(57)【要約】本発明は、βヘマチンを含むワクチンアジュバント組成物の調製法および該調製法により得られたワクチンアジュバント組成物の提供を目的とし、本発明は平均粒子径２０〜５００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物である。
2011074711.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒子径２０〜５００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物。
【請求項２】
平均粒子径５０〜３００ｎｍのβヘマチン結晶を含む、請求項１記載のワクチンアジュバント組成物。
【請求項３】
平均粒子径５０〜２００ｎｍのβヘマチン結晶を含む、請求項２記載のワクチンアジュバント組成物。
【請求項４】
塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、粒子径により分画し、平均粒子径２０〜１０００ｎｍの画分を得ることを含む、βヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
【請求項５】
塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、粒子径により分画し、平均粒子径５０〜２００ｎｍの画分を得ることを含む、請求項４記載のβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
【請求項６】
βヘマチン結晶をオートクレーブ処理することにより微細化する方法。
【請求項７】
微細化により、平均粒子径５０〜３００ｎｍのβヘマチン結晶が得られる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
微細化により、平均粒子径５０〜２００ｎｍのβヘマチン結晶が得られる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により、βヘマチン結晶をオートクレーブ処理することにより微細化することを含む、βヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
【請求項１０】
塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、オートクレーブ処理を行うことを含む、平均粒子径２０〜１０００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
【請求項１１】
塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、オートクレーブ処理を行うことを含む、請求項１０記載の平均粒子径５０〜３００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンアジュバント組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
強力なワクチンは、長期間の適応免疫を誘発する防御抗原だけでなく、自然免疫系を活性化するアジュバント成分を含む。
マラリア感染の防御および干渉のためには、最近になって赤血球期を標的として全寄生虫ワクチンストラテジーが注目されている。しかしながら、免疫原性のために重要なアジュバント成分およびその作用メカニズムについてはわかっていなかった。
ヘモゾイン（Ｈｅｍｏｚｏｉｎ）は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ原虫の食胞に存在するヘム分子の解毒産物である疎水性ヘムダイマー集合体（結晶）であり、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ原虫が宿主ヘモグロビンを消化することによりできる。ＣｐＧ  ＤＮＡと同様にＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ９（ＴＬＲ９）のリガンドとして作用することが報告されていた。塩化ヘミンから合成されたヘモゾインはβヘマチンと呼ばれる（非特許文献１を参照）。
ヘモゾインがｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウスの脾臓細胞や樹状細胞を活性化することが報告されている（特許文献１を参照）。また、ヘモゾインがマウスにおいてリボヌクレアーゼＡの抗体産生に対するアジュバント効果を有することが報告されている（特許文献２を参照）。
さらに、βヘマチンがＤＮＡワクチンのアジュバントとしての効果を有することが報告され（非特許文献２を参照）、また、βヘマチンがＴＬＲ９のＤＮＡ分子（いわゆるＣｐＧモチーフと呼ばれる非メチル化ＤＮＡ鎖）以外のリガンドとして機能することが報告されている（非特許文献３を参照）。
さらに、ヘモゾインをｉｎ  ｖｉｖｏでアレルゲンワクチンや細菌やウイルスの感染症のワクチンの効果を高めるワクチンアジュバントとして用いることが報告されていた（特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００６／０６１９６５号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５８４９３０７号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００９／０５７７６３号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｌａｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：３２５−３２９，１９９１
【非特許文献２】Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００２  Ｊｕｌ；７０（７）：３９３９−４３
【非特許文献３】Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００５  Ｊａｎ  ３；２０１（１）：１９−２５
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、βヘマチンを含むワクチンアジュバント組成物の調製法および該調製法により得られたワクチンアジュバント組成物の提供を目的とする。
本発明者等は、宿主の赤血球のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐｆ）感染の間に生成されるヘム結晶である合成ヘモゾインがＤＮＡの存在を必要とせずに、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）９およびＣＡＲＤを含むａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｐｅｃｋ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ＣＡＲＤ（ＡＳＣ）を含むインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）を別々に活性化することにより、強力なアジュバント活性を有することを見出した。
さらに、本発明者らは、塩化ヘミンを水酸化ナトリウム溶液に溶解し、塩酸を少量添加後、６０℃でｐＨ４．８付近になるまで酢酸を添加し、室温下１６時間静置反応した。次に、遠心分離により沈殿を得て、その沈殿にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を２％含むｐＨ９程度の弱塩基性重炭酸溶液を添加し洗浄し、水で置換した後、遠心分離で分画し、湿式レーザー回折散乱式粒度分布測定装置で測定したサンプルを用いて各サイズのアジュバント効果を調べた。その結果、５０〜２００ｎｍのサイズを有する画分が最も強力なアジュバント効果を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  平均粒子径２０〜５００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物。
［２］  平均粒子径５０〜３００ｎｍのβヘマチン結晶を含む［１］のワクチンアジュバント組成物。
［３］  平均粒子径５０〜２００ｎｍのβヘマチン結晶を含む［２］のワクチンアジュバント組成物。
［４］  塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を加え室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、粒子径により分画し、平均粒子径２０〜１０００ｎｍの画分を得ることを含む、βヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
［５］  塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、粒子径により分画し、平均粒子径５０〜２００ｎｍの画分を得ることを含む、［４］のβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
［６］  βヘマチン結晶をオートクレーブ処理することにより微細化する方法。
［７］  微細化により、平均粒子径５０〜３００ｎｍのβヘマチン結晶が得られる、［６］の方法。
［８］  微細化により、平均粒子径５０〜２００ｎｍのβヘマチン結晶が得られる、［６］の方法。
［９］  ［６］〜［８］のいずれかの方法により、βヘマチン結晶をオートクレーブ処理することにより微細化することを含む、βヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
［１０］  塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、オートクレーブ処理を行うことを含む、平均粒子径２０〜１０００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
［１１］  塩化ヘミンをＮａＯＨ水溶液に溶解して得られた溶液に、少量の塩酸を添加し、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６に調整し、混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液で洗浄して得られたβヘマチン結晶を、オートクレーブ処理を行うことを含む、［１０］の平均粒子径５０〜３００ｎｍのβヘマチン結晶を含むワクチンアジュバント組成物の作製方法。
本発明のβヘマチンを含むワクチンアジュバント組成物をアレルゲンワクチンや細菌、ウイルス、リケッチア、寄生虫等の病原体の感染症のワクチンと併用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、病原体に対する抗体価がアジュバントを併用しない場合に比べ上昇し、効果的にアレルギー疾患や感染症を予防または治療することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−２８７７０９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、Ｐｆ粗抽出物のＴＬＲ９依存性様式でのアジュバント効果を示す図であり、血清中の抗Ｐｆ抽出物特異的ＩｇＧ抗体産生を示す図である。
図２は、Ｐｆ粗抽出物のＴＬＲ９依存性様式でのアジュバント効果を示す図であり、血清中の抗Ｐｆ抽出物特異的ＩｇＧ２ｃ抗体産生を示す図である。
図３は、Ｐｆ粗抽出物のＴＬＲ９依存性様式でのアジュバント効果を示す図であり、培養脾臓細胞のＩＦＮγ産生を示す図である。
図４は、２つの方法（実施例の方法１および方法２）で合成した合成ヘモゾインのＦＥＳＥＭ像を示す図であり、図４Ａは方法１で合成したヘモゾインを、図４Ｂは方法２で合成したヘモゾインを示す。スケールバーは５００ｎｍである。
図５は、方法１または方法２で合成した合成ヘモゾインのあるなしで皮下注射によりＯＶＡ抗原で免疫したＣ５７Ｂ／６マウス血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ反応を示す図である（ＥＬＩＳＡで測定）。
図６は、方法１で合成した合成ヘモゾインを分画した際の粒度分布（粒子数割合）を示す図である。
図７は、異なるサイズの合成ヘモゾイン（５０〜２００ｎｍおよび２〜２０μｍ）またはヘミン（５０ｎｍ以下）のアジュバント効果を示す図であり、ＯＶＡで免疫したＣ５７Ｂ／６マウスの血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体反応を示す図である。
図８は、合成ヘモゾインの強力なアジュバント活性及び濃度依存性を示す図である。野生型マウスを種々の濃度の合成ヘモゾインと共に１０μｇのモデル抗原であるＨＳＡで免疫し、同量のＨＳＡおよび合成ヘモゾインで１０日後に追加免疫を行い、追加免疫後１週間後の血清中ＨＳＡ特異的ＩｇＧ反応を示す（ＥＬＩＳＡで測定）。
図９は、合成ヘモゾインの強力なアジュバント活性を示す図である。野生型マウスを種々の濃度の合成ヘモゾインと共に１０μｇのモデル抗原であるＨＳＡで免疫し、同量のＨＳＡおよび合成ヘモゾインで１０日後に追加免疫を行い、追加免疫後１週間後の血清中ＨＳＡ特異的ＩｇＧのアイソタイプを示す。
図１０は、アラム、ＣｐＧ  ＤＮＡおよび合成ヘモゾインのアジュバント効果の比較を示す図である。マウスをＯＶＡ抗原とアラム（２００μｇ）、ＣｐＧ  ＤＮＡ（５０μｇ）および合成ヘモゾイン（８００μｇ）で免疫し、１０日後に追加免疫を行い、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ反応をＥＬＩＳＡで測定した。
図１１は、合成ヘモゾインの全血マラリア抗原に対するアジュバント効果を示す図であり、野生型マウスを１０μｇのＰｆ粗抽出物および８００μｇの合成ヘモゾインで免疫し、同量のＰｆ粗抽出物および合成ヘモゾインで追加免疫し、追加免疫の１週間後に血清中Ｐｆ粗抽出物特異的ＩｇＧ反応をＥＬＩＳＡで測定した。
図１２は、合成ヘモゾインのイヌのダニアレルギーに対する効果を示す図であり、Ｄｅｒｆ２単独、５００μｇのアラムもしくはアラムと合成ヘモゾインとを混合調製したＤｅｒｆ２で免疫したビーグル犬の血清中の抗Ｄｅｒｆ２特異的ＩｇＧ２およびＩｇＧ１反応を示す。
図１３は、合成ヘモゾインのイヌアレルギーに対する効果を示す図であり、Ｄｅｒｆ２感作後のビーグル犬の血清中の抗Ｄｅｒｆ２特異的ＩｇＥ反応を示す図である。
図１４は、タンパク質、脂質および膜を含むＰｆ粗抽出物、Ｐｆから抽出した純粋な天然ヘモゾインおよびＭＳＵ結晶のＦＥＳＥＭ像を示す図である。スケールバーは５００ｎｍ。
図１５は、ヘモゾインのアジュバント効果を示す図であり、Ｂａｌｂ／ｃマウスを皮下注射によりＯＶＡ単独または合成ヘモゾインと共に免疫し、１０日後に同量で追加免疫した結果を示す図である。
図１６は、ヘモゾインのアジュバント効果を示す図であり、Ｂａｌｂ／ｃマウスを鼻腔投与によりＯＶＡ単独または合成ヘモゾインと共に免疫し、１０日後に同量で追加免疫した結果を示す図である。
図１７は、合成ヘモゾイン調製物の純度を示す図であり、合成ヘモゾイン調製物中のヘミンの混入を示すＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）の結果を示す図である。合成ヘモゾインとその１０％ヘム鉄等量のヘミンをシリカゲルプレートにスポットしメタノールで展開した図であり、ＴＬＣプレートの右側に合成ヘモゾイン中の混入ヘミンの薄いバンドが観察される。
図１８は、ヘミンおよび合成ヘモゾインのＦＴ−ＩＲの結果を示す図である。ヘミンのピークはシフトしており、βヘマチンが生成したことを示唆している。
図１９は、合成ヘモゾインの粉末Ｘ線解析の回折パターンを示す図である。
図２０は、平均粒子径が大（２〜５０μｍ）及び小（２０〜５００ｎｍ）のβヘマチン各２Ｌｏｔ間でのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＣ５７ＢＬ６マウス血清中の抗ＯＶＡ（卵白アルブミン）特異的ＩｇＧの抗体産生を示す図である。
図２１は、平均粒子径が大（２〜５０μｍ）及び小（２０〜５００ｎｍ）のβヘマチン各２Ｌｏｔ間でのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＣ５７ＢＬ６マウス血清中の抗ＯＶＡ（卵白アルブミン）特異的ＩｇＧ２ａ抗体産生を示す図である。
図２２は、平均粒子径が大（２〜５０μｍ）及び小（２０〜５００ｎｍ）のβヘマチン各２Ｌｏｔ間でのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＣ５７ＢＬ６マウス血清中の抗ＯＶＡ（卵白アルブミン）特異的ＩｇＧ２ｂ抗体産生を示す図である。
図２３は、平均粒子径が大（２〜５０μｍ）及び小（２０〜５００ｎｍ）のβヘマチンのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＢａｌｂ／ｃマウス血清中の抗ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）特異的ＩｇＧ抗体産生を示す図である。
図２４は、平均粒子径が大（２〜５０μｍ）及び小（２０〜５００ｎｍ）のβヘマチンのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＣ５７ＢＬ６マウス血清中の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体産生を示す図である。
図２５は、平均粒子径が大（２〜５０μｍ）及び小（２０〜５００ｎｍ）のβヘマチンのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ腹腔投与でのＣ５７ＢＬ６マウス血清中の抗ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体産生を示す図である。
図２６は、Ｆｌｕｋａ社の原料より各々合成された、平均粒子径が大（Ｂｉｇ、２〜５０μｍ）及び小（Ｓｍａｌｌ、２０〜５００ｎｍ）のβヘマチンのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＢａｌｂ／ｃマウス血清中の抗ＨＳＡ特異的ＩｇＧ抗体産生を示す図である。
図２７は、ＴＣＩ（東京化成）社の原料より各々合成された、平均粒子径が大（Ｂｉｇ、２〜５０μｍ）及び小（Ｓｍａｌｌ、２０〜５００ｎｍ）のβヘマチンのアジュバント効果を示す図であり、４ｍＭ皮下投与でのＢａｌｂ／ｃマウス血清中の抗ＨＳＡ特異的ＩｇＧ抗体産生を示す図である。
図２８は、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したβヘマチンサンプルをマウスに投与した場合の血中トータルＩｇＧ濃度を示す図である。
図２９は、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したβヘマチンサンプルをマウスに投与した場合の血中ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＧ３を示す図である。
図３０は、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したβヘマチンサンプルの粒度分布を示す図である。
図３１は、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理前後のβヘマチンサンプルの実体顕微鏡像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のワクチンアジュバント組成物の構成成分であるβヘマチンは、合成ヘモゾインであり、塩化ヘミンより以下の方法で合成することができる。
塩化ヘミン４５ｍｇを１Ｎ  ＮａＯＨ水溶液４．５ｍＬに溶解し１Ｎ  ＨＣｌ水溶液を０．４５ｍＬ添加する。得られた溶液に、室温〜６０℃にて酢酸を滴下し、ｐＨを４〜６、好ましくは４．５〜５、さらに好ましくは４．８に調整する。混合液を室温〜４０℃で１〜２４時間静置反応後、遠心分離を行い、沈殿を得て、２％ＳＤＳを含むｐＨ９程度の弱塩基性溶液、例えば０．１Ｍ重炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．１）で洗浄し精製水で置換する。このようにしてβヘマチン結晶を得ることができる。このようにして作製したβヘマチンをさらに粒子径により分画し、小粒子径のものを用いる。平均粒子径の測定は、例えば湿式レーザー回折散乱式粒度分布測定装置を用いて行うことができる。本発明のワクチン組成物が含むβヘマチン結晶の大きさは、平均粒子径で２０〜１０００ｎｍ、好ましくは２０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは５０〜２００ｎｍである。なお、このようにして作製したβヘマチンは図４Ａに示すような結晶構造をとる。本発明のβヘマチンは、分散しているｎｍサイズの単結晶（一次粒子）のβヘマチンであり、凝集体を形成したβヘマチンを分画処理し、ｎｍサイズの単結晶の平均粒子径を測定している（図６）。凝集体の平均粒子径は２〜５０μｍであり、それを分散した一次粒子の平均粒子径が２０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍとなる。
合成したβヘマチンは、２％  ＳＤＳを含む２０ｍＭ水酸化ナトリウムに溶解させ２時間室温にて静置反応したのち、４００ｎｍの吸光度を測定することにより定量することができる。定量は、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１１８６５−１１８７０，１９９６に記載の方法に従って行うことができる。
さらに、塩化ヘミンを上記のようにＨＣｌ及び酢酸で処理して得られた沈殿をオートクレーブ処理してもよい。オートクレーブ処理は通常滅菌処理に用いるオートクレーブ装置を用いて行えばよい。オートクレーブ処理は例えば、１００℃以上の温度で１〜９９分間、好ましくは１０５〜１３５℃で１〜９９分間、さらに好ましくは１２１℃で１０〜３０分間行えばよい。オートクレーブ処理は通常２気圧の加圧下で行われる。上記沈殿中のβヘマチンは凝集体を形成しており、オートクレーブ処理により、βヘマチンは単結晶として分散する。βヘマチン結晶をオートクレーブ処理して単結晶として分散させることを微細化という。その単結晶の平均粒子径は、２０〜１０００ｎｍ、好ましくは２０〜５００ｎｍ、さらに好ましくは５０〜３００ｎｍ、特に好ましくは５０〜２００ｎｍである。
本発明は、上記のβヘマチンの免疫応答を刺激するのに有効な量を含むワクチンアジュバント組成物である。ワクチンアジュバントとは、ワクチンと併用した場合に、ワクチンの効果を高め、生体においてワクチンとして用いる免疫原に対する抗体の生産を上昇させる物質をいう。また、本発明は、該ワクチンアジュバント組成物ならびに免疫応答を刺激するのに有効な量のアレルゲンを含むアレルゲンワクチンまたは細菌、ウイルス、リケッチアもしくは寄生虫等の病原体の抗原を含む感染症ワクチンを含むワクチン組成物である。
ワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物中のβヘマチンの量はβヘマチンと抗原を結び付けるような物質（例えば水酸化アルミニウムやプルランなど）を処方に含める場合１μＭ〜５ｍＭ、好ましくは５μＭ〜３ｍＭ、さらに好ましくは７．５μＭ〜２ｍＭ、さらに好ましくは１０μＭ〜２ｍＭ、さらに好ましくは１０μＭ〜１０００μＭ、さらに好ましくは５０μＭ〜５００μＭである。あるいは１μＭ〜１０μＭも好ましい。
βヘマチンをアジュバントとして単独で用いる場合、１μＭ〜４０ｍＭ、好ましくは５０μＭ〜３０ｍＭ、さらに好ましくは１００μＭ〜２０ｍＭ、さらに好ましくは５００μＭ〜１０ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ〜８ｍＭ、さらに好ましくは３ｍＭ〜５ｍＭである。あるいは１μＭ〜１０μＭも好ましい。
本発明のワクチンアジュバント組成物には、βヘマチンの他にフロイントの完全アジュバント、結核菌体などの微生物死菌体、アラムアジュバント等の他の免疫賦活物質を添加してもよい。
本発明のアジュバントは、アレルゲンワクチン、感染症用のワクチン用のアジュバントとして用いることができる。
アレルゲンワクチンとは、生体にアレルゲンを投与することにより、アレルゲンに対するＩｇＧ抗体を生産させてアレルギーの原因となるＩｇＥの作用をブロックし、あるいは生体内でアレルゲンに特異的な１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１細胞）を増加させ、アレルギー症状に関与する２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２細胞）を減少させるためのワクチンをいい、減感作によりアレルギー症状を抑制し得る。アレルゲンワクチンは、種々のアレルギーの原因となるアレルゲンからなる。本発明のワクチンアジュバント組成物と併用するアレルゲンとしては、限定されないが食物アレルゲン、ハウスダストアレルゲン、スギ花粉等の花粉アレルゲン、動物の体毛等のアレルゲンなどが挙げられる。具体的には、花粉アレルゲンとして、スギ花粉アレルゲン（Ｃｒｙ  ｊ  １、Ｃｒｙ  ｊ  ２）、ブタクサアレルゲン（Ａｍｂ  ａ  １、Ａｍｂ  ａ  ２、Ａｍｂ  ａ  ５、Ａｍｂ  ｔ  ５、Ａｍｂ  ｐ  ５）、カモガヤアレルゲン（Ｄａｃ  ｇ  ２）等が挙げられ、食物アレルゲンとして、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリン、オボムコイド、オボアルブミン、コンアルブミン等が挙げられ、ハウスダストアレルゲンとして、ダニ類アレルゲン（Ｄｅｒ  ｆ  １、Ｄｅｒ  ｆ  ２、Ｚｅｎ  １、Ｄｅｒ  ｐ  １、Ｄｅｒ  ｐ  ２）等が挙げられる。この中でも、Ｃｒｙ  ｊ  １などのスギ花粉アレルゲンやＺｅｎ  １、Ｄｅｒ  ｆ  １、Ｄｅｒ  ｆ  ２等のダニアレルゲンが望ましい。
感染症用のワクチンとしては、不活性化された完全ワクチン、サブユニットワクチン、トキソイド等が挙げられる。これらのワクチンは、細菌、ウイルス、リケッチア、寄生虫等の病原体に対して動物に免疫を生じさせる。
感染症用ワクチンとしては、ヒトを対象とする場合、例えば、Ａ型、Ａ／Ｈ１Ｎ１型、Ｂ型インフルエンザ等のインフルエンザ、ポリオウイルス、日本脳炎、結核菌、ヒトパピローマウイルス、マラリア原虫、ＳＡＲＳ、ヒトに感染し得るトリインフルエンザ、腸チフス、パラチフス、ペスト、百日咳、発疹チフス等の感染症用ワクチンが挙げられる。また、非ヒト動物を対象とする場合、例えば、ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウマ脳髄膜炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病、ネコ汎白血球減少症、ネコ鼻気管炎、感染性ウシ鼻気管炎、３型パラインフルエンザ、ウシのウイルス性下痢、ウシアデノウイルス、ブタパルボウイルス、イヌアデノウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザ、トリインフルエンザ、ブルセラ症、ビブリオ症、レプトスピラ症、クロストリジウム感染症、サルモネラ症等の感染症用ワクチンが挙げられる。この中でも、大腸菌（牛乳房炎）、黄色ブドウ球菌（牛乳房炎）、マイコプラズマ（豚肺炎）、ＰＲＲＳウイルス（豚肺炎）、犬狂犬病ウイルス等の感染症用ワクチンが望ましい。
本発明においては、βヘマチンを含むワクチンアジュバント組成物を単独で用いてもよい。この場合、ワクチンアジュバント組成物と上記ワクチンを別々に動物に投与すればよい。また、ワクチンアジュバント組成物とワクチンを混合して用いてもよく、この場合、βヘマチンを含むワクチン組成物として用いることができる。
本発明のワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物の投与対象となる動物は限定されず、免疫系を有するあらゆる動物が挙げられ、ほ乳類、鳥類等を含む。ほ乳類としては、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス等が挙げられる。鳥類としてはニワトリ、アヒル、ガチョウ等が挙げられる。特に本発明のワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物は、ヒトのアレルギーワクチンおよび感染症ワクチン、イヌ、ネコ等のペット動物のアレルギーワクチンおよび感染症ワクチン、ならびにウシ、ブタ、ニワトリ等の産業動物の感染症ワクチンとして有用である。
ワクチン組成物中の抗原量は、対象とする感染症の種類、投与する動物種等により変えることができるが、１回数十ｎｇ〜数ｍｇである。
本発明のワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、またはエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。ワクチン組成物は、経口、経鼻、経粘膜、筋肉内、経皮、皮下、皮内、鼻腔内、気管内等の各経路によって接種できる。また、ワクチン組成物は点眼、穿刺、噴霧、塗察等により投与することができる。また、本発明のワクチンアジュバント組成物またはワクチン組成物は飲料水や餌に含ませた状態で動物に摂取させてもよい。本発明は、本発明のワクチンアジュバント組成物またはワクチン組成物を含む飲料水および餌も包含する。
本発明のワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物は、単回投与でもよいし、２日から８週間間隔で数回にわたって投与してもよい。
本発明のワクチンアジュバント組成物をワクチンとともに動物に投与し、または本発明のワクチン組成物を動物に投与することにより、Ｔｈ１細胞が増加し、アレルギー特異抗体であるＩｇＥの産生が低下し、感染症において防御抗体として作用するＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２ａ抗体の産生が上昇する。この結果、動物においてアレルギー症状を抑え、さらにアレルギー症を治療することができる。また、感染症を予防または治療することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００８】
本実施例は以下の材料を用いて以下の方法により実施した。
１．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ原虫（マラリア原虫；Ｐｆ）粗抽出物、天然ヘモゾイン（ＨＺ）、合成ヘモゾイン（ｓＨＺ）およびＰｆ−ＤＮＡの調製
マイコプラズマフリーのマラリア原虫（３Ｄ７）は、５％Ｏ２、５％ＣＯ２雰囲気下、３％Ｏ型ヒト赤血球、１０％熱不活性化ヒト血清を含む培地中で維持した（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２９，３１９−３２４（２００８））。育成ステージを同調させた後、成熟体およびヘモゾインに富む栄養体および分裂体段階の寄生虫（約４〜５％）について６３％Ｐｅｒｃｏｌｌ密度勾配遠心分離を行い、洗浄し不完全培地に懸濁し、３〜４回の凍結融解を行い、用時まで−８０℃で保存した。
ヘモゾインを多く含むＰｆ粗抽出調製物は、約１×１０９／ｍＬの感染赤血球を含んでいた。タンパク質濃度は分光光度計を用いて２８０ｎｍで測定した。コントロールとして、非感染ヒト赤血球を用いた。精製ヘモゾイン（天然ＨＺ）をＰｆ（３Ｄ７株）感染赤血球から精製した（Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９，９３９−９４３（２００９））。合成ヘモゾインを２通りの方法（Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２，１３−３６，Ｔａｂｌｅ（２００９））にて、塩化ヘミンから合成し精製した。塩化ヘミンはＦｌｕｋａ社より入手した（ＨＰＬＣで測定した純度は９８％以上）。方法１（酸触媒法）は、より小さく均一な結晶を生じることが知られている（Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９，９３９−９４３（２００９）；Ｃｏｂａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５，２７１−２７８（２００７））。簡単には、４５ｍｇの塩化ヘミンを４．５ｍＬのＮａＯＨ溶液に溶解し、１Ｎ  塩酸を０．４５ｍＬ添加した。その後、６０℃で攪拌しながら酢酸をｐＨが４．８になるまで添加した。混合物を室温で１６時間静置反応し、βヘマチン結晶を形成させた。次に遠心分離により沈殿を得、これを２％ＳＤＳを含む０．１Ｍ  重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）で３回洗浄後、精製水で完全に置換した。方法２（メタノール中無水法）はより大きな結晶を生じることが知られている（Ｊｏｆｆｒｅ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２７，２３４−２４７（２００９））。簡単には、５２．２ｍｇの塩化ヘミンを、２ｍＬの２，６−ルチジンに溶解し１０ｍＬのジメチルスルホキシド−メタノールの１：１混合物で希釈し、パラフィルム等を用いて密封し、遮光下室温で２週間以上放置し、その後遠心分離を行い１０ｍＬの０．１Ｍ  重炭酸ナトリウム溶液を用いて洗浄した。最終産物を水とメタノールで各３回洗浄し、乾燥させ、精製水で再分散させた。精製水中のストック懸濁液をｉｎ  ｖｉｖｏ研究用に調製し、４℃で保存した。ヘモゾイン濃度は、合成ヘモゾインの乾燥重量を秤量した後、ｍＭまたはｍｇ／ｍＬで算出した。図４Ｂ並びに図５に示す結果を除き多くの検討は方法１で調製した合成ヘモゾインを用いて行った。合成、洗浄及び希釈に用いるすべての溶液をエンドトキシン不含精製水で調製し、４℃遮光下で保存した。エンドトキシンレベルはヘモゾイン１ｎｍｏｌ当たり０．００１ＥＵ未満であった。合成ヘモゾインであることをフーリエ変換型赤外分光（ＦＴ−ＩＲ）により、精製サンプルに残存原料であるヘミンの混入がないことをＴＬＣにより確認した（図１７および１８）さらに、合成ヘモゾインの粉末についてＸ線解析を行った（図１９）。ＰｆゲノムＤＮＡをＳＤＳ／プロテイナーゼＫ法で単離した後、フェノール−クロロホルム抽出を行った。
２．マウスおよび免疫
（１）マウス
ＴＬＲ９遺伝子を欠失したＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドのマウスを作製し用いた（Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９，９３９−９４３（２００９）；Ｇｉｒａｒｄ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＶａｃｃｉｎｅ  ２５，１５６７−１５８０（２００７））。マウスはＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎから入手した。
野生型マウスおよびＴｌｒ９−／−マウスにＰｆ粗抽出物（１００μＬ、約１×１０８個の原虫に相当）またはＤＮａｓｅＩで処理したＰｆ粗抽出物を腹腔内注射し、免疫を行った。３週間後、マウス血清中のＰｆ粗抽出物に対する抗体をＥＬＩＳＡにより測定した。
抗原として、ＯＶＡ（卵白アルブミン）またはＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を用い、以下の種々の免疫スケジュールで免疫した。
（２）皮下免疫
０日目にマウスに２００μＬの種々の濃度の合成ヘモゾイン溶液中５０μｇのＯＶＡ（または１０μｇのＨＳＡ）を皮下注射し、１０日後に上記と同じ２００μＬの合成ヘモゾイン溶液中２５μｇのＯＶＡ（または１０μｇのＨＳＡ）で追加免疫を行った。１７日目に血液サンプルを回収し、ＯＶＡまたはＨＳＡ特異的抗体反応を分析した。
（３）鼻腔内免疫
マウスに麻酔をかけ、５μｇのＯＶＡを８０μｇの合成ヘモゾインとともに、２週間の間隔をあけ２回鼻腔に投与した（１５μＬ）。追加免疫の１０日後にマウスから血清および気管支肺胞洗浄液および鼻腔分泌液サンプルを採取し、ＩｇＡを測定した。
３．イヌおよびアレルギーモデル
合成ヘモゾインのアジュバントとしての有用性を検討するために，イヌにおけるアレルギー性疾患の病態モデルを作製した。
ハウスダストマイト（コナヒョウヒダニ；Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）の主要アレルゲンの１つであるＤｅｒ  ｆ  ２（１００〜５００μｇ）とアラムアジュバント（５０ｍｇ）を皮下投与して感作させたビーグル犬では，Ｄｅｒ  ｆ  ２に対するアレルギー反応を皮内反応により評価することができる。この反応はアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ応答（血中濃度上昇）とよく相関する。
本発明者は、５ヶ月齢のビーグルを用いて犬モデルを作製し、これにＤｅｒ  ｆ  ２（１００μｇ）、Ｄｅｒ  ｆ  ２（１００μｇ）＋アラムアジュバント（５００μｇ）、またはＤｅｒ  ｆ  ２（１００μｇ）＋アラムアジュバント（５００μｇ）＋合成ヘモゾイン（７．５μＭ）を投与し、２週間後に追加免疫を行った。
４．抗原特異的Ｔ細胞反応の測定
Ｔ細胞仲介細胞反応を脾細胞のＰｆ粗抽出物特異的サイトカイン分泌を測定することによりモニタした。脾臓を最初の免疫の３週間後に採取し１×１０６個の脾細胞を９６ウェルプレートに播き、Ｐｆ粗抽出物で刺激した。７２時間後、細胞培養上清を集めＩＦＮγおよびＩＬ１３濃度をＥＬＩＳＡ（ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社）を用いて測定した。
５．抗体ＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを１μｇ／ｍＬ  ＯＶＡ（卵白アルブミン）抗原、１０μｇ／ｍＬ  ＨＳＡまたは１μｇ／ｍＬ  Ｄｅｒｆ２でコーティングし、ＥＬＩＳＡを行った。
また、別途プレートを３μｇ／ｍＬのＰｆ−ＳＥ３６抗原でコーティングし、ＥＬＩＳＡを行った。二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を用いた。
６．ＦＥＳＥＭおよび粒子サイズ分析
スライドガラスをポリ−Ｌ−リジンでコートし合成ヘモゾインを吸着させ、ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＦＥＳＥＭ（Ｓ−４８００、日立製作所）を用いて画像を採取した。合成ヘモゾイン溶液中の粒度分布は、湿式レーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ＬＡ−９５０Ｖ２、堀場製作所）を用いて測定した。
７．統計処理は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを利用して行った。
結果
１．Ｐｆ粗抽出物は非ＤＮＡ  ＴＬＲ９リガンドを、同時投与されるマラリア抗原に固有なアジュバントとして含む
Ｐｆ感染赤血球の凍結融解により大量の完全寄生虫抗原を調製した。得られた抽出物をＰｆ粗抽出物と名付けた。Ｐｆ粗抽出物には寄生虫と宿主赤血球の両方由来の産物を含んでいた。それをマウスに腹腔内注射により免疫した。追加のアジュバントなしの完全寄生虫抗原免疫後、血清Ｐｆ粗抽出物特異的ＩｇＧが用量依存的に未処理（ｎａｉｖｅ）マウスに比べて高タイターで検出された（図１）。
次いで、完全寄生虫ワクチンの免疫原性が、ＴＬＲ９の非存在下で変化するか否かを調べた。何故ならば、ＴＬＲ９は熱不安定性画分であるＰｆ由来ヘモゾインおよびＤＮＡにより、自然免疫系の活性化を仲介することが示されていたからである。従って、ＴＬＲ９を欠失したマウスは野生型マウスより有意に低い血清ＩｇＧ反応およびＴ細胞特異的ＩＦＮγレベルを示した（図１〜図３）。この完全寄生虫抗原のＴＬＲ９依存性アジュバント効果は、ＤＮａｓｅ−Ｉ処理によって影響を受けず、Ｐｆ−ＳＥＲＡ５タンパク質等のＰｆ抗原に特異的であった。ＴＬＲ９依存性ＩｇＧ反応はＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３で認められた。
２．  ヘモゾインは強力なアジュバントとして作用し、そのアジュバント活性はサイズに依存する
種々の合成ヘモゾイン合成法があったので、最初にいくつかの方法で合成を行い、合成ヘモゾインのアジュバント特性を調べた。合成ヘモゾインをヘミンから合成する２つのよく用いられる方法によりアジュバント効果の異なる、区別可能な外観を有する結晶が得られた。酢酸の存在下で重合したヘモゾイン（方法１）では、ほとんどが５０ｎｍ〜１μｍの長さを有する結晶が得られた。一方、有機塩基を用いる方法（方法２）では、ＦＥＳＥＭで観察したところ１〜２０μｍの範囲の長さを有する結晶が得られた（図４ＡおよびＢ）。マウスを方法１または方法２で作製した合成ヘモゾインを共存させるか、または共存させないモデルタンパク質抗原ＯＶＡ（卵白アルブミン）の皮下注射（５０μｇ／回）により免疫し、１０日後に追加免疫を行ったところ、ヘモゾインに対するＯＶＡ特異的トータルＩｇＧ反応は、方法２よりも方法１で作製したもので高かった（図５）。さらに、方法１で作製したヘモゾインを２つのサイズ分布に分離し湿式レーザー回折散乱式粒度分布測定装置で測定し（図６）、ＯＶＡとともに免疫した。ＯＶＡと同時に投与した場合、５０〜２００ｎｍの合成ヘモゾインサイズはより大きいサイズの合成ヘモゾイン（２〜２０μｍ）およびより小さいサイズの溶解させたヘミン（５０ｎｍ以下）よりも最適なアジュバント効果を示した（図７）。さらに、異なる投与ルート、皮下、鼻腔内投与による合成ヘモゾインのアジュバント効果を調べたところ、いずれも抗原特異的抗体反応の増加が認められた（図１５、１６）。さらに、同様の検討をＨＳＡについても行い（１０μｇ／回）、同様の結果が得られた（図８、９、２３、２６、２７）。さらに、用量反応を分析した。また合成ヘモゾインにより上昇するＩｇＧアイソタイプは、マウスでは主にＩｇＧ１であり次いでＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃであることが確認された（図９）。この反応はアラムやＣｐＧ  ＤＮＡアジュバントと比較して強力であった（図１０）。従って、合成ヘモゾインが、最適サイズ５０〜２００ｎｍでタンパク質ワクチンに対する強力なアジュバントとなり得ることがわかった。これは、レセプター仲介エンドサイトーシスに仲介される抗原提示細胞により取り込まれる他の粒子アジュバントと一致していた。
３．  合成ヘモゾインはマラリア抗原と同様にアレルゲンに対しても強力なアジュバントとなり得るか
合成ヘモゾインが寄生虫由来Ｐｆ粗抽出物による免疫の際に強力なアジュバント効果を有するかを調べるために、マウスを１０μｇのＰｆ粗抽出物で合成ヘモゾインと共に免疫し、２回追加免疫を行った後に、抗Ｐｆ粗抽出物特異的抗体反応を測定した。合成ヘモゾインによりＰｆ粗抽出物に対するＩｇＧレベル（図には示していないが、主にＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ１）が上昇した（図１１）。
合成ヘモゾインがマウス以外の動物に用いることができるかどうかを確認するために、アレルギーモデルイヌを用いて評価した。本発明者はビーグル犬モデルにＤｅｒ  ｆ  ２、Ｄｅｒ  ｆ  ２＋アラムアジュバント、またはＤｅｒ  ｆ  ２＋アラムアジュバント＋合成ヘモゾインを投与し、２週間後に追加免疫を行った。これらのイヌの血清中のＤｅｒ  ｆ  ２特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡにて経時的に測定したところ、合成ヘモゾイン併用群では追加免疫後にＩｇＧ２抗体価の有意な上昇がみられたが、ＩｇＧ１の有意な上昇はなく、Ｔｈ１反応に類似する免疫応答を示していた（図１２）。さらに、免疫後のイヌをＤｅｒ  ｆ  ２で再度感作させると、合成ヘモゾイン併用群では非併用群に比較してＤｅｒ  ｆ  ２特異的ＩｇＥ抗体価の上昇が有意に少なかった（図１３）。これらのデータから、合成ヘモゾインはイヌのアレルギー性疾患の病態モデルにおいて、強力なＴｈ１様アジュバントとして機能する可能性のあることが示唆された。
これらのデータは水酸化アルミニウムなどの抗原と結び付ける物質と共存している合成ヘモゾインがイヌモデルにおいて強力なＴｈ１アジュバントであることを示す。一方、マウスモデルにおいては、単独で用いた場合Ｔｈ２優性なアジュバントであった。非ヒト霊長類を用いた実験では、合成ヘモゾインはＣｐＧ  ＤＮＡと同様に、タンパク質ワクチン投与に対してＴｈ１タイプアジュバントとして有力であることが示された。
Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ培養物から精製された天然ヘモゾインは合成ヘモゾインと同一という報告があるが（Ｐａｇｏｌａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０４，３０７−３１０．）、精製及び合成方法の違いにより２０ｎｍ〜２０μｍの異なるサイズの結晶及び結晶凝集体が生じ、単位結晶（１次粒子）の性状や凝集体（２次粒子）の有無などにより異なるアジュバント活性を示すことが示された（図５）。
さらに、本実施例では、合成ヘモゾインは特定の至適化された合成方法およびサイズのときに強力なアジュバント活性を示すことが示された。このタンパク質ワクチンに対する合成ヘモゾインのアジュバント活性はＯＶＡとＨＳＡという異なる抗原モデルで、さらに皮下注射と腹腔内注射と鼻腔内投与という異なる投与ルートで確認された。種特異性を示すＣｐＧ  ＤＮＡとは異なり、ヘモゾインはマウス、イヌ、非ヒト霊長類を含む数種の動物のワクチン動物モデルで確認された（図５、７〜１３、１５および１６）。マウスにおいては、合成ヘモゾイン単独をアジュバントとして用いて免疫を行った場合、ＩｇＧ１が優先となるアジュバント効果を示した。この結果は、ヘモゾインはマウスにおいて、Ｔｈ２タイプ免疫反応を引き起こすことを示している（図５、７〜１１、１５および１６）。一方、イヌに対して合成ヘモゾインと抗原を結び付ける物質（例えば水酸化アルミニウムやプルラン）をアジュバントとして用いた場合、ＩｇＧ２反応が優先的に生じた。これはＴｈ１タイプ免疫反応が引き起こされたことを示す。イヌアレルギーモデルに対する合成ヘモゾインの使用は、非常に強力にアレルゲン特異的ＩｇＥ反応を減少させた（図１２および１３）。この結果は、合成ヘモゾインをアレルギーに対するアジュバントとして有効に用い得ることを示す。非ヒト霊長類においても、合成ヘモゾインはマラリア抗原特異的ＩｇＧ反応を引き起こし、完全血液段階ワクチン用の新規なワクチンアジュバントとして用い得ることがわかった。
本実施例により、ヘモゾインはＴＬＲ９経路の制御を介して炎症およびアジュバント活性を示し、それによりマラリア感染を治療するための治療ターゲットとして働き、ワクチンアジュバント開発に有用であることが示された。
【実施例２】
【０００９】
（１）マウス
Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃバックグラウンドの６〜１２週齢の野生型マウスをＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎから入手し用いた。
（２）抗原およびアジュバント
抗原として、ＯＶＡ（卵白アルブミン）またはＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を用い、以下の種々の免疫スケジュールで免疫した。
合成ヘモゾインは、実施例１に記載の方法により原料として塩化ヘミンを用い合成した。この際、Ｆｌｕｋａ社の塩化ヘミンおよびＴＣＩ（東京化成社）の塩化ヘミンを用いた。また、合成ヘモゾインは合成ロット違いのものを２種類用い、ロット間差を調べた。
合成ヘモゾイン粒子径により分画し、粒子径が大きいもの（２〜５０μｍ）と小さいもの（２０〜５００ｎｍ）を用いた。
（２）皮下免疫
０日目にマウスに２００μＬのｓｉｇｍａ社製のＰＢＳで希釈した種々の濃度の合成ヘモゾイン溶液中、５０μｇのＯＶＡ（または１０μｇのＨＳＡ）を皮下注射投与し、１０日後に上記と同濃度の２００μＬのＰＢＳで希釈した合成ヘモゾイン溶液中、２５μｇのＯＶＡ（または１０μｇのＨＳＡ）で追加免疫を行った。１７日目に血液サンプルを回収し、血清中のＯＶＡまたはＨＳＡ特異的抗体反応をＥＬＩＳＡ法により分析した。
（３）腹腔免疫
０日目にマウスに２００μＬのｓｉｇｍａ社製のＰＢＳで希釈した種々の濃度の合成ヘモゾイン溶液中、５０μｇのＯＶＡ（または１０μｇのＨＳＡ）を腹腔注射投与し、１０日後に上記と同濃度の２００μＬのＰＢＳで希釈した合成ヘモゾイン溶液中、２５μｇのＯＶＡ（または１０μｇのＨＳＡ）で追加免疫を行った。１７日目に血液サンプルを回収し、血清中のＯＶＡまたはＨＳＡ特異的抗体反応をＥＬＩＳＡ法により分析した。
結果
１、合成ヘモゾインのアジュバント効果は粒子径（または粒度分布及び粒子性状）に依存し、Ｌｏｔ間の再現性がある。
酢酸の存在下で重合したヘモゾイン（方法１）で複数Ｌｏｔの合成を行い、Ｌｏｔ間でのアジュバント効果の差及び平均粒子径の大小（凝集の有無）で比較したところ、平均粒子径の小さい分画の方が複数Ｌｏｔにおいて同様に抗原特異的抗体反応におけるＩｇＧの産生能が高く（図２０〜２７）、ＯＶＡ以外でＨＳＡ抗原を用いた場合でも同様であった（図２３）。また、サブタイプにおいても同様であった（図２０〜２２）。
２、合成ヘモゾインのアジュバント効果の粒子径（または粒子性状）依存性は腹腔投与でも同様であり、原料のメーカーに依存しない。
皮下投与と同様に、腹腔投与においても平均粒子径の小さい分画の方が抗原特異的ＩｇＧ抗体産生能が高かった（図２４および２５）。また、ＦｌｕｋａとＴＣＩの２メーカーのヘミンより合成したβヘマチンにおいても、各々高いアジュバント効果を示し、かつ粒子径の小さい分画がいずれも高いアジュバント効果を示した（図２６および２７）。
【実施例３】
【００１０】
オートクレーブ処理βヘマチンの効果
４５ｍｇの塩化ヘミン（Ｆｕｌｕｋａ社）を４．５ｍＬのＮａＯＨ溶液に溶解し、１Ｎ  塩酸を０．４５ｍＬ添加した。その後、６０℃で攪拌しながら酢酸をｐＨが４．８になるまで添加した。混合物を室温で一晩静置反応し、βヘマチン結晶を形成させた。次に遠心分離により沈殿を得た。これを２％ＳＤＳを含む０．１Ｍ  重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）で３回洗浄後、精製水で完全に置換した。該沈殿を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。オートクレーブ装置は株式会社平山製作所のＨＩＣＬＡＶＥ  ＨＶＰ−５０を用いた。
上記沈殿（オートクレーブ未処理）及び沈殿をオートクレーブ処理したサンプルについて実施例１の２．（２）に記載の皮下免疫の方法に従って、マウスに皮下免疫し、マウス血中のトータルＩｇＧを実施例１の５．の抗体ＥＬＩＳＡの方法に従って、測定した。追加免疫前、追加免疫１または４週間後に採取した血清中のトータルＩｇＧ濃度の測定結果を図２８に示す。図２８中、オートクレーブ処理していないサンプルは「プレ」で示してある（図２９も同じ）。図２８に示すように、沈殿を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したサンプルにおいて、より高い血中トータルＩｇＧ濃度が認められた。
また、同様にマウス血中のＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＧ３を測定した。追加免疫３週間後に採取した血清中のＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＧ３濃度の測定結果を図２９に示す。図２９に示すように、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＧ３いずれも沈殿を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したサンプルで血中濃度が上がった。特にＩｇＧ２ａにおいて顕著であった。
さらに、上記サンプルについて実施例１の６．のＦＥＳＥＭ及び粒子サイズ分析の方法に従って、粒度分布を測定し、実体顕微鏡で形態を観察した。図３０に得られたサンプルの粒度分布を示し、図３１に顕微鏡観察像を示す。１２１℃、２０分間オートクレーブ処理したサンプルにおいて、粒径が小さくなっていた。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明のワクチンアジュバント組成物およびワクチン組成物は、医学、獣医学の分野でヒトを含む動物のアレルギー疾患および感染症の予防、治療に用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図４】
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【図１４】
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【図１７】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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