(57)【要約】体液サンプル中の細菌を高い信頼性で検出するための複雑なマトリックスサンプルの自動逐次分析は、プロセッサ制御のロボット液体ハンドリングシステムおよびフローサイトメーターを用いて達成される。高い信頼性の細菌検出および薬物感受性予測のための複雑なマトリックスサンプルの逐次分析のためのシステム、装置および方法が開示される。フローサイトメーターによる大規模のサンプル集団の計数の精度を向上させるための補償技術も開示される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の存在について体液の臨床サンプルを試験し、場合により少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定するための自動流体ハンドリングシステムにおけるフローサイトメーターの使用方法であって、
前記自動流体ハンドリングシステムを使用して、前記サンプルの一部分を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
フローサイトメーターにより第１のウェルから前記サンプルの一部分を試験して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地により、前記サンプルを、前記全細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈調整サンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを少なくとも含むウェルに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより時間Ｔ０で前記Ｔ０ベースラインウェル内のサンプルを試験して、前記Ｔ０ウェル内のサンプルの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１までのＴ１コントロールウェルの前記サンプルを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を備えるフローサイトメーターの使用方法。
【請求項２】
時間０またはそれに近い時間において、
それぞれ、目的の抗生物質を有する少なくとも１つの抗生物質試験（ＡＴ）ウェルで、接種するステップと、
自動流体ハンドリングシステムを使用して、前記サンプルの希釈分取分を少なくとも１つのＡＴウェルに分配するステップと、
フローサイトメーターで前記第１のウェルから前記サンプルの一部分を試験して、少なくとも１つのＡＴウェル内の前記サンプルの測定特性に関するＡＴ計数細菌値を決定するステップと、
前記ＡＴ計数値を前記Ｔ１コントロール値と比較して、目的の抗生物質に対する前記サンプルの応答を決定するステップと、
をさらに備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ０ベースライン値および前記Ｔ１コントール値は、細菌に特化した対象領域（ＲＯＩ）における対象の細胞事象を含み、
前記比較するステップは、
Ｔ０およびＴ１における前記対象の細胞事象を比較するステップと、
Ｔ０と比べてＴ１における対象の細胞事象の数が統計的に有意な増加がある場合、対象の細胞が存在するか否かを決定するステップと、
を含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象の細胞は、病原性細菌である、
請求項１、２、または、３に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ０とＴ１との間の相対的な増殖を、細菌集団の拡大を表す増殖整数に変換するステップと、
Ｔ０ベースラインおよびＴ１コントロールからの前記増殖整数を、試験されている疾患状態で表現される病原体の既知のライブラリからの少なくとも１つの既知の増殖整数と比較するステップと、
前記比較に基づいて、前記サンプル中に存在する病原体の型を決定するステップと、
をさらに備える、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ０とＴ１との間の相対増殖を、細菌集団の拡大を表す増殖整数に変換するステップと、
Ｔ０コントロールおよびＴ１からの前記増殖整数を、評価されている疾患状態において表現される可能性のある細菌汚染物質の既知のライブラリの既知の増殖整数と比較するステップと、
前記比較に基づいて、前記サンプル中に存在する細菌汚染物質のタイプを決定するステップと、
をさらに備える、
請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つのウェルがｎ個のＡＴサンプルをさらに含み、
ｎ個のＡＴサンプルのそれぞれがｎ個の異なる抗生物質の異なる１つによって処理され、
ｎが０よりも大きい整数である、
請求項３から６のいずれかに記載の方法であって、
前記方法は、さらに、
前記フローサイトメーターにより、時間Ｔ１でｎ個のＡＴサンプルの各々を試験してｎ個のＡＴサンプル値を取得するステップと、
前記対象領域の前記Ｔ０ベースライン事象を前記対象領域の前記ｎ個のＴ１サンプル事象のそれぞれと比較して、前記ｎ個の異なる抗生物質に対する検出細菌の感受性または耐性を決定するステップと、
を備える。
【請求項８】
前記Ｔ１コントロール値と前記ｎ個のＡＴサンプル値とを比較して、前記ｎ個の抗生物質のいずれか１つに対して異なる応答を有する亜集団に起因する、細菌の複数の亜集団の存在を検出するステップをさらに備える、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記体液は、尿、血液、胸膜液、滑液または脳脊髄液からなる群から選択される、
先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記フローサイトメーターは、メモリに記憶された命令を実行するプロセッサによって制御され、
前記メモリは、
ａ．既知のマトリクスノイズ、そして、体液タイプに特有の統計的信頼情報を提供するもの、
ｂ．病理学的細菌感染に関連する病原体について予め定義された増殖整数、
ｃ．通常のサンプリングに伴う可能性のある汚染物質の定義済みの増殖整数、
の根拠となる、尿、血液、または脳脊髄液のそれぞれについて別々の体液に特化したデータセットをさらに含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、臨床サンプル、前記Ｔ０サンプル、および前記Ｔ１サンプルの間の自動流体ハンドリングシステムによって、分割される、
先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
細菌決定に使用される関連染色試薬は、試薬およびサンプルを吸引し、注入し、そして混合する自動流体処理システムを用いて添加される、
先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
すべてのｎ個のＡＴサンプルは、自動流体ハンドリングを用いて前記臨床サンプルから調製される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
先行するいずれかの請求項に記載の方法であって、
既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性を有している試験計数補償（ＴＥＣ）粒子であって、サンプル中の既知濃度の試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を含めるステップと、
前記フローサイトメーターによる前記サンプル試験を用いて前記ＴＥＣ粒子を計数するステップと、
試験された前記サンプル中の前記既知のＴＥＣ粒子の濃度と比較して、計数されたＴＥＣ粒子値に基づいて、補償因子を決定するステップと、
前記補償係数によって前記サンプル試験計数値を調整するステップと、
をさらに備える。
【請求項１５】
前記のＴＥＣ粒子を計数するステップは、各フローサイトメーターサンプル試験に含まれる、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の決定するステップは、前記細菌ＲＯＩとは別個の一意のＴＥＣ粒子ＲＯＩを適用して、前記ＴＥＣ粒子を計数するステップを備える、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
細菌の存在について体液のサンプルを試験するためにフローサイトメーターを使用する、場合により少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定する方法であって、
サンプルを所定の濃度に希釈するステップと、
希釈したサンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）バッチおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）バッチを含む少なくとも２つのバッチに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより、前記Ｔ０ベースラインバッチを時間Ｔ０で試験して、前記Ｔ０バッチの測定された特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１まで、増殖培地中で前記Ｔ１コントロールバッチを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定された特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を得るステップと、
細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するために、前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較するステップと、
を備える方法。
【請求項１８】
前記Ｔ０ベースライン値および前記Ｔ１コントロール値は、細菌に特化した対象領域（ＲＯＩ）における対象の細胞事象を含み、
前記の比較するステップは、
前記対象の細胞事象をＴ０およびＴ１で比較するステップと、
Ｔ０と比較してＴ１における対象の細胞事象の数の統計的に有意な増加がある場合、対象の細胞が存在するか否かを決定するステップと、
を含む、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つのウェルは、さらにｎ個のＡＴサンプルを含み、
ｎ個のＡＴサンプルのそれぞれは、ｎ個の異なる抗生物質の異なる１つによって処理され、ｎが０より大きい整数である、
請求項１７または１８に記載の方法であって、前記方法は、
前記フローサイトメーターにより、時間Ｔ１で、ｎ個のＡＴサンプルの各々を試験してｎ個のＡＴサンプル値を取得するステップと、
前記ＲＯＩ中の前記Ｔ０ベースライン細胞事象を、前記ＲＯＩ中の前記ｎ個のＴ１サンプル細胞事象のそれぞれと比較して、前記ｎ個の異なる抗生物質に対する、検出された細菌の感受性または耐性を決定するステップと、
を含む。
【請求項２０】
前記統計的に有意な増加は、約１２５％から約３２５％の増加である、
請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
流体サンプル中の対象粒子のフローサイトメーター計数における不正確さを補償する方法であって、
既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性を有する試験計数補償（ＴＥＣ）粒子であって、既知の濃度の計数すべきサンプル中の試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を含めるステップと、
前記フローサイトメーターによるサンプル計数により、前記ＴＥＣ粒子を計数するステップと、
試験されたサンプル中の既知のＴＥＣ粒子濃度と比較して、計数されたＴＥＣ粒子値に基づいて、補償因子を決定するステップと、
前記補償因子によって前記サンプル試験計数値を調整するステップと、
を含む方法。
【請求項２２】
前記の決定するステップは、前記ＴＥＣ粒子を計数するために前記対象の粒子ＲＯＩとは別個の固有のＴＥＣ粒子ＲＯＩを適用するステップを含む、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＥＣ粒子の既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性は、前記対象粒子の対応する特性と類似している、
請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
細菌の存在について体液のサンプルを自動検査し、場合によっては少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定するためのシステムであって、
流体サンプルをウェルプレートのウェル間に分配するための自動ピペットシステムを含む流体ハンドリング装置と、
前記流体ハンドリング装置から受け取ったウェルプレート内のサンプルを培養するように構成されるインキュベータと、
サンプルを含むウェルプレートを、前記流体ハンドリング装置から前記インキュベータに送り、ウェルプレートを前記インキュベータから前記流体ハンドリング装置に戻すように構成されるプレート搬送装置と、
前記流体ハンドリングシステムによって提供されるサンプル中の細胞数を計測するように構成されるフローサイトメーターと、
プロセッサとメモリであって、前記プロセッサは、前記メモリに格納された命令を実行して、前記命令に従って前記システムを制御するプロセッサであって、前記格納された命令は、前記システムに、
サンプルの一部を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
少なくとも第１の試験ウェルから前記サンプルの一部分を計数して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地での前記サンプルを、総細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈サンプルを、少なくとも、時間０ベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１コントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを含むウェルに分けるステップと、
時間Ｔ０において前記Ｔ０ベースラインのウェル内の前記サンプルを計数し、前記Ｔ０ウェル内の前記サンプルの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
前記サンプルを前記インキュベータに送るステップと、
時間０から時間１まで、前記Ｔ１コントロールウェル中のサンプルを培養するステップと、
培養後に前記サンプルを前記流体ハンドリング装置に戻すステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でＴ１コントロールバッチを計数して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を実行させる前記プロセッサと、前記メモリと、
少なくとも前記プロセッサと通信するグラフィカルユーザインターフェースであって、前記システムとユーザとの交流を可能にする前記グラフィカルユーザインタフェースと、
を備えるシステム。
【請求項２５】
前記メモリに格納された前記命令は、時間０において、または、おおよそ時間０に近い時間において、前記システムに、
対象の抗生物質が接種された少なくとも１つのＡＴウェルにサンプルの希釈部を分配するステップと、
フローサイトメーターにより前記第１のウェルから前記サンプルの一部分を計数して、少なくとも１つのＡＴウェル内のサンプルの測定された特性に関するＡＴの計数細菌値を決定するステップと、
前記ＡＴ計数値を前記Ｔ１コントロール値と比較して、対象の抗生物質に対する前記サンプルの応答を決定するステップと、
を実行させる、
請求項２５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１６年４月２５日に出願された、「フローサイトメーターを用いた計数補償のための分析方法」と題する米国仮特許出願第６２／３２７，００７号、および、２０１７年３月１３日に出願された、「抗菌剤の有効性を定量化するための自動流体処理システムおよびそれを使用する方法を含むフローサイトメーターシステム」と題する米国仮特許出願第６２／４７０，５９５号に係る優先権を主張する。この出願には、参照によりその開示内容の全てが組み込まれる。
発明の分野
【０００２】
本発明は、一般に、体液サンプル中の細菌検出を高い信頼性で行うための複雑なマトリックスサンプルの逐次分析の技術に関する。
特に、本発明は、フローサイトメーターを用いた、高い信頼性の細菌検出および薬物感受性予測のための複雑なマトリックスサンプルの逐次分析のためのシステム、デバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体サンプル中の汚染物質を検出し計数（列挙）するためにフローサイトメーターベースのシステムを使用することは、周知である。さらに、フローサイトメトリーは、流体サンプル中の細菌の検出に利用されている。多数の特許文献および非特許文献は、流体サンプル中の細菌または感染の「迅速な」検出または診断が可能なフローサイトメトリーシステムおよび方法を提供すると主張している。
そのような刊行物の例として、以下のものが挙げられる。
Sakaiらの米国特許第7,645,594号、フローサイトメーターによる細菌の識別のための分析サンプルの調製方法；
Tanaka等の米国特許第8,333,926号、尿中の粒子分析装置およびその方法；
Mansourら、米国特許第4,622,298号、尿中の微生物、白血球および扁平上皮細胞の検出および定量；
Gronerら、米国特許第5,858,697号、尿路感染症の迅速診断法；
Czarnek、米国特許第7,468,789号、迅速な細菌検出のためのフローサイトメーター；
Kawashima、欧州特許第1466985号、細菌を測定するための方法、細菌測定装置、および細菌を分析するためのコンピュータ実行可能プログラムを記憶するための記憶媒体;
Nudingら、フローサイトメトリーによる細菌の検出、同定および感受性試験、J. Bacteriol Parasitol 2013, S:5；
Walbergら、メシリナムおよびアンピシリン細菌感受性の迅速フローサイトメトリー評価、Journal of Antimicrobial Chemotherapy (1996) 37, 1063-1075；
Durodieら、フローサイトメトリーによる抗菌活性の迅速な検出、Cytometry 21:374-377 (1995)。
【０００４】
このようなシステムおよび方法は、従来のベンチベースインキュベーション法と比較して「迅速」であると特徴付けられるが、現在のフローサイトメーターベースのシステムおよび方法論は、不正確さおよび様々な要因から生じる他の欠点により、その能力が限定されている。
したがって、より正確であり、誤った結果を低減して、迅速に検出、診断および試験することができるシステム、装置および方法が当該分野において必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１つの実施態様において、本開示は、細菌の存在についての体液の臨床サンプルを試験するための自動流体ハンドリングシステムにおけるフローサイトメーターの使用方法であって、場合によっては少なくとも１つ抗生物質に反応するサンプルを決定するための自動流体ハンドリングシステムにおけるフローサイトメーターの使用方法である。
この方法は、
自動流体ハンドリングシステムを使用して、サンプルの一部分を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
フローサイトメーターにより第１のウェルから前記サンプルの部分を試験して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地により、前記サンプルを、前記全細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈調整サンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを少なくとも含むウェルに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより時間Ｔ０で前記Ｔ０ベースラインウェル内のサンプルを試験して、前記Ｔ０ウェル内のサンプルの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１までのＴ１コントロールウェルの前記サンプルを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を備える。
【０００６】
別の実施形態では、本開示は、細菌の存在について体液のサンプルを試験するためにフローサイトメーターを使用する、場合により少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定する方法に関する。
この方法は、サンプルを所定の濃度に希釈するステップと、
希釈したサンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）バッチおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）バッチを含む少なくとも２つのバッチに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより、前記Ｔ０ベースラインバッチを時間Ｔ０で試験して、前記Ｔ０バッチの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１まで、増殖培地中で前記Ｔ１コントロールバッチを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を得るステップと、
細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するために、前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較するステップと、
を備える。
【０００７】
さらに別の実施形態では、本開示は、流体サンプル中の対象粒子のフローサイトメーター計数における不正確さを補償する方法に関する。
この方法は、既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性を有する試験計数補償（ＴＥＣ）粒子であって、既知の濃度の計数すべきサンプル中の試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を含めるステップと、
前記フローサイトメーターによるサンプル計数により、前記ＴＥＣ粒子を計数するステップと、
試験されたサンプル中の既知のＴＥＣ粒子濃度と比較して、計数されたＴＥＣ粒子値に基づいて、補償因子を決定するステップと、
前記補償因子によって前記サンプル試験計数値を調整するステップと、
を含む。
【０００８】
さらに別の実施形態では、本開示は、細菌の存在についての体液サンプルを自動検査し、場合によっては少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定するためのシステムに関する。
このシステムは、流体サンプルをウェルプレートのウェル間に分配するための自動ピペットシステムを含む流体ハンドリング装置と、
前記流体ハンドリング装置から受け取ったウェルプレート内のサンプルを培養するように構成されるインキュベータと、
サンプルを含むウェルプレートを、前記流体ハンドリング装置から前記インキュベータに送り、ウェルプレートを前記インキュベータから前記流体ハンドリング装置に戻すように構成されるプレート搬送装置と、
前記流体ハンドリングシステムによって提供されるサンプル中の細胞数を計測するように構成されるフローサイトメーターと、
プロセッサとメモリであって、前記プロセッサは、前記メモリに格納された命令を実行して、前記命令に従って前記システムを制御するプロセッサであって、前記格納された命令は、前記システムに、
サンプルの一部分を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
少なくとも第１の試験ウェルから前記サンプルの一部分を計数して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地での前記サンプルを、総細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈調整サンプルを、少なくとも、時間０ベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１コントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを含むウェルに分けるステップと、
時間Ｔ０において前記Ｔ０ベースラインのウェル内の前記サンプルを計数し、前記Ｔ０ウェル内の前記サンプルの測定された特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
前記サンプルを前記インキュベータに送るステップと、
時間０から時間１まで、前記Ｔ１コントロールウェル中のサンプルを培養するステップと、
培養後に前記サンプルを前記流体ハンドリング装置に戻すステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でＴ１コントロールバッチを計数して、前記Ｔ１サンプルの測定された特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を実行させる前記プロセッサと、前記メモリと、
少なくとも前記プロセッサと通信するグラフィカルユーザインターフェースであって、前記システムとユーザとの交流を可能にする前記グラフィカルユーザインタフェースと、
を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明を説明するために、図面は、本発明の１つ以上の実施形態の態様を示している。しかし、本発明は、図面に示されている正確な構成および手段に限定されることはない。
【図１】本明細書に開示された一実施形態に係るシステムで使用されるハードウェアの図。
【図２】本明細書に開示された実施形態に係るシステムの機能ユニットの概略ブロック図。
【図３】本明細書で開示される実施形態による方法を示す高レベルフロー図。
【図４】本明細書に開示される一実施形態に係る流体ハンドリングシステムおよびマルチウェルカセットの概略図。
【図５】別のマルチウエルカセットの概略図。
【図６】さらなる別のマルチウェルカセットの概略図。
【図７】細菌を同定する工程と、抗生物質に対する耐性／感受性について試験する工程とを含む、本明細書において開示される実施形態に係る方法を示すフロー図。
【図８】本明細書において開示される別の実施形態による別の方法を示すフロー図。  図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上の散布図として描写された臨床標本の真核細胞のスクリーニング計数を表すサイトグラムであり、灰色の陰影の領域は所定のＲＯＩを表す（これについては、本明細書における他の全てのサイトグラムで同様である）。  図１０Ａおよび図１０Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）上に散布図として希釈および描写された臨床標本の細菌スクリーニング計数を表すサイトグラムである。  図１１Ａおよび１１Ｂは、Ｔ０コントロールサンプル（対照サンプル）を表す別の臨床検体の細菌計数を表すサイトグラムである。  図１２Ａおよび１２Ｂは、図１１Ａおよび１１Ｂに表されているが、Ｔ１増殖率を決定するために計数された臨床標本の細菌数を表すサイトグラムである。  図１３Ａおよび図１３Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上に散布図として描かれた試験計数補償粒子を希釈して提供した別の臨床検体の細菌計数を表すサイトグラムである。  図１４Ａおよび図１４Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上に散布図として描かれた試験計数補償粒子を希釈して提供したさらなる臨床標本の細菌計数を表すサイトグラムである。  図１５は、本開示による別の制御システムの構成要素を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、試験カセットウェル内に臨床サンプルを十分に装填するためのプロセスと、例えば、抗生物質の有効性の分析のような後続して実行される分析のための自動流体ハンドリングフローサイトメーターシステムによるサンプル処理であって、後続して実行されるサンプル処理を知らせるための初期サンプル試験から取得した定量的な結果を用いるプロセスとを含む。
図１〜図６および図１５は、自動流体ハンドリングフローサイトメーターシステムを例示している。
当該システムは、尿、血液、または脳脊髄液などの流体を分析するためのフローサイトメーターと、
以下に説明するように、試験のためのフローサイトメーターに対して特定倍の特定の濃度の流体混合物を実現する液体ハンドリングシステムと、
流体ハンドリングシステム内においてサンプル間の流体ラインを洗浄するための洗浄システムと、
インキュベーターから流体ハンドリングシステムへ流体カセットを搬送するためのカセットトランスポーターと、
複数のカセットをインキュベート（培養）するインキュベーターと、
を含む。
当該システムは、当該システムを操作するための様々なソフトウェアプログラムを含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の実施形態は、短期増殖パラメータを使用し、細菌集団の増殖を増殖前に評価した元の比較対象試験と比較することによって、複合マトリックスにおける細菌の識別を改善するためのシステム、方法およびデバイスに関する。
本明細書に記載された実施形態によれば、従来技術や従来のシステムよりも優れている効果を実現することができる。本明細書に記載された実施形態により、体液サンプル内の死細胞から生細胞をより正確に区別するための定量的方法が実現され、また、細菌の場合には、臨床的な関心があるものではないが、対象となる病原性細菌と、生存しているかもしれない汚染菌とをより正確に区別するための定量的方法が実現される。
さらに、短期増殖プロトコル（短期増殖の実施要綱）は、複数のクラスの抗生物質が存在する環境下で、十分に分裂されること、および、培養されることを含む。また、短期増殖プロトコルは、試験された抗生物質に対する、細菌の予期される耐性または感受性の予測プロファイルを提供するのに十分な特定の抗生物質に対するサンプル応答の迅速かつ正確な測定を提供する（以下、「抗生物質予測プロファイル」または「ＡＰＰ」という）。
場合によっては、測定されたサンプル応答は、抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）などの他の臨床試験についても有用であり得る。
本明細書に開示された方法によるＡＰＰ試験は、細菌汚染物質が存在するならば、細菌汚染物質の迅速な抗生物質の感受性／耐性プロファイルを提供することができる。
元と増殖の拡大の評価は、適切なアッセイ試薬、および、統合ソフトウェア分析プログラムを用いたフローサイトメーターにより計数される。
このアプローチでは、核酸挿入染料、および、細菌を計数するための細菌散乱特性の評価を用いて、感染および細菌増殖特性を示すことができる細菌レベルをより正確かつ迅速に評価することで、現在の方法を改善する。
【００１２】
第２の実施形態は、サンプルカセットに関する。そして、サンプルカセットには、細菌を含むと疑われるサンプルが充填され、当該サンプルは、細胞分割を促進する適切な温度で分析および培養するために、増殖培地および場合によっては抗生物質を含む多数のウェルの間で等しく分割される。
フローサイトメトリーソフトウェアにより、ユーザは、抗菌剤の作用による細菌集団の散乱特性および蛍光特性の変化を評価することができる。
集団計数の変化、例えば、範囲および変動係数など（なお、これらには限定されない）の集団統計、および、散乱特性の変化を、抗菌剤のクラスに対する細菌単離株の脆弱性に関する信頼区間を提供するために、使用することができる。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において、非細菌事象の計数を減少させ、病原性細菌を非病原性汚染細菌から区別することを目的として、フローサイトメトリーソフトウェアを用いることで、複数回の細菌分裂による集団拡大の変化をユーザが評価することが可能になる。
別の実施形態では、自動システムが実現される。そして、当該自動システムでは、細菌を含むことが疑われるサンプルが充填されるサンプルカセットが、細胞分割を促進する適切な温度で分析および培養するために、増殖培地および場合によっては抗生物質を含む多数のウェルの間で均等に分割される。
フローサイトメトリーソフトウェアにより、ユーザは、抗菌剤の作用による細菌集団の散乱特性および蛍光特性の変化を評価することができる。
集団計数の変化、例えば、範囲および変動係数など（なお、これらには限定されない）の集団統計、および、散乱特性の変化を、抗菌剤のクラスに対する細菌分離株の脆弱性に関する信頼区間をユーザーに提供するために、使用することができる。
【００１４】
本明細書に記載されるシステムの例示的な実施形態が、図１および図２に概略的に示されている。
高レベルにおいて、システム１０は、処理制御部１２と、グラフィカル・ユーザ・インターフェース（ＧＵＩ）とを備えており、これにより、ユーザは、システムのハードウェア構成要素に対する制御処理を行うことができる。
ハードウェアシステム１５は、流体ハンドリングシステム１６、自動カセットハンドリングシステム１８、インキュベータ２０およびフローサイトメータ２２などのハードウェア構成要素を含むことができる。
流体ハンドリングシステム１６は、例えば、自動ピペットシステム２４（図４に示す）と、１つまたは複数のカセットハンドリングロボットおよびマイクロプレート洗浄機とを含むことができる。
本明細書で特に明記されている場合を除いて、これらのハードウェア構成要素は、記載された機能を実行するための市販の装置から選択されるものであってもよいし、本明細書に示された教示に照らして当業者の知識に基づいて構成されるものであってもよい。
【００１５】
図２に示すように、処理制御部１２は、プロセッサ３４およびメモリ３６を備えることができる。
メモリおよびプロセッサは、適切なアプリケーション・プログラミング・インターフェース（ＡＰＩ）および通信バス３８を介してＧＵＩ１４およびハードウェアシステム１５と通信する。
プロセッサの通信および制御に関する構成については、図１５により以下でより詳細に説明する。メモリ３６の構成要素として、接続されるハードウェア構成要素および流体ライブラリ４２を制御および操作するために特別に構成されたソフトウェアモジュール４０を含んでもよい。
例えば、ソフトウェアモジュールは、ＧＵＩモジュール４４、フローサイトメータモジュール４６、インキュベータモジュール４８、流体ハンドリングデバイスモジュール５０、およびカセットハンドリングデバイスモジュール５２を備えることができる。
流体ライブラリ４２には、例えば、尿、髄液、および血液など（なお、これらには限定されない）の分析中の特定のタイプの流体を分析するために使用される流体および細菌固有の情報が入力される。
例えば、フローサイトメータソフトウェアモジュール４６は、検査される様々な流体中の細菌の様々な種を検出するために流体ライブラリに記憶されている、所定の対象領域（ＲＯＩ）、散乱値および蛍光値などにアクセスすることができる。
ゲーティング戦略、および／または、フローサイトメーターソフトウェアによって実行される計算分析によって決定される、散乱値および蛍光値などの標的事象の特性を有するＲＯＩを検出することにより、サンプル中の対象の粒子、細胞または細菌の濃度を決定するようにしてもよい。
また、以下でより詳細に説明するが、特定の流体タイプに対する複数のＲＯＩを、分析の異なるポイントで使用するために格納することができる。
【００１６】
本明細書中に提示される様々な実施形態の記載から理解されるように、１つの例示的な実施形態には、指定されたウェルに増殖培地および抗生物質を含むマルチウェルカセットが含まれ、一般的な細菌染色または他の分析のためのキットが含まれ得る。
増殖培地は、流体ハンドリングシステム内に配置される期間に、あるいは、その期間の前に、初期処理工程において、水和などによって活性化され得る乾燥状態、凍結乾燥状態または他の保存状態で提供され得る。
本明細書で使用されるマルチウェルカセットは、自動アッセイおよび流体処理に適合した任意のカセット、プレートまたはウェル構造を指すものであってもよい。
そのようなカセットは、一例として、図４に示すように、ウェルが個々に取り外し可能なチューブによって形成される６×６エッペンドルフ・チューブ・ラック２８（および関連するチューブ）であってもよい。
マルチウエルカセットの他の例として、本明細書でその用語が使用されているように、図５に示すような９６穴のウェルプレート３０などの従来のマイクロウェルプレートが挙げられる。
特定の用途のために様々なサイズを有する、他の代替の、あるいは、カスタムのマルチウエルカセット３２（図６）を考案してもよい。
再び図４を参照すると、流体ハンドリングシステム１６の自動ピペットシステム２４を使用して、マルチウエルカセットのウェル間に流体を分配することができる。
【００１７】
１つの例示的な実施形態において、単一容積のサンプルがカセットに装填され、すべてのサンプルウェルに均等に分配される。
これには、Ｔ０コントロールウェル、Ｔ１コントロールウェル、および抗生物質を含むすべてのウェルが含まれる。
サンプルは自動フローサイトメーターに装填され、サンプルＩＤがカセットに割り当てられる。
計数、平均蛍光、ＣＶ、集団の範囲、およびサンプル中の補償ビーズからの「距離」の計算を含み、細菌ＲＯＩに割り当てられた任意の集団についてＴ０コントロール値が決定される。
このデータは、Ｔ１でのサンプル培養の後に後続する分析のための参照用として保存され、使用される。
【００１８】
使用中、流体サンプルは、カセットのウェルの間で分けられる。
サンプルは、少なくとも生細菌を染色する染色試薬で処理され、場合によっては、死んだ細胞を染色して、生細胞と、損傷した／死んだ細菌細胞と、を区別する。
存在する任意の細菌について治療するための抗菌剤の有効性を試験するために、１つ以上の抗菌剤が選択され、様々なウェルに添加されうる。
少なくとも２つのコントロールウェル（増殖培地を含むが抗菌剤を含まないＴ０およびＴ１ウェル）があり、場合によっては抗菌剤を試験するための少なくとも１つの追加のウェルがある。
【００１９】
Ｔ０コントロールウェルサンプルは、細菌に合わせた対象領域（ＲＯＩ）を画定する細菌ライブラリを含むフローサイトメーターで分析される。
Ｔ０サンプルは、細菌の対象領域（ＲＯＩ）に割り当てられた任意の集団のベースラインＴ０コントロール値を得るために時間ゼロで試験され、計数、平均蛍光、ＣＶ、集団の範囲を含み、蛍光補償ビーズが使用される場合、サンプル中の補償ビーズからの距離の計算を含む。
このデータは、Ｔ１でのサンプルインキュベーションの後、後続する分析のための参照用として保存され、使用される。
【００２０】
サンプルの次の量は、所定の時間および温度（例えば、３７℃）で培養され、Ｔ１で、おそらくはＴ１を超えて、システムによって分析される。
最初のＴ０サンプルに対する比較分析を行うことで、所定の細菌に特定のＲＯＩにおける集団拡大を決定することができるであろう。
【００２１】
Ｔ１コントロールサンプルが細菌を含有する場合、初期Ｔ０試験結果と比較してＲＯＩに集団が拡大する。
このような拡大は、検出された事象が実際に細菌であり、ノイズまたは非細菌粒子などの偽のデータではないことを保証するのに役立つ。
言い換えれば、細菌を含まないサンプルにおいて、ＲＯＩ集団の変化はなく、細菌ＲＯＩにおいて検出された事象は、細胞破片またはノイズである可能性が最も高い。
【００２２】
複数のＴ１試験を実施することができ、各Ｔ１サンプルは、１つ以上の臨床的に関連する化学物質および／または抗生物質と共に培養されている。
感受性の細菌株は、フローサイトメーターで評価された散乱特性の潜在的変化と、Ｔ１コントロールに対する細菌ＲＯＩの生細胞事象数の減少とを示す。
耐性細菌株は、Ｔ１コントロールと比較して細菌数の減少がほとんどまたは全くないことと、散乱特性の変化もないこととを示すであろう。
【００２３】
信頼性の高い細菌同定に加えて、この技術は、抗生物質感受性試験と併用すると、共感染の同定に適用することができる（すなわち、サンプルは２種類以上の細菌を含む）。
特定の抗生物質とともに培養されたサンプルの逐次分析では、サンプル中の抗生物質とは異なる反応を示す２つの集団など、複数の亜集団の生存細胞ＲＯＩを確認する能力が実現される。
【００２４】
画像分析ソフトウェアを使用することで、生きている細胞のＲＯＩ内の事象密度の追跡が可能となる。
例えば、２種の細菌は、細胞破片および白血球のような同じサンプル中の他の粒子と比較して、一般に同じ散乱特性および蛍光特性を有するが、異なる細菌種は、わずかに異なるパラメータ（例えば、散乱）を有し得る。
抗生物質で治療（処理）された、次のＴ１、Ｔ２などのサンプルを試験する場合において、抗生物質がある種に対して他の種よりも高い有効性を有するときは、生細胞ＲＯＩにおける事象の特性は非対称的にシフトし始める可能性があり、２つ以上の集団が示唆される。
【００２５】
抗生物質効果が、領域との集団変化における明らかな差異を示す場合、信頼区間が、サンプル中に２つ以上の種の細菌が存在する可能性を示していると考えることができる。
【００２６】
一例として、本発明は、臨床検査室で所定の容量の血液を複数の検査ウェルに装填することを可能にすることによって、臨床血液サンプル中の菌血症を決定することに関する。そして、複数の検査ウェルの全ては、増殖培地を含んでおり、複数の検査ウェルのいくつかは、臨床的に関連する濃度の抗生物質を含んでいる。
自動化されたソフトウェアおよびハードウェアは、損傷細胞または死細胞から生細胞を識別する色素であって、細菌を標的とする適切な色素を用いて、時間ゼロ（Ｔ０）でサンプルを分析する。
陽性集団を含むサンプルの値が決定される。そして、陽性集団を含むサンプルの値には、集団計数、集団平均蛍光、集団蛍光ＣＶ、および集団範囲が含まれる。
このＴ０テンプレートは、システムによって保存され、今後のすべてのテストの参照結果として使用される。
サンプルの次の量は、所定の時間および温度（すなわち、「３７℃」）で培養され、Ｔ１、おそらくはＴ１を超えて、システムによって分析される。
最初のＴ０サンプルに対する比較分析を行うことで、細菌と有意に相関する所定の対象領域（ＲＯＩ）における集団の拡大を決定することができるであろう。
細菌汚染を含むサンプルでは、最初の試験結果と比較してＲＯＩに集団が拡大する。
細菌が含まれていないサンプルでは、細胞破片やノイズの可能性があるＲＯＩ集団に変化はないはずである。
同様に、臨床的に関連する化学物質および抗生物質と共にサンプルを培養した場合、複数のＴ１試験が行われる。
影響を受けやすい細菌株は、Ｔ１コントロールと比較してＲＯＩにおける事象数の減少を示し、また、フローサイトメーターで評価した散乱特性の潜在的変化を示す。
耐性細菌株は、Ｔ１コントロールと比較して細菌数の減少を示さず、また、散乱特性の変化も示さない。
【００２７】
例示的な一実施形態において、細菌の存在についてサンプルを分析し、細菌の抗生物質感受性を決定するための自動化された方法は、システム１０全体の流体ハンドリングシステム１６で使用するように構成されたマルチウエルカセットにサンプルを置く工程を含む。
また、カセットは、１つ以上の培地ウェル（例えば、図４〜６を参照）において、所定量（例えば、１ｍｌ）の増殖培地を有していてもよい。
一例として、ミューラーヒントンブロスを増殖培地として使用することができる。
また、カセットは、所定量の抗生物質を含有する複数の抗生物質ウェルを有していてもよい。
流体ハンドリングシステム１６は、フローサイトメーター２２による分析のために流体サンプルを染色するための染料または他の染色剤を含む試薬ラック２６などの１つまたは複数のウェルを有していてもよい。
一例として、生細胞／死細胞の色素を使用してもよい。
サンプルウェル内に置かれた（注入された）流体サンプルを有するカセットは、手で流体ハンドリングシステムに装填されてもよく、また、複数の他のカセットと共にインキュベータ内に装填されて、自動カセットハンドリングシステム１８により、自動的にインキュベーターから流体ハンドリングシステムに装填されてもよい。
【００２８】
流体ハンドリングシステムにおいて、流体ハンドリングシステム１６が、自動ピペットシステムまたは他の適切なプローブ２４を利用して、流体ハンドリングシステム内に貯蔵された色素ウェルから所定量の生細胞／死細胞の色素を除去（例えば、吸引）し、流体サンプルを含むサンプルウェルに色素を沈着させる。
また、流体ハンドリングシステムは、以下にさらに詳細に説明するようにフローサイトメーター測定の精度を検証するために使用することができる流体サンプル中に所定量の標準化蛍光ビーズを堆積（注入）させるように構成してもよい。
他の例として、色素およびビーズをサンプルウェルに手動で添加してもよい。
【００２９】
また、流体ハンドリングシステム１６は、染料をサンプルと適切に混合するための混合プロセスを実行するようにプログラムされていてもよい。
次いで、カセットは、染料が細菌と反応して細菌を染色できるように、流体ハンドリングシステムの温度制御されたインキュベーションチャンバー内で所定時間培養されてもよい。
色素の培養時間が経過すると、流体ハンドリングシステムは、初期測定のために、流体サンプルの所定量をサンプルウェルからフローサイトメーターに自動的に輸送するようにしてもよい。
【００３０】
一実施形態として、図７を参照して、例えば、自動化方法は、サンプルをマルチウェルカセットに装填することから開始するようにしてもよい（ステップ５４）。
流体ハンドリングシステム１６の自動ピペットシステム２４（または他の適切な流体分配装置）は、サンプルをウェルＡからウェルＢおよびＣに適切な量で分配する（ステップ５６）。
説明を明瞭にするために、この例示的な実施形態は、ウェルの単一の「列」（すなわち、図４のＡ１〜Ｆ１）について説明されることに留意されたい。
当業者は、複数のサンプルの同時分析のために任意の数のカラムおよびウェルを使用できることを理解するであろう。
【００３１】
ステップ５８において、自動ピペットシステム２４は、試薬ラック２６の指定されたウェルから適切な細胞染色剤（例えば、ヨウ化プロピジウムまたはチゾールオレンジ）を取得し、ウェルＢおよびＣのサンプルを染色する。
次に、流体ハンドリングシステムは、ステップ６０でウェルＢの内容物を真核細胞の計数のためにフローサイトメーター２２に送る。
計数ステップ６０の例示的な結果が、図９Ａの散布図および図９Ｂおよび図９Ｃの蛍光プロットに示されている。
図９ＡのＲＯＩは、赤血球数および白血球数のゲートを提供する。
フローサイトメーターの分野でよく理解されているように、図９Ｂ（赤血球数、「ＲＢＣ」）および図９Ｃ（白血球数、「ＷＢＣ」）に示されている蛍光強度に基づいて、それぞれのＲＯＩ内にあるイベント（両方のＲＯＩ内にあるイベントを含む）はさらに分析される。
この場合も、同定されたＲＯＩ内のイベントは細胞数を表す。
典型的には、ＷＢＣが報告されるが、臨床的要件に応じて、ＷＢＣおよび／またはＲＢＣが報告され得る。
【００３２】
一実施形態では、次に、ステップ６２において、サンプルウェルＣの内容物が、流体ハンドリングシステム１６によって、細菌検査の計数のためのフローサイトメーター２２に送られる。
図１０Ａおよび１０Ｂにそれぞれ示されている散布図ゲーティングおよび蛍光強度分析は、図１０ＢのＲＯＩ内にある事象に対応する細菌数を決定するために再度使用される。
いくつかの実施形態では、ステップ５８でウェルＣに適用される色素は、少なくとも２つの異なる色素、例えば、死細胞のみを透過する１つの色素、および、すべての細胞を透過するもう１つの色素を含んでいてもよい。
このように異なる色素タイプを使用することにより、異なる色素の異なる蛍光特性に基づいて、生細胞と死細胞を区別することが可能になる。
使用される技術に応じて死細胞を除外することができるステップ６２での細菌のスクリーンカウント（選別した数）を所定の閾値と比較して、サンプルの継続的分析が正当か否かを評価する。
例えば、尿路感染の評価に関連する現在の臨床基準は、患者の臨床状態などの要因に応じて、１０４／ｍｌまたは１０５／ｍｌの閾値を示す。
他の臨床兆候または他の臨床状況の分析に適切な他の閾値を適用してもよい。
当業者であれば、他の実施形態では、ステップ６０および６２の計数を逆の順序で実行してもよく、あるいはハードウェアまたはシステムの制限によって除外されない限り、同時に実行してもよいことを理解するであろう。
【００３３】
なお、細菌スクリーニングステップ６２は、蛍光識別色素を使用して死細胞を細胞計数から大部分排除するために実行してもよいが、その一方で、この段階での細胞計数は、全てのタイプの生細胞を含んでいるかもしれない。つまり、対象の細胞と、対象外の細胞の両方とを含んでいるかもしれない。したがって、汚染細胞であると考えられうる生細胞を含んでいるかもしれない。
例えば、尿路感染症の評価において、対象の主要な病原菌は、大腸菌である。
しかしながら、典型的なヒト尿サンプルは、多くの異なる種の非病原性細菌叢も含んでいるかもしれない。
これらの非病原性細菌叢は、病原体の正確な臨床分析に関して汚染物質とみなされ得る。
【００３４】
ステップ６３において、前のステップで決定された細菌数に基づいて、サンプル濃度が調整され、実施される分析のために必要に応じてサンプルがさらなるウェルに分配される。
ハードウェアの能力に依存して、ステップ６３は、以下のような個々のステップを含むことができ、単一処理により、または逐次処理により、実行され得る。
サンプル濃度６４の調整は、サンプルが自動ピペットシステム２４によってさらに分配されるときに適切な量の増殖培地６６を添加することによって達成されうる。
サンプル分配６８は、少なくともＴ０サンプルのウェルＤ７０への分布およびＴ１サンプルのウェルＥ７２への分配を含むであろう。
場合によっては、ＡＰＰまたは他の抗生物質試験が分析に含められる場合、さらなるサンプルを抗生物質試験（ＡＴ）ウェル７４に分配してもよい。
一実施形態では、調整ステップ６４は、適切に希釈されたサンプルを最初のウェル（例えば、ウェルＤ）に注入し、その後、最初のウェルからのそのサンプルのある量を、使用される他のすべてのウェルに分配することによって達成される。
【００３５】
当該技術分野で知られているように、抗生物質の耐性または感受性のための細菌の試験では、典型的には、約５×１０４〜約５×１０５細菌／ｍｌの範囲の細菌濃度を必要とする。
しかし、使用される機器の感度および精度（例えば、いくつかのフローサイトメーターシステムが他よりも感度がよい）によっては、より低い濃度を使用することができる。
したがって、本開示の方法は、１×１０３細菌／ｍｌの範囲の低濃度で使用することができる。
例えば、機器の感度は、約１×１０４細菌／ｍｌ〜約５×１０４細菌／ｍｌの範囲の濃度を示し得る。あるいは、他の機器では、約１×１０３細菌／ｍｌ〜約５×１０３細菌／ｍｌの範囲の濃度を使用し得る。
【００３６】
一実施形態において、サンプル濃度は、帯域（バンド）で、または、範囲で調整される。
例えば、結果に悪影響を及ぼすことなく処理を単純化するために、Ａ）５０〜４９９９／μｌ、Ｂ）５０００〜２４９９９／μｌ、および、Ｃ）２５０００〜４００００／μｌの３つのバンドを使用することができる。
他のバンドまたはバンド数は、所望の速度および精度、機器感度および臨床目的などのパラメータに基づいて、当業者によって導き出されるものであってもよい。
上述したようにステップ６３でサンプルを注入するときに、濃度を所望の範囲に調整するために、各濃度バンドに対して標準希釈（標準値に希釈したもの）を用いることができる。
次に、ステップ７６において、染色剤がサンプルＴ０に添加される。次いで、流体ハンドリングシステム１６を介した分配の後、ステップ８０において、Ｔ０サンプルが、フローサイトメーター２２によって計数される。
Ｔ０サンプルは、後続の増殖速度測定に対する対照標準（コントロール）としての機能を果たす。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、この計数の結果を示す。
【００３７】
ステップ８０において、サンプルＴ０が計数の対象にされた後、サンプルＴ１および任意の所望のＡＴサンプルを含むマルチウェルカセットは、自動カセットハンドリングシステム１８によってインキュベータ２０に送られ、ステップ７８において、培養される。
ＡＴウェルには、検査が行われる特定の抗生物質が予め充填されていてもよく、あるいは、流体ハンドリングシステムによって適切なソースウェルから別個に充填されてもよい。
培養時間は、調査されるべき細胞の性質に依存する。
例えば、泌尿生殖器フローラ（植物相）のような対象の細胞についての培養時間は、約２．５時間、典型的には３時間以下であるが２時間よりも長い時間の範囲であってもよい。
培養の後、マルチウェルカセットは、自動カセットハンドリングシステム１８によって流体ハンドリングシステム１６に戻される。
ステップ８２において、Ｔ１サンプルは、自動ピペット処理システム２４によって染色される。
同時に、ステップ８４において、ＡＴウェル中のサンプルも染色される。
その後、ステップ８６において、Ｔ１サンプルが計数され（図１２Ａおよび１２Ｂ）、培養後の増殖比、すなわち、Ｔ０に対するＴ１のセル比がステップ８８で決定される。
【００３８】
病原性細胞／対象の細菌と、汚染細菌／細菌との間の定量的識別を可能にするために、計数（８０，８６）、判定（８８）およびＴ１／Ｔ０細胞増殖比（８９）の評価が重要なステップである。
本出願人は、病原性細菌が非病原性の汚染細菌と比較して異なる増殖速度を示し、増殖速度のこれらの差異を、めっきサンプルの濁度などのより主観的で定性的な測定に依存することなく、臨床的に関心を引く（対象の）細胞と汚染細胞との間で定量的に識別するのに用いることができることを発見した。
例えば、ヒト尿中の病原性細胞は、約２．５時間の短い培養時間にわたって培養した場合、汚染細胞の増殖速度よりも約２．２５±１倍の増殖速度を示すことが判明した。
状況によっては、増殖速度の差異をより具体的に、２．２５±０．５とすることが可能であるかもしれない。
したがって、一実施形態では、Ｔ１からＴ０までの細胞増殖比が約１．２５から３．２５（すなわち、約１２５％から約３２５％）であると決定された場合、サンプルは病原菌陽性として（ステップ８９Ａ）評価されるかもしれない（ステップ８９）。
【００３９】
別の実施形態では、システムは、Ｔ０とＴ１との間の相対的な増殖を、細菌集団の拡大を表す整数に変換するようにプログラムされてもよい。
そのような実施形態では、Ｔ０ベースラインからＴ１コントロール増殖までの誘導された増殖整数は、試験される疾患状態で表現される病原体の既知のライブラリの既知の増殖整数と比較される。
代表的な疾患状態には、尿路感染に関連する病原体、血流感染（菌血症／敗血症）に関連する病原体、髄膜炎に関連する病原体または他の神経系感染症が含まれ得るが、これらに限定されない。
代替的または追加的に、誘導増殖整数は、例えば、疑われる尿路感染と関連する正規の泌尿生殖器のフローラや、菌血症の疑いのあるサンプルでの血液採取に伴う皮膚の汚染物質などのように（なお、これらに限定されない）、評価されている疾患状態で表現される可能性のある細菌汚染物質の既知のライブラリの既知の増殖整数と比較される。
病原体および汚染物質の既知のライブラリは、メモリ３６の流体ライブラリ４２に格納されてもよい。
【００４０】
臨床目的に応じて、例えば尿路感染症の存在を単に判定することが目標である場合、肯定的な結果を停止点としてもよく、結果は、適切な医療提供者または患者に報告されてもよい。
しかし、本発明の実施形態はまた、そのような情報が望ましい場合、抗生物質耐性／感受性予測の迅速な評価を提供する。
ステップ８９における評価の結果が肯定的である場合、ＡＴウェルに置かれたサンプルを計数する処理を進めてよい。
サンプルがＴ０およびＴ１ウェルと同時にＡＴウェルに分配されたので、ＡＴウェルのサンプルは、培養ステップ７８の間においても培養される。したがって、追加の培養時間なしに直ちに、ＡＴウェルのサンプルを計数することができる。
ステップ９０、９２、および、それ以降のステップにおいて、ＡＴウェル１−ｎからのサンプルは、抗生物質予測プロファイルを決定するために計数され、あるいは、Ｔ１サンプルとの比較に基づいて抗生物質感受性を決定する際の情報として使用される。
これらの比較のために、Ｔ１を計数することで、ＡＴウェルの計数が比較されるベースラインが提供される。
耐性予測は、特定の臨床適応症、および／または、薬物および抗生物質について確立され得るように、増殖速度の閾値に基づくものであってもよい。
なお、再度、フローサイトメーター計数を使用し、例えば、ＡＴｎ／Ｔ１の比を比較することにより、抗生物質／薬物有効性を定量的に測定できることに留意されたい。
【００４１】
他の実施形態では、後続の試験のために初期サンプル濃度を所定の濃度に自動的に調整するように、システムを構成してもよい。
図８に示すように、染色後の、あるいは、場合によっては補償ビーズを添加した後の最初のサンプルを、フローサイトメーター２２によって測定して、細菌の初期濃度および感染の初期決定を得るようにしてもよい。
図示された、フローサイトメータおよび流体ハンドリングシステムのソフトウェアモジュール４６、５０は、初期測定値が感染を示すかどうかを決定するために流体ライブラリ４２から流体およびフローサイトメータに特化したパラメータを取得するように構成されてもよい。
測定された細菌の初期濃度では、流体ハンドリングシステムのソフトウェアは、さらなる試験のために必要な濃度調整を自動的に計算してもよい。
ソフトウェアはまた、培地ウェルに沈着した増殖培地の量に基づいて、さらなる試験のために必要な濃度に達するように、第１の培地ウェルに注入する液体サンプルの量を決定してもよい。
いくつかの例では、システムによる流体輸送の正確な量を保証するために、最小量の流体サンプル、例えば、＞１マイクロリットル（１マイクロリットルよりも多い量）が吸引される必要があり得る。
図８に示すように、細菌の初期濃度、必要とされる希釈、最小吸入量、および培地ウェル中の増殖培地の量によって、目標濃度に達するために多段階希釈プロセスが必要とされ得る。
【００４２】
例えば、様々な抗菌効力試験法は、標準濃度の細菌、例えば、１×１０４細菌／ｍｌの所定の細菌濃度を必要とすることがある。
臨床サンプルの初期試験がより高い濃度を示す場合（例えば、フローサイトメーターが初期サンプルを１×１０７細菌／ｍｌで計数する場合）、システムは、後続の試験のために濃度を自動的に調整してもよい。
一例として、サンプルの１マイクロリットルを流体ハンドリングシステムによって吸引し、培地ウェルの最初の１つに１０００マイクロリットルの培地に入れて、１×１０４の目標濃度に到達させるようにしてもよい。
別の例として、第２の希釈工程が必要となるように、初期濃度は１×１０７細菌／ｍｌよりも大きくてもよく、および／または、最小吸入容量は１マイクロリットルよりも多くてもよく、および／または、目標濃度はより低くてもよい。
目標濃度、例えば、１×１０４細菌／ｍｌに到達するために、流体ハンドリングシステムは、含む培地を含む第１の培地ウェルから吸引される第２の流体量と、第２の培地ウェル内に注入するための流体サンプルの第１の量とを決定するように構成されてもよい。
【００４３】
目標濃度の、（１）初期流体サンプル（２）色素（３）補償ビーズの一部、および（４）希釈媒体、例えば、増殖培地のうちの１つ以上を含む流体を自動的に生成した後、流体処理システムのソフトウェアモジュールには、流体ハンドリングシステムに、所定量の目標濃度の、１つ以上の抗生物質ウェル（図２）および２つのコントロールウェルを自動的に注入するための命令を含ませてもよい。
次いで、流体ハンドリングシステムは、コントロールウェルの１つ（以下、時間ゼロのコントロールウェル）から所定量の流体を自動的に吸引し、時間ゼロの細菌測定結果を得るために制御をフローサイトメーター２２に移譲してもよい。
時間ゼロのコントロールサンプルをフローサイトメータに輸送した後、制御された温度、例えば生理学的な温度（例えば、３５〜３７℃）で一定時間培養するために、カセットを、例えば、手で、または、カセット・トランスポータを用いてインキュベータに移動させてもよい。
細菌数を計数するためのフローサイトメーターを利用することにより、所要の培養時間は、現在の細菌感受性試験と比べて、著しく低減される。例えば、１〜２日を必要とする従来技術に比べて、約１〜３時間の培養時間となる。
当業者には理解されるように、このような時間の短縮は、非常に貴重であり、治療（処理）前の包括的な感受性試験を可能にする。そして、それによって、目標とする抗生物質治療を可能にし、この分野において現在実施されているような、多数の抗生物質の慢性的な過剰処方を避けることができる。
【００４４】
培養の後、カセットを流体ハンドリングシステムに戻してもよい。そして、第２のコントロールウェルおよび抗生物質ウェルの流体混合物は、分析のために、それぞれの制御された容量を別々にフローサイトメーターへ送ることによって、自動的に分析されるものであってもよい。
各フローサイトメーターの読み取りの間に、システムはまた、洗浄システムを作動させるように構成されてもよく、洗浄システムは、洗浄流体（例えば流体処理システム（いくつかの例として、フローサイトメーター）を洗い流すために使用され得る消毒流体）の流体リザーバを含むものであってもよい。
【００４５】
システムは、時間ゼロおよびその後の対照測定（コントロール測定）を利用して、抑制されない細菌増殖速度を決定してもよい。
また、システムは、時間ゼロのコントロールと各抗生物質ウェルのその後の測定との間の細菌数の差異を比較し、所定の抗生物質が静的（変化のないもの）であるか（時間ゼロのコントロールと統計的に計数される数が同じであるか）、あるいは、死滅的であるか（時間ゼロのコントロールよりも統計的に計数される数が少ないか）を決定することを含み、当該サンプル中の細菌が所定の抗生物質に対して感染しやすいか否かを決定することもできる。
測定内補償粒子
【００４６】
本明細書では、フローサイトメーターによって、標的とする集団の不正確な計数を補償する方法について説明する。標的とする集団の不正確な計数は、対象とする全ての事象を、計数できないか、あるいは、捕らえることができないために生ずる。
そのような不正確な計数は、センサおよび／または他のデータ取得コンポーネントの制限によって、および、システムのソフトウェアの制限によって、起こり得る。
例えば、フローサイトメーターは、過剰な粒子を含むサンプルを取り扱う場合、対象となる全ての粒子を計数することができず、その結果、標的とする集団の正確な計数結果を取得することができないことになる。
【００４７】
マイクロビーズは、機器が適切に動作しているかどうかを判定するために、サンプルが分析される前のフローサイトメーター較正のために広く用いられている。
本明細書に記載された実施形態では、計数の精度を決定するときに使用するために、そして、例えば計器のデータ取得のための閾値を超えたときに、過小に計量されることを補償するときに使用するために、マイクロビーズが、サンプルに、すなわちアッセイ内補償粒子として、組み込まれる。
一例として、フローサイトメーターの読みの不正確さを定量化するために、蛍光マイクロビーズのような既知の数の補償粒子がサンプルに添加される。
例示的な補償粒子は、固有の散乱特性および蛍光特性を有していてもよく、そして、これらの特性は、補償粒子が容易に区別および計数され得る目標の集団の特性とは十分に区別できる特性である。
一例として、約５０〜３００補償粒子／μｌの濃度の液が、計数される前にサンプルに添加される。
より具体的には、サンプル中の補償粒子の濃度は、約２００補償粒子／μｌであってもよい。
他の例として、他の濃度を使用してもよい。
【００４８】
データ取得において計数精度が所定の閾値に一致する、または、超える状況では、補償粒子集団の計器の計数も不正確であるので、計数の前にサンプルに追加された既知の補償粒子濃度の濃度に基づいて、期待値よりも低い粒子集団数を提供する。
期待される事象の数（サンプルに加えられた既知数のマイクロビーズに基づく）と計数された事象との間の差異は、サンプル中に存在する実際の値をより正確に表すために、目標集団の報告された計数の数値を調整するのに使用することができる。
例えば、スケーリング係数（スケーリング因子）を、予測数に対する補償粒子の測定数の比に基づいて決定することができる。
そして、スケーリング係数は、細菌の目的の集団の測定数に適用することができる。
１つの例として、直接の１：１の線形スケーリング係数が、補償粒子測定のパーセント不正確さと、測定対象とされる粒子のパーセント不正確さとの間に１対１の関係を仮定した測定値に適用される。
例えば、既知の数の補償粒子が８０％しか検出されない場合、対象としているイベントの数は、実際の数の８０％にすぎない場合もある。
したがって、測定された数は２０％増加する可能性がある。
他の例として、経験的に基づく乗数を、１：１以外の線形関係を仮定するスケーリング係数に適用してもよい。
さらに他の例として、非線形スケーリング係数を適用してもよい。
【００４９】
このようなスケーリング係数は、例えば、感染の有無を決定するために、サンプル中の細菌のより正確な計数を行うために使用してもよい。
いくつかの例では、抗菌効力試験のように、その後の試験および分析のためにサンプルの濃度を下げる必要があるかもしれない。
一例として、約１×１０５細菌／ｍｌ〜約５×１０５細菌／ｍｌのような抗菌試験の目標濃度が存在し得る。この目標濃度は、例えば、約１×１０４細菌／ｍｌ〜約５×１０４細菌／ｍｌ；または約１×１０３細菌／ｍｌ〜約５×１０３細菌／ｍｌである、あるいは、１×１０３細菌／ｍｌ〜約５×１０５細菌／ｍｌの範囲内の全体の濃度の中の特定のバンド内にある目標濃度である。
サンプルの抗菌効力を決定する方法は、感染の決定を行い、サンプル中の細菌の濃度を決定するために、フローサイトメーターによる初期試験を含んでいてもよい。
上述のように、フローサイトメーターシステムのデータ取得が超過されたかどうかを決定するために、補償粒子を使用してもよい。
そうである場合、初期サンプル中の実際の細菌濃度を計算するために、上記のようにスケーリング係数を決定し、測定した細菌数に適用してもよい。
次いで、実際の濃度を使用して、その後の試験で要求される目標濃度に達するのに必要な希釈プロセスを決定するようにしてもよい。
【００５０】
図１３Ａ〜図１３Ｂは、一例として、希釈された臨床検体を表すサイトグラム（細胞所見）である。
図１３Ａは、対象のある粒子、例えば、１種以上の細菌を同定するために開発されたゲートを表す影付きの「窓」を有する前方散乱および側方散乱に基づくサンプル内の事象を表している。
右側の画像は、サンプル中に存在する補償粒子を含むサンプル用の蛍光ゲートを表している。
当技術分野で知られているように、図１３Ｂに示される蛍光計数は、図１３Ａの散布図に示されるゲート内に入る事象でのみ起こる。
【００５１】
予想される補償値Ｂ１は８４／ｕｌであるが、既知の実際の値は８２／ｕｌである。
一例として、これは十分に正確であると考えられ、測定値と実際値との間の差異が測定器の既知の統計的精度内にあるかどうかを決定することによってデータ収集システムの能力を超えていないことを示している。
したがって、ターゲット母集団Ｔ１の期待値は正確であると考えることができる。
【００５２】
図１４Ａ〜図１４Ｂは、同じ数の補償粒子（８２／ｕｌ）が異なるサンプルで使用された場合の別の例を示している。
図１３Ａと図１４Ａとを比較すると、図１４Ａに示されたサンプルではかなり多くの粒子が検出されていることが分かる。
第２の実施例では、補償粒子の集団は、６９／ｕｌで計数され、既知の集団よりも少ない。
図示された例において、その差は、正常動作中の計器の既知の統計的変動に起因する差よりも大きく、データ取得システムの能力を超えていることを示している。
これは、標的集団Ｔ２（図１４Ｂ）のような目標の集団の計数（計数した数値）が実際よりも低い可能性があることを示している。
一例として、スケーリング係数は、エラーを補償するために、母集団Ｔ２の計数など、任意のターゲット母集団の計数に適用されてもよい。
一例として、スケーリング係数は、測定された補償粒子の計数値の、既知の補償粒子の計数値に対する比に基づいて決定されてもよい。
図１４Ｂに示す例において、約１．２のスケーリング係数を、計数されたターゲット母集団に適用してもよい。
当該スケーリング係数を適用することにより、より正確な細菌濃度が決定され、その後の抗菌効力試験のために目標濃度の濃縮液を調製するために必要とされる希釈の程度を決定するために使用することができる。
【００５３】
なお、コンピュータ技術の当業者には明らかであるように、本明細書に記載された態様および実施形態のいずれか１つまたは複数は、本明細書の教示に従ってプログラムされた１つまたは複数のマシン（たとえば、１つまたは複数のコンピューティングデバイス）を使用して都合よく実施され得ることに留意されたい。
適切なソフトウェアコーディングは、ソフトウェア分野の当業者には明らかであるように、本開示の教示に基づいて熟練したプログラマーによって容易に作成することができる。
ソフトウェアおよび／またはソフトウェアモジュールを使用する上述の態様および実装は、ソフトウェアおよび／またはソフトウェアモジュールの機械実行可能命令の実装を支援するための適切なハードウェアを含むこともできる。
【００５４】
このようなソフトウェアは、機械で読み取り可能な読記憶媒体を使用するコンピュータプログラム製品であってもよい。
機械で読み取り可能な記憶媒体は、機械（例えば、コンピューティングデバイス）による実行のための命令のシーケンスを記憶および／または符号化することができ、機械に、本明細書に記載されている方法および／または実施形態のうちの任意の１つを実行させる、任意の媒体としてもよい。
機械で読み取り可能な媒体の例には、磁気ディスク、光ディスク（例えば、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−Ｒなど）、光磁気ディスク、読み出し専用メモリ「ＲＯＭ」デバイス、ランダムアクセスメモリ「ＲＡＭ」デバイス、磁気カード、光カード、固体メモリデバイス、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、および任意のそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される機械で読み取り可能な媒体は、単一の媒体だけでなく、例えば、コンパクトディスクの集合体またはコンピュータメモリと組み合わせた１つまたは複数のハードディスクドライブなどの物理的に別個の媒体の集合体を含むことを意図している。
本明細書で使用されているように、機械で読み取り可能な記憶媒体は、信号伝送の一時的な形態を含まない。
【００５５】
図１５は、コンピュータシステム１５００の例示的な形態における処理制御部１２の１つの別の実施形態の概略図を示している。そして、コンピュータシステム１５００内において、図１、２のハードウェアシステム１５のような制御システムに対して、本開示の態様および／または方法の任意の１つ以上のものを実行させるための命令セットが実行されうる。
また、複数のコンピューティングデバイスを利用して、フローサイトメーター２２などの１つ以上のデバイスに、本開示の態様および／または方法のうちの任意の１つまたは複数を実行させるために特別に構成された命令セットを実装することも考えられる。
コンピュータシステム１５００は、バス１５１２を介して、互いに、そして、他の構成要素と通信するプロセッサ１５０４およびメモリ１５０８を含む。
バス１５１２は、様々なバスアーキテクチャのいずれかを含んでいてもよい。当該バスアーキテクチャとして、例えば、メモリバス、メモリコントローラ、周辺バス、ローカルバス、およびそれらの任意の組み合わせを含むものであってもよいが、これらに限定されない。そして、バス１５１２は、多様なタイプのバスアーキテクチャを用いてもよい。
【００５６】
メモリ１５０８は、ランダムアクセスメモリコンポーネント、読み出し専用コンポーネント、およびそれらの任意の組み合わせを含む様々なコンポーネント（例えば、機械で読み取り可能な媒体）を含んでいてもよい。なお、これらに限定されない。
一例として、起動中など、コンピュータシステム１５００内の要素間で情報を転送するのを補助する基本ルーチンを含む基本入出力システム１５１６（ＢＩＯＳ）をメモリ１５０８に格納することができる。
また、メモリ１５０８は、本開示の態様および／または方法のいずれか１つまたは複数を具体化する（例えば、１つまたは複数の機械で読み取り可能な媒体に格納された）命令（例えば、ソフトウェア）１５２０を含んでいてもよい。
別の例として、メモリ１５０８は、オペレーティングシステム、１つまたは複数のアプリケーションプログラム、他のプログラムモジュール、プログラムデータ、およびそれらの任意の組み合わせ（なお、これらには限定されない）を含む任意の数のプログラムモジュールをさらに含むことができる。
【００５７】
また、コンピュータシステム１５００は、記憶装置１５２４を含んでいてもよい。
ストレージデバイス（例えば、ストレージデバイス１５２４）の例として、ハードディスクドライブ、磁気ディスクドライブ、光媒体と組み合わせた光ディスクドライブ、ソリッド・ステート・メモリデバイス、および、それらを任意に組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
記憶装置１５２４は、適切なインターフェース（図示せず）によってバス１５１２に接続してもよい。
インターフェースの例として、ＳＣＳＩ、ＡＴＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、シリアルＡＴＡ、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、ＩＥＥＥ１３９４（ＦＩＲＥＷＩＲＥ(登録商標)）、および、それらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一例として、記憶装置１５２４（またはその１つ以上のコンポーネント）は、（例えば、外部ポートコネクタ（図示せず）を介して）コンピュータシステム１５００と取り外し可能に入出力処理を行うことができる。
特に、記憶装置１５２４および関連する機械で読み取り可能な媒体１５２８により、コンピュータシステム１５００のための機械で読み取り可能な命令、データ構造、プログラムモジュール、および／または他のデータの不揮発性および／または揮発性記憶を実現することができる。
一例として、ソフトウェア１５２０は、機械で読み取り可能な媒体１５２８内に完全にまたは部分的に存在するものであってもよい。
別の例として、ソフトウェア１５２０は、プロセッサ１５０４内に完全にまたは部分的に存在するものであってもよい。
【００５８】
また、コンピュータシステム１５００は、入力装置１５３２を含んでいてもよい。
一例として、コンピュータシステム１５００のユーザは、入力装置１５３２を介してコンピュータシステム１５００にコマンドおよび／または他の情報を入力してもよい。
入力デバイス１５３２の例として、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、ポインティングデバイス、ジョイスティック、ゲームパッド、オーディオ入力デバイス（例えば、マイクロホン、音声応答システムなど）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス）、タッチパッド、光スキャナ、ビデオキャプチャデバイス（例えば、スチルカメラ、ビデオカメラ）、タッチスクリーン、およびそれらの任意の組み合わたものが挙げられる。なお、これらに限定されない。
入力デバイス１５３２は、シリアルインターフェース、パラレルインターフェース、ゲームポート、ＵＳＢインターフェース、ＦＩＲＥＷＩＲＥ(登録商標)インターフェース、ダイレクトインターフェース（これらに限定されない）、および、それらを任意に組み合わせたものを含む種々のインターフェース（図示せず）のいずれかを介してバス１５１２にインターフェースで接続され得る。
入力装置１５３２は、ディスプレイ１５３６の一部である。または、ディスプレイ１５３６とは別のタッチスクリーンインターフェイスを含んでもよく、以下でさらに説明する。
入力装置１５３２は、上述のようにグラフィカルインタフェース内の１つ以上のグラフィック表現を選択するためのユーザ選択装置として利用されてもよい。
【００５９】
ユーザは、記憶装置１５２４（例えば、リムーバブルディスクドライブ、フラッシュドライブなど）および／またはネットワークインターフェースデバイス１５４０を介して、コンピュータシステム１５００にコマンドおよび／または他の情報を入力してもよい。
ネットワークインターフェースデバイス１５４０のようなネットワークインターフェースデバイスは、コンピュータシステム１５００を、ネットワーク１５４４およびそれに接続された１つまたは複数のリモートデバイス１５４８などの１つまたは複数の様々なネットワークに接続するために利用されるものであってもよい。
ネットワークインターフェースデバイスの例として、ネットワークインターフェースカード（例えば、モバイルネットワークインターフェースカード、ＬＡＮカード）、モデム、およびそれらの任意の組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
ネットワークの例として、広域ネットワーク（例えば、インターネット、企業ネットワーク）、ローカルエリアネットワーク（例えば、オフィス、建物、キャンパスまたは他の比較的地理的に小さいスペースでのネットワーク）、電話通信網、電話通信業者のデータネットワーク（例えば、音声および／またはデータの携帯電話通信網プロバイダ）、２つのコンピュータ装置の間の直接接続、および、それらの組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
ネットワーク１５４４などのネットワークは、有線および／または無線の通信モードを使用することができる。
一般に、任意のネットワークトポロジを使用することができる。
情報（例えば、データ、ソフトウェア１５２０等）は、ネットワークインターフェースデバイス１５４０を介して、コンピュータシステム１５００と、双方向または単方向に、通信されるものであってもよい。
【００６０】
コンピュータシステム１５００は、表示可能な画像を表示装置１５３６などの表示装置と通信するためのビデオ表示アダプタ１５５２をさらに含んでいてもよい。
表示装置の例として、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、陰極線管（ＣＲＴ）、プラズマディスプレイ、発光ダイオード（ＬＥＤ）ディスプレイ、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
ディスプレイアダプタ１５５２およびディスプレイデバイス１５３６は、プロセッサ１５０４と組み合わせて利用することで、本開示の態様のグラフィック表示を提供するものであってもよい。
表示装置に加えて、コンピュータシステム１５００は、音声スピーカ、プリンタ、およびそれらの任意の組み合わせを含む１つ以上の他の周辺出力装置を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
そのような周辺出力装置は、周辺インターフェース１５５６を介してバス１５１２に接続されてもよい。
周辺インターフェースの例として、シリアルポート、ＵＳＢ接続、ＦＩＲＥＷＩＲＥ(登録商標)接続、並列接続、およびそれらの任意の組合せたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
上記は、本発明の例示的な実施形態の詳細な説明である。
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲において、「Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つ」および「Ｘ、ＹおよびＺの１つ以上」という語句に使用されるような結合語は、特に明記しない限り、結合リスト内の各アイテムが、リスト内の他のすべてのアイテムを除く任意の数、または結合リスト内の任意のまたはすべてのアイテムと組み合わせて任意の数で存在し得ることを意味すると解釈されるべきであり、それぞれは任意の数で存在していてもよい。
この一般的な規則を適用すると、結合リストがＸ、Ｙ、およびＺからなる前述の例における結合句は、それぞれ、以下の場合を含む。
Ｘ、Ｙ、およびＺからなる結合リストは、以下の場合を含む。
１つ以上のＸ；１つ以上のＹ；１つ以上のＺ；
１つ以上のＸと、１つ以上のＹ；
１つ以上のＹと、１つ以上のＺ；
１つ以上のＺと、１つ以上のＸ；
１つ以上のＸと、１つ以上のＹと、１つ以上のＺ；
【００６２】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正および追加を行うことができる。
上述した様々な実施形態のそれぞれの特徴は、関連する新しい実施形態において多数の特徴の組み合わせを提供するために、適宜、他の記載された実施形態の特徴と組み合わせることができる。
さらに、前述において、多くの別個の実施形態を記載しているが、本明細書に記載されているのは、本発明の原理の適用の単なる例示にすぎない。
さらに、本明細書における特定の方法は、特定の順序で実行されるものとして図示および／または説明され得るが、順序は、本開示の態様を達成するために通常の技術の範囲内で広く可変させることができるものである。
したがって、この説明は、単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６３】
本開示のさらに別の例示的な実施形態を以下の段落で説明する。
【００６４】
一例として、細菌の存在について体液のサンプルを試験するためのフローサイトメーターを使用する方法であって、以下の工程を含む。
サンプルを、少なくとも時間０のコントロール（Ｔ０コントロール）および時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）を含む少なくとも２つのバッチに分割する工程；
フローサイトメーターにより、Ｔ０コントロールを時刻Ｔ０で試験し、Ｔ０サンプルの測定された特性に関連するＴ０計数ベースライン細菌値を取得する工程；
フローサイトメーターにより、Ｔ１コントロールを時刻で試験し、Ｔ０サンプルの測定された特性に関連するＴ０計数ベースライン細菌値を取得する工程；
Ｔ１コントロール値をＴ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖整数を決定する工程。
Ｔ０ベースライン値およびＴ１コントロール値は、細菌に特化した対象領域（ＲＯＩ）における生細胞事象を含むことができる。そして、比較工程は、Ｔ０およびＴ１における生細胞事象を比較し、Ｔ０に比べてＴ１における生細胞事象の数が統計的に著しく増加したときに生存細菌が存在するかどうかを決定する工程を含む。
【００６５】
全ての試験時間における細菌に特化した領域の計数精度は、テスト実行中にデータ取得の不足を補う目的で、既知の期待値を用いて実行されたテスト中において、試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を利用することによって改善される。試験計数補償（ＴＥＣ）粒子としては、例えば、フローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性が類似しているが、目標の母集団の特性からわずかに異なる特性を有するビーズが挙げられる。
生細菌のＲＯＩとは別個の独自のＲＯＩを調製して、すべての分析実行中にＴＥＣを計数するようにしてもよい。
【００６６】
さらに、少なくとも２つのバッチはさらにｎ個のＡＴサンプルを含み、ｎ個のＡＴサンプルの各々はｎ個の異なる抗生物質の異なる１つによって処理（治療）され、ここでｎは０より大きい整数である。そして、この方法はさらに以下の工程を含む。
フローサイトメーターを用いて時間Ｔ１でｎ個のＡＴサンプルのそれぞれを試験してｎ個のＡＢサンプル値を得る工程；
ＲＯＩ中のＴ０コントロールの生細胞事象を、ＲＯＩ中のｎ個のＴ１コントロールの生細胞事象のそれぞれと比較して、ｎ個の異なる抗生物質に対する検出された細菌の感受性または耐性を決定する工程。
必要に応じて、細菌計数値について試験された全てのＡＴサンプルは、上記の方法に従ってＴＥＣ補償粒子を用いて補償されてもよい。
【００６７】
試験される抗生物質濃度は、一般に、試験される個々の抗生物質についてＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって定義された、臨床的に許容されるよりも低い解釈上のブレークポイントを表すものであってもよい。
さらに、試験される抗生物質濃度は、試験される個々の抗生物質についてＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって定義された各抗生物質の最小抑制濃度を規定するために使用される臨床的に許容される抗生物質濃度の範囲を表すものであってもよい。
【００６８】
さらなる実施形態において、ｎ個の抗生物質のいずれか１つに対して異なる応答を有する亜集団に起因する、細菌の複数の亜集団の存在を検出するために、Ｔ１コントロール値とｎ個のＴ１サンプル値とを比較することを含むことができる。
体液は、少なくとも尿、血液、胸膜液、滑液または脳脊髄液からなる群から選択されるものであってもよい。
フローサイトメーターシステムは、尿、血液、または脳脊髄液のそれぞれについて別々の体液に特化したデータセットを含むソフトウェアを備える。そして、尿、血液、または脳脊髄液は、以下のものの根拠となる。
既知のマトリクスノイズ、そして、体液タイプに特有の統計的信頼情報を提供するもの；
病理学的細菌感染に関連する病原体のための予め定義された増殖整数；
通常のサンプリングに伴う可能性のある汚染物質の定義済み増殖整数。
【００６９】
サンプルが採取された体液が血液である場合、細菌の存在および抗生物質の感受性は、約２〜１２時間の培養の後に決定することができる（細菌が、現在の技術を用いて検出されるのに十分に増殖することが可能となるのに現在必要とされる培養時間が１８〜２２時間であるのに対して）。
【００７０】
自動流体ハンドリング技術を使用して、分割されている元の臨床サンプルを、自動流体ハンドリングシステムによって、臨床サンプルＴ０サンプルとＴ１サンプルとに分割するようにしてもよい。
さらに、細菌の特定に使用される全ての関連する染色試薬は、試薬およびサンプルを吸引し、注入し、そして混合する自動流体処理システムを用いて添加される。
さらに、すべてのｎ個のＡＴサンプルは、自動流体ハンドリングを用いて臨床サンプルから調製されてもよい。
【００７１】
さらなる実施形態において、一時的ではないコンピュータで読み取り可能な媒体またはコンピュータプログラム製品は、上述のように試験、計数評価および比較を自動的に実行し、病原性細菌と非病原性細菌とを自動的に識別するための、フローサイトメーターソフトウェア解析プログラムおよびアルゴリズムを提供するか、あるいは、格納していてもよい。
一例として、フローサイトメーターソフトウェア分析プログラムは、フローサイトメーターベースの逐次分析システムにおいて以下の機能の１つ以上を実行するための記憶された命令を含んでいてもよい。
試験した抗生物質の定量的効果を自動的に決定する機能、
試験した抗生物質の相対的効果を自動的に判定し、グラフィカルユーザーインターフェースを介して、その細菌が試験されている抗生物質に対して感受性があるかどうかを報告する機能、
試験された抗生物質の相対的効果を自動的に判定し、グラフィカルユーザーインターフェースを介して、その細菌が試験される抗生物質に対して耐性があるかどうかを報告する機能、
試験に先立って自動流体ハンドリングシステムによってサンプル中に入れられたＴＥＣ粒子を用いて細菌または他の目的の粒子の計数値を自動的に補償する機能、および／または、生細菌ＲＯＩ内の集団密度と事象の統計的評価とに基づいて、同時感染の可能性を示すサンプル中に、１つよりも多くの細菌の亜集団が存在しているか否かについての情報を提供する機能。
【００７２】
例示的な実施形態は、上記で開示されており、添付の図面に示されている。
当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に具体的に開示されたものに様々な変更、省略および追加がなされ得ることが理解される。
【図１】
2019520045.tif 000003
【図２】
2019520045.tif 000004
【図３】
2019520045.tif 000005
【図４】
2019520045.tif 000006
【図５】
2019520045.tif 000007
【図６】
2019520045.tif 000008
【図７】
2019520045.tif 000009
【図８】
2019520045.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月22日(2019.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１６年４月２５日に出願された、「フローサイトメーターを用いた計数補償のための分析方法」と題する米国仮特許出願第６２／３２７，００７号、および、２０１７年３月１３日に出願された、「抗菌剤の有効性を定量化するための自動流体処理システムおよびそれを使用する方法を含むフローサイトメーターシステム」と題する米国仮特許出願第６２／４７０，５９５号に係る優先権を主張する。この出願には、参照によりその開示内容の全てが組み込まれる。
発明の分野
【０００２】
本発明は、一般に、体液サンプル中の細菌検出を高い信頼性で行うための複雑なマトリックスサンプルの逐次分析の技術に関する。
特に、本発明は、フローサイトメーターを用いた、高い信頼性の細菌検出および薬物感受性予測のための複雑なマトリックスサンプルの逐次分析のためのシステム、デバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
液体サンプル中の汚染物質を検出し計数（列挙）するためにフローサイトメーターベースのシステムを使用することは、周知である。さらに、フローサイトメトリーは、流体サンプル中の細菌の検出に利用されている。多数の特許文献および非特許文献は、流体サンプル中の細菌または感染の「迅速な」検出または診断が可能なフローサイトメトリーシステムおよび方法を提供すると主張している。
そのような刊行物の例として、以下のものが挙げられる。
Sakaiらの米国特許第7,645,594号、フローサイトメーターによる細菌の識別のための分析サンプルの調製方法；
Tanaka等の米国特許第8,333,926号、尿中の粒子分析装置およびその方法；
Mansourら、米国特許第4,622,298号、尿中の微生物、白血球および扁平上皮細胞の検出および定量；
Gronerら、米国特許第5,858,697号、尿路感染症の迅速診断法；
Czarnek、米国特許第7,468,789号、迅速な細菌検出のためのフローサイトメーター；
Kawashima、欧州特許第1466985号、細菌を測定するための方法、細菌測定装置、および細菌を分析するためのコンピュータ実行可能プログラムを記憶するための記憶媒体;
Nudingら、フローサイトメトリーによる細菌の検出、同定および感受性試験、J. Bacteriol Parasitol 2013, S:5；
Walbergら、メシリナムおよびアンピシリン細菌感受性の迅速フローサイトメトリー評価、Journal of Antimicrobial Chemotherapy (1996) 37, 1063-1075；
Durodieら、フローサイトメトリーによる抗菌活性の迅速な検出、Cytometry 21:374-377 (1995)。
【０００４】
このようなシステムおよび方法は、従来のベンチベースインキュベーション法と比較して「迅速」であると特徴付けられるが、現在のフローサイトメーターベースのシステムおよび方法論は、不正確さおよび様々な要因から生じる他の欠点により、その能力が限定されている。
したがって、より正確であり、誤った結果を低減して、迅速に検出、診断および試験することができるシステム、装置および方法が当該分野において必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１つの実施態様において、本開示は、細菌の存在についての体液の臨床サンプルを試験するための自動流体ハンドリングシステムにおけるフローサイトメーターの使用方法であって、場合によっては少なくとも１つ抗生物質に反応するサンプルを決定するための自動流体ハンドリングシステムにおけるフローサイトメーターの使用方法である。
この方法は、
自動流体ハンドリングシステムを使用して、サンプルの一部分を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
フローサイトメーターにより第１のウェルから前記サンプルの部分を試験して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地により、前記サンプルを、前記全細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈調整サンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを少なくとも含むウェルに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより時間Ｔ０で前記Ｔ０ベースラインウェル内のサンプルを試験して、前記Ｔ０ウェル内のサンプルの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１までのＴ１コントロールウェルの前記サンプルを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を備える。
【０００６】
別の実施形態では、本開示は、細菌の存在について体液のサンプルを試験するためにフローサイトメーターを使用する、場合により少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定する方法に関する。
この方法は、サンプルを所定の濃度に希釈するステップと、
希釈したサンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）バッチおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）バッチを含む少なくとも２つのバッチに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより、前記Ｔ０ベースラインバッチを時間Ｔ０で試験して、前記Ｔ０バッチの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１まで、増殖培地中で前記Ｔ１コントロールバッチを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を得るステップと、
細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するために、前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較するステップと、
を備える。
【０００７】
さらに別の実施形態では、本開示は、流体サンプル中の対象粒子のフローサイトメーター計数における不正確さを補償する方法に関する。
この方法は、既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性を有する試験計数補償（ＴＥＣ）粒子であって、既知の濃度の計数すべきサンプル中の試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を含めるステップと、
前記フローサイトメーターによるサンプル計数により、前記ＴＥＣ粒子を計数するステップと、
試験されたサンプル中の既知のＴＥＣ粒子濃度と比較して、計数されたＴＥＣ粒子値に基づいて、補償因子を決定するステップと、
前記補償因子によって前記サンプル試験計数値を調整するステップと、
を含む。
【０００８】
さらに別の実施形態では、本開示は、細菌の存在についての体液サンプルを自動検査し、場合によっては少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定するためのシステムに関する。
このシステムは、流体サンプルをウェルプレートのウェル間に分配するための自動ピペットシステムを含む流体ハンドリング装置と、
前記流体ハンドリング装置から受け取ったウェルプレート内のサンプルを培養するように構成されるインキュベータと、
サンプルを含むウェルプレートを、前記流体ハンドリング装置から前記インキュベータに送り、ウェルプレートを前記インキュベータから前記流体ハンドリング装置に戻すように構成されるプレート搬送装置と、
前記流体ハンドリングシステムによって提供されるサンプル中の細胞数を計測するように構成されるフローサイトメーターと、
プロセッサとメモリであって、前記プロセッサは、前記メモリに格納された命令を実行して、前記命令に従って前記システムを制御するプロセッサであって、前記格納された命令は、前記システムに、
サンプルの一部分を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
少なくとも第１の試験ウェルから前記サンプルの一部分を計数して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地での前記サンプルを、総細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈調整サンプルを、少なくとも、時間０ベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１コントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを含むウェルに分けるステップと、
時間Ｔ０において前記Ｔ０ベースラインのウェル内の前記サンプルを計数し、前記Ｔ０ウェル内の前記サンプルの測定された特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
前記サンプルを前記インキュベータに送るステップと、
時間０から時間１まで、前記Ｔ１コントロールウェル中のサンプルを培養するステップと、
培養後に前記サンプルを前記流体ハンドリング装置に戻すステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でＴ１コントロールバッチを計数して、前記Ｔ１サンプルの測定された特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を実行させる前記プロセッサと、前記メモリと、
少なくとも前記プロセッサと通信するグラフィカルユーザインターフェースであって、前記システムとユーザとの交流を可能にする前記グラフィカルユーザインタフェースと、
を備える。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明を説明するために、図面は、本発明の１つ以上の実施形態の態様を示している。しかし、本発明は、図面に示されている正確な構成および手段に限定されることはない。
【図１】本明細書に開示された一実施形態に係るシステムで使用されるハードウェアの図。
【図２】本明細書に開示された実施形態に係るシステムの機能ユニットの概略ブロック図。
【図３】本明細書で開示される実施形態による方法を示す高レベルフロー図。
【図４】本明細書に開示される一実施形態に係る流体ハンドリングシステムおよびマルチウェルカセットの概略図。
【図５】別のマルチウエルカセットの概略図。
【図６】さらなる別のマルチウェルカセットの概略図。
【図７】細菌を同定する工程と、抗生物質に対する耐性／感受性について試験する工程とを含む、本明細書において開示される実施形態に係る方法を示すフロー図。
【図８】本明細書において開示される別の実施形態による別の方法を示すフロー図。
【図９Ａ】図９Ａは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上の散布図として描写された臨床標本の真核細胞のスクリーニング計数を表すサイトグラムであり、灰色の陰影の領域は所定のＲＯＩを表す（これについては、本明細書における他の全てのサイトグラムで同様である）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上の散布図として描写された臨床標本の真核細胞のスクリーニング計数を表すサイトグラムであり、灰色の陰影の領域は所定のＲＯＩを表す（これについては、本明細書における他の全てのサイトグラムで同様である）。
【図９Ｃ】図９Ｃは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上の散布図として描写された臨床標本の真核細胞のスクリーニング計数を表すサイトグラムであり、灰色の陰影の領域は所定のＲＯＩを表す（これについては、本明細書における他の全てのサイトグラムで同様である）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、例示的な対象領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）上に散布図として希釈および描写された臨床標本の細菌スクリーニング計数を表すサイトグラムである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ（ｓ）  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）上に散布図として希釈および描写された臨床標本の細菌スクリーニング計数を表すサイトグラムである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、Ｔ０コントロールサンプル（対照サンプル）を表す別の臨床検体の細菌計数を表すサイトグラムである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、Ｔ０コントロールサンプル（対照サンプル）を表す別の臨床検体の細菌計数を表すサイトグラムである。
【図１２Ａ】図１２Ａは、図１１Ａおよび１１Ｂに表されているが、Ｔ１増殖率を決定するために計数された臨床標本の細菌数を表すサイトグラムである。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１１Ａおよび１１Ｂに表されているが、Ｔ１増殖率を決定するために計数された臨床標本の細菌数を表すサイトグラムである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上に散布図として描かれた試験計数補償粒子を希釈して提供した別の臨床検体の細菌計数を表すサイトグラムである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上に散布図として描かれた試験計数補償粒子を希釈して提供した別の臨床検体の細菌計数を表すサイトグラムである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上に散布図として描かれた試験計数補償粒子を希釈して提供したさらなる臨床標本の細菌計数を表すサイトグラムである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、例示的な対象領域（ＲＯＩ）上に散布図として描かれた試験計数補償粒子を希釈して提供したさらなる臨床標本の細菌計数を表すサイトグラムである。
【図１５】図１５は、本開示による別の制御システムの構成要素を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、試験カセットウェル内に臨床サンプルを十分に装填するためのプロセスと、例えば、抗生物質の有効性の分析のような後続して実行される分析のための自動流体ハンドリングフローサイトメーターシステムによるサンプル処理であって、後続して実行されるサンプル処理を知らせるための初期サンプル試験から取得した定量的な結果を用いるプロセスとを含む。
図１〜図６および図１５は、自動流体ハンドリングフローサイトメーターシステムを例示している。
当該システムは、尿、血液、または脳脊髄液などの流体を分析するためのフローサイトメーターと、
以下に説明するように、試験のためのフローサイトメーターに対して特定倍の特定の濃度の流体混合物を実現する液体ハンドリングシステムと、
流体ハンドリングシステム内においてサンプル間の流体ラインを洗浄するための洗浄システムと、
インキュベーターから流体ハンドリングシステムへ流体カセットを搬送するためのカセットトランスポーターと、
複数のカセットをインキュベート（培養）するインキュベーターと、
を含む。
当該システムは、当該システムを操作するための様々なソフトウェアプログラムを含んでいてもよい。
【００１１】
本発明の実施形態は、短期増殖パラメータを使用し、細菌集団の増殖を増殖前に評価した元の比較対象試験と比較することによって、複合マトリックスにおける細菌の識別を改善するためのシステム、方法およびデバイスに関する。
本明細書に記載された実施形態によれば、従来技術や従来のシステムよりも優れている効果を実現することができる。本明細書に記載された実施形態により、体液サンプル内の死細胞から生細胞をより正確に区別するための定量的方法が実現され、また、細菌の場合には、臨床的な関心があるものではないが、対象となる病原性細菌と、生存しているかもしれない汚染菌とをより正確に区別するための定量的方法が実現される。
さらに、短期増殖プロトコル（短期増殖の実施要綱）は、複数のクラスの抗生物質が存在する環境下で、十分に分裂されること、および、培養されることを含む。また、短期増殖プロトコルは、試験された抗生物質に対する、細菌の予期される耐性または感受性の予測プロファイルを提供するのに十分な特定の抗生物質に対するサンプル応答の迅速かつ正確な測定を提供する（以下、「抗生物質予測プロファイル」または「ＡＰＰ」という）。
場合によっては、測定されたサンプル応答は、抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）などの他の臨床試験についても有用であり得る。
本明細書に開示された方法によるＡＰＰ試験は、細菌汚染物質が存在するならば、細菌汚染物質の迅速な抗生物質の感受性／耐性プロファイルを提供することができる。
元と増殖の拡大の評価は、適切なアッセイ試薬、および、統合ソフトウェア分析プログラムを用いたフローサイトメーターにより計数される。
このアプローチでは、核酸挿入染料、および、細菌を計数するための細菌散乱特性の評価を用いて、感染および細菌増殖特性を示すことができる細菌レベルをより正確かつ迅速に評価することで、現在の方法を改善する。
【００１２】
第２の実施形態は、サンプルカセットに関する。そして、サンプルカセットには、細菌を含むと疑われるサンプルが充填され、当該サンプルは、細胞分割を促進する適切な温度で分析および培養するために、増殖培地および場合によっては抗生物質を含む多数のウェルの間で等しく分割される。
フローサイトメトリーソフトウェアにより、ユーザは、抗菌剤の作用による細菌集団の散乱特性および蛍光特性の変化を評価することができる。
集団計数の変化、例えば、範囲および変動係数など（なお、これらには限定されない）の集団統計、および、散乱特性の変化を、抗菌剤のクラスに対する細菌単離株の脆弱性に関する信頼区間を提供するために、使用することができる。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において、非細菌事象の計数を減少させ、病原性細菌を非病原性汚染細菌から区別することを目的として、フローサイトメトリーソフトウェアを用いることで、複数回の細菌分裂による集団拡大の変化をユーザが評価することが可能になる。
別の実施形態では、自動システムが実現される。そして、当該自動システムでは、細菌を含むことが疑われるサンプルが充填されるサンプルカセットが、細胞分割を促進する適切な温度で分析および培養するために、増殖培地および場合によっては抗生物質を含む多数のウェルの間で均等に分割される。
フローサイトメトリーソフトウェアにより、ユーザは、抗菌剤の作用による細菌集団の散乱特性および蛍光特性の変化を評価することができる。
集団計数の変化、例えば、範囲および変動係数など（なお、これらには限定されない）の集団統計、および、散乱特性の変化を、抗菌剤のクラスに対する細菌分離株の脆弱性に関する信頼区間をユーザーに提供するために、使用することができる。
【００１４】
本明細書に記載されるシステムの例示的な実施形態が、図１および図２に概略的に示されている。
高レベルにおいて、システム１０は、処理制御部１２と、グラフィカル・ユーザ・インターフェース（ＧＵＩ）とを備えており、これにより、ユーザは、システムのハードウェア構成要素に対する制御処理を行うことができる。
ハードウェアシステム１５は、流体ハンドリングシステム１６、自動カセットハンドリングシステム１８、インキュベータ２０およびフローサイトメータ２２などのハードウェア構成要素を含むことができる。
流体ハンドリングシステム１６は、例えば、自動ピペットシステム２４（図４に示す）と、１つまたは複数のカセットハンドリングロボットおよびマイクロプレート洗浄機とを含むことができる。
本明細書で特に明記されている場合を除いて、これらのハードウェア構成要素は、記載された機能を実行するための市販の装置から選択されるものであってもよいし、本明細書に示された教示に照らして当業者の知識に基づいて構成されるものであってもよい。
【００１５】
図２に示すように、処理制御部１２は、プロセッサ３４およびメモリ３６を備えることができる。
メモリおよびプロセッサは、適切なアプリケーション・プログラミング・インターフェース（ＡＰＩ）および通信バス３８を介してＧＵＩ１４およびハードウェアシステム１５と通信する。
プロセッサの通信および制御に関する構成については、図１５により以下でより詳細に説明する。メモリ３６の構成要素として、接続されるハードウェア構成要素および流体ライブラリ４２を制御および操作するために特別に構成されたソフトウェアモジュール４０を含んでもよい。
例えば、ソフトウェアモジュールは、ＧＵＩモジュール４４、フローサイトメータモジュール４６、インキュベータモジュール４８、流体ハンドリングデバイスモジュール５０、およびカセットハンドリングデバイスモジュール５２を備えることができる。
流体ライブラリ４２には、例えば、尿、髄液、および血液など（なお、これらには限定されない）の分析中の特定のタイプの流体を分析するために使用される流体および細菌固有の情報が入力される。
例えば、フローサイトメータソフトウェアモジュール４６は、検査される様々な流体中の細菌の様々な種を検出するために流体ライブラリに記憶されている、所定の対象領域（ＲＯＩ）、散乱値および蛍光値などにアクセスすることができる。
ゲーティング戦略、および／または、フローサイトメーターソフトウェアによって実行される計算分析によって決定される、散乱値および蛍光値などの標的事象の特性を有するＲＯＩを検出することにより、サンプル中の対象の粒子、細胞または細菌の濃度を決定するようにしてもよい。
また、以下でより詳細に説明するが、特定の流体タイプに対する複数のＲＯＩを、分析の異なるポイントで使用するために格納することができる。
【００１６】
本明細書中に提示される様々な実施形態の記載から理解されるように、１つの例示的な実施形態には、指定されたウェルに増殖培地および抗生物質を含むマルチウェルカセットが含まれ、一般的な細菌染色または他の分析のためのキットが含まれ得る。
増殖培地は、流体ハンドリングシステム内に配置される期間に、あるいは、その期間の前に、初期処理工程において、水和などによって活性化され得る乾燥状態、凍結乾燥状態または他の保存状態で提供され得る。
本明細書で使用されるマルチウェルカセットは、自動アッセイおよび流体処理に適合した任意のカセット、プレートまたはウェル構造を指すものであってもよい。
そのようなカセットは、一例として、図４に示すように、ウェルが個々に取り外し可能なチューブによって形成される６×６エッペンドルフ・チューブ・ラック２８（および関連するチューブ）であってもよい。
マルチウエルカセットの他の例として、本明細書でその用語が使用されているように、図５に示すような９６穴のウェルプレート３０などの従来のマイクロウェルプレートが挙げられる。
特定の用途のために様々なサイズを有する、他の代替の、あるいは、カスタムのマルチウエルカセット３２（図６）を考案してもよい。
再び図４を参照すると、流体ハンドリングシステム１６の自動ピペットシステム２４を使用して、マルチウエルカセットのウェル間に流体を分配することができる。
【００１７】
１つの例示的な実施形態において、単一容積のサンプルがカセットに装填され、すべてのサンプルウェルに均等に分配される。
これには、Ｔ０コントロールウェル、Ｔ１コントロールウェル、および抗生物質を含むすべてのウェルが含まれる。
サンプルは自動フローサイトメーターに装填され、サンプルＩＤがカセットに割り当てられる。
計数、平均蛍光、ＣＶ、集団の範囲、およびサンプル中の補償ビーズからの「距離」の計算を含み、細菌ＲＯＩに割り当てられた任意の集団についてＴ０コントロール値が決定される。
このデータは、Ｔ１でのサンプル培養の後に後続する分析のための参照用として保存され、使用される。
【００１８】
使用中、流体サンプルは、カセットのウェルの間で分けられる。
サンプルは、少なくとも生細菌を染色する染色試薬で処理され、場合によっては、死んだ細胞を染色して、生細胞と、損傷した／死んだ細菌細胞と、を区別する。
存在する任意の細菌について治療するための抗菌剤の有効性を試験するために、１つ以上の抗菌剤が選択され、様々なウェルに添加されうる。
少なくとも２つのコントロールウェル（増殖培地を含むが抗菌剤を含まないＴ０およびＴ１ウェル）があり、場合によっては抗菌剤を試験するための少なくとも１つの追加のウェルがある。
【００１９】
Ｔ０コントロールウェルサンプルは、細菌に合わせた対象領域（ＲＯＩ）を画定する細菌ライブラリを含むフローサイトメーターで分析される。
Ｔ０サンプルは、細菌の対象領域（ＲＯＩ）に割り当てられた任意の集団のベースラインＴ０コントロール値を得るために時間ゼロで試験され、計数、平均蛍光、ＣＶ、集団の範囲を含み、蛍光補償ビーズが使用される場合、サンプル中の補償ビーズからの距離の計算を含む。
このデータは、Ｔ１でのサンプルインキュベーションの後、後続する分析のための参照用として保存され、使用される。
【００２０】
サンプルの次の量は、所定の時間および温度（例えば、３７℃）で培養され、Ｔ１で、おそらくはＴ１を超えて、システムによって分析される。
最初のＴ０サンプルに対する比較分析を行うことで、所定の細菌に特定のＲＯＩにおける集団拡大を決定することができるであろう。
【００２１】
Ｔ１コントロールサンプルが細菌を含有する場合、初期Ｔ０試験結果と比較してＲＯＩに集団が拡大する。
このような拡大は、検出された事象が実際に細菌であり、ノイズまたは非細菌粒子などの偽のデータではないことを保証するのに役立つ。
言い換えれば、細菌を含まないサンプルにおいて、ＲＯＩ集団の変化はなく、細菌ＲＯＩにおいて検出された事象は、細胞破片またはノイズである可能性が最も高い。
【００２２】
複数のＴ１試験を実施することができ、各Ｔ１サンプルは、１つ以上の臨床的に関連する化学物質および／または抗生物質と共に培養されている。
感受性の細菌株は、フローサイトメーターで評価された散乱特性の潜在的変化と、Ｔ１コントロールに対する細菌ＲＯＩの生細胞事象数の減少とを示す。
耐性細菌株は、Ｔ１コントロールと比較して細菌数の減少がほとんどまたは全くないことと、散乱特性の変化もないこととを示すであろう。
【００２３】
信頼性の高い細菌同定に加えて、この技術は、抗生物質感受性試験と併用すると、共感染の同定に適用することができる（すなわち、サンプルは２種類以上の細菌を含む）。
特定の抗生物質とともに培養されたサンプルの逐次分析では、サンプル中の抗生物質とは異なる反応を示す２つの集団など、複数の亜集団の生存細胞ＲＯＩを確認する能力が実現される。
【００２４】
画像分析ソフトウェアを使用することで、生きている細胞のＲＯＩ内の事象密度の追跡が可能となる。
例えば、２種の細菌は、細胞破片および白血球のような同じサンプル中の他の粒子と比較して、一般に同じ散乱特性および蛍光特性を有するが、異なる細菌種は、わずかに異なるパラメータ（例えば、散乱）を有し得る。
抗生物質で治療（処理）された、次のＴ１、Ｔ２などのサンプルを試験する場合において、抗生物質がある種に対して他の種よりも高い有効性を有するときは、生細胞ＲＯＩにおける事象の特性は非対称的にシフトし始める可能性があり、２つ以上の集団が示唆される。
【００２５】
抗生物質効果が、領域との集団変化における明らかな差異を示す場合、信頼区間が、サンプル中に２つ以上の種の細菌が存在する可能性を示していると考えることができる。
【００２６】
一例として、本発明は、臨床検査室で所定の容量の血液を複数の検査ウェルに装填することを可能にすることによって、臨床血液サンプル中の菌血症を決定することに関する。そして、複数の検査ウェルの全ては、増殖培地を含んでおり、複数の検査ウェルのいくつかは、臨床的に関連する濃度の抗生物質を含んでいる。
自動化されたソフトウェアおよびハードウェアは、損傷細胞または死細胞から生細胞を識別する色素であって、細菌を標的とする適切な色素を用いて、時間ゼロ（Ｔ０）でサンプルを分析する。
陽性集団を含むサンプルの値が決定される。そして、陽性集団を含むサンプルの値には、集団計数、集団平均蛍光、集団蛍光ＣＶ、および集団範囲が含まれる。
このＴ０テンプレートは、システムによって保存され、今後のすべてのテストの参照結果として使用される。
サンプルの次の量は、所定の時間および温度（すなわち、「３７℃」）で培養され、Ｔ１、おそらくはＴ１を超えて、システムによって分析される。
最初のＴ０サンプルに対する比較分析を行うことで、細菌と有意に相関する所定の対象領域（ＲＯＩ）における集団の拡大を決定することができるであろう。
細菌汚染を含むサンプルでは、最初の試験結果と比較してＲＯＩに集団が拡大する。
細菌が含まれていないサンプルでは、細胞破片やノイズの可能性があるＲＯＩ集団に変化はないはずである。
同様に、臨床的に関連する化学物質および抗生物質と共にサンプルを培養した場合、複数のＴ１試験が行われる。
影響を受けやすい細菌株は、Ｔ１コントロールと比較してＲＯＩにおける事象数の減少を示し、また、フローサイトメーターで評価した散乱特性の潜在的変化を示す。
耐性細菌株は、Ｔ１コントロールと比較して細菌数の減少を示さず、また、散乱特性の変化も示さない。
【００２７】
例示的な一実施形態において、細菌の存在についてサンプルを分析し、細菌の抗生物質感受性を決定するための自動化された方法は、システム１０全体の流体ハンドリングシステム１６で使用するように構成されたマルチウエルカセットにサンプルを置く工程を含む。
また、カセットは、１つ以上の培地ウェル（例えば、図４〜６を参照）において、所定量（例えば、１ｍｌ）の増殖培地を有していてもよい。
一例として、ミューラーヒントンブロスを増殖培地として使用することができる。
また、カセットは、所定量の抗生物質を含有する複数の抗生物質ウェルを有していてもよい。
流体ハンドリングシステム１６は、フローサイトメーター２２による分析のために流体サンプルを染色するための染料または他の染色剤を含む試薬ラック２６などの１つまたは複数のウェルを有していてもよい。
一例として、生細胞／死細胞の色素を使用してもよい。
サンプルウェル内に置かれた（注入された）流体サンプルを有するカセットは、手で流体ハンドリングシステムに装填されてもよく、また、複数の他のカセットと共にインキュベータ内に装填されて、自動カセットハンドリングシステム１８により、自動的にインキュベーターから流体ハンドリングシステムに装填されてもよい。
【００２８】
流体ハンドリングシステムにおいて、流体ハンドリングシステム１６が、自動ピペットシステムまたは他の適切なプローブ２４を利用して、流体ハンドリングシステム内に貯蔵された色素ウェルから所定量の生細胞／死細胞の色素を除去（例えば、吸引）し、流体サンプルを含むサンプルウェルに色素を沈着させる。
また、流体ハンドリングシステムは、以下にさらに詳細に説明するようにフローサイトメーター測定の精度を検証するために使用することができる流体サンプル中に所定量の標準化蛍光ビーズを堆積（注入）させるように構成してもよい。
他の例として、色素およびビーズをサンプルウェルに手動で添加してもよい。
【００２９】
また、流体ハンドリングシステム１６は、染料をサンプルと適切に混合するための混合プロセスを実行するようにプログラムされていてもよい。
次いで、カセットは、染料が細菌と反応して細菌を染色できるように、流体ハンドリングシステムの温度制御されたインキュベーションチャンバー内で所定時間培養されてもよい。
色素の培養時間が経過すると、流体ハンドリングシステムは、初期測定のために、流体サンプルの所定量をサンプルウェルからフローサイトメーターに自動的に輸送するようにしてもよい。
【００３０】
一実施形態として、図７を参照して、例えば、自動化方法は、サンプルをマルチウェルカセットに装填することから開始するようにしてもよい（ステップ５４）。
流体ハンドリングシステム１６の自動ピペットシステム２４（または他の適切な流体分配装置）は、サンプルをウェルＡからウェルＢおよびＣに適切な量で分配する（ステップ５６）。
説明を明瞭にするために、この例示的な実施形態は、ウェルの単一の「列」（すなわち、図４のＡ１〜Ｆ１）について説明されることに留意されたい。
当業者は、複数のサンプルの同時分析のために任意の数のカラムおよびウェルを使用できることを理解するであろう。
【００３１】
ステップ５８において、自動ピペットシステム２４は、試薬ラック２６の指定されたウェルから適切な細胞染色剤（例えば、ヨウ化プロピジウムまたはチゾールオレンジ）を取得し、ウェルＢおよびＣのサンプルを染色する。
次に、流体ハンドリングシステムは、ステップ６０でウェルＢの内容物を真核細胞の計数のためにフローサイトメーター２２に送る。
計数ステップ６０の例示的な結果が、図９Ａの散布図および図９Ｂおよび図９Ｃの蛍光プロットに示されている。
図９ＡのＲＯＩは、赤血球数および白血球数のゲートを提供する。
フローサイトメーターの分野でよく理解されているように、図９Ｂ（赤血球数、「ＲＢＣ」）および図９Ｃ（白血球数、「ＷＢＣ」）に示されている蛍光強度に基づいて、それぞれのＲＯＩ内にあるイベント（両方のＲＯＩ内にあるイベントを含む）はさらに分析される。
この場合も、同定されたＲＯＩ内のイベントは細胞数を表す。
典型的には、ＷＢＣが報告されるが、臨床的要件に応じて、ＷＢＣおよび／またはＲＢＣが報告され得る。
【００３２】
一実施形態では、次に、ステップ６２において、サンプルウェルＣの内容物が、流体ハンドリングシステム１６によって、細菌検査の計数のためのフローサイトメーター２２に送られる。
図１０Ａおよび１０Ｂにそれぞれ示されている散布図ゲーティングおよび蛍光強度分析は、図１０ＢのＲＯＩ内にある事象に対応する細菌数を決定するために再度使用される。
いくつかの実施形態では、ステップ５８でウェルＣに適用される色素は、少なくとも２つの異なる色素、例えば、死細胞のみを透過する１つの色素、および、すべての細胞を透過するもう１つの色素を含んでいてもよい。
このように異なる色素タイプを使用することにより、異なる色素の異なる蛍光特性に基づいて、生細胞と死細胞を区別することが可能になる。
使用される技術に応じて死細胞を除外することができるステップ６２での細菌のスクリーンカウント（選別した数）を所定の閾値と比較して、サンプルの継続的分析が正当か否かを評価する。
例えば、尿路感染の評価に関連する現在の臨床基準は、患者の臨床状態などの要因に応じて、１０４／ｍｌまたは１０５／ｍｌの閾値を示す。
他の臨床兆候または他の臨床状況の分析に適切な他の閾値を適用してもよい。
当業者であれば、他の実施形態では、ステップ６０および６２の計数を逆の順序で実行してもよく、あるいはハードウェアまたはシステムの制限によって除外されない限り、同時に実行してもよいことを理解するであろう。
【００３３】
なお、細菌スクリーニングステップ６２は、蛍光識別色素を使用して死細胞を細胞計数から大部分排除するために実行してもよいが、その一方で、この段階での細胞計数は、全てのタイプの生細胞を含んでいるかもしれない。つまり、対象の細胞と、対象外の細胞の両方とを含んでいるかもしれない。したがって、汚染細胞であると考えられうる生細胞を含んでいるかもしれない。
例えば、尿路感染症の評価において、対象の主要な病原菌は、大腸菌である。
しかしながら、典型的なヒト尿サンプルは、多くの異なる種の非病原性細菌叢も含んでいるかもしれない。
これらの非病原性細菌叢は、病原体の正確な臨床分析に関して汚染物質とみなされ得る。
【００３４】
ステップ６３において、前のステップで決定された細菌数に基づいて、サンプル濃度が調整され、実施される分析のために必要に応じてサンプルがさらなるウェルに分配される。
ハードウェアの能力に依存して、ステップ６３は、以下のような個々のステップを含むことができ、単一処理により、または逐次処理により、実行され得る。
サンプル濃度６４の調整は、サンプルが自動ピペットシステム２４によってさらに分配されるときに適切な量の増殖培地６６を添加することによって達成されうる。
サンプル分配６８は、少なくともＴ０サンプルのウェルＤ７０への分布およびＴ１サンプルのウェルＥ７２への分配を含むであろう。
場合によっては、ＡＰＰまたは他の抗生物質試験が分析に含められる場合、さらなるサンプルを抗生物質試験（ＡＴ）ウェル７４に分配してもよい。
一実施形態では、調整ステップ６４は、適切に希釈されたサンプルを最初のウェル（例えば、ウェルＤ）に注入し、その後、最初のウェルからのそのサンプルのある量を、使用される他のすべてのウェルに分配することによって達成される。
【００３５】
当該技術分野で知られているように、抗生物質の耐性または感受性のための細菌の試験では、典型的には、約５×１０４〜約５×１０５細菌／ｍｌの範囲の細菌濃度を必要とする。
しかし、使用される機器の感度および精度（例えば、いくつかのフローサイトメーターシステムが他よりも感度がよい）によっては、より低い濃度を使用することができる。
したがって、本開示の方法は、１×１０３細菌／ｍｌの範囲の低濃度で使用することができる。
例えば、機器の感度は、約１×１０４細菌／ｍｌ〜約５×１０４細菌／ｍｌの範囲の濃度を示し得る。あるいは、他の機器では、約１×１０３細菌／ｍｌ〜約５×１０３細菌／ｍｌの範囲の濃度を使用し得る。
【００３６】
一実施形態において、サンプル濃度は、帯域（バンド）で、または、範囲で調整される。
例えば、結果に悪影響を及ぼすことなく処理を単純化するために、Ａ）５０〜４９９９／μｌ、Ｂ）５０００〜２４９９９／μｌ、および、Ｃ）２５０００〜４００００／μｌの３つのバンドを使用することができる。
他のバンドまたはバンド数は、所望の速度および精度、機器感度および臨床目的などのパラメータに基づいて、当業者によって導き出されるものであってもよい。
上述したようにステップ６３でサンプルを注入するときに、濃度を所望の範囲に調整するために、各濃度バンドに対して標準希釈（標準値に希釈したもの）を用いることができる。
次に、ステップ７６において、染色剤がサンプルＴ０に添加される。次いで、流体ハンドリングシステム１６を介した分配の後、ステップ８０において、Ｔ０サンプルが、フローサイトメーター２２によって計数される。
Ｔ０サンプルは、後続の増殖速度測定に対する対照標準（コントロール）としての機能を果たす。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、この計数の結果を示す。
【００３７】
ステップ８０において、サンプルＴ０が計数の対象にされた後、サンプルＴ１および任意の所望のＡＴサンプルを含むマルチウェルカセットは、自動カセットハンドリングシステム１８によってインキュベータ２０に送られ、ステップ７８において、培養される。
ＡＴウェルには、検査が行われる特定の抗生物質が予め充填されていてもよく、あるいは、流体ハンドリングシステムによって適切なソースウェルから別個に充填されてもよい。
培養時間は、調査されるべき細胞の性質に依存する。
例えば、泌尿生殖器フローラ（植物相）のような対象の細胞についての培養時間は、約２．５時間、典型的には３時間以下であるが２時間よりも長い時間の範囲であってもよい。
培養の後、マルチウェルカセットは、自動カセットハンドリングシステム１８によって流体ハンドリングシステム１６に戻される。
ステップ８２において、Ｔ１サンプルは、自動ピペット処理システム２４によって染色される。
同時に、ステップ８４において、ＡＴウェル中のサンプルも染色される。
その後、ステップ８６において、Ｔ１サンプルが計数され（図１２Ａおよび１２Ｂ）、培養後の増殖比、すなわち、Ｔ０に対するＴ１のセル比がステップ８８で決定される。
【００３８】
病原性細胞／対象の細菌と、汚染細菌／細菌との間の定量的識別を可能にするために、計数（８０，８６）、判定（８８）およびＴ１／Ｔ０細胞増殖比（８９）の評価が重要なステップである。
本出願人は、病原性細菌が非病原性の汚染細菌と比較して異なる増殖速度を示し、増殖速度のこれらの差異を、めっきサンプルの濁度などのより主観的で定性的な測定に依存することなく、臨床的に関心を引く（対象の）細胞と汚染細胞との間で定量的に識別するのに用いることができることを発見した。
例えば、ヒト尿中の病原性細胞は、約２．５時間の短い培養時間にわたって培養した場合、汚染細胞の増殖速度よりも約２．２５±１倍の増殖速度を示すことが判明した。
状況によっては、増殖速度の差異をより具体的に、２．２５±０．５とすることが可能であるかもしれない。
したがって、一実施形態では、Ｔ１からＴ０までの細胞増殖比が約１．２５から３．２５（すなわち、約１２５％から約３２５％）であると決定された場合、サンプルは病原菌陽性として（ステップ８９Ａ）評価されるかもしれない（ステップ８９）。
【００３９】
別の実施形態では、システムは、Ｔ０とＴ１との間の相対的な増殖を、細菌集団の拡大を表す整数に変換するようにプログラムされてもよい。
そのような実施形態では、Ｔ０ベースラインからＴ１コントロール増殖までの誘導された増殖整数は、試験される疾患状態で表現される病原体の既知のライブラリの既知の増殖整数と比較される。
代表的な疾患状態には、尿路感染に関連する病原体、血流感染（菌血症／敗血症）に関連する病原体、髄膜炎に関連する病原体または他の神経系感染症が含まれ得るが、これらに限定されない。
代替的または追加的に、誘導増殖整数は、例えば、疑われる尿路感染と関連する正規の泌尿生殖器のフローラや、菌血症の疑いのあるサンプルでの血液採取に伴う皮膚の汚染物質などのように（なお、これらに限定されない）、評価されている疾患状態で表現される可能性のある細菌汚染物質の既知のライブラリの既知の増殖整数と比較される。
病原体および汚染物質の既知のライブラリは、メモリ３６の流体ライブラリ４２に格納されてもよい。
【００４０】
臨床目的に応じて、例えば尿路感染症の存在を単に判定することが目標である場合、肯定的な結果を停止点としてもよく、結果は、適切な医療提供者または患者に報告されてもよい。
しかし、本発明の実施形態はまた、そのような情報が望ましい場合、抗生物質耐性／感受性予測の迅速な評価を提供する。
ステップ８９における評価の結果が肯定的である場合、ＡＴウェルに置かれたサンプルを計数する処理を進めてよい。
サンプルがＴ０およびＴ１ウェルと同時にＡＴウェルに分配されたので、ＡＴウェルのサンプルは、培養ステップ７８の間においても培養される。したがって、追加の培養時間なしに直ちに、ＡＴウェルのサンプルを計数することができる。
ステップ９０、９２、および、それ以降のステップにおいて、ＡＴウェル１−ｎからのサンプルは、抗生物質予測プロファイルを決定するために計数され、あるいは、Ｔ１サンプルとの比較に基づいて抗生物質感受性を決定する際の情報として使用される。
これらの比較のために、Ｔ１を計数することで、ＡＴウェルの計数が比較されるベースラインが提供される。
耐性予測は、特定の臨床適応症、および／または、薬物および抗生物質について確立され得るように、増殖速度の閾値に基づくものであってもよい。
なお、再度、フローサイトメーター計数を使用し、例えば、ＡＴｎ／Ｔ１の比を比較することにより、抗生物質／薬物有効性を定量的に測定できることに留意されたい。
【００４１】
他の実施形態では、後続の試験のために初期サンプル濃度を所定の濃度に自動的に調整するように、システムを構成してもよい。
図８に示すように、染色後の、あるいは、場合によっては補償ビーズを添加した後の最初のサンプルを、フローサイトメーター２２によって測定して、細菌の初期濃度および感染の初期決定を得るようにしてもよい。
図示された、フローサイトメータおよび流体ハンドリングシステムのソフトウェアモジュール４６、５０は、初期測定値が感染を示すかどうかを決定するために流体ライブラリ４２から流体およびフローサイトメータに特化したパラメータを取得するように構成されてもよい。
測定された細菌の初期濃度では、流体ハンドリングシステムのソフトウェアは、さらなる試験のために必要な濃度調整を自動的に計算してもよい。
ソフトウェアはまた、培地ウェルに沈着した増殖培地の量に基づいて、さらなる試験のために必要な濃度に達するように、第１の培地ウェルに注入する液体サンプルの量を決定してもよい。
いくつかの例では、システムによる流体輸送の正確な量を保証するために、最小量の流体サンプル、例えば、＞１マイクロリットル（１マイクロリットルよりも多い量）が吸引される必要があり得る。
図８に示すように、細菌の初期濃度、必要とされる希釈、最小吸入量、および培地ウェル中の増殖培地の量によって、目標濃度に達するために多段階希釈プロセスが必要とされ得る。
【００４２】
例えば、様々な抗菌効力試験法は、標準濃度の細菌、例えば、１×１０４細菌／ｍｌの所定の細菌濃度を必要とすることがある。
臨床サンプルの初期試験がより高い濃度を示す場合（例えば、フローサイトメーターが初期サンプルを１×１０７細菌／ｍｌで計数する場合）、システムは、後続の試験のために濃度を自動的に調整してもよい。
一例として、サンプルの１マイクロリットルを流体ハンドリングシステムによって吸引し、培地ウェルの最初の１つに１０００マイクロリットルの培地に入れて、１×１０４の目標濃度に到達させるようにしてもよい。
別の例として、第２の希釈工程が必要となるように、初期濃度は１×１０７細菌／ｍｌよりも大きくてもよく、および／または、最小吸入容量は１マイクロリットルよりも多くてもよく、および／または、目標濃度はより低くてもよい。
目標濃度、例えば、１×１０４細菌／ｍｌに到達するために、流体ハンドリングシステムは、含む培地を含む第１の培地ウェルから吸引される第２の流体量と、第２の培地ウェル内に注入するための流体サンプルの第１の量とを決定するように構成されてもよい。
【００４３】
目標濃度の、（１）初期流体サンプル（２）色素（３）補償ビーズの一部、および（４）希釈媒体、例えば、増殖培地のうちの１つ以上を含む流体を自動的に生成した後、流体処理システムのソフトウェアモジュールには、流体ハンドリングシステムに、所定量の目標濃度の、１つ以上の抗生物質ウェル（図２）および２つのコントロールウェルを自動的に注入するための命令を含ませてもよい。
次いで、流体ハンドリングシステムは、コントロールウェルの１つ（以下、時間ゼロのコントロールウェル）から所定量の流体を自動的に吸引し、時間ゼロの細菌測定結果を得るために制御をフローサイトメーター２２に移譲してもよい。
時間ゼロのコントロールサンプルをフローサイトメータに輸送した後、制御された温度、例えば生理学的な温度（例えば、３５〜３７℃）で一定時間培養するために、カセットを、例えば、手で、または、カセット・トランスポータを用いてインキュベータに移動させてもよい。
細菌数を計数するためのフローサイトメーターを利用することにより、所要の培養時間は、現在の細菌感受性試験と比べて、著しく低減される。例えば、１〜２日を必要とする従来技術に比べて、約１〜３時間の培養時間となる。
当業者には理解されるように、このような時間の短縮は、非常に貴重であり、治療（処理）前の包括的な感受性試験を可能にする。そして、それによって、目標とする抗生物質治療を可能にし、この分野において現在実施されているような、多数の抗生物質の慢性的な過剰処方を避けることができる。
【００４４】
培養の後、カセットを流体ハンドリングシステムに戻してもよい。そして、第２のコントロールウェルおよび抗生物質ウェルの流体混合物は、分析のために、それぞれの制御された容量を別々にフローサイトメーターへ送ることによって、自動的に分析されるものであってもよい。
各フローサイトメーターの読み取りの間に、システムはまた、洗浄システムを作動させるように構成されてもよく、洗浄システムは、洗浄流体（例えば流体処理システム（いくつかの例として、フローサイトメーター）を洗い流すために使用され得る消毒流体）の流体リザーバを含むものであってもよい。
【００４５】
システムは、時間ゼロおよびその後の対照測定（コントロール測定）を利用して、抑制されない細菌増殖速度を決定してもよい。
また、システムは、時間ゼロのコントロールと各抗生物質ウェルのその後の測定との間の細菌数の差異を比較し、所定の抗生物質が静的（変化のないもの）であるか（時間ゼロのコントロールと統計的に計数される数が同じであるか）、あるいは、死滅的であるか（時間ゼロのコントロールよりも統計的に計数される数が少ないか）を決定することを含み、当該サンプル中の細菌が所定の抗生物質に対して感染しやすいか否かを決定することもできる。
測定内補償粒子
【００４６】
本明細書では、フローサイトメーターによって、標的とする集団の不正確な計数を補償する方法について説明する。標的とする集団の不正確な計数は、対象とする全ての事象を、計数できないか、あるいは、捕らえることができないために生ずる。
そのような不正確な計数は、センサおよび／または他のデータ取得コンポーネントの制限によって、および、システムのソフトウェアの制限によって、起こり得る。
例えば、フローサイトメーターは、過剰な粒子を含むサンプルを取り扱う場合、対象となる全ての粒子を計数することができず、その結果、標的とする集団の正確な計数結果を取得することができないことになる。
【００４７】
マイクロビーズは、機器が適切に動作しているかどうかを判定するために、サンプルが分析される前のフローサイトメーター較正のために広く用いられている。
本明細書に記載された実施形態では、計数の精度を決定するときに使用するために、そして、例えば計器のデータ取得のための閾値を超えたときに、過小に計量されることを補償するときに使用するために、マイクロビーズが、サンプルに、すなわちアッセイ内補償粒子として、組み込まれる。
一例として、フローサイトメーターの読みの不正確さを定量化するために、蛍光マイクロビーズのような既知の数の補償粒子がサンプルに添加される。
例示的な補償粒子は、固有の散乱特性および蛍光特性を有していてもよく、そして、これらの特性は、補償粒子が容易に区別および計数され得る目標の集団の特性とは十分に区別できる特性である。
一例として、約５０〜３００補償粒子／μｌの濃度の液が、計数される前にサンプルに添加される。
より具体的には、サンプル中の補償粒子の濃度は、約２００補償粒子／μｌであってもよい。
他の例として、他の濃度を使用してもよい。
【００４８】
データ取得において計数精度が所定の閾値に一致する、または、超える状況では、補償粒子集団の計器の計数も不正確であるので、計数の前にサンプルに追加された既知の補償粒子濃度の濃度に基づいて、期待値よりも低い粒子集団数を提供する。
期待される事象の数（サンプルに加えられた既知数のマイクロビーズに基づく）と計数された事象との間の差異は、サンプル中に存在する実際の値をより正確に表すために、目標集団の報告された計数の数値を調整するのに使用することができる。
例えば、スケーリング係数（スケーリング因子）を、予測数に対する補償粒子の測定数の比に基づいて決定することができる。
そして、スケーリング係数は、細菌の目的の集団の測定数に適用することができる。
１つの例として、直接の１：１の線形スケーリング係数が、補償粒子測定のパーセント不正確さと、測定対象とされる粒子のパーセント不正確さとの間に１対１の関係を仮定した測定値に適用される。
例えば、既知の数の補償粒子が８０％しか検出されない場合、対象としているイベントの数は、実際の数の８０％にすぎない場合もある。
したがって、測定された数は２０％増加する可能性がある。
他の例として、経験的に基づく乗数を、１：１以外の線形関係を仮定するスケーリング係数に適用してもよい。
さらに他の例として、非線形スケーリング係数を適用してもよい。
【００４９】
このようなスケーリング係数は、例えば、感染の有無を決定するために、サンプル中の細菌のより正確な計数を行うために使用してもよい。
いくつかの例では、抗菌効力試験のように、その後の試験および分析のためにサンプルの濃度を下げる必要があるかもしれない。
一例として、約１×１０５細菌／ｍｌ〜約５×１０５細菌／ｍｌのような抗菌試験の目標濃度が存在し得る。この目標濃度は、例えば、約１×１０４細菌／ｍｌ〜約５×１０４細菌／ｍｌ；または約１×１０３細菌／ｍｌ〜約５×１０３細菌／ｍｌである、あるいは、１×１０３細菌／ｍｌ〜約５×１０５細菌／ｍｌの範囲内の全体の濃度の中の特定のバンド内にある目標濃度である。
サンプルの抗菌効力を決定する方法は、感染の決定を行い、サンプル中の細菌の濃度を決定するために、フローサイトメーターによる初期試験を含んでいてもよい。
上述のように、フローサイトメーターシステムのデータ取得が超過されたかどうかを決定するために、補償粒子を使用してもよい。
そうである場合、初期サンプル中の実際の細菌濃度を計算するために、上記のようにスケーリング係数を決定し、測定した細菌数に適用してもよい。
次いで、実際の濃度を使用して、その後の試験で要求される目標濃度に達するのに必要な希釈プロセスを決定するようにしてもよい。
【００５０】
図１３Ａ〜図１３Ｂは、一例として、希釈された臨床検体を表すサイトグラム（細胞所見）である。
図１３Ａは、対象のある粒子、例えば、１種以上の細菌を同定するために開発されたゲートを表す影付きの「窓」を有する前方散乱および側方散乱に基づくサンプル内の事象を表している。
右側の画像は、サンプル中に存在する補償粒子を含むサンプル用の蛍光ゲートを表している。
当技術分野で知られているように、図１３Ｂに示される蛍光計数は、図１３Ａの散布図に示されるゲート内に入る事象でのみ起こる。
【００５１】
予想される補償値Ｂ１は８４／ｕｌであるが、既知の実際の値は８２／ｕｌである。
一例として、これは十分に正確であると考えられ、測定値と実際値との間の差異が測定器の既知の統計的精度内にあるかどうかを決定することによってデータ収集システムの能力を超えていないことを示している。
したがって、ターゲット母集団Ｔ１の期待値は正確であると考えることができる。
【００５２】
図１４Ａ〜図１４Ｂは、同じ数の補償粒子（８２／ｕｌ）が異なるサンプルで使用された場合の別の例を示している。
図１３Ａと図１４Ａとを比較すると、図１４Ａに示されたサンプルではかなり多くの粒子が検出されていることが分かる。
第２の実施例では、補償粒子の集団は、６９／ｕｌで計数され、既知の集団よりも少ない。
図示された例において、その差は、正常動作中の計器の既知の統計的変動に起因する差よりも大きく、データ取得システムの能力を超えていることを示している。
これは、標的集団Ｔ２（図１４Ｂ）のような目標の集団の計数（計数した数値）が実際よりも低い可能性があることを示している。
一例として、スケーリング係数は、エラーを補償するために、母集団Ｔ２の計数など、任意のターゲット母集団の計数に適用されてもよい。
一例として、スケーリング係数は、測定された補償粒子の計数値の、既知の補償粒子の計数値に対する比に基づいて決定されてもよい。
図１４Ｂに示す例において、約１．２のスケーリング係数を、計数されたターゲット母集団に適用してもよい。
当該スケーリング係数を適用することにより、より正確な細菌濃度が決定され、その後の抗菌効力試験のために目標濃度の濃縮液を調製するために必要とされる希釈の程度を決定するために使用することができる。
【００５３】
なお、コンピュータ技術の当業者には明らかであるように、本明細書に記載された態様および実施形態のいずれか１つまたは複数は、本明細書の教示に従ってプログラムされた１つまたは複数のマシン（たとえば、１つまたは複数のコンピューティングデバイス）を使用して都合よく実施され得ることに留意されたい。
適切なソフトウェアコーディングは、ソフトウェア分野の当業者には明らかであるように、本開示の教示に基づいて熟練したプログラマーによって容易に作成することができる。
ソフトウェアおよび／またはソフトウェアモジュールを使用する上述の態様および実装は、ソフトウェアおよび／またはソフトウェアモジュールの機械実行可能命令の実装を支援するための適切なハードウェアを含むこともできる。
【００５４】
このようなソフトウェアは、機械で読み取り可能な読記憶媒体を使用するコンピュータプログラム製品であってもよい。
機械で読み取り可能な記憶媒体は、機械（例えば、コンピューティングデバイス）による実行のための命令のシーケンスを記憶および／または符号化することができ、機械に、本明細書に記載されている方法および／または実施形態のうちの任意の１つを実行させる、任意の媒体としてもよい。
機械で読み取り可能な媒体の例には、磁気ディスク、光ディスク（例えば、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ、ＤＶＤ−Ｒなど）、光磁気ディスク、読み出し専用メモリ「ＲＯＭ」デバイス、ランダムアクセスメモリ「ＲＡＭ」デバイス、磁気カード、光カード、固体メモリデバイス、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、および任意のそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される機械で読み取り可能な媒体は、単一の媒体だけでなく、例えば、コンパクトディスクの集合体またはコンピュータメモリと組み合わせた１つまたは複数のハードディスクドライブなどの物理的に別個の媒体の集合体を含むことを意図している。
本明細書で使用されているように、機械で読み取り可能な記憶媒体は、信号伝送の一時的な形態を含まない。
【００５５】
図１５は、コンピュータシステム１５００の例示的な形態における処理制御部１２の１つの別の実施形態の概略図を示している。そして、コンピュータシステム１５００内において、図１、２のハードウェアシステム１５のような制御システムに対して、本開示の態様および／または方法の任意の１つ以上のものを実行させるための命令セットが実行されうる。
また、複数のコンピューティングデバイスを利用して、フローサイトメーター２２などの１つ以上のデバイスに、本開示の態様および／または方法のうちの任意の１つまたは複数を実行させるために特別に構成された命令セットを実装することも考えられる。
コンピュータシステム１５００は、バス１５１２を介して、互いに、そして、他の構成要素と通信するプロセッサ１５０４およびメモリ１５０８を含む。
バス１５１２は、様々なバスアーキテクチャのいずれかを含んでいてもよい。当該バスアーキテクチャとして、例えば、メモリバス、メモリコントローラ、周辺バス、ローカルバス、およびそれらの任意の組み合わせを含むものであってもよいが、これらに限定されない。そして、バス１５１２は、多様なタイプのバスアーキテクチャを用いてもよい。
【００５６】
メモリ１５０８は、ランダムアクセスメモリコンポーネント、読み出し専用コンポーネント、およびそれらの任意の組み合わせを含む様々なコンポーネント（例えば、機械で読み取り可能な媒体）を含んでいてもよい。なお、これらに限定されない。
一例として、起動中など、コンピュータシステム１５００内の要素間で情報を転送するのを補助する基本ルーチンを含む基本入出力システム１５１６（ＢＩＯＳ）をメモリ１５０８に格納することができる。
また、メモリ１５０８は、本開示の態様および／または方法のいずれか１つまたは複数を具体化する（例えば、１つまたは複数の機械で読み取り可能な媒体に格納された）命令（例えば、ソフトウェア）１５２０を含んでいてもよい。
別の例として、メモリ１５０８は、オペレーティングシステム、１つまたは複数のアプリケーションプログラム、他のプログラムモジュール、プログラムデータ、およびそれらの任意の組み合わせ（なお、これらには限定されない）を含む任意の数のプログラムモジュールをさらに含むことができる。
【００５７】
また、コンピュータシステム１５００は、記憶装置１５２４を含んでいてもよい。
ストレージデバイス（例えば、ストレージデバイス１５２４）の例として、ハードディスクドライブ、磁気ディスクドライブ、光媒体と組み合わせた光ディスクドライブ、ソリッド・ステート・メモリデバイス、および、それらを任意に組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
記憶装置１５２４は、適切なインターフェース（図示せず）によってバス１５１２に接続してもよい。
インターフェースの例として、ＳＣＳＩ、ＡＴＡ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、シリアルＡＴＡ、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、ＩＥＥＥ１３９４（ＦＩＲＥＷＩＲＥ（登録商標））、および、それらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一例として、記憶装置１５２４（またはその１つ以上のコンポーネント）は、（例えば、外部ポートコネクタ（図示せず）を介して）コンピュータシステム１５００と取り外し可能に入出力処理を行うことができる。
特に、記憶装置１５２４および関連する機械で読み取り可能な媒体１５２８により、コンピュータシステム１５００のための機械で読み取り可能な命令、データ構造、プログラムモジュール、および／または他のデータの不揮発性および／または揮発性記憶を実現することができる。
一例として、ソフトウェア１５２０は、機械で読み取り可能な媒体１５２８内に完全にまたは部分的に存在するものであってもよい。
別の例として、ソフトウェア１５２０は、プロセッサ１５０４内に完全にまたは部分的に存在するものであってもよい。
【００５８】
また、コンピュータシステム１５００は、入力装置１５３２を含んでいてもよい。
一例として、コンピュータシステム１５００のユーザは、入力装置１５３２を介してコンピュータシステム１５００にコマンドおよび／または他の情報を入力してもよい。
入力デバイス１５３２の例として、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、ポインティングデバイス、ジョイスティック、ゲームパッド、オーディオ入力デバイス（例えば、マイクロホン、音声応答システムなど）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス）、タッチパッド、光スキャナ、ビデオキャプチャデバイス（例えば、スチルカメラ、ビデオカメラ）、タッチスクリーン、およびそれらの任意の組み合わたものが挙げられる。なお、これらに限定されない。
入力デバイス１５３２は、シリアルインターフェース、パラレルインターフェース、ゲームポート、ＵＳＢインターフェース、ＦＩＲＥＷＩＲＥ（登録商標）インターフェース、ダイレクトインターフェース（これらに限定されない）、および、それらを任意に組み合わせたものを含む種々のインターフェース（図示せず）のいずれかを介してバス１５１２にインターフェースで接続され得る。
入力装置１５３２は、ディスプレイ１５３６の一部である。または、ディスプレイ１５３６とは別のタッチスクリーンインターフェイスを含んでもよく、以下でさらに説明する。
入力装置１５３２は、上述のようにグラフィカルインタフェース内の１つ以上のグラフィック表現を選択するためのユーザ選択装置として利用されてもよい。
【００５９】
ユーザは、記憶装置１５２４（例えば、リムーバブルディスクドライブ、フラッシュドライブなど）および／またはネットワークインターフェースデバイス１５４０を介して、コンピュータシステム１５００にコマンドおよび／または他の情報を入力してもよい。
ネットワークインターフェースデバイス１５４０のようなネットワークインターフェースデバイスは、コンピュータシステム１５００を、ネットワーク１５４４およびそれに接続された１つまたは複数のリモートデバイス１５４８などの１つまたは複数の様々なネットワークに接続するために利用されるものであってもよい。
ネットワークインターフェースデバイスの例として、ネットワークインターフェースカード（例えば、モバイルネットワークインターフェースカード、ＬＡＮカード）、モデム、およびそれらの任意の組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
ネットワークの例として、広域ネットワーク（例えば、インターネット、企業ネットワーク）、ローカルエリアネットワーク（例えば、オフィス、建物、キャンパスまたは他の比較的地理的に小さいスペースでのネットワーク）、電話通信網、電話通信業者のデータネットワーク（例えば、音声および／またはデータの携帯電話通信網プロバイダ）、２つのコンピュータ装置の間の直接接続、および、それらの組み合わせたものが挙げられるが、これらに限定されない。
ネットワーク１５４４などのネットワークは、有線および／または無線の通信モードを使用することができる。
一般に、任意のネットワークトポロジを使用することができる。
情報（例えば、データ、ソフトウェア１５２０等）は、ネットワークインターフェースデバイス１５４０を介して、コンピュータシステム１５００と、双方向または単方向に、通信されるものであってもよい。
【００６０】
コンピュータシステム１５００は、表示可能な画像を表示装置１５３６などの表示装置と通信するためのビデオ表示アダプタ１５５２をさらに含んでいてもよい。
表示装置の例として、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、陰極線管（ＣＲＴ）、プラズマディスプレイ、発光ダイオード（ＬＥＤ）ディスプレイ、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
ディスプレイアダプタ１５５２およびディスプレイデバイス１５３６は、プロセッサ１５０４と組み合わせて利用することで、本開示の態様のグラフィック表示を提供するものであってもよい。
表示装置に加えて、コンピュータシステム１５００は、音声スピーカ、プリンタ、およびそれらの任意の組み合わせを含む１つ以上の他の周辺出力装置を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
そのような周辺出力装置は、周辺インターフェース１５５６を介してバス１５１２に接続されてもよい。
周辺インターフェースの例として、シリアルポート、ＵＳＢ接続、ＦＩＲＥＷＩＲＥ（登録商標）接続、並列接続、およびそれらの任意の組合せたものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
上記は、本発明の例示的な実施形態の詳細な説明である。
なお、本明細書および添付の特許請求の範囲において、「Ｘ、ＹおよびＺの少なくとも１つ」および「Ｘ、ＹおよびＺの１つ以上」という語句に使用されるような結合語は、特に明記しない限り、結合リスト内の各アイテムが、リスト内の他のすべてのアイテムを除く任意の数、または結合リスト内の任意のまたはすべてのアイテムと組み合わせて任意の数で存在し得ることを意味すると解釈されるべきであり、それぞれは任意の数で存在していてもよい。
この一般的な規則を適用すると、結合リストがＸ、Ｙ、およびＺからなる前述の例における結合句は、それぞれ、以下の場合を含む。
Ｘ、Ｙ、およびＺからなる結合リストは、以下の場合を含む。
１つ以上のＸ；１つ以上のＹ；１つ以上のＺ；
１つ以上のＸと、１つ以上のＹ；
１つ以上のＹと、１つ以上のＺ；
１つ以上のＺと、１つ以上のＸ；
１つ以上のＸと、１つ以上のＹと、１つ以上のＺ；
【００６２】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な修正および追加を行うことができる。
上述した様々な実施形態のそれぞれの特徴は、関連する新しい実施形態において多数の特徴の組み合わせを提供するために、適宜、他の記載された実施形態の特徴と組み合わせることができる。
さらに、前述において、多くの別個の実施形態を記載しているが、本明細書に記載されているのは、本発明の原理の適用の単なる例示にすぎない。
さらに、本明細書における特定の方法は、特定の順序で実行されるものとして図示および／または説明され得るが、順序は、本開示の態様を達成するために通常の技術の範囲内で広く可変させることができるものである。
したがって、この説明は、単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６３】
本開示のさらに別の例示的な実施形態を以下の段落で説明する。
【００６４】
一例として、細菌の存在について体液のサンプルを試験するためのフローサイトメーターを使用する方法であって、以下の工程を含む。
サンプルを、少なくとも時間０のコントロール（Ｔ０コントロール）および時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）を含む少なくとも２つのバッチに分割する工程；
フローサイトメーターにより、Ｔ０コントロールを時刻Ｔ０で試験し、Ｔ０サンプルの測定された特性に関連するＴ０計数ベースライン細菌値を取得する工程；
フローサイトメーターにより、Ｔ１コントロールを時刻で試験し、Ｔ０サンプルの測定された特性に関連するＴ０計数ベースライン細菌値を取得する工程；
Ｔ１コントロール値をＴ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖整数を決定する工程。
Ｔ０ベースライン値およびＴ１コントロール値は、細菌に特化した対象領域（ＲＯＩ）における生細胞事象を含むことができる。そして、比較工程は、Ｔ０およびＴ１における生細胞事象を比較し、Ｔ０に比べてＴ１における生細胞事象の数が統計的に著しく増加したときに生存細菌が存在するかどうかを決定する工程を含む。
【００６５】
全ての試験時間における細菌に特化した領域の計数精度は、テスト実行中にデータ取得の不足を補う目的で、既知の期待値を用いて実行されたテスト中において、試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を利用することによって改善される。試験計数補償（ＴＥＣ）粒子としては、例えば、フローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性が類似しているが、目標の母集団の特性からわずかに異なる特性を有するビーズが挙げられる。
生細菌のＲＯＩとは別個の独自のＲＯＩを調製して、すべての分析実行中にＴＥＣを計数するようにしてもよい。
【００６６】
さらに、少なくとも２つのバッチはさらにｎ個のＡＴサンプルを含み、ｎ個のＡＴサンプルの各々はｎ個の異なる抗生物質の異なる１つによって処理（治療）され、ここでｎは０より大きい整数である。そして、この方法はさらに以下の工程を含む。
フローサイトメーターを用いて時間Ｔ１でｎ個のＡＴサンプルのそれぞれを試験してｎ個のＡＢサンプル値を得る工程；
ＲＯＩ中のＴ０コントロールの生細胞事象を、ＲＯＩ中のｎ個のＴ１コントロールの生細胞事象のそれぞれと比較して、ｎ個の異なる抗生物質に対する検出された細菌の感受性または耐性を決定する工程。
必要に応じて、細菌計数値について試験された全てのＡＴサンプルは、上記の方法に従ってＴＥＣ補償粒子を用いて補償されてもよい。
【００６７】
試験される抗生物質濃度は、一般に、試験される個々の抗生物質についてＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって定義された、臨床的に許容されるよりも低い解釈上のブレークポイントを表すものであってもよい。
さらに、試験される抗生物質濃度は、試験される個々の抗生物質についてＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって定義された各抗生物質の最小抑制濃度を規定するために使用される臨床的に許容される抗生物質濃度の範囲を表すものであってもよい。
【００６８】
さらなる実施形態において、ｎ個の抗生物質のいずれか１つに対して異なる応答を有する亜集団に起因する、細菌の複数の亜集団の存在を検出するために、Ｔ１コントロール値とｎ個のＴ１サンプル値とを比較することを含むことができる。
体液は、少なくとも尿、血液、胸膜液、滑液または脳脊髄液からなる群から選択されるものであってもよい。
フローサイトメーターシステムは、尿、血液、または脳脊髄液のそれぞれについて別々の体液に特化したデータセットを含むソフトウェアを備える。そして、尿、血液、または脳脊髄液は、以下のものの根拠となる。
既知のマトリクスノイズ、そして、体液タイプに特有の統計的信頼情報を提供するもの；
病理学的細菌感染に関連する病原体のための予め定義された増殖整数；
通常のサンプリングに伴う可能性のある汚染物質の定義済み増殖整数。
【００６９】
サンプルが採取された体液が血液である場合、細菌の存在および抗生物質の感受性は、約２〜１２時間の培養の後に決定することができる（細菌が、現在の技術を用いて検出されるのに十分に増殖することが可能となるのに現在必要とされる培養時間が１８〜２２時間であるのに対して）。
【００７０】
自動流体ハンドリング技術を使用して、分割されている元の臨床サンプルを、自動流体ハンドリングシステムによって、臨床サンプルＴ０サンプルとＴ１サンプルとに分割するようにしてもよい。
さらに、細菌の特定に使用される全ての関連する染色試薬は、試薬およびサンプルを吸引し、注入し、そして混合する自動流体処理システムを用いて添加される。
さらに、すべてのｎ個のＡＴサンプルは、自動流体ハンドリングを用いて臨床サンプルから調製されてもよい。
【００７１】
さらなる実施形態において、一時的ではないコンピュータで読み取り可能な媒体またはコンピュータプログラム製品は、上述のように試験、計数評価および比較を自動的に実行し、病原性細菌と非病原性細菌とを自動的に識別するための、フローサイトメーターソフトウェア解析プログラムおよびアルゴリズムを提供するか、あるいは、格納していてもよい。
一例として、フローサイトメーターソフトウェア分析プログラムは、フローサイトメーターベースの逐次分析システムにおいて以下の機能の１つ以上を実行するための記憶された命令を含んでいてもよい。
試験した抗生物質の定量的効果を自動的に決定する機能、
試験した抗生物質の相対的効果を自動的に判定し、グラフィカルユーザーインターフェースを介して、その細菌が試験されている抗生物質に対して感受性があるかどうかを報告する機能、
試験された抗生物質の相対的効果を自動的に判定し、グラフィカルユーザーインターフェースを介して、その細菌が試験される抗生物質に対して耐性があるかどうかを報告する機能、
試験に先立って自動流体ハンドリングシステムによってサンプル中に入れられたＴＥＣ粒子を用いて細菌または他の目的の粒子の計数値を自動的に補償する機能、および／または、生細菌ＲＯＩ内の集団密度と事象の統計的評価とに基づいて、同時感染の可能性を示すサンプル中に、１つよりも多くの細菌の亜集団が存在しているか否かについての情報を提供する機能。
【００７２】
例示的な実施形態は、上記で開示されており、添付の図面に示されている。
当業者であれば、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に具体的に開示されたものに様々な変更、省略および追加がなされ得ることが理解される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の存在について体液の臨床サンプルを試験し、場合により少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定するための自動流体ハンドリングシステムにおけるフローサイトメーターの使用方法であって、
前記自動流体ハンドリングシステムを使用して、前記サンプルの一部分を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
フローサイトメーターにより第１のウェルから前記サンプルの一部分を試験して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地により、前記サンプルを、前記全細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈調整サンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを少なくとも含むウェルに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより時間Ｔ０で前記Ｔ０ベースラインウェル内のサンプルを試験して、前記Ｔ０ウェル内のサンプルの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１までのＴ１コントロールウェルの前記サンプルを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を備えるフローサイトメーターの使用方法。
【請求項２】
時間０またはそれに近い時間において、
それぞれ、目的の抗生物質を有する少なくとも１つの抗生物質試験（ＡＴ）ウェルで、接種するステップと、
自動流体ハンドリングシステムを使用して、前記サンプルの希釈分取分を少なくとも１つのＡＴウェルに分配するステップと、
フローサイトメーターで前記第１のウェルから前記サンプルの一部分を試験して、少なくとも１つのＡＴウェル内の前記サンプルの測定特性に関するＡＴ計数細菌値を決定するステップと、
前記ＡＴ計数値を前記Ｔ１コントロール値と比較して、目的の抗生物質に対する前記サンプルの応答を決定するステップと、
をさらに備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ０ベースライン値および前記Ｔ１コントール値は、細菌に特化した対象領域（ＲＯＩ）における対象の細胞事象を含み、
前記比較するステップは、
Ｔ０およびＴ１における前記対象の細胞事象を比較するステップと、
Ｔ０と比べてＴ１における対象の細胞事象の数が統計的に有意な増加がある場合、対象の細胞が存在するか否かを決定するステップと、
を含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象の細胞は、病原性細菌である、
請求項１、２、または、３に記載の方法。
【請求項５】
Ｔ０とＴ１との間の相対的な増殖を、細菌集団の拡大を表す増殖整数に変換するステップと、
Ｔ０ベースラインおよびＴ１コントロールからの前記増殖整数を、試験されている疾患状態で表現される病原体の既知のライブラリからの少なくとも１つの既知の増殖整数と比較するステップと、
前記比較に基づいて、前記サンプル中に存在する病原体の型を決定するステップと、
をさらに備える、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｔ０とＴ１との間の相対増殖を、細菌集団の拡大を表す増殖整数に変換するステップと、
Ｔ０コントロールおよびＴ１からの前記増殖整数を、評価されている疾患状態において表現される可能性のある細菌汚染物質の既知のライブラリの既知の増殖整数と比較するステップと、
前記比較に基づいて、前記サンプル中に存在する細菌汚染物質のタイプを決定するステップと、
をさらに備える、
請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つのウェルがｎ個のＡＴサンプルをさらに含み、
ｎ個のＡＴサンプルのそれぞれがｎ個の異なる抗生物質の異なる１つによって処理され、
ｎが０よりも大きい整数である、
請求項３から６のいずれかに記載の方法であって、
前記方法は、さらに、
前記フローサイトメーターにより、時間Ｔ１でｎ個のＡＴサンプルの各々を試験してｎ個のＡＴサンプル値を取得するステップと、
前記対象領域の前記Ｔ０ベースライン事象を前記対象領域の前記ｎ個のＴ１サンプル事象のそれぞれと比較して、前記ｎ個の異なる抗生物質に対する検出細菌の感受性または耐性を決定するステップと、
を備える。
【請求項８】
前記Ｔ１コントロール値と前記ｎ個のＡＴサンプル値とを比較して、前記ｎ個の抗生物質のいずれか１つに対して異なる応答を有する亜集団に起因する、細菌の複数の亜集団の存在を検出するステップをさらに備える、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記体液は、尿、血液、胸膜液、滑液または脳脊髄液からなる群から選択される、
先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記フローサイトメーターは、メモリに記憶された命令を実行するプロセッサによって制御され、
前記メモリは、
ａ．既知のマトリクスノイズ、そして、体液タイプに特有の統計的信頼情報を提供するもの、
ｂ．病理学的細菌感染に関連する病原体について予め定義された増殖整数、
ｃ．通常のサンプリングに伴う可能性のある汚染物質の定義済みの増殖整数、
の根拠となる、尿、血液、または脳脊髄液のそれぞれについて別々の体液に特化したデータセットをさらに含む、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルは、臨床サンプル、前記Ｔ０サンプル、および前記Ｔ１サンプルの間の自動流体ハンドリングシステムによって、分割される、
先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
細菌決定に使用される関連染色試薬は、試薬およびサンプルを吸引し、注入し、そして混合する自動流体処理システムを用いて添加される、
先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
すべてのｎ個のＡＴサンプルは、自動流体ハンドリングを用いて前記臨床サンプルから調製される、
請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
先行するいずれかの請求項に記載の方法であって、
既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性を有している試験計数補償（ＴＥＣ）粒子であって、サンプル中の既知濃度の試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を含めるステップと、
前記フローサイトメーターによる前記サンプル試験を用いて前記ＴＥＣ粒子を計数するステップと、
試験された前記サンプル中の前記既知のＴＥＣ粒子の濃度と比較して、計数されたＴＥＣ粒子値に基づいて、補償因子を決定するステップと、
前記補償係数によって前記サンプル試験計数値を調整するステップと、
をさらに備える。
【請求項１５】
前記のＴＥＣ粒子を計数するステップは、各フローサイトメーターサンプル試験に含まれる、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記の決定するステップは、前記細菌ＲＯＩとは別個の一意のＴＥＣ粒子ＲＯＩを適用して、前記ＴＥＣ粒子を計数するステップを備える、
請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
細菌の存在について体液のサンプルを試験するためにフローサイトメーターを使用する、場合により少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定する方法であって、
サンプルを所定の濃度に希釈するステップと、
希釈したサンプルを、時間０のベースライン（Ｔ０ベースライン）バッチおよび時間１のコントロール（Ｔ１コントロール）バッチを含む少なくとも２つのバッチに分けるステップと、
前記フローサイトメーターにより、前記Ｔ０ベースラインバッチを時間Ｔ０で試験して、前記Ｔ０バッチの測定された特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
時間０から時間１まで、増殖培地中で前記Ｔ１コントロールバッチを培養するステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でのＴ１コントロールバッチを試験して、前記Ｔ１サンプルの測定された特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を得るステップと、
細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するために、前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較するステップと、
を備える方法。
【請求項１８】
前記Ｔ０ベースライン値および前記Ｔ１コントロール値は、細菌に特化した対象領域（ＲＯＩ）における対象の細胞事象を含み、
前記の比較するステップは、
前記対象の細胞事象をＴ０およびＴ１で比較するステップと、
Ｔ０と比較してＴ１における対象の細胞事象の数の統計的に有意な増加がある場合、対象の細胞が存在するか否かを決定するステップと、
を含む、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つのウェルは、さらにｎ個のＡＴサンプルを含み、
ｎ個のＡＴサンプルのそれぞれは、ｎ個の異なる抗生物質の異なる１つによって処理され、ｎが０より大きい整数である、
請求項１７または１８に記載の方法であって、前記方法は、
前記フローサイトメーターにより、時間Ｔ１で、ｎ個のＡＴサンプルの各々を試験してｎ個のＡＴサンプル値を取得するステップと、
前記ＲＯＩ中の前記Ｔ０ベースライン細胞事象を、前記ＲＯＩ中の前記ｎ個のＴ１サンプル細胞事象のそれぞれと比較して、前記ｎ個の異なる抗生物質に対する、検出された細菌の感受性または耐性を決定するステップと、
を含む。
【請求項２０】
前記統計的に有意な増加は、約１２５％から約３２５％の増加である、
請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
流体サンプル中の対象粒子のフローサイトメーター計数における不正確さを補償する方法であって、
既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性を有する試験計数補償（ＴＥＣ）粒子であって、既知の濃度の計数すべきサンプル中の試験計数補償（ＴＥＣ）粒子を含めるステップと、
前記フローサイトメーターによるサンプル計数により、前記ＴＥＣ粒子を計数するステップと、
試験されたサンプル中の既知のＴＥＣ粒子濃度と比較して、計数されたＴＥＣ粒子値に基づいて、補償因子を決定するステップと、
前記補償因子によって前記サンプル試験計数値を調整するステップと、
を含む方法。
【請求項２２】
前記の決定するステップは、前記ＴＥＣ粒子を計数するために前記対象の粒子ＲＯＩとは別個の固有のＴＥＣ粒子ＲＯＩを適用するステップを含む、
請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＥＣ粒子の既知のフローサイトメトリー散乱特性および蛍光特性は、前記対象粒子の対応する特性と類似している、
請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
細菌の存在について体液のサンプルを自動検査し、場合によっては少なくとも１つの抗生物質に対するサンプル応答を決定するためのシステムであって、
流体サンプルをウェルプレートのウェル間に分配するための自動ピペットシステムを含む流体ハンドリング装置と、
前記流体ハンドリング装置から受け取ったウェルプレート内のサンプルを培養するように構成されるインキュベータと、
サンプルを含むウェルプレートを、前記流体ハンドリング装置から前記インキュベータに送り、ウェルプレートを前記インキュベータから前記流体ハンドリング装置に戻すように構成されるプレート搬送装置と、
前記流体ハンドリングシステムによって提供されるサンプル中の細胞数を計測するように構成されるフローサイトメーターと、
プロセッサとメモリであって、前記プロセッサは、前記メモリに格納された命令を実行して、前記命令に従って前記システムを制御するプロセッサであって、前記格納された命令は、前記システムに、
サンプルの一部を少なくとも第１の試験ウェルに分配するステップと、
少なくとも第１の試験ウェルから前記サンプルの一部分を計数して、総細菌数を決定するステップと、
増殖培地での前記サンプルを、総細菌数に基づいて所定の濃度に希釈するステップと、
希釈サンプルを、少なくとも、時間０ベースライン（Ｔ０ベースライン）ウェルおよび時間１コントロール（Ｔ１コントロール）ウェルを含むウェルに分けるステップと、
時間Ｔ０において前記Ｔ０ベースラインのウェル内の前記サンプルを計数し、前記Ｔ０ウェル内の前記サンプルの測定特性に関するＴ０計数ベースライン細菌値を取得するステップと、
前記サンプルを前記インキュベータに送るステップと、
時間０から時間１まで、前記Ｔ１コントロールウェル中のサンプルを培養するステップと、
培養後に前記サンプルを前記流体ハンドリング装置に戻すステップと、
前記フローサイトメーターにより、時間１でＴ１コントロールバッチを計数して、前記Ｔ１サンプルの測定特性に関するＴ１計数コントロール細菌値を取得するステップと、
前記Ｔ１コントロール値を前記Ｔ０ベースライン値と比較して、細菌を含有するサンプルの増殖率を決定するステップと、
を実行させる前記プロセッサと、前記メモリと、
少なくとも前記プロセッサと通信するグラフィカルユーザインターフェースであって、前記システムとユーザとの交流を可能にする前記グラフィカルユーザインタフェースと、
を備えるシステム。
【請求項２５】
前記メモリに格納された前記命令は、時間０において、または、おおよそ時間０に近い時間において、前記システムに、
対象の抗生物質が接種された少なくとも１つのＡＴウェルにサンプルの希釈部を分配するステップと、
フローサイトメーターにより前記第１のウェルから前記サンプルの一部分を計数して、少なくとも１つのＡＴウェル内のサンプルの測定された特性に関するＡＴの計数細菌値を決定するステップと、
前記ＡＴ計数値を前記Ｔ１コントロール値と比較して、対象の抗生物質に対する前記サンプルの応答を決定するステップと、
を実行させる、
請求項２５に記載のシステム。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図９Ａ】
2019520045.tif 000011
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図９Ｂ】
2019520045.tif 000012
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｃ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図９Ｃ】
2019520045.tif 000013
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１０Ａ】
2019520045.tif 000014
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１０Ｂ】
2019520045.tif 000015
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１１Ａ】
2019520045.tif 000016
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１１Ｂ】
2019520045.tif 000017
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１２Ａ】
2019520045.tif 000018
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１２Ｂ】
2019520045.tif 000019
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１３Ａ】
2019520045.tif 000020
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１３Ｂ】
2019520045.tif 000021
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１４Ａ】
2019520045.tif 000022
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１４Ｂ】
2019520045.tif 000023
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１５】
2019520045.tif 000024
【国際調査報告】
2019520045.tif 000025
2019520045.tif 000026
2019520045.tif 000027
2019520045.tif 000028
2019520045.tif 000029