(57)【要約】  本発明は、ライセニンの変異体形態に関する。本発明はまた、ライセニンの変異体形態を使用した分析物の特徴付けに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーであって、前記バリアントが、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｋ１１２、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む、変異体ライセニンモノマー。
【請求項２】
前記バリアントが、以下の位置、Ｔ９１、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、及びＫ１１２のうちの１つ以上における修飾を含む、請求項１に記載の変異体モノマー。
【請求項３】
前記修飾が、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）による置換である、請求項２に記載の変異体モノマー。
【請求項４】
前記バリアントが、以下の置換、Ｔ９１Ｓ、Ｖ９５Ｓ、Ｙ９６Ｓ、Ｓ９８Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｖ１００Ｓ、Ｉ１０１Ｓ、及びＫ１１２Ｓのうちの１つ以上を含む、請求項２または３に記載の変異体モノマー。
【請求項５】
前記バリアントが、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む、請求項１に記載の変異体モノマー。
【請求項６】
前記修飾が、アスパラギン（Ｎ）、トリプトファン（Ｗ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）による置換である、請求項５に記載の変異体モノマー。
【請求項７】
前記バリアントが、以下の置換、Ｋ３７Ｎ／Ｗ／Ｓ／Ｑ、Ｇ４３Ｋ、Ｋ４５Ｄ／Ｒ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、Ｖ４７Ｋ／Ｓ／Ｎ、Ｓ４９Ｋ／Ｌ、Ｔ５１Ｋ、Ｈ８３Ｓ／Ｋ、Ｖ８８Ｉ／Ｔ、Ｔ９１Ｋ、Ｔ９３Ｋ、Ｙ９６Ｄ、Ｓ９８Ｋ、Ｋ９９Ｑ／Ｌ、Ｐ１０８Ｋ／Ｒ、Ｐ１０９Ｋ、Ｔ１１０Ｋ／Ｒ、Ｓ１１１Ｋ、及びＴ１１４Ｋのうちの１つ以上を含む、請求項５または６に記載の変異体モノマー。
【請求項８】
前記バリアントが、以下の位置の組み合わせのうちの１つ以上における修飾を含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の変異体モノマー：
【表１６】
2019520035.tif 000022
【請求項９】
前記バリアントが、以下の置換の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項８に記載の変異体モノマー：
【表１７】
2019520035.tif 000023
【請求項１０】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーであって、前記バリアントが、以下の置換のうちの１つ以上を含む、変異体ライセニンモノマー：
Ｄ３５Ｎ／Ｓ、
Ｓ７４Ｋ／Ｒ、
Ｅ７６Ｄ／Ｎ、
Ｓ７８Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８０Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｅ８４Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ、
Ｅ８５Ｎ、
Ｓ８６Ｋ／Ｑ、
Ｓ８９Ｋ、
Ｍ９０Ｋ／Ｉ／Ａ、
Ｅ９２Ｄ／Ｓ、
Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ／Ｎ、
Ｅ１０２Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｓ、
Ｔ１０４Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｔ１０６Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｒ１１５Ｓ、
Ｑ１１７Ｓ、及び
Ｎ１１９Ｓ。
【請求項１１】
前記バリアントが、置換Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｓ８６Ｑ、及びＥ９２Ｓのうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の変異体モノマー。
【請求項１２】
前記バリアントが、以下の置換のうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の変異体モノマー：
Ｄ３５Ｎ／Ｓ、
Ｓ７４Ｋ／Ｒ、
Ｅ７６Ｄ／Ｎ、
Ｓ７８Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８０Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｅ８４Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ、
Ｅ８５Ｎ、
Ｓ８６Ｋ、
Ｓ８９Ｋ、
Ｍ９０Ｋ／Ｉ／Ａ、
Ｅ９２Ｄ、
Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｋ／Ｎ、
Ｅ１０２Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｓ、
Ｔ１０４Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｔ１０６Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｒ１１５Ｓ、
Ｑ１１７Ｓ、及び
Ｎ１１９Ｓ。
【請求項１３】
前記バリアントが、以下の置換の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の変異体モノマー：
【表１８】
2019520035.tif 000024
2019520035.tif 000025
【請求項１４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーであって、前記バリアントが、以下の位置の組み合わせのうちの１つ以上における変異を含む、変異体ライセニンモノマー：
【表１９】
2019520035.tif 000026
【請求項１５】
前記バリアントが、以下の置換の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１４に記載の変異体モノマー：
【表２０】
2019520035.tif 000027
2019520035.tif 000028
【請求項１６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーであって、前記バリアントが、以下の置換の対のうちの１つ以上を含む、変異体ライセニンモノマー：
Ｅ８４Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ａ／Ｅ９４Ｑ、
Ｅ８４Ｋ／Ｅ９４Ｑ、及び
Ｅ９４Ｑ／Ｄ１２１Ｓ。
【請求項１７】
前記モノマーが、任意の数及び任意の組み合わせの、請求項１〜１６のいずれか１項に定義される修飾及び／または置換を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の変異体ライセニンモノマー。
【請求項１８】
配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーであって、前記バリアントにおいて、（ａ）配列番号２の３４位〜７０位のアミノ酸に対応するアミノ酸のうちの２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０個が欠失されており、（ｂ）配列番号２の７１位〜１０７位のアミノ酸に対応するアミノ酸のうちの２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０個が欠失されている、変異体ライセニンモノマー。
【請求項１９】
（ａ）及び（ｂ）において同じ数のアミノ酸が欠失されている、請求項１８に記載の変異体モノマー。
【請求項２０】
欠失されている前記アミノ酸の前記位置が、表１もしくは２の１行または表１及び／もしくは２の２行以上に示されている、請求項１８または１９に記載の変異体。
【請求項２１】
配列番号２中の以下のアミノ酸に対応するアミノ酸が欠失されている、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の変異体モノマー：
（ｉ）Ｎ４６／Ｖ４７／Ｔ９１／Ｔ９２、または
（ｉｉ）Ｎ４８／Ｓ４９／Ｔ９１／Ｔ９２。
【請求項２２】
前記バリアントが、適切な場合、請求項１〜１７のいずれか１項に定義される前記修飾及び／または置換のうちのいずれかをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の変異体モノマー。
【請求項２３】
前記バリアントが、
配列番号２の以下の位置、（ａ）Ｅ８４、Ｅ８５、Ｅ９２、Ｅ９７、及びＤ１２６、（ｂ）Ｅ８５、Ｅ９７、及びＤ１２６、もしくは（ｃ）Ｅ８４及びＥ９２のうちの１つ以上における置換、または
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇのうちの１つ以上、もしくは、適切な場合、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇの全てにおける置換、をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の変異体モノマー。
【請求項２４】
前記バリアントが、以下の置換の組み合わせのうちの１つを含む、請求項２３に記載の変異体モノマー：
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、または
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ。
【請求項２５】
ポアを形成することが可能である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の変異体ライセニンモノマー。
【請求項２６】
前記バリアントが、配列番号２に示される配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異体ライセニンモノマー。
【請求項２７】
ライセニンに由来する２つ以上の共有結合したモノマーを含む構造体であって、前記モノマーのうちの少なくとも１つが請求項１〜２６のいずれか１項に定義される変異体ライセニンモノマーである、構造体。
【請求項２８】
前記２つ以上のモノマーが、同じであるか、または異なる、請求項２７に記載の構造体。
【請求項２９】
前記２つ以上のモノマーが、遺伝的に融合されている、請求項２７または２８に記載の構造体。
【請求項３０】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の変異体ライセニンモノマーまたは請求項２７に記載の構造体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの変異体ライセニンモノマー及び／または請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの構造体を含む、ポア。
【請求項３２】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の６〜１２個の変異体ライセニンモノマーを含むホモオリゴマーポアである、請求項３１に記載のポア。
【請求項３３】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの変異体ライセニンモノマーを含むヘテロオリゴマーポアである、請求項３１に記載のポア。
【請求項３４】
標的分析物を特徴付ける方法であって、
（ａ）前記標的分析物を、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポアと、前記標的分析物が前記ポアを通って移動するように接触させることと、
（ｂ）前記分析物が前記ポアに対して移動する間に、１つ以上の測定値であって、前記標的分析物の１つ以上の特徴を示す、測定値をとり、それによって前記標的分析物を特徴付けることと、を含む、方法。
【請求項３５】
（ｉ）前記ポアが、チャンバを２つの区画に分離する膜内に存在し、各区画が水溶液を含み、
（ｉｉ）ステップ（ａ）が、１つの区画に前記分析物を提供することを含み、
（ｉｉｉ）ステップ（ｂ）が、前記膜にわたって電位差を印加することを含み、及び／または
（ｉｖ）ステップ（ｃ）が、前記膜にわたる電流を測定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的分析物が、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、染料、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物、または環境汚染物質である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的分析物が、標的ポリヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ａ）が、前記標的ポリヌクレオチドを前記ポア及びポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることを含み、前記タンパク質が前記ポアを通る前記標的ポリヌクレオチドの移動を制御する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けることが、前記標的ポリヌクレオチドの配列を推定することまたは前記標的ポリヌクレオチドをシークエンシングすることを含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成する方法であって、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との間で複合体を形成し、それにより前記標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成することを含む、方法。
【請求項４１】
前記複合体が、（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの存在下で前記ポア及び前記ポリヌクレオチド結合タンパク質を接触させることと、（ａ）前記ポアにわたって電位を印加することと、によって形成される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記電位が、電圧電位または化学的電位である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記複合体が、前記ポアを前記ポリヌクレオチド結合タンパク質に共有結合させることによって形成される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサであって、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との間の複合体を含む、センサ。
【請求項４５】
標的分析物を特徴付けるための、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポアの使用。
【請求項４６】
（ａ）請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポアと、（ｂ）膜とを含む、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキット。
【請求項４７】
前記キットが、両親媒性層を含むチップをさらに含む、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
（ａ）請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の複数のポアと、（ｂ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質とを含む、試料中の標的ポリヌクレオチドを特徴付けるための装置。
【請求項４９】
配列番号２に示される配列を含むライセニンモノマーのポリヌクレオチドを特徴付ける能力を改善する方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に定義される前記修飾及び／または置換のうちの１つ以上を行うことを含む、方法。
【請求項５０】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の構造体を生成する方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの変異体ライセニンモノマーを、ライセニン由来の１つ以上のモノマーに共有結合させることを含む、方法。
【請求項５１】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のポアを形成する方法であって、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの変異体モノマーまたは請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの構造体を、十分な数の、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のモノマー、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の構造体、及び／またはライセニン由来のモノマーとオリゴマー形成させて、ポアを形成することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライセニンの変異体形態に関する。本発明はまた、ライセニンの変異体形態を使用した分析物の特徴付けに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノポアセンシングは、分析物分子と受容体との間の個々の結合または相互作用の事象の観察に依拠するセンシングの手法である。ナノポアセンサは、ナノメートル寸法の単一のポアを絶縁膜内に置き、分析物分子の存在下でポアを通る電圧駆動イオン輸送を測定することによって作製され得る。分析物の同一性は、その固有の電流シグネチャ、とりわけ電流ブロックの時間及び程度、ならびに電流レベルの変動を通して明らかになる。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄによって販売される、例えば、電子チップ内に一体となったナノポアのアレイを含むＭｉｎＩＯＮ（商標）デバイスなどの、かかるナノポアセンサが市販されている。
【０００３】
幅広い用途にわたって、迅速かつ安価な核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）シークエンシング技術が現在必要とされている。既存の技術は、主に、大量の核酸を生成するために増幅技術に依拠し、シグナル検出のための専門の蛍光薬剤が大量に必要とするため、時間がかかりかつ高価である。ナノポアセンシングは、必要とされるヌクレオチド及び試薬の量を減らすことによって迅速かつ安価な核酸シークエンシングを提供する可能性を有する。
【０００４】
ナノポアセンシングを使用した核酸をシークエンシングする必須成分の１つは、ポアを通る核酸移動の制御である。別のものは、核酸ポリマーがポアを通って移動する際のヌクレオチドの識別である。過去に、ヌクレオチドの識別を達成するために、核酸は、溶血毒の変異体を通されてきた。これは、配列依存性であることが示されてきた電流シグネチャを提供した。溶血毒ポアを使用したときに、認められた電流に多数のヌクレオチドが寄与することも示し、これは、認められた電流とポリヌクレオチドとの間の直接的な関係を困難にした。
【０００５】
ヌクレオチドの識別のための電流範囲は、溶血毒ポアの変異体を通して改善されてきたものの、ヌクレオチド間の電流差をさらに改善させることができれば、シークエンシングシステムは、より高い性能を有することができるであろう。さらに、核酸がポアを通って移動すると、いくつかの電流状態が高い変動性を示すことが認められた。いくつかの変異体溶血毒ポアが他のものよりも高い変動を提示することも示された。これらの状態の変動は配列特異情報を含み得る一方、システムを簡略化するために低い変動を有するポアを生成することが望ましい。また、認められた電流に寄与するヌクレオチドの数を減らすことも望ましい。
【０００６】
ライセニン（ｅｆＬ１としても既知である）は、ミミズ、エイセニアフェティダ（Ｅｉｓｅｎｉａ  ｆｅｔｉｄａ）の体腔液から精製されたポア形成毒素である。これは、ライセニン誘導性溶血を阻害するスフィンゴミエリンに特異的に結合する（Ｙａｍａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３（９）：５３００−６）。ライセニンモノマーの結晶構造は、Ｄｅ  Ｃｏｌｂｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１２；２０：１４９８−１５０７に開示されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、驚くべきことに、１つ以上の修飾がなされた新規の変異体ライセニンモノマーがポリヌクレオチドと相互作用するモノマーの能力を改善することを同定した。本発明者らはまた、驚くべきことに、新規の変異体モノマーを含むポアが、ポリヌクレオチドと相互作用する向上した能力を有し、それによって、ポリヌクレオチドの配列などの特徴を推定する向上した特性を提示することを示した。変異体ポアは、驚くべきことに、改善されたヌクレオチドの識別を提示する。とりわけ、変異体ポアは、驚くことに、異なるヌクレオチド間の識別を容易にする電流範囲の増加、及びシグナル対ノイズ比を増加させる状態の変動の低下を提示する。さらに、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間の、電流に寄与するヌクレオチドの数は減少する。これは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間に認められた電流と、ポリヌクレオチドとの間の直接的な関係性を特定することを容易にする。
【０００８】
本明細書に開示される全てのアミノ酸置換、欠失、及び／または付加は、別段記載されない限り、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーに関連する。
【０００９】
配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーへの言及は、配列番号１４〜１６に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを包含する。アミノ酸置換、欠失、及び／または付加は、配列番号２に関連して本明細書に開示される置換、欠失、及び／または付加と同等である配列番号２に示される配列のバリアントを含むライセニンモノマーに行われ得る。
【００１０】
変異体モノマーは、単離されたモノマーとして考えられ得る。
【００１１】
したがって、本発明は、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｋ１１２、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む。
【００１２】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下の置換のうちの１つ以上を含む
Ｄ３５Ｎ／Ｓ、
Ｓ７４Ｋ／Ｒ、
Ｅ７６Ｄ／Ｎ、
Ｓ７８Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８０Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｅ８４Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ、
Ｅ８５Ｎ、
Ｓ８６Ｋ／Ｑ、
Ｓ８９Ｋ、
Ｍ９０Ｋ／Ｉ／Ａ、
Ｅ９２Ｄ／Ｓ、
Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ／Ｎ、
Ｅ１０２Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｓ、
Ｔ１０４Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｔ１０６Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｒ１１５Ｓ、
Ｑ１１７Ｓ、及び
Ｎ１１９Ｓ。
【００１３】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下のうちの１つ以上における変異を含む
Ｄ３５／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｅ１０２／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｔ１０４／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｅ１０２／Ｔ１０６、
Ｇ４３／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｖ４７／Ｅ９２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｖ４７／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｓ４９／Ｅ９２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｓ４９／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｔ１０６、
Ｖ４７／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｖ４７／Ｖ８８／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｓ４９／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｔ５１／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６、
Ｓ７４／Ｅ９４、
Ｅ７６／Ｅ９４、
Ｓ７８／Ｅ９４、
Ｙ７９／Ｅ９４、
Ｓ８０／Ｅ９４、
Ｓ８２／Ｅ９４、
Ｓ８２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｈ８３／Ｅ９４、
Ｈ８３／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ８５／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｓ８６／Ｅ９４、
Ｖ８８／Ｍ９０／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｓ８９／Ｅ９４、
Ｍ９０／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｔ９１／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ９２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｔ９３／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｙ９６／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｓ９８／Ｋ９９／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｋ９９／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｅ１０２、
Ｅ９４／Ｔ１０４、
Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｐ１０８、
Ｅ９４／Ｐ１０９、
Ｅ９４／Ｔ１１０、
Ｅ９４／Ｓ１１１、
Ｅ９４／Ｔ１１４、
Ｅ９４／Ｒ１１５、
Ｅ９４／Ｑ１１７、及び
Ｅ９４／Ｅ１１９。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下の置換のうちの１つ以上を含む：
Ｅ８４Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ａ／Ｅ９４Ｑ、
Ｅ８４Ｋ／Ｅ９４Ｑ、及び
Ｅ９４Ｑ／Ｄ１２１Ｓ。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、バリアントが以下の置換の組み合わせのうちの１つを含む：
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ；
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ；または
Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ。
【００１６】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、バリアント（ａ）において、配列番号２の３４位〜７０位の、またはそれらの位置に対応する、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０個のアミノ酸が欠失されており、（ｂ）配列番号２の７１位〜１０７位の、またはそれらの位置に対応する、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０個のアミノ酸が欠失されている。
【００１７】
本発明はまた、以下：
ライセニンに由来する２つ以上の共有結合したモノマーを含む構造体であって、モノマーの少なくとも１つが、本発明の変異体ライセニンモノマーである構造体と、
本発明の変異体モノマーまたは本発明の遺伝子的に融合される構造体をコードするポリヌクレオチドと、
本発明の十分な数の変異体ライセニンモノマーを含むライセニンに由来するホモオリゴマーポアと、
本発明の少なくとも１つの変異体ライセニンモノマーを含むライセニンに由来するヘテロオリゴマーポアと、
本発明の少なくとも１つの構造体を含むポアと、
標的分析物を特徴付ける方法であって、（ａ）標的分析物がポアを通って移動するように、標的分析物を本発明のポアと接触させること及び（ｂ）ポアに対して分析物が移動する間に１つ以上の測定値をとり、測定値が標的分析物の１つ以上の特性を示し、それによって標的分析物を特徴付けることと、を含む方法と、
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成する方法であって、本発明のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との間で複合体を形成し、それにより標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサを形成することを含む、方法と、
標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサであって、本発明のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との間の複合体を含む、センサと、
標的分析物を特徴付けるための本発明のポアの使用と、
（ａ）本発明のポアと、（ｂ）膜とを含む、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットと、
（ａ）本発明の複数のポアと、（ｂ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質とを含む、試料中のポリヌクレオチドを特徴付けるための装置と、
ポリヌクレオチドを特徴付けるために配列番号２に示される配列を含むライセニンモノマーの能力を改善する方法であって、本発明の１つ以上の修飾及び／または置換を行うことを含む、方法と、
ライセニンに由来する１つ以上のモノマーに本発明の少なくとも１つの変異体ライセニンモノマーを共有結合させることを含む、本発明の構造体を生成する方法と、
本発明のポアを形成する方法であって、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーまたは本発明の少なくとも１つの構造体を、十分な数の、本発明のモノマー、本発明の構造体、またはライセニン由来のモノマーとオリゴマー形成させて、ポアを形成することを含む方法と、を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ライセニン変異体１の中央値のプロットを示す。
【図２】ライセニン変異体１０の中央値のプロットを示す。
【図３】ライセニン変異体−ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）の中央値のプロットを示す。
【図４】ライセニン変異体−ライセニン−Ｅ９４Ｃを介して結合した２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミドを有する（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）の中央値のプロットを示す。
【図５】実施例で使用したアダプターを示す。Ａは３０  ｉＳｐＣ３に対応する。Ｂは配列番号１９に対応する。Ｃは４  ｉＳｐ１８に対応する。Ｄは配列番号２０に対応する。Ｅは、その５’末端に結合した５ＢＮＡ−Ｇ／／ｉＢＮＡ−Ｇ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉ−ＢＮＡ−Ａを有する配列番号２１に対応する。Ｆは、５’ホスフェートを有する配列番号２２に対応する。Ｇは配列番号２４に対応する。Ｈはコレステロールに対応する。
【図６】ライセニンのモノマーの３Ｄ構造を示す。スフィンゴミエリン含有膜との相互作用の際に、ライセニンモノマーは一緒に集まって、中間プレポアを介して九量体ポアを形成する。集合プロセスの間、黒色（配列番号２のアミノ酸６５〜７４に対応する）で示されるポリペプチド部分が、図７に示されるベータバレルの最下部ループに変換される。黒色で示されるポリペプチド部分、それらのベータシートを黒色で示されたポリペプチド部分に連結するポリペプチド部分（配列番号２のアミノ酸３４〜６４及び７５〜１０７に対応）は、図７に示すように、ポアのベータバレルを形成する。このような大きな構造変化は、モノマー構造を研究することによってライセニンポアのベータバレル領域を予測することを困難にする。
【図７】ライセニンポアの領域を示す。図７Ａは、ライセニンの九量体ポアの３Ｄ構造を示し、図７Ｂは、ライセニンポアから得たモノマーの構造を示す。各モノマーが、２つのベータシートをライセニンポアのバレルに寄与する。ベータシート（配列番号２のアミノ酸３４〜６４及び７５〜１０７に対応するアミノ酸を含む）は、ポアの底で非構造ループ（配列番号２の位置６５〜７４に対応するアミノ酸２）によって連結されている。
【図８】３つのライセニン関連タンパク質（配列番号１４〜１６）のアミノ酸配列とのライセニンのアミノ酸配列（配列番号２）のアラインメントである。ライセニンに密接に関連する配列を有する３つのライセニン相同体は、非重複タンパク質配列のデータベースを使用してＢＬＡＳＴ検索を行うことによって同定された。ライセニン関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、ライセニン関連タンパク質２（ＬＲＰ２）、及びライセニン関連タンパク質３（ＬＲＰ３）のタンパク質配列は、ライセニンの配列と整列して４つのタンパク質の類似性を示した。濃い灰色の陰影は、全ての４つの配列に同一のアミノ酸が存在する位置を示す。ＬＲＰ１はライセニンと約７５％同一であり、ＬＲＰ２はライセニンと約８８％同一であり、ＬＲＰ３はライセニンと約７９％同一である。
【００１９】
配列表の説明
配列番号１は、ライセニンモノマーをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２０】
配列番号２は、ライセニンモノマーのアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号３は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を示す。
【００２２】
配列番号４は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号５は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｓｂｃＢ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）をコードする。
【００２４】
配列番号６は、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩ酵素（ＥｃｏＥｘｏ  Ｉ）のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号７は、Ｅ．ｃｏｌｉからのｘｔｈＡ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素をコードする。
【００２６】
配列番号８は、Ｅ．ｃｏｌｉからのエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’モノホスフェートヌクレオシドの分配性消化（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の一方の鎖から３’−５’方向で行う。鎖上の酵素開始は、約４個のヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
【００２７】
配列番号９は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのｒｅｃＪ遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）をコードする。
【００２８】
配列番号１０は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＲｅｃＪ酵素（ＴｔｈＲｅｃＪ−ｃｄ）のアミノ酸配列を示す。この酵素は、５’モノホスフェートヌクレオシドの加工性消化（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）をｓｓＤＮＡから５’−３’方向で行う。鎖上の酵素開始は、約４個のヌクレオチドを必要とする。
【００２９】
配列番号１１は、バクテリオファージラムダｅｘｏ（ｒｅｄＸ）遺伝子に由来するコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。これは、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼをコードする。
【００３０】
配列番号１２は、バクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。配列は、トリマーを形成する３つの同一のサブユニットのうちの１つである。酵素は、高度な加工性消化をｄｓＤＮＡの一方の鎖から５’−３’方向で行う（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｎｅｂｅｃｏｍｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔＭ０２６２．ａｓｐ）。鎖上の酵素開始は、優先的に、５’ホスフェートを有する約４個のヌクレオチドの５’オーバーハングを必要とする。
【００３１】
配列番号１３は、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕのアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号１４は、ライセニン関連タンパク質（ＬＲＰ）１のアミノ酸配列を示す。
【００３３】
配列番号１５は、ライセニン関連タンパク質（ＬＲＰ）２のアミノ酸配列を示す。
【００３４】
配列番号１６は、ライセニン関連タンパク質（ＬＲＰ）３のアミノ酸配列を示す。
【００３５】
配列番号１７は、パラスポリン−２の活性化バージョンのアミノ酸配列を示す。全長タンパク質は、そのアミノ及びカルボキシ末端で開裂して、ポアを形成することができる活性化バージョンを形成する。
【００３６】
配列番号１８は、Ｄｄａ  １９９３のアミノ酸配列を示す。
【００３７】
配列番号１９〜２４は、実施例で使用されるポリヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
開示される生成物及び方法の異なる適用が、当該技術分野における特定の必要性に適合され得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定的であることは意図されないことも理解されたい。
【００３９】
さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「変異体モノマー（ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｏｎｏｍｅｒ）」への言及は「変異モノマー（ｍｕｔａｎｔ  ｍｏｎｏｍｅｒｓ）」を含み、「置換」への言及は２つ以上のそのような置換を含み、「ポア」への言及は２つ以上のそのようなポアが含まれ、ポリヌクレオチドへの言及は２つ以上のそのようなポリヌクレオチド等を含む。
【００４０】
本明細書において、特定の位置における異なるアミノ酸が記号「／」によって分けられている場合、それらの記号「／」は、「または」を意味する。例えば、Ｐ１０８Ｒ／ＫはＰ１０８ＲまたはＰ１０８Ｋを意味する。異なる位置または異なる置換が記号「／」によって分離されている本明細書では、記号「／」は「及び」を意味する。例えば、Ｅ９４／Ｐ１０８はＥ９４及びＰ１０８を意味し、Ｅ９４Ｄ／Ｐ１０８ＫはＥ９４Ｄ及びＰ１０８Ｋを意味する。
【００４１】
上記または下記の本明細書に引用される全ての出版物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
変異体ライセニンモノマー
一態様において、本発明は変異体ライセニンモノマーを提供する。変異体ライセニンモノマーを使用して、本発明のポアを形成することができる。変異体ライセニンモノマーは、その配列が野生型ライセニンモノマーの配列（例えば、配列番号２、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６）と異なるモノマーである。変異体ライセニンモノマーは、典型的には、本発明の他のモノマーまたはライセニンからの他のモノマーまたはライセニン由来のモノマーの存在下でポアを形成する能力を保持する。したがって、変異体モノマーは、典型的には、ポアを形成することができる。変異体モノマーのポアを形成する能力を確認するための方法は、当該技術分野で周知であり、実施例で説明される。例えば、ポアの形成は電気生理学によって決定される。ポアは、典型的には、例えば、脂質膜またはブロックコポリマー膜であり得る膜に挿入される。電気的または光学的測定値は、単一のライセニンポア、例えば膜に挿入された本発明の１つ以上のモノマーを含むポアから得ることができる。電位差が膜にわたって印加され、膜を通る電流が検出され得る。電流の流れは、電気的または光学的手段等の任意の好適な方法によって検出され得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質、ＤＮＡ、燃料（例えば、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ）プレミックスを付加すること、電位差（例えば、１８０ｍＶ）を印加すること、及びポアを通る電流の流れを監視することによって、ポリヌクレオチド、好ましくは一本鎖ポリヌクレオチドを転位させるポアの能力を決定することができ、ポリヌクレオチド結合タンパク質によって制御されるＤＮＡの動きを検出する。
【００４３】
変異体モノマーは、ポアに存在する場合、ポリヌクレオチドと相互作用する変化した能力を有する。したがって、１つ以上の変異体モノマーを含むポアは、改善されたヌクレオチド読取り特性、例えば、（１）改善されたポリヌクレオチド捕捉及び（２）改善されたポリヌクレオチド認識または識別を掲示する。とりわけ、変異体モノマーから構成されたポアは、野生型よりも容易にヌクレオチド及びポリヌクレオチドを捕捉する。さらに、変異体モノマーから構成されたポアは、異なるヌクレオチド間の識別を容易にする電流範囲の増加、及びシグナル対ノイズ比を増加させる状態の変動の低下を提示する。さらに、変異体から構成されたポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間の、電流に寄与するヌクレオチドの数は減少する。これは、ポアを通ってポリヌクレオチドが移動する間に認められた電流と、ポリヌクレオチドとの間の直接的な関係性を特定することを容易にする。変異体の改良されたヌクレオチド読取り特性は、５つの主なメカニズム、すなわち：
・立体構造（アミノ酸残基のサイズの増加または減少）、
・電荷（例えば、負電荷の導入または除去、及び／または正電荷の導入または除去）、
・水素結合（例えば、塩基対に水素結合できるアミノ酸を導入する）、
・ｐｉスタッキング（例えば、非局在化電子ｐｉ系を介して相互作用するアミノ酸を導入する）、及び／または
・ポアの構造の変化（例えば、バレルまたはチャネルのサイズを増加させるアミノ酸の導入）における変化を介して達成される。
【００４４】
これらの５つのメカニズムの任意の１つ以上が、本発明の変異体モノマーから形成されたポアの改善された特性を担う可能性がある。例えば、本発明の変異体モノマーを含むポアは、変化した立体構造、変化した水素結合、及び変化した構造の結果として、改善されたヌクレオチド読取り特性を掲示し得る。
【００４５】
本発明の変異体モノマーは、配列番号２に示される配列のバリアントを含む。配列番号２は、ライセニンモノマーの野生型配列である。配列番号２のバリアントは、配列番号２のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。典型的には、バリアントは、ポアを形成するその能力を保持する。
【００４６】
Ｓ８０、Ｔ１０６、Ｔ１０４における置換を含む変異体モノマーのうちの１つ以上を含むポアは、改善されたポリヌクレオチド捕捉を掲示する。そのような置換の特定の例として、Ｓ８０Ｋ／Ｒ、Ｔ１０４Ｒ／Ｋ、及びＴ１０６Ｒ／Ｋが挙げられる。これらの位置のいずれか１つ以上、例えば２、３、４、または５で、アミノ酸側鎖の正電荷を増加させるこれらの位置における他の置換を使用して、変異体モノマーを含むポアの特性を改善し、ポアまたはＥ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇのような他の捕捉増強変異を含む変異体モノマーを含む野生型ポア、例えばそれらの変異体のみを含む変異体モノマーまたは以下の変異体、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを含む変異体モノマーを含むポアと比較して、すなわちポリヌクレオチドの捕捉を改善することができる。典型的には、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６ＧまたはＥ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇのような他の変異を含むポアについて改善が決定される場合、それらの変異体はまた、試験されている変異体モノマー中に存在し、すなわち変異体または変異体の組み合わせの効果（複数可）が、試験位置（複数可）以外で試験されるモノマー／ポアと同一であるベースラインモノマー／ポアについて決定される。変異体モノマーはまたは対照モノマーを含むポアの特性は、ヘテロオリゴマーポア、またはより好ましくはホモオリゴマーポアを使用して決定することができる。変異の好ましい組み合わせの例は、本明細書を通して、例えば表９に説明されている。
【００４７】
Ｄ３５、Ｋ３７、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｅ７６、Ｓ７８、Ｓ８２、Ｖ８８、Ｓ８９、Ｍ９０、Ｔ９１、Ｅ９２、Ｅ９４、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｖ１００、Ｔ１０４における置換を含む変異体モノマーのうちの１つ以上を含むポアは、改善されたポリヌクレオチド認識または識別を掲示する。そのような置換の具体的な例として、Ｄ３５Ｎ、Ｋ３７Ｎ／Ｓ、Ｋ４５Ｒ／Ｋ／Ｄ／Ｔ／Ｙ／Ｎ、Ｖ４７Ｋ／Ｒ、Ｓ４９Ｋ／Ｒ／Ｌ、Ｔ５１ＫＥ７６Ｓ／Ｎ、Ｓ７８Ｎ、Ｓ８２Ｎ、Ｖ８８Ｉ、Ｓ８９Ｑ、Ｍ９０Ｉ／Ａ、Ｔ９１Ｓ、Ｅ９２Ｄ／Ｅ、Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｎ、Ｙ９６Ｄ、Ｓ９８Ｑ、Ｖ１００Ｓ、及びＴ１０４Ｋが挙げられる。これらの変異は、それぞれ、表９に説明されるように、ノイズを減少させ、電流範囲を増大させ、及び／またはチャネル開閉を減少させ得る。これらの例示的な変異体のうちの任意の１つ以上と同じ様式でアミノ酸側鎖のサイズを増加または減少させる、電荷を増加または減少させる、同じ水素結合形成をもたらす、及び／またはｐｉスタッキングに影響を及ぼす他の変異が、配列番号２において特定された位置または配列番号２のバリアントにおける対応する位置になされてもよい。変異は、個々にまたは組み合わせて導入され得る。例えば、これらの位置の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８は変異されて、変異体モノマーを含むポアの特性を改善、すなわちシグナル対ノイズを改善し得、野生型ポア、変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、及び／または変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇのそれらの変異のみを含むモノマーのような、変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２ＱＥ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを含む変異体モノマーを含むポアと比較して、ポリヌクレオチド認識または識別が改善されるように、範囲の増加、及び／またはチャネル開閉を減少させる。典型的には、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ、またはＥ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇのような他の変異を含むポアについて改善が決定される場合、それらの変異体はまた、試験されている変異体モノマー中に存在し、すなわち変異体または変異体の組み合わせの効果（複数可）が、試験位置（複数可）以外で試験されるモノマー／ポアと同一であるベースラインモノマー／ポアについて決定される。変異体モノマーまたは対照モノマーを含むポアの特性は、ヘテロオリゴマーポアまたはより好ましくはホモオリゴマーポアを使用して決定することができる。変異の好ましい組み合わせの例は、本明細書を通して、例えば表９に説明されている。
【００４８】
Ｅ９４及び／またはＹ９６における置換を含む変異体モノマーのうちの１つ以上を含むポアは、野生型ポアまたは変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２ＱＥ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを含む変異体モノマーを含むポアと比較して、ポリヌクレオチドがポアを通って移動する間に電流に寄与するヌクレオチドの数を減少させ得る。例えば、置換Ｙ９６Ｄ／Ｅは、好ましくはＥ９４Ｑ／Ｄと組み合わせて、読取りヘッドのサイズを減少させることができる。野生型ポアまたは変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２ＱＥ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを含む変異体モノマーを含むポアと比較して、ポリヌクレオチドがポアを通って移動する間に電流に寄与するヌクレオチドの数の減少は、ポアのバレルの一部を形成するモノマーの２つのベータストランドの各々から、すなわち本明細書に説明されるような、配列番号２のアミノ酸３４〜６５及び７４〜１０７に対応する位置であり、アミノ酸（典型的には、ポアの内腔及びポアの内腔から離れて面する隣接アミノ酸に存在する）の数さえ欠失させることによって達成し得る。
【００４９】
本発明の修飾
本発明は、ライセニンポアにおけるバレルの構造に寄与するベータシートのアミノ酸配列が野生型ライセニンと比較し、当該技術分野、例えば、ＷＯ２０１３／１５３３５９に開示されているライセニン変異体と比較して改変される、変異体ライセニンモノマーを提供する。本発明の修飾は、配列番号２のアミノ酸３４〜１０７、特に配列番号２のアミノ酸３４〜６５、及び７４〜１０７に対応するライセニンモノマーの領域にある。ＬＲ１、ＬＲ２、及びＬＲ３のモノマーの対応する領域は、図８のアラインメントに示される。
【００５０】
本発明は、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが例えば２〜２２、３〜２０、４〜１５、５〜１０、６、７、８、または９等の、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｋ１１２、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む。バリアントは、任意の数及び位置の任意の組み合わせにおける修飾を含み得る。一態様において、修飾は、アミノ酸の置換、欠失、または付加であり得、好ましくは、置換または欠失変異である。好ましい修飾は、「更なる修飾」という見出しの下で以下に議論される。変異体ライセニンモノマーは、配列番号２の他の位置における修飾を含み得る。例えば、２〜２０、３〜１５、４〜１０、または６〜８といった本発明の変異体のうちの１つ以上に加えて、変異体ライセニンモノマーは、２〜２０、３〜１５、４〜１０、または６〜８といった、当該技術分野、例えばＷＯ２０１３／１５３３５９に説明される、配列番号２の配列における１つ以上のアミノ酸置換または欠失を有し得る。
【００５１】
バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｔ９１、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、及びＫ１１２のうちの１つ以上における修飾を含む。バリアントは、位置の任意の数及び任意の組み合わせにおける修飾を有してもよい。修飾は、好ましくは、セリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）による置換である。バリアントは、好ましくは、置換、Ｔ９１Ｓ、Ｖ９５Ｓ、Ｙ９６Ｓ、Ｓ９８Ｑ、Ｋ９９Ｓ、Ｖ１００Ｓ、Ｉ１０１Ｓ、及びＫ１１２Ｓのうちの１つ以上を含む。バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。
【００５２】
バリアントは、好ましくは、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む。バリアントは、任意の数及び位置の任意の組み合わせにおける修飾を含み得る。修飾は、好ましくは、トリプトファン（Ｗ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）、スレオニン（Ｔ）、チロシン）、ロイシン（Ｌ）、またはイソロイシン（Ｉ）との置換である。バリアントは、好ましくは、置換、Ｋ３７Ｎ／Ｗ／Ｓ／Ｑ、Ｇ４３Ｋ、Ｋ４５Ｄ／Ｒ／Ｎ／Ｑ／Ｔ／Ｙ、Ｖ４７Ｋ／Ｓ／Ｎ、Ｓ４９Ｋ／Ｌ、Ｔ５１Ｋ、Ｈ８３Ｓ／Ｋ、Ｖ８８Ｉ／Ｔ、Ｔ９１Ｋ、Ｔ９３Ｋ、Ｙ９６Ｄ、Ｓ９８Ｋ、Ｋ９９Ｑ／Ｌ、Ｐ１０８Ｋ／Ｒ、Ｐ１０９Ｋ、Ｔ１１０Ｋ／Ｒ、Ｓ１１１Ｋ、及びＴ１１４Ｋのうちの１つ以上を含む。バリアントは、好ましくは、以下の位置のうちの１つ以上における修飾を含む：
【表１】
2019520035.tif 000002
【００５３】
バリアントは、好ましくは、以下の置換のうちの１つ以上を含む：
【表２】
2019520035.tif 000003
【００５４】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下の置換のうちの１つ以上を含む：
Ｄ３５Ｎ／Ｓ、
Ｓ７４Ｋ／Ｒ、
Ｅ７６Ｄ／Ｎ、
Ｓ７８Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８０Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｅ８４Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ、
Ｅ８５Ｎ、
Ｓ８６Ｋ／Ｑ、
Ｓ８９Ｋ、
Ｍ９０Ｋ／Ｉ／Ａ、
Ｅ９２Ｄ／Ｓ、
Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ／Ｎ、
Ｅ１０２Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｓ、
Ｔ１０４Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｔ１０６Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｒ１１５Ｓ、
Ｑ１１７Ｓ、及び
Ｎ１１９Ｓ。
【００５５】
バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。バリアントは、好ましくは、Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｓ８６Ｑ、Ｅ９２Ｓ、Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ及びＳ８６Ｑ、Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ及びＥ９２Ｓ、Ｓ８６Ｑ及びＥ９２Ｓ、またはＥ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｓ８６Ｑ、及びＥ９２Ｓ等の、置換Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｇ／Ａ／Ｋ／Ｒ／Ｓ、Ｓ８６Ｑ、及びＥ９２Ｓのうちの１つ以上を含む。
【００５６】
バリアントは、好ましくは、以下の置換のうちの１つ以上を含む
Ｄ３５Ｎ／Ｓ、
Ｓ７４Ｋ／Ｒ、
Ｅ７６Ｄ／Ｎ、
Ｓ７８Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８０Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｒ／Ｎ／Ｑ、
Ｅ８４Ｒ／Ｋ／Ｎ／Ａ、
Ｅ８５Ｎ、
Ｓ８６Ｋ、
Ｓ８９Ｋ、
Ｍ９０Ｋ／Ｉ／Ａ、
Ｅ９２Ｄ、
Ｅ９４Ｄ／Ｑ／Ｋ／Ｎ、
Ｅ１０２Ｎ／Ｑ／Ｄ／Ｓ、
Ｔ１０４Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｔ１０６Ｒ／Ｋ／Ｑ、
Ｒ１１５Ｓ、
Ｑ１１７Ｓ、及び
Ｎ１１９Ｓ。
【００５７】
バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。
【００５８】
バリアントは、好ましくは、以下の置換のうちの１つ以上を含む
【表３】
2019520035.tif 000004
2019520035.tif 000005
【００５９】
バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。
【００６０】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下のうちの１つ以上における変異を含む
Ｄ３５／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｅ１０２／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｔ１０４／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ３７／Ｅ９４／Ｅ１０２／Ｔ１０６、
Ｇ４３／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｖ４７／Ｅ９２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｖ４７／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｓ４９／Ｅ９２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｓ４９／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｋ４５／Ｔ１０６、
Ｖ４７／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｖ４７／Ｖ８８／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｓ４９／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｔ５１／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６、
Ｓ７４／Ｅ９４、
Ｅ７６／Ｅ９４、
Ｓ７８／Ｅ９４、
Ｙ７９／Ｅ９４、
Ｓ８０／Ｅ９４、
Ｓ８２／Ｅ９４、
Ｓ８２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｈ８３／Ｅ９４、
Ｈ８３／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ８５／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｓ８６／Ｅ９４、
Ｖ８８／Ｍ９０／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｓ８９／Ｅ９４、
Ｍ９０／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｔ９１／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ９２／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｔ９３／Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｙ９６／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｓ９８／Ｋ９９／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｋ９９／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｅ１０２、
Ｅ９４／Ｔ１０４、
Ｅ９４／Ｔ１０６、
Ｅ９４／Ｐ１０８、
Ｅ９４／Ｐ１０９、
Ｅ９４／Ｔ１１０、
Ｅ９４／Ｓ１１１、
Ｅ９４／Ｔ１１４、
Ｅ９４／Ｒ１１５、
Ｅ９４／Ｑ１１７、及び
Ｅ９４／Ｅ１１９。
【００６１】
バリアントは、好ましくは、以下の置換のうちの１つ以上を含む：
Ｄ３５Ｎ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｄ３５Ｓ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ３７Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ１０２Ｎ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ３７Ｓ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ１０２Ｓ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ３７Ｓ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０４Ｋ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ３７Ｎ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ３７Ｗ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ３７Ｓ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｇ４３Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｎ／Ｖ４７Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｎ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｔ／Ｖ４７Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｎ／Ｓ４９Ｋ／Ｅ９４Ｎ／Ｅ９２Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｙ／Ｓ４９Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｄ／Ｅ９４Ｋ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｒ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｎ／Ｅ９４Ｎ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｋ４５Ｒ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｖ４７Ｓ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｖ４７Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｖ４７Ｎ／Ｖ８８Ｔ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｓ４９Ｌ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｔ５１Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｓ７４Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ７４Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ７６Ｄ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ７６Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ７６Ｓ／Ｅ９４Ｑ、
Ｅ７６Ｎ／Ｅ９４Ｑ、
Ｓ７８Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ７８Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ７８Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ７８Ｑ／Ｅ９４Ｑ、
Ｙ７９Ｓ／Ｅ９４Ｑ、
Ｓ８０Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ８０Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ８０Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ８０Ｑ／Ｅ９４Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ８２Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ８２Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｓ８２Ｑ／Ｅ９４Ｑ、
Ｓ８２Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｈ８３Ｓ／Ｅ９４Ｑ、
Ｈ８３Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ８５Ｎ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｓ８６Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｖ８８Ｉ／Ｍ９０Ａ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｓ８９Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｍ９０Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｍ９０Ｉ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｔ９１Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｑ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｔ９３Ｋ／Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９４Ｑ／Ｙ９６Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｓ９８Ｋ／Ｋ９９Ｌ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｋ９９Ｑ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｅ１０２Ｎ、
Ｅ９４Ｄ／Ｅ１０２Ｑ、
Ｅ９４Ｄ／Ｅ１０２Ｄ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０４Ｒ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０４Ｋ、
Ｅ９４Ｑ／Ｔ１０４Ｑ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｒ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９４Ｑ／Ｔ１０６Ｑ、
Ｅ９４Ｑ／Ｔ１０６Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｐ１０８Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｐ１０８Ｒ、
Ｅ９４Ｄ／Ｐ１０９Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１１０Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１１０Ｒ、
Ｅ９４Ｄ／Ｓ１１１Ｋ、
Ｅ９４Ｄ／Ｔ１１４Ｋ、
Ｅ９４Ｑ／Ｒ１１５Ｓ、
Ｅ９４Ｑ／Ｑ１１７Ｓ、及び
Ｅ９４Ｑ／Ｎ１１９Ｓ。
【００６２】
バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。
【００６３】
本発明はまた、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、モノマーがポアを形成することができ、バリアントが以下の置換のうちの１つ以上を含む
Ｅ８４Ｒ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ｋ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ｎ／Ｅ９４Ｄ、
Ｅ８４Ａ／Ｅ９４Ｑ、
Ｅ８４Ｋ／Ｅ９４Ｑ、及び
Ｅ９４Ｑ／Ｄ１２１Ｓ。
【００６４】
バリアントは、これらの置換の任意の数及び組み合わせを含んでもよい。
【００６５】
本発明の変異体モノマーは、好ましくは、上記で定義した修飾及び／または置換の任意の組み合わせを含む。例示的な組み合わせは、実施例に開示されている。
【００６６】
バレル欠失
別の実施形態において、配列番号２に示される配列のバリアントを含む変異体ライセニンモノマーを提供し、バリアント（ａ）において、配列番号２の３４位〜７０位の、またはそれらの位置に対応する、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２０のアミノ酸が欠失されているか、あるいは配列番号２の３４位〜７０位に対応する位置でアミノ酸残基が欠失されており、（ｂ）配列番号２の７１位〜１０７位の、またはそれらの位置に対応する、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、もしくは２０のアミノ酸が欠失されているか、あるいは配列番号２の７１位〜１０７位に対応する位置でアミノ酸残基が欠失されている。
【００６７】
３４位〜７０位から欠失したアミノ酸の数は、７１位〜１０７位から欠失したアミノ酸の数と異なっていてもよい。３４位〜７０位から欠失されたアミノ酸の数は、７１位〜１０７位から欠失されたアミノ酸の数と同じであることが好ましい。
【００６８】
３４位〜７０位のアミノ酸及び７１位〜１０７位のアミノ酸の任意の組み合わせは、欠失され得る。欠失されたアミノ酸の位置は、好ましくは、表１もしくは２の１行または表１及び／もしくは２の２行以上に示される。例えば、Ｄ３５及びＶ３４が３４位〜７０位から欠失している場合、Ｔ１０４及びＩ１０５は７１位〜１０７位から欠失され得る。同様に、Ｄ３５、Ｖ３４、Ｋ３７、及びＩ３８は、３４位〜７０位から欠失され得、Ｅ１０２、Ｈ１０３、Ｔ１０４、及びＩ１０５は、７１位〜１０７位から欠失され得る。これは、ポアのバレルを覆うベータシート構造の維持を確実にする。
【表４】
2019520035.tif 000006
2019520035.tif 000007
2019520035.tif 000008
【表５】
2019520035.tif 000009
2019520035.tif 000010
2019520035.tif 000011
【００６９】
３４位〜７０位及び７１位〜１０７位から欠失したアミノ酸は、表１または２の行にある必要はない。例えば、Ｄ３５及びＶ３４が３４位〜７０位から欠失している場合、Ｉ７２及びＥ７１は７１位〜１０７位から欠失され得る。
【００７０】
３４位〜７０位から欠失したアミノ酸は、好ましくは連続している。７１位〜１０７位から欠失したアミノ酸は、好ましくは連続している。３４位〜７０位から欠失したアミノ酸及び７１位〜１０７位から欠失したアミノ酸は、好ましくは連続している。
【００７１】
本発明は、好ましくは、以下の欠失した変異体モノマーを提供する：
（ｉ）Ｎ４６／Ｖ４７／Ｔ９１／Ｔ９２、または
（ｉｉ）Ｎ４８／Ｓ４９／Ｔ９１／Ｔ９２。
【００７２】
当業者は、本発明に従って欠失され得るアミノ酸の他の組み合わせを同定することができる。以下の議論では、配列番号２での残基の番号付けを使用する（すなわち、上記で定義したように任意のアミノ酸が欠失される前）。
【００７３】
バレル欠失バリアントはさらに、好ましくは、適切な場合、上記または下記の修飾及び／または置換のいずれかを含む。「適切な場合」とは、バレル欠失後に、位置が変異体モノマー中に依然として存在するかどうかを意味する。
【００７４】
化学修飾
別の態様において、本発明は、化学的に修飾された変異体ライセニンモノマーを提供する。変異体モノマーは、上記または下記に論じられるもののいずれかであり得る。その結果として、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｋ１１２、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む配列番号２のバリアントか、または上記に論じられるバレル欠失を含むバリアントのような、本発明の変異体モノマーは、下記に論じられるように本発明に従って化学的に修飾され得る。
【００７５】
以下に議論される更なる修飾のいずれかを含む変異体モノマーは、すなわちモノマーまたは好ましくはその領域の能力を変化させる配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域内に１つ以上の修飾を含み、ポリヌクレオチドと相互作用し、化学的に修飾され得る。これらの化学的に修飾されたモノマーは、本発明の修飾を含む必要はなく、すなわち、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｋ１１２、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む必要がない。化学的に修飾された変異体モノマーは、好ましくは、配列番号２の以下の位置、（ａ）Ｅ８４、Ｅ８５、Ｅ９２、Ｅ９７、及びＤ１２６、（ｂ）Ｅ８５、Ｅ９７、及びＤ１２６、または（ｃ）Ｅ８４及びＥ９２、のうちの１つ以上における置換を含む、配列番号２のバリアントを含む。以下に議論される置換の任意の数及び組み合わせを行うことができる。
【００７６】
変異体モノマーは、モノマーから形成されるポアのバレルまたはチャネルの直径が減少または狭められるような任意の方法で化学的に修飾されることができる。これは、以下により詳細に論じられる。
【００７７】
化学修飾は、化学分子が、好ましくは、変異体モノマーに共有結合されるようなものである。化学分子は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して変異体モノマーと共有結合され得る。化学分子は、典型的には、化学結合を介して結合される。
【００７８】
変異体モノマーは、好ましくは、１つ以上のシステインへの分子の結合（システイン結合）、１つ以上のリジンへの分子の結合、１つ以上の非天然型アミノ酸への分子の結合、またはエピトープの酵素修飾によって化学的に修飾される。化学修飾剤がシステイン結合を介して結合している場合、１つ以上のシステインは、好ましくは、置換によって変異体モノマーに導入されている。そのような修飾を実施するための好適な方法は、当該技術分野で周知である。好適な非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）及びＬｉｕ  Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｐ．Ｇ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７９，４１３−４４４の図１中のアミノ酸番号１〜７１のうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。
【００７９】
変異体モノマーは、任意の位置または部位におけるモノマーから形成されたポアのバレルの直径を減少または狭める効果を有する、任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。例えば、変異体モノマーは、（ｉ）４−フェニルアゾマレイナニル、１．Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミド、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、１．３−マレイミドプロピオン酸、１．１−４アミノフェニル−１Ｈ−ピロール，２，５，ジオン、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルマレイミド、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド、３−マレイミド−プロキシル、Ｎ−（４−クロロフェニル）マレイミド、１−［４−（ジメチルアミノ）−３，５−ジニトロフェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｎ−［４−（２−ベンズイミダゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−［４−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−（１−ナフチル）−マレイミド、Ｎ−（２，４−キシリル）マレイミド、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）マレイミド、Ｎ−（３−クロロ−パラ−トリル）−マレイミド、１−（２−アミノ−エチル）−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、１−シクロペンチル−３−メチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−（３−アミノプロピル）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、３−メチル−１−［２−オキソ−２−（ピペラジン−１−イル）エチル］−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、１−ベンジル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、３−メチル−１−（３，３，３−トリフルオロプロピル）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−［４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオントリフルオロ酢酸、ＳＭＩＬＥＳ  Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＣ＝２Ｃ＝ＣＮ＝ＣＣ２、ＳＭＩＬＥＳ  Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＮ２ＣＣＮＣＣ２、１−ベンジル−３−メチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−２，５−ジヒドロ１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｎ−（４−フェノキシフェニル）マレイミド、Ｎ−（４−ニトロフェニル）マレイミド等のマレイミド、（ｉｉ）３−（２−ヨードアセトアミド）−プロキシル、Ｎ−（シクロプロピルメチル）−２−ヨードアセトアミド、２−ヨード−Ｎ−（２−フェニルエチル）アセトアミド、２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミド、Ｎ−（４−アセチルフェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（４−（アミノスルホニル）フェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（２，６−ジエチルフェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（２−ベンゾイル−４−クロロフェニル）−２−ヨードアセトアミド等のヨードセトアミド、（ｉｉｉ）Ｎ−（４−（アセチルアミノ）フェニル）−２−ブロモアセトアミド、Ｎ−（２−アセチルフェニル）−２−ブロモアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（２−シアノフェニル）アセトアミド、２−��ロモ−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アセトアミド、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−２−ブロモアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−メチルブタンアミド、Ｎ−ベンジル−２−ブロモ−Ｎ−フェニルプロピオンアミド、Ｎ−（２−ブロモ−ブチリル）−４−クロロ−ベンゼンスルホンアミド、２−ブロモ−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−フェネチル−アセトアミド，２−アダマンタン−１−イル−２−ブロモ−Ｎ−シクロヘキシル−アセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（２−メチルフェニル）ブタンアミド、モノブロモアセトアニリド等のブロモアセトアミド、（ｉｖ）アルドリチオール−２、アルドリチオール−４、イソプロピルジスルフィ、１−（イソブチルジスルファニル）−２−メチルプロパン、ジベンジルジスルフィド、４−アミノフェニルジスルフィド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ等のジスルフィド、及び（ｖ）４−フェニルチアゾール−２−チオール、プルパルド、５，６，７，８−テトラヒドロ−キナゾリン−２−チオール等のチオール、の結合によって化学的に修飾され得る。
【００８０】
変異体モノマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、核酸、例えばＤＮＡ、色素、フルオロフォア、または発色団の結合によって化学的に修飾され得る。いくつかの実施形態において、変異体モノマーは、モノマーを含むポアと、標的分析物、標的ヌクレオチド、または標的ポリヌクレオチドとの間の相互作用を容易にする分子アダプターによって化学的に修飾される。アダプターの存在は、ポア及びヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのホスト−ゲストケミストリーを改善し、それにより変異体モノマーから形成されたポアのシークエンシング能力を改善する。
【００８１】
化学的に修飾された変異体モノマーは、好ましくは、配列番号２に示される配列のバリアントを含む。バリアントは以下に定義される。バリアントは、典型的には、１つ以上の残基がシステイン、リジン、または非天然アミノ酸で置き換えられている１つ以上の置換を含む。非天然アミノ酸には、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）、４−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−アセトアセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−アリル−Ｌ−チロシン、３−（フェニルセラニル）−Ｌ−アラニン、Ｏ−２−プロピン−１−イル−Ｌ−チロシン、４−（ジヒドロキシボリル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−［（エチルスルファニル）カルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−４−［（プロパン−２−イルスルファニル）カルボニル］フェニル；プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−４−［（２−アミノ−３−スルファニルプロパノイル）アミノ］フェニル；プロパン酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−（トリフルオロメチル）チロシン、４−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヒドロキシ−Ｌ−チロシン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、４−イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、３−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン、４−フェニル−Ｌ−フェニルアラニン、（２Ｓ）−２−アミノ−３−（ナフタレン−２−イルアミノ）プロパン酸、６−（メチルスルファニル）ノルロイシン、６−オキソ−Ｌ−リジン、Ｄ−チロシン、（２Ｒ）−２−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸、（２Ｒ）−２−アンモニオオクタノエート３−（２，２’−ビピリジン−５−イル）−Ｄ−アラニン、２−アミノ−３−（８−ヒドロキシ−３−キノリル）プロパン酸、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−（２−ニトロベンジル）システイン、（２Ｒ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）スルファニル］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−３−［（２−ニトロベンジル）オキシ］プロパン酸、Ｏ−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）−Ｌ−セリン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（［（２−ニトロベンジル）オキシ］カルボニル；アミノ）ヘキサン酸、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、２−ニトロフェニルアラニン、４−［（Ｅ）−フェニルジアゼニル］−Ｌ−フェニルアラニン、４−［３−（トリフルオロメチル）−３Ｈ−ジアジレン−３−イル］−Ｄ−フェニルアラニン、２−アミノ−３−［［５−（ジメチルアミノ）−１−ハフチル］スルホニルアミノ］プロパン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−４−（７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）ブタン酸、（２Ｓ）−３−［（６−アセチルナフタレン−２−イル）アミノ］−２−アミノプロパン酸、４−（カルボキシメチル）フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、Ｏ−スルホ−Ｌ−チロシン、（２Ｒ）−６−アセトアミド−２−アンモニオヘキサノエート、１−メチルヒスチジン、２−アミノノナン酸、２−アミノデカン酸、Ｌ−ホモシステイン、５−スルファニルノルバリン、６−スルファニル−Ｌ−ノルロイシン、５−（メチルスルファニル）−Ｌ−ノルバリン、Ｎ６−［（２Ｒ，３Ｒ）−３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−イル］カルボニル；−Ｌ−リジン、Ｎ６−［（ベンジルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（シクロペンチルカルボニル）アミノ］ヘキサン酸、Ｎ６−［（シクロペンチルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（２Ｒ）−テトラヒドロフラン−２−イルカルボニル］アミノ；ヘキサン酸、（２Ｓ）−２−アミノ−８−［（２Ｒ，３Ｓ）−３−エチニルテトラヒドロフラン−２−イル］−８−オキソオクタン酸、Ｎ６−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リジン、（２Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−（［（２−メチル−２−プロパニル）オキシ］カルボニル；アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−［（アリルオキシ）カルボニル］リジン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−（［（２−アジドベンジル）オキシ］カルボニル；アミノ）ヘキサン酸、Ｎ６−Ｌ−プロリル−Ｌ−リジン、（２Ｓ）−２−アミノ−６−［（プロパ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル］アミノ；ヘキサン酸、及びＮ６−［（２−アジドエトキシ）カルボニル］−Ｌ−リジンが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）である。
【００８２】
変異体モノマーは、配列番号２：Ｋ３７、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５５、Ｓ８６、Ｅ９２、及びＥ９４のいずれかの位置での任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。より好ましくは、変異体モノマーは、位置Ｅ９２及び／またはＥ９４で、任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。一実施形態において、変異体モノマーは、これらの位置における１つ以上のシステイン（システイン結合）、１つ以上のリジン、または１つ以上の非天然アミノ酸への分子の結合によって化学的に修飾される。変異体モノマーは、好ましくは、Ｋ３７Ｃ、Ｖ４７Ｃ、Ｓ４９Ｃ、Ｔ５５Ｃ、Ｓ８６Ｃ、Ｅ９２Ｃ、及びＥ９４Ｃのうちの１つ以上を含む、配列番号２に示される配列のバリアントを含み、１つ以上の分子が１つ以上の導入されたシステインに結合している。変異体モノマーは、より好ましくは、Ｅ９２Ｃ及び／またはＥ９４Ｃを含む配列番号２に示される配列のバリアントを含み、１つ以上の分子が導入されたシステイン（複数可）に結合している。これらの２つの好ましい実施形態のそれぞれにおいて、１つ以上のシステイン（Ｃｓ）は、１つ以上のリジンまたは１つ以上のＦａｚのような１つ以上の非天然アミノ酸で置き換えられ得る。
【００８３】
システイン残基の反応性は、隣接する残基の修飾によって増強され得る。例えば、側方のアルギニン、ヒスチジン、またはリジン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａを、より反応性のＳ−基のものに変えることになる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが結合する前に、変異体モノマーの１つ以上のシステイン残基と反応され得る。
【００８４】
分子は、変異体モノマーと直接結合してもよい。分子は、好ましくは、化学架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体モノマーに結合している。好適な化学架橋剤は、当該技術分野で周知である。好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタナノエート（ｏｃｔａｎａｎｏａｔｅ）が含まれる。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）である。典型的には、分子は、分子／架橋剤複合体が変異体モノマーと共有結合する前に二官能性架橋剤と共有結合しているが、二官能性架橋剤／モノマー複合体が分子に結合する前に二官能性架橋剤をモノマーと共有結合させることも可能である。
【００８５】
リンカーは、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好適なリンカーには、ヨードアセトアミド系及びマレイミド系リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の化学的に修飾された変異体モノマーを含むポアの利点は、以下でより詳細に論じられる。
【００８７】
本発明に従って行われ得るさらなる化学修飾は、以下に論じられる。
【００８８】
さらなる修飾
上記で論じられる変異体モノマーのいずれかは、適切な場合（すなわち、関連するアミノ位が変異体モノマーに残っているか、または別のアミノ酸で修飾／置換されていない場合）配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域内でさらに修飾を有する。この領域の少なくとも一部は、典型的には、ライセニンの膜貫通領域に寄与する。この領域の少なくとも一部は、典型的には、ライセニンのバレルまたはチャネルに寄与する。この領域の少なくとも一部は、典型的には、ライセニンの内壁また内部に寄与する。
【００８９】
ライセニンの膜貫通領域は、配列番号２の４４位〜６７位として同定されている（Ｄｅ  Ｃｏｌｂｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１２；２０：１４９８−１５０７）。
【００９０】
バリアントは、好ましくは、モノマー、または好ましくは領域の能力を変化させて、ポリヌクレオチドと相互作用する配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域内に１つ以上の修飾を含む。モノマーとポリヌクレオチドとの間の相互作用は増減してもよい。モノマーとポリヌクレオチドとの間の増加した相互作用は、例えば、変異体モノマーを含むポアによるポリヌクレオチドの捕捉を容易にするであろう。領域とポリヌクレオチドとの間の減少した相互作用は、例えば、ポリヌクレオチドの認識または識別を改善するであろう。ポリヌクレオチドの認識または識別は、変異体モノマーを含むポアの状態の分散（シグナル対ノイズ比を増加させる）を減少させること及び／または電流に寄与するポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数を、ポリヌクレオチドが変異体モノマーを含むポアを通って移動する間に減少させることによって改善され得る。
【００９１】
ポリヌクレオチドと相互作用するモノマーの能力は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。モノマーは、例えば、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π（π）−カチオン相互作用、または静電気力等の非共有相互作用によって、いずれかの方法でポリヌクレオチドと相互作用することができる。例えば、ポリヌクレオチドに結合する領域の能力は、従来の結合アッセイを用いて測定することができる。好適なアッセイには、蛍光ベースの結合アッセイ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、ポリヌクレオチドと相互作用する変異体モノマーのうちの１つ以上を含むポアの能力は、上記または下記で論じられる方法のいずれかを使用して決定することができる。好ましいアッセイは実施例に説明されている。
【００９２】
１つ以上の修飾は、配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域内でさらに行われ得る。１つ以上の修飾は、好ましくは、以下の領域、約４０位〜約１２５位、約５０位〜約１２０位、約６０位〜約１１０位、及び約７０位〜約１００位のうちの任意の１つ以内である。１つ以上の修飾がポリヌクレオチド捕捉を改善するために行われている場合、それらは、より好ましくは、以下の領域、約４４位〜約１０３位、約６８位〜約１０３位、約８４位〜約１０３位、約４４位〜約９７位、約６８位〜約９７位、または約８４位〜約９７位のうちのいずれか１つ以内で行われる。１つ以上の修飾が、ポリヌクレオチド認識または識別を改善するために行われている場合、それらは、より好ましくは、約４４位〜約１０９位、約４４位〜約９７位、または約４８位〜約８８位のうちのいずれか以内で行われる。領域は、好ましくは、配列番号２の約４４位〜約６７位である。
【００９３】
１つ以上の修飾がポリヌクレオチド認識または識別を改善することを意図される場合、それらは、好ましくは、ポリヌクレオチドの捕捉を改善するための１つ以上の修飾に加えて行われる。これにより、変異体モノマーから形成されたポアが効果的にポリヌクレオチドを捕捉し、以下に論じられるようにその配列を推定するなど、ポリヌクレオチドを特徴付けることを可能にする。
【００９４】
ポリヌクレオチドと相互作用する能力を変化させる、特にポリヌクレオチドを捕捉するその能力及び／または認識または識別する能力を改変するタンパク質ナノポアの修飾は、当技術分野で十分に文書化されている。例えば、そのような修飾は、ＷＯ２０１０／０３４０１８及びＷＯ２０１０／０５５３０７に開示されている。同様の修飾は、本発明に従ってライセニンモノマーに行われ得る。
【００９５】
１回、２回、５回、１０回、１５回、２０回、３０回、またはそれ以上の修飾といった任意の数の修飾を行うことができる。ポリヌクレオチドと相互作用するモノマーの能力が変化される限り、任意の修飾を行うことができる。好適な修飾には、アミノ酸置換、アミノ酸付加及びアミノ酸欠失が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の修飾は、好ましくは、１つ以上の置換である。これは、以下により詳細に論じられる。
【００９６】
１つ以上の修飾は、好ましくは、（ａ）モノマーの立体効果を変化させるか、または好ましくは領域の立体効果を変化させる、（ｂ）モノマーの正味電荷を変化させるか、または好ましくは領域の正味電荷を変化させる、（ｃ）モノマーの能力を変化させるか、または好ましくは領域の能力を変化させて、ポリヌクレオチドと水素結合する、（ｄ）非局在化電子ｐｉ系を介して相互作用する化学基を導入または除去する、及び／または（ｅ）モノマーの構造を変化させるか、または好ましくは領域の構造を変化させる。１つ以上の修飾は、より好ましくは、（ａ）及び（ｂ）；（ａ）及び（ｃ）；（ａ）及び（ｄ）；（ａ）及び（ｅ）；（ｂ）及び（ｃ）；（ｂ）及び（ｄ）；（ｂ）及び（ｅ）；（ｃ）及び（ｄ）；（ｃ）及び（ｅ）；（ｄ）及び（ｅ）、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）；（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、及び（ｄ）；（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）；（ａ）、（ｄ）、及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）、及び（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）；ならびに（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）のような（ａ）〜（ｅ）の任意の組み合わせをもたらす。
【００９７】
（ａ）については、モノマーの立体効果を増減させることができる。立体効果を変化させる任意の方法を本発明に従って使用することができる。フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはヒスチジン（Ｈ）などの嵩高い残基の導入は、モノマーの立体構造を増加させる。１つ以上の修飾は、好ましくは、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上の導入である。Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨの任意の組み合わせは、導入されてもよい。Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上は、付加によって導入されてもよい。Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上は、好ましくは置換によって導入される。このような残基の導入のための好適な位置は、以下でより詳細に論じられる。
【００９８】
フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはヒスチジン（Ｈ）のような嵩高い残基の除去は、逆にモノマーの立体構造を減少させる。１つ以上の修飾は、好ましくは、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨの１つ以上の除去である。Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨの任意の組み合わせは、除去されてもよい。Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上は、欠失によって除去され得る。セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、及びバリン（Ｖ）のような、より小さな側基を有する残基で置換することにより、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＨの１つ以上が好ましくは除去される。
【００９９】
（ｂ）については、正味の電荷は任意の方法で変化され得る。正味の正電荷は好ましくは増加または減少される。正味の正電荷は、任意の様式で増加され得る。正味の正電荷は、好ましくは、１つ以上の正に荷電したアミノ酸を導入することによって、好ましくは置換によって及び／または１つ以上の負電荷を中和することによって、好ましくは置換によって、増加され得る。
【０１００】
正味の正電荷は、好ましくは、１つ以上の正に荷電したアミノ酸を導入することによって増加される。１つ以上の正に荷電したアミノ酸は、付加によって導入され得る。１つ以上の正に荷電したアミノ酸は、好ましくは、置換によって導入される。正に荷電したアミノ酸は、正味の正電荷を有するアミノ酸である。正に荷電したアミノ酸（複数可）は、天然型であっても非天然型であってもよい。正に荷電したアミノ酸は、合成であっても修飾されていてもよい。例えば、正味の正電荷を有する修飾アミノ酸は、本発明における使用のために特別に設計され得る。アミノ酸へのいくつかの異なる種類の修飾が当該技術分野で周知である。
【０１０１】
好ましい天然型の正に荷電したアミノ酸には、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。１つ以上の修飾は、好ましくは、Ｈ、Ｋ、及びＲのうちの１つ以上の導入である。Ｈ、Ｋ、及びＲの任意の数及び組み合わせは、導入され得る。Ｈ、Ｋ、及びＲのうちの１つ以上は、付加によって導入されてもよい。Ｈ、Ｋ、及びＲのうちの１つ以上は、好ましくは、置換によって導入される。このような残基の導入のための好適な位置は、以下でより詳細に論じられる。
【０１０２】
天然型アミノ酸を付加または置換するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、メチオニン（Ｍ）は、モノマーをコードするポリヌクレオチドの関連する位置においてメチオニンのコドン（ＡＴＧ）をアルギニンのコドン（ＡＧＡ）に置き換えることによってアルギニン（Ｒ）で置換され得る。ポリヌクレオチドは、次いで、以下に論じられるように発現され得る。
【０１０３】
非天然型アミノ酸を付加または置換するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、非天然型アミノ酸は、ポアを発現させるために使用されるＩＶＴＴシステム中に合成アミノアシル−ｔＲＮＡを含むことによって導入され得る。代替的には、それらは、特定のアミノ酸について栄養要求性であるＥ．ｃｏｌｉ中で、それらの特定のアミノ酸の合成（すなわち、非天然型）類似体の存在下で、モノマーを発現させることによって導入され得る。それらはまた、ポアが部分的ペプチド合成を使用して生成される場合、ネイキッドライゲーション（ｎａｋｅｄ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって生成され得る。
【０１０４】
いずれのアミノ酸も正に荷電したアミノ酸で置換され得る。１つ以上の荷電していないアミノ酸、非極性アミノ酸及び／または芳香族アミノ酸は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸で置換されていてもよい。荷電していないアミノ酸は正味の電荷を有さない。好適な荷電していないアミノ酸には、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）が挙げられるが、これらに限定されない。非極性アミノ酸は、非極性側鎖を有する。好適な非極性アミノ酸には、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、及びバリン（Ｖ）が挙げられるが、これらに限定されない。芳香族アミノ酸は、芳香族側鎖を有する。好適な芳香族アミノ酸には、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）及び、チロシン（Ｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、１つ以上の負に荷電したアミノ酸は、１つ以上の正に荷電したアミノ酸で置換されている。好適な負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
好ましい導入には、ＫによるＥの置換、ＲによるＭの置換、ＨによるＭの置換、ＫによるＭ置換、ＲによるＤの置換、ＨによるＤの置換、ＫによるＤの置換、ＲによるＥの置換、ＨによるＥ置換、ＲによるＮの置換、ＲによるＴの置換、及びＲによるＧの置換が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましくは、ＥはＫで置換されている。
【０１０６】
任意の数の正に荷電したアミノ酸は、導入または置換され得る。例えば、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上の正に荷電したアミノ酸は、導入または置換され得る。
【０１０７】
正味の正電荷は、より好ましくは、１つ以上の負電荷を中和することによって増加される。１つ以上の負電荷は、１つ以上の負に荷電したアミノ酸を１つ以上の非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び／または芳香族アミノ酸で置換することによって中和され得る。負電荷の除去は、正味の正電荷を増加させる。非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び／または芳香族アミノ酸は、天然型または非天然型アミノ酸であり得る。それらは合成または修飾されていてもよい。好適な非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸は、上記に論じられる。好ましい置換には、ＱによるＥの置換、ＳによるＥの置換、ＡによるＥの置換、ＱによるＤの置換、ＮによるＥの置換、ＮによるＤの置換、ＧによるＤの置換、及びＳによるＤの置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び／または芳香族アミノ酸の任意の数及び組み合わせが置換され得る。例えば、１、２、５、１０、１５、２０、２５、または３０以上の非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び／または芳香族アミノ酸が置換されていてもよい。負に荷電したアミノ酸は、（１）非荷電アミノ酸、（２）非極性アミノ酸、（３）芳香族アミノ酸、（４）非荷電アミノ酸及び非極性アミノ酸、（５）非荷電アミノ酸及び芳香族アミノ酸、（５）非極性アミノ酸及び芳香族アミノ酸、または（６）非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸で置換されてもよい。
【０１０９】
１個以上の負電荷は、１、２、３、または４個のアミノ酸以内等、１個以上の負に荷電したアミノ酸に近いまたは隣接する１個以上の正に荷電したアミノ酸を導入することによって中和され得る。正及び負に荷電したアミノ酸の例は上記に論じられる。正に荷電したアミノ酸は、例えば置換によって、上記に論じられる任意の様式で導入され得る。
【０１１０】
正味の正電荷は、好ましくは、１つ以上の負に荷電したアミノ酸を導入及び／または１つ以上の正電荷を中和することによって減少される。これが行われる可能性のある方法は、正味の正電荷を増加させることに関して上記の議論から明らかであろう。正味の正電荷を増加させることに関して上記に論じられる全ての実施形態は、電荷が逆の方法で変化されることを除いて正味の正電荷を減少させることに等しく適用する。特に、１つ以上の正電荷は、好ましくは、１つ以上の正電荷アミノ酸を１つ以上の非荷電アミノ酸、非極性アミノ酸、及び／または芳香族アミノ酸で置換することによって、あるいは１、２、３、もしくは４つ以内に近いアミノ酸といった１つ以上の負に荷電したアミノ酸、または１つ以上の正に荷電したアミノ酸に隣接して導入することによって中和され得る。
【０１１１】
正味の負電荷は、好ましくは増加または減少される。正味の正電荷を増加または減少させることに関して上記に論じられる全ての上記の実施形態は、正味の負電荷をそれぞれ減少または増加させることに等しく適用する。
【０１１２】
（ｃ）については、水素結合に対するモノマーの能力は、任意の様式で変化され得る。セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）、またはヒスチジン（Ｈ）の導入は、モノマーの水素結合能力を増加させる。１つ以上の修飾は、好ましくは、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上の導入である。Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨの任意の組み合わせは、導入され得る。Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上は、付加によって導入されてもよい。Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、、及びＨのうちの１つ以上は、好ましくは、置換によって導入される。このような残基の導入のための好適な位置は、以下でより詳細に論じられる。
【０１１３】
セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、チロシン（Ｙ）、またはヒスチジン（Ｈ）の除去は、モノマーの水素結合能力を減少させる。１つ以上の修飾は、好ましくは、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上の除去である。Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨの任意の組み合わせは、除去され得る。Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上は、欠失によって除去され得る。アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、及びロイシン（Ｌ）等の、水素結合があまり良好でない他のアミノ酸で置換することによって、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、及びＨのうちの１つ以上が好ましくは除去される。
【０１１４】
（ｄ）については、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはヒスチジン（Ｈ）等の芳香族残基の導入は、モノマー中のｐｉスタッキングを増加させる。フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、またはヒスチジン（Ｈ）等の芳香族残基の除去もまた、モノマー中のｐｉスタッキングを減少させる。そのようなアミノ酸は、（ａ）を参照して上記に論じられるように導入または除去することができる。
【０１１５】
（ｅ）については、モノマーの構造を変化させる本発明に従って１つ以上の修正が行われ得る。例えば、１つ以上のループ領域を除去、短縮、または拡張することができる。これは、典型的には、ポリヌクレオチドのポアへの出入りを容易にする。１つ以上のループ領域は、ポアのシス側、ポアのトランス側、またはポアの両側にあってもよい。代替的には、ポアのアミノ末端及び／またはカルボキシ末端のうちの１つ以上の領域は、拡張されることができるか、または欠失されることができる。これは、典型的には、ポアのサイズ及び／または電荷を変化させる。
【０１１６】
特定のアミノ酸の導入が、２つ以上のメカニズムを介してポリヌクレオチドと相互作用するモノマーの能力を高めることは、上記の考察から明らかであろう。例えば、ＥをＨで置換することは、（ｂ）に従って正味の正電荷を（負電荷を中和することによって）増加させるだけでなく、（ｃ）に従ってモノマーの水素結合に対する能力も増加させるであろう。
【０１１７】
バリアントは、好ましくは、配列番号２の以下の位置、Ｍ４４、Ｎ４６、Ｎ４８、Ｅ５０、Ｒ５２、Ｈ５８、Ｄ６８、Ｆ７０、Ｅ７１、Ｓ７４、Ｅ７６、Ｓ７８、Ｙ７９、Ｓ８０、Ｈ８１、Ｓ８２、Ｅ８４、Ｅ８５、Ｓ８６、Ｑ８７、Ｓ８９、Ｍ９０、Ｅ９２、Ｅ９４、Ｅ９７、Ｅ１０２、Ｈ１０３、Ｔ１０４、Ｔ１０６、Ｒ１１５、Ｑ１１７、Ｎ１１９、Ｄ１２１、及びＤ１２６のうちの１つ以上における置換を含む。バリアントは、好ましくは、それらの位置のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４における置換を含む。バリアントは、好ましくは、配列番号２の以下の位置、Ｄ６８、Ｅ７１、Ｓ７４、Ｅ７６、Ｓ７８、Ｓ８０、Ｓ８２、Ｅ８４、Ｅ８５、Ｓ８６、Ｑ８７、Ｓ８９、Ｅ９２、Ｅ１０２、Ｔ１０４、Ｔ１０６、Ｒ１１５、Ｑ１１７、Ｎ１１９、及びＤ１２１のうちの１つ以上における置換を含む。バリアントは、好ましくは、これらの位置のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０における置換を含む。
【０１１８】
バリアントは、好ましくは、配列番号２の以下の位置、（ａ）Ｅ８４、Ｅ８５、Ｅ９２、Ｅ９７、及びＤ１２６、（ｂ）Ｅ８５、Ｅ９７、及びＤ１２６、または（ｃ）Ｅ８４及びＥ９２のうちの１つ以上における置換を含む。バリアントに置換されたアミノ酸は、天然に存在するまたは天然に存在しないその誘導体であってもよい。バリアントに置換されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であってもよい。上記に列挙される各位置は、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、またはアラニン（Ａ）であり得る。
【０１１９】
バリアントは、好ましくは、配列番号２の以下の変異のうちの少なくとも１つを含む：
（ａ）４４位のセリン（Ｓ）、
（ｂ）４６位のセリン（Ｓ）、
（ｃ）４８位のセリン（Ｓ）、
（ｄ）５２位のセリン（Ｓ）、
（ｅ）５８位のセリン（Ｓ）、
（ｆ）６８位のセリン（Ｓ）、
（ｇ）７０位のセリン（Ｓ）、
（ｈ）７１位のセリン（Ｓ）、
（ｉ）７６位のセリン（Ｓ）、
（ｊ）７９位のセリン（Ｓ）、
（ｋ）８１位のセリン（Ｓ）、
（ｌ）８４位のセリン（Ｓ）、アスパラギン酸（Ｄ）、またはグルタミン（Ｑ）、
（ｍ）８５位のセリン（Ｓ）またはリジン（Ｋ）、
（ｎ）８７位のセリン（Ｓ）、
（ｏ）９０位のセリン（Ｓ）、
（ｐ）９２位のアスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）、
（ｑ）９４位のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）、
（ｒ）９７位のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）、
（ｓ）１０２位のセリン（Ｓ）、
（ｔ）１０３位のセリン（Ｓ）、
（ｕ）１２１位のアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）、
（ｖ）５０位のセリン（Ｓ）、
（ｗ）９４位のアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）、
（ｘ）９７位のアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）、
（ｙ）１２１位のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）、
（ｚ）１２６位のアスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）、及び
（ａａ）１２８位のセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）。
【０１２０】
バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６，または２７個等の変異（ａ）〜（ａａ）の任意の数を含み得る。変異の好ましい組み合わせは、以下で論じられる。バリアントに導入されるアミノ酸は、天然型または非天然型のその誘導体であってもよい。バリアントに導入されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であってもよい。
【０１２１】
バリアントは、好ましくは、配列番号２の以下の変異のうちの少なくとも１つを含む：
（ａ）６８位のセリン（Ｓ）、
（ｂ）７１位のセリン（Ｓ）、
（ｃ）７６位のセリン（Ｓ）、
（ｄ）８４位のアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン（Ｑ）、
（ｅ）８５位のリジン（Ｋ）、
（ｆ）９２位のアスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）、
（ｇ）１０２位のセリン（Ｓ）、
（ｈ）１２１位のアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）、
（ｉ）５０位のセリン（Ｓ）、
（ｊ）９４位のアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）、
（ｋ）９７位のアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）、及び
（ｌ）１２６位のアスパラギン（Ｎ）またはグルタミン（Ｑ）またはグリシン（Ｇ）。
【０１２２】
バリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２の変異等の任意の数の変異（ａ）〜（ｌ）を含み得る。変異の好ましい組み合わせは、以下で論じられる。バリアントに導入されるアミノ酸は、天然型または非天然型のその誘導体であってもよい。バリアントに導入されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であってもよい。
【０１２３】
バリアントは、配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域外で１つ以上の追加の修飾を含むことができ、上記に論じられる領域中の修飾と組み合わせてポリヌクレオチドの捕獲を改善し及び／またはポリヌクレオチドの認識または識別を改善する。好適な修飾は、Ｄ３５、Ｅ１２８、Ｅ１３５、Ｅ１３４、及びＥ１６７のうちの１つ以上における置換を含むが、これらに限定されない。特に、位置１２８、１３５、１３４、及び１６７のうちの１つ以上でＥを置換することによる負電荷の除去は、ポリヌクレオチド捕獲を改善する。これらの位置の１つ以上でのＥは、上記に論じられる方法のいずれかで置換されてもよい。好ましくは、Ｅ１２８、Ｅ１３５、Ｅ１３４、及びＥ１６７の全てが上記に論じられるように置換される。Ｅは好ましくはＡで置換されている。換言すれば、バリアントは、好ましくは、Ｅ１２８Ａ、Ｅ１３５Ａ、Ｅ１３４Ａ、及びＥ１６７Ａのうちの１つ以上または全てを含む。別の好ましい置換はＤ３５Ｑである。
【０１２４】
好ましい実施形態において、バリアントは、配列番号２の以下の置換を含む：
ｉ．Ｅ８４Ｄ及びＥ８５Ｋのうちの、両方等の、１個以上、
ｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｉｉｉ．Ｅ９２Ｎ、Ｅ９４Ｎ、Ｅ９７Ｎ、Ｄ１２１Ｎ、及びＤ１２６Ｎのうちの、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｉｖ．Ｅ９２Ｎ、Ｅ９４Ｎ、Ｅ９７Ｎ、Ｄ１２１Ｎ、Ｄ１２６Ｎ、及びＥ１２８Ｎのうちの、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｖ．Ｅ７６Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｖｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ５０Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｖｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ７１Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｖｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ９４Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｉｘ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ１０２Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ１２８Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ１３５Ｓのうち２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＤ６８Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＤ１２１Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘｉｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＤ１３４Ｓのうちの、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘｖ．Ｅ８４Ｄ、Ｅ８５Ｋ、及びＥ９２Ｑのうちの、２もしくは３個等の、１個以上、
ｘｖｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１３５Ｓのうち１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｖｉｉ．Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９４Ｓ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｖｉｉｉ．Ｅ７６Ｓ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｉｘ．Ｅ７１Ｓ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｘ．Ｄ６８Ｓ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｘｉ．Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、もしくは４個等の、１個以上、
ｘｘｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｈ１０３Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｍ９０Ｓ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｉｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｑ８７Ｓ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｓ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｘｖｉ．Ｅ８４Ｓ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｘｖｉｉ．Ｈ８１Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｖｉｉｉ．Ｙ７９Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｉｘ．Ｆ７０Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｘ．Ｈ５８Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｘｉ．Ｒ５２Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｘｉｉ．Ｎ４８Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｘｉｉｉ．Ｎ４６Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｘｉｖ．Ｍ４４Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｘｘｘｖ．Ｅ９２Ｑ及びＥ９７Ｓのうちの、両方等の、１個以上、
ｘｘｘｖｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、及びＥ９７Ｓのうちの、１、２、３、もしくは４個等の、１個以上、
ｘｘｘｖｉｉ．Ｅ８４Ｑ及びＥ８５Ｋのうちの、両方等の、１個以上、
ｘｘｘｖｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、もしくは３個等の、１個以上、
ｘｘｘｉｘ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、もしくは４個等の、１個以上、
ｘｌ．Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、もしくは３個等の、１個以上、
ｘｌｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＤ１２６Ｇのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｌｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｌｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｌｉｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｌｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｌｖｉ．Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、
ｘｌｖｉｉ．Ｅ８４Ｄ、Ｅ８５Ｋ、及びＥ９２Ｑのうちの、１、２、もしくは３個等の、１個以上、
ｘｌｖｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＤ１２１Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｘｌｉｘ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＤ６８Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ１３５Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ１２８Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ１０２Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｉｉｉ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ９４Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｉｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ、及びＥ７１Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｖ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、Ｅ１６７Ａ及びＥ５０Ｓのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｖｉ．Ｅ７６Ｓ、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、５、６、もしくは７個等の、１個以上、
ｌｖｉｉ．Ｅ９２Ｎ、Ｅ９４Ｎ、Ｅ９７Ｎ、Ｄ１２１Ｎ、Ｄ１２６Ｎ、及びＥ１２８Ｎのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上、
ｌｖｉｉｉ．Ｅ９２Ｎ、Ｅ９４Ｎ、Ｅ９７Ｎ、Ｄ１２１Ｎ、及びＤ１２６Ｎのうちの、１、２、３、４、もしくは５個等の、１個以上、または
ｌｉｘ．Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａのうちの、１、２、３、４、５、もしくは６個等の、１個以上
【０１２５】
上記において、最初の文字は配列番号２のアミノ酸が置き換えられていることを示し、数字は配列番号２の位置であり、２番目の文字は最初のものが置換されるアミノ酸を指す。したがって、Ｅ８４Ｄは、８４位のグルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）で置換することを意味する。
【０１２６】
バリアントは、例えば１、２、３、４、５、６、または７の、ｉ〜ｌｉｘのうちのいずれか１つで任意の数の置換を含み得る。バリアントは、好ましくは、上記のｉ〜ｌｉｘのうちのいずれか１つに示される全ての置換を含む。
【０１２７】
好ましい実施形態において、バリアントは、上記のｉ〜ｘｖのうちのいずれか１つで置換を含む。バリアントは、例えば１、２、３、４、５、６、または７の、ｉ〜ｘｖのうちのいずれか１つで任意の数の置換を含み得る。バリアントは、好ましくは、上記のｉ〜ｘｖのうちのいずれか１つに示される全ての置換を含む。
【０１２８】
１つ以上の修飾が、ポリヌクレオチドを認識または識別するためのモノマーの能力を改善することが意図される場合、それらは、好ましくは、Ｅ８４Ｑ、Ｅ８５Ｋ、Ｅ９２Ｑ、Ｅ９７Ｓ、Ｄ１２６Ｇ、及びＥ１６７Ａ等のポリヌクレオチド捕捉を改善する上記に論じられる修飾に加えて行われる。
【０１２９】
同定された領域に対して行われた１つ以上の修飾は、領域中の１つ以上のアミノ酸の、ライセニンのホモログまたはパラログ中に対応する位置（複数可）に存在するアミノ酸による置換に関係し得る。ライセニンのホモログの４つの例は、配列番号１４〜１７に示される。そのような置換の利点は、ホモログモノマーもまたポアを形成するため、それらがポアを形成する変異体モノマーをもたらす可能性が高いことである。例えば、変異は、配列番号２と配列番号１４〜１７のうちのいずれか１つとの間で異なる配列番号２の位置のうちの１つ以上において行われ得る。そのような変異は、配列番号２のアミノ酸の、配列番号１４〜１７のうちのいずれか１つで対応する位置からのアミノ酸、好ましくは配列番号１４〜１６のうちのいずれか１つのアミノ酸による置換であってもよい。代替的には、これらの位置のうちのいずれか１つにおける変異は、任意のアミノ酸による置換であり得るか、または欠失もしくは挿入変異、例えば２〜２０、３〜１０、または４〜８のアミノ酸等の１〜３０のアミノ酸の置換、欠失、もしくは挿入であり得る。本明細書中に開示される変異、及び先行技術に開示される変異以外では、例えばＷＯ２０１３／１５３３５９において、配列番号２と、配列番号１４〜１７の全て、より好ましくは、配列番号１４〜１６の全てとの間で保存または同一であるアミノ酸は、好ましくは、保存されているか、または本発明のバリアントに存在する。保存的変異は、配列番号２と配列番号１４〜１７またはより好ましくは配列番号１４〜１６との間で保存されているかまたは同一であるこれらの位置のいずれか１つ以上において行われ得る。
【０１３０】
本発明は、配列番号２の特定の位置に対応するライセニンモノマーの構造の位置において、配列番号２の特定の位置に置換されている、本明細書に記載されるアミノ酸のうちのいずれか１つ以上を含むライセニン変異体モノマーを提供する。対応する位置は、当該技術分野における標準的な技術によって決定され得る。例えば、上記に述べられているＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ライセニンモノマーの配列を配列番号２と整列させることができ、それによって対応する残基を同定することができる。
【０１３１】
変異体モノマーは、典型的には、野生型ライセニンモノマーと同じ３Ｄ構造、例えば配列番号２の配列を有するライセニンモノマーと同じ３Ｄ構造を形成する能力を保持する。ライセニンモノマーの３Ｄ構造は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｄｅ  Ｃｏｌｂｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１２（２０）：１４９８−１５０７に開示されている。変異体モノマーは、典型的には、他のライセニンモノマーと共にホモオリゴマー及び／またはヘテロオリゴマーのポアを形成する能力を保持する。変異体モノマーは、典型的には、ポア中に存在する場合、野生型ライセニンモノマーと同じ３Ｄ構造を形成するようにリフォールディングする能力を保持する。ライセニンポア中のライセニンモノマーの３Ｄ構造は、本明細書の図７に示される。本明細書に説明される変異に加えて、野生型ライセニン配列には、２〜１００、３〜８０、４〜７０、５〜６０、１０〜５０、または２０〜４０個等の任意の数の変異が行われ得るが、但し、ライセニン変異体モノマーが、本発明の変異によってそれに付与された改善された特性のうちの１つ以上を保持することを条件とする。
【０１３２】
典型的には、ライセニンモノマーは、他の同一の変異体モノマーと、または異なるライセニン変異体モノマーと組み合わされてポアを形成する場合、２つのベータシートをライセニンポアのバレルに寄与する能力を保持するであろう。
【０１３３】
バリアントは、さらに好ましくは、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇのうちの１つ以上、または適切な場合、Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇの全てを含む。「適切な場合には」とは、位置が変異体モノマーにまだ存在するか、または異なるアミノ酸で修飾されていないかどうかを意味する。
【０１３４】
上記の特定の変異に加えて、バリアントは、他の変異を含んでもよい。これらの変異は、ポリヌクレオチドと相互作用するモノマーの能力を必ずしも高めない。変異は、例えば、発現及び／または精製を容易にし得る。配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸類似性または同一性に基づき、その配列に対して少なくとも５０％のホモログを有する。より好ましくは、バリアントは、配列全体にわたって、アミノ酸類似性または同一性に基づき、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％のホモログを有し得る。１００個以上、例えば１２５、１５０、１７５、または２００個以上の連続したアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のアミノ酸類似性または同一性があってもよい（「ハードホモロジー（ｈａｒｄｈｏｍｏｌｏｇｙ）」）。
【０１３５】
相同性を判定するために、当該技術分野における標準的な方法が使用され得る。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、例えばそのデフォルト設定で使用されて、相同性を計算するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されるように、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、相同性を計算するか、または配列を並べる（同等の残基または対応する配列を同定する（典型的には、それらのデフォルト設定において））ことができる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて一般に利用可能である。類似性は、ペアワイズ同一性を用いて、またはＢＬＯＳＵＭ６２等のスコアリングマトリックスを適用し、同等の同一性に変換することによって測定することができる。それらは進化した変化ではなく機能的なものであるため、相同性を判定する際に意図的に変異した位置はマスクされる。類似性は、タンパク質配列の包括的データベース上の例えばＰＳＩＢＬＡＳＴを使用する位置特異的スコアリングマトリックスの適用によってより敏感に決定され得る。進化的時間スケール（例えば、電荷）にわたる置換の頻度よりもむしろアミノ酸の化学物理的特性を反映する異なるスコアリングマトリックスを使用することができる。
【０１３６】
上記に論じられるものに加えて、配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸置換、例えば最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０個の置換が行われ得る。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性、または類似の側鎖量の他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、または荷電性を有し得る。代替的には、保存的置換は、既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は、当該技術分野で周知であり、以下の表３に定義されるように、２０個のアミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これはまた、表４におけるアミノ酸側鎖の疎水性スケールを参照して判定することもできる。
【表６】
2019520035.tif 000012
【表７】
2019520035.tif 000013
【０１３７】
バリアントは、アミノ酸が、ライセニンのホモログ及びパラログ中で対応する位置（複数可）において置き換えられている、上記で特定された領域外の１つ以上の置換を含み得る。ライセニンのホモログの４つの例は、配列番号１４〜１７に示される。
【０１３８】
配列番号２のアミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸残基は、上記に説明されているバリアントからさらに欠失され得る。最大で１、２、３、４、５、１０、２０、または３０個以上の残基が欠失され得る。
【０１３９】
バリアントは、配列番号２の断片を含み得る。そのような断片は、ポア形成活性を保持する。これは、上記のようにアッセイすることができる。断片は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、または２５０個のアミノ酸の長さであり得る。そのような断片を使用して、本発明のポアを生成することができる。配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域は、本発明に従って１つ以上の欠失によって修飾され得るため、断片は全領域を含む必要はない。したがって、未修飾領域の長さよりも短い断片が本発明によって想定される。断片は、好ましくは、配列番号２のポア形成ドメインを含む。断片は、より好ましくは、本発明に従って修飾されている配列番号２の約４４位〜約１２６位の領域を含む。
【０１４０】
代替的に、またはさらに、１つ以上のアミノ酸が上記に説明されているバリアントに付加されてもよい。配列番号２のバリアントのアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端において、伸長が提供されてもよく、その断片を含む。伸長は非常に短くてもよく、例えば、１〜１０アミノ酸長であってもよい。代替的には、伸長はより長くてもよく、例えば、最大で５０〜１００個のアミノ酸であってもよい。本発明によるアミノ酸配列に、担体タンパク質が融合されてもよい。他の融合タンパク質は、以下により詳細に論じられる。
【０１４１】
上記のように、バリアントは、配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有し、かつポアを形成するその能力を保持するポリペプチドである。バリアントは、典型的には、ポア形成を担う配列番号２の領域、すなわち約４４位から約１２６位までを含み、この領域は上記に論じられるように本発明に従って修飾されている。上記に論じられるように、この領域の断片を含み得る。本発明の修飾に加えて、配列番号２のバリアントは、置換、付加、または欠失等の１つ以上の追加の修飾を含み得る。これらの修飾は、好ましくは、配列番号２の約１位〜約４３位及び約１２７位〜約２９７位（すなわち、本発明に従って修飾された領域外）に対応するバリアントのストレッチに位置する。
【０１４２】
変異体モノマーは、例えば、ポリペプチドがそのような配列を天然に含まない細胞からのそれらの分泌を促進するための、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはｆｌａｇタグの付加によって、またはシグナル配列の付加によって修飾され、それらの同定または純化を補助することができる。遺伝的タグを導入することの代替法は、ポア上の天然のまたは操作された位置上にタグを化学反応させることである。これの例は、ゲルシフト試薬を、ポアの外側に操作されたシステインに反応させることであろう。これは、溶血毒ヘテロオリゴマーを分離するための方法として示されている（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９７  Ｊｕｌ；４（７）：４９７−５０５）。
【０１４３】
変異体モノマーは、顕示標識（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｌａｂｅｌ）で標識されてもよい。顕示標識は、ポアが検出されることを可能にする任意の好適な標識であり得る。好適な標識には、蛍光分子、放射性同位体、例えば、１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ペプチド、及びビオチン等のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
変異体モノマーはまた、Ｄ−アミノ酸を使用して生成され得る。例えば、変異体モノマーは、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の混合物を含み得る。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを生成するための当該技術分野における従来法である。
【０１４５】
変異体モノマーは、ポリヌクレオチドとの相互作用を容易にするための１つ以上の特異的修飾を含む。モノマーはまた、それらがポア形成に干渉しない限り、他の非特異的修飾を含んでもよい。いくつかの非特異的側鎖修飾は当該技術分野で既知であり、変異体モノマーの側鎖に行われ得る。そのような修飾には、例えば、アルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ４での還元によるアミノ酸の還元アルキル化、メチルアセトイミデート（ｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｉｍｉｄａｔｅ）によるアミジン化、または無水酢酸でのアシル化が含まれる。
【０１４６】
変異体モノマーは、当該技術分野で既知の標準的な方法を用いて生成されることができる。モノマーは、合成的に、または組み換え手段によって作製され得る。例えば、モノマーは、インビトロ翻訳及び転写（ＩＶＴＴ）によって合成され得る。ポアモノマーを生成するための好適な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）、または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に記載されている。ポアを膜内に挿入するための方法は、以下に論じられる。
【０１４７】
変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して得られ、複製され得る。そのような配列は、以下により詳細に論じられる。変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して細菌宿主細胞において発現され得る。変異体モノマーは、組み換え発現ベクターからのポリペプチドのインサイツ発現によって細胞内で生成され得る。発現ベクターは、任意に、ポリペプチドの発現を制御するために誘導性プロモーターを担持する。
【０１４８】
変異体モノマーは、ポア生成有機体から、任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製に続いて、または以下に論じられるように組み換え発現の後に大規模に生成され得る。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステム、及びＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが含まれる。変異体モノマーは、次いで、本発明に従って使用するための天然型または人工の膜に挿入され得る。ポアを膜内に挿入するための方法は、以下に論じられる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、変異体モノマーは、化学修飾される。変異体モノマーは、任意の方法で、任意の部位において化学修飾され得る。変異体モノマーは、好ましくは、１つ以上のシステインへの分子の結合（システイン結合）、１つ以上のリジンへの分子の結合、１つ以上の非天然型アミノ酸への分子の結合、エピトープの酵素修飾、または末端の修飾によって化学修飾される。そのような修飾を実施するための好適な方法は、当該技術分野で周知である。好適な非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）及びＬｉｕ  Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｐ．Ｇ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７９，４１３−４４４の図１中のアミノ酸番号１〜７１のうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。変異体モノマーは、任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。例えば、変異体モノマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、核酸、例えばＤＮＡ、色素、フルオロフォア、または発色団の結合によって化学的に修飾され得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、変異体モノマーは、モノマーを含むポアと、標的分析物、標的ヌクレオチド、または標的ポリヌクレオチドとの間の相互作用を容易にする分子アダプターによって化学的に修飾される。アダプターの存在は、ポア及びヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのホスト−ゲストケミストリーを改善し、それにより変異体モノマーから形成されたポアのシークエンシング能力を改善する。ホスト−ゲストケミストリーの原理は、当該技術分野で周知である。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとのその相互作用を改善させるポアの物理的または化学的特性に対する効果を有する。アダプターは、ポアのバレルまたはチャネルの電荷を改変し得るか、またはヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドと特異的に相互作用するかもしくはそれらに結合し、それによりポアとのその相互作用を促進し得る。
【０１５１】
分子アダプターは、好ましくは、環状分子、例えばシクロデキストリン、ハイブリダイゼーションが可能な種、ＤＮＡ結合剤もしくは相互キレート剤（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｏｒ）、ペプチドもしくはペプチド類似体、合成ポリマー、芳香族平面分子、正に荷電した小分子、または水素結合が可能な小分子である。
【０１５２】
アダプターは、環状であってもよい。環状アダプターは、好ましくは、ポアと同じ対称性を有する。
【０１５３】
アダプターは、典型的には、ホスト−ゲストケミストリーを介して、分析物、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドと相互作用する。アダプターは、典型的には、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用することができる。アダプターは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用することができる１つ以上の化学基を含む。１つ以上の化学基は、好ましくは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用、及び／または静電力などの非共有結合相互作用によって、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用する。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用することができる１つ以上の化学基は、好ましくは、正に荷電している。ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと相互作用することができる１つ以上の化学基は、より好ましくはアミノ基を含む。アミノ基は、第１級、第２級、または第３級炭素原子に結合し得る。アダプターは、さらにより好ましくは、アミノ基の環、例えば、６、７、８、または９個のアミノ基の環を含む。アダプターは、最も好ましくは、６または９個のアミノ基の環を含む。プロトン化されたアミノ基の環は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中の負に荷電したリン酸基と相互作用し得る。
【０１５４】
ポア内でのアダプターの正しい位置付けは、アダプターと変異体モノマーを含むポアとの間のホスト−ゲストケミストリーによって促進され得る。アダプターは、好ましくは、ポア内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することができる１つ以上の化学基を含む。アダプターは、より好ましくは、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、π−カチオン相互作用、及び／または静電力等の非共有結合相互作用を介して、ポア内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することができる１つ以上の化学基を含む。ポア内の１つ以上のアミノ酸と相互作用することができる化学基は、典型的には、ヒドロキシルまたはアミンである。ヒドロキシル基は、第１級、第２級、または第３級炭素原子に結合し得る。ヒドロキシル基は、ポア内の荷電していないアミノ酸と水素結合を形成し得る。ポアとヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの間の相互作用を容易にする任意のアダプターを使用することができる。
【０１５５】
好適なアダプターには、シクロデキストリン、環状ペプチド、及びククルビツリルが挙げられるが、これらに限定されない。アダプターは、好ましくは、シクロデキストリンまたはその誘導体である。シクロデキストリンまたはその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．Ｖ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、ＨＪ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，６０８１〜６０８８に開示されているもののうちのいずれかであり得る。アダプターは、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、またはヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。ｇｕ７−βＣＤのグアニジノ基は、ａｍ７−βＣＤの第１級アミンよりもはるかに高いｐＫａを有するため、より正に荷電されている。測定される残留電流の精度を高めるため、ならびに高温または低いデータ取得率における塩基検出率を高めるために、このｇｕ７−βＣＤアダプターを使用して、ポア中のヌクレオチドの滞留時間を増加させることができる。
【０１５６】
以下により詳細に論じられるようにスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）架橋剤が使用される場合、アダプターは、好ましくは、ヘプタキス（６−デオキシ−６−アミノ）−６−Ｎ−モノ（２−ピリジル）ジチオプロパノイル−β−シクロデキストリン（ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ）である。
【０１５７】
より好適なアダプターには、８個の糖単位を含む（及びしたがって、８回対称性を有する）、γ−シクロデキストリンが含まれる。γ−シクロデキストリンは、リンカー分子を含み得るか、または上記のβ−シクロデキストリン例において使用された修飾された糖単位のうちの全て以上を含むように修飾され得る。
【０１５８】
分子アダプターは、好ましくは、変異体モノマーと共有結合している。アダプターは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してポアと共有結合され得る。アダプターは、典型的には、化学結合を介して結合している。分子アダプターがシステイン結合を介して結合している場合、１つ以上のシステインが、好ましくは、置換によって変異体に導入されている。本発明の変異体モノマーは、当然ながら、２７２位及び２８３位の一方または両方でシステイン残基を含むことができる。変異体モノマーは、分子アダプターのこれらシステインの一方または両方への結合によって化学的に修飾され得る。代替的には、変異体モノマーは、他の位置で導入された１つ以上のシステインまたはＦＡｚ等の非天然型アミノ酸への分子結合によって化学的に修飾され得る。
【０１５９】
システイン残基の反応性は、隣接する残基の修飾によって増強され得る。例えば、側方のアルギニン、ヒスチジン、またはリジン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａを、より反応性のＳ−基のものに変えることになる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢなどのチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが結合する前に、変異体モノマーの１つ以上のシステイン残基と反応され得る。分子は、変異体モノマーと直接結合してもよい。分子は、好ましくは、化学架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体モノマーに結合している。
【０１６０】
好適な化学架橋剤は、当該技術分野で周知である。好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタナノエート（ｏｃｔａｎａｎｏａｔｅ）が含まれる。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）である。典型的には、分子は、分子／架橋剤複合体が変異体モノマーと共有結合する前に二官能性架橋剤と共有結合しているが、二官能性架橋剤／モノマー複合体が分子に結合する前に二官能性架橋剤をモノマーと共有結合させることも可能である。
【０１６１】
リンカーは、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好適なリンカーには、ヨードアセトアミド系及びマレイミド系リンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
他の実施形態では、モノマーは、ポリヌクレオチド結合タンパク質に結合してもよい。これは、本発明のシークエンシングの方法に使用され得るモジュラーシークエンシング（ｍｏｄｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）システムを形成する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、以下に論じられる。
【０１６３】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、変異体モノマーに共有結合され得る。タンパク質は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用してポアに共有結合され得る。モノマー及びタンパク質は、化学的に融合されるかまたは遺伝的に融合されてもよい。構造体全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマー及びタンパク質は、遺伝的に融合される。ポアのポリヌクレオチド結合タンパク質への遺伝的融合は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）に記載されている。
【０１６４】
ポリヌクレオチド結合タンパク質がシステイン結合を介して結合している場合、１つ以上のシステインは、好ましくは、置換によって変異体に導入されている。そのような置換は、典型的には、変異または挿入が許容され得ることを示すホモログ間で低い保存性を有するループ領域で行われる。したがって、それらはポリヌクレオチド結合タンパク質の結合に好適である。そのような置換は、典型的には、配列番号２の残基１〜４３及び１２７〜２９７において行われる。システイン残基の反応性は、上記の修飾によって増強され得る。
【０１６５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、変異体モノマーに直接結合してもよく、または１つ以上のリンカーを介して結合してもよい。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されるハイブリダイゼーションリンカーを使用して変異体モノマーに結合されてもよい。代替的には、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリンカーは、アミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可動性、及び親水性は、典型的には、それがモノマー及び分子の機能を妨げないように設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは、２〜２０個、例えば４、６、８、１０、または１６個のセリン及び／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、及び（ＳＧ）８を含み、式中、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛直なリンカーは、２〜３０個、例えば４、６、８、１６、または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛直なリンカーは、（Ｐ）１２を含み、式中、Ｐはプロリンである。
【０１６６】
変異体モノマーは、分子アダプター及びポリヌクレオチド結合タンパク質によって化学修飾され得る。
【０１６７】
変異体ライセニンモノマーの作製
本発明はまた、ポリヌクレオチドを特徴付けるために配列番号２に示される配列を含むライセニンモノマーの能力を改善する方法を提供する。方法は、配列番号２において本発明の１つ以上の修飾及び／または置換を行うことを含む。変異体ライセニンモノマーを参照して上記に論じられる実施形態及びポリヌクレオチドの特徴付けを参照して以下に論じられる実施形態のいずれかを、本発明のこの方法に等しく適用する。
【０１６８】
構造体
本発明はまた、ライセニンに由来する２つ以上の共有結合したモノマーを含む構造体を提供し、モノマーの少なくとも１つが、本発明の変異体ライセニンモノマーである。本発明の構造体は、ポアを形成するその能力を保持する。本発明の１つ以上の構造体を使用して、標的分析物を特徴付けるためのポアを形成することができる。本発明の１つ以上の構造体を使用して、標的ポリヌクレオチドを特徴付け、例えば標的ポリヌクレオチドをシークエンシングするためのポアを形成することができる。構造体は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上のモノマーを含み得る。２個以上のモノマーは、同じであるか、または異なる。
【０１６９】
構造体中の少なくともモノマーは、本発明の変異体モノマーである。構造体中の２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上のモノマーが、本発明の変異体モノマーであってもよい。構造体中のモノマーは全て、好ましくは、本発明の変異体モノマーである。変異体モノマーは、同じであるか、または異なってもよい。好ましい実施形態では、構造体は、２個の本発明の変異体モノマーを含む。
【０１７０】
構造体中の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。構造体中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数及び／または長さの単位で測定され得る。構造体中の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、上記に説明されているように３４位〜７０位及び／または７１位〜１０７位から欠失した同じ数のアミノ酸を有する。
【０１７１】
構造体中の他のモノマーは、本発明の変異体モノマーである必要はない。例えば、少なくとも１つのモノマーは、配列番号２に示される配列を含み得る。構造体中の少なくとも１つのモノマーは、配列番号２のパラログまたはホモログであり得る。好適なホモログは、配列番号１４〜１７に示される。
【０１７２】
代替的には、少なくとも１つのモノマーは、アミノ酸同一性に基づいてその配列全体にわたって、配列番号２に対して少なくとも５０％ホモログである配列番号２のバリアントを含んでもよいが、本発明の変異体モノマーによって必要とされるかまたはアミノ酸が上記に説明されるように欠失されていない特定の変異のいずれも含まない。より好ましくは、バリアントは、配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％のホモログであり得る。バリアントは、上記に論じられる断片または任意の他のバリアントであってもよい。本発明の構造体はまた、アミノ酸同一性に基づきその配列全体にわたって、配列番号１４、１５、１６、または１７に対して、少なくとも５０％ホモログまたは上記に述べられている相同性の少なくともいずれかの他のレベルである、配列番号１４、１５、１６、または１７のバリアントを含み得る。
【０１７３】
構造体中のモノマーは全て、本発明の変異体モノマーであり得る。変異体モノマーは、同じであるか、または異なってもよい。より好ましい実施形態では、構造体は２つのモノマーを含み、モノマーの少なくとも１つは本発明の変異体モノマーである。
【０１７４】
モノマーは、遺伝的に融合されてもよい。構造体全体が単一のポリヌクレオチド配列から発現される場合、モノマーは、遺伝的に融合される。モノマーのコード配列は、任意の方法で組み合わされて、構造体をコードする単一のポリヌクレオチド配列を形成し得る。遺伝的融合は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）に記載されている。
【０１７５】
モノマーは、任意の構成で遺伝的に融合されてもよい。モノマーは、それらの末端アミノ酸を介して融合されてもよい。例えば、１つのモノマーのアミノ末端は、別のモノマーのカルボキシ末端に融合され得る。
【０１７６】
２つ以上のモノマーは、直接共に遺伝的に融合されてもよい。モノマーは、好ましくは、リンカーを使用して遺伝的に融合される。リンカーは、モノマーの移動を制約するように設計され得る。好ましいリンカーは、アミノ酸配列（すなわち、ペプチドリンカー）である。上記に論じられるペプチドリンカーのいずれかを使用することができる。
【０１７７】
ペプチドリンカーの長さ、可動性、及び親水性は、それぞれ典型的には、それらがモノマー及び分子の機能を妨げないように設計される。好ましい可動性ペプチドリンカーは、２〜２０個、例えば４、６、８、１０、または１６個のセリン及び／またはグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可動性リンカーは、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５、及び（ＳＧ）８を含み、式中、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛直なリンカーは、２〜３０個、例えば４、６、８、１６、または２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛直なリンカーは、（Ｐ）１２を含み、式中、Ｐはプロリンである。
【０１７８】
別の好ましい実施形態において、モノマーは、化学的に融合されている。モノマーが、例えば化学架橋剤を介して化学的に結合されている場合、モノマーは化学的に融合されている。上記に論じられる化学架橋剤のいずれかを使用することができる。リンカーは、本発明の変異体モノマー内に導入された１つ以上のシステイン残基またはＦａｚ等の非天然型アミノ酸に結合されてもよい  代替的には、リンカーは、構造体中のモノマーのうちの１つの末端に結合されてもよい。モノマーは、典型的には、配列番号２の残基１〜４３及び１２７〜２９７のうちの１つ以上を介して連結される。
【０１７９】
構造体が異なるモノマーを含有する場合、モノマーのそれら自体への架橋は、モノマーを大幅に超えてリンカーの濃度を維持することによって防止される。代替的には、２つのリンカーが使用される「ロックアンドキー」配置を使用してもよい。各リンカーの一方の端部のみが互いに反応してより長いリンカーを形成し、リンカーの他方の端部は各々、異なるモノマーと反応し得る。そのようなリンカーは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３２号（ＷＯ２０１０／０８６６０２として公開）に記載されている。
【０１８０】
本発明はまた、本発明の構造体を生成する方法を提供する。方法は、本発明の少なくとも１つの変異体ライセニンモノマーをライセニンに由来する１つ以上のモノマーに共有結合させることを含む。本発明の構造体を参照して上記に論じられる実施形態のいずれも、構造体を生成する方法に等しく適用する。
【０１８１】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体モノマーをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。変異体モノマーは、上記に論じられるもののいずれかであり得る。ポリヌクレオチド配列は、好ましくは、配列全体にわたって、ヌクレオチド同一性に基づき、配列番号１の配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％ホモログの配列を含む。３００個以上、例えば３７５、４５０、５２５、または６００個以上の連続したヌクレオチドのストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のヌクレオチド同一性があってもよい（「ハードホモロジー」）。相同性は、上記に論じられるように計算することができる。ポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号の縮重に基づき、配列番号１と異なる配列を含み得る。
【０１８２】
本発明はまた、遺伝的に融合された本発明の構造体のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ポリヌクレオチドは、好ましくは、上記に説明されるように配列番号１またはそのバリアントに示される２つ以上の配列を含む。
【０１８３】
ポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を使用して得られ、複製され得る。野生型ライセニンをコードする染色体ＤＮＡは、ポア生成有機体、例えばエイセニアフェティダから抽出され得る。ポアモノマーをコードする遺伝子は、特異的プライマーを伴うＰＣＲを使用して増幅され得る。増幅された配列は、次いで、部位特異的変異誘発を経ることがある。部位特異的変異誘発の好適な方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、化合連鎖反応が含まれる。本発明の構造体をコードするポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されるもの等の、周知の技術を使用して作製され得る。
【０１８４】
得られたポリヌクレオチド配列は、次いで、複製可能な組み換えベクター、例えばクローニングベクターに組み込まれ得る。ベクターを使用して、適合する宿主細胞においてポリヌクレオチドを複製することができる。したがって、ポリヌクレオチド配列は、複製可能なベクター内にポリヌクレオチドを導入し、適合する宿主細胞内にベクターを導入し、ベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって作製され得る。ベクターは、宿油脂細胞から回収され得る。ポリヌクレオチドのクローニングのために好適な宿主細胞は、当該技術分野で既知であり、以下により詳細に記載される。
【０１８５】
ポリヌクレオチド配列は、好適な発現ベクターへとクローニングされ得る。発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、典型的には、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動可能に結合している。そのような発現ベクターを使用して、ポアサブユニットを発現させることができる。
【０１８６】
「作動可能に結合している」という用語は、並置を指し、記載される構成要素は、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係性にある。コード配列に「作動可能に結合した」制御配列は、コード配列の発現が制御配列に適合した条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。同じまたは異なるポリヌクレオチド配列の複数のコピーが、ベクター内に導入されてもよい。
【０１８７】
発現ベクターは、次いで、好適な宿主細胞内に導入され得る。したがって、本発明の変異体モノマーまたはポアは、発現ベクター内にポリヌクレオチド配列を挿入し、適合する細菌宿主細胞内にベクターを導入し、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって生成され得る。組み換え発現されたモノマーまたは構造体は、宿主細胞膜のポア内に自己組織化し得る。代替的には、この様式で生成された組み換えポアは、宿主細胞から除去され、別の膜内に挿入されてもよい。少なくとも２つの異なるサブユニットを含むポアを生成するとき、異なるサブユニットは、上記に論じられるように異なる宿主細胞内で別個に発現され、宿主細胞から取り出され、ヒツジ赤血球膜またはスフィンゴミエリンを含有するリポソーム等の別個の膜のポアを形成してもよい。
【０１８８】
例えば、ライセニンモノマーは、スフィンゴミエリンと以下の脂質、ホスファチジルセリン、ＰＯＰＥ、コレステロール、及びＳｏｙ  ＰＣのうちの１つ以上とを含む脂質混合物を添加し、混合物を例えば３０℃で６０分間インキュベートすることによってオリゴマー形成され得る。オリゴマー形成されたモノマーは、任意の好適な方法、例えば、ＷＯ２０１３／１５３３５９に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル精製によって精製され得る。
【０１８９】
ベクターは、例えば、プラスミド、または複製開始点を伴うウイルスまたはファージベクター、任意に当該ポリヌクレオチド配列の発現のためのプロモーター及び任意にプロモーターのレギュレーターであり得る。ベクターは、１つ以上の選択的マーカー遺伝子、例えば、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を含み得る。プロモーター及び他の発現調節シグナルは、そのために発現ベクターが設計される宿主細胞に適合するように選択され得る。Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、ａｒａ、またはλＬプロモーターが典型的に使用される。
【０１９０】
宿主細胞は、典型的には、ポアサブユニットを高レベルで発現する。ポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞は、細胞を形質転換するために使用された発現ベクターと適合するように選択されることになる。宿主細胞は、典型的に細菌であり、好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。λ  ＤＥ３溶原菌を有する任意の細胞、例えば、Ｃ４１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、ＴＵＮＥＲ、Ｏｒｉｇａｍｉ、及びＯｒｉｇａｍｉ  Ｂは、Ｔ７プロモーターを含むベクターを発現することができる。上記に列挙されている条件に加えて、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８  Ｄｅｃ  ３０；１０５（５２）：２０６４７−５２に引用されている方法のいずれかは、ライセニンタンパク質を発現するために使用され得る。
【０１９１】
ポア
本発明はまた、様々なポアを提供する。本発明のポアは、分析物の特徴付けに理想的である。本発明のポアは、特に、それらが異なるヌクレオチドを高度の感受性で識別することができるため、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングに理想的である。ポアは、核酸のシークエンシング及び単一の塩基変化の同定を含む、ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸を特徴付けるために使用されることができる。本発明のポアは、さらに、メチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドを識別することができる。本発明のポアの塩基分解能は驚くほど高い。ポアは、４つのＤＮＡヌクレオチドの全てのほぼ完全な分離を示す。ポアはポア中の滞留時間及びポアを通って流れる電流に基づき、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）とメチル−ｄＣＭＰを識別するためにさらに使用されることができる。
【０１９２】
本発明のポアはまた、一定範囲の条件下で異なるヌクレオチドを識別することができる。とりわけ、ポアは、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングに好都合な条件下でヌクレオチドを識別することになる。本発明のポアが異なるヌクレオチドを識別することができる程度は、印加される電位、塩濃度、緩衝液、温度、ならびに尿素、ベタイン、及びＤＴＴなどの添加剤の存在を変えることによって制御することができる。これは、特にシークエンシングの際に、ポアの機能を微調整することを可能にする。これは、以下により詳細に論じられる。本発明を使用して、ヌクレオチドごとに行うのではなく、１つ以上のモノマーとの相互作用からポリヌクレオチドポリマーを同定することもできる。
【０１９３】
本発明のポアは、単離されているか、実質的に単離されているか、精製されているか、または実質的に精製されていてもよい。本発明のポアは、それが脂質または他のポアなどの任意の他の構成要素を一切含まない場合、単離または精製されている。ポアは、それが、その意図される使用に干渉しない担体または希釈剤と混合されている場合、実質的に単離されている。例えば、ポアは、それが、１０％未満、５％未満、２％未満、または１％未満の他の構成要素、例えば脂質または他のポアを含む形態で存在する場合、実質的に単離されているか、または実質的に精製されている。代替的には、本発明のポアは、脂質二分子層内に存在してもよい。
【０１９４】
本発明のポアは、個々のポア、または単一のポアとして存在し得る。代替的には、本発明のポアは、ホモログまたは異種性集団もしくは複数の２つ以上のポアにおいて存在してもよい。
【０１９５】
ホモオリゴマーポア
本発明はまた、本発明の同一の変異体モノマーを含むライセニンに由来するホモオリゴマーポアを提供する。モノマーは、それらのアミノ酸配列に関して同一である。本発明のホモオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングに理想的である。本発明のホモオリゴマーポアは、上記の利点のいずれかを有し得る。本発明の特定のホモオリゴマーポアの利点は、実施例に示される。
【０１９６】
ホモオリゴマーポアは、任意の数の変異体モノマーを含み得る。ポアは、典型的には、２つ以上の変異体モノマーを含む。ホモオリゴマーポアは、任意の数の変異体モノマーを含み得る。ポアは、典型的には、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個の同一の変異体モノマー、例えば６、７、８、９、または１０個の変異体モノマーを含む。ポアは、好ましくは、８または９個の同一の変異体モノマーを含む。ポアは、最も好ましくは、９個の同一の変異体モノマーを含む。このモノマーの数は、本明細書では「十分な数」と呼ばれる。
【０１９７】
変異体モノマーのうちの１個以上、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個は、好ましくは、上記または下記に論じられるように化学的に修飾されている。
【０１９８】
変異体モノマーのうちの１つ以上は、好ましくは、上記または下記に論じられるように化学的に修飾されている。換言すれば、化学的に修飾されているモノマーの１つ以上（及び化学的に修飾されていない他のモノマー）は、モノマーの各々のアミノ酸配列が同一である限り、ポアがホモオリゴマーであることを妨げない。
【０１９９】
ライセニンのポアを作製する方法は、実施例及びＹａｍａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８；２７３（９）：５３００−６．に記載されている。
【０２００】
ヘテロオリゴマーポア
本発明はまた、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーを含むライセニンに由来するヘテロオリゴマーポアを提供し、モノマーの少なくとも１つが、他のものと異なる。モノマーは、そのアミノ酸配列に関して他のものと異なる。本発明のヘテロオリゴマーポアは、ポリヌクレオチドの特徴付け、例えばシークエンシングに理想的である。ヘテロオリゴマーポアは、当該技術分野で既知の方法を使用して作製することができる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００２  Ｊｕｌ；１１（７）：１８１３−２４）。
【０２０１】
ヘテロオリゴマーポアは、ポアを形成するために十分なモノマーを含有する。モノマーは、例えば、野生型を含む、任意の種類であり得る。ポアは、典型的には、２つ以上のモノマーを含む。ポアは、典型的には、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０個のモノマー、例えば６、７、８、９、または１０個のモノマーを含む。ポアは、好ましくは、８または９個のモノマーを含む。ポアは、最も好ましくは９個のモノマーを含む。このモノマーの数は、本明細書では「十分な数」と呼ばれる。
【０２０２】
ポアは、配列番号２に示される配列、そのパラログ、そのホモログ、または本発明の変異体モノマーによって必要とされる変異を有さないかもしくは上記に論じられるようにアミノ酸が欠失されていないそのバリアントを含む少なくとも１つのモノマーを含み得る。好適なバリアントは、配列番号２、１４、１５、１６、及び１７とそのバリアントを含む、本発明の構造体を参照して上記に論じられるもののいずれかである。この実施形態において、残りのモノマーは、好ましくは、本発明の変異体モノマーである。
【０２０３】
好ましい実施形態において、ポアは、（ａ）本発明の変異体モノマー及び（ｂ）ポアを形成するのに十分な数の同一モノマーを含み、（ａ）における変異体モノマーが（ｂ）における同一モノマーと異なる。（ｂ）における同一モノマーは、好ましくは、配列番号２に示される配列、そのパラログ、そのホモログ、または本発明の変異体モノマーによって必要とされる変異を有さないそのバリアント含む。
【０２０４】
本発明のヘテロオリゴマーポアは、好ましくは、本発明の１つの変異体ライセニンモノマーのみを含む。
【０２０５】
別の好ましい実施形態において、ヘテロオリゴマーポア中の全てのモノマーは、本発明の変異体モノマーであり、それらのうちの少なくとも１つが他のものと異なる。
【０２０６】
ポア中の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。ポア中の本発明の変異体モノマーのバレルは、好ましくは、およそ同じ長さであるか、または同じ長さである。長さは、アミノ酸の数及び／または長さの単位で測定され得る。ポア内の本発明の変異体モノマーは、好ましくは、３４位〜７０位及び／または７１位〜１０７位において欠失された同じ数のアミノ酸を有する。
【０２０７】
上記に論じられる全ての実施形態において、変異体モノマーのうちの１つ以上は、好ましくは、上記または下記に論じられるように化学的に修飾される。１つのモノマー上に化学修飾が存在しても、ポアはヘテロオリゴマーではない。少なくとも１つのモノマーのアミノ酸配列は、他のモノマーの配列（複数可）と異なっていなければならない。ポアを作製するための方法は、以下により詳細に論じられる。
【０２０８】
構造体含有ポア
本発明はまた、少なくとも１つの本発明の構造体を含むポアを提供する。本発明の構造体は、ライセニンに由来する２つ以上の共有結合したモノマーを含み、モノマーの少なくとも１つが、本発明の変異体ライセニンモノマーである。換言すれば、構造体は、１つ超のモノマーを含有しなければならない。ポア中のモノマーのうちの少なくとも２つは、本発明の構造体の形態にある。モノマーは、任意の種類であり得る。
【０２０９】
ポアは、典型的には、（ａ）２つのモノマーを含む１つの構造体及び（ｂ）ポアを形成するのに十分な数のモノマーを含む。構造体は、上記に論じられるもののいずれかであり得る。モノマーは、本発明の変異体モノマーを含む、上記に論じられるもののいずれかであり得る。
【０２１０】
別の典型的なポアは、１個超の本発明の構造体、例えば２、３、または４個の本発明の構造体を含む。そのようなポアは、ポアを形成するのに十分な数のモノマーをさらに含む。モノマーは、上記に論じられるもののいずれかであり得る。本発明のさらなるポアは、２個のモノマーを含む構造体のみを含む。本発明による特定のポアは、それぞれ２個のモノマーを含むいくつかの構造体を含む。構造体は、各構造体の１個のみのモノマーがポアに寄与するような構造で、ポア内にオリゴマー形成し得る。典型的には、構造体の他のモノマー（すなわち、ポアを形成しないもの）は、ポアの外側にある。
【０２１１】
変異は、上記に論じられるように構造体内に導入され得る。変異は交互であってもよく、すなわち、変異は２個のモノマー構造体以内の各モノマーについて異なり、構造体はホモオリゴマーとして形成され、交互修飾をもたらす。換言すれば、ＭｕｔＡ及びＭｕｔＢを含むモノマーは、融合及び組織化されてＡ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂ：Ａ−Ｂポアを形成する。代替的には、変異は隣接していてもよく、すなわち、同一の変異が構造体中の２個のモノマー内に導入され、これは次いで、異なる変異体モノマーとオリゴマー形成される。換言すれば、ＭｕｔＡを含むモノマーは融合され、続いてＭｕｔＢ含有モノマーとオリゴマー形成されて、Ａ−Ａ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂ：Ｂを形成する。
【０２１２】
構造体含有ポア中の本発明のモノマーのうちの１個以上は、上記または下記に論じられるように化学修飾されていてもよい。
【０２１３】
本発明の化学修飾されたポア
別の態様において、本発明は、組み立てられたポアのバレル／チャネルの開口径が２、３、４または５個の部位等の、バレルの長さに沿って１個の部位またはそれ以上において減少、縮小、または狭窄されるように、化学的に修飾されている１個以上の変異体モノマーを含む化学修飾されたライセニンポアを提供する。ポアは、本発明のホモオリゴマー及びヘテロオリゴマーのポアを参照して、上記に論じられる任意の数のモノマーを含み得る。ポアは、好ましくは、９個の化学修飾されたモノマーを含む。化学修飾されたポアは、上記に論じられるホモオリゴマーであってもよい。換言すれば、化学修飾されたポア内の全てのモノマーは、同じアミノ酸配列を有してもよく、同様に化学的に修飾されていてもよい。化学修飾されたポアは、上記に論じられるようにヘテロオリゴマーであってもよい。換言すれば、ポアは、（ａ）化学的に修飾された１個のモノマーのみ、（ｂ）２、３、４、５、６、７、または８個等の１個超の化学的に修飾されたモノマーであって、そこでは３、４、５、６、または７個等の少なくとも２個の化学修飾されたモノマーが互いに異なるモノマー、または（ｃ）３、４、５、６、７、８、または９個等の少なくとも２個の化学修飾されたモノマーが互いに異なる、化学修飾されたモノマーのみ（すなわち、モノマーの全てが化学的に修飾されている）を含み得る。モノマーは、それらのアミノ酸配列、それらの化学修飾、それら化学修飾、またはそれらのアミノ酸配列及びそれらの化学修飾の両方に関して互いに異なっていてもよい。化学修飾されたモノマー（複数可）は、上記及び／または下記に論じられるもののいずれかであり得る。
【０２１４】
本発明はまた、下記に論じられる方法のいずれかで化学修飾された変異体ライセニンモノマーを提供する。変異体モノマーは、上記または下記に論じられるもののいずれかであり得る。その結果として、以下の位置、Ｋ３７、Ｇ４３、Ｋ４５、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５１、Ｈ８３、Ｖ８８、Ｔ９１、Ｔ９３、Ｖ９５、Ｙ９６、Ｓ９８、Ｋ９９、Ｖ１００、Ｉ１０１、Ｐ１０８、Ｐ１０９、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｋ１１２、及びＴ１１４のうちの１つ以上における修飾を含む配列番号２のバリアントか、または上記に論じられるバレル欠失を含むバリアントのような、本発明の変異体モノマーは、下記に論じられるように本発明に従って化学的に修飾され得る。
【０２１５】
変異体モノマーは、組み立てられたポアのバレルの直径が、ポアを通過する分析物のサイズに依存する任意の減少係数によって減少または狭められるように、化学修飾されることができる。狭窄領域の幅は、典型的には、例えば分析物がポアを通るイオン流を減少させるために、分析物の転位中の測定シグナルの破壊の程度を決定する。シグナルの破壊が大きいほど、典型的には測定における感度がより高くなる。したがって、狭窄領域は、転位される分析物よりもわずかに広くなるように選択されてもよい。例えばｓｓＤＮＡの転位の場合、狭窄領域の幅は、０．８〜３．０ｎｍの範囲の値から選択することができる。
【０２１６】
化学修飾はまた、狭窄領域の長さを決定し、次に、測定シグナルに寄与するポリマー単位、例えばヌクレオチドの数を決定する。任意の特定の時点で電流シグナルに寄与するヌクレオチドは、ｋ−ｍｅｒとして示され得、ここでｋは整数であり、整数または端数であり得る。４種類の核酸塩基を有するポリヌクレオチドの測定の場合において、３量体は４３の潜在的なシグナルレベルを生じさせるであろう。より大きなｋの値は、より大きな数のシグナルレベルを生じさせる。典型的には、これは、測定シグナルデータの分析を簡単にするため、狭い狭窄領域を提供することが望ましい。
【０２１７】
化学修飾は、化学分子が、好ましくは、変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーに共有結合されるようなものである。化学分子は、当技術分野で既知の任意の方法を使用して、ポア、変異体モノマー、または１つ以上の変異体モノマーに共有結合され得る。化学分子は、典型的には、化学結合を介して結合される。
【０２１８】
変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーは、好ましくは、システインへの分子の結合（システイン結合）、１つ以上のリジンへの分子の結合、１つ以上の非天然型アミノ酸への分子の結合、またはエピトープの酵素修飾によって化学的に修飾される。化学修飾剤がシステイン結合を介して結合している場合、１つ以上のシステインは、好ましくは、置換によって変異体に導入されている。そのような修飾を実施するための好適な方法は、当該技術分野で周知である。好適な非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）及びＬｉｕ  Ｃ．Ｃ．ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｐ．Ｇ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７９，４１３−４４４の図１中のアミノ酸番号１〜７１のうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。
【０２１９】
変異体モノマーまたは１つ以上変異体モノマーは、任意の位置または部位で組み立てられたポアのバレルの直径を減少または狭める効果を有する、任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。例えば、変異体モノマーは、（ｉ）４−フェニルアゾマレイナニル、１．Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミド、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、１．３−マレイミドプロピオン酸、１．１−４アミノフェニル−１Ｈ−ピロール，２，５，ジオン、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルマレイミド、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド、３−マレイミド−プロキシル、Ｎ−（４−クロロフェニル）マレイミド、１−［４−（ジメチルアミノ）−３，５−ジニトロフェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｎ−［４−（２−ベンズイミダゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−［４−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−（１−ナフチル）−マレイミド、Ｎ−（２，４−キシリル）マレイミド、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）マレイミド、Ｎ−（３−クロロ−パラ−トリル）−マレイミド、１−（２−アミノ−エチル）−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、１−シクロペンチル−３−メチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−（３−アミノプロピル）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、３−メチル−１−［２−オキソ−２−（ピペラジン−１−イル）エチル］−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、１−ベンジル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、３−メチル−１−（３，３，３−トリフルオロプロピル）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−［４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオントリフルオロ酢酸、ＳＭＩＬＥＳ  Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＣ＝２Ｃ＝ＣＮ＝ＣＣ２、ＳＭＩＬＥＳ  Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＮ２ＣＣＮＣＣ２、１−ベンジル−３−メチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−２，５−ジヒドロ１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｎ−（４−フェノキシフェニル）マレイミド、Ｎ−（４−ニトロフェニル）マレイミド等のマレイミド、（ｉｉ）３−（２−ヨードアセトアミド）−プロキシル、Ｎ−（シクロプロピルメチル）−２−ヨードアセトアミド、２−ヨード−Ｎ−（２−フェニルエチル）アセトアミド、２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミド、Ｎ−（４−アセチルフェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（４−（アミノスルホニル）フェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（２，６−ジエチルフェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（２−ベンゾイル−４−クロロフェニル）−２−ヨードアセトアミド等のヨードアセトアミド、（ｉｉｉ）Ｎ−（４−（アセチルアミノ）フェニル）−２−ブロモアセトアミド、Ｎ−（２−アセチルフェニル）−２−ブロモアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（２−シアノフェニル）ア��トアミド、２−ブロモ−Ｎ−（３−（トリフルオロメチル）フェニル）アセトアミド、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−２−ブロモアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−メチルブタンアミド、Ｎ−ベンジル−２−ブロモ−Ｎ−フェニルプロピオンアミド、Ｎ−（２−ブロモ−ブチリル）−４−クロロ−ベンゼンスルホンアミド、２−ブロモ−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−フェネチル−アセトアミド，２−アダマンタン−１−イル−２−ブロモ−Ｎ−シクロヘキシル−アセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（２−メチルフェニル）ブタンアミド、モノブロモアセトアニリド等のブロモアセトアミド、（ｉｖ）アルドリチオール−２、アルドリチオール−４、イソプロピルジスルフィ、１−（イソブチルジスルファニル）−２−メチルプロパン、ジベンジルジスルフィド、４−アミノフェニルジスルフィド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤ等のジスルフィド、及び（ｖ）４−フェニルチアゾール−２−チオール、プルパルド、５，６，７，８−テトラヒドロ−キナゾリン−２−チオール等のチオール、の結合によって化学的に修飾され得る。
【０２２０】
変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、核酸、例えばＤＮＡ、色素、フルオロフォアまたは発色団の付着によって化学的に修飾することができる。いくつかの実施形態では、変異体モノマーは、モノマーを含むポアと標的ヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチド配列との間の相互作用を容易にする分子アダプターによって化学修飾される。アダプターの存在は、ポア及びヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのホスト−ゲストケミストリーを改善し、それにより変異体モノマーから形成されたポアのシークエンシング能力を改善する。
【０２２１】
変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーは、位置Ｋ３７、Ｖ４７、Ｓ４９、Ｔ５５、Ｓ８６、Ｅ９２、Ｅ９４のいずれかで組み立てられたポアのバレルの開口直径を減少または狭める効果を有する、任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。より好ましくは、変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーは、Ｅ９２及びＥ９４で組み立てられたポアのバレルの開口直径を減少または狭める効果を有する、任意の分子の結合によって化学的に修飾され得る。一実施形態において、変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーは、これらの位置における１つ以上のシステイン（システイン結合）への分子の結合によって化学的に修飾される。
【０２２２】
システイン残基の反応性は、隣接する残基の修飾によって増強され得る。例えば、側方のアルギニン、ヒスチジン、またはリジン残基の塩基性基は、システインチオール基のｐＫａを、より反応性のＳ−基のものに変えることになる。システイン残基の反応性は、ｄＴＮＢ等のチオール保護基によって保護され得る。これらは、リンカーが結合する前に、変異体モノマーの１つ以上のシステイン残基と反応され得る。
【０２２３】
分子は、変異体モノマーまたは１つ以上の変異体モノマーと直接結合してもよい。分子は、好ましくは、化学架橋剤またはペプチドリンカーなどのリンカーを使用して変異体モノマーに結合される。好適な化学架橋剤は、当該技術分野で周知である。好ましい架橋剤には、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパノエート、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ブタノエート、及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル８−（ピリジン−２−イルジスルファニル）オクタナノエート（ｏｃｔａｎａｎｏａｔｅ）が含まれる。最も好ましい架橋剤は、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）である。典型的には、分子は、分子／架橋剤複合体が変異体モノマーと共有結合する前に二官能性架橋剤と共有結合しているが、二官能性架橋剤／モノマー複合体が分子に結合する前に二官能性架橋剤をモノマーと共有結合させることも可能である。
【０２２４】
リンカーは、好ましくは、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に耐性である。好適なリンカーは、ヨードアセトアミド系及びマレイミド系リンカーを含むが、これらに限定されない。
【０２２５】
この方法で化学的に修飾されたポアは、（ｉ）読取りヘッドの鮮鋭さの改善、（ｉｉ）塩基間の改善された識別、及び（ｉｉｉ）改善された範囲、すなわち改善されたシグナル対ノイズ比の特定の利点を示す。
【０２２６】
バレル内の特定の位置を化学分子で修飾することによって、新しい読取りヘッドを導入することができるか、または古い読取りヘッドを修飾することができる。修飾された分子のサイズのために、読取りヘッドの物理的サイズを大幅に変化させることができる。同様に、修飾された分子の化学的性質のために、読取りヘッドの特性を変化させることができる。２つの効果を組み合わせは、改善された分解能及び塩基のより良好な識別性を有する読取りヘッドが得られることを示した。異なる位置の異なる塩基のシグナルへの相対的な寄与が変化しただけでなく、極端における読取りヘッドの位置は、シグナルに対するそれらの寄与を意味する大幅に少ない識別が大幅に減少されることを示し、それによって、所定の瞬間にアッセイされているＫｍｅｒの長さがより短い。このより鮮鋭な読取りヘッドは、生シグナルからＫｍｅｒｓのデコンボリューションのプロセスを簡単にする。
【０２２７】
本発明のポアの生成
本発明はまた、本発明のポアを生成する方法を提供する。方法は、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーまたは本発明の少なくとも１つの構造体を、十分な数の、本発明の変異体モノマー、本発明の構造体、ライセニンモノマー、またはライセニン由来のモノマーとオリゴマー形成させて、ポアを形成することを含む。方法が本発明のホモオリゴマーポアを作製することに関する場合、その方法で使用される全てのモノマーは、同じアミノ酸配列を有する本発明の変異体ライセニンモノマーである。方法が本発明のヘテロオリゴマーポアを作製することに関係する場合、モノマーの少なくとも１つは他のモノマーとは異なる。
【０２２８】
典型的には、モノマーは、上記に論じられるように宿主細胞内で発現され、宿主細胞から取り出され、ヒツジ赤血球膜またはスフィンゴミエリンを含有するリポソーム等の別個の膜のポアを形成してもよい。
【０２２９】
例えば、ライセニンモノマーは、スフィンゴミエリンと以下の脂質、ホスファチジルセリン、ＰＯＰＥ、コレステロール、及びＳｏｙ  ＰＣのうちの１つ以上とを含む脂質混合物を添加し、混合物を例えば３０℃で６０分間インキュベートすることによってオリゴマー形成され得る。オリゴマー形成されたモノマーは、任意の好適な方法、例えば、ＷＯ２０１３／１５３３５９に記載されているようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル精製によって精製され得る。
【０２３０】
本発明のポアを参照して上記に論じられる実施形態のいずれも、ポアを生成する方法に等しく適用する。
【０２３１】
分析物を特徴付ける方法
本発明は、標的分析物を特徴付ける方法を提供する。方法は、（ａ）標的分析物がポアを通って移動するように、標的分析物を本発明のポアと接触させることを含む。ポアは、上記に論じられるもののいずれかであり得る。次に、当該技術分野で既知の標準的な方法を使用して、分析物がポアに対して移動するにつれて、標的分析物の１つ以上の特性が測定される。標的分析物の１つ以上の特性は、好ましくは、分析物がポアを通って移動するにつれて測定される。ステップ（ａ）及び（ｂ）は、好ましくは、ポアにわたって電位が印加された状態で実施される。以下により詳細に論じられるように、印加される電位は、典型的には、ポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との間で複合体の形成をもたらす。印加される電位は、電圧電位であり得る。代替的には、印加される電位は、化学的電位であり得る。この例は、両親媒性層にわたって塩勾配を使用することである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７  Ｊｕｌ  １１；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。
【０２３２】
本発明の方法は、標的分析物を特徴付けるためのものである。方法は、少なくとも１つの分析物を特徴付けるためのものである。方法は、２つ以上の分析物を特徴付けることに関し得る。方法は、任意の数の分析物、例えば２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００個、またはそれ以上の分析物を特徴付けることを含んでもよい。
【０２３３】
標的分析物は、好ましくは、金属イオン、無機塩、ポリマー、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、染料、漂白剤、医薬品、診断薬、レクリエーショナルドラッグ、爆発物、または環境汚染物質である。方法は、２つ以上の同じ種類の分析物、例えば２つ以上のタンパク質、２つ以上のヌクレオチド、または２つ以上の医薬品を特徴付けることに関し得る。代替的には、方法は、２つ以上の異なる種類の分析物、例えば１つ以上のタンパク質、１つ以上のヌクレオチド、及び１つ以上の医薬品を特徴付けることに関し得る。
【０２３４】
標的分析物は、細胞から分泌され得る。代替的には、標的分析物は、細胞の内部に存在する分析物であり得、その場合、分析物は、本発明が実施され得る前に細胞から抽出されなければならない。
【０２３５】
分析物は、好ましくは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、及び／またはタンパク質である。アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然型であっても非天然型であってもよい。ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの中に合成または修飾アミノ酸を含み得る。アミノ酸へのいくつかの異なる種類の修飾が当該技術分野で既知である。好適なアミノ酸及びその修飾は、上記である。本発明の目的において、標的分析物は、当該技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることを理解されたい。
【０２３６】
タンパク質は、酵素、抗体、ホルモン、成長因子、または成長調節タンパク質、例えばサイトカインであり得る。サイトカインは、インターロイキン、好ましくは、ＩＦＮ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１３、インターフェロン、好ましくは、ＩＬ−γ、ならびに他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−αから選択され得る。タンパク質は、細菌タンパク質、真菌タンパク質、ウイルスタンパク質、または寄生虫由来のタンパク質であり得る。
【０２３７】
標的分析物は、好ましくは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、核酸塩基、糖、及び少なくとも１つのリン酸基を含有する。核酸塩基は、典型的には、複素環である。核酸塩基には、プリン及びピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシル、及びシトシンが挙げられるが、これらに限定されない。糖は、典型的には、五炭糖である。ヌクレオチド糖は、リボース及びデオキシリボースを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、典型的には、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、典型的には、一リン酸、二リン酸、または三リン酸を含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に結合され得る。
【０２３８】
ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、及び５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン三リン酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは、脱塩基（すなわち、核酸塩基を欠く）であってもよい。ヌクレオチドは、追加の修飾を含んでもよい。特に、好適な修飾ヌクレオチドには、２’−アミノピリミジン（例えば、２’−アミノシチジン及び２’−アミノウリジン）、２’−ヒドロキシルプリン（例えば、２’−フルオロピリミジン（例えば、２’−フルオロシチジン及び２’フルオロウリジン）、ヒロドキシルピリミジン（例えば、５’−α−Ｐ−ボラノウリジン）、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、及び２’−Ｏ−メチルウリジン）、４’−チオピリミジン（例えば、４’−チオウリジン及び４’−チオシチジン）が含まれ、ヌクレオチドは、核酸塩基（例えば、５−ペンチニル−２’−デオキシウリジン、５−（３−アミノプロピル）−ウリジン及び１，６−ジアミノヘキシル−Ｎ−５−カルバモイルメチルウリジン）の修飾を有するが、これらに限定されない。
【０２３９】
オリゴヌクレオチドは、典型的には５０個以下のヌクレオチド、例えば４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、または５個以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、脱塩基及び修飾ヌクレオチドを含む、上記に論じられるヌクレオチドのいずれかを含んでもよい。本発明の方法は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものである。核酸等のポリヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオチドを含む高分子である。ポリヌクレオチドはまたは核酸は、任意のヌクレオチドの任意の組み合わせを含み得る。ヌクレオチドは、天然であっても人工であってもよい。標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、酸化またはメチル化されてもよい。標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、損傷していてもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ピリミジンダイマーを含んでもよい。そのようなダイマーは、典型的には、紫外線による損傷に関連付けられ、皮膚メラノーマの主因である。標的ポリヌクレオチド中の１つ以上のヌクレオチドは、例えば標識またはタグによって修飾され得る。好適な標識は、上記に説明される。標的ポリヌクレオチドは、１つ以上のスペーサを含み得る。
【０２４０】
ヌクレオチドは上記に定義されている。ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドには、典型的には、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、及びデオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）が含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＵＭＰから選択される。
【０２４１】
ヌクレオチドは、脱塩基（すなわち、核酸塩基を欠く）であってもよい。
【０２４２】
ポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、任意の様式で互いに結合され得る。ヌクレオチドは、典型的には、核酸と同様に、それらの糖及びリン酸基によって結合される。ヌクレオチドは、ピリミジンダイマーと同様に、それらの核酸塩基を介して接続され得る。
【０２４３】
ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドの少なくとも一部は、好ましくは、二本鎖である。一本鎖ポリヌクレオチドは、そこにハイブリダイズした１つ以上のプライマーを有し、それゆえに二本鎖ポリヌクレオチドの１つ以上の短い領域を含む。プライマーは、標的ポリヌクレオチドと同じ種類のポリヌクレオチドであってもよく、異なる種類のポリヌクレオチドであってもよい。
【０２４４】
ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの１本の鎖にハイブリダイズされたＲＮＡの１本の鎖を含むことができる。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の合成核酸、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーであり得る。
【０２４５】
この方法を用いて、標的ポリヌクレオチドの全部または一部のみは、特徴付けられ得る。標的ポリヌクレオチドは、任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００ヌクレオチド対の長さであり得る。ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌクレオチド対、５０００以上のヌクレオチド対の長さ、または１０００００以上のヌクレオチド対の長さであり得る。
【０２４６】
標的ポリヌクレオチド等の標的分析物は、任意の好適な試料中に存在する。本発明は、典型的には、標的ポリヌクレオチド等の標的分析物を含むことが既知であるか、それを含む疑いがある試料上で実施される。代替的には、本発明は、１つ以上の標的ポリヌクレオチド等の１つ以上の標的分析物の同一性を確認するために、試料上で実施されてもよく、試料中のその存在が既知であるかまたは予想される。
【０２４７】
試料は、生体試料であり得る。本発明は、任意の有機体または微生物から得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。有機体または微生物は、典型的には、古細菌、原核生物、または真核生物であり、典型的には、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、及び原生生物界の５つの界のうちの１つに属する。本発明は、任意のウイルスから得られたかまたは抽出された試料上でインビトロで実施され得る。試料は、好ましくは、流体試料である。試料は、典型的には、患者の体液を含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液、または羊水であり得るが、好ましくは、血液、血漿、または血清である。典型的には、試料は、人間起源であるが、代替的には、別の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、またはブタなどの商業用飼育動物であり得るか、または代替的には、ネコまたはイヌなどの愛玩動物であり得る。代替的には、植物起源の試料は、典型的には、穀物、マメ科植物、果物、または野菜等の商業用作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿から得られる。
【０２４８】
試料は、非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは、流体試料である。非生体試料の例としては、外科用流体、水、例えば飲料水、海水、または河川水、及び臨床検査用の試薬が挙げられる。
【０２４９】
試料は、典型的には、アッセイされる前に、例えば、遠心分離によって、または不必要な分子もしくは細胞を濾過して取り除く膜を通した通過によって、処理される。試料は、採取された直後に測定されてもよい。試料はまた、典型的には、アッセイの前に、好ましくは−７０℃未満で保管され得る。
【０２５０】
ポアは、典型的には、膜内に存在する。本発明に従い、任意の膜を使用することができる。好適な膜は、当該技術分野で周知である。膜は、好ましくは、スフィンゴミエリンを含む。膜は、好ましくは、両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１つの親水性部分と少なくとも１つの親油性または疎水性部分の両方を有する、リン脂質等の両親媒性分子から形成された層である。両親媒性分子は、合成または天然であり得る。非天然型両親媒性物質及び単分子層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で既知であり、例えば、ブロックコポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７−１０４５０）が含まれる。ブロックコポリマーは、２つ以上のモノマーサブユニットが共に重合されて単一ポリマー鎖を作製する、ポリマー材料である。ブロックコポリマーは、典型的には、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有しない固有の特性を有し得る。ブロックコポリマーは、モノマーサブユニットのうちの１つが疎水性（すなわち、親油性）である一方、他のサブユニット（複数可）が水性媒体中で親水性であるように操作することができる。この場合、ブロックコポリマーは、両親媒性特性を保有し得、生体膜を模倣する構造を形成し得る。ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）であり得るが、３つ以上のモノマーサブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置でもあり得る。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、またはペンタブロックコポリマーであってもよい。
【０２５１】
両親媒性層は、一分子層または二分子層であり得る。両親媒性層は、典型的には、平面脂質二分子層または支持二分子層である。
【０２５２】
両親媒性層は、典型的には、脂質二分子層である。脂質二分子層は、細胞膜のモデルであり、幅広い実験研究のための優秀な基盤として働く。例えば、脂質二分子層は、シングルチャネルレコーディングによる膜タンパク質のインビトロ調査のために使用することができる。代替的には、脂質二分子層は、幅広い物質の存在を検出するためのバイオセンサとして使用することができる。脂質に二分子層は、任意の脂質二分子層であり得る。好適な脂質二分子層には、平面脂質二分子層、支持二分子層、またはリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。脂質二分子層は、好ましくは、平面脂質二分子層である。好適な脂質二分子層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）、及び国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【０２５３】
脂質二分子層を形成するための方法は、当該技術分野で既知である。好適な方法は実施例に開示されている。脂質二分子層は、Ｍｏｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２；６９：３５６１−３５６６）の方法によって一般に形成され、この方法において、脂質一分子層は、水溶液／空気界面上で、その界面に対して直角な孔の両側を通り過ぎて担持される。
【０２５４】
Ｍｏｎｔａｌ  ＆  Ｍｕｅｌｌｅｒの方法は、費用効果があり、かつタンパク質ポア挿入のために好適である高品質の脂質二分子層を形成する比較的簡単な形成方法であるため、普及している。二分子層形成の他の一般的な方法には、先端浸漬（ｔｉｐ−ｄｉｐｐｉｎｇ）、二分子層の塗装（ｐａｉｎｔｉｎｇ  ｂｉｌａｙｅｒｓ）、及びリポソーム二分子層のパッチクランプが含まれる。
【０２５５】
好ましい実施形態では、脂質二分子層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載されるように形成される。別の好ましい実施形態において、膜は固体層である。固体層は生物起源のものではない。換言すれば、固体層は、有機体または細胞等の生物学的環境、もしくは生物学的に利用可能な構造の合成的に製造されたバージョンに由来しないか、またはそれらから単離されない。固体層は、微細電子材料、絶縁材料、例えばＳｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３、及びＳｉＯ、有機及び無機ポリマー、例えばポリアミド、プラスチック、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）またはエラストマー、例えば二成分付加硬化シリコンゴム、及びガラスを含むがこれらに限定されない有機及び無機材料の両方から形成することができる。固体層は、グラフェン等の単原子層、またはいくつかのみの原子の厚さの層から形成することができる。好適なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。
【０２５６】
本方法は、典型的には、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然型脂質二分子層、または（ｉｉｉ）ポアが内部に挿入された細胞を使用して実施される。本方法は、典型的には、人工両親媒性層、例えば人工脂質二分子層を使用して実施される。層は、ポアに加えて、他の膜貫通タンパク質及び／または膜内タンパク質、ならびに他の分子を含んでもよい。好適な装置及び条件は、以下に論じられる。本発明の方法は、典型的には、インビトロで実施される。標的ポリヌクレオチド等の分析物は、膜に結合されてもよい。これは、任意の既知の方法を用いて行われ得る。膜が、脂質二分子層（上記に詳細に論じられるように）等の両親媒性層である場合、標的ポリヌクレオチド等の分析物は、好ましくは、膜中に存在するポリペプチドまたは膜中に存在する疎水性アンカーを介して膜に結合される。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、またはアミノ酸である。
【０２５７】
標的ポリヌクレオチド等の分析物は、膜に直接結合されてもよい。標的ポリヌクレオチド等の分析物は、好ましくは、リンカーを介して膜に結合される。好ましいリンカーには、ポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドが膜に直接結合されている場合、膜とポアの内部との間の距離に起因して、特徴付けの実行がポリヌクレオチドの末端まで続けることができないため、いくつかのデータが失われることになる。リンカーが使用される場合、ポリヌクレオチドは完了するまで処理されることができる。リンカーが使用される場合、リンカーは、任意の位置でポリヌクレオチドに結合され得る。リンカーは、好ましくは、テールポリマーにおいてポリヌクレオチドに結合される。
【０２５８】
結合は、安定していても一時的であってもよい。特定の用途の場合、結合の一時的な性質が好ましい。安定な結合分子がポリヌクレオチドの５’または３’末端のいずれかに直接結合された場合、二分子層とポアの内部との間の距離に起因して、特徴付けの実行がポリヌクレオチドの末端まで続けることができないため、いくつかのデータが失われることになる。結合が一時的である場合、結合した末端がランダムに二分子層から分離されると、ポリヌクレオチドは完了するまで処理されることができる。膜と共に安定または過渡的な関係を形成する化学基は、以下により詳細に論じられる。標的ポリヌクレオチド等の分析物は、コレステロールまたは脂肪アシル鎖を使用して、脂質二分子層等の両親媒性層に一時的に結合され得る。ヘキサデカン酸などの６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を使用することができる。
【０２５９】
好ましい実施形態において、標的ポリヌクレオチド等の分析物は、両親媒性層に結合される。核酸の合成脂質二分子層への標的ポリヌクレオチド等の分析物の結合は、以前に、様々な異なるテザリング戦略を用いて実施されてきた。これらは、以下の表５に要約される。
【表８】
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【０２６０】
ポリヌクレオチドは、チオール、コレステロール、脂質、及びビオチン基等の反応性基の付加のために容易に適合可能である、合成反応において修飾ホスホラミダイトを用いて官能化され得る。これらの異なる結合化学は、ポリヌクレオチドのための一式の結合オプションを与える。欠く異なる修飾基は、わずかに異なる方法でポリヌクレオチドをつなぎ、結合は、必ずしも永久的ではないため、ポリヌクレオチドについて異なる滞留時間を二分子層に与える。一時的結合の利点は、上記に論じられる。
【０２６１】
ポリヌクレオチドの結合はまた、いくつかの他の手段によって達成され得るが、但し、反応性基がポリヌクレオチドに付加され得ることを条件とする。ＤＮＡのいずれかの末端への反応性基の付加は、以前に報告されている。ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰγＳを使用して、チオール基をｓｓＤＮＡの５’に付加することができる（Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｐ．  Ｚ．Ｑｉｎ（２００７）．“Ａ  ｆａｃｉｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｔｔａｃｈｉｎｇ  ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ  ｓｐｉｎ  ｌａｂｅｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ５’  ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５（１０）：ｅ７７）。ビオチン、チオール、及びフルオロフォアなどの化学基のより多様な選択は、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３’に組み込むために、末端トランスフェラーゼを使用して付加することができる（Ｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｐ．Ｔｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）．“Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．”Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６９（２）：３７６−８２）。
【０２６２】
代替的には、反応基は、二分子層に既に結合されているものに相補的なＤＮＡの短片の付加であると考えられ、その結果、ハイブリダイゼーションによって結合が達成され得る。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩを使用した、ｓｓＤＮＡの短片のライゲーションが報告されている（Ｔｒｏｕｔｔ，Ａ．Ｂ．，Ｍ．Ｇ．ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．“Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ＰＣＲ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８９（２０）：９８２３−５）。代替的には、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかは、天然のｄｓＤＮＡに連結され、その後２本の鎖を熱変性または化学的変性によって分離することができる。天然のｄｓＤＮＡには、ｓｓＤＮＡの片を二本鎖の末端の一方または両方に付加するか、もしくは一方または両方の末端にｄｓＤＮＡを付加することが可能である。次いで、二本鎖が融解すると、各一本鎖は、ｓｓＤＮＡがライゲーションに使用された場合、５’または３’修飾のいずれかを有することになるか、もしくはｄｓＤＮＡがライゲーションに使用された場合、５’末端、３’末端、またはその両方における修飾を有することになる。ポリヌクレオチドが合成鎖である場合、ポリヌクレオチドの化学合成中に結合化学が組み込まれ得る。例えば、ポリヌクレオチドは、反応性基が結合したプライマーを使用して合成することができる。
【０２６３】
ゲノムＤＮＡの部分の増幅のための一般的な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することである。ここでは、２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＤＮＡの同じ部分のいくつかのコピーを生成することができ、各コピーについて、二本鎖中の各鎖の５’が、合成ポリヌクレオチドとなる。コレステロール、チオール、ビオチン、または脂質等の反応性基を有するアンチセンスプライマーを使用することによって、増幅された標的ＤＮＡの各コピーが、結合のための反応性基を含むことになる。
【０２６４】
本発明の方法で使用されるポアは、本発明のポア（すなわち、本発明の少なくとも１つの変異体モノマーまたは本発明の少なくとも１つの構造体を含むポア）である。ポアは、上記に論じられる方法のいずれかにおいて化学的に修飾され得る。ポアは、好ましくは、上記に論じられるように標的分析物と相互作用することができる共有結合アダプターで修飾される。
【０２６５】
方法は、好ましくは、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのものであり、ステップ（ａ）が、標的ポリヌクレオチドをポア及びポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることを含み、ポリヌクレオチド結合タンパク質がポアを通って標的ポリヌクレオチドの移動を制御する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合することができ、かつポアを通るその移動を制御することができる任意のタンパク質であり得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを判定することは、当該技術分野において簡単である。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用するか、またはそれを修飾する。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。部分は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させる、すなわちその移動を制御することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。
【０２６６】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素である。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの特性と相互作用しかつそれを修飾することができるポリペプチドである。酵素は、それを開裂して個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを形成することによってポリヌクレオチドを修飾し得る。酵素は、特定の位置にそれを配向するか、またはそれを移動させることによってポリヌクレオチドを修飾し得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質は、典型的には、ポリヌクレオチド結合ドメイン及び触媒ドメインを含む。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、それが、標的配列に結合し、かつポアを通るその移動を制御することができる限り、酵素活性を提示する必要がない。例えば、酵素は、その酵素活性を除去するように修飾されてもよく、または酵素として作用することを防ぐ条件下で使用されてもよい。そのような条件は、以下により詳細に論じられる。
【０２６７】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の構造体に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０、及び３．１．３１のうちのいずれかのメンバーに由来する。酵素は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されているもののいずれかであり得る。
【０２６８】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、及びトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。好適な酵素には、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩ（配列番号６）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素（配列番号８）、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＲｅｃＪ（配列番号１０）及びバクテリオファージラムダエキソヌクレアーゼ（配列番号１２）、ならびにそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。配列番号１０に示される配列またはそのバリアントを含む３つのサブユニットは相互作用して、トリマーエキソヌクレアーゼを形成する。酵素は、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）またはそのバリアントであり得る。酵素は、ヘリカーゼであっても、ヘリカーゼ由来であってもよい。典型的なヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８、ＲｅｃＤ、またはＸＰＤ、例えばＨｅｌ３０８  Ｍｂｕ（配列番号１３）またはその変異体である。
【０２６９】
酵素は、最も好ましくは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＲｅｃＤヘリカーゼ、例えばＴｒａＩヘリカーゼまたはＴｒｗＣヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼまたはＤｄａヘリカーゼに由来する。ヘリカーゼは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５２５７９号（ＷＯ２０１３／０５７４９５として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７４号（ＷＯ２０１３／０９８５６２として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５３２７３号（ＷＯ２０１３０９８５６１として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２５号（ＷＯ２０１４／０１３２６０として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２４号（ＷＯ２０１４／０１３２５９として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５１９２８号（ＷＯ２０１４／０１３２６２として公開）、及び第ＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５２７３６号に開示されるヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼ、またはヘリカーゼ構造体のいずれかであり得る。
【０２７０】
ヘリカーゼは、好ましくは、配列番号１８（Ｄｄａ）に示される配列またはそのバリアントを含む。バリアントは、膜貫通ポアについて以下に論じられる方法のいずれかにおいて天然配列とは異なり得る。配列番号１８の好ましいバリアントは、（ａ）Ｅ９４Ｃ及びＡ３６０Ｃ、または（ｂ）Ｅ９４Ｃ、Ａ３６０Ｃ、Ｃ１０９Ａ、及びＣ１３６Ａ、ならびに任意に（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（すなわち、Ｍ１の欠失、及びその後Ｇ１及びＧ２の付加）を含む。
【０２７１】
配列番号４、６、８、１０、１２、１３、または１８のバリアントは、配列番号４、６、８、１０、１２、１３、または１８のものとは異なるアミノ酸配列を有し、かつポリヌクレオチド結合能力を保持する酵素である。バリアントは、高い塩濃度及び／または室温において、ポリヌクレオチドの結合を促進し、かつ／またはその活性を容易にする修飾を含んでもよい。
【０２７２】
配列番号４、６、８、１０、１２、１３、または１８のアミノ酸配列の全長にわたって、バリアントは、好ましくは、アミノ酸同一性に基づき、その配列に対して少なくとも５０％のホモログを有することになる。より好ましくは、バリアントポリペプチドは、配列全体にわたって、アミノ酸同一性に基づき、配列番号４、６、８、１０、１２、１３、または１８のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％のホモログを有し得る。２００個以上、例えば２３０、２５０、２７０、または２８０個以上の連続したアミノ酸のストレッチにわたって、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性があってもよい（「ハードホモロジー（ｈａｒｄｈｏｍｏｌｏｇｙ）」）。相同性は、上記に説明されるように判定される。バリアントは、配列番号２に関して上記に論じられる方法のいずれかにおいて野生型配列とは異なり得る。酵素は、下記に論じられるようにポアに共有結合され得る。
【０２７３】
ナノポアを使用してポリヌクレオチドのシークエンシングを行うためには、２つの主要な戦略、すなわち鎖のシークエンシング及びエキソヌクレアーゼのシークエンシングが存在する。本発明の方法は、鎖のシークエンシングまたはエキソヌクレアーゼのシークエンシングのいずれかの方法に関し得る。
【０２７４】
鎖シークエンシングにおいて、ＤＮＡは、印加された電位と共にまたはそれに対して、ナノポアを通って転移される。二本鎖ＤＮＡ上で進行的または前進的に作用するエキソヌクレアーゼをポアのシス側に使用して、印加された電位化で、または逆電位下のトランス側で、残りの一本鎖を貫通接続することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを解くヘリカーゼも、類似の様式で使用することができる。ポリメラーゼも使用することができる。印加された電位に対する鎖転移を必要とするシークエンシングアプリケーションの可能性もあるが、ＤＮＡはまず、逆電位下または電位のない状態下で酵素によって「捕まら」なければならない。その後、結合に続いて電位が戻されると、鎖は、ポアをシスからトランスへと通り、電流によって拡張された立体構造で保持されることになる。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼまたは一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは分子モーターとして作用して、印加された電位に対して、新たに転移された一本鎖を、制御された様式でポアを通ってトランスからシスへと引き戻すことができる。
【０２７５】
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法は、標的配列を、ポア及びヘリカーゼ酵素と接触させることを伴う。方法において、任意のヘリカーゼを使用することができる。ヘリカーゼは、ポアに対して２つのモードで働き得る。最初に、本方法は、好ましくは、それが印加された電位から生じる電界と共にポアを通る標的配列の移動を制御するように、ヘリカーゼを使用して実施される。このモードにおいて、ＤＮＡの５’末端がまずポア内に捕捉され、酵素は、それが最終的に二分子層のトランス側を通って転移するまで、標的配列が電界と共にポアに通されるように、ＤＮＡのポア内への移動を制御する。代替的には、方法は、好ましくは、ヘリカーゼ酵素が、印加された電位から生じる電界に対してポアを通る標的配列の移動を制御するように実施される。このモードにおいて、ＤＮＡの３’末端がまずポア内に捕捉され、酵素は、標的配列が、最終的に二分子層のシス側に戻って排出されるまで、印加された電界に対してポアの外に引き出されるように、ポアを通るＤＮＡの移動を制御する。
【０２７６】
エキソヌクレアーゼシークエンシングにおいて、エキソヌクレアーゼは、個々のヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドの一方の末端から放出し、これらの個々のヌクレオチドは、以下に論じられるように同定される。別の実施形態では、標的ポリヌクレオチドを特徴付ける方法は、標的配列をポア及びエキソヌクレアーゼ酵素と接触させることを伴う。方法において、下記論じられるエキソヌクレアーゼのいずれかを使用することができる。酵素は、下記に論じられるようにポアに共有結合され得る。
【０２７７】
エキソヌクレアーゼは、典型的には、ポリヌクレオチドの一方の末端にラッチされ、その末端から１つずつのヌクレオチドで配列を消化する酵素である。エキソヌクレアーゼは、５’から３’方向または３’から５’方向でポリヌクレオチドを消化することができる。エキソヌクレアーゼが結合するポリヌクレオチドの末端は、典型的には、使用される酵素の選択を介して、かつ／または当該技術分野で既知の方法を使用して判定される。典型的には、ポリヌクレオチドの両端におけるヒドロキシル基またはキャップ構造を使用して、ポリヌクレオチドの特定の末端へのエキソヌクレアーゼの結合を防止または容易にすることができる。
【０２７８】
方法は、上記に論じられるようなヌクレオチドの一部の特徴付けまたは同定を可能にする速度でヌクレオチドがポリヌクレオチドの末端から消化されるように、ポリヌクレオチドをエキソ促進するヌクレアーゼと接触させることを伴う。これを行う方法は、当該技術分野で周知である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してそれらが同定され得るように、ポリペプチドの末端から単一のアミノ酸を連続的に消化するためにエドマン分解が使用される。本発明において、相同法が使用され得る。
【０２７９】
エキソヌクレアーゼが機能する速度は、典型的には、野生型エキソヌクレアーゼの最適速度よりも遅い。本発明の方法におけるエキソヌクレアーゼの活性の好適な速度は、毎秒０．５〜１０００ヌクレオチド、毎秒０．６〜５００ヌクレオチド、毎秒０．７〜２００ヌクレオチド、毎秒０．８〜１００ヌクレオチド、毎秒０．９〜５０ヌクレオチド、毎秒１〜２０または１０ヌクレオチドの消化を伴う。速度は、好ましくは、毎秒１、１０、１００、５００、または１０００ヌクレオチドである。エキソヌクレアーゼ活性の好適な速度は、様々な方法で達成することができる。例えば、活性の低減された最適速度を有するバリアントエキソヌクレアーゼが本発明に従って使用され得る。
【０２８０】
本発明の方法は、標的ポリヌクレオチド等の標的分析物の１つ以上の特徴を測定することを含む。方法は、標的ポリヌクレオチド等の標的分析物の２、３、４、または５つ以上の特徴を測定することを含み得る。標的ポリヌクレオチドについて、１つ以上の特徴は、好ましくは、（ｉ）標的ポリヌクレオチドの長さ、（ｉｉ）標的ポリヌクレオチドの同一性、（ｉｉｉ）標的ポリヌクレオチドの配列、（ｉｖ）標的ポリヌクレオチドの二次構造、及び（ｖ）標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かから選択される。本発明に従って、（ｉ）〜（ｖ）の任意の組み合わせが測定され得る。
【０２８１】
（ｉ）について、ポリヌクレオチドの長さは、標的ポリヌクレオチドとポアとの間の相互作用の数を用いて測定され得る。
【０２８２】
（ｉｉ）について、ポリヌクレオチドの同一性は、いくつかの方法で測定され得る。ポリヌクレオチドの同一性は、標的ポリヌクレオチドの配列の測定と併せて、または標的ポリヌクレオチドの配列の測定を伴わずに測定され得る。前者は簡単であり、ポリヌクレオチドがシークエンシングされ、それにより同定される。後者は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、ポリヌクレオチド中の特定のモチーフの存在が測定され得る（ポリヌクレオチドの残りの配列を測定することなく）。代替的には、本方法における特定の電気的及び／または光学的シグナルの測定は、特定の供給源から得られるものとして標的ポリヌクレオチドを同定することができる。
【０２８３】
（ｉｉｉ）について、ポリヌクレオチドの配列は、前述のように判定することができる。好適なシークエンシング方法、特に電気的測定を使用するものは、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されている。
【０２８４】
（ｉｖ）について、二次構造は、様々な方法で測定され得る。例えば、方法が電気的測定を伴う場合、二次構造は、滞留時間の変化またはポアを通過する電流の変化を使用して測定され得る。これは、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの領域を識別することを可能にする。
【０２８５】
（ｖ）について、任意の修飾の存在または不在が測定され得る。方法は、好ましくは、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、１つ以上のタンパク質によって、または１つ以上の標識、タグ、もしくはスペーサによって標的ポリヌクレオチドが修飾されているか否かを判定することを含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、これは下記に説明される方法を使用して測定することができる。例えば、メチルシオチン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｏｔｓｉｎｅ）は、各ヌクレオチドとのその相互作用中にポアを通過する電流に基づき、シトシンと区別され得る。
【０２８６】
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドの配列を推定する方法を提供する。本発明はさらに、標的ポリヌクレオチドをシークエンシングする方法を提供する。
【０２８７】
様々な異なる種類の測定を行うことができる。これは、電気的測定及び光学的測定を含むが、これらに限定されない。考えられる電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｊａｎ  １２；１１（１）：２７９−８５）、及びＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）が挙げられる。蛍光の測定を含む好適な光学的方法は、Ｊ．  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。光学的測定は、電気的測定（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）と組み合わせられ得る。測定は、膜貫通電流測定、例えば、ポアを通過するイオン電流の測定であり得る。
【０２８８】
電気的測定は、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されているような標準的な単一チャネル記録装置を使用して行われ得る。代替的には、電気的測定は、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号及び国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載されているように、マルチチャネルシステムを使用して行われ得る。
【０２８９】
好ましい実施形態において、方法は、
（ａ）標的ポリヌクレオチドがポアを通って移動し、結合タンパク質がポアを通る標的ポリヌクレオチドの移動を制御するように、標的ポリヌクレオチドを本発明のポア及びポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることと、
（ｂ）ポリヌクレオチドがポアに対して移動する間に、ポアを通過する電流であって、電流が標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特徴を示す、電流を測定し、それによって標的ポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。
【０２９０】
方法は、ポアが膜内に挿入される膜／ポアシステムを調査するために好適な任意の装置を使用して実施することができる。方法は、膜貫通ポアセンシングのために好適な任意の装置を使用して実施され得る。例えば、装置は、水溶液を含むチャンバと、チャンバを２つの部分に分ける障壁とを備える。障壁は、ポアを含む膜が形成される孔を有する。
【０２９１】
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ２００８／１０２１２０）に記載される装置を使用して実施され得る。
【０２９２】
方法は、ポアに対して標的ポリヌクレオチド等の分析物が移動する間の、ポアを通過する電流を測定することを伴う。したがって、装置はまた、電位を印加し、膜及びポアにわたる電気シグナルを測定することができる電気回路を含み得る。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実施され得る。方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を伴う。
【０２９３】
本発明の方法は、ポアに対して標的ポリヌクレオチド等の分析物が移動する間の、ポアを通過する電流の測定を伴う。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するために好適な条件は、当該技術分野で既知であり、実施例において開示される。方法は、典型的には、膜及びポアにわたって電圧が印加された状態で実施される。使用される電圧は、典型的には＋２Ｖ〜−２Ｖ、典型的には−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、及び０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、及び＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲内である。使用される電圧は、より好ましくは１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲内である。増加した印加電位を使用することによって、ポアによる異なるヌクレオチド間の識別を増加させることが可能である。
【０２９４】
方法は、典型的には、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン塩、例えば塩化物塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの任意のチャージキャリアの存在下で実施される。チャージキャリアには、イオン性液体または有機塩、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウム、または１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドが含まれ得る。上記の例示的な装置において、塩は、チャンバ内の水溶液中に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、または塩化セシウム（ＣｓＣｌ）が典型的には使用される。ＫＣｌが好ましい。塩濃度は、飽和であり得る。塩濃度は、３Ｍ以下であり得、典型的には、０．１〜２．５Ｍ、０．３〜１．９Ｍ、０．５〜１．８Ｍ、０．７〜１．７Ｍ、０．９〜１．６Ｍ、または１Ｍ〜１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。方法は、好ましくは、少なくとも０．３Ｍ、例えば少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍ、または少なくとも３．０Ｍの塩濃度を使用して実施される。高い塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比をもたらし、通常の電流変動のバックグラウンドに対して、ヌクレオチドの存在を示す電流の同定を可能にする。
【０２９５】
方法は、典型的には、緩衝液の存在下で実施される。上記に論じられる例示的な装置において、緩衝液は、チャンバ内の水溶液中に存在する。本発明の方法において、任意の緩衝液を使用することができる。典型的には、緩衝液はＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、典型的には、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、または７．０〜８．８、または７．５〜８．５のｐＨで実施される。使用されるｐＨは、好ましくは、約７．５である。
【０２９６】
方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０°Ｃ、１９℃〜７０℃、または２０℃〜６０°Ｃで実施され得る。方法は、典型的には、室温で実施される。方法は、任意に、酵素機能を支持する温度、例えば約３７℃で実施される。
【０２９７】
方法は、典型的には、遊離ヌクレオチドまたは遊離ヌクレオチド類似体、及びヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼ等のポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を容易にする酵素補因子の存在下で実施される。遊離ヌクレオチドは、上記に論じられる個々のヌクレオチドのいずれかの１つ以上であり得る。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、またはｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ヘリカーゼが機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【０２９８】
標的ポリヌクレオチドは、任意の順序でポア及びポリヌクレオチド結合タンパク質と接触させることができる。標的ポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチド結合タンパク質及びポアと接触される場合、ポリヌクレオチドはまず、ポリヌクレオチド結合タンパク質と複合体を形成することが好ましい。ポアにわたって電圧が印加されると、標的ポリヌクレオチド／タンパク質複合体は次いで、ポアと複合体を形成し、ポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０２９９】
個々のヌクレオチドを同定する方法
本発明はまた、個々のヌクレオチドを特徴付ける方法を提供する。換言すれば、標的分析物は個々のヌクレオチドである。方法は、ヌクレオチドがポアと相互作用するようにヌクレオチドを本発明のポアと接触させることと、相互作用中にポアを通過する電流を測定することと、それによってヌクレオチドを特徴付けることと、を含む。したがって、本発明は、個々のヌクレオチドのナノポアセンシングを含む。本発明はまた、相互作用中にポアを通過する電流を測定することと、それによってヌクレオチドの同一性を判定することと、を含む、個々のヌクレオチドを同定する方法を提供する。上記に論じられる本発明のポアのいずれかが使用され得る。ポアは、好ましくは、上記に論じられるように分子アダプターを用いて化学的に修飾される。
【０３００】
ヌクレオチドについて特異的な様式で電流がポアを通過する場合（すなわち、ヌクレオチドに関連付けられる固有の電流がポアを通過することが検出された場合）、ヌクレオチドは存在する。ヌクレオチドについて特異的な様式で電流がポアを通過しない場合、ヌクレオチドは不在である。
【０３０１】
本発明を使用して、それらがポアを通過する電流にもたらす異なる影響に基づいて、類似構造のヌクレオチドを区別することができる。個々のヌクレオチドは、それらがポアと相互作用するときの電流振幅から、単一分子レベルで同定することができる。本発明を使用して、試料中に特定のヌクレオチドが存在するか否かを判定することもできる。本発明を使用して、試料中の特定のヌクレオチドの濃度を測定することもできる。
【０３０２】
ポアは、典型的には、膜内に存在する。方法は、上記に論じられる任意の好適な膜／ポア系を使用して実施され得る。
【０３０３】
個々のヌクレオチドは、単一のヌクレオチドである。個々のヌクレオチドは、ヌクレオチド結合によって別のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと結合していないものである。ヌクレオチド結合は、ヌクレオチドのリン酸基のうちの１つが、別のヌクレオチドの糖基に結合することを伴う。個々のヌクレオチドは、典型的には、ヌクレオチドによって、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００ヌクレオチドの別のポリヌクレオチドに結合していないものである。例えば、個々のヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ鎖から消化されている。本発明の方法は、任意のヌクレオチドを同定するために使用され得る。ヌクレオチドは、上記に論じられるもののいずれかであり得る。
【０３０４】
ヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の核酸配列の消化に由来し得る。核酸配列は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して消化され得る。好適な方法は、酵素または触媒を使用するものを含むが、これに限定されない。核酸の触媒消化は、Ｄｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２；４１：６６９−６７７に開示されている。
【０３０５】
単一のポリヌクレオチドからの個々のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの全部または一部をシークエンシングするために、連続した様式でポアと接触され得る。ポリヌクレオチドをシークエンシングすることが、上記により詳細に論じられる。
【０３０６】
ヌクレオチドは、膜の両側のポアと接触され得る。ヌクレオチドは、膜の両側のポアに導入され得る。ヌクレオチドは、ヌクレオチドがポアを通って膜の反対側に通過することを可能にする膜の側面と接触され得る。例えば、ヌクレオチドはポアの末端と接触されており、その天然環境において、ヌクレオチドがポアを通過し得るようにポアのバレルまたはチャネルへイオンまたはヌクレオチド等の小分子の侵入を可能にする。そのような場合において、ヌクレオチドは、ポアのバレルまたはチャネルを通って膜を通過する際に、ポア及び／またはアダプターと相互作用する。代替的には、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがアダプターを介してまたはそれと併せてポアと相互作用し、ポアから解離し、膜の同じ側に留まることを可能にする、膜の側面と接触され得る。本発明は、アダプターの位置が固定されているポアを提供する。その結果として、ヌクレオチドは、好ましくは、アダプターがヌクレオチドと相互作用することを可能にするポアの末端と接触される。
【０３０７】
個々のヌクレオチドは、任意の様式及び任意の部位でポアと相互作用し得る。ヌクレオチドは、好ましくは、アダプターを介してまたはそれと併せて、ポアに逆向きに結合する。ヌクレオチドは、最も好ましくは、それが膜にわたってポアを通過する間に、アダプターを介してまたはそれと併せて、ポアに逆向きに結合する。ヌクレオチドはまた、それが膜にわたってポアを通過する間に、アダプターを介してまたはそれと併せて、ポアのバレルまたはチャネルに逆向きに結合することができる。
【０３０８】
ヌクレオチドとポアとの間の相互作用の間、ヌクレオチドは、そのヌクレオチドについて特異的な様式でポアを通って流れている電流に影響を及ぼす。例えば、特定のヌクレオチドは、特定の平均時間にわたり、かつ特定の程度まで、ポアを通って流れている電流を低減させることになる。換言すれば、ポアを通って流れている電流は、特定のヌクレオチドについて固有である。分析物の存在下で対照実験を実施して、ポアを通って流れている電流に対して特定のヌクレオチドが有する影響を判定することができる。試験試料上で本発明の方法を実施した結果を、その後、そのような対照実験から得られた結果と比較して、試料中の特定のヌクレオチドを同定するか、または特定のヌクレオチドが試料中に存在するかどうかを判定することができる。特定のヌクレオチドを示す様式でポアを通って流れている電流が影響される周波数を使用して、試料中のそのヌクレオチドの濃度を判定することができる。試料内の異なるヌクレオチドの割合も計算することができる。例えば、ｄＣＭＰ対メチルｄＣＭＰの割合を計算することができる。
【０３０９】
方法は、上記に論じられる任意の装置、試料、または条件の使用を含み得る。
【０３１０】
センサ形成する方法
本発明はまた、標的ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサを形成する方法を提供する。方法は、本発明のポアと、ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼ等のポリヌクレオチド結合タンパク質との間で複合体を形成することを含む。複合体は、ポア及びタンパク質を標的ポリヌクレオチドの存在下で接触させることと、その後、ポアにわたって電位を印加することと、によって形成され得る。印加される電位は、上記に論じられるように化学的電位または電圧電位であり得る。代替的には、複合体は、ポアをタンパク質に共有結合させることによって形成され得る。共有結合のための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ２０１０／００４２６５として公開）及び第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ２０１０／０８６６０３として公開）に開示されている。複合体は、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのセンサである。方法は、好ましくは、本発明のポアとヘリカーゼとの間で複合体を形成することを含む。上記に論じられる実施形態のいずれかを、この方法に等しく適用する。
【０３１１】
本発明はまた、標識ポリヌクレオチドを特徴づけるためのセンサを提供する。センサは、本発明のポアとポリヌクレオチド結合タンパク質との間の複合体を含む。上記に論じられる実施形態のいずれかを、本発明のセンサに等しく適用する。
【０３１２】
キット
本発明はまた、例えばシークエンシングといった、標的ポリヌクレオチドを特徴付けるためのキットを提供する。キットは、（ａ）本発明のポアと、（ｂ）膜の構成要素と、を含む。キットは、好ましくは、ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼ等のポリヌクレオチド結合タンパク質をさらに含む。上記に論じられる実施形態のいずれかを、本発明のキットに等しく適用する。
【０３１３】
本発明のキットは、上記に述べられる実施形態のいずれかを実施することを可能にする１つ以上の他の試薬または器具をさらに含み得る。そのような試薬または器具には、以下、好適な緩衝液（複数可）（水溶液）、対象から試料を得るための手段（容器もしくは針を含む器具等）、ポリヌクレオチド配列を増幅及び／もしくは発現させるための手段、上記に定義されるような膜、または電圧もしくはパッチクランプ装置のうちの１つ以上が含まれる。試薬は、流体試料が試薬を再懸濁するように、乾燥状態でキット内に存在してもよい。キットはまた、任意に、キットが本発明の方法で使用されることを可能にするための使用説明書、または本方法が使用され得る患者に関する詳細を含んでもよい。キットは、任意に、ヌクレオチドを含み得る。
【０３１４】
装置
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドをシークエンシングするなどの特徴付けのための装置を提供する。装置は、（ａ）本発明の複数のポアと、（ｂ）複数のポリヌクレオチド結合タンパク質、例えば、ヘリカーゼまたはエキソヌクレアーゼとを含み得る。装置は、分析物分析のための任意の従来の装置、例えばアレイまたはチップであり得る。
【０３１５】
アレイまたはチップは、典型的には、それぞれが単一のナノポアが挿入されたブロックコポリマー膜等の、膜の複数のウェルを含む。アレイは、電子チップ内に統合され得る。
【０３１６】
装置は、好ましくは、
複数のポア及び膜を支持することと、ポア及びタンパク質を使用して分析物の特徴付けまたはシークエンシングを実施するように動作可能であるようにすることと、が可能であるセンサデバイスと、
特徴付けまたはシークエンシングを実施するための材料を保持するための少なくとも１つの貯蔵器と、
材料を少なくとも１つの貯蔵器からセンサデバイスへと制御可能に供給するように構成された流体工学システムと、
それぞれの試料を受容するための複数の容器であって、流体工学システムが、試料を容器からセンサデバイスへと選択的に供給するように構成されている、複数の容器と、を備える。
【０３１７】
装置は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００７８９号（ＷＯ２０１０／１２２２９３として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ１０／００２２０６号（ＷＯ２０１１／０６７５５９として公開）、または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５６７９号（ＷＯ２０００／２８３１２として公開）に記載されているもののいずれかであり得る。
【０３１８】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【０３１９】
実施例１
この実施例は、ヘリカーゼ−Ｔ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ（変異Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを有する配列番号１８）がどのように使用されて、いくつかの異なる変異体ライセニンナノポアを通したＤＮＡの移動を制御したかを説明する。試験した全てのナノポアは、ＤＮＡがナノポアを通って転位した際の電流の変化を提示した。試験した変異体ナノポアは、変異体対照ナノポアと比較した際に、１）増加した範囲、２）ノイズの低減、３）改善されたシグナル：ノイズ、またはベースラインと比較した際に、５）変化した読取りヘッドのサイズを提示した。
【０３２０】
材料及び方法
ＤＮＡ構造体の調製
●７０μＬのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃを、２ｍＭのＥＤＴＡと共に７０μＬの１倍ＫＯＡｃ緩衝液に（Ｚｅｂａカラムを使用して）緩衝液交換した。
●７０ｕＬのＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃの緩衝液交換混合物を、７０ｕＬの２μＭ  ＤＮＡアダプターに添加した（シーケンスの詳細については図５を参照）。次に、試料を混合し、室温で５分間インキュベートした。
●１μＬの１４０ｍＭ  ＴＭＡＤを添加し、その試料を混合し、室温で６０分間インキュベートした。この試料は、試料Ａとして既知であった。次に、Ａｇｉｌｅｎｔ分析のために２ｕｌのアリコートを取り除いた。
【０３２１】
ＨＳ／ＡＴＰステップ
●以下の表の試薬を混合し、室温で２５分間インキュベートした。この試料は試料Ｂとして既知であった。
【表９】
2019520035.tif 000015
【０３２２】
ＳＰＲＩ精製
●１．１ｍＬのＳＰＲＩビーズを試料Ｂに添加し、次にその試料を混合し、５分間インキュベートした。
●ビーズをペレット化し、上清を除去した。次にビーズを、５０ｍＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０％ＰＥＧ８０００で洗浄した。
●試料Ｃを、７０ｕＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。
【０３２３】
酵素を用いたアダプターへの１０ｋｂラムダＣのライゲーション
●以下の表の試薬をサーモサイクラーで２０℃で１０分間インキュベートした。
【表１０】
2019520035.tif 000016
●次に、反応混合物（１倍５００ｕｌアリコート）を、２００ｕｌの２０％ＳＰＲＩビーズでＳＰＲＩ精製し、７５０ｕｌの洗浄緩衝液１で洗浄し、１２５ｕｌの溶出緩衝液１で溶出させた。最終ＤＮＡ配列（配列番号２４）を、ＤＮＡにハイブリダイズさせた。この試料は、試料Ｄとして既知であった。
【０３２４】
【表１１】
2019520035.tif 000017
【０３２５】
電気生理学実験
緩衝液（２５ｍＭ  Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中でブロックコポリマーに挿入された単一ライセニンナノポアから電気的測定を得た。ブロックコポリマーに挿入された単一ポアを達成した後に、次いで、緩衝液（２ｍＬ、２５ｍＭ  Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭフェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに通して流して任意の余剰ライセニンナノポアを除去した。次いで、１５０ｕＬの５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｋリン酸、ｐＨ８．０をシステムに通して流した。１０分後、さらに１５０μＬの５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｋリン酸塩、ｐＨ８．０をシステムに通して流し、次いでＴ４  Ｄｄａ−Ｅ９４Ｃ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、ＤＮＡ、燃料（ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ）プレミックス（合計１５０μＬ、試料Ｄ）を、単一ナノポア実験システムに流した。実験は１８０ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を監視した。
【０３２６】
結果
膜貫通ポアの領域に対する変異の影響を判定するために、いくつかの異なるナノポアを調査した。調査した変異体ポアを、それらを比較したベースラインナノポアと共に以下に列挙する（ベースラインポア１−４）。改善されたナノポアの１）改善されたナノポアではベースラインより低くなるであろうシグナル（ノイズが全ての鎖にわたって計算された鎖の全ての事象の標準偏差に等しい）の平均ノイズ、２）シグナル内の電流レベルの広がりの尺度であり、改善されたナノポアではベースラインよりも高くなるであろう平均電流範囲、３）全ての鎖中のノイズ（シグナルの平均ノイズによって分割された平均電流範囲）に対するシグナルであり、改善されたナノポアではベースラインよりも高くなるであろう、表中に引用されるノイズに対する平均シグナル、４）改善されたナノポアではベースラインより高くなり得るであろうＤＮＡの捕捉率、及び５）改善されたナノポアではベースラインの読取りヘッドのサイズに応じて増加または減少し得る読取りヘッドサイズ、を同定するために、いくつかの異なるパラメータを調べた。
【０３２７】
以下の各表は、対応するベースラインナノポア、表６＝変異体１、表７＝変異体２、表８＝変異体３、及び後に変異したポアと比較された表９＝変異体１０の関連データを含む。
ライセニン変異体１＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。（ベースライン１）
ライセニン変異体２＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。（ベースライン２）
ライセニン変異体３＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。（ベースライン３）
ライセニン変異体４＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｓ８９Ｑ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｓ８９Ｑ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体５＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｔ９１Ｓ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｔ９１Ｓ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体６＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｓ９８Ｑ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｓ９８Ｑ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体７＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｖ１００Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｖ１００Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体８＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｓ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｓ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体９＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｒ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｒ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１０＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。（ベースライン４）
ライセニン変異体１１＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０４Ｒ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０４Ｒ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１２＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０４Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０４Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１３＝ライセニン−（Ｓ７８Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｓ７８Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１４＝ライセニン−（Ｓ８２Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｓ８２Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１５＝ライセニン−（Ｅ７６Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ７６Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１６＝ライセニン−（Ｅ７６Ｓ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ７６Ｓ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｅ９７Ｓ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１７＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｙ９６Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｑ／Ｙ９６Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１８＝ライセニン−（Ｋ４５Ｄ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｋ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ４５Ｄ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｋ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体１９＝ライセニン−（Ｋ４５Ｒ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ４５Ｒ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２０＝ライセニン−（Ｄ３５Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｄ３５Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２１＝ライセニン−（Ｋ３７Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ３７Ｎ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２２＝ライセニン−（Ｋ３７Ｓ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ３７Ｓ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２３＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｑ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｑ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２４＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｅ／Ｅ９４Ｑ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｅ／Ｅ９４Ｑ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２５＝ライセニン−（Ｋ３７Ｓ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０４Ｋ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ３７Ｓ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｄ９７Ｓ／Ｔ１０４Ｋ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２６＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｍ９０Ｉ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｍ９０Ｉ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２７＝ライセニン−（Ｋ４５Ｔ／Ｖ４７Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ４５Ｔ／Ｖ４７Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２８＝ライセニン−（Ｔ５１Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｔ５１Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体２９＝ライセニン−（Ｋ４５Ｙ／Ｓ４９Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ４５Ｙ／Ｓ４９Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体３０＝ライセニン−（Ｓ４９Ｌ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｓ４９Ｌ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体３１＝ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｖ８８Ｉ／Ｍ９０Ａ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｖ８８Ｉ／Ｍ９０Ａ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体３２＝ライセニン−（Ｋ４５Ｎ／Ｓ４９Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｎ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ４５Ｎ／Ｓ４９Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｎ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
ライセニン変異体３３＝ライセニン−（Ｋ４５Ｎ／Ｖ４７Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｎ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ）９（変異Ｋ４５Ｎ／Ｖ４７Ｋ／Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｄ／Ｅ９４Ｎ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇを有する配列番号２）。
【表１２】
2019520035.tif 000018
【表１３】
2019520035.tif 000019
【表１４】
2019520035.tif 000020
【表１５】
2019520035.tif 000021
【０３２８】
読取りヘッド分析
ライセニン変異体１及び１０について、全ての可能な９ｍｅｒポリヌクレオチドの予想されるイオン電流分布のモデルを得た。モデルは、各９ｍｅｒの電流分布の平均及び標準偏差を含み得る。
【０３２９】
ライセニン変異体１及び１０について、得られたモデルの構造を調べ、比較した。図（図１及び図２を参照）は、そのような比較の実施例を提供する。各モデル（すなわち、ライセニン１または１０）の場合において、形態Ａ、ｘ＿２、ｘ＿３、ｘ＿４、ｘ＿５、ｘ＿６、ｘ＿７、ｘ＿８、ｘ＿９、ここで、ｘ＿｛ｉ｝は｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ｝から選択される任意のポリヌクレオチド）の全ての９ｍｅｒへの分布の平均を組み合わせて、平均に適用される組み合わせは中央値をとる。この中央値の平均化は、位置１、及び全ての位置についての全てのヌクレオチド｛Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ｝について、９ｍｅｒの９個の位置のいずれかに存在する際、各ヌクレオチドの中央効果をコードする３６個の中央値を得るように繰り返される。
【０３３０】
図１（ライセニン変異体１）及び２（ライセニン変異体２）は、これらの中央値を２つの異なるポアについてプロットする。図１及び図２のプロットは、読取りヘッド内の各位置における全ての塩基間の識別のレベルを示す。識別が大きいほど、その特定の位置における電流寄与レベル間の差が大きくなる。位置が読取りヘッドの一部でない場合、その位置における電流寄与は４つの塩基全てについて同様であるだろう。図２（ライセニン変異体１０）は、読取りヘッドの６位〜８位における４つの塩基全てについて同様の電流寄与を示す。図１（ライセニン変異体１）は、読取りヘッドでの任意の位置における４つの塩基全てについて同様の電流寄与を示さない。したがって、ライセニン変異体１０は、ライセニン変異体１よりも短い読取りヘッドを有する。より短い読取りヘッドは、より少ない塩基が、改善されたベースコール精度をもたらすことができる任意の時間におけるシグナルに寄与するため、有利であり得る。
【０３３１】
実施例２
この実施例は、バレル／チャネルの減少した直径を有する化学的に修飾された形成されたポアを生成するために使用されるプロトコルを説明する。
【０３３２】
モノマーライセニン試料（約１０μモル）をまず還元して、システイン残基の最大反応性を確実にし、したがって、高効率結合反応を確実にした。モノマーライセニン試料（約１０μモル）を、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）と共に５〜１５分間インキュベートした。次いで、細胞破片及び懸濁した凝集物を、２０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を通してペレット化した。次いで、可溶性画分を回収し、７Ｋｄ分子量カットのＺｅｂａスピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、１ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。
【０３３３】
結合されるべき分子（例えば、２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミド）を、好適な溶媒、典型的にはＤＭＳＯ中に１００ｍＭの濃度で溶解した。これを、１ｍＭの最終濃度まで、緩衝液交換したライセニンモノマー試料に添加した。結果として得られた溶液を３０℃で２時間インキュベートした。次いで、修飾された試料（１００ｕＬ）を、２０μＬの、Ｅｎｃａｐｓｕｌａ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ホスファチジルセリン（０．３２５ｍｇ／ｍｌ）：ＰＯＰＥ（０．５５ｍｇ／ｍｌ）：コレステロール（０．４５ｍｇ／ｍｌ）：Ｓｏｙ  ＰＣ（０．９ｍｇ／ｍｌ）：スフィンゴミエリン（０．２７５ｍｇ／ｍｌ））からの５脂質混合物を添加することによって、オリゴマー形成させた。試料を３０℃で６０分間インキュベートした。次いで、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５０６６７（ＷＯ２０１３／１５３３５９として公開）に記載されているようにゲルから精製した。
【０３３４】
実施例３
この実施例は、化学的に修飾された形成されたライセニンポアを、バレル／チャネルの減少した直径と比較した（ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）と共に、Ｅ９４Ｃ（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）を介して結合された２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミドを有するライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９。
【０３３５】
材料及び方法
ＤＮＡ構造体を、実施例１に説明されるように調製した。電気生理学実験を、実施例１に説明されるように実施した。
【０３３６】
結果
電気生理学実験は、化学的に修飾されたポア（Ｅ９４Ｃ（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）を介して結合された２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミドを有する（ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９が、１２ｐＡの中央値範囲を示したライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９より大きかった２１ｐＡの中央値範囲を提示したことを示した。この中央値範囲の増加は、ｋｍｅｒｓの分解能のためのより大きな電流スペースを提供した。
【０３３７】
図３（ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９）及び図４（Ｅ９４Ｃ（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）を介して結合された２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミドを有する、（ライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｋ／Ｅ９２Ｑ／Ｅ９４Ｃ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９は、実施例１に説明されるように中央値のプロットを示した。図４を図３と比較すると、異なる位置における異なる塩基のシグナルに対する相対的な寄与は変化されており、図４の極端（７位〜８位）における読取りヘッド位置は、シグナルに対するそれらの寄与を意味する大幅に少ない識別が大幅に減少されたことを示し、それによって、所定の瞬間にアッセイされているＫｍｅｒの長さはより短かった。このより短い読取りヘッドは、より少ない塩基が、改善されたベースコール精度をもたらすことができる任意の時間におけるシグナルに寄与するため、有利であり得る。
【０３３８】
実施例３に説明されるものと同様の実験を、Ｅ９２Ｃ（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｓ／Ｅ９２Ｃ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２を介して結合された２−ヨード−Ｎ−（２−フェニルエチル）アセトアミドを有するライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｓ／Ｅ９２Ｃ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）９及びＥ９２Ｃ（変異Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｓ／Ｅ９２Ｃ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａを有する配列番号２）を介して結合された１−ベンジル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンを有するライセニン−（Ｅ８４Ｑ／Ｅ８５Ｓ／Ｅ９２Ｃ／Ｅ９４Ｄ／Ｅ９７Ｓ／Ｔ１０６Ｋ／Ｄ１２６Ｇ／Ｃ２７２Ａ／Ｃ２８３Ａ）上で実施した。
【図１】
2019520035.tif 000029
【図２】
2019520035.tif 000030
【図３】
2019520035.tif 000031
【図４】
2019520035.tif 000032
【図５】
2019520035.tif 000033
【図６】
2019520035.tif 000034
【図７】
2019520035.tif 000035
【図８】
2019520035.tif 000036
【配列表】
2019520035000001.app
【国際調査報告】
2019520035.tif 000037
2019520035.tif 000038
2019520035.tif 000039
2019520035.tif 000040
2019520035.tif 000041
2019520035.tif 000042
2019520035.tif 000043