(57)【要約】  本実施形態は、１：０．２０〜１：０．９０の範囲内で選択されたモル比での担体タンパク質と担体−Ｚ融合タンパク質のｃｏ−フィブリル化により得ることができる抗体結合性ナノフィブリルに関する。この抗体結合性ナノフィブリルは、非常に高い抗体結合能を有し、それにより抗体の精製、および医療現場または実験室診断の用途におけるバイオマーカの検出等の、様々な用途で使用できる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１：０．２０〜１：０．９０の範囲内で選択されるモル比での担体タンパク質と担体−Ｚ融合タンパク質のｃｏ−フィブリル化により得ることができる抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項２】
１：０．２０〜１：０．９０の範囲内で選択されるモル比で前記担体タンパク質および前記担体−Ｚ融合タンパク質を含む請求項１に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項３】
前記モル比が、１：０．３０〜１：０．９０の範囲内、好ましくは１：０．３０〜１：０．７０の範囲内、かつより好ましくは１：０．３０〜１：０．５０の範囲内で選択される、請求項１または２に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項４】
前記キャリアタンパク質が、Ｓｕｐ３５キャリアタンパク質であり、かつ前記キャリア−Ｚ融合タンパク質が、Ｓｕｐ３５−Ｚ融合タンパク質である、請求項１〜３の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項５】
前記Ｓｕｐ３５キャリアタンパク質が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のＮ末端断片であり、かつ前記Ｓｕｐ３５−Ｚ融合タンパク質が、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５の前記Ｎ末端断片と少なくとも１つのＺドメインとの融合タンパク質である、請求項４に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項６】
前記Ｎ末端断片が、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のアミノ酸番号１〜６１からなる、請求項５に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項７】
前記モル比が、１：０．３０〜１：０．４０の範囲内、好ましくは１：０．３０〜１：０．３５の範囲内で選択され、かつより好ましくは約１：０．３３に等しい、請求項４〜６の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項８】
前記担体タンパク質が、Ｕｒｅ２担体タンパク質であり、かつ前記担体−Ｚ融合タンパク質が、Ｕｒｅ２−Ｚ融合タンパク質である、請求項１〜３の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項９】
前記Ｕｒｅ２担体タンパク質が、サッカロマイセス・セレビシエ・セレビシエウレイドコハク酸輸送タンパク質のＮ末端断片であり、かつ前記Ｕｒｅ２−Ｚ融合タンパク質が、Ｓ．セレビシエ・ウレイドコハク酸輸送タンパク質の前記Ｎ末端断片と少なくとも１つのＺドメインとの融合タンパク質である、請求項８に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１０】
前記Ｎ末端フラグメントが、Ｓ．セレビシエ・ウレイドコハク酸輸送タンパク質のアミノ酸番号１〜８０からなる、請求項８に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１１】
前記モル比が、１：０．４５〜１：０．５５の範囲内、好ましくは１：０．４７〜１：０．５１の範囲内で選択され、かつより好ましくは約１：０．４９に等しい、請求項８〜１０の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１２】
前記担体−Ｚ融合タンパク質が、前記担体タンパク質とプロテインＡの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメインとの間の融合タンパク質である、請求項１〜１１の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１３】
前記担体−Ｚ融合タンパク質が、担体−Ｚ二量体融合タンパク質である、請求項１〜１２の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１４】
前記抗体結合性ナノフィブリルが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を結合できる、請求項１〜１３の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１５】
前記抗体結合性ナノフィブリルが、ナノフィブリル１ｍｇ当たり少なくとも１．５ｍｇの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、好ましくはナノフィブリル１ｍｇ当たり少なくとも１．６ｍｇのＩｇＧ、より好ましくは１ｍｇのナノフィブリル当たり少なくとも１．７ｍｇのＩｇＧ、ナノフィブリル１ｍｇ当たり少なくとも１．８ｍｇのＩｇＧなどの結合能を有する、請求項１〜１４の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１６】
担体−Ｚ融合タンパク質の少なくとも１つのＺドメインに結合される少なくとも１つの抗体を含む、請求項１〜１５の何れか1項に記載の抗体結合性ナノフィブリル。
【請求項１７】
サンプル中の化学物質の存在を検出するためのキットであって、
請求項１〜１５の何れか１項に記載の抗体結合性ナノフィブリルと、
前記サンプル中の前記化学物質に特異的に結合する抗体とを含み、
前記抗体結合性ナノフィブリルの担体−Ｚ融合タンパク質が、前記抗体に結合できる、キット。
【請求項１８】
固体表面上に固定化された請求項１〜１５の何れか１項に記載の抗体結合性ナノフィブリルを含む抗体捕捉装置。
【請求項１９】
抗体結合性ナノフィブリルを製造する方法であって、前記抗体結合性ナノフィブリルを形成するために１：０．２０〜１：０．９０の範囲内において選択されるモル比で担体担体タンパク質及び担体−Ｚ融合タンパク質をｃｏ−フィブリル化すること（Ｓ２）を含む、方法。
【請求項２０】
水溶液中で担体タンパク質を超音波処理することによりタネを製造すること（Ｓ１）を更に含む、請求項１９に記載の方法であって、前記担体タンパク質と前記担体−Ｚ融合タンパク質をｃｏ−フィブリル化すること（Ｓ２）が、前記モル比での前記担体タンパク質及び前記担体−Ｚ融合タンパク質と共に前記タネをインキュベート（Ｓ２）して前記抗体結合性ナノフィブリルを形成することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本実施形態は一般に、ナノフィブリルに関し、特に抗体結合性ナノフィブリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
材料の特性がサブμｍスケールで実質的に変化するという認識が、ナノテクノロジーの出現の誘因となった。例えば、１００ｎｍ未満の直径を有する繊維またはフィブリルはそれらの巨視的対応物よりも、表面積／体積比、種々の機能および機械的特性において優れている。ナノフィブリルは、炭素、アクリルニトリル、シリコンなどの多種多様な材料から、またはセルロース、キチンおよびタンパク質などの生物起源の分子から合成することができる。
【０００３】
秩序だったナノフィブリルまたはナノ繊維へのタンパク質のアセンブリ（フィブリル化）の性質は、非常に複雑である。そのため、フィブリル化の詳細を解明するため、およびナノフィブリルの分子構造を理解するために相当な努力が行われてきた。これらの研究は、機能的凝集体の構築及びアミロイド疾患の遺伝をカバーする生命科学の、不可欠な側面に対する洞察を提供することを意図している。成熟したフィブリルは架橋β型構造を有し、これは極めて硬質であり且つ並外れた物理的および化学的安定性を示す。この事実が架橋β線維を、全ての種類のバイオテクノロジー応用を探求するための標的にする。この文脈において、別の有用な特性は、タンパク質の再折畳みおよびナノフィブリルアセンブリが自己伝播性であることであり、これは、時に重合と称される凝集の、連続的な制御の必要性を排除する。更に、タンパク質工学は遺伝子レベルで実施されるので、ペプチドのフィブリル化は、ナノフィブリル材料を意図した目的に応じて適合され得る。
【０００４】
診断目的および治療のために使用される抗体についてのニーズの高まりは、それらを精製するためのコスト効率的手段を必要とする。典型的には、抗体は、プロテインＡ［例えばプロテインＡセファロース（登録商標）ＣＬ４Ｂ（ＧＥヘルスケア）］で被覆された、架橋アガロースビーズのマトリックスに基づくアフィニティークロマトグラフィーにより精製される。プロテインＡセファロース（登録商標）は抗体精製のための主力であるが、媒体の高コストに関連して、２０〜５０ｍｇ／ｍＬの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結合能が精製の律速因子である。この精製プロトコルにより提起される制約は、プロテインＡを用いる必要性を回避するために、ＩｇＧの正確な生化学的特性に基づく別のクロマトグラフィー法の開発を促進してきた。結合能力を増加させることを目的とする別のアプローチは、プロテインＡ提示のためのマトリックスを変化させることである。例えば、ポリエステルビーズのＰｏｌｙＢｉｎｄ−Ｚ（商標）（ＰｏｌｙＢａｔｉｃｓ製）は、排出された媒質１ｇ当たり１００ミリグラムの結合能力を生じることが示された。
【０００５】
二官能性タンパク質ナノフィブリルが、プロテインＧまたはメチルパラチオンヒドロラーゼ（ＭＰＨ）と遺伝子的に融合された、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の播種誘発性自己アセンブルＳｕｐ３５タンパク質を用いて製造された［１］。プロテインＧはＩｇＧ分子に結合でき、ＩｇＧ分子が特異性を有する抗原を固定化したプレート上にナノフィブリルを固定するために使用された。この免疫アッセイは、従来の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）と比較して、ペスト菌Ｆ１抗原の検出に適用した場合に１００倍の感度増強をもたらした。
【０００６】
タンパク質ナノフィブリルは、Ｓｕｐ３５蛋白質およびヒトＬａ蛋白質を用いて製造された［２６］。これらのタンパク質ナノフィブリルは、ヒトＬａタンパク質の断片（アミノ酸１７９〜３６４）への結合により抗ＳＳＢ／Ｌａ抗体を検出するために使用された。従って、タンパク質ナノフィブリルは、シェーグレン症候群のマーカーを検出するために使用できる。
【０００７】
しかしながら、抗体に対して高い結合能を有し、かつ抗体を捕獲および／または精製するために用いることができる技術が必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
目的は、抗体結合性ナノフィブリルを提供することである。
【０００９】
特別な目的は、改善された抗体結合能を有するそのようなナノフィブリルを提供することである。
【００１０】
これらのおよび他の目的は、本明細書に開示される実施形態によって満たされる。
【００１１】
実施形態のある態様は、１：０．２０〜１：０．９０の範囲内の選択されたモル比での担体タンパク質及び担体−Ｚ融合タンパク質のｃｏ−フィブリル化により得られる抗体結合性ナノフィブリルに関する。
【００１２】
実施形態の別の態様は、サンプル中の化学物質の存在を検出するためのキットに関する。キットは、上記の抗体結合性ナノフィブリル及びサンプル中の化学物質に特異的に結合する抗体を含む。上記抗体結合性ナノフィブリルの担体−Ｚ融合タンパク質は、抗体を結合できる。
【００１３】
実施形態の更なる態様は、固体表面上に固定化された上記の抗体結合性ナノフィブリルを含む抗体補足装置に関する。
【００１４】
実施形態の更に別の態様は、抗体結合性ナノフィブリルを製造する方法に関する。この方法は、１：０．２０〜１：０．９０の範囲内の選択されたモル比で担体タンパク質及び担体―Ｚ融合タンパク質をｃｏ−フィブリル化して抗体結合性ナノフィブリルを形成することを含む。
【００１５】
実施形態の抗体結合性ナノフィブリル抗体は、改善された抗体結合能を有する。この改善された抗体結合能は、抗体精製に関して今日のゴールドスタンダードであるプロテインＡセファロース（登録商標）アフィニティー媒体と比較して、約２０倍高い。
【００１６】
添付の図面と一緒に以下の説明を参照することによって、実施形態は、その更なる目的及び利点と共に最も良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例において用いた非官能性及び官能性Ｓｕｐ３５及びＵｒｅ２タンパク質構築物を概略的に示す。略語ＴＳはトロンビン切断部位を指す。
【図２−１】固定化されたＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ（Ａ、Ｅ）、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）（Ｂ）、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺフィブリル（Ｃ）、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）フィブリル（Ｄ）またはＺ（Ｆ）とのヒトＩｇＧの相互作用のビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサグラムを示す。タンパク質及びフィブリルは、Ｈｉｓ６−ｔａｇを介してＮＴＡ−ｃｈｉｐ上に固定化された。（Ａ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、（Ｂ）リガンド：ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｃ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺフィブリル（官能性タンパク質：非官能性タンパク質のモル比は１：０．０４）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｄ）リガンド：ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）フィブリル（非官能性タンパク質：官能性タンパク質のモル比は１：０．０４）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｅ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ（ｌａｂ−精製）、（Ｆ）リガンド：Ｚ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ。オリジナルデータは、低濃度点（塗り潰し）から高濃度点（白抜き）へと点により表される。データは、１：１結合モデル（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または実線で示される２価アナライトモデル（Ｃ、Ｄ）に適合された。
【図２−２】固定化されたＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ（Ａ、Ｅ）、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）（Ｂ）、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺフィブリル（Ｃ）、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）フィブリル（Ｄ）またはＺ（Ｆ）とのヒトＩｇＧの相互作用のビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサグラムを示す。タンパク質及びフィブリルは、Ｈｉｓ６−ｔａｇを介してＮＴＡ−ｃｈｉｐ上に固定化された。（Ａ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、（Ｂ）リガンド：ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｃ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺフィブリル（官能性タンパク質：非官能性タンパク質のモル比は１：０．０４）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｄ）リガンド：ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）フィブリル（非官能性タンパク質：官能性タンパク質のモル比は１：０．０４）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｅ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ（ｌａｂ−精製）、（Ｆ）リガンド：Ｚ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ。オリジナルデータは、低濃度点（塗り潰し）から高濃度点（白抜き）へと点により表される。データは、１：１結合モデル（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または実線で示される２価アナライトモデル（Ｃ、Ｄ）に適合された。
【図２−３】固定化されたＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ（Ａ、Ｅ）、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）（Ｂ）、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺフィブリル（Ｃ）、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）フィブリル（Ｄ）またはＺ（Ｆ）とのヒトＩｇＧの相互作用のビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）センサグラムを示す。タンパク質及びフィブリルは、Ｈｉｓ６−ｔａｇを介してＮＴＡ−ｃｈｉｐ上に固定化された。（Ａ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、（Ｂ）リガンド：ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｃ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺフィブリル（官能性タンパク質：非官能性タンパク質のモル比は１：０．０４）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｄ）リガンド：ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）フィブリル（非官能性タンパク質：官能性タンパク質のモル比は１：０．０４）、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ、（Ｅ）リガンド：Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ（ｌａｂ−精製）、（Ｆ）リガンド：Ｚ、アナライト：ヒトＩｇＧ５−４０ｎＭ。オリジナルデータは、低濃度点（塗り潰し）から高濃度点（白抜き）へと点により表される。データは、１：１結合モデル（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または実線で示される２価アナライトモデル（Ｃ、Ｄ）に適合された。
【図３】官能性ドメインＺＺを表すＳｕｐ３５（１−６０）（Ａ）またはＵｒｅ２（１−８０）（Ｂ）ナノフィブリルを用いた、ヒト血清からのＩｇＧの精製を示す。（Ａ）ヒトＩｇＧの重鎖が５０ｋＤａで、軽鎖が２５ｋＤａで見られ、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺは２２ｋＤａで、およびＳｕｐ３５（１−６１）は１４ｋＤａで見られる。レーン１．ヒト血清、２．遠心分離及びフィブリルとのインキュベーション後の上清、３．ウォッシュ、４．溶出後に残る不溶性物質、５．溶出液、６．ゲル濾過後の溶出液。７〜１１．ヒトＩｇＧ：０．０６２５〜１ｍｇ／ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１２．プレシジョン  プラス  プロテイン未着色標準（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（Ｂｉｏｒａｄ）。（Ｂ）ヒトＩｇＧの重鎖が５０ｋＤａで、軽鎖が２５ｋＤａで見られ、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）は２５ｋＤａで、またＵｒｅ２（１−８０）は１８ｋＤａで見られる。レーン１．ヒト血清、２．遠心分離及びフィブリルとのインキュベーション後の上清、３．ウォッシュ、４．溶出後に残る不溶性物質、５．溶出液、６．ゲル濾過後の溶出液、７〜１０．ヒトＩｇＧ、０．１２５〜１ｍｇ／ｍＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１１．プレシジョン  プラス  プロテイン未着色標準（Ｂｉｏｒａｄ）。
【図４−１】１：０．１６の非官能性タンパク質：官能性タンパク質の比を有する抗体結合性フィブリルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。このフィブリルは、ヒトＩｇＧで飽和され、金に結合された二次抗体で標識された。画像の指定された部分は、１２．５〜２５倍拡大された。黒の点は、５ｎｍの金粒子を表す。
【図４−２】１：０．１６の非官能性タンパク質：官能性タンパク質の比を有する抗体結合性フィブリルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。このフィブリルは、ヒトＩｇＧで飽和され、金に結合された二次抗体で標識された。画像の指定された部分は、１２．５〜２５倍拡大された。黒の点は、５ｎｍの金粒子を表す。
【図５−１】ＩｇＧ結合パラメータに対する、ｃｏ−フィブリル組成物、即ち、フィブリルドーピング頻度の影響を概略的に示す。非官能性タンパク質：官能性タンパク質についてモル比１：０．０４〜０．６５（Ｓｕｐ３５−ｃｏ−フィブリル、Ａ、Ｃ、Ｅ）または１：０．０４〜０．９（Ｕｒｅ２−ｃｏ−フィブリル、Ｂ、Ｄ、Ｆ）をカバーする、幾つかのフィブリル型が研究された。足場タンパク質に対する融合タンパク質のモル頻度は、ｘ軸上で「ドーピング頻度」と呼ばれる。（Ａ、Ｂ）ドーピング頻度の関数としてのｃｏ−フィブリルのＩｇＧ結合能。フィブリル１ｍｇ当たりの極大値１．８ｍｇ（Ｓｕｐ３５）及び１．７ｍｇ（Ｕｒｅ２）が、それぞれ１：０．３３及び１：０．４９のモル比で達成された。（Ｃ、Ｄ）１つの抗体分子を結合するために必要なタンパク質の数。（Ｅ、Ｆ）理論的な最大結合能で除した実験的に決定されたＩｇＧ結合能は、最低ドーピング頻度、即ち、０．０４および０．０８を有するフィブリルを考慮しないならば線形減少を示す。全てのデータ点は、６つの独立測定値からの平均値を表す。
【図５−２】ＩｇＧ結合パラメータに対する、ｃｏ−フィブリル組成物、即ち、フィブリルドーピング頻度の影響を概略的に示す。非官能性タンパク質：官能性タンパク質についてモル比１：０．０４〜０．６５（Ｓｕｐ３５−ｃｏ−フィブリル、Ａ、Ｃ、Ｅ）または１：０．０４〜０．９（Ｕｒｅ２−ｃｏ−フィブリル、Ｂ、Ｄ、Ｆ）をカバーする、幾つかのフィブリル型が研究された。足場タンパク質に対する融合タンパク質のモル頻度は、ｘ軸上で「ドーピング頻度」と呼ばれる。（Ａ、Ｂ）ドーピング頻度の関数としてのｃｏ−フィブリルのＩｇＧ結合能。フィブリル１ｍｇ当たりの極大値１．８ｍｇ（Ｓｕｐ３５）及び１．７ｍｇ（Ｕｒｅ２）が、それぞれ１：０．３３及び１：０．４９のモル比で達成された。（Ｃ、Ｄ）１つの抗体分子を結合するために必要なタンパク質の数。（Ｅ、Ｆ）理論的な最大結合能で除した実験的に決定されたＩｇＧ結合能は、最低ドーピング頻度、即ち、０．０４および０．０８を有するフィブリルを考慮しないならば線形減少を示す。全てのデータ点は、６つの独立測定値からの平均値を表す。
【図５−３】ＩｇＧ結合パラメータに対する、ｃｏ−フィブリル組成物、即ち、フィブリルドーピング頻度の影響を概略的に示す。非官能性タンパク質：官能性タンパク質についてモル比１：０．０４〜０．６５（Ｓｕｐ３５−ｃｏ−フィブリル、Ａ、Ｃ、Ｅ）または１：０．０４〜０．９（Ｕｒｅ２−ｃｏ−フィブリル、Ｂ、Ｄ、Ｆ）をカバーする、幾つかのフィブリル型が研究された。足場タンパク質に対する融合タンパク質のモル頻度は、ｘ軸上で「ドーピング頻度」と呼ばれる。（Ａ、Ｂ）ドーピング頻度の関数としてのｃｏ−フィブリルのＩｇＧ結合能。フィブリル１ｍｇ当たりの極大値１．８ｍｇ（Ｓｕｐ３５）及び１．７ｍｇ（Ｕｒｅ２）が、それぞれ１：０．３３及び１：０．４９のモル比で達成された。（Ｃ、Ｄ）１つの抗体分子を結合するために必要なタンパク質の数。（Ｅ、Ｆ）理論的な最大結合能で除した実験的に決定されたＩｇＧ結合能は、最低ドーピング頻度、即ち、０．０４および０．０８を有するフィブリルを考慮しないならば線形減少を示す。全てのデータ点は、６つの独立測定値からの平均値を表す。
【図６】一実施形態に従って抗体結合性ナノフィブリルを製造する方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態は一般に、当該技術においてナノ繊維とも称される、ナノフィブリルに関する。特に、実施形態は、抗体を結合できる新規なナノフィブリル、即ち、抗体結合性ナノフィブリルに関する。
【００１９】
実施形態の抗体結合性ナノフィブリルは、２つのタンパク質種またはペプチド種、所謂担体タンパク質もしくはペプチドと、官能化された担体タンパク質もしくはペプチドとのｃｏ−フィブリル化、即ち、アセンブリによって得られる。担体タンパク質は、分子自己アセンブリプロセスでオリゴマーへと凝集し、更にフィブリル及び繊維へと凝集する可溶性タンパク質モノマーである。このことは、担体タンパク質が自然に、または誘導されて、担体タンパク質モノマーから出発してより長い構造へと凝集及びアセンブルし、かつオリゴマー及び更にはフィブリルへと成長することを意味する。フィブリルは一般にナノメートル範囲の直径を有し、従って、本明細書ではナノフィブリルと称される。ナノフィブリルの典型的なコア径は、とりわけ、官能化担体タンパク質における特定の担体タンパク質及び官能基（複数可）に応じて、３〜２０ナノメートル内である。ナノフィブリルは、フィブリル化プロセスの間に、長さが1ミクロンまたは数ミクロンのかなり長いフィブリルへと成長し得る。ナノ繊維の微小径であるが比較的大きい長さの結果、ナノフィブリルは、優れた表面積／体積比を提示する。
【００２０】
２つのタンパク質種、即ち、担体タンパク質および官能化された担体タンパク質のｃｏ−フィブリル化は、得られるナノフィブリルが官能基を、即ち、抗体結合性の基またはドメインを含むことを意味する。
【００２１】
プロテインＧと遺伝子的に融合されたサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｕｐ３５とＭＰＨと遺伝子的に融合されたＳｕｐ３５タンパク質の自己アセンブリによって得られる二官能性ナノフィブリルが当技術分野において知られている［１］。このナノフィブリルのプロテインＧ基はＩｇＧ分子に結合し、ＩｇＧ分子が特異性を有する固定化された抗原を有するプレート上に上記ナノフィブリルを固定化するために使用された。抗体結合性ナノフィブリルは、ヒトＬａタンパク質の断片と遺伝的に融合されたＳｕｐ３５タンパク質により得られた。［１，２６］に例示されるように抗体結合能力を有する従来技術のナノフィブリルは、しかしながら、ナノフィブリルの抗体結合能に関して最適化されていない。
【００２２】
本実施形態は、向上した抗体結合能を有する抗体結合性ナノフィブリルに向けられる。この改善された抗体結合能は、担体タンパク質と官能化された担体タンパク質との間の選択された範囲のモル比を使用することによって達成される。本明細書で提示される実験データは、抗体結合能力に関する改善は、本発明のモル比の範囲内における担体タンパク質と官能化された担体タンパク質とのｃｏ−フィブリル化によってのみ達成されることを示している。
【００２３】
従って、ｃｏ−フィブリル化プロセスの際の官能化された担体タンパク質の量が非官能性担体タンパク質に比較して低すぎれば、得られる抗体結合性ナノフィブリルは、低い数の抗体結合ドメインを有し、それにより最大の抗体結合能には遥かに届かないであろう。しかしながら、非官能性担体タンパク質に対する官能化された担体タンパク質の量が本発明の範囲の上限を超えて増大すれば、得られるナノフィブリルの抗体結合能は低下する。より多い官能化ドメインを備えたナノフィブリルに見られるこの予測されなかった抗体結合能の低下は、ナノフィブリル内での立体的制限によって生じる官能化されたドメインのアクセス可能性の低下に起因するものであろう。この発見は、各担体タンパク質が官能化された［即ち、何れもが酵素ドメイン（ＭＰＨ）または抗体結合性ドメイン（プロテインＧ）を有する］先行技術［１，２６］の抗体結合性ナノフィブリルを考慮すると、非常に驚くべきものである。
【００２４】
従って、担体タンパク質と官能化された担体タンパク質とのモル比が本発明の範囲未満であれば、ナノフィブリルは僅かな抗体結合性ドメインしか提示せず、それにより、本実施形態の抗体結合性ナノフィブリルに比較して遥かに低い抗体結合能を有するであろう。これに対応して、モル比が逆に上記本発明の範囲を超えていれば、ナノフィブリルは多くの抗体結合ドメインを提示する。しかしながら、立体障害のために、実際にアクセス可能で且つ抗体を結合できる抗体結合性ドメインの数は、本実施形態の抗体結合性ドメインに比較して低いであろう。
【００２５】
実施形態の一つの態様は、１：０．２０〜１：０．９0の範囲内で選択されたモル比での担体タンパク質と担体−Ｚ融合タンパク質とのｃｏ−フィブリル化により得られる、抗体結合性ナノフィブリル、即ち、ナノ繊維に関する。
【００２６】
抗体結合性ナノフィブリルは従って、ｃｏ−フィブリル化、即ち、担体タンパク質と官能化された担体タンパク質、即ち、抗体結合能を有する、担体−Ｚ融合タンパク質のｃｏ−アセンブリまたはｃｏ−凝集により得ることができる。上記ｃｏ−フィブリル化は、二つの異なるモノマー種が凝集し、ナノメータ範囲内の直径及び典型的なマイクロメータ領域内の長さを典型的に備えたフィブリル構造を形成することを意味する。実施形態の選択されたモノマー種のモル比は、十分に高濃度のＺドメイン、即ち、抗体結合性ドメインを備えた高い抗体結合能を有するナノフィブリルの形成を導くが、そのようなＺドメインの濃度は、抗体に対するＺドメインのアクセス可能性を低下させるほど高くはない。
【００２７】
実施形態の抗体結合性ナノフィブリルは、それによって、１：０．２０〜１：０．９0の範囲内で選択されるモル比で上記担体タンパク質及び担体Ｚ融合タンパク質を含む。
【００２８】
ある実施形態において、抗体結合性ナノフィブリルの抗体結合性ドメイン、即ち、Ｚドメインは好ましくは、上記抗体結合性ナノフィブリルの全長に亘って分布される。従って、好ましい実施形態において、上記Ｚドメインは、抗体結合性ナノフィブリルの一部分に単に存在するだけでなく、抗体結合性ナノフィブリルの全長、または少なくともその大部分に亘って、均等に分布される。
【００２９】
本明細書で使用される担体−Ｚ融合タンパク質は、担体タンパク質モノマーまたはドメイン、即ちフィブリル化ドメインが少なくとも１つのＺドメイン、即ち抗体結合性ドメイン（複数可）に融合されて、融合タンパク質を形成することを指す。ドメインの融合は好ましくは、遺伝子レベルで、即ち、上記担体タンパク質をコードするヌクレオチド配列を少なくとも１つのＺドメインをコードするヌクレオチド配列と組み合わせること、または融合させることによって行われる。ヌクレオチド配列の融合は、担体−Ｚ融合タンパク質をコードする遺伝子をもたらす。
【００３０】
担体−Ｚ融合タンパク質を得る現在の好ましい方法は、担体−Ｚ融合タンパク質の転写制御下に担体−Ｚ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む、プラスミドなどの発現カセットを含む、または宿主細胞のゲノム中のプロモーターの転写制御下に担体−Ｚ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞中での、担体−Ｚ融合タンパク質の産生である。しかしながら、実施形態はこれに限定されるものではない。例えば、別々に製造された担体タンパク質およびＺドメインを化学的に連結するなどの、担体−Ｚ融合タンパク質を生成する別の方法も可能である。
【００３１】
ある実施形態において、担体タンパク質のＮ末端またはＣ末端は、担体−Ｚ融合タンパク質中の少なくとも１つのＺドメインのＣ末端またはＮ末端に直接的に連結されてよい。或いは、担体タンパク質および少なくとも１つのＺドメインは、架橋またはリンカーによって相互連結され得るであろう。このようなリンカーは、Ｎアミノ酸の短いペプチドの形態であり得る。ある実施形態において、Ｎは好ましくは、３〜１５、好ましくは３〜１２、より好ましくは３〜７の範囲内で選択され、例えば約５である。ある実施形態において、リンカーのアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グルタミン酸（Ｅ）およびリシン（Ｋ）、並びにそれらの組合せから好ましく選択される。そのようなモチーフの例は、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号１）であり、ｎは好ましくは２〜５、より好ましくは２〜３である。そのようなモチーフは、リンカー中にヘリックスを導入する。他のヘリックス形成モチーフが上記リンカーに使用され得るであろう。上記実施形態に従って使用できる更なるリンカーは、［２］における表３に開示されており、上記実施形態に従って使用され得る表３のリンカーモチーフに関するその教示は、本明細書の一部として本明細書に援用される。
【００３２】
ある実施形態において、担体タンパク質と担体−Ｚ融合タンパク質との間のモル比は、好ましくは１：０．３０〜１：０．９０、より好ましくは１：０．３０〜１：０．７０の範囲内である。特に好ましい範囲は、１：０．３０〜１：０．５０である（表２および表３、並びに図５Ａおよび図５Ｂを参照されたい）。
【００３３】
これらの好ましく且つより限定されたモル比範囲は、先に述べたより広い範囲と比較して、より高い抗体結合能を有するナノフィブリルをもたらす。
【００３４】
ある実施形態において、担体タンパク質はＳｕｐ３５担体タンパク質であり、担体−Ｚ融合タンパク質はＳｕｐ３５−Ｚ融合タンパク質である。ある実施形態において、Ｓｕｐ３５担体タンパク質は、サッカロマイセス・セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５の完全アミノ酸配列、即ち６８５アミノ酸を含む。しかしながら、一般には、このアミノ酸配列の一部分だけ、従って上記アミノ酸配列のフィブリル化部分を使用することが好ましい。このフィブリル化部分は、Ｓｕｐ３５タンパク質のＮ末端断片を構成する。簡単に言うと、Ｓｕｐ３５タンパク質は、アミノ酸１〜１２３に対応するフィブリル化Ｎ末端、Ｓｕｐ３５タンパク質に可溶性を与える中間ドメイン（Ｍドメイン）、およびＳｕｐ３５タンパク質の本来の機能にとって必須であるＣ末端またはＣ末端ドメインの３つのドメインからなる。従って、ある実施形態において、Ｓｕｐ３５担体タンパク質は、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のＮ末端断片であるか、或いは、一般にはあまり好ましくないが、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のＮ＋Ｍドメインまたはドメイン断片である。Ｓｕｐ３５−Ｚ融合タンパク質は従って、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のＮ末端断片と、少なくとも１つのＺドメインとの融合タンパク質である。
【００３５】
Ｎ末端フラグメントは従って、Ｓｕｐ３５タンパク質の完全なアミノ酸配列の一部を構成する。特定の実施形態において、Ｎ末端フラグメントは、本明細書中でＳｕｐ３５（１−６１）と表示される、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のアミノ酸番号１〜６１からなる。別の実施形態において、Ｎ末端フラグメントは、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のアミノ酸番号１〜４７からなる。更なる実施形態において、Ｎ末端フラグメントは、Ｓ．セレビシエ真核生物翻訳放出因子Ｓｕｐ３５のアミノ酸番号１〜５７からなる。
【００３６】
これらのＳｕｐ３５のＮ末端断片は、凝集の際にβシート構造をとり、フィブリル化過程で高度に秩序化されたクロスβ構造のナノフィブリルに自己アセンブルできる［３，４］。
【００３７】
ｃｏ−フィブリル化によって得られ、好ましくはＳｕｐ３５（１−６１）タンパク質およびＳｕｐ３５（１−６１）−Ｚ融合タンパク質を含む抗原結合性ナノフィブリルは、好ましくは１：０．３０〜１：４０の範囲内のＳｕｐ３５（１−６１）タンパク質およびＳｕｐ３５（１−６１）−Ｚ融合タンパク質のモル比を有する。モル比はより好ましくは、１：０．３０〜１：０．３５の範囲内であり、例えば好ましくは約１：０．３３に等しい。
【００３８】
表２および図５Ａに示される実験データは、担体タンパク質としてＳｕｐ３５、特にＳｕｐ３５（１−６１）を使用することに関して、上記のモル比の範囲または値が好ましいことを示している。
【００３９】
Ｓｕｐ３５（１−６１）−Ｚ融合タンパク質は好ましくは、そのＮ末端からＣ末端に向かって、Ｓｕｐ３５（１−６１）タンパク質に続いて少なくとも１つのＺドメインを含む。別の実施形態では、Ｓｕｐ３５（１−６１）タンパク質および少なくとも１つのＺドメインの順序は交換される。Ｓｕｐ３５（１−６１）ドメインと少なくとも１つのＺドメインとを相互接続する任意の架橋またはリンカーがＳｕｐ３５（１−６１）−Ｚ融合タンパク質中に存在し得る。
【００４０】
別の実施形態において、担体タンパク質はＵｒｅ２担体タンパク質であり、担体−Ｚ融合タンパク質はＺ−Ｕｒｅ２融合タンパク質である。ある実施形態において、Ｕｒｅ２担体タンパク質は、Ｓ．セレビシエのウレイドコハク酸輸送体タンパク質の完全なアミノ酸配列、即ち、３５４アミノ酸を含む。しかしながら、一般には、アミノ酸配列の一部分のみ、従ってアミノ酸配列のフィブリル化部分を使用することが好ましい。このフィブリル化部分は、Ｕｒｅ２タンパク質のＮ末端断片を構成する。従って、ある実施形態において、Ｕｒｅ２担体タンパク質は、Ｓ．セレビシエ真核生物ウレイドコハク酸輸送体タンパク質のＮ末端断片である。従って、Ｚ−Ｕｒｅ２融合タンパク質は、Ｓ．セレビシエ真核生物ウレイドコハク酸輸送体タンパク質のＮ末端断片と、少なくとも１つのＺドメインとの融合タンパク質である。
【００４１】
Ｎ末端断片は従って、Ｕｒｅ２タンパク質の完全なアミノ酸配列の一部を構成する。特定の実施形態において、Ｎ末端断片は、本明細書ではＵｒｅ２（１−８０）と表示される、Ｓ．セレビシエのウレイドコハク酸輸送体タンパク質のアミノ酸番号１〜８０からなる。他の特定の実施形態は、Ｓ．セレビシエのウレイドコハク酸輸送体Ｕｒｅ２のアミノ酸番号１〜９３，１〜６５，１〜８９および１０〜３９からなるＮ末端断片を使用することを含む。
【００４２】
Ｕｒｅ２のこれらのＮ末端フラグメントは、フィブリル化プロセスにおいて、高度に秩序化されたクロスβ構造のナノフィブリルへと自己アセンブルできる［５］。
【００４３】
ｃｏ−フィブリル化によって得られる、好ましくはＵｒｅ２（１−８０）タンパク質およびＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）融合タンパク質を含む抗原結合性ナノフィブリルは好ましくは、１：０．４５〜１：５５の範囲内の、Ｕｒｅ２（１−８０）タンパク質とＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）融合タンパク質とのモル比を有する。モル比は、より好ましくは１：０．４７〜１：０．５１の範囲内であり、例えば好ましくは約１：０．４９に等しい。
【００４４】
表３および図５Ｂに示す実験データは、担体タンパク質としてＵｒｅ２、特にＵｒｅ２（１−８０）を用いることに関して、上で述べたモル比の範囲または値が好ましいことを示す。
【００４５】
Ｚ−Ｕｒｅ２（１−８０）融合タンパク質は好ましくは、そのＮ末端からＣ末端に向かって、少なくとも１つのＺドメインに続くＵｒｅ２（１−８０）タンパク質を含む。別の実施形態では、Ｕｒｅ２（１−８０）タンパク質および少なくとも１つのＺドメインの順序は交換される。Ｕｒｅ２（１−８０）ドメインと少なくとも１つのＺドメインとを相互接続する任意の架橋またはリンカーが、Ｚ−Ｕｒｅ２（１−８０）融合タンパク質中に存在してもよい。
【００４６】
一般的に、実施形態は、融合タンパク質内の担体タンパク質および少なくとも１つのＺドメインの任意の順序、即ち、担体質に続いて、Ｎ末端からＣ末端に向けて、少なくとも１つのＺドメイン、または少なくとも１つのＺドメインに続いて担体タンパク質を使用できる。
【００４７】
Ｓｕｐ３５およびＵｒｅ２は、抗体結合性ナノフィブリルのための好ましい担体タンパク質である。実施形態はしかし、これに限定されない。このことは、分子自己アセンブリ（ＭＳＡ）が可能な他のタンパク質またはタンパク質断片もまた、上記実施形態に従って使用でき、かつ少なくとも１つのＺドメインで官能化され得るであろうことを意味する。上記実施形態に従って使用できるそのような他の担体タンパク質の非限定的かつ例証的な例は、タンデムリピートＳＨ３ドメイン［６］、Ｂ１６［７］、ウシホエイタンパク質［８］、βテールペプチド［９］、α−シヌクレイン［１０］、ＣｓｇＡ［１１］およびＲｎｑ１［１２］を含む。
【００４８】
ある実施形態において、Ｓｕｐ３５（１−６１）−Ｚ融合タンパク質またはＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）融合タンパク質などの、担体−Ｚ融合タンパク質は好ましくは、Ｓｕｐ３５（１−６１）またはＵｒｅ２（１−８０）などの、担体タンパク質と、プロテインＡの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメイン（本明細書ではＺドメインと称される）との間の融合タンパク質である。
【００４９】
プロテインＡは、細菌である黄色ブドウ球菌の細胞壁でもともと見出された、４２ｋＤａの表面タンパク質である。それはｓｐａ遺伝子によってコードされる。それは免疫グロブリンに結合するその能力のために、生化学的研究における用途を見出してきた。それは３つのヘリックス束に折り畳まれる５つの相同なＩｇ結合ドメインから構成される。各ドメインは、多くの哺乳動物種に由来するタンパク質、特にＩｇＧに結合できる。それは、殆どの免疫グロブリンのＦｃ領域内およびヒトＶＨ３科の場合にはＦａｂ領域内の重鎖を結合する。
【００５０】
ある実施形態において、融合タンパク質のＺドメインは、プロテインＡの任意の天然のまたは野生型のＩｇＧ結合ドメイン、またはプロテインＡのそのようなＩｇＧ結合ドメインの組換えバージョンであり得る。例えば、Ｚドメインは、プロテインＡの８ｋＤａの改変されたＢドメイン変異体であり得る［１３］。このＩｇＧ結合ドメインは現在、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（登録商標）分子を作製するための足場として使用され、かつ低ｎＭ領域の解離定数（ＫＤ）でＩｇＧのＦｃ部分を本来的に結合する。上記実施形態に従って使用できるＺドメインの別の例は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）で使用されるＩｇＧ結合ドメインである。このＩｇＧ結合ドメインは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で産生されＩｇＧに対する増強された結合能力を与える配向したカップリングに有利なように特異的に操作された組換えプロテインＡ中のＺドメインを構成する。
【００５１】
上記実施形態に従って使用し得るＩｇＧ結合ドメインの他の例は、プロテインＧ［１４］、プロテインＡ／Ｇ［１５］、プロテインＭ［１６］、プロテインＬ［１７］、ＳｐＡおよびＳｂｉ［１８］並びにプロテインＨ［１９］を含む。
【００５２】
特定の実施形態において、担体−Ｚ融合タンパク質は、担体−Ｚ二量体融合タンパク質である。従って、この実施形態において、担体−Ｚ融合タンパク質は好ましくは、２つのＺドメイン、即ち、Ｚ二量体（ＺＺ）を含む。従って、好ましい担体−Ｚ融合タンパク質は、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺおよびＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）を含む。
【００５３】
二価のＺ、即ちＺ二量体（ＺＺ）は、おそらくはアビディティ効果により、ＩｇＧに対するより高い親和性を有するので、一価のＺドメインよりも一般に好ましい。ＩｇＧに対するＺＺの結合速度はより速く、且つＩｇＧの放出はより遅い（図２および表１参照）。このことは、官能基の完全な占有および漏れの減少に依存する用途のために潜在的に有利である。
【００５４】
Ｚ二量体は好ましくは、２つの相互接続されたＺドメイン、即ちＺＺの形態である。別の実施形態において、Ｚ二量体は、架橋またはリンカーによって相互接続された２つのＺドメインの形態である。例えば、２つのＺドメインは、ドメイン間ヘリックス断片（ＺｈＺ）により、または可撓性リンカー（ＺｆＺ）により相互連結され得る。そのようなドメイン間ヘリックス断片の例はＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（配列番号１）であり、ｎは好ましくは２〜５である。可撓性リンカーは、Ｍアミノ酸のペプチド形態であり得るであろう。ある実施形態において、Ｍは好ましくは、１０〜６０、好ましくは１５〜５０、より好ましくは２０〜４５の範囲内で選択される。ある実施形態において、リンカーのアミノ酸は好ましくは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グルタミン酸（Ｅ）およびリジン（Ｋ）、並びにそれらの組合せから選択される。上記実施形態に従って使用できる更なるリンカーは、［２］の表３に開示されており、上記実施形態に従って使用し得る表３のリンカーモチーフに関する教示は、本明細書の一部として援用される。
【００５５】
リンカーは、ＩｇＧのＦｃ断片の両側をＺ二量体に結合させる能力を与するために使用でき、これは次いで、今度は親和性を増加させるであろう。各Ｆｃ断片は、６９．６Å離れた２つのＺ結合部位を有する。Ｚ二量体中の２つのＺドメインがリンカーなしで相互接続される場合、１つの部位のみがアクセス可能である。従って、リンカーが完全に伸長されないことを考慮して、リンカーは、少なくとも８０Åの距離広がれることが好ましい。一般に、各アミノ酸は３．２５Åを与えるので、上記リンカーには少なくとも２５アミノ酸が好ましく使用される。上記実施形態に従って使用できる十分に可撓性のリンカーの非限定的な例は、（ＧＧＧＧＳ）５−７（配列番号２）、（ＧＧＧＧＴ）５−７（配列番号３）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ−ＧＧＧＧＳ−ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４）、およびＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ−ＧＧＧＧＴ−ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号５）を含む。ヘリックス部分とフレキシブルな部分の両方を含むリンカーまたは架橋は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ−Ａ（ＥＡＡＡＫ）２−３Ａ−ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６）、ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴ−Ａ（ＥＡＡＡＫ）２−３Ａ−ＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴ（配列番号７）、およびＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ−Ａ（ＥＡＡＡＫ）２−３Ａ−ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号８）を含む。
【００５６】
２つのＺドメインをヘリック断片またはリンカーと相互接続することは可能であるが、実験的データは、そのようなＺ二量体（即ちＺｈＺおよびＺｆＺ）は、相互に連結されたＺドメイン（即ちＺＺ）と比較したときに、抗体及びＩｇＧに対して如何なる増大した親和性も持たないことを示している。
【００５７】
上記実施形態の抗体結合性ナノフィブリルは、高親和性および高容量で抗体を結合できる。抗体結合性ナノフィブリルは好ましくは、ＩｇＧ抗体を結合できる。
【００５８】
ある実施形態において、抗体結合性ナノフィブリルは、ナノフィブリル１ｍｇ当たり少なくとも１．５ｍｇのＩｇＧの結合能力を有する。好ましい実施形態において、抗体結合性ナノフィブリルは、ナノフィブリル１ｍｇ当たり少なくとも１．６ｍｇのＩｇＧ、より好ましくは１ｍｇのナノフィブリル当たり少なくとも１．７ｍｇのＩｇＧ、例えばナノフィブリル１ｍｇ当たり少なくとも１．８ｍｇの結合力を有する。
【００５９】
本明細書に示す実験データは、Ｕｒｅ２（１−８０）およびＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）のｃｏ−フィブリル化によって作製されたナノフィブリルが、ナノフィブリル１ｍｇあたり約１．７ｍｇのＩｇＧの結合能力を達成でき、一方でＳｕｐ３５（１−６１）およびＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺのｃｏ−フィブリル化によって製造されたナノフィブリルは、ナノフィブリル１ｍｇあたり約１．８ｍｇのＩｇＧの結合能力を達成できることを示す。これらの結合能力は、抗体結合性ナノフィブリルのＺドメインにＩｇＧ分子を結合させる場合に使用される結合条件を最適化しなくても達成された。
【００６０】
しかしながら、これらの最適化されていない結合条件下でさえ、上記実施形態の抗体結合性ナノフィブリルは、今日では抗体精製に関するゴールドスタンダードであるプロテインＡ・ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＣＬ４Ｂ（ＧＥヘルスケア）などのプロテインＡセファロース（登録商標）アフィニティー媒体と比較して、殆ど２０倍超の結合能を有する。
【００６１】
上記実施形態の別の態様は、抗体結合性ナノフィブリルの担体−Ｚ融合タンパク質の少なくとも１つのＺドメインに結合される少なくとも１つの抗体を含む、上記実施形態による抗体結合性ナノフィブリルに関する。ある実施形態において、少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＩｇＧ分子である。
【００６２】
図６は、上記実施形態による抗体結合性ナノフィブリルの製造方法を示すフローチャートである。この方法は、ステップＳ２において、担体タンパク質および担体−Ｚ融合タンパク質を、１：０．２０〜１：０．９０の範囲内で選択されるモル比でｃｏ−フィブリル化して、抗体結合性ナノフィブリルを形成することを含む。
【００６３】
様々な実施形態において、上述した特定のモル比範囲、担体タンパク質およびＺドメインを、図６の方法で使用できるであろう。
【００６４】
任意の実施形態において、方法はまた、ステップＳ１を含む。このステップＳ１は、水溶液中で担体タンパク質を超音波処理することによりタネを生成することを含む。当該方法は次いで、ステップＳ２へと続き、それは、この実施形態において、このタネを上記モル比での担体タンパク質および担体−Ｚ融合タンパク質と共にインキュベートして、抗体結合性ナノフィブリルを形成することを含む。
【００６５】
ステップＳ１で形成されるタネは従って、そこに担体タンパク質および担体−Ｚ融合タンパク質のモノマーが凝集して抗体結合性ナノフィブリルを成長させることができる、タネとして働く。
【００６６】
水性フィブリル化緩衝液は、ｐＨ７．０〜約８．５、例えば約７．０〜約８．０の範囲内のｐＨを好ましくは有する任意の水性緩衝液であり得るであろう。そのような水性緩衝液の非限定的で説明的な例は、リン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を含む。
【００６７】
フィブリル化のための好ましい条件は、０℃〜４２℃の範囲内の温度、３〜９の範囲内のｐＨ、０ｍＭ〜２００ｍＭの塩濃度、０μＭ〜１５０μＭのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤濃度、０ｒｐｍ〜６００ｒｐｍの一定の回転速度、および数時間〜数日間のフィブリル化時間を含む。これらの条件における変化は、繊維形態および凝集の完全性に影響を及ぼす可能性がある。また、フィブリル化の動力学は、担体タンパク質の濃度に大きく依存する。
【００６８】
上記実施形態の抗体結合性ナノフィブリルは、選択されたモル比の範囲内の担体タンパク質および担体−Ｚ融合タンパク質を含み、且つこれらから製造される。抗体結合性ナノフィブリルの官能化ドメインは従って、抗体結合能を有するＺドメインである。しかし、ｃｏ−フィブリル化プロセスの際に他の担体−官能化ドメイン融合タンパク質を含むことによって、抗体結合性ナノフィブリル中に他の官能化ドメインを導入することも可能である。このような他の官能化ドメインの非限定的で例示的な実例は、酵素、金属結合ドメイン、シトクロムｐ４５０等であり得るであろう。しかしながら、このような他の官能化ドメインは、抗体結合性Ｚドメインへの抗体のアクセス可能性に対して負の影響を有し得るであろう。従って、一般には、少なくとも抗体精製用途では、Ｚドメイン以外の官能化ドメインを持たない抗体結合性ナノフィブリルを使用することが好ましい。
【００６９】
治療剤としておよび診断目的のために使用される抗体、特にモノクローナル抗体に対する需要が着実に増加している。従って、費用効率の高い、高負荷抗体精製法に対するニーズが高まっている。抗体精製の現在のゴールドスタンダードは、高度に選択的な媒体プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）を用いるアフィニティークロマトグラフィーである。にもかかわらず、ＩｇＧ精製の生産性は、プロテインＡ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）の限定された結合能力によって制限される。設定された境界を克服するために、抗体結合性ナノフィブリルを、ＩｇＧ結合性Ｚドメイン二量体を提示するための足場として使用できる。ナノフィブリルにより提供される優れた表面積／体積比は、このような抗体精製用途に極めて適している。
【００７０】
従って、上記実施形態の抗体結合性ナノフィブリルを、抗体およびモノクローナル抗体の精製用途において有利に使用できる。
【００７１】
実施形態の更なる態様は従って、固体表面上に固定化された上記実施形態の抗体結合性ナノフィブリルを含む抗体捕捉装置に関する。
【００７２】
固体表面上への抗体結合性ナノフィブリルの固定化は、種々の実施形態に従って達成できる。ある実施形態において、少なくとも幾つかの担体タンパク質、少なくとも幾つかの担体−Ｚ融合タンパク質または少なくとも幾つかの担体タンパク質及び担体−Ｚ融合タンパク質は、担体タンパク質及び／または担体−Ｚ融合タンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端に、Ｈｉｓｎタグ等のＨｉｓタグを含む。特定の実施形態において、ｎは、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも６であり、典型的には当該分野においてポリヒスタジンタグと呼ばれる。ｎの上限は、好ましくは１４である。例えば、Ｈｉｓ６タグを、Ｓｕｐ３５（１−６１）およびＵｒｅ（１−８０）担体タンパク質のＮ末端に、Ｓｕｐ（１−３５）−ＺＺ融合タンパク質のＮ末端に、および／またはＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）融合タンパク質のＣ末端に結合できるであろう（図１参照）。
【００７３】
そのようなＨｉｓタグは、抗体結合性タンパク質がＮｉ２＋またはＣｏ２＋荷電表面上に固定化されることを可能にする。当該表面は、結合された二価イオンまたはコバルトイオンを含む親和性樹脂の表面であり得る。これらの樹脂は一般に、ニッケルについてはイミノ二酢酸（ＩＤＡ）またはニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、コバルトについてはカルボキシルメチルアスパルテート（ＣＭＡ）などの、キレート剤で官能化された、セファロースまたはアガロースである。このようなキレート化剤で官能化された樹脂の例は、ＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。ＨｉｓタグとＮｉ２＋またはＣｏ２＋との間の相互作用を介して抗体結合性ナノフィブリルを固定化するために使用できる固体表面のさらなる例は、ＮＴＡ、ＩＤＡまたはＣＭＡのチップまたはビーズである。
【００７４】
Ｈｉｓタグ−Ｎｉ２＋／Ｃｏ２＋以外の固定化溶液も可能である。例えば、ビオチン−ストレプトアビジンまたはビオチン−アビジンを使用して、抗体結合性ナノフィブリルを固体表面上に固定化できる。そのようなアプローチでは、少なくとも幾つかの担体タンパク質および／または少なくとも幾つかの担体−Ｚ融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端が、直接または間接にビオチン分子またはストレプトアビジンまたはアビジン分子に連結される。そのようなアプローチにおいて、上記固体表面は、固定化されたストレプトアビジンまたはアビジン分子またはビオチン分子を含む。
【００７５】
更に、ナノフィブリルを固体表面に共有結合させる多くの方法が存在する［２０，２１］。例えば、スペーサーアームとして働くヘキサメチレンは、アクリルガラスの慣用名で良く知られているジアミン・ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）のカルボニル基と容易に反応する。カルボジイミドを次いで使用して、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル基を上記スペーサーアームに共有結合できる。別の選択肢は、エポキシ樹脂上での固定化である。これは、シアヌル酸を有する樹脂のヒドロキシル基の活性化と、それが次いで、リシン、アスパラギンおよびグルタミン等のアミノ酸により提示されるアミン基と反応することによって達成される。タンパク質固定化のために以前に使用されてきた他の表面は、特に、デキストランで誘導体化されたＰＤＭＳ、セルロース、金およびポリスチレンを含むが、これに限定されない。しかし、これらのカップリング技術は、繊維の非特異的結合をもたらす。
【００７６】
表面への特異的な化学的カップリングは、Ｃ末端システイン残基（Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＣｙｓまたはＵｒｅ２（１−８０）−Ｃｙｓ）を提示するＳｕｐ３５（１−６１）またはＵｒｅ２（１−８０）を用いることによって達成できる。担体タンパク質Ｓｕｐ３５（１−６１）またはＵｒｅ２（１−８０）およびそれらの官能化された対応物中にはシステイン残基が存在しないため、フィブリルのアセンブリの際にＳｕｐ３５（１−６１）−ＣｙｓおよびＵｒｅ２（１−８０）−Ｃｙｓを加え、従って、当該ナノフィブリル中に組み込むことができる。システインを提示するごく少数の担体タンパク質を導入することは、カップリングがナノフィブリルに沿って非常に少数の場所で、好ましくは1つの場所で起こり、残りのナノフィブリルに対する自由な水平移動の能力を与えることを保証する。任意の実施形態において、担体タンパク質および／または担体−Ｚ融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端は、必ずしも固定タグまたはアンカータグもしくは分子に直接連結される必要はない。ＮまたはＣ末端と固定化タグまたはアンカータグもしくは分子との間に、リンカーまたは架橋を有することが可能である。そのようなアプローチにおいて、リンカーまたは架橋は、制限酵素切断部位の形態であっても、またはそれを含んでいてもよく、制限酵素切断部位は図１に示され、ここでプロテアーゼ切断部位はトロンビン切断部位（ＴＳ）によって例示される。これは、特定のプロテアーゼの添加により、上記表面から、上記固定された抗体結合性ナノフィブリルを放出させる効率的な方法を提供する。
【００７７】
疾病伝播の初期段階を示すバイオマーカの検出は、患者の良好な治療のために極めて重要である。従って、血液中に放出される疾患特異的タンパク質の検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）を低下させる目的で、ＥＬＩＳＡの最適化およびその進歩した変法の開発により、イムノアッセイは絶えず改善されている。デジタルＥＬＩＳＡ、即ち、５０ｆＬの反応チャンバー中に酵素標識されたタンパク質を捕捉するマイクロビーズの単離は、ｆＭ範囲未満に検出限界を下げたが、高度な実験装置および訓練された人間を必要とする。一方、ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＡ）は、医療現場（ＰＯＣ）での検出には適しているが、膜の抗体結合能が低いため、１０−１１Ｍ未満のバイオマーカを検出できない。しかしながら、頻繁に言及される前立腺癌バイオマーカの前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの感染症、神経学的障害などの同定は典型的には、１０−１２〜１０−１６Ｍの検出限界を必要とする。これらの制限を克服するために、標的タンパク質のプレ濃縮は幾つかの改善を可能にする。ＬＦＡのＬＯＤを低下させるための別の選択肢は、膜上の捕捉抗体の密度を大幅に増加させることである。これは、利用可能な表面積を増幅し、従ってバイオマーカ結合部位の数を増加させる、当該実施形態の抗体結合性フィブリルを用いることによって達成できるであろう。更に、抗体結合性ナノフィブリルは、より大きな表面積から利益を得ると思われる任意の免疫アッセイまたは装置を改善する可能性を有する。
【００７８】
ＰＯＣ用途および実験室診断の両方のために、低濃度バイオマーカについての高感度アッセイが必要とされている。
【００７９】
従って、当該実施形態の更に別の態様は、サンプル中の化学物質の存在を検出するためのキットに関する。キットは、上記実施形態による抗体結合性ナノフィブリルを含む。このキットはまた、サンプル中の化学物質に特異的に結合する、ＩｇＧ等の抗体も含む。抗体結合性ナノフィブリルの担体−Ｚ融合タンパク質は、上記抗体を結合できる。
【００８０】
化学物質は、抗体結合性フィブリルのＺドメインに結合できる、ＩｇＧ等の、抗体により認識され得る任意の化合物、薬剤、アナライトまたはバイオマーカであり得るであろう。非限定的で例示的な例は、心血管系疾患のバイオマーカ、例えばトロポニンまたは高感受性Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）；頭蓋外傷または外傷のバイオマーカ、例えばＳ１００カルシウム結合性タンパク質Ｂ（Ｓ１００Ｂ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、神経フィラメント軽タンパク質（ＮＦＬ）、Ｄ−二量体（フィブリン分解産物）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；脳卒中のバイオマーカ、例えばＳ１００Ｂ、ＧＦＡＰ、ＮＦＬ；様々な癌タイプのバイオマーカ、例えばＰＳＡ、核マトリックスタンパク質ｎｏ．２２（ＭＰ２２）、膀胱腫瘍抗原（ＢＴＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）；感染症のためのバイオマーカ、例えばインフルエンザＡまたはＢ、ＨＩＶのためのバイオマーカ；アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、認知症などの、神経学的疾患のバイオマーカ、例えばＮＦＬ、アミロイド−ｂペプチド、タウを含む。
【００８１】
従って、当該実施形態のキットは、化学物質に特異的に結合する、抗体、好ましくはＩｇＧ分子によって認識される任意の化学物質を検出するために使用できる。
【００８２】
化学物質への、即ち、抗原性化学物質のエピトープへの抗体の結合に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的または優先的結合を決定する方法もまた、当該技術分野において周知である。抗体は化学物質に、それが他の化学物質に結合するよりも大きな親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、「特異的に結合する」。典型的には、特異的に結合するとは、解離定数（ＫＤ）＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭを意味する。
【００８３】
もちろん、複数種類の抗体を、当該実施形態の抗体結合性ナノフィブリルに結合させることも可能である。このような場合、これらの２以上の異なる抗体タイプは、異なる抗原（即ち、化学物質）、および／または所与の抗原（即ち、化学物質）上の異なるエピトープに対する特異性を有し、これに結合できる。
【００８４】
抗体が特異的に結合する化学物質を含むサンプルは、任意のサンプルであってよいが、好ましくは、ヒトまたは動物の身体に由来する生体サンプルである。例示的なそのようなサンプルの例は、体液サンプル、例えば血液サンプル、血漿サンプルまたは血清サンプルを含む。身体サンプルの他の例は、組織サンプル、脳脊髄液サンプル、尿サンプルなどを含む。
【００８５】
従って、本明細書に記載の抗体結合性ナノフィブリルを含む実施形態のキットは、特定の化学物質、特に、サンプル中に低濃度で存在するそのような化学物質の存在を検出する必要がある、ＰＯＣおよび／または実験室診断で使用できる貴重なツールを構成する。抗体結合能を最大にするか、または少なくとも顕著に改善するよう設計され、且つ優れた表面積／体積の比を有する実施形態の抗体結合性ナノフィブリルは、抗体結合性ナノフィブリルが固定化される所定の体積または表面積内で、上記抗体結合性ナノフィブリルに結合または付着される非常に高い量または数の抗体を可能にする。
【００８６】
例えば、捕獲抗体が固体表面に付着されるサンドイッチＥＬＩＳＡ等の従来のＥＬＩＳＡと比較して、本実施形態では、代わりに上記抗体結合性ナノフィブリルを固体表面に付着させ、それにより固体表面の所定面積についての捕捉抗体数を有意に増加させる。
【００８７】
従って、当該実施形態のキットは、ｐＭ、ｆＭ、ａＭまたはそれより低濃度においてであっても、試料中の化学物質の存在を検出するために使用できる。
【００８８】
［実施例］
この研究では、抗体の精製を目的としたナノフィブリルが、最大の結合能力を達成することを目的として設計された。この目的のために、フィブリル重量は、プロテインＡの操作されたＢドメイン変異体であるＺドメイン（８ｋＤａ）を用いた官能化によって最小化された。Ｚドメインは、ＡＦＦＩＢＯＤＹ（登録商標）分子を作製するための足場として使用されるが、低ｎＭ範囲でＩｇＧのＦｃ部分を本来的に結合する。官能基単位の最大限のアクセス可能性および保持された親和性を付与するために、Ｓｕｐ３５（１−６１）−Ｚ二量体およびＵｒｅ２（１−８）−Ｚ二量体融合タンパク質を、それぞれ非官能性Ｓｕｐ３５断片およびＵｒｅ２断片とｃｏ−アセンブルした。この戦略は、我々がフィブリル組成を最適化することを可能にし、それにより既存製品の動的結合能力を少なくとも1桁超えるコンセプト材料が得られた。
【００８９】
＜材料及び方法＞
・クローニング
Ｓｕｐ３５（１−６１）、Ｕｒｅ２（１−８０）、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）およびＺの遺伝子を、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化し、またＧｅｎｅＡｒｔ  Ｓｔｒｉｎｇｓ  ＤＮＡ断片合成（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からＤＮＡ断片を入手した。これらの断片をＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で切断し、ｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクターに連結した。最終構築物Ｈｉｓ６−ＴＳ−Ｓｕｐ３５（１−６１）（配列番号９）、Ｈｉｓ６−ＴＳ−Ｕｒｅ２（１−８０）（配列番号１０）、Ｈｉｓ６−ＴＳ−Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＧＧＧＳＧリンカーＺホモ二量体（配列番号１１）、Ｚホモ二量体−ＧＧＧＳＧリンカーＵｒｅ２（１−８０）−Ｈｉｓ６（配列番号１２）およびＨｉｓ６−Ｚ（図１）を、ウプサラゲノムセンター（ウプサラ大学、ウプサラ、スウェーデン）のサイエンス・フォー・ライフ・ラボラトリー（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において配列決定した。
【００９０】
・発現および精製
それぞれの遺伝子Ｓｕｐ３５（１−６１）、Ｕｒｅ２（１−８０）、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、またはＺを有するｐＥＴ２８ｂ（＋）発現ベクターを保持する形質転換ＢＬ２１ｓｔａｒ（ＤＥ３）の一晩（ＯＮ）培養物（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ−ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地；２５℃；１８０ｒｐｍ）を、９００ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃブロス（ＴＢ）培地（３０μｇ／ｍｌカナマイシン）中に１：１００希釈した。この培養物を、ＯＤ６００が０．６に達するまで３７℃および１８０ｒｐｍで増殖させた。最終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、タンパク質発現を誘導し、細菌を１８０ｒｐｍにて、３７℃で４．５時間（Ｓｕｐ３５（１−６１）、Ｕｒｅ２（１−８０）およびＺ）、または３０℃で５時間（Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ）追加的にインキュベートした。ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）の発現のために、出発培養物（ＴＢ培地；３７℃；１８０ｒｐｍ；５時間）を、９００ｍＬのＴＢ培地（３０μｇ／ｍｌカナマイシン）中で１：１８０希釈した。この培養物を、ＯＤ６００が１．０に達するまで１８０ｒｐｍで増殖させ、その時点で培養物を氷上で冷却し、その後ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭまで添加した。タンパク質発現を、２０℃および１８０ｒｐｍで１４時間行った。
【００９１】
細胞を、Ｆ９−６ｘ１０００ＬＥＸロータを用いるＳｏｒｖａｌｌ  ＬＹＮＸ６０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）遠心分機において、４℃にて２０分間３，５００×ｇで回収した。上清を捨て、残りの細胞ペレットを、Ｓｕｐ３５（１−６１）およびＵｒｅ２（１−８０）について緩衝液ＬＤ［８Ｍ尿素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８］中で、またはＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）およびＺについて緩衝液ＬＮ［２５ｍＭトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８］中で穏やかに攪拌することにより再懸濁し、−２０℃で保存した。自然条件での細胞溶解を、１．３５ｋｂａにて細胞破壊装置（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で実施した。続いて、１０００ＵのＤＮＡｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１個の完全ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。氷上で３０分間インキュベートした後、溶解物をＳｏｒｖａｌｌ・ＲＣ６＋（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、Ｆ２１−８ｘ５０ｙロータを３９，０００×ｇで用いて４℃で３０分間遠心分離して不溶性破片を除去した。尿素を含む緩衝液中の細胞ペレット再懸濁物を解凍し、６０分および周囲温度にて同じ方法で遠心分離した。最後に、溶解物を、シリンジ駆動のＦｉｌｔｒｏｐｕｒＳ０．４５μｍフィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を通して濾過した。
【００９２】
タンパク質の精製を、固有の緩衝液条件について４℃で、または変性条件について室温で、アクタ  エクスプローラ（Ａｅｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）プラットフォーム上で行った。変性条件においては、細胞溶解液をロードする前に、Ｎｉ２＋を充填した５ｍＬのＨｉＴｒａｐキレートＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を緩衝液ＡＤ［８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ８］で平衡化した。弱く結合するタンパク質がまず、３０ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液ＡＤで溶出された。Ｓｕｐ３５（１−６１）は９０ｍＭのイミダゾールで溶出され、３つの連続したピークを生じ、一方で第３のピークはＳｕｐ３５（１−６１）を含んだ。Ｕｒｅ２（１−８０）は２００ｍＭのイミダゾールで溶出された。５ｍＬのＭｏｎｏＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を緩衝液ＡＤで平衡化した後、Ｓｕｐ３５（１−６１）またはＵｒｅ２（１−８０）をロードし、純粋なタンパク質をフロースルー中に回収した。Ｓｕｐ３５（１−６１）を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０ＭＷＣＯ  ５，０００Ｄａを用いて＞１０００μＭに濃縮した。
【００９３】
官能化されたＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）、並びにＺを、緩衝液ＡＮ［２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８］を用いて天然緩衝液条件下で精製した。タンパク質を、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムから、２００ｍＭのイミダゾールを含有する天然の緩衝液で本質的に純粋に溶出した。最終精製段階として、タンパク質を、ＨｉＬｏａｄ１６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ゲル濾過カラムにかけた。全てのタンパク質の純度およびサイズを、４〜２０％のＭｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって確認した。
【００９４】
マトリックス支援レーザ脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）−飛行時間（ＴＯＦ）質量分光法（ＭＳ）により、Ｓｕｐ３５（１−６１）およびＵｒｅ２（１−８０）について、８Ｍ尿素中での貯蔵による翻訳後修飾は存在しないことが確認された。Ｓｕｐ３５（１−６１）、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）およびＺのタンパク質濃度を、２８０ｎｍでの吸光度（Ａｂｓ２８０）を測定することにより、および計算された配列特異的吸光係数を用いることにより決定した［２２］。加えて、ビシンコニン酸アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃアッセイキット）を用いて、Ｕｒｅ２（１−８０）およびＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）の濃度を決定した。これらのタンパク質をアリコートに分け、液体窒素で急速冷凍してから−８０℃で長期保存した。
【００９５】
・官能化されたナノフィブリルの凝集
Ｓｕｐ３５（１−６１）とＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺ、およびＵｒｅ２（１−８０）とＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）との同時凝集であるｃｏ−フィブリル化を、それぞれ緩衝液ＦＢＳ［３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０］および緩衝液ＦＢＵ［１０ｍＭのＫＰｉ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４］の中で実施した。１８μｇのＳｕｐ３５（１−６１）を最初に緩衝液ＦＢＳ中で５０倍希釈することによって、官能性Ｓｕｐ３５（１−６１）フィブリルをアセンブリ化した。このサンプルを、１．５ｍＬのエッペンドルフバイアル中で、Ｂｒａｎｓｏｎ２５１０超音波処理浴において８分間超音波処理した。次いで、これらのタネを、７９μｇのＳｕｐ３５（１−６１）および１０〜１５９μｇのＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺを含有する試料に直ちに添加した。添加されたタネの量を考慮すると、１：０．０４〜１：０．６５に対応するＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺに対するＳｕｐ３５（１−６１）の最終モル比が得られた。同様に、Ｕｒｅ２（１−８０）のタネを得るために、タンパク質をＶｉｖａｓｐｉｎ５００ＭＷＣＯ３，０００Ｄａにより９，０００×ｇで約１ｍＭに濃縮し、次いでバッファーＦＢＵ中で５０倍に希釈した。次に、ステップマイクロチップを使用するＶｉｂｒａ・Ｃｅｌｌ・ＶＣ５０５（Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて、１００μｇを超音波処理した（２秒間オン、８秒間オフ、２０％振幅、合計時間６０秒）。タネは直ちに、７１μｇのＵｒｅ２（１−８０）及び８〜１６９μｇのＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）を含有する試料に添加され、これにより、添加されたタネの量も考慮したときに、１：０．０４〜１：０．９に対応するＵｒｅ２（１−８０）／ＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）の最終モル比が得られた。完全な凝集のために、サンプルを室温で一晩インキュベートした。フィブリル化の完全性を、フィブリルを沈降させるための７，０００×ｇでの１０分間の遠心分離、その後Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で上清の２８０ｎｍでの吸光度を測定することまたは如何なる残留タンパク質も存在しないことを確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した。アセンブルされたフィブリルを、使用まで４℃で保存した。
【００９６】
・生体分子相互作用
全ての相互作用研究は、２５℃、流速３０μＬ／分において、Ｂｉａｃｏｒｅ・Ｘ１００（ＧＥヘルスケア）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを用いて実施した。Ｈｉｓ６タグ化したタンパク質を、１０ｎｇ／ｍＬのＺを３０秒間、４０ｎｇ／ｍＬのＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺを９０秒間、または１６０ｎｇ／ｍＬのＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）を９０秒間、ニッケル帯電された表面を覆って注入することにより、ニッケル（Ｎｉ２＋）キレート化されたニトリロトリアセテート（ＮＴＡ）チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。典型的には、１０応答単位（ＲＵ）〜４０ＲＵの安定した最終固定化レベルが達成された。ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、緩衝液ＨＢＳ−Ｐ［１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ後ＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ｐＨ７．４］中での連続２倍希釈シリーズで調製し、５〜４０ｎＭの間で変化させた。分析は、複数サイクル設定で、即ち、分析物の各注入後にＮｉ２＋帯電表面を完全再生させて実施された。会合段階を１８０秒間、解離段階を６００秒間モニターした。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて１：１結合モデルに適合させた。各実験は４回繰り返し行った。ｃｏ−フィブリル（モル比１：０．０４）の結合動態を記録するために同様の設定を用いた。ｃｏ−フィブリルを１６０ｎｇ／ｍＬ（Ｓｕｐ３５）または１μｇ／ｍＬ（Ｕｒｅ２）に希釈し、ＮＴＡチップのニッケル帯電表面上に１８０秒間注入し、３０ＲＵの固定化レベルを得た。分析物（ポリクローナルＩｇＧ）の濃度は５〜４０ｎＭの間で変化させた。得られたセンサグラムを二価アナライトモデルに適合させた。
【００９７】
・ヒト血清からのＩｇＧの精製
１：０．１６のモル比を有する約６８０μｇのＳｕｐ３５ｃｏ−フィブリル、または１：０．４９のモル比を有する５３０μｇのＵｒｅ２フィブリルを、緩衝液ＦＢＳで２回洗浄し、室温で３０分間、ヒト血清（３Ｈ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）と共にインキュベートした。フィブリルを次いで、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｐｉｃｏ１７  Ｔａｂｌｅ  Ｔｏｐ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、１７，０００×ｇで１０分間遠心分離して沈降させ、厳密に3回洗浄した。結合したＩｇＧを、緩衝液ＥＢ（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ３）を用いて溶出させ、溶出したＩｇＧの総量を２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより推定した。ポリッシングのために、溶出されたＩｇＧを、緩衝液ＡＮを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＩｇＧの良好な精製を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価した。
【００９８】
・電子顕微鏡法
ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を一次抗体として使用して、１：０．１６フィブリルに等しい比で提示されたＺＺドメインを飽和させた。室温で３０分間インキュベートした後、二次ヤギ抗ヒトＩｇＧの５ｎｍ金コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、免疫金粒子当たり６６または４００ＺＺ結合部位の最終比になるまで上記フィブリルに加えた。追加の重量によりフィブリルは非常に迅速に沈降し、これにより上清の除去および新しい緩衝液ＥＭ（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８）中での再懸濁が可能になった。緩衝液ＥＭを用いて洗浄を４回繰り返した。上記フィブリルを炭素被覆グリッド（ＳＰＩ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ）上に載せ、１％ウラニルアセテートで陰性染色した［２３］。ＴＥＭ画像を、ＳｃｉＬｉｆｅ・ｌａｂ・ＢｉｏＶｉｓ施設（Ｒｕｄｂｅｃｋ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で撮影した。
【００９９】
・ナノフィブリルの結合能力
ＺＺを提示するｃｏ−フィブリルの最大ＩｇＧ結合能力を、ドーピング頻度の関数として決定した。この目的のために、ｃｏ−フィブリルを、１：０．０４〜１：０．６５（Ｓｕｐ３５）または１：０．０４〜１：０．９（Ｕｒｅ２）に対応する非官能性／官能性フィブリルタンパク質の相対モル比でアセンブルした。上記比に応じて、７．４〜１７．８μｇのＳｕｐ３５足場ｃｏ−フィブリル、または６．６〜１７．８μｇのＵｒｅ２足場ｃｏ−フィブリルを、ヒトＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に室温で６０分間インキュベートした。添加された抗体の量は、実際のフィブリル結合能力の１．５〜２倍の範囲であった。使用前に、ＩｇＧをストックから新たに希釈し、２８０ｎｍでの吸光度（ε＿パーセント＝１３．７ｇ／１００ｍＬ−１ｃｍ−１）を４回測定して最終濃度を決定した。インキュベーション後、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｐｉｃｏ１７  Ｔａｂｌｅ  Ｔｏｐ遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、サンプルを１７，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清の２８０ｎｍでの吸光度を３回測定した。上清の２８０ｎｍでの吸光度は、フィブリルに結合したＩｇＧの量に直接関連した。各フィブリルタイプの結合能力を6回測定した。
【０１００】
＜結果＞
・タンパク質の精製
Ｓｕｐ３５（１−６１）およびＵｒｅ２（１−８０）を変性条件下で精製し、それぞれ、大腸菌培養物１Ｌ当たり１０ｍｇおよび２０ｍｇのタンパク質を得た。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより、Ｓｕｐ３５（１−６１）（８，９９５Ｄａ）およびＵｒｅ２（１−８０）（１０，７９３Ｄａ）の理論質量を確認し、これは尿素中での貯蔵に起因する改変がないことを示唆した。官能的変異体のＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺおよびＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）を、天然状態で発現および精製した。ＩＭＡＣ精製後、収量はそれぞれ７１ｍｇ／Ｌおよび２０ｍｇ／Ｌと推定された。同様に、Ｚドメインの精製により、ＩＭＡＣ後に純粋なタンパク質８９ｍｇ／Ｌが得られた。
【０１０１】
・生体分子相互作用
効率的にＩｇＧに結合することを目的としてナノフィブリルを設計することは、機能ドメインの選択に本質的に依存する。Ｚ−ドメインは、この目的のために慎重に選択された候補である。更に、以前の研究では、二量体ＺＺは、個々のＺドメインと比較してＩｇＧに対する増加した結合親和性をもたらすことが示されている［２４］。Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、個々の分子として融合タンパク質Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺおよびＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）でおよびアセンブリされたフィブリルで利用される、ＺＺの保持された能力を評価した（図２Ａおよび２Ｂ）。結果は、反応速度論が、文献で入手できるデータとよく一致していることを示唆した（表１）［２４，２５］。しかし、ｋｏｆｆは、以前に報告された値よりも約1桁遅い。データの相違についてのもっともらしい正当な理由は、官能性ＺＺの最適な配向を達成するために、Ｎｉ２＋帯電ＮＴＡチップを、Ｈｉｓ６タグを介したタンパク質固定化に利用したという事実である。この実験設計とは対照的に、以前のデータは、ＣＭ５チップへのＩｇＧのアミンカップリングによる非特異的固定化を用いて得られ、これは異種表面を生じた。それにもかかわらず、ＺＺはそのタグによって損なわれず、またＩｇＧに対する有効なＺＺ結合は無傷のままであり、これが高ｐＭ範囲の親和性を提供すると結論付けることができる。
【０１０２】
【表１】
2019525889.tif 000003
Ａ．データは、二価アナライトモデルに適合された。速度ｋｏｎおよびｋｏｆｆは、ＩｇＧ−繊維相互作用の主成分である。ｃｏ−フィブリルにおける官能性タンパク質に対する非官能性タンパク質のモル比は、１：０．０４であった。
Ｂ．データは、１：１結合モデルに適合された。
【０１０３】
ｃｏ−フィブリルのアセンブリおよび官能性
共凝集を開始するためのタネの使用は、２つの実体の比とは無関係に、１日未満で官能性ｃｏ−フィブリルを生じた。従って、フィブリルに沿ったＺＺの密度は、ｃｏ−フィブリルの凝集後の、Ｓｕｐ３５（１−６１）−ＺＺまたはＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）濃度の変化によって容易に調整された。良好なフィブリル化を、遠心分離により懸濁液からフィブリルを除去することによって評価した。上清中に可溶性タンパク質が完全に存在しないことを、吸光度測定またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０１０４】
アセンブリ化された材料上に提示されたＺＺの保存された官能性を評価するために、もう一度ＳＰＲ技術を適用して、ｃｏ−フィブリルに対するＩｇＧの速度論的結合速度を測定した（図２Ｃおよび２Ｄ）。この相互作用のセンサグラムはより複雑であり、１：１結合モデルに適合させることができなかった。この観察は、ｃｏ−フィブリル固定化が全ての結合部位に対して等しいアクセス可能性を提供するとは期待されないという理論的根拠に合致する。その結果、二価アナライトモデルを用いてデータを適合させた。相互作用の主成分は、可溶性キメラタンパク質から得られたデータと一致する速度を生じ、Ｓｕｐ３５（１−６１）並びにＵｒｅ２（１−８０）フィブリル上に提示されたＺＺの官能性を証明した。この知見を強調するために、複合マトリックスからのＩｇＧの精製を試みた。この目的のために、Ｓｕｐ３５およびＵｒｅ２足場ｃｏ−フィブリルについてのドーピング頻度がそれぞれ１：０．１６および１：０．４９のＺＺ官能化フィブリルを、ヒト血清と共にインキュベートした。上記フィブリルを次いで、遠心分離によってペレット化し、徹底的に洗浄し、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３）でＩｇＧを除去した。この精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、機能的な物質が専らＩｇＧを結合し、他の非常に豊富なタンパク質を結合しなかったことを示した（図３Ａおよび３Ｂ）。溶出された抗体の純度は、遠心分離により除去されなかった恐らくは小さなフィブリル断片の存在を除き、商業的に得られるＩｇＧに匹敵した。純度を高め小さなフィブリルフラグメントを除去するために、サンプルをゲル濾過した。合計７２０μｇ（Ｓｕｐ３５−足場ｃｏ−フィブリル）および６５０μｇ（Ｕｒｅ２−足場ｃｏ−フィブリル）のＩｇＧをヒト血清から精製し、これはそれぞれ、１．０６および１．２２ｍｇのＩｇＧ／１ｍｇのフィブリル収量に相当した。精製された抗体の完全性を、商業的に得られた純粋なＩｇＧで最初に行われたＳＰＲアッセイを繰り返すことによって確認した。ラボ精製したＩｇＧの固定化されたＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺとの相互作用によって結合定数が得られ（ｋｏｎ３．３０±０．２４×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ０．８２±０．４１×１０−４ｓ−１およびＫＤ０．２５±０．１２ｎＭ）、これは（表１）に記載されているレートと実際に同じである。
【０１０５】
ｃｏ−フィブリルの官能性を、ＴＥＭを用いても確認した（図４）。フィブリルをまずヒトＩｇＧで完全に飽和させ、次いで金結合二次抗体で標識した。明らかに、金標識された抗体は均一に分布され、専らフィブリルに沿って配置された。フィブリル幅の概算は、Ｓｕｐ３５（１−６１）およびＵｒｅ２（１−８０）足場におけるｃｏ−フィブリルのコアが、それぞれ約５ｎｍおよび６ｎｍであることを明らかにした。３０ｎｍの最大幅のフィブリル周囲の拡散雲も観察された、これはフィブリルの両側にＩｇＧが存在することによる可能性が最も高く、ＩｇＧが１２ｎｍの長さを有することを考慮するとこれは妥当であった。
【０１０６】
・ナノフィブリルの抗体結合能力
フィブリル上のＺＺ−ドメインの上昇した密度は、ＩｇＧの結合能力の増加を導く可能性がある。にもかかわらず、これはまた、立体的な制約のため各機能領域のアクセス可能性を低下させる可能性がある。結合能力に関してＺＺ密度がＩｇＧ結合を妨害するドーピング頻度を同定するために、官能性担体タンパク質に対する非官能性担体タンパク質のモル比が増加するフィブリル（複数）を、正確に決定された量のＩｇＧで飽和させた。次に、フィブリルをペレット化し、上清の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。これは、フィブリルに結合されたＩｇＧ及び結合されなかったＩｇＧの定量を可能にした。収集したデータによれば、結合能力とフィブリル組成との間には明確な相関があった（図５Ａおよび５Ｂ、並びに表２）。モル比１：０．０４から出発して、ＩｇＧ結合能は着実に増大し、ドーピング頻度が１：０．３３（Ｓｕｐ３５フィブリル）または１：０．４９（Ｕｒｅ２フィブリル）に近づくにつれてプラトーに達した。Ｓｕｐ３５フィブリルについての比１：０．３３もまた最大総結合能を示し、これはフィブリル１ｍｇあたり１．８ｍｇのＩｇＧに等しかった。１：０．０４および１：０．０８の比を有するｃｏ−フィブリルの最大ＩｇＧ結合能力は、キメラタンパク質と本質的に等モルであり、全ての結合部位がアクセスされ得ることを示している。これは、約１２個の非官能性の担体タンパク質が、Ｓｕｐ３５ｃｏ−フィブリル中の各繋留されたＺＺ分子を取り囲んでいる場合である（図５Ｂ）。より高いＺＺ含量を有するフィブリルは、理論的に可能な量のＩｇＧの一部のみが結合されたという事実に示唆されるように、各ＺＺ部位への完全なアクセスを与えなかった。比が１：０．１６から１：０．６５／０．９へと増加するにつれて、アクセス可能なＺＺ結合部位の割合は直線的に減少した（図５Ｃ）。１分子のＩｇＧを結合するのに必要であったキャリアタンパク質の数を表すデータは、漸近傾向に従い、Ｓｕｐ３５ｃｏ−フィブリルについては６．５、またはＵｒｅ２ｃｏ−フィブリルについては６．０に接近した（図５Ｂ）。
【０１０７】
従って、ＩｇＧの精製のためにＺＺドープされたナノフィブリルを用いることはより高いスループットをもたらし、これが今度は全体のプロセス時間を最小限にし、従ってコスト効率を向上できるであろう。
【０１０８】
【表２】
2019525889.tif 000004
【０１０９】
Ａ．ｃｏ−フィブリルにおけるＳｕｐ３５（１−６１）−ＺＺに対するＳｕｐ３５（１−６１）のモル比；
Ｂ．それぞれのフィブリルの実験的に決定されたヒトＩｇＧ結合能の平均値；
Ｃ．実験的に決定されたＩｇＧ結合能の平均値を、理論上の最大結合能力で除した値；
Ｄ．１分子のＩｇＧを結合するために必要なタンパク質の数。
示される誤差は標準偏差である。
【０１１０】
【表３】
2019525889.tif 000005
【０１１１】
Ａ．ｃｏ−フィブリルにおけるＺＺ−Ｕｒｅ２（１−８０）に対するＵｒｅ２（１−８０）のモル比；
Ｂ．それぞれのフィブリルの実験的に決定されたヒトＩｇＧ結合能の平均値；
Ｃ．実験的に決定されたＩｇＧ結合能の平均値を、理論上の最大結合能力で除した値；
Ｄ．１分子のＩｇＧに結合するために必要なタンパク質の数。
示される誤差は標準偏差である。
【０１１２】
上述した実施形態は、本発明の幾つかの例示的実施形態として理解されるべきでものある。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修飾、組み合わせ、および変更を上記実施形態に加えることができることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分解決策は、技術的に可能な場合には他の構成において組み合わせることができる。しかしながら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定されるものである。
【０１１３】
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【図１】
2019525889.tif 000006
【図２−１】
2019525889.tif 000007
【図２−２】
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【図２−３】
2019525889.tif 000009
【図３Ａ】
2019525889.tif 000010
【図３Ｂ】
2019525889.tif 000011
【図４−１】
2019525889.tif 000012
【図４−２】
2019525889.tif 000013
【図５−１】
2019525889.tif 000014
【図５−２】
2019525889.tif 000015
【図５−３】
2019525889.tif 000016
【図６】
2019525889.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月17日(2019.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019525889000001.app
【国際調査報告】
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