(57)【要約】  ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法。ウイルスに特異的なＴ細胞の集団の増殖速度を加速するための方法、および発生または増殖したＴ細胞の集団を用いて疾患または障害を治療しまたは予防するための方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含み、前記細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法。
【請求項２】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団の増殖速度を加速するための方法であって、ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含み、前記細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法。
【請求項３】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、および
（ｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によって前記Ｔ細胞を再刺激するステップであって、前記細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む方法。
【請求項４】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた前記細胞を収集するステップ、および
（ｉｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によって前記Ｔ細胞を再刺激するステップであって、前記細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む方法。
【請求項５】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた前記細胞を収集するステップ、
（ｉｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によって前記Ｔ細胞を再刺激するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）によって得られた前記細胞を収集するステップ、および
（ｖ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によって前記Ｔ細胞を再刺激するステップであって、前記細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む方法。
【請求項６】
馴化培地が、ステップ（ｉｉｉ）の刺激培養から得られる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
馴化培地が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを１〜８日の培養期間刺激培養した後に得られる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
馴化培地が、レスポンダー：スティミュレーターの比が１：１〜１０：１でのＴ細胞とＡＰＣとの刺激培養から得られる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣが、ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１０％の馴化培地が、２０〜４０％の馴化培地である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた少なくとも１０％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中で、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法。
【請求項１２】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に特異的なＴ細胞の集団の増殖速度を加速するための方法であって、
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた少なくとも１０％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法。
【請求項１３】
エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、
（ｉ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が１０：１〜８０：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下でＰＢＭＣを７〜１４日培養することによってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた前記細胞を収集するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で収集した細胞を、４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下で１〜８日培養することによって前記Ｔ細胞を再刺激するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）によって得られた前記細胞を収集するステップ、ならびに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で収集した細胞を、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）の終了時で得られた少なくとも１０％の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下で１〜８日培養することによって前記Ｔ細胞を再刺激するステップ
を含む方法。
【請求項１４】
（ｖｉ）ステップ（ｖ）によって得られた前記細胞を収集するステップ、ならびに
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）で収集した細胞を、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）ステップ（ｖ）の終了時で得られた少なくとも１０％の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下で１〜８日培養することによって前記Ｔ細胞を再刺激するステップ
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞を収集し、収集した細胞を（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）先行する刺激ステップの終了時で得られた少なくとも１０％の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射したＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下で１〜８日培養することによって前記Ｔ細胞を再刺激する追加ステップを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象における癌を治療する方法であって、
（１）対象からＴ細胞を単離するステップ、
（２）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激することを含む方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップであって、細胞が培養される培地の１０〜２５％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ、ならびに
（３）発生または増殖したＴ細胞の集団を対象に投与するステップ
を含む方法。
【請求項１７】
馴化培地が、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１でのＴ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む１〜８日の刺激培養から得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップが、
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた１０％〜２５％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣが、ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）細胞である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
癌がＥＢＶ陽性癌である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
癌がＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が培養される培地の約１５％が、馴化培地である、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（２）が、発生または増殖したＴ細胞の集団を収集するステップをさらに含む、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
対象における癌を治療する方法であって、
（１）対象からＴ細胞を単離するステップ、
（２）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激することを含む方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップであって、前記細胞が培養される培地の１０〜２５％が、馴化培地であり、馴化培地が、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１でのＴ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む１〜８日の刺激培養から得られる、ステップ、ならびに
（３）発生または増殖したＴ細胞の集団を対象に投与するステップ
を含む方法。
【請求項２５】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップが、
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた１０％〜２５％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
癌がＥＢＶ陽性癌である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
癌がＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
１０％〜２５％の馴化培地が、約１５％の馴化培地である、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（２）が、発生または増殖したＴ細胞の集団を収集するステップをさらに含む請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含み、前記細胞が培養される培地の１０％〜２５％は、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法。
【請求項３１】
馴化培地が、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む１〜８日の刺激培養から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップが、
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた１０％〜２５％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣが、ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）細胞である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３４】
１０％〜２５％の馴化培地が、約１５％の馴化培地である、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
発生または増殖したＴ細胞の集団を収集するステップをさらに含む、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
発生または増殖したＴ細胞の集団を薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合するステップをさらに含む、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞は、請求項１から１５または３０から３６のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、得ることができるか、またはその生成物である、Ｔ細胞の集団。
【請求項３８】
請求項３７に記載のＴ細胞の集団、ならびに薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項３９】
疾患または障害の治療または予防における使用のための、請求項３７に記載のＴ細胞の集団または請求項３８に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
疾患または障害の治療または予防における使用のための医薬またはワクチンの製造における、請求項３７に記載のＴ細胞の集団または請求項３８に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４１】
請求項３７に記載のＴ細胞の集団または請求項３８に記載の薬学的組成物の治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む、対象における疾患または障害を治療しまたは予防する方法。
【請求項４２】
疾患または障害が、前記Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスによる感染によって引き起こされるかもしくは増悪される疾患または障害であるか、または前記Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスによる感染が危険因子である疾患または障害である、請求項３９に記載の使用、請求項４０に記載の使用、または請求項４１に記載の方法のための前記Ｔ細胞の集団または薬学的組成物。
【請求項４３】
疾患または障害が癌である、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の使用のためのＴ細胞の集団もしくは薬学的組成物、その使用、または方法。
【請求項４４】
癌がＥＢＶ陽性癌である、請求項４３に記載の使用のためのＴ細胞の集団もしくは薬学的組成物、その使用、または方法。
【請求項４５】
癌がＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である、請求項４３または４４に記載の使用のためのＴ細胞の集団もしくは薬学的組成物、その使用、または方法。
【請求項４６】
請求項３７に記載のＴ細胞の集団または請求項３８に記載の薬学的組成物の所定量を含むパーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生および／または増殖させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスに 特異的なＴ細胞の養子免疫伝達は、ウイルス性疾患の予防および治療のための有望な戦略である。
養子免疫伝達には、多数のＴ細胞の使用が必要である。たとえば、Ｃｈｉａら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２０１４）２２（１）：１３２〜１３９頁には、全数中央値９．６×１０８個のＥＢＶ−ＣＴＬ（６．３〜１０．３×１０８個のＣＴＬの範囲）の養子免疫伝達によるＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）の治療が記載されている。
【０００３】
Ｔ細胞の養子免疫伝達による治療の主な問題点は、投与にとって十分に多い数のウイルスに特異的なＴ細胞を発生させるのにかかる時間である。Ｃｈｉａら（上記）は、ＣＴＬの最初の用量を産生するために必要な時間の中央値は１３週（８〜２２週の範囲）であったと報告している。さらに、この研究において３名の患者でＣＴＬの産生の遅れによる治療予定からの逸脱があったと報告されている。
【発明の概要】
【０００４】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生および／または増殖させるための方法には、典型的には目的のウイルス（即ち、Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルス）のペプチドを提示する抗原提示細胞でＴ細胞を数回刺激することが含まれる。
【０００５】
本発明は、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団が、刺激ステップから得られた馴化培地の存在下で再刺激を行なうことによってより迅速に増殖できるという発見に基づく。有利なことに、それによって従来の方法と比較してより短い時間で多数のウイルスに特異的なＴ細胞を得ることができる。したがって本発明は研究および／または治療用途における使用のためにウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生／増殖させるために有用である。
【０００６】
１つの態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法はウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含み、このステップにおいて細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団の増殖速度を加速するための方法であって、本方法はウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含み、このステップにおいて細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法は
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、および
（ｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップであって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む、方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法は
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップ、および
（ｉｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップであって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む、方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、馴化培地はステップ（ｉｉ）の刺激培養から得られる。
【００１０】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させる方法であって、本方法は
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、および
（ｉｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップであって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む、方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法は
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、
（ｉｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、および
（ｖ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップであって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む、方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、馴化培地はステップ（ｉｉｉ）の刺激培養から得られる。
【００１２】
本発明の種々の態様と関連して、いくつかの実施形態では、馴化培地は、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを１〜８日の培養期間刺激培養した後に得られる。いくつかの実施形態では、馴化培地はレスポンダー：スティミュレーター比が１：１〜１０：１でのＴ細胞とＡＰＣとの刺激培養から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣはＥＢＶでトランスフォームされた（以下、ＥＢＶで形質転換された）リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）細胞である。いくつかの実施形態では、少なくとも１０％の馴化培地は２０〜４０％の馴化培地である。いくつかの実施形態では、少なくとも１０％の馴化培地は１０〜２５％、好ましくは約１５％の馴化培地である。
【００１３】
別の態様では、本発明はエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法は
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた少なくとも１０％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中で、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む、方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明はエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に特異的なＴ細胞の集団の増殖速度を加速するための方法であって、本方法は
（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた少なくとも１０％の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む、方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明はエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法は
（ｉ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が１０：１〜８０：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下でＰＢＭＣを７〜１４日培養することによってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で収集した細胞を、４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下で１〜８日培養することによってＴ細胞を再刺激するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、ならびに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で収集した細胞を、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）の終了時で得られた少なくとも１０％の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下で１〜８日培養することによってＴ細胞を再刺激するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）によって得られた細胞を収集するステップ、ならびに
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）で収集した細胞を、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）ステップ（ｖ）の終了時で得られた少なくとも１０％の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下で１〜８日培養することによってＴ細胞を再刺激するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は細胞を収集し、収集した細胞を（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）先行する刺激ステップの終了時で得られた少なくとも１０％の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射したＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下で１〜８日間培養することによってＴ細胞を再刺激する追加ステップを含む。
【００１６】
別の態様では、本発明は対象における癌を治療する方法であって、本方法は
（１）対象からＴ細胞を単離するステップ、
（２）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激することを含む方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップであって、細胞が培養される培地の１０〜２５％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ、ならびに
（３）発生または増殖したＴ細胞の集団を対象に投与するステップ
を含む、方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、馴化培地は、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む１〜８日の刺激培養から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップは、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた１０〜２５％の馴化培地、ならびに（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣはＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）細胞である。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞が培養される培地の約１５％は馴化培地である。いくつかの実施形態では、ステップ（２）は発生または増殖したＴ細胞の集団を収集するステップをさらに含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は対象における癌を治療する方法を含み、本方法は
（１）対象からＴ細胞を単離するステップ、
（２）ウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップであって、細胞が培養される培地の１０〜２５％が、馴化培地であり、馴化培地が、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む１〜８日の刺激培養から得られる、ステップを含む方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップ、ならびに
（３）発生または増殖したＴ細胞の集団を対象に投与するステップ
を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップは、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた１０〜２５％の馴化培地、ならびに（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養を含む。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。いくつかの実施形態では、細胞が培養される培地の約１５％は馴化培地である。いくつかの実施形態では、ステップ（２）は発生または増殖したＴ細胞の集団を収集するステップをさらに含む。
【００２０】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるための方法であって、本方法はウイルスのペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップを含み、細胞が培養される培地の１０％〜２５％は、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、レスポンダー：スティミュレーターの比が２：１〜７：１での、馴化培地はＴ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む１〜８日の刺激培養から得られる。いくつかの実施形態では、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップは、（ａ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、および１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた１０％〜２５％の馴化培地、ならびに（ｃ）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダー：スティミュレーターの比が２：１〜７：１での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの存在下における１〜８日の培養を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣはＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）細胞である。いくつかの実施形態では、１０％〜２５％の馴化培地は約１５％の馴化培地である。いくつかの実施形態では、本方法は発生または増殖したＴ細胞の集団を収集するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は発生または増殖したＴ細胞の集団を薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合するステップをさらに含む。
【００２２】
別の態様では、本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞の集団は本発明による方法によって得られるか、得ることができるか、またはその生成物である、集団を提供する。
【００２３】
別の態様では、本発明は本発明によるＴ細胞の集団、ならびに薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本発明は疾患または障害の治療または予防における使用のための、本発明によるＴ細胞の集団または薬学的組成物を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は疾患または障害の治療または予防における使用のための医薬またはワクチンの製造における、本発明によるＴ細胞の集団または薬学的組成物の使用を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は本発明によるＴ細胞の集団または薬学的組成物の治療または予防有効量を対象に投与するステップを含む、対象における疾患または障害を治療しまたは予防する方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、疾患または障害は、Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスによる感染によって引き起こされるかもしくは増悪される疾患または障害であるか、またはＴ細胞がそれに対して特異的であるウイルスによる感染が危険因子である疾患または障害である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は癌である。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。
【００２７】
別の態様では、本発明は本発明によるＴ細胞の集団または薬学的組成物の所定量を含むパーツのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ドナー１（図１Ａ）ならびにドナー２および３（図１Ｂ）から得た細胞由来のＥＢＶに特異的なＴ細胞の増殖に対する馴化培地の効果を示すグラフである。増加する百分率の馴化培地を培養培地に添加する。ＬＣＬとの１週間の共培養の後、増殖したＴ細胞の数を、播種した最初のＴ細胞の数と比較する。
【図２】３名のドナーから得た細胞由来のＥＢＶに特異的なＴ細胞のＧｒｅｘ−１００バイオリアクターにおける増殖に対する馴化培地の効果を示すグラフである。増加する百分率の馴化培地を培養培地に添加する。ＬＣＬとの１週間の共培養の後、増殖したＴ細胞の数を、播種した最初のＴ細胞の数と比較する。
【図３】ＥＢＶに特異的なＴ細胞によるＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ細胞の特異的殺滅を示すグラフである。０％および３０％の馴化培地中の培養によって増殖したＴ細胞を、異なったエフェクター／ターゲット細胞比でＬＣＬと共培養し、４時間後にＬＣＬ細胞の特異的細胞溶解を測定する。
【図４】Ｇｒｅｘ−１００バイオリアクター培養容器中で培養したＥＢＶ特異的ＣＴＬの増殖倍率に対する異なった百分率の馴化培地の存在の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
Ｔ細胞および抗原提示細胞
本発明はウイルスに特異的なＴ細胞の集団の発生および／または増殖に関する。
本明細書で用いる場合、ウイルスに特異的なＴ細胞はウイルスに感染した細胞またはウイルスのペプチドを含む細胞と反応するＴ細胞である。ウイルスに特異的なＴ細胞は、Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスのペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合することができるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を含む。
【００３０】
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、典型的にはα鎖およびβ鎖を含むヘテロダイマーの抗原結合分子である。天然には、α鎖およびβ鎖はインバリアントＣＤ３鎖との複合体としてＴ細胞の細胞表面に発現する（αβＴ細胞）。γ鎖およびδ鎖を含む代替のＴＣＲはＴ細胞のサブセットに発現する（γδＴ細胞）。ＴＣＲは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される抗原ペプチドを認識（これに結合）する。ＴＣＲ構造およびペプチド−ＭＨＣ複合体の認識は、たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ  Ｊｒ、Ｔｒａｖｅｒｓ  Ｐ、Ｗａｌｐｏｒｔ  Ｍら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）、第３章および第６章に詳細に述べられている。
【００３１】
Ｔ細胞は、ＴＣＲポリペプチド（たとえばα、β、γまたはδ鎖）、ＣＤ３ポリペプチド（たとえばγ、δまたはε鎖）、ＣＤ８、およびＣＤ４の１つまたは複数の表面発現を参照して特徴付けされる。所与のポリペプチドの表面発現は当技術で周知の種々の方法、たとえば免疫組織化学、免疫細胞化学、およびフローサイトメトリー等の抗体に基づく方法によって測定することができる。
【００３２】
本発明の方法によって増殖したＴ細胞は、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は細胞毒性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の方法はウイルスに特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびヘルパーＴリンパ球の集団を発生および／または増殖させるためのものである。
【００３３】
ＣＴＬはパーフォリン、グランザイム、グラニュリシン等の細胞毒性因子を放出することによって、および／またはＴ細胞上に発現したＦＡＳＬを通して感染した細胞にＦＡＳをライゲートすることによる感染細胞のアポトーシスを誘導することによって、ウイルスに感染した細胞における細胞死をもたらすことができる（たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｈａｖｅｚ−Ｇａｌａｎら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００９）、６（１）：１５〜２５頁に記載されている）。細胞毒性はたとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＺａｒｉｔｓｋａｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１）、９（６）、６０１〜６１６頁に概説された方法のいずれかを用いて検討することができる。標的細胞に対するＴ細胞の細胞毒性のアッセイの１つの例は、標的細胞が５１Ｃｒで処理されてこれを内在化する５１Ｃｒ放出アッセイである。Ｔ細胞による標的細胞の溶解によって放射活性５１Ｃｒが細胞培養上清中に放出され、これを検出することができる。
【００３４】
ＡＰＣによって提示されるウイルスのペプチドはウイルス粒子から誘導でき、またはウイルスの核酸によってコードされる。本明細書で用いる場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸モノマーの鎖を意味し、その長さは５０アミノ酸またはそれより少ない。
【００３５】
ウイルスのペプチドはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩの分子によって提示される。ＭＨＣクラスＩ分子はα鎖およびβ２ミクログロブリンのヘテロダイマーである。α鎖はα１、α２およびα３と指定される３つのドメインを有する。α１およびα２ドメインはともに溝を形成し、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されたペプチドがこれに結合してペプチド−ＭＨＣ複合体を形成する。ＭＨＣクラスＩα鎖は多形であり、異なったα鎖は異なったペプチドと結合してこれを提示することができる。ＭＨＣクラスＩ分子と同様に、ＭＨＣクラスＩＩ分子もヘテロダイマーであり、α鎖およびβ鎖からなっている。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩα鎖、ならびにＭＨＣクラスＩＩαおよびβ鎖は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によってコードされている。
【００３６】
本開示によるウイルスに特異的なＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され、Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスのペプチドに結合することができるＴＣＲを含む。
【００３７】
Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス（たとえばアデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ｓｓＲＮＡウイルス（たとえばパルボウイルス）、ｄｓＲＮＡウイルス（たとえばレオウイルス）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（たとえばピコルナウイルス、トガウイルス）、（−）ｓｓＲＮＡウイルス（たとえばオルソミキソウイルス、ラブドウイルス）、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（たとえばレトロウイルス）またはｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（たとえばヘパドナウイルス）であってよい。本開示はアデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、ヘペウイルス科、レトロウイルス科、オルソミキソウイルス科、アレナウイルス科、ブニアウイルス科、フィロウイルス科、パラミキソウイルス科、ラブドウイルス科およびレオウイルス科のウイルスファミリーを意図している。
【００３８】
疾患または障害に関連するウイルスが特に目的となる。したがって、以下のウイルス、アデノウイルス、ヘルペスシンプレックスタイプ１ウイルス、ヘルペスシンプレックスタイプ２ウイルス、バリセラゾスターウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルスタイプ８、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、リノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、ルベラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハンターンウイルス、エボラウイルス、マルブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルチウイルス、およびバンナウイルスが意図される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ウイルスはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）である。したがって、いくつかの実施形態では、本方法はＥＢＶに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるためのものである。いくつかの実施形態では、ＥＢＶはＢ９５−８、Ｐ３ＨＲ−１株、またはそれらの誘導体である。
【００４０】
本発明では、ウイルスペプチドは抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって提示される。ＡＰＣは分子機械によってポリペプチドを処理してペプチドにし、これが次にＭＨＣ分子と会合して細胞表面においてペプチド−ＭＨＣ複合体として提示される。異なったＴＣＲは異なったペプチド−ＭＨＣ複合体と結合する異なった能力、したがってこれらとの異なった反応性を示す。
【００４１】
ウイルスのペプチド／ポリペプチドは処理されてＭＨＣ分子との複合体の中に提示される。ＭＨＣ上の抗原の処理、負荷および提示は、たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ  Ｊｒ、Ｔｒａｖｅｒｓ  Ｐ、Ｗａｌｐｏｒｔ  Ｍら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）第５章に詳細に述べられている。
【００４２】
異なった種類のＴ細胞はＭＨＣ−ペプチド複合体の認識によりＴＣＲを通して活性化される。ＣＤ８＋Ｔ細胞はペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を認識する一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体を認識する。Ｔ細胞の活性化には、それに対するＴ細胞のＴＣＲがＡＰＣからの陽性の共刺激シグナルに関連する高い親和性を有するＭＨＣ−ペプチド複合体の結合が必要である。Ｔ細胞の活性化のプロセスは当業者には周知であり、たとえば参照により全体として組み込まれるＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ  Ｊｒ、Ｔｒａｖｅｒｓ  Ｐ、Ｗａｌｐｏｒｔ  Ｍら、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１）、第８章に詳細に述べられている。
【００４３】
本発明によるＡＰＣはプロフェッショナルＡＰＣであってよい。プロフェッショナルＡＰＣは抗原をＴ細胞に提示することに特化しており、細胞表面においてＭＨＣ−ペプチド複合体を処理し提示する効率が高く、高いレベルの共刺激分子を発現する。プロフェッショナルＡＰＣには樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、およびＢ細胞が含まれる。非プロフェッショナルＡＰＣはＭＨＣ−ペプチド複合体をＴ細胞に、特にＭＨＣクラスＩ−ペプチド複合体をＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することができる他の細胞である。
【００４４】
本発明に関連して、ＡＰＣはＴ細胞がそれに対して特異的なＴＣＲを含むウイルスに感染した、またはそのペプチドを含むもしくは発現する任意の細胞であってよい。ウイルスに感染した、またはそのペプチドを含むもしくは発現する細胞は、細胞表面におけるＭＨＣ分子と関連するウイルスのペプチドを提示してよい。
【００４５】
本明細書における「ペプチド」への言及は、複数のペプチドを包含することが理解されよう。たとえば、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣは、ウイルスの複数のペプチドを提示してよい。
【００４６】
ＡＰＣは、Ｔ細胞のＴＣＲがそれに対して特異的であるウイルスのペプチドを提示することができるＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子をコードするＨＬＡアレレを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡＰＣはＴ細胞のＴＣＲによって認識されるウイルスペプチドとＨＬＡマッチしてよい。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＡＰＣはウイルス感染の結果としてウイルスのペプチドを発現しまたは含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡＰＣはウイルスのペプチドを含みまたは発現するように改変されていてよい。たとえば、いくつかの実施形態では、細胞はウイルスのペプチドをコードする核酸を含むように改変されてよく、またはウイルスのペプチドでパルスされていてよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ウイルスペプチドはペプチド混合物のライブラリーでＡＰＣに提供されてよく、これはペップミックスと称される。いくつかの実施形態では、ＡＰＣに曝露するための種々のペップミックスのプールがある。ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣは、ある種のウイルスペプチドに特異的なＴ細胞の刺激をもたらすように、ある条件下で末梢血Ｔ細胞に曝露されてよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ＡＰＣはＢ細胞であるか、Ｂ細胞から誘導される。特定の実施形態では、ＡＰＣはリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）の細胞であってよい。
ＬＣＬはＢ細胞のウイルス形質転換によって調製することができる。ＬＣＬは典型的にはエプスタインバーウイルスによるＢ細胞の形質転換によって産生される。ＬＣＬの発生および特徴は、たとえば参照により両方とも全体として本明細書に組み込まれるＨｕｉ−Ｙｕｅｎら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ（２０１１）、５７：３３２１頁およびＨｕｓｓａｉｎ、Ｍｕｌｈｅｒｋａｒ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄ（２０１２）、  １（２）：７５〜８７頁に詳細に述べられている。簡単に述べると、ＬＣＬはＥＢＶを産生する細胞、たとえばＢ９５−８細胞の濃縮細胞培養上清とともにシクロスポリンＡの存在下でＰＢＭＣをインキュベーションすることによって産生することができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＡＰＣはＴ細胞の集団がそれから発生または増殖した対象と同じ対象から得られた細胞から得られ、またはそれから誘導される。即ち、いくつかの実施形態では、ＡＰＣとＴ細胞とは自己起源である。いくつかの実施形態では、ＡＰＣはＴ細胞の集団がそれから発生または増殖した対象とは異なる対象から得られた細胞から得られ、またはそれから誘導される。即ち、いくつかの実施形態では、ＡＰＣとＴ細胞とは異種起源である。
【００５１】
本発明によるいくつかの実施形態では、ＡＰＣは、ＥＢＶによるＢ細胞の形質転換によって調製されるＬＣＬであり、Ｂ細胞は本発明の方法において用いるＴ細胞と同じ対象から得られる。いくつかの実施形態では、ＬＣＬはＴ細胞がそれから得られた対象とは異なる対象から得られたＢ細胞の形質転換によって調製される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ＬＣＬの調製に用いるＢ細胞は、本発明によるウイルスに特異的なＴ細胞の集団がそれから発生しおよび／または増殖した末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）の集団と同じ個体から得られたＰＢＭＣの集団から得られる。いくつかの実施形態では、ＬＣＬの調製に用いるＢ細胞は、本発明によるウイルスに特異的なＴ細胞の集団がそれから発生しおよび／または増殖したＰＢＭＣの同じ集団から得られる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ＡＰＣ（たとえばＬＣＬ）は、Ｔ細胞の存在下における培養の前にその増殖を防止するために物質（たとえばマイトマイシンＣ）とともに照射されまたは処理される。本方法によるＬＣＬの照射は、典型的には６０００〜１２０００ラッドである。
【００５４】
本方法はウイルスに特異的なＴ細胞の発生／増殖のための従来の方法と比べてより短い時間で多数のウイルスに特異的なＴ細胞を産生するために有用である。特に、本方法はウイルスによって引き起こされまたは増悪される疾患、またはウイルスによる感染が危険因子である疾患の治療または予防のためのウイルスに特異的なＴ細胞の養子免疫伝達のために多数のウイルスに特異的なＴ細胞を産生させるために有用である。
【００５５】
たとえば、本方法がＥＢＶに特異的なＴ細胞の集団を発生および／または増殖させるためであれば、細胞はたとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｈｉａ  ＷＫら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１４）、２２（１）：１３２〜１３９頁に記載されたように、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）等のＥＢＶ関連障害を養子免疫伝達によって治療するために有用である。
【００５６】
Ｔ細胞の養子免疫伝達は一般に、典型的には血液試料を採取することによって対象からＴ細胞を得るプロセスを意味する。次いでＴ細胞は典型的にはある方法で処置されまたは変化させられ、同じ対象に返還されるか、または異なった対象に導入される。処置は典型的にはある所望の特徴を有するＴ細胞の集団を対象に提供すること、またはその対象におけるそのような特徴を有するＴ細胞の頻度を増加させることを目的とする。ウイルスに特異的なＴ細胞の養子免疫伝達は、たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＣｏｂｂｏｌｄら（２００５）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２：３７９〜３８６頁およびＲｏｏｎｅｙら（１９９８）、Ｂｌｏｏｄ  ９２：１５４９〜１５５５頁に記載されている。
【００５７】
本明細書において対象はヒトであってよい。いくつかの実施形態では、対象は非ヒト哺乳類（たとえばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたはその他のげっ歯類（げっ歯目に含まれる任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、たとえば乳牛またはウシ目に含まれる任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目に含まれる任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類）であってよい。
Ｔ細胞を刺激するステップ
本発明において、Ｔ細胞の集団は発生しおよび／または増殖する。本方法は一般にＴ細胞を刺激するステップを含み、それにより細胞分裂が起こり、したがってその数が増加する。
【００５８】
Ｔ細胞の集団は刺激および結果として生じる細胞分裂によって単一のＴ細胞から発生し得る。存在するＴ細胞の集団は刺激および結果としてのＴ細胞の集団の細胞の細胞分裂によって増殖し得る。
【００５９】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣはウイルスに特異的なＴ細胞（即ち、ＡＰＣによって提示されたウイルスペプチドを認識することができるＴＣＲを有するＴ細胞）を優先的に刺激し、したがって刺激はたとえばウイルスに特異的なＴＣＲを含まない／発現しない他のＴ細胞よりもこれらの細胞の細胞分裂および増殖を引き起こす。したがって刺激の終了時における細胞の集団は、刺激前の細胞の集団に比べてウイルスに特異的なＴ細胞の数が多くなる。即ち、刺激の後ではウイルスに特異的なＴ細胞が細胞の集団の中で増加した頻度で存在する。このようにして、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団が、異なった特異性を有するＴ細胞の不均一な集団の中で増殖し／発生する。
【００６０】
Ｔ細胞は刺激されて活性化の後の細胞分裂によって増殖する。上記のように、Ｔ細胞の活性化はＴ細胞のＴＣＲがＡＰＣからの陽性の共刺激シグナルに関連する高い親和性を有するＭＨＣ−ペプチド複合体と結合することによって起こる。活性化によってＴ細胞はＩＬ−２を産生するように誘導され、これが細胞分裂を促進する。Ｔ細胞の活性化はＩＬ−２レセプターの発現をも上方調節し、したがって活性化されたＴ細胞の増殖は自己分泌型で促進される。
【００６１】
本発明の方法は、Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスのペプチドを提示するＡＰＣを用いてＴ細胞を刺激しおよび再刺激するステップを含む。刺激ＡＰＣはＴ細胞がそれに対して特異的であるＴＣＲを含むウイルスに感染し、またはそのペプチドを含みもしくは発現し、ＭＨＣ分子と関連してウイルスペプチドを提示する。刺激により細胞分裂が促進され（即ちＴ細胞の増殖が引き起こされ）、それによりウイルスに特異的なＴ細胞の集団が発生しおよび／または増殖する。
【００６２】
ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を「刺激する」および／または「再刺激する」ステップを含む方法ステップは、本明細書において「刺激ステップ」と称される。本発明による刺激ステップに関連するＴ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの培養は、本明細書において「刺激培養」と称される。本開示から明らかになるように、刺激ステップの刺激培養は、細胞培養培地を含む培地、多くの場合には馴化培地をも含む培地中における培養中の細胞を含む。
【００６３】
本発明の方法によってＴ細胞を刺激するステップは、ＡＰＣの存在下のＴ細胞の培養、即ちＴ細胞とＡＰＣとの共培養を含む。共培養は典型的にはインビトロまたはエクスビボで実施される。
【００６４】
本方法において、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団は、典型的にはＰＢＭＣの集団から発生し、またはこれから増殖する。したがって、本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＡＰＣの存在下の培養によって刺激されたＴ細胞は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および／または単球等の他のＰＢＭＣとともに培養中に存在する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の集団は白血球の集団から発生し、またはこれから増殖し、したがってＢ細胞、ＮＫ細胞、単球、好中球、好酸球および／または好塩基球等の、Ｔ細胞以外の白血球とともに培養中に存在してよい。
【００６５】
ウイルスに特異的なＴ細胞の集団がそれから発生し、または増殖する細胞の集団は、本明細書において「レスポンダー」と称され、ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣは本明細書において「スティミュレーター」と称される。いくつかの実施形態では、本方法の刺激ステップは「レスポンダー」と「スティミュレーター」を、本明細書において「レスポンダーとスティミュレーターとの比」と称される特定の比率で提供する。上記から明らかになるように、いくつかの実施形態では、本明細書で用いる「レスポンダー」はＰＢＭＣの集団を意味する。いくつかの実施形態では、「レスポンダー」はＴ細胞、または白血球の集団を意味する。
【００６６】
初期刺激ステップにおいて、「レスポンダー」は、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団がそれから発生しおよび／または増殖するＴ細胞を含む細胞の集団である。初期刺激の「レスポンダー」は、たとえばＴ細胞の集団、リンパ球の集団、白血球の集団、またはＰＢＭＣの集団であってよい。特定の実施形態では、初期刺激の「レスポンダー」はＰＢＭＣの集団である。
【００６７】
初期刺激ステップに続く刺激ステップ（即ちＴ細胞を再刺激するステップ）において、「レスポンダー」は先行する刺激ステップの終了時における細胞、たとえば先行する刺激ステップの終了時に収集された細胞である。後続の刺激ステップの「レスポンダー」には、分裂するように刺激された細胞を含む、先行する刺激ステップの終了時における培養中の生きた細胞が含まれることになる。
【００６８】
たとえば、以下のステップ
（ｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、および
（ｉｉｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を再刺激するステップであって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとの刺激培養から得られた馴化培地である、ステップ
を含む方法において、
ステップ（ｉｉｉ）の刺激の「レスポンダー」は、ステップ（ｉｉ）で収集された細胞である。
【００６９】
「レスポンダーとスティミュレーターとの比」は、所与の刺激ステップの初めにおける細胞の相対的な数、即ち刺激ステップの開始時に培養に提供された細胞の比を意味することが理解されよう。
【００７０】
いくつかの実施形態では、再刺激ステップの「レスポンダー」はＴ細胞以外の細胞、たとえば上記のような他のＰＢＭＣまたは白血球を含んでよい。たとえば、本発明による方法の初期刺激ステップのレスポンダーがＰＢＭＣである実施形態では、前記初期刺激ステップの終了時に収集される細胞は、Ｔ細胞以外のＰＢＭＣまたは白血球を含んでよい。
【００７１】
ウイルスに特異的なＴ細胞を増殖させるための多重刺激ステップを含む方法は当業者には周知である。典型的な培養条件（即ち細胞培養培地、添加剤、温度、気体雰囲気）、レスポンダーとスティミュレーターとの比、刺激ステップの培養期間等は、たとえば両方とも参照により全体として本明細書に組み込まれるＢｏｌｌａｒｄら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００４）、２００（１２）：１６２３〜１６３３頁およびＳｔｒａａｔｈｏｆら、Ｂｌｏｏｄ（２００５）、１０５（５）：１８９８〜１９０４頁を参照することによって容易に決定することができる。
【００７２】
本発明による刺激ステップにおけるＴ細胞とＡＰＣとの共培養は細胞培養培地中で実施される。細胞培養培地は本発明によるＴ細胞およびＡＰＣがその中でインビトロ／エクスビボ培養中に維持される任意の培地であってよい。リンパ球の培養における使用に好適な培養培地は当業者には周知であり、たとえばＡＩＭ−Ｖ培地、イスコーブ培地、およびＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「細胞培養培地」は「馴化培地」と区別される。本開示の充足度から明らかになるように、本発明によるＴ細胞およびＡＰＣを含む培養は、（たとえば初期刺激ステップにおいて）実質的に細胞培養培地のみを用いて確立することができ、または（たとえば後続の刺激ステップにおいて）細胞培養培地および馴化培地の両方を含んでもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地はＲＰＭＩ−１６４０培地および／またはクリック培地（イーグルハムアミノ酸（ＥＨＡＡ）培地としても知られる）を含んでよい。これらの培地の組成は当業者には周知である。ＲＰＭＩ−１６４０培地の処方はたとえばＭｏｏｒｅら、ＪＡＭＡ（１９６７）、１９９：５１９〜５２４頁に記載されており、クリック培地の処方はＣｌｉｃｋら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９７２）、３：２６４〜２７６頁に記載されている。ＲＰＭＩ−１６４０培地はたとえばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手でき、クリック培地はたとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログＮｏ．Ｃ５５７２）から入手できる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地はＲＰＭＩ−１６４０培地とクリック培地を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は（体積で）２５〜６５％のＲＰＭＩ−１６４０培地と２５〜６５％のクリック培地を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は３０〜６０％のＲＰＭＩ−１６４０培地と３０〜６０％のクリック培地を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は３５〜５５％のＲＰＭＩ−１６４０培地と３５〜５５％のクリック培地を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地と４０〜５０％のクリック培地を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は４５％のＲＰＭＩ−１６４０培地と４５％のクリック培地を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は１つまたは複数の細胞培養培地添加剤を含んでよい。細胞培養培地添加剤は当業者には周知であり、抗生物質（たとえばペニシリン、ストレプトマイシン）、血清（たとえばウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、Ｌ−グルタミン、サイトカイン／成長因子等を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は（体積で）５〜２０％のＦＢＳ、７．５〜１５％のＦＢＳ、または１０％のＦＢＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は１〜５ｍＭのＬ−グルタミン、１．５〜３ｍＭのＬ−グルタミンまたは２ｍＭのグルタミンを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、刺激ステップのための細胞培養培地はＩＬ−２を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２が添加される（本明細書では「添加されたＩＬ−２」と称する）。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は外因性、即ち培養細胞によって産生されないＩＬ−２でよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ−２は組み換えＩＬ−２でよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明による刺激ステップの細胞培養培地は、最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌ、１５〜１７５ＩＵ／ｍｌ、２０〜１５０ＩＵ／ｍｌ、３０〜１２５ＩＵ／ｍｌ、または４０〜１００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む。最終濃度は刺激ステップの培養中の培地の全体積における濃度である（細胞培養培地、および任意の馴化培地を含む）。
【００８０】
いくつかの特定の実施形態では、細胞培養培地は４０〜５０％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％のクリック培地、５〜２０％のＦＢＳ、１〜５ｍＭのＬ−グルタミン、および最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は４２．５〜４７．５％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４２．５〜４７．５％のクリック培地、７．５〜１５％のＦＢＳ、１．５〜３ｍＭのＬ−グルタミン、および最終濃度２０〜１５０ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は４５％のＲＰＭＩ−１６４０培地、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および最終濃度４０〜１００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む。
【００８１】
本発明による刺激ステップは、典型的にはＴ細胞とＡＰＣとの所定時間の共培養を含む。適切には、時間は少なくともＡＰＣがＴ細胞を刺激して細胞分裂を起こさせるために十分に長い。いくつかの実施形態では、時間は刺激および少なくとも刺激されたＴ細胞の単一の細胞分裂のために十分に長い。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法による刺激ステップは、Ｔ細胞とＡＰＣとの少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも３６時間、少なくとも７２時間、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日のうちの１つの期間の培養を含む。いくつかの実施形態では、刺激ステップはＴ細胞とＡＰＣとの２０日以内、１４日以内、１３日以内、１２日以内、１１日以内、１０日以内、９日以内、８日以内、７日以内、６日以内、５日以内、４日以内、または７２時間以内のうちの１つの期間の培養を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法による刺激ステップは、Ｔ細胞とＡＰＣとの２４時間〜２０日、４８時間〜１４日、および３〜１２日のうちの１つの期間の培養を含む。いくつかの実施形態では、刺激ステップはＴ細胞とＡＰＣとの７〜１４日、８日〜１３日、および９〜１２日のうちの１つの期間の培養を含む。いくつかの実施形態では、刺激ステップはＴ細胞とＡＰＣとの１〜８日、２日〜６日、および３〜４日のうちの１つの期間の培養を含む。
【００８４】
刺激ステップは、典型的には培養中の細胞を、細胞がその中で培養されていた培地から分離することによって終了される。いくつかの実施形態では、本方法は刺激ステップの終了時に細胞を収集する（即ち先行する刺激ステップの終了時に得られた細胞を収集する）ステップを含む。刺激ステップの終了はそのステップの培養期間によって決定される。たとえばウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における７日の培養によってＴ細胞を刺激するステップを含む方法ステップは、７日の培養期間の終了時に細胞を収集することによって終了される。
【００８５】
本発明による方法のいくつかの実施形態では、刺激ステップはたとえば細胞培養培地の添加によって培養を希釈することによって終了される。そのような実施形態では細胞の収集は必要なく、本発明による再刺激ステップは、再刺激ステップのための細胞培養培地、馴化培地（および任意の添加剤）の所望の百分率／濃度を達成するために適切な量で細胞培養培地（および本明細書に記載した任意の他の添加剤）を添加することによって確立される。
【００８６】
刺激ステップの培養期間の終了時に、細胞は細胞培養上清から収集され、分離される。懸濁培養で増殖した細胞（リンパ球等）については、細胞は遠心分離によって収集され、細胞培養上清が細胞ペレットから分離される。次いで細胞ペレットは、たとえばさらなる刺激ステップのために細胞培養培地中で再懸濁される。いくつかの実施形態では、細胞は収集の後に洗浄ステップを受ける。洗浄ステップはリン酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ）等の等張緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁するステップ、遠心分離によって細胞を収集するステップ、および上清を廃棄するステップを含んでよい。
【００８７】
本発明によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生および／または増殖させるための方法は、典型的には単一を超える刺激ステップを含む。本発明による方法において実施される刺激ステップの数に上限はない。いくつかの実施形態では、本方法は２、３、４、または５を超える刺激ステップを含む。いくつかの実施形態では、本方法は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の刺激ステップのうちの１つを含む。
【００８８】
本発明による方法における刺激ステップは互いに異なっていてよい。
増殖すべきウイルスに特異的なＴ細胞の頻度は、初期レスポンダー集団（たとえば対象から得られたＰＢＭＣの試料）では極めて低いことがあり、後続のステップではレスポンダー集団中のウイルスに特異的なＴ細胞の頻度は先行する刺激の結果としてより大きくなる。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は後続の（即ち再刺激）ステップよりは初期の刺激ステップにおいて高いレスポンダーとスティミュレーターとの比を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、初期の刺激ステップにおけるレスポンダー／スティミュレーターの比は、１０：１〜８０：１、１５：１〜７０：１、２０：１〜６５：１、２５：１〜６０：１、３０：１〜５０：１、３５：１〜４５：１、または４０：１のうちの１つの範囲である。いくつかの実施形態では、再刺激ステップにおけるレスポンダー／スティミュレーターの比は、１：１〜１０：１、１．５：１〜８：１、２：１〜７：１、２．５：１〜６：１、３：１〜５：１、３．５：１〜４．５：１、または４：１のうちの１つの範囲である。
【００９０】
初期刺激ステップ（即ち本方法の最初の刺激ステップ）は、典型的には後続の刺激ステップの培養期間よりも長い期間のＴ細胞およびＡＰＣの培養を含む。時間が長いことによって、初期刺激のレスポンダー集団における一般に低い頻度からの、ウイルスに特異的なＴ細胞の数の明らかな増加が可能になる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、初期刺激ステップは７〜１４日、８日〜１３日、および９〜１２日のうちの１つの期間の、Ｔ細胞とＡＰＣとの培養を含む。いくつかの実施形態では、後続の刺激ステップは、１〜８日、２日〜５日、および３〜４日のうちの１つの期間の、Ｔ細胞とＡＰＣとの培養を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、初期刺激ステップの培養は添加されたＩＬ−２を含まなくてよく、一方後続の刺激ステップの培養は添加されたＩＬ−２を含んでよい。
いくつかの実施形態では、本方法は初期刺激ステップおよびそれに続く１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４回の後続の刺激ステップを含む。いくつかの実施形態では、後続の刺激ステップのそれぞれは、同じまたは同様の期間のＴ細胞とＡＰＣとの培養を含む。いくつかの実施形態では、後続の刺激ステップのそれぞれは、同じまたは同様のレスポンダーとスティミュレーターとの比でのＴ細胞とＡＰＣとの培養を含む。いくつかの実施形態では、後続の刺激ステップのそれぞれの培養は、同じまたは同様の最終濃度で添加したＩＬ−２を含む。
【００９３】
便利には、本開示による細胞の培養は３７℃で５％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で維持される。培養は、培養の体積に適した任意の容器において、たとえば細胞培養プレートのウェル、細胞培養フラスコ、バイオリアクター、その他において実施することができる。本発明による細胞培養の細胞は、当業者には容易に決定されるように、任意の好適な密度で確立され、および／または維持されてよい。たとえば、培養は培養のｍｌあたり約０．５×１０６〜約５×１０６個（たとえば約１×１０６個の細胞／ｍｌ）の初期密度で確立される。
【００９４】
細胞は任意の好適な細胞培養容器で培養される。本発明の種々の態様による方法のいくつかの実施形態では、細胞はバイオリアクター中で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は参照により全体として本明細書に組み込まれるＳｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｄｕｄｌｅｙ、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１２）、１（８）：１４３５〜１４３７頁に記載されたバイオリアクター中で培養される。いくつかの実施形態では、細胞はＧＲｅｘ細胞培養容器、たとえばＧＲｅｘフラスコまたはＧＲｅｘ１００バイオリアクター中で培養される。
馴化培地
本発明は馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）中における細胞の培養を含む。「馴化培地」は、細胞培養培地中における細胞の培養によって得られた培地を意味する。馴化培地は培養された細胞から分泌された／放出された因子（たとえばサイトカイン、ケモカイン、増殖因子、その他）を含む。馴化培地は培地を馴化するために十分な時間、培養培地中で細胞を培養し、次いで馴化培地を収集することによって産生される。
【００９５】
本発明による刺激ステップの培養は、細胞培養培地と馴化培地の混合物を含んでよい。即ち、刺激培地の（たとえば刺激ステップの）細胞がその中で確立され培養される培地は、細胞培養培地と馴化培地の両方を含んでよい。馴化培地と新鮮培地の混合物を用いることにより、培養中の細胞に有利な、より複雑な栄養混合物が得られる。
【００９６】
馴化培地の組成は、細胞、時間、培養条件、任意の添加剤の使用および馴化培地がそれから得られる培養のために用いる細胞培養培地の組成に依存することになると理解されよう。
【００９７】
本発明では、馴化培地はＴ細胞とＡＰＣとを含む刺激培養から得られる。
いくつかの実施形態では、本方法による刺激培養の細胞培養培地および馴化培地は、馴化培地が馴化されていること以外は同じであってよい。
【００９８】
本発明の方法によるいくつかの実施形態では、馴化培地は本明細書に記載した任意の実施形態による刺激ステップの培養から得られる。
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの終了時で収集される。便利には、馴化培地は刺激ステップの終了時で、細胞を収集する時に収集される。たとえば本発明による馴化培地は、本明細書に記載したように、刺激ステップの終了時に細胞を収集するための遠心分離によって得られる上清から得られる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明による刺激ステップの培養（即ち刺激培養）に含まれる馴化培地は、本明細書に記載したように刺激ステップの培養から得られる。いくつかの実施形態では、馴化培地は初期刺激ステップ（即ち本発明による方法の最初の刺激ステップ）の培養から得られない。
【０１００】
培地を馴化するための適切な培養期間は、既知の方法に基づいて当業者によって決定され得る。典型的には、培地は約１時間〜約８日、たとえば約１日〜８日、２日〜５日、または３〜４日の間、馴化されることになる。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明による馴化培地は、
（１）Ｔ細胞がそれに対して特異的であるウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下におけるウイルスに特異的なＴ細胞の刺激培養；
（２）１〜８日、２日〜６日、および３〜４日のうちの１つの培養期間の後の（１）による刺激培養；
（３）レスポンダー：スティミュレーターの比が、１：１〜１０：１、１．５：１〜８：１、２：１〜７：１、２．５：１〜６：１、３：１〜５：１、３．５：１〜４．５：１、または４：１のうちの１つにおける（１）または（２）による刺激培養；
（４）刺激培養に用いる細胞培養培地が３０〜６０％のＲＰＭＩ−１６４０培地および／または３０〜６０％のクリック培地および／または５〜２０％のＦＢＳおよび／または１〜５ｍＭのＬ−グルタミンを含む、（１）から（３）のいずれか１つによる刺激培養；
（５）最終濃度１０〜２００ＩＵ／ｍｌ、１５〜１７５ＩＵ／ｍｌ、２０〜１５０ＩＵ／ｍｌ、３０〜１２５ＩＵ／ｍｌ、または４０〜１００ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む、（１）から（４）のいずれか１つによる刺激培養；
（６）（１）から（５）のいずれか１つによる刺激培養から得られた少なくとも１０％の馴化培地をさらに含む、（１）から（５）のいずれか１つによる刺激培養；
（７）ＡＰＣがＬＣＬ、たとえばＥＢＶで形質転換されたＬＣＬである、（１）から（６）のいずれか１つによる刺激培養
から得られる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、所与の刺激ステップの培養に含まれる馴化培地は、同じ方法の別の異なった刺激ステップの培養から得てもよい。たとえば、本発明による方法の第３の刺激ステップの培養に含まれる馴化培地は、第２の刺激ステップの培養から得てもよい。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、刺激ステップの培養に含まれる馴化培地は、本方法の先行する刺激ステップの培養から得てもよい。たとえば、第３の刺激ステップの培養に含まれる馴化培地は、第２の刺激ステップの培養から得てもよく、第４の刺激ステップの培養に含まれる馴化培地は、第３の刺激ステップの培養から得てもよい、等々である。
【０１０４】
本発明による方法の実施形態では、全ての刺激ステップが馴化培地を含む培地中の培養を含むわけではない。たとえば、いくつかの実施形態では、本方法による初期刺激ステップの培養は、馴化培地を含まない。
【０１０５】
馴化培地を含む刺激ステップの培養は、刺激ステップの培養中の培地の全体積の少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも７．５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のうちの１つの量（体積で）で馴化培地を含んでよい。残りの体積は任意の添加剤を含む、本明細書に記載した細胞培養培地で補ってよい。いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の少なくとも１０％を占めてよい。
【０１０６】
馴化培地は増殖因子およびサイトカインに富んでいるが、これはたとえば培地中で培養された細胞による消費のため、馴化していない同等の細胞培養培地に比べると典型的にはたとえばアミノ酸およびグルコースの濃度が低い。馴化培地は、培地を馴化するために用いた細胞の老廃物をも含んでいることがある。これらの因子は細胞の増殖および分裂に悪影響を有し得るので、本発明による刺激ステップの刺激培養中の培地の１００％が、馴化培地でないことが重要である。いくつかの実施形態では、馴化培地を含む刺激ステップの培養は、刺激ステップの培養中の培地の全体積の１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、または１５％未満のうちの１つの量（体積で）の馴化培地を含んでよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の３０％まで、２５％まで、２０％までまたは１５％までを占めてよい。
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の５〜７０％、７．５〜７０％、１０〜７０％、１０〜６５％、１０〜６０％、１２．５〜５５％、１５〜５０％、１５〜４５％、１５〜４０％、１７．５〜４５％、２０〜４０％、２０〜３５％、または２０〜３０％のうちの１つを占めてよい。いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の２０〜３０％を占めてよい。いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の１０〜２５％、好ましくは約１５％を占めてよい。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の５〜３０％、５〜２７．５％、５〜２５％、５〜２２．５％、５〜２０％、または５〜１７．５％のうちの１つを占めてよい。いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の７．５〜３０％、１０〜３０％、または１２．５〜３０％のうちの１つを占めてよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の５〜３０％、１０〜２５％、１０〜２０％、１２．５〜１７．５％、または約１５％のうちの１つを占めてよい。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養中の培地の全体積の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％または３０％のうちの１つを占めてよい。
【０１１１】
培養培地は１倍処方または濃縮処方、たとえば２倍〜２５０倍濃縮培地処方であってよい。１倍処方では、培地中のそれぞれの成分は、細胞培養のために意図した濃度である。濃縮処方では、成分の１つまたは複数は、細胞培養に意図した濃度より高い濃度で存在する。濃縮培養培地は当技術では公知である。培養培地は既知の方法、たとえば塩沈降または選択的濾過によって濃縮することができる。濃縮培地は使用のために水（好ましくは脱イオンおよび蒸留した水）または任意の適切な溶液、たとえば食塩水溶液、水性緩衝液または培養培地で希釈してよい。
【０１１２】
表示した百分率は馴化培地の１倍処方に関して作られたことは認識されよう。当業者であれば、馴化培地の１倍処方の１０％を含む培養は、馴化培地の１０倍濃縮処方の１％を含む培養と等価であることが理解される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、馴化培地は刺激ステップの培養から収集され、たとえば−８０℃で保存されてよい。保存された馴化培地は次いで解凍され、本発明による方法で用いられる。いくつかの実施形態では、馴化培地はたとえば濾過によって細胞または破片を除去するために処理される。
本方法の特定の例示的実施形態
本発明によれば、本方法のいくつかの特定の例示的実施形態が提供される。以下の特定の実施形態は純粋に説明の目的のためであり、上に述べた種々の特徴がどのように組み合わされるかを示すためで、いかなる方法でも本発明を限定することを意図していない。
【０１１４】
ＥＢＶに特異的なＴ細胞（たとえばＣＴＬ）の集団を発生もしくは増殖させるための方法、またはその増殖の速度を加速するための方法であって、
（ａ）４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、
（ｂ）４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１（たとえば４：１）での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下における１〜８（たとえば３〜４）日の培養によって（たとえばＰＢＭＣの集団中の）Ｔ細胞を刺激するステップを含む方法によって得られた少なくとも１０％（たとえば１０％〜７０％）の馴化培地、ならびに
（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２
を含む培地中で、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１（たとえば４：１）での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下における１〜８（たとえば３〜４）日の培養によって（たとえばＰＢＭＣの集団中の）Ｔ細胞を刺激するステップを含む方法。
【０１１５】
ＥＢＶに特異的なＴ細胞（たとえばＣＴＬ）の集団を発生または増殖させるための方法であって、
（ｉ）４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が１０：１〜８０：１（たとえば４０：１）での、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下における７〜１４（たとえば９〜１２）日の培養によって（たとえばＰＢＭＣの集団中の）Ｔ細胞を刺激するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で収集した細胞を、４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含み、最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌでＩＬ−２を添加した細胞培養培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１（たとえば４：１）で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下で１〜８（たとえば３〜４）日培養することによってＴ細胞を再刺激するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）によって得られた細胞を収集するステップ、ならびに
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で収集した細胞を、（ａ）４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）ステップ（ｉｉｉ）の終了時で得られた少なくとも１０％（たとえば１０％〜７０％）の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１（たとえば４：１）で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下で１〜８（たとえば３〜４）日培養することによってＴ細胞を再刺激するステップを含む、
方法。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本方法は、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）によって得られた細胞を収集するステップ、ならびに
（ｖｉｉ）ステップ（ｖｉ）で収集した細胞を、（ａ）４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）ステップ（ｖ）の終了時で得られた少なくとも１０％（たとえば１０％〜７０％）の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１（たとえば４：１）で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下で１〜８（たとえば３〜４）日培養することによってＴ細胞を再刺激するステップをさらに含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本方法は細胞を収集し、収集した細胞を（ａ）４０〜５０％（たとえば４５％）のＲＰＭＩ−１６４０培地、４０〜５０％（たとえば４５％）のクリック培地、５〜２０％（たとえば１０％）のＦＢＳ、および１〜５ｍＭ（たとえば２ｍＭ）のＬ−グルタミンを含む細胞培養培地、（ｂ）先行する刺激ステップの終了時で得られた少なくとも１０％（たとえば１０％〜７０％）の馴化培地、および（ｃ）最終濃度１０〜２００（たとえば４０〜１００）ＩＵ／ｍｌで添加したＩＬ−２を含む培地中、レスポンダーとスティミュレーターとの比が２：１〜７：１（たとえば４：１）で、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ（たとえば照射されたＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ）の存在下で１〜８（たとえば３〜４）日培養することによってＴ細胞を再刺激する追加ステップを含む。
増殖の速度
本方法によって、従来技術の方法に比べて改善されたウイルスに特異的なＴ細胞の集団の増殖速度が達成される。
【０１１８】
Ｔ細胞の集団の増殖速度は、当業者には周知の方法によって解析することができる。方法には、１つまたは複数の時点でＴ細胞の数を測定するステップが含まれる。
たとえば、本発明による方法を実施した後でＴ細胞の数を決定し、その方法の開始前のＴ細胞の数と比較することができ、次いでＴ細胞の数の増殖倍率を計算することができる。
【０１１９】
増殖速度は、ある期間にわたるＴ細胞による細胞分裂を解析することによって決定することもできる。Ｔ細胞の所与の集団についての細胞分裂は、たとえば３Ｈ−チミジンの取り込みのインビトロ解析によって、またはＣＦＳＥ希釈アッセイによって、たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＦｕｌｃｈｅｒ、Ｗｏｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９）、７７（６）、５５９〜５６４頁に記載されているように解析することができる。
【０１２０】
本発明による方法によって達成される増殖速度の改善は、本発明による方法を実施し、その方法におけるＴ細胞の増殖を、馴化培地の存在下における刺激培養のない比較可能な対照方法と比較することによって決定することができる。
【０１２１】
たとえば、増殖速度を２つの方法、（ｉ）ウイルスのペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によってＴ細胞を刺激する本発明による方法であって、細胞が培養される培地の少なくとも１０％が、Ｔ細胞とウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとを含む刺激培養から得られた馴化培地である、方法と、（ｉｉ）馴化培地の代わりに細胞培養培地を用いること以外は同じである比較可能な対照方法との間で比較することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明による方法におけるＴ細胞の集団についての増殖速度は、馴化培地の代わりに細胞培養培地を用いた比較可能な対照方法における増殖速度の少なくとも１．００１倍、１．００２倍、１．００３倍、１．００４倍、１．００５倍、１．００６倍、１．００７倍、１．００８倍、１．００９倍、１．０１倍、１．０２倍、１．０３倍、１．０４倍、１．０５倍、１．０６倍、１．０７倍、１．０８倍、１．０９倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍または２倍のうちの１つである。
【０１２３】
増殖速度はウイルスに特異的なＴ細胞集団の増殖速度であってよく、または全Ｔ細胞集団の増殖速度であってもよい。
増殖した細胞の特性
有利には、本発明の方法によって発生した／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞は、従来技術の方法によって発生した／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞と同じ機能特性を保持している。即ち、促進された増殖速度は増殖したＴ細胞の機能特性に悪影響を及ぼさない。
【０１２４】
たとえば、本方法によってウイルスに特異的なＣＴＬの集団を発生／増殖させる実施形態では、ＣＴＬは、ウイルスに感染し、またはウイルスのペプチドを含む／発現する細胞に対して、馴化培地の存在下における刺激培養のない方法によって増殖させたウイルスに特異的なＣＴＬと同様の細胞毒性を示す。
【０１２５】
増殖したＣＴＬの細胞毒性は、たとえば、増殖したＴ細胞の集団をＴ細胞がそれに対して特異的であるウイルスのペプチドを提示するＡＰＣとともに異なったエフェクター（即ちＴ細胞）／ターゲット（即ちＡＰＣ）比で培養して、ＡＰＣの特異的細胞溶解を測定することによって解析することができる。たとえば、ＥＢＶ特異的ＣＴＬ集団の細胞毒性は、異なったエフェクター／ターゲット比におけるＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ細胞の特異的細胞溶解を測定することによって解析することができる。
治療および予防への応用
本方法には医学的処置の方法における応用がある。処置は処置を必要とする疾患または状態を有する対象に提供される。
【０１２６】
特に、本明細書に記載したように、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生もしくは増殖させるための方法、またはウイルスに特異的なＴ細胞の集団の増殖速度を加速させるための方法を含む、疾患または障害（たとえば癌）を治療しまたは予防するための方法が提供される。
【０１２７】
本発明による疾患または障害を治療しまたは予防する方法は、Ｔ細胞の養子免疫伝達を含んでよい。
１つの態様では、本発明は対象における疾患または障害を治療しまたは予防する方法であって、本方法は
（１）対象からＴ細胞を単離するステップ、
（２）本明細書に記載したようにしてウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップ、および
（３）発生または増殖したＴ細胞の集団を対象に投与するステップ
を含む、方法を提供する。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本方法のステップ（１）でそれからＴ細胞を得る対象は、本明細書に記載した方法によって発生または増殖したＴ細胞の集団が本方法のステップ（３）で投与される対象と同じ対象である（即ち、自己Ｔ細胞の養子伝達免疫）。いくつかの実施形態では、本方法のステップ（１）でそれからＴ細胞を得る対象は、本明細書に記載した方法によって発生または増殖したＴ細胞の集団が本方法のステップ（３）で投与される対象と異なる対象である（即ち、同種Ｔ細胞の養子伝達免疫）。
【０１２９】
上記のステップ（１）によって対象から単離されたＴ細胞は、ＰＢＭＣの集団内のものであってよいことが認識されよう。
いくつかの実施形態では、本方法は以下のステップ：対象から血液試料を採取するステップ、血液試料からＰＢＭＣを単離するステップ、血液試料からＴ細胞を単離するステップ、本明細書に記載した方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップ、Ｔ細胞を改変して、たとえばキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現させるステップ、発生した／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞の集団を収集するステップ、発生した／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞の集団をアジュバント、希釈剤、または担体と混合するステップ、発生した／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞の集団を対象に投与するステップの１つまたは複数を含んでよい。
【０１３０】
本方法は、あらゆる方法によるＴ細胞の改変または処置を含んでよい。たとえば、Ｔ細胞をインビトロまたはエクスビボで改変してキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現させまたは含ませてよい。Ｔ細胞は、当業者には周知の方法で改変することができる。改変は移送された核酸の永久的または一時的発現のための核酸移送を含んでよい。そのような改変には任意の好適な遺伝子エンジニアリングプラットフォームを用いることができる。好適な方法には、たとえば参照により全体として本明細書に組み込まれるＭａｕｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４）、３２：１８９〜２２５頁に記載のガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＤＮＡトランスフェクション、トランスポゾンに基づく遺伝子送達およびＲＮＡトランスフェクション等の遺伝子エンジニアリングプラットフォームの使用が含まれる。
【０１３１】
処置は疾患／障害の予防を目標としてよく、したがって本発明の方法によって発生した／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞を疾患状態の進行に対して予防的に用いてよい。これは疾患状態の症状の発現の前に行なってよく、および／または疾患または障害のリスクが大きくなると考えられる対象に与えてもよい。
【０１３２】
本発明によるＴ細胞の集団の投与、または本発明によるＴ細胞の集団を含む薬学的組成物の投与によって、疾患または障害は治療されまたは予防される。
疾患または状態は、本発明の方法によって発生／増殖したＴ細胞がそれに対して特異的であるウイルスによる感染によって引き起こされまたは増悪する疾患または状態であってよい。いくつかの実施形態では、疾患または状態は本明細書に記載したウイルスによる感染によって引き起こされまたは増悪する疾患または状態であってよい。
【０１３３】
特に、疾患または状態はエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ）またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされまたは増悪する疾患または状態であってよい。
【０１３４】
本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞は、癌の治療または予防のための方法において有用である。したがって、いくつかの実施形態では、疾患または障害の治療または予防の方法は、癌を治療しまたは予防するためである。
【０１３５】
医学的処置の方法は、癌細胞を根絶する免疫システムが本方法のステップによって補助されまたは強化される、ヒト対象における悪性腫瘍を改善し、治療し、または予防する方法による癌の治療を含んでよい。そのような方法は、癌細胞を殺滅するための能動的免疫応答を惹起する（または受動的免疫応答を達成する）、本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞の投与を含む。処置の方法は、化学療法、照射、または手術等の従来の癌治療法と組み合わせた生物学的アジュバント（たとえばインターロイキン、サイトカイン、バシラスコメットゲラン、モノホスホリルリピッドＡ等）の共投与を任意選択で含んでよい。処置の方法は、本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞を、免疫システムを活性化して癌細胞の増殖を予防または破壊することによって機能するワクチンとして投与するステップを含んでよい。医学的処置の方法はインビボ、エクスビボ、ならびに自己および／または異種細胞または不死化細胞株を用いるものを含む養子免疫療法を含んでよい。
【０１３６】
癌は任意の望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖の兆候を示す任意の疾患）、新生物もしくは腫瘍、または望ましくない細胞増殖、新生物もしくは腫瘍のリスクの増大もしくは素因であり得る。癌は良性または悪性であり、一次または二次（転移）であり得る。新生物または腫瘍は細胞の任意の異常な成長または増殖であり、任意の組織に存在し得る。組織の例には、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含み、または含まない）、小脳、頚部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（たとえば腎上皮細胞）、胆嚢、食道、グリア細胞、心臓、回腸、空腸、腎、涙腺、喉頭、肝、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、上顎、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、肋膜、前立腺、唾液腺、Ｓ字状結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、陰門、白血球が含まれる。
【０１３７】
治療すべき腫瘍は神経系または非神経系腫瘍であってよい。神経系腫瘍は中枢または末梢神経系に起源し、たとえば神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫および乏突起膠腫がある。非神経系癌／腫瘍はその他の非神経組織に起源し、その例には黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、肝癌、類表皮癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、膵癌、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液癌および肉腫が含まれる。
【０１３８】
特に、頭頸部癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、口腔咽頭癌（ＯＰＣ）、頚癌（ＣＣ）、消化器／胃癌または肺癌の治療が意図される。
いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶまたはＨＰＶ陽性癌である。いくつかの実施形態では、癌はＥＢＶ陽性ＮＰＣである。いくつかの実施形態では、癌はＨＰＶ陽性ＯＰＣまたはＨＰＶ陽性ＣＣである。
【０１３９】
本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞の投与は、好ましくは「治療または予防に有効な量」であり、これは個体に利益をもたらすために十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療される疾患の性質および重篤度による。治療の処方、たとえば用量の決定等は、一般医およびその他の医師の責任の範囲内であり、典型的には治療すべき障害、個々の患者の病状、送達の部位、投与の方法、および臨床医には既知の他の要素が考慮される。上述の手法およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０版、２０００年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ出版に見ることができる。
【０１４０】
本発明は、本明細書に記載した方法によって発生または増殖したＴ細胞の集団を提供する。したがって、Ｔ細胞の集団が本発明による方法によって得られた、得られる、またはその生成物である、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団が提供される。
【０１４１】
本明細書に記載した疾患または障害の治療または予防のための方法におけるＴ細胞の集団の使用も提供される。
即ち、本発明は疾患または障害の治療または予防における使用のための、Ｔ細胞の集団が本発明による方法によって得られた、得られる、またはその生成物である、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を提供する。
【０１４２】
Ｔ細胞の集団が本発明による方法によって得られた、得られる、またはその生成物である、ウイルスに特異的なＴ細胞の集団を対象に投与するステップを含む、対象における疾患または障害を治療しまたは予防する方法も提供される。
【０１４３】
Ｔ細胞の集団が本発明による方法によって得られた、得られる、またはその生成物であるＴ細胞の集団または本発明による薬学的組成物の、疾患または障害の治療または予防における使用のための医薬またはワクチンの製造における使用も提供される。
薬学的に有用な組成物および医薬
本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞は臨床使用のために製剤化され、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバントを含んでよい。
【０１４４】
本発明によれば、本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞を含む薬学的に有用な組成物の製造のための方法も提供され、そのような製造方法は、本発明の方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生／増殖させるステップ、および／または本発明の方法によって発生／増殖したウイルスに特異的なＴ細胞を薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤と混合するステップから選択される１つまたは複数のステップを含んでよい。
【０１４５】
１つの態様では、本発明は薬学的組成物、医薬またはワクチンを調製する方法であって、本方法は本発明の方法によってウイルスに特異的なＴ細胞の集団を発生または増殖させるステップ、および得られた細胞を薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤と混合するステップを含む、方法を提供する。
【０１４６】
本発明は、本発明によるＴ細胞の集団、および薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤または希釈剤を含む薬学的組成物も提供する。Ｔ細胞の集団は本発明による方法によって得られ、得ることができ、またはその生成物である。
【０１４７】
本発明は、疾患または障害の治療または予防の方法における使用のための、本発明による薬学的組成物を提供する。
本発明による薬学的組成物を対象に投与するステップを含む、対象における疾患または障害を治療または予防する方法も提供される。
【０１４８】
疾患または障害の治療または予防における使用のための医薬またはワクチンの製造における、本発明による薬学的組成物の使用も提供される。
対象
治療の対象は任意の動物またはヒトであってよい。対象は好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。対象は非ヒト哺乳類であってよいが、より好ましくはヒトである。対象は男性または女性であってよい。対象は患者であってよい。
【０１４９】
対象は、治療を必要とする疾患または状態を有すると診断されていてよく、そのような疾患または状態を有する疑いがあってよく、またはそのような疾患または状態が進行するリスクがあってもよい。
キット
本発明の１つの態様ではパーツのキットが提供される。パーツのキットは、本発明によるＴ細胞の集団、または本発明による薬学的組成物を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、キットは本明細書に記載したように疾患または障害を治療しまたは予防するためにＴ細胞の集団または薬学的組成物を用いるための説明書を含んでよい。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、キットは、好ましくは注入によって、より好ましくは自己養子細胞免疫療法の方法における注入による投与のための対象への（たとえば好適な担体、賦形剤、希釈剤、またはアジュバントとの混合による）投与のために処方された本発明の方法によって得られた量のＴ細胞を含む容器を含んでよい。キットは所定の温度、たとえば約４℃未満、約−２℃未満または約−５０℃未満で保存してよい。キットは、キットの保存および／もしくは輸送のため、ならびに／またはＴ細胞の投与のための説明書をさらに含んでよい。
【０１５２】
本発明は記述した態様および好ましい特徴の組合せが明らかに容認できないか、明示的に避けられる場合を除き、このような組合せを含む。
本明細書で用いる項目の見出しは整理のためのみであって、記述した主題を限定すると解釈すべきではない。
【０１５３】
ここで添付した図面を参照し、例として本発明の態様および実施形態を説明する。当業者にはさらなる態様および実施形態は明らかであろう。本明細書に述べる全ての文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
以下の特許請求の範囲を含め、本明細書の全体を通して、文脈によって他が要求されない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という語、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変化は、記載した整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を包含するが、その他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除しないことを意味していると理解されよう。
【０１５５】
本明細書および添付した特許請求の範囲に用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって明らかに他が指示されない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。本明細書において範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表される。そのような範囲が表現された場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行する「約」を用いることによって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することは理解されよう。
【０１５６】
ここで本発明の原理を説明する実施形態および実施例を、添付した図面を参照して考察する。
【実施例】
【０１５７】
以下の実施例で、本発明者らは馴化培地の存在下における培養を含むＥＢＶに特異的なＴ細胞の増殖について述べる。本発明者らは、培養中に含ませる馴化培地の最適百分率を決定するため、および増殖したＣＴＬの細胞毒性活性を確認するための実験について述べる。
【０１５８】
実施例１
馴化培地の最適百分率
Ｔ細胞の増殖のための馴化培地の最適百分率を決定するため、２４ウェルプレートで行なったＴ細胞の増殖において、４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％および６０％の、Ｔ細胞とＬＣＬ細胞の共培養から得た馴化培地と混合する。
【０１５９】
ＬＣＬ細胞との共培養１週間の後、Ｔ細胞の数を計数して播種した細胞の数と比較し、増殖倍率を決定する。
予想される増殖結果を図１Ａに示す。馴化培地の存在下における培養を含む方法によって、Ｔ細胞はより速い速度で増殖する。最大の増殖倍率を得るための、Ｂによる方法ステップにおける馴化培地の最適百分率は、馴化培地２０〜３０％と予想される。
【０１６０】
さらに２人の異なったドナー（ドナー２および３）から得た細胞について同じ実験を行なう。結果はドナー１についてと同様であることが予想され、最大のＴ細胞増殖は馴化培地２０〜３０％で観察される（図１Ｂ参照）。
【０１６１】
Ｔ細胞の大スケールの増殖はＧｒｅｘ−１００培養容器等のバイオリアクターで実施されるので、馴化培地の最適百分率をバイオリアクター培養でさらに検討する。
説明の目的のため、培地２００ｍｌ中、細胞密度１×１０６個／ｍｌで細胞を培養する。培地中、馴化培地の百分率を変動させる。
【０１６２】
【表１】
2019520061.tif 000002
【０１６３】
Ｔ細胞の増殖の予想される結果を図２に示す。馴化培地の最適百分率は２０〜３０％で、ドナーが異なっても一定であることが予想される。
実施例２
ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの発生およびＥＢＶ特異的ＣＴＬの増殖
ＥＢＶ陽性ＮＰＣを有する患者から得た末梢血（４０〜６０ｍＬ）を用いて、ＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球Ｂ細胞株（ＬＣＬ）およびＥＢＶに特異的なＴ細胞の両方を発生させる。
ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬの発生
簡単に述べると、ＬＣＬを発生させるために、１５×１０６個の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を、１μｇ／ｍＬのシクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｏｚ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）の存在下に、Ｂ９５−８培養の濃縮した上清とともにインキュベートして、ＬＣＬを確立する。
【０１６４】
ＬＣＬは刺激に用いる前に（刺激の当日に）６０Ｇｙで照射する。
ＥＢＶに特異的なＴ細胞の増殖
２つの異なった方法によるＥＢＶに特異的なＴ細胞の増殖を比較する。
【０１６５】
両方の方法において、第１の刺激を次のようにして行なう。
・６０×１０６個のＰＢＭＣを４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中に再懸濁し、生存細胞の計数を行なう。
・２４ウェルプレートのウェルにＰＢＭＣを２×１０６個／ウェルで播種する。
・レスポンダーとスティミュレーターとの比が４０：１で、照射してアシクロビルで処理した自己ＬＣＬでＰＢＭＣを刺激する。
・細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で９〜１２日培養する。
【０１６６】
次いで両方の方法において、以下のように第２の刺激を行なう。
・第１の刺激の終了時に細胞を収集し、生存細胞の計数を行ない、４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中、１×１０６個／ｍｌで細胞を再懸濁する。
・４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中、１ｍｌの細胞を２４ウェルプレートのウェルに加えるか、または細胞懸濁液を１５×１０６個／ＧＲｅｘ１０の濃度でバイオリアクターに加え、レスポンダーとスティミュレーターとの比が４：１で、照射した自己ＬＣＬによって細胞を再刺激する。
・細胞を３〜４日培養し、次いで４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む新鮮な細胞培養培地中で細胞を再懸濁する。組み換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２、プロロイキン；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を最終濃度４０〜１００ＩＵ／ｍｌで細胞培養に添加する。
【０１６７】
後続の刺激
第２の刺激の後で細胞を収集し、生存細胞の計数を行なう。培養培地（即ち馴化培地）は、以下の方法Ｂにおける使用のために保存する。次いで４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中、１×１０６個／ｍｌ（２４ウェルプレートの場合）または０．５×１０６個／ｍｌ（ＧＲｅｘ１０の場合）で細胞を再懸濁し、レスポンダーとスティミュレーターとの比が４：１で、照射した自己ＬＣＬによって細胞を再刺激する。
【０１６８】
いったん２００×１０６個の細胞が得られれば、次いで方法ステップＡまたは方法ステップＢによって細胞を刺激する。
【０１６９】
【表２】
2019520061.tif 000003
【０１７０】
方法ステップＡまたは方法ステップＢによる刺激の終了時に細胞を収集し、同じ方法ステップＡまたはＢによって再刺激する。
方法ステップＢによる再刺激については、用いる馴化培地は先行するＢによる刺激から得たものである。
【０１７１】
実施例３
効率の試験
馴化培地の存在下における培養を含む方法によって増殖したＣＴＬの細胞毒性活性を、馴化培地の存在下における培養をせずに増殖したＣＴＬの細胞毒性活性と比較する。
【０１７２】
０％〜３０％の馴化培地で増殖したＴ細胞を、異なったエフェクター／ターゲット細胞比（Ｅ／Ｔ比）でＬＣＬ細胞に添加して、４時間後にＬＣＬ細胞の特異的細胞溶解を測定する。０％と３０％の馴化培地中における培養によって増殖した細胞の特異的細胞溶解の間に殆どまたは全く差がないことが予想される（図３）。
【０１７３】
増加した速度で増殖したＣＴＬは、ＥＢＶで形質転換されたＬＣＬ細胞を特異的に殺滅する能力を保持していることが予想される。
実施例４
馴化培地を用いるエプスタインバーウイルスに特異的なＴ細胞（ＥＢ−ＶＳＴ）の増殖の最適化
以下の実施例によって、ＣＴＬの増殖を最大化するための、再刺激に含まれるべき馴化培地の最適百分率の検討について述べる。
第１週：
・リンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）試料を解凍し、１週間培養した。
・実験を開始するため最低１０×１０６個のＬＣＬが必要。
第２週：
・異なった患者からの凍結されたＥＢ−ＶＳＴ０３細胞を解凍し、４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中に再懸濁し、生存細胞の計数を実施した。
【０１７４】
・ＥＢ−ＶＳＴ０３細胞は実施例２によるＰＭＢＣの培養によって得た。ＰＢＭＣには第１および第２の刺激、次いで方法ステップＡによる（即ち馴化培地非存在下に）第３の刺激を行ない、その後で細胞を収穫し凍結した。
・ＥＢ−ＶＳＴ０３細胞を２４ウェルプレートに１×１０６個／ウェルで播種した。
・４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中で、細胞懸濁液をバイオリアクターに加え（１５×１０６個／Ｇ−Ｒｅｘ１０）、レスポンダー：スティミュレーターの比が４：１で、照射した自己ＬＣＬによって再刺激した。
・細胞を３〜４日培養し、次いで４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む細胞培養培地中に再懸濁した。
・次いでＩＬ−２を最終濃度４０〜１００ＩＵ／ｍｌで細胞培養に添加した。
第３週以降
・細胞を収穫し、プールし、細胞数が１２０×１０６個になるまで、上記の第２週で記載したように計数し刺激した。
・次いで４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および異なった百分率の（先行する刺激培養の終了時における培養から得られた）馴化培地を含む細胞培養培地中で、以下のように１００×１０６個の細胞をＧ−Ｒｅｘ１００フラスコに播種した。
【０１７５】
【表３】
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【０１７６】
・次いで細胞を５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３〜４日培養した。
・次いでＩＬ−２を最終濃度４０〜１００ＩＵ／ｍｌで細胞培養に添加した。
・１週間後、細胞を収穫し、生存細胞計数を実施した。
【０１７７】
全ての生存率は７０％を超えることが観察された。結果を図４に示す。
４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１５％までの馴化培地を含む細胞培養培地中における培養によってＥＢ−ＶＳＴの最大の収率が得られることが見出され、これは４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のクリック培地、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含む１００％の細胞培養培地を用いるステップと比較して約２０％高いＥＢ−ＶＳＴの速度であった。
【０１７８】
より高い百分率（即ち３０％、４５％）の馴化培地を用いた場合にはＥＢ−ＶＳＴの増殖倍率が低下した。
試料３のＥＢ−ＶＳＴについて観察された増殖倍率は、試料１および試料２について観察されたものほど顕著ではなかった。これは試料３のＥＢ−ＶＳＴがさらなる刺激のサイクルを受けており、その結果、細胞増殖が過大なストレスに曝されたためであろう。
【０１７９】
１５％の馴化培地と８５％の新鮮培養培地（完全クリック培地）との組合せによって最大のＥＢ−ＶＳＴ収率、即ち１００％の新鮮培養培地を用いるステップと比較してより高いＥＢ−ＶＳＴ増殖速度が得られることが結論される。
【０１８０】
ＥＢ−ＶＳＴの増殖に対する馴化培地の効果は異なった個体の間で変動するが、１５％の馴化培地を用いることによって全ての場合に最良の増殖速度が得られることが見出された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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