(57)【要約】血漿／血清及び組織試料を含む、臨床前の動物生体試料またはヒト生体試料中に存在し得るヒト及びヒト化抗体、ならびにそれらの複合体を検出、特徴付け、測定、及び定量化する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体−薬物複合体の抗体複合体化薬物濃度及び全抗体濃度の両方を定量化する方法であって、
（ａ）抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を、前記抗体を還元する組成物と接触させて、変性抗体を形成することと、
（ｂ）前記変性抗体を消化して、単一の分析試料中で、消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物を形成することと、
（ｃ）前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析して、前記単一の分析試料中で、少なくとも１つの抗体署名ペプチド及び薬物部分を検出することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＡＤＣが、前記接触させるステップの前に、緩衝液、全血、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、尿、リンパ液、胆汁、糞便、汗、硝子体、涙、及び組織から選択されるマトリックス中で懸濁される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＤＣが、前記消化するステップの前に、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、選択的沈降、分画遠心分離、ろ過、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、免疫沈降、プロテインＡ及びプロテインＧ、ＮＨＳ及びストレプトアビジン鉄もしくはリン、または固定化抗体もしくはレクチンを含むスピントラップカラム、常磁性ビーズ、免疫除去、分画、固相抽出法、リンペプチド富化、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ならびに脱塩処理から選択される技法により富化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＤＣが、親和性捕捉培地に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記親和性捕捉培地が、ビーズまたは樹脂により支持されたプロテインＡ／Ｇ、標的抗原−常磁性ビーズ捕捉培地、抗イディオタイプ抗体、抗Ｈｕ抗体、及び抗薬物抗体のうちの少なくとも１つである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記親和性捕捉培地に結合されたＡＤＣを洗浄して、前記ＡＤＣと接触している非抗体タンパク質を減少させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記親和性捕捉培地に結合された前記ＡＤＣを脱リン酸することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＤＣが前記親和性捕捉培地に結合されている間に、前記変性抗体を消化して、消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物を形成する前記ステップが起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＤＣを酵素消化する前記ステップの前に、前記ＡＤＣを前記親和性捕捉培地から溶出することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体を還元する前記組成物が、ジチオールトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）から選択される少なくとも１つの還元剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体を還元する前記組成物が、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ＳＤＳ、尿素、酸分解性界面活性剤、デシルフラニルスルホン酸塩、及びグアニジンＨＣｌから選択される少なくとも１つの変性剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体を還元する前記組成物が、メタノール、エタノール、ＨＣｌ、重炭酸アンモニウム、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ、酢酸アンモニウム、及びアセトニトリルから選択される少なくとも１つの化学物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変性抗体を消化する前記ステップが、鉱酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸の存在下の酸性加水分解、臭化シアンによるタンパク質分解、及び２５０℃を上回る熱誘導性タンパク質分解のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記変性抗体を消化する前記ステップが、前記変性抗体をタンパク質分解酵素と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、ＬｙｓＮ、ＬｙｓＣ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、ＡｒｇＣ、及びＰＮＧａｓｅＦのうちの少なくとも１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記変性抗体を消化する前記ステップが、前記薬物を前記変性抗体から分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記変性抗体を消化する前記ステップが、前記変性抗体を、前記薬物を前記変性抗体から切断する化学物質と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物を分析する前記ステップの前に、前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物を前記親和性捕捉培地から溶出することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析することが、前記消化された抗体−薬物複合体のペプチド断片を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチド断片が、前記ＡＤＣの可変領域の少なくとも１つの部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチド断片が、前記ＡＤＣの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチド断片が、前記ＡＤＣの非可変領域の少なくとも１つの部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬物が、前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物中で、ペプチド−リンカー−薬物複合物として検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体−薬物複合体の前記全抗体濃度が、前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物の前記分析から算出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＤＣの抗体複合体化薬物濃度が、前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物の前記分析から算出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＤＣの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が、前記消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物の前記分析から算出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬物部分が、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エリナフィド、抗生物質、ならびにそれらの立体異性体、イソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）、代謝体、類似体、または誘導体から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＤＣの前記抗体部分が、抗体断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＡＤＣの前記抗体部分が、抗体変異形であり、前記抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＡＤＣの前記抗体部分が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＤＣが、１つ以上の特定の場所で操作システインを有するＴＤＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＤＣの前記抗体部分が、下記（１）〜（５３）：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）、
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、
（４）ＭＵＣ１６（０７７２Ｐ、ＣＡ１２５）、
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、
（６）Ｎａｐｉ２ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、
（７）Ｓｅｍａ  ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、
（８）ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）、
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌種由来の成長因子）、
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ  ７３７９２）、
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）、
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、
（１７）ＨＥＲ２、
（１８）ＮＣＡ、
（１９）ＭＤＰ、
（２０）ＩＬ２０Ｒα、
（２１）Ｂｒｅｖｉｃａｎ、
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ、
（２３）ＡＳＬＧ６５９、
（２４）ＰＳＣＡ、
（２５）ＧＥＤＡ、
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３）、
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム）、
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ）、
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１）、
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）、
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）、
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、
（３５）ＦｃＲＨ５（ＩＲＴＡ２、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２）、
（３６）ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）、
（３７）ＰＭＥＬ１７（ｓｉｌｖｅｒ相同体、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン−１）、
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１）、
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合物、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、
（４１）ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ相同体２（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ＳＨＩＳＡ２）、
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合物、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合物、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、
（５２）ＣＤ３３、ならびに
（５３）ＣＬＬ−１から選択される１つ以上の腫瘍関連抗原または細胞表面受容体に結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
生体試料中に存在する抗体−薬物複合体の抗体複合体化薬物濃度及び全抗体濃度の両方を定量化する方法であって、
（ａ）動物からの血液、血清、血漿、組織、または細胞から選択される生体試料を抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）と接触させることと、
（ｂ）前記ＡＤＣを含む前記生体試料を親和性捕捉培地と接触させて、ＡＤＣ−親和性捕捉培地複合物を形成することと、
（ｃ）前記ＡＤＣ−親和性捕捉培地複合物を洗浄して、前記ＡＤＣと接触している非抗体タンパク質を減少させることと、
（ｄ）前記ＡＤＣ−親和性捕捉培地複合物を、前記抗体を還元する組成物と接触させて、変性抗体を形成することと、
（ｅ）前記変性抗体を酵素消化して、単一の分析試料中で、消化されたＡＤＣペプチド混合物を形成することと、
（ｆ）前記消化されたＡＤＣペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析して、前記単一の分析試料中で、少なくとも１つの抗体署名ペプチド及び薬物部分を検出することと、
（ｇ）前記少なくとも１つの抗体署名ペプチド及び薬物部分の前記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析検出から、前記ＡＤＣの全抗体濃度、前記ＡＤＣの抗体複合体化薬物濃度、及び前記ＡＤＣの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）から選択される前記ＡＤＣの少なくとも１つの特徴付けを決定する。
【請求項３４】
前記消化されたＡＤＣペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する前記ステップの前に、ペプチド断片を前記親和性捕捉培地から溶出することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＡＤＣ複合物を、前記抗体を還元する組成物と接触させる前記ステップの前に、前記ＡＤＣを前記親和性捕捉培地から溶出することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
３７ＣＦＲ§１．５３（ｂ）で出願されたこの正規の出願は、２０１６年３月２５日に出願された米国仮出願第６２／３１３，６０８号の３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の利益を主張し、これは、参照により全体が組み込まれる。
【０００２】
本開示は、質量分析により、非生体または生体マトリックスの抗体−薬物複合体、ならびにそれらの断片及び代謝体を捕捉、検出、分析、特徴付け、及び定量化する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ブレンツキシマブベドチン（商品名：Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））及びトラスツズマブエムタンシン（商品名：Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）の承認により、特定の作用部位への薬学的活性薬物または毒素分子の標的送達を提供する抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の療法的可能性が確認され、さらなる研究及び開発がなされている。ＡＤＣは一般には、抗体、薬学的活性小分子薬物または毒素（しばしば、「ペイロード」と称される）、及びこの２つを連接するための任意のリンカーから構成される。典型的にはペプチド誘導体であるリンカーは、特定の細胞型、典型的には、がん細胞上の抗原を標的とするように選択されるか、または操作される、小分子で効力の高い薬物を大分子抗体に結合させる。それ故に、ＡＤＣは、モノクローナル抗体の強力な標的能力を用いて、効力の高い複合体化小分子療法薬をがん細胞に特異的に送達する。
【０００４】
継続中の研究及び開発プログラムにより奏効的なＡＤＣ候補が明らかになり、臨床評価及び市場承認に進むため、巨大タンパク質複合物（抗体）と、典型的には、非常により小さいが効力の高い薬物分子との組み合わせにより作り出された複合化学組成物を効果的に評定し得る安全で効能のあるアッセイが必要とされている。薬物−抗体結合、抗体及び薬物濃度、ならびに薬物対抗体比、ならびにこれらのＡＤＣ組成物の安定性の特徴付けが最初に確立され、次いで、粘度に関して監視されるべきであるが、これは、ＡＤＣのこれらの特性が、これらの療法体の生物活性、薬物動態、分布、免疫原性、安全性、及び安定性プロファイルに影響を与え得るためである。
【０００５】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析は、血漿／血清／組織試料のような非常に複合的なマトリックスにおいて、タンパク質分析及び定量化のための強力な手段である。目的とするタンパク質及び他の内因性タンパク質の消化から生じるペプチドが同じかまたは類似の見掛けの質量を有し得るため、ＭＳ断片化の二次元目はしばしば、目的とするペプチド固有の断片を提供する。特定の親ペプチドと固有の断片イオンとの組み合わせが、定量化される分子を選択的に監視するために使用される。かかる手法は、「多重反応モニタリング」（ＭＲＭ）と命名されるが、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）とも称され、これは、タンパク質定量化に関して一般的に使用される形式である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の態様は、抗体の消化及びＡＤＣの薬物成分の分離による全抗体及び抗体複合体化薬物量を検出及び定量化するための堅牢な方法、次に、消化された抗体からの放出薬物とペプチドとの組み合わせの得られた組成物の同時クロマトグラフィー分析及び質量分光光度分析を提供する。
【０００７】
それ故に、ある特定の態様において、本開示は、抗体−薬物複合体の抗体複合体化薬物濃度及び全抗体濃度の両方を定量化する方法を提供する。これらの方法は、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を、抗体を還元する組成物と接触させて、変性抗体を形成することと、変性抗体を消化して、単一の分析試料中で、消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物を形成することと、を含む。次いで、単一の分析試料中の消化された薬物及びペプチド混合物はＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析され、抗体からの少なくとも１つの署名ペプチド及び薬物が検出され得る。
【０００８】
これらの方法において、ＡＤＣが抗体を還元する組成物と接触する前に、中にＡＤＣが見られ得る、緩衝液、全血、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、尿、リンパ液、胆汁、糞便、汗、硝子体、涙、または組織などのマトリックス中で直接分析される。ＡＤＣが十分な分析には低すぎる濃度でマトリックス中に見られるか、またはＡＤＣの効率的なもしくは正確な分析に支障をきたし得る分子を含有する生体試料中に見られる事例において、ＡＤＣは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、選択的沈降、分画遠心分離、ろ過、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、免疫沈降、プロテインＡ及びプロテインＧ、ＮＨＳ及びストレプトアビジン鉄もしくはリン、または固定化抗体もしくはレクチンを含むスピントラップカラム、常磁性ビーズ、免疫除去、分画、固相抽出法、リンペプチド富化、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、あるいは脱塩処理などの技法により富化され得る。それ故に、本開示の分析方法は、親和性捕捉培地に結合されるＡＤＣ、またはそれらの断片を用いて進み得、これは、任意に洗浄及び溶出して、分析されるＡＤＣ、またはＡＤＣ断片をさらに精製または富化するステップを含み得る。
【０００９】
これらの分析方法は、ＡＤＣを脱リン酸することも含み得、これにより、ＡＤＣを還元及び／または変性し、ＡＤＣを酵素消化する。ＡＤＣの酵素消化は、抗体をタンパク質分解酵素、例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、ＬｙｓＮ、ＬｙｓＣ、ＡｓｐＮ、ＧｌｕＣ、ＡｒｇＣ、ＰＮＧａｓｅＦ、またはかかる酵素の組み合わせと接触させることにより達成され得る。これらの方法において、消化は、薬物をＡＤＣの抗体から分離し得る。あるいは、薬物が、抗体の消化後に分離され得る。これらの方法において、ＡＤＣは、薬物をＡＤＣから特異的に分離する試薬と接触され得る。
【００１０】
消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物の分析は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより実行され得、かかる分析は、消化されたＡＤＣから１つのペプチド断片を検出することを含み得る。分析は、消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物内で薬物部分を検出することも含む。薬物は、ペプチド−リンカー−薬物複合物として検出され得る。
【００１１】
これらの分析方法により、抗体−薬物複合体の全抗体濃度、ＡＤＣの抗体複合体化薬物濃度、及び／またはＡＤＣの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が決定され得る。
【００１２】
これらの分析方法において、ＡＤＣの抗体部分は、抗体断片、またはシステイン残基で置換されているアミノ酸残基を含む抗体変異形であり得る。これらの抗体、断片、または変異形は、ヒトまたはヒト化抗体であり得る。
【００１３】
本開示の例示的な多重分析方法は、生体試料を親和性捕捉培地と接触させて、ＡＤＣ−親和性捕捉培地複合物を形成することにより、血液、血清、血漿、組織、または細胞などの生体試料中に存在する抗体−薬物複合体の抗体複合体化薬物濃度及び全抗体濃度の両方を定量化することができる。複合物は、洗浄されて、ＡＤＣと接触している非抗体タンパク質を減少させる。次いで、ＡＤＣ−親和性捕捉培地複合物が抗体を還元する組成物で洗浄されて、変性抗体を形成する。抗体は、酵素消化もされて、単一の分析試料中で、消化されたＡＤＣペプチド混合物を形成する。次いで、この単一の分析試料は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析されて、抗体の少なくとも１つの署名ペプチド及び薬物部分を検出する。次いで、例えば、ＡＤＣの全抗体濃度、ＡＤＣの抗体複合体化薬物濃度、及びＡＤＣの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を含むＡＤＣの少なくとも１つの特徴が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析から決定され得る。
【００１４】
本発明の概要は、本開示の全体及び全範囲を表すことを意図せず、かつそのように解釈されるべきではない。さらに、ここで本明細書における「本開示」またはそれらの態様に対してなされる参照が、本開示のある特定の実施形態を意味すると理解されたく、必ずしも全ての実施形態を特定の記述に限定すると解釈されるべきではない。本開示は、本発明の概要、ならびに添付図面及び実施形態の説明において様々なレベルで詳細に記載され、本発明の概要における要素、成分などの包含または非包含のいずれかにより、本開示の範囲に関して限定されないことが意図される。本開示の追加の態様は、実施形態の説明により、特に図面とともに用いられるとき、より容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】試料からのＡＤＣの親和性捕捉、ＡＤＣの酵素消化及び薬物切断、ならびに単一の処理試料中に存在する薬物及びペプチド断片の同時ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を含む、ＡＤＣ分析方法の図を示す。
【図２Ａ】薬物の直線状の濃度依存還元及び薬物の放出を示す、薬物（ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ＳＧ２０５７）のピーク領域対薬物濃度のプロットを示す。
【図２Ｂ】全抗体のピーク領域対ＡＤＣ濃度の図２Ａに類似するプロットを示す。
【図３】消化され、かつ酸の添加によりクエンチされたか、またはクエンチされなかった個別の試料に対する内部標準ピーク領域のプロットを示す。
【図４Ａ】調製及び酸性溶液中のメタノールの添加後の、分析された薬物のピーク領域のプロットを示す。
【図４Ｂ】調製及び塩基性溶液中のメタノールの添加後の、分析された薬物のピーク領域のプロットを示す。
【図５Ａ】調製及び酸性溶液中のメタノールの添加後の、全抗体を定量化するために使用される、抗体消化によるペプチドのピーク領域のプロットを示す。
【図５Ｂ】調製及び塩基性溶液中のメタノールの添加後のペプチドのピーク領域のプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
実施形態の説明
本開示は、単一の試料調製物からの全抗体及び抗体複合体化薬物量を堅牢測定し、それにより、薬物対抗体比（ＤＡＲ）の算出、ならびに著しい時間及び資源の節約を提供する、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の抗体及び薬物成分を検出及び定量化するための単一の測定方法に対して記載される。
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有し、それらは、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  （１９９４）“Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、及びＪａｎｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ（２００１）“Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ”，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋと一致する。商品名が本明細書で使用される場合、商品名の製品配合物、ジェネリック医薬品、及び商品名の製品の活性薬学的成分（複数可）も含まれる。
【００１８】
定義
「生体試料」という用語は、動物に由来するか、または動物から分離された任意の成分であり、血液、血漿、血清、細胞、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、乳、気管支洗浄液、骨髄、羊水、唾液、胆汁、硝子体、涙、または組織が含まれる。
【００１９】
「消化酵素」という用語は、特定または一般的な無作為な手法で、ペプチドまたはタンパク質を切断または加水分解して断片にすることができる酵素である。消化酵素は、抗体が生体試料の成分である、抗体から消化された抗体試料を形成し得る。消化酵素には、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、パパイン、ペプシン、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｒｇＣ、ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８、キモトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｓｎ−Ｃ、ＰＮＧａｓｅＦ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣ、及びＬｙｓＮが含まれる。
【００２０】
「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００２１】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説に関しては、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説に関しては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）、ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。エピトープ残基に結合し、増加したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含むＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察に関しては、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【００２３】
ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である（ＥＰ４０４０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４に記載されている。
【００２４】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（米国特許第６，２４８，５１６号）。
【００２５】
抗体断片は、本明細書に記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質消化、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない様々な技法により作製され得る。
【００２６】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００２７】
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあれば、存在しない場合もある。本明細書で別途明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，１９９１に記載されている、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００２８】
「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。定常ドメインのＦＲは一般に、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）にＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４の順序で出現する。
【００２９】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように互換的に使用される。
【００３０】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００３１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に起こるアミノ酸残基を表す抗体のフレームワーク領域である。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の下位群からである。概して、配列の下位群は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ  （１９９１），ｖｏｌｓ．１−３にあるような下位群である。一実施形態において、ＶＬに関して、下位群は、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにあるような下位群カッパＩである。一実施形態において、ＶＨに関して、下位群は、上記のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌにあるような下位群カッパＩＩＩである。
【００３２】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を経た抗体を指す。
【００３３】
「キメラ」抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えば、サルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【００３４】
ある特定の実施形態において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、及びＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むであろう。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【００３５】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、米国特許第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフトを記載している）、Ｐａｄｌａｎ，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（「リサーフェシング」を記載している）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（「ＦＲシャッフリング」を記載している）、及びＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８３：２５２−２６０（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」手法を記載している）にさらに記載されている。
【００３６】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞株フレームワーク領域（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，（２００８）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３）、及びＦＲライブラリのスクリーニングから誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４、及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
ヒト抗体は、当該技術分野で既知の様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【００３８】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修正されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することにより調製され得る。かかる動物は典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内に無作為に組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説に関しては、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載している米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号、ＨｕＭＡＢ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号、Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号、ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載しているＵＳ２００７／００６１９００）も参照されたい。かかる動物により生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに修飾され得る。
【００３９】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６を参照されたい）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体も、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５０２（２００６）に記載されている。追加の方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）、Ｎｉ，（２００６）Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されているものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，（２００５）Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１にも記載されている。
【００４０】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技法は、以下に記載される。
【００４１】
本発明の抗体は、所望の活性（複数可）を有する抗体に関してコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体に関してかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で既知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００１）に概説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２にさらに記載されている。
【００４２】
ある特定のファージディスプレイ方法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングされ、ファージライブラリで無作為に組み換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されているように抗原結合ファージに関してスクリーニングされ得る。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫化源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）により記載されるように、ナイーブレパートリーは、クローニングされ（例えば、ヒトから）、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原また自己抗原に対する抗体の単一の源を提供することができる。最後に、ナイーブライブラリは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）により記載されているように、幹細胞由来の再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、かつ無作為な配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによっても合成的に作製されて、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配置を達成することができる。ヒト抗体ファージライブラリは、米国特許第５，７５０，３７３号、ＵＳ２００５／００７９５７４、ＵＳ２００５／０１１９４５５、ＵＳ２００５／０２６６０００、ＵＳ２００７／０１１７１２６、ＵＳ２００７／０１６０５９８、ＵＳ２００７／０２３７７６４、ＵＳ２００７／０２９２９３６、ＵＳ２００９／０００２３６０に記載されている。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【００４３】
抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体であり得る。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。結合特異性のうちの一方は、１つの抗原に対するものであり得るが、他方は、第２の抗原に対するものである。あるいは、二重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させるためにも使用され得る。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【００４４】
多重特異性抗体を作製するための技法には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）を参照されたい）、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１））、及び「ノブインホール」操作（米国特許第５，７３１，１６８号）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４））、ならびに三重特異性抗体を調製すること（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０）によっても作製され得る。
【００４５】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、米国特許公開第２００６／００２５５７６号を参照されたい）。
【００４６】
本明細書の抗体または断片には、抗原、ならびに別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、米国特許公開第２００８／００６９８２０号を参照されたい）。
【００４７】
抗体変異形
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異形は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによるか、またはペプチド合成により調製され得る。かかる修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び／またはそこへの挿入、及び／またはその置換が含まれる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、但し、その最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【００４８】
抗体は、抗体及びタンパク質、薬物部分、標識、またはいくつかの他の基を含む融合タンパク質を含む。融合タンパク質は、組み換え技法、複合体化、またはペプチド合成により作製されて、薬物動態などの特性を最適化し得る。本発明のヒトまたはヒト化抗体は、アルブミン結合ペプチド（ＡＢＰ）配列を含む融合タンパク質でもあり得る（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）“Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓ  Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  Ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３、ＷＯ０１／４５７４６）。本発明の抗体は、（ｉ）Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３  ａｔ  Ｔａｂｌｅｓ  ＩＩＩ  ａｎｄ  ＩＶ，ｐａｇｅ  ３５０３８、（ｉｉ）ＵＳ２００４／０００１８２７  ［００７６］、及び（ｉｉｉ）ＷＯ０１／４５７４６  ページ  １２−１３により教示されるＡＢＰ配列を有する融合タンパク質を含み、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
置換、挿入、及び欠失変異形
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異形が提供される。置換型突然変異誘発の目的とする部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換が、「保存的置換」という見出しで表１に示される。より実質的な変化が、「例示の置換」という見出しで表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換が目的とする抗体中に導入され得、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善に関して産生物がスクリーニングされ得る。
【表１−１】
2019518195.tif 000002
【表１−２】
2019518195.tif 000003
【００５０】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされ得る：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族：Ｔｉｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【００５１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【００５２】
ある種類の置換変異形は、親抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般に、さらなる研究のために選択される、得られた変異形（複数可）は、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性における修正（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）を有し、及び／または実質的に保持された親抗体のある特定の生物学的特性を有することになる。例示的な置換変異形は、例えば、本明細書に記載される技法などのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成され得る親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ以上のＨＶＲ残基が突然変異され、変異形抗体がファージ上にディスプレイされ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。
【００５３】
改変（例えば、置換）は、ＨＶＲにおいて、例えば抗体親和性を改善するために行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で突然変異を経るコドンによりコードされた残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行われてもよく、得られた変異形ＶＨまたはＶＬが結合親和性に関して試験される。二次ライブラリを構築し、それから再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７に記載されている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，（２００１））。親和性成熟のいくつかの実施形態において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作り出される。次いで、ライブラリがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異形を特定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６つの残基）が無作為化されるＨＶＲ指向手法を伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して、具体的に特定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が、しばしば標的化される。
【００５４】
ある特定の実施形態において、置換、挿入、または欠失は、かかる改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＨＶＲ間で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるような保存的置換）がＨＶＲ内で行われ得る。かかる改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外側であり得る。上述の変異形ＶＨ配列及びＶＬ配列のある特定の実施形態において、各ＨＶＲは、改変されないか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有するかのいずれかである。
【００５５】
突然変異誘発のために標的化され得る抗体の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載されている「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法において、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負荷電アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）により置き換えられて、抗体と抗原との相互作用に影響が及ぼされたかどうかを決定する。さらなる置換が最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に導入され得る。あるいは、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を特定するための抗原−抗体複合物の結晶構造。かかる接触残基及び隣接する残基が置換の候補として標的とされ得るか、または排除され得る。変異形がスクリーニングされて、それらが所望の特性を有するかを決定することができる。
【００５６】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドの範囲であるアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異形には、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）またはポリペプチドへの抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合が含まれ、これは抗体の血清半減期を増加させる。
【００５７】
グリコシル化変異形
ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、または除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。
【００５８】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞により産生された天然抗体は典型的には、Ｎ結合によりＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む（Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２）。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体中におけるオリゴ糖の修飾は、ある特定の特性の改善を有する抗体変異形を作り出すために行われ得る。
【００５９】
一実施形態において、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異形が提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合物、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を算出することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７も、抗体の軽微な配列変異に起因して、２９７位の上流または下流の約±３アミノ酸に、すなわち２９４〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異形は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る（ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＵＳ２００４／００９３６２１）。「脱フコース化」または「フコース欠損」抗体変異形に関する公開の例には、ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４が含まれる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、ＵＳ２００３／０１５７１０８，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８、ＷＯ２００３／０８５１０７）が含まれる。
【００６０】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異形がさらに提供される。かかる抗体変異形は、低減されたフコシル化及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。かかる抗体変異形は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異形が記載されている（ＷＯ１９９７／３００８７、ＷＯ１９９８／５８９６４、ＷＯ１９９９／２２７６４）。
【００６１】
Ｆｃ領域変異形
ある特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸修飾が、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異形が生成され得る。Ｆｃ領域変異形は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【００６２】
ある特定の実施形態において、本発明は、全てではなくいくつかのエフェクター機能を保有し、それにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、さらにある特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不必要であるか、または有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体変異形を企図する。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏が確認され得る。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）のページ４６４の表３に要約される。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評定するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２、米国特許第５，８２１，３３７号、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．を参照されたい）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６に開示されているものなどの動物モデルにおいて評定され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、故にＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評定するために、ＣＤＣアッセイが行われ得る（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期決定は、当技術分野において既知の方法を使用しても行われ得る（Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９）。
【００６３】
低減したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有する抗体が含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ突然変異体には、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、及び３２７位のうちの２つ以上の置換を有するＦｃ突然変異体、例えば、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【００６４】
加えて、ＦｃＲへの結合が改善または低減された抗体変異形が記載されている（米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４）。
【００６５】
抗体変異形は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域２９８位、３３３位、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含み得る。
【００６６】
例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４１７８−４１８４に記載されているように、改変がＦｃ領域内で行われ得、これにより、改変した（すなわち、改善されたか、または低減されたかのいずれかの）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）がもたらされる。
【００６７】
増加した半減期と、母体ＩｇＧの胎児への移送に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域のＦｃＲｎへの結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異形には、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異形の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【００６８】
システイン操作抗体変異形
抗体の１つ以上の残基がシステイン残基（複数可）で置換されている、システイン操作抗体、（例えば、「ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）」）を作り出すことが望ましい。置換された残基は、抗体の到達可能な部位で起こり得る。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の到達可能な部位に位置付けられ、それを使用して、抗体を他の部分、例えば、薬物部分またはリンカー−薬物部分に複合体化して、免疫複合体とも称される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）を作り出すことができる。かかるＴＨＩＯＭＡＢの例には、システイン操作抗体が含まれ、以下の残基のうちのいずれか１つ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）、ならびに重鎖Ｆｃ領域の５４００（ＥＵ番号付け）、ならびに軽鎖のＳ１２１及びＫ１４９。システイン操作抗体を作製する例示的な方法には、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されている方法が含まれるが、これに限定されず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６９】
それ故に、本開示の方法は、システイン操作抗体を含む抗体−薬物複合体に適用され得、ここで、野生型または親抗体の１つ以上のアミノ酸がシステインアミノ酸で置き換えられる（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標））。抗体のいずれの形態も、そのように操作、すなわち突然変異され得る。例えば、親Ｆａｂ抗体断片は、操作されて、システイン操作Ｆａｂを形成し得る。同様に、親モノクローナル抗体は、操作されて、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）を形成し得る。単一の部位の突然変異により、Ｆａｂ抗体断片に単一の操作システイン残基が生じるが、単一部位の突然変異により、ＩｇＧ抗体の二量体性に起因して完全長ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）に２つの操作システイン残基が生じることに留意されたい。置き換えられた（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する突然変異体は、新しく導入された、操作されたシステインチオール基の反応性に関して評価される。チオール反応性値は、０〜１．０の範囲内の相対的な数値であり、任意のシステイン操作抗体に関して測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０、０．７〜１．０、または０．８〜１．０の範囲である。
【００７０】
システインアミノ酸は、抗体の重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）内の反応性部位で操作され得、これは、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２００８ｂ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：９２５−９３２、Ｄｏｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４（１３）：２７２１−２７２９、ＵＳ７５２１５４１、ＵＳ７７２３４８５、ＷＯ２００９／０５２２４９、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（２）：１８４−１９１、Ｊｕｎｕｔｕｌａ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３３２：４１−５２）。操作されたシステインチオールは、チオール−反応性で求電子性のピリジルジスルフィド基を有する本発明のリンカー試薬またはリンカー−薬物中間体と反応して、システイン操作抗体（ＴＨＩＯＭＡＢ（商標））及び薬物（Ｄ）部分を有するＡＤＣを形成し得る。それ故に、薬物部分の場所は、設計され、制御され、既知であり得る。薬物の負荷量は、操作されたシステインチオール基が典型的に、チオール反応性リンカー試薬またはリンカー−薬物中間体と高い収率で反応するため、制御され得る。重鎖または軽鎖の単一部位にて置換によりシステインアミノ酸を導入するように抗体を操作することで、対称の抗体上に２つの新しいシステインが得られる。２に近い薬物の負荷量が達成され得、複合体化産生物ＡＤＣのほぼ均一性が達成され得る。
【００７１】
システイン操作抗体は好ましくは、それらの野生型の親抗体対応物の抗原結合能力を保持する。それ故に、システイン操作抗体は、抗原に、好ましくは特異的に結合することができる。かかる抗原には、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、細胞表面受容体タンパク質及び他の細胞表面分子、膜貫通タンパク質、シグナル伝達タンパク質、細胞生存制御因子、細胞増殖制御因子、組織の発達または分化と関連する（例えば、それに機能的に寄与することが既知であるか、または想定される）分子、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期制御に関与する分子、脈管形成に関与する分子、ならびに血管新生に関連する（例えば、それに機能的に寄与することが既知であるか、または想定される）分子が含まれる。腫瘍関連抗原は、クラスター分化因子（すなわち、ＣＤタンパク質）であり得る。システイン操作抗体が結合することができる抗原は、上述の分類のうちの１つのサブセットのメンバーであり得、ここで、当該分類の他のサブセット（複数可）は、（目的とする抗原に関して）異なる特徴を有する他の分子／抗原を含む。
【００７２】
システイン操作抗体は、鎖内ジスルフィド基の還元及び再酸化により、リンカー−薬物中間体との複合体化のために調製される。
【００７３】
本開示の方法で使用するための抗体−薬物複合体を形成し得るシステイン操作抗体には、細胞表面受容体及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体を含むが、これらに限定されないがんの治療で有用なシステイン操作抗体が含まれる。腫瘍関連抗原は、当該技術分野において既知であり、当該技術分野において周知の方法及び情報を使用して抗体を生成するのに使用するために調製され得る。がんの診断及び療法のための有効な細胞標的を発見するための試みにおいて、研究者らは、１つ以上の正常な非がん性細胞（複数可）と比較して、１つ以上の特定の種類（複数可）のがん細胞の表面上に特異的に発現する膜貫通ポリペプチドまたは他の様式で腫瘍に関連するポリペプチドを特定しようとした。しばしば、かかる腫瘍関連ポリペプチドは、非がん性細胞の表面上と比較して、がん細胞の表面上でより豊富に発現する。かかる腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの特定により、抗体に基づく療法を介してがん細胞の破壊のために特異的に標的とする能力が生じた。
【００７４】
腫瘍関連抗原ＴＡＡの例には、以下に列挙されるＴＡＡ（１）〜（５３）が含まれるが、これらに限定されない。便宜上、これらの抗原（全て当該技術分野で既知である）に関連する情報を以下に列挙し、この情報には、名称、別称、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号、及び主な参考文献（複数可）に続き、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）の核酸及びタンパク質配列を特定する慣例が含まれている。ＴＡＡ（１）〜（５３）に対応する核酸及びタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて入手可能である。抗体により標的とされる腫瘍関連抗原には、引用される参考文献において特定されている配列と比較して、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を保有する全てのアミノ酸配列変異形及びアイソフォーム、または引用される参考文献中に見出される配列を有するＴＡＡと実質的に同じ生物学的特性もしくは特徴を呈するものが含まれる。例えば、変異形配列を有するＴＡＡは一般に、列挙されている対応する配列を有するＴＡＡに特異的に結合する抗体に特異的に結合することができる。本明細書に具体的に引用される参考文献中の配列及び開示は、参照により明示的に組み込まれる。
【００７５】
腫瘍関連抗原：
（１）ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体−ＩＢ型、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２０３）ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４（５１５５）：１０１−１０４（１９９４）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４（１１）：１３７７−１３８２（１９９７））、ＷＯ２００４０６３３６２（請求項２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３１３４７９０−Ａ１（ページ３８〜３９）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、ページ２９６）、ＷＯ２００３０５５４４３（ページ９１〜９２）、ＷＯ２００２９９１２２（実施例２、ページ５２８〜５３０）、ＷＯ２００３０２９４２１（請求項６）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図１１２）、ＷＯ２００２９８３５８（請求項１、ページ１８３）、ＷＯ２００２５４９４０（ページ１００〜１０１）、ＷＯ２００２５９３７７（ページ３４９〜３５０）、ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７、ページ３７６）、ＷＯ２００１４８２０４（実施例、図４）
ＮＰ＿００１１９４骨形成タンパク質受容体、ＩＢ型／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００１１９４．１−
相互参照：ＭＩＭ：６０３２４８、ＮＰ＿００１１９４．１、ＡＹ０６５９９４
【００７６】
（２）Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４８６）
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５（２），２８３−２８８（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９５（６６９９）：２８８−２９１（１９９８）、Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（１６）：１１２６７−１１２７３）、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＷＯ２００２９９０７４（請求項１９、ページ１２７〜１２９）、ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７、ページ２２２、３９３）、ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０、ページ２９３）、ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３、ページ９３〜９５）、ＷＯ２０００１４２２８（請求項５、ページ１３３〜１３６）、ＵＳ２００３２２４４５４（図３）、ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２、ページ１５０）、ＮＰ＿００３４７７溶質輸送体ファミリー７（カチオン性アミノ酸輸送体、ｙ＋システム）、メンバー５／ｐｉｄ＝ＮＰ＿００３４７７．３−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、相互参照：ＭＩＭ：６００１８２、ＮＰ＿００３４７７．３、ＮＭ＿０１５９２３、ＮＭ＿００３４８６＿１
【００７７】
（３）ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４４９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（１５），５８５７−５８６０（２００１）、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２５）：１４５２３−１４５２８）、ＷＯ２００４０６５５７７（請求項６）、ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｌ）、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３１５７０８９（実施例５）、ＵＳ２００３１８５８３０（実施例５）、ＵＳ２００３０６４３９７（図２）、ＷＯ２００２８９７４７（実施例５、ページ６１８〜６１９）、ＷＯ２００３０２２９９５（実施例９、図１３Ａ、実施例５３、ページ１７３、実施例２、図２Ａ）、ＮＰ＿０３６５８１前立腺の６回膜貫通上皮抗原。相互参照：ＭＩＭ：６０４４１５、ＮＰ＿０３６５８１．１、ＮＭ＿０１２４４９＿１
【００７８】
（４）０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３６１４８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２９）：２７３７１−２７３７５（２００１））、ＷＯ２００４０４５５５３（請求項１４）、ＷＯ２００２９２８３６（請求項６、図１２）、ＷＯ２００２８３８６６（請求項１５、ページ１１６〜１２１）、ＵＳ２００３１２４１４０（実施例１６）、ＵＳ７９８９５９。相互参照：ＧＩ：３４５０１４６７、ＡＡＫ７４１２０．３、ＡＦ３６１４８６＿１
【００７９】
（５）ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５８２３）Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２），８０５−８０８（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（２０）：１１５３１−１１５３６（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（１）：１３６−１４０（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３７）：２１９８４−２１９９０（１９９５））、ＷＯ２００３１０１２８３（請求項１４）、（ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、ページ２８７〜２８８）、ＷＯ２００２１０１０７５（請求項４、ページ３０８〜３０９）、ＷＯ２００２７１９２８（ページ３２０〜３２１）、ＷＯ９４１０３１２（ページ５２〜５７）、相互参照：ＭＩＭ：６０１０５１、ＮＰ＿００５８１４．２、ＮＭ＿００５８２３＿１
【００８０】
（６）Ｎａｐｉ３ｂ（ＮＡＰＩ−３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６４２４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（２２）：１９６６５−１９６７２（２００２）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２（２）：２８１−２８４（１９９９）、Ｆｅｉｌｄ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５８（３）：５７８〜５８２）、ＷＯ２００４０２２７７８（請求項２）、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、ページ３２６）、ＥＰ８７５５６９（請求項１、ページ１７〜１９）、ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、ページ３２９）、ＷＯ２００４０３２８４２（実施例ＩＶ）、ＷＯ２００１７５１７７（請求項２４、ページ１３９〜１４０）、
相互参照：ＭＩＭ：６０４２１７、ＮＰ＿００６４１５．１、ＮＭ＿００６４２４＿１
【００８１】
（７）Ｓｅｍａ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ  Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢ０４０８７８）
Ｎａｇａｓｅ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ（２０００）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．７（２）：１４３〜１５０）、ＷＯ２００４０００９９７（請求項１）、ＷＯ２００３００３９８４（請求項１）、ＷＯ２００２０６３３９（請求項１、ページ５０）、ＷＯ２００１８８１３３（請求項１、ページ４１〜４３、４８〜５８）、ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）、ＷＯ２００３１０１４００（請求項１１）、受託番号：Ｑ９Ｐ２８３、ＥＭＢＬ、ＡＢ０４０８７８、ＢＡＡ９５９６９．１．Ｇｅｎｅｗ、ＨＧＮＣ：１０７３７。
【００８２】
（８）ＰＳＣＡ  ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ２７０００５０Ｃ１２遺伝子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３５８６２８）、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：２５４６−２５５３、ＵＳ２００３１２９１９２（請求項２）、ＵＳ２００４０４４１８０（請求項１２）、ＵＳ２００４０４４１７９（請求項１１）、ＵＳ２００３０９６９６１（請求項１１）、ＵＳ２００３２３２０５６（実施例５）、ＷＯ２００３１０５７５８（請求項１２）、ＵＳ２００３２０６９１８（実施例５）、ＥＰ１３４７０４６（請求項１）、ＷＯ２００３０２５１４８（請求項２０）、相互参照：ＧＩ：３７１８２３７８、ＡＡＱ８８９９１．１、ＡＹ３５８６２８＿１
【００８３】
（９）ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２７５４６３）、Ｎａｋａｍｕｔａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７７，３４−３９，１９９１、Ｏｇａｗａ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，２４８−２５５，１９９１、Ａｒａｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊｐｎ．Ｃｉｒｃ．Ｊ．５６，１３０３−１３０７，１９９２、Ａｒａｉ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３４６３−３４７０，１９９３、Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ａ．，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７８，６５６−６６３，１９９１、Ｅｌｓｈｏｕｒｂａｇｙ  Ｎ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，３８７３−３８７９，１９９３、Ｈａｅｎｄｌｅｒ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０，ｓ１−Ｓ４，１９９２、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  ２２８，４３−４９，１９９９、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８２，３１１６−３１２３，１９９７、Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１５８９−２１５９６，１９９７、Ｖｅｒｈｅｉｊ  Ｊ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ  Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１０８，２２３−２２５，２００２、Ｈｏｆｓｔｒａ  Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５，１８０−１８５，１９９７、Ｐｕｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ  Ｅ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  ７９，１２５７−１２６６，１９９４、Ａｔｔｉｅ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４，２４０７−２４０９，１９９５、Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：３５１−３５４，１９９６、Ａｍｉｅｌ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５，３５５−３５７，１９９６、Ｈｏｆｓｔｒａ  Ｒ．Ｍ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１２，４４５−４４７，１９９６、Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０３，１４５−１４８，１９９８、Ｆｕｃｈｓ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７，１１５−１２４，２００１、Ｐｉｎｇａｕｌｔ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１１，１９８−２０６、ＷＯ２００４０４５５１６（請求項１）、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０４００００（請求項１５１）、ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２６１０８７（図１）、ＷＯ２００３０１６４９４（図６）、ＷＯ２００３０２５１３８（請求項１２、ページ１４４）、ＷＯ２００１９８３５１（請求項１、ページ１２４〜１２５）、ＥＰ５２２８６８（請求項８、図２）、ＷＯ２００１７７１７２（請求項１、ページ２９７〜２９９）、ＵＳ２００３１０９６７６、ＵＳ６５１８４０４���図３）、ＵＳ５７７３２２３（請求項１ａ、欄３１〜３４）、ＷＯ２００４００１００４。
【００８４】
（１０）ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮説上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７７６３）、
ＷＯ２００３１０４２７５（請求項１）、ＷＯ２００４０４６３４２（実施例２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００３０８３０７４（請求項１４、ページ６１）、ＷＯ２００３０１８６２１（請求項１）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９３）、ＷＯ２００１６６６８９（実施例６）、相互参照：ＬｏｃｕｓＩＤ：５４８９４、ＮＰ＿０６０２３３．２、ＮＭ＿０１７７６３＿１
【００８５】
（１１）ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ−１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ４５５１３８）
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．８２（１１）：１５７３−１５８２（２００２））、ＷＯ２００３０８７３０６、ＵＳ２００３０６４３９７（請求項１、図１）、ＷＯ２００２７２５９６（請求項１３、ページ５４〜５５）、ＷＯ２００１７２９６２（請求項１、図４Ｂ）、ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１１）、ＷＯ２００３１０４２７０（請求項１６）、ＵＳ２００４００５５９８（請求項２２）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＵＳ２００３０６０６１２（請求項１２、図１０）、ＷＯ２００２２６８２２（請求項２３、図２）、ＷＯ２００２１６４２９（請求項１２、図１０）、相互参照：ＧＩ：２２６５５４８８、ＡＡＮ０４０８０．１、ＡＦ４５５１３８＿１
【００８６】
（１２）ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６３６）。Ｘｕ、Ｘ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１９）：１０６９２−１０６９７（２００１）、Ｃｅｌｌ  １０９（３）：３９７−４０７（２００２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３３）：３０８１３−３０８２０（２００３））、ＵＳ２００３１４３５５７（請求項４）、ＷＯ２０００４０６１４（請求項１４、ページ１００〜１０３）、ＷＯ２００２１０３８２（請求項１、図９Ａ）、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００２３０２６８（請求項２７、ページ３９１）、ＵＳ２００３２１９８０６（請求項４）、ＷＯ２００１６２７９４（請求項１４、図１Ａ〜Ｄ）、
相互参照：ＭＩＭ：６０６９３６、ＮＰ＿０６０１０６．２、ＮＭ＿０１７６３６＿１
【００８７】
（１３）ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌種由来の成長因子、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３２０３またはＮＭ＿００３２１２）。Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ  ＥＭＢＯ  Ｊ．８（７）：１９８７−１９９１（１９８９）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４９（３）：５５５−５６５（１９９１））、ＵＳ２００３２２４４１１（請求項１）、ＷＯ２００３０８３０４１（実施例１）、ＷＯ２００３０３４９８４（請求項１２）、ＷＯ２００２８８１７０（請求項２、ページ５２〜５３）、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図５８）、ＷＯ２００２１６４１３（請求項１、ページ９４〜９５、１０５）、ＷＯ２００２２２８０８（請求項２、図１）、ＵＳ５８５４３９９（実施例２、欄１７〜１８）、ＵＳ５７９２６１６（図２）、
相互参照：ＭＩＭ：１８７３９５、ＮＰ＿００３２０３．１、ＮＭ＿００３２１２＿１
【００８８】
（１４）ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウィルス受容体）またはＨｓ．７３７９２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２６００４）。Ｆｕｊｉｓａｋｕ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（４）：２１１８−２１２５）、Ｗｅｉｓ  Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７，１０４７−１０６６，１９８８、Ｍｏｏｒｅ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，９１９４−９１９８，１９８７、Ｂａｒｅｌ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５，１０２５−１０３１，１９９８、Ｗｅｉｓ  Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，５６３９−５６４３，１９８６、Ｓｉｎｈａ  Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０，５３１１−５３２０、ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）、ＵＳ２００４００５５３８（実施例１）、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＷＯ２００４０４５５２０（実施例４）、ＷＯ９１０２５３６（図９．１〜９．９）、ＷＯ２００４０２０５９５（請求項１）、受託番号：Ｐ２００２３、Ｑ１３８６６、Ｑ１４２１２、ＥＭＢＬ、Ｍ２６００４、ＡＡＡ３５７８６．１。
【００８９】
（１５）ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９ｂ、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００６２６または１１０３８６７４）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（２００３）１００（７）：４１２６−４１３１，Ｂｌｏｏｄ（２００２）１００（９）：３０６８−３０７６、Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（６）：１６２１−１６２５）、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２、図１４０）、ＷＯ２００３０８７７６８、ＵＳ２００４１０１８７４（請求項１、ページ１０２）、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＵＳ２００２１５０５７３（請求項５、ページ１５）、ＵＳ５６４４０３３、ＷＯ２００３０４８２０２（請求項１、ページ３０６及び３０９）、ＷＯ９９／５５８６５８、ＵＳ６５３４４８２（請求項１３、図１７Ａ／Ｂ）、ＷＯ２０００５５３５１（請求項１１、ページ１１４５〜１１４６）、相互参照：ＭＩＭ：１４７２４５、ＮＰ＿０００６１７．１、ＮＭ＿０００６２６＿１
【００９０】
（１６）ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３０７６４、ＡＹ３５８１３０）。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０（２００３）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４（２）：８７−９５（２００２）、Ｂｌｏｏｄ  ９９（８）：２６６２−２６６９（２００２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（１７）：９７７２−９７７７（２００１）、Ｘｕ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８０（３）：７６８−７７５、ＷＯ２００４０１６２２５（請求項２）、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項５、図１８Ｄ−１〜１８Ｄ−２）、ＷＯ２００３０９７８０３（請求項１２）、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項２５）、相互参照：ＭＩＭ：６０６５０９、ＮＰ＿１１０３９１．２、ＮＭ＿０３０７６４＿１
【００９１】
（１７）ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１１７３０）Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０（４７３０）：１１３２−１１３９）、Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ３１９，２３０−２３４，１９８６、Ｓｅｍｂａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，６４９７−６５０１，１９８５、Ｓｗｉｅｒｃｚ  Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６５，８６９−８８０，２００４、Ｋｕｈｎｓ  Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３６４２２−３６４２７，１９９９、Ｃｈｏ  Ｈ．−Ｓ．，ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ４２１，７５６−７６０，２００３、Ｅｈｓａｎｉ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，４２６−４２９、ＷＯ２００４０４８９３８（実施例２）、ＷＯ２００４０２７０４９（図１Ｉ）、ＷＯ２００４００９６２２、ＷＯ２００３０８１２１０、ＷＯ２００３０８９９０４（請求項９）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＵＳ２００３１１８５９２、ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）、ＷＯ２００３０５５４３９（請求項２９、図１Ａ〜Ｂ）、ＷＯ２００３０２５２２８（請求項３７、図５Ｃ）、ＷＯ２００２２２６３６（実施例１３、ページ９５〜１０７）、ＷＯ２００２１２３４１（請求項６８、図７）、ＷＯ２００２１３８４７（ページ７１〜７４）、ＷＯ２００２１４５０３（ページ１１４〜１１７）、ＷＯ２００１５３４６３（請求項２、ページ４１〜４６）、ＷＯ２００１４１７８７（ページ１５）、ＷＯ２０００４４８９９（請求項５２、図７）、ＷＯ２０００２０５７９（請求項３、図２）、ＵＳ５８６９４４５（請求項３、欄３１〜３８）、ＷＯ９６３０５１４（請求項２、ページ５６〜６１）、ＥＰ１４３９３９３（請求項７）、ＷＯ２００４０４３３６１（請求項７）、ＷＯ２００４０２２７０９、ＷＯ２００１００２４４（実施例３、図４）、
受託番号：Ｐ０４６２６、ＥＭＢＬ、Ｍ１１７６７、ＡＡＡ３５８０８．１．ＥＭＢＬ、Ｍ１１７６１、ＡＡＡ３５８０８．１。
【００９２】
（１８）ＮＣＡ（ＣＥＡＣＡＭ６、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１８７２８）、Ｂａｒｎｅｔｔ  Ｔ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３，５９−６６，１９８８、Ｔａｗａｒａｇｉ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５０，８９−９６，１９８８、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１６８９９−１６９０３，２００２、ＷＯ２００４０６３７０９、ＥＰ１４３９３９３（請求項７）、ＷＯ２００４０４４１７８（実施例４）、ＷＯ２００４０３１２３８、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２００２７８５２４（実施例２）、ＷＯ２００２８６４４３（請求項２７、ページ４２７）、ＷＯ２００２６０３１７（請求項２）、
受託番号：Ｐ４０１９９、Ｑ１４９２０、ＥＭＢＬ、Ｍ２９５４１、ＡＡＡ５９９１５．１．ＥＭＢＬ、Ｍ１８７２８。
【００９３】
（１９）ＭＤＰ（ＤＰＥＰ１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＣ０１７０２３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（２６）：１６８９９−１６９０３（２００２））、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２６４７９８（請求項３３、ページ８５〜８７）、ＪＰ０５００３７９０（図６〜８）、ＷＯ９９４６２８４（図９）、相互参照：ＭＩＭ：１７９７８０、ＡＡＨ１７０２３．１、ＢＣ０１７０２３＿１
【００９４】
（２０）ＩＬ２０Ｒα（ＩＬ２０Ｒａ、ＺＣＹＴＯＲ７、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１８４９７１）、Ｃｌａｒｋ  Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３，２２６５−２２７０，２００３、Ｍｕｎｇａｌｌ  Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，８０５−８１１，２００３、Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ  １０４，９−１９，２００１、Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７，３５４５−３５４９，２００１、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ  Ｊ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，４７５１７−４７５２３，２００２、Ｐｌｅｔｎｅｖ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１２６１７−１２６２４、Ｓｈｅｉｋｈ  Ｆ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，２００６−２０１０、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＵＳ２００４００５３２０（実施例５）、ＷＯ２００３０２９２６２（ページ７４〜７５）、ＷＯ２００３００２７１７（請求項２、ページ６３）、ＷＯ２００２２２１５３（ページ４５〜４７）、ＵＳ２００２０４２３６６（ページ２０〜２１）、ＷＯ２００１４６２６１（ページ５７〜５９）、ＷＯ２００１４６２３２（ページ６３〜６５）、ＷＯ９８３７１９３（請求項１、ページ５５〜５９）、受託番号：Ｑ９ＵＨＦ４、Ｑ６ＵＷＡ９、Ｑ９６ＳＨ８、ＥＭＢＬ、ＡＦ１８４９７１、ＡＡＦ０１３２０．１。
【００９５】
（２１）Ｂｒｅｖｉｃａｎ（ＢＣＡＮ、ＢＥＨＡＢ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２２９０５３）。Ｇａｒｙ  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ  ２５６，１３９−１４７，２０００、Ｃｌａｒｋ  Ｈ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３，２２６５−２２７０，２００３、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６８９９−１６９０３，２００２、ＵＳ２００３１８６３７２（請求項１１）、ＵＳ２００３１８６３７３（請求項１１）、ＵＳ２００３１１９１３１（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２２（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２６（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１２１（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２９（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１３０（請求項１）、ＵＳ２００３１１９１２８（請求項１、図５２）、ＵＳ２００３１１９１２５（請求項１）、ＷＯ２００３０１６４７５（請求項１）、ＷＯ２００２０２６３４（請求項１）。
【００９６】
（２２）ＥｐｈＢ２Ｒ（ＤＲＴ、ＥＲＫ、Ｈｅｋ５、ＥＰＨＴ３、Ｔｙｒｏ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４４２）
Ｃｈａｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗａｔｔ，Ｖ．Ｍ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６（６），１０５７−１０６１（１９９１）  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １０（５）：８９７−９０５（１９９５），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３０９−３４５（１９９８），Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９６：１７７−２４４（２０００））、ＷＯ２００３０４２６６１（請求項１２）、ＷＯ２０００５３２１６（請求項１、ページ４１）、ＷＯ２００４０６５５７６（請求項１）、ＷＯ２００４０２０５８３（請求項９）、ＷＯ２００３００４５２９（ページ１２８〜１３２）、ＷＯ２０００５３２１６（請求項１、ページ４２）、相互参照：ＭＩＭ：６００９９７、ＮＰ＿００４４３３．２、ＮＭ＿００４４４２＿１
【００９７】
（２３）ＡＳＬＧ６５９（Ｂ７ｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＸ０９２３２８）。ＵＳ２００４０１０１８９９（請求項２）、ＷＯ２００３１０４３９９（請求項１１）、ＷＯ２００４０００２２１（図３）、ＵＳ２００３１６５５０４（請求項１）、ＵＳ２００３１２４１４０（実施例２）、ＵＳ２００３０６５１４３（図６０）、ＷＯ２００２１０２２３５（請求項１３、ページ２９９）、ＵＳ２００３０９１５８０（実施例２）、ＷＯ２００２１０１８７（請求項６、図１０）、ＷＯ２００１９４６４１（請求項１２、図７ｂ）、ＷＯ２００２０２６２４（請求項１３、図１Ａ〜１Ｂ）、ＵＳ２００２０３４７４９（請求項５４、ページ４５〜４６）、ＷＯ２００２０６３１７（実施例２、ページ３２０〜３２１、請求項３４、ページ３２１〜３２２）、ＷＯ２００２７１９２８（ページ４６８〜４６９）、ＷＯ２００２０２５８７（実施例１、図１）、ＷＯ２００１４０２６９（実施例３、ページ１９０〜１９２）、ＷＯ２０００３６１０７（実施例２、ページ２０５〜２０７）、ＷＯ２００４０５３０７９（請求項１２）、ＷＯ２００３００４９８９（請求項１）、ＷＯ２００２７１９２８（ページ２３３〜２３４、４５２〜４５３）、ＷＯ０１１６３１８。
【００９８】
（２４）ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原前駆体、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＪ２９７４３６）
Ｒｅｉｔｅｒ  Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１７３５−１７４０，１９９８、Ｇｕ  Ｚ．，ｅｔ  ａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９，１２８８−１２９６，２０００、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２０００）２７５（３）：７８３−７８８、ＷＯ２００４０２２７０９、ＥＰ１３９４２７４（実施例１１）、ＵＳ２００４０１８５５３（請求項１７）、ＷＯ２００３００８５３７（請求項１）、ＷＯ２００２８１６４６（請求項１、ページ１６４）、ＷＯ２００３００３９０６（請求項１０、ページ２８８）、ＷＯ２００１４０３０９（実施例１、図１７）、ＵＳ２００１０５５７５１（実施例１、図１ｂ）、ＷＯ２０００３２７５２（請求項１８、図１）、ＷＯ９８５１８０５（請求項１７、ページ９７）、ＷＯ９８５１８２４（請求項１０、ページ９４）、ＷＯ９８４０４０３（請求項２、図１Ｂ）、受託番号：Ｏ４３６５３、ＥＭＢＬ、ＡＦ０４３４９８、ＡＡＣ３９６０７．１。
【００９９】
（２５）ＧＥＤＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ２６０７６３）、ＡＡＰ１４９５４脂肪腫ＨＭＧＩＣ融合パートナー様タンパク質／ｐｉｄ＝ＡＡＰ１４９５４．１−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ種：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）ＷＯ２００３０５４１５２（請求項２０）、ＷＯ２００３０００８４２（請求項１）、ＷＯ２００３０２３０１３（実施例３、請求項２０）、ＵＳ２００３１９４７０４（請求項４５）、相互参照：ＧＩ：３０１０２４４９、ＡＡＰ１４９５４．１、ＡＹ２６０７６３＿１。
【０１００】
（２６）ＢＡＦＦ−Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１１６４５６）、ＢＡＦＦ受容体／ｐｉｄ＝ＮＰ＿４４３１７７．１−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３（５５３７），２１０８−２１１１（２００１）、ＷＯ２００４０５８３０９、ＷＯ２００４０１１６１１、ＷＯ２００３０４５４２２（実施例、ページ３２〜３３）、ＷＯ２００３０１４２９４（請求項３５、図６Ｂ）、ＷＯ２００３０３５８４６（請求項７０、ページ６１５〜６１６）、ＷＯ２００２９４８５２（欄１３６〜１３７）、ＷＯ２００２３８７６６（請求項３、ページ１３３）、ＷＯ２００２２４９０９（実施例３、図３）、相互参照：ＭＩＭ：６０６２６９、ＮＰ＿４４３１７７．１、ＮＭ＿０５２９４５＿１、ＡＦ１３２６００。
【０１０１】
（２７）ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２−Ｂアイソフォーム、ＢＬ−ＣＡＭ、Ｌｙｂ−８、Ｌｙｂ８、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＦＬＪ２２８１４、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＫ０２６４６７）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１３７−１４６、ＷＯ２００３０７２０３６（請求項１、図１）、相互参照：ＭＩＭ：１０７２６６、ＮＰ＿００１７６２．１、ＮＭ＿００１７７１＿１。
【０１０２】
（２８）ＣＤ７９ａ（ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｉｇベータ（ＣＤ７９Ｂ）と共有結合により相互作用し、ＩｇＭ分子と表面上で複合物を形成し、Ｂ細胞分化に関与するシグナルを伝達するＢ細胞特異的タンパク質）、ｐＩ：４．８４、ＭＷ：２５０２８  ＴＭ：２［Ｐ］遺伝子染色体：１９ｑ１３．２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７４．１０）、ＷＯ２００３０８８８０８、ＵＳ２００３０２２８３１９、ＷＯ２００３０６２４０１（請求項９）、ＵＳ２００２１５０５７３（請求項４、ページ１３〜１４）、ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１６）、ＷＯ９２０７５７４（図１）、ＵＳ５６４４０３３、Ｈａ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５２６−１５３１、Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２：１６２１−１６２５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４０（４）：２８７−２９５、Ｐｒｅｕｄ’ｈｏｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０（１）：１４１−１４６、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（２）６３３−６３７、Ｓａｋａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７（１１）：３４５７−３４６４。
【０１０３】
（２９）ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、ＣＸＣＬ１３ケモカインにより活性化され、リンパ球遊走及び液性防御において機能し、ＨＩＶ−２感染、ならびにおそらくはＡＩＤＳ、リンパ腫、骨髄腫、及び白血病の発症において役割を果たす、Ｇタンパク質結合型受容体）、３７２ａａ、ｐＩ：８．５４  ＭＷ：４１９５９  ＴＭ：７［Ｐ］遺伝子染色体：１１ｑ２３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７０７．１）、ＷＯ２００４０４００００、ＷＯ２００４０１５４２６、ＵＳ２００３１０５２９２（実施例２）、ＵＳ６５５５３３９（実施例２）、ＷＯ２００２６１０８７（図１）、ＷＯ２００１５７１８８（請求項２０、ページ２６９）、ＷＯ２００１７２８３０（ページ１２〜１３）、ＷＯ２０００２２１２９（実施例１、ページ１５２〜１５３、実施例２、ページ２５４〜２５６）、ＷＯ９９２８４６８（請求項１、ページ３８）、ＵＳ５４４００２１（実施例２、欄４９〜５２）、ＷＯ９４２８９３１（ページ５６〜５８）、ＷＯ９２１７４９７（請求項７、図５）、Ｄｏｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：２７９５−２７９９、Ｂａｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０９：７７３−７７９。
【０１０４】
（３０）ＨＬＡ−ＤＯＢ（ペプチドに結合し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球にそれらを提示する、ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原））、２７３ａａ、ｐＩ：６．５６  ＭＷ：３０８２０  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：６ｐ２１．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１１１．１）Ｔｏｎｎｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４（１１）：２８３９−２８４７、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９（６）：４１１−４１３、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：４３３−４４１、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１６８９９−１６９０３、Ｓｅｒｖｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：８７５９−８７６６、Ｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：１−１３、Ｎａｒｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５９：５１２−５１９、ＷＯ９９５８６５８（請求項１３、図１５）、ＵＳ６１５３４０８（欄３５〜３８）、ＵＳ５９７６５５１（欄１６８〜１７０）、ＵＳ６０１１１４６（欄１４５〜１４６）、Ｋａｓａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３０（１）：６６−６８、Ｌａｒｈａｍｍａｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２６）：１４１１１−１４１１９。
【０１０５】
（３１）Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５、シナプス伝達及び神経発生に関与し得る、細胞外ＡＴＰにより開閉されるイオンチャネル、不足すると突発性排尿筋不安定の病態生理に寄与し得る）、４２２ａａ）、ｐＩ：７．６３、ＭＷ：４７２０６  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１７ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２５５２．２）、Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１８（１−２）：１９５−１９９、ＷＯ２００４０４７７４９、ＷＯ２００３０７２０３５（請求項１０）、Ｔｏｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：１６５−１７３、ＷＯ２００２２２６６０（請求項２０）、ＷＯ２００３０９３４４４（請求項１）、ＷＯ２００３０８７７６８（請求項１）、ＷＯ２００３０２９２７７（ページ８２）。
【０１０６】
（３２）ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ−２）タンパク質配列完全ｍａｅａｉｔｙ．．．ｔａｆｒｆｐｄ（１…３５９、３５９ａａ）、ｐＩ：８．６６、ＭＷ：４０２２５  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：９ｐ１３．３、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１７７３．１）、ＷＯ２００４０４２３４６（請求項６５）、ＷＯ２００３０２６４９３（ページ５１〜５２、５７〜５８）、ＷＯ２０００７５６５５（ページ１０５〜１０６）、Ｖｏｎ  Ｈｏｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４（１２）：４８７０−４８７７、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１６８９９−１６９０３。
【０１０７】
（３３）ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質、Ｂ細胞の活性化及びアポトーシスを制御し、機能消失が、全身性エリテマトーデスを有する患者において疾患活性の増加と関連付けられている）、６６１ａａ、ｐＩ：６．２０、ＭＷ：７４１４７  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：５ｑ１２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５５７３．１）、ＵＳ２００２１９３５６７、ＷＯ９７０７１９８（請求項１１、ページ３９〜４２）、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３８（３）：２９９−３０４、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：２８１５−２８２２、ＷＯ２００３０８３０４７、ＷＯ９７４４４５２（請求項８、ページ５７〜６１）、ＷＯ２０００１２１３０（ページ２４〜２６）。
【０１０８】
（３４）ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１、Ｃ２型Ｉｇ様及びＩＴＡＭドメインを含有する免疫グロブリンＦｃドメインの推定上の受容体、Ｂ−リンパ球分化において役割を有し得る）、４２９ａａ、ｐＩ：５．２８、ＭＷ：４６９２５  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１−１ｑ２２、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４３１７０．１）、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項６、図１８Ｅ−１〜１８−Ｅ−２）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８（１７）：９７７２−９７７７、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項８）、ＥＰ１３４７０４６（請求項１）、ＷＯ２００３０８９６２４（請求項７）。
【０１０９】
（３５）ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転位関連２、Ｂ細胞の成長及びリンパ腫形成に潜在的な役割を有する推定上の免疫受容体、転位による遺伝子の制御解除が一部のＢ細胞悪性腫瘍で生じる）、９７７ａａ、ｐＩ：６．８８  ＭＷ：１０６４６８  ＴＭ：１［Ｐ］遺伝子染色体：１ｑ２１、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ヒト：ＡＦ３４３６６２、ＡＦ３４３６６３、ＡＦ３４３６６４、ＡＦ３４３６６５、ＡＦ３６９７９４、ＡＦ３９７４５３、ＡＫ０９０４２３、ＡＫ０９０４７５、ＡＬ８３４１８７、ＡＹ３５８０８５、マウス：ＡＫ０８９７５６、ＡＹ１５８０９０、ＡＹ５０６５５８、ＮＰ＿１１２５７１、ＷＯ２００３０２４３９２（請求項２、図９７）、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７（１）：１２４−１２７、ＷＯ２００３０７７８３６、ＷＯ２００１３８４９０（請求項３、図１８Ｂ−１〜１８Ｂ−２）。
【０１１０】
（３６）ＴＥＮＢ２（ＴＭＥＦＦ２、トモレグリン、ＴＰＥＦ、ＨＰＰ１、ＴＲ、推定上の膜貫通プロテオグリカン、成長因子のＥＧＦ／ヘレグリンファミリー及びフォリスタチン関連）、３７４ａａ、ＮＣＢＩ受託番号：ＡＡＤ５５７７６、ＡＡＦ９１３９７、ＡＡＧ４９４５１、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５７２７６、ＮＣＢＩ遺伝子：２３６７１、ＯＭＩＭ：６０５７３４、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｑ９ＵＩＫ５、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１７９２７４、ＡＹ３５８９０７、ＣＡＦ８５７２３、ＣＱ７８２４３６、ＷＯ２００４０７４３２０、ＪＰ２００４１１３１５１、ＷＯ２００３０４２６６１、ＷＯ２００３００９８１４、ＥＰ１２９５９４４（ページ６９〜７０）、ＷＯ２００２３０２６８（ページ３２９）、ＷＯ２００１９０３０４、ＵＳ２００４２４９１３０、ＵＳ２００４０２２７２７、ＷＯ２００４０６３３５５、ＵＳ２００４１９７３２５、ＵＳ２００３２３２３５０、ＵＳ２００４００５５６３、ＵＳ２００３１２４５７９、Ｈｏｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６７：１４６−１５２、Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６６：５９３−６０２、Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：４９０７−１２、Ｇｌｙｎｎｅ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｏｃｔ  １５；９４（２）：１７８−８４。
【０１１１】
（３７）ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ（ｓｉｌｖｅｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ）、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、ＭＥ２０、ｇｐ１００）ＢＣ００１４１４、ＢＴ００７２０２、Ｍ３２２９５、Ｍ７７３４８、ＮＭ＿００６９２８、ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０６（３３），１３７３１−１３７３６、Ｋｕｍｍｅｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（４），２２９６−２３０６。
【０１１２】
（３８）ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様ドメイン及び２つのフォリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン１）、Ｈ７３６５、Ｃ９ｏｒｆ２、Ｃ９ＯＲＦ２、Ｕ１９８７８、Ｘ８３９６１、ＮＭ＿０８０６５５、ＮＭ＿００３６９２、Ｈａｒｍｓ，Ｐ．Ｗ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７（２１），２６２４−２６２９、Ｇｅｒｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２（１８）：２７２３−２７２７。
【０１１３】
（３９）ＧＤＮＦ−Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ−アルファ１、ＧＦＲ−ＡＬＰＨＡ−１）、Ｕ９５８４７、ＢＣ０１４９６２、ＮＭ＿１４５７９３  ＮＭ＿００５２６４、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２９（８），２２６４−２２７７、Ｔｒｅａｎｏｒ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２（６５８６）：８０−８３。
【０１１４】
（４０）Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合物、遺伝子座Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ−Ｅ、ＳＣＡ−２、ＴＳＡ−１）、ＮＰ＿００２３３７．１、ＮＭ＿００２３４６．２、ｄｅ  Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０３（６），７６８−７７４、Ｚａｍｍｉｔ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２（３）：９４６−９５２。
【０１１５】
（４１）ＴＭＥＭ４６（シサホモログ（ｓｈｉｓａ  ｈｏｍｏｌｏｇ）２（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）、ＳＨＩＳＡ２）、ＮＰ＿００１００７５３９．１、ＮＭ＿００１００７５３８．１、Ｆｕｒｕｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０６（２），４８０−４９２、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０。
【０１１６】
（４２）Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合物、遺伝子座Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６−Ｄ、ＭＥＧＴ１）、ＮＰ＿０６７０７９．２、ＮＭ＿０２１２４６．２、Ｍａｌｌｙａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８０（１）：１１３−１２３、Ｒｉｂａｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１）：２７８−２８７。
【０１１７】
（４３）ＬＧＲ５（ロイシンリッチ反復含有Ｇタンパク質結合型受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、ＮＰ＿００３６５８．１、ＮＭ＿００３６６７．２、Ｓａｌａｎｔｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．１７０（５）：５３７−５４５、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３７（３）：５２８−５３３。
【０１１８】
（４４）ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ−ＥＬＥ１）、ＮＰ＿０６６１２４．１、ＮＭ＿０２０９７５．４、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．１００（１０）：１８９５−１９０１、Ｎａｒｉｔａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２８（３４）：３０５８−３０６８。
【０１１９】
（４５）ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合物、遺伝子座Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、ＮＰ＿０５９９９７．３、ＮＭ＿０１７５２７．３、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７（２４）：１１６０１−１１６１１、ｄｅ  Ｎｏｏｉｊ−ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ，Ａ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０３（６）：７６８−７７４。
【０１２０】
（４６）ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質結合型受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、ＮＰ＿００６１３４．１、ＮＭ＿００６１４３．２、Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｄ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１０５（１−２）：１６２−１６４、Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３９４（３）：３２５−３２９。
【０１２１】
（４７）ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、ＮＰ＿１１５９４０．２、ＮＭ＿０３２５５１．４、Ｎａｖｅｎｏｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５（６）：１３００−１３０６、Ｈａｔａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２９（２）：６１７−６２３。
【０１２２】
（４８）ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、ＮＰ＿８５９０６９．２、ＮＭ＿１８１７１８．３、Ｇｅｒｈａｒｄ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（１０Ｂ）：２１２１−２１２７。
【０１２３】
（４９）チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、ＮＰ＿０００３６３．１、ＮＭ＿０００３７２．４、Ｂｉｓｈｏｐ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１（８）：９２０−９２５、Ｎａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２５（４）：９０９−９１７。
【０１２４】
（５０）ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、ＮＰ＿００１１０３３７３．１、ＮＭ＿００１１０９９０３．１、Ｃｌａｒｋ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３（１０）：２２６５−２２７０、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４０（７０８２）：３４６−３５１
【０１２５】
（５１）ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質結合型受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、ＮＰ＿０７８８０７．１、ＮＭ＿０２４５３１．３、Ｅｒｉｃｓｓｏｎ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１１）：６７５９−６７６４、Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５２０（１−３）：９７−１０１。
【０１２６】
（５２）シアル酸に結合する免疫グロブリン様レクチンファミリーのメンバーであるＣＤ３３は、６７ｋＤａのグリコシル化膜貫通タンパク質である。ＣＤ３３は、委任骨髄単球性前駆細胞及び赤血球前駆細胞に加えて、ほとんどの骨髄性白血病細胞及び単球性白血病細胞上で発現する。これは、最も初期の多能性幹細胞、成熟顆粒球、リンパ系細胞、または非造血系細胞には見られない（Ｓａｂｂａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７５：７５６−５６、Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ  ６８：１０３０−５）。ＣＤ３３は、その細胞質尾部に２つのチロシン残基を含有し、これらの各々に、多くの阻害性受容体に見られる免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）に類似する疎水性残基が続いている。
【０１２７】
（５３）ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）は、Ｃ型レクチン／Ｃ型レクチン様ドメイン（ＣＴＬ／ＣＴＬＤ）スーパーファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、タンパク質の折り畳みが共通しており、細胞接着、細胞間シグナル伝達、糖タンパク質代謝回転、ならびに炎症及び免疫応答における役割など、多様な機能を有する。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、顆粒球及び単球の機能の負の制御因子である。この遺伝子のいくつかの代替的なスプライス転写物変異形が記載されているが、これらの変異形のうちのいくつかに関しては全長の性質が決定されていない。この遺伝子は、染色体１２ｐ１３上のナチュラルキラー遺伝子複合物領域内の他のＣＴＬ／ＣＴＬＤスーパーファミリーメンバーに緊密に結合している（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ  Ｋ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（５）：５８５−９０、ｖａｎ  Ｒｈｅｎｅｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ１１０（７）：２６５９−６６、Ｃｈｅｎ  ＣＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｌｏｏｄ１０７（４）：１４５９−６７、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６（８）：２１５９−６９、Ｂａｋｋｅｒ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（２２）：８４４３−５０、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（１５）：１４７９２−８０２）。ＣＬＬ−１は、単一のＣ型レクチン様ドメイン（カルシウムまたは糖のいずれにも結合することが予測されていない）、ストーク領域、膜貫通ドメイン、及びＩＴＩＭモチーフを含有する短い細胞質尾部を含む、ＩＩ型膜貫通受容体であることが示されている。
【０１２８】
抗体誘導体
本明細書に提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に好適な部分には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得、分岐状または非分岐状であり得る。抗体に結合したポリマーの数は異なり得、１つより多くのポリマーが結合している場合、それらは同じ分子または異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義された条件下である療法に使用されるかなどを含むが、これらに限定されない考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
【０１２９】
抗体及び非タンパク質性部分の複合体は、放射線への曝露により選択的に加熱することにより形成され得る。かかる複合体の非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブであり得る（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５）。放射線は、任意の波長のものであり得、通常の細胞を傷つけないが、抗体−非タンパク質性部分に隣接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長を含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列中で超可変であり、及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）中にあり、３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）中にある。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性を有し、及び／または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）において起こる（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５、及びＨ３の９５〜１０２において起こる（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）。ＶＨ内のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ）短縮−ＣＤＲ、またはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に収容される。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１〜３４、Ｌ２の５０〜５５、Ｌ３の８９〜９６、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜５８、及びＨ３の９５〜１０２で起こる（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，（２００８）Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３）。別途指定されない限り、ＨＶＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って本明細書で番号付けされる。
【０１３１】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から分離された抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）により決定される場合、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体純度の評定のための方法の概説に関して、例えばＦｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７。
【０１３２】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異形抗体を除き、かかる変異形は一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それ故に、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるときの抗体の特徴を示しており、いかなる特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技法により作製され得、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法が、本明細書に記載される。
【０１３３】
「裸の抗体」は、異種性部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に複合体化されていない抗体を指す。裸の抗体は、薬学的製剤中に存在し得る。
【０１３４】
「天然抗体」とは、多様な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。
【０１３５】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、及びいずれの保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当業者が備えている技能の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたる最大整列を達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．が開発したものであり、ソースコードは、ユーザ文書とともに米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に出願されており、それは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており、変動しない。
【０１３６】
アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：１００×分数Ｘ／Ｙ、式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によりそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致とスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％が、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解される。別途具体的に明記されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１３７】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ、相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８）。
【０１３８】
「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、当該技術分野で既知であり、当該技術分野で周知の方法及び情報を使用してヒトまたはヒト化抗体を生成するのに使用するために調製され得る。がんの診断及び療法のための有効な細胞標的を発見するための試みにおいて、研究者らは、１つ以上の正常な非がん性細胞（複数可）と比較して、１つ以上の特定の種類（複数可）のがん細胞の表面上に特異的に発現する膜貫通ポリペプチドまたは他の様式で腫瘍に関連するポリペプチドを特定しようとした。しばしば、かかる腫瘍関連ポリペプチドは、非がん性細胞の表面上と比較して、がん細胞の表面上でより豊富に発現する。かかる腫瘍関連細胞表面の抗原ポリペプチドの特定により、抗体に基づく療法を介してがん細胞の破壊のために特異的に標的とする能力が生じた。ＴＡＡの例には、米国特許第８，６７９，７６７号及び同第８，５４１，１７８号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されず、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１３９】
本開示の方法で有用なＡＤＣの抗体成分は、例えば、ＵＳ４８１６５６７に記載されているように、組み換え方法及び組成物を使用して産生され得る。本明細書に記載されるかかる抗体をコードする単離核酸が提供される。かかる核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。かかる核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）も提供される。かかる核酸を含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含み得る（例えば、それらで形質転換されている）。宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）であり得る。それ故に、抗体を作製する方法が提供され、本方法は、上述される抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することとを含む。
【０１４０】
抗体の組み換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され、配列決定され得る。
【０１４１】
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、原核生物細胞または真核生物細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌中で産生され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、米国特許第５，８４０，５２３号、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗体断片の発現を記載する、Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，（２００３），ｐｐ．２４５−２５４）を参照されたい。発現後、抗体は、可溶性画分中で細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製され得る。
【０１４２】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗体をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株及び酵母株を含む（Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，（２００４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５）。
【０１４３】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用され得る、多数のバキュロウイルス株が特定されている。
【０１４４】
植物細胞培養物は、宿主としても利用され得る（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載しているＵＳ５９５９１７７、ＵＳ６０４０４９８、ＵＳ６４２０５４８、ＵＳ７１２５９７８、ＵＳ６４１７４２９）。
【０１４５】
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）に記載されているような２９３または２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌種細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８に記載されているようなＴＲ１細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説に関しては、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【０１４６】
ＡＤＣの抗体成分は、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性に関して、当該技術分野で既知の様々なアッセイにより、特定され、スクリーニングされ、または特徴付けられ得る。抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの既知の方法により、その抗原結合活性に関して試験され得る。抗原への結合に関して別の既知の抗体と競合する抗体を特定するために、競合アッセイも使用され得る。ある特定の実施形態において、かかる競合抗体は、既知の抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状または立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）に提供されている。
【０１４７】
ＡＤＣを形成する例示的な抗体には、トラスツズマブ、オクレリズマブ、ペルツズマブ、抗ＰＤＬＬ、抗ニューロピリン−１、抗ＭＵＣ１６、リツキシマブ、抗メソテリン、抗ＬＹ６Ｅ、抗ＳＴＥＡＰ１、抗ＦｃＲＨ５、抗ＣＤ２２、抗Ｂ７Ｈ４、抗ＬＧＲ５、抗ＣＤ７９ｂ、及び抗Ｎａｐｉ２ｂを含み得るが、これらに限定されない。
【０１４８】
ＡＤＣの薬物成分を形成する薬物部分は、リンカー単位により抗体に共有結合して、標的療法効果のための抗体−薬物複合体を形成し得る。抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）化合物の例示的な実施形態は、例えば、腫瘍細胞を標的とする抗体（Ａｂ）と、細胞傷害性薬物部分または細胞増殖抑制性薬物部分（Ｄ）と、ＡｂをＤに結合させるリンカー部分（Ｌ）とを含む。本抗体は、リンカー部分（Ｌ）により、リジン及びシステインなどの１つ以上のアミノ酸残基を通してＤに結合し、本組成物は、式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐを有し、式中、ｐは、１〜約２０、または約２〜約５である。反応性リンカー部分を介して抗体分子に複合体化され得る薬物部分の数は、抗体中に存在するか、もしくは本明細書に記載される方法により導入され得る遊離システイン残基を含むシステイン残基、または抗体の鎖間ジスルフィド結合を形成する天然システインの数により限定され得る。
【０１４９】
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の薬物部分（Ｄ）は、任意の療法化合物、部分、または基、特に細胞傷害性効果もしくは細胞増殖抑制性効果を有する基を含み得る。例示的な薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはインターカレーション、ならびにＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質合成、及びトポイソメラーゼの阻害を含むが、これらに限定されない機序により、かかる細胞傷害性効果及び細胞増殖抑制性効果を付与し得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドに複合体化されると、不活性になるか、または活性がより低減される傾向がある。例示的な薬物部分には、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＰＮＵ−１５９６８２、アントラサイクリン、デュオカルマイシン、ビンカアルカロイド、タキサン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エリナフィド、リファマイシンまたはリファマイシン類似体を含む抗生物質、ならびに細胞傷害活性を有するこれらの薬物の誘導体を含むそれらの立体異性体、イソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）、類似体、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）は、非特異的な毒性を低減し、従来の小分子及び抗体がん化学療法と比較して効能を増加するように設計された標的化抗がん療法薬である。それらは、モノクローナル抗体の強力な標的能力を用いて、効力の高い複合体化小分子療法薬をがん細胞に特異的に送達する。これらのＡＤＣの効能、安定性、相同性、薬物動態、及び毒性などの特性を評価するために、単一の試料分析的分析を介して、溶液、血漿、尿、及び他の生体試料からの抗体成分及び薬物部分を同時に特徴付けし、定量化できることは有用である。ビーズに基づく親和性捕捉方法（ＵＳ２００９／０２８６２５８）を含む、免疫親和性膜（ＩＡＭ）捕捉及び質量分析による抗体−薬物複合体を検出及びスクリーニングする方法が開示されている（ＵＳ２００５／０２３２９２９）。
単一の試料アッセイにおける抗体及び薬物部分の同時定量化の方法
【０１５１】
本開示は、ＡＤＣ療法構築物の抗体及び薬物成分の同時定量化に関して、再現可能で効率的、かつ経済的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳに基づく方法を提供する。図１は、試料からのＡＤＣの任意の親和性捕捉、ＡＤＣの酵素消化及びＡＤＣの薬物切断放出、ならびに、続いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる単一の処理試料中に存在する薬物及びペプチド断片の同時分析を含む、本開示のＡＤＣ試料アッセイにおける作業フローの図を示す。
【０１５２】
これらの方法において、ＡＤＣ試料は、試料のタンパク質成分を減少、変性、及び消化するように処理されて、単一の分析試料で、消化された抗体−薬物複合体ペプチド混合物を産生し得る。次いで、薬物及び消化された抗体成分の両方を含む単一の分析試料は、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により分析されて、ＡＤＣの薬物及び抗体成分の両方を検出及び定量化する。
【０１５３】
ＡＤＣのリンカー成分の同一性、ならびに試料のタンパク質成分を減少、変性、及び／または消化するために適用される化学処理に応じて、ＡＤＣの薬物部分は、ＡＤＣの抗体／ペプチド成分から切断され得、よって、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析において非複合体化薬物成分として検出及び定量化され得る。
【０１５４】
あるいは、または加えて、ＡＤＣの薬物部分成分は、ＡＤＣの還元及び変性後に、ＡＤＣの抗体／ペプチド成分に結合したままであり得、よって、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析においてペプチド結合薬物成分として検出及び定量化され得る。
【０１５５】
薬物及び抗体または抗体成分の両方を含む単一の分析試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析が使用されて、抗体−薬物複合体の全抗体濃度、ＡＤＣの抗体複合体化薬物濃度を決定し、ＡＤＣの平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）を算出し、ＡＤＣのこれらの特徴の組み合わせを決定し得る。
【０１５６】
分析／定量化のためのＡＤＣを含有する試料は、試料を予備清浄または富化しない、還元、変性、及び／または消化（すなわち、試料の「直接消化」）の対象となり得る。あるいは、または加えて、ＡＤＣを含有する試料は、さらなる分析のために富化または濃縮され得る。低存在量ペプチドまたは薬物のかかる濃縮法には、サイズ排除クロマトログラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｒｏｇｒａｐｈｙ）、透析、選択的沈降、分画遠心分離、ろ過、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、免疫沈降、プロテインＡ及びプロテインＧ、ＮＨＳ及びストレプトアビジン鉄もしくはリン、または固定化抗体もしくはレクチンを含むスピントラップカラム、常磁性ビーズ、免疫除去、分画、固相抽出法、リンペプチド富化、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、脱塩処理などの富化技法が含まれ得る。
【０１５７】
分析のために提示されるＡＤＣは、動物もしくはヒトへの投与のために製剤化された薬学的組成物などの溶液もしくは懸濁液、またはＡＤＣの産生ステップ中に存在し得る細胞培養液もしくは上清、または動物もしくはヒトから得られる生体試料中にも存在し得る。それ故に、ＡＤＣは、緩衝液、全血、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、尿、リンパ液、胆汁、糞便、汗、硝子体、涙、及び組織から選択されるマトリックス中に存在し得る。ＡＤＣの様々な安全性、効能、及び薬物動態／生体分布パラメータの分析のために頻繁に提示される生体試料には、ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスの血漿及び組織試料、ならびに他の非ヒト種由来の生体試料が含まれる。
【０１５８】
ＡＤＣは、かかる生体試料の一部として提示されるとき、親和性捕捉培地と接触され得る。親和性捕捉は、インタクトなタンパク質を富化／単離して、結合パートナー及びタンパク質複合物を特定するためか、または翻訳後修飾を調査するために幅広く使用される方法である。タンパク質またはタンパク質複合物は、非特異的手段（例えば、ゲル電気泳動、プロテインＡまたはＧ培地、１型抗神経細胞核自己抗体（ＡＮＮＡ−１、「抗Ｈｕ」としても既知である）、または特異的手段（例えば、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）抗体、または抗アイドタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｏｔｙｐｉｃ）抗体）により分離され得る。次いで、ＡＤＣは、還元、変性、及び／または消化の前に試料の清浄手段として親和性捕捉培地から溶出され、続いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析にかけられ得る。
【０１５９】
あるいは、または加えて、ＡＤＣ試料は、富化された消化抗体試料の親和性捕捉培地からの溶出、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の前に、ビーズまたは樹脂により支持されたプロテインＡ／Ｇによる親和性捕捉、その後のビーズによる脱リン酸、還元、変性、及び／または消化を用いて分析される。ビーズに基づく親和性捕捉方法（米国特許公開第２００９／０２８６２５８号）を含む、免疫親和性膜（ＩＡＭ）捕捉及び質量分析による抗体−薬物複合体を捕捉、洗浄、及び溶出する方法が開示されている（米国特許公開第号２００５／０２３２９２９）。
【０１６０】
ＡＤＣは、少なくとも１つの還元剤、例えば、ジチオールトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、またはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を含む組成物との接触により還元される。ＡＤＣは、少なくとも１つの変性剤、例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ＳＤＳ、尿素、グアニジン、ナトリウム３−（（１−（フラン−２−イル）ウンデシルオキシ）カルボニルアミノ）プロパン−１−スルホネート（ＰｒｏｔｅａｓｅＭａｘ（商標））、及び／またはＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）−ＳＦ−界面活性剤などの、ジオキソランもしくはジオキサン官能基を含有するものなどの酸分解性界面活性剤（複数可）（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２２９，５３９号及びＵＳ８，５８０，５３３に記載されているような）を含む組成物との接触により変性もされ得る。ＡＤＣは、少なくとも１つの還元剤及び少なくとも１つの変性剤を含む組成物との接触により同時に還元及び変性され得る。かかる組成物は、追加の溶媒、緩衝液、及び／またはｐＨ変性剤、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ＨＣｌ、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、及び／またはギ酸、脱リン酸剤、例えば、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ、ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ、もしくはラムダタンパク質ホスファターゼなどのホスファターゼを含み得る。
【０１６１】
試料のタンパク質成分は、鉱酸もしくはトリフルオロ酢酸もしくはギ酸の存在下での酸性加水分解などの非酵素的タンパク質分解法、臭化シアンを用いるタンパク質分解、または２５０℃を上回る熱誘導性タンパク質分解を用いて消化され得る。あるいは、または加えて、試料は、トリプシン、パパイン、ペプシン、エンドプロテアーゼＬｙｓＣ、エンドプロテアーゼＡｒｇＣ、ｓｔａｐｈ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８、キモトリプシン、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｓｎ−Ｃ、ＰＮＧａｓｅＦ、エンドプロテアーゼＧｌｕＣ、及びＬｙｓＮ、またはこれらの酵素の組み合わせなどのタンパク質分解酵素を用いて消化され得る。
【０１６２】
次いで、ＡＤＣの薬物（または、ペプチド−リンカー−薬物）及び消化された抗体成分の両方を含む分析試料は、分離のために、単一の試料として液体クロマトグラフィー支持に適用され、液体クロマトグラフィーからの溶出物は、質量分析により分析されて、消化された抗体の少なくとも１つのペプチド断片の質量対電荷比、及びＡＤＣの薬物（または、ペプチド−リンカー−薬物）部分の質量対電荷比を確立する。
【０１６３】
抗体の消化により、単一の分析試料中に、ＡＤＣの抗体に対して固有であるペプチドが提供される。抗体を消化するために使用されるタンパク質分解法または酵素（複数可）は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる検出及び定量化のための固有のペプチド断片を産生するために選択され得る。ＡＤＣの抗体に対して固有のペプチド断片のうちの１つ以上が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより検出及び定量化され、それにより、ＡＤＣの一部分を形成しない、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに適用される単一の分析試料中に存在し得るバックグラウンドタンパク質もしくは非特異的タンパク質、または他の夾雑物を排除する。
【０１６４】
本明細書に引用される各公開または特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
ここに概して記載されている本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、それらは、単に本開示の実施形態のある特定の態様の例示の目的のために含まれる。実施例は、当業者が上の教示及び以下の実施例から、他の技法及び方法が特許請求の範囲を満たし得、本開示の範囲を逸脱することなく用いられ得ることを認識するように、本開示を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１６６】
実施例１：ＡＤＣ多重アッセイの設計及び検証
本開示の多重アッセイを試験及び検証するために、市販供給されているカニクイザル血漿を使用して、ＡＤＣ（米国特許公開第７，５２１，５４１号に記載されているように調製されたシステイン操作抗体である、ピロロベンゾジアゼピン二量体に結合するジスフルフィド（ｄｉｓｆｕｌｆｉｄｅ））を強化して、標準較正試料を提供する。事前にＡＤＣが投与されたカニクイザルから得られた凍結血漿試料も試験のために使用した。プロテインＡ磁性ビーズ（Ｐｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ）を、０．１体積％のＴｗｅｅｎ２０、５．０体積％のトリズマ塩酸塩（１Ｍ）、３．０体積％の塩化ナトリウム（５Ｍ）、０．２体積％のＥＤＴＡ（０．５Ｍ）、０．１重量％のウシ血清アルブミン、及び９１．７体積％の水を含有する緩衝液中で洗浄し、３回洗浄した。次いで、プロテインＡビーズを上の洗浄緩衝液を用いてインキュベーションし、血漿試料を常に振りながら、室温で２時間解凍した。
【０１６７】
次いで、ビーズを、５．０体積％のトリズマ塩酸塩（１Ｍ）、３．０体積％の塩化ナトリウム（５Ｍ）、０．２体積％のＥＤＴＡ（０．５Ｍ）、及び９１．８体積％の水を含有する緩衝液中で２回洗浄した。次いで、洗浄したビーズを、以下を含有する１１０μｌの全反応溶液中で、常に振りながら、中性ｐＨで、６０℃で１時間インキュベーションした：
１）７５μｌの変性溶液（０．０５重量％のＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）ＳＦ界面活性剤（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、３７．５体積％の重炭酸アンモニウム（５０ｍＭ）、及び１０体積％のアセトニトリル）、
２）１０μｌの還元溶液（２００ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））、及び
３）２５μｌの安定標識化内部標準。
【０１６８】
次いで、還元した試料／ビーズをアルキル化して、還元システイン残基の再酸化を阻止し、これにより、再形成ジスルフィド結合が再形成されるのを阻止した。暗所の室温で４５分間、ｐＨ８の５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の２５μＬの２００ｍＭのヨードアセタミドを含有する溶液中でのインキュベーションによりアルキル化を実行した。
【０１６９】
次いで、１０μＬの消化溶液（５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中の配列決定グレード修飾トリプシン２５０ｕｇ／ｍｌ）を添加することにより、抗体を消化して、試料を還元及びアルキル化し、３７℃で２時間ボルテックス及びインキュベーションした。次いで、酵素消化を、１５μｌの２ＭのＨＣｌを添加することによりクエンチし、ボルテックスし、かつ３７℃で３０分間、インキュベーションした。
【０１７０】
試料中のタンパク質は、薬物内部標準を含有する４体積の有機溶媒の添加により沈降する。
【０１７１】
次いで、還元及び消化した試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ、ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ５５００  ＱＴｒａｐ質量分光計）により分析した。
【０１７２】
表２Ａは、データの比較を提供し、図２Ａは、薬物の直線状の濃度依存還元及び薬物の放出を示す薬物（ＳＧ２０５７）ピーク領域対薬物濃度のプロットを示し、ｒ２値は０．９９７であり、正確性は±１０％の高パーセントである。
【表２Ａ】
2019518195.tif 000004
【０１７３】
表２Ｂは、データの比較を提供し、図２Ｂは、全抗体ピーク領域対ＡＤＣ濃度のプロットを示し、これは、同様に、０．９９４の高いｒ２値、及び±２０％の高パーセントの正確性を示す。これらのデータは、システイン操作抗体薬物複合体（ＴＨＩＯＭＡＢ）のための新しい多重アッセイの開発の成功を示す。
【表２Ｂ】
2019518195.tif 000005
【０１７４】
実施例２：酵素反応の酸クエンチ
実施例１に記載されているように、ＡＤＣを含有する凍結血漿試料を解凍し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。実施例１に記載されているように、軽度な界面活性剤変性剤（ＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）ＳＦ界面活性剤）を使用して、可溶化し、タンパク質の折り畳みを解き、それにより、タンパク質構造を開いてタンパク質分解部位を露出させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための試料の調製の消化ステージにおいて、プロセスした試料の半分は、クエンチされた酵素消化を有しなかったが一方で、プロセスした試料のもう半分は、酸の添加（実施例１に記載されているようなＨＣｌの添加）によりクエンチされた酵素消化を有した。使用した界面活性剤は、酸性条件で加水分解を経て、不活性及び非妨害性副産物を形成する酸不安定性界面活性剤であり、これは、後のＭＳ分析でペプチドのイオン化を抑制しない。軽度な界面活性剤変性剤は、プロテアーゼ活性に対して破壊的ではなく、それにより、試料プロセンシングの消化ステップで必要とされる量の酵素（複数可）を還元する。
【０１７５】
図３は、消化され、酸の添加によりクエンチされたか、またはクエンチされなかった個別の試料に対する内部標準ピーク領域のプロットを示す。これらのデータは、酵素消化への酸の添加により、酵素反応がクエンチされ、界面活性剤が加水分解され、界面活性剤により引き起こされるイオン化抑制が減少され、その間中、試料の安定性に影響が及ぼされないことを示す。これらのデータは、界面活性剤が放出薬物に影響を与えないことを示し、この多重アッセイが酸クエンチを有さず、または界面活性剤の使用を排除することなしに行われ得ることを提示する。
【０１７６】
実施例３：放出薬物成分の安定性
還元及び消化した試料中の薬物の安定性を評定するために、実施例１に記載されているように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために試料を調製し、（ＨＣｌを含有する酸性溶液中、または重炭酸アンモニウムを含有する塩基性溶液中のいずれかの）メタノールの添加により保存した。試料をすぐに分析するか、または保全し、１２時間、２４時間、もしくは７２時間後に分析した。図４Ａは、調製及び酸性溶液中のメタノールの添加後の、分析された薬物のピーク領域のプロットを示す。同様に、図４Ｂは、調製及び塩基性溶液中のメタノールの添加後の、分析された薬物のピーク領域のプロットを示す。これらのデータは、放出薬物が塩基性溶液または酸性溶液中のメタノールを含有する溶液中に残っていることを示す。酵素消化の酸クエンチを含む試料調製技法の使用に関して、図４Ａは、放出薬物が、酸及び有機タンパク質沈降の存在下で試料調製後、最大７２時間、安定したままであり、可溶性を保ったままであったことを示す。
【０１７７】
実施例４：消化された抗体成分の安定性
還元及び消化した試料中の全抗体の定量化における酸クエンチ及びメタノール沈降の効果を評定するために、実施例１に記載されているように、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために試料を調製し、（ＨＣｌを含有する酸性溶液中、または重炭酸アンモニウムを含有する塩基性溶液中のいずれかの）メタノールの添加により保存した。試料をすぐに分析するか、または保全し、１２時間、２４時間、もしくは７２時間後に分析した。図５Ａは、調製及び酸性溶液中のメタノールの添加後の、全抗体を定量化するために使用される、抗体消化によるペプチドのピーク領域のプロットを示す。同様に、図５Ｂは、調製及び塩基性溶液中のメタノールの添加後のペプチドのピーク領域のプロットを示す。これらのデータは、全抗体の定量化も、酸クエンチ及び有機タンパク質沈降からなる試料調製後、最大７２時間、安定していたことを示す。
【０１７８】
前述の発明が明確な理解のために例証及び例により多少詳しく記載されているが、これらの記述及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。したがって、全ての好適な修正、及び等価物が、この後の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲内にあると見なされ得る。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【図１】
2019518195.tif 000006
【図２Ａ】
2019518195.tif 000007
【図２Ｂ】
2019518195.tif 000008
【図３】
2019518195.tif 000009
【図４Ａ】
2019518195.tif 000010
【図４Ｂ】
2019518195.tif 000011
【図５Ａ】
2019518195.tif 000012
【図５Ｂ】
2019518195.tif 000013
【国際調査報告】
2019518195.tif 000014
2019518195.tif 000015
2019518195.tif 000016