(57)【要約】  Abeta42の唾液中レベルを正確に決定するための方法およびキットが提供される。唾液試料を分析する方法は、対象からの唾液試料を得るステップと、唾液試料を安定化させるステップと、安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる抗体と接触させることによって、安定化させた唾液試料中に存在するAbeta42のレベルを測定するステップと、安定化させた唾液中に存在するAbeta42の決定されたレベルを、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルと比較するステップと、決定されたレベルと対照レベルとの比較を表示するステップであって、相対的な決定されたレベルが対照レベルより大きいことは、対象におけるアルツハイマー病を示すか、または対象がアルツハイマー病を発症するリスクを有することを示すステップとを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるアルツハイマー病を診断するために唾液試料を分析する方法であって、
前記対象からの前記唾液試料を得るステップと、
前記唾液試料を安定化させるステップと、
前記安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる抗体と接触させることによって、前記安定化させた唾液試料中に存在するAbeta42のレベルを測定するステップと、
前記安定化させた唾液中に存在する前記Abeta42の決定されたレベルを、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルのものと比較するステップと、
前記決定されたレベルと前記対照レベルとの前記比較を表示するステップであって、前記決定されたレベルが前記対照レベルより大きいことは、前記対象におけるアルツハイマー病を示す、ステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
相対的な前記決定されたレベルが前記対照レベルより少なくとも1.5倍大きいことが、前記対象におけるアルツハイマー病を示す、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
相対的な前記決定されたレベルが前記対照レベルの少なくとも2倍であることが、前記対象におけるアルツハイマー病を示す、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記安定化させるステップが抗凝集剤を加えることを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗凝集剤がチオフラビンSである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記安定化させるステップが抗菌剤を加えることを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗菌剤がアジ化ナトリウムである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が非ヒトポリクローナル抗体を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記測定ステップは、前記安定化させた唾液試料をAbeta42と結合することができる前記抗体と接触させた後に、前記安定化させた唾液試料をAbeta42と結合することができる第2の抗体と接触させることを含み、前記第2の抗体は非交差反応抗体である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非交差反応抗体が非ヒトモノクローナル抗体を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
対象におけるアルツハイマー病発症のリスクを評価する方法であって、
前記対象からの唾液試料を得るステップと、
前記唾液試料を安定化させるステップと、
前記安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる非ヒト抗体と接触させることによって、前記安定化させた唾液試料中に存在するAbeta42のレベルを測定するステップと、
前記Abeta42の決定されたレベルを、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルのものと比較するステップと、
前記決定されたレベルと前記対照レベルとの前記比較を表示するステップであって、前記決定されたレベルが前記対照レベルより大きいことは、前記対象がアルツハイマー病を発症するリスクがあることを示す、ステップと
を含む、前記方法。
【請求項１２】
相対的な前記決定されたレベルが前記対照レベルより少なくとも1.5倍大きいことが、前記対象はアルツハイマー病を発症するリスクがあることを示す、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
相対的な前記決定されたレベルが前記対照レベルの少なくとも2倍であることが、前記対象はアルツハイマー病を発症するリスクがあることを示す、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定化させるステップが抗凝集剤を加えることを含む、請求項11から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗凝集剤がチオフラビンSである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記安定化させるステップが抗菌剤を加えることを含む、請求項11から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗菌剤がアジ化ナトリウムである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ヒト抗体がポリクローナル抗体を含む、請求項11から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定ステップが、前記安定化させた唾液試料をAbeta42と結合することができる前記抗体と接触させた後に、前記安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる第2の非ヒト抗体と接触させることを含む、請求項11から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第2の非ヒト抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
対象における唾液中Abeta42のレベルを測定する方法であって、
前記対象からの唾液試料を得るステップと、
前記唾液試料を安定化させるステップと、
前記安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる非ヒトポリクローナル抗体と接触させるステップと、
前記安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる非ヒトモノクローナル抗体と接触させるステップと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記非ヒトポリクローナル抗体がウサギポリクローナル抗体である、請求項21に記載の前記方法。
【請求項２３】
前記非ヒトモノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項21に記載の前記方法。
【請求項２４】
対象においてアルツハイマー病を診断するためのキットであって、
前記対象から唾液試料を採取するための無菌プラスチックチューブと、
唾液中Abeta42と結合することができる抗体である、少なくとも1種の結合剤と、
較正基準と、
罹患していない対照群試料から得た対照唾液試料と
を含む、前記キット。
【請求項２５】
前記無菌プラスチックチューブが抗凝集剤で予め充填されている、請求項24に記載のキット。
【請求項２６】
前記抗凝集剤がチオフラビンSを含む、請求項24または請求項25に記載のキット。
【請求項２７】
前記無菌プラスチックチューブが抗菌剤で予め充填されている、請求項24から26のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記抗菌剤がアジ化ナトリウムを含む、請求項24に記載のキット。
【請求項２９】
前記結合抗体が非ヒトポリクローナル抗体を含む、請求項24から28のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記非ヒトポリクローナル抗体がウサギポリクローナル抗体である、請求項29に記載のキット。
【請求項３１】
前記結合抗体が非ヒトモノクローナル抗体を含む、請求項24から28のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記非ヒトモノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体である、請求項31に記載のキット。
【請求項３３】
対象においてアルツハイマー病を診断するためのキットであって、
唾液中Abeta42と結合することができる抗体である少なくとも1種の結合剤で飽和させた無菌ニトロセルロース片と、
較正基準と、
罹患していない対照群試料から得た対照唾液試料と
を含む、前記キット。
【請求項３４】
測定された唾液中Abeta42レベルが、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルより高い対象におけるアルツハイマー病を治療するための、抗炎症剤の使用。
【請求項３５】
対象におけるアルツハイマー病発症のリスクを低減させる方法であって、
前記対象からの唾液試料を得るステップと、
前記唾液試料を安定化させるステップと、
前記安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる非ヒト抗体と接触させることによって、前記安定化させた唾液試料中に存在するAbeta42のレベルを測定するステップと、
前記Abeta42の決定されたレベルを、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルのものと比較するステップと、
前記決定されたレベルと前記対照レベルとの前記比較を表示するステップであって、前記決定されたレベルが対照レベルより少なくとも1.5倍または少なくとも2倍大きいことは、前記対象がアルツハイマー病を発症するリスクがあることを示す、ステップと、
抗炎症剤を対象に投与することによって、アルツハイマー病を発症するリスクがある前記対象における、アルツハイマー病発症のリスクを低減させるステップと、
を含む、方法。
【請求項３６】
前記抗炎症剤が非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)または補体阻害剤である、請求項35に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病のリスクを診断し、予測するための方法およびキットに関する。より詳細には、本発明は、アルツハイマー病の診断および治療における唾液中のベータアミロイドタンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病(AD)の問題に対する解決策を見つける緊急性を誇張することは難しいだろう。国際アルツハイマー病協会は、その2010年の世界アルツハイマーレポートにおいて、ADに罹患している3,500万人の人々が存在し、そのコストは年間6040億ドルになると推計した。2013年の米国アルツハイマー病協会のレポートは、米国だけで520万件の症例が存在し、68秒ごとに新たな症例が確認されていると推計した。その時の米国における年間コストは2,030億ドルであると推定されるが、患者の未払いの医療費は含んでおらず、それらはさらに年間2,160億ドルであると推定された(アルツハイマー病協会、2013年)。
【０００３】
ADは、42位で終結したベータアミロイドタンパク質(Abeta)の脳内沈着を特徴とする。Abeta42はアミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチド画分である。この画分は比較的不溶性であり、脳内に蓄積すると、老人斑の形態の細胞外沈着物を産生する。これらの斑は炎症反応を刺激する。上記炎症反応は、次に、補体系を完全に活性化する。これは、残存脳ニューロンを直接損傷する膜侵襲複合体(MAC)の形成をもたらす。これらの脳ニューロンの進行性消失が発生し、最終的には、臨床的ADと定義される認知障害をもたらす。
【０００４】
この一連の事象は、抗炎症剤を用いた早期介入によって回避することができる。従来の非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDs)はそのようなクラスの薬剤の1つである。補体阻害剤は別の新たに出現した治療クラスである。AD発症が予想される時期より前にNSAIDsを摂取している人は、上記疾患を発症するリスクが大幅に低下することを示す複数の疫学的研究が実施されている(McGeerら、1996年)。NSAIDsの摂取と、上記予想されるADの発症との間の時間間隔が長いほど、上記リスクの低減はより大きくなる。それは5〜6倍にもなり得る(McGeerら、1990年)。さらに、従来のNSAIDsは、ADのトランスジェニックマウスモデルを使用した14件の研究のうちの13件において、病理および挙動に対して改善効果を有することが示された。イブプロフェンは、これらの研究のうちの10件において最適なNSAIDであった(Kukarら、2005年;McGeerおよびMcGeer、2013年)。
【０００５】
ADに対するバイオマーカーを使用する最近の進歩は、これらの結果についてのもっともらしい説明を提供している。現在、バイオマーカーレベルは、AD発症の10年よりも前に変化することが知られている。Batemanら(2012年)は、遺伝子変異によってADの発症が避けられない128件の症例を用いた画期的な研究において、CSF中のAbeta42の濃度が、予想された臨床的発症の25年前から低下していたことを見出した。Pittsburgh化合物B PET試験によって明らかになったように、脳内のAbeta沈着物は、予想された臨床的発症の15年前から検出された。Villemagneら(2013年)は、ADの臨床診断レベルに到達するまでに、Abeta沈着物の19.2年間の直線的蓄積、4.2年間の海馬萎縮、および3.3年間の記憶障害を要したと推定した。
【０００６】
これらの予測の根拠となるのは、プレセニリン1(PS1)およびプレセニリン2(PS2)において、ある特定の遺伝子変異を有するヒトが必然的にADを発症することである。それらは異常に高いレベルのAbeta42の発現をもたらす。これらの変異を発現するトランスジェニックマウスモデルは脳内でAbeta42を過剰生産する。これらは早くも2〜4カ月齢で検出可能である(Citronら、1997年)。
【０００７】
この逆は、ADを防ぐAPP遺伝子における変異(A673T)として観察される。この置換はベータセクレターゼ切断部位の近傍にある。その結果、in vitroにおけるアミロイド生成性のペプチドの形成が40%低下する(Jonssonら、2012年)。
【０００８】
本発明者らは、ADのバイオマーカー予測と臨床的発症との間の治療機会を活用することで、ADを防ぐことができることを特定した。10年間以上の前臨床的進行中に非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、補体阻害剤、または他の抗炎症剤で介入することで、ADの発症をうまく防ぐことができるはずである。この機会を利用するために、広く一般大衆が利用できる、簡単で、安価で、非侵襲的な診断方法および検査が必要とされる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、対象における唾液試料中のAbeta42のレベルを正確に決定するための方法およびキットを記載する。本発明者らは、Abeta42が身体の本質的に全ての末梢器官によって産生され、連続的に生成されている基本分子であることを特定した。本発明者らは、一般的な非AD個体が、性別または年齢にかかわらず、その唾液中に低レベルのAbeta42を分泌し、一方で、ADに罹患している個体、およびADを発症するリスクが高い個体は、これらの一般的な非AD症例よりも実質的に高いレベルのAbeta42を分泌することを特定した。したがって、唾液中の高いAbeta42レベルが、ADを診断し、将来の発症のリスクを予測するために使用され得る。
【００１０】
本発明は、唾液中に存在するAbeta42を安定化させ、それを定量的に捕捉し、次いでそのレベルを正確に測定するための方法およびキットを提供する。次に唾液中Abeta42の決定されたレベルが、対象におけるアルツハイマー病(AD)を診断するために使用され得る。さらに唾液中Abeta42の決定されたレベルが、上記対象におけるAD発症のリスクを評価するために使用され得る。
【００１１】
一態様では、唾液試料を分析する方法は、対象からの唾液試料を得るステップと、唾液試料を安定化させるステップと、安定化させた上記唾液試料を、Abeta42と結合することができる抗体と接触させることによって、安定化させた上記唾液試料中に存在するAbeta42のレベルを測定するステップと、上記安定化させた唾液中に存在するAbeta42の決定されたレベルを、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルと比較するステップと、決定されたレベルと上記対照レベルとの比較を表示するステップであって、相対的な決定されたレベルが上記対照レベルより大きいことは、上記対象におけるアルツハイマー病を示すか、または上記対象がアルツハイマー病を発症するリスクがあることを示す、ステップとを含む。
【００１２】
本発明はまた、唾液中Abeta42レベルが、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルよりも大きい対象を治療する方法も提供する。上記方法は、ADを発症するリスクを低減させるために有効量のNSAIDs、補体阻害剤、または他の抗炎症剤を投与するステップを含む。
【００１３】
添付の図面は本発明の非限定的な例示的な実施形態を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】RT-PCRによりヒト器官におけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)mRNAsの発現を検出するアガロースゲル電気泳動実験の結果を示す写真である。
【００１５】
【図１Ｂ】RT-PCRによりマウス臓器におけるアミロイド前駆体タンパク質(APP)mRNAsの発現を検出するアガロースゲル電気泳動実験の結果を示す写真である。
【００１６】
【図２】ウサギポリクローナルAbeta42抗体を使用したELISAアッセイにおいてAbeta42濃度に対して450nmでの吸光度をプロットした標準曲線を示す。
【００１７】
【図３】図3A〜3Dは、マウスモノクローナルAbeta42を使用したドットブロットを示す。図3AはPBS緩衝液のみである。図3Bおよび3Cは正常な非AD個体由来の唾液試料である。図3DはAD個体由来の唾液試料である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下の説明全体にわたって、具体的詳細が本発明のより深い理解を提供するために示される。しかしながら、本発明はこれらの事項を用いずに実施されてもよい。他の場合、周知の要素は、本発明を不必要に不明瞭にすることを回避するために詳細に示されていないか、または記載されていない。したがって、本明細書および図面は、限定的な意味ではなく、例示的な意味とみなされるものである。
【００１９】
本発明は、アルツハイマー病(AD)を診断し、将来のAD発症のリスクを予測するための非侵襲的方法および関連するキットに関する。上記方法および関連するキットは、42位で終結するベータアミロイドタンパク質（Abeta42）の唾液中レベルを測定することに基づく。Abeta42は脳内でのみ産生される(血液および尿中でのその出現は単に脳クリアランスの結果である)と以前は広く考えられていたが、本発明者らはこの仮定は誤りであり、身体の多くの臓器がAbeta42を連続的に産生し、Abeta42が唾液中に見出され得ると特定した。ADについての予測および診断試験として役立つためには、本発明の方法およびキットは、唾液試料中の本質的に全てのAbeta42を測定することができなければならない。
【００２０】
本発明の一実施形態によれば、アルツハイマー病を診断する方法は、ヒト患者から唾液試料を得るステップと、上記唾液試料を安定化させるステップと、安定化させた唾液試料を、Abeta42と結合することができる抗体と接触させることによって、安定化させた唾液試料中に存在するAbeta42のレベルを測定するステップと、上記測定レベルを所定のレベルと比較するステップと、上記測定レベルと上記所定のレベルとの比較を表示するステップとを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、上記安定化ステップは、Abeta42凝集を防ぐために抗凝集剤を上記唾液試料に加えるステップを含む。例示的な一実施形態では、上記抗凝集剤はチオフラビンSである。他の実施形態では、上記抗凝集剤は、scyllo-イノシトール、トラミプロセート(3-アミノ-1-プロパンスルホン酸、ホモタウリン）、クルクミン、メラトニン、レスベラトロールなどの、アミロイド凝集を防ぐことができる任意の好適な薬剤であってもよい。
【００２２】
上記安定化ステップは、さらにまたは代替として、上記唾液試料中の微生物増殖を防ぐために抗菌剤を加えるステップを含んでもよい。例示的な一実施形態では、上記抗菌剤はアジ化ナトリウムである。他の実施形態では、上記抗菌剤は、抗菌性および抗真菌性抗生物質を含む、微生物増殖を防ぐことができる任意の適切な薬剤であってもよい。
【００２３】
上記測定ステップは、上記試料中に存在する本質的に全てのAbeta42と結合するように、上記の安定化させた唾液試料をAbeta42抗体により処理するように設計される。上記検出ステップは、測定される抗原としてAbeta42を使用する抗原-抗体反応に基づくELISA試験などのイムノアッセイを含んでもよい。
【００２４】
例えば、捕捉抗体は、Abeta42に特異的なポリクローナル抗体であってもよい。結合したAbeta42は、次に、上記第1のAbeta42抗体と交差反応しない第2のAbeta42抗体によって検出される。いくつかの実施形態では、上記第2のAbeta42抗体は、マウスモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体であってもよい。次いでビオチンが、上記モノクローナル抗体、またはビオチンが結合される第3のIgG抗体と結合され得る。上記ビオチンのレベルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と連結したストレプトアビジン溶液によりまず処理し、続いてテトラメチルベンジジン溶液により処理して、分光光度計において得られた色を読み取ることによって上記HRPを検出することによって検出される。
【００２５】
Abeta42標的のELISA標準濃度グラフは、例えば、吸光度検出、蛍光検出、ルミネセンス検出、または電気化学的検出によって得ることができる。図2は、450nmでの吸光度によって得られたAbeta42についての標準濃度グラフを示す。あるいは、イムノアッセイが、Abeta42を直接的または間接的に検出することができる方法によって実施され得る。このような代替方法の例には、MS(質量分析)、MS/MS、および液体クロマトグラフィーが含まれる。
【００２６】
上記比較ステップは、上記検出ステップから得たAbeta42の上記測定レベルをAbeta42の所定のレベルと比較するステップを含んでもよい。Abeta42の上記所定のレベルは、ADを有さず、ADについての遺伝的素因を全く有さない正常な個体由来の同時的なまたは前の唾液試料から得ることができる。
【００２７】
上記表示ステップは、値、図、イラストなどを表示するステップを含む。このステップは、好ましくは、上記測定レベルと上記所定のレベルとの差を評価するのを支援することができるステップである。例えば、上記差は、上記所定のレベルに対する上記測定レベルの比によって表示されてもよい。ADの診断、またはADの将来の発症のリスクの予測は、例えば、この比が1.5、または2.0、または2.5を超える場合に行われ得る。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、定性的スクリーニング試験が提供される。例えば、上記試験は、以下の実施例5に記載されるようなドットブロットを含んでもよい。このような試験は、唾液中Abeta42レベルの定量的決定を実施すべきかどうかを決定するために個体によって使用され得る。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、唾液中Abeta42レベルが、罹患していない対照群試料の唾液試料に由来するAbeta42の対照レベルよりも大きい対象を治療する方法が提供される。上記所定のレベルに対する上記測定した唾液中Abeta42レベルの比が1.5、2.0、または2.5を超える場合、有効量のNSAIDs、補体阻害剤、または他の抗炎症剤が、AD発症を防ぐために上記対象に投与される。多数の疫学的研究により、AD発症の予想される時間の前に、NSAIDsなどの抗炎症剤を摂取する人々は、疾患を発症するリスクを実質的に低減させることが示唆されている(McGeerら、1996年)。
【００３０】
本発明は、例示として提供され、限定することを意図しない以下の実施例を参照することによってさらに理解することができる。
【実施例】
【００３１】
実施例1  -  臓器におけるAPP mRNAおよびAbeta42ペプチドの検出
本発明者らは最初に、APPについてのmRNAが脳以外の臓器に存在するか否かを調べた。
【００３２】
ヒト臓器およびマウス脳の凍結試料をその出発材料として利用した。上記試料をソニックディスメンブレーター(sonic dismembrator)(Fisher Scientific、Ottawa、ON)によって均質化した。次いでそれらを100マイクロリットルのTRIzol(GIBCO-BRL、Gathersburg、MD)により処理した。1時間後、その溶解物を10,000rpmにて10分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移した。次いでRNAの純度および量を分光光度的に測定した。
【００３３】
全RNAアリコート(20μg)を、モロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV)逆転写酵素(GIBCO-BRL)を用いて第１鎖相補的DNA(cDNA)を合成するために使用した。次いで上記cDNA産物を、GeneAmpサーマルサイクラー(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用してPCRによって増幅した。
【００３４】
ヒトβAPPおよびGAPDHについての特異的プライマーは、βAPP:フォワード5'-CGGAATTCCCTTGGTGTTCTTTGCAGAAG-3'およびリバース5'-CGGAATTCCGTTCTGCATCTGCTCAAAG-3'(248bp)(Miklossyら、2010年)、ならびにGAPDH:フォワード5'-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3'およびリバース5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3'(251bp)(Leeら、2010年)である。マウスβAPPおよびGAPDHについての特異的プライマーは、βAPP:フォワード5'CCACCACAACCACCACTGAG-3'およびリバース5'CTGGATACACCCGGGGACGA-3'(APP770について331bp、APP751について274bpおよびAPP695について107bp)(Jeongら、1997年)、ならびにb-アクチン:フォワード5'-GGCTGCTTTTGTAGGCTTCAGTGG-3'およびリバース5'-TCTAGACTTCGAGCAGGAGATGGCC-3'(739bp)(Matsumuraら、2004年)である。ヒト臓器についてのPCR条件は、95℃で6分間の初期変性ステップの後、95℃で45秒間の変性、55〜60℃で1分間のアニーリングおよび72℃で1分間の伸長からなる30サイクル増幅プログラムであった。最終伸長は72℃で10分間実施した。マウス臓器について、PCR条件は、95℃で1分間の初期変性、続いて95℃で45秒間の変性、55℃で1分間のアニーリングおよび72℃で2分間の伸長からなる30サイクル増幅プログラムであった。最終伸長は72℃で10分間実施した。増幅したPCR産物を、臭化エチジウム(最終濃度0.5μg/ml)を含有する1.5%アガロースゲルを使用して同定し、紫外線下で可視化した。
【００３５】
図1Aおよび1Bに示されるように、Abeta42に翻訳され得るAPPのmRNAは、試験した全てのヒトおよびマウス臓器において発現していた。下のパネルに示されるGAPDHおよびβ-アクチンローディングコントロールの発現は、ヒトおよびマウスそれぞれについて、基準として使用された。
【００３６】
次に本発明者らは、このmRNAがタンパク質に翻訳され、その結果、以下の表1に示されるように、試験した全ての身体臓器においてAbeta42が検出されたことを実証した。ヒト肝臓、肺、小腸、感覚皮質、海馬、膵臓、心臓、腎臓、脾臓および３つのマウス脳由来の凍結組織を解凍し、小片に切断した。切断片を、10倍過剰の0.01Mリン酸緩衝食塩水(PBS、PH7.4)が入った冷却したチューブに加えた。その混合物を、20%振幅にて25秒間、10回超音波処理した(Branson Digital Sonifier、USA)。次いで上記混合物を10,000ｇにて30分間、4℃にて遠心分離した。該試料を、本発明によるイムノアッセイを使用して分析した(唾液試料に関するアッセイを下記でさらに説明する)。
【００３７】
このように、Abeta42は脳においてのみ産生される(そして血中および尿中のその出現は単に脳クリアランスの結果である)と以前は広く考えられていたが、本発明者らはこの仮定はしたがって誤りであって、身体の多くの臓器がAbeta42を連続的に産生することを特定した。
【表１】
2019525176.tif 000003
【００３８】
表1はまた、Invitrogen(Frederick、MD)製の市販のELISAキットを使用して得られた結果に対して本発明の方法を使用して得られた結果を比較する。上記製造業者の使用説明書に厳密に従った。表1から理解できるように、上記市販のELISAキットは、本発明の方法によって決定される組織に存在するAbeta42の約20%を検出するに過ぎない。
【００３９】
実施例2  -  唾液中のAbeta42ペプチドの定量的検出
唾液中のAbeta42含有量を決定するために、PBS中で1/1000希釈したウサギポリクローナル抗Abeta42抗体100μLを96ウェルプレートに加え、4℃にて一晩静置して、上記抗体を上記プレートに結合させた。この場合、一次あるいは捕捉抗体は、Novus Biochemicals(NBP2-44113、Littleton CO)から得たウサギポリクローナルAbeta42抗体であった。次いでその上清を捨てた。次に、上記捕捉抗体との非特異的結合を遮断するために、400μLの5%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma、St.Louis、MO)を上記プレートに加え、続いて37℃にて1時間インキュベートした。上記BSA溶液を捨て、ウェルをPBSにより2回洗浄した。
【００４０】
種々の濃度(0〜100μL)の唾液を上記プレートに加え、37℃にて4時間インキュベートした。次いでその上清を捨てた。上記プレートをPBSにより2回洗浄した。次にそれらをAbeta42に対するマウスモノクローナル抗体とインキュベートした。この場合の抗体はAnaspec(Fremont、CA)製であった。それをPBS中の5%BSAの1/200希釈液100μLとして加えた。インキュベーションを37℃にて2時間実施した。上記プレートをPBSにより2回洗浄した。次にそれらを、5%BSAを含有するPBS中で1/200希釈したビオチン連結ウサギ抗マウスIgG抗体(DAKO、Mississauga、ON、Canada)100μLと37℃にて1時間インキュベートした。その上清は捨てられた。
【００４１】
結合したビオチンを検出するために、ストレプトアビジン溶液(ABC、1/1000希釈、Vector Laboratories)を加え、インキュベーションを37℃にて30分間実施した。上記プレートをPBSにより2回洗浄し、テトラメチルベンジジン(TMB)溶液(100μL、Invitrogen、Carlsbad、CA)を加え、インキュベーションを37℃にてさらに30分間実施した。反応を停止させ、450nmで光学密度を測定した。
【００４２】
次いで本発明者らは、唾液中に存在するAbeta42を安定化させる効果を実証した。容器あたり2mLの唾液を採取した。対照試料については、安定剤を加えなかった。試験試料については、チオフラビンS(0.5mg、Sigma St.Louis MO)を即座に加えてAbeta42の凝集を阻止し、アジ化ナトリウム(0.5mg、Fischer Scientific、Suwanee GA)も加えて細菌増殖を阻止した。上記容器を室温にて７日間静置し、その間にAbeta42およびタンパク質の測定のためにアリコートを定期的に採取した。
【００４３】
表2の結果が示すように、安定剤を用いていないAbeta42は急速に劣化する。周囲温度にて3日以内に、数値は、最初に存在していたものの1％をはるかに下回るまで低下した。しかしながら、チオフラビンSおよびアジ化ナトリウムを加えると、周囲温度で7日経過した後、およびその後の非特定期間に渡り、完全に安定であった。この安定化により、唾液を保存および/または輸送することが実用的になる。例えば、物流問題、試料処理能力問題などにより、試料が数日間分析されないことが要求され得る。したがって、上記安定化ステップは、試料採取および周囲温度における保存から少なくとも1日、または少なくとも2日、または少なくとも3日、または少なくとも5日、または少なくとも1週間後に分析ステップが行われる実施形態において重要である。
【００４４】
表2の最後の3列に示すように、採取時における唾液の希釈を補償するために適切な参照基準も同定した。試料中の全タンパク質はこのような基準であることが判明した。標準的なタンパク質測定方法に従った。濃度は、Thermo Scientific Inc.(Rockford、IL)によって提供されるアッセイキットを使用して決定した。上記キットはビシンコニン酸との反応に基づく。ウシ血清アルブミンが参照基準である。唾液試料または対照としてのPBS(10μL)をマイクロウェルプレートに加えた。インキュベーションを37℃にて30分間実施した。次いで562nmで光学密度(OD)を読み取った。
【表２】
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【００４５】
実施例3  -  ADの検出および予測
表3は、一連の個体における唾液中Abeta42レベルを測定することによるADの診断および予測可能性を例示する。上記表は、対照およびADの値が重ならないことを示し、本発明が、測定が実施される各人について確実に診断し、予測することができることを示している。
【表３】
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【００４６】
実施例2に記載される方法を利用して、表3に示すように、一連の33人の個体においてAbeta42レベルを決定した。上記表が例示するように、非AD症例（対照）は16〜92歳にわたって非常に一定のレベルを発現し、男性と女性との間に差はなかった。パーキンソン病を有する1人を含む25件の非AD症例は、平均23.34±1.50ピコグラム/mlを示した。6件のAD症例は、平均57.89±6.53ピコグラム/mlを示した。一元ANOVAを実施して上記対照とADの症例との差の有意性を検証した(p<.001)。症例26および27を除いて、ADと非AD症例との間に重なりはなかった。それらは上記AD範囲の値を有し、Pre-ADと指定された。両方の症例がADに罹患した母親を有していたので、ADを発症するリスクが通常よりも高いことが知られていた。唾液中Abeta42レベルは、それらの症例において、上記リスクは可能性があるというよりむしろ明確であることを証明している。全般的に、これらのデータは、本発明がADを診断でき、将来の発症のリスクを予測できることを実証している。
【００４７】
実施例4  -  ADの定性的検出
ADを検出する迅速で定性的な方法を提供するために、本発明者らはドットブロット試験の実現可能性を評価した。ニトロセルロース膜の小片を、1/1000希釈におけるウサギポリクローナルAbeta42抗体(Novus Biologicals)で飽和させた。次いで唾液の小さなドットを適用した。乾燥後、上記膜を、室温にて1時間、ブロッキング溶液(PBS中の5%BSA)により処理した。次いでマウスモノクローナルAbeta42抗体(Anaspec、1/200希釈)をドット領域に適用し、続いてウサギポリクローナル抗マウスIgG抗体6E10(1/200)を適用した。洗浄後、プレートを、37℃にて1時間、3%BSA中のビオチン連結ウサギ抗マウスIgG抗体(5%(DAKO、Mississauga、ON、Canada)中に1/200)とインキュベートした。HRP連結ストレプトアビジン溶液(ABC溶液、1/1000希釈、Vector Laboratories)を加え、インキュベーションを37℃にて30分間実施した。増強された化学発光システム(LuminataTM Crecendo Western HRP Substrates、Millipore、Billerica、MA)を用いて呈色反応を5分間実施した。
【００４８】
図3A〜3Dは、一般的な正常症例および一般的なAD症例における唾液中Abeta42のドットブロットの結果を示す。AD症例において検出されたAbeta42は2件の正常な症例におけるよりも約2.7倍多かった。
【表４】
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【００４９】
構成要素が上記に言及されている場合、別段の指示がない限り、その構成要素に対する言及（「手段」に対する言及を含む）は、本発明の示された例示的な実施形態における機能を実施する開示された構造と構造的に等価ではないものも含め、記載された構成要素の上記機能を実施する（すなわち機能的に等価である）任意の構成要素を、その構成要素の等価物として含むと解釈されるべきである。
【００５０】
本出願は、その一般的原理を使用する本発明の任意の変形、使用または適応を含むことを意図する。さらに、本出願は、本開示からのこのような逸脱を、本発明が関係する分野における公知または慣用の実施の範囲内に含み、本添付の特許請求の範囲の該範囲内に含むことを意図する。したがって、特許請求の範囲は、本説明に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体として本説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【００５１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【国際調査報告】
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