(57)【要約】本開示は、弱毒化ジカウイルスおよびワクチン、弱毒化キメラジカウイルスおよびワクチン、ならびにジカワクチンおよび他のフラビウイルスに対するワクチンを含む多価の免疫原性組成物に関する。キメラジカウイルスは、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）からの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、第１のフラビウイルスからの少なくとも１つの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、および第２のフラビウイルスからの（３’）非翻訳領域の第３のヌクレオチド配列を含む。
2019511221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）からの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、
第１のフラビウイルスからの少なくとも１つの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、および
第２のフラビウイルスからの３’非翻訳領域の第３のヌクレオチド配列
を含む、ジカ核酸キメラ。
【請求項２】
前記第１のフラビウイルスがデングウイルスである、請求項１に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項３】
前記第１のフラビウイルスがＺＩＫＶである、請求項１に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項４】
前記第２のフラビウイルスがデングウイルスである、請求項１に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項５】
前記第２のフラビウイルスがＺＩＫＶである、請求項１に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項６】
前記デングウイルスがデング血清型１である、請求項２に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項７】
前記デングウイルスがデング血清型２である、請求項２に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項８】
前記デングウイルスがデング血清型３である、請求項２に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項９】
前記デングウイルスがデング血清型４である、請求項２に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１０】
前記デングウイルスがデング血清型１である、請求項４に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１１】
前記デングウイルスがデング血清型２である、請求項４に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１２】
前記デングウイルスがデング血清型３である、請求項４に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１３】
前記デングウイルスがデング血清型４である、請求項４に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１４】
前記３’非翻訳領域が前記ヌクレオチド配列に欠失を含有する、請求項１〜１４のいずれかに記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１５】
前記欠失が、Δ３０欠失、Δ３１欠失、Δ３０／３１欠失およびΔ８６欠失からなる群より選択される、請求項１４に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１６】
ＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１および／またはＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４９９５に変異をさらに含む、請求項１４または１５に記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの構造タンパク質が前膜（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）またはその両方である、請求項１〜１６のいずれかに記載のジカ核酸キメラ。
【請求項１８】
デング血清型１に対して免疫原性である第１の弱毒化ウイルス、
デング血清型２に対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス、
デング血清型３に対して免疫原性である第３の弱毒化ウイルス、
デング血清型４に対して免疫原性である第４の弱毒化ウイルス、および
ＺＩＫＶに対して免疫原性である第５の弱毒化ウイルス
を含む、五価の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記第５の弱毒化ウイルスが請求項１〜１７のいずれかに記載のジカ核酸キメラである、請求項１８に記載の五価の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記弱毒化ウイルスの各々が同じ弱毒化欠失または変異を含む、請求項１８または１９に記載の五価の免疫原性組成物。
【請求項２１】
前記欠失が前記３’非翻訳領域のヌクレオチド配列における欠失である、請求項２０に記載の五価の免疫原性組成物。
【請求項２２】
前記欠失が、Δ３０欠失、Δ３１欠失、Δ３０／３１欠失およびΔ８６欠失からなる群より選択される、請求項２１に記載の五価の免疫原性組成物。
【請求項２３】
ＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１および／またはＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４９９５に変異をさらに含む、請求項２１または２２に記載の五価の免疫原性組成物。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含む、請求項１８〜２３のいずれかに記載の五価の免疫原性組成物。
【請求項２５】
フラビウイルスに対して免疫原性である少なくとも１つの第１の弱毒化ウイルス、および
ＺＩＫＶに対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス
を含む、多価の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記フラビウイルスが、デングウイルス血清型１、デングウイルス血清型２、デングウイルス血清型３、デングウイルス血清型４、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の多価の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記第２の弱毒化ウイルスが請求項１〜１７のいずれかに記載のジカ核酸キメラである、請求項２５または２６に記載の多価の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記第２の弱毒化ウイルスが、ゲノムに１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶである、請求項２５または２６に記載の多価の免疫原性組成物。
【請求項２９】
被験体において免疫応答を誘導する方法であって、有効量の請求項１〜２８のいずれかに記載の組成物を前記被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
被験体においてＺＩＫＶ感染を予防または処置する方法であって、前記被験体に、有効量の請求項１〜１７のいずれかに記載のジカ核酸キメラ、または有効量の請求項１８〜２８に記載の免疫原性組成物を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年３月１１日に出願された「ＬＩＶＥ  ＡＴＴＥＮＴＵＡＴＥＤ  ＺＩＫＡ  ＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥ」との表題の米国仮出願第６２／３０７，１７０号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府資金提供
本出願を支援する研究は、Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって代表されるアメリカ合衆国によって実行された。米国政府は、本発明にある特定の権利を有する。
【０００３】
参照による組込み
米国特許法施行規則§１．５２（ｅ）（５）に従って、Ｐａｔｅｎｔ−Ｉｎ  ３．５およびＣｈｅｃｋｅｒ  ４．４．０を使用して２０１７年３月９日に作成された電子ファイル名１４２０３７８＿４４２ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；サイズ１４６ＫＢに含まれる配列情報は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０００４】
背景
１．開示の分野
【０００５】
本開示は、免疫原性の弱毒化された生ＺＩＫＶワクチンの生成のため、ならびに１つまたは複数のフラビウイルス（例えば、デングウイルスおよびＺＩＫＶ）に対して免疫原性である多価（例えば、五価）ワクチン組成物への組入れのための、弱毒化免疫原性ジカウイルスおよびデングウイルス骨格の上に構築されたジカウイルス（または、「ＺＩＫＶ」）キメラに関する。
【背景技術】
【０００６】
２．背景
【０００７】
ＺＩＫＶはＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科に、特にＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ属に属し、本属は、西ナイルウイルス、デングウイルスおよび黄熱病ウイルスを含む多数の重要なヒト病原性関連ウイルスを含む。フラビウイルスは、１ビリオンにつきおよそ５０ｎｍの直径を有する正二十面体および／または球状幾何構造を有するエンベロープを持つウイルスとして、一般的に特徴付けられる。フラビウイルスゲノムは、３つの主要なウイルス構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ）／膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質）および少なくとも７つの非構造（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）タンパク質をコードする、長さが約１０〜１１キロベースで単一の長いオープンリーディングフレームを含有する線状の正のセンスＲＮＡゲノム（図１Ａを参照する）を含む。構造および非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳される。ポリタンパク質は細胞およびウイルスのプロテアーゼによって次にプロセシングされて、個々のウイルスポリペプチドを形成する。さらに、フラビウイルスゲノムは、長さが約１００ヌクレオチド（ｎｔ）の保存された５’非コード領域（ＮＣＲまたは非翻訳領域（５’ＵＴＲ））、および、ウイルス複製に一部関与する様々な保存されたステムアンドループ構造を含有する、長さが約４００〜８００ヌクレオチドの３’ＵＴＲも含有する。
【０００８】
ＺＩＫＶによる感染は、ヒトにおいて軽度の症状を引き起こすことが歴史的に知られているだけであった。さらに、ＺＩＫＶ感染は、アフリカとアジアの間の赤道の近くに位置する限定的地理的領域で一般的に観察された。しかし、このウイルスは、妊娠女性における乳児小頭症および流産と関連があると今では考えられ、その地理的範囲を拡大している。ジカは、メキシコ、中南米およびカリブに今では拡散している。Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）は、南米においてジカ感染が汎発流行レベルに到達したと現在報告している。
【０００９】
他のフラビウイルスと同様に、ＺＩＫＶは、主に媒介動物としてのカによってヒトからヒトに伝染する。特に、ＺＩＫＶはＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉとして知られる雌の種によって伝染するが、Ａ．ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ａ．ｆｕｒｃｉｆｅｒおよびＡ．ｈｅｎｓｉｌｌｉを含むＡｅｄｅｓ属の多数の他のカの種で検出されている。ジカ感染は性感染することもあると、今では考えられてもいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
デング、黄熱、ダニ媒介性脳炎および日本脳炎などの他のフラビウイルスのためには有効なワクチンが存在するが、ＺＩＫＶに対する有効なワクチンはまだ利用可能でない。世界的大流行の現在の状態を考慮すると、有効な抗ジカワクチンを開発する差し迫った必要性が当技術分野にある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、免疫原性の弱毒化された生ＺＩＫＶワクチンの生成のため、ならびに１つまたは複数のフラビウイルス（例えば、デングウイルスおよびＺＩＫＶ）に対して免疫原性である多価（例えば、五価）ワクチンへの組入れのための、弱毒化免疫原性ジカウイルスおよびデングウイルス骨格の上に構築されたＺＩＫＶキメラに関する。
【００１２】
一態様によれば、本開示は、１つまたは複数の弱毒化変異（例えば、点変異、挿入、欠失、反転またはそれらの任意の組み合わせ）を含有するように改変されたＺＩＫＶゲノムを提供する。
【００１３】
さらなる態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むキメラＺＩＫＶゲノムを提供する。
【００１４】
別の態様によれば、本開示は、１つまたは複数の弱毒化変異を含有するように改変されたＺＩＫＶゲノムを含むＺＩＫＶビリオン（すなわち、ウイルス粒子）を提供する。
【００１５】
さらなる態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むキメラＺＩＫＶゲノムを含むＺＩＫＶビリオン（すなわち、ウイルス粒子）を提供する。
【００１６】
ある態様によれば、本開示は、弱毒化ＺＩＫＶを含む免疫原性組成物またはワクチンを提供する。弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果であり得る。
【００１７】
特定の態様によれば、本開示は、弱毒化キメラＺＩＫＶを含む免疫原性組成物またはワクチンを提供する。キメラＺＩＫＶは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを含む。
【００１８】
別の態様によれば、本開示は、免疫原性組成物またはワクチンを含む薬学的キットを提供する。ワクチンは、弱毒化ＺＩＫＶを含むことができる。弱毒化は、被験体をワクチン接種するために組成物を使用するための一組の指示と一緒になった、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムからもたらすことができる。
【００１９】
さらなる態様によれば、本開示は、免疫原性組成物またはワクチンを含む薬学的キットを提供する。ワクチンは、被験体をワクチン接種するために組成物を使用するための一組の指示と一緒になった、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを有する弱毒化キメラＺＩＫＶを含む。
【００２０】
一態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対する免疫を提供するために被験体をワクチン接種するための方法を提供する。本方法は、ＺＩＫＶワクチンの薬学的に許容される用量を投与することを含む。ワクチンは、弱毒化ＺＩＫＶを含む。弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果であり得る。
【００２１】
一態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対する免疫を提供するために被験体をワクチン接種するための方法を提供する。本方法は、ＺＩＫＶワクチンの薬学的に許容される用量を投与することを含む。ワクチンは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを有する弱毒化キメラＺＩＫＶを含み得る。
【００２２】
さらなる態様によれば、本開示は、弱毒化ＺＩＫＶを含むワクチンを製造するための方法を提供し、前記弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果である。製造のための方法は、野生型ＺＩＫＶのゲノムに少なくとも１つの弱毒化変異および／または欠失を導入すること、ならびに弱毒化ＺＩＫＶを１つまたは複数の薬学的賦形剤と合わせて前記ワクチンを提供することを含む。
【００２３】
別の態様によれば、本開示は、弱毒化キメラＺＩＫＶを含むワクチンを製造するための方法を提供する。製造することは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を合わせて、弱毒化キメラＺＩＫＶを提供すること、ならびに弱毒化キメラＺＩＫＶを１つまたは複数の薬学的賦形剤と合わせて前記ワクチンを提供することを含む。
【００２４】
さらなる態様によれば、本開示は、五価の免疫原性組成物を提供する。組成物は、デング血清型１に対して免疫原性である第１の弱毒化ウイルス、デング血清型２に対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス、デング血清型３に対して免疫原性である第３の弱毒化ウイルス、デング血清型４に対して免疫原性である第４の弱毒化ウイルス、およびＺＩＫＶに対して免疫原性である第５の弱毒化ウイルスを含む。特定の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、本開示によるＺｉｋａ核酸キメラである。別の特定の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、ゲノムに１つまたは複数の弱毒化変異を含むＺＩＫＶである。
【００２５】
本発明の一態様によれば、本開示は、多価の免疫原性組成物を提供する。本組成物は、フラビウイルスに対して免疫原性である１つまたは複数の第１の弱毒化ウイルスおよびＺＩＫＶに対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルスを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の第１の弱毒化ウイルスは、デングウイルス（例えば、血清型１、２、３、４またはそれらの組み合わせ）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスに対して免疫原性である。別の実施形態では、第２の弱毒化ウイルスは、本開示によるジカ核酸キメラである。別の特定の実施形態では、第２の弱毒化ウイルスは、ゲノムに１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶである。
【００２６】
さらなる態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。本方法は、弱毒化ＺＩＫＶを含むＺＩＫＶワクチンの薬学的に許容される用量を投与することを含み、前記弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果である。
【００２７】
さらなる態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。この方法は、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを有する弱毒化キメラＺＩＫＶを含むＺＩＫＶワクチンの薬学的に許容される用量を投与することを含む。
【００２８】
一態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載される五価の免疫原性組成物の薬学的に許容される用量を投与することを含む。
【００２９】
さらなる態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載される多価の免疫原性組成物の薬学的に許容される用量を投与することを含む。
【００３０】
様々な実施形態では、弱毒化変異は、３つの主要なウイルス構造タンパク質（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質）をコードする遺伝子の１つもしくは複数、または少なくとも７つの非構造（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）タンパク質をコードする遺伝子に導入することができる。
【００３１】
他の実施形態では、弱毒化変異および／または欠失は、５’ＵＴＲに導入することができる。
【００３２】
さらに他の実施形態では、弱毒化変異および／または欠失は、３’ＵＴＲに導入することができる。
【００３３】
さらなる実施形態では、弱毒化変異および／または欠失は、非構造遺伝子、構造遺伝子、５’ＵＴＲ、または３’ＵＴＲまたはそれらの組み合わせのいずれかに導入することができる。
【００３４】
様々な実施形態では、弱毒化され、免疫原性であるキメラフラビウイルスが提供される。弱毒化ジカウイルスも提供される。ある特定の実施形態では、キメラジカウイルスは、骨格としてデングウイルスの１つまたは複数の非構造タンパク質遺伝子（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）を含有し、それは、ＺＩＫＶの構造タンパク質遺伝子（例えば、カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質遺伝子）の１つまたは複数と組み合わされる。これらのキメラウイルスは、付随するウイルス性疾患の臨床症状なしで、顕著な免疫原性を示す。弱毒化キメラウイルスは免疫原またはワクチンとして有効であり、ＺＩＫＶに対する免疫を付与するための薬学的組成物の中で組み合わせることができる。
【００３５】
一態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶからの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、第１のフラビウイルスからの少なくとも１つの非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）をコードする第２のヌクレオチド配列、および第２のフラビウイルスからの３’非翻訳領域の第３のヌクレオチド配列を含むジカ核酸キメラを提供する。一実施形態では、第１のフラビウイルスは、デングウイルスである。別の実施形態では、第１のフラビウイルスは、ＺＩＫＶである。さらに別の実施形態では、第２のフラビウイルスは、デングウイルスである。さらなる実施形態では、第２のフラビウイルスは、ＺＩＫＶである。特定の実施形態では、デングウイルスは、デング血清型１、血清型２、血清型３または血清型４である。ある特定の実施形態では、構造タンパク質は、前膜（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）またはその両方である。
【００３６】
ある特定の実施形態では、弱毒化ウイルスの各々は、同じ弱毒化欠失および／または変異を含む。他の実施形態では、３’非翻訳領域は、ヌクレオチド配列に１つまたは複数の欠失を含有する。例えば、欠失は、Δ３０欠失、Δ３１欠失、Δ３０／３１欠失およびΔ８６欠失からなる群より選択することができる。ある特定の実施形態では、欠失には、例えばＤＥＮ４ゲノムのＮＳ３遺伝子の４８９１位であるかもしくはそれに対応するヌクレオチドでのさらなる弱毒化変異、および／またはＤＥＮ４ゲノムのＮＳ３遺伝子の４９９５位であるかもしくはそれに対応するヌクレオチドでの変異が付随する。
【００３７】
適用可能であるかまたは具体的に権利を放棄しない場合、実施形態が本発明の異なる態様の下で記載される場合であっても、本明細書に記載される実施形態のいずれか１つは任意の他の１つまたは複数の実施形態と組み合わせることができることが企図される。
【００３８】
これらおよび他の実施形態は、下の発明を実施するための形態から開示されるか、またはそれにより包含される企図されたバリエーションである。
【００３９】
本発明の上のおよび他の特徴は、単なる実例として本明細書に下で与えられ、したがって本発明を限定するものでない添付の図に図示されるそのある特定の例示的な実施形態を参照して、次に詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】図１Ａは、フラビウイルスポリタンパク質の翻訳およびプロセシングを示す。最上部には、示した構造および非構造タンパク質コード領域、５’キャップならびに５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を有するウイルスゲノムを表す。ゲノムの下のボックスは、タンパク分解性プロセシングカスケードによって生成される前駆体および成熟タンパク質を示す。成熟構造タンパク質は陰影をつけたボックスによって示し、非構造タンパク質および構造タンパク質前駆体は白抜きのボックスによって示す。非荷電アミノ酸の連続ストレッチは、黒色のバーによって示す。アスタリスクはＮ連結グリカンを有するタンパク質を表すが、利用される部位の位置または数を示すとは限らない。宿主シグナラーゼ（signalase）（菱形）、ウイルスのセリンプロテアーゼ（ハート）、フューリンもしくは他のゴルジに位置するプロテアーゼ（ハート）、または未知のプロテアーゼ（？）のための切断部位を示す。Field's Virology、２００１年、第４版、B. D. LindenbachおよびC. M. Rice、９９８頁、第３２章からとった。
【００４１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＤＥＮ２のｐｒＭおよびＥタンパク質の遺伝子をＺＩＫＶの対応する遺伝子で置き換えて、候補弱毒化ワクチン株の役割をするジカ／ＤＥＮ２キメラを生成するために使用される戦略を示す。
【００４２】
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＤＥＮ４のｐｒＭおよびＥタンパク質の遺伝子をＺＩＫＶの対応する遺伝子で置き換えて、候補弱毒化ワクチン株の役割をするジカ／ＤＥＮ４キメラを生成するために使用される戦略を示す。
【００４３】
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＥＮ１血清型ウイルスの３’−ＵＴＲのＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３領域の予測された二次構造を示す。二次構造モデルの構築のために使用される配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示す。公知であり実験的に検証された構造エレメントの構造の環状化および以降の誤った折り畳みを回避するために、ＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３を含む最後の２７８ヌクレオチドだけを使用する。各構造モデルに特異的なｍｆｏｌｄプログラム制約を示す。重要な欠失（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に接しているヌクレオチドを丸で囲み、番号を付し、ヌクレオチドの番号付けは３’ゲノム末端から始まる（逆方向番号付けシステム）（配列番号１０）。
【００４４】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＤＥＮ１のために表す、Δ３０欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ３０変異はＤＥＮ１のｎｔ１７４〜１４５を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１１）。
【００４５】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＤＥＮ１のために表す、Δ３０／３１欠失変異を示す。Δ３０変異を含むヌクレオチドの欠失に加えて、Δ３１変異は、逆方向番号付けシステムでＤＥＮ１のｎｔ２５８〜２２８を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１２）。
【００４６】
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＤＥＮ１のために表す、Δ８６の欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ８６変異はＤＥＮ１のｎｔ２２８〜１４５を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１３）。
【００４７】
【図３Ａ】図３Ａは、ＤＥＮ２血清型ウイルスの３’−ＵＴＲのＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３領域の予測された二次構造を示す。二次構造モデルの構築のために使用される配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示す。公知であり実験的に検証された構造エレメントの構造の環状化および以降の誤った折り畳みを回避するために、ＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３を含む最後の２８１ヌクレオチドだけを使用する。各構造モデルに特異的なｍｆｏｌｄプログラム制約を示す。重要な欠失（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に接しているヌクレオチドを丸で囲み、番号を付し、ヌクレオチドの番号付けは３’ゲノム末端から始まる（逆方向番号付けシステム）（配列番号１４）。
【００４８】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＤＥＮ２のために表す、Δ３０欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ３０変異はＤＥＮ２のｎｔ１７３〜１４４を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１５）。
【００４９】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤＥＮ２のために表す、Δ３０／３１欠失変異を示す。Δ３０変異を含むヌクレオチドの欠失に加えて、Δ３１変異は、逆方向番号付けシステムでＤＥＮ２のｎｔ２５８〜２２８を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１６）。
【００５０】
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＤＥＮ２のために表す、Δ８６の欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ８６変異はＤＥＮ２のｎｔ２２８〜１４４を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１７）。
【００５１】
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＥＮ３血清型ウイルスの３’−ＵＴＲのＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３領域の予測された二次構造を示す。二次構造モデルの構築のために使用される配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示す。公知であり実験的に検証された構造エレメントの構造の環状化および以降の誤った折り畳みを回避するために、ＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３を含む最後の２７６ヌクレオチドだけを使用する。各構造モデルに特異的なｍｆｏｌｄプログラム制約を示す。重要な欠失（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に接しているヌクレオチドを丸で囲み、番号を付し、ヌクレオチドの番号付けは３’ゲノム末端から始まる（逆方向番号付けシステム）（配列番号１８）。
【００５２】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＤＥＮ３のために表す、Δ３０欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ３０変異はＤＥＮ３のｎｔ１７３〜１４３を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号１９）。
【００５３】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＤＥＮ３のために表す、Δ３０／３１欠失変異を示す。Δ３０変異を含むヌクレオチドの欠失に加えて、Δ３１変異は、逆方向番号付けシステムでＤＥＮ３のｎｔ２５８〜２２８を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号２０）。
【００５４】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＤＥＮ３のために表す、Δ８６の欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ８６変異はＤＥＮ３のｎｔ２２８〜１４３を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号２１）。
【００５５】
【図５Ａ】図５Ａは、ＤＥＮ４血清型ウイルスの３’−ＵＴＲのＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３領域の予測された二次構造を示す。二次構造モデルの構築のために使用される配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を示す。公知であり実験的に検証された構造エレメントの構造の環状化および以降の誤った折り畳みを回避するために、ＴＬ−１、ＴＬ−２およびＴＬ−３を含む最後の２８１ヌクレオチドだけを使用する。各構造モデルに特異的なｍｆｏｌｄプログラム制約を示す。重要な欠失（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に接しているヌクレオチドを丸で囲み、番号を付し、ヌクレオチドの番号付けは３’ゲノム末端から始まる（逆方向番号付けシステム）（配列番号２２）。
【００５６】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＤＥＮ４のために表す、Δ３０欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ３０変異はＤＥＮ４のｎｔ１７２〜１４３を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号２３）。
【００５７】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＤＥＮ４のために表す、Δ３０／３１欠失変異を示す。Δ３０変異を含むヌクレオチドの欠失に加えて、Δ３１変異は、逆方向番号付けシステムでＤＥＮ４のｎｔ２５８〜２２８を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号２４）。
【００５８】
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＤＥＮ４のために表す、Δ８６の欠失変異を示す。逆方向番号付けシステムで、Δ８６変異はＤＥＮ４のｎｔ２２８〜１４３を削除する。欠失させた領域は、Δ記号によって示される（配列番号２５）。
【００５９】
【図６】図６は、生の弱毒化四価のデングウイルスワクチンが４つの血清型の各々を表すデングウイルスを含有することを示し、各血清型は、変更されていない野生型の構造および非構造タンパク質の完全セットならびに共有されたΔ３０弱毒化変異を含有する。各構成成分の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のΔ３０変異の相対位置は、矢印によって示す。本明細書に記載されるある特定の態様または実施形態では、生の弱毒化五価ウイルスワクチンは、ＺＩＫＶに対して免疫原性である弱毒化ウイルスと組み合わせた生の弱毒化四価デングウイルスワクチンを含む（図示せず）。
【００６０】
【図７Ａ】図７Ａは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４、ならびにそれらのΔ３０誘導体のＴＬ２領域のヌクレオチド配列アラインメントを示す。４つのＤＥＮ血清型の各々の対応する領域も示す。大文字は４つ全ての血清型の間の配列相同性を示し、下線はステム構造を形成するヌクレオチド対形成を示す。
【００６１】
【図７Ｂ】図７Ｂは、各ＤＥＮ血清型のＴＬ２領域の予測された二次構造を示す。Δ３０変異によって除去されるヌクレオチドは、四角で囲まれる（ＤＥＮ１−ヌクレオチド１０５６２〜１０５９１の間、ＤＥＮ２トンガ／７４−ヌクレオチド１０５４１〜１０５７０の間、ＤＥＮ３スレマン（sleman）／７８−ヌクレオチド１０５３５〜１０５６５の間、およびＤＥＮ４−ヌクレオチド１０４７８〜１０６０７の間）。
【００６２】
【図８Ａ】図８Ａは、ＤＥＮ２（トンガ／７４）のＣＭＥまたはＭＥ領域のいずれかをＤＥＮ４遺伝子バックグラウンドに導入することによって、組換えキメラデングウイルスを構築したことを示す。３’ＵＴＲのΔ３０変異の相対位置は矢印で示し、型間接合部１、２および３を示す。
【００６３】
【図８Ｂ】図８Ｂは、型間接合部領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーで使用した制限酵素認識部位を示す。
【００６４】
【図９Ａ】図９Ａは、ＤＥＮ３（スレマン／７８）のＣＭＥまたはＭＥ領域のいずれかをＤＥＮ４遺伝子バックグラウンドに導入することによって、組換えキメラデングウイルスを構築したことを示す。３’ＵＴＲのΔ３０変異の相対位置は矢印で示し、型間接合部１、２および３を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーで使用した制限酵素認識部位を示す。
【００６５】
【図９Ｂ】図９Ｂは、型間接合部領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーで使用した制限酵素認識部位を示す。
【００６６】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＤＥＮ１（プエルトリコ／９４）のＣＭＥまたはＭＥ領域のいずれかをＤＥＮ４遺伝子バックグラウンドに導入することによって、組換えキメラデングウイルスを構築したことを示す。３’ＵＴＲのΔ３０変異の相対位置は矢印で示し、型間接合部１、２および３を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーで使用した制限酵素認識部位を示す。
【００６７】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、型間接合部領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。各キメラｃＤＮＡのアセンブリーで使用した制限酵素認識部位を示す。
【００６８】
【図１１】図１１は、ジカ／ＤＥＮ２Δ３０キメラのプラスミドを示す。下に記載する他のデングウイルス骨格のいずれかを、図１１のＤＥＮ２Δ３０骨格と置換することができることに注意するべきである。
【００６９】
【図１２】図１２は、五価のＤＥＮＶおよびＺＩＫＶワクチンを示す。示されるキメラｃＤＮＡプラスミドは、ＤＥＮ２Δ３０またはＤＥＮ４Δ３０のｐｒＭおよびＥ遺伝子領域を、ＺＩＫＶ−パライバ／２０１５（ブラジル）に由来するものと置き換える。Ｅ．ｃｏｌｉにおける安定性のために、ウイルスのオープンリーディングフレームをイントロン配列によって破壊した。感染性ウイルスを回収するために、ベロ細胞にｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクトし、ウイルスゲノムを作製する転写はＣＭＶプロモーター配列から進行し、リボザイム（ＲＢＺ）およびターミネーター（ＴＥＲＭ）配列によって終了する。イントロン配列は、正常なＲＮＡスプライシングプロセスによって除去された。
【００７０】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＤＥＮＶ−２（図１３Ａ）およびＤＥＮＶ−４（図１３Ｂ）バックグラウンドのためのプラスミドマップを示す。
【００７１】
【図１４ＡＢ】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、イントロン挿入位置を図示する。標準のイントロン配列は、各ｃＤＮＡ構築物について同じである。ＺＶ−Ｄ２は、ＮＳ１遺伝子領域のアラニンコドン１４９に単一の挿入を含有する（図１４Ａ）。ＺＶ−Ｄ４は、ＮＳ２Ａのアラニンコドン１４８（図１４Ｂ）およびＮＳ５のアラニンコドン４２５（図１４Ｃ）に位置する２つのイントロン挿入を含有する。
【図１４Ｃ】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、イントロン挿入位置を図示する。標準のイントロン配列は、各ｃＤＮＡ構築物について同じである。ＺＶ−Ｄ２は、ＮＳ１遺伝子領域のアラニンコドン１４９に単一の挿入を含有する（図１４Ａ）。ＺＶ−Ｄ４は、ＮＳ２Ａのアラニンコドン１４８（図１４Ｂ）およびＮＳ５のアラニンコドン４２５（図１４Ｃ）に位置する２つのイントロン挿入を含有する。
【００７２】
【図１５Ａ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＤＥＮＶ−ＺＩＫＶキメラのために２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス増殖動態を評価したことを示す。キメラウイルスｒＺＩＫＶ／Ｄ２Δ３０−７１０（ＤＥＮ２Δ３０バックグラウンド）およびｒＺＩＫＶ／Ｄ４Δ３０−７１３（ＤＥＮ４Δ３０バックグラウンド）をベロ細胞で回収し、ベロ細胞における２回の限界希釈（terminal dilution）によって生物学的にクローニングし、次に、ベロ細胞での継代によってさらに増幅し、有効シードストック(working seed stock)を生成した。両キメラウイルスは６ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ超まで複製し、力価は５日目頃にピークに達する。両ウイルスで、０．０１のＭＯＩはより高い収量を提供した。
【図１５Ｂ】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＤＥＮＶ−ＺＩＫＶキメラのために２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス増殖動態を評価したことを示す。キメラウイルスｒＺＩＫＶ／Ｄ２Δ３０−７１０（ＤＥＮ２Δ３０バックグラウンド）およびｒＺＩＫＶ／Ｄ４Δ３０−７１３（ＤＥＮ４Δ３０バックグラウンド）をベロ細胞で回収し、ベロ細胞における２回の限界希釈（terminal dilution）によって生物学的にクローニングし、次に、ベロ細胞での継代によってさらに増幅し、有効シードストック(working seed stock)を生成した。両キメラウイルスは６ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ超まで複製し、力価は５日目頃にピークに達する。両ウイルスで、０．０１のＭＯＩはより高い収量を提供した。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
デング、黄熱および日本脳炎などの他のフラビウイルスのためには有効なワクチンが存在するが、ＺＩＫＶに対する有効なワクチンはまだ利用可能でない。世界的大流行の現在の状態を考慮すると、有効な抗ジカワクチンを開発する差し迫った必要性が当技術分野にある。本開示は、ＺＩＫＶに対するワクチンを提供することによって、当技術分野におけるこの欠乏に対処する。本発明は、これらに限定されないが、弱毒化デングウイルスおよびＺＩＫＶゲノムを含む、免疫原性組成物およびワクチンならびに／または多価免疫原性組成物およびワクチンは、被験体において複数のフラビウイルス（例えば、デングおよびジカ）に対して免疫応答を生成する、および／または保護を提供することができるとの発見に少なくとも一部基づく。本開示は、新規弱毒化ジカウイルス；新規弱毒化キメラジカウイルス；１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶゲノム；キメラＺＩＫＶゲノム；ＺＩＫＶに対して免疫を誘導するのに有効な免疫原性組成物；弱毒化された生ジカウイルスを含む抗ジカワクチン；ジカ感染症から保護する抗ジカワクチンで被験体をワクチン接種するための方法；弱毒化ＺＩＫＶゲノムまたはキメラＺＩＫＶゲノムを製造するための方法；弱毒化ＺＩＫＶワクチンまたは弱毒化キメラＺＩＫＶワクチンを製造するための方法；ならびに、弱毒化ＺＩＫＶワクチンもしくは弱毒化キメラＺＩＫＶワクチン、または１つもしくは複数のフラビウイルスワクチン（例えば、１つもしくは複数のデングウイルスワクチン）およびジカワクチンを含む多価（例えば、五価）ワクチンを含む薬学的キットを含む様々な態様を記載する。他の態様が含まれ、本明細書にさらに記載される。
【００７４】
ＺＩＫＶおよびデングウイルスは、カが媒介するフラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、続いてカプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、続いて前膜／膜タンパク質（ｐｒＭ）コード領域、続いてエンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、続いて非構造タンパク質（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）をコードする領域、および最後に３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含有する。ウイルスの構造タンパク質はＣ、ｐｒＭおよびＥであり、非構造タンパク質はＮＳ１−ＮＳ５である。構造および非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳され、細胞およびウイルスのプロテアーゼによってプロセシングされる。
【００７５】
ある特定の態様では、本開示は、ＺＩＫＶからの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、第１のフラビウイルスからの少なくとも１つの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、および第２のフラビウイルスからの３’非翻訳領域の第３のヌクレオチド配列を含む、ジカ核酸キメラに関する。本開示は、デング血清型１に対して免疫原性である第１の弱毒化ウイルス、デング血清型２に対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス、デング血清型３に対して免疫原性である第３の弱毒化ウイルス、デング血清型４に対して免疫原性である第４の弱毒化ウイルス、およびＺＩＫＶに対して免疫原性である第５の弱毒化ウイルスを含む、五価の免疫原性組成物にも関する。第５の弱毒化ウイルスは、本開示による核酸キメラであってもよい。
【００７６】
ある態様によれば、本開示は、１つまたは複数の弱毒化変異（例えば、点変異、欠失、挿入、反転またはそれらの任意の組み合わせ）を含有するように改変されたＺＩＫＶゲノム、あるいはＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むキメラＺＩＫＶゲノムを提供する。
【００７７】
別の態様によれば、本開示は、１つまたは複数の弱毒化変異を含有するように改変されたＺＩＫＶゲノム、あるいはＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むキメラＺＩＫＶゲノムを含むＺＩＫＶビリオン（すなわち、ウイルス粒子）を提供する。
【００７８】
ある態様によれば、本開示は、弱毒化ＺＩＫＶを含む免疫原性組成物またはワクチン、あるいは弱毒化ＺＩＫＶを提供する。弱毒化ＺＩＫＶの弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果であり得る。キメラＺＩＫＶは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを含む。
【００７９】
別の態様によれば、本開示は、免疫原性組成物またはワクチンを含む薬学的キットを提供する。ある実施形態では、ワクチンは、弱毒化ＺＩＫＶを含み、弱毒化は、被験体をワクチン接種するために組成物を使用するための一組の指示と一緒になった、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムからもたらす。別の実施形態では、ワクチンは、被験体をワクチン接種するために組成物を使用するための一組の指示と一緒になった、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを有する弱毒化キメラＺＩＫＶを含む。
【００８０】
一態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対する免疫を提供するために被験体をワクチン接種するための方法を提供する。本方法は、ＺＩＫＶワクチンの薬学的に許容される用量を投与することを含む。ワクチンは、弱毒化ＺＩＫＶまたは弱毒化キメラＺＩＫＶのいずれかを含む。弱毒化キメラＺＩＫＶは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを有する。
【００８１】
さらなる態様によれば、本開示は、弱毒化ＺＩＫＶを含むワクチンを製造するための方法を提供し、前記弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果である。ある実施形態では、製造のための方法は、野生型ＺＩＫＶのゲノムに少なくとも１つの弱毒化変異および／または欠失を導入すること、ならびに弱毒化ＺＩＫＶを１つまたは複数の薬学的賦形剤と合わせて前記ワクチンを提供することを含む。
【００８２】
別の態様によれば、本開示は、弱毒化キメラＺＩＫＶを含むワクチンを製造するための方法を提供する。ある実施形態では、製造することは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を合わせて、弱毒化キメラＺＩＫＶを提供すること、ならびに弱毒化キメラＺＩＫＶを１つまたは複数の薬学的賦形剤と合わせて前記ワクチンを提供することを含む。
【００８３】
本発明の一態様によれば、本開示は、多価の免疫原性組成物を提供する。本組成物は、フラビウイルスに対して免疫原性である少なくとも１つの第１の弱毒化ウイルスおよびＺＩＫＶに対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルスを含む。特定の実施形態では、１つまたは複数の第１の弱毒化ウイルスは、デングウイルス（例えば、血清型１、２、３、４またはそれらの組み合わせ）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスに対して免疫原性である。別の実施形態では、第２の弱毒化ウイルスは、本開示によるジカ核酸キメラである。別の特定の実施形態では、第２の弱毒化ウイルスは、ゲノムに１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶである。特定の実施形態では、少なくとも１つの第１の弱毒化ウイルスは、デング血清型１に対して免疫原性である第１の弱毒化ウイルス、デング血清型２に対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス、デング血清型３に対して免疫原性である第３の弱毒化ウイルス、およびデング血清型４に対して免疫原性である第４の弱毒化ウイルスを含み、それによって、五価の免疫原性組成物を生成する。
【００８４】
さらなる態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。この方法は、弱毒化ＺＩＫＶまたは弱毒化キメラＺＩＫＶを含むＺＩＫＶワクチンの薬学的に許容される用量を投与することを含む。一実施形態では、弱毒化ＺＩＫＶの弱毒化は、１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶのゲノムの結果である。別の実施形態では、弱毒化キメラＺＩＫＶは、ＺＩＫＶゲノムの一部、および少なくとも１つの他のフラビウイルス、例えば、これらに限定されないが、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはそれらの組み合わせのゲノムの一部を含むゲノムを有する。
【００８５】
一態様によれば、本開示は、ＺＩＫＶに対して免疫応答を誘導するための方法を提供する。本方法は、本明細書に記載される五価の免疫原性組成物または本明細書に記載される多価の免疫原性組成物の薬学的に許容される用量を投与することを含む。
【００８６】
本明細書に引用または参照される全ての刊行物、特許出願、特許、図面および他の参考文献、ならびに本明細書に引用される文書において引用または参照される全ての文書は、本明細書または本明細書に参照により組み込まれる任意の文書で言及される、任意の製品のための任意の製造業者の説明書、記載、製品仕様書および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。例えば、本開示は、米国仮特許出願２００９／００２８９００Ａ１、２０１０／０３１６６７０Ａ１、２００５／００１００４３Ａ１、２００４／００３３５９４Ａ１、２００５／０１００８８６Ａ１、２００７／０１３４２５６、２０１０／０１０４５９８Ａ１、２００７／０００９５５２Ａ１、ＷＯ２００８／１５７１３６Ａ１、ＷＯ２００６／０３６２３３Ａ１、ＷＯ０３／０９２５９２Ａ１、ＷＯ０３／０５９３８４Ａ１およびＷＯ０１／５９０９３Ａ１に関連し、これら全ては全ての目的のために参考として援用される。
【００８７】
特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ＰおよびＳａｉｎｓｂｕｒｙ  Ｄ．、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１、およびＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版、Ｋｎｉｐｅ  Ｄ．Ｍ．およびＨｏｗｌｅｙ  Ｐ．Ｍ．編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ２００１を参照。
【００８８】
用語「約」は、１つ、２つまたは３つ以内のヌクレオチドを意味する。
【００８９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明らかに特記しない限り、その冠詞の文法上の対象物の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【００９０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、語句「および／または」は、そのように結び付けられる要素、すなわち、一部の場合には一緒に存在し、他の場合には離れて存在する要素の「一方または両方」を意味すると理解するべきである。「および／または」で掲載される複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結び付けられる要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。「および／または」の文節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定されるそれらの要素に関係するかまたは無関係であるにせよ、他の要素が任意選択で存在することができる。したがって、非限定的な例として、「含む」などのオープンエンド言語と一緒に使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一実施形態ではＡだけ（任意選択でＢ以外の要素を含む）；別の実施形態ではＢだけ（任意選択でＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（任意選択で他の要素を含む）；等を指すことができる。
【００９１】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上で定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解するべきである。例えば、リスト中の項目を分離する場合、「または」または「および／または」は包括的である、すなわちいくつかの要素または要素リストのうちの少なくとも１つを含むが、１つより多くも含み、任意選択でさらなる未掲載項目を含むと解釈されるものとする。明らかにそれとは反対に示される用語だけ、例えば「のうちの１つだけ」または「のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲において使用されるときの「からなる」は、いくつかの要素または要素リストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される場合、用語「または」は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つだけ」または「のうちの正確に１つ」が先行するときに、排他的代替物（すなわち、「どちらか一方であるが両方でない」）を示すとのみ解釈されるものとする。
【００９２】
特許請求の範囲ならびに明細書の上では、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する（carrying）」、「有する（having）」、「含有する」、「含む（involving）」、「保持する」、「構成される」などの全ての移行句は、オープンエンドであること、すなわち、限定されずに含むことを意味すると理解するべきである。米国特許庁特許審査基準セクション２１１１．０３に示される通り、移行句「からなる」および「から本質的になる」だけは、それぞれ閉鎖的または半閉鎖的な移行句であるものとする。
【００９３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたは複数の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト中の要素の任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリストの中に具体的に掲載されるあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素のリスト中の要素のいかなる組み合わせも排除しないと理解するべきである。この定義は、具体的に特定されるそれらの要素と関係するにせよ無関係であるにせよ、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリストの中の具体的に特定される要素以外の要素が任意選択で存在してもよいことも可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＡ（Ｂは存在せず、任意選択でＢ以外の要素を含む）を指すことができ；別の実施形態では、任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＢ（Ａは存在せず、任意選択でＡ以外の要素を含む）を指すことができ；さらに別の実施形態では、任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＡ、および任意選択で１つより多くを含む少なくとも１つのＢ（任意選択で他の要素を含む）を指すことができる；等々。
【００９４】
１つより多くのステップまたは行為を含む本明細書に記載されるある特定の方法では、文脈が特記しない限り、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解するべきである。
【００９５】
用語「同時投与」および「同時投与すること」または「併用療法」は、治療剤がある程度、好ましくは有効な量で、患者に同時に存在する限り、同時的投与（２つまたはそれより多い治療剤の同時の投与）と、時間の異なる投与（さらなる治療剤（１つまたは複数）の投与とは異なる時間での１つまたは複数の治療剤の投与）の両方を指す。ある特定の好ましい態様では、本明細書に記載される本化合物のうちの１つまたは複数は、特に抗がん剤を含む少なくとも１つのさらなる生体活性剤と組み合わせて同時投与される。特に好ましい態様では、化合物の同時投与は、抗がん活性を含む相乗的活性および／または療法をもたらす。
【００９６】
用語「患者」または「被験体」は、本明細書全体で、予防的処置を含む、本開示による組成物による処置が提供される動物、好ましくはヒトまたは家畜動物を記載するために使用される。ヒト患者などの特定の動物に特異的である感染症、状態または疾患状態の処置に関して、用語患者は、イヌもしくはネコなどの家畜動物またはウマ、ウシ、ヒツジ等などの畜産動物（farm animal）を含む特定の動物を指す。一般に、本開示において、用語患者は、特記されないかまたはその用語の使用の文脈から他に暗示されない限り、ヒト患者を指す。
【００９７】
用語「有効」は、その意図される使用の文脈内で使用されるときに意図される結果をもたらす化合物、組成物または構成成分の量を記載するために使用される。用語有効は、本出願において別途記載または使用される、全ての他の有効量または有効濃度の用語を包含する。
【００９８】
用語「残基」は、本明細書において、アミド結合によってペプチドに組み込まれるアミノ酸（ＤまたはＬ）またはアミノ酸模倣体（mimetic）を指すために使用される。したがって、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であってもよいか、または特に限定されない限り、天然に存在するアミノ酸と類似の方法で機能する天然アミノ酸の公知の類似体（すなわち、アミノ酸模倣体）を包含することができる。さらに、アミド結合模倣体は、当業者に周知であるペプチド骨格改変を含む。
【００９９】
さらに、コードされる配列の中の単一のアミノ酸または小さい百分率のアミノ酸（一般的に５％未満、より一般的に１％未満）を変更、付加または削除する、アミノ酸配列またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列における個々の置換、欠失または付加が保存的に改変されたバリエーションであることを当業者は認め、ここで、変更は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。以下の６群の各々は、互いの保存的置換であるアミノ酸を含む：（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。他の用語は定義されるか、さもなければ本明細書に記載される。
【０１００】
変異体弱毒化ジカウイルスおよびキメラ弱毒化ジカウイルス
【０１０１】
本発明は、（ａ）ジカウイルスゲノムへの１つまたは複数（例えば、少なくとも１、２、３、４または５つ）の弱毒化変異の導入、あるいは（ｂ）免疫原性構成成分をコードする１つまたは複数のＺＩＫＶ遺伝子（例えば、ジカカプシドまたは前膜タンパク質またはその両方をコードする遺伝子）を含むように第１のフラビウイルス「骨格」ゲノム（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３もしくはＤＥＮ４、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたは西ナイルウイルス）を改変することによって、ＺＩＫＶをキメラウイルスに変換することの結果として弱毒化されるジカウイルスに関する。
【０１０２】
弱毒化ジカウイルスの場合、弱毒化変異は、任意の点変異、挿入、欠失もしくは反転、またはそれらの任意の組み合わせ、あるいは、ＺＩＫＶのビルレンスを低減または排除するが、複製する、および他の方法でその免疫原性構成成分の発現を可能にするウイルスの能力をブロックしない任意のそのような変異を含むことができる。弱毒化変異は、ゲノムのいかなる場所にも導入することができる。例えば、変異は１つもしくは複数の非構造遺伝子（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５遺伝子）、または１つもしくは複数の構造遺伝子（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質遺伝子）、または５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせに導入することができる。
【０１０３】
キメラジカウイルスの場合、キメラウイルスの構造は、かなり異なってもよい。ある特定の実施形態では、ＺＩＫＶゲノム（例えば、ＺＩＫＶの野生型株）は、ジカゲノムの１つまたは複数の遺伝成分（例えば、非構造遺伝子、構造遺伝子、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）を、別のフラビウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）からの同じ遺伝成分で置き換えるかまたは置換することによって改変することができる。この実施形態では、ＺＩＫＶは、その中のある特定の遺伝成分が別のフラビウイルスからの対応する遺伝成分で置き換えられてキメラウイルスを形成する骨格ゲノムと考えることができる。結果として生じるキメラウイルスは、弱毒化される。ある特定の他の実施形態では、ジカ以外のフラビウイルスゲノム（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４）は、フラビウイルスゲノムの１つまたは複数の遺伝成分（例えば、非構造遺伝子、構造遺伝子、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ）を、ＺＩＫＶゲノムからの対応する遺伝成分で置き換えるかまたは置換することによって改変することができる。この実施形態では、フラビウイルスゲノムは、その中のある特定の遺伝成分がＺＩＫＶからの対応する遺伝成分で置き換えられてキメラウイルスを形成する骨格ゲノムと考えることができる。結果として生じるキメラウイルスは、弱毒化される。
【０１０４】
一実施形態では、本発明は、フラビウイルス骨格から構築されるキメラＺＩＫＶを提供し、ここで、その中の１つまたは複数の構造遺伝子（フラビウイルスＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ）はＺＩＫＶからの対応する１つまたは複数の構造遺伝子で置き換えられている。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、デングウイルス骨格（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３もしくはＤＥＮ４、またはそのキメラ）から構築されるキメラＺＩＫＶを提供し、ここで、その中の１つまたは複数の構造遺伝子（デングＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ）はＺＩＫＶからの対応する１つまたは複数の構造遺伝子で置き換えられている。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、本発明は、デング血清型２ウイルス骨格から構築されるキメラＺＩＫＶを提供し、ここで、その中の１つまたは複数の構造遺伝子（デング血清型２のＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ）はＺＩＫＶからの対応する１つまたは複数の構造遺伝子で置き換えられている。
【０１０７】
なお別の実施形態では、本発明は、デング血清型４ウイルス骨格から構築されるキメラＺＩＫＶを提供し、ここで、その中の１つまたは複数の構造遺伝子（デング血清型４のＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ）はＺＩＫＶからの対応する１つまたは複数の構造遺伝子で置き換えられている。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明は、デング血清型１ウイルス骨格から構築されるキメラＺＩＫＶを提供し、ここで、その中の１つまたは複数の構造遺伝子（デング血清型１のＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ）はＺＩＫＶからの対応する１つまたは複数の構造遺伝子で置き換えられている。
【０１０９】
なお別の実施形態では、本発明は、デング血清型３ウイルス骨格から構築されるキメラＺＩＫＶを提供し、ここで、その中の１つまたは複数の構造遺伝子（デング血清型３のＣ、ｐｒＭおよび／またはＥ）はＺＩＫＶからの対応する１つまたは複数の構造遺伝子で置き換えられている。
【０１１０】
キメラＺＩＫＶ実施形態のいずれでも、キメラＺＩＫＶ（例えば、ある特定の実施形態ではＺＩＫＶ、または他の実施形態では別のフラビウイルス）を形成するために使用される骨格ウイルスは、上記の１つまたは複数の弱毒化変異をさらに含むことができる。これらのさらなる弱毒化変異は、骨格ゲノムのいかなる場所にも導入することができる。例えば、変異は１つもしくは複数の非構造遺伝子（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５遺伝子）、または１つもしくは複数の構造遺伝子（カプシド（Ｃ）、前膜／膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質遺伝子）、または５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲ、またはそれらの組み合わせに導入することができる。例えば、その中の１つまたは複数の構造タンパク質遺伝子が対応するジカ構造タンパク質遺伝子で置換されたＤＥＮ２骨格またはＤＥＮ４骨格を含むキメラＺＩＫＶは、Δ３０、Δ３０／３１もしくはΔ８６を、または、Δ３０、Δ３０／３１もしくはΔ８６変異に加えて３’ＵＴＲに任意の他の弱毒化変異をさらに含むことができる。
【０１１１】
免疫原性ジカキメラおよびジカキメラを調製するための方法は、本明細書で提供される。薬学的に許容される担体の中の免疫原性ＺＩＫＶキメラは、ＺＩＫＶによる感染に対して個体および動物を免疫化および保護する免疫原性組成物として、単独または併用で有用である。ある特定の実施形態では、ジカキメラは、ＺＩＫＶに対して体液性（抗体）応答を誘導するべきであり、デングウイルスの非構造タンパク質はＴ細胞応答を含むべきである。
【０１１２】
本開示のジカキメラは、ＺＩＫＶの免疫原性構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびデングウイルスの骨格から選択されるさらなるヌクレオチド配列を含むことができる。本開示のジカキメラは、ＺＩＫＶの免疫原性構造タンパク質および非構造タンパク質、ならびにデングウイルス（例えば、血清型１、血清型２、血清型３または血清型４）の３’ＵＴＲをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。一実施形態では、デングウイルスの３’ＵＴＲは、弱毒化欠失を含有する。デングウイルスの弱毒化に関して下に記載されるように、本開示は、弱毒化欠失または変異を含む弱毒化ＺＩＫＶも企図する。ヌクレオチド配列に由来するジカキメラウイルスは、ＺＩＫＶに対して免疫原性応答を誘導するために使用することができる。
【０１１３】
別の実施形態では、好ましいキメラは、ＺＩＫＶからの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、およびデングウイルスからの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含むジカ核酸キメラである。別の実施形態では、デングウイルスは弱毒化される。別の実施形態では、デングウイルスはＤＥＮ２である。別の実施形態では、デングウイルスはＤＥＮ４である。さらに別の実施形態では、デングウイルスはＤＥＮ３である。さらなる実施形態では、デングウイルスはＤＥＮ１である。特定の実施形態では、構造タンパク質は、ＺＩＫＶのＣタンパク質、ＺＩＫＶのｐｒＭタンパク質、ＺＩＫＶのＥタンパク質またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、用語「ジカキメラ」、「ジカキメラウイルス」および「キメラＺＩＫＶ」は、ＺＩＫＶの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、およびフラビウイルス、例えばこれに限定されないがデングウイルス、または弱毒化ＺＩＫＶの骨格に由来するさらなるヌクレオチド配列を含む、本発明の感染性構築物を意味する。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「感染性構築物」は、細胞を感染させるために使用することができる、ウイルス、ウイルス構築物、ウイルスキメラ、ウイルスまたはその任意の部分に由来する核酸を示す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ジカ核酸キメラ」は、ＺＩＫＶの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、およびフラビウイルス、例えばこれに限定されないがデングウイルスまたは弱毒化ＺＩＫＶの骨格に由来するさらなるヌクレオチド配列を含む核酸を含む、本明細書に記載の構築物を意味する。対応して、本明細書に記載される任意のキメラフラビウイルスまたはフラビウイルスキメラは、核酸キメラの一例として認めることができる。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「構造および非構造タンパク質」は、完全タンパク質の配列、タンパク質のエピトープまたは、例えば、その３つもしくはそれより多くのアミノ酸残基を含む任意の断片を含む任意のタンパク質またはそれをコードする任意の遺伝子を意味するか、または含むことができる。
【０１１８】
本発明のフラビウイルスキメラは、ＺＩＫＶからの構造タンパク質遺伝子を、フラビウイルス、例えばこれに限定されないがデングウイルス、例えばＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４からの非構造タンパク質遺伝子と融合することによって形成される構築物である。任意の株、例えば表１のデング株の使用が企図される。
【表Ａ−１】
2019511221.tif 000003
【表Ａ−２】
2019511221.tif 000004
【表Ａ−３】
2019511221.tif 000005
【表Ａ−４】
2019511221.tif 000006
【表Ａ−５】
2019511221.tif 000007
【表Ａ−６】
2019511221.tif 000008
【０１１９】
本明細書で提供される弱毒化免疫原性フラビウイルスキメラは、付与される免疫原性の対象となるＺＩＫＶの構造タンパク質遺伝子またはその抗原性部分の１つまたは複数、および別のフラビウイルス、例えばデングウイルスの非構造タンパク質遺伝子を含有する。
【０１２０】
ある特定の態様では、本明細書に記載されるキメラは、デングゲノムのＣ、ｐｒＭもしくはＥタンパク質（複数可）をコードする構造タンパク質遺伝子（複数可）またはそれらの組み合わせが、保護の対象となるＺＩＫＶからの対応する構造タンパク質遺伝子（複数可）で置き換えられる、デングウイルスゲノムを骨格として含有する。結果として生じるキメラウイルスは、デングウイルスでキメラ化されることによって弱毒化の特性を有し、したがってビルレンスが低減されているが、ＺＩＫＶ構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現し、したがって免疫原性である。
【０１２１】
本明細書に記載される弱毒化キメラの骨格として、任意のフラビウイルスのゲノムを使用することができる。骨格は、フラビウイルスの弱毒化表現型に寄与する、または製造のために使用される細胞基材（cell substrate）、例えばベロ細胞における複製を促進する変異を含有することができる。変異は、非構造タンパク質、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列にあってもよい。骨格は、弱毒化表現型の安定性を維持し、弱毒化ウイルスまたはキメラがビルレントの野生型ウイルスに戻り得る可能性を低減するために、さらなる変異を含有することもできる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される弱毒化キメラの骨格として、任意のデングウイルスのゲノムを使用することができる。骨格は、デングウイルスの弱毒化表現型に寄与する、または製造のために使用される細胞基材（cell substrate）、例えばベロ細胞における複製を促進する変異を含有することができる。変異は、非構造タンパク質、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列にあってもよい。骨格は、弱毒化表現型の安定性を維持し、弱毒化ウイルスまたはキメラがビルレントの野生型ウイルスに戻り得る可能性を低減するために、さらなる変異を含有することもできる。
【０１２３】
図２Ａ、３Ａ、４Ａおよび５Ａを参照すると、アプローチを使用して、デングウイルスの３’−ＵＴＲは様々な保存された配列モチーフを含有する。この領域における様々な配列構成成分の位置は、逆方向番号付けシステムで指定される。これらの配列は、末端ループ１（ＴＬ−１）を含有するステム−ループ１（ＳＬ−１）を形成すると予測される、３’遠位二次構造（例えば、ＤＥＮ４のヌクレオチド１〜９３）を含む。ＤＥＮ４のヌクレオチド１１７〜１８３は、ＴＬ−２を含有するステム−ループ（ＳＬ−２）を形成する。ＤＥＮ４のヌクレオチド２０１〜２７７は、ＴＬ−３を一部含有するステム−ループ（ＳＬ−３）の対を形成する。ＳＬ−２と近隣のＳＬ−１およびＳＬ−３の間のヌクレオチド間隔は、デングウイルス血清型の間で異なるが、ＳＬ−２の全体構造は良好に保存されている。さらに、ＴＬ−２を含む露出した９ヌクレオチドは、４つ全てのデング血清型内で同一である。それはＴＬ−２であり、それは、Δ３０変異（例えば、ＤＥＮ４のヌクレオチド１４３〜１７２あたり）によって除去されるステム構造を支持している。これらの３０ヌクレオチドの除去は、デングウイルス血清型の各々で同一である一次配列および二次構造を有する、新しい予測された構造エレメント（ＳＬ−２Δ３０）の形成をもたらす。
【０１２４】
特に、ヌクレオチド１０４７８〜１０５０７の間のＤＥＮ４ゲノムの３’非翻訳領域からの３０ヌクレオチドの欠失（「Δ３０」）である変異は、ＤＥＮ４ウイルスの弱毒化をもたらす。したがって、この位置にそのような変異を含有する任意の４型デングウイルスのゲノムは、本明細書に記載される弱毒化キメラの骨格として使用することができる。さらに、他のデングウイルス血清型のゲノムの３’非翻訳領域に類似した欠失変異を含有する他のデングウイルスゲノムを、本開示のキメラの骨格構造として使用することもできる。例えば、この遺伝子座の変異は、本開示のキメラの骨格構造として、デング１型（ＤＥＮ１の１０５６２〜１０５９１の間の３０ヌクレオチドの欠失；ＤＥＮ１Δ３０）、デング２型（ＤＥＮ２トンガ／７４の１０５４１〜１０５７０の間の３０ヌクレオチドの欠失；ＤＥＮ２Δ３０）、デング３型（ＤＥＮ３スレマン／７８の１０５３５〜１０５６５の間の３０ヌクレオチドの欠失；ＤＥＮ３Δ３０）、および／またはデング４型（ＤＥＮ４の１０４７８〜１０５０７の間の３０ヌクレオチドの欠失；ＤＥＮ４Δ３０）のゲノムで使用することができる。Δ３０欠失は、ＴＬ−２相同構造およびＴＬ−３相同構造までの配列を除去し、図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂで見ることができる。
【０１２５】
別の実施形態では、デングゲノムのＴＬ−３からの３１ヌクレオチドの欠失（「Δ３１」）である変異は、本発明のキメラの骨格構造を弱毒化する。図２Ｃ、３Ｃ、４Ｃおよび５Ｃは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３およびＤＥＮ４のΔ３１欠失をそれぞれ図示する。したがって、この遺伝子座にそのような変異を含有する任意の２型デングウイルスのゲノムは、本明細書に記載される弱毒化キメラの骨格として使用することができる。さらに、他のデングウイルス血清型のゲノムのＴＬ−３に類似した欠失変異を含有する他のデングウイルスゲノムを、本開示のキメラの骨格構造として使用することもできる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示のジカキメラのデング骨格構造は、Δ３０およびΔ３１変異の両方（すなわち、ＤＥＮ１Δ３０／３１、ＤＥＮ２Δ３０／３１Δ、ＤＥＮ３Δ３０／３１および／またはＤＥＮ４Δ３０／３１）を含む。
【０１２７】
別の実施形態では、８６ヌクレオチドの欠失（「Δ８６」）である変異は、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３および／またはＤＥＮ４）のＴＬ−２相同構造およびＴＬ−３相同構造までの配列を除去する。したがって、この遺伝子座にそのような変異を含有する任意の１、２、３および／または４型デングウイルスのゲノムは、本明細書に記載される弱毒化キメラの骨格として使用することができる。図２Ｄ、３Ｄ、４Ｄおよび５Ｄは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ２およびＤＥＮ４のΔ８６欠失をそれぞれ図示する。
【０１２８】
特定の実施形態では、ジカキメラは、ＤＥＮ２Δ３０をキメラの骨格構造として含む。別の実施形態では、ジカキメラは、ＤＥＮ４Δ３０をキメラの骨格構造として含む。他の実施形態では、ジカキメラは、ＤＥＮ３Δ３０／３１をキメラの骨格構造として含む。
【０１２９】
様々な実施形態では、本発明のジカキメラは、Δ３０、Δ３１およびΔ８６欠失に加えて、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６００４（DEVELOPMENT OF DENGUE VIRUS VACCINE COMPONENTS）に記載されるものを含む変異および／または欠失を、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲに含むことができる。
【０１３０】
上記の変異は、当業者に公知の技術を使用した部位特異的変異誘発によって達成することができる。ビルレントの骨格構造と弱毒化された骨格構造とを識別するために、本明細書に記載される、および当技術分野で周知であるビルレンススクリーニングアッセイを使用することができることが当業者に理解される。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７６００４（DEVELOPMENT OF DENGUE VIRUS VACCINE COMPONENTS）で議論される変異誘発技術のいずれも企図される。
【０１３１】
ジカフラビウイルスキメラの構築
【０１３２】
本明細書に記載されるフラビウイルスキメラは、当業者に周知の組換え操作技術を使用して、すなわち、指定されたデングウイルス遺伝子を除去して、それをＺＩＫＶの所望の対応する遺伝子で置き換えることによって、免疫が所望されるＺＩＫＶの構造タンパク質遺伝子の少なくとも１つをデングウイルスゲノム骨格に置換することによって生成することができる。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋに提供される配列を使用して、公知の核酸合成技術を使用して、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子を合成して、適当なベクターに挿入することができる。したがって、弱毒化免疫原性ウイルスは、当業者に公知の組換え操作技術を使用して生成される。
【０１３３】
上で言及した通り、骨格に挿入される遺伝子は、ＺＩＫＶ構造タンパク質をコードする。好ましくは、挿入されるＺＩＫＶ遺伝子は、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする遺伝子である。デングウイルス骨格に挿入される配列は、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質の両方をコードすることができる。デングウイルス骨格に挿入される配列は、Ｃ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質をコードすることができる。デングウイルス骨格は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３もしくはＤＥＮ４ウイルスゲノムであるか、またはこれらの血清型のいずれかの弱毒化デングウイルスゲノムであり、ＺＩＫＶのＣ、ｐｒＭおよび／もしくはＥ構造タンパク質をコードする置換された遺伝子（複数可）、またはＺＩＫＶのｐｒＭおよび／もしくはＥ構造タンパク質をコードする置換された遺伝子（複数可）を含む。
【０１３４】
ＺＩＫＶの構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する、適するキメラウイルスまたは核酸キメラは、免疫原性の保持を伴ってビルレンスの低減を示す弱毒化の表現型マーカーについてそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性について評価することができる。抗原性および免疫原性は、当業者に公知である慣例的なスクリーニング法を使用して、ジカ抗体または免疫反応性血清とのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ反応性を使用して評価することができる。
【０１３５】
フラビウイルスワクチン
【０１３６】
好ましいキメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用である弱毒化された生ウイルスを提供する。好ましい実施形態では、キメラは、危険な病原性または致死性の影響を同時に及ぼさずに高い免疫原性を示す。
【０１３７】
本発明のキメラウイルスまたは核酸キメラは、野生型または弱毒化デングウイルス骨格にＺＩＫＶの構造遺伝子を含むことができる。例えば、キメラは、デングウイルスまたは弱毒化デングウイルスバックグラウンドでＺＩＫＶの構造タンパク質遺伝子を発現することができる。
【０１３８】
デングウイルスゲノムの非構造領域を含有する遺伝子バックグラウンドを使用する、本明細書に記載の戦略、および、キメラ化によって、ＺＩＫＶの構造タンパク質遺伝子を発現する弱毒化の特性は、所望の免疫原性の構造タンパク質遺伝子を発現する弱毒化された生フラビウイルスワクチン候補の開発につながった。したがって、ＺＩＫＶ病原体の制御のためのワクチン候補を、設計することができる。
【０１３９】
本明細書に記載されるキメラで使用されるウイルスは、当技術分野で公知の技術を使用して一般的に増殖させる。ウイルスプラークまたはフォーカス形成単位（ＦＦＵ）滴定を次に実行し、プラークまたはＦＦＵを数えて、細胞培養物で増殖させたウイルスの生存度、力価および表現型特性を評価する。弱毒化候補出発材料を誘導するために、野生型ウイルスを変異誘発させる。
【０１４０】
キメラの感染性クローンは、様々なフラビウイルス株から構築される。所望により、ウイルス特異的ｃＤＮＡ断片のクローニングを達成することもできる。構造タンパク質または非構造タンパク質遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片を、様々なプライマーでフラビウイルスＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅させる。増幅させた断片は、他の中間クローンの切断部位にクローニングする。挿入されたフラビウイルス特異的ｃＤＮＡの配列を検証するために、中間のキメラフラビウイルスクローンを次に配列決定する。
【０１４１】
フラビウイルスの構造または非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することによって構築される完全ゲノム長キメラプラスミドは、当業者に周知の組換え技術を使用して入手できる。
【０１４２】
多価および五価のフラビウイルスキメラワクチン
【０１４３】
本開示は、ワクチンとして使用するためのジカおよびジカキメラウイルスに、ならびに前記ワクチンそれ自体に関するだけでなく、少なくとも２つの異なるワクチンの組み合わせを含む多価ワクチンにも関し、ここで、少なくとも１つのワクチンはＺＩＫＶに対するワクチンである。言い換えると、本開示は、１つまたは複数のジカワクチン（例えば、弱毒化ＺＩＫＶ、キメラ弱毒化ＺＩＫＶまたはその両方）を他の病原体に対する１つまたは複数のさらなるワクチンと組み合わせることを企図する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のさらなるワクチンは、フラビウイルスワクチンである。１つまたは複数のさらなるワクチンは、任意のフラビウイルスワクチン、例えばこれらに限定されないがデングワクチン（ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４またはそれらの組み合わせに対する）、黄熱病ウイルスワクチン、ＪＥＶワクチン、ＴＢＥＶワクチン、西ナイルウイルスワクチンまたはそれらの組み合わせから選択することができる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、多価ワクチンは以下を含む：
【０１４５】
（ａ）１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのさらなるフラビウイルスワクチンと組み合わせた、１つまたは複数のジカワクチン（例えば、弱毒化ＺＩＫＶまたはキメラ弱毒化ＺＩＫＶ）；
【０１４６】
（ｂ）１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのさらなるデングワクチン（ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４、それらのキメラまたはそれらの組み合わせに対する）と組み合わせた、１つまたは複数のジカワクチン（例えば、弱毒化ＺＩＫＶまたはキメラ弱毒化ＺＩＫＶ）；
【０１４７】
（ｃ）ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３もしくはＤＥＮ４ウイルス、またはそれらのキメラ、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つを各々含む１つまたは複数のデングウイルスワクチンと組み合わせた、キメラ弱毒化ＺＩＫＶワクチン；ならびに
【０１４８】
（ｄ）ＤＥＮ１ウイルスワクチン、ＤＥＮ２ウイルスワクチン、ＤＥＮ３ウイルスワクチンおよびＤＥＮ４ウイルスワクチン、またはそれらのキメラと組み合わせた、すなわち五価のワクチンとなるキメラ弱毒化ＺＩＫＶワクチン。
【０１４９】
多価および／または五価のワクチンに関する任意の実施形態では、１つまたは複数のさらなるフラビウイルスワクチンは、３’ＵＴＲにおける欠失および／または変異を含む１つまたは複数の弱毒化変異、例えばΔ３０、Δ３０／３１およびΔ８６弱毒化変異を含む、フラビウイルスを含むことができる。
【０１５０】
本明細書は、弱毒化ＺＩＫＶまたはジカキメラを用いて安全、有効かつ経済的な多価フラビウイルスワクチン（例えば、二価、三価、四価または五価の）に製剤化することができる、型特異的な弱毒化された生フラビウイルスワクチン構成成分（例えば、デングウイルス）のセットを提供する。Δ３０変異は、アカゲザルでＤＥＮ２およびＤＥＮ４を弱毒化する。Δ３０変異は、デングウイルス血清型１、２、３および４の各々において相同構造（ＴＬ−２）を除去する（図２Ｂ、３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂ）。しかし、Δ３０変異は、アカゲザルにおけるＤＥＮ２およびＤＥＮ４と同じ程度にＤＥＮ３を弱毒化しないことが見出された。対照的に、Δ３０変異は、ＤＥＮ２およびＤＥＮ４よりも大きな程度までＤＥＮ１を弱毒化することが見出された。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本記載は、弱毒化をもたらす１つまたは複数の変異を有するフラビウイルス（例えば、デングウイルス）およびキメラフラビウイルス（例えば、デングウイルス）、そのようなデングウイルスを作製する方法、ならびにフラビウイルス感染（例えば、デングウイルス感染）を予防または処置するためにこれらのフラビウイルスを使用するための方法を提供する。本発明のデングウイルス中の変異（複数可）は、弱毒化の決定で役割をすることが示されている、ウイルスＲＮＡの最も下流の概ね３８４ヌクレオチドによって形成される３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に存在する。以下の通り、本発明のウイルスおよび方法はさらに記載される。遺伝的に安定した弱毒化された生の多価（例えば、五価）ジカ、フラビウイルスウイルス免疫原性組成物またはワクチンを開発するために、分子アプローチが使用される。多価の免疫原性組成物は、フラビウイルスに対して免疫原性である少なくとも１つの第１の弱毒化ウイルスおよびＺＩＫＶに対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルスを含む。特定の実施形態では、第１の弱毒化ウイルスは、デングウイルス（例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４またはそれらの組み合わせ）、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスまたはこれらの組合せからなる群より選択されるウイルスに対して免疫原性である。別の実施形態では、第２の弱毒化ウイルスは、本開示によるジカ核酸キメラである。別の特定の実施形態では、第２の弱毒化ウイルスは、ゲノムに１つまたは複数の弱毒化変異を含むＺＩＫＶである。多価ワクチンの各構成成分は、弱毒化され、遺伝的に安定し、免疫原性でなければならない。
【０１５２】
例えば、五価のワクチンの各構成成分、例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４およびＺＩＫＶは、弱毒化され、遺伝的に安定し、免疫原性でなければならない。五価のワクチンは、４つのデングウイルスの各々に対する同時保護を確実にし、それによって、異型野生型デングウイルスによる二次感染の間にヒトで起こる、より重大な疾病であるデング出血熱／デングショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）を起こす可能性を排除する。デングウイルスは天然で遺伝子組換えを起こすことがあるので、五価のワクチンは、弱毒化変異を欠いているウイルスの生成につながるかもしれないその５つのウイルス構成成分の間で組換え事象を起こすことが遺伝的にできない。四価のデングウイルスワクチンを開発する以前のアプローチは、異種宿主に由来する組織培養細胞での継代などの、別個の変異促進手順によって４つのウイルス構成成分の各々を独立して導くことに基づいた。この戦略は、弱毒化ワクチン候補を以前にもたらした。しかし、これらの独立して導かれた四価のワクチンの４つの構成成分の間の遺伝子交換（gene exchange）がワクチン被接種者において起こるかもしれず、おそらくビルレントの組換えウイルスを生成する可能性がある。三価ポリオウイルスワクチンの投与の後に、ワクチン被接種者において組換えに由来するビルレントのポリオウイルスが生成されたことがある。
【０１５３】
ある特定の態様では、本開示は、（１）本開示による弱毒化ジカキメラ、ｒＤＥＮ４Δ３０、ならびにｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０およびｒＤＥＮ３Δ３０組換えウイルス（ｒＤＥＮ４Δ３０組換えウイルスのものに相同的である３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の部分に３０ヌクレオチド欠失（Δ３０）を含有する）；（２）本開示による弱毒化核酸ジカキメラ、ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０およびｒＤＥＮ４Δ３０；（３）弱毒化抗原性キメラウイルス、ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０およびｒＤＥＮ３／４Δ３０（ｒＤＥＮ４Δ３０のＣＭＥ、ＭＥまたはＥ遺伝子領域がＤＥＮ１、ＤＥＮ２またはＤＥＮ３に由来するもので置き換えられた）、ｒＤＥＮ４Δ３０ならびにジカキメラ；あるいはｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０およびｒＤＥＮ４／３Δ３０（ｒＤＥＮ３Δ３０のＣＭＥ、ＭＥまたはＥ遺伝子領域がＤＥＮ１、２または４に由来するもので置き換えられた）、ｒＤＥＮ３Δ３０ならびにジカキメラ；あるいはｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０およびｒＤＥＮ４／２Δ３０（ｒＤＥＮ２Δ３０のＣＭＥ、ＭＥまたはＥ遺伝子領域がＤＥＮ１、３または４に由来するもので置き換えられた）、ｒＤＥＮ２Δ３０ならびにジカキメラ；ならびにあるいはｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０およびｒＤＥＮ４／１Δ３０（ｒＤＥＮ１Δ３０のＣＭＥ、ＭＥまたはＥ遺伝子領域がＤＥＮ２、３または４に由来するもので置き換えられた）、ｒＤＥＮ１Δ３０およびジカキメラ；ならびに（４）弱毒化ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０およびジカキメラ；あるいは、ｒＤＥＮ１／３Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０およびジカキメラ；あるいは、ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０およびジカキメラ；ならびに、あるいはｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、ｒＤＥＮ１Δ３０およびジカキメラを含むことができる五価のワクチンを提供する。ワクチンの各構成成分は同じΔ３０弱毒化欠失変異を有するので、それらはワクチン被接種者においてビルレントの野生株ウイルスを生成する可能性を排除する共有される弱毒化変異を含有するので、これらの五価のワクチンは独特なものである。さらに、ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、ジカキメラ五価ワクチンは、Δ３０変異の安定性を広い抗原性と組み合わせた最初のものである。あるいは、同じスキームを利用して、３’ＵＴＲのΔ３１、Δ３０／３１またはΔ８６の欠失は、上記のキメラスキームで、またはＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４およびジカキメラの中で利用することができる。Δ３０、Δ３１、Δ３０／３１およびΔ８６欠失変異は各ウイルスの３’ＵＴＲにあるので、５つの構成成分ウイルスのタンパク質の全ては防御免疫応答を誘導するのに利用可能である。したがって、本方法は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４およびジカキメラウイルスのタンパク質の各々を、各デングウイルス血清型およびＺＩＫＶに存在する構造および非構造タンパク質の全てに対��て体液性および細胞性免疫応答を誘導する、５つのウイルスのタンパク質の各々の完全な能力を保存する状態に維持する弱毒化機構を提供する。
【０１５４】
前述の通り、ＤＥＮ４組換えウイルス、ｒＤＥＮ４Δ３０（以前には２ＡΔ３０と呼ばれた）は、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲに３０ヌクレオチドの欠失を含有するように操作された（Durbin, A. P.ら、２００１年、Am J Trop Med Hyg ６５巻：４０５〜１３頁；Men, R.ら、１９９６年、J Virol ７０巻：３９３０〜７頁）。アカゲザルでの評価は、野生型の親のウイルスと比較してこのウイルスは有意に弱毒化されるが、高度に免疫原性および完全に保護的であることを示した。また、成体ヒトボランティアでのフェーズＩ臨床試験は、ｒＤＥＮ４Δ３０組換えウイルスが安全であり、十分に免疫原性であることを示した（Durbin, A. P.ら、２００１年、Am J Trop Med Hyg ６５巻：４０５〜１３頁）。非翻訳領域に共有される弱毒化変異を有する五価のワクチンを開発するために、それがアカゲザルで野生型ＤＥＮ４ウイルスを弱毒化し、ヒトに安全であったので、血清型１、２および３の野生型デングウイルスを弱毒化するためにΔ３０、Δ３１、Δ３０／３１またはΔ８６欠失を使用することができる。米国特許出願公開第２００７／０００９５５２号。
【０１５５】
一態様によれば、本開示は、デング血清型１（ＤＥＮ１）に対して免疫原性である第１の弱毒化ウイルス、デング血清型２（ＤＥＮ２）に対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス、デング血清型３（ＤＥＮ３）に対して免疫原性である第３の弱毒化ウイルス、デング血清型４（ＤＥＮ４）に対して免疫原性である第４の弱毒化ウイルス、およびＺＩＫＶに対して免疫原性である第５の弱毒化ウイルスを含む五価の免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、本開示によるジカ核酸キメラである。
【０１５６】
ある実施形態では、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスは、（１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（１０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（１１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（１２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（１３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（１４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（１５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（１６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（１７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（１８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（１９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（３０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（３１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（３２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（３３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（３４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（３５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（３６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（３７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（３８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（３９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（４０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（４１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（４２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（４３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（４４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（４５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（４６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（４７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（４８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（４９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（５０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（５１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（５２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（５３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（５４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（５５）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（５６）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（５７）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（５８）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（５９）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（６０）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（６１）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（６２）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（６３）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０��ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（６４）ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（６５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（６６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（６７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（６８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（６９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（７０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（７１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（７２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（７３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（７４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（７５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（７６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（７７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（７８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（７９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（８０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（８１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（８２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（８３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（８４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（８５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（８６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（８７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（８８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（８９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（９０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（９１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（９２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（９３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（９４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２���１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（９５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（９６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（９７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（９８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（９９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（１００）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（１０１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（１０２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（１０３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（１０４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（１０５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（１０６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（１０７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（１０８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（１０９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（１１０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３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、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２２２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２２３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２２４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／１Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２２５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２２６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２２７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２２８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２２９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２３０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２３１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２３２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２３３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２３４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２３５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２３６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２３７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２３８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２３９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２４０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／３Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２４１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２４２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２４３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２４４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２４５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２４６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２４７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２４８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／１Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２４９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２５０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２５１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、（２５２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／２Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０、（２５３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４Δ３０、（２５４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／１Δ３０、（２５５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／２Δ３０、および（２５６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３／４Δ３０、ｒＤＥＮ４／３Δ３０からなる群から選択される。別の実施形態では、上記の第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスの組み合わせのいずれかの五価の免疫原性組成物の第５の弱毒化ウイルスは、上でより詳細に記載されるように本開示のジカキメラである。一実施形態では、弱毒化ウイルスの各々は、同じデング骨格を含む。別の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスと異なるデングウイルス骨格を含む。
【０１５７】
ある実施形態では、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスは、（１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（５）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（６）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（７）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（８）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（９）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（１０）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（１１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（１２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（１３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（１４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（１５）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（１６）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（１７）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（１８）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（１９）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２０）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２５）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２６）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２７）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２８）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２９）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（３０）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（３１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（３２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（３３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（３４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（３５）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（３６）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（３７）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（３８）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（３９）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（４０）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（４１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（４２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（４３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（４４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（４５）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（４６）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（４７）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（４８）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（４９）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（５０）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（５１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（５２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（５３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（５４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（５５）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（５６）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（５７）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（５８）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（５９）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（６０）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（６１）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（６２）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（６３）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１��ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（６４）ｒＤＥＮ１Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（６５）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（６６）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（６７）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（６８）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（６９）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（７０）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（７１）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（７２）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（７３）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（７４）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（７５）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（７６）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（７７）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（７８）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（７９）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（８０）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（８１）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（８２）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（８３）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（８４）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（８５）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（８６）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（８７）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（８８）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（８９）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（９０）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（９１）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（９２）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（９３）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（９４）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２���１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（９５）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（９６）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（９７）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（９８）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（９９）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（１００）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（１０１）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（１０２）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（１０３）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（１０４）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（１０５）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（１０６）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（１０７）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（１０８）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（１０９）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（１１０）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（１１１）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（１１２）ｒＤＥＮ１／２Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（１１３）ｒＤＥＮ１／２
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ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２１９）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２２０）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２２１）ｒＤＥＮ１／４Δ３１
、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２２２）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２２３）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２２４）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２２５）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２２６）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２２７）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２２８）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２２９）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２３０）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２３１）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２３２）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２３３）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２３４）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２３５）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２３６）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２３７）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２３８）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２３９）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２４０）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２４１）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２４２）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２４３）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２４４）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２４５）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２４６）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２４７）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２４８）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２４９）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２５０）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２５１）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、（２５２）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３１、（２５３）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４Δ３１、（２５４）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３１、（２５５）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３１、および（２５６）ｒＤＥＮ１／４Δ３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３１、ｒＤＥＮ４／３Δ31からなる群から選択される。別の実施形態では、上記の第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスの組み合わせのいずれかの五価の免疫原性組成物の第５の弱毒化ウイルスは、上でより詳細に記載されるように本開示のジカキメラである。一実施形態では、弱毒化ウイルスの各々は、同じデング骨格を含む。別の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスと異なるデングウイルス骨格を含む。
【０１５８】
ある実施形態では、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスは、（１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（５）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（６）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（７）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（８）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（９）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１０）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１５）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１６）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１７）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１８）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１９）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２０）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２５）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２６）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２７）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２８）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２９）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（３０）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（３１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（３２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（３３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（３４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（３５）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（３６）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（３７）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（３８）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（３９）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（４０）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（４１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（４２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（４３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（４４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（４５）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（４６）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（４７）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（４８）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（４９）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（５０）ｒＤＥＮ１Δ３０／３��、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（５１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（５２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（５３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（５４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（５５）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（５６）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（５７）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（５８）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（５９）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（６０）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（６１）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（６２）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（６３）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（６４）ｒＤＥＮ１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（６５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（６６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（６７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（６８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（６９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（７０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（７１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（７２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（７３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（７４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤ���Ｎ４／１Δ３０／３１、（７５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（７６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（７７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（７８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（７９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（８０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（８１）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（８２）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（８３）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（８４）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（８５）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（８６）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（８７）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（８８）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（８９）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（９０）ｒＤＥＮ１／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／
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０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１７７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１７８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１７９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１８０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１８１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１８２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１８３）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１８４）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１８５）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１８６）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１８７）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１８８）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１８９）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１９０）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１９１）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１９２）ｒＤＥＮ１／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１９３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１９４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１９５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（１９６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（１９７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（１９８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（１９９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２００）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／���１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２０１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２０２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２０３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２０４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２０５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２０６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２０７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２０８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２０９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２１０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２１１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２１２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２１３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２１４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２１５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２１６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２１７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２１８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２１９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２２０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２２１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２２２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２２３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、��ＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２２４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２２５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２２６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２２７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２２８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２２９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２３０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２３１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２３２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２３３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２３４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２３５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２３６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２３７）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２３８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２３９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２４０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２４１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２４２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２４３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２４４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２４５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２４６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２４７）ｒＤ��Ｎ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２４８）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／１Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２４９）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２５０）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２５１）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、（２５２）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／２Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１、（２５３）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０／３１、（２５４）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／１Δ３０／３１、（２５５）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／２Δ３０／３１、および（２５６）ｒＤＥＮ１／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ２／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ３／４Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４／３Δ３０／３１からなる群から選択される。別の実施形態では、上記の第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスの組み合わせのいずれかの五価の免疫原性組成物の第５の弱毒化ウイルスは、上でより詳細に記載されるように本開示のジカキメラである。一実施形態では、弱毒化ウイルスの各々は、同じデング骨格を含む。別の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスと異なるデングウイルス骨格を含む。
【０１５９】
ある実施形態では、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスは、（１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（５）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（６）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（７）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（８）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（９）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（１０）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（１１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（１２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（１３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（１４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（１５）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（１６）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（１７）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（１８）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（１９）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２０）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２５）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２６）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２７）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２８）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２９）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（３０）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（３１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（３２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（３３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（３４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（３５）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（３６）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（３７）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（３８）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（３９）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（４０）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（４１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（４２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（４３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（４４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（４５）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（４６）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（４７）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（４８）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（４９）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（５０）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（５１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（５２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（５３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（５４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（５５）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（５６）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（５７）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（５８）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（５９）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（６０）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（６１）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（６２）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（６３）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６��ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（６４）ｒＤＥＮ１Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（６５）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（６６）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（６７）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（６８）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（６９）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（７０）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（７１）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（７２）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（７３）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（７４）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（７５）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（７６）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（７７）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（７８）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（７９）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（８０）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（８１）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（８２）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（８３）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（８４）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（８５）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（８６）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（８７）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（８８）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（８９）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（９０）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（９１）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（９２）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（９３）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（９４）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２���１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（９５）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（９６）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（９７）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（９８）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（９９）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（１００）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（１０１）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（１０２）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（１０３）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（１０４）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（１０５）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（１０６）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（１０７）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（１０８）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（１０９）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（１１０）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（１１１）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（１１２）ｒＤＥＮ１／２Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（１１３）ｒＤＥＮ１／２
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ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２１９）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２２０）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２２１）ｒＤＥＮ１／４Δ８６
、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２２２）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２２３）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２２４）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／１Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２２５）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２２６）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２２７）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２２８）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２２９）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２３０）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２３１）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２３２）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２３３）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２３４）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２３５）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２３６）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２３７）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２３８）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２３９）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２４０）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／３Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２４１）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２４２）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２４３）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２４４）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２４５）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２４６）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２４７）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２４８）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／１Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２４９）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２５０）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２５１）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、（２５２）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／２Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６、（２５３）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４Δ８６、（２５４）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／１Δ８６、（２５５）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／２Δ８６、および（２５６）ｒＤＥＮ１／４Δ８６、ｒＤＥＮ２／４Δ８６、ｒＤＥＮ３／４Δ８６、ｒＤＥＮ４／３Δ８６からなる群から選択される。別の実施形態では、上記の第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスの組み合わせのいずれかの五価の免疫原性組成物の第５の弱毒化ウイルスは、上でより詳細に記載されるように本開示のジカキメラである。一実施形態では、弱毒化ウイルスの各々は、同じデング骨格を含む。別の実施形態では、第５の弱毒化ウイルスは、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスと異なるデングウイルス骨格を含む。
【０１６０】
他の実施形態では、第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスは、段落［０１５０］から［０１５３］において明瞭に示される第１、第２、第３および第４の弱毒化ウイルスから独立して選択され、第５の弱毒化ウイルスは、上でより詳細に記載されるように本開示の弱毒化ＺＩＫＶまたはキメラＺＩＫＶである。例えば、一実施形態では、第１の弱毒ウイルスはｒＤＥＮ１Δ３０（段落［０１４８］から）であり、第２の弱毒化ウイルスはｒＤＥＮ２／４Δ３０（段落［０１４８］から）であり、第３の弱毒化ウイルスはｒＤＥＮ３Δ３０／３１（段落［０１５０］から）であり、第４の弱毒化ウイルスはｒＤＥＮ４Δ３０（段落［０１４８］から）である。一実施形態では、第１の弱毒ウイルスはｒＤＥＮ１Δ３０であり、第２の弱毒化ウイルスはｒＤＥＮ２／４Δ３０であり、第３の弱毒化ウイルスはｒＤＥＮ３Δ３０／３１であり、第４の弱毒化ウイルスはｒＤＥＮ４Δ３０であり、第５の弱毒化ウイルスはＺＩＫＶ／ＤＥＮ２Δ３０またはＺＩＫＶ／ＤＥＮ３Δ３０である。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、弱毒化ウイルスの各々は、同じ弱毒化欠失および／または変異を含む。特定の実施形態では、欠失は、３’非翻訳領域のヌクレオチド配列における欠失であってもよい。例えば、欠失は、Δ３０欠失、Δ３１欠失、Δ３０／３１欠失およびΔ８６欠失からなる群より選択される。別の実施形態では、変異は、ＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１および／またはＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４９９５にある。弱毒化ウイルスの各々で利用される同じ弱毒化欠失および／または変異は、少なくとも２つの異なるデング骨格の上にあってもよい（すなわち、弱毒化ウイルスの各々は、同じ種類の弱毒化欠失および／または変異を含有する同じおよび／または異なるデング骨格を有することができる）ことに注意するべきである。
【０１６２】
免疫原性デングキメラおよびそれらの調製方法
【０１６３】
免疫原性デングキメラおよびデングキメラを調製するための方法が、本明細書で提供される。免疫原性デングキメラは、デングウイルスおよびＺＩＫＶによる感染を最小にするか、阻害するか、またはそれに対して個体および動物を免疫化する免疫原性組成物として、薬学的に許容される担体の中で単独または併用で、本開示のジカキメラで有用である。
【０１６４】
デングキメラは、１つの血清型のデングウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、および異なる血清型のデングウイルスの骨格から選択されるさらなるヌクレオチド配列を含む。デングウイルスに対して免疫原性応答を誘導するために、これらのキメラを使用することができる。
【０１６５】
別の実施形態では、好ましいデングキメラは、第１の血清型のデングウイルスからの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、および第１のものと異なる第２の血清型のデングウイルスからの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラである。別の実施形態では、第２の血清型のデングウイルスは、ＤＥＮ４である。別の実施形態では、構造タンパク質は、第１の血清型のデングウイルスのＣタンパク質、第１の血清型のデングウイルスのｐｒＭタンパク質、第１の血清型のデングウイルスのＥタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０１６６】
さらに、コードされる配列の中の単一のアミノ酸または小さい百分率のアミノ酸（一般的に５％未満、より一般的に１％未満）を変更、付加または削除する、アミノ酸配列またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列における個々の置換、欠失または付加が保存的に改変されたバリエーションであることを当業者は認め、ここで、変更は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。以下の６群の各々は、互いの保存的置換であるアミノ酸を含む：［００３０］１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；［００３１］２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；［００３２］３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；［００３３］４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；［００３４］５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および［００３５］６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、用語「デングキメラ」および「キメラデングウイルス」は、１つの血清型のデングウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、および異なる血清型のデングウイルスの骨格に由来するさらなるヌクレオチド配列を含む、本発明の感染性構築物を意味する。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「感染性構築物」は、細胞を感染させるために使用することができる、ウイルス、ウイルス構築物、ウイルスキメラ、ウイルスまたはその任意の部分に由来する核酸を示す。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「デング核酸キメラ」は、１つの血清型のデングウイルスの免疫原性をコードするヌクレオチド配列、および異なる血清型のデングウイルスの骨格に由来するさらなるヌクレオチド配列を含む核酸を含む、本発明の構築物を意味する。対応して、本発明の任意のキメラウイルスまたはウイルスキメラは、核酸キメラの一例として認めることができる。
【０１７０】
本発明の構造および非構造タンパク質は、完全タンパク質の配列、タンパク質のエピトープまたは、例えば、その３つもしくはそれより多くのアミノ酸残基を含む任意の断片を含む任意のタンパク質またはそれをコードする任意の遺伝子を含むと理解するべきである。
【０１７１】
デングキメラ
【０１７２】
本発明のデングキメラは、１つの血清型のデングウイルス、例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４からの構造タンパク質遺伝子を、異なる血清型のデングウイルス、例えば、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３またはＤＥＮ４からの非構造タンパク質遺伝子と融合することによって形成される構築物である。
【０１７３】
本明細書で提供される弱毒化免疫原性デングキメラは、付与される免疫原性の対象となる１つの血清型のデングウイルスの構造タンパク質遺伝子またはその抗原性部分の１つまたは複数、および異なる血清型のデングウイルスの非構造タンパク質遺伝子を含有する。
【０１７４】
デングキメラは、デングゲノムのＣ、ｐｒＭもしくはＥタンパク質（複数可）をコードする構造タンパク質遺伝子（複数可）またはそれらの組み合わせが、保護の対象となる異なる血清型のデングウイルスからの対応する構造タンパク質遺伝子（複数可）で置き換えられる、１つの血清型のデングウイルスゲノムを骨格として含有する。結果として生じるウイルスデングキメラは、別の血清型のデングウイルスでキメラ化されることによって弱毒化の特性を有し、したがってビルレンスが低減されているが、構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現し、したがって免疫原性である。
【０１７５】
本明細書に記載される弱毒化キメラ（デングおよびジカ）の骨格として、任意のデングウイルスのゲノムを使用することができる。骨格は、デングウイルスの弱毒化表現型に寄与する、または製造のために使用される細胞基材（cell substrate）、例えばベロ細胞における複製を促進する変異を含有することができる。変異は、ジカキメラに関して上記されるように、非構造タンパク質、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列にあってもよい。骨格は、弱毒化表現型の安定性を維持し、弱毒化ウイルスまたはキメラがビルレントの野生型ウイルスに戻り得る可能性を低減するために、さらなる変異を含有することもできる。例えば、所望により、３’非翻訳領域の第１の変異および５’非翻訳領域の第２の変異は、さらなる弱毒化表現型安定性を提供する。
【０１７６】
そのような変異は、当業者に公知の技術を使用した部位特異的変異誘発によって達成することができる。ビルレントの骨格構造と弱毒化された骨格構造とを識別するために、本明細書に記載される、および当技術分野で周知であるビルレンススクリーニングアッセイを使用することができることが当業者に理解される。
【０１７７】
デングキメラの構築
【０１７８】
本明細書に記載されるデングウイルスキメラは、当業者に周知の組換え操作技術を使用して、すなわち、指定された１つの血清型のデングウイルス遺伝子を除去して、それを異なる血清型のデングウイルスの所望の対応する遺伝子で置き換えることによって、免疫が所望される１つの血清型のデングウイルスの構造タンパク質遺伝子の少なくとも１つを異なる血清型のデングウイルスゲノム骨格に置換することによって生成することができる。あるいは、ＧｅｎＢａｎｋに提供される配列を使用して、公知の核酸合成技術を使用して、デングタンパク質をコードする核酸分子を合成して、適当なベクターに挿入することができる。したがって、弱毒化免疫原性ウイルスは、当業者に公知の組換え操作技術を使用して生成される。
【０１７９】
上で言及した通り、骨格に挿入される遺伝子は、１つの血清型のデング構造タンパク質をコードする。挿入される異なる血清型のデング遺伝子は、Ｃタンパク質、ｐｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする遺伝子である。デングウイルス骨格に挿入される配列は、他の血清型のｐｒＭおよびＥ構造タンパク質の両方をコードすることができる。デングウイルス骨格に挿入される配列は、他の血清型のＣ、ｐｒＭおよびＥ構造タンパク質をコードすることができる。デングウイルス骨格は、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３もしくはＤＥＮ４ウイルスゲノムであるか、またはこれらの血清型のいずれかの弱毒化デングウイルスゲノムであり、異なる血清型のデングウイルスのＣ、ｐｒＭおよび／もしくはＥ構造タンパク質をコードする置換された遺伝子（複数可）、または異なる血清型のデングウイルスのｐｒＭおよび／もしくはＥ構造タンパク質をコードする置換された遺伝子（複数可）を含む。
【０１８０】
いずれかの血清型のデングウイルスの構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する、適するキメラウイルスまたは核酸キメラは、免疫原性の保持を伴ってビルレンスの低減を示す弱毒化の表現型マーカーについてそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性について評価することができる。抗原性および免疫原性は、当業者に公知である慣例的なスクリーニング法を使用して、デング抗体または免疫反応性血清とのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ反応性を使用して評価することができる。
【０１８１】
デングおよびジカワクチン
【０１８２】
好ましいデングおよびジカキメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用である弱毒化された生ウイルスを提供する。好ましい実施形態では、キメラは、危険な病原性または致死性の影響を同時に及ぼさずに高い免疫原性を示す。
【０１８３】
本開示のデングキメラウイルスまたは核酸キメラは、異なる血清型の野生型または弱毒化デングウイルス骨格に１つの血清型のデングウイルスの構造遺伝子を含むことができ、本開示のジカ−デングキメラウイルスまたは核酸キメラは、野生型または弱毒化デングウイルス骨格にＺＩＫＶの構造遺伝子を含む。例えば、デングキメラは、異なる血清型のデングウイルスまたは弱毒化デングウイルスバックグラウンドで１つの血清型のデングウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現することができる。
【０１８４】
１つの血清型のデングウイルスゲノムの非構造領域を含有する遺伝子バックグラウンドを使用する、本明細書に記載の戦略、および、キメラ化によって、異なる血清型のデングウイルスおよびＺＩＫＶの構造タンパク質遺伝子を発現する弱毒化の特性は、所望の免疫原性の構造タンパク質遺伝子を発現する弱毒化された生ジカ、デングワクチン候補の開発につながった。したがって、デングおよびジカ病原体の制御のためのワクチン候補を、設計することができる。
【０１８５】
本明細書に記載されるキメラで使用されるウイルスは、当技術分野で公知の技術を使用して一般的に増殖させる。ウイルスプラークまたはフォーカス形成単位（ＦＦＵ）滴定を次に実行し、プラークまたはＦＦＵを数えて、細胞培養物で増殖させたウイルスの生存度、力価および表現型特性を評価する。弱毒化候補出発材料を誘導するために、野生型ウイルスを変異誘発させる。
【０１８６】
キメラの感染性クローンは、様々なデング血清型から構築される。所望により、ウイルス特異的ｃＤＮＡ断片のクローニングを達成することもできる。構造タンパク質または非構造タンパク質遺伝子を含有するｃＤＮＡ断片を、様々なプライマーでデングＲＮＡから逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅させる。増幅させた断片は、他の中間クローンの切断部位にクローニングする。挿入されたデング特異的ｃＤＮＡの配列を検証するために、中間のキメラデングクローンを次に配列決定する。
【０１８７】
デングウイルスの構造または非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することによって構築される完全ゲノム長キメラプラスミドは、当業者に周知の組換え技術を使用して入手できる。
【０１８８】
投与方法
【０１８９】
本明細書に記載されるウイルスキメラは、ヒトまたは動物への免疫原またはワクチンとしての投与のために、薬学的に許容される担体またはビヒクルと個々に、または共同で組み合わされる。本明細書において、用語「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容されるビヒクル」は、これらに限定されないが、有害な生理反応を引き起こすことなく生きている動物またはヒト組織と接触させて使用するのに適し、組成物の他の構成成分と有害な方法で相互作用しない、水または食塩水、ゲル、膏薬（salve）、溶媒、希釈剤、液状軟膏基剤、リポソーム、ミセル、巨大ミセルなどを含む、任意の組成物または化合物を意味するために使用される。
【０１９０】
免疫原性またはワクチン製剤は、ウイルスプラーク形成単位（ＰＦＵ）またはフォーカス形成単位（ＦＦＵ）剤形の形で便利に提供することができ、従来の製薬技術を使用することによって調製することができる。そのような技術は、有効成分および薬学的担体（複数可）または賦形剤（複数可）を会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体と均一および緊密に会合させることによって調製される。非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる水性および非水性の無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。製剤は、単位用量または多回用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液および懸濁物は、当業者が一般に使用する無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０１９１】
好ましい単位投薬製剤は、投与される成分の用量もしくは単位、またはその適当な一部を含有するものである。上で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は当業者によって一般に使用される他の薬剤を含むことができることを理解するべきである。
【０１９２】
免疫原性またはワクチン組成物は、これらに限定されないが、頬側および舌下、直腸、エアゾール、経鼻、筋肉内、皮下、皮内および局所を含む、経口または非経口などの様々な経路を通して投与することができる。組成物は、これらに限定されないが、溶液、乳剤および懸濁物、マイクロスフェア、粒子、微粒子、ナノ粒子およびリポソームを含む、様々な形で投与することができる。免疫化スケジュールにつき、約１から約５用量が必要とされ得ると予想される。初回用量は、約１００から約１００，０００ＰＦＵまたはＦＦＵの範囲であり得、好ましい投薬量範囲は約５００から約２０，０００ＰＦＵまたはＦＦＵであり得、より好ましい投薬量範囲は約７５０から約１２，０００ＰＦＵまたはＦＦＵであり得、最も好ましい投薬量範囲は約７５０から約４０００ＰＦＵまたはＦＦＵであり得る。ブースター注射は、約１００から約２０，０００ＰＦＵまたはＦＦＵの投薬量の範囲であり得、好ましい投薬量範囲は約５００から約１５，０００であり得、より好ましい投薬量範囲は約５００から約１０，０００ＰＦＵまたはＦＦＵであり得、最も好ましい投薬量範囲は約５００から約５０００ＰＦＵまたはＦＦＵであり得る。例えば、投与体積は、投与経路によって変動する。筋肉内注射は、約０．１ｍｌから１．０ｍｌの範囲内の体積であってもよい。
【０１９３】
組成物は、約−１００℃から約４℃の温度で保存することができる。組成物は、室温を含む様々な温度で、凍結乾燥状態で保存することもできる。組成物は、当業者に公知である従来の手段を通して滅菌することができる。そのような手段には、これに限定されないが、濾過が含まれる。組成物は、細菌増殖を阻害するために、静菌剤と組み合わせることもできる。
【０１９４】
投与スケジュール
【０１９５】
本明細書に記載される免疫原性またはワクチン組成物は、ヒトまたは家畜、例えばウマまたは鳥類、特にＺＩＫＶ感染が存在する領域に移動する個体に、またそれらの領域の居住者に投与することができる。組成物の投与について最適な時間は、ＺＩＫＶへの初期曝露の約１〜３カ月前である。しかし、疾患進行を改善するために初期感染の後に、または疾患を処置するために初期感染の後に組成物を投与することもできる。
【０１９６】
アジュバント
【０１９７】
当業者に公知である様々なアジュバントを、本発明の免疫原またはワクチン組成物中でキメラウイルスと併用して投与することができる。そのようなアジュバントには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ポリマー、コポリマー、例えばポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー、例えばブロックコポリマー、ポリマーｐ１００５、フロイント完全アジュバント（動物の場合）、フロイント不完全アジュバント；ソルビタンモノオレエート、スクアレン、ＣＲＬ−８３００アジュバント、ミョウバン、ＱＳ２１、ムラミルジペプチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドのモチーフの組み合わせ、トレハロース、細菌抽出物、例えばミコバクテリウム抽出物、解毒されたエンドトキシン、膜脂質またはそれらの組み合わせ。
【０１９８】
核酸配列
【０１９９】
ＺＩＫＶおよびデングウイルスの核酸配列は、試料または検体中のＺＩＫＶおよびデングウイルスキメラの高い感度および特異性での検出のための核酸プローブおよびプライマーを設計するのに有用である。ワクチンウイルスの存在を検出するために、ＺＩＫＶおよびデングウイルスに対応するプローブまたはプライマーを使用することができる。核酸および対応するアミノ酸配列は、生物体および疾患を研究するための、ならびに疾患のための療法および処置を開発するための研究室ツールとして有用である。
【０２００】
核酸プローブおよびプライマーは、ＺＩＫＶおよびデングウイルスをコードする核酸分子と、またはその相補配列と選択的にハイブリダイズする。「選択的」または「選択的に」は、ＺＩＫＶ配列およびデングウイルス配列の十分な検出を阻止する他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。したがって、ハイブリダイズする核酸の設計において、選択性は、試料中に存在する他の構成成分に依存する。ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％の相補性を有するべきである。核酸を記載するために本明細書で使用される場合、用語「選択的にハイブリダイズする」は、時折のランダムにハイブリダイズする核酸を排除し、したがって、「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味を有する。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸プローブおよびプライマーは、それがハイブリダイズする配列のセグメントと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％の相補性、好ましくは８５％またはそれより高い相補性を有することができる。
【０２０１】
本発明は、コード核酸または該核酸の相補的なもしくは対向する鎖に選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーも企図する。機能的種間ハイブリダイゼーション能力が維持される限り、核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、核酸における少数の改変または置換があっても起こり得る。「プローブ」または「プライマー」は、それらの検出または増幅のために相補的核酸配列との選択的ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして使用することができる核酸配列を意味し、これらのプローブまたはプライマーは、長さが約５から約１００ヌクレオチドまで、または好ましくは約１０から約５０ヌクレオチド、または最も好ましくは約１８から約２４ヌクレオチドまで変動することができる。Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Sambrook、FritschおよびManiatis、ColdSpring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.、１９８９年に記載されるように、ストリンジェントな条件下で種特異的核酸と選択的にハイブリダイズし、目的の配列に相補的な少なくとも５つのヌクレオチドを有するべきである、単離された核酸が本明細書に提供される。
【０２０２】
プライマーとして使用される場合、所望の領域を増幅するように、組成物は、標的分子の異なる領域にハイブリダイズする少なくとも２つの核酸分子を好ましくは含む。プローブまたはプライマーの長さによって、標的領域は７０％の相補性塩基と完全な相補性の間で変動することができ、ストリンジェントな条件下でなおハイブリダイズすることができる。例えば、ＺＩＫＶおよびデングウイルスの存在を検出するために、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列の間の相補性の程度は、他の生物体からの核酸とのハイブリダイゼーションを識別するのに少なくとも十分である。
【０２０３】
ＺＩＫＶおよびデングウイルスをコードする核酸配列は、プラスミドなどのベクターに挿入することができ、生体において組換えにより発現させて、組換えＺＩＫＶおよびデングウイルスペプチドおよび／またはポリペプチドを生成することができる。
【０２０４】
本発明の核酸配列は、逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ならびにｃＤＮＡアンプリコンを増幅するように設計されているフォワードおよびリバースアンプライマー（amplimer）を使用することによってウイルスゲノムのＲＮＡ鋳型から増幅したｃＤＮＡアンプリコンの検出を報告する役目をする診断プローブを含む。ある特定の場合では、アンプライマーの１つは、アンプライマーの３’末端にワクチンウイルス特異的変異を含有するように設計され、そのことは、標的部位でのプライマーの伸長、およびその結果としての増幅は、ウイルスのＲＮＡ鋳型がその特異的変異を含有する場合だけに起こるので、試験を効果的にワクチン株にさらにより特異的にする。
【０２０５】
自動化されたＰＣＲをベースとした核酸配列検出システムおよびＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、広く使用されている。診断遺伝子試験のためのより最近開発された戦略は、分子ビーコンを利用する（TyagiおよびKramer、１９９６年、Nature Biotechnology１４巻：３０３〜３０８頁）。分子ビーコンアッセイは、ＴａｑＭａｎアッセイで使用されるものと異なるクエンチャーおよびリポーター色素を用いる。これらおよび他の検出システムを、当業者は使用することができる。
【０２０６】
フラビウイルスキメラ生成
【０２０７】
本明細書に記載されるように、弱毒化された生フラビウイルスワクチンは、組換えＤＮＡテクノロジーを使用して開発される。本明細書において、この技術は、フラビウイルスの間での、ゲノム構成、ウイルスタンパク質の数、複製戦略、遺伝子発現、ビリオン構造および形態形成の保存によって促進される。全てのフラビウイルスは、プロセシングされてカプシド（Ｃ）、前膜（ｐｒＭ）およびエンベロープ糖タンパク質（Ｅ）構造タンパク質を与え、続いて非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４ＢおよびＮＳ５をその順序で与える、単一の長いポリタンパク質をコードする正のセンスの非セグメント化ＲＮＡゲノムを有する。これらの共有される特性のために、生存能力のあるキメラウイルスは、フラビウイルスの完全長感染性ｃＤＮＡクローンのウイルス構造タンパク質のための遺伝子を、別のフラビウイルスの対応するウイルス遺伝子（ｃＤＮＡの形の）で置き換えることによって生成される。試験をしたとき、この戦略は、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）またはダニ媒介性のランガットウイルス（ＬＧＴ）のウイルス構造タンパク質ｐｒＭおよびＥの配列を含有したキメラで成功したが、全ての他の配列は、カ媒介性４型デングウイルス（ＤＥＮ４）の完全長感染性ｃＤＮＡに由来した。これは、異種のフラビウイルス、ＴＢＥＶまたはＬＧＴのウイルス構造タンパク質が、ＤＥＮ４のシス作用性５’および３’配列ならびに非構造タンパク質との関連で機能するかもしれないことを示した。重要なことに、両方のキメラは、末梢のビルレンス、すなわち、末梢の接種部位からＣＮＳに拡散して脳炎を引き起こすウイルスの能力に関して、マウスにおいて高度に弱毒化されることを証明した。それにもかかわらず、キメラは免疫原性であって、ＴＢＥＶまたはＬＧＴでのチャレンジに対してマウスにおいて抵抗性を誘導することができることを証明した。ｉｎ  ｖｉｖｏウイルス複製の低減（弱毒化）と防御免疫の誘導との間の好ましい平衡が達成されたようであった。これは、ダニ媒介性のフラビウイルスのｐｒＭおよびＥは、ＤＥＮ４非構造タンパク質ならびにシス作用性５’および３’配列との関連で、感染性および免疫の誘導に十分であるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高レベルの複製およびＣＮＳに拡散する能力を必要とするビルレンスの完全な発現に十分でないレベルで、相互作用することができることを意味すると解釈される。最近、西ナイルウイルスおよび弱毒化デングウイルス骨格からの構造タンパク質を含有する西ナイルウイルスおよびデングウイルスキメラは、免疫原またはワクチンとして有効であることが示された。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５／０１００８８６Ａ１号を参照する。
【０２０８】
これらのワクチン候補の構成成分の役割をするデングウイルスの非構造タンパク質のための遺伝子におけるさらなる変異の導入によるジカ／デングキメラのさらなる弱毒化。１つまたは複数の弱毒化変異をキメラのデング構成成分に加えることによって、候補ワクチンジカ／ＤＥＮまたはジカ／ＤＥＮ−Δ３０キメラ（血清型１、２、３または４）の弱毒化レベルの増加が達成される。例えば、マウスにおいてＤＥＮ４を弱毒化する変異の大きなセットが、米国特許出願公開第２００５／０１００８８６Ａ１号に記載されるＷＮ／ＤＥＮ４キメラウイルスに含まれるＤＥＮ４ゲノムの一部で同定された。弱毒化変異のこのセットからのメンバーをジカ／デング（血清型１、２、３または４）キメラウイルスに導入して、これらのウイルスをさらに弱毒化することができる。ジカ／ＤＥＮ４ウイルスをさらに弱毒化する必要があるかもしれない。さらなる弱毒化を達成するこのアプローチの実現可能性は、温度感受性表現型ならびに乳のみマウス脳における成長制限の表現型を規定する存続可能な変異をジカ／デングキメラのデング構成成分の非構造タンパク質３（ＮＳ３）に導入することによって、例示される。変異４８９１（イソロイシン＞トレオニン）は、ＤＥＮ４のＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１で、以前に同定されていた。変異４８９１は、２つの望ましい表現型、すなわち、温度感受性および脳組織における成長制限を規定した。同様に、同じくＮＳ３における変異４９９５（セリン＞プロリン）は、同じ２つの望ましい表現型を規定した。４８９１および４９９５変異も、ベロ細胞におけるＤＥＮ４の複製適応度を増加させる、すなわち、それらはベロ細胞適応変異である。ＤＥＮ４の４８９１の野生型アミノ酸残基（イソロイシン）は、ＤＥＮ２トンガ／７４およびＤＥＮ３スレマン／７８で保存されているが、ＤＥＮ１西太平洋では保存されていない。ＤＥＮ４の４９９５の野生型アミノ酸残基（セリン）は、ＤＥＮ１西太平洋、ＤＥＮ２トンガ／７４で保存されているが、ＤＥＮ３スレマンでは保存されていない。これらの変異の１つまたはその両方も、ジカ／ＤＥＮ１、２または３キメラに含まれてもよい。したがって、ジカ／ＤＥＮ４ウイルスにおけるそれらの組入れは、ベロ細胞におけるウイルス複製またはベロ細胞における製造の間の変異の遺伝的安定性の増加を達成するものと考えられている。
【０２０９】
遠縁のダニ媒介性およびカ媒介性のフラビウイルスのｐｒＭおよびＥタンパク質は高度に異なるが、これらのタンパク質は一部の場合にウイルス生存度を失わずに交換できることが実証された。このアプローチは、新しいキメラフラビウイルスを作製するために使用された。
【０２１０】
さらに、存続可能なダニ媒介性／ＤＥＮ４キメラを構築して、回収した。これらの場合には、ダニ媒介性の親フラビウイルスは、ダニ媒介性脳炎ウイルス（高度にビルレントなウイルス）またはランガットウイルス（天然弱毒化ダニ媒介性ウイルス）であった。したがって、これらのキメラの２つの構成成分は、異種のベクター宿主、すなわち、ダニ、およびＤＥＮ４の場合にはカを有した。キメラにおける遺伝子生成物相互作用の効率の低下は、これらのハイブリッドウイルスによって示される著しい弱毒化の基礎であると考えられた。それにもかかわらず、マウスでは高度に弱毒化されるが、ＴＢＥＶ／ＤＥＮ４およびＬＧＴ／ＤＥＮ４キメラは免疫原性であり、それらの親のダニ媒介性のフラビウイルスに対してかなりの保護を提供した。
【０２１１】
構造ｐｒＭおよびＥタンパク質のためのその遺伝子がＷＮ株ＮＹ９９の対応する遺伝子で置き換えられたＤＥＮ４ゲノムを含有した、存続可能なＷＮ／ＤＥＮ４キメラも構築した。米国特許出願公開第２００５／０１００８８６Ａ１号。ＷＮ／ＤＥＮ４キメラの親ウイルスは、カによって伝染する。しかし、ベクターの好みは異なり、ＤＥＮ４はＡｅｄｅｓを、ＷＮはＣｕｌｅｘを好む。高度に弱毒化されるが、ＷＮ／ＤＥＮ４キメラは、ＷＮのＮＹ９９に対する中程度から高レベルの血清中和抗体を刺激した。免疫化によって誘導されるＷＮに対する中和抗体のレベルと以降の致死性のＷＮチャレンジへの抵抗性の間に、強力な相関があった。
【０２１２】
【実施例】
【０２１３】
弱毒化ＶＩＫＶの構築。Δ３０変異を含有する弱毒化ＺＩＫＶ（ｒＺＩＫＶΔ３０）、またはｒＤＥＮ４Δ３０からの３’ＵＴＲを含有するＺＩＫＶ（ｒＺＩＫＶ−３’Ｄ４Δ３０）を構築する。
【０２１４】
弱毒化キメラＺＩＫＶの構築。図１１に示すように、弱毒化ＺＩＫＶは、ＺＩＫＶのｐｒＭおよびＥをＤＥＮ２Δ３０に導入することによって構築される。新しいキメラウイルスは、ｒＺＩＫＶ／Ｄ２Δ３０と命名されるだろう。同様に、ＺＩＫＶのｐｒＭおよびＥをＤＥＮ３Δ３０に導入することができる。
【０２１５】
多価ワクチンの製造。多価ワクチンは、弱毒化ウイルス、例えば、ｒＤＥＮ１Δ３０、ｒＤＥＮ２／４Δ３０、ｒＤＥＮ３Δ３０／３１、ｒＤＥＮ４Δ３０およびｒＺＩＫＶ／Ｄ２Δ３０を組み合わせることによって構築される。
【０２１６】
五価のＤＥＮＶ−ＺＩＫＶワクチンの開発。図１２に表すキメラｃＤＮＡプラスミドは、ＤＥＮ２Δ３０またはＤＥＮ４Δ３０のｐｒＭおよびＥ遺伝子領域を、ＺＩＫＶ−パライバ／２０１５（ブラジル）に由来するものと置き換える。Ｅ．ｃｏｌｉでの安定性のために、ウイルスのオープンリーディングフレームがイントロン配列の挿入によって破壊されなければならないと決定され、それは図１４Ａ〜１４Ｃにより詳細に示され、下で議論される。感染性ウイルスを回収するために、ベロ細胞にｃＤＮＡプラスミドをトランスフェクトした。転写はＣＭＶプロモーター配列から進行し、リボザイム（ＲＢＺ）およびターミネーター（ＴＥＲＭ）配列によって終了して、ウイルスゲノムを生成する。イントロン配列は、正常なＲＮＡスプライシングプロセスによって除去される。ＤＥＮＶ−２およびＤＥＮＶ−４バックグラウンドのためのプラスミドマップは、図１３Ａおよび１３Ｂに示す。
【０２１７】
上記で考察されるように、キメラＤＥＮＶ−ＺＩＫＶ構築物を安定させるために、イントロン配列が要求された。同じ標準のイントロン配列が、各ｃＤＮＡ構築物のために使用された。ＺＶ−Ｄ２は、ＮＳ１遺伝子領域のアラニンコドン１４９に単一の挿入を含有する（図１４Ａ）。ＺＶ−Ｄ４は、ＮＳ２Ａのアラニンコドン１４８（図１４Ｂ）およびＮＳ５のアラニンコドン４２５（図１４Ｃ）に位置する２つのイントロン挿入を含有する。
【０２１８】
組織培養細胞におけるＤＥＮＶ−ＺＩＫＶキメラウイルスの複製動態およびピーク力価の評価。キメラウイルスｒＺＩＫＶ／Ｄ２Δ３０−７１０（ＤＥＮ２Δ３０バックグラウンド）およびｒＺＩＫＶ／Ｄ４Δ３０−７１３（ＤＥＮ４Δ３０バックグラウンド）をベロ細胞で生成して、それから回収し、ベロ細胞における２回の限界希釈によって生物学的にクローニングし、次に、ベロ細胞での継代によってさらに増幅し、有効シードストックを生成した。２つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）でウイルス増殖動態を評価した。図１５Ａに示すように、両ウイルスは６ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ超まで複製し、力価は約５日目にピークに達する。両ウイルスで、０．０１のＭＯＩはより高い収量を提供した（図１５Ｂ）。両ウイルスは、さらなる評価および製造のために適すると考えられた。
【０２１９】
弱毒化のレベルは、２つのバックグラウンドでわずかに異なる可能性がある。弱毒化の試験は、非ヒト霊長類における研究およびヒト被験体におけるフェーズＩ評価によって判定される。最終ワクチン候補への下方選択（down selection）は、ヒト被験体における安全性、感染性および免疫原性に基づく。
【０２２０】
ＤＥＮＶ−ＺＩＫＶキメラウイルスの弱毒化の評価。ワクチン候補の弱毒化は、非ヒト霊長類の研究を通してアクセスし、ここで、ウイルス複製およびワクチン候補の免疫原性は、野生型ＺＩＫＶと比較した。アカゲザルを、野生型ウイルス（ＺＩＫＶ−ＳＪＲＰ／２０１６、ＺＩＫＶ−ニカラグア／２０１６、またはＺＩＫＶ−パライバ／２０１５）またはキメラＺＩＫＶワクチン候補（ｒＺＩＫＶＤ２Δ３０−７１０またはｒＺＩＫＶＤ４Δ３０−７１３）の１０４ｐｆｕ（４．０ｌｏｇ１０ＰＦＵ）で、皮下に接種した。接種の２から８日後に、血清を毎日収集した。収集した血清を、感染性ウイルスについてベロ細胞で分析した。下の表１は、ウイルス血症評価の結果を示し、表２は、ウイルス血症評価の平均力価を示す。
【０２２１】
野生型ＺＩＫＶは、３〜４日間に約２ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬの力価まで複製した。キメラワクチン候補の複製は、検出レベル（＜０．７ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ）未満であって、それによって、野生型ＺＩＫＶと比較したそれらの弱毒化表現型を確認した。検出された弱毒化は、おそらくキメラ化およびΔ３０変異の存在による。
【表１】
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【表２】
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【０２２２】
具体的な実施形態
【０２２３】
ある態様によれば、本開示は、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）からの少なくとも１つの構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、第１のフラビウイルスからの少なくとも１つの非構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列、および第２のフラビウイルスからの３’非翻訳領域の第３のヌクレオチド配列を含む、ジカ核酸キメラを提供する。
【０２２４】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第１のフラビウイルスはデングウイルスである。
【０２２５】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第１のフラビウイルスはＺＩＫＶである。
【０２２６】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第２のフラビウイルスはデングウイルスである。
【０２２７】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第２のフラビウイルスはＺＩＫＶである。
【０２２８】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、デングウイルスはデング血清型１である。
【０２２９】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、デングウイルスはデング血清型２である。
【０２３０】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、デングウイルスはデング血清型３である。
【０２３１】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、デングウイルスはデング血清型４である。
【０２３２】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、３’非翻訳領域はヌクレオチド配列に欠失を含有する。
【０２３３】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、欠失は、Δ３０欠失、Δ３１欠失、Δ３０／３１欠失およびΔ８６欠失からなる群より選択される。
【０２３４】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、ジカ核酸キメラは、ＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１および／またはＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４９９５に変異をさらに含む。
【０２３５】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、少なくとも１つの構造タンパク質は前膜（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）またはその両方である。
【０２３６】
ある態様によれば、本開示は、デング血清型１に対して免疫原性である第１の弱毒化ウイルス、デング血清型２に対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルス、デング血清型３に対して免疫原性である第３の弱毒化ウイルス、デング血清型４に対して免疫原性である第４の弱毒化ウイルス、およびＺＩＫＶに対して免疫原性である第５の弱毒化ウイルスを含む、五価の免疫原性組成物を提供する。
【０２３７】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第５の弱毒化ウイルスは本開示のジカ核酸キメラである。
【０２３８】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、弱毒化ウイルスの各々は同じ弱毒化欠失または変異を含む。
【０２３９】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、欠失は３’非翻訳領域のヌクレオチド配列における欠失である。
【０２４０】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、欠失は、Δ３０欠失、Δ３１欠失、Δ３０／３１欠失およびΔ８６欠失からなる群より選択される。
【０２４１】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、さらに変異を含む五価の免疫原性組成物は、ＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４８９１および／またはＮＳ３遺伝子のヌクレオチド４９９５である。
【０２４２】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、本開示の五価の免疫原性組成物はアジュバントをさらに含む。
【０２４３】
さらなる態様によれば、本開示は、フラビウイルスに対して免疫原性である少なくとも１つの第１の弱毒化ウイルス、およびＺＩＫＶに対して免疫原性である第２の弱毒化ウイルスを含む、多価の免疫原性組成物を提供する。
【０２４４】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、フラビウイルスは、デングウイルス血清型１、デングウイルス血清型２、デングウイルス血清型３、デングウイルス血清型４、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせである。
【０２４５】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第２の弱毒化ウイルスは本開示のジカ核酸キメラである。
【０２４６】
本明細書に記載のある態様または実施形態において、第２の弱毒化ウイルスは、ゲノムに１つまたは複数の弱毒化変異および／または欠失を含むＺＩＫＶである。
【０２４７】
別の態様によれば、本開示は、被験体において免疫応答を誘導する方法を提供する。この方法は、有効量の本開示の組成物を被験体に投与することを含む。
【０２４８】
なおさらなる態様によれば、本開示は、被験体においてＺＩＫＶ感染を予防または処置する方法を提供する。この方法は、被験体に、有効量の本開示のジカ核酸キメラ、または有効量の本開示の免疫原性組成物を投与することを含む。
【０２４９】
本発明を明解性および理解のために多少詳細に記載したが、形態および細部の様々な変更を本発明の真の範囲を逸脱することなく加えることができることを、当業者は認める。上で参照した全ての図面、表、付録、特許、特許出願および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【数１】
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本明細書に引用または参照される全ての刊行物、特許出願、特許、図面および他の参考文献、ならびに本明細書に引用される文書において引用または参照される全ての文書は、本明細書でまたは本明細書に参照により組み込まれる任意の文書で言及される、任意の製品のための任意の製造業者の説明書、記載、製品仕様書および製品シートと一緒に、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ＡＢ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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