(57)【要約】  本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、及びＮＡＳＨの処置の受診者候補として被験者を分類するための新規方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中、血清中、若しくは血漿中に循環しているｈｓａ−ｍｉＲ−３４又はその共線変数の１つ、及び少なくとも１つの他の血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルの測定を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断するための、及び／又は被験者におけるＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度を決定するための、及び／又はＮＡＳＨの処置の受診者若しくは非受診者として被験者を分類するための、及び／又は医学的処置の有効性を評価するための、及び／又はＮＡＳＨ患者における病態の進行若しくは減退を決定するための、及び／又は医学的処置に対する応答者候補若しくは非応答者候補として患者を分類するための、及び／又は患者における疾患の転帰を予測するための、及び／又は臨床的に妥当な転帰の代理マーカーを同定するための方法。
【請求項２】
ＮＡＳＨを診断するための、又はＮＡＳＨの処置の受診者若しくは非受診者として被験者を分類するための、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記の少なくとも１つの他の循環している肝障害マーカーが、α２マクログロブリン、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、インスリン、Ｃ−ペプチド、インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ）、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、ＹＫＬ−４０、ＣＫ１８−Ｍ３０、ＣＫ１８−Ｍ６５、ＡＬＴ、ＡＳＴ、尿比重（Ｕｒｉ Ｓｐｅｃ Ｇｒａｖ）、尿クレアチニン、好塩基球、高感度反応性タンパク質（ＨＳＣＲＰ）、尿中β−ＮＡＧ、白血球、好中球、及びフィブリノーゲンからなる群より選択され、該方法がさらに、被験者の身長などの少なくとも１つの他のパラメーターの測定も含み得る、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ａ）、及び少なくとも１つの血液中、血清中、又は血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルを測定する工程、及び
−結果を数学的アルゴリズムを通して組み合わせることによりＮＡＳＨスコアを得る工程
を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数９】
2019511225.tif 000029
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ＋ｇ＊Ｇ
に従って計算され、
ここで、
ＳはＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｂは、ＨｂＡ１ｃのレベル（％）であり；
Ｃは、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｆは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｇは、ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、α２マクログロブリンのレベルに関連した係数であり；
ｂは、ＨｂＡ１ｃのレベルに関連した係数であり；
ｃは、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチドのレベルに関連した係数であり；
ｄは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｆは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルに関連した係数であり；そして
ｇは、ＹＫＬ−４０のレベルに関連した係数であり；
ここで、
ａ）前記方法はメディアンモデルから誘導され、
ｋは、５．９４〜５０．７４の数値、特に２５．１３であり；
ａは、０〜１．０７の数値、特に０．５２であり；
ｂは、０〜１．２０の数値、特に０．５７であり；
ｃは、０〜０．２４の数値、特に０．１２であり；
ｄは、−０．９７〜０の数値、特に−０．４３であり；
ｆは、−０．８７〜０の数値、特に−０．４７であり；
ｇは、０〜１．７４×１０−５の数値、特に９．５４×１０−６であり；
ここで、０．２０１７〜０．４６４５、特に０．２３０２の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中程度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有する患者の指標であるか；
又は、
ｂ）前記方法はブートストラップモデルから誘導され、ここで
ｋは、８．２４〜３５．４４の数値、特に２１．８４であり；
ａは、０．０６〜０．８８の数値、特に０．４７であり；
ｂは、０．１４〜１．０４の数値、特に０．５９であり；
ｃは、０．０３〜０．２３の数値、特に０．１３であり；
ｄは、−０．７５〜−０．０５の数値、特に−０．４であり；
ｆは、−０．７３〜−０．０７の数値、特に−０．４であり；そして
ｇは、３．５９×１０−６〜１．７８×１０−５の数値、特に１．０７×１０−５であり；
ここで、０．２７１８〜０．６３９１、特に０．３５０２の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中程度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数１０】
2019511225.tif 000030
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ
に従って計算され、
ここで、
ａ）前記方法はブートストラップモデルから誘導され、ここで
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
Ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベル（％）であり（例えば、測定されたＨｂＡ１ｃの比率が１０％である場合、Ｄは１０である）；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベルに関連した係数であり；
ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベルに関連した係数であり；そして
ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベルに関連した係数であり；
ここで、
ｋは、９．５１〜３４．３７の数値、特に２１．９４であり；
ａは、−１．１７〜−０．４７の数値、特に−０．８２であり；
ｂは、０．０２〜０．８４の数値、特に０．４３であり；
ｃは、６．１０×１０−６〜２．０９×１０−５の数値、特に１．３５×１０−５であり；
ｄは、０．０７〜０．８９の数値、特に０．４８であり；
ここで、０．２０１３〜０．５９６５、特に０．４６６１の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有する患者の指標であるか；
又は、
ｂ）前記方法はメディアンモデルから誘導され、ここで
ｋは、６．０２〜５６．６９の数値、特に２８．１７であり；
ａは、−１．２６〜０．００の数値、特に−０．８４であり；
ｂは、０．００〜０．８８の数値、特に０．３６であり；
ｃは、０．００〜２．００×１０−５の数値、特に１．２３×１０−５であり；
ｄは、０．００〜０．９６の数値、特に０．４１であり；
ここで、
０．９７７３〜０．９９５５の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数１１】
2019511225.tif 000031
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ
に従って計算され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（ｌｏｇ１０）（コピー数/μL）であり；
Ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
Ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベル（％）であり（例えば、測定されたＨｂＡ１ｃの比率が１０％である場合、Ｄは１０である）；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベルに関連した係数であり；
ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベルに関連した係数であり；
ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベルに関連した係数であり；
ここで、
ａ）前記方法はブートストラップモデルから誘導され、ここで
ｋは、−１４．５０〜−７．４０の数値、特に−１０．９５であり；
ａは、１．３８〜３．５８の数値、特に２．４８であり；
ｂは、０．０２〜０．８４の数値、特に０．４３であり；
ｃは、５．９８×１０−６〜２．０８×１０−５の数値、特に１．３４×１０−５であり；
ｄは、０．０７〜０．８９の数値、特に０．４８であり；
ここで、０．１８９５〜０．６０８９、特に０．４２５５の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有する患者の指標であるか、又は
ｂ）前記方法はメディアンモデルから誘導され、ここで
ｋは、−２７．１６〜−０．７８の数値、特に−１１．０３であり；
ａは、０〜３．９７の数値、特に２．５９であり；
ｂは、０〜０．８９の数値、特に０．３８であり；
ｃは、０〜１．９８×１０−５の数値、特に１．２１×１０−５であり；
ｄは、０〜０．９７の数値、特に０．４０であり；
ここで、０．１４２１〜０．４５５６、特に０．３２０１の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項８】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数１２】
2019511225.tif 000032
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ
に従って計算され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
ｋは、−１１６．０８〜４０．９７の数値、特に１２．８７であり；
ａは、−０．８２〜０の数値、特に−０．４２であり；
ｂは、０〜１．８８×１０−５の数値、特に８．１６０×１０−６であり；
ここで、０．１３８７〜０．３４８１、特に０．２１８７の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中程度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項９】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数１３】
2019511225.tif 000033
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ
に従って計算され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
Ｃは、尿比重のレベル（単位なし）であり；
Ｄは、好塩基球のレベル（１×１０９/Ｌ）であり；
Ｆは、ＨＳＣＲＰのレベル（mg/dL）であり；
ｋは、−１２４．８１〜１．１３の数値、特に−６１．８４であり；
ａは、−０．９１〜−０．２５の数値、特に−０．５８であり；
ｂは、４．７７×１０−６〜２．３９×１０−５の数値、特に１．４４×１０−５であり；
ｃは、１７．２１〜１４１．５１の数値、特に７９．３６であり；
ｄは、２．８０〜６０．７４の数値、特に３１．７７であり；
ｆは、０．０１〜０．２３の数値、特に０．１２であり；
ここで、０．５７９１〜０．８２６９、特に０．７７５８の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数１４】
2019511225.tif 000034
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ＋ｇ＊Ｇ
に従って計算され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＣＫ１８−Ｍ６５のレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｃは、尿中β−ＮＡＧのレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｄは、白血球球のレベル（１×１０９/Ｌ）であり；
Ｆは、α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｇは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
ｋは、−６９．８９〜５７．０２の数値、特に２４．９８であり；
ａは、−１．０９〜０の数値、特に−０．５４であり；
ｂは、０〜０．００５の数値、特に０．００２であり；
ｃは、０〜０．２８の数値、特に０．１４であり；
ｄは、０〜０．６９の数値、特に０．３２であり；
ｆは、０〜１．０８の数値、特に０．４３であり；
ｇは、−０．８０〜０の数値、特に−０．３７であり；
ここで、０．０１９７〜０．１１３６、特に−０．３７の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ＝１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
ＮＡＳＨスコアが、以下の対数関数：
【数１５】
2019511225.tif 000035
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ＋ｇ＊Ｇ＋ｈ＊Ｈ
に従って計算され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＣＫ１８−Ｍ６５のレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｃは、尿中β−ＮＡＧのレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｄは、白血球球のレベル（１×１０９/Ｌ）であり；
Ｆは、α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｇは、フィブリノーゲンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｈは、身長値（cm）であり；
ｋは、８．３１〜３５．７９の数値、特に２２．０５であり；
ａは、−０．９６〜−０．２６の数値、特に−０．６１であり；
ｂは、０．０００６〜０．００３４の数値、特に０．００２であり；
ｃは、０．０４〜０．２４の数値、特に０．１４であり；
ｄは、０．０４〜０．５２の数値、特に０．２８であり；
ｆは、０．０７〜０．８９の数値、特に０．４８であり；
ｇは、０．１４〜１．２８の数値、特に０．７１であり；
ｈは、−０．０８〜−０．００１の数値、特に−０．０４であり；
ここで、０．３３７３〜０．７２６０、特に０．６３７０の閾値より高いＮＡＳＨスコアは、重症のＮＡＳＨ、又は中等度若しくは高度のＮＡＳＨ活動性の指標であり；したがって、脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ＝１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有する患者の指標である、請求項４記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群より選択された少なくとも１つのマーカー；及び
（ｉｉ）少なくとも１つの血液中、血清中、又は血漿中に循環している肝障害マーカー
のレベルを決定するための手段を含むキット。
【請求項１３】
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群より選択された少なくとも１つのマーカー；及び
（ｉｉ）請求項１〜５０のいずれか一項記載の方法に使用される少なくとも１つの血液中、血清中、又は血漿中に循環している対応する肝障害マーカー
のレベルを決定するための手段を含む、請求項１２記載のキット。
【請求項１４】
ＮＡＳＨの処置法に使用するための抗ＮＡＳＨ分子であって、該抗ＮＡＳＨ分子は、ＮＡＳＨと診断されたか又は請求項１〜５０のいずれか一項の方法に従って分類された、特にＮＡＳＨの処置の受診者として分類されたそれを必要とする患者に投与される、前記抗ＮＡＳＨ分子。
【請求項１５】
前記分子が、式（Ｉ）：
【化２】
2019511225.tif 000036
（式中、
Ｘ１は、ハロゲン基、Ｒ１基、又はＧ１−Ｒ１基を示し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基又はＣＨ２−ＣＨ２基を示し；
Ｘ２は、Ｇ２−Ｒ２基を示し；
Ｇ１及びＧ２は、同一又は異なり、酸素原子又は硫黄原子を示し；
Ｒ１は、水素原子、置換されていないアルキル基、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているアリール基又はアルキル基、アルコキシ基又はアルキルチオ基、シクロアルキル基、シクロアルキルチオ基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ２は、少なくとも１つの−ＣＯＯＲ３基によって置換されたアルキル基を示し、ここでのＲ３は、水素原子、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ４及びＲ５は、同じ又は異なり、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示す）
で示される、請求項１４記載の使用のための抗ＮＡＳＨ分子又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項１６】
前記化合物が、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸、及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸イソプロピルエステル；又は薬学的に許容されるその塩からなる群より選択され、特に１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン又は薬学的に許容されるその塩である、請求項１４又は１５記載の使用のための抗ＮＡＳＨ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、及びＮＡＳＨの処置の受診者候補として被験者を分類するための新規な方法に関する。
【０００２】
発明の背景
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、単純な脂肪肝から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）におよぶ進行的な肝疾患である。
【０００３】
非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）はまた、脂肪酸の蓄積、アルコール性肝炎に似た肝細胞の障害及び炎症によって組織学的に特徴付けられる進行的な肝疾患である。ＮＡＳＨは、肝硬変、肝不全及び／又はＨＣＣ（肝細胞癌）へと至る可能性のある過程における重要な段階である。かなりの量のアルコール摂取はないという慎重な履歴の聴取が、この診断を確立するのに不可欠である。ＮＡＳＨは、肝臓学者に評価のために照会された患者における上昇したアミノトランスフェラーゼの最も多い原因の１つである。肥満及び２型糖尿病は、ＮＡＳＨに関連している。
【０００４】
世界における肥満率と共に、ＮＡＳＨの発生率は近年増加し、ＮＡＳＨを発症する患者では、肝臓に関連した死亡率は上昇している。これらの疾患の罹患率は上昇しつつあるので、ＮＡＳＨの罹患率も上昇していることが予想され、それ故、この疾患は米国並びに他の諸国においても新興の公衆問題となりつつある。したがって、これらの疾患に関連した上昇しつつある罹患率及び上昇している死亡率は、ｉ）疾患進行の機構に関するより深い理解、及びｉｉ）ＮＡＳＨのより高感度で信頼性のある非侵襲的診断法の開発の必要性を強調する。
【０００５】
これらの疾患は、十分に早期に診断されれば元に戻すことができる可能性があるか、又は少なくともその結果を制限することができるので、このような迅速で正確な早期診断を可能とする新規なツールを医療分野に提供することができることは非常に重要であるようである。
【０００６】
ＮＡＳＨを診断しそしてその活動性、ステージ、又は重症度を決定するための非侵襲的な方法を提案するいくつかの試みがなされているが、今日の時点では肝生検材料の組織学的分析が依然として、ＮＡＳＨと初期段階の脂肪肝とを区別するための最適なアプローチである。脂肪化、小葉内炎症及び門脈の炎症、風船様腫大及びアポトーシスの形態の肝細胞損傷、並びに線維化が、生検材料から評価されたＮＡＳＨの特色である。しかしながら、肝生検は、多くの明白な欠点を有する。まず、肝生検で収集された材料は、診断された被験者の肝臓の非常に小さな部分しか示さず、これにより、収集された試料が被験者の臓器の全体的な状態を代表しているかどうかに関する疑念が生じる。さらに、肝生検は、患者にとって厄介で心配で痛みを伴うものであり得、罹患率及び死亡率に関する懸念を生じる、非常に侵襲的な手技である。最後に、前記を鑑みて、母集団におけるヒト又はさらにはＮＡＳＨのリスクのある患者がＮＡＳＨに罹患しているかどうかを決定するための、並びに／あるいは前記のヒトにおけるＮＡＳＨの活動性、ステージ、又は重症度を決定するための日常的な手技として肝生検を提唱することは合理的に考えてできない。
【０００７】
脂肪肝を診断するために超音波診断も使用された。しかしながら、この方法は主観的である。なぜならそれは、エコーの強度（エコー輝度）及び特殊なエコーパターン（テクスチャ）に基づいているからである。結果として、特に進行した線維症を有する患者においては、十分な感度ではなく、しばしば不正確である。
【０００８】
現在のＮＡＳＨ診断ガイドラインは、重症ではない患者においてはＡＳＴ／ＡＬＴ比を（Angulo P. N. Engl. J. Med. 2002 Apr 18; 346(16):1221-31 ; Maher JJ. Semin Gastrointest Dis. 2002 ;13 :31-9）、マドレーの判別関数が３２を超える重症の患者においては肝生検（Levitsky J, Mailliard ME. Semin Liver Dis. 2004;24:233-47; Mathurin P, et al. Gastroenterology. 1996;110:1847-53; Mathurin P, et al. J Hepatol. 2002; 36:480-7）の使用を推奨している。
【０００９】
肝生検は依然として、サンプリング誤差の可能性を有する侵襲的かつ費用のかかる手技であるので、患者におけるＮＡＳＨのレベルの良好な予測値を与えるであろう検査を実施するための迅速かつ簡易な方法を有することは有益であり得る。
【００１０】
いくつかの研究は、線維症のいくつかの血清バイオマーカーが、トランスアミナーゼ又はアクチテスト（ActiTest）などの標準的な血清マーカーよりも良好な診断値を示したことを観察したが（Naveau S, et al., Clin Gastroenterol Hepatol. 2005; 3(2); Castera L, et al., J. Hepatol. 2000; 32:412-8; Annoni G, et al. Hepatology. 1989;9:693-7 ; Nojgaard C, et al. J Hepatol. 2003;39: 179-86; Chossegros P. 1995;22(2 Su[ppl):96-9）、これらの中のどの試験も、ＮＡＳＨマーカーの的確な組合せを実際に同定していない。
【００１１】
さらに、近年、肝臓の診断の分野において重要性を増している非侵襲的なバイオマーカーの使用を開発するいくつかの試みがなされた。例えば、欧州特許第１８４６８６２Ｂ号は、７つの生化学マーカーの濃度を測定し、次いで、それらを対数関数を通して組み合わせることにより最終値を得る工程を含む、患者の血清試料又は血漿試料からのアルコール性又は非アルコール性脂肪性肝炎の非侵襲的なインビトロにおける診断法を記載している。
【００１２】
国際公開公報第２０１４／０４９１３１号では、アポトーシスを反映している少なくとも１つのバイオマーカー、人体計測を反映している少なくとも１つのバイオマーカー、代謝活性を反映している少なくとも１つのバイオマーカー、及び場合により肝臓の状態を反映している少なくとも１つのバイオマーカー、及び該バイオマーカー間の組合せの数字関数の測定に基づいた、非アルコール性脂肪性肝炎の非侵襲的な診断のための血液検査が開示された。
【００１３】
非侵襲的なバイオマーカーを比較しかつ組み合わせることにより、肝線維症を評価するための、しかしまたそうした非侵襲的なバイオマーカーを取り込んだ様々なアルゴリズムの正確度を比較するためのいくつかの試験が実施された。難しいのは、効果的かつ妥当なバイオマーカーを選択し、最終的にはそれらをアルゴリズムを通して組合せ、様々な結果を分析し、及び場合により、応答する患者を良好な方法で定めることである。
【００１４】
しかしながら、ＮＡＳＨのそのような正確な診断法は現在入手できない。
【００１５】
それ故、被験者におけるＮＡＳＨを診断及びその活動性、ステージ、又は重症度を決定するための正確で非侵襲的な手段を提供する強い必要性が存在する。
【００１６】
発明の要約
本発明は、患者の肝生検材料から得られた組織学的データを含む、出願人によって実施された臨床試験（試験ＧＦＴ５０５−２１２−７−ＮＣＴ０１６９４８４９）中にＮＡＳＨ患者から得られた３００個を超える高品質の試料から決定された膨大な数の変数の非常に細かくかつ完全な分析に基づく。この試験により、ＮＡＳＨ及びその重症度又はステージ又は活動性の指標である、重要な循環中の因子（すなわちバイオマーカー）が発見された。
【００１７】
本発明は、血液中、血清中、若しくは血漿中に循環しているｈｓａ−ｍｉＲ−３４又はその共線変数の１つ、及び少なくとも１つの他の血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルの測定を含む、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の診断のための、及び／又は被験者におけるＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度の決定のための、及び／又はＮＡＳＨの処置の受診者若しくは非受診者として被験者を分類するための、及び／又は医学的処置の有効性の評価のための、及び／又はＮＡＳＨ患者における病態の進行若しくは減退の決定のための、及び／又は医学的処置に対する応答者候補若しくは非応答者候補として患者を分類するための、及び／又は患者における疾患の転帰の予測のための、及び／又は臨床的に妥当な転帰の代理マーカーの同定のための方法を開示する。
【００１８】
他の態様及び実施態様は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の循環しているマイクロＲＮＡ（群）（ｍｉＲＮＡ（群））及び他の循環しているバイオマーカー、例えば循環している肝障害マーカーである生化学バイオマーカーの定量及び／又は組合せに基づく。
【００２０】
特に、出願人は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの状況において炎症マーカー候補を有する当技術分野において開示されたｍｉＲＮＡの中で（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａがＮＡＳＨの診断のための重要なバイオマーカーであることを同定した。
【００２１】
したがって、本発明の第一の態様は、血液中、血清中、若しくは血漿中に循環しているｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、及び場合により少なくとも１つの他の血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルの測定を含む、被験者におけるＮＡＳＨの診断のための、又はＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度の決定のための方法に関する。
【００２２】
本発明によると、特定のｍｉＲＮＡ（群）の組合せ及び場合により他の特定の生化学マーカーの組合せにより、被験者におけるＮＡＳＨを診断及びその活動性、ステージ、又は重症度を決定するための非常に正確で非侵襲的な手段がもたらされ得る。したがって、本発明は、該方法が非常に強力かつ正確となるような、両方の種類のマーカーの組合せを開示する。本発明の方法は、被験者におけるＮＡＳＨに関して選択性及び特異性の両方を提供する。
【００２３】
したがって、本発明は、総合的に考えた場合に、ＮＡＳＨ又はその重症度若しくはステージ若しくは活動性について試験された被験者におけるＮＡＳＨ及び／又はＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度の指標である、規定のセットの循環マーカーの同定から始まる。本発明は特に、循環中のマイクロＲＮＡ（群）（ｍｉＲＮＡ（群））及び他の循環中の肝障害マーカーの同定及びそれらのレベルの定量を組み合わせて、被験者における非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を診断するための及び／又はＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度を決定するための方法に関する。
【００２４】
近年、がん、肝炎、肝損傷、及びＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪肝疾患）をはじめとする様々な疾患のバイオマーカーとしての循環ｍｉＲＮＡ（群）を取り巻く熱狂はかなりのものである（Osman, Clin. Lab. 2012; 58:393-402; Cermelli et al., PloS.One, 2011; 6:e23937; Elfimova et al., Front Physiol. 2012; 3:476）。ｍｉＲＮＡ（群）は、タンパク質合成を調節する進化的に保存された分子機序としての標的化ｍＲＮＡの部分的抑制又は分解によって、転写後レベルで遺伝子発現を調節する、ノンコーディングな短い（１９〜２５ヌクレオチド長）高度に保存された調節ＲＮＡである。
【００２５】
現在、ヒトゲノムの様々な遺伝子間配列、イントロン配列、又はエキソン配列にコードされている公知のｍｉＲＮＡは２０００個を超え、ｍｉＲＮＡは、全てのヒト遺伝子の最大６０％を直接標的化し得ると推定されている。ｍｉＲＮＡ（群）は、細胞のアポトーシス、分化、発達、増殖、及び代謝をはじめとする様々な生物学的プロセスに関与している。
【００２６】
循環しているｍｉＲＮＡ（群）は、リボヌクレオタンパク質複合体又は小胞に取り込まれることができるので、リボヌクレアーゼの豊富な血液中の環境では著しく安定である。ｍｉＲＮＡ（群）特異的発現プロファイルは、いくつかのがん、肝臓、心臓、腎臓、及び自己免疫疾患をはじめとするいくつかの疾患に関連している。循環中のｍｉＲＮＡ（群）の発現プロファイルが特定の容態に強く相関している場合、循環中のｍｉＲＮＡ（群）のプロファイルは、疾患を診断及びモニタリングするためのバイオマーカーとして作用し得る。ｍｉＲＮＡは近年、ＮＡＦＬＤの管理における新規なバイオマーカー及び治療標的候補として出現している。
【００２７】
ｍｉＲＮＡの発見以来、ｍｉＲＮＡは、ヒト疾患における関連の可能性について調べられてきた。正常な組織及び血清と比較したその発現パターンの変化は、多くの疾患状態において見られる。特に、心疾患、敗血症、悪性疾患、及び自己免疫疾患におけるｍｉＲＮＡ発現の変化は、新規な研究手段、及びヒト疾患を処置するための標的を示唆している。
【００２８】
この有望な新規分野は研究を前進させ、血清中及び血漿中で検出可能な安定なｍｉＲＮＡが、疾患の初期段階のバイオマーカーとしての役目を果たし得るか、又は疾患の重症度を決定する非侵襲的な手段であり得る可能性を開拓した。しかしながら、十分に強力でＮＡＳＨの有意な指標となるｍｉＲＮＡ、及びそれらを実施する方法が依然として必要とされている。なぜなら、ＮＡＳＨを診断又はそのステージを決定するための現在の最も信頼できる基準は依然として肝生検であるからである。
【００２９】
ｍｉＲＮＡ（群）の中で、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２が肝疾患のバイオマーカーとして提唱された（Chang et al., 2004; Lagos-Quintana et al., 2002）。
【００３０】
発現プロファイリング研究により、ヒト及びマウスのＮＡＳＨにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５５をはじめとする、いくつかの発現差を有するｍｉＲＮＡが同定され、これらのｍｉＲＮＡの変化した発現は、ＮＡＳＨの病態発生における有意な役割を示唆する。しかしながら、ＮＡＳＨの調査及び臨床管理におけるいくつかの近年の成功にも関わらず、大きな不備が依然として存在する。これには、生化学的病因、広範なその症状、及びＮＡＦＬＤからＮＡＳＨへの疾患の進行の基本的プロセスの乏しい理解が含まれる。
【００３１】
特に、特定の患者又は組織の、ＮＡＳＨへの進行のし易さに差異があるかどうか、及びこの感受性がｍｉＲＮＡの変化した発現に関連している可能性があるかどうかは依然として不明であった。
【００３２】
現在の時点では、単独での又は組み合わせたｍｉＲＮＡの発現変化に基づいた、より正確なＮＡＳＨの診断のための診断検査は利用可能ではなかった。
【００３３】
本発明は、臨床試験中に患者の生検材料を非常に精密に分析して、循環中の生物学的マーカーの存在又はレベルの相互関係を明らかにし、処置される予定の様々なタイプの患者を以下に記載のようなＮＡＳスコアリングに従って規定することから始まる。特に、本発明は、処置される予定の３つのクラスのＮＡＳＨ患者を非制限的に規定する。これらの患者は、ＮＡＳＨの特徴のスコアリングに関して分類される。
【００３４】
特定の実施態様では、各々のクラスの患者について、出願人は、いくつかのクラスの患者に対する妥当なバイオマーカーのリストを定める。これらの異なる妥当なバイオマーカーを組み合わせる方法をさらに開示する。
【００３５】
したがって、様々な方法が、処置される予定の患者と直接連関する。本発明による方法は、それらのＮＡＳＨスコアの特色に応じて、ＮＡＳＨの処置の将来的受診者又は非受診者として患者を分類することを可能とし得る。処置される予定の患者は、規制当局又は各国の健康政策に依存し得る。ここに、処置される予定のこれらの患者を医師が同定するための強力なツールが提供される。なぜなら、出願人は、いくつかのクラスの患者を同定するためのマーカーの様々な組合せを提案しているからである。本発明の方法の実施により、モニタリング下にある被験者の正確な分類が行なわれる。
【００３６】
本発明によると、処置される予定の各タイプの患者について、ＮＡＳＨスコアを得ることができる。
【００３７】
本発明は、ＮＡＳＨの処置の受診者若しくは非受診者として、又は受診者候補若しくは非受診者候補として被験者を分類するための方法を提供する。この分類はまた、肝生検を受けることによるなどの当技術分野において公知である方法によるＮＡＳＨのさらなる確定を被験者が受けるべきであるかどうかをさらに決定するための根拠でもあり得る。
【００３８】
本発明の方法は、
−被験者におけるＮＡＳＨを診断するために、
−被験者におけるＮＡＳＨの活動性を決定するために、
−被験者におけるＮＡＳＨのステージを決定するために、
−被験者におけるＮＡＳＨの重症度を決定するために、
−被験者をＮＡＳＨの処置の受診者又は非受診者として分類するために、
−薬物の有効性などの、ＮＡＳＨの医学的処置の有効性を評価するために、
−ＮＡＳＨ患者における病態の進行又は減退を決定するために、
−医学的処置の投与後にＮＡＳＨ患者における病態の進行又は減退を決定するために、
−患者が受け入れるか否か、すなわち、ＮＡＳＨの医学的処置に対する応答者（候補）又は非応答者（候補）であるかどうかを予測するために、
−予後の評価、すなわち、疾患の転帰の予測を確立するために、
−臨床的に妥当な転帰の代理マーカーを提供するために、使用され得る。
【００３９】
本発明の方法は、患者におけるＮＡＳＨの診断を可能とするが、しかしまたＮＡＳＨの進行の追跡も可能とする。これらの方法は有利には、いつ例えば医学的処置を開始するか、又はより危機に瀕した患者ではいつ（例えば肝移植による）手術を行なうかを決定するために実施され得る。
【００４０】
本発明は、ＮＡＳＨの処置用の非常に有望な薬物であるエラフィブラノールの有効性に関する大規模な臨床試験の転帰に適用された数学的アルゴリズムのお蔭で同定された様々なバイオマーカーの素晴らしい組合せに基づく。エラフィブラノールは、ジェンフィット社の最も重要なピペリン産物である。エラフィブラノールは、１日１回の経口による処置であり、特にＮＡＳＨを処置するために開発されたペルオキシソーム増殖因子により活性化されるアルファ／デルタ二重経路を介して作用する第一級の薬物である。エラフィブラノールは、炎症、インスリン感受性、脂質／代謝プロファイル、及び肝マーカーをはじめとする、ＮＡＳＨの複数の局面に対処すると考えられている。
【００４１】
特定の実施態様では、様々なアルゴリズム（その中のそれぞれが、特定のクラスの患者に特化している）が実行される。
【００４２】
患者の状態により特定のアルゴリズムを決定することによって、結果のさらなる活用はより細かくかつ予測的となる。
【００４３】
驚くべきことに、ＮＡＳＨに何らか関連していることが知られている全てのｍｉＲＮＡの中で、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（又はその共線変数の１つ）が、本発明者らによって、少なくとも１つの他のバイオマーカーと組み合わせられた場合に、ＮＡＳＨの最も強力かつ指標的なバイオマーカーであると決定された。
【００４４】
本発明によると、「非アルコール性脂肪性肝炎」すなわち「ＮＡＳＨ」は、脂肪肝、肝細胞の風船様腫大、及び肝炎症の存在として定義される。
【００４５】
前記疾患のこの基本的な定義に、ＮＡＳＨはさらに肝線維症を含み得る。
【００４６】
本発明によると、「被験者」及び「患者」という用語は互換的に使用され、哺乳動物被験者、特にヒト被験者又はヒト患者を示す。
【００４７】
本発明は、その非侵襲的な性質のお蔭で、ＮＡＳＨの公知の素因又は疑わしい素因が全くない被験者などの、あらゆる被験者に対して実施され得る。
【００４８】
しかしながら、特定の実施態様では、被験者は、ＮＡＳＨを有しているリスクがあるか又は将来ＮＡＳＨを発症するリスクがある被験者、例えば、肥満、糖尿病を有するか、代謝症候群を患っているか、又は循環中の肝酵素レベル（ＡＬＴ及び／又はＡＳＴ）が上昇しているか、又は以前に非アルコール性脂肪肝疾患（又は脂肪肝）と診断された被験者である。
【００４９】
被験者はまた、すでにＮＡＳＨと同定された被験者であり得、本発明の方法はこれにより、肝硬変、線維症、肝癌、肝移植、又は心血管疾患へと疾患が進行するリスクを決定することが可能となる。
【００５０】
被験者がＮＡＳＨに罹患している場合、本発明の方法は、ＮＡＳＨ疾患の処置用の薬物の有効性の決定、及びまた、処置に対する応答者／非応答者としての患者の分類を可能とする。
【００５１】
本発明は、ＮＡＳＨの処置に対する応答者又は非応答者であり得る患者を同定するために実施され得る。特に、本発明は、患者を様々なクラスに分類することを可能とする。
【００５２】
各患者の分類のために、血液中、血清中、若しくは血漿中に循環しているｈｓａ−ｍｉＲ−３４（例えばｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ）又はその共線変数、及び少なくとも１つの他の血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルの測定を含む、ＮＡＳＨの診断のための、又は被験者におけるＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度の決定のための、又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の処置の受診者若しくは非受診者として被験者を分類するための、又は薬物を投与することによるなどの薬物を投与することなどによるＮＡＳＨの医学的処置の有効性を評価するための、又はＮＡＳＨ患者における病態の進行若しくは減退を決定するための、又は医学的処置の投与後のＮＡＳＨの進行若しくは減退を決定するための、又は患者が医学的処置を受け入れるか否かを予測するための、又は予後評価、すなわち患者の疾患の転帰を予想するための、又は臨床的に妥当な転帰の代理マーカーを同定するための方法が提供される。
【００５３】
患者の分類は、臨床試験中に、ＮＡＳＨ患者の高品質な試料に由来する肝生検材料の組織学的特色（肝細胞の脂肪化、風船様腫大、小葉内炎症、及び場合により線維化）に従って規定された。
【００５４】
以前の分析に基づいて、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）が確立され、以下のように定義され得る：
ＮＡＳは３つの特色に基づき、それらの各々は０〜２又は３のスコアが付される（以下の表を参照）。ＮＡＳは、脂肪化（Ｓ）スコアと小葉内炎症（Ｌ）スコアと肝細胞の風船様腫大（Ｂ）スコアの合計である。したがって、ＮＡＳは０〜８であり得る。
【００５５】
次いで、場合により、ＮＡＳＨ患者はさらに、線維症（存在する場合）のステージによって特徴付けられ得る。ＮＡＳＨにおける線維症のステージ分類は４つのステージとして定義され得、以下に示されているようにステージ１については３つの可能性を有する。  
【００５６】
【表１】
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【００５７】
本発明者らによって収集されたデータは、疾患及び／又はその重症度若しくはステージ若しくは活動性の指標であるスコアの決定をもたらす２つの異なる生物統計学的アプローチに従って処理され、これにより、被験者がＮＡＳＨに罹患しているかどうかを医師が容易に決定するための、又は疾患のステージ若しくは活動性若しくは重症度を決定するための強力で正確で高度に予測的であるツールが提供された。
【００５８】
２つの生物統計学的アプローチであるメディアンモデル及びブートストラップモデルを使用して、以下に記載のようなＮＡＳＨ患者に相関したマーカーの組合せを細かく規定した。
【００５９】
本発明において測定されたマーカーのレベルは、被験者の体液から決定され、これは特に、血液試料、より特定すると血清試料又は血漿試料であり得る。試料はさらに、尿などの別の体液に対応してもよい。
【００６０】
特定の実施態様によると、本発明において測定されるマーカー及び特にｍｉＲＮＡ（群）のレベルは、血漿試料から、好ましくは血小板非含有の血漿試料から決定される。
【００６１】
本発明者らによって同定されたマーカーのレベルは、バイオマーカーの種類（例えばタンパク質、マイクロＲＮＡ、血糖値など）に応じて、当技術分野において周知である慣用的な方法、例えばイムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、又は分子的及び生化学的アッセイ（定量ＲＴ−ＰＣＲ、比色アッセイ）、又は分析法（例えば質量分析法）によって決定され得る。
【００６２】
試験されたマーカーがマイクロＲＮＡ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａである場合、その測定は、以下の実施例に提示されているような、当技術分野において周知である多くの方法に従って実施され得る。
【００６３】
簡潔に言えば、測定は、血液試料、血漿試料又は血清試料、特に無細胞でクエン酸で誘導された血小板非含有の血漿試料から抽出された全ＲＮＡで実施される。適切な内部対照（例えば公知の配列及び品質であるマイクロＲＮＡ、例えば線虫（C.elegans）のｍｉＲ−３９）を、ＲＮＡ抽出前に試料に添加し得る。Ｃｑ値は、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して決定される。このようなアッセイを実施するための市販のキットは入手可能である。例えば、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ：ＴａｑｍａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ２０Ｘ、及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスＩＩ（アプライドバイオシステムズ社）は、製造業者の説明書に従って使用され得る。逆転写は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社）などの容易に入手可能なＰＣＲシステムを、１６℃で３０分間、次いで４２℃で３０分間及び８５℃で５分間、その後、４℃で保持するなどの適切なサイクリングパラメーターと共に使用して実施され得る。逆転写は、マルチプレックス形式で実施され得る。次いで、定量ＰＣＲを、ＣＦＸ９６ＴＭリアルタイムシステム（Ｃ１０００ＴｏｕｃｈＴＭサーマルサイクラー、バイオラッド社）などの定量ＰＣＲシステムを使用して実施する。サイクリング条件は、以下であり得る：９５℃で１０分間、次いで９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間を計５０サイクル、次いで３０℃で３０秒間。Ｃｑの測定モードは、定量ＰＣＲシステムにおいて回帰モードであり得る。特定の実施態様では、本発明の方法に従って決定されたＣｑ値は、上記の特定のパラメーター及び材料を使用して得ることのできるＣｑ値である。もしも数値が各ｍｉＲＮＡの標準曲線の最大Ｃｑを上回る場合には、試料のＣｑ値は分析から除外され得る。標準曲線を使用して、反応効率を評価し得る。
【００６４】
最も濃縮されたｃＤＮＡ試料から開始して８つの点におよぶ連続希釈が実施され得、標準曲線が、試験中に出くわし得る全ての鋳型濃度候補を確実に網羅するようにする。標準曲線は、出発鋳型量の対数を、得られたＣｑ値に対してプロットすることによって作成され得る。絶対的な定量データを得るために、合成ｈｓａ−ｍｉＲＮＡｓ（例えばインテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社製）を３．１２５fmol/mLに希釈し得、血清試料から抽出されたＲＮＡと同時に５μLを逆転写のために使用し得る。次いで、生成物を連続希釈し得、ＰＣＲを全ての試料（標準物質及び血清由来ＲＮＡ）に対して実施し得る。標準曲線を２通り作成し得、これを使用してＣｑデータ（コピー数/μL）を変換し得る。Ｃｑの測定モードは回帰であった。アルゴリズムの作成に使用されるデータはＬｏｇ１０（コピー数/血清のμL）の形式であった。
【００６５】
本発明によると、被験者は、特に対照（又は基準）試料から得られた基準値と比較した場合に、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａのレベル及び少なくとも１つの他のマーカーのレベルが上昇している場合に、ＮＡＳＨを有していると診断されるか、又はＮＡＳＨを有している可能性があるか若しくはＮＡＳＨを有するようであると診断される。基準試料は、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを有さない１人以上、例えば２人以上の被験者から得られた、血液試料、血清試料、又は血漿試料などの体液試料に相当し得る。
【００６６】
本発明において、上記のように測定された、バイオマーカーのレベル、すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（例えばｈｓ−ｍｉＲ−３４ａ）又はその共線変数の１つのレベル、及び少なくとも１つの他のマーカーのレベルも使用して、疾患スコア、別名「ＮＡＳＨスコア」を決定し得る。以下の記載におけるこのスコアは、医師及びそれを必要とする被験者の双方にとって貴重かつ強力なツールである。なぜなら、それは、非侵襲的な手技を使用して、すなわち肝生検に依拠することなく、ＮＡＳＨの診断、又はＮＡＳＨの重症度若しくはステージ若しくは活動性、しかしまた以下に列挙された全てのパラメーターの決定も可能とするからである。ＮＡＳＨスコアは、低度のＮＡＳＨ活動性と中程度のＮＡＳＨ活動性と高度のＮＡＳＨ活動性を区別する、又は中等症のＮＡＳＨと重症のＮＡＳＨとを区別する閾値と比較し得る。
【００６７】
さらに、ＮＡＳＨスコアはまた、薬物の同化に基づいた医学的処置などの、医学的処置の有効性も予測し得る。
【００６８】
ＮＡＳＨスコアは、臨床的に妥当な転帰の代理マーカーを提供する。
【００６９】
本発明によると、この情報は有利には、被験者がＮＡＳＨの治療的処置を受けるか否かを決定するために使用され得る。特定の実施態様によると、ＮＡＳＨ患者（低度、中程度、若しくは高度なＮＡＳＨ活動性、又は重症のＮＡＳＨ）として決定された被験者は、適切なＮＡＳＨの医学的処置を用いて処置されるだろう。さらなる特定の実施態様では、中程度から高度のＮＡＳＨ活動性又は重症のＮＡＳＨを有する被験者が処置されるだろう。
【００７０】
さらに、ＮＡＳＨスコアの計算は、患者が医学的処置を受け入れるか否か、すなわち、医学的処置に対する応答者又は非応答者かを予測することも可能とする。
【００７１】
同じように、ＮＡＳＨスコアは、ＮＡＳＨ患者における病態の進行又は減退の追跡を許容する。さらに、それは、医学的処置の投与後にＮＡＳＨの進行又は減退の決定を可能とする。
【００７２】
ＮＡＳＨスコアはまた、予後の評価、すなわち、肝硬変を発症するリスクなどの、患者の疾患の転帰の予測も可能とする。
【００７３】
効果的に、高いＮＡＳＨスコアは、患者にリスクがあり、マイナスな問題へと、すなわち肝硬変又はさらには死へと進行し得ることを示す。
【００７４】
したがって、本発明は、ＮＡＳＨの処置の受診者若しくは非受診者として、又は受診者候補若しくは非受診者候補として被験者を分類するための方法に関し、該方法は、上記に定義されているようなマーカーのレベルの決定、本明細書に提供されているようなＮＡＳＨスコアの計算、及び該ＮＡＳＨスコアに基づいた処置の受診者（候補）又は非受診者（候補）としての被験者の分類を含む。この分類はまた、肝生検を受けることによるなどの当技術分野において公知の方法によるＮＡＳＨのさらなる確認を、被験者が受けるべきであるかどうかをさらに決定するための根拠でもあり得る。
【００７５】
さらに、被験者の分類はまた、被験者における低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを決定し、この分類に基づいて被験者にＮＡＳＨを元に戻すための食事及び／又は生活様式の勧告を提供するために使用され得る。。
【００７６】
処置される予定の患者は、低度、中程度、若しくは高度のＮＡＳＨ活動性を有し得るか、又は重症のＮＡＳＨを呈し得る。しかしながら、好ましい実施態様によると、出願人は、処置される予定の患者は、リスクのある患者に限定されるという前提から出発する。
【００７７】
よって、本発明において考えられる患者は好ましくは中等症から重症のＮＡＳＨ患者として分類される。
【００７８】
特定の実施態様によると、本発明において、中程度から高度のＮＡＳＨ活動性として又は重症のＮＡＳＨ患者として分類された被験者は、ＮＡＳＨの処置の受診者又は受診者候補であると考えられる。
【００７９】
本発明の脈絡において、一般的にＮＡＳＨ患者は、以下の肝生検から得られた等級を呈すると定義される：
−脂肪化スコア≧１
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１
−小葉内炎症スコア≧１
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧３（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計として定義される）。
【００８０】
本発明の方法は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（例えばｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ）又はその共線変数の１つ、及び少なくとも１つの他の血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーの測定を含む。
【００８１】
特定の実施態様では、ｍｉＲＮＡ（群）のレベルの測定は、血漿試料、特に血小板非含有の血漿試料に対して行なわれる。
【００８２】
統計分析によると、バイオマーカーはまた、以下に記載のような共線性検定を通しても試験された。
【００８３】
２つ又はいくつかの変数が、０．７より優れた相関を提示する場合、患者を規定する反応変数に関するそれらの平均差の単変量検定を実施した。そのことは、共線変数もそれらが存在する場合には含まれることを意味する。単変量検定において最善の結果を有する変数が、その共線変数の中から選択された。これらの選択された変数並びに他の共線性ではない変数も、モデリングアプローチに含まれる。
【００８４】
本発明において、上記のように測定されたバイオマーカーのレベルはまた、疾患スコア、別名「ＮＡＳＨスコア」を決定するために使用され得る。
【００８５】
したがって、本発明はまた、ＮＡＳＨスコアが、測定された血液中、血清中、又は血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルから計算される方法、並びにＮＡＳＨが診断される及び／又はＮＡＳＨのステージ若しくは活動性若しくは重症度が決定される方法、並びに／あるいは、ＮＡＳＨの処置の受診者又は非受診者としての被験者の分類が決定される方法、並びに／あるいは、薬物の投与に基づいた医学的処置の有効性が決定される方法、並びに／あるいは、ＮＡＳＨ患者における病態の進行又は減退が測定される方法、並びに／あるいは医学的処置の投与後のＮＡＳＨの進行又は減退が測定される方法、並びに／あるいは医学的処置を受け入れる又は受け入れない患者の特徴が決定される方法、並びに／あるいは、予後評価、すなわち患者の疾患の転帰の予測が確立される方法、並びに／あるいは、臨床的に妥当な転帰の代理マーカーが提供される方法も記載する。
【００８６】
本発明によると、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４又はその共線変数の１つ；及び少なくとも１つの血液中、血清中、又は血漿中に循環している肝障害マーカーのレベルを測定する工程、並びに
−結果を数学的アルゴリズムを通して組み合わせることにより、ＮＡＳＨスコアを得る工程を含む。
【００８７】
特定の実施態様では、少なくとも１つの他の循環している肝障害マーカーは、α２マクログロブリン、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、フルクトサミンレベル、インスリン、Ｃ−ペプチド、インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ）、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチド、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、ＹＫＬ−４０、ＣＫ１８−Ｍ３０、ＣＫ１８−Ｍ６５、ＡＬＴ、ＡＳＴ、尿比重（Ｕｒｉ Ｓｐｅｃ Ｇｒａｖ）、尿クレアチニン、好塩基球、高感度反応性タンパク質（ＨＳＣＲＰ）、尿中β−ＮＡＧ、白血球、好中球、及びフィブリノーゲンからなる群より選択される。これらの尺度は、以下で明らかであろうように、被験者の身長の測定値などの他のパラメーターを用いて完全になり得る。特定の実施態様では、本発明の方法は、ｍｉＲ３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルの測定値と、ＹＫＬ−４０のレベルの測定値を組み合わせる。さらなる特定の実施態様では、本発明の方法は、ｍｉＲ３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルの測定値と、ＹＫＬ−４０とα２マクログロブリンのレベルの測定値を組み合わせる。別の特定の実施態様では、本発明の方法は、ｍｉＲ３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルの測定値と、ＹＫＬ−４０、α２マクログロブリン及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のレベルの測定値を組み合わせる。
【００８８】
本発明によると、本明細書に記載の方法において、対照試料のレベルと比較して、アッセイされたマーカーのレベルの変化は、ＮＡＳＨ及び／又はＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度、及び／又はＮＡＳＨの処置の受診者若しくは非受診者としての被験者の分類、及び／又は薬物の投与に基づいた医学的処置の有効性、及び／又はＮＡＳＨ患者における病態の進行若しくは減退、及び／又は医学的処置の投与後のＮＡＳＨの進行若しくは減退、及び／又は医学的処置を受け入れる若しくは受け入れない患者の特徴、及び／又は予後の評価、すなわち、患者の疾患の転帰の予測、の指標である。
【００８９】
ＮＡＳＨスコアは、「Ｓ」とも称されるが、これは特定の実施態様では、中程度から高度のＮＡＳＨ活動性又は重症のＮＡＳＨを有する確率を指し得る。
【００９０】
第一のサブクラスの患者
本発明の脈絡において、及び本発明の第一の変法において、第一のサブクラスの患者は、以下の肝生検から得られた等級を呈する患者として又はそれと等価であるとして定義される：
−脂肪化スコア≧１
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１
−小葉内炎症スコア≧１
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計である）
−線維化ステージ≧２（例えば線維化ステージは２、３又は４、特に２又は３である）。
【００９１】
以下の方法は、被験者におけるＮＡＳＨを診断するために、又は上記の肝生検から得られた等級を提示する可能性があるとして被験者を分類するために、又はＮＡＳＨ処置の受診者若しくは非受診者であると患者を特徴付けるために実施され得る。
【００９２】
第一のサブクラスの患者を同定（又は診断）するための方法の第一の変法において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４レベル、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐが測定され、共線変数は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐからなる群より選択される。
【００９３】
本発明の第一の変法の好ましい実施態様では、前記方法は
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐのレベルを測定する工程；及び
−α２マクログロブリン、
−糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、又はフルクトサミンのレベル、
−ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、
−ＹＫＬ−４０
からなる群より選択された少なくとも１つの他のマーカー、好ましくは全てのマーカーのレベルを測定する工程
を含む。
【００９４】
本発明の第一の変法の特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されているように測定された以下のマーカーのレベルから計算される：
−ｍｉＲ−３４ａ（より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル；及び
−α２マクログロブリンのレベル；及び
−ＨｂＡ１ｃのレベル；及び
−ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチドのレベル；及び
−ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル；及び
−ＹＫＬ−４０のレベル。
【００９５】
第一の変法のさらなる特定の実施態様では、スコアは、対数関数：
【数１】
2019511225.tif 000003
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ＋ｇ＊Ｇ
として定義され、
ここで、
Ｓは、本発明によるＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｂは、ＨｂＡ１ｃのレベル（％）であり（例えば、測定されたＨｂＡ１ｃの比率が１０％である場合、Ｂは１０である）；
Ｃは、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチドのレベル（ng/mL）であり；
Ｄは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｆは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｇは、ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、α２マクログロブリンのレベルに関連した係数であり；
ｂは、ＨｂＡ１ｃのレベルに関連した係数であり；
ｃは、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチドのレベルに関連した係数であり；
ｄは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｆは、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｇは、ＹＫＬ−４０のレベルに関連した係数である。
【００９６】
したがって、ＮＡＳＨスコアは、中程度から高度のＮＡＳＨ活動性又は重症のＮＡＳＨを有する確率である。
【００９７】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【００９８】
本出願の実験部に記載のようなメディアンモデルから誘導された、特定の実施態様では：
ｋは、５．９４〜５０．７４の数値であり；
ａは、０〜１．０７の数値であり；
ｂは、０〜１．２０の数値であり；
ｃは、０〜０．２４の数値であり；
ｄは、−０．９７〜０の数値であり；
ｆは、−０．８７〜０の数値であり；
ｇは、０〜１．７４×１０−５の数値であり；
ここで、閾値は、０．２０１７〜０．４６４５、より特定すると０．２３０２である。
【００９９】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２０１７〜０．４６４５の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１００】
メディアンモデルから依然として誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、２５．１３であり；
ａは、０．５２であり；
ｂは、０．５７であり；
ｃは、０．１２であり；
ｄは、−０．４３であり；
ｆは、−０．４７であり；そして
ｇは、９．５４×１０−６であり；
ここで、閾値は、０．２０１７〜０．４６４５、より特定すると０．２３０２である。
【０１０１】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２０１７〜０．４６４５の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１０２】
この特定の実施態様によると、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）は、少なくとも０．８０、好ましくは０．８２、より好ましくは０．８４である。ＡＵＣは、アルゴリズムの品質を測定するために多くの適用において使用されている非常によく知られている基準である。その数値が１に近づけば近づくほど、アルゴリズムはより良好となる。
【０１０３】
本出願の実験部に記載のようなブートストラップモデルから誘導された、別の特定の実施態様では、
ｋは、８．２４〜３５．４４の数値であり；
ａは、０．０６〜０．８８の数値であり；
ｂは、０．１４〜１．０４の数値であり；
ｃは、０．０３〜０．２３の数値であり；
ｄは、−０．７５〜−０．０５の数値であり；
ｆは、−０．７３〜−０．０７の数値であり；
ｇは、３．５９×１０−６〜１．７８×１０−５の数値であり；
ここで、閾値は０．２７１８〜０．６３９１、より特定すると０．３５０２である。
【０１０４】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２７１８〜０．６３９１の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１０５】
これもまたブートストラップモデルから誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、２１．８４であり；
ａは、０．４７であり；
ｂは、０．５９であり；
ｃは、０．１３であり；
ｄは、−０．４０であり；
ｆは、−０．４０であり；そして
ｇは、１．０７×１０−５であり；
ここで、閾値は、０．２７１８〜０．６３９１、より特定すると０．３５０２である。
【０１０６】
特定の実施態様によると、被験者は、ＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２７１８〜０．６３９１の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１０７】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２、より好ましくは０．８４である。
【０１０８】
特定の実施態様では、第一の変法について記載された上記の方法は、血漿試料から実施される。
【０１０９】
ブートストラップモデル及びメディアンモデルから誘導されたものの両方について、ＡＵＣは非常に良好である。このことは、両方のモデルを本発明において互換的に利用することができることを意味する。
【０１１０】
本発明はまた、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２（特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐ）からなる群より選択された少なくとも１つのマーカー；並びに
（ｉｉ）α２マクログロブリン；
（ｉｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、空腹時血糖値、フルクトサミンレベルからなる群より選択された少なくとも１つのマーカー；
（ｉｖ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチド；
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）、及び
（ｖｉ）ＹＫＬ−４０
から選択された少なくとも１つの他のマーカー、特に全てのマーカー
のレベルを決定するための手段を含む、キットにも関する。
【０１１１】
本発明の特定の実施態様では、前記キットは、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、
（ｉｉ）α２マクログロブリン、
（ｉｉｉ）ＨｂＡ１ｃ、
（ｉｖ）ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチド；
（ｖ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）及びＹＫＬ−４０
のレベルを決定するための手段を含む。
【０１１２】
本発明のキットは、上記の方法を実施するのに有用であり、さらに場合により、該方法を実施するための説明書を含み得る。該キットは、上記で同定されたマーカーのレベルの測定を実施するのに適した試薬及び緩衝液を含み得る。特に、該キットは、定量しようとするタンパク質に対して特異的である抗体、及び／又は、当技術分野において周知であるようなマイクロＲＮＡのレベルを定量するのに有用なプライマーを含み得る。
【０１１３】
本発明のこの第一の変法の中で、出願人は、研究をさらに進め、血清中に循環しているｍｉＲＮＡ（群）に焦点を当てることを決断した。
【０１１４】
一般的に、処置される予定のリスクのある様々な患者の血漿からの様々な循環しているマーカー、特にｍｉＲＮＡ（群）が評価される。
【０１１５】
新規なアプローチでは、出願人は、血清上に循環している様々なマーカーを評価した。血清は、全血を凝固させた後に全血をその固体成分と液体成分とに分離した時に得られる透明な黄色がかった液体として定義され得る。
【０１１６】
血清から評価されるｍｉＲＮＡ（群）は、Ｌｏｇ１０（コピー数/血清のμL）で表現され、この数値を決定するための詳細な方法を以下に提示する。
【０１１７】
別のモデルでは、血清中で評価されたｍｉＲＮＡ（群）はＣｑで表現される。
【０１１８】
本発明の第一の変法の好ましい実施態様（ここでは血清中のｍｉＲＮＡが評価されかつＣｑで表現される）によると、該方法は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はＣＫ１８−Ｍ３０、ＣＫ１８−Ｍ６５、又はＡＬＴ又はＡＳＴ、及び少なくとも１つの血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーの血清中のレベルを測定する工程、並びに
−結果を数学的アルゴリズムを通して組み合わせることによりＮＡＳＨスコアを得る工程
を含む。
【０１１９】
本発明のこの態様の別の好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はＣＫ１８−Ｍ３０、ＣＫ１８−Ｍ６５、又はＡＬＴ又はＡＳＴの血清中のレベルを測定する工程、
−α２マクログロブリンのレベルを測定する工程、
−糖化ヘモグロビンレベル（ＨｂＡ１ｃ）、空腹時血糖値、又はフルクトサミンレベルを測定する工程、
−ＹＫＬ−４０のレベルを測定する工程
を含む。
【０１２０】
本発明の第一の態様の特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されるように測定された以下のマーカーのレベルから計算される：
−血清中で測定されたｍｉＲ−３４ａ（より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル；及び
−血清中のα２マクログロブリンのレベル；及び
−血清中のＹＫＬ−４０のレベル、及び
−ＨｂＡ１ｃのレベル。
【０１２１】
この特定の実施態様によると、スコアは、ｈａｓ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）の血清中のレベルがＣｑ単位で表現されている、対数関数
【数２】
2019511225.tif 000004
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
Ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベル（％）であり（例えば、測定されたＨｂＡ１ｃの比率が１０％である場合、Ｄは１０である）；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベルに関連した係数であり；
ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベルに関連した係数であり；
ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベルに関連した係数である。
【０１２２】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨについて処置される予定であるか、又はＮＡＳＨについて処置される可能性があると分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１２３】
本出願の実験部に記載のようなブートストラップモデルから誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、９．５１〜３４．３７の数値であり；
ａは、−１．１７〜−０．４７の数値であり；
ｂは、０．０２〜０．８４の数値であり；
ｃは、６．１０×１０−６〜２．０９×１０−５の数値であり；
ｄは、０．０７〜０．８９の数値であり；
ここで、閾値は０．２０１３〜０．５９６５、より特定すると０．４６６１である。
【０１２４】
特定の実施態様によると、被験者は、ＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２０１３〜０．５９６５の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１２５】
これもまたブートストラップモデルから誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、２１．９４であり；
ａは、−０．８２であり；
ｂは、０．４３であり；
ｃは、１．３５×１０−５であり；
ｄは、０．４８であり；
ここで、閾値は０．２０１３〜０．５９６５、より特定すると０．４６６１である。
【０１２６】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２０１３〜０．５９６５の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１２７】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２である。
【０１２８】
本出願の実験部に記載のようなメディアンモデルから誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、６．０２〜５６．６９の数値であり；
ａは、−１．２６〜０．００の数値であり；
ｂは、０．００〜０．８８の数値であり；
ｃは、０．００〜２．００×１０−５の数値であり；
ｄは、０．００〜０．９６の数値であり；
閾値は、０．９７７３〜０．９９５５、より特定すると０．９９３６である。
【０１２９】
特定の実施態様によると、被験者は、ＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．９７７３〜０．９９５５の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１３０】
これもまたメディアンモデルから誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、２８．１７であり；
ａは、−０．８４であり；
ｂは、０．３６であり；
ｃは、１．２３×１０−５であり；
ｄは、０．４１であり；
ここで、閾値は０．９７７３〜０．９９５５、より特定すると０．９９３６である。
【０１３１】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．９７７３〜０．９９５５の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１３２】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも１つの０．８０、好ましくは０．８２である。
【０１３３】
ブートストラップモデル及びメディアンモデルから誘導されたものの両方について、ＡＵＣは非常に良好である。このことは、両方のモデルを本発明において互換的に利用することができることを意味する。
【０１３４】
これもまた本発明の第一の変法の特定の実施態様（ここで血清中のｍｉＲＮＡが評価され、ｌｏｇ１０（コピー数/μl）で表現される）によると、該方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＳＴ、及び少なくとも１つの血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーの血清中のレベルを測定する工程、並びに
−結果を数学的アルゴリズムを通して組み合わせることによりＮＡＳＨスコアを得る工程
を含む。
【０１３５】
本発明のこの第一の変法の別の好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＳＴの血清中レベルを測定する工程、
−α２マクログロブリンのレベルを測定する工程、
−糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のレベル、空腹時血糖値、又はフルクトサミンのレベルを測定する工程、
−ＹＫＬ−４０のレベルを測定する工程
を含む。
【０１３６】
これもまたこの特定の実施態様によると、スコアは、血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルがｌｏｇ１０（コピー数/μL）で表現されている、対数関数
【数３】
2019511225.tif 000005
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（ｌｏｇ１０）（コピー数/μL）であり；
Ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
Ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベル（％）であり（例えば、測定されたＨｂＡ１ｃの比率が１０％である場合、Ｄは１０である）；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｂは、血清中α２マクログロブリンのレベルに関連した係数であり；
ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベルに関連した係数であり； 
ｄは、ＨｂＡ１ｃのレベルに関連した係数である。
【０１３７】
したがって、ＮＡＳＨスコアは、中程度から高度のＮＡＳＨ活動性又は重症のＮＡＳＨを有する確率である。
【０１３８】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１３９】
本出願の実験部に記載のようなブートストラップモデルから誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、−１４．５０〜−７．４０の数値であり；
ａは、１．３８〜３．５８の数値であり；
ｂは、０．０２〜０．８４の数値であり；
ｃは、５．９８×１０−６〜２．０８×１０−５の数値であり；
ｄは、０．０７〜０．８９の数値であり；
ここで、閾値は０．１８９５〜０．６０８９、より特定すると０．４２５５である。
【０１４０】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．１８９５〜０．６０８９の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１４１】
これもまたブートストラップモデルから誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、−１０．９５であり；
ａは、２．４８であり；
ｂは、０．４３であり；
ｃは、１．３４×１０−５であり；
ｄは、０．４８であり；
ここで、閾値は０．１８９５〜０．６０８９、より特定すると０．４２５５である。
【０１４２】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．１８９５〜０．６０８９の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１４３】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２である。
【０１４４】
本出願の実験部に記載のようなメディアンモデルから誘導された、さらなる特定の実施態様では、
ｋは、−２７．１６〜−０．７８の数値であり；
ａは、０〜３．９７の数値であり；
ｂは、０〜０．８９の数値であり；
ｃは、０〜１．９８×１０−５の数値であり；
ｄは、０〜０．９７の数値であり；
ここで、閾値は０．１４２１〜０．４５５６、より特定すると０．３２０１である。
【０１４５】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．１４２１〜０．４５５６の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１４６】
さらなる特定の実施態様では、
ｋは、−１１．０３であり；
ａは、２．５９であり；
ｂは、０．３８であり；
ｃは、１．２１×１０−５であり；
ｄは、０．４０であり；
ここで、閾値は０．１４２１〜０．４５５６、より特定すると０．３２０１である。
【０１４７】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．１４２１〜０．４５５６の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１４８】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２である。
【０１４９】
血清中で評価されｌｏｇ１０（コピー数/μl）で表現されるｍｉＲＮＡに関するこの第一の変法の最後の実施態様では、出願人はまた、他のいくつかのバイオマーカーの測定値をｌｏｇ１０値へ変換することを決断した。このことは、上記に定義されたいくつかのマーカーの測定値が、ｌｏｇ１０で表現されることを意味する。
【０１５０】
よって、本発明の第一の態様のこの最後の実施態様によると、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＬＴ又はＡＳＴ、及び少なくとも１つの血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーの血清中のレベルを測定する工程、並びに
−結果を数学的アルゴリズムを通して組み合わせることによりＮＡＳＨスコアを得る工程
を含む。
【０１５１】
本発明のこの変法の別の好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＬＴ又はＡＳＴの血清中のレベルを測定する工程、
−ｌｏｇ１０（ＨＯＭＡ）（インスリン抵抗性指数）又は血漿中空腹時血糖、又は血清中空腹時血糖、又はｌｏｇ１０（フルクトサミン）、又はＨＢＡ１ｃ、又はインスリン、又はＣ−ペプチドのレベルを測定する工程、
−ＹＫＬ−４０のｌｏｇ１０値を測定する工程
を含む。
【０１５２】
これもまたこの特定の実施態様によると、スコアは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルがｌｏｇ１０（コピー数/μL）で表現されている、対数関数
【数４】
2019511225.tif 000006
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（ｌｏｇ１０）（コピー数/μL）であり；
Ｂは、血清中ＨＯＭＡのレベルのｌｏｇ１０であり；
Ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベルのｌｏｇ１０であり；
ｋは、対数関数の定数であり；
ａは、血清中ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベルに関連した係数であり；
ｂは、血清中ＨＯＭＡのレベルのｌｏｇ１０に関連した係数であり；
ｃは、血清中ＹＫＬ−４０のレベルのｌｏｇ１０に関連した係数である。
【０１５３】
したがって、ＮＡＳＨスコアは、中程度から高度のＮＡＳＨ活動性又は重症のＮＡＳＨを有する確率である。
【０１５４】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１５５】
本出願の実験部に記載のようなブートストラップモデルから誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、−２５．６８〜−１３．３４の数値であり；
ａは、１．６２〜３．７８の数値であり；
ｂは、０．４０〜２．５２の数値であり；
ｃは、１．３７〜３．６１の数値である。
【０１５６】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２３９２〜０．５９０７の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１５７】
依然としてブートストラップモデルから誘導されたさらなる特定の実施態様では、
ｋは、−１９．５１であり；
ａは、２．７０であり；
ｂは、１．４６であり；
ｃは、２．４９であり；
閾値は、０．２３９２〜０．５９０７、より特定すると０．５３１３である。
【０１５８】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧２を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．２３９２〜０．５９０７の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１５９】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２である。
【０１６０】
第二のサブクラスの患者
本発明の脈絡において及び本発明の第二の変法において、第二のサブクラスの患者は、以下の肝生検から得られた等級を提示する患者として又は患者に等価であるとして定義される：
−脂肪化スコア≧１
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１
−小葉内炎症スコア≧１
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計として定義される）、
−線維化ステージ≧１（例えば線維化ステージは１、２、３、又は４である）。
【０１６１】
本発明の方法は、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４又はその共線変数の１つ、及び少なくとも１つの他の血液中、血清中、若しくは血漿中に循環している肝障害マーカーの測定を含む。
【０１６２】
統計分析によると、バイオマーカーはまた、以下に記載のような共線性検定を通して試験された。
【０１６３】
第二のサブクラスの患者を同定（又は診断）するための方法の第一の変法において、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐのレベルが測定され、共線変数は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐからなる群より選択される。
【０１６４】
本発明の第二の変法の好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐのレベルを測定する工程、及び共線変数は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐからなる群より選択される、
−ＹＫＬ−４０のレベルを測定する工程；及び場合により
−尿比重（Ｕｒｉ Ｓｐｅｃ Ｇｒａｖ）又は尿クレアチニンのレベルを測定する工程；
−好塩基球のレベルを測定する工程；及び
−ＨＳＣＲＰ（高感度Ｃ反応性タンパク質）のレベルを測定する工程
を含む。
【０１６５】
メディアンモデルから誘導された本発明のこの第二の変法のより好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐのレベルを測定する工程、
−ＹＫＬ−４０のレベルを測定する工程
を含む。
【０１６６】
本発明の第二の変法の特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されたように測定された以下のマーカーのレベルから計算される：
−ｍｉＲ−３４ａ（より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル；及び
−ＹＫＬ−４０のレベル。
【０１６７】
本発明の第二の変法のさらなる特定の実施態様では、スコアは、対数関数：
【数５】
2019511225.tif 000007
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
ｋは、−１１６．０８〜４０．９７の数値であり；
ａは、−０．８２〜０の数値であり；
ｂは、０〜１．８８×１０−５の数値であり；
閾値は０．１３８７〜０．３４８１、より特定すると０．２１８７である。
【０１６８】
特定の実施態様によると、被験者は、ＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．１３８７〜０．３４８１、より特定すると０．２１８７の閾値より高い又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１６９】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１７０】
本出願の実験部に記載のようなメディアンモデルから依然として誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、１２．８７であり；
ａは、−０．４２であり；
ｂは、８．１６０×１０−６であり；
ここで、閾値は、０．１３８７〜０．３４８１、より特定すると０．２１８７である。
【０１７１】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．１３８７〜０．３４８１、より特定すると０．２１８７の閾値より高い又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１７２】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．６８、好ましくは０．７０である。
【０１７３】
ブートストラップモデルから誘導された本発明のこの第二の変法の別の好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐのレベルを測定する工程、
−ＹＫＬ−４０のレベルを測定する工程、
−尿比重のレベルを測定する工程、
−好塩基球のレベルを測定する工程、
−ＨＳＣＲＰのレベルを測定する工程
を含む。
【０１７４】
本発明の第二の変法の特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されているように測定された以下のマーカーのレベルから計算される：
−ｍｉＲ−３４ａ（より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル；及び
−ＹＫＬ−４０のレベル；及び
−尿比重のレベル；及び
−好塩基球のレベル、及び
−ＨＳＣＲＰのレベル。
【０１７５】
本発明の第二の変法のさらなる特定の実施態様では、スコアは、対数関数：
【数６】
2019511225.tif 000008
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＹＫＬ−４０のレベル（pg/ml）であり；
Ｃは、尿比重のレベル（単位なし）であり；
Ｄは、好塩基球のレベル（１×１０９/Ｌ）であり；
Ｆは、ＨＳＣＲＰのレベル（mg/dL）であり；
ｋは、−１２４．８１〜１．１３の数値であり；
ａは、−０．９１〜−０．２５の数値であり；
ｂは、４．７７×１０−６〜２．３９×１０−５の数値であり；
ｃは、１７．２１〜１４１．５１の数値であり；
ｄは、２．８０〜６０．７４の数値であり；
ｆは、０．０１〜０．２３の数値であり；
ここで、閾値は、０．５７９１〜０．８２６９、より特定すると０．７７５８である。
【０１７６】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．５７９１〜０．８２６９の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１７７】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者は脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１７８】
本出願の実験部に記載のようなブートストラップモデルから誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、−６１．８４であり；
ａは、−０．５８であり；
ｂは、１．４４×１０−５であり；
ｃは、７９．３６であり；
ｄは、３１．７７であり；
ｆは、０．１２であり；
ここで、閾値は、０．５７９１〜０．８２６９、より特定すると０．７７５８である。
【０１７９】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．５７９１〜０．８２６９の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１８０】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．７５、好ましくは０．７７である。
【０１８１】
本発明はまた、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ又はｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐからなる群より選択された少なくとも１つのマーカー、及び
（ｉｉ）ＹＫＬ−４０；及び場合により
（ｉｉｉ）尿比重（Ｕｒｉ Ｓｐｅｃ Ｇｒａｖ）又は尿クレアチニン；好塩基球；及びＨＳＣＲＰ（高感度反応性タンパク質）
のレベルを決定するための手段を含むキットにも関する。
【０１８２】
本発明の特定の実施態様では、前記キットは、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及び
（ｉｉ）ＹＫＬ−４０
のレベルを決定するための手段を含む。
【０１８３】
本発明の別の特定の実施態様では、前記キットは、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及び
（ｉｉ）ＹＫＬ−４０、及び
（ｉｉｉ）尿比重、及び
（ｉｖ）好塩基球、及び
（ｖ）ＨＳＣＲＰ
のレベルを決定するための手段を含む。
【０１８４】
本発明のキットは、上記の方法を実施するのに有用であり、さらに場合により、該方法を実施するための説明書を含み得る。該キットは、上記で同定されたマーカーのレベルの測定を実施するのに適した試薬及び緩衝液を含み得る。特に、該キットは、定量しようとするタンパク質に対して特異的である抗体、及び／又は、当技術分野において周知であるようなマイクロＲＮＡのレベルを定量するのに有用なプライマーを含み得る。
【０１８５】
第三のサブクラスの患者
本発明の脈絡において及び本発明の第三の変法において、第三のサブクラスの患者は、以下の肝生検から得られた等級を提示している患者として又は患者に等価であるとして定義される：
−脂肪化スコア≧１
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１
−小葉内炎症スコア≧１
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計として定義される）、
−線維化ステージ＝１ｂ、１ｃ、２、３、又は４。
【０１８６】
本発明の第三の変法の好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ａ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐのレベルを測定する工程、
−ＣＫ１８−Ｍ６５、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＳＴ又はＡＬＴのレベルを測定する工程、及び
−尿中β−ＮＡＧレベルを測定する工程、及び
−白血球又は好中球のレベルを測定する工程、及び
−α２マクログロブリンのレベルを測定する工程、及び場合により
−ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐのレベルを測定する工程、及び
−フィブリノーゲンのレベルを測定する工程、及び
−患者の身長を測定する工程
を含む。
【０１８７】
メディアンモデルから誘導された、本発明のこの第三の変法のより好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ａ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐのレベルを測定する工程、
−ＣＫ１８−Ｍ６５、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＳＴ又はＡＬＴのレベルを測定する工程、及び
−尿中β−ＮＡＧのレベルを測定する工程、及び
−白血球又は好中球のレベルを測定する工程、及び
−α２マクログロブリンのレベルを測定する工程、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−２００、特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐのレベルを測定する工程
を含む。
【０１８８】
メディアンモデルから誘導された、本発明のこの第三の態様の特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されているように測定された以下のマーカーのレベルから計算される：
−ｍｉＲ−３４ａ（より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル、及び
−ＣＫ１８−Ｍ６５のレベル、及び
−尿中β−ＮＡＧのレベル、及び
−白血球のレベル、及び
−α２マクログロブリンのレベル、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）のレベル。
【０１８９】
本発明の第三の変法のさらなる特定の実施態様では、スコアは、対数関数：
【数７】
2019511225.tif 000009
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ＋ｇ＊Ｇ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＣＫ１８−Ｍ６５のレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｃは、尿中β−ＮＡＧのレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｄは、白血球のレベル（１×１０９/Ｌ）であり；
Ｆは、α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｇは、ｈｓａ−ｍｉＲ-２００ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
ｋは、−６９．８９〜５７．０２の数値であり；
ａは、−１．０９〜０の数値であり；
ｂは、０〜０．００５の数値であり；
ｃは、０〜０．２８の数値であり；
ｄは、０〜０．６９の数値であり；
ｆは、０〜１．０８の数値であり；
ｇは、−０．８０〜０の数値であり；
ここで、閾値は、０．０１９７〜０．１１３６、より特定すると０．０５９２である。
【０１９０】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．０１９７〜０．１１３６、より特定すると０．０５９２の閾値より高いか又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１９１】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１９２】
依然として本出願の実験部に記載のようなメディアンモデルから誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、２４．９８であり；
ａは、−０．５４であり；
ｂは、０．００２であり；
ｃは、０．１４であり；
ｄは、０．３２であり；
ｆは、０．４３であり；及び
ｇは、−０．３７であり；
ここで、閾値は、０．０１９７〜０．１１３６、より特定すると０．０５９２である。
【０１９３】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．０１９７〜０．１１３６、より特定すると０．０５９２の閾値より高い又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１９４】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２、より好ましくは０．８３である。
【０１９５】
ブートストラップモデルから誘導された本発明のこの第三の変法のより好ましい実施態様では、前記方法は、
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ａ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ、又はｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐのレベルを測定する工程、
−ＣＫ１８−Ｍ６５、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＳＴ又はＡＬＴのレベルを測定する工程、及び
−尿中β−ＮＡＧのレベルを測定する工程、及び
−白血球又は好中球のレベルを測定する工程、及び
−α２マクログロブリンのレベルを測定する工程、及び
−フィブリノーゲンのレベルを測定する工程、及び
−身長を測定する工程
を含む。
【０１９６】
ブートストラップモデルから誘導された本発明のこの第三の変法の特定の実施態様では、本発明のＮＡＳＨスコアは、上記に提供されているように測定された以下のマーカーのレベルから計算される：
−ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐのレベル、
−ＣＫ１８−Ｍ６５のレベル、及び
−尿中β−ＮＡＧのレベル、及び
−白血球のレベル、及び
−α２マクログロブリンのレベル、
−フィブリノーゲンのレベル、
−患者の身長値。
【０１９７】
本発明の第三の変法のさらなる特定の実施態様では、スコアは、対数関数：
【数８】
2019511225.tif 000010
Ｙ＝ｋ＋ａ＊Ａ＋ｂ＊Ｂ＋ｃ＊Ｃ＋ｄ＊Ｄ＋ｆ＊Ｆ＋ｇ＊Ｇ＋ｈ＊Ｈ
として定義され、
ここで、
Ｓは、ＮＡＳＨスコアであり；
Ａは、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）のレベル（Ｃｑ）であり；
Ｂは、ＣＫ１８−Ｍ６５のレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｃは、尿中β−ＮＡＧのレベル（Ｕ/Ｌ）であり；
Ｄは、白血球のレベル（１×１０９/Ｌ）であり；
Ｆは、α２マクログロブリンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｇは、フィブリノーゲンのレベル（ｇ/Ｌ）であり；
Ｈは、身長値（cm）であり；
ｋは、８．３１〜３５．７９の数値であり；
ａは、−０．９６〜−０．２６の数値であり；
ｂは、０．０００６〜０．００３４の数値であり；
ｃは、０．０４〜０．２４の数値であり；
ｄは、０．０４〜０．５２の数値であり；
ｆは、０．０７〜０．８９の数値であり；
ｇは、０．１４〜１．２８の数値であり；
ｈは、−０．０８〜−０．００１の数値であり；
ここで、閾値は、０．３３７３〜０．７２６０、より特定すると０．６３７０である。
【０１９８】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．３３７３〜０．７２６０、より特定すると０．６３７０の閾値より高い又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０１９９】
Ｓが閾値より高いか又は等しい場合、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいはＮＡＳＨについて処置される予定であるか又はＮＡＳＨについて処置される可能性があるとして分類される。特定の実施態様によると、Ｓが閾値より低い場合、被験者は処置される予定であるか又は処置されない予定であるとして、特に処置されない予定であるとして分類され得、並びに／あるいは、被験者はその低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための食事及び／又は生活様式の勧告の受診者又は受診者候補として分類される。
【０２００】
依然として本出願の実験部に記載のようなブートストラップモデルから誘導された、特定の実施態様では、
ｋは、２２．０５であり；
ａは、−０．６１であり；
ｂは、０．００２であり；
ｃは、０．１４であり；
ｄは、０．２８であり；
ｆは、０．４８であり；
ｇは、０．７１であり；及び
ｈは、−０．０４であり；
ここで、閾値は、０．３３７３〜０．７２６０、より特定すると０．６３７０である。
【０２０１】
特定の実施態様によると、被験者はＮＡＳＨを有しているか、あるいは脂肪化スコア≧１、肝細胞の風船様腫大スコア≧１、小葉内炎症スコア≧１、ＮＡＳ≧４、及び線維化ステージ≧１ｂ、１ｃ、２、３、又は４を有しているか又は有している可能性があるとして分類されるか、並びに／あるいは、ＮＡＳＨスコアＳが０．３３７３〜０．７２６０、より特定すると０．６３７０の閾値より高い又は等しい場合、処置の受診者又は受診者候補として分類される。
【０２０２】
この特定の実施態様によると、ＡＵＣは少なくとも０．８０、好ましくは０．８２、より好ましくは０．８４である。
【０２０３】
この第三の変法によると、本発明はまた、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ−５ａ）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１２２−５ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、特にｈｓａ−ｍｉＲ−１９２−５ｐからなる群より選択された少なくとも１つのマーカー、及び
（ｉｉ）ＣＫ１８−Ｍ６５、又はＣＫ１８−Ｍ３０、又はＡＳＴ又はＡＬＴ、及び
（ｉｉｉ）尿中β−ＮＡＧ、及び
（ｉｖ）白血球又は好中球、及び
（ｖ）α２マクログロブリン、及び場合により
（ｖｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）、フィブリノーゲン、及び身長
のレベルを決定するための手段を含むキットにも関する。
【０２０４】
本発明の特定の実施態様では、前記キットは、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及び
（ｉｉ）ＣＫ１８−Ｍ６５、及び
（ｉｉｉ）尿中β−ＮＡＧ、及び
（ｉｖ）白血球、及び
（ｖ）α２マクログロブリン、及び
（ｖｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−２００（特にｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、より特定するとｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ）
のレベルを決定するための手段を含む。
【０２０５】
本発明の別の特定の実施態様では、前記キットは、
（ｉ）ｈｓａ−ｍｉＲ−３４（特にｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、より特定するとｍｉＲ−３４ａ−５ｐ）、及び
（ｉｉ）ＣＫ１８−Ｍ６５、及び
（ｉｉｉ）尿中β−ＮＡＧ、及び
（ｉｖ）白血球、及び
（ｖ）α２マクログロブリン、及び
（ｖｉ）フィブリノーゲン、及び
（ｖｉｉ）身長
のレベルを決定するための手段を含む。
【０２０６】
本発明のキットは、上記の方法を実施するのに有用であり、該方法を実施するための説明書をさらに含み得る。該キットは、上記で同定されたマーカーのレベルを測定を実施するのに適した試薬及び緩衝液を含み得る。特に、該キットは、定量しようとするタンパク質に対して特異的である抗体、及び／又は、当技術分野において周知であるようなマイクロＲＮＡのレベルを定量するのに有用なプライマーを含み得る。
【０２０７】
別の態様によると、本発明はまた、患者を分類するための様々な方法にも関する。
【０２０８】
処置法
本発明はさらに、（ａ）被験者におけるＮＡＳＨを診断するか又はＮＡＳＨの活動性、ステージ、若しくは重症度を決定する工程、ＮＡＳＨの処置の受診者又は非受診者として被験者を分類する工程、薬物の同化に基づいた医学的処置の有効性を決定する工程、ＮＡＳＨの進行又は減退を決定する工程、及び上記に提供された方法に従って患者の転帰を決定する工程；（ｂ）ＮＡＳＨのための処置を工程（ａ）に基づいて該被験者に投与する工程を含む、被験者におけるＮＡＳＨの処置法に関する。
【０２０９】
本発明はさらに、（ａ）上記に定義されているような分類法に従って前記被験者を分類する工程；（ｂ）該被験者が、工程（ａ）による処置の受診者として分類された場合、被験者にＮＡＳＨのための処置を投与する工程を含む、被験者におけるＮＡＳＨの処置法に関する。
【０２１０】
本発明はさらに、（ａ）上記に定義されているような分類法に従って前記被験者を分類する工程；（ｂ）該被験者が工程（ａ）による処置の非受診者として分類された場合、被験者に食事及び／又は生活様式の勧告を提供する工程を含む、被験者における低度のＮＡＳＨ活動性又は中等症のＮＡＳＨを管理するための方法に関する。
【０２１１】
本発明に従ってＮＡＳＨを処置するための方法は、それを必要とする被験者に対する、１つ以上の抗ＮＡＳＨ化合物（群）、例えば式（Ｉ）：
【化１】
2019511225.tif 000011
（式中、
Ｘ１は、ハロゲン基、Ｒ１基、又はＧ１−Ｒ１基を示し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基又はＣＨ２−ＣＨ２基を示し；
Ｘ２はＧ２−Ｒ２基を示し；
Ｇ１及びＧ２は、同じ又は異なり、酸素原子又は硫黄原子を示し；
Ｒ１は、水素原子、置換されていないアルキル基、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているアリール基又はアルキル基、アルコキシ基又はアルキルチオ基、シクロアルキル基、シクロアルキルチオ基、又はヘテロ環式基を示し；
Ｒ２は、少なくとも１つの−ＣＯＯＲ３基によって置換されているアルキル基を示し、ここでのＲ３は、水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、又はヘテロ環式基を示し、
Ｒ４及びＲ５は、同じ又は異なり、１つ以上のハロゲン原子によって置換されているか又は置換されていないアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロ環式基を示す）
で示される化合物又は薬学的に許容されるその塩の投与を含む。
【０２１２】
ＮＡＳＨのこの処置法の特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔｅｒｔブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸、及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸イソプロピルエステル；又は薬学的に許容されるその塩からなる群より選択される。本発明のさらなる特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン又は薬学的に許容されるその塩である。
【０２１３】
本発明のＮＡＳＨ処置法に使用され得る他の化合物としては、以下のクラス及びこれより以後の特定の化合物から選択される化合物が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【０２１４】
本発明の実施に有用な例示的で非制限的な抗ＮＡＳＨ剤としては、
−アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤；
−抗ＬＰＳ抗体；
−頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤；
−生理活性脂質；
−カンナビノイドＣＢ１受容体アンタゴニスト；
−カスパーゼ阻害剤；
−カテプシン阻害剤；
−ＣＣＲアンタゴニスト；
−ジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤；
−ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）阻害剤；
−２種類のＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）１及び４阻害剤；
−細胞外マトリックスタンパク質モジュレーター；
−ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸抱合体（ＦＡＢＡＣ）；
−ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト；
−線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ−１９）組換え体；
−線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）アゴニスト；
−ガレクチン３阻害剤；
−グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体；
−Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）モジュレーター；
−インテグリン阻害剤；
−ロイコトリエン（ＬＴ）／ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）／リポキシゲナーゼ（ＬＯ）阻害剤；
−マクロライド；
−ｍｉＲＮＡアンタゴニスト；
−モノクローナル抗体；
−ｍＴＯＲモジュレーター；
−核内受容体リガンド；
−Ｐ２Ｙ１３タンパク質アゴニスト；
−プロテアーゼ活性型受容体（ＰＡＲ）−２アンタゴニスト；
−プロテインキナーゼモジュレーター；
−ＰＰＡＲαアゴニスト；
−ＰＰＡＲγアゴニスト；
−ＰＰＡＲδアゴニスト；
−ＰＰＡＲα／γアゴニスト；
−ＰＰＡＲα／δアゴニスト；
−ＰＰＡＲγ／δ；
−ＰＰＡＲα／γ／δアゴニスト又はＰＰＡＲパンアゴニスト；
−Ｒｈｏ結合プロテインキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）阻害剤；
−シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤；
−ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）２阻害剤；
−ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸抱合体；
−甲状腺受容体β（ＴＨＲβ）アゴニスト；
−Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）アンタゴニスト；
−チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）モジュレーター；
−血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）阻害剤、及び
−ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニスト、が挙げられる。
【０２１５】
他の抗ＮＡＳＨ剤としては、ＫＢ−ＧＥ−００１及びＮＧＭ−３８６及びＮＧＭ−３９５及びＮＣ−１０及びＴＣＭ−６０６Ｆが挙げられる。
【０２１６】
本発明によると、本明細書において使用する「アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤」という用語には、ＧＳ−０９７６；ＮＤ−６５４；ＡＣ−８６３２；ＰＦ０５１７５１５７が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１７】
本発明によると、本明細書において使用する「抗ＬＰＳ抗体」という用語には、ＩＭＭ−１２４−Ｅが含まれるがこれに限定されない。
【０２１８】
本発明によると、本明細書において使用する「頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤」という用語には、Ａ−４２５０；ボリキシバット；マラリキシバット（以前はＳＨＰ−６２５）；ＧＳＫ−２３３０６７２；エロビキシバット；ＣＪ−１４１９９が含まれるがこれらに限定されない。
【０２１９】
本発明によると、本明細書において使用する「生理活性脂質」という用語には、５−ヒドロキシエイコサペンタエン酸（１５−ＨＥＰＥ、ＤＳ−１０２）が含まれるがこれに限定されない。
【０２２０】
本発明によると、本明細書において使用する「カンナビノイドＣＢ１受容体アンタゴニスト」という用語には、ナマシズマブ（namacizumab）；ＧＲＣ−１０８０１；ＭＲＩ−１５６９；ＭＲＩ−１８６７；ＤＢＰＲ−２１１；ＡＭ−６５２７；ＡＭ−６５４５；ＮＥＳＳ−１１−ＳＭ；ＣＢＸ−０２９；ＧＣＣ−２６８０；ＴＭ−３８８３７；Ｏｒｇ−５０１８９；ＰＦ−５１４２７３；ＢＭＳ−８１２２０４；ＺＹＯ−１；ＡＺＤ−２２０７；ＡＺＤ−１１７５；オテナバント；イビピナバント；スリナバント；リモナバント；ドリナバント；ＳＬＶ−３２６；Ｖ−２４３４３；Ｏ−２０９３が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２１】
本発明によると、本明細書において使用する「カスパーゼ阻害剤」という用語には、エムリカサン；ベルナカサン；ニボカサン；ＩＤＮ−７３１４；Ｆ−５７３；ＶＸ−１６６；ＹＪＰ−６０１０７；ＭＸ−１１２２；ＩＤＮ−６７３４；ＴＬＣ−１４４；ＳＢ−２３４４７０；ＩＤＮ−１９６５；ＶＸ−７９９；ＳＤＺ−２２０−９７６；Ｌ−７０９０４９が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２２】
本発明によると、本明細書において使用する「カテプシン阻害剤」という用語には、ＶＢＹ−３７６；ＶＢＹ−８２５；ＶＢＹ−０３６；ＶＢＹ−１２９；ＶＢＹ−２８５；Ｏｒｇ−２１９５１７；ＬＹ３０００３２８；ＲＧ−７２３６；ＢＦ／ＰＣ−１８が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２３】
本発明によると、本明細書において使用する「ＣＣＲアンタゴニスト」という用語には、セニクリビロック（ＣＣＲ２／５アンタゴニスト）；ＰＧ−０９２；ＲＡＰ−３１０；ＩＮＣＢ−１０８２０；ＲＡＰ−１０３；ＰＦ−０４６３４８１７；ＣＣＸ−８７２が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２４】
本発明によると、本明細書において使用する「ジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ阻害剤」という用語には、ＩＯＮＩＳ−ＤＧＡＴ２Ｒｘ（以前はＩＳＩＳ−ＤＧＡＴ２Ｒｘ）；ＬＹ−３２０２３２８；ＢＨ−０３００４；ＫＲ−６９５３０；ＯＴ−１３５４０；ＡＺＤ−７６８７；ＡＢＴ−０４６が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２５】
本発明によると、本明細書において使用する「ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤」という用語には、エボグリプチン；ビルダグリプチン；フォタグリプチン（fotagliptin）；アログリプチン；サキサグリプチン；チログリプチン（tilogliptin）；アナグリプチン；シタグリプチン；レタグリプチン（retagliptin）；メログリプチン；ゴソグリプチン；トレラグリプチン；テネリグリプチン；デュトグリプチン；リナグリプチン；ゲミグリプチン；ヨグリプチン（yogliptin）；ベタグリプチン（betagliptin）；イミグリプチン；オマリグリプチン；ビダグリプチン；デナグリプチンが含まれるがこれらに限定されない。
【０２２６】
本発明によると、本明細書において使用する「２種類のＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）１及び４阻害剤」という用語には、ＧＫＴ−８３１（以前はＧＫＴ１３７８３１）；ＧＫＴ−９０１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２７】
本発明によると、本明細書において使用する「細胞外マトリックスタンパク質モジュレーター」という用語には、ＣＮＸ−０２４；ＣＮＸ−０２５；ＳＢ−０３０が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２８】
本発明によると、本明細書において使用する「ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト」という用語には、オベチコール酸；ＧＳ−９６７４；ＬＪＮ−４５２；ＥＤＰ−３０５；ＡＫＮ−０８３；ＩＮＴ−７６７；ＧＮＦ−５１２０；ＬＹ２５６２１７５；ＩＮＶ−３３；ＮＴＸ−０２３−１；ＥＰ−０２４２９７；Ｐｘ−１０３；ＳＲ−４５０２３が含まれるがこれらに限定されない。
【０２２９】
本発明によると、本明細書において使用する「線維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ−１９）組換え体」という用語には、ＮＧＭ−２８２が含まれるがこれに限定されない。
【０２３０】
本発明によると、本明細書において使用する「線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）アゴニスト」という用語には、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１（以前はＢＭＳ−９８６０３６）；ＹＨ−２５３４８；ＢＭＳ−９８６１７１；ＹＨ−２５７２３；ＬＹ−３０２５８７６；ＮＮＣ−０１９４−０４９９が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３１】
本発明によると、本明細書において使用する「ガレクチン３阻害剤」という用語には、ＧＲ−ＭＤ−０２；ＴＤ−１３９；ＡＮＧ−４０２１；ガレクチン−３Ｃ；ＬＪＰＣ−２０１；ＴＦＤ−１００；ＧＲ−ＭＤ−０３；ＧＲ−ＭＤ−０４；ＧＭ−ＭＤ−０１；ＧＭ−ＣＴ−０１；ＧＭ−ＣＴ−０２；Ｇａｌ−１００；Ｇａｌ−２００が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３２】
本発明によると、本明細書において使用する「グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似体」という用語には、セマグルチド；リラグルチド；エキセナチド；アルビグルチド；デュラグルチド；リキシセナチド；ロキセナチド（loxenatide）；エフェグレナチド（efpeglenatide）；タスポグルチド；ＭＬＣ−２５３；ＤＬＰ−２０５；ＯＲＭＤ−０９０１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３３】
本発明によると、本明細書において使用する「Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）モジュレーター」という用語には、ＣＮＸ−０２３が含まれるがこれに限定されない。
【０２３４】
本発明によると、本明細書において使用する「インテグリン阻害剤」という用語には、プライアント・セラピューティクス社のインテグリン阻害剤；インダロ・セラピューティクス社のインテグリン阻害剤；セントルイス大学のインテグリン阻害剤；ＰｒｏＡｇｉｏ；ＧＳＫ−３００８３４８が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３５】
本発明によると、本明細書において使用する「ロイコトリエン／ホスホジエステラーゼ／リポキシゲナーゼ阻害剤」という用語には、チペルカスト（以前はＭＮ−００１）；トメルカスト；スルカスト；マシルカスト；ザフィルルカスト；プランルカスト；モンテルカスト；ゲミルカスト；ベルルカスト；アクルカスト（aklukast）；ポビリカスト（pobilikast）；シナルカスト；イラルカストが含まれるがこれらに限定されない。
【０２３６】
本発明によると、本明細書において使用する「マクロライド」という用語には、ソリスロマイシン；アジスロマイシン；エリスロマイシンが含まれるがこれらに限定されない。
【０２３７】
本発明によると、本明細書において使用する「ｍｉＲＮＡアンタゴニスト」という用語には、ＲＧ−１２５（以前はＡＺＤ４０７６）；ＲＧＬＳ−５０４０；ＲＧ−１０１；ＭＧＮ−５８０４；ＭＲＧ−２０１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２３８】
本発明によると、本明細書において使用する「メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）刺激因子」という用語には、エラストミックス社のＭＭＰ−９刺激因子が含まれるがこれに限定されない。
【０２３９】
本発明によると、本明細書において使用する「モノクローナル抗体」という用語には、ベルチリムマブ；ＮＧＭ−３１３；ＩＬ−２０を標的化するｍＡｂ；フレソリムマブ（抗ＴＧＦβ抗体）（以前はＧＣ１００８）；チモルマブ（timolumab）（以前はＢＴＴ−１０２３）；ナマシズマブ（namacizumab）；オマリズマブ；ラニビズマブ；ベバシズマブ；レブリキズマブ；エプラツズマブ；フェルビズマブ；マツズマブ；モナリズマブ；レスリズマブ；イネビリズマブが含まれるがこれらに限定されない。
【０２４０】
本発明によると、本明細書において使用する「ｍＴＯＲモジュレーター」という用語には、ＭＳＤＣ−０６０２；ＳＶＰ−シロリムスと共投与されるＡＡＶ遺伝子療法が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４１】
本発明によると、本明細書において使用する「核内受容体リガンド」という用語には、ＤＵＲ−９２８（以前はＤＶ９２８）が含まれるがこれに限定されない。
【０２４２】
本発明によると、本明細書において使用する「Ｐ２Ｙ１３タンパク質アゴニスト」という用語には、ＣＥＲ−２０９が含まれるがこれに限定されない。
【０２４３】
本発明によると、本明細書において使用する「プロテアーゼ活性型受容体（ＰＡＲ）−２アンタゴニスト」という用語には、ＰＺ−２３５；ＮＰ−００３が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４４】
本発明によると、本明細書において使用する「プロテインキナーゼモジュレーター」という用語には、ＣＮＸ−０１４；ＭＢ−１１０５５；ＡＬＦ−１；マンギフェリン；アムレキサノックス；ＧＳ−４４４２１７；ＲＥＧ−１０１；バリンが含まれるがこれらに限定されない。
【０２４５】
本発明によると、本明細書において使用する「ＰＰＡＲαアゴニスト」という用語には、フェノフィブラート、シプロフィブラート、ペマフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ビニフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブリン酸、ニコフィブラート、ピリフィブラート、プラフィブリド、ロニフィブラート、テオフィブラート、トコフィブラート、ＳＲ１０１７１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４６】
本発明によると、本明細書において使用する「ＰＰＡＲγアゴニスト」という用語には、ピオグリタゾン、重水素化ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、エファツタゾン（efatutazone）、ＡＴｘ０８−００１、ＯＭＳ−４０５、ＣＨＳ−１３１、ＴＨＲ−０９２１、ＳＥＲ−１５０−ＤＮ、ＫＤＴ−５０１、ＧＥＤ−０５０７−３４−Ｌｅｖｏ、ＣＬＣ−３００１、ＡＬＬ−４が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４７】
本発明によると、本明細書において使用する「ＰＰＡＲδアゴニスト」という用語には、ＧＷ５０１５１６（エンデュラボル（Endurabol）、すなわち（｛４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］−２−メチルフェノキシ｝酢酸））又はＭＢＸ８０２５（セラデルパル（Seladelpar）、すなわち｛２−メチル−４−［５−メチル−２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イルメチルスルファニル］−フェノキシ｝−酢酸）又はＧＷ０７４２（［４−［［［２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチル−５−チアゾリル］メチル］チオ］−２−メチルフェノキシ］酢酸）又はＬ１６５０４１又はＨＰＰ−５９３又はＮＣＰ−１０４６が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４８】
本発明によると、本明細書において使用する「ＰＰＡＲα／γアゴニスト」（グリタザルとも命名される）という用語には、サログリタザル、アレグリタザル、ムラグリタザル、テサグリタザル、ＤＳＰ−８６５８が含まれるがこれらに限定されない。
【０２４９】
エラフィブラノールの他に、例示的なＰＰＡＲα／δアゴニストには、Ｔ９１３６５９が含まれるがこれに限定されない。
【０２５０】
本発明によると、本明細書において使用する「ＰＰＡＲγ／δアゴニスト」という用語には、抱合したリノール酸（ＣＬＡ）、Ｔ３Ｄ−９５９が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５１】
本発明によると、本明細書において使用する「ＰＰＡＲα／γ／δアゴニスト」又は「ＰＰＡＲパンアゴニスト」という用語には、ＩＶＡ３３７又はＴＴＡ（テトラデシルチオ酢酸）又はババチニン又はＧＷ４１４８又はＧＷ９１３５、又はベザフィブラート又はロベグリタゾン、又はＣＳ０３８が含まれるがこれに限定されない。
【０２５２】
本発明によると、本明細書において使用する「Ｒｈｏ結合プロテインキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）阻害剤」という用語には、ＫＤ−０２５；ＴＲＸ−１０１；ＢＡ−１０４９；ＬＹＣ−５３９７６；ＩＮＳ−１１７５４８；ＲＫＩ−１４４７が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５３】
本発明によると、本明細書において使用する「シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤」という用語には、ＧＳ−４９９７が含まれるがこれに限定されない。
【０２５４】
本発明によると、本明細書において使用する「ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）２阻害剤」という用語には、レモグリフロジン；ダパグリフロジン；エンパグリフロジン；エルツグリフロジン；ソタグリフロジン；イプラグリフロジン；チアナグリフロジン；カナグリフロジン；トフォグリフロジン；ジャナグリフロジン（janagliflozin）；ベキサグリフロジン；ルセオグリフロジン；セルグリフロジン；ＨＥＣ−４４６１６；ＡＳＴ−１９３５；ＰＬＤ−１０１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５５】
本発明によると、本明細書において使用する「ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸抱合体」という用語には、アラムコール；ＧＲＣ−９３３２；ステアムコール（steamchol）；ＴＳＮ−２９９８；ＧＳＫ−１９４００２９；ＸＥＮ−８０１が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５６】
本発明によると、本明細書において使用する「甲状腺受容体β（ＴＨＲβ）アゴニスト」という用語には、ＶＫ−２８０９；ＭＧＬ−３１９６；ＭＧＬ−３７４５；ＳＫＬ−１４７６３；ソベチロム；ＢＣＴ−３０４；ＺＹＴ−１；ＭＢ−０７８１１；エプロチロムが含まれるがこれらに限定されない。
【０２５７】
本発明によると、本明細書において使用する「Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）アンタゴニスト」という用語には、ナルトレキソン；ＪＫＢ−１２１；Ｍ−６２８１２；レサトルビド；デンドロフィリン（dendrophilin）；ＣＳ−４７７１；ＡｙｕＶ−１；ＡｙｕＶ−２５；ＮＩ−０１０１；ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７；エリトランが含まれるがこれらに限定されない。
【０２５８】
本発明によると、本明細書において使用する「チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）モジュレーター」という用語には、ＣＮＸ−０２５；ＫＢＰ−７０１８が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５９】
本発明によると、本明細書において使用する「血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）阻害剤」という用語には、ＰＸＳ−４７２８Ａ；ＣＰ−６６４５１１；ＰＲＸ−１６７７００；ＡＳＰ−８２３２；ＲＴＵ−１０９６；ＲＴＵ−００７；ＢＴＴ−１０２３が含まれるがこれらに限定されない。
【０２６０】
本発明によると、本明細書において使用する「ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニスト」という用語には、カルシフェロール；アルファカルシドール；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３；ビタミンＤ２；ビタミンＤ３；カルシトリオール；ビタミンＤ４；ビタミンＤ５；ジヒドロタキステロール；カルシポトリオール；タカルシトール；１，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３；パリカルシトールが含まれるがこれらに限定されない。
【０２６１】
本発明はまた、他の肝疾患、より特定すると線維性肝疾患、例えばウイルス性肝炎（ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、アルコール性脂肪性肝炎、胆道疾患（原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠乏症）にも関する。
【０２６２】
実施例
材料及び方法
試料の収集及び分析
臨床試験
臨床試験（ＮＡＳＨの第２相ＧＯＬＤＥＮ−５０５試験（ＧＦＴ５０５−２１２−７−ＮＣＴ０１６９４８４９）は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）患者における脂肪性肝炎に対する１日１回のエラフィブラノール（１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロップ−２−エン−１−オン）の有効性及び安全性を評価するための、多施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験である。
【０２６３】
他の病因の肝疾患を適切に排除した後に、肝生検を実施して、ＮＡＳＨの診断を確定した。ＮＡＳＨは、無作為化前の６カ月間以内に肝生検によって評価したところ脂肪性肝炎と診断された。脂肪性肝炎の確定は、肝生検材料の中心部分を解読することに基づいた。ＮＡＳＨ患者は、脂肪化スコア≧１及び肝細胞の風船様腫大≧１及び小葉内炎症≧１を含む、ＮＡＳ≧３を用いて定義された。
【０２６４】
各々の治験参加中心施設における試験は、適切な規制機関によって認可され、全ての患者が医学研究への参加について同意した。
【０２６５】
ＮＡＳＨの第２相ＧＯＬＤＥＮ−５０５試験に由来する血漿試料を使用して、ＮＡＳＨの最も強力かつ重要なマーカー（群）を同定した。
【０２６６】
他の病因の肝疾患を適切に排除した後に、肝生検を実施して、ＮＡＳＨの診断を確定した。
【０２６７】
ＮＡＳＨは、無作為化前の６カ月間以内に肝生検によって評価したところ脂肪性肝炎と診断された。脂肪性肝炎の確定は、肝生検材料の中心部分を解読することに基づいた。各々の治験参加中心施設における試験は、適切な規制機関によって認可され、全ての患者が医学研究への参加について同意した。
【０２６８】
血液サンプリング及び臨床検査
血液試料は、中央検査機関のプロトコール及びマニュアル−ジェンフィット社−ＧＦＴ５０５−２１２−７に従って収集された。
【０２６９】
試験プロトコールに従って、以下の分析を実施した。
【０２７０】
血液検査には、ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球、白血球数、白血球分画（好中球、リンパ球、好酸球、単球、好塩基球の全体数及び％値）、血小板、及び網状赤血球が含まれる。
【０２７１】
生化学検査Ｉには、血漿中グルコース、トリグリセリド（ＴＧ）、クレアチニン、クレアチニンクリアランス、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アルカリホスファターゼ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及びＨｂＡ１ｃが含まれる。
【０２７２】
生化学検査ＩＩには、血漿中グルコース、クレアチニン、クレアチニンクリアランス、総タンパク質、アルブミン、ナトリウム、カリウム、クロライド、カルシウム、尿酸、血液尿素窒素（ＢＵＮ）として表現される尿素、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ、クレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、総ビリルビン、抱合型ビリルビン、Ｃ反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、及びＨｂＡ１ｃが含まれる。
【０２７３】
尿検査には、
−ディップスティック分析（比重、ｐＨ、赤血球、白血球、グルコース、タンパク質、ケトン、ビリルビン、ウロビリノーゲン、及び硝酸塩）、
−顕微鏡分析は、赤血球、白血球、キャスト（ｃａｓｔ）、結晶、細菌、上皮細胞、及び酵母を含む、
−化学分析（アルブミン及びクレアチニン）
が含まれる。
【０２７４】
血清検査には、ＨＩＶ抗体Ｉ／ＩＩ、ＨＣＶ抗体、ＨＣＶ ＲＮＡ（ＨＣＶ ＲＮＡの来診時の試料を受け取った時、及びＨＣＶ抗体について「反応性あり」又は「未定」の結果の場合にのみ検査する）及びＨｂｓＡｇが含まれる。
【０２７５】
脂質検査には、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール、ノンＨＤＬ−Ｃ（計算値）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ−Ｃ）（計算値）、計算された超低密度リポタンパク質コレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）（計算値）、アポリポタンパク質ＡＩ（ＡｐｏＡＩ）、及びアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）が含まれる。
【０２７６】
尿化学検査には、α−１−ミクログロブリン、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧ）及び好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（Ｎ−Ｇａｌ）が含まれる。
【０２７７】
安全性マーカーには、ホモシステイン、ＮＴ−ＰｒｏＢＮＰ、トロポニンＴ、シスタチンＣ、及びβ２−ミクログロブリンが含まれる。
【０２７８】
血糖及び他の脂質に関するパラメーターには、レプチン、インスリン、インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）、血清中グルコース（ＨＯＭＡ−ＩＲの計算のための）、フルクトサミン、Ｃ−ペプチド、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が含まれる。
【０２７９】
炎症マーカーには、ハプトグロビン、フィブリノーゲン、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、及びプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）抗原（クエン酸塩）が含まれる。
【０２８０】
肝マーカーには、サイトケラチン−１８（ＣＫ１８）（Ｍ６５及びＭ３０）、アディポネクチン、フェリチン、α２マクログロブリン、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１、ヒアルロン酸（シーメンス社（ベルギー）によって入手され、経由してジェンフィット社に請求された試薬であるアドヴィアケンタウルス）、ＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端プロ−ペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）（シーメンス社（ベルギー）によって入手された試薬であるアドヴィアケンタウルス）、及び組織マトリックスメタロプロテアーゼ−１阻害剤（ＴＩＭＰ−１）（シーメンス社によって入手された試薬であるアドヴィアケンタウルス）が含まれる。
【０２８１】
各々の生化学アッセイのための方法、機器、及び製造業者のリストをこの表に報告する。
【０２８２】
【表２】
2019511225.tif 000012
【０２８３】
【表３】
2019511225.tif 000013
【０２８４】
試料の収集及び保存
このバイオマーカー試験に使用される血液試料は、処置期間前の５０５．２１２．７試験の患者から得た。追加の試料の収集、保存、及び使用のための書面によるインフォームドコンセントが、各患者から得られた。
【０２８５】
クエン酸塩を含有しているチューブに収集された血液 ２．７mLは、収集から１５分以内に、１，５００×ｇで１５分間の遠心分離によって血球から無細胞血漿を分離することによって処理された。上澄みの血漿を新しいチューブに移した。チューブを−７０℃に保った。ＲＮＡの抽出へと進めるために、次いで、血漿チューブを１３，０００×ｇで２分間遠心分離にかけて、血小板をペレット化し除去した。上澄みの血小板非含有血漿を新しいチューブに移し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存した。
【０２８６】
クエン酸の添加された血漿中の全ＲＮＡの抽出及びｍｉＲＮＡの定量
ｍｉＲＮＡの保存された全ＲＮＡを、４００μlの血小板非含有の血漿から、ｍｉＲＮｅａｓｙ抽出キット（ｍｉＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（カタログ番号２１７１８４））によって及び製造業者の説明書に従って１：５の血漿／ＱＩＡｚｏｌ比を使用して抽出した。合成スパイクイン線虫（C.elegans）ｍｉＲ−３９を、ＲＮＡ抽出プロセスの内部対照として、ＲＮＡ抽出前に試料［３．１２５fmol］に加えた。１８μlの溶出緩衝液中で溶出を行なった。
【０２８７】
成熟ｍｉＲＮＡの発現は、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ：ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（参照番号：４３６６５９６、アプライドバイオシステムズ社、カールズバッド、ＣＡ州）、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ２０Ｘ（参照番号：４４４０８８７、アプライドバイオシステムズ社）、及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスＩＩ（参照番号：４４４００４０、アプライドバイオシステムズ社）を使用して製造業者の説明書に従って検出された。
【０２８８】
逆転写は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００サーマルサイクラー（参照番号：２００００５、アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１６℃で３０分間、その後、４２℃で３０分間及び８５℃で５分間、その後、４℃で保持するというサイクリング条件で実施された。逆転写は、ＲＮＡ試料を保存するために４つのｍｉＲＮＡ特異的逆プライマーを用いて多重化された。定量ＰＣＲは、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステム（Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー、バイオラッド社）を使用して、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間を計５０サイクル、並びに３０℃で３０秒間のサイクリング条件で実施された。
【０２８９】
関心対象の候補のｍｉＲＮＡに対する特異的なプライマーの配列は、以下の表２に従って選択された。
【０２９０】
【表４】
2019511225.tif 000014
【０２９１】
アルゴリズムの作成に使用されたデータは、Ｃｑの形式であった。Ｃｑの測定モードは回帰であった。
【０２９２】
血清中の全ＲＮＡの抽出及びｍｉＲＮＡの定量
ｍｉＲＮＡの保存された血清中の全ＲＮＡを、１００μlの血清から、ｍｉＲＶａｎａＰａｒｉｓ抽出キット（ＡＭ１５５６、アンビオン社）によって製造業者の説明書に従って抽出した。合成スパイクイン線虫（C.elegance）のｍｉＲ−３９を、ＲＮＡ抽出プロセスの内部対照として、ＲＮＡ抽出前に試料［３．１２５fmol］（ＭＳＹ０００００１０、キアゲン社）に加えた。１００μlの溶出緩衝液中で溶出を行なった。
【０２９３】
成熟ｍｉＲＮＡの発現は、Ｔａｑｍａｎ ｍｉＲＮＡ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ：ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（参照番号：４３６６５９６、アプライドバイオシステムズ社、カールズバッド、ＣＡ州）、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイ２０Ｘ（参照番号：４４４０８８７、アプライドバイオシステムズ社）、及びＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックスＩＩ（参照番号：４４４００４０、アプライドバイオシステムズ社）を使用して製造業者の説明書に従って検出された。
【０２９４】
逆転写は、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００サーマルサイクラー（参照番号：２００００５、アプライドバイオシステムズ社）を使用して、１６℃で３０分間、その後、４２℃で３０分間及び８５℃で５分間、その後、４℃で保持するというサイクリング条件で実施された。逆転写は、貴重なＲＮＡ試料を保存するために４つのｍｉＲＮＡ特異的逆プライマーを用いて多重化された。
【０２９５】
定量ＰＣＲは、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムシステム（Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ（商標）サーマルサイクラー、バイオラッド社）を使用して、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で６０秒間を計５０サイクル、並びに３０℃で３０秒間のサイクリング条件で実施された。
【０２９６】
関心対象のｍｉＲＮＡに対する特異的プライマーの配列は、以下の表に従って選択された：
【表５】
2019511225.tif 000015
【０２９７】
合成ｈｓａ−ｍｉＲＮＡ（インテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ社）を３．１２５fmol/mLに希釈し、５μLを、血清試料から抽出されたＲＮＡと同時に逆転写のために使用した。生成物を連続希釈し、全ての試料（標準物質及び血清由来ＲＮＡ）にＰＣＲを実施した。標準曲線を二通り作成し、これを使用してＣｑデータ（コピー数/μL）を変換した。Ｃｑ測定モードは回帰であった。アルゴリズムの作成に使用されたデータはＬｏｇ１０（コピー数/血清のμL）の形式であった。
【０２９８】
【表６】
2019511225.tif 000016
【０２９９】
統計分析
目的及び定義
これらの分析の目的は、処置される予定のＮＡＳＨ患者の同定に関連し得るバイオマーカーを発見することであった。処置される予定の患者（ＴＢＴ）（to be treated）は、試験の異なる部分に応じて異なって定義された。
【０３００】
本発明の第一の態様によると、ＴＢＴは、
−脂肪化スコア≧１、
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１、
−小葉内炎症スコア≧１、
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計として定義される）、
−線維化ステージ≧２（例えば線維化ステージは２、３、又は４、特に２又は３である）
として定義される。
【０３０１】
本発明の第二の態様によると、ＴＢＴは、
−脂肪化スコア≧１、
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１、
−小葉内炎症スコア≧１、
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計として定義される）、
−線維化ステージ≧１（例えば線維化ステージは１、２、３、又は４である）
として定義される。
【０３０２】
本発明の第三の態様によると、ＴＢＴは、
−脂肪化スコア≧１、
−肝細胞の風船様腫大スコア≧１、
−小葉内炎症スコア≧１、
−ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ活動性スコア）≧４（ＮＡＳは、脂肪化スコアと肝細胞の風船様腫大スコアと小葉内炎症スコアの合計として定義される）、
−線維化ステージ＝１ｂ、１ｃ、２、３、又は４
として定義される。
【０３０３】
他の患者は、処置される予定がない（ＮＴＢＴ）と記載された。分析のために、ＴＢＴ患者は反応変数１と分類され、ＮＴＢＴは反応変数０と分類された。上記に示されているように、説明変数は、人口統計学的記録（年齢、性別、人種）、地域に関する記録（治験中心施設、国、大陸）、又は医療（糖尿病）記録がある限りにおいて、血液試料中（血液検査、生化学検査、凝固、肝マーカー、循環しているｍｉＲＮＡ）又は尿試料中（ディップスティック、沈渣）で測定された多種多様なバイオマーカーを包含した。
【０３０４】
データセットの管理
この試験に使用されるデータセットは、Ｇｏｌｄｅｎ−５０５試験から得られ、最初は２７４人の患者及び１２１個の変数から構成された。データセット管理は、以下の工程を含んでいた：
１．ｍｉＲＮＡの測定を行なわなかった患者の除去
２．１０個を超える欠落値を有する変数の除去
３．極値を有する患者及び欠落値の残っている２８人の患者の除去
【０３０５】
２１２人の患者に対して実施された血清に関する方法を除く本発明の全ての方法のための２１６人の患者、及び説明変数間の共線性を試験するために使用された１１２個の変数を有するデータセットが得られた。
【０３０６】
共線性の試験
量的変数間のピアソン相関を２つずつ計算した。２つの変数が、血漿中ｍｉＲＮＡを使用した分析において０．７を超える相関、又は血清中ｍｉＲＮＡを使用した分析では０．６を超える相関を提示した場合に、患者のＴＢＴを規定する反応変数に関するその平均差の単変量検定を実施した。選択された変数はより有意であった。
【０３０７】
共線変数及び選択された変数を表３から表８に提示する。
【０３０８】
これらの変数は患者の定義に依存し、したがって、患者のカテゴリー毎に変化を受け易い。
【０３０９】
メディアンモデル
メディアンモデリングプロセスは、ＴＢＴ／ＮＴＢＴ患者の２/３に相当する訓練セット及びＴＢＴ／ＮＴＢＴ患者の残りの１/３に相当する検証セットのデータセットのサンプリングから始まる。このサンプリングは１００万回無作為に行なわれ、訓練セットと検証セットとの間に同質性を示す試料（２つのセット間の全ての説明変数において有意差は全くない）を、分析のために保持する。各訓練セットにおける説明変数（バイオマーカー）に関連した反応変数（ＴＢＴ／ＮＴＢＴ患者を規定する）のロジスティック一般化線形モデルをコンピューター計算する。各訓練セットモデルについて変数の後退選択を実施し、最も低い赤池情報量基準（ＡＩＣ）によって最適なモデルが発見される。それ故、全ての説明変数は、各訓練セットについてモデル係数を有する。メディアンアルゴリズムは、ゼロとは異なる係数の中央値を示す変数及びそれらの対応する係数を使用して作成される。このアルゴリズムは各検証セットにおいて検証され（ＲＯＣ、ＡＵＣ、最適な閾値、全体的な正確度、感度、特異性、陽性反応適中度、及び陰性反応適中度の計算）、最適な閾値の中央値が得られる。ブートストラップモデルとの比較のために、メディアンモデルはまた、検証のために全データセットにも適用される。
【０３１０】
ブートストラップモデル
ブートストラップモデリングプロセスにおいて、説明変数（バイオマーカー）に関連した反応変数（ＴＢＴ／ＮＴＢＴ患者を規定する）のロジスティック一般化線形モデルを、全データセットに由来する全ての患者に関してコンピューター計算する。変数の後退選択が実施され、最適なアルゴリズムはＡＩＣを使用して選択される。次いで、この最適なアルゴリズムからの変数係数の有意性を、１０００個のブートストラップ試料を使用してアルゴリズムを行なうことによって試験する。ゼロを除外した９５％の信頼区間を示す係数を有意と判断する。次いで、アルゴリズムを、ＲＯＣ、ＡＵＣ、最適な閾値、全体的な正確度、感度、特異性、陽性反応適中度、及び陰性反応適中度を計算することによって検証する。
【０３１１】
他のＮＡＳＨスコアリング法との比較
ＮＡＳＨスコアを確立するための方法は、以前に文献に記載されていた：
−ＮＡＦＬＤ線維化スコア（Ａｎｇｕｌｏ指数）（Angulo et al, 2007）、
−ＥＬＦ（Guha et al, 2008）（ＥＬＦ明細シートhttp://www.healthcare.siemens.com/clinical-specialities/liver-disease/elf-test-now-availも参照）、
−フィブロテスト（Ratziu et al, 2006）、
−フィブロメーター（Cales et al, 2009）、
−ＦＬＩ（Bedogni et al, 2006）、
−線維化スコア又はステアトテスト（SteatoTest）（Poynard et al, 2005）。
【０３１２】
本発明者らはこのようにして、多くのこれらの以前の方法を使用して本発明のＮＡＳＨスコアを評価した。
【０３１３】
本発明の様々なモデルのスコアと他のスコアとの間の比較、及び本発明の様々なモデルのスコアと個々の変数との間の比較を、表９〜１３に提示する。
【０３１４】
本明細書に提示されたデータは、ＮＡＳＨ患者又はＮＡＳＨ患者候補の同定、ＮＡＳＨの活動性、ステージ又は重症度の決定の正確度の見事な改善を示す。この知見は最も重要であり、患者の管理効率を改善するための価値あるツールであるだろう。
【０３１５】
【表７】
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【０３１６】
【表８】
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【０３１７】
【表９】
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【０３１８】
【表１０】
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【０３１９】
【表１１】
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【０３２０】
【表１２】
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【０３２１】
【表１３】
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【０３２２】
【表１４】
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【０３２３】
【表１５】
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【０３２４】
【表１６】
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【０３２５】
【表１７】
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【０３２６】
参考文献
【表１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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