(57)【要約】  本発明は、対象からなどの試料中のがん特異的核酸の量を評価するための、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、対象におけるがんなどの状態のリスクを決定するために、使用することができる。
2019518437.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの試料中のがん特異的核酸の量を評価する方法であって、方法が、
１以上の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して、少なくとも２つのプライマー対を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施すること、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては、３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、
およびＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得るかまたは提供して、試料中のがん特異的核酸の量を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
結果がレポートで提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法がさらに、試料中のがん特異的核酸の量を、結果に基づいて決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
結果が、試料中のがん特異的核酸の量を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
対象からの試料中のがん特異的核酸の量を評価する方法であって、方法が：
１以上の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的それぞれについて、試料またはその一部に対して実施した、少なくとも２つのプライマー対を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得ること、ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つの１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および
がん特異的核酸の量を、結果に基づいて評価すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
試料中のがん特異的核酸の量が、ＰＣＲ定量アッセイなどの、増幅に基づいた定量アッセイの結果に基づく、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結果がレポートから得られる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つのプライマー対のもう１つのプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
量が、アッセイで測定された野生型または総核酸に対するがん特異的核酸の比率またはパーセンテージである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
結果が、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
量が、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果に基づく、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
方法がさらに、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果を選択することを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
選択された情報提供的結果が、平均化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果が、対象の遺伝子型に基づいて選択されている、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法がさらに、対象の遺伝子型を得ることを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
方法がさらに、多数のＳＮＶ標的を得ることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
方法がさらに、１以上のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１以上のＳＮＶ標的が、少なくとも１つのＳＮＶ標的である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１以上のＳＮＶ標的が、少なくとも２つのＳＮＶ標的である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１以上のＳＮＶ標的が、少なくとも３つのＳＮＶ標的である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
１以上のＳＮＶ標的が、少なくとも４つのＳＮＶ標的である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
１以上のＳＮＶ標的が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のＳＮＶ標的である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
１以上のＳＮＶ標的が、それぞれ同じ種類のがんに特異的である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
１以上のＳＮＶ標的のうちの１以上が、膵がんに特異的である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
１以上のＳＮＶ標的が、ＫＲＡＳ遺伝子および／またはｐ５３遺伝子におけるＳＮＶ標的を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
１以上のＳＮＶ標的が、それぞれ対象におけるがんに特異的である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
方法がさらに、対象におけるがんの遺伝子型を得ることを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのＳＮＶ標的が、１種類のがんに特異的であり、少なくとも１つの他のＳＮＶ標的が、別の種類のがんに特異的である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
１以上のＳＮＶ標的が、１、２、３、４または５種類以上のがんに特異的である、またはがん特異的変異と関連した１、２、３、４または５つ以上の遺伝子を由来とする、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
試料中のがん特異的核酸の量が、少なくとも０．２５％である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
試料中のがん特異的核酸の量が、少なくとも０．５％である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
試料中のがん特異的核酸の量が、少なくとも０．７５％である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
試料中のがん特異的核酸の量が、少なくとも１％である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
試料中のがん特異的核酸の量が、少なくとも２％である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
試料中のがん特異的核酸の量が、少なくとも５％である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
がん特異的核酸が、がん特異的無細胞（cell-free）ＤＮＡである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＣＲ定量アッセイが、リアルタイムＰＣＲアッセイまたはデジタルＰＣＲアッセイである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
方法がさらに、対象におけるリスクを試料中のがん特異的核酸の量に基づいて、決定することを含む、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
リスクが、がんに関連したリスクである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
がん特異的核酸の量が、閾値よりも大きい場合に、リスクが増加している、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
がん特異的核酸の量が、閾値よりも少ない場合に、リスクが減少している、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４２】
方法がさらに、対象の処置をがん特異的核酸の量に基づいて選択することを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
方法がさらに、がん特異的核酸の量に基づいて対象を処置することを含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
方法がさらに、がん特異的核酸の量に基づいて対象の処置について情報を提供することを含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
方法がさらに、経時的または後の時点での対象におけるがん特異的核酸の量をモニタリングすることまたはモニタリングを示唆することを含む、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
方法がさらに、対象に投与する処置の効果を、がん特異的核酸の量に基づき評価することを含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
処置が、がんの処置である、請求項４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
試料またはその一部を提供するまたは取得することをさらに含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
核酸を試料から抽出することをさらに含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
増幅前ステップを実施することをさらに含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
試料が、血液、血漿または血清を含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
組成物またはキットであって、
１以上のがん特異的ＳＮＶ標的それぞれについてのプライマー対を含み、ここで各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅する、ここで１以上のＳＮＶ標的を含む、
前記組成物またはキット。
【請求項５３】
１以上のがん特異的ＳＮＶ標的のそれぞれについて別のプライマー対をさらに含み、ここで別のプライマー対がＳＮＶ標的の別のアレルを増幅する、請求項５２の組成物またはキット。
【請求項５４】
１以上のがん特異的ＳＮＶ標的が、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のＳＮＶ標的である、請求項５２または５３に記載の組成物またはキット。
【請求項５５】
がん特異的ＳＮＶ標的が、それぞれ同じ種類のがんに特異的である、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項５６】
１以上のＳＮＶ標的のうち１以上が、膵がんに特異的である、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項５７】
がん特異的ＳＮＶ標的が、ＫＲＡＳ遺伝子および／またはｐ５３遺伝子におけるＳＮＶ標的を含む、請求項５２〜５４いずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項５８】
がん特異的ＳＮＶ標的が、対象におけるがんにそれぞれ特異的である、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項５９】
少なくとも１つのＳＮＶ標的が、１つの種類のがんに特異的であり、少なくとも１つの他のＳＮＶ標的が、別の種類のがんに特異的である、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６０】
１以上のＳＮＶ標的が、１、２、３、４または５を超える種類のがんの種類に特異的である、または１、２、３、４または５を超えるがん特異的変異に関連した遺伝子に由来したものである、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６１】
ＳＮＶ標的のそれぞれについて、別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項５３〜６０のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６２】
緩衝液をさらに含む、請求項５２〜６１のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６３】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項５２〜６２のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６４】
プローブをさらに含む、請求項５２〜６３のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６５】
プローブが蛍光プローブである、請求項６４に記載の組成物またはキット。
【請求項６６】
使用説明書をさらに含む、請求項５２〜６５のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６７】
使用説明書が、がんまたはがんを有すると疑いのある対象からの試料中のがん特異的核酸の量を決定するまたは評価するための説明書である、請求項６６に記載の組成物またはキット。
【請求項６８】
請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項５２〜６７のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項６９】
本明細書で提供される方法のいずれか１つで使用するための、請求項５２〜６７のいずれか１項に記載の組成物またはキット。
【請求項７０】
方法であって、
請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法に基づいてがん特異的核酸の量を得ること、および
がんのリスクがある、がんを有する、がんを有すると疑いのある、または、以前にがんを有していた対象において、リスクを、レベルまたは量に基づいて評価すること、
を含む、前記方法。
【請求項７１】
処置または処置もしくは無処置に関する情報が、評価されたリスクに基づいて対象について選択されるかまたは提供される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
方法がさらに、対象におけるがん特異的核酸の量を経時的にモニタリングすることまたはモニタリングを示唆することを含む、請求項７０または７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の元で、２０１６年４月２９日に出願された米国仮出願第62/330,043号の出願日の利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価するための、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、がんなどの状態のリスクを決定するために使用することができる。本発明はさらに、非天然無細胞デオキシリボ核酸（がん特異的無細胞ＤＮＡなどの非天然無細胞ＤＮＡ）の量を評価するための、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を使用した、方法および組成物に関する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、少なくとも部分的に多重／最適化ミスマッチ増幅を用いて対象からの試料中の低頻度の非天然核酸を定量することができるという、驚くべき発見に基づく。多重／最適化ミスマッチ増幅は、特定配列の増幅のために３’末端から２番目のミスマッチを、しかし代替配列に対しては二重ミスマッチを含み得るプライマーの設計を包含する。かかるプライマーの増幅は、核酸の異種集団において、非天然核酸の量が、例えば、１％未満または０．５％である場合でさえ、試料中の非天然核酸の量の定量的決定を可能とし得る。
【０００４】
本明細書にて提供されるものは、かかる増幅アッセイに関する方法、組成物およびキットである。本方法、組成物またはキットはそれぞれ、例および図面にあるもののいずれか１つを含む、本明細書で提供される、いずれか１つの方法、組成物またはキットであり得る。
一側面において、対象からの試料中のがん特異的核酸の量を評価する方法が、提供される。一態様において、方法は、１以上の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部について、少なくとも２つのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づいた定量アッセイを実施することを含み、ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいて、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを増幅し、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイから結果を得るまたは提供し、試料中のがん特異的核酸の量を決定することを含む。
【０００５】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、結果は、レポートで提供される。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、結果に基づいて試料中のがん特異的核酸の量を決定することを含む。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、結果は、試料中のがん特異的核酸の量を含む。
一側面において、対象からの試料中のがん特異的核酸の量を評価する方法であって、１以上の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイから結果を得ることを含み、少なくとも２つのプライマー対を用いて、試料またはその一部に実施される方法であって、ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいて、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対の別のものはＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅し、結果に基づいてがん特異的核酸の量を評価する方法が、提供される。
【０００６】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、試料中のがん特異的核酸の量は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの結果に基づく。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、結果はレポートから得られる。
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも２つのプライマー対のうちの別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する。
【０００７】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、量は、アッセイにおいて測定された野生型または総核酸に対するがん特異的遺伝子の比率またはパーセンテージである。
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、結果は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、量は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果に基づいている。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果を選択することを含む。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、選択された情報提供的結果は、平均化されている。
【０００８】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づいた定量アッセイの情報提供的結果は、対象の遺伝子型に基づいて選択される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに対象の遺伝子型を得ることを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさら複数のＳＮＶ標的を得ることを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、１以上のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む。
【０００９】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも２つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも３つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも４つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも５つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも６つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも７つのＳＮＶ標的である。
【００１０】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも８つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも９つのＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１０のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１１のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１２のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１３のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１４のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、少なくとも１５のＳＮＶ標的である。
【００１１】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的は、それぞれ同じ種類のがんに特異的である。方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様における、がんの種類は、膵がんである。方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様における、１以上のＳＮＶ標的はＫＲＡＳ遺伝子および／またはｐ５３遺伝子におけるＳＮＶ標的を含む。方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のＳＮＶ標的それぞれ対象におけるがんに特異的である。方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１つのＳＮＶ標的は、１種類のがんに特異的であり、少なくとも１つの他のＳＮＶ標的は、別の種類のがんに特異的である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＳＮＶ標的は、対象の以前のがんにおける変異した配列である。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象におけるがんの遺伝子型を得ることを含む。
【００１２】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中のがん特異的核酸の量は、少なくとも０．２５％である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中のがん特異的核酸の量は、少なくとも０．５％である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中のがん特異的核酸は、少なくとも１％である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中のがん特異的核酸の量は、少なくとも２％である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中のがん特異的核酸の量は５％である。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、がん特異的核酸は、がん特異的無細胞ＤＮＡである。
【００１３】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＰＣＲ定量アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイまたはデジタルＰＣＲアッセイである。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、試料中のがん特異的核酸の量に基づいて、対象におけるリスクを決定することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、リスクはがんに関連するリスクである。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、がん特異的核酸の量が閾値より大きい場合に、リスクは増加している。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、がん特異的核酸の量が閾値より少ない場合に、リスクは減少している。
【００１４】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、がん特異的核酸の量に基づいて、対象の処置を選択することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、がん特異的核酸の量に基づいて、対象を処置することを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、がん特異的核酸の量に基づいて、対象の処置について情報を提供することを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、経時的または後の時点での対象におけるがん特異的核酸の量をモニタリングすることまたはモニタリングを示唆することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、がん特異的核酸の量に基づいて、対象に投与される処置の効果を評価することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置は、がんの処置である。
【００１５】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、試料またはその一部を提供することまたは得ることを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、試料から核酸を抽出することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、ＳＮＶ標的のプライマーを用いて増幅前ステップを実施することを含む。プライマーは非天然核酸の量を決定するためのものと同じであっても異なっていてもよい。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、１以上またはすべてのＰＣＲ定量アッセイにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対の鎖上にはない。
【００１６】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料は、血液、血漿または血清を含む。
一側面において、１以上のがん特異的ＳＮＶ標的のそれぞれについて、プライマー対を含む、組成物またはキットであって、ここで各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、ここで１以上のＳＮＶ標的が提供される。
本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはさらに、１以上のがん特異的核酸のそれぞれについて、別のプライマー対を含み、ここで別のプライマー対は、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する。
【００１７】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、１以上のがん特異的ＳＮＶ標的は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、がん特異的ＳＮＶ標的は、それぞれ同じ種類のがんに特異的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、がんの種類は膵がんである。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、がん特異的ＳＮＶ標的は、ＫＲＡＳ遺伝子および／またはｐ５３遺伝子におけるＳＮＶ標的を含む。
【００１８】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、がん特異的ＳＮＶ標的は、それぞれ対象におけるがんに特異的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１つのＳＮＶ標的は、１つの種類のがんに特異的であり、少なくとも１つの他のＳＮＶ標的は、別の種類のがんに特異的である。
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、プライマーにおいて、ＳＮＶ標的のそれぞれについて、別のプライマー対もまた、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して、３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する。
【００１９】
本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはさらに緩衝液を含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはさらにポリメラーゼを含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはさらにプローブを含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、プローブは蛍光プローブである。
本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはさらに使用説明書を含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、使用説明書は、がんのリスクのある、がんを有する、またはがんを有すると疑いのある対象からの試料中のがん特異的核酸の量を決定するためまたは評価するための説明書である。
【００２０】
一側面において、本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つは、本明細書で提供される方法のいずれか１つの使用のためのものであり得る。
一側面において、本明細書で提供される方法のいずれか１つに基づいて、がん特異的核酸の量を得ること、および、がんのリスクがある、がんを有する、がんを有すると疑わしい、または以前にがんを有していた対象におけるリスクをレベルまたは量に基づいて評価することを含む方法が、提供される。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置、処置または非処置についての情報は、評価されたリスクに基づいて選択され、または対象に提供される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象におけるがん特異的核酸の量を経時的にモニタリングすることまたはモニタリングを示唆することを含む。提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、後の時点でのものなど、対象からの別の試料を得ることおよび本明細書で提供される方法のいずれか１つのものなどの、テストを試料に実施することを含む。
【００２１】
一側面において、本明細書で提供されるものなどの１以上の結果を含有するレポートが、提供される。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは、電子形式である。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは、ハードコピーである。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは口頭で与えられる。
提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、ミスマッチされたプライマー（単数または複数）は、フォワードプライマー（単数または複数）である。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、各ＳＮＶ標的についてのプライマー対のリバースプライマーは同じである。
一態様において、本明細書で提供される方法についてのいずれか１つの態様は、提供される組成物、キットまたはレポートのいずれか１つについての態様であり得る。一態様において、本明細書で提供される、組成物、キットまたはレポートについてのいずれか１つの態様は、本明細書で提供される方法のいずれか１つについての態様であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
添付の図面は、一定の縮尺で描くことを意図していない。図面は例示的なものに過ぎず、開示を可能にするためには必要とされない。
【図１】図１は、ＭＯＭＡプライマー例示的で非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ  Ａを含有する配列の伸長が起こることが予想され、これによりＳＮＶ  Ａの検出が行われ、続いて定量され得る。しかし、ＳＮＶ  Ｂの伸長は、二重ミスマッチのために起こることは予想されない。
【図２】図２は、例示的な増幅トレースを提供する。
【図３】図３は、１０４個のＭＯＭＡ標的の平均バックグラウンドノイズを提供する。
【図４】図４は、ＭＯＭＡを使用する方法のバックグラウンドノイズのさらなる例を提供する。
【図５】図５は、例に記載された増幅曲線と検量線を提供する。
【図６】図６は、いくつかの態様が動作することができるコンピューターシステムの例を示す。
【００２３】
発明の詳細な説明
本開示の側面は、試料中の非天然核酸の高感度の検出および／または定量化のための方法に関する。非天然ＤＮＡなどの非天然核酸は、がんを含む様々な状況において個体に存在してもよい。本開示は、がんのリスクのある、またはがんであるといった対象から得た試料中の非天然無細胞ＤＮＡ濃度などの非天然核酸を検出、分析および／または定量するための技術を提供する。
【００２４】
本明細書中で使用する場合、「非天然核酸」は、別の供給源からのものであるか、対象において見出される核酸の突然変異型である（野生型（ＷＴ）配列などの特定の配列に関して）核酸を指す。したがって、「天然核酸」は、別の供給源からのものではなく、対象において見出される核酸の突然変異型ではない（特定の配列に関して）核酸である。いくつかの態様において、非天然核酸は、非天然無細胞核酸である。「無細胞核酸」（またはｃｆ−ＤＮＡ）は、細胞の外側、例えば対象の血液、血漿、血清、尿中などに存在するＤＮＡである。いかなる特定の理論またはメカニズムに拘束されることを望まないが、ｃｆ−ＤＮＡは、例えば、細胞のアポトーシスを介して、細胞から放出されると考えられている。非天然核酸の例は、対象におけるがんからの核酸である。本明細書で使用する場合、本明細書で提供される組成物および方法は、がん特異的ＤＮＡ、がん特異的無細胞ＤＮＡ（例えば、がん特異的ｃｆＤＮＡ、ＣＳ  ｃｆＤＮＡ）などの非天然供給源からの無細胞ＤＮＡの量を決定するために使用することができる。
【００２５】
本明細書で提供されるものは、配列同一性の違いを有する核酸を測定するために使用することができる、方法および組成物である。いくつかの態様において、配列同一性の違いは、一塩基バリアント（ＳＮＶ）である；しかしながら、ＳＮＶが本明細書中で指される場合はいつでも、天然核酸と非天然核酸との間のいかなる配列同一性の違いも、適用可能であることが意図される。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つは、配列同一性に違いがある場合に、天然核酸対非天然核酸に適用されてもよい。本明細書で使用する場合、「一塩基バリアント」は、単一ヌクレオチド（a single nucleotide）において配列可変性がその中に存在する、核酸配列を指す。これらのＳＮＶは、公知のがん変異またはがん特異的であるもしくはがんを同定できるいずれかの変異であり得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、かかる変異は、本明細書で提供されるがんのいずれか１つに関連する変異である。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、変異は、対象がかつて有していたがんからの変異であり、方法は、がんの再発のために対象をモニタリングするための方法である。プライマーは、いずれの１以上の提供される変異の本明細書で提供されるものとして調製され得る。
【００２６】
がん関連変異が生じ得る遺伝子の例は、これらに限定されるものではないが、ＡＲＨＧＥＦ１２、ＡＴＭ、ＢＣＬ１１Ｂ、ＢＬＭ、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡＲＳ、ＣＢＦＡ２Ｔ３、ＣＤＨ１、ＣＤＫ６、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ２、ＣＲＥＢ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＹＬＤ、ＤＤＸ５、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＦＢＸＷ７、ＦＨ、ＦＬＴ３、ＦＯＸＰ１、ＧＰＣ３、ＩＤＨ１、ＩＬ２、ＪＡＫ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲ４Ａ３、ＮＵＰ９８、ＰＡＬＢ２、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＵＮＸ１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＣＡＲＣＢ１、ＳＯＣＳ１、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、ＳＵＺ１２、ＳＹＫ、ＴＣＦ３、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＰ５３、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＷＲＮ、ＷＴ１、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７およびＳＴ１４などの腫瘍抑制遺伝子を含む。
【００２７】
他の例は、発がん遺伝子および、これらに限定されるものではないが、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＴＦ１、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＲＡＦ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬＢ、ＣＢＬＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＤＸ２、ＣＴＮＮＢ１、ＤＤＢ２、ＤＤＩＴ３、ＤＤＸ６、ＤＥＫ、ＥＧＦＲ、ＥＬＫ４、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ４、ＥＴＶ６、ＥＶＩ１、ＥＷＳＲ１、ＦＥＶ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１ＯＰ、ＦＧＦＲ２、ＦＵＳ、ＧＯＬＦＡ５、ＧＯＰＣ、ＨＭＧＡ１、ＨＭＧＡ２、ＨＲＡＳ、ＩＲＦ４、ＪＵＮ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＭＯ２、ＭＡＦ、ＭＡＦＢ、ＭＡＭＬ２、ＭＤＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＣＯＡ４、ＮＦＫＢ２、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＵＰ２１４、ＰＡＸ８、ＰＤＧＦＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＭ１、ＰＬＡＧ１、ＰＰＡＲＧ、ＰＴＰＮ１１、ＲＡＦ１、ＲＥＬ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＳＳ１８、ＴＣＬ１Ａ、ＴＥＴ２、ＴＦＧ、ＴＬＸ１、ＰＲ、ＵＳＰ６、ＲＡＳ、ＷＮＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫおよびＴＲＫを含む。本明細書で提供されるＳＮＶ標的は、いくつかの態様におけるいずれかの１以上のこれらの遺伝子の変異配列であってもよい。
【００２８】
ＳＮＶなどの配列同一性の変異性を内に有する核酸配列は、一般的に「標的」と呼ばれる。本明細書で使用される場合、「ＳＮＶ標的」は、単一ヌクレオチドなどの配列可変性を内に有する核酸配列を指す。ＳＮＶ標的は１より多くのアレルを有しており、好ましい態様において、ＳＮＶ標的は、両アレルである。非天然核酸は、きわめて低いレベルであっても、ＳＮＶ標的に対して特異的なプライマーを用いた定量的ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施することにより、定量化され得ることが発見された。いくつかの態様において、非天然核酸の量は、複数のＳＮＶ標的についてのプライマーを用いた、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づいた定量アッセイを試みることにより決定される。「複数のＳＮＶ標的」は、それぞれの標的について少なくとも２つのアレルのある、１より多くのＳＮＶ標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的は、両アレルであると予想され、ＳＮＶ標的のそれぞれのアレルについて特異的なプライマー対は、各アレルの核酸を特異的に増幅するために使用され、ここで増幅は、アレル特異的な核酸が、試料中に存在する場合に発生する。
【００２９】
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量アッセイは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づいた定量アッセイは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ではあるが１５未満の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量アッセイは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量アッセイは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ではあるが１５未満の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で使用される場合、１つのアレルは、標的配列の突然変異型であってもよく、別のアレルは、配列の非突然変異型である。
【００３０】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つの一態様において、ＳＮＶ標的（単数または複数）についての１以上のプライマー対は、がんなどの遺伝子型の知識などの、ＳＮＶ標的が情報提供的であるだろう知識に基づいて事前に選択され得る。かかる態様において、対象は以前にがんを有していてもよく、方法は、がんの再発を評価するためのものである。かかる態様において、対象は以前にがんであると診断されていてもよく、方法は、経時的にがんをモニタリングするためのものである。かかる態様において、がんの遺伝子型は決定されている。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、対象におけるがんの遺伝子型判定または遺伝子型を得るステップを含み得る。
【００３１】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、複数のＳＮＶ標的についてのプライマー対は、少なくとも１つが情報提供的であるだろうとの見込みのために選択される。かかる態様において、がん特異的ＳＮＶ標的のパネルについてのプライマー対は、本明細書で提供される方法のいずれの１つにおいて使用される。いくつかの態様において、がん特異的標的のそれぞれのパネルは、同じ種類のがんに特異的である。がんは、本明細書で提供されるまたは他に当業者に公知であるがんのいずれか１つであり得る。ＳＮＶ標的は、本明細書で提供される、または他に当業者に公知のがん関連遺伝子のいずれか１つにおけるものであってもよい。他の態様において、パネルは、１以上が１つの種類のがんに特異的であり、１以上が別の種類のがんに特異的であるなどの、多くの異なる種類のがんに特異的である、多くのＳＮＶ標的を指向している。いくつかの態様において、かかるパネルは多くのより共通したがんに関連する多くのより共通したＳＮＶ標的を指向し得る。
【００３２】
提供される方法または組成物のいずれか１つについて、方法または組成物は前述の多くの標的のいずれか１つに向けられ得る。
本明細書で使用される「情報提供的なＳＮＶ標的」は、本明細書で提供されるプライマーを用いて増幅が発生するものであり、その結果が情報提供的なものである。本明細書で提供される「情報提供的な結果」は、試料中の非天然核酸および／または天然核酸のレベルを定量化するために使用され得る結果である。いくつかの態様において、情報提供的な結果は、「コールなし」または誤ったコール結果と思われる結果を除外する。情報提供的な結果から、アレルのパーセンテージが、提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、検量線を用いて算出され得る。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、非天然核酸および／または天然核酸の量は、それぞれ非天然核酸および／または天然核酸についての情報提供的な結果全体の平均値を表す。
【００３３】
非天然核酸の量ならびに比率またはパーセンテージなどのレベルは、いくつかの態様における天然核酸の遺伝子型と同様にメジャーおよびマイナーアレルの量を用いて決定されてもよい。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、アレルは、対象の天然核酸の以前の遺伝子型決定に基づいて決定され得る。遺伝子型決定の方法は、当業者にとって周知である。かかる方法は、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、などのシーケンシング、他の分離技術またはＰＣＲアッセイを含む。本明細書で提供される方法のいずれの１つも、かかる遺伝子型を得る工程を含み得る。
【００３４】
本明細書で使用される「得ること」は、それによってそれぞれの情報または材料を獲得し得る、いずれかの方法を指す。したがって、それぞれの情報は、いくつかの態様において、天然の遺伝子型を決定するなどの、実験方法によって獲得され得る。それぞれの材料は、いくつかの態様において、さまざまな実験的または実験室的な方法を用いることで作成、設計などされ得る。それぞれの情報または材料は、レポート中などの情報または材料を与えられまたは提供されることによってもまた獲得され得る。材料は、いくつかの態様において、商業的手段（すなわち購入によって）与えられまたは提供されてもよい。
【００３５】
レポートは、口頭、書面（またはハードコピー）または視覚化または表示させることができる形式などの電子形式であってもよい。いくつかの態様において、本明細書で提供されるそれぞれのアッセイについて「生の」結果がレポートで提供され、このレポートから、試料中の非天然核酸の量を決定するためのさらなるステップがとられ得る。これらのさらなるステップは以下の、情報提供的な結果を選択すること、天然の遺伝子型を得ること、天然核酸および非天然核酸に関する情報提供的な結果についてアレルのパーセンテージを算出すること、アレルのパーセンテージを平均化することなど、のいずれか１以上を含んでいてもよい。他の態様において、レポートは、試料中の非天然核酸の量を提供する。いくつかの態様において、量から臨床医は、対象についての処置の必要性または経時的に非天然核酸の量をモニターする必要性を評価してもよい。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、対象における非核酸の量を、１つよりも多い時点で評価することを含み得る。かかる評価は、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つを用いて実施される。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、対象からの１以上の試料中の、総無細胞ＤＮＡなどの核酸の総量を決定するまたは得る工程を含んでもよい。したがって、本明細書で提供されるレポートのいずれか１以上は、総無細胞ＤＮＡなどの総核酸の１以上の量を含んでいてもよく、それは非天然核酸と総核酸の量の組み合わせであり、レポート中にあり、そこから臨床医が、対象についての処置の必要性または対象をモニターする必要性を評価してもよい。
【００３７】
本明細書で提供されるＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイは、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を利用する。かかるアッセイで使用するためのプライマーを得ることができ、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施するための１以上のプライマー対を得るステップを含むことができる。一般に、プライマーは核酸の量を定量する際にそれらの使用を容易にする、ユニークな特性を有する。例えば、プライマー対のフォワードプライマーは３’ヌクレオチド（例えば末端から２番目の３’ヌクレオチド）でミスマッチであり得る。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいてであるが、ＳＮＶ位置に隣接している。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ位置に対するプライマーのミスマッチ位置は、図１に示されるとおりである。
【００３８】
一般に、かかるフォワードプライマーは３’ミスマッチを有していても、増幅反応において増幅産物（適切なリバースプライマーと併せて）を生成し、こうしてそれぞれのＳＮＶを有する核酸の増幅およびその結果としての検出を可能にする。特定のＳＮＶが存在せず、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある場合、増幅産物は一般に生成されない。好ましくは、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的について、各アレルの特異的増幅が、他のアレル（単数または複数）の増幅なしで起こり得るプライマー対が得られる。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅なしの、またはバックグラウンドもしくはノイズなしを超える別の核酸配列の増幅なしの、標的の特異的アレルの増幅を言う。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的なアレルのみの増幅をもたらす。
【００３９】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、両アレルである各ＳＮＶ標的について、２つのプライマー対があり、それぞれが２個のアレルのうちの１つに特異的であり、したがって、それが増幅するアレルに関しては１つのミスマッチを有し、増幅しないアレルに関して二重ミスマッチを有する（さらにこれらのアレルの核酸が存在する場合に限る）。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーはフォワードプライマーである。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的についての２つのプライマーのリバースプライマーは、同一である。
【００４０】
これらの概念は、本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つでのプライマー対の設計において使用することができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特定の遺伝子座の断片を増幅するために、反対の鎖（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖）に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマー対のフォワードおよびリバースプライマーは、任意の適切なサイズの核酸断片を増幅するように設計されてもよく、例えば、本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出する。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、本明細書に記載の１つ以上のプライマー対を得るための１つ以上のステップを含むことができる。
【００４１】
本明細書に記載のプライマー対は、ＰＣＲアッセイなどの多重の増幅に基づく定量アッセイに使用されてもよいことを理解されるべきである。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、ＰＣＲ反応において他のプライマー対と適合するように設計される。例えば、プライマー対は、ＰＣＲ反応における他のプライマー対と少なくとも１個、少なくとも2個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個などと適合するように設計されてもよい。本明細書で使用する場合、ＰＣＲ反応におけるプライマー対は、それらの標的を同じＰＣＲ反応で増幅できる場合に、「適合的」である。
【００４２】
いくつかの態様において、プライマー対が適合的であるのは、同じＰＣＲ反応が多重化されているときに、それらの標的ＤＮＡの増幅が、１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下または６０％以下阻害されている場合である。プライマー対は、多くの理由で適合性でないこともあり、その理由としては、限定はされないが、プライマー二量体の形成および他のプライマー対と干渉するだろう鋳型上の標的外部位への結合を含む。したがって、本開示のプライマー対は、他のプライマー対と二量体の形成を妨げるか、または標的外結合部位の数を制限するように設計されてもよい。多重ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマーを設計するための例示的な方法は当技術分野で知られており、さもなくば本明細書に別途記載される。
【００４３】
いくつかの態様において、本明細書に記載のプライマー対は、非天然核酸の量を定量するために、ＰＣＲアッセイなどの多重の増幅に基づく定量アッセイにおいて使用される。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、潜在的に非２倍体であるゲノム領域を検出するよう設計されたプライマー対を除いて、２倍体であるゲノム領域を検出するよう設計される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマー対は、反復マスク領域、既知コピー数可変領域または非２倍体であるだろう他のゲノム領域を検出しない。
【００４４】
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅に基づく定量アッセイは、それによって核酸が増幅され、核酸の量を決定することができる任意の定量アッセイである。かかるアッセイは、核酸を本明細書に記載のＭＯＭＡプライマーで増幅し、定量するものを含む。かかるアッセイは、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代シーケンシングなどを含む。
【００４５】
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、核酸の量が決定され得ることを意味する定量的ＰＣＲである。定量的ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、ＴＡＱＭＡＮ（商標）などを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは、「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスがまだ進行している間に反応動態を液相でモニタリングすることができる、ＰＣＲ反応を指す。従来のＰＣＲとは対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応においてリアルタイムで同時に検出または定量する能力を提供する。特定の色素からの蛍光強度の増加に基づき、標的の濃度を、増幅がそのプラトーに達する前であっても、決定することができる。
【００４６】
複数プローブの使用は、単一プローブリアルタイムＰＣＲの能力を拡大することができる。多重リアルタイムＰＣＲは、各アッセイが固有の蛍光色素で標識された特異的プローブを有し得、各アッセイについて異なる観察色をもたらす、複数のプローブに基づくアッセイを使用する。リアルタイムＰＣＲ装置は、異なる色素から生成される蛍光を区別することができる。異なるプローブは、それぞれ固有の発光スペクトルを有する異なる色素で標識することができる。スペクトル信号は、離散光学系で収集され、一連のフィルターセットを通過し、検出器のアレイによって収集される。色素間のスペクトルの重なりの補正は、純粋な色素スペクトルを用いて、行列代数により実験データをデコンボリューションすることにより、実施することができる。
【００４７】
プローブは、本開示の方法、特に定量化ステップを含む方法のために有用であってもよい。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイ（単数または複数）の実施におけるプローブの使用を含むことができ、一方、本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つは、１以上のプローブを含むことができる。重要なことに、本明細書で提供される方法のいずれか１以上のいくつかの態様において、ＰＣＲ定量アッセイの１以上またはすべてにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対鎖上にはない。このようにプローブをＰＣＲ反応に組み込む際に、さらなるアレル特異的識別が提供できることが見出されている。
【００４８】
一例として、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブは、５’末端にＦＡＭ（商標）またはＶＩＣ（登録商標）色素標識を有し、３’末端にマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）を有する、加水分解プローブである。ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブの原理は、一般に、相補的なプローブ結合領域へのハイブリダイゼーション中に二重標識ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを切断するための、Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、およびフルオロフォアに基づく検出に依存する。ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブは、定量的ＰＣＲ反応の指数関数的段階の間に、定量的測定における検出の特異性を高めることができる。
【００４９】
ＰＣＲシステムは、一般に、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存し、そのシグナルは反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増加する。例えば、最も簡単で最も経済的な形式においては、そのレポーターは、二本鎖ＤＮＡ特異的色素ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Molecular Probes社）であることができる。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎは、二本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブに結合する色素である。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素が、二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増加する。より多くの二本鎖アンプリコンが生成されると、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素シグナルが増加する。
【００５０】
本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、ＰＣＲは、デジタルＰＣＲであってもよい。デジタルＰＣＲは、希釈された増幅産物を複数の個別試験部位に分割して、ほとんどの個別試験部位が、ゼロまたは１つの増幅産物を含むようにすることを含む。次いで増幅産物を分析して、試料中に選択された関心対象のゲノム領域の頻度の表示を提供する。個別試験部位ごとに１つの増幅産物を分析すると、各個別試験部位について２値の「イエスまたはノー」の結果が得られ、選択された関心のあるゲノム領域が定量化され、選択された関心のあるゲノム領域の相互に関する相対頻度が決定される。
【００５１】
ある側面において、これに加えて、または代替として、複数の分析を、所定の領域からのゲノム領域に対応する増幅産物を使用して行うことができる。２つ以上の所定の領域の分析結果は、増幅産物の数の相対頻度の定量および決定することに使用できる。２つ以上の所定の領域を使用して、試料中の頻度を決定することにより、単一の検出アッセイによっては容易には明らかにならない、増幅効率の変動などを介したバイアスの可能性が低減される。デジタルＰＣＲを使用してＤＮＡを定量する方法は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許公開番号US20140242582に記載されている。
【００５２】
本明細書で提供されるＰＣＲ条件は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って機能するように、改変または最適化できることが、理解されるべきである。典型的には、ＰＣＲ条件は、使用する酵素、標的鋳型、および／またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の１つ以上の成分が改変または最適化される。最適化されてもよいＰＣＲ反応の成分の非限定的な例としては、鋳型ＤＮＡ、プライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度、緩衝液、プローブ（例えば、リアルタイムＰＣＲを実施するとき）、緩衝液、および反応容量を含む。
【００５３】
前述の態様のいずれにおいても、任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素）を利用することができ、これは熱安定性ポリメラーゼを含む。適切なポリメラーゼ酵素は、当事者に知られており、大腸菌ポリメラーゼ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼを含む。例示的なポリメラーゼは、限定はされないが、Bacillus stearothermophilus ｐｏｌＩ、Thermus aquaticus（Ｔａｑ）ｐｏｌＩ、Pyrccoccus furiosus（Ｐｆｕ）、Pyrococcus woesei（Ｐｗｏ）、Thermus flavus（Ｔｆｌ）、Thermus thermophilus（Ｔｔｈ）、Thermus litoris（Ｔｌｉ）およびThermotoga maritime（Ｔｍａ）を含む。これらの酵素、これらの酵素の改変型、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含む販売元から市販されている。代表的な酵素としては、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）（New England Biolabs、Ipswith、MA）、Ｈｏｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｔａｑ（商標）（Eppendorf）、ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）Ｍｐｘ（Finnzymes）、Ｐｙｒｏｓｔａｒｔ（登録商標）（Fermentas）、ＫＯＤ（EMD Biosciences）、Ｚ−Ｔａｑ（TAKARA）、およびＣＳ３ＡＣ／ＬＡ（KlenTaq、University city、MO）を含む。
【００５４】
塩および緩衝液としては、当業者によく知られているものが挙げられ、これにはそれぞれ、ＭｇＣｌ２、およびＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものが含まれる。典型的には、１．５〜２．０ｎＭのマグネシウムがＴａｑＤＮＡポリメラーゼに最適であるが、しかし最適なマグネシウム濃度は、鋳型、緩衝液、ＤＮＡおよびｄＮＴＰに依存するだろうが、これはそれぞれがマグネシウムをキレート化する可能性があるからである。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が低すぎると、ＰＣＲ産物が形成されない場合がある。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が高すぎると、望ましくないＰＣＲ産物が見られる場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、０．１ｍＭまたは０．５ｍＭ増分で約５ｍＭまでのマグネシウム濃度を補充することにより、最適化することができる。
【００５５】
本開示に従って使用される緩衝液は、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの添加剤を、当業者のよく知る他のものと同様に含んでもよい。ヌクレオチドは一般的に、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などのデオキシリボヌクレオチド三リン酸であり、これらは標的核酸の増幅についての反応適切量に添加される。いくつかの態様において、１以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、約１０μＭから約５００μＭまでであり、これはＰＣＲ反応で生成されるＰＣＲ産物の長さおよび数に依存するだろう。
【００５６】
いくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマーは、改変される。プライマーは、それらの意図された標的（例えば、特定のＳＮＶ）のみに、高い特異性で結合し、さらなるヌクレオチド配列の差異に対して高い識別を示すように設計されてもよい。プライマーは、特定の算出された融解温度（Ｔｍ）、例えば、４６℃から６４℃までの範囲の融解温度、を有するよう改変することができる。所望の融解温度を有するプライマーを設計するために、プライマーの長さを変えることができ、および／またはプライマーのＧＣ含量を変えることができる。典型的には、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを増加させることにより、プライマーのＴｍを増加させるだろう。逆に、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを減少させると、プライマーのＴｍが典型的に減少させるだろう。特定のＳＮＶ（または配列非同一性の他の形態）を別のものよりも高感度で検出するために、標的に対して意図的にミスマッチ（単数または複数）を組み込むことにより、プライマーを改変できることが理解されるべきである。したがって、プライマーは、それらが結合するように設計された特定の配列（例えば、特定のＳＮＶ）に関して、１つ以上のミスマッチを組み込むことにより改変されてもよい。
【００５７】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応において使用されるプライマーの濃度は、改変または最適化されてよい。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応におけるプライマー（例えば、フォワードまたはリバースプライマー）の濃度は、例えば、約０．０５μＭから約１μＭまでであってもよい。特定の態様において、各プライマーの濃度は、約１ｎＭから約１μＭまでである。本開示に従ったプライマーは、ＰＣＲ反応において同一または異なる濃度で使用されてもよいことが理解されるべきである。例えば、プライマー対のフォワードプライマーを０．５μＭの濃度で使用し、プライマー対のリバースプライマーを０．１μＭで使用することができる。プライマーの濃度は、限定はされないが、プライマー長、ＧＣ含量、純度、標的ＤＮＡとのミスマッチ、またはプライマー二量体を形成する可能性を含む因子に基づくだろう。
【００５８】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の熱プロファイルは、改変または最適化される。ＰＣＲ熱プロファイル改変の非限定的な例には、変性温度および持続時間、アニーリング温度および持続時間および伸長時間が含まれる。
ＰＣＲ反応溶液の温度は、所定のサイクル数の間、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で順次循環させることができる。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的に依存性であり得る。任意の所与の反応について、変性状態は、ある態様において約７０℃から約１００℃までの範囲であり得る。さらに、アニーリング温度および時間は、標的核酸内の特定の座位に結合するプライマーの特異性および効率に影響を及ぼし得、特定のＰＣＲ反応にとって重要であってもよい。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様において約２０℃から約７５℃までの範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約４６℃から６４℃までであり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温（例えば、約２０℃から約２５℃まで）で行うことができる。
【００５９】
伸長温度および時間もまた、アレル産物の収量に影響するだろう。所与の酵素に対して、伸長状態は、ある態様において約６０℃から約７５℃までの範囲であることができる。
ＰＣＲアッセイからのアレルの量の定量化は、本明細書で提供されるように、または当業者に明らかな他のようにして、実施することができる。一例として、増幅トレースを、一貫性および堅牢な定量化のために分析する。内部標準を使用して、Ｃｔ値（Cycle threshold）を入力核酸（例えば、ＤＮＡ）の量に翻訳してもよい。アレルの量は、性能（performant）アッセイの平均として算出することができ、遺伝子型について調整することができる。広範囲の効果的な増幅は、低濃度核酸の成功した検出を示す。
【００６０】
本明細書で提供される方法および組成物は、試料中の、非天然核酸などの低レベルの核酸を検出するために使用できることが見出されている。したがって、本明細書で提供される方法は、比較的まれな核酸の検出が必要とされる試料で使用することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、全ｃｆ−ＤＮＡなどの全核酸に対して試料中で少なくとも約０．２５％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約０．５％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約１％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約２％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約５％である非天然核酸を検出することができる。
【００６１】
非天然核酸の量を、低レベルにおいても決定する能力により、本明細書で提供される方法および組成物は、対象中のがんなどの対象における、リスクを評価するために使用することができる。本明細書で提供される「リスク」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または不在または進行、または、例えばがんのかかる状態の存在または不在または進行の可能性の増加を指す。がんは、本明細書で提供されるがんのいずれか１つであり得る。本明細書で提供される「増加したリスク」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または進行、または、かかる状態の存在または進行の可能性の増加を指す。本明細書で提供される「リスクの減少」とは、対象における任意の望ましくない状態または進行の不在、または、かかる状態の存在または進行の可能性の低下（または不在または非進行の可能性の増加）を指す。
【００６２】
本明細書で提供されるように、がんなどの状態の早期検出またはモニタリングは、処置を容易にし、臨床予後を向上する。上記で述べたように、提供される方法のいずれか１つは、がんもしくは腫瘍、がんもしくは腫瘍の再発、またはがんもしくは腫瘍の転移を有するかまたはこれを有するリスクのある対象に、実施され得る。したがって、いくつかの態様において、対象は、がん、転移、および／または再発を有することが疑われる対象である。いくつかの態様において、対象は、がん、転移、および／または再発を有する兆候または症状を示さないだろう。しかしながら、いくつかの態様において、対象はがんに関連する症状を示してもよい。症状の種類は、がんの種類に依存するだろうし、当技術分野で周知である。
【００６３】
がんは、限定されるものではないが、白血病、リンパ腫、骨髄腫、癌腫、転移性癌腫、肉腫、腺腫、神経系癌および泌尿生殖器(geritonurinary)がんを含む。例示的ながんには、限定されるものではないが、成人および小児の急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連のがん、肛門がん、虫垂のがん、星状細胞腫、基底細胞がん、胆管癌、膀胱がん、骨がん（bone cancer）、骨肉腫（osteosarcoma）、線維性組織球種、脳がん、脳幹グリオーマ、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、視床下部膠腫、乳がん、男性乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、起源不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、悪性神経膠腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸がん、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、子宮内膜がん、上衣細胞腫（ependymoma）、食道がん、ユーイング腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆のうがん、胃がん、消化管間質腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頚部がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部および視経路膠腫、眼内黒色腫、膵島腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、腎細胞がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、中枢神経系原発悪性リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、髄芽腫、黒色腫、メルケル細胞がん、悪性中皮腫、頸部扁平上皮がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、副鼻腔および鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体がん、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、前立腺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、軟部組織の肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、非黒色腫皮膚がん、小腸がん、扁平上皮細胞がん、頸部扁平上皮がん、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、睾丸がん、咽喉がん、胸腺腫および胸腺がん、甲状腺がん、移行上皮がん、絨毛性腫瘍、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、およびウイルムス腫瘍、を含む。いくつかの態様において、がんは、前立腺がん、膀胱がん、膵がん、肺がん、腎臓がん、乳がんまたは結腸癌である。
【００６４】
対象におけるリスクは例えば、がん特異的無細胞ＤＮＡ（ＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡ）などの非天然ｃｆ−ＤＮＡの量を評価することによって、決定することができる。ＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡは、がんからおそらくは剥がれ落ちたＤＮＡを指し、その配列は、がんの遺伝子型に（全体または一部が）適合するものである。本明細書で使用する場合、ＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡはＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡ集団における特定の配列（単数または複数）を指してもよく、ここでこの配列は対象のｃｆ−ＤＮＡ（例えば、異なる配列を特定のヌクレオチド位置（単数または複数）に有している）から区別され、または、ＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡはＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡ集団全体を指してもよい。
【００６５】
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、非天然核酸の増加および／または天然核酸もしくは総核酸と比較した非天然核酸の比率またはパーセンテージの増加を、がんなどの状態のリスクの増加と相関させることを含むことができる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、相関させることは、非天然核酸のレベル（例えば、濃度、比率またはパーセンテージ）を閾値と比較して、状態のリスクが増加または低下している対象を同定することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と比較して増加した量の非天然核酸を有する対象は、状態のリスクが高いと同定される。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値と比較して非天然核酸の量が減少または同程度の対象は、状態のリスクが減少していると同定される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「量」とは、核酸の測定のための任意の定量値を指し、絶対量または相対量で与えることができる。さらに、量は、総量、頻度、比率、パーセンテージなどであることができる。本明細書で使用する場合、「レベル」という用語は、「量」の代わりに使用することができるが、同じ種類の値を指すことを意図する。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの好適な態様において、核酸の総量は、本明細書で提供されるＭＯＭＡアッセイによって決定され、好ましくは、情報提供的標的からのＭＯＭＡアッセイにより決定される、天然核酸および非天然核酸の量の測定である。いくつかの態様において、核酸の総量は本明細書で提供されるＭＯＭＡアッセイなどの任意の方法または本明細書で提供されるＭＯＭＡアッセイではない当業者に知られた他のアッセイにより決定される。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「閾値（threshold）」または「閾値（threshold value）」は、状態の有無またはリスクの有無を示す、任意の所定のレベルまたはレベルの範囲を指す。閾値は、様々な形態をとることができる。これは、中央値または平均値などの単一カットオフ値であることができる。これは、１つの定義群のリスクが別の定義群のリスクの２倍の場合などの、比較群に基づいて設定することができる。これは範囲であることができ、例えば、試験される集団を複数の群に等しく（または不等に）分割するか（低リスク群、中リスク群および高リスク群など）、またはクォードラント（quadrant）に分割して、最も低い象限はリスクが最も低い対象で、最も高い象限はリスクが最も高い対象である、などである。
【００６８】
閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、明らかに健康な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値は、状態またはリスクの存在前または処置経過後のベースライン値から、決定することができる。かかるベースラインは、試験されているリスクまたは状態と相関していない、対象における正常状態または他の状態を示すことができる。いくつかの態様において、閾値は、試験される対象のベースライン値であることができる。したがって、選択された所定の値は、対象が属するカテゴリーを考慮に入れてよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者の通常の実験を用いて選択することができる。
【００６９】
非天然核酸レベルの変化も、経時的にモニターすることができる。例えば、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどの、閾値（ベースラインなど）からの変化は、リスク、例えばがんに関連するリスクの非侵襲的臨床指標として使用することができる。これは、臨床状態における変動の測定を可能にし、および／または正常値またはベースラインレベルの算出を可能にする。一般に、本明細書で提供されるように、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセントは、がんなどの状態に関連するリスクの有無を示すことができ、またはさらなる検査または監視の必要性を示すことができる。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、がんなどの状態を評価するための、さらなる試験を含み得る。追加の１以上の試験は、本明細書に提供される方法のいずれか１つであってよい。
【００７０】
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、非天然核酸の量、例えば比率またはパーセンテージなどが閾値を上回ると決定された場合、本明細書で提供される方法のいずれか１つはさらに、対象または対象からの試料に、別の試験を実施することを含む。かかる別の試験は、例えば、がんを有する、がんを有するリスクがある、またはがんを有すると疑わしい、がんが進行している、またはがんの再発のリスクを有する対象においてリスクの有無を決定するのに有用であることが当業者に知られている、任意の別の試験であることができる。いくつかの態様において、別の試験は、本明細書で提供される方法のいずれか１つである。
【００７１】
がん、転移、および／または再発を有する、と疑われる対象についての例示的な追加の試験は、限定されるものではないが、生検（例えば、穿刺吸引、コア生検、またはリンパ節除去）、Ｘ線、ＣＴスキャン、超音波、ＭＲＩ、内視鏡検査、末梢循環腫瘍細胞レベル、全血球計算値、特異的腫瘍バイオマーカーの検出（ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＨＥＲ２、ＫＲＡＳ、ｃ−ＫＩＴ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＰＤＧＦＲ、ＢＲＡＦまたはＰＳＭＡ）、および／または遺伝子型決定（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＨＮＰＣＣ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ１またはＰＭＳ２）を含む。追加の１以上の試験は、疑われるがん／転移／再発の種類に依存するだろうし、十分に当業者の決定の範囲内である。
【００７２】
いくつかの態様において、方法はさらに、対象に対してさらなる試験、またはさらなる試験を推奨すること、および／または対象を処置すること、または処置を示唆すること、を含んでもよい。これらの態様のいくつかにおいて、さらなる試験は、本明細書で提供される方法のいずれか１つである。これらの態様のいくつかにおいて、処置はがんの処置である。いくつかの態様において、情報は書面または電子形式で提供される。いくつかの態様において、情報は、コンピュータで読むことができる使用説明書として提供されてもよい。いくつかの態様において、情報は口頭で提供されてもよい。
【００７３】
本明細書で提供されるように、提供される方法のいずれか１つは、対象に治療または治療に関する情報を提供するステップを含み得る。治療は、抗がん治療などのがん、腫瘍または転移の処置のためのものであり得る。かかる治療には、限定されるものではないが、ドセタキセルなどの抗腫瘍剤；プレドニゾンまたはヒドロコルチゾンなどの副腎皮質ホルモン；免疫刺激薬；免疫調節剤；またはそれらのいくつかの組み合わせを含む。抗腫瘍剤は、細胞傷害性薬物、化学療法剤および腫瘍血管新生に作用する薬剤を含む。細胞傷害性薬物は、細胞傷害性放射性核種、化学的毒素およびタンパク毒素を含む。細胞傷害性放射性核種または放射線治療用アイソトープは、アルファ放射またはベータ放射であり得る。細胞傷害性放射性核種はまた、オージェおよび低エネルギー電子を放出し得る。好適な化学毒素または化学療法剤は、カリケアマイシン、エスペラマイシンなどのエンジイン属の分子の一員を含む。
【００７４】
化学毒素はまた、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルから成る群から取られ得る。他の抗悪性腫瘍薬には、ドラスタチン(米国特許番号第6,034,065号および第6,239,104号)およびその誘導体を含む。毒素はまた、毒性レクチン、リシン、アブリン、モデシンなどの植物毒素、ボツリヌス毒素およびジフテリア毒素を含む。他の化学療法剤は、当業者に公知である。がん化学療法剤の例は、限定されるものではないが、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）；エルロチニブ；ゲフィチニブ（イレッサ（商標））；メシル酸イマチニブ（グリベック）；オキサリパチン（oxalipatin）；アンソラサイクリン−イダルビシンおよびダウノルビシン；ドキソルビシン；メルファランおよびクロラムブシルなどのアルキル化剤；シスプラチン、メトトレキサート、およびビンデシンならびにビンブラスチンなどのアルカロイドを含む。いくつかの態様において、さらなるまたは代替ながんの処置は、放射線療法および／または外科的療法などが、本明細書で企図される。
【００７５】
処置または治療の投与は、当技術分野において知られた任意の方法によって達成されてもよい（例えば、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照）。好ましくは、処置または治療の投与は、治療的に有効な量において生じる。投与は、局所であっても全身であってもよい。投与は、非経口（例えば、静脈内、皮下、または皮内）であっても経口であってもよい。異なる投与経路のための組成物は当技術分野でよく知られている（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martinを参照）。
【００７６】
本明細書で提供される方法のいずれか１つは、対象から得られた試料から、無細胞ＤＮＡなどの核酸を抽出することを含み得る。かかる抽出は、当技術分野で知られている任意の方法または本明細書に提供される他の方法を用いて行うことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、最新版またはＱＩＡａｍｐ循環核酸キットまたは他の適切な市販キットを参照）。無細胞ＤＮＡを血液から単離するための例示的な方法は、記載されている。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含有する血液を、対象から採取する。ｃｆ−ＤＮＡを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する（例えば、遠心分離または濾過によって）。任意の二次分離を行って、任意の残存する細胞を血漿から除去することができる（例えば、第２の遠心分離または濾過ステップ）。その後ｃｆ−ＤＮＡを、当技術分野で知られている任意の方法、例えばＱｉａｇｅｎにより製造されたものなどの市販のキットを用いて、抽出することができる。ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法も、当技術分野で知られている（例えば、Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613；およびSwinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526を参照）。
【００７７】
本明細書で使用する場合、対象からの試料は、生物学的試料であり得る。かかる生物学的試料の例には、全血、血漿、血清、尿などが含まれる。いくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準の、試料への添加が行われ得る。
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅前ステップが実施される。例示的なかかる増幅方法は以下の通りであり、かかる方法は、本明細書で提供される方法のいずれか１つに含めることができる。約１５ｎｇの無細胞血漿ＤＮＡを、約１３個の標的とＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅する；ここでプールされたプライマーは合計で４μＭであった。試料を、約２５サイクルに供する。反応は合計で２５μｌである。増幅後、試料は、ＡＭＰＵＲＥビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または簡単にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（商標）もしくはＺｙｍｏを含む、いくつかのアプローチを用いて洗浄することができる。
【００７８】
本開示はまた、試料中の非天然核酸の量を評価するために有用であり得る、組成物またはキットを提供する。いくつかの態様において、組成物またはキットは、１以上のプライマー対を含む。組成物またはキットのプライマー対のそれぞれは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができ、ここで、本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーの１つには３’ミスマッチがある（例えば、末端から２番目の３’ヌクレオチドにおいて）。本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいて、ＳＮＶ位置に隣接しており、ここで特定のＳＮＶが存在しない場合、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対のミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ標的の各アレルのリバースプライマーは、同一である。
【００７９】
本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０などのかかるプライマー対を含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物はＳＮＶ標的（例えば、両アレルのＳＮＶ標的）などの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物またはキットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０を超えるが１５より少ないＳＮＶ標的について、２つのプライマー対などの、少なくとも１つを含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、組成物またはキットのプライマー対は、定量的ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づいた定量アッセイにおける使用のために適合するように設計される。例えば、プライマー対は、プライマー二量体を妨げる、および／または標的外結合部位の数を制限するように設計される。組成物またはキットのプライマー対は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って最適化または設計されてもよいと理解されるべきである。
【００８０】
いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つは、緩衝液をさらに含む。いくつかの態様において、緩衝液は、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のＰＣＲ反応添加剤などの添加剤を含む。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つが、例えばポリメラーゼをさらに含む場合、組成物またはキットは、以下を含んでよい：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、ＲＥＤＴａｑ（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼ。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つはさらに、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つはさらに、プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブ）を含む。
【００８１】
本明細書で使用される「キット」とは、典型的には、例えば、前述のように、１つ以上の本発明の組成物、および／または本発明に関連する他の組成物を含む、パッケージまたはアセンブリを定義する。本明細書で提供されるキットのいずれか１つはさらに、少なくとも１つの反応チューブ、ウェル、チャンバーなどを含んでよい。本明細書に記載のプライマー、プライマーシステム（複数の標的のためのプライマーのセットなど）またはプライマー組成物のいずれか１つは、キットの形態で提供され得るか、またはキット内に含まれ得る。
キットの各組成物は、液体形態（例えば、溶液）、固体形態（例えば、乾燥粉末）などで提供されてもよい。キットはいくつかの場合において、任意の形態における使用説明書を含んでよく、これは本発明の組成物と関連して提供され、使用説明書が本発明の組成物と関連していることを当業者が認識するような様式のものである。使用説明書は、本明細書で提供される方法のいずれか１つを実施するための使用説明書を含んでもよい。使用説明書は、組成物および／またはキットに付随する他の組成物の、使用、改変、混合、希釈、保存、投与、組み立て、保管、包装および／または調製のための使用説明書を含んでもよい。使用説明書は、かかる使用説明書を含むのに好適な媒体として当業者により認識され得る任意の形態で提供されてよく、例えば、任意の様式で提供される書面または発表、口頭、聴覚的（例えば、電話による）、デジタル、光学的、視覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、または電子通信（インターネットまたはウェブベースの通信を含む）を含んでもよい。
【００８２】
本発明の様々な側面は、単独で、組み合わせて、または前述の態様で具体的に論じられていない様々な構成で使用されてもよく、したがって、それらの用途においては、前述の説明または図面に示された構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一態様に記載された側面は、他の態様に記載された側面と任意の様式で組み合わせてもよい。
また、本発明の態様は、その一例が提供されている、１つ以上の方法として実装されてもよい。方法の一部として実行される行為は、任意の適切な手段で順序付けられる。したがって、図示されていない順序で行為が実施される態様が構成されてもよく、これは、例示的な態様において連続的な行為として示されている場合でも、いくつかの行為を同時に実行することを含んでよい。
【００８３】
特許請求の範囲における順序を示す用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの、クレーム要素を修飾するための使用は、それ自体、任意の優先順位、序列、または１つのクレーム要素の他の要素に対する順序、または方法の行為が実施される時間的順序を示さない。かかる用語は、特定の名称を有する１つのクレーム要素を、同じ名称を有する別の要素（但し、順序を示す用語の使用は除く）から区別するための、標識としてのみ使用される。
本明細書で使用される語法および専門用語は、説明目的のものであり、限定的であると見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目および追加の項目を包含することを意味する。
本発明のいくつかの態様を詳細に説明したので、当業者には様々な改変および改良が容易に思い浮かぶであろう。かかる改変および改良は、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明は単なる例示に過ぎず、限定を意図するものではない。以下の説明は、本明細書で提供される方法の例を提供する。
【実施例】
【００８４】
例１−ＭＯＭＡ ｃｆ−ＤＮＡアッセイ
この例示的アッセイは、対象の血液試料中に存在するＣＳ  ｃｆ−ＤＮＡのパーセンテージを決定するために設計される。この態様において、対象の血液試料をＥＤＴＡチューブに収集し、遠心分離して血漿とバフィーコート（buffy coat）を分離する。血漿およびバフィーコートを２つの別個の１５ｍＬコニカルチューブに等分し、凍結させることができる。血漿試料は定量的遺伝子型決定（ｑＧＴ）に使用することができ、バフィーコートは対象の基本的遺伝子型決定（ｂＧＴ）に使用することができる。
プロセスの第１ステップは、血漿試料から無細胞ＤＮＡ（ｑＧＴに使用される）を、バフィーコート、全血、または組織試料からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（ｂＧＴに使用される）を、抽出することであり得る。ｃｆＤＮＡの全量は、ｑＰＣＲによって決定し、標的濃度に対して標準化することができる。このプロセスはｃｆ−ＤＮＡ定量として知られている。ＵＶ分光光度法を使用してｇＤＮＡを定量し、標準化することができる。１５ｎｇのＤＮＡは、一般に正確で有効な結果を提供する。
【００８５】
標準化された患者のＤＮＡは、それぞれがＭＯＭＡ標的部位の１つを含む領域を増幅するプライマー対を含有する多重化されたライブラリーＰＣＲ増幅反応への入力として使用することができる。得られたライブラリーは、ＭＯＭＡ標的プライマーおよびプローブ部位を有するＰＣＲアンプリコンからなるため、ｂＧＴまたはｑＧＴアッセイのいずれかのための入力として使用することができる。このステップは、高度に特異的なｑＰＣＲ増幅の前にそれぞれの標的のコピー数を増加させることによって、アッセイ全体の感度を向上させることができる。対照およびキャリブレーター／スタンダードは、多重ライブラリーを使用して患者の試料とともに増幅することができる。ライブラリー増幅の後、下流の増幅への干渉を防ぐために、過剰のプライマーおよび組み込まれていないデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を除去するために酵素的クリーンアップを行うことができる。
【００８６】
平行したワークフローで、マスターミックスを調製し、３８４ウェルＰＣＲプレートに移すことができる。次いで、増幅された試料、対照、およびキャリブレーター／スタンダードを、ライブラリー希釈緩衝剤で所定の体積および濃度に希釈することができる。希釈された試料および対照は、６ウェルのリザーバープレートに等分し、アコースティック液体ハンドラー（acoustic liquid handler）を使用して３８４ウェルＰＣＲプレートに移すことができる。次いで、プレートを密封し、リアルタイムＰＣＲ増幅および検出システムに移すことができる。
【００８７】
ＭＯＭＡは、がんを有する対象と有しない対象の間ではっきりしている可能性が高く、これはそれらを非常に情報提供的なものとする、両アレルのＳＮＶを標的化することにより、基本的および定量的遺伝子型判定分析の両方を実施することができる。ＭＯＭＡアッセイは、患者の腫瘍特異的ＳＮＶ、または一般に見られる腫瘍特異的ＳＮＶを標的化するよう設計することができる。定量的遺伝子型決定分析は、検量線と共に、マイナー種の割合として知られる、各標的について腫瘍特異的アレルの存在を定量化することができる。品質管理に合格したアレル比率は、各ＳＮＶについてＣＳ  ｃｆＤＮＡの％の決定に使用することができる。各情報提供的標的からの結果は、いくつかの態様において、平均化することができる。
【００８８】
例２−転移性膵がん試料を用いたＭＯＭＡアッセイ
多重ライブラリーの生成
ＫＲＡＳおよびｐ５３についての標的を含む、１３のがん特異的標的の多重ライブラリーは、約１５ｎｇの入力鋳型ＤＮＡおよびQ5 high-fidelity DNA polymerase（New England Biolabs）を用いて２５サイクルの反応において調製し、４μＭの最終濃度の膵がんプライマーをもたらした。サイクルのプロトコルは以下のとおりであった：９８℃で３０秒間を１サイクル；９８℃で１０秒間、６０℃で２０秒間、７２℃で３０秒間を２５サイクル、７２℃で２分間を１サイクル；次いで反応物は４℃で保存した。反応物は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（商標）（Thermo Fisher Scientific）で洗浄し、１Ｘ保存溶液（０．１８ＸＴＢＥおよび０．２μｇ／ｕｌ  ＢＳＡ）にて１：１でオーバーレイした（overlayed）。
【００８９】
ヒトＫＲＡＳエクソン２定量的遺伝子型決定アッセイ
無細胞ＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）は、２人の転移性膵がん患者および１人の健康な対照から単離した。スパイク−イン対照鋳型；ＴＡＩ５は、反応ごとに４５００コピーで９９：１（ＶＶ：ＲＲ）混合物として追加した。細胞株ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（ＨＤ２７２；Horizon Diagnostics, Cambridge, UK）は、変異ヒトＫＲＡＳエクソン２バリアントＤＮＡ（５０％変異ＤＮＡ）について使用した。野生型（ＷＴ）ＤＮＡ（１００％  ＷＴ  ＤＮＡ）と共に、前記２つは、ヒトゲノムＤＮＡ試料をつくるために使用した。これらの再構成されたＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆ−ＤＮＡ）をシミュレートするために超音波処理され、０．２５％と５０％の間の範囲の理論上のアレル頻度を生成する。
【００９０】
定量的遺伝子型決定は、ＡｐｔａＴＡＱマスターミックス（Roche）を使用して、３μｌの反応物（１μｌの試料；２μｌのマスターミックス）において始まった。２つのプライマー対は、ＫＲＡＳエクソン２標的について使用された（１つの対は、がん特異的な突然変異型について、他の対は参照ＫＲＡＳエクソン２配列について）。試料は、０．５Ｘ保存溶液（上記記載）を用いて１：１００に希釈された。プレートは、ヒートシールされ（heat sealed）、室温で３分間スピンされ、当技術分野において知られた標準プロトコルを使用してＰＣＲ（ＬＣ４８０、Roche）を経た。実験の結果は、表１および図５に示した。
【表１】
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【００９１】
例３−コンピュータで実施される態様の例
いくつかの態様において、上述の診断技術は、１つ以上のソフトウェアファシリティを実行する１つ以上の計算機器を介して実施され、経時的に対象の試料を分析し、試料中の核酸（無細胞ＤＮＡなど）を測定し、１つ以上の試料に基づく診断結果を生み出すことができる。図６は、いくつかの態様が動作することができるコンピュータシステムの例を示しているが、態様は図６に示すタイプのシステムでの動作に限定されないことを理解されたい。
【００９２】
図６のコンピュータシステムは、対象８０２から試料８０６を得ることができる対象８０２および臨床医８０４を含む。上記から理解されるように、試料８０６は、対象８０２のための任意の適切な生物学的材料の試料（対象８０２の核酸（無細胞ＤＮＡなど）の存在を測定するために使用されてもよく、血液試料を含む）であってもよい。試料８０６は分析装置８０８に提供することができ、これは、当業者が前述のことから理解するように、試料８０６を分析して、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の全量および試料８０６および／または対象８０２の非天然核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を決定する（推定を含む）。図示を容易にするために、分析装置８０８は単一の装置として示されているが、分析装置８０８は、任意の適切な形態をとることができ、いくつかの態様において、複数の装置として実施することができることを理解されたい。
【００９３】
試料８０６および／または対象８０２における核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を決定するために、分析装置８０８は、上記の任意の技術を実施することができ、特定の分析を実施することに限定されない。分析装置８０８は、他のハードウェアを動作させ、他のハードウェアによって実施されるタスクの結果を受け取るようにプロセッサ（単数または複数）を駆動して、分析の全体的な結果（試料８０６および／または対象８０２の核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量であってもよい）を決定するソフトウェアに実施された分析ファシリティを実行する１つ以上のプロセッサを含むことができる。分析ファシリティは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体（装置８０８のメモリーなど）に保存され得る。他の態様において、試料を分析するための本明細書に記載の技術は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の専用コンピュータ構成要素、またはソフトウェア実施の代わりになる他の適切な形態のコンピュータ構成要素で部分的または全体的に実行されてもよい。
【００９４】
いくつかの態様において、臨床医８０４は、試料８０６を分析装置８０８に直接提供することができ、対象８０２から試料８０６を得ることに加えて装置８０８を作動させることができ、一方他の態様において、装置８０８は臨床医８０４および対象８０２から地理的に離れていてもよく、試料８０６は出荷され、または分析装置８０８の場所へ転送される必要があってもよい。いくつかの態様において、試料８０６は、試料８０６が得られた日付および／または時間に関する試料８０６および／または対象８０２、または試料８０６を記載または同定する他の情報の識別子（例えば、任意の適切なインターフェースを介した入力）とともに分析装置８０８に提供されてもよい。
【００９５】
分析装置８０８は、いくつかの態様において、試料８０６に対して実行された分析の結果を、データベースまたは他の適切なデータストアとして実施されることができるデータストア８１０Ａを含み得る計算機器８１０に提供するように構成されてもよい。いくつかの態様において、計算機器８１０は、クラウドサービスプロバイダなどの分散計算プラットフォームの１つ以上の物理的および／または仮想的な機械を含む１つ以上のサーバとして実施されてもよい。他の態様において、装置８１０は、デスクトップまたはラップトップパーソナルコンピュータ、スマート携帯電話、タブレットコンピュータ、専用ハードウェア装置、または他の計算機器として実施することができる。
【００９６】
いくつかの態様において、分析装置８０８は、その分析の結果を、インターネットを含む１つ以上の有線および／または無線、ローカルおよび／またはワイドエリアコンピュータ通信ネットワークを介して装置８１０に通信することができる。分析の結果は、任意の適切なプロトコルを使用して通信されてもよく、試料８０６および／または対象８０２の識別子、または試料８０６が得られた日付および／または時間など、試料８０６を記載または同定する情報とともに通信されてもよい。
【００９７】
計算機器８１０は、本明細書に記載の診断技術を実行するためのプロセッサ（単数または複数）を駆動することができるソフトウェアに実施された診断ファシリティを実行するための１つ以上のプロセッサを含むことができる。診断ファシリティは、装置８１０のメモリなどの１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体に保存することができる。他の態様において、試料を分析するための本明細書に記載された技術は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の専用コンピュータ構成要素、またはソフトウェア実施の代わりになることができる他の任意の適切な形態のコンピュータ構成要素で部分的または全体的に実施することができる。
【００９８】
診断ファシリティは、分析の結果および試料８０６を記載または同定する情報を受け取り、その情報をデータストア８１０Ａに保存することができる。情報は、対象８０２の以前の試料に関する情報が診断ファシリティによって以前に受信され、保存されている場合など、対象８０２の他の情報に関連して、データストア８１０Ａに保存されてもよい。複数の試料に関する情報は、対象８０２の識別子などの共通の識別子を使用して関連付けることができる。いくつかの場合において、データストア８１０Ａは、複数の異なる対象について情報を含むことができる。
【００９９】
診断ファシリティはまた、対象８０２の診断を決定するために、ユーザ入力によって特定された特定の対象８０２に対する１つ以上の試料８０６の分析の結果を分析するように動作されてもよい。診断は、対象８０２が特定の状態を有している、有するかもしれない、または将来的に発症するかもしれないというリスクの結論であってもよい。診断ファシリティは、特定の試料８０６について決定された核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を１つ以上の閾値と比較すること、または試料８０６について経時的に決定された核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量の経時的な変化を１つ以上の閾値と比較することを含む、上記の様々な例のいずれかを使用して診断を決定することができる。例えば、診断ファシリティは、１つ以上の試料８０６に対する核酸（非天然無細胞ＤＮＡなど）の量を１つの閾値と比較することによって、ある状態の対象８０２に対するリスクを決定することができる。閾値との比較に基づいて、診断ファシリティは、ある状態の対象８０２に対するリスクを示す出力を生成することができる。
【０１００】
前述から理解されるように、いくつかの態様において、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を比較することができる異なる閾値で診断ファシリティを構成することができる。異なる閾値は、例えば、異なる人口統計学的群（年齢、性別、人種、経済的クラス、病歴における特定の処置／状態／他の有無、または他の人口統計学的分類）、異なる状態、および／または他のパラメータまたはパラメータの組み合わせに対応してもよい。かかる態様において、診断ファシリティは、計算機器８１０のメモリに保存された異なる閾値を用いて、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量と比較される閾値を選択するように構成することができる。
【０１０１】
したがって、選択は、人口統計学的群に基づいて閾値が異なる態様における対象８０２の人口統計学的情報に基づき、これらの場合、対象８０２の人口統計学的情報は、診断ファシリティに提供されるか、または対象８０２の識別子を使用する診断ファシリティによって（別の計算機器、またはデータストア８１０Ａと同じかまたは異なるデータストア、または任意の他の適切な供給源から）回収される。選択は、追加的または代替的に、リスクが決定されるべき条件に基づいてもよく、診断ファシリティは、リスク受信を入力として条件を決定する前に、条件を使用して、リスクの決定の基礎となる閾値を選択する状態を使用することができる。診断ファシリティは、複数の閾値がサポートされる態様において、任意の特定の方法で閾値を選択することに限定されないことを理解されたい。
【０１０２】
いくつかの態様において、診断ファシリティは、リスクの診断および／または対象８０２の診断のための基礎を含むユーザーインターフェースをユーザに提示するために出力するように構成されてもよい。診断の基礎は、例えば、対象８０２について１つ以上の試料８０６に検出された核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を含んでもよい。いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、上述の結果、値、量、グラフなどの任意の例を含んでもよい。それらは経時的な結果、値、量などを含み得る。例えば、いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、本明細書で提供される図のいずれか１つに示されるものと同様のグラフを組み込むことができる。かかる場合、グラフには、グラフに表示されたデータの分析から生成することのできる異なる診断に、グラフの異なる領域がどのように対応しているかをユーザに示すために注釈を付けることができる。例えば、グラフ化データと比較して分析を決定することのできる閾値をグラフ（単数または複数）に課すことができる。
【０１０３】
グラフ、特に線および／または影を有するグラフを含むユーザーインターフェースは、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量に基づいて対象８０２のリスクを決定するための、他のユーザーインターフェースを介して提供され得るものよりも、より直感的で迅速なレビューインタフェースをユーザに提供することができる。しかしながら、態様は、任意の特定のユーザーインターフェースで実施されることに限定されないことを理解されたい。
いくつかの態様において、診断ファシリティは、対象８０２および／または臨床医８０４または別の臨床医であってもよい臨床医によって操作されてもよい１つ以上の他の計算機器８１４（装置８１４Ａ、８１４Ｂを含む）に診断またはユーザーインターフェースをアウトプットしてもよい。診断ファシリティは、ネットワーク（単数または複数）８１２を介して診断および／またはユーザーインターフェースをデバイス８１４に送信することができる。
【０１０４】
本明細書で説明される原理に従って動作する技術は、任意の適切な方法で実施されてもよい。上記の議論には、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量の分析に基づく状態のリスクを決定する様々なプロセスのステップおよび動作を示す一連のフローチャートが含まれている。上述の処理ブロックおよび決定ブロックは、これらの様々なプロセスを実行するアルゴリズムに含まれてもよいステップおよび動作を表す。これらのプロセスから導出されたアルゴリズムは、１つ以上の単一または多目的プロセッサの動作に統合され、その動作を指示するソフトウェアとして実施されてもよく、デジタル信号処理（ＤＳＰ）回路または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの機能的に等価な回路として実施されてもよく、あるいは他の適切な方法で実施することができる。態様は、任意の特定の回路または任意の特定のプログラミング言語またはプログラミング言語のタイプの任意の特定の構文または動作に限定されないことを理解されたい。むしろ、当業者であれば、上記の説明を使用して回路を製作するか、または本明細書で説明したタイプの技術を実行する特定の装置の処理を実行するコンピュータソフトウェアアルゴリズムを実施することができる。本明細書で別段の指示がない限り、上述のステップおよび／または動作の特定のシーケンスは、本明細書に記載された原理の実施および態様において実施され、変更され得るアルゴリズムの単なる例示であることも理解されたい。
【０１０５】
したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の技術は、アプリケーションソフトウェア、システムソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、埋め込みコード、または任意の他の適切なタイプのコンピュータコードを含む、ソフトウェアとして実施されるコンピュータ実行可能命令で実施することができる。かかるコンピュータ実行可能命令は、任意の多数の適切なプログラミング言語および／またはプログラミングツールまたはスクリプトツールを使用して記述することができ、フレームワークまたは仮想機械上で実行される実行可能な機械言語コードまたは中間コードとしてコンパイルすることもできる。
【０１０６】
本明細書で説明される技術がコンピュータ実行可能命令として実行されるとき、これらのコンピュータ実行可能命令は、これらの技術に従って動作するアルゴリズムの実行を完了する１つ以上の動作をそれぞれ提供する多数の機能的ファシリティを含む任意の適切な方法で実施されてもよい。「機能的ファシリティ」は、例えば、１つ以上のコンピュータと統合され、実行されると、１つ以上のコンピュータに特定の動作上の役割を実施させるコンピュータシステムの構造的な構成要素である。機能的ファシリティは、ソフトウェア要素の一部または全部であってもよい。例えば、機能的ファシリティは、プロセスの機能として、または個別プロセスとして、または任意の他の適切な処理のユニットとして実施されてもよい。本明細書に記載された技術が複数の機能ファシリティとして実施される場合、それぞれの機能ファシリティはそれ自身の方法で実施されてもよく、すべて同じ方法で実施する必要はない。さらに、これらの機能的ファシリティは、必要に応じて並列および／または直列に実行することができ、それらが実行しているコンピュータ（単数または複数）上の共有メモリを使用して、メッセージパッシングプロトコルまたは他の適切な方法を使用して、互いに情報を渡してもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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