(57)【要約】赤血球を溶解し、それによりＲＮＡなどの分析種を分析に適した形で宿主または病原体から放出させるための溶解試薬が本明細書に開示される。この試薬は、少なくとも緩衝液と、洗剤と、塩化物含有塩及び抗凝固薬のうちの１つまたは両方と、を含む。この試薬は、血液細胞を溶解し、放出された分析種を溶解物中での分解から保護し、標的捕捉、増幅、検出、または配列決定などの分析種の分析のためのその後のステップと適合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩化アンモニウムと、アニオン洗剤と、抗凝固薬と、を含む、試薬。
【請求項２】
緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記緩衝液が重炭酸ナトリウムである、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
前記試薬が約７．０〜約８．０のｐＨを有する、請求項２または請求項３に記載の試薬。
【請求項５】
前記ｐＨが約７．２〜約７．６である、請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
前記ｐＨが約７．３である、請求項５に記載の試薬
【請求項７】
前記抗凝固薬が、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはクエン酸塩である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項８】
前記抗凝固薬がであり、前記ＥＤＴＡが約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で存在する、請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
前記ＥＤＴＡが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項７に記載の試薬。
【請求項１０】
前記ＥＤＴＡが約０．１ｍＭの濃度で存在する、請求項９に記載の試薬。
【請求項１１】
前記ＥＤＴＡが約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項９に記載の試薬。
【請求項１２】
塩化アンモニウムが約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１３】
前記塩化アンモニウムが約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在する、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
塩化アンモニウムが約２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１３に記載の試薬。
【請求項１５】
前記アニオン洗剤が、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１６】
前記アニオン洗剤がＬＬＳであり、前記ＬＬＳが約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
前記ＬＬＳが約５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１６に記載の試薬。
【請求項１８】
前記ＬＬＳが約８％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１７に記載の試薬。
【請求項１９】
前記重炭酸ナトリウムが約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項３〜１８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項２０】
前記重炭酸ナトリウムが約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、請求項１９に記載の試薬。
【請求項２１】
前記重炭酸ナトリウムが約１４ｍＭの濃度で存在する、請求項２０に記載の試薬。
【請求項２２】
前記塩化アンモニウムが約２５０ｍＭの濃度で存在し、前記アニオン洗剤がＬＬＳであり、前記ＬＬＳが約８％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、前記試薬が重炭酸ナトリウムである緩衝液をさらに含み、前記重炭酸ナトリウムが約１４ｍＭの濃度で存在し、前記試薬が約７．２〜約７．６のｐＨを有する、請求項１に記載の試薬。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の試薬と、赤血球または赤血球由来の産物と、を含む、組成物。
【請求項２４】
前記組成物が全血を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約３：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約４：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）〜約４：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記全血がヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
（ｉ）緩衝液と、（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、（ｉｉｉ）塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬のうちの１つまたは両方と、を含む、溶血試薬であって、５．５よりも高いｐＨを有する、溶血試薬。
【請求項３１】
前記緩衝液が、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する重炭酸ナトリウムである、請求項２０に記載の試薬。
【請求項３２】
前記重炭酸ナトリウムが、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、請求項３１に記載の試薬。
【請求項３３】
前記重炭酸ナトリウムが、約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、請求項３２に記載の試薬。
【請求項３４】
前記重炭酸ナトリウムが、約１４ｍＭの濃度で存在する、請求項３０に記載の試薬。
【請求項３５】
前記ＬＬＳが、約８％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３６】
前記試薬がＥＤＴＡを含み、前記ＥＤＴＡが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項３７】
前記ＬＬＳが約８％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、前記試薬が約２００ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在する塩化アンモニウムを含む、請求項３６に記載の試薬。
【請求項３８】
前記ＥＤＴＡが約１０ｍＭの濃度で存在する、請求項３７に記載の試薬。
【請求項３９】
前記塩化アンモニウムが約２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項３７または請求項３８に記載の試薬。
【請求項４０】
前記緩衝液がリン酸ナトリウムであり、前記リン酸ナトリウムが約１０ｍＭ〜約３３ｍＭの濃度で存在する、請求項３０に記載の試薬。
【請求項４１】
前記緩衝液がリン酸ナトリウムであり、前記リン酸ナトリウムが約１５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項３０に記載の試薬。
【請求項４２】
前記リン酸ナトリウム緩衝液が、約１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムと、約１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液と、を含む、請求項４０または請求項４１に記載の試薬。
【請求項４３】
前記ＬＬＳが、約８％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項４４】
前記試薬が抗凝固薬を含み、前記抗凝固薬がＥＤＴＡ−Ｎａ２である、請求項３０及び４０〜４３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項４５】
前記試薬が抗凝固薬を含み、前記抗凝固薬が約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度のＥＧＴＡを含む、請求項３０及び４０〜４４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項４６】
前記抗凝固薬がＥＤＴＡ−Ｎａ２をさらに含み、前記ＥＤＴＡ−Ｎａ２が約１ｍＭの濃度で存在する、請求項４５に記載の試薬。
【請求項４７】
前記ＥＧＴＡが約１ｍＭの濃度で存在する、請求項４５または請求項４６に記載の試薬。
【請求項４８】
前記ＬＬＳが約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項４９】
前記ＬＬＳが約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、前記抗凝固薬が約１ｍＭの濃度で存在するＥＤＴＡ−Ｎａ２と、約１ｍＭの濃度で存在するＥＧＴＡと、を含む、請求項４２に記載の試薬。
【請求項５０】
前記緩衝液がＴＲＩＳであり、前記試薬が塩化マグネシウムを含み、前記試薬が前記抗凝固薬を含んでいない、請求項３０に記載の試薬。
【請求項５１】
前記塩化マグネシウムが、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で存在する、請求項５０に記載の試薬。
【請求項５２】
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項５０または請求項５１に記載の試薬。
【請求項５３】
前記ＬＬＳが約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５４】
前記ＬＬＳが約６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項５３に記載の試薬。
【請求項５５】
前記試薬が、ＴＲＩＳ緩衝液と、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で存在する塩化マグネシウム塩と、約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する前記ＬＬＳと、から本質的になる、請求項３０に記載の試薬。
【請求項５６】
前記ＴＲＩＳが約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項５０〜５５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５７】
前記ＴＲＩＳが約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項５６に記載の試薬。
【請求項５８】
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５９】
前記ＬＬＳが約６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６０】
前記緩衝液がＴＲＩＳであり、前記ＴＲＩＳが約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項３０に記載の試薬。
【請求項６１】
前記試薬が塩化マグネシウム塩を含み、前記塩化マグネシウムが約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で存在する、請求項６０に記載の試薬。
【請求項６２】
前記ＬＬＳが約４％〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６０または請求項６１に記載の試薬。
【請求項６３】
前記ＴＲＩＳが約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６４】
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項６０〜６３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６５】
前記ＬＬＳが約６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６６】
前記試薬が前記抗凝固薬を含んでいない、請求項６０〜６５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項６７】
請求項３０〜６６のいずれか１項に記載の試薬と、血液細胞と、を含む、組成物。
【請求項６８】
前記試薬が全血を含む、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約１：１（ｖ／ｖ）〜約４：１（ｖ／ｖ）である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約３：１（ｖ／ｖ）である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７２】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約４：１（ｖ／ｖ）である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７３】
前記全血がヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７４】
血液細胞から分析種を分析する方法であって、（ａ）血液細胞を、塩化アンモニウムと、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、抗凝固薬と、を含む、試薬と接触させ、それにより前記血液細胞の少なくとも一部が溶解し、分析種が前記溶解した血液細胞から放出され、前記試薬が、前記血液細胞から放出された分析種の分解を有効に阻害するステップと、（ｂ）前記血液細胞から放出された前記分析種を分析するステップと、を含む、方法。
【請求項７５】
前記分析種が病原体由来の分析種である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記分析種がＲＮＡ分析種である、請求項７４または請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記血液細胞の少なくとも５０％が前記試薬によって５分以内に溶解する、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
溶解した赤血球の百分率が、溶解した白血球の百分率よりも大きい、請求項７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記試薬が、請求項１〜２２のいずれか１項に定義される通りである、請求項７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記接触させるステップの後に、固体支持体上に前記分析種を固定するステップをさらに含む、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
固体支持体上に前記分析種を固定する前記ステップが、前記放出された分析種を、固体支持体に結合した捕捉プローブ及び固定したプローブと接触させるステップを含み、前記捕捉プローブが、前記分析種と相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を有し、前記分析種が、前記捕捉プローブの前記第１のセグメントへ結合し、前記捕捉プローブの前記第２のセグメントが、前記固定したプローブへ結合する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
増幅反応を実施して前記分析種を増幅させ、その結果として得られた増幅産物を検出プローブで検出することをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記増幅反応が等温増幅反応である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記増幅反応が転写媒介性増幅反応である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記血液細胞から放出された前記分析種から前記試薬を分離するための遠心分離ステップなしで実施される、請求項７４〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記分析種が病原性生物である、請求項７４〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記病原性生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記接触させるステップにおいて、前記赤血球が全血中にあり、試薬と全血の比が１：１〜４：１である、請求項７４〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
血液細胞を溶解し、そこから分析種を放出させる方法であって、（ａ）血液細胞を含有する試料を、前記血液細胞を溶解させ、そこから分析のための分析種を放出させるのに有効な溶解試薬と接触させるステップであって、前記溶解試薬が、（ｉ）緩衝液と、（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、（ｉｉｉ）塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬のうちの少なくとも１つと、を含み、前記試薬が、５．５よりも高いｐＨを有するステップと、（ｂ）前記試料中の血液細胞を溶解させ、それにより前記血液細胞の少なくとも一部が溶解し、そこから前記分析種が放出される条件を提供するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において放出された前記分析種を分析するステップと、を含む、方法。
【請求項９３】
前記分析種が病原体由来の分析種である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記分析種がＲＮＡ分析種である、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記血液細胞の少なくとも５０％が前記試薬によって５分以内に溶解する、請求項９２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記試薬が、請求項２８〜６４ｈのいずれか１項に定義される通りである、請求項９２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
固体支持体上に前記分析種を固定するステップをさらに含む、請求項９２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記分析種を固定する前記ステップは、前記放出された分析種を捕捉プローブ及び固定したプローブと接触させることを含み、前記捕捉プローブが、前記分析種に相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を有し、前記分析種が前記捕捉プローブへ結合し、前記結合した捕捉プローブが、前記固定したプローブへ結合する、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記固定した分析種が、増幅反応を用いて前記分析種を増幅し、結果として得られた増幅産物を検出プローブで検出して分析される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記増幅反応が等温増幅反応である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記増幅反応が転写媒介性増幅である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記方法が、前記赤血球から放出された前記標的から前記試薬を分離するための遠心分離ステップなしで実施される、請求項９２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記分析種が病原性生物である、請求項９２〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記病原生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記試料が全血を含み、前記接触させるステップの間に、試薬と全血の比が１：１〜４：１である、請求項９２〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０９】
血液細胞を含有する試料から分析種を分離する方法であって、（ａ）溶解試薬と血液細胞を含有する試料との混合物を、前記試料中の前記血液細胞の少なくとも一部の溶解に十分な条件下でインキュベートし、それにより分析種を放出させるステップ、（ｂ）前記混合物を、前記分析種を固定するように構成された固体支持体と接触させるステップ、及び（ｃ）前記固定した分析種を前記混合物から分離するステップから本質的になり、前記溶解試薬が、緩衝液と、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、塩化物含有塩及び抗凝固薬のうちの少なくとも１つと、を含み、前記抗凝固薬が、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記試薬が５．５よりも高いｐＨを有する、方法。
【請求項１１０】
前記固体支持体が、付着した固定したプローブを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記接触させるステップ（ｂ）は、前記混合物を、前記分析種に相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を含む、捕捉プローブと接触させることをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
ステップ（ｂ）の後でありかつステップ（ｃ）の前にあるステップ（ｉ）をさらに含み、前記ステップ（ｉ）が、前記捕捉プローブの前記第１のセグメントと前記分析種との間のハイブリッド形成複合体の形成を好むハイブリッド形成条件を提供することを含む、請求項１１１に記載の方法、
【請求項１１３】
ステップ（ｉ）の後でありかつステップ（ｃ）の前であるステップ（ｉｉ）をさらに含み、前記ステップ（ｉｉ）が、前記捕捉プローブの前記第２のセグメントと、前記固体支持体へ付着した前記固定したプローブとの間のハイブリッド形成複合体の形成を好むハイブリッド形成条件を提供することを含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記固体支持体が磁気ビーズ固体支持体である、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記固体支持体がシリカ固体支持体である、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記シリカ固体支持体がグラスウールである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記シリカ固体支持体がビーズである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記固体支持体がカラム内に含有される、請求項１０９〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記分析種が病原性生物である、請求項１０９〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記病原性生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記分析種がＲＮＡ分析種である、請求項１０９〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ＲＮＡ分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記試料が全血試料である、請求項１０９〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
請求項１〜２２及び３０〜６６のいずれか１項に定義される通りの溶解試薬を含むキット。
【請求項１２８】
細胞試料から放出された分析種を固定するための固体支持体をさらに含む、請求項１２７に記載のキット。
【請求項１２９】
プライマー、少なくとも１つの検出プローブ、またはそれらの両方をさらに含む、請求項１２７または１２８に記載のキット。
【請求項１３０】
請求項１〜２２及び３０〜６６のいずれか１項に記載の溶解試薬を、血液細胞を含有する試料と混合することによって調製される反応混合物。
【請求項１３１】
前記反応混合物が、前記溶解試薬及び血液細胞を含有する前記試料と一緒に、前記血液細胞から放出された分析種を固定するための固体支持体を混合することをさらに含む、請求項１３０に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の下で、２０１６年４月２７日出願の米国仮出願第６２／３２８，３５８号に対する利益を主張し、その全体的な内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
血中ＲＮＡを検出するための市販のアッセイはあるが、このようなアッセイにおいて検出されたＲＮＡは、血中のＨＩＶ粒子またはＨＣＶ粒子など、細胞外形態で通常存在する。血液細胞内からの、特に赤血球内からのＲＮＡ分子または他の標的分子の検出は、より労力を要する。溶解に使用される試薬は、溶解によって放出される多くの非標的分子、特にヌクレアーゼまたはプロテアーゼが標的分子を分解し得るので、後続の加工に干渉し得る。
全血中のＲＮＡの本質的な不安定性及びＲＮアーゼの存在は、ＲＮＡの単離を困難な課題としている。高純度、未処置のＲＮＡの使用によって、感度の高い臨床用診断アッセイが容易になる。既存のアプローチは、典型的には、いくつかの連続的なステップを包含する：細胞を破壊するステップ、タンパク質を変性させるステップ、ＲＮアーゼからのＲＮＡの安定化及び保護のためのさらなるステップ、次いでＲＮＡの単離のためのステップ
テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート（ＴＤＴＭＡＯ）は通常、血液の搬送、貯蔵及び加工に使用されている（米国特許第６，６０２，７１８号及び第６，６１７，１７０号）。この第四級アミンは、例えば、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の中に含まれおり、細胞に浸透して、細胞内標的ＲＮＡを安定させることによって作用する。次に、このＲＮＡは、後で標準的な技術を用いて、全血成分から精製及び分析することができる。細胞を溶解し、グアニジニウム塩を用いてＲＮアーゼを阻害するための方法も既知である（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，６０２，７１８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，６１７，１７０号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
緩衝液と、洗剤と、を含み、塩、抗凝固薬、またはこの両方をさらに含む、試薬が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、この試薬は、緩衝液と、塩と、洗剤と、を含む。いくつかの実施形態において、この試薬は、緩衝液と、塩と、抗凝固薬と、を含む。いくつかの実施形態において、塩、緩衝液、洗剤、及び抗凝固薬のうちの１つ以上を含む試薬が提供される。いくつかの実施形態において、塩と、洗剤と、抗凝固薬と、を含む、試薬が提供される。いくつかの実施形態において、緩衝液と、塩と、洗剤と、を含む、試薬が提供される。いくつかの実施形態において、緩衝液と、塩と、洗剤と、抗凝固薬と、を含む、試薬が提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、この緩衝液は、重炭酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、この緩衝液は、ＴＲＩＳ（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）緩衝液である。いくつかの実施形態では、この緩衝液は、重炭酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態において、この緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態において、この緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で試薬中にある重炭酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態において、この緩衝液は、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１２５ｍＭ、または約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度で試薬中にあるＴＲＩＳ緩衝液である。いくつかの実施形態では、この緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、または約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で試薬中にあるリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）緩衝液である。いくつかの実施形態において、試薬中のリン酸ナトリウムの濃度は、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである。いくつかの実施形態では、試薬中の一塩基性リン酸ナトリウムの濃度は、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである。いくつかの実施形態において、試薬中の二塩基性リン酸ナトリウムの濃度は、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭである。範囲は、これらの中にある全部の数及び部分的な数をすべてを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、この抗凝固薬は、ＥＤＴＡ（（エチレンジニトリロ）四酢酸）、ＥＤＴＡ−Ｎａ２（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物）、ＥＧＴＡ（エチレン−ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸）、ヘパリンまたはクエン酸塩のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、この抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で試薬中にＥＤＴＡを含む。いくつかの実施形態では、この抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で試薬中にあるＥＤＴＡである。いくつかの実施形態では、この抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で試薬中にあるＥＤＴＡ−Ｎａ２である。いくつかの実施形態では、この抗凝固薬は、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で試薬中にあるＥＧＴＡである。範囲は、これらの中にある全部の数または部分的な数をすべてを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、この塩は、次のイオンのうちの１つ以上を含む：ナトリウムイオン、カリウムイオン、アンモニウムイオン、マグネシウムイオン、リチウムイオン、及び塩化物イオン。いくつかの実施形態において、この塩は、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、または塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態において、この塩は、塩化物イオンと、マグネシウムイオン、ナトリウムイオンまたはカリウムイオンのうちの１つと、を含み、試薬中の塩の濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約４０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約３５ｍＭである。いくつかの実施形態では、この塩は、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、または約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で試薬中にある塩化アンモニウムである。範囲は、これらの中にある全部の数または部分的な数をすべてを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、この洗剤は、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ４０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のうちの１つである。いくつかの実施形態において、この洗剤はアニオン洗剤である。いくつかの実施形態において、この洗剤はＬＬＳまたはＳＤＳである。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約１．５％（ｖ／ｖ）よりも高い濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約１５．５％（ｖ／ｖ）よりも低い濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤はＬＬＳであり、試薬中のＬＬＳの濃度は約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）、約４％〜約１０％（ｖ／ｖ）、または約５％〜約８％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、この洗剤はＬＬＳであり、約１４ｍＭ〜約５０ｍＭで試薬中に存在する。範囲は、これらの中にある全部の数または部分的な数をすべてを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、この試薬のｐＨは、ｐＨ５．５よりも高い。いくつかの実施形態において、この試薬のｐＨは、ｐＨ１０．５よりも低い。いくつかの実施形態において、この試薬のｐＨは、約６．０〜約１０．０である。いくつかの実施形態において、この試薬のｐＨは、約６．５〜約８．０、または約７．０〜約８．０、または約７．２〜約７．６、または約６．７〜約７．５、または約６．７、または約７．３または約７．５である。範囲は、これらの中にある全部の数または部分的な数をすべてを含む。
【００１１】
この試薬のいくつかの実施形態において、重炭酸ナトリウムの濃度は１４ｍＭであり、塩化アンモニウムの濃度は２５０ｍＭであり、ＬＬＳの濃度は８％（ｖ／ｖ）であり、ＥＤＴＡの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、ｐＨは７．２〜７．６である。この試薬のいくつかの実施形態において、緩衝液は、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びＴＲＩＳからなる群から選択され、洗剤は、約５％〜約１０％（ｖ／ｖ）であり、ｐＨは、約６．５〜約８．０であり、塩は、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、及び塩化カリウムからなる群から選択される。この試薬のいくつかの実施形態において、緩衝液は、リン酸ナトリウム及びＴＲＩＳからなる群から選択され、塩は、塩化マグネシウム及び塩化アンモニウムからなる群から選択される。この実施形態のいくつかの態様において、抗凝固薬の濃度は約０ｍＭ〜約１ｍＭである。この実施形態のいくつのさらなる態様において、洗剤は約６％〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度のＬＬＳである。この実施形態のいくつかのさらなる態様において、緩衝液は約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のＴＲＩＳであり、試薬のｐＨは約７．２〜約７．５である。この実施形態のいくつかのさらなる態様において、抗凝固薬は約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度であり、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、またはこれらの組み合わせである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、この試薬を、血液細胞と、赤血球と、または赤血球に由来する産物と混合する。ある特定の実施形態において、この試薬を全血と混合する。いくつかの実施形態において、この試薬を、間にあって全部を数に入れた比及び部分的に数に入れた比をすべて含む約１：１（ｖ／ｖ）〜約４：１（ｖ／ｖ）の比で全血と混合する。いくつかの実施形態において、この試薬を３：１（ｖ／ｖ）の比で全血と混合する。いくつかの実施形態において、全血は、ヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である。
【００１３】
血液細胞由来の分析種を分析する方法であって、（ａ）血液細胞を緩衝液と、塩と、界面活性剤と、を含む試薬と接触させ、この試薬は、血液細胞を溶解して血液細胞から放出された分析種の分解を阻害するのに有効であること、及び（ｂ）血液細胞から放出された分析種を分析することを含む、方法が本明細書にさらに提供される。
【００１４】
いくつかの方法において、標的は、病原体由来の標的である。いくつかの方法において、標的はＲＮＡである。
【００１５】
いくつかの方法において、標的を分析することは、核酸アッセイを含む。いくつかの方法において、標的を分析することは、放出された標的を捕捉プローブ及び固定したプローブと接触させることを含み、この捕捉プローブは、標的と相補的な第１のセグメントと、固定したプローブと相補的な第２のセグメントとを有するものであって、標的は捕捉プローブへ結合し、結合した捕捉プローブは、固定したプローブへ結合する。いくつかの方法は、標的の転写媒介性増幅を実施することと、結果として生じる増幅産物を検出プローブで検出することと、をさらに含む。
【００１６】
いくつかの方法は、血液細胞から放出された標的から試薬を分離するための遠心分離ステップなしで実施される。
【００１７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、非Ｔ７プライマーの核酸配列を示す。
【００１８】
配列番号２は、Ｔ７プライマーの核酸配列を示す。
【００１９】
配列番号３は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）プローブの核酸配列を示す。
【００２０】
配列番号４は、標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）プローブの核酸配列を示す。
【００２１】
定義
病原体には、ヒト及び他の動物における疾患の原因となるウイルス、細菌、原虫、真菌、及び他の微生物が含まれる。
【００２２】
分析種（本明細書では標的と呼ばれることもある）は、タンパク質または核酸などの単一のタイプの分子、または寄生生物由来の何らかのタンパク質もしくはＲＮＡ、または血液細胞由来の何らかのタンパク質もしくはＲＮＡなどの分子のクラスであり得る。ＲＮＡ分析種及びタンパク質分析種、または２つの異なるｍＲＮＡ分析種、もしくは１つのｍＲＮＡ分析種及び１つのｒＲＮＡ分析種などの２つの異なるＲＮＡ分析種検体、などの複数の異なる分析種も分析することができる。分析種には、血液細胞の内在性成分及び、感染した血液細胞の病原性感染の結果として生じる血液成分が含まれており、この分析種は、典型的には感染病原体（すなわち「病原性」または「病原体由来」の分析種）によってコードされている。
【００２３】
溶解試薬とは、赤血球またはペレット化した赤血球などの赤血球産物の溶解を含む、全血中の血液細胞の溶解を誘導するのに有効な、液状でしばしば提供される試薬である。
【００２４】
洗剤は、疎水性分子を可溶化するのに有効な界面活性剤である。概して、洗剤は、親水性基または水中溶解度を亢進させる官能基に結合した疎水性部分、通常は長いアルキル鎖からなる水溶性界面活性剤である。洗剤には、アニオン洗剤、カチオン洗剤、両性イオン性洗剤、非イオン性洗剤、及び消泡剤が含まれる。
【００２５】
抗凝固薬は、全血の凝固を阻害する。抗凝固薬には、ヘパリン及びカルシウムキレート剤が含まれる。ヘパリンは、アンチトロンビンＩＩＩを活性化し、アンチトロンビンＩＩＩは、トロンビン及び血液凝固に関与する他のプロテアーゼの活性を阻害する。ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及びクエン酸塩のようなカルシウムキレート剤は、血液凝固に必要なカルシウムイオンを結合する。
【００２６】
緩衝液とは、溶液のｐＨを維持するために使用される弱酸または弱塩基をいう。
【００２７】
核酸とは、互いに結合してポリマーを形成する含窒素複素環式塩基または含窒素複素環式塩基類似体を有するヌクレオチドまたは類似体を含む、多量体化合物をいい、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ混合物、及びこれらの類似体を含む。
【００２８】
含窒素複素環塩基は、核酸塩基ということができる。核酸塩基は、従来のＤＮＡ塩基またはＲＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、塩基類似体（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１１，ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．，１９９２、ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（２１）：４３６３−７０）、ピリミジン誘導体またはプリン誘導体（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（８）：４２５８−６３、Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（１９）：５１４９−５２）、ピレン官能化ＬＮＡヌクレオシド類似体（Ｂａｂｕ  ＆  Ｗｅｎｇｅｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃａｍｂ．）２０：２１１４−５、Ｈｒｄｌｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（３８）：１３２９３−９）、及び水素結合なしで二本鎖ＤＮＡを形成する疎水性核酸塩基（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１５）：２９１１−４）であり得る。多くの誘導体化した及び修飾された核酸塩基または類似体は、市販されている（例えば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，バージニア州スターリング地区）。
【００２９】
糖に付着した核酸塩基単位は、核酸塩基単位またはモノマーということができる。核酸の糖部分は、例えば、２’メトキシ置換または２’ハロゲン化物置換を有するリボース、デオキシリボース、または類似の化合物であり得る。ヌクレオチド及びヌクレオシドは、核酸塩基単位の例である。
【００３０】
核酸塩基単位は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオアート結合もしくはメチルホスホナート結合、ペプチド−核酸結合（ＰＮＡ）（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５（１）：３−７、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３９５号）、二環式フラノース単位を有するヌクレオチドモノマーが糖の立体配座を模倣するＲＮＡに固定されているロックされた核酸（ＬＮＡ）の立体配座（Ｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１、Ｈａｋａｎｓｓｏｎ  ＆  Ｗｅｎｇｅｌ，２００１，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１（７）：９３５−８）を含む種々の結合もしくは立体配座、または核酸鎖におけるこのような結合の組み合わせを含む。核酸は、１つ以上の「無塩基性」残基を含み得、すなわち、その骨格は、１つ以上の位置に対して窒素塩基を含んでいない（米国特許第５，５８５，４８１号）。
【００３１】
核酸は、従来のＲＮＡ糖またはＤＮＡ糖、塩基及び結合のみを含み得、または従来の成分及び置換（例えば、２’−Ｏ−メチル結合を有する従来のＲＮＡ塩基、または従来の塩基及び類似体の混合物）を両方含み得る。帯電した結合（例えば、ホスホロチオアート）または中性基（例えば、メチルホスホナート）を含有するオリゴマーを含む、ＰＮＡ、２’−メトキシもしくは２’−フルオロで置換されたＲＮＡ、またはハイブリッド形成複合体の全体的な電荷、電荷密度、または立体結合に影響を及ぼす構造を含むことは、核酸によって形成される二本鎖の安定性に影響を及ぼし得る。
【００３２】
オリゴマーは、全長及び他の特性において実質的に同じであるが、オリゴマーの少なくとも一部が、指定された長さについて異なる塩基の無作為な組み込み、例えばＤＮＡオリゴマーにおける４つの標準的な塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）全部の無作為な組み合わせまたはより大きなオリゴマーの規定された部分における数個の塩基（ＵまたはＴ及びＧ）の無作為な組み込みによって合成されるオリゴマーの集団をいう「ランダムポリマー」配列を含有し得る。得られたオリゴマーは、実際には、有限数のメンバーが無作為部分を構成する塩基の長さ及び数によって決まるオリゴマーの集団である（例えば、２つの異なる塩基を用いることによって合成される６−ｎｔの無作為配列を含有するオリゴマーの集団中の２６個のオリゴマー）。
【００３３】
核酸の相補性とは、核酸の一方の鎖におけるヌクレオチド配列が、その核酸塩基基の向きにより、反対側の核酸塩基鎖における別の配列に水素結合することを意味する。相補的な塩基は、典型的には、ＤＮＡでは、ＡとＴ及びＣとＧ、ＲＮＡではＣとＧ、及びＵとＡである。相補性は、完全（すなわち、正確）または実質的で／十分であり得る。２つの核酸間の完全な相補性とは、２つの核酸が、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）対形成によって、二本鎖におけるあらゆる塩基が相補的な塩基へ結合した二本鎖を形成することができることを意味する。「実質的に」または「十分に」相補的なとは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列と完全には及び／または完璧には相補的ではないが、十分な結合がこの２つの鎖の塩基間に生じて、ハイブリッド形成条件のセット（例えば、塩濃度及び温度）において安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、これらの配列及び標準的な算術計算を用いて、ハイブリッド形成した鎖のＴｍを予測することによって、または通例の方法を用いることによるＴｍの演繹的な決定によって予測することができる。Ｔｍとは、２つの核酸鎖の間に形成されたハイブリッド形成複合体の集団が５０％変性している温度をいう。Ｔｍを下回る温度では、ハイブリッド形成複合体の形成が有利であるが、Ｔｍを上回る温度では、ハイブリッド形成複合体における鎖の融解または分離が有利である。Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を用いることによって、１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について概算することができるが、他の既知のＴｍ計算は、核酸の構造的特徴を考慮に入れる。
【００３４】
「分離する」または「単離する」または「精製する」とは、試料などの複雑な混合物から１つ以上の成分を取り出すことをいう。好ましくは、分離する、単離するまたは精製するステップは、核酸分析種を他の試料成分から少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％ｗ／ｗを取り出す。分離する、単離するまたは精製するステップは、任意に、非分析種試料成分を取り出すために追加の洗浄するステップを含み得る。
【００３５】
捕捉ハイブリッドの「放出」とは、捕捉プローブから核酸分析種を、及び／または固定したプローブから捕捉プローブを分離することなど、捕捉ハイブリッドの１つ以上の成分を互いから分離することをいう。核酸鎖の放出は、捕捉ハイブリッドの他の成分から分析種を分離し、この分析種を検出プローブへの結合に対して利用可能にする。捕捉ハイブリッドの他の成分は、例えば捕捉プローブ鎖を捕捉支持体上にある固定したプローブへ、分析種の検出に影響を及ぼすことなく結合したままであり得る。
【００３６】
「標識」とは、例えば、検出可能なシグナルを生じる反応を触媒することによって、検出可能である、または検出可能な応答もしくはシグナルを直接的または間接的に生じる、分子部分をいう。標識には、発光部分（蛍光化合物、生物発光化合物または化学発光化合物）、放射性同位体、特異的結合対のメンバー（例えば、ビオチン及びアビジン）、酵素もしくは酵素基質、反応基または検出可能な色彩を生じる色素もしくは粒子などの発色団が含まれる。
【００３７】
捕捉プローブには、配列の標的相補性領域を含む第１のセグメントと、固定したプローブへ捕捉プローブまたは捕捉プローブを含むハイブリッド形成複合体を付着させるための第２のセグメントと、が含まれる。第１のセグメントは、実施例において説明されているなど、ハイブリッド形成条件下で第１のセグメント及び標的核酸がハイブリッド形成して安定した二本鎖（すなわち、検出可能な融点を有する）を形成することができるように、特定の核酸分析種配列（または標的配列）と実質的に相補的であるよう構成されることができる。あるいは、ハイブリッド形成条件下で試料中の核酸配列へ非特異的に結合するように第１のセグメントを構成することができる（ＷＯ２００８／０１６９８８を参照されたい）。第２のセグメントには、固定したプローブの配列に相補的な配列の領域が含まれる。好ましくは、キメラ捕捉プローブには、捕捉プローブの標的相補領域に共有結合し、既に説明されているように（Ｗｅｉｓｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，１１０，６７８号）、固定したプローブの相補的ホモポリマー（例えば、ポリＴまたはポリＡ）へ適切な条件下でハイブリッド形成する核酸ホモポリマー（例えば、それぞれポリＡまたはポリＴ）が含まれる。捕捉プローブは、捕捉反応において未結合の標的捕捉プローブを不活性化するための閉鎖配列として作用する第３のセグメントをさらに含み得る。この第３のセグメントは、第２のセグメントの反対側の第１のセグメントに隣接することができ（例えば、捕捉配列：標的ハイブリッド形成配列：閉鎖配列）、または第１のセグメントの反対側の第２のセグメントに隣接することができる（例えば、閉鎖配列：捕捉配列：標的ハイブリッド形成配列）。ＷＯ２００６／００７５６７及びＵＳ２００９−０２８６２４９を参照されたい。
【００３８】
固定したプローブには、支持体へ直接的にまたは間接的に結合した核酸が含まれる。核酸は、捕捉プローブ中の核酸と相補的であるが、捕捉プローブにおけるのと同じ長さ（核酸塩基単位数）であってもなくてもよい。固定したプローブ中の核酸は好ましくは、少なくとも６個の連続した核酸塩基単位を含有しており、例えば、包括的には１０〜４５個または１０〜４０個または１０〜３０個または１０〜２５個または１５〜２５個のＬ型核酸塩基単位を含有することができる。核酸は、好ましくはホモポリマーであり、より好ましくはアデニンまたはチミンのホモポリマーである。固定したプローブの好ましい形態は、アデニン残基のホモポリマーを有する第２のセグメントを含む捕捉プローブとの併用のための１４個のチミン残基のホモポリマーであるか、またはこれを含む。固定したプローブの核酸部分は、典型的には、一本鎖形態で提供されるか、またはそうでない場合、使用前もしくは使用中に一本鎖形態に変性する。
【００３９】
種々の材料のいかなるものも、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、及び磁気誘引性材料、から作製されたマトリックスまたは粒子が、固定したプローブのための支持体として使用され得る。単分散磁性球体は、大きさが比較的均一であり、反応容器へ磁力を、好ましくは自動化システムにおいて適用することによって、溶液から容易に回収されるので、好ましい支持体である。固定したプローブは、例えば、種々の共有結合、キレート結合、もしくはイオン相互作用のいずれかを用いることによって、捕捉支持体へ直接的に結合し得るか、または支持体へ連結した１つ以上のリンカーを介して間接的に結合し得る。リンカーには、捕捉プローブにハイブリッド形成するのではなく、固定したプローブの核酸と当該プローブの支持体の間のスペーサーとして作用するように意図された１つ以上のヌクレオチドが含まれることができる。
【００４０】
「検出プローブ」とは、標的配列へ特異的に結合し、その結合が標的配列の存在を示す検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じる核酸または他の分子である。検出プローブは、検出可能なシグナルを生じるために標識される必要はなく、例えば、プローブをその標的配列へ結合させることにより生じる電気的インパルスは、検出可能なシグナルであり得る。「標識したプローブ」とは、標識を含有するプローブ、または標識へ直接的にもしくは間接的に結合したプローブである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｈａｐｔ．１０、米国特許第６，３６１，９４５号，Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５８，７３７号，Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６５６，２０７号，Ｗｏｏｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５４７，８４２号，Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２８３，１７４号，Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，５８１，３３３号，Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，７３１，１４８号，Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）。例えば、検出プローブには、非ヌクレオチドリンカー及びこのリンカーに付着した化学発光標識が含まれ得る（米国特許第５，１８５，４３９号、第５，５８５，４８１号及び第５，６３９，６０４号，Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）。検出プローブの例としては、均質な反応物中で検出される付着した標識を有する長さ約５〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、例えば、結合したまたは結合していないプローブ上の標識の差次的加水分解を用いるものが含まれる。
【００４１】
検出プローブは、アッセイのフォーマットに応じて標的配列と同じまたは反対のセンスのヌクレオチド配列を有することができる。検出プローブは、捕捉プローブと同じまたは異なるセグメントの標的配列へハイブリッド形成することができる。いくつかの検出プローブは、付着した化学発光マーカー、例えばアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物を有する（米国特許第５，１８５，４３９号、第５，６３９，６０４号、第５，５８５，４８１号及び第５，６５６，７４４号）。いくつかの検出プローブでは、アクリジニウムエステル標識は、非ヌクレオチドリンカーを用いることによってＡ及びＴ塩基対の領域付近のプローブの中央領域に付着し（米国特許第５，５８５，４８１号及び第５，６５６，７４４号，Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）、このことは、ＡＥの両側のヌクレオチド塩基のアミンを制限し、インターカレーションのための部位を提供する。あるいは、ＡＥ標識は、検出プローブの３’末端または５’末端へ付着し得、このＡＥ標識が、標的核酸上の検出プローブ付近でハイブリッド形成して標的核酸によって寄与される近隣のアミンの作用を制限する、第２のオリゴマーとともに使用される。いくつかの検出プローブにおいて、関連する非標的ポリヌクレオチド配列とのミスマッチの部位のまたはその近くのＡＥ標識は、関連する配列と、たった１個のヌクレオチドだけ異なり得る標的配列の間の識別を可能にし、その理由は、ミスマッチ部位の周りの二本鎖領域が十分に不安定化して、関連する非標的配列とハイブリッド形成したプローブ上のＡＥを易加水分解性にするからである。ＨＩＶ−１及びＨＣＶは、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ製の市販のＰＲＯＣＬＥＩＸ（登録商標）ＵＬＴＲＩＯ  ＨＩＶ−１／ＨＣＶ／ＨＢＶアッセイの改変形態を用いて検出され得る。この改変は、捕捉プローブ及び固定したプローブにおけるＤ−ポリＡ配列及びＤ−ポリＴ配列をそれぞれＬ−ポリＡ及びＬ−ポリＴと置き換えることを包含する。
【００４２】
「ハイブリッド形成条件」とは、１つの核酸鎖が第２の核酸鎖へ相補鎖相互作用及び水素結合によって結合して、ハイブリッド形成複合体を生じる累積的な環境をいう。このような条件には、核酸を含有する水溶液または有機溶液の化学成分及びその濃度（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）、ならびに混合物の温度が含まれる。インキュベーション時間の長さまたは反応チャンバー寸法などの他の因子は、こうした環境に寄与し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２．ｓｕｐ．ｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．１．９０−１．９１，９．４７−９．５１，１１．４７−１１．５７（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー地区，１９８９））。
【００４３】
標的捕捉オリゴマーの１個のまたは複数の標的核酸への特異的結合は、標的捕捉オリゴマーの第１のセグメント中の単一の規定された配列と標的核酸（複数可）上の正確にまたは実質的に相補的なセグメントの間の結合で、安定した二本鎖を形成することを意味する。このような結合は、単一の規定された標的捕捉オリゴマー配列に対して正確にまたは実質的に相補的なセグメントを欠いている試料中の他の核酸への結合よりも検出可能に強い（シグナルまたは融解温度が高い）。標的捕捉オリゴマーの標的核酸への非特異的結合は、標的捕捉オリゴマーが、単一の規定された標的捕捉オリゴマー配列と正確なまたは実質的な相補性を有するセグメントを共有しない標的配列の集団へ結合することができることを意味する。このようなことは、例えば、捕捉プローブの第１のセグメントにおける無作為化した配列を用いることによって達成することができる。
【００４４】
核酸間の結合を欠いていることは、実質的な相補性を欠く無作為に選択された核酸対だが、問題の核酸と同じ長さの無作為に選択されたこの核酸対の間で生じる非特異的結合と区別できない結合によって明らかにすることができる。
【００４５】
捕捉ハイブリッドの「放出」とは、捕捉プローブから標的核酸を、及び／または固定したプローブから標的捕捉オリゴマーを分離することなど、捕捉ハイブリッドの１つ以上の成分を互いに分離することをいう。標的核酸鎖の放出は、捕捉ハイブリッドの他の成分から分析種を分離し、検出プローブへの結合に対して分析種を利用可能にする。捕捉ハイブリッドの他の成分は、例えば、分析種の検出に影響を及ぼすことなく、標的捕捉オリゴマー鎖を捕捉担体上の固定したプローブへ結合させたままであり得る。
【００４６】
「感度」とは、そのようなものとして正しく識別された真の陽性の割合（例えば、感染したと正しく識別された感染患者の百分率）である。特異性は、正しく識別された真の陰性の割合（例えば、感染していないと正しく識別された非感染患者の百分率）を測定する。
【００４７】
値の範囲への参照には、範囲内の整数及び範囲内の整数で定義された部分範囲も含まれる。いかなる数値または数値範囲に対する参照も、他の典型的な使用条件を重要とみなす、測定において固有であるようないかなる変化も、包含するものとして理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
Ｉ．一般
血液細胞を溶解し、それによってＲＮＡまたは他の分析種を分析に適した形態で放出するための溶解試薬が、本明細書に提供される。好ましくは、溶解試薬は、赤血球を含む血液細胞を溶解し、それによりＲＮＡまたは他の分析種を分析に適した形態で放出する。一態様において、溶解試薬は、血液細胞を含んでいる試料、血液細胞からなる試料、または本質的に血液細胞からなる試料を溶解し、それにより分析に適した形態のＲＮＡまたは他の分析種を放出する。溶解試薬は、少なくとも緩衝液、塩及び洗剤を含む。試薬は、血液細胞を溶解し、放出された分析種を溶解物中の分解から保護するよう機能し、標的捕捉、増幅、検出及び／または配列決定などの分析種の分析のためのその後の工程と適合する。溶解試薬は、病原体または宿主からの分析種の分析に適している。分析種は、好ましくは、病原体または宿主由来の核酸分析種である。より好ましくは、分析種は、病原体または宿主由来のＲＮＡ分析種である。溶解試薬は、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルスなどのフラビウイルス、ならびにバベシア及びプラスモジウム種などの寄生生物を含むがこれらに限定されない、血液細胞に感染する病原体由来の核酸の分析に特に適している。
【００４９】
開示された溶解試薬は、病原体由来ＲＮＡを赤血球から調製及び分析するための種々の既知の溶解薬を用いて欠陥を識別することから一部生じるが、溶解試薬は、血液細胞から多数の成分を調製するために使用することができる。既知の溶解薬は、病原体由来のＲＮＡを分析するための試薬及び方法と適合しないことが認められており、溶解した試料を捕捉試薬へ添加したときに、細胞凝集、沈殿物の出現、及び磁気ビーズの喪失を引き起こした。対照的に、本発明の溶解試薬は、こうした方法と適合しており、全血試料中の血液細胞の溶解、ならびに標的捕捉及び転写媒介性増幅後に放出された病原体由来ＲＮＡの高感度検出を可能にした。本発明の溶解試薬は、溶解後のヌクレアーゼ及びプロテアーゼによる病原体由来ＲＮＡの分解を阻害し、試料間の再現性を実証した。
【００５０】
ＩＩ．溶解試薬
本発明の溶解試薬は、少なくとも緩衝液、洗剤、ならびに塩及び抗凝固薬の一方または両方を含む。緩衝液は、約５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で溶解試薬中に存在する。重炭酸ナトリウムは、適切な緩衝液の一例である（ＮａＨＣＯ３）。重炭酸ナトリウム緩衝液は、例えば、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１２ｍＭ〜約１６ｍＭ、または約１４ｍＭの濃度で試薬中に存在することができる。ＴＲＩＳ緩衝液は、例えば、約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約１００ｍＭ〜約１２５ｍＭ、約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度で試薬中に存在することができる。リン酸ナトリウム緩衝液は、例えば、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭの濃度で試薬中に存在することができる。一塩基性リン酸ナトリウム緩衝液は、例えば、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭの濃度で試薬中に存在することができる。二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液は、例えば、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３３ｍＭ、約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３０ｍＭ、または約１５ｍＭの濃度で試薬中に存在することができる。
【００５１】
試薬のｐＨは、例えば、約６．０〜約１０．０、約６．５〜約９．０、約７．０〜約８．０、約７．２〜約７．６、約７．５、約７．３、または約６．７であることができる。範囲は、これら中にある全部の数及び部分的な数をすべてを含む。
【００５２】
洗剤は、溶解薬としても、溶血後の分析種分解の阻害剤としても作用することができる。洗剤は、核酸の分解を阻害するのに特に有用である。例示的な洗剤には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。ＬＬＳが好ましい。例として、溶解試薬中の洗剤の濃度範囲には、約２％〜約１５％（ｖ／ｖ）、約４％〜約１０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約８％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、または約１０％（ｖ／ｖ）が含まれる。
【００５３】
溶解試薬中に存在する場合、塩は、約１０ｍＭ〜約１，０００ｍＭの濃度である。試薬中の塩化アンモニウムについての例示的な濃度範囲には、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約８００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２４０ｍＭ〜約２６０ｍＭ、または約２５０ｍＭが含まれる。試薬中の塩化マグネシウムについての例示的な濃度範囲には、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約３３ｍＭ、または約３０ｍＭが含まれる。試薬中の塩化カリウムの例示的な濃度範囲には、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約３５ｍＭ、約３３ｍＭ、または約３０ｍＭが含まれる。
【００５４】
溶解試薬中に存在する場合、抗凝固薬は、試料（例えば、全血または赤血球）の凝固を阻害するのに十分な濃度にある。凝固を阻害することにより、抗凝固薬は、赤血球を単離する方法において試料を遠心分離する必要性を排除する。例示的な抗凝固剤には、ＥＤＴＡ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、ヘパリンまたはクエン酸塩が含まれる。溶解試薬中のＥＤＴＡの例示的濃度には、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２．５ｍＭまたは約０．１ｍＭが含まれる。溶解試薬中のＥＤＴＡ−Ｎａ２の例示的濃度には、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２．５ｍＭ、または約０．１ｍＭが含まれる。溶解試薬中のＥＧＴＡの例示的濃度には、約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、約７．５ｍＭ、約３ｍＭまたは約１ｍＭが含まれる。
【００５５】
好ましい溶解試薬には、粉末形態の、または水などの溶媒中の、先に記載の濃度のいずれかの重炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ＬＬＳ、及びＥＤＴＡが含まれる。好ましくは、重炭酸ナトリウムは、１２ｍＭ〜１６ｍＭの濃度、またはより好ましくは１４ｍＭであり、塩化アンモニウムは、１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度、またはより好ましくは２５０ｍＭであり、ＬＬＳは、４％〜１５％の濃度、より好ましくは８％（溶液形態の場合はｖ／ｖ）であり、ＥＤＴＡは、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度、またはより好ましくは０．１ｍＭもしくは１０ｍＭの濃度であり、試薬のｐＨは、７．２〜７．６、またはより好ましくは７．３である。任意に、溶解試薬は、重炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ＬＬＳ、ＥＤＴＡ及び水から本質的になる。
【００５６】
好ましい溶解試薬には、粉末形態または水などの溶媒中の、先に記載の濃度のいずれかのリン酸ナトリウム、ＬＬＳ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２及びＥＧＴＡが含まれる。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭであり、ＬＬＳは、４％〜１５％の濃度、またはより好ましくは１０％（溶液形態の場合はｖ／ｖ）である。ＥＤＴＡ−Ｎａ２は、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度、またはより好ましくは１ｍＭであり、ＥＧＴＡは、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度、またはより好ましくは１ｍＭであり、試薬のｐＨは６．０〜８．０、またはより好ましくは６．７である。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、一塩基性リン酸ナトリウム及び二塩基性リン酸ナトリウムの一方または両方を含む。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムを含む。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含む。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムを含み、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含む。任意に、溶解試薬は、リン酸ナトリウム、洗剤、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及び水から本質的になる。
【００５７】
好ましい溶解試薬には、粉末形態または水などの溶媒中の、先に記載の濃度のいずれかのＴＲＩＳ、塩化マグネシウム、及びＬＬＳが含まれる。好ましくは、ＴＲＩＳは、７５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度、またはより好ましくは１００ｍＭの濃度であり、塩化マグネシウムは、１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭであり、ＬＬＳは、４〜１５％、より好ましくは６％（溶液形態の場合はｖ／ｖ）であり、試薬のｐＨは、７．０〜８．０、またはより好ましくは７．５である。任意に、溶解試薬は、ＴＲＩＳ、塩化マグネシウム、及びＬＬＳ、ならびに水から本質的になる。任意に、溶解試薬は、消泡剤を含有する。
【００５８】
溶解試薬は、捕捉プローブ、固定したプローブ、固体支持体、検出プローブ、及び／または後述の分析種のいずれかを含む血液細胞から単離されることになっている分析種に関するアッセイを実施するためのプライマーも含むキットとして提供することができる。このようなキットには、溶解試薬を使用するための及び／または血液細胞から単離された分析種に関するアッセイを実施するための説明書が含まれることができる。血液細胞溶解反応混合物、標的捕捉反応混合物、核酸増幅反応混合物、核酸検出反応混合物、及びこれらの組み合わせを含む反応混合物を、キットから調製することができる。いくつかの反応混合物は、本明細書に開示される溶解試薬を含有する。
【００５９】
ＩＩＩ．溶解試薬の使用
全血は、全血献血者からまたは血液バンク施設から直接を含む、多数の源から入手することができる。赤血球は、全血またはペレット化赤血球などの赤血球を含む全血の何らかの画分など、何らかの利用可能な源から得ることができる。全血は、ヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの組み合わせであることができる。
【００６０】
溶解試薬は、細胞溶解を誘導し、細胞から所望の分析種（複数可）の分子の放出を生じるのに十分な時間、血液細胞と混合することができる。溶解試薬と混合した血液細胞を維持するための例示的な時間には、１〜３０分、２〜１５分、３〜１０分、４〜６分、または５分が含まれる。好ましくは、時間は、３０分、１５分、１０分または５分以下である。好ましくは、混合物は、溶解後に目に見える粒子がない。範囲は、これらの中にある全部の数及び部分的な数をすべてを含む。
【００６１】
溶解試薬と血液細胞とのインキュベーションの温度は変化させることができる。温度は、好ましくは、溶解の程度及び速度を最大限にし、分析種（複数可）の分解を最小限にするかまたはその後の加工の阻害を防止するように選択される。例示的な温度範囲には、０〜５０℃、５〜４５℃、１０〜４０℃、１５〜３７℃、２０〜３０℃、２２〜２７℃または２５℃が含まれる。雰囲気温度が適切である。血液細胞の溶解は、本明細書に説明される方法によって検出可能となる十分量の分析種分子を放出すべきである。好ましくは、溶解は、溶解される試料中の血液細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の溶解を結果的に生じる。範囲は、これらの中の全部の数及び部分的な数のすべてを含む。
【００６２】
全血が溶解試薬と組み合わされる比率は、細胞溶解の程度及び速度ならびに、溶解した細胞からの放出後の分解からの分析種分子の保護に影響を及ぼすことができる。全血が溶解試薬と混合される例示的な比率には、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０の比率が、または１：１と１：１０の間の比率（ｖ／ｖ；全血：試薬）の範囲において含まれる。好ましい比率は、溶解試薬と約１：２〜約１：４または１：２または１：３または１：４（ｖ／ｖ）の比率で混合された全血である。試料が、ペレット化赤血球など、全血から単離された赤血球を含むとき、赤血球は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０の例示的な比率で、または１：１〜１：１０（ｖ／ｖ；赤血球：試薬）の比率の範囲で、溶解試薬と混合することができる。範囲は、これらの中の全部の数及び部分的な数のすべてを含む。
【００６３】
ＩＶ．分析種
本発明の試薬によって赤血球を含む血液細胞から放出された分析種は、病原体由来の分析種または宿主由来の分析種であり得る。本発明の溶解試薬によって赤血球からを含む血液細胞から放出された分析種には、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、粒子全体、タンパク質及び抗体が含まれることができる。分析種は、好ましくは、病原体由来のまたは宿主由来の核酸分析種である。より好ましくは、分析種は、病原体由来のまたは宿主由来のＲＮＡ分析種である。種々のタイプのＲＮＡ分析種を検出することができる。ＲＮＡ分析種は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または異質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）であり得る。病原体由来の分析種についての好ましい分析種は、リボソームＲＮＡ、特に１８Ｓ  ｒＲＮＡ、５Ｓ  ｒＲＮＡ、５．８Ｓ  ｒＲＮＡ、または２８Ｓ  ｒＲＮＡである。
【００６４】
例示的な病原体には、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルスなどのフラビウイルス、及び寄生生物が含まれるが、これらに限定されない、血液細胞から検出することのできる病原体が含まれる。例示的な寄生生物には、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、またはトキソプラズマ属由来の寄生虫が含まれる。ヒトにおいて疾患を発症させるバベシア属の生物は、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、またはバベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）であり得る。プラスモジウム属の生物は、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、またはプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）であり得る。
【００６５】
Ｖ．アッセイ
血液細胞の溶解から放出された分析種分子は、分析の対象となる。分析種分子は、分析前に溶解試薬から（遠心分離などによって）分離されていてもされていなくてもよい。分離ステップを省略することにより、アッセイを実施する上での効率的な作業の流れを容易にすることができる。アッセイのタイプは分析種に依存する。
【００６６】
Ａ．核酸
核酸分析種の分析はしばしば、捕捉、増幅及び検出のステップを包含する。あるいは、増幅及び検出の方法は、事前の標的捕捉なしで実施することができる。好ましくは、増幅、及び検出及び標的捕捉（実施する場合）は、溶解試薬から分析種分子を分離することなく行われる。したがって、プロセス全体を単一の容器内で実施することができる。
【００６７】
１．標的捕捉アッセイ
例示的な標的捕捉アッセイは、１つ以上の捕捉プローブ、固定したプローブ、試料、ならびに標的核酸への標的捕捉オリゴマーのハイブリッド形成及び固定したプローブへの標的捕捉オリゴマーのハイブリッド形成を可能にするための適切な媒体を用いて、次のように実施することができる。アッセイを実施する前に、試料を加熱して（例えば、６５℃〜９５℃）二本鎖形態のいかなる核酸も変性させることができる。構成要素は、何らかの順序で混合することができる。例えば、標的捕捉オリゴマーを試料に添加し、試料中の標的核酸とハイブリッド形成させた後、固定したプローブを添加することができる。しかしながら、自動アッセイについては、標的捕捉オリゴマー及び固定したプローブを同時にまたは実質的に同時に供給することによって、添加ステップ数を最小限にすることが好ましい。この場合、ハイブリッド形成の順序は、標的捕捉オリゴマーと標的核酸の間に二本鎖を形成することができるが、捕捉プローブの第１のステムセグメントと第２のステムセグメントの間に、及び標的捕捉オリゴマーと固定したプローブの間に形成されるであろう二本鎖の融解温度を超える条件下で第１のハイブリッド形成を実施することによって、次に、低いストリンジェンシー条件下で、好ましくは第１のステムセグメントと第２のステムセグメントの間、及び標的捕捉オリゴマーと固定したプローブの間に形成された二本鎖の融解温度よりも低い条件下で第２のハイブリッド形成を実施することによって制御することができる。ストリンジェンシーは、アッセイ混合物の温度を下げることによって低下させることができる。高温では、標的結合部位は標的核酸と二本鎖形成する。低温では、互いに標的核酸二本鎖へ結合していない捕捉プローブの第１及び第２のステムセグメント、ならびに標的核酸へ結合した捕捉プローブの第１のステムセグメントは、固定したプローブと二本鎖を形成する。例えば、より高いストリンジェンシーのハイブリッド形成は、６０℃またはそれに近い温度で、より低いストリンジェンシーのハイブリッド形成は、室温または２５℃へ冷却させておくことによって実施することができます。ストリンジェンシーは、塩濃度を下げること、またはカオトロピック溶媒の濃度を増やすまたは上昇させることによっても低下させることができる。いくつかの方法において、全ステップ（二本鎖標的を変性させるための高温での初期変性ステップという起こり得る例外を伴う）を等温で実施することができる。
【００６８】
標的核酸：捕捉プローブの形成に続いて、固定したプローブのハイブリッド（捕捉ハイブリッド複合体）は、種々の既知の方法のいずれか、例えば磁気捕捉支持体の遠心分離、濾過、または磁性引力を用いて、捕捉支持体を物理的に分離することによって、他の試料成分から分離される。分離は、好ましくは、標的捕捉オリゴマーによって形成されたステムループ構造の融解温度を下回る温度で実施され、それにより空の標的捕捉オリゴマーは変性する機会がなく、したがって捕捉プローブへ結合する。いくつかの方法では、ハイブリッド形成条件のストリンジェンシーならびに識別されたマッチした及びマッチしていない標的核酸の結果としての能力を維持するために、ステムループ構造の融解温度（例えば、６０℃）よりも低いが１０℃以内の温度で分離を実施する。
【００６９】
捕捉ハイブリッドの何らかの部分へ非特異的に接着する他の試料成分からの標的核酸の単離をさらに容易にするために、捕捉ハイブリッドを１回以上洗浄して他の試料成分を希釈及び除去し得る。洗浄は、捕捉ハイブリッドを、その個々の成分へと適切な水溶液（例えば、トリス及びＥＤＴＡを含有する溶液）中で解離させることによって達成され得る。例えば、米国特許第６，１１０，６７８号を参照されたい）及び適切な条件（例えば、成分のＴｍを上回る温度）に次いで、捕捉ハイブリッドの再形成を可能にする条件を再調整する。しかしながら、取り扱いを容易にし、ステップを最小限にするために、洗浄は、好ましくは、捕捉ハイブリッドを維持する条件を用いることによって、溶液中の捕捉支持体に付着した未処置の捕捉ハイブリッドをすすぐ。好ましくは、実施する場合、洗浄を伴う標的核酸の捕捉は、標的核酸の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは約９５％を他の試料成分から単離する。単離された核酸は、核酸増幅などの多くの下流のプロセスに使用することができる。
【００７０】
標的捕捉アッセイは、リアルタイムの、二相性の、標的捕捉及び増幅の方法の一部としても実施され得る。このような方法では、５００μＬの試料及び４００μＬの標的捕捉試薬（ＴＣＲ）を反応チューブへ入れる。ＴＣＲは、磁性粒子、試料中に存在する生物を溶解する成分、捕捉オリゴ、Ｔ７開始プロモーター、及び内部較正物質を含有する。反応チューブ中の流体は、混合物が均一であることを確保するために、指定の時間及び速度で混合される。次に、反応チューブを４３．７℃の遷移インキュベーターへ移して、反応チューブ中の流体を予熱する。次に、反応チューブを、６４℃に設定されたアニールインキュベーターへ移す。６４℃でのインキュベーション中に、溶解試薬によってこれまで破壊されなかったサンプル中に存在するいかなる生物も破壊して、分析種の放出を引き起こす。次に、反応チューブを遷移インキュベーターに移してクールダウンプロセスを開始させ、チラーランプ（１７℃〜１９℃）でさらに冷却し、Ｔ７開始プロモーターの結合ならびに分析種及び内部較正物質を、捕捉オリゴを介して磁性粒子へ結合させる。反応チューブを磁気パーキングステーションに移動し、そこで反応チューブを磁石に供し、磁性粒子をチューブの両側へ引っ張った後、洗浄ステーションに入れる。洗浄ステーションにおいて、磁性粒子を洗浄することによって潜在的な干渉物質を反応物から除去する。
【００７１】
２．増幅
核酸分析種は、等温増幅反応（例えば、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、核酸配列をもとにした増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ仲介性等温増幅、ポリメラーゼスパイラル反応（ＰＳＲ）（Ｌｉｕ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｓｐｉｒａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＳＲ）：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１２７２３；（２０１５））、リガーゼ連鎖反応、及び他の等温増幅方法）、または熱サイクル増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＴ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＴ）、または他の熱サイクル増幅方法）、あるいは他の増幅方法などの方法を使用して増幅することができる。増幅されたＲＮＡ分析種産物の検出は、増幅中に（リアルタイム）または増幅後に（エンドポイント）実施することができる。
【００７２】
ｉ．転写媒介性増幅
ＴＭＡは。これまでに説明されてきた（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，８２４，５１８号及び第７，８３３，７１６号、また、例えばＦ．  Ｇｏｎｚａｌｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ．  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１９９８  Ｅｄ．Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｆｅｒｒｅ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ．ＰＰ．１８９−２０４）。ＴＭＡにおいて、増幅されることになっている配列を含有する標的核酸は、一本鎖核酸（例えば、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）として提供される。二本鎖核酸（例えば、ｄｓＤＮＡ）を一本鎖核酸へ変換する何らかの従来法を用いてもよい。プロモータープライマーは、その標的配列で分析種核酸へ特異的に結合し、逆転写酵素（ＲＴ）は、標的鎖を鋳型として用いてプロモータープライマーの３’末端を伸長してｃＤＮＡコピーを作り出し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を結果的に生じる。ＲＮアーゼ活性（例えば、ＲＴ酵素のＲＮアーゼＨ）は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖のＲＮＡを消化し、第２のプライマーは、プロモーター−プライマー末端の下流にあるｃＤＮＡにおけるその標的配列へ特異的に結合する。次に、ＲＴは、ｃＤＮＡを鋳型として使用して、第２のプライマーの３’末端を伸長することによって、新たなＤＮＡ鎖を合成して、機能的プロモーター配列を含有するｄｓＤＮＡを作り出す。機能的プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼは、転写を開始して、初期標的鎖に相補的な約１００〜１０００個のＲＮＡ転写産物（増幅コピーまたはアンプリコン）をつくる。第２のプライマーは、各アンプリコン中のその標的配列へ特異的に結合し、ＲＴはアンプリコンＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを作り出し、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖を生じる。ＲＮアーゼは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡ二本鎖由来のアンプリコンＲＮＡを消化し、プロモータープライマーの標的特異的配列は、新たに合成されたＤＮＡにおけるその相補的配列へ結合し、ＲＴは、プロモータープライマーの３’末端及びｃＤＮＡの３’末端を伸長し、機能的プロモーターを含有するｄｓＤＮＡを作り出し、そのｄｓＤＮＡに対してＲＮＡポリメラーゼが結合し、標的鎖と相補的なさらなるアンプリコンを転写する。反応中にこれらのステップを反復して使用する自己触媒サイクルは、最初の標的配列の約１０億倍の増幅を生じる。任意に、アンプリコンは、アンプリコンに含有される配列へ特異的に結合するプローブを用いることによって、増幅（リアルタイム検出）または反応の終点（エンドポイント検出）の間に検出してもよい。結合したプローブから生じるシグナルの検出は、試料中の標的核酸の存在を示す。
【００７３】
ＴＭＡは、リアルタイムの、二相性の、標的捕獲及び増幅方法の一部としても実施され得る。このような方法において、捕捉された分析種分子を含有する反応チューブに増幅試薬（５０μＬ／回）を添加し、増幅負荷ステーションの中で混合することによってＴＭＡを実施することができる。増幅試薬は、核酸を構築するのに必要なオリゴ及び成分を含有する。反応チューブを４３．７℃の遷移インキュベーターへ移動させて反応チューブ内の液体の温度を上昇させ、次に増幅負荷ステーションへ戻し、酵素（２５μＬ／回）を添加する。反応チューブを、４２．７℃に設定した増幅インキュベーターへ移し、インキュベーター内に５分間放置し、その間に第１回の増幅を開始する。反応チューブを増幅負荷ステーションへ戻し、プロモーター試薬（２５μＬ／回）を添加する。さらなる回の分析種増幅のために、反応チューブを増幅インキュベーターへ戻す。プロモーター試薬は、オリゴ及びトーチを含有する。トーチは、分析種または内部較正物質と相補的であり、蛍光は、結合すると、リアルタイムでシグナルを生じる。標的及び内部較正物質についてのシグナルは好ましくは、異なる波長を有しており、区別することができる。
【００７４】
ｉｉ．ポリメラーゼ連鎖反応
あるいは、ＰＣＲ増幅（例えば、逆転写酵素またはリアルタイムＰＣＲ）は、増幅に使用することができる。ＰＣＲは、捕捉複合体からの標的核酸の事前放出を伴って、または伴わずに実施することができる。ＰＣＲ反応は、捕捉ステップと同じ容器（例えば、微量遠心チューブ）の中で実施することができる。ＰＣＲ反応は、解離のための約９５℃（例えば、９０〜９９℃）の高温と、アニーリングのための約６０℃の低温、例えば４０〜７５または５０〜７０または５５〜６４℃の間の熱サイクルを包含する。典型的には、完全な熱サイクルの数は、少なくとも１０、２０、３０または４０である。ＰＣＲ増幅は、１つ以上のプライマー対を用いて実施される。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマー対は、配列決定されることが望ましい領域に隣接する標的核酸の反対鎖に相補的な２つのプライマーを含む。ウイルスゲノムの大部分（例えば、５０、７５または９９％超）を配列決定するために、プライマーは、好ましくはウイルスゲノムの両端近くに位置する。関連分子（例えば、患者試料中に存在する同じウイルスの突然変異体）の増幅のために、プライマーは、好ましくは、集団の大部分のメンバーに存在すると思われる標的核酸の保存領域に相補的である。ＰＣＲ増幅は、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州ニューヨーク市，１９９２）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，カリフォルニア州サンディエゴ市，１９９０）、Ｍａｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）、Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，１７（１９９１）、ＰＣＲ（ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード市）、及び米国特許第４，６８３，２０２号において説明されている。
【００７５】
３．検出
核酸分析種の検出は、何らかの既知の方法を使用することによって、捕捉の前、及び（リアルタイム）増幅の間かまたは（エンドポイント）増幅後のいずれかで実施することができる。ＲＮＡの増幅産物はしばしば、ＲＴ−ＰＣＲから結果的に生じるＤＮＡ、またはＴＭＡから結果的に生じるＲＮＡコピーの形態である。増幅された核酸は、液相において、またはこの核酸をマトリックス中またはマトリックス上で濃縮し、それらと結合した標識（例えば、臭化エチジウムなどのインターカレート剤）を検出することによって検出され得る。いくつかの検出方法は、増幅産物中の配列と相補的なプローブを使用し、プローブ：産物複合体の存在を検出するか、またはプローブの複合体を用いて増幅産物から検出されたシグナルを増幅する（例えば、米国特許第５，４２４，４１３号、第５，４５１，５０３号、第５，８４９，４８１号）。他の検出方法は、標識したプローブが分子ビーコン、分子トーチまたはハイブリッド形成スイッチプローブなどにおける増幅産物へ結合する場合にのみシグナルの変化が結果的に生じるため、シグナル発生が標的配列の存在に関連するプローブを使用する（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、第５，２１０，０１５号、第５，３１２，７２８号、第５，５３８，８４８号、第５，５４１，３０８号、第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号、第５，９２５，５１７号、第６，１５０，０９７号、第６，３６１，９４５号、第６，５３４，２７４号、第６，８３５，５４２号、及び第６，８４９，４１２号、ならびに米国公開第２００６／０１９４２４０Ａ１号）。このようなプローブは、典型的には、プローブの一方の末端に付着した標識（例えば、フルオロフォア）、及びプローブの別の位置に付着した相互作用性化合物（例えば、クエンチャー）を用いて、増幅産物にハイブリッド形成しないことを示すある立体配座（「閉じた」）にプローブがある場合に標識からのシグナル発生を阻害するが、その立体配座を（「開いた」へ）変化させる増幅産物へプローブがハイブリッド形成すると、検出可能なシグナルが発生する。増幅産物と特異的に結合する直接的または間接的に標識されたプローブからのシグナルの検出は、増幅しておいた標的核酸の存在を示す。
【００７６】
４．配列決定
増幅後、核酸分析種は、定性的または定量的検出を受けるのと同様に、またはその代わりに配列決定することができる。所望の場合、精製は、シリカカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ重力フローカラム）で実施することができる。標的核酸はカラムへ結合し、そこで標的核酸を洗浄した後に溶出することができる。あるいは、精製は、核酸プローブをもとにした精製システムを用いて実施することができる（例えば、米国特許第６，１１０，６７８号もしくは第８，０３４，５５４号、ＵＳ２０１３／０２０９９９２もしくはＵＳ２００９／０２８６２４９、またはＷＯ２０１２／０３７５３１もしくはＷＯ２０１３／１１６７７４）。増幅された分析種ＤＮＡは、アダプターの付着によっていくつかの配列フォーマットに適合させることもできる。増幅されたＤＮＡは、ヌクレオチド（通常はホモポリマー）のクレノー媒介性付加によって尾部付加した後、付加された尾部に相補的なオリゴヌクレオチドへのアニーリング、及びライゲーションを行うことができる。使用される配列決定プラットフォームに応じて、配列決定前に特別なアダプターを鋳型へライゲートする。例えば、ＳＭＲＴベルアダプターを、Ｐａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰａｃＢｉｏ  ＲＳ配列決定装置を用いた配列決定のための試料鋳型へライゲートする（例えば、Ｔｒａｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２０１０）３８（１５）：ｅ１５９を参照されたい）。
【００７７】
増幅された標的核酸は、種々の技術による配列分析に適している。標的核酸の捕捉は、いわゆる次世代及び第３世代の配列決定方法のいくつかの異なるフォーマットへカップリングさせることができる。このような方法は、何百万もの標的鋳型を並行して配列決定することができる。このような方法は、標的核酸がバリアントの異種混合物である場合に特に有用である。多くの利点の中で、バリアントを並行して配列決定することは、試料中の薬物耐性突然変異体の特性を提供し、たとえ試料内に比較的わずかな割合で存在する薬剤突然変異体でさえそうである。
【００７８】
いくつかの次世代配列方法は、エマルションＰＣＲによって増幅する。標的捕捉オリゴマーを介してビーズへ固定された標的核酸は、エマルションＰＣＲに適した出発材料を提供する。ビーズをＰＣＲ試薬及びエマルションオイルと混合して、単一ビーズを含有する個々のマイクロリアクターを作り出す（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，３７６‐８０（２００５））。次に、エマルションを破壊し、増幅したＤＮＡを有する個々のビーズを配列決定する。配列決定は、例えばＲｏｃｈｅ  ４５４  ＧＳ  ＦＬＸ配列決定装置（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ  ０６４０５）を用いて実施されるピロシーケンスであり得る。あるいは、配列決定は、例えば、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州カールスバッド市  ９２００８）を用いて行われる連結／検出であり得る。別の変法では、標的捕捉オリゴマーを有するビーズから分析種核酸を溶出し、アレイ（例えば、ＨｉＳｃａｎＳＱ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，カリフォルニア州サンディエゴ市  ９２１２１））上の異なる位置に固定する。標的核酸をブリッジ増幅によって増幅し、標識したヌクレオチドの鋳型指向性組み込みによって、アレイフォーマット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定する。別のアプローチでは、分析種核酸を標的捕捉オリゴマーから溶出し、ポリメラーゼによって組み込みヌクレオチドをリアルタイムで検出することによって分析する（単一分子リアルタイム配列決定またはＳＭＲＴ配列決定）。ヌクレオチドは、組み込んだ際にシグナルを放出する標識したヌクレオチド（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３２３  ｐｐ．１３３−１３８（２００９））または未標識ヌクレオチドであり得、このシステムは、組み込みの際の化学変化を測定する（例えば、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。
【００７９】
捕捉された標的核酸は、何らかの技術によって配列決定することができるが、第３世代法、次世代法または大量併行法は、Ｓａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｘａｍ  Ｇｉｌｂｅｒｔの配列決定を超えるかなりの利点を提示する。いくつかのグループは、超高処理量ＤＮＡ配列決定手順を説明してきた（例えば、Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，米国特許第５，３０２，５０９号、Ｍｅｔｚｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４２５９（１９９４）を参照されたい）。合成によってＤＮＡを配列決定するための４つの天然ヌクレオチド（アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）の塩基を含む）及びいくつかの他の酵素を採用するピロシーケンスアプローチは、今や、変異検出に広く使用されている（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，３６３（１９９８）、Ｂｉｎｌａｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，ｉｓｓｕｅ  ２，ｅｌ９７（２００７年２月）、Ｒｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８６，３７８（２０１０年３月）、Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｙｐｉｎｇ，Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０），  ｄｏｉ  １０．１０１６／ｊｈｕｍｉｍｍ．２０１０．０６．０１６（印刷中）、Ｓｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１；１９９（５）：６１０（２００９））。このアプローチでは、検出は、ＤＮＡポリメラーゼ反応中に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）、スルフリラーゼによるピロリン酸のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）への定量的変換、及びその後のホタルルシフェラーゼによる可視光の発生に基づいている。より近年の研究は、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の３’−ＯＨ基をキャップするために蛍光色素に結合した光開裂可能な化学的部分に主に焦点を絞った合成方法によるＤＮＡ配列決定を実施している（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８，１９７（１９９９）、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，７７７，０１３号、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，６４５，５９６号、Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，３９９，３３５号、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，０５２，８３９号及び第７，０３３，７６２号、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，０４１，８１２号、Ｓｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ，米国特許出願第２００４−０１５２１１９号、Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２３，１３３（２００９））。合成による配列決定法において、ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ／ポリメラーゼ複合体を各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）で別々にかつ連続的に検査する際に、ピロリン酸放出を測定することによって推定されているところである。Ｒｏｎａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３  ３６５（１９９８）、Ｈｙｍａｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４，４２３（１９８８）、Ｈａｒｒｉｓ，米国特許第７，７６７，��００号を参照されたい。
【００８０】
Ｂ．その他の分析種
抗体、タンパク質、粒子及び他の分析種は、免疫沈降、ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、競合的イムノメトリックアッセイなどのフォーマットによって検出することができる。Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，１９８８）、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８７９，２６２号、第４，０３４，０７４号、第３，７９１，９３２号、第３，８１７，８３７号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、及び第４，０９８，８７６号を参照されたい。サンドイッチアッセイが好ましいフォーマットである（米国特許第４，３７６，１１０号、第４，４８６，５３０号、第５，９１４，２４１号、及び第５，９６５，３７５号を参照されたい）。
【００８１】
競合アッセイを用いることもできる。いくつかの方法では、試料中の分析種抗原は、抗体検出試薬への結合のために、外来的に供給された標識分析種抗原と競合する。抗体に結合した標識分析種抗原の量は、試料中の分析種抗原の量に反比例する。抗体は、結合した複合体の試料からの分離を検出前に容易にするために固定することができる。
【００８２】
ラテラルフロー装置も、分析種を検出するために使用することができる。分析種が存在し得る試料で処理された検査ストリップへ流体を適用する。標識した結合分子はストリップを通過するので、分析種を有する試料を含有する特定の区域へと通過するにつれ、捕捉することができる。
【００８３】
ＶＩ．感度
本発明の方法は、血液細胞からの分析種の高感度の検出を提供することができる。病原体由来ＲＮＡ分析種について、感度は、全血の容積中に存在する最小数の病原性ＲＮＡコピーとして表すことができる。全血の容積は、溶解試薬と直接接触するものであり得、またはペレット化赤血球などの血液画分を調製するために使用されるものであり得、これらは順に、溶解試薬と接触する。好ましくは、こうした方法は、全血中の病原性ＲＮＡの存在を、約２×１０３コピー（１匹の寄生虫／１ｍＬに等しい）リボソームＲＮＡ／全血ｍＬ以上、２×１０３コピー／５ｍＬ全血以上、または２×１０３コピー／１０ｍＬ全血以上、２×１０３コピー／５０ｍＬ全血以上、または２×１０３コピー／１００ｍＬ全血以上の感度で検出する。好ましくは、こうした方法は、約８×１０３コピー（４匹の寄生虫／１ｍｌに等しい）リボソームＲＮＡ／全血ｍＬ以上、８×１０３コピー／全血５ｍＬ以上、８×１０３コピー／全血１０ｍＬ以上、８×１０３コピー／全血５０ｍＬ以上、または８×１０３コピー／全血１００ｍＬ以上の感度で、全血中の病原性ＲＮＡの存在を検出する。好ましくは、こうした方法は、約２４×１０３コピー（１２匹の寄生虫／１ｍＬに等しい）リボソームＲＮＡ／全血ｍＬ以上、２４×１０３コピー／全血５ｍＬ以上、２４×１０３コピー／全血１０ｍＬ以上、２４×１０３コピー／全血５０ｍＬ以上、または２４×１０３コピー／全血１００ｍＬ以上の感度で、全血中の病原性ＲＮＡの存在を検出する。
【実施例】
【００８４】
実施例１．細胞溶解及びバベシアＲＮＡの安定化のための試薬の分析
本実施例の目的は、ヒト全血中の赤血球を有効にかつ優先的に溶解し、溶解した試料中の分析種（複数可）を安定させ、ＲＮアーゼの活性を阻害する溶解試薬を識別することとした。血液の他の細胞成分に対する赤血球の優先的溶解は、溶解した赤血球の百分率が、分析中の試料中に存在する他の細胞成分の百分率よりも高く、他の細胞タイプが凝集体中で評価されることを意味する。本実施例では、分析種は、病原体由来ＲＮＡ分析種である、バベシア寄生虫由来の１８ＳリボソームＲＮＡである。磁気ビーズを用いたＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’Ｔａｒｇｅｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙと適合するために、溶解試薬は、効率的な標的捕捉のために、均質な溶解物を好ましくは結果的に生じるべきである。
【００８５】
この第１の実施例では、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、溶解試薬Ａ及び溶解試薬Ｂを、バベシア試料調製物について評価した。各チューブに含有されるＰＡＸｇｅｎｅ試薬は、細胞膜を溶解して安定化試薬として作用することが既知である第４級アンモニウム塩である活性化合物テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサラート（ＴＤＴＭＡＯ）を含む。溶解試薬Ａは、ｐＨ７．４で、１４ｍＭ重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化アンモニウム、５％（ｖ／ｖ）ＬＬＳ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの水溶液であった。溶解試薬Ｂは、ｐＨ７．３で、１４ｍＭ重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化アンモニウム、８％（ｖ／ｖ）ＬＬＳ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの水溶液であった。
【００８６】
調製に用いた試料は、バベシア感染したハムスター血を添加したヒト全血とした。１０ｕＬの感染したハムスター血を９０ｕＬの新鮮なヒトドナー血（非感染）と組み合わせることによって、感染したハムスター全血を連続希釈した。次に、これらの連続希釈物の各々を、９００ｕＬの新鮮なヒトドナー血と組み合わせて、１ｍＬの試料を提供した。各１ｍＬの試料をまず、ＰＡＸｇｅｎｅチューブからの溶解試薬３ｍＬと室温で組み合わせ、５分間揺らしておいて細胞溶解を誘導した。次に、５００μＬの溶解したサンプルを５００μＬのＴａｒｇｅｔ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＣＲ）へ添加した。Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ、及びＡｐｔｉｍａ  ＴＣＲを評価した。溶解した試料をＴＣＲに添加した後、白色の沈殿物が形成された。それゆえ、ＰＡＸｇｅｎｅシステムは、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅの標的捕捉、増幅及び検出試薬を用いた、全血溶解、バベシアの捕捉、増幅及び検出には不適切であった。
【００８７】
次の実験において、１４ｍＭ重炭酸ナトリウムで緩衝し、ＬＬＳ及びＥＤＴＡを含有する２５０ｍＭ塩化アンモニウム（ＡＣＬ）の溶解試薬を評価した。先に概して説明した通り、ヒト全血を、１×１０−５〜１×１０−８の範囲の希釈でバベシア感染ハムスターの血液で刺激した。次に、１ｍＬの刺激された全血を３ｍＬの溶解試薬Ａと２５℃で５分間混合して、赤血球溶解を誘導した。５００μＬの溶解した試料を５００μＬのＴＣＲへ添加した後、沈殿は観察されなかった。標的捕捉は、米国特許第６，１１０，６７８号に概して説明される通り実施した。バベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡは、転写媒介性増幅によって各試料において検出された（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，８２４，５１８号及び第７，８３３，７１６号）。各希釈条件の６つの複製物を増幅し、検出した。寄生虫負荷は、１ｍＬあたり約１個の寄生虫を含有するように希釈物を統計的に識別することに基づいて決定した。さらに、既知濃度のＩＶＴストックの連続希釈物を別々の反応ウェルで増幅及び検出して、ハムスター血液の増幅／検出した各希釈物における寄生虫負荷を算出するための曲線を提供した。試料中のバベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡを捕捉、増幅及び検出するために使用した標的捕捉オリゴマー、プライマー及びプローブは次の通りであった：
【表１】
2019515277.tif 000002
【００８８】
先に記載の各条件からの増幅及び検出の結果は、溶解試薬Ａが、その後の分析のために赤血球を有効に溶解してバベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡを放出したことを示している。連続希釈のこれらの各試料において検出したバベシアｒＲＮＡと、連続希釈したＩＶＴによる結果との比較は、１ｍＬあたり０．０１個の寄生虫という低い検出限界を示した。
【００８９】
さらなる溶解試薬を、血液細胞の溶解及び病原体由来分析種の検出について評価した。
【００９０】
実施例２．さらなる溶血試薬の評価
その後の評価のために有効に溶血し、分析種を放出する能力を評価するために、溶解試薬の試験を実施した。本実施例では、本明細書に説明される通り、ＴＭＡ増幅及び検出反応を用いて、バベシア寄生虫由来の１８Ｓ  ｒＲＮＡを識別して、核酸分析種を評価した。
本実施例において使用した試料は、バベシア感染ヒト全血とし、ＰＣＲによってバベシアに対して陽性であると判定された。寄生虫血症は、バベシア感染血を非感染血へと連続的に希釈し、次に非感染血を用いて各希釈物の容積を１ｍＬへ増量し、１ｍＬの希釈物を３ｍＬの溶解試薬Ａと混合し、次に実施例１に説明される通り、捕捉、増幅及び検出反応を実施することによって判定した。ストック感染ヒト血液試料中の寄生虫負荷は、１ｍＬあたり約１個の寄生虫を含有するように希釈物を統計的に識別し、次に、ストック感染血液試料へと逆算することに基づいて決定した。次に、概して説明されている通り、感染血試料を別々に希釈して、総容積１ｍＬで１２個／ｍＬ（１２ｐ／ｍＬ）及び４個／ｍＬ（４ｐ／ｍＬ）の希釈物を得た。以下のアッセイでは、１２ｐ／ｍＬ及び４ｐ／ｍＬをそれぞれ使用した。
【００９１】
溶解試薬Ｃを溶解試薬Ｂと同様に作製したが、ＥＤＴＡの濃度を１０ｍＭまで上昇させた。溶解試薬Ｄは、ｐＨ６．７で１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１０％（ｖ／ｖ）ＬＬＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２二水和物からなる水溶液とした。溶解試薬Ｅは、ｐＨ７．５で１００ｍＭのＴＲＩＳ  ３０ｍＭの塩化マグネシウム、及び６％（ｖ／ｖ）ＬＬＳの水溶液とした。分離した刺激済み全血試料（先に説明ずみ）を１：２または１：４（血液試料：溶解試薬）の比の溶解試薬Ｃ〜Ｅのうちの１つで各々溶解し、表２〜４において識別される通り、条件ごとに３６〜７２個の複製物で検査した。反応性のある試料とは、ＲＬＵ値が１００，０００ＲＬＵを超えるものであると判定された。先に説明した通り、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ  ＴＣＲ及びＴＭＡによる増幅を用いて、各試料においてバベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡを検出した。感度、安定性及び頑強性について条件を評価した。溶解試薬Ｃ〜Ｅについての結果を表２、表３、表４に示す。
【表２】
2019515277.tif 000003
【表３】
2019515277.tif 000004
【表４】
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【００９２】
これらのデータは、溶解試薬Ｃ〜Ｅが、全血を溶解し、その後の分析のために病原体由来の分析種を血液細胞から放出する上で良好に挙動することを示している。溶解試薬Ｃ〜Ｅを使用して血液細胞から得られたバベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡの増幅及び検出のためのＴＭＡアッセイの分析感度は、４：１と低い、全血に対する溶解緩衝液の希釈物で、４ｐ／ｍＬと少なくとも低かった。結果の大きな変動によってわかるように、４℃で保存の３日後、感度の喪失が観察された。この感度の喪失は、２：１希釈及び４ｐ／ｍＬを有する試料において容易に観察できた。
【００９３】
理解を明確にする目的のために本発明を詳細に説明してきたが、ある一定の変更は、添付の特許請求の範囲内で実施され得る。受託番号、ウェブサイト等を含むすべての公開物、及び本出願に引用された特許文献はその全体が参照により、各々が個別に示されているのと同じ程度まで、すべての目的のために本明細書により組み込まれる。配列、ウェブサイトまたは他の参照の広範な異なる版が異なる時刻に存在し得る場合には、有効な出願日における参照と関連する版が意図される。有効な出願日とは、発行時の受託番号が開示された最も早い優先日を意味する。文脈から他に明らかでない限り、本発明のいかなる要素、実施形態、ステップ、特徴または態様も、その他と組み合わせて実施することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月31日(2018.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＴＲＩＳと、（ｉｉ）約４％（ｗ／ｖ）〜約１５％（ｗ／ｖ）の濃度のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、（ｉｉｉ）約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度の塩化マグネシウムと、を含む、溶血試薬であって、５．５よりも高いｐＨを有する、溶血試薬。
【請求項２】
前記試薬が、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬抗凝固薬を含んでいない、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
前記ＬＬＳが約６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項２または３に記載の試薬。
【請求項５】
前記試薬が、ＴＲＩＳと、塩化マグネシウム塩と、ＬＬＳと、から本質的になる、請求項１に記載の試薬。
【請求項６】
前記ＴＲＩＳが約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項７】
前記ＴＲＩＳが約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項９】
前記ＬＬＳが約６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項５〜８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１０】
前記ＴＲＩＳが約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１に記載の試薬。
【請求項１１】
前記ＴＲＩＳが約１００ｍＭの濃度で存在する、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１０または１１に記載の試薬。
【請求項１３】
前記ＬＬＳが約６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１４】
前記試薬が、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬を含んでいない、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項１５】
（ｉ）リン酸ナトリウムと、（ｉｉ）約８％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、（ｉｉｉ）約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度のＥＤＴＡ−Ｎａ２と、（ｉｖ）約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度のＥＧＴＡと、を含む、溶血試薬であって、５．５よりも高いｐＨを有する、溶血試薬。
【請求項１６】
前記リン酸ナトリウムが約１０ｍＭ〜約３３ｍＭの濃度で存在する、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１７】
前記リン酸ナトリウムが約１５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、請求項１５に記載の試薬。
【請求項１８】
前記リン酸ナトリウムが、約１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムと、約１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液と、を含む、請求項１６または１７に記載の試薬。
【請求項１９】
前記ＥＤＴＡ−Ｎａ２が約１ｍＭの濃度で存在する、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項２０】
前記ＥＧＴＡが約１ｍＭの濃度で存在する、請求項１９に記載の試薬。
【請求項２１】
前記ＬＬＳが約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項２２】
前記ＬＬＳが約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し、前記抗凝固薬が約１ｍＭの濃度で存在するＥＤＴＡ−Ｎａ２と、約１ｍＭの濃度で存在するＥＧＴＡと、を含む、請求項１８に記載の試薬。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の試薬と、血液細胞と、を含む、組成物。
【請求項２４】
前記組成物が全血を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約１：１（ｖ／ｖ）〜約４：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約３：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約４：１（ｖ／ｖ）である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記全血がヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
血液細胞を溶解し、そこから分析種を放出させる方法であって、（ａ）血液細胞を含有する試料を、前記血液細胞を溶解させ、そこから分析のための分析種を放出させるのに有効な溶解試薬と接触させるステップであって、前記溶解試薬は、請求項１または１５に定義される通りのものであるステップと、（ｂ）前記試料中の血液細胞を溶解させ、それにより前記血液細胞の少なくとも一部が溶解し、そこから前記分析種が放出される条件を提供するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において放出された前記分析種を分析するステップと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記分析種が病原体由来の分析種である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分析種がＲＮＡ分析種である、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記血液細胞の少なくとも５０％が前記試薬によって５分以内に溶解する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記試薬が、請求項１〜２２のいずれか１項に定義される通りである、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
固体支持体上に前記分析種を固定するステップをさらに含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析種を固定する前記ステップは、前記放出された分析種を捕捉プローブ及び固定したプローブと接触させることを含み、前記捕捉プローブが、前記分析種に相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を有し、前記分析種が前記捕捉プローブへ結合し、前記結合した捕捉プローブが、前記固定したプローブへ結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記固定した分析種が、増幅反応を用いて前記分析種を増幅し、結果として得られた増幅産物を検出プローブで検出して分析される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記増幅反応が等温増幅反応である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅反応が転写媒介性増幅である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、前記赤血球から放出された前記標的から前記試薬を分離するための遠心分離ステップなしで実施される、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記分析種が病原性生物である、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記病原生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が全血を含み、前記接触させるステップの間に、試薬と全血の比が１：１〜４：１である、請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
血液細胞を含有する試料から分析種を分離する方法であって、（ａ）溶解試薬と血液細胞を含有する試料との混合物を、前記試料中の前記血液細胞の少なくとも一部の溶解に十分な条件下でインキュベートし、それにより分析種を放出させるステップ、（ｂ）前記混合物を、前記分析種を固定するように構成された固体支持体と接触させるステップ、及び（ｃ）前記固定した分析種を前記混合物から分離するステップから本質的になり、前記溶解試薬が、請求項１または１５において定義される通りのものである、方法。
【請求項４８】
前記固体支持体が、付着した固定したプローブを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記接触させるステップ（ｂ）は、前記混合物を、前記分析種に相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を含む、捕捉プローブと接触させることをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｂ）の後でありかつステップ（ｃ）の前にあるステップ（ｉ）をさらに含み、前記ステップ（ｉ）が、前記捕捉プローブの前記第１のセグメントと前記分析種との間のハイブリッド形成複合体の形成を好むハイブリッド形成条件を提供することを含む、請求項４９に記載の方法、
【請求項５１】
ステップ（ｉ）の後でありかつステップ（ｃ）の前であるステップ（ｉｉ）をさらに含み、前記ステップ（ｉｉ）が、前記捕捉プローブの前記第２のセグメントと、前記固体支持体へ付着した前記固定したプローブとの間のハイブリッド形成複合体の形成を好むハイブリッド形成条件を提供することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記固体支持体が磁気ビーズ固体支持体である、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記固体支持体がシリカ固体支持体である、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記シリカ固体支持体がグラスウールである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記シリカ固体支持体がビーズである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記固体支持体がカラム内に含有される、請求項４７〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記分析種が病原性生物である、請求項４７〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５９】
前記病原性生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記分析種がＲＮＡ分析種である、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＲＮＡ分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記試料が全血試料である、請求項４７〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１〜２２のいずれか１項に定義される通りの溶解試薬を含むキット。
【請求項６６】
細胞試料から放出された分析種を固定するための固体支持体をさらに含む、請求項６５に記載のキット。
【請求項６７】
プライマー、少なくとも１つの検出プローブ、またはそれらの両方をさらに含む、請求項６５または６６に記載のキット。
【請求項６８】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の溶解試薬を、血液細胞を含有する試料と混合することによって調製される反応混合物。
【請求項６９】
前記反応混合物が、前記溶解試薬及び血液細胞を含有する前記試料と一緒に、前記血液細胞から放出された分析種を固定するための固体支持体を混合することをさらに含む、請求項６８に記載の反応混合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
いくつかの実施形態において、この洗剤は、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ４０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００のうちの１つである。いくつかの実施形態において、この洗剤はアニオン洗剤である。いくつかの実施形態において、この洗剤はＬＬＳまたはＳＤＳである。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約１．５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）よりも高い濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約１５．５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）よりも低い濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）の濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤は、約２％〜約１５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）の濃度で試薬中に存在する。いくつかの実施形態において、この洗剤はＬＬＳであり、試薬中のＬＬＳの濃度は約２％〜約１５％（ｗ／ｖ）、約４％〜約１０％（ｗ／ｖ）、または約５％〜約８％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、この洗剤はＬＬＳであり、約１４ｍＭ〜約５０ｍＭで試薬中に存在する。範囲は、これらの中にある全部の数または部分的な数をすべてを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
この試薬のいくつかの実施形態において、重炭酸ナトリウムの濃度は１４ｍＭであり、塩化アンモニウムの濃度は２５０ｍＭであり、ＬＬＳの濃度は８％（ｗ／ｖ）であり、ＥＤＴＡの濃度は約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭであり、ｐＨは７．２〜７．６である。この試薬のいくつかの実施形態において、緩衝液は、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びＴＲＩＳからなる群から選択され、洗剤は、約５％〜約１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）であり、ｐＨは、約６．５〜約８．０であり、塩は、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、及び塩化カリウムからなる群から選択される。この試薬のいくつかの実施形態において、緩衝液は、リン酸ナトリウム及びＴＲＩＳからなる群から選択され、塩は、塩化マグネシウム及び塩化アンモニウムからなる群から選択される。この実施形態のいくつかの態様において、抗凝固薬の濃度は約０ｍＭ〜約１ｍＭである。この実施形態のいくつのさらなる態様において、洗剤は約６％〜約１０％（ｗ／ｖ）の濃度のＬＬＳである。この実施形態のいくつかのさらなる態様において、緩衝液は約９０ｍＭ〜約１１０ｍＭの濃度のＴＲＩＳであり、試薬のｐＨは約７．２〜約７．５である。この実施形態のいくつかのさらなる態様において、抗凝固薬は約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度であり、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、またはこれらの組み合わせである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
洗剤は、溶解薬としても、溶血後の分析種分解の阻害剤としても作用することができる。洗剤は、核酸の分解を阻害するのに特に有用である。例示的な洗剤には、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が含まれる。ＬＬＳが好ましい。例として、溶解試薬中の洗剤の濃度範囲には、約２％〜約１５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、約４％〜約１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、約５％〜約８％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、または約１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）が含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
好ましい溶解試薬には、粉末形態の、または水などの溶媒中の、先に記載の濃度のいずれかの重炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ＬＬＳ、及びＥＤＴＡが含まれる。好ましくは、重炭酸ナトリウムは、１２ｍＭ〜１６ｍＭの濃度、またはより好ましくは１４ｍＭであり、塩化アンモニウムは、１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度、またはより好ましくは２５０ｍＭであり、ＬＬＳは、４％〜１５％の濃度、より好ましくは８％（ｗ／ｖ）であり、ＥＤＴＡは、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度、またはより好ましくは０．１ｍＭもしくは１０ｍＭの濃度であり、試薬のｐＨは、７．２〜７．６、またはより好ましくは７．３である。任意に、溶解試薬は、重炭酸ナトリウム、塩化アンモニウム、ＬＬＳ、ＥＤＴＡ及び水から本質的になる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
好ましい溶解試薬には、粉末形態または水などの溶媒中の、先に記載の濃度のいずれかのリン酸ナトリウム、ＬＬＳ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２及びＥＧＴＡが含まれる。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭであり、ＬＬＳは、４％〜１５％の濃度、またはより好ましくは１０％（ｗ／ｖ）である。ＥＤＴＡ−Ｎａ２は、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度、またはより好ましくは１ｍＭであり、ＥＧＴＡは、０．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度、またはより好ましくは１ｍＭであり、試薬のｐＨは６．０〜８．０、またはより好ましくは６．７である。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、一塩基性リン酸ナトリウム及び二塩基性リン酸ナトリウムの一方または両方を含む。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムを含む。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含む。好ましくは、リン酸ナトリウム緩衝液は、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムを含み、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭもしくは１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウムを含む。任意に、溶解試薬は、リン酸ナトリウム、洗剤、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及び水から本質的になる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
好ましい溶解試薬には、粉末形態または水などの溶媒中の、先に記載の濃度のいずれかのＴＲＩＳ、塩化マグネシウム、及びＬＬＳが含まれる。好ましくは、ＴＲＩＳは、７５ｍＭ〜１５０ｍＭの濃度、またはより好ましくは１００ｍＭの濃度であり、塩化マグネシウムは、１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度、またはより好ましくは３０ｍＭであり、ＬＬＳは、４〜１５％、より好ましくは６％（ｗ／ｖ）であり、試薬のｐＨは、７．０〜８．０、またはより好ましくは７．５である。任意に、溶解試薬は、ＴＲＩＳ、塩化マグネシウム、及びＬＬＳ、ならびに水から本質的になる。任意に、溶解試薬は、消泡剤を含有する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
この第１の実施例では、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、溶解試薬Ａ及び溶解試薬Ｂを、バベシア試料調製物について評価した。各チューブに含有されるＰＡＸｇｅｎｅ試薬は、細胞膜を溶解して安定化試薬として作用することが既知である第４級アンモニウム塩である活性化合物テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサラート（ＴＤＴＭＡＯ）を含む。溶解試薬Ａは、ｐＨ７．４で、１４ｍＭ重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化アンモニウム、５％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの水溶液であった。溶解試薬Ｂは、ｐＨ７．３で、１４ｍＭ重炭酸ナトリウム、２５０ｍＭ塩化アンモニウム、８％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡの水溶液であった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
溶解試薬Ｃを溶解試薬Ｂと同様に作製したが、ＥＤＴＡの濃度を１０ｍＭまで上昇させた。溶解試薬Ｄは、ｐＨ６．７で１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、１０％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ−Ｎａ２二水和物からなる水溶液とした。溶解試薬Ｅは、ｐＨ７．５で１００ｍＭのＴＲＩＳ  ３０ｍＭの塩化マグネシウム、及び６％（ｗ／ｖ）ＬＬＳの水溶液とした。分離した刺激済み全血試料（先に説明ずみ）を１：２または１：４（血液試料：溶解試薬）の比の溶解試薬Ｃ〜Ｅのうちの１つで各々溶解し、表２〜４において識別される通り、条件ごとに３６〜７２個の複製物で検査した。反応性のある試料とは、ＲＬＵ値が１００，０００ＲＬＵを超えるものであると判定された。先に説明した通り、Ｐｒｏｃｌｅｉｘ  ＴＣＲ及びＴＭＡによる増幅を用いて、各試料においてバベシア１８Ｓ  ｒＲＮＡを検出した。感度、安定性及び頑強性について条件を評価した。溶解試薬Ｃ〜Ｅについての結果を表２、表３、表４に示す。
【表２】
2019515277.tif 000006
【表３】
2019515277.tif 000007
【表４】
2019515277.tif 000008
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
理解を明確にする目的のために本発明を詳細に説明してきたが、ある一定の変更は、添付の特許請求の範囲内で実施され得る。受託番号、ウェブサイト等を含むすべての公開物、及び本出願に引用された特許文献はその全体が参照により、各々が個別に示されているのと同じ程度まで、すべての目的のために本明細書により組み込まれる。配列、ウェブサイトまたは他の参照の広範な異なる版が異なる時刻に存在し得る場合には、有効な出願日における参照と関連する版が意図される。有効な出願日とは、発行時の受託番号が開示された最も早い優先日を意味する。文脈から他に明らかでない限り、本発明のいかなる要素、実施形態、ステップ、特徴または態様も、その他と組み合わせて実施することができる。
例えば、本発明の実施形態の一部の例は、以下の項目に示される。
（項目１）
塩化アンモニウムと、アニオン洗剤と、抗凝固薬と、を含む、試薬。
（項目２）
緩衝液をさらに含む、項目１に記載の試薬。
（項目３）
前記緩衝液が重炭酸ナトリウムである、項目２に記載の試薬。
（項目４）
前記試薬が約７．０〜約８．０のｐＨを有する、項目２または項目３に記載の試薬。
（項目５）
前記ｐＨが約７．２〜約７．６である、項目４に記載の試薬。
（項目６）
前記ｐＨが約７．３である、項目５に記載の試薬
（項目７）
前記抗凝固薬が、ＥＤＴＡ、ヘパリン、またはクエン酸塩である、項目１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
（項目８）
前記抗凝固薬がであり、前記ＥＤＴＡが約０．０５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で存在する、項目７に記載の試薬。
（項目９）
前記ＥＤＴＡが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する、項目７に記載の試薬。
（項目１０）
前記ＥＤＴＡが約０．１ｍＭの濃度で存在する、項目９に記載の試薬。
（項目１１）
前記ＥＤＴＡが約１０ｍＭの濃度で存在する、項目９に記載の試薬。
（項目１２）
塩化アンモニウムが約１００ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度で存在する、項目１〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１３）
前記塩化アンモニウムが約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在する、項目１２に記載の試薬。
（項目１４）
塩化アンモニウムが約２５０ｍＭの濃度で存在する、項目１３に記載の試薬。
（項目１５）
前記アニオン洗剤が、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなる群から選択される、項目１〜１４のいずれか１項に記載の試薬。
（項目１６）
前記アニオン洗剤がＬＬＳであり、前記ＬＬＳが約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目１５に記載の試薬。
（項目１７）
前記ＬＬＳが約５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目１６に記載の試薬。
（項目１８）
前記ＬＬＳが約８％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目１７に記載の試薬。
（項目１９）
前記重炭酸ナトリウムが約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、項目３〜１８のいずれか１項に記載の試薬。
（項目２０）
前記重炭酸ナトリウムが約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、項目１９に記載の試薬。
（項目２１）
前記重炭酸ナトリウムが約１４ｍＭの濃度で存在する、項目２０に記載の試薬。
（項目２２）
前記塩化アンモニウムが約２５０ｍＭの濃度で存在し、前記アニオン洗剤がＬＬＳであり、前記ＬＬＳが約８％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、前記試薬が重炭酸ナトリウムである緩衝液をさらに含み、前記重炭酸ナトリウムが約１４ｍＭの濃度で存在し、前記試薬が約７．２〜約７．６のｐＨを有する、項目１に記載の試薬。
（項目２３）
項目１〜２２のいずれか１項に記載の試薬と、赤血球または赤血球由来の産物と、を含む、組成物。
（項目２４）
前記組成物が全血を含む、項目２３に記載の組成物。
（項目２５）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約３：１（ｖ／ｖ）である、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）である、項目２４に記載の組成物。
（項目２７）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約４：１（ｖ／ｖ）である、項目２４に記載の組成物。
（項目２８）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）〜約４：１（ｖ／ｖ）である、項目２４に記載の組成物。
（項目２９）
前記全血がヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、項目２４〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目３０）
（ｉ）緩衝液と、（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、（ｉｉｉ）塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬のうちの１つまたは両方と、を含む、溶血試薬であって、５．５よりも高いｐＨを有する、溶血試薬。
（項目３１）
前記緩衝液が、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する重炭酸ナトリウムである、項目２０に記載の試薬。
（項目３２）
前記重炭酸ナトリウムが、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、項目３１に記載の試薬。
（項目３３）
前記重炭酸ナトリウムが、約１５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在する、項目３２に記載の試薬。
（項目３４）
前記重炭酸ナトリウムが、約１４ｍＭの濃度で存在する、項目３０に記載の試薬。
（項目３５）
前記ＬＬＳが、約８％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目３０〜３４のいずれか１項に記載の試薬。
（項目３６）
前記試薬がＥＤＴＡを含み、前記ＥＤＴＡが約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する、項目３０〜３５のいずれか１項に記載の試薬。
（項目３７）
前記ＬＬＳが約８％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、前記試薬が約２００ｍＭ〜約３５０ｍＭの濃度で存在する塩化アンモニウムを含む、項目３６に記載の試薬。
（項目３８）
前記ＥＤＴＡが約１０ｍＭの濃度で存在する、項目３７に記載の試薬。
（項目３９）
前記塩化アンモニウムが約２５０ｍＭの濃度で存在する、項目３７または項目３８に記載の試薬。
（項目４０）
前記緩衝液がリン酸ナトリウムであり、前記リン酸ナトリウムが約１０ｍＭ〜約３３ｍＭの濃度で存在する、項目３０に記載の試薬。
（項目４１）
前記緩衝液がリン酸ナトリウムであり、前記リン酸ナトリウムが約１５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で存在する、項目３０に記載の試薬。
（項目４２）
前記リン酸ナトリウム緩衝液が、約１５ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウムと、約１５ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム緩衝液と、を含む、項目４０または項目４１に記載の試薬。
（項目４３）
前記ＬＬＳが、約８％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目４０〜４２のいずれか１項に記載の試薬。
（項目４４）
前記試薬が抗凝固薬を含み、前記抗凝固薬がＥＤＴＡ−Ｎａ２である、項目３０及び４０〜４３のいずれか１項に記載の試薬。
（項目４５）
前記試薬が抗凝固薬を含み、前記抗凝固薬が約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度のＥＧＴＡを含む、項目３０及び４０〜４４のいずれか１項に記載の試薬。
（項目４６）
前記抗凝固薬がＥＤＴＡ−Ｎａ２をさらに含み、前記ＥＤＴＡ−Ｎａ２が約１ｍＭの濃度で存在する、項目４５に記載の試薬。
（項目４７）
前記ＥＧＴＡが約１ｍＭの濃度で存在する、項目４５または項目４６に記載の試薬。
（項目４８）
前記ＬＬＳが約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目４０〜４７のいずれか１項に記載の試薬。
（項目４９）
前記ＬＬＳが約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し、前記抗凝固薬が約１ｍＭの濃度で存在するＥＤＴＡ−Ｎａ２と、約１ｍＭの濃度で存在するＥＧＴＡと、を含む、項目４２に記載の試薬。
（項目５０）
前記緩衝液がＴＲＩＳであり、前記試薬が塩化マグネシウムを含み、前記試薬が前記抗凝固薬を含んでいない、項目３０に記載の試薬。
（項目５１）
前記塩化マグネシウムが、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で存在する、項目５０に記載の試薬。
（項目５２）
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、項目５０または項目５１に記載の試薬。
（項目５３）
前記ＬＬＳが約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目５０〜５２のいずれか１項に記載の試薬。
（項目５４）
前記ＬＬＳが約６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目５３に記載の試薬。
（項目５５）
前記試薬が、ＴＲＩＳ緩衝液と、約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で存在する塩化マグネシウム塩と、約４％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する前記ＬＬＳと、から本質的になる、項目３０に記載の試薬。
（項目５６）
前記ＴＲＩＳが約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、項目５０〜５５のいずれか１項に記載の試薬。
（項目５７）
前記ＴＲＩＳが約１００ｍＭの濃度で存在する、項目５６に記載の試薬。
（項目５８）
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、項目５５〜５７のいずれか１項に記載の試薬。
（項目５９）
前記ＬＬＳが約６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目５５〜５８のいずれか１項に記載の試薬。
（項目６０）
前記緩衝液がＴＲＩＳであり、前記ＴＲＩＳが約７５ｍＭ〜約１５０ｍＭの濃度で存在する、項目３０に記載の試薬。
（項目６１）
前記試薬が塩化マグネシウム塩を含み、前記塩化マグネシウムが約２０ｍＭ〜約３５ｍＭの濃度で存在する、項目６０に記載の試薬。
（項目６２）
前記ＬＬＳが約４％〜約１５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目６０または項目６１に記載の試薬。
（項目６３）
前記ＴＲＩＳが約１００ｍＭの濃度で存在する、項目６０〜６２のいずれか１項に記載の試薬。
（項目６４）
前記塩化マグネシウムが約３０ｍＭの濃度で存在する、項目６０〜６３のいずれか１項に記載の試薬。
（項目６５）
前記ＬＬＳが約６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、項目６０〜６４のいずれか１項に記載の試薬。
（項目６６）
前記試薬が前記抗凝固薬を含んでいない、項目６０〜６５のいずれか１項に記載の試薬。
（項目６７）
項目３０〜６６のいずれか１項に記載の試薬と、血液細胞と、を含む、組成物。
（項目６８）
前記試薬が全血を含む、項目６７に記載の組成物。
（項目６９）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約１：１（ｖ／ｖ）〜約４：１（ｖ／ｖ）である、項目６８に記載の組成物。
（項目７０）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約２：１（ｖ／ｖ）である、項目６８に記載の組成物。
（項目７１）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約３：１（ｖ／ｖ）である、項目６８に記載の組成物。
（項目７２）
前記組成物中の前記試薬と前記全血の比が約４：１（ｖ／ｖ）である、項目６８に記載の組成物。
（項目７３）
前記全血がヒト全血、非ヒト全血、またはこれらの混合物である、項目６８〜７２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７４）
血液細胞から分析種を分析する方法であって、（ａ）血液細胞を、塩化アンモニウムと、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、抗凝固薬と、を含む、試薬と接触させ、それにより前記血液細胞の少なくとも一部が溶解し、分析種が前記溶解した血液細胞から放出され、前記試薬が、前記血液細胞から放出された分析種の分解を有効に阻害するステップと、（ｂ）前記血液細胞から放出された前記分析種を分析するステップと、を含む、方法。
（項目７５）
前記分析種が病原体由来の分析種である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記分析種がＲＮＡ分析種である、項目７４または項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記血液細胞の少なくとも５０％が前記試薬によって５分以内に溶解する、項目７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
（項目７８）
溶解した赤血球の百分率が、溶解した白血球の百分率よりも大きい、項目７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
（項目７９）
前記試薬が、項目１〜２２のいずれか１項に定義される通りである、項目７４〜７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
前記接触させるステップの後に、固体支持体上に前記分析種を固定するステップをさらに含む、項目７４〜７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
固体支持体上に前記分析種を固定する前記ステップが、前記放出された分析種を、固体支持体に結合した捕捉プローブ及び固定したプローブと接触させるステップを含み、前記捕捉プローブが、前記分析種と相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を有し、前記分析種が、前記捕捉プローブの前記第１のセグメントへ結合し、前記捕捉プローブの前記第２のセグメントが、前記固定したプローブへ結合する、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
増幅反応を実施して前記分析種を増幅させ、その結果として得られた増幅産物を検出プローブで検出することをさらに含む、項目８０に記載の方法。
（項目８３）
前記増幅反応が等温増幅反応である、項目８０に記載の方法。
（項目８４）
前記増幅反応が転写媒介性増幅反応である、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記血液細胞から放出された前記分析種から前記試薬を分離するための遠心分離ステップなしで実施される、項目７４〜８４のいずれか１項に記載の方法。
（項目８６）
前記分析種が病原性生物である、項目７４〜８５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８７）
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記病原性生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記接触させるステップにおいて、前記赤血球が全血中にあり、試薬と全血の比が１：１〜４：１である、項目７４〜９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目９２）
血液細胞を溶解し、そこから分析種を放出させる方法であって、（ａ）血液細胞を含有する試料を、前記血液細胞を溶解させ、そこから分析のための分析種を放出させるのに有効な溶解試薬と接触させるステップであって、前記溶解試薬が、（ｉ）緩衝液と、（ｉｉ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、（ｉｉｉ）塩化物含有塩ならびにＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬のうちの少なくとも１つと、を含み、前記試薬が、５．５よりも高いｐＨを有するステップと、（ｂ）前記試料中の血液細胞を溶解させ、それにより前記血液細胞の少なくとも一部が溶解し、そこから前記分析種が放出される条件を提供するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において放出された前記分析種を分析するステップと、を含む、方法。
（項目９３）
前記分析種が病原体由来の分析種である、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記分析種がＲＮＡ分析種である、項目９２または項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記血液細胞の少なくとも５０％が前記試薬によって５分以内に溶解する、項目９２〜９４のいずれか１項に記載の方法。
（項目９６）
前記試薬が、項目２８〜６４ｈのいずれか１項に定義される通りである、項目９２〜９５のいずれか１項に記載の方法。
（項目９７）
固体支持体上に前記分析種を固定するステップをさらに含む、項目９２〜９６のいずれか１項に記載の方法。
（項目９８）
前記分析種を固定する前記ステップは、前記放出された分析種を捕捉プローブ及び固定したプローブと接触させることを含み、前記捕捉プローブが、前記分析種に相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を有し、前記分析種が前記捕捉プローブへ結合し、前記結合した捕捉プローブが、前記固定したプローブへ結合する、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
前記固定した分析種が、増幅反応を用いて前記分析種を増幅し、結果として得られた増幅産物を検出プローブで検出して分析される、項目９７に記載の方法。
（項目１００）
前記増幅反応が等温増幅反応である、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記増幅反応が転写媒介性増幅である、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記方法が、前記赤血球から放出された前記標的から前記試薬を分離するための遠心分離ステップなしで実施される、項目９２〜１０１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０３）
前記分析種が病原性生物である、項目９２〜１０２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０４）
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記病原生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記試料が全血を含み、前記接触させるステップの間に、試薬と全血の比が１：１〜４：１である、項目９２〜１０７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０９）
血液細胞を含有する試料から分析種を分離する方法であって、（ａ）溶解試薬と血液細胞を含有する試料との混合物を、前記試料中の前記血液細胞の少なくとも一部の溶解に十分な条件下でインキュベートし、それにより分析種を放出させるステップ、（ｂ）前記混合物を、前記分析種を固定するように構成された固体支持体と接触させるステップ、及び（ｃ）前記固定した分析種を前記混合物から分離するステップから本質的になり、前記溶解試薬が、緩衝液と、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）と、塩化物含有塩及び抗凝固薬のうちの少なくとも１つと、を含み、前記抗凝固薬が、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ−Ｎａ２、ＥＧＴＡ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記試薬が５．５よりも高いｐＨを有する、方法。
（項目１１０）
前記固体支持体が、付着した固定したプローブを含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記接触させるステップ（ｂ）は、前記混合物を、前記分析種に相補的な第１のセグメントと、前記固定したプローブに相補的な第２のセグメントと、を含む、捕捉プローブと接触させることをさらに含む、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
ステップ（ｂ）の後でありかつステップ（ｃ）の前にあるステップ（ｉ）をさらに含み、前記ステップ（ｉ）が、前記捕捉プローブの前記第１のセグメントと前記分析種との間のハイブリッド形成複合体の形成を好むハイブリッド形成条件を提供することを含む、項目１１１に記載の方法、
（項目１１３）
ステップ（ｉ）の後でありかつステップ（ｃ）の前であるステップ（ｉｉ）をさらに含み、前記ステップ（ｉｉ）が、前記捕捉プローブの前記第２のセグメントと、前記固体支持体へ付着した前記固定したプローブとの間のハイブリッド形成複合体の形成を好むハイブリッド形成条件を提供することを含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記固体支持体が磁気ビーズ固体支持体である、項目１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１５）
前記固体支持体がシリカ固体支持体である、項目１０９〜１１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１６）
前記シリカ固体支持体がグラスウールである、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記シリカ固体支持体がビーズである、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）
前記固体支持体がカラム内に含有される、項目１０９〜１１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１９）
前記分析種が病原性生物である、項目１０９〜１１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２０）
前記病原性生物が、肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、フラビウイルス、ジカウイルス、及び寄生生物からなる群から選択される、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記病原性生物が、バベシア属由来の寄生虫、プラスモジウム属由来の寄生虫、トリパノソーマ属由来の寄生虫、リーシュマニア属由来の寄生虫、アナプラズマ属由来の寄生虫、トキソプラズマ属由来の寄生虫、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、バベシア・ダイバーゲンス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ダンカニ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｕｎｃａｎｉ）、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモジウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモジウム・オベール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ）、プラスモジウム・ヴィバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、及びプラスモジウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）からなる群から選択される寄生生物である、項目１２０に記載の方法。
（項目１２２）
前記病原性生物がバベシア属に由来し、前記分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、項目１２１に記載の方法。
（項目１２３）
前記病原性生物が、バベシア・ミクロチ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記分析種がＲＮＡ分析種である、項目１０９〜１２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２５）
前記ＲＮＡ分析種がリボソームＲＮＡ分析種である、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記試料が全血試料である、項目１０９〜１２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２７）
項目１〜２２及び３０〜６６のいずれか１項に定義される通りの溶解試薬を含むキット。
（項目１２８）
細胞試料から放出された分析種を固定するための固体支持体をさらに含む、項目１２７に記載のキット。
（項目１２９）
プライマー、少なくとも１つの検出プローブ、またはそれらの両方をさらに含む、項目１２７または１２８に記載のキット。
（項目１３０）
項目１〜２２及び３０〜６６のいずれか１項に記載の溶解試薬を、血液細胞を含有する試料と混合することによって調製される反応混合物。
（項目１３１）
前記反応混合物が、前記溶解試薬及び血液細胞を含有する前記試料と一緒に、前記血液細胞から放出された分析種を固定するための固体支持体を混合することをさらに含む、項目１３０に記載の反応混合物。
【国際調査報告】
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