(57)【要約】  炎症性サイトカインＩＬ−１ファミリ−分子、ＩＬ−１７ファミリ−分子の阻害剤、特にＩＬ−１７Ｆ阻害剤を含む腸疾患治療用医薬組成物が提供される。また、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤とＩＬ−１７Ａ（ＩＬ−１７）阻害剤を含む腸疾患治療用医薬組成物が提供される。大腸癌発症時における炎症性サイトカインＩＬ−１ファミリ−分子やＩＬ−１７ファミリ−分子は腫瘍形成促進に働いており、これらのサイトカインを抑制することで腫瘍形成を抑制出来ることが見出された。
2011096438.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１７Ｆ阻害剤を含む腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記ＩＬ−１７Ｆ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ｆ抗体である、請求項１に記載の腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項３】
ＩＬ−１７Ａ阻害剤と組み合わせて使用する、請求項１記載の腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項４】
ＩＬ−１７Ａ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ａ抗体であり、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ｆ抗体である、請求項３に記載の腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項５】
前記腸疾患が、腸管内のポリプ又は癌である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項６】
前記腸管内のポリプ又は癌が、大腸ポリプ又は大腸癌である、請求項５に記載の腸疾患治療用医薬組成物。
【請求項７】
腸疾患を治療する方法であって、当該治療が必要な患者に対してＩＬ−１７Ｆ阻害剤の治療有効量を投与することを含む、腸疾患の治療方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−１７Ｆ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ｆ抗体である、請求項７に記載の治療方法。
【請求項９】
更に、ＩＬ−１７Ａ阻害剤の治療有効量と組み合わせてＩＬ−１７Ｆ阻害剤の治療有効量を投与することを含む、請求項７に記載の治療方法。
【請求項１０】
ＩＬ−１７Ａ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ａ抗体であり、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ｆ抗体である、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記腸疾患が、腸管内のポリプ又は癌である、請求項７ないし１０のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項１２】
前記腸管内のポリプ又は癌が、大腸ポリプ又は大腸癌である、請求項１１に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腸疾患を治療するためのインタ−ロイキン（本明細書において、「ＩＬ」と略すことがある。）関連物質の使用に関する。特に、大腸ポリプ又は大腸癌の進行を抑制又は阻止するためのＩＬ関連物質の使用に関する。とりわけ、抗ＩＬ−１７Ｆ抗体に代表されるＩＬ−１７Ｆ阻害剤の、大腸ポリプ又は大腸癌の進行を抑制又は阻止するための使用に関する。本発明は、更に、上記疾患の治療用途のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性サイトカイン：
癌細胞の増殖、浸潤、転移などといった悪性化のプロセスは、癌細胞自体の持つ性質によってのみ決まると考えがちだが、実際には癌細胞と周囲の環境が深く関与している。生体で増殖する癌は、癌細胞のみで形成されているのではなく、様々な細胞と相互作用し癌細胞自身が増殖しやすい環境を作り出していると考えられている（非特許文献１）。その多くは骨髄・末梢血中から遊走される好中球、好酸球、マクロファ−ジ、樹状細胞などの炎症細胞、血管細胞、上皮細胞、線維芽細胞、などの間質細胞である。これらの癌環境と炎症性サイトカインとの関わりは近年注目されている。【０００３】
サイトカインは炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ、Ｇ−ＣＳＦなど）と抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、Ｉｌ−１３、ＴＧＦβなど）に分けられ、免疫細胞の活性化を起こし炎症の種類を決定させる。例えばＩＦＮγが主体で産生されればＴｈ１型の炎症を引き起こし、ＩＬ−４が産生されればＴｈ２型の炎症を引き起こす（非特許文献２〜５）。このように炎症性サイトカインは免疫細胞、細胞障害性Ｔ細胞を活性化し異物を除去する機構を制御するため腫瘍を抑制するという報告とともに、炎症性サイトカインによって作り出された炎症環境が腫瘍を促進させているという、相反する報告がなされている（非特許文献６〜８）。【０００４】
炎症性サイトカインによる腫瘍抑制効果は免疫系の活性化に依存している。免疫系は生体外から侵入した細菌、ウィルス等の外的物質のみならず、生体内で生じた内的異物を認識・排除することで生体の恒常性を維持している。このような機構には、多くの病原体がもつ共通の特徴を認識し、自己と非自己の区別により作用する自然免疫と広範囲にわたる病原体を認識する適応免疫の成立が欠かせない。これまで、適応免疫における免疫機構の制御にはＣＤ４＋Ｔ細胞が担っていることが知られていた。ＣＤ４＋Ｔ細胞はナイ−ブＴ細胞が末梢リンパ節において抗原と相互作用することでＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞とＴｈ１７細胞といった代表的な３つのサブセットに分化する（非特許文献５及び９）。それぞれのサブセットに分化したＣＤ４＋Ｔ細胞はお互いに協調的、あるいは排他的に増殖していき免疫系の活性化を調節している。Ｔｈ１細胞は炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ細胞の産生を介しＣＤ８＋Ｔ細胞やＮＫ細胞などを活性化し、活性化したこれらの細胞は、細胞内寄生感染症に対する生体防御を担う。活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞は自己細胞の変異によって生じた内的異物である腫瘍細胞を排除する機構としても作用している（非特許文献１０）。【０００５】
ＩＦＮ−γなどの炎症性サイトカインによる腫瘍免疫の活性化はマウスを用いた実験から証明されてきた（非特許文献１１及び１２）。ＩＦＮ−γは免疫細胞を活性化するだけでなく、腫瘍細胞そのものにも作用し、ＭＨＣクラスＩ、ＩＩの発現を亢進させると同時に直接的な増殖抑制作用を持つことが知られている。このような細胞障害性Ｔ細胞による抗腫瘍効果は抗原性の高い悪性黒色腫などには有用であったが、そもそも腫瘍細胞は細菌などとは異なり、明らかに宿主と異なる抗原を有していることはまれである。腫瘍細胞は、抗原性が弱いだけでなく腫瘍細胞そのものが免疫応答を減衰させるＴＧＦ−βやＩＬ−１０を産生することから（非特許文献１３）、生体内で腫瘍免疫が効果的に働いているとは言い難く、特に腸管における発癌過程で腫瘍免疫がどの程度働いているかはよく分かっていない。【０００６】
一方、炎症性サイトカインによって作り出される炎症環境が腫瘍形成を促進させているという報告もある（非特許文献６）。家族性腫瘍で観察されるように発癌はゲノム異常に基づく疾患である。炎症性サイトカインによって遊走されてきた炎症細胞は活性酸素を産生し、この活性酸素はＤＮＡの突然変異、ＤＮＡの切断、塩基修飾など直接ＤＮＡ障害を引き起こすため発癌と深く関わっていることが知られている。また、炎症性サイトカインはＶＥＧＦＡなどの血管形成因子を亢進させ、腫瘍環境に血管を新生させることにより細胞増殖や転移を促進させるという報告がなされるなど、炎症状態と腫瘍形成促進の報告は多い（非特許文献１５〜１７）。また、日本住血吸虫は大腸癌のリスク因子であり、Ｃ型肝炎ウィルスは肝臓癌、ピロリ菌が胃癌、といったように細菌感染による炎症が発癌のリスク因子であることも知られている。しかし、炎症性サイトカインはこれらの感染症防御にも働いているため（非特許文献５）、炎症性サイトカインと発癌の関りは複雑である。特に腸管では多数の腸内細菌が常在しており、これらの腸内細菌の中にはフロ−ラの変化によって炎症を誘導するような菌も存在しているため大腸癌発症機構における炎症性サイトカインの役割は、これまでにも予想が極めて困難であった。【０００７】
ＩＬ−１ファミリ−分子：
ＩＬ−１ファミリ−分子はマクロファ−ジなど様々な免疫細胞から産生され、関節リウマチなどの炎症性疾患に重要な役割を果たしている（非特許文献１８〜２２）。また、その下流でシクロオキシダ−ゼ（ＣＯＸ）２の発現を制御している。ＣＯＸ２はプロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ２からＰＧＧ２への代謝の律速酵素である。ＰＧＧ２はＰＧＥ２へと代謝され血管新生やアポト−シス抑制を起こし腫瘍形成を促進させており、大腸癌や胃癌の発生にＣＯＸ２は大変重要な役割を担っている。大腸癌モデルマウスとＣＯＸ２の遺伝子ノックアウトマウスとの多重変異マウスの解析から、ＣＯＸ２を産生しないマウスでは劇的に腫瘍形成が抑制されることが分かっている（非特許文献２３）。また、疫学的にもＣＯＸ１、ＣＯＸ２の阻害剤（アスピリン）常用者では大腸癌発症のリスクを抑えられることが知られている（非特許文献２４）。【０００８】
ＩＬ−１７ファミリ−分子：
また、上記ＩＬ−１のシグナルは、下流でＴｈ１７分化調節を担っていることが知られている（非特許文献２５）。特に、ＩＬ−１７（一般に、「ＩＬ−１７Ａ」とも表記される。本明細書においても、「ＩＬ−１７」と「ＩＬ−１７Ａ」の用語は互いに同義のものとして用いる。）は、Ｔｈ１７細胞から産生され、関節リウマチ、多発性硬化症といった炎症性疾患の重要な因子である。これらの炎症性疾患においてＩＬ−１７Ａの発現亢進が認められており、ノックアウトマウスの解析ではコラ−ゲン誘導関節炎や実験的自己免疫性能脊椎炎の発症にきわめて重要であることが示されており、また、細菌や原虫の感染防御機構にも関与することが示されている（非特許文献２６）。【０００９】
一方、「ＩＬ−１７Ｆ」は、６つのＩＬ−１７ファミリ−分子の中でＩＬ−１７Ａとの相同性が最も高く、同じレセプタ−に結合するとされているものの（非特許文献２７〜２９）、ＩＬ−１７ＡがＴ細胞から産生されるのに対し、ＩＬ−１７ＦはＴ細胞以外でも産生されており、またその作用も免疫系においてＩＬ−１７Ａと一致していないことが知られている（非特許文献２６）。また、上記のように炎症性自己免疫疾患の発症にはＩＬ−１７Ａは重要な働きを担っているが、ノックアウトマウスの解析からＩＬ−１７Ｆはほとんど関与していないことが明らかにされている（非特許文献２６）。【００１０】
しかし、石亀らの報告によりＩＬ−１７Ｆは粘膜組織での日和見感染症に関与していることが見出されている。つまり、ＩＬ１７Ａ／Ｆノックアウトマウスでは加齢と共に鼻部皮下に日和見感染菌である黄色ブドウ球菌の増殖による膿瘍が形成されるのに対し、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆそれぞれ単独のノックアウトマウスでは加齢しても感染を起こさないことからＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｆは同等に感染防御に重要な役割を果たしていることが示された（非特許文献２６）。同様に、マウスの病原性大腸菌であるＣｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの感染実験の結果、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆノックアウトマウスは野生型に比べ大腸菌に感染しやすくなっていることからも（非特許文献２６）、ＩＬ−１７ファミリ−分子と腸内フロ−ラの変動とそれに伴う炎症の関係は密接であり、腸管の恒常性を維持するためにも重要である。【００１１】
このようにＩＬ−１７ファミリ−分子は炎症の重要な因子であるとともに、腸内フロ−ラの恒常性維持にも関っているため、腸管癌とＩＬ−１７ファミリ−分子との関りを容易に予想することは依然として困難である。【００１２】
ＡｐｃＭｉｎ／＋マウス：
本研究では、大腸癌モデルマウスとしてＡｐｃＭｉｎ／＋マウスを使用した。Ａｐｃは代表的な大腸癌の癌抑制遺伝子として知られており、生体での作用は核内転写因子であるβ−カテニンを制御する働きをしている。β−カテニンはＡＰＣによって捕捉され、捕捉されたβ−カテニンはリン酸化され、さらにユビキチン化されプロテアソ−ム分解されるため核内にβ−カテニンはほとんど存在しない（非特許文献３０〜３２）。しかし、Ａｐｃ遺伝子に変異が起こりその機能が喪失するとβ−カテニンはリン酸化されず、結果として分解されないため核内に移行し転写因子として働く。その転写産物にｃｙｃｌｉｎ  Ｄなどの細胞増殖に関わる因子があるためＡｐｃの変異は癌の初期段階になる（日特許文献３３〜３５）。特に、大腸ではＬｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（ＬＯＨ）という片側アレルの喪失を頻繁に起こすためＡｐｃ遺伝子の変異は一つだけであっても加齢と共に大腸癌を発症してしまう。そして大腸癌患者の約８割の人がこのＡｐｃ遺伝子の変異を持っていることが知られている（非特許文献３６）。そのため、Ａｐｃ遺伝子のコ−ド領域にナンセンス点変異をもつＡｐｃＭｉｎ／＋マウスは加齢と共に腸管全域にポリプを自然発症する家族性大腸腺腫症モデルマウスである。本明細書の実施例において使用したモデルマウスも、上記ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＩｌ１ｒｎ−／−マウス（非特許文献３７参照）、Ｉｌ１７ａ−／−（非特許文献３８参照）、Ｉｌ１７ｆ−／−、Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウス（非特許文献２６及び該文献のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ；「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ／Ｓ１０７４−７６１３（０８）００５５４−２」参照）を交配することにより作製した多重変異マウスである。【００１３】
大腸癌発症機構へのＩＬ−１７ファミリ−分子の関与：
これまでＩＬ−１７と発癌については相反する報告がなされてきた（非特許文献４０）。とりわけ、腸管癌発症機構にＩＬ−１７が関与するのかという報告はヒト及びマウスにおいてあまり無い。最近Ｃｙｎｔｈｉａ  Ｌ．Ｓｅａｒｓらのグル−プによって、腸内細菌の一種であるｅｎｔｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｌａｇｉｌｉｓ（ＥＴＢＦ）を移植し定着させることで細菌が毒素を産生し慢性炎症が誘導され、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスにおいて極めて短時間に大腸癌を誘導する系が確立された。この系において癌形成が抗ＩＬ−１７Ａ抗体によって抑制されることから、癌形成促進にＴｈ１７及び、それらから産生されるＩＬ−１７Ａが重要だという報告がなされた（非特許文献４１）。ＩＬ−１７Ａに拮抗するとされる抗ヒトＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）抗体は公知である（特許文献１）。【００１４】
しかし、未だ、自己免疫疾患時には重要でないと知られていたＩＬ−１７Ｆと癌との関わりを示唆する報告はなく、従って、ＩＬ−１７Ｆの癌形成時の作用メカニズムや自然発症時における腸管癌とこれらのサイトカインとの関わりについても調べられてはいなかった。【００１５】
大腸癌抑制：
２００４年、Ｄｕｎｎ，Ｇ．Ｐらの免疫不全マウスを用いた発癌の実験により免疫系が癌から生体を守るという報告があり、細胞障害性Ｔ細胞による抗腫瘍免疫応答が注目されてきた（非特許文献４２）。Ｂ１６メラノ−マをＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）ノックアウトマウスに移植した実験の結果、腫瘍促進がみられ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤が抑制されていることが知られている（非特許文献４３）。このことからもＩＬ−１７ＡによるＣＴＬの活性化は抗原性の高い癌に有効ではあると考えられていた。本願の優先日後、ＩＬ−１７ＡノックアウトマウスでＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの腸管ポリ−プ形成が抑制され、抗ＩＬ−１７Ａ抗体投与によっても抑制可能であることが報告された（非特許文献４４）。【００１６】
血管新生因子をタ−ゲットとした抗体医薬はすで効果をあげている。抗ヒトＶＥＧＦＡ中和抗体（アバスチン）は大腸癌患者への第ＩＩＩ相臨床試験が行われ、著しい延命効果を示している（非特許文献４５）。しかし、癌の血管新生阻害薬は万能ではなく、高血圧、腎障害、血栓形成などの重篤な副作用を示す報告もされている。従って、大腸などの腸管の上皮細胞において癌細胞局所的に発現が高い血管新生因子を特異的に阻害することは興味深い対象である。【００１７】
また、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの中には炎症を抑えるＩＬ−１０を産生する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）という細胞集団が存在する。２００９年Ｋｈａｓｈａｙａｒｓｈａ  Ｋｈａｚａｉｅらの実験により大腸癌モデルマウスにＴｒｅｇを移植させた結果、腫瘍形成が抑制されることが分かった。しかし、驚くことに多くのＴｒｅｇが癌細胞局所に浸潤しているにも関わらず、浸潤していたＴｒｅｇは抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０を産生せず、ＩＬ−１７Ａを産生していた。移植されたＴｒｅｇも移植後しばらくはＩＬ−１０産生性Ｔｒｅｇであったが、時間がたつにつれＩＬ−１７Ａ産生性Ｔｒｅｇに変化することがわかった（非特許文献４６）。しかし、このＩＬ−１７Ａ産生性Ｔｒｅｇから産生されるＩＬ−１７Ａが生体でどのように働いているのかは分かっていない。【００１８】
腸内フロ−ラと大腸癌との関わりも重要である。前掲Ｃｙｎｔｈｉａ  Ｌ．Ｓｅａｒｓらのグル−プが用いている腸内細菌ＥＴＢＦは、多くの大腸癌患者に存在しており、特に幼児期に感染すると大腸炎を起こすことが知られていることから着目された菌である（非特許文献４１）。また、Ｒｕｓｌａｎ  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖらの実験結果から腸内細菌による刺激に対するセンサ−分子ＴＬＲの下流にあるシグナルアダプタ−分子Ｍｙｄ８８ノックアウトマウスにおいて腫瘍形成が抑制されていることが示された（非特許文献４７）。飼育環境下の違いによるに腸内フロ−ラに常在する菌種の違からＩＬ−１７産生を亢進させる菌がいることも分かってきた。２００９年Ｄａｎ  Ｒ．  Ｌｉｔｔｍａｎらの実験によりＪａｃｋｓｏｎ社で飼育されたＣ５７ＢＬ／６ＪマウスとＴａｃｏｎｉｃ社で飼育されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスで腸管におけるＴｈ１７細胞の存在量が異なり、その原因としてＴａｃｏｎｉｃ社のマウスにはＳｅｇｍｅｎｔｅｄ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａという腸内細菌が常在しており、その菌がＩＬ−１７産生を亢進させることが分かった（非特許文献４８）。これらの結果は、ＩＬ−１７ファミリ−分子は腸内細菌の刺激により産生されており、産生されたＩＬ−１７ファミリ−分子によって腸内フロ−ラの恒常性が保たれていることを予想させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｍａｒｇａｒｅｔａ  Ｍ．  Ｍｕｅｌｌｅｒ＆  Ｎｏｒｂｅｒｔ  Ｅ．  Ｆｕｓｅｎｉｇ：  Ｆｒｉｅｎｄｓ  ｏｒ  ｆｏｅｓ  −  ｂｉｐｏｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｔｒｏｍａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ４，  ８３９−８４９  （２００４）
【非特許文献２】Ｍｉｎｇ  Ｏ．  Ｌｉ，  Ｓｈｏｍｙｓｅｈ  Ｓａｎｊａｂｉ１  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．  Ｆｌａｖｅｌｌ：  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β  Ｃｏｎｔｒｏｌｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，４５５−４７１  （２００６）
【非特許文献３】Ｋ  Ｗ  Ｍｏｏｒｅ，  Ａ  Ｏ’Ｇａｒｒａ，  Ｒ  Ｗ  Ｍａｌｅｆｙｔ，  Ｐ  Ｖｉｅｉｒａ，  ａｎｄ  ，  Ｔ  Ｒ  Ｍｏｓｍａｎｎ  ：  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０：Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １１：  １６５−１９０  （１９９３）
【非特許文献４】Ｌａｕｒｉｅ  Ｈ．  Ｇｌｉｍｃｈｅｒ  ＆  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍ．  Ｍｕｒｐｈｙ：  Ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｔｈｅ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｓ  ｕｐ：Ｇｅｎｅｓ  ＆Ｄｅｖｏｌｏｐｍｅｎｔ：  １４：  １６９３−１７１１（２０００）
【非特許文献５】Ｔ  Ｒ  Ｍｏｓｍａｎｎ，  ＆，  Ｒ  Ｌ  Ｃｏｆｆｍａｎ  ；  ＴＨ１  ａｎｄ  ＴＨ２  Ｃｅｌｌｓ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｌｅａｄ  ｔｏ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ；  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７：  １４５−１７３  （１９８９）
【非特許文献６】Ｍｕｒｕｇａｉｙａｎ，  Ｇ．，  Ｓ．  Ｍａｒｔｉｎ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｓａｈａ．  ２００７．  ＣＤ４０−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｕｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｕｉｔｓｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｅｓｃａｐｅ  ｏｒ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ？  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２８：  （４６７−４７３）
【非特許文献７】Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，  Ｌ．，  Ａ．  Ｔｅｓｎｉｅｒｅ，  ａｎｄ  Ｇ．  Ｋｒｏｅｍｅｒ．：Ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６  ７１５−７２７（２００６）
【非特許文献８】Ｍｕｒｕｇａｉｙａｎ，  Ｇ．，  Ｓ．  Ｂａｓａｋ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｓａｈａ．：  Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐａｒａｌｙｓｉｓ：  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｕｒｒ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２：  ２６１−２７２（２００６）
【非特許文献９】Ｃａｒｍｅｎ  Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｄｕａｒｔｅ，  Ｈｅｉｄｉ  Ｆ．  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．  Ｂｙｒｎｅ，  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｋａｍｒａｄｔ：  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１７  ｉｎ  Ｔｈ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：  １６５：  ６１０７  −  ６１１５  （２０００）
【非特許文献１０】Ｌａｕｒｅｎｃｅ  Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，  Ａｎｔｏｉｎｅ  Ｔｅｓｎｉｅｒｅ，  Ｇｕｉｄｏ  Ｋｒｏｅｍｅｒ：  Ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ：  ｉｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ  ：  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，  ７１５−７２７  （２００６）
【非特許文献１１】Ｈａｎｓ  Ｓｔｒａｎｄｅｒ  ＆  Ｓｔｅｆａｎ  Ｅｉｎｈｏｒｎ：  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ：  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ８：  ２１３−２１８，  （１９９６）
【非特許文献１２】Ｇａｖｉｎ  Ｐ．  Ｄｕｎｎ１，  Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｍ．  Ｋｏｅｂｅｌ１  ＆  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｄ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ：  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ：  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６，  ８３６−８４８  （２００６）
【非特許文献１３】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊ．  Ｍｕｌｌｅｒ１＆  Ｐｅｇｇｙ  Ａ．  Ｓｃｈｅｒｌｅ：  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，  ６１３−６２５  （２００６）
【非特許文献１４】Ｎｕｍａｓａｋｉ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｔ．  Ｌｏｔｚｅ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓａｓａｋｉ．  ：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ９３：  ３９−４３（２００４）
【非特許文献１５】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｈ．，  Ｍ．  Ｎｕｍａｓａｋｉ，  Ｍ．  Ｔ．  Ｌｏｔｚｅ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｓａｓａｋｉ．：  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂＦＧＦ−，  ＨＧＦ−  ａｎｄ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  ９８：  １８９−１９３  （２００５）．
【非特許文献１６】Ｋｅｈｌｅｎ，  Ａ．，  Ｋ．  Ｔｈｉｅｌｅ，  Ｄ．  Ｒｉｅｍａｎｎ，  Ｎ．  Ｒａｉｎｏｖ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｌａｎｇｎｅｒ．：  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩκＢα  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６  ａｎｄ  ＩＬ−８  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １０１：  １−６．  （２０００）
【非特許文献１７】Ｋｅｈｌｅｎ，  Ａ．，  Ｋ．  Ｔｈｉｅｌｅ，  Ｄ．  Ｒｉｅｍａｎｎ，  Ｎ．  Ｒａｉｎｏｖ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｌａｎｇｎｅｒ．：  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉ＿Ｂ＿  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−６  ａｎｄ  ＩＬ−８  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  １０１：  １−６．（  ２０００）
【非特許文献１８】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，  Ｃ．  Ａ．  ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ，  ８７，  ：２０９５−２１４７，  （１９９６）
【非特許文献１９】Ｎａｋａｅ，  Ｓ．，  Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．，  Ｋｏｍｉｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｎａｍｂｕ，  Ａ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｍ．，  Ｎａｋａｎｅ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．    ：Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＩＬ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．    Ｉｎ  “Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ”，  （ｅｄ．  Ｇ．  Ｆａｎｔｕｚｚｉ），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  ＮＪ，    ９５−１０９，  （２００３）
【非特許文献２０】Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．，  Ｓａｉｊｏ，  Ｓ．，  Ｔａｎｉｏｋａ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｅ，  Ｓ．，  Ｓｕｄｏ，  Ｋ．，  Ｏｋａｈａｒａ，  Ａ．，  Ｉｋｕｓｅ，  Ｔ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．  ：  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ  ｒｅｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ  ，  １９１，  ３１３−２０，  （２０００）
【非特許文献２１】Ｓａｉｊｏ，  Ｓ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｍ．，  Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．，  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．  ：  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ＩＬ−１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｉｎ  ｗｈｉｃｈ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｌｏｗ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＣＤ４０Ｌ  ａｎｄ  ＯＸ４０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．    Ａｒｔｈ．  Ｒｈｅｕｍ．，  ４６，  ５３３−５４４，  （２００２）
【非特許文献２２】Ｎａｋａｅ，  Ｓ．，  Ｓａｉｊｏ，  Ｓ．，  Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．，  Ｓｕｄｏ，  Ｋ．，  Ｍｏｒｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．  ：  ＩＬ−１７  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １００，  ５９８６−５９９０，  （２００３）
【非特許文献２３】Ｍａｓａｎｏｂｕ  Ｏｓｈｉｍａ，  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｅ．  Ｄｉｎｃｈｕｋ，  Ｓｔａｃｉａ  Ｌ．  Ｋａｒｇｍａｎ，  Ｈｉｒｏｋｏ  Ｏｓｈｉｍａ，  Ｂｒｕｎｏ  Ｈａｎｃｏｃｋ，  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｋｗｏｎｇ，  Ｊａｍｅｓ  Ｍ．  Ｔｒｚａｓｋｏｓ，  Ｊｉｌｌｙ  Ｆ．  Ｅｖａｎｓ，‡  ａｎｄ  Ｍａｋｏｔｏ  Ｍ．  Ｔａｋｅｔｏ  ：  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｉｎ  ＡｐｃＤ７１６  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｉｃｅ  ｂｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ２  （ＣＯＸ−２）：  Ｃｅｌｌ，    ８７，  ８０３−８０９，  （１９９６）
【非特許文献２４】Ｔｈｕｎ  ＭＪ，  Ｎａｍｂｏｏｄｉｒｉ  ＭＭ，  Ｈｅａｔｈ  ＣＷ  Ｊｒ．  ：  Ａｓｐｉｒｉｎ  ｕｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｆａｔａｌ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ    ３２５：  １５９３−６  （１９９１）
【非特許文献２５】Ｙｅｏｎｓｅｏｋ  Ｃｈｕｎｇ，  Ｓｅｏｎ  Ｈｅｅ  Ｃｈａｎｇ，  Ｇｕｓｔａｖｏ  Ｊ．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｘｕｅｘｉａｎ  Ｏ．  Ｙａｎｇ  ，  Ｒｏｚａ  Ｎｕｒｉｅｖａ，  Ｈｏｎｇ  Ｓｏｏｎ  Ｋａｎｇ，  Ｌｉ  Ｍａ，  Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｓ．  Ｗａｔｏｗｉｃｈ，  Ａｎｔｏｎ  Ｍ．  Ｊｅｔｔｅｎ，  Ｑｉａｎｇ  Ｔｉａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ  Ｄｏｎｇ：  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｒｌｙ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０  ５７６−５８７  （２００９）
【非特許文献２６】Ｉｓｈｉｇａｍｅ，  Ｈ．，  Ｋａｋｕｔａ，  Ｓ．，  Ｎａｇａｉ，  Ｔ．，  Ｋａｄｏｋｉ，  Ｍ．，  Ｎａｍｂｕ，  Ａ．，  Ｋｏｍｉｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｆｕｊｉｋａｄｏ，  Ｎ．，  Ｔａｎａｈａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ａｋｉｔｓｕ，  Ａ．，  Ｋｏｔａｋｉ，  Ｈ．，  Ｓｕｄｏ，  Ｋ．，  Ｎａｋａｅ，  Ｓ．，  Ｓａｓａｋａｗａ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７Ａ  ａｎｄ  −１７Ｆ  ｉｎ  Ｈｏｓｔ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｕｃｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０  １０８−１１９  （２００９）
【非特許文献２７】Ａｇｇａｒｗａｌ  Ｓ，  Ｇｕｒｎｅｙ  ＡＬ．  ＩＬ−１７：  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ    ７１    １−８  （２００２）
【非特許文献２８】Ｋｏｌｌｓ  ＪＫ，  Ｌｉｎｄｅｎ  Ａ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１７  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２１  ：  ４６７−７６  （２００４  ）
【非特許文献２９】Ｗｅａｖｅｒ  ＣＴ，  Ｈａｔｔｏｎ  ＲＤ，  Ｍａｎｇａｎ  ＰＲ，  ：  ＩＬ−１７  Ｆａｍｉｌｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ    ２５  ：  ８２１−５２  （２００７）
【非特許文献３０】Ｓａｔｏｓｈｉ  Ｉｋｅｄａ，  Ｓｈｏｓｅｉ  Ｋｉｓｈｉｄａ，  Ｈｉｄｅｋｉ  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｈｉｒｏｓｈｉ  Ｍｕｒａｉ，  Ｓｈｉｎｙａ  Ｋｏｙａｍａ，  Ａｋｉｒａ  Ｋｉｋｕｃｈｉ  ：  Ａｘｉｎ，  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ，  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＧＳＫ−３β  ａｎｄ  β−ｃａｔｅｎｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＧＳＫ−３β−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  β−ｃａｔｅｎｉｎ：  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７，  １３７１−１３８４    （１９９８）
【非特許文献３１】Ｔｓｕｔｏｍｕ  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｆｕｍｉｈｉｋｏ  Ｈａｍａｄａ，  Ｔａｋａｏ  Ｉｓｈｉｄａｔｅ，  Ｋｅｎ−ｉｃｈｉ  Ａｎａｉ，  Ｋｏｈｉｃｈｉ  Ｋａｗａｈａｒａ，  Ｋｕｍａｏ  Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，  Ｔｅｔｓｕ  Ａｋｉｙａｍａ  ：  Ａｘｉｎ，  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ，  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ    −ｃａｔｅｎｉｎ，  ＧＳＫ−３    ａｎｄ  ＡＰＣ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ    −ｃａｔｅｎｉｎ  ｌｅｖｅｌ：  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ    ３  ，３９５−４０３（１９９８）
【非特許文献３２】Ｊｕｒｇｅｎ  Ｂｅｈｒｅｎｓ，  Ｂｏｒｉｓ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊｅｒｃｈｏｗ，  Ｍａｒｔｉｎ  Ｗｕｒｔｅｌｅ，  Ｊａｎ  Ｇｒｉｍｍ，  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ａｓｂｒａｎｄ，  Ｒａｌｐｈ  Ｗｉｒｔｚ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋｕｈｌ，  Ｄｏｒｉｓ  Ｗｅｄｌｉｃｈ，  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ  Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ：  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｘｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇ，  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎ，  ｗｉｔｈ    −Ｃａｔｅｎｉｎ，  ＡＰＣ，  ａｎｄ  ＧＳＫ３  ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３  ５９６−５９９  （１９９８）
【非特許文献３３】Ｂ  Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄ，  Ｂ  Ｓｏｕｚａ，  Ｉ  Ａｌｂｅｒｔ，  Ｏ  Ｍｕｌｌｅｒ，  ＳＨ  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，  ＦＲ  Ｍａｓｉａｒｚ，  Ｓ  Ｍｕｎｅｍｉｔｓｕ，  ａｎｄ  Ｐ  Ｐｏｌａｋｉｓ：  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２  １７３１−１７３４  （１９９３）
【非特許文献３４】ＬＫ  Ｓｕ，  Ｂ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，  ａｎｄ  ＫＷ  Ｋｉｎｚｌｅｒ：  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｔｅｎｉｎｓ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２  １７３４−１７３７  （１９９３）
【非特許文献３５】Ｋｅｎ  Ｍ．  Ｃａｄｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｅｌ  Ｎｕｓｓｅ１：  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｈｅｍｅ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１  ３２８６−３３０５  （１９９７）
【非特許文献３６】Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．  Ｋｉｎｚｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ：  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｃｅｌｌ  ８７  １５９−１７０  （１９９６）
【非特許文献３７】Ｈｏｒａｉ，  Ｒ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｍ．，  Ｓｕｄｏ，  Ｋ．，  Ｋａｎｕｋａ，  Ｈ．，  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｍ．，  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ，  Ｍ．，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ：  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ＩＬ−１α，  ＩＬ−１β，  ＩＬ−１α／β，  ａｎｄ  ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｓｈｏｗｓ  ｔｈａｔ  ＩＬ−１β  ｉｓ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｉｎ  ｔｕｒｐｅｎｔｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｅｖｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８７：  １４６３−１４７５  （１９９８）．
【非特許文献３８】Ｎａｋａｅ，  Ｓ．，  Ｋｏｍｉｙａｍａ，  Ｙ．，  Ｎａｍｂｕ，  Ａ．，  Ｓｕｄｏ，  Ｋ．，  Ｉｗａｓｅ，  Ｍ．，  Ｈｏｍｍａ，  Ｉ．，  Ｓｅｋｉｋａｗａ，  Ｋ．，  Ａｓａｎｏ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．：  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｉｎ  ＩＬ−１７−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ，  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  １７，  ３７５−３８７  （２００２）．
【非特許文献３９】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／
【非特許文献４０】Ｇｏｐａｌ  Ｍｕｒｕｇａｉｙａｎ  ａｎｄ  Ｂｈａｓｋａｒ  Ｓａｈａ：  Ｐｒｏｔｕｍｏｒ  ｖｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＩＬ−１７：  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８３；４１６９−４１７５  （２００９）
【非特許文献４１】Ｓｈａｏｇｕａｎｇ  Ｗｕ，  Ｋｉ−Ｊｏｎｇ  Ｒｈｅｅ，  Ｅｍｉｌｉａ  Ａｌｂｅｓｉａｎｏ，  Ｓｈｅｒｖｉｎ  Ｒａｂｉｚａｄｅｈ，  Ｘｉｎｑｕｎ  Ｗｕ，  Ｈｕｎｇ−Ｒｏｎｇ  Ｙｅｎ，  Ｄａｖｉｄ  Ｌ  Ｈｕｓｏ，  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｌ  Ｂｒａｎｃａｔｉ，  Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｗｉｃｋ，  Ｆｌｏｒｅｎｃｉａ  ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ，  Ｆｒａｎｃｋ  Ｈｏｕｓｓｅａｕ，  Ｄｒｅｗ  Ｍ  Ｐａｒｄｏｌｌ  ＆  Ｃｙｎｔｈｉａ  Ｌ  Ｓｅａｒｓ：  Ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １７  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎ  １５  １０１６  −  １０２２  （２００９）
【非特許文献４２】Ｇａｖｉｎ  Ｐ．  Ｄｕｎｎ，Ｌｌｏｙｄ  Ｊ．  Ｏｌｄ，  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｄ．  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ：  Ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ  Ｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ：  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２２：  ３２９−３６０  （２００４）
【非特許文献４３】Ｉｌｏｎａ  Ｋｒｙｃｚｅｋ，  Ｓｈｕａｎｇ  Ｗｅｉ，  Ｗｏｊｃｉｅｃｈ  Ｓｚｅｌｉｇａ，  Ｌｉｎｈｕａ  Ｖａｔａｎ，  ａｎｄ  Ｗｅｉｐｉｎｇ  Ｚｏｕ：  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＬ−１７  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：  Ｂｌｏｏｄ  １１４  ３５７−３５９  （２００９）
【非特許文献４４】Ｃｈａｅ  ＷＪ，  Ｇｉｂｓｏｎ  ＴＦ，  Ｚｅｌｔｅｒｍａｎ  Ｄ，  Ｈａｏ  Ｌ，  Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  Ｏ，  Ｂｏｔｈｗｅｌｌ  ＡＬ．  ：  Ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１７Ａ  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０７（１２）：５５４０−４  （２０１０）
【非特許文献４５】Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｈｕｒｗｉｔｚ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｌｏｕｉｓ  Ｆｅｈｒｅｎｂａｃｈｅｒ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｎｏｖｏｔｎｙ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈｅｉｍ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｊｏｒｄａｎ  Ｂｅｒｌｉｎ，  Ｍ．Ｄ．，  Ａｒｉ  Ｂａｒｏｎ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｓｕｓａｎ  Ｇｒｉｆｆｉｎｇ，  Ｂ．Ｓ．，  Ｅｒｉｃ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，  Ｐｈ．Ｄ．，  Ｎａｐｏｌｅｏｎｅ  Ｆｅｒｒａｒａ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｇｗｅｎ  Ｆｙｆｅ，  Ｍ．Ｄ．，  Ｂｅｔｈ  Ｒｏｇｅｒｓ，  Ｂ．Ｓ．，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｒｏｓｓ，  Ｍ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｆａｉｒｏｏｚ  Ｋａｂｂｉｎａｖａｒ，  Ｍ．Ｄ：  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＬ−１７  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：Ｂｌｏｏｄ：  Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，  Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，  ａｎｄ  Ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ：ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ｏｆ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ  ３５０：２３３５−２３４２  （２００４）
【非特許文献４６】Ｅｌｉａｓ  Ｇｏｕｎａｒｉｓ，  Ｎｉｃｈｏｌｅ  Ｒ．  Ｂｌａｔｎｅｒ，  Ｋｒｉｓｔｅｎ  Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｆａｙ  Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．  Ｇｕｒｉｓｈ，  Ｔｅｒｒｙ  Ｂ．  Ｓｔｒｏｍ，  Ｐｈｉｌｉｐｐ  Ｂｅｃｋｈｏｖｅ，  Ｆｏｔｉｎｉ  Ｇｏｕｎａｒｉ  ａｎｄ  Ｋｈａｓｈａｙａｒｓｈａ  Ｋｈａｚａｉｅ：  Ｔ−Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｈｉｆｔ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｔｏ  ａ  Ｃａｎｃｅｒ−Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ    ６９：  ５４９０−５４９７  （２００９）
【非特許文献４７】Ｓｅｔｈ  Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ  ａｎｄ  Ｒｕｓｌａｎ  ：  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｙＤ８８：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７  １２４−１２７  （２００７）
【非特許文献４８】Ｉｖａｙｌｏ  Ｉ．  Ｉｖａｎｏｖ，  Ｋｏｊｉ  Ａｔａｒａｓｈｉ，  Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｍａｎｅｌ，  Ｅｏｉｎ  Ｌ．  Ｂｒｏｄｉｅ，  Ｔａｔｓｕｉｃｈｉｒｏ  Ｓｈｉｍａ，  Ｕｌａｓ  Ｋａｒａｏｚ，  Ｄｏｎｇｇｕａｎｇ  Ｗｅｉ，  Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｃ．  Ｇｏｌｄｆａｒｂ，  Ｃｌａｒｋ  Ａ．  Ｓａｎｔｅｅ，  Ｓｕｓａｎ  Ｖ．  Ｌｙｎｃｈ，  Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｔａｎｏｕｅ，  Ａｋｅｍｉ  Ｉｍａｏｋａ，  Ｋｉｋｕｊｉ  Ｉｔｏｈ，  Ｋｉｙｏｓｈｉ  Ｔａｋｅｄａ，  Ｙｏｓｈｉｎｏｒｉ  Ｕｍｅｓａｋｉ，  Ｋｅｎｙａ  Ｈｏｎｄａ，  Ｄａｎ  Ｒ．  Ｌｉｔｔｍａｎ：  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｈ１７  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：  Ｃｅｌｌ  １３９  ４８５−４９８  （２００９）
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００７／１１７７４９号パンフレット
【発明の概要】
【００２１】
このように、大腸癌発症機構における炎症性サイトカインの役割は十分に解明されているとはいえない。そこで、本発明者らは、炎症の重要な因子（炎症性サイトカイン）であるＩＬ−１ファミリ−遺伝子と大腸癌の関わりについて着目した。すなわち、ＩＬ−１α、βの内因性アンタゴニストとして働いるＩＬ−１レセプタ−アンタゴニスト（ＲＡ）の遺伝子（Ｉｌ１ｒｎ）をノックアウトすることによりＩＬ−１シグナルが過剰となりＣＯＸ２の発現を亢進される事が予想されるマウスを用いてＩＬ−１が引き起こす炎症状態と腫瘍形成に与える影響を評価した。
【００２２】
また、前記のとおり、ＩＬ−１ファミリ−分子は下流でＩＬ−１７産生性Ｔ細胞（Ｔｈ１７）分化の調節因子として働くことが知られており、よって、ＩＬ−１７ファミリ−分子も炎症の重要な因子であるとともに、他方で腸内フロ−ラの恒常性維持にも関っているため、大腸癌とＩＬ−１７ファミリ−分子との関りを容易に予想することは、依然として困難である。そこで、本発明者らは、ＩＬ−１７ファミリ−分子と大腸癌の関わりについても着目し、ＩＬ−１７ファミリ−分子の遺伝子改変マウスを用いることでこれらの分子が大腸癌の腫瘍形成促進に働くのか抑制に働くのかを評価した。
【００２３】
具体的に、加齢と共に腸管全域にポリプを自然発症する家族性大腸腺腫症モデルマウスであるＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＩＬ−１、ＩＬ−１７ファミリ−遺伝子（Ｉｌ１ｒｎ−／−、Ｉｌ１７ａ−／−、Ｉｌ１７ｆ−／−、Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）欠損マウスを交配することにより多重変異マウスを作製した。そして、これらとＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに発生したポリプの大きさ、発生数を比較することでポリプ形成時に炎症性サイトカインが関与するのかを調べ、その作用メカニズムを解明した。
【００２４】
その結果、ＩＬ−１ファミリ−遺伝子及びＩＬ−１７ファミリ−分子と大腸癌の密接な関わりが示された。
【００２５】
つまり、ＩＬ−１レセプタ−アンタゴニスト（Ｉｌ１ｒｎ−／−）欠損マウスにおいて有意にポリプの発生数、大きさ共に増加していることが示された。また、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−多重変異マウスのポリプとＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリプを比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−多重変異マウスのＩｌ１７ａ、Ｉｌ１７ｆの発現量が亢進していることが示された。さらにＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスではＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスと比べ３ｍｍ以上の大きさのポリプ発生数が有意に減少しており、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスでは１ｍｍ以上の大きさポリプが減少していた。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスではそれぞれの単独ノックアウトマウスに比べさらにポリプの発生数が減少しており、その原因としてＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆは線維芽細胞に作用し、血管新生を亢進させていることをつきとめた。従って、理論に拘束されるわけではないが、ＩＬ−１７ファミリ−分子は血管新生を亢進させる事で細胞増殖を促し、腫瘍形成を促進させていることを示唆する。
【００２６】
また、腸管全域におけるポリプ発生数をＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスで比較したところ、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスにおいて有意にポリプ発生数が減少していることが示された。この結果は、ポリプ局所においてＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）は浸潤細胞のみが産生しているがＩＬ−１７Ｆは浸潤細胞に加え腸管上皮細胞自身も産生しているため、ポリプ局所的ではＩＬ−１７Ｆの産生がＩＬ−１７に比べ過多になっていることを示唆し得るであろう。
【００２７】
以上の結果から、腫瘍の治療方法である外科療法、化学療法、放射線療法、免疫療法、に続く第５の治療方法として期待されている抗体療法のタ−ゲットとして、ＩＬ−１ファミリ−分子及びＩＬ−１７ファミリ−分子、殊に、ＩＬ−１７Ｆ分子を新たに加えることが出来るであろう。
【００２８】
従って、本発明の第１の局面では、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤を含む腸疾患治療用医薬組成物が提供される。
【００２９】
すなわち、これまでの多くの研究は、ＩＬ−１７Ａに比べＩＬ−１７Ｆは作用が弱いことを指し示していたが、実際の大腸癌発症機構において、ＩＬ−１７Ｆは上皮細胞及び浸潤細胞からも産生されるため、腫瘍局所的にＩＬ−１７Ｆが過剰に産生されることで腫瘍形成に中心的な役割を果たしていると考え得る証拠が得られた。つまり、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは同様に線維芽細胞に作用し血管新生を亢進させているにも関らず、その発現量の低さから、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスではポリプの大きさが３ｍｍ以上と大きくならないと発生数に変化が見られないのに対し、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスではでは１ｍｍ以上の大きさのポリプ発生数においてさえその発生数に差が見られたのだと推論することは合理的であろう。以上のことから、大腸癌発症時における炎症性サイトカインＩＬ−１ファミリ−分子や、ＩＬ−１７ファミリ−分子は腫瘍形成促進に働いており、これらのサイトカイン、殊にＩＬ−１７Ｆを抑制することで腫瘍形成を抑制出来ると考えられる。
【００３０】
前記ＩＬ−１７Ｆ阻害剤としての抗ＩＬ−１７Ｆ抗体の使用及び効果を実施例に示した。従って、本発明の第２の局面では、前記ＩＬ−１７Ｆ阻害剤が抗ＩＬ−１７Ｆ抗体である、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤を含む腸疾患治療用医薬組成物が提供される。
【００３１】
次いで、本発明の第３の局面は、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤と組み合わせてＩＬ−１７Ａ阻害剤を使用する腸疾患治療用医薬組成物が提供される。典型的なＩＬ−１７Ａ阻害剤は、抗ＩＬ−１７Ａ抗体である。抗ＩＬ−１７Ｆ抗体と抗ＩＬ−１７Ａ抗体の組合せた使用及び効果も実施例に示した。
【００３２】
更に、本発明の第４の局面では、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤により治療されるべき腸疾患が、腸管内のポリプ又は癌であり、当該腸管が大腸である腸疾患治療用医薬組成物が提供される。従って、本発明の有利な態様は、大腸癌の予防及び／又は治療薬ないし当該用途のための医薬組成物を包含する。
【００３３】
また、本発明の第５の局面では、その他のＩＬ−１７Ｆ阻害剤としてのＩＬ−１７Ｆ阻害活性を有するＩＬ−１７Ｆ模倣物、ｓｉＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡの前記目的のための使用が意図される。
【００３４】
そして、本発明は、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤を用いた腸疾患、典型的には腸管内のポリプ又は癌、より特定的には大腸癌患者を治療する方法を意図する。また、本発明は、腸疾患、典型的には腸管内のポリプ又は癌、より特定的には大腸癌患者を治療するための医薬組成物の製造のための、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤の使用を意図する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス（４．５ヶ月齢）における腸管の様子を示す。写真の上がＡｐｃＭｉｎ／＋マウス、下がＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスである。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスはＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに比べポリプの発生数が多いこと観察された。デ−タはどちらもｎ＝６で観察し代表的な１サンプルの様子を記載した。
【図２】ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスとのポリプ発生数の比較結果を示す。大腸、小腸部分に分けて比較を行ったところ、どちらの部位でもＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスの方がポリプ発生数が多いことが観察された（ａ）。腸管全長で大きさごとに分類しポリプの発生数を調べたところ０．５ｍｍ〜１ｍｍにおける発生数に変化は見られなかったがそれ以上大きくなると有意に増加している（ｂ）。デ−タはＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスともにｎ＝３で比較した。
【図３】ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの非腫瘍部と腫瘍部におけるマイクロアレイ解析結果を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスの非腫瘍部（ＷＴ Ｎ）と腫瘍部（ＷＴ Ｐ）においてＧＳＥＡを用いて機能グル−プ解析を行ったところ炎症経路が有意に亢進していることが示された。
【図４】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスの非腫瘍部と腫瘍部におけるマイクロアレイ解析結果を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスの非腫瘍部（ＲＡ Ｎ）と腫瘍部（ＲＡ Ｐ）においてＧＳＥＡを用いて機能グル−プ解析を行った（非特許文献３９）ところ線維芽細胞の細胞周期に関わる経路が有意に亢進していることが示された。
【図５】定量的ＰＣＲ法によるＩｌ１７ファミリ−分子の発現変動を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスにおいて非ポリプ部分とポリプ局所におけるＩｌ１７ａの産生に差は見られ見られなかったが、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスにおいてはポリプ局所で有意に発現が増加していることが分かった。また、ポリプ局所同士を比較したところＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスにおいて有意な発現上昇が見られた（ａ）。ＡｐｃＭｉｎ／＋マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスともにポリプ局所におけるＩｌ１７ｆの産生に差が見られた。またポリプ局所同士を比較したところＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスにおいて有意な発現上昇が見られた（ｂ）。
【図６】定量的ＰＣＲ法によるＣｏｘ２の発現変動を示す。定量的ＰＣＲ法を用いてＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス腫瘍部同士におけるＣｏｘ２の発現を調べたところ両者に有意な差は見られなかった。ｎ＝３でそれぞれ行った。
【図７】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスにおけるポリプ発生数の様子を示す。（ａ）がＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスにおける比較した様子を示した。（ｂ）がＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスを比較した様子を示した写真である。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスはｎ＝７、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスはｎ＝６、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスはｎ＝５で比較したうちの代表的な写真を記載した。
【図８】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスにおける部位ごとによるポリプ発生数の比較結果を示す。大腸ではＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスに比べＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスではポリプの発生数に有意な差は見られなかったのに対しＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスでは有意にポリプの発生数が減少していることが示された（ａ）。小腸ではＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスに比べＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスともにポリプの発生数が減少していることが示された（ｂ）。また、腸管全域におけるポリプ発生数はＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスに比べＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスでは有意に減少していることが示された（ｃ）。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスはｎ＝７、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスはｎ＝６、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスはｎ＝５で比較した
【図９】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスと、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスにおける腸管全域でのポリプの大きさごとの比較を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスを比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスでは０．５ｍｍ〜３ｍｍまでの部位でＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスに比べ有意なポリプの発生数の差は見られなかった［（ａ）及び（ｂ）］が、３ｍｍ以上の場合ではポリプ発生数が有意に減少していることが確かめられた（ｃ）。それに対し、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスと比べた場合に、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスでは０．５ｍｍ〜１ｍｍまででは有意な差は見られなかったが（ａ）、それ以上の大きさになるとポリプの発生数が有意に減少していることが確かめられた［（ｂ）及び（ｃ）］。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスを比較した場合は有意な差は見られなかった。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスはｎ＝７で、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスはｎ＝６で、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスはｎ＝５で比較した。
【図１０】ポリプ局所におけるＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ産生細胞の違いを示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウスについてＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆを免疫染色した結果、ＩＬ−１７Ａは浸潤細胞が産生し（ａ）、ＩＬ−１７Ｆは浸潤細胞の他に上皮細胞が産生している（ｃ）ことが示された。（ｂ）及び（ｄ）は、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスでそれぞれＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆを免疫染色した結果である。デ−タは独立に４回行ったうちの代表的な一枚を記載した。
【図１１】定量的ＰＣＲ法を用いたＭＥＦによるＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ刺激に対する血管新生因子の発現変動を示す。マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）にＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ刺激した時の血管新生因子（Ｖｅｇｆａ、ｃｏｘ２、ｃｘｃｌ１）の発現変動を示した。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ両者とも濃度依存的に血管新生因子の発現上昇が見られた。デ−タは独立に３回行った結果をまとめたものである。
【図１２】定量的ＰＣＲ法を用いたＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウススのポリプ局所におけるＶｅｇｆａ産生量の比較結果を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスのポリプ局所におけるＶｅｇｆａ産生量を比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおいて有意に産生量が減少していることが示された。両マウスともｎ＝４で行った。
【図１３】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウスポリプ局所におけるＶＥＧＦＡによる免疫染色を示す。左図がＶＥＧＦＡ染色であり、右図が核染色である。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスによる免疫染色の結果、ＶＥＧＦＡ産生細胞は上皮細胞で無いことが確認された。また両者を比較したところＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおいてＶＥＧＦＡ産生量が減少していることが示唆された。デ−タは両者ｎ＝４で行った。
【図１４】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスによるＶＩＭＥＮＴＩＮの免疫染色を示す。左図がＶＩＭＥＮＴＩＮ染色であり、右図が核染色である。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスで線維芽細胞のマ−カ−であるＶＩＭＥＮＴＩＮを染色した結果、ポリプを構成する間質細胞の大部分が線維芽細胞であることが分かった。デ−タはｎ＝６で行い代表的な一枚を記載した。
【図１５】ＴＵＮＥＬ法によるアポト−シス細胞の比較結果を示す。ＴＵＮＥＬ法によりアポト−シス細胞の検出を行った。左図がアポト−シス細胞であり、右図が核を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウス（ａ）、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウスが（ｂ）。両者に有意な差は見られなかった。両マウスともｎ＝６で行った。
【図１６】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスと、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウスにおける増殖細胞の免疫染色法による比較結果を示す。左図が細胞周期のＭ期にある細胞で増殖中の細胞である。右図が核を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスの結果が（ａ）及び（ｂ）である。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスの結果が（ｃ）及び（ｄ）である。両者を比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおいて増殖細胞が有意に減少していることが確かめられた（ｅ）。デ−タはｎ＝６で行い代表的なサンプルを記載した。
【図１７】免疫染色法によるＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウスのポリプ局所における血管細胞の様子を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスを比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおいて血管量が減少していることが示された。デ−タは両者ともｎ＝６で行い代表的な一種を記載した。
【図１８】ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−）マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−（ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−）マウス（６ヶ月齢）との比較結果を示す。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおけるポリプ形成の様子を示した（ａ）。写真はｎ＝６で確認した結果の代表的な１サンプルの様子を示した。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスのポリプ形成を部位ごとに比較した結果、大腸、小腸の両部位でポリプ形成がＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおいて抑制されていることが示された（ｂ）。大きさごとに分類した結果、０．５ｍｍ〜１ｍｍの大きさのポリプは有意な差が見られなかったのに対し、それ以上の大きさになるとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスにおいて有意にポリプ形成が抑制されていることが分かった（ｃ）。またＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス及びＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスと比較した結果、それぞれのシングルノックアウトマウスに比べＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスでは小腸部分と３ｍｍ以上の大きさのポリプ発生数が有意に減少していることが分かった。デ−タはＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ＋／−マウスはｎ＝７、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ／ｆ−／−マウスはｎ＝６、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスはｎ＝６、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスはｎ＝５で確認した。
【図１９】２次スクリ−ニング後の抗ＩＬ−１７Ｆ中和活性評価の結果を示す。各モノクロ−ナル抗体のｒＩＬ−１７ＦによるＭＥＦでのＩＬ−６誘導阻害活性を示した。
【図２０】２次スクリ−ニング後の抗ＩＬ−１７Ａ中和活性評価の結果を示す。各モノクロ−ナル抗体のｒＩＬ−１７ＡによるＭＥＦでのＩＬ−６誘導阻害活性を示した。
【図２１】精製抗ＩＬ−１７Ｆ抗体（クロ−ンＫ１３−４）のＩＬ−１７Ｆ中和活性を示す。ｒＩＬ−１７ＦによるＭＥＦでのＩＬ−６誘導阻害活性を示した。
【図２２】精製抗ＩＬ−１７Ａ抗体（クロ−ンＫ１５−２及びＫ３３−４）のＩＬ−１７Ａ中和活性を示す。ｒＩＬ−１７ＡによるＭＥＦでのＩＬ−６誘導阻害活性を示した。
【図２３】４ヶ月例のＡｐｃＭｉｎ／＋マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景）に対して、マウスＩｇＧ（コントロ−ル）、抗マウスＩＬ−１７Ａ抗体、抗マウスＩＬ−１７Ｆ抗体、及び抗マウスＩＬ−１７Ａ抗体と抗マウスＩＬ−１７Ｆ抗体の両方を、１回／週腹腔内投与で６回投与した後の大腸における大きなポリプ（３ｍｍ以上）の発生数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
前記のとおり、本発明は、ＩＬ−１ファミリ−分子、ＩＬ−１７ファミリ−分子、特にＩＬ−１７Ｆをタ−ゲットとした腸疾患治療及びそのための医薬品を提供する。本発明以前には、ＩＬ−１７Ｆと癌との関わりを示唆する報告はなく、従って、ＩＬ−１７Ｆの癌形成時の作用メカニズムや自然発症時における大腸癌とこれらのサイトカインとの関わりについて調べられてはいなかった。
【００３７】
かくして、ＩＬファミリ−分子、とりわけＩＬ−１７Ｆ分子を阻害することにより腸疾患の治療をする本発明の新規な方法は、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤、典型的にはＩＬ−１７Ｆレセプタ−とＩＬ−１７Ｆが結合することを抑制することができるＩＬ−１７Ｆ拮抗物質であるか、又は組織においてＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ｆレセプタ−の発現を阻害することができる物質の治療的に有効な量を含む組成物と、腸管内ポリプ又は癌が生じているか又はそれらが生じる危険性がある組織とを接触させることを含む。
【００３８】
Ａ．ＩＬ−１７Ｆ拮抗物質
ＩＬ−１７Ｆ拮抗物質は、組織でのＩＬ−１７Ｆの生理学的作用を阻害するための薬剤として本発明で用いられ、それらは、天然のＩＬ−１７ＦとＩＬ−１７Ｆレセプタ−との機能的な相互作用を干渉するような態様でＩＬ−１７Ｆレセプタ−又はＩＬ−１７Ｆと相互に作用する化合物を含む種々の形態をとることができる。例示的な拮抗物質は、ＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ｆレセプタ−のいずれかと免疫反応を生じるモノクロ−ナル又はポリクロ−ナル抗体、及びＩＬ−１７Ｆレセプタ−のリガンド結合反応に必要な構造領域を模倣するＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ｆレセプタ−のいずれかの模倣物を含む。
【００３９】
抗体：
一具体例で、本発明は、ＩＬ−１７Ｆと免疫的に反応し、本明細書で述べるように天然のＩＬ−１７ＦとＩＬ−１７Ｆレセプタ−が結合するのを抑制するモノクロ−ナル抗体の形態をとるＩＬ−１７Ｆ拮抗物質を開示する。そのような抗体を産生する細胞株を作製する方法、およびこのモノクロ−ナル抗体を生成する方法は当業者にとって容易に実施可能であり、その好適な一態様を実施例においても示す。
【００４０】
なお、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の集団および／または免疫グロブリンの免疫学的に活性な部分（すなわち抗体結合部位またはパラト−プを含む分子）の集団を指す集合名詞として本明細書では用いられる。「抗体結合部位」とは、抗原と特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変並びに超可変領域から構成される抗体分子の構造部分である。
【００４１】
本発明で使用する典型的な抗体は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子および、パラト−プを含む免疫グロブリン分子の部分（当分野でＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として知られ、また抗体フラグメントと称される部分を含む）である。例えば、抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分（フラグメント）は、周知の方法（例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ  ＆  Ｄｉｘｏｎ，米国特許第４３４２５６６号を参照のこと）による実質的に完全な抗体のそれぞれパパインおよびペプシンによる蛋白分解反応によって調製される。Ｆａｂ’抗体部分もまた周知であるが、２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合を例えばメルカプトエタノ−ルで還元し、生じた蛋白メルカプタンを例えばヨ−ドアセトアミドのような試薬でアルキル化してＦ（ａｂ’）２部分から生成される。その他の抗体関連阻害剤は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．：Ｔｗｏ  ｈｅａｄｓ  ａｒｅ  ｂｅｔｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ｖｏｌ．２５（１１）：１２３３−４（２００７）を参照することができる。
【００４２】
「モノクロ−ナル抗体」は、典型的にはただ１種の抗体分子を分泌（産生）するハイブリド−マと呼ばれる単一の細胞クロ−ンによって産生される抗体から成る。このハイブリド−マ細胞は、抗体産生細胞とミエロ−マまたは他の自己永続化細胞株とを融合させて形成される。そのような抗体の調製は、最初コ−ラ−とミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））によって記載された。また別の方法はゾ−ラ（Ｚｏｌａ，“モノクロ−ナル抗体：術式の手引（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７））によって記載されている。
【００４３】
ただしＩＬ−１７Ｆは内因性の分子であるので、抗マウスＩＬ−１７Ｆ抗体産生ハイブリド−マを形成する際には、「Ｉｓｈｉｇａｍｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．３０、ｐｐ．１０８−１１９（２００９）」（非特許文献２６）及びそのＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｄａｔａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｃｏｍ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ／Ｓ１０７４−７６１３（０８）００５５４−２）に作製法が詳細に記載されているＩｆ１７ｆ−／−マウスを免疫動物として用いることにより、当該抗体産生細胞を効率的に取得することができる。
【００４４】
そして、そのように調製したハイブリド−マの上清をＩＬ−１７Ｆと免疫的に反応させ、さらに天然のＩＬ−１７Ｆレセプタ−へのＩＬ−１７Ｆ結合を抑制する中和抗体分子の存在についてスクリ−ニングすることができる。つまり、そのようにしてスクリ−ニングされた中和抗体は、本発明のＩＬ−１７Ｆ阻害剤として、天然のＩＬ−１７ＦとＩＬ−１７Ｆレセプタ−が結合するのを抑制するために用いることができる。
【００４５】
上記のような中和抗体スクリ−ニングの一具体例としては、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）によるＩＬ−６産生を指標とする方法が挙げられる。すなわち、ＭＥＦはＩＬ−１７Ｆ刺激によりＩＬ−６を産生することが知られており（Ｈｕ  Ｙ，Ｏｔａ  Ｎ，Ｐｅｎｇ  Ｉ，Ｒｅｆｉｎｏ  ＣＪ，Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ  ＤＭ，Ｃａｐｌａｚｉ  Ｐ，Ｏｕｙａｎｇ  Ｗ．：ＩＬ−１７ＲＣ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＩＬ−１７Ａ−  ａｎｄ  ＩＬ−１７Ｆ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１８４（８）：４３０７−１６（２０１０））、従って、当該ＩＬ−６産生阻害について抗ＩＬ−１７Ｆ抗体の中和活性をスクリ−ニングすることができる。当該スクリ−ニングの詳細は実施例に記載する。
【００４６】
なお、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）モノクロ−ナル抗体は、特に人間に治療的に使用する場合はマウスのモノクロ−ナル抗体より特別な利点を提供する。具体的には、ヒトの抗体は外来抗原のように急激に血液循環から排除されず、さらに外来抗原および外来抗体と同じ態様で免疫系を活性化させない。ヒト化抗体の調製方法は当分野で一般に周知であり、本発明の抗体に容易に応用できる。
【００４７】
模倣物：
典型的な本発明の「模倣物」は、ＩＬ−１７Ｆとそのレセプタ−との相互作用に必要な領域にＩＬ−１７Ｆ自体またはＩＬ−１７Ｆレセプタ−のいずれかの特徴的なアミノ配列を有し、さらにＩＬ−１７Ｆ拮抗物質活性を示すポリペプチドであり得る。ＩＬ−１７Ｆ模倣物のデザインは、当分野で既知の薬剤デザインのための様々な構造分析方法のいずれを用いても実施できる。これらの分析方法には、分子モデリング、二次元核磁気共鳴（２−ＤＮＭＲ）分析、Ｘ線結晶学、ペプチドのランダムスクリ−ニング、ペプチド類似体または他の化学ポリマ−ライブラリ−および同様な薬剤デザイン方法が含まれる。
【００４８】
ＩＬ−１７Ｆに対して選択性をもつ好ましいＩＬ−１７Ｆ拮抗物質の識別は、例えば前記のＭＥＦによるＩＬ−６産生阻害アッセイで容易に明らかにできる。例えば、模倣物は、それが必要なアミノ酸配列を含むペプチドであり、さらに例えば本明細書で述べるようなアッセイでＩＬ−１７Ｆ拮抗物質として機能することができる限り、本発明の目的に使用できることは理解されよう。また、模倣物のポリペプチドは、ペプチド誘導体の種々の形態のいずれかをとることができ、これは、アミド、蛋白との共役物、重合ペプチド、フラグメント、化学修飾ペプチドおよび同様な誘導体を含む。「化学的修飾」とは、官能側鎖基の反応によって化学的に誘導された１つまたは２つ以上の残基を有するポリペプチドを指す。そのような誘導分子は、例えば、遊離アミノ基が、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはフォルミル基を形成するように誘導された分子を含む。遊離カルボキシ基は、塩、メチルおよびエチルエステルもしくはエステルの他の種類を形成するように誘導することができる。遊離ヒドロキシ基は、ｏ−アシルまたはｏ−アルキル誘導体を形成するように誘導することができる。化学誘導体として含まれるものはまた、２０種の標準アミノ酸の天然に生じる１つまたは２つ以上のアミノ酸誘導体を含むペプチドである。
【００４９】
Ｂ．ＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ｆレセプタ−の発現阻害物質
本発明のＬＦ−１７Ｆ阻害剤は、組織においてＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ｆレセプタ−の発現を阻害することができる物質を含む。典型的な当該発現阻害物質は、ＩＬ−１７Ｆ（又はそのレセプタ−）を標的とするｓｉＲＮＡ分子或いはアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。
【００５０】
ｓｉＲＮＡ分子：
本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）は、好適にはＩＬ−１７Ｆ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）であって標的とする配列と相補的なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ鎖）および当該ＲＮＡに相補的なＲＮＡ（センスＲＮＡ鎖）が結合した二重鎖ＲＮＡである。本発明のＩＬ−１７Ｆ遺伝子の転写産物の配列は当業者によく知られている。また、マウスＩＬ−１７Ｆ用のｓｉＲＮＡは、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．より「ＩＬ−１７Ｆ  ｓｉＲＮＡ（ｍ）：ｓｃ−１４６２０４」として入手可能である。
【００５１】
一般的にｓｉＲＮＡが細胞に導入されると、ＲＮＡｉ現象が生じ、相同な配列を有するＲＮＡが分解される。本発明のｓｉＲＮＡには、ｓｉＲＮＡそのもの（二重鎖ＲＮＡ）の他、当該ｓｉＲＮＡを生成するようなｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ
ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ），ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＲＮＡ）又はそれらを発現できる発現ベクタ−も含まれ、これらはＲＮＡｉを引き起こすことができればどのような形態のものでもよい。また、当該ｓｉＲＮＡは、人工的に化学合成されたもの、修飾されたもの、生化学的に合成されたもの、又は生物体内で合成されたもの或いは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが生体で分解されたものであり、１０塩基対以上の二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの塩基数は、一般的には１０〜３０塩基、好ましくは１５〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基である。また、当該ｓｉＲＮＡは、通常、５‘−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３‘末端は約２塩基突出していることが好ましい（Ｅｌｂａｓｈｉｒ
ＳＭ， Ｈａｒｂｏｒｔｈ Ｊ， Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ Ｗ， Ｙａｌｃｉｎ Ａ， Ｗｅｂｅｒ Ｋ， Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ． Ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ２１−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ２００１ Ｍａｙ ２４；
４１１（６８３６）： ４９４−８）。ｓｉＲＮＡは一本鎖化し、一方の鎖（ガイド鎖）がタンパク質と共に、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。ＲＩＳＣは、ガイド鎖と相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。斯様にして、ｓｉＲＮＡは、その標的となる遺伝子のｍＲＮＡを分解することによりその発現を抑制することができる。
【００５２】
アンチセンスＲＮＡ：
「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコ−ドしている「センス」核酸に相補的な、例えば二本鎖ｃＤＮＡのコ−ディング鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、全ＩＬ−１７Ｆコ−ディング鎖に、またはそのフラグメントのみに相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、化学合成および酵素ライゲ−ション反応を用いて、当該分野で公知の方法を用いて構築することができる。また、別法として、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配置でサブクロ−ンされている発現ベクタ−を用いて生物学的に製造することができる。
【００５３】
本発明のアンチセンスＲＮＡ分子は、典型的には、ＩＬ−１７Ｆをコ−ドしている細胞内ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合して、それにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによりポリペプチドの発現を阻害する。
【００５４】
Ｃ．ＩＬ−１７Ａ阻害剤
前記のとおり、発明以前には、ＩＬ−１７Ｆと癌との関わりを示唆する報告はなかった。また、これまでの多くの研究は、ＩＬ−１７Ａに比べＩＬ−１７Ｆは作用が弱いことを指し示していた。しかるに、本発明者らが、実際の大腸癌発症機構において、腫瘍局所的にＩＬ−１７Ｆが過剰に産生されることで、当該ＩＬ−１７Ｆが腫瘍形成に中心的な役割を果たしていることを示唆する結果を得たことは驚嘆すべきことであった。いっぽうで、本発明者らは、ＩＬ−１７Ａも線維芽細胞に作用して血管新生を亢進させていることを確認した。また当該ＩＬ−１７Ａの阻害により大腸ポリプの発生数が減少すること、そしてその効果はＩＬ−１７Ｆ阻害との併用により更に増強されることを実証した。従って、ＩＬファミリ−分子を阻害することにより腸疾患の治療をする本発明の新規な方法は、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤とＩＬ−１７Ａ阻害剤を組み合わせて使用することを包含する。なお、本発明において「組み合わせて使用する」というときには、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤とＩＬ−１７Ａ阻害剤を一緒に又は逐次に（すなわち別々の時間に）、同一の又は異なる投与経路で投与することを意図する。従って、両薬剤の剤形も特に限定されるものではなく、両者が同一の単位剤中に含まれていても、或いは別個の単位剤に含まれていてもよい。
【００５５】
本発明のＩＬ−１７Ａ阻害剤については、ＩＬ−１７Ｆ阻害剤について前記したことが全て適用可能である。すなわち、ＩＬ−１７Ａ阻害剤も、典型的にはＩＬ−１７Ａレセプタ−とＩＬ−１７Ａが結合することを抑制することができるＩＬ−１７Ａ拮抗物質であるか、又は組織においてＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ａレセプタ−の発現を阻害することができる物質である。ＩＬ−１７Ａ拮抗物質及び発現阻害物質についても、ＩＬ−１７Ｆで説明したものが当て嵌まる。
【００５６】
ＩＬ−１７Ａ阻害剤の好適な例は、抗ＩＬ−１７Ａモノクロ−ナル抗体を含む。ＩＬ−１７Ａに拮抗するとされる抗ヒトＩＬ−１７（ＩＬ−１７Ａ）抗体は国際公開第ＷＯ２００７／１１７７４９号パンフレット（特許文献１）により公知であるが、更にそのような抗体を産生する細胞株を作製する方法およびこのモノクロ−ナル抗体を生成する方法は当業者にとっても容易に実施可能であり、その好適な一態様を実施例においても示す。
【００５７】
つまり、当該モノクロ−ナル抗体の調製は、コ−ラ−とミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））によって記載された方法は、或いはゾ−ラ（Ｚｏｌａ，“モノクロ−ナル抗体：術式の手引（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）”ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７））に記載されている方法に基づけばよい。
【００５８】
ただしＩＬ−１７Ａも内因性の分子であるので、抗マウスＩＬ−１７Ａ抗体産生ハイブリド−マを形成する際には、「Ｎａｋａｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．１７、ｐｐ．３７５−３８７（２００２）」（非特許文献３８）に作製法が詳細に記載されているＩ１７ａ−／−マウスを免疫動物として用いることにより、当該抗体産生細胞を効率的に取得することができる。
【００５９】
そして、そのように調製したハイブリド−マの上清をＩＬ−１７Ａと免疫的に反応させ、さらに天然のＩＬ−１７Ａレセプタ−へのＩＬ−１７Ａ結合を抑制する中和抗体分子の存在についてスクリ−ニングすることができる。つまり、そのようにしてスクリ−ニングされた中和抗体は、本発明のＩＬ−１７Ａ阻害剤として、天然のＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ａレセプタ−が結合するのを抑制するために用いることができる。
【００６０】
上記のような中和抗体スクリ−ニングの一具体例としては、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）によるＩＬ−６産生を指標とする方法が挙げられる。すなわち、ＭＥＦはＩＬ−１７Ｆ刺激によりＩＬ−６を産生することが知られており（Ｈｕ  Ｙ，Ｏｔａ  Ｎ，Ｐｅｎｇ  Ｉ，Ｒｅｆｉｎｏ  ＣＪ，Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ  ＤＭ，Ｃａｐｌａｚｉ  Ｐ，Ｏｕｙａｎｇ  Ｗ．：ＩＬ−１７ＲＣ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＩＬ−１７Ａ−  ａｎｄ  ＩＬ−１７Ｆ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．１８４（８）：４３０７−１６（２０１０））、従って、当該ＩＬ−６産生阻害について抗ＩＬ−１７Ｆ抗体の中和活性をスクリ−ニングすることができる。当該スクリ−ニングの詳細は実施例に記載する。
【００６１】
Ｄ．腸疾患の治療方法及び腸疾患治療用医薬組成物
既に明らかなように、腸疾患治療のための本発明の新規な方法はＩＬ−１７Ｆ阻害剤の治療的に有効な量を含む医薬組成物と、腸管疾患が生じているか又はそれらが生じる危険性がある組織とを接触させることを含む。本発明の治療対象である腸疾患は、典型的には腸管内の腫瘍であり、当該腫瘍はポリプ及び癌を含む。また、本発明の方法および医薬組成物により治療される腫瘍は、典型的には大腸に存在し得る。当該大腸腫瘍としては、悪性上皮性腫瘍、カルチノイド腫瘍、非上皮性腫瘍、リンパ腫、転移性腫瘍、良性上皮性腫瘍、及び腫瘍性病変（過形成性ポリプなど）を含む。
【００６２】
本発明の医薬組成物を製造するにあたっては、活性成分であるＩＬ−１７Ｆ阻害剤（なお、ここでの全ての説明は、ＩＬ−１７Ａ阻害剤について当て嵌まる。）に、必要により製薬上許容される補助成分を添加して医薬組成物となすことが好ましい。ただし、通常の使用状況下でＩＬ−１７Ｆ阻害剤の薬学的効力を実質上、低下させるような相互作用がないように、補助成分の選択と活性成分との混合を適合させるのが好ましい。また薬学上許容される補助成分は勿論、ヒトへの投与に際して何ら安全上の問題が無いほど、充分に高い純度と充分に低い毒性とを兼ね備えていることが望ましい。薬学上許容される補助成分としては、例えば糖類、デンプン、セルロ−ス誘導体、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、植物油、ポリオ−ル類、アルギン酸、等張化剤、緩衝剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、香味剤、保存剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤、抗微生物剤などが挙げられる。
【００６３】
本発明の医薬組成物の薬剤形態としては、例えば注射剤、直腸吸収剤、経口投与剤などが挙げられるが、これらの具体的な投与形態については何ら限定されるものではない。
【００６４】
例えば、本発明の医薬組成物を注射剤として投与する場合には、好ましくは筋肉内投与または皮下投与または静脈内投与のためのものとして適合され得、また、直腸吸収剤として投与する場合には一般に坐薬の形態とされてよく、さらに経口投与剤として投与する場合にはリポソ−ム製剤、マイクロカプセル製剤などの経口用としての形態とすることもできる。
【００６５】
より具体的な例としては、本発明の医薬組成物を注射剤として処方する場合には、例えば抗ＩＬ−１７Ｆ抗体を、緩衝剤、等張化剤およびｐＨ調節剤を適量溶解した注射用蒸留水に溶解し、除菌フィルタ−を通して滅菌したものをアンプルに分注することによって、所望の注射剤を調製し得る。
【００６６】
また、本発明の医薬組成物を直腸吸収剤として処方する場合には、例えば抗ＩＬ−１７Ｆ抗体を、ペクチン酸ナトリウムやアルギン酸ナトリウムなどのキレ−ト能を有する吸収促進剤および塩化ナトリウムやグルコ−スなどの高張化剤を適宜選択使用して、それらとともに蒸留水または油性溶媒に溶解または分散して坐剤となし得る（英国特許第２０９２００２号明細書、同第２０９５９９４号明細書参照）。
【００６７】
さらに本発明の医薬組成物を経口投与剤として処方する場合には、例えば抗ＩＬ−１７Ｆ抗体を、公知の薬学上許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色剤等の担体とともに、錠剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、カプセル剤となし得る。
【００６８】
本発明の医薬組成物に活性成分として含まれるＩＬ−１７Ｆ阻害剤、例えば抗ＩＬ−１７Ｆ抗体の治療有効量は、年齢、体格、性別、対象者の健康度、投与されるＩＬ−１７Ｆ阻害剤の比活性、薬剤形態、投与頻度などによって異なるが、例えば体重キログラムあたり約０．０５ｍｇから約２０ｍｇ、より通常は体重キログラムあたり約０．１ｍｇから約５ｍｇの投与量が例示される。投与頻度も、年齢、体格、性別、対象者の健康度、投与されるＩＬ−１７Ｆ阻害剤の比活性、投与量、薬剤形態などによって異なるが、１回／月〜３回／日の範囲であればいずれでもよく、好ましくは１回／週〜１回／日であり、さらに好ましくは１回／週または１回／日である。
【００６９】
本発明の医薬組成物の有効成分は他剤との相互作用もないため、対象者の都合に合わせて、様々な薬剤との併用が可能である。当該併用可能な薬剤の例としては、国際公開第ＷＯ２００７／１１７７４９号パンフレット（特許文献１）に記載のものが挙げられる。
【００７０】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の例に限定されることはない。
【実施例】
【００７１】
実施例１：大腸癌発症機構におけるＩＬファミリ−分子の役割
＜材料と方法＞
１）マウス
・ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊ背景のマウスをジャクソン研究所より購入した。
・Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスは、「Ｈｏｒａｉら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．１８７、ｐｐ．１４６３−１４７５（１９９８）」（非特許文献３７）に記載された方法により作製した。８世代以上のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本ＳＬＣ株式会社）にバッククロスした個体を以下の実験に用いた。
・Ｉｌ１７ａ−／−マウスは、「Ｎａｋａｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．１７、ｐｐ．３７５−３８７（２００２）」（非特許文献３８）に従い、ＡＴＧ開始コドンを含むエキソン１−２をＥＳ細胞上でネオマイシン耐性遺伝子と置換することで作製された。８世代以上のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本ＳＬＣ株式会社）にバッククロスした個体を以下の実験に用いた。
・Ｉｌ１７ｆ−／−マウスは、「Ｉｓｈｉｇａｍｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｖｏｌ．３０、ｐｐ．１０８−１１９（２００９）」（非特許文献２６）に従い、Ｉｌ１７＋／−ＥＳ細胞を用いて、ハイブロマイシンマイシン耐性遺伝子をエキソン２−３と置換することにより作製された。８世代以上のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本ＳＬＣ株式会社）にバッククロスした個体を以下の実験に用いた。
以上のマウスを交配することで、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスを作製した。なお、マウスは東京大学医科学研究所ヒト疾患モデル研究センタ−において、ＳＰＦ環境下で維持した。全ての実験は、医科学研究所動物実験実地マニュアルと遺伝子組み換え生物等の使用に関する法律に沿って行った。【００７２】
２）ポリプ形成の比較
ＡｐｃＭｉｎ／＋マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスは４．５ヶ齢で腸管を取り出し中性緩衝１０％ホルマリン溶液で固定後、顕微鏡下で０．５ｍｍから１ｍｍ、１ｍｍから３ｍｍ、３ｍｍ以上の大きさに分類し、その個数を大腸、小腸、それぞれの部位に対しポリプ発生数を測定した。
ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスは６ヶ月齢で腸管を取り出し中性緩衝１０％ホルマリン溶液で固定後、顕微鏡下で０．５ｍｍから１ｍｍ、１ｍｍから３ｍｍ、３ｍｍ以上の大きさに分類し、その個数を大腸、小腸、それぞれの部位に対しポリプ発生数を測定した。【００７３】
３）ｍＲＮＡの抽出
それぞれのマウスからポリプ部分、非ポリプ部分を採取し、セパゾ−ルＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク株式会社）で抽出後、イソプロパノ−ル沈殿を行いｍＲＮＡを分離した。なおポリプの大きさは２ｍｍから３ｍｍの大きさに揃えて実験を行った。細胞株についても同様にセパゾ−ルＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク株式会社）のプロトコルに沿って行った。なお細胞株（ＭＥＦ）は１×１０６に調製後、３時間、抗生物質含有（ペニシリン、ストレプトマイシン）ＲＰＭＩ培地で培養し、その後ＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄ株式会社）、ＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄ株式会社）を、それぞれ、１ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ調製し添加後３時間で細胞を回収した。【００７４】
４）細胞株
ＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）はＣ５７ＣＬ／６Ｊマウスの胎児（１４．５日）より作製した。ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）に１０％ＦＣＳ、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加したもので培養し初代培養細胞を用いた。【００７５】
５）ＤＮＡマイクロアレイ解析
上記３）で抽出したＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリプ部分と非ポリプ部分、及びＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスのポリプ部分と非ポリプ部分の計４種類のｍＲＮＡに対して、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０Ａｒｒａｙ（ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ社）のチップを用いマイクロアレイ解析を行った。そして、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリプ部分と非ポリプ部分、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスのポリプ部分と非ポリプ部分に対して解析ソフト「ＧＳＥＡ」を用い機能グル−プ解析を行った（非特許文献３９）。【００７６】
６）定量的ＰＣＲ法による解析
上記３）で抽出したｍＲＮＡを５０ｎｇ／μｌに調整後、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ＲＴ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いｃＤＮＡへと転写した。その後、ＳＹＢＲＥ  ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用い定量的ＰＣＲを行った。発現量はハウスキ−ピング遺伝子であるＧａｐｄｈを用い補正した。【００７７】
７）組織切片の作製
上記２）でサンプリングされたポリプを１０％中性緩衝ホルマリン溶液で１時間固定後自動包埋機を用いパラフィン包埋を行った。その後５μｍに薄切し組織切片を作製した。【００７８】
８）ＴＵＮＥＬ法によるアポト−シス細胞の検出
上記７）で作製された組織切片をキシレン、エタノ−ルを用い脱パラフィン化した後、アポト−シス検出ｋｉｔ（ロシュ社）を用いＴＵＮＥＬ法によりアポト−シス細胞の検出を行った。【００７９】
９）免疫染色法による染色
上記７）で作製された組織切片に対し免疫染色を行った。キシレン、エタノ−ルによる脱パラフィン後、０．１Ｍクエン酸バッファ−（ｐＨ６）による抗原の賦活化を行った。ブロッキングは２％ヤギ血清（ＶＥＣＯＴＲ社）／ＰＢＳで一時間行い、一次抗体は、Ｖｅｇｆ  ａｌｆａ（ａｂｃａｍ社）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（ａｂｃａｍ社）、ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｌａｔｉｏｎ  Ｈｉｓｔｎ  Ｈ（ＰＨ）３（ａｂｃａｍ社）、ＣＤ３１（ａｂｃａｍ社）、ＩＬ−１７Ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｎｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、ＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄ社）、を用い一晩反応させた。二次抗体Ａｌｅｘａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、Ｃｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ社）、ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用い一時間反応させた。核染色はＨｏｅｃｈｅｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、ＤＡＢ（ナカライテスク社）を用いた。なお観察は全て、ＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用い、解析はＢＺ−ＩＩ（ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いた。なおＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆに関してはチラミド増幅法であるＴＳＡ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用い免疫染色を行った。【００８０】
１０）統計的評価
得られた結果は全てのｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ検定により、統計学的に評価した。なお有意差は＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１とした。【００８１】
＜結果＞
１．  ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウス（４．５ヶ月齢）との比較
ＡｐｃＭｉｎ／＋マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスとのポリプ数を測定したところＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスではＡｐｃＭｉｎ／＋マウスに比べ優位にポリプ数が増加していた（図１及び図２）。またマイクロアレイ解析の結果ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリプ部分において炎症性シグナル経路の亢進が見られた（図３）。またＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスの非腫瘍部、腫瘍部をマイクロアレイ解析のデ−タと文献デ−タを比較した結果線維芽細胞の細胞周期に関わる因子が増加していることが示された（図４）。しかし定量的ＰＣＲ法による解析の結果Ｃｏｘ２の発現はＡｐｃＭｉｎ／＋マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスとのポリプ部分を比較した結果有意な差は見られなかった（図６）。同様に定量的ＰＣＲ法による解析の結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋マウスポリプ部分においてＩｌ１７ｆの産生が有意に亢進しており、さらにＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリプ部分を比べたところＩｌ１７ｆ産生が有意に亢進していることが分かった（図５ａ）。Ｉｌ１７ａの産生量についてはＡｐｃＭｉｎ／＋マウスではポリプ部分、非ポリプとも変動が見られなかったがＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋マウスのポリプ部分を比べたところＩｌ１７ａ産生が有意に亢進していることが分かった（図５ｂ）。
以上の結果から、ＩＬ−１ファミリ−分子による過剰な炎症状態はＣＯＸ２に非依存的な経路により大腸癌を増悪化させていることが示唆された。また、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１ｒｎ−／−マウスのマイクロアレイによる遺伝子発現変動との比較は、線維芽細胞の細胞周期に関わる経路の発現変動とＩＬ−１ファミリ−分子との関連を示した。【００８２】
２．  ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスとのポリプ形成（６ヶ月齢）の比較
ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスそれぞれのポリプ数、大きさを比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスはＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスに比べポリプの減少量は小さかったが、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスと比較して３ｍｍ以上ポリプ数は有意に減少していることが分かった（図７、８及び９）。また、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスでは１ｍｍから３ｍｍのポリプ数も減少していることが示された（図９）。ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスの腸管に発生した全ポリプ数を比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスにおいてのみ有意なポリプ数減少が見られた（図８ｃ）。【００８３】
３．  ＩＬ−１７およびＩＬ−１７Ｆ産生細胞の特定
ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスの組織切片においてＩＬ１７、ＩＬ−１７Ｆの産生細胞を特定するために免疫染色を行った結果、ＩＬ−１７の産生細胞は主に浸潤細胞であるのに対し、ＩＬ−１７Ｆの産生細胞は浸潤細胞の他に上皮細胞および癌細胞自身も産生していることが分かった（図１０）。【００８４】
４．  マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）による血管新生因子の測定
ＭＥＦにＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆを添加し、血管新生の因子であるＶｅｇｆａ、Ｃｘｃｌ１、Ｃｏｘ２の発現を定量的ＰＣＲ法を用いて測定した結果、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｆの濃度依存的に血管新生因子が増加していることが分かった（図１１のａ，ｂ，ｃ）。
これらの結果は、Ｉｌ−１７ファミリ−分子が血管新生を亢進させて腫瘍形成を促進していることを示している。そのメカニズムとしてＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆは腫瘍環境下で線維芽細胞に作用し、ＶＥＧＦＡ、ＣＸＣＬ１、ＣＯＸ２といった血管新生に関与する因子の発現を亢進させることにより癌局所に血管を作り、癌細胞が発育しやすい環境を作り出すことが原因であることを予測させる。【００８５】
５．  ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスにおけるポリプ環境の比較
定量的ＰＣＲ法を用いてＶｅｇｆａの発現を調べたところ、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスのポリプ部分では、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスのポリプ部分と比べ、Ｖｅｇｆａの発現量が減少していることが分かった（図１２）。免疫染色法によるＶＥＧＦＡの染色の結果、ＶＥＧＦの産生は上皮細胞では無く浸潤細胞であることが確認された（図１３）。そこでポリプ局所における浸潤細胞の種類を調べるため線維芽細胞のマ−カ−であるＶｉｍｅｎｔｉｎで染色を行った結果、浸潤細胞の大部分が線維芽細胞であることが分かった（図１４）。【００８６】
６．  ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスマウスのポリプ環境下における増殖、アポト−シス応答
ポリプ環境下での増殖応答、細胞死を比較するためマウスの組織切片を用いてＴＵＮＥＬ法によるアポト−シス細胞数、免疫染色法によるｐＨ３染色を行った。その結果アポト−シス細胞数に差が無いことが示唆され（図１５）、増殖細胞がＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスで有意に減少していることが分かった（図１６ｅ）。そこで免疫染色法によるＣＤ３１（血管のマ−カ−）の染色の結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスのポリプ局所において血管が減少していることが分かった（図１７）。【００８７】
７．  ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウス（６ヶ月齢）との比較
ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ＋／−マウスとＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスとを比較した結果、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスにおいて有意にポリプ形成が減少することがわかった（図１８）。また、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ＋／−マウス、ＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ＋／−／ｆ−／−マウスそれぞれの単独ノックアウトマウスに比べＡｐｃＭｉｎ／＋−Ｉｌ１７ａ−／−／ｆ−／−マウスでは有意にポリプの発生が減少していることが分かった（図１８のｂ，ｃ，ｅ，ｆ）。
以上の結果より、Ｉｌ１７ａ及びＩｌ１７ｆのシングルノックアウトマウスでは確かにポリプ形成の抑制が見られ、さらにＩＬ−１７Ａに比べＩＬ−１７Ｆの寄与の方が大きいという結果が見られた。また、Ｉｌ１７ａ／ｆダブルノックアウトマウスはシングルノックアウトマウスに比べ有意にポリプ形成が抑制されることからも抗癌治療として抗ＩＬ−１７Ｆ抗体投与、もしくは抗ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ抗体の併用がより効果的であると考えられる。【００８８】
実施例２：抗ＩＬ−１７Ｆ抗体及び抗ＩＬ−１７Ａ抗体による大腸癌抑制
（１）抗ＩＬ−１７Ｆ抗体及び抗ＩＬ−１７Ａ抗体の作製
抗ＩＬ−１７Ｆ抗体及び抗ＩＬ−１７Ａ抗体を作製するために、Ｉｌ１７ｆ−／−マウス及びＩｌ１７ａ−／−マウスを、それぞれ、リコンビナントＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ−１７Ａにより免疫した。【００８９】
具体的に、上記実施例１に記載の文献に準じて作製されたＩｌ１７ｆ−／−マウス及びＩｌ１７ａ−／−マウスを免疫動物として用いた。抗原としてのリコンビナントマウスＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ−１７Ａは、市販（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）のものを用いた。アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  （ＦＲＥＵＮＤ）；三菱化学ヤトロン社製ＲＭ６０６−１）と１ｍｇ／ｍｌの抗原溶液を混ぜ、エマルジョンにして、マウスに免疫した。計３回の免疫を行い、ＰＥＧ法で細胞融合を行った。融合、播種の、３日後に培地を交換し、ハイブリド−マのコロニ−形成が確認された段階で（２〜３週間後）９６穴プレ−トから培養上清をサンプリングし、次の１次スクリ−ニングを行った。【００９０】
一次スクリ−ニングはＥＬＩＳＡ法により行った。まず、抗原（リコンビナントマウスＩＬ−１７Ｆ又はＩＬ−１７Ａ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈後、感作用プレ−ト（ＮＵＮＣ社製；Ｃａｔ  Ｎｏ  ４６８６６７）に５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃  ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔで静置した。その後、抗原溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、４℃  ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔで静置した。上記でサンプリングした各培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で６０分間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳで３回洗浄後、Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識（ＭＢＬ社製；Ｃｏｄｅ．３３０）を希釈Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ製）で１０，０００倍希釈したものを５０μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で６０分間反応させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０  ｉｎ  ＰＢＳで３回洗浄後、発色液（ＭＢＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで加え５分間発色させ、その後、１．５  ｍｏｌ／Ｌリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで加えて反応を停止した。反応停止後、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６２０ｎｍで吸光度を測定した。【００９１】
上記の１次スクリ−ニングで陽性と判断した培養上清に基づいて選択されたハイブリド−マに対して限界希釈法による単クロ−ン化の作業を行った。具体的に、対数増殖期に入った状態の良いハイブリド−マをパスツ−ルピペットでピペッティングした後採取し、培地で希釈後、１ウェルあたりの細胞数が１個から３２，０００個になるように細胞濃度をふって９６穴プレ−トに播種した。ハイブリド−マのシングルコロニ−の形成が確認された段階で（１〜２週間後）９６穴プレ−トから培養上清をサンプリングした。【００９２】
次いで、単クロ−ンの確認（アイソタイプ確認）を、アイソタイピングキット（Ｉｓｏ  Ｓｔｒｉｐ  マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイピングキット；Ｒｏｃｈｅ社製、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １−４９３−０２７）を用いて行った。すなわち、上記でサンプリングした培養上清をＰＢＳで１００倍希釈したものをディベロップメントチュ−ブに滴下し、着色ラテックスビ−ズを再懸濁した。チュ−ブに上記キットのアイソタイプ用ストリップを浸漬し、５分間おきに特定のサブクラス部分に検出されたバンドを確認した。この限界希釈法により単クロ−ン化されたハイブリド−マを９６穴プレ−ト１穴から、４８穴プレ−ト、２４穴プレ−ト、１２穴プレ−トまで継代培養した。１ウェルの細胞を遠心回収し、セルバンカ−５００μＬで懸濁し、ストックチュ−ブ１本に入れ−８０℃で保存した。【００９３】
（２）マウスＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａに対する中和抗体の選択
上記でスクリ−ニングされた抗ＩＬ−１７Ｆ抗体及び抗ＩＬ−１７Ａ抗体のマウスＩＬ−１７およびＦＩＬ−１７Ａに対する中和活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）をリコンビナントＩＬ−１７ＡあるいはＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で刺激（２４時間）したときのＩＬ−６産生誘導を指標（ハイブリド−マ培養上清を１／３量添加したときの阻害活性）として評価した。【００９４】
具体的に、マウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ）は以下のように調製した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの性成熟に達したオスとメスを同居させ、その後、毎朝、膣栓（ｐｌｕｇ）の確認を行い、確認のできた日の朝を０．５日とカウントし、１４．５日に妊娠マウスを開腹し、胎仔を取り出した。胎仔は、冷ＰＢＳ内にて頭部および臓器を取り除き、残りの部分をハサミにて細切した。その後、３７℃インキュベ−タ−内にて０．０５％トリプシン溶液で２０分加温・撹拌した。トリプシン溶液にフィ−ダ−用培地（非必須アミノ酸／ピルビン酸ナトリウム添加ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を等量加え、トリプシンを失活させた後、ナイロンメッシュで濾過、１，０００ｒｐｍ、５分遠心後、上清を捨て、適当量のフィ−ダ−用培地に細胞を懸濁した。ゼラチンコ−ト済みの１５ｃｍディッシュに１ｘ１０７個の細胞を播種し、３７℃のＣＯ２インキュベ−タ−内で培養した。翌日あるいは翌々日に細胞が十分増殖したら継代し、さらに増殖させた後、凍結保存した。【００９５】
次いで、前記の１次スクリ−ニングにより選択されたハイブリド−マ上清のｉｎ  ｖｉｔｒｏ中和活性測定を、以下のようにして行った。【００９６】
４８−ｗｅｌｌプレ−トに上記で調製したＭＥＦを１〜２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５００μｌフィ−ダ−用培地）となるように播種し、３７℃のＣＯ２インキュベ−タ−内で１日培養した。その培地を除去した後、新たな培地を１００μｌ、ハイブリド−マ培養上清を１００μｌ、及びリコンビナント（ｒ）ＩＬ−１７ＡまたはｒＩＬ−１７Ｆ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）含有培地を１００μｌ、その順番で培養ＭＥＦに加えた。このとき、ｒＩＬ−１７Ｆは終濃度が１．０−５０ｎｇ／ｍｌの範囲の希釈系列となるように、また、ｒＩＬ−１７Ａは終濃度０．２−１０ｎｇ／ｍｌの範囲の希釈系列となるようにした。３７℃のＣＯ２インキュベ−タ−内で２４時間培養した後に培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法｛ＤｕｏＳｅｔ
(登録商標）：  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓを使用｝にて培養上清中に含まれるＩＬ−６の濃度を測定した。【００９７】
上記の測定により中和活性が陽性と判定されたハイブリド−マは、再度、限界希釈法により単クロ−ン化し、更に上記と同様のＩＬ−６産生誘導阻害を指標にしたスクリ−ニングを行って、好適な中和抗体を選択した。選択された幾つかのＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａに対する中和抗体のＩＬ−６産生誘導阻害活性を、それぞれ、図１９および図２０に示す。【００９８】
上記のようにして選択した抗体のうちで、クロ−ンＫ１３−４（抗ＩＬ−１７Ｆ抗体）、並びにクロ−ンＫ１５−２及びＫ３３−４（抗ＩＬ−１７Ａ抗体）に関して、無血清培地（ＢＤ  ＣｅｌｌＴＭ  ＭＡｂ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）で培養し、その上清から精製抗体（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラムにて精製）を作製した。具体的に、ハイブリド−マは当初、血清入り培地（ＲＰＭＩ１６４０、１５％  ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン。１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）で培養を行い、その後、継代時に血清入り培地に無血清培地｛ＢＤ  Ｃｅｌｌ(登録商標）  ＭＡｂ  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン｝を加えていき、無血清培地への馴化を図った。１００％無血清培地での培養で増殖ができるようになった時点で、３ｘ１０７細胞を専用培養槽ＣＥＬＬｉｎｅ(登録商標）  ＣＬ−１０００（ＢＤ社製）にて培養した。１週間毎にハイブリド−マの培養上清（〜１５ｍｌ）を回収した。回収した培養上清について、Ｃｌｅａｎａｓｃｉｔｅ(登録商標）（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｇｒｏｕｐ、ＬＣＣ）を１／４量加えて１０分間室温でやさしく震盪した後、２０００ｒｐｍで遠心を行い、その上清を回収した。０．４５μｍフィルタ−で濾過した後、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラム（ＧＥ社製）にて精製を行った。０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）にて溶出された抗体濃縮液は、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ(登録商標）  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）にて透析（１００倍量のＰＢＳ内にて、１時間ｘ２、終夜ｘ１）を行い、ＰＢＳに置換した。０．２２μｍフィルタ−で濾過滅菌を行った後、タンパク濃度をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて決定した。また、精製度については、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて確認した。【００９９】
クロ−ンＫ１３−４（抗ＩＬ−１７Ｆ抗体）、並びにクロ−ンＫ１５−２及びＫ３３−４（抗ＩＬ−１７Ａ抗体）の中和活性を、前記のＩＬ−６産生誘導阻害を指標にして再評価した結果を、それぞれ、図２１及び図２２に示す。なお、以下の実験では、ＩＬ−１７Ａの中和抗体として、クロ−ンＫ１５−２した。【０１００】
（２）ｉｎ  ｖｉｖｏ中和活性評価（腸管ポリ−プ形成阻害効果）
４ヶ月例のＡｐｃＭｉｎ／＋マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景）に対して、下記抗体を１回／週腹腔内投与を６回行い、最終投与１週間後に腸管を取り出しポリ−プ数を測定した。
・コントロ−ル・マウスＩｇＧ  ０．５ｍｇ
・抗マウスＩＬ−１７Ａ抗体（Ｋ１５−２）  最初の２回０．４ｍｇ、その後０．２ｍｇ
・抗マウスＩＬ−１７Ｆ抗体（Ｋ１３−４）  ０．２ｍｇ
・抗マウスＩＬ−１７Ａ抗体と抗マウスＩＬ−１７Ｆ抗体の両方
図２３に示したとおり、抗ＩＬ−１７Ｆ抗体を投与されたマウスでは、コントロ−ル・マウスに比べて３ｍｍ以上のポリ−プ数が減少していた。抗ＩＬ−１７Ａ抗体を投与した場合も同様な傾向が見られた。抗ＩＬ−１７Ｆ抗体及び抗ＩＬ−１７Ａを組み合わせて投与した場合は、それぞれを単独で投与した場合よりも若干のポリ−プ数の減少が見られた。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
ここにおいて、本発明者らは、大腸癌発症時における炎症性サイトカインＩＬ−１ファミリ−分子や、ＩＬ−１７ファミリ−分子は腫瘍形成促進に働いており、これらのサイトカインを抑制することで腫瘍形成を抑制出来ることを明らかにした。これらの結果から、癌の治療方法である外科療法、化学療法、放射線療法、免疫療法、に続く第５の治療方法として期待されている抗体療法のタ−ゲットとしてＩＬ−１ファミリ−分子、ＩＬ−１７ファミリ−分子、特にＩＬ−１７Ｆを新たに加えることが出来る。従って、本発明のＩＬ−１７Ｆ阻害剤を含む腸疾患治療用医薬組成物は、医薬品製造業分野等において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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