(57)【要約】核酸を合成、検出、及び／または定量化するための組成物、方法、及びキットが本明細書に提供される。実施形態は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、粗抽出物または粗溶解物の試料中の核酸標的の核酸合成、増幅、検出、及び／または定量化を改善する薬剤とを含む、核酸増幅組成物を含む。2019515667.tif 000003
2019515667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼと、
（ｂ）少なくとも１つの塩と、
（ｃ）少なくとも１つの消泡剤と、
（ｄ）少なくとも１つのｄＮＴＰと、
（ｅ）少なくとも１つのｄＮＴＰ誘導体と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びそれらの突然変異体、変異体、または誘導体から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ由来のＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記塩が、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記塩が５ｍＭ〜２００ｍＭの全濃度である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記消泡剤がシリコーン系消泡剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記シリコーン系消泡剤が、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記消泡剤が非シリコーン系消泡剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記非シリコーン系消泡剤が、有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、及びポリアルキレンイミン化合物から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリアルキレンイミン化合物が、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４またはＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記消泡剤が０．００１％〜０．１％の濃度である、請求項７または９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ｄＮＴＰがｄＧＴＰである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ｄＮＴＰ誘導体が、７−デアザ−ｄＧＴＰ（７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ｄＧＴＰが０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記７−デアザ−ｄＧＴＰが０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
１：２〜２：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
１：２〜１：１０の比でｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
２：１〜１０：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＰＣＲ阻害因子遮断剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＰＣＲ阻害因子遮断剤がタンパク質である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質が、アルブミン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ゼラチン及び血清アルブミンを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ゼラチンが、ウシゼラチン、フィッシュゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ウシゼラチンが０．０１％〜１．０％の濃度であり、かつ／または前記フィッシュゼラチンが０．０１％〜１．０％の濃度である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記血清アルブミンがウシ血清アルブミンである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ウシ血清アルブミンが０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記非イオン性界面活性剤が、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ＴＷＥＥＮ  ８０、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、及びＢｒｉｊ  ５８からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記界面活性剤が、Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記非イオン性界面活性剤が０．００５％〜０．１％の濃度である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
パッシブリファレンスコントロール色素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記パッシブリファレンスコントロール色素が蛍光色素である、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記蛍光色素がＲＯＸ色素またはＭＬＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ色素である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記パッシブリファレンス色素が、５０ｎＭ〜５００ｎＭの濃度である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び／またはｄＵＴＰをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
核酸合成反応を実施する方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を、標的特異的プライマーと共に標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料と接触させて反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）核酸合成を実施する工程と
を含む、方法。
【請求項３９】
前記核酸合成反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸合成反応が増幅反応である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記生物学的試料が溶解物である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子型を決定する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＰＣＲが、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて実施された同等のＰＣＲと比較して、より短い期間で増幅産物を産生する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＰＣＲがシンプレックスＰＣＲである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶解物が、１つまたは複数のＰＣＲ阻害因子を含む粗溶解物である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記溶解物が、血液、尿、または唾液試料から得られる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が検出工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出工程が加水分解プローブを利用する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記工程（ｃ）が加水分解プローブの使用を含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子型決定が少なくとも９９％正確である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記コピー数の変動が、標準的な反応混合物または他の市販の組成物を用いて実施される同等の方法と比較して少なくとも１０％改善される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１に記載の組成物を含むキットであって、前記キットが、少なくとも、第１のプライマー対及び／または第１の標識プローブをさらに含み、前記第１のプライマー対及び前記第１の標識プローブが第１の標的核酸に特異的である、キット。
【請求項５７】
前記キットが、コントロール核酸試料ならびに第２のプライマー対及び／または第２の標識プローブをさらに含み、前記第２のプライマー対及び前記第２の標識プローブが、前記コントロール核酸試料中に存在する第２の標的核酸に特異的である、請求項４９に記載のキット。
【請求項５８】
前記標識プローブが加水分解プローブである、請求項５３または５４に記載のキット。
【請求項５９】
前記加水分解プローブがＴａｑＭａｎプローブである、請求項５５に記載のキット。
【請求項６０】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
０．０５ｍＭ〜０．７ｍＭの濃度である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
【請求項６１】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が１：２〜２：１である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
【請求項６２】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が１：２〜１：１０である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
【請求項６３】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
カリウム塩と、
消泡剤と、
ｄＧＴＰと、
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が２：１〜１０：１である、デアザ−ｄＧＴＰと
を含む、組成物。
【請求項６４】
前記消泡剤がシリコーンを含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
アルブミン、ゼラチン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
フィッシュゼラチンとウシゼラチンの組み合わせを含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
フィッシュゼラチン及びウシ血清アルブミンを含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６８】
Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記非イオン性界面活性剤が０．００５〜０．０５％の濃度である、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記非イオン性界面活性剤が、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ＴＷＥＥＮ  ８０、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、またはＢｒｉｊ  ５８からなる群から選択される、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
パッシブリファレンスコントロール色素をさらに含む、請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと、
塩化カリウムと、
シリコーンを含む消泡剤と、
デアザ−ｄＧＴＰが約０．０５ｍＭ〜０．７ｍＭの濃度である、ｄＧＴＰ及びデアザ−ｄＧＴＰと、
Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤と、
０．０１〜０．２５％の濃度であるウシゼラチンと、
０．０５％〜１．０％の濃度であるフィッシュゼラチンと、
０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．８ｍｇ／ｍｌの濃度であるウシ血清アルブミンと
を含む、組成物。
【請求項７３】
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が１：２〜２：１である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
ｄＧＴＰ濃度対デアザ−ｄＧＴＰ濃度の比が約１：１である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７５】
ＰＣＲを実施するための方法であって、
（ａ）前記請求項のいずれか一項に記載の組成物を、標的ポリヌクレオチドを含む核酸試料及び標的特異的プライマーと接触させて、反応混合物を形成する工程と、
（ｂ）前記反応混合物にＰＣＲを実施して、増幅産物を形成する工程と
を含む、方法。
【請求項７６】
（ｃ）前記増幅産物を用いて前記核酸試料の遺伝子型を決定する工程をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
（ｃ）前記増幅産物を用いて前記標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定する工程をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＰＣＲの実行時間が、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて実施された同等のＰＣＲと比較して減少する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＰＣＲがシンプレックスＰＣＲである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、請求項７５に記載の方法。
【請求項８１】
前記核酸試料が溶解物である、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
前記溶解物が、血液または口腔細胞に由来する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記核酸試料が唾液、尿、または血清に由来する、請求項７５に記載の方法。
【請求項８４】
請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、ＤＮＡ標的のＰＣＲ増幅及び検出の両方に特異的なプライマー対及び標識プローブをさらに含む、キット。
【請求項８５】
請求項６０〜６３のいずれか一項に記載の組成物を含むキットであって、コントロール核酸試料、及び前記コントロール核酸試料中のＤＮＡ標的のＰＣＲ増幅に特異的なプライマー対をさらに含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）条の下で２０１６年４月６日に出願された米国仮特許出願第６２／３１９，１５１号に基づく優先権の権益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本教示は、分子生物学、及び遺伝子解析の分野にある。本発明は、核酸の合成に有用な組成物、方法及びキットに関する。より具体的には、組成物、方法及びキットは、核酸分子、特に低コピー数を有するもの、及び／または粗溶解物のような阻害因子の存在下での増幅、検出、及び／または定量化のために提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
最も簡単な形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、反対側の鎖にハイブリダイズし、標的ＤＮＡの対象領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して特異的ＤＮＡ配列を酵素的に合成するためのインビトロの方法である。テンプレート変性、プライマーアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長を含む反復的な一連の反応ステップは、その末端がプライマーの５’末端によって規定される特異的フラグメントの指数関数的な蓄積をもたらす。ＰＣＲは、特異的ＤＮＡ配列の選択的濃縮を１０９倍に生成することができる。例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（特許文献１）、同第４，６８３，１９５号（特許文献２）、同第４，８００，１５９号（特許文献３）、及び同第４，９６５，１８８号（特許文献４）、ならびにＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０（非特許文献１）を参照されたい。
【０００４】
市販されるＰＣＲマスターミックスは、効率を改善し、ハイスループット分析に必要とされる多数のＰＣＲ反応の集合に関連するエラーを低減する。これらのマスターミックスは、すべてのＰＣＲ反応に共通するであろう試薬の組み合わせが含まれている。例えば、マスターミックスは、緩衝液、ＭｇＣｌ２などの塩、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでもよい。典型的には、マスターミックスは、濃縮溶液または凍結乾燥粉末として製造されて流通し、最終反応物が集められるときに希釈または溶解される。
【０００５】
正確な核酸解析のために、ＰＣＲマスターミックスは、信頼性があり、堅牢で、かつ再現性のあるＰＣＲ結果を提供すべきである。さらに、ＰＣＲマスターミックスは、低コピー数の標的核酸の検出を可能にすべきである。例えば、多くの医学的、診断的、及び法医学的用途は、配列が非常に少ない量で存在する試料中の特定のＤＮＡ配列の増幅に依存する。また、そのような多くの用途は、細胞または組織の粗溶解物のような粗製または未精製試料からの核酸配列の増幅に依存する。
【０００６】
したがって、粗試料調製物及び／または低量の標的を含む全ての型の核酸試料において信頼性を有しつつ実施されるＰＣＲ組成物が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献３】米国特許第４，８００，１５９号
【特許文献４】米国特許第４，９６５，１８８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０
【発明の概要】
【０００９】
概要
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる、ポリメラーゼ依存性核酸合成による核酸の合成、検出、及び／または定量化のための組成物、キット、及び方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、及びｄＮＴＰとｄＮＴＰ誘導体との組み合わせを含む組成物が本明細書において提供される。
【００１０】
ある実施形態において、本教示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びそれらの突然変異体、変異体、または誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ由来のＤＮＡポリメラーゼである。
【００１１】
ある実施形態において、本教示は、カリウム塩、マグネシウム塩、及び／またはナトリウム塩を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、塩濃度は約５ｍＭ〜約２００ｍＭである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、組成物はシリコーン系消泡剤を含む。いくつかの実施形態において、シリコーン系消泡剤は、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、消泡剤Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択される。いくつかの実施形態において、組成物は、非シリコーン系消泡剤を含む。いくつかの実施形態において、非シリコーン系消泡剤は、有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、ならびにＡｎｔｉｆｏａｍ  ２０４及びＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０を非限定的に含むポリアルキレンイミン化合物から選択される。いくつかの実施形態において、消泡剤の濃度は、約０．００１％〜０．１％である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰは、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰから選択される。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰはｄＧＴＰである。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰは、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度である
【００１４】
いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ誘導体は、７−デアザ−２−デオキシ−ＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、及びα−チオ−ｄＣＴＰから選択される。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ誘導体は７−デアザ−２−デオキシ−ＧＴＰである。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ誘導体は７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰである。いくつかの実施形態において、７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰは、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、組成物は、約１：２〜約２：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約１：２〜約１：１０の比でｄＧＴＰと７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約２：１〜約１０：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約１：１の比でｄＧＴＰと７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰを含む。
【００１６】
ある実施形態において、提供される組成物は、ＰＣＲ阻害因子遮断剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ阻害因子遮断剤はタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質は、アルブミン、ゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、組成物は、ゼラチン及び血清アルブミンを含む。ある実施形態において、ゼラチンは、ウシゼラチン、フィッシュゼラチン、及びそれらの組み合わせから選択される。ある実施形態において、ウシゼラチンは０．０１％〜１．０％の濃度であり、及び／または上記フィッシュゼラチンは０．０１％〜１．０％の濃度である。いくつかの実施形態において、血清アルブミンはウシ血清アルブミンである。ある実施形態において、ウシ血清アルブミンは、０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００１７】
ある実施形態において、提供される組成物は、界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ＴＷＥＥＮ  ８０、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５及びＢｒｉｊ  ５８からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０以外の界面活性剤である。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．００５％〜０．１％の濃度で組成物中に存在する。ある実施形態において、提供される組成物は、パッシブリファレンスコントロール色素をさらに含む。いくつかの実施形態において、パッシブリファレンスコントロール色素は蛍光色素である。いくつかの実施形態において、パッシブ蛍光パッシブリファレンス色素は、ＲＯＸ色素またはＭＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ色素である。いくつかの実施形態において、パッシブリファレンス色素は、約２５ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度である。
【００１８】
ある実施形態において、本教示は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、塩化カリウム、シリコーンを含む消泡剤、ｄＧＴＰ及び７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰを含み、７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰが約０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭの濃度、Ｔｗｅｅｎ２０以外の非イオン性界面活性剤、ウシゼラチンが０．０１％〜１．０％の濃度、フィッシュゼラチンが０．０１％〜１．０％の濃度、及びウシ血清アルブミンが０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５．０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００１９】
ある実施形態において、本教示は、核酸合成を実施する方法であって、本明細書において提供される組成物を、標的特異的プライマーと共に標的ポリヌクレオチドを含む生物学的試料と任意の順序または組み合わせで接触させて反応混合物を形成する工程と、増幅産物を形成するための反応混合物中において核酸合成を実施する工程とを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、核酸合成反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、核酸合成反応は増幅反応である。いくつかの実施形態において、核酸合成反応はプライマー伸長反応である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、増幅産物を使用して標的ポリヌクレオチドの遺伝子型を決定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、提供される方法は、増幅産物を使用して標的ポリヌクレオチドのコピー数を決定する工程をさらに含む。
【００２１】
提供される方法のいくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物または反応混合物を使用して実施されるＰＣＲの実行時間は、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて行われる同等のＰＣＲと比較して減少する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物または反応混合物を使用して実施されるＰＣＲは、標準的なＰＣＲ反応混合物を用いて行われる同等のＰＣＲと比較して、より短い期間で増幅産物を産生する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＰＣＲはシンプレックス（ｓｉｍｐｌｅｘ）ＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲである。本明細書において使用されるとき、用語「シンプレックス」または「シンプレックスＰＣＲ」は、反応容器内の単一の産物の増幅を提供するアッセイを指す。産物は異なるプライマー対を用いてプライミングされる。シンプレックス反応は、増幅産物に特異的である標識されたプローブをさらに含むことができ、プローブは、検出可能な部分、例えば蛍光色素で検出可能に標識される。本明細書で使用されるとき、用語「マルチプレックス」または「マルチプレックスＰＣＲ」は、同一の反応容器内の２つ以上の産物の同時増幅を提供するアッセイを指す。各々の産物は、異なるプライマー対を用いてプライミングされる。マルチプレックス反応は、各々の産物に特異的である標識されたプローブをさらに含むことができ、プローブは異なる検出可能な部分で検出可能に標識される。いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲは、実質的に同時に１回の反応において、（ｉ）単一の試料において複数の標的が増幅され、１つの試料中に２つ以上の標的があるもの、または（ｉｉ）複数の試料が同時に増幅され、２つの異なる試料中に２つの標的があるものを含む。
【００２３】
提供される方法のいくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液溶解物または口腔由来細胞を含む溶解物のような溶解物である。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、唾液、尿、または血清由来である。いくつかの実施形態において、溶解物は粗溶解物である。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、ＩｇＧ、ヘマチン、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数のＰＣＲ阻害因子を含む。
【００２４】
ある実施形態において、本教示は、本明細書において提供される組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、核酸合成（例えば、ＰＣＲ増幅）産物及び／またはＤＮＡ標的の検出に特異的なプライマー対及び／または標識プローブをさらに含む。
【００２５】
ある実施形態において、本教示は、本明細書において提供される組成物、コントロール核酸試料、及び核酸合成（例えば、ＰＣＲ増幅）産物及び／またはコントロール核酸試料中のＤＮＡ標的に特異的なプライマー対及び／または標識プローブを含むキットを提供する。
【００２６】
上記及びその他の特徴は、以下の図及び発明を実施するための形態によって例示される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１Ａ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図１Ｂ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図１Ｃ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図１Ｄ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図１Ｅ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図１Ｆ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図１Ｇ】本明細書において開示される組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行において増幅された口腔粘膜粗溶解物の２マイクロリットル試料についてのＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、添加された溶解溶液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ａ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ｂ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ｃ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ｄ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ｅ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ｆ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図２Ｇ】本明細書において開示された組成物の一実施形態（左上のパネル）及び市販のＰＣＲマスターミックス（右上のパネル）を用いたＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙの二重の実行で増幅された未処理の唾液の変化する試料量に関するＰＣＲサイクルの関数としたΔＲｎのグラフを示す。下のパネルは、未処理の唾液の各々の容量における両方のマスターミックスによる結果の個々のグラフを示す。
【図３】本明細書において開示された組成物の一実施形態を用いて血液粗溶解物に対して実施されるアッセイからの遺伝子型決定プロットを示す。
【図４Ａ】血液粗溶解物（左の棒）及び対応する精製ＤＮＡ試料（右の棒）を用いて実施したコピー数変動アッセイの結果のグラフである。アッセイは、本明細書において開示された組成物の一実施形態を用いて実施した。
【図４Ｂ】血液粗溶解物（左の棒）及び対応する精製ＤＮＡ試料（右の棒）を用いて実施したコピー数変動アッセイの結果のグラフである。アッセイは、本明細書において開示された組成物の一実施形態を用いて実施した。
【図５Ａ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図５Ｂ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図５Ｃ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図５Ｄ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図６Ａ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、ＳＥ−１５を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図６Ｂ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、ＳＥ−１５を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図６Ｃ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、ＳＥ−１５を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【図６Ｄ】０％〜０．１％の範囲の濃度で様々な量の消泡剤、ＳＥ−１５を含む反応混合物に関するＰＣＲサイクルの関数としたＳＹＢＲ（登録商標）緑色蛍光シグナルのグラフを示す。反応物（１０μＬ）を、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて３８４ウェルマイクロタイタープレート上で９６の重複で実行した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
いくつかの実施形態において、核酸の合成、検出及び／または定量化のための組成物、方法、及びキットが、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、プライマー伸長またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない、ポリメラーゼ媒介性核酸合成による核酸の合成、検出、及び／または定量化のための組成物、方法、及びキットが本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物は、特に有効であり、粗溶解物または粗抽出物などの粗製または未精製の核酸試料において優れた性能を示す。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される組成物は、標的核酸の検出、定量化、及び／または分析を含む広範囲のアッセイにおいて有用である。例えば、組成物は、一塩基多型（ＳＮＰ）を非限定的に含む遺伝子型決定、マイクロサテライト分析、ならびに他の変異遺伝子型決定、コピー数決定及び変動解析のため、遺伝子発現の検出、ならびに小型ＲＮＡ発現（例えば、マイクロＲＮＡ発現）の検出のためのアッセイにおいて使用できる。
【００３０】
組成物及びキットを使用する方法と同様に、組成物を含むキットも開示される。
【００３１】
一態様において、本明細書において提供されるのは、標準的なＰＣＲ装置において実行される場合に、標準的なＰＣＲ試薬混合物と比較して優れた性能感度、正確性及び特異性を示す、集められたＰＣＲマスターミックス組成物である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される集められたＰＣＲマスターミックスの使用は、標準的なＰＣＲ組成物の使用と比較して粗製または未精製試料調製物中に存在する核酸標的分子の優れた増幅、検出、及び／または定量化をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される集められたＰＣＲマスターミックスの使用は、標準的なＰＣＲマスターミックス組成物の使用と比較して試料調製物中に低コピー数で存在する核酸標的分子の優れた増幅、検出、及び／または定量化をもたらす。
【００３２】
いくつかの実施形態において、遺伝子型決定のための本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物の使用は、標準的なＰＣＲ組成物の使用と比較して改善された感度及び特異性をもたらす。いくつかの実施形態において、遺伝子発現解析のための本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物の使用は、標準的なＰＣＲ組成物の使用と比較して改善された感度をもたらす。いくつかの実施形態において、粗溶解物または未精製核酸試料を使用する遺伝子型決定または遺伝子発現解析のためのそのような集められたＰＣＲ組成物は、対応する精製核酸試料で得られる結果と同等な結果を生じる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、コピー数決定及び／またはコピー数変動解析のための本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物の使用は、標準的なＰＣＲ組成物の使用と比較して改善された感度、正確性、及び特異性をもたらす。いくつかの実施形態において、コピー数決定及び／またはコピー数変動解析のための本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物の使用は、標準的なＰＣＲ組成物の使用と比較して高いコピー数コールレート及び一致をもたらす。いくつかの実施形態において、コピー数決定及び／または解析のための本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物の使用は、標準的なＰＣＲ組成物の使用と比較してより低いコピー数範囲（最大から最小）及びヌル値を改善する。このようなコピー数変動解析の改善は、粗溶解物などの粗核酸試料または精製核酸試料を使用するときに見出される。いくつかの実施形態において、核酸試料として粗溶解物を使用するコピー数変動の解析のための本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物の使用は、対応する精製核酸試料で得られる結果と同等な結果を生じる。
【００３４】
いくつかの実施形態において、本明細書において開示された組成物を用いて構築されるＰＣＲの優れた感度は、ＦＡＳＴまたは標準的なＰＣＲ装置のいずれかにおけるＰＣＲ実行時間の低減を可能にする。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ組成物は、シンプレックスＰＣＲ及び検出反応における使用のためのものである。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ組成物は、マルチプレックスＰＣＲ及び検出反応における使用のためのものである。典型的には、マルチプレックスＰＣＲは、単一の反応から多重標的を同時に検出することにより、ランニングコスト及び試料使用量を低減する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、及びｄＮＴＰを含む集められた組成物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、及び少なくとも１種のｄＮＴＰと少なくとも１種のｄＮＴＰ誘導体との組み合わせを含む集められた組成物が本明細書において提供される。
【００３６】
いくつかの態様において、本教示の組成物は、１種以上のポリメラーゼを含む。そのようなポリメラーゼは、ＤＮＡ分子を複製することができる任意の酵素であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写のための酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、及び／または両方の型の酵素の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせ及び／またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが、本明細書において開示される組成物中に存在し得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本明細書において使用されるポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、本明細書中において使用される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、核酸合成またはＰＣＲ増幅の間に一本鎖核酸の不安定化または二本鎖核酸の変性を生じさせるために必要な時間で高温に供されるとき、不可逆的に不活性化されない。酵素の不可逆的変性は、酵素活性の実質的な消失を意味する。好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ増幅において典型的に必要とされる条件下で、約９０〜１００℃において不可逆的に変性しないであろう。
【００３８】
本教示によるＤＮＡポリメラーゼは、当該技術分野で周知の技術（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６２００号、同第ＷＯ９６／１０６４０号、米国特許第５，４５５，１７０号、同第５，９１２，１５５号及び同第５，４６６，５９１号を参照できこれらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に完全に組み込まれる）によって、天然または組換えの源から分離することができ、市販されている様々な好熱性細菌（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  Ｍｄ．）から、または組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０６４０号、及び米国特許第５，９１２，１５５号を参照できる）によって得ることができる。耐熱性ポリメラーゼ、または組換え系における発現のためのそれらの遺伝子の源としての使用に好適なものは、例えば、好熱性細菌、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の他の種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の他の種、及びＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、ならびにそれらの突然変異体、変異体または誘導体である。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される、組成物、方法、及びキットは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するそれらの突然変異体または誘導体、及び上記の任意の組み合わせからなる群より選択される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含む。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びその突然変異形態は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から市販されているか、または、これまでに記載されるように（例えば、米国特許第４，８８９，８１８号及び同第４，９６５，１８８号を参照でき、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、それらの天然の源から（例えば、Ｔａｑポリメラーゼに関して好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから）単離することができる。Ｔｎｅ  ＤＮＡポリメラーゼは、その天然の源である好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａから単離することができ（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１０６４０号及び米国特許第５，９１２，１５５号を参照できる）、Ｔｍａ  ＤＮＡポリメラーゼは、その天然の源である好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａから単離することができる（例えば、米国特許第５，���７４，５５３号を参照でき、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例示的な熱安定性ポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
しかしながら、他の生物由来のＤＮＡポリメラーゼもまた、本明細書中において、その範囲または好ましい実施形態から逸脱することなく、使用することができることを理解されたい。単離の代替として、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  Ｏｙ（Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、及びＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ  ＣＴ）から市販される。本明細書に具体的に開示されていないポリメラーゼを、その範囲または好ましい実施形態から逸脱することなく含む様々なＤＮＡポリメラーゼを、本発明の組成物、方法、及びキットにおいて使用できることを理解されたい。
【００４０】
ある実施形態において、本明細書において開示される組成物及び反応混合物中の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、１マイクロリットル当たり約０．０１〜約５００単位、１マイクロリットル当たり約０．０１〜約５０単位、１マイクロリットル当たり約０．０１〜約２５単位、１マイクロリットル当たり約０．０１〜約１０単位、１マイクロリットル当たり約０．１〜約５単位、１マイクロリットル当たり約０．１〜約２単位、１マイクロリットル当たり約０．１〜約１単位、または１マイクロリットル当たり約０．１〜約０．５単位（１マイクロリットル当たりの単位＝Ｕ／μＬ）であり、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度及び濃度範囲を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物は消泡剤を含む。本明細書で使用されるとき、消泡剤は、気体放出を促進し、例えば反応物を混合することによって生じる発泡を防止するよう作用する界面活性化学物質である。消泡剤は、泡を防止、排除、及び／または低減することができる。消泡剤は、さらに、湿潤、分散、乳化、及び可溶化などの有益な補助的な表面特性を付与することができる。いくつかの実施形態において、提供される組成物の消泡剤は、界面活性剤以外である。いくつかの実施形態において、異なる消泡剤の組み合わせが、本明細書において記載される組成物中に存在してもよい。いくつかの実施形態において、消泡剤（複数可）は、ＰＣＲ反応の感度を高めるのに有効な量で存在する。
【００４２】
アルキルポリオキシアルキレングリコールエーテル、エステル、アルコール、シロキサン、シリコーン、サルファイト、スルホネート、脂肪酸、及びその誘導体を含むがこれらに限定されない多くの化学物質を消泡剤として使用することができる。様々なそのような薬剤が知られており、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙを含む供給源より市販される。消泡剤組成物は、単に共に混合することによって組み合わせることができる単一成分または複数成分を含むことができる。いくつかの実施形態において、提供される組成物における使用のための消泡剤は、シロキサンポリマー、有機非シリコーンポリプロピレン系ポリエーテル分散物の混合物、シリコーンエマルション、非イオン性シメチコンエマルション、有機脂肪酸エステルタイプの消泡剤を非限定的に含む。例えば、周知の種類のシリコーン系消泡剤であるオルガノシロキサンは、ジメチルポリシロキサンのような純粋なシリコンオイル、及びジメチルポリシロキサンのようなポリシロキサン／ポリオキシアルキレンブロックコポリマーを含む。いくつかの実施形態において、消泡剤はシリコーン系消泡剤であり、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、消泡剤Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、消泡剤は非シリコーン系消泡剤である。非シリコーン系消泡剤の例は、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４及びＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０を含む有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、ならびにポリアルキレンイミン化合物を非限定的に含む。
【００４４】
ある実施形態において、本明細書において開示される組成物または反応混合物中に存在する消泡剤は、約０．０００５％〜約０．５％、約０．００１％〜約０．１％、０．００２％〜約０．０５％または０．００５％〜約０．０２％、または約０．０１％〜約０．０５％の濃度であり、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度及び濃度範囲を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物は、少なくとも１種のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む。ある実施形態において、組成物は、１種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）と１種以上のｄＮＴＰ誘導体との組み合わせをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、２〜８種の異なるｄＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ誘導体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、２、３、４、５、または６種の異なるｄＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ誘導体を含む。本明細書において提供される組成物、反応混合物またはキットに含まれ得るｄＮＴＰの例は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ及び／またはｄＩＴＰを含むが、これらに限定されない。可能性のあるｄＮＴＰ誘導体の例は、７−デアザ−ｄＧＴＰ（例えば、７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰ）、７−デアザ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、及び／またはα−チオ−ｄＣＴＰを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、組成物は、１種以上のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）と１種以上のｄＮＴＰ誘導体との組み合わせをさらに含み得る。ある実施形態において、組成物は、１種以上のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及び／または１種以上のｄｄＮＴＰ誘導体をさらに含み得る。ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ及びそれらの各々の誘導体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙを含む供給源から市販されている。このようなｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ及びそれらの各々の誘導体は、標識されていなくてもよいし、それらを、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、または３５Ｓ）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、またはフィコエリトリン）、化学発光標識、ジオキシゲニン（ＤＩＧ）などによって当該技術分野に既知の方法と結合することによって検出可能に標識してもよい。標識されたｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、及びそれらの各々の誘導体はまた、例えばＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から商業的に入手することができる。
【００４６】
組成物中の個々のｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、及び／またはそれらの各々の誘導体の濃度は同一である必要はない。本発明の組成物のいくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ及び／またはｄｄＮＴＰを、約０．００１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、または好ましくは約０．２ｍＭ〜約０．８ｍＭの各々のｄＮＴＰ及び／またはｄｄＮＴＰの濃度であって、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含むものを提供するよう添加することができる。ある実施形態において、組成物中の各々のｄＮＴＰ及び／またはｄｄＮＴＰの濃度は、構築されたＰＣＲにおけるその最終濃度が約０．０１５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．０５〜約２ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約０．１５ｍＭ〜約０．６５ｍＭ、約０．１５ｍＭ〜約０．３５ｍＭ、または約０．３５ｍＭ〜約０．６５ｍＭであり、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含むようにされる。本発明の組成物のいくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ誘導体及び／またはｄｄＮＴＰ誘導体を添加して、約０．００１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、または好ましくは約０．２ｍＭ〜約０．８ｍＭの各々のｄＮＴＰ誘導体及び／またはｄｄＮＴＰ誘導体の濃度であって、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含むものを提供することができる。ある実施形態において、組成物中の各々のｄＮＴＰ及び／またはｄｄＮＴＰの濃度は、構築されたＰＣＲにおけるその最終濃度が約０．０１５ｍＭ〜約５ｍＭ、約０．０５〜約２ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ、約０．１５ｍＭ〜約０．６５ｍＭ、約０．１５ｍＭ〜約０．３５ｍＭ、または約０．３５ｍＭ〜約０．６５ｍＭであり、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含むようにされる。
【００４７】
ある実施形態において、組成物は、ｄＮＴＰと対応するそれらの同一のヌクレオチドの誘導体との組み合わせ、例えば、ｄＮＴＰと、対応する同一のヌクレオチドのα−チオ−ｄＮＴＰ誘導体との組み合わせ、またはｄＮＴＰと、対応する同一のヌクレオチドのデアザ−ｄＮＴＰ誘導体との組み合わせを含む。例えば、一実施形態において、提供される組成物は、ｄＧＴＰとα−チオ−ｄＧＴＰとの両方を含む。別の実施形態において、提供される組成物は、ｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰとの両方を含む。さらに別の実施形態において、組成物は、ｄＡＴＰと７−デアザ−ｄＡＴＰとの組み合わせを含む。
【００４８】
ｄＮＴＰとそれらの誘導体との両方が組成物中に存在するとき、ｄＮＴＰの誘導体に対する相対濃度または濃度比は変動し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ：ｄＮＴＰ誘導体の相対濃度は１：１である。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度：ｄＮＴＰ誘導体濃度は、約１００：１〜約１：１、約５０：１〜約１．２：１、約２５：１〜約１．５：１、約１０：１〜約２：１である。他の実施形態において、ｄＮＴＰ濃度：ｄＮＴＰ誘導体濃度は、約１：１〜約１：１００、約１：１．２〜約１：５０、約１：２５〜約１：１．５、約１：１１０〜約１：２である。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度：ｄＮＴＰ誘導体濃度は、約２：１〜約１：２である。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度：ｄＮＴＰ誘導体濃度は、約１０：１〜約２：１である。いくつかの実施形態において、ｄＮＴＰ濃度：ｄＮＴＰ誘導体濃度は、約１：２〜約１：１０である。例えば、ある実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：α−チオ−ｄＧＴＰ濃度は、約１００：１〜約１．５：１または約５０：１〜約１２：１である。他の実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：α−チオ−ｄＧＴＰ濃度は、約１：１．５〜約１：１００または約１：１２〜約１：５０である。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：α−チオ−ｄＧＴＰ濃度は、約２：１〜約１：２である。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：α−チオ−ｄＧＴＰ濃度は、約１０：１〜約２：１である。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：α−チオ−ｄＧＴＰ濃度は、約１：２〜約１：１０である。ある実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：７−デアザ−ｄＧＴＰ濃度は、約１００：１〜約１．５：１または約５０：１〜約１２：１である。他の実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：７−デアザ−ｄＧＴＰ濃度は、約１：１．５〜約１：１００または約１：１２〜約１：５０である。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：７−デアザ−ｄＧＴＰ濃度は、約２：１〜約１：２である。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：７−デアザ−ｄＧＴＰ濃度は、約１０：１〜約２：１である。いくつかの実施形態において、ｄＧＴＰ濃度：７−デアザ−ｄＧＴＰ濃度は、約１：２〜約１：１０である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム塩、消泡剤、ならびにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、及び７−デアザ−ｄＧＴＰの組み合わせを含む集められたＰＣＲ組成物が本明細書において提供される。一実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム塩、消泡剤、ならびにｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、及び７−デアザ−ｄＡＴＰの組み合わせを含む集められたＰＣＲ組成物が本明細書において提供される。一実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、カリウム塩、消泡剤、及びｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰとの組み合わせを含む集められたＰＣＲ組成物が本明細書において提供される。一実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、カリウム塩、消泡剤、及びｄＡＴＰと７−デアザ−ｄＡＴＰとの組み合わせを含む集められたＰＣＲ組成物が本明細書において提供される。一実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム塩、消泡剤、及びｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰとの組み合わせを含む集められたＰＣＲ組成物が本明細書において提供される。一実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、マグネシウム塩、消泡剤、及びｄＡＴＰと７−デアザ−ｄＡＴＰとの組み合わせを含む集められたＰＣＲ組成物が本明細書において提供される。ある実施形態において、消泡剤はシリコーン系消泡剤である。一実施形態において、シリコーン系消泡剤は、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、消泡剤Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択される。他の実施形態において、消泡剤は非シリコーン系消泡剤である。一実施形態において、非シリコーン系消泡剤は、有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２０４及びＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０を非限定的に含むポリアルキレンイミン化合物から選択される。
【００５０】
提供される組成物はまた、１つまたは複数のＰＣＲ阻害因子遮断剤を含み得る。このようなＰＣＲ阻害因子遮断剤は、核酸調製、単離または精製に使用される生物学的試料においてしばしば見出される様々な化合物によるＰＣＲ反応の阻害を克服するのを助けるために、本明細書において開示される組成物または反応混合物に添加され得る。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ阻害因子遮断剤は、そのようなＰＣＲ阻害因子遮断剤の非存在下で観察される阻害レベルと比較して、ＰＣＲ阻害因子によるＰＣＲ阻害の量をゼロより高いパーセンテージから１００％まで減少させることができる。例えば、少なくとも約０．５％、約１％、約２％、約５％、約１０％、約２０％、約５０％、約７５％、約９０％、約９５％、もしくは約１００％、またはその間の任意のパーセンテージの阻害を減少させることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるようなＰＣＲ阻害因子遮断剤はタンパク質である。いくつかの実施形態において、このようなタンパク質は、アルブミン、ゼラチン、及びＤＮＡ結合タンパク質、またはそのペプチドもしくはポリペプチド変異体、それらの断片もしくは誘導体を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本教示での使用のための他の非タンパク質系ＰＣＲ阻害因子遮断剤は、例えば、メシル酸デフェロキサミンを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ＰＣＲ阻害因子遮断剤及び／またはタンパク質の組み合わせを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、アルブミン、ゼラチン、またはアルブミンとゼラチンとの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、アルブミンまたはゼラチンは、血清アルブミン、フィッシュゼラチン、または血清アルブミンとフィッシュゼラチンとの組み合わせから選択され得る。血清アルブミンは、任意の動物、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）由来であり得る。いくつかの実施形態において、アルブミンは、当業者に周知の動物の他の種に由来する。いくつかの実施形態において、アルブミンは、組換えＢＳＡ（ｒＢＳＡ）のような組換えアルブミンである。ゼラチンは、任意の動物、例えば、フィッシュゼラチン、ウシゼラチン由来であってもよい。いくつかの実施形態において、ゼラチンは、当業者に周知の動物の他の種に由来する。いくつかの実施形態において、ゼラチンは、組換えヒトゼラチンのような組換えゼラチンである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質は、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｔ４  ｇｐ３２）を含むことができるが、これに限定されない。
【００５２】
ある種のＰＣＲ阻害因子遮断化合物または剤を本発明の組成物に添加して、約０．０００１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約８ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約６ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの濃度であって、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含む組成物中の濃度を提供することができる。あるＰＣＲ阻害因子遮断剤はまた、例えば、約０．００１％〜約１５％、約０．０５％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、または約０．１％〜約１％であって、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含む組成物の最終濃度のパーセンテージとして添加することができる。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、ＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質、例えばアルブミンを、構築されたＰＣＲにおけるその濃度が約０．００１ｍｇ／ｍＬ〜約１０．０ｍｇ／ｍＬ、０．００５ｍｇ／ｍＬ〜約５．０ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約４．０ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約３．０ｍｇ／ｍＬ、または約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２．０ｍｇ／ｍＬであって、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含むようにされるような濃度で含むことができる。別の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、ＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質、例えばゼラチンを、構築されたＰＣＲにおけるその濃度が約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１．０％（ｗ／ｖ）、より具体的には約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）であって、上記のいずれかの範囲内のすべての濃度または濃度範囲を含むようにされるような濃度で含むことができる。さらに別の実施形態において、本明細書において記載される組成物は、上記の濃度のいずれかでアルブミンとゼラチンとの組み合わせを含む。いくつかの好ましい実施形態において、アルブミンは約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬであり、ゼラチンは約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）の濃度である。いくつかの実施形態において、アルブミンはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、ゼラチンはフィッシュゼラチン及び／またはウシゼラチンである。
【００５３】
いくつかの実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５またはそれ以上の異なるＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質及び／または剤を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、組成物は、アルブミン、フィッシュゼラチン、及びウシゼラチンを含む。いくつかの実施形態において、各々のＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質及び／または剤の濃度は同一である。いくつかの実施形態において、各々のＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質及び／または剤の濃度は異なる。いくつかの実施形態において、生物学的試料中にしばしば見出される様々な阻害因子によるＰＣＲの阻害を克服するのを助けるために、組成物または反応混合物に１つまたは複数のＰＣＲ阻害因子遮断剤を添加し、そのような阻害因子は、例えばヘパリン（血液）、ヘマチン（血液）、ＥＤＴＡ（血液）、クエン酸塩（血液）、免疫グロブリンＧ（血液、血清）、フミン酸（土壌、糞便）、ラクトフェリン（乳、唾液、他の分泌液）、尿素（尿）、植物多糖（植物）、メラニン（皮膚、毛髪）、ミオグロビン（組織）、及びインジゴ染料（布地）を含む。個々にまたは組み合わせて、ＰＣＲ阻害因子遮断剤を添加することにより、そのようなＰＣＲ阻害因子の混入物質に対する耐性を高めることができる。したがって、本発明の組成物は、例えば、フミン酸、ヘマチン、及びヘパリンを含む様々なＰＣＲ阻害因子に対する耐性を増加させるために、単独でまたは組み合わせて作用する剤をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物または反応混合物中の各々のＰＣＲ阻害因子遮断剤またはタンパク質は、組成物または反応混合物中の他のＰＣＲ阻害因子遮断剤またはタンパク質とは異なる阻害因子または阻害因子群を遮断することができる。いくつかの実施形態において、組成物または反応混合物中の異なるＰＣＲ阻害因子遮断剤またはタンパク質は、同一の阻害因子または阻害因子群を遮断することができる。いくつかの実施形態において、組成物または反応混合物中の異なるＰＣＲ阻害因子遮断剤またはタンパク質は、阻害因子群の重複する数の阻害因子を遮断することができる。例えば、いくつかの実施形態において、ゼラチンは、少なくともフミン酸及びヘパリンによるＰＣＲ阻害を低減するのに有効であり、アルブミンは、少なくともフミン酸及びヘマチンによるＰＣＲ阻害を低減するのに有効である。
【００５４】
本教示によれば、本明細書において提供される組成物は、核酸テンプレート（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の全部または一部に相補的なＤＮＡ分子（例えば、一本鎖ｃＤＮＡ分子または二本鎖ｃＤＮＡ分子）の合成を促進する一つ以上のプライマーを含むことができる。さらに、これらのプライマーは、本教示による核酸分子の増幅に使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、２ヌクレオチド長以上（例えば、２、３、４、５、８、１０、１５、２０、２５など）の任意のオリゴヌクレオチドであり得る。そのようなプライマーは、標的特異的プライマー（好ましくは遺伝子特異的プライマーである）、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムプライマー、または任意プライマーを含むが、これらに限定されない。本明細書に開示された方法によるＤＮＡ分子の増幅のために使用できるさらなるプライマーは、当業者には明らかであろう。本明細書に具体的に開示されていないものを、その範囲または好ましい実施形態から逸脱することなく含む無数のプライマーが、本発明の組成物、方法、及びキットにおいて有用であり得ることを理解されたい。
【００５５】
いくつかの実施形態において、プライマーの最終濃度は、約２５ｎＭ〜約２０００ｎＭ、例えば約５０ｎＭ〜約１７００ｎＭ、約７５ｎＭ〜約１５００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、またはその間の任意の範囲であり得る。いくつかの例示的な実施形態において、各々のプライマーの濃度は、約４００ｎＭ〜約９００ｎＭであって、その間のすべての量または範囲を含む。
【００５６】
本教示によれば、組成物は、標的核酸の検出のためのプローブをさらに含み得る。様々なプローブが当該技術分野において既知であり、例えば（ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（例えば、米国特許第５，５３８，８４８号を参照）、様々なステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号及び同第５，９２５，５１７号ならびにＴｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，  １９９６，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８を参照）、ステムレスまたは線状ビーコン（例えばＷＯ９９／２１８８１を参照）、ＰＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ（商標）（例えば米国特許第６，３５５，４２１号及び同第６，５９３，０９１号を参照）、線状ＰＮＡビーコン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＳＰＩＥ  ４２６４：５３−５８を参照）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）／Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号）、ステムループ及びデュープレックスＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブ（例えば、Ｓｏｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：Ｅ９６及び米国特許第６，５８９，７４３号を参照）、バルジループプローブ（例えば、米国特許第６，５９０，０９１号を参照）、シュードノットプローブ（例えば、米国特許第６，５８９，２５０号を参照）、サイクリコン（例えば、米国特許第６，３８３，７５２号を参照）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ヘアピンプローブ（例えば米国特許第６，５９６，４９０号を参照）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）ライトアッププローブ、自己組織化ナノ粒子プローブ、及びフェロセン修飾プローブ、例えば、米国特許第６，４８５，９０１号、Ｍｈｌａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４６３−４７１；  Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７：８０４−８０７、Ｉｓａｃｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ．１４：３２１−３２８、Ｓｖａｎｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８１：２６−３５、Ｗｏｌｆｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７６６：７６９−７７１、Ｔｓｏｕｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４２０８−４２１５、Ｒｉｃｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４０８８−４０９３、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２  Ｓｈａｎｇｈａｉ．３４：３２９−３３２、Ｍａｘｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９６０６−９６１２、Ｂｒｏｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：２４９−５６、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．  １５：１１８−１２６、及びＹｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  １４：１１１５５−１１１６１に記���されるようなものである。プローブは、例えば６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）またはテトラクロロフルオレッセン（ＴＥＴ）などのレポーター色素を含むことができる。検出プローブはまた、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、アイオワブラック（ＩＤＴ）、ＱＳＹクエンチャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＤａｂｓｙｌ  ａｎｄ  Ｄａｂｃｅｌスルホネート／カルボキシレートクエンチャー（Ｅｐｏｃｈ）などのクエンチャー部分も含み得る。プローブは、２つのプローブを含むことができ、例えば、蛍光体が一方のプローブ上にあり、クエンチャーが他方の上にあり、標的上の２つのプローブのハイブリダイゼーションが共にシグナルを消光させるか、または標的上のハイブリダイゼーションが、蛍光の変化を介してシグナル特性を変化させる。
【００５７】
例示的な検出可能な標識は、例えば、蛍光色素または蛍光体（例えば、光によって励起され、蛍光または燐光を放出し得る化学基）、蛍光ドナー色素から蛍光シグナルを消光することができる「アクセプター色素」などを含む。好適な検出可能な標識は、例えばフルオレセイン（例えば、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、６−ＨＡＴ、６−ＪＯＥ、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ蛍光体（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）フルオロフォア（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０−Ｘ、６５０／６６５−Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−セラミド、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ）、クマリン（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＡＢＱ、ＣＰＭメチルクマリン、クマリンファロイジン、ヒドロキシクマリン、ＣＭＦＤＡ、メトキシクマリン）、カルセイン、カルセインＡＭ、カルセインブルー、カルシウム染料（例えば、カルシウムクリンソン、カルシウムグリーン、カルシウムオレンジ、カルコフルオルホワイト）、カスケードブルー、カスケードイエロー、Ｃｙ（商標）色素（例えば、３、３．１８、３．５、５、５．１８、５．５、７）、シアンＧＦＰ、サイクリックＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質（例えばＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）ＦＲＥＴドナー／アクセプター対（例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ダブシル、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ７及びＱＳＹ９）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ及びＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（例えば、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ  ＤＰＸ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＨＣＫ−１２３、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６７、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１８９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１５３、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  １０，０００  Ｍ���デキストラン）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（例えば、４８８，  ４８８−Ｘ、５００、５１４）、ローダミン（例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ  ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂ  ｅｘｔｒａ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ＲｈｏｄａｍｉｎｅＢ、Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎｅ、Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄ−２，  ５−ＲＯＸ（ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｃａｎ  Ｃ、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇ  Ｅｘｔｒａ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ  （ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＶＩＣ、ならびに例えば、米国特許公開第２００９／０１９７２５４号に記載される他の標識を含んでもよく、当業者に知られている他のものの中から選択することができる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、プローブは、例えば、米国特許第６，７２７，３５６号に開示されている方法及び原理に従って設計される（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかのプローブは配列に基づくものであり得、例えば５’ヌクレアーゼプローブであり、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどの一部は非配列特異的ＤＮＡ結合色素であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、検出プローブはＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）である。本明細書に具体的に開示されていないものを含む、本発明の組成物、方法、及びキットにおいて使用され得る、広範な種類のプローブが当該技術分野において既知であることを理解されたい。
【００５９】
いくつかの実施形態において、作業溶液中のプローブ濃度は、約５ｎＭ〜約７５０ｎＭ、例えば約１０ｎＭ〜約６００ｎＭ、約２５ｎＭ〜約５００ｎＭ、約５０ｎＭ〜約４００ｎＭ、約７５ｎＭ〜約３００ｎＭ、またはその間の任意の数の範囲であり得る。いくつかの例示的な実施形態において、各々のプローブの濃度は、約１００ｎＭ〜約２５０ｎＭであり、その間の全ての量または範囲を含む。
【００６０】
本教示によれば、核酸テンプレートからの核酸の合成を最適化するために、本発明の組成物、方法、及びキット中に１つまたは複数の追加の成分及び／または添加物を組み込むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、核酸合成反応を促進または増強することができる追加の成分及び／または添加剤（例えば、ＰＣＲを促進または増強するための試薬）を含み得る。核酸合成を増強する成分及び／または添加剤は、有機または無機の化合物であり得る。本発明の組成物、方法、及びキットに有用ないくつかの成分及び／または添加剤は、ポリペプチド及び非ポリペプチド成分を含む。そのような成分及び／または添加剤は、ほんの数例を挙げると、例えば、一本鎖結合ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質、硫黄含有化合物、アセテート含有化合物、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、エクトイン、アジ化ナトリウム、カトン、ポリオール、ＮａＮ３、緩衝液、界面活性剤、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ  ２０、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｉｎ  Ｘ−１００、及びＣＨＡＰＳ）、ホットスタートＰＣＲにおいて使用される成分または化合物、定量的リアルタイムＤＮＡ検出アッセイにおけるサンプル間及び／またはウェル間の変動を最小化するためのパッシブリファレンスコントロール、ならびに／またはウラシルＤＮＡグリコシラーゼを含むが、これらに限定されない。組成物は、Ｆｉｃｏｌｌ  ７０、グリコーゲン、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような密集剤をさらに含み得る。当業者は、本発明の組成物、方法、及びキットに従って使用するための追加の試薬及び／または添加物を同定することができるであろう。
【００６１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物またはキットは、グリセロールを含み得る。いくつかの実施形態において、グリセロールは、その濃度が約５〜約５０％（ｗ／ｖ）、または約１０％（ｗ／ｖ）〜約３０％（ｗ／ｖ）であって、上記の量のいずれかの間の全ての濃度または濃度範囲を含むものとなるような濃度で組成物中に存在する。
【００６２】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物またはキットは、ＮａＮ３を含み得る。いくつかの実施形態において、ＮａＮ３は、その濃度が約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約０．０５％（ｗ／ｖ）、または約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）となるような濃度で組成物中に存在する。
【００６３】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物またはキットは、界面活性剤または界面活性剤の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、ＰＣＲ反応の感度を高めるのに有効な量で存在する。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、及び／または非イオン性界面活性剤であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤は、非限定的に、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、ＴＷＥＥＮ  ２０、ＴＷＥＥＮ  ８０、Ｂｒｉｊ  ３０、Ｂｒｉｊ  ３５、及び／またはＢｒｉｊ  ５８であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、ＴＷＥＥＮ２０などの任意の非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物はＴＷＥＥＮ  ２０以外の非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物はＴＷＥＥＮ  ２０を含まず、検出可能なＴＷＥＥＮ  ２０を含まない。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物は、ＰＣＲ反応の感度を高めるのに有効な量で存在する、ＴＷＥＥＮ２０以外の非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、組成物はＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（登録商標）を含む。いくつかの実施形態において、組成物はＮＰ−４０を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、Ｂｒｉｊ３０、Ｂｒｉｊ３５、またはＢｒｉｊ５８を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、上記の界面活性剤の任意の組み合わせを含む。界面活性剤は、約０．００１％〜約０．５０％（ｗ／ｖ）、約０．００５（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）、または約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．０５％（ｗ／ｖ）であって、上記の量のいずれかの間の全ての濃度または濃度範囲を含む濃度で組成物中に存在し得る。
【００６４】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物、反応混合物、またはキットは、緩衝化塩溶液などの緩衝成分を含むことができる。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の安定性を維持するための適切なｐＨ条件を提供する。本明細書において使用されるとき、用語「安定な」及び「安定性」は、一般に、酵素または酵素を含む組成物が、およそ室温の温度（例えば約２０℃〜約２５℃）で約３日間、約４℃の温度で約１〜８週間、約−２０℃の温度で約２〜６ヶ月、及び約−８０℃の温度で約６ヶ月以上保存された後で、酵素組成物のような組成物によって元の酵素活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、及び最も好ましくは少なくとも９０％が保持されることを意味する。そのような緩衝剤の例は、例えば、ＴＲＩＳ、ＴＲＩＣＩＮＥ、ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ  ＴＡＰＳ、ＰＩＰＥＳ、及びＣＡＰＳを含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される組成物及び／または反応混合物の緩衝液濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、及び約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの間であり、上記の量の範囲内のいずれかの濃度または範囲を含む。本明細書に具体的に開示されていないものを含む、本発明の組成物、方法、及びキットにおいて使用され得る、広範な種類の緩衝液（または緩衝塩）が当該技術分野において既知であることを理解されたい。
【００６５】
本明細書において提供される組成物に含めるのに好適な塩の例は、非限定的に、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムを含む。ある実施形態において、組成物は、１種超（例えば、２種、３種、４種、５種、６種など）の塩成分を含む。例えば、本明細書において記載される組成物は、２種の異なる塩を含むことができる。他の実施形態において、組成物は３種の異なる塩を含む。さらに他の実施形態において、組成物は４種の異なる塩を含む。一実施形態において、組成物は、約０．５ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及び約２ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度であって上記の範囲の範囲内のいずれかの濃度または範囲を含む濃度で特定の塩を含む。非限定的に、組成物が塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及び／または酢酸アンモニウムなどの塩を含むある実施形態において、組成物は、構築されたＰＣＲにおいて、約５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、５ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１２０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約９０ｍＭ、または約４０〜約８０ｍＭであって、上記の範囲の範囲内のいずれかの濃度または範囲を含むものとなるような濃度になるように、塩を含む。非限定的に、組成物が酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、または硫酸マンガンのような塩を含むある実施形態において、組成物は、構築されたＰＣＲにおいて、約０．５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約７５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約２ｍＭ〜約３０ｍＭ、約３ｍＭ〜約１５ｍＭ、約４ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約１ｍＭ〜約５ｍＭであって、上記の範囲の範囲内のいずれかの濃度または範囲を含むものとなるような濃度になるように、塩を含む。本明細書に具体的に開示されていないものを含む、本発明の組成物、方法、及びキットに従って使用され得る、広範な種類の塩または塩溶液が当該技術分野において既知であることを理解されたい。
【００６６】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物またはキットは、パッシブリファレンスコントロール成分を含み得る。いくつかの実施形態において、パッシブリファレンスコントロールは、定量的リアルタイム核酸検出アッセイにおける試料間及び／またはウェル間の変動を最小にし、かつ／または検出可能なコントロールとしてのその使用を可能にする濃度で含むことができる。一実施形態において、パッシブリファレンスコントロールとして、リファレンス発色団、特にフルオロフォアが含まれる。一実施形態において、リファレンス発色団は蛍光色素である。いくつかの実施形態において、蛍光色素はＲＯＸ色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。いくつかの実施形態において、蛍光色素はＭＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ染料（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。パッシブリファレンスは、構築されたＰＣＲ中のその濃度が約１０〜約７５０ｎＭ、または約２０ｎＭ〜約５００ｎＭ、または約５０ｎＭ〜約２００ｎＭであって、上記の範囲の範囲内のいずれかの濃度を含むものとなるような濃度になるように、組成物中に含まれ得る。
【００６７】
いくつかの態様において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧまたはＵＤＧ）は、本明細書において提供される組成物またはキットに含まれ得る。酵素は、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、またはＵＳＢのような多くの商業的供給源から市販されている。いくつかの実施形態において、ＵＮＧは熱不安定性である。他の実施形態において、ＵＮＧは熱安定性である。熱不安定性または熱安定性のＵＮＧは、最終的に構築されるＰＣＲにおけるその濃度が約０．０００１Ｕ／μＬ〜約５０Ｕ／μＬ、約０．０００５Ｕ／μＬ〜約１０Ｕ／μＬ、約０．００１Ｕ／μＬ〜約５Ｕ／μＬ、０．００５Ｕ／μＬ〜約１．０Ｕ／μＬ、または０．０１Ｕ／μＬ〜約０．５Ｕ／μＬ（Ｕ／μＬ＝１マイクロリットル当たりの単位）であって、上記の範囲の範囲内のいずれかの濃度または範囲を含むものとなるような濃度で、組成物中に含まれ得る。
【００６８】
ＰＣＲプロセスの間に起こり得る望ましくない増幅反応は、通常、反応混合物を集める最中に、またはサーマルサイクラーが最初の変性温度まで加熱している間に開始する。これらの偽反応は、「ホットスタート」増幅を実施することによって最小化することができる。一般に、ホットスタート技術は、しばしば６０℃を超える高温に達するまで、必須の反応成分の利用可能性を制限する。
【００６９】
本教示による組成物、キット、及び方法は、非特異的な核酸合成をさらに防止、低減または排除するための手段として、「ホットスタート」メカニズム、成分、またはステップを含むことができる。手動の技術、障壁、可逆的ポリメラーゼ不活性化、及び特別に設計されたヘアピンプライマーを含む、ホットスタート反応を実施するためのいくつかの方法が存在する。いくつかの実施形態において、ＰＣＲにおけるようなホットスタート反応に使用される成分または化合物は、アニーリング段階中のようなより低い温度でポリメラーゼ活性を不活性化することによってＤＮＡの非特異的増幅を防止し、一方で伸長段階などのより高い温度でポリメラーゼ活性の再活性化または活性化を可能にするものの任意のものであり得る。ホットスタート成分のこのような例は、抗体、化学修飾（例えば、ポリメラーゼの）、オリゴヌクレオチド、アプタマー、特別に設計されたプライマー、結合タンパク質、及び／または隔離ワックスビーズを挙げることができるが、これらに限定されない。ホットスタートＰＣＲのためのワックスビーズは市販されており、例えば、ＨｏｔＳｔａｒｔ（商標）Ｓｔｏｒａｇｅ反応チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）がある。好適なホットスタートアプタマーの選択は、当該技術分野において既知の方法によって実施することができるか、または市販のホットスタートアプタマーを使用することができる。同様に、好適なホットスタートヘアピンプライマーの選択は、当該技術分野において既知の方法によって実施することができるか、または市販のホットスタートプライマーを使用することができる。ホットスタートＰＣＲのための抗体は、当該技術分野で既知の様々な方法によって生成または選択することができる。代替的に、市販の抗体、例えば、天然、組換え、及びＮ末端欠失変異体を含む任意のＴａｑ由来ＤＮＡポリメラーゼについて有効であるＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することができる。場合によっては、好適なホットスタートプライマーは、サイクリング温度がそれらを変性させて広げるまでプライマーがアニーリングするのを防ぐ二次構造（例えば、ヘアピンプライマー）を有するように特別に設計されたプライマーであり得る。集められた反応混合物中のホットスタートＰＣＲのための化合物または試薬の適切な濃度は、当該技術分野において既知の多数の方法によって、または市販製品については、製造者による示唆によって決定することができる。ホットスタートメカニズム、成分、またはステップのいくつかは、以下でより詳細に説明されている。
【００７０】
一般的には、手動のホットスタート法は、常にそうとは限らないが、反応物が加熱されるまで、通常はマグネシウムまたはポリメラーゼである重要な成分を研究者が保留することを必要とする。次いで、保留された成分を添加して反応を開始させる。第２の方法は、物理的障壁（例えば、ワックス）を使用して、重要な成分をテンプレート及びプライマーから分離する。米国特許第５，５６５，３３９号は、ワックスバリヤーを使用して、試験管中で様々なＰＣＲ試薬を互いに分離することを記載している。米国特許第５，４１３，９２４号は、ＤＮＡポリメラーゼを隔離するためにパラフィンワックスビーズを使用することを記載している。
【００７１】
ホットスタート増幅の別の方法は、可逆的ポリメラーゼ不活性化である。ポリメラーゼは、ポリメラーゼのヌクレオチド結合ドメインに結合する抗体またはオリゴヌクレオチドアプタマーと反応し、ポリメラーゼを不活性にする。例えば、Ｔａｑポリメラーゼに対するモノクローナル抗体、例えば、Ｓｉｇｍａから入手可能な抗Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体を、反応混合物に導入する。加熱の際、化合物はポリメラーゼから解離し、酵素活性を回復する。別の例において、米国特許第５，６７７，１５２号は、ＤＮＡポリメラーゼが化学的に修飾されて、それが高温でのみ活性になることを確実にする方法を記載している。
【００７２】
ホットスタート増幅を達成するための別のアプローチは、自己アニールして特定のヘアピン構造を形成するプライマーを設計することである。ヘアピンプライマーは、ヘアピン立体配座において標的核酸にアニーリングすることはできない。ヘアピンプライマーは、変性温度に加熱されるまで、ヘアピン立体配座のままである。しかしながら、ヘアピン構造が一本鎖伸長を含む場合、ヘアピン構造自体は鋳型にアニーリングされたプライマーに類似し、鎖伸長をもたらし得る。
【００７３】
上述のものに加えて、様々な他のホットスタート成分またはメカニズムもまた、当業者に周知であり、本教示に従って機能する能力に基づいて容易に選択可能である。ある実施形態において、組成物、反応混合物、キット、及び方法は、第１の条件下（例えばより低い温度）で核酸ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を阻害または実質的に阻害するために使用され、第２の条件下（例えばより高い温度）でポリメラーゼ活性化を可能にするような、少なくとも２つのホットスタートメカニズム、成分、または段階を含んで提供される。このようなホットスタートメカニズムは、より低い温度においてＤＮＡポリメラーゼ活性を遮断する抗体または抗体の組み合わせ、より低い温度においてＤＮＡポリメラーゼ活性を遮断するオリゴヌクレオチド、高温において解離するＤＮＡポリメラーゼの可逆的化学修飾、より低い温度において低減した活性をもたらすＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸修飾、超安定なＤＮＡ結合ドメイン及びトポイソメラーゼを含む融合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する温度依存性リガンド、より低い温度においてプライマーを隔離する一本鎖結合タンパク質、改変プライマー、または改変ｄＮＴＰを含むが、上記のこれらに限定されない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、組成物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ阻害因子遮断剤の組み合わせ、緩衝液、ホットスタート成分、グリセロール、非イオン性界面活性剤、及びパッシブリファレンス色素を含む。他の実施形態において、組成物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、カリウム塩、マグネシウム塩、ソリコーン系消泡剤、ｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ誘導体の組み合わせを含むｄＮＴＰ、アルブミン、フィッシュゼラチン、緩衝液、ホットスタート成分、グリセロール、ＴＷＥＥＮ  ２０以外の非イオン性洗剤、及びパッシブリファレンス色素を含む。成分は、当業者によって決定されるように、置換または変更されてもよい。当該技術分野において既知である広範な種類の追加の成分が、本明細書に具体的に開示されていないものを含み、本発明の組成物、方法、及びキットにおいて有用であり得ることを理解されたい。当業者はまた、本教示に従って各々の成分の最適な使用のための特定の条件または濃度を決定するために必要な方法を理解するであろう。
【００７５】
一態様において、組成物は、濃縮ストック溶液または混合物として提供され得る。本明細書で使用されるとき、用語「濃縮ストック」は、特定の機能（例えばＰＣＲ増幅）を実施するための溶液中で使用のための最適濃度を達成するために、さらなる希釈が必要な濃度にあることを意味する。例えば、組成物は、約２×、約３×、約４×、約５×、約６×、約１０×などであって上記のいずれかの間の任意の量を含むストック溶液であり得る。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば核酸合成または増幅方法における使用のための、作業濃度または最適な濃度とするために、２×超、３×超、４×超、５×超、６×超、１０×超などであって上記のいずれかの間の任意の量を含むものの希釈を必要とし得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、作業濃度で、または「作業溶液または混合物」として提供することもできる。本明細書において使用されるとき、「作業濃度」または「作業溶液または混合物」は、特定の作用または反応（増幅またはＰＣＲなど）を実施するために使用される最適濃度またはそれに近い濃度である溶液または混合物を指すために使用される。いくつかの実施形態において、使用濃度である組成物は、使用前に希釈を必要としないか、または最小限の希釈を必要とする。例えば、いくつかの実施形態において、作業濃度である組成物は、集められた反応混合物における最終濃度の約１×、約１．２５×、約１．５×、約１．８×、約２×、または約２．２×の濃度である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本教示の組成物は、マスターミックスとして配合され得る。マスターミックスは、効率を改善し得、ハイスループット分析に必要とされる多数の反応の集合に関連するエラーを低減し得る。いくつかの実施形態において、マスターミックスは、すべての反応に共通の試薬の組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、マスターミックスは、緩衝液、塩、例えばＭｇＣｌ２、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、界面活性剤、及びＰＣＲ阻害因子遮断剤を含むことができる。したがって、あるアッセイにおける使用のために、各々の反応は、共通のマスターミックスのアリコートならびに特異的な標的核酸テンプレート及び少なくとも１つのプライマーを含む。いくつかの実施形態において、マスターミックスは、濃縮ストック溶液または混合物として製造及び流通することができる。マスターミックスは、最後の反応が構築されるときに希釈することができる。他の実施形態において、マスターミックスは、作業溶液または混合物として製造及び流通することができる。
【００７７】
いくつかの態様において、本発明はまた、反応混合物である組成物に関する。本明細書中で使用されるとき、「反応混合物」は、共に反応を引き起こすことができる２つ以上の物質の混合物を指し、または２つ以上の物質の混合物が化学的変換または変化を引き起こすことができるものを指す。いくつかの実施形態において、反応混合物は、（ａ）少なくとも１種のポリメラーゼ、（ｂ）少なくとも１種のＰＣＲ阻害因子遮断剤、（ｃ）少なくとも１種の界面活性剤、（ｄ）少なくとも１種の消泡剤、（ｅ）少なくとも１種の塩、（ｆ）緩衝液、（ｇ）少なくとも１種のｄＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ誘導体、（ｈ）少なくとも１つのプライマー、（ｉ）及び核酸試料を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物は、標識プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、反応混合物のポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、反応混合物の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、反応混合物のＰＣＲ阻害因子遮断剤はタンパク質である。いくつかの実施形態において、反応混合物のＰＣＲ阻害因子遮断タンパク質は、アルブミン、ゼラチン、またはアルブミンとゼラチンとの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、反応混合物の界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態において、反応混合物の非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０以外の非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態において、反応混合物の消泡剤はシリコーン系剤である。いくつかの実施形態において、反応混合物のシリコーン系剤は、ＸＩＡＭＥＴＥＲ（登録商標）ＡＦＥ−１０１０、ＡＦＥ−１４３０、ＡＦＥ−１５１０、ＡＦＥ−１５２０、ＡＦＥ−２２１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ａ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｂ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｃ、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｈ−１０、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−３５、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＯ−２５、消泡剤Ｙ−３０、及びＡｎｔｉｆｏａｍ  ２８９から選択される。いくつかの他の実施形態において、反応混合物の消泡剤は非シリコーン系剤である。いくつかの実施形態において、反応混合物の非シリコーン系剤は、有機スルホネート、ポリエーテル、有機ホスフェート、アセチレングリコール、フルオロカーボン、ポリアルケンポリアミン、ならびにＡｎｔｉｆｏａｍ  ２０４及びＡｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−３０を非限定的に含むポリアルキレンイミン化合物から選択される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、反応混合物のｄＮＴＰは、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰから選択される。いくつかの実施形態において、反応混合物のｄＮＴＰ誘導体は、７−デアザ−ｄＧＴＰ（例えば７−デアザ−２−デオキシ−ｄＧＴＰ）、７−デアザ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ、α−チオ−ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＧＴＰ、及びα−チオ−ｄＣＴＰから選択される。いくつかの実施形態において、反応混合物は、上記のｄＮＴＰとｄＮＴＰ誘導体とのいくつかの組み合わせを含むｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ誘導体混合物を含む。いくつかの実施形態において、反応混合物の核酸テンプレートは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、反応混合物中のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）または相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、組成物を保持することができ、組成物の成分と大きく相互作用しない好適な容器に詰めることができる。容器は、個人または液体ハンドリング装置によって剤形を容易に分配できるように設計された容器であり得る。組成物の容器は、マルチパック単位にさらに詰めることができる。いくつかの実施形態において、マルチパックユニットは、ＰＣＲ中のような反応混合物中での使用の前に、組成物に添加される添加剤または他の試薬を含む追加の容器をさらに含み得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、水和溶液などの液体形態であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、ゲル形態であり得る。本明細書において使用されるとき、「ゲル」は、−２０℃において固体でなく、凍結もしない組成物である。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される組成物は、凍結乾燥組成物などの脱水または乾燥形態であり得る。
【００８１】
組成物または組成物を含む詰められた容器を含むキットもまた、本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、組成物は、核酸合成または増幅反応における使用のためのキットに集めることができる。キットは、核酸を合成、検出または定量化するために使用される１つまたは複数のアッセイにおいて使用される追加の試薬をさらに含むことができる。一実施形態において、組成物は、ＰＣＲ中のような核酸分子の増幅における使用のためのキット中に存在し得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、キットは、バイアル、チューブ、アンプル、プレート、ボトルなどの容器を中に閉じ込めて収容する箱、カートン、チューブなどのようなキャリアを含む。１種以上の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ及びＵＮＧ）がキットに含まれるとき、酵素は、２つ以上（例えば、２、３、４、５など）の酵素の混合物として単一の容器、または別個の容器中にあってもよい。本発明のキットは、塩溶液、消泡剤、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ誘導体の混合物または混合物、プローブ及び／またはプライマーを（同一または別個の容器中に）含むこともできる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、ｄＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ誘導体の混合物または混合物、及び緩衝液を単一のチューブまたは容器中で混合する。
【００８３】
別の態様において、キットは、核酸合成または増幅反応における使用のためのマスターミックス組成物を含み得る。このような組成物は、濃縮ストック（例えば、２×、３×、４×、５×、６×など）として配合することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、及びｄＮＴＰを含む単一のチューブまたは容器中に濃縮ストックとして配合され得る。いくつかの実施形態において、このような濃縮ストック組成物は、緩衝溶液中の、ＰＣＲ阻害因子遮断剤、ＴＷＥＥＮ２０以外の非イオン性界面活性剤、ホットスタート成分、及び／またはパッシブリファレンス色素の組み合わせをさらに含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、そのような緩衝液は、グリセロール、ＤＭＳＯ、及び／または第２の塩を含み得る。
【００８４】
一実施形態において、キットは、組成物またはマスターミックスに加えて、核酸標的のＰＣＲ増幅に特異的な少なくとも１つのプライマー対、及び／または増幅された核酸標的に特異的な少なくとも１つのプローブをさらに含むことができる。例えば、プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、ＨｙｄｒｏｌＥａｓｙ（商標）プローブ、マイナーグルーブ結合（ＭＧＢ）プローブ、ロック核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎまたはＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）プローブ、またはサイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）プローブであり得る。
【００８５】
別の実施形態において、キットは、コントロール核酸試料、ならびにコントロール核酸試料中の核酸標的のＰＣＲ増幅に特異的な少なくとも１つのプライマー対、及び／またはコントロール核酸試料中の増幅された核酸標的に特異的な少なくとも１つのプローブをさらに含むことができる。増幅を検出するためのプローブもキットに含めることができる。
【００８６】
組成物以外のキットの成分は、別個の容器中で提供できるか、または必要に応じて単一の容器中で提供できる。いくつかの実施形態において、キットを有利に使用するための説明書、マニュアル、及び／またはプロトコールを提供することができる。多くのアッセイは、開示された組成物及び反応混合物を使用して標的核酸を合成する際の使用に好適であり、当業者に理解されるように本明細書においてそれが意図される。
【００８７】
記載された組成物及びキットを使用する方法も本明細書に開示される。本明細書において提供される組成物、反応混合物、及びキットは、核酸標的を検出、定量化、及び／または分析するための様々な核酸合成に基づくアッセイにおいて使用することができる。いくつかの実施形態において、このようなアッセイは、本明細書において提供される組成物のいずれかを核酸試料及び１つまたは複数のプライマーと混合し、前記アッセイを実施することを含む。ある実施形態において、方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる核酸増幅を含む。
【００８８】
ある態様において、本明細書において提供される方法はまた、核酸の検出のための加水分解プローブを使用することができる。加水分解プローブは、いくつかのポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。ＰＣＲ反応の伸長または伸長段階の間、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼは、結合部位として上流プライマーを使用し、次に伸長する。加水分解プローブは、ポリメラーゼ伸長中に、ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性によって、その５’末端で切断される。
【００８９】
用語「上流」及び「下流」は、本明細書において、標的特異的プライマーによってプライミングされる新生鎖の合成に関して使用される。したがって、例えば、標的核酸の、プライマーがハイブリダイズする領域の「下流」にある標的核酸の領域にハイブリダイズした標的特異的プローブは、プライマーの３’に位置し、５’から３’の方向にプライマーを伸長させるポリメラーゼの経路にあるであろう。
【００９０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１０，０１５号を参照）は、加水分解プローブに基づいたアッセイの例である。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイにおいては、加水分解プローブは、典型的には、５’末端にレポーター、３’末端にクエンチャーで標識される。レポーターとクエンチャーが同一のプローブに固定されているとき、それらはごく近接した状態にとどまる。この近接は、プローブが標的配列にハイブリダイズするとき、レポーターシグナルを効果的に消光する。加水分解プローブは、ポリメラーゼ伸長中に、Ｔａｑの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって５’末端で切断される。これが起こるとき、レポーターフルオロフォアはプローブから放出され、その後、もはやクエンチャーにごく近接しなくなる。これは、ＰＣＲ反応がサイクルを継続するにつれて、各々の伸長段階でレポーターシグナルの永続的増加を生じる。各々のサイクルで最大のシグナルを得るために、加水分解プローブは反応中のプライマーよりも約１０℃高いＴｍでしばしば設計される。リアルタイム加水分解プローブ反応の使用はまた、米国特許第５，５３８，８４８号、同第６，６５３，４７３号、同第７，４８５，４４２号、及び同第７，２０５，１０５号に記載されており、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される方法は、核酸分析及び／または検出のためのＴａｑＭａｎアッセイの使用を含む。例えば、本開示の組成物は、ＴａｑＭａｎプローブ及び／またはアッセイを含む方法において使用され得る。このようなアッセイは、遺伝子発現アッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ）、コピー数変動アッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙｓ）、遺伝子型決定アッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ＡｓｓａｙｓまたはＴａｑＭａｎ（商標）ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ）、ｍｉＲＮＡアッセイ（ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ）、またはＲＮＡ定量化アッセイ（例えば、２段階逆転写ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ）、及びＴａｑＭａｎ（商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ  Ａｓｓａｙｓを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
本明細書において使用されるとき、用語「反応容器」は、一般に、本教示に従って反応が起こり得る任意の容器を指す。いくつかの実施形態において、反応容器は、マイクロチューブ、例えば、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（商標）Ｏｐｔｉｃａｌチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはマイクロ遠心分離チューブなどの０．２ｍＬまたは０．５ｍＬ反応チューブチューブ、または分子生物学の研究室で一般的に実用される種類の他の容器であってもよいが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、反応容器は、ＴａｑＭａｎ（商標）Ａｒｒａｙプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のようなマイクロタイタープレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート）のウェル、ガラススライド上のスポット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（商標）Ａｒｒａｙ  ＣａｒｄもしくはＰｌａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＴａｑＭａｎ（商標）ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のスルーホールであってもよい。例えば、複数の反応容器が同一の支持体上に存在してもよい。いくつかの実施形態において、例えばＣａｌｉｐｅｒ及びＦｌｕｉｄｉｇｍから入手可能なラボオンチップ型デバイスは、反応容器を提供することができる。いくつかの実施形態において、様々なマイクロ流体アプローチを使用することができる。様々な反応容器が当該技術分野で使用可能であり、本教示の範囲内に入ることが認識されるであろう。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、用語「アンプリコン」及び「増幅産物」または「増幅された産物」は、一般に、増幅反応の産物を指す。アンプリコンは、二本鎖または一本鎖であり得、そして二本鎖増幅産物を変性させることによって得られる分離された成分である鎖を含み得る。ある実施形態において、１増幅サイクルのアンプリコンは、その後の増幅サイクルにおいてテンプレートとして機能することができる。
【００９３】
本明細書で使用されるとき、用語「増幅する」は、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチド代替物、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部を、典型的にはテンプレート依存的に複製する任意の手段を意味し、非限定的に、または線形もしくは指数関数的に、のいずれかで酸配列を増幅するための広範な技術を含む。いくつかの方法のいずれかを使用して、標的ポリヌクレオチドを増幅することができる。核酸の標的配列のコピーを増殖させるための任意のインビトロ手段を利用することができる。これらは、線形、対数、または任意の他の増幅方法を含む。例示的な方法は、とりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、プライマー分子の部分的破壊（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００６／０８７５７４号を参照）、リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｗｕ，  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９  （１９９０）及びＢａｒａｎｙ，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３  （１９９１）を参照、ＱβＲＮＡレプリカーゼ系（例えばＷＯ１９９４／０１６１０８を参照）、ＲＮＡ転写に基づく系（例えば、ＴＡＳ、３ＳＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、米国特許第５，８５４，０３３号、Ｌｉｚａｒｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２  （１９９８）、及びＢａｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：  ５０７３−５０７８  （１９９８）を参照）、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Ｌｉｔｔｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：７７７−７８４  （１９９９））を含む。多くのシステムは、標的核酸の増幅における使用に好適であり、当業者に理解されるように本明細書においてそれが意図される。本発明の方法のいくつかの実施形態において、ＰＣＲによって核酸増幅反応を実施することができる。いくつかの実施形態において、ＰＣＲは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）であり得る。ある実施形態において、ｑＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲによって実施することができる。他の実施形態において、ＰＣＲはエンドポイントＰＣＲであり得る。他の実施形態において、ＰＣＲはデジタルＰＣＲであり得る。さらに他の実施形態において、ＰＣＲは温度サイクリングを含むことができる。いくつかの実施形態において、温度サイクリングを高速温度サイクルのために最適化することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＰＣＲによって核酸を増幅する方法は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、塩、消泡剤、ならびにｄＮＴＰ及び／またはｄＮＴＰ誘導体を含む本明細書において提供されるような組成物を反応容器に添加する工程と、核酸試料及びプライマーを反応容器に添加して反応混合物を形成する工程と、核酸試料に対してＰＣＲを実施する工程とを含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲは、組成物、核酸試料、及びプライマーを反応容器に添加することに続いて、７２時間まで（例えば、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間まで）続けて実施する。
【００９５】
いくつかの実施形態において、標的核酸を増幅するための方法は、複数の標的が同時に増幅されるマルチプレックスＰＣＲ増幅であり得る。増幅される標的の数は、２個の標的、５個の標的、１０個の標的、２５個の標的、５０個の標的、１００個の標的、１０００個の標的、５０００個の標的などであって、それらの間の全ての数を含むものまでであり得る。いくつかの実施形態において、マルチプレックス標的の１つは、増幅のための内在性または外来性の内部陽性コントロールである。いくつかの実施形態において、標的核酸を検出するための方法は、複数の標的が同時に検出されるマルチプレックスＰＣＲ及び／または検出アッセイであり得る。ある実施形態において、増幅及び／または検出される標的の数は、２５個の標的、１０個の標的、８個の標的、６個の標的、５個の標的、４個の標的、３個の標的、または２個の標的までであり得る。一実施形態において、マルチプレックス標的のうちの１つは、増幅及び／または検出のための内在性または外来性の内部陽性コントロールである。いくつかの実施形態において、複数の標的が同時に増幅され、検出される。いくつかの実施形態において、複数の標的が増幅され、同一の反応容器中で検出される。いくつかの実施形態において、様々なＴａｑＭａｎ（商標）プローブレポーター色素及びパッシブ色素の選択肢を、マルチプレックスＰＣＲのために組み合わせることができる。例えば、ＲＯＸパッシブリファレンス色素を含むＰＣＲ組成物と組み合わせたＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（商標）、及びＡＢＹ（商標）レポーター色素を有するＴａｑＭａｎ（商標）プローブを、３重マルチプレックスＰＣＲ増幅及び検出アッセイに使用することができる。別の例として、ＭＵＳＴＡＮＧ  ＰＵＲＰＬＥ（商標）パッシブリファレンス色素を含むＰＣＲ組成物と組み合わせたＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＡＢＹ（商標）、及びＪＵＮ（商標）レポーター色素を有するＴａｑＭａｎ（商標）プローブを、４重マルチプレックスＰＣＲ増幅及び検出アッセイに使用することができる。いくつかの実施形態において、核酸合成（例えば、核酸増幅反応またはＰＣＲ）及び核酸検出（例えば、アンプリコンの）が同時に起こり得る。したがって、いくつかの実施形態において、核酸合成及び核酸検出は、同一の反応容器内で実施される。
【００９６】
一般に、ＰＣＲサーマルサイクリングは、高温での最初の変性ステップを含み、その後に、テンプレート変性、プライマーアニーリング、及びアニーリング下プライマーのポリメラーゼによる伸長を可能にするよう設計された反復する一連の温度サイクルが続く。一般に、試料は、約２〜１０分間、約９５℃の温度で最初に加熱され、二本鎖ＤＮＡ試料を変性させる。次いで、各々のサイクルの開始時に、試料及び使用される機装置の型に応じて約１０〜６０秒間、試料が変性される。変性後、プライマーは、より低い温度、典型的には約４０℃〜約６０℃で約２０〜６０秒間、標的ＤＮＡへのアニーリングを可能にする。ポリメラーゼによるプライマーの伸長は、しばしば、約６０℃〜約７２℃の範囲の温度で実施される。伸長のために使用される時間の量は、アンプリコンのサイズ及び増幅に使用される酵素の型に依存し、日常的な実験によって容易に決定される。さらに、アニーリングステップを伸長ステップと組み合わせて２段階サイクリングをもたらすことができる。温度サイクルはまた、ＰＣＲアッセイにおけるさらなる温度シフトを含み得る。アッセイで使用されるサイクル数は、使用されるプライマー、存在する試料ＤＮＡの量、及び温度サイクル条件を含む多くの因子に依存する。任意のアッセイにおいて使用されるサイクル数は、日常的な実験を用いて当業者によって容易に決定され得る。任意で、全ての増幅産物の合成を確実にするために、温度サイクルの完了後に最終伸長ステップを加えることができる。
【００９７】
一実施形態において、本明細書において開示される組成物及び反応混合物を使用するＰＣＲ増幅のための例示的な温度サイクル条件は以下の通りである：
ＵＮＧステップ（オプション）：５０℃、２分間（例えば、以前のＰＣＲからのアンプリコン／キャリーオーバーの混入の防止のため）
活性化：９５℃、２０秒間
変性：９５〜９７℃／  １〜３秒間
延長：６０〜６２℃／２０〜３０秒間（×４０サイクル）
【００９８】
一実施形態において、本明細書において開示される組成物がＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）プラットフォームに使用されるとき、９２℃で１０分間の活性化が推奨される。
【００９９】
提供される組成物及び反応混合物はまた、前増幅反応におけるような、限定された数のサイクルが生じる増幅反応（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５サイクルの増幅）において使用することができる。ある実施形態において、提供された組成物及び反応混合物を使用して、前増幅ステップが実施される（例えば、その開示が参照によりその全てが組み込まれる、米国特許第９，２０６，４７５号を参照）。いくつかの実施形態において、一対のユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて前増幅を実施する。いくつかの実施形態において、２０サイクル未満、例えば２〜１８サイクルの間、前増幅を実施する。いくつかの実施形態において、前増幅ステップは、増幅反応プラトーに達する前に短縮される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、本明細書において提供される組成物及び反応混合物を使用して増幅する前に実施される前増幅ステップを含み得る。
【０１００】
開示された組成物を用いたＰＣＲは、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）７９００ＨＴ、７５００、及び７３００の標準的なＰＣＲシステムなどの「標準的な」ＰＣＲ装置、またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＳｔｅｐＯｎｅ、ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ、７５００、及び７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムなどの「Ｆａｓｔ」ＰＣＲ装置で実施することができる。いくつかの実施形態において、開示された組成物を用いたＰＣＲは、非限定的に、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲシステム９７００、９６００、２７００、または２４００サーモサイクラー、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＶｉｉＡ（商標）７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）１２Ｋ  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｄｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）６  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）７  Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）３  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）５  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍなど（全てＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）のような装置を用いる温度サイクリングを含む。方法における使用のための分光測光サーマルサイクラーの他の例は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＣｙｃｌｅｒ  ＩＱ（商標）、Ｃｅｐｈｅｉｄ  ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（商標）  ＩＩ、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００、Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｒ．Ａ．Ｐ．Ｉ．Ｄ．（商標）、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｒｏｍｏ  ４（商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）２．０、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３０００Ｐ（商標）、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ４０００（商標）を含むがこれらに限定されない。
【０１０１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物、キット及び方法は、核酸合成及び／または検出に使用される標準または従来の組成物、キット及び方法（例えば他の市販のマスターミックスまたはキット）を超える利点がある。いくつかの実施形態において、そのような利点は、以下のいずれかを含むが、これらに限定されない。
ａ）未処理試料から直接核酸を（例えば、リアルタイムｑＰＣＲによって）増幅することができる（例えば、唾液及び全血から標的を直接増幅することができる）、
ｂ）コピー数変動の結果の正確性を改善する、
ｃ）種々のＰＣＲ阻害因子に対する増加した耐性を提供する、
ｅ）増加した特異性及び感受性をもたらす、
ｆ）迅速な読み出しのための高速サーマルサイクリングプロトコールで使用できる、かつ／または
ｇ）単一の反応において実質的に同時にマルチプレックスの性能を可能にする（例えば、（ｉ）単一の試料を用いて複数の標的、すなわち１つの試料中の２つ以上の標的を増幅できる、または（ｉｉ）複数の試料、すなわち、２つの異なる試料中の２つの標的を増幅できる）。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物、キット、及び方法を使用することを、標準的または従来の組成物、キット、及び方法を使用するＰＣＲにおいて観察されたコピー数の変動と比較するとき、ＰＣＲにおけるコピー数の変動の正確性は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％改善する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物、キット、及び方法を使用することを、標準的または従来の組成物、キット、及び方法を使用するＰＣＲにおいて観察された入力検出感度と比較するとき、ＰＣＲにおける入力検出感度は、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍改善する。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される組成物、キット、及び方法を用いるとき、ＰＣＲにおける特異性及び感受性は、遺伝子型決定について、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％正確である。いくつかの実施形態において、上に列挙した利点（ａ）〜（ｇ）のいずれかは、核酸合成及び／または検出のための標準的または従来の組成物、キット及び方法を使用して観察されるものと少なくとも同等である。
【０１０３】
本明細書において使用されるとき、「ヌクレオチド」は、塩基−糖−ホスフェートの結合を指す。「ヌクレオシド」は、塩基−糖の結合を指す。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）の単量体単位である。用語ヌクレオチドは、モノ−、ジ−、及びトリホスフェートの形態のデオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシド、ならびにそれらの誘導体を含む。ｄＮＴＰは、標識されていなくてもよいし、それらを、放射性同位元素（例えば、Ｈ３、Ｃ１４、Ｐ３２、またはＳ３５）、ビタミン（例えば、ビオチン）、蛍光部分（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、またはフィコエリトリン）、化学発光標識、ジオキシゲニンなどによって当該技術分野で既知の方法と結合することによって検出可能に標識してもよい。標識ｄＮＴＰは、例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙから商業的に入手できる。
【０１０４】
本明細書において使用されるとき、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、１つのヌクレオチドのペントースの３’位と隣接するヌクレオチドのペントースの５’位との間でホスホジエステル結合によって連結され得るヌクレオチドの共有結合した配列を含む合成または生物学的に産生された分子を指す。さらに、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、修飾または非天然の糖残基（例えば、アラビノース）及び／または修飾された塩基残基を含んでもよい。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはまた、分子と特定のタンパク質、酵素または基質との相互作用を妨げるブロッキング基を含んでもよい。
【０１０５】
本明細書において使用されるとき、「核酸」は、複数の天然ヌクレオチド及び／または非天然（または「誘導体」）のヌクレオチド単位を有する化合物を含む。「核酸」は、非ヌクレオチド単位、例えばペプチドをさらに含み得る。したがって、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、ホスホチオエート含有核酸、ホスホネート含有核酸などのような化合物を包含する。核酸が２個以上のヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、またはそれらの組み合わせ、具体的には５、１０、１５、２５、５０、１００またはそれ以上を含むという条件で、核酸中の単位の数に関して特に制限はない。核酸は、一本鎖及び二本鎖の形態と、完全または部分的に二重鎖のハイブリッド（例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＰＮＡ、またはＤＮＡ−ＰＮＡ）との両方を包含し得る。
【０１０６】
本明細書において使用されるとき、用語「プライマー」は、１つを超えるプライマーを指す場合があり、それは、精製された制限消化物のように天然に生じるか、または合成的に産生されたかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長鎖の合成が触媒される条件下に置かれるとき、相補鎖に沿う合成の開始点として作用することが可能である。そのような条件は、好適な緩衝液（「緩衝液」は補因子である置換基、またはｐＨ、イオン強度などに影響する置換基を含む）中の、好適な温度における、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合誘発剤の存在を含む。プライマーは、増幅効率を最大にするために好ましくは一本鎖である。プライマーは、典型的には１１塩基以上であり、より具体的には、プライマーは１７塩基以上であるが、必要に応じてより短いプライマーまたは長いプライマーを用いてもよい。当業者には理解されるように、オリゴヌクレオチドは、様々な伸長、合成、または増幅反応において１つまたは複数のプライマーとして使用され得る。
【０１０７】
本明細書において使用されるとき、核酸配列の相補体は、ある配列の５’末端が他の配列の３’末端と対になるように核酸配列と整列させたとき、「逆平行の会合」であるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。天然核酸に一般的に見出されない特定の塩基は、本発明の核酸に含まれてもよく、例えば、イノシン及び７−デアザグアニンを含む。相補性は完全である必要はなく、安定な二重鎖は、ミスマッチ塩基対または不一致塩基を含み得る。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の発生を含む多くの変数を経験的に考慮して、二重鎖の安定性を決定することができる。
【０１０８】
核酸二重鎖の安定性は、融解温度（「Ｔｍ」）によって測定される。特定の条件下での特定の核酸二重鎖のＴｍは、塩基対の半分が解離した温度である。
【０１０９】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに言及するとき、活性の１単位は、標準的にプライミングされたＤＮＡ合成条件下で３０分以内に１０ナノモルのｄＮＴＰを酸不溶性材料（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）に組み込む酵素の量である。
【０１１０】
本明細書中で使用されるとき、用語「標的」、「標的配列」、「標的テンプレート」、または「標的核酸配列」は、増幅、検出のいずれかまたはその両方がなされる、核酸配列または核酸配列の領域を指す。典型的には、ＰＣＲにおいて、標的配列は、増幅のために使用される２つのプライマー配列の間に存在する。
【０１１１】
本明細書において使用されるとき、「またはそれらの組み合わせ」は、用語に先行して列挙された用語のすべての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図しており、特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢをもまた含む。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つまたは複数の項目または用語の繰り返しを含む組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から他が明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせにおける項目または用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【０１１２】
例示的な核酸試料は、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡを含む。一実施形態において、核酸は、単離された及び／または精製された核酸である。単離または精製された核酸は、タンパク質、多糖、もしくは他の細胞、細菌、またはウイルスの成分のような他の成分を実質的に含まない。別の実施形態において、核酸は単離または精製されていない。いくつかの実施形態において、核酸試料は生物学的試料中にある。例えば、核酸は、粗溶解物または全細胞抽出物などの複合混合物に存在してもよい。別の実施形態において、核酸はインサイチューであってよく、その正常な細胞、細菌、またはウイルスの環境内に存在し得る。
【０１１３】
標的核酸は、任意の源から得ることができ、任意の数の異なる組成成分を含むことができる。例えば、標的は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または他の成熟小型ＲＮＡであり得、核酸類似体または他の核酸模倣物を含む。標的は、メチル化、非メチル化、またはその両方であり得る。標的は、重亜硫酸塩処理されたものでも、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換されたものでもよい。さらに、「標的核酸」は、標的核酸自体、およびそれらの代替物、例えば増幅産物及び天然配列を指してもよいことが理解されよう。
【０１１４】
本教示の核酸試料は、ウイルス、古細菌、原生生物、原核生物、及び真核生物を非限定的に含む、任意の数の生物学的源から取得でき、例えば、真核生物、最も好ましくは霊長類、例えばチンパンジーまたはヒト、ウシ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばモルモット、ラット、マウス、ウサギ、または鳥類、爬虫類、または魚類から取得される生物学的試料から取得できる。核酸は、異なる発生段階の細胞、組織、器官、または生物から取得することができる。核酸試料はまた、ヒトを含む動物から得られた癌細胞及び前癌細胞から取得することができる。核酸はまた、形質転換及び非形質転換の細胞培養株を含む細胞培養株から取得することができる。核酸試料は、様々な源から抽出することができる。これらは、衣類、土壌、紙、金属表面、空気、水、植物部分、ならびにヒト及び／または動物の皮膚、毛、血液、血清、糞便、乳、唾液、尿、及び／または他の分泌液を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
核酸試料及び標的核酸は、生物学的及び他の試料から、例えば、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭａｇＭａｘ（商標）Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴａｒｇｅｔＰｒｅｐ  ＲＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ＦＦＰＥ及びＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＦＦＰＥ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６１００  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＰｒｅｐＳｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６７００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの当該技術分野において既知の様々な手順の任意のものを用いて抽出することができることは理解されよう。
【０１１６】
「生物学的試料」は、生検及び剖検試料などの組織切片、ならびに組織学的目的のために採取された凍結切片を含む。このような試料は、血液及び血液画分または血液製剤（例えば、血清、血小板、赤血球など）、リンパ、骨髄、喀痰、気管支肺胞洗浄液、羊水、毛、皮膚、培養細胞、例えば初代培養、外植片、及び形質転換細胞、便、尿などを含む。核酸調製の前に、生物学的試料は、新たに調製された、凍結した、またはホルマリンもしくはパラホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）であってもよい。
【０１１７】
提供されるＰＣＲ組成物は、粗核酸抽出方法と適合性があり、試料調製物から持ち越されるＰＣＲ阻害因子を耐容することができる。ＰＣＲ組成物は、例えば液体形態の全血、紙上で乾燥した全血、バッカルスワブ（例えば、口腔粘膜）、未精製唾液、尿、血清、毛包、植物の葉、及びＦＦＰＥなどから調製された粗細胞または組織溶解物と適合性がある。
【０１１８】
本明細書において使用されるとき、用語「粗試料」は、核酸を含むことが疑われる、核酸の単離または精製の手順を受けていない、生物起源の試料を指す。例えば、血液または尿の試料は粗試料である。さらに、ＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎから市販されている）のような溶解試薬を含む紙にスポットされた血液の試料も粗試料と考えられる。頬の細胞のバッカルスワブは、粗試料の別の例である。粗試料は、血液、希釈血液、紙の上の血液、バッカルスワブ、及びＦＴＡ紙のような試料保存用の基材上のバッカルスワブを含むが、これらに限定されない。粗試料中の細胞は、任意で溶解して「粗溶解物」を作製することができる。当業者は、本発明の教示によって分析が促進されるであろう膨大な数の他の粗試料または粗溶解物を認識するであろう。
【０１１９】
増幅または合成の後、増幅または合成された核酸フラグメントは、さらなる使用または分析のために単離され得る。このステップは、通常、増幅されたまたは合成された核酸フラグメントのサイズによる分離またはゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー（サイジング、親和性及びイムノクロマトグラフィーを含む）、密度勾配遠心分離、及び免疫吸着を含む任意の物理的または生化学的手段によって達成される。例示的な方法は、複数の核酸フラグメントの高感度な分離の迅速かつ高い制限性の手段を提供するゲル電気泳動による核酸フラグメントの分離であり、核酸のいくつかの試料におけるフラグメントの直接的、同時の比較を可能にする。
【０１２０】
一実施形態において、化学的抽出、電気抽出、または物理的切除などの標準的な技術に従って、同定に使用されたゲル（上記参照）から増幅または合成された核酸フラグメントの１つまたは複数を取り出す。次いで、単離された固有の核酸フラグメントを、種々の原核生物（細菌）または真核生物（酵母、植物、もしくはヒト及び他の哺乳類を含む動物）の細胞のトランスフェクションまたは形質転換に好適な発現ベクターを含む標準的なベクターに挿入することができる。代替的に、本方法によって産生された核酸は、例えば、シーケンシング（すなわち、核酸フラグメントのヌクレオチド配列の決定）によって、以下に記載される方法及び当該技術分野で標準的な他の方法によってさらに分析され得る（例えば、米国特許第４，９６２，０２２号及び同第５，４９８，５２３号を参照でき、これはＤＮＡシーケンシング方法に関する）。Ｓａｎｇｅｒ連鎖終止反応法（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：  ５４６３−５４６７  （１９７７））及びＭａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの化学分解法（Ｍａｘａｍ，  Ａ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：  ５６０−５６４  （１９７７））のような古典的なシーケンシング方法を利用することもできる。
【０１２１】
一実施形態において、本方法によって産生された核酸は、次世代シーケンシングによってさらに分析され得る。本明細書において使用されるとき、用語「次世代シーケンシング」または「ＮＧＳ」は、一般に、超並列末端固有配列解析、ハイスループットシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤシーケンシング）、プロトンイオン半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、単一分子シーケンシング、及びナノポアシーケンシングを含むが、これらに限定されないハイスル−プットシーケンシング技術を指す。
【０１２２】
増幅及び／またはシーケンシングのための好適なＤＮＡポリメラーゼは、本明細書において以前に開示されたもののいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、このようなポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ（商標））  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ  （Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｏｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ  ＫＯＤ２（ＫＯＤ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ（ＤＹＮＡＺＹＭＥ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  Ｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、及び一般的にｐｏｌ  Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ、それらの突然変異体、変異体、及び誘導体、ならびに上記の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１２３】
好適な核酸ポリメラーゼは、中温性または好熱性であり得、好ましくは好熱性及び熱安定性である。本明細書において使用されるとき、用語「熱安定性核酸ポリメラーゼ」は、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のヌクレオシド三リン酸の重合を触媒するヌクレオチドポリメラーゼと比較するとき、熱に対して比較的安定な酵素を指す。一般に、酵素は、標的配列にアニーリングされたプライマーの３’末端で合成を開始し、テンプレートに沿って５’方向に進行し、５’から３’ヌクレアーゼ活性を有する場合には、合成が終結するまで、介在するアニーリングされたプローブを加水分解して標識プローブフラグメントと非標識プローブフラグメントの両方を放出する。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）から単離された代表的な熱安定性酵素は、米国特許第４，８８９，８１８号に記載されており、従来のＰＣＲでそれを使用する方法はＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７に記載されている。
【０１２４】
好適な中温性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼのＰｏｌ  Ｉファミリー（及びそれらのそれぞれのＫｌｅｎｏｗフラグメント）であって、その任意のものがＥ．  ｃｏｌｉ、Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｄ．  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃ．  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｒ．  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｔ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌ．  ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．  ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌ５、ｐｈｉ−Ｃ３１、Ｔ７、Ｔ３、Ｔ５、ＳＰ０１、ＳＰ０２、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＩＰ−１からのミトコンドリア、及びｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ、ならびにＤ．  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのような生物から単離することができるもの（Ａｓｔａｔｋｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８，  １４７−１６５）、任意の源から単離されるｐｏｌ  ＩＩＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの突然変異体、誘導体、または変異体などを含む。
【０１２５】
ある実施形態において、核酸ポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する。本明細書において定義されるとき、「５’→３’ヌクレアーゼ活性」または「５’から３’のヌクレアーゼ活性」は、いくつかのＤＮＡポリメラーゼに伝統的に関連する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のいずれかを含み、それによってヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの５’末端から連続的に除去されるテンプレート特異的核酸ポリメラーゼ活性（すなわち、Ｅ．  ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するが、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントはそうではない）、または、５’末端から１を超えるホスホジエステル結合（ヌクレオチド）の切断が起こる５’→３’エンドヌクレアーゼ活性、またはその両方を指す。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成依存性の鎖置換５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有する（Ｇｅｌｆａｎｄ，  “Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ”  ｉｎ  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｅｄ．，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．（１９８９），  Ｃｈａｐｔｅｒ  ２を参照）。いくつかの実施形態において、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む方法が本明細書中において意図される。このような方法において、本明細書において提供される組成物及び反応混合物は、逆転写酵素活性を有する酵素をさらに含み得る。逆転写酵素活性を有する好適な酵素は、例えば、レトロウイルス逆転写酵素、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ逆転写酵素、ＭＡＶ逆転写酵素、ＡＳＬＶ逆転写酵素、及びレンチウイルス逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有するそれらの対応する突然変異体、変異体、もしくは誘導体であってもよい。本明細書において使用されるとき、「突然変異体、変異体、または誘導体」は、その化学種の決定的な化学活性を依然として保持している、存在し得るまたは産生され得る化学種のすべての順列を指す。本発明において使用するためのいくつかの好ましい酵素は、ＲＮａｓｅＨ＋酵素、例えばＲＮａｓｅＨ＋Ｍ−ＭＬＶまたはＲＮａｓｅＨ＋ＡＭＶ逆転写酵素であるものを含む。代替的に、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性を低減するか、実質的に低下するか、または排除してもよい（例えば、米国特許第７，０７８，２０８号を参照でき、その開示は参照によりその全体が完全に組み込まれる）。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖に特異的なプロセッシブ５’及び３’リボヌクレアーゼである（Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８４））。ＲＮａｓｅＨ活性は、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，  Ｍ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：２６５  （１９８８）  ａｎｄ  ｉｎ  Ｇｅｒａｒｄ，  Ｇ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＯＣＵＳ  １４（５）：９１（１９��２）に記載されているような様々なアッセイによって決定され得る。
【０１２６】
逆転写酵素は、天然に存在する逆転写酵素と比較して変異を含んでいてもよい。例えば、逆転写酵素は、増加した逆転写酵素安定性及び／または機能性をもたらす変異を含むように改変され得る。好適な酵素はまた、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を低減するか、実質的に低減するか、または排除したものを含み得る。そのような増加または減少した機能性を示す逆転写酵素は、例えば、米国特許第７，０５６，７１６号及び同第７，０７８，２０８号に記載されている。
【０１２７】
本明細書中に提供されるように、本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物は、市販のマスターミックスを用いた同等のＰＣＲと比較して、ＰＣＲ実行時間を低減するのに有効である。これは、ＰＣＲに添加された核酸試料が粗溶解物であり、かつ／または標的配列が低いコピー数で存在するときに特に当てはまる。いくつかの実施形態において、このＰＣＲ実行時間の低減は、より低いＣｔ値によって実証される。いくつかの実施形態において、市販される組成物またはマスターミックスによる同等のＰＣＲと比較して、本明細書において提供される集められたＰＣＲ組成物を使用するとき、Ｃｔ値は少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、または少なくとも１０００倍低い。
【０１２８】
本明細書において使用されるとき、用語「Ｃｔ」または「Ｃｔ値」は、閾値サイクルを指し、アンプリコン生成を示すレポーターからのシグナル（例えば蛍光）が最初にバックグラウンドレベルより上で検出可能になるＰＣＲ増幅アッセイのサイクルを意味する。いくつかの実施形態において、閾値サイクルまたは「Ｃｔ」は、ＰＣＲ増幅が指数関数的になるサイクル数である。一実施形態において、蛍光などのレポーターからのシグナルはデルタＲｎとして記載される。本明細書において使用されるとき、用語「ｄＲｎ」または「デルタＲｎ」は、パッシブリファレンス信号によって標準化されたバックグラウンドシグナル（ベースライン）から差し引かれた標準化されたレポーターシグナル（Ｒｎ）における差異を指す。デルタＲｎは、式Ｒｎ＋−Ｒｎ−によって決定され、式中、Ｒｎ＋は、テンプレートを含む全ての成分を含む反応のＲｎ値であり、Ｒｎ−は未反応の試料の値である。
【０１２９】
様々な実施形態によれば、Ｃｔ値は、ＰＣＲ曲線の導関数を用いて決定することができる。例えば、Ｃｔ値を決定するために、第１、第２、またはｎ次微分法をＰＣＲ曲線上で実施することができる。様々な実施形態において、導関数の特性は、Ｃｔ値の決定に使用され得る。そのような特性は、二次導関数の正の変曲、二次導関数の負の変曲、二次導関数のゼロ交差、または一次導関数の正の変曲を含むことができるが、これらに限定されない。様々な実施形態において、Ｃｔ値は閾値処理及びベースライン法を使用して決定することができる。例えば、ＰＣＲ曲線の指数期に対する上限は、微分法を用いて確立することができ、ＰＣＲ曲線のベースラインは、ＰＣＲ曲線の指数期に対する下限を確立するために決定することができる。ＰＣＲ曲線の上下限から、Ｃｔ値が決定される閾値を確立することができる。当該技術分野で既知のＣｔ値の決定のための他の方法は、例えば非限定的に、フィットポイント法の様々な実施形態、及びシグモイド法の様々な実施形態である（例えば、米国特許第６，３０３，３０５号、同第６，５０３，７２０号、同第６，７８３，９３４号、同第７，２２８，２３７号、及び米国特許出願第２００４／００９６８１９号に記載され、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１３０】
本明細書において使用されるとき、用語「アニーリング」及び「ハイブリダイゼーション」は交換可能に使用され、二重鎖、三重鎖または他の高次構造の形成をもたらす一の核酸と別の核酸との相補的な塩基対形成相互作用を意味する。いくつかの実施形態において、一次相互作用は、Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ及びＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型水素結合による塩基特異的、例えば、Ａ／Ｔ及びＧ／Ｃである。いくつかの実施形態において、塩基の積み重ね及び疎水性相互作用はまた、二重鎖の安定性に寄与し得る。核酸プローブ及びプライマーを相補的及び実質的に相補的な標的配列にハイブリダイズするための条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．（１９８５）及びＪ．Ｗｅｔｍｕｒ  ａｎｄ  Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４９  ｅｔ  ｓｅｑ．（１９６８）に記載されるように周知である。一般的にそのようなアニーリングが起こるかどうかは、とりわけ、プローブの長さ及び相補的な標的配列、ｐＨ、温度、一価及び二価カチオンの存在、ハイブリダイズ領域におけるＧとＣのヌクレオチドの割合、媒体の粘度、ならびに変性剤の存在の影響を受ける。そのような変数は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響する。したがって、好ましいアニーリング条件は、特定の用途に依存する。しかしながら、そのような条件は、過度の実験をすることなく、当業者によって日常的に決定され得る。さらに、一般に、本教示のプローブ及びプライマーは、標的配列と相補的であるように設計され、標的とプローブまたはプライマーとのハイブリダイゼーションが生じる。しかし、この相補性は完全である必要はなく、本教示の標的配列と一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションと干渉するであろう任意の数の塩基対ミスマッチが存在し得ることが理解されよう。しかし、塩基対ミスマッチの数が非常に多いために最小のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが起こらない場合、その配列は相補的な標的配列ではない。したがって、本明細書において「実質的に相補的」は、プローブまたはプライマーが標的配列に対して十分に相補的であり、選択された反応条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【０１３１】
本明細書において使用されるとき、用語「標識」は、検出可能なシグナルを提供するために使用することができ、核酸またはタンパク質に結合させることができる任意の原子または分子を指す。標識は、蛍光、放射能、比色分析、重力測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供することができる。いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは定量化可能なシグナルである。
【０１３２】
例えば、標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する、（ｉｉ）第１の標識または第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変するために第２の標識と相互作用する、または（ｉｉｉ）捕捉機能、例えば疎水性親和性、抗体／抗原、イオン性複合体を与える、任意の部分であり得る。当業者は、多くの異なる種のレポーター標識を、本発明の教示において個別にまたは１つまたは複数の異なる標識と組み合わせてのいずれかで使用できることを理解するであろう。例示的な標識は、フルオロフォア、放射性同位元素、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ、色素、酵素、エピトープタグを含むがこれらに限定されない抗体、重金属、色素、燐光基、化学発光基、電気化学的検出部分、親和性タグ、結合タンパク質、燐光体、希土類キレート、及び近赤外線染料を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
好適な検出可能な標識は、当業者に既知の他のもののうちで、例えばフルオレセイン（例えば５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、６−ＨＡＴ、６−ＪＯＥ、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ蛍光体（例えば、３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）、ＢＯＤＩＰＹ（商標）フルオロフォア（例えば、４９２／５１５、４９３／５０３、５００／５１０、５０５／５１５、５３０／５５０、５４２／５６３、５５８／５６８、５６４／５７０、５７６／５８９、５８１／５９１、６３０／６５０−Ｘ、６５０／６６５−Ｘ、６６５／６７６、ＦＬ、ＦＬ  ＡＴＰ、ＦＩ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ、Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＴＭＲ、ＴＭＲ−Ｘ  コンジュゲート、ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、ＴＲ、ＴＲ  ＡＴＰ、ＴＲ−Ｘ  ＳＥ）、クマリン（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＡＭＣＡ−Ｘ、ＡＢＱ、ＣＰＭメチルクマリン、クマリンファロイジン、ヒドロキシクマリン、ＣＭＦＤＡ、メトキシクマリン）、カルセイン、カルセインＡＭ、カルセインブルー、カルシウム染料（例えば、カルシウムクリンソン、カルシウムグリーン、カルシウムオレンジ、カルコフルオルホワイト）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃｙ（商標）色素（例えば、３、３．１８、３．５、５、５．１８、５．５、７）、シアンＧＦＰ、サイクリックＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光たんぱく質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ）、ＦＲＥＴドナー／アクセプター対（例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ダブシル、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ、フルオレセイン／ＱＳＹ７及びＱＳＹ９）、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）及びＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）（例えば、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−２２、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ  ＤＰＸ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ  ＨＣＫ−１２３、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−２６、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６７、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１８９、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ  ＤＮＤ−１５３、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  １０，０００ＭＷデキストラン）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（例えば、４８８、４８８−Ｘ、５００、５���４）、ローダミン（例えば、１１０、１２３、Ｂ、Ｂ  ２００、ＢＢ、ＢＧ、Ｂ  ｅｘｔｒａ、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５  ＧＬＤ、６−カルボキシローダミン６Ｇ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎｅ、Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄ−２，５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ及びＣ、Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇ  Ｅｘｔｒａ、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＷＴ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＶＩＣ、ならびに例えば米国特許出願公開第２００９／０１９７２５４号に記載される他の標識を含む。当業者に知られているように、他の検出可能な標識を使用することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１９７２５４号を参照）。
【０１３４】
蛍光レポーター分子及びクエンチャー分子が、互いに最小消光距離内に分離または導入されることに基づく生物学的事象を観察するために、蛍光レポーター分子−クエンチャー分子対がオリゴヌクレオチドプローブ上に組み込まれている。例えば、レポーター分子の蛍光強度が、クエンチャー分子からのレポーター分子の分離のために増加するプローブが開発されている。クエンチャー分子がレポーター分子に近接するため、蛍光を失うプローブも開発されている。これらのレポーター−クエンチャー分子対プローブは、レポーター分子によって生成された蛍光シグナルの出現または消失のいずれかを観察することによって、ハイブリダイゼーションアッセイ及び核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を観察するために使用されてきた。（例えば、米国特許第６，０３０，７８７号を参照）。
【０１３５】
例示的なレポーター−クエンチャー対は、フルオレセイン及びローダミン色素を含むキサンテン色素から選択され得る。結合の部位として、またはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合機能として使用することができる、そのフェニル部分上の置換基を有するこれらの化合物の多くの好適な形態は、商業的に広く入手可能である。蛍光化合物の別の群は、αまたはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物には、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート、及び２−ｐ−トウジニル−６−ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素は、３−フェニル−７−イソシアナトクマリン、９−イソチオシアナトアクリジン及びアクリジンオレンジなどのアクリジン類、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどを含む。
【０１３６】
好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、フルオレセイン及びローダミン色素から選択される。これらの色素及びオリゴヌクレオチドへの結合のための適切な連結方法は、多くの文献、例えば、Ｍａｒｓｈａｌｌ，  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，  ７：  ２９９−３０３  （１９７５）、Ｍｅｎｃｈｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号、Ｍｅｎｃｈｅｎら、欧州特許出願第８７３１０２５６．０号、及びＢｅｒｇｏｔら、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号に記載されている。
【０１３７】
本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、決して所望の主題を限定すると解釈されるものではない。特許、特許出願、記事、書籍及び論文を含むが、これらに限定されない、本開示に引用される全ての文献は、いかなる目的のためにも参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。組み込まれた文献のいずれかが本開示で定義されたいずれかの用語と矛盾する場合、本開示が優位となる。
【０１３８】
本教示は、これらの例示的な実施形態に関して記載されているが、当業者は、過度の実験をすることなくこれらの例示的な実施形態の多数の変形及び改変が可能であることを容易に理解するであろう。そのような変形及び改変は全て、本教示の範囲内にある。本教示の態様は、いかなる方法でも本教示の範囲を限定するものと解釈されるべきでない以下の実施例に照らしてさらに理解され得る。
【実施例】
【０１３９】
実施例１：例示的な組成物
例示的な組成物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、カリウム塩、マグネシウム塩、シリコーン系消泡剤、ｄＧＴＰと７−デアザ−ｄＧＴＰとの組み合わせを含むｄＮＴＰ、ＢＳＡ、フィッシュゼラチン、緩衝液、ホットスタート成分、グリセロール、ＴＷＥＥＮ  ２０以外の非イオン性界面活性剤、及びパッシブリファレンス色素を含む２倍濃縮ストック溶液として配合される。例示的なＰＣＲ組成物は、以下の実施例に記載されるような多くのアッセイにおいて試験された。
【０１４０】
実施例２：例示的な組成物による未精製試料のＰＣＲの優れた感度
ＴａｑＭａｎ（商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙにおける実施例１のＰＣＲ組成物の性能を、２つの異なる核酸試料を用いて、市販の組成物であるＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（「ＭＭ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、カタログ番号４４４４５５７）の性能と比較した。アッセイは、アッセイ及びＭＭのための製造者のプロトコールに従って実施されたが、１セットのアッセイにおいてＭＭを例示的な組成物と置換した。
【０１４１】
製造者のプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、カタログ番号４４０２５９９）に従って、バッカルスワブ及びＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔを用いて採取し、口腔粘膜から粗核酸試料を調製した。手短に、口腔粘膜試料は、参加者の口の各々の頬に４Ｎ６ＦＬＯＱＳｗａｂを擦ることによって取得した。スワブを２００μｌの溶解試薬に加え、９５℃で３分間インキュベートした。試料を室温まで冷却した後、２００μｌの安定化試薬を各々の溶解溶液試料に添加して、口腔粘膜の粗溶解物を形成した。
【０１４２】
ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮａｓｅ  Ｐ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙは、２μｌの粗溶解物及びさらなる量の溶解溶液を用いて実施した。反応は二重で実施した。
【０１４３】
１回の構築された２０μＬのＰＣＲは、以下の成分を含む。
１μＬのＲＮａｓｅＰアッセイ（２０×；フォワード及びリバースのＰＣＲプライマーならびにＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）
２μＬの粗溶解物
１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ、または７μＬの溶解溶液
１０μＬのＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘまたは実施例１の組成物
２０μＬの全ＰＣＲ容量までのＲＮａｓｅフリー水
【０１４４】
ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＶｉｉＡ（商標）７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて以下の温度サイクリング条件で実施した。
ＵＮＧステップ（任意）：５０℃、２分間
活性化：９５℃、２０秒間
（変性：９５℃／１秒間、
伸長：６０℃／２０秒間）×４０サイクル
【０１４５】
実施例１の組成物または市販のＭＭを用いる各々のアッセイについて決定された閾値サイクル数（Ｃｔ）を図１Ａ〜図１Ｇに示す。実施例１の組成物は、バッカルスワブ由来の２μｌの粗溶解物からの単一コピー遺伝子ＲＮａｓｅ  Ｐの増幅及び検出をもたらしたが、一方で市販のＰＣＲマスターミックスを使用してシグナルが得られなかった。実施例１の組成物を用いて、追加の１μＬ、２μＬ、３μＬ、または４μＬの溶解溶液の存在下においてさえ、ＲＮａｓｅＰシグナルが検出された。粗溶解物及び追加の溶解溶液からのこのシグナル検出は、反応条件が、アッセイにおいてさらなる試料溶解物の使用を可能にすることを示す。したがって、本明細書において提供される例示的な組成物は、粗溶解物試料からのより堅牢な増幅を助け、市販のマスターミックスよりも粗抽出物から持ち越されたＰＣＲ阻害因子に対してより耐性である。
【０１４６】
コピー数アッセイにおける例示的な組成物と市販のＰＣＲマスターミックスとの比較のためのＤＮＡ源として、新たに調製された生の唾液試料を使用した。唾液試料は、溶解溶液またはプロセスで前処理されなかった。ＴａｑＭａｎ（商標）ＲＮａｓｅ  Ｐ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙは、１〜９マイクロリットルの未精製唾液を用いて実施した。反応は二重で実施した。
【０１４７】
１回の構築された２０μＬのＰＣＲは、以下の成分を含む。
１μＬのＲＮａｓｅＰアッセイ（２０×；フォワード及びリバースのＰＣＲプライマーならびにＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）
１０μＬのＴａｑＭａｎ（商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘまたは実施例１の組成物
１〜９μＬの未精製唾液
２０μＬの全ＰＣＲ容量までのＲＮａｓｅフリー水
【０１４８】
上記の温度サイクリング条件を用いてＶｉｉＡ（商標）７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍとしてＰＣＲを実施した。実施例１の組成物または市販のＭＭを用いる各々のアッセイについて決定された閾値サイクル数（Ｃｔ）を、変動する未精製唾液の用量に関して図２Ａ〜図２Ｇに示す。実施例１の組成物は、試験した全ての唾液試料からの単一コピー遺伝子ＲＮａｓｅ  Ｐの増幅及び検出をもたらしたが、１μＬの唾液試料のみが、市販のＰＣＲマスターミックスを用いてシグナルをもたらした。未精製唾液の１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ、及び９μＬ試料の各々は、例示的なＰＣＲ組成物（図２Ａ〜図２Ｇ、上のパネル、左のボックス）で明確な検出可能な応答を生じた。市販のＰＣＲマスターミックスは、５％を超える唾液由来の反応容量には適合しなかった。市販のＰＣＲマスターミックスを用いて未精製唾液粗溶解物の２μＬ、３μＬ、４μＬ、または９μＬの試料からシグナルは得られなかった（図２Ａ〜図２Ｇ、上のパネル、右のボックス）。したがって、本明細書において提供される例示的な組成物は、未精製唾液試料からのより堅牢な増幅を助け、市販のマスターミックスよりも未精製唾液から持ち越されたＰＣＲ阻害因子に対してより耐性である。
【０１４９】
実施例３：例示的な組成物による粗溶解物試料の遺伝子型決定
製造者のプロトコールに従って、ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔを用いて、全血から粗核酸試料を調製した。手短に、全血試料の試料を９５℃で３分間溶解溶液と共にインキュベートし、続いて安定化溶液を添加して血液粗溶解物を生成した。
【０１５０】
２μｌの各々の血液粗溶解物及び実施例１の例示的なＰＣＲ組成物を用いて、ＣＹＰ２Ｃ１９＊．ｇ．−８０６Ｃ＞Ｔ  ＴａｑＭａｎ（商標）Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ（商標）ＳＮＰ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ番号Ｃ＿４６９８５７＿１０）を実施した。遺伝子型決定アッセイは、製造者のプロトコールに従って実施した。５０回のＰＣＲサイクルをアッセイのために実施した。
【０１５１】
粗血液溶解物の分析から得られた遺伝子型決定プロットを図３に示す。ＶＩＣ標識ＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブがアレル１（マイナーアレル）を検出し、ＦＡＭ標識ＴａｑＭａｎ（商標）プローブがアレル２を検出した。図３のグラフにおいて、各々の線は各々のＰＣＲサイクルにおけるシグナル強度のトレースを示し、クラスターは４０サイクル目の強度を示す。これらの結果は、本明細書において提供される例示的な組成物が、粗核酸試料で正確な遺伝子型判定結果を生成し得ることを示す。例示的な組成物によるＰＣＲ及び遺伝子型決定アッセイは、粗核酸試料中に存在するＰＣＲ阻害因子を耐容する。
【０１５２】
実施例４：例示的な組成物による粗溶解物試料と精製ＤＮＡ試料の比較
コピー数変動において粗溶解物と精製ＤＮＡ試料との比較を実施した。製造者のプロトコールに従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ａｌｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔを用いて、全血から粗溶解物を調製した。精製ＤＮＡ試料は、製造元のプロトコール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってＭａｇＭａｘ（商標）Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して生成した。精製したＤＮＡを定量し、５ｎｇ／μＬに標準化した。
【０１５３】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓは、１８の全血試料からの粗溶解物及び精製ＤＮＡを用いて実施した。コピー数変動アッセイＨｓ０００１０００３＿ｃｎ、４８ＤＧＶ  ＩＤは、２μＬの粗溶解物または１０ｎｇの精製ＤＮＡのいずれかを用いる１０μＬのＰＣＲにおいて、実施例１の例示的ＰＣＲ組成物を用いて実施した。コピー数は、ＲＮａｓｅ  Ｐ遺伝子を標準化遺伝子としてΔΔＣｔ法により算出し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒ  （商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．１をコピー数計算に使用した。図４Ａ〜４Ｂは、粗溶解物からのコピー数を示す左側のバー、及び対応する精製ＤＮＡ試料からのコピー数を示す右側のバーを有する結果を示す。コピー数変動の結果は、本明細書において提供される例示的なＰＣＲ組成物の高い阻害因子耐容性のために、粗溶解物と精製ＤＮＡ試料との間で同等であった。したがって、本明細書において提供される例示的な組成物は、粗溶解物試料を用いるコピー数変動アッセイにおいて良好に機能する。これらの結果は、本明細書において提供される例示的な組成物が、粗核酸試料を用いて正確なコピー数結果を生成し得ることを示す。例示的な組成物によるＰＣＲ及びコピー数アッセイは、粗核酸試料中に存在するＰＣＲ阻害因子を耐容する。
【０１５４】
実施例５：様々な濃度の異なる消泡剤の比較
Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を購入し、下記のような追加の成分を加えて１×濃度で製造者の指示に従って使用した。１０ｐｇ／μＬのテンプレートｃＤＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ及びＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ  Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔで製造者の指示に従って製造した）ならびに２００ｎＭの１８ｓ遺伝子標的フォワード及びリバースのプライマーをマスターミックスに添加した。Ａｎｔｉｆｏａｍ  ２０４（Ｓｉｇｍａ）（図５Ａ〜図５Ｄ）またはＡｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５（Ｓｉｇｍａ）（図６Ａ〜図６Ｄ）のいずれかの様々な濃度（０％、０．０１％、０．０５％、及び０．１％）を、マスターミックスに添加してから、３８４ウェルのマイクロタイタープレートに中に１０μＬの反応／ウェルに分割した（９６ウェルで複製して試験した４つの異なる消泡剤濃度の各々）。増幅に先立ち、プレーティング及び１０００ｒｐｍの６０秒間の遠心の後、各々の反応ウェル内の気泡形成を肉眼で検査した。次いで、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のデフォルトの高速サイクル条件を製造者の指示に従って使用して、増幅を実施した。図５Ａ〜図５Ｄ及び図６Ａ〜図６Ｄにおいて、グラフ中の水平及び赤色曲線は、ＲＯＸパッシブリファレンス色素の蛍光シグナルを示し、緑色曲線は温度サイクリング中のＰＣＲ標的のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎの色素蛍光を追跡する。
【０１５５】
図５Ａ〜図５Ｄに示すように、Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４を添加しないとき、左上のプロットは、サイクリングの前に８７個の気泡が観察され、これらの気泡がサイクル０〜３６の間のいずこかで消失したことを示す（ＲＯＸ蛍光の増加によって示される）。０．０１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を添加するとき、６０個の気泡がＰＣＲの前に計数され、反応の第１のサイクルの前に排除されたようであった。０．０５％及び０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  ２０４を添加するとき、プレートの遠心分離後に気泡は観察されず、ＲＯＸパッシブ信号に影響しなかった。
【０１５６】
図６Ａ〜図６Ｄに示すように、Ａｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５を添加しないとき、左上のプロットは、サイクリングの前に９２個の気泡が観察され、これらの気泡がサイクル０〜４０の間のいずこかで消失したことを示す（ＲＯＸ蛍光の増加によって示される）。０．０１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５を添加するとき、１０個の気泡がＰＣＲの前に計数され、反応の第２のサイクルの前に排除されたようであった。０．０５％及び０．１％のＡｎｔｉｆｏａｍ  ＳＥ−１５を添加するとき、プレートの遠心分離後に気泡は観察されず、ＲＯＸパッシブ信号に影響しなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【国際調査報告】
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