(57)【要約】  本発明は、（１）アデノウイルスベクター産生細胞を培養し、アデノウイルスベクターを産生させる工程、及び（２）工程（１）で得られたアデノウイルスベクターをプロテアーゼで処理する工程、を包含することを特徴とするアデノウイルスベクターの製造方法に関する。該製造方法により、細胞に外来遺伝子を導入するのに適した、感染効率が向上したアデノウイルスベクターが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を包含することを特徴とする、アデノウイルスベクターの製造方法：
（１）アデノウイルスベクター産生細胞を培養し、アデノウイルスベクターを産生させる工程、及び
（２）工程（１）で得られたアデノウイルスベクターをプロテアーゼで処理する工程。
【請求項２】
アデノウイルスベクターが外来遺伝子を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アデノウイルスベクターがエンド型プロテアーゼで処理される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の方法により製造されるアデノウイルスベクター。
【請求項５】
請求項２記載の方法により製造されるアデノウイルスベクターを細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする、細胞への遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において標的細胞に遺伝子を導入する際に使用される、感染効率が向上したアデノウイルスベクター、ならびにその製造方法に関する。
なお、本願は、２００９年１２月１５日出願の日本国特許出願第２００９−２８４４７５号に対して優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００９−２８４４７５号の全内容を本願に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルスは、１９５３年に小児の扁桃腺やアデノイド組織培養液中から分離され、現在までにヒト、トリ、ウシ、サル、イヌ、マウスあるいはブタを宿主とする８０以上の血清型の存在が明らかにされている。ヒトを宿主とするアデノウイルスについては、これまで５０種類以上の血清型が発見されており、その中でも２型と５型とが遺伝子治療用ベクターとして用いられている。【０００３】
アデノウイルスは直径約８０ｎｍの大きさで正二十面体の形をしたウイルスで、エンベロープはもたない。そのゲノムは直鎖状二本鎖ＤＮＡである。コアを包んでいるカプシドは、各頂点に位置する１２個のペントン（ペントンベース及びファイバーからなる）ならびに２４０個のヘキソンから構成されている。【０００４】
アデノウイルスの感染は、アデノウイルスのファイバーが宿主の細胞表面のｃｏｘａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）に結合して細胞に接着することで開始される。アデノウイルスが細胞に接着すると、ペントンベースと細胞接着因子インテグリンとの結合によってエンドサイトーシスが誘導され、細胞内に取り込まれる。細胞内に取り込まれた後、エンドソームの膜がペントンベースによって破壊され、アデノウイルスが細胞質に放出される。核に達したアデノウイルスは、そのゲノムＤＮＡを核膜孔から核の中に送り込む。核の中でアデノウイルスＤＮＡの転写、複製及びパッケージングが起こる。【０００５】
アデノウイルスベクター開発当初、アデノウイルスの病原性との関連から気管支等へのベクターの投与が最適と思われていたが、実際にはベクターを尾静脈からマウスに投与すると、ほとんどのベクターが肝臓に集積されている（非特許文献１及び２）。また、血球系の細胞よりも接着系の細胞の方が総じて感染効率が高いという特徴もある。これらは、ウイルスレセプターが多い細胞にベクターが導入されやすいという特徴を反映している。比較的多くの細胞種に導入が可能であるとは言え、実際には遺伝子治療が期待されている多くの癌細胞ではアデノウイルスベクターに対するレセプター量が減少しているとの報告もあり、現在ではウイルスのファイバーに変異を加えたベクター等の開発も進んでいる。しかしながら、ウイルス力価が低いなどの問題が残存している（例えば、非特許文献３及び４）。【０００６】
すでに、癌細胞をプロテアーゼで前処理することにより、組換えアデノウイルスによる感染効率が上昇することが報告されている（非特許文献５）。しかし、アデノウイルスベクターをプロテアーゼで処理することにより、標的細胞への感染効率が上昇することについては、記載も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ネイチャー  ジェネティックス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第４巻、第２７頁〜３４頁（１９９３）
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  クリニカル  インベスティゲーション（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．）、第９１巻、第２２５頁〜２３４頁（１９９３）
【非特許文献３】バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ）、第１５６８巻、第１３頁〜２０頁（２００１）
【非特許文献４】ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第９巻、第２５０３頁〜２５１５頁（１９９８）
【非特許文献５】ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第１１巻、第２２１９頁〜２２３０頁（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、標的細胞に遺伝子を導入する際に使用される、感染効率が向上したアデノウイルスベクター、ならびにその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意努力した結果、プロテアーゼで処理したアデノウイルスベクターを使用することにより、標的細胞に外来遺伝子が高効率で導入されることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち本発明を概説すれば、本発明の第１の態様は、下記工程を包含することを特徴とする、アデノウイルスベクターの製造方法に関する：
（１）アデノウイルスベクター産生細胞を培養し、アデノウイルスベクターを産生させる工程、及び
（２）工程（１）で得られたアデノウイルスベクターをプロテアーゼで処理する工程。【００１１】
本発明の第１の態様において、アデノウイルスベクターが外来遺伝子を含むものであってもよい。また、アデノウイルスベクターがエンド型プロテアーゼで処理されてもよい。
本発明により、感染効率が向上したアデノウイルスベクターが提供される。【００１２】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様により得られる、アデノウイルスベクターに関する。【００１３】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様により得られる、外来遺伝子を含むアデノウイルスベクターを細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする、細胞への遺伝子導入方法に関する。本発明により、標的細胞に外来遺伝子を高効率で導入することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、細胞に外来遺伝子を導入するのに適した高力価のアデノウイルスベクター、ならびにその製造方法が提供される。当該製造方法により得られるアデノウイルスベクターは、遺伝子治療の分野だけでなく、種々の外来遺伝子を持つ細胞をインビトロで得るためにも極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
アデノウイルスは線状２本鎖ＤＮＡウイルスであり、そのゲノムＤＮＡの大きさは約３６ｋｂで、ゲノムＤＮＡの両端の５’末端にはウイルスがコードする末端タンパク質が共有結合して、ＤＮＡ−末端蛋白複合体（ＤＮＡ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＤＮＡ−ＴＰＣ）を形成している。
【００１６】
本発明に用いられるアデノウイルスは特に限定はないが、例えば、増殖効率が高く、病原性が軽微なヒトアデノウイルス２型又は５型を用いることができる。通常、ウイルスゲノムを人為的に改変した組換えアデノウイルスがベクターとして使用されるが、好ましくは、ゲノムよりウイルスの複製に関与するＥ１領域を欠失させた非増殖型アデノウイルスをベクターとして使用する。Ｅ１領域を欠失したアデノウイルスは増殖能を欠くため、病的な事態を起こしうる、感染した細胞内でのウイルスの増殖を起こさず、安全性の観点から本発明に好適である。
【００１７】
ウイルスのゲノムの欠失はベクターとしての機能に支障のない範囲であれば特に限定はない。例えば、前記したＥ１領域に加えて、培養細胞でのウイルス増殖には必須でないＥ３領域の一部または全部を欠失したものも本発明にて使用できる。
【００１８】
Ｅ１領域を欠失させて作製されたアデノウイルスベクター、あるいはＥ１領域およびＥ３領域を欠失させて作製されたアデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の遺伝子を持続的に発現する細胞、例えば、ヒト胎児腎由来細胞２９３細胞などを宿主として増殖させることが出来る。
【００１９】
また、副作用の原因となりうる免疫原産生軽減の観点から、上記したＥ１領域及びＥ３領域の欠失に加え、Ｅ２領域を又はＥ４領域をさらに欠失させたウイルスもベクターとして使用できる。さらに、ウイルスゲノムの複製及びパッケージングに必要な領域（左端約０．４ｋｂ、右端約０．２ｋｂ）以外の全てを欠失させたｇｕｔｌｅｓｓ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ［米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９３巻、第１３５６５〜１３５７０頁（１９９６）］も本発明にて使用できる。
【００２０】
これらのアデノウイルスベクターは、欠失させた領域にコードされるタンパク質を発現する細胞にて、あるいは欠損させた領域を保持するヘルパーウイルスと共感染させることで増殖させることができる。こうして構築された細胞は、ウイルス産生細胞と呼ばれる。
前記のアデノウイルスベクターの構築、ベクターへの外来遺伝子の挿入及びウイルスベクター粒子の調製は、いずれも当業者に公知の手法により実施することができる。アデノウイルスベクター粒子は、ウイルス産生細胞の培養上清及び産生細胞内に蓄積される。ウイルス産生細胞を含む培養液を超音波破砕あるいは凍結融解の繰り返し等の操作に供して当該培養液に含まれる細胞を破砕することによって、アデノウイルスベクターを得ることができる。得られた破砕液はアデノウイルスベクターとしてそのまま使用することができるが、目的に応じて塩化セシウム密度勾配遠心等の手段により精製アデノウイルスベクター粒子を得ることができる。
【００２１】
本発明に使用されるアデノウイルスベクターは外来遺伝子を含んでいてもよい。外来遺伝子は特に限定はなく、細胞に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。このような遺伝子としては、例えば、酵素、構造タンパク質、サイトカイン、レセプター又はその他のタンパク質をコードするもの以外に、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、リボザイム又はデコイをコードするものを使用することができる。また、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどのレポーターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子等）を同時に導入してもよい。これらの遺伝子の起源に特に限定はなく、該遺伝子が導入される細胞と同種の生物由来のもの、異種の生物由来のもの、又は遺伝子工学的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子がライゲーション等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。更に、その目的に応じて天然の配列に変異が導入された配列を有するものであってもよい。また、これらの遺伝子にその発現を調節するための適当なプロモーター、エンハンサー等の調節要素が付加されていてもよい。
【００２２】
また、標的細胞に導入される外来遺伝子のサイズは、特に限定するものではないが、組換えアデノウイルスベクターのパッケージングの観点から、例えばＥ１領域およびＥ３領域を欠失したベクターの場合、約７ｋｂ以下であることが望ましい。また、ｇｕｔｌｅｓｓ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒでは、標的細胞に導入される外来遺伝子のサイズは３７ｋｂ以下であることが望ましい。
【００２３】
本発明に使用されるプロモーターは、外来遺伝子を標的細胞内で発現できるものであれば特に限定はなく、例えば、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター等が挙げられ、目的に応じて選択することができる。組織特異的プロモーターを用いれば、組織特異的に外来遺伝子を発現させることができ、例えば、肝臓特異的プロモーターであるα１ＡＴプロモーターを用いれば肝細胞特異的に、骨格筋特異的α−アクチンプロモーターを用いれば骨格筋細胞特異的に、神経特異的エノラーゼプロモーターを用いれば神経細胞特異的に、血管内皮細胞特異的ｔｉｅプロモーターを用いれば血管内皮細胞特異的に、胃癌特異的ＣＥＡプロモーターを用いれば胃癌細胞特異的に、又は肝癌特異的ＡＦＰプロモーターを用いれば肝癌細胞特異的にそれぞれ外来遺伝子を発現させることができる。
【００２４】
本発明の方法によるアデノウイルスベクターの製造は、ウイルス産生細胞を培養してアデノウイルスベクターを産生させる第１工程、第１工程で得られたアデノウイルスベクターをプロテアーゼで処理する第２工程、により実施される。
【００２５】
第１の工程に使用されるウイルス産生細胞は、公知の方法により作製することができる。一つの態様において、例えば、下記の操作でウイルス産生細胞を作製することができる。複製に関与する遺伝子を欠失させたアデノウイルスのゲノムを含むコスミドベクターを調製し、所望により外来遺伝子を挿入する。このコスミドベクターを制限酵素で切断して調製された消化コスミドＤＮＡで適当な宿主細胞、例えば２９３細胞を形質転換する。得られる形質転換体は、アデノウイルスを産生する能力を獲得している。当該細胞を適当な条件で培養することにより、細胞内及び／又は培養液からアデノウイルスベクターを産生させることができる。
【００２６】
上記のウイルス産生細胞の作製は、例えば、完全長ウイルスゲノム導入法［ヒューマン  ジーン  セラピー（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第９巻、第２５７７頁〜２５８３頁（１９９８）］あるいはＣＯＳ−ＴＰＣ法［米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ）、第９３巻、第１３２０〜１３２４頁（１９９６）］等により、所望の外来遺伝子が挿入された組換えアデノウイルスベクターを作製することによって実施される。当該方法によれば、煩雑な操作を行なうことなく、高い効率で組換えアデノウイルスベクターを調製することができる。両方法とも使用可能な組換えアデノウイルス作製キットとして、例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｄｕａｌ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）などがあり、キットに添付の取扱説明書に従い、組換えアデノウイルスベクターを調製することができる。
【００２７】
第２工程では、前記のウイルス産生細胞の細胞内及び培養液上清より回収又は精製されたアデノウイルスベクター粒子がプロテアーゼで処理される。上記第２工程において、使用されるプロテアーゼとしては特に限定はないが、例えば、エンド型プロテアーゼを使用することができる。当該エンド型プロテアーゼとしては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、スブチリシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、パパインなどが例示される。好適には、トリプシンあるいはスブチリシンが本発明に使用される。アデノウイルスベクター粒子を含有する溶液にトリプシンを作用させる際の濃度には特に限定はなく、細胞に対する感染力価の上昇等を指標として適宜設定すればよい。例えば、０．００１０〜０．０３０重量％、特に０．００２５〜０．０１２５重量％のトリプシンが好適である。また、アデノウイルスベクター粒子を含有する溶液にスブチリシンを作用させる際の濃度にも特に限定はなく、細胞に対する感染力価の上昇等を指標として適宜設定すればよい。市販のスブチリシン（１６ＫＮＰＵ／Ｇ、シグマアルドリッチ社製、Ｃｏｄｅ  Ｐ３１１１）を使用する場合、例えば、０．０１６〜８０ＮＰＵ／ｍＬ、特に０．２５〜３５ＮＰＵ／ｍＬが好適である。同様に、反応条件も本発明の効果が発揮される条件を、使用するプロテアーゼに適した範囲で適宜設定すればよい。例えば、３０〜４０℃の温度範囲で、１０分間〜３時間処理することができる。
【００２８】
本発明を特に限定するものではないが、第１工程で得られたアデノウイルスベクターを再び適当な宿主細胞（例えば、２９３細胞）に感染させ、感染細胞及び培養液上清からアデノウイルスベクター２次ウイルスを回収し、得られた２次ウイルスを再び宿主細胞に感染させ、感染細胞及び培養液上清からアデノウイルスベクター３次ウイルスを回収し、得られた３次ウイルスを再び宿主細胞に感染させ、感染細胞及び培養液上清からアデノウイルスベクター４次ウイルスを回収するといった作業を繰り返すことによって、アデノウイルスベクターの力価を高めることが可能である。宿主細胞に感染する際の前処理として上記第２工程を施すことによって宿主細胞への感染効率が向上し、ウイルス産生が亢進し、高力価アデノウイルスベクターを獲得することが可能である。なお、上記第２工程の実施回数は特に限定されるものではなく、例えば、前記一連の作業ごとに実施してもよく、また、最終的に回収されたアデノウイルスベクターにのみ実施してもよい。
回収されたアデノウイルスベクターに上記第２工程を施すことによって、各種標的細胞への遺伝子導入にも有効な、感染効率の上昇したアデノウイルスベクターの提供が可能となる。
【００２９】
上記の方法により得られた本発明のアデノウイルスベクターは本発明に包含される。実施例３、５及び７に記載のとおり、本発明のアデノウイルスベクターは各種標的細胞、特に癌細胞に対する感染性ウイルス粒子数が上昇した高力価のアデノウイルスベクターである。
【００３０】
本発明により、外来遺伝子を標的細胞に導入する方法が提供される。本発明の外来遺伝子を標的細胞に導入する方法は、第１工程として、ウイルス産生細胞を培養して外来遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクターを産生させる工程、第２工程として、第１工程で得られたアデノウイルスベクターをプロテアーゼで処理する工程、及び第３工程として、第２工程で得られたアデノウイルスベクターを標的細胞に感染させる工程を包含することを特徴とする。
【００３１】
上記第１及び第２工程については前述したとおりである。上記第３工程において、第２工程で得られたアデノウイルスベクターを標的細胞に接触させ、アデノウイルスベクターを標的細胞に感染させる。感染時間は特に限定はないが、１５分〜６時間が好適であり、１〜３時間がより好適である。感染時の温度は標的細胞に適した温度であればよい。
【００３２】
本発明の外来遺伝子導入方法は、遺伝子治療の分野で有用である。治療目的で本発明の遺伝子導入方法を実施する手段としては、体外に取り出した標的細胞に本発明のアデノウイルスを感染させ、その後に感染細胞を生体に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子導入法、本発明のアデノウイルスベクターを生体に投与するｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子導入法を利用することができる。該方法による遺伝子治療の対象疾患には特に限定はなく、先天的に遺伝子に異常がみられる遺伝子病、ＡＩＤＳのようなウイルス感染症、癌等の治療に利用できる。癌を標的とする場合には、制限増殖型のオンコリティックウイルスベクターを使用してもよい。
本発明の方法により製造された、治療用遺伝子が挿入されたアデノウイルスベクターは、各種の疾患の治療剤として使用することができる。例えば、前記アデノウイルスベクターを公知の非経口投与に適した有機又は無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより、点滴、注射、吸入等により投与可能な製剤として調製できる。
【００３３】
また、本発明の外来遺伝子導入方法は、遺伝子治療のみならず、種々の外来遺伝子を持つ細胞をインビトロで得るためにも有用であり、得られた遺伝子導入細胞は有用物質の生産、疾患モデルの開発等に有用である。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例の範囲に何ら限定されるものではない。【００３５】
実施例１  ＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクターの作製
ｐＺｓＧｒｅｅｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（クロンテック社製）を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で切断し、アガロースゲル電気泳動を行い、緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎをコードする配列を含む約０．７ｋｂｐのフラグメントを回収した。回収したフラグメントをＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端平滑化後、Ｅ１およびＥ３遺伝子を欠失させたアデノウイルスゲノムの全長を含むコスミドベクターであるｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２（タカラバイオ社製）のＳｗａＩサイトに挿入した。こうして得られたコスミドベクターをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（アジレントテクノロジー社製）を用いて大腸菌ＤＨ５アルファ（タカラバイオ社製）を形質転換した後、得られた形質転換体をアンピシリン添加ＬＢ培地で培養し、培養物よりｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２−ＺｓＧｒｅｅｎコスミドＤＮＡを調製した。
次に、得られたｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２−ＺｓＧｒｅｅｎコスミドＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＴ１０４Ｉ（タカラバイオ社製）で切断して得られる消化済コスミドＤＮＡと、ＴｒａｎｓＩＴ−２９３（ミラス  バイオ社製）を用いて２９３細胞を形質転換した後、培養を行った。培地には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ナルジェヌンクインターナショナル社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を使用した。培養後、細胞を含む培養液を超音波処理し、次いで遠心して上清を回収することにより、１次アデノウイルス液（ＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクター）を得た。１次アデノウイルス液を感染させた２９３細胞を培養した後、細胞を含む培養液を超音波処理し、遠心して上清を回収することにより２次アデノウイルス液を得た。さらに同様の操作を行って３次アデノウイルス液、及び４次アデノウイルス液を調製した。以下、この４次アデノウイルス液をＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクターとして以下の実験に使用した。【００３６】
実施例２  アデノウイルスベクターのトリプシン処理―１
実施例１で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクター２０μＬに細胞剥離用０．２５％トリプシン―ＥＤＴＡ水溶液（インビトロジェン社製）４μＬ及びＰＢＳ３７６μＬを添加し、トリプシン終濃度０．００２５％の反応液を調製した。また、ＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクター２０μＬに細胞剥離用０．２５％トリプシン―ＥＤＴＡ水溶液（インビトロジェン社製）２０μＬ及びＰＢＳ３６０μＬを添加し、トリプシン終濃度０．０１２５％の反応液を調製した。比較対照として、ＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクター２０μＬにＰＢＳ３８０μＬを添加して２０倍希釈した反応液を調製した。調製した各反応液を３７℃水浴中で１時間インキュベートした後で、氷冷して反応を停止させた。【００３７】
実施例３  細胞への感染実験−１
１２ウェルのプレートの各ウェルに１×１０５個のＨｅＬａ細胞［ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２］を添加し、２４時間培養した。培地として、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）１ｍＬを使用した。次いで、各ウェルの細胞に実施例２で調製した各アデノウイルス液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈して添加し、３７℃で１時間感染した。感染終了後、ウイルス上清を除去し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１ウェルあたり１ｍＬ添加してさらに２日間培養を行った。２日間の培養後、剥離して回収した細胞を４％ホルムアルデヒド液に懸濁して固定後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔ、ベクトンディッキンソン社製）で解析し、緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎの発現している割合を分析し、遺伝子導入効率を算出した。得られた遺伝子導入効率にウイルス希釈倍率を乗じた値から、感染性ウイルス粒子の数（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ；Ｉ．Ｖ．Ｐ．／ｍＬ）を算出した。感染性ウイルス粒子数を表１に示す。表１に示すように、アデノウイルスベクターをトリプシン処理した群では、プロテアーゼ処理を行わなかった群と比較して感染性ウイルス粒子数が上昇した。【００３８】
【表１】
2011074564.tif 000002
【００３９】
実施例４  アデノウイルスベクターのトリプシン処理―２
実施例１で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクター２０μＬに細胞剥離用０．２５％トリプシン―ＥＤＴＡ水溶液２０μＬとＰＢＳ３６０μＬを添加し、トリプシン終濃度０．０１２５％の反応液を調製した。比較対照として、アデノウイルスベクター２０μＬにＰＢＳ３８０μＬを添加して２０倍希釈した反応液を調製した。調製した反応液を３７℃水浴中で１時間反応後、氷冷して反応を停止した。【００４０】
実施例５  細胞への感染実験−２
ＨｅＬａ細胞および２９３細胞［ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３］は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で、ＭＫＮ１細胞［理研細胞バンク  ＲＣＢ１００３］およびＭＫＮ４５細胞［理研細胞バンク  ＲＣＢ１００１］は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養を行い、アデノウイルス感染の前日に、１２ウェルのプレートの各ウェルに１×１０５個をそれぞれ播種し、２４時間培養した。次いで、各ウェルの細胞に実施例４で反応させたアデノウイルス液、および未反応のアデノウイルス液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈して添加し、３７℃で３時間感染した。感染終了後、ウイルス上清を除去し、各培養用培地を１ウェルあたり１ｍＬ添加して、さらに２日間培養を行った。培養終了後、剥離して回収した細胞を４％ホルムアルデヒド液で懸濁して固定後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔ）で解析し、緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎの発現している割合を分析し、遺伝子導入効率を算出した。得られた遺伝子導入効率にウイルス希釈倍率を乗じた値から、感染性ウイルス粒子の数（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ；Ｉ．Ｖ．Ｐ．／ｍＬ）を算出した。感染性ウイルス粒子数を表２に示す。表２に示すように、アデノウイルスベクターをトリプシン処理することにより、各種細胞に対する感染性ウイルス粒子数が上昇した。【００４１】
【表２】
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【００４２】
実施例６  アデノウイルスベクターのプロテアーゼ処理
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．由来のプロテアーゼ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、１６．９ＫＮＰＵ／Ｇ、シグマアルドリッチ社製）を、ＰＢＳで５０倍希釈、２５０倍希釈、１２５０倍希釈又は６２５０倍希釈した。１．５ｍＬ容マイクロチューブに、ＰＢＳ８５μＬと、実施例１で調製したＺｓＧｒｅｅｎ発現アデノウイルスベクター５μＬとを添加し、さらに、先に希釈したプロテアーゼ溶液を１０μＬ添加した（最終プロテアーゼ濃度はそれぞれ、３３．８ＮＰＵ／ｍＬ、６．７６ＮＰＵ／ｍＬ、１．３５ＮＰＵ／ｍＬ又は０．２７ＮＰＵ／ｍＬ）。比較対照として、プロテアーゼを含まないＰＢＳを１０μＬ添加した。調製した反応液を３７℃水浴中で１時間反応後、氷冷して反応を停止させた。【００４３】
実施例７  細胞への感染実験
アデノウイルス感染の前日に、ＨｅＬａ細胞を１２ウェルのプレートの各ウェルに１×１０５個播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。次いで、各ウェルの細胞に実施例６で反応したアデノウイルス液、および未反応のアデノウイルス液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で段階希釈して添加し、３７℃で２時間感染した。感染終了後、ウイルス上清を除去し、各培養用培地をウェルあたり１ｍＬ添加して、さらに２日間培養を行った。培養終了後、剥離して回収した細胞を４％ホルムアルデヒド液で懸濁して固定後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｎｔ）で解析し、緑色蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎの発現している割合を分析し、遺伝子導入効率を算出した。得られた遺伝子導入効率にウイルス希釈倍率を乗じた値から、感染性ウイルス粒子の数（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ；Ｉ．Ｖ．Ｐ．／ｍＬ）を算出した。感染性ウイルス粒子数を表３に示す。表３に示すように、アデノウイルスベクターをプロテアーゼ処理した群では、プロテアーゼ処理を行わなかった群と比較して、ＨｅＬａ細胞に対する感染性ウイルス粒子数が上昇した。【００４４】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、細胞に外来遺伝子を導入するのに適した高力価のアデノウイルスベクター、ならびにその製造方法が提供される。当該製造方法により得られるアデノウイルスベクターは、遺伝子治療の分野だけでなく、種々の外来遺伝子を持つ細胞をインビトロで得るためにも極めて有用である。
【国際調査報告】
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