(57)【要約】  本発明は、眼および／または角膜外植片へのヒト白血球抗原Ｇの送達のためのベクター、および、角膜移植拒絶反応および免疫応答および／または血管新生と関連する他の障害の治療および／または予防のためにそれを用いる方法に関する。【選択図】  図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）をコードするポリヌクレオチドであって、
前記ヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている、
ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ｇ１および／またはＨＬＡ−Ｇ５をコードする、
ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列または機能性ＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードするそれらのフラグメントを含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列または機能性ＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードするそれらのフラグメントを含む、
ポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、
発現カセット。
【請求項６】
請求項５の発現カセットであって、
前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ｇ１をコードする、
発現カセット。
【請求項７】
請求項５の発現カセットであって、
前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ｇ５をコードする、
発現カセット。
【請求項８】
請求項５の発現カセットであって、
前記発現カセットは、ＨＬＡ−Ｇ１をコードするポリヌクレオチドおよびＨＬＡ−Ｇ５をコードするポリヌクレオチドを含む、
発現カセット。
【請求項９】
請求項５の発現カセットであって、
ＨＬＡ−Ｇをコードする前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ５を二者択一的に発現する単一のオープンリーディングフレームである、
発現カセット。
【請求項１０】
請求項５から９のいずれか一項の発現カセットであって、
前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドは、請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチドである、
発現カセット。
【請求項１１】
請求項５から１０のいずれか一項の発現カセットであって、
前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、プロモーターに動作可能に連結されている、
発現カセット。
【請求項１２】
請求項５から１１のいずれか一項の発現カセットであって、
前記の少なくとも１つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、ポリアデニル化シグナルに動作可能に連結されている、
発現カセット。
【請求項１３】
請求項５から１２のいずれか一項の発現カセットであって、
少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端配列（ＩＴＲ）をさらに含む、
発現カセット。
【請求項１４】
請求項１３の発現カセットであって、
前記発現カセットは、２つのＡＡＶ  ＩＴＲを含む、
発現カセット。
【請求項１５】
請求項１４の発現カセットであって、
前記の２つのＡＡＶ  ＩＴＲは、同一のヌクレオチド配列を有する、
発現カセット。
【請求項１６】
請求項１４の発現カセットであって、
前記の２つのＡＡＶ  ＩＴＲは、異なるヌクレオチド配列を有する、
発現カセット。
【請求項１７】
請求項１３から１６のいずれか一項の発現カセットであって、
前記ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲである、
発現カセット。
【請求項１８】
請求項５から１７のいずれか一項の発現カセットであって、
前記発現カセットは、自己相補ＡＡＶゲノムである、
発現カセット。
【請求項１９】
請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチドまたは請求項５から１８のいずれか一項の発現カセットを含む、
ベクター。
【請求項２０】
請求項１９のベクターであって、
ウイルスベクターである、
ベクター。
【請求項２１】
請求項２０のベクターであって、
ＡＡＶベクターである、
ベクター。
【請求項２２】
請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項５から１８のいずれか一項の発現カセット、および／または、請求項１９から２１のいずれか一項のベクターを含む、
形質転換された細胞。
【請求項２３】
請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項５から１８のいずれか一項の発現カセット、請求項１９から２１のいずれか一項のベクター、および／または請求項２２の形質転換された細胞を含む、
トランスジェニック動物。
【請求項２４】
請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチドまたは請求項５から１８のいずれか一項の発現カセットを含む、
組み換えＡＡＶ粒子。
【請求項２５】
請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項５から１８のいずれか一項の発現カセット、請求項１９から２１のいずれか一項のベクター、請求項２２の形質転換された細胞、および／または請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子および薬学的に許容できる担体を含む、
医薬組成物。
【請求項２６】
組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法であって、
ＡＡＶ複製を許容する細胞に：
（ａ）（ｉ）請求項１から４のいずれか一項のポリヌクレオチドまたは請求項５から１８のいずれか一項の発現カセット、および（ｉｉ）逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む、組み換えＡＡＶテンプレート；および
（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチドを；
前記組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で提供するステップを含み；
それにより、前記細胞において組み換えＡＡＶ粒子が生産される、
方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、
前記のＲｅｐコード配列およびＣａｐコード配列は、前記組み換えＡＡＶ粒子へパッケージされることができない、
方法。
【請求項２８】
請求項２６または２７の方法であって、
前記のＲｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、プラスミドによって提供される、
方法。
【請求項２９】
請求項２６または２７の方法であって、
前記のＲｅｐコード配列および／またはＣａｐコード配列は、ウイルスベクターによって提供される、
方法。
【請求項３０】
請求項２９の方法であって、
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターからなる群より選択される、
方法。
【請求項３１】
請求項２６から３０のいずれかの方法であって、
前記Ｒｅｐコード配列は、前記細胞内に安定して組み込まれる、
方法。
【請求項３２】
請求項２６から３０のいずれかの方法であって、
前記Ｃａｐコード配列は、前記細胞内に安定して組み込まれる、
方法。
【請求項３３】
請求項２６から３２のいずれかの方法であって、
前記組み換えＡＡＶテンプレートは、プラスミドまたはウイルスベクターによって提供されて、または、プロウイルスとして前記細胞内に安定して組み込まれる、
方法。
【請求項３４】
細胞においてＨＬＡ−Ｇを発現する方法であって、
前記細胞を、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物と接触させるステップを含み、
それにより、前記細胞においてＨＬＡ−Ｇを発現する、
方法。
【請求項３５】
請求項３４の方法であって、
ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方が、前記細胞において発現される、
方法。
【請求項３６】
ＨＬＡ−Ｇを角膜外植片に送達する方法であって、
前記角膜外植片を、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物と接触させるステップを含み、
それにより、ＨＬＡ−Ｇを前記角膜外植片に送達する、
方法。
【請求項３７】
哺乳類の対象における移植後の角膜外植片の拒絶を阻害する方法であって、
前記角膜外植片を、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物と接触させるステップを含み、
それにより、移植後の前記角膜外植片の拒絶を阻害する、
方法。
【請求項３８】
請求項３７の方法であって、
前記移植は、同種異系移植である、
方法。
【請求項３９】
請求項３７の方法であって、
前記移植は、異種移植である、
方法。
【請求項４０】
請求項３７から３９のいずれか一項の方法であって、
前記角膜外植片は、移植前に、前記組み換えＡＡＶ粒子または前記医薬組成物と接触される、
方法。
【請求項４１】
請求項３７から３９のいずれか一項の方法であって、
前記角膜外植片は、移植中および／または移植後に、前記組み換えＡＡＶ粒子または前記医薬組成物と接触される、
方法。
【請求項４２】
請求項３６から４１のいずれか一項の方法であって、
ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方が、前記角膜外植片において発現される、
方法。
【請求項４３】
請求項３６から４２のいずれか一項の方法であって、
前記組み換えＡＡＶ粒子または前記医薬組成物は、前記角膜外植片に注入される、
方法。
【請求項４４】
請求項３６から４２のいずれか一項の方法であって、
前記組み換えＡＡＶ粒子または前記医薬組成物は、前記角膜外植片とともにインキュベートされる、
方法。
【請求項４５】
哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する方法であって、
前記の哺乳類の対象の眼に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物と接触された細胞を投与するステップを含み、
それにより、前記の哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する、
方法。
【請求項４６】
請求項４５の方法であって、
前記細胞は、幹細胞である、
方法。
【請求項４７】
請求項４６の方法であって、
前記細胞は、間葉系幹細胞である、
方法。
【請求項４８】
哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する方法であって、
前記の哺乳類の対象の眼に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物を投与するステップを含み、
それにより、前記の哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する、
方法。
【請求項４９】
請求項４５から４８のいずれか一項の方法であって、
ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方が、前記眼において発現される、
方法。
【請求項５０】
それを必要とする哺乳類の対象において、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する方法であって、
前記の哺乳類の対象の眼に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物と接触された細胞を投与するステップを含み、
それにより、免疫応答および／または血管新生と関連する前記眼障害を治療する、
方法。
【請求項５１】
請求項５０の方法であって、
前記細胞は、幹細胞である、
方法。
【請求項５２】
請求項５１の方法であって、
前記細胞は、間葉系幹細胞である、
方法。
【請求項５３】
それを必要とする哺乳類の対象において、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する方法であって、
前記の哺乳類の対象の眼に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物を投与するステップを含み、
それにより、免疫応答および／または血管新生と関連する前記眼障害を治療する、
方法。
【請求項５４】
請求項５０から５３のいずれか一項の方法であって、
ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方が、前記眼において発現される、
方法。
【請求項５５】
請求項４５から５４のいずれか一項の方法であって、
前記対象は、ヒト対象である、
方法。
【請求項５６】
請求項４５から５５のいずれか一項の方法であって、
前記のＡＡＶ粒子または医薬組成物は、基質内、局所、硝子体内、前房内、結膜下、網膜下、強膜上、強膜内、眼周囲、脈絡膜上、眼球後、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される経路によって投与される、
方法。
【請求項５７】
請求項４８から５６のいずれか一項の方法であって、
免疫応答と関連する前記眼障害は、移植拒絶反応、免疫介在性ドライアイ、アレルギー性結膜炎、または免疫介在性ブドウ膜炎である、
方法。
【請求項５８】
請求項４８から５６のいずれか一項の方法であって、
血管新生と関連する前記眼障害は、角膜外傷、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、後眼における血管新生、脈絡膜血管新生、または血管新生緑内障である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の陳述］
本出願は、２０１６年７月２６日に出願された米国仮出願番号６２／３６６，８２２の利益を主張し、その内容全体は、本明細書において参照により援用される。
【０００２】
［政府支援の陳述］
本発明は、国立衛生研究所により授けられた助成金番号ＡＩ０７２１７６およびＡＲ０６４３６９の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
【０００３】
［本発明の分野］
本発明は、眼および／または角膜外植片へのヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）の送達のためのベクター、および、角膜移植拒絶反応および免疫応答および／または血管新生と関連する他の障害の治療および／または予防のためにそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
［本発明の背景］
失明を治療するための角膜移植は、世界中の組織移植の最も一般的な形態であり、米国だけでおよそ４７，０００の発生がある。リスクの低い患者では、２年後の移植拒絶反応はおよそ１５％であり、その成功は相対的に健康な角膜における血管新生の欠如に主に起因する。対照的に、ハイリスクの角膜移植は、たった２年後に警戒すべき５０〜７０％の拒絶率を示し、重度の角膜疾患を有する多くの患者は、その処置の候補として考えられない。これらのハイリスクの場合は、大量の前から存在する角膜血管新生および／または以前の移植を有すると定義される。現行の治療は、低いレベルの成功および重大な有害の副作用を示す局所的および全身的コルチコステロイドに部分的に頼る。
【０００５】
眼は、免疫特権部位であると広く考えられていて、その指定は角膜を含む。角膜の免疫特権状態は、血液と眼のバリア、角膜リンパ系および血管系の欠如、角膜細胞上のＦａｓリガンドの発現、角膜細胞上の腫瘍組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子の低い発現、角膜中央におけるほとんど成熟していない（ｆｅｗ  ｍａｔｕｒｅ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）、眼房水および涙液膜内の免疫調節性因子の存在（例えば、αメラニン形成細胞刺激ホルモンおよび形質転換増殖因子β）、および、前房関連の免疫偏向の現象を含む、いくつかのメカニズムによって維持される。角膜移植は、角膜の免疫特権の任意の構成要素の喪失がある場合は、拒絶に関してハイリスクで考えられて、眼の炎症、感染、外傷、およびその後の血管新生を引き起こし得る。
【０００６】
角膜移植片拒絶は、外科的処置後、数週間以内に発生して、上皮または内皮の拒絶ライン、間質拒絶バンド、角膜の厚さの増大、および前区炎症（角膜後面沈着物、房水フレア、および細胞）によって臨床的に現れる。この急性の移植片拒絶によって、ドナーＡＰＣの表面上のドナーＭＨＣ分子（クラスＩおよびＩＩ）が宿主レシピエントＴ細胞によって直接認識されて迅速なエフェクター炎症をもたらし、移植片拒絶に関する直接のパスウェイとして説明されている。移植が増大してドナーＡＰＣがドナー組織の外に移行した後には、このタイプの拒絶が発生する可能性はより低くなる。しかしながら慢性的に、移植の失敗は、ドナーＭＨＣ分子が取り込まれてレシピエントＭＨＣ分子によってレシピエントＴ細胞に提示されるときにも生じ得て、求心性の免疫応答を開始して、それは、移植片拒絶の間接的なパスウェイと呼ばれる。したがって、ＭＨＣアロ抗原のレシピエントＴ細胞認識が、角膜の移植片拒絶において重要な役割を果たす。
【０００７】
ドナークラスＩ抗原（上皮、間質、および内皮細胞のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ）は、宿主細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）によって認識されて、一方で、ＡＰＣ（例えば、リンパ球、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、および間質樹状細胞）によって提示されるドナークラスＩＩ抗原は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）によって認識されて、それは、活性化されると、ケモカイン、サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、マクロファージ活性化因子、遊走阻害因子）、および、一酸化窒素、スーパーオキシドラジカル、および腫瘍壊死因子α）を含む毒性分子を上方制御して、それぞれ、角膜同種移植片を損傷させる。これらのサイトカインおよびケモカインは、クラスＩＩ抗原のさらなる発現によって炎症を高める。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、外来抗原を保有する細胞を直接攻撃する一次エフェクター細胞である。適応性の免疫応答に加えて、先天性免疫応答のＮＫ細胞およびマクロファージもまた、角膜移植片拒絶において役割を果たす。角膜移植片の長期生存は、Ｆｏｘｐ３＋の発現が高いＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋制御性Ｔ細胞の発達に依存し、Ｔ細胞の激増の抑制に効果的である。
【０００８】
ＣＴＬによる直接的な認識および溶解の他に、角膜移植片拒絶における間接的であるが別の一次ファクターは、レシピエント角膜における血管新生およびリンパ管であり；そのいずれかの存在は、角膜免疫特権を消滅させる。臨床的には、拒絶の最初の位置は、宿主血管新生に最も近い角膜移植片の縁であることが観察されている。血液およびリンパ管は、末梢免疫系およびリンパ節へのアロ抗原（血管）またはＡＰＣ（リンパ）の退出のための直接的な経路を提供することによって、および、角膜同種移植片への循環するエフェクター免疫細胞およびアロ抗原特異的Ｔ細胞の遊走を促進することによっても、移植片拒絶を高めて、拒絶を開始させる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、角膜外植片および眼におけるＨＬＡ−Ｇの発現のためのベクター、および、角膜移植拒絶反応および免疫応答および／または血管新生と関連する他の眼障害を治療および／または予防するための方法を提供することによって、当該分野における短所を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）の遺伝子送達を介した外来組織に対する免疫寛容の体の自然な方法を模倣した概念に基づく。ＨＬＡ−Ｇの可溶性および膜貫通の形態の両方とも、母体／胎児の界面で発現されて、外来抗原を発現する胎児の拒絶を防止する。ＨＬＡ−Ｇの効果は多レベルであり、抗血管新生、および、Ｔ細胞および抗原提示細胞との直接的な相互作用を含む。
【００１１】
角膜におけるＨＬＡ−Ｇ発現は、ＮＫ細胞、エフェクター細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔ細胞激増、およびドナー抗原の提示を阻害するその能力を通して、ドナー角膜移植片抗原の寛容を部分的に改善し得る。ＨＬＡ−ＧがＣＴＬを阻害する能力に加えて、膜貫通および可溶型のＨＬＡ−Ｇは、血管新生を阻害して、内皮細胞のアポトーシスを引き起こす。したがって、ＨＬＡ−Ｇ発現は、角膜血管新生の予防／減少を通して間接的に、および／または、ＣＴＬ不活性化を介して直接的に、角膜移植片の寛容を改善し得る。
【００１２】
角膜外植片および眼においてＨＬＡ−Ｇが血管新生を阻害して免疫応答を抑制する能力は、移植拒絶反応および免疫応答および／または血管新生と関連する他の眼障害の治療および／または予防をもたらす。
【００１３】
したがって、本発明の一態様は、ＨＬＡ−Ｇをコードするポリヌクレオチドに関し、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。
【００１４】
本発明の別態様は、本発明の核酸を含むＡＡＶベクターゲノム、ＡＡＶベクターゲノムを含むＡＡＶ粒子、およびＡＡＶ粒子を含む医薬組成物に関する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、ＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセット、および、それを含むベクター、ウイルス粒子、細胞、トランスジェニック動物、および医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、組み換えＡＡＶ粒子を生産する方法に関し、ＡＡＶ複製を許容する細胞に：（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）逆位末端配列（ＩＴＲ）を含む、組み換えＡＡＶテンプレート；および（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチドを；組み換えＡＡＶテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えＡＡＶ粒子が生産される。
【００１７】
本発明の別態様は、細胞にＨＬＡ−Ｇを送達する方法に関し、細胞を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより、細胞にＨＬＡ−Ｇを送達する。
【００１８】
本発明の別態様は、細胞においてＨＬＡ−Ｇを発現する方法に関し、細胞を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより、細胞においてＨＬＡ−Ｇを発現する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、ＨＬＡ−Ｇを角膜外植片に送達する方法に関し、角膜外植片を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより、角膜外植片にＨＬＡ−Ｇを送達する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象における移植後の角膜外植片の拒絶を阻害する方法に関し、角膜外植片を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み（例えば、移植前、移植中、および／または移植後）、それにより、移植後の角膜外植片の拒絶を阻害する。
【００２１】
本発明の別態様は、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与／送達する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する。
【００２２】
本発明の別態様は、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与／送達する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象（例えば、それを必要としている対象）において、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触された細胞（例えば、それを含む細胞）を投与／送達するステップを含み、それにより、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する。
【００２５】
本発明のこれらの態様および他の態様は、以下の本発明の説明において、より詳細に示される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ−１Ｃ】インビトロでのｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇの特徴を示す。Ａ）自己相補ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇベクターカセットの漫画。Ｂ）ウエスタンブロットによる、２９３細胞におけるｏｐｔＨＬＡ−Ｇアイソフォーム生産の確認。ＪＥＧ−３細胞は胎盤細胞であり、ポジティブコントロールとしての役割を果たす。ウエスタンブロット画像は、縁が切り落とされていて、これらのデータを簡潔に表すために並べられていて、全長ブロットは図１１に提供される。Ｃ）示されたｃＤＮＡによる２９３細胞のトランスフェクション後に同一の曝露時間で撮像された、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇアイソフォームのジアミノベンジジン染色。ＩＴＲ＝逆位末端配列。
【図２Ａ−２Ｂ】ＷＴまたはコドン最適化ｃＤＮＡ由来の、ＨＬＡ−Ｇの多さの比較を示す。Ａ）ＷＴ  ＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡまたはコドン最適化ＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡを含む同一のプラスミドのコンテキストを、別個の２９３細胞トランスフェクションにおいて用いた。溶解物をトランスフェクションの３日後に回収して、示されたタンパク質に関してウエスタンブロットによって分析した。Ｂ）Ａに示されたデータのウエスタンブロット濃度測定に基づく定量化。Ｏｐｔ＝コドン最適化、ＯＲＦ＝オープンリーディングフレーム。
【図３】ＡＡＶ−ＨＬＡ−Ｇが、ヒト細胞において抗血管新生機能を有することを示す。
【図４】抗血管新生のモデルとしての内皮管アッセイにおけるＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５発現の効果を示す。
【図５Ａ−５Ｃ】ｓｃＡＡＶ８Ｇ９が、ウサギ角膜において遺伝子送達を仲介することを示す。Ａ）ウサギ角膜間質への５０μｌのベクター注入は、一過的に角膜曇りを引き起こす。Ｂ）注入によって覆われた角膜の領域の定量化。Ｃ）ＧＦＰ発現の強度を表わす代表的なインビボ画像、および、示された時点における示された注入剤のＧＦＰ強度の定量化（Ｐ＜．０００９）。Ｐ．Ｉ．＝注入後、ｓｃ＝自己相補。
【図６Ａ−６Ｂ】ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが、熱傷によって誘導される角膜血管新生を防ぐことを示す。ウサギ角膜を、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏ（１：１比のアイソフォーム１および５）の角膜基質内注入の７日前に、中心的に焼いた。Ａ）示されたベクターによる注入の４２日後の、処置された角膜の血管新生トレーシングの血管新生に沿った画像を表わす代表的なインビボ画像。Ｂ）角膜熱傷の直後（０日目）、示されたベクターの注入の３日後（１０日目）、および、最後の実験時点（５６日目）の、トレースされた血管新生の領域の定量化（１０日目でＰ＜．００１および５６日目でＰ＜．００２）。ｓｃ＝自己相補。
【図７Ａ−７Ｃ】熱傷によって誘導される角膜血管新生分析およびインビボ画像の定量化を示す。中心的に焼かれたウサギ角膜は、損傷を誘導した７日後に、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏのいずれかの基質内注入が与えられた。Ａ−Ｃ）血管内部成長の領域全体を定量化するための、示された時点における示されたベクターにより処置された角膜のインビボのライブ画像由来のトレースされた血管新生を表わす代表的な画像。ｓｃ＝自己相補。
【図８Ａ−８Ｂ】ＡＡＶベクター角膜注入後の眼内圧を示す。ウサギ角膜を、生理食塩水、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ、またはｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏ（１：１比のアイソフォーム１および５）の角膜基質内注入の８日前に、中心的に焼いた。Ａ）眼内圧は、注入後の示された日に報告される。Ｂ）角膜中央の厚さは、注入後の示された日に報告される。
【図９Ａ−９Ｂ】ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが、角膜熱傷によって誘導される血管新生および免疫細胞浸潤を防ぐことを示す。ウサギ角膜の切片を、外傷が誘導された角膜への示されたベクターの注入の６０日後に得て、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。Ａ）示されたベクター製剤によって処置された、処理済み切片の代表的な画像。Ｂ）（Ａ）に示された全てのＨ＆Ｅ切片の臨床組織学的試験スコアの定量化（Ｐ＜．０００５）。
【図１０Ａ−１０Ｃ】ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが、角膜熱傷によって誘導される血管新生および細胞傷害性Ｔ細胞浸潤を防ぐことを示す。ウサギ角膜切片を、熱傷角膜への示されたベクターの注入の６０日後に得て、示された処置群における、内皮細胞マーカー（ＣＤ３１）、Ｔ細胞マーカー、および、導入遺伝子の多さに関して染色した。スケールバー＝（Ａ）１０μｍ、（Ｂ）５μｍ、（Ｃ）２０μｍ。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ウエスタンブロット分析を示す。（Ａ）２９３細胞におけるｏｐｔＨＬＡ−Ｇアイソフォーム生産の確認のための、ＨＬＡ−Ｇ、ＧＦＰおよびβアクチン、および、（Ｂ）ＷＴ  ＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡまたはコドン最適化ＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡを含む同一のプラスミドコンテキストのトランスフェクションの３日後に回収された溶解物におけるＨＬＡ−Ｇおよびβアクチン発現に関する、全長ウエスタンブロット画像。ＨＬＡ−Ｇ、ＧＦＰおよびβアクチンに関する予想される標的サイズは、それぞれ、３９ｋＤａ、２７ｋＤａ．および４２ｋＤａである。
【図１２Ａ−１２Ｄ】ＡＡＶ−ＨＬＡ−Ｇが、移植関連の角膜免疫応答を阻害することを示す。Ａ）ウサギにおいて、同種異系角膜移植組織を、ＡＡＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ−ＨＬＡ−Ｇによってエクスビボで処置した。Ｂ）角膜移植拒絶反応は、ＡＡＶ−ＧＦＰによって処置された眼において急速に進行したが、一方で、ＡＡＶ−ＨＬＡ−Ｇによって処置されたものは、８４日を通して拒絶しなかった。Ｃ）拒絶指標スコア。Ｄ）外科的処置の８４日後のインキュベートされたドナー組織の増大したＨＬＡ−Ｇ発現（赤）を示す免疫蛍光。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明はここで、本発明の好ましい実施態様が示される付随する図面に関して説明される。しかしながら、本発明は異なる形態で実現され得て、本明細書中に示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように、そして、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。
【００２８】
別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を持つ。本明細書において、本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の制限を意図しない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。
【００２９】
ヌクレオチド配列は、別段の明確な指示がない限り、本明細書において、一本鎖のみによって、５’から３’の方向で、左から右に示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７  ＣＦＲ  §１．８２２および確立された使用に従って表される。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ，９９−１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（米国特許商標庁）を参照。
【００３０】
別段の指示がされる場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えパルボウイルスおよびＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現するパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために、用いられ得る。そのような技術は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。
【００３１】
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書中に示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討する。
【００３２】
さらに説明すると、仮に、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択され得ることを示す場合、この言い回しは、あたかもそれぞれのそのようなサブコンビネーションが本明細書中に明示的に示されるかのように、アミノ酸は、これらのアミノ酸（単数または複数）の任意のサブセット、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから選択され得ることも示す。さらに、そのような言い回しは、規定のアミノ酸の１つまたは複数が否認され得ることも示す。例えば、特定の実施態様では、アミノ酸は、あたかもそれぞれのそのようなあり得る否認が本明細書中に明示的に示されるかのように、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない；などである。
【００３３】
定義
以下の用語は、本明細書中の説明および添付される特許請求の範囲において用いられる。
【００３４】
単数形「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形も同様に含むことが意図される。
【００３５】
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、投与量、時間、温度などの量のような測定可能な値を指す場合は、規定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または実に０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３６】
また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある挙げられた項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、代替（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
【００３７】
本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲に記載された発明（例えば、ｒＡＡＶ複製）の、列挙された材料またはステップ、「および、基礎的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきでない。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（および文法上の変形）は、列挙された配列（例えば、配列番号）、および、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないように列挙された配列の５’および／または３’またはＮ末端および／またはＣ末端上の合計で１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の両方からなる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計で１０個以下のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸は、さらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の合計数を両末端上に合わせて含む。本発明のポリヌクレオチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して少なくとも約５０％以上の、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。本発明のポリペプチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリペプチドの活性と比較して少なくとも約５０％以上の、酵素活性の増大または低減を指す。
【００３９】
本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。
【００４０】
ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。
【００４１】
本明細書において用いられる用語「アデノ付随ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くの相対的に新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３−：３７５；および表１を参照）。
【００４２】
本発明のパルボウイルスベクター、粒子およびゲノムは、限定されないが、ＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３−：３７５−３８３；Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および、米国特許第６，１５６，３０３号も参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３  ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６），「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州によって提供される（その全体で本明細書中に援用される）。
【００４３】
本明細書において用いられる用語「向性」は、細胞へのウイルスの侵入を指し、任意選択で、および好ましくは、細胞においてウイルスゲノムによって保有される配列の発現（例えば、転写、および任意選択で、翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。ＡＡＶの場合は、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス、非組込みのエピソーム、ならびに、ウイルスが細胞内で取り得る任意の他の形態由来であってよい。
2019521688.tif 000003
【００４４】
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶによる細胞の「形質導入」は、パルボウイルス／ＡＡＶが介在する細胞中への遺伝物質の移行を指す。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第３版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。
【００４５】
用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。
【００４６】
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【００４７】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよく、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかであってよい。
【００４８】
本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
【００４９】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
【００５０】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
【００５１】
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。
【００５２】
アミノ酸配列同一性の値のパーセンテージは、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視する）。
【００５３】
同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
【００５４】
アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセンテージの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な発現に割り当てられない。
【００５５】
一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算に関して以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。
【００５６】
本明細書において用いられる「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素またはポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリヌクレオチドを意味する。
【００５７】
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。
【００５８】
「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象内のタンパク質の不存在または欠陥に起因する症候を緩和または低減し得るポリペプチドである。あるいは、「治療的ポリペプチド」は、抗癌効果または移植生存性の改善のような、他の方法で対象に利益を与えるものである。
【００５９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる、本明細書において用いられる用語「改変」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。
【００６０】
本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法上の等価物）によって、ウイルスベクターが、出発原料内の他の構成要素の少なくとも一部から、少なくとも部分的に分離されることを意味する。
【００６１】
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「〜の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ）」（およびそれらの文法上の変形）によって、対象の状態の重症度が低減され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候における一部の軽減、緩和、低減または安定化が達成され、および／または、疾患または障害の進行に遅れがあることを意味する。
【００６２】
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびそれらの文法上の変形）は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の予防および／または遅延、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の重症度の低減を指す。予防は、完全であってよく、例えば、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の全体的な不存在であってよい。また、予防は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発生および／または発症の重症度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも低いような、部分的であってもよい。
【００６３】
本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候に何らかの軽減、緩和、低減、または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。
【００６４】
本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延するのに十分な、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を低減および／または遅延するのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。
【００６５】
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書において相互交換可能に用いられて、ウイルスにおける天然起源でない配列を指す。一部の実施態様では、異種核酸は、ポリペプチドまたは翻訳されていない目的ＲＮＡ（例えば、細胞または対象への送達のため）をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００６６】
本明細書において用いられる用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独、またはプラスミドを指すために用いられてよい。
【００６７】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重のパルボウイルス粒子であってよい（その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムがパッケージされ得る。
【００６８】
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生産するためにシスで１４５塩基のＩＴＲのみを必要とする。全ての他のウイルス配列は不必要であり、トランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、１つまたは複数のＩＴＲ配列のみ保持する。構造的および非構造的タンパク質コード配列は、トランスで提供され得る（例えば、プラスミドのようなベクターから、または、配列をパッケージング細胞内に安定的に組み込むことによって）。本発明の実施態様では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ配列）、任意選択で２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ  ＩＴＲ）を含み、それは典型的に、ベクターゲノムの５’および３’末にあって異種核酸と隣接するが、それに連続している必要はない。ＩＴＲは、同一または互いに異なってよい。
【００６９】
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して逆位末端配列として機能する（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲまたは非ＡＡＶ  ＩＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）のもののような非ＡＡＶ  ＩＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起点として作用するＳＶ４０ヘアピンが、ＩＴＲとして用いられ得て、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＩＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「ダブル−Ｄ配列」のように、部分的または完全に合成であってよい。
【００７０】
パルボウイルスゲノムは、それらの５’および３’末の両方に回文配列を有する。配列の回文性質は、相補塩基対の間の水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成をもたらす。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」形状を採用すると考えられる。例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
【００７１】
「ＡＡＶ逆位末端配列」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、持続性、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。
【００７２】
本発明のウイルスベクターは、さらに、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６１９に記載される「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスキャプシドは、異なるパルボウイルス由来である）であってよい。
【００７３】
さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムのエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。
【００７４】
用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、パルボウイルスウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。
【００７５】
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
【００７６】
「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、少なくともこれらの複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ  Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。
【００７７】
本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。
【００７８】
当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＭＶＭに関しては、ＮＳ−１およびＮＳ−２タンパク質（スプライス変異）は、互いに独立に発現され得る。同様に、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ  ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５を参照）。
【００７９】
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージおよび標的細胞を感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。
【００８０】
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に説明される。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「コドン最適化」は、コード配列内（例えば、野生型配列内、例えば、ＨＬＡ−Ｇに関するコード配列を含む）に通常存在する１つまたは複数のコドンを、同一（同義）アミノ酸に関するコドンによって置換することによって、発現を増大するように最適化されている遺伝子コード配列を指す。この様式において、遺伝子によってコードされるタンパク質は同一であるが、根底となる遺伝子の核酸塩基配列または対応するｍＲＮＡは異なる。一部の実施態様では、最適化は、１つまたは複数のレアコドン（すなわち、特定の種由来の細胞において相対的に稀に生じるｔＲＮＡに関するコドン）を、翻訳の効率を改善するために、より頻繁に生じる同義コドンによって置換する。例えば、ヒトコドン最適化では、コード配列内の１つまたは複数のコドンは、同一アミノ酸に関してヒト細胞においてより頻繁に生じるコドンによって置換される。コドン最適化は、転写および／または翻訳の効率を改善し得る他のメカニズムを通して遺伝子発現を増大することもできる。ストラテジーは、制限されずに、合計ＧＣ含有量（すなわち、コード配列全体におけるグアニンおよびシトシンのパーセント）の増大、ＣｐＧ含有量（すなわち、コード配列におけるＣＧまたはＧＣジヌクレオチドの数）の低減、潜在性のスプライスのドナーまたはアクセプター部位の除去、および／または、コザック配列のようなリボソームエントリー部位の付加または除去を含む。望ましくは、コドン最適化遺伝子は、改善されたタンパク質発現を示し、例えば、それによってコードされるタンパク質は、他の点で同様の細胞において野生型遺伝子によって提供されるタンパク質の発現レベルと比較して、細胞において、検出可能により大きなレベルで発現される。
【００８２】
ＨＬＡ−Ｇを発現するベクター
ＨＬＡ−Ｇが、角膜外植片および眼において血管新生を阻害および免疫応答を抑制する能力は、眼における移植拒絶反応および免疫応答および／または血管新生と関連する他の眼障害の治療および／または予防をもたらす。
【００８３】
本発明の一態様は、ヒト白血球抗原−Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）をコードするポリヌクレオチドに関し、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に関してコドン最適化されている。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、ＨＬＡ−Ｇの膜貫通型（ＨＬＡ−Ｇ１）および／またはＨＬＡ−Ｇの可溶型（ＨＬＡ−Ｇ５）をコードする。一部の実施態様では、核酸は、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列、または、配列番号１または配列番号２と例えば少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の機能性ＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードするそれらのフラグメントを含む。一部の実施態様では、核酸は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列または機能性ＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードするそれらのフラグメントを含む、から本質的になる、またはからなる。本明細書において用いられる機能性ＨＬＡ−Ｇポリペプチドは、全長ＨＬＡ−Ｇの生物学的活性、例えば、免疫抑制および／または抗血管（ａｎｔｉｖａｓｃｕｌａｒ）活性の少なくとも約２５％、５０％、または７５％を保持する全長ＨＬＡ−Ｇポリペプチドの一部である。機能性ＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードするポリヌクレオチドフラグメントは、野生型ヌクレオチド配列のヌクレオチドの隣接および／または非隣接の欠失を含んでよい。
【００８４】
生物における発現を最大化するためにヌクレオチド配列をコドン最適化する方法は、当技術分野でよく知られていて、公共に利用可能なソフトウェアを用いて行なうことができる。ＨＬＡ−Ｇの野生型ヌクレオチド配列は、当技術分野で知られていて、本明細書において配列番号４として記載される。
【００８５】
一部の実施態様では、本発明のコドン最適化配列は、野生型配列と比較してヒト細胞におけるＨＬＡ−Ｇの高い発現、例えば、野生型配列と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、または５倍の発現増大または少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、または３００％の発現強化を提供する。
【００８６】
また、本発明は、ＨＬＡ−Ｇをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現カセットも提供する。特定の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇポリヌクレオチドは、野生型ＨＬＡ−Ｇ配列またはコドン最適化配列である。発現カセットは、ＨＬＡ−Ｇ１をコードするポリヌクレオチド、ＨＬＡ−Ｇ５をコードするポリヌクレオチド、または両方を含んでよい。特定の実施態様では、発現カセットは、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ５を二者択一的に発現する単一のオープンリーディングフレームを含む。二者択一の発現は、示差的スプライシングに起因してよく、例えば、ＨＬＡ−Ｇの膜貫通部分コードするヌクレオチドを取り囲むイントロンのドナー／アクセプター部位の存在などに起因してよい。本来、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５は、ＨＬＡ−Ｇ１のＣ末端における約２５アミノ酸の膜貫通ドメインの前にＨＬＡ−Ｇ５を終結させる、示差的スプライシングによって生産される。この実施態様では、同一のプロモーターからＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５を生産するために、２つの異なるエクソンに対するスプライシングを可能にする制御可能な合成のイントロンが用いられ得る。
【００８７】
発現カセットは、さらなる発現制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはポリアデニル化シグナルをさらに含んでよい。一部の実施態様では、プロモーターは、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターであってよい。他の実施態様では、プロモーターは、組織特異的または好適プロモーターまたは細胞型特異的または好適プロモーターであってよい。一部の実施態様では、プロモーターは、角膜特異的プロモーター、例えば、ケラトカンであってよい。発現カセットが、１つよりも多いＨＬＡ−Ｇオープンリーディングフレームを含む場合は、一部の実施態様では、それぞれのオープンリーディングフレームは、１つまたは複数の発現制御エレメントに動作可能に連結されてよい。他の実施態様では、多数のＨＬＡ−Ｇオープンリーディングフレームが、プロモーターのような単一の発現制御エレメントに動作可能に連結されてよい。
【００８８】
一部の実施態様では、発現ベクターは、ウイルスベクターゲノム、例えば、パルボウイルスベクターゲノム、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムの部分であってよい。特定の実施態様では、発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば、２つのＡＡＶ  ＩＴＲをさらに含む。２つのＩＴＲは、同一のヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有してよい。ＡＡＶ  ＩＴＲは、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２由来であってよい。それぞれのＩＴＲは独立に、野生型配列または改変された配列であってよい。一部の実施態様では、発現カセットは、ＡＡＶゲノム、例えば、自己相補ＡＡＶゲノムである。
【００８９】
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターに関する。適切なベクターは、限定されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルス、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを含んでよい、からなってよい、またはから本質的になってよい。一部の実施態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、パルボウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９ベクターである。ウイルスベクターは、組み換えウイルステンプレートを含む核酸をさらに含んでよく、ここで核酸は、パルボウイルスキャプシドによってキャプシド形成される。本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えパルボウイルス粒子（例えば、組み換えＡＡＶ粒子）をさらに提供する。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、以下にさらに議論される。
【００９０】
特定の実施態様では、ウイルスベクターは、本発明のキャプシドタンパク質の存在に起因して、改変された向性を示す。一実施態様では、パルボウイルスベクターは、角膜および／または眼の別の組織に関して全身性向性を示す。他の実施態様では、パルボウイルスベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、肝臓に関して減少された向性を有する。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターを含む形質転換された細胞に関する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、細胞ゲノムに安定して組み込まれる。
【００９２】
本発明の別態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を含むトランスジェニック動物に関する。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換された細胞を、薬学的に許容できる担体内に含む医薬製剤に関する。
【００９４】
ウイルスベクターを生産する方法
本発明は、ウイルスベクターを生産する方法をさらに提供する。１つの特定の実施態様では、本発明は、組み換えパルボウイルス粒子を生産する方法を提供し、パルボウイルス複製を許容する細胞に：（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）パルボウイルスＩＴＲを含む、組み換えパルボウイルステンプレート；（ｂ）ＲｅｐおよびＣａｐコード配列を含む、ポリヌクレオチドを；組み換えパルボウイルステンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えパルボウイルス粒子が生産される。組み換えパルボウイルステンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、パルボウイルステンプレートの複製およびパルボウイルスキャプシド中へのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、パルボウイルスｒｅｐ配列およびパルボウイルスｃａｐ配列）およびアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施態様では、パルボウイルステンプレートは、２つのパルボウイルスＩＴＲ配列を含み、それは、異種核酸配列に対して５’および３’に位置するが、それに直接的に連続している必要はない。
【００９５】
一部の実施態様では、組み換えパルボウイルステンプレートは、Ｒｅｐによって分解されないＩＴＲを含み、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１において記載される二重のＡＡＶベクターを作る。
【００９６】
パルボウイルステンプレートおよびパルボウイルスｒｅｐおよびｃａｐ配列は、パルボウイルスキャプシド内にパッケージされたパルボウイルステンプレートを含むウイルスベクターが細胞において生産されるような条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含んでよい。ウイルスベクターは、培地から、および／または、細胞を溶解させることによって、回収され得る。
【００９７】
細胞は、パルボウイルスウイルス複製を許容する細胞であってよい。当技術分野で知られている任意の適切な細胞が用いられ得る。特定の実施態様では、細胞は、哺乳類の細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を与えるトランス補完パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であってよい。
【００９８】
パルボウイルス複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコルは、典型的に、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一のプラスミド上に発現する。パルボウイルス複製およびパッケージング配列は、一緒に与えられる必要はないが、そうすることが便利であり得る。パルボウイルスｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。また、ＥＢＶベクターを用いてパルボウイルスｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現してもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであり、さらに、継続的な細胞分裂にわたって高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と指定される染色体外エレメントとして細胞内に安定して組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
【００９９】
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。
【０１００】
典型的に、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲによって隣接されない。
【０１０１】
パルボウイルステンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、パルボウイルステンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２：５０２５は、ＡＡＶ  ＴＲによって隣接されたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載する。ＥＢＶベクターは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述のように、テンプレートを送達するために用いられてもよい。
【０１０２】
別の代表的な実施態様では、パルボウイルステンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施態様では、パルボウイルステンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。
【０１０３】
ウイルス力価を高めるために、生産的なパルボウイルス感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。パルボウイルス複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：１２９５、および、米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号によって説明されるように、効率的なパルボウイルス生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る。
【０１０４】
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または、安定した染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージングされ得ず、例えば、ＩＴＲによって隣接されない。
【０１０５】
当業者は、パルボウイルス複製およびキャプシド配列、および、ヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を、単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよい。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってよい。
【０１０６】
１つの特定の実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、パルボウイルステンプレートをさらに含んでよい。パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはパルボウイルステンプレートは、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入され得る。
【０１０７】
さらなる実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施態様によれば、パルボウイルステンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。
【０１０８】
別の実例となる実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供されて、パルボウイルステンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、パルボウイルステンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
【０１０９】
さらなる例示的な実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。パルボウイルステンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、パルボウイルステンプレートは、パルボウイルス粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
【０１１０】
前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合は、ＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖に埋め込まれて、これらの配列がアデノウイルスキャプシド内にパッケージされ得るように、５’および３’シス配列によって隣接される。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびパルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列がパルボウイルスビリオン内にパッケージされないように、一般に、ＩＴＲによって隣接されない。
【０１１１】
Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１８：７０４−１２）は、アデノウイルスおよびＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含む、キメラヘルパーを記載する。
【０１１２】
また、ヘルペスウイルスが、パルボウイルスパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして用いられてもよい。パルボウイルスＲｅｐタンパク質（単数または複数）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなパルボウイルスベクター生産スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ−２  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプＩ（ＨＳＶ−１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ００／１７３７７。
【０１１３】
さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：１９３５−４３によって説明されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびパルボウイルステンプレートを送達するために、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内で生産され得る。
【０１１４】
ヘルパーウイルスの汚染がないパルボウイルスベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、パルボウイルスおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、パルボウイルスは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから区別され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：９７３）。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠損した複製欠損ヘルパーウイルスが用いられ得る。さらなる代替として、アデノウイルス初期遺伝子発現のみがパルボウイルスのパッケージングを仲介するのに必要とされるので、後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。
【０１１５】
組み換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボで、およびインビボで、細胞にポリヌクレオチドを送達するのに有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳類を含む動物の細胞に核酸を送達または移行するのに有利に用いられ得る。特に、本発明のウイルスベクターは、対象の眼または移植が意図される眼組織、例えば、角膜外植片へ、ＨＬＡ−Ｇをコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用である。
【０１１６】
ＨＬＡ−Ｇをコードするポリヌクレオチドは、適切な制御配列と動作可能に関連され得ることが当業者によって理解される。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御エレメント、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどと動作可能に関連され得る。
【０１１７】
当業者は、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて用いられ得ることを理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が導入された野生型宿主には、転写開始領域が見られないことを意図する。
【０１１８】
特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にネイティブであってよい。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、ＨＬＡ−Ｇポリヌクレオチド配列にネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。
【０１１９】
誘導性の発現制御エレメントは、核酸配列の発現に対して調節を提供することが望ましい適用において典型的に有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、眼特異的または好適（心網膜特異的および角膜特異的を含む）プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。
【０１２０】
ポリヌクレオチド配列が転写されて、それから標的細胞内で翻訳される実施態様において、特異的な開始シグナルは、一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であってよい。
【０１２１】
本発明のウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターであってよい。ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型であってよい。一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施態様では、ＡＡＶベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、一方の血清型由来のキャプシドタンパク質および別の血清型由来のゲノムを有するもの、または、合成のキャプシドタンパク質を有するものである。特定の実施態様では、ベクターは、変更された向性を有するハイブリッドキャプシドを含む。一例では、ハイブリッドキャプシドは、一方の血清型（例えば、ＡＡＶ９）由来のグリカン結合部位（例えば、ガラクトース結合部位）を、別の血清型（例えば、ＡＡＶ８）由来のキャプシド配列内に含む（例えば、ＷＯ２０１４／１４４２２９を参照、その全体で本明細書中に参照により援用される）。
【０１２２】
本発明に係るウイルスベクターは、ＨＬＡ−Ｇポリヌクレオチドを、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞へ送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、ポリペプチドをインビトロで生産するため、または、エクスビボでの遺伝子治療のために、ポリヌクレオチドを細胞にインビトロで送達するために用いられ得る。ウイルスベクターは、例えばＨＬＡ−Ｇを発現するために、ポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に送達する方法においてさらに有用である。この様式では、ポリペプチドは、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが不足しているので、ポリペプチドを必要とし得る。さらに、当該方法は、対象におけるポリペプチドの生産が何らかの有益な効果を与え得るので実施され得る。
【０１２３】
ウイルスベクターは、培養細胞または対象において、ＨＬＡ−Ｇを生産するために用いられてもよい（例えば、ポリペプチドを生産するための、または、例えばスクリーニング方法と合わせて対象に対するポリペプチドの効果を観察するための、バイオリアクターとして対象を用いる）。
【０１２４】
本発明のウイルスベクターは、ＨＬＡ−Ｇを送達することが有益である任意の病状または状態、例えば、角膜移植拒絶反応、免疫介在性ドライアイ、アレルギー性結膜炎、免疫介在性ブドウ膜炎、または加齢黄斑変性／慢性の新血管新生を治療および／または予防するために、ＨＬＡ−Ｇをコードするポリヌクレオチドを送達するために用いられ得る。
【０１２５】
本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法での用途を見いだし、それにより、ＨＬＡ−Ｇポリヌクレオチドは、細胞培養系、臓器または臓器培養（例えば、眼）、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて、一時的または安定して発現される。
【０１２６】
また、本発明のウイルスベクターは、制限されないが、当業者に明らかなように、遺伝子ターゲッティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含む、様々な非治療的目的のためにも用いられ得る。また、ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも用いられ得る。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価の前に規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。
【０１２７】
あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与されてよく、変更された細胞が対象に投与される。ＨＬＡ−Ｇポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、細胞に導入されて、細胞が対象に投与されて、ここで、核酸が発現され得る。
【０１２８】
対象、医薬製剤、および投与モード
本発明に係るウイルスベクターおよびキャプシドは、獣医および医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコなどを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、青少年および成人を含む。一部の実施態様では、対象は、治療を必要とする者、例えば、本発明の方法によって治療可能な障害を有すると診断されている、またはその疑いがある対象である。
【０１２９】
特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体において、本発明のウイルスベクター、および任意選択で、他の医療薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注入のために、担体は典型的に液体である。投与の他の方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体微粒子形態であってよい。
【０１３０】
「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
【０１３１】
本発明の一態様は、核酸を細胞にインビトロで移行する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切である標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞内に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および特定のウイルスベクターに応じて変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約１０３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
【０１３２】
ウイルスベクターが中に導入される細胞（単数または複数）は、制限されないが、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、毛様体、および角膜細胞（例えば、角膜実質細胞、上皮細胞、および内皮細胞）を含む）および免疫細胞を含む、任意のタイプであってよい。一部の実施態様では、細胞は、ＨＬＡ−Ｇの発現のために眼に送達される細胞、例えば幹細胞、例えば間葉系幹細胞である。さらに、細胞は、上記に説明されたように、任意の種の起源由来であってよい。
【０１３３】
ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞は元の対象内に投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、ドナー対象から細胞内に、培養細胞内に、または、任意の他の適切な由来から細胞内に導入され得て、細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。
【０１３４】
エクスビボでの遺伝子送達に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約１０２〜約１０８細胞または少なくとも約１０３〜約１０６細胞が、薬学的に許容できる担体において投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて治療有効量または予防有効量で対象に投与される。
【０１３５】
本発明のさらなる態様は、対象にウイルスベクターを投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に係るウイルスベクターの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。任意選択で、ウイルスベクターは、薬学的に許容できる担体において治療効果的または予防効果的な投与量で送達される。
【０１３６】
対象に投与されるべきウイルスベクターの用量は、投与モード、治療および／または予防されるべき疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達されるべき核酸などに依存し、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８形質導入単位、任意選択で約１０８〜約１０１５または約１０８〜約１０１３形質導入単位の力価である。
【０１３７】
特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）が、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。
【０１３８】
眼への例示的な投与モードは、基質内、局所、硝子体内、前房内、結膜下、網膜下、強膜上、強膜内、眼周囲、脈絡膜上、眼球後、およびそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１３９】
標的組織への送達は、ウイルスベクターを含むデポーを送達することによっても達成される。代表的な実施態様では、ウイルスベクターを含むデポーは、角膜または眼の他の組織へ移植されて、または、組織は、ウイルスベクターを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。そのような移植可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載される。
【０１４０】
したがって、本発明の一態様は、細胞においてＨＬＡ−Ｇを発現する方法に関し、細胞を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより、細胞においてＨＬＡ−Ｇを発現する。一部の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方が、細胞において発現される。
【０１４１】
本発明のさらなる態様は、ＨＬＡ−Ｇを角膜外植片に送達する方法に関し、角膜外植片を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより、ＨＬＡ−Ｇを角膜外植片に送達する。
【０１４２】
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象における移植後の角膜外植片の拒絶を阻害する方法に関し、角膜外植片を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含み、それにより、移植後の角膜外植片の拒絶を阻害する。一部の実施態様では、移植は同種異系移植である。一部の実施態様では、移植は異種移植である。一部の実施態様では、角膜外植片は、ブタなどの非霊長類由来であり、ヒトなどの霊長類に移植される。
【０１４３】
本発明の別態様は、角膜外植片の移植、例えば、異種移植を行なう方法に関し、角膜外植片を、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含む。一部の実施態様では、角膜外植片は、ヒトなどの霊長類由来であり、ヒトなどの霊長類に移植される。一部の実施態様では、角膜外植片は、ブタなどの非霊長類由来であり、ヒトなどの霊長類に移植される。
【０１４４】
一部の実施態様では、角膜外植片は、移植前に、組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触される。一部の実施態様では、角膜外植片は、移植中および／または移植後に、組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触される。一部の実施態様では、角膜外植片は、移植前、移植中および／または移植後に、組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触される。ＡＡＶ粒子または医薬組成物は、外植片においてＨＬＡ−Ｇを発現するのに効果的な任意の手段によって、外植片に送達され得る。一部の実施態様では、ＡＡＶ粒子または医薬組成物は、外植片に注入される。一部の実施態様では、外植片は、ＡＡＶ粒子または医薬組成物においてインキュベートされる。
【０１４５】
一部の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方は、角膜外植片において発現される。
【０１４６】
本発明のさらなる態様は、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する。一部の実施態様では、細胞は、間葉系幹細胞などの幹細胞である。
【０１４７】
本発明の別態様は、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、本発明の組み換えＡＡＶ粒子または医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、哺乳類の対象の眼にＨＬＡ−Ｇを投与する。
【０１４８】
一部の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方が、眼において、または、眼の一部または組織において発現される。
【０１４９】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する。一部の実施態様では、細胞は、間葉系幹細胞などの幹細胞である。
【０１５０】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類の対象において、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する方法に関し、哺乳類の対象の眼に、請求項２４の組み換えＡＡＶ粒子または請求項２５の医薬組成物を投与するステップを含み、それにより、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害を治療する。
【０１５１】
一部の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ５、または両方は、眼において、または眼の一部または組織において発現される。
【０１５２】
ＡＡＶ粒子または医薬組成物は、送達に効果的であることが当技術分野で知られている任意の手段によって、眼に、または眼の一部に送達されてよい。一部の実施態様では、ＡＡＶ粒子または医薬組成物は、基質内、局所、硝子体内、前房内、結膜下、網膜下、強膜上、強膜内、眼周囲、脈絡膜上、眼球後、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される経路によって送達される。
【０１５３】
一部の実施態様では、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害は、免疫応答と関連する障害である。本明細書において用いられる免疫応答と関連する障害は、細胞性および／または体液性免疫応答が障害の１つまたは複数の症候の原因であり、免疫応答の阻害が障害の１つまたは複数の症候の寛解をもたらす障害である。例は、制限されずに、移植拒絶反応、免疫介在性ドライアイ、アレルギー性結膜炎、および免疫介在性ブドウ膜炎を含む。ＨＬＡ−Ｇ１発現は、免疫応答の抑制と関連する。したがって、免疫応答と関連する眼障害の治療は、ＨＬＡ−Ｇ１、または、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５の両方の発現によって治療され得る。
【０１５４】
一部の実施態様では、免疫応答および／または血管新生と関連する眼障害は、血管新生と関連する障害である。本明細書において用いられる血管新生と関連する障害は、血管新生が障害の１つまたは複数の症候の原因であり、血管新生の阻害が障害の１つまたは複数の症候の寛解をもたらす障害である。例は、制限されずに、角膜外傷、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、後眼における血管新生、脈絡膜血管新生、および血管新生緑内障を含む。ＨＬＡ−Ｇ５発現は、血管新生の抑制と関連する。したがって、血管新生と関連する眼障害の治療は、ＨＬＡ−Ｇ５、または、ＨＬＡ−Ｇ５およびＨＬＡ−Ｇ１の両方の発現によって治療され得る。
【０１５５】
一部の実施態様では、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５の一緒の発現は、他のポリペプチド単独の発現よりも効果的であり、例えば、相加または相乗効果を有する。
【０１５６】
眼または外植片におけるＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５の両方の発現は、両方のポリペプチドを発現する単一のベクターを用いて、または、ポリペプチドのうちの１つをそれぞれが発現する別個のベクターを用いて行なわれ得る。別個のベクターを用いる場合は、ベクターは、連続してまたは異なるときに投与される別個の組成物中の同一の組成物において投与され得る。
【０１５７】
注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態として、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、局所的な様式で、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与され得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、外科的に移植可能なマトリックス（例えば、米国特許公報番号２００４−００１３６４５に記載）に付着されて送達され得る。
【０１５８】
本発明を説明したので、同一のものが以下の実施例においてより詳細に説明され、それは説明目的のみのために本明細書中に含められて、本発明に対する限定を意図しない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１
ＡＡＶベクターが介在するＨＬＡ−Ｇの発現は、損傷によって誘導される角膜血管新生および免疫細胞浸潤を減少させる
【０１６０】
この試験の目的は、損傷後の角膜血管新生の治療に関する、免疫抑制の自然なメカニズムに基づく治療を設計および評価することであった。この目的に向けて、ＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡをコドン最適化によって高めて、自己相補ＡＡＶベクターコンテキストにおいてインビトロで評価した。それから、最適化されたＨＬＡ−Ｇ１および５のカセットを、多種の角膜遺伝子の送達に熟達したキャプシド内にパッケージして（Ｖａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐ．６：２２１３１（２０１６））、ウサギモデルにおいて、角膜の化学的熱傷の８日後に基質内注入を介して投与した。大いに血管形成されたコントロールが注入された角膜とは対照的に、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇを受け取った角膜は、損傷後、２ヶ月の期間にわたって血管系のほぼ完全な不存在を示した。この結果は、細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、角膜の低減された免疫細胞浸潤と組み合わされた。傷付けられた角膜の基質内注入後の生体内分布に関して、ベクターゲノムは、角膜の外側には検出されなかったが、ＡＡＶキャプシド中和抗体応答は、事例のおよそ５０％において誘発された。集合的なデータは、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇが、眼の表面免疫におけるより広範な役割および同種異系の臓器移植の可能性を暗示しながら、角膜の血管新生を排除する臨床潜在性を示す。
【０１６１】
材料および方法
最適化されたＡＡＶ  ＨＬＡ−Ｇ構築物およびインビトロ発現：ＨＬＡ−Ｇ１  ｃＤＮＡをコドン最適化して（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ウエスタンブロット検出を用いて、ＷＴまたはコドン最適化ＨＬＡ−Ｇ１  ｃＤＮＡ由来のプラスミドによって保有されるＨＬＡ−Ｇ１の量を比較した。それから、ＰＣＲ増幅を用いて、ＨＬＡ−Ｇ１膜貫通ドメインを欠失させて、可溶性アイソフォーム、ＨＬＡ−Ｇ５、ｃＤＮＡを生産した。ヒト胚腎臓２９３細胞におけるこれらのプラスミドのトランスフェクション後、細胞溶解物を作製して、ウエスタンブロット分析を用いて、生産されたタンパク質産物のサイズを検出した。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の使用とともに免疫細胞化学を用いて、トランスフェクトされた２９３細胞におけるＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５の細胞内局在を観察した。ヒト胎盤細胞（ＪＥＧ−３細胞）をポジティブコントロールとして用いた（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ３６（商標））。それから、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５の両方を、自己相補ＡＡＶプラスミドコンテキスト内にクローニングした。
【０１６２】
ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇの基質内注入後のインビボでのＨＬＡ−Ｇ発現：この試験における動物の使用は、ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓを厳密に固守して、プロトコルは、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認および監視された。非近交系の正常な雄Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）を用いた。ウサギを麻酔して、局所麻酔薬（０．５％プロパラカインＨＣｌ［Ａｌｃａｉｎｅ，Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ］）の適用後に、２０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨ中で３０秒間インキュベートされた５．０ｍｍ直径の円形フィルターディスクを角膜中央に対して適用することによって、右眼に角膜創傷を作製した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．４６：６６（２０１１）；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｙｅ  ２０：４８２（２００６））。角膜創傷の７日後に、それぞれのウサギを麻酔して、生理食塩水（平衡食塩水（ＢＳＳ）、Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）、またはＧＦＰをコードするｓｃＡＡＶ８Ｇ９ベクター、または１：１比でＨＬＡ−Ｇ１＋ＨＬＡ−Ｇ５ベクターの組み合わせ（それぞれの処置群についてｎ＝３）のいずれかによる基質内注入を両眼に施した。それぞれの注入に関して、３１ゲージ針を用いて、５０μＬの生理食塩水または１×１０９ｖｇ／μｌのウイルス濃度でＡＡＶベクターのいずれかを、表面角膜間質に送達した。創傷に続いて、基質内注入後に、予防的抗生物質（モキシフロキサシン、Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）をそれぞれの角膜に局所的に適用して、ブプレノルフィンを皮下に与えて、処置後の不快感を減少させるのを助けた。注入に続いて、意識があるあいだに、ＧＦＰのインビボ発現を、４８２ｎｍレーザー光源（Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｃＳＬＯ；ＲｅｔｉＭａｐ  Ｒｏｌａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｌｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備える走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）を用いて、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰを注入したウサギにおいて評価した。それから、ＧＦＰ蛍光発現の強度を、補正された合計細胞蛍光（ＣＴＣＦ）を計算するために、以前に説明された方法を用いてインビボ画像から定量化して、ここで、ＣＴＣＦは、統合された密度−（選択された細胞の面積／蛍光×バックグラウンド・リーディングの平均蛍光）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｙ−（Ａｒｅａ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｘ  Ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｒｅａｄｉｎｇｓ））と等しい（Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１２５６４（２０１０）；ＭｃＣｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，Ｔｅｘ．）１３：１４００（２０１４））。
【０１６３】
インビボでの角膜血管新生に対するｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇの効果：新血管新生を細隙灯生体顕微鏡検査および写真撮影によって監視して、角膜中央の角膜厚測定（ＰａｃｈＰｅｎ  Ｈａｎｄｈｅｌｄ  Ｐａｃｈｙｍｅｔｅｒ，Ａｃｃｕｔｏｍｅ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）、および眼内圧（ＩＯＰ；Ｔｏｎｏｖｅｔ  ｔｏｎｏｍｅｔｅｒ，Ｉｃａｒｅ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を、０日目（創傷前）およびその後の５６日間、２〜３日ごとに行なった。血管新生を、ＩｍａｇｅＪを介してそれぞれのインビボ細隙灯生体顕微鏡検査画像ファイルを８ビットに変換して、縁検索（ｆｉｎｄｉｎｇ  ｅｄｇｅ）および全ての黒および白の値を反転させるのと一緒にコントラスト強調処理を用いて血管系の可視化を増大させることによって、定量化した。それから、変換された画像を、ＧＮＵ  Ｉｍａｇｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＧＩＭＰ  ２．８．２０）において開いて、透明なオーバレイ・レイヤーをそれぞれのイメージファイルに加えて、血管を新しいレイヤー上に手作業でトレースして、最後に、トレースされた血管の領域を、ＩｍａｇｅＪを用いて総画素数に変換した。
【０１６４】
損傷した角膜における、ＨＬＡ−Ｇによる免疫寛容の発現および再建：ウサギを安楽死させて、眼を回収して、中性緩衝化ホルマリン中で一晩４℃にて後固定して（ｐｏｓｔ  ｆｉｘｅｄ）、それから、パラフィン包埋されるまで７０％ＥｔＯＨ中で保管した。組織を５μＭで切片化して、角膜血管系の定量化（ＣＤ３１）およびＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４を用いて免疫応答に関して病理組織学的に評価した。ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色された切片を、光学顕微鏡によって試験した。角膜組織学的スコアスキームを、以前に記載された方法（Ｍｅｒｃａｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４０４（１９９３））から改変して、以下の領域、細胞浸潤の度合い、線維症の程度、および血管新生の程度を採点した。０〜４のスコアは、以下の注釈に基づいて割り当てられた：０、重大な病変なし；１、少数の炎症性細胞、軽度の線維症、最小の血管新生；２、中度のびまん性の間質炎症性細胞浸潤、線維症、または新血管新生；３、中度〜顕著なびまん性の間質炎症性細胞浸潤、線維症、または新血管新生；４、顕著なびまん性の細胞浸潤、線維症、血管新生。それから、累積の組織学的スコアを分析して、処置群ごとに平均±標準偏差（ＳＤ）として報告した。
【０１６５】
免疫組織化学：角膜組織をパラフィン内に包埋して、ミクロトームを用いて、５μｍの切片を切断して、それから、スライド上に乗せて乾燥させた。組織切片を染色して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体を用いて蛍光を撮像するために、切片を脱パラフィンして再水和させた。脱パラフィンは、キシレン中でスライドを２回、それぞれ５分インキュベートすることによって行なった。低減するエタノールグラジエントを用いて、１００％エタノール中で２回のインキュベーションをそれぞれ３分間、９５％中で１回のインキュベーション、８０％中で１回のインキュベーション、そして最後に脱イオン水中で少なくとも５分間リンスを通して、スライドを連続して動かすことによって、組織を再水和させた。組織切片を染色する前に、加熱によって誘導されるエピトープ回復（ＨＥＩＲ）手順を９８℃で１５〜２０分間行なって、パラフィン処理中に架橋されたタンパク質のエピトープのマスクを取った。具体的には、ＨＬＡ−Ｇ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−２１７９９，希釈１：５０）、ＧＦＰ（Ａｖｅｓ，ｇｆｐ−１０２０，希釈１：５００）、ＣＤ３（Ｂｉｏｒｂｙｔ，ｏｒｂ３２３３９１，１：１００）、ＣＤ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＡ１−８１５８８，１：１００）、およびＣＤ８（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＮＢ１００６４０２１，１：１００）に関して染色された切片を、事前に加熱されたクエン酸系の抗原回復溶液、ｐＨ６．０（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈ−３３００）中に浸して、一方で、ＣＤ３１（Ａｂｃａｍ，ａｂ１９９０１２，１μｇ／ｍｌ）エピトープを１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中で回復させた。ＨＥＩＲが完了した後に、室温で２０分間スライドを冷却させて、それから切片を、穏やかに撹拌しながらＴＢＳ＋０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で５分ずつ２回洗浄した。それから、スライドを１０％の正常血清とともにインキュベートすることによって組織内の非特異的な結合部位をブロックして、ＨＬＡ−Ｇに関して染色された組織を正常ウマ血清によってブロックして、一方で、全ての他のものを、室温で１時間、ＴＢＳ中で１％ＢＳＡを用いて正常ヤギ血清によってブロックした。ブロッキング溶液をスライドから排出させて、それから切片を、１％ＢＳＡを用いてＴＢＳ中に適切に希釈された一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、穏やかに撹拌しながら、ＴＢＳ＋０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて、切片を２回、それぞれ５分洗浄して、非特異的に結合した一次抗体を除去した。適切なフルオロフォア−コンジュゲート二次抗体を、製造元の指示に従ってＴＢＳ＋１％ＢＳＡ中に希釈して、それから、それぞれの組織切片に添加して、穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。最後に、ＴＢＳを用いて３回、それぞれ５分、スライドを洗浄した。ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐ３６９７１）によってカバースリップを乗せたときに、それぞれの切片内の核を染色した。それぞれのスライドからの画像を、４０×対物レンズを備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８３倒立型リサーチ顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて撮って、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｃｅｌｌＳａｎｓ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ画像ソフトウェアを用いて処理した。
【０１６６】
間質注入後のＡＡＶ８Ｇ９生体内分布：これらの実験の開始前および完了時に血清を集めて、ＡＡＶキャプシドに対して生産された中和抗体に関して分析した。加えて、肝臓、脳、腎臓、心臓、および排出リンパ節を、Ｑ−ＰＣＲを用いたベクター生体内分布アッセイのために採取した。
【０１６７】
中和抗体アッセイ：ウサギ血清中の中和抗体の存在を、以前に記載された方法をわずかに改変して用いて分析した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：２８８（２０１２））。ＨＥＫ２９３細胞を、２４ウェルプレート内に、５００μｌの完全ＤＭＥＭ（１０％血清、１％Ｐ／Ｓ）中、ウェルあたり５×１０４細胞で蒔いた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間培養した。それぞれのウサギの注入前および注入後の血清を、ＤＰＢＳ中１２．５μｌの最終容量に、２倍でスタートして１：２５６まで段階希釈した。血清希釈を、４℃で２時間、ＡＡＶ８Ｇ９−ルシフェラーゼの３．８４×１０８ウイルスゲノム（７，６８０ゲノム／細胞）とともにインキュベートした。それから、蒔かれたＨＥＫ２９３細胞を、形質導入効率がルシフェラーゼアッセイによって測定される前に、最適な培養条件下で４８時間、ウイルス−血清混合物によって形質導入した。
【０１６８】
ルシフェラーゼアッセイ：ルシフェラーゼアッセイを行なって、ウサギ血清存在下でのＡＡＶ８Ｇ９の形質導入効率を測定した。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを以下のとおりに行なった。１×溶解試薬を、ｄｄＨ２Ｏ中に５×Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを希釈することによって調製した。培地を吸引して、２５０μｌの溶解試薬をＨＥＫ２９３細胞の各ウェルに添加してプレートを室温で２０分間振とうすることによって、細胞を溶解させた。１００μｌの溶解した細胞および１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬の混合物を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３マルチラベルプレートリーダーを用いて、カウント／秒（ＣＰＳ）として発光を測定した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００ｃ分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定して、それぞれのサンプルに関して、ルシフェラーゼ活性を合計のタンパク質濃度に対して標準化して、ＣＰＳ／［Ｐ］として報告した。
【０１６９】
結果
最適化されたＡＡＶ  ＨＬＡ−Ｇ構築物およびインビトロ発現：はじめに、ＨＬＡ−Ｇ１  ｃＤＮＡ（アクセッションＢＣ０２１７０８）を、ヒト細胞における理論的に高い導入遺伝子生産のために、ならびに、不要な二者択一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を除去するために、コドン最適化した（図１Ａ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１０７７０（２００９））。ＷＴまたはコドン最適化ＨＬＡ−Ｇ１  ｃＤＮＡのいずれか由来のプラスミドによって保有されるＨＬＡ−Ｇ１のウエスタンブロット検出は、ヒト胎芽２９３細胞においてコドン最適化バージョン（ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ１）を用いた場合、一貫した３倍の上昇を示した（図２Ａ−２Ｂ）。次に、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ１膜貫通ドメインを欠失させてｏｐｔＨＬＡ−Ｇ５  ｃＤＮＡを生産して、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ１およびｏｐｔＨＬＡ−Ｇ５の両方を、自己相補ＡＡＶプラスミドコンテキスト内にクローニングした（図１Ａ）。２９３細胞におけるこれらのプラスミドのトランスフェクション後のウエスタンブロット分析は、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ１に関して３９ｋＤＡに予期された単一バンドおよびｏｐｔＨＬＡ−Ｇ５に関して予期されたより小さな産物を生産して、それは、より小さな形態を伴い、そのうちの１つは、ＪＥＧ−３胎盤制御細胞において約３２ｋＤＡに見られる、より小さなＨＬＡ−Ｇ形態のサイズと一致するように見えた（図１Ｂ）。次に、ＨＬＡ−Ｇ１（膜貫通）およびＨＬＡ−Ｇ５（可溶型および分泌型）の細胞内局在を、２９３細胞におけるトランスフェクション後の免疫細胞化学を介して研究した。ＪＥＧ−３細胞の免疫染色は、細胞質、表面、および細胞外染色を示した。対照的に、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ１によってトランスフェクトされた２９３細胞は、主に表面膜の染色を示した。一方で、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ５がトランスフェクトされた細胞は、細胞基質および細胞外マトリックスにより多くの染色を有するように見える（図１０）。これらの集合的な結果は、最適化ＨＬＡ−Ｇアイソフォームが、効率的なタンパク質生産および予期されたＨＬＡ−Ｇ局在をもたらすことを示す。
【０１７０】
ＨＬＡ−Ｇの抗血管新生機能：ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における管形成アッセイを行なって、ＨＬＡ−Ｇの抗血管新生活性を分析した。ＨＵＶＥＣをマトリゲル上で培養して、自然発生的に管を形成させた（図３）。それから、ＨＬＡ−Ｇ１またはＨＬＡ−Ｇ５ベクター１×１０４ウイルスゲノム／細胞によって細胞を感染させて、２４時間培養した。図４は、両方のベクターが実質的に管形成を低減させたことを示し、ＨＬＡ−Ｇ１およびＨＬＡ−Ｇ５の両方が血管新生を阻害する能力を示唆する。
【０１７１】
ＡＡＶ８Ｇ９キャプシドは、ウサギ角膜への効率的な遺伝子送達を仲介する：推定のＡＡＶ９ガラクトース受容体結合ドメインと繋げられたＡＡＶ８キャプシド配列であるキメラキャプシド「８Ｇ９」は、基質内注入後のヒト角膜形質導入に関して優れていることが見いだされた（Ｖａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐ．６：２２１３１（２０１６））。ＡＡＶ８Ｇ９がウサギ角膜も形質導入することかどうか決定するために、自己相補（ｓｃ）ＪＥＴ−ＧＦＰレポーターカセットをＡＡＶ８Ｇ９キャプシド内にパッケージして、５×１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）の５０μｌ基質内注入を介してウサギ角膜に投与した（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ８：１２４８（２００１））。平衡食塩水（ＢＳＳ）またはｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰの基質内注入後に、急速な角膜中央の不透明性が角膜中央のおよそ３０％にわたって発生した（図５Ａおよび５Ｂ）。この不透明性は、注入の２４時間内に完全に分解した（図５Ａ）。ライブイメージングを用いて、ＧＦＰ蛍光が、注入の２１日後に、ベクター注入の位置において角膜中央に検出された（図５Ｃ）。シグナルの定量化は、注入の２８日後にピークのＧＦＰ強度を示した（図５Ｃ）。
【０１７２】
インビボでの角膜血管新生に対するｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇの効果：ＨＬＡ−Ｇホモログは非霊長類種において同定されていないが、ＨＬＡ−Ｇタンパク質を用いた以前の報告は、ヒトにおけるその公知の役割と一致して、ウサギモデルにおけるＨＬＡ−Ｇの機能を示した（Ｆｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０８：２６０８（２００６））。加えて、ウサギの眼は、ヒトの眼と構造およびサイズが似ていて、おそらく眼の研究のための最もポピュラーなモデルである。ＡＡＶ８Ｇ９がウサギ角膜形質導入に関して検証されたことを考慮して（図５Ａ−５Ｃ）、ｏｐｔＨＬＡ−Ｇプラスミド構築物を用いて前臨床ｓｃＡＡＶ８Ｇ９ベクターを生産した。臨床的に関連のあるシナリオを模倣するために、ウサギに麻酔をかけて、ＡＡＶベクター注入前に、中央の５ｍｍ角膜の化学的ＮａＯＨ熱傷を介して角膜を損傷させた。熱傷７日後に、ＧＦＰをコードするｓｃＡＡＶ８Ｇ９ベクターによる基質内注入、または、ＨＬＡ−Ｇアイソフォームの正確な役割が未知であることに起因して、および治療的効果を見る機会を増大させる試みにおいて、１：１比でｏｐｔＨＬＡ−Ｇ１＋ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ５（ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏ）。角膜血管新生は、損傷のおよそ７日後に、角膜輪部を超えて角膜組織中へ進行し始めて、損傷後１０日目までに処置群の間で有意差が存在した（ｐ＜．００１）（図６Ａ）。実際の熱傷は、実験期間にわたって分解しない角膜中央の不透明性が残ることに注意すべきである。ＩｍａｇｅＪを用いた血管新生の領域の定量化は、全ての実験時点において血管内部成長の増大を示し、損傷後５６日において、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰによって処置された角膜における血管新生が最大であった。対照的に、損傷の２ヶ月後、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏを受け取った対象は、いかなる有意な血管形成も現れず、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰによって処置された眼の１０倍、より少なかった（Ｐ＜０．００２）（図６Ａおよび６Ｂおよび７Ａ−７Ｃ）。注入後２４時間まで、および実験評価期間の全体を通して、眼内圧または角膜の厚さと関連する有意な変化はなかった（図８Ａ−８Ｂ）。
【０１７３】
損傷した角膜における、ＨＬＡ−Ｇによる免疫寛容の発現および再建：観察の８週間後、組織学的分析のために組織を回収した。ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰが注入された損傷が誘導された角膜の組織学は、角膜中央の単核細胞の浸潤、角膜中央への血管新生、および、軽度から中度の量の線維症からなる組織学的変化を明らかにした（図９Ａ）。一方で対照的に、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが注入された損傷した角膜の組織学的分析は、細胞浸潤は最小限であり、血管新生はなく、結果として、ＧＦＰコントロールベクターが注入された角膜とは有意に異なった（図９Ｂ）。実際に、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが注入された損傷後角膜の平均累積組織学スコアは、ＧＦＰコントロールベクターが注入された角膜に関する平均スコアよりも有意に低かった（Ｐ＜．０００５）（図９Ｂ）。
【０１７４】
Ｈ＆Ｅ染色に加えて、内皮細胞間結合細胞マーカー、ＣＤ３１の存在を明らかにすることによって、免疫蛍光を用いて角膜中央における血管を確認した（図１０Ａ）。ＣＤ３免疫染色は、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰの損傷した角膜における浸潤細胞の大部分が、ＣＤ３表面抗原に関してポジティブであることを確認した（図１０Ｂ）。この集団のサブセットは、ＣＤ８に関してもポジティブに染色されて、角膜損傷後の細胞傷害性Ｔ細胞の流入を示した（図１０Ｂ）。このＴ細胞集団のより小さなサブセットは、ＣＤ４＋であることがわかり、ヘルパーＴ細胞の存在も示した。
【０１７５】
また、角膜組織も分析して、免疫蛍光を用いてベクター由来の導入遺伝子生産を確認した。我々が報告したヒトの結果と同様に（Ｖａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐ．６：２２１３１（２０１６））、ＧＦＰは、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰが与えられたウサギの角膜の全体にわたって存在することが見いだされた。予期されたとおり、ＨＬＡ−Ｇタンパク質は、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが注入された角膜においてのみ明らかであり、それにより、ＨＬＡ−Ｇに対する治療的効果と相関した（図１０Ｃ）。
【０１７６】
角膜基質内注入後のＡＡＶ８Ｇ９生体内分布：潜在的な臨床適用は、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９基質内注入後の持続的なＡＡＶベクターの生体内分布を決定することが重要であり、この投与経路は未だ診療所においてなされていない。これを行なうために、全ＤＮＡを、肝臓および２つの脳領域；角膜を刺激する三叉神経核、および網膜を刺激する外側膝状核のサンプルから回収した。
【０１７７】
トランスジェニックカセットに対するプライマーを用いたＰＣＲは、これらの実験の結論とは独立に、試験された組織において角膜の外側でいかなるウイルスゲノムも検出しなかった。これにもかかわらず、この試験の結論では、強力なｓｃＡＡＶ８Ｇ９キャプシド特異的中和抗体の応答が、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ処置を受けたウサギの１匹において検出されて、１／２５６の力価で広範囲の角膜血管新生が進行した（表１）。他の２匹のウサギは、血管新生の出現または導入遺伝子とは独立に、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９キャプシドに対する非常に軽度の抗体応答を示した（表１）。
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【０１７８】
考察
米国だけで年間１４０万人を超える人々に影響を与える角膜血管新生は、２種類の状態、炎症または低酸素状態のうちの１つによって誘発される。炎症および／または低酸素状態は、細菌またはウイルス感染、自己免疫または変性疾患、物理的な外傷／操作、コンタクトレンズの長期着用、化学的熱傷または毒性汚染を含む様々な損傷の結果であり得る。角膜輪部から始まる血管の浸潤は、視力に影響または視覚を塞ぐだけでなく、角膜の免疫恒常性を破壊して、炎症および瘢痕の増大のような二次的状態をもたらし、ドライアイおよび角膜移植拒絶反応を発生させる主な構成要素である。血管新生を処置するための現行の薬物モダリティは、頻繁な投与に依拠していて、部分的にのみ効果的であり、重篤な視覚を脅かす副作用がある。アルゴンレーザー光凝固および切離のようなより侵襲性の手順は、診断によっては特に成功的でなく、次第に用いられなくなっている。したがって、視覚を脅かす副作用を伴わずに血管系の退行を誘導、または予防することが可能な単回投与治療が、現行の角膜血管新生治療の欠点を置き換えるために必要とされる。この目的に向けて、コドン最適化ＨＬＡ−ＧアイソフォームのＡＡＶ遺伝子送達が、ウサギ角膜における損傷後に用いられた。理解は不完全であるが、ＨＬＡ−Ｇが眼の免疫特権に関与すると仮定されたので、ＨＬＡ−Ｇの効果は多因子であり、おそらく眼において自然である（Ｃａｒｏｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：３３（２０１５））。さらに、胎児の母体免疫寛容におけるその生来の機能は、ヒトにおいて、ＨＬＡ−Ｇが、「自己」タンパク質（成功的な遺伝子治療アプローチに重要な属性）であることを暗示する。ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇのインビトロ特性化およびベクター検証に続いて、実験的データは、驚くべき有意性で、２つの重要な治療的成果：ｉ）外傷後に投与された場合の角膜血管新生のほぼ完全な阻害（図６Ａ−６Ｂ）、およびｉｉ）角膜の免疫細胞浸潤の予防による免疫恒常性の維持（図９Ａ−９Ｂ）を示す。予期された臨床適用に関するさらなる特性化は、熱傷角膜中に注入されたＡＡＶベクターが、ウイルスキャプシドに対する全身性抗体応答を誘発することが可能であることを示した（表１）。しかしながら、試験された組織においては、注入の２ヶ月後、角膜の外側にトランスジェニックゲノムは検出されなかった。
【０１７９】
はじめに、ＨＬＡ−Ｇ１のコドン使用頻度を、ＷＴ  ＨＬＡ−Ｇ  ｃＤＮＡと比較して全体的な多さを増大する様式で、想定されたヒト適用に関して変更して、全身性の遺伝子治療後にＣＴＬを誘発し得る二者択一のＯＲＦを除外した（図２Ａ−２Ｂ）（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０６：１０７７０（２００９））１９。コドン最適化は、矛盾して成功的であるが（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１：２２０５（２０１３）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３７１４（２０００））、ＨＬＡ−Ｇ１の場合は、結果は、合成のＯＲＦを用いて３倍の増大した多さを示し、それは、マイクロＲＮＡを標的するＷＴ  ＨＬＡ−Ｇによる、変更された転写後調節に部分的に起因し得る（Ｓｅｔｈｕｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２４：４８９（２００８）；Ｖａｓｕｄｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：１９３１（２００７））。概念的に、これは、付随する投与量の低減を可能にして、ヒトにおける利用可能なＡＡＶベクターの結果に基づき、より少ない投与された投与量は、より少ないベクター関連の免疫合併症およびより良好な治療的成果をもたらす（Ｓａｌｇａｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒ．３：ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｓｐｅｃ．ＭＤＮＡ３−００５２−２０１４（２０１５））。我々の知識において、これは、角膜でのＡＡＶ遺伝子治療に対する最初に報告された免疫応答であり、ＡＡＶベクター；キャプシドまたは外来導入遺伝子産物（この場合ではＧＦＰ）のいずれかと関連する外来エピトープによって誘発されると考えられる。
【０１８０】
ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ基質内注入は、２４時間までの角膜のほぼ完全なクリアリングおよび注入後３日までの注入関連の炎症の分解に十分耐容であった（図５Ａ−５Ｃ）。これらの注入は、ヒト角膜と同様のサイズの角膜を有する種であるウサギの正常および損傷した角膜において、ＧＦＰまたはＨＬＡ−Ｇアイソフォームの広範な角膜形質導入をもたらした。５０μｌの合計の注入容量の後に、注入が、およそ３０％の角膜の被覆をもたらしたことは特定の注意がされるべきである（図５Ａ）。基質内に注入されたこの容量は、注入の２ヶ月後に、血清中のキャプシド中和抗体を矛盾して誘発した。対照的に、ＡＡＶベクターゲノムは、非標的組織（例えば、肝臓、脳）では見られず、周辺的ウイルス（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖｉｒｕｓ）のレベルが、ＰＣＲの感知検出よりも下であること、またはＡＡＶベクター形質導入がほぼ完全に角膜に制限されることを示した。どちらにしても、想定または予期されないが、角膜への成功的な繰り返しのＡＡＶベクター投与は、ＡＡＶキャプシドワクチン接種とは独立に報告されている（Ｈｉｐｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ７：３５３１８，（２０１２））。
【０１８１】
治療的レベルでは、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰと比較した場合、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ｏｐｔＨＬＡ−Ｇ  Ｃｏｍｂｏが注入された角膜は、角膜損傷の２ヶ月後、血管新生および炎症性細胞浸潤が有意により少なかった。ＨＬＡ−Ｇが、血管新生、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、および単球浸潤を抑制する他のモデルと関係して、ウサギ角膜におけるこれらのデータは、ＨＬＡ−Ｇを用いたＡＡＶ治療が、眼の表面に対して持続された免疫寛容を提供するという見解をサポートする。
【０１８２】
本明細書における結果は、角膜血管新生に関する単回投与の安全で効果的な治療のために楽観的に生産された任意の組織におけるＨＬＡ−Ｇ遺伝子治療のためのＡＡＶベクターを用いる、我々が知る限りで最初の適用を示す。角膜におけるＨＬＡ−Ｇ遺伝子治療のこの有効性は、角膜損傷、感染、免疫介在性疾患を含む通常の免疫寛容が破壊されている眼の表面障害の治療、および、ローリスクおよびハイリスク患者の両方における角膜移植拒絶反応の予防に関する広い含意、ならびに、ドライアイ、血管新生緑内障、ブドウ膜炎、網膜／脈絡膜血管新生、および任意の固形臓器移植の処置に関する含意を有する。
【０１８３】
実施例２
ＡＡＶ  ＨＬＡ−Ｇは、同種異系角膜移植片拒絶を防止する
ＨＬＡ−Ｇが移植片拒絶を防止する能力を試験するために、同種異系角膜移植を、数週間内にそのような移植を急速に拒絶することが知られるウサギにおいて行なった。この実験では、安楽死されたウサギは角膜ドナーとしての役割を果たし、一方で、２匹のウサギはレシピエントとしての役割を果たした。移植前に、角膜ドナーのボタンを、ｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＧＦＰ（コントロール）またはｓｃＡＡＶ８Ｇ９−ＨＬＡ−Ｇ  ｃｏｍｂｏを含む溶液内で１時間インキュベートした。角膜移植を、経時的に監視した（図１２Ａ−１２Ｄ）。角膜血管新生、角膜移植浮腫およびかすみが、ＧＦＰによって処置され角膜において外科的処置の１０日後に観察されて、６よりも大きな拒絶指標（ＲＩ）をもたらし、移植が臨床的に拒絶されることを示した。驚くべきことに、ＨＬＡ−Ｇによって処置された角膜ボタンは、８４日の観察期間にわたって角膜血管新生がなく透明のままであった（図１２Ｂ、１２Ｃ）。実際に、ドナーおよびレシピエント角膜は、軽度の線維性の外科的な瘢痕以外、完全に健康のままであった。ウサギモデルにおける同種異系角膜移植のこの長期生存は、ＡＡＶ−ＨＬＡ−Ｇのエクスビボ形質導入が、同種異系角膜の移植拒絶反応を予防する能力を示し、異種移植の成功に潜在性を暗に示す。
【０１８４】
前述は本発明の例示であり、その制限と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物はその中に含まれるべきである。
【０１８５】
配列
配列番号１  ＨＬＡ−Ｇ１ＣｏｄｏｎＯｐｔ＃１（４３２）
配列番号２  ＨＬＡ−Ｇ１ＣｏｄｏｎＯｐｔ＃２（４３８）
配列番号３  ＨＬＡ−Ｇ５（４３５）
配列番号４  ＷＴＨＬＡ−Ｇ１（４２９）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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