(57)【要約】経鼻胃管、浣腸および／またはカプセル若しくは錠剤を介して送達するための薬物製品中の生存細菌微生物の定量。ＰＭＡ（プロピジウムモナジド）−ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイのような分子ベースのアプローチは、生菌の定量に有用であり得る。ｑＰＣＲと組み合わせたＰＭＡ処理を利用することにより、サンプル中の生菌細胞の数を決定することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物叢回復療法（ＭＲＴ）薬物物質中の生存細菌微生物を定量するプロセスであって、前記プロセスは、
ＭＲＴ薬物物質からＭＲＴ薬物物質試験サンプルを調製するステップと、
対照サンプルから対照試験サンプルを調製するステップと、
プロピジウムモナジド（ＰＭＡ）で前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルを処理するステップと、
前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルの一部を試験プレートの複数の個々のウェルに等分するステップと、
前記対照試験サンプルの一部を試験プレートの複数の個々のウェルに等分するステップと、
前記試験プレートを１０分の範囲の間、光に暴露するステップと、
前記複数の個々のウェルの各々における前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記複数の個々のウェルの各々における前記対照試験サンプルからＤＮＡサンプルを抽出するステップと、
前記複数の個々のウェルの各々における前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記複数の個々のウェルの各々における前記対照試験サンプルからの前記ＤＮＡサンプルを分子グレードの水で希釈するステップと、
第２の試験プレートの複数のウェルに定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）混合物を加えるステップと、
前記試験プレートの前記複数の個々のウェルの各々における前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記複数の個々のウェルの各々における前記対照試験サンプルからの前記希釈されたＤＮＡサンプルを、前記第２の試験プレートの複数のウェルに加えるステップと、
前記第２の試験プレートを遠心分離するステップと、
前記第２の試験プレートをｑＰＣＲ検出システムに置き、サーモサイクラープロトコルを開始するステップと、
前記第２の試験プレートの複数の個々のウェルにおける各試験サンプルのミリリットル（ｍＬ）当たりの総コロニー形成単位（ＣＦＵ）（ＣＦＵ／ｍＬ）を計算するステップと、
を含むプロセス。
【請求項２】
前記ＭＲＴ薬物物質を調製するステップが、０．９％生理食塩水の約９．９ミリリットルを、１００マイクロリットルのＭＲＴ物質生成物に添加するステップを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記対照サンプルが陽性対照サンプルを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項４】
前記陽性対照サンプルが、ＭＲＴ薬物物質を含む生成物標準品を含む、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
対照サンプルが陰性対照サンプルを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記対照サンプルが２つ以上の対照サンプルを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記２つ以上の対照サンプルが、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルを含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルをＰＭＡで処理するステップが、前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルの５００μＬアリコートに、２０ミリモルのＰＭＡストック溶液の１．２５マイクロリットル（μＬ）を加えるステップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルをプロピジウムモナジド（ＰＭＡ）で処理するステップが、前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルをＰＭＡと機械的に混合するステップをさらに含む、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび対照試験サンプルをプロピジウムモナジド（ＰＭＡ）で処理するステップが、前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルを前記ＰＭＡと混合した後に、暗環境下で前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記対照試験サンプルをインキュベートするステップをさらに含む、請求項８〜９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記試験プレートを１０分の範囲の間光に暴露するステップの間に、複数の個々のウェル中の各ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび各対照試験サンプルが、前記１０分の間に少なくとも１回混合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記複数の個々のウェルの各々における前記ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記複数の個々のウェルの各々における対照試験サンプルからＤＮＡを抽出するステップが、
前記試験プレートを遠心分離するステップと、
前記複数のウェルの各ウェルから上清を除去して複数のウェルの各ウェルの底にペレットを残すステップと、
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて複数のウェルの各ウェルの底にある前記ペレットを再懸濁するステップと、
ＰＢＳ中にて複数のウェルの各ウェルの底にある前記ペレットを再懸濁した後に、前記試験プレートに２回目の遠心分離をするステップと、
前記試験プレートに２回目の遠心分離をした後に、前記複数のウェルの各ウェルから第２の上清を除去して、前記複数のウェルの各ウェルの底にペレットを残すステップと、
複数のウェルの各ウェルから前記第２の上清を除去した後に、前記複数のウェルの各ウェルの底にて第２のペレットを残すステップと、
調製試薬中にて複数のウェルの各ウェルの底にある前記第２のペレットを再懸濁するステップと、
前記複数のウェルの各ウェルの底にある前記第２のペレットを再懸濁した後に、前記試験プレートを冷凍庫で５〜３０分間冷却するステップと、
前記試験プレートを冷却した後に、同試験プレートを熱サイクルさせるステップと、
前記試験プレートを熱サイクルさせた後に、同試験プレートに３回目の遠心分離をするステップと、
前記試験プレートに３回目の遠心分離をした後に、前記複数のウェルの各ウェルから第３の上清を除去して、前記複数のウェルの各ウェルの底に第３のペレットを残すステップであって、前記第３の上清が前記複数の個々のウェルの各々におけるＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび前記複数の個々のウェルの各々における対照試験サンプルからのＤＮＡサンプルを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ｑＰＣＲ混合物が、ＤＮＡポリメラーゼ、複数のヌクレオチド、第１のプライマー、第２のプライマー、および分子グレードの水を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記サーモサイクラープロトコルが、初期変性ステップ、変性ステップ、およびアニーリングステップを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
総ＣＦＵ／ｍＬが、以下の式：
【数１】
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を使用して計算され、
式中、サンプルバックグラウンドはＣＦＵ形質転換前の平均バックグラウンド遺伝子コピー数であり、試験サンプルは標準曲線に基づいて検出システムによって出力される遺伝子コピー値であり、希釈係数は５．０ｘ１０５であり、ＣＦＵ当たりの平均１６ｓ遺伝子コピー数は５である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、患者を治療するための組成物を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様な組成物および方法が、消化管の疾患および／または病状を治療するために開発されている。公知の組成物および方法の各々には、ある利点および欠点がある。消化管の疾患および／または病状を治療するための代替的な組成物および方法を提供する継続的な必要性が存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
微生物叢回復療法（ＭＲＴ）の薬物物質（ｄｒｕｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）中の生存細菌微生物を定量するための例示的なプロセスは、ＭＲＴ薬物物質からＭＲＴ薬物物質試験サンプルを調製することと、対照サンプルから対照試験サンプルを調製することと、を含み得る。ＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび対照試験サンプルをプロピジウムモナジド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｍｏｎａｚｉｄｅ）（ＰＭＡ）で処理し、次に試験プレートの複数の個々のウェルに等分する（ａｌｉｑｕｏｔ）ことができる。試験プレートは、１０分の範囲の間、光に暴露されてもよい。複数の個々のウェルの各々におけるＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび複数の個々のウェルの各々における対照試験サンプルからＤＮＡサンプルが抽出され得る。複数の個々のウェルの各々におけるＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび複数の個々のウェルの各々における対照試験サンプルからのＤＮＡサンプルは、分子グレードの水で希釈され得る。定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）混合物を、第２の試験プレートの複数のウェルに添加し、次いで、試験プレートの複数の個々のウェルの各々におけるＭＲＴ薬物物質試験サンプルおよび複数の個々のウェルの各々における対照試験サンプルからの希釈ＤＮＡサンプルが、第２の試験プレートの複数のウェルに添加され得る。次いで、第２の試験プレートが遠心分離され得る。第２の試験プレートをｑＰＣＲ検出システムに配置し、サーモサイクラープロトコルが開始され得る。次いで、第２の試験プレートの複数の個々のウェルにおける試験サンプルの各々のミリリットル（ｍＬ）当たりの総コロニー形成単位（ＣＦＵ）（ＣＦＵ／ｍＬ）が計算され得る。
【０００４】
いくつかの実施形態において、浣腸管または経鼻胃管（ｇａｓｔｒｏ−ｎａｓａｌ  ｔｕｂｅ）を介した送達のために、ヒト糞便サンプルから微生物叢回復療法（ＭＲＴ）薬物物質が調製され得る。ＭＲＴ薬物物質を調製するための方法は、ヒトドナーから新鮮な糞便サンプルを採取するステップ、新鮮な糞便サンプルにある量の生理食塩水を添加するステップ、新鮮な糞便サンプルにポリエチレングリコールを約３０〜９０ｇ／Ｌ（または約１０〜９０ｇ／Ｌ）の濃度で添加するステップ、新鮮な糞便サンプル、生理食塩水およびポリエチレングリコールを一緒に混合して混合組成物を調製するステップ、および混合組成物を濾過して濾液を回収するステップと、を含み、濾液はＭＲＴ薬物物質を定義する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、微生物叢回復療法（ＭＲＴ）薬物物質は、経口送達のためにヒト糞便サンプルから調製され得る。ＭＲＴ薬物物質を調製する方法は、ヒト糞便サンプルを採取するステップ、ヒト糞便サンプルを精製して精製サンプルを形成するステップ、精製されたサンプルを安定化させて安定化したサンプルを形成するステップ、安定化したサンプルを固体に変換するステップ、１つまたは複数の添加剤および／または賦形剤を固体に添加して治療組成物を形成することを含み、治療組成物はＭＲＴ薬物物質を定義する。
【０００６】
いくつかの実施形態の上記概要は、開示された各実施形態または本開示のすべての実装形態を説明することを意図するものではない。以下の図面および詳細な説明は、これらの実施形態をより具体的に例示する。
【０００７】
本開示は、添付する図面に関連して、同開示の種々の実施形態の以下の詳細な説明を考慮してより完全に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】標準化されたＦＭＴ組成物を製造するための全体プロセスを示すフローチャートである。
【図２】代表的な製造プロセスにおけるさらなるステップを示すフローチャートである。
【図３】代表的な製造プロセスにおけるさらなるステップを示すフローチャートである。
【図４】例示的な分析方法を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は様々な修正および代替形態に従うが、その詳細は図面において例として示されており、詳細に説明される。しかしながら、その意図は、記載された特定の実施形態に本開示を限定するものではないことを理解されたい。むしろ、本開示の精神および範囲内に入るすべての修正、等価物、および代替物を包含することを意図するものである。
【００１０】
以下の定義された用語については、特許請求の範囲または本明細書の他の箇所で異なる定義が与えられていない限り、これらの定義が適用されるものとする。
すべての数値は、明示されているか否かに関わらず、用語「約」によって修飾されているものとする。「約」という用語は、一般に、当業者が列挙された値と同等である（すなわち、同じ機能または結果を有する）と考えられる数の範囲を指す。多くの場合、「約」という用語は、最も近い有効数字に丸められた数字を含むことができる。
【００１１】
終点による数値範囲の列挙は、その範囲内の全ての数値を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５を含む）。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、用語「または」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、一般に、その意味に「および／または」を含んで使用される。
【００１２】
本明細書において「実施形態」、「いくつかの実施形態」、「他の実施形態」などという場合には、記載の実施形態は１以上の特定の特徴、構造、および／または特性を含み得ることに留意されたい。しかしながら、このような列挙は、全ての実施形態が特定の特徴、構造、および／または特性を含むことを必ずしも意味しない。加えて、特定の特徴、構造、および／または特性が１つの実施形態に関して記載されている場合には、このような特徴、構造、および／または特性は、背反することが明示されない限り、明示的に記載されているか否かに関わらず、他の実施形態に関しても使用可能であると理解されるべきである。
【００１３】
以下の詳細な説明は図面の参照しながら読むべきであり、図面において、異なる図面の同じ要素には同じ番号が付されている。図面は必ずしも一定の尺度で示されていないが、例示的な実施形態を示し、本開示の範囲を限定することを意図しない。
【００１４】
「哺乳動物」は、本明細書で使用される場合、限定されるものではないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、および他の無尾猿および有尾猿種；農用動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭内哺乳動物、例えば、イヌおよびネコ；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類を含む実験室動物などを含む哺乳綱の任意のメンバーを意味する。この用語は特定の齢または性を表すものではない。よって、雄であれ雌であれ、成体および新生対象、ならびに胎児がこの用語の範囲内含まれるものとする。
【００１５】
用語「冷凍保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用される場合、生体細胞、組織、または器官を、それらの生存力を維持するような非常に低温に冷却し保存する処理を意味する。限定されない例として、冷凍保存は、凍結点より低い温度（例えば、−１９６Ｋ）にて細胞を冷却し保存し、解凍時に細胞の高い生存率を可能とする技術であり得る。
【００１６】
用語「凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」は、本明細書で使用される場合、生体細胞または組織を凍結の影響から保護するために使用される物質を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「微生物叢」は、ヒトマイクロバイオーム、ヒト微生物叢、またはヒト消化管微生物叢を意味し得る。ヒトマイクロバイオーム（またはヒト微生物叢）は、ヒトの皮膚の表面および深層、唾液および口腔粘膜、結膜、および消化管、尿生殖器管または膣管に定着する微生物の集塊である。ヒトマイクロバイオームは、細菌、真菌および古細菌からなる。これらの生物のいくつかは、ヒト宿主に有用な役割を果たしているが、ヒトマイクロバイオームを構成する生物の大部分の機能は知られていない。通常の状況では、これらの微生物はヒト宿主に疾患を引き起こすことはなく、その代わりに健康の維持に関わっている。ゆえに、この生物集団は多くの場合「ノーマルフローラ（ｎｏｒｍａｌ  ｆｌｏｒａ）」と呼ばれる。
【００１７】
ヒト消化管に生息する微生物集団は一般に、「消化管フローラ（ｇｕｔ  ｆｌｏｒａ）」、および／または「消化管微生物叢（ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）」と呼ばれる。ヒト消化管の微生物叢は、消化、ビタミン類の合成を助け、ヒト身体によって産生されない酵素を作り出す広範な微生物を包含する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「微生物叢回復療法」という句は、限定されるものではないが、患者またはドナー由来の生きている消化管フローラを含有するヒト糞便材料、希釈剤、および凍結保護剤を含み得る組成物を意味する。さらなる組成物は、等価な凍結乾燥・再構成糞便または「合成」糞便組成物を含む。ヒト糞便材料は、微生物叢回復療法におけるその使用に先立って病原性微生物の存在に関してスクリーニングされる。ヒト糞便材料は、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、例えば、Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ノロウイルス、アデノウイルス、腸管病原体、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）の種、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉａ）の種およびその他の病原体（例えば、抗酸菌）、腸球菌（例えば、限定されるものではないが、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ：ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ））に対する抗原、ならびに任意の卵または寄生虫、または胞子形成寄生虫、例えば、限定されるものではないが、イソスポラ属（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、クリスロスポラ属（Ｃｌｙｓｌｏｓｐｏｒａ）、およびクリプトスポラ属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒａ）の存在に関してスクリーニングされる。
【００１９】
糞便細菌療法のプロセスは、健康なまたは望ましい腸内細菌叢を再増殖させるために患者の胃腸管に健康なドナーの糞便サンプルまたは１つまたは複数の所望の特徴を有するドナーの糞便サンプルを導入することを含み得る。特定の例では、糞便サンプルを導入する前に、患者の消化管フローラを抗生物質を用いて破壊させてもよく、それにより、健康なまたは望ましい腸内微生物叢が一旦患者に導入されると容易に消化管を占めることができる。
【００２０】
ヒト糞便物質は、任意選択的に、微生物叢回復療法に使用する前に濾過される。
本開示は、微生物叢回復療法（ＭＲＴ）における生存細菌の定量方法に関する。ＭＲＴは、クロストリジウム・ディフィシル感染（ＣＤＩ）の治療に使用することができる。ＣＤＩは一般的な院内感染であり、特に高齢の患者において、重度の罹患率および死亡率に関連することが多い。ＣＤＩ治療は、本明細書に開示されたＭＲＴ組成物の一使用例であるが、これに限定されるものではない。他の疾患および／または病状が考えられる。ＭＲＴ組成物による治療によって望ましく影響され得る病状のいくつかは、心血管および／または末梢血管疾患、アレルギー、肥満、低血糖症、便秘、セリアックスプルー（例えば、セリアック病）、消化管癌（例えば、消化管癌は、胃癌、食道癌、結腸癌、胆嚢癌、肝臓癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肛門癌、および消化管間質腫瘍のうちの少なくとも１である）、ミオクロヌス失調症、仙腸骨炎（ｓａｃｒｏｉｌｉｉｔｉｓ）、脊椎関節症（ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｌｉｙ）、脊椎関節炎（ｓｐｏｎｄｙｌａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、近位型筋強直性ミオパチー；自己免疫疾患、腎炎症候群、自閉症、旅行者下痢、小腸細菌過剰増殖、慢性膵炎、膵機能不全、慢性疲労症候群、良性筋痛性脳脊髄炎、慢性疲労免疫不全症候群、パーキンソン病（ＰＤ：Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ：ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、多発性硬化症（ＭＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、変性性神経疾患、大発作または小発作、スタイナート病、慢性伝染性単核球症、流行性筋痛性脳脊髄炎（ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｍｙａｌｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ：ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）、急性または慢性アレルギー反応、肥満症、食欲不振症、過敏性腸症候群（ＩＢＳ：ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅまたは痙攣性結腸）、クローン病、過敏性腸疾患（ＩＢＤ：ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、大腸炎、潰瘍性大腸炎またはクローン大腸炎、慢性伝染性単核球症、流行性筋痛性脳脊髄炎（ｅｐｉｄｅｍｉｃ  ｍｙａｌｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、急性または慢性じんま疹、狼瘡、関節リウマチ（ＲＡ：ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）または若年性特発性関節炎（ＪＩＡ：ｊｕｖｅｎｉｌｅ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、前糖尿病性症候群、線維筋痛症（ＦＭ：ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、急性または慢性不眠症、片頭痛、肝性脳症、および注意欠陥／多動障害（ＡＤＨＤ：ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ／ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）が含まれる。
【００２１】
ヒトの場合、本開示は、異常な腸内微生物叢の存在に関連する慢性障害の治療方法を包含する。このような障害としては、限定されるものではないが、以下のカテゴリーの病状が含まれる：消化管障害（過敏性腸症候群または痙攣性結腸を含む）、機能性腸疾患（ＦＢＤ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）（便秘型ＦＢＤ、疼痛型ＦＢＤ、上腹部ＦＢＤを含む）、非潰瘍性消化不良（ＮＵＤ：ｎｏｎｕｌｃｅｒ  ｄｙｓｐｅｐｓｉａ）、胃食道逆流、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、鑑別不能大腸炎、膠原線維性大腸炎、顕微鏡的大腸炎）、慢性クロストリジウム・ディフィシル感染症、偽膜性大腸炎、粘液性大腸炎、抗生物質関連大腸炎、特発性または単純性便秘、憩室症、ＡＩＤＳ腸症、小腸細菌過剰増殖、セリアック病、大腸ポリポーシス、結腸ポリープ、慢性特発性偽性閉塞症候群；細菌、ウイルス、真菌および原虫を含む特定の病原体による慢性消化管感染；ウイルス消化管障害（ウイルス性胃腸炎、ノーウォークウイルス性胃腸炎、ロタウイルス胃腸炎、ＡＩＤＳ関連胃腸炎を含む）；肝臓障害（例えば、原発性胆汁性肝硬変、肝性脳症、原発性硬化性胆管炎、脂肪肝または原虫性肝硬変）；リウマチ性障害（例えば、関節リウマチ）、非リウマチ性関節炎、非リウマチ性因子陽性関節炎、強直性脊椎炎、ライム病、およびライター症候群；免疫介在障害（例えば、糸球体腎炎、溶血性尿毒症症候群、若年性真性糖尿病、混合型寒冷グロブリン血症、多発性動脈炎、家族性地中海熱、アミロイドーシス、硬皮症、全身性紅斑性狼瘡、およびベーチェット症候群）；自己免疫障害（全身性狼瘡、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、溶血性尿毒症症候群または硬皮症を含む）：神経症候群（例えば、慢性疲労症候群、片頭痛、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、重症筋無力症、ギラン−バレー症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害，および他の変性障害）；精神疾患（慢性鬱病、統合失調症、精神性障害、躁鬱病を含む）；退行性障害（アスペルガー症候群（Ａｓｂｅｒｇｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レット症候群、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、および注意欠陥障害（ＡＤＤ：ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒを含む）；退行性障害、自閉症；乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ：ｓｕｄｄｅｎ  ｉｎｆａｎｔ  ｄｅａｔｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、神経性無食欲症；皮膚病態（例えば、慢性じんま疹、座瘡、疱疹性皮膚炎および血管炎障害）；ならびに心血管および／または血管障害および疾患。
【００２２】
全般的に、薬物耐性生物の有病率の増加は、臨床医にとって、公衆衛生上のリスクをもたらすかもしれない多くの課題を生み出してきた。薬物耐性生物（例えば、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ））による感染およびクロストリジウム・ディフィシル感染は、同様の危険因子を有する。ＶＲＥは、院内の病原体であり、移植および免疫不全患者の合併症となり得る。ＶＲＥキャリアはまた、ＶＲＥに起因する感染の危険性が増大している可能性があり、また他の人へのＶＲＥ伝播の潜在的な原因でもあり得る。便中のＶＲＥの放出は、抗菌剤の曝露によって増加し、抗菌剤が中止された後の腸内の微生物叢の正常化とともに減少する。したがって、腸内微生物叢の正常化は、クロストリジウム・ディフィシル感染（慢性感染症を含む）の治療に有用であるのみならず、薬物耐性生物（例えば、ＶＲＥおよび／または開示されたものを含む他の薬剤耐性生物）による感染を治療する上でも有用である。
【００２３】
いくつかの例では、本明細書に開示される微生物叢回復療法組成物（および／または糞便細菌治療組成物）は、薬物耐性生物および／または多剤耐性生物（ＭＤＲＯ）による感染患者を治療するために使用され得る。薬剤耐性生物は、抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗寄生虫剤、他の薬剤、それらの組み合わせなど）に耐性であり、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、などのような薬剤耐性微生物を含み得る。本明細書中に開示される微生物叢回復療法組成物によって治療され得る感染症は、消化管に沿って、または患者の他の系に沿って存在し得る。
【００２４】
微生物叢回復療法組成物は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、拡張スペクトルβ−ラクタマーゼ産生グラム陰性菌、クレブシエラ肺炎桿菌カルバペネマーゼ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ）産生グラム陰性菌、多剤耐性グラム陰性桿菌（例えば、エンテロバクター種、大腸菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）および緑膿菌など）、薬剤耐性エンテロバクター種、多剤耐性結核菌（例えば、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、薬剤耐性ブドウ球菌、薬剤耐性腸球菌、薬剤耐性淋菌、薬剤耐性連鎖球菌（肺炎連鎖球菌を含む）、薬剤耐性サルモネラ菌、薬剤耐性グラム陰性菌、薬剤耐性カンジダ、薬剤耐性ＨＩＶ、薬剤耐性インフルエンザウイルス、薬剤耐性サイトメガロウイルス、薬剤耐性単純ヘルペスウイルス、薬剤耐性マラリア、薬剤耐性三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、薬剤耐性熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、薬剤耐性トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）など、および／または他の薬剤耐性生物が挙げられる。これらは単なる例である。
【００２５】
本明細書中に開示される微生物叢回復療法組成物を用いる、薬物耐性生物による感染の治療は、薬物耐性生物による感染の既往歴のない患者を治療すること、これまでに１回薬物耐性生物による感染を受けた患者を治療すること、これまでに２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上）薬物耐性生物による感染を受けた患者を治療すること、などを含む。いくつかの例において、微生物叢回復療法組成物は、これまでに３回薬剤耐性生物による感染を受けた患者を治療するために使用され得る。他の例では、先の感染により入院した場合、先の感染または現在の感染が毒性薬物による治療を必要とする場合、または先の感染が全て同一の生物であった場合、微生物叢回復療法組成物は、これまでに２回薬剤耐性生物による感染を受けた患者を治療するために使用され得る。
【００２６】
場合によっては、ＭＲＴ組成物は、浣腸または他の適切な技術を用いて患者に投与されてもよい。しかしながら、ＭＲＴ組成物を経口投与することが望ましい場合がある。経口投与に適した形態のＭＲＴ組成物を調製するために、多くのステップが実施され得る。一般に、これらのステップは、糞便サンプルを採取すること、糞便サンプルを処理すること、処理された糞便サンプルを凍結乾燥または「フリーズドライ」すること、１つ以上の添加剤および／または賦形剤を添加すること、および凍結乾燥された材料および添加剤から経口投与形態のＭＲＴ組成物（例えば、錠剤、カプセル剤、液剤など）を形成すること、を含み得る。
【００２７】
ＭＲＴ組成物が患者への投与のために調製されると、薬物製品中の生存している細菌性微生物を定量することが望ましい場合がある。例えば、ＭＲＴ組成物中の活性成分は、懸濁液および／または凍結乾燥製品中に存在する生存細菌微生物であると考えられる。品質仕様に基づいて製品をリリースするには、その製品の「効力」を決定する必要がある（「効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、２１  ＣＦＲ  ６００．３において、「適切な実験室試験によって、或いは所与の結果を達成するように意図された様式にて、製品の投与によって得られた適切に制御された臨床データによって、示されるものとして、製品の特定の能力（ａｂｉｌｉｔｙ）および生産量（ｃａｐａｃｉｔｙ）として定義される」。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用して生存細菌微生物を定量化することが考えられ、これについては以下でより詳細に検討する。
【００２８】
図１は、例示的なＭＲＴ製造プロセスの一部を示すフローチャートである。これは単なる例である。ドナーをスクリーニングし、ヒト糞便サンプルを得て、そして糞便サンプルをＭＲＴ生成物に処理する他の例は、同一出願人による米国特許出願公開第２０１４／０３６３３９８号明細書に開示されており、同明細書は参照により本明細書にて援用される。より詳細には、図１は、ドナー糞便サンプルを採取し、かつ検査するためのプロセスを概略的に示す。採取／検査プロセスにおける最初のステップとして、糞便の潜在的なドナーがスクリーニングされる。ドナーがスクリーニングに合格すると、ステップ２は、自宅で行うか採取施設で行うかにかかわらず、本明細書で定義されるヒト糞便採取キットを用いてドナーの糞便を採取することを含み得る。このキットは、限定されるものではないが、蓋付きの清浄なヒト糞便採取容器、閉鎖可能／封止可能な大型バック、提供フォームおよびヒト糞便採取説明シートを含み得る。採取から処理までの時間および輸送条件を追跡するために、採取日時を、ドナー識別情報および輸送方法とともに記録することができる。非限定的な例として、採取容器は、サンプルが曝される最低温度および最高温度のインジケータを含み得る。別の非限定的な例として、約４℃より低温およびおよその室温（約２２〜２９℃）より高い温度で色が変わる１以上の温度感受性ステッカーを容器に貼付することができる。
【００２９】
ステップ３は、サンプルを処理施設に輸送することを含み得る。サンプルが処理設備で採取される場合、サンプルを輸送する必要がないことが理解されよう。場合によっては、サンプルの処理流通過程の管理（ｃｈａｉｎ  ｏｆ  ｃｕｓｔｏｄｙ）をより明確に確立するために処理施設でサンプルを採取することが望ましいことがある。任意の個人について、最初の糞便の提供（ｄｏｎａｔｉｏｎ）を受けて、各ドナーのプロファイルが作成される。その後、糞便サンプルをヒト糞便検査に供することができ、これを用いてドナーの識別情報と提供物（ｄｏｎａｔｉｏｎ）の照合および確認を行う。事前に採取したサンプルに基づいて、ドナーのヒトの糞便プロファイルを作成し、提供が繰り返される間、これを維持または拡張することができる。いずれの新しいサンプルもこのプロファイルと比較して、それは同じドナーであることを確認する。ヒト糞便中のバクテリオイデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）の種の呈示に基づきドナー識別情報を確認するために差分（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を作製することもできる。非限定的な例では、プロファイルを作成するために使用される基本セットの糞便サンプルは、プロファイルサンプルにおけるドナー識別情報を保証するために処理施設において採取される。別の非限定的な例では、プロファイルを作成するために使用される基本セットの糞便サンプルは、状況または場所に適切なドナー識別情報保証プロトコルを用い、処理施設以外の場所で採取することができる。
【００３０】
この方法の第４のステップは、提供物に「隔離（Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ）」のラベルを付けること、および処理前に長くても２４時間から５日間の範囲を越えないで、提供物を隔離状態で、室温以下で保持すること、を含み得る。温度インジケータが活性化されていた場合、または提供と受容の間の時間が２４時間を超える場合には、提供は拒絶されることがある。さらに、該当する場合には、ヒト糞便検査結果をドナープロファイルと照合しなければならない。ヒト糞便検査がドナープロファイルと一致しなければ、その日に採取された提供物は廃棄され、そのドナーを失格とする。
【００３１】
本開示の１つの方法において、ヒト糞便サンプルは、採取の約２４時間以内に処理される。本出願の別の方法では、採取時間は、糞便サンプルが処理施設に到着した時点で記録される。ステップ６は、糞便提供物を検査することを含み得る。目視検査は、糞便サンプルが処理施設に到着した際に完了させることができる。ヒト糞便サンプルがゆるく、形を成さないか、十分な重量がないか（例えば、約５０ｇ未満）、または限定されるものではないが、サンプル品質が低いことを示す証拠もしくはドナーの健康に関する懸念を含む、他の何らかの理由がある場合には、そのサンプルを拒絶してよく、「検品−拒絶（Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ−Ｒｅｊｅｃｔｅｄ）」のラベルを付け、その提供物を廃棄する。さらに、ヒト糞便採取フォームに記載されている質問に対する回答は、訓練を受けた者により審査することができる。採取フォームにおける特定の回答は、十分な拒絶を要することがある。サンプルが受け入れられれば、それに「検品−受入れ（Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ−Ａｃｃｅｐｔｅｄ）」のラベルを付けてよく、製造プロセスに送ることができる。
【００３２】
図２は、ＭＲＴのための糞便サンプルを経口投与量として調製する一般的な例示的な方法の一部を示すフローチャートである。経口投与剤としてのＭＲＴの糞便サンプルを調製するための方法内の中間生成物は、浣腸管または経鼻胃管を介してＭＲＴに適していると考えられる。糞便サンプルは、例えば、図１に関して記載された方法で最初に採取され、スクリーニングされ得る（１００）。サンプルが受け入れられたら、同サンプルは精製され、濃縮され得る（１０２）。サンプルは、遠心分離、膜濾過、またはそれらの組み合わせを使用して精製して、特定の粒子径を超える糞便物質を除去することができる。関心のある大部分の細菌は０．３ミクロン（μｍ）〜３０μｍの範囲にあるので、サンプルを処理して５０〜７０μｍより大きい粒子を除去することが考えられる。サンプルを処理して７５％〜９０％の細菌濃度を得ることができる。これは、さらなる処理のための製剤賦形剤対細菌の比率における柔軟性の増大を可能にし得る。
【００３３】
サンプルは、限定されるものではないが、フィルタバッグ、圧力フィルタおよび／または真空フィルタの使用を含む多くの異なる方法で膜濾過されてもよい。いくつかの例では、サンプルは、より小さなフィルタ膜を使用して複数回濾過され、その後にそれぞれが濾過され得る。いくつかの例では、生理食塩水が希釈剤として１：３（糞便対生理食塩水）の比率で添加されてもよいが、これは必須ではない。他の例では、生理食塩水と凍結保護剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）３３５０）との混合物を希釈剤として使用することができる。希釈剤のＰＥＧ濃度は、約３０〜９０ｇ／リットル（または約１０〜９０ｇ／リットル）とすることができる。希釈剤のＰＥＧ濃度は、およそ約２５〜７５ｇ／リットルの間であってもよい。一例では、生理食塩水／ＰＥＧ混合物と糞便サンプルとの比率は、２：１、すなわち１グラムのヒト糞便に対して２ｍＬの生理食塩水／ＰＥＧ混合物である。非限定的な例として、５０ｇのヒト糞便に対しておよそ１００ｍＬの生理食塩水／ＰＥＧ混合物を使用することができる。生理食塩水／ＰＥＧは希釈剤（および／または凍結保護剤）として使用するために適切であり得るが、これに限定されるものではない。他の凍結保護剤を利用することもできる。例えば、デキストロース、ベタイン、グリシン、スクロース、ポリビニルアルコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７、マンニトール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、ヒドロキシプロピルセルロース、グリセロール、ＰＥＧ／グリセロール混合物、プロピレングリコール、またはそれらの組合せが凍結保護剤として使用可能である。これらの物質は、単独で使用してもよいし、または生理食塩水などの溶媒と組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
１つの例では、サンプルを希釈剤の有無にかかわらず５００μｍのフィルタバッグに入れ、例えばストマッカー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）撹拌を用いて２３０ｒｐｍで約２分間撹拌して、およそ５００μｍ以下の粒子径を有する濾液を得ることができる。次いで、この濾液を、５００μｍより小さい細孔サイズ、例えば２８０μｍの細孔サイズを有するフィルタバッグに入れることができる。サンプルは、例えば、約４分間、希釈剤の有無にかかわらず２３０ｒｐｍにてストマッカー攪拌を用いて再び撹拌して、約２８０μｍ以下の粒子径を有する濾液を得ることができる。この濾液は、限定はしないが例えば６０μｍのような、例えば２８０μｍより小さい孔径を有する別の濾過バッグに入れることができる。サンプルは、希釈剤の有無にかかわらず、例えばストマッカー攪拌を用いて２３０ｒｐｍにて約４分間再度撹拌して、約５０〜７０μｍ以下の粒子径を有する濾液を生成することができる。
【００３５】
別の例では、サンプルは、希釈剤の有無にかかわらず、５００μｍフィルタバッグに入れ、例えばストマッカー撹拌を用いて撹拌して、約５００μｍ以下の粒子径を有する濾液を得ることができる。次いで、この濾液を、約１６０μｍの孔径を有する圧力フィルタを用いて処理し、得られた濾液を、約６０μｍの孔径を有する圧力フィルタを用いて処理することができる。場合によっては、圧力フィルタを使用する前に、１６０μｍ〜５００μｍの孔径を有するバッグフィルタを使用して、サンプルが２回処理される必要がある場合がある。
【００３６】
別の例では、サンプルを希釈剤の有無にかかわらず５００μｍフィルタバッグに入れ、例えばストマッカー撹拌を用いて撹拌して、約５００μｍ以下の粒子径を有する濾液を得ることができる。次いで、この濾液を、約１６０μｍの孔径を有する真空フィルタを用いて処理し、得られた濾液を、約６０μｍの孔径を有する真空フィルタを用いて処理することができる。いくつかの例では、真空フィルタを使用する前に、１６０μｍ〜５００μｍの孔径を有するバッグフィルタを使用してサンプルが２回処理される必要がある場合がある。
【００３７】
サンプルが約６０μｍ以下の粒子径を有するように処理されたら、同サンプルを次に洗浄し、遠心分離機を用いてさらに濃縮することができる。ある場合には、遠心分離管は、５０〜５００ｍＬまたはそれ以上の範囲の容量を有し得る。濾過された懸濁液は、遠心分離管の体積の約２０〜８０％まで充填される。一例では、サンプルを１１００〜３６００回転／分（ｒｐｍ）で１０〜１５分間のサイクルで遠心分離することができる。別の例では、サンプルを、遠心力が１５〜４５分の間、または２０〜３０分の間、約８〜１２，０００ｇ（例えば、約１０，０００ｇ）の範囲にあるような速度で遠心分離してもよい。遠心分離機は、約８〜１２，０００ｇ（例えば、約１０，０００ｇ）の範囲の遠心力を作り出すのに必要な速度まで、上昇させるか、または徐々に加速させてもよい。遠心分離機は、遠心分離プロセスが完了したときにゆっくりと減速または減速させることも考えられる。場合によっては、大気圧への戻りが潜在的な破裂から細菌細胞を保護するためにゆっくりとなるように、可能な限りゆっくりと遠心機を減速させることが望ましい場合がある。上清を除去し、管中の残りの物質が精製中間体ＭＲＴ組成物である。これにより、約６０％濃縮された製品が得られる可能性がある。いくつかの例では、遠心分離プロセスは２段階プロセス（２−ｔｉｅｒｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ）であってもよい。例えば、生成物はまず糞便繊維質物質を除去するための「プレスピン（ｐｒｅ−ｓｐｉｎ）」（例えば、３００ｇで２〜５分間）を受け、次いで生成物を濃縮するためにより長い遠心分離を受けてもよい。更に、濃度の量の低下を生ずることなく、３００ｍＬまでの容量を遠心分離することが考えられる。得られるＭＲＴ組成物は、７０μｍ以下の粒子径および約１×１０１０ＣＦＵ／ｇのオーダーの細菌濃度を有する細菌懸濁液である。得られたＭＲＴ組成物はまた、冷蔵条件下で３週間安定であり得る。このようにして得られたＭＲＴ組成物は、浣腸管または経鼻胃管を介して患者に送達するのに適している。液体ＭＲＴ組成物を経口送達に適した固体に変換するために、さらなる処理が必要とされ得る。
【００３８】
いくつかの実施形態において、遠心分離のみを精製および濃縮のために複数回使用することができる。しかしながら、細菌懸濁液の粒子径は、依然としてピペットチップを詰まらせる範囲（例えば、６０μｍより大きい）にある可能性がある。しかしながら、場合によっては、広いピペットチップを使用することができる。これが成功するかどうかは、変数である入力糞便物質に依存する。さらに、バッチサイズが数十リットル以上の範囲であれば、セパレータおよびデカンタのシステムを使用することもできると考えられる。しかしながら、これは、出発製品が以前に処理された場合には必要ではない。
【００３９】
いくつかの実施形態において、冷蔵条件下で、処理されたサンプルを懸濁液１０４中で１〜２週間の範囲内で安定させることが望ましい場合がある。いくつかの例では、糞便物質の除去および水溶液に可溶な担体または賦形剤による置換は、細菌を液体中に懸濁させ、安定性の懸念なしにさらに処理することを可能にする。これらの賦形剤溶液についての考慮事項は、ｐＨ、濃度、および等張性または等分散性（ｉｓｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）であり得る。賦形剤は、タンパク質製剤およびモノクローナル抗体製剤、および生物製剤の安定化において提案された役割に基づいて選択することができる。サンプルの液体安定化１０４を提供するために使用され得るいくつかの例示的な賦形剤には、限定されるものではないが、塩（ＮａＣｌ）、スクロース、トレハロース、Ｌ−アルギニン一塩酸塩、および／またはＰＥＧ３３５０が含まれ得る。
【００４０】
膜濾過中に細菌を保護するために類似の賦形剤を使用することもできると考えられる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８４年８月第４４１〜４４３頁において、ファーバー（Ｆａｒｂｅｒ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐｅ）は、特定の食物残渣（ニンジン、チーズ、モモ、マグロ）の存在下で細菌の回収率が改善され、ｐＨが重要である（ニンジンはｐＨ５．８８〜６．４０、チーズはｐＨ４．７５〜５．０２、マグロはｐＨ５．９〜６．２、桃はｐＨ３．３〜４．０５）ことを述べている。砂糖、炭水化物、またはタンパク質の存在は重要であり、細菌をコートし、細菌増殖（前生物活性）を促進し、濾過中に細菌細胞壁を支持するこれらの食品の特性は重要であり得る。
【００４１】
標準化された製品の生産時から患者への投与時までに、標準化された製品は生存可能に（ｖｉａｂｌｅ）維持されなければならない。これには、生存力を維持するために凍結保存技術および凍結保護剤を使用することが含まれ得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＭＲＴ製品のための有効な凍結保護剤として使用することができる。保存時間、解凍技術、輸送技術および解凍製品の取り扱いも、生存力に影響を及ぼす因子であり、本明細書に定義される。一実施形態において、凍結保護剤ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、処理の際にヒト糞便サンプルおよび等張性生理食塩水と混合することができる。ＰＥＧは、約０．１ｇ／ｍｌ〜約７０ｇ／ｍｌ、または約２ｇ／ｍｌ〜約６８ｇ／ｍｌ、または約４ｇ／ｍｌ〜約６５ｇ／ｍｌ、または約５ｇ／ｍｌ〜約６０ｇ／ｍｌの濃度で加えることができる。使用されるＰＥＧは平均分子量が約６００〜約２００００であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは平均分子量が約２０００〜約４０００、例えば、ＰＥＧ３３５０の製剤で提供されるように約３３５０である。デキストロース、ベタイン、グリシン、スクロース、ポリビニルアルコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７、マンニトール、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、ヒドロキシプロピルセルロース、グリセロール、ＰＥＧなど他の凍結保護剤を使用してもよい。
【００４２】
適切な担体は、組成物の所望の形態および投与様式によって変化し得る。例えば、それらは、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、流動促進剤、潤滑剤などのような希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。典型的には、担体は、固体（粉末を含む）、液体、またはそれらの組み合わせであり得る。各担体は好ましくは、組成物中の他の成分と適合し、かつ、対象に害がないという点で「許容」されるものである。担体は、生物学的に許容され、かつ、不活性であり得る（例えば、担体は、適当な部位に送達されるまで組成物がその生物材料の生存力を維持することを可能とする）。
【００４３】
経口組成物は、不活性希釈剤または可食担体を含み得る。経口の治療的投与の目的では、活性化合物を賦形剤と配合し、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）の形態で使用することができる。経口組成物はまた、本開示の組成物と食品を合わせることによって調製することもできる。一実施形態では、投与に使用される食品は冷却される（例えば、アイスクリーム）。薬学上適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を本組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の類似の性質の成分、または化合物のいずれかを含み得る：微晶質セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローテ（ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジフレーバー、または他の適切な香味剤などの香味剤。これらは単なる例示のためのものであり、限定することを意図するものではない。
【００４４】
この時点で、経鼻胃管または浣腸を介して送達するのに適した水性懸濁液（例えば、上記のＭＲＴ組成物）中でサンプルを精製および安定化したならば、サンプルは、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形態のような経口送達に適したものとするためにさらに処理されてもよい。例えば、水溶液を固体１０６に変換することができる。細菌処理技術のリストは、Ｍａｒｔｉｎ他のＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第２７巻、１５〜２５頁（２０１５年）に見出すことができる。
【００４５】
場合によっては、凍結乾燥またはフリーズドライを使用して、サンプルを液体から固体に変換することができる。サンプルは、凍結の影響から細菌を保護するために、限定されるものではないが、例えば、ＰＥＧ、スキムミルク、木炭、アスコルビン酸またはそれらの組み合わせなどの凍結防止剤が提供されてもよい。サンプルは、限定されるものではないが、スクロース、イノシトール、トレハロース、グリセロール、またはそれらの組み合わせなどの凍結保護剤が提供されてもよい。いくつかの例では、サンプルは、酸緩衝化を提供し得る富化材料（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌ）が提供されてもよい。代替的にまたは追加的に、富化材料は細菌をより活性に保つことができ、分析試験を容易にし得る。いくつかの例示的な富化材料には、限定されるものではないが、スキムミルク、木炭、ゼラチン、アスコルビン酸、ＧＩ培地、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。代替的にまたは追加的に、凍結乾燥の前および／または後に脱酸素剤をサンプルに添加してもよい。理論に縛られることを望むものではないが、脱酸素剤がサンプルの安定性および／または生存力を改善し得ると考えられる。凍結乾燥チューブは、凍結乾燥後に凍結乾燥チューブから凍結乾燥ペレットを排出するために使用され得るインサートを含み得ることが考えられる。凍結乾燥チューブの幅は、経口治療のためのカプセルシェルの幅より小さくてもよい。これにより、ペレットのトレーがカプセルシェル内に直接移動することが可能になる。これは、製剤への粒子サイジングの必要性を低減または排除するか、カプセル内への流動特性の改善のために、製剤をさらに混合することが考えられる（１０８）。用量はまた、ペレットサイズによって決定され得る。いくつかの例では、凍結乾燥プロセスで生成されたペレットは、約４．５×１０８個のコロニー形成単位（ＣＦＵ）（ＣＤＣ）を含み得る。サイズ０のカプセルは、３つのペレットを収容することができる。従って、カプセルは、約６．７×１０９ＣＦＵ（ＣＤＣ）を含み得る。１日２回服用する８カプセルは、１回の浣腸投与量と同等である必要がある。さらに、カプセル充填前に混合されたペレットのバッチの均質性を試験する必要はない。いくつかの例では、タンパリング（ｔａｍｐｅｒｉｎｇ）により、各カプセル内のより大きな濃度または数のペレットが可能になることがある。例えば、カプセル内のペレットのタンパリングは、各カプセル内のペレットの数の約２〜４倍（例えば、約２．５倍）を可能にし得る（例えば、タンパリングがない場合、各カプセルは２〜４個または約３個のペレットを収容する一方、タンパリングがある場合、各カプセルは、約７〜１０個または約８個のペレットを収容し得る）。これは、所望の用量を達成するために患者が摂取する必要のあるカプセルの数を減らすのに役立ち得る。
【００４６】
例示的な凍結乾燥手順（例えば固体から液体への変換）１０６を図３に関して以下に説明する。ＭＲＴ組成物または精製中間体は、凍結乾燥賦形剤溶液と１：１の比率で混合され得る。凍結乾燥賦形剤溶液は、２．３％のＰＥＧ３３５０、１％のグリセリン、１０％のトレハロース、および１０％のスクロースを含み得る。しかしながら、他の凍結乾燥賦形剤が使用されてもよい。賦形剤溶液を精製中間体に添加する前に、凍結乾燥賦形剤溶液（グリセリンを含まない）を０．２μｍフィルタを通して濾過する。グリセリンを１２１℃で１５分間オートクレーブ処理し、無菌的に添加する。凍結乾燥賦形剤および精製中間体が混合されたら（凍結乾燥懸濁液）、凍結乾燥懸濁液の単一の２００マイクロリットル（２００μＬ）アリコートを９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、凍結乾燥する。
【００４７】
凍結乾燥を実施するために、一旦充填すると、ステップ２０２に示すように、９６ウェルプレートを無菌バイオシールドで覆ってもよい。他のプレートサイズも考えられる。全てのプレートが覆われた後、それらは、ステップ２０４に示すように、直ちに輸送され、凍結乾燥機に装填され得る。凍結乾燥機を密封し、凍結乾燥サイクルを開始してもよい。製品は、ステップ２０６に示すように、製品棚温度を約−４０℃〜−４５℃の範囲に下げることによって凍結される。製品が凍結した後、ステップ２０８に示すように、真空を適用し、棚温度を０℃まで上昇させることにより、一次乾燥（昇華）が起こる。ステップ２１０に示すように、二次乾燥ステップを開始して水分含量をさらに低減し、生成物を周囲温度（約２５℃）にする。ステップ２１２に示すように、二次乾燥ステップの終わりに真空を解放し、生成物を凍結乾燥機から取り出す。凍結乾燥されたアリコートを採取するために、嫌気性チャンバー内に製品を配置し得る。ステップ２１４に示すように、凍結乾燥されたアリコートは、ペレット形態であってもよく、乾燥剤を含むパッケージに移される。充填されたパッケージは、ステップ２１６に示すように、窒素ガスでパージされ、ヒートシールされてもよい。
【００４８】
場合によっては、凍結乾燥ペレットが３０℃を超えるガラス転移温度（Ｔｇ）を有することが望ましい場合がある。これにより、室温で安定した最終生成物が得られる。ガラス転移温度はまた、凍結乾燥プロセスから受け取った製品をスクリーニングするため、および／または最終製品の安定性を確認するためのツールとして使用することもできる。
【００４９】
他の例では、気化フォーム乾燥（ｖａｐｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏａｍ  ｄｒｙｉｎｇ）によってサンプルを保存することが望ましい場合がある。従来の賦形剤および装置をこのプロセスで使用することができると考えられる。処理中に泡を生成するために、より高い賦形剤濃度および最適なプロセスパラメータは、水分含量の低い処方物をもたらし得る。含水率が低いほど、室温での安定性の確率が高くなる。再び図２を参照すると、一旦サンプルが乾燥されると（１０６）、サンプルは、経口生成物処理のためのサンプルを調製するために、所望の粒子径および／または混合を達成する（１０８）ためにさらに処理され得る。
【００５０】
さらに他の実施形態において、胆汁、アルギン酸塩および／またはポリマーから保護するために液体サンプルを脂質によって任意にマイクロカプセル化することができる。一旦サンプルがマイクロカプセル化されると、サンプルは、経口生成物処理のためのサンプルを調製するために、所望の粒子径および／または混合を達成する（１０８）ためにさらに処理され得る。経口生成物の処理のためのサンプルを調製するために、サンプルが所望の粒子径に処理され、および／または混合された（１０８）後に、以下でより詳細に説明するように、サンプルをカプセル化することができる（１１０）。カプセル化プロセスは、低ｐＨ保護を提供し得る（１１２）ことが考えられる。例えば、カプセル化プロセスは、ＭＲＴ組成物が腸管の所望の部分に放出されるように、胃の酸性環境においてカプセル殻、錠剤および／またはトローチが破壊されるのを防止するまたは実質的に防止することができる。腸溶性コーティングカプセルは、胃内の保護を提供し、小腸および大腸にてカプセルの崩壊をもたらすために必要とされ得ることが考えられる。いくつかの例では、カプセルは、腸溶性コーティングでパンコーティング（ｐａｎ  ｃｏａｔｅｄ）されてもよい。腸溶性コーティング材料は、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチックおよび植物繊維を含み得る。ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（またはヒプロメロースカプセルとも呼ばれる）のパンコーティングは、低ｐＨで保護し、水分から保護する助けとなる。いくつかの適切なカプセルは、Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標）から入手可能なＤＲｃａｐｓ（商標）およびＶｃａｐｓ（商標）を含み得る。同様に、６０％ＨＰＭＣおよび４０％ＨＰＭＣＰ（ヒプロメロースフタレート）の組成を有するＡＲｃａｐｓは、同じ特性を有し得る。ゼラチンではないタイプのカプセルは、より少ない水（ゼラチンカプセルは通常は１０〜１２％の水であるのに対し、他のポリマーカプセルは３〜４％以下の水を含有する）を含むことができる。低ｐＨ環境では不溶性のポリマーを用いるカプセルのバンディング（ｂａｎｄｉｎｇ）が必要となることがあり、これについては後で詳しく説明する。他の例では、２つ以上のカプセルを用いてサンプルを包むようにカプセルを積み重ねることができる。例えば、サンプルをカプセルに入れ、次いでそのカプセルを別のより大きなカプセルに入れることができる。
【００５１】
凍結乾燥された中間体を受け取ると、それをパッケージから取り出してカプセルに充填することができる。凍結乾燥した中間体をサンプリングし、全生存数をＰＭＡ−ｑＰＣＲ法によって測定することもできる。凍結乾燥された中間体の酸素への暴露を最小にするために、周囲温度で窒素パージされた領域でカプセル化を行ってもよい。凍結乾燥中間体は、ヒプロメロースカプセル内に封入される。複数の凍結乾燥中間体は、カプセルサイズ（例えば、サイズ１、０、または００）に応じてヒプロメロースカプセルに充填されてもよい。
【００５２】
次いで、カプセルをバンディングすることができる。いくつかの例では、カプセルはヒプロメロースでバンディングされてもよい。他の例では、バンディング材料は、メタクリル酸およびメタクリル酸メチルをベースとするアニオン性コポリマー（例えば、限定されるものではないが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００）であってもよい。さらに他の例では、バンディング材料は、ヒプロメロースフタレートまたはヒプロメロースアセテートスクシネートであってもよい。これらは単なる例である。バンディング材料は、低ｐＨ環境（例えば、胃）に耐性であり、高ｐＨ環境（例えば、腸管）において分解する任意の材料であり得る。崩壊性能が許容限度を満たすように、各カプセルに一定のバンディングの厚さを適用する。カプセルは、窒素パージされたバルクプラスチック容器中、または乾燥剤と共に包装された冷蔵条件にて、５±３℃で貯蔵される。カプセル化され、バンディングされた薬物製品は、乾燥剤と共に包装され、ヒートシールされてもよい。いくつかの例では、カプセル化され、バンディングされた薬物製品は、金属化ポリエステル／ポリエチレン結合フィルム中に個々の投与量で包装されてもよい。これは、製品の分解を引き起こす可能性のある酸素および／または水分への薬物製品の暴露を最小にすることができる。金属化ポリエステル／ポリエチレン結合フィルムは、２４時間で０．０２ｇ／１００ｉｎ２（６４５．２ｃｍ２）の水蒸気透過率および０．０４０２／ｍＬ／１００ｉｎ２（６４５．２ｃｍ２）の酸素透過率を有し得る。接着フィルムパケットは、小児安全（ｃｈｉｌｄ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）臨床供給パッケージングの必要性を満たすために小児安全容器で患者に提供することができる。小児安全容器は、小児安全キャップを備えた４０ドラム（ｄｒａｍ）（２．５オンス）の緑色の薬局用バイアルであってもよい。バイアルは、半透明で遮光性のポリプロピレン製であってもよい。低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）の小児安全キャップは、使用者が容器を開けるためにキャップを押し下げて回転させることを必要とすることによって、不正アクセスを防止するのに役立つ。
【００５３】
上記のように、経鼻胃管、浣腸および／またはカプセル若しくは錠剤を介して送達するための薬物製品中の生存細菌微生物を定量することが望ましい場合がある。ＰＭＡ（プロピジウムモナジド）−ｑＰＣＲ（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイのような分子ベースのアプローチは、生菌（ｖｉａｂｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の定量に有用であり得る。生存細胞と死細胞の両方からのＤＮＡが増幅されるので、定量的ＰＣＲ単独ではサンプル中の生菌の数を決定するには十分ではない可能性がある。ｑＰＣＲと組み合わせてＰＭＡ処理を利用することにより、サンプル中の生菌細胞の数を決定することができる。簡潔に述べると、ＰＭＡ−ｑＰＣＲアッセイは２つの部分からなるプロセスである。まず、サンプルをプロピジウムモノアジド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｍｏｎｏａｚｉｄｅ）（ＰＭＡ）と称される光反応性ＤＮＡ結合色素で処理する。光活性化の際、ＰＭＡはＤＮＡの塩基の間にインターカレートし、ＰＣＲ増幅されないようにする。ＰＭＡの化学構造のために、それは細菌細胞膜に浸透することができない。したがって、死細胞（破裂した細胞膜）からのＤＮＡはＰＭＡによって結合されて、ＰＣＲ増幅されることが不可能になる一方で、生存細胞（損傷を受けていない細胞膜）中のＤＮＡはＰＭＡから保護される（Ｆｉｔｔｉｐａｌｄｉ  Ｍ．、Ｎｏｃｋｅｒ  Ａ．、Ｃｏｄｏｎｙ  Ｆ．、２０１２、ＤＮＡ増幅と組み合わせて生存性色素を用いた生存細胞の優先検出の理解の進歩（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，第９１（２）巻、２７６−８９頁）。この方法の第２の部分は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を利用する。定量的ＰＣＲは、検出された遺伝子コピー数に基づいてサンプル中の生体の数を決定することを可能にする培養非依存性アッセイである。プライマーは、特定の遺伝子の特定の領域を増幅するように設計または選択することができる。
【００５４】
微生物叢回復療法製品を分析するために、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するためにプライマーを選択および／または設計することが考えられる。この領域は、高度に保存された配列が隣接した超可変領域であり、ＰＭＡ−ｑＰＣＲの適切な配列長であるために選択された。場合によっては、プライマーは、以下の表１に示すように、カスタムデザインされたＪＥ３４１Ｆ（フォワードセンスプライマー）および／またはＶ３−Ｒ１（標準的な逆アンチセンスプライマー）を使用することができる。これらは単なる例である。
【００５５】
【表１】
2019520804.tif 000003
【００５６】
１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅するために、他のプライマーを選択および／または設計することができる。他の領域および／または遺伝子を所望通りに増幅するために、他のプライマーが選択および／または設計され得ることがさらに考えられる。これらのプライマー（ＪＥ３４１Ｆおよび／またはＶ３−Ｒ１）は、すべての原核生物（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｔｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＲＤＰ））の９５．５５％の被覆率を有し得る。これは、すべての原核生物の９５．５５％から１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３領域を増幅することができることを意味する。したがって、サンプル中の細菌の「総数」または１００％は、処理されるすべてのサンプルにおいて検出されないことがある。
【００５７】
図４は、ＰＭＡ（登録商標）−ｑＰＣＲを用いてＭＲＴ薬物物質中の生存微生物の数を決定するための例示的な方法３００を示すフローチャートである。この方法は、浣腸管を介してまたは浣腸若しくは経鼻胃管を介して送達するために調製されたＭＲＴ薬物物質について同じであってもよいと考えられる。ＭＲＴ薬物物質を得て調製され得る（３０２）。いくつかの例では、ＭＲＴ薬物物質の最小の２００マイクロリットル（μＬ）が分析を実行するために必要とされ得る。ＭＲＴ薬物物質は、分析を行う前に−８０（−１０／＋２０）℃で保存できると考えられる。しかしながら、すべてのサンプルで冷凍が必要であるとは限らない。試験用にＭＲＴ薬物物質を調製するために、ＭＲＴ薬物物質は１００倍に希釈されてもよい。例えば、９．９ミリリットル（ｍＬ）の生理食塩水（０．９％）が、１００μＬのＭＲＴ薬物物質に添加されてもよい。陽性対照と同じ方法で混合されてもよい希釈したＭＲＴ薬物物質を遠心分離管に入れることができる。いくつかの例では、約５００μＬの希釈されたＭＲＴ薬物物質（以下、「試験サンプル」と称する）を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に入れることができる。追加の量が入手可能であるＭＲＴ薬物物質を用いて、１回または複数回の試験が実施されてもよい。単一または複数のＭＲＴ薬物物質は、プロセスごとに独特の別個のマイクロ遠心管で調製されてもよい。
【００５８】
対照サンプルも調製され得る（３０４）。陽性対照および陰性対照の両方を比較目的のために使用することができると考えられる。陽性対照は、品質試験のために維持されたＭＲＴ薬物物質を含み得る生成物標準品（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）（ＰＲＳ）から構成されてもよい。場合によっては、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルは−８０（−１０／＋２０）℃で保存されてもよい。対照サンプルは、冷凍庫から取り出し、室温で約１５〜３０分間解凍させてもよいが、１５分未満または３０分超の他の時間期間が考えられる。陽性対照サンプルは、生理食塩水（０．９％）で５倍に希釈されてもよい。陰性対照は生理食塩水で希釈されなくてもよいが、生理食塩水では５倍以下または以上の希釈係数が使用されてもよい。例えば、１００μＬの陽性対照に４００μＬの生理食塩水が添加されてもよい。いくつかの実施形態において、生理食塩水を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に入れて、同マイクロ遠心管に陽性対照が加えられてもよい。これは単なる例である。陽性対照を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に入れて、その後、同マイクロ遠心管に生理食塩水が添加され得ることが考えられる。マイクロ遠心管は、生理食塩水と陽性対照を短時間で混合するために（手または機械のいずれかで）旋回されるか、またはボルテックスされてもよい（ｖｏｒｔｅｘｅｄ）。
【００５９】
試験サンプルおよび対照サンプルが混合されると、３０６に示すように、試験サンプルおよび対照サンプルがＰＭＡで処理され得る。２０ミリモル（ｍＭ）のＰＭＡストック溶液の１．２５μＬを、試験サンプル、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプルの５００μＬアリコートに添加することができる。ＰＭＡ色素の２０ｍＭストック溶液を調製するために、１ミリグラム（ｍｇ）のＰＭＡ色素を９８μＬの滅菌溶液に溶解してもよい。ＰＭＡストック溶液は−２０℃で約６ヶ月間保存されてもよい。ＰＭＡストック溶液をＵＶ耐性容器に貯蔵するか、そうでなければ光からＰＭＡストック溶液を保護することが望ましい場合がある。ＰＭＡストック溶液は、使用前に短時間遠心分離してバイアルの底に溶液が集められてもよいが、とはいえ、これは要求されるものではない。
【００６０】
マイクロ遠心管の各々を５回反転させて、ＰＭＡストック溶液とサンプルとを混合してもよい。これは単なる例である。マイクロ遠心分離管は、所望とされる任意の回数にて反転させてもよく、または他の方法（例えば、限定されるものではないが、旋回すること）にて混合されてもよい。混合手順の間、ＰＭＡ染料への光の暴露を最小にすることが望ましいことがある。試験サンプルおよび対照サンプルは、おおよそ６分±１分間、暗所でインキュベートされてもよい。試験サンプルおよび対照サンプルはそれぞれ、インキュベーション期間のおよそ２分にて、およびインキュベート期間のおよそ４分にて、２回反転させてもよい。
【００６１】
インキュベーション期間が終了した後、サンプルのトレーサビリティを維持するために一意的に標識されていてもよい蓋付きＶ底９６ウェルプレート内で、各試験サンプルおよび対照サンプルから１００μＬを３つの個々のウェルにサンプルあたり合計３００μＬ加えられてもよい。個々の独特な（ｕｎｉｑｕｅ）ウェルあたり、９６ウェルプレートごとに複数のサンプルが含まれ得る。異なる形状のプレートおよび／または異なるサイズの（例えば、９６ウェルよりも小さいかまたはそれよりも大きい）プレートを使用することもできると考えられる。次いで、蓋をプレートから取り外し、プレートを発光ダイオード（ＬＥＤ）の光の下に合計で１０分±１分間の間、配置され得る。場合によっては、ＬＥＤライトは１７２０ルーメンのＬＥＤワークライトであってもよい。しかしながら、他のＬＥＤライトを使用してもよい。プレートの頂部は、光源の表面からおよそ２．５センチメートル（ｃｍ）±０．５ｃｍに配置され得る。およそ５分±０．５分の露光の後に、プレートを光源の下から取り外すことができる。サンプルを、マルチチャンネルピペットで５回上下にピペット操作することによって混合してもよい。サンプルは、他の方法を使用して、または任意の回数（例えば、５回より少ないかまたは５回より多い）上下にピペット操作することによって混合できることが考えられる。バブリングを低減または排除するために、ピペットの容積を約７０μＬに設定することが望ましい場合がある。プレートを光の下に戻し、さらに５分±０．５分の間、露光させてもよい。
【００６２】
試験サンプルおよび対照サンプルがＬＥＤ光に曝露された後、３０８で示されるように、ＤＮＡ抽出が開始され得る。試験サンプルおよび対照サンプルは、９６ウェルプレート中２，１００ｇで約５分±１分の間、遠心分離されてもよい。所望の加速を達成するのに必要とされるＲＰＭは、遠心分離機の半径に依存し得る。遠心分離後、遠心管の底にあるペレットを乱さないように、上清がマルチチャンネルピペットで注意深く取り除かれてもよい。次いで、ペレットのそれぞれを１００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液に再懸濁させてもよい。ペレットの各々は、ＰＢＳ緩衝液と混合されてもよく、マルチチャンネルピペットで５回上下にピペット操作することによって混合されてもよい。サンプルは、他の方法を使用して、または任意の回数（例えば、５回より少ないかまたは５回より多い）ピペット操作することによって混合できることが考えられる。再懸濁した試験サンプルおよび対照サンプルを２，１００ｇで約５分±１分の間、遠心分離されてもよい。遠心分離後、遠心管の底にあるペレットを乱さないように、上清がマルチチャンネルピペットで注意深く取り除かれてもよい。次いで、各ペレットは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能な５０μＬのＰｒｅｐＭａｎ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ中で再懸濁されてもよい。各ペレットは、ＰｒｅｐＭａｎ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔとともに混合されてもよく、マルチチャンネルピペットで１２回上下にピペット操作することによって混合されてもよい。サンプルは、他の方法を用いて、または任意の回数（例えば、１２回より少ないかまたは１２回より多い）上下にピペット操作することによって混合できることが考えられる。次いで、（ＰｒｅｐＭａｎ（商標）Ｕｌｔｒａ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔとともに混合された）試験サンプルおよび対照サンプルを、Ｖ底９６ウェルプレートから二次９６ウェル高プロファイルセミスカートＰＣＲプレートに移されてもよい。
【００６３】
試験サンプルおよび対照サンプルを含むプレートは、−８０℃の冷凍庫に約５〜３０分間置くことができる。プレートを取り出してサーマルサイクラー（サーモサイクラー、ＰＣＲマシン、またはＤＮＡ増幅器としても周知である）に入れることができる。サーマルサイクラーは、サンプルを９５℃で３分±０．５分の間加熱し、その後、３０秒±１０秒の間、４℃に冷却するプログラムまたはプロトコルを実行するようにプログラムされていてもよい。熱サイクルの後、サンプルをＶ底９６ウェルプレートに移し、２，１００ｇで約５分±１分の間、遠心分離されてもよい。遠心分離後、プレートの底にあるペレットを乱さないように、約３０μＬの上清がマルチチャンネルピペットで注意深く取り除かれてもよい。その後、３０μＬの上清は清浄な９６ウェルプレートに配置されてもよい。これらの３０μＬアリコートは、分析されるＤＮＡサンプル（試験サンプルおよび対照サンプルの両方）である。この時点で、上清を約−２０℃の冷凍庫に保存できることが考えられる。次いで、ＤＮＡサンプルは超純水中で５０倍に希釈され得る。ＤＮＡサンプルが以前に凍結されている場合は、希釈する前に解凍されるべきである。一実施形態において、１９６μＬの分子グレードの水を滅菌９６ウェルプレートの各ウェルに入れることができる。Ｖ底ＰＣＲプレートまたは同様のものを用いてサンプルを含有させることができる。３０μＬのＤＮＡサンプルのそれぞれからの４μＬを１９６μＬの分子グレードの水に各ウェル中の合計２００μＬで添加されてもよい。
【００６４】
希釈後、３１０に示すように、ＤＮＡサンプルがｑＰＣＲ反応のために調製され得る。トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中で１：１０希釈または等価で再水和されたＧブロック脱水ＤＮＡのようなｑＰＣＲ標準が調製され、標準曲線を提供するために、ＭＲＴ試験サンプル（例えば未知のもの（ｕｎｋｎｏｗｎｓ））とともに実行され得る。標準曲線は、未知のサンプルの各々について、遺伝子コピー数を決定することを可能にする。標準希釈液は、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８および１０−９であり得ることが考えられる。
【００６５】
ｑＰＣＲ反応混合物は、テンプレート（例えば、標準希釈液、陽性対照、陰性対照、またはＭＲＴ試験サンプル）に加えて、ＰＣＲプレートの個々のウェル／チューブに提供されてもよい。個々のウェルの各々には１つのテンプレートのみが配置されていることに留意すべきである。ｑＰＣＲ反応混合物は、以下の表２に列挙される試薬および容量（チューブあたり）を含み得る。
【００６６】
【表２】
2019520804.tif 000004
【００６７】
ｑＰＣＲマスターミックスを調製するために、ｑＰＣＲの実行に必要なｑＰＣＲウェルの数に、表２に記載されている各容量を掛けて、それらの容量を１．５ｍＬのマイクロ遠心管に加える。場合によっては、起こりうる移動損失を許容するために、各試薬の必要以上のもの（ｅｘｔｒａ）（例えば約５％の必要以上のもの）を加えることが望ましい場合がある。例えば、５０ウェルを使用する場合、５００μＬのＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｔｏｌｅｒａｎｔ  ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘが必要である（例えば、５０ウェル×１０μＬ／ウェル）。起こりうる移動損失を許容するために、合計５２５μＬとするために、２５μＬ（例えば約５％）が添加されてもよい。必要に応じて、起こりうる移動損失を許容するために必要な容量に５％未満または５％以上が加えられてもよいと考えられる。表２に示される試薬は、遠心分離管に以下の順序：分子グレードのＨ２０、プライマー１、プライマー２、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｔｏｌｅｒａｎｔ  ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘで加えられ、混合するために短時間ボルテックスされてもよい。遠心分離管は、必要に応じて手動または機械で混合されてもよいと考えられる。
【００６８】
ｑＰＣＲマスターミックスの１５μＬが、ｑＰＣＲ手順に使用される９６ウェルｑＰＣＲプレートの各ウェルに添加され得る。試験すべきＭＲＴ試験サンプル、対照サンプルおよび／または標準希釈液の数に応じて、任意の数のウェルを使用することができると考えられる。例えば、９６個のウェル全てまたは９６個未満のウェルが使用されてもよい。ｑＰＣＲマスターミックスは、試験サンプル、対照サンプル、および／または標準希釈液を含むであろう多数のウェルにのみ添加されるべきである。いくつかの例では、少なくとも３つのウェルがテンプレート対照のない（ｎｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＴＣ））サンプルを含み得る。これらのサンプルはコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含まないかもしれない。５μＬの分子グレードの水がＮＴＣとして指定されたサンプルウェルに添加され得る。分子グレードの水を添加した後、汚染を防止または最小化するためにＮＴＣサンプルウェルを覆ってもよい。５μＬの標準希釈系列、陽性対照、陰性対照、および／または試験サンプルが指定されたウェルに添加され得る。いくつかの例では、試験サンプル（未知のもの）、陽性対照、陰性対照、ＮＴＣおよび標準をｑＰＣＲプレートのどこに置くべきかを示すために、テンプレートが提供されてもよい。テンプレートをｑＰＣＲマスターミックスに添加した後、プレートはシールされ得る。場合によっては、シールはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（商標）、「Ｂ」シールであってもよい。とはいえ、これは必要とされるものではない。次いでｑＰＣＲプレートを約２１００ＲＰＭで約１分間遠心分離して、ｑＰＣＲ反応混合物の各々が確実にチューブの底にあるようにする。ＲＰＭは、使用する遠心分離機のサイズに応じて変更されてもよい。
【００６９】
遠心分離後、ｑＰＣＲプレートがｑＰＣＲ検出システムに配置され得る。場合によっては、検出システムはＢＩＯ−ＲＡＤ  ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（登録商標）Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍであってもよいが、他のリアルタイム検出システムが使用されてもよい。ｑＰＣＲ検出システムは、以下の表３に概略を示す以下のサーモサイクルプロトコルを実行するようにプログラムされ得る。
【００７０】
【表３】
2019520804.tif 000005
【００７１】
ステップ２および３が、合計４０回の変性／アニーリングサイクルの間に３９回繰り返され得る。アニーリングステップの間、曝露された細菌ＤＮＡに対するＰＭＡ色素の接着の蛍光または発現強度が記録され得る。一旦ｑＰＣＲが完了すると、３１２に示すように、各ＭＲＴ試験サンプルの総ＣＦＵ／ｍＬが次の式を用いて決定され得る。
【００７２】
【数１】
2019520804.tif 000006
【００７３】
ここで、大腸菌または生成物標準品のような生存／死亡生物の既知の比を用いて確立され得るサンプルバックグラウンドは、ＣＦＵ形質転換前の平均バックグラウンド遺伝子コピー数であり、試験サンプルは、標準曲線に基づいて検出システムによって出力される遺伝子コピー値であり、希釈係数は５．０ｘ１０５であり、ＣＦＵ当たりの平均１６ｓ遺伝子コピー数は５である。サンプルＣＦＵ／ｍＬは、コンピュータプログラムによって、またはオペレータによって手動で、計算され得る。各提供物および／またはＭＲＴ製品から複数の試験サンプルが採取され得ると考えられる。これらのサンプルのそれぞれについてのＣＦＵ／ｍＬを平均して、提供物および／またはＭＲＴ製品の平均ＣＦＵ／ｍＬを決定することができる。
【００７４】
正確な結果を確実にするために、３１４で示されるように、特定のシステム適合性受入れ基準を検証することが望ましい場合がある。例えば、以下の基準が満たされる必要があるか、結果が無効になる可能性がある。
【００７５】
・平均陽性対照生（ｒａｗ）遺伝子コピー数対平均陰性対照生遺伝子コピー数の比は、＞１５００：１でなければならない。
・平均陰性対照定量化サイクル（Ｃｑ）は、平均ＮＴＣ  Ｃｑ値の±５Ｃｑ以内でなければならない。
【００７６】
・陽性対照ＣＦＵ／ｍＬは、寒天培地で平板培養することによって決定される既知のＣＦＵ／ｍＬ濃度の＋／−１  ｌｏｇでなければならない。
・ｑＰＣＲ標準曲線はｒ２＞０．９７でなければならない。
【００７７】
・ｑＰＣＲ標準曲線は、１００±１５％の範囲内のＥ値を有していなければならない。
・平均ＮＴＣ  Ｃｑ値は＞３１．００でなければならない。ＮＴＣの平均Ｃｑは、未知のものの定量化をサポートするために、平均の未知のもののＣｑ値から＞２Ｃｑ値でなければならない。
【００７８】
場合によっては、ｑＰＣＲを繰り返し行ってもよいが、他の場合には、方法３００全体を繰り返す必要があり得る。
この開示は、多くの点で例示的なものに過ぎないことを理解されたい。特に、開示の範囲を逸脱することなく、形状、サイズ、およびステップの配置の事項について詳細に変更することができる。本発明の範囲は、無論、添付の特許請求の範囲に表現される言語で定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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