(57)【要約】  光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子、特に架橋ポリフルオレンナノ粒子に結合した薬物、細胞または生体分子を含む複合体、ならびにその製造方法、ならびに生物学的画像化および感知用途におけるその使用が、本明細書に記載される。
2019511455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合した薬物分子、生体分子または細胞を含む複合体であって、
前記薬物分子、生体分子、または細胞は、
（ｉ）前記光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子上に存在する官能基と、前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在する官能基との反応により形成された共有結合、
（ｉｉ）前記光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に共有結合した第１の部分と、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分との間の親和性対形成
により、前記光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合しており、
前記光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、π共役架橋ポリマーまたはその塩から形成され、前記π共役架橋ポリマーは、
ａ）８０〜９９．９モル％のπ共役モノマーと、
ｂ）０．１〜２０モル％の以下に示される式Ｉを有する架橋剤と、
【化１】
2019511455.tif 000075
（式中、
Ｚ１およびＺ２は、モノマー部分であり、
Ｙは、存在しないか、結合であるか、または連結基である）
ｃ）前記薬物分子、生体分子または細胞上の官能基と反応して、前記ナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞に連結する共有結合を形成することができる、１または複数の官能基（例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニルまたはチオール基）、または、前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分と親和性対形成することができる第１の部分と
を含む、複合体。
【請求項２】
前記共有結合が、アミド、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、イミン、エナミンまたはエステル連結（例えばアミド連結）から選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記親和性対形成を形成する前記第１または第２の部分の一方がストレプトアビジンであり、他方がビオチンであるか、一方が抗体であり、他方が抗原であるか、一方がエピトープであり、他方がパラトープであるか、一方がＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ鎖であり、他方が相補的ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡ鎖であるか、または一方が薬物であり、他方が結合受容体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子が、
（ｉ）前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在するカルボキシ基と反応して、前記ポリマーナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするエステル結合を形成することができる１つまたは複数のヒドロキシル基、
（ｉｉ）前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在するカルボキシ基と反応して、前記ポリマーナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするアミド結合を形成することができる１つまたは複数のアミノ基、
（ｉｉｉ）前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在するアミノ基と反応して、前記ポリマーナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするアミド結合を形成することができる１つまたは複数のカルボキシ基、
（ｉｖ）前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在するチオール基と反応して、前記ポリマーナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするジスルフィド結合を形成することができる１つまたは複数のチオール基、
（ｖ）前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在するチオール基と反応して、前記ポリマーナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするスルフィド結合を形成することができる１つまたは複数のビニル基、および／または
（ｖｉ）前記薬物分子、生体分子または細胞上に存在するアミン基と反応して、前記ポリマーナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするイミンまたはエナミン結合を形成することができる１つまたは複数のカルボニル基を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
式Ｉの前記架橋剤が、π共役している、請求項１から４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記架橋剤が、以下に示される式ＩＩを有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の複合体。
【化２】
2019511455.tif 000076
（式中、
Ｙは、存在しないか、結合であるか、または連結基である）
【請求項７】
Ｙが、存在しない、請求項１から６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記架橋剤が、以下に示される式ＩＩＩを有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の複合体。
【化３】
2019511455.tif 000077
【請求項９】
前記π共役モノマーが、それぞれ独立して、以下に示される式ＩＶを有する部分を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の複合体。
【化４】
2019511455.tif 000078
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素または基：
−Ｘ−Ｑ
［式中、
Ｘは、存在しない、（１〜３０Ｃ）アルキレン、−Ｏ−（１〜３０Ｃ）アルキレン、−Ｓ−（１〜３０Ｃ）アルキレン、−ＮＨ−（１〜３０Ｃ）アルキレン、（２〜３０Ｃ）アルケニレン、（２〜３０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−  −［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−Ｓｉ（Ｒｚ）２］ｎ（式中、Ｒｚは、（１〜４Ｃ）アルキルであり、ｎは、１から３０である）、−［（ＣＨ２）ｎ’−（ＣＦ２）ｍ’］−（式中、ｎ’は、０〜２０であり、ｍ’は、１〜３０である）からなる群から選択され、
Ｑは、水素、ハロゲン、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ビオチン、−ストレプトアビジン、−抗体、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン、ならびにシラン、シロキサン、アクリレート、エポキシ、スチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される末端基である］
であり、
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、置換基で任意選択的に置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり；
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、置換基で任意選択的に置換された環系（例えば、フェニルまたはフルオレン環）を形成するように連結しており；
但し、式ＩＶの少なくとも１つのモノマーにおいて、Ｑは、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチン、−ストレプトアビジン、抗体、またはアクリレート、エポキシおよびスチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される基であるか、または選択される基を含む）
【請求項１０】
前記π共役モノマーが、それぞれ独立して、以下に示される式Ｖに従う構造を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載の複合体。
【化５】
2019511455.tif 000079
（式中、Ａ１およびＡ２は、独立して、存在しないか、または以下の部分：
【化６】
2019511455.tif 000080
のいずれか１つから選択され、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、請求項９において定義される基Ｒ１およびＲ２であるか、または、それぞれ独立して、水素または基：
−Ｘ１−Ｑ１
［式中、
Ｘ１は、（１〜３０Ｃ）アルキレン、（２〜３０Ｃ）アルケニレン、（２〜３０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−、−［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−Ｓｉ（Ｒｚ）２］ｎ−（式中、Ｒｚは、（１〜４Ｃ）アルキルであり、ｎは、１から３０である）、−［（ＣＨ２）ｎ’−（ＣＦ２）ｍ’］−（式中、ｎ’は、０〜２０であり、ｍ’は、１〜３０である）からなる群から選択され、
Ｑ１は、水素、ハロゲン、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ビオチン、−ストレプトアビジン、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン（例えばベタイン）、ならびにシラン、シロキサン、アクリレート、エポキシ、スチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される末端基である］
であり、
Ｍは、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｃｕ、ＰｄおよびＡｕから選択される金属であり；
Ｌは、ハロ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＰから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択的に含む（１〜３０Ｃ）ヒドロカルビル、または（１〜４Ｃ）アルキル、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的に置換されたアリールまたはヘテロアリール基からなる群から独立して選択される配位子であり；
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ（特にＮ、ＯまたはＳ）から選択されるヘテロ原子であり、
任意選択的にπ共役した環式または多環式基（例えばフルオレン）であり；
ｐは、１から４であり；
但し、式Ｖの少なくとも１つのモノマーにおいて、Ｑ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジン、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン（ベタイン）から選択される基であるか、または選択される基を含む）
【請求項１１】
前記π共役モノマーが、それぞれ独立して、下記式ＶＩにより定義される構造を有する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の複合体。
【化７】
2019511455.tif 000081
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、請求項９において定義される通りであり；
Ａ１およびＡ２は、請求項１０において定義される通りである）
【請求項１２】
Ａ１およびＡ２が、独立して、存在しないか、または以下の部分のいずれか１つから選択される、請求項１０または１１に記載の複合体。
【化８】
2019511455.tif 000082
（式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｍ、Ｌおよびｐは、請求項１０において定義される通りである）
【請求項１３】
Ａ１またはＡ２が、存在しない、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
Ａ１およびＡ２の両方が存在しない、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、基：
−Ｘ−Ｑ
（式中、
ＸおよびＱは、請求項９において定義された通りである）
である、請求項９から１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、非分岐／分岐（１〜３０Ｃ）アルキレン、（２〜３０Ｃ）アルケニレン、（２〜３０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）ｍ（ＣＦ２）ｎ］−、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−、−［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−Ｓｉ（Ｒｚ）２］ｎ−（式中、Ｒｚは、メチルであり、ｎは、１から３０であり、ｍは、０から３０である）からなる群から独立して選択され；
ＱおよびＱ１は、独立して、水素、ハロゲン、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ビオチン、−ストレプトアビジン、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン（ベタイン）、ならびにアクリレート、エポキシおよびスチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｃｕ、ＰｄおよびＡｕから選択される金属であり；
Ｌは、ハロ、またはＮ、Ｏ、Ｓ、ＳｉもしくはＰから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択的に含む（１〜３０Ｃ）ヒドロカルビル、または（１〜４Ｃ）アルキル、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的に置換されたアリールまたはヘテロアリール基からなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から４であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、またはそれを含む、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記π共役架橋ポリマーが、以下の構造のいずれかから選択される８０〜９９．９モル％のπ共役モノマーを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の複合体。
【化９】
2019511455.tif 000083
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、−（ＣＨ２）ｎＲ５０および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＲ５０からそれぞれ独立して選択され；
ｎは、１から１５であり、Ｒ５０は、Ｈ、（１〜１５Ｃ）アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（１〜６Ｃ）アルキル、−ＣＯ２Ｎａ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＯＣ（Ｏ）−ビオチンおよび−ＯＳＯ３Ｎａから選択され；
Ｘは、Ｏである）
【請求項１８】
Ｒ１およびＲ２が、両方とも、−（ＣＨ２）７ＣＨ３、−（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｅｔ、−（ＣＨ２）１０ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ２、−（ＣＨ２）１１ＯＳＯ３Ｎａ、−（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｅｔ、−（ＣＨ２）１０ＣＯ２Ｎａ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ３、−（ＣＨ２）１１ＯＣ（Ｏ）−ビオチンおよび−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１２ＣＨ３から選択され；Ｒ３およびＲ４が、２−エチルヘキシル、−（ＣＨ２）１１ＯＳＯ３Ｎａ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３および−（ＣＨ２）１０ＣＯ２Ｎａから選択される、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記架橋剤が、以下の構造を有する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の複合体。
【化１０】
2019511455.tif 000084
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか１項に記載の複合体を形成する方法であって、
（ｉ）エマルション重合、ミニエマルション重合または分散重合技術により前記ナノ粒子を形成して、ナノ粒子の水性懸濁液を提供するステップと；
（ｉｉ）前記ナノ粒子を前記薬物分子、生体分子または細胞と反応させて、前記複合体の水性懸濁液を形成するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、クロスカップリング重合反応（例えば鈴木および／またはスティル反応）により形成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ナノ粒子の水性懸濁液を精製するステップをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ナノ粒子の水性懸濁液が、前記ナノ粒子の水性懸濁液を少なくとも１種の有機溶媒と接触させることにより精製される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１種の有機溶媒が、極性および非極性溶媒からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種の有機溶媒が、メタノールまたはプロパノールである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的画像化、フローサイトメトリー、または感知のための、請求項１から１８のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本発明は、光ルミネッセンス性ナノ粒子と、薬物分子、生体分子または細胞との間に形成された複合体に関する。さらに、本発明は、これらの複合体の製造方法、および生物学的画像化用途におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子染料および量子ドット（ＱＤ）は、これまで、細胞によりそれらが内在化され、それにより個々の細胞小器官が染色され得るいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ生体画像化用途において有望であることが示されている。しかしながら、ＱＤの場合において毒性重金属種（例えばカドミウムおよび鉛）を放出し得る光酸化分解の傾向によって、それらは最終的に、人間に対して、または長期の細胞追跡用途において使用することができない。さらに、そのような重金属の使用は、ある特定の領域において厳しく制限されており、したがってより毒性の低い代替物の必要性が強調される。
【０００３】
したがって、明るく、安定した、高純度でより毒性の低い、生物学的画像化用途のための分子染料およびＱＤの実現可能な代替物が必要とされている。
【０００４】
本発明は、上記を念頭に置いて考案された。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第１の態様によれば、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合した薬物分子、生体分子または細胞を含む複合体であって、
薬物分子、生体分子、または細胞は、
（ｉ）光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子上に存在する官能基と、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する官能基との反応により形成された共有結合；
（ｉｉ）光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に共有結合した第１の部分と、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分との間の親和性対形成
により、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合しており、
光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、π共役架橋ポリマーまたはその塩から形成され、π共役架橋ポリマーは、
ａ）８０〜９９．９モル％のπ共役モノマーと、
ｂ）０．１〜２０モル％の以下に示される式Ｉを有する架橋剤と、
【化１】
2019511455.tif 000003
（式中、
Ｚ１およびＺ２は、モノマー部分であり、
Ｙは、存在しないか、結合であるか、または連結基である）
ｃ）薬物分子、生体分子または細胞上の官能基と反応して、ナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞に連結する共有結合を形成することができる、１または複数の官能基（例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニルまたはチオール基）、または、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分と親和性対形成することができる第１の部分と
を含む、複合体が提供される。
【０００６】
本発明の第２の態様によれば、水性媒体内に分散された、本明細書において定義されるような複数の複合体を含む水性組成物が提供される。
【０００７】
本発明の第３の態様によれば、本明細書において定義されるような複合体を形成する方法であって、
（ｉ）エマルション重合、ミニエマルション重合または分散重合技術によりナノ粒子を形成して、ナノ粒子の水性懸濁液を提供するステップと；
（ｉｉ）ナノ粒子を、薬物分子、生体分子または細胞と反応させるか、および／または混合して、複合体の水性懸濁液を形成するステップと
を含む、方法が提供される。
【０００８】
本発明の第４の態様によれば、本明細書において定義される方法により得ることができる、得られる、または直接的に得られる複合体または水性組成物が提供される。
【０００９】
本発明の第５の態様によれば、本明細書において定義される複合体または水性組成物の、生物学的画像化のための使用が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（定義）
別段に指定されない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される次の用語は、以下に記載される次の意味を有する。
【００１１】
本明細書における「親和性対形成」または「親和性対」への言及は、ナノ粒子上の第１の部分と、薬物または生体分子に結合した第２の部分との間の非共有結合的相互作用を指す。分子間の非共有結合は、１つまたは複数のイオン性、疎水性、ファンデルワールスおよび／または水素結合相互作用により誘引され得る。相互作用の強さは、生体液および細胞培養培地中でナノ粒子および薬物または生体分子を互いに結合させ保持するために十分高い必要がある。
【００１２】
本明細書において、「スティル反応」（スティルカップリングとしても知られる）への言及は、パラジウムにより触媒される、ｓｐ２混成有機ハライドに対して有機スズ化合物が関与する周知の化学反応カップリングを示す。この反応は、有機合成において広く使用される。共役ポリマー系の生成のためのスティル重合反応の使用は、例えば、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２０１１，  １１１，  １４９３−１５２８に記載されている。一般的反応スキームを以下に示す。
（Ｒ）３Ｓｎ−Ｒ１  ＋  Ｘ−Ｒ２  →  Ｒ１−Ｒ２
式中、
Ｒは、（１〜６Ｃ）アルキル等のヒドロカルビル置換基であり；
Ｒ１およびＲ２は、共に、カップリングされるモノマー単位であり；
Ｘは、反応基、典型的にはＣｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハライド、またはトリフレート、ＣＦ３ＳＯ３−等の擬ハライドである。
【００１３】
「鈴木反応」への言及は、アリール−またはビニル−ボロン酸と、アリール−またはビニル−ハライドとの周知の有機反応を示す。鈴木反応は、典型的には、パラジウム（０）錯体触媒により触媒される。この反応は、化学分野において周知であり、以下に示される一般的反応スキームに従う。
【化２】
2019511455.tif 000004
【００１４】
この反応はまた、ハライドの代わりにトリフレート（ＯＴｆ）等の擬ハライドを用いても機能する。ボロン酸の代わりにボロン酸エステルおよび有機トリフルオロボレート塩が使用されてもよい。ポリマー合成の場合、Ｒ１およびＲ２は、モノマー単位を表す。
【００１５】
「ヒドロカルビル」という用語は、直鎖および分岐鎖両方の、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。
【００１６】
「アルキレン」という用語は、直鎖および分岐鎖アルキレン基の両方を含む。「プロピレン」等の個々のアルキレン基への言及は、直鎖型のみに特定され、「イソプロピレン」等の個々の分岐鎖アルキレン基への言及は、分岐鎖型のみに特定される。例えば、「（１〜２０Ｃ）アルキレン」は、（１〜１４Ｃ）アルキレン、（１〜１２Ｃ）アルキレン、プロピレン、イソプロピレンおよびｔ−ブチレンを含む。本明細書において言及される他の基にも、同様の規則が適用される。
【００１７】
「アルケニレン」および「アルキニレン」という用語は、直鎖および分岐鎖両方の、アルケニルおよびアルキニル基を含む。
【００１８】
「アリール」という用語は、本明細書において、例えば、フェニル、ナフタレン、スピロフルオレンまたはアントラセン環等の芳香族炭素環系を指すように使用される。一実施形態において、「アリール」は、フェニル、ナフタレンまたはスピロフルオレン環であり、特にフェニルまたはスピロフルオレンである。
【００１９】
「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」という用語は、１個または複数（例えば１〜４個、特に１個、２個または３個）のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ）を組み込んだ、芳香族単環式、二環式または三環式環を意味する。ヘテロアリール基の例は、５個から１８個の環員を含有する単環式、二環式および三環式基である。ヘテロアリール基は、例えば、５員もしくは６員単環式環、８員、９員もしくは１０員二環式環、または１５員、１６員、１７員もしくは１８員三環式環であってもよい。好適には、二環式または三環式環系における各環は、５個または６個の環原子を含む。
【００２０】
ポリマーに関して本明細書において使用される「架橋」という用語は、線形または超分岐ポリマーを包含しない。超分岐ポリマーのポリマー「分岐」は、全て単一の焦点から生じている。対照的に、本発明の一部を形成する架橋ポリマーのポリマーストランドは、全て単一の焦点に集束しない。むしろ、本発明の一部を形成する架橋ポリマーのストランドは、ポリマー全体を通して互いに無作為に架橋しており、架橋部位のいずれも、超分岐ポリマーの意味での単一の焦点を表すことはない。さらに、本発明の一部を形成するポリマー内において、所与の架橋部位から４つ以上のポリマー鎖が生じており、一方、超分岐ポリマー内の単一の焦点（または他の分岐点）は、３配位のみである。さらに、本発明の一部を形成する架橋ポリマーは、全ての溶媒（水性、有機、極性および非極性溶媒を含む）に不溶となる程度まで架橋しており、一方、超分岐ポリマーは、一般的に可溶である。
【００２１】
本明細書において使用される「塩」という用語は、任意の好適な塩を包含する。好適な塩は、これらに限定されないが、カルボン酸塩（例えばＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｍ＋（式中、Ｍ＋は、好適なカチオン、例えばＮａ＋である））、アンモニウム塩（例えばＲ−ＮＨ３＋Ｘ−（式中、Ｘ−は、好適なアニオン、例えばＣｌ−である））、アルコキシド（例えばＲ−Ｏ−Ｍ＋（式中、Ｍ＋は、好適なカチオン、例えばＮａ＋である））、チオール酸塩（例えばＲ−Ｓ−Ｍ＋（式中、Ｍ＋は、好適なカチオン、例えばＮａ＋である））、硫酸塩（例えばＲ−ＯＳＯ２Ｏ−Ｍ＋（式中、Ｍ＋は、好適なカチオン、例えばＮａ＋である））、亜硫酸塩（例えばＲ−ＳＯ２Ｏ−Ｍ＋）、亜リン酸塩（例えばＲＯＰＯ２ＯＮａ）、および両性イオン性塩（例えばベタイン）を含む。
【００２２】
（本発明の複合体）
上で議論されたように、本発明は、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合した薬物分子、生体分子または細胞を含む複合体を提供し、
薬物分子、生体分子または細胞は、
（ｉ）光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子上に存在する官能基と、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する官能基との反応により形成された共有結合；
（ｉｉ）光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に共有結合した第１の部分と、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分との間の親和性対形成
により、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合しており、
光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、π共役架橋ポリマーまたはその塩から形成され、π共役架橋ポリマーは、
ａ）８０〜９９．９モル％のπ共役モノマーと、
ｂ）０．１〜２０モル％の以下に示される式Ｉを有する架橋剤と、
【化３】
2019511455.tif 000005
（式中、
Ｚ１およびＺ２は、モノマー部分であり、
Ｙは、存在しないか、結合であるか、または連結基である）
ｃ）薬物分子、生体分子または細胞上の官能基と反応して、ナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞に連結する共有結合を形成することができる、１または複数の官能基（例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニルまたはチオール基）、または、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分と親和性対形成することができる第１の部分と
を含む。
【００２３】
上で示されたように、一実施形態において、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する官能基と反応して、ナノ粒子と薬物分子、生体分子または細胞との間に共有連結／結合を形成することができる、１つまたは複数の官能基を含む。任意の好適な共有連結で十分である。一実施形態において、共有連結／結合は、アミド、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、イミン、エナミンまたはエステル連結等から選択される。
【００２４】
一実施形態において、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、光ルミネッセンス性π共役ポリマーナノ粒子である。
【００２５】
好適には、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、
（ｉ）薬物分子、生体分子または細胞上に存在するカルボキシ基と反応して、ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするエステル結合を形成することができる１つまたは複数のヒドロキシル基；
（ｉｉ）薬物分子、生体分子または細胞上に存在するカルボキシ基と反応して、ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするアミド結合を形成することができる１つまたは複数のアミノ基；
（ｉｉｉ）薬物分子、生体分子または細胞上に存在するアミノ基と反応して、ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするアミド結合を形成することができる１つまたは複数のカルボキシ基；
（ｉｖ）薬物分子、生体分子または細胞上に存在するチオール基と反応して、ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするジスルフィド結合を形成することができる１つまたは複数のチオール基；
（ｖ）薬物分子、生体分子または細胞上に存在するチオール基と反応して、ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするスルフィド結合を形成することができる１つまたは複数のビニル基；および／または
（ｖｉ）薬物分子、生体分子または細胞上に存在するアミン基と反応して、ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞にカップリングするイミンまたはエナミン結合を形成することができる１つまたは複数のカルボニル基
を含む。
【００２６】
好適には、少なくともある割合の官能基が、ナノ粒子の表面上に存在する。
【００２７】
また、光ルミネッセンスポリマーナノ粒子は、ナノ粒子を、薬物分子、生体分子または細胞に結合させるように、ナノ粒子に共有結合し得るある特定の部分と、薬物分子、生体分子または細胞との間に生じ得る親和性対形成／結合により、薬物分子、生体分子または細胞に結合されてもよいことが理解される。したがって、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、それに共有結合する第１の部分を有してもよく、これは、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２の部分と高い親和性で結合する。例えば、親和性対形成を形成する第１または第２の部分の一方がストレプトアビジンであり、他方がビオチンであってもよく、一方が抗体であり、他方が抗原であってもよく、一方がエピトープであり、他方がパラトープであってもよく、一方がＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ鎖であり、他方が相補的ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡ鎖であってもよく、または一方が薬物であり、他方が薬物が結合する受容体であってもよい。したがって、高い親和性で互いに結合する好適な部分の例は、ストレプトアビジン／ビオチン；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡと相補的ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ；抗体／抗原；ならびにパーフルオロアルキル化合物を含む。
【００２８】
一実施形態において、親和性対形成を形成する第１または第２の部分の一方はストレプトアビジンであり、他方はビオチンである。さらなる実施形態において、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合する第１の部分は、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２のビオチン部分に高い親和性で結合するストレプトアビジン分子である。別の実施形態において、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子に結合する第１の部分は、薬物分子、生体分子または細胞上に存在する第２のストレプトアビジン部分に高い親和性で結合するビオチンである。
【００２９】
一実施形態において、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、共有アミド結合（ナノ粒子または薬物／生体分子または細胞の一方に存在するカルボキシ基と、他方に存在するアミノ基との反応により形成される）により、あるいは、ナノ粒子または薬物／生体分子または細胞の一方に存在するストレプトアビジン部分と、他方に存在するビオチン部分との間の相互作用により、薬物分子、生体分子または細胞に結合している。
【００３０】
別の実施形態において、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子は、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子を薬物分子、生体分子または細胞に共役させるために使用される官能基（複数可）に加えて、１つまたは複数の追加の官能基を含む。１つまたは複数の追加の官能基は、光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子の親水性を増加させるのに役立ち得る。したがって、一実施形態において、１種または複数の追加の官能基は、親水性であってもよい。好適な親水性官能基は、−ＯＳＯ３Ｈ、またはその好適な塩（例えば−ＯＳＯ３Ｎａ）、−ＳＯ３Ｈまたはその好適な塩（例えば−ＳＯ３Ｎａ）、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎＨまたはその好適な末端官能基（例えば−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎＭｅ）、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎＯＨまたはその好適な末端官能基（例えば−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎＯＭｅ）、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−またはその好適な末端官能基（例えば−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−Ｍｅ）、−［ＯＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−またはその好適な末端官能基（例えば−［ＯＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−Ｍｅ）、ホスファイト−ＯＰＯ２ＯＮａおよび両性イオン性塩（例えばベタイン）を含む。
【００３１】
（光ルミネッセンス性ポリマーナノ粒子）
上で示されたように、ナノ粒子は、π共役架橋ポリマーまたはその塩から形成され、π共役架橋ポリマーは、
ａ）８０〜９９．９モル％のπ共役モノマーと、
ｂ）０．１〜２０モル％の以下に示される式Ｉを有する架橋剤とを含む。
【化４】
2019511455.tif 000006
（式中、
Ｚ１およびＺ２は、モノマー部分であり、
Ｙは、存在しないか、結合であるか、または連結基である）
【００３２】
本発明の複合体において利用されるナノ粒子は、技術水準と比較していくつかの利点を提供する。重要なことに、ナノ粒子は、π共役架橋ポリマーから形成される。π共役架橋ポリマー自体は、π共役モノマーの骨格を備え、架橋部分がπ共役骨格に沿って散在している。架橋部分の構造は、１つのモノマーが２つのポリマー骨格鎖にわたるような構造である。したがって、ポリマーの構築中、π共役骨格鎖への架橋部分の組み込みが、架橋部分の両側でのさらなるπ共役骨格鎖の拡大のための直接的な部位を提供する。したがって、本発明のナノ粒子組成物を形成するポリマー内の架橋は、モノマー単位の連結中にｉｎ−ｓｉｔｕで形成され、これは、架橋度が単に架橋剤の濃度を変更することによって容易に調節され得ることを意味する。そのπ共役構造により、この種の架橋ポリマーは、良好な電子非局在化特性を提供する。そのようなポリマーはまた、架橋剤を介した隣接骨格鎖間の電子非局在化の可能性を提供する。上述の架橋のこの直接的なｉｎ−ｓｉｔｕ形成とは対照的に、先行技術のＣＰＮは、ある特定の条件下で架橋されやすい、特別に修飾されたペンダント側鎖を有するモノマーから形成されるポリマーの調製に焦点を置いている。実行可能な方法ではあるが、そのような手法は、必然的に、骨格鎖をそれらの間の架橋を誘導するのに好適な条件下に置く前に、ポリマー骨格鎖を形成する最初のステップを必要とする。この複数ステップの手法は、本発明の組成物を形成するポリマーを調製するために使用される手法より複雑であり、ポリマー鎖間の架橋度は、制御するのが特に困難である。
【００３３】
製造の単純性および調整可能性とは別に、本発明の一部を形成するπ共役架橋ポリマーは、特に高いレベルの純度を示すナノ粒子組成物を得るのに適している。不溶性の架橋剤は、π共役架橋ポリマーが溶媒和性溶媒と接触した際に膨潤を示すように、ナノ粒子組成物を水および有機溶媒に不溶性とする。このようにポリマーを膨潤させることにより、触媒および他の試薬等のポリマーネットワーク内に捕捉された不純物は、洗浄によって容易に除去され得る。したがって、先行技術の組成物とは異なり、得られる高純度光ルミネッセンス性ナノ粒子組成物は、生体画像化等の生物学的用途、および他のｉｎ  ｖｉｖｏプロセスにおける使用に極めて好適である。
【００３４】
式Ｉに関して、Ｚ１は、第１のポリマー鎖を形成するように、π共役ポリマーおよび芳香族モノマーと重合することができる。Ｚ２は、第１のポリマー鎖の隣に第２のポリマー鎖を形成し、それにより２つの隣接するポリマー鎖を互いに連結するように、π共役ポリマーおよび芳香族モノマーと重合することができる。したがって、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立して、本明細書において定義されるモノマーの一部または全てを形成する部分の例のいずれかから選択され得る。一実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、π共役している。別の実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、芳香族である。
【００３５】
さらに式Ｉに関して、Ｚ１および／またはＺ２は、（π共役モノマーへの結合のための）２つよりも多くの共有結合点を有してもよい。例えば、Ｚ１および／またはＺ２は、３つの共有結合点を有してもよい。
【００３６】
さらに式Ｉに関して、Ｙは、任意の好適な連結基であってもよく、またπ共役または非π共役であってもよい。例示的な連結基は、原子（例えばＯ、Ｓ）、金属（例えば、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｐｄ、Ａｕ）または他の基（例えば、−ＳｉＲ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ６Ｈ４−）を含む。Ｙは、結合である場合、単結合または二重結合であってもよい。Ｙが存在しない場合、Ｚ１は、Ｚ２に直接連結し、例えば、Ｚ１は、Ｚ２に縮合している、または共通の（共有の）スピロ炭素原子によってそれに接続している。
【００３７】
式（Ｉ）の架橋剤は、様々な形態をとり得る。特に、Ｙは、存在しなくてもよく、結合であってもよく、または連結基であってもよい。
【００３８】
Ｙが存在しない（ならびにＺ１およびＺ２が互いに直接連結している）場合、架橋剤は、下記式（Ｉａ）に従う構造を有し得る。
【化５】
2019511455.tif 000007
そのような架橋剤の例は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化６】
2019511455.tif 000008
そのような実施形態において、Ｚ１がＺ２に縮合している、またはＺ１およびＺ２が１つもしくは複数の共通する原子を共有するという意味で、Ｚ１はＺ２に直接連結していてもよい。
【００３９】
Ｙが結合（単結合または二重結合）である場合、架橋剤は、下記式（Ｉｂ）に従う構造を有し得る。
【化７】
2019511455.tif 000009
そのような架橋剤の例は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化８】
2019511455.tif 000010
【００４０】
Ｙが連結基である場合、連結基は、π共役または非π共役であってもよい。π共役連結基を有する架橋剤の例は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化９】
2019511455.tif 000011
非π共役連結基を有する架橋剤の例は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化１０】
2019511455.tif 000012
【００４１】
ある特定の実施形態において、Ｙが連結基である場合、連結基は、追加的なモノマー部分Ｚｎを含んでもよい。そのような実施形態において、Ｙは、下記式（Ａ）に従う構造を有し得る。
【化１１】
2019511455.tif 000013
（式中、Ｙ１は、本明細書において定義されるような連結基であり；
Ｚは、モノマー部分であり、本明細書において定義されるＺ１またはＺ２に関して定義された通りであり；
ｎは、１または１よりも大きい（例えば１または２））
一実施形態において、ｎは１であり、架橋剤は、下記式（Ｉｃ）に従う構造を有し得る。
【化１２】
2019511455.tif 000014
Ｙ１がπ共役連結基である場合、この種の例示的架橋剤は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化１３】
2019511455.tif 000015
代替として、Ｙ１が原子の連結基である場合、この種の例示的架橋剤は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化１４】
2019511455.tif 000016
代替として、式（Ｉｃ）の架橋剤は、（π共役モノマーへの結合のための）異なる数の共有結合点を有してもよい。例えば、架橋剤は、以下に示すように、５つ、７つ、８つまたは９つの共有結合点を含有してもよい。
【化１５】
2019511455.tif 000017
【００４２】
別の実施形態において、モノマー部分Ｚ１およびＺ２のそれぞれは、２つの別個の結合によりＹに結合してもよい。この種の架橋剤は、以下に示される式（Ｉｄ）に従う構造を有し得る。
【化１６】
2019511455.tif 000018
一実施形態において、Ｙが式Ａ中で定義された通りである場合、架橋剤は、下記式（Ｉｄ’）に従う構造を有し得る。
【化１７】
2019511455.tif 000019
（式中、Ｙ１は、本明細書において定義されるような連結基であり；
Ｚは、モノマー部分であり、本明細書において定義されるＺ１またはＺ２に関して定義された通りである）
Ｙ１が原子の連結基である場合、この種の例示的架橋剤は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化１８】
2019511455.tif 000020
代替として、式（Ｉｄ’）の架橋剤は、（π共役モノマーへの結合のための）異なる数の共有結合点を有してもよい。例えば、架橋剤は、４つ（Ｚは共有結合点を有さない）、５つ、７つ、８つまたは９つの共有結合点を含有してもよい。
【００４３】
一実施形態において、Ｙは、式（Ａ）において定義された通りであり、ｎは、２である。そのような実施形態において、架橋剤は、下記式（Ｉｅ）に従う構造を有し得る。
【化１９】
2019511455.tif 000021
（式中、Ｙ１は、本明細書において定義されるような連結基であり；
各Ｚは、独立してモノマー部分であり、本明細書において定義されるＺ１またはＺ２に関して定義された通りである）
Ｙ１が非π共役連結基である場合、そのような架橋剤の例は、これらに限定されないが、以下を含む。
【化２０】
2019511455.tif 000022
【００４４】
一実施形態において、ナノ粒子は、同一の架橋剤、または複数の異なる架橋剤を含む。
【００４５】
別の実施形態において、Ｙが連結基である場合、前記連結基は、追加的なモノマー部分Ｚを含まない。そのような実施形態において、Ｚ１およびＺ２は、架橋剤中に存在する唯一のモノマー部分である。
【００４６】
別の実施形態において、架橋剤は、以下に示される式ＩＩを有する。
【化２１】
2019511455.tif 000023
（式中、
Ｙは、存在しないか、結合であるか、または連結基である）
【００４７】
一実施形態において、Ｙは、存在せず、したがってＺ１は、Ｚ２に直接連結し、例えば、Ｚ１は、Ｚ２に縮合している、または１つもしくは複数の共通の（共有の）原子（例えばスピロ炭素原子）によってそれに接続している。好適には、Ｚ１は、共通のスピロ炭素原子によってＺ２に接続している。
【００４８】
別の実施形態において、架橋剤は、以下に示される式ＩＩＩを有する。
【化２２】
2019511455.tif 000024
【００４９】
好適には、架橋剤は、以下の構造を有する。
【化２３】
2019511455.tif 000025
【００５０】
ナノ粒子組成物は、８０〜９９．９モル％の１つまたは複数のπ共役モノマーを含む。重合してナノ粒子を形成し得る任意の好適なπ共役モノマーが使用され得る。
【００５１】
一実施形態において、本発明のπ共役ポリマーは、炭素−炭素三重結合をまったく含まない。したがって、一態様において、本発明は、炭素−炭素三重結合をまったく含まないπ共役架橋ポリマーに関する。炭素−炭素三重結合中の電子は、π電子が完全に非局在化していない構造を生じる。
【００５２】
当業者には、架橋π共役ポリマーを形成するために使用されるモノマー単位が、単独で、または組み合わせてπ共役環系を有するモノマーを提供する、異なる化学的部分の選択を含み得ることが理解される。
【００５３】
また、ナノ粒子を形成するために使用されるπ共役ポリマーは、薬物分子、生体分子または細胞上の官能基と反応し得る１または複数の官能基（例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニルまたはチオール基）、または、薬物分子、生体分子または細胞上の第２の部分（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、抗体または第１の部分の抗体に結合することができるタンパク質）と非共有結合的な親和性対形成を形成することができる第１の部分（例えば、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体または第２の部分の抗体により結合され得るタンパク質）、またはポリマーナノ粒子が形成されたら第１の部分に結合するように反応し得る官能基をさらに含まなければならないことが、当業者により理解される。
【００５４】
単独で、または任意の好適な組合せでモノマー単位内に存在し得る好適なπ共役環系の例は、単環式アリール基（例えばフェニル環）、多環式アリール環系（例えばフルオレン環系、ナフチル環）、単環式へテロアリール環（例えばチオフェン環）もしくは多環式ヘテロアリール環系（例えばベンゾチアゾール、ベンゾジアザタゾール環、チエノ［３，２−ｂ］チオフェン、もしくはピロロ［３，４−ｃ］ピロール）、または他の共役ヘテロ環式環系（例えばピロロ−ピロール−１，４−ジオン環）を含み、各部分は、１つまたは複数の有機基、例えば１から３０個の炭素原子を任意選択的に含み、１つまたは複数のヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ）を任意選択的に含むヒドロカルビル置換基で任意選択的に置換され、そのような部分の２つ以上が存在する場合、それらは、結合または原子の連結（例えばビアリールアミンまたはトリアリールアミン基の場合等）により互いに連結され得、但し、少なくとも１つのモノマーは、本明細書において定義されるような少なくとも１つの官能基（例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニルまたはチオール基）または第１の部分（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、抗体または第２の部分の抗体に結合し得るタンパク質）、あるいはポリマーナノ粒子が形成されたら第１の部分（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）に共有結合し得る官能基であるか、またはそれを含む置換基を有する。
【００５５】
π共役モノマーの一部または全てを形成し得る具体的な部分のさらなる例は、以下のいずれか１つを含む。
【化２４】
2019511455.tif 000026
（式中、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ（特にＮ、ＯまたはＳ）から選択されるヘテロ原子であり；
Ａｒは、任意選択的にπ共役した環式または多環式基（例えばフルオレン）であり；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素あるいは有機置換基（例えば、１から３０個の炭素原子を任意選択的に含み、１つまたは複数のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ）を任意選択的に含む任意選択的に置換されたヒドロカルビル置換基、または任意選択的に置換された芳香族もしくはヘテロ芳香族基、または本明細書において定義されたようなＲ１もしくはＲ２）であり；
Ｍは、金属（例えば、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｃｕ、Ｐｄ、またはＡｕ）であり；
Ｌは、配位子（例えば、ハライド、または１から３０個の炭素原子を任意選択的に含み、１つまたは複数のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、またはＰ）を任意選択的に含むヒドロカルビル置換基、または芳香族もしくはヘテロ芳香族基）である）；
上記構造のそれぞれは、１つまたは複数の有機置換基（例えば、１から３０個の炭素原子を任意選択的に含み、１つまたは複数のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ）を任意選択的に含むヒドロカルビル置換基、または芳香族もしくはヘテロ芳香族基）によって任意選択的にさらに置換されていてもよく；
但し、少なくとも１つのモノマーは、少なくとも１つの官能基（例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニルまたはチオール基）、または本明細書において定義されるような第１の部分（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）、またはポリマーナノ粒子が形成されたら第１の部分（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）に共有結合し得る官能基であるか、またはそれを含む置換基を有する。
【００５６】
上記構造内の基＞Ｘ（＝Ｘ）２の具体例は、＞ＳＯ２である。
【００５７】
一実施形態において、π共役モノマーの一部または全てを形成し得る具体的な部分は、以下のいずれか１つを含む。
【化２５】
2019511455.tif 000027
（式中、Ｍ、Ｌ、Ｒ３およびＲ４は、上で定義された通りである）
【００５８】
一実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下に示される式ＩＶを有する部分を含む。
【化２６】
2019511455.tif 000028
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素または基：
−Ｘ−Ｑ
［式中、
Ｘは、存在しないか、（１〜３０Ｃ）アルキレン、−Ｏ−（１〜３０Ｃ）アルキレン、−Ｓ−（１〜３０Ｃ）アルキレン、−ＮＨ−（１〜３０Ｃ）アルキレン、（２〜３０Ｃ）アルケニレン、（２〜３０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−  −［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−Ｓｉ（Ｒｚ）２］ｎ（式中、Ｒｚは、（１〜４Ｃ）アルキルであり、ｎは、１から３０である）、−［（ＣＨ２）ｎ’−（ＣＦ２）ｍ’］−（式中、ｎ’は、０〜２０であり、ｍ’は、１〜３０である）からなる群から選択され、
Ｑは、水素、ハロゲン、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ビオチン、−ストレプトアビジン、−抗体、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン（例えばベタイン）、ならびにシラン、シロキサン、アクリレート、エポキシ、スチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される末端基である］
であり、
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、置換基（例えば、上記式−Ｘ−Ｑの１つまたは複数の基）によって任意選択的に置換されたアリールまたはヘテロアリール基であり；
あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、置換基（例えば、上で定義された基−Ｘ−Ｑ）によって任意選択的に置換された環系（例えば、フェニルまたはフルオレン環）を形成するように連結しており；
但し、式ＩＶの少なくとも１つのモノマーにおいて、Ｑは、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチン、−ストレプトアビジンまたは抗体から選択される基であるか、または選択される基を含む）  
【００５９】
別の実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下に示される式Ｖにより定義される構造を有する。
【化２７】
2019511455.tif 000029
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、上で定義された通りであり；
Ａ１およびＡ２は、存在しないか、またはそれぞれ独立して、存在しないか、もしくは以下の部分のいずれか１つから選択される。
【化２８】
2019511455.tif 000030
［Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、上で定義される通りであるか、または本明細書において定義されるような基Ｒ１およびＲ２であるか、またはそれぞれ独立して、水素または基：
−Ｘ１−Ｑ１
［式中、
Ｘ１は、（１〜３０Ｃ）アルキレン、（２〜３０Ｃ）アルケニレン、（２〜３０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−、−［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−Ｓｉ（Ｒｚ）２］ｎ−（式中、Ｒｚは、（１〜４Ｃ）アルキルであり、ｎは、１から３０である）、−［（ＣＨ２）ｎ’−（ＣＦ２）ｍ’］−（式中、ｎ’は、０から２０であり、ｍ’は、１から３０である）からなる群から選択され、
Ｑ１は、水素、ハロゲン、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ビオチン、−ストレプトアビジン、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン（例えばベタイン）、ならびにシラン、シロキサン、アクリレート、エポキシ、スチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される末端基である］
であり、
Ｍは、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｃｕ、ＰｄおよびＡｕから選択される金属であり；
Ｌは、ハロ、またはＮ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓもしくはＰから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択的に含む（１〜３０Ｃ）ヒドロカルビル、または（１〜４Ｃ）アルキル、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたアリールもしくはヘテロアリール基からなる群から独立して選択される配位子であり；
Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｇｅ、ＡｓまたはＳｅ（特にＮ、ＯまたはＳ）から選択されるヘテロ原子であり；
任意選択的にπ共役した環式または多環式基（例えばフルオレン）であり；
ｐは、１から４であり；
但し、式Ｖの少なくとも１つのモノマーにおいて、Ｑ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む］）
【００６０】
別の実施形態において、Ａ１およびＡ２は、存在しないか、または、以下のいずれか１つから独立して選択される。
【化２９】
2019511455.tif 000031
（式中、Ｍ、Ｌ、ｐ、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ上で定義された通りである）
【００６１】
別の実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下の式ＶＩにより定義される構造を有する。
【化３０】
2019511455.tif 000032
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ１およびＡ２は、上で定義された通りである）
【００６２】
別の実施形態において、Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または以下の部分のいずれか１つから選択される。
【化３１】
2019511455.tif 000033
（式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｍ、Ｌおよびｐは、上で定義された通りである）
【００６３】
別の実施形態において、Ａ１およびＡ２の両方が存在しない。
【００６４】
別の実施形態において、存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、それぞれ独立して、（１〜３０Ｃ）アルキレン、（２〜３０Ｃ）アルケニレン、（２〜３０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−、−［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−Ｓｉ（Ｒｚ）２］ｎ−（式中、Ｒｚは、メチルであり、ｎは、１から３０である）からなる群から選択され；
ＱおよびＱ１は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ビオチン、−ストレプトアビジン、−ＣＦ３、ＯＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＰＯ２ＯＨおよび両性イオン（例えばベタイン）、ならびにシラン、シロキサン、アクリレート、エポキシ、スチレンまたはそれらの塩から選択される重合性基から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｒｅ、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｃｒ、Ｃｕ、ＰｄおよびＡｕから選択される金属であり；
Ｌは、ハロ、またはＮ、Ｏ、Ｓ、ＳｉもしくはＰから選択される１つまたは複数のヘテロ原子を任意選択的に含む（１〜３０Ｃ）ヒドロカルビル、または（１〜４Ｃ）アルキル、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたアリールもしくはヘテロアリール基からなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から４であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む。
【００６５】
別の実施形態において、存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、それぞれ独立して、（１〜２０Ｃ）アルキレン、（２〜２０Ｃ）アルケニレン、（２〜２０Ｃ）アルキニレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−  −［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−、−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−（式中、ｎは、１から２０である）からなる群から選択され；
ＱおよびＱ１は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、−ＳＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−ビオチンもしくは−ストレプトアビジン、またはそれらの塩から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｒ、Ｃｕ、ＰｄおよびＡｕから選択される金属であり；
Ｌは、ハロ、またはＮ、Ｏ、もしくはＳから選択される１つもしくは複数のヘテロ原子を任意選択的に含む（１〜２０Ｃ）ヒドロカルビル、または（１〜４Ｃ）アルキル、ハロ、アリールもしくはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたアリールもしくはヘテロアリール基からなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から４であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む。
【００６６】
別の実施形態において、存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、それぞれ独立して、（１〜２０Ｃ）アルキレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−、−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−、−［Ｏ−ＣＨ２ＭｅＣＨ２］ｎ−および−［ＣＨ２ＭｅＣＨ２−Ｏ］ｎ−（式中、ｎは、１から２０である）からなる群から選択され；
ＱおよびＱ１は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、−ＳＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、アミノ、−ビオチンもしくは−ストレプトアビジン、またはそれらの塩から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒ、Ｐｔ、Ｃｒ、Ｃｕ、ＰｄおよびＡｕから選択される金属であり；
Ｌは、（１〜４Ｃ）アルキル、ハロ、アリールまたはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から４であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む。
【００６７】
別の実施形態において、存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、それぞれ独立して、（１〜２０Ｃ）アルキレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−（式中、ｎは、１から２０である）からなる群から選択され；
ＱおよびＱ１は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、−ＳＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、（１−４Ｃ）アルコキシカルボニル、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、アミノ、−ビオチンもしくは−ストレプトアビジン、またはそれらの塩から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒであり；
Ｌは、アリールまたはヘテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたアリールまたはヘテロアリールからなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から２であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む。
【００６８】
別の実施形態において、存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、それぞれ独立して、（４〜１２Ｃ）アルキレン、−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−および−［Ｏ−（ＣＨ２）２］ｎ−（式中、ｎは、１から１５である）からなる群から選択され；
ＱおよびＱ１は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、−ＳＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、（１〜４Ｃ）アルコキシカルボニル、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、アミノ、−ビオチンもしくは−ストレプトアビジン、またはそれらの塩から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒであり；
Ｌは、フェニルまたは６員へテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたフェニルまたは６員ヘテロアリールからなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から２であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む。
【００６９】
別の実施形態において、存在する場合には、
ＸおよびＸ１は、それぞれ独立して、（４〜１２Ｃ）アルキレンおよび−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−（式中、ｎは、１から１５である）からなる群から選択され；
ＱおよびＱ１は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、−ＳＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−Ｃ≡ＣＨ、（１−４Ｃ）アルコキシカルボニル、メチル、ヒドロキシル、カルボキシ、アミノ、−ビオチンもしくは−ストレプトアビジン、またはそれらの塩から選択される末端基であり；
Ｍは、Ｉｒであり；
Ｌは、フェニルまたは６員へテロアリールから選択される１つまたは複数の置換基によって任意選択的に置換されたフェニルまたは６員ヘテロアリールからなる群から独立して選択される配位子であり；
ｐは、１から２であり；
但し、少なくとも１つの基Ｑおよび／またはＱ１は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、−ビオチンまたは−ストレプトアビジンから選択される基であるか、または選択される基を含む。
【００７０】
上述された実施形態のいずれにおいても、Ｘおよび／またはＸ１はまた、−（ＣＨ２）ｍ（ＣＦ２）ｎ−（式中、ｍは、０から３０であり、ｎは、１から３０である）であってもよく、Ｑおよび／またはＱ１はまた、−ＣＦ３であってもよい。
【００７１】
別の実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下の構造のいずれかから選択される。
【化３２】
2019511455.tif 000034
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｎＲ５０および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＲ５０から選択され；
ｎは、１から１５であり、Ｒ５０は、Ｈ、（１〜１５Ｃ）アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（１〜６Ｃ）アルキル、−ＣＯ２Ｎａ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＯＣ（Ｏ）−ビオチンおよび−ＯＳＯ３Ｎａから選択され；
Ｘは、Ｏである）
【００７２】
別の実施形態において、Ｒ１およびＲ２は、両方とも、−（ＣＨ２）７ＣＨ３、−（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｅｔ、−（ＣＨ２）１０ＣＯ２Ｈ、−（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ２、−（ＣＨ２）１１ＯＳＯ３Ｎａ、−（ＣＨ２）５ＣＯ２Ｅｔ、−（ＣＨ２）１０ＣＯ２Ｎａ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３ＣＨ３、−（ＣＨ２）１１ＯＣ（Ｏ）−ビオチンおよび−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１２ＣＨ３から選択され；Ｒ３およびＲ４は、２−エチルヘキシル、−（ＣＨ２）１１ＯＳＯ３Ｎａ、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ３および−（ＣＨ２）１０ＣＯ２Ｎａから選択される。
【００７３】
一実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下の構造のいずれかから選択される。
【化３３】
2019511455.tif 000035
【００７４】
別の実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下の構造のいずれかからそれぞれ選択される。
【化３４】
2019511455.tif 000036
（但し、少なくとも１つのモノマー成分は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、ストレプトアビジンおよび／もしくはビオチン基、またはその後の反応においてストレプトアビジンもしくはビオチン基と結合することができる官能基、またはそれらの塩を含む。）
【００７５】
別の実施形態において、π共役モノマーは、それぞれ独立して、以下の構造のいずれかから選択される。
【化３５】
2019511455.tif 000037
（但し、少なくとも１つのモノマー成分は、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシル、ハロゲン、ビニル、アルケニル、アルキニル、カルボニル、チオール、ストレプトアビジンおよび／もしくはビオチン基、またはその後の反応においてストレプトアビジンもしくはビオチン基と結合することができる官能基、またはそれらの塩を含む。）
【００７６】
別の実施形態において、ナノ粒子は、２０〜４００ｎｍの粒子サイズ（Ｚ平均、ＤＬＳにより測定される）を有する。好適には、ナノ粒子は、３０〜４００ｎｍの粒子サイズを有する。より好適には、ナノ粒子は、３０未満〜３００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ３０−３００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。さらにより好適には、ナノ粒子は、３０未満〜２５０ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ３０−２５０  ｎｍ）の粒子サイズを有する。さらにより好適には、ナノ粒子は、３０未満〜２００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ３０−２００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。最も好適には、ナノ粒子は、３０未満〜１００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ３０−１００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。
【００７７】
別の実施形態において、ナノ粒子は、２０〜４００ｎｍの粒子サイズを有する。より好適には、ナノ粒子は、２０未満〜３００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０−３００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。さらにより好適には、ナノ粒子は、２０未満〜２５０ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０−２５０  ｎｍ）の粒子サイズを有する。さらにより好適には、ナノ粒子は、２０未満〜２００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０−２００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。最も好適には、ナノ粒子は、２０未満〜１００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０−１００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。
【００７８】
別の実施形態において、ナノ粒子は、１０〜４００ｎｍの粒子サイズを有する。より好適には、ナノ粒子は、１０未満〜３００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  １０−３００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。さらにより好適には、ナノ粒子は、１０未満〜２５０ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  １０−２５０  ｎｍ）の粒子サイズを有する。さらにより好適には、ナノ粒子は、１０未満〜２００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  １０−２００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。最も好適には、ナノ粒子は、１０未満〜１００ｎｍ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  １０−１００  ｎｍ）の粒子サイズを有する。
【００７９】
別の実施形態において、本発明のナノ粒子を形成するポリマーは、１０から８００、より好適には２０から６００の重合度を有する。
【００８０】
別の実施形態において、ナノ粒子は、１〜１０モル％の架橋剤を含む。好適には、ナノ粒子は、２〜８モル％の架橋剤を含む。より好適には、ナノ粒子は、３〜７モル％の架橋剤を含む。最も好適には、ナノ粒子は、４．５〜５．５モル％の架橋剤を含む。
【００８１】
（薬物または生体分子）
一実施形態において、複合体は、薬物分子を含む。任意の好適な薬物分子が使用され得る。ナノ粒子にカップリングされるためには、薬物分子は、（例えばエステル、アミド、ジスルフィド結合を形成するように）ナノ粒子上に存在する官能基と反応することができる官能基、またはナノ粒子上に存在する第１の部分（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）に親和性対形成することができる第２の部分（例えば、ストレプトアビジンまたはビオチン）を含まなければならない。
【００８２】
好適には、複合体は、生体分子を含む。好適な生体分子の例は、これらに限定されないが、細胞、タンパク質（例えば、抗体、酵素等）、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはペプチド核酸を含む。
【００８３】
一実施形態において、生体分子は、タンパク質（例えば、抗体、酵素等）、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはペプチド核酸である。
【００８４】
さらなる実施形態において、生体分子は、タンパク質（例えば、抗体、酵素等）、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはペプチド核酸である。
【００８５】
さらなる実施形態において、生体分子は、抗体、酵素、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはペプチド核酸である。
【００８６】
さらなる実施形態において、生体分子は、抗体である。
【００８７】
（水性組成物）
さらなる態様において、本発明は、水性媒体内に分散された、本明細書において定義されるような複数の複合体を含む水性組成物を提供する。
【００８８】
水性媒体は、ナノ粒子が分散される水系ビヒクルを提供する。媒体は、溶解した材料（塩、緩衝液等）のような追加的な成分を含んでもよい。好適には、水性媒体は、水である。より好適には、水性媒体は、精製水である。
【００８９】
別の実施形態において、本発明の水性組成物は、複合体を懸濁状態に維持するために、安定剤をさらに含んでもよい。例えば、当該技術分野において知られている非イオン性、カチオン性またはアニオン性安定剤等の、任意の好適な安定剤が使用され得る。好適な安定剤の具体例は、非イオン性安定剤、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘシリーズのオクチルフェノールエトキシレート、Ｔｅｒｇｉｔｏｌシリーズのノニルフェノールエトキシレート（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）；Ｂｒｉｊシリーズのポリ（オキシエチレン）グリコールアルキルエーテル、Ｓｕｐｅｒｏｎｉｃシリーズ、Ｔｗｅｅｎシリーズのポリソルベート界面活性剤（Ｃｒｏｄａ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃシリーズのエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドをベースとしたブロックコポリマー（ＢＡＳＦ）；Ｔｅｔｒｏｎｉｃシリーズのエチレンオキシドおよびプロピレンオキシドをベースとした四官能性ブロックコポリマー、Ｌｕｔｅｎｓｏｌシリーズ（ＢＡＳＦ）；Ｉｇｅｐａｌシリーズ、Ｒｈｏｄａｓｕｒｆシリーズ、Ａｎｔａｒｏｘシリーズ（Ｒｈｏｄｉａ）；ならびにＭｅｒｐｏｌシリーズ（Ｓｔｅｐａｎ  Ｃｏ．）および高分子量ＰＥＧを含む。
【００９０】
別の実施形態において、水性組成物は、アニオン性安定剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および／またはカチオン性安定剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）をさらに含む。
【００９１】
水性組成物への複合体の投入量は、高くてもよい。例えば、水性媒体中の複合体の濃度は、１５ｍＭ以上であってもよい。一実施形態において、水性媒体中の複合体の濃度は、２０ｍＭ以上である。代替の実施形態において、水性媒体中の複合体の濃度は、２５ｍＭ以上である。
【００９２】
代替として、関心ある用途に応じて、水性組成物は、より希薄であってもよい。一実施形態において、水性媒体（例えば水）中の複合体の濃度は、１５ｍｇ／ｍｌ以下である。
【００９３】
代替の実施形態において、水性媒体中の複合体の濃度は、５ｗｔ％以下である。好適には、水性媒体中の複合体の濃度は、３ｗｔ％以下である。より好適には、水性媒体中の複合体の濃度は、１ｗｔ％以下である。
【００９４】
（本発明の方法）
本発明の第３の態様によれば、本明細書において定義されるような複合体を形成する方法であって、
（ｉ）エマルション重合、ミニエマルション重合または分散重合技術によりナノ粒子を形成して、ナノ粒子の水性懸濁液を提供するステップと；
（ｉｉ）ナノ粒子を薬物または生体分子と反応させて、複合体の水性懸濁液を形成するステップと
を含む方法が提供される。
【００９５】
ステップ（ｉ）において、エマルション重合、ミニエマルション重合または分散重合技術によりナノ粒子が形成され、ナノ粒子の懸濁液が提供される。好適には、重合反応は、水性媒体中のナノ粒子の懸濁液を生成するために、水性媒体中で行われる。
【００９６】
エマルション重合、ミニエマルション重合および分散重合技術は、当業者に知られている。
【００９７】
ミニエマルション重合の場合、モノマー成分が、触媒（例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＩＰｒ＊ＰｄＴＥＡＣｌ２またはＰｄ２（ｄｂａ）３／Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３）と共に、好適な有機溶媒（例えば、クロロベンゼン、トルエンまたはキシレン）中に溶解される。次いで、この溶液は、水、好適な塩基（例えば、水酸化テトラエチルアンモニウム溶液（水中４０％）、ＮａＯＨ）および任意選択的に好適な乳化剤の水性媒体に添加される。任意の好適な乳化剤、例えばＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１０２／Ｘ４０５／Ｘ７０５、Ｂｒｉｊ  Ｌ２３、および／またはＴｗｅｅｎ  ２０等が使用され得る。得られたエマルションは、撹拌および／または超音波処理され、エマルションを、好適にはミニエマルションを形成し得る。次いで、エマルション混合物は、３０℃から１００℃の間の温度まで（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、Ｐｄ２（ｄｂａ）３／Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３の場合、好適には５０℃から９５℃の間、より好適には５０℃から８０℃の間であり；ＩＰｒ＊ＰｄＴＥＡＣｌ２の場合、理想的には３０℃である）、ある期間（例えば１時間から２日間）穏やかに加熱され、ポリマーナノ粒子を形成し得る。加熱温度は、使用される触媒系に依存することが当業者に理解される。
【００９８】
一実施形態において、ナノ粒子は、鈴木カップリングまたはスティルカップリング反応により形成される。そのようなカップリング反応は、当該技術分野において知られている。
【００９９】
別の実施形態において、ナノ粒子は、本明細書において定義されるようなπモノマー部分を、本明細書において定義されるような事前に調製された架橋部分と反応させることにより形成される。
【０１００】
別の実施形態において、方法は、ナノ粒子の水性懸濁液を精製するステップをさらに含む。好適には、ナノ粒子の水性懸濁液は、ナノ粒子の水性懸濁液を少なくとも１種の有機溶媒と接触させることにより、または接線流濾過を使用した溶媒（通常は緩衝液または水）交換により精製される。
【０１０１】
別の実施形態において、ナノ粒子の水性懸濁液を少なくとも１種の好適な有機溶媒と接触させることは、ナノ粒子の沈殿をもたらす。次いで、沈殿したナノ粒子が遠心分離され、次いで上澄みがデカンテーションされて、精製されたナノ粒子を得ることができる。任意選択的に、精製されたナノ粒子が水中に再懸濁され、次いで精製プロセスが繰り返されてもよい。
【０１０２】
別の実施形態において、ナノ粒子が親油性である場合、少なくとも１種の有機溶媒は、水と混和性の極性溶媒（例えばメタノール、プロパノール、アセトン）である。
【０１０３】
別の実施形態において、ナノ粒子が親水性である場合、少なくとも１種の有機溶媒は、非極性溶媒である。
【０１０４】
本発明の複合体を形成するために、ステップ（ｉｉ）において、ナノ粒子を薬物または生体分子と反応させる。これに関して、「反応」という用語は、ナノ粒子を薬物または生体分子と混合すること、及び薬物または生体分子へのナノ粒子の結合を促進することを包含する。薬物／生体分子またはナノ粒子の一方がビオチン部分を有し、他方がストレプトアビジン部分を有する実施形態において、結合は、好適な媒体、例えば水性媒体中で薬物／生体分子をナノ粒子と単に混合することにより促進される。薬物／生体分子をナノ粒子に結合させるためにアミド、エステルまたはジスルフィド結合形成が必要である実施形態においては、そのような結合形成を促進するために好適な溶媒／緩衝液および反応条件が使用される。当業者には、適切な反応条件、溶媒等の選択によりそのような結合を形成する方法が理解される。
【０１０５】
好適には、ステップ（ｉｉ）における反応は、水性媒体中で行われる。
【０１０６】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書において定義される方法により得ることができる、得られる、または直接的に得られる複合体または水性組成物が提供される。
【０１０７】
（ナノ粒子組成物の使用）
本発明の複合体は、生物学的用途に特に適している。本発明の複合体は、水性媒体中で便利に調製され、水性組成物として投与され得る。さらに、本発明のナノ粒子は極めて光ルミネッセンス性であり、それによって少量の複合体が生物学的画像化に使用され得る。
【０１０８】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本明細書において定義されるような複合体の、生物学的画像化または感知のための使用を提供する。
【０１０９】
一実施形態において、ナノ粒子組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ画像化または感知用途において使用される。
【０１１０】
ここで、参照および例示のみを目的として、添付の図を参照しながら本発明の実施例を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】水（実線）またはＴＨＦ（破線）中の実施例１．１の架橋ナノ粒子のＤＬＳ粒子サイズヒストグラムを示す図である。
【図２】水（実線）またはＴＨＦ（破線）中の実施例１．１の架橋ナノ粒子のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す図である。
【図３】水（実線）またはＴＨＦ（破線）中の実施例１．１の架橋ナノ粒子のＰＬスペクトルを示す図である。
【図４】水（実線）およびＴＨＦ（破線）分散媒中の実施例１．２の架橋ナノ粒子のＤＬＳ粒子サイズヒストグラムを示す図である。
【図５】実施例１．２の架橋ナノ粒子のＵＶ／Ｖｉｓ（破線）およびＰＬ（実線）スペクトルを示す図である。
【図６】実施例１．３の架橋ナノ粒子の、水（実線）またはＴＨＦ（破線）中の架橋リン光性ナノ粒子のＤＬＳサイズヒストグラムを示す図である。
【図７】水（実線）またはＴＨＦ（破線）中の実施例１．３の架橋ナノ粒子のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す図である。
【図８】水（実線）またはＴＨＦ（破線）中の実施例１．３の架橋ナノ粒子のＰＬスペクトルを示す図である。
【図９】水（実線）およびＴＨＦ（破線）中の実施例１．４の架橋ナノ粒子のＤＬＳサイズヒストグラムを示す図である。
【図１０】水中の実施例１．５の架橋ナノ粒子のＤＬＳサイズヒストグラムを示す図である。
【図１１】水（破線）およびＴＨＦ（実線）中の実施例１．６の架橋ナノ粒子のＤＬＳサイズヒストグラムを示す図である。
【図１２】実施例１．４（図１２ａ）、１．５（図１２ｂ）および１．６（図１２ｃ）の架橋ナノ粒子の吸収および発光スペクトルを示す図である。
【図１３】ストレプトアビジンに共役したナノ粒子の電気泳動ゲルを示す図である。
【図１４】ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体に共役したナノ粒子の電気泳動ゲルを示す図である。
【図１５】イメージングサイトメトリーにより得られた画像を示す図である（実施例２．７）
【実施例】
【０１１２】
［実施例１］
架橋ＰＦＯナノ粒子の調製
［実施例１．１］  架橋ＰＦＯナノ粒子
（合成）
以下に示されるスキーム１および表１を参照して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（５０．０ｍｇ）および脱イオン水（１０ｍＬ）をシュレンク管に移し、得られた溶液を、アルゴンを２０分間吹き込むことにより脱気した。モノマーＡ（表１を参照されたい）、架橋剤Ｂ（表１を参照されたい）およびモノマーＣ（５８．６ｍｇ、９．１２×１０−２ｍｍｏｌ）をトルエン（１ｍＬ）中に溶解し、これにヘキサデカン（７８μＬ）もまた添加し、この溶液を同様に５分間脱気した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．２ｍｇ、９．１３×１０−３ｍｍｏｌ）をモノマー溶液に添加し、次いでこれを反応槽に移した。氷浴で冷却しながら２分間超音波処理（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  ７５０Ｗ超音波処理機、マイクロチップを装着、２２％出力）することにより、反応混合物を乳化した。シュレンク管を再び封止し、ミニエマルションを７２℃に加熱し、続いて１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３６５μＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。室温に冷却した後、反応槽のキャップを外し、エマルションを５時間撹拌して、残留トルエンを除去した。
【化３６】
2019511455.tif 000038
【表１】
2019511455.tif 000039
【０１１３】
（界面活性剤の除去およびＤＬＳ分析（水中のナノ粒子））
４００μＬの粗ナノ粒子懸濁液のアリコートを、１．６ｍＬの脱イオン水で希釈し、これにＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２樹脂（２０ｍｇ、２×２ｍＬの水で事前洗浄）を添加した。懸濁液を室温で１５分間振盪してから、ナノ粒子懸濁液をデカンテーションした。このＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２精製ステップを繰り返し（この時点以降懸濁液は振盪により気泡しなかった）、グラスウールを通して濾過してから、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して粒子サイズの動的光散乱（ＤＬＳ）分析を行った。結果を表２および図１に示す。
【表２】
2019511455.tif 000040
【０１１４】
（ＤＬＳ分析（ＴＨＦ中のナノ粒子））
２００μＬの粗ナノ粒子懸濁液のアリコートを、１．３ｍＬのトルエンの添加により凝集させ、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１分）および上澄みのデカンテーションによりポリマーを単離した。空気中でポリマーを乾燥させて残留メタノールを除去してから、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１ｍＬ）中に分散した。Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して、得られた懸濁液を直接測定した。結果を表３および図１に示す。
【表３】
2019511455.tif 000041
【０１１５】
（ＵＶ／Ｖｉｓ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２での処理による界面活性剤の除去後、４０μＬのナノ粒子懸濁液を３ｍＬの水で希釈した。この濃度でのナノ粒子のＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５５  ５０００ＵＶ−Ｖｉｓ−ＮＩＲ分光光度計によって室温で記録した。図２は、架橋ＰＦＯナノ粒子のＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示す。
【０１１６】
（光ルミネッセンス（ＰＬ）分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−２での処理による界面活性剤の除去後、４０μＬのナノ粒子懸濁液を３ｍＬの水で希釈した。ＰＬスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計で記録した。図２は、架橋ＰＦＯナノ粒子のＰＬスペクトルを示す。
【０１１７】
（光ルミネッセンス（ＰＬ）分析（水中のナノ粒子））
Ｆｌｕｏｒｏｍａｘ−４分光蛍光光度計を使用して、光ルミネッセンス測定値を得た。バックグラウンド測定と同じ量の水を使用して、水中のナノ粒子の希薄分散体（８００μＬ、吸光度＞１）に対して測定を行った。結果を表４に記載する。
【表４】
2019511455.tif 000042
【０１１８】
［実施例１．２］  エチルエステル官能化架橋ＰＦＯナノ粒子
（合成）
以下に示されるスキーム２を参照して、ドデシル硫酸ナトリウム（５０．０ｍｇ）および脱イオン水（１０ｍＬ）をシュレンク管に移し、得られた溶液を、アルゴンを２０分間吹き込むことにより脱気した。架橋剤Ａ（５．８ｍｇ、９．１２×１０−３ｍｍｏｌ）、モノマーＢ（４４．４ｍｇ、７．３０×１０−２ｍｍｏｌ）およびモノマーＣ（５８．６ｍｇ、９．１２×１０−２ｍｍｏｌ）をトルエン（１ｍＬ）中に溶解し、これにヘキサデカン（７８μＬ）もまた添加し、この溶液を同様に５分間脱気した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．２ｍｇ、９．１３×１０−３ｍｍｏｌ）をモノマー溶液に添加し、次いでこれを反応槽に移した。氷浴で冷却しながら２分間超音波処理（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  ７５０Ｗ超音波処理機、マイクロチップを装着、２２％出力）することにより、反応混合物を乳化した。シュレンク管を再び封止し、ミニエマルションを７２℃に加熱し、続いて１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３６５μＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。室温に冷却した後、反応槽のキャップを外し、エマルションを５時間撹拌して、残留トルエンを除去した。
【化３７】
2019511455.tif 000043
【０１１９】
（ＤＬＳ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
実施例１に記載の一般的手順を使用して、界面活性剤の除去を行った。実施例１に記載の一般的手順を使用して、凝集およびＴＨＦ中への再懸濁を行った。分散媒として水またはＴＨＦを使用して、実施例１のようにＤＬＳ分析を行った。結果を表５および図４に記載する。
【表５】
2019511455.tif 000044
【０１２０】
（ＵＶ／ＶｉｓおよびＰＬ分析（水中のナノ粒子））
実施例１に記載の一般的ＵＶ／ＶｉｓおよびＰＬ分析手順を使用して、希薄水性分散体中のナノ粒子のＵＶ／ＶｉｓおよびＰＬスペクトルを記録した。結果を図５に示す。
【０１２１】
（ＰＬ分析（水中のナノ粒子））
実施例１に記載の一般的方法を使用して、ＰＬ測定値を得た。結果を表６に記載する。
【表６】
2019511455.tif 000045
【０１２２】
［実施例１．３］  架橋リン光性ナノ粒子
（方法）
以下に示されるスキーム３および表７を参照して、ドデシル硫酸ナトリウム（５０．０ｍｇ）および脱イオン水（１０ｍＬ）をシュレンク管に移し、得られた溶液を、アルゴンを２０分間吹き込むことにより脱気した。モノマーＡ（表７を参照されたい）、Ｃ（２０．５ｍｇ、１．８２×１０−２ｍｍｏｌ）およびＤ（５８．６ｍｇ、９．１２×１０−２ｍｍｏｌ）、ならびに架橋剤Ｂ（５．８ｍｇ、９．１２×１０−３ｍｍｏｌ）をトルエン（１ｍＬ）中に溶解し、これにヘキサデカン（７８μＬ）もまた添加し、この溶液を同様に５分間脱気した。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２．２ｍｇ、９．１３×１０−３ｍｍｏｌ）をモノマー溶液に添加し、次いでこれを反応槽に移した。氷浴で冷却しながら２分間超音波処理（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ  ７５０Ｗ超音波処理機、マイクロチップを装着、２２％出力）することにより、反応混合物を乳化した。シュレンク管を再び封止し、ミニエマルションを７２℃に加熱し、続いて１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（３６５μＬ）を添加し、反応混合物を１６時間撹拌した。室温に冷却した後、反応槽のキャップを外し、エマルションを５時間撹拌して、残留トルエンを除去した。
【化３８】
2019511455.tif 000046
【表７】
2019511455.tif 000047
【０１２３】
（ＤＬＳ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
実施例１に記載の一般的手順を使用して、界面活性剤の除去を行った。実施例１に記載の一般的手順を使用して、凝集およびＴＨＦ中への再懸濁を行った。分散媒として水またはＴＨＦを使用して、実施例１のようにＤＬＳ分析を行った。結果を表８および図６に記載する。
【表８】
2019511455.tif 000048
【０１２４】
（ＵＶ／ＶｉｓおよびＰＬ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
実施例１に記載の一般的ＵＶ／ＶｉｓおよびＰＬ分析手順を使用して、希薄水性分散体またはＴＨＦ中のナノ粒子のＵＶ／Ｖｉｓ（図７）およびＰＬ（図８）スペクトルを記録した。
【０１２５】
（ＰＬ分析（水中のナノ粒子））
実施例１に記載の一般的方法を使用して、ＰＬ測定値を得た。結果を表９に記載する。
【表９】
2019511455.tif 000049
【０１２６】
［実施例１．４］  ＰＥＧ３官能化１０％架橋ＰＦＯナノ粒子
（合成）
以下に示されるスキーム４を参照して、１００ｍｌの三口丸底フラスコ内で、水酸化テトラエチルアンモニウム溶液（水中４０％）（０．１５６７ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１０２（２．５ｇ、脱イオン水中５ｗｔ％）の水溶液（５０ｍｌ）に添加した。次いで、撹拌溶液に窒素ガスを吹き込むことにより、内容物を３０分間脱気した。次いで、別個の１０ｍｌの二口丸底フラスコを使用して、有機溶媒中でモノマーを互いに混合してから、反応フラスコに加えた。９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジ−ボロン酸−ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（０．１１５１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ビス（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）フルオレン（０．０９６７ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）および２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（０．０１２６ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、キシレン（２ｍｌ）中に溶解した。モノマー溶液を脱気し、次いで触媒ＩＰｒ＊ＰｄＴＥＡＣｌ２（０．００９５ｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて得られた溶液をさらに脱気した。シリンジを使用して、モノマー／触媒を、３０℃で維持されている主反応フラスコ内の撹拌界面活性剤／塩基溶液中に移し、２４時間撹拌および窒素ガス下に維持した。
【化３９】
2019511455.tif 000050
【０１２７】
（ＤＬＳ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
５００μｌの試料を遠心分離バイアルに移し、１．５ｍｌのメタノールを添加した。試料バイアルを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで液体をデカンテーションした。粗試料をメタノールで３回洗浄し、粒子のサイズを測定するためにＴＨＦ中に再分散させた。それ以上精製していない未処理生成物もまた調査した。結果を図９および表１０に示す。水中のポリマーの濃度は、２３μｇ／ｍｌであった。
【表１０】
2019511455.tif 000051
【０１２８】
（光学特性）
表１１および図１２を参照すると、ＬＭ５５は、３７０ｎｍに最大バンドを示したが、β相は観察されなかった。
【表１１】
2019511455.tif 000052
【０１２９】
［実施例１．５］  ＰＥＧ３官能化５％架橋ＰＦＯナノ粒子
（合成）
以下に示されるスキーム５を参照して、１００ｍｌの三口丸底フラスコ内で、水酸化テトラエチルアンモニウム溶液（水中４０％）（０．１５６７ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１０２（２．５ｇ、脱イオン水中５ｗｔ％）の水溶液（５０ｍｌ）に添加した。次いで、撹拌溶液に窒素ガスを吹き込むことにより、内容物を３０分間脱気した。次いで、別個の１０ｍｌの二口丸底フラスコを使用して、有機溶媒中でモノマーを互いに混合してから、反応フラスコに加えた。９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジ−ボロン酸−ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（０．１１５１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジオクチルフルオレン（０．０７６８ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ビス（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル）フルオレン（０．０２４２ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）および２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（０．００６３ｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、キシレン（２ｍｌ）中に溶解した。モノマー溶液を脱気し、次いで触媒ＩＰｒ＊ＰｄＴＥＡＣｌ２（０．００９５ｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて得られた溶液をさらに脱気した。シリンジを使用して、モノマー／触媒を、３０℃で維持されている主反応フラスコ内の撹拌界面活性剤／塩基溶液中に移し、２４時間撹拌および窒素ガス下に維持した。
【化４０】
2019511455.tif 000053
【０１３０】
（ＤＬＳ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
５００μｌの試料を遠心分離バイアルに移し、１．５ｍｌのメタノールを添加した。試料バイアルを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで液体をデカンテーションした。粗試料をメタノールで３回洗浄し、粒子のサイズを測定するためにＴＨＦ中に再分散させた。それ以上精製していない未処理生成物もまた調査した。結果を図１０および表１２に示す。水中のポリマーの濃度は、２３μｇ／ｍｌであった。
【表１２】
2019511455.tif 000054
【０１３１】
（光学特性）
表１３および図１２を参照すると、ＬＭ５６は、３７８ｎｍに吸収ピークを示した。
【表１３】
2019511455.tif 000055
【０１３２】
［実施例１．６］  ＰＥＧ１２官能化１０％架橋ＰＦＯナノ粒子
（合成）
以下のスキーム６を参照して、１００ｍｌの三口丸底フラスコ内で、水酸化テトラエチルアンモニウム溶液（水中４０％）（０．１５６７ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１０２（２．５ｇ、脱イオン水中５ｗｔ％）の水溶液（５０ｍｌ）に添加した。次いで、撹拌溶液に窒素ガスを吹き込むことにより、内容物を３０分間脱気した。次いで、別個の１０ｍｌの二口丸底フラスコを使用して、有機溶媒中でモノマーを互いに混合してから、反応フラスコに加えた。９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジ−ボロン酸−ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（０．１１５１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ビス（ポリエチレングリコールモノエーテル）フルオレン（０．２２５５ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）および２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（０．０１２６ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、キシレン（２ｍｌ）中に溶解した。モノマー溶液を脱気し、次いで触媒ＩＰｒ＊ＰｄＴＥＡＣｌ２（０．００９５ｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を添加し、続いて得られた溶液をさらに脱気した。シリンジを使用して、モノマー／触媒を、３０℃で維持されている主反応フラスコ内の撹拌界面活性剤／塩基溶液中に移し、２４時間撹拌および窒素ガス下に維持した。
【化４１】
2019511455.tif 000056
【０１３３】
（ＤＬＳ分析（水またはＴＨＦ中のナノ粒子））
５００μｌの試料を遠心分離バイアルに移し、１．５ｍｌのメタノールを添加した。試料バイアルを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いで液体をデカンテーションした。粗試料をメタノールで３回洗浄し、粒子のサイズを測定するためにＴＨＦ中に再分散させた。それ以上精製していない未処理生成物もまた調査した。結果を図１１および表１４に示す。水中のポリマーの濃度は、２３μｇ／ｍｌであった。
【表１４】
2019511455.tif 000057
【０１３４】
（光学特性）
表１５および図１２は、水中のＬＭ０２−６の光学特性の概要を示す。
【表１５】
2019511455.tif 000058
【０１３５】
［実施例１．７］  ５％の２，１，３−ベンゾチアジアゾール、３５％の９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレンおよび５％の９，９’−スピロビフルオレン架橋ポリフルオレンナノ粒子
（合成）
【化４２】
2019511455.tif 000059
シュレンク管内に、水（２２．０ｍＬ）、ドデシル硫酸ナトリウム（１１０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１０８０μＬ、１０８０μｍｏｌ）を加えた。溶液をアルゴンで２時間パージした。バイアル内で、９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン（９６．９ｍｇ、１４０μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）、トリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）およびヘキサデカン（１７１μＬ、５８５μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴン充填グローブボックスに移し、ゴム栓で封止し、取り出した。トルエン（２．１９ｍＬ）をバイアルに加え、均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、超音波プローブを挿入し、トルエン溶液を速やかに水に注入した。溶液に１分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、さらに１分間超音波処理した。シュレンク管を封止し、５０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。シュレンクを開封し、撹拌しながら、５０℃でエマルション上に窒素ガスのストリームを通過させた。エマルションを室温に冷却し、脱イオン水で体積を２３．０ｍＬに増加させ、グラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、乳白暗緑色の溶液として得られた。ＤＬＳ（水）：Ｚ平均＝７９．０ｎｍ、ＰｄＩ＝０．１１７、Ｄｎ＝５２．４ｎｍおよびＳＤ＝１５．３ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３８０ｎｍ、λｓｅｃ．＝４５０ｎｍ、λｏｎｓｅｔ＝５２０ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝５３５ｎｍ、λｓｅｃ．＝４２４ｎｍ。
【０１３６】
［実施例１．８］  ４０％のジ（ｔ−ブチルヘキサノエート）フルオレンおよび５％の９，９’−スピロビフルオレン架橋ポリフルオレンナノ粒子
（合成）
【化４３】
2019511455.tif 000060
シュレンク管内に、水（２２．０ｍＬ）、ドデシル硫酸ナトリウム（１１０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（８００μＬ、８００μｍｏｌ）を加えた。溶液をアルゴンで２時間パージした。バイアル内で、９，９−ジオクチル−９Ｈ−フルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（１２８．５ｍｇ、２００μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ｔ−ブチルヘキサノエート）フルオレン（１０６．３ｍｇ、１６０μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（５．８ｍｇ、５μｍｏｌ）およびヘキサデカン（１７１μＬ、５８５μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴン充填グローブボックスに移し、ゴム栓で封止し、取り出した。トルエン（２．１９ｍＬ）をバイアルに加え、均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、超音波プローブを挿入し、トルエン溶液を速やかに水に注入した。溶液に１分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、さらに１分間超音波処理した。シュレンク管を封止し、７２℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。シュレンクを開封し、撹拌しながら、５０℃でエマルション上に窒素ガスのストリームを通過させた。エマルションを室温に冷却し、脱イオン水で体積を２３．０ｍＬに増加させ、グラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、乳白薄緑色の溶液として得られた。ＤＬＳ（水）：Ｚ平均＝１２９ｎｍ、ＰｄＩ＝０．２２６、Ｄｎ＝６４ｎｍおよびＳＤ＝２３．４ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３８４ｎｍ、λｏｎｓｅｔ＝４４１ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝４３０ｎｍ、λｓｅｃ．＝４５３ｎｍ、λｓｅｃ．＝４８４ｎｍ。
【０１３７】
［実施例１．９］  ２％の９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン、５％の２，１，３−ベンゾチアジアゾール、３３％のジ（ヘキサ−５−エン−１−イル）フルオレンおよび５％の９，９’−スピロビフルオレン架橋ポリフルオレンナノ粒子
（合成）
【化４４】
2019511455.tif 000061
シュレンク管内に、水（２２．０ｍＬ）、ドデシル硫酸ナトリウム（１１０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（８１６μＬ、８１６μｍｏｌ）を加えた。溶液をアルゴンで２時間パージした。バイアル内で、９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン（５．５ｍｇ、８μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ヘキサ−５−エン−１−イル）フルオレン（６４．５ｍｇ、１３２μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）、トリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）およびヘキサデカン（１７１μＬ、５８５μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴン充填グローブボックスに移し、ゴム栓で封止し、取り出した。トルエン（２．１９ｍＬ）をバイアルに加え、均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、超音波プローブを挿入し、トルエン溶液を速やかに水に注入した。溶液に１分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、さらに１分間超音波処理した。シュレンク管を封止し、５０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。シュレンクを開封し、撹拌しながら、５０℃でエマルション上に窒素ガスのストリームを通過させた。エマルションを室温に冷却し、脱イオン水で体積を２３．０ｍＬに増加させ、グラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、乳白暗緑色の溶液として得られた。ＤＬＳ（水）：Ｚ平均＝１０１ｎｍ、ＰｄＩ＝０．１６６、Ｄｎ＝５５．１ｎｍおよびＳＤ＝１８．１ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３８１ｎｍ、λｓｅｃ．＝４５３ｎｍ、λｏｎｓｅｔ＝５２２ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝５３０ｎｍ。
【０１３８】
［実施例１．１０］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、４５％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカニルサルフェート）フルオレンおよび５０％の９，９−ジオクチル（フルオレン）ナノ粒子の合成
【化４５】
2019511455.tif 000062
Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２２．０ｍＬ）、ドデシル硫酸ナトリウム（１１０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１０８０μＬ、１０８０μｍｏｌ）を加えた。溶液をアルゴンで２時間パージした。バイアル内で、９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ナトリウムウンデカニルサルフェート）フルオレン（１５６．４ｍｇ、１８０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）  トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）、トリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）およびヘキサデカン（１７１μＬ、５８５μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴン充填グローブボックスに移し、ゴム栓で封止し、取り出した。トルエン（２．１９ｍＬ）をバイアルに加え、均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、超音波プローブを挿入し、トルエン溶液を速やかに水に注入した。溶液に１分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、さらに１分間超音波処理した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を封止し、５０℃に予熱した油浴内に設置し、１６時間撹拌した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を開封し、撹拌しながら、５０℃でエマルション上に窒素ガスのストリームを通過させた。エマルションを室温に冷却し、脱イオン水で体積を２３．０ｍＬに増加させ、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、乳白暗緑色の溶液として得られた。
【０１３９】
［実施例１．１１］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、３５％の９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレンおよび５％の９，９’−スピロビフルオレン架橋ポリフルオレンナノ粒子
（合成）
【化４６】
2019511455.tif 000063
Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２２．０ｍＬ）、ドデシル硫酸ナトリウム（１１０ｍｇ、３８２μｍｏｌ）および１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１０８０μＬ、１０８０μｍｏｌ）を加えた。溶液をアルゴンで２時間パージした。バイアル内で、９，９−ジオクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（１，３−プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン（９６．９ｍｇ、１４０μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）、トリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）およびヘキサデカン（１７１μＬ、５８５μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴン充填グローブボックスに移し、ゴム栓で封止し、取り出した。トルエン（２．１９ｍＬ）をバイアルに加え、均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、超音波プローブを挿入し、トルエン溶液を速やかに水に注入した。溶液に１分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、さらに１分間超音波処理した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を封止し、５０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を開封し、撹拌しながら、５０℃でエマルション上に窒素ガスのストリームを通過させた。エマルションを室温に冷却し、脱イオン水で体積を２３．０ｍＬに増加させ、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、乳白暗緑色の溶液として得られた（ＣＰＮ１）。ＤＬＳ（水）：Ｚ平均＝７９．０ｎｍ、ＰｄＩ＝０．１１７、Ｄｎ＝５２．４ｎｍおよびＳＤ＝１５．３ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３８０ｎｍ、λｓｅｃ．＝４５０ｎｍ、λｏｎｓｅｔ＝５２０ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝５３５ｎｍ、λｓｅｃ．＝４２４ｎｍ。
【０１４０】
［実施例１．１２］  ５％の９，９’−スピロビフルオレン、９０％のジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレンナノ粒子
【化４７】
2019511455.tif 000064
アルゴン入口を装着した２５０ｍＬの丸底フラスコに、水（１００ｍＬ）、水酸化ナトリウム（１６０ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）およびドデシル硫酸ナトリウム（５５１ｍｇ）を入れ、溶液をアルゴンで１時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管内で、９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（８２７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン（５１３ｍｇ、７００μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（６３．２ｍｇ、１００μｍｏｌ）、ヘキサデカン（８５５μＬ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（２９．４ｍｇ、１００μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２２．４ｍｇ、２５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（４５．６ｍｇ、１５０μｍｏｌ）を秤量した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を、４回の真空−アルゴンサイクルに供した。トルエン（１０ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（１／２インチのエクステンダーチップ）。溶液に４０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、次いでさらに２分間超音波処理した。フラスコを封止し、７０℃に予熱した油浴内に設置し、１６時間撹拌した。フラスコを５０℃に冷却し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、１６時間静置し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、明緑色の濁った分散液として得られた。ＤＬＳ：ｚ平均：１１５．９ｎｍ、ＰｄＩ：０．１５３。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３９１ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝４２２ｎｍ。
【０１４１】
［実施例１．１３］  ５％の９，９’−スピロビフルオレン、１０％のジ（（４−（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）フェニル））フルオレン、８０％のジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレンナノ粒子
【化４８】
2019511455.tif 000065
アルゴン入口を装着した２５０ｍＬの丸底フラスコに、水（１００ｍＬ）、水酸化ナトリウム（１６０ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）および２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（４−（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）フェニル））フルオレン（２１１ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、溶液をアルゴンで２時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管内で、９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（８２７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン（４４０ｍｇ、６００μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（６３．２ｍｇ、１００μｍｏｌ）、ヘキサデカン（８５５μＬ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２２．４ｍｇ、２５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（４５．６ｍｇ、１５０μｍｏｌ）を秤量した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を、４回の真空−アルゴンサイクルに供した。トルエン（１０ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（１／２インチのエクステンダーチップ）。溶液に４０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、次いでさらに２分間超音波処理した。フラスコを封止し、６０℃に予熱した油浴内に設置し、１６時間撹拌した。フラスコを５０℃に冷却し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、１６時間静置し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、暗緑色／灰色の濁った分散液として得られた。ＤＬＳ：ｚ平均：１７１．２ｎｍ、ＰｄＩ：０．０４７。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３９８ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝４２２ｎｍ。
【０１４２】
［実施例１．１４］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、８５％のジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレンナノ粒子
【化４９】
2019511455.tif 000066
アルゴン入口を装着した２５０ｍＬの丸底フラスコに、水（１００ｍＬ）、水酸化ナトリウム（１６０ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）およびドデシル硫酸ナトリウム（５５１ｍｇ）を入れ、溶液をアルゴンで１時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管内で、９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（８２７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン（５１３ｍｇ、７００μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（６３．２ｍｇ、１００μｍｏｌ）、ヘキサデカン（８５５μＬ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（２９．４ｍｇ、１００μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２２．４ｍｇ、２５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（４５．６ｍｇ、１５０μｍｏｌ）を秤量した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を、４回の真空−アルゴンサイクルに供した。トルエン（１０ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（１／２インチのエクステンダーチップ）。溶液に４０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、次いでさらに２分間超音波処理した。フラスコを封止し、７０℃に予熱した油浴内に設置し、１６時間撹拌した。フラスコを５０℃に冷却し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、１６時間静置し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、明緑色の濁った分散液として得られた。ＤＬＳ：ｚ平均：１１５．１ｎｍ、ＰｄＩ：０．１６０。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３８７ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝５２６ｎｍ。
【０１４３】
［実施例１．１５］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、１０％のジ（（４−（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）フェニル））フルオレン、７５％のジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレンナノ粒子
【化５０】
2019511455.tif 000067
アルゴン入口を装着した２５０ｍＬの丸底フラスコに、水（１００ｍＬ）、水酸化ナトリウム（１６０ｍｇ、４．００ｍｍｏｌ）および２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（４−（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）フェニル））フルオレン（２１１ｍｇ、２００μｍｏｌ）を入れ、溶液をアルゴンで１時間パージした。トルエンをアルゴンで１時間脱気した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管内で、９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（ピナコール）エステル（８２７ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（４−（（２−エチルヘキシル）オキシ）フェニル））フルオレン（３６６ｍｇ、５００μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（６３．２ｍｇ、１００μｍｏｌ）、ヘキサデカン（８５５μＬ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（２９．４ｍｇ、１００μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（２２．４ｍｇ、２５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（４５．６ｍｇ、１５０μｍｏｌ）を秤量した。Ｓｃｈｌｅｎｋ管を、４回の真空−アルゴンサイクルに供した。トルエン（１０ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却し、トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（１／２インチのエクステンダーチップ）。溶液に４０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、次いでさらに２分間超音波処理した。フラスコを封止し、７０℃に予熱した油浴内に設置し、１６時間撹拌した。フラスコを５０℃に冷却し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、１６時間静置し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、明緑色の濁った分散液として得られた。ＤＬＳ：ｚ平均：１８４．５ｎｍ、ＰｄＩ：０．０３１。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３９３ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝５２７ｎｍ。
【０１４４】
［実施例１．１６］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、７５％の９，９−ジオクチル（フルオレン）、１０％の９，９−ジ（ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（Ｍｎ  ９００））（フルオレン）
【化５１】
2019511455.tif 000068
Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２０ｍＬ）および水酸化ナトリウム（３２．０ｍｇ、８００μｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴンで２時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。バイアル内で、９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、９，９−ジ−ｎ−オクチル−２，７−ジブロモフルオレン（５４．８ｍｇ、１００μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（（ポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（Ｍｎ  ９００））フェニル））フルオレン（８６．３ｍｇ、４０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ヘキサデカン（１５０μＬ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴンで３０分間パージした。トルエン（２．００ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。最初の水溶液を氷浴内で０℃に冷却した。トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（６ｍｍのマイクロチップ）。溶液に３０％の振幅で１分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、さらに１分間超音波処理した。フラスコを封止し、４０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。フラスコを５０℃に加熱し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、１６時間静置し、綿メッシュを通して濾過した。エマルションは、明緑色の濁った分散液として得られた。
【０１４５】
［実施例１．１７］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、７４％の９，９−ジオクチル（フルオレン）、１０％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）（フルオレン）、１％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルカルボキシレート）（フルオレン）
【化５２】
2019511455.tif 000069
Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２０ｍＬ）および水酸化ナトリウム（３２．０ｍｇ、８００μｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴンで２時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。バイアル内で、９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、９，９−ジ−ｎ−オクチル−２，７−ジブロモフルオレン（４１．７ｍｇ、７６μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン（２．８ｍｇ、４．０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴンで３０分間パージした。トルエン（２．００ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）２，７−ジブロモフルオレン（３４．７ｍｇ、４０μｍｏｌ）を最初の水溶液に添加し、氷浴内で０℃に冷却した。トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（６ｍｍのマイクロチップ）。溶液に３０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、このシーケンスをさらに４回繰り返した。フラスコを封止し、４０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。フラスコを５０℃に加熱し、撹拌しながらエマルション上に空気を７時間通した。エマルションを室温に冷却し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、明緑色の濁った分散液として得られた。
【０１４６】
［実施例１．１８］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、７０％の９，９−ジオクチル（フルオレン）、１０％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）（フルオレン）、５％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルカルボキシレート）（フルオレン）
【化５３】
2019511455.tif 000070
Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２０ｍＬ）および水酸化ナトリウム（３３．６ｍｇ、８４０μｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴンで２時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。バイアル内で、９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、９，９−ジ−ｎ−オクチル−２，７−ジブロモフルオレン（４３．９ｍｇ、８０μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン（１３．９ｍｇ、２０．０μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、ヘキサデカン（１５０μＬ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴンで３０分間パージした。トルエン（２．００ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）２，７−ジブロモフルオレン（３４．７ｍｇ、４０μｍｏｌ）を最初の水溶液に添加し、氷浴内で０℃に冷却した。トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（６ｍｍのマイクロチップ）。溶液に３０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、このシーケンスをさらに４回繰り返した。フラスコを封止し、４０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。フラスコを５０℃に加熱し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、明緑色の若干濁った分散液として得られた。ＤＬＳ：ｚ平均：７７．１ｎｍ、ＰｄＩ：０．２１１。
【０１４７】
［実施例１．１９］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、７０％の９，９−ジオクチル（フルオレン）、１０％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）（フルオレン）、５％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルカルボキシレート）（フルオレン）
【化５４】
2019511455.tif 000071
Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２０ｍＬ）および水酸化ナトリウム（３３．６ｍｇ、８４０μｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴンで２時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。バイアル内で、９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、９，９−ジ−ｎ−オクチル−２，７−ジブロモフルオレン（４３．９ｍｇ、８０μｍｏｌ）、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（ウンデカン酸）フルオレン（１３．９ｍｇ、２０．０μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴンで３０分間パージした。トルエン（２．００ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）２，７−ジブロモフルオレン（３４．７ｍｇ、４０μｍｏｌ）を最初の水溶液に添加し、氷浴内で０℃に冷却した。トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加した。撹拌棒を入れ、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（６ｍｍのマイクロチップ）。溶液に３０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、このシーケンスをさらに４回繰り返した。フラスコを封止し、４０℃に予熱した油浴内に設置し、２０時間撹拌した。フラスコを５０℃に加熱し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、ガラスウールプラグを通して濾過した。エマルションは、明緑色の透明分散液として得られた。ＤＬＳ：ｚ平均：６７．６ｎｍ、ＰｄＩ：０．２３７。ＵＶ−Ｖｉｓ吸収（水）：λｍａｘ＝３７５ｎｍ。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＰＬ（水）：λｍａｘ＝５３６ｎｍ。
【０１４８】
［実施例２］
複合体の調製
［実施例２．１］  ナノ粒子溶液ＣＮＰ１のＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１、５０ｍＭ）への移動
ナノ粒子溶液ＣＮＰ１（実施例１．１１）（２．００ｍＬ）に、ＭＥＳ緩衝液（８．００ｍＬ（ｐＨ６．１、５０ｍＭ））を添加した。溶液を「Ｖｉｖａｐｏｒｅ  １０／２０静的濃縮器」に移し、体積を１．０ｍＬに減少させた。ＭＥＳ緩衝液（９．００ｍＬ（ｐＨ  ６．１、５０ｍＭ））を添加し、溶液を「第２のｖｉｖａｐｏｒｅ  １０／２０静的濃縮器」に移し、体積を１ｍＬに減少させた。ＭＥＳ緩衝液（９．００ｍＬ（ｐＨ６．１、５０ｍＭ））で体積を１０．０ｍＬに増加させ、ナノ粒子溶液ＣＮＰ２（１．１６ｍｇ  ｍＬ−１、６１μＭ、２．０μｍｏｌ  ｍＬ−１  ＣＯ２Ｈ）を生成した。
【０１４９】
［実施例２．２］  Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドによるナノ粒子活性化
ナノ粒子溶液ＣＰＮ１（実施例１．１１）（５．００ｍＬ、１．１６ｍｇｍＬ−１、６１μＭ、２．０μｍｏｌ  ｍＬ−１  ＣＯ２Ｈ）に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．９ｍｇ、１０μｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（４．３ｍｇ、２０μｍｏｌ）を添加した。溶液を３０分間撹拌し、次いでＭＥＳ緩衝液（５．００ｍＬ（ｐＨ６．１、５０ｍＭ））を添加した。溶液を「Ｖｉｖａｐｏｒｅ  １０／２０静的濃縮器」に移し、体積を０．５ｍＬに減少させた。ＭＥＳ緩衝液（９．５０ｍＬ（ｐＨ６．１、５０ｍＭ））を添加し、「第２のｖｉｖａｐｏｒｅ  １０／２０静的濃縮器」に移し、体積を０．５ｍＬに減少させた。ＭＥＳ緩衝液（４．５０ｍＬ（ｐＨ６．１、５０ｍＭ））を添加して、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化ナノ粒子（ＣＰＮ２）（１．０８ｍｇ  ｍＬ−１、５７μＭおよび（１．９μｍｏｌ  ｍＬ−１  ＣＯ２Ｈ））を生成した。
【０１５０】
［実施例２．３］  ナノ粒子のストレプトアビジンへの生体共役反応
図１３は、以下のナノ粒子試料を示す。
試料ａ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ１。
試料ｂ：１８時間混合したナノ粒子溶液ＣＰＮ２。
試料ｃ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ２（４００μＬ、２２．８ｐｍｏｌ）を１６時間混合し、次いでグリシン（３．８μＬの２００μＭ溶液、０．７６μｍｏｌ）でクエンチし、さらに２時間混合した。
試料ｄ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ２（３３２μＬ、１８．９ｐｍｏｌ）に、ストレプトアビジン（１０μＬ、１８９ｐｍｏｌ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１２ｍＭ）中の１８．９μＭ溶液））を添加し、ＲＴで１６時間混合した。グリシン（３．２μＬの２００μＭ溶液、０．６３μｍｏｌ）を添加し、溶液をさらに２時間混合した。
試料ｅ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ１（３１０μＬ、１８．９ｐｍｏｌ）を、ストレプトアビジン（１０μＬ、１８９ｐｍｏｌ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２、１２ｍＭ）中の１８．９μＭ溶液））と混合し、１８時間混合した。
【０１５１】
［実施例２．４］  ナノ粒子のロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体への生体共役反応
図１４は、以下のナノ粒子試料を示す。
試料ａ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ１。
試料ｂ：１８時間混合したナノ粒子溶液ＣＰＮ２。
試料ｃ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ２（４００μＬ、２２．８ｐｍｏｌ）を１６時間混合し、次いでグリシン（３．８μＬの２００μＭ溶液、０．７６μｍｏｌ）でクエンチし、さらに２時間撹拌した。
試料ｄ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ２（２３３μＬ、１３．３ｐｍｏｌ）に、二次抗体（１０μＬ、１３３ｐｍｏｌ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１２ｍＭ）中の１３．３μＭ溶液））を添加し、室温で１６時間混合した。グリシン（２．２μＬの２００μＭ溶液、０．４４μｍｏｌ）を添加し、溶液をさらに２時間混合した。
試料ｅ：ナノ粒子溶液ＣＰＮ１（２１８μＬ、１３．３ｐｍｏｌ）を、二次抗体（１０μＬ、１３３ｐｍｏｌ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１２ｍＭ）中の１３．３μＭ溶液））と混合し、１８時間混合した。
【０１５２】
［実施例２．５］  Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）によるナノ粒子活性化およびその後のカップリング
（ステップ１）  ナノ粒子のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化
【表１６】
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上記体積を混合し、１５分間インキュベートした。
次いで、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で事前に平衡化されたＰＤ１０カラム（脱塩Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）を使用して上記反応物を脱塩し、蛍光（緑）画分を収集した（〜１．０ｍｌ）。通過および他の画分は非蛍光性であった。
【０１５３】
以下のように、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で平衡化されたＰＤ１０カラム内で、タンパク質を脱塩した。
（ｉ）ストレプトアビジン−Ｃｙ５ストック（１６ｕＭ）（Ｃｙ５−ＳＡ）を、ＨＥＰＥＳ（１００ｕＬ＋３００ｕＬ  ＨＥＰＥＳ）中に４倍希釈し、またＨＥＰＥＳ中でＰＤ１０カラムで脱塩した。最終濃度は３ｕＭであった。
（ｉｉ）抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＩｇＧ１）  ２５０ｕＬ＋２５０ｕＬ  ＨＥＰＥＳ
（ｉｉｉ）抗ビオチンＩｇＧ−ＡＫＰ（ＩｇＧ２）  １００ｕＬ＋４００ｕＬ  ＨＥＰＥＳ
（ｉｉｉ）５００ｕＬ中のＰｅｒＣＰ（２ｍｇ／ｍＬ）。
（ｉｖ）ストック５ｍｇ／ｍＬビオチン−カダベリン（Ｂｔ−Ｃａｄ）  １ｍｇ／２００ｕＬ  ＨＥＰＥＳ（１１ｍＭ）
蛍光画分の最終体積を収集した（約６００ｕＬ）。
【０１５４】
（ステップ２）  ＥＤＣ−ＮＨＳ活性化ナノ粒子とのカップリング反応
脱塩された試料を以下のようにカップリングした。
【表１７】
2019511455.tif 000073
各４００ｕＬの反応物を、室温で２時間インキュベートしてから、１０ｕＬの１Ｍエタノールアミンを添加した。次いで、反応物を４℃で一晩保存した。
【０１５５】
（ステップ３）  ＥＤＣ−ＮＨＳ活性化ナノ粒子カップリング反応の評価。
ストレプトアビジン−ＨＰ  ＳｐｉｎＴｒａｐカラム（高度架橋アガロース、６％）を、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で事前に平衡化した。
（ｉ）ビオチン化ナノ粒子をＨＥＰＥＳ中に１０倍希釈（５０ｕＬ＝４５０ｕＬ  ＨＥＰＥＳ）  −  ４００ｕＬをスピンカラムに投入した。
（ｉｉ）ナノ粒子対照の６０倍希釈物を使用（ナノ粒子のみ５０ｕＬ＝４５０ｕＬ  ＨＥＰＥＳ）  −  ４００ｕＬをスピンカラムに投入した。
（ｉｉｉ）室温で１時間インキュベートした。
（ｉｖ）インキュベーション後に上澄みの蛍光を測定した。
ビオチン化ナノ粒子＝１００ＲＦＵ、Ｌｕｍｉｎｓｐｈｅｒｅｓ（商標）対照＝２４０ＲＦＵ。より多くのビオチン化Ｌｕｍｉｎｓｐｈｅｒｅｓ（商標）がストレプトアビジン共役アガロースビーズに特異的に結合したことを示している。
（ｖ）両方のスピンカラムをＨＥＰＥＳ（０．５ｍＬ）で洗浄、通過および洗浄画分は蛍光性ではなかった。
【０１５６】
［実施例２．６］  ５％のベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール、５％の９，９’−スピロビフルオレン、７０％の９，９−ジオクチル（フルオレン）、１０％の９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）（フルオレン）、５％の９，９−ジ（ビオチン−ウンデカノエート）（フルオレン）の合成
【化５５】
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Ｓｃｈｌｅｎｋ管内に、水（２０ｍＬ）および水酸化ナトリウム（３２．０ｍｇ、８００μｍｏｌ）を加え、溶液をアルゴンで２時間パージした。トルエンをアルゴンで２時間脱気した。バイアル内で、９，９−ジ−ｎ−オクチルフルオレン−２，７−ジボロン酸ビス（プロパンジオール）エステル（１１１．７ｍｇ、２００μｍｏｌ）、９，９−ジ−ｎ−オクチル−２，７−ジブロモフルオレン（４３．９ｍｇ、８０μｍｏｌ）、９，９−ジ（ビオチン−ウンデカノエート）ジブロモフルオレン（２２．３ｍｇ、２０．０μｍｏｌ）、２，２’，７，７’−テトラブロモ−９，９’−スピロビフルオレン（１２．６ｍｇ、２０μｍｏｌ）、４，７−ジブロモベンゾ［ｃ］−１，２，５−チアジアゾール（５．９ｍｇ、２０μｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（４．６ｍｇ、５．０μｍｏｌ）およびトリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９．１ｍｇ、３０μｍｏｌ）を秤量した。バイアルをアルゴンで３０分間パージした。トルエン（２．００ｍＬ）を添加し、超音波浴内で均質溶液に達するまで懸濁液に超音波処理した。９，９−ジ（ナトリウムウンデカノイルサルフェート）２，７−ジブロモフルオレン（３４．７ｍｇ、４０μｍｏｌ）を最初の水溶液に添加し、氷浴内で０℃に冷却した。トルエン溶液をアルゴンストリーム下で速やかに水相に添加し、２ｃｍの深さまで超音波プローブを挿入した（６ｍｍのマイクロチップ）。溶液に３０％の振幅で２分間超音波処理し、３０秒間撹拌し、このシーケンスをさらに４回繰り返した。撹拌棒を入れ、フラスコを封止し、４０℃に予熱した湯浴内に設置し、２０時間撹拌した。フラスコを５０℃に加熱し、撹拌しながらエマルション上に空気を５時間通した。エマルションを室温に冷却し、４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ガラスウールプラグを通して濾過すると、明緑色の分散液が得られた（エマルションの測定質量：２３．００ｇ。予測濃度：７．１８ｍｇ／ｍＬ）。
【０１５７】
［実施例２．７］  ナノ粒子−細胞フローおよびイメージングサイトメトリー
（細胞培養およびナノ粒子のインキュベーション）
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種し、完全密集まで増殖させた。ナノ粒子（７ｍｇ／ｍｌ、ＣＯ２Ｈ  １．８ｕｍｏｌ／ｍＬ、サイズ＝７６ｎｍ、吸収＝３７５ｎｍ、発光＝５３６ｎｍ）懸濁液の対数希釈を、細胞培養培地（添加ＤＭＥＭ）中で１：１０２から１：１０６まで行った。培地を細胞から吸引し、ナノ粒子懸濁液を含有する培地で置換した。１つのウェルは、対照ウェルとして機能させるために、ナノ粒子なしの成長培地を有していた。３７℃／５％ＣＯ２で５５分間細胞をインキュベートし、ナノ粒子の潜在的結合／取込みをもたらした。ナノ粒子を細胞から吸引し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。０．２ｍＬのトリプシン−ＥＤＴＡで５分間のインキュベーションにより細胞をプレートから回収し、０．３ｍＬのＰＢＳ＋５％ＢＳＡを細胞に添加し、０．５ｍＬの最終体積への穏やかなピペット操作により細胞を分離させた。
【０１５８】
（フローサイトメトリー分析）
凝集物を除去するために、５０ｕｍメッシュを通して、５ｍＬのポリプロピレン丸底管内に細胞を濾過した。死滅細胞を特定するために、生存判別マーカーＴＯＰＲＯ−３を１〜５００の希釈率で添加した。非標識化細胞を用いることにより決定された設定を使用して、細胞を３５５、４８８、４０５、５６１および６４７ｎｍレーザー線励起によりＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘ細胞選別機にかけた。細胞残屑および死滅細胞から生存細胞が特定され、２０，０００細胞が記録された。フローサイトメトリーの後、最適なポジティブ信号を有する試料を、Ａｍｎｉｓ  ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍイメージングサイトメーターでの分析に選択した。
【０１５９】
（イメージングサイトメトリー）
１００ｕｌの細胞懸濁液を１．５ｍＬのエッペンドルフ管内に入れ、ＩＳＸイメージングサイトメーターに投入した。４８８ｎｍ（１００ｍＷ出力設定）および４０５ｎｍ（２０ｍＷ出力設定）励起を使用して、ビーズの上で細胞が特定され、１０００細胞が明視野において記録され、側方散乱および２つの蛍光発光チャネルはナノ粒子発光に最適となるように選択され、倍率は４０倍であった。データはＩＤＥＡＳ  ｖ６ソフトウェアを使用して分析された（図１５を参照されたい）。
【０１６０】
本明細書において、参照および例示を目的として本発明の特定の実施形態を説明してきたが、添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲から逸脱せずに、様々な修正が当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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