(57)【要約】  本発明は、結合タンパク質および小分子剤、典型的には小分子薬物、を含むタンパク−薬物コンジュゲートの送達のために使用される結合タンパク質を含む、細胞外小胞（ＥＶ）に関する。また、本発明は、そのようなＥＶを製造する方法、並びに、そのようなＥＶの医薬組成物および医学的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合タンパク質を含む細胞外小胞（ＥＶ）であって、少なくとも１つの小分子剤が結合タンパク質に結合することを特徴とする、細胞外小胞（ＥＶ）。
【請求項２】
前記結合タンパク質は、ＧＰＣＲ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、リポタンパク質、インテグリン、チロシンキナーゼ、ＤＮＡ−結合タンパク質、ＲＮＡ−結合タンパク質、ヌクレアーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、イソメラーゼ、ホスファターゼ、ＧＴＰアーゼ、アロマターゼ、エステラーゼ、アダプタータンパク質、Ｇタンパク質、ＧＥＦ、サイトカイン、インターロイキンおよびインターロイキン受容体、インターフェロンおよびインターフェロン受容体、カスパーゼ、転写因子、神経栄養因子およびそれらの受容体、成長因子およびそれらの受容体、シグナル認識粒子および受容体成分、細胞外マトリックスタンパク質、膜の必須成分、リボソームタンパク質、翻訳伸長因子、翻訳開始因子、ＧＰＩアンカー型タンパク質、組織因子、ジストロフィン、ユートロフィン、ジストロブレビン、並びに、その任意の融合物、組み合わせ、サブユニット、誘導体またはドメイン、を含む群から選択される、請求項１に記載のＥＶ。
【請求項３】
前記少なくとも１つの小分子剤は、抗癌剤、細胞増殖抑制剤、ＤＮＡまたはＲＮＡインターカレーター、ヌクレオシド、スプライシングモジュレーター、キナーゼ阻害剤、ＢＴＫ阻害剤またはＢｃｒ−Ａｂｌ阻害剤などのチロシンキナーゼ阻害剤、スタチン、ＮＳＡＩＤ、抗生物質、抗真菌剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗線維剤、抗高血圧剤、血管拡張剤、ホルモンおよびその類似体、アロマターゼ阻害剤、エステラーゼ阻害剤、抗コリン剤、ＳＳＲｉｓ、ＢＫＴ阻害剤、ＰＰＡＲアゴニスト、ドーパミンアゴニスト、ＨＥＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、サイトカイン阻害剤、ＩＬおよびＩＬＲ阻害剤、ＴＮＦおよびＴＮＦＲ阻害剤、血管形成阻害剤、シンターゼ阻害剤、オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、スプライス−スイッチングオリゴヌクレオチド、ペプチド、細胞透過性ペプチド、ＡＬＫ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ネプリライシン阻害剤、β２−アゴニスト、ＣＲＴＨ２アンタゴニスト、ＦＸＲアゴニスト、ＢＡＣＥ阻害剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体調節剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ＬＳＤ１阻害剤、ラクタマーゼ阻害剤、１ＤＯ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、Ｃｈｋ１阻害剤、およびその任意の誘導体、サブユニット、ドメイン、または組み合わせ、を含む群から選択される薬剤である、請求項１または２のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項４】
前記少なくとも１つの小分子剤の前記結合は、任意に、結合タンパク質を治療活性化させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項５】
前記治療活性化された結合タンパク質は、シグナリング−応答能またはシグナリング−不能である、請求項４に記載のＥＶ。
【請求項６】
前記結合タンパク質は、結合タンパク質部分およびＥＶタンパク質を含む融合タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項７】
前記ＥＶタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、インターロイキン受容体、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、およびそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される、請求項６に記載のＥＶ。
【請求項８】
標的部分をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＥＶ。
【請求項９】
ａ．結合タンパク質を含むＥＶを、任意にＥＶタンパク質を有する融合タンパク質の形態で提供するステップと、
ｂ．前記ＥＶを小分子剤に曝露して、前記結合タンパク質への前記小分子剤の結合を可能にするステップと、を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＥＶを外因的に製造する方法。
【請求項１０】
ａ．結合タンパク質を含むＥＶソース細胞を、任意に少なくとも１つの小分子剤によりＥＶタンパク質を有する融合タンパク質の形態で、インキュベートするステップと、
ｂ．前記ＥＶソース細胞により産生されたＥＶを採取するステップであって、前記ＥＶは前記結合タンパク質に結合する小分子剤を含む、採取するステップと、を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＥＶを内因的に製造する方法。
【請求項１１】
結合タンパク質−小分子コンジュゲート、結合タンパク質、および／または、小分子剤を送達する方法であって、
ａ．請求項１〜８のいずれか一項に記載のＥＶを提供するステップと、
ｂ．標的位置にＥＶを送達するステップと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記標的位置は、細胞、細胞もしくは細胞下コンパートメント、臓器、組織、および／または血液、胆汁、リンパ液、もしくは間質液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＥＶおよび薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬品における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＥＶ、または請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合タンパク質および小分子剤、典型的には小分子薬物を含むタンパク−薬物複合体の送達のための結合タンパク質を含む細胞外小胞（ＥＶ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞（ＥＶ）は、それらの内容物（主にＲＮＡ、タンパク質、および脂質）を標的組織中のレシピエント細胞に提示することによって、正常な生理学および病理学における細胞間コミュニケーションを調節する。様々な種類の薬剤を組み込むためのＥＶの改変は、例えば、生物学的治療剤の細胞内送達のためのエキソソームの使用を開示するＷＯ２０１３／０８４０００、またはエキソソームを用いる外因的遺伝物質の送達を記載するＷＯ２０１０／１１９２５６のように、多くの状況において探求されている。
【０００３】
薬物送達ビヒクルとしてのＥＶの有用性は、例えばｓｉＲＮＡ、細胞内成分を標的とする大型タンパク質ベースの薬物のような核酸ベースの薬物、および例えば難溶性または非常に毒性の高い小分子治療薬の場合には疑問ではない。ＥＶ仲介小分子薬物送達もまた、例えば、ＥＶの薬物ロードに対する典型的なアプローチを表すＷＯ２０１１／０９７４８０を含めて、大いに調査されている。ＷＯ２０１１／０９７４８０には非常に容易な方法が記載されており、例えば、植物化学小分子薬剤であるクルクミンおよびレスベラトロールは、単純な共インキュベーション工程を用いてＥＶにロードされ、その間に、精製されたＥＶおよび遊離薬物（例えば、クルクミン）は、ＥＶへの薬物の拡散に依存して、室温でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で一緒にインキュベートされる。非常に便利で直接的ではあるが、小分子薬剤をＥＶにロードするこの従来のアプローチは特に効率的ではなく、結果として小分子薬剤が著しく浪費される。また、ローディングプロセスを制御するのが非常に難しい場合がある。また、他のもの（例えば、Ｆｕｈｒｍａｎ  ｅｔ  ａ／，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｉ．，２０１５）は、光活性小分子薬剤ポルフィリンのローディング効率を高める手段として、サポニンなどの界面活性剤を用いてＥＶの透過性を評価した。
【０００４】
また、最近の特許出願（ＷＯ２０１５／１２０１５０）は小分子と大きな生物製剤の両方をカバーする様々なタイプの抗癌剤による腫瘍由来ＥＶのローディングに関する。しかしながら、当技術分野ではしばしばそうであるように、エキソソームをロードする方法についての情報はほとんどなく、利用可能な方法がある場合、小分子を運ぶＥＶのローディングおよび実際の治療的応用にはほとんど役に立たない。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、その後の治療的適用のための小分子剤（典型的には小分子薬物または診断薬剤）によるＥＶのローディングに関連する上記の問題を克服することである。さらに、本発明は、小分子薬剤だけでなく、小分子とＥＶ上に存在する結合タンパク質との間の結合体を標的化された制御可能な様式（本明細書では、結合タンパク質−小分子コンジュゲートおよび類似の用語を指す）で効果的に送達するための、当該技術分野における他の既存のニーズを満たすことを目的とする。
【０００６】
本発明は、そのような小分子剤、または小分子剤と、治療効果および／または予防効果を有する結合蛋白質の組み合わせのいずれかの送達モダリティとしてＥＶを用いることにより、これらおよび他の目的を達成する。本発明によるＥＶは、典型的には、少なくとも１つの小分子剤（小分子薬物など）のための相互作用パートナー（すなわち結合剤）として作用する治療タンパク質（受容体など）であり得る、結合タンパク質を含み得る。
【０００７】
したがって、第１の態様において、本発明は、結合タンパク質を含むＥＶに関し、小分子剤が結合タンパク質に結合することを特徴とする。バインダータンパク質は、いくつかの異なる役割を果たすことができる：例えば、（ｉ）主にそれに結合した小分子剤を輸送することを意味する担体および／または送達モダリティ、（ｉｉ）バインダータンパク質−小分子コンジュゲートを担持するＥＶの特定の位置への輸送を指示するための標的剤、（ｉｉｉ）アゴニストまたはアンタゴニスト効果を有し得る小分子の結合を介して治療的に活性または不活性になる治療的活性タンパク質、（ｉｖ）小分子貨物の有無にかかわらず、細胞および／または身体変化並びに関連する治療効果および／もしくは予防効果を発揮または寄与し得るシグナル伝達タンパク質。結合タンパク質は、小分子薬剤を適切な位置に放出することによって、身体および／もしくは細胞の作用または活性並びに関連する治療効果にさらに寄与し得るか、またはそれに結合した小分子剤を保持することによってそのような効果に寄与し得る。
【０００８】
有利な実施形態では、ＥＶタンパク質表面への結合タンパク質の制御されたローディングおよびディスプレイを可能にするために、結合タンパク質は、結合タンパク質とＥＶタンパク質とを含む融合タンパク質である。しかし、ＥＶに天然に存在する結合タンパク質またはＥＶにシャトルするように操作された結合タンパク質も本発明の範囲内であり、結合タンパク質の選択および／または設計は、治療されるべき疾患、薬理学的標的および結合タンパク質が結合する小分子剤によって大きく影響されるであろう。
【０００９】
別の態様では、本発明は、細胞シグナル伝達を調節する方法に関し、小分子剤がＥＶ上に提示された結合タンパク質と非共有結合的または共有結合的に相互作用し、続いて得られた結合タンパク質−小分子薬物コンジュゲート、結合タンパク質それ自体、並びに／または特定の標的および／もしくは標的位置に結合タンパク質に結合した小分子剤を露出させることを含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のＥＶを製造する方法に関する。そのような方法は、（ａ）ＥＶタンパク質との融合タンパク質の形態の結合タンパク質を含むＥＶを提供するステップと、（ｂ）小分子剤と結合タンパク質との相互作用および結合を可能にするために、結合タンパク質を小分子剤に曝露するステップと、を含み得る。
【００１１】
さらに、本発明は、また、）結合タンパク質、結合タンパク質−小分子コンジュゲート、および／または小分子剤を送達する方法に関し、（ａ）本発明によるＥＶを提供し、（ｂ）本発明のＥＶを提供すること、（ｂ）結合タンパク質、結合タンパク質−小分子コンジュゲート、および／または小分子剤（典型的には小分子薬物）を標的位置に送達することを含む。
【００１２】
一般に、本発明の小分子剤は、広範な薬物および／または診断薬カテゴリー、例えば、抗癌剤、ドキソルビシン、５−フルオロウラシルまたは他のヌクレオシド類似体、例えばシトシンアラビノシド、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ、またはイマチニブまたはセリシリブなどのキナーゼ阻害剤、またはナプロキセン、アスピリン、またはセレコキシブなどのＮＳＡＩＤ、ヒラシリンのような抗生物質、またはエナラプリルなどのＡＣＥ阻害剤などの抗高血圧剤、カンデサルタンなどのＡＲＢから選択されることとしてもよい。種々のタイプのヘテロまたはホモ二量体、三量体または多量体小分子剤もまた、本発明の範囲内であり、そのような薬剤は、結合タンパク質と、目的の別のタンパク質または非タンパク質標的分子との間の相互作用を促進し得る。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、小分子薬物を、標的細胞などの標的位置、細胞質または核などの標的細胞成分、標的組織、標的器官に、または任意の標的区画（体液、例えば血流または脳脊髄液も含むことができる）に送達するための方法に関する。そのような方法は、結合タンパク質とのコンジュゲートの形態（小分子が結合タンパク質に結合するという意味でコンジュゲート）または結合タンパク質からＥＶにまたはＥＶから放出された小分子のいずれかの小分子がロードされたＥＶに、標的位置を曝露することを含み得る。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、小分子薬物の薬物動態または薬力学特性を変更する方法にも関する。そのような方法は、当の小分子薬物のインビボおよび潜在的にインビトロの特性を調節するために、当の小分子をＥＶ上および／またはＥＶ内に存在する結合タンパク質にロードすることを含む。
【００１５】
さらに、さらなる態様において、本発明は、結合タンパク質小分子コンジュゲートの形態の低分子を有するＥＶを含む医薬組成物に関する。実際には、本発明による医薬組成物は少数のＥＶを含むだけでなく、実際には多数のＥＶを含む。そのような組成物中のＥＶ濃度は、多くの異なる方法、例えば、単位当たりのＥＶタンパク質の量（しばしば容量）、または用量あたり、単位（しばしば量、動物当たり、体重１ｋｇあたりなど）または用量あたりのＥＶまたは粒子の数、単位または用量あたりの小分子薬物の濃度などで表され得る。典型的には、このような医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を使用してインビボおよびインビトロでの使用のために製剤化される。
【００１６】
最後に、本発明はまた、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌、代謝障害、または任意の適切な疾患もしくは障害の治療、診断、予防またはモニタリングのための、または、化粧品もしくは他の病気に関連しない用途のための、結合タンパク質−小分子コンジュゲートを含むＥＶの医学的使用および用途にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＥＶをロードしたＡＰＯが、下流の生存ＦＧＦ−２の産生を増加させるＰＫＡおよびＭＡＰＫ依存性シグナル伝達を誘導する機能を保持するか、またはその機能を増大させることを示す。
【図２】図２は、ＡＢＬ１受容体チロシンキナーゼ−イマチニブコンジュゲートを有するＥＶが腫瘍重量を減少させ、生存率を増加させることを示す。
【図３】図３は、ＬＰＳ誘発急性敗血症モデルにおけるＡＢＬ１受容体チロシンキナーゼイマチニブコンジュゲートを有するＥＶの効果を示す。
【図４】図４は、ＦＫＢＰ１２、またはＦＫＢＰ１２に結合する小分子ラパマイシンを有するＦＫＢＰ１２およびＣＤ６３を含む融合タンパク質のいずれかを含む結合タンパク質−小分子コンジュゲートを含むＭＳＣ由来ＥＶのＭＣＦ７乳癌に対する抗癌効果を示す。
【図５】図５は、結合タンパク質ＣＡＬＣＲＬ（ＡＭに対する受容体）またはＥＶタンパク質ＣＤ８１に融合されたＣＡＬＣＲＬを含むＥＶにロードされたアドレノメデュリン（ＡＭ）を用いた、３Ｔ３−Ｌ１細胞における脂肪分解誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、とりわけ、新規な方法、組成物、ＥＶ、および小分子、タンパク質生物製剤および／またはタンパク質小分子コンジュゲートの送達のためのＥＶの使用を記載する。さらに、本発明は、ＥＶをロードするための方法、小分子を運ぶＥＶ、このようなＥＶを利用するための様々な方法、ＥＶを治療有効量で含む医薬組成物、および本発明どおり、小分子運搬ＥＶの医学的使用に関する。
【００１９】
便宜および明瞭さのために、本明細書で使用される特定の用語を収集し、以下に説明する。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２０】
本発明の特徴、態様、実施形態または代替物がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関しても記載されることを認識するであろう。当業者はさらに、本発明がマーカッシュ群のメンバーの個々のメンバーまたはサブグループの任意の組み合わせに関して記載されることを認識するであろう。さらに、本発明の態様および／または実施形態のうちの１つに関連して記載された実施形態および特徴は、本発明の他の態様および／または実施形態のすべてに準用することに留意されたい。例えば、小分子を運ぶＥＶに関連して記載された様々な小分子は、結合タンパク質−小分子薬物コンジュゲートをＥＶにロードする方法の文脈において、開示され、関連し、含まれると理解されるべきであり、それは全ての小分子剤であり、すべての結合タンパク質は潜在的相互作用パートナーのすべてを開示すると考えられる。さらに、特定の態様に関連して記載される特定の実施形態、例えば、小分子を運ぶＥＶの投与経路は、そのようなＥＶによる特定の医学的徴候の治療に関する態様に関して記載されているように、本発明の医薬組成物に関連するもののような他の態様および／または実施形態に関して当然関連し得る。さらに、任意のおよびすべての特徴（例えば、マーカッシュグループのすべてのメンバー）は、任意のおよび他のすべての特徴（例えば、他のマーカッシュグループのすべてのメンバー）と自由に組み合わせることができ、例えば、任意の結合タンパク質を任意の小分子剤と組み合わせてもよく、または任意の結合タンパク質は、本発明の要旨を逸脱することなく、任意のＥＶタンパク質と組み合わせることができる。さらに、本明細書中の教示が、単数形のＥＶおよび／または離散した天然ナノ粒子様小胞としてのＥＶを指す場合、そのような教示の全てが、複数のＥＶおよびＥＶの集団に等しく関連し、適用可能であることを理解されたい。一般的な見解として、本発明に係る小分子薬剤、結合タンパク質、標的部分、細胞源、ＥＶタンパク質、および他の全ての態様、実施形態、および代替物は、本発明の範囲および要旨から逸脱することなく、任意かつすべての可能な組合せで自由に組み合わせることができる。さらに、本発明の任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列（それぞれ、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）は、所与の分子がそれに関連する技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび配列からかなり外れることがある。それらの生物学的特性が保持されている限り、本出願によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列は、可能な限り高い配列同一性が好ましいけれども（例えば、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％またはそれ以上）、天然配列と比較して５０％（例えば、ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｉＷを用いて計算される）ほど逸脱し得る。例えば、少なくとも１つの結合タンパク質および少なくとも１つのエキソソームタンパク質の組み合わせ（融合）は、それぞれのポリペプチドの特定のセグメントが置換および／または修飾され得ることを意味し、これは、基本性質（例えば、標的特性、エキソソームの表面への輸送、治療活性、小分子剤への結合など）が保存される限り、天然配列からの逸脱が重要であり得ることを意味する。したがって、同様の推論は、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に当然適用される。
【００２１】
「細胞外小胞」または「ＥＶ」または「エキソソーム」という用語は、本明細書では互換的に使用され、マイクロベシクル（例えば、細胞の原形質膜から放出される任意の小胞）、エキソソーム（例えば、エンドリソソーム経路に由来する任意の小胞）、アポトーシス体（例えば、アポトーシス細胞から得ることができる）、微粒子（これは、例えば血小板に由来し得る）、エクトソーム（血清中の好中球および単球から誘導可能）、前立腺癌（例えば、前立腺癌細胞から得ることができる）、またはカルディオソーム（例えば、心臓細胞から誘導可能）など、任意の形態の細胞から得ることができる任意のタイプの小胞に関連すると理解される。さらに、前記用語は、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンなどのリポタンパク質粒子、並びに、リポソーム、ハイブリッド小胞、細胞外小胞（ＥＶ）模倣物、膜押し出しまたは他の技術によって得られる細胞膜ベースの小胞などに関連すると理解されるべきである。本質的に、本発明は、目的の小分子のための送達または輸送媒体として作用することができる任意のタイプの脂質ベースの構造（小胞形態または任意の他のタイプの適切な形態）に関連し得る。ＥＶの医学的および科学的用途および適用を説明するとき、本発明は通常複数のＥＶ、すなわち数千万、数百万または数十億のＥＶを含むことができるＥＶの集団に関連することは当業者には明らかであろう。以下の実験のセクションから分かるように、ＥＶは、単位容積あたり１０１０、１０１１、１０１５、１０１８、１０２５ＥＶ（しばしば「粒子」と呼ばれる）などの濃度（例えば、１ｍｌあたり）、またはより大きい、より小さい、またはその間の任意の他の数などの濃度で存在し得る。同じように、例えば特定の小分子を含むＥＶに関連する「集団」という用語は、そのような集団を構成する複数の本質的に類似した実体を包含するものと理解されるべきである。言い換えれば、個々のＥＶが複数で存在する場合にはＥＶ集団を構成する。
【００２２】
従って、当業者には明らかであるように、本発明は、小分子を含む個々のＥＶおよび通常は結合タンパク質に結合した小分子を含むＥＶを含む集団の両方に関連する。インビボで適用される場合のＥＶの投与量は、治療される疾患、投与経路、小分子貨物などに応じて、当然にかなり変化し得る。
【００２３】
用語「小分子剤」または「小分子」または「小分子薬剤」または「小分子治療薬」は、本明細書中では互換的に使用され、疾患および／または障害の治療および／または診断のために、また疾患および／または障害の調節または変化、例えば、結合タンパク質の活性および／または結合および／または位置のために使用され得る任意の分子薬剤に関連すると理解されるべきである。小分子剤は、化学合成手段を介して通常合成されるが、例えば天然源からの精製を介して天然由来であってもよく、または任意の他の適切な手段または技術の組み合わせによって得ることができる。「小分子」の簡潔で非限定的な定義は、本質的に任意の方法で生物学的プロセスを調節、衝撃または影響を及ぼしうる分子量が９００ｇ／ｍｏｌ（ダルトン）未満の任意の有機化合物である。本発明の目的のためには、小分子は、９００ｇ／ｍｏｌより実質的に大きく、例えば１５００ｇ／ｍｏｌ、３０００ｇ／ｍｏｌ、または場合によってはさらに大きくてもよい。基本的に、分子量および／または分子サイズは、小分子剤を構成する要素の背後にある決定的要因ではない。実際、本発明の目的のために、ＥＶ上に提示される結合タンパク質によって結合され得る任意の作用物質は、「小分子剤」であると考えられる。このように、天然および／または修飾ヌクレオチド、さらにはタンパク質を含む合成および天然ペプチド、ＲＮＡベースの薬剤は、それらが結合タンパク質によって結合され得る限り、本発明のような小分子薬剤と考えられる。特定の実施形態では、小分子薬剤は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ鎖、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはスプライススイッチングオリゴヌクレオチド、または任意の他のタイプのＲＮＡ分子を含むようなオリゴヌクレオチドであってもよい。さらに別の実施形態では、小分子剤は、受容体リガンド、神経ペプチド、Ａβ阻害剤、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、エンドソーム脱出を誘導するペプチド、標的化ペプチド、または任意の他の適切なペプチドのようなペプチドであってもよい。小分子はしばしば良好な経口バイオアベイラビリティを示すが、薬物動態、薬力学、および／または毒性または安定性の理由により、多くの小分子薬物を静脈内または他の投与経路で投与する必要がある。小分子の例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、５−フルオロウラシル、メトトレキセートなどの抗癌剤、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、あるいは、イマチニブもしくはセリシリブなどのキナーゼ阻害剤、ナプロキセン、アスピリン、またはセレコキシブなどのＮＳＡＩＤ、ヘプシリンなどの抗生物質、ＡＣＥ阻害薬、例えばエナラプリルなどの抗高血圧剤、カンデサルタンのようなＡＲＢ、オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、スプライススイッチングＲＮＡ、ペプチド、ヘテロ二量体またはホモダイマー小分子などが含まれる。本発明は、当業者には明らかであるように、本発明の要旨を逸脱することなく、本質的に他の小分子にも本質的に適用可能である。
【００２４】
用語「結合タンパク質」、「結合タンパク質」、「結合剤」、「受容体タンパク質」および類似の用語は、本明細書では互換的に使用され、非共有結合または共有結合を介して、または共有および非共有相互作用の両方の組み合わせを介して、小分子剤が結合し得る任意のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（すなわち、アミノ酸の配列を含む任意の分子）に関連すると理解されるべきである。本明細書では、結合タンパク質と小分子剤との組み合わせを、「結合タンパク質−小分子コンジュゲート」、または「結合タンパク質−小分子薬物コンジュゲート」または「結合タンパク質−小分子剤コンジュゲート」または単に「コンジュゲート」などの用語を用いて説明する。結合タンパク質は、いくつかの異なる役割を果たし得る：それは、例えば、（ｉ）主にそれに結合した小分子剤を輸送することを意味するキャリアおよび／または送達モダリティ、（ｉｉ）バインダータンパク質−小分子コンジュゲートを担持するＥＶの特定の位置への直接の輸送を指示するための標的剤、（ｉｉｉ）アゴニストまたはアンタゴニスト効果を有し得る小分子の結合を介して治療的に活性または不活性になる治療的に活性なタンパク質、（ｉｖ）その小分子貨物と共にまたは無しで、細胞および／または身体変化および関連する治療効果および／または予防効果を発揮または寄与し得るシグナル伝達タンパク質、（ｖ）別のタンパク質等に近接した場合にのみ、特定の反応を実施または触媒するタンパク質、である。結合タンパク質は、小分子剤を適切な位置に放出することによって、身体および／または細胞の作用または活性および関連する治療効果にさらに寄与し得るか、またはそれに結合した小分子剤を保持することによってそのような効果に寄与し得る。第１の場合の例は、結合タンパク質がＥＶ媒介送達後に標的細胞の内部で小分子薬物を放出する場合であり、第２の場合の例は、抗体−小分子薬物コンジュゲートを腫瘍に送達する場合である。典型的には、結合タンパク質はヒト起源のものであるが、当業者に知られている特定の例では、結合タンパク質は任意の他の種（例えば、結合タンパク質が、細菌タンパク質であるＣａｓ９のようなヌクレアーゼである場合、非限定的な例を使用して）から得ることができる。さらに、結合タンパク質は、その全体が存在する必要はなく、所望の効果（送達、治療活性、標的化などに関連する効果であろう）が維持されている限り、サブユニット、ドメイン、トランケートされたタンパク質、その誘導体または変異体の形態で存在してもよい。結合タンパク質は、ＥＶにおいておよび／またはＥＶソース細胞において天然に存在し得るか、またはそれらはＥＶタンパク質との融合構築物を介してＥＶに輸送され得る。本発明による結合タンパク質の非限定的な例には、ＧＰＣＲ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、インテグリン、チロシンキナーゼ（例えば、ＢＴＫまたはＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ）などの酵素、ＣａｓおよびＣａｓ９などのヌクレアーゼ、プロテアーゼ、インテグラーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ＤＮＡ結合およびＲＮＡ結合タンパク質、例えばＡｇｏ２、Ｄｉｃｅｒ、ＧＷ１８２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＤＤＸ４、ＡＤＡＤ１、ＤＡＺＬ、ＥＬＡＶＬ４、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＳＡＭＤ４Ａ、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ＦＭＲ１、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＥＩＦ４Ａ１−３、ＭＳ２コートタンパク質；アロマターゼまたはエステラーゼ、アダプタータンパク質（ＳＨ２ドメインなど）、Ｇタンパク質、ＧＥＦ、カルモジュリン、Ｒａｓ、タリン、ビンクリン、パキシリン、Ｒａｆ、カスパーゼ、ＭｙｏＤおよびＭｙｆ５などの転写因子、ｐ５３などの腫瘍抑制因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子などの神経栄養因子、神経伝達物質受容体、ドーパミン受容体、構造タンパク質、例えば、ジストロフィン、ユートロフィン、タイチン、ネブリン、ジストロビン結合タンパク質、例えばジストロブレビン、シンコフィン、シンコイリン、デスミン、サルコグリカン、ジストログリカン、サルコサン、アグリン、および／またはフクチン、ＩＬ１アルファおよびベータ、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１７、ＩＬ２３などのインターロイキンおよび他のインターロイキンおよびすべてのインターロイキン受容体例えば、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ｇｐ１３０、ＩＬ１ＯＲ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、インターフェロン（ＩＮＦアルファおよびベータなど）およびインターフェロン受容体、ＴＮＦアルファおよびベータなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびそれらの受容体、ＡＮＸＡ２およびＡＮＸＡ５のようなアネキシン、シグナル認識粒子およびＳＲＰＢ２およびＳＲＰ５４などの受容体成分、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ６Ａ１のような細胞外マトリックス成分、溶質担体ＳＬＣ２５Ａ５およびＳＬＣ２５Ａ１３、リボソームタンパク質ＲＰＳ２７ＡおよびＲＰＬ７、ＥＥＦ１Ａ１およびＥＥＦ１Ａ２などの翻訳伸長因子、ＥＩＦ４Ａ１およびＥＩＦ４Ａ２のような開始因子、ＧＰＩアンカー型タンパク質、ＣＤ６３およびＣＤ８１などのテトラスパン、組織因子、増殖因子およびＥＧＦおよびＥＧＦＲなどのそれらの受容体、ならびに上記結合タンパク質のいずれかの任意の融合物、組み合わせ、サブユニット、誘導体またはドメインが含まれる。
【００２５】
用語「ＥＶタンパク質」、「エキソソームタンパク質」、「エキソソームソーティングドメイン」、「ＥＶソーティングドメイン」、「ＥＶソーティングタンパク質」、「エキソソームタンパク質」、「エキソソームポリペプチド」、「ＥＶポリペプチド」などは、本明細書中で互換的に使用され、ポリペプチド構築物（これは、典型的には、ＥＶタンパク質に加えて、目的の少なくとも１つのタンパク質を含む）を適切な小胞構造、すなわち適切なＥＶに輸送するために利用され得る任意のポリペプチドに関連すると理解されるべきである。より具体的には、該用語は、ポリペプチド構築物をエキソソームなどの小胞構造に輸送、転送または移送することを可能にする任意のポリペプチドを含むと理解されるべきである。そのようなエキソソームソーティングドメインの例は、例えばＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１，ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−１またはＭＨＣ−１１コンポーネント、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、およびそれらの任意の組合せであるが、ポリペプチド構築物をＥＶに輸送することができる多数の他のポリペプチドが本発明の範囲内に含まれる。本発明によるＥＶタンパク質は、典型的にはヒト起源であり、Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＲＣＳＢなどの様々な公的に入手可能なデータベースに見出すことができる。ＥＶタンパク質は、例えば、表面ディスプレイを増強し、アビディティーを増大させ、または非共有結合様式で特定のタイプの結合タンパク質との相互作用を可能にするために、様々な他のタンパク質および／またはタンパク質ドメインに融合され得る。
【００２６】
「ソース細胞」または「ＥＶソース細胞」または「親細胞」または「細胞源」または「ＥＶ産生細胞」または他の同様の用語は、適切な細胞培養条件下で、ＥＶを産生することができる任意のタイプの細胞、例えば、エキソソームに関連すると理解される。そのような状態は、懸濁細胞培養または付着培養または任意の他のタイプの培養系であり得る。中空繊維バイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクターおよび他のタイプのバイオリアクターは、非常に適切な細胞培養インフラストラクチャを表す。本発明によるソース細胞は、広範囲の細胞および細胞株、例えば間葉系幹細胞または間質細胞または線維芽細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ワートンゼリー、周産期組織、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得ることができる）、羊膜細胞、より具体的には様々な初期マーカーを任意に発現する羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞から選択することができる。具体的な関心のある細胞株には、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、微小血管またはリンパ内皮細胞などの内皮細胞系、軟骨細胞、ＭＳＣ、気道または肺胞上皮細胞、および細胞源の様々な他の非限定的な例が含まれる。
【００２７】
ソース細胞は、治療対象の患者に対して本質的に、同種異系、自己、または異種のいずれかであってもよい。すなわち、細胞は、患者自身または無関係な、一致した、または一致しないドナーからであってもよい。特定の状況では、ロジスティカルな観点から、そのようなソースは既製の治療法を提供するので、同種細胞が好ましいかもしれない。
【００２８】
第１の態様では、本発明は、結合タンパク質に小分子剤（例えば、小分子薬剤）が結合している結合タンパク質を含むＥＶに関する。典型的には、小分子剤は、非共有結合／結合を介して結合タンパク質に結合するが、結合はまた、共有結合相互作用に基づいてもよい。非共有結合相互作用の非限定的な例は、ＡＢＬ１受容体チロシンキナーゼと小分子薬物イマチニブとの間の結合である。結合タンパク質と小分子薬物との間の共有結合相互作用の非限定的な例は、抗体−薬物コンジュゲートにおけるモノクローナル抗体と抗癌剤とを典型的に結合する共有結合、例えば、ブレントキシマブとモノメチルアウリスタチンＥ（ブレンツキシマブベドチン）との共有結合である。小分子薬物、結合タンパク質および／またはタンパク質−薬物結合体が所望の効果を発揮し得る限り、結合タンパク質から小分子薬物を放出することは有利であるが、必須ではない。放出可能な共有結合の適切な非限定的な例には、還元環境下で還元を受け得る、ジスルフィド架橋およびチオエーテル結合、例えば、プロテアーゼおよび他の酵素によって開裂してもよいアミド結合、
特定のインビボ条件下で解離するビオチン−ストレプトアビジン結合などを含む。それにもかかわらず、エステル結合、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、マレイミド−ＮＨＳ反応による結合、ＥＤＣ−ＮＨＳ反応による結合、ステープリングされた連結（例えば、全炭化水素のステープル）および様々な他の結合のような非限定的な例では、結合タンパク質への小分子薬物の共有結合／結合のために利用可能な複数の戦略が存在する。
【００２９】
有利な実施形態では、結合タンパク質は、ＥＶタンパク質に融合された結合タンパク質それ自体を含む融合タンパク質である。上記のように、結合タンパク質は必ずしもタンパク質全体である必要はないが、天然配列と比較して、アミノ酸のサブユニット、ドメイン、誘導体、トランケーション、または他のタイプの修飾された配列であってもよい。このような改変の一例は、抗体全体を使用する代わりに、抗体の一本鎖断片可変（ｓｃＦｖ）ドメインの使用である。
【００３０】
本発明による結合タンパク質は、本発明のように小分子に結合することができる本質的に任意のタンパク質であり得る。上記のように、本発明による結合タンパク質のいくつかの非限定的な例には、ＧＰＣＲ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、インテグリン、チロシンキナーゼなどの酵素、ＣａｓおよびＣａｓ９などのヌクレアーゼ、ＤＮＡ結合またはＲＮＡ結合タンパク質またはそのドメイン、プロテアーゼ、リガーゼ、イソメラーゼ、インテグラーゼ、ホスファターゼ、ＧＴＰアーゼ、アロマターゼまたはエステラーゼ、アダプタータンパク質、例えばＳＨ２ドメイン、Ｇタンパク質、ＧＥＦ、カルシウム結合タンパク質、例えばカルモジュリン、Ｒａｓ、タリン、ビンクリン、パキシリン、Ｒａｆ、カスパーゼ、ＭｙｏＤおよびＭｙｆ５などの転写因子、ｐ５３、ｐ２１、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、およびＳＴ１４などの腫瘍抑制因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子などの神経栄養因子、構造タンパク質、例えば、ジストロフィン、ユートロフィン、タイチン、ネブリン、ジストロフィン関連タンパク質、例えば、ジストロブレビン、シンコウリン、シンコイリン、デスミン、サルコグリカン、ジストグリカン、サルコサン、アグリン、および／またはフクチン、ならびに、上記の結合タンパク質のいずれかの任意の融合物、組み合わせ物、サブユニット、誘導体またはドメインが含まれる。
【００３１】
抗体の形態の結合タンパク質は、非限定的な実施形態において、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトックスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アジドナマブ（Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルトモマブペンテタイト、アマタキシマブ、アナトモマブマフェナトックス、アニフロルマブ、アヌリキンスマブ、アポリツマブ、アーチトモマブ、アゼリズマブ、アチヌマブ、アトリスマブ、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクトモマブ、ベリムマブ、ベラルリズマブ、バシリムマブ、ベシレサマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ（ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ、ビマグラマブ、ビバツズマブ、メルタシン、ブリナトモマブ、ブロゾズマブ、ブレントキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ、メルタンシン、カンツズマブレブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫コンジュゲート、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス、チクツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、コンシツマブ、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デシズマブ、デノスマブ、デトモマブ、ドリモマブアリトクス、ドロジトマブ、デュリゴトマブ、デュピルマブ、ドシギトマブ、エコメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフンガマブ、エルデルマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリスマブ、エボロクマブ、エクビビルマブ、フラノサマブ、ファラリモマブ、ファレツズマブ、ファシヌマブ、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィジツママブ、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フォンフォリズマブ、フォルラルマブ、フォラビルマブ、フレゾリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニトマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲオビキズマブ、ギレントキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、ラバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴモマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダタキシマブラブタンシン、インフルリシマブ、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、リピリムマブ、ラトゥママブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ランブロリズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レデリムマブ、レキサトムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロルボツズマブメルタシン、ルカツズマブ、ルミリキシマブ、マパツズマブ、マルジェツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メプロリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミレトモマブ、ミトモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モクセトモマプパセドトックス、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトックス、ナミルマブ、ナプタモマエスタフェナトックス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシトムマブ、ネレリモマブ、ネズバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェトモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オズリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナツズマブ、オントキシズマブ、オポーツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルティクマブ、オテリキシズマブ、オルトルツズマブ、オキザルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスクリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムトモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペクセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブベドチン、ピントモマブ、プラクルマブ、ポラトズマブベドツイン、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリトキシマサブ、プリツムマブ、クイリズマブ、ラコトモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ローデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サムリズマブ、サルルマブ、サトモマブペンデチド、セキキヌマブ、セリバントマブ、セトキサキシマブ、セビルマブ、シブロツマブ、シファリムマブ、シルトキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、セレソマブ、スビズマブ、タバルマルブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリトモマブパプトクス、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、テナトモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、ベクサキサール、トベツマブ、トロンキヌマブ、トラスツズマブ、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トコツズマブセルモレーキン、ツビルマブ、ウリツキマブ、ウルシツラマブ、ウルトキサマブ、ウスチキヌマブ、ヴァンティクツマブ、バプリキシマブ、バチリズマブ、ベドリズマブ、ヴェルツズマブ、ベパリモマブ、ベシンクマブ、ビシリズマブ、ボルシキシマブ、ボルツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザロニムマブ、ザトキシマブ、ジリムママブ、ゾリモマブアリトックス、またはこれらの任意の組み合わせのいずれか１つ以上を含み得る。抗体は、結合タンパク質として利用される場合、いくつかの役割を���たすことができる。例えば、抗体は、（ｉ）目的の細胞、組織、および／または器官への標的化された送達を提供し、（ｉｉ）固有の治療活性を有し、（ｉｉｉ）ＥＶ表面に結合された場合、インビトロおよびインビボで標的細胞に送達され得、（ｉｖ）小分子薬物（しばしば抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれる）を細胞内または体外の細胞外に送達することを目的とする結合タンパク質として作用し、（ｖ）複数の小分子剤のためのいくつかの結合部位を提供することができる。
【００３２】
上記のように、本発明による小分子薬物は、本質的に、薬学的および／または薬理学的および／または診断的に関連する薬剤の全スペース、例えば抗癌剤、細胞増殖抑制剤、チロシンキナーゼ阻害剤、スタチン、ＮＳＡＩＤ、抗生物質、抗真菌剤、抗菌剤、抗寄生虫剤、抗炎症剤、抗線維症剤、抗高血圧薬、アロマターゼまたはエステラーゼ阻害剤、抗コリン剤、ＳＳＲｉ、ＢＫＴ阻害剤、ＰＰＡＲ作動薬、ＨＥＲ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤、シグナル伝達阻害剤、血管新生阻害剤、シンターゼ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ネプリライシン阻害剤、ベータ２−作動薬、ＣＲＴＨ２アンタゴニスト、ＦＸＲアゴニスト、ＢＡＣＥ阻害剤、スフィンゴシン−１−リン酸受容体モジュレーター、ＭＡＰＫ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ＬＳＤ１阻害剤、ラクタマーゼ阻害剤、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ＩＤＯ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、Ｃｈｋ１阻害剤、スプライシング調節剤、ＤＮＡまたはＲＮＡインターカレーター、血管拡張剤、ヘテロマーまたはホモマーのいずれかである単量体、二量体、三量体および／または多量体小分子などから得ることとしてもよい。本発明による小分子薬物の他の非限定的な例には、例えばエベロリムス、トラベクテイン、アブラキサン、パゾパニブ、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ−１調節剤、Ｂｃｌ−２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ  ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ−ＴＫ阻害剤、抗ＨＧＦ抗体、Ｐｌ３キナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、チェックポイント−１または２阻害剤、焦点接着キナーゼ阻害剤、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）阻害剤、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ、ニロチニブ、デカタニブ、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、ノルアトレキセド、バタブリン、オアツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テシミリフェン、オブリメルセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、シロリチド、ギマタン、ルカントン、ニューラジアブ、ワイツパン、タランパネル、アトラセンタン、ロミデプシン、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５’−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、セリシクリブ、カペシタビン、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、トレミフェンクエン酸塩、アナスタゾール、エキセメスタン、レトロゾール、バタラニブ、酢酸ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、トリプトレリンパモエート、酢酸メドロキシプロゲステロン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸メゲストロール、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ロナファミブ、チピファルニブ、アミホスチン、スベロイルアナナイドヒドロキサム酸、バルプロ酸、トリコスタチンソラフェニブ、アルンサクリン、アナグレリド、ブレオマ��シン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルモスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビン、フルドコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−シス−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスウリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メカプリン、デオキシコルモシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビノレルビン、トポテカン、レゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、スクアラミン、エンドスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステライド、シミチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトックス、ゲフィチニブ、ボルテージミブ、パクリタキセル、クレモフォアを含まないパクリタキセル、ドセタキセル、エピシロンＢ、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンシキシフェン、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソファキシフェン、イドキシフェン、トポテカン、ラパマイシン、テムシロリムス、ゾレンドロネート、プレドニゾン、レナリドマイド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、デキサゾキサン、アレムツズマブ、オールトランスレチン酸、ケトコナゾール、メゲストロール、免疫グロブリン、ナイトロジェンマスタード、メチルプレドニゾロン、ブリツモマブチウキセタン（ｉｂｒｉｔｇｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エディトロン酸塩、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、エドワナ−アスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カスピタント、ネットピタント、ＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファおよびダルベポエチンアルファ、エファビレンツなどが中でも含まれる。上述したように、本発明は、当業者には明らかであるように、本発明の要旨を逸脱することなく他の小分子にも当然適用可能である。
【００３３】
上記のように、結合タンパク質は、結合タンパク質それ自体と適切なＥＶタンパク質との間の融合タンパク質としてＥＶ上に有利に発現される。ＥＶタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩコンポーネント、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、およびそれらの任意の組み合わせなどのタンパク質を含む群から選択され得るが、ポリペプチド構築物をＥＶに輸送することができる多数の他のポリペプチドが本発明の範囲内に含まれる。ＥＶタンパク質は、典型的にはヒト起源であり、Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＲＣＳＢなどの様々な公的に入手可能なデータベースに見られ得る。ＥＶタンパク質は、例えば、表面ディスプレイを増強し、アビディティーを増大させ、または非共有結合様式で特定のタイプの結合タンパク質との相互作用を可能にするために、様々な他のタンパク質および／またはタンパク質ドメインに融合され得る。
【００３４】
さらなる実施形態では、小分子薬剤の結合は、結合タンパク質を治療的に活性にすることができる。これの非限定的な例は、アゴニストまたはアンタゴニスト小分子による結合タンパク質への結合であり、例えば、シグナル伝達を可能にすることまたはシグナル伝達を阻害することを介して、結合タンパク質を治療的に活性化することができる。したがって、シグナリング−応答能はあるが、シグナル伝達能力のない結合タンパク質が治療的に活性化され得る特定の場合では、結合タンパク質は治療的に活性化され得、例えば、特定のシグナル伝達経路を妨害することによって薬理学的効果を発揮することができる。治療的に活性化された結合タンパク質のさらに別の非限定的な例は酵素であり、酵素活性は場合により小分子剤と標的の両方の存在を必要とする。
【００３５】
さらに別の実施形態では、本発明によるＥＶは、ＥＶの表面に表示される少なくとも１つの標的化部分を含み、関心のある組織、器官、または細胞型を標的化することによってその治療可能性をさらに高める。標的部分は、通常、例えばファージディスプレイまたは任意の他のタイプのスクリーニング方法によって同定することができるアミノ酸の配列を含む。標的部分は、典型的には、標的部分およびエキソソームタンパク質を含む融合タンパク質を含むＥＶを産生するようにソース細胞をトランスフェクトする、ＥＶソース細胞の遺伝子工学によってＥＶ表面上に提示される。本発明によるＥＶタンパク質は、とりわけ、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン−１、シンテニン−２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｅ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩコンポーネント、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ−ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ−１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ−１アルファ、Ｍａｃ−１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、およびそれらの任意の組み合わせを含むが、ポリペプチド構築物をＥＶに輸送することができる多数の他のポリペプチドが本発明の範囲内に含まれる。ＥＶタンパク質は、典型的にはヒト起源であり、Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＲＣＳＢなどの様々な公的に入手可能なデータベースに見ることができる。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）小分子薬物、（ｉｉ）治療上活性な形態または治療的活性化のために準備された形態、または、例えば標的と接触したとき治療活性化の準備が整った形態での結合タンパク質、および／または、（ｉｉｉ）バインダータンパク質−小分子薬物コンジュゲートのうち少なくとも１つで、標的位置に送達する方法に関する。そのような送達方法は、本発明のように、標的細胞、標的組織、または標的器官（血液、胆汁、リンパ液、間質液、脳脊髄液などの流体および液体を含み得る）をＥＶに曝露することを含み得る。上述のように、ＥＶは、その表面上に発現される標的部分を含むことができ、または天然指向性および標的に依存してもよく、または非標的であってもよい。標的細胞中および標的細胞への送達は、状況に応じて、インビトロおよび／またはインビボで行うことができる。さらに、本発明は、小分子薬物またはタンパク質−薬物コンジュゲートの薬物動態学的または薬力学的プロファイルを変更する方法に関する。これは、吸着、分布、代謝、酵素活性、組織浸透、クリアランスなどの因子に影響を及ぼす、ＥＶの中および上に問題の小分子剤および結合タンパク質をロードすることによって達成される。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、細胞シグナル伝達を調節する方法に関し、小分子剤をＥＶ上に提示された結合タンパク質に結合させ、結合タンパク質および小分子剤を含むコンジュゲートを標的シグナル伝達経路に曝露する工程を含む。
【００３８】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるＥＶを製造する方法に関する。このような方法は、任意の適切なＥＶ産生細胞、例えばＭＳＣ、線維芽細胞、免疫細胞、ＨＥＫ細胞、または任意の他の適切な細胞型から得られたＥＶを用いて実施することができる。結合タンパク質−薬物コンジュゲートを含むＥＶを産生するためのいわゆる外因的方法は、（ａ）ＥＶタンパク質を有する融合タンパク質の形態の結合タンパク質を含むＥＶを提供することと、（ｂ）小分子剤の結合タンパク質への非共有結合または共有結合を可能にするために、結合タンパク質を小分子剤に曝露することのステップを含むこととしてもよい。通常、上記ステップは、ＥＶ産生細胞を遺伝的に改変して、任意に、ＣＤ６３、ＣＢ８１、ＣＤ９、またはＬａｍｐ２ｂまたは任意の他の適切なＥＶポリペプチドなどのＥＶポリペプチドとの融合タンパク質の形態で、それらの表面に結合タンパク質を提示したＥＶを分泌させることとしてもよい。ＥＶの分泌後、ＥＶによりコンディショニングされた（すなわち、ＥＶを含む）培養培地は、以下により詳細に記載されるような様々な方法を用いて精製され、続いて目的の小分子薬物に曝露され得る。小分子薬物への暴露は、問題の薬物と結合タンパク質との間の相互作用を可能にし、結合の形成、ひいては結合タンパク質−小分子薬物コンジュゲートの形成をもたらす。
【００３９】
さらなる態様では、本発明のようなＥＶを産生する方法は、小分子薬物によるＥＶ結合タンパク質の内因的ローディングを含み得る。そのような方法は、（ａ）小分子薬剤を、任意にＥＶタンパク質を有する融合タンパク質の形態で、結合タンパク質を含むＥＶソース細胞の培養物と共にインキュベートするようなステップを含むこととしてもよい。続いて、ＥＶソース細胞によって産生されたＥＶを採取し、ＥＶは結合タンパク質に結合した小分子剤を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、結合タンパク質−小分子コンジュゲートを含むＥＶを産生する方法は、アダプタータンパク質を含むＥＶを分泌するために、ＥＶ産生細胞を遺伝子改変するステップを含み得る。任意にＥＶタンパク質に融合され得るアダプタータンパク質は、例えば抗体のような様々なタイプの結合タンパク質を非共有結合的に結合するために使用され得る。従って、１つの非限定的な例において、アダプタータンパク質を含むＥＶの産生後、第１の外因的ローディングステップを実施することができ、その間に、例えば、抗体はＥＶに結合する。続いて、小分子剤を抗体または他の結合タンパク質に付着させることができる第２の外因的ローディング工程を行うことができる。任意に、これらの２つのローディングステップは、小分子剤が既にロードされている結合タンパク質でＥＶをコーティングすることによって、１つの単一ステップとして実施することができる。
【００４１】
さらに別の態様において、本発明は、結合タンパク質−小分子コンジュゲートを含むＥＶを含む医薬組成物に関する。典型的には、本発明による医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に処方される１種類の治療用ＥＶ（すなわち、その結合タンパク質パートナーと組み合わせた特定の所望の小分子を含むＥＶの集団）を含むが、例えば、コンビナトリアル処置が望ましい場合には、複数のタイプのＥＶ集団を医薬組成物に含めることとしてもよい。少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤は、任意の薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば固体または液体の充填剤、希釈剤、賦形剤、担体、溶媒またはカプセル化物質、を含む群から選択することができ、これは、例えば、１つの臓器、または身体の一部分から、別の器官、または身体の部分へと（例えば、血液から、目的の組織および／または器官および／または身体部分へと）ＥＶ集団の活性を維持するか、またはＥＶ集団を運搬するかもしくは輸送することを含み得る。
【００４２】
本発明はまた、結合タンパク質−小分子運搬ＥＶの化粧品および皮膚科学的用途にも関する。したがって、本発明は、乾いた肌、しわ、ひだ、隆起、および／または皮膚のしわなどの症状および問題を改善および／または軽減するために、適切なＥＶを含む、クリーム、ローション、ゲル、エマルジョン、軟膏、ペースト、散剤、リニメント剤、サンスクリーン剤、シャンプーなどのスキンケア製品に関する。一実施形態では、ＥＶ（関心対象の小分子を含む）は、しわ、ライン、ひだ、隆起および／または皮膚のしわの美容的または治療的軽減に使用するための化粧用クリーム、ローションまたはゲルに含まれる再生特性を有する適切なＥＶ生成細胞源（例えば、間葉系幹細胞）から得られる。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、医薬品における使用のための本発明によるＥＶに関する。当然のことながら、本発明による小分子を含むＥＶが医薬品において使用される場合、実際には通常、使用されているのはＥＶの集団である。患者に投与されるＥＶの用量は、ＥＶにロードされた小分子薬物の量、治療または緩和される疾患または症状、投与経路、小分子自体の薬理学的作用、ＥＶの固有の性質、ならびに他の関連パラメータに依存する。
【００４４】
したがって、本発明によるＥＶおよびそのＥＶ集団は、予防目的および／または治療目的のために、例えば、種々の疾患および障害の予防および／または治療および／または緩和における使用のために使用され得る。本発明によるＥＶを適用することができる疾患の非限定的なサンプルは、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン−１受容体アンタゴニストの欠乏（ＤＩＲＡ）、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、線維症、ギラン・バレー症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、腎不全、心不全または急性もしくは慢性臓器不全および関連する根底にある病因、移植片対宿主病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、および他の筋ジストロフィー、リソソーム蓄積疾患、例えばゴーシェ病、ファブリー病、ＭＰＳＩ、ＩＩ（ハンター症候群）、およびＩＩＩ、ニーマン・ピック病、シスキノシス、ポンペ病等、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および他のトリヌクレオチド反復関連疾患を含む神経変性疾患、認知症、ＡＬＳ、癌誘発悪液質、食欲不振、２型糖尿病、および様々な癌を含む。実質的にすべてのタイプの癌は、本発明の関連疾患標的、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、附属癌、星細胞腫、小脳または大脳、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳癌、脳腫瘍（小脳星細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、上咽頭原始神経外胚葉腫瘍、視覚経路および視床下部神経膠腫）乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児、胃腸管）原発未知の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、脱細胞性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、頭蓋外生殖細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼内メラノーマ、網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃部の（胃）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍（頭蓋外、奇形または卵巣）、妊娠性栄養芽腫、神経膠腫（脳幹グリオーマ、大脳星細胞腫、視覚経路および視床下部神経膠腫）、胃カルチノイド、毛様細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（（急性リンパ芽球性（急性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、急性骨髄性白血病（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ球性（慢性リンパ球性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性（慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、毛様細胞性白血病））、口腔および口腔、腔内がん、脂肪肉腫、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン、髄芽細胞腫、メルケル細胞癌、中皮腫、潜在性原発巣を有する転移性扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍、多発性骨髄腫／血漿細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮−間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣悪性腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚芽腫、松果体芽細胞腫および原発性原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、肺表面芽細胞腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（腫瘍肉腫のユーイングファミリー、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（非メラノーマ、メラノーマ）、小腸癌、扁平上皮細胞、扁平上皮首癌、胃癌、上咽頭原始神経外胚葉腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣がん、小卵巣がん、ワルデンスストロママクログロブリン血症、または／またはウィルムス腫瘍である。
【００４５】
本発明による結合タンパク質−小分子ＥＶは、種々の異なる投与経路、例えば耳（ａｕｒｉｃｕｌａｒ）（耳（ｏｔｉｃ））、頬、結膜、皮膚、歯科、電気浸透、子宮頸部、内皮内、気管内、経腸、硬膜外、羊水過多、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、口腔内、心臓内、脈絡膜内、尾部内、海綿内、腔内、大脳内、大槽内、角膜内、歯冠内（歯科）、冠動脈内、陰茎海綿体、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、内腔内、表皮内、食道内、胃内、歯内組織内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ管内、髄内、髄膜、筋肉内、眼内、卵巣内、心嚢内、腹腔内、胸膜内、静脈内、肺内、内臓、脊髄内、滑膜、腱内、腹腔内、髄腔内、胸腔内、管腔内、腫瘍内、軽度のパニック、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌流、喉頭、経鼻、鼻腔胃、閉塞性包帯技術、眼科、口腔、口腔咽頭、他の、非経口、経皮、関節周囲、周膜、神経周囲、歯周病、直腸、呼吸器（吸入）、後眼球、軟部組織、くも膜下腔、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経胸腔、尿管、尿道、および／もしくは膣内投与であり、並びに／または典型的には治療される疾患および／もしくは低分子薬物またはＥＶ集団の特徴に依存する上記投与経路の任意の組合せを介してヒトまたは動物対象に投与することとしてもよい。
【００４６】
本発明の方法はまた、得られたＥＶの収量または特性に影響を及ぼすために、血清飢餓、低酸素、バフィロマイシン、またはサイトカイン、例えばＴＮＦ−アルファおよび／またはＩＦＮガンマに、ＥＶソース細胞を曝露することを含むこととしてもよい。ＥＶ生成スケールおよびタイムラインは、ＥＶ生成細胞または細胞株に大きく依存し、したがって、当業者によって適宜適合され得る。本発明の方法は、ＥＶ精製工程をさらに含むことができ、ここで、ＥＶは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、スピン濾過、接線流濾過、中空糸ろ過、遠心分離、免疫沈降、フローフィールド分画、透析、マイクロ流体ベースの分離など、またはそれらの任意の組み合わせを含む技術の群から選択される手順によって精製される。有利な実施形態において、ＥＶの精製は、濾過（好ましくは限外濾過（ＵＦ）、タンジェンシャルフロー濾過または中空繊維濾過）およびサイズ排除液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の逐次的組み合わせを用いて行われる。精製工程のこの組み合わせは最適化された精製をもたらし、これは優れた治療活性をもたらす。さらに、エキソソームを精製するために日常的に使用されている超遠心分離法（ＵＣ）と比較して、逐次濾過−クロマトグラフィーは、かなり速く、より高い製造量まで拡大することが可能であり、これは、従来技術を支配する現在のＵＣ方法論の重大な欠点である。別の有利な精製方法は、スケーラビリティおよび純度を提供する接線流濾過（ＴＦＦ）であり、濾過などの他のタイプの精製技術と組み合わせることができる。
【００４７】
上述の例示的な態様、実施形態、代替形態、および変形形態は、本発明の範囲から逸脱することなく変更可能であることを理解されたい。本発明は、ここで、本発明の範囲および要旨から逸脱することなく、当然に変更することができる添付の実施例でさらに例示される。
材料と方法
【００４８】
結合タンパク質とＥＶタンパク質（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、シンテニン、シンデカン、Ａｌｉｘ、ＣＤ１３３など）を含む様々な融合タンパク質が設計され、評価されている。ＯＲＦは、典型的には合成によって生成され、哺乳動物発現ベクターｐＳＦ−ＣＡＧ−Ａｍｐにクローニングされた。簡潔に述べると、合成ＤＮＡおよびベクタープラスミドを、製造業者の指示（ＮＥＢ）に従って酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。制限された、精製されたＤＮＡ断片を、製造業者の指示（ＮＥＢ）に従ってＴ４リガーゼを用いて一緒にライゲーションした。成功したライゲーション事象は、アンピシリン補充プレート上の細菌形質転換のために選択された。トランスフェクションのためのプラスミドは、製造者の指示に従って、「ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ」によって作製した。
【００４９】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＮＥＢ、Ｉｎｃ．）を使用してクローニングの大部分を行い、Ｓａｎｇｅｒ配列決定（Ｓｏｕｒｃｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を使用して確認した。
【００５０】
プラスミドをＮＥＢ５−アルファコンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ、Ｉｎｃ．）に形質転換し、メーカーの推奨に従って振とう培養器で一晩増殖させた。製造業者の指示（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）に従って、「ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ」キットを用いてプラスミドを単離し精製した。
【００５１】
実験デザインおよびアッセイに依存して、ある場合には、非ウイルス一過性トランスフェクションおよびエキソソーム産生を、従来の２Ｄ細胞培養で実施し、他の場合には、ウイルス媒介形質導入を用いて、中空繊維バイオリアクターおよび撹拌タンクバイオリアクターのような異なるタイプのバイオリアクターで典型的に培養された安定な細胞株を作製した。簡潔にするために、ここではいくつかの例のみを述べる。
【００５２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、典型的には、１５ｃｍのディッシュ（１つのディッシュあたり９×１０６細胞）に播種し、ＡＴＣＣによって推奨されるように血清含有ＤＭＥＭ中に一晩放置した。翌日、細胞に直接添加したリポプレックスＤＮＡを、細胞に過渡的にトランスフェクトした。簡潔には、ＤＮＡおよびポリエチレンイミン（ＰＥ１）をＯｐｔｉＭＥＭ中で５分間別々にインキュベートした後、一緒に室温で２０分間混合した。リポプレックスされたＤＮＡおよび細胞を６時間共インキュベートし、続いて条件培養培地をＯｐｔｉＭＥＭに４８時間交換した。ディッシュ、フラスコおよび他の細胞培養容器で評価された他の細胞および細胞株は、骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）およびワートンゼリー由来ＭＳＣ（ＷＪ−ＭＳＣ）、羊膜細胞、線維芽細胞、種々の内皮細胞および上皮細胞、並びに、種々の免疫細胞および細胞株が含まれた。
【００５３】
ウイルス形質導入および安定細胞株の作成の場合、ＢＭ−ＭＳＣ、ＷＪ−ＭＳＣ、線維芽細胞、羊膜細胞、線維芽細胞、種々の内皮細胞および上皮細胞などの細胞源は、レンチウイルス（ＬＶ）を用いてウイルスにより形質導入された。典型的には、感染の２４時間前に、１００，０００細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣなど）または２００，０００細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）を６ウェルプレートに播種する。２μＬのＬＶおよび場合によりポリブレン（または臭化ヘキサジメトリン、ウェルの最終濃度８μｇ／ｍＬ）を添加し、形質導入の２４時間後、形質導入細胞の細胞培地を新鮮な完全培地に交換する。形質導入の７２時間後に、通常７日間ピューロマイシン選択（４〜６μｇ／ｍｌ）を行い、その後ポリペプチド構築物の安定した発現を分析する。
【００５４】
安定した細胞を、２Ｄ培養またはバイオリアクター、典型的には中空繊維バイオリアクターおよび撹拌タンクバイオリアクターのいずれかで培養し、次に馴化培地をエキソソーム調製のために採取した。種々の調製および精製工程を行った。標準的なワークフローは、インビトロおよび／またはインビボアッセイのための適切な緩衝液中の上清の事前清浄化、濾過に基づく濃縮、タンパク質汚染物のクロマトグラフィーに基づく除去および得られたエキソソーム組成物の任意の処方の工程を含む。
【００５５】
アッセイおよび分析に関しては、ウエスタンブロットを用いて、ＥＶにおいて、場合によりエキソソームタンパク質に融合した結合タンパク質の濃縮を評価した。簡潔には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏｖｅｘ  ＰＡＧＥ  ４〜１２％ゲル）に従って実施し、１×１０１０個のエキソソームおよび２０μｇの細胞溶解物をウェルごとにロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル由来のタンパク質を、製造業者の指示（ｌｍｍｏｂｉｌｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＰＶＤＦ膜に移した。膜をオデッセイブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ）でブロックし、製造者の指示に従って（一次抗体−Ａｂｅａｍ、二次抗体−Ｌｉｃｏｒ）、結合タンパク質およびエキソソームタンパク質に対する抗体でプローブした。６８０および８００ｎｍの波長で可視化された分子プローブ。
【００５６】
ＥＶサイズの決定のために、分析ソフトウェアを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ機器を用いてナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を行った。すべての記録について、すべての撮影後設定に、１３または１５のカメラのレベルおよび自動機能を使用した。電子顕微鏡および蛍光顕微鏡検査は、ＥＶを定量および分析するために頻繁に用いられた。
【００５７】
ＥＶは、様々な方法、典型的にはＴＦＦのような濾過と液体クロマトグラフィーとの組み合わせを用いて単離および精製された。典型的には、ＥＶ含有培地を収集し、３００ｇで５分間低速スピンにかけ、続いて２０００ｇスピンで１０分間処理して、より大きな粒子および細胞破片を除去した。次いで、上清を０．２２μｍシリンジフィルターでろ過し、異なる精製工程に供した。１００ｋＤａカットオフフィルターを有するＶｉｖａｆｌｏｗ  ５０Ｒ接線流（ＴＦＦ）装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）または１００または３００ｋＤａカットオフ中空繊維フィルターを有するＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステム（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）を使用して、大容量をダイアフィルトレーションし、およそ２０ｍｌに濃縮した。その後、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓまたはＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続したビーズ溶出カラム（ＨｉＳｃｒｅｅｎまたはＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｃｏｒｅ  ７００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に予備濃縮培地をロードした。現場での手順における、カラム平衡化、サンプルローディングおよびカラム洗浄の流速設定は、製造業者の指示に従って選択した。サンプルをＵＶ吸光度クロマトグラムに従って収集し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ分子量カットオフスピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１００μｌの最終容量に濃縮し、さらなる下流分析のために−８０℃で保存した。タンパク質およびＲＮＡ溶出プロフィールを評価するために、培地を濃縮し、１００ｋＤａおよび３００ｋＤａの中空繊維フィルターおよびＴｒｉｃｏｒｎ  １０／３００  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｓ４ＦＦ）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した試料を使用して、ＫＲ２ｉ  ＴＦＦシステムでダイアフィルトレーションした。結合タンパク質を含むＥＶへの小分子薬物の外因的ローディングは、適切な時間の期間の同時インキュベーション、続いて本質的に同じ工程またはこれらの工程の少なくとも一部を用いた再精製によって実施した。
実施例１：パーキンソン病のためのアポモルフィンローディングＥＶ
【００５８】
ドーパミン受容体０２を内因的に発現するＭＳＣ、およびＥＶタンパク質Ｃ０６３およびドーパミン受容体０２を含む融合タンパク質を発現するように遺伝子操作されたＭＳＣをＭＳＣＧＭ増殖培地中で培養した。パーキンソン病の治療に使用される薬物であるアポモルフィン（ＡＰＯ）をＭＳＣ  ＥＶに内因的にロードするために、ＭＳＣ培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と交換し、２Ｍ  ＡＰＯと共に１２時間インキュベートした。その後、馴化培地を回収し、接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーによりＡＰＯ−ＥＶを単離した。ＭＳＣ−ＥＶをＡＰＯで外因的にロードするために、上記のようにして未処理ＭＳＣからのＥＶを単離し、２時間ＡＰＯとともにインキュベートし、再度単離してＥＶにロードされていないＡＰＯ分子を除去した。ＥＶへのＡＰＯローディングは、シグナル伝達能力のあるドーパミンレセプターの「プレチャージ」をもたらすＥＶ表面上のドーパミンレセプターＤ２のその相互作用によって促進される。
【００５９】
遺伝的に修飾されたＭＳＣおよび未修飾ＭＳＣの両方から得られたＡＰＯ−ＥＶの活性を試験して、初代星状細胞におけるドーパミン受容体シグナル伝達を増強した。アストロサイトを無血清ＯＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養し、０．５または６時間、２Ｍの遊離ＡＰＯまたはＡＰＯ−ＥＶ（内因的にまたは外因的にロードされた）で処理した。シグナル伝達活性は、０．５時間の時点で、アストロサイト細胞溶解物中のリン酸化プロテインキナーゼＡ（ｐ−ＰＫＡ）およびリン酸化されたマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ−ＭＡＰＫ）のレベルを測定することによって評価し、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）の下流産生を、６時間の時点でアストロサイト馴化培地で評価した。ｐ−ＰＫＡ、ｐ−ＭＡＰＫおよびＦＧＦ−２のレベルを、ＬＩ−ＣＯＲイメージングシステムを用いた半定量的ウェスタンブロッティングによって評価した。
実施例２：癌治療のためのＥＶへのイマチニブローディング
【００６０】
ＡＢＬ１受容体チロシンキナーゼを内因的に発現するＭＳＣおよびＥＶタンパク質シンテニンおよびＡＢＬ１受容体チロシンキナーゼの融合タンパク質を発現するように遺伝子操作されたＭＳＣをＭＳＣＧＭ増殖培地で培養した。イマチニブ（ＩＭＡ）でＭＳＣ‐ＥＶを内因的にロードするために、ＭＳＣ培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と交換し、２ｍｇのＩＭＡと共にインキュベートした。その後、馴化培地を回収し、接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーによりＩＭＡ−ＥＶを単離した。ＭＳＣ−ＥＶをＩＭＡで外因的にロードするために、上記のようにして未処理ＭＳＣからのＥＶを単離し、その後、２ｍｇのＩＭＡと共に２時間インキュベートし、再度単離してＥＶにロードされなかったＩＭＡ分子を除去した。
【００６１】
ＩＭＡは、ＡＢＬ１への結合およびその後のＢｃｒ−Ａｂｌ受容体チロシンキナーゼコンジュゲートの安定化のために、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用される薬物であり、ＩＭＡにキナーゼの効率的阻害剤を与える。ＥＶへのＩＭＡローディングは、内因的にまたはシンテニンのようなＥＶタンパク質の助けを借りて、ＥＶに分類されたＡＢＬ１との相互作用によって促進される。
【００６２】
マウスにＫＵ８１２細胞異種移植片を接種し、遊離ＩＭＡまたはＩＭＡ−ＥＶでの５０ｍｇ／ｋｇＩＭＡの同等の１日用量でのｉ．ｐ．治療後に腫瘍重量およびマウス生存率を測定した後、ヌードマウスでＩＭＡ−ＥＶの活性を評価した。
実施例３：静脈内ＬＰＳ誘発敗血症を予防するためのイマチニブのＥＶへのローディング
【００６３】
細胞培養、ＥＶロードおよびＥＶ単離を実施例２と同様に行ったが、ＥＶロードＩＭＡの活性を静脈内ＬＰＳ誘発急性敗血症モデルで試験した。ＬＰＳ処理は、敗血症性ショックおよびＡＲＤＳに関与する高レベルの活性酸素種を誘導することが知られている。カタラーゼ活性を増加させるＩＭＡ機能は、ＤＮＡ損傷の低下および前炎症性サイトカインＴＮＦ−アルファおよびＩＬ−６の産生の低下に関連している。
【００６４】
マウスを５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳの眼窩後方注射によりＬＰＳに感作させた。ＩＭＡおよびＥＶ  ＩＭＡ処置は、毎日実施する前日に開始し、２００ｍｇ／ｋｇ／日ＩＭＡに相当し、マウス生存をモニターした。
実施例４：ｍＴＯＲ活性を阻害するためのＥＶへのラパマイシンローディング
【００６５】
ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＦＫＢＰ１２（ＭＳＣ  ＦＫＢＰ１２）を内因的に発現するＭＳＣ、およびＥＶタンパク質ＣＤ６３およびＦＫＢＰ１２（ＭＳＣ−ＣＤ６３ＦＫＢＰ１２）イソメラーゼを含む融合タンパク質を発現するように遺伝子操作されたＭＳＣをＭＳＣＧＭ増殖培地で培養した。ＭＳＣ−ＥＶにラパマイシン（ＦＫＢＰ１２に直接結合する分子）を内在的にロードするために、ＭＳＣ培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と交換し、２０ｎＭのラパマイシンと共に１２時間インキュベートした。その後、馴化培地を回収し、接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーによりラパマイシン−ＥＶを単離した。ラパマイシンでＭＳＣ−ＥＶを外因的にロードするために、未処理のＭＳＣ−ＦＫＢＰ１２およびＭＳＣ−ＣＤ６３ＦＫＢＰ２１細胞からのＥＶを上記のようにして単離し、次に５００ｎＭのラパマイシンと共に２時間インキュベートし、ＥＶにロードされていないラパマイシン分子を除去するために再単離した。ＥＶへのラパマイシンのロードは、ＦＫＢＰ−ラパマイシンコンジュゲートがｍＴＯＲ活性を阻害するレシピエント細胞へのその送達に先立ってその「プレチャージ」をもたらすＥＶ−ロードＦＫＢＰ１２イソメラーゼの相互作用によって促進される。
【００６６】
ＭＣＦ７乳癌細胞において、ラパマイシンで外因的または内因的にロードされたＥＶの活性を試験した。１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養したＭＣＦ７細胞を２４ウェル組織培養プレートに播種した。翌日、ＭＣＦ７細胞をラパマイシンロードＥＶ、裸ラパマイシン、非ロードＥＶまたは未処理ＥＶで処置した。処理の２４時間後、ＭＣＦ７細胞を採取し、Ｋ−ＬＩＳ  ｍＴＯＲ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてｍＴＯＲＣ活性についてアッセイした。
実施例５：脂肪細胞における脂肪分解誘導のためのＥＶへのアドレノメデュリンローディング
【００６７】
ＣＡＬＣＲＬ−ＣＤ８１融合タンパク質を用いてＥＶ対して特異的に標的とされる結合タンパク質または結合タンパク質としてアドレノメデュリン（ＡＭ）ＣＡＬＣＲＬ（ＡＭの受容体）を発現するように遺伝子操作されたＭＳＣを、ＭＳＣＧＭ増殖培地で培養し、ＡＭを分泌型ＥＶに内因的にローディングするように導いた。ＡＭにロードされたＥＶを単離するために、ＭＳＣ培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地と交換し、４８時間インキュベートした。その後、馴化培地を回収し、接線流濾過およびサイズ排除クロマトグラフィーによりＡＭロードＥＶを単離した。ＡＭロードＥＶの脂肪分解活性をマウス３Ｔ３−Ｌ１細胞で試験した。１０％ＦＢＳおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ培地で培養した３Ｔ３−Ｌ１細胞を１２ウェル組織培養プレートに播種し、分化に供し、１２時間血清飢餓状態にし、遊離ＡＭ、ＡＭをロードしたＥＶ、または対照で処理した。グリセロール放出の相対的変化は、製造業者の推奨に従って遊離グリセロール試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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