(57)【要約】  コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体を開示し、抗体はｓｃＦｖ−Ｆｃ構造を有する組換え免疫グロブリンである。ｓｃＦｖは重鎖及び軽鎖の可変領域を含む単鎖抗体を指し、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２で表される。Ｆｃは定常領域を指す。ヒトコネキシン２６細胞外領域の４１〜５６位のアミノ酸配列、即ちKEVWGDEQADFVCNTLを抗原として使用する。本発明は、単鎖抗体ファージディスプレイライブラリー及びスクリーニング技術によって得られる。抗体の生化学的解析及び免疫蛍光同定は、抗体がコネキシン２６を特異的に認識し、コネキシン２６の形成するヘミチャネルの活性を阻害することを示した。動物実験は、抗体がマウス蝸牛組織切片のヘミチャネル活性に対して有意な阻害効果を発揮することを示した。従って抗体をコネキシン変異関連疾患の治療に使用できる。【選択図】  図２Ａ
2019504829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体であって、前記完全ヒト抗体が、ｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を有する組換え免疫グロブリンであり、ｓｃＦｖが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単鎖抗体を指し、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で表され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２で表され、Ｆｃが定常領域を指す、完全ヒト抗体。
【請求項２】
前記定常領域が、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む、請求項１に記載のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体。
【請求項３】
コネキシン２６の細胞外領域の４１位〜７５位のアミノ酸部分を特異的に認識する、請求項１に記載のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体の単鎖抗体との相同性が３０％以上の相同配列を有する、遺伝子組換え抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片およびＦｃ断片からなる群より選ばれる１種、または２種以上の断片の組合せ、または他のタンパク質もしくはペプチド鎖を有する、少なくとも１種の断片の誘導体を含む、請求項４に記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項６】
前記遺伝子組換え抗体の重鎖ＣＤＲ３領域の配列がＤＦＳＷＲＧＹＹＭＤＶであり、軽鎖ＣＤＲ３領域の配列がＱＱＹＧＳＳＰＲＴである、請求項４に記載の遺伝子組換え抗体。
【請求項７】
コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号３または配列番号４で表されるヌクレオチド配列。
【請求項８】
コネキシン２６変異に起因する聴覚消失、皮膚疾患または腫瘍の治療のための医薬またはキットの製造における、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体または請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え抗体の使用。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体または請求項４〜６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え抗体を有効成分として含む、聴覚消失、皮膚疾患または腫瘍を治療するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学医学の分野に属し、特に本発明は、ヒト蝸牛および皮膚組織に発現するコネキシン２６を特異的に認識し、コネキシン２６のヘミチャネルを阻害することができる、単鎖抗体または当該抗体を発現するプラスミド、ならびにコネキシン２６変異に起因する聴覚消失、皮膚疾患および腫瘍を治療するための医薬および診断キットの調製における抗体の使用を提供する。本発明はまた、抗体を使用して調製する診断キットを提供する。当該キットは、モノクローナル抗体を有効成分として含む。
【背景技術】
【０００２】
ギャップ結合は、イオンチャネルにより形成される細胞間結合である。ギャップ結合チャネルは、細胞同士の細胞質を接続することにより、１．８ＫＤよりも小さい小分子、たとえばイオン、代謝産物およびセカンドメッセンジャーが自由に通過することを可能にする（非特許文献１、非特許文献２）。脊椎動物では、コネキシンで構成されるギャップ結合経路が、隣接細胞間でのイオン、小分子、およびシグナリング分子の交換を仲介し、哺乳動物の初期発生段階において極めて重要である。ギャップ結合チャネルは、種々の多くのコネキシンタンパク質により構成され、コネキシン組成に応じた異なる透過特性を示しうる。隣接細胞は、ギャップ結合仲介性細胞間コミュニケーションまたはギャップ非依存性経路を使用して、発生の過程において、発生シグナルを伝達し、細胞の増殖、移動および分化を制御する。コネキシンファミリーのタンパク質は、脊椎動物細胞において広範に発現する。このファミリーのメンバーの六量体が、ギャップ結合またはヘミチャネルを形成するように細胞膜上に位置し、細胞間および細胞外マトリックスとの間の物質の交換を仲介する。ゲノムにおいてコネキシンタンパク質をコードする遺伝子は、コネキシン遺伝子ファミリーを構成する（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、ヒトゲノムでは２１種類のコネキシン遺伝子が見出され、マウスゲノムでは２０種類のコネキシン遺伝子（非特許文献３）が見出された。細胞増殖制御、分化および発生を含む多くの重要な細胞機能が、ギャップ結合チャネルおよびコネキシンヘミチャネルコミュニケーションにより仲介される（非特許文献４〜６）。コネキシン遺伝子の変異は、心血管異常、末梢神経疾患、多白内障および聴覚消失を含む多くのヒト疾患と関連する。コネキシン２６（Ｃｘ２６）およびコネキシン３０（Ｃｘ３０）チャネルおよびヘミチャネルは、内耳のカリウムイオン循環に関与し、Ｃｘ２６およびＣｘ３０の欠失は、深刻な聴力損失およびそれに付随する蝸牛の発生途中のコルチ器官における細胞死を引き起こす（非特許文献４、７、８）。Ｃｘ２６およびＣｘ３０は、２つの隣接する遺伝子（ＧＪＢ２およびＧＪＢ６）によって発現され、一方でＣｘ２６およびＣｘ３０は、内耳の非応答性細胞と結合し、多面体を形成する。両方のタンパク質が、内耳で共発現される（非特許文献９）。ＤＮＦＢ１は、１３番染色体ｑ１１〜ｑ１２上に位置する（非特許文献１０）。遺伝性聴覚消失の５０パーセントが、ＤＦＮＢ１と関連し、地中海沿岸地域では７９％以下である（非特許文献１０、１１）。Ｃｘ２６およびＣｘ３０における欠失変異は、蝸牛らせん管の器官形成に深刻な影響を及ぼす（非特許文献１２〜１４）。いくつかの事例では、コネキシンにおける点変異は、異常なヘミチャネル開閉を引き起こしうるが、これは聴覚消失および皮膚疾患をもたらすと考えられる（非特許文献１５）。Ｃｘ２６を特異的に認識し、その機能を修復する抗体は、コネキシン変異に起因する聴覚消失および皮膚疾患を治療することが期待される。
【０００４】
近年、モノクローナル抗体は、疾患、とりわけ特定の抗原を発現する疾患、の診断および治療において、重要な役割を果たしてきた。モノクローナル抗体および抗原の反応の検出は、疾患診断のための黄金律として使用できる。モノクローナル抗体はまた、自己免疫疾患および腫瘍疾患における薬物として重要な役割を果たす。
【０００５】
コネキシン変異に起因する疾患は、発症率が相対的に低く、治療薬が相対的に少ない。さらに、抗体医薬の投与が困難であるがゆえに、聴覚消失または皮膚疾患を治療するための、コネキシンチャネルを標的とする抗体医薬は利用可能ではない。臨床診断のためのキットは存在せず、それゆえ、コネキシンを認識してそれと結合することができる単鎖抗体は、結腸直腸癌の診断および治療において重要なツールである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】D.A. Goodenough, D.L. Paul, Gap junctions, Cold Spring HarbPerspectBiol 1 (2009) a002576.
【非特許文献２】A.L. Harris, Connexin channel permeability to cytoplasmic molecules, ProgBiophysMolBiol 94 (2007) 120-143.
【非特許文献３】G. Sohl, K. Willecke, Gap junctions and the connexin protein family, Cardiovasc Res 62 (2004) 228-232.
【非特許文献４】C.J. Wei, X. Xu, C.W. Lo, Connexins and cell signaling in development and disease, Annu Rev Cell Dev Biol 20 (2004) 811-838.
【非特許文献５】A.B. Belousov, J.D. Fontes, Neuronal gap junctions: making and breaking connections during development and injury, Trends in Neurosciences 36 (2013) 227-236.
【非特許文献６】I. Fasciani, A. Temperan, L.F. Perez-Atencio, A. Escudero, P. Martinez-Montero, J. Molano, J.M. Gomez-Hernandez, C.L. Paino, D. Gonzalez-Nieto, L.C. Barrio, Regulation of connexin hemichannel activity by membrane potential and the extracellular calcium in health and disease, Neuropharmacology (2013).
【非特許文献７】D.W. Laird, Life cycle of connexins in health and disease, Biochem J 394 (2006) 527-543.
【非特許文献８】R. Dobrowolski, K. Willecke, Connexin-caused genetic diseases and corresponding mouse models, Antioxid Redox Signal 11 (2009) 283-295.
【非特許文献９】F. Ceriani, F. Mammano, A rapid and sensitive assay of intercellular coupling by voltage imaging of gap junction networks, Cell Commun Signal 11 (2013) 78.
【非特許文献１０】F.J. del Castillo, I. del Castillo, The DFNB1 subtype of autosomal recessive non-syndromic hearing impairment, Front Biosci 16 (2011) 3252-3274.
【非特許文献１１】L. Zelante, P. Gasparini, X. Estivill, S. Melchionda, L. D'Agruma, N. Govea, M. Mila, M.D. Monica, J. Lutfi, M. Shohat, E. Mansfield, K. Delgrosso, E. Rappaport, S. Surrey, P. Fortina, Connexin26 mutations associated with the most common form of non-syndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans, Hum Mol Genet 6 (1997) 1605-1609.
【非特許文献１２】M. Cohen-Salmon, F.J. del Castillo, C. Petit, Connexins Responsiblbe for Hereditary Deafness - The Tale Unfolds, in: E. Winterhager (Ed.), Gap Junctions in Development and Disease, Springer-Verlag, Berlin, 2005, pp. 111-134.
【非特許文献１３】M. Leibovici, S. Safieddine, C. Petit, Mouse models for human hereditary deafness, Curr Top Dev Biol 84 (2008) 385-429.
【非特許文献１４】R. Dobrowolski, K. Willecke, Connexin-Caused Genetic Diseases and Corresponding Mouse Models, Antioxidants & Redox Signaling 11 (2009) 283-295.
【非特許文献１５】F.J. del Castillo, I. del Castillo, The DFNB1 subtype of autosomal recessive non-syndromic hearing impairment, Frontiers in Bioscience-Landmark 16 (2011) 3252-3274.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ヒトコネキシン２６抗原と特異的に結合し、したがって、コネキシン２６の変異に起因する疾患を治療する医薬またはコネキシン２６に関する診断キットの調製に使用できる、単鎖抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するために、本発明は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ構造を有する組換え免疫グロブリンである、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体であって、ｓｃＦｖが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単鎖抗体を指し、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、Ｆｃが定常領域を指す、完全ヒト抗体を提供する。
【０００９】
好ましくは、定常領域は、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む。
【００１０】
好ましくは、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体は、コネキシン２６の細胞外領域の４１位〜７５位のアミノ酸部分を特異的に認識する。
【００１１】
本発明はまた、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体の単鎖抗体との相同性が３０％以上の相同配列を有する、遺伝子組換え抗体を提供する。
【００１２】
好ましくは、遺伝子組換え抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片およびＦｃ断片からなる群より選ばれる１種、または２種以上の断片の組合せ、または他のタンパク質もしくはペプチド鎖を有する、少なくとも１種の断片の誘導体を含む。
【００１３】
好ましくは、遺伝子組換え抗体の重鎖ＣＤＲ３領域配列はＤＦＳＷＲＧＹＹＭＤＶであり、軽鎖ＣＤＲ３領域配列はＱＱＹＧＳＳＰＲＴである。
【００１４】
本発明はまた、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコードするヌクレオチド配列であって、その配列が配列番号３または配列番号４で表されるヌクレオチド配列を提供する。
【００１５】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、上述のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコードする。
【００１６】
本発明はまた、コネキシン２６変異に起因する聴覚消失、皮膚疾患または腫瘍の治療のための医薬またはキットの製造における、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体または遺伝子組換え抗体の使用を提供する。
【００１７】
本発明はまた、聴覚消失、皮膚疾患または腫瘍を治療するための医薬であって、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体または遺伝子組換え抗体を有効成分として含む医薬を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体を、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃと命名した。後述する結果は、複数ラウンドのファージライブラリースクリーニングにより得られる単鎖抗体は、コネキシンと選択的に結合可能であり、コネキシンにより形成されるヘミチャネルを特異的に阻害しうることを示す。抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃは、組換え単鎖ヒト抗体であり、これは、臨床的応用において、通常のＩｇＧ抗体とは異なる。抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃは、ＩｇＧとは異なる抗体構造、生化学的特性および生物学的機能を有する。本発明者らの実験は、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ単鎖抗体は、分子量が約１００ｋｄであり、コネキシン細胞外ドメインの標的抗原エピトープを認識してそれと結合し、コネキシン２６を過剰発現する細胞を特異的に認識し、さらに抗体およびコネキシン２６が細胞表面に共局在化することを明らかにした。機能的実験は、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃが、コネキシン２６ヘミチャネルの活性を阻害可能であることを示す。当該抗体のみの免疫組織化学的染色によって、様々な組織におけるヒトコネキシン２６の発現をより正確に診断することができる。要約すると、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ単鎖抗体は、聴覚消失、皮膚疾患および腫瘍の治療ならびにコネキシン２６診断試薬において、潜在的用途を有する。
【００１９】
本発明は、ヒトコネキシン２６細胞外領域の４１位〜５６位のアミノ酸配列を抗原として使用し、そのアミノ酸配列は、ＫＥＶＷＧＤＥＱＡＤＦＶＣＮＴＬである。抗体は、単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーおよびスクリーニング技術により得られる。生化学的解析および免疫蛍光同定を通じて、本発明により提供される抗体が、コネキシン２６を特異的に認識し、そのヘミチャネル活性の形成を阻害することが確認された。動物実験は、抗体が、マウス蝸牛組織切片のヘミチャネル活性に対する顕著な阻害効果を有することを示す。したがって、抗体を、コネキシン関連疾患の治療において使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】単鎖抗体のスクリーニングおよび配列の確認。抗体のエンリッチ後の抗原結合活性を検出するために、ファージＥＬＩＳＡを使用した。
【図１Ｂ】単鎖抗体のスクリーニングおよび配列の確認。選択されたモノクローナル抗体と抗原との間の結合のＥＬＩＳＡアッセイ。
【図２Ａ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。ｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫グロブリンの構造図である。
【図２Ｂ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。ウェスタンブロットにより試験された単鎖抗体の分子量は、約５８ＫＤａである。
【図２Ｃ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体熱安定性試験。
【図２Ｄ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。質量分析は、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ二量体の分子量が１０５１４０．３であることを示す。
【図３Ａ】抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体とＣｘ２６抗原との間の結合親和性の試験。抗体／Ｃｘ２６タンパク質結合親和性を試験するためのＥＬＩＳＡ。
【図３Ｂ】抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体とＣｘ２６抗原との間の結合親和性の試験。抗体／Ｃｘ２６タンパク質結合親和性を試験するためのＳＲＰアッセイであり、結果は、Ｃｘ２６タンパク質と結合する抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体のＫＤが７．３×１０−８Ｍであることを示した。
【図４】抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体およびＣｘ２６−ＧＦＰタンパク質の共局在についての免疫蛍光試験。結果は、これらの２つのタンパク質が共局在化したことを示した。
【図５】活性化したＣｘ２６イオンチャネルの脱分極後にパッチクランプ法により試験した、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体がＣｘ２６ヘミチャネル活性を遮断する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明を、特定の実施形態に関してさらに後述する。以下の実施例は、本発明を単に例示するためのものにすぎず、本発明の範囲の限定を意図しないものであることを理解されたい。加えて、本発明を読んだのち、当業者は、本発明に対して様々な改変または変更を行うことができ、このような均等な形態もまた、本出願の添付の特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。
【実施例１】
【００２２】
単鎖抗体のスクリーニングおよび精製
【００２３】
１．材料：
（１）Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成されたビオチン化抗原ポリペプチド（配列：ＫＥＶＷＧＤＥＱＡＤＦＶＣＮＴＬ、配列番号５、以下、「抗原」と称する）。（２）本研究室のファージディスプレイヒト抗体ライブラリー。（３）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入したストレプトアビジン磁気ビーズ。（４）Ｃｏｒｎｉｎｇ社から購入した高吸着ＥＬＩＳＡマイクロプレート。（５）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体。（６）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入したヘルパーファージ（カタログＮｏ．１８３１１０１９）。（７）Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能なＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌（カタログＮＯ．２００２２８）。（８）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した発色液ＡＢＴＳ溶液、カタログＮＯ．００２０２４。
【００２４】
２．方法：
ヒト単鎖抗体を発現する２００マイクロリットルのファージディスプレイヒト抗体ライブラリー（１×１０１１個のファージ粒子を含有）を、５マイクログラムの抗原と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次に、５０マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズに添加した。抗原に結合したファージをストレプトアビジン磁気ビーズにより捕捉し、非結合ファージをＰＢＳＴによりすすいで除去し、次に、安定的に結合したファージをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）バッファーで溶出した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログＮｏ．２００２２８）を２００ｍＬのＳＢ培地中に接種し、ＯＤが０．６に到達したとき、溶出ファージをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次に一晩３０℃でインキュベートした。遠心分離により細菌を収集し、３０マイクロリットルのヘルパーファージ（１×１０１１個のヘルパーファージ粒子を含有）を添加した。増幅後に次のラウンドのスクリーニングを実施した。上のパニング工程を３〜４ラウンド反復した。次に、ファージ含有ＸＬ１−Ｂｌｕｅブロスを十分希釈し、各プレート上に１００〜５００個のクローンを有する１０ｃｍプレート上にプレートし、単一クローンを採取した。ファージライブラリーパニングの各ラウンド後に、ファージＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【００２５】
ファージＥＬＩＳＡ試験は、以下の工程を含む。すなわち、ファージ含有ＸＬ１−Ｂｌｕｅモノクローナル細菌を、９６ウェルプレート内の２００マイクロリットルのＳＢ培地中に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの速度で４〜６時間振盪し、ＯＤが０．６に近接したら１マイクロリットルのヘルパーファージを添加し、３０℃で一晩振盪し、翌日、使用のための上清を収集するために、３０００ｇの遠心分離に付し、抗原を用いて９６低透過性マイクロプレートを一晩コーティングし、上清中の調製ファージをマイクロプレートに添加し、２時間室温でインキュベートした後に抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体を添加して３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、そして５０マイクロリットルのＡＢＴＳを発色液として添加する。
【００２６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果は、パニングが進行するにつれて、酵素結合免疫吸着のシグナルが継続的に上昇する一方で、対照抗原（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ０−Ｈ８２Ｆ２）のシグナルは低いままであることを示す。第４ラウンドのパニング後、抗原のシグナル強度は、対照抗原の複数倍となり、４ラウンドのパニング後には、抗原特異的結合抗体を発現可能なファージが富化されたことを示す。第３および第４ラウンドのライブラリーから単一クローンを抜き出し、ＥＬＩＳＡの結果が対照クローンの２倍を超えたクローンを、陽性クローンとして選択した。陽性クローンの配列を解析し、異なる抗体配列および富化条件を、比較解析により決定した。
【００２７】
３．結果：
図１Ａに示すとおり、ペプチド抗原ＣＢを、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーに対してスクリーニングした。４ラウンドの選択後、選択した群のＥＬＩＳＡ読出値は、対照群と比較して継続的に増加した。図１Ｂに示すとおり、７００個のモノクローナル抗体を抜き出し、ＥＬＩＳＡアッセイにより試験し、ＥＬＩＳＡの結果が対照群の２倍を超えたクローンを、陽性クローンとして選択した。１５０個の陽性クローンの配列解析を実施した。比較およびアラインメント解析後、より多くの反復を有するものが、より強力な抗体結合親和性を有するということに基づいて、有効な富化配列を決定した。本発明において選択した陽性クローンは、１５０個のクローン配列中で８４回繰り返されていることから、より高い親和性を有する。
【００２８】
選択した陽性クローンの配列を決定したところ、選択した陽性クローンの核酸配列は、配列番号３だった。
【実施例２】
【００２９】
単鎖抗体の精製および生化学的特性の検出
【００３０】
１．材料：
（１）Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ染料を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。（２）ｐＦＵＳＥ発現ベクターｐＦＵＳＥ−ｈＩＧｇ１−ＦＣ２、カタログＮｏ．ｐｆｕｓｅ−ｈｇ１ｆｃ２を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社から購入した。（３）ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムを、ＧＥ社から購入した。（４）ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１００タンパク質精製装置を、ＧＥ社から購入した。（５）リアルタイム定量ＰＣＲ機器を、ＢｉｏＲａｄ社から購入した。（６）プラスミド抽出キットを、Ｑｉａｇｅｎ社から購入した。（７）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット、Ｐｉｅｒｃｅ社  ＃  ２３２５３）。（８）ＢａｍＨ１およびＢｇＩＩＩ制限酵素を、ＮＥＢ社から購入した。
【００３１】
２．方法：
実施例１で得られた陽性配列（すなわち配列番号３）を、遺伝子合成法（Ｎａｎｊｉｎｇ  ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｌｔｄ．社）により合成し、ＢａｍＨ１およびＢｇＩＩＩの制限部位を配列の両端に付加した。得られた核酸配列を、ＮＥＢ社の取扱説明書に記載の手順を参照にして、制限部位のＢａｍＨ１およびＢｇＩＩＩにおける酵素消化後、ｐＦＵＳＥ−ｈＩＧｇ１−ＦＣ２発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、取扱説明書に記載の手順を参照した）内に挿入し、Ｆｃセグメントを有する単鎖抗体である抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃの真核生物抗体発現プラスミドを得た。２９３フェクチン（Ｆｅｃｔｉｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１２３４７５００）を、真核生物抗体発現プラスミドと、３０マイクロリットル：１５マイクログラムの体積質量比で混合した。得られた混合物を、３０ｍＬの２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手可能）に添加し、１２００ｒｐｍおよび３７℃で振盪しながら一晩インキュベートした。遠心分離後に上清を収集し、抗体タンパク質（抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ）を、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１００タンパク質精製装置上でＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムを使用して精製した。最後に、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃２３２５２）を、取扱説明書に記載の手順を参照して使用することにより、抗体濃度を試験した。
【００３２】
精製抗体をウェスタンブロットにより試験した：５マイクログラムの精製抗体試料を、１１０Ｖの電気泳動電圧を用いて６０分間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のためにロードし、酢酸セルロース膜に移し、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗ヒト二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とハイブリダイズさせた。膜をすすぎ、次に、発色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃３５０５５）を可視化のために添加した。
【００３３】
精製抗体を、以下の工程を伴う熱安定性試験に供した。すなわち、精製抗体を０．１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ染料を１：２０００の体積比で添加して密封し、２５℃から９０℃まで、１分当たり０．５℃の加熱プログラムを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ機器（ＢｉｏＲａｄ社）上にロードし、そして蛍光値を検出する。
【００３４】
精製抗体をＬＣ−ＭＳ質量分析により、以下の工程を用いて試験した。すなわち、５マイクログラムの精製抗体を、１マイクロリットルのＰＮＧａｓｅ酵素（ＮＥＢ  Ｉｎｃ．社から入手可能、カタログＮｏ．Ｐ０７０９Ｓ）と３７℃で１時間混合し、そして高分解能質量分析のためにＡｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ機器上にロードする。
【００３５】
３．結果：
実施例１で得られた核酸配列（配列番号：３）を、酵素消化後に、ｐＦＵＳＥ−ｈＩＧｇ１−ＦＣ２発現ベクター内に挿入し、Ｆｃ領域を含有するｓｃＦｖ  ＩＩ  ＤＮＡ配列（配列番号４）を得た。ｓｃＦｖ  ＩＩ  ＤＮＡ配列は、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト単鎖抗体（抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ、配列番号６）、すなわち、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコード可能であり、これは、図２Ａに示すｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を有する組換え免疫グロブリンであり、ｓｃＦｖは重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単鎖抗体を指し、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２で表され、重鎖ＣＤＲ３領域の配列はＤＦＳＷＲＧＹＹＭＤＶであり、軽鎖ＣＤＲ３領域の配列はＱＱＹＧＳＳＰＲＴであり、Ｆｃは定常領域を指す。定常領域は、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む。コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体は、コネキシン２６の細胞外領域の４１位〜７５位のアミノ酸部分を特異的に認識する。
【００３６】
ウェスタンブロットの結果を図２Ｂに示す。５８ｋｄにおける明らかなバンドは、抗体がＣｘ２６タンパク質を特異的に認識できることを示す。図２Ｃに示すとおり、熱安定性試験結果を使用して算出された抗体のＴｍは６５℃であり、したがって、本明細書に記載の抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体は、高い安定性を有する。図２Ｄに示すＬＣ−ＭＳの質量分析結果は、抗体の分子量が１０５１４０ダルトンであることを示す。
【実施例３】
【００３７】
コネキシン２６に対する単鎖抗体の結合を試験するためのＥＬＩＳＡアッセイ
【００３８】
１．材料：
１．ＣＢＳ抗原固定溶液を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。２．抗ヒトＦｃ  ＨＲＰ二次抗体を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。３．発色基質ＡＢＳＴ溶液を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。４．９６ウェル平底プレートを、Ｃｏｒｎｉｎｇ社から購入した。
【００３９】
２．方法：
１ウェル当たり５０μｌのＣｘ２６ポリペプチド抗原（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により合成、ＣＢＳ抗原固定溶液を用いて希釈、配列番号５）および１ウェル当たり０．０５μｇの抗原を９６ウェルプレートに添加し、一晩４℃でインキュベートし、次に、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを用いて９６ウェルプレートを３回すすぎ、５％のミルクを含有するＰＢＳＴ溶液を用いて３７℃で６０分間ブロッキングし、ＰＢＳを用いて３回すすいだ。実施例２で得られた抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体を添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。９６ウェルプレートをすすいで乾燥させたのち、抗ヒトＦｃ二次抗体をそこに添加し、３０分間振盪しながら室温でインキュベートした。ＰＢＳを用いて９６ウェルプレートを３回すすぎ、発色基質を添加し、最終的にマイクロプレートリーダーを用いて読み取った。
【００４０】
３．結果：
図３Ａに示すとおり、陰性対照ウェルのＯＤ値は０．２未満であり、陽性ウェルのＯＤ値は０．４を超えた。ＥＬＩＳＡの結果に基づき、１５０個の陽性コロニーウェルを選択した。
【実施例４】
【００４１】
ＳＲＰによる単鎖抗体およびコネキシン２６の結合の検出
【００４２】
１．材料：
１．Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器およびその検出チップ（ＣＭ５チップ）を、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から購入した。２．抗ヒトＩｇＧ抗体を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
【００４３】
２．実験方法：
抗体および抗原の親和性および動態を、マルチサイクルカイネティクス法により検出した。抗体の固定化を捕捉法により実施した。まず、抗ヒトＩｇＧ抗体をＣＭ５チップと結合し、次に、段階希釈した後に、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体試料をチップ表面全体に流した。次に、結合した抗ヒトＦｃ抗体により、検出される抗体を捕捉した。次に、ポリペプチド抗原（Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ社により合成、配列：配列番号５）を添加し、シグナルを検出しおよび記録した。最後に、ＣＭ５チップ表面上の抗体および抗原試料を、再生試薬（グリシン溶液、ｐＨ１．７）により、試験の新規ラウンドのために溶出した。
【００４４】
３．結果：
図３Ｂに示すとおり、抗体とコネキシン２６との間の相互作用のＳＲＰ検出は、Ｃｘ２６を伴う抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体のＫＤが、７．３×１０−８Ｍであることを示した。
【実施例５】
【００４５】
抗体により特異的に認識されるＣｘ２６タンパク質の細胞免疫蛍光検出
【００４６】
１．材料：
（1）ＨｅＬａ  ＤＨ細胞を、Ｓｉｇｍａ社から購入した。（２）Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰレポータープラスミド、カタログＮｏ．６９０１６を、Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入した。（３）蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ヒトを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。（４）蛍光共焦点顕微鏡を、Ｌｅｉｃａ社から購入した。
【００４７】
２．方法：
Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰプラスミドを、取扱説明書に記載の手順を参照して２９３フェクチン（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて、ＨｅＬａ  ＤＨ細胞内にトランスフェクトした。プラスミドＣｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰは、ヒトＣｘ２６タンパク質を、細胞膜上に緑色蛍光を伴って発現することができる。２％のホルマリンを用いて固定後、細胞を、室温で１０分間維持した。すすいだのち、細胞を、ＰＢＳ中２％のＢＳＡを用いて３０分間ブロッキングし、次に、１ｍｇ／ｍＬの抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体溶液を１％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１：５００の希釈率で希釈することにより得られた、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体溶液中で、４から５時間インキュベートした。すすいだ後、細胞に、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中１：１０００の希釈率で希釈された蛍光Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ヒト二次抗体を添加した。細胞を、室温で６０分間インキュベートし、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、５分間インキュベートし、すすぎ、共焦点レーザー走査顕微鏡上にマウントし、検出した。
【００４８】
３．結果：
図４に示すとおり、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体は、両方のＣｘ２６−ＧＦＰタンパク質と共局在化した。
【実施例６】
【００４９】
抗体により阻害されるＣｘ２６ヘミチャネル活性のパッチクランプ法による検出
【００５０】
１．材料：
（１）ＨｅＬａ  ＤＨ細胞を、Ｓｉｇｍａ社から購入した。（２）Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰレポータープラスミド、カタログＮｏ．６９０１６を、Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入した。（３）自動パッチクランプシステムを、米国ＭＤＣ社から購入した。
【００５１】
２．方法：
２９３フェクチン（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用い、取扱説明書に記載の手順を参照して、Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰプラスミドをＨｅＬａ  ＤＨ細胞内にトランスフェクトした。ホールセルパッチクランプを、単一膜イオン電流を記録するために使用した。９４０ｎＭの抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体を細胞の上清中に添加し、さらに陽性対照群には１００μＭのＺｎ２＋を添加し、ブランク対照群には抗体を添加しなかった。細胞が脱分極するように電圧を４０ミリボルトまで増加したところ、Ｃｘ２６ヘミチャネルの開口をもたらした。抗体を添加した実験群、陽性対照群およびブランク対照群のヘミチャネル電流を記録した。細胞を過分極させるように電圧を−４０ミリボルトまで減少させ、同時に、各群のヘミチャネル電流を記録した。
【００５２】
３．結果：
図５に示すとおり、抗体抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃは、Ｃｘ２６ヘミチャネル活性を効果的に阻害した。これは、非特異的阻害剤Ｚｎ２＋よりも１００倍高い。
【図１Ａ】
2019504829.tif 000003
【図１Ｂ】
2019504829.tif 000004
【図２Ａ】
2019504829.tif 000005
【図２Ｂ】
2019504829.tif 000006
【図２Ｃ】
2019504829.tif 000007
【図２Ｄ】
2019504829.tif 000008
【図３Ａ】
2019504829.tif 000009
【図３Ｂ】
2019504829.tif 000010
【図４】
2019504829.tif 000011
【図５】
2019504829.tif 000012
【配列表】
2019504829000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月27日(2018.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学医学の分野に属し、特に本発明は、ヒト蝸牛および皮膚組織に発現するコネキシン２６を特異的に認識し、コネキシン２６のヘミチャネルを阻害することができる、単鎖抗体または当該抗体を発現するプラスミド、ならびにコネキシン２６変異に起因する聴覚消失、皮膚疾患および腫瘍を治療するための医薬および診断キットの調製における抗体の使用を提供する。本発明はまた、抗体を使用して調製する診断キットを提供する。当該キットは、モノクローナル抗体を有効成分として含む。
【背景技術】
【０００２】
ギャップ結合は、イオンチャネルにより形成される細胞間結合である。ギャップ結合チャネルは、細胞同士の細胞質を接続することにより、１．８ＫＤよりも小さい小分子、たとえばイオン、代謝産物およびセカンドメッセンジャーが自由に通過することを可能にする（非特許文献１、非特許文献２）。脊椎動物では、コネキシンで構成されるギャップ結合経路が、隣接細胞間でのイオン、小分子、およびシグナリング分子の交換を仲介し、哺乳動物の初期発生段階において極めて重要である。ギャップ結合チャネルは、種々の多くのコネキシンタンパク質により構成され、コネキシン組成に応じた異なる透過特性を示しうる。隣接細胞は、ギャップ結合仲介性細胞間コミュニケーションまたはギャップ非依存性経路を使用して、発生の過程において、発生シグナルを伝達し、細胞の増殖、移動および分化を制御する。コネキシンファミリーのタンパク質は、脊椎動物細胞において広範に発現する。このファミリーのメンバーの六量体が、ギャップ結合またはヘミチャネルを形成するように細胞膜上に位置し、細胞間および細胞外マトリックスとの間の物質の交換を仲介する。ゲノムにおいてコネキシンタンパク質をコードする遺伝子は、コネキシン遺伝子ファミリーを構成する（非特許文献３）。
【０００３】
これまで、ヒトゲノムでは２１種類のコネキシン遺伝子が見出され、マウスゲノムでは２０種類のコネキシン遺伝子（非特許文献３）が見出された。細胞増殖制御、分化および発生を含む多くの重要な細胞機能が、ギャップ結合チャネルおよびコネキシンヘミチャネルコミュニケーションにより仲介される（非特許文献４〜６）。コネキシン遺伝子の変異は、心血管異常、末梢神経疾患、多白内障および聴覚消失を含む多くのヒト疾患と関連する。コネキシン２６（Ｃｘ２６）およびコネキシン３０（Ｃｘ３０）チャネルおよびヘミチャネルは、内耳のカリウムイオン循環に関与し、Ｃｘ２６およびＣｘ３０の欠失は、深刻な聴力損失およびそれに付随する蝸牛の発生途中のコルチ器官における細胞死を引き起こす（非特許文献４、７、８）。Ｃｘ２６およびＣｘ３０は、２つの隣接する遺伝子（ＧＪＢ２およびＧＪＢ６）によって発現され、一方でＣｘ２６およびＣｘ３０は、内耳の非応答性細胞と結合し、多面体を形成する。両方のタンパク質が、内耳で共発現される（非特許文献９）。ＤＮＦＢ１は、１３番染色体ｑ１１〜ｑ１２上に位置する（非特許文献１０）。遺伝性聴覚消失の５０パーセントが、ＤＦＮＢ１と関連し、地中海沿岸地域では７９％以下である（非特許文献１０、１１）。Ｃｘ２６およびＣｘ３０における欠失変異は、蝸牛らせん管の器官形成に深刻な影響を及ぼす（非特許文献１２〜１４）。いくつかの事例では、コネキシンにおける点変異は、異常なヘミチャネル開閉を引き起こしうるが、これは聴覚消失および皮膚疾患をもたらすと考えられる（非特許文献１５）。Ｃｘ２６を特異的に認識し、その機能を修復する抗体は、コネキシン変異に起因する聴覚消失および皮膚疾患を治療することが期待される。
【０００４】
近年、モノクローナル抗体は、疾患、とりわけ特定の抗原を発現する疾患、の診断および治療において、重要な役割を果たしてきた。モノクローナル抗体および抗原の反応の検出は、疾患診断のための黄金律として使用できる。モノクローナル抗体はまた、自己免疫疾患および腫瘍疾患における薬物として重要な役割を果たす。
【０００５】
コネキシン変異に起因する疾患は、発症率が相対的に低く、治療薬が相対的に少ない。さらに、抗体医薬の投与が困難であるがゆえに、聴覚消失または皮膚疾患を治療するための、コネキシンチャネルを標的とする抗体医薬は利用可能ではない。臨床診断のためのキットは存在せず、それゆえ、コネキシンを認識してそれと結合することができる単鎖抗体は、結腸直腸癌の診断および治療において重要なツールである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】D.A. Goodenough, D.L. Paul, Gap junctions, Cold Spring HarbPerspectBiol 1 (2009) a002576.
【非特許文献２】A.L. Harris, Connexin channel permeability to cytoplasmic molecules, ProgBiophysMolBiol 94 (2007) 120-143.
【非特許文献３】G. Sohl, K. Willecke, Gap junctions and the connexin protein family, Cardiovasc Res 62 (2004) 228-232.
【非特許文献４】C.J. Wei, X. Xu, C.W. Lo, Connexins and cell signaling in development and disease, Annu Rev Cell Dev Biol 20 (2004) 811-838.
【非特許文献５】A.B. Belousov, J.D. Fontes, Neuronal gap junctions: making and breaking connections during development and injury, Trends in Neurosciences 36 (2013) 227-236.
【非特許文献６】I. Fasciani, A. Temperan, L.F. Perez-Atencio, A. Escudero, P. Martinez-Montero, J. Molano, J.M. Gomez-Hernandez, C.L. Paino, D. Gonzalez-Nieto, L.C. Barrio, Regulation of connexin hemichannel activity by membrane potential and the extracellular calcium in health and disease, Neuropharmacology (2013).
【非特許文献７】D.W. Laird, Life cycle of connexins in health and disease, Biochem J 394 (2006) 527-543.
【非特許文献８】R. Dobrowolski, K. Willecke, Connexin-caused genetic diseases and corresponding mouse models, Antioxid Redox Signal 11 (2009) 283-295.
【非特許文献９】F. Ceriani, F. Mammano, A rapid and sensitive assay of intercellular coupling by voltage imaging of gap junction networks, Cell Commun Signal 11 (2013) 78.
【非特許文献１０】F.J. del Castillo, I. del Castillo, The DFNB1 subtype of autosomal recessive non-syndromic hearing impairment, Front Biosci 16 (2011) 3252-3274.
【非特許文献１１】L. Zelante, P. Gasparini, X. Estivill, S. Melchionda, L. D'Agruma, N. Govea, M. Mila, M.D. Monica, J. Lutfi, M. Shohat, E. Mansfield, K. Delgrosso, E. Rappaport, S. Surrey, P. Fortina, Connexin26 mutations associated with the most common form of non-syndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans, Hum Mol Genet 6 (1997) 1605-1609.
【非特許文献１２】M. Cohen-Salmon, F.J. del Castillo, C. Petit, Connexins Responsiblbe for Hereditary Deafness - The Tale Unfolds, in: E. Winterhager (Ed.), Gap Junctions in Development and Disease, Springer-Verlag, Berlin, 2005, pp. 111-134.
【非特許文献１３】M. Leibovici, S. Safieddine, C. Petit, Mouse models for human hereditary deafness, Curr Top Dev Biol 84 (2008) 385-429.
【非特許文献１４】R. Dobrowolski, K. Willecke, Connexin-Caused Genetic Diseases and Corresponding Mouse Models, Antioxidants & Redox Signaling 11 (2009) 283-295.
【非特許文献１５】F.J. del Castillo, I. del Castillo, The DFNB1 subtype of autosomal recessive non-syndromic hearing impairment, Frontiers in Bioscience-Landmark 16 (2011) 3252-3274.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ヒトコネキシン２６抗原と特異的に結合し、したがって、コネキシン２６の変異に起因する疾患を治療する医薬またはコネキシン２６に関する診断キットの調製に使用できる、単鎖抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するために、本発明は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ構造を有する組換え免疫グロブリンである、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体であって、ｓｃＦｖが、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単鎖抗体を指し、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号２で表され、Ｆｃが定常領域を指す、完全ヒト抗体を提供する。
【０００９】
好ましくは、定常領域は、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む。
【００１０】
好ましくは、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体は、コネキシン２６の細胞外領域の４１位〜７５位のアミノ酸部分を特異的に認識する。
【００１１】
本発明はまた、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体の単鎖抗体との相同性が３０％以上の相同配列を有する、遺伝子組換え抗体を提供する。
【００１２】
好ましくは、遺伝子組換え抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片およびＦｃ断片からなる群より選ばれる１種、または２種以上の断片の組合せ、または他のタンパク質もしくはペプチド鎖を有する、少なくとも１種の断片の誘導体を含む。
【００１３】
好ましくは、遺伝子組換え抗体の重鎖ＣＤＲ３領域配列はＤＦＳＷＲＧＹＹＭＤＶであり、軽鎖ＣＤＲ３領域配列はＱＱＹＧＳＳＰＲＴである。
【００１４】
本発明はまた、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコードするヌクレオチド配列であって、その配列が配列番号３または配列番号４で表されるヌクレオチド配列を提供する。
【００１５】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、上述のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコードする。
【００１６】
本発明はまた、コネキシン２６変異に起因する聴覚消失、皮膚疾患または腫瘍の治療のための医薬またはキットの製造における、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体または遺伝子組換え抗体の使用を提供する。
【００１７】
本発明はまた、聴覚消失、皮膚疾患または腫瘍を治療するための医薬であって、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体または遺伝子組換え抗体を有効成分として含む医薬を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のコネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体を、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃと命名した。後述する結果は、複数ラウンドのファージライブラリースクリーニングにより得られる単鎖抗体は、コネキシンと選択的に結合可能であり、コネキシンにより形成されるヘミチャネルを特異的に阻害しうることを示す。抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃは、組換え単鎖ヒト抗体であり、これは、臨床的応用において、通常のＩｇＧ抗体とは異なる。抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃは、ＩｇＧとは異なる抗体構造、生化学的特性および生物学的機能を有する。本発明者らの実験は、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ単鎖抗体は、分子量が約１００ｋｄであり、コネキシン細胞外ドメインの標的抗原エピトープを認識してそれと結合し、コネキシン２６を過剰発現する細胞を特異的に認識し、さらに抗体およびコネキシン２６が細胞表面に共局在化することを明らかにした。機能的実験は、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃが、コネキシン２６ヘミチャネルの活性を阻害可能であることを示す。当該抗体のみの免疫組織化学的染色によって、様々な組織におけるヒトコネキシン２６の発現をより正確に診断することができる。要約すると、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ単鎖抗体は、聴覚消失、皮膚疾患および腫瘍の治療ならびにコネキシン２６診断試薬において、潜在的用途を有する。
【００１９】
本発明は、ヒトコネキシン２６細胞外領域の４１位〜５６位のアミノ酸配列を抗原として使用し、そのアミノ酸配列は、ＫＥＶＷＧＤＥＱＡＤＦＶＣＮＴＬである。抗体は、単鎖抗体ファージディスプレイライブラリーおよびスクリーニング技術により得られる。生化学的解析および免疫蛍光同定を通じて、本発明により提供される抗体が、コネキシン２６を特異的に認識し、そのヘミチャネル活性の形成を阻害することが確認された。動物実験は、抗体が、マウス蝸牛組織切片のヘミチャネル活性に対する顕著な阻害効果を有することを示す。したがって、抗体を、コネキシン関連疾患の治療において使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】単鎖抗体のスクリーニングおよび配列の確認。抗体のエンリッチ後の抗原結合活性を検出するために、ファージＥＬＩＳＡを使用した。
【図１Ｂ】単鎖抗体のスクリーニングおよび配列の確認。選択されたモノクローナル抗体と抗原との間の結合のＥＬＩＳＡアッセイ。
【図２Ａ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。ｓｃＦｖ−Ｆｃ免疫グロブリンの構造図である。
【図２Ｂ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。ウェスタンブロットにより試験された単鎖抗体の分子量は、約５８ＫＤａである。
【図２Ｃ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体熱安定性試験。
【図２Ｄ】単鎖抗体の構造および生化学的活性の同定。質量分析は、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ二量体の分子量が１０５１４０．３であることを示す。
【図３Ａ】抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体とＣｘ２６抗原との間の結合親和性の試験。抗体／Ｃｘ２６タンパク質結合親和性を試験するためのＥＬＩＳＡ。
【図３Ｂ】抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体とＣｘ２６抗原との間の結合親和性の試験。抗体／Ｃｘ２６タンパク質結合親和性を試験するためのＳＲＰアッセイであり、結果は、Ｃｘ２６タンパク質と結合する抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体のＫＤが７．３×１０−８Ｍであることを示した。
【図４】抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体およびＣｘ２６−ＧＦＰタンパク質の共局在についての免疫蛍光試験。結果は、これらの２つのタンパク質が共局在化したことを示した。
【図５】活性化したＣｘ２６イオンチャネルの脱分極後にパッチクランプ法により試験した、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体がＣｘ２６ヘミチャネル活性を遮断する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明を、特定の実施形態に関してさらに後述する。以下の実施例は、本発明を単に例示するためのものにすぎず、本発明の範囲の限定を意図しないものであることを理解されたい。加えて、本発明を読んだのち、当業者は、本発明に対して様々な改変または変更を行うことができ、このような均等な形態もまた、本出願の添付の特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。
【実施例１】
【００２２】
単鎖抗体のスクリーニングおよび精製
【００２３】
１．材料：
（１）Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社により合成されたビオチン化抗原ポリペプチド（配列：ＫＥＶＷＧＤＥＱＡＤＦＶＣＮＴＬ、配列番号５、以下、「抗原」と称する）。（２）本研究室のファージディスプレイヒト抗体ライブラリー。（３）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入したストレプトアビジン磁気ビーズ。（４）Ｃｏｒｎｉｎｇ社から購入した高吸着ＥＬＩＳＡマイクロプレート。（５）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体。（６）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入したヘルパーファージ（カタログＮｏ．１８３１１０１９）。（７）Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能なＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌（カタログＮＯ．２００２２８）。（８）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した発色液ＡＢＴＳ溶液、カタログＮＯ．００２０２４。
【００２４】
２．方法：
ヒト単鎖抗体を発現する２００マイクロリットルのファージディスプレイヒト抗体ライブラリー（１×１０１１個のファージ粒子を含有）を、５マイクログラムの抗原と混合し、室温で３０分間インキュベートし、次に、５０マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズに添加した。抗原に結合したファージをストレプトアビジン磁気ビーズにより捕捉し、非結合ファージをＰＢＳＴによりすすいで除去し、次に、安定的に結合したファージをグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）バッファーで溶出した。ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社カタログＮｏ．２００２２８）を２００ｍＬのＳＢ培地中に接種し、ＯＤが０．６に到達したとき、溶出ファージをＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、次に一晩３０℃でインキュベートした。遠心分離により細菌を収集し、３０マイクロリットルのヘルパーファージ（１×１０１１個のヘルパーファージ粒子を含有）を添加した。増幅後に次のラウンドのスクリーニングを実施した。上のパニング工程を３〜４ラウンド反復した。次に、ファージ含有ＸＬ１−Ｂｌｕｅブロスを十分希釈し、各プレート上に１００〜５００個のクローンを有する１０ｃｍプレート上にプレートし、単一クローンを採取した。ファージライブラリーパニングの各ラウンド後に、ファージＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【００２５】
ファージＥＬＩＳＡ試験は、以下の工程を含む。すなわち、ファージ含有ＸＬ１−Ｂｌｕｅモノクローナル細菌を、９６ウェルプレート内の２００マイクロリットルのＳＢ培地中に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの速度で４〜６時間振盪し、ＯＤが０．６に近接したら１マイクロリットルのヘルパーファージを添加し、３０℃で一晩振盪し、翌日、使用のための上清を収集するために、３０００ｇの遠心分離に付し、抗原を用いて９６低透過性マイクロプレートを一晩コーティングし、上清中の調製ファージをマイクロプレートに添加し、２時間室温でインキュベートした後に抗Ｍ１３  ＨＲＰ抗体を添加して３０分間インキュベートし、ＰＢＳＴを用いて３回洗浄し、そして５０マイクロリットルのＡＢＴＳを発色液として添加する。
【００２６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果は、パニングが進行するにつれて、酵素結合免疫吸着のシグナルが継続的に上昇する一方で、対照抗原（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＣＤ０−Ｈ８２Ｆ２）のシグナルは低いままであることを示す。第４ラウンドのパニング後、抗原のシグナル強度は、対照抗原の複数倍となり、４ラウンドのパニング後には、抗原特異的結合抗体を発現可能なファージが富化されたことを示す。第３および第４ラウンドのライブラリーから単一クローンを抜き出し、ＥＬＩＳＡの結果が対照クローンの２倍を超えたクローンを、陽性クローンとして選択した。陽性クローンの配列を解析し、異なる抗体配列および富化条件を、比較解析により決定した。
【００２７】
３．結果：
図１Ａに示すとおり、ペプチド抗原ＣＢを、ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーに対してスクリーニングした。４ラウンドの選択後、選択した群のＥＬＩＳＡ読出値は、対照群と比較して継続的に増加した。図１Ｂに示すとおり、７００個のモノクローナル抗体を抜き出し、ＥＬＩＳＡアッセイにより試験し、ＥＬＩＳＡの結果が対照群の２倍を超えたクローンを、陽性クローンとして選択した。１５０個の陽性クローンの配列解析を実施した。比較およびアラインメント解析後、より多くの反復を有するものが、より強力な抗体結合親和性を有するということに基づいて、有効な富化配列を決定した。本発明において選択した陽性クローンは、１５０個のクローン配列中で８４回繰り返されていることから、より高い親和性を有する。
【００２８】
選択した陽性クローンの配列を決定したところ、選択した陽性クローンの核酸配列は、配列番号３だった。
【実施例２】
【００２９】
単鎖抗体の精製および生化学的特性の検出
【００３０】
１．材料：
（１）Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ染料を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。（２）ｐＦＵＳＥ発現ベクターｐＦＵＳＥ−ｈＩＧｇ１−ＦＣ２、カタログＮｏ．ｐｆｕｓｅ−ｈｇ１ｆｃ２を、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社から購入した。（３）ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムを、ＧＥ社から購入した。（４）ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１００タンパク質精製装置を、ＧＥ社から購入した。（５）リアルタイム定量ＰＣＲ機器を、ＢｉｏＲａｄ社から購入した。（６）プラスミド抽出キットを、Ｑｉａｇｅｎ社から購入した。（７）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙキット、Ｐｉｅｒｃｅ社  ＃  ２３２５３）。（８）ＢａｍＨ１およびＢｇＩＩＩ制限酵素を、ＮＥＢ社から購入した。
【００３１】
２．方法：
実施例１で得られた陽性配列（すなわち配列番号３）を、遺伝子合成法（Ｎａｎｊｉｎｇ  ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｌｔｄ．社）により合成し、ＢａｍＨ１およびＢｇＩＩＩの制限部位を配列の両端に付加した。得られた核酸配列を、ＮＥＢ社の取扱説明書に記載の手順を参照にして、制限部位のＢａｍＨ１およびＢｇＩＩＩにおける酵素消化後、ｐＦＵＳＥ−ｈＩＧｇ１−ＦＣ２発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、取扱説明書に記載の手順を参照した）内に挿入し、Ｆｃセグメントを有する単鎖抗体である抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃの真核生物抗体発現プラスミドを得た。２９３フェクチン（Ｆｅｃｔｉｎ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号１２３４７５００）を、真核生物抗体発現プラスミドと、３０マイクロリットル：１５マイクログラムの体積質量比で混合した。得られた混合物を、３０ｍＬの２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手可能）に添加し、１２００ｒｐｍおよび３７℃で振盪しながら一晩インキュベートした。遠心分離後に上清を収集し、抗体タンパク質（抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ）を、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１００タンパク質精製装置上でＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラムを使用して精製した。最後に、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃２３２５２）を、取扱説明書に記載の手順を参照して使用することにより、抗体濃度を試験した。
【００３２】
精製抗体をウェスタンブロットにより試験した：５マイクログラムの精製抗体試料を、１１０Ｖの電気泳動電圧を用いて６０分間のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動のためにロードし、酢酸セルロース膜に移し、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗ヒト二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とハイブリダイズさせた。膜をすすぎ、次に、発色試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、カタログ＃３５０５５）を可視化のために添加した。
【００３３】
精製抗体を、以下の工程を伴う熱安定性試験に供した。すなわち、精製抗体を０．１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ染料を１：２０００の体積比で添加して密封し、２５℃から９０℃まで、１分当たり０．５℃の加熱プログラムを用いたリアルタイム定量ＰＣＲ機器（ＢｉｏＲａｄ社）上にロードし、そして蛍光値を検出する。
【００３４】
精製抗体をＬＣ−ＭＳ質量分析により、以下の工程を用いて試験した。すなわち、５マイクログラムの精製抗体を、１マイクロリットルのＰＮＧａｓｅ酵素（ＮＥＢ  Ｉｎｃ．社から入手可能、カタログＮｏ．Ｐ０７０９Ｓ）と３７℃で１時間混合し、そして高分解能質量分析のためにＡｇｉｌｅｎｔ  ６２３０  ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳ機器上にロードする。
【００３５】
３．結果：
実施例１で得られた核酸配列（配列番号：３）を、酵素消化後に、ｐＦＵＳＥ−ｈＩＧｇ１−ＦＣ２発現ベクター内に挿入し、Ｆｃ領域を含有するｓｃＦｖ  ＩＩ  ＤＮＡ配列（配列番号４）を得た。ｓｃＦｖ  ＩＩ  ＤＮＡ配列は、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト単鎖抗体（抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ、配列番号６）、すなわち、コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体をコード可能であり、これは、図２Ａに示すｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を有する組換え免疫グロブリンであり、ｓｃＦｖは重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単鎖抗体を指し、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で表され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２で表され、重鎖ＣＤＲ３領域の配列はＤＦＳＷＲＧＹＹＭＤＶであり、軽鎖ＣＤＲ３領域の配列はＱＱＹＧＳＳＰＲＴであり、Ｆｃは定常領域を指す。定常領域は、ＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む。コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体は、コネキシン２６の細胞外領域の４１位〜７５位のアミノ酸部分を特異的に認識する。
【００３６】
ウェスタンブロットの結果を図２Ｂに示す。５８ｋｄにおける明らかなバンドは、抗体がＣｘ２６タンパク質を特異的に認識できることを示す。図２Ｃに示すとおり、熱安定性試験結果を使用して算出された抗体のＴｍは６５℃であり、したがって、本明細書に記載の抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体は、高い安定性を有する。図２Ｄに示すＬＣ−ＭＳの質量分析結果は、抗体の分子量が１０５１４０ダルトンであることを示す。
【実施例３】
【００３７】
コネキシン２６に対する単鎖抗体の結合を試験するためのＥＬＩＳＡアッセイ
【００３８】
１．材料：
１．ＣＢＳ抗原固定溶液を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。２．抗ヒトＦｃ  ＨＲＰ二次抗体を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。３．発色基質ＡＢＳＴ溶液を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。４．９６ウェル平底プレートを、Ｃｏｒｎｉｎｇ社から購入した。
【００３９】
２．方法：
１ウェル当たり５０μｌのＣｘ２６ポリペプチド抗原（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により合成、ＣＢＳ抗原固定溶液を用いて希釈、配列番号５）および１ウェル当たり０．０５μｇの抗原を９６ウェルプレートに添加し、一晩４℃でインキュベートし、次に、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳを用いて９６ウェルプレートを３回すすぎ、５％のミルクを含有するＰＢＳＴ溶液を用いて３７℃で６０分間ブロッキングし、ＰＢＳを用いて３回すすいだ。実施例２で得られた抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体を添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。９６ウェルプレートをすすいで乾燥させたのち、抗ヒトＦｃ二次抗体をそこに添加し、３０分間振盪しながら室温でインキュベートした。ＰＢＳを用いて９６ウェルプレートを３回すすぎ、発色基質を添加し、最終的にマイクロプレートリーダーを用いて読み取った。
【００４０】
３．結果：
図３Ａに示すとおり、陰性対照ウェルのＯＤ値は０．２未満であり、陽性ウェルのＯＤ値は０．４を超えた。ＥＬＩＳＡの結果に基づき、１５０個の陽性コロニーウェルを選択した。
【実施例４】
【００４１】
ＳＲＰによる単鎖抗体およびコネキシン２６の結合の検出
【００４２】
１．材料：
１．Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器およびその検出チップ（ＣＭ５チップ）を、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から購入した。２．抗ヒトＩｇＧ抗体を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
【００４３】
２．実験方法：
抗体および抗原の親和性および動態を、マルチサイクルカイネティクス法により検出した。抗体の固定化を捕捉法により実施した。まず、抗ヒトＩｇＧ抗体をＣＭ５チップと結合し、次に、段階希釈した後に、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体試料をチップ表面全体に流した。次に、結合した抗ヒトＦｃ抗体により、検出される抗体を捕捉した。次に、ポリペプチド抗原（Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ社により合成、配列：配列番号５）を添加し、シグナルを検出しおよび記録した。最後に、ＣＭ５チップ表面上の抗体および抗原試料を、再生試薬（グリシン溶液、ｐＨ１．７）により、試験の新規ラウンドのために溶出した。
【００４４】
３．結果：
図３Ｂに示すとおり、抗体とコネキシン２６との間の相互作用のＳＲＰ検出は、Ｃｘ２６を伴う抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体のＫＤが、７．３×１０−８Ｍであることを示した。
【実施例５】
【００４５】
抗体により特異的に認識されるＣｘ２６タンパク質の細胞免疫蛍光検出
【００４６】
１．材料：
（1）ＨｅＬａ  ＤＨ細胞を、Ｓｉｇｍａ社から購入した。（２）Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰレポータープラスミド、カタログＮｏ．６９０１６を、Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入した。（３）蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ヒトを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。（４）蛍光共焦点顕微鏡を、Ｌｅｉｃａ社から購入した。
【００４７】
２．方法：
Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰプラスミドを、取扱説明書に記載の手順を参照して２９３フェクチン（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて、ＨｅＬａ  ＤＨ細胞内にトランスフェクトした。プラスミドＣｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰは、ヒトＣｘ２６タンパク質を、細胞膜上に緑色蛍光を伴って発現することができる。２％のホルマリンを用いて固定後、細胞を、室温で１０分間維持した。すすいだのち、細胞を、ＰＢＳ中２％のＢＳＡを用いて３０分間ブロッキングし、次に、１ｍｇ／ｍＬの抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体溶液を１％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１：５００の希釈率で希釈することにより得られた、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体溶液中で、４から５時間インキュベートした。すすいだ後、細胞に、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ溶液中１：１０００の希釈率で希釈された蛍光Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ抗ヒト二次抗体を添加した。細胞を、室温で６０分間インキュベートし、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、５分間インキュベートし、すすぎ、共焦点レーザー走査顕微鏡上にマウントし、検出した。
【００４８】
３．結果：
図４に示すとおり、抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体は、両方のＣｘ２６−ＧＦＰタンパク質と共局在化した。
【実施例６】
【００４９】
抗体により阻害されるＣｘ２６ヘミチャネル活性のパッチクランプ法による検出
【００５０】
１．材料：
（１）ＨｅＬａ  ＤＨ細胞を、Ｓｉｇｍａ社から購入した。（２）Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰレポータープラスミド、カタログＮｏ．６９０１６を、Ａｄｄｇｅｎｅ社から購入した。（３）自動パッチクランプシステムを、米国ＭＤＣ社から購入した。
【００５１】
２．方法：
２９３フェクチン（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用い、取扱説明書に記載の手順を参照して、Ｃｘ２６−Ｖｅｎｕｓ−ＹＦＰプラスミドをＨｅＬａ  ＤＨ細胞内にトランスフェクトした。ホールセルパッチクランプを、単一膜イオン電流を記録するために使用した。９４０ｎＭの抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃ抗体を細胞の上清中に添加し、さらに陽性対照群には１００μＭのＺｎ２＋を添加し、ブランク対照群には抗体を添加しなかった。細胞が脱分極するように電圧を４０ミリボルトまで増加したところ、Ｃｘ２６ヘミチャネルの開口をもたらした。抗体を添加した実験群、陽性対照群およびブランク対照群のヘミチャネル電流を記録した。細胞を過分極させるように電圧を−４０ミリボルトまで減少させ、同時に、各群のヘミチャネル電流を記録した。
【００５２】
３．結果：
図５に示すとおり、抗体抗Ｃｘ２６−ｓｃＦｖＩＩ−Ｆｃは、Ｃｘ２６ヘミチャネル活性を効果的に阻害した。これは、非特異的阻害剤Ｚｎ２＋よりも１００倍高い。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号１：  ヒト抗体の重鎖可変領域
配列番号２：  ヒト抗体の軽鎖可変領域
配列番号３：  コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体
配列番号４：  コネキシン２６特異的阻害性の完全ヒト抗体
配列番号５：  抗原ポリペプチド
配列番号６：  完全ヒト単鎖抗体
【国際調査報告】
2019504829.tif 000013
2019504829.tif 000014
2019504829.tif 000015
2019504829.tif 000016
2019504829.tif 000017
2019504829.tif 000018