(57)【要約】  急性腎傷害を発症するリスクがある被験体を同定するための方法、キット、及び組成物が本明細書で提供される。これらの方法、キット、及び組成物は、心血管手術などの外科的介入を受ける前、又は化学療法を開始する前に、急性腎傷害を発症するリスクがある被験体を同定するのに有用である。特に、p16及び/又はp14のレベルが、これらの被験体の急性腎傷害のリスクを同定するのに有用である。また、急性腎傷害を発症するリスクがある被験体の同定において有用である、p16及び/又はp14の一部又は全部に対応する非天然DNA配列も本明細書に記載される。【選択図】  図１
2019511928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法であって、
a)心血管外科的介入又に被験体から血液試料を取得するステップと;
b)配列が配列番号2〜5の1つ以上に対する85%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む第2のDNA配列セグメントにホスホジエステル結合により接続された配列番号1に対する88%の同一性を有する第1のDNA配列セグメントを含む、血液試料から非天然DNA配列を生成するステップと;
c)該非天然DNA配列のレベルを検出するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ(a)の血液試料から末梢血Tリンパ球を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
d)非天然DNA配列のレベルと、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベルとを比較するステップと;
e)非天然DNA配列のレベルが、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベルと等しいか、又はそれより高い場合、被験体を急性腎傷害のリスクがあると同定するステップと
をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第1の配列セグメントが、配列番号2〜5のいずれか1つに対する85%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む第3のDNA配列セグメントに、ホスホジエステル結合により接続されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
非天然DNA配列が、5'から3'の方向に、配列番号2、配列番号1、及び配列番号4の一部又は全部を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
非天然DNA配列が、5'から3'の方向に、配列番号3、配列番号1、及び配列番号4の一部又は全部を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
合計組合せ配列の長さが30〜150個の塩基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
合計組合せ配列の長さが30〜75個の塩基を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列が配列番号6、7、若しくは25又はその組合せを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非天然DNA配列。
【請求項１０】
方法が約30%〜約100%の感度を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
方法が約30%〜約100%の特異度を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
予め決定された閾値がROC分析により決定されたものである、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法であって、
a)被験体が心血管外科的介入を受ける前に被験体から血液試料を取得するステップと;
b)試料中のp14ARF又はp16INK4aの遺伝子発現レベルを検出するステップと;
c)試料中のp14ARF又はp16INK4aの遺伝子発現レベルと、遺伝子発現の予め決定された閾値レベルとを比較するステップと;
d)p14ARF又はp16INK4aの少なくとも一方の遺伝子発現レベルが、遺伝子発現の予め決定された閾値レベルと等しいか、又はそれより高い場合、被験体を急性腎傷害のリスクがあると同定するステップと
を含む、前記方法。
【請求項１４】
ステップ(a)の血液試料から末梢血Tリンパ球を単離するステップと、該試料に由来する末梢血Tリンパ球中のp14ARF又はp16INK4aの発現レベルを検出するステップとをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子発現のレベルが、定量PCR、マイクロアレイ、又はRNA配列決定を含む方法により検出される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現のレベルが、試料中のp14ARF又はp16INK4aの遺伝子産物を検出することにより検出される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
予め決定された閾値がROC分析により決定される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
心血管外科的介入が、心臓カテーテル処置を含む、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
方法が約30%〜約100%の感度を有する、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法が約30%〜約100%の特異度を有する、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
心臓手術の被験体における急性腎傷害を診断及び処置する方法であって、
(a)請求項１〜１２及び請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の急性腎傷害のリスクがある被験体を同定するステップと、
(b)前記被験体に、急性腎傷害のための1つ以上の予防的処置を投与することにより心臓手術前に該被験体を処置するステップと
を含む、前記方法。
【請求項２２】
心臓手術の被験体における急性腎傷害を診断及び処置する方法であって、
a) 臨床検査の結果を要求するステップ、ここで前記臨床検査は、請求項１〜１２及び請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法を含むものである、及び
b)前記被験体に、急性腎傷害のための1つ以上の予防的処置を投与することにより、心臓手術前に被験体を処置するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
1つ以上の予防的処置が、等張性塩化ナトリウム溶液を含む静脈内容量水分補給、液体、血液製剤及び昇圧剤の投与を含む血行力学パラメータのプロトコールに基づく管理、診断のために使用される造影剤の量の最小化、ACE阻害剤、NSAID及び手術前に腎傷害を引き起こすことが知られる他の薬物の中止を含むAKIの他の増悪因子の回避、血管拡張剤、カルシウムチャンネル遮断剤、強心剤、アミノフィリン、増殖因子、血管作動性ペプチド、接着分子、若しくはエンドセリン阻害剤を含む薬学的活性剤（薬学的に活性な薬剤）の投与、又はループ利尿剤を含む利尿剤の限定的使用を含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するためのキットであって、
a)プライマーとプローブのセットを含む定量的PCRにより被験体の生物学的試料から請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非天然DNA配列を調製し、増幅するための試薬のセット;
c)参照又は対照RNA;
d)被験体が急性腎傷害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための指示書のセットを含む、前記キット。
【請求項２５】
非天然DNA配列を調製し、増幅するためのプライマーとプローブのセットが、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号16、配列番号17、若しくは配列番号18、又はその組合せを含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
急性腎傷害を発症するリスクがある被験体を同定するための方法、キット、及び組成物が本明細書で提供される。これらの方法、キット、及び組成物は、心血管手術などの外科的介入を受ける前、又は化学療法を開始する前に、急性腎傷害を発症するリスクがある被験体を同定するのに有用である。また、急性腎傷害を発症するリスクがある被験体の同定において有用である非天然DNA配列も本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００２】
急性腎傷害(AKI)は、虚血、炎症疾患又は腎臓毒性に起因する腎機能の一過的喪失である。AKIの病因は複雑であり、いくつかの血行力学、炎症、代謝及び腎臓毒性因子を含み得る。院内獲得型AKIは、一般的には心血管手術及び侵襲的な冠動脈造影により引き起こされる。AKIの発生率は、心臓介入患者においては30%に達することがあり、その発症は、病院内での死亡のリスクの増大と独立に関連する。通常、AKIが明らかとなるには術後2〜3日かかり、少なくとも0.3mg/dLの絶対血清クレアチニン(SCr)レベルの増加又はベースラインレベルに対する50%の相対増加率を特徴とする。AKIと関連する死亡率は、いくらかの患者集団においては50%を超えることがあり、支持療法の進歩にも拘わらず、依然として高い。わずか約1%のAKI患者が最大300%のSCr増加を経験し、末期腎疾患に進行するが、血清クレアチニンのわずかな増加(50%)でも、30日死亡率の有意な増加、入院期間の延長、並びに長期的な心及び腎イベントと関連し、AKIを危険かつコストがかかるものにする。
【０００３】
AKIを発症するリスクが高い患者を同定するための一般に受け入れられている診断法はないが、いくつかの臨床マーカー及び患者特性が、AKIを発症する患者のリスクの増大と関連するものとして同定されている。一般に、元々存在する腎不全又は糖尿病を有する患者は、AKIを発症するリスクがより高い。しかしながら、ベースライン腎機能とは関係なく、AKIを発症する患者は、AKIを発症しない患者と比較して、合併症のリスクが増大している。
【０００４】
伝統的には、医師はクレアチニンを測定して、腎機能をチェックする。クレアチニンレベルは、血清クレアチニン、年齢、及び性別を使用して推算糸球体濾過量(eGFR)を算出するために使用される。60mL/min/1.73m2を超えるeGFRを有する患者は、正常な腎機能を有すると考えられるが、59〜15mL/min/1.73m2のeGFRを有する患者は腎疾患を有し得る。
【０００５】
クレアチニン/eGFRは依然として最も広く測定されている腎機能の指標であるが、GFR推定値は、特に高齢患者及び腎傷害を示すか、又はeGFRを算出するために使用される範囲から外れた体格指数(BMI)を有する患者においては依然として不正確である。さらに、入院患者におけるAKI診断は、患者の入院を通してクレアチニンレベルを連続的にモニタリングすることにより達成することができる。しかしながら、クレアチニンの変化は、典型的には、腎傷害が起こった後、2〜3日までは検出不可能であり、この時点で、約50%の腎機能が既に失われている。かくして、クレアチニンレベルの測定は、一般的には、入院設定におけるAKIの早期検出にとって、特に、外来処置を受けている患者における院内獲得型AKIの検出にとって無効な戦略である。
【０００６】
多くの心血管障害の診断及び処置のための外来カテーテル処置は、実際の、又は認識されている費用軽減のリスクと関連することが多いため、患者及び第三者支払人にとってますますポピュラーになっている。しかしながら、全ての手順にはリスクがある。心臓手術を受けている患者は、血管形成術を受けている患者と比較して有意に高い院内死亡率(30日以内)を有するが、血管形成術を受けている患者は、心臓手術患者と比較して有意に高率の反復血行再建術を有する。カテーテル患者もまた、心臓カテーテル処置において頻繁に使用される造影剤の投与後の腎機能の急性的な低下である、造影剤誘導性AKI(CI-AKI)又は造影剤誘導性腎症(CIN)に罹りやすい。CI-AKIを経験する患者は一般に、CI-AKIを有さない患者よりも多くの合併症、入院の延長、及び死亡を含む有害な長期的転帰を有する。さらに、重篤な、多枝病変患者における心臓手術は、血管形成術よりも生存利益を提供すると考えられ、その利益は、早ければ処置後2.5年で見られる。したがって、カテーテル処置と開胸心臓処置は両方とも、入院誘導性AKIのリスクを抱える。
【０００７】
AKIの早期診断は、傷害の過程において早期に実施し、その後の腎機能の喪失を予測することができる十分な精度の検査が存在しないため、問題が多かった。この問題に応答して、いくつかのバイオマーカーが、AKIの早期診断の早期検出のための可能性のある手段として最近調査されている。これらのバイオマーカーのうち、特に有望な結果は、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)、シスタチンC、及びNephroCheckと集合的に命名された、最近認可されたTIMP-2/IGFBP7バイオマーカーパネルについて報告されている。例えば、尿中NGALは、小児心臓手術後のAKIの発生、持続期間及び重症度の予測において有用であると考えられ、血清シスタチンCは、重病患者においては血清クレアチニンよりも1〜2日早くAKIを予測できる。また、血清シスタチンCは、慢性腎疾患を検出するための血清クレアチニンよりも優れていると考えられ、クレアチニンと違って、シスタチンCは、体格指数、食事、又は薬物により影響されない。Nephrocheckは、入場の12h以内に、ICUに入場した患者においてAKIを発症するリスクを予測することができる；しかしながら、それは50%の偽陽性率を有する。
【０００８】
心血管手術患者におけるAKIの発症を防止する又は軽減するための手段として、いくつかの予防法が利用可能である。しかしながら、これらの手段は、合併症がないわけではない。例えば、心臓処置及び限られた容量の造影剤の投与の前及び間の生理食塩溶液による静脈容量拡張は、高リスク患者におけるAKI防止に向かう有意な利益をもたらす。しかしながら、そのような処置は、電解質不均衡、胃腸障害及び高血圧などの合併症を引き起こすことがあり、したがって、低リスク患者における幅広い使用には適さない。
【０００９】
かくして、心血管処置後にAKIを発症するリスクが高い心血管外科的介入前の患者を同定するために使用することができるさらなるバイオマーカーが必要である。そのようなバイオマーカーにより、医師は、術前、術中、及び術後の手段を含む、腎保護戦略を用いてこれらの患者を標的とすることができ、また、それらは患者の転帰を改善する。
【発明の概要】
【００１０】
急性腎傷害を発症するリスクがある被験体を同定するための方法、キット、及び組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、患者試料中でp14ARF及びp16INK4aのレベルが測定される。所定の閾値を超えるこれらのバイオマーカーのレベルは、急性腎傷害を発症するリスクと一致する。p14ARF及びp16INK4aのレベルを、本明細書に記載の任意の好適な手段により測定することができる。いくつかの実施形態においては、急性腎傷害を発症するリスクは、非天然DNA配列のレベルを測定することにより決定される。
【００１１】
本明細書に記載の一実施形態は、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも85%の同一性を有する5〜316塩基を含む第2のDNA配列セグメントに、ホスホジエステル結合により接続された、配列番号1に対する88%の同一性を有する第1のDNA配列セグメントを含む、非天然DNA配列である。
【００１２】
本明細書に記載の別の実施形態は、心血管外科的介入前の被験体から非天然DNA配列を生成する方法であって、被験体から血液試料を取得すること、及び血液試料から非天然DNA配列を生成することを含み、該配列が、配列番号2〜5のいずれか1つに対する85%の同一性を有する5〜316塩基を含む第2のDNA配列セグメントに、ホスホジエステル結合により接続された、配列番号1に対する88%の同一性を有する第1のDNA配列セグメントを含む、前記方法である。別の態様では、前記方法は、血液試料から末梢血Tリンパ球を単離することをさらに含む。一態様では、前記方法は、血液試料からRNAを抽出すること、及びcDNAライブラリーを生成することをさらに含む。別の態様では、前記方法は、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAライブラリーから非天然DNA配列を増幅することをさらに含む。別の態様では、増幅は、配列番号8〜13又は16〜18のいずれか1つに記載の1つ以上のプライマー及びプローブを含む。別の態様では、前記方法は、血液試料からRNAを抽出すること、及びcDNAライブラリーを生成することをさらに含む。別の態様では、前記方法は、ポリメラーゼ連鎖反応によりcDNAライブラリーから非天然DNA配列を増幅することをさらに含む。
【００１３】
本明細書に記載の別の実施形態においては、非天然DNA配列を生成する方法は、非天然DNA配列のレベルを検出することをさらに含む。別の態様では、前記方法は、非天然DNA配列のレベルが、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベル（所定の閾値レベル）と等しいか、又はそれより高い場合、急性腎傷害のリスクがあると被験体を同定することをさらに含み、ここで、閾値より上のレベルは、急性腎傷害を示す。
【００１４】
本明細書に記載の別の実施形態は、a)心血管外科的介入前の被験体から血液試料を取得すること; b)配列が配列番号2〜5の1つ以上に対する85%の同一性を有する5〜316塩基を含む第2のDNA配列セグメントに、ホスホジエステル結合により接続された、配列番号1に対する88%の同一性を有する第1のDNA配列セグメントを含む、血液試料から非天然DNA配列を生成すること；及びc)非天然DNA配列のレベルを検出することを含む、心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法である。一態様では、前記方法は、ステップ(a)の血液試料から、末梢血Tリンパ球を単離することをさらに含む。別の態様では、前記方法は、d)非天然DNA配列のレベルと、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベルとを比較すること； e)非天然DNA配列のレベルが、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベルと等しいか、又はそれより高い場合、急性腎傷害のリスクがあると被験体を同定することをさらに含む。
【００１５】
本明細書に記載の別の実施形態は、a)被験体が心血管外科的介入を受ける前に被験体から血液試料を取得すること; b)試料中のp14ARF及びp16INK4aの遺伝子発現レベルを検出すること; c)試料中のp14ARF及びp16INK4aの遺伝子発現レベルと、遺伝子発現の予め決定された閾値レベルとを比較すること;並びにd) p14ARF及びp16INK4aの少なくとも1つの遺伝子発現レベルが、遺伝子発現の予め決定された閾値レベルと等しいか、又はそれよりも高い場合、急性腎傷害のリスクがあると被験体を同定することを含む、心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法である。一態様においては、前記方法は、ステップ(a)の血液試料から末梢血Tリンパ球を単離すること、及び試料に由来する末梢血Tリンパ球中のp14ARF及びp16INK4aの発現レベルを検出することをさらに含む。別の態様においては、遺伝子発現のレベルは、定量PCR(定量的PCR)、マイクロアレイ、又はRNA配列決定を含む方法により検出される。別の態様においては、遺伝子発現のレベルは、試料中のp14ARF及びp16INK4aの遺伝子産物を検出することにより検出される。別の態様においては、遺伝子産物は、固相イムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、又は2-Dゲル分離を含む方法により検出される。別の態様では、予め決定された閾値(所定の閾値)は、ROC分析により決定される。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、心血管外科的介入は、冠動脈バイパス術である。いくつかの他の態様においては、心血管外科的介入は、心臓カテーテル処置である。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の非天然DNA配列は、配列番号2〜5のいずれか1つに対する85%の同一性を有する5〜316塩基を含む第3のDNA配列セグメントにホスホジエステル結合により接続されている。いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号2、配列番号1、及び配列番号4を含む。いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号3、配列番号1、及び配列番号4を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、30〜150塩基の合計の組み合わせた配列長を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、30〜75塩基の合計の組み合わせた配列長を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、30〜50塩基の合計の組み合わせた配列長を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、1つ以上の非天然塩基を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号6である。
【００２０】
いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号7である。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号25である。
【００２２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、心血管外科的介入前の被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法は、約30%〜約100%の感度を有する（含む）。いくつかの態様においては、同定は、約50%〜約100%の感度を有する。いくつかの態様においては、同定は、約70%〜約100%の感度を有する。
【００２３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、心血管外科的介入前の被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法は、約30%〜約100%の特異度を有する。いくつかの態様においては、同定は、約50%〜約100%の特異度を有する。いくつかの態様においては、同定は、約70%〜約100%の特異度を有する。
【００２４】
本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の方法により急性腎傷害のリスクがある被験体を同定すること、及び急性腎傷害のための1つ以上の予防的処置を被験体に投与することにより心臓手術前に被験体を処置することを含む、心臓手術被験体における急性腎傷害を処置するための方法である。
【００２５】
本明細書に記載の別の実施形態は、a)本明細書に記載の急性腎傷害のリスクがある被験体を同定する方法を含む臨床検査の結果を要求する(請求する)こと、及びb)急性腎傷害のための1つ以上の予防的処置を被験体に投与することにより心臓手術前に被験体を処置することを含む、心臓手術被験体における急性腎傷害を処置するための方法である。
【００２６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、1つ以上の予防的処置は、等張性塩化ナトリウム溶液を含む静脈内容量水分補給、液体、血液製剤及び昇圧剤の投与を含む血行力学パラメータのプロトコールに基づく管理、診断のために使用される造影剤の量の最小化、ACE阻害剤、NSAID及び手術前に腎傷害を引き起こすことが知られる他の薬物の中止を含むAKIの他の増悪因子の回避、血管拡張剤、カルシウムチャンネル遮断剤、強心剤、アミノフィリン、増殖因子、血管作動性ペプチド、接着分子、若しくはエンドセリン阻害剤を含む薬学的活性剤の投与、又はループ利尿剤を含む利尿剤の限定的使用を含む。
【００２７】
本明細書に記載の別の実施形態は、a)プライマーとプローブのセットを含む定量PCRにより被験体の生物学的試料から本明細書に記載の方法により生成される本明細書に記載の非天然DNA配列を生成するための試薬のセット; b)参照又は対照RNA; 及びc)被験体が急性腎傷害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための指示書のセットを含む、心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するためのキットである。一態様においては、キットは、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号16、配列番号17、若しくは配列番号18の1つ以上、又はその組合せを含む、プライマーとプローブのセットを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】臨床評価項目（臨床エンドポイント）である急性腎傷害(AKI)に関するp16Ink4a発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図２】臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図３】臨床評価項目である30日の主要有害臨床事象(30d-MACE)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図４】野生型を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である(パネルA)。
【図５】ヘテロ接合性rs10757278遺伝子座を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である(AA又はAG;パネルB)。
【図６】変異rs10757278遺伝子座を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である(GG;パネルC)。
【図７】変異rs10757278遺伝子座を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である(GG)。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の段落は、本明細書に記載の本発明の実施形態をより詳細に定義するものである。本明細書に記載の本発明の範囲、実施形態、又は特定の態様から逸脱することなく、好適な改変及び適合化を行うことができることが当業者には容易に明らかとなるため、以下の実施形態は、本発明を限定するか、又はその範囲を狭めることを意味するものではない。本明細書で引用される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００３０】
本明細書を解釈するために、以下の用語及び定義が適用され、好適な場合はいつでも、単数形で使用される用語は、複数も含み、その逆も然りである。以下に記載される定義のいずれかが、参照により本明細書に組み込まれる文献のいずれかと矛盾する事象においては、以下に記載の定義が効力を持つものとする。
【００３１】
本明細書で使用される語句「心血管外科的介入」は、患者の心血管系に影響する1つ以上の侵襲的な処置を意味する。非限定例は、バルーン血管形成術及び冠動脈バルーン拡張を含む冠動脈血管形成術、経皮冠動脈介入、レーザー血管形成術、冠動脈バイパス移植手術(CABG)、弁修復術、アクセス制限冠動脈手術、ポートアクセス冠動脈バイパス(PACAB又はPortCAB)、及び低侵襲性冠動脈バイパス移植(MIDCAB)を含む低侵襲性心臓手術、カテーテルアブレーション、経心筋的血行再建術、心臓移植、並びに人工心臓弁手術である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、ヒト又は他の動物である個体であってよい。「患者」とは、処置する医師(例えば、医師又は獣医師)にかかっている被験体のクラスを指す。被験体は、任意の年齢の雄性又は雌性であってもよい。例示的かつ非限定的な被験体としては、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、イヌ、及びネコが挙げられる。一実施形態においては、被験体は、本明細書に記載の心血管外科的介入などの、外科的介入を受けているか、又は受けるであろう。他の実施形態においては、被験体は、化学療法剤、例えば、シスプラチンで処置されているか、又は処置されるであろう。
【００３３】
本明細書で使用される語句「急性腎傷害のための処置」は、心血管外科的介入を受けている患者においてAKIの発生を軽減する、又は防止することが知られる外科的処置の前、間、及び/又は後に、１つ以上の薬学的活性剤を投与すること、1つ以上の処置を実施すること、又は患者の心血管外科的処置の１つ以上のプロトコールを追加若しくは改変することを意味する。そのような薬剤、処置又はプロトコールは、当業者には公知である。非限定例としては、等張性塩化ナトリウム溶液、重炭酸バッファー、及びPlasmalyteを含む静脈内容量水分補給、液体、血液製剤及び昇圧剤の投与などの血行力学パラメータのプロトコールに基づく管理、診断に用いられる造影剤の量の最小化、ACE阻害剤、NSAID及び手術前に急性腎傷害を引き起こすことが知られる他の薬物の中止などのAKIの他の増悪因子の回避、血管拡張剤、カルシウムチャンネル遮断剤、強心剤、アミノフィリン、増殖因子、血管作動性ペプチド、接着分子、及びエンドセリン阻害剤などの薬学的活性剤の投与、並びに利尿剤、特に、ループ利尿剤の注意深い使用が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用される用語「試料（サンプル）」とは、ゲノム情報を含有する被験体から得られる、又は誘導される組成物を指す。試料は、全血又は分画された血液試料であってもよい。試料は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、及び単球を含む末梢血白血球であってもよい。いくつかの実施形態においては、試料は、B細胞、T細胞及びNK細胞から選択される末梢血リンパ球である。一実施形態においては、試料は、末梢血Tリンパ球(例えば、T細胞)又はT細胞のサブセット(例えば、CD3+細胞)である。別の実施形態においては、試料は組織生検である。
【００３５】
本明細書で使用される用語「遺伝子」とは、RNAをコードする核酸、例えば、限定されるものではないが、ポリペプチドをコードする構造遺伝子などの核酸配列を指す。用語「遺伝子」はまた、生物学的機能と関連するDNAの任意のセグメントを広く指す。そのようなものとして、用語「遺伝子」は、限定されるものではないが、コード配列、プロモーター領域、転写調節配列、調節タンパク質のための特異的認識配列である非発現DNAセグメント、遺伝子発現に寄与する非発現DNAセグメント、所望のパラメータを有するように設計されたDNAセグメント、又はその組合せを含む配列を包含する。生物学的試料からのクローニング、既知の、又は予測された配列情報に基づく合成、及び１つ以上の既存の配列からの組換え誘導を含む、様々な方法により遺伝子を取得することができる。
【００３６】
用語「遺伝子発現」とは一般的に、生物学的に活性なポリペプチドがDNA配列から産生され、細胞中で生物学的活性を示す細胞プロセスを指す。そのようなものとして、遺伝子発現は、転写及び翻訳のプロセスを含むが、遺伝子又は遺伝子産物の生物学的活性に影響し得る転写後及び翻訳後プロセスも含む。これらのプロセスとしては、限定されるものではないが、RNAの合成、プロセッシング、及び輸送、並びにポリペプチドの合成、輸送、及びポリペプチドの翻訳後改変が挙げられる。さらに、細胞内でのタンパク質間相互作用に影響するプロセスも、本明細書に定義される遺伝子発現に影響し得る。いくつかの実施形態においては、語句「遺伝子発現」とは、これらのプロセスのサブセットを指す。そのようなものとして、「遺伝子発現」とは、いくつかの実施形態においては、細胞型又は組織中での遺伝子の転写を指す。かくして、語句「発現レベル」は、細胞中でのRNA分子の安定状態レベルを指してもよく、RNA分子は遺伝子の転写産物である。発現レベルを、都合のよいどのような用語で表してもよく、限定されるものではないが、絶対尺度及び相対尺度が挙げられる。例えば、発現レベルを、細胞あたり、又は細胞から単離された1マイクログラムの全RNAあたりのmRNA転写物の分子数として表すことができる。あるいは、又はさらに、第1の細胞中での発現レベルを、第2の細胞に対する相対量(例えば、倍数増加又は倍数減少)として記述することができ、ここで、第1の細胞及び第2の細胞は、異なる被験体に由来する同じ細胞型、同じ被験体における異なる細胞型、又は同じ被験体におけるが、異なる時間(例えば、所与の処置の前後、異なる時間的時点など)にアッセイされた同じ細胞型である。
【００３７】
用語「遺伝子産物」とは一般的に、タンパク質、ペプチド、又は酵素などの、転写される遺伝子の産物を指す。しかしながら、遺伝子産物はまた、機能的RNA(fRNA)、例えば、マイクロRNA(miRNA)、piRNA、リボソームRNA(rRNA)、転移RNA(tRNA)などの、非タンパク質を指してもよい。
【００３８】
本明細書で使用される用語「鋳型核酸」及び「標的核酸」とはそれぞれ、本明細書に上記された生物学的試料から単離された核酸を指す。
【００３９】
用語「標的特異的プライマー」とは、標的配列、例えば、p16INK4a遺伝子又はARF遺伝子から誘導されるmRNA転写物中に存在する標的配列に選択的及び予測的にハイブリダイズするプライマーを指す。標的特異的プライマーを、標的核酸の既知のヌクレオチド配列に対して相補的であるように選択又は合成することができる。
【００４０】
本明細書で使用される用語「プライマー」とは、いくつかの実施形態においては、約6個以上のヌクレオチド、いくつかの実施形態においては、約10〜20個のヌクレオチド(例えば、15マー)、いくつかの実施形態においては、約20〜30個のヌクレオチド(例えば、22マー)を含む連続配列を指す。本明細書に開示される主題の方法を実施するために使用されるプライマーは、核酸分子上での重合の開始を提供するための十分な長さ及び適切な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。
【００４１】
用語「感度」とは、バイナリー検査において実際の陽性に同定された結果の割合(例えば、診断検査において疾患又は状態を有すると正確に同定される、疾患又は状態を有すると同定される個体の割合)の測定値を指す。
【００４２】
用語「特異度」とは、バイナリー検査において実際の陰性に同定された結果の割合(例えば、診断検査において疾患又は状態を有さないと正確に同定される、疾患又は状態を有さないと同定される個体の割合)の測定値を指す。
【００４３】
用語「陰性予測値」とは、診断検査において疾患又は状態について実際に陰性である同定された陰性結果の割合を指す。
【００４４】
用語「陽性予測値」とは、診断検査において疾患又は状態について実際に陽性である同定された陽性結果の割合を指す。
【００４５】
用語「閾値」とは、測定されたパラメータが確立された特定のレベルを指す。正確な閾値及びAKIなどの疾患状態との診断的相関は、遺伝子発現測定アッセイに応じて変化し、AKIの獲得について陽性及び陰性であることが示されている参照試料との比較により経験的に決定することができる。この閾値を超える、及びこの閾値より低い発現レベルは、それぞれ、陽性又は陰性の診断結果を示す。閾値のための特異的カットオフは、被験体集団のための望ましい感度及び特異度に応じて設定することができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態においては、非天然DNA配列の閾値レベルを使用して、AKIを獲得する可能性があると被験体を同定することができる。
【００４６】
本明細書で使用される用語「予測すること」及び「尤度」は、結果が100%の確度で起こっていることを意味するものではない。そうではなく、結果が起こらないよりも起こる可能性がより高いことを意味することが意図される。「予測する」又は「予測を行う」ために取られる行動は、結果が起こらないものよりも起こる可能性がより高い尤度の決定を含んでもよい。
【００４７】
用語「p14ARF」とは、サイクリン依存的キナーゼ阻害剤2a(CDKN2A)転写物変異体4によりコードされる遺伝子を指す。この遺伝子は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)登録番号NM_058195.3(mRNA)及びNP_478102.1(タンパク質)に対応する。本明細書で使用される場合、p14ARFとは、p14又は任意の他の一般的な遺伝子同義語も指す。
【００４８】
用語「p16INK4a」とは、サイクリン依存的キナーゼ阻害剤2a(CDKN2A)転写物変異体4によりコードされる遺伝子を指す。この遺伝子は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)登録番号NM_000077.4(mRNA)及びNP_000068.1(タンパク質)に対応する。本明細書で使用される場合、p16INK4aとは、p16又は任意の他の一般的な遺伝子同義語も指す。
【００４９】
急性透析品質イニシアチブ(Acute Dialysis Quality Initiative)により作出されたリスク(Risk)、損傷(Injury)、不全(Failure);及び喪失(Loss); 並びに末期(End-stage)腎臓病(RIFLE)基準などの、腎傷害の重症度のいくつかの定義が存在する。リスク(Risk)は、ベースラインと比較した血清クレアチニンの50〜99%の増加と定義される; 損傷(Injury)は、100〜199%の増加と定義される; 不全(Failure)は、200%を超える増加と定義される、及び喪失(Loss)は、透析を必要とする4週間を超える急性腎不全と定義される。RIFLE基準は、2012年にKidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO)により出された、より新しい指針に組み込まれた。本明細書で使用される場合、AKIは、48時間以内の0.3mg/dL以上までの、又は最新7日以内の50%以上を超える血清クレアチニンの増加と定義される。AKIの重症度は、以下のステージ:ステージ1-ベースラインと比較した血清クレアチニンの50〜99%の増加、ステージ2-100〜199%の増加、及びステージ3-200%を超える増加により定義される。
【００５０】
別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５１】
AKIは、30日死亡率の有意な増加、入院の延長、並びに長期的な有害心イベント及び腎イベントと関連する。支持療法は、AKIを経験する患者を処置するのに有効である場合もあるが、AKIの発生の防止は、一度発症したらAKIを処置するのに実質的により有効である。例えば、心血管外科的介入を受ける患者は、30%もの発生率で院内獲得型AKIを経験する。さらに、AKIは、標準的な化学療法レジメンを受けるがん患者の一般的な副作用である。したがって、侵襲性外科的処置の前又は化学療法を開始する前にAKIを発症するリスクがある患者を同定することは、より良好な患者転帰及び医療コストの減少を提供することができる。あるいは、外科手術の直後に、又は化学療法の開始後にAKIを発症するリスクがある患者を同定することは、AKIの処置を開始させることができる。
【００５２】
本明細書に記載されるように、INK4a/ARF遺伝子座は、AKI感受性を確立するのに有用である。具体的には、p14ARF及び/又はp16INK4aのレベルは、AKI感受性を示す。いくつかの研究において、p14ARFは、AKIの発生のより信頼できる予測因子であると考えられるが、p16INK4aは、AKIの早期診断の重症度の指標であり得る。第9p21染色体上のINK4a/ARF遺伝子座(CDKN2Aとも呼ばれる)は、2つの異なる遺伝子、すなわち、p14ARF及びp16INK4aをコードする。これらの遺伝子の発現の変化は、様々なヒト新生物と関連していた。米国特許第8,158,347号は、p14ARF及び/又はp16INK4aの発現レベルを定量すること、並びにそのようなレベルと、ある特定の標準とを比較して、細胞又は組織が、その細胞又は組織の実年齢より上であるか、又は下であるか、又は同じであるかどうかを決定することにより、細胞又は組織の分子年齢を決定するための方法を記載する。
【００５３】
この理解にも拘わらず、AKI中でのINK4a/ARF遺伝子座の役割は、本開示前には、完全に未知であった。したがって、これらの遺伝子のレベルの決定もまた、様々な疾患の素因を有する患者の同定、臓器移植に関する患者の好適性の同定、又は化学療法若しくは放射線療法により引き起こされる毒性などの療法誘導性毒性の予測において有用であり得る。
【００５４】
したがって、本発明は、外科的介入の前若しくは後、又は化学療法を開始する前若しくは後に、被験体におけるAKIを発症するリスクを同定するための非天然DNA配列、方法、及びキットを提供する。この方法は、被験体から血液試料を取得すること、及び試料中のバイオマーカー(例えば、p14ARF及びp16INK4a)の発現レベルを検出することを含む。次いで、これらのバイオマーカーのレベルを、所定の発現レベル閾値と比較する。バイオマーカーの発現レベルが所定の発現レベル閾値と等しいか、又はそれより高い場合、被験体は、急性腎傷害のリスクがあると同定される。
【００５５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、外科的介入を受けるであろう、若しくは受けた被験体から、又は化学療法剤を投与される前若しくは後の被験体から血液試料を取得することを含む、被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法である。いくつかの実施形態においては、前記方法は、p14ARFの遺伝子発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、p16INK4aの遺伝子発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、p16INK4a及びp14ARFの遺伝子発現レベルを検出することを含む。いくつかの実施形態においては、前記方法は、試料中のp14ARF、p16INK4a、又はp14ARF及びp16INK4aの遺伝子発現レベルを検出すること;試料中のp14ARF又はp16INK4a又はp14ARF及びp16INK4aの遺伝子発現レベルと、所定の遺伝子発現レベル閾値とを比較すること;並びにp14ARF及びp16INK4aの少なくとも1つの遺伝子発現レベルが、所定の遺伝子発現レベル閾値と等しいか、又はそれより高い場合、患者を、急性腎傷害のリスクがあると同定することを含む。一態様においては、外科的介入は、心血管外科的介入を含む。別の態様においては、被験体は、外科的介入の前にAKIに罹患しやすいと同定される。別の態様においては、被験体は、化学療法剤を受ける前にAKIに罹患しやすいと同定される。
【００５６】
本明細書に記載の他の実施形態は、AKIを発症するリスクがあると同定された患者を処置する方法である。一態様においては、処置は、外科的介入の前に、又は化学療法を開始する前に１つ以上の予防的治療レジメンを投与することを含む。別の態様においては、処置は、外科的介入後に、又は化学療法を開始した後に治療レジメンを投与することを含む。別の態様においては、患者は、AKIを既に有していてもよく、投与される処置はAKIの重症度を軽減するか、又は最小化する。
【００５７】
本明細書に記載の方法を使用して、生物学的試料、より特には、被験体(例えば、ヒト患者)における血液試料中の遺伝子発現を検出することができる。遺伝子発現レベルを、全血試料中で決定することができるか、又はより典型的には、全血試料を、遺伝子発現レベルを決定する前に操作若しくは分画することができる。血液試料の操作は当業界で周知であり、特定の白血球を単離すること、又はより具体的には、Tリンパ球を単離すること、及び単離された細胞型における遺伝子発現レベルを測定することを含む、白血球及び血漿からの赤血球の分離、又は様々な細胞型の互いの分離を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、p14ARF及びp16INK4aの遺伝子発現レベルは、単離されたTリンパ球の試料から測定される。
【００５８】
遺伝子発現のレベルを、当業界で周知の様々な分子生物学技術を使用して決定することができる。例えば、発現レベルを、生物学的試料から単離されたRNAを分析することにより決定しようとする場合、RNA発現レベルを決定するための技術としては、限定されるものではないが、ノーザンブロッティング、ヌクレアーゼ保護アッセイ、定量PCR (例えば、デジタルRT-PCR及び/又はリアルタイム定量的RT-PCR)、分枝DNAアッセイ、RNA seqによるRNAの直接配列決定、nCounter遺伝子発現技術(NanoString Technologies)、及び核酸マイクロアレイが挙げられる。いくつかの実施形態においては、発現レベルは、p14ARF及びp16INK4a遺伝子のための特異的PCRプライマーを用いるリアルタイム定量PCR(RT-PCR)により決定される。p14ARF及びp16INK4aのためのPCRプライマーは、例えば、米国特許第8,158,347号に記載されており、そのような記載は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【００５９】
あるいは、抗体を使用して生物学的試料中のタンパク質レベルを分析することにより、発現レベルを決定することができる。生物学的試料中の特定のタンパク質を定量するための方法は、当業界で公知である。代表的な抗体に基づく技術としては、限定されるものではないが、ELISAなどの免疫検出法、ウェスタンブロッティング、細胞中でのウェスタンブロッティング、ビーズに基づく免疫親和性、免疫親和性カラム、及び2-Dゲル分離が挙げられる。
【００６０】
核酸単離のための方法は、全核酸の同時的単離、又は個々の核酸型(例えば、ゲノムDNA、無細胞RNA、オルガネラDNA、全細胞RNA、mRNA、ポリA+RNA、rRNA、tRNA)の別々の、及び/若しくは連続的な単離、次いで、場合により、複数の核酸型の単一試料中への混合を含んでもよい。そのような単離技術は、当業者には公知である。その後の増幅及び標識化のために使用される核酸は、分光光度測定又は電気泳動分解後の分析(BioAnalyzer、Agilent)により決定された場合、分析的に純粋であってよい。核酸試料は、多糖、タンパク質、及び酵素反応の阻害剤などの夾雑物を含有しないものであってよい。RNA試料がプローブとしての使用について意図される場合、それはヌクレアーゼ夾雑物を含有しないものであってよい。DNA抽出のための樹脂(例えば、BioRad Laboratories, Hercules, Calif., United States of AmericaからのCHELEX(商標)100)を使用して、又は標準的なフェノール抽出及びエタノール沈降により、夾雑物及び阻害剤を除去するか、又は実質的に減少させることができる。場合により、単離された核酸を、増幅前に制限酵素消化又は剪断により断片化してもよい。
【００６１】
目的の特定の核酸配列のためのプライマーを設計するための様々な方法が、当業界で周知である。p14ARF及びp16INK4aを別々に増幅するためのプライマーを、選択された特定の配列に基づいて設計することができる。例えば、p14ARF及びp16INK4a転写物はそれぞれ、ユニークなエクソン1を有するが、エクソン2の一部を共有する。したがって、p14ARF及びp16INK4aのそれぞれに特異的なプライマーを設計するために、フォワードプライマーをそれぞれのユニークなエクソン1について選択し、リバースプライマーを共通のエクソン2について選択することができる。逆に、好適なプライマーを、p14ARF及びp16INK4aの共有部分であるエクソン2を増幅するように設計して、両遺伝子の発現レベルを一緒に決定することができる。さらに、エクソン/イントロン接続部に隣接するプライマーを設計して、例えば、RT-PCR反応におけるゲノムDNA夾雑物に由来する増幅シグナルを除去することが有益であり得る。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態においては、生物学的試料(例えば、末梢血Tリンパ球から抽出されたmRNA)中に存在する特異的mRNA種の存在量を、定量的RT-PCRにより評価する。標準的な分子生物学的技術を特異的PCRプライマーと共に使用して、目的の遺伝子又は複数の遺伝子に対応するmRNA分子を定量的に増幅する。特異的PCRプライマーを設計するため、及びmRNAを含む核酸の定量的増幅を実施するための方法は、当業界で周知である。例えば、Heidら、1996; Sambrook & Russell, 2001; Joyce, 2002; Vandesompeleら、2002を参照されたい。いくつかの実施形態においては、発現レベルを決定するための技術は、TAQMAN(登録商標)Real-time Quantitative PCR System (ThermoFisher Scientific, United States of America)の使用を含む。
【００６３】
目的の遺伝子(例えば、p16INK4a及びp14ARF)のための特異的プライマーを、これらの遺伝子の発現レベルを決定するために用いる。いくつかの実施形態においては、ハウスキーピング遺伝子は、YWHAZ遺伝子である。一態様においては、試料からのp16INK4a及び/又はp14ARFの発現レベルを、混合試料のバッチに由来するハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。別の態様においては、試料からのp16INK4a及び/又はp14ARFの発現レベルを、同じ試料に由来するハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。
【００６４】
増幅及び検出のために使用されるプライマー及びプローブは、放射標識、蛍光標識、又は酵素標識などの検出可能な標識を含んでもよい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,869,717号を参照されたい。ある特定の実施形態においては、プローブは蛍光標識される。蛍光標識されたヌクレオチドを、Kambaraら、Bio/Technol., 6:816-21, (1988); Smithら、Nucl. Acid Res., 13:2399-2412, (1985); 及びSmithら、Nature, 321: 674-679, (1986)(それぞれの内容は、その教示について参照により本明細書に組み込まれるものとする)に記載のものなどの様々な技術により製造することができる。化学的又は酵素的手段により容易に切断されるリンカーアームにより、蛍光色素をデオキシリボースに連結することができる。Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, (1991); Zuckermanら、Polynucleotides Res., 15: 5305-5321, (1987); Sharmaら、Polynucleotides Res.,19:3019, (1991); Giustiら、PCR Methods and Applications, 2:223-227, (1993); Fungら(米国特許第4,757,141号); Stabinsky (米国特許第4,739,044号); Agrawalら、Tetrahedron Letters, 31:1543-1546, (1990); Sproatら、Polynucleotides Res., 15:4837, (1987); 及びNelsonら、Polynucleotides Res., 17:7187-7194, (1989)(それぞれの内容は、その教示について参照により本明細書に組み込まれるものとする)に示されたように、標識をヌクレオチドに結合させるためのいくつかのリンカー及び方法がある。ヌクレオチドに付加することができる一般的な反応基による共有結合のためにフルオロフォア及びクエンチャー分子を誘導体化するための詳細な指針が文献中に存在する。Oligonucleotides and Analogues、上掲; Guistiら、上掲; Agrawalら、上掲; 及びSproatら、上掲に記載のように、フルオロフォア部分をヌクレオチドに結合させるための多くの連結部分及び方法も存在する。
【００６５】
TAQMAN(登録商標)Real-time Quantitative PCR Systemにおいて用いられる定量PCRを、PCR産物に特異的にハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドを使用して検出することができる。典型的には、このプローブオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の1つ以上の検出可能な標識を用いて5'及び/又は3'末端で標識される。いくつかの実施形態においては、5'末端は蛍光標識で標識され、3'末端は蛍光クエンチャーを用いて標識される。いくつかの実施形態においては、5'末端はテトラクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(TET(商標); Applera Corp., Norwalk, Conn., United States of America)及び/又は6-FAM(商標)(Applera Corp.)で標識され、3'末端はテトラメチルローダミン(TAMRA(商標); Applera Corp.)、NFQ、BHQ、及び/又はMGBクエンチャーを含む。
【００６６】
さらなる例示的かつ非限定的な検出可能な標識を、プライマー又はプローブに結合させることができ、それらは直接的又は間接的に検出可能であってもよい。正確な標識は、少なくとも部分的には、使用される特定の型の検出方法に基づいて選択することができる。例示的な検出方法としては、放射性検出、吸光度検出、例えば、UV-可視光線吸収検出、光放射検出、例えば、蛍光;リン光又は化学発光;ラマン散乱が挙げられる。好ましい標識としては、蛍光標識などの光学的に検出可能な標識が挙げられる。蛍光標識の例としては、限定されるものではないが、4-アセトアミド-4'-イソチオシアナトスチルベン-2,2'ジスルホン酸;アクリジン及び誘導体:アクリジン、アクリジンイソチオシアネート;5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS);4-アミノ-N-[3-ビニルスルホニル)フェニルナフタリミド-3,5ジスルホネート;N-(4-アニリノ-1-ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;BODIPY; アレクサ;フルオレシン;コンジュゲート化マルチ色素;ブリリアントイエロー(Brilliant Yellow);クマリン及び誘導体;クマリン、7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC、クマリン120)、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクルアリン(クマラン151);シアニン色素;シアノシン;4',6-ジアミニジノ-2-フェニルインドール(DAPI);5'5''-ジブロモピロガロール-スルホナフタレイン(ブロモピロガロールレッド);7-ジエチルアミノ-3-(4'-イソチオシアナトフェニル)-4-メチルクマリン;ジエチレントリアミン五酢酸;4,4'-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸;4,4'-ジイソチオシアナトスチルベン-2,2'-ジスルホン酸;5-[ジメチルアミノ]ナフタレン-1-スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-イソチオシアネート(DABITC);エオシン及び誘導体;エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシン及び誘導体;エリスロシンB、エリスロシン、イソチオシアネート;エチジウム;フルオレセイン及び誘導体;5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル)アミノフルオ
レセイン(DTAF)、2',7'-ジメトキシ-4'5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、QFITC、(XRITC);フルオレスカミン;IR144;IR1446;マラカイトグリーンイソチオシアネート;4-メチルウンベリフェロネオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラノサニリン;フェノールレッド;B-フィコエリトリン;o-フタルジアルデヒド;ピレン及び誘導体:ピレン、酪酸ピレン、スクシンイミジル1-ピレン;酪酸量子ドット; Reactive Red 4(Cibacron(商標)Brilliant Red 3B-A)ローダミン及び誘導体:6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド); N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA);テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;Atto色素、Cy3;Cy5;Cy5.5;Cy7;IRD700;IRD800;La Jolta Blue;フタロシアニン;並びにナフタロシアニンが挙げられる。他の光学的に検出可能な標識を含む、蛍光標識以外の標識は、本明細書に記載の方法により想定(企図)される。
【００６７】
遺伝子発現レベルを決定するための他の方法を用いることもでき、Amplified Antisense RNA (aaRNA)及びGlobal RNA Amplification (Van Gelderら、1990; Wangら、2000; Hampsonらの米国特許第6,066,457号)などが挙げられるが、これに限らない。本明細書に開示される主題の方法によれば、上記のPCR技術又は関連技術のいずれか1つを用いて、核酸試料を増幅するステップ及び/又は特定の標的核酸の発現を定量するステップを実施することができる。さらに、そのような方法を、核酸の特定のサブセット(例えば、全mRNAに対する特異的mRNA分子)の増幅のために最適化することができ、代表的な最適化基準及び関連する指針を、当業界に見出すことができる。Williams, 1989; Linzら、1990; Cha & Thilly, 1993; McPhersonら、1995; Roux, 1995; Robertson & Walsh-Weller, 1998を参照されたい。
【００６８】
任意の特定のバイオマーカーについて、心血管外科的介入後に院内獲得型AKIを発症する、又は発症しない被験体(例えば、手術前の被験体)に関する遺伝子発現レベルのグラフ分布は、完全に異なるものではなくむしろ重複する。したがって、バイオマーカーを測定する診断検査は、100%の精度で、AKIを発症するリスクがある患者から正常患者又は低リスク患者を絶対的に識別するものではない。重複のグラフ面積は、検査が低リスク又は正常と、高リスクとを識別できない遺伝子発現レベルの範囲と相関する。かくして、検査の開発者は、重複の面積から発現の閾値レベルを選択しなければならず、閾値より上のレベルはAKIを発症するリスクがあると考えられ、閾値より下の発現レベルは正常であるか、又はリスクがないと考えられる。重複の面積が小さいほど、診断検査の精度は高くなる。
【００６９】
院内獲得型AKI(例えば、心血管外科的介入後)を発症する、又は発症しないものを決定するための正確な閾値の決定は、開発されるアッセイ形式に依存するであろう。これらの閾値を、当業者には周知の技術を使用して経験的に決定することができる。例えば、AKIを獲得するリスクを決定するための閾値を、手術を受ける前に遺伝子又は遺伝子産物を測定することができる患者の集団から好適な生物学的試料を取得することにより決定することができる。さらに、血清クレアチニンレベルなどの、術後AKI状態の公知の同定因子も測定して、術後AKIを実際に被った患者を確立する。したがって、有用な患者集団は、AKIを被った患者のセット及びAKIを被らなかった患者のセットを有するであろう。アッセイに関する最適な閾値レベルを、様々な遺伝子発現閾値レベルでAKIを有すると陽性に同定された患者及び陰性に同定された患者の数を算出することにより決定することができる。最適な閾値は、最も高いパーセンテージの患者を、AKIを発症するリスクがあると、及びそのリスクがないと正確に同定し、それにより、2つの集団の患者を識別する遺伝子発現レベルである。
【００７０】
2つの集団を識別する特定の検査の能力を決定するための1つの例示的かつ非限定的な方法は、受信者操作特性(ROC)分析を使用することによるものであってもよい。決定閾値は連続的に変化するため、ROC曲線を描くために、真陽性率(TPR)及び偽陽性率(FPR)が決定される。TPRは感度と直接相関し、FPRは特異度と逆相関する(1-特異度)ため、ROCグラフは、感度対(1-特異度)プロットと呼ばれることもある。ROC曲線の曲線下面積は、把握された測定値が状態の正確な同定を可能にする確率の尺度である。完全な検査は、1.0のROC曲線下面積を有するが、無作為検査は0.5の面積を有する。したがって、ROC分析を使用して分析される任意の実際の診断検査は、0.5〜1.0のどこかのROC曲線下面積を有する。曲線が1.0に近づくほど、検査はより正確である。
【００７１】
ROC分析は、「疾患」サブ集団と、「非疾患」サブ集団とを識別するための特異度及び感度の許容し得るレベルを提供する閾値を選択するために使用されることが多い、一般に、最適な閾値は、左上の角に最も近いROC曲線上の点である(100%の感度；100%の特異度)。しかしながら、疾患又は患者集団に応じて、ROC分析並びに診断検査及び予測モデルを評価するためのその使用のより詳細な説明を、当技術分野において、例えば、Zouら、Circulation. 2007;115:654-657に見出すことができる。
【００７２】
AUCの測定に加えて、疾患を予測する、又は診断するための所与のバイオマーカーの有効性を、診断検査精度のいくつかのさらなる尺度により見積もることができる(Fischerら、Intensive Care Med. 29: 1043-51, 2003に記載されている)。これらの尺度は、感度及び特異度、尤度比(LR)、並びに診断オッズ比(OR)を含む。
【００７３】
一実施形態においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約30%〜約100%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。一態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約50%〜約100%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約70%〜約100%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約30%〜約50%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約40%〜約60%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約50%〜約70%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約60%〜約80%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約70%〜約90%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの特異度は、約30%、約35%、約40%、50%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又はさらには約100%である。
【００７４】
別の実施形態においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約30%〜約100%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。一態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約50%〜約100%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約70%〜約100%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約30%〜約50%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約40%〜約60%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約50%〜約70%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約60%〜約80%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約70%〜約90%の範囲であり、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、AKIを同定するためのアッセイの感度は、約30%、約35%、約40%、50%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又はさらには約100%である。
【００７５】
別の実施形態においては、ROC曲線面積は、約0.5〜約1の範囲の面積であり、特定された範囲内のそれぞれの分数、整数を含む。一態様においては、ROC曲線面積は、少なくとも0.5、少なくとも0.6、少なくとも0.7、少なくとも0.8、少なくとも0.9、又はさらには少なくとも0.95より大きい。
【００７６】
別の実施形態においては、好適な正の尤度比は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも10の比(感度/(1-特異度)として算出される)である；負の尤度比((1-感度)/特異度として算出される)は、1未満、0.5以下、0.3以下、0.1以下である；オッズ比は、1、少なくとも約2以上、少なくとも約3以上、少なくとも約4以上、少なくとも約5以上、又はさらには少なくとも約10以上異なる。
【００７７】
別の実施形態においては、AKIを予測するマーカー(すなわち、p14ARF及び/又はp16INK4aのレベル)を、他のマーカー、例えば、腎臓の健康のマーカーであるシスタチンC、血清クレアチニン、NephroCheck(登録商標)、L-FABPと組み合わせることができる。アッセイ結果を組み合わせるための方法は、多変量ロジスティック回帰、n-of-m分析、決定木分析、ハザード比の算出などの使用を含んでもよい。この一覧は、限定を意味するものではない。これらの方法において、介入前に測定された個々のマーカーを組み合わせることにより決定される複合結果を、あたかもそれ自体がマーカーであるかのように処理することができる;すなわち、個々のマーカーについて本明細書に記載の複合結果について決定された閾値、及び複合結果を、個々の患者のオッズ比を算出するために使用することができる。一態様においては、被験体は、p14ARFの遺伝子発現及び血清クレアチニンレベルを測定することにより、AKIのリスクがあることについて同定される。別の態様においては、別の態様においては、被験体は、p16INK4aの遺伝子発現及び血清クレアチニンレベルを測定することにより、AKIのリスクがあることについて同定される。別の態様においては、被験体は、血清クレアチニンレベルを測定することに加えて、p14ARF及びp16INK4aの遺伝子発現を測定することにより、AKIのリスクがあることについて同定される。
【００７８】
別の実施形態においては、バイオマーカーを使用して、被験体集団を階層化し、p14及びp16の測定値がAKI及び他の有害な転帰を、最も高い感度、特異度、及び正の尤度で予測する集団を同定することができる。これらのマーカーは、臓器機能、炎症状態などのマーカーであってもよく、又は遺伝子マーカーであってもよい。例えば、AKI被験体集団を階層化するための遺伝子マーカーは、染色体遺伝子座9p21に位置する単一ヌクレオチド多型(SNP)、具体的には、rs10757278、rs2383206、rs2383207、又はrs10757274である。これらの遺伝子座のそれぞれの1つの両コピーにおける突然変異は、患者を心血管疾患に罹りやすくすることが知られ、例えば、米国特許出願公開第2009/0150134号を参照されたい。さらに、リスク遺伝子座を有する、又は有さない患者におけるp16及び/又はp14の測定値は、異なる閾値を必要とし得る。
【００７９】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、AKIを発症するリスクがあると被験体を同定するのに有用である非天然DNA配列である。被験体がAKIを発症するリスクがあるかどうかを確立するのに有用であるこれらの非天然DNA配列は、介在イントロン配列を含有することなく、少なくとも1個のエクソン-エクソン境界又は非翻訳領域-エクソン境界と交差する少なくとも1つの配列セグメントを含有する。したがって、これらのDNA配列は、天然のものではない。当業者には理解されるように、これらの非天然DNA配列を、逆転写酵素-PCR、次いで、好適なプライマーを用いる増幅により、RNAなどの天然の生物学的試料から生成することができる。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、当業者に公知の非天然又は改変DNA塩基をさらに含む。
【００８０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、AKIを発症するリスクがある被験体を同定するために非天然DNA配列を使用する方法である。一態様においては、非天然DNA配列は、被験体に由来する試料(例えば、血液試料)から生成され、測定される。非天然DNA配列の予め決定された閾値(所定の閾値)を超えるレベルは、AKIを発症するリスクを示す。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の非天然DNA配列は、p16のmRNA転写物のcDNAに対応する配列番号23の全部又は一部を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号23の10〜1267個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号23の10〜400個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号23の10〜100個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号23の10〜50個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、配列番号23の一部又は全部に対する約85%〜約100%の相同性を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、配列番号23の一部又は全部に対する約85%、約90%、約95%、約99%、又は100%の相同性を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、本明細書に記載の非天然DNA配列は、p14のmRNA転写物のcDNAに対応する配列番号24の全部又は一部を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号24の10〜1164個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号24の10〜400個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号24の10〜100個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、DNA配列は、配列番号24の10〜50個のヌクレオチドを含み、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、配列番号24の一部又は全部に対する約85%〜約100%の相同性を含む。いくつかの態様においては、非天然DNA配列は、配列番号24の一部又は全部に対する約85%、約90%、約95%、約99%、又は100%の相同性を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、p16の一部又は全コード領域に対応する相補的DNA配列を含む(配列番号14)。いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、p14の一部又は全タンパク質コード領域に対応する相補的DNA配列を含む(配列番号15)。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のDNA配列は、p16の5'非翻訳領域(UTR)の一部又は全部をさらに含有してもよい(配列番号19)。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のDNA配列は、p16の3'非翻訳領域(UTR)の一部又は全部をさらに含有してもよい(配列番号20)。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のDNA配列は、p14の5'非翻訳領域(UTR)の一部又は全部をさらに含有してもよい(配列番号21)。いくつかの実施形態においては、本明細書に記載のDNA配列は、p14の3'非翻訳領域(UTR)の一部又は全部をさらに含有してもよい(配列番号22)。
【００８４】
いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号29に対応する一部又は全配列に対応する相補的DNA配列を含む。いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号30に対応する一部又は全配列に対応する相補的DNA配列を含む。いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号31に対応する一部又は全配列に対応する相補的DNA配列を含む。いくつかの実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号32に対応する一部又は全配列に対応する相補的DNA配列を含む。
【００８５】
一実施形態においては、非天然DNA配列は、第2のDNA配列セグメントにホスホジエステル結合により接続された、第1のDNA配列セグメントを含む。別の実施形態においては、第1のDNA配列セグメントは、第1のDNA配列が第2及び第3のDNA配列に隣接するように、第2のDNA配列及び第3のDNA配列にホスホジエステル結合により接続されている。一態様においては、第1のDNA配列は、配列番号1の一部又は全部を含む。別の態様においては、第2及び第3のDNA配列は、配列番号2〜5のいずれか1つの一部又は全部を含む。
【００８６】
一態様においては、第1のDNA配列セグメントは、配列番号1に対する約88%の同一性を有する。別の態様においては、第1のDNA配列セグメントは、配列番号1に対する100%の同一性を有する。
【００８７】
別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む、配列番号2〜5のいずれか1つの、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む、5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも50%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも55%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも60%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも65%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも70%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも75%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも80%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも85%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも90%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも95%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも97%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも98%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対
する少なくとも99%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第2のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する100%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。
【００８８】
別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも50%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも55%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも60%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも65%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも70%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも75%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも80%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも85%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも90%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも95%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも97%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも98%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する少なくとも99%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。別の態様においては、第3のDNA配列セグメントは、配列番号2〜5のいずれか1つに対する
100%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む。
【００８９】
一実施形態においては、非天然DNA配列は、第1のDNA配列の一部又は全部と、第2のDNA配列セグメントの一部又は全部とを含む。一態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号1の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号2の一部又は全部を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号1の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号3の一部又は全部を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号4の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号1の一部又は全部を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号5の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号1の一部又は全部を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、本明細書に記載のように、配列番号1に対する88%又は100%の同一性並びに配列番号2、3、4、及び5のいずれか1つに対する50%〜100%の同一性を有してもよく、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。
【００９０】
別の実施形態においては、非天然DNA配列は、第1のDNA配列、第2のDNA配列セグメント、及び第3のDNA配列セグメントを含む。一態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号1の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号2の一部又は全部を含み、ここで、配列番号1は、配列番号4の一部又は全部にホスホジエステル結合によりさらに接続される。別の態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号1の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号2の一部又は全部を含み、ここで、配列番号1は、配列番号5の一部又は全部にホスホジエステル結合によりさらに接続される。別の態様においては、非天然DNA配列は、5'から3'の方向に、配列番号1の一部又は全部にホスホジエステル結合により接続された配列番号3の一部又は全部を含み、ここで、配列番号1は、配列番号4の一部又は全部にホスホジエステル結合によりさらに接続される。非天然DNA配列は、本明細書に記載のように、配列番号1に対する88%又は100%の同一性並びに配列番号2、3、4、及び5のいずれか1つに対する50%〜100%の同一性を有してもよく、記載された範囲内のそれぞれの整数を含む。
【００９１】
別の実施形態においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25の一部又は全部を含む。一態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約50%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約60%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約70%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約80%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約85%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約90%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約97%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する約99%の配列同一性を有する。別の態様においては、非天然DNA配列は、配列番号6、7、又は25に対する100%の配列同一性を有する。
【００９２】
本明細書に記載の非天然DNA配列は、10〜1000個の塩基を含んでもよく、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。一態様においては、非天然DNA配列は、10〜500個の塩基を含み、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、10〜300個の塩基を含み、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、10〜200個の塩基を含み、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、30〜150個の塩基を含み、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。別の態様においては、非天然DNA配列は、30〜75個の塩基を含み、特定された範囲内のそれぞれの整数を含む。
【００９３】
本明細書に記載の別の実施形態は、AKIを発症するリスクがある被験体を同定するのに有用である本明細書に記載の非天然DNA配列を生成するための方法である。第1に、メッセンジャーRNA(mRNA)のプールを含有するRNA試料からの逆転写PCR(RT-PCR)により、相補的DNA(cDNA)配列ライブラリーを生成することができる、mRNAを含有するRNAを、当業界で公知の任意の好適な方法により試料(例えば、血液)から精製し、非特異的プライマーと共に好適な逆転写酵素と接触させることができる。例えば、好適なプライマーは、ポリデオキシ-チミジンを含有してもよいか、又は無作為化プライマーであってもよい。このステップは、非特異的cDNAライブラリーを生成する。cDNAライブラリーから非天然DNA配列を特異的に増幅するように設計されたプライマーにより、非天然DNA配列を生成することができる。一態様においては、非天然DNA配列を生成するためのプライマーは、配列番号8、9、11、12、16、若しくは17、又はその組合せを含む。一態様においては、非天然DNA配列を生成するためのプライマーは、配列番号8及び配列番号9を含む。別の態様においては、非天然DNA配列を生成するためのプライマーは、配列番号11及び配列番号12を含む。別の態様においては、非天然DNA配列を生成するためのプライマーは、配列番号16及び配列番号17を含む。
【００９４】
本発明はまた、急性腎傷害のリスクを同定するための診断キットも提供する。いくつかの実施形態においては、診断キットは、AKIを示す1つ以上の遺伝子のレベルを測定するための試薬を含む。いくつかの態様においては、キットは、p16及びp14のレベルを測定するための試薬を含む。キットは、1つ以上の遺伝子又は遺伝子産物を測定することができる試料を単離するための試薬をさらに含んでもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態においては、キットは、定量的RT-PCRキットである。一実施形態においては、定量的RT-PCRキットは、以下のもの:(a)本明細書に記載のバイオマーカー(例えば、p16及びp14)の組合せのそれぞれを増幅するために使用されるプライマー;(b)逆転写酵素を含むバッファー及び酵素;(c)1つ以上の熱安定性ポリメラーゼ;並びに(d)Sybr(登録商標)Green又は標識されたプローブ、例えば、TaqMan（登録商標）プローブを含む。別の実施形態においては、本明細書に記載のキットはまた、（a)参照対照RNAも含む。
【００９６】
RT-PCRキットについて、キットは、一般的には、p16及び/又はp14の一部又は全部に対応する特定のcDNAを増幅するために特異的な予め選択されたプライマーを含む。RT-PCRキットはまた、核酸（例えば、Taqなどのポリメラーゼ）を逆転写する、及び/又は増幅するのに好適な酵素、並びに逆転写及び増幅のための反応混合物にとって必要なデオキシヌクレオチド及びバッファーを含んでもよい。RT-PCRキットはまた、p16及び/又はp14の一部又は全部に対応する特定のcDNAに特異的なプローブを含んでもよい。プローブは、検出可能な標識(例えば、蛍光標識)で標識されていても、又はされていなくてもよい。RT-PCRキットの各成分は、一般的には、それ自身の好適な容器中にある。かくして、これらのキットは一般的には、それぞれ個々の試薬、酵素、バッファー、プライマー及びプローブにとって好適な別々の容器を含む。キットは、好適なハウスキーピング遺伝子を使用して、例えば、チロシン3-モノオキシゲナーゼ/トリプトファン5-モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質、ゼータポリペプチド(YWHAZ)又はβ-アクチンなどの、結果を正規化することができるような試薬及び材料を含んでもよい。さらに、RT-PCRキットは、アッセイ及びアッセイの性能から得られるデータを解釈し、分析するための方法を実施するための指示書を含んでもよい。一態様においては、キットは、AKIを発症するリスクがあると被験体を同定するための指示書を含有する。
【００９７】
本明細書に記載の一実施形態は、定量PCRにより被験体の生物学的試料から本明細書に記載の非天然DNA配列を生成するための試薬のセットと、包装材料とを含む、AKIを発症するリスクにある被験体を同定するためのキットである。一態様においては、キットは、a)cDNAから少なくともp16及び/又はp14転写物の領域を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマー;並びにb)熱安定性ポリメラーゼ及び反応バッファーを含む。別の態様においては、キットは、cDNAライブラリーからの非天然DNA配列の生成又は増幅を検出するためのプローブをさらに含む。一態様では、フォワードプライマーは、配列番号8、配列番号11、又は配列番号16を含む。別の態様においては、リバースプライマーは、配列番号9、配列番号12、又は配列番号17を含む。別の態様においては、プローブは、TaqManプローブ又はSyberグリーンプローブを含む。別の態様においては、プローブは、配列番号10、配列番号13、又は配列番号18を含む。別の態様においては、キットは、YWHAZハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定するためのフォワード及びリバースプライマー並びにプローブを含む。別の態様においては、YWHAZフォワードプライマーは配列番号26を含む;リバースプライマーは配列番号27を含む;及びプローブは配列番号28を含む。
【００９８】
別の実施形態においては、診断キットは、生物学的試料中に存在するp16及びp14 mRNAの絶対量を決定するための較正標準をさらに含んでもよい。較正標準は、既知量のp16又はp14遺伝子の一部又は全オープンリーディングフレームを含むクローニングされたcDNAセグメントであってもよい。較正標準を使用して、本明細書に記載の定量的RT-PCR法の間に生成される非天然DNA配列の正確な量又は濃度を定量することができる。
【実施例１】
【００９９】
心臓手術臨床試験
【０１００】
47人の患者を、冠動脈バイパス(CABG)外科的処置を受けている高齢の成人(中央年齢65.8歳)の前向きコホート研究に動員した。試験に登録されるために、各患者は、試験対象患者基準を全て満たす必要があり、かつ除外基準を満たしてはならない。試験対象患者基準:第一選択又は緊急の冠動脈バイパス手術を受けている55歳以上の年齢。除外基準:緊急又はサルベージ冠動脈バイパスを必要とすること;再手術処置;大動脈若しくは弁の外科的処置の組合せ又は一次左心補助装置埋込みを受けていること;冠動脈疾患以外の急性疾患を有すること;術前の変力又は血管作動性医薬を必要とすること。静脈血試料を、診療所への患者の術前訪問中、又は全身麻酔の誘導後であるが、外科的切開の前の術中に、EDTA中に各患者から収集した。
【０１０１】
T細胞を、製造業者のプロトコールを使用してRosetteSep(商標)Human T Cell Enrichment Cocktail(カタログ番号15061;Stemcell Technologies)を用いて各患者に由来する6mlの全血から単離し、-80℃の冷凍庫で凍結保存した。全RNAを、製造業者のプロトコールを使用してRNeasy Plus Mini Kit(カタログ番号74134;Qiagen)を使用してT細胞から単離した。RNA濃度を、NanoDrop 2000分光光度計を使用して測定した。cDNAを、製造業者のプロトコールを使用して、ImProm-II逆転写酵素(カタログ番号A3801; Promega)及び0.5μgのランダムプライマー(カタログ番号C1181; Promega)を使用して1μgの全RNAから調製した。得られたcDNA反応物を、蒸留水で1:4に希釈した。4.5μlの希釈したcDNAを、5μgのTaqMan 2x Universal PCR Master Mix(カタログ番号4324018;ThermoFisher Scientific)及び0.5μlの20xアッセイプライマー/プローブミックス(p16プライマー:フォワード5’- CCAACGCACCGAATAGTTACG- 3’; リバース5’- GCGCTGCCCATCATCATG- 3’; p16プローブ: 5’ FAM-CCTGGATCGGCCTCCGAC-MGB NFQ - 3’; p14プライマー: フォワード5’-CTGAGGAGCCAGCGTCTAG- 3’; リバース5’- CCCATCATCATGACCTGGTCTTCTA- 3’; p14プローブ5’ FAM - CAGCAGCCGCTTCC-MGB NFQ- 3’; YWHAZカタログ番号4331182 Hs03044281_g1; ThermoFisher Scientific)と混合した。リアルタイムPCR反応を、ViiA7 PCR機器(Invitrogen)を使用して実施した。37のサイクル閾値(Ct)をカットオフ点として使用し、37以上の任意の発現シグナルを無視した。p16又はp14の発現を、YWHAZハウスキーピング遺伝子を使用して正規化した(p16norm=p16i-YWHAZi+YWHAZaverage)。p16又はp14発現を、37から正規化されたCt値を減算することにより算出し、得られた値をROC分析のために使用した。5.3の閾値をp16について選択し、8.1の閾値をp14について選択した。
【０１０２】
生物学的試料中のp16及びp14遺伝子転写物の絶対量を、較正標準を使用してさらに定量した。p16レベルを決定するための較正標準は、p16のオープンリーディングフレーム(ORF)を含有するp16プラスミドからなっていた。同様に、p14レベルを決定するための較正標準は、p14のオープンリーディングフレームを含有するp14プラスミドからなっていた。T7 RNAポリメラーゼを使用して、p16及びp14 ORFのそれぞれから参照相補的RNA(cRNA)をin vitroで転写した後、試料中のcRNAの量(分子/μl)を定量した。参照cRNA及び患者に由来するRNA試料を逆転写し、定量的RT-PCRを行い、Universal RNAからYWHAZ遺伝子に対して正規化した。標準曲線を参照試料について生成し、転写物の絶対量を、蛍光強度値を外挿することにより評価した。
【０１０３】
手術後のピーク血清クレアチニンを使用して、AKIを有する患者を同定した。ベースラインより50%以上高い血清クレアチニン中の増加を示す患者を、AKI陽性と同定したが、50%未満の減少、変化なし、又は増加を示す患者を、AKI陰性と同定した。
【０１０４】
実施例1に記載の47人の患者のうち、7人の患者がAKIを発症し、40人の患者がAKIを発症しなかった(15%の発生率)。AKIを発症した患者におけるクレアチニン(CRT)の人口動態、eGFR及び変化を、表1にまとめる。
【０１０５】
【表１】
2019511928.tif 000003
AKIを発症した患者におけるp16及びp14の発現レベル並びに30d主要有害臨床事象(30d-MACE)の発生率を、表2にまとめる。
【０１０６】
【表２】
2019511928.tif 000004
【０１０７】
表3にまとめられるように、AKIを発症した7人の患者のうち、わずか1人が、手術前に60未満のeGFRにより同定されたであろう。p16の測定は、AKIを発症した7人のうち4人の患者を同定したであろう。これに対してp14の測定は、AKIを発症した7人のうち6人の患者を同定したであろう。
【０１０８】
【表３】
2019511928.tif 000005
【０１０９】
AKIを発症しなかった40人の患者のうち、22人が60未満のeGFRを有し、6人が5.3の閾値を超えるp16発現を有し、9人が8.1の閾値を超えるp14発現を有していた。
【０１１０】
臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関する分析を実施した冠動脈バイパス移植(CABG)手術前に実施例Iに記載の患者から得られた試料における末梢血Tリンパ球(PBTL)中でのp16Ink4a及びp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」)分析を、図1〜2に示す。
【０１１１】
30日MACE(主要有害臨床事象:死亡をもたらす、又は術後にリハビリテーション施設での回復を必要とする有害転帰、例えば、心停止、腎不全、深部胸骨創傷感染、敗血症の複合)に関する分析を実施した冠動脈バイパス移植(CABG)手術前に実施例Iに記載の患者から得られた試料における末梢血Tリンパ球(PBTL)中でのp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」)分析を、図3に示す。
【０１１２】
心臓動脈バイパス手術後にAKIを発症するリスク又は主要有害臨床事象(30d-MACE)を予測するためのp16Ink4a又はp14Arfの発現の診断精度のパラメータを、表4にまとめる。
【０１１３】
【表４】
2019511928.tif 000006
【０１１４】
製造業者のプロトコールを使用して、QIAamp DNA Blood Mini Plus Mini Kit(カタログ番号51104;Qiagen)を使用して、各患者に由来する400μlの全血から、ゲノムDNAを単離した。DNA濃度を、NanoDrop 2000分光光度計を使用して測定した。SNP状態を、市販の予め設計されたTaqMan(登録商標)SNP Genotyping Assays(ThermoFisher Scientific)を使用するリアルタイムPCRにより決定した。150ngの希釈したゲノムDNA(15μl容量)を、2.5μlのTaqMan Genotyping Master Mix(カタログ番号4371353; ThermoFisher Scientific)及び0.25μlの40x TaqMan SNP Genotyping Assay(rs10757278についてはC_11841860_10; rs2383206についてはC_1754669_10; rs2383207についてはC_15789010_10;についてはC_26505812_10、カタログ番号4351379 ThermoFisher Scientific)と混合した。ViiA7 PCR機器(Invitrogen)を使用して、リアルタイムPCR反応を実施した。単一ヌクレオチド多型状態を、AA、AG又はGGとして製造業者のソフトウェアにより報告した。
【０１１５】
臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関する分析を実施した冠動脈バイパス移植(CABG)手術前に実施例Iに記載の患者から得られた試料における末梢血Tリンパ球(PBTL)中でのp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」)分析を、図4〜6に示す。この研究における患者を、野生型又はヘテロ接合型rs10757278(AA又はAG)を含むものと、ホモ接合性の突然変異型rs10757278(GG;リスク遺伝子座)を含むものとの2群に階層化した。
【０１１６】
全試験に由来する患者又はリスク遺伝子座rs10757278患者を含まない集団における心臓手術後にAKIを発症するリスクを予測するためのp14Arfの発現の診断精度のパラメータを、表5にまとめる。8.1の閾値を、両集団においてp14のために選択した。
【０１１７】
【表５】
2019511928.tif 000007
【実施例２】
【０１１８】
カテーテル試験
【０１１９】
経皮冠動脈介入(PCI)を含む、又は含まない心臓カテーテル処置を受けている200人の患者を、試験に動員する。試験に登録されるためには、各患者は、全ての試験対象患者基準を満たす必要があり、かつ除外基準を満たしてはならない。試験対象患者基準:18歳以上の年齢で、腎傷害の中程度のリスクに彼らを置く少なくとも1つのリスク因子を有する(Mehranら、15464318により定義された場合、14%以上)。その群に入る患者は、鬱血性心疾患ステージIII/IV(New York Heart Associationによって定義される)又は慢性腎疾患(15<eGFR<60ml/min/1.73m2)及び糖尿病を有してもよく、又は75歳を超える年齢については、上記条件のいずれか1つを有してもよい。除外基準:急性の活動性感染(例えば、HIV、肺炎、敗血性ショック)を有する;最後の72h以内の造影剤曝露;STEMIを示すこと;心原性ショックの存在;血行動態不安定の存在又はIABPの昇圧剤の必要性;25%未満の既知EFの重症心不全;心臓移植患者又はLVAD患者;末期腎疾患のための透析を受けていること;腎臓移植及び肝臓移植患者並びに現在免疫抑制剤を使用している全患者;慢性肝疾患/肝硬変;基底細胞癌又は扁平上皮皮膚癌を除くがん及び化学療法の履歴。
【０１２０】
静脈血を、カテーテル処置の前に各患者からEDTAチューブ中に採取する。次いで、末梢血Tリンパ球及び末梢血単核細胞を、新鮮な血液から単離し、p16及びp14Arf発現の分析のために凍結保存する。末梢血を、ステント留置術を受けている患者から10〜20hで、腎臓機能のマーカーの測定のために全患者から48〜72hで採取する。尿を、ベースライン時に、及び早期腎傷害のマーカーの測定のためにステント留置術を受けている患者から10〜20hで採取する。
【０１２１】
ベースラインと比較した48〜72hでの血清クレアチニンの変化を使用して、AKIを有する患者を同定する(ベースラインと比較して25%以上の血清クレアチニンの増加)。
【０１２２】
処置の10〜20h後とベースラインとの間の他の血漿及び尿バイオマーカー(シスタチンC、NGAL、KIM-1、L-FABP)の変化を使用して、AKIを有する患者を同定する代替的な方法を提供する。
【０１２３】
実施例1と同様、p16及びp14の発現を、Tリンパ球中で測定し、受信者操作曲線(ROC)分析において使用して、非疾患集団と疾患(AKI)集団とを識別するための閾値、感度、特異度、及びAUCを決定する(図7)。
【０１２４】
【表６】
2019511928.tif 000008
【実施例３】
【０１２５】
心臓手術臨床試験
【０１２６】
186人の患者を、Duke University Hospitalsでの冠動脈バイパス(CABG)外科的処置を受けている高齢成人の前向きコホート研究に動員する。試験に登録されるためには、各患者は、全ての試験対象患者基準を満たす必要があり、かつ除外基準を満たしてはならない。試験対象患者基準:心肺バイパスを使用する非緊急心臓手術(CABG、CABG/弁手術の組合せ、又は弁手術)を受けている40歳以上の年齢。除外基準:緊急手術を必要とすること;オフポンプ冠動脈バイパス移植、大動脈瘤修復;鬱血性心疾患修復;心臓移植又はLVAD患者;重症心不全(LVEF<25%);血行動態不安定又は術前の昇圧剤若しくはIABPを必要とすること;元々存在する末期腎臓疾患又は腎移植;大きな活動性感染の存在；又は慢性肝疾患/肝硬変。静脈血を、診療所への患者の術前訪問中、又は全身麻酔の誘導後であるが、外科的切開の前の術中に、EDTA中に各患者から収集した。
【０１２７】
T細胞を、製造業者のプロトコールを使用してRosetteSep(商標)Human T Cell Enrichment Cocktail(カタログ番号15061;Stemcell Technologies)を用いて各患者に由来する5mlの全血から単離し、-80℃で凍結保存した。全RNAを、製造業者のプロトコールを使用してQuick-RNA MiniPrepキット(カタログ番号R1055;Zymo Research)を使用してT細胞から単離した。RNA濃度を、NanoDrop 8000分光光度計を使用して測定した。cDNAを、製造業者のプロトコールを使用して、ImProm-II逆転写酵素(カタログ番号A3801; Promega)及び0.5μgのランダムヘキサマー(Eton Bioscience)を使用して400ngの全RNAから調製した。得られたcDNA反応物を、蒸留水で1:4に希釈した。4.5μlの希釈したcDNAを、5μgのiTaq Universal Probes Supermix(カタログ番号1725134;Bio-Rad)及び0.5μlの20xアッセイプライマー/プローブミックス(p16INK4aプライマー:フォワード5’- CCAACGCACCGAATAGTTACG-3'; リバース5'- GCGCTGCCCATCATCATG- 3'; p16INK4aプローブ: 5' FAM-CCTGGATCGGCCTCCGAC-MGB NFQ-3'; p14ARF プライマー:フォワード5'-CTCGTGCTGATGCTACTGA-3'; リバース5'-TCATCATGACCTGGTCTTCT-3'; p14ARFプローブ5'-[6-FAM]AAGCGGCTGCTGCCCTAGAC[BHQ1a-Q]-3'; YWHAZカタログ番号4331182 = Hs03044281_g1, ThermoFisher  Scientific)と混合した。リアルタイムPCR反応を、CFX384 TouchリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)を使用して実施した。37のサイクル閾値(Ct)をカットオフ点として使用し、37以上の任意の発現シグナルを無視した。p16INK4a又はp14ARFの発現を、YWHAZハウスキーピング遺伝子を使用して正規化した(p16INK4anorm=p16INK4ai-YWHAZi)。p16INK4a又はp14ARF発現を、20から正規化されたCt値を減算することにより算出し、得られた値をROC分析のために使用した。
【０１２８】
手術後のピーク血清クレアチニンを使用して、AKIを有する患者を同定した。手術の7日以内にベースラインと比較して0.3mg/dL又は50%以上の血清クレアチニンの増加を示す患者を、AKI陽性と同定したが、0.3mg/dL又は50%未満の減少、変化なし、又は増加を示す患者をAKI陰性と同定した。
【０１２９】
ゲノムDNAを、製造業者のプロトコールを使用してQuick-DNA 96キット(カタログ番号D3011;Zymo Research)を使用して各患者に由来する100μlの全血から単離した。NanoDrop 8000分光光度計を脂油男して、DNA濃度を測定した。SNP状態を、市販の予め設計されたTaqMan(登録商標)SNP Genotyping Assays(ThermoFisher Scientific)を使用するリアルタイムPCRにより決定した。40ngの希釈したゲノムDNA(4μl容量)を、5μlのiTaq Universal Probes Supermix(カタログ番号1725134;Bio-Rad)及び0.25μlの40x TaqMan SNP Genotyping Assay(rs10757278についてはC_11841860_10; rs2383206についてはC_1754669_10; rs2383207についてはC_15789010_10; rs10757274についてはC_26505812_10;全てカタログ番号4351379、ThermoFisher Scientific)と混合した。リアルタイムPCR反応を、CFX384 TouchリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)を使用して実施した。単一ヌクレオチド多型状態を、AA(対立遺伝子1)、AG(ヘテロ接合体)又はGG(対立遺伝子2)として製造業者のソフトウェアにより報告した。試験の結果は示さないが、実施例1のデータと一致する。
【図１】
2019511928.tif 000009
【図２】
2019511928.tif 000010
【図３】
2019511928.tif 000011
【図４】
2019511928.tif 000012
【図５】
2019511928.tif 000013
【図６】
2019511928.tif 000014
【図７】
2019511928.tif 000015
【配列表】
2019511928000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月1日(2018.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【図１】臨床評価項目（臨床エンドポイント）である急性腎傷害(AKI)に関するp16Ink4a発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図２】臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図３】臨床評価項目である30日の主要有害臨床事象(30d-MACE)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図４】患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図５】野生型（AA)又はヘテロ接合性（AG）のrs10757278遺伝子座を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である。
【図６】rs10757278遺伝子座にホモ接合性変異を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である(GG)。
【図７】rs10757278遺伝子座にホモ接合性変異を有する患者の臨床評価項目である急性腎傷害(AKI)に関するp14Arf発現レベルの受信者操作特性(「ROC」）分析を表す図である(GG)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
用語「p16INK4a」とは、サイクリン依存的キナーゼ阻害剤2a(CDKN2A)転写物変異体1によりコードされる遺伝子を指す。この遺伝子は、National Center for Biotechnology Information(NCBI)受託番号NM_000077.4(mRNA)及びNP_000068.1(タンパク質)に対応する。本明細書で使用される場合、p16INK4aとは、p16又は任意の他の一般的な遺伝子同義語も指す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
目的の特定の核酸配列のためのプライマーを設計するための様々な方法が、当業界で周知である。p14ARF及びp16INK4aを別々に増幅するためのプライマーを、選択された特定の配列に基づいて設計することができる。例えば、p14ARF及びp16INK4a転写物はそれぞれ、ユニークなエクソン1を有するが、エクソン2を共有する。したがって、p14ARF及びp16INK4aのそれぞれに特異的なプライマーを設計するために、フォワードプライマーをそれぞれのユニークなエクソン1について選択し、リバースプライマーを共通のエクソン2について選択することができる。逆に、好適なプライマーを、p14ARF及びp16INK4aのエクソン2の共有部分を増幅するように設計して、両遺伝子の発現レベルを一緒に決定することができる。さらに、エクソン/イントロン接続部に隣接するプライマーを設計して、例えば、RT-PCR反応におけるゲノムDNA夾雑物に由来する増幅シグナルを除去することが有益であり得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
経皮冠動脈介入(PCI)を含む、又は含まない心臓カテーテル処置を受けている200人の患者を、試験に動員する。試験に登録されるためには、各患者は、全ての試験対象患者基準を満たす必要があり、かつ除外基準を満たしてはならない。試験対象患者基準:18歳以上の年齢で、腎傷害の中程度のリスクに彼らを置く少なくとも1つのリスク因子を有する(Mehranら., J. Am. Coll. Cardiol. 44(7) pp. 1393-1399 (2004). PMID: 15464318により定義された場合、14%以上)。その群に入る患者は、鬱血性心疾患ステージIII/IV(New York Heart Associationによって定義される)又は慢性腎疾患(15<eGFR<60ml/min/1.73m2)及び糖尿病を有してもよく、又は75歳を超える年齢については、上記条件のいずれか1つを有してもよい。除外基準:急性の活動性感染(例えば、HIV、肺炎、敗血性ショック)を有する;最後の72h以内の造影剤曝露;STEMIを示すこと;心原性ショックの存在;血行動態不安定の存在又はIABPの昇圧剤の必要性;25%未満の既知EFの重症心不全;心臓移植患者又はLVAD患者;末期腎疾患のための透析を受けていること;腎臓移植及び肝臓移植患者並びに現在免疫抑制剤を使用している全患者;慢性肝疾患/肝硬変;基底細胞癌又は扁平上皮皮膚癌を除くがん及び化学療法の履歴。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2019511928.tif 000016
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
ゲノムDNAを、製造業者のプロトコールを使用してQuick-DNA 96キット(カタログ番号D3011;Zymo Research)を使用して各患者に由来する100μlの全血から単離した。NanoDrop 8000分光光度計を脂油男して、DNA濃度を測定した。SNP状態を、市販の予め設計されたTaqMan(登録商標)SNP Genotyping Assays(ThermoFisher Scientific)を使用するリアルタイムPCRにより決定した。40ngの希釈したゲノムDNA(4μl容量)を、5μlのiTaq Universal Probes Supermix(カタログ番号1725134;Bio-Rad)及び0.25μlの40x TaqMan SNP Genotyping Assay(rs10757278についてはC_11841860_10; rs2383206についてはC_1754669_10; rs2383207についてはC_15789010_10; rs10757274についてはC_26505812_10;全てカタログ番号4351379、ThermoFisher Scientific)と混合した。リアルタイムPCR反応を、CFX384 TouchリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad)を使用して実施した。単一ヌクレオチド多型状態を、AA(対立遺伝子1)、AG(ヘテロ接合体)又はGG(対立遺伝子2)として製造業者のソフトウェアにより報告した。試験の結果は示さないが、実施例1のデータと一致する。   
本発明は以下の実施形態を包含する。   
[１]  心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法であって、
a)心血管外科的介入又に被験体から血液試料を取得するステップと;
b)配列が配列番号2〜5の1つ以上に対する85%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む第2のDNA配列セグメントにホスホジエステル結合により接続された配列番号1に対する88%の同一性を有する第1のDNA配列セグメントを含む、血液試料から非天然DNA配列を生成するステップと;
c)該非天然DNA配列のレベルを検出するステップと
を含む、前記方法。   
[２]  ステップ(a)の血液試料から末梢血Tリンパ球を単離することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。   
[３]  d)非天然DNA配列のレベルと、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベルとを比較するステップと;
e)非天然DNA配列のレベルが、非天然DNA配列の予め決定された閾値レベルと等しいか、又はそれより高い場合、被験体を急性腎傷害のリスクがあると同定するステップと
をさらに含む、実施形態１又は２に記載の方法。   
[４]  第1の配列セグメントが、配列番号2〜5のいずれか1つに対する85%の同一性を有する5〜316個の塩基を含む第3のDNA配列セグメントに、ホスホジエステル結合により接続されている、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。   
[５]  非天然DNA配列が、5'から3'の方向に、配列番号2、配列番号1、及び配列番号4の一部又は全部を含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。   
[６]  非天然DNA配列が、5'から3'の方向に、配列番号3、配列番号1、及び配列番号4の一部又は全部を含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。   
[７]  合計組合せ配列の長さが30〜150個の塩基を含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。   
[８]  合計組合せ配列の長さが30〜75個の塩基を含む、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。   
[９]  配列が配列番号6、7、若しくは25又はその組合せを含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の非天然DNA配列。   
[１０]  方法が約30%〜約100%の感度を有する、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。   
[１１]  方法が約30%〜約100%の特異度を有する、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。   
[１２]  予め決定された閾値がROC分析により決定されたものである、実施形態３〜１１のいずれかに記載の方法。   
[１３]  心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するための方法であって、
a)被験体が心血管外科的介入を受ける前に被験体から血液試料を取得するステップと;
b)試料中のp14ARF又はp16INK4aの遺伝子発現レベルを検出するステップと;
c)試料中のp14ARF又はp16INK4aの遺伝子発現レベルと、遺伝子発現の予め決定された閾値レベルとを比較するステップと;
d)p14ARF又はp16INK4aの少なくとも一方の遺伝子発現レベルが、遺伝子発現の予め決定された閾値レベルと等しいか、又はそれより高い場合、被験体を急性腎傷害のリスクがあると同定するステップと
を含む、前記方法。   
[１４]  ステップ(a)の血液試料から末梢血Tリンパ球を単離するステップと、該試料に由来する末梢血Tリンパ球中のp14ARF又はp16INK4aの発現レベルを検出するステップとをさらに含む、実施形態１３に記載の方法。   
[１５]  遺伝子発現のレベルが、定量PCR、マイクロアレイ、又はRNA配列決定を含む方法により検出される、実施形態１３又は１４に記載の方法。   
[１６]  遺伝子発現のレベルが、試料中のp14ARF又はp16INK4aの遺伝子産物を検出することにより検出される、実施形態１３〜１５のいずれかに記載の方法。   
[１７]  予め決定された閾値がROC分析により決定される、実施形態１３〜１６のいずれかに記載の方法。   
[１８]  心血管外科的介入が、心臓カテーテル処置を含む、実施形態１３〜１７のいずれかに記載の方法。   
[１９]  方法が約30%〜約100%の感度を有する、実施形態１３〜１８のいずれかに記載の方法。   
[２０]  方法が約30%〜約100%の特異度を有する、実施形態１３〜１９のいずれかに記載の方法。   
[２１]  心臓手術の被験体における急性腎傷害を診断及び処置する方法であって、
(a)実施形態１〜１２及び実施形態１３〜２０のいずれかに記載の急性腎傷害のリスクがある被験体を同定するステップと、
(b)前記被験体に、急性腎傷害のための1つ以上の予防的処置を投与することにより心臓手術前に該被験体を処置するステップと
を含む、前記方法。   
[２２]  心臓手術の被験体における急性腎傷害を診断及び処置する方法であって、
a) 臨床検査の結果を要求するステップ、ここで前記臨床検査は、実施形態１〜１２及び実施形態１３〜２０のいずれかに記載の方法を含むものである、及び
b)前記被験体に、急性腎傷害のための1つ以上の予防的処置を投与することにより、心臓手術前に被験体を処置するステップ、
を含む、前記方法。   
[２３]  1つ以上の予防的処置が、等張性塩化ナトリウム溶液を含む静脈内容量水分補給、液体、血液製剤及び昇圧剤の投与を含む血行力学パラメータのプロトコールに基づく管理、診断のために使用される造影剤の量の最小化、ACE阻害剤、NSAID及び手術前に腎傷害を引き起こすことが知られる他の薬物の中止を含むAKIの他の増悪因子の回避、血管拡張剤、カルシウムチャンネル遮断剤、強心剤、アミノフィリン、増殖因子、血管作動性ペプチド、接着分子、若しくはエンドセリン阻害剤を含む薬学的活性剤（薬学的に活性な薬剤）の投与、又はループ利尿剤を含む利尿剤の限定的使用を含む、実施形態２１又は２２に記載の方法。   
[２４]  心血管外科的介入前に被験体における急性腎傷害のリスクを同定するためのキットであって、
a)プライマーとプローブのセットを含む定量的PCRにより被験体の生物学的試料から実施形態１〜１２のいずれかに記載の非天然DNA配列を調製し、増幅するための試薬のセット;
c)参照又は対照RNA;
d)被験体が急性腎傷害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための指示書のセットを含む、前記キット。   
[２５]  非天然DNA配列を調製し、増幅するためのプライマーとプローブのセットが、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号16、配列番号17、若しくは配列番号18、又はその組合せを含む、実施形態２４に記載のキット。
【国際調査報告】
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