(57)【要約】  本発明は、ニトロイミダゾール系化合物の結晶形、塩形およびその製造方法を公開し、さらに、結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における前記結晶形および塩形の使用を含む。2019521175.tif 000025
2019521175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）化合物
【化１】
2019521175.tif 000020
【請求項２】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、５．７４±０．２°、１３．２９±０．２°、１７．７９±０．２°、１８．４８±０．２°、２０．２５±０．２°、２０．５１±０．２°、２２．０７±０．２°、２３．３３±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形。
【請求項３】
ＸＲＰＤスペクトルが図１で示される請求項２に記載の式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形。
【請求項４】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、
【化２】
2019521175.tif 000021
ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記溶媒がアセトンから選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項５】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の５０〜１５０倍で、前記溶媒がブタノンから選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項６】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がテトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項７】
テトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である請求項６に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項８】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がアセトンとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項９】
アセトンとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である請求項８に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１０】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１０〜２０倍で、前記溶媒がアセトンと酢酸の混合溶媒から選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１１】
アセトンと酢酸の体積比が１〜１．５：１である請求項１０に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１２】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、５．２６±０．２°，１０．３９±０．２°，１２．８２±０．２°，２０．７５±０．２°，２２．０８±０．２°，２３．１９±０．２°，２７．０９±０．２°，３７．４５±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形。
【請求項１３】
ＸＲＰＤスペクトルが図４で示される請求項１２に記載の式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形。
【請求項１４】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記反応溶媒がアセトンから選ばれる、請求項１２に記載のＢ結晶形の製造方法。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）化合物
【化３】
2019521175.tif 000022
【請求項１６】
式（ＩＶ）化合物
【化４】
2019521175.tif 000023
【請求項１７】
式（Ｖ）化合物
【化５】
2019521175.tif 000024
【請求項１８】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、７．１８±０．２°，１０．７８±０．２°，１４．１０±０．２°，１４．４１±０．２°，１５．３６±０．２°，２３．７２±０．２°，２５．３６±０．２°，２７．４９±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（Ｉ）化合物のＣ結晶形。
【請求項１９】
ＸＲＰＤスペクトルが図６で示される請求項１８に記載の式（Ｉ）化合物のＣ結晶形。
【請求項２０】
結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における請求項１に記載の化合物または請求項２〜３に記載のＡ結晶形または請求項１２〜１３に記載のＢ結晶形の使用。
【請求項２１】
結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における請求項１５〜１７に記載の化合物の使用。
【請求項２２】
結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における請求項１８に記載のＣ結晶形の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトロイミダゾール系化合物の結晶形、塩形およびその製造方法に関し、さらに、結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における前記結晶形および塩形の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)は結核病の病原体である。世界中に存在する致命的な感染性疾患として、世界保健機関の統計によると、毎年約８００万人以上が感染され、２００万人が結核病で死亡する。過去の十年間で、結核病の症例は世界中で２０％の速度で増加し、この増加は貧困地域で特に顕著である。このまま発展していくと、結核病の症例はこれからの二十年で４１％の増加幅で増加し続けるかもしれない。初めて化学療法が応用されてからの５０年内で、結核病はずっとエイズにつぐ、成人の死亡につながる主な感染病である。
【０００３】
結核病の現在の治療は、アメリカ公衆衛生局が推奨する複数の薬剤の組み合わせの処方が使用され、まず、イソニアジド、リファンピシン、ピラジンアミドおよびエタンブトールの組み合わせを２か月使用した後、単独でイソニアジドおよびリファンピシンの組み合わせて４か月使用することが含まれる。エイズに感染した患者に対し、このような薬物の組み合わせの使用は７か月に延長する。多剤耐性結核病に感染した患者に対し、この薬物の組み合わせは、さらに、ストレプトマイシン、カナマイシン、アミカシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、シプロフロキサシンやレボフロキサシンのようなほかの第二選択薬を添加する必要がある。このような多剤耐性結核病（通常、治療期間が２年超）の患者に使用される組み合わせの治療薬は、通常、現在の市販の第一選択薬と比べ、より低い活性およびより高い副作用がある。
【０００４】
現在、大塚製薬の新製品であるデルティバ（デラマニド）、すなわち、化合物コードＯＰＣ−６７６８３はすでに市販され、多剤耐性結核病の治療の併用薬物として、薬剤耐性および忍容性の面を考慮し、成人へ治療が許可された。デラマニドの作用機序は、メトキシミコール酸およびケトミコール酸の合成を抑制することによって、細菌を殺滅するが、これらはいずれも結核菌の細胞壁の重要な構成部分である。デラマニドは多剤耐性結核菌に対して体外でも体内でも高い活性を示し、２０１３年１１月２１日に、欧州のヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）によって条件付きでデルティバ（デラマニド）の５０  ｍｇの薄膜コーティング錠の多剤耐性結核病の治療における使用が承認された。２０１４年４月２８日に正式に欧州で市販されるようになった。その構造式は以下の通りである。
【化１】
2019521175.tif 000003
【０００５】
ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７２４４７の特許には、主にマイコバクテリウム菌、たとえばマイコバクテリウム・ツベルクローシスの感染による関連疾患、とくに薬剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスによる疾患の治療に使用される置換ニトロイミダゾール系誘導体が記載された。その構造は式（Ｂ−１）で表される。
【化２】
2019521175.tif 000004
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、式（ＩＩ）化合物を提供する。
【化３】
2019521175.tif 000005
【０００７】
また、本発明は、ＸＲＰＤスペクトルが図１で示される式（ＩＩ）の化合物のＡ結晶形を提供する。
【０００８】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表１の通りである。
【表１】
2019521175.tif 000006
【０００９】
本発明の一部の形態において、上記式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形では、前記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、５．７４±０．２°、１３．２９±０．２°、１７．７９±０．２°、１８．４８±０．２°、２０．２５±０．２°、２０．５１±０．２°、２２．０７±０．２°、２３．３３±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【００１０】
また、本発明は上記Ａ結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、
【化４】
2019521175.tif 000007
【００１１】
ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記溶媒がアセトンから選ばれる、方法を提供する。
【００１２】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の５０〜１５０倍で、前記溶媒がブタノンから選ばれる。
【００１３】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がテトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる。
【００１４】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法では、テトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である。
【００１５】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がアセトンとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる。
【００１６】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法では、アセトンとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である。
【００１７】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１０〜２０倍で、前記溶媒がアセトンと酢酸の混合溶媒から選ばれる。
【００１８】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法では、アセトンと酢酸の体積比が１〜１．５：１である。
【００１９】
また、本発明は式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形であって、前記Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、５．２６±０．２°，１０．３９±０．２°，１２．８２±０．２°，２０．７５±０．２°，２２．０８±０．２°，２３．１９±０．２°，２７．０９±０．２°，３７．４５±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する結晶形を提供する。
【００２０】
本発明の一部の形態において、上記式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形は、ＸＲＰＤスペクトルが図４で示される。
【００２１】
本発明の一部の形態において、上記Ｂ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表２の通りである。
【表２】
2019521175.tif 000008
【００２２】
また、本発明はＢ結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記反応溶媒がアセトンから選ばれる、方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、式（ＩＩＩ）化合物を提供する。
【化５】
2019521175.tif 000009
【００２４】
また、本発明は、式（ＩＶ）化合物を提供する。
【化６】
2019521175.tif 000010
【００２５】
また、本発明は、式（Ｖ）化合物を提供する。
【化７】
2019521175.tif 000011
【００２６】
また、本発明は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形であって、前記Ｃ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、７．１８±０．２°，１０．７８±０．２°，１４．１０±０．２°，１４．４１±０．２°，１５．３６±０．２°，２３．７２±０．２°，２５．３６±０．２°，２７．４９±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する結晶形を提供する。
【００２７】
本発明の一部の形態において、上記式（Ｉ）化合物のＣ結晶形は、ＸＲＰＤスペクトルが図６で示される。
【００２８】
本発明の一部の形態において、上記Ｃ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表３の通りである。
【表３】
2019521175.tif 000012
【００２９】
また、本発明は、結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における上記化合物および上記Ａ結晶形、Ｂ結晶形またはＣ結晶形の使用を提供する。
【００３０】
技術効果本発明によって提供される式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形、Ｂ結晶形および式（Ｉ）化合物のＣ結晶形は、性質が安定で、溶解度が良く、吸湿性が良く、優れた薬物になる将来性がある。
【００３１】
本発明によって提供される式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形、Ｂ結晶形および式（Ｉ）化合物のＣ結晶形は、製造が容易で、使用される試薬が通常のもので、市販品として手に入りやすくて安価で、溶媒が環境にやさしく、クラス３の溶媒が多く、多くの溶媒で単一で安定した結晶形が得られ、操作が簡単で、条件が温和で、純度が良く、収率が高い。
【００３２】
定義と説明別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語および連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語または用語は、特別に定義されない場合、不確定または不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品またはその活性成分を指す。
【００３３】
本発明の中間体化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、ほかの化学合成方法と合わせた実施形態および当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の具体的な実施形態の化学反応は適切な溶媒で完成され、前記の溶媒は本発明の化学変化およびそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を得るため、当業者が既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択することが必要であることもある。
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の何らの制限にもならない。
【００３６】
本発明に使用されたすべての溶媒は市販品で、さらに精製せずにそのままで使用してもよい。
【００３７】
本発明は下記略語を使用する。ａｑ．は水で、ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔは当量で、ＴＨＦはテトラヒドロフランで、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドで、ＡｃＯＨは酢酸で、ＴｓＯＨはｐ−トルエンスルホン酸で、ＣＨ3ＳＯ3Ｈはメタンスルホン酸で、Ｈ2ＳＯ4は硫酸で、ＨＣＬは塩酸で、ＣｕＩはヨウ化第一銅を、ＣｕＢｒは臭化第一銅を、ＣｕＣｌは塩化第一銅を、Ｃｕは銅粉を、Ｃｕ2Ｏは酸化第一銅を、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表す。
【００３８】
化合物は人工的にまたはＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトによって名付けられ、市販化合物はメーカーのカタログの名称が使用された。
【００３９】
本発明の粉末Ｘ線回折（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法装置型式：ブルカーＤ８  ａｄｖａｎｃｅ  Ｘ線回折装置測定方法：約１０〜２０  ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用した。
【００４０】
詳細なＸＲＰＤパラメーターは以下の通りである。Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）管電圧：４０  ｋＶ、管電流：４０  ｍＡ発散スリット：０．６０  ｍｍ検出器スリット：１０．５０  ｍｍ散乱防止スリット：７．１０  ｍｍ走査範囲：４〜４０度ステップ幅：０．０２度ステップ時間：０．１２秒サンプルプレート回転数：１５  ｒｐｍ本発明の示差走査熱量分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法装置型式：ＴＡ  Ｑ２０００示差走査熱量計測定方法：サンプル（〜１  ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムパン内に置いて測定し、５０  ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ2の条件において、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを２５℃から３００℃（または３５０℃）に加熱する。
【００４１】
本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法装置型式：ＴＡ  Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析装置測定方法：サンプル（２〜５  ｍｇ）をＴＧＡ白金パン内に置いて測定し、２５  ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ2の条件において、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを室温から重量減少が２０％になるまで加熱する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図２】図２は式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のＤＳＣチャートである。
【図３】図３は式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のＴＧＡグラフである。
【図４】図４は式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図５】図５は式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形のＤＳＣチャートである。
【図６】図６は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図７】図７は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形のＤＳＣチャートである。
【図８】図８は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形のＴＧＡグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の内容がより良く理解されるように、具体的な実施例と合わせてさらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容に対する制限ではない。
【実施例】
【００４４】
【化８】
2019521175.tif 000013
【００４５】
工程１：ｔ−ブチル−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸  ｔ−ブチル（２．００  ｇ、１１．８２  ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（６．００  ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（９．１８  ｇ、８０．５１  ｍｍｏｌ、６．８１当量）を入れ、混合物を２０℃で１時間撹拌した。混合物を減圧で濃縮させ、得られた粗製品は黒褐色の油状物であった。そのまま次の工程に使用した。
【００４６】
工程２：２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール（２．１６  ｇ、１１．７９  ｍｍｏｌ、１．００当量、ＴＦＡ）のジクロロメタン（１０．００  ｍＬ）溶液にＴｏｓＣｌ（２．７０  ｇ、１４．１５  ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびトリエチルアミン（３．５８  ｇ、３５．３７  ｍｍｏｌ、３．００当量）を入れた。混合物を２０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を１Ｍ希塩酸（３０  ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３０  ｍＬ）および食塩水（３０  ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、１−（ｐ−トルエンスルホニル）−２，５−ジヒドロピロール（１．５０  ｇ、６．７２  ｍｍｏｌ、収率５６．９８％）を得、褐色の固体であった。
【００４７】
工程３：１−（ｐ−トルエンスルホニル）−２，５−ジヒドロピロール（１．５０  ｇ、６．７２  ｍｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＳＯ（１０．００  ｍＬ）およびアセトニトリル（５．００  ｍＬ）溶液に０℃でＮＢＳ（１．７９  ｇ、１０．０８  ｍｍｏｌ、１．５０当量）を分けて入れた。その後、混合物を１５℃で１６時間撹拌した。反応混合物に水（５０  ｍＬ）を入れ、そして酢酸エチルで（３０  ｍＬ×２）抽出した。合併した有機層を食塩水（３０  ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１〜３：１）によって精製し、得られた４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オール（１．５８  ｇ、４．９３  ｍｍｏｌ、収率７３．４３％）は白色の固体であった。
【００４８】
工程４：４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オール（１．５８  ｇ、４．９３  ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（１５．００  ｍＬ）溶液にデス・マーチン試薬（４．１９  ｇ、９．８７  ｍｍｏｌ、２．００当量）を入れた後、窒素ガスで置換し、さらに混合物を１０〜１５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液（５０  ｍＬ×２）で洗浄し、そして酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって分離して精製し（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１〜１：１）、得られた４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オン（９８０．００  ｍｇ、３．０８  ｍｍｏｌ、収率６２．４７％）は黄色の固体であった。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3）  ７．６９−７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３５−７．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．３２−４．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．００−３．９１  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．５５−３．４７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ）．
【００４９】
工程５：４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オン（８８０．００  ｍｇ、２．７７  ｍｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＦ（１２．００  ｍＬ）溶液に４−フルオロチオベンズアミド（４３０．００  ｍｇ、２．７７  ｍｍｏｌ、１．００当量）を入れた。混合物を６０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧で濃縮させ、残留物を酢酸エチル（１０  ｍＬ）で希釈し、ろ過し、ケーキを収集してろ過後の液体をシリカゲルクロマトグラフィーによって（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１，３：１）精製し、２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−４，５，６，６ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピロロ［３，４−ｄ］チアゾール３ａのアルコール（９００．００  ｍｇ、２．４９  ｍｍｏｌ）を得、灰白色の固体であった。
【００５０】
工程６：２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−４，５，６，６ａ−テトラヒドロテトラヒドロ−３ａＨ−ピロロ［３，４−ｄ］チアゾール３ａのアルコール（９００．００  ｍｇ、２．２９  ｍｍｏｌ、１．００当量）を、メタンスルホニルクロリド（４４４．００  ｍｇ、３．８８  ｍｍｏｌ、１．６９当量）およびトリエチルアミン（７３０．００  ｍｇ、７．２１  ｍｍｏｌ、３．１５当量）をジクロロメタン（２０．００  ｍＬ）に溶解させ、混合物を脱気して窒素ガスで保護し、さらに混合物を２０℃で１６時間撹拌した。水（５０  ｍＬ）を入れ、そしてジクロロメタン（３０  ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝２０：１〜１：１）精製し、２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（６００．００  ｍｇ、１．１１  ｍｍｏｌ、収率４８．２８％、純度６９％）を得、浅黄色の固体であった。
【００５１】
工程７：２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（５５０．００  ｍｇ、１．０１  ｍｍｏｌ、１．００当量）の水（３．００  ｍＬ）およびＡｃＯＨ（１５．００  ｍＬ）の混合溶液に臭化水素の酢酸溶液（８１．７２  ｍｇ、１．０１  ｍｍｏｌ、１．００当量）を入れた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧で濃縮させた後、水（５０  ｍＬ）で希釈し、そして酢酸エチルで（５０  ｍＬ）抽出した。水層をＮａＯＨで塩基化してｐＨ値＝１１になるように調整した後、酢酸エチル（４０  ｍＬ×２）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、２−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（１４５．００  ｍｇ、６５８．２８  μｍｏｌ、収率６５．１８％）を得、淡黄色の固体であった。
【００５２】
工程８：２−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（１６０．００  ｍｇ、７２６．３８  μｍｏｌ、１．００当量）溶液に２−クロロ−１−［［（２Ｒ）−２−メチルエチレンオキサイド−２−イル］メチル］−４−ニトロイミダゾール（１５８．００  ｍｇ、７２６．０７  μｍｏｌ、１．００当量）およびジイソプロピルアミン（４８１．００  ｍｇ、３．７２  ｍｍｏｌ、５．１２当量）を入れた。混合物を８０℃で１６時間撹拌した。水（５０  ｍＬ）を入れ、そして酢酸エチル（３０  ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物を分取薄層クロマトグラフィーによって分離し（シリカ、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）、（２Ｓ）−１−（２−クロロ−４−ニトロイミダゾール−１−イル）−３−［２−（４−フルオロフェニル）−４，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］チアゾール−５−イル］−２−メチル−プロパン−２−オール（１５０．００  ｍｇ、３４２．５６  μｍｏｌ、収率４７．１６％）を得、淡黄色の固体であった。
【００５３】
工程９：（２Ｓ）−１−（２−クロロ−４−ニトロイミダゾール−１−イル）−３−［２−（４−フルオロフェニル）−４，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］チアゾール−５−イル］−２−メチル−プロパン−２−オール（１５０．００  ｍｇ、３４２．５６  μｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＦ（５．００  ｍＬ）溶液に０℃で窒素ガスの保護下において水素化ナトリウム（３０．００  ｍｇ、７５０．００  μｍｏｌ、２．１９当量）を入れた。混合物を０℃で１時間撹拌した。反応混合物を０℃で飽和塩化アンモニウム溶液（４０  ｍＬ）に注ぎ、さらに酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧で濃縮させ、残留物を酢酸エチルで精製し、実施例１（１７．７１  ｍｇ、４０．９０  μｍｏｌ、収率１１．９４％、純度９２．７１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3）  ７．９１−７．８４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１７−７．０９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５３−４．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．３  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．１３−４．０７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０３−３．９７  （ｍ，  Ｊ  ＝  ９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．６４−１．６０  （ｍ，  ３Ｈ）．  ＬＣＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：  ４０２．１０  （Ｍ＋１）．
【００５４】
実施例２：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（５００  ｍｇ、１．２５  ｍｍｏｌ）をアセトン（７５  ｍＬ）に入れ、５０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（５９３  ｍｇ、３．７５  ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃で１０分間撹拌し、大量の固体が析出し、ゆっくり室温に下がり、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥して灰色の固体の製品（５００  ｍｇ、０．８９  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９７．４％で、収率は７１．５％であった。
【００５５】
実施例３：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（４．８  ｇ、１１．９６  ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１７  ｍＬ）およびアセトン（１４０  ｍＬ）の混合溶液に入れ、６０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（２．０８  ｍｇ、１３．１６  ｍｍｏｌ）をアセトン（３０  ｍＬ）に溶解させて反応フラスコに滴下し、大量の固体が析出し、４０℃に降温させて加熱して１時間撹拌し、室温１５℃に降温させて１１時間撹拌し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥して得られたオフ白色の固体の製品をアセトン（４０  ｍＬ）に溶解させ、４０℃で加熱して１２時間撹拌し、ろ過してオフ白色の固体の製品（５．２０  ｇ、９．２２  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．２％で、収率は７７．０％であった。
【００５６】
実施例４：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（１００  ｍｇ、０．２４９  ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（０．３５  ｍＬ）およびブタノン（３．５  ｍＬ）の混合溶液に入れ、６０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（４３．３  ｍｇ、０．２７４  ｍｍｏｌ）をブタノン（０．１  ｍＬ）に溶解させて反応フラスコに滴下し、大量の固体が析出し、４０℃に降温させて加熱して１時間撹拌し、室温１５℃に降温させて１１時間撹拌し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥してオフ白色の固体の製品（１１０  ｍｇ、０．１９５  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．４％で、収率は７８．４％であった。
【００５７】
実施例５：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（１．００  ｇ、２．４９  ｍｍｏｌ）をアセトン（１０  ｍＬ）および酢酸（１０  ｍＬ）の混合溶液に入れ、室温１５℃で均一に撹拌し、溶液は懸濁の状態で、さらにベンゼンスルホン酸（４３３  ｍｇ、２．７４  ｍｍｏｌ）を入れ、懸濁固体が溶解し、溶液が清澄になり、続いて１２時間撹拌し、大量の固体が析出し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥してオフ白色の固体の製品（１．２５ｇ、２．２２  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．２％で、収率は８８．９％であった。
【００５８】
実施例６：式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（６．００  ｇ、１４．９５  ｍｍｏｌ）をアセトン（６００  ｍＬ）に入れ、６０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（２．６０  ｇ、１６．４５  ｍｍｏｌ）をアセトン（３０  ｍＬ）に溶解させ、ゆっくり反応フラスコに滴下し、大量の固体が析出し、室温に降温させて１２時間撹拌し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥して白色の固体の製品（７．１０  ｇ、１２．６４  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．６％で、収率は８４．５％であった。
【００５９】
実施例７：式（Ｉ）化合物のＣ結晶形の製造式（Ｖ）化合物（３．８９  ｇ、６．７８  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１００  ｍＬ）と混合し、当該混合物に固体の炭酸水素ナトリウム（８５４．５７  ｍｇ、１０．１７  ｍｍｏｌ）を入れ、２５℃で１５分間撹拌し、混合物を濃縮させ、水（２００  ｍＬ）で洗浄し、水溶液をジクロロメタン（３００  ｍＬ×３）で抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄し、有機相を濃縮させ、残留物をメタノール（５０  ｍＬ）で撹拌して白色の固体の製品（２．５１  ｇ、６．２２  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．４％で、収率は９１．７％であった。
【００６０】
実施例８：式（ＩＩＩ）化合物の製造式（Ｉ）化合物（８０  ｍｇ、０．１９９  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２  ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２００  μＬ）に溶解させ、５０℃に加熱して溶解させ、当該混合物に塩酸（２０  μＬ、０．２４  ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０  μＬ）の混合溶媒を入れ、５０℃で２時間撹拌し、混合物を室温に冷却して一晩撹拌し、快速遠心で沈殿を取って乾燥して白色の固体製品を得た。
【００６１】
実施例９：式（ＩＶ）化合物の製造式（Ｉ）化合物（８０  ｍｇ、０．１９９  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２  ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２００  μＬ）に溶解させ、５０℃に加熱して溶解させ、当該混合物にメタンスルホン酸（１５  μＬ、０．２３４  ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０  μＬ）の混合溶媒を入れ、５０℃で２時間撹拌し、混合物を室温に冷却して一晩撹拌し、快速遠心で沈殿を取って乾燥して白色の固体の製品を得た。
【００６２】
実施例１０：式（Ｖ）化合物の製造式（Ｉ）化合物（８０  ｍｇ、０．１９９  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２  ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２００  μＬ）に溶解させ、５０℃に加熱して溶解させ、当該混合物にｐ−トルエンスルホン酸（４２．２６  ｍｇ、０．２４５  ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０  μＬ）の混合溶媒を入れ、５０℃で２時間撹拌し、混合物を室温に冷却して一晩撹拌し、少量の固体が析出し、逆溶解の酢酸エチルを入れ、大量の固体が析出し、快速遠心で沈殿を取って乾燥して白色の固体の製品を得た。
【００６３】
異なる溶媒における式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の安定性実験３０  ｍｇの式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形を複数分取り、それぞれ０．２  ｍＬの下記表における単一または混合溶媒に入れ、４０℃の条件で２日撹拌した後遠心した。すべてのサンプルにおける固体を収集し、真空乾燥器（４０℃）で一晩乾燥し、ＸＲＰＤによってその結晶形の状態を検出した。結果を表４に示す。
【表４】
2019521175.tif 000014
【００６４】
高温と高湿の条件における式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の固体安定性実験『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬局方２０１５版四部通則９００１）に準じ、式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の高温（６０℃、開口）、高湿（室温／相対湿度９２．５％、開口）の条件における安定性を考察した。
【００６５】
式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のサンプルを約７  ｍｇ量って、ガラスサンプル瓶の底部に置き、薄く一層に敷いた。高温および高湿の条件において置いたアンプルをアルミ箔で封じ、そして環境の空気と十分に接触できるようにアルミ箔に小さい孔を開け、強光照射の条件において置いたサンプルをスクリューキャップで密封した。異なる条件において置いたサンプルを５日目、１０日目にサンプリングして検出し、検出結果を０日の初期検出結果と比べ、試験結果を下記表５に示す。
【表５】
2019521175.tif 000015
【００６６】
式（Ｉ）化合物のＣ結晶形の異なる溶媒における溶解度測定溶解度測定は、常温の条件で手動段階希釈の方法を使用して同時に溶解状態を観察して測定を行った。約２  ｍｇの式（Ｉ）化合物のＣ結晶形を異なる液相小瓶に入れ、さらに少しずつ有機溶媒または溶媒混合物を入れ、化合物の溶解状態を観察した。
【００６７】
化合物の溶解度測定の結果を表６に示す。
【表６】
2019521175.tif 000016
【００６８】
式（Ｉ）化合物の体外薬物効果の測定試験方法：濃度が１０  ｍｇ／ｍｌになるように式（Ｉ）化合物を純ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  ２７６８５５−２Ｌ）に溶解させて化合物母液とした。Ｖ底９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ−ｗｉｐｐ０２２８０）の２列目から１１列目のウェルに３０  μｌ  ＤＭＳＯを入れた。２列目のウェルに３０  μｌの化合物の母液を入れ、均一に混合した後、２列目のウェルから３０  μｌ取り出して３列目のウェルに入れ、吹いて均一に混合した。このように１０列目まで操作した。１１列目は薬物を入れず、３０  μｌ  ＤＭＳＯのみ含まれる。これは化合物の「親プレート」である。２列目から１１列目に相応する化合物の濃度は５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０２、０  ｍｇ／ｍｌであった。薬物効果の良い化合物に対し、適切にテスト濃度を低下させた。平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０９０）を「子プレート」とした。すべての子プレートのウェルに９８  μｌの７Ｈ９  （Ｓｉｇｍａ  Ｍ０１７８）培地を入れた。親プレートから２  μｌの化合物を吸い取って相応の位置の子プレートに入れた。子プレートのＡおよびＨの行、１列目および１２列目に７Ｈ９培地のみが含まれる。
【００６９】
グリセリン冷凍保存管におけるＨ３７Ｒｖ菌株を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９培地に接種し、３７℃、２００回／分のシェーカーで４週間培養した。菌液を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９培地で２回洗浄して同じ培地に再懸濁させた。同じ培地で菌液の吸光度をＯＤ550＝０．４−０．５の間に調整した。この菌液を微型遠心管に分注して−８０℃で保存した。保存時間は１か月以下とした。テスト当日に、分けた菌液を解凍した。７Ｈ９培地で解凍した菌液を２０倍希釈した後、さらに５０倍希釈し、合計１０００倍希釈し、この菌液を子プレートへの接種に使用した。１００  μｌの菌液を子プレートの各ウェルに接種し、１２列目に１００  μｌの７Ｈ９培地を入れ、菌液を入れなかった。
【００７０】
テスト用子プレートを３７℃インキュベーターに置いて培養し、湿度を＞８０％に維持した。１週間後から、毎日一つの細菌を含有する１列目のウェルおよび一つの細菌を含有しない１２列目のウェルに１２．５  μｌの２０％ツイン８０含有７Ｈ９培地および２０  μｌのアラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＡＬ１１００）を入れ、そして続いて２４時間培養してから観察した。１列目のウェルにおける菌液が入れられたアラマーブルーを２４時間内でピンク色に還元した場合、２０％ツイン８０含有７Ｈ９培地およびアラマーブルーをテストプレートにおけるすべてのウェルに入れ、３７℃で続いて２４時間培養してから蛍光値を測量した。
【００７１】
濃度が１２．８ｍｇ／ｍｌになるように化合物（Ｉ）を純ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  ２７６８５５−２Ｌ）に溶解させて化合物母液とした。Ｖ底９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ−ｗｉｐｐ０２２８０）の１列目から１２列目のウェルに３０  μｌ  ＤＭＳＯを入れた。  １列目のウェルに３０  μｌの化合物の母液を入れた。１列目のウェルから３０  μｌ取り出して２列目のウェルに入れ、吹いて均一に混合した。このように１１列目まで２倍勾配希釈を行った。  １２列目は化合物を入れず、３０  μｌ  ＤＭＳＯのみが含まれる。すべてのＡ行およびＨ行のウェルに３０  μｌ  ＤＭＳＯのみ入れた。これは化合物の「親プレート」である。１列目から１２列目に相応する化合物の濃度は６．４、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５および０  ｍｇ／ｍｌである。薬物効果の良い化合物に対し、適切にテスト濃度を低下させた。平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０９０）を「子プレート」とした。すべての子プレートのウェルに９８  μｌの７Ｈ９  （Ｓｉｇｍａ  Ｍ０１７８）培地を入れた。親プレートから２  μｌの化合物溶液を吸い取って相応の位置の子プレートに入れた。子プレートのＡおよびＨの行および１２列目に７Ｈ９培地および相応する濃度のＤＭＳＯのみ含まれる。
【００７２】
グリセリン冷凍保存管におけるＢＣＧワクチン菌株を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９液体培地に接種し、３７℃、２００回／分のシェーカーで４週間培養した。菌液を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９培地で２回洗浄して同じ培地に再懸濁させた。同じ培地で菌液の吸光度をＯＤ５５０＝０．４〜０．５の間に調整した。この菌液を微型遠心管に分注して−８０℃で保存した。保存時間は１か月以下とした。テスト当日に、分注した菌液を解凍した。７Ｈ９培地で解凍した菌液を２０倍希釈した後、さらに５０倍希釈し、合計１０００倍希釈し、この菌液を接種に使用した。１００  μｌ  の菌液を子プレートにおけるＡ行以外の各ウェルに接種した。Ａ行のウェルに１００  μｌ  ７Ｈ９培地のみ入れ、菌液が添加されていない。薬物の測定の最終濃度は６４、３２、１６、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５および０  μｇ／ｍｌである。テスト用子プレートを３７℃インキュベーターに置いて培養し、湿度を＞８０％に維持した。
【００７３】
１週間後から、毎日一つの細菌を含有しないＡ行のウェルおよび一つの細菌を含有するＨ行のウェルに１２．５  μｌの２０％ツイン８０含有７Ｈ９培地および２０  μｌのアラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＡＬ１１００）を入れ、そして続いて２４時間培養してから観察した。Ｈ行のウェルにおける菌液が添加されたアラマーブルーを２４時間内でピンク色に還元した場合、アラマーブルーをテストプレートにおけるすべてのウェルに入れ、３７℃で続いて２４時間培養した後、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を観察した。
【００７４】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の定義は、肉眼観察ではアラマーブルーの変色を完全に抑制できる最小薬物濃度、または蛍光計による測量では９０％超の還元型アラマーブルーの生成を抑制できる最小薬物濃度である。
【００７５】
実験結果：表７に示す。
【表７】
2019521175.tif 000017
【００７６】
結論：式（Ｉ）化合物はマイコバクテリウム・ボビスのＢＣＧワクチン菌株にもマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＨ３７Ｒｖ菌株にも優れた抑制活性を有し、かつ細胞毒性がない。
【００７７】
動態学的溶解度およびＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞の両方向の浸透性の評価実験動態学的溶解度の測定方法：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のサンプルを量って純ＤＭＳＯに溶解させ、最終濃度は１０  ｍＭで、被験化合物と対照化合物（１０  ｍＭ  ＤＭＳＯ母液、各ウェル１０  μＬ）を各ウェルに４９０  μＬ緩衝液を含有する９６ウェルプレートに入れた。２分間ボルテックスした後、サンプルプレートを振とう器で室温で（２２±２℃）２４時間インキュベートした。その後、２００  μＬのサンプルうをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎろ過プレート（ポリカーボネート膜）に移し、ミリポア真空マニホールド（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ）でろ過してろ液を収集した。ＨＰＬＣ−ＵＶによってろ液における化合物の濃度を測定した。３つの異なる濃度のＵＶ標準品溶液と溶解度の測定サンプルを前後で仕込んだ。各サンプルを２回仕込み、標準曲線に代入して濃度を計算し、平均値を求めた。
【００７８】
ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞の両方向の浸透性の評価実験の方法：永久的にヒトＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルＩｎｓｅｒｔ細胞プレートに接種し、４〜７日培養した後集合した単層細胞が形成した。フェノテロール（低浸透性マーカー）とプロプラノロール（高浸透性マーカー）の単方向（Ａ→Ｂ）浸透性、およびジゴキシン（P-糖タンパク質基質）の両方向浸透性を評価することによって単層細胞の品質を検証した。この３つの対照化合物は２つの重複ウェルを設けた。
【００７９】
インキュベート終了後、ドナーウェル（ｄｏｎｏｒ  ｗｅｌｌｓ）およびレシーバーウェル（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｗｅｌｌｓ）におけるサンプル溶液を取ってすぐに内部標準品を含有する冷アセトニトリル溶液と混合した。そして内部標準品を含有する冷アセトニトリル溶液で細胞を分解させ、細胞における化合物の蓄積量を測定した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法によって被験化合物のすべてのサンプル（初期ドナー液、ドナーウェル上清液、レシーバー液、細胞分解液を含む）における濃度を分析した。被験化合物の濃度をそのピーク面積と内部標準品のピーク面積の比で表す。
【００８０】
式（Ｉ）化合物の輸送実験の標準条件は以下の通りである。測定濃度：  ２  μＭ  （ＤＭＳＯ≦１％）、重複：ｎ＝３、方向：両方向輸送、Ａ→ＢとＢ→Ａの両方向を含む、インキュベート時間：単一の時点、２．５時間、輸送緩衝液：ＨＢＳＳ、ｐＨ７．４、インキュベート条件：  ３７℃、５％  ＣＯ2、９５％相対湿度。
【００８１】
実験結果：表８に式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の動態学的溶解度測定および式（Ｉ）化合物のＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞の両方向浸透性評価の結果を示す。
【表８】
2019521175.tif 000018
【００８２】
結論：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形は動態学的溶解度でＯＰＣ−６７６８３よりも良く、体内における薬物の吸収と製剤の研究に有利で、参照化合物（ＯＰＣ−６７６８３）と比べ、式（Ｉ）化合物はさらに優れた浸透性を有し、薬物の吸収の面では優勢が顕著で、より優れた抗結核菌の効果に達する。
【００８３】
式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のマウス慢性感染モデルにおける体内薬物効果の実験の設計と方法：実験原理は、アトマイザーで結核菌を含有するエアゾールを生成させてマウスにエアゾールを吸わせて感染させた後、正常の条件で感染したマウスを３１日飼育して結核菌慢性肺部感染を形成させた後、マウスに対して経口投与の形態による薬物治療を行った。実験終了後、マウスの肺部の菌担持量を計数して薬物の殺菌効果を検出した。
【００８４】
実験に使用された菌種は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｅｒｄｍａｎ，ＡＴＣＣ  ３５８０１であった。増幅培地はＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９に基づいたブロス培地で、そして最終濃度が０．２％のグリセリン、０．０５％のツイン８０、および１０％のＯＡＤＣ  （ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ａｌｂｕｍｉｎ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ−ｃａｔａｌａｓｅ、オレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ）溶液なるように添加された。細菌を増幅培地に接種し、対数増殖期に達するように３７℃で１〜２週間培養した。その後、４℃で３１５０ｇで１５分間遠心して菌液を収集した。０．０５％ツイン８０を添加したＰＢＳで収集した結核菌を２回洗浄した後、孔径８μｍのフィルターで菌液をろ過して大きすぎる菌塊を除去し、いずれも４℃で行われた。菌液を０．５ｍｌを単位として分けて−８０℃の超低温冷蔵庫で保存した。調製された菌液の実際の濃度は７Ｈ１１プレートにおける集落で計数して得られた。
【００８５】
動物を動物飼育施設で少なくとも２日適応性飼育した。動物感染実験の当日に、上記工程で得られた菌液を溶解し、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９でＯＤ６００＝０．１になるように希釈し、当該吸光度の結核菌液は約０．５〜１×１０6  ＣＦＵ／ｍｌ含有した。１００μｌのこの菌液を取って７Ｈ１１プレートに塗布し、菌液の実際ＣＦＵ濃度を測定し、この菌液を接種液とした。
【００８６】
１０  ｍｌの細菌接種液を使用してＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ吸入暴露システム（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ、ＩＥＳ）（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ，  Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｒｅ，ＩＮ，ＵＳＡ）でエアゾールを生成させて動物にエアゾールを吸わせて感染させた。感染前、ＩＥＳを１５分間予備加熱し、マウスを固定し、アトマイザーに菌液を入れ、１．５時間のエアゾール暴露吸入感染を行った。すぐにＩＥＳを徹底的に滅菌し、そして感染時間を記録した。
【００８７】
感染後４日目および３２日目にそれぞれＣＯ2安楽死Ｔ４群およびＴ３２群のマウスを使用し、全肺の結核菌に対してＣＦＵ計数を行った。すなわち、マウスをＣＯ2安楽死安した後、肺を３  ｍｌ  ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液で２０〜３０ｓ混合し、さらに１５秒超音波処理した。同様のＨＢＳＳ緩衝液で均質化液を１：１０〜１：１００００に１０倍勾配希釈した。６ウェルプレートで７Ｈ１１プレートを作り、各ウェルに５０μｌの均質化液を接種した。すべての６ウェルプレートを３７℃１８日培養した後、ＣＦＵを計数した。
【００８８】
溶媒対照群および治療群では、感染後３２日目から、５９日目まで投与した。１日後、６０日目に実験を終え、マウスをＣＯ2安楽死した後全肺の結核菌に対してＣＦＵ計数を行った。
【００８９】
実験結果：表９に示す。
【表９】
2019521175.tif 000019
【００９０】
結論：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形は体内薬物効果慢性モデルにおいて１０、３０、１００  ｍｇ／Ｋｇ投与量で投与量と効果の関係が顕著で、かつ１００ｍｇ／Ｋｇ投与量の場合集落数ＣＦＵ低下Ｌｏｇ値は１．７で、参照化合物ＯＰＣ−６７６８３の０．９  Ｌｏｇよりも顕著に良く、１０ｍｇ／Ｋｇの集落数ＣＦＵ低下Ｌｏｇ値は参照化合物ＯＰＣ−６７６８３の１００ｍｇ／Ｋｇにおけるものに相当する。
【図１】
2019521175.tif 000026
【図２】
2019521175.tif 000027
【図３】
2019521175.tif 000028
【図４】
2019521175.tif 000029
【図５】
2019521175.tif 000030
【図６】
2019521175.tif 000031
【図７】
2019521175.tif 000032
【図８】
2019521175.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月2日(2019.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトロイミダゾール系化合物の結晶形、塩形およびその製造方法に関し、さらに、結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における前記結晶形および塩形の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)は結核病の病原体である。世界中に存在する致命的な感染性疾患として、世界保健機関の統計によると、毎年約８００万人以上が感染され、２００万人が結核病で死亡する。過去の十年間で、結核病の症例は世界中で２０％の速度で増加し、この増加は貧困地域で特に顕著である。このまま発展していくと、結核病の症例はこれからの二十年で４１％の増加幅で増加し続けるかもしれない。初めて化学療法が応用されてからの５０年内で、結核病はずっとエイズにつぐ、成人の死亡につながる主な感染病である。
【０００３】
結核病の現在の治療は、アメリカ公衆衛生局が推奨する複数の薬剤の組み合わせの処方が使用され、まず、イソニアジド、リファンピシン、ピラジンアミドおよびエタンブトールの組み合わせを２か月使用した後、単独でイソニアジドおよびリファンピシンの組み合わせて４か月使用することが含まれる。エイズに感染した患者に対し、このような薬物の組み合わせの使用は７か月に延長する。多剤耐性結核病に感染した患者に対し、この薬物の組み合わせは、さらに、ストレプトマイシン、カナマイシン、アミカシン、カプレオマイシン、エチオナミド、シクロセリン、シプロフロキサシンやレボフロキサシンのようなほかの第二選択薬を添加する必要がある。このような多剤耐性結核病（通常、治療期間が２年超）の患者に使用される組み合わせの治療薬は、通常、現在の市販の第一選択薬と比べ、より低い活性およびより高い副作用がある。
【０００４】
現在、大塚製薬の新製品であるデルティバ（デラマニド）、すなわち、化合物コードＯＰＣ−６７６８３はすでに市販され、多剤耐性結核病の治療の併用薬物として、薬剤耐性および忍容性の面を考慮し、成人へ治療が許可された。デラマニドの作用機序は、メトキシミコール酸およびケトミコール酸の合成を抑制することによって、細菌を殺滅するが、これらはいずれも結核菌の細胞壁の重要な構成部分である。デラマニドは多剤耐性結核菌に対して体外でも体内でも高い活性を示し、２０１３年１１月２１日に、欧州のヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）によって条件付きでデルティバ（デラマニド）の５０  ｍｇの薄膜コーティング錠の多剤耐性結核病の治療における使用が承認された。２０１４年４月２８日に正式に欧州で市販されるようになった。その構造式は以下の通りである。
【化１】
2019521175.tif 000034
【０００５】
ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７２４４７の特許には、主にマイコバクテリウム菌、たとえばマイコバクテリウム・ツベルクローシスの感染による関連疾患、とくに薬剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスによる疾患の治療に使用される置換ニトロイミダゾール系誘導体が記載された。その構造は式（Ｂ−１）で表される。
【化２】
2019521175.tif 000035
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、式（ＩＩ）化合物を提供する。
【化３】
2019521175.tif 000036
【０００７】
また、本発明は、ＸＲＰＤスペクトルが図１で示される式（ＩＩ）の化合物のＡ結晶形を提供する。
【０００８】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表１の通りである。
【表１】
2019521175.tif 000037
【０００９】
本発明の一部の形態において、上記式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形では、前記Ａ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、５．７４±０．２°、１３．２９±０．２°、１７．７９±０．２°、１８．４８±０．２°、２０．２５±０．２°、２０．５１±０．２°、２２．０７±０．２°、２３．３３±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する。
【００１０】
また、本発明は上記Ａ結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、
【化４】
2019521175.tif 000038
【００１１】
ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記溶媒がアセトンから選ばれる、方法を提供する。
【００１２】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の５０〜１５０倍で、前記溶媒がブタノンから選ばれる。
【００１３】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がテトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる。
【００１４】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法では、テトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である。
【００１５】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がアセトンとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる。
【００１６】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法では、アセトンとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である。
【００１７】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法は、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１０〜２０倍で、前記溶媒がアセトンと酢酸の混合溶媒から選ばれる。
【００１８】
本発明の一部の形態において、上記Ａ結晶形の製造方法では、アセトンと酢酸の体積比が１〜１．５：１である。
【００１９】
また、本発明は式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形であって、前記Ｂ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、５．２６±０．２°，１０．３９±０．２°，１２．８２±０．２°，２０．７５±０．２°，２２．０８±０．２°，２３．１９±０．２°，２７．０９±０．２°，３７．４５±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する結晶形を提供する。
【００２０】
本発明の一部の形態において、上記式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形は、ＸＲＰＤスペクトルが図４で示される。
【００２１】
本発明の一部の形態において、上記Ｂ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表２の通りである。
【表２】
2019521175.tif 000039
【００２２】
また、本発明はＢ結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記反応溶媒がアセトンから選ばれる、方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、式（ＩＩＩ）化合物を提供する。
【化５】
2019521175.tif 000040
【００２４】
また、本発明は、式（ＩＶ）化合物を提供する。
【化６】
2019521175.tif 000041
【００２５】
また、本発明は、式（Ｖ）化合物を提供する。
【化７】
2019521175.tif 000042
【００２６】
また、本発明は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形であって、前記Ｃ結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルは、７．１８±０．２°，１０．７８±０．２°，１４．１０±０．２°，１４．４１±０．２°，１５．３６±０．２°，２３．７２±０．２°，２５．３６±０．２°，２７．４９±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する結晶形を提供する。
【００２７】
本発明の一部の形態において、上記式（Ｉ）化合物のＣ結晶形は、ＸＲＰＤスペクトルが図６で示される。
【００２８】
本発明の一部の形態において、上記Ｃ結晶形のＸＲＰＤスペクトルの解析データは表３の通りである。
【表３】
2019521175.tif 000043
【００２９】
また、本発明は、結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における上記化合物および上記Ａ結晶形、Ｂ結晶形またはＣ結晶形の使用を提供する。
【００３０】
技術効果本発明によって提供される式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形、Ｂ結晶形および式（Ｉ）化合物のＣ結晶形は、性質が安定で、溶解度が良く、吸湿性が良く、優れた薬物になる将来性がある。
【００３１】
本発明によって提供される式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形、Ｂ結晶形および式（Ｉ）化合物のＣ結晶形は、製造が容易で、使用される試薬が通常のもので、市販品として手に入りやすくて安価で、溶媒が環境にやさしく、クラス３の溶媒が多く、多くの溶媒で単一で安定した結晶形が得られ、操作が簡単で、条件が温和で、純度が良く、収率が高い。
【００３２】
定義と説明別途に説明しない限り、本明細書で用いられる以下の用語および連語は以下の意味を含む。一つの特定の連語または用語は、特別に定義されない場合、不確定または不明瞭ではなく、普通の定義として理解されるべきである。本明細書で商品名が出た場合、相応の商品またはその活性成分を指す。
【００３３】
本発明の中間体化合物は当業者に熟知の様々な合成方法によって製造することができ、以下に挙げられた具体的な実施形態、ほかの化学合成方法と合わせた実施形態および当業者に熟知の同等の代替方法を含み、好適な実施形態は本発明の実施例を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明の具体的な実施形態の化学反応は適切な溶媒で完成され、前記の溶媒は本発明の化学変化およびそれに必要な試薬と材料に適するべきである。本発明の化合物を得るため、当業者が既存の実施形態に基づいて合成工程または反応スキームを変更または選択することが必要であることもある。
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の何らの制限にもならない。
【００３６】
本発明に使用されたすべての溶媒は市販品で、さらに精製せずにそのままで使用してもよい。
【００３７】
本発明は下記略語を使用する。ａｑ．は水で、ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔは当量で、ＴＨＦはテトラヒドロフランで、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドで、ＡｃＯＨは酢酸で、ＴｓＯＨはｐ−トルエンスルホン酸で、ＣＨ3ＳＯ3Ｈはメタンスルホン酸で、Ｈ2ＳＯ4は硫酸で、ＨＣＬは塩酸で、ＣｕＩはヨウ化第一銅を、ＣｕＢｒは臭化第一銅を、ＣｕＣｌは塩化第一銅を、Ｃｕは銅粉を、Ｃｕ2Ｏは酸化第一銅を、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表す。
【００３８】
化合物は人工的にまたはＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトによって名付けられ、市販化合物はメーカーのカタログの名称が使用された。
【００３９】
本発明の粉末Ｘ線回折（Ｘ−ｒａｙ  ｐｏｗｄｅｒ  ｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ、ＸＲＰＤ）方法装置型式：ブルカーＤ８  ａｄｖａｎｃｅ  Ｘ線回折装置測定方法：約１０〜２０  ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出に使用した。
【００４０】
詳細なＸＲＰＤパラメーターは以下の通りである。Ｘ線管：Ｃｕ、ｋα、（λ＝１．５４０５６Å）管電圧：４０  ｋＶ、管電流：４０  ｍＡ発散スリット：０．６０  ｍｍ検出器スリット：１０．５０  ｍｍ散乱防止スリット：７．１０  ｍｍ走査範囲：４〜４０度ステップ幅：０．０２度ステップ時間：０．１２秒サンプルプレート回転数：１５  ｒｐｍ本発明の示差走査熱量分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ、ＤＳＣ）方法装置型式：ＴＡ  Ｑ２０００示差走査熱量計測定方法：サンプル（〜１  ｍｇ）をＤＳＣアルミニウムパン内に置いて測定し、５０  ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ2の条件において、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを２５℃から３００℃（または３５０℃）に加熱する。
【００４１】
本発明の熱重量分析（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＴＧＡ）方法装置型式：ＴＡ  Ｑ５０００ＩＲ熱重量分析装置測定方法：サンプル（２〜５  ｍｇ）をＴＧＡ白金パン内に置いて測定し、２５  ｍＬ／ｍｉｎ  Ｎ2の条件において、１０℃／ｍｉｎの升温速度で、サンプルを室温から重量減少が２０％になるまで加熱する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図２】図２は式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のＤＳＣチャートである。
【図３】図３は式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のＴＧＡグラフである。
【図４】図４は式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図５】図５は式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形のＤＳＣチャートである。
【図６】図６は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形のＣｕ−Ｋα線のＸＲＰＤスペクトルである。
【図７】図７は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形のＤＳＣチャートである。
【図８】図８は式（Ｉ）化合物のＣ結晶形のＴＧＡグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の内容がより良く理解されるように、具体的な実施例と合わせてさらに説明するが、具体的な実施形態は本発明の内容に対する制限ではない。
【実施例】
【００４４】
【化８】
2019521175.tif 000044
【００４５】
工程１：ｔ−ブチル−２，５−ジヒドロピロール−１−カルボン酸  ｔ−ブチル（２．００  ｇ、１１．８２  ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（６．００  ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（９．１８  ｇ、８０．５１  ｍｍｏｌ、６．８１当量）を入れ、混合物を２０℃で１時間撹拌した。混合物を減圧で濃縮させ、得られた粗製品は黒褐色の油状物であった。そのまま次の工程に使用した。
【００４６】
工程２：２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール（２．１６  ｇ、１１．７９  ｍｍｏｌ、１．００当量、ＴＦＡ）のジクロロメタン（１０．００  ｍＬ）溶液にＴｏｓＣｌ（２．７０  ｇ、１４．１５  ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびトリエチルアミン（３．５８  ｇ、３５．３７  ｍｍｏｌ、３．００当量）を入れた。混合物を２０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を１Ｍ希塩酸（３０  ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ3溶液（３０  ｍＬ）および食塩水（３０  ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、１−（ｐ−トルエンスルホニル）−２，５−ジヒドロピロール（１．５０  ｇ、６．７２  ｍｍｏｌ、収率５６．９８％）を得、褐色の固体であった。
【００４７】
工程３：１−（ｐ−トルエンスルホニル）−２，５−ジヒドロピロール（１．５０  ｇ、６．７２  ｍｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＳＯ（１０．００  ｍＬ）およびアセトニトリル（５．００  ｍＬ）溶液に０℃でＮＢＳ（１．７９  ｇ、１０．０８  ｍｍｏｌ、１．５０当量）を分けて入れた。その後、混合物を１５℃で１６時間撹拌した。反応混合物に水（５０  ｍＬ）を入れ、そして酢酸エチルで（３０  ｍＬ×２）抽出した。合併した有機層を食塩水（３０  ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１〜３：１）によって精製し、得られた４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オール（１．５８  ｇ、４．９３  ｍｍｏｌ、収率７３．４３％）は白色の固体であった。
【００４８】
工程４：４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オール（１．５８  ｇ、４．９３  ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（１５．００  ｍＬ）溶液にデス・マーチン試薬（４．１９  ｇ、９．８７  ｍｍｏｌ、２．００当量）を入れた後、窒素ガスで置換し、さらに混合物を１０〜１５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液（５０  ｍＬ×２）で洗浄し、そして酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって分離して精製し（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１〜１：１）、得られた４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オン（９８０．００  ｍｇ、３．０８  ｍｍｏｌ、収率６２．４７％）は黄色の固体であった。1Ｈ  ＮＭＲ  （３００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3）  ７．６９−７．６１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．３５−７．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．３２−４．２５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．００−３．９１  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．５５−３．４７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３９  （ｓ，  ３Ｈ）．
【００４９】
工程５：４−ブロモ−１−（ｐ−トルエンスルホニル）ピロリジン−３−オン（８８０．００  ｍｇ、２．７７  ｍｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＦ（１２．００  ｍＬ）溶液に４−フルオロチオベンズアミド（４３０．００  ｍｇ、２．７７  ｍｍｏｌ、１．００当量）を入れた。混合物を６０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧で濃縮させ、残留物を酢酸エチル（１０  ｍＬ）で希釈し、ろ過し、ケーキを収集してろ過後の液体をシリカゲルクロマトグラフィーによって（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝１０：１，３：１）精製し、２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−４，５，６，６ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピロロ［３，４−ｄ］チアゾール３ａのアルコール（９００．００  ｍｇ、２．４９  ｍｍｏｌ）を得、灰色の固体であった。
【００５０】
工程６：２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−４，５，６，６ａ−テトラヒドロテトラヒドロ−３ａＨ−ピロロ［３，４−ｄ］チアゾール３ａのアルコール（９００．００  ｍｇ、２．２９  ｍｍｏｌ、１．００当量）を、メタンスルホニルクロリド（４４４．００  ｍｇ、３．８８  ｍｍｏｌ、１．６９当量）およびトリエチルアミン（７３０．００  ｍｇ、７．２１  ｍｍｏｌ、３．１５当量）をジクロロメタン（２０．００  ｍＬ）に溶解させ、混合物を脱気して窒素ガスで保護し、さらに混合物を２０℃で１６時間撹拌した。水（５０  ｍＬ）を入れ、そしてジクロロメタン（３０  ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって（シリカ、石油エーテル／酢酸エチル＝２０：１〜１：１）精製し、２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（６００．００  ｍｇ、１．１１  ｍｍｏｌ、収率４８．２８％、純度６９％）を得、薄黄色の固体であった。
【００５１】
工程７：２−（４−フルオロフェニル）−５−トルエンスルホニル−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（５５０．００  ｍｇ、１．０１  ｍｍｏｌ、１．００当量）の水（３．００  ｍＬ）およびＡｃＯＨ（１５．００  ｍＬ）の混合溶液に臭化水素の酢酸溶液（８１．７２  ｍｇ、１．０１  ｍｍｏｌ、１．００当量）を入れた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧で濃縮させた後、水（５０  ｍＬ）で希釈し、そして酢酸エチルで（５０  ｍＬ）抽出した。水層をＮａＯＨで塩基化してｐＨ値＝１１になるように調整した後、酢酸エチル（４０  ｍＬ×２）で抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、２−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（１４５．００  ｍｇ、６５８．２８  μｍｏｌ、収率６５．１８％）を得、薄黄色の固体であった。
【００５２】
工程８：２−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，４−Ｄ］チアゾール（１６０．００  ｍｇ、７２６．３８  μｍｏｌ、１．００当量）溶液に２−クロロ−１−［［（２Ｒ）−２−メチルエチレンオキサイド−２−イル］メチル］−４−ニトロイミダゾール（１５８．００  ｍｇ、７２６．０７  μｍｏｌ、１．００当量）およびジイソプロピルアミン（４８１．００  ｍｇ、３．７２  ｍｍｏｌ、５．１２当量）を入れた。混合物を８０℃で１６時間撹拌した。水（５０  ｍＬ）を入れ、そして酢酸エチル（３０  ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過して減圧で濃縮させ、残留物を分取薄層クロマトグラフィーによって分離し（シリカ、ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）、（２Ｓ）−１−（２−クロロ−４−ニトロイミダゾール−１−イル）−３−［２−（４−フルオロフェニル）−４，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］チアゾール−５−イル］−２−メチル−プロパン−２−オール（１５０．００  ｍｇ、３４２．５６  μｍｏｌ、収率４７．１６％）を得、薄黄色の固体であった。
【００５３】
工程９：（２Ｓ）−１−（２−クロロ−４−ニトロイミダゾール−１−イル）−３−［２−（４−フルオロフェニル）−４，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］チアゾール−５−イル］−２−メチル−プロパン−２−オール（１５０．００  ｍｇ、３４２．５６  μｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＦ（５．００  ｍＬ）溶液に０℃で窒素ガスの保護下において水素化ナトリウム（３０．００  ｍｇ、７５０．００  μｍｏｌ、２．１９当量）を入れた。混合物を０℃で１時間撹拌した。反応混合物を０℃で飽和塩化アンモニウム溶液（４０  ｍＬ）に注ぎ、さらに酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出した。合併した有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧で濃縮させ、残留物を酢酸エチルで精製し、実施例１（１７．７１  ｍｇ、４０．９０  μｍｏｌ、収率１１．９４％、純度９２．７１％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ3）  ７．９１−７．８４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１７−７．０９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．５３−４．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．３  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．１３−４．０７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．０３−３．９７  （ｍ，  Ｊ  ＝  ９．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．１２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．６４−１．６０  （ｍ，  ３Ｈ）．  ＬＣＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ：  ４０２．１０  （Ｍ＋１）．
【００５４】
実施例２：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（５００  ｍｇ、１．２５  ｍｍｏｌ）をアセトン（７５  ｍＬ）に入れ、５０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（５９３  ｍｇ、３．７５  ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃で１０分間撹拌し、大量の固体が析出し、ゆっくり室温に下がり、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥して灰色の固体の製品（５００  ｍｇ、０．８９  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９７．４％で、収率は７１．５％であった。
【００５５】
実施例３：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（４．８  ｇ、１１．９６  ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（１７  ｍＬ）およびアセトン（１４０  ｍＬ）の混合溶液に入れ、６０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（２．０８  ｍｇ、１３．１６  ｍｍｏｌ）をアセトン（３０  ｍＬ）に溶解させて反応フラスコに滴下し、大量の固体が析出し、４０℃に降温させて加熱して１時間撹拌し、室温１５℃に降温させて１１時間撹拌し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥して得られたオフ白色の固体の製品をアセトン（４０  ｍＬ）に溶解させ、４０℃で加熱して１２時間撹拌し、ろ過してオフ白色の固体の製品（５．２０  ｇ、９．２２  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．２％で、収率は７７．０％であった。
【００５６】
実施例４：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（１００  ｍｇ、０．２４９  ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（０．３５  ｍＬ）およびブタノン（３．５  ｍＬ）の混合溶液に入れ、６０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（４３．３  ｍｇ、０．２７４  ｍｍｏｌ）をブタノン（０．１  ｍＬ）に溶解させて反応フラスコに滴下し、大量の固体が析出し、４０℃に降温させて加熱して１時間撹拌し、室温１５℃に降温させて１１時間撹拌し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥してオフ白色の固体の製品（１１０  ｍｇ、０．１９５  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．４％で、収率は７８．４％であった。
【００５７】
実施例５：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（１．００  ｇ、２．４９  ｍｍｏｌ）をアセトン（１０  ｍＬ）および酢酸（１０  ｍＬ）の混合溶液に入れ、室温１５℃で均一に撹拌し、溶液は懸濁の状態で、さらにベンゼンスルホン酸（４３３  ｍｇ、２．７４  ｍｍｏｌ）を入れ、懸濁固体が溶解し、溶液が清澄になり、続いて１２時間撹拌し、大量の固体が析出し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥してオフ白色の固体の製品（１．２５ｇ、２．２２  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．２％で、収率は８８．９％であった。
【００５８】
実施例６：式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形の製造式（Ｉ）化合物（６．００  ｇ、１４．９５  ｍｍｏｌ）をアセトン（６００  ｍＬ）に入れ、６０℃に昇温させて清澄まで撹拌し、さらにベンゼンスルホン酸（２．６０  ｇ、１６．４５  ｍｍｏｌ）をアセトン（３０  ｍＬ）に溶解させ、ゆっくり反応フラスコに滴下し、大量の固体が析出し、室温に降温させて１２時間撹拌し、ろ過し、ケーキを少量のアセトンで洗浄し、乾燥して白色の固体の製品（７．１０  ｇ、１２．６４  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．６％で、収率は８４．５％であった。
【００５９】
実施例７：式（Ｉ）化合物のＣ結晶形の製造式（Ｖ）化合物（３．８９  ｇ、６．７８  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１００  ｍＬ）と混合し、当該混合物に固体の炭酸水素ナトリウム（８５４．５７  ｍｇ、１０．１７  ｍｍｏｌ）を入れ、２５℃で１５分間撹拌し、混合物を濃縮させ、水（２００  ｍＬ）で洗浄し、水溶液をジクロロメタン（３００  ｍＬ×３）で抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄し、有機相を濃縮させ、残留物をメタノール（５０  ｍＬ）で撹拌して白色の固体の製品（２．５１  ｇ、６．２２  ｍｍｏｌ）を得、ＨＰＬＣ純度は９９．４％で、収率は９１．７％であった。
【００６０】
実施例８：式（ＩＩＩ）化合物の製造式（Ｉ）化合物（８０  ｍｇ、０．１９９  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２  ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２００  μＬ）に溶解させ、５０℃に加熱して溶解させ、当該混合物に塩酸（２０  μＬ、０．２４  ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０  μＬ）の混合溶媒を入れ、５０℃で２時間撹拌し、混合物を室温に冷却して一晩撹拌し、快速遠心で沈殿を取って乾燥して白色の固体製品を得た。
【００６１】
実施例９：式（ＩＶ）化合物の製造式（Ｉ）化合物（８０  ｍｇ、０．１９９  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２  ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２００  μＬ）に溶解させ、５０℃に加熱して溶解させ、当該混合物にメタンスルホン酸（１５  μＬ、０．２３４  ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０  μＬ）の混合溶媒を入れ、５０℃で２時間撹拌し、混合物を室温に冷却して一晩撹拌し、快速遠心で沈殿を取って乾燥して白色の固体の製品を得た。
【００６２】
実施例１０：式（Ｖ）化合物の製造式（Ｉ）化合物（８０  ｍｇ、０．１９９  ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２  ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２００  μＬ）に溶解させ、５０℃に加熱して溶解させ、当該混合物にｐ−トルエンスルホン酸（４２．２６  ｍｇ、０．２４５  ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０  μＬ）の混合溶媒を入れ、５０℃で２時間撹拌し、混合物を室温に冷却して一晩撹拌し、少量の固体が析出し、逆溶解の酢酸エチルを入れ、大量の固体が析出し、快速遠心で沈殿を取って乾燥して白色の固体の製品を得た。
【００６３】
異なる溶媒における式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の安定性実験３０  ｍｇの式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形を複数分取り、それぞれ０．２  ｍＬの下記表における単一または混合溶媒に入れ、４０℃の条件で２日撹拌した後遠心した。すべてのサンプルにおける固体を収集し、真空乾燥器（４０℃）で一晩乾燥し、ＸＲＰＤによってその結晶形の状態を検出した。結果を表４に示す。
【表４】
2019521175.tif 000045
【００６４】
高温と高湿の条件における式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の固体安定性実験『原薬と製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬局方２０１５版四部通則９００１）に準じ、式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の高温（６０℃、開口）、高湿（室温／相対湿度９２．５％、開口）の条件における安定性を考察した。
【００６５】
式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のサンプルを約７  ｍｇ量って、ガラスサンプル瓶の底部に置き、薄く一層に敷いた。高温および高湿の条件において置いたアンプルをアルミ箔で封じ、そして環境の空気と十分に接触できるようにアルミ箔に小さい孔を開け、強光照射の条件において置いたサンプルをスクリューキャップで密封した。異なる条件において置いたサンプルを５日目、１０日目にサンプリングして検出し、検出結果を０日の初期検出結果と比べ、試験結果を下記表５に示す。
【表５】
2019521175.tif 000046
【００６６】
式（Ｉ）化合物のＣ結晶形の異なる溶媒における溶解度測定溶解度測定は、常温の条件で手動段階希釈の方法を使用して同時に溶解状態を観察して測定を行った。約２  ｍｇの式（Ｉ）化合物のＣ結晶形を異なる液相小瓶に入れ、さらに少しずつ有機溶媒または溶媒混合物を入れ、化合物の溶解状態を観察した。
【００６７】
化合物の溶解度測定の結果を表６に示す。
【表６】
2019521175.tif 000047
【００６８】
式（Ｉ）化合物の体外薬物効果の測定試験方法：濃度が１０  ｍｇ／ｍｌになるように式（Ｉ）化合物を純ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  ２７６８５５−２Ｌ）に溶解させて化合物母液とした。Ｖ底９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ−ｗｉｐｐ０２２８０）の２列目から１１列目のウェルに３０  μｌ  ＤＭＳＯを入れた。２列目のウェルに３０  μｌの化合物の母液を入れ、均一に混合した後、２列目のウェルから３０  μｌ取り出して３列目のウェルに入れ、吹いて均一に混合した。このように１０列目まで操作した。１１列目は薬物を入れず、３０  μｌ  ＤＭＳＯのみ含まれる。これは化合物の「親プレート」である。２列目から１１列目に相応する化合物の濃度は５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１２５、０．１５６、０．０７８、０．０３９、０．０２、０  ｍｇ／ｍｌであった。薬物効果の良い化合物に対し、適切にテスト濃度を低下させた。平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０９０）を「子プレート」とした。すべての子プレートのウェルに９８  μｌの７Ｈ９  （Ｓｉｇｍａ  Ｍ０１７８）培地を入れた。親プレートから２  μｌの化合物を吸い取って相応の位置の子プレートに入れた。子プレートのＡおよびＨの行、１列目および１２列目に７Ｈ９培地のみが含まれる。
【００６９】
グリセリン冷凍保存管におけるＨ３７Ｒｖ菌株を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９培地に接種し、３７℃、２００回／分のシェーカーで４週間培養した。菌液を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９培地で２回洗浄して同じ培地に再懸濁させた。同じ培地で菌液の吸光度をＯＤ550＝０．４−０．５の間に調整した。この菌液を微型遠心管に分注して−８０℃で保存した。保存時間は１か月以下とした。テスト当日に、分けた菌液を解凍した。７Ｈ９培地で解凍した菌液を２０倍希釈した後、さらに５０倍希釈し、合計１０００倍希釈し、この菌液を子プレートへの接種に使用した。１００  μｌの菌液を子プレートの各ウェルに接種し、１２列目に１００  μｌの７Ｈ９培地を入れ、菌液を入れなかった。
【００７０】
テスト用子プレートを３７℃インキュベーターに置いて培養し、湿度を＞８０％に維持した。１週間後から、毎日一つの細菌を含有する１列目のウェルおよび一つの細菌を含有しない１２列目のウェルに１２．５  μｌの２０％ツイン８０含有７Ｈ９培地および２０  μｌのアラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＡＬ１１００）を入れ、そして続いて２４時間培養してから観察した。１列目のウェルにおける菌液が入れられたアラマーブルーを２４時間内でピンク色に還元した場合、２０％ツイン８０含有７Ｈ９培地およびアラマーブルーをテストプレートにおけるすべてのウェルに入れ、３７℃で続いて２４時間培養してから蛍光値を測量した。
【００７１】
濃度が１２．８ｍｇ／ｍｌになるように化合物（Ｉ）を純ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  ２７６８５５−２Ｌ）に溶解させて化合物母液とした。Ｖ底９６ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ−ｗｉｐｐ０２２８０）の１列目から１２列目のウェルに３０  μｌ  ＤＭＳＯを入れた。  １列目のウェルに３０  μｌの化合物の母液を入れた。１列目のウェルから３０  μｌ取り出して２列目のウェルに入れ、吹いて均一に混合した。このように１１列目まで２倍勾配希釈を行った。  １２列目は化合物を入れず、３０  μｌ  ＤＭＳＯのみが含まれる。すべてのＡ行およびＨ行のウェルに３０  μｌ  ＤＭＳＯのみ入れた。これは化合物の「親プレート」である。１列目から１２列目に相応する化合物の濃度は６．４、３．２、１．６、０．８、０．４、０．２、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、０．００６２５および０  ｍｇ／ｍｌである。薬物効果の良い化合物に対し、適切にテスト濃度を低下させた。平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ６５５０９０）を「子プレート」とした。すべての子プレートのウェルに９８  μｌの７Ｈ９  （Ｓｉｇｍａ  Ｍ０１７８）培地を入れた。親プレートから２  μｌの化合物溶液を吸い取って相応の位置の子プレートに入れた。子プレートのＡおよびＨの行および１２列目に７Ｈ９培地および相応する濃度のＤＭＳＯのみ含まれる。
【００７２】
グリセリン冷凍保存管におけるＢＣＧワクチン菌株を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９液体培地に接種し、３７℃、２００回／分のシェーカーで４週間培養した。菌液を０．０５％ツイン８０含有７Ｈ９培地で２回洗浄して同じ培地に再懸濁させた。同じ培地で菌液の吸光度をＯＤ５５０＝０．４〜０．５の間に調整した。この菌液を微型遠心管に分注して−８０℃で保存した。保存時間は１か月以下とした。テスト当日に、分注した菌液を解凍した。７Ｈ９培地で解凍した菌液を２０倍希釈した後、さらに５０倍希釈し、合計１０００倍希釈し、この菌液を接種に使用した。１００  μｌ  の菌液を子プレートにおけるＡ行以外の各ウェルに接種した。Ａ行のウェルに１００  μｌ  ７Ｈ９培地のみ入れ、菌液が添加されていない。薬物の測定の最終濃度は６４、３２、１６、８、４、２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５および０  μｇ／ｍｌである。テスト用子プレートを３７℃インキュベーターに置いて培養し、湿度を＞８０％に維持した。
【００７３】
１週間後から、毎日一つの細菌を含有しないＡ行のウェルおよび一つの細菌を含有するＨ行のウェルに１２．５  μｌの２０％ツイン８０含有７Ｈ９培地および２０  μｌのアラマーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＡＬ１１００）を入れ、そして続いて２４時間培養してから観察した。Ｈ行のウェルにおける菌液が添加されたアラマーブルーを２４時間内でピンク色に還元した場合、アラマーブルーをテストプレートにおけるすべてのウェルに入れ、３７℃で続いて２４時間培養した後、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を観察した。
【００７４】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の定義は、肉眼観察ではアラマーブルーの変色を完全に抑制できる最小薬物濃度、または蛍光計による測量では９０％超の還元型アラマーブルーの生成を抑制できる最小薬物濃度である。
【００７５】
実験結果：表７に示す。
【表７】
2019521175.tif 000048
【００７６】
結論：式（Ｉ）化合物はマイコバクテリウム・ボビスのＢＣＧワクチン菌株にもマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＨ３７Ｒｖ菌株にも優れた抑制活性を有し、かつ細胞毒性がない。
【００７７】
動態学的溶解度およびＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞の両方向の浸透性の評価実験動態学的溶解度の測定方法：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のサンプルを量って純ＤＭＳＯに溶解させ、最終濃度は１０  ｍＭで、被験化合物と対照化合物（１０  ｍＭ  ＤＭＳＯ母液、各ウェル１０  μＬ）を各ウェルに４９０  μＬ緩衝液を含有する９６ウェルプレートに入れた。２分間ボルテックスした後、サンプルプレートを振とう器で室温で（２２±２℃）２４時間インキュベートした。その後、２００  μＬのサンプルをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎろ過プレート（ポリカーボネート膜）に移し、ミリポア真空マニホールド（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ）でろ過してろ液を収集した。ＨＰＬＣ−ＵＶによってろ液における化合物の濃度を測定した。３つの異なる濃度のＵＶ標準品溶液と溶解度の測定サンプルを前後で仕込んだ。各サンプルを２回仕込み、標準曲線に代入して濃度を計算し、平均値を求めた。
【００７８】
ＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞の両方向の浸透性の評価実験の方法：永久的にヒトＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を発現するＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞を９６ウェルＩｎｓｅｒｔ細胞プレートに接種し、４〜７日培養した後集合した単層細胞が形成した。フェノテロール（低浸透性マーカー）とプロプラノロール（高浸透性マーカー）の単方向（Ａ→Ｂ）浸透性、およびジゴキシン（P-糖タンパク質基質）の両方向浸透性を評価することによって単層細胞の品質を検証した。この３つの対照化合物は２つの重複ウェルを設けた。
【００７９】
インキュベート終了後、ドナーウェル（ｄｏｎｏｒ  ｗｅｌｌｓ）およびレシーバーウェル（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｗｅｌｌｓ）におけるサンプル溶液を取ってすぐに内部標準品を含有する冷アセトニトリル溶液と混合した。そして内部標準品を含有する冷アセトニトリル溶液で細胞を分解させ、細胞における化合物の蓄積量を測定した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法によって被験化合物のすべてのサンプル（初期ドナー液、ドナーウェル上清液、レシーバー液、細胞分解液を含む）における濃度を分析した。被験化合物の濃度をそのピーク面積と内部標準品のピーク面積の比で表す。
【００８０】
式（Ｉ）化合物の輸送実験の標準条件は以下の通りである。測定濃度：  ２  μＭ  （ＤＭＳＯ≦１％）、重複：ｎ＝３、方向：両方向輸送、Ａ→ＢとＢ→Ａの両方向を含む、インキュベート時間：単一の時点、２．５時間、輸送緩衝液：ＨＢＳＳ、ｐＨ７．４、インキュベート条件：  ３７℃、５％  ＣＯ2、９５％相対湿度。
【００８１】
実験結果：表８に式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形の動態学的溶解度測定および式（Ｉ）化合物のＭＤＲ１−ＭＤＣＫ細胞の両方向浸透性評価の結果を示す。
【表８】
2019521175.tif 000049
【００８２】
結論：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形は動態学的溶解度でＯＰＣ−６７６８３よりも良く、体内における薬物の吸収と製剤の研究に有利で、参照化合物（ＯＰＣ−６７６８３）と比べ、式（Ｉ）化合物はさらに優れた浸透性を有し、薬物の吸収の面では優勢が顕著で、より優れた抗結核菌の効果に達する。
【００８３】
式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形のマウス慢性感染モデルにおける体内薬物効果の実験の設計と方法：実験原理は、アトマイザーで結核菌を含有するエアゾールを生成させてマウスにエアゾールを吸わせて感染させた後、正常の条件で感染したマウスを３１日飼育して結核菌慢性肺部感染を形成させた後、マウスに対して経口投与の形態による薬物治療を行った。実験終了後、マウスの肺部の菌担持量を計数して薬物の殺菌効果を検出した。
【００８４】
実験に使用された菌種は結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｅｒｄｍａｎ，ＡＴＣＣ  ３５８０１であった。増幅培地はＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９に基づいたブロス培地で、そして最終濃度が０．２％のグリセリン、０．０５％のツイン８０、および１０％のＯＡＤＣ  （ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ａｌｂｕｍｉｎ−ｄｅｘｔｒｏｓｅ−ｃａｔａｌａｓｅ、オレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ）溶液なるように添加された。細菌を増幅培地に接種し、対数増殖期に達するように３７℃で１〜２週間培養した。その後、４℃で３１５０ｇで１５分間遠心して菌液を収集した。０．０５％ツイン８０を添加したＰＢＳで収集した結核菌を２回洗浄した後、孔径８μｍのフィルターで菌液をろ過して大きすぎる菌塊を除去し、いずれも４℃で行われた。菌液を０．５ｍｌを単位として分けて−８０℃の超低温冷蔵庫で保存した。調製された菌液の実際の濃度は７Ｈ１１プレートにおける集落で計数して得られた。
【００８５】
動物を動物飼育施設で少なくとも２日適応性飼育した。動物感染実験の当日に、上記工程で得られた菌液を溶解し、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９でＯＤ６００＝０．１になるように希釈し、当該吸光度の結核菌液は約０．５〜１×１０6  ＣＦＵ／ｍｌ含有した。１００μｌのこの菌液を取って７Ｈ１１プレートに塗布し、菌液の実際ＣＦＵ濃度を測定し、この菌液を接種液とした。
【００８６】
１０  ｍｌの細菌接種液を使用してＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ吸入暴露システム（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ、ＩＥＳ）（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ，  Ｔｅｒｒｅ  Ｈａｕｒｅ，ＩＮ，ＵＳＡ）でエアゾールを生成させて動物にエアゾールを吸わせて感染させた。感染前、ＩＥＳを１５分間予備加熱し、マウスを固定し、アトマイザーに菌液を入れ、１．５時間のエアゾール暴露吸入感染を行った。すぐにＩＥＳを徹底的に滅菌し、そして感染時間を記録した。
【００８７】
感染後４日目および３２日目にそれぞれＣＯ2安楽死Ｔ４群およびＴ３２群のマウスを使用し、全肺の結核菌に対してＣＦＵ計数を行った。すなわち、マウスをＣＯ2安楽死安した後、肺を３  ｍｌ  ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液で２０〜３０ｓ混合し、さらに１５秒超音波処理した。同様のＨＢＳＳ緩衝液で均質化液を１：１０〜１：１００００に１０倍勾配希釈した。６ウェルプレートで７Ｈ１１プレートを作り、各ウェルに５０μｌの均質化液を接種した。すべての６ウェルプレートを３７℃１８日培養した後、ＣＦＵを計数した。
【００８８】
溶媒対照群および治療群では、感染後３２日目から、５９日目まで投与した。１日後、６０日目に実験を終え、マウスをＣＯ2安楽死した後全肺の結核菌に対してＣＦＵ計数を行った。
【００８９】
実験結果：表９に示す。
【表９】
2019521175.tif 000050
【００９０】
結論：式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形は体内薬物効果慢性モデルにおいて１０、３０、１００  ｍｇ／Ｋｇ投与量に依存的であることが顕著で、かつ１００ｍｇ／Ｋｇ投与量の場合集落数ＣＦＵ低下Ｌｏｇ値は１．７で、参照化合物ＯＰＣ−６７６８３の０．９  Ｌｏｇよりも顕著に良く、１０ｍｇ／Ｋｇの集落数ＣＦＵ低下Ｌｏｇ値は参照化合物ＯＰＣ−６７６８３の１００ｍｇ／Ｋｇにおけるものに相当する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）化合物
【化１】
2019521175.tif 000051
【請求項２】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、５．７４±０．２°、１３．２９±０．２°、１７．７９±０．２°、１８．４８±０．２°、２０．２５±０．２°、２０．５１±０．２°、２２．０７±０．２°、２３．３３±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形。
【請求項３】
ＸＲＰＤスペクトルが図１で示される請求項２に記載の式（ＩＩ）化合物のＡ結晶形。
【請求項４】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、
【化２】
2019521175.tif 000052
ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記溶媒がアセトンから選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項５】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の５０〜１５０倍で、前記溶媒がブタノンから選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項６】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がテトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項７】
テトラヒドロフランとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である請求項６に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項８】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の２５〜５０倍で、前記溶媒がアセトンとジメチルスルホキシドの混合溶媒から選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項９】
アセトンとジメチルスルホキシドの体積比が６〜１０：１である請求項８に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１０】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１０〜２０倍で、前記溶媒がアセトンと酢酸の混合溶媒から選ばれる、請求項２〜３に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１１】
アセトンと酢酸の体積比が１〜１．５：１である請求項１０に記載のＡ結晶形の製造方法。
【請求項１２】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、５．２６±０．２°，１０．３９±０．２°，１２．８２±０．２°，２０．７５±０．２°，２２．０８±０．２°，２３．１９±０．２°，２７．０９±０．２°，３７．４５±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形。
【請求項１３】
ＸＲＰＤスペクトルが図４で示される請求項１２に記載の式（ＩＩ）化合物のＢ結晶形。
【請求項１４】
結晶形の製造方法であって、任意の形態の式（Ｉ）化合物とベンゼンスルホン酸とを溶媒に入れて結晶させて得る工程を含み、ここで、ベンゼンスルホン酸と式（Ｉ）化合物のモル比が１．２〜１．０：１で、溶媒使用量が式（Ｉ）化合物の重量の１５０〜３００倍で、前記反応溶媒がアセトンから選ばれる、請求項１２に記載のＢ結晶形の製造方法。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）化合物
【化３】
2019521175.tif 000053
【請求項１６】
式（ＩＶ）化合物
【化４】
2019521175.tif 000054
【請求項１７】
式（Ｖ）化合物
【化５】
2019521175.tif 000055
【請求項１８】
結晶形の粉末Ｘ線回折スペクトルが、７．１８±０．２°，１０．７８±０．２°，１４．１０±０．２°，１４．４１±０．２°，１５．３６±０．２°，２３．７２±０．２°，２５．３６±０．２°，２７．４９±０．２°といった２θ角に特徴的回折ピークを有する式（Ｉ）化合物のＣ結晶形。
【請求項１９】
ＸＲＰＤスペクトルが図６で示される請求項１８に記載の式（Ｉ）化合物のＣ結晶形。
【請求項２０】
結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における使用のための請求項１に記載の化合物または請求項２又は３に記載のＡ結晶形または請求項１２又は１３に記載のＢ結晶形。
【請求項２１】
結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２２】
結核菌またはほかの微生物による感染を予防および治療する薬物の製造における使用のための請求項１８に記載のＣ結晶形。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2019521175.tif 000056
【図２】
2019521175.tif 000057
【図３】
2019521175.tif 000058
【図４】
2019521175.tif 000059
【図５】
2019521175.tif 000060
【図６】
2019521175.tif 000061
【図７】
2019521175.tif 000062
【図８】
2019521175.tif 000063
【国際調査報告】
2019521175.tif 000064
2019521175.tif 000065
2019521175.tif 000066
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2019521175.tif 000068
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