(57)【要約】  本発明は、ジベレリンの検出に関し、より詳細には、オオムギにおけるジベレリンの検出に関するが、これのみではない。当技術分野における問題は、ジベレリンを検出する検査には、専用の装置が必要であり、それにより費用と時間のかかるものになっていることである。したがって、本発明の目的は、上記の欠点を少なくとも部分的に克服又は軽減することができるジベレリンを検出するためのリガンド結合アッセイを提供すること、及び／又は本技術分野に対してより有用な代替案を提供することである。本発明は、アプタマーの使用によりオオムギ種子でジベレリンを検出するための、使用時点でのリガンド結合アッセイを提供することが想定されている。
2019525777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む試料のジベレリンの存在を検出するためのリガンド結合アッセイ：
−ジベレリンに結合するように選択された標的結合要素、及び
−前記標的結合要素がジベレリンに結合したときに前記試料のジベレリンの存在を示す視覚的指標と関連する前記標的結合要素。
【請求項２】
標的結合要素がアプタマーである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
アプタマーが、核酸配列
５’−ＮＨＭＣＶＮＮＮＨＤＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＮＮＮＨＷＮＤＹＤ
ＤＮＤＮＮＨＨＨＮＨＮＶＶＨＮＮＮＮＮＤＮＮＤＢＮＨＮＮＮＨＤ−３’
（配列番号１２）
の６２ヌクレオチド
−ＹはＴ又はＣであり、
−ＭはＡ又はＣであり、
−ＷはＡ又はＴであり、
−ＢはＧ又はＣ又はＴであり、
−ＤはＡ又はＧ又はＴであり、
−ＨはＡ又はＣ又はＴであり、
−ＶはＡ又はＧ又はＣであり、
−ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである、
又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体、を有する、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
アプタマーが核酸配列
５’−ＴＧＡＧＧＤＶＮＶＮＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＭＡＡＹＤＨＭＨＮ
ＶＮＮＮＮＮＨＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＤＨＮＮＮ−３’
（配列番号１３）
の６２ヌクレオチド
−ＹはＴ又はＣであり、
−ＭはＡ又はＣであり、
−ＤはＡ又はＧ又はＴであり、
−ＨはＡ又はＣ又はＴであり、
−ＶはＡ又はＧ又はＣであり、
−ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである、
又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体、を有する、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項５】
アプタマーが、配列番号１〜１１の配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の相同性を有する核酸配列を含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項６】
リガンド結合アッセイがラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイであり、アプタマーが担体に結合しており、指標が、前記担体のアプタマー結合部位の飽和状態から結合シグナルの形態で提供される、請求項２〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項７】
アッセイが阻害アッセイである、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
担体がチオール化によりアプタマーに結合した金ナノ粒子である、請求項６又は７に記載のアッセイ。
【請求項９】
高度に局在化した濃度の金ナノ粒子に由来する表面のプラズマ共鳴が、試料にジベレリンが存在しない場合に視覚的指標を提供する、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
視覚的指標が、ラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイの表示部分の可視の赤色信号として知覚可能である、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
可視の赤色信号が、アプタマー結合金ナノ粒子複合体が担体の結合部位を飽和させ、それによって金粒子の凝集を妨げた結果である、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１２】
アッセイが、ジベレリンの存在下で視覚的指標が蛍光の形態で提供されるように、フルオロフォアとクエンチャーの対に化学的に連結されているアプタマーを含む、非放射性リガンド結合アッセイである、請求項２〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１３】
フルオロフォアとクエンチャーの対が、核酸の染料及び蛍光ハイブリダイゼーションプローブである、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１４】
リガンド結合アッセイが、ジベレリンの存在下で視覚的指標が蛍光の形態で提供されるように、アクセプター及びドナーの対に化学的に連結されているアプタマーを含む、請求項２〜５のいずれかに記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド結合アッセイに関するものであり、より具体的にはオオムギにおいてジベレリンを検出するためのリガンド結合アッセイに関するが、これのみではない。
【背景技術】
【０００２】
ジベレリン又はジベレリン酸（ＧＡ）は、成長を調節し、茎の伸長、発芽、休眠、開花、性の発現、酵素の誘導、及び葉及び果実の老化を含む、様々な発達過程に影響を与える植物のホルモンである。
【０００３】
すべての既知のジベレリンは、プラスチドでテルペノイド経路によって合成され、次いでそれらがその生物学的に活性な形態に達するまで小胞体及びサイトゾルにて修飾される、四環式ジテルペン酸である。すべてのジベレリンはｅｎｔ−ジベレラン骨格を介して誘導されるが、ｅｎｔ−カウレンを介して合成される。
【０００４】
当技術分野における問題は、ジベレリンを検出する検査には、専用の装置が必要であり、それにより費用と時間のかかるものになっていることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明の目的は、先行技術に関連する問題を少なくとも部分的に軽減する、ジベレリンを検出するためのリガンド結合アッセイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、試料のジベレリンの存在を検出するためのリガンド結合アッセイであって、
−ジベレリンに結合するように選択された標的結合要素、及び
−標的結合要素がジベレリンに結合したときに試料のジベレリンの存在を示す視覚的指標と関連する標的結合要素
を含むリガンド結合アッセイが提供される。
【０００７】
ジベレリンはジベレリン酸ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４又はＧＡ７である。
【０００８】
標的結合要素は標的部分である。その部分はアプタマーである。
【０００９】
アプタマーが、核酸配列−５’ＮＨＭＣＶＮＮＮＨＤＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＮＮＮＨＷＮＤＹＤＤＮＤＮＮＨＨＨＮＨＮＶＶＨＮＮＮＮＮＤＮＮＤＢＮＨＮＮＮＨＤ−３’（配列番号１２）の６２ヌクレオチドを有する。
ここで、ＹはＴ又はＣであり、
ここで、ＭはＡ又はＣであり、
ここで、ＷはＡ又はＴであり、
ここで、ＢはＧ又はＣ又はＴであり、
ここで、ＤはＡ又はＧ又はＴであり、
ここで、ＨはＡ又はＣ又はＴであり、
ここで、ＶはＡ又はＧ又はＣであり、
ここで、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである、未知である、又はその他である、
又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体である。
【００１０】
アプタマーが核酸配列５’−ＴＧＡＧＧＤＶＮＶＮＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＭＡＡＹＤＨＭＨＮＶＮＮＮＮＮＨＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＤＨＮＮＮ−３’（配列番号１３）の６２ヌクレオチドを有する。
ここで、ＹはＴ又はＣであり、
ここで、ＭはＡ又はＣであり、
ここで、ＤはＡ又はＧ又はＴであり、
ここで、ＨはＡ又はＣ又はＴであり、
ここで、ＶはＡ又はＧ又はＣであり、
ここで、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである、未知である、又はその他である、
又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体である。
【００１１】
アプタマーは、以下の配列番号１〜１１からなる群から選択される核酸配列からなる群Ｇ１〜Ｇ１０から選択される配列に対して少なくとも９０％の相同性を有する核酸配列、又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体を含み得る。
【００１２】
リガンド結合アッセイがラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイであってよく、この場合アプタマーが担体に結合しており、指標が、担体のアプタマー結合部位の飽和状態から結合シグナルの形態で提供される。
【００１３】
ラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイは阻害アッセイであり得る。
【００１４】
担体は金ナノ粒子であってもよく、金ナノ粒子はチオール化によってアプタマーに結合していてもよい。
【００１５】
高度に局在化した濃度の金ナノ粒子に由来する表面のプラズマ共鳴は、試料にジベレリンが不在であることの視覚的な指標を生じる。視覚的指標は、ラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイの表示部分の可視の赤色信号として知覚可能な場合がある。
【００１６】
金ナノ粒子のアプタマー結合部位の飽和状態に由来する結合シグナルが減少したことにより、試料にジベレリンが存在する赤色信号の不在に至る。
【００１７】
可視の赤色信号は、アプタマー結合金ナノ粒子複合体が担体の結合部位を飽和させ、それによって金粒子の凝集を妨げた結果である。
【００１８】
リガンド結合アッセイは、ディスポーザブルな検査の膜に生成物を適用した、ラテラルフロー又は垂直フローのディスポーザブル検査の形態であってよい。
【００１９】
垂直フローのディスポーザブル検査は、標準的なサンドイッチ垂直フローアッセイ又は競合型の垂直フローアッセイであり得る。
【００２０】
リガンド結合アッセイは、ジベレリンの存在下で視覚的指標が蛍光の形態で提供されるように、フルオロフォアとクエンチャーの対に化学的に連結されているアプタマーを含む、非放射性リガンド結合アッセイであり得る。
【００２１】
フルオロフォアとクエンチャーの対は、核酸染料及び蛍光ハイブリダイゼーションプローブであり得る。
【００２２】
リガンド結合アッセイは、ジベレリンの存在下で視覚的指標が蛍光の形態で提供されるように、アクセプター及びドナーの対に化学的に連結されているアプタマーを含む。
【００２３】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照しながら、非限定的な例にすぎない例によって、以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ジベレリン標的に対するライブラリーの反応の濃縮プロファイルを示すグラフである。
【図２】指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）によるリガンドの２０サイクルの系統的変化の後に得られた最も豊富なアプタマーの配列を示す表である。
【図３】互いに整列し、９０％の配列相同性に基づいてプールに特徴付けられた図２のアプタマー配列を示す表である。
【図４】「ＴＧＡＧＧ」と呼ばれるクラスの可能なアプタマー配列の概略図である。
【図５】「ＣＣＡＣＣ」と呼ばれるクラスの可能なアプタマー配列の概略図である。
【図６】その最も安定した形態の「ＴＧＡＧＧ」のクラスから得た代表的な配列の可能な構造の概略図である。
【図７】その異なる状態の「ＣＣＡＣＣ」のクラスから得た代表的な配列の可能な構造の概略図である。
【図８】代表的な配列群Ｇ１〜Ｇ１０を表す表である。
【図９】異なる濃度のジベレリンにおけるＧ１からＧ１０までの結合反応を示すグラフである。
【図１０】４つのジベレリンに対するＧ２の混合性の結合反応を示すグラフである。
【図１１】ジベレリンＡ１に対するＧ２の反応曲線を示すグラフである。
【図１２】ジベレリンＡ３に対するＧ２の反応曲線を示すグラフである。
【図１３】ジベレリンＡ４に対するＧ２の反応曲線を表すグラフである。
【図１４】ジベレリンＡ７に対するＧ２の反応曲線を示すグラフである。
【図１５】競合阻害アッセイである。
【図１６】蛍光及び蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイの描写である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
オオムギの発芽
オオムギの種子は生きている植物器官であり、それらの発達は、便宜上、３段階、すなわち成長、成熟及び発芽に分けることができる。しかし、各段階に特徴的な主要なプロセスの間にかなりの重なりが存在し、前の段階が完了する前に次の段階が開始し得るので、ある段階から次の段階への移行を明確に識別することは可能ではない。最初の２つの段階は、種子がまだ植物に付着している間にのみ完了し得る。最終的な発芽に必要な初期発芽過程は成熟の後期段階の間に植物において開始されるが、最終的な発芽は通常、種子が植物から分離した後にのみ起こる。発芽が成功するためには、種子が植物から分離するとそれが完全に発芽することを可能にする成熟の段階（収穫時の熟度／熟した状態）に達していなければならない。収穫後、環境条件が発芽に有利になるまで、オオムギの種子は静止状態（休眠状態）になる。種子が十分に吸水されている場合にのみ発芽は成功する。吸水は種子の発芽のプロセスを開始する。乾燥種子の吸水は、発芽の重要な時期と見なされている。非常に速い吸水により引き起こされるストレスは、乾燥種子の発芽に悪影響を及ぼす可能性がある。十分に吸水しているが、その後から再び乾燥している種子も、成功裏に発芽しない。
【００２６】
この現象は前発芽（ｐｒｅ−ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）と呼ばれている。前発芽は、貯蔵している乾燥種子の生存率を低下させる。それが種子の部分的な吸水を伴い、最終的な発芽反応を誘発するが、プロセスを持続できないこと、又は最終的に収穫時の熟度／熟した状態に達する前に種子の発達段階で最終的な発芽を開始するホルモンの変化を伴うことが理由である。両方の場合において、種子の貯蔵された蓄え及び貯蔵のメッセンジャーＲＮＡの一部が消費され、それにより、長期間の貯蔵状態に耐えるのに十分な供給源が種子に残らない。その結果、オオムギは時期尚早に発芽し、麦芽製造工程で使用することができなくなる。前発芽が起こったかどうかを判断するために種子を目視で検査することは不可能である。
【００２７】
ジベレリンと発芽
植物ホルモン間、特にジベレリン（ＧＡ）とアブシジン酸（ＡＢＡ）間の相互作用は、種子の胚形成から発芽への移行を制御する重要な要素である。オオムギ穀物が発芽する間、胚はＧＡをデンプンの層に分泌し、そこでは成長する胚を維持するためにデンプンの蓄えの動員に関与するいくつかの加水分解酵素の合成を促進する。これらの酵素の合成は、種子の発育中、休眠中の種子、及び好ましくない発芽状態下の実生植物において、ＡＢＡによって阻害される。貯蔵後のオオムギの種子の発芽は、前発芽、すなわち「穂発芽（ｐｒｅ−ｈａｒｖｅｓｔ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）」としても知られている、依然として穂が出ている成熟前の種子の発芽を特徴とする状態によって酷く抑制される。この現象は、ほとんどの場合、成熟した未収穫の種子が雨天に長時間さらされることによって引き起こされる。発芽に関連するプロセスのそのような時期尚早の開始は、ＡＢＡとＧＡとの間のバランスに好ましくない影響を与え、そのようにして貯蔵後の発芽を抑制する。前発芽は種子にストレスを与え、ＡＢＡの濃度がＧＡの貯蔵前の濃度の低下と同時に好ましくないレベルに増加する可能性がある。
【００２８】
オオムギの種子は、麦芽製造工程で使用するために発芽させる必要がある。発芽しない種子は十分な発芽エネルギー（ＧＥ）を持たないため、麦芽製造工程では使用できない。したがって、オオムギの種子に必要なＧＥが含まれているかどうかを判断することが重要である。ジベレリンとＧＥとの間の相関は、発芽の重度の阻害をもたらしたＧＡ合成の阻害因子でのオオムギ種子の処理によって示される。結果は、ＧＡの合成がオオムギの発芽において重要な役割を果たすことを示した。そのため、ジベレリンの測定は、オオムギの種子が発芽したか否かを示すことができる。
【００２９】
ジベレリンの検出
ジベレリンを検出するには、専用の装置が必要であり、それにより費用と時間がかかる。典型的には、試料はバッチから採取され、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）による検査のために実験室に送られる。ＥＬＩＳＡ検査は抗体の結合に依存する。ジベレリンなどの低分子量化合物に対して生成された迅速なポリクローナル抗体の使用に関連するかなり一般的な問題は、遊離ジベレリンに対してそのような抗体の親和性が低いことである。免疫化のために使用する担体タンパク質化合物コンジュゲートに対する親和性は、遊離化合物が独立型ハプテンとして十分に免疫原性であるわけではないので、化合物のみを検出するという点で、一般的に乏しい。そのため、抗体はジベレリンである小さいエピトープに迅速に結合することができない。また、アッセイを実施するために、ＥＬＩＳＡには数時間のインキュベーション及び資格のある技術者が必要である。結果が実験室から得られる時までに、貯蔵条件に応じて、種子のバッチのＧＥが変化する可能性がある。
【００３０】
アプタマーは抗体に対する実行可能な代替物を提供し、ジベレリンの検出のために抗体を使用するときに遭遇する制約を克服する可能性がある。アプタマーには、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ペプチドアプタマーの３種類がある。どれも非常によく似た性質を備えているが、明確に独特なものである。アプタマーを任意の分子標的に対して使用することは、理論上可能である。アプタマーは、それらの特定の標的に対して高い特異度、精度及び親和性で結合する。アプタマーはそれらの標的に結合するように構造的に適合するので、これは、それらの標的に対する免疫応答と共に抗原及びエピトープを必要とする抗体と比較した場合に、より広い範囲の可能な標的をアプタマーに授ける。
【００３１】
アプタマーのインビトロでの選択
上記に従って、試料にてジベレリンの存在を検出するためのリガンド結合アッセイを開発した。アッセイは、ジベレリンに結合するように選択された標的結合要素を含む。標的結合要素は視覚的指標と関連づけられており、視覚的指標は、標的結合要素がジベレリンに結合するときに、試料にジベレリンが存在していることを示す。ジベレリンはジベレリン酸ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４又はＧＡ７であり得、標的結合要素はアプタマーの形態の標的部分であり得る。
【００３２】
アプタマーのインビトロでの選択は、独自のアプタマーライブラリーに対して遊離ジベレリンをスクリーニングすることによって行った。指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）手法によるリガンドのビーズベースの系統的進化を使用した。ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４又はＧＡ７に対する結合親和性を有するアプタマーが同定された。４つすべての標的を、それぞれ１ｍＭの最終的な濃度まで、１つの溶液に混合した。前述のように、ジベレリンは、テルペノイド経路を介してジテルペノイド酸から合成されて四環式ジテルペン酸を生成する植物ホルモンである。これらの生物活性分子は植物開発の様々な局面に関与しているが、このプロジェクトにとって興味深いことに、それらの検出は発芽をモニターするために重要である。すべての既知のジベレリンのうち、ＧＡ１、ＧＡ３、ＧＡ４及びＧＡ７が最も生物活性が高く、そのためインビトロでの選択のため標的としてのそれらを使用する。
【００３３】
４つのジベレリンに対するアプタマーのインビトロでの選択は、２０サイクルのビーズベースのＳＥＬＥＸアプローチにわたって行われ、図１に示される。典型的なインビトロ選択実験は１０〜１５サイクル以内に終了する傾向があるが、アプタマー分子の濃縮が遅いため、本プロジェクトでは２０サイクル実施した。ジベレリンの存在下で固体支持体から溶出したＤＮＡの速度が、ジベレリンの非存在下で溶出したＤＮＡの速度を超えたので、アプタマーの単離成功の最初の兆候は、サイクル１２の終了時に認められた。サイクル１２の終了時に、ライブラリーをディープシークエンシング分析にかけた。しかし、配列決定データは、所望の配列の濃縮が始まったばかりであり、１つの特定の配列の明確な優位性が認められなかったことを示唆した。結果として、インビトロでの選択をさらに８サイクルの間再開させた。サイクル２０の終わりまでに、図１に示すように、ジベレリン標的に対するライブラリーの反応の明確な濃縮プロファイルがあった。次にこのライブラリーをディープシークエンシング分析にかけた。
【００３４】
ディープシークエシング分析
サイクル１４、１６、１８、及び２０を分析するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）ＭｉＳｅｑをディープシークエンシング分析に使用した。いくつかの漸進的なサイクルにわたり複数の配列決定分析を行うことによって、ライブラリーは、様々な程度の濃縮を伴う配列についてモニターできる。さらに、上位１０の最も豊富な配列の挙動は、選択サイクルを通して追跡することができる。配列決定データの分析は、ライブラリー内の特定の配列の頻度を調べることから始まる。インビトロでの選択は、配列分子間の競合の一形態であり、それによって最も反応性の高い配列が選択的に濃縮され、その一方で貧弱な配列又は不活性な配列が捨てられる。より頻繁な（又は豊富な）配列が見られることは、その分子がジベレリン標的に対して何らかの形の好ましい活性を有することを示唆する。
【００３５】
図２は、濃縮のサイクル２０の終了時に存在量の順にランク付けした配列を示す。表の２列目と３列目で、それぞれの配列を追跡して、サイクル１８とサイクル１６のどこでランク付けされたかを確認する。この種の分析は、分子が多くの選択サイクルにわたって他の分子と競合するため、分子の成長又は価値の低下を描写することができる場合がある。例えば、３位及び５位にランク付けされた配列は、インビトロでの選択の早期のサイクルにおいて高くランク付けされたが、２０サイクルまでに、より強力な配列が増殖し始めると、それらの集団は減少した。配列ランク１は、高い成長速度の一例である。サイクル１６では、それは集団の中で８番目にランク付けされたが、わずか２サイクル後（サイクル１８）に、それは４番目に優勢な集団になり、それから最後のサイクルで最も優勢になった。これは所望のパターンであり、活性アプタマーを示し得る。
【００３６】
図３は、次いで、ランク付けされたすべての配列が互いに整列され、９０％の配列の類似性に基づいて、プールに分類されることを示す。一旦プールされると、選択の過程にわたる特定のクラスの濃縮又は劣化の速度を判定するために、同じ分析を行うことができる。このデータセットにおいて、１位にランク付けされたクラスは図２に見られる２番目に豊富な配列（配列番号２）であり、一方で図２の最も豊富な配列（配列番号１）は、分類に関して２位にランク付けされた。アプタマー活性を判定するために重要であり得る２つの注目すべき傾向がある。第１に、速い速度である。２位にランク付けされたクラスが１６〜２０サイクルで発達した速度である。第２に、ほとんどの配列及びクラスが、「ＴＧＡＧＧ」の特定の配列パターンで始まっている。
【００３７】
構造解析
図４及び図５は、それぞれ最高ランクの「ＣＣＡＣＣ」クラス及び「ＴＧＡＧＧ」クラスをさらに分析するために作成された概略図である。（概略図は以下の参考文献から作成された：１）Ｃｒｏｏｋｓ  ＧＥ，Ｈｏｎ  Ｇ，Ｃｈａｎｄｏｎｉａ  ＪＭ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＳＥ  ＷｅｂＬｏｇｏ：Ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｏｇｏ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：１１８８−１１９０（２００４）、２）Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＴＤ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＲＭ．１９９０Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｏｇｏｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｗａｙ  ｔｏ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６０９７−６１００）。「ＣＣＡＣＣ」クラスは、核酸配列５’−ＮＨＭＣＶＮＮＮＨＤＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＮＮＮＨＷＮＤＹＤＤＮＤＮＮＨＨＨＮＨＮＶＶＨＮＮＮＮＮＤＮＮＤＢＮＨＮＮＮＨＤ−３’（配列番号１２）の６２ヌクレオチドのアプタマー分子として一般化することができ、この場合ＹはＴ又はＣであり、ＭはＡ又はＣであり、ＷはＡ又はＴであり、ＢはＧ又はＣ又はＴであり、ＤはＡ又はＧ又はＴであり、ＨはＡ又はＣ又はＴであり、ＶはＡ又はＧ又はＣであり、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである。同様に、「ＴＧＡＧＧ」クラスは、核酸配列５’−ＴＧＡＧＧＤＶＮＶＮＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＭＡＡＹＤＨＭＨＮＶＮＮＮＮＮＨＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＤＨＮＮＮ−３’（配列番号１３）の６２ヌクレオチドのアプタマー分子として一般化することができ、この場合ＹはＴ又はＣであり、ＭはＡ又はＧであり、ＤはＡ又はＧ又はＴであり、ＨはＡ又はＣ又はＴであり、ＶはＡ又はＧ又はＣであり、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである。一般化された配列若しくはその相補物、又は分子のＲＮＡ等価物もまた有効であり得る。
【００３８】
「ＴＧＡＧＧ」は高度に保たれた配列であり、配列決定ライブラリー内で容易に見出された。実際、「ＴＧＡＧＧ」は各配列で２回繰り返され、２番目は捕獲部位にて見出された。
【００３９】
「ＣＣＡＣＣ」配列のクラスは、「ＴＧＡＧＧ」ファミリーの配列ほど明白ではなかった。保たれた部位を示す特定の位置があった。
【００４０】
代表の配列の構造
図６及び図７は、ｍ倍分析（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／）から得られた結果を示す。図６は、クラス「ＣＣＡＣＣ」から得た代表的な配列の構造を示す。左側の構造（Ａ）は結合前／認識状態である。ジベレリンの存在下では、構造は中央（Ｂ）又は右側の形態（Ｃ）のいずれかに切り替わる（どちらもより安定な立体配座である）。したがって、「ＣＣＡＣＣ」クラスは、デルタＧが−１４．８９、−１４．８５、及び−１４．０１の３つの可能な構造的立体配座を有し、配列内に見出される構造が「ＴＧＡＧＧ」分子のものよりも安定していることを示している。さらに、この構造は２つの状態で存在する構造の切り替えメカニズムを示唆している。第１の状態は、固定化及び認識構造である。それによってアプタマー配列が固体支持体にハイブリダイズし、ジベレリンに結合する「準備態勢」になる。第２の状態（より安定している構造）は、ジベレリンの存在下でのアプタマー形成、及び固体支持体からの解離を示唆している。
【００４１】
「ＣＣＡＣＣ」のクラスに対する構造の切り替えの理論的根拠は、ヌクレオチド配列部位３０〜４２における変化から導かれる。その配列空間は、固体支持体（磁気ビーズ又はアガロースビーズ）に固定化されている相補的な「キャッチ」配列とハイブリダイズするために使用される。ジベレリンの存在下では、配列はより安定した構造にリフォールディングして捕捉配列を置換し、それによって自らを固体支持体から放つ。
【００４２】
図６は、その最も安定した形態における「ＴＧＡＧＧ」クラスから得た代表的な配列の構造を示し、また他の構造が存在するが、最も安定した構造は、２２℃で−１１．９６ｋｃａｌ／ｍｏｌのデルタＧを有していた。明確な構造の切り替えの立体配座は「ＴＧＡＧＧ」のクラスについて観察されないが、ヘアピン構造が存在していることは、ジベレリンを認識し得る可能なモチーフを示唆している。
【００４３】
初期結合反応検査
図３に列挙した配列番号１〜８、１０及び１１を化学合成し、１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて精製した。配列番号は、対応する群の番号と共に図８に再度記載している。初期の広域反応検査は、３つの異なる濃度（２５０μＭ、５００μＭ、及び１０００μＭ）で評価された。すべてのデータの値は少なくとも３つ作成された。全体として、これらの配列はジベレリン混合物に対していくらかの活性反応を示した。さらなる研究のための理想的なアプタマーとしてＧ２を選択した。図９は、３つの異なる濃度のジベレリンにおける、Ｇ１からＧ１０までの結合反応を示す。
【００４４】
ジベレリンに対するＧ２の結合
図１０は、０〜１ｍＭの範囲の濃度にわたって個々のジベレリン（Ａ１、Ａ３、Ａ４、及びＡ７）に対して評価されたＧ２の混合性の結合反応を示す。蛍光測定は、固体支持体から放出された蛍光ＤＮＡの量に基づいた。
【００４５】
図１０から分かるように、Ｇ２アプタマーはジベレリンの混合物に反応した。図１１〜図１４は、Ｇ２アプタマーがジベレリンＡ７に対して最も高い活性反応、及びジベレリンＡ１に対して最も低い活性反応を有することを示す。おおよそのＫｄ値は以下の通りである：ジベレリンＡ１〜２２５μＭ、ジベレリンＡ３〜１７１μＭ、ジベレリンＡ４〜１１６μＭ、及びジベレリンＡ７〜８０μＭ。
【００４６】
アプタマー選択プロセスの結論
ジベレリンＡ１、Ａ３、Ａ４及びＡ７に対するアプタマーのスクリーニングは、２０サイクルのインビトロでの選択実験にわたって成功裏に行われた。１つのプールの４つすべての標的分子を選択のために使用することによって、最終的なアプタマーＧ２は、４つすべての標的を認識することができた。
【００４７】
実施形態
リガンド結合アッセイの第１の実施形態は、担体に結合したアプタマーを含むラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイであり得る。担体は金ナノ粒子であってもよく、金ナノ粒子はチオール化によってアプタマーに結合していてもよい。指標は、担体のアプタマー結合部位の飽和状態からの結合シグナルの形で得られる。ラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイは阻害アッセイであり得る。少なくとも１つのチオール化アプタマーは、金ナノ粒子の格子構造と、アプタマーオリゴヌクレオチドにおけるチオール基との間の相互作用を介して、金に結合する。
【００４８】
高度に局在化した濃度の金ナノ粒子に由来する表面のプラズマ共鳴は、ジベレリンの不在下での視覚的な指標を生じる。視覚的指標は、ラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイの表示部分の可視の赤色信号として知覚可能な場合がある。金ナノ粒子のアプタマー結合部位の飽和状態に由来する結合シグナルが減少したことにより、ジベレリンの存在下での赤色信号の不在に至る。可視の赤色信号は、アプタマー結合金ナノ粒子複合体が担体の結合部位を飽和させ、それによって金粒子の凝集を妨げた結果である。
【００４９】
リガンド結合アッセイは、ディスポーザブルな検査の、膜などの表示部分に生成物を適用した、ラテラルフロー又は垂直フローのディスポーザブル検査の形態であってよい。垂直フローのディスポーザブル検査は、標準的なサンドイッチ垂直フローアッセイ又は競合型の垂直フローアッセイであり得る。検査は、ネガティブコントロールがディスポーザブル検査ユニットの膜の可視の赤色部分を表す競合的阻害様式を含み得る。競合型のフォーマットでは、検査検体に標的が存在していれば、これがアプタマー被覆金ナノ粒子の結合部位を飽和状態にし、その結果、アプタマー被覆金ナノ粒子は、もはやオボアルブミン又は他のペプチドコンジュゲートジベレリンが膜との結合を促進するために使用されている膜に結合しない。このプロセスは図１５に要約されている。
【００５０】
リガンド結合アッセイの第２の実施形態は、フルオロフォアとクエンチャーの対に化学的に結合するアプタマーを含む非放射性リガンド結合アッセイの形態であり得る。この実施形態では、視覚的指標は、ジベレリンの存在下で溶液の蛍光の形態で提供される。フルオロフォアとクエンチャーの対は、核酸染料及び蛍光ハイブリダイゼーションプローブであり得る。ジベレリンの存在下では、クエンチャーはフルオロフォア／クエンチャー対から除去され、図１６（Ａ）に示されるように、フルオロフォアに特異的な蛍光シグナルを生じることになる。さらに、それによって結合シグナルの増加が抗原の存在を明らかにし、さらにシグナルを標準に対して定量することができる。
【００５１】
標的用の検査１は、検体の原料から抗原を抽出するために使用される緩衝液で行われる。抽出緩衝液は、ＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）を含み得るが、これに限定されない。さらに、フルオロフォアに特異的な蛍光の蛍光を検出し、事前に較正させた基準又は値に対してその潜在的な定量化をするために、蛍光光度計が使用される。
【００５２】
リガンド結合アッセイは、視覚的指標がジベレリンの存在下で溶液の蛍光の形態で提供されるように、アクセプターとドナーの対に化学的に連結されているアプタマーを含み得る。抗原の存在下では、アクセプターはアクセプター／ドナーの対から取り除かれ、図１６（Ｂ）に示すように、放出波長の変化をもたらす。したがって放出波長のシグナルの差が抗原の存在を明らかにすることに留意されたい。上記を考慮して、初期放出波長とエンドポイントの放出波長との間の差を標準に対して定量化し、標的濃度の定量分析を実現することができる。
【００５３】
標的の検査は、検体の原料から抗原を抽出するために使用される緩衝液で行われ、抽出緩衝液はＴＢＳ（トリス緩衝食塩水）を含むことができるが、これに限定されない。さらに、フルオロフォアに特異的な蛍光の蛍光を検出し、事前に較正させた基準又は値に対してその潜在的な定量化をするために、蛍光光度計が使用される。蛍光は非常に感度が高く、非常に低い濃度の分析物を検出することができる。それはまた、フルオロフォアのシグナルが非常に特異的であるため、非常に特異的である。これは、フルオロフォアが非常に狭いバンドギャップ内で発光するように設計されているので、良好な信号対雑音比を有する非常に質の高い信号を生じる。
【００５４】
本発明はジベレリンの速い検出のための使用時点でのリガンド結合アッセイを提供することが想定される。具体的には、使用時点でのアッセイは、種子の発芽エネルギーを判定するのに有利であり、質の指標を提供する。
【００５５】
【表１】
2019525777.tif 000003
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列表１〜１３  ＜２２３＞合成
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月15日(2018.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む試料のジベレリンの存在を検出するためのリガンド結合アッセイ：
−ジベレリンに結合するように選択された標的結合要素、及び
−前記標的結合要素がジベレリンに結合したときに前記試料のジベレリンの存在を示す視覚的指標と関連する前記標的結合要素であり、該標的結合要素はアプタマーである。
【請求項２】
アプタマーが、核酸配列
５’−ＮＨＭＣＶＮＮＮＨＤＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＮＮＮＨＷＮＤＹＤ
ＤＮＤＮＮＨＨＨＮＨＮＶＶＨＮＮＮＮＮＤＮＮＤＢＮＨＮＮＮＨＤ−３’
（配列番号１２）
の６２ヌクレオチド
−ＹはＴ又はＣであり、
−ＭはＡ又はＣであり、
−ＷはＡ又はＴであり、
−ＢはＧ又はＣ又はＴであり、
−ＤはＡ又はＧ又はＴであり、
−ＨはＡ又はＣ又はＴであり、
−ＶはＡ又はＧ又はＣであり、
−ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである、
又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体、を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
アプタマーが核酸配列
５’−ＴＧＡＧＧＤＶＮＶＮＧＣＴＧＡＧＧＴＡＴＧＣＭＡＡＹＤＨＭＨＮ
ＶＮＮＮＮＮＨＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＤＨＮＮＮ−３’
（配列番号１３）
の６２ヌクレオチド
−ＹはＴ又はＣであり、
−ＭはＡ又はＣであり、
−ＤはＡ又はＧ又はＴであり、
−ＨはＡ又はＣ又はＴであり、
−ＶはＡ又はＧ又はＣであり、
−ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴである、
又はその相補体、或いは分子のＲＮＡ等価物又はその相補体、を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
アプタマーが、配列番号１〜１１の配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の相同性を有する核酸配列を含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
リガンド結合アッセイがラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイであり、アプタマーが担体に結合しており、指標が、前記担体のアプタマー結合部位の飽和状態から結合シグナルの形態で提供される、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項６】
アッセイが阻害アッセイである、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
担体がチオール化によりアプタマーに結合した金ナノ粒子である、請求項５又は６に記載のアッセイ。
【請求項８】
高度に局在化した濃度の金ナノ粒子に由来する表面のプラズマ共鳴が、試料にジベレリンが存在しない場合に視覚的指標を提供する、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
視覚的指標が、ラテラルフローアッセイ又は垂直フローアッセイの表示部分の可視の赤色信号として知覚可能である、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
可視の赤色信号が、アプタマー結合金ナノ粒子複合体が担体の結合部位を飽和させ、それによって金粒子の凝集を妨げた結果である、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１１】
アッセイが、ジベレリンの存在下で視覚的指標が蛍光の形態で提供されるように、フルオロフォアとクエンチャーの対に化学的に連結されているアプタマーを含む、非放射性リガンド結合アッセイである、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【請求項１２】
フルオロフォアとクエンチャーの対が、核酸の染料及び蛍光ハイブリダイゼーションプローブである、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
リガンド結合アッセイが、ジベレリンの存在下で視覚的指標が蛍光の形態で提供されるように、アクセプター及びドナーの対に化学的に連結されているアプタマーを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のアッセイ。
【国際調査報告】
2019525777.tif 000020
2019525777.tif 000021
2019525777.tif 000022
2019525777.tif 000023