(57)【要約】本出願では、粒子のサイズが約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなるナノアラム粒子が提供される。当該ナノアラム粒子は安定であり、バイアル瓶に入れる前の最終滅菌工程に適している。ナノアラム粒子を含んでなる組成物、ならびにナノアラム粒子の製造および使用もまた提供される。【選択図】図１−２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アルミニウム塩、および
（ｂ）サイジング剤
を含んでなるナノアラム粒子であって、
前記粒子のサイズが約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である、前記ナノアラム粒子。
【請求項２】
前記粒子の平均サイズが、動的光散乱によって測定されるＺ平均である、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項３】
前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、ＡｌＰＯ４、ＡｌＯ（ＯＨ）、Ａｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）、およびＫＡｌ（ＳＯ４）２からなる群から選択される、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項４】
前記サイジング剤が、表１に示されているサイジング剤から選択される、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項５】
前記サイジング剤が、ＰＡＡ、ＰＥＧ、脂質に結合したＰＥＧ、キトサン、デキストラン、またはポリ（アリルアミン）からなる群から選択される、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項６】
前記サイジング剤が、ＰＡＡ、ＰＥＧ、および脂質に結合したＰＥＧからなる群から選択される、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項７】
前記サイジング剤がリン脂質に結合したＰＥＧである、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項８】
前記サイジング剤がＰＥＧであり、前記ＰＥＧの平均分子量が約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項９】
前記サイジング剤が脂質（場合によりリン脂質）に結合したＰＥＧであり、前記ＰＥＧの平均分子量が約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項１０】
前記脂質が、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、およびＤＬＰＥからなる群から選択される、請求項９に記載のナノアラム粒子。
【請求項１１】
前記サイジング剤がキトサンである、請求項５に記載のナノアラム粒子。
【請求項１２】
前記サイジング剤がデキストランであり、前記デキストランが硫酸デキストランのナトリウム塩である、請求項５に記載のナノアラム粒子。
【請求項１３】
前記サイジング剤がポリ（アリルアミン）である、請求項５に記載のナノアラム粒子。
【請求項１４】
前記サイジング剤がＰＡＡであり、前記ＰＡＡの平均分子量が約７５０ダルトン〜約７０００ダルトンの範囲である、請求項１に記載のナノアラム粒子。
【請求項１５】
前記ナノアラム粒子が、濾過滅菌された液体製剤中にある、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノアラム粒子。
【請求項１６】
前記ナノアラム粒子が、約０℃〜約８℃で、約１ヶ月以上、約６ヶ月以上、または約１年以上の間、液体製剤中で安定である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のナノアラム粒子。
【請求項１７】
前記ナノアラム粒子が、凍結−融解サイクルを繰り返した後で安定である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノアラム粒子。
【請求項１８】
前記ナノアラム粒子が、約３７℃で、約１ヶ月以上の間、液体製剤中で安定である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のナノアラム粒子。
【請求項１９】
前記サイジング剤がアルミニウム塩と会合している、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のナノアラム粒子。
【請求項２０】
ナノアラム粒子製造方法であって、サイジング剤の存在下でアルミニウム塩を高エネルギー源に付し、それによりナノアラム粒子を製造することを含んでなり、前記ナノアラム粒子のサイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、前記方法。
【請求項２１】
ナノアラム粒子製造方法であって、（ａ）アルミニウム塩を高エネルギー源に付して、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲のサイズのナノアラム粒子を製造することと、（ｂ）工程（ａ）の後約３０分以内に、サイジング剤と前記ナノアラム粒子とを混合することとを含んでなる、前記方法。
【請求項２２】
前記高エネルギー源が、マイクロフルイダイザー、押出機、超音波処理機、高せん断ミキサー（例えば、シルバーソンミキサー）、またはホモジナイザーから得られる、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記高エネルギー源が、マイクロフルイダイザー、押出機、超音波処理機、高せん断ミキサー（例えば、シルバーソンミキサー）、またはホモジナイザーのうちの２以上から得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記高エネルギー源が、マイクロフルイダイザーおよび高せん断混合物から得られ、前記アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなる前記混合物を、前記マイクロフルイダイザーに１回〜約３０回通過させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記高エネルギー源が、マイクロフルイダイザーから得られ、前記アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなる前記混合物を、前記マイクロフルイダイザーに１回〜約１５回通過させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記アルミニウム塩が、サイズが０．５〜１０μｍまたは０．５〜２０μｍの粒子からなる、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、ＡｌＰＯ４、ＡｌＯ（ＯＨ）、Ａｌ（ＯＨ）ｘ（ＰＯ４）ｙ、およびＫＡｌ（ＳＯ４）２からなる群から選択される、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記サイジング剤が、ＰＡＡ、ＰＥＧ、脂質に結合したＰＥＧ、キトサン、デキストラン、またはポリ（アリルアミン）からなる群から選択される、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記サイジング剤がキトサンまたはポリ（アリルアミン）であり、サイジング剤の存在下で前記アルミニウム塩を高エネルギー源に付す前に、前記アルミニウム塩がリン酸リガンド交換を介して表面改質を受ける、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイジング剤が、ＰＡＡ、ＰＥＧ、および脂質に結合したＰＥＧからなる群から選択される、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記サイジング剤がＰＥＧであり、前記ＰＥＧの平均分子量が約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サイジング剤が脂質（場合によりリン脂質）に結合したＰＥＧであり、前記ＰＥＧの平均分子量が約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記脂質が、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、およびＤＬＰＥからなる群から選択される、請求項３０または３２に記載の方法。
【請求項３４】
アルミニウム塩対ＰＥＧの比が約２：１〜約７．５：１である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記サイジング剤がキトサンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記サイジング剤がデキストランであり、前記デキストランが硫酸デキストランのナトリウム塩である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記サイジング剤がポリ（アリルアミン）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記サイジング剤がＰＡＡであり、前記ＰＡＡの平均分子量が約７５０ダルトン〜約７０００ダルトンの範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノアラム粒子を濾過滅菌することをさらに含んでなる、請求項２０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナノアラム粒子のサイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、請求項２０〜３９のいずれか一項に記載の方法によって得られる、または製造されるナノアラム粒子。
【請求項４１】
請求項１〜１９および４０のいずれか一項に記載のナノアラム粒子を含んでなる組成物。
【請求項４２】
生物活性剤をさらに含んでなる請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記生物活性剤が、前記組成物中の前記ナノアラム粒子と会合している、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
約７５％を超える前記生物活性剤が、ゲル電気泳動によって測定される、組成物中のナノアラム粒子との会合をしている、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４５】
前記生物活性剤が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、または生物である、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記生物活性剤がポリペプチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ポリペプチドが、抗原、融合タンパク質、全長タンパク質、ペプチド、またはペプチド模倣物である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記抗原がＲｉｇ−ＩアゴニストまたはＩＤ９７である、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記生物活性剤がポリヌクレオチドである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＤＮＡがポリペプチドをコードする配列を含んでなる、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＤＮＡがオリゴヌクレオチドである、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ＲＮＡが、レプリコンＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択されるか、またはアプタマーＲＮＡである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ＲＮＡがポリペプチドをコードする配列を含んでなる、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５６】
前記組成物がアジュバントをさらに含んでなる、請求項４１〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記アジュバントが、ＡＳ−２、モノホスホリルリピドＡ、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ、ＩＦＡ、ＱＳ２１、ＣＷＳ、ＴＯＭ、ＡＧＰ、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、Ｌｅｉｆ、サポニン、サポニン模倣物、生物由来および合成のリピドＡ、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン、ＧＬＡ、ＳＬＡ、ＳＴＩＮＧ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記組成物が液体製剤である、請求項４１〜５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
０．４５ミクロンサイズのフィルターを通して濾過することができる、請求項４１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
０．２０ミクロンサイズのフィルターを通して濾過することができる、請求項４１〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
バイアルに入れる前に最終滅菌することができる、請求項４１〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
約０℃〜約８℃で、約１ヶ月以上、約６ヶ月以上、または約１年以上の間、安定である、請求項４１〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
約３７℃で、約１ヶ月以上の間、安定である、請求項４１〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記組成物がリポソームをさらに含んでなる、請求項４１〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記組成物中の前記粒子の平均サイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍである、請求項４１〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
請求項４１〜６５のいずれか一項に記載の組成物を含有する第１のバイアルを含んでなるキット。
【請求項６７】
別の薬剤を含有する第２のバイアルをさらに含んでなる、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、請求項４１〜６５のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与し、それによって前記対象において免疫応答を刺激することを含んでなる、前記方法。
【請求項６９】
前記免疫応答が非特異的免疫応答である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記免疫応答が抗原特異的免疫応答である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫応答が主にＴＨ１免疫応答である、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫応答が主にＴＨ２免疫応答である、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫応答がＴＨ１およびＴＨ２免疫応答の両方である、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記免疫応答が、Ｂ細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化、抗体の産生、またはサイトカインの放出を伴う、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物が単独療法に使用される、請求項６８〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物が、アレルギー、嗜癖、癌、または自己免疫の治療に使用される、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物の投与経路が、経口、静脈内、皮内、経皮、経鼻、皮下、または肛門である、請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象がヒトである、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象がヒト以外の哺乳類である、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ヒト以外の哺乳類が、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
生物活性剤を対象の細胞に送達する方法であって、（ａ）アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなるナノアラム粒子であって、サイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍである前記粒子、ならびに（ｂ）生物活性剤を含んでなる組成物を前記対象に投与し、それにより、前記生物活性剤を前記対象の前記細胞に送達することを含んでなる、前記方法。
【請求項８２】
前記生物活性剤を前記細胞内に送達する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記生物活性剤が、ポリペプチドをコードする配列を含んでなるＲＮＡであり、前記ポリペプチドが前記細胞によって発現される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記組成物が前記対象において免疫応答を生じさせる、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
請求項１〜１９および４０のいずれか一項に記載のナノアラム粒子を生物活性剤と混合することを含んでなる、組成物製造方法。
【請求項８６】
組成物製造方法であって、（ａ）サイジング剤の存在下でアルミニウム塩を高エネルギー源に付し、それによりナノアラム粒子を製造する工程であって、前記ナノアラム粒子のサイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、前記工程と、（ｂ）工程（ａ）で製造したナノアラム粒子を生物活性剤と混合する工程と、を含んでなる、前記方法。
【請求項８７】
組成物製造方法であって、（ａ）アルミニウム塩を高エネルギー源に付して、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲のサイズのナノアラム粒子を製造する工程と、（ｂ）工程（ａ）の後約３０分以内に、サイジング剤と前記ナノアラム粒子とを混合する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の間または後に、前記ナノアラム粒子と生物活性剤とを混合する工程と、を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年６月１日に出願された米国仮出願第６２／３４４，３４７号の利益を主張し、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、医薬品およびワクチン製剤の分野に関する。より詳細には、本明細書に記載の実施形態は、ナノアラム粒子、ナノアラム粒子を含んでなる組成物、ならびにナノアラム粒子の製造方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アルミニウム塩（総称してアラム）は、安全性プロファイルが良好であり、吸着したワクチン抗原に対する増強された免疫応答を誘発する能力があるため、８０年以上にわたり、ワクチンに使用されてきた［１，２］。米国ＦＤＡによって承認されたいくつかのクラスのアジュバントの１つとして、アルミニウム塩は、より新しいアジュバント製剤とは対照的に、確立された調節経路を有する［１］。水溶液中に分散させると、アルミニウム塩は、サイズが約０．５〜１０ミクロン（μｍ）の不均一凝集粒子を形成し、水中油型エマルションなどの単分散サイズ集団を有する製剤と比較して品質管理のためのキャラクタリゼーションが困難になり得る。この複雑さは、リン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシフォスフェイト硫酸塩、およびオキシ水酸化アルミニウムを含む、異なる特性を有する複数種類のアルミニウム塩が利用可能であるという事実によってさらに悪化する。
【０００４】
いくつかの研究では、アジュバント製剤の平均粒径がワクチンの生物活性に影響を与え得る重要な因子であることが提唱されている（１）。近年、アルミニウム塩を用いて、アラムナノ粒子を含有する新しい合成製剤を新規に製造する新規な合成アプローチが採用されている。これらの合成ナノ粒子は、微粒子と比較して、注射部位での炎症を減少させながら、より強い免疫応答を発生させると記載されている［１，４，５］。それにもかかわらず、これらの研究の各々において、ボトムアップ合成アプローチを用いてアルミニウム粒子を製造し、Alhydrogel（登録商標）などの臨床用アルミニウム塩アジュバントとの比較は行わなかったので、臨床的に承認された物質に対する新規な製剤の価値を解釈することが困難となっている。
【０００５】
さらに、規制上の観点から、臨床用のアルミニウムベースの微粒子は、０．４５または０．２０ミクロンのフィルターを通した濾過により最終滅菌することができず、放射線またはオートクレーブによってのみ滅菌することができ、そのため、抗原またはアジュバントと組み合わせた場合の最終滅菌工程にそれらの製造は適さなくなっている。ほとんどもしくは全く凝集を示さないか、または凝集の減少を示し、バイアルに入れる前に最終滅菌することができる、アルミニウムベースのナノ粒子を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、ナノアラム粒子、ナノアラム粒子を含んでなる組成物、ならびにナノアラム粒子の製造方法および使用方法を提供する。ナノアラム粒子は、医薬品および／またはワクチン製剤の分野において有用である。本明細書では、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなる複数のナノアラム粒子を含んでなる組成物（製剤を含む）であって、前記組成物中の前記粒子のサイズが１μｍ未満である、前記組成物が提供される。ナノアラム粒子という用語は、粒子がアルミニウムを含んでなり、ナノメートルで測定されたサイズ、典型的には１ｎｍ〜約４５０ｎｍを有することを示すように本明細書で使用されている。いくつかの実施形態において、組成物は、ＦＤＡ規制（例えば、≦０．４５ミクロンフィルターの使用）に従った製品用フィルターによる最終滅菌用である。いくつかの実施形態において、組成物中に存在する粒子のサイズは、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、組成物中の粒子の平均サイズは、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、組成物中の粒子の平均サイズは、約１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲である。本明細書に記載のナノアラム組成物は、顕微溶液化、超音波処理、および高せん断混合を含むがこれらに限定されない当分野で公知の標準的な技術によって、サイジング剤の存在下で、水酸化アルミニウムを処理または粉砕することによって、製造し得る。高せん断ミキサーを用いて高せん断混合を行うことができる。シルバーソン（Silverson）は、本発明の方法で使用できる高せん断ミキサーを製造する１つの会社である。
【０００７】
組成物中のナノアラム粒子は安定であり、ほとんどもしくは全く凝集を示さないか、または凝集の減少を示し、バイアルに入れる前の最終滅菌工程に適している。本明細書で提供されるナノアラム粒子は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの薬剤の個体への送達に有用である。ほんの一例として、本明細書で提供されるナノアラム粒子は、免疫応答を発生させるために宿主に抗原および／またはアジュバントを送達するのに有用である。
【０００８】
本開示は、（ａ）アルミニウム塩、および（ｂ）サイジング剤を含んでなるナノアラム粒子であって、前記粒子のサイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、前記ナノアラム粒子を提供する。
【０００９】
特定の実施形態において、粒子の平均サイズは、動的光散乱によって測定されるＺ平均である。
【００１０】
特定の実施形態において、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、ＡｌＰＯ４、ＡｌＯ（ＯＨ）、Ａｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）、およびＫＡｌ（ＳＯ４）２からなる群から選択される。
【００１１】
特定の実施形態において、サイジング剤は、表１に示されているサイジング剤から選択される。サイジング剤は、ＰＡＡ、ＰＥＧ、および脂質に結合したＰＥＧからなる群から選択されることができる。サイジング剤は、キトサン、デキストラン（例えば硫酸デキストラン）、またはポリ（アリルアミン）からなる群から選択されることができる。サイジング剤は、ＰＡＡ、ＰＥＧ、脂質に結合したＰＥＧ、キトサン、硫酸デキストラン、またはポリ（アリルアミン）からなる群から選択されることができる。
【００１２】
特定の実施形態において、サイジング剤は、脂質に結合したＰＥＧである。特定の実施形態において、サイジング剤はＰＥＧであり、ＰＥＧの平均分子量は、約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態において、サイジング剤は脂質（場合によりリン脂質）に結合したＰＥＧであり、ＰＥＧの平均分子量は約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態において、脂質は、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、およびＤＭＰＥからなる群から選択される。特定の実施形態において、サイジング剤はＰＡＡであり、ＰＡＡの平均分子量は約７５０ダルトン〜約７０００ダルトンの範囲である。
【００１３】
サイジング剤がキトサンである場合、サイジング剤は低分子量キトサン（例えば、約１５ｋＤａ〜約１９０ｋＤａの分子量）、中程度の分子量のキトサン（例えば、約１９０ｋＤａ〜約７００ｋＤａの分子量）、または高分子量キトサン（例えば、約７００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量）であることができる。キトサンの脱アシル化の程度（ＤＤＡ）は、精製方法および反応条件によって異なる。キトサンの脱アシル化の程度は、典型的には約４０％〜約９０％の範囲であり、市販のキトサンは約７０％〜約９０％のＤＤＡを通常有するが、約４０％〜約９０％、好ましくは約７０％〜約９０％のＤＤＡを有するキトサンと同様に、本発明の方法においては、ＤＤＡが９０％を超える、または４０％未満であるキトサンを使用することができる。いくつかの実施形態において、キトサンのＣ２炭素上の１以上の一級アミン基を共有結合のための部位として使用することができる。したがって、本明細書で使用される用語キトサンは、マンノシル化キトサンまたは蛍光標識キトサンを含むが、これらに限定されない、キトサンコンジュゲートを含む。本発明の方法において使用するためのキトサンは、SIGMA-ALDRICHTMを含む多くの供給源から市販されている。
【００１４】
サイジング剤がデキストランである場合、サイジング剤は、１０００ダルトン以上の分子量を有するクラス１、２、または３のデキストランのいずれかであることができる。サイジング剤として使用するのに特に好ましいデキストランは硫酸デキストランである。硫酸デキストランは、典型的にはそのナトリウム塩として販売されている−したがって、本明細書で使用される場合、用語硫酸デキストランは、そのナトリウム塩形態を含むその塩形態も含む。キトサンと同様に、サイジング剤が硫酸デキストランである場合、サイジング剤は、低分子量（例えば、５０００ダルトン〜１００ｋＤａ）、中程度の分子量（例えば、１００ｋＤａ〜５００ｋＤａ）、または高分子量硫酸デキストラン（例えば、５００ｋＤａ〜１０００またはさらには２０００ｋＤａ）であることができる。好ましい硫酸デキストランは、約２０ｋＤａ〜約８０ｋＤａの分子量を有する。
【００１５】
ポリ（アリルアミン）は、本明細書に記載のサイジング剤として使用できる遊離一級アミノ基を有する水溶性カチオン性ポリマーである。ポリ（アリルアミン）は、好ましくは、約５ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａの分子量を有する。遊離塩基形態のポリ（アリルアミン）またはその塩形態（例えば、塩酸塩）のいずれかを使用することができる。当業者であれば、１００ｋＤａより大きい分子量を有するポリ（アリルアミン）ポリマーを本明細書に記載の方法で使用することができ、さらに、塩形態のポリ（アリルアミン）を使用すると、その分子量が増加することを理解するであろう。
【００１６】
特定の実施形態において、ナノアラム粒子は、濾過滅菌される液体製剤中に存在する。特定の実施形態において、ナノアラム粒子は、約０℃〜約８℃で、約１ヶ月以上、約６ヶ月以上、または約１年以上の間、液体製剤中で安定である。特定の実施形態において、ナノアラム粒子は、約３７℃で、約１ヶ月以上の間、液体製剤中で安定である。特定の実施形態において、サイジング剤は、アルミニウム塩と会合する。
【００１７】
本開示は、ナノアラム粒子製造方法であって、サイジング剤の存在下でアルミニウム塩を高エネルギー源に付し、それによりナノアラム粒子を製造することを含んでなり、前記ナノアラム粒子のサイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、前記方法を提供する。
【００１８】
当業者には理解されるように、本発明のナノアラム粒子は、マイクロメーターサイズのより大きな粒子から製造することができる。したがって、本
開示は、０．５μｍ〜２０μｍのサイズ、または０．５μｍ〜１０μｍのサイズの前駆体アルミニウム塩粒子から、記載のナノアラム粒子を製造する方法を提供する。
【００１９】
本開示は、ナノアラム粒子製造方法であって、（ａ）アルミニウム塩を高エネルギー源に付して、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲のサイズのナノアラム粒子を製造することと、（ｂ）（ａ）の後約３０分以内に、サイジング剤と前記ナノアラム粒子とを混合することとを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２０】
特定の実施形態において、高エネルギー源は、マイクロフルイダイザー、押出機、超音波処理機、高せん断ミキサー（例えば、シルバーソンミキサー）、またはホモジナイザーから得られる。２以上の高エネルギー源を使用することができる。例えば、高エネルギー源は、マイクロフルイダイザーおよび高せん断ミキサーから得ることができ、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなる混合物を、１回以上（例えば、１回〜約３０回以上）、マイクロフルイダイザーに通過させることができる。特定の実施形態において、高エネルギー源は、マイクロフルイダイザーから得られ、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなる混合物を、マイクロフルイダイザーに１回〜約１５回通過させる。特定の実施形態において、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、ＡｌＰＯ４、ＡｌＯ（ＯＨ）、Ａｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）、およびＫＡｌ（ＳＯ４）２からなる群から選択される。特定の実施形態において、サイジング剤は、ＰＡＡ、ＰＥＧ、および脂質に結合したＰＥＧからなる群から選択される。あるいは、サイジング剤は、表１に記載のサイジング剤から、またはキトサン、デキストラン、もしくはポリ（アリルアミン）から選択することができる。特定の実施形態において、サイジング剤はＰＥＧであり、ＰＥＧの平均分子量は、約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態において、サイジング剤は脂質（場合によりリン脂質）に結合したＰＥＧであり、ＰＥＧの平均分子量は約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態において、脂質は、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、およびＤＭＰＥからなる群から選択される。特定の実施形態において、サイジング剤はＰＡＡであり、ＰＡＡの平均分子量は約７５０ダルトン〜約７０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態において、方法は、ナノアラム粒子を濾過滅菌することをさらに含んでなる。特定の実施形態において、アルミニウム塩対ＰＥＧの比は、約２：１〜約７．５：１である。サイジング剤がキトサンまたはポリ（アリルアミン）である実施形態では、アルミニウム塩はリン酸リガンド交換による表面改質を受ける。
【００２１】
本開示は、サイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、本明細書に開示されている方法によって得られるか、または製造されるナノアラム粒子を提供する。
【００２２】
本開示は、本明細書に開示されるナノアラム粒子を含んでなる組成物を提供する。
【００２３】
特定の実施形態において、組成物は、生物活性剤をさらに含んでなる。特定の実施形態において、生物活性剤は、組成物中のナノアラム粒子と会合している。特定の実施形態において、約７５％を超える生物活性剤が、ゲル電気泳動によって測定される、組成物中のナノアラム粒子との会合をしている。特定の実施形態において、生物活性剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、または生物である。特定の実施形態において、生物活性剤はポリペプチドである。特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗原、融合タンパク質、全長タンパク質、ペプチド、またはペプチド模倣物である。特定の実施形態において、抗原はＲｉｇ  Ｉアゴニストである。特定の実施形態において、生物活性剤はポリヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。特定の実施形態において、ＤＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含んでなる。特定の実施形態において、ＤＮＡはオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。特定の実施形態において、ＲＮＡは、レプリコンＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される。特定の実施形態において、ＲＮＡは、ポリペプチドをコードする配列を含んでなる。特定の実施形態において、組成物はアジュバントをさらに含んでなる。特定の実施形態において、アジュバントはＡＳ−２、モノホスホリルリピドＡ、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ、ＩＦＡ、ＱＳ２１、ＣＷＳ、ＴＯＭ、ＡＧＰ、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、Ｌｅｉｆ、サポニン、サポニン模倣物、生物由来および合成のリピドＡ、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン、ＧＬＡ、ＳＬＡ、ＳＴＩＮＧ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２４】
特定の実施形態において、組成物は液体製剤である。特定の実施形態において、組成物は、０．２０ミクロンサイズのフィルターまたは０．４５ミクロンサイズのフィルターを通して濾過することができる。特定の実施形態において、組成物は、バイアルに入れる前に最終滅菌することができる。特定の実施形態において、組成物は、約０℃〜約８℃で、約１ヶ月以上、約６ヶ月以上、または約１年以上の間、安定である。特定の実施形態において、組成物は、約３７℃で、約１ヶ月以上の間、安定である。特定の実施形態において、組成物はリポソームをさらに含んでなる。特定の実施形態において、組成物中の粒子の平均サイズは、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍである。
【００２５】
本開示は、本明細書に開示されている組成物を含有する第１のバイアルを含んでなるキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、別の薬剤を含有する第２のバイアルをさらに含んでなる。
【００２６】
本開示は、対象において免疫応答を刺激する方法であって、本明細書に開示されている組成物を対象に投与し、それによって前記対象において免疫応答を刺激することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２７】
特定の実施形態において、免疫応答は非特異的免疫応答である。特定の実施形態において、免疫応答は抗原特異的免疫応答である。特定の実施形態において、免疫応答は、Ｂ細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化、抗体の産生、またはサイトカインの放出を伴う。特定の実施形態において、組成物は単独療法に使用される。特定の実施形態において、組成物は、アレルギー、嗜癖、癌、または自己免疫の治療に使用される。特定の実施形態において、組成物の投与経路は、経口、静脈内、皮内、経皮、経鼻、皮下、または肛門である。特定の実施形態において、対象はヒトである。特定の実施形態において、対象はヒト以外の哺乳類である。特定の実施形態において、ヒト以外の哺乳類は、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマである。
【００２８】
本開示は、生物活性剤を対象の細胞に送達する方法であって、（ａ）アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなるナノアラム粒子であって、サイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍである前記粒子、ならびに（ｂ）生物活性剤を含んでなる組成物を前記対象に投与し、それにより、前記生物活性剤を前記対象の前記細胞に送達することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２９】
特定の実施形態において、生物活性剤を細胞内に送達する。特定の実施形態において、生物活性剤は、ポリペプチドをコードする配列を含んでなるＲＮＡであり、ポリペプチドは細胞によって発現される。特定の実施形態において、組成物は、対象において免疫応答を発生させる。
【００３０】
本開示は、本明細書に開示されているナノアラム粒子を生物活性剤と混合することを含んでなる、組成物製造方法を提供する。
【００３１】
本開示は、組成物製造方法であって、（ａ）サイジング剤の存在下でアルミニウム塩を高エネルギー源に付し、それによりナノアラム粒子を製造する工程であって、前記ナノアラム粒子のサイズが約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である、前記工程と、（ｂ）工程（ａ）で製造したナノアラム粒子を生物活性剤と混合する工程と、を含んでなる、前記方法を提供する。
【００３２】
本開示は、組成物製造方法であって、（ａ）アルミニウム塩を高エネルギー源に付して、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲のサイズのナノアラム粒子を製造する工程と、（ｂ）工程（ａ）の後約３０分以内に、サイジング剤と前記ナノアラム粒子とを混合する工程と、（ｃ）工程（ｂ）の間または後に、前記ナノアラム粒子と生物活性剤とを混合する工程と、を含んでなる、前記方法を提供する。
【００３３】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると、明らかになるであろう。さらに、本発明の特定の態様をより詳細に記載する様々な参考文献が本明細書に挙げられており、それゆえ、それらはその全体で参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１−１】図１Ａ〜ＦはＰＡＡおよびＰＥＧサイジング剤を含むナノアルラム製剤ならびにナノアラム製剤の安定性分析。図１Ａは、３０Ｋ  ＰＳＩで３回または６回の通過に付したサイジング剤としてのＰＡＡ２０００の存在下で処理または粉砕されたナノアラム製剤が、約１００ｎｍの平均粒径を有し、約０．２５〜０．３の多分散性を有することを示す。粉砕を１０〜１５通過に増加させると、多分散性の増加なしに約７８〜８７ｎｍのナノアラム製剤が得られた。図１Ｂ〜Ｃは、サイジング剤としてＰＥＧリン脂質（アラムに対して２：１の比のＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ）またはＰＡＡのいずれかを含むナノアラム製剤の経時的な粒径を示す。約７８ｎｍの初期粒径を有する製剤を４℃で最大１年間保存し、粒径および多分散性について示された時点で試験した。サンプルを三重に採取した。図１Ｄ〜Ｆ：ナノアラム製剤の熱安定性。異なるＰＥＧ長（５０００、２０００、および７５０）ならびに／または異なるアシル鎖長（１８、１６、もしくは１４炭素）のペグ化脂質を用いて製剤化された１００ｎｍ未満の粒径のナノアラム製剤を、２５℃、３７℃で、または６０℃で、０、２、または４週間、熱安定性について評価した。ＱＧ１９４はＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥであり、ＱＧ１９５はＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであり、ＱＧ１９６はＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥであり、ＱＧ１９７はＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥであり、ＱＧ１９８はＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥである。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【００３５】
【図２】図２は様々なサイジング剤を有するナノアラム製剤は、予測アラム含有量を含有する。様々なアシル鎖長のリン脂質に連結された様々な長さのＰＥＧサイジング剤を用いて調製したナノアラム製剤は、予測アラム含有量を有する。１８Ｃ（ＤＳＰＥ）のリン脂質と、５０００（サンプル１）、２０００（サンプル４）、および７５０（サンプル５）の様々なＰＥＧ長とを有するサイジング剤からなるナノアラム製剤は、ＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥ（サンプル５）についての３．９ｍｇ／ｍｌからＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ（サンプル３）についての４．５ｍｇ／ｍｌの範囲のＩＣＰ−ＯＥＳ試験による尺度として予測される４ｍｇ／ｍｌのほぼ等量のアラム初期値を含有する。
【００３６】
【図３−１】図３Ａ〜Ｄは２．５μｇのＩＤ９７単独で、またはアラム、ＰＡＡ、ナノアラムＰＡＡ、ナノアラムＰＥＧ、もしくはＴＬＲ４アゴニストＧＬＡ−ＳＥでアジュバント添加して、マウスを免疫した。免疫化の１週間後、脾細胞を単離し、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａの存在下、３７℃で８時間、ＩＤ９７タンパク質で刺激しないかまたは刺激した。次いで、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４４の表面発現、ならびにＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、およびＩＬ−１７Ａの細胞内発現について細胞を染色した。抗原特異的応答は、ＩＤ９７刺激サンプルで応答を生じているＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度から非刺激サンプルを差し引いたものとして計算した。図３Ａは、ＩＤ９７に特異的な各応答を生じているＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度を示す。免疫化の１週間後に血清を免疫動物から採取し、ＩｇＧアイソタイプ（３Ｂ）ならびにＩｇＧ１（３Ｃ）およびＩｇＧ２サブクラス（３Ｄ）についてＥＬＩＳＡによりＩＤ９７結合抗体価を評価した。データは、ナノアラムＰＡＡがＴｈ１応答を増大させることを示している。図３Ｂの凡例は３Ａの凡例と同じであり、３Ｃの凡例は３Ｄの凡例と同じである。
【図３−２】同上。
【００３７】
【図４−１】図４Ａ〜Ｃは雌マウスを、生理食塩水、アラム、ナノアラムＰＡＡ、またはナノアラムＰＥＧで筋肉内で免疫した。１日後、流入領域リンパ節を取り出し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによって分泌されたサイトカインおよびケモカインを分析した。データは、ナノアラムＰＡＡが、マウスの流入領域リンパ節においてＴｈ１スキューイングサイトカイン（Th1 skewing cytokine）を増大させることを示している。
【図４−２】同上。
【００３８】
【図５】図５は野生型マウスおよびＩＬ−１８Ｒ−／−マウスを、２．５μｇのＩＤ９７および１μｇのＰＥ組み換え抗原アジュバント添加ナノアラムＰＡＡで免疫した。免疫化の１週間後、脾細胞を単離し、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａの存在下で３７℃で８時間、ＩＤ９７タンパク質で刺激しないか、または刺激した。次いで、細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４４の表面発現、ならびにＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、およびＩＬ−１７Ａの細胞内発現について染色した。抗原特異的応答は、ＩＤ９７刺激サンプルで応答を生じているＣＤ４  Ｔ細胞の頻度から非刺激サンプルを差し引いたものとして計算した。データは、ナノアラムＰＡＡがＩＬ−１８Ｒ依存性機構を介してＴｈ１応答を増大させることを示している。
【００３９】
【図６】図６Ａ〜Ｃはマウスを、ナノアラムで製剤化したＲＮＡレプリコン発現ベクターで免疫した。データは、注射後２４時間で、非製剤化ＲＮＡ（３０μｇ）より３０倍および３００倍（１または０．１μｇ）低い用量で、カチオン性エマルションと混合されたＲＮＡレプリコンが、非製剤化ＲＮＡと同等の発現を示し、一方でＰＡＡナノアラムがより低い発現を示したことを示す（図６Ａ）。しかしながら、注射後４日目および７日目までに、対照カチオン性エマルションまたはＰＡＡナノアラムのいずれかと混合されたＲＮＡは、１μｇ（ｍｃｇ）および０．１μｇ（ｍｃｇ）用量の両方でほぼ同等の発現（図６Ｂおよび６Ｃ）を示す。
【００４０】
【図７】図７Ａ〜ＤはナノアラムＲＮＡで製剤化したＲＮＡレプリコンベクターの発現は、ナノアラム製剤中のサイジング剤によるものではない。図７Ａ〜Ｄにおいて、製剤に従って、かつ、２４時間で送達されたレプリコンベクターの用量（ｍｃｇ  それぞれ、＋）として示されている非製剤化、１μｇ（ｍｃｇ）、および０．１μｇ（ｍｃｇ））によってグループ化されたデータは、ＰＡＡ単独（右上のパネル）は、０．１または１．０μｇの用量でＲＮＡレプリコンの発現レベルを送達および／または誘発しないが、対照カチオン性エマルションまたはＰＡＡナノアラムのいずれかと製剤化または混合された同じ用量のＲＮＡレプリコンは、検出可能なルシフェラーゼ発現を示すことを示す。
【００４１】
【図８】図８Ａ〜Ｃはナノアラムと製剤化されたｍＲＮＡで免疫されたマウスは、インビボでＲＮＡにコードされた遺伝子産物を発現する。データは、ナノアラム製剤がｍＲＮＡの送達およびｍＲＮＡからの発現が可能であり、非製剤化ｍＲＮＡと比較して用量節約特性を有することを示す。図８Ａは、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを注射された動物で観察され、ルシフェラーゼ遺伝子の発現について画像化された相対発光を示す。非製剤化ｍＲＮＡは、注射後２４時間にアクセスした場合、１０μｇおよび１μｇの両方で検出可能な発現を示すが、０．１μｇでは検出可能な発現を示さない（左群）。しかしながら、対照カチオン性製剤およびＰＡＡナノアラム製剤（中央および右端の群）は、互いに比較した場合、全ての用量（１０μｇ、１μｇ、および０．１μｇ）で等しいレベルのｍＲＮＡコード遺伝子を発現するだけでなく、それらはまた、非製剤化ｍＲＮＡと比較して、１μｇ用量で発現レベルの増加（＞３０倍）を示し、０．１μｇの用量で検出可能なレベルの発現を有し、ナノアラム製剤の用量節約特性を実証する。図８Ｂは、注射後５日目にｍＲＮＡの発現について画像化された動物の相対免疫蛍光を示す。注射後５日目に評価した場合、非製剤化ｍＲＮＡは、１０μｇでｍＲＮＡコード遺伝子の検出可能な発現を示すが、低用量（１μｇおよび０．１μｇ）では検出可能な発現を示さず、対照カチオン性製剤で製剤化されたｍＲＮＡは、送達された用量のいずれにおいても検出可能な発現を示さない（１０μｇ、１μｇ、０．１μｇ）（左の群および中央）。ＰＡＡナノアラム製剤（右端群）は、１０μｇの用量で＞１０倍高いレベルのｍＲＮＡがコードするルシフェラーゼを発現し、１μｇ用量で検出可能な発現を示し、これは１０μｇの非製剤化ｍＲＮＡで観察されるレベルとほぼ同等であり、ｍＲＮＡの送達の５日後でさえナノアラム製剤に用量節約特性があることを示す。図８Ｃは、非製剤化、対照カチオン性エマルション製剤、またはＰＡＡナノアラムとして混合してインビボで注射した後６時間、２４時間、および５日でのｍＲＮＡコードルシフェラーゼ遺伝子の相対インビボ発現を示す。データは、ナノアラム製剤で製剤化されたｍＲＮＡで免疫された動物では、発現が急速に減少した非製剤化ｍＲＮＡ（●）または対照カチオン性エマルション製剤化ｍＲＮＡ（Δ）と比較して、５日間にわたってｍＲＮＡコードルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルが増加し、比較的一定であった（□）ことを示す。
【００４２】
【図９−１】図９Ａ〜Ｅはナノアラム製剤はＲＮＡを安定化させる。この図は、ナノアラム製剤（中央の群、ＰＡＡナノアラム）をＲＮＡと混合し、４℃で１時間、４時間、または２４時間単一のバイアル調製物として保存し、続いてマウスを免疫するために使用する場合、混合された製剤は、複製ＲＮＡからのルシフェラーゼ発現のレベルが、１日目（図９Ａ中央の群）または５日目（図９Ｂ中央の群）に分析したときに、混合され、ゼロ時で直ちに投与された製剤と同等またはそれ以上であるように、レプリコンＲＮＡコンストラクトを送達することができることを示す。非製剤化ＲＮＡレプリコンは、投与後２４時間または５日に遺伝子発現を測定した場合に、４時間または２４時間の保存後に検出可能な発現を示さないが、混合後直ちにまたは混合から１時間後に投与した場合に、検出可能な発現を示す。同様に、対照カチオン性製剤は、混合し、４℃で１時間、４時間、または２４時間保存し、遺伝子発現を注射から１日または５日後に測定した場合に、ＲＮＡレプリコンの保護を示す。図９Ｃ〜Ｅは、対照カチオン性製剤、ＰＡＡナノアラム、および非製剤化レプリコンをそれぞれ直接比較するデータの散布図である。レプリコンＲＮＡと混合直後に投与した場合（Ｔ＝０、左パネル９Ｃ）、混合および４℃での保存（Ｔ＝１ｈ、中央パネル９Ｄ）、または混合および４℃での２４時間の保存（Ｔ＝２４ｈ、右パネル９Ｅ）から４時間後に投与した場合のＲＮＡ。遺伝子発現は、動物への投与後５日目に相対発光単位により測定する。ルシフェラーゼ発現レベルは、非製剤化ＲＮＡと比較して、最大２４時間の間４℃で単一のバイアル製剤として混合した場合、ナノアラム製剤化ＲＮＡが安定であることを示す。
【図９−２】同上。
【００４３】
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｅはナノアラムで製剤化されたリーシュマニア症融合タンパク質をコードするＲＮＡレプリコン発現ベクターで免疫されたマウスは、インビボでＲＮＡを発現し、用量節約抗原特異的免疫応答を誘発する。この図は、リーシュマニア症融合ポリヌクレオチドであるＥＭＣＨをコードするＲＮＡレプリコンベクターで免疫されたマウスが抗原特異的応答を発生することを示す。図１０Ａ〜Ｄは、対照カチオン性エマルションまたはＰＡＡナノアラムで製剤化されたＥＭＣＨ  ＲＮＡの１００倍低い用量での免疫化が、０．１μｇの非製剤化ＲＮＡレプリコンの投与後にサイトカイン誘発がほとんどまたは全くないのと比較される１０μｇの非製剤化ＲＮＡとほぼ同等のパーセンテージのＣＤ４＋  ＣＤ４４高ＣＤ１５４、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、またはＴＮＦαサイトカイン産生Ｔ細胞を生じることを示す。図１０Ｅ：防御的リーシュマニア症免疫応答の特徴には、複数のサイトカインを分泌する多機能性抗原特異的Ｔ細胞の存在が含まれる。ＣＤ４＋  ＣＤ４４高Ｔ細胞を、多機能性Ｔ細胞応答についてさらに分析した。データは、ＰＡＡナノアラムで製剤化された（斜線の棒）、または対照カチオン性エマルションで製剤化された（対角斜線の棒）１００ｎｇのＥＭＣＨ  ＲＮＡレプリコンで免疫されたマウスが、１０μｇの非製剤化ＲＮＡ（黒く塗りつぶされた棒）で免疫された動物と同数の三重陽性ＣＤ４４高  ＩＦＮ−γ＋  ＩＬ−２＋  ＴＮＦα＋  ＣＤ４＋  Ｔ細胞を有したことを示す。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２またはＩＬ−２およびＴＮＦαを発現する二重陽性細胞も存在した。データは、ＰＡＡナノアラム製剤が、関連する抗原特異的免疫応答を発生させるのに充分なレベルで発現されるＲＮＡを送達することができることを示している。
【図１０−２】同上。
【００４４】
【図１１】図１１Ａ〜ＢはＴＢ融合ペプチドＩＤ９３に吸着した４００ｎｍ、１３０ｎｍ、または７５ｎｍのナノアラム粒径を有するナノアラム製剤で免疫されたマウスが、抗原特異的免疫応答を誘発することを示す。図１１Ａは、ナノアラム製剤がＴｈ２偏性を示す抗原特異的ＩｇＧ１抗体力価を誘発することを示す。図１１Ｂは、ナノアラム製剤プラスＴＬＲ４アゴニストのＳＬＡが、Ｔｈ１偏性を示す抗原特異的ＩｇＧ２ｃ抗体力価を誘発することを示す。
【００４５】
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｃは様々なアシル鎖長のリン脂質に連結されたＰＥＧ長が異なる、または同じＰＥＧ長のＰＥＧ化リン脂質サイジング剤を含んでなり、ＴＢ融合ペプチドＩＤ９３プラスＴＬＲ４アゴニストＳＬＡと混合されたＰＥＧナノアラム製剤で免疫されたマウスが、抗原特異的免疫応答を誘発することを示す。
【図１２−２】同上。
【００４６】
【図１３】図１３Ａは、AdjuPhos（登録商標）前駆体および７５〜８５％ＤＤの１２０ｋＤａのキトサンを用いて合成されたナノアラムの流体力学的サイズに対する３０，０００ｐｓｉでの顕微溶液化通過回数の効果を示す。図１３Ｂは、前駆体としてAdjuPhos（登録商標）アジュバントを使用し、７５〜８５％ＤＤの１２０ｋＤａのキトサンの量を変化させて製造されたナノアラムの流体力学的直径およびＰＤＩを示す。サンプルを３０，０００ｐｓｉで２２回の別個の通過で顕微溶液化した。
【００４７】
【図１４】図１４Ａは、４０ｋＤａの硫酸デキストランで安定化されたAlhydrogel（登録商標）由来のナノアラム（０．２％ｗ／ｖ  Ａｌ）の粒径を示す。顕微溶液化は、３０，０００  ｐｓｉで行った。図１４Ｂは、５℃、２５℃、および３７℃で保存されたナノアラム−デキストランロットＱＧ７７４（０．２％ｗ／ｖアルミニウム＋０．２２％硫酸デキストラン−４０ｋＤａ）の粒径安定性データを示す。
【００４８】
【図１５】図１５Ａは、６７ｍＭのリン酸塩を含有するＰＢＳ緩衝液で処理する前後の、未変性Alhydrogel（登録商標）アジュバントのゼータ電位を示す。図１５Ｂは、様々な量のキトサンで安定化されたAlhydrogel（登録商標）由来ナノアラム（０．２％ｗ／ｖ  Ａｌまたは２ｍｇＡｌ／ｍｌ）の粒径（Ｚ平均）およびサイズ分布を示す。サイズデータは、顕微溶液化直後および滅菌濾過前に収集した。
【００４９】
【図１６】図１６はＰＥ−Alhydrogel（登録商標）から合成されたナノアラムの粒径およびサイズ分布に対するポリ（アリルアミン）（ＰＡＨ）画分の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
詳細な説明
本明細書に記載の本開示は、ナノアラム粒子、ナノアラム粒子を含んでなる組成物、ならびにナノアラム粒子の製造方法および使用方法を提供する。
Ｉ．定義
【００５１】
以下の用語は、別段の定めがない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、その技術分野で認識されている意味を有する。
【００５２】
本明細書において、用語「約」および「から本質的になる」は、別段の定めがない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。いくつかの実施形態において、用語「約」および「から本質的になる」は、別段の定めがない限り、示された範囲、値、または構造の±１５％、±１０％、または±５％を意味する。
【００５３】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「含む」、「有する」、および「含んでなる」は、同義語として使用されており、これらの用語およびその変形は非限定的なものと解釈されるべきであることが意図されている。
【００５５】
本明細書で使用される場合と、添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を意味しない限り、複数の言及を含む。
【００５６】
本明細書で使用される用語「生物活性剤」は、本開示のナノアラム製剤によって送達される物質を指し、限定するものではないが、巨大分子、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、核酸、オリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＲｉｇＩ、レプリコンＲＮＡ、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９アゴニスト）を含むアジュバント、サポニン、全ウイルス粒子、ウイルス断片、細胞断片を含む。生物活性剤という用語には、例えば、アプタマー、炭水化物、コンジュゲート化炭水化物、およびウイルス様粒子も含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される用語「巨大分子」は、生物起源または合成起源のペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドによって例示されるが、これらに限定されない大分子を指す。巨大分子という用語には、例えば、炭水化物も含まれる。
【００５８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって分断されていてもよい。当該用語はまた、天然にまたは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体、ならびにペプチドおよびタンパク質から非天然アミノ酸を用いた構造的修飾によって誘導されるペプチド模倣化合物を含む当該分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。
【００５９】
用語「単離」は、分子がその天然の環境から取り出されたことを意味する。
【００６０】
「精製」は、分子がその天然の環境に存在するよりも、ならびに／または実験室条件下で最初に合成および／もしくは増幅されたときよりも、より純粋な形態で分子が存在するように、分子の純度が高められたことを意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度を意味するものではない。いくつかの実施形態において、精製は、その天然の環境に存在するよりも、ならびに／または実験室条件下で最初に合成および／もしくは増幅されたときよりも、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％より純粋であることを意味することができる。
【００６１】
本明細書において互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでなり得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後に付与され得る。本開示のポリヌクレオチドは、当分野で公知のリボヌクレオチド（例えば、当分野で周知の用語としてのＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）ならびにデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を含み、一本鎖または二本鎖分子であり得る。
【００６２】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、通常、必然的ではないが、長さが約２００ヌクレオチド未満である、短く、通常一本鎖であり、通常合成のポリヌクレオチドを概して指す。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、オリゴヌクレオチドに同等かつ完全に適用可能である。例には、Ｒｉｇ  Ｉアゴニストが含まれる。
【００６３】
本明細書で使用される「レプリコン」は、それ自身の制御下で大部分が複製することができる、遺伝要素、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスを含む。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。
【００６４】
「個体」または「対象」は、任意の哺乳類である。哺乳類には、ヒト、霊長類、家畜、狩猟動物、ペット（ネコ、イヌ、ウマなど）、およびげっ歯類が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
「アルキル」は、直鎖状または分岐状の飽和炭化水素である。例えば、アルキル基は、１〜３０個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキル）または１〜２０個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１〜Ｃ２０アルキル）または１〜１０個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル）または１〜８個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル）または１〜６個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル）または１〜４個の炭素原子（すなわち、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル）を有することができる。当該用語には、例として、直鎖状および分岐状のヒドロカルビル基、例えば、メチル（ＣＨ３−）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）、およびｎ−ヘキシル（ＣＨ３（ＣＨ２）５−）が含まれる。
【００６６】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
【００６７】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は基−ＯＨを指す。
【００６８】
「アルコキシ」は、基−Ｏ−アルキルを指し、ここで、アルキルは、本明細書で定義されている通りである。アルコキシには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシなどが含まれる。
【００６９】
「カルボキシルエステル」または「カルボキシエステル」は、基−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキルおよび−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキルを指し、ここで、アルキルおよび置換アルキルは、本明細書で定義されているとおりである。
ＩＩ．一般的方法
【００７０】
本開示の実施は、別段の定めがない限り、当該分野の技術範囲内にある分子生物学、組み換えＤＮＡ、生化学、および化学の従来技術を用いる。このような技術は文献で充分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Pat.No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.1984); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); and in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。
ＩＩＩ．ナノアラム粒子
【００７１】
本明細書で提供されるナノアラム粒子は、（互換的にアラムと呼ばれる）アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなり、粒子のサイズは、約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である。アルミニウム塩およびサイジング剤についての考察を以下に示す。
Ａ．アルミニウム塩
【００７２】
本明細書に記載の組成物は、本明細書でアラムと称され得るアルミニウム塩を含んでなることができる。好適なアルミニウム塩には、水酸化アルミニウム、アルミニウム三水和物、オキシ水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、アルミニウムヒドロキシフォスフェイト硫酸塩、および硫酸アルミニウムカリウムが含まれる。アルミニウム塩はまた、式：Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＨ３Ｏ３、ＡｌＨ６Ｏ３、ＡｌＯ（ＯＨ）、Ａｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）、およびＫＡｌ（ＳＯ４）２により表すこともできる。当業者は、ヒドロキシリン酸アルミニウムが不定比であり、本明細書ではＡｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）として表されているが、表面ヒドロキシル対ホスフェートの比は製造条件に応じて変化し、より正確には、式：Ａｌ（ＯＨ）ｘ（ＰＯ４）ｙで表されることを理解するだろう。
【００７３】
コアジュバント（co-adjuvant）として使用されるアルミニウム塩は、良好な安全性記録を有し、抗体応答を増大させ、抗原を安定化し、そして大規模生産のために比較的単純であるため、有利である。(Edelman 2002 Mol.Biotechnol.21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect.Dis.2:370-383.）
【００７４】
特定の実施形態において、アルミニウム塩はAlhydrogel（登録商標）、水酸化アルミニウム、またはオキシ水酸化アルミニウムである。Alhydrogel（登録商標）は、全体的に正の電荷を有し、負に帯電した部分を容易に吸着することができる。Alhydrogel（登録商標）は、Amphojel；水酸化アルミニウムゲル；水和アルミナ；アルミニウムトリヒドロキシド；またはAlugelibyeとも呼ばれ得る。
【００７５】
特定の実施形態において、アルミニウム塩は、リン酸アルミニウムであるAdjuPhos（登録商標）である。AdjuPhos（登録商標）は、全体的に負の電荷を有し、正に帯電した部分を容易に吸着することができる。
【００７６】
当業者は、使用されるアルミニウム塩およびサイジング剤が同じ表面電荷を有する実施形態では、アルミニウム塩の電荷を逆転させ、それによってサイジング剤とアルミニウム塩との間に引力を発生させることができるようにアルミニウム塩に表面改質を施すことが望ましいことを理解するだろう。一例として、アルミニウム塩がカチオン性表面電荷を有し（例えば、ＡＬＯ（ＯＨ））、サイジング剤がカチオン性表面電荷を有する（例えば、キトサン、ポリ（アリルアミン））場合、リガンド交換（例えば、リン酸リガンド交換）が、アルミニウム塩の表面電荷をアニオン性に変化させ、それによってサイジング剤とアルミニウム塩との間の相互作用を可能にするように作用する。
Ｂ．サイジング剤
【００７７】
いくつかの実施形態において、サイジング剤を含まずにアルミニウム塩を含んでなるナノアラムと比較した場合、サイジング剤が処理または粉砕されたアルミニウム塩の凝集を減少、阻害、または遅延させるので、ナノアラム粒子のサイズは維持される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、所望のナノアラム粒径を達成するための超音波処理または顕微溶液化などの高エネルギー入力によるアルミニウム塩の処理中に、サイジング剤を添加する。いくつかの実施形態において、所望のナノアラム粒径を達成するための超音波処理または顕微溶液化などの高エネルギー入力によるアルミニウム塩の処理後に、サイジング剤を添加する。いくつかの実施形態において、超音波処理または顕微溶液化などの高エネルギー入力によって所望のナノアラム粒径を達成するためにアルミニウム塩を処理した後にサイジング剤を添加する場合、サイジング剤を、処理直後、または所望のナノアラム粒径を達成するためのアルミニウム塩の処理後約０．５分、０．５〜１．０分、１．０〜１．５分、１．５〜２．０分、２．０〜２．５分、２．５〜３．０分、３．０〜３．５分、３．５〜４．０分、４．０〜４．５分、４．５〜５．０分、５．０５〜５．５分、５．５〜６．０分、６．０〜６．５分、６．５〜７．０分、７．０〜７．５分、７．５〜８．０分、８．０〜８．５分、８．５〜９．０分、約１０分、約１２分、約１４分、約１６分、約１８分、約２０分、約２２分、約２４分、約２６分、約２８分、約３０分に添加する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、サイジング剤は、アルミニウム塩の表面特性を変化させるものである。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、アルミニウム塩のサイズを安定化させるものである。
【００８０】
いくつかの実施形態において、サイジング剤は、生物活性剤を安定化または保護するものである。生物活性剤の例には、抗原、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、ペプチド模倣物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、全ウイルスゲノム、および全ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。生物活性剤は、本開示のナノアラム製剤によって送達することができる。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、生物活性剤を酸化から保護または遮蔽する。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、生物活性剤を熱の温度および時間の因子を含み得る熱ストレスから保護または遮蔽する。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、生物活性剤を低温および時間の因子を含み得る寒冷ストレスから保護または遮蔽する。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、生物活性剤を分解から保護または遮蔽する。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、本開示のナノアラム製剤によって送達される生物活性剤を、血清または血液成分にさらされたときに分解または不活性化から保護または遮蔽するものである。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、生物活性剤を保護または遮蔽して、薬剤がナノ粒子と共に安定な単一バイアル製剤として製剤化され得るようにする。
【００８１】
いくつかの実施形態において、サイジング剤の非存在下で形成されたナノアラム粒子と比較して、サイジング剤の存在は、アルミニウム塩の凝集もしくは再凝集を、５％以上、１０％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上減少、阻害、もしくは遅延させるか、またはアルミニウム塩の凝集もしくは再凝集をほぼ１００％阻害する。
【００８２】
本明細書で提供されるナノアラム粒子において、サイジング剤はアルミニウム塩と会合している。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、アルミニウム塩と直接結合している。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、ナノアラム粒子に吸着している。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、リガンド交換によってアルミニウム塩と会合している。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、電荷／静電相互作用によってアルミニウム塩と会合している。いくつかの実施形態において、サイジング剤は、サイジング剤上に見られるリン酸頭部基を介してアルミニウム塩と会合している。いくつかの実施形態において、サイジング剤はさらに脂質に結合している。いくつかの実施形態において、サイジング剤はさらにリン脂質に結合している。
【００８３】
表１は、本明細書で提供されるナノアラム粒子に包含されるサイジング剤の非限定的なリストを提供する。
表１：サイジング剤
【表１−１】
2019521960.tif 000003
【表１−２】
2019521960.tif 000004
【表１−３】
2019521960.tif 000005
【表１−４】
2019521960.tif 000006
【００８４】
いくつかの実施形態において、サイジング剤はポリアクリル酸（ＰＡＡ）である。いくつかの実施形態において、ＰＡＡの平均分子量は約５００〜７０００；１０００〜７０００；１５００〜７０００；２０００〜７０００；２５００〜７０００；３０００〜７０００；３５００〜７０００；４０００〜７０００；４５００〜７０００；５０００〜７０００；５５００〜７０００；６０００〜７０００；または６５００〜７０００の範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＡＡの平均分子量は約５００〜１０００；５００〜１５００；５００〜２０００；５００〜２５００；５００〜３０００；５００〜３５００；５００〜４０００；５００〜４５００；５００〜５０００；５００〜５５００；５００〜６０００；５００〜６５００；または５００〜７０００の範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＡＡの平均分子量は、約１０００〜３０００または１５００〜２５００の範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＡＡの平均分子量は約７０００、６５００、６０００、５５００、５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２４００、２３００、２２００、２１００、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２５０、１２００、１１００、１０００、または５００である。いくつかの実施形態において、ＰＡＡの平均分子量は、約５０００、２０００、１２５０、１２００、または１０００である。いくつかの実施形態において、ＰＡＡの平均分子量は、約２０００である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、サイジング剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの特定の実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は、約５００ダルトン〜約６０００ダルトンの範囲である。いくつかの特定の実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は、約７５０ダルトン〜約５０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は約７５０〜１０００；７５０〜１５００；７５０〜２０００；７５０〜２５００；７５０〜３０００；７５０〜３５００；７５０〜４０００；７５０〜４５００；または７５０〜５０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は約４５００〜５０００；４０００〜５０００；３５００〜５０００；３０００〜５０００；２５００〜５０００；２０００〜５０００；１５００〜５０００；１０００〜５０００；または７５０〜５０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は、約５００〜１０００；５００〜７５０；または７５０〜１０００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は、約１５００〜２５００；１５００〜２０００；または２０００〜２５００ダルトンの範囲である。いくつかの実施形態において、ＰＥＧまたはＰＥＧ長の平均分子量は、約４５００〜５５００；４５００〜５０００；または５０００〜５５００ダルトンの範囲である。一つの例示的な実施形態において、サイジング剤はＰＥＧ７５０である。一つの例示的な実施形態において、サイジング剤はＰＥＧ２０００である。一つの例示的な実施形態において、サイジング剤はＰＥＧ５０００である。
Ｃ．サイジング剤に結合した脂質
【００８６】
いくつかの実施形態において、サイジング剤はさらに脂質またはリン脂質に結合している。表２は、サイジング剤に結合していることができる脂質の非限定的なリストを提供する。例示的な一実施形態において、サイジング剤はＰＥＧであり、ＰＥＧはＤＳＰＥに結合している。特定の実施形態において、サイジング剤はＰＥＧであり、ＰＥＧはＤＰＰＥに結合している。特定の実施形態において、サイジング剤はＰＥＧであり、ＰＥＧはＤＭＰＥに結合している。
【００８７】
特定の実施形態において、脂質は、リン脂質または四級アンモニウム塩脂質である。特定の実施形態において、脂質は、ホスファチジルコリンまたはホスホグリセリドであるリン脂質である。特定の実施形態において、脂質は、以下の部分：
【化１】
2019521960.tif 000007
のいずれかを含んでなり、
式中、Ｘ−はアルカリ金属対イオンであり、Ｙ＋はハロゲン化物対イオンである。
【００８８】
特定の実施形態において、界面活性剤はポロキサマー：
【化２】
2019521960.tif 000008
であり、式中、ａは２〜１３０であり、ｂは１５〜６７である。
【００８９】
特定の実施形態において、脂質は、Ｃ１０〜２０アルキル鎖を含んでなる。特定の実施形態において、脂質は、Ｃ１２〜１８アルキル鎖を含んでなる。
【００９０】
特定の実施形態において、脂質はアニオン性である。特定の実施形態において、脂質はカチオン性である。特定の実施形態において、脂質は、全体的に中性に帯電している。特定の実施形態において、脂質は双性イオンである。
【００９１】
特定の実施形態において、好適な脂質は、表２に示されている。
表２−脂質
【表２−１】
2019521960.tif 000009
【表２−２】
2019521960.tif 000010
【表２−３】
2019521960.tif 000011
【００９２】
特定の実施形態において、脂質はポロキサマー１８８である。
【００９３】
特定の実施形態において、脂質は、ＤＬＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＯＰＧ、ＤＳＴＡＰ、およびＤＰＴＡＰから選択される。特定の実施形態において、脂質は、ＤＬＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、およびＤＯＰＧから選択される。特定の実施形態において、脂質は、ＤＳＴＡＰおよびＤＰＴＡＰから選択される。
【００９４】
特定の実施形態において、脂質はＤＳＰＧである。特定の実施形態において、脂質はＤＳＴＡＰである。特定の実施形態において、脂質はＤＰＴＡＰである。
【００９５】
特定の実施形態において、脂質は、ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ、およびポロキサマー１８８から選択される。
【００９６】
特定の実施形態において、脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、およびＰＯＰＣから選択される。特定の実施形態において、脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＳＰＣ、およびＤＯＰＣから選択される。
【００９７】
特定の実施形態において、脂質はＤＳＰＥである。例示的な実施形態において、サイジング剤ＰＥＧは、ナノアラム粒子中でＤＳＰＥに結合している。
【００９８】
特定の実施形態において、脂質はＤＰＰＥである。例示的な実施形態において、サイジング剤ＰＥＧは、ナノアラム粒子中でＤＰＰＥに結合している。
【００９９】
特定の実施形態において、脂質はＤＭＰＥである。例示的な実施形態において、サイジング剤ＰＥＧは、ナノアラム粒子中でＤＭＰＥに結合している。
【０１００】
特定の実施形態において、脂質はＤＬＰＥである。例示的な実施形態において、サイジング剤ＰＥＧは、ナノアラム粒子中でＤＬＰＥに結合している。
Ｄ．ナノアラム粒子製造方法
【０１０１】
本明細書では、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなるナノアラム粒子であって、サイズが約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である、前記ナノアラム粒子が提供される。本開示は、当該ナノアラム粒子を製造するための方法を提供する。
【０１０２】
ナノアラム粒子製造方法は、サイジング剤の存在下でアルミニウム塩を高エネルギー源または高エネルギーせん断力に付し、それによりアルミニウム塩のサイズを低減し、ナノアラム粒子を製造することを含んでなり、ここで、ナノアラム粒子のサイズは、約１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲である。
【０１０３】
特定の実施形態において、アラムをサイジング剤の存在下で処理もしくは粉砕するか、または粉砕したアラムに、処理から少なくとも数秒、数分、もしくは数時間後にサイジング剤を添加する。いくつかの実施形態において、アラムを処理し、直ちに凍結乾燥または乾燥させ、再構成時または再構成の数秒、数分、数時間以内にサイジング剤を添加する。処理または粉砕は、超音波処理、高せん断混合（例えば、シルバーソン混合）、および顕微溶液化を含む当分野で公知の標準的な技術を用いて行われる。本発明の方法で使用することができる当分野で公知の他の標準的な技術は、高圧ホモジナイゼーションである。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、５０００ＰＳＩ以上、１０，０００ＰＳＩ以上、１５，０００ＰＳＩ以上、２０，０００ＰＳＩ以上、２５，０００ＰＳＩ以上、３０，０００ＰＳＩ以上、３５，０００ＰＳＩ以上、４０，０００ＰＳＩ以上、４５，０００ＰＳＩ以上、または５０，０００ＰＳＩを与える。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、約５０００〜５００００；５０００〜１００００；５０００〜１５０００；５０００〜２００００；５０００〜２５０００；５０００〜３００００；５０００〜３５０００；５０００〜４００００；５０００〜４５０００；または５０００〜５００００ＰＳＩを与える。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、約４５０００〜５００００；４００００〜５００００；３５０００〜５００００；３００００〜５００００；２５０００〜５００００；２００００〜５００００；１５０００〜５００００；１００００〜５００００；または５０００〜５００００ＰＳＩを与える。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、２５０００〜３５０００；２５０００〜３００００；または３００００〜３５０００ＰＳＩを与える。いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、約３００００ＰＳＩを与える。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、高せん断源である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、マイクロフルイダイザーである。顕微溶液化は、組成物が高せん断力にさらされるプロセスを記述するために使用される。本開示のいくつかの実施形態において、MICROFLUIDIZER（登録商標）として知られている機器または装置によって組成物を処理する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、押出機である。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、超音波処理機である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、高エネルギー源は、ホモジナイザーである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、アルミニウム塩およびサイジング剤を、高せん断力の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、または１００の通過に付す。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩およびサイジング剤を、高せん断力の１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、または９１〜１００の通過に付す。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩およびサイジング剤を、高せん断力の３、６、または１０の通過に付す。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本開示のナノアラム粒子の製造方法を、０℃、４℃、２５℃、３０℃、５０℃、または６０℃で実施する。いくつかの実施形態において、本開示のナノアラム粒子の製造方法を、０〜４、５〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜３５、３６〜４０、４１〜４５、４６〜５０、５１〜５５、または５６〜６０℃で実施する。いくつかの実施形態において、本開示のナノアラム粒子の製造方法を４℃で実施する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、アルミニウム塩の出発濃度は１０ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩の出発濃度は４ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩の出発濃度は２ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩の出発濃度は、０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、０．５〜５ｍｇ／ｍｌ；１〜５ｍｇ／ｍｌ；０．５〜４ｍｇ／ｍｌ；０．５〜３ｍｇ／ｍｌ；または０．５〜３ｍｇ／ｍｌである。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、アルミニウム塩の出発サイズは１μｍである。いくつかの実施形態において、アルミニウム塩の出発サイズは、０．５〜５μｍ；０．５〜４μｍ；０．５〜３μｍ；０．５〜２μｍ；または０．５〜１μｍである。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノアラム粒子は、サイジング剤の存在下で本明細書に記載の方法に従って粉砕または処理することによって製造され、１〜４５０ｎｍの平均粒径を有する。特定の実施形態において、合成ナノアラムは、本開示のサイジング剤が添加されて安定な水性ナノアラム製剤を生じる適当なアラム粒径が得られるように新規に合成される、当分野で記載されている合成アラムを含み得る。製剤のナノアラム粒子は、ナノアラム組成物または製剤を製造するために、当分野で公知の薬剤的に許容できる賦形剤と混合され得る。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、用語「粉砕」、「サイジング」、または「処理」は、ナノサイズの粒子を達成するためにアラムの溶液を処理するプロセスを指す。当該プロセスは、高エネルギー源または入力を介してアラム組成物（製剤を含む）を処理して、０．５〜１０μｍ未満の減少した平均粒径によって測定されるように、アラム粒子の凝集を減少させることを含む。ナノアラム組成物を達成するためのエネルギー入力の好適な例には、高せん断混合（例えば、超音波処理またはシルバーソン高せん断ミキサーによる高せん断混合）、押出、ホモジナイゼーション、および顕微溶液化が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、高せん断混合を、１０００、２０００、５０００、または１０，０００ｒｐｍで１分、２分、５分、または１０分間実施する。いくつかの実施形態において、マイクロフルイダイザーは、ダイヤモンドＦ１２Ｙ相互作用チャンバーとそれに続くセラミックＨ３０Ｚ補助処理モジュールを備えたMicrofluidics M110P（マサチューセッツ州ニュートン）である。いくつかの実施形態において、アラム組成物を、３，０００ＰＳＩ、５，０００ＰＳＩ、１０，０００ＰＳＩ、１５，０００ＰＳＩ、または３０，０００ＰＳＩの圧力で顕微溶液化する。いくつかの実施形態において、アラムの溶液を、６０℃、４０℃、２０℃、または４℃の再循環水温でマイクロフルイダイザーによって処理して、ナノアラム組成物を得る。いくつかの実施形態において、アラムの溶液を、少なくとも約１、３、６、１０、１５、２０、または３０の通過で粉砕または処理して、サイズが１〜４５０ｎｍの平均粒径の本開示のナノ粒子を再現可能に得る。いくつかの実施形態において、アラムの溶液を、処理中の温度上昇を防ぐために、再循環する４℃の水を用いて３０，０００ＰＳＩで最大１０通過で顕微溶液化する。いくつかの実施形態において、アラムの溶液をサイジング剤の存在下で処理する。いくつかの実施形態において、サイジング剤対アラムの比は、３０：１、２０：１、１５：１、１０：１、７．５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、０．５：１、または０．２５：１である。いくつかの実施形態において、サイジング剤対アラムの比は、７．５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１である。
【０１１６】
実施形態のナノアラム粒子製造方法において、特定の変数を制御できることが理解される。特定の変数には、サイジング剤、高エネルギー源の種類、高エネルギー源によって加えられる圧力、高エネルギー源を通る混合物の通過回数、プロセスが行われる温度、サイジング剤の濃度、サイジング剤がアルミニウムに添加される方法における時点、およびアルミニウム塩対サイジング剤の重量比が含まれるが、これらに限定されない。
【表３】
2019521960.tif 000012
【０１１７】
特定の変数およびそれらの組み合わせは、表３に示すように、実施形態のナノアラム粒子製造方法に関与し得ることが理解される。
【０１１８】
特定の実施形態において、サイジング剤がＰＥＧ５０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）プロセスが行われる温度は約４℃である；
ｅ）アラムの濃度は約４ｍｇ／ｍｌである
ｆ）サイジング剤の濃度は約８ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：２である。
【０１１９】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｇ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｇ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｇ）に適合する。
【０１２０】
特定の実施形態において、サイジング剤がＰＥＧ２０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）プロセスが行われる温度は約４℃である；
ｅ）アラムの濃度は４ｍｇ／ｍｌである；
ｆ）サイジング剤の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：２．５である。
【０１２１】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｇ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｇ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｇ）に適合する。
【０１２２】
特定の実施形態において、サイジング剤がＰＥＧ７５０であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）プロセスが行われる温度は約４℃である；
ｅ）アラムの濃度は４ｍｇ／ｍｌである；
ｆ）サイジング剤の濃度は約３０ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：７．５である。
【０１２３】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｇ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｇ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｇ）に適合する。
【０１２４】
特定の実施形態において、サイジング剤がＰＥＧ７５０であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）プロセスが行われる温度は約４℃である；
ｅ）アラムの濃度は４ｍｇ／ｍｌである；
ｆ）サイジング剤の濃度は約２０ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：５である。
【０１２５】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｆ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｆ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｇ）に適合する。
【０１２６】
特定の実施形態において、サイジング剤がＰＡＡであるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）プロセスが行われる温度は約４℃である；
ｅ）アラムの濃度は１．６ｍｇ／ｍｌである；
ｆ）サイジング剤の濃度は約４．８ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：３である。
【０１２７】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｆ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｆ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｇ）に適合する。
【表４】
2019521960.tif 000013
【０１２８】
特定の変数およびそれらの組み合わせは、表４に示すように、実施形態のナノアラム粒子製造方法に関与し得ることが理解される。
【０１２９】
特定の実施形態において、サイジング剤がＤＳＰＥ−１８Ｃを有するＰＥＧ５０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）サイジング剤の濃度は約８ｍｇ／ｍｌである；
ｅ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：２である。
【０１３０】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）に適合する。
【０１３１】
特定の実施形態において、サイジング剤がＤＳＰＥ−１８Ｃを有するＰＥＧ２０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）サイジング剤の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌである；
ｅ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：２．５である。
【０１３２】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）に適合する。
【０１３３】
特定の実施形態において、サイジング剤がＤＰＰＥ−１６Ｃを有するＰＥＧ５０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）サイジング剤の濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約８ｍｇ／ｍｌ、例えば４または８ｍｇ／ｍｌである；
ｅ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：１または１：２である。
【０１３４】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）に適合する。
【０１３５】
特定の実施形態において、サイジング剤がＤＰＰＥ−１６Ｃを有するＰＥＧ２０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）サイジング剤の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌである；
ｅ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：２．５である。
【０１３６】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）に適合する。
【０１３７】
特定の実施形態において、サイジング剤がＤＭＰＥ−１４Ｃを有するＰＥＧ２０００であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴のいずれか１つ以上を有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類はマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）高エネルギー源を通る混合物の通過回数は、１〜１０、例えば３、６、または１０通過である；
ｄ）サイジング剤の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌである；
ｅ）アルミニウム塩対サイジング剤の比は約１：２５である。
【０１３８】
一変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の１つ以上に適合する。別の変形形態では、当該方法は、特徴（ａ）〜（ｅ）の２つ以上（特定の変形形態では全て）に適合する。特定の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）に適合する。別の変形形態では、当該方法は特徴（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）に適合する。
【０１３９】
特定の実施形態において、サイジング剤がキトサンであり、アルミニウム塩がＡｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）（例えば、AdjuPhos（登録商標））であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴の任意の組み合わせを有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類は、高せん断ミキサー、次いでマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）マイクロフルイダイザーを通る混合物の通過回数は、１〜３０、好ましくは１０〜３０である；
ｄ）高せん断ミキサーは約５，０００ｒｐｍで混合する
ｅ）アラムの濃度は約２ｍｇアルミニウム／ｍｌである
ｆ）サイジング剤の濃度は約２ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の質量比は約１：1である
ｈ）サイジング剤は低分子量キトサンである。
【０１４０】
特定の実施形態において、サイジング剤がデキストラン（例えば、硫酸デキストランナトリウム塩）であり、アルミニウム塩がＡｌＯ（ＯＨ）（例えば、Alhydrogel（登録商標））であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴の任意の組み合わせを有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類は、高せん断ミキサー、次いでマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）マイクロフルイダイザーを通る混合物の通過回数は、１〜３０、好ましくは１０〜３０である；
ｄ）高せん断ミキサーは約５，０００ｒｐｍで混合する
ｅ）アラムの濃度は約２ｍｇアルミニウム／ｍｌである
ｆ）サイジング剤の濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．４４ｍｇ／ｍｌ）である；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の質量比は約４．５：１である
ｈ）サイジング剤は低分子量硫酸デキストランナトリウム塩である。
【０１４１】
特定の実施形態において、サイジング剤がキトサンであり、アルミニウム塩がＡｌＯ（ＯＨ）（例えば、Alhydrogel（登録商標））であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴の任意の組み合わせを有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類は、高せん断ミキサー、次いでマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）マイクロフルイダイザーを通る混合物の通過回数は、１〜３０、好ましくは１０〜３０である；
ｄ）高せん断ミキサーは約５，０００ｒｐｍで混合する
ｅ）アラムの濃度は約２ｍｇアルミニウム／ｍｌである
ｆ）サイジング剤の濃度は約１ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の質量比は約２：１である
ｈ）サイジング剤は低分子量キトサンである。
ｉ）アルミニウム塩とサイジング剤を混合する前に、アルミニウム塩をリガンド交換（例えば、リン酸リガンド交換）に付す。
【０１４２】
特定の実施形態において、サイジング剤がポリ（アリルアミン）であり、アルミニウム塩がＡｌ（ＯＨ）（例えば、Alhydrogel（登録商標））であるナノアラム粒子製造方法について、当該方法は以下の特徴の任意の組み合わせを有し得る：
ａ）高エネルギー源の種類は、高せん断ミキサー、次いでマイクロフルイダイザーである；
ｂ）高エネルギー源によって加えられる圧力は約３０ｋ  ｐｓｉである；
ｃ）マイクロフルイダイザーを通る混合物の通過回数は、１〜３０、好ましくは１０〜３０である；
ｄ）高せん断ミキサーは約５，０００ｒｐｍで混合する
ｅ）アラムの濃度は約２ｍｇアルミニウム／ｍｌである
ｆ）サイジング剤の濃度は約０．５ｍｇ／ｍｌである；
ｇ）アルミニウム塩対サイジング剤の質量比は約４：１である
ｈ）サイジング剤は約１５ｋＤａである
ｉ）アルミニウム塩とサイジング剤を混合する前に、アルミニウム塩をリガンド交換（例えば、リン酸リガンド交換）に付す。
Ｅ．ナノアラム粒子のサイズ
【０１４３】
本明細書で提供される場合、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなるナノアラム粒子のサイズは、約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜７５ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは約１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは、約１ｎｍである、約５ｎｍである、約１０ｎｍである、約１５ｎｍである、約２０ｎｍである、約２５ｎｍである、約３０ｎｍである、約３５ｎｍである、約４０ｎｍである、約４５ｎｍである、約５０ｎｍである、約５５ｎｍである、約６０ｎｍである、約６５ｎｍである、約７０ｎｍである、約７５ｎｍである、約８０ｎｍである、約８５ｎｍである、約９０ｎｍである、約９５ｎｍである、約１００ｎｍである、約１０５ｎｍである、約１１０ｎｍである、約１１５ｎｍである、約１２０ｎｍである、約１２５ｎｍである、約１３０ｎｍである、約１３５ｎｍである、約１４０ｎｍである、約１４５ｎｍである、約１５０ｎｍである、約１５５ｎｍである、約１６０ｎｍである、約１６５ｎｍである、約１７０ｎｍである、約１７５ｎｍである、約１８０ｎｍである、約１８５ｎｍである、約１９０ｎｍである、約１９５ｎｍである、約２００ｎｍである、約２１０ｎｍである、約２２０ｎｍである、約２４０ｎｍである、約２５０ｎｍである、約２６０ｎｍである、約２８０ｎｍである、約２００ｎｍである、約３００ｎｍである、約３２０ｎｍである、約３４０ｎｍである、約３５０ｎｍである、約３６０ｎｍである、約３８０ｎｍである、約４００ｎｍである、約４２０ｎｍである、約４４０ｎｍである、または約４５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズは、約１ｎｍ以下、約５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約１５ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、約２５ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約３５ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約４５ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約５５ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約６５ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約７５ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約９５ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約１０５ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１１５ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１２５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１３５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１４５ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１５５ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１６５ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１７５ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１８５ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１９５ｎｍ以下、約１９９ｎｍ以下、約２１０ｎｍ以下、約２３０ｎｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約２７０ｎｍ以下、約２９０ｎｍ以下、約３１０ｎｍ以下、約３３０ｎｍ以下、約３５０ｎｍ以下、約３７０ｎｍ以下、約３９０ｎｍ以下、約４１０ｎｍ以下、約４３０ｎｍ以下、約４４０ｎｍ以下、または約４４９ｎｍ以下、または約４５０ｎｍ以下である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、少なくとも０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、０．４５ミクロン以下の細孔径のフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、０．２０ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。
Ｆ．安定性
【０１４６】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、アルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなる１〜４５０ｎｍのサイズのナノアラム粒子は、４５０ｎｍ未満のナノアラム粒子のサイズが維持されるという点で、および、サイジング剤の非存在下でのアルミニウム塩と比較した場合に、アルミニウム塩が凝集の減少を示すか、または全く凝集を示さないという点で、安定である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、「安定」とは、「凝集」しないナノアラム粒子からなるナノアラム製剤または組成物が、ほとんどもしくは全く凝集を示さないか、もしくは凝集の減少を示し、およびまたは初期粒径と比較して、製剤の平均粒径もしくは多分散性の経時的な全体的な増加をほとんどもしくは全く示さないことを指す。
【０１４８】
ナノアラム粒子の安定性は、当業者に周知の技術によって測定することができる。いくつかの実施形態において、安定性を視覚的に観察する。目視検査は、粒子、凝結物、または凝集物の検査を含むことができる。いくつかの実施形態において、安定性をナノアラム粒子のサイズによって測定する。例えば、サイズは、Ｘ線およびレーザー回折、動的光散乱（ＤＬＳ）、ＣｒｙｏＥＭ、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅを含むがこれらに限定されない、当該分野における公知の技術によって評価することができる。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子のサイズはＺ平均直径を指す。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子中のアルミニウム塩の凝集％を評価することによって安定性を求める。いくつかの実施形態において、安定性を、特定のサイズのフィルター、例えば０．２０、０．２２、または０．４５ミクロンのフィルターを通過するナノアラム粒子の能力によって評価する。いくつかの実施形態において、ｐＨによって安定性を求める。いくつかの実施形態において、安定性を、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）技術を用いて、多分散指数（ＰｄＩ）の測定によって求める。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子のＺ平均直径は、アッセイされた期間にわたって５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、１％未満増加する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、アッセイされた期間にわたって５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、１％未満増加する。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は０〜８℃で安定である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、または８℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は２０〜３０℃で安定である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、２５℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は３５〜４０℃で安定である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、または４０℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、２ヶ月以上の間、３ヶ月以上の間、４ヶ月以上の間、５ヶ月以上の間、６ヶ月以上の間、７ヶ月以上の間、８ヶ月以上の間、９ヶ月以上の間、１０ヶ月以上の間、１１ヶ月以上の間、１年以上の間、２年以上の間、または５年以上の間、安定である。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は５７〜６２℃で安定である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、または６２℃で、１分以上の間、５分以上の間、１０分以上の間、１５分以上の間、２０分以上の間、２５分以上の間、３０分以上の間、３５分以上の間、４０分以上の間、４５分以上の間、５０分以上の間、５５分以上の間、１時間以上の間、２時間以上の間、６時間以上の間、１２時間以上の間、１８時間以上の間、２４時間以上の間、４８時間以上の間、７２時間以上の間、１週間以上の間、２週間以上の間、３週間以上の間、１ヶ月以上の間、安定である。
【０１５４】
一つの例示的な実施形態において、ナノアラム粒子は、４℃で２年以上の間安定である。一つの例示的な実施形態において、ナノアラム粒子は、４℃で４年以上の間安定である。一つの例示的な実施形態において、ナノアラム粒子は、４℃で５年以上の間安定である。一つの例示的な実施形態において、ナノアラム粒子は、２５℃で１ヶ月以上の間安定である。一つの例示的な実施形態において、ナノアラム粒子は、３７℃で２週間以上の間安定である。一つの例示的な実施形態において、ナノアラム粒子は、６０℃で２週間以上の間安定である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、１〜４回の凍結融解後に安定である。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子は、１、２、３、または４回の凍結融解後に安定である。
ＩＶ．ナノアラム粒子組成物
【０１５６】
本明細書では、ナノアラム粒子を含んでなる組成物であって、前記ナノアラム粒子がアルミニウム塩およびサイジング剤を含んでなり、前記ナノアラム粒子のサイズが約１ｎｍ〜４５０ｎｍのサイズである、前記組成物が提供される。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜７５ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜４００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約５０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは約１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは、約１ｎｍである、約５ｎｍである、約１０ｎｍである、約１５ｎｍである、約２０ｎｍである、約２５ｎｍである、約３０ｎｍである、約３５ｎｍである、約４０ｎｍである、約４５ｎｍである、約５０ｎｍである、約５５ｎｍである、約６０ｎｍである、約６５ｎｍである、約７０ｎｍである、約７５ｎｍである、約８０ｎｍである、約８５ｎｍである、約９０ｎｍである、約９５ｎｍである、約１００ｎｍである、約１０５ｎｍである、約１１０ｎｍである、約１１５ｎｍである、約１２０ｎｍである、約１２５ｎｍである、約１３０ｎｍである、約１３５ｎｍである、約１４０ｎｍである、約１４５ｎｍである、約１５０ｎｍである、約１５５ｎｍである、約１６０ｎｍである、約１６５ｎｍである、約１７０ｎｍである、約１７５ｎｍである、約１８０ｎｍである、約１８５ｎｍである、約１９０ｎｍである、約１９５ｎｍである、約２００ｎｍである、約２１０ｎｍである、約２２０ｎｍである、約２４０ｎｍである、約２５０ｎｍである、約２６０ｎｍである、約２８０ｎｍである、約２００ｎｍである、約３００ｎｍである、約３２０ｎｍである、約３４０ｎｍである、約３５０ｎｍである、約３６０ｎｍである、約３８０ｎｍである、約４００ｎｍである、約４２０ｎｍである、約４４０ｎｍである、または約４５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ナノアラム組成物の平均サイズは、ＤＬＳにより測定して、約１ｎｍ以下、約５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約１５ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、約２５ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約３５ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約４５ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約５５ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約６５ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約７５ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約９５ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約１０５ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１１５ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１２５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１３５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１４５ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１５５ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１６５ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１７５ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１８５ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１９５ｎｍ以下、約１９９ｎｍ以下、約２１０ｎｍ以下、約２３０ｎｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約２７０ｎｍ以下、約２９０ｎｍ以下、約３１０ｎｍ以下、約３３０ｎｍ以下、約３５０ｎｍ以下、約３７０ｎｍ以下、約３９０ｎｍ以下、約４１０ｎｍ以下、約４３０ｎｍ以下、約４４０ｎｍ以下、または約４４９ｎｍ以下である。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、組成物は、濾過でき、バイアルに入れる前に最終滅菌することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、０．２０ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、組成物は水性製剤として維持される。いくつかの実施形態において、組成物は凍結乾燥製剤として維持される。いくつかの実施形態において、組成物は噴霧乾燥製剤として維持される。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、組成物はナノアラムおよびエマルションを含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物のエマルションは油中水型エマルションである。いくつかの実施形態において、組成物のエマルションはピッカリング（pickering）エマルションである。いくつかの実施形態において、組成物のエマルションは水中油型エマルションである。いくつかの実施形態において、エマルションの油は生物分解性油である。他の実施形態において、油はスクアレンである。他の実施形態において、油は合成生物分解性油である。
【０１６０】
リポソームおよびリポソーム由来のナノベシクルは、当分野で公知であり［８］、本開示のナノアラムと共に使用され得る。いくつかの実施形態において、組成物はナノアラム粒子を含有するリポソームを含んでなる。いくつかの実施形態において、組成物は、ナノアラムおよびリポソームを含んでなり、前記リポソームは、カチオン性リポソームである。いくつかの実施形態において、組成物は、ナノアラムおよびリポソームを含んでなり、前記リポソームは、アニオン性リポソームである。いくつかの実施形態において、組成物は、ナノアラムおよびリポソームを含んでなり、前記リポソームは、中性リポソームである。いくつかの実施形態において、組成物は、ナノアラムおよびリポソームを含んでなり、前記リポソームは、古細菌由来リポソーム（archaeosome）である。いくつかの実施形態において、組成物は、ナノアラムおよびリポソームを含んでなり、前記リポソームは、ビロソームである。
Ａ．生物活性剤
【０１６１】
いくつかの実施形態において、組成物は、１以上の生物活性剤をさらに含んでなり、例えば、生物活性剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、生物、ゲノム、ウイルス、ウイルスゲノムであることができる。いくつかの実施形態において、組成物は、２以上の生物活性剤を含んでなる。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、ナノアラム粒子と会合している。いくつかの実施形態において、生物活性剤は、リガンド交換によって、および／または静電的（電荷に基づく）相互作用によってナノアラム粒子と会合している。いくつかの実施形態において、２５％以上、４０％以上、５０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上の組成物中に存在する生物活性剤がナノアラム粒子と会合している。いくつかの実施形態において、生物活性剤とナノアラム粒子との会合のパーセントを、ゲル電気泳動またはＵＶ分光法によって測定する。会合のパーセントを測定する１つの例示的な方法を、実施例に示す。
ｉ．巨大分子
【０１６２】
いくつかの実施形態において、生物活性剤は巨大分子である。巨大分子には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または抗原が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、巨大分子は天然に存在する。いくつかの実施形態において、巨大分子は合成である。いくつかの実施形態において、巨大分子は標識またはタグ付けされている。
ａ．ポリヌクレオチド
【０１６３】
タンパク質、タンパク質サブユニット、および不活性化病原体は、抗体応答（体液性免疫）の有効な刺激因子であり、体液性免疫が防御と強い相関がある多数の感染性疾患の良好なワクチンとして成功裏に開発されている。しかしながら、いくつかの慢性感染症または癌では、体液性応答に加えて、古典的な細胞性または細胞溶解性のＴ細胞応答が必要とされ得る。細胞性免疫応答の古典的な発生は、主要組織適合性分子との関連で抗原の内在性または細胞内提示から生じる。これにより、研究者は、細胞内抗原をコードする核酸の送達が、慢性感染および癌に対するより良好なワクチン接種戦略につながり得ることを理論化するようになった。ＲＮＡワクチンは、ＲＮＡにより転写されたタンパク質が、宿主の主要組織適合性分子との関連において、より効率的に提示され得ることに理論的に基づき、核酸送達に特に魅力的である。当分野におけるＲＮＡワクチンの送達には、例えば、メッセンジャーＲＮＡおよびアルファウイルスコンストラクトから発現された複製ＲＮＡコンストラクトの送達が含まれ、これらの両方が、細胞内でのＲＮＡコードタンパク質の送達および発現を利用する。このアプローチは理論的に有望であると思われるが、今まで実際には、ＲＮＡワクチンの開発は、ＲＮＡの製造コスト、インビボでのＲＮＡの比較的に非効率な送達、裸のＲＮＡの不安定性、およびＲＮＡの発現の相対的インビボレベルによって制限されてきた。簡単に言えば、これらの制限は全て、インビボでのＲＮＡの効率的な送達の欠如に起因する可能性がある。最近、これらの制限に対処するために、化学的に修飾されたヌクレオチドの組み込み、ＡＲＣＡキャップおよび伸長されたポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ構造の改変、ならびに裸のＲＮＡからカチオン性脂質およびポリマー送達ビヒクルに及ぶＲＮＡの送達戦略の評価を含む多くの戦略が採用されてきた（１〜５）。恐らく、ＲＮＡの送達のために最もよく研究された製剤は、カチオン性脂質、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ、ソルビタントリオレート、ポリソルベート、およびスクアレンからなるカチオン性エマルションである（５）。これらのカチオン性リポソームは、粒子のコアにカプセル化されたＲＮＡを有する合成脂質ナノ粒子に自己集合することが実証されている。これらのカチオン性リポソームは、ＲＮＡワクチンを送達し、免疫応答を誘発することができることを示しているが、これらの製剤の製造はかなり複雑で高価である。当分野で必要とされているものは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含むポリヌクレオチドの送達のための最終滅菌製剤を含む、安定で、安価で、大規模製造に適しているものである。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、生物活性剤はポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、およびオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはコードＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、レプリコンＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、Ｒｉｇ  Ｉ、およびマイクロＲＮＡからなる群から選択される。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、以下でさらに記載するように、抗原であるか、または抗原を含んでなるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、ＩＤ９３である。
【０１６６】
一つの特定の実施形態において、ナノ粒子はＰＥＧサイジング剤を含んでなり、薬剤はＲＮＡである。
【０１６７】
一つの特定の実施形態において、ナノ粒子はＰＡＡサイジング剤を含んでなり、薬剤はＲＮＡである。
１．組み換え発現コンストラクト
【０１６８】
本明細書に開示されている特定の実施形態によれば、本明細書に記載の組成物は、ポリペプチドをコードする塩基配列に機能的に結合したプロモーターを含んでなる１以上の組み換え発現コンストラクトを含み得る。特定の他の実施形態において、組み換え発現コンストラクトは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクター中に存在する。このような発現コンストラクトおよびベクターを作製および使用するための組成物および方法は、本明細書に提供されるポリペプチド抗原の発現について、例えば、Ausubel et al.(Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NYにより、当分野で公知である。組み換え発現コンストラクトの非限定的な例は、現在開示されている特定の実施形態での使用のために、本明細書で提供されるポリペプチド抗原の発現に適合させることができる教示と共に、概して、例えば、米国特許第６，８４４，１９２号；第７，０３７，７１２号；第７，０５２，９０４号；第７，００１，７７０号；第６，１０６，８２４号；第５，６９３，５３１号；第６，６１３，８９２号；第６，８７５，６１０号；第７，０６７，３１０号；第６，２１８，１８６号；第６，７８３，９８１号；第７，０５２，９０４号；第６，７８３，９８１号；第６，７３４，１７２号；第６，７１３，０６８号；第５，７９５，５７７号、および第６，７７０，４４５号などで見ることができる。
２．交互ヌクレオシド間結合および核酸類似体
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、交互ヌクレオシド間結合または核酸類似体を含む。例えば、一実施形態において、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド間結合は、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含む本開示の範囲内であるが、ポリヌクレオチドは、ホスホロジチオエートまたはホスホロチオエート結合を含んでなる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートの製造方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、第５，２７８，３０２号、およびＷＯ９５／２６２０４に記載されている。
３．レプリコン
【０１７０】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはレプリコンである。いくつかの実施形態において、レプリコンは、主にそれ自身の制御下で複製することができるプラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルスである。いくつかの実施形態において、レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの実施形態において、レプリコンは、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態において、レプリコンはＲＮＡウイルスに由来する。
ｂ．ポリペプチド
【０１７１】
いくつかの実施形態において、生物活性剤はポリペプチドである。したがって、これらの実施形態において、記載の組成物は、本明細書で提供されるナノアラム粒子を含んでなり、ポリペプチドをさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは全長タンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはペプチドである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは融合タンパク質である。いくつかの特定の実施形態において、融合タンパク質は、個体への投与の際に免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態において、以下にさらに説明するように、ポリペプチドは抗原である。
ｃ．抗原
【０１７２】
いくつかの実施形態において、生物活性剤は抗原である。いくつかの実施形態において、抗原はポリヌクレオチドがコードするポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原はポリヌクレオチドがコードするポリペプチドである。いくつかの実施形態において、抗原は、ポリペプチドをコードする本開示のナノアラム製剤に送達されるＤＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、抗原は、ポリペプチドをコードする本開示のナノアラム製剤に送達されるＲＮＡポリヌクレオチドである。したがって、いくつかの実施形態において、記載の組成物は、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか一つを含んでなり、かつ、抗原をさらに含んでなり、ナノアラム粒子の抗原は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとして提供される。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、抗原は、アレルギー、癌、または感染症に関与するか、または由来する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、ワクチン接種用途に有用であり、ワクチン製剤（ワクチン組成物）として提供される。
【０１７５】
抗原は、対象において免疫反応の誘発または増強が望まれる、標的エピトープ、（生体分子を含む）分子、（生体分子を含む分子複合体を含む）分子複合体、細胞内集合体、細胞、または組織であり得る。しばしば、抗原という用語は、目的のポリペプチド抗原を指す。しかしながら、本明細書中で使用される場合、抗原は、目的のポリペプチド抗原をコードする組み換えコンストラクト（例えば、発現コンストラクト）を指す場合もある。特定の実施形態において、抗原は、感染症、癌、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、または抗原特異的免疫応答の刺激が望ましいか、もしくは有益である他の状態に関連する感染性病原体および／もしくはエピトープ、生体分子、細胞、または組織であり得るか、またはこれらに由来し得るか、またはこれらと免疫学的に交差反応性であり得る。
【０１７６】
したがって、特定の実施形態は、細菌、ウイルス、または真菌などの１以上の感染性病原体、例えば、結核菌もしくは癩菌もしくは別のマイコバクテリアなどのアクチノバクテリア；サルモネラ属、ナイセリア属、ボレリア属、クラミジア属、もしくはボルデテラ属のメンバーなどの細菌；単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびサイトメガロウイルスなどのウイルス；ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２などのＨＩＶ；アスペルギルス、ブラストミセス、コクシジオイデス、およびニューモシスチスなどの真菌もしくはＣ．  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．  ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃ．  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、およびＣ．  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓなどのカンジダ種を含む酵母；原生動物などの寄生生物、例えばＰ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．  ｖｉｖａｘ、Ｐ．  ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰ．  ｏｖａｌｅを含むプラスモディウム種；または別の寄生生物、例えばアカントアメーバ、赤痢アメーバ、住血線虫、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、クリプトスポリジウム、鉤虫、赤痢アメーバ、大腸アメーバ、エントアメーバ・ディスパー、ハルトマンアメーバ、ポレックアメーバ、バンクロフト糸状虫、ジアルジア、およびリーシュマニアのうちの１以上、に由来する抗原を企図する。
【０１７７】
例えば、特定の実施形態において、抗原は、ボレリア属種由来であり、抗原は、核酸、病原体由来抗原または抗原調製物、組み換え産生されたタンパク質またはペプチド、およびキメラ融合タンパク質を含み得る。一つのこのような抗原はＯｓｐＡである。ＯｓｐＡは、宿主細胞におけるその生合成のために脂質化形態の完全成熟タンパク質（Ｌｉｐｏ−ＯｓｐＡ）であり得るか、あるいは非脂質化誘導体であり得る。このような非脂質化誘導体には、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ１）の最初の８１個のＮ末端アミノ酸を有する非脂質化ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質、および完全なＯｓｐＡタンパク質、ならびに３つのさらなるＮ末端アミノ酸を有するＯｓｐＡの非脂質化形態である別のＭＤＰ−ＯｓｐＡが含まれる。
【０１７８】
特定の実施形態において、抗原は、ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０、もしくはｇｐ１６０）、ヒトヘルペスウイルス、例えば、ｇＤもしくはその誘導体、もしくは最初期タンパク質、例えば、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７、サイトメガロウイルス（（（特にヒト）（例えば、ｇＢもしくはその誘導体）、ロタウイルス（弱毒生ウイルスを含む）、エプスタイン・バーウイルス（例えば、ｇｐ３５０もしくはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩＩ、およびＩＥ６３）、または肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原もしくはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルス、または他のウイルス病原体、例えばパラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えば、ＦおよびＧタンパク質もしくはそれらの誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６，１１，１６，１８など）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、ジカウイルス、ポワッサンウイルス）、またはインフルエンザウイルス（卵もしくはＭＤＣＫ細胞中で増殖させた全生もしくは不活性化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス、もしくは（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載の）全インフルエンザビロソーム、もしくはそれらの精製もしくは組み換えタンパク質、例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、もしくはＭタンパク質、もしくはそれらの組み合わせ）由来である。
【０１７９】
特定の他の実施形態において、抗原は、１以上の細菌性病原体、例えば、淋菌ならびに髄膜炎菌（例えば、莢膜多糖およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含むナイセリア属種；化膿レンサ球菌（例えば、Ｍタンパク質もしくはその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、Ｂ群溶血性レンサ球菌（S. agalactiae）、ミュータンス菌：軟性下疳菌；カタル球菌（Branhamella catarrhalis）としても知られているモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）を含むモラクセラ属種（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｓｐｐ）（例えば、高分子量および低分子量アドヘシンおよびインベジン）；百日咳菌（例えば、ペルタクチン、百日咳毒素もしくはその誘導体、繊維状赤血球凝集素、アデニル酸シクラーゼ、フィムブリエ）、パラ百日咳菌、および気管支敗血症菌を含むボルデテラ属種；結核菌（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂ、もしくは−Ｃ）、ウシ型結核菌（M. bovis）、癩菌、Ｍ．アビウム（M. avium）、ヨーネ菌（M. paratuberculosis）、Ｍ．スメグマチス（M. smegmatis）を含むマイコバクテリウム属種；在郷軍人病菌を含むレジオネラ属種；腸内毒素性（enterotoxic）大腸菌（例えば、定着因子、易熱性毒素もしくはその誘導体、耐熱性毒素もしくはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸内病原性大腸菌（例えば、志賀毒素様毒素もしくはその誘導体）を含むエシェリキア属種；コレラ菌（例えば、コレラ毒素もしくはその誘導体）を含むビブリオ属種；赤痢菌、志賀赤痢菌、Ｓ．フレックスネリ（S. flexnerii）を含むシゲラ属種；エンテロコリチカ菌（Y. enterocolitica）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、ペスト菌、偽結核菌を含むエルシニア属種；ジェジュニ菌（C. jejuni）（例えば、毒素、アドヘシン、およびインベジン）ならびにＣ.コリ（C. coli）を含むカンピロバクター属種；チフス菌、パラチフス菌、Ｓ．コレレスイス（S. choleraesuis）、Ｓ．エンテリティディス（S. enteritidis）を含むサルモネラ属種; Ｌ．モノサイトジェネス（L. monocytogenes）を含むリステリア属種；ピロリ菌（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むヘリコバクター属種；緑膿菌を含むシュードモナス属種; 黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌を含むスタフィロコッカス属種;フェカリス菌（E. faecalis）、フェシウム菌（E. faecium）を含むエンテロコッカス属種；破傷風菌（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、ボツリヌス菌（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、ディフィシル菌（C. difficile）（例えば、クロストリジウム毒素ＡもしくはＢおよびその誘導体）を含むクロストリジウム属種；炭疽菌（例えばボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むバチルス属種；ジフテリア菌（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）を含むコリネバクテリウム属種；ライム病ボレリア（B. Burgdorferi）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ガリニ（ B. garinii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アフゼリ（B. Afzelii ）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．アンダーソニー（B. Andersonii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．ヘルムスイ（B. hermsii）を含むボレリア属種；Ｅ．ｅｑｕｉおよびヒ��顆粒球エーリキア症の薬剤を含むエーリキア属種；リケッチア（R. Rickettsii）を含むリケッチア属種; Ｃ．トラコマチス（C. trachomatis）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、肺炎球菌（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジアを含むクラミジア属種；Ｌ．インターロガンス（L. interrogans）を含むレプトスピラ属種; 梅毒トレポネマ（例えば、希少な外膜タンパク質）、Ｔ．デンティコラ（T. denticola）、Ｔ．ヒオディセンテリエ（T.hyodysenteriae）を含むトレポネマ属種；または他の細菌性病原体由来である。
【０１８０】
特定の他の実施形態において、抗原は、１以上の寄生生物（例えば、John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia参照）、例えば、熱帯熱原虫を含むプラスモディウム属種;Ｔ．ゴンディ（T. gondii）（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ属種；赤痢アメーバを含むエントアメーバ属種; Ｂ．マイクロッティ（B. microti）を含むバベシア属種；クルーズトリパノソーマを含むトリパノソーマ属種；ランブル鞭毛虫を含むジアルジア属種；Ｌ．マニア（ L. major）を含むリーシュマニア属種；Ｐ．カリニ（P. carinii）を含むニューモシスチス属種；腟トリコモナスを含むトリコモナス属種；または哺乳類に感染することができる蠕虫、例えば：（ｉ）線虫感染症（例えば、限定はされないが、蟯虫、回虫、鞭虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、回旋糸状虫、メジナ虫、旋毛虫、および糞線虫）；（ｉｉ）吸虫感染症（例えば、限定はされないが、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、メコン住血吸虫、肝吸虫、肺吸虫属、肝蛭、巨大肝吸虫（Fasciola magna）、 巨大肝蛭（Fasciola gigantica））；ならびに（ｉｉｉ）条虫感染症（例えば、限定はされないが、無鉤条虫および有鉤条虫）由来である。特定の実施形態において、抗原は、住血吸虫属種、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、および／もしくは日本住血吸虫由来であるか、または酵母、例えば、カンジダ属種、例えば、Ｃ．  ａｌｂｉｃａｎｓ；クリプトコッカス属種、例えば、Ｃ．ネオフォルマンス（C. neoformans）由来である。
【０１８１】
他の特異的抗原は、結核菌、例えばＴｈ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ  １４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２、およびｈＴＣＣ１（ＷＯ  ９９／５１７４８）由来である。結核菌のタンパク質には、２、３、もしくは４以上またはそれ以上の結核菌のポリペプチドが融合してより大きなタンパク質になっている融合タンパク質およびその変異体も含まれる。特定の融合体には、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩが含まれる（ＷＯ  ９９１５１７４８）。使用され得る他の抗原には、抗原、抗原の組合せ、ならびにＵＳ  ２０１０／０１２９３９１およびＷＯ  ２００８／１２４６４７に記載の融合タンパク質が含まれる。一つの例示的な実施形態において、融合タンパク質はＩＤ９３である。一つの例示的な実施形態において、融合タンパク質はＩＤ９１である。
【０１８２】
他の特異的抗原は、リーシュマニア由来であり、例えば、本開示のリーシュマニアポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、種々の手順のいずれかを使用し、Ｌ．  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．  ｃｈａｇａｓｉ、Ｌ．  ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．  ｍａｊｏｒ、Ｌ．  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．  ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ、Ｌ．  ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．  ｔｒｏｐｉｃｓ、およびＬ．  ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓを含むがこれらに限定されない種々のリーシュマニア種のいずれかを使用して、調製または単離され得る。このような種は、例えば、メリーランド州ロックビルのAmerican Type Culture Collection（ATCC）から入手可能である。リーシュマニアのタンパク質には、リーシュマニアの少なくとも２、３、もしくは４、またはそれ以上のポリペプチドがＷＯ２００９／０１２１６６、ＷＯ２０１４／１６０９８７、ＷＯ２０１４／１６０９８５に記載の大きなタンパク質に融合されている、融合タンパク質およびそれらの変異体も含まれる。一つの例示的な実施形態において、融合タンパク質は、本明細書に記載のＥＭＣＨである。
【０１８３】
他の特異的抗原はクラミジア由来であり、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（ＷＯ  ９９／１７７４１）、ＯＲＦ３（ＥＰ  ３６６  ４１２）、および推定膜タンパク質（Ｐｍｐ）が含まれる。他のクラミジア抗原は、ＷＯ  ９９１２８４７５に記載されている群から選択することができる。特定の抗原は、ストレプトコッカス属種、例えば肺炎球菌（例えば、莢膜多糖およびそのコンジュゲート、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）およびタンパク質抗原ニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、ならびにそれらの変異解毒誘導体（ＷＯ  ９０／０６９５１；ＷＯ  ９９／０３８８４）由来であり得る。他の細菌ワクチンは、インフルエンザ菌タイプＢ（例えばＰＲＰおよびそのコンジュゲート）、分類不能型インフルエンザ菌、例えばＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（米国特許第５，８４３，４６４号）、またはそれらの複数コピー変異型もしくは融合タンパク質を含むヘモフィルス属種由来の抗原を含んでなる。
【０１８４】
他の特異的抗原は、Ｂ型肝炎由来で生じる。Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は、当該分野で周知であり、とりわけ、欧州特許出願ＥＰ−Ａ４１４３７４；ＥＰ−Ａ−０３０４５７８、およびＥＰ  １９８４７４に記載されているＰｒｅＳ１、Ｐａｒｓ２Ｓ抗原の誘導体が含まれる。一態様において、抗原は、特にＣＨＯ細胞で発現される場合、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０である。他の実施形態において、抗原はｇＤ２ｔである。
【０１８５】
他の実施形態において、抗原は、性器疣贅の原因と考えられるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１など）、および子宮頸癌の原因となるＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）に由来する。特定の抗原には、Ｌ１粒子またはカプソメア、ならびにＨＰＶ６およびＨＰＶ１１タンパク質Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２から選択される１以上の抗原を含んでなる融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質のある種の形態には、ＷＯ  ９６／２６２７７に開示されているＬ２Ｅ７、およびＧＢ  ９７１７９５３．５（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５）に開示されているタンパク質Ｄ（１／３）−Ｅ７が含まれる。さらなる可能な抗原には、ＨＰＶ  １６または１８抗原が含まれる。例えば、Ｌ１もしくはＬ２抗原モノマー、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）として一緒に提示されるＬ１もしくはＬ２抗原、もしくはＶＬＰもしくはカプソメア構造で単独で提示されるＬ１単独タンパク質である。このような抗原、ウイルス様粒子、およびカプソメアは、それ自体公知である。例えば、ＷＯ９４／００１５２、ＷＯ９４／２０１３７、ＷＯ９４／０５７９２、およびＷＯ９３／０２１８４を参照されたい。
【０１８６】
他の実施形態において、抗原は融合タンパク質である。融合タンパク質は、単独で、または例えばＥ７、Ｅ２、もしくはＦ５などの融合タンパク質として含まれていてもよく、特定の実施形態は、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を含んでなるＶＬＰを含む（ＷＯ  ９６／１１２７２）。特定のＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６由来のタンパク質Ｄ−Ｅ６もしくはＥ７融合体を形成するためのタンパク質Ｄ担体と融合した初期タンパク質Ｅ６もしくはＦ７、もしくはそれらの組み合わせ、またはＥ６もしくはＥ７とＬ２との組み合わせを含んでなる（ＷＯ  ９６／２６２７７）。あるいは、ＨＰＶ１６または１８初期タンパク質Ｅ６およびＥ７は、単一の分子、例えば、タンパク質Ｄ−Ｅ６／Ｅ７融合体で提示され得る。組成物は、例えばタンパク質Ｄ−Ｅ６もしくはタンパク質Ｄ−Ｅ７融合タンパク質またはタンパク質Ｄ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の形態の、初期ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質のいずれかまたは両方を、必要に応じて含み得る。組成物は、他のＨＰＶ株由来の抗原、例えばＨＰＶ３１または３３株由来の抗原をさらに含んでなり得る。
【０１８７】
抗原はまた、マラリアを引き起こす寄生生物に由来し得る。例えば、熱帯熱原虫由来の抗原には、ＲＴＳ，Ｓ、およびＴＲＡＰが含まれる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４つのアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結された熱帯熱原虫のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的に全てのＣ末端部分を含んでなるハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第９１２４３９０．７号からの優先権を主張するＷＯ  ９３／１０１５２として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号に開示されている。酵母で発現されると、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として産生され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と同時発現されると、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を産生する。
【０１８８】
ＴＲＡＰ抗原は、ＷＯ  ９０／０１４９６として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号に記載されている。本開示の実施形態は、抗原調製物がＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含んでなるマラリアワクチンである。多段階マラリアワクチンの成分の有力候補である他のプラスモディウム抗原は、熱帯熱原虫ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、およびプラスモディウム属種のそれらの類似体である。
【０１８９】
一実施形態において、抗原は、癌の免疫療法に有用であり得るように、癌細胞に由来する。例えば、抗原は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、または黒色腫癌などの腫瘍拒絶抗原であり得る。例示的な癌または癌細胞由来抗原には、ＭＡＧＥ１、３、およびＭＡＧＥ４、またはＷＯ９９／４０１８８に開示されているものなどの他のＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、（ＮＹ  Ｅｏｓ  １としても知られている）Ｌａｇｅ、ＳＡＧＥ、およびＨＡＧＥ（ＷＯ９９／５３０６１）、またはＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al.(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p.293）が含まれる。癌抗原のこれらの非限定的な例は、黒色腫、肺癌、肉腫、および膀胱癌などの広範囲の腫瘍型で発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照されたい。
【０１９０】
他の腫瘍特異的抗原には、ＧＭ２およびＧＭ３などの腫瘍特異的もしくは腫瘍関連ガングリオシドもしくはキャリアタンパク質とのそれらのコンジュゲート；または、多くの癌の治療に有用な、短い１０アミノ酸長のペプチドである、全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、ＷＯ  ９５／２０６００）などの自己ペプチドホルモンが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、前立腺抗原、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（例えば、 Proc.Nat. Acad.Sci.USA 95(4) 1735-1740 1998）、ＰＳＭＡ、または一実施形態においてはプロステート（Prostase）として知られる抗原（例えば、Nelson, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999.96, 3114-3119；ＷＯ  ９８／１２３０２；米国特許第５，９５５，３０６号；ＷＯ  ９８／２０１１７；米国特許第５，８４０，８７１号および第５，７８６，１４８号；ＷＯ  ００／０４１４９）を使用する。他の前立腺特異的抗原は、ＷＯ  ９８／１３７４１８およびＷＯ／００４１４９から公知である。他はＳＴＥＡＰである（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）。
【０１９１】
本開示において有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１（J Biol.Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70、米国特許第５，６５４，１４０号）、およびＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号）が含まれる。さらに、癌の治療におけるワクチンに特に適している抗原は、チロシナーゼおよびサバイビンも含んでなる。
【０１９２】
他の実施形態において、本開示の組成物に使用される薬剤には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの状態の予防および治療のための、細菌感染（例えば、肺炎球菌）によって引き起こされるかまたは増悪する疾患などの呼吸器疾患に関連する抗原が含まれる。ＣＯＰＤは、慢性気管支炎および／または肺気腫を有する患者における不可逆的またはある程度可逆的な気道閉塞の存在によって生理学的に定義される（Am J Respir Crit Care Med.1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121）。ＣＯＰＤの増悪は、しばしば、細菌（例えば、肺炎球菌）感染によって引き起こされる（Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63）。
ＩＩ．アジュバント
【０１９３】
いくつかの実施形態において、薬剤はアジュバントであり、したがって、本明細書に記載のナノアラム粒子のいずれかを含んでなる組成物は、抗原の存在下または非存在下のいずれかでアジュバントを含んでなる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、アジュバントはＡＳ−２、モノホスホリルリピドＡ、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ、ＩＦＡ、ＱＳ２１、ＣＷＳ、ＴＯＭ、ＡＧＰ、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、Ｌｅｉｆ、サポニン、サポニン模倣物、生物由来および合成のリピドＡ、イミキモド、ガーディキモド、レシキモド、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン、ＧＬＡ、ＳＬＡ、ＳＴＩＮＧ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１９５】
一つの例示的な実施形態において、アジュバントはＧＬＡである。一つの例示的な実施形態において、アジュバントはＳＬＡである。
Ｄ．ＴＬＲアゴニスト
【０１９６】
本明細書に記載されているように、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のナノアラム粒子を含んでなることを企図し、１以上のトール様受容体アゴニスト（ＴＬＲアゴニスト）をさらに含む。トール様受容体（ＴＬＲ）は、多数の感染性病原体の中または上に存在し得るような種々の保存された微生物分子構造に対して宿主細胞に早期認識能力を与える先天性免疫系の細胞表面膜貫通受容体を含む。（例えば、Armant et al., 2002 Genome Biol.3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr.Opin.Immunol.9:4; Luster 2002 Curr.Opin.Immunol.14:129; Lien et al.2003 Nat. Immunol.4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol.1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol.21:335; Takeda et al.2005 Int. Immunol.17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect.6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol.170:4102）。
【０１９７】
先天性免疫系による免疫応答の開始を促進するＴＬＲ媒介シグナル伝達の誘発は、細胞表面ＴＬＲに結合するＴＬＲアゴニストによって達成され得る。例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）は、ＴＬＲ２またはＴＬＲ４を介するＴＬＲアゴニストであり得（Tsan et al., 2004 J. Leuk.Biol.76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol.Cell Phsiol.286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206）、ポリ（イノシン−シチジン）（ｐｏｌｙｌ：Ｃ）は、ＴＬＲ３を介するＴＬＲアゴニストであり得（Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119）、ＣｐＧ配列（非メチル化シトシン−グアノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチドまたは「ＣｐＧ」ジヌクレオチドモチーフ、例えば、ＣｐＧ７９０９，Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473；ＣｐＧ１０１０１  Bayes et al.Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al.Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob.Agents Chemother.48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol.173:5148）は、ＴＬＲ９を介するＴＬＲアゴニストであり得（Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol.177:2373）、ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２および／またはＴＬＲ６アゴニストであり得（Soboll et al., 2006 Biol.Reprod.75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol.174:1566）、３Ｍ００３（関連化合物３Ｍ００１および３Ｍ００２の供給源でもあるミネソタ州セントポールの3M Pharmaceuticalsからの４−アミノ−２−（エトキシメチル）−α，α−ジメチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール水和物，Ｍｏｌ．Ｗｔ．３１８  Ｄａ；Gorden et al., 2005 J. Immunol.174:1259）は、ＴＬＲ７アゴニスト（Johansen 2005 Clin.Exp.Allerg.35:1591）および／またはＴＬＲ８アゴニスト（Johansen 2005）であり得、フラゲリンは、ＴＬＲ５アゴニストであり得（Feuillet et al., 2006 Proc.Nat. Acad.Sci.USA 103:12487）、Ｃ型肝炎抗原は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ９を介するＴＬＲアゴニストとして作用し得る（Lee et al., 2006 Proc.Nat. Acad.Sci.USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol.42:724）。他のＴＬＲアゴニストが公知であり（例えば、Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol.171:5198）、本明細書中に記載されているいくつかの実施形態に従って使用され得る。
ｂ．ＴＬＲ７／８アゴニスト
【０１９８】
本明細書に記載の組成物に使用することができるＴＬＲ７／８アゴニストが、本明細書において提供される。本明細書で使用される場合、「ＴＬＲ７／８アゴニスト」は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、または両方とのその相互作用を介してその生物活性に影響を与えるアゴニストを指す。このような生物活性には、先天性免疫系を介した免疫応答の阻害を促進するＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８媒介シグナル伝達の誘発が含まれるが、これに限定されない。
ＴＬＲ４アゴニスト
【０１９９】
本明細書に記載の組成物に使用することができるＴＬＲ４アゴニストが、本明細書において提供される。特定の実施形態において、本明細書の組成物に使用されるＴＬＲ４アゴニストは、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、例えば、その内容が参照によりその全体で本明細書に援用される、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２１０１７号、第ＵＳ２００９／０４５０３３号、第ＵＳ２０１０／０３７４６６号、および第ＵＳ２０１０／０３１０６０２号に記載されているものを含んでなる。
【０２００】
例えば、特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＩＶ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント、
【化３】
2019521960.tif 000014
または薬剤的に許容できるその塩であり、式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、同じかまたは異なり、独立して、−Ｏ−、−ＮＨ−、または−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同じかまたは異なり、独立して、存在しないか、または−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は酸官能基であり、
Ｙ２およびＹ３は、同じかまたは異なり、独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、または酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、同じかまたは異なり、独立して、Ｃ８〜１３アルキルであり、
Ｒ２およびＲ４は、同じかまたは異なり、独立して、Ｃ６〜１１アルキルである。
【０２０１】
合成ＧＬＡ構造のいくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ８アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２０２】
例えば、特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（Ｖ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化４】
2019521960.tif 000015
【０２０３】
特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０アルキルである。
【０２０４】
別の特定の実施形態において、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ１３アルキルである上記の式を有する。
【０２０５】
別の特定の実施形態において、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がC10アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がC8アルキルである上記の式を有する。
【０２０６】
別の特定の実施形態において、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６がＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４がＣ９〜Ｃ２０アルキルである上記の式を有する。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２０７】
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（Ｖ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化５】
2019521960.tif 000016
【０２０８】
上記ＧＬＡ構造の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２０９】
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＶＩ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化６】
2019521960.tif 000017
【０２１０】
上記ＧＬＡ構造の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２１１】
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、式（ＶＩＩ）の以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化７】
2019521960.tif 000018
【０２１２】
上記ＧＬＡ構造の特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２１３】
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント（ＳＬＡ）である。
【化８】
2019521960.tif 000019
【０２１４】
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化９】
2019521960.tif 000020
【０２１５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化１０】
2019521960.tif 000021
【０２１６】
別の実施形態において、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）は、本明細書に記載の組成物に組み込まれる。ＡＬＤは、分子がより少ない、または異なるリピドＡの副作用を呈するように変更または構築されているリピドＡ様分子である。これらの副作用には、発熱原性、局所シュワルツマン反応性、およびニワトリ胚５０％致死量アッセイ（ＣＥＬＤ５０）で評価される毒性が含まれる。本開示に係る有用なＡＬＤには、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）および３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）が含まれる。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡは公知であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。例えば、モノホスホリルリピドＡおよびその製造を開示する、 Ribi ImmunoChem Research, Inc.に与えられた１９８４年３月１３日発行の米国特許第４，４３６，７２７号を参照されたい。同様にRibi ImmunoChem Research, Inc.に与えらえた、米国特許第４，９１２，０９４号およびMyers, et al.に対する再審査証明書Ｂ１米国特許第４，９１２，０９４号は、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびその製造方法を具体化する。ＭＬＡおよび３Ｄ−ＭＬＡに関するこれらの特許のそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０２１７】
上記のＴＬＲ４アゴニスト化合物において、全電荷は分子中の官能基に従って決定することができる。例えば、リン酸基は、リン酸基のイオン化状態に応じて、負に帯電していること、または中性であることができる。
ｄ．ＣｐＧヌクレオチド
【０２１８】
一実施形態において、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫促進性オリゴヌクレオチドである（例えば、米国特許第６，５４４，５１８号）。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（「ＣｐＧ」）を含む免疫促進性オリゴヌクレオチドは、アジュバントとして知られている。いくつかの実施形態では、本開示のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、３以上、４以上、５以上、もしくは６以上、またはそれ以上のヌクレオチドによって分離された２以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含むことができる。
【０２１９】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列の例は、以下の刊行物に開示されている；本明細書に開示されている特定の実施形態では、配列はホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる：
ＣｐＧ７９０９：Cooper et al., “CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults.”AIDS, 2005 Sep 23;19(14):1473-9.
ＣｐＧ１０１０１：Bayes et al., “Gateways to clinical trials.”Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.2005 Apr;27(3):193-219.
Vollmer J., “Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9.”Expert Opinion on Biological Therapy.2005 May; 5(5): 673-682
【０２２０】
別のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、それらが重要でない塩基配列の置換、挿入、欠失、および／または付加を有する点で異なる、上記の刊行物に記載された配列の変異体を含んでなり得る。本開示の特定の実施形態において利用されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当分野で公知の任意の方法（例えば、ＥＰ  ４６８５２０）によって合成され得る。好都合なことに、当該オリゴヌクレオチドは、自動合成機を利用して合成し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。一実施形態において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合はホスホロジチオエート、またはホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルも現在企図される実施形態の範囲内である。異なるヌクレオチド間結合を含んでなるオリゴヌクレオチド、例えば、混合ホスホロチオエートホスホジエステルも企図される。オリゴヌクレオチドを安定化させる他のヌクレオチド間結合も使用し得る。
ｉｉｉ．生物およびウイルス
【０２２１】
いくつかの実施形態において、薬剤は生物である。したがって、これらの実施形態において、記載の組成物は、本明細書で提供されるナノアラム粒子を含んでなり、生物をさらに含んでなる。
【０２２２】
例えば、結核菌は、結核（ＴＢ）を引き起こす。現在、生きた細菌によるワクチン接種は、結核に対する防御免疫を誘発するための最も効率的な方法である。この目的のために使用される最も一般的なマイコバクテリウムは、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）の非病原性株であるカルメット・ゲラン杆菌（ＢＣＧ）である。したがって、いくつかの実施形態において、組成物はナノアラム粒子およびマイコバクテリウムを含んでなる。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、薬剤はウイルスまたはウイルスゲノムである。したがって、これらの実施形態において、記載の組成物は、本明細書で提供されるナノアラム粒子を含んでなり、ウイルス粒子、単離ウイルス外被、またはウイルスゲノムをさらに含んでなる。
Ｂ．ナノアラム粒子との会合
【０２２４】
本明細書で提供される実施形態において、本明細書で提供される組成物の薬剤は、ナノアラム粒子と会合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物の薬剤は、ナノアラム粒子と結合する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物の薬剤は、ナノアラム粒子に吸着している。このような結合または吸着は、限定されるものではないが、生化学的、生理学的、および/または化学的相互作用を含む、特異的または非特異的結合または相互作用に典型的に起因する、相互親和性または結合能力を示す分子またはその部分間の相互作用を指す。特定の実施形態において、ナノアラム粒子への結合は、ＵＶ分光法またはゲル電気泳動によって測定することができる。
【０２２５】
ナノアラム粒子への吸着は、通常、限定されるものではないが以下のメカニズム：静電相互作用およびリガンド交換により、起こり得る。静電相互作用は、特定の溶液条件下で成分に反対の電荷が存在することを利用する。リガンド交換は、成分の１つのリン酸基を使用して、別の成分のヒドロキシル基と交換する。リガンド交換では、成分中の接近可能なリン酸基およびヒドロキシル基が使用される。いくつかの実施形態において、薬剤、抗原、またはアジュバントを含む組成物を調製するために、薬剤上のリン酸基およびヒドロキシル基の電荷および存在を考慮する。
ｉ．リガンド交換
【０２２６】
リガンド交換メカニズムに関する特定の実施形態では、薬剤とアルミニウム塩との間にリガンド交換が存在し得る。
【０２２７】
特定の実施形態において、アジュバント剤とアルミニウム塩との間にリガンド交換が存在し得る。アジュバント組成物中の特定の成分はリン酸基を含んでなり、一方、他の特定の成分はヒドロキシル基を含んでなり、そのためリガンド交換が可能になる。例えば、特定のＴＬＲ４アゴニストはリン酸基を含んでなる。AdjuPhos（登録商標）は、リン酸基を含んでなる。ヒドロキシル基は、少なくとも以下の成分：抗原、ＴＬＲアゴニスト、脂質／界面活性剤、およびAlhydrogel（登録商標）中に存在する。
ＩＩ．静電相互作用
【０２２８】
静電相互作用メカニズムに関する特定の実施形態では、薬剤とアルミニウム塩との間にリガンド交換が存在し得る。
【０２２９】
静電相互作用メカニズムに関する特定の例示的な実施形態では、ワクチン組成物は、ほぼ生理的ｐＨで実質的に中性に帯電している。ワクチン組成物用の抗原が帯電している場合、アジュバント組成物用の成分は、抗原の電荷を中和して実質的に中性に帯電したワクチン組成物を与えるように選択することができる。ワクチン組成物用の抗原が実質的に中性に帯電している場合、アジュバント組成物用の成分は、抗原の実質的に中性の電荷を維持して、実質的に中性に帯電したワクチン組成物を与えるように選択することができる。
【０２３０】
上記のように、組成物中の各成分は、負に帯電していること、正に帯電していること、または中性に帯電していることによって特徴付けることができる。
Ｃ．用量節約
【０２３１】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子を含んでなり、薬剤をさらに含んでなる組成物は、用量節約および／または高レベルのインビボ発現を示す。一実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、送達に使用されていない本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物が有した同じ生物学的および／または生理学的効果を達成するために使用された薬剤の量と比較して、５％以上少ない、１０％以上少ない、２０％以上少ない、２５％以上少ない、３０％以上少ない、４０％以上少ない、５０％以上少ない、６０％以上少ない、７５％以上少ない、８０％以上少ない、９０％以上少ない、９５％以上少ない、または９９％以上少ない薬剤の使用を可能にする。一実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、生物学的および／または生理学的効果を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇの用量の薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、所望の生物学的および／または生理学的効果を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、または１０ｎｇ、１ｎｇのポリペプチドの用量の薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、免疫応答を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇのポリペプチドの用量の薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、所望の生物学的および／または生理学的効果を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇのポリヌクレオチドの用量の薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、免疫応答を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、または１０ｎｇ、１ｎｇのポリヌクレオチドの用量の薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、免疫応答を達成するために、約１００ｎｇ、５０ｎｇ、３０ｎｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇのＲＮＡポリヌクレオチドの用量のＲＮＡ薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、免疫応答を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇのレプリコンＲＮＡベクターポリヌクレオチドの用量の薬剤の使用を可能にする。一つの特定の実施形態において、本明細書で提供されるナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物の使用は、免疫応答を達成するために、約１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇのｍＲＮＡベクターポリヌクレオチドの用量の薬剤の使用を可能にする。
【０２３２】
一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドを送達してポリペプチド抗原の発現を達成して、免疫応答を発生させるのに必要とされるＲＮＡを、非製剤化ＲＮＡと比較して３００分の１に低減して、用量節約が達成される。一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドを送達してポリペプチド抗原の発現を達成して、免疫応答を発生させるのに必要とされるＲＮＡを、非製剤化ＲＮＡと比較して１００分の１に低減して、用量節約が達成される。一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドを送達してポリペプチド抗原の発現を達成して、免疫応答を発生させるのに必要とされるＲＮＡを、非製剤化ＲＮＡと比較して５０分の１に低減して、用量節約が達成される。一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドを送達してポリペプチド抗原の発現を達成して、免疫応答を発生させるのに必要とされるＲＮＡを、非製剤化ＲＮＡと比較して３０分の１に低減して、用量節約が達成される。一実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドを送達してポリペプチド抗原の発現を達成して、免疫応答を発生させるのに必要とされるＲＮＡを、非製剤化ＲＮＡと比較して１０分の１に低減して、用量節約が達成される。
Ｄ．医薬組成物
【０２３３】
本明細書に記載のナノアラム粒子および組成物を含んでなる医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ナノアラム粒子を含んでなる組成物は、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含んでなる。いくつかの実施形態において、医薬組成物はワクチ組成物である。本明細書に記載の組成物は、治療または診断目的のために対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、対象における免疫応答（非特異的応答および抗原特異的応答を含む）を刺激するために使用される。本明細書で提供される実施形態において、対象は、哺乳類（例えば、家畜（ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、ペット（ネコ、イヌなど）、およびげっ歯類（ラット、マウスなど）を含む動物、またはヒト）である。特に、Ｔｈ１免疫応答を促進する本発明の製剤および組成物は、対象において当該応答を刺激するために使用することができる。
【０２３４】
医薬組成物は、通常、本明細書に記載の組成物を含んでなり、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて、抗原、追加のアゴニスト、または組み換え発現コンストラクトから選択される本明細書で提供される１以上の成分をさらに含んでなり得る。
【０２３５】
本明細書において提供される実施形態において、医薬組成物は、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、０．２０ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過することができる。
【０２３６】
一実施形態において、本開示は、ＴＬＲ７／８アゴニストまたはＴＬＲ４アゴニストを含んでなるナノアラム粒子を含んでなる医薬組成物に関する。当該組成物は、本明細書に記載のＴＬＲ７／８アゴニストまたはＴＬＲ４アゴニストが組成物中に製剤化され、組成物が他の抗原を実質的に欠き、生物による感染などの疾患または他の状態の診断、治療、または予防の目的のために、免疫応答、例えば、非特異的免疫応答または抗原特異的免疫応答を刺激するために対象に組成物を投与する「単独療法」に使用することができる。
【０２３７】
他の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の組成物および抗原の両方を含んでなるワクチン組成物であり、薬剤的に許容できる担体、賦形剤、または希釈剤と組み合わせて、本明細書で提供される１以上の成分をさらに含んでなり得る。例示的な担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。
【０２３８】
例示的な担体は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって非毒性である。
【０２３９】
本明細書において提供される実施形態において、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与量の医薬組成物を投与する。本明細書において提供される実施形態において、約１ｎｇ〜約１ｍｇの投与量の医薬組成物を投与する。いくつかの実施形態において、約５００μｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇ、２５μｇ、２０μｇ、１５μｇ、１０μｇ、５μｇ、２μｇ、１μｇ、１０ｎｇ、または１ｎｇの投与量の医薬組成物を投与する。投与の回数および頻度が対象の応答に依存することは、当業者には明らかであろう。治療用途用の「薬剤的に許容できる担体」は、製薬分野において周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A.R. Gennaro edit.1985）に記載されている。例えば、生理的ｐＨの滅菌生理食塩水およびリン酸緩衝食塩水を使用し得る。防腐剤と、安定剤と、染料と、さらには矯味剤も、医薬組成物中に提供され得る。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として添加し得る。１４４９でＩｄ。また、抗酸化剤および懸濁化剤を使用し得る。Ｉｄ。
【０２４０】
「薬剤的に許容できる塩」は、本開示の化合物と有機もしくは無機酸（酸付加塩）または有機もしくは無機塩基（塩基付加塩）との組み合わせに由来する本開示の化合物の塩を指す。本開示の組成物は、遊離塩基または塩のいずれかの形態で使用され得、両方の形態が本開示の範囲内にあると見なされる。
【０２４１】
医薬組成物は、組成物を患者に投与することを可能にする任意の形態であり得る。例えば、組成物は、固体、液体、または気体（エアロゾル）の形態であり得る。典型的な投与経路には、経口、局所、非経口（例えば舌下または口腔内）、舌下、直腸内、膣内、および鼻腔内（例えばスプレーとして）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語、非経口には、イオントフォレーシス（例えば、Ｕ．Ｓ．７，０３３，５９８；７，０１８，３４５；６，９７０，７３９）、ソノフォレーシス （sonophoretic）（例えば、Ｕ．Ｓ．４，７８０，２１２；４，７６７，４０２；４，９４８，５８７；５，６１８，２７５；５，６５６，０１６；５，７２２，３９７；６，３２２，５３２；６，０１８，６７８）、サーマル（例えば、Ｕ．Ｓ．５，８８５，２１１；６，６８５，６９９）、受動的経皮（例えば、Ｕ．Ｓ．３，５９８，１２２；３，５９８，１２３；４，２８６，５９２；４，３１４，５５７；４，３７９，４５４；４，５６８，３４３；５，４６４，３８７；英国特許明細書第２２３２８９２号；Ｕ．Ｓ．６，８７１，４７７；６，９７４，５８８；６，６７６，９６１）、顕微針（例えば、Ｕ．Ｓ．６，９０８，４５３；５，４５７，０４１；５，５９１，１３９；６，０３３，９２８）およびジェット式注射投与、ならびに皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、陰茎海綿体、くも膜下腔内、道内（intrameatal）、尿道内注射または注入技術が含まれる。特定の実施形態において、（ワクチンおよび医薬組成物を含む）本明細書に記載の組成物を、イオントフォレーシス、マイクロキャビテーション、ソノフォレーシス、または顕微針から選択される技術によって皮内に投与する。
【０２４２】
医薬組成物が対象に投与されると、医薬組成物に含有されている活性成分が生体利用可能になるように、医薬組成物を製剤化することができる。対象に投与される組成物は、１以上の投与単位の形態をとり、例えば、錠剤が単一の投与単位であり得、エアロゾル形態の本開示の１以上の化合物の容器が複数の投与単位を保持し得る。
【０２４３】
経口投与では、賦形剤および／または結合剤が存在し得る。例は、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびエチルセルロースである。着色剤および／または矯味剤が存在し得る。コーティングシェル（coating shell）を使用し得る。
【０２４４】
組成物は、液体、例えばエリキシル、シロップ、溶液、エマルション、または懸濁液の形態であり得る。液体は、２つの例として、経口投与用または注射による送達用であり得る。経口投与が意図されている場合、組成物は、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および香味増強剤のうちの１以上を含有することができる。注射によって投与されることが意図されている組成物中に、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、および等張剤のうちの１以上が含まれ得る。
【０２４５】
溶液、懸濁液、または他の同様の形態の形態である、本明細書で使用される液体医薬組成物は、以下の担体または賦形剤のうちの１以上を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、固定油、例えばスクアレン、スクアラン、鉱油、マンニドモノオレエート、コレステロール、および／または溶媒もしくは懸濁媒体として働き得る合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張度調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または多人数用バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０２４６】
別の実施形態において、本開示の組成物は、エアロゾル化され得る様式で製剤化される。
【０２４７】
また、アルミニウム塩、油中水型エマルション、生物分解性油状ビヒクル、水中油型エマルション、生物分解性マイクロカプセル、およびリポソームを含むがこれらに限定されない送達ビヒクルなどの他の成分を医薬組成物に含めることが望ましい場合もある。このようなビヒクルに用いるための追加の免疫調節性物質（コアジュバント（co-adjuvant））の例は、上記にも記載されており、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマインターフェロン、およびＩＬ−１２が含まれ得る。
【０２４８】
当業者に公知の任意の好適な担体が本開示の医薬組成物に使用され得るが、担体の種類は、投与様式および持続放出が望まれるかどうかに依存して変わる。皮下注射などの非経口投与では、担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含んでなることができる。経口投与では、上記担体または固体担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカン、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムのうちのいずれかを使用し得る。生物分解性微細球（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））もまた、本開示の医薬組成物用担体として使用し得る。好適な生物分解性微細球は、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および第５，０７５，１０９号に開示されている。これに関して、微細球は、約２５ミクロンよりも大きいことが好ましい。
【０２４９】
医薬組成物は、緩衝剤などの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約１０未満残基）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロース、またはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤も含有し得る。中性緩衝食塩水または非特異的血清アルブミンと混合した生理食塩水は、例示的な適当な希釈剤である。例えば、製品は、希釈剤として適当な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を用いて、凍結乾燥物として製剤化され得る。
【０２５０】
上記のように、特定の実施形態では、本開示は、所望の抗原をコードする核酸分子を送達することができる組成物を含む。当該組成物は、組み換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス（ＷＯ  ９０／０７９３６、ＷＯ  ９１／０２８０５、ＷＯ  ９３／２５２３４、ＷＯ  ９３／２５６９８、およびＷＯ  ９４／０３６２２を参照）、アデノウイルス（Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988；Li et al., Hum.Gene Ther.4:403-409, 1993；Vincent et al., Nat. Genet.5:130-134, 1993；およびKolls et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219, 1994を参照）、ポックスウイルス（米国特許第４，７６９，３３０号；米国特許第５，０１７，４８７号；およびＷＯ  ８９／０１９７３を参照）、ポリカチオン性分子と複合体を形成した組み換え発現コンストラクト核酸分子（ＷＯ  ９３／０３７０９を参照）、ならびにリポソームと会合した核酸（Wang et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851, 1987を参照）を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡは、死滅した、または不活性化されたアデノウイルスと結合し得る（Curiel et al., Hum.Gene Ther.3:147-154, 1992；Cotton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6094, 1992を参照）。他の好適な組成物は、ＤＮＡ−リガンド（Wu et al., J. Biol.Chem.264:16985-16987, 1989を参照）および脂質−ＤＮＡの組み合わせ（Feigner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417, 1989を参照）を含む。
【０２５１】
特定の実施形態において、非経口投与または経口投与のいずれかが意図された液体組成物は、好適な投与量が得られるような量のワクチン組成物を含有すべきである。典型的には、この量は、組成物中の０．０１重量％以上の抗原である。経口投与が意図されている場合、この量は、組成物の重量の０．１〜約７０％の間で変化させ得る。経口組成物は、約４％〜約５０％の抗原を含有することができる。組成物および製剤は、非経口投与単位が０．０１〜１重量％の活性組成物を含有するように調製することができる。
【０２５２】
医薬組成物は、局所投与を目的とし得、この場合、担体は、溶液、エマルション、軟膏、またはゲル基剤を適宜含んでなり得る。基剤は、例えば、以下のうちの１以上を含んでなり得る：ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜ろう、鉱油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定剤。増粘剤が局所投与用医薬組成物中に存在し得る。経皮投与が意図されている場合、組成物は、経皮パッチまたはイオントフォレーシス装置を含み得る。局所製剤は、約０．１〜約１０％ｗ／ｖ（単位体積あたり重量）の濃度の抗原（例えば、ＧＬＡ抗原ワクチン組成物）またはＧＬＡ（例えば、免疫アジュバント組成物；ＧＬＡは、アラバマ州アラバスターのAvanti Polar Lipids, Inc.から入手可能である；例えば、製品番号６９９８００）を含有し得る。
【０２５３】
組成物は、例えば直腸内で融解して薬剤を放出する坐剤の形態での、直腸投与を目的とし得る。直腸投与用組成物は、好適な非刺激性賦形剤として油性基剤を含有し得る。このような基剤には、ラノリン、カカオバター、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。本開示の方法において、ワクチン組成物／アジュバントを、挿入剤（insert）、ビーズ、徐放性製剤、パッチ、または速放性製剤の使用により投与し得る。
Ｖ．ナノアラム粒子および組成物の使用
Ａ．治療薬
【０２５４】
いくつかの実施形態において、薬剤は治療目的に有用である。したがって、いくつかの実施形態において、記載の組成物は、本明細書で提供されるナノアラム粒子を含んでなり、かつ、疾患、状態、または障害の治療のための薬剤をさらに含んでなる。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、薬剤は、アレルギー、癌、感染症、自己免疫、または嗜癖の治療または予防に有用である。
【０２５６】
本明細書において開示される実施形態、組成物は、癌抗原を含んでなる。いくつかの実施形態において、ワクチン組成物は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現または他の癌特異的もしくは癌関連抗原などの腫瘍関連抗原発現によって特徴付けられる癌に対して有用である癌抗原を含んでなる。
【０２５７】
本開示の特定の実施形態に係る組成物および方法はまた、宿主または対象の免疫系が「自己」組織、細胞、生体分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオリピド、脂質、糖脂質、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸、オリゴ糖、多糖、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、もしくは同種のもの、ならびに対象の細胞および組織の他の分子成分）またはエピトープ（例えば、抗体可変領域相補性決定領域（ＣＤＲ）によって、もしくはＴ細胞受容体ＣＤＲによって認識されるものなどの特異的な免疫学的に確定される認識構造）に対する免疫応答を有害に媒介する疾患、状態、または障害を含む、自己免疫疾患の予防または治療のために使用され得る。
【０２５８】
したがって、自己免疫疾患は、いずれの場合も正常な自己組織に向けられた、細胞または抗体のいずれかを含む異常な免疫応答によって特徴付けられる。哺乳類における自己免疫疾患は、一般に、２つの異なるカテゴリー：細胞媒介性疾患（すなわち、Ｔ細胞）または抗体媒介性障害のうちの１つに分類され得る。細胞媒介性自己免疫疾患の非限定的な例には、多発性硬化症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病（若年発症糖尿病）、および自己免疫性網膜ぶどう膜炎（uvoretinitis）が含まれる。抗体媒介性自己免疫障害には、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（またはＳＬＥ）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少、自己免疫性喘息、クリオグロブリン血症、血栓性（thrombic）血小板減少性紫斑病、原発性硬化性胆管炎、および悪性貧血が含まれるが、これらに限定されない。全身性エリテマトーデスに関連する抗原は、低分子核リボ核酸タンパク質（ｓｎＲＮＰ）であり、グレーブス病に関連する抗原は、サイロトロピン受容体、チログロブリン、および甲状腺上皮細胞の他の成分であり（Akamizu et al., 1996；Kellerman et al., 1995；Raju et al., 1997；およびTexier et al., 1992）、天疱瘡に関連する抗原は、デスモグレイン３および他の接着分子などのカドヘリン様の天疱瘡抗原であり（Memar et al., 1996: Stanley, 1995；Plott et al., 1994；およびHashimoto, 1993）、血栓性（thrombic）血小板減少性紫斑病に関連する抗原は、血小板の抗原である（例えば、米国特許第６，９２９，７９６号；Gorski et al.(Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA；Radbruch and Lipsky, P.E.(Eds.)Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr.Top.Microbiol. and Immunol.）2001, Springer, NY.を参照）。
【０２５９】
自己免疫は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチ、強皮症、および甲状腺疾患を含む８０を超える様々な疾患に関与する。ほとんどの自己免疫疾患について、罹患率の精力的な量的推定は、不充分である。１９９０年代後半に行われた最近の研究では、自己免疫疾患が米国で３番目に頻度の高い主要な疾患であることが明らかになり、最も頻度の高い自己免疫疾患は８５０万人を超えるアメリカ人に発症している。当該疾患の有病率の現在の推定値は、米国人口の５〜８パーセントに及ぶ。ほとんどの自己免疫疾患は女性に偏って発症する。女性は男性よりも自己免疫疾患を発症する確率が２．７倍高い。女性は自己免疫疾患の影響を受けやすく、男性は女性よりもナチュラルキラー細胞活性のレベルが高いようである。（Jacobsen et al, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997.）
【０２６０】
本明細書で提供される組成物は、例えば結核に対する防御免疫を誘発するために使用され得、１以上のマイコバクテリウムタンパク質の１以上の免疫原性部分を含むポリペプチド、ならびに当該ポリペプチドをコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子の使用を含む。さらに、当該化合物は、マイコバクテリウム感染に対する免疫化のためのワクチンおよび／または医薬組成物に製剤化され得る（米国特許第６，９４９，２４６および第６，５５５，６５３号）。
【０２６１】
特定の実施形態において、本開示の組成物は、腎臓透析の対象、化学療法および／または放射線療法の対象、移植レシピエント、ならびに同種の者などを含む高齢者および／または免疫抑制者の治療に特に適用可能である。このような個体は、通常、ワクチンに対する免疫応答の低下を示し、したがって、本開示の組成物の使用は、これらの対象において達成される免疫応答を増強することができる。
【０２６２】
他の実施形態において、本開示の組成物には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの状態の予防および治療のための、細菌感染（例えば、肺炎球菌）によって引き起こされるかまたは増悪する疾患などの呼吸器疾患に関連する抗原が含まれる。
【０２６３】
直接的なインビボ手順に加えて、細胞を宿主から取り出し、改変し、同一または別の宿主動物に入れるエキソビボ手順を使用し得る。エキソビボの状況において抗原コード核酸分子を組織細胞に導入するために、上記組成物のいずれかを利用することができることは明らかであろう。ウイルス、物理的および化学的取り込み方法のプロトコールは、当分野において周知である。
【０２６４】
したがって、本開示は、宿主である患者において、または細胞培養物において、免疫応答を増強または誘発するために有用である。本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物を指す。患者は、感染症、乳癌などの癌、もしくは自己免疫疾患に罹患していることがあり得、または正常であること（すなわち、検出可能な疾患および／または感染がないこと）があり得る。「細胞培養物」は、免疫担当細胞または免疫系の単離細胞（Ｔ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞、および樹状細胞を含むが、これらに限定されない）を含む調製物である。このような細胞は、当業者に周知の様々な技術のいずれか（例えば、フィコール−ハイパック質密度遠心分離）によって単離し得る。細胞は、癌に罹患している患者から単離し得（しかし、そうである必要はない）、治療後に患者に再導入し得る。
Ｂ．ワクチン
【０２６５】
したがって、本開示は、免疫応答を開始することができる宿主において免疫応答を変化させる（すなわち、例えば当業者に周知の適当な対照と比較して、統計的に有意な様式で増加または減少させる）ための組成物を提供する。当業者に知られているように、免疫応答は、宿主の免疫状態の維持および／または調節に関与する、１つ以上の組織、器官、細胞、または分子の構造または機能における何らかの変化を含み得る、宿主の免疫状態の何らかの活性な変化であり得る。典型的には、免疫応答は、限定されるものではないが、以下のインビボまたはインビトロでの測定を含む、様々な周知のパラメーターのいずれかによって検出され得る：可溶性免疫グロブリンもしくは抗体;サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、および同種のものなどの可溶性メディエーター、ならびに他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、および／もしくは脂質メディエーター；免疫系の細胞の機能的もしくは構造的特性の変化によって決まる細胞の活性化状態の変化、例えば細胞増殖、運動性の変化、特異的遺伝子発現もしくは細胞溶解挙動などの特殊な活性の誘発；表面抗原発現プロファイルの変化もしくはアポトーシスの開始（プログラム細胞死）を含む、免疫系の細胞による細胞分化；または免疫応答の存在が検出され得る他の基準。
【０２６６】
当業者であれば容易に習熟する多数の周知の免疫アッセイのうちのいずれかによって、本開示の組成物による免疫応答の誘発の測定を確立し得る。当該アッセイには、以下のインビボまたはインビトロでの測定が含まれるが、これに限定されるものではない：可溶性抗体;サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、および同種のものなど可溶性メディエーター、ならびに他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド、および／もしくは脂質メディエーター；免疫系の細胞の機能的もしくは構造的特性の変化によって決まる細胞の活性化状態の変化、例えば細胞増殖、運動性の変化、特異的遺伝子発現もしくは細胞溶解挙動などの特殊な活性の誘発；表面抗原発現プロファイルの変化もしくはアポトーシスの開始（プログラム細胞死）を含む、免疫系の細胞による細胞分化。これらおよび類似のアッセイを実施するための手順は広く知られており、例えばLefkovits（Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998；Current Protocols in Immunologyも参照；例えば、Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MAも参照；Mishell and Shigii (eds.)Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA；Green and Reed, 1998 Science 281:1309、およびそこに引用された参考文献）に見られ得る。
【０２６７】
抗原反応性Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞の増殖は、ＤＮＡ合成の速度を測定することによって検出することができ、抗原特異性は、候補抗原反応性Ｔ細胞が曝露される刺激（例えば、特異的な所望の抗原または対照抗原パルス抗原提示細胞など）を制御することによって測定することができる。刺激されて増殖するＴ細胞は、ＤＮＡ合成の速度の増加を示す。ＤＮＡ合成の速度を測定する典型的な方法は、例えば、新たに合成されたＤＮＡに取り込まれたヌクレオシド前駆体であるトリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識することによるものである。取り込まれたトリチウム化チミジンの量は、液体シンチレーション分光光度計を用いて測定することができる。Ｔ細胞増殖を検出する他の方法には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、Ｃａ２＋フラックス、または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２−テトラゾリウムなどの色素の取り込みの増加の測定が含まれる。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロン−ガンマ）の合成を測定し得るか、または特定の抗原に応答できるＴ細胞の相対数を定量化し得る。
【０２６８】
抗原特異的抗体産生の検出は、例えば、本開示に係るワクチンで処理された宿主からのサンプル（例えば、血清、血漿、または血液などの免疫グロブリン含有サンプル）を、インビトロ方法論、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、平衡透析、またはウェスタンブロッティングを含む固相イムノブロッティングを使用してアッセイすることによって、達成され得る。実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、例えばアッセイの感度を高めるために、抗原に特異的な固相モノクローナル抗体による標的抗原の抗原捕捉固定化をさらに含み得る。可溶性メディエーター（例えば、サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、プロスタグランジンなど）の生成もまた、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）によって、例えば商業的供給源（例えば、ミズーリ州セントルイスのSigma；ミネソタ州ミネアポリスのR & D SystemsのR & D Systems 2006 Catalogも参照）から容易に入手可能な方法、装置、および試薬を用いて、容易に測定され得る。
【０２６９】
任意の数の他の免疫学的パラメーターを、当分野で周知のルーチン分析を用いてモニタリングし得る。これらには、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、二次インビトロ抗体応答、十分に確立されたマーカー抗原系を用いる様々な末梢血もしくはリンパ系単核細胞亜集団のフロー免疫細胞蛍光分析（flow immunocytofluorimetric analysis）、免疫組織化学、または他の関連アッセイが含まれ得る。これらとその他のアッセイは、例えば、Rose et al.(Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DCに見られ得る。
【０２７０】
したがって、本明細書で提供される組成物が、宿主において、Ｔｈ１型Ｔリンパ球応答、ＴＨ２型Ｔリンパ球応答、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、抗体応答、サイトカイン応答、リンホカイン応答、ケモカイン応答、および炎症反応から選択される１つ以上の免疫応答を誘発または増強することができることが、企図されている。特定の実施形態において、免疫応答は、１つまたは複数のサイトカインの産生であって、前記サイトカインがインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）から選択される、前記サイトカインの産生、１つまたは複数のインターロイキンの産生であって、前記インターロイキンがＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３から選択される、前記インターロイキンの産生、１つまたは複数のケモカインの産生であって、前記ケモカインがＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ４、およびＣＣＬ５から選択される、前記ケモカインの産生、ならびに記憶Ｔ細胞応答、記憶Ｂ細胞応答、エフェクターＴ細胞応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、およびエフェクターＢ細胞応答から選択されるリンパ球応答のうちの１以上を含んでなり得る。例えば、ＷＯ  ９４／００１５３；ＷＯ  ９５／１７２０９；ＷＯ  ９６／０２５５５；Ｕ．Ｓ．  ６，６９２，７５２；Ｕ．Ｓ．  ７，０８４，２５６；Ｕ．Ｓ．  ６，９７７，０７３；Ｕ．Ｓ．  ６，７４９，８５６；Ｕ．Ｓ．  ６，７３３，７６３；Ｕ．Ｓ．  ６，７９７，２７６；Ｕ．Ｓ．  ６，７５２，９９５；Ｕ．Ｓ．  ６，０５７，４２７；Ｕ．Ｓ．  ６，４７２，５１５；Ｕ．Ｓ．  ６，３０９，８４７；Ｕ．Ｓ．  ６，９６９，７０４；Ｕ．Ｓ．  ６，１２０，７６９；Ｕ．Ｓ．  ５，９９３，８００；Ｕ．Ｓ．  ５，５９５，８８８；Smith et al., 1987 J Biol Chem.262:6951；Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53；Beutler et al., 1986 Nature 320:584；Ｕ．Ｓ．  ６，９９１，７９１；Ｕ．Ｓ．  ６，６５４，４６２；Ｕ．Ｓ．  ６，３７５，９４４を参照されたい。
【０２７１】
本発明のナノアラム製剤は、百日咳、結核、ハンセン病、マラリア、ＨＩＶ、リーシュマニア症、およびインフルエンザなどの疾患の治療または予防に有用である。特に、ナノアラム製剤はＴｈ１免疫を促進することができるので、ナノアラム製剤は、この点で特に有用である。
Ｃ．診断薬
【０２７２】
いくつかの実施形態において、薬剤は診断薬である。したがって、これらの実施形態において、記載の組成物は、本明細書で提供されるナノアラム粒子を含んでなり、かつ、診断薬をさらに含んでなり、疾患、状態、または障害の診断に有用である。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、診断薬は癌の検出に有用である。本明細書に記載の癌を有するか、または癌を発症するリスクがあると疑われる対象を同定するための組成物および方法は、当分野で公知である。癌を有するか、または癌を有するリスクがあると疑われる対象における癌の診断は、広範な技術的に許容される方法論のいずれかによって達成され得、方法論は、臨床所見、癌の進行の程度、癌の種類、および他の要因を含む様々な要因に依存して変わり得る。癌診断の例には、患者サンプル（例えば、血液、皮膚生検、他の組織生検、外科用標本など）の組織病理学的、組織細胞化学的、免疫組織細胞化学的、および免疫組織病理学的検査、規定の遺伝的（例えば、核酸）マーカーのＰＣＲ試験、循環癌関連抗原もしくは当該抗原を有する細胞の、もしくは規定の特異性の抗体の血清学的試験、または当業者であれば習熟するようになる他の方法論が含まれる。例えば、米国特許第６，７３４，１７２号；第６，７７０，４４５号；第６，８９３，８２０号；第６，９７９，７３０号；第７，０６０，８０２号；第７，０３０，２３２号；第６，９３３，１２３号；第６，６８２，９０１号；第６，５８７，７９２号；第６，５１２，１０２号；第７，０７８，１８０号；第７，０７０，９３１号；ＪＰ５−３２８９７５；Waslylyk et al., 1993 Eur.J Bioch.211(7):18を参照されたい。これらの診断薬のいずれか１つ以上を、本明細書に記載のナノアラム粒子を含んでなる組成物に含めることができる。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、診断薬は自己免疫疾患の検出に有用である。したがって、自己抗体の検出は、自己免疫疾患発症の存在またはリスクの早期発見または認識を可能にする。これらの知見に基づいて、自己抗原に対する様々な自己抗体が発見されており、自己抗原に対する自己抗体が臨床試験で測定されており（例えば、米国特許第６，９１９，２１０号、第６，５９６，５０１号、第７，０１２，１３４号、第６，９１９，０７８号）、一方で、他の自己免疫診断は、関連する代謝産物（例えば、米国特許第４，６５９，６５９号）または免疫学的反応性（例えば、米国特許第４，６１４，７２２号および第５，１４７，７８５号、第４，４２０，５５８号、第５，２９８，３９６号、第５，１６２，９９０号、第４，４２０，４６１号、第４，５９５，６５４号、第５，８４６，７５８号、第６，６６０，４８７号）の検出を伴い得る。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノアラム粒子のいずれか１つを含んでなる組成物は、自己抗原の検出に有用な自己抗体をさらに含んでなる。
【０２７５】
一実施形態において、診断薬は感染症の検出に有用である。本明細書に記載の感染性病原体による感染を有するか、または有するリスクがあると疑われる対象を同定するための組成物および方法は、当分野において公知である。
【０２７６】
例えば、結核菌は、結核（ＴＢ）を引き起こす。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノアラム粒子のいずれかを含んでなる組成物は、結核の診断用の薬剤をさらに含んでなる。このようなポリペプチドまたはＤＮＡ配列および好適な検出試薬を含有する診断キットは、患者および生体サンプルにおけるマイコバクテリウム感染の検出のために使用され得る。このようなポリペプチドに対する抗体もまた提供される。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノアラム粒子のいずれかを含んでなる組成物は、以下に記載の診断薬のいずれか１つを用いて、マラリアを診断するための薬剤をさらに含んでなる。個体におけるマラリアのインビトロ診断法であって、個体から採取した組織または生体液を分子またはポリペプチド組成物と接触させて置くことであって、前記分子またはポリペプチド組成物が、熱帯熱マラリア原虫の感染活性に起因するタンパク質の１以上のＴエピトープの全部または一部を有する１以上のペプチド配列を含んでなり、前記組成物と組織または生体液中に存在し得る抗体との間でインビトロ免疫反応が起こることを可能にする条件下で置くことと、形成された抗原−抗体複合体のインビトロ検出とを含んでなる前記診断法が公知である（例えば、米国特許第７，０８７，２３１号参照）。
【０２７８】
組み換え熱帯熱マラリア原虫（３Ｄ７）ＡＭＡ−１外部ドメインの発現および精製が記載されている。従前の方法は、天然分子のフォールディングおよびジスルフィド架橋を保持する高度に精製されたタンパク質を産生していた。組み換えＡＭＡ−１は、抗体産生と同様に診断試薬として有用であり、マラリアを予防するためのワクチンとして単独で、または一部として使用するためのタンパク質として有用である。（米国特許第７，０２９，６８５号）
【０２７９】
感染後に感受性哺乳動物宿主の血漿に分泌されるタンパク質またはタンパク質の断片である種特異的な三日熱マラリア原虫マラリアペプチド抗原をコードするポリヌクレオチドが当分野で記載されており、これらの抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も記載されている。ペプチド抗原、モノクローナル抗体、および／またはポリクローナル抗体は、マラリアを診断するため、ならびに三日熱マラリア原虫が感染の原因となる種であるかどうかを判定するために用いられるアッセイに利用される。（米国特許第６，７０６，８７２号）感染後に感受性哺乳動物宿主の血漿に分泌されるタンパク質またはタンパク質の断片である種特異的な三日熱マラリア原虫マラリアペプチド抗原も報告されており、これらの抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も記載されている。ペプチド抗原、モノクローナル抗体、および／またはポリクローナル抗体は、マラリアを診断するため、ならびに三日熱マラリア原虫が感染の原因となる種であるかどうかを判定するために用いられるアッセイに利用される（例えば、米国特許第６，２３１，８６１号参照）。
【０２８０】
組み換え熱帯熱マラリア原虫（３Ｄ７）ＡＭＡ−１外部ドメインもまた、天然分子のフォールディングおよびジスルフィド架橋を保持する高度に精製されたタンパク質を産生する方法によって発現されている。組み換えＡＭＡ−１は、診断試薬として、抗体産生に使用するため、およびワクチンとして有用である。（米国特許第７，０６０，２７６号）同様に、天然分子のフォールディングおよびジスルフィド架橋を保持する組み換え熱帯熱マラリア原虫（３Ｄ７）ＭＳＰ−１４２の発現および精製も公知である。組み換えＭＳＰ−１４２は、診断試薬として、抗体産生に使用するため、およびワクチンとして有用である。（米国特許第６，８５５，３２２号）
【０２８１】
したがって、マラリア感染性病原体による感染を有するか、または有するリスクがあると疑われる対象を同定するためのヒトマラリア感染の検出のための診断法は、これらおよび関連する開示により公知である。具体的には、例えば、血液サンプルを、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（ＡＰＡＤ）、基質（例えば、乳酸塩または乳酸）、および緩衝液を含有する試薬と混合する。試薬は、マラリア原虫によって産生される特有の解糖酵素の存在を検出するように設計されている。この酵素は、寄生生物乳酸デヒドロゲナーゼ（ＰＬＤＨ）として知られている。ＰＬＤＨは、上記の試薬を用いて宿主ＬＤＨと容易に区別される。試薬と寄生血液サンプルとの混合は、ＡＰＡＤの還元をもたらす。しかしながら、ＡＰＡＤは宿主ＬＤＨによって還元されない。そして、還元されたＡＰＡＤは、スペクトル、蛍光、電気泳動、または比色分析を含む様々な技術によって検出され得る。上記の方法で還元されたＡＰＡＤを検出することにより、マラリア感染の陽性の指標が得られる（例えば、米国特許第５，１２４，１４１号）。マラリアを診断するための別の方法論では、熱帯熱マラリア原虫抗原ＧＬＵＲＰに由来する特徴的なアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドは、ポリペプチドに対して産生された、またはポリペプチドと反応する特異的抗体によって被検試料中で認識される。（米国特許第５，２３１，１６８号）
【０２８２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノアラム粒子のいずれかを含んでなる組成物は、リーシュマニア症の診断に有用な薬剤をさらに含んでなり、以下に記載の診断薬のいずれか１つを用いる。リーシュマニア症は、インド亜大陸、アフリカ、およびラテンアメリカでしばしば流行している広範囲にわたる寄生虫病であり、ワクチン開発について世界保健機関の優先疾患である。異なる疾患の複合体であるリーシュマニア寄生虫は、内臓器官の致命的な感染と重度の皮膚病も引き起こす。リーシュマニア症の最も深刻な形態の１つは、鼻および口の外観を損なう感染である。リーシュマニア症の症例数が増えており、現在では多くの地域でコントロール不能になっている。リーシュマニア症は、一部の先進国でも、特にＨＩＶ感染の結果として南ヨーロッパで増加している。利用可能な薬剤は毒性があり、高価であり、長期の連日注射が必要である。
【０２８３】
リーシュマニアは、マクロファージまたは免疫系の白血球に生息する寄生原生動物である。地球の広い範囲に生息しているため、制御しにくい、小さな吸血昆虫（スナバエ）の噛み付きにより、寄生生物は伝播する。
【０２８４】
内臓リーシュマニア症は、この疾患の３つの発現の中で最も危険である。毎年、約５００，０００の内臓型（カラアザールまたは「致命的疾患」）の新規症例が生じていると推定されている。２億を超える人々に、現在、内臓リーシュマニア症に罹患するリスクがある。内臓リーシュマニア症の症例の９０％以上が、インド、バングラデシュ、スーダン、ブラジル、およびネパールで発生している。死亡のほとんどは小児で起こる。皮膚型を有する者は、しばしば回復不能に外見が損なわれる。
【０２８５】
リーシュマニア感染症は診断が困難であり、典型的には組織生検標本の組織病理学的分析を伴う。しかしながら、いくつかの血清学的および免疫学的診断アッセイが開発されている。（米国特許第７，００８，７７４号；Senaldi et al., (1996) J. Immunol.Methods 193:9 5; Zijlstra, et al., (1997) Trans.R. Soc.Trop.Med.Hyg.91:671 673；Badaro, et al., (1996) J. Inf.Dis.173:758 761；Choudhary, S., et al., (1992) J. Comm.Dis.24:32 36; Badaro, R., et al., (1986) Am. J. Trop.Med.Hyg.35:72 78；Choudhary, A., et al., (1990) Trans.R. Soc.Trop.Med.Hyg.84:363 366；およびReed, S. G., et al., (1990) Am. J. Trop.Med.Hyg.43:632 639）。プロマスチゴートは代謝産物を培養培地に放出して馴化培地を生じる。これらの代謝産物は、宿主に対して免疫原性である。Schnur, L. F., et al., (1972) lsrl.J. Med.Sci.8:932 942；Sergeiev, V. P., et al., (1969) Med.Parasitol.38:208 212；El-On, J., et al., (1979) Exper.Parasitol.47:254 269；Choudhary, A., et al., (1966) Trans.R. Soc.Trop.Med.Hyg.60:605 609；米国特許第６，８４６，６４８号、米国特許第５，９１２，１６６号；米国特許第５，７１９，２６３号；米国特許第５，４１１，８６５号を参照されたい。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のナノアラム粒子のいずれかを含んでなる組成物は、ＨＩＶの診断に有用な薬剤をさらに含んでなり、以下に記載の診断薬のいずれか１つを用いる。ウイルス培養、患者検体由来の決定的な塩基配列のＰＣＲ、および患者血清中の抗ＨＩＶ抗体の存在についての抗体試験を含む、ＨＩＶ感染を診断するための方法が公知である（例えば、米国特許第６，９７９，５３５号、第６，５４４，７２８号、第６，３１６，１８３号、第６，２６１，７６２号、第４，７４３，５４０号を参照）。
ＶＩ．キット
【０２８７】
また、特定の実施形態において、１つ以上の容器で提供され得る、ナノアラム粒子を含んでなる本明細書に記載の組成物を含んでなるキットも企図されている。一実施形態において、組成物の全ての成分が単一の容器に一緒に存在するが、実施形態は、これに限定されることを意図されておらず、例えば免疫アジュバント組成物が抗原成分から分離しており、抗原成分と接触していない２つ以上の容器も企図する。非限定的な理論として、いくつかの場合において、免疫アジュバント組成物のみの投与が有益に行われ得、一方、他の場合には、当該投与は、抗原の投与と時間的および／または空間的に（例えば、異なる解剖学的部位で）有益に分離され得、さらに他の場合において、本明細書に記載されており、かつ、抗原およびアジュバント組成物の両方と、必要に応じて他の本明細書に記載の成分も含有する、ワクチン組成物の対象への投与が、有益に実施されると考えられている。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、キットのバイアルは、ナノアラム粒子を含んでなる組成物を含んでなる。
【０２８９】
いくつかの実施形態において、キットの１つのバイアルは、ナノアラム粒子を含んでなる組成物を含んでなり、キットの第２のバイアルは生物活性剤を含む。いくつかの実施形態において、キットは、アジュバントを含む第３のバイアルを含んでなる。
【０２９０】
いくつかの実施形態において、キットの１つのバイアルは、ナノアラム粒子を含んでなる組成物を含んでなり、キットの第２のバイアルはアジュバントを含む。いくつかの実施形態において、キットは、生物活性剤を含む第３のバイアルを含んでなる。
【０２９１】
本開示のキットは、本明細書に記載の使用のための説明書またはバイアルに含まれる物質を混合するための説明書をさらに含んでなり得る。いくつかの実施形態において、バイアル中の物質は乾燥または凍結乾燥されている。いくつかの実施形態において、バイアル中の物質は液体である。
【０２９２】
このようなキットの実施形態に係る容器は、任意の好適な入れ物、容器、バイアル、アンプル、チューブ、カップ、ボックス、ボトル、フラスコ、ジャー、皿、単一ウェルもしくはマルチウェル装置のウェル、リザーバ、タンク、もしくは同種のもの、または本明細書に開示された組成物が置かれ、貯蔵され、および／もしくは運搬され、そしてアクセスされて内容物が除去され得る他の装置であり得る。典型的には、このような容器は、目的の用途に適合し、かつ含まれる内容物の回収が容易に達成され得る材料製であり得る。このような容器の非限定的な例には、針および注射器を使用して内容物を引き出すことに適合するゴム隔膜または他のシール手段を有するものを含む、ガラスおよび／またはプラスチックでシールされた、または再シール可能なチューブおよびアンプルが含まれる。このような容器は、例えば、容器から材料を効率的に回収することを可能にし、かつ／または、例えば紫外線もしくは極端な温度などの分解条件から、もしくは微生物夾雑物を含む望ましくない夾雑物の混入から物質を保護する材料で作られているか、または被覆されていてもよい、ガラスまたは化学的に適合するプラスチックもしくは樹脂でつくられていることがあり得る。容器は、好ましくは、無菌または滅菌可能であり、本明細書に記載のワクチン組成物および／または免疫アジュバント組成物および／または抗原および／または組み換え発現コンストラクトなどを懸濁または溶解させるために使用され得るものなどの任意の担体、賦形剤、溶媒、ビヒクル、または同種のものと適合する材料製である。
【０２９３】
以下の実施例は、例示のために提供されるものであって、限定のために提供されるものではない。
【実施例】
【０２９４】
実施例１  ＰＥＧおよびＰＡＡナノアラム製剤の製造
ナノアラム製剤の製造。水酸化アルミニウム２％またはＡｌ（ＯＨ）３、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム２％（Alhydrogel（登録商標）８５）を湿性ゲル懸濁液としてEM Sargeantから購入した。以下の脂質をCorden Pharma（スイスのリースタル）から購入した：ジステアロイルグリセロホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、Ｎ−カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０）−１．２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥ）、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ｍＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（ｍＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１．２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ）、およびＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００）−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ５０００−ＤＭＰＥ）。Alhydrogel（登録商標）「85」は、EM Sergeant Pulp and Chemical Company（ニュージャージー州クリフトン）から購入し、Brenntag（ドイツのミュールハイム・アン・デア・ルール）によって製造された。ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）はSigma Aldrichから購入した。
【０２９５】
ナノアラム製剤の製造。簡単に述べると、４０ｍｌのAlhydrogel（登録商標）（１０ｍｇ／ｍｌのアルミニウム）を６０ｍｌの水に希釈し、Crest Powersonic CP230D（ニュージャージー州トレントン）水浴中で約６０℃で２時間加熱することによって、ＰＥＧナノアラムを製造した。ＤＳＰＥまたはＰＥＧ化ＤＳＰＥリン脂質を、約０．５〜３０ｍｇ／ｍｌのリン脂質の範囲の指定濃度で、加熱したAlhydrogel（登録商標）溶液に添加した（表３）。全ての製剤を約６０℃の水浴に戻して、目に見えるリン脂質凝集物を溶解させた。処理中の温度上昇を防ぐために再循環冷却水を用いて、３０，０００ｐｓｉで最大１０通過で製剤を処理するために、ダイヤモンドＦ１２Ｙ相互作用チャンバーとそれに続くセラミックＨ３０Ｚ補助処理モジュールを備えたMicrofluidics M110P（マサチューセッツ州ニュートン）を使用した。５０μｌアリコートを、動的光散乱による粒径キャラクタリゼーションのために選択された通過の間で除去した。残りの製剤を１０回目の通過後に収集し、粒径をモニタリングするために安定性スケジュールに置いた。１１０Ｐマイクロフルイダイザーで製造された選択された製剤を、インビボ生物活性評価の前に０．２μｍ  Supor膜で濾過した。選択された製剤を、顕微溶液化の代わりに、Silverson高せん断ミキサー（マサチューセッツ州イースト・ロングメドー）を使用して、５分間、５０００ｒｐｍで処理した。
【０２９６】
ＰＡＡナノアラム製剤については、平均分子量が２０００のＰＡＡをSigma Aldrichから購入した。水中５０重量％の原液を水で希釈して水中３０重量％を得た。３０重量％のＰＡＡ１６ｇを１０ｍｇ／ｍｌのAlhydrogel（登録商標）原液１６０ｇと混合し、ｐＨを１０Ｍ  ＮａＯＨで６．６に調整した。１１０Ｐマイクロフルイダイザーを用いて、３０ｋ  ＰＳＩ、４℃で、１、３、６、１０、１５、または２０通過で製剤を処理した。
【０２９７】
ナノアラム製剤の粒子分析。製剤を、Malvern Instruments（イギリスのウスターシャー州）Zetasizer Nano-SまたはNano-ZSを用いる動的光散乱（ＤＬＳ）により、およびBeckman Coulter（カリフォルニア州ブレア）LS230を用いるレーザー回折粒子分析により、粒径についてキャラクタライズした。沈降分析およびｃｒｙｏＴＥＭにより、粒径情報も得られた（以下に記載）。ＤＬＳ分析のために、アラム製剤を１．５ｍｌポリスチレン使い捨てキュベット中で水で１：１００倍に希釈した。ＤＬＳ測定を三重に行い、その値を散乱強度に基づく平均粒径Ｚ−平均として報告した。ＤＬＳで実行されたサンプルを、６０および２００ｎｍのポリスチレン標準（ポリスチレン屈折率＝１．５５−１．５９）に対して測定した。アルミニウムは１．２４の屈折率を有する。レーザー回折に基づく測定のために、アラムサンプルを水充填サンプルチャンバーに直接入れ、５０％±５％の間の偏光散乱強度差計測（ＰＩＤＳ）値に達した。（レーザーがオフの間に回路の電圧を測定することによって電気的ノイズのベースラインを確立する）オフセットオプションを６０秒に、バックグラウンド測定を９０秒に、連続運転時間を９０秒間隔に、ポンプ速度を５０％に設定した。サンプル分析の前および間に、LS230の気泡を３回除去した。
【０２９８】
沈降分析。レーザー散乱光学プロファイリングは、波長４７０ｎｍ、６３０ｎｍ、および８７０ｎｍの３つのレーザーを備えたLUM GmbH（コロラド州ボルダー）LUMiReaderを用いて行った。粒子沈降速度は、サンプルキュベットの垂直断面からのレーザー光透過プロファイルの変化に基づいて測定した。未希釈製剤４ｍＬを分析のために円筒状ガラスセルに直接添加した。サンプルを２５℃で２〜４時間、３０°の最大傾斜角で測定し、６０秒ごとに測定スキャンを収集した。さらに、多波長分析法（２）に基づいて、粒子沈降速度を使用して約０．５μｍより大きな粒子の体積基準粒径分布を計算することができた。
【０２９９】
抗原吸着。ナノアラム製剤への抗原結合を、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイした。遠心分離の前に、サンプルを以下の順序：アラム製剤、ＴＬＲリガンド、抗原、および希釈剤（生理食塩水またはグリセロール溶液）で混合した。次いで、サンプルをBeckman Coulter（カリフォルニア州ブレア）Optima Max-XP Ultra Centrifugeで４℃、３５，０００×ｇで３０分間遠心分離した。３０μｌのサンプルを１０μｌの４Ｘ還元LDS Sample Bufferと混合し、続いて２０μｌを８μｌのSeeBlue2 Prestained Standardを含む１２レーンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。各ゲルを１９０Ｖで５５分間泳動し、次いで５０：４０：１０のＥｔＯＨ：ＣＨ３ＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏの定着液に最低２時間または一晩まで置いた。次いで、ゲルをSigma-Aldrich（ミズーリ州セントルイス）ProteoSilver Plus Silver Stain Kitによって提供された指示に従って染色した。
【０３００】
ＴＬＲリガンド吸着。ナノアラム製剤へのＴＬＲ−９リガンドの結合を、同じ遠心分離および希釈調製物、ゲル条件、ならびに染色キットを用いて、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってアッセイした。３〜６ｋＤａの範囲の暗褐色のバンドの存在は、ＴＬＲ−９リガンドがゲル上に存在することを示した。ナノアラム製剤へのＴＬＲ−４リガンドの結合を、ＴＬＲ−４リガンドをナノアラム製剤と遠心分離し、移動相Ａ（２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび１％酢酸を含む７５：１５：１０［ｖ：ｖ：ｖ］のメタノール：クロロホルム：水）へ１：５で希釈した非結合ＴＬＲ−４リガンドの存在について上清を試験することによって、アッセイした。各上清サンプルを、Agilent Model 1100 HPLC（カリフォルニア州サンタクララ）に取り付けたWaters Co.（マサチューセッツ州ミルフォード）Xbridge BEH Shielf RP18カラムに５０μｌ容量で注入した。移動相ＡおよびＢ（２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよび１％酢酸を含む１：１［ｖ：ｖ］のメタノール：クロロホルム）からなる勾配を２５分間かけて泳動させた。検出は、ESA Biosciences（マサチューセッツ州チェルムズフォード）Coronoa Charged Aerosol Detector (CAD)によって行った。定量化は、移動相Ｂに様々な容量で感染させたＧＬＡ標準を用いて、標準曲線を作成して行った。
【０３０１】
ＸＲＤ。Ｘ線粉末回折分析をTriclinic Labs（インディアナ州ウェストラフィエット）に送られた４つのサンプルについて行い、同じＰＥＧ化脂質／Alhydrogel（登録商標）組成物に対する様々な処理の効果を測定した。サンプルを超遠心分離し、まだ乾いていない固体および上澄み液のＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）分析を行った。Rigaku Smart-Lab  Ｘ線回折システム（テキサス州ウッドランズ）を、線源Ｘ線ビームを用いて反射型Bragg-Brentanoジオメトリ用に構成した。Ｓ線源は４０ｋＶおよび４４４ｍＡで作動させた銅の長いファインフォーカスチューブである。この線源は、高角度の狭い線から低角度の広い矩形に変化するサンプルの入射ビームプロファイルを与える。ビームコンディショニングスリットは、線のＸ線源に使用され、最大ビームサイズが線に沿っても線に垂直でも１０ｍｍ未満であることを保証する。Bragg-Brentanoジオメトリは、受動的拡散と受光スリットとによって制御され、サンプル自体がオプティクスの集光コンポーネントとして機能する、パラフォーカシングジオメトリである。Bragg-Brentanoジオメトリの固有の分解能は、回折計の半径と使用する受光スリットの幅によって部分的に制御される。通常、Rigaku Smart-Labを、ピーク幅が０．１°２θ以下になるように操作する。Ｘ線ビームの軸方向拡散は、入射および回折ビーム経路の両方において５．０°Sollerスリットによって制御される。軽い指圧を用いてサンプルを低バックグラウンドのシリコンホルダーに置き、サンプル表面を平らに、かつホルダーの基準面と同じ高さに保った。各サンプルを、毎分６°２θの連続スキャンを用いて２〜４０°２θで分析し、達成されたステップサイズは、０．０２°２θであった。各データセットを、低周波応答を除去するためにデジタルフィルタ処理した。得られたパターンを調べることにより、明らかに異なる２つの結晶応答：ガウス型ピークとローレンツ型ピークの同定が可能になった。ガウス型ピークは、通常、微結晶材料と関連し、結晶領域と非晶質領域の両方を含む材料を表すために使用される。ローレンツ型ピークは、通常、ナノ結晶材料と関連し、ナノメートルサイズの結晶を含む。
ナノアラム製剤のＣｒｙｏＥＭ分析
【０３０２】
ＣｒｙｏＥＭ分析は、NanoImaging Servicesによって実施された。簡単に述べると、ＥＭ分析のサンプルを、４００メッシュの銅グリッド上のホーリーカーボンフィルムによって支持されたガラス状の氷中に保存した。３μＬのサンプル懸濁液の滴を清浄なグリッドに滴下し、濾紙で吸い取り、直ちに液体エタン中でガラス化を進めることによって、各サンプルを調製した。グリッドを、イメージングのために電子顕微鏡に移動させるまで、液体窒素下で保存した。FEI Eagle  ４ｋ×４ｋ  ＣＣＤカメラを装備した１２０ｋｅＶで動作するFEI Tecnai T12電子顕微鏡を用いて、電子顕微鏡法を実施した。ガラス状の氷のグリッドを、−１７０℃以下の温度でグッドを維持するクライオステージを用いて電子顕微鏡に移動させた。各グリッドのイメージを試験片の全体的な分布を評価するために複数のスケールで取得した。より低い倍率でイメージングするのに潜在的に適した標的領域を特定した後、１１０，０００ｘ（０．１０ｎｍ／ピクセル）、５２，０００ｘ（０．２１ｎｍ／ピクセル）、および２１，０００ｘ（０．５０ｎｍ／ピクセル）の公称倍率で高倍率画像を取得した。−２μｍ（１１０，０００ｘ）、−３μｍ〜−２μｍ（５２，０００ｘ）、および−５μｍ（２１，０００ｘ）の公称アンダーフォーカス、ならびに約９〜４２ｅ／Å２の電子線量で画像を得た。
ナノアラム製剤の生成−サイジング剤の開発
ＰＥＧナノアラム−ＰＥＧ化リン脂質サイジング剤
【０３０３】
溶液中のオキシ水酸化アルミニウム（アラム）は、通常、より大きな典型的な結晶様配列またはシートに凝集する。未処理alhydrogel（登録商標）は、未処理アラム製剤中で１ミクロン以上の水酸化アルミニウム分子のより大きな典型的な結晶様配列またはシートを形成する。示されていないデータでは、種々の条件下での水酸化アルミニウム溶液単独の顕微溶液化による粉砕または処理がナノアラム製剤をもたらすかどうかを判定するために実験を行ったが、ストック水酸化アルミニウム単独の顕微溶液化が安定したナノアラム製剤をもたらす条件を決定することができなかった。
【０３０４】
理論に縛られることを望むものではないが、水酸化アルミニウム分子の凝集を防止または妨害するためにサイジング剤または安定化剤の添加が必要であることが、理論上想定された。リン脂質は、水溶液中の微細球の乳化剤および安定剤として通常添加され、サイジング剤として最初に選択される。アラム溶液の粉砕または処理中にリン脂質などのサイジング剤を含有させることによりナノアラム製剤を得ることができるかどうかを試験するために、初期実験を行った。実験は、それぞれ１８、１６、および１４個の炭素という異なるアシル鎖長を有する単一のリン脂質種ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、およびＤＭＰＥの包含について実施した。示されていないデータでは、試験したリン脂質は効果的なサイジング剤であるとは見出されず、アラム分子の凝集を防止しなかった。
【０３０５】
リン脂質に結合したポリエチレングリコール部分の添加が有効なサイジング剤を生じるかどうかを判定するために、さらなる実験を行った。サイジング剤を含めることがアラム分子の凝集を妨害してナノアラム製剤を製造することができるかどうかを評価するために、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ原液を３０ｋ  ＰＳＩで１０通過で顕微溶液化することにより粉砕し、ベンチトップを水酸化アルミニウム原液と直ちに混合して、８ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ：４ｍｇ／ｍｌ  Alhydrogel（登録商標）製剤を得た。混合し顕微溶液化したペグ化リン脂質：水酸化アルミニウム製剤のＣｒｙｏＥＭ分析は、水酸化アルミニウムを顕微溶液化したペグ化脂質と混合することが、アラムのより大きな結晶性凝集体の形成を妨害せず、ナノアラム製剤を生じないことを示した。
【０３０６】
後続の実験を実施して、ストックナノアラム製剤の粉砕または処理中にサイジング剤を添加することによって、ナノアラム製剤を製造することができるかどうかを判定した。粉砕またはサイジング処理中に様々な条件下でストックアラム製剤と混合した、様々なアシル鎖長を有する様々なリン脂質（それぞれ１８炭素、１６炭素、および１４炭素のアシル鎖長を有するＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ）に結合した様々な分子量の（７５０〜５０００ｋＤ  Ｍｒにわたる）ポリエチレングリコール部分を有するＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、およびＤＭＰＥペグ化リン脂質を評価するために一連の実験を行い、アラムの粉砕または処理中のサイジング剤の添加によりナノアラム製剤を製造することができるかどうかを判定した。Ｍａｌｖｅｒｎ分析およびｃｒｙｏＥＭ分析によって、製剤を粒径について分析した。ペグ化リン脂質などのサイジング剤の存在下でのアラムの粉砕または処理は、約４００〜７０ｎｍの範囲の粒径を有するナノアラム製剤を生じた（表４および示されていないデータ）。
【０３０７】
示されたデータの分析は、サイジング剤の存在下でアラムを粉砕するように使用された方法または条件が、様々な定められた粒径を有するナノアラム製剤を製造し得ることを示す。未処理のアラムは約１０００〜１０，０００ｎｍのサイズを有する（表４）。Silversonミキサーを用いて、５０００ｒｐｍで５分間、サイジング剤としての５０００ｋＤの分子量のＰＥＧ−ＤＳＰＥの存在下でアラムを混合すると（例えば、８ｍｇ：４ｍｇのサイジング剤：アラム）、約４００ｎｍの平均粒径を有するナノアラム製剤が生じる（表３および示されていないデータ）。約５０００ｋＤの分子量のＰＥＧ−ＤＳＰＥと混合したアラム（例えば、８ｍｇ：４ｍｇのサイジング剤：アラム）の１０ｋ  ＰＳＩで１回通過でので顕微溶液化は、約１２０〜１３０ｎｍの平均粒径を有するナノアラム製剤を生じる。混合したアラムの５０００ｋＤ分子量のＰＥＧ−ＤＳＰＥ溶液を６、１０、１５、または最大２０回の通過で処理すると、平均粒径７０ｎｍのナノアラム製剤が生じる（表３および示されていないデータ）。表４のデータおよび示されていないデータは、粉砕もしくはサイジング装置（例えば、シルバーソンミキサーもしくはマイクロフルイダイザー）、または粉砕条件（例えば、マイクロフルイダイザーでは、ＰＳＩもしくは通過数を変えることにより）を変えることにより、サイジング剤の存在下でのアラムの処理を変えることは、様々なナノ粒子サイズ（４００ｎｍ、１２０ｎｍ、７０ｎｍ）を有するナノアラム製剤を製造することができることを示している。示されたデータに基づき、当業者であれば、高エネルギー源または高エネルギー入力などの充分に認識された技術および装置を用いて、ペグ化脂質などのサイジング剤の存在下でアラムを粉砕または処理して、所望のサイズ範囲のナノアラム製剤を達成できる。
【０３０８】
表４のデータおよび示されていないデータのさらなる分析は、広範囲の分子量のＤＳＰＥリン脂質に結合したＰＥＧ部分が、有効なサイジング剤を生じることを示している。表４のデータおよび示されていないデータに実証されているように、７０ｎｍの粒径のナノアラム製剤を製造するように決められた粉砕条件下で粉砕した場合に、ＰＥＧ長を７５０から２０００から５０００ｋＤに変化させることは（表３および示されていないデータ）、ナノアラム製剤の粒径に影響を及ぼさなかった。したがって、本開示のペグ化リン脂質サイジング剤は、広範囲の分子量のポリエチレングリコール部分を含んでなることができる。
【０３０９】
アラム対ペグ化リン脂質サイジング剤の比を変化させることを、ナノアラム製剤の粒径を調節するために用いることができるかどうかを判定するために、実験を行った。
【０３１０】
表４に示されているデータは、サイジング剤対アラムの比を変化させることを、ナノアラム製剤の粒径に影響を及ぼすために使用できることを示している。例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００サイジング剤では、アラム対サイジング剤の比が１：１で、約３００〜４００ｎｍの平均粒径を有するナノアラムを再現可能に製造することができ、一方、サイジング剤を１：１．５または１：２に増加させると、それぞれ約１００ｎｍまたは７０〜８０ｎｍのナノアラムが再現可能に生じる。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００サイジング剤、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ−５０００またはＰＡＡ２００サイジング剤の比較は、１：２〜１：３の範囲のアラム対サイジング剤の最適比が、７０〜８０ｎｍアラムのナノアラムを再現可能に生じることを実証する。さらに、表４のデータおよび示されていないデータは、ペグ化リン脂質のアシル鎖長が、所望のサイズ範囲のナノアラムを生じさせるサイジング剤の能力に影響しなかったことを示している。アラム製剤と混合し、同じ方法により粉砕した場合、１８炭素（１８Ｃ  ＤＳＰＥ）、１６炭素（１６Ｃ  ＤＰＰＥ）、および１４炭素（１４Ｃ  ＤＭＰＥ）という様々なアシル鎖長のペグ化リン脂質は、全て、同じ粒径を有するナノアラム製剤を生じた（表４および示されていないデータ）。したがって、本開示のペグ化リン脂質サイジング剤は、様々なアシル鎖長を有するリン脂質を含んでなることができる。
濃ＨＣＬ、ＨＮＯ３、およびプロピオン酸によるｐＨの低下
【０３１１】
５分間の超音波処理による粉砕に付された場合、濃酸を用いるアラムのｐＨの劇的な低下は、本開示のナノアラム製剤を生じた。濃塩酸および硝酸の両方を添加して１．０の最終ｐＨを達成することを試験し、両方とも、高多分散性の３２４ｎｍ（データは示さず）のナノアラム製剤を生じた。したがって、濃酸溶液は、本開示の特定の態様用のナノアラム製剤を製造するためのサイジング剤として好適であり得る。しかしながら、ナノアラム製剤の最終ｐＨが１．０であることは、タンパク質、ペプチド、および核酸の送達を含む本開示の全ての態様にとっては有利ではない可能性があるため、より低い全ｐＨプロファイルを有する他の酸をさらに評価した。
【０３１２】
簡単に述べると、４ｍＭのオレイン酸を水と混合して３０ｍｌのエマルションを得た。この混合物を１０分間超音波プローブで（４０％出力で）処理した。等しい容積の１．６重量体積％（% volume by weight）のAlhydrogel（登録商標）原液を同量の乳化オレイン酸溶液と混合して、Alhydrogel（登録商標）：オレイン酸製剤０．８ｖ％：２ｍＭオレイン酸を得、これをさらに１０分間超音波プローブを用いて４０％出力でさらに超音波処理した。得られたナノアラムは、粒径が１９４ｎｍであり、最終ｐＨが２．４であった。したがって、特定の態様では、オレイン酸は、ナノアラム製剤用の好適なサイジング剤である。
【０３１３】
ｐＨが６．１、５．１、または４．５に調整されるまで、撹拌しながら、５％酢酸を添加して、上記のようにアラムを超音波処理した。サイジング剤としての酢酸は、約１００〜１３０ｎｍの平均粒径を有する有効なナノアラム製剤を生じた。さらに、製剤のナノ粒子は、ゼータ電位により測定して、正に帯電していた。したがって、本開示のいくつかの態様では、酢酸は、本開示のナノアラムを製造するための有効なサイジング剤であり得る。
ＰＡＡナノアラム−サイジング剤としてのポリアクリル酸（ＰＡＡ）
【０３１４】
初期実験では、０．４重量％のアラム４０ｇをＰＡＡの２０重量％溶液と強く攪拌しながら混合し、濃水酸化アンモニウムでｐＨ６．０にｐＨを調整し、約１４０ｎｍの粒径のナノアラムが得られ、ナノ粒子がゼータ電位で測定して負に帯電していたことにより、ナノアラムを製造するためのサイジング剤としてのＰＡＡの使用を評価した。
【０３１５】
後続の実験では、簡単に述べると、２０重量％のＰＡＡをアラム原液と混合し、ｐＨを水酸化ナトリウムで６．６に調整し、１１０Ｐマイクロフルイダイザーを用いて粉砕した。ＰＥＧナノアラム製剤の開発からのデータに基づいて、製剤を４℃再循環による顕微溶液化によって粉砕し、それぞれ３、６、１０、および１５通過で３０ｋ  ｐｓｉで評価した。３または６通過は、約１００ｎｍの粒径を有するナノアラムを生じ、３通過と６通過との間には、粒径に目立った効果は観察されなかった。通過数を１０から１５に増加させると、一貫して、約７０〜８５ｎｍの粒径および良好な多分散性のナノアラムを生じた。後続の実験では、１０通過を利用した。データは、ＰＡＡがナノアラム製剤用の有効なサイジング剤であることを示している。
ナノアラム製剤の安定性およびキャラクタリゼーション
【０３１６】
データは、ペグ化脂質およびポリアクリル酸などの好適なサイジング剤の存在下で粉砕することによって、ナノアラム製剤を得ることができることを示した。しかしながら、薬剤または生物製剤の送達製剤としての商業化のためには、製剤の望ましい特性は、粒径が経時的に安定であることである。７０ｎｍの初期粒径に粉砕した場合に、水性ＰＥＧナノアラムまたはＰＡＡナノアラム製剤が安定であり、かつ、初期粒径を維持するか、またはサイズが増大しないか、もしくは平均サイズ２００ｎｍを超えて凝集しないかどうかを判定するために、実験を行った。簡単に述べると、ＰＥＧナノアラム製剤およびＰＡＡナノアラムを上記のように調製し、示されるように４℃で保存した。調製から１週間、２週間、ならびに１、３、６、９、および１２カ月後に３つのサンプルを取り出し、本明細書に記載されているように粒径および多分散性について評価した。ＰＡＡナノアラム製剤についての図１Ｂのデータは、ＰＡＡナノアラム製剤が非常に安定であり、試験された１、３、および６ヶ月にわたって、ならびに１２ヶ月を超えて約７５ｎｍの平均粒径を維持することを示す（データは示さず）。同様に、１Ｃに示されたＰＥＧナノアラム製剤も著しく安定であり、Malvern Zetasizerを用いる動的光散乱によって測定した場合、１、３、６、９、および最大１２ヶ月の期間、約７５ｎｍの平均粒径を維持する。
【０３１７】
２〜８℃での長期安定性はワクチン製剤にとって重要な特性であるが、コールドチェーン保存の維持は、地球規模の保健のためのワクチン供給の制限要因となり得る。我々は、本開示のナノアラム製剤が、４週間の期間にわたり、ある範囲の温度（２５℃、３７℃、および６５℃）にわたって熱安定性であるかどうかを試験した。簡単に述べると、３つのサンプルを所望の温度で保存し、Malvern zetasizerを用いる動的光散乱によって測定した平均粒径および多分散性の変化についてアッセイした。我々は、ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ（１８炭素アシル鎖長）、ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ（１４炭素アシル鎖長）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ（１６炭素アシル鎖長）、ＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥ（１８炭素アシル鎖長）、およびＰＥＧ２００−ＤＳＰＥ（１８炭素アシル鎖長）を評価することにより、ＰＥＧ長およびアシル鎖長が水性ナノアラム製剤の熱安定性に及ぼし得る影響をさらに分析した。図１Ｄ〜Ｆのデータは、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥが、２５℃および３７℃までの温度で非常に安定であり、０、２、または４週間でほとんどもしくは全く凝集を示さないか、または粒径の変化がなく、６０℃においても、２週間まで安定であったことを示す。６０℃で４週間でも、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥナノアラム製剤は、粒径のわずかな増加しかを示さず、１１４ｎｍの平均粒径を依然として有し、サイジング剤を含むナノアラムがコールドチェーン保存を必要としない可能性を示した。ＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ（ＰＥＧ長５０００かつアシル鎖長１８Ｃ）、ＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ（ＰＥＧ長２０００かつアシル鎖長１６Ｃ）、およびＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥ（ＰＥＧ長７５０かつアシル鎖長１８Ｃ）のナノアラム製剤は、０、２、および４週間、２５℃および３７℃で、熱安定性を示したが、６０℃では熱不安定性であり、２および４週間で粒子凝集を示し、平均粒径は２０００ｎｍを超えた。興味深いことに、ナノアラム製剤ＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥ（ＰＥＧ長２０００かつアシル鎖長１４Ｃ）は、２５℃で４週間までの間と、３７℃で２週間の間、安定であったが、３７℃および６０℃では安定ではなく、粒子凝集を示し、平均粒径は２０００ｎｍを超えた。したがって、本開示のナノアラム製剤は、熱安定性の向上を示す。ナノアラム製剤の熱安定性は、専用のコールドチェーン保存なしで領域へのより広いグローバルアクセスを可能にするだけでなく、製剤の全体的なコストを低減させ得る。図の凡例において、ＱＧ１９４はＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥであり、ＱＧ１９５はＰＥＧ２０００−ＤＭＰＥであり、ＱＧ１９６はＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥであり、ＱＧ１９７はＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥであり、ＱＧ１９８はＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥである。
【０３１８】
ナノアラムの安定性をさらに評価するために、我々はアラムおよびナノアラム製剤のコロイド安定性に対する凍結融解サイクルの効果を評価した。製剤の凍結前の粒径は、アラム製剤についてはHoriba LA-960を用いて、ナノアラム製剤についてはMalvern Zetasizerを用いて測定した。製剤をドライアイス／アセトンバッチで凍結し、次いで３７℃の水浴中で融解した。粒径を測定し、凍結融解サイクルの前後で比較した。Alhydrogel（登録商標）８５（アラム）の平均粒径は、１回の凍結融解サイクルの後に１６０％増加し、コロイド安定性の損失を示した。（ナノアラム−ポリ（アクリル酸））の平均粒径は、３回の凍結融解サイクルの後に粒径の有意な変化を示さなかった。ナノアラム−ＰＥＧの平均粒径は、１回の凍結融解サイクルの後に２７３％増加し、コロイド安定性の損失を示した。Alhydrogel（登録商標）８５アジュバントは、１回の凍結融解サイクル後にコロイド的に不安定であり、凍結の不安定化効果に対する耐性が低いことを示唆する。一方、ポリ（アクリル酸）で安定化されたナノアラムは、凍結融解サイクルを繰り返した後に優れた安定性を示し、この安定性は、ナノアラム−ＰＡＡ製剤の長期間の凍結保存を容易にし得る。
【０３１９】
アラムは、（Ａｌ３＋イオンまたは負に帯電した対イオンを含む）静電相互作用［１１］、金属イオン配位ならびに水分子およびヒドロキシル基の水素結合［９］、［１０］、および［１２］、ならびに場合によっては疎水性相互作用［１３］により、タンパク質抗原に結合または吸着すると記載されている魅力的なアジュバントである。アラムのアジュバント特性にタンパク質吸着が必要とされる場合にその程度に関して、当分野で議論がある。我々は、アラムと比較して表面積および粒径がはるかに小さい本開示のナノアラムが、効率的に抗原を吸着するかどうかを試験した。簡単に述べると、遠心分離の前に、サンプルを以下の順序：アラム製剤、ＴＬＲリガンド（ＧＬＡまたはＣｐＧ  ５μｇ）、抗原（ＴＢ融合タンパク質ＩＤ９３（０．５μｇ））、および希釈剤（生理食塩水またはグリセロール溶液）で混合した。サンプルを３５，００００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、ペレット化していない上清からの３０μｌのサンプルを１０μｌの４Ｘ還元LDS Sample Bufferと混合した。２０μｌを、８μｌのSeeBlue2 Prestained Standardを含む１２レーンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。各ゲルを１９０Ｖで５５分間泳動し、次いで５０：４０：１０のＥｔＯＨ：ＣＨ３ＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏの定着液に最低２時間または一晩まで置いた。次いで、ProteoSilver Plus Silver Stain Kitでゲルを染色し、上清にＩＤ９３が存在するのか、またはアラムへの吸着によりペレット化したかを測定した。データは、ナノアラム製剤中に存在するサイジング剤が抗原またはアジュバントの結合または会合を妨害せず、本開示の生物活性剤の送達媒体として好適であることを実証した（データは示さず）。サイジング剤であるＰＥＧ−５０００  ＤＳＰＥがアラムへのタンパク質吸着を妨害しないこと、またはアッセイに通常干渉しないことを確認するために、ＩＤ９３融合タンパク質をＴＬＲ４アジュバント、ＧＬＡ、およびアラムと混合した。ゲル上に６２Ｋｄ  ＩＤ９３バンドが存在しないことから、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ５０００が、ミクロン（０．５〜１．０ミクロン）サイズのアラム粒子への抗原の吸着を遮断しないことが確認される。１８炭素（ＤＳＰＥ）、１６炭素（ＤＰＰＥ）、または１４炭素（ＤＭＰＥ）の様々なアシル鎖長のリン脂質に結合した、５０００、２０００、もしくは７５０の様々なＰＥＧ長、または２０００の一定のＰＥＧ長のサイジング剤ＰＥＧ  ＤＳＰＥを含有する粒径が１００ｎｍ未満の本開示のナノアラム製剤は、ゲル上に６２Ｋｄ  ＩＤ９３バンドが存在しないことによって示されるように、融合タンパク質ＩＤ９３を同等に吸着することができる（データは示さず）。したがって、ナノアラム製剤の平均表面積または粒径の減少は、タンパク質抗原の吸着の減少をもたらさず、ナノアラム製剤をワクチンに特に有用な製剤にする。
【０３２０】
我々は、次に、本開示のナノアラム粒子に存在する水酸化アルミニウムの濃度をキャラクタライズした。簡単に述べると、種々のＰＥＧ長（５０００、２０００、７５０）のサイジング剤、または様々なアシル鎖長（１８Ｃ−ＤＳＰＥ、１６Ｃ−ＤＰＰＥ、または１４Ｃ  ＤＭＰＥ）を有するリン脂質を含有するナノアラム製剤を、本明細書に記載のように処理し、アルミニウム含有量をＩＣＰ−ＯＥＳ試験によって評価した（図２）。図２のデータは、様々なサイジング剤を含んでなるナノアラム製剤が、様々なアシル鎖長のリン脂質に結合した様々なＰＥＧ長のＰＥＧサイジング剤で調製した場合の予測アラム含有量を含むことを示す。３０，０００ｐｓｉで、４℃、１０通過で顕微溶液化により粉砕した、ストック４ｍｇ／ｍｌアラム製剤と示されたサイジング剤から製造された、１８Ｃ（ＤＳＰＥ）のリン脂質と、５０００（サンプル１）、２０００（サンプル２〜４）、および７５０（サンプル５）の様々なＰＥＧ長とを有するサイジング剤からなるナノアラム製剤は、ＰＥＧ７５０−ＤＳＰＥ（サンプル５）についての３．９ｍｇ／ｍｌからＰＥＧ２０００−ＤＰＰＥ（サンプル３）についての４．５ｍｇ／ｍｌの範囲のＩＣＰ−ＯＥＳ試験による尺度として予測される４ｍｇ／ｍｌの初期値のほぼ等量を含有する。興味深いことに、サイジング剤の不存在下で粉砕されたアラムおよび未処理アラムの両方が、低下したアラム含有量を含んでいた（それぞれ、サンプル６では３．２ｍｇ／ｍｌ、サンプル７では３．４ｍｇ／ｍｌ）。
【０３２１】
データは、適当なサイジング剤の存在下での水酸化アルミニウム（Alhydrogel（登録商標））の処理または粉砕が、本開示の薬剤の送達に適した安定なナノアラム製剤を製造し得ることを示す。本開示のサイジング剤は、限定されないが、ペグ化リン脂質およびＰＡＡを含む。
実施例２：免疫応答を刺激するためのタンパク質またはペプチド（例えば、ＩＤ９７）の送達のためのＰＥＧ５０００およびＰＡＡナノアラム製剤の使用
【０３２２】
１００ｎｍのスケールでより小さいアラム粒子を生じる水酸化アルミニウム（Alhydrogel（登録商標））に対する修飾がＴｈ１に偏った免疫応答を促進する可能性を評価するために、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）をベースとするもの、およびＰＥＧ５０００をベースとするものという２種のナノアラムアジュバントを作製した。これらの候補のアジュバントポテンシャルを試験するために、我々は、The Jackson Laboratoryから購入した８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（１群あたり５匹）を、組み換え抗原ＩＤ９７−結核菌由来の４つのタンパク質の組み換え融合体：Ｒｖ１８８６、Ｒｖ３４７８、Ｒｖ３６１９、およびＲｖ２８７５で免疫した。ＩＤ９７を、単独で、またはアラム（１００μｇ）、ＰＡＡ、ナノアラムＰＡＡ１：１（アラム１００μｇ、粒径７０ｎｍ）、ナノアラムＰＥＧ（アラム１００μｇ、粒径７０ｎｍ）、もしくはＴｈ１誘発の陽性対照としてのＴＬＲ４アゴニストアジュバントＧＬＡ−ＳＥでアジュバント添加して送達した。マウスを筋肉内で一回免疫した。免疫化から７日後、我々は、GolgiインヒビターBrefeldin Aの存在下でＩＤ９７で脾細胞を刺激するか、または細胞を刺激しないでおくことにより、ＩＤ９７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を評価した。次いで、細胞を、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４４の表面発現、ならびにＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、およびＩＬ−１７Ａの細胞内発現について染色した。抗原特異的応答は、ＩＤ９７刺激サンプルで応答を生じているＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度から非刺激サンプルを差し引いたものとして計算した。図３Ａは、各群におけるＴｈ１応答の結果を示す。予想通り、アジュバント未添加、アラムアジュバント添加、およびＰＡＡアジュバント添加群は、ＣＤ１５４（抗原特異性のマーカーであるがＴｈ１、ＴＨ２、またはＴｈ１７のコミットメントには特異的でないマーカー）のリコール発現に基づいてＩＤ９７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が低いことを示す。驚くべきことに、ＰＡＡベースのナノアラムは、Ｔｈ１の顕著なサイトカインであるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＩＬ−２の産生により特徴付けられるロバストなＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発した。応答のレベルは、陽性対照アジュバントＧＬＡ−ＳＥで得られたレベルと同様であった。また、体液性応答の質は免疫化の７日後に評価した。ＰＡＡベースのナノアラムおよび陽性対照ＧＬＡ−ＳＥのみが、ＩＤ９７特異的ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ力価を増大させた（図３Ｂ〜Ｄ）。ＩｇＧ２ｃへのクラススイッチは、ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ１細胞の誘発によって影響を受けるので、このスキューイングは、Ｔｈ１応答を増大させるＰＡＡベースのナノアラムを支持する。驚くべきことに、ＰＡＡベースのナノアラムは、ＧＬＡ−ＳＥとは異なり、ＩｇＧ１抗体力価も促進し、特有の作用様式を有し得ることを示唆する。ＰＡＡナノアラムは、ＴＨ１応答をプログラムする特有で驚くべきアジュバント特性を有する。さらに、これらの応答は、それ自体がＴｈ１アジュバント活性を有していなかったので、単にＰＡＡ成分の特性ではない。
【０３２３】
ＰＡＡベースのナノアラムがワクチン抗原に対するＴｈ１免疫を増強する機構を解明するために、筋肉内免疫化の１日後に免疫したマウスの流入領域リンパ節における重要なＴｈ１増強サイトカインの濃度を評価した（図４Ａ〜Ｃ）。ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＬ−１８は、両方ともＩＦＮ−γを誘発するために重要であり、ＩＰ−１０は初期ＩＦＮ−γ誘発性サイトカインである。生理食塩水またはアラム免疫化と比較して、ＰＡＡベースのナノアラムは、免疫化の１日後にＩＬ−１８およびＩＬ−１２ｐ７０の両方の発現を増大させた。ＩＰ−１０発現もＰＡＡベースのナノアラムを与えられた動物で増加したので、ＰＡＡベースのナノアラムは、ＩＦＮ−γの初期発現をおそらく増大させた。ＰＥＧベースのナノアラムも、ＩＬ−１８を増加させたが、ＩＬ−１２ｐ７０またはＩＰ−１０の発現は、ＰＡＡベースのナノアラムの特有な特性をさらに示すことはなかった。この初期のＩＬ−１８誘発がＴｈ１プログラミングにとって重要であったかどうかを判定するために、野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびＩＬ−１８に感受性でないＩＬ−１８Ｒ−／−マウスにおけるＴｈ１ＣＤ４＋Ｔ細胞プロファイルを決定した。野生型マウスと比較して、ＰＡＡベースのナノアラムはＩＤ９７抗原に対するＴｈ１応答を誘発できなかった（図５）。
【０３２４】
まとめると、これらのデータは、ＰＡＡベースのナノアラムアジュバントおよび潜在的な他のナノ粒子アラムベースのアジュバントが、アラムと比較して特有のアジュバント特性を有するという知見を裏付ける。これらの特性には、具体的には、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２ｐ７０ならびにＩＰ−１０などのＩＦＮ−γ応答性サイトカインを含む、Ｔｈ１免疫をプログラムする先天性サイトカインの誘発が含まれる。さらに、アラムと比較して、ＰＡＡベースのナノアラムおよび潜在的な他のナノアラムは、Ｔｈ１プロファイル（抗原刺激時のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＩＬ−２分泌）を伴うＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発を増強し、ＩｇＧ２ｃクラススイッチおよび抗原特異的抗体力価を増大させる。これらのプロセスは、ＩＬ−１８：ＩＬ１８Ｒシグナル伝達軸の活性化に依存する。ワクチン抗原に対するＴｈ１応答の増強は、ＭＰＬ、ＧＬＡ、ＳＬＡ、ＣｐＧ、ポリＩＣ：ＬＣ、またはＰａｍ２ＣＳＫ４などの公知のトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストの包含に主に依存していた。我々の知る限り、これは、Ｔｈ１免疫をロバストに促進することができる第１の非ＴＬＲ含有アジュバントである。これには、百日咳、結核、ハンセン病、マラリア、ＨＩＶ、リーシュマニア症、およびインフルエンザなどの疾患に対するワクチンを含む、多くの潜在的なワクチンアジュバント用途がある。
【０３２５】
示されていないデータにおいて、ＴＢワクチン抗原ＩＤ９３を含むＰＡＡナノアラム製剤も、未処理アラムと比較して、Ｔｈ１型アジュバント活性の増強を示した。
実施例３．核酸薬剤を送達するためのＰＡＡナノアラム製剤の使用。
【０３２６】
本開示のナノアラムが安定性が向上しており、安価で、最終滅菌可能であり、大規模製造に適していることに基づいて、我々は、ナノアラム製剤がＲＮＡを効率的に送達することができるかどうかを評価した。我々は、当分野で記載されているカチオン性エマルションに対するナノアラム製剤の性能を基準に従って評価した。簡単に述べると、得られたエマルション０．５％ｗ／ｖｏｌ  Ｓｐａｎ８５，５．０％ｖ／ｖｏｌスクアレン、０．４％ｗ／ｖｏｌ  ＤＯＴＡＰ、および０．５％ｗ／ｖｏｌ  Ｔｗｅｅｎ８０を用いて、カチオン性エマルションを当分野で記載されているように（５）調製した。レプリコンＲＮＡは、カプシドおよびＥ糖タンパク質（Ｃ−Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１）を含む構造タンパク質が除去され、ルシフェラーゼ遺伝子で置換された改変アルファウイルスゲノム由来であった。簡単に述べると、ＲＮＡ発現ベクターは、カプシドおよびＥ糖タンパク質（Ｃ−Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１）を含む構造タンパク質を欠失しているが、細胞内のＲＮＡの複製および発現に必要な全ての非構造遺伝子（ｎｓ１〜ｎｓ５）を含む改変アルファウイルスゲノムから構築された、サブゲノムプロモーターによって駆動される、ルシフェラーゼを発現するレプリコンＲＮＡベクターであった。ＲＮＡレプリコンおよびＰＡＡナノアラムによって送達されるインビボのルシフェラーゼを分析するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスを麻酔し、剃毛し、２５０μｌの示された製剤プラスおよびマイナス示された用量のＲＮＡで大腿部に筋肉内（ｉ．ｍ．）で免疫した。ＲＮＡ用量（濃度）は、注射前にNanodrop分光光度計を用いる測定によって確認した。免疫したマウスを麻酔にかけ、剃毛し、注射後２４時間、４日、および７日に、IVIS Illumina II撮像装置を用いて６０秒間、ＲＮＡ発現を評価した。動物を画像化し、対数スケールでの相対発光単位を得た。本明細書の実施例は、ＰＡＡナノアラム製剤を利用して提示されるが、本明細書に開示されるナノアラムの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３２７】
ナノアラムで製剤化されたＲＮＡレプリコン発現ベクターで免疫したマウスは、インビボでＲＮＡを発現する。ナノアラムがＲＮＡを送達する能力を評価するために、本明細書に記載の２５０μｌの１：３ＰＡＡナノアラム製剤または対照カチオン性エマルション製剤、および１μｇまたは０．１μｇの用量のレプリコンＲＮＡを記載のようにマウスに注射した（１群あたり３匹のマウス）。対照は、３０μｇ、１μｇ、または０．１μｇの用量の生理食塩水ビヒクル、カチオン性エマルション、ＰＡＡナノアラム、または裸のレプリコンＲＮＡを含んでいた。非製剤化レプリコンＲＮＡ発現は、３０μｇのルシフェラーゼレプリコンＲＮＡの最高用量を受けた１匹の動物を除いて、２４時間で検出できなかった（データは示さず）。しかしながら、４日目および７日目まで、３０μｇの非製剤化ルシフェラーゼレプリコンＲＮＡベクターで免疫した全ての動物は、ビヒクル（生理食塩水）対照と比較して検出可能な発現を有した（データは示さず）。１μｇまたは０．１μｇの裸のレプリコンＲＮＡを受けた動物のいずれも、検出可能な発現を有していなかった。対照カチオン性エマルション製剤と混合されたＲＮＡの３０倍低用量（ＲＮＡレプリコン１μｇ）では、送達後２４時間、４日、または７日での３匹の全ての動物が検出可能なルシフェラーゼ発現を有し（データは示さず）、カチオン性エマルションが、ＲＮＡレプリコンの送達を増強し、非製剤化物質と比較してＲＮＡレプリコンの同等以上の発現を有するという効果によって定義される用量節約をもたらしたことを示す。ＰＡＡナノアラム製剤と混合された同じ３０倍低用量のＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン１μｇ）もまた、２４時間での３匹の動物のうち１匹、ならびに４日目および７日目それぞれでの全ての免疫した動物において、ルシフェラーゼ発現を示した（データは示さず）。対照カチオン性製剤と混合された３００倍低用量のＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン１００ｎｇ）では、２４時間での３匹中３匹の動物、および４日目または７日目での３匹中２匹の動物が検出可能なルシフェラーゼを発現した（データは示さず）。ＰＡＡナノアラム製剤と混合された３００倍低用量のＲＮＡ（ＲＮＡレプリコン１００ｎｇ）では、２４時間での３匹中１匹の動物、および４日目または７日目での３匹中２匹の動物が検出可能なルシフェラーゼを発現した（データは示さず）。
【０３２８】
上記の画像データを、Living ImageソフトウェアからのCircular ROIを介して定量化し、図６Ａ〜Ｃにグラフで示す。２４時間（図６Ａ）、４日（図６Ｂ）、および７日（図６Ｃ）での相対発光データを、対数スケールで、製剤により（それぞれ左端、中央、および右端のペインに非製剤化、対照カチオン性エマルション、およびＰＡＡナノアラム）、および送達したレプリコンベクターの用量により（それぞれ０μｇ（ｍｃｇ）、１μｇ（ｍｃｇ）、および０．１μｇ（ｍｃｇ））、グループ化して表した。データは、注射後２４時間で、非製剤化ＲＮＡ（３０μｇ）より３０倍および３００倍低い用量（１または０．１μｇ）でカチオン性エマルションと混合されたＲＮＡレプリコンが、非製剤化ＲＮＡと同等の発現を示したことを示す。２４時間で、非製剤化ＲＮＡ（３０μｇ）より３０倍および３００倍低い同じ用量（１または０．１μｇ）で、ＰＡＡナノアラム製剤化レプリコンＲＮＡは、カチオン性エマルションと比較して、より低い発現を示した（図６Ａ）が、注射後４日目および７日目までに、対照カチオン性エマルションまたはＰＡＡナノアラムのいずれかと混合されたＲＮＡは、１μｇ（ｍｃｇ）および０．１μｇ（ｍｃｇ）用量の両方でほぼ同等の発現を示す（図６Ｂおよび６Ｃ）。データは、ＰＡＡナノアラム製剤がレプリコンＲＮＡベクターの送達および発現が可能であり、非製剤化ＲＮＡと比較して用量節約特性を有することを示す。
【０３２９】
我々は、次に、ナノアラム製剤中のサイジング剤ＰＡＡがＲＮＡレプリコンベクターの送達または発現に影響を与えるか否かを試験した（図７）。ＰＡＡのみがＲＮＡレプリコンベクターからのルシフェラーゼ発現の原因であるか否かを判定するために、非製剤化ＲＮＡレプリコン（７Ａ）、ＰＡＡ単独プラスＲＮＡレプリコン（７Ｂ）、対照カチオン性エマルションプラスＲＮＡレプリコン（７Ｃ）、またはＰＡＡナノアラムプラスＲＮＡレプリコン（７Ｄ）で、非製剤化レプリコンについて３０μｇ、または製剤化ＲＮＡレプリコンについて１μｇおよび１００ｎｇの用量で、マウスを免疫した。ルシフェラーゼ発現を、IVIS Illumina II撮像装置を用いて評価し、画像データを、注射後２４時間で、記載されているように、Circular ROIにより定量化した。データは、ＰＡＡ単独（７Ｂ）は、０．１または１．０μｇの用量で、発現可能なレベルのＲＮＡレプリコンを送達および／または誘発しないが、対照カチオン性エマルションまたはＰＡＡナノアラムのいずれかと製剤化または混合された同じ用量のＲＮＡレプリコンは、非製剤化ＲＮＡレプリコンの３０〜３００倍高い送達とほぼ同等のレベルで検出可能なルシフェラーゼ発現を示すことを示している。データは、サイジング剤単独であるＰＡＡが、ＲＮＡレプリコンからの発現可能なレベルのタンパク質を送達および／または誘発することができないことを示す。
【０３３０】
以前の実験は、本開示のナノアラム製剤が、裸のＲＮＡレプリコンと比較して、発現可能であるＲＮＡレプリコンを送達することができ、用量節約特性を呈することを実証した。我々は次に、ナノアラム製剤がメッセンジャーＲＮＡを効率的に送達できるか否かを判定した（図８）。このことを試験するために、我々は、完全に処理された成熟ｍＲＮＡ（Ｌｕｃ  ｍＲＮＡ）を模倣する、哺乳動物系に最適化され、プソイドウリジンおよび５−メチルシチジンで修飾された、キャップが付加され（Ｃａｐ０）ポリアデニル化されたｍＲＮＡ  ＦＬｕｃ  ｍＲＮＡをTrilink Biotechnologiesから購入した。ｍＲＮＡは、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）というホタルからもともと単離された、ルシフェラーゼタンパク質を発現する。簡単に述べると、非製剤化ＲＮＡ、ＰＡＡナノアラムと製剤化されたｍＲＮＡ、または対照カチオン性エマルションと製剤化されたｍＲＮＡで、１０μｇ、１μｇ、もしくは０．１μｇのＲＮＡ用量で、記載したように、マウス（１群あたり３匹）を免疫した。６時間、２４時間（図８Ａ）、および５日（図８Ｂ）でIVIS Illumina II撮像装置を用いてＲＮＡ発現を評価し、画像化したデータを、Circular ROIにより定量化した。注射から２４時間後での図８Ａのデータは、非製剤化ｍＲＮＡ（左群）を受けた動物が、１０μｇおよび１μｇのｍＲＮＡ用量レベルの両方で検出可能なルシフェラーゼ発現を有したが、０．１μｇでは発現を有しなかったことを示す。しかしながら、対照カチオン性製剤およびＰＡＡナノアラム製剤（図８Ａ中央および右端の群）は両方、互いに比較した場合、全ての用量（１０μｇ、１μｇ、および０．１μｇ）で等しいレベルのｍＲＮＡを発現するだけでなく、それらはまた、非製剤化ｍＲＮＡと比較して、１μｇ用量で発現レベルの増加（＞３０倍）を示し、０．１μｇのＲＮＡ用量で検出可能なレベルの発現を有し、ナノアラム製剤の用量節約特性を実証する。注射後５日目（図８Ｂ）では、非製剤化ｍＲＮＡは、低レベルではあるが１０μｇＲＮＡ用量でＬＵＣの検出可能な発現を示すが、１μｇおよび０．１μｇのより低い用量ではルシフェラーゼｍＲＮＡ発現は検出されない。興味深いことに、注射後５日目の対照カチオン性製剤化ｍＲＮＡを受けたマウスは、送達された用量１０μｇ、１μｇ、０．１μｇ（左群および中央）のいずれでも、ｍＲＮＡの検出可能な発現を示さない。しかしながら、ＰＡＡナノアラム製剤化ｍＲＮＡ（右端群）を受けたマウスは、１０μｇ用量で＞１０倍高いレベルのｍＲＮＡを発現するだけでなく、１μｇ用量でも検出可能な発現を示し、ｍＲＮＡの送達後５日目でもナノアラム製剤の用量節約特性を示す。次に、我々は、インビボでの送達の６時間後、２４時間後、および５日後での、１０μｇ用量のｍＲＮＡで、非製剤化、カチオン性エマルション製剤化、またはＰＡＡナノアラム製剤化ｍＲＮＡを受けた動物の発現動態を比較した（図８Ｃ）。データは、ナノアラム製剤で製剤化されたｍＲＮＡで免疫された動物では、発現が急速に減少した非製剤化ｍＲＮＡ（●）または対照カチオン性エマルション製剤化ｍＲＮＡ（Δ）と比較して、５日間にわたってｍＲＮＡの発現レベルが増加し、比較的一定であった（□）ことを示す。
【０３３１】
対照カチオン性リポソームによって送達された場合、５日目までのｍＲＮＡ発現の発現の低下が文献に報告されており、予想外ではなかったが、非製剤化ｍＲＮＡまたはナノアラム製剤化ｍＲＮＡの持続的発現は、驚くべきことであり、興味深いことに、５日目で、依然として、１０倍の用量節約効果が観察された。１０μｇ用量の相対的発現レベルは、ナノアラム製剤化ｍＲＮＡについての１μｇ  ＲＮＡ用量とほぼ同等であった。理論に縛られることを望むものではないが、我々は、本開示のナノアラム製剤はｍＲＮＡコンストラクトを安定化し得ると仮説した。
【０３３２】
本開示のナノアラムと製剤化されたｍＲＮＡのインビボ発現の驚くべき安定性に基づいて、我々は、本開示のナノアラムがインビトロでＲＮＡを安定化するかどうかをさらに調べた。このことを試験するために、我々は、１μｇのＲＮＡレプリコンを対照カチオン性またはＰＡＡ製剤と混合し、この混合物を４℃で１時間、４時間、または２４時間、単一バイアル調製物として保存した。４℃で１時間、４時間、または２４時間保存した非製剤化レプリコンＲＮＡは、対照として役立った。次いで、これらの混合した単一バイアル製剤を用いてマウス（１群あたり３匹）を免疫し、インビボ送達後１日（図９Ａ）および５日（図９Ｂ）に、IVIS Illumina II撮像装置を用いてＲＮＡ発現を評価し、データをCircular ROIにより定量化した。データは、混合後４時間または２４時間４℃で保存し、インビボ送達の２４時間後または５日後にアッセイしたときに、非製剤化ＲＮＡレプリコンが検出可能な発現を有しなかったことを示す。しかしながら、非製剤化、カチオン性リポソーム製剤化、またはＰＡＡナノアラム製剤化ＲＮＡレプリコンを、４℃で保存後直ちに（時間０）または１時間後に投与した場合に、インビボ送達の２４時間後または５日後にアッセイしたときに、検出可能な発現は示されなかった。文献に報告されているように、ＲＮＡの相対的不安定性に起因して、４℃で４時間または２４時間保存した場合、非製剤化ＲＮＡは検出可能な発現を有しなかった。非製剤化ＲＮＡレプリコンのデータと対照カチオン性またはナノアラム製剤化ＲＮＡレプリコンのデータとを比較すると、ＲＮＡレプリコンは、インビボ投与前に４℃で１時間、４時間、または２４時間、単一バイアルとして混合して保存した場合、１日目（図９Ａ）または５日目（図９Ｂ）に測定して、ほぼ同等の発現を示した。我々は、対照カチオン性製剤、ＰＡＡナノアラム、および非製剤化レプリコンＲＮＡそれぞれについてのデータを直接比較する、散布図（図９Ｃ〜Ｅ）を分析することによって、データをさらに分析した。レプリコンＲＮＡとの混合直後に投与した場合（Ｔ＝０，９Ｃ）、４℃で混合および保存した４時間後に投与した場合（Ｔ＝１ｈ，９Ｄ）、または４℃で２４時間混合および保存して投与した場合（Ｔ＝２４ｈ，９Ｅ）、ＲＮＡは、投与後５日目で同等レベルの発現を有し、４℃で２４時間まで単一バイアル製剤として混合した場合に、ナノアラム製剤化ＲＮＡが安定であることが示された。
【０３３３】
本明細書に提示された実施例においてＲＮＡコードレポーター遺伝子を使用して、我々は、以下を実証した：（１）本開示のナノアラムは、インビボで発現可能な形態のポリヌクレオチド剤および具体的にはＲＮＡ剤の送達が可能であり、送達されるＲＮＡ形態は、ｍＲＮＡまたは発現ベクターＲＮＡコンストラクトである；（２）ナノアラム製剤は、ＲＮＡベクターの用量節約送達を可能にし、このことは、ナノアラム製剤では、ＲＮＡの同等の発現が、非製剤化ＲＮＡより３０〜３００倍以上低いＲＮＡの用量で達成されることを意味する；ならびに（３）本開示のナノアラム製剤は、インビボおよびインビトロの両方でＲＮＡ剤の安定性を増強する。ＲＮＡのナノ製剤送達の特性を開発しキャラクタライズして、我々は、宿主における免疫応答の刺激をもたらすＲＮＡを送達するナノアラム製剤の能力を評価した。
【０３３４】
本実施形態のナノアラム製剤によって送達されるＲＮＡ抗原の能力を評価するために、我々は、本開示のナノアラムと製剤化されたＥＭＣＨ融合ポリペプチドを発現するＲＮＡレプリコンで免疫したマウスにおける免疫応答を分析した。
【０３３５】
ＥＭＣＨ融合ポリペプチドの構築。ＥＭＣＨと呼ばれる融合ポリペプチドは、推定ミトコンドリアＨＳＰ７０（８Ｅまたは８）ポリペプチドのカルボキシル末端の断片の５’末端に付加されたメチオニン開始コドン（ＡＴＧ）をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム、リンゴ酸脱水素酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのカルボキシル末端断片、システインプロテイナーゼＢポリペプチド（ＣｐＢ、ＣＰＢ、またはＣ）のカルボキシル末端断片、およびヒストンＨ２ＢＮポリペプチド（Ｈ２ＢＮ、ｈ２Ｂｎ、またはＨ）のアミノ末端の断片をコードするポリヌクレオチドのオープンリーディングフレームのタンデム結合によって得られる。ＥＭＣＨは、Ｌ．  ｉｎｆａｎｔｕｍ由来の推定ミトコンドリアＨＳＰ７０（８Ｅまたは８）ポリペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸５０９〜６６０をコードする２，６３１のポリヌクレオチド配列、Ｌ．  ｉｎｆａｎｔｕｍ由来のリンゴ酸脱水素酵素遺伝子のカルボキシ末端のアミノ酸１〜３２２をコードする４６０〜１４２５、システインプロテイナーゼＢポリペプチド（Ｂ）のカルボキシル末端断片のアミノ酸１５４〜４４３をコードするポリヌクレオチド１４２６〜２２９５、およびＬ．  ｉｎｆａｎｔｕｍ由来のヒストンＨ２ＢＮ（Ｈ）ポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸１〜１１１をコードするポリヌクレオチド２２９７〜２６３１を有する。８７７アミノ酸融合ポリペプチドを大腸菌で発現させ、カラムクロマトグラフィーにより精製した。核酸成分ならびに製造方法および使用方法は、ＷＯ２０１４／１６０９８５に、より充分に記載されており、全ての目的のためにその全体で参照により本明細書に援用される。
【０３３６】
簡単に述べると、非製剤化の裸のＲＮＡ対照、対照カチオン性リポソームと混合したＲＮＡレプリコン、またはＲＮＡ  ＰＡＡナノアラム製剤と混合したＲＮＡレプリコンのいずれかとしての、リーシュマニア融合ＲＮＡポリヌクレオチドＥＭＣＨをコードするアルファウイルスＲＮＡレプリコンベクター１０μｇまたは０．１μｇで、時間０で、マウスを免疫し、全ての群を３週間後に追加免疫した。脾細胞を回収し、最後の追加免疫の４週間後にＥＭＣＨポリペプチドでインビボで刺激した後の細胞内サイトカイン染色によって測定したリコール抗原特異的Ｔ細胞応答について分析した。免疫したマウス脾細胞からのサイトカイン産生を、フローサイトメトリーで測定したＥＭＣＨ特異的ＣＤ４４ｈｉ  ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞について分析した。抗原刺激された脾細胞を、ＣＤ３およびＣＤ４発現に基づく細胞内サイトカイン染色によって同定し、さらにＣＤ４４高細胞上でゲーティングした。ＣＤ４４高ＣＤ４＋Ｔ細胞を、細胞内ＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ２、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−５についてさらに染色した。ＥＭＣＨ特異的ＣＤ４４高ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γに対して陽性の多機能性Ｔ細胞応答を示し、抗原特異的リーシュマニア応答に典型的なＴＮＦαおよびＩＬ−２データ（１０Ａ〜Ｄ）は、対照カチオン性リポソームまたはＰＡＡナノアラムで製剤化された１００倍低い用量のＥＭＣＨ  ＲＮＡ，０．１μｇでの免疫化が、ＣＤ４＋  ＣＤ４４高ＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、またはＴＮＦα単一陽性サイトカイン染色Ｔ細胞を１０μｇの非製剤化ＲＮＡとほぼ同等のパーセンテージ生じさせることを示す。０．１μｇ用量の非製剤化ＲＮＡレプリコンは、検出可能な染色をほとんどまたは全く示さない。したがって、本開示のナノアラム製剤は、ワクチン接種を受けた宿主において免疫応答を刺激するワクチン製剤として、病原体の抗原をコードするＲＮＡを送達することができる。
【０３３７】
我々は、本開示のナノアラムと製剤化されて送達された場合、ＲＮＡベクターによって発現されるリーシュマニアポリペプチドに対する免疫応答の質をさらにキャラクタライズした。防御的リーシュマニア症免疫応答の特徴には、複数のサイトカインを分泌する多機能性抗原特異的Ｔ細胞の存在が含まれる。我々は、ＣＤ４＋  ＣＤ４４高Ｔ細胞を、多機能性Ｔ細胞応答について分析した。データ（図１０Ｅ）は、ＰＡＡナノアラムで製剤化された（斜線の棒）、または対照カチオン性エマルションで製剤化された（対角斜線の棒）１００ｎｇのＥＭＣＨ  ＲＮＡレプリコンで免疫されたマウスが、１０μｇの非製剤化ＲＮＡ（黒く塗りつぶされた棒）で免疫された動物と比較して同数の三重陽性ＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦα  ＣＤ４＋  ＣＤ４４高Ｔ細胞を有した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２またはＩＬ−２およびＴＮＦαを発現する二重陽性細胞も存在した。データは、ＰＡＡナノアラム製剤が、ワクチン特有の関連する抗原特異的免疫応答を発生させるのに充分なレベルで充分に発現されるＲＮＡを送達することができることを示している。
実施例４．免疫応答を刺激するためのタンパク質またはペプチド（ＩＤ９３）送達用ＰＥＧナノアラム製剤（様々な長さのＰＥＧ）の使用
【０３３８】
本開示のナノアラム製剤が、タンパク質またはポリペプチド剤を単独で、または他の薬剤（具体的にはＴＬＲアゴニスト）と組み合わせて送達して、宿主における免疫応答を刺激することができるかどうかを試験するために、実験を行った。
【０３３９】
動物モデル。簡単に述べると、実験動物および６〜８週齢の雌のＣＢ５７ＢＬ／６マウスをThe Jackson LaboratoryまたはCharles Riverから購入し、特定の病原体のない状態（Specific Pathogen Free conditions）で維持した。
【０３４０】
ＩＤ９３は、以前に記載されているように［１４］産生された４つの結核菌ペプチドＲｖ１８１３、Ｒｖ２６２０、およびＲｖ２６０８、およびＲｖ３６１９を組み込んだ融合タンパク質である。
【０３４１】
治療レジメンあたり４〜５匹の動物から脾細胞を単離した。Red Blood Cell Lysis Buffer（eBioscience）を用いて赤血球を溶解し、ＲＰＭＩ１６４０，１０％ＦＢＳに再懸濁した。PCAシステム（Guava Technologies）でViaCountアッセイを用いて全生存細胞を数え、９６ウェルプレートに２×１０６細胞／ウェルで播種し、培地またはＩＤ９３（１０μｇ／ｍＬ）で３７℃で２時間刺激した。GolgiPlug（BD Biosciences）を添加し、細胞を３７℃でさらに８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７）、およびＣＤ８（クローン５３−６．７）に対する蛍光色素標識抗体（BioLegendおよびeBioscience）で、抗マウスＣＤ１６／３２の存在下、４℃で２０分間表面染色した。細胞を洗浄し、室温で２０分間Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）で透過処理した。細胞をPerm/Wash（BD Biosciences）で２回洗浄し、ＣＤ１５４（クローンＭＲ１）ＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ−１．２）、ＴＮＦ（ＭＰ６−ＸＴ２２）、ＧＭ−ＣＳＦ（ＭＰ１−２２Ｅ９）、ＩＬ−１７Ａ（クローンＴＣ１１−１８Ｈ１０）、およびＩＬ−５（ＴＲＦＫ５）に対する蛍光色素標識抗体（BioLegendおよびeBioscience）で、室温で２０分間細胞内染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。４つのレーザーLSR Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences）で最大１０６のイベントを収集した。一重項＞リンパ球＞ＣＤ４＋ＣＤ８−＞ＣＤ４４ｈｉ＞サイトカイン陽性として細胞をゲーティングした。ＩＤ９３特異的応答頻度は、マッチしたサンプル中のＩＤ９３刺激細胞から未刺激細胞の応答陽性の頻度を差し引くことによって求めた。
抗体応答
【０３４２】
マウス血清を、眼窩後血液をマイクロティナ血清採取チューブ（ペンシルベニア州ウエストチェスターのVWR International）に採取し、続いて１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して調製した。次いで、各血清サンプルを抗体捕捉ＥＬＩＳＡによって分析した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレート（ニューヨーク州ロチェスターのNunc）を０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液中の２μｇ／ｍｌ組み換え抗原ＩＤ９３でコーティングし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックした。次いで、連続した順序で、かつ、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後に、連続希釈した血清サンプル、抗マウスＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ−ＨＲＰ（全てアラバマ州バーミングハムのSouthern Biotech）、およびＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２（メリーランド州ゲイザースバーグのKirkegaard and Perry Laboratories）をプレートに添加した。プレートを４０５ｎｍ（ELX808，バーモント州ウィヌースキーの Bio-Tek Instruments Inc）で分析した。Prismソフトウェア（GraphPad Software, Inc.）を用いて中点力価を計算し、最小二乗適合法を用いてＳ字形用量反応曲線を求めた。
【０３４３】
結核菌モデルで以前に公表されたデータは、ＧＬＡ／ＳＥと製剤化された融合ポリペプチドＩＤ９３で免疫化したマウスが、Ｔｈ１偏性応答を示す、より大きなＩＤ−９３特異的ＩｇＧ２ｃ応答を誘発することを示した（Baldwin 2012）。公表されたデータはまた、アラム製剤が、しかしながら、より大きなＩｇＧ１抗体応答によって示される、より大きなＴｈ２応答を通常誘発することも示している。我々は、ナノアラム製剤の平均粒径の変化が、ＩＤ９３融合ポリペプチドに対して発生する免疫応答の質に影響を及ぼすかどうかを評価した。これを評価するために、対照製剤となる１００μｇのミクロンアラム（例えば、市販されている未処理アラム）と混合された０．５μｇＩＤ９３、または１００μｇナノアラム製剤（得られる製剤が４００ｎｍ、１３０ｎｍ、または７５ｎｍの平均粒径を有するように粉砕されたサイジング剤としてのＰＥＧ  ５０００−ＤＳＰＥ）と混合された０．５μｇのＩＤ９３、プラスまたはマイナス５μｇのＴＬＲ４アゴニストＳＬＡで、ゼロ日目に、四頭筋の筋肉内で、動物を免疫した。免疫後２１日目に、動物から採血し、血清を回収し、記載したようにＩＤ９３特異的抗体応答について分析した。２１日目のＩＤ９３特異的ＩｇＧ１（図１１Ａ）およびＩｇＧ２ｃ（図１１Ｂ）の抗体中点力価は、我々がこれまでに記載しているように、ＳＬＡ−ＳＥ製剤と混合したＩＤ９３で免疫した動物がＩＤ９３特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃ抗体力価の両方を生じ、Ｔｈ１応答を示すＩｇＧ２ｃ力価がわずかに上昇したことを示す。予想通りに、ＩＤ９３融合ポリペプチド単独でのマウスの免疫化は、測定可能なＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｃ抗体力価をもたらさなかった。１〜１０ミクロンの粒径を有するアラム製剤による免疫化は、文献で予測されているように、高ＩｇＧ１抗体価および低力価ＩｇＧ２ｃ力価によって示されるＴｈ２応答に対する顕著な偏りを示した。これらの対照を、実施例１に記載のように方法を変化させることによって（５０００ｒｐｍで５分間のシルバーソン混合、１０ｋ  ＰＳＩで１通過での、または３０ｋ  ＰＳＩで１０通過での顕微溶液化）粉砕またはサイジングして、それぞれ４００ｎｍ、１３０ｎｍ、または７５ｎｍの粒径のナノアラムを生じさせた、サイジング剤としてのＰＥＧ−５０００  ＤＳＰＥを含んでなるＰＥＧナノアラム製剤と比較した。データ（図１１Ａ）は、４００ｎｍのＰＥＧナノアラム製剤が未処理のアルミニウム製剤と同じエンドポイントＩｇＧ１力価を誘発することを示す。１３０ｎｍおよび７５ｎｍの粒径のＰＥＧナノアラム製剤はまた、アラムまたは４００ｎｍの粒径のＰＥＧナノアラムと比較してほぼ半減するが、高い２１日目のＩｇＧ１中点力価を生じた。データは、試験したＰＥＧナノアラム製剤のいずれも、免疫したマウスにおいて測定可能なＩｇＧ２ｃ  ＩＤ９３抗体力価をもたらさなかったことを示す。混合されたナノアラム製剤へのＴＬＲ４アゴニストの添加が、ＩｇＧ２ｃによって測定されるＴｈ１応答を生じるように応答に偏りを生じさせることができるかどうかを判定するために、マウスをＴＬＲ４アゴニスト、ＳＬＡプラスＩＤ９３抗原、およびＰＥＧナノアラム製剤でも免疫した。データは、ＴＬＲ４アゴニスト���ＬＡをアラム製剤または４００ｎｍの粒径のＰＥＧナノアラム製剤と混合することには、ＩＤ９３特異的ＩｇＧ１応答の中点力価に対して、無視できるほどの影響しかなかったが、ＳＬＡを１３０ｎｍまたは７５ｎｍの粒径のＰＥＧナノアラムと混合することには、中点ＩＤ９３特異的ＩｇＧ１応答を増加させる傾向があった。同様に、ＩＤ９３抗原特異的ＩｇＧ２ｃの２１日目の中点力価を分析する図１１Ｂに示されたデータは、ＳＬＡが存在しないＩＤ９３／ＰＥＧナノアラムで免疫した動物で検出可能な力価がないことに比べて、ＳＬＡを４００ｎｍ、１３０ｎｍ、または７５ｎｍの粒径のＰＥＧナノアラム製剤に添加した場合に、ＩＤ９３  ＩｇＧ２ｃ力価が誘発されることを示した。データは、ＰＥＧナノアラムがＴｈ２偏性免疫応答を誘発することができるが、１３０ｎｍ以下の粒径を有するＰＥＧナノアラム製剤は、アラムまたは４００ｎｍ  ＰＥＧナノアラムと比較して、ほぼ半減したＩＤ９３  ＩｇＧ１力価を有することを示す。興味深いことに、ＴＬＲ４アゴニストであるＳＬＡの添加は、従来のアラム製剤に匹敵する程度のＴｈ２偏性応答をほぼ回復させた。さらに、ＩＤ９３特異的ＩｇＧ２ｃ抗体力価は、ＩＤ９３ＰＥＧナノアラムで免疫したマウスでは検出されなかったが、ＩＤ９３／ＰＥＧナノアラムワクチン組成物にＴＬＲ４アゴニストであるＳＬＡを添加すると、ＩｇＧ２ｃの産生がもたらされ、ＳＬＡによりＴｈ１への応答の偏りがいくらか生じたことが示された。
【０３４４】
様々なアシル鎖長のリン脂質に連結されたＰＥＧ長が異なる、または同じＰＥＧ長のＰＥＧ化リン脂質サイジング剤を含んでなり、ＴＢ融合ペプチドＩＤ９３プラスＴＬＲ４アゴニストＳＬＡと混合されたＰＥＧナノアラム製剤で免疫されたマウスは、抗原特異的免疫応答を誘発する。表５は、ＰＥＧ−５０００  ＤＳＰＥ（粉砕または処理なし）とベンチ混合した（bench mixed）１００μｇの従来の１〜１０μｍの粒径のアラム製剤プラス５μｇのＴＬＲ４アゴニストＳＬＡへの０．５μｇの融合タンパク質ＩＤ９３の吸着を、０．５μｇの融合タンパク質ＩＤ９３プラス５μｇのＳＬＡに吸着された５０００、２０００、または７５０の異なるＰＥＧ長を有するサイジング剤ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含んでなるナノアラム製剤、ならびに２０００の所定のＰＥＧ長を有するＰＥＧ化リン脂質サイジング剤と１８炭素（ＤＳＰＥ）、１６炭素（ＤＰＰＥ）、および１４炭素（ＤＭＰＥ）という異なるアシル鎖長のリン脂質とを含有するナノアラム製剤の顕微溶液化と比較する実験群の表を表す。
【表５】
2019521960.tif 000022
【０３４５】
５０００、２０００、または７５０のＰＥＧ長および約７０ｎｍの粒径を有する１００μｇのＰＥＧナノアラム製剤（サイジング剤としてＰＥＧ−ＤＳＰＥ）に吸着された５μｇの用量のＴＬＲアゴニストＳＬＡおよび０．５μｇのＩＤ９３融合タンパク質で免疫したマウス、２１日目に中点力価として測定される、ＩＤ９３抗原特異的ＩｇＧ１抗体力価を誘発する。図１２Ａは、従来の１〜１０μｍの粒径のアラム製剤、および５０００、２０００、もしくは７５０のＰＥＧ長または１８（ＤＳＰＥ）もしくは１６（ＤＰＰＥ）炭素のアシル鎖長のリン脂質に結合した２０００のＰＥＧ長を有するサイジング剤ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含んでなる７０ｎｍのナノアラム製剤で免疫したマウスにおいて、同等のＩｇＧ１力価が誘発されることを示す。１４炭素のアシル鎖長（ＤＭＰＥ）および２０００のＰＥＧ長を有するリン脂質を有するナノアラム製剤は、他のナノアラム製剤と比較して約半分に減少したＩｇＧ１力価を有する。図１２Ｂは、０．５μｇＩＤ９３プラス５μｇのＴＬＲ４アゴニストＳＬＡに吸着させた、５０００、２０００、もしくは７５０のＰＥＧ長または１８（ＤＳＰＥ）もしくは１６（ＤＰＰＥ）のアシル鎖長のリン脂質に結合した２０００のＰＥＧ長を有するサイジング剤ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含んでなる１００μｇの用量の７０ｎｍの粒径のナノアラム製剤が、Ｔｈ１偏性を示す抗原特異的ＩｇＧ２ｃ抗体力価を誘発するが、応答は１〜１０μｍの粒径のアラム製剤で見られる応答の約半分であることを示す。１４炭素のアシル鎖長（ＤＭＰＥ）および２０００のＰＥＧ長を有するリン脂質を有するナノアラム製剤は、感知され得るＩＤ９３  ＩｇＧ２ｃを示さない。図１２Ｃは、ＩＤ９３ナノアラム製剤が抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を誘発することを示す。免疫したマウスからのサイトカイン産生を、フローサイトメトリーで測定したＩＤ９３特異的ＣＤ４４ｈｉ  ＣＤ４＋記憶Ｔ細胞について分析した。GolgiStopの存在下で１２時間ＩＤ９３で刺激したワクチン接種マウス由来の脾細胞とＩＤ９３刺激脾細胞とを、ＣＤ３およびＣＤ４発現に基づく細胞内サイトカイン染色によって同定し、さらに、ＣＤ４４高細胞でゲーティングした。ＣＤ４４高ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、細胞内ＣＤ１５４、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１７、およびＩＬ−５についてさらに染色した。ＩＤ９３特異的ＣＤ４４高  ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、抗原特異的ＩＤ９３応答に典型的なＴＮＦαおよびＩＬ−５について陽性の多機能性Ｔ細胞応答を示し、これらのナノアラムがＩＤ９３抗原に対するＴｈ１免疫を誘発するためのＴＬＲ４アゴニストＳＬＡの有効なビヒクルであり得ることを実証した。
実施例４：キトサン−、デキストラン−、およびポリ（アリルアミン）−ナノアラム製剤の製造
【０３４６】
アルミニウム含有アジュバントは、１９２０年代半ばからヒトおよび動物に投与されてきた。アラムという用語は、ワクチンに使用されるアルミニウム系アジュバントを一般的に分類するために広く使用されているが、化学的にはこれらは、主に、オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯ（ＯＨ））またはリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）ｘ（ＰＯ４）ｙとも呼ばれるＡｌＰＯ４）である。ＡｌＯ（ＯＨ）はそのＸ線回折（ＸＲＤ）パターンから明らかなように結晶性が悪いが、結晶構造は擬ベーマイトであり、安定なコランダム（α−Ａｌ２Ｏ３）相の多くの準安定相の１つである。ＡｌＯ（ＯＨ）の表面はカチオン性であり、したがってアニオン性抗原の吸着に最も適している。ＴＥＭイメージングは、懸濁液中で５〜１０ミクロンの広い粒径分布を有する凝集体を形成する、４．５×２．２×１０ｎｍの算出平均寸法を有する繊維状ナノ粒子を示す。リン酸アルミニウムは、その名称に反して、非化学量論量のリン酸塩および水酸化物対イオンの両方を含み、正味の負の（アニオン性）表面電荷を有し、そのため、カチオン性抗原の吸着に最も適している。ＡｌＯ（ＯＨ）とは異なり、リン酸アルミニウムは、Ｘ線に対して無水であり、中央径約４μｍの緩やかな凝集体を形成する約５０ｎｍの円盤状粒子からなる。本明細書には、市販のミクロンサイズのアラム（例えば、Alhydrogel（登録商標）またはAdjuPhos（登録商標））を出発物質として用い、安定化剤の存在下で顕微溶液化して製造されるアルミニウム系ナノ粒子アジュバント（ナノアラム）の実施例が記載されている。
【０３４７】
AdjuPhos（登録商標）（Ａｌ（ＯＨ）ｘ（ＰＯ４）ｙ）アジュバントを用いるナノアラム−キトサン：以下は、アラム前駆体としてAdjuPhos（登録商標）、安定化剤として７５〜８５％の脱アセチル化度（ＤＤ）を有する低分子量キトサン（２５℃での１％酢酸中の１重量％溶液の２０〜３００ｃＰの粘度に基づく５０，０００〜１９０，０００Ｄａ）を使用する、ナノアラム合成の一般的方法を記載する。
【表６】
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【０３４８】
AdjuPhos（登録商標）アジュバント濃度（５ｍｇＡｌ／ｍｌで１０ｍｌ；５０ｍｇ  Ａｌ）を一定に保ち、様々な量のキトサンで安定化させた。混合する前に、所定のキトサンを、ｐＨ＝５．４の穏やかな酸性の０．１２Ｍ酢酸ナトリウム／０．０２Ｍ酢酸緩衝液４０ｍｌに溶解した。完全に溶解した後、キトサン溶液（４０ｍｌ）を１０ｍｌのAdjuPhos（登録商標）（５０ｍｇのアルミニウム）と混合し、シルバーソン高せん断ミキサーで５，０００ｒｐｍで５分間混合し、次いでＬＭ２０高せん断マイクロフルイダイザー（Microfluidics）で３０，０００ｐｓｉで２２の別個の通過で顕微溶液化した。顕微溶液化物質は、目視では濁っていたが、半透明であった。キトサンで安定化された様々なAdjuphos（登録商標）由来のナノアラムの組成を、以下の表６に示す。流体力学的直径は、図１３Ａに示すように、通過の数と共に減少した。同じホモジナイゼーションプロセスでは、流体力学的直径は、キトサン画分の増加とともに低下する傾向であった（１３Ｂ）。平均して、ナノアラム−キトサン製剤のゼータ電位は＋２０ｍＶであった。
表６．出発物質としてAdjuphos（登録商標）、安定剤として低分子量キトサン（約１２０，０００Ｄａ、最低８５％ＤＤ）を用いて製造されたナノアラムの組成。
【表７】
2019521960.tif 000024
【０３４９】
Alhydrogel（登録商標）（ＡｌＯ（ＯＨ））アジュバントを用いるナノアラム−デキストラン−以下は、アラム前駆体としてAlhydrogel（登録商標）、安定化剤として硫酸デキストラン（４０，０００Ｄａ）を使用してナノアラムを合成するための一般的方法を記載する。
【表８】
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【０３５０】
Alhydrogel（登録商標）アジュバント濃度（１０ｍｇＡｌ／ｍｌで１０ｍｌ；１００ｍｇ  アルミニウム）を一定に保ち、様々な量の硫酸デキストランで安定化させた。混合する前に、所定の硫酸デキストランを４０ｍｌの脱イオン水に溶解した。１０ｍｌのAlhydrogel（登録商標）（１００ｍｇ  Ａｌ）を４０ｍｌの硫酸デキストラン溶液に添加し、シルバーソン高せん断ミキサーで５，０００ｒｐｍで５分間混合し、次いでＬＭ２０高せん断マイクロフルイダイザー（Microfluidics）で３０，０００ｐｓｉで１５の別個の通過で顕微溶液化した。顕微溶液化物質は透明から半透明であり、２００ｎｍのＰＥＳ膜で滅菌濾過した。硫酸デキストランで安定化された様々なAlhydrogel（登録商標）由来のナノアラムの組成を、以下の表７に示す。流体力学的直径は、図１４Ａに示すように、通過の数と共に減少した。平均して、ナノアラム−デキストラン製剤のゼータ電位は−４０ｍＶであった。この報告書の時点で入手可能な粒子安定性データは、ナノアラム−デキストラン（例として示されたロットＱＧ７７４）のサイズにおいて、製造日から３ヶ月後まで有意な変化を示さない（図１４Ｂ）。
表７．出発アラム物質としてAlhydrogel、安定化剤として硫酸デキストラン（４０ｋＤａ）を使用して製造したナノアラムの組成
【表９】
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【０３５１】
Alhydrogel（登録商標）（ＡｌＯ（ＯＨ））アジュバントを用いるナノアラム−キトサン。以下は、アラム前駆体としてAlhydrogel（登録商標）、安定化剤としてキトサン（１５，０００Ｄａ、最低８５％ＤＤ）を使用してナノアラムを合成するための一般的方法を記載する。
【表１０】
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【０３５２】
天然alhydrogel（ＡｌＯ（ＯＨ））はカチオン性表面電荷を有し、したがって同様にカチオン性であるキトサンを静電的にはね返す。Alhydrogel（登録商標）にキトサンを吸着させるためには、Alhydrogel（登録商標）はリン酸リガンド交換による表面改質を受けなければならない。リン酸交換のために、Alhydrogel（登録商標）（１０ｍｇ  Ａｌ／ｍｌ）を１０ｘ  ＰＢＳと１：２体積比で混合し、オービタルシェーカーで３７℃で２４〜４８時間反応させた。リン酸交換したAlhydrogel（登録商標）（ＰＥ−Alhydrogel（登録商標））を２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、透明な上清をデカントした。次いで、ペレット化ＰＥ−Alhydrogel（登録商標）を脱イオン水に分散させ、遠心分離−デカント工程を３回繰り返してリン酸緩衝液を洗い流した。最後に洗浄したＰＥ−Alhydrogel（登録商標）ペレットを１０ｍｇ  Ａｌ／ｍｌの濃度で脱イオン水に分散させ、室温で保存した。リン酸交換の前と後のAlhydrogel（登録商標）のゼータ電位測定により、表面電荷がカチオン性からアニオン性に成功裏に変換されたことが確認された（図１５Ａ）。ＰＥ−Alhydrogel（登録商標）と混合するための原液として、１％ｖ／ｖ酢酸中の２％ｗ／ｖキトサン溶液を調製した。１０ｍｌのＰＥ−Alhydrogel（登録商標）（１００ｍｇ  Ａｌ）を、脱イオン水で２％キトサン原液を希釈することによって調製した様々な量のキトサンと混合した。混合条件の例を表８に挙げる。
表８．ＰＥ−Alhydrogel（登録商標）とキトサンとの混合条件の例。
【表１１】
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【０３５３】
ＰＥ−Alhydrogel（登録商標）とキトサンとの混合物各５０ｍｌをシルバーソン高せん断ミキサーで５，０００ｒｐｍで５分間ホモジナイズし、次にＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Microfluidics）を用いて３０，０００ｐｓｉで、連続モードで、１１０ｍｌ／分で５分間顕微溶液化した。顕微溶液化された物質は乳白色であり、ほぼ透明であった。合成されたロット例の組成を表９に示す。ＤＬＳからの予め濾過したナノアラム−キトサン物質の粒径を図１５Ｂに示す。概して、Ｚ平均直径は使用したキトサンの量と正の相関があった。製剤を、濾過が可能な場合には、２００ｎｍのＰＥＳ膜でろ過し、４℃で保存した。平均して、ナノアラム−キトサン製剤のゼータ電位は＋２０ｍＶであった。
表９．キトサン（１５ｋＤａ、最低８５％ＤＤ）で安定化されたAlhydrogel（登録商標）由来のナノアラムの組成。
【表１２】
2019521960.tif 000029
【０３５４】
ｚ平均流体力学的直径は経時的に増加するが、使用されるキトサンの量に依存して、約３００〜５００ｎｍでプラトーになる。第２に、サイズ増加の速度は温度依存性であり、サイズはより高い温度でより急速に増加する。これは、サイズ増加が吸熱であり、エントロピーの増加によって潜在的に引き起こされることを示唆する。
【０３５５】
Alhydrogel（登録商標）（ＡｌＯ（ＯＨ））アジュバントを用いるナノアラム−ポリ（アリルアミン）−以下は、アラム前駆体としてAlhydrogel（登録商標）、安定化剤としてポリ（アリルアミン）（１５，０００Ｄａ）を使用してナノアラムを合成するための一般的方法を記載する。
【表１３】
2019521960.tif 000030
【０３５６】
天然Alhydrogel（登録商標）（ＡｌＯ（ＯＨ））はカチオン性表面電荷を有し、したがって同様にカチオン性であるポリ（アリルアミン）を静電的にはね返す。Alhydrogel（登録商標）にポリ（アリルアミン）を吸着させるためには、Alhydrogel（登録商標）はリン酸リガンド交換による表面改質を受けなければならない。リン酸交換のために、Alhydrogel（登録商標）（１０ｍｇ  Ａｌ／ｍｌ）を１０ｘ  ＰＢＳと１：２体積比で混合し、オービタルシェーカーで３７℃で２４〜４８時間反応させた。リン酸交換したAlhydrogel（登録商標）（ＰＥ−Alhydrogel（登録商標））を２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、透明な上清をデカントした。次いで、ペレット化ＰＥ−Alhydrogel（登録商標）を脱イオン水に分散させ、遠心分離−デカント工程を３回繰り返してリン酸緩衝液を洗い流した。最後に洗浄したＰＥ−alhydrogel（登録商標）ペレットを１０ｍｇ  Ａｌ／ｍｌの濃度で脱イオン水に分散させ、室温で保存した。リン酸塩交換の前と後のAlhydrogel（登録商標）のゼータ電位測定により、表面電荷がカチオン性からアニオン性に成功裏に変換されたことが確認された。ポリ（アリルアミン）で安定化したナノアラムを合成するために、１０ｍｌのＰＥ−alhydrogel（１００ｍｇ  Ａｌ）を様々な量の１５％ｗ／ｖのポリ（アリルアミン）と混合した。混合比の例を表１０に要約する。ポリ（アリルアミン）の遊離塩基形態を使用したので、ＰＥ−alhydrogelとポリ（アリルアミン）との混合物のｐＨは８〜１１であり、したがって６Ｍ  ＨＣｌを用いて７に調整する必要があった。
表１０．ポリ（アリルアミン）で安定化されたAlhydrogel（登録商標）由来のナノアラムを調製するために使用される混合比の例。
【表１４】
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【０３５７】
安定なナノアラムを製造するために、ＰＥ−Alhydrogel（登録商標）とポリ（アリルアミン）との混合物をシルバーソン高せん断ミキサーを用いて５，０００ｒｐｍで５分間混合し、次いでＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Microfluidics）を用いて３０，０００ｐｓｉで、１１０ｍｌ／分で５分間顕微溶液化した。顕微溶液化物質はほぼ透明であり、２００ｎｍのＰＥＳ膜で滅菌濾過した。図１６に示すナノアラムの粒径は、ポリ（アリルアミン）含量とともに増加した。平均して、ナノアラム−ポリ（アリルアミン）製剤のゼータ電位は約＋２０ｍＶであった。調製したナノアラム−ポリ（アリルアミン）製剤例の組成を表１１に示す。
表１１．ポリ（アリルアミン）で安定化されたAlhydrogel（登録商標）由来のナノアラム製剤の例
【表１５】
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【０３５８】
ＲＮＡベースのワクチンを製剤化するためのナノアラム−ポリ（アリルアミン）−ＲＮＡと複合体を形成するナノアラム−ポリ（アリルアミン）の適合性を評価するために、我々は、ジカ抗原をコードする１０ｋｂの自己複製ＲＮＡ１μｇを、１ｍｇ／ｍｌ（ロットＱＧ８６０）、２ｍｇ／ｍｌ（ロットＱＧ８５９）、または２０ｍｇ／ｍｌ（ロットＱＧ８５４）ポリ（アリルアミン）を含有する希釈ナノアラム−ポリ（アリルアミン）製剤と混合した。裸のＲＮＡ対照と共に、ナノアラム複合体化ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡに結合する各製剤の能力および負荷能力を評価するために、ゲル遅延度アッセイ（ＧＲＡ）でアッセイした。ＱＧ８５９（２ｍｇ／ｍｌの未希釈ポリ（アリルアミン））は１／２００希釈（０．０１ｍｇ／ｍｌのポリ（アリルアミン））で１００％のＲＮＡに結合した。同様に、ＱＧ８６０（１ｍｇ／ｍｌの未希釈ポリ（アリルアミン））は１／１００希釈（０．０１ｍｇ／ｍｌのポリ（アリルアミン））で１００％のＲＮＡに結合した。両方の製剤は、ポリ（アリルアミン）の量と相関する同様の結合特性を示した。一方、ＱＧ８５４（２０ｍｇ／ｍｌの未希釈ポリ（アリルアミン））は１／４０００希釈（０．００５ｍｇ／ｍｌのポリ（アリルアミン））でも、ほぼ１００％のＲＮＡに結合した。
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2019521960.tif 000039
【図４−１】
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【図４−２】
2019521960.tif 000041
【図５】
2019521960.tif 000042
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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2019521960.tif 000058
2019521960.tif 000059
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