(57)【要約】本発明は、免疫療法を、他の従来のがん処置と組み合わせてがん患者に投与する方法を対象とし、前記投与は、ＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。本発明は、がん患者が免疫療法に応答する尤度の増大を、ＫＲＡＳバリアントの存在に基づいて決定するための診断方法をさらに提供する。本発明は、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、免疫系を変化させているという発見に関する。具体的には、本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳバリアント被験体は、成功したがんの処置について利用される、弱化した免疫系を有することが示されている。本明細書に記載されるように、そのような免疫系は、適当な免疫調節剤の投与により、強化または刺激することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん被験体を処置する方法であって、免疫療法を、１種または複数の従来のがん処置と組み合わせて前記被験体に投与することを含み、前記投与はＫＲＡＳバリアントの存在に依存する、方法。
【請求項２】
前記被験体が、１種または複数の従来のがん処置で処置されているかまたは前に処置されたことがある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１種または複数の従来のがん処置が、化学療法、放射線療法、または手術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がんまたは頭頸部がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、前記被験体のための免疫療法の有益な効果の増大を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫療法が免疫賦活分子の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫賦活分子が、Ｔ細胞活性化因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫賦活分子が、樹状細胞活性化／成熟因子である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫療法が、モノクローナル抗体またはその断片の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が、がん細胞の表面に発現された抗原に特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫療法が抗ＥＧＦＲ抗体療法である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫療法がセツキシマブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一塩基多型が、配列番号１３の４位におけるＧである、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
ＫＲＡＳバリアントがん被験体のための免疫療法の有益な効果の増大を予測する方法であって、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が免疫療法から生ずる有益な効果の増大を示す、方法。
【請求項１５】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がんまたは頭頸部がんである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
免疫系を刺激または強化するようにデザインされた薬物の投与または処置を伴う臨床試験のデザインに適した標的患者または患者の標的亜集団を同定するための方法であって、患者試料または患者試料の集団中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、適した標的患者または患者の亜集団の同定を示す、方法。
【請求項１７】
チェックポイント阻害剤として機能する薬物の投与または処置を伴う臨床試験のデザインに適さない標的患者または患者の標的亜集団を同定するための方法であって、患者試料または患者試料の集団中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、適さない標的患者または患者の亜集団の同定を示す、方法。
【請求項１８】
試験薬物の効力が免疫療法の共投与により強化される前記薬物の投与または処置を伴う臨床試験のデザインに適した標的患者または患者の標的亜集団を同定するための方法であって、患者試料または患者試料の集団中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、適した標的患者または患者の亜集団の同定を示す、方法。
【請求項１９】
試験薬物の効力がチェックポイント阻害剤として機能する薬物または処置の共投与により強化される前記試験薬物の投与または処置を伴う臨床試験のデザインに適さない標的患者または患者の標的亜集団を同定するための方法であって、患者試料または患者試料の集団中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、適さない標的患者または患者の亜集団の同定を示す、方法。
【請求項２０】
患者における処方された薬物の効力の増大の尤度を検出するための方法であって、前記効力が、ＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在に依存し、前記方法が、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含む、方法。
【請求項２１】
ＫＲＡＳバリアントの存在について患者を試験することが、薬物処置に先立って、医師により開始される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
使用の条件として、診断試験と組み合わせて使用されなければならない薬物の使用に言及する組み合わせ薬物の表示であって、前記診断試験が、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するようにデザインされている、組み合わせ薬物の表示。
【請求項２３】
がんを処置する低毒性の方法であって、ＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を有すると決定されたがん被験体に、免疫調節がん療法を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
被験体において、免疫調節がん療法の毒性を予測する方法であって、前記被験体からの核酸中におけるＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または不在を検出することを含み、前記多型の存在が、前記被験体における毒性の尤度の低下を示す、方法。
【請求項２５】
前記免疫調節がん療法が、放射線療法を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫調節がん療法がチェックポイント阻害剤を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一塩基多型が、配列番号１３の４位におけるＧである、請求項２３または２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３２８，５４８号（この全体は、参考として本明細書に援用される）に対する優先権およびその利益を主張する。
【０００２】
本発明は、免疫調節剤を、それを必要とする患者に投与する方法を対象とし、免疫調節剤の選択は、ＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。本発明の一態様では、免疫系を強化するようにデザインされた免疫調節剤を、他の従来のがん処置と組み合わせてがん患者に投与する方法が提供される。好ましい実施形態では、薬剤は、放射線処置と組み合わせてがん患者に投与される。本発明は、がん患者、または自己免疫患者が、特定の免疫療法に応答する尤度の増大を、ＫＲＡＳバリアントの存在に基づいて決定するための診断方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＫＲＡＳバリアントは、がんリスクの増大を予測する、ＫＲＡＳがん遺伝子における生物学的に機能性のあるマイクロＲＮＡ結合部位のバリアントである。重要な成長および生存遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位バリアントは、生殖細胞系変異の最近発見された新規なクラスであり、それは、がんリスクおよび処置応答の強力なバイオマーカーである（Ｃｉｐｏｌｌｉｎｉら（２０１４年）ＰＨＡＲＭＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＰＥＲＳ  ＭＥＤ７巻：１７３〜１９１頁）。
【０００４】
このクラスで最初に発見された変異の１つが、ＫＲＡＳバリアント、ＫＲＡＳがん遺伝子の３’ＵＴＲ中のｌｅｔ−７結合部位変異である（Ｃｈｉｎら、（２００８年）ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ  ６８巻：８５３５〜４０頁）。この変異により、非小細胞肺がん（同誌）、閉経期前の女性におけるトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）（Ｐａｒａｎｊａｐｅら（２０１１年）ＴＨＥ  ＬＡＮＣＥＴ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ  １２巻（４号）：３７７〜３８６頁）および卵巣がん（Ｒａｔｎｅｒら（２０１０年）ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １５巻：６５０９〜１５頁；Ｒａｔｎｅｒら（２０１２年）ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ３１巻（４２号）：４５５９〜６６頁；Ｐｉｌａｒｓｋｉら（２０１２年）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７巻（５号）：ｅ３７８９１頁）を含む数種のがんのリスクの増大が予測される。ＫＲＡＳバリアントにより、ＫＲＡＳに依存するシグネチャーならびにエストロゲン陰性、基底細胞様遺伝子の発現パターン（Ｒａｔｎｅｒ、２０１２年、前出；Ｐａｒａｎｊａｐｅ、前出）を示すＫＲＡＳバリアント患者における腫瘍に伴う独特の腫瘍生物学が予測されることも示された。ＫＲＡＳバリアントを有する女性は、乳房および卵巣がん、ならびに第３の独立のがんを含む複数の原発性のがんを、同じ個体で発生させる有意に増大したリスクにあることも見出された（Ｐｉｌａｒｓｋｉ、前出）。
【０００５】
ＫＲＡＳバリアントが、治療に対する応答のがんバイオマーカーとして作用する実質的な証拠も存在する。これは、卵巣のまたは頭頸部のがんを有するＫＲＡＳバリアント患者におけるシスプラチン耐性（Ｒａｔｎｅｒ、２０１２年、前出；Ｃｈｕｎｇら（２０１４年）ＡＮＮ  ＯＮＣＯＬ、７月３１日［印刷前のＥｐｕｂ］）、結腸がん（Ｓａｒｉｄａｋｉら（２０１４年）ＣＬＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ  ２０巻（１７号）：４４９９〜５１０頁）または頭頸部がん（Ｃｈｕｎｇ、前出）を有するＫＲＡＳバリアント患者におけるセツキシマブ感受性、および非小細胞肺がんを有するＫＲＡＳバリアント患者におけるエルロチニブ（ｅｒｌｏｔｏｎｉｂ）耐性、ただしソラフェニブ感受性（ＮＳＣＬＣ）（Ｗｅｉｄｈａａｓら（２０１４年）Ｊ  ＣＬＩＮ  ＯＮＣＯＬ  ３２巻（５２号）：補遺；要約８１３５頁）を含む。細胞系統のデータは、化学療法への曝露に対するＫＲＡＳバリアントの独特の応答をさらに支持する（Ｓａｒｉｄａｋｉ、前出）。
【０００６】
がんの処置に対する免疫療法の手法は、以前に実施されたことがある。例えば、がん処置において、がん自体に対する免疫応答を引き出すための試みは、行われている。そのような処置は、例えば、がん細胞を特異的に認識してがん細胞の破壊を標的とするモノクローナル抗体およびそれらの断片を含む抗体の投与、免疫系を刺激するようにデザインされた免疫サイトカインまたはチェックポイント阻害剤の投与、および幾つかの場合には、遺伝子操作され、それらの免疫機能を強化され、がん細胞に対する好首尾の免疫応答を引き出すと予想される自家または同種の免疫細胞の投与を、典型的には含む。したがって、当技術分野では、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体におけるがんを予防および処置する方法に対する必要性がある。それに加えて、当技術分野では、正しい処置が適当に投与されるような特定の免疫療法に対して応答する可能性があるこれらのがん被験体を予測する方法が必要である。そのような処置を適当に管理または指示するために、そのような処置から毒性を経験するかまたは経験しない患者を同定する必要性もある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｉｐｏｌｌｉｎｉら、ＰＨＡＲＭＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＰＥＲＳ  ＭＥＤ（２０１４年）７巻：１７３〜１９１頁
【非特許文献２】Ｃｈｉｎら、ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ（２００８年）６８巻：８５３５〜４０頁
【非特許文献３】Ｐａｒａｎｊａｐｅら（２０１１年）ＴＨＥ  ＬＡＮＣＥＴ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ  １２巻（４号）：３７７〜３８６頁
【非特許文献４】Ｒａｔｎｅｒら（２０１０年）ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １５巻：６５０９〜１５頁
【非特許文献５】Ｒａｔｎｅｒら（２０１２年）ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ３１巻（４２号）：４５５９〜６６頁
【非特許文献６】Ｐｉｌａｒｓｋｉら（２０１２年）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７巻（５号）：ｅ３７８９１頁
【非特許文献７】Ｃｈｕｎｇら（２０１４年）ＡＮＮ  ＯＮＣＯＬ、７月３１日［印刷前のＥｐｕｂ］
【非特許文献８】Ｓａｒｉｄａｋｉら（２０１４年）ＣＬＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳ  ２０巻（１７号）：４４９９〜５１０頁
【非特許文献９】Ｗｅｉｄｈａａｓら（２０１４年）Ｊ  ＣＬＩＮ  ＯＮＣＯＬ  ３２巻（５２号）：補遺；要約８１３５頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、免疫系を変化させているという発見に関する。具体的には、本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳバリアント被験体は、成功したがんの処置について利用される、弱化した免疫系を有することが示されている。本明細書に記載されるように、そのような免疫系は、適当な免疫調節剤の投与により、強化または刺激することができる。
【０００９】
したがって、一態様では、本発明は、ＫＲＡＳバリアントの存在下で、特定の免疫調節剤をがん患者に投与する方法を対象とする。特定の実施形態では、免疫調節剤は、他の従来のがん処置と組み合わせて投与される。そのような場合、ＫＲＡＳバリアント被験体は、例えば、化学療法、放射線療法、または手術を含む１種または複数の従来のがん処置で、処置されているか、処置されるか、または前に処置されたことがある。より具体的には、本発明は、ＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位に一塩基多型（ＳＮＰ）を有するＫＲＡＳバリアントがん被験体を処置する、免疫調節剤の投与を含む方法を提供するが、ここで、前記被験体は、化学療法、放射線療法、または手術を含む１種または複数の療法で処置されているか、処置されるか、または前に処置されたことがある。
【００１０】
本発明の特定の実施形態では、放射線処置は、免疫調節剤でさらに処置するための増感剤として機能することができ、セツキシマブなどの免疫調節剤の投与は、がん細胞に向けられた免疫応答のさらなる強化に結びつくことができる。したがって、本発明の特定の実施形態では、放射線療法は、例えば、セツキシマブまたはパニツミマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）などの抗がん抗体とともに、ＫＲＡＳバリアントがん被験体に共投与される。他の選択肢は、Ｔ細胞療法、または他の免疫強化療法を含むこともできる。
【００１１】
方法は、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することをさらに含み、前記ＳＮＰの存在は、前記被験体のための特定の免疫調節剤の投与と関連する有益な効果の増大を示す。さらに、ＫＲＡＳバリアントの存在は、正常組織における放射線療法に対する感受性を増大させるが、転移性疾患の発生を生じさせる全身的免疫応答のないことを示し、放射線療法と免疫強化の共投与の有用性を示す。本発明の実施形態では、がんは、例えば、乳がん、卵巣がん、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん、結腸直腸がん、膵がん、脳がん、胃がん、子宮がん、精巣がん、肉腫、前立腺がん、リンパ腫および頭頸部がんを含む放射線で処置される任意のがんを含むが、これらに限定されない。本発明は、がん被験体が、特定の免疫調節剤の投与に応答する可能性があるか否かをＫＲＡＳバリアントの存在に基づいて、決定する方法も提供する。具体的には、本発明は、それを必要とする患者に対する特定の免疫調節剤を選択する方法を対象とし、ここで、投与されるべき免疫調節剤の選択は、ＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。ＫＲＡＳバリアントの存在下で、弱化した免疫系を最初に刺激するように機能する免疫調節剤は、それらの利益について十分に機能性のある免疫系を利用する薬剤よりも好ましい。ＫＲＡＳバリアント患者に投与されるべき免疫調節剤は、例えば、抗体、サイトカイン、養子細胞移入を含み、それに対してチェックポイント阻害剤などの薬剤は、それほど好ましくない。より具体的には、本発明は、ＫＲＡＳバリアントがん被験体に対するそのような投与の有益な効果の増大を予測する、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含む方法を提供し、前記ＳＮＰの存在は、免疫療法から生ずる有益な効果の増大を示す。それに加えて、ＫＲＡＳバリアントの存在は、免疫調節剤および放射線療法の共投与と関連する有益な効果の増大を示すこともできる。本発明は、方法が、がん被験体が免疫調節剤の投与に応答する可能性があるかどうかを同定する手段を提供するので、顕著な臨床的価値を有する。ＫＲＡＳバリアントを有すると同定された患者は、免疫療法に応答する可能性が高いと同定され、ＫＲＡＳバリアントを有しない患者は、免疫調節剤の投与に応答する可能性が低いと同定される。したがって、患者がＫＲＡＳバリアントに対して陽性であれば、医師は、最適の処置を選択し、一方無効な処置を回避する手段を提供される。
【００１２】
それに加えて、本発明は、臨床試験のデザインに適した標的患者または患者の標的亜集団を同定するための手段を提供する。本発明の特定の実施形態では、ＫＲＡＳバリアントの存在は、ある標的集団が、１つのタイプの免疫療法を別のタイプと比較して受けるべきであることを示す。したがって、ＫＲＡＳのバリアントを有する被験体は、前記処置が免疫系を刺激または強化するようにデザインされた薬物の投与または処置を伴う臨床試験に選択され得るが、それらの利益について十分に機能性のある免疫系を利用する薬剤はそれほど好ましくない。あるいは、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、試験薬物の効力が、免疫調節剤の共投与により強化される臨床試験に選択されてもよい。試験被験体のそのような標的とされる選択は、試験のサイズおよび数の低下により薬物承認プロセスを能率化するのに役立つことができ、それにより迅速な規制当局承認および薬物の上市への前進を容易にする。
【００１３】
ＫＲＡＳバリアントの存在が、試験薬物または処置の効力の増大と関連することが見出された場合には、本発明は、試験／承認された薬物の医師による処方の前に、ＫＲＡＳバリアントの存在について患者を試験する方法をさらに提供する。そのような場合に、薬物の表示は、患者は、薬物または処置の投与の前に、ＫＲＡＳバリアントの存在について試験されるべきであるという指示を含有することができる。したがって、本発明は、組み合わせ薬物の表示も対象とし、前記表示は、使用の条件として、診断試験と組み合わせて使用されなければならない薬物の使用に言及し、前記診断試験は、前記被験体におけるＫＲＡＳバリアントの存在を検出するようにデザインされている。より具体的には、本発明は、薬物の処方の前に、患者を試験するための診断方法および組み合わせ薬物の表示を提供し、診断試験は、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在は、免疫調節剤の投与から生ずる有益な効果の増大を示す。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、がんを処置する低毒性の方法を提供し、免疫調節がん療法が、ＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を有すると決定されたがん被験体に投与される。本発明によれば、免疫調節がん療法は、放射線であるが、別の実施形態では、免疫調節がん療法は、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤＬ１または抗ＰＤ１抗体療法である。
【００１５】
本発明は、被験体における免疫調節がん療法の毒性を予測する方法も提供する。この方法では、被験体からの核酸中におけるＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）の存在または不在を検出する。多型が患者で検出されれば、それは、被験体における免疫調節がん療法の毒性の尤度の低下を示す。本発明の一実施形態によれば、免疫調節がん療法は、放射線であってもよいが、別の実施形態では、免疫調節がん療法は、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤＬ１または抗ＰＤ１抗体療法であってもよい。
【００１６】
本出願のファイルは、色で描かれた少なくとも１つの図面を含有する。色付き図面（複数可）付きの本特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いがあれば当局により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄは、ＨＮＳＣＣ患者について、ＫＲＡＳバリアント状態および割り当てられた処置による無増悪生存（ＰＦＳ）、局所領域不全（ＬＲＦ）、遠隔転移（ＤＭ）および全生存（ＯＳ）を表す図である。合計で、４１３名の患者のうち１７９名がＰＦＳ不全を経験した（図１Ａ）：セツキシマブで処置していないＫＲＡＳバリアント群では３８名のうち１９名、セツキシマブで処置されたＫＲＡＳバリアント群では３２名のうち１３名、セツキシマブで処置していない非バリアント群では１６９名のうち７４名、およびセツキシマブで処置された非バリアント群では１７４名のうち７３名である。合計で、４１３名の患者のうち９７名が局所領域不全を経験した（図１Ｂ）：セツキシマブで処置していないＫＲＡＳバリアント群の３８名のうち８名、セツキシマブで処置されたＫＲＡＳバリアント群では３２名のうち６名、非バリアントのセツキシマブで処置していない群では１６９名のうち３９名、および非バリアントのセツキシマブで処置された群では１７４名のうち４４名である。合計で、４１３名の患者のうち５１名が遠隔転移を経験していた（図１Ｃ）：セツキシマブで処置していないＫＲＡＳバリアント群では３８名のうち８名、セツキシマブで処置されたＫＲＡＳバリアント群では３２名のうち３名、非バリアントのセツキシマブで処置していない１６９名のうち２１名、および非バリアントのセツキシマブで処置された群では１７４名のうち１９名である。合計で、４１３名の患者のうち１３４名が、関係する時間枠内で死亡した（図１Ｄ）：セツキシマブで処置していないＫＲＡＳバリアント群では３８名のうち１４名、セツキシマブで処置されたＫＲＡＳバリアント群では３２名のうち８名、非バリアントのセツキシマブで処置していない群では１６９名のうち５８名、および非バリアントのセツキシマブで処置された群では１７４名のうち５４名である。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【００１８】
【図１Ｅ】図１Ｅは、ｐ１６状態およびセツキシマブ処置によるＫＲＡＳバリアント患者についての局所不全を表す図である。ＨＰＶ陽性（実線）対陰性（破線）。黒色の線はセツキシマブ処置を表す。赤線（中実円でマークした）は、セツキシマブなしを表す。より高いＬＲＦはＨＰＶ陽性患者について観察され（赤実線対破線）、セツキシマブの利益はなかった。ｐ１６陰性患者についてより良い局所制御が、セツキシマブの利益とともに観察され、ＬＲＦはなかった（黒点線）。
【００１９】
【図１Ｆ】図１Ｆは、ｐ１６状態およびセツキシマブ処置によるＫＲＡＳバリアント患者についての遠隔転移を表す図である。ＨＰＶ陽性（実線）対陰性（破線）。黒色の線は、セツキシマブ処置を表す。赤線（中実円でマークした）は、セツキシマブなしを表す。より高い遠隔転移が、ＨＰＶ陽性（赤実線）およびＨＰＶ陰性（赤点線）の両方についてセツキシマブなしで観察された。ｐ１６陰性について、セツキシマブの影響は時間により左右される。
【００２０】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂは、セツキシマブで処置されなかったかまたは処置された患者について、ＫＲＡＳ遺伝子型およびｐ１６状態による無増悪生存を表す図である。実線は、ＫＲＡＳバリアント患者、点線は非バリアントであり、黒色の線はｐ１６陽性を表し、赤線（中実円でマークした）はｐ１６陰性を表す。（図２Ａ）セツキシマブなしのＰＦＳ。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者（黒実線）は、非バリアントｐ１６陽性患者と比較して劣り（ブロック点線）、ＫＲＡＳバリアントでｐ１６陰性の患者（赤実線）は、非バリアント／ｐ１６陰性患者と比較して改善された転帰を有する（赤点線）。（図２Ｂ）セツキシマブの８週間によるＰＦＳ。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者（黒実線）は、非バリアントｐ１６陽性患者（黒点線）と同様なＰＦＳを有し、それが５年の追跡期間を通して持続する。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者は、初めは改善されたＰＦＳを有するが、３年後に低下する。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｂは、セツキシマブで処置されなかったかまたは処置された患者について、ＫＲＡＳ遺伝子型およびｐ１６状態による無増悪生存を表す図である。実線は、ＫＲＡＳバリアント患者、点線は非バリアントであり、黒色の線はｐ１６陽性を表し、赤線（中実円でマークした）はｐ１６陰性を表す。（図２Ａ）セツキシマブなしのＰＦＳ。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者（黒実線）は、非バリアントｐ１６陽性患者と比較して劣り（ブロック点線）、ＫＲＡＳバリアントでｐ１６陰性の患者（赤実線）は、非バリアント／ｐ１６陰性患者と比較して改善された転帰を有する（赤点線）。（図２Ｂ）セツキシマブの８週間によるＰＦＳ。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者（黒実線）は、非バリアントｐ１６陽性患者（黒点線）と同様なＰＦＳを有し、それが５年の追跡期間を通して持続する。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者は、初めは改善されたＰＦＳを有するが、３年後に低下する。
【００２１】
【図３】図３Ａ〜Ｂは、セツキシマブで処置されなかったかまたは処置された患者について、ＫＲＡＳ遺伝子型およびｐ１６状態による全生存を表す図である。実線はＫＲＡＳバリアント患者、点線は非バリアント患者であり、黒色はｐ１６陽性であり、赤（中実円でマークした）はｐ１６陰性である。（図３Ａ）セツキシマブなしのＯＳ。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者（黒実線）は、非バリアント／ｐ１６陽性患者（ブロック点線）と比較して劣り、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者（赤実線）は、非バリアント／ｐ１６陰性患者（赤点線）と比較して改善された転帰を有する。（図３Ｂ）セツキシマブの８週間によるＯＳ。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者（黒実線）は、５年の追跡期間を通して持続する改善されたＯＳを有する。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者は、初めは改善されたＯＳを有するが、３年後に低下する。
【００２２】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、ＫＲＡＳバリアント対非バリアントＨＰＶ陽性のＨＮＳＣＣ患者の免疫プロファイリングを表す図である。（図４Ａ）評価されたリンパおよび骨髄のサブセット、さらにＣＤ４およびＣＤ８サブセットの免疫プロファイリングを示す。有意差がＫＲＡＳバリアント患者で見出され（赤  ２番と表示された）、ＣＤ４＋細胞、主としてエフェクター細胞はより高く、ＰＤ１＋ＣＤ８細胞は境界線でやや低め、ＣＤ４／ＣＤ８比は変化して、ＮＫ細胞はより低い。骨髄のサブセットも有意に変化する。（図４Ｂ）ＫＲＡＳバリアント（実線）患者と非バリアント（点線）患者の間の差のグラフによる描写。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、ＫＲＡＳバリアント対非バリアントＨＰＶ陽性のＨＮＳＣＣ患者の免疫プロファイリングを表す図である。（図４Ａ）評価されたリンパおよび骨髄のサブセット、さらにＣＤ４およびＣＤ８サブセットの免疫プロファイリングを示す。有意差がＫＲＡＳバリアント患者で見出され（赤  ２番と表示された）、ＣＤ４＋細胞、主としてエフェクター細胞はより高く、ＰＤ１＋ＣＤ８細胞は境界線でやや低め、ＣＤ４／ＣＤ８比は変化して、ＮＫ細胞はより低い。骨髄のサブセットも有意に変化する。（図４Ｂ）ＫＲＡＳバリアント（実線）患者と非バリアント（点線）患者の間の差のグラフによる描写。
【００２３】
【図５】図５は、二本鎖切断修復およびＫＲＡＳバリアントを表す図である。正常組織細胞系統（ＭＣＦ１０Ａ、Ｐ＝親、Ｍ＝ＫＲＡＳバリアント）で、バリアントは、照射後のより高いベースラインＤＳ損傷およびより遅い修復と関連する。腫瘍細胞系統（Ｈ１２９９、Ｐ＝親、Ｍ＝ＫＲＡＳバリアント）で、バリアントは、照射後のより小さいベースラインＤＳ損傷およびより速い修復と関連する。これらの知見は、ＫＲＡＳバリアント患者の正常組織は、放射線に対して感受性であるが、それらの腫瘍組織は抵抗性であり得ることを示す。
【００２４】
【図６】図６は、ＫＲＡＳバリアント細胞系統の放射線感受性を表す図である。試験管内腫瘍細胞感受性試験を実施して、同質遺伝子細胞系統、ＭＣＦ１０ＡおよびＨ１２９９の２対で放射線感受性を評価した。バリアント＝ＫＲＡＳバリアント、および非バリアント＝親系統。誤差バーは、百分率で示された複製間の標準偏差を表す。正常組織のＫＲＡＳバリアント系統はより感受性である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
序論
本明細書では「ＬＣＳ６  ＳＮＰ」または「ＫＲＡＳバリアント」と称するＫＲＡＳバリアント、ＫＲＡＳの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中のＳＮＰは、生殖細胞系で、ＫＲＡＳがん遺伝子中の動的に調節されたマイクロＲＮＡ結合部位の変異であり、それにより、免疫調節剤の投与に応答するがん患者の尤度の増大が予測される。本発明は、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体が、免疫系を変化させているという予想外の発見に基づく。具体的には、本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳバリアント被験体は、正常ではがん細胞の破壊に利用される、弱化した免疫系を有することが示され、これは、がんを処置するための免疫調節剤の投与により、強化されまたは刺激され得る。
【００２６】
したがって、本発明は、がん被験体が特定の免疫調節剤の投与に有利に応答する可能性があるかどうかを決定する、ＫＲＡＳバリアントの存在に基づく方法を提供する。具体的には、本発明は、それを必要とする患者に投与されるべき特定の免疫調節剤を選択する方法を対象とし、投与されるべき免疫調節剤の選択はＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。ＫＲＡＳバリアントの存在下で、弱化した免疫系を最初に刺激するように機能する免疫調節剤は、それらの利益について十分に機能性のある免疫系を利用する薬剤よりも好ましい。ＫＲＡＳ患者に投与されるべき免疫調節剤は、例えば、抗体、サイトカイン、養子細胞移入を含むが、チェックポイント阻害剤などの薬物は、それほど好ましくはない。より具体的には、本発明は、ＫＲＡＳバリアントがん被験体のための免疫療法の有益な効果の増大を予測する、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在が、免疫療法から生ずる有益な効果の増大を示す方法を提供する。本発明は、顕著な臨床的価値を有する。なぜなら方法により、がん被験体が、１つの特定の免疫調節剤の投与に対して、別の免疫調節剤よりも応答する可能性があるかどうかを同定する手段が提供されるからである。ＫＲＡＳバリアントを有すると同定された患者は、免疫療法に応答する可能性が高いと同定され、ＫＲＡＳバリアントを有しない患者は、免疫療法に応答する可能性が低いと同定される（例えば、腫瘍に対する免疫応答の開始に役立つ補助的な治療レジメンがない場合）。ある免疫調節剤、例えばチェックポイント阻害剤などについて、ＫＲＡＳバリアントを有すると同定されたがん患者は、ＫＲＡＳバリアントを有しない患者よりも、治療に応答する可能性は低い（例えば、腫瘍に対する免疫応答の開始に役立つ補助的な治療レジメンがない場合）。したがって、患者がＫＲＡＳバリアントについて試験されれば、医師は、最適の処置を選択し、一方無効の処置を回避する手段を提供される。
【００２７】
それに加えて、本発明は、臨床試験のデザインに適した標的患者または患者の標的亜集団を同定するための方法を提供する。したがって、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、前記処置が免疫系を刺激するようにデザインされた薬物の投与または処置を伴う臨床試験に選択され得る。あるいは、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、試験薬物の効力が免疫療法の共投与により強化され得る臨床試験に選択され得る。そのような標的とされる試験被験体の選択は、試験のサイズおよび数の低下により承認プロセスを能率化するのに役立つことができ、それにより迅速な規制当局承認および薬物の上市への前進を容易にする。
【００２８】
ＫＲＡＳバリアントの存在が、試験薬物の効力の増大と関連することが見出される場合、本発明は、試験／承認された薬物の医師による処方の前に、ＫＲＡＳバリアントの存在について患者を試験する方法をさらに提供する。そのような場合に、薬物の表示は、患者は、薬物の投与の前に、ＫＲＡＳバリアントの存在について試験されるべきであるという指示を含有することができる。したがって、本発明は、薬品の表示に関し、前記表示は、使用の条件として、診断試験と組み合わせて使用されなければならない薬物の使用または処置方法に言及し、前記診断試験はＫＲＡＳバリアントの存在を検出するようにデザインされている。そのような場合、ＫＲＡＳバリアントの存在は、前記薬物の用法または処置を示す。
【００２９】
ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳを含む３種のヒトＲＡＳ遺伝子がある。各遺伝子は、それらのｍＲＮＡ転写物の３’ＵＴＲに複数のｍｉＲＮＡ相補性部位を含む。具体的には、各ヒトＲＡＳ遺伝子は、複数のｌｅｔ−７相補性部位（ＬＣＳ）を含む。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のｌｅｔ−７ファミリーは、それらの標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に結合することによりがん遺伝子の発現を制御するのに重要な包括的な遺伝調節因子である。
【００３０】
具体的には、用語「ｌｅｔ−７相補性部位」は、ｌｅｔ−７ファミリーメンバーが、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子または遺伝子転写物のその領域に結合することができてもできなくても、またはしてもしなくても、ｌｅｔ−７ファミリーのｍｉＲＮＡの配列に相補性の遺伝子または遺伝子転写物の任意の領域を説明することを意図している。用語「相補性」は、各配列中におけるヌクレオチドの大部分が他の配列内のヌクレオチドの大部分に配列をトランスで結合することができる、２つの配列間の結合の閾値を表す。
【００３１】
ヒトＫＲＡＳ３’ＵＴＲは、それぞれＬＣＳ１〜ＬＣＳ８と名付けられた８種のＬＣＳを含む。以下の配列について、チミン（Ｔ）が、ウラシル（Ｕ）の代わりに使用されてもよい。ＬＣＳ１は、配列ＧＡＣＡＧＵＧＧＡＡＧＵＵＵＵＵＵＵＵＵＣＣＵＣＧ（配列番号１）を含む。ＬＣＳ２は、配列ＡＵＵＡＧＵＧＵＣＡＵＣＵＵＧＣＣＵＣ（配列番号２）を含む。ＬＣＳ３は、配列ＡＡＵＧＣＣＣＵＡＣＡＵＣＵＵＡＵＵＵＵＣＣＵＣＡ（配列番号３）を含む。ＬＣＳ４は、配列ＧＧＵＵＣＡＡＧＣＧＡＵＵＣＵＣＧＵＧＣＣＵＣＧ（配列番号４）を含む。ＬＣＳ５は、配列ＧＧＣＵＧＧＵＣＣＧＡＡＣＵＣＣＵＧＡＣＣＵＣＡ（配列番号５）を含む。ＬＣＳ６は、配列ＧＡＵＵＣＡＣＣＣＡＣＣＵＵＧＧＣＣＵＣＡ（配列番号６）を含む。ＬＣＳ７は、配列ＧＧＧＵＧＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＣＡＣＡＧＵＡＣＣＵＣＧ（配列番号７）を含む。ＬＣＳ８は、配列ＡＧＵＧＣＵＵＡＵＧＡＧＧＧＧＡＵＡＵＵＵＡＧＧＣＣＵＣ（配列番号８）を含む。
【００３２】
ヒトＫＲＡＳは、転写物ａおよびｂによりコードされる２種の野生型形態を有し、それらは、以下それぞれ配列番号９および１０として提供される。ＬＣＳ６  ＳＮＰ（ＫＲＡＳバリアント）を含有する各ヒトＫＲＡＳ転写物の配列は、以下配列番号１１および１２として提供される。
【００３３】
ヒトＫＲＡＳの転写物バリアントａは、以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿０３３３６０および配列番号９）（非翻訳領域を太字にしてあり、ＬＣＳ６には下線を引いてある）によりコードされる。
【化１】
2019515035.tif 000002
【化２】
2019515035.tif 000003
【化３】
2019515035.tif 000004
【００３４】
ヒトＫＲＡＳ、転写物バリアントｂは、以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿００４９８５および配列番号１０）（非翻訳領域を太字にしてある、ＬＣＳ６には下線を引いてある）によりコードされる。
【化４】
2019515035.tif 000005
【化５】
2019515035.tif 000006
【化６】
2019515035.tif 000007
【００３５】
ＬＣＳ６  ＳＮＰ（ＫＲＡＳバリアント）を含むヒトＫＲＡＳ、転写物バリアントａは、以下のｍＲＮＡ配列（配列番号１１）（非翻訳領域を太字にしてあり、ＬＣＳ６には下線を引いてある、ＳＮＰは大文字にしてある）によりコードされる。
【化７】
2019515035.tif 000008
【化８】
2019515035.tif 000009
【化９】
2019515035.tif 000010
【化１０】
2019515035.tif 000011
【００３６】
ＬＣＳ６  ＳＮＰ（ＫＲＡＳバリアント）を含むヒトＫＲＡＳ、転写物バリアントｂは、以下のｍＲＮＡ配列（配列番号１２）（非翻訳領域を太字にしてあり、ＬＣＳ６には下線を引いてあり、ＳＮＰは大文字にしてある）によりコードされる。
【化１１】
2019515035.tif 000012
【化１２】
2019515035.tif 000013
【化１３】
2019515035.tif 000014
【００３７】
本発明は、ＫＲＡＳの３’ＵＴＲ内にＳＮＰを包含する。具体的には、このＳＮＰは、ＬＣＳ６の配列番号６の４位においてＵの代わりにＧを置換した結果である。このＬＣＳ６  ＳＮＰ（ＫＲＡＳバリアント）は、配列
【化１４】
2019515035.tif 000015
（ＳＮＰを強調のために太字にしてある）（配列番号１３）を含む。
【００３８】
ＫＲＡＳバリアントは、ＫＲＡＳのｍｉＲＮＡ調節を乱すことにより、変化したＫＲＡＳ発現を導く。ＫＲＡＳバリアントの同定および特徴付けは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／６５３０２号（ＷＯ２００８／１５１００４）にさらに記載されており、その内容は参照によりその全体で組み込まれる。
【００３９】
がんを処置する方法
本発明者らは、ＫＲＡＳバリアントの存在が、がん患者において、別のタイプよりも、１つの特定のタイプの免疫調節剤の投与に対する応答の相対的尤度を増大させることを発見した。具体的には、本発明は、それを必要とする患者に投与されるべき特定の免疫調節剤を選択する方法を対象とし、投与されるべき免疫調節剤の選択は、ＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。ＫＲＡＳバリアントの存在下で、弱化した免疫系を最初に刺激するように機能する免疫調節剤は、それらの利益について十分に機能性のある免疫系を利用する薬剤よりも好ましい。ＫＲＡＳバリアント患者に投与されるべき免疫調節剤は、例えば、抗体、サイトカイン、養子細胞移入を含むが、チェックポイント阻害剤などの薬剤はそれほど好ましくはない。
【００４０】
したがって、本発明は、免疫調節剤を、それを必要とするがん患者に投与する方法に関し、前記投与は、前記患者におけるＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。本発明の実施形態では、方法は、ＫＲＡＳバリアント被験体に免疫調節剤を、手術、化学療法または放射線療法などの別のがん処置と組み合わせて投与することを含むこともできる。好ましい実施形態では、免疫調節剤は、放射線療法とともに投与される。
【００４１】
本発明者らは、ＫＲＡＳバリアントの存在が、免疫療法に対して毒性応答を有するがん患者の尤度を低下させることも発見した。具体的には、本発明は、がんを処置する低毒性の方法を対象とし、免疫調節剤が、それを必要とする患者に投与され、免疫調節剤の投与は、ＫＲＡＳバリアントの存在に依存する。別の実施形態では、本発明は、患者において免疫調節剤の毒性を予測する方法を対象とし、方法は、ＫＲＡＳバリアントの存在を検出することを必要とし、ＫＲＡＳバリアントが検出されれば、ＫＲＡＳバリアントの存在は被験体における免疫調節剤の毒性の尤度の低下を示すので、免疫調節剤が患者に投与される。
【００４２】
本明細書において使用する用語「免疫療法」は、がん細胞の阻害または破壊のために、免疫系を刺激するようにデザインされた任意の免疫に基づく治療に関する。本発明の一態様では、免疫療法は、自然免疫ならびに適応免疫を患者で強化する免疫調節剤の投与を含む。
【００４３】
本明細書において使用する、用語「毒性」または「毒性応答」は、患者が、がん治療、および最も一般的にはがん免疫療法に対する応答で経験することがある、１種または複数の免疫応答の有害な反応（複数可）（ｉｒＡＥ）、特定のクラスの有害な反応の発生を指す。ｉｒＡＥは、がん治療による免疫系の刺激の結果として起こると考えられており、これらの治療の投与により誘発される自己免疫の異なる形態、例えば、肺炎、肝炎、膵炎、および大腸炎などを含む。例えば、ｉｒＡＥは、チェックポイント阻害剤療法で処置されている患者で特に観察される。ｉｒＡＥは、例えば、Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂら、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、１１巻（７号）：ｅ０１６０２２１頁（２０１６年）で、さらに十分に論じられている。
【００４４】
本発明の一態様では、がん細胞を認識してがん細胞の破壊を標的とするようにデザインされた免疫グロブリン分子、またはその断片が投与され得る。そのような免疫グロブリン分子には、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブなどのモノクローナル抗体が含まれる。例えばアバスチンなどのＶＥＧＦを認識する抗体も使用することができる。がん細胞の生理学に関与する抗原を標的とすることに加えて、投与された抗体は、免疫サーベイランスにとって重要な免疫学的経路を調節するように機能することもできる。
【００４５】
本発明の別の態様では、免疫系を刺激することが公知であるかまたは免疫系を利用する化学療法剤の投与は、ＫＲＡＳバリアントを有するがん患者を処置するために特に有用であることもあり有用でないこともある。そのような薬剤には、エルロチニブ、バンデタニブ、シスプラチン、イリノテカン、エトポシド、タキソール、ｒａｆ阻害剤、例えば、ソラフェニブ、セレコキシブ、セツキシマブおよびパニツミマブが含まれるが、これらに限定されない。薬剤の組み合わせおよび免疫系に対するそれらの影響は、ＫＲＡＳバリアント患者にとって重要であり、免疫を一緒に強化する、ある組み合わせは有用であり、および免疫を妨げ得る他の組み合わせは、有害であるかまたは有用でない。そのような薬剤は、例えば、以下の免疫賦活特性の１つまたは複数を有することができる：ＮＫ（ナチュラルキラー）に対するがん細胞の感受性および／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に媒介される細胞溶解の強化、成熟樹状細胞（ＤＣ）およびＣＤ８Ｔ細胞数の刺激、ＤＣおよび腫瘍細胞による免疫抑制の低下、ＤＣ、ＮＫおよび腫瘍特異的ＣＴＬの誘発された活性化、Ｔｈｌ細胞免疫の増強、ＴＹＲＯ３の刺激、ＡＸＬおよびＭＥＲ（ＴＡＭ）受容体タンパク質チロシンキナーゼに媒介される細胞障害性、Ｔリンパ球による認識を可能にするがん細胞抗原の発現の強化、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体に依存する細胞傷害性（ＣＤＣ）の強化ならびに自然免疫および養子免疫の一般的強化。
【００４６】
あるいは、免疫系の細胞を活性化するように機能するサイトカインなどの免疫賦活分子を投与することができる。そのような因子には、例えば、Ｔ細胞活性化因子または樹状細胞活性化／成熟因子が含まれる。それに加えて、患者のがんに対する天然のまたは遺伝子操作による反応性を有するＴ細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発生され、がん患者に移入で戻される養子細胞移入を使用することもできる。それに加えて、患者のＴ細胞を取り出して、腫瘍抗原を認識するように特化されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を発現するように遺伝子操作することもできる。細胞は、次に、がん細胞の標的とされた破壊のために、患者に移入で戻される。
【００４７】
別の態様では、本発明は、ＫＲＡＳバリアントがん被験体が、特定の処置のプロトコール中の特定の時に、１つの免疫療法に、別の免疫療法に対するよりも良く応答できることをさらに提供する。例えば、刺激された免疫系の下流で機能するチェックポイント阻害剤は、初期の免疫系刺激に続いて投与することができる。チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞に、がん細胞を含む身体中の他の細胞を攻撃させないことを補助するあるタイプの「オフスイッチ」として通常は作用する。幾つかの場合に、チェックポイント阻害剤は、がん被験体に投与されて「オフスイッチ」を除去し、それによりがん被験体のＴ細胞のがん細胞に対する応答を強化することができる。そのようなチェックポイント阻害剤は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的として阻害して、がん細胞に対する免疫応答を高める処置を含む。ＰＤ−１を標的とする処置の例は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））を含む。ＰＤ−Ｌ１を標的とする処置の例は、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（アテゾリズマブ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、およびＢａｖｅｎｃｉｏ（登録商標）（アベルマブ）である。イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））は、ＣＴＬＡ−４を標的とするモノクローナル抗体であり、タンパク質が細胞傷害性Ｔリンパ球を阻害することを防止する。これは、がん細胞に対する身体の免疫応答を高めることができる。
【００４８】
それに加えて、本発明は、臨床試験のデザインに適した標的患者または患者の標的亜集団を同定するための手段を提供する。したがって、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、前記処置が免疫系を刺激または強化するようにデザインされた薬物の投与または処置を伴う臨床試験に選択されてもよいが、そのような被験体は、チェックポイント阻害剤を伴う試験から排除される。あるいは、ＫＲＡＳバリアントを有する被験体は、試験薬物の効力が免疫療法の共投与により強化される臨床試験に選択されてもよい。標的とされる試験被験体のそのような選択は、試験のサイズおよび数の低下により薬物承認プロセスを能率化するのに役立つことができ、それにより迅速な規制当局承認および薬物の上市への前進を容易にする。
【００４９】
ＫＲＡＳバリアントの存在が、試験薬物の効力の増大と関連することが見出された場合、本発明は、試験／承認された薬物の医師による処方の前に、ＫＲＡＳバリアントの存在について患者を試験する方法をさらに提供する。そのような場合に、薬物の表示は、患者は、薬物の投与の前に、ＫＲＡＳバリアントの存在について試験されるべきであるという指示を含有することができる。したがって、本発明は、組み合わせ薬物の表示も対象とし、前記表示は、使用の条件として、診断試験と組み合わせて使用されなければならない薬物の使用に言及し、前記診断試験は、前記被験体におけるＫＲＡＳバリアントの存在を検出するようにデザインされている。より具体的には、本発明は、薬物の処方の前に、患者を試験するための診断方法および組み合わせ薬物の表示を提供し、診断試験は、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在は、免疫療法から生ずる有益な効果の増大を示す。
【００５０】
本明細書において使用する「処置する」は、疾患に冒されたかまたは疾患を発生するリスクにある被験体に、被験体の状態における（例えば、１種または複数の症状における）改善、疾患の増悪の遅延、症状の発症の遅延または症状の増悪の遅延その他を含む利益を与える任意のタイプの処置または予防を指す。したがって、用語「処置」は、症状の発症を予防するための被験体の予防処置も含む。
【００５１】
本明細書において使用する、「処置」および「予防」は、症状の治癒または完全な除去を含むことは意図しない。むしろ、これらは、疾患に冒された患者に、患者の状態における（例えば、１種または複数の症状における）改善、疾患の増悪の遅延、その他を含む利益を与える任意のタイプの処置を指す。
【００５２】
本明細書において使用する「処置有効量」は、がんに冒された患者に、患者の状態における（例えば、１種または複数の症状における）改善、疾患の増悪における遅延、その他を含む望ましい効果を生じさせるために十分な免疫療法の量を意味する。
【００５３】
本明細書に記載された方法による処置を必要とする被験体は、腫瘍およびがん、例えば、例えば、肺、結腸、乳房、脳、肝、前立腺、脾臓、筋肉、卵巣、膵、頭頸部、皮膚（メラノーマを含む）、その他に冒された被験体を含む。腫瘍は、原発性腫瘍、転移性腫瘍、または再発腫瘍であることもある。
【００５４】
本明細書において使用する用語「治療剤」、「化学療法剤」、または「薬物」は、がん細胞と相互作用して、それにより細胞の増殖状態を低下させるおよび／または細胞を死滅させることができる化合物またはその誘導体を指す。化学療法剤の例として、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド）、代謝アンタゴニスト（例えば、メトトレキセート（ＭＴＸ）、５−フルオロウラシルまたはその誘導体）、抗腫瘍抗生物質（例えば、マイトマイシン、アドリアマイシン）、植物から誘導された抗腫瘍剤（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール）、白金系化学療法剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、トリプラチンテトラナイトレート、フェナントリプラチン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｐｌａｔｉｎ）、ピコプラチン、サトラプラチン）、エトポシドなどが含まれるが、これらに限定されない。そのような薬剤は、抗がん剤トリメトトリキセート（ＴＭＴＸ）、テモゾロミド、ラルチトレキセド（ｒｅａｌｔｒｉｔｒｅｘｅｄ）、Ｓ−（４−ニトロベンジル）−６−チオイノシン（ＮＢＭＰＲ）、６−ベンジルグアニジン（ｂｅｎｚｙｇｕａｎｉｄｉｎｅ）（６−ＢＧ）、ビス−クロロニトロソウレア（ＢＣＮＵ）およびカンプトテシン、またはその任意の治療薬の誘導体をさらに含むことができるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書において使用する用語「放射線療法」は、腫瘍を収縮させ、およびがん細胞を死滅させる高エネルギー放射線を使用する放射線療法を指す。Ｘ線、ガンマ線、光子および荷電粒子は、がん処置のために使用されるタイプの放射線である。放射線は、身体の外側（外部ビーム放射線療法）から送達され得るか、または身体のがん細胞近くに放射性物質を配置することにより送達され得る（内部放射線療法、近接照射療法とも言われる）。全身的放射線療法は、放射性ヨウ素などの放射性物質を使用して、それが血液中を移動してがん細胞を死滅させる。本明細書に記載されるように、ＫＲＡＳバリアント患者は、それらの正常組織において放射線療法に対して増大した感受性を有することが観察されるが、それらのベースラインの免疫抑制が原因で、遠隔疾患には成功せず、それらの免疫強化に対する必要性が示される。
【００５６】
本明細書において使用する用語「治療有効量」は、処置される疾患、状態、または障害の症状の１つまたは複数をある程度軽減する、投与される化合物の量を指す。調節されない細胞分裂に関するがんまたは病理に関して、治療有効量は、（１）腫瘍のサイズを縮小させる、（２）異常な細胞分裂、例えばがん細胞分裂を阻害する（即ち、ある程度まで遅延させる、好ましくは停止する）、（３）がん細胞の転移を予防または減少させる、および／または、（４）調節されないかまたは異常な、例えば、がん、または血管新生を含む細胞分裂に関連するかまたは部分的にそれにより引き起こされる病理と関連する１種または複数の症状を、ある程度まで軽減する（または、好ましくは排除する）効果を有する量を指す。
【００５７】
疾患（または状態または障害）の「処置すること」または「処置」という本明細書において使用する用語は、疾患に対する素因を有し得るが疾患の症状を未だ経験または示していない動物で疾患が生ずることを予防すること（予防的処置）、疾患を阻害すること（その発生を遅延させるまたは阻止すること）、疾患の症状または副作用からの軽減をもたらすこと（対症的処置を含む）、および疾患を軽減すること（疾患の退行を起こすこと）を指す。がんに関して、これらの用語は、がんに罹った個体の平均余命が増大し得ること、または疾患の症状の１つまたは複数が縮小することも意味する。
【００５８】
本明細書において使用する用語「被験体」および「患者」は、ヒト、哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ、その他）、生きている細胞、および他の生きている生物体を含む。
【００５９】
本明細書において使用する用語「がん」は、異常細胞が制御なく分裂する疾患のための一般的用語として、その通常の意味を与えられるものとする。がん細胞は、近くの組織に浸潤し得、血流およびリンパ系を通して身体の他の部分に広がることができる。数種類の主要なタイプのがんがあり、例えば、癌腫は、皮膚または内部器官を裏打ちするかまたは覆う組織で始まるがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織または支持組織で始まるがんである。白血病は、骨髄などの血液形成組織で始まり、多数の異常血液細胞が産生され、それが血流に侵入することを引き起こすがんである。リンパ腫は、免疫系の細胞で始まるがんである。
【００６０】
正常細胞が、特殊化された、制御された、および協調する単位として振る舞うそれらの能力を失うときに、腫瘍が形成される。一般的に、固形腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常は含有しない組織の異常な塊である（ただし、一部の脳腫瘍は嚢胞を有し、中枢壊死領域は液体で満たされる）。単一の腫瘍は、間違った異なるプロセスで、その中に細胞の異なる集団を有することさえある。固形腫瘍は、良性（がん性でない）であることも、または悪性（がん性）であることもある。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプで命名される。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般的に固形腫瘍を形成しない。
【００６１】
代表的ながんには、とりわけ、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、頭頸部がん、白血病、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、子宮がん、子宮頚がん、甲状腺がん、胃がん、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、膠芽腫、上衣腫、ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍、生殖細胞腫瘍、頭蓋外がん、ホジキン病、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肝がん、髄芽腫、神経芽細胞腫、一般的に脳腫瘍、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、一般的に軟組織肉腫、テント上未分化神経外胚葉性および松果体腫瘍、視路および視床下部神経膠腫、ウイルムス腫瘍、急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、食道がん、ヘアリーセル白血病、腎臓がん、多発性骨髄腫、口腔がん、膵がん、原発性中枢神経系リンパ腫、皮膚がん、小細胞肺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
製剤
本開示の医薬組成物（例えば、化学療法剤および／または免疫療法剤）は、当技術分野において周知なように、それらの意図される使用に応じて、種々の手段により投与することができる。例えば、本開示の組成物が経口的に投与されるべきであれば、それらは、錠剤、カプセル、顆粒、散剤またはシロップとして製剤化されてもよい。あるいは、本明細書で開示された製剤は、注射（静脈内、筋肉内または皮下）、点滴注入調製物または坐薬として非経口的に投与されることもできる。これらの製剤は、従来の手段により調製することができ、所望であれば、組成物は、任意の従来の添加剤、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭薬、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤またはコーティング剤と混合することもできる。開示された賦形剤は、１つより多い機能で役立つこともある。例えば、充填剤または結合剤は、崩壊剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、抗粘着剤、滑沢剤、甘味料などであってもよい。
【００６３】
本開示の製剤において、湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、着香料（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）および香料、防腐剤および抗酸化剤は、製剤化された薬剤中に存在してもよい。
【００６４】
対象組成物は、経口、経鼻（例えば、乾燥粉末製剤または噴霧製剤を使用する吸入による）、局部（バッカルおよび舌下を含む）、肺（エアロゾル投与を含む）、直腸、膣、エアロゾルおよび／または非経口的（例えば、注射、例えば、静脈内または皮下注射による）投与に適する場合がある。製剤は、単位剤形で提示されると便利であり、薬学分野において周知の任意の方法により調製することができる。単一用量を産生するために担体材料と合わせられ得る組成物の量は、処置される被験体、および投与の特定の様式に依存して変わる。
【００６５】
これらの製剤を調製する方法は、本開示の組成物を担体および、任意選択で、１種または複数の補助成分と会合させるステップを含む。一般的に、製剤は、均一におよび緻密に、薬剤を液体担体、または細かく分割された固体担体または両方と会合させ、次に必要であれば、生成物を形作ることにより調製される。
【００６６】
経口投与に適した製剤は、活性成分としてそれらの対象組成物の所定の量を各々含有する、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（香味付けされた基剤、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントを使用する）、散剤、顆粒の形態で、または水性もしくは非水性液体中の溶液または懸濁物として、または水中油もしくは油中水液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、または香錠として（不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴムなどを使用する）であってもよい。本開示の組成物は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与されてもよい。
【００６７】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤、顆粒など）では、対象組成物は、１種または複数の薬学的に許容される担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれか：（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、デキストロース、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など；（２）結合剤、例えば、セルロース（例えば、微結晶性セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）およびカルボキシメチルセルロース）、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、例えば、グリセリン；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィン；（６）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど；（８）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなど；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物など；および（１０）着色剤と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合には、組成物は、緩衝剤を含むこともできる。同様なタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖類、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用する、軟質および硬質の充填されたゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。開示された賦形剤は、１つより多い機能で役立つこともある。例えば、充填剤または結合剤は、崩壊剤、流動促進剤、抗粘着剤、滑沢剤、甘味料などであってもよい。
【００６８】
製剤および組成物は、開示された化合物の微粒子化された結晶を含むこともできる。微粒子化は、化合物の結晶単独で、または結晶と薬学的賦形剤もしくは担体の一部もしくは全部との混合物で実施することができる。開示された化合物の微粒子化された結晶の平均粒子サイズは、例えば約５から約２００ミクロン、または約１０から約１１０ミクロンであってもよい。
【００６９】
錠剤は、圧縮または成形により、任意選択で１種または複数の補助成分とともに作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチン、微結晶性セルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、ナトリウムデンプングリコレートまたは架橋されたナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性剤または分散剤を使用して、調製することができる。成形された錠剤は、適切な機械で、不活性液体希釈剤で加湿された対象組成物の混合物を成形することにより作製することができる。錠剤、および他の固体剤形、例えば、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒などは、任意選択でスコアをつけて、コーティングおよびシェル、例えば、薬学的製剤化技術分野で周知の腸溶コーティングおよび他のコーティングなどを用いて調製することができる。開示された賦形剤は、１つより多い機能で役立つこともある。例えば、充填剤または結合剤は、崩壊剤、流動促進剤、抗粘着剤、滑沢剤、甘味料などであってもよい。
【００７０】
開示された組成物が、凍結乾燥されたまたはフリーズドライされた、本明細書で開示された化合物を含むことができることは認識されるであろう。例えば、本明細書で開示されるのは、開示された化合物の結晶性および／または非晶質粉末が形成する組成物である。そのような形態は、例えば、水性組成物として使用するために再構成することができる。
【００７１】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容される、エマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシル剤を含む。対象組成物に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、シクロデキストリンおよびそれらの混合物などを含有してもよい。
【００７２】
懸濁物は、対象組成物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、ヒドロキシアルミニウムオキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物のような懸濁剤を含有することもできる。
【００７３】
直腸または膣投与のための製剤は、坐薬として提示されてもよく、それは、対象組成物と例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチレートを含む１種または複数の適切な非刺激性の賦形剤または担体とを混合することにより調製することができ、それは、室温では固体であるが、体温で液体であり、それ故、体腔で溶解して活性作用物を放出するであろう。膣投与に適した製剤には、適当であることが当技術分野において公知であるような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル、ペースト、フォームまたは噴霧製剤も含まれる。
【００７４】
対象組成物の経皮投与のための剤形は、散剤、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム剤、ローション剤、ゲル、溶液、およびパッチを含む。活性構成要素は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされることがある任意の防腐剤、緩衝液、または噴霧体と混合することができる。
【００７５】
軟膏、ペースト、クリーム剤およびゲルは、対象組成物に加えて、賦形剤、例えば、動物および植物の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはその混合物を含有することができる。
【００７６】
散剤および噴霧は、対象組成物に加えて、賦形剤、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などを含有することができる。さらに、噴霧は、通例の噴霧体、例えば、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えば、ブタンおよびプロパンなどを含有することもできる。
【００７７】
本開示の組成物および化合物は、あるいは、エアロゾルにより投与することもできる。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物または固体粒子を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧体）懸濁物を使用することができる。超音波ネブライザーは、対象組成物に含有される化合物の分解を生じ得る剪断への薬剤の曝露を最小化するので、使用することができる。
【００７８】
通常、水性エアロゾルは、対象組成物の水溶液または懸濁物を従来の薬学的に許容される担体および安定剤と一緒に製剤化することにより作製される。担体および安定剤は、特定の対象組成物の要件により変化するが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖類または糖アルコールを含む。エアロゾルは、一般的に、等張溶液から調製される。
【００７９】
例として挙げられた賦形剤は、１つより多い機能を有することがあることは注目されるべきである。例えば、充填剤または結合剤は、崩壊剤、流動促進剤、抗粘着剤、滑沢剤、甘味料などであってもよい。
【００８０】
非経口的投与に適した本開示の医薬組成物は、１種または複数の薬学的に許容される滅菌等張の水溶液または非水溶液、分散物、懸濁物またはエマルション、または滅菌粉末と組み合わされた対象組成物を含み、それは、使用直前に、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有していてもよい、滅菌注射用溶液または分散物に再構成することができる。例えば、開示された化合物を含み、例えば、デキストロース（例えば、水中約１から約１０重量パーセントのデキストロース、または約５重量パーセントのデキストロース（Ｄ５Ｗ））をさらに含んでいてもよい水性組成物が、本明細書で提供される。
【００８１】
本開示の医薬組成物で使用され得る適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物、植物油、例えばオリーブ油など、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステル、およびシクロデキストリンを含む。適度の流動性は、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用により、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。
【００８２】
企図された製剤、例えば、経口製剤（例えば、丸剤または錠剤）は、制御された放出の製剤、例えば、即時放出性製剤、遅延放出性製剤、またはその組み合わせとして製剤化され得ることは認識されるであろう。
【００８３】
ある特定の実施形態では、被験体化合物は、錠剤、丸剤、カプセルまたは他の適当な摂取可能な製剤（以後「錠剤」と総称する）として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、治療用量は、１０錠剤またはそれより少数で提供されてもよい。別の例では、治療用量は、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５または３錠で提供される。
【００８４】
本発明の目的のために、免疫調節剤の量または用量は、例えば、被験体または動物で、妥当な時間枠で、治療または予防的応答をもたらすために十分であるべきである。例えば、免疫調節剤の用量は、被験体において、がん抗原に結合するか、またはがんを検出、処置または予防するために十分であるべきである。用量は、薬剤の効力および処置されるべき被験体（例えばヒト）の状態、ならびに被験体（例えばヒト）の体重により決定されるであろう。投与量を決定するためのアッセイは、当技術分野において周知である。
【００８５】
免疫調節剤を含有する組成物の用量は、特定の薬剤の投与に伴うことのある何らかの有害な副作用の存在、性質および程度により決定することもできる。典型的には、主治医が、各患者個人を処置するための薬剤の投与量を、種々の要因、例えば、年齢、体重、一般的健康、食事、性別、投与経路、および処置される状態の重症度を考慮に入れて決定するであろう。
【００８６】
免疫療法の投与
記載された免疫療法は、抗体に基づく治療であってもよい。一般的に、抗体の治療有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。投与される量は、疾患のタイプおよび程度または処置されるべき適応症、患者の全体的健康、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性、薬学的製剤、および投与の経路などの変数に依存するであろう。初期投与量は、所望の血液レベルまたは組織レベルに急速に達する目的で、上方（ｕｐｐｅｒ）のレベルを超えて増大することができる。あるいは、初期投与量は、最適より少なくすることもでき、投与量を、処置の過程中に漸進的に増大させてもよい。最適の用量は、日常的実験により決定することができる。非経口的投与のためには、０．１ｍｇ／ｋｇと１００ｍｇ／ｋｇの間、あるいは０．５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇの間、あるいは、１ｍｇ／ｋｇと２５ｍｇ／ｋｇの間、あるいは２ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間、あるいは５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの間の用量が投与され、例えば、１処置サイクル当たり１週間に１回、隔週に１回、３週間毎に１回、または１ヵ月に１回与えられてもよい。一実施形態では、用量は、３週間毎に静脈内投与により２００ｍｇであり、それに対して別の実施形態では、用量は、３週間毎に静脈内投与により２ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態では、用量は、２週間毎に静脈内投与により２４０ｍｇであるが、さらに別の実施形態では、用量は、２週間毎に静脈内投与により３ｍｇ／ｋｇである。さらに別の実施形態では、用量は、３週間毎に静脈内投与により１２００ｍｇである。
【００８７】
免疫療法に対する応答の尤度または免疫療法に対する毒性応答の尤度を予測する方法
本発明は、単独の、または１種または複数の従来のがん処置との組み合わせのいずれかにおける、免疫療法に対する応答の尤度の増大を予測する方法も特徴とする。方法は、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在は、がん被験体における免疫療法に対する応答の尤度の増大を示す。具体的には、検出される変異は、ＫＲＡＳのＬＣＳ６の４位におけるＳＮＰであり、それは、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）への変換を生ずる。ある特定の非限定的な実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、メラノーマ、または頭頸部がんである。変異の同定は、免疫療法に対する応答の尤度の増大を示す。
【００８８】
「尤度の増大」は、ＫＲＡＳバリアントを保有している個体が、ＫＲＡＳバリアントを保有していない個体と比較して免疫療法に応答する確率の増大を説明することが意図される。ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳバリアント保有者は、ＫＲＡＳバリアントを保有していない個体よりも、１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、５．５×、６×、６．５×、７×、７．５×、８×、８．５×、９×、９．５×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、または１００×高く免疫療法に応答する可能性がある。
【００８９】
被験体は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。被験体は、雄であることも雌であることもできる。
【００９０】
本発明は、免疫療法に対して毒性応答を有する尤度の低下を予測する方法も特徴とする。方法は、患者試料中のＫＲＡＳのｌｅｔ−７相補性部位６の４位における一塩基多型（ＳＮＰ）を検出することを含み、前記ＳＮＰの存在は免疫療法に対する毒性応答を有する患者の尤度の低下を示す。具体的には、検出される変異は、ウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）のグアニン（Ｇ）への変換を生ずる、ＫＲＡＳのＬＣＳ６の４位におけるＳＮＰである。ある特定の非限定的な実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、メラノーマ、または頭頸部がんである。変異の同定は、免疫療法に対する毒性応答を有する尤度の低下を示す。
【００９１】
「尤度の低下」は、ＫＲＡＳバリアントを保有している個体が、ＫＲＡＳバリアントを保有していない個体と比較して、免疫療法に対する毒性応答を有する確率が減少していることを説明することが意図される。ある特定の実施形態では、ＫＲＡＳバリアント保有者は、ＫＲＡＳバリアントを保有していない個体よりも、免疫療法に対する毒性応答を有する可能性が、１．５×、２×、２．５×、３×、３．５×、４×、４．５×、５×、５．５×、６×、６．５×、７×、７．５×、８×、８．５×、９×、９．５×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、または１００×低い。
【００９２】
本発明の関係における「尤度」は、事象が特定の期間にわたって起こるであろう確率に関し、被験体の「絶対」尤度または「相対」尤度を意味する場合がある。絶対尤度は、関係する時間コホートについて測定後の実際の観察に関してか、または関係する期間の間に追跡された統計的に妥当な過去のコホートから生じた指標の値に関してのいずれかで測定することができる。相対尤度は、被験体の絶対尤度を、低尤度のコホートの絶対尤度または臨床尤度因子がどのように査定されたかにより変化し得る平均集団尤度のいずれかと比較した比を指す。オッズ比、即ち、所与の試験結果についての陰性事象に対する陽性事象の比率も、一般的に変換されずに使用される（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）にしたがい、ここでｐは事象の確率であり、（１−ｐ）は事象が起こらない確率である）。
【００９３】
本発明の関係における「尤度評価」または「尤度の評価」は、がん被験体が免疫療法に応答するかまたは免疫療法に対する毒性応答を有する確率、オッズ、または尤度の予測をすることを包含する。そのような評価は、前に測定された集団に関して、絶対的または相対的のいずれかの観点で、未来の臨床パラメーター、伝統的実験室リスク因子の値、またはがんの他の指標の予測を含むこともできる。
【００９４】
連鎖不平衡（ＬＤ）とは、所与の集団における各対立遺伝子の発生の別々の頻度から予想されるよりも大きい頻度の、２箇所またはそれよりも多い異なるＳＮＰ部位における対立遺伝子の共遺伝（例えば、代替的ヌクレオチド）を指す。独立に遺伝された２つの対立遺伝子の共発生の予想される頻度は、第１の対立遺伝子の頻度に第２の対立遺伝子の頻度を乗じた積である。予想される頻度で共発生する対立遺伝子は、「連鎖平衡」にあると言われる。対照的に、ＬＤとは、２箇所またはそれよりも多い異なるＳＮＰ部位における対立遺伝子（複数可）間の任意の非ランダム遺伝的関連を指し、それは、染色体に沿った２つの遺伝子座の物理的近接に一般的に基づく。ＬＤは、２箇所またはそれよりも多いＳＮＰ部位が、所与の染色体上で互いに物理的に非常に近接している場合に起こり得、それ故、これらのＳＮＰ部位にある対立遺伝子は、複数の世代を通して分離されないままである傾向があり、その結果、１つのＳＮＰ部位にある特定のヌクレオチド（対立遺伝子）が、近くに位置する異なるＳＮＰ部位にある特定のヌクレオチド（対立遺伝子）との非ランダム関連を示すであろう。それ故、ＳＮＰ部位の１つの遺伝子型を決定すると、ＬＤにある他のＳＮＰ部位の遺伝子型決定と殆ど同じ情報が得られるであろう。
【００９５】
個体を遺伝的障害について（例えば、予後のまたはリスク）スクリーニングする目的で、特定のＳＮＰ部位が障害をスクリーニングするために有用であることが見出されれば、当業者は、このＳＮＰ部位とＬＤにある他のＳＮＰ部位も、状態をスクリーニングするために有用であろうと認識するであろう。種々の程度のＬＤが、２箇所またはそれよりも多いＳＮＰ間で遭遇され得る結果、幾つかのＳＮＰは他のものより密接に関連する（即ち、より強いＬＤで）。さらに、ＬＤが染色体に沿って広がる物理的距離は、ゲノムの異なる領域の間で異なり、それ故、ＬＤが起こるために必要な、２箇所またはそれよりも多いＳＮＰ部位の間の物理的分離の程度は、ゲノムの異なる領域の間で異なり得る。
【００９６】
実際に疾患を惹起する（原因となる）多型ではないが、そのような原因となる多型とＬＤにある多型（例えば、ＳＮＰおよび／またはハプロタイプ）も、スクリーニングに適用するために有用である。そのような場合に、原因となる多型とＬＤにある多型（複数可）の遺伝子型により、原因となる多型の遺伝子型が予測され、その結果として、原因となるＳＮＰ（複数可）により影響される表現型（例えば、疾患）が予測される。したがって、原因となる多型とＬＤにある多型のマーカーは、マーカーとして有用であり、実際の原因となる多型（複数可）が未知である場合に特に有用である。
【００９７】
ヒトゲノムにおける連鎖不平衡は：Ｗａｌｌら（２００３年）  ＮＡＴ  ＲＥＶ  ＧＥＮＥＴ．４巻（８号）：５８７〜９７頁；Ｇａｍｅｒら（２００３年）ＧＥＮＥＴ  ＥＰＩＤＥＭＩＯＬ．２４巻（１号）：５７〜６７頁；Ａｒｄｌｉｅら（２００２年）ＮＡＴ  ＲＥＶ  ＧＥＮＥＴ．３巻（４号）：２９９〜３０９頁（（２００２年）ＮＡＴ  ＲＥＶ  ＧＥＮＥＴ  ３巻（７号）：５６６頁に正誤表）；およびＲｅｍｍら（２００２年）ＣＵＲＲ  ＯＰＩＮ  ＣＨＥＭ  ＢＩＯＬ．６巻（１号）：２４〜３０頁で概説されている。
【００９８】
本発明のスクリーニング技法は、試験被験体が、検出可能な形質を発生するリスクの増大または減少と関連するＳＮＰまたはＳＮＰパターンを有するかどうか、または個体が、特定の多型／変異の結果として検出可能な形質に罹患するかどうかを決定する、例えば、ハプロタイプを決定するための個体の染色体の分析、家族の研究、単一精子のＤＮＡ分析、または体細胞ハイブリッドを可能にする方法を含む種々の方法を使用することができる。本発明の診断を使用して分析される形質は、病理および障害で一般的に観察される任意の検出可能な形質であってもよい。
【００９９】
ＳＮＰ遺伝子型決定方法
どの特定のヌクレオチド（即ち、対立遺伝子）が、１箇所または複数のＳＮＰ位置の各々、例えば、配列番号１１、１２または１３で開示された核酸分子中のＳＮＰの位置などに存在するかを決定するプロセスは、ＳＮＰ遺伝子型決定と称される。本発明は、例えば、種々の障害についてのスクリーニング、またはその素因の決定、または処置の形態に対する応答性または予後の決定において、またはゲノムマッピングまたはＳＮＰ関連の分析、その他において、使用するためのＳＮＰ遺伝子型決定の方法を提供する。
【０１００】
核酸の試料は、どの対立遺伝子（複数可）が、任意の所与の目的の遺伝的領域（例えば、ＳＮＰの位置）に存在するかを決定するために、当技術分野において周知の方法により遺伝子型を決定することができる。隣接する配列は、オリゴヌクレオチドプローブなどのＳＮＰ検出試薬をデザインするために使用することができ、それは、キットのフォーマットで、任意選択で実行されてもよい。例示的なＳＮＰ遺伝子型決定方法は、Ｃｈｅｎら（２００３年）ＰＨＡＲＭＡＣＯＧＥＮＯＭＩＣＳ  Ｊ．  ３巻（２号）：７７〜９６頁；Ｋｗｏｋら（２００３年）ＣＵＲＲ  ＩＳＳＵＥＳ  ＭＯＬ．  ＢＩＯＬ．５巻（２号）：４３〜６０頁；Ｓｈｉ（２００２年）ＡＭ  Ｊ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＧＥＮＯＭＩＣＳ  ２巻（３号）：１９７〜２０５頁；およびＫｗｏｋ（２００１年）ＡＮＮＵ  ＲＥＶ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ  ＨＵＭ  ＧＥＮＥＴ  ２巻：２３５〜５８頁に記載されている。高スループットＳＮＰ遺伝子型決定のための例示的技法は、Ｍａｍｅｌｌｏｓ（２００３年）ＣＵＲＲ  ＯＰＩＮ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶ  ＤＥＶＥＬ．６巻（３号）：３１７〜２１頁に記載されている。一般的なＳＮＰ遺伝子型決定方法は、ＴａｑＭａｎアッセイ、分子ビーコンアッセイ、核酸アレイ、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アレイ型プライマー伸長、ホモジニアスプライマー伸長アッセイ、質量分析法による検出を伴うプライマー伸長、ピロシークエンシング、遺伝子アレイでソーティングされるマルチプレックスプライマー伸長、ローリングサークル増幅を用いるライゲーション、ホモジニアスライゲーション、ＯＬＡ（米国特許第４，９８８，１６７号）、遺伝子アレイでソーティングされるマルチプレックスライゲーション反応、制限断片長多型、単一塩基伸長タグアッセイ、およびインベーダーアッセイを含むが、これらに限定されない。そのような方法は、検出機構、例えば、ルミネッセンスまたは化学発光検出、蛍光検出、時間分解蛍光検出、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光分極、質量分析法、および電気的検出などと組み合わせて使用することもできる。
【０１０１】
多型を検出するための種々の方法は、切断剤からの保護が、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖中におけるミスマッチ塩基を検出するために使用される方法（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）ＳＣＩＥＮＣＥ  ２３０巻：１２４２頁；Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８年）ＰＮＡＳ  ８５巻：４３９７頁；およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２年）ＭＥＴＨ．  ＥＮＺＹＭＯＬ．２１７巻：２８６〜２９５頁）、バリアントおよび野生型核酸分子の電気泳動移動度の比較（Ｏｒｉｔａら（１９８９年）ＰＮＡＳ  ８６巻：２７６６頁；Ｃｏｔｔｏｎら（１９９３年）ＭＵＴＡＴ．  ＲＥＳ．  ２８５巻：１２５〜１４４頁；およびＨａｙａｓｈｉら（１９９２年）ＧＥＮＥＴ．  ＡＮＡＬ．  ＴＥＣＨ．  ＡＰＰＬ．９巻：７３〜７９頁）、および変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用した、変性剤のグラジエントを含有するポリアクリルアミドゲルにおける多型または野生型断片の移動のアッセイ（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）、ＮＡＴＵＲＥ  ３１３巻：４９５頁）を含むが、これらに限定されない。特定の位置における配列の変化も、ヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばＲＮアーゼおよびＳＩ保護または化学切断方法により査定することができる。
【０１０２】
好ましい実施形態では、ＳＮＰ遺伝子型決定は、５’ヌクレアーゼアッセイとしても公知のＴａｑＭａｎアッセイ（米国特許第５，２１０，０１５号および第５，５３８，８４８号）を使用して実施される。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＰＣＲ中に特定の増幅生成物の蓄積を検出する。ＴａｑＭａｎアッセイは、蛍光性レポーター色素およびクエンチャー色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを利用する。レポーター色素は、適当な波長で照射により励起され、エネルギーを、同じプローブ中のクエンチャー色素に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と呼ばれるプロセスを通して移動させる。プローブに取り付けられたとき、励起されたレポーター色素は、シグナルを放射しない。インタクトなプローブ中のレポーター色素にクエンチャー色素が近づくと、レポーターの蛍光の減少が維持される。レポーター色素およびクエンチャー色素は、それぞれ最も５’側の端および最も３’側の端にあってもよく、または逆の場合も可能である。あるいは、レポーター色素が、最も５’側または最も３’側の端にある場合があり、一方クエンチャー色素は、内部のヌクレオチドに取り付けられているか、または逆の場合もある。さらに別の実施形態では、レポーターおよびクエンチャーの両方が、内部のヌクレオチドに、レポーターの蛍光が減少するような互いからある距離で取り付けられていることもある。
【０１０３】
ＰＣＲ中に、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、それによりレポーター色素とクエンチャー色素を分離して、レポーターの蛍光の増大を生じさせる。ＰＣＲ生成物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増大をモニターすることにより直接検出される。ＤＮＡポリメラーゼは、プローブがＰＣＲ中に増幅される標的ＳＮＰ含有鋳型にハイブリダイズした場合にのみ、レポーター色素とクエンチャー色素の間でプローブを切断して、プローブは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在する場合にのみ、標的ＳＮＰ部位にハイブリダイズするようにデザインされている。
【０１０４】
好ましいＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブの配列は、本明細書で提供されるＳＮＰおよび関連する核酸配列情報を使用して、容易に決定することができる。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）などの多くのコンピュータプログラムを、最適のプライマー／プローブのセットを迅速に得るために使用することができる。ＳＮＰを検出するためのそのような本発明のプライマーおよびプローブは、がんを含む種々の障害について予後のアッセイに有用であり、キットフォーマットに容易に組み込むことができることは、当業者には明らかであろう。本発明は、当技術分野において周知のＴａｑｍａｎアッセイの改変、例えば、分子ビーコンプローブの使用（米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号）および他のバリアントフォーマット（米国特許第５，８６６，３３６号および第６，１１７，６３５号）も含む。
【０１０５】
多型の正体も、リボプローブ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９８５年）ＰＮＡＳ  ８２巻：７５７５頁；Ｍｅｙｅｒｓら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０巻：１２４２頁）およびヌクレオチドのミスマッチを認識するタンパク質、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳのタンパク質（Ｍｏｄｒｉｃｈ（１９９１年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５巻：２２９〜２５３頁）を使用するＲＮアーゼ保護方法を含むが、これらに限定されないミスマッチ検出技法を使用して決定することができる。あるいは、バリアントの対立遺伝子は、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析（Ｏｒｉｔａら（１９８９年）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５巻：８７４〜８７９頁；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｒ．  Ｅｌｌｅｓ編、３２１〜３４０頁、１９９６年）または変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｗａｒｔｅｌｌら（１９９０年）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８巻：２６９９〜２７０６頁；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら（１９８９年）ＰＮＡＳ  ８６巻：２３２〜２３６頁）により同定することができる。
【０１０６】
ポリメラーゼに媒介されるプライマー伸長方法は、多型（複数可）を同定するためにも使用することができる。いくつかのそのような方法は、特許および科学文献に記載されており、「遺伝子ビット分析」方法（ＷＯ９２／１５７１２）およびリガーゼ／ポリメラーゼに媒介される遺伝子ビット分析（米国特許第５，６７９，５２４号）を含む。関連する方法が、ＷＯ９１／０２０８７、ＷＯ９０／０９４５５、ＷＯ９５／１７６７６、米国特許第５，３０２，５０９号、および第５，９４５，２８３号に開示されている。多型を含有する伸長されたプライマーは、米国特許第５，６０５，７９８号に記載されたように質量分析法により検出することができる。別のプライマー伸長方法は、対立遺伝子特異的ＰＣＲである（Ｒｕａｎｏら（１９８９年）ＮＵＣＬ．  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１７巻：８３９２頁；Ｒｕａｎｏら（１９９１年）ＮＵＣＬ．  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１９巻、６８７７〜６８８２頁；ＷＯ９３／２２４５６；Ｔｕｒｋｉら（１９９５年）Ｊ  ＣＬＩＮ．  ＩＮＶＥＳＴ．９５巻：１６３５〜１６４１頁）。それに加えて、複数の多型部位を、Ｗａｌｌａｃｅら（ＷＯ８９／１０４１４）に記載された対立遺伝子特異的プライマーのセットを使用して、核酸の複数の領域を同時に増幅させることにより調べることもできる。
【０１０７】
本発明のＳＮＰの遺伝子型を決定するための別の好ましい方法は、ＯＬＡで２つのオリゴヌクレオチドプローブを使用することである（例えば、米国特許第４，９８８，６１７号を参照されたい）。この方法では、１つのプローブが、標的核酸のセグメントにＳＮＰ部位と整列した最も３’側の端でハイブリダイズする。第２のプローブが、第１のプローブに対してすぐ３’側で標的核酸分子の隣接するセグメントにハイブリダイズする。２つの並列したプローブは標的核酸分子へハイブリダイズし、第１のプローブの最も３’側のヌクレオチドとＳＮＰ部位の間に完全な相補性があれば、リガーゼなどの連結剤の存在でライゲーションされる。ミスマッチがあれば、ライゲーションは起こらないであろう。反応後、ライゲーションされたプローブは標的核酸分子から分離され、ＳＮＰの存在の指示薬として検出される。
【０１０８】
全て参照により本明細書に組み込まれる、以下の特許、特許出願、および公開された国際特許出願は、種々のタイプのＯＬＡを実施するための技法に関係する追加の情報を提供する：米国特許第６，０２７，８８９号、第６，２６８，１４８号、第５，４９４，８１０号、第５，８３０，７１１号、および第６，０５４，５６４号は、ＳＮＰ検出を実施するためのＯＬＡ戦略を記載している；ＷＯ９７／３１２５６およびＷＯ００／５６９２７は、ｚｉｐコード配列がハイブリダイゼーションプローブの１つに導入されてもよく、生じた生成物または増幅生成物が、ユニバーサルｚｉｐコードアレイにハイブリダイズする、ユニバーサルアレイを使用してＳＮＰ検出を実施するためのＯＬＡ戦略を記載している；米国特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１７３２９（および出願番号０９／５８４，９０５）は、ＯＬＡ（またはＬＤＲ）とそれに続くＰＣＲを記載しており、そこでｚｉｐコードはＯＬＡプローブに組み込まれて、増幅されたＰＣＲ生成物は、電気泳動またはユニバーサルｚｉｐコードアレイの読出しにより決定される；米国特許出願第６０／４２７，８１８号、第６０／４４５，６３６号、および第６０／４４５，４９４号は、ＳＮＰｌｅｘ方法およびＯＬＡとそれに続くＰＣＲを使用するマルチプレックス化ＳＮＰ検出のためのソフトウェアを記載しており、そこではｚｉｐコードがＯＬＡプローブに組み込まれて、増幅されたＰＣＲ生成物がｚｉｐｃｈｕｔｅ試薬とハイブリダイズされ、ＳＮＰの正体がｚｉｐｃｈｕｔｅの電気泳動読出しから決定される。一部の実施形態では、ＯＬＡは、ＰＣＲ（または核酸増幅の別の方法）に先立って実施される。他の実施形態では、ＰＣＲ（または核酸増幅の別の方法）は、ＯＬＡに先立って実施される。
【０１０９】
ＳＮＰ遺伝子型決定のための別の方法は、質量分析法に基づく。質量分析法は、ＤＮＡの４種のヌクレオチドの各々の固有の質量を利用する。別のＳＮＰ対立遺伝子を有する核酸の質量の差を測定することにより、ＳＮＰの遺伝子型を質量分析法により一義的に同定することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリクス補助レーザー脱離イオン化−飛行時間）質量分析法の技術は、例えばＳＮＰなどの極めて精密な分子量の決定のために好ましい。ＳＮＰ分析に対する多数の手法が質量分析法に基づいて開発されている。ＳＮＰ遺伝子型決定の質量分析法に基づく好ましい方法は、プライマー伸長アッセイを含み、その方法も、伝統的なゲルに基づくフォーマットおよびマイクロアレイなどの他の手法と組み合わせて利用することができる。
【０１１０】
典型的には、プライマー伸長アッセイは、プライマーをデザインして、標的ＳＮＰの位置から上流（５’側）の鋳型ＰＣＲアンプリコンにアニーリングすることを含む。ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）および／またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の混合物を、鋳型（例えば、典型的にはＰＣＲなどにより増幅されたＳＮＰ含有核酸分子）、プライマー、およびＤＮＡポリメラーゼを含有する反応混合物に加える。プライマーの伸長は、混合物中のｄｄＮＴＰの１つに相補性のヌクレオチドが存在する、鋳型中の最初の位置で停止する。プライマーは、直ぐ隣接する（即ち、プライマーの３’末端にあるヌクレオチドが、標的ＳＮＰ部位の隣のヌクレオチドにハイブリダイズする）かまたはＳＮＰの位置から２個またはそれよりも多いヌクレオチドだけ隔たった位置のいずれかにあり得る。プライマーが、標的ＳＮＰの位置から数ヌクレオチド隔たっている場合、唯一の制限は、プライマーの３’末端とＳＮＰの位置の間の鋳型配列が、検出されるべきものと同じタイプのヌクレオチドを含有することができないこと、またはこのことが、伸長プライマーの早すぎる停止の原因となることである。あるいは、４種全てのｄｄＮＴＰのみが、ｄＮＴＰなしで、反応混合物に加えられる場合、プライマーは、常に、標的ＳＮＰの位置に相当する１ヌクレオチドしか伸長されない。この場合には、プライマーは、ＳＮＰの位置から１ヌクレオチド上流に結合するようにデザインされる（即ち、プライマーの３’末端にあるヌクレオチドが、標的ＳＮＰ部位の５’側で標的ＳＮＰ部位に直ぐ隣接するヌクレオチドにハイブリダイズする）。ほんの１ヌクレオチドの伸長は、伸長されたプライマーの全体的質量を最小化して、それにより別のＳＮＰヌクレオチドとの間の質量差の分解能を増大させるので、好ましい。さらに、質量タグ付きのｄｄＮＴＰは、プライマー伸長反応で、改変されていないｄｄＮＴＰの代わりに使用することができる。これは、これらのｄｄＮＴＰで伸長されたプライマー間の質量差を増大させて、それにより向上した感度および精度を提供して、ヘテロ接合の塩基位置の型を決定するために特に有用である。質量タグ付けは、集約的な試料調製手順の必要性を緩和して、質量分析計の必要な分解能も減少させる。
【０１１１】
伸長されたプライマーは、次に精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析され、標的ＳＮＰの位置に存在するヌクレオチドの正体を決定することができる。分析の１つの方法で、プライマー伸長反応からの生成物は、マトリクスを形成する光を吸収する結晶と組み合わされる。マトリクスは、次に、レーザーなどのエネルギー供給源に衝突され、核酸分子をイオン化して気相中に脱離させる。イオン化された分子は、次に飛行管中に射出され、検出器に向かって管内で加速される。レーザーパルスなどイオン化事象と検出器と分子の衝突との間の時間が、その分子の飛行時間である。飛行時間は、イオン化分子の電荷に対する質量の比（ｍ／ｚ）と精密に相関される。ｍ／ｚがより小さいイオンは、ｍ／ｚがより大きいイオンよりも速く管を移動して、それ故、より軽いイオンが、より重いイオンの前に検出器に到達する。次に、飛行時間は、対応するおよび高度に精密なｍ／ｚに変換される。この様式で、ＳＮＰは、単一の塩基位置に異なるヌクレオチドを有する核酸分子に固有の質量の僅かな差、および対応する飛行時間差に基づいて同定され得る。ＳＮＰ遺伝子型決定のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法に関連するプライマー伸長アッセイの使用に関するさらなる情報については、例えば、Ｗｉｓｅら、「Ａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」、ＲＡＰＩＤ  ＣＯＭＭＵＮ  ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣＴＲＯＭ．２００３年；１７巻（１１号）：１１９５〜２０２頁を参照されたい。
【０１１２】
以下の参照文献は、ＳＮＰ遺伝子型決定のための質量分析法に基づく方法を記載するさらなる情報を提供する：Ｂｏｃｋｅｒ（２００３年）ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  １９巻の補遺１巻：１４４〜１５３頁；Ｓｔｏｒｍら（２００３年）ＭＥＴＨＯＤＳ  ＭＯＬ．  ＢＩＯＬ．２１２巻：２４１〜６２頁；Ｊｕｒｉｎｋｅら（２００２年）ＡＤＶ  ＢＩＯＣＨＥＭ  ＥＮＧ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．７７巻：５７〜７４頁；およびＪｕｒｉｎｋｅら（２００２年）ＭＥＴＨＯＤＳ  ＭＯＬ．  ＢＩＯＬ．１８７巻：１７９〜９２頁。
【０１１３】
ＳＮＰは、直接ＤＮＡ配列決定によりスコアをつけることもできる。質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎら（１９９６年）ＡＤＶ．  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲ．３６巻：１２７〜１６２頁；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３年）ＡＰＰＬ．  ＢＩＯＣＨＥＭ．  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．３８巻：１４７〜１５９頁を参照されたい）を含む種々の自動化された配列決定手順を利用することができる（（１９９５年）ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  １９巻：４４８頁）。本発明の核酸配列は、当業者が、そのような自動化された配列決定手順のための配列決定プライマーを容易にデザインすることを可能にする。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７７、３１００、３７００、３７３０、および３７３０ｘ１  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ）などの市販の計器類が、当技術分野で自動化された配列決定のために一般的に使用される。
【０１１４】
本発明のＳＮＰの遺伝子型を決定するために使用することができる他の方法は、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、および変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）ＮＡＴＵＲＥ  ３１３巻：４９５頁）を含む。ＳＳＣＰは、Ｏｒｉｔａら、ＰＲＯＣ．  ＮＡＴ．  ＡＣＡＤ．に記載されたように、一本鎖のＰＣＲ生成物の電気泳動移動における変化により塩基差を同定する。一本鎖のＰＣＲ生成物は、二本鎖のＰＣＲ生成物を加熱するかまたは他の方法で変性させることにより発生させることができる。一本鎖の核酸は、塩基配列に部分的に依存する二次構造を再びフォールディングするかまたは形成することができる。一本鎖の増幅生成物の異なる電気泳動移動度は、ＳＮＰの位置における塩基−配列差と関連する。ＤＧＧＥは、異なる配列に依存する安定性および多型ＤＮＡに固有の融解特性および変性グラジエントゲルにおける電気泳動移動パターンにおける対応する差に基づいて、ＳＮＰの対立遺伝子を識別する（Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年、第７章）。
【０１１５】
配列特異的リボザイム（米国特許第５，４９８，５３１号）は、リボザイム切断部位の発生または喪失に基づいて、ＳＮＰにスコアをつけることに使用することもできる。完全にマッチした配列は、ヌクレアーゼ切断消化アッセイにより、または融解温度の差により、ミスマッチ配列と区別することができる。ＳＮＰが制限酵素切断部位に影響するならば、ＳＮＰは、制限酵素消化パターンにおける変化により同定することができ、核酸断片の長さにおける対応する変化はゲル電気泳動により決定される。
【０１１６】
ＳＮＰ遺伝子型決定は、例えば、ヒト被験体からの生物学的試料（例えば、組織、細胞、体液、分泌物、その他の試料）を収集するステップ、試料の細胞から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは両方）を単離するステップ、標的核酸領域のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下で、核酸を、標的ＳＮＰを含有する単離された核酸の領域に特異的にハイブリダイズする１種または複数のプライマーと接触させるステップ、および目的のＳＮＰの位置に存在するヌクレオチドを決定するステップを含むことができ、または、幾つかのアッセイでは、増幅生成物の存在または不在を検出することを含むことができる（アッセイは、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅が、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在するかまたは存在しない場合にのみ起こるようにデザインすることができる）。幾つかのアッセイでは、増幅生成物のサイズが検出され、対照試料の長さと比較される；例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較した増幅生成物のサイズにおける変化により検出することができる。
【０１１７】
ＳＮＰ遺伝子型決定のための生物学的試料は、核酸を含有する任意の組織または流体であってもよい。種々の実施形態は、パラフィン包埋組織、凍結された組織、手術用の細い注射針による吸引物、および乳房、子宮内膜、卵巣、子宮、または子宮頸部の細胞を含む。他の実施形態は、流体試料、例えば、末梢血のリンパ球、リンパ液、腹水、漿液、痰、および糞便または膀胱洗浄液および尿などの泌尿器検体を含む。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
ＫＲＡＳバリアント（ｒｓ６１７６４３７０、ＧＧ／ＴＧ、ＬＣＳ６）は、ＫＲＡＳ中のｌｅｔ−７のマイクロＲＮＡ結合部位における生殖細胞系変異であり、それは、ＫＲＡＳ経路のシグナル伝達およびｌｅｔ−７マイクロＲＮＡレベルを変化させる。下で示すように、ＫＲＡＳバリアントは、放射線およびセツキシマブを用いてまたは用いずに化学療法で処置された局所的に進行した頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）を有する患者において、変化した応答のバイオマーカーとして作用することができる。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性であった患者における転帰に対するＫＲＡＳバリアントの影響も調べた。
【０１１９】
下で詳細に説明するように、試験された４１３名の患者のうち、７０名（１６．９％）がＫＲＡＳバリアントを有した。全体として、セツキシマブで処置されたＫＲＡＳバリアント患者について、最初の１年の間における無増悪生存（ＰＦＳ）に（ＨＲ０．３１、ｐ＝０．０４）、および１〜２年における全生存（ＯＳ）（ＨＲ０．１９、ｐ＝０．０３）に有意の改善があったが、非ＫＲＡＳバリアント群におけるセツキシマブ処置には利益がなかった。セツキシマブなしで処置された患者について、ＫＲＡＳバリアントとｐ１６状態との有意の相互作用があった（ｐ＝０．０４）。ＫＲＡＳバリアントおよびｐ１６陽性であった患者は、非バリアント患者と比較して、より劣るＰＦＳ（ＨＲ２．５９）およびＯＳ（ＨＲ２．４８）を有したが、それでもＫＲＡＳバリアントおよびｐ１６陰性であった患者は、非バリアント患者よりも良いＰＦＳおよびＯＳを有した（それぞれＨＲ０．６２および０．６１）。セツキシマブの添加は、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者について、ＰＦＳ（ＨＲ０．６０）およびＯＳ（ＨＲ０．２１）を改善するように思われた。ＨＰＶ陽性のＨＮＳＣＣ患者の免疫プロファイリングにより、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者は、免疫が抑制されたベースラインと矛盾しない免疫の変化を有することが示され、それが彼らを非ＫＲＡＳバリアント患者と区別した。
【０１２０】
プロトコールおよび患者
ＮＲＧ腫瘍学ＲＴＯＧ０５２２は、ＨＮＳＣＣが進行した患者について、同時にシスプラチンを含む放射線療法にセツキシマブを加えることを試験する第ＩＩＩ相試験であった。２名の適格患者が、病理学的に証明された中咽頭、下咽頭、または喉頭の扁平上皮細胞癌を有し、選択されたステージＩＩＩまたはＩＶ疾患（Ｔ２  Ｎ２〜３  Ｍ０またはＴ３〜４  任意のＮ  Ｍ０）、Ｚｕｂｒｏｄパフォーマンスステータス０〜１、年齢≧１８歳、および十分な骨髄、肝、および腎機能を有した。ＨＰＶ状態は、以前に記載したように１、２、ｐ１６発現により評価した。
【０１２１】
ＵＣＬＡ  ＣＣＲＯ−０２２は、ヒトパピローマウイルスと関連する局所的に進行したＨＮＳＣＣについての、２サイクルの誘発パクリタキセルおよびカルボプラチン化学療法とそれに続く放射線およびパクリタキセルの第ＩＩ相試験であった。適格患者は、中咽頭、下咽頭または喉頭のステージＩＩＩまたはＩＶのＭ０扁平上皮がんを有する、ｐ１６陽性の患者であった。Ｚｕｂｒｏｄパフォーマンスステータス０〜１、年齢≧１８歳、および十分な骨髄、肝、および腎機能も要求された。
【０１２２】
ＫＲＡＳバリアントの試験
末梢血単核細胞または全血から、ゲノムＤＮＡを、遺伝子型決定について以前に記載されたように３１単離して、１００ｎｇをＣＬＩＡ認証を受けた実験室で、ＫＲＡＳバリアントについて分析した（Ｍｉｒａ  Ｄｘ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）。これらの分析のために、ホモ接合体の（ＧＧ）患者をヘテロ接合の（ＴＧ）患者とグループ化した。
【０１２３】
統計方法
局所領域不全（ＬＲＦ）、遠隔転移（ＤＭ）、無増悪生存（ＰＦＳ）、および全生存（ＯＳ）は、ＮＲＧ腫瘍学ＲＴＯＧ０５２２のプロトコールで定義された通りである。ＬＲＦおよびＤＭ率は、累積発生率法３２により推定した。ＰＦＳおよびＯＳ率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの方法３３により推定した。ハザード比は、Ｃｏｘモデル３４により推定した。有害事象は、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）バージョン３．０により等級づけた。オッズ比は、ロジスティック回帰により推定した。患者の特徴は、フィッシャーの正確検定（カテゴリー的変数）またはウィルコクソン順位和検定（序数または連続変数）により比較した。全ての分析は、ＳＡＳバージョン９．４を使用して実施した。
【０１２４】
ＣＣＲＯ  ＨＮＳＣＣ患者の免疫表現型決定
ＣＣＲＯ研究の一部であった２６名のＨＮＳＣＣ患者からの血液試料を分析した。放射線処置前に、４０ｍｌまでの血液を採取してヘパリン処理されたＢＤ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）に入れた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を血液採取の３時間以内にＦｉｃｏｌｌグラジエント遠心分離により単離して、アリコートで１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有するウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、−８０℃に制御された速度で凍結した後、アッセイまで液体窒素に移しておいた。
【０１２５】
患者からのＰＢＭＣを、予め加温した、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で希釈することにより解凍し、ＤＮアーゼで処理して洗浄した。各被験体からの４×１０６のアリコートを、固定可能な生存度染色液５１０（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）を用いて、メーカーの指示に従って調製した後、リンパパネルおよび骨髄パネルの部分として表面マーカーについてアッセイした。リンパパネルを、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＰＥ抗ヒトＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１）、ＰＥ−ＣＦ５９４抗ヒトＣＸＣＲ３（クローンＩＣ６）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１２７（クローンＨＩＬ−７Ｒ−Ｍ２１）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ７００抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、ＢＶ４２１抗ヒトＰＤ−１（クローンＥＨ１２．２Ｈ７）およびＢＶ６５０抗ヒトＣＣＲ６（クローン１１Ａ９）を含有するブリリアント染色緩衝液（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で予め混合した。大部分の試料について、１〜２×１０６細胞を、ＢＶ６０５抗ヒトＣＣＲ７（クローン３Ｄ１２）単独の存在下に３７℃で、１０分予備的に加熱活性化した後、５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で２０分間室温で染色した。細胞を洗浄して３００μｌのＰＢＳに再懸濁して２時間以内にフローサイトメトリーにより分析した。可能であれば、２×１０５事象を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でＵｌｔｒａＣｏｍｐ  ｅＢｅａｄｓ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて累積させた。
【０１２６】
分析は、ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ（Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で、以下のゲーティング戦略を使用して行なった：１）ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）を排除するＦＳＣ−Ｈ／ＦＳＣ−Ａドットプロット；２）生存度ゲートを設定するＦＶＳ５１０−Ａ／ＦＳＣ−Ａドットプロット；３）リンパ球にゲートを設けるＳＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ａドットプロット；４）ＣＤ３＋Ｔ細胞のためにゲートを設定するＣＤ３／ＦＳＣ−Ａドットプロット；５）ＣＤ３＋ＣＤ８＋およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択するＣＤ８／ＣＤ４ドットプロット；５）ナイーブ、エフェクター、セントラルメモリーおよびエフェクターメモリーサブセットを詳細に分析するために、ＣＣＤ７／ＣＤ４５ＲＡ発現３５ならびにそれらのＰＤ１レベルについて個々にチェックされるＣＤ３＋ＣＤ８＋およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞；７）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ状態に従ってＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート内で規定され、それに対してＣＸＣ３とＣＣＲ６の組み合わせは、Ｔヘルパー系統間の区別を導いた。品質制御は、全ての得られたデータが、生存度≧５０％およびＣＤ３＋ＣＤ８＋およびＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞≧２，０００であることを要求した。
【０１２７】
骨髄パネルは、ブリリアント染色緩衝液中で上記のように予め混合されたＦＩＴＣ抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ（クローンＧ４６−６）、ＰＥ抗ヒトＣＤ１４（クローンＭｑＰ９）、ＰＥ−ＣＦ５９４抗ヒトＣＤ５６（クローンＢＩ５９）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１５（クローンＨＩ９８）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００抗ヒトＣＤ１１ｃ（クローンＢ−ｌｙ６）、ＡＰＣ−Ｈ７抗ヒトＣＤ２０（クローン２Ｈ７）、ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ１２３（クローン７Ｇ３）、ＢＶ５１０抗ヒトＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１）、およびＢＶ６５０抗ヒトＣＤ１６（クローン３Ｇ８）を含んだ。１〜２×１０６の細胞を、５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ染色緩衝液中で、３０分間室温で染色し、洗浄して上記のように分析した。ゲーティング戦略は以下の通りであった：１）ダブレットをゲートにより排除するＦＳＣ−Ｈ／ＦＳＣ−Ａドットプロット；２）ＣＤ３＋リンパ球および死細胞を排除する５１０−Ａ／ＦＳＣ−Ａドットプロット；３）生きているＣＤ３−ＣＤ１９−細胞および生きているＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞をＣＤ２０の同時発現に基づいて最終的にＢ細胞を生じさせるＣＤ１９＋サブセットとともに選択するＣＤ１９／ＦＳＣ−Ａドットプロット；４）ＣＤ１９−サブセットを、ＨＬＡ−ＤＲ＋骨髄系統とＨＬＡ−ＤＲ−骨髄系統の間を識別するために使用した；６）ＤＲ＋細胞は、古典的、中間および非古典的単球のためのＣＤ１４／ＣＤ１６発現により単球のサブセットに導かれた、７）それと反対にＤＲ−細胞は、本発明者らをＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４−／ｌｏＣＤ１５ｈｉ顆粒球性骨髄から誘導されたサプレッサー細胞（ｇＭＤＳＣ）に導いた；８）生きているＣＤ３−ＣＤ１９−細胞を、ＣＤ１１ｂ＋ＤＲｌｏ／−ＣＤ１４＋単球系骨髄から誘導されたサプレッサー細胞（ｍＭＤＳＣ）、ＣＤ１４−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋／−ＮＫ細胞ならびに骨髄（ＣＤ１１ｃｈｉ／ＣＤ１４−）変種（ｆｌａｖｏｒ）の樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３ｈｉ／ＣＤ１４−）変種の樹状細胞にゲートさせるために使用した３５。
【０１２８】
全てのデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を用いて統計有意性について分析した。統計有意性は５％水準であった。
【０１２９】
結果
ＫＲＡＳバリアントを有するおよび有しない患者の臨床特徴
９４０名の患者をＮＲＧ腫瘍学ＲＴＯＧ０５２２に登録し、そのうち８９１名（９４．８％）は、プロトコール分析のために適格であり、４１３名は、ＫＲＡＳバリアントの試験に利用可能な生物学的試料を有した（４６．４％）。ＫＲＡＳバリアントについて試験されなかった患者は、ＫＲＡＳバリアントについて試験された患者よりも有意に低年齢（ｐ＝０．０２）であったが、差の中央値は僅か２年であった（５６歳対５８歳）（表１）。ＰＦＳおよびＯＳも、ＫＲＡＳバリアントについて試験された患者および試験されなかった患者について同様であった［ＰＦＳハザード比０．９２（９５％ＣＩ  ０．７６から１．１３）；ＯＳハザード比０．９９（９５％ＣＩ  ０．７８から１．２５）］。
【表１−１】
2019515035.tif 000016
【表１−２】
2019515035.tif 000017
【０１３０】
分析時に、生存患者についての追跡期間の中央値は４．８年であった（範囲は０．２から６．９年）。ＫＲＡＳバリアントについて試験された４１３名の研究参加者のうち、５名（１．２％）がホモ接合（ＧＧ）および６５名（１５．７％）がヘテロ接合（ＴＧ）であり、この患者集団における全体的有病率は１６．９％という結果であった。ＫＲＡＳバリアントとｐ１６陽性の関連はなく、ＫＲＡＳバリアントは、ｐ１６陰性患者の１７．４％およびｐ１６陽性患者の１６．０％に見出され、以前の研究と一致した２３。
【０１３１】
セツキシマブで処置された群  対  処置されなかった群における臨床特徴
ＫＲＡＳバリアントコホート内の、セツキシマブで処置されたサブセットは、セツキシマブを受けなかったサブセットより多くのｐ１６陽性で中咽頭腫瘍を有する患者を有し（８６．７％対５０．０％、ｐ＝０．０５）、白色人種の患者はより少なかった（８７．５％対１００％、ｐ＝０．０４；表２）。非バリアントコホート内の、セツキシマブで処置されたサブセットは、セツキシマブを受けなかったサブセットよりも有意に年齢が低くかったが、差の中央値は２年に過ぎなかった（５９歳対５７歳、ｐ＝０．０５）。
【表２−１】
2019515035.tif 000018
【表２−２】
2019515035.tif 000019
【０１３２】
ＫＲＡＳバリアント状態、セツキシマブおよび無増悪生存
ＫＲＡＳバリアント群において、セツキシマブ処置の有意の陽性効果が、最初の１年にＰＦＳについて見出された（ハザード比０．３１、９５％ＣＩ  ０．１０から０．９４、ｐ＝０．０４）が、しかし１年後には有意差は見出されなかった（ハザード比１．７６、９５％ＣＩ  ０．６２から４．９５、ｐ＝０．２８）。ＫＲＡＳバリアント患者について、セツキシマブ処置の効果は、時間をわたり有意に変化した［処置と無増悪生存時間の間の相互作用についてｐ＝０．０２（＞１年）］。非バリアント群では、セツキシマブのＰＦＳに対する影響はなく、処置効果のハザード比［セツキシマブ／セツキシマブなし］は１．００であった（９５％ＣＩ  ０．７２から１．３８、ｐ＝０．９８）。ＫＲＡＳバリアント状態および割り当てられた処置によるＰＦＳを図１Ａに示す。ＫＲＡＳバリアントおよび非バリアント患者の両方を含む多変量解析（表３）で、処置、時間（＞１年）およびＫＲＡＳ群の間で相互作用は依然有意であり（ｐ＝０．０２）、ＫＲＡＳバリアント群では処置と時間との間に相互作用があるが、非バリアント群ではないことを示す。最初の１年におけるＫＲＡＳバリアント群についての処置効果は、０．４２（ｐ＝０．１２）であり、その後１．２２（ｐ＝０．６４）であった（相互作用についてｐ＝０．１０）。非バリアント群では、処置効果は、最初の１年およびその後に、それぞれ１．２０（ｐ＝０．３９）および０．７９（ｐ＝０．３８）であった（相互作用についてｐ＝０．２１）。
【表３】
2019515035.tif 000020
【０１３３】
［０１２４］不全のパターンの多変量解析は、ＬＲＦよりもむしろＤＭが、ＫＲＡＳバリアント患者についてＰＦＳにおける差に貢献している可能性があること：ＫＲＡＳバリアント群では、ＤＭについての処置効果は、０．４５であり（９５％ＣＩ  ０．１２から１．７０）およびＬＲＦについては０．８４（９５％ＣＩ  ０．２９から２．４２）であることを示す。非バリアント群では、ＤＭおよびＬＲＦについての処置効果は、それぞれ、０．９０（９５％ＣＩ  ０．４８から１．７０）および１．２４（９５％ＣＩ  ０．８０から１．９２）である。ＫＲＡＳバリアント状態および割り当てられた処置によるＬＲＦおよびＤＭを、図１Ｂおよび１Ｃに示す。
【０１３４】
ＫＲＡＳバリアント状態、セツキシマブおよび全生存
ＫＲＡＳバリアント患者について、ＯＳに対して、最初の２年には８週間のセツキシマブ処置の有意にポジティブな影響もあったが（ハザード比０．１９、９５％ＣＩ  ０．０４から０．８６、ｐ＝０．０３）、その後はなかった（ハザード比２．３４、９５％ＣＩ  ０．５８から９．４１、ｐ＝０．２３）。処置効果と生存時間（＞２年）の間の相互作用は有意であり（ｐ＝０．０２）、最初の２年とその後では異なる処置効果を示した。非バリアント群では、セツキシマブ処置の全生存に対する影響はなかった（処置効果ハザード比［セツキシマブ／セツキシマブなし］０．９０（９５％ＣＩ  ０．６２から１．３０、ｐ＝０．５６）。ＫＲＡＳバリアント状態および割り当てられた処置によるＯＳを、図１Ｄに示す。ＫＲＡＳバリアント患者および非バリアント患者の両方を含む多変量解析（表３）において、処置、時間（＞２年）、およびＫＲＡＳ群の間の相互作用は有意であり（ｐ＝０．０４）、ＫＲＡＳバリアント群では処置と時間との間に相互作用があるが、非バリアント群ではそれがないことが示された。ＫＲＡＳバリアント群についての最初の２年における処置効果は０．２７（ｐ＝０．０９）であり、その後は１．４７（ｐ＝０．４６）である（相互作用についてｐ＝０．０５）。非バリアント群では、処置効果は、最初の２年では０．８９（ｐ＝０．６２）であり、その後０．８１（ｐ＝０．４９）（相互作用についてｐ＝０．８０）である。
【０１３５】
ＫＲＡＳバリアント患者および毒性の転帰
ＫＲＡＳバリアント患者は、セツキシマブを用いなくても用いてもグレード３〜４の同様なレベルの粘膜炎（４７．４％対５０．０％）を有し、差は有意でないように思われた［ＯＲ  １．１１（９５％ＣＩ  ０．４３から２．８５）、ｐ＝０．８３］。対照的に、セツキシマブの添加は、非バリアント患者におけるグレード３〜４粘膜炎を３７．９％から５０．６％に増大させ、差は有意であった（ＯＲ  １．６８［９５％ＣＩ  １．０９から２．５８］、ｐ＝０．０２）（表４Ａ）。しかしながら、ＫＲＡＳバリアントの状態、セツキシマブ処置および粘膜炎の間の相互作用の検定は、有意でなかった（ｐ＝０．４３）。ＫＲＡＳバリアント患者も、セツキシマブを用いなくても用いても、門脈内側にグレード３〜４の同様なレベルの皮膚反応を有した、１８．４％対１５．６％（ＯＲ  ０．８２［９５％ＣＩ  ０．２３から２．８９］、ｐ＝０．７６）（表４Ｂ）。対照的に、非バリアント患者について、セツキシマブの添加は、門脈内側のグレード３〜４の皮膚反応を１１．２％から２１．８％に増大させ、差は有意であった（ＯＲ  ２．２１［９５％ＣＩ  １．２１から４．０１］、ｐ＝０．０５）が、やはり相互作用の検定は有意でなかった（ｐ＝０．１６）。非バリアント患者およびＫＲＡＳバリアント患者の両方とも、セツキシマブで増大した門脈外側の皮膚反応を発生させた（非バリアントのＯＲ  ５０．１５、ｐ＜０．００１；ＫＲＡＳバリアントのＯＲ  ８．５４、ｐ＝０．０５）（表４Ｃ）。ＫＲＡＳバリアント患者は、粘膜および門脈内側の皮膚の両方で、非バリアント患者と比較してより高いベースラインの毒性を有するように思われたが、これらの差は、おそらく試料サイズのために、統計的に有意ではなかった。
【表４】
2019515035.tif 000021
【０１３６】
ＫＲＡＳバリアント、セツキシマブ、およびｐ１６
セツキシマブで処置された群におけるｐ１６および境界線上の不均衡の既知の予後値のために、ｐ１６の状態を考慮して、ＫＲＡＳバリアント患者における転帰を評価した。ＰＦＳについては、セツキシマブ処置、ＫＲＡＳ、およびｐ１６（ｐ＝０．２０）の間に３通りの相互作用について幾つかの証拠がある。セツキシマブを用いずに処置された患者では、ＫＲＡＳとｐ１６の間の２通りの相互作用が有意であった（ｐ＝０．０４）。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者は、非バリアント／ｐ１６陽性患者と比較してより劣るＰＦＳ（ＨＲ２．５９）を有した。反対の効果が、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者で見られ、彼らは、非バリアント／ｐ１６陰性患者と比較して、改善されたＰＦＳを有した（ＨＲ０．６２）（図２Ａ）。
【０１３７】
対照的に、８週間のセツキシマブ処置は、ＫＲＡＳバリアント患者について、ＰＦＳに対するｐ１６の差次的な効果を除くように思われた（ｐ１６陽性に対してＨＲ０．８９およびｐ１６陰性に対して０．７７；ｐ＝０．８４）（図２Ｂ）。セツキシマブ処置効果は、非バリアント／ｐ１６陽性患者の１．７４（処置とＫＲＡＳの間の相互作用についてｐ＝０．１４）と比較して、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者では０．６０であるので、セツキシマブのポジティブな影響は、主としてＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者に限定されるように見えた。ｐ１６陰性患者では、処置効果は、ＫＲＡＳバリアントおよび非バリアント患者について同様であるが、時間により影響され得る（ＨＲ１．１０および０．８８、相互作用についてｐ＝０．７５）。
【０１３８】
ＯＳについて、セツキシマブ処置、ＫＲＡＳバリアントの状態、およびｐ１６（ｐ＝０．０２）の間に、有意の３通りの相互作用がある。セツキシマブを用いずに処置された患者（ｐ＝０．１０）とセツキシマブを用いて処置された患者で（ｐ＝０．１１）、ｐ１６によるＫＲＡＳの差次的な効果があり得る。セツキシマブを用いずに処置された場合、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者は、非バリアント／ｐ１６陽性患者と比較してより劣ったＯＳ（ＨＲ２．４８）を有した。反対の効果がＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者で見られ、彼らは、非バリアント／ｐ１６陰性患者と比較して改善されたＯＳを有した（ＨＲ０．６１）（図３Ａ）。
【０１３９】
ＯＳについて、８週間のセツキシマブ処置は、ＫＲＡＳバリアント患者について転帰に影響し続けるように思われ、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者は、非バリアント／ｐ１６陽性患者よりも良いＯＳを有した（ＨＲ０．２２）（図３Ｂ）。ｐ１６陽性患者では、処置効果は、非バリアント患者の２．３６（処置とＫＲＡＳの間の相互作用についてｐ＝０．０５）と比較して、ＫＲＡＳバリアント患者では０．２１である。反対の効果が、ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者で見られ、彼らは、セツキシマブ添加（ＨＲ１．４３）でより劣るＯＳを有するように思われたが、それらのＯＳは時間をわたり劇的に減少した。ｐ１６陰性患者では、処置効果は、非バリアント患者における０．６２と比較して、ＫＲＡＳバリアント患者で１．４７である（ｐ＝０．２４）。
【０１４０】
セツキシマブが、ＫＲＡＳバリアント患者に対して、ＰＦＳおよびＯＳにどのように有意に影響したかを理解するために、ＫＲＡＳバリアント患者について、局所不全および遠隔不全を、８週間のセツキシマブ処置のみをともなって、またはそれをともなわずに評価した。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陰性患者では、セツキシマブは、これらの患者が局所不全を有しなかったので、局所不全を減少させるように思われる。ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者では、セツキシマブの添加で局所不全にいかなる改善も生じなかったように思われる（図１Ｅ）。セツキシマブは、ｐ１６陽性または陰性のいずれであっても、ＫＲＡＳバリアント患者については、遠隔転移性不全の率を減少させるように思われ、それが、ｐ１６陽性患者については長く持続したが、ｐ１６陰性患者では続かなかった（図１Ｆ）。
【０１４１】
ＫＲＡＳバリアントおよび免疫学的展望
ＫＲＡＳバリアント／ｐ１６陽性患者が、セツキシマブの添加で有意に改善されたＯＳを有したが、セツキシマブを用いない場合、おそらく遠隔転移性疾患における変化により有意に劣ったという事実は、ＫＲＡＳバリアント患者は、放射線に対して不十分な免疫応答を有し得、セツキシマブは何らかの形でそれを克服することに役立つことを示す。それ故、ＫＲＡＳバリアント患者で、照射前のベースライン免疫における差を評価するために、ｐ１６陽性ＨＮＳＣＣ患者で免疫系を評価した。
【０１４２】
ｐ１６陽性の進行したＨＮＳＣＣ患者のコホートで、本発明者らは、放射線処置の開始前に、ベースライン免疫のプロファイリングを実施した。男性と女性とは、彼らの免疫学的構成が実質的に異なり得るという事実のために、また被験体の大部分（２６名のうち２１名；８１％）は、この研究において男性であったので、分析は、男性のみを含めて能率化した。このコホート中のＫＲＡＳバリアントを有する男性（３／２１）におけるベースライン免疫は、その残りとは、比較的多くのＣＤ４＋ＰＢＭＣ（ｐ＝０．０３４）ならびより高いＣＤ４／ＣＤ８比（ｐ＝０．０３６）を有することにより、有意に異なった。対照的に、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ、ｐ＝０．０１７）および顆粒球性骨髄から誘導されたサプレッサー細胞（ｇＭＤＳＣ、ｐ＝０．０２９）は、ＫＲＡＳバリアント患者で有意に少なかった（図４Ａ）。ＣＤ４系統内で、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−エフェクター細胞は、たとえ統計的に有意でなくても、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋ナイーブおよびＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋セントラルメモリーサブセットの利点になることはより頻度が少ない（ｐ＝０．００６）。それ故、ＫＲＡＳバリアント患者は、リンパおよび骨髄系統の両方に影響する免疫の均衡が大きくシフトしているようであり、そのことはベースライン免疫の欠損と矛盾しないようである（図４Ｂ）。
【０１４３】
（実施例２）
以下の例は、ＫＲＡＳバリアント患者における増大した放射線感受性を示す。臨床的に変化した放射線感受性の生物学的および機構的根拠を研究するために、一連の正常およびがんのマッチした、同質遺伝子のＫＲＡＳバリアントを有する細胞系統と有しない細胞系統を、標的化ゲノム編集により創り出した（表５）。
【表５】
2019515035.tif 000022
【０１４４】
ＫＲＡＳバリアントの位置的ヘテロ接合の挿入を、各同質遺伝子対で、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定により確認した。対立遺伝子特異的ｍＲＮＡ発現およびウェスタンブロットによるＫＲＡＳタンパク質発現の分析により、各同質遺伝子対について、ＫＲＡＳの遺伝子座における２対立遺伝子の発現を確認した。最終的に、各同質遺伝子細胞系統の真正性をＧｅｎｅｔｉｃａ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおけるＳＴＲ分析により証明した。
【０１４５】
二本鎖（ＤＳ）切断修復は、ＫＲＡＳバリアント腫瘍組織と比較してＫＲＡＳバリアント正常組織で非効率的である。ベースライン、ならびに同質遺伝子対で、放射線をともなうおよび放射線をともなわない残存二本鎖切断を評価するために、γＨ２ＡＸアッセイを実施した。ＫＲＡＳバリアントを有するかまたは有しない正常および腫瘍組織を代表するＭＣＦ１０ＡおよびＨ１２９９細胞系統を評価した。細胞を５Ｇｙで照射して、ベースライン、放射線後３０分および４時間に、ＦＩＴＣコンジュゲートγＨ２ＡＸの免疫蛍光分析を、フローサイトメトリーによりで実施した（図５）。正常組織（ＭＣＦ１０Ａ、１番と表示された青のバーおよび２番と表示された赤のバー）では、全ての時点で、ＫＲＡＳバリアント細胞系統においてより多くの二本鎖切断があった（赤対青、２つの別のバリアント系統の平均、標準偏差を含む）ことが見出された。対照的に、腫瘍組織（Ｈ１２９９、３番と表示された緑色のバーおよび４番と表示された紫色）では、ベースラインおよび４時間で、ＫＲＡＳバリアント系統では二本鎖切断がより少なかったことが見出された（紫色対緑色）。これらの知見は、腫瘍組織と比較してＫＲＡＳバリアント正常組織におけるより劣ったＤＮＡ維持および修復を示す。
【０１４６】
ＫＲＡＳバリアントの同質遺伝子正常組織（ＭＣＦ１０Ａ）および腫瘍（Ｈ１２９９）細胞系統の放射線感受性を、正常および腫瘍両方の同質遺伝子のＫＲＡＳバリアントを有するかまたは有しない細胞系統におけるクローン原性の細胞生存アッセイを使用して評価した。ＫＲＡＳバリアントの正常組織細胞系統は、その姉妹非バリアント系統と比較して、劇的に放射線感受性であることが観察された。その非バリアント姉妹と比較して、ＫＲＡＳバリアント腫瘍系統における適度な放射線感受性が観察された（図６）。
【０１４７】
（実施例３）
以下の例は、ＫＲＡＳバリアント患者が、免疫療法に対する毒性応答、即ち、免疫に関連する有害な事象（ｉｒＡＥ）を経験する尤度の統計的に有意な低下を有することを示す。ｉｒＡＥは、例えば、Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂら、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、１１巻（７号）：ｅ０１６０２２１頁（２０１６年）で論じられている。
【０１４８】
抗ＰＤ１抗体療法Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペンブロリズマブ）またはＯｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ）で、または抗ＰＤＬ１抗体療法のＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）（アテゾリズマブ）で処置された８８名の患者からデータを集めた。表６に示したように、処置を受けた８８名の患者のうち、５７名の患者は、処置に対する応答で毒性を経験しなかったが、３１名の患者が、毒性応答を経験した。毒性を経験しない５７名の患者のうち、１４名がＫＲＡＳバリアントを有した。毒性を経験した３１名の患者のうち、２名がＫＲＡＳバリアントを有した。表６に示したこれらのデータのカイ２乗分析に基づいて、４．４２６８のカイ２乗値および０．０３５３７８のｐ値（ｐ＜０．０５が有意である）を考慮すると、ＫＲＡＳバリアントを保有している患者は、免疫療法を用いる処置に対して、ＫＲＡＳバリアントを保有していない患者と比較して、毒性応答の尤度の統計的に有意な低下を有することが示された。したがって、ＫＲＡＳバリアントを保有している患者は、免疫療法、例えば、チェックポイント阻害剤療法に対する無毒性応答を有する可能性が非常に高い。
【表６】
2019515035.tif 000023
【０１４９】
したがって、この例に基づいて、医師は、患者がＫＲＡＳバリアントを保有しているかどうかを決定することにより、患者に対して特定の免疫療法を投与するか否かを決定することができる。ＫＲＡＳバリアントの存在は、患者が治療に対する無毒性応答を有している可能性があること、および患者が治療を安全に続けると予想することができることを示すであろう。これは、医師が、患者のがんを処置するのに適した処置レジメンを決定する際に、考慮に入れるための１つの重要な要因である。対照的に、患者中におけるＫＲＡＳバリアントの不在は、患者の免疫療法に対する予測される毒性を確定するものではない。
【０１５０】
等価物
本発明は、本発明の精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化することもできる。それ故、前述の実施形態は、本明細書に記載された本発明に対する限定を課すものではなく、全ての点で例示と考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によらず、添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に入る全ての変化は本発明の内に包含されることが意図される。
【０１５１】
参照による組み込み
本出願で引用された全ての刊行物および特許文献は、恰も、個々の各刊行物または特許文献の内容全体が、本明細書に組み込まれたかの如く、同じ程度で、全ての目的のために、それらの全体で、参照により組み込まれる。
参照文献
【化１５】
2019515035.tif 000024
【化１６】
2019515035.tif 000025
【化１７】
2019515035.tif 000026
【図１Ａ】
2019515035.tif 000027
【図１Ｂ】
2019515035.tif 000028
【図１Ｃ】
2019515035.tif 000029
【図１Ｄ】
2019515035.tif 000030
【図１Ｅ】
2019515035.tif 000031
【図１Ｆ】
2019515035.tif 000032
【図２Ａ】
2019515035.tif 000033
【図２Ｂ】
2019515035.tif 000034
【図３】
2019515035.tif 000035
【図４Ａ】
2019515035.tif 000036
【図４Ｂ】
2019515035.tif 000037
【図５】
2019515035.tif 000038
【図６】
2019515035.tif 000039
【配列表】
2019515035000001.app
【国際調査報告】
2019515035.tif 000040
2019515035.tif 000041
2019515035.tif 000042
2019515035.tif 000043