(57)【要約】  本発明は、循環核酸を不活性化するのに好適なポリペプチドが固定された固相を含む、血液を処置するためのデバイスに関する。好適なポリペプチドは、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼまたはシトシンデアミナーゼである。さらに、本発明は、慢性腎不全、がんまたはエリテマトーデスに罹患している患者を処置するためのこのようなデバイスの使用、ならびに循環核酸が体外で不活性化される、血液を処置するための方法およびシステムを含む。
2019504737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を処置するためのデバイスであって、
（ａ）全血または血漿を患者から流出させ、患者に流入させるための管、および
（ｂ）遊離核酸の不活性化に適しているポリペプチドが固定された固相
を含むデバイス。
【請求項２】
（ｃ）透析器または血液濾過器をさらに含む、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
ポリペプチドが、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドリボヌクレアーゼ、エキソリボヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ活性を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
ポリペプチドが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）またはメチルトランスフェラーゼ活性を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項５】
ポリペプチドが、シトシンデアミナーゼ活性を有する、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項６】
固相が、分析器または血液濾過器の上流にある、請求項２から５のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項７】
固相が、透析器または血液濾過器内に位置する、請求項２から５のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項８】
（ｄ）血漿フィルターをさらに含む、請求項１から７のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項９】
ポリペプチドが固定された固相が、中空糸膜、ビーズまたは不織布を含む、請求項１から８のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項１０】
不活性化される遊離核酸が、炎症作用を有する、請求項１から９のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項１１】
不活性化される遊離核酸が、ヒトゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）またはｍＲＮＡからなる群から選択される、請求項１から１０のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項１２】
不活性化される遊離核酸が、細菌またはウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される、請求項１から１０のうちの１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
遊離核酸を不活性化することによる、慢性腎不全、がんまたはエリテマトーデスに罹患している患者の炎症促進状態の処置のための、請求項１から１２のうちの１項に記載のデバイスの使用。
【請求項１４】
遊離核酸が体の外で不活性化される、血液の処置のための方法。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１から１２のうちの１項に記載のデバイスを準備するステップ、および
（ｉｉ）固相上に固定したポリペプチドによって、遊離核酸を不活性化することができる条件下で、患者の全血または血漿をデバイスを通して運ぶステップ
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉａ）全血から血漿を濾過するステップ
をさらに含む、請求項１４または１５のうちの１項に記載の方法。
【請求項１７】
不活性化された遊離核酸が、透析によって全血または血漿から除去される、請求項１４から１６のうちの１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１２のうちの１項に記載のデバイスを含有する体外循環を含む、血液の処置のためのシステム。
【請求項１９】
遊離核酸を不活性化することによる、慢性腎不全、がんまたはエリテマトーデスに罹患している患者の炎症促進状態の処置のための、請求項１８に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遊離核酸の不活性化のためにポリペプチドが固定された固相を含む、血液の処置のためのデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液透析または腹膜透析方法による処置を受けている患者は、通常の集団と比較して、ＮＦκＢシグナル伝達経路を介して放出される炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＩＬ−１βなどのレベルが上昇している。根本的原因については様々な説明がある。いかなる場合にも、これらの催炎物質の濃度の増加は、慢性的な透析の場合には、患者の低い生存性に結び付くものであり（Panichi V., Paoletti S. et al. Inflammatory pattern in hemodiafiltration. Contrib. Nephrol. 2008; 161: 185-190）、根本的なシグナル伝達カスケードの誘導を病原学的に抑制する必要性が存在するとの結果をもたらす。炎症性サイトカインの放出が抑制されることが可能であれば、患者の生存の見込みが増大する。
炎症性サイトカインの誘導および放出について多くの知られている原因のうちの１つは、血液中を遊離して循環するＤＮＡと、ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）構造を認識する受容体との間の接触である。ＰＡＭＰを検出する関連ＰＲＲ（パターン認識受容体）タンパク質は、病原体の基本構造を認識し、免疫系を活性化するために対応するシグナルを発する受容体分子の系統的に古い不均一系である。
【０００３】
したがって、例えば、グラム陰性細菌から放出されるリポ多糖（ＬＰＳ、同意語：エンドトキシン）は、最も少ない量であっても、全血と接触すると、炎症性サイトカインの放出を誘導する。エンドトキシンの生物学的に活性なリピドＡ部分の認識は、微細構造が異なるが様々な種の細菌のリピドＡ構造を認識することができるＴＬＲ−４（トール様受容体）を介して引き起こされる（Medzhitov R. M., Janeway C. Innate Immunity. N. Engl. J. Med. 2000; 338: 338-344）。
さらに、細菌細胞上に存在するホスホリルコリン基は、ヒト血液のＣ反応性タンパク質によって認識される。下流の補体に媒介される活性化手順によって、この場合、炎症性サイトカインも放出される（Tillet, W. S., Francis T. J. Serological reactions in pneumonia with a non-protein somatic fraction of pneumococcus. J. Exp. Med. 1930; 52: 561-585、Black S., Kushner I. et al. C-reactive protein. J. Biol. Chem. 2004; 279: 48487-48490）。
【０００４】
名称ＴＬＲ−９を有する別のＰＲＲは、ＤＮＡの認識について記載されている（Chi H., Flavell R. A. Innate recognition of non-self nucleid acids. Genome Biol. 2008; 9:211）。ＴＬＲ−９が細菌のＤＮＡを認識し、細菌のＤＮＡによって活性化されることが以前に示された。しかしながら、人体の内因性ＤＮＡに対するＴＬＲ−９の反応は未だ知られておらず、その理由として、細菌のＤＮＡ断片による透析液の汚染について、専門家の間で議論された（Kwan B. C. H., Chow K. M. et al. Effect of using ultrapure dialysate for hemodialysis on the level of circulating bacterial fragment in renal failure patients. Nephron. Clin. Pract. 2013; 123: 246-253、Schindler, R., Beck W. et al. Short bacterial DNA fragments: detection in the dialysate and induction of cytokines. J. Am. Soc. Nephrol. 2004; 15: 3207-3214）。
しかしながら、ＣＫＤ患者の血液中に存在する遊離アポトーシス細胞のＤＮＡ量が増加していることも知られていた。ＤＮＡの正確な発生源およびその放出機序は、未だ決定されていない。遊離して循環する核酸は、通常のヒトの血液中でも検出されうるため（Tamkovich, S. N., Bryzgunova, O. E. et al. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors. Clin. Chem. 2005; 7: 1317-1319）、ＣＫＤ患者では、アポトーシスが増加するために、形成率の増加を呈するのか、またはここで、ＤＮＡの分解が阻害されるのかのいずれかの可能性が存在する。特に、患者の尿毒症の代謝状態の結果として、デオキシリボヌクレアーゼ、すなわち、正確には、ＤＮＡの分解を担う酵素の活性を阻害する物質が形成される可能性がある。最近、この遊離ＤＮＡが、炎症性サイトカインの放出を担うことを示すことができた（Atamaniuk J., Kopechky C. et al. Apoptotic cell-free DNA promotes inflammation in haemodialysis patients. Nephrol. Dial. Transplant. 2011; 0:1-4）。
【０００５】
遊離ＤＮＡの発生源についての参照文献は、心血管研究の分野でも見出される。ここで、その発生源は、サイトカイン誘導を担うアポトーシス細胞の分解プロセス由来のヒトゲノムＤＮＡではなく、細胞内に局在するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）であることが証明された（Oka T., Hikoso S.et al. Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure. Nature. 2012; 485: 251-255）。同様に、このことは、ＣＫＤ患者の血液中において、細菌のＤＮＡ断片だけがサイトカイン誘導を担うのではなく、血液中に少なくとも部分的に遊離形態で存在するすべてのヒトのミトコンドリアＤＮＡもサイトカイン誘導を担うということを意味する。系統学的理由（共生説）として、ミトコンドリアＤＮＡは、細菌のＤＮＡと同様に、統計的に過小評価されたＣｐＧジヌクレオチド（さらに、ゲノムＤＮＡと比較して、ほんのわずかな程度にしかメチル化されない）を有する。ＰＡＭＰ（非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド）へのこの類似性のために、したがって、遊離して循環するミトコンドリアＤＮＡはＴＬＲ−９受容体を活性化し、次いで、順に、サイトカイン合成を誘導し得る。
【０００６】
遊離して循環するＤＮＡは、エリテマトーデス（ＬＥ）、遺伝的自己免疫疾患の臨床像においても役割を果たす。したがって、抗ＤＮＡ抗体の形成を誘導し、したがって、サイトカインの放出および炎症反応を引き起こす遊離核酸は、ＬＥ患者の血液中で検出された（Tan E. M., Schur P. H. et al. Deoxyribonucleic acid (DNA) and antibodies to DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 1966; 46: 1732-1740）。これらの抗ＤＮＡ抗体は、ＬＥ患者の腎臓症状にも実質的に寄与する（Termaat, R. M., Asmann, M. et al. Anti-DNA antibodies can bind to the glomerulus via two distinct mechanisms. Anti-DNA antibodies. 1992: 61）。
【０００７】
別の種類の遊離核酸、すなわちｍＲＮＡの濃度の増加については、がん患者において記載された（Tani N., Ichikawa D. et al. Circulating Cell-free mRNA in Plasma as a Tumor Marker for Patients with Primary and Recurrent Gastric Cancer. Anticancer Research. 2007; 27: 1207-1212、Garcia V., Garcia, J. M. et al. Free circulating mRNA in plasma from breast cancer patients and clinical outcome. Cancer Letters. 2008; 263: 312-320、March-Villaalba J. A., Martinez-Jabaloyas J. M. et al. Cell-Free Circulating Plasma hTERT mRNA Is a Useful Marker for Prostate Cancer Diagnosis and Is Associated with Poor Prognosis Tumor Characteristics. PLoS One. 2012; 7(8): e43470）。一般的に、炎症反応は、腫瘍進行にも寄与することが知られている（Coussens L. M., Werb Z., Inflammation and cancer. Nature. 2002; 420: 860-867）。さらに、より新しい研究では、がんの症例でも、炎症状態は、ＴＬＲ−７受容体などのＰＲＲの活性化によって引き起こされることが示唆されている（Chatterjee S., Crozet L. et al. TLR7 Promotes Tumor Progression, Chemotherapy Resistance, and Poor Clinical Outcomes in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res. 2014; 74: 5008-5018）。ｍＲＮＡなどの遊離核酸は、本明細書において、炎症反応のメディエーターとしても検討される。
したがって、炎症性サイトカインの誘導系は、指定された臨床像において、遊離して循環する核酸の生物学的作用を阻害することによって妨害されうることが確実である。この阻害は、例えば、固相上での直接的分解もしくは液相中での分解によって、またはＤＮＡのメチル化もしくは脱アミノ化によって、核酸不活性化を標的化して達成することができ、それによって、ＰＡＭＰモチーフは認識不能となり、ＴＬＲ−９はもはや活性化されず、したがって、サイトカイン合成はもはや誘導されない。
【０００８】
現況技術では、血液中で遊離して循環するＤＮＡを分解するために、がん患者にデオキシリボヌクレアーゼであるＤＮａｓｅＩを投与することができると報告されている（欧州特許第１６５５０３６号）。しかしながら、この方法は、対応する酵素が患者の体に直接侵入するため、多数の危険性と問題を有する。一方、対応する効果を少しでも達成するためには、比較的高用量が必要とされる。一方、例えば、活性酵素が細胞に侵入することによって副作用が引き起こされることは否定できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、血液中に遊離して循環する核酸を改良された方式で不活性化するためのデバイスおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、この目的を
（ａ）全血または血漿を患者から流出させ、患者に流入させるための管、および
（ｂ）遊離核酸の不活性化に適している、ポリペプチドが固定された固相
を含有する、血液処置のためのデバイスを提供することによって達成する。
ポリペプチドが固定された、本発明によるデバイスの固相は、中空糸膜もしくは中空ビーズまたは不織布のいずれかであってよい。本発明の構成の範囲内で、膜は、パラメトキシメタンフェタミン（ＰＭＭＡ）、セルロース、エステル、ポリアミド、ポリメチルスルホネート、ポリエーテルイミド、ポリエーテルスルホンまたはポリスルホン単独、またはポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくは共重合体と混合したものからなりうる。さらに、膜は追加の修飾を有する場合もあり、または修飾されない場合もある。膜の層の数は限定されず、３層を有する中空糸膜の実施形態が特に好ましい。
ポリペプチドは、当技術分野の最新の状態から知られている様々な方法で固定することができる。固相に固定した酵素の場合に最適な酵素活性を得るために、最適な長さのリンカーが通常必要とされる。このスペーサーの最適な長さは、表面の種類および酵素の種類によって変わり、当業者によって容易に決定されうる。
本発明による固相は、好ましくは、ポリマーに結合したポリペプチドをスピニングすることによって得ることができる。
【００１１】
さらに、本発明による固相は、中空糸膜の表面にポリペプチドを固定することによって得ることができる。このため、膜の内面の、活性化した、活性化可能なまたは反応性の化学官能基の存在に基づく方法が検討される。活性可能な基として、ＯＨおよびＣＯＯＨ基がとりわけ検討される。表面上のＮＨ2またはＳＨ2基もまた、リガンドの化学的に活性化した基と反応することができる。
米国特許第４，１７７，０３８号に一例がある。例えば、セルロース系の膜の場合に使用することのできる、そこに記載された方法に加えて、カルボキシル修飾ポリスルホンもしくはポリエーテルスルホンを単独で、または非修飾ポリスルホンをカルボキシル修飾ＰＶＰ誘導体と組み合わせて使用する可能性もある。
例えば、本発明による固相は、
−  ポリスルホンまたはＰＶＰをベースとするカルボキシル含有ポリマーをスピニングするステップ
−  このようにして生産した繊維の束から固相を準備するステップ
−  蒸気噴射、すすぎおよび乾燥により固相のコンディションを整えるステップ
−  ＥＤＣおよび場合によってはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液でカルボキシル基を活性化するステップ
−  例えば、６個の炭素原子（アミノカプロン酸）の長さを有するリンカーを挿入するステップ
−  末端のカルボキシル基を再度ＥＤＣで活性化し、次に、ポリペプチド溶液と反応させてポリペプチドを固定させる（ポリペプチドのアミノ基（リシン）は、ポリマーの活性化したカルボキシル基への共有結合のために使用される）ステップ
−  固相をすすぎ、穏やかに乾燥させるステップ
−  ガンマ線または好ましくはＥビームプロセスで固相を滅菌するステップ
によって得ることができる。
【００１２】
本発明の構成の範囲内で、用語「遊離核酸の不活性化」は、遊離核酸の生物学的活性を阻害するのに好適なすべての酵素活性を含む。本発明の一態様では、これには、遊離核酸のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することによる遊離核酸の分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）または分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が含まれる。別の態様では、不活性化には、例えば、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドをメチル化することによって、または脱アミノ化によりシトシンをウラシルに変換することによって、遊離核酸の免疫原性モチーフを認識不可能とすることが含まれる。
遊離核酸の不活性化は体の外で実施されるため、体内でのポリペプチドの活性による副作用は除外される。さらに、デバイスは複数回使用することができ、対応するポリペプチドの直接的投与と比較して、治療を、特に費用効果的なものにする。
【００１３】
本発明の構成の範囲内で、用語「遊離核酸」は、血液中を循環する無細胞核酸の種類のすべてを含む。遊離核酸の発生源は限定されない。アポトーシス細胞またはネクローシス細胞のいずれかに由来する遊離核酸は、インタクト細胞によって分泌されると考えられる。遊離核酸は、ヒトゲノムもしくはミトコンドリアＤＮＡまたはｍＲＮＡの両方からなってもよい。ウイルスおよび細菌のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびにその断片も含まれ、これらは、感染中に患者の血流に侵入する。本発明の手段で不活性化される遊離核酸は、タンパク質に結合されるか、またはタンパク質によって安定化されうる。遊離核酸の長さは制限されず、２０ヌクレオチド／塩基対から数百万塩基対の範囲である。一実施形態では、不活性化される遊離核酸は、炎症作用を有する。
【００１４】
本発明によれば、遊離核酸の生物学的活性は、固相上で、酵素による不活性化によって抑制される。好適なポリペプチドはこのために使用される。実施形態では、デオキシリボヌクレアーゼおよび／またはリボヌクレアーゼは、固相上に固定される。これらの酵素の分類には、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両方が含まれる。好ましい実施形態では、ヒトと同一のエンドヌクレアーゼ（例えば、嚢胞性線維症を有する患者の肺で高分子ＤＮＡを分解するために、商標名「プルモザイム」で使用される）であるＤＮａｓｅＩが使用される。本発明によれば、ヌクレアーゼ活性を有する様々な種類のポリペプチドを同時に固定することもできる。好ましい実施形態では、ＤＮａｓｅＩは、例えば、ＤＮＡの分子量の低減を実質的に増大させ、遊離核酸の断片のより十分な透析性をもたらすエキソヌクレアーゼと一緒に、ＤＮａｓｅＩを使用することができる。
【００１５】
さらなる実施形態では、固定されたポリペプチドは、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドのモチーフをその活性によって認識できなくする酵素、例えば、シトシン脱アミノ化酵素およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼなどである。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの好ましい例は、ヒトＤＮＭＴ１である。
本発明の構成の範囲内で、そのタンパク質配列がヒトのものに相当する酵素およびポリペプチドの使用が、多重使用の場合に、それによって抗体の形成が妨げられ得る
ため、好ましい。さらに、例えば、より高い熱安定性もしくは溶媒安定性または他の改良された特性を有するポリペプチドの使用も検討される。当業者は、このような突然変異体が標的変異原性を介してどのように生じうるか、およびこのような突然変異体がそれらの特性についてどのように検査されうるかを知っている。
【００１６】
本発明によれば、用語「ポリペプチド」は、全配列を有する酵素に加えて、所望の機能性を示す指定された酵素の短縮および変化したバリアントも含む。ここで、バリアントは、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５または１００％の配列相同性を有する。バリアントは、好ましくは、７５、８０、８５、９０、９２、９５または１００％の配列相同性を有する。対応する酵素の個々のドメインは、これらが必要な触媒活性を有する場合には、使用することもできる。ポリペプチドの触媒（残存）活性を測定する方法は、当業者に十分に知られており、機能アッセイ、活性アッセイ、およびその反応によって分光光度的変化が生じる化学発光または蛍光物質（複数可）を用いるアッセイを含む。
【００１７】
さらなる実施形態では、所望の酵素活性を有する短いペプチド配列が使用される。ヌクレアーゼ活性を有するペプチドは、例えば、国際特許出願第０２／４０６３１号に記載されている。そのようなペプチドは、技術的滅菌プロセスに耐える利点を有する。当業者は、公知の手段を用いて、これらのペプチドの対応する酵素活性を測定することもできる。
本発明によるデバイスの管は、患者に直接接続することができる。あるいは、それを介して、患者がデバイスに流体接続される、さらなる管が提供されうる。管は、流れる全血または血漿に対して使用される。
【００１８】
実施形態では、本発明によるデバイスは、透析器または血液濾過器をさらに含有する。透析および血液濾過方法は当業者に知られており、この点について、隔膜を使用する腎臓の排出機能の欠損または低減によって影響を受ける患者の体液から望ましくない物質を排除するすべての方法を指す。
これには、血液を透析液に接触させることによって、血液から望ましくない物質が除去される血液透析方法が含まれる。拡散および対流による材料の交換を可能にするポリマー膜が、血液と透析液の間の分離限界として使用される。
腹膜透析法を使用することもできる。本明細書では、患者の腹膜は、材料の交換に対する分離限界として作用する。この場合、腹膜は、患者の体液から腹部に導入された透析液を分離する。材料の交換は、実質的には拡散により起こる。
【００１９】
記載された基本原理に従う指定された透析方法の技術的バリエーションが存在する。生理学的理由のため、およそ６９ｋＤａ、すなわち、アルブミンの分子量を超える分子量を有する物質が患者の体からいつまでも除去されないことは、すべての方法に共通する。およそ６５０Ｄａ／塩基対（ｂｐ）の二本鎖ＤＮＡが高分子量であるため、短くても１００ｂｐからの範囲のＤＮＡ断片は、分離限界が６９ｋＤａの透析膜ではもはや有効に分離することができない。
静的システムに加えて、略称「ＷＡＫ」（携帯型人工腎臓）で知られている、患者に携帯されうるシステム、すなわち、一箇所で操作されるが、容易に輸送することができるポータブルシステムは、当技術分野の最新の状態によれば公知である。
本発明の構成の範囲内で、固定されたポリペプチドを有する固相は、透析器または血液濾過器の上流に存在するか、または透析器または血液内に位置する可能性がある。最初の場合には、固定されたポリペプチドを有する固相と透析器または血液濾過器は、管を介して流体接続している。各場合には、不活性化された遊離核酸の断片は、透析中に、全血または血漿から除去されうる。
さらなる実施形態では、血液の処置のためのデバイスは、血漿濾過器をさらに含有する。これは、例えば、前部において患者に由来する全血を圧力勾配により濾過する血漿濾過器である可能性があり、一方、浄化された血漿は後部で逆濾過され、したがって、透析器を通過した後、患者に戻される。全血から血漿を濾過するデバイスは、細胞分離器、例えば遠心分離器であってもよい。血漿を濾過するためのデバイスは、遊離核酸の不活性化を妨害する可能性のある血液の細胞構成成分を保持する役割を果たす。さらに、したがって、固定されたポリペプチドが血液細胞に損傷を与えないようにすることが可能である。
【００２０】
さらに、慢性腎不全、がんまたはエリテマトーデスに罹患している患者の炎症促進状態の処置のために、本発明によるデバイスを使用することによって、本目的が達成される。自然免疫系によって認識される遊離核酸を除去することによって、炎症性サイトカインの放出は、３つすべての臨床像で阻害される場合があり、したがって、患者の炎症反応は低減される場合がある。
【００２１】
さらに、本発明は、遊離核酸が体外で不活性化される、血液の処置のための方法を含む。一実施形態では、本発明による方法は、以下のステップ：
（ｉ）本発明によるデバイスを準備するステップ、および
（ｉｉ）固相上に固定したポリペプチドによって、遊離核酸を不活性化することができる条件下で、患者の全血または血漿をデバイスを通して運ぶステップ
を含む。
特に、適当な流速、酵素活性の最適化を可能にする操作温度および固定されたポリペプチドの充分に高い密度が、ここで確保されるべきである。本発明によれば、遊離核酸の不活性化をより充分に達成するために、この方法のステップ（ｉｉ）を繰り返すことができる。
さらなる実施形態では、本発明による方法は、全血由来の血漿を濾過するステップ（ｉａ）をさらに含むことができる。
本発明による方法の好ましい実施形態では、遊離核酸の透析と不活性化を組み合わせるため、ポリペプチドの活性によって形成される遊離核酸の断片は、血液の処置中に、血漿または全血から濾出されうる。
【００２２】
本発明は、本発明によるデバイスを含有する体外循環を含む、血液の処置のためのシステムをさらに含む。このシステムは、追加の要素、例えば、体液コンベア、ポンプ、フィルター、吸着器、制御素子、測定および入力単位、ならびにデータ回線を含有することができる。このシステムがいくつかの流体回路からなることが検討される。
好ましい実施形態では、本発明によるシステムは、慢性腎不全、がんまたはエリテマトーデスに罹患している患者の炎症促進状態の処置のために使用される。
さらに、本発明は、図面および実施例を参照してより詳細に説明されるが、これらは限定するものとして理解されるものではない。以下に示される：
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ポリペプチドがビーズ材料または不織布の固相上に固定されており、透析器をさらに接続することも血漿分離することもない、本発明によるデバイスの実施形態の模式的ブロック図である。
【図２】透析器の外側でポリペプチドがビーズ材料または不織布の固相上に固定された、本発明によるデバイスの実施形態の模式的ブロック図である。
【図３】ポリペプチドが内腔側に固定された多層中空糸膜を有する、本発明によるデバイスの実施形態の模式的ブロック図である。
【図４】ポリペプチドが内腔側に固定された本発明による多層中空糸膜の図である。
【図５】血漿分離がさらに行われる、本発明によるデバイスの実施形態の模式的ブロック図である。
【図６】ＤＮａｓｅＩによるヒト染色体ＤＮＡ処理のアガロースゲル画像である。
【図７】繊維材料上に固定したＤＮａｓｅＩの有効性を示すアガロースゲル画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
図１では、本発明によるデバイスのさらなる実施形態が模式的に表されている。この図の参照番号は、以下に再現されるように割り当てられる：
１  ポリペプチドが固定された固相
３  患者から通じる管
６  患者へと通じる管
全血または血漿は、本発明による、遊離核酸の不活性化のためのペプチドが固定された固相１に、管３を介して運ばれる。遊離核酸が不活性化された後、全血または血漿は、患者Ｐに運ばれ戻される。
【００２５】
図２では、遊離核酸の不活性化と透析が別々に起こる本発明によるデバイスの実施形態が模式的に表される。この図の参照番号は、以下に再現されるように割り当てられる：
１  コーティングされたビーズ材料の形態の、またはコーティングされた不織布を有する固相
２  透析器
３  患者から通じる管
６  患者へと通じる管
７  血液入口
８  透析液出口
９  透析液入口
１０  血液出口
Ｐ  患者
この実施形態では、血液は、最初に、ポリペプチドが固定された、コーティングされたビーズ材料またはコーティングされた不織布の形態の固相１の上に運ばれる。ここで、血液中に含有される遊離核酸は分解される。固相１を通過した後、血液は透析器２を通ってさらに運ばれ、透析器２では遊離核酸の断片が透析により除かれる。
【００２６】
図３では、透析器内の多層中空糸膜の内腔側にポリペプチドが固定された本発明によるデバイスの実施形態が模式的に表されている。この図の参照番号を以下のように再現する：
２’  ポリペプチドが内腔側に固定された透析器
３  患者から通じる管
６  患者へと通じる管
７  血液入口
８  透析液出口
９  透析液入口
１０  血液出口
Ｐ  患者
【００２７】
管３は第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端は患者Ｐに接続させることができ、第２の末端は透析器２’の血液入口７に接続される。透析器２’は、固相として、ポリペプチドが内腔側に固定された多層中空糸膜を有する。管６は第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端は透析器２’の血液出口１０に接続され、第２の末端は患者Ｐに接続させることができる。血液入口７を通って侵入する全血は透析器２’内で透析され、透析器２’内では、同時に、固定されたポリペプチドは遊離核酸を不活性化し、この透析手順の間に断片は透析により血液から除かれる。全血は血液出口１０を介して再び出ていくことができ、管６を介して患者に戻される。透析液は、それぞれ、透析液入口９を介して透析器２’に導入され、透析液出口８を通って透析器２’から運ばれる。
【００２８】
図４では、ポリペプチドが内腔側に固定された多層中空糸膜の形態の本発明による固相の構造が模式的に示される。この図の参照番号は、以下に再現されるように割り当てられる：
２１  膜材料の外層
２２  膜材料の内層
２３  中空糸膜の内腔
ポリペプチドは、内層２２に固定される。
【００２９】
図５では、血漿セパレーターを含む本発明によるデバイスのさらなる実施形態が模式的に表される。この図の参照番号は、以下に再現されるように割り当てられる：
１  ポリペプチドが固定される固相
２  透析器
３  患者から通じる管
４  接続管
５  接続管
６  患者へと通じる管
７  血液入口
８  透析液出口
９  透析液入口
１０  血液出口
１１  血漿フィルター
１２  無濾過側の流体供給入口
１３  無濾過側の流体除去出口
１４  濾過側の流体供給入口
１５  濾過側の流体除去出口
Ｐ  患者
【００３０】
管３は第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端は患者Ｐに接続させることができ、第２の末端はフィルター１１の無濾過側の流体供給入口１２に接続される。無濾過側に加えて、血漿フィルター１１は濾過側を有し、無濾過側は少なくとも１種の濾過材料によって濾過側から分離されている。管６は第１の末端と第２の末端を有し、第１の末端は透析器２の流体除去出口１０に接続されており、第２の末端は患者Ｐに接続させることができる。無濾過側の流体入口１２を通って侵入する全血は濾過側の流体除去出口１３を通る血漿として一部が再び出ていくことができる。次いで、管４を介して、分離された血漿は、本発明によるペプチドが固定された固相１を通って運ばれる。固定されたポリペプチドによって、血漿中に含有される遊離核酸が不活性化されることが保証される。次いで、不活性化された遊離核酸を有する血漿は、管５を介して流れ、濾過側の流体供給入口１４で再び血漿フィルター１１に入り、無濾過側の流体除去出口１５を通って出ていく。次いで、全血は透析器２を通って運ばれ、透析器２では、同時に、分解された遊離核酸の断片が透析により除かれうる。透析器２を通過した後、浄化された全血は運ばれて再び患者Ｐに戻る。
【００３１】
図６では、ＤＮａｓｅＩによるヒト染色体ＤＮＡの処理を示すアガロースゲル画像を見ることができる。試料は以下のようにアプライされた（左から右へ）：１ｋＢのラダー１０μｌ、１００ｂｐのラダー１０μｌ、空、未処理ＤＮＡ、２ＵのＤＮａｓｅＩ、空、０．５ＵのＤＮａｓｅＩ、空、０．０５ＵのＤＮａｓｅＩ、空、０．００５ＵのＤＮａｓｅＩ、空、１ｋＢのラダー５μｌ、１００ｂｐのラダー５μｌ。
図７では、固定されたＤＮａｓｅＩの有効性を示すアガロースゲル画像を見ることができる。試料は以下のようにアプライされた（左から右へ）：１ｋＢのラダー１０μｌ、１００ｂｐのラダー１０μｌ、未処理ＤＮＡ  ４００ｎｇ、空、透析器通過後のＤＮＡ  ４００ｎｇ、空、１ｋＢのラダー５μｌ、１００ｂｐのラダー５μｌ。
【実施例】
【００３２】
（例１）
ＤＮａｓｅＩによるヒト染色体ＤＮＡの処理
高分子であるヒトＤＮＡを、赤血球の溶解後、フェノール−クロロホルム法を使用して、全血から得た。
各場合には、このＤＮＡ  ８００ｎｇを、様々な活性の市販のＤＮａｓｅＩ調製物を用いて、３７℃で１０分間インキュベートした。反応時間の終わりに、５ｍＭのＥＤＴＡを含むローディングバッファーを添加することによって反応を停止させ、次いで、レーン毎に１７５ｎｇを１％アガロースゲルにアプライした（トリス／酢酸／ＥＤＴＡバッファー、１１０Ｖ、２時間）。１ｋＢラダーが分子量標準として、１０ｋＢが最も大きい分子量としての役割を果たし、１００ｂｐのラダーと未消化ゲノムＤＮＡ  １７５ｎｇが基準としての役割を果たした。
ゲルをランした後、エチジウムブロマイド溶液を染色するために使用し、ゲルを、ＵＶ照射下での写真により文書として記録した。
【００３３】
結果：典型的な分解パターンの欠如によって明らかに特定することができるように、わずか０．００５Ｕの濃度のＤＮａｓｅＩでさえ、ＤＮＡ  ８００ｎｇは、３７℃にて１０分で完全に分解される。ＤＮＡが部分的に分解される場合には、明らかに特定可能な染色が、１０ｋｂｐ以下の範囲で影響を受けたレーンで特定されることになる。未処理の基準では、これらの分解産物を、１０ｋｂｐのバンドの少し上で特定することができる（図６を参照のこと）。
【００３４】
（例２）
酵素でコーティングされた中空糸の調製
本発明によるヌクレアーゼを使用するための中空糸は、独国特許出願公開第１０  ２０１１  ０１０  ９２１号および独国特許出願公開第１０  ２００８  ００３  ０９０号に由来する方法により調製することができる。ここで説明された膜は、それらの内腔側の層にセルロースエステルを含有し、これは、水酸化ナトリウム希釈溶液でおよそ３０分間持続して処理することによって、完全にまたは部分的にセルロースに変換することができる。セルロースは、化学的活性化によって生体分子に結合させるために調製することができる。使用される技術は、米国特許第４，１７７，０３８号に記載されている。
固定されるＤＮａｓｅＩは、カップリング反応のために５倍過剰で使用される。
【００３５】
（例３）
繊維材料上に固定されたＤＮａｓｅＩの有効性
中空糸膜に固定されたＤＮａｓｅＩの有効性を試験するため、３６００Ｕ／ｍ2のＤＮａｓｅＩを１．４ｍ2の内腔表面積を有する中空糸透析器に固定した。ヒトＤＮＡ５００μｇを添加した新鮮な試験血液５００ｍｌを、ポンプを使用して、３７℃で、内腔の流速１５０ｍｌ／分でこの中空糸透析器を単回通過させた。中空糸透析器の繊維の内径は１８５μｍであり、透析器における流体の滞留時間は２８秒であった。透析器の透析液側を、生理濃度の一価および二価カチオン、特にカルシウムおよびマグネシウムを有する等張な透析液で満たした。
アガロースゲルでの分析のために、透析器通過後に試料を採取した。ゲノムＤＮＡ４００ｎｇの絶対量がゲルにアプライされるように試料の体積を選択した。同量の未処理のゲノムＤＮＡが基準としての役割を果たした。
【００３６】
結果：透析器通過後、１０ｋｂｐ未満の典型的な分解産物のない状態で、ゲノムＤＮＡが完全に分解されており、このことは明らかに特定可能である（図７を参照のこと）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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