えば、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、ＰＮＡのような人工核酸であってもよい。第１のアプタマー１は、特に制限されないが、標的物質５のエピトープと特異的に結合するアプタマーの構造を有するものが好ましく、一部に標的物質５と結合しない構造部分を有していてもよい。第１のアプタマー１は、例えば、ＳＥＬＥＸ法等の公知のアプタマースクリーニング方法を用いて取得できる。また、必要に応じて、ＳＥＬＥＸ等で取得された核酸配列に所望する塩基配列を足したものを合成しても良い。第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との二本鎖核酸部位は、第１のアプタマー１の任意の部分にあってもよく、例えば、アプタマーの端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、第１のアプタマー１の一本鎖核酸の全配列が二本鎖核酸部位を形成していてもよい。ただし、ここでの二本鎖核酸部位は、標的物質５と第１のアプタマー１が結合した際に、ブランチマイグレーションを生じ易くするために、標的物質５と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５〜２０塩基であることが好ましい。また、第１のアプタマー１は、後述する二本鎖核酸部位の検出の為に、蛍光物質や、クエンチャーなどの標識物質が修飾されていても良い。
【００３５】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第２のアプタマー２は、第２のリガンド６と特異的に結合できる核酸であり、第１のアプタマー１および核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成可能な相補な塩基配列を持っていればよい。この第２のアプタマー２としては、第１のアプタマー１と同様に、ＳＥＬＥＸ法等の公知のアプタマースクリーニング方法を用いて取得したＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を用いることができ、必要に応じて、ＳＥＬＥＸ等で取得された核酸配列に所望する塩基配列を足したものを合成しても良い。第２のアプタマー２と第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位は、第２のアプタマー２の任意の部分にあってもよく、例えば、第２のアプタマー２の端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。ただし、第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位は、第２のリガンド６が結合した際に、第１のアプタマー１の再結合を阻害するように、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５〜２０塩基であることが好ましい。すなわち、第２のリガンド６（物質）との結合により、二本鎖核酸部位に相当する第１のアプタマーの相補鎖（第２のアプタマー２）の構造を変形させることができる。くわえて、核酸断片３との二本鎖核酸部位は、第２のリガンド６が結合した際に、ブランチマイグレーションを生じ易くするために、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５〜２０塩基であることが好ましい。また、第２のアプタマー２は、後述する二本鎖核酸部位の検出の為に、蛍光物質や、クエンチャーなどの標識物質を修飾しても良い。
【００３６】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、核酸断片３は、第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成できる相補な塩基配列を有しており、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ等を用いることができる。また、核酸断片３は、その一部に、第２のアプタマー２と相補的な塩基配列に加えて、相補的でない塩基配列を有していてもよい。第２のアプタマー２との二本鎖核酸部位は、核酸断片３の任意の部分にあってもよく、例えば、端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。また、核酸断片３は、後述する二本鎖核酸部位の検出の為に、蛍光物質や、クエンチャーなどの標識物質を修飾しても良い。
【００３７】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１のアプタマー１および核酸断片３が第２のアプタマー２に結合することによって構成される複合体４は、それぞれの核酸を混合した溶液をアニールすることによって形成することができる。アニールをおこなう温度や時間等の条件は一般的な条件で良く、使用する配列の相補的な塩基対の長さや種類、塩濃度などに基づいて適切に設定する。
【００３８】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、複合体４の濃度は、特に限定されないが、二本鎖核酸部位における開裂が検出しやすいように１ｎＭ以上１ｍＭ以下が好ましい。
【００３９】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法は、通常は検査対象物を含む溶液中でおこなう。ここで溶液は一般的な反応溶液でよい。また、各工程を行う際の温度、ｐＨ、金属イオン等の条件は適切に設定する。標的物質５と第１のアプタマー１の結合を促進させるために、Ｍｇ２＋イオンを溶液に加えると良い。ただし、実施の形態の標的物質の検出方法は、核酸の二本鎖部分を利用するため、核酸の二重鎖結合が維持できないような温度条件やｐＨ等は望ましくない。
【００４０】
第１の実施の形態の標的物質の検出方法において、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成された二本鎖核酸部位における開裂および第２のアプタマー２と相補な核酸断片３との間で形成された二本鎖核酸部位における開裂を検出する方法は、一般的な二本鎖核酸の開裂を検出する方法を用いることができ、その方法は特に限定されない。この二本鎖核酸の開裂の検出方法としては、例えば、蛍光色素とクエンチャーを用いる方法（非特許文献３）、核酸に金ナノ粒子を修飾しその凝集および分散を検出する方法（特許文献１）や、リアルタイムＰＣＲなどで二本鎖核酸部位の量を定量する為に用いられるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどの二本鎖核酸指示薬を使用する方法、などを用いることができる。
【００４１】
ここでは、蛍光色素（蛍光物質８）とクエンチャー９を修飾物質として用いる場合の二本鎖核酸部位の開裂の検出例について、再度図２を用いて説明する。図２（ａ）では、第２のアプタマー２の一端に蛍光物質８が、核酸断片３の一端にクエンチャー９が修飾されている。蛍光物質８とクエンチャー９が互いに近接するように、第２のアプタマー２の端部の塩基配列と、核酸断片３の端部の塩基配列は連続する相補な配列となっている。
【００４２】
はじめに、複合体４に接触させる前に、検査対象物の溶液（図２（ａ））に対して蛍光測定を行う。溶液に励起光を照射すると、第２のアプタマー２に修飾された蛍光物質８は、核酸断片３のクエンチャー９が近接しているため蛍光が弱められる。
【００４３】
次に、検査対象物を複合体４に接触させた後、溶液を蛍光測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位に標的物質５が結合し（図２（ｂ））、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れる（図２（ｃ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合し（図２（ｄ））、第２のリガンドの二本鎖核酸部分が消え、第２のアプタマー２が核酸断片３から離れる（図２（ｅ））。これにより、クエンチャー９が離れる。その結果、第２のアプタマー２の蛍光物質８の蛍光が回復する。したがって、溶液の蛍光強度は、標的物質５を第１のアプタマー１に接触させた方が大きくなる。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第１のアプタマー１は核酸断片３に結合し続ける為、第２のアプタマー２は分離しないので、上記溶液の蛍光強度は変化しない。
【００４４】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後の蛍光強度を比較することによって、標的物質５の有無を調べることができる。
【００４５】
また、第１の実施の形態においては、上記複合体４を含むアプタマーセットを、標的物質５の検出に用いることができる。すなわち、このアプタマーセットは、被検用試料中の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質５が結合する第１のアプタマーの１塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる。このアプタマーセットにおいては、標的物質５と第１のアプタマー１との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位が開裂する。一方、第２のリガンド６と第２のアプタマー２との結合により、二本鎖形成部位に相当する第１のアプタマー１の構造体が変形する、又は第１のアプタマー１と共に二本鎖核酸部位を形成する構造体が変形する。これにより、本実施の形態の効果が得られる。
【００４６】
また、第１の実施の形態に係る標的物質５の検出装置は、標的物質５を含む検査対象物と第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３がそれぞれ二本鎖核酸部位において二本鎖を形成している複合体４とを接触させる接触部と、複合体４の二本鎖核酸部位における開裂を検出する検出部と、を備える。すなわち、この検出装置は、上記アプタマーセットと標的物質５とを接触させる接触部と、複合体４の二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部と、を備える。このような二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部は、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的変化を検出できる限り限定されず、例えば、光学的シグナル、電気的シグナル、色彩的シグナル等のシグナル変化の検出が挙げられる。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。
【００４７】
また、第１の実施の形態においては、第１のアプタマー１及び／又は第２のアプタマーが、核酸断片３と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成して複合体４を構成している。
【００４８】
［第２の実施の形態］
第２の実施の形態では、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３を含む複合体４において、少なくとも１カ所が部材に固定されている場合について説明する。図３は、第２の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
なお、第２の実施の形態は、第１の実施の形態の応用であるので、第１の実施の形態と同様な点については説明を省略する。
【００４９】
第２の実施の形態の複合体４においては、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と少なくとも１カ所が二本鎖核酸部位を形成しており、第２のアプタマー２は第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位に加えて核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成している。第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３の少なくとも１カ所が部材に固定されている。これにより、複合体４は部材に固定されている。
【００５０】
第２の実施の形態において、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３は、第１の実施の形態と同様のものを用いることができるが、少なくともいずれかが部材に固定する為の官能基を有することが好ましい。そのような官能基としては、部材の表面と共有結合または特異的な吸着を形成可能なものであれば限定されず、例えば、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、ジスルフィド基、スクシンイミジル基、マレイミド基、ビオチンなどが挙げられる。これらの官能基は、一般的な核酸合成方法で作製したものを用いることができる。また、官能基は、アプタマーとリガンドの特異的結合を妨げない限り、任意の部位に修飾されても良く、例えば、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２または核酸断片３の端部にあっても良いし、中央部にあっても良い。
【００５１】
第２の実施の形態に係る部材は、核酸を固定可能なもの、もしくは、固定させるように処理が可能なものであれば、その材料は特に限定されない。部材に核酸を固定する方法としては、例えば、核酸の官能基と部材表面の官能基を利用してペプチド結合を形成する方法や、部材表面に金、白金、銀、パラジウムなどを存在させた上で、その表面に核酸のチオール基を化学吸着させる方法や、部材表面にアビジンを固定して、ビオチン−アビジン結合を形成する方法などがある。部材がこれらの官能基を持たない場合は、部材をチオールやシランなどで処理して、所望の官能基を形成すればよい。部材としては、基板１１、ビーズ等の粒子、またはマイクロアレイチップ等を用いても良い。部材に核酸を部材に固定するタイミングは、特に限定されず、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２および核酸断片３の複合体４が形成した後でも良いし、官能基を有する核酸を部材に固定した後に、固定された核酸に対して他の核酸をハイブリダイズさせても良い。なお、部材に導電性材料を用いた場合、複合体４が固定された部材は、本発明の第３の実施の形態で説明するセンサ素子としても使用することができる。
【００５２】
第２の実施の形態に係る標的物質５の検出について説明する。第２のターゲット分子（第２のリガンド６）が存在する状態下で、センサ（複合体４が固定された基板１１）が標的物質５と接触すると、第１の実施形態で説明した第１〜第４の工程と同様の仕組みで、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間で形成される二本鎖核酸部位における二本鎖および第２のアプタマー２と核酸断片３の間で形成される二本鎖核酸部位における二本鎖が開裂する。従って、第１の実施の形態と同様に、これらの二本鎖核酸部位の開裂を検出することにより、検査対象物に標的物質５が含まれるか否かを検査することが可能となる。また、第２の実施の形態においても、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
【００５３】
第２の実施の形態において、二本鎖核酸部位の開裂を検出する方法は特に限定されないが、例えば、複合体４のうち、核酸断片３を基板１１（部材）に固定し、第１のアプタマー１を標識する。蛍光色素（蛍光物質８）、放射性同位体（ＲＩ）、蛍光クエンチャー等で第１のアプタマー１をあらかじめ標識しておく。そして、これら標識による基板表面の信号強度を測定することによって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との開裂を検出できる。また、表面プラズモン共鳴や水晶振動マイクロバランス法などの公知の方法によって、部材表面に結合している核酸の重さを定量しても良い。以下に、標識物質に蛍光色素を用い、部材に基板１１を用いた例について、図３を用いて説明する。
【００５４】
はじめに、検査対象物を接触させる前の基板１１表面を蛍光測定する（図３（ａ））。基板１１に励起光を照射して、第１のアプタマー１に修飾された蛍光物質８を励起する。蛍光物質８から蛍光が発せられ、基板１１の表面の蛍光物質８（蛍光分子）の量に応じた強度が測定できる。
【００５５】
次に、検査対象物を接触させた後の基板１１を蛍光測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合（図３（ｂ））、検査対象物５を接触させると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消える為、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れ、基板１１からも離れる（図３（ｃ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合して（図３（ｄ））、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が消え、第２のアプタマー２が基板１１から離れる（図３（ｅ））。従って、基板１１の表面の蛍光強度は、標的物質５を接触させた方が小さくなる。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第１のアプタマー１は基板１１に結合し続ける為、基板１１の表面の蛍光強度は変化しない。
【００５６】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後の基板１１の表面の蛍光強度を比較することによって、標的物質５の有無を調べることができる。基板１１から離れた第１のアプタマー１は、平衡反応によって標的物質５から解離し得る。解離した第１のアプタマー１が部材（基板１１）に再結合する為には、第２のアプタマー２と接触して二本鎖核酸部位を再形成する過程と、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との結合体が基板１１上の相補な核酸断片３と接触する過程を必要とする。被検用試料の溶液中には第２のリガンド２が高濃度で含まれる為、第１のアプタマー１と結合した第２のアプタマーの存在比率は僅かである点、仮に第１のアプタマー１と第２のアプタマー２が再結合した場合でも、溶液中に分散した結合体が基板１１の表面の相補な核酸断片３と接触する頻度は低い点、の相乗効果により、一度部材から遊離した第１のアプタマー１は基板１１に再結合することがほとんどない。従って、部材を使用しない第１の実施の形態と比較して、標的物質５が低濃度の場合でも第１のアプタマーと第２のアプタマー２の解離が進行し、より大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
【００５７】
なお、必要に応じて、蛍光測定をする前に測定液を交換するなどして部材から離れたアプタマーを除去してもよい。これにより、溶液中の蛍光物質が除去されて、バックグラウンドシグナルが減少し、測定感度を向上させることができる。
【００５８】
また、第２の実施の形態では、相補な核酸断片３を部材に固定したが、部材に固定するのは核酸断片に限らず、第１のアプタマー１または第２のアプタマー２を固定しても良い。また、標識をする核酸も第１のアプタマー１に限らず、第２のアプタマー２または相補な核酸断片３に標識をしても良い。これらは、第１の実施の形態の第１〜第４工程で説明した二本鎖核酸部位の開裂がシグナル変化として生じればよく、適切に組み合わせて使用することができる。
【００５９】
また、第２の実施の形態においては、上記複合体４を含むセンサを、標的物質５の検出に用いることができる。このセンサは、複合体４が固定されて部材をさらに備える。すなわち、このセンサは、被検用試料中の標的物質５が特異的に結合する第１のアプタマー１と、標的物質５以外の標的外物質（第２のリガンド６）が特異的に結合する第２のアプタマー２と、を備え、第１のアプタマー１は１以上の二本鎖形成部位を有しており、第２のアプタマー２は２以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、この複合体が固定された部材とを有する。このセンサにおいては、標的物質５と第１のアプタマー１との結合により、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位が開裂する。一方、第２のリガンド６と第２のアプタマー２との結合により、二本鎖形成部位に相当する第１のアプタマー１の構造体が変形する又は第１のアプタマー１と共に二本鎖核酸部位を形成する構造体が変形する。これにより、本実施の形態の効果が得られる。また、あらかじめこれらの核酸の複合体４が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
【００６０】
また、第２の実施の形態の標的物質５の検出装置は、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２、および核酸断片３がそれぞれ二本鎖核酸部位において二本鎖を形成した複合体４が固定された部材（基板１１）と、標的物質５を部材に固定された複合体４に接触させる接触部と、複合体４の二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。すなわち、この検出装置は、上記センサと、標的物質５を第１のアプタマー１に結合させる結合部と、標的物質５とは異なる第２のリガンド６を第２のアプタマー２に結合させる接合部と、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の開裂を検出する検出部と、を含む。この装置は、複合体４が部材に固定されることにより、複数の液を混合するための流路やバルブ機構を簡略化させることができる。
【００６１】
［第３の実施の形態］
第３の実施の形態は、第２の実施の形態の応用であり、同様な点については説明を省略する。
図４は、第３の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。第３の実施の形態において、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２及び核酸断片３を含む複合体４が部材に固定される点は、第２の実施の形態と同じであるが、この部材が導電性部材である点が異なる。導電性の部材としては、電極１２が挙げられる。電極１２としては、電気伝導性が高く、かつ表面を修飾するのが容易であることから、金、白金、炭素等の材料が好適に用いられる。また、電極１２としては、表面に表面積を大きくして感度を高める目的で、その表面に、金微粒子や白金微粒子、カーボンナノチューブなどの微細材料が付着していても良い。
【００６２】
第３の実施の形態の標的物質５の検出方法は、導電性の部材を電極１２として使用して、二本鎖核酸部位の開裂を電気化学測定により検出する点を除き、第２の実施の形態と同様である。電気化学測定により二本鎖核酸部位の開裂を検出する方法は、例えば、インターカレータなどの二本鎖核酸結合物質を添加して、二本鎖核酸部位に結合した二本鎖核酸結合物質について、電極１２で酸化および還元した際に流れる電流値により二本鎖核酸部位の量を定量する方法や、第１のアプタマー１、第２のアプタマー２または核酸断片３に電極反応物質を修飾し、二本鎖核酸部位の開裂にともなう電子伝達の変化を電極１２により測定する方法などがある。
【００６３】
以下で、導電性の部材に電極１２を用い、電極反応物質としてメチレンブルー１４を核酸断片３に修飾した場合の標的物質の検出メカニズムについて、図４を用いて具体例を挙げて説明する。
【００６４】
なお、第３の実施の形態では、核酸断片３を電極１２に固定し、核酸断片３に電極反応物質としてメチレンブルー１４を標識したが、電極１２に固定する核酸と電極反応物質を修飾する核酸および電極反応物質はこれに限らず、二本鎖核酸部位の開裂がシグナル変化として生じる組み合わせを、適切に選択して使用することができる。
【００６５】
はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（導電性の部材）（図４（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達を測定する。電子伝達は、例えば、作用極として電極１２を、図示しない参照電極および対極と共にポテンショスタットに接続し、銀／塩化銀参照電極に対して＋０．１Ｖの電位から−０．５Ｖまでの電位範囲でのスクウェアウェーブボルタンメトリー（ＳＷＶ）により測定することができる。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、電子が電極に伝達され、還元電流が観測される。
【００６６】
次に、検査対象物を接触させた後の電極１２と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると（図４（ｂ））、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消える。このため、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れ、電極１２からも離れる（図４（ｃ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合する（図４（ｄ））。これにより、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が消え、第２のアプタマー２が電極１２から離れる（図４（ｅ））。すると、相補的な核酸断片３の二本鎖核酸部位が消滅することで、相補的な核酸断片３の自由度が向上し、メチレンブルー１４と電極間の接触頻度が増加する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が大きくなり、より大きな還元電流が観測される。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第１のアプタマー１は電極１２に結合し続ける為、メチレンブルー１４の電子伝達は変化せず、還元電流値も変化しない。
【００６７】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、標的物質５の有無を調べることができる。第２の実施の形態で述べたとおり、一度電極１２から離れた第１のアプタマー１が電極１２に再結合できない為、標的物質５が低濃度の場合でも第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。また、第３の実施の形態は、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
【００６８】
なお、検査対象物を接触させる前の電子伝達があらかじめ分かっている場合や、無視できるほど小さい場合など、必要に応じて、検査対象物を接触させる前の電子伝達の測定は省略することができる。
【００６９】
なお、第３の実施の形態では、二本鎖核酸部位の開裂による核酸の自由度の向上により電子伝達効率が変化したが、それに限らず、例えば、部材から遊離する核酸に電極反応物質が修飾されていても良い。例えば、第２のアプタマー２にメチレンブルー１４が修飾されていてもよく、その場合、標的物質５によって電極１２から第２のアプタマー２が離れることにより、ＳＷＶの還元電流値は標的物質５が存在する場合の方が小さくなる。
【００７０】
なお、第３の実施の形態に係る電極反応物質は、電極１２との接触頻度により電子伝達効率が変化するものであればよく、例えば、金属やその錯体、複素環式化合物、触媒、酵素などが用いられる。具体的には、金属としては、例えば、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｔｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ａｇ、Ｐｄ、Ｗ、Ａｕ等の粒子、このような金属の塩および酸化物、金属のイオンを中心金属とする錯体等を挙げることができ、複素環式化合物として、ヒドロキノンやアントラキノン等のキノン類およびその誘導体、メチレンブルーおよびその誘導体、ピロール類やピリジン、ビオロゲン等を挙げることができ、触媒としては、Ｐｔや酸化チタン等の微粒子を挙げることができ、酵素としては、特に制限されないが、例えば、グルコースオキシダーゼやビリルビンオキシダーゼ等の酸化酵素、グルコースデヒドロゲナーゼ等の脱水素酵素、ジアフォラーゼ等の補酵素酸化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼやカタラーゼ等の過酸化物還元酵素、を挙げることができる。
【００７１】
電子伝達を測定する手段は特に限定されず、各種電気化学測定法を用いることができるが、例えば、ＳＷＶ、サイクリックボルタンメトリー、ディファレンシャルパルスボルタンメトリー、交流ボルタンメトリー、交流インピーダンス、アンペロメトリー、ポテンシオメトリーなどが挙げられる。
【００７２】
また、二本鎖核酸部位の検出に二本鎖核酸結合物質を用いる場合、二本鎖核酸結合物質は、二本鎖核酸部位に特異的に結合する性質を有し電極反応性を有するものであれば限定されず、例えば、メチレンブルー、キノン、アクリジン、およびそれらの誘導体等を挙げることができる。また、インターカレータ自身に、電極反応性の分子を修飾したものを用いてもよい。例えば、アクリジン、エチジウムブロマイドなどの含窒素縮合環化合物、メチレンブルー、ベンゾピレン、アクチノマイシン、ノガラマイシン、ディスタマイシンＡ、メチジウム、およびこれらの誘導体等のインターカレータに、上記電極反応物質を修飾したものを用いることができる。これらを検出する方法は、例えば、前述の電子伝達を測定する手段を用いればよい。
【００７３】
第３の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２と核酸断片３とが二本鎖核酸部位において二本鎖を形成した複合体４が固定された導電性の部材（電極１２）と、検知対象物と電極１２とを接触させる接触部と、電気化学測定により二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有するものである。この装置は、光学的な機構を用いない為、装置構成を簡略化することができ、装置の小型化や低コスト化が可能となる。
【００７４】
第３の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２と核酸断片３とが二本鎖核酸部位を形成した上記複合体４が固定された導電性の部材（電極１２）である。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が用いられることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
【００７５】
［第４の実施の形態］
第４の実施の形態では、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と２箇所の二本鎖核酸部位を形成して複合体４を構成している。
【００７６】
第４の実施の形態において、第１のアプタマー１は、前述の標的物質５と結合可能な塩基配列と、第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列と、必要に応じて部材（電極１２）に固定可能な官能基および修飾物質を有する。この第１のアプタマー１は、さらに、標的物質５と結合しない塩基配列を備えてもよい。標的物質との結合に関与しない塩基配列は、例えば、前述の第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な核酸断片３の塩基配列である。第１のアプタマー１が標的物質５と結合可能な立体構造を形成可能なように、標的物質５と結合する塩基配列は、これら２つの二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列の間に位置しないことが好ましい。なお、第１のアプタマー１は、標的物質５と結合しない構造部分を有していてもよい。
【００７７】
第２のアプタマー２は、第１〜３の実施の形態で説明したものと同様のものを用いることができる。
【００７８】
続いて、第４の実施の形態の検出メカニズムについて図５を用いて具体的に説明する。なお、第１〜３の実施の形態と同様な点は説明を省略する。図５は、第４の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
第４の実施の形態において、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と２箇所の二本鎖核酸部位を形成して複合体４を構成している。この複合体４は、第１のアプタマー１の一端が電極１２（部材）に固定されている。第２のアプタマー２には、電極１２に近い側の一端に電極反応物質としてメチレンブルー１４が修飾されている（図５（ａ））。
【００７９】
はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（図５（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、還元電流が観測される。
【００８０】
次に、検査対象物を接触させた後の電極１２と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位の一つが消えて、第１のアプタマー１の一部が第２のアプタマー２から離れる（図５（ｂ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合して（図５（ｃ））、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部分が消える。これにより、第２のアプタマー２が電極１２から離れる（図５（ｄ））。すると、メチレンブルー１４が電極１２から離れることによって、メチレンブルー１４と電極１２間の接触頻度が減少する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が少なくなり、測定される還元電流が減少する。一方、検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、第２のアプタマーは電極に結合し続ける為、メチレンブルー１４の電子伝達は変化せず、還元電流値も変化しない。
【００８１】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。第１のアプタマー１から離れた第２のアプタマー２は、第２のリガンド６の濃度が高いため、第１のアプタマー１と再結合可能な一本鎖核酸状態をとることができなくなる。このため、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
【００８２】
なお、第４の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いればよい。これにより、標的物質５の検出を行うことができる。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の複合体４も部材に固定されていなくてもよい。
【００８３】
第４の実施の形態の標的物質の検出方法では、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２と二本鎖核酸部位を形成可能な核酸断片３の塩基配列を有することにより、核酸断片３を省くことが可能となる。
【００８４】
第４の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２とが二本鎖核酸部位を形成した複合体４と、検知対象物と複合体４とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。
【００８５】
第４の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２とが２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
【００８６】
［第５の実施の形態］
第５の実施の形態は、第１のアプタマー１は第２のアプタマー２と少なくとも１箇所の二本鎖核酸部位における二本鎖を形成して複合体４を構成している。第２のアプタマー２は、第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位に加え、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を有している。
【００８７】
第５の実施の形態において、第１のアプタマー１は、第１〜３の実施の形態で説明したものと同様のものを用いることができる。また、第５の実施の形態において、第２のアプタマー１は、第２のリガンド６と結合可能な塩基配列と、第１のアプタマー１と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列と、必要に応じて部材に固定可能な官能基および修飾物質を有し、さらに、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズ可能な塩基配列を有する。自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズ可能なこの塩基配列は、第２のリガンド６が結合した際にブランチマイグレーションを生じ易いことから、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５〜２０塩基であることが好ましい。なお、第２のアプタマー２は、第２のリガンド６と結合しない構造部分を有していてもよい。
【００８８】
第５の実施の形態の検出メカニズムについて図６を用いて具体的に説明する。なお、第１〜３の実施の形態と同様な点は説明を省略する。図６は、第５の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
第５の実施の形態において、複合体４は、第１のアプタマー１の一端が電極１２である部材に固定されている。第２のアプタマー２は、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を有しており、電極１２に近い側の一端に電極反応物質としてメチレンブルー１４が修飾されている（図６（ａ））。
【００８９】
はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（図６（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、還元電流が観測される。
【００９０】
次に、検査対象物を接触させた後の電極１２と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が消えて、第１のアプタマー１が第２のアプタマー２から離れる（図６（ｂ））。第２のアプタマー２が離れることにより、第２のアプタマー２に修飾されたメチレンブルー１４と電極１２が離れる。
【００９１】
続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合して（図６（ｃ））、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位が消える（図６（ｄ））。
【００９２】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。検査対象物が標的物質５を含む場合、二本鎖核酸部位の開裂によりメチレンブルー１４が電極１２から離れる。これにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度が減少する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が少なくなり、測定される還元電流が減少する。検査対象物に標的物質が含まれない場合は、第２のアプタマー２は第１のアプタマー１との二本鎖核酸部位と、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位とが形成されたままとなる。このため、第２のアプタマー２はアプタマーとしての立体構造を形成することができず、第２のリガンド６と結合しない。したがって、第２のアプタマー２は電極１２に結合し続ける為、メチレンブルー１４の電子伝達は変化せず、還元電流値も変化しない。
【００９３】
第１のアプタマー１から離れた第２のアプタマー２は、第２のリガンド６の濃度が高いため、第１のアプタマーと再結合可能な一本鎖核酸状態をとることがほとんどない。このため、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。また、第５の実施の形態においても、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
【００９４】
なお、第５の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いて、標的物質５を検出しても良い。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２との複合体４も部材に固定されていなくてもよい。
【００９５】
第５の実施の形態では、第２のアプタマー２が自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズ可能な塩基配列を持つことにより、核酸断片３を省くことができる。
【００９６】
第５の実施の形態の標的物質の検出装置は、二本鎖核酸部位において、第１のアプタマー１が自身の配列の相補的な塩基配列同士で二本鎖を形成した第２のアプタマー２と少なくとも１箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４において、この複合体４と検知対象物とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度が得られる。
【００９７】
第５の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１が自身の配列の相補的な塩基配列同士で二本鎖核酸部位を形成した第２のアプタマー２と少なくとも１箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
【００９８】
［第６の実施の形態］
第６の実施の形態では、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６が、核酸断片３と少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を有している。この連結アプタマー１６および核酸断片３で複合体４が構成されている。
【００９９】
第１のアプタマー１の塩基配列部分とは、第１〜３の実施の形態で説明した標的物質と結合可能な第１のアプタマーの塩基配列のことであり、標的物質５と結合しない構造部分を有してもよい。また、第２のアプタマー２の塩基配列部分とは、第１〜３の実施の形態で説明したような第２のリガンド６と結合可能な塩基配列のことであり、第２のリガンド６と結合しない構造部分を有してもよい。第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分は、連結アプタマー１６の任意の部分にあってもよく、例えば、それぞれが、連結アプタマーの端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。
【０１００】
核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成可能な部位は、連結アプタマー１６の任意の部分にあってもよく、例えば、連結アプタマー１６の端部にあってもよいし、中央部にあってもよい。ただし、二本鎖核酸部位を形成可能な部位のうち１箇所は、標的物質５と連結アプタマー１６が結合した際にブランチマイグレーションを生じ易いことから、標的物質５と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５〜２０塩基であることが好ましい。さらに好ましくは、標的物質５から解離した第１のアプタマー１の再結合が生じづらいことから、５〜１０塩基である。さらに、二本鎖核酸部位を形成可能な部位は、第２のリガンド６が結合した際に核酸断片３との再結合が阻害されやすいように、第２のリガンドと結合する塩基配列の一部を含むことが好ましい。さらに好ましくは、標的物質５が結合した際のブランチマイグレーションにより二本鎖核酸部位が開裂しやすいことから、二本鎖核酸部位における第２のリガンドの結合する塩基配列は、１０塩基以下である。また、二本鎖核酸部位を形成可能な部位の別の１箇所は、第２のリガンド６が結合した際にブランチマイグレーションを生じ易いことから、第２のリガンド６と結合する塩基配列の一部を含むよう形成することが好ましく、その長さは５〜２０塩基であることが好ましい。
【０１０１】
第６の実施の形態では、標的物質５が結合する第１のアプタマー１の塩基配列は、第１のアプタマー１の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む。このため、標的物質５が第１のアプタマー１に結合すると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位の構造が変形し、第１のアプタマー１と核酸断片３とが開裂する（図７（ｂ））。また、第２のリガンド６が結合する第２のアプタマー２の塩基配列は、第２のアプタマー２の２つの二本鎖形成部位の塩基配列の一部または全部と共通している。このため、第２のリガンド６が第２のアプタマー２に結合すると、第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位に一部に相当する第２のアプタマー２の１つの二本鎖核酸部位の構造体が変形する。第１のアプタマー１の構造体は変形したままであるので、第１のアプタマー１が、核酸断片３と再度二本鎖核酸部位を形成することが抑制される。一方、第２のリガンド６と第２のアプタマー２とが結合すると、別の核酸断片３との二本鎖核酸部位との相補的な塩基配列を有する第２のアプタマー２の二本鎖核酸部位の構造体が変形する。これにより、第２のアプタマー２と核酸断片３とが開裂する。このため、第２のアプタマー２が核酸断片３から離れるため、第２のアプタマー２ととともに連結アプタマー１６を構成する第１のアプタマー１も、核酸断片３から離れる。これにより、第１のアプタマー１が核酸断片３と再度二本鎖核酸部位を形成することがさらに抑制される（図７（ｄ））。
【０１０２】
また、連結アプタマー１６は、必要に応じて部材に固定可能な官能基および二本鎖核酸部位の開裂を検出可能な修飾物質を有していてよい。
【０１０３】
第６の実施の形態において、核酸断片３は、連結アプタマー１６と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を持っている。核酸断片は、連結アプタマーの２箇所の二本鎖核酸部位に結合可能な２種類の核酸断片を用いてもよいし、連結アプタマーと２つの二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を持つ１本の核酸断片３を用いてもよい。核酸断片３は、必要に応じて部材に固定可能な官能基および二本鎖核酸部位の開裂を検出可能な修飾物質を有していてよい。第６の実施の形態では、第１の実施の形態と同様の効果が得られる。
【０１０４】
第６の実施の形態の検出メカニズムについて図７を用いて具体的に説明する。なお、第１〜３の実施の形態と同様な点は説明を省略する。図７は、第６の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
【０１０５】
第６の実施の形態において、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分２を有する連結アプタマー１６が、核酸断片３と２箇所の二本鎖核酸部位を形成している。二本鎖核酸部位のうち、１箇所は第１のアプタマーの標的物質５と結合する塩基配列と第２のリガンド６と結合する塩基配列を含んでおり、もう一箇所は第２のリガンド６と結合する塩基配列を含んでいる。核酸断片３は、一端が電極１２に固定されており、別の一端に電極反応物質としてメチレンブルー１４が修飾されている（図７（ａ））。
【０１０６】
はじめに、検査対象物を接触させる前の電極１２（図７（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。ＳＷＶにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度に応じてメチレンブルー１４の還元反応が起こり、還元電流が観測される。
【０１０７】
次に、検査対象物を接触させた後の電極１２とメチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の塩基配列部分を含む二本鎖核酸部位が消えて、核酸断片３から離れる（図７（ｂ））。続いて、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合する。先の工程で、第１のアプタマー１の塩基配列部分と一緒に二本鎖核酸部位を形成していた第２のアプタマー２の塩基配列部分が自由になる。このため、第２のアプタマー２の塩基配列部分がアプタマーとしての構造をとれるようになり、第２のリガンド６との結合能力が回復する。これにより、第２のアプタマー２の塩基配列部分が溶液中に添加されている第２のリガンド６と結合する（図７（ｃ））。第２のアプタマー２の塩基配列部分が第２のリガンド６と結合すると、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部分が消えて、連結アプタマー１６が核酸断片３から離れる（図７（ｄ））。連結アプタマー１６との二本鎖核酸部位が消えることにより、核酸断片３の自由度が向上し、メチレンブルー１４と電極１２との接触頻度が向上する。
【０１０８】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、連結アプタマー１６と核酸断片３の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。検査対象物が標的物質５を含む場合、二本鎖核酸部位の開裂により核酸断片３の自由度が向上することにより、メチレンブルー１４と電極１２との間の接触頻度が向上する。したがって、メチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達は、標的物質５を接触させた方が大きくなる。検査対象物に標的物質５が含まれない場合は、連結アプタマー１６は核酸断片３に結合し続ける。このため、メチレンブルー１４の電子伝達は変化しない。
【０１０９】
核酸断片３から離れた連結アプタマー１６は、第２のリガンド６の濃度が高いため、第２のアプタマー２の塩基配列部分が第２のリガンド６と結合し続ける。したがって、第１のアプタマー１は核酸断片３と再結合可能な一本鎖核酸状態をとることがほとんどない。このため、標的物質５が低濃度の場合でも、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２の解離が進行し、大きなシグナル変化を得ることが可能となる。
【０１１０】
なお、第６の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いればよい。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、核酸断片３と連結アプタマー１６の複合体４も部材に固定されていなくてもよい。二本鎖核酸部位の開裂をＱＣＭやＳＰＲのような核酸自体の重さや誘電率変化によって検出する場合、核酸への修飾物質を省略しても良い。
【０１１１】
第６の実施の形態の標的物質の検出方法では、第１のアプタマー１と第２のアプタマー２は独立の一本鎖核酸で構成されていなくても良い。
【０１１２】
なお、図７では、連結アプタマー１６と２つの二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を持つ１本の核酸断片３を用いたが、それに限定されず、各種の変形例を採用することができる。これらの変形例は、図９〜１２に示す。これらの変形列においては、連結アプタマー１６の第１のアプタマー１の塩基配列が１カ所の二本鎖核酸部位を形成し、第２のアプタマー２の塩基配列が２カ所以上の二本鎖核酸部位を形成し、標的物質５がトリガーとなって、これらの二本鎖核酸部位が開裂する構成であればよい。例えば、図９に示すように、連結アプタマー１６に異なる２つの核酸断片３がハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成してもよい。また、図１０に示すように、第２のアプタマー２の塩基配列が、核酸断片３と同様の塩基配列を持つ連結アプタマー１６の一部とハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成してもよい。また、図１１に示すように、第１のアプタマー１の塩基配列が、核酸断片３と同様の塩基配列を持つ連結アプタマー１６の一部とハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成し、第２のアプタマー２の塩基配列部分が核酸断片３と二本鎖核酸部位を形成しても良い。いずれも第６の実施の形態と同様の効果が得られる。
【０１１３】
さらには、図１２に示すように、連結アプタマー１６が、第１のアプタマー１の塩基配列および第２のアプタマー２の塩基配列と二本鎖核酸部位を形成可能な塩基配列を有し、これらがハイブリダイズして二本鎖核酸部位を形成しても良い。これは、第６の実施の形態と同様に、第１のアプタマー１の構造体の変形により、第１のアプタマー１が、第２のアプタマー２と再度二本鎖核酸部位を形成することが抑制されるという効果が得られる。
【０１１４】
第６の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４において、この複合体４と検知対象物とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、大きなシグナル変化が起こり、高い測定感度がえられる。
【０１１５】
第６の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は必要なときに直ちに標的物質の検出をおこなうことができる。
【０１１６】
［第７の実施の形態］
第７の実施の形態は、連結アプタマー１６の第１のアプタマー１の塩基配列部分に結合した標的物質５は、第２のリガンド６と第２のアプタマー２の塩基配列部分の結合によって、第１のアプタマー１から離れ、別の第１のアプタマー１に結合する。そして、この別の第１のアプタマー１の二本鎖核酸部位が開裂することにより、二本鎖核酸部位の開裂を増幅する。第７の実施の形態は第６の実施の形態の応用であるので、第６の実施の形態と同様の点は説明を省略する。
【０１１７】
第７の実施の形態の検出メカニズムについて図８を用いて具体的に説明する。図８は、第７の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。第７の実施の形態において、第６の実施の形態と同様に、連結アプタマー１６が核酸断片３と２カ所の二本鎖核酸部位を形成して、複合体４が構成されている。（図８（ａ））。この核酸断片３は、メチレンブルー１４で修飾され電極１２に固定されている。
【０１１８】
はじめに、第６の実施の形態と同様に、検査対象物を接触させる前の電極１２（図８（ａ））と、メチレンブルー１４との間の電子伝達をＳＷＶによって測定する。
【０１１９】
次に、検査対象物を複合体４に接触させる。検査対象物に標的物質５が含まれていた場合、検査対象物を接触させると、標的物質５が第１のアプタマー１に結合する（図８（ｂ））。これにより、ブランチマイグレーションによって第１のアプタマー１の塩基配列部分を含む二本鎖核酸部位が消えて、第１のアプタマー１が核酸断片３から離れる（図８（ｃ））。
【０１２０】
次に、第２のアプタマー２が第２のリガンド６と結合する。先の工程で、第１のアプタマー１の塩基配列部分と一緒に二本鎖核酸部位を形成していた第２のアプタマー２の塩基配列部分が自由になる。これにより、第６の実施の形態と同様に、第２のアプタマー２の塩基配列部分が溶液中に添加されている第２のリガンド６と結合する（図８（ｄ））。
【０１２１】
続いて、標的物質５が第１のアプタマー１の塩基配列から離れる。第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分が近接している。このため、標的物質５と第２のリガンド６の立体障害により、連結アプタマー１６に対して標的物質５と第２のリガンド６は競争的に結合する。したがって、溶液中に第２のリガンド６が存在すると、第１のアプタマー１の塩基配列と標的物質５が結合する平衡反応と第２のアプタマー２の塩基配列と第２のリガンド６の結合が結合する平衡反応の競争反応によって、第１のアプタマー１部分に結合した標的物質５の追い出し反応が起こる。そして、標的物質５が第１のアプタマー１の塩基配列から離れる（図８（ｅ））。標的物質５が離れると、第２のアプタマー２の二本鎖核酸部分が消えて、連結アプタマー１６が核酸断片３から離れる（図８（ｆ））。連結アプタマー１６との二本鎖核酸部位が消えることにより、核酸断片３の自由度が向上し、メチレンブルー１４と電極１２との接触頻度が向上する。
【０１２２】
以上の方法を用いて、検査対象物を接触させる前後のメチレンブルー１４と電極１２との間の電子伝達を比較することによって、連結アプタマー１６と核酸断片３の間の二本鎖核酸部位の開裂を検出することができる。これにより、標的物質５の有無を調べることができる。
【０１２３】
第２のリガンド６と結合した連結アプタマー１６は、第２のリガンド６が立体障害となるため、見かけ上の標的物質５との結合定数が下がる。そのため、第１のアプタマー１の塩基配列から離れた標的物質５は、第２のリガンド６と結合していない核酸断片３と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成している連結アプタマー（図８（ａ））に優先的に結合する。そして、二本鎖核酸部位を開裂し、連結アプタマー１６を核酸断片３から離し、再び、第１のアプタマー１の塩基配列から離れる。このように、標的物質５により連結アプタマー１６が核酸断片３から離れる反応が繰り返される。これにより、二本鎖核酸部位の開裂が増幅され、標的物質５を高感度に検出することが可能となる。
【０１２４】
第７の実施の形態において、第１のアプタマー１の塩基配列、第２のアプタマー２の塩基配列、および連結アプタマー１６は、第６の実施の形態と同様のものを用いることができる。ここでは、第１のアプタマー１の塩基配列と標的物質５のあいだの解離定数（Ｋｄ１）と第２のアプタマー２の塩基配列と第２のリガンド６のあいだの解離定数（Ｋｄ２）の比（Ｋｄ２／Ｋｄ１）は好ましくは１以下であり、さらに好ましくは、０．２以下である。これにより、第２のリガンド６と第２のアプタマー２の塩基配列の結合による標的物質５の追い出し反応が生じやすくなる。
【０１２５】
溶液中に添加される第２のリガンド６の濃度は、高いほど第２のアプタマー２と第２のリガンド６の結合体の存在比率が高まる。このため、第２のリガンド６の濃度は、好ましくは第２のアプタマー２と第２のリガンド６の解離定数（Ｋｄ２）の５倍以上であり、さらに好ましくは５０倍以上である。これにより、第２のリガンド６と第２のアプタマー２の塩基配列の結合による標的物質５の追い出し反応が生じやすくなる。
【０１２６】
なお、第７の実施の形態では、メチレンブルー１４のＳＷＶによって標的物質５を検出したが、それに限らず、二本鎖核酸部位の開裂によって生じる物理的、化学的な変化を検知可能な手段を用いればよい。したがって、部材は導電性のものに限定されず、また、核酸断片３と連結アプタマー１６の複合体４も部材に固定されていなくてもよい。二本鎖核酸部位の開裂をＱＣＭやＳＰＲのような核酸自体の重さや誘電率変化によって検出する場合、核酸への修飾物質を省略しても良い。
【０１２７】
第７の実施の形態の標的物質の検出装置は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４において、この複合体４と検知対象物とを接触させる接触部と、二本鎖核酸部位の開裂を検出する検出部とを有する。この標的物質の検出装置においては、先に説明した標的物質の検出方法によって、標的物質が低濃度の場合であっても、二本鎖核酸部位の開裂が増幅して引き起こされ、高い測定感度がえられる。
【０１２８】
第７の実施の形態のセンサ（標的物質の検出用の装置）は、第１のアプタマー１の塩基配列部分と第２のアプタマー２の塩基配列部分を有する連結アプタマー１６と、核酸断片３とが、少なくとも２箇所の二本鎖核酸部位を形成した複合体４が固定された部材を有する。あらかじめこれらの核酸が固定された部材が提供されることにより、使用者は本実施の形態の標的物質の検出方法によって必要なときに直ちに標的物質を検出することができる。
【０１２９】
また、本実施の形態は以下の態様も含む。
［１］標的物質をリガンドとする第１のアプタマーと、上記標的物質とは別の物質である第２のリガンドと結合する第２のアプタマーと、を備え、上記第１のアプタマーは少なくとも１カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第２のアプタマーは二カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーとを含む、複合体を用意し、被検用試料中の上記標的物質と上記第１のアプタマーとの結合により、上記第１のアプタマーおよび上記第２のアプタマーの二本鎖核酸部位を開裂させ、上記二本鎖核酸部位の開裂を検出することにより、上記標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
［２］上記第１のアプタマーおよび／または第２のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成して上記複合体を形成していることを特徴とする、［１］に記載の標的物質の検出方法。
［３］上記第２のアプタマーが、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を形成していることを特徴とする、［１］または［２］に記載の標的物質の検出方法。
［４］上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーが、連結されていることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［５］上記第１のアプタマーと結合した上記標的物質が、上記第２のリガンドと上記第２のアプタマーの結合によって上記第１のアプタマーと離れ、再び別の第１のアプタマーと結合することにより二本鎖核酸部位の開裂を増幅することを特徴とする、［４］に記載の標的物質の検出方法。
［６］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が１以下であることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［７］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が、０．２以下であることを特徴とする［６］に記載の標的物質の検出方法。
［８］上記複合体が、部材に固定されていることを特徴とする、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［９］上記部材が、電極であり、二本鎖核酸部位の開裂を、電気的反応として検出することを特徴とする、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［１０］上記複合体が、電極反応物質により修飾されており、二本鎖核酸部位の開裂を、上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出することを特徴とする、［９］に記載の標的物質の検出方法。
［１１］上記第２のリガンドの濃度が、上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の５倍以上であることを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［１２］上記第２のリガンドの濃度が、上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の５０倍以上であることを特徴とする、［１１］に記載の標的物質の検出方法。
［１３］上記第１のアプタマーおよび／または上記第２のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位を形成して上記複合体を形成していることを特徴とする、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
［１４］標的物質をリガンドとする第１のアプタマーと、標的物質とは別の物質である第２のリガンドと結合する第２のアプタマーと、部材と、を備え、上記第１のアプタマーは少なくとも１カ所以上の二本鎖核酸部位を有し、上記第２のアプタマーが二カ所以上の二本鎖核酸部位を有し、上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーとが二本鎖核酸部位により結合して形成した複合体が、上記部材に固定され、標的物質の検出方法に使用することを特徴とする、センサ（標的物質検出用の装置）。
［１５］上記第１のアプタマーおよび／または上記第２のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位を形成して形成した上記複合体が、上記部材に固定されていることを特徴とする、［１６］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１６］上記第２のアプタマーが、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を形成していることを特徴とする、［１４］または［１５］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１７］上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーが、連結されていることを特徴とする［１４］〜［１６］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１８］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が、１以下である、［１４］〜［１７］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［１９］上記第１のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第２のアプタマーと上記第２のリガンドとの解離定数の比が、０．２以下であることを特徴とする［１８］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［２０］上記部材が電極であり、二本鎖核酸部位の開裂を、電気的反応として検出可能なことを特徴とする［１４］〜［１９］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［２１］上記複合体が、電極反応物質により修飾されており、二本鎖核酸部位の開裂を、上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出可能なことを特徴とする［２０］に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）。
［２２］標的物質をリガンドとする第１のアプタマーと、上記標的物質とは別の物質である第２のリガンドと結合する第２のアプタマーと、を備え、上記第１のアプタマーは少なくとも１カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第２のアプタマーは二カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第１のアプタマーと上記第２のアプタマーとを含む、複合体と被検用試料とを接触させる手段と、上記被検用試料中の上記標的物質との結合による二本鎖核酸部位の開裂を検出する手段とを含み、標的物質の検出方法に使用することを特徴とする、標的物質検出装置。
［２３］［１４］〜［２１］のいずれか一項に記載のセンサ（標的物質検出用の装置）と、被検用試料中の標的物質と第１のアプタマーとの結合による上記複合体からの二本鎖核酸部位の開裂を検出する手段と、を備える、［２２］に記載の標的物質検出装置。
［２４］上記被検用試料中の上記標的物質と第１のアプタマーの結合による上記複合体からの二本鎖核酸部位の開裂を電気的反応として検出する電気反応検出手段を備える、［２３］に記載の標的物質検出装置。
［２５］上記二本鎖核酸部位の開裂を上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出する電子伝達検出手段を備える、［２４］に記載の標的物質検出装置。
【０１３０】
なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。
【０１３１】
この出願は、２０１０年９月１日に出願された日本出願特願２０１０−１９６０５３号を基礎とする優先権を主張しその開示の全てをここに取り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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