(57)【要約】本発明は、多重特異性抗体を精製する方法を提供する。方法は、捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、及び第２の混合モードクロマトグラフィーを行う逐次的なステップを含む。いくつかの態様では、本発明は、多重特異性抗体の組成物を提供し、その組成物は、１つ以上の生成物特異的不純物及び／またはプロセス特異的不純物の低減されたレベル有する。【選択図】図１
2019521986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがＶＨ／ＶＬ単位を含み、前記方法が、逐次的な、
ａ）前記組成物を捕獲クロマトグラフィーにかけて、捕獲クロマトグラフィー溶出物を生成するステップと、
ｂ）前記捕獲クロマトグラフィー溶出物を第１の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第１の混合モード溶出物を生成するステップと、
ｃ）前記第１の混合モード溶出物を第２の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第２の混合モード溶出物を生成するステップと、
ｄ）前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
【請求項２】
前記捕獲クロマトグラフィー溶出物が、前記第１の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはＨＩＣクロマトグラフィーにかけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがＶＨ／ＶＬ単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが別々に生成され、前記方法が、逐次的な、
ａ）前記多重特異性抗体の各アームを捕獲クロマトグラフィーにかけて、前記多重特異性抗体の各アームに対する捕獲溶出物を生成するステップと、
ｂ）前記多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームの捕獲溶出物を含む混合物を形成するステップと、
ｃ）前記多重特異性抗体を含む前記組成物を第１の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第１の混合モード溶出物を生成するステップと、
ｄ）前記第１の混合モード溶出物を第２の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第２の混合モード溶出物を生成することと、
ｅ）前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
【請求項４】
前記多重特異性抗体を含む前記組成物が、前記第１の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはＨＩＣクロマトグラフィーにかけられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記捕獲クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＬクロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ及びプロテインＧクロマトグラフィーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＡクロマトグラフィーである、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記捕獲クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の混合モードクロマトグラフィー及び前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、連続的である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜１０及び１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
溶出が勾配溶出である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記溶出が勾配溶出である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の混合モード溶出物を限外瀘過するステップをさらに含む請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記限外濾過が、逐次的に、第１の限外濾過、透析濾過、及び第２の限外濾過を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記プロテインＡクロマトグラフィーが、アガロースに連結されたプロテインＡを含む、請求項７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プロテインＡクロマトグラフィーが、
ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ及びＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  ＬＸ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、プロテインＡセファロースファストフロー、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌプロテインＡクロマトグラフィーである、請求項７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記プロテインＡクロマトグラフィーが、プロテインＡ平衡化緩衝液、プロテインＡ装填緩衝液、またはプロテインＡ洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び／または洗浄緩衝液が、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、請求項７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロテインＡ平衡化緩衝液が、約ｐＨ７．７である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロテインＡ平衡化緩衝液が、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロテインＡクロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記多重特異性抗体が、ｐＨ段階溶出によって前記プロテインＡクロマトグラフィーから溶出される、請求項７〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記多重特異性抗体が、低いｐＨを有するプロテインＡ溶出緩衝液を前記プロテインＡクロマトグラフィーに適用することによって前記プロテインＡから溶出される、請求項７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロテインＡ溶出緩衝液が、約１５０ｍＭの酢酸、約ｐＨ２．９を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロテインＡ溶出物がプールされ、前記溶出物のＯＤ２８０が約０．５を超える、請求項７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、第四級アミン及び疎水性部分を含む、請求項１０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、高架橋アガロースに連結された第四級アミン及び疎水性部分を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記混合モードクロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記カチオン交換混合モードクロマトグラフィーが、Ｎ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミンを含む、請求項１１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記混合モードクロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、前記混合モード装填緩衝液、及び／または前記混合モード洗浄緩衝液は、約ｐＨ６〜約ｐＨ７である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液が、約ｐＨ５〜約ｐＨ８である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液が、約ｐＨ６．５である、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記混合モード事前平衡化緩衝液が、約５００ｍＭの酢酸塩を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記混合モード平衡化緩衝液が、約５０ｍＭの酢酸塩を含む、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記多重特異性抗体が、ｐＨ勾配によって前記第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項１５及び１８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記多重特異性抗体が、低いｐＨを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モードイオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項１５及び請求項１８〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記多重特異性抗体が、ｐＨ勾配によって前記第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項１５及び１８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記多重特異性抗体が、低いｐＨを有する混合モード溶出緩衝液を混合モード交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、請求項１５及び請求項１８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、第四級アミンを含む、請求項２及び４〜４７のいずれか一項に記載される方法。
【請求項４９】
前記イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーであり、前記アニオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに連結された第四級アミンを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記混合モードアニオン交換クロマトグラフィーが、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記アニオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、またはアニオン交換装填緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び／またはアニオン交換装填緩衝液が、約ｐＨ６〜約ｐＨ８である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び／または前記アニオン交換装填物が、約ｐＨ６．５である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アニオン交換事前平衡化緩衝液が、約５０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、請求項５１または請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アニオン交換平衡化緩衝液が、約５０ｍＭのトリスを含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記アニオン交換クロマトグラフィーが、装填後にアニオン交換平衡化緩衝液で洗浄される、請求項５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記多重特異性抗体が、塩勾配によって前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有するアニオン交換溶出緩衝液を前記アニオン交換クロマトグラフィーに適用させることによって、前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、請求項５１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記アニオン交換溶出緩衝液が、約５０ｍＭのトリス、１００ｍＭの酢酸ナトリウムを約ｐＨ８．５で含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記アニオン交換溶出物がプールされ、前記溶出物の前記ＯＤ２８０が約０．５〜約２．０を超える、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記多重特異性抗体の前記アームが、細胞中で産生される、請求項１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、原核生物細胞である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記原核生物細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞が、１つ以上のシャペロンを発現するように操作される、請求項６１または請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記シャペロンが、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、またはＤｓｂＣのうちの１つ以上である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記シャペロンが、Ｅ．ｃｏｌｉシャペロンである、請求項６３または請求項６４
に記載の方法。
【請求項６６】
前記細胞が、真核細胞である、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記真核細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項６６または請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が、捕獲クロマトグラフィーの前に、溶解され、前記多重特異性抗体または前記多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解液を生成する、請求項６０〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が、クロマトグラフィーの前に前記細胞溶解液に添加される、請求項６９または請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記方法が、前記組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、浸出されたプロテインＡ、核酸、細胞培養培地構成成分、またはウイルス性不純物のうちのいずれか１つの量を低減する、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記二重特異性抗体が、ノブインホール（ＫｉＨ）二重特異性抗体である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である、請求項７３または請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記画分が、少なくとも約９５％の多重特異性抗体を含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記生成物特異的不純物が、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種（ＨＭＷＳ）、低分子量種（ＬＭＷＳ）、酸性バリアント、または塩基性バリアントのうちの１つ以上である、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記画分が、約５％以下の非対抗体のアームを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記画分が、約５％以下の抗体ホモ二量体を含む、請求項７７または請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記画分が、約２％以下の凝集体または高分子量種（ＨＭＷＳ）を含む、請求項７７〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記画分が、約２％以下のＬＭＷＳを含む、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記画分が、約５０％以下の酸性バリアントを含む、請求項７７〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記画分が、約３５％以下の塩基性バリアントを含む、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記画分が、約５％以下の３／４抗体を含む、請求項７７〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記画分が、
ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、
ｂ）約１％〜約５％以下の非対抗体のアーム、
ｃ）約１％〜約５％以下の抗体ホモ二量体、
ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、
ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び
ｆ）約５％以下の３／４抗体を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８６】
請求項１〜８５のいずれか一項に記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
【請求項８７】
がんまたは眼疾患の治療のための、請求項１〜８５のいずれか一項に記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
【請求項８８】
マルチステップクロマトグラフィー方法でＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップを含み、２つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップが後に続き、
それによって、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する、前記方法。
【請求項８９】
前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、
ｉ．親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、
または
ｉｉ．親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、請求項８８〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、正確に３つのクロマトグラフィーのステップを含む、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、フロースルーモードで行われる、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導値を有する溶液中に適用される、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約６ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導値を有する溶液中に適用される、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、約７のｐＨで行われる、請求項８９〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導性及び約７のｐＨを有する溶液中に適用される、請求項８９〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、クロマトグラフィー材料の、１リットル当たり約１００ｇ〜約３００ｇの範囲で適用される、請求項８９〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である、請求項８９〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び０．０８〜０．１１ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍＬの培地のイオン容量を有する、請求項８９〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィーの培地である、請求項８９〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び２５〜３９μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する、請求項８９〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、結合及び溶出モードで行われる、請求項８９〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、またはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Ｆｖリガンド親和性クロマトグラフィー、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦｃＸＬクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、請求項８８〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記親和性クロマトグラフィーのステップが、プロテインＡクロマトグラフィーのステップである、請求項８８〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記親和性クロマトグラフィーのステップが、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、請求項８８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、抗体、二重特異性抗体、またはＦｃ−融合タンパク質である、請求項８８〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、二重特異性抗体である、請求項８８〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、ＣｒｏｓｓＭａｂである、請求項９０〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、
ａ）第１の抗原を特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、第２の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、二重特異性抗体である、請求項９０〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記二重特異性抗体が、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ＣｒｏｓｓＭａｂが、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記二重特異性抗体が、ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂである、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含む、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、ならびに配列番号１１のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記二重特異性抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、ならびに配列番号１５のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約５％以下の３／４抗体を含む、請求項１０８〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
マルチステップクロマトグラフィー方法でＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、
それによって、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体を精製し、
二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含むか、
または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む、前記方法。
【請求項１２０】
ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体が、
ａ）前記第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、前記第２の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも約９５％、二重特異性抗体を含む、前記組成物。
【請求項１２２】
前記組成物が、約５％以下の非対抗体のアームを含む、請求項１２１に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記組成物が、約５％以下の抗体ホモ二量体を含む、請求項１２１または１２２に記載の組成物。
【請求項１２４】
ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも９５％のＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を含む、前記組成物。
【請求項１２５】
前記組成物が、約２％以下の凝集体または高分子量種（ＨＭＷＳ）を含む、請求項１２１〜１２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２６】
前記組成物が、約２％以下の低分子量種（ＬＭＷＳ）を含む、請求項１２１〜１２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２７】
前記組成物が、約５０％以下の酸性バリアントを含む、請求項１２１〜１２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２８】
前記組成物が、約３５％以下の塩基性バリアントを含む、請求項１２１〜１２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２９】
前記組成物が、約５％以下の３／４抗体を含む、請求項１２１〜１２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記組成物が、
ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、
ｂ）約１％〜約５％以下の非対抗体のアーム、
ｃ）約１％〜約５％以下の抗体ホモ二量体、
ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、
ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び
ｆ）約５％以下の３／４抗体を含む、請求項１２１または請求項１２２に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記二重特異性抗体が、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する、請求項１２１〜１３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３２】
ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体が、
ａ）前記第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、前記第２の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項１３３】
ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下の３／４抗体を含む、前記組成物。
【請求項１３４】
ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体が、
ａ）前記第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、前記第２の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、請求項１３３に記載の組成物。
【請求項１３５】
前記組成物が、請求項１１９に記載の方法を使用して得られる、請求項１３３または１３４に記載の組成物。
【請求項１３６】
Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のための、請求項８８〜１１８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１３７】
Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、請求項８８〜１１８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１３８】
がんまたは眼疾患の前記治療のための医薬品の製造のための、請求項８８〜１１８のいずれか一項に記載の方法で得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または請求項１１９〜１２０のいずれか一項に記載の方法を使用して得られるＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体。
【請求項１３９】
がんまたは眼疾患の前記治療における使用のための、請求項８８〜１１８のいずれか一項に記載の方法から得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または請求項１１９〜１２０のいずれか一項に記載の方法を使用して得られるＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体。
【請求項１４０】
Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法であって、
ｉ．Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ｉｉ．前記Ｆｃ−含有ヘテロ二量体タンパク質を細胞または培養培地から回収するステップと、
ｉｉｉ．請求項８８〜１１８のいずれか一項に記載の方法で前記Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するステップと、を含み、
それによって、前記Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する、前記方法。
【請求項１４１】
請求項１１９〜１２０のいずれか一項に記載の方法を使用して得られるＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を産生する方法であって、
ｉ．前記二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ｉｉ．前記二重特異性抗体を前記細胞または前記培養培地から回収するステップと、
ｉｉｉ．請求項１１９〜１２０のいずれか一項に記載の方法で前記二重特異性抗体を精製するステップと、を含み、
それによって、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体を産生する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月１７日出願の米国仮特許出願第６２／３５１，９０８号の優先権利益を主張するものであり、この仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３６３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１７年６月９日、サイズ：３２ＫＢ）。
【０００３】
多重特異性抗体、及び少なくとも１つの生成物−特異的不純物を含む少なくとも１つの不純物を含む組成物からの多重特異性抗体を精製するための方法が提供される。いくつかの実施形態では，生成物−特異的不純物は、例えば、多重特異性抗体の前駆体、凝集体、及び／またはバリアントである。方法に従って精製される多重特異性抗体、及びそのような多重特異性抗体を含む組成物及び製剤もまた提供される。
【背景技術】
【０００４】
ヒト患者への投与に許容される組換え生物薬剤学的タンパク質の場合、製造及び精製プロセスによって生じる残留不純物が最終生物学的産物から除去されることが重要である。これらのプロセス構成成分としては、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が挙げられる。多重特異性抗体などの新しい抗体の形式の開発は、従来の製造及び精製プロセスが、非対抗体のアーム及びミスアセンブリングされた抗体を含む生成物−特異的不純物を十分に除去するために不十分であるため、新しい課題を呈する。
【０００５】
標準の抗体の精製と比較した場合、生成培地からの多重特異性抗体の精製は、独特の課題を呈する。標準の単一−特異性二価抗体が、同一の重鎖／軽鎖サブユニットの二量体化から生じる一方で、多重特異性抗体の産生は、少なくとも２つの異なる重鎖／軽鎖サブユニットの二量体化を必要とし、各々が異なる重鎖、ならびに異なる軽鎖を含む。最小限の量の誤対合、ミスアセンブリングされた、または不完全な分子を有する、最終的及び完全な多重特異性抗体の生成及び精製は、異なる課題を呈する。鎖誤対合（例えば、同一の重鎖ペプチドまたは不適当な重鎖／軽鎖会合のホモ−二量体化）は、異なる抗体鎖の不平衡の宿主細胞発現に起因する不完全なタンパク質アセンブリであるため、しばしば観察される。一般に観察される生成物−特異的不純物は、半（１／２）抗体（単一の重鎖／軽鎖対を含む）、４分の３（３／４）抗体（単一軽鎖を欠乏する完全な抗体を含む）、及びホモ二量体を含む。追加の生成物−特異的不純物は、使用される多重特異性の形式に応じて観察され得る。例えば、多重特異性抗体の可変ドメインが、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）として構築されている場合、生成物による５／４抗体（追加の重鎖または軽鎖可変ドメインを含む）が観察され得る。そのような対応する生成物−特異的不純物は、標準の抗体生成においては生じない。
【０００６】
ＨＣＰ、ＤＮＡ、内毒素、ならびに抗体とは非常に異なる特徴及び特性を有する他の物質などのプロセス関連不純物を除去するために設計された従来の精製技術は、多重特異性抗体により類似する不純物を除去するために実行されるときに不十分であり得る。かくして、生成物−特異的不純物を効果的に除去、ならびに十分な量の正しい及び完全な多重特異性抗体を産出する製造及び精製スキームを開発する必要性がある。
【０００７】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に説明及び例示されるように、出願者は、最初の捕獲クロマトグラフィーのステップ後の少なくとも２つの混合モード（本明細書でマルチモーダル（ｍｕｌｔｉ−ｍｏｄａｌ）またはマルチモーダル（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ）とも称される）クロマトグラフィーのステップの使用が、生成物−特異的不純物のより大きな除去をもたらし、多重特異性抗体を精製するためのプロセスを改善したことを発見した。したがって、ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法が提供され、多重特異性抗体は複数のアームを含み、各アームはＶＨ／ＶＬ単位を含み、方法は、逐次的な、ａ）組成物を捕獲クロマトグラフィーにかけて、捕獲クロマトグラフィー溶出物を生成するステップ；ｂ）捕獲クロマトグラフィー溶出物を第１の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第１の混合モード溶出物を生成するステップ；ｃ）第１の混合モード溶出物を第２の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第２の混合モード溶出物を生成するステップ；及びｄ）多重特異性抗体を含む画分を収集するステップを含み、方法は、組成物の生成物−特異的不純物の量を低減する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィー溶出物は、第１の混合モードクロマトグラフィーの前に、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換）または疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられる。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モード溶出物は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換）または疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法が提供され、多重特異性抗体は複数のアームを含み、各アームはＶＨ／ＶＬ単位を含み、多重特異性抗体の各アームは、別々に生成され、方法は、逐次的な、ａ）多重特異性抗体の各アームを捕獲クロマトグラフィーにかけて、多重特異性抗体の各アームに捕獲溶出物を生成するステップ、ｂ）多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で、多重特異性抗体の各アームの捕獲溶出物を含む混合物を形成するステップ、ｃ）多重特異性抗体を含む組成物を第１の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第１の混合モード溶出物を生成するステップ、及びｄ）第１の混合モード溶出物を第２の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第２の混合モード溶出物を生成するステップ；及びｅ）多重特異性抗体を含む画分を収集するステップを含み、方法は、組成物の生成物−特異的不純物の量を低減する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィー溶出物は、第１の混合モードクロマトグラフィーの前に、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換）または疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられる。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モード溶出物は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アニオン交換）または疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられる。
【００１０】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＬクロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ及びプロテインＧクロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーは、結合及び溶出モードで実施される。
【００１１】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィー及び第２の混合モードクロマトグラフィーは、連続的である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、結合及び溶出モードまたはフロースルーモードで実施される。第１の混合モードクロマトグラフィーが結合及び溶出モードで実施される実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、溶出は、勾配溶出である。
【００１３】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、結合及び溶出モードまたはフロースルーモードで実施される。第２の混合モードクロマトグラフィーが結合及び溶出モードで実施される実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、溶出は、勾配溶出である。
【００１４】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、方法は、第２の混合モード溶出物を限外濾過するステップをさらに含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、限外濾過は、逐次的に、第１の限外濾過、透析濾過、及び第２の限外濾過を含む。
【００１５】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、アガロースに連結されたプロテインＡを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーはＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ及びＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  ＬＸ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、プロテインＡセファロースファストフロー、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌプロテインＡクロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、プロテインＡ平衡化緩衝液、プロテインＡ装填緩衝液、またはプロテインＡ洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び／または洗浄緩衝液は、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡ平衡化緩衝液は、約ｐＨ７．７である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡ平衡化緩衝液は、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、低いｐＨを有するプロテインＡ溶出緩衝液をプロテインＡクロマトグラフィーに適用することによって、プロテインＡから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、プロテインＡ溶出緩衝液は、約１５０ｍＭの酢酸、約ｐＨ２．９を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ｐＨ勾配によってプロテインＡクロマトグラフィーから溶出される。
【００１６】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換混合モードクロマトグラフィーは、第四級アミン及び疎水性部分を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換混合モードクロマトグラフィーは、アガロースに連結された第四級アミン及び高架橋疎水性部分を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、カチオン交換混合モードクロマトグラフィーは、Ｎ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミンを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである。
【００１７】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、混合モード洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液は、約ｐＨ６〜約ｐＨ７である。いくつかの実施形態では、アニオン混合モード平衡化緩衝液は、約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８である。
【００１８】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液を使用し、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液は、約ｐＨ５〜約ｐＨ８、任意に約ｐＨ５〜約ｐＨ７、または約ｐＨ５〜約ｐＨ６、または約ｐＨ６〜約ｐＨ７である。
【００１９】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液は、約ｐＨ５．５である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、混合モード事前平衡化緩衝液は、約５００ｍＭの酢酸塩を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、混合モード平衡化緩衝液は、約５０ｍＭの酢酸塩を含む。
【００２０】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、塩勾配及び／もしくはｐＨ勾配またはｐＨ段階溶出によって第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、低いｐＨを有する混合モード溶出緩衝液を混合モード交換クロマトグラフィーに適用させることによって、第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、塩勾配及び／もしくはｐＨ勾配またはｐＨ段階溶出によって、第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、低いｐＨを有する混合モード溶出緩衝液を混合モード交換クロマトグラフィーに適用させることによって、第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、混合モード溶出緩衝液は、約２５ｍＭの酢酸塩、約ｐＨ５．５を含む。
【００２１】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、第四級アミンを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、架橋アガロースに連結された第四級アミンを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、ＱＳＦＦクロマトグラフィーである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、またはアニオン交換装填緩衝液のうちの１つ以上を使用し、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、及び／またはアニオン交換装填緩衝液は、約ｐＨ８〜約ｐＨ９である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、及び／またはアニオン交換装填緩衝液は、約ｐＨ８．５である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換事前平衡化緩衝液は、約５０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換平衡化緩衝液は、約５０ｍＭのトリスを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、装填後にアニオン交換平衡化緩衝液で洗浄される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、塩勾配によってアニオン交換クロマトグラフィーから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、増加した塩濃度を有するアニオン交換溶出緩衝液をアニオン交換クロマトグラフィーに適用させることによって、アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、アニオン交換溶出緩衝液は、約５０ｍＭのトリス、１００ｍＭの酢酸ナトリウムを約ｐＨ８．５で含む。
【００２２】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体のアームは、細胞中で産生される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物細胞である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、原核生物細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のシャペロンを発現するように操作されている。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、シャペロンは、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、またはＤｓｂＣのうちの１つ以上である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、シャペロンは、Ｅ．ｃｏｌｉシャペロンである。上記の実施形態による（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。上記の実施形態による（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である。上記の実施形態による（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【００２３】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は、捕獲クロマトグラフィーの前に、溶解され、多重特異性抗体または多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解液を生成する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、細胞は、微小流動化剤を使用して溶解される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、クロマトグラフィーの前に、細胞溶解液に添加される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、ＰＥＩは、約０．４％の最終濃度まで溶解液に添加される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、遠心分離によって浄化される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞の細胞溶解液は、薬剤の添加によって１つ以上の以下の処理、熱不活化、低ｐＨ不活性化、ウイルス不活性化を受ける。
【００２４】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、方法は、組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、浸出されたプロテインＡ、核酸、細胞培養培地構成要素、またはウイルス性不純物のうちのいずれか１つなどのプロセス特異的不純物の量を低減する。
【００２５】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。
【００２６】
上記の方法のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、最後のクロマトグラフィーのステップ後に収集され、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の多重特異性抗体を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、最後のクロマトグラフィーのステップ後に収集され、生成物−特異的不純物の低減された量を含み、生成物−特異的不純物は、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、高分子量種（ＨＭＷＳ）、低分子量種（ＬＭＷＳ）、または３／４抗体のうちの１つ以上である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の非対抗体のアームを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の抗体ホモ二量体を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、約１％以下または約２％以下のＨＭＷＳを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、約２％以下または約１％以下のＬＭＷＳを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の３／４抗体を含む。
【００２７】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、画分は、
ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、
ｂ）約１％−〜５％未満の非対抗体のアーム、
ｃ）約１％〜約５％未満の抗体ホモ二量体、
ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、
ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び／または
ｆ）約５％以下の３／４抗体を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、上記に説明される方法のうちのいずれか１つの方法によって精製される多重特異性抗体を含む組成物が提供される。
【００２９】
上記の方法のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物が提供され、組成物は、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の多重特異性抗体を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物が提供され、組成物は、生成物−特異的不純物の低減された量を含み、生成物−特異的不純物は、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、高分子量種（ＨＭＷＳ）、低分子量種（ＬＭＷＳ）、または３／４抗体のうちの１つ以上である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の非対抗体のアームを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物は、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の抗体ホモ二量体を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物は、約１％以下または約２％以下のＨＭＷＳを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物は、約２％以下または約１％以下のＬＭＷＳを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物は、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の３／４抗体を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物中の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびにｂ）第２の抗原結合部位を含む全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含み、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられる。
【００３０】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物は、ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、ｂ）約１％〜約５％未満の非対抗体のアーム、ｃ）約１％〜約５％未満の抗体ホモ二量体、ｄ）約１％または２％以下のＨＭＷＳ、ｅ）約１％または２％以下のＬＭＷＳ、及び／またはｆ）約５％以下の３／４抗体を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物中の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびにｂ）第２の抗原結合部位を含む全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含み、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられる。
【００３１】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、がんまたは眼疾患の治療のための、上記に説明される方法のうちのいずれか１つによって精製される多重特異性または二重特異性抗体（ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体など）を含む組成物が提供される。
【００３２】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、がんまたは眼疾患の治療のための医薬品の製造のための、上記に説明される方法のうちのいずれか１つによって精製される多重特異性または二重特異性抗体（ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体など）を含む使用が提供される。
【００３３】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のために使用される。
【００３４】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、組成物中のＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド−関連不純物の低減のための本明細書に提供される方法のうちのいずれかの使用が提供される。
【００３５】
ある特定の実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法でＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するための方法が提供され、方法は、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続く２つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、それによって、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法は、（ｉ）親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、または（ｉｉ）親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む。
【００３６】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法は、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法は、正確に３つのクロマトグラフィーのステップを含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップは、フロースルーモードで行われる。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導値を有する溶液中に適用される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約６ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの範囲で伝導値を有する溶液中に適用される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導値を有する溶液中に適用される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップは、約７のｐＨで行われる。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導性及び約７のｐＨを有する溶液中に適用される。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、クロマトグラフィー材料の１リットル当たり約１００ｇ〜約３００ｇの範囲で適用される。
【００３７】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料は、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料は、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び０．０８〜０．１１ｍｍｏｌＣｌ−／ｍＬの培地のイオン容量を有する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィー培地は、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィー培地である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィー培地は、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、３６〜４４μｍ平均粒子サイズ、及び２５〜３９μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップは、結合及び溶出モードで行われる。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィーによって実施される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、またはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Ｆｖリガンド親和性クロマトグラフィー、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦｃＸＬクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップは、プロテインＡクロマトグラフィーのステップである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである。
【００３８】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、抗体、二重特異性抗体、またはＦｃ−融合タンパク質である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、ＣｒｏｓｓＭａｂである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、ａ）第１の抗原を特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびにｂ）第２の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含み、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられる。
【００３９】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、ＣｒｏｓｓＭａｂは、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂである。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む。
【００４０】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む。
【００４１】
上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約５％以下の３／４抗体を含む。
【００４２】
ある特定の実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法でＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を精製するための方法が提供され、方法は、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、それによって、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を精製し、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含むか、または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む。上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）いくつかの実施形態では、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびにｂ）第２の抗原結合部位を含む全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含み、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）方法のいずれかの使用が提供される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、がんまたは眼疾患の治療のための医薬品の製造のための、上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）方法で得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドが提供される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、がんまたは眼疾患の治療における使用のための、上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）方法で得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドが提供される。
【００４６】
ある特定の実施形態では、（ｉ）Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、（ｉｉ）Ｆｃ−含有ヘテロ二量体タンパク質を細胞または培養培地から回収するステップと、（ｉｉｉ）上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）方法を使用してＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製し、それによって、Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成するステップとを含むＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成するための方法が提供される。
【００４７】
ある特定の実施形態では、（ｉ）二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、（ｉｉ）二重特異性抗体を細胞または培養培地から回収するステップと、（ｉｉｉ）上記の実施形態のいずれかによる（または、それらに適用される）方法を使用して二重特異性抗体を精製し、それによって、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を産生するステップとを含むＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を産生する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】実施例１において使用される第１の精製スキームを示す。
【図１Ｂ】実施例１において使用される第２の精製スキームを示す。
【図１Ｃ】実施例１において使用される第３の精製スキームを示す。
【図２】実施例２において使用される精製スキームを示す。
【図３Ａ】実施例３において使用される第１の精製スキームを示す。
【図３Ｂ】実施例３において使用される第２の精製スキームを示す。
【図４】実施例４において使用される精製スキームを示す。
【図５Ａ】実施例６において使用される第１の精製スキームを示す。
【図５Ｂ】実施例６において使用される第２の精製スキームを示す。
【図６Ａ】実施例７において使用される第１の精製スキームを示す。
【図６Ｂ】実施例７において使用される第２の精製スキームを示す。
【図７Ａ】実施例８において使用される第１の精製スキームを示す。
【図７Ｂ】実施例８において使用される第２の精製スキームを示す。
【図７Ｃ】実施例８において使用される第３の精製スキームを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
多重特異性抗体を含む組成物を、逐次的な、ａ）捕獲クロマトグラフィーにかけるステップ、ｂ）第１の混合モードクロマトグラフィーにかけるステップ、及びｃ）第２の混合モードクロマトグラフィーにかけるステップを含む多重特異性抗体（二重特異性抗体または二価のＦ（ａｂ’）２など）を精製する方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、多重特異性抗体を精製するための方法が提供され、多重特異性抗体の個々のアームは、それぞれ、別個の培養において生成され、捕獲クロマトグラフィーによってそれぞれ別々に精製される。次いで、精製された抗体のアームは、多重特異性抗体を生成するようにアセンブリングされる。次いで、アセンブリングされた多重特異性抗体は、第１の混合モードアニオン交換クロマトグラフィー、その後に第２の混合モードクロマトグラフィーにかけられる。以下にさらに詳細に説明されるように、捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、及び／または第２の混合モードクロマトグラフィーの各々が、任意に先行され、及び／またはその後に１つ以上の追加のクロマトグラフィーのステップが続く。混合モードクロマトグラフィー及びマルチモーダルクロマトグラフィーという用語は、本明細書で交換可能に使用される。
【００５０】
いくつかの態様では、非対抗体のアーム、ホモ二量体、凝集体、低分子量種、酸性及び塩基性バリアントなどの１つ以上のプロセス特異的及び／または生成物特異的不純物の低減されたレベルを有する多重特異性抗体を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、例えば、原核生物宿主細胞タンパク質、真核宿主細胞タンパク質（ＣＨＯタンパク質または「ＣＨＯＰ」など）、核酸、及びシャペロン（そのような原核生物シャペロン、例えば、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣ）などの１つ以上のプロセス特異的不純物の低減されたレベルを有する多重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、本明細書に提供される方法を使用して得られる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、当該技術分野で既知の方法を使用して得られる組成物よりも、１つ以上のプロセス特異的及び／または生成物特異的不純物の低減されたレベルを有する。
【００５１】
いくつかの態様では、Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製及びＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド−関連不純物の低減のための、本明細書に報告される方法の使用が提供される。生成物−特異的不純物の改善された低減が達成される。ＣｒｏｓｓＭａｂ−特異的不純物の場合では、例えば３／４抗体の低減が達成される。
【００５２】
定義
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸塩化、もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体を具体的に包含する。
【００５３】
「精製された」ポリペプチド（例えば、抗体またはイムノアドヘシン）とは、ポリペプチドがその天然環境下で存在するよりもさらに純粋な形態で存在するように、及び／または実験室条件下で最初に合成及び／または増幅されたときにポリペプチドの純度が増加することを意味する。純度は、相対用語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。本明細書で交換可能に使用される「精製する」、「分離する」、または「単離する」という用語は、所望の分子及び１つ以上の不純物を含む組成物または試料の所望の分子（多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体など）の純度を増加させることを指す。典型的には、所望の分子の純度は、少なくとも１つの不純物を組成物から除去（完全にまたは部分的に）することによって増加される。
【００５４】
「対象の抗原を結合する」二重特異性抗体は、二重特異性抗体が、タンパク質、またはタンパク質を発現する細胞もしくは組織を標的とするのに診断及び／または治療剤として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応しないように十分な親和性で抗原を結合するものである。このような実施形態では、二重特異性抗体の「非標的」タンパク質への結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）、またはＥＬＩＳＡなどによって決定されるように、二重特異性抗体のその特定の標的タンパク質への結合の約１０％未満である。二重特異性抗体の標的分子との結合に関して、特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的な結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、非特異的相互作用（例えば、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミンまたはカゼインを結合することであり得る）とはある程度異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的、例えば、過剰な非標識標的に類似である対照分子との競合によって決定され得る。この場合、プローブへの標識した標的の結合が過剰な非標識標的によって競合的に阻害された場合に、特異的結合が示される。本明細書で使用される特定のポリペプチドもしくは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的な結合」または「特異的に結合する」または「特異的である」という用語は、例えば、少なくとも約２００ｎＭ、代替的には少なくとも約１５０ｎＭ、代替的には少なくとも約１００ｎＭ、代替的には少なくとも約６０ｎＭ、代替的には少なくとも約５０ｎＭ、代替的には少なくとも約４０ｎＭ、代替的には少なくとも約３０ｎＭ、代替的には少なくとも約２０ｎＭ、代替的には少なくとも約１０ｎＭ、代替的には少なくとも約８ｎＭ、代替的には少なくとも約６ｎＭ、代替的には少なくとも約４ｎＭ、代替的には少なくとも約２ｎＭ、代替的には少なくとも約１ｎＭ、またはそれを超える親和性の標的に対するＫｄを有する分子によって示され得る。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、多重特異性抗原結合タンパク質がいずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドまたはエピトープに結合する結合を指す。
【００５５】
「結合親和性」とは、分子（例えば、多重特異性抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別段示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。例えば、Ｋｄは、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、または約１ｎＭ以下であり得る。親和性は、本明細書に記載のものを含む当該技術分野で既知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原により早く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野で既知であり、これらのいずれも、本明細書に提供される方法及び組成物の目的のために使用され得る。
【００５６】
一実施形態では、本発明による「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、２５℃で、−１０の応答単位（ＲＵ）で固定化標的（例えば、抗原）ＣＭ５チップを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイ使用して測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．）は、供給業者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を用いて抗原を５μｇ／ｍＬ（約０．２μＭ）になるまで希釈した後、５μＬ／分の流量で注入して、およそ１０の応答単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロックする。動態測定について、Ｆａｂの２倍段階希釈液（例えば、０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）は、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中に、約２５ｕＬ／分の流量で、２５℃で注入される。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、単純１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、結合速度は、ストップトフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌レッドキュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定される、増加する抗原濃度の存在下、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定され得る。
【００５７】
本明細書における「活性な」または「活性」とは、天然のまたは天然に存在するポリペプチドの生物学的及び／または免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態（複数可）を指し、「生物学的」活性とは、天然のまたは天然に存在するポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の天然のまたは天然に存在するポリペプチドによって引き起こされる生物学的機能（阻害または刺激のいずれか）を指し、「免疫学的」活性とは、天然のまたは天然に存在するポリペプチドが有する抗原エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指す。
【００５８】
抗体、断片、またはその誘導体などの本明細書に提供される多重特異性抗原結合タンパク質に関する「生物学的に活性」及び「生物学的活性」及び「生物学的特徴」は、別段の特定の場合を除き、生物学的分子を結合する能力を有することを意味する。
【００５９】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を具体的に包含するが、これは、それらが所望の生物活性を呈する場合に限る。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と同義に使用される。
【００６０】
抗体は、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子であり、それらの構造は全て免疫グロブリン折り畳みに基づく。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域が抗体の抗原結合特異性を決定する一方で、Ｃ領域は、構造的支持を提供し、免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体または抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の能力である。
【００６１】
抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性を有するより短い領域によって分離される１５〜３０個のアミノ酸を有するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
【００６２】
各Ｖ領域は、典型的には、３つの相補性決定領域（各々が「超可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するために必要とされる最小の構造単位である抗体結合部位は、典型的には、３つのＣＤＲと、適切な立体配座でのＣＤＲを保持し提示するためにそれらの間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。古典的な４つの鎖抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが協働して定義される抗原結合部位を有する。ラクダ及びサメ抗体などのある特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。単一ドメインの操作された免疫グロブリンは、ＶＨとＶＬとの間に協働がない場合、結合部位が重鎖または軽鎖のみによって形成されるように調製され得る。
【００６３】
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が抗体の中で大きく異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用し、３つの超可変領域により連結され、βシート構造に連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する４つのＦＲを含む。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって、他方の鎖の超可変領域と近接して保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。
【００６４】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（例えば、ＶＬでは、ほぼ、残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨでは、ほぼ、３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、及び／または「超可変ル−プ」からのそれらの残基（例えば、ＶＬでは、残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、及び９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶＨでは、２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））からのアミノ酸残基を含み得る。
【００６５】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるような超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００６６】
抗体または半抗体との関連での「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸展と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖内Ｓ−Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列し得る。
【００６７】
Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、通常、ヒンジ領域のすぐＣ末端にある残基の伸展、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３９と定義される。本出願の前は、ＦｃγＲ結合は、概して、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域におけるアミノ酸残基に起因するものであった。
【００６８】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＩｇＧの残基約２３１から約３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合されないという点で特有である。むしろ、２つのＮ結合分岐状炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。炭水化物がドメイン−ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）
【００６９】
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基約３４１からアミノ酸残基約４４７）の残基の伸展を含む。
【００７０】
「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（例えば、米国特許第５，６４１，８７０号の実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）；一アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ、一本鎖抗体分子；抗体断片から形成される多重特異性抗体（例えば、Ｄｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−Ｆｃ、ｔａＤｂ−ＣＨ３、（ｓｃＦＶ）４−Ｆｃ、ジ−ｓｃＦｖ、バイ−ｓｃＦｖ、またはタンデム（ジ、トリ）−ｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない）；及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥｓ）が挙げられる。
【００７１】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して表記される１つの残留「Ｆｃ」断片とが産生される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）とともに全Ｌ鎖、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片が産出され、これは、概して、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有する点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも既知である。
【００７２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原−認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を画定する。集合的に、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な超可変領域を３つのみ含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。
【００７３】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも既知である。
【００７４】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる種類のうちの１つに割り当てられ得る。
【００７５】
抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。無傷抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分割され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成は、周知である。
【００７６】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチドに存在している。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖに関する概説については、Ｐｌuｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００７７】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生成することができる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により詳しく記載されている。
【００７８】
本明細書で使用される「半抗体」または「ヘミマー」は、一価の抗原結合ポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、半抗体またはヘミマーは、ＶＨ／ＶＬ単位、及び任意に免疫グロブリン定常ドメインの少なくとも一部を含む。ある特定の実施形態では、半抗体またはヘミマーは、１つの免疫グロブリン軽鎖に関連する１つの免疫グロブリン重鎖、またはその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、半抗体またはヘミマーは、単一−特異性であり、すなわち、単一抗原またはエピトープを結合する。当業者は、半抗体が、単一可変ドメインからなる、例えば、ラクダ科に由来する抗原結合ドメインを有し得ることを容易に理解するであろう。
【００７９】
「ＶＨ／ＶＬ単位」という用語は、少なくとも１つのＶＨ  ＨＶＲ及び少なくとも１つのＶＬ  ＨＶＲを含む抗体の抗原結合領域を指す。ある特定の実施形態では、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＨ  ＨＶＲ、及び少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全てのＶＬ  ＨＶＲを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨ／ＶＬ単位は、フレームワーク領域の（ＦＲ）少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ／ＶＬ単位は、３つのＶＨ  ＨＶＲ及び３つのＶＬ  ＨＶＲを含む。いくつかのそのような実施形態では、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てのＶＨ  ＦＲ、及び少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つ全てのＶＬ  ＦＲを含む。
【００８０】
「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つもしくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つもしくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体または二価のＦ（ａｂ’）２など）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体としては、完全長抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、及びトリアボディなど）、共有結合的または非共有結合的に連結されている抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。重鎖定常領域の少なくとも一部分及び／または軽鎖定常領域の少なくとも一部分をさらに含むＶＨ／ＶＬ単位は、「ヘミマー」または「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態では、半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部分及び単一の軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。いくつかのそのような実施形態では、２つの半抗体を含み、かつ２つの抗原に結合する二重特異性抗体は、第１の抗原または第１のエピトープに結合するが、第２の抗原または第２のエピトープには結合しない第１の半抗体、及び第２の抗原または第２のエピトープに結合するが、第１の抗原または第１のエピトープには結合しない第２の半抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、多重特異性抗体は、５Ｍ〜０．００１ｐＭ、３Ｍ〜０．００１ｐＭ、１Ｍ〜０．００１ｐＭ、０．５Ｍ〜０．００１ｐＭ、または０．１Ｍ〜０．００１ｐＭの親和性で各抗原またはエピトープに結合するＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、第２のヘミマーとの分子内ジスルフィド結合が形成されることを可能にするのに十分な重鎖可変領域の一部分を含む。いくつかの実施形態において、ヘミマーは、例えば、相補的ホール変異またはノブ変異を含む第２のヘミマーまたは半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異またはホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下でさらに論じられる。
【００８１】
「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有するもの、または「二重特異性」であるとも称される。別途示されない限り、二重特異性抗体によって結合される抗原が二重特異性抗体名で列記される順序は無作為である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び任意に重鎖定常領域の少なくとも一部分、ならびに単一の軽鎖可変領域及び任意に軽鎖定常領域の少なくとも一部分を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、１つよりも多くの単一の重鎖可変領域を含まず、１つよりも多くの単一の軽鎖可変領域を含まない。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、第１の半抗体は、第１の抗原に結合し、第２の抗原には結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原に結合し、第１の抗原には結合しない。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「ノブイントゥホール」または「ＫｉＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する界面で一方のポリペプチドに隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチドに空洞（ホール）を導入することによって、インビトロまたはインビボでの対合を指向する技術を指す。例えば、ＫｉＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合界面、ＣＬ：ＣＨ１界面、またはＶＨ／ＶＬ界面に導入されている（例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ６：７８１−７８８を参照されたい）。いくつかの実施形態において、ＫｉＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の対合が駆動される。例えば、それらのＦｃ領域内にＫｉＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインをさらに含み得るか、または類似のもしくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインをさらに含み得る。ＫｉＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、または異なる標的認識配列（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合物を含む）を含む任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。
【００８３】
本明細書で使用される「ノブ変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で隆起（ノブ）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ホール変異を有する（例えば、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６、ＵＳ８，２１６，８０５を参照されたい）。
【００８４】
本明細書で使用される「ホール変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で空洞（ホール）をポリペプチドに導入する変異を指す。いくつかの実施形態では、他方のポリペプチドは、ノブ変異を有する（例えば、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，７３１，１６８、ＵＳ５，８０７，７０６、ＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６、ＵＳ８，２１６，８０５を参照されたい）。
【００８５】
「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）または「単一可変ドメイン（ＳＶＤ）抗体」という表現は、一般に、単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）が抗原結合を付与し得る抗体を指す。言い換えれば、単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要はない。単一ドメイン抗体の例としては、ラクダ科動物（ラマ及びラクダ）ならびに軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）由来の抗体、ならびにヒト及びマウス抗体由来の組換え方法から得られる抗体が挙げられる（Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４−５４６、Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００６）３０：４３−５６、Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ（２００１）２６：２３０−２３５、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００３）：２１：４８４−４９０、ＷＯ２００５／０３５５７２、ＷＯ０３／０３５６９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ（１９９４）３３９：２８５−２９０、ＷＯ００／２９００４、ＷＯ０２／０５１８７０）。
【００８６】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体を除いて、同一であり、及び／または同じエピトープに結合し、そのような変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本明細書に提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製されても、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製されてもよい。モノクローナル抗体はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００８７】
本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびにそれらが所望される生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において対象となるキメラ抗体としては、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、またはカニクイザルなどの旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が挙げられる（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００８８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも供与体抗体にも見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００８９】
本明細書では、「無傷抗体」は、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含むものである。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒトの天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであり得る。好ましくは、無傷抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００９０】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖が１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合している一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられている。
【００９１】
「裸抗体」は、細胞毒性部分などの異種分子または放射標識に複合されない（本明細書に定義される）抗体である。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（このアミノ酸配列は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、抗体の定常領域と比較して「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣＨ２及び／またはＣＨ３配列）。例示的なアドヘシン配列としては、目的とするタンパク質に結合する受容体またはリガンドの一部分を含む連続したアミノ酸配列が挙げられる。アドヘシン配列は、目的とするタンパク質に結合するが、受容体またはリガンド配列ではない配列（例えば、ペプチボディにおけるアドヘシン配列）でもあり得る。そのようなポリペプチド配列は、ファージディスプレイ技法及び高スループット選別方法を含む種々の方法によって選択または特定され得る。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得られ得る。
【００９３】
ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、抗体、二重特異性抗体、またはＦｃ−融合タンパク質である。
【００９４】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法によって生成されるＦｃ−融合タンパク質は、標的化免疫サイトカインである。ある特定の実施形態では、標的化免疫サイトカインは、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。ある特定の実施形態では、ＣＥＡ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。ある特定の実施形態では、標的化免疫サイトカインは、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。ある特定の実施形態では、ＦＡＰ−ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。
【００９５】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法によって生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡ及び少なくとも１つの追加の標的分子を結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法によって生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的化サイトカイン及び少なくとも１つの追加の標的分子を結合する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法によって生成される多重特異性抗体は、ＩＬ２ｖ（すなわち、インターロイキン２価）及び少なくとも１つの追加の標的分子に融合される。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法によって生成される多重特異性抗体は、Ｔ−細胞二重特異性抗体（すなわち、二重特異性Ｔ−細胞エンゲージャーまたはＢｉＴＥ）である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体の下方調節が挙げられる。
【００９７】
「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、同種抗原と複合した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われ得る。
【００９８】
「抗体依存性細胞媒介細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価してもよい。
【００９９】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球を含み、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。
【０１００】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び選択的スプライシング形態を含む、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａeｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．
”１２６：３３０−４１（１９９５）に概説される。将来的に特定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母体ＩｇＧｓの胎児への移行に関与している新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
【０１０１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、同義に使用され、外因性核酸が中に導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞としては、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が挙げられ、これらは、初代形質転換細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含量の点で完全に同一ではないが、変異を含み得る。最初に形質転換された細胞についてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が、本明細書に含まれる。
【０１０２】
「不純物」とは、所望のポリペプチド生成物とは異なる物質を指す。不純物とは、一アーム抗体及びミスアセンブリングされた抗体、塩基性バリアント及び酸性バリアントを含む抗体バリアント、ならびに凝集体などの生成物−特異的ポリペプチドを指し得る。他の不純物としては、これらに限定されないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの宿主細胞物質、浸出されたプロテインＡ、核酸、別のポリペプチド、内毒素、ウイルス性混入物、細胞培養培地構成成分などを含むプロセス特異的不純物が挙げられる。いくつかの例では、不純物は、例えばこれらに限定されないが、細菌性細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＥＣＰ）、昆虫細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞からのＨＣＰであってもよい。いくつかの例では、不純物は、ＣＨＯ細胞、すなわち、ＣＨＯ細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）などの哺乳動物細胞からのＨＣＰであってもよい。不純物は、例えば、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣなどの原核生物シャペロンなど、多重特異性抗体の発現、折り畳み、またはアセンブリを容易にするために使用される付属タンパク質を指し得る。
【０１０３】
本明細書で使用される「複合体」または「複合した」は、ペプチド結合でない結合及び／または力（例えば、ファンデルワールス力、疎水性力、親水性力）を通して互いに相互作用する２つ以上の分子の会合を指す。一実施形態では、複合体は、ヘテロ多量体である。本明細書で使用される「タンパク質複合体」または「ポリペプチド複合体」という用語は、タンパク質複合体（例えば、これらに限定されないが、毒素または検出剤などの化学分子を含む）中でタンパク質コンジュゲートされる非タンパク質の主体を有する複合体を含むことが理解されるべきである。
【０１０４】
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１０５】
基準ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、候補配列内のアミノ酸残基が、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一であるパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記述され、ソースコードは、ユーザ文書とともに米国著作権庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用する場合はコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており、変動しない。
【０１０６】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
【０１０７】
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【０１０８】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ９１（２００７）を参照されたい。）単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び中に導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが操作可能に連結している核酸の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
【０１１０】
クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「逐次的な」という用語は、特定の配列におけるクロマトグラフィーのステップ、例えば、第１のクロマトグラフィーのステップ、その後に続く第２のクロマトグラフィーのステップ、その後に続く第３のクロマトグラフィーのステップを指す。さらなるステップは、逐次的なクロマトグラフィーのステップの間に含まれ得る。
【０１１１】
クロマトグラフィーに関して本明細書で使用される「連続」という用語は、直接または第１のクロマトグラフィー材料と第２のクロマトグラフィー材料との間の連続流を可能にするいくつかの他の機構を介して接続されたこれらの２つのクロマトグラフィー材料を有することを指す。
【０１１２】
「装填密度」とは、クロマトグラフィー材料の体積（例えば、リットル）と接触した組成物の量（例えば、グラム）を指す。いくつかの例では、装填密度は、ｇ／Ｌで表わされる。
【０１１３】
「試料」とは、より大量の材料のわずか一部を指す。一般に、本明細書に記載の方法に従う試験は、試料で行われる。試料は、典型的には、例えば、培養された組換えポリペプチド発現細胞株（本明細書で「産物細胞株」とも称される）から、または培養された宿主細胞から得られる組換えポリペプチド調製物から得られる。本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は、目的とする組換えポリペプチドまたは産物の発現のための遺伝子を含有しない。試料は、例えば、採取された細胞培養液から、精製プロセスのある特定のステップでのインプロセスプールから、または最終精製産物から得られ得るが、これらに限定されない。試料はまた、希釈剤、緩衝剤、洗剤、及び汚染物質種、所望の分子（多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体など）とともに混合されて見出される残屑などを含む。
【０１１４】
本明細書において「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」を言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【０１１５】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。
【０１１６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形は、態様及び変形「からなる」及び／または「本質的にからなる」を含むことが理解される。
【０１１７】
特許出願及び公報を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
多重特異性抗体の精製方法
多重特異性抗体を精製するための方法が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、第１の標的を結合する第１のＦ（ａｂ）及び第２の標的を結合する第２のＦ（ａｂ）を含む二価のＦ（ａｂ’）２である。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、すなわち、アミノ酸配列において同一である２つの抗原結合アームを有する抗体であり、各Ｆａｂアームは、２つの抗原（二重作用Ｆａｂ抗体など）を認識することが可能である。
【０１１９】
いくつかの態様では、多重特異性抗体の精製は、逐次的な、捕獲クロマトグラフィーのステップ、第１の混合モードクロマトグラフィーのステップ、及び第２の混合モードクロマトグラフィーのステップを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、捕獲クロマトグラフィーの前にアセンブリングされる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、捕獲クロマトグラフィーの後にアセンブリングされる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体または二価のＦ（ａｂ’）２など）は、２つ以上の抗体のアームを含み、異なる抗体のアームは、異なるエピトープを結合する。ある特定の実施形態では、異なるエピトープは、同じ抗原上にある。ある特定の実施形態では、各エピトープは、異なる抗原上にある。ある特定の実施形態では、抗体のアームは、ＶＨ／ＶＬ単位を含む。ある特定の実施形態では、抗体のアームは、半抗体としても既知のヘミマーを含む。アセンブリを容易にするために、ある特定の実施形態では、１つの抗体のアームの重鎖は、「ノブ」を含むように修飾され、別の抗体のアームの重鎖は、第１の重鎖のノブが第２の重鎖のホールに適合するように「ホール」を含む。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体の各アームは、別個の細胞培養中で産生される。宿主細胞中で抗体のアームの発現後、全体の細胞ブロスは、収集及び均質化され、抗体のアームが抽出される。ある特定の実施形態では、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、クロマトグラフィーの前に細胞溶解液に添加される。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、クロマトグラフィーの前に遠心分離される。次いで、多重特異性抗体の各アームは、捕獲クロマトグラフィーによって精製される（各アームが、別個のクロマトグラフィーカラムまたは膜上で精製されるように）。ある特定の実施形態では、捕獲クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＧクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、タンパク質Ａ／Ｇクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＬクロマトグラフィーである。捕獲クロマトグラフィー後、精製された抗体のアームは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣクロマトグラフィー、質量分析などによって分析され得る。次いで、多重特異性抗体の精製されたアームは、本明細書の他でさらに詳細に論じられるように、組み合わされて、アセンブリングすることが可能になる。
【０１２２】
他の実施形態では、多重特異性抗体の各アームは、別個の細胞培養中で産生される。宿主細胞中で抗体のアームの発現後、全体の細胞ブロスは、収集及び均質化される。次いで、各培養の細胞ホモジネートは混合され、組み合わされた抗体のアームが抽出される。いくつかの実施形態では、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、クロマトグラフィーの前に細胞溶解液に添加される。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、クロマトグラフィーの前に遠心分離される。次いで、多重特異性抗体の組み合わされたアームは、親和性クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。この時点で、精製された抗体のアームは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣクロマトグラフィー、質量分析などによって分析され得る。次いで、多重特異性抗体の精製されたアームは、本明細書に説明される方法によって、組み合わされて、アセンブリングすることが可能になる。
【０１２３】
他の実施形態では、多重特異性抗体の各アームは、同じ細胞培養中で産生される。宿主細胞中で抗体のアームの発現後、全体の細胞ブロスは、収集及び均質化され、抗体のアームが抽出される。いくつかの実施形態では、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、クロマトグラフィーの前に細胞溶解液に添加される。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、クロマトグラフィーの前に遠心分離される。次いで、多重特異性抗体のアームは、親和性クロマトグラフィーによって精製される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。この時点で、精製された抗体のアームは、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣクロマトグラフィー、質量分析などによって分析され得る。次いで、多重特異性抗体の精製されたアームは、本明細書に説明される方法によって集合することが可能になる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、細胞溶解液中のＰＥＩの最終濃度は、少なくとも約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約２．０％、約３．０％、約４．０％、または約５．０のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、細胞溶解液中のＰＥＩの最終濃度は、約０．１％〜約５％、約０．１％〜約１％、約０．１％〜約０．５％、約０．５％〜約５％、約０．５％〜約１％、または約１％〜約５％のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＰＥＩを含む細胞溶解液は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、または約２４時間のうちのいずれかを超える間保持される。いくつかの実施形態では、ＰＥＩを含む細胞溶解液は、約１時間〜２４時間、１時間〜６時間、６時間〜１２時間、１２時間〜１８時間、１８時間〜２４時間のうちのいずれかを超える間保持される。いくつかの実施形態では、ＰＥＩを含む細胞溶解液は、約１０時間〜１４時間のうちのいずれかの間保持される。いくつかの実施形態では、ＰＥＩを含む細胞溶解液は、約４℃〜３７℃で保持される。いくつかの実施形態では、ＰＥＩを含む細胞溶解液は、約周囲温度で保持される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、クロマトグラフィーの前に遠心分離によって浄化される。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、クロマトグラフィーの前に濾過される。いくつかの実施形態では、細胞溶解液は、クロマトグラフィーの前に０．２２μｍのフィルターを介して濾過される。
【０１２６】
親和性クロマトグラフィーの例としては、これらに限定されないが、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー、またはプロテインＬクロマトグラフィーが挙げられる。親和性クロマトグラフィー材料の例としては、これらに限定されないが、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）−ｖＡ、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、プロテインＡセファロース（登録商標）ファストフロー、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＡＦ−ｒプロテインＡ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）ＬＸ、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）、及びＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＦｃＸＬが挙げられる。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィー材料は、カラム中にある。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、「結合及び溶出モード」（代替的には「結合及び溶出プロセス」と称される）で行われる。「結合及び溶出モード」は、試料中の生成物（多重特異性抗体など）親和性クロマトグラフィー材料を結合する生成物分離技術を指し、親和性クロマトグラフィー材料から逐次的に溶出される。いくつかの実施形態では、溶出は、移動相の組成物が溶出プロセスの間に１つまたはいくつかの場合に段階的に変更される段階溶出である。ある特定の実施形態では、溶出は、移動相の組成物が溶出プロセスの間に連続的に変更される勾配溶出である。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィー材料は、膜である。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、プロテインＡクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーは、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィーである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦｃＸＬクロマトグラフィーである。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップの溶出物は、逐次的に、第１の混合モードクロマトグラフィーに適用される。ある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、以下の官能性、アニオン交換、カチオン交換、水素結合、ｐｉ−ｐｉ結合相互作用、親水性相互作用、親チオ性相互作用、及び疎水性相互作用のうちのいずれか１つ以上が可能である官能基を含む。ある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、アニオン交換及び疎水性相互作用が可能である官能基を含む。ある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、カチオン交換及び疎水性相互作用が可能である官能基を含む。ある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、４−メルカプト−エチル−ピリジン、２−ベンズアミド−４−メルカプトブタン酸、ヘキシルアミン、またはフェニルプロピルアミン、または架橋ポリアリルアミンを含む。混合モード材料の例としては、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）樹脂、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）樹脂、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）樹脂、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ  Ｉｍｐｒｅｓ、Ｎｕｖｉａ（商標）ｃＰｒｉｍｅ（商標）膜が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１の混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。ある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。ある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣである。ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含まない。ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。いくつかの実施形態では、溶出は、段階溶出である。ある特定の実施形態では、溶出は、勾配溶出である。ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで行われる。上記のある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、カラム中にある。上記のある特定の実施形態では、第１の混合モード材料は、膜内にある。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、捕獲クロマトグラフィー及び第１の混合モードクロマトグラフィーは、連続的であり、例えば、捕獲クロマトグラフィー材料及び第１の混合モード材料は、直接的に接続されるか、または捕獲クロマトグラフィー材料と第１の混合モード材料との間の連続流を可能にするいくつかの他の機序によって接続されるかのいずれかである。ある特定の実施形態では、捕獲クロマトグラフィー及び第１の混合モードクロマトグラフィーは、連続的であり、第１の混合モードクロマトグラフィーは、捕獲クロマトグラフィーの直後に行われる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、捕獲クロマトグラフィーの溶出物は、第１の混合モードの樹脂に適用される前に１つ以上の追加のクロマトグラフィーのステップにかけられる。例えば、捕獲クロマトグラフィーの溶出物は、第１の混合モードクロマトグラフィーにかけられる前に、任意の順序及び／または任意の組み合わせで以下のクロマトグラフィーのステップ、疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）などのうちのいずれか１つ以上にかけられ得る。
【０１３０】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、生体分子を疎水性に従って分離する液体クロマトグラフィー技術である。ＨＩＣクロマトグラフィー材料の例としては、これらに限定されないが、例えば、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ヘキシル−６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ブチル−６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）フェニル−６５０、Ｔｏｙｏｐｅａｒ（登録商標）ｌエーテル−６５０、ＨｉＴｒａｐ（登録商標）セファロース、オクチルセファロース（登録商標）、フェニルセファロース（登録商標）、ブチルセファロース（登録商標）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、フェニルセファロースを含む。ある特定の実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。いくつかの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで行われる。上記のいくつかの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、カラム中にある。上記のいくつかの実施形態では、ＨＩＣクロマトグラフィー材料は、膜内にある。
【０１３１】
アニオン交換クロマトグラフィー材料は、正に荷電しており、かつ固相を通るか、または通過した水溶液（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）中のアニオンとの交換のために遊離アニオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、アニオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。一実施形態では、アニオン交換材料は、樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、または第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、またはジエチルアミノアエチル（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｅｔｈｙｌ）官能基を含み得る。アニオン交換材料の例は、当該技術分野で既知であり、これらに限定されないが、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＱ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＰＩ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）Ｄ、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、Ｑセファロース（登録商標）ファストフロー（ＱＳＦＦ）、第四級メチルアミン（ＱＭＡ）樹脂を含むＡｃｃｅｌｌ（商標）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳＴＩＣ（登録商標）、及びＤＥＡＥ−セファロース（登録商標）を含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで行われる。上記のいくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、カラム中にある。上記のいくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、膜内にある。
【０１３２】
カチオン交換クロマトグラフィー材料は、負に荷電しており、かつ固相を通るか、または通過した水溶液（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）中のアニオンとの交換のために遊離アニオンを有する固相である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、カチオン交換材料は、膜、モノリス、または樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン交換材料は、樹脂であり得る。カチオン交換材料は、例えば、スルホン酸塩、カルボキシル、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、またはオルトリン酸塩であるが、これらに限定されないカルボン酸官能基またはスルホン酸官能基を含み得る。上記のいくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カチオン交換クロマトグラフィーカラムである。上記のいくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カチオン交換クロマトグラフィー膜である。当該技術分野で既知のカチオン交換材料の例は、これらに限定されないが、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ、ＳＯ３Ｍｏｎｏｌｉｔｈ（例えば、ＣＩＭ（登録商標）、ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（登録商標）、及びＣＩＭａｃ（登録商標）ＳＯ３など）、Ｓ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＸＳ、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ５０、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）ＨＳ２０、スルホプロピル−セファロース（登録商標）ファストフロー（ＳＰＳＦＦ）、ＳＰ−セファロース（登録商標）ＸＬ（ＳＰＸＬ）、ＣＭ  セファロース（登録商標）ファストフロー、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  Ｓｅ  Ｈｉｃａｐ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３−、またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ−を含む。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。いくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで行われる。上記のいくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カラム中にある。上記のいくつかの実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィー材料は、膜内にある。
【０１３３】
ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）クロマトグラフィー材料の官能基は、結晶カルシウムイオン（Ｃ−部位）、及び結晶リン酸塩（Ｐ−部位）の三つ組に関連する６つの負に荷電された酸素原子のクラスターの正に荷電された対を含む。Ｃ−部位、Ｐ−部位、及びヒドロキシルは、結晶表面上に固定されたパターンで分布される。タンパク質は、典型的には、低濃度（例えば、１０〜２５ｍＭ）のリン酸塩緩衝液中でヒドロキシアパタイトに吸収されるが、ある特定の酸性タンパク質は、水、食塩水、または非リン酸塩緩衝液中に装填される場合、吸収され得る。タンパク質は、通常、リン酸塩勾配を増加させることによって溶出されるが、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、またはＣｌ−イオンの勾配もまた、塩基性タンパク質の選択的な溶出などに使用され得る。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料は、樹脂であり得る。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料は、樹脂であり得る。上記のいくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料は、カラムである。当該技術分野で既知のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー材料の例としては、これらに限定されないが、ＣＨＴ（商標）セラミックヒドロキシアパタイト、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩ型担体、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型担体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで行われる。
【０１３４】
一実施形態では、本明細書に報告される方法はさらに、Ｆｃドメインを含む二重特異性抗体を二重特異性抗体を含む溶液から分離する方法を含み得、方法は、（ａ）溶液をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー培地と接触させること、（ｂ）二重特異性抗体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー培地に吸収させること、及び（ｃ）塩化物イオンの存在下で二重特異性抗体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー培地から溶出することを含み、溶液は、１つ以上の断片がＦｃドメインを含む二重特異性抗体の１つ以上の断片をさらに含み、及び／または溶液は、二重特異性抗体の分子量を超える分子量を有する１つ以上のポリペプチドを含み、かつ１つ以上のポリペプチドがＷＯ２０１５／０２４８９６に参照されるＦｃドメインをさらに含む二重特異性抗体の２つの重鎖のうちの少なくとも１つを含む。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、捕獲クロマトグラフィーの溶出物は、アニオン交換クロマトグラフィーにかけられる。ある特定の実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィー材料は、Ｑセファロース（登録商標）ファストフロー（ＱＳＦＦ）である。ある特定の実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーの後に収集される溶出物は、逐次的に、第２の混合モードクロマトグラフィーに適用される。ある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、以下の官能性、アニオン交換、カチオン交換、水素結合、ｐｉ−ｐｉ結合相互作用、親水性相互作用、親チオ性相互作用、及び疎水性相互作用のうちのいずれか１つ以上が可能である官能基を含む。ある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、アニオン交換及び疎水性相互作用が可能である官能基を含む。ある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、カチオン交換及び疎水性相互作用が可能である官能基を含む。ある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、４−メルカプト−エチル−ピリジン、２−ベンズアミド−４−メルカプトブタン酸、ヘキシルアミン、またはフェニルプロピルアミン、または架橋ポリアリルアミンを含む。混合モード材料の例としては、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）樹脂、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）樹脂、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ  Ｉｍｐｒｅｓ、Ｎｕｖｉａ（商標）ｃＰｒｉｍｅ（商標）膜が挙げられる。いくつかの実施形態では、第２の混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。ある特定の実施形態では、第１２混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。ある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣである。ある特定の実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含まない。ある特定の実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モードで行われる。いくつかの実施形態では、溶出は、段階溶出である。ある特定の実施形態では、溶出は、勾配溶出である。ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーは、「フロースルー」モードで行われる。上記のある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、カラム中にある。上記のある特定の実施形態では、第２の混合モード材料は、膜内にある。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィー及び第２の混合モードクロマトグラフィーは、連続的であり、例えば、捕獲クロマトグラフィー材料及び第１の混合モード材料は、直接的に接続されるか、または捕獲クロマトグラフィー材料と第１の混合モード材料との間の連続流を可能にするいくつかの他の機序によって接続されるかのいずれかである。ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィー及び第２の混合モードクロマトグラフィーは、連続的であり、第２の混合モードクロマトグラフィーは、第１の混合モードクロマトグラフィーの直後に行われる。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーの溶出物は、第２の混合モードの樹脂に適用される前に１つ以上の追加のクロマトグラフィーの操作にかけられる。例えば、第１の混合モードクロマトグラフィーの溶出物は、第２の混合モードクロマトグラフィーにかけられる前に、任意の順序及び／または任意の組み合わせで以下のクロマトグラフィーのステップ、疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）などのうちの１つ以上にかけられ得る。
【０１３９】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーの溶出物は、１つ以上の追加のクロマトグラフィーのステップにかけられる。例えば、第２の混合モードクロマトグラフィーの溶出物は、任意の順序及び／または任意の組み合わせで以下のクロマトグラフィーのステップ、疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィー、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、混合モードクロマトグラフィーなどのうちのいずれか１つ以上にかけられ得る。
【０１４０】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、方法は、緩衝液を使用することを含む。様々な緩衝液は、例えば、緩衝液の所望のｐＨ、緩衝液の所望の伝導度、精製される多重特異性抗体の特徴、及び精製方法に応じて、多重特異性抗体の精製の間に用いられ得る。緩衝液は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、または洗浄緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上が同じである。ある特定の実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液は異なる。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、緩衝液は塩を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、トリスＨＣｌ、トリス酢酸塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、ＭＯＰＳ、ビストリス、アルギニン、アルギニンＨＣｌ、またはそれらの混合物を含む。ある特定の実施形態では、緩衝液は、塩化ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。ある特定の実施形態では、緩衝液は、トリス、アルギニン、リン酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、またはＭＯＰＳ緩衝液である。
【０１４１】
「装填物」とは、クロマトグラフィー材料に装填される組成物を指す。装填緩衝液は、組成物（例えば、多重特異性抗体及び不純物を含む組成物、または抗体のアーム及び不純物を含む組成物）をクロマトグラフィー材料（本明細書に記載されるクロマトグラフィー材料のうちのいずれか１つなど）に装填するために使用される緩衝液である。クロマトグラフィー材料は、精製される組成物の装填前に平衡化緩衝液で平衡化され得る。洗浄緩衝液は、組成物をクロマトグラフィー材料に装填した後に使用される。溶出緩衝液は、対象のポリペプチドを固相から溶出するために使用される。
【０１４２】
多重特異性抗体（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）を含む組成物の本明細書に記載されるクロマトグラフィー材料のうちのいずれかへの装填は、不純物から多重特異性抗体の精製のために最適化され得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）を含む組成物のクロマトグラフィー材料への装填は、クロマトグラフィーが結合及び溶出モードで行われるときに、多重特異性抗体のクロマトグラフィー材料への結合のために最適化される（例えば、本明細書に設計される親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィー）。
【０１４３】
伝導度とは、２つの電極間に電流を伝導する水溶液の能力を指す。溶液中で、電流は、イオン輸送により流れる。したがって、水溶液中に存在するイオンの量が増加すると、この溶液は、より高い伝導度を有するようになる。伝導度の尺度の基本単位は、ジーメンス（ｍＳ／ｃｍ）またはｏｈｍ（ｍｈｏ）であり、様々なモデルのＯｒｉｏｎ伝導度計などの伝導度計を使用して測定され得る。電解質伝導度が電流を搬送する溶液中のイオンの能力であるため、溶液の伝導度は、その中のイオンの濃度を変化させることによって変更され得る。例えば、溶液中の緩衝剤の濃度及び／または塩（例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、または塩化カリウム）の濃度は、所望の伝導度を達成するために変更され得る。好ましくは、様々な緩衝液の塩濃度は、所望の伝導度を達成するために修正される。
【０１４４】
例えば、ある特定の実施形態では、多重特異性抗体（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）を含む組成物は、装填緩衝液の伝導度を一定に保ちながら、いくつかの異なるｐＨ値の装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料、例えば、本明細書に記載されるクロマトグラフィー材料のうちのいずれか１つを含むクロマトグラフィーカラムに装填される。代替的には、多重特異性抗体を含む溶液は、装填緩衝液のｐＨを一定に保ちながら、いくつかの異なる伝導度の装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料に装填され得る。多重特異性抗体（多重特異性抗体及び不純物を含む組成物など）を含む組成物をクロマトグラフィー材料に装填し、クロマトグラフィー材料から産物をプール画分中に溶出させた時点で、プール画分中に残っている不純物の量は、所与のｐＨまたは伝導度に対する多重特異性抗体の不純物からの分離に関する情報を提供する。同様に、クロマトグラフィーについて、多重特異性抗体がクロマトグラフィー材料を貫流する場合、装填緩衝液は、多重特異性抗体がクロマトグラフィーを貫流するようなｐＨ及び伝導度のために最適化されるが、不純物は、クロマトグラフィー材料によって保持されるか、または多重特異性抗体より異なる速さでクロマトグラフィー材料を貫流する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体または抗体のアームを含む溶液の装填密度は、親和性クロマトグラフィー材料（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー材料）の約１０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、または約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかを超える。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体または抗体のアームを含む溶液の装填密度は、捕獲クロマトグラフィー材料（親和性クロマトグラフィー材料、例えば、プロテインＡクロマトグラフィー材料、プロテインＧクロマトグラフィー材料、プロテインＡ／Ｇクロマトグラフィー材料、またはプロテインＬクロマトグラフィー材料など）の約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌである。
【０１４６】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、アニオン交換クロマトグラフィー材料（例えば、Ｑセファロース（登録商標）ファストフロー（ＱＳＦＦ））に装填される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、または約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかを超えるアニオンクロマトグラフィー材料（例えば、Ｑセファロース（登録商標）ファストフロー（ＱＳＦＦ））の多重特異性抗体の装填密度で、アニオン交換クロマトグラフィー材料に装填される。いくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌのうちのいずれかのアニオン交換クロマトグラフィー材料（例えば、Ｑセファロース（登録商標）ファストフロー（ＱＳＦＦ））の多重特異性抗体の装填密度で、アニオン交換クロマトグラフィー材料に装填される。
【０１４７】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、捕獲クロマトグラフィーの後（任意に、本明細書に記載されるクロマトグラフィー操作のうちのいずれかを含む捕獲クロマトグラフィー及び１つ以上の追加のクロマトグラフィーのステップの後）に得られる溶出物は、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、または約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかを超える第１の混合モードクロマトグラフィー材料（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー材料またはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー材料）の多重特異性抗体の装填密度で、第１の混合モードクロマトグラフィー材料に装填される。いくつかの実施形態では、捕獲モードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌのうちのいずれかの第１の混合モードクロマトグラフィー材料（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー材料またはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー材料）の多重特異性抗体の装填密度で、第１の混合モードクロマトグラフィー材料に装填される。
【０１４８】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、または約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかを超える多重特異性抗体の装填密度で、第２の混合モードクロマトグラフィー材料（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー材料またはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー材料）に装填される。いくつかの実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌのうちのいずれかの混合モードクロマトグラフィー材料（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー材料またはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー材料）の多重特異性抗体の装填密度で、第２の混合モードクロマトグラフィー材料に装填される。
【０１４９】
本明細書に記載される方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ、約１１０ｇ／Ｌ、約１２０ｇ／Ｌ、約１３０ｇ／Ｌ、約１４０ｇ／Ｌ、または約１５０ｇ／Ｌのうちのいずれかを超える逐次的なクロマトグラフィー材料の多重特異性抗体の装填密度で、逐次的なクロマトグラフィー材料（疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー材料、アニオン交換クロマトグラフィー材料、カチオン交換クロマトグラフィー材料、サイズ排除クロマトグラフィー材料、親和性クロマトグラフィー材料、または追加の混合モードクロマトグラフィー材料など）に装填される。いくつかの実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィーの後に得られる溶出物は、約１０ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ〜約４０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、約６０ｇ／Ｌ〜約７０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ〜約８０ｇ／Ｌ、約８０ｇ／Ｌ〜約９０ｇ／Ｌ、約９０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌのうちのいずれかの逐次的なクロマトグラフィー材料の多重特異性抗体の装填密度で、逐次的なクロマトグラフィー材料（疎水性相互作用（ＨＩＣ）クロマトグラフィー材料、アニオン交換クロマトグラフィー材料、カチオン交換クロマトグラフィー材料、サイズ排除クロマトグラフィー材料、親和性クロマトグラフィー材料、または追加の混合モードクロマトグラフィー材料など）に装填される。
【０１５０】
溶出は、本明細書で使用されるとき、生成物、例えば、多重特異性抗体または抗体のアームのクロマトグラフィー材料からの除去である。溶出緩衝液は、クロマトグラフィー材料から対象の多重特異性抗体または他の生成物を溶出させるために使用される緩衝液である。多くの場合、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる物理的特徴を有する。例えば、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる伝導度または装填緩衝液とは異なるｐＨを有し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも低い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも高い伝導度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも低いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液よりも高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液とは異なる伝導度及び異なるｐＨを有する。溶出緩衝液は、より高いまたはより低い伝導度及びより高いまたはより低いｐＨの任意の組み合わせを有し得る。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、クロマトグラフィー材料からの多重特異性抗体の溶出は、最小不純物及び最小溶出体積またはプール体積で生成物の産出のために最適化される。例えば、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体のアームを含む組成物は、装填緩衝液中のクロマトグラフィー材料、例えば、クロマトグラフィーカラムに装填され得る。装填が完了した時点で、多重特異性抗体または抗体のアームは、溶出緩衝液の伝導度を一定に保ちながら、いくつかの異なるｐＨ値の緩衝液で溶出される。あるいは、多重特異性抗体または抗体のアームは、溶出緩衝液のｐＨを一定に保ちながら、いくつかの異なる伝導度の溶出緩衝液中のクロマトグラフィー材料から溶出され得る。クロマトグラフィー材料からの多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体のアームの溶出が完了した時点で、プール画分中の不純物の量は、所与のｐＨまたは伝導度に対する多重特異性抗体または抗体のアームの不純物からの分離に関する情報を提供する。多数のカラム体積（例えば、８カラム体積）における多重特異性抗体または抗体のアームの溶出は、溶出プロファイルの「テーリング」を示す。いくつかの実施形態では、溶出のテーリングは、最小化される。
【０１５２】
例えば、緩衝液の所望のｐＨ、緩衝液の所望の伝導度、対象のタンパク質の特徴、クロマトグラフィー材料、及び精製プロセス（例えば、「結合及び溶出」または「フロースルー」モード）に応じて用いられ得る様々な緩衝液。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの緩衝液の使用を含む。緩衝液は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、溶出緩衝液、または洗浄緩衝液であり得る。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、溶出緩衝液、及び／または洗浄緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液など）のうちの１つ以上は同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液など）は異なる。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、緩衝液は塩を含む。装填緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液など）は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、トリス、アルギニン、リン酸塩、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、ビストリス、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、クエン酸塩、コハク酸塩、またはそれらの混合物を含み得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、塩化ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。ある特定の実施形態では、緩衝液は、トリス、アルギニン、リン酸塩、ＭＥＳ、ＣＨＥＳ、またはＭＯＰＳ緩衝液である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、トリスを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニンを含む。
【０１５３】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液など）は、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。伝導度は、約１ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍ、または約５ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、伝導度は、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、または約２０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかである。一態様では、伝導度は、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液の伝導度である。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液など）のうちの１つ以上の伝導度は同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液の伝導度は、洗浄緩衝液及び／または平衡化緩衝液の伝導度とは異なる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、装填緩衝液の伝導度未満の伝導度を有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、約０ｍＳ／ｃｍ、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４．０ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、または約７．０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれか未満の伝導度を有する。伝導度は、約０ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、または約４ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約０ｍＳ／ｃｍ〜約５．０ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜約５ｍＳ／ｃｍ、約２ｍＳ／ｃｍ〜約５ｍＳ／ｃｍ、約３ｍＳ／ｃｍ〜約５ｍＳ／ｃｍ、または約４ｍＳ／ｃｍ〜約５ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）の伝導度は、約０ｍＳ／ｃｍ、約０．５ｍＳ／ｃｍ、約１．０ｍＳ／ｃｍ、約１．５ｍＳ／ｃｍ、約２．０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ、約３．０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ、約４ｍＳ／ｃｍ、約４．５ｍＳ／ｃｍ、約５．０ｍＳ／ｃｍ、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、または約７．０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、装填緩衝液の伝導度を超える伝導度を有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍ、約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約１６ｍＳ／ｃｍ、約１７．０ｍＳ／ｃｍ、約１８．０ｍＳ／ｃｍ、約１９．０ｍＳ／ｃｍ、約２０．０ｍＳ／ｃｍ、約２１．０ｍＳ／ｃｍ、約２２．０ｍＳ／ｃｍ、約２３．０ｍＳ／ｃｍ、約２４．０ｍＳ／ｃｍ、約２５．０ｍＳ／ｃｍ、約２６．０ｍＳ／ｃｍ、約２７．０ｍＳ／ｃｍ、約２８．０ｍＳ／ｃｍ、約２９．０ｍＳ／ｃｍ、または約３０．０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかを超える伝導度を有する。伝導度は、約５．５ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約７ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約８ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約９ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、または約１０ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液の伝導度は、約５．５ｍＳ／ｃｍ、約６．０ｍＳ／ｃｍ、約６．５ｍＳ／ｃｍ、約７．０ｍＳ／ｃｍ、約７．５ｍＳ／ｃｍ、約８．０ｍＳ／ｃｍ、約８．５ｍＳ／ｃｍ、約９．０ｍＳ／ｃｍ、約９．５ｍＳ／ｃｍ、約１０ｍＳ／ｃｍ、約１１ｍＳ／ｃｍ、約１２ｍＳ／ｃｍ、約１３ｍＳ／ｃｍ、約１４ｍＳ／ｃｍ、約１５ｍＳ／ｃｍ、約１６ｍＳ／ｃｍ、約１７．０ｍＳ／ｃｍ、約１８．０ｍＳ／ｃｍ、約１９．０ｍＳ／ｃｍ、約２０．０ｍＳ／ｃｍ、約２１．０ｍＳ／ｃｍ、約２２．０ｍＳ／ｃｍ、約２３．０ｍＳ／ｃｍ、約２４．０ｍＳ／ｃｍ、約２５．０ｍＳ／ｃｍ、約２６．０ｍＳ／ｃｍ、約２７．０ｍＳ／ｃｍ、約２８．０ｍＳ／ｃｍ、約２９．０ｍＳ／ｃｍ、または約３０．０ｍＳ／ｃｍのうちのいずれかである。上記の実施形態のうちのいずれかのいくつかの態様では、溶出緩衝液の伝導度（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、段階勾配または線形勾配によって装填物及び／または洗浄緩衝液から変更される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む溶液は、約＜６．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する装填緩衝液中の第１の混合モードクロマトグラフィー材料に装填され、ポリペプチドは、約１．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する溶出緩衝液中の第１の混合クロマトグラフィー材料から溶出される。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約６．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し、溶出緩衝液は、約３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約５．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し、溶出緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約５．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し、溶出緩衝液は、約１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。上記の実施形態のさらなる実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。上記の実施形態のさらなる実施形態では、第１の混合モードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂である。
【０１５７】
上記の実施形態のうちのいずれかのいくつかの態様では、溶出緩衝液の伝導度は、段階勾配または線形勾配によって装填物及び／または洗浄緩衝液から変更される。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、＜６．５ｍＳ／ｃｍで第１の混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）に装填され、多重特異性抗体は、約１．５ｍＳ／ｃｍまでの段階伝導勾配によって第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む溶液は、約＜６．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する装填緩衝液中の第２の混合モードクロマトグラフィー材料に装填され、ポリペプチドは、約１．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する溶出緩衝液中の第２の混合クロマトグラフィー材料から溶出される。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約６．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し、溶出緩衝液は、約３ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約５．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し、溶出緩衝液は、約２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。いくつかの実施形態では、装填緩衝液は、約５．５ｍＳ／ｃｍの伝導度を有し、溶出緩衝液は、約１ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する。上記の実施形態のさらなる実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。上記の実施形態のさらなる実施形態では、第２の混合モードクロマトグラフィー材料は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂である。
【０１５９】
上記の実施形態のうちのいずれかのいくつかの態様では、溶出緩衝液の伝導度は、段階勾配または線形勾配によって装填物及び／または洗浄緩衝液から変更される。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、＜６．５ｍＳ／ｃｍで第２の混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）に装填され、多重特異性抗体は、約１．５ｍＳ／ｃｍまでの段階伝導勾配によって第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、＜２．５ｍＳ／ｃｍでアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＱＳＦＦクロマトグラフィー）に装填され、多重特異性抗体は、約８．６ｍＳ／ｃｍまでの段階伝導勾配によってアニオン交換クロマトグラフィーから溶出される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約５．０ｍＳ／ｃｍでカチオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＰＯＲＯＳ５０ＨＳクロマトグラフィー）に装填され、多重特異性抗体は、約２７．５ｍＳ／ｃｍまでの段階伝導勾配によってカチオン交換クロマトグラフィーから溶出される。
【０１６２】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液など）は、約１０、約９、約８、約７、約６、または約５のうちのいずれか未満のｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、装填緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液など）は、約４、約５、約６、約７、約８、または約９のうちのいずれかを超えるｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。装填緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液など）は、約４〜約９、約４〜約８、約４〜約７、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５〜約６のうちのいずれかのｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。いくつかの実施形態では、装填緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液など）のｐＨは、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、または約８のうちのいずれかのｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ｐＨは、装填緩衝液、平衡化緩衝液、または洗浄緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのために使用される装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液など）のｐＨであり得る。いくつかの実施形態では、装填緩衝液、平衡化緩衝液、及び／または洗浄緩衝液のうちの１つ以上のｐＨは、同じである。いくつかの実施形態では、装填緩衝液のｐＨは、平衡化緩衝液及び／または洗浄緩衝液のｐＨとは異なる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、装填緩衝液のｐＨ未満のｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２のうちのいずれか未満のｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。溶出緩衝液のｐＨは、約４〜約９、約４〜約８、約４〜約７、約４〜約６、約４〜約５、約５〜約９、約５〜約８、約５〜約７、約５〜約６、約６〜約９、約６〜約８、約６〜約７のうちのいずれかであり得、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）のｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、または約９．０のうちのいずれかであり、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、装填緩衝液のｐＨを超えるｐＨを有する。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液（第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、約５、約６、約７、約８、または約９のうちのいずれかを超えるｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）は、約２、約４、または約４のうちのいずれかを超えるｐＨを有し、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）のｐＨは、約２〜約９、約３〜約９、約４〜約９、約２〜約８、約３〜約８、約４〜約８、約２〜約７、約３〜約７、約４〜約７、約２〜約６、約３〜約６、及び約４〜約６のうちのいずれかであり得、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０のうちのいずれかであり、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体または抗体のアームを含む溶液は、約ｐＨ７で親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）に装填され、多重特異性抗体または抗体のアームは、約２．９のｐＨまでの段階勾配によって親和性クロマトグラフィーから溶出される。
【０１６６】
上記の実施形態のうちのいずれかのいくつかの態様では、溶出緩衝液（捕獲クロマトグラフィー、第１の混合モードクロマトグラフィー、第２の混合モードクロマトグラフィー、及び／またはアニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、追加の混合モードクロマトグラフィー等などの任意の追加のクロマトグラフィーのための溶出緩衝液など）のｐＨは、段階勾配または線形勾配によって装填物及び／または洗浄緩衝液から変更される。
【０１６７】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、流量は、約５０ＣＶ／時間、約４０ＣＶ／時間、または約３０ＣＶ／時間のうちのいずれか未満である。流量は、約５ＣＶ／時間〜約５０ＣＶ／時間、約１０ＣＶ／時間〜約４０ＣＶ／時間、または約１８ＣＶ／時間〜約３６ＣＶ／時間のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、流量は、約９ＣＶ／時間、約１８ＣＶ／時間、約２５ＣＶ／時間、約３０ＣＶ／時間、約３６ＣＶ／時間、または約４０ＣＶ／時間のうちのいずれかである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、流量は、約１００ｃｍ／時間、約７５ｃｍ／時間、または約５０ｃｍ／時間のうちのいずれか未満である。流量は、約２５ｃｍ／時間〜約１５０ｃｍ／時間、約２５ｃｍ／時間〜約１００ｃｍ／時間、約５０ｃｍ／時間〜約１００ｃｍ／時間、または約６５ｃｍ／時間〜約８５ｃｍ／時間のうちのいずれかであり得る。
【０１６８】
床高さは、使用されるクロマトグラフィー材料の高さである。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、床高さは、約５ｃｍ、約１０ｃｍ、約１５ｃｍ、約２０ｃｍ、約２５ｃｍ、約３０ｃｍ、約３５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、または約５０ｃｍのうちのいずれかを超える。いくつかの実施形態では、床高さは、約５ｃｍ〜約５０ｃｍである。いくつかの実施形態では、床高さは、装填物中のポリペプチドまたは混入物の量に基づいて決定される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーは、約１ｍＬ、約２ｍＬ、約３ｍＬ、約４ｍＬ、約５ｍＬ、約６ｍＬ、約７ｍＬ、約８ｍＬ、約９ｍＬ、約１０ｍＬ、約１５ｍＬ、約２０ｍＬ、約２５ｍＬ、約３０ｍＬ、約４０ｍＬ、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２５Ｌ、約５０Ｌ、約１００Ｌ、約２００Ｌ、約３００Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、または約１０００Ｌを超える体積を有するカラムまたは容器内である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、画分は、クロマトグラフィーから収集される。いくつかの実施形態では、収集される画分は、約０．０１ＣＶ、約０．０２ＣＶ、約０．０３ＣＶ、約０．０４ＣＶ、約０．０５ＣＶ、約０．０６ＣＶ、約０．０７ＣＶ、約０．０８ＣＶ、約０．０９ＣＶ、約０．１ＣＶ、約０．２ＣＶ、約０．３ＣＶ、約０．４ＣＶ、約０．５ＣＶ、約０．６ＣＶ、約０．７ＣＶ、約０．８ＣＶ、約０．９ＣＶ、約１．０ＣＶ、約２．０ＣＶ、約３．０ＣＶ、約４．０ＣＶ、約５．０ＣＶ、約６．０ＣＶ、約７．０ＣＶ、約８．０ＣＶ、約９．０ＣＶ、または約１０．０ＣＶを超える。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、精製されたまたは部分的に精製された生成物、例えば、多重特異性抗体（二重特異性抗体または二価のＦ（ａｂ’）２）または抗体のアームまたはＦａｂを含む画分はプールされる。画分中のポリペプチドの量は、当業者によって決定され得、例えば、画分中のポリペプチドの量は、紫外分光法によって決定され得る。ある特定の実施形態では、画分は、ＯＤ２８０が、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、及び約１．０のうちのいずれかを超える場合に収集される。ある特定の実施形態では、画分は、ＯＤ２８０が、約０．５〜約１．０、約０．６〜約１．０、約０．７〜約１．０、約０．８〜約１．０、または約０．９〜約１．０のうちのいずれかである場合に収集される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）または抗体のアームを含む画分はプールされる。
【０１７２】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、不純物は、生成物特異的不純物である。生成物特異的不純物の例としては、これらに限定されないが、非対半抗体、非対抗体軽鎖、非対重鎖、抗体断片、ホモ二量体（例えば、同じ重鎖及び軽鎖を含む二重特異性抗体の対半二量体）、凝集体、高分子量種（ＭＨＷＳ）（超高分子量種（ｖＨＭＷＳ））、誤対合ジスルフィドを有する多重特異性抗体、軽鎖二量体、重鎖二量体、低分子量種（ＬＭＷＳ）、及び荷電バリアント（抗体の酸性バリアント及び塩基性バリアントなど）が挙げられる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、非対半抗体のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び非対半抗体を含む組成物から除去または低減する。組成物中の非対半抗体の存在またはレベルを測定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、質量分析（液体クロマトグラフィー−質量分析など）、ＣＥ−ＳＤＳ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ  ＨＰＬＣによる。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の非対半抗体の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の非対半抗体の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中の非対半抗体の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、非対半抗体の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の非対半抗体の量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中の非対半抗体の量と比較することによって測定される。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、ホモ二量体のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及びホモ二量体を含む組成物から除去及び低減する。組成物中のホモ二量体の存在またはレベルを測定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、質量分析（液体クロマトグラフィー−質量分析など）、逆相ＨＰＬＣ、及びＨＩＣ  ＨＰＬＣによる。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のホモ二量体の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のホモ二量体の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中のホモ二量体の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、ホモ二量体の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のホモ二量体の量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中のホモ二量体の量と比較することによって測定される。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、高分子量種（ＨＭＷＳ）タンパク質のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及びＨＭＷＳタンパク質を含む組成物から除去または低減する。ＨＭＷＳタンパク質は、例えば、凝集体化ポリペプチド（凝集体化多重特異性抗体、凝集体化半抗体、凝集体化ホモ二量体等など）を含み得る。ある特定の実施形態では、凝集体化ポリペプチドは、重鎖多量体、軽鎖多量体、及び／または多重特異性抗体の多量体を含む。ＨＭＷＳタンパク質は、重鎖または軽鎖の２、３、４、５、６、７、または８、またはそれ以上の単量体、または２、３、４、５、６、７、または８、またはそれ以上の凝集体化多重特異性抗体を含み得る。凝集体化タンパク質（例えば、ＨＭＷＳタンパク質）を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１１／１５０１１０に記載されている。そのような方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）、及び液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＨＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＨＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中のＨＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、ＨＭＷＳタンパク質の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＨＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中のＨＭＷＳタンパク質の量と比較することによって測定される。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、低分子量種（ＬＭＷＳ）タンパク質のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及びＬＭＷＳタンパク質を含む組成物から除去または低減する。ＬＭＷＳタンパク質は、断片化ポリペプチドを含み得る。ある特定の実施形態では、断片化ポリペプチドは、多重特異性抗体の断片、抗体のアームの断片、重鎖断片、または軽鎖断片である。ＬＭＷＳタンパク質の例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ（すなわち、断片抗原結合）、Ｆｃ（断片、結晶化可能）、領域、もしくは両方の組み合わせ、または対象の多重特異性抗体、重鎖、もしくは軽鎖の任意のランダム断片化部分、または１／２抗体（１つの抗体の軽鎖／重鎖対を含む）もしくは３／４抗体（本明細書でＨＨＬとも示される、抗体重鎖及び抗体軽鎖のヘテロ二量体またはホモ二量体を含む）が挙げられる。断片化タンパク質（例えば、ＬＭＷＳタンパク質）を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１１／１５０１１０に記載されている。そのような方法は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）、及び液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＬＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＬＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中のＬＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、ＬＭＷＳタンパク質の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＬＭＷＳタンパク質の量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中のＬＭＷＳタンパク質の量と比較することによって測定される。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、酸性及び／または塩基性バリアントのレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）ならびに酸性及び／または塩基性バリアントを含む組成物から除去または低減する。抗体（多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体など）の酸性バリアントは、抗体のｐＩが天然の無傷の抗体のｐＩ未満のバリアントである。抗体（多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体など）の塩基性バリアントは、抗体のｐＩが天然の無傷の抗体のｐＩを超えるバリアントである。そのような荷電バリアント（例えば、酸性及び塩基性バリアント）は、酸化、脱アミド化、リジン残基のＣ末端処理、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、及び抗体のグリコシル化などの自然プロセスの結果であり得る。荷電バリアントを測定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、画像キャピラリーなどの電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）である。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の荷電バリアントの量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の荷電バリアントの量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中の荷電バリアントの量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、荷電バリアントの存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の荷電バリアントの量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中の荷電バリアントの量と比較することによって測定される。
【０１７８】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、不純物は、プロセス特異的不純物である。例えば、プロセス特異的不純物は、浸出されたプロテインＡ、宿主細胞物質、核酸、他のポリペプチド、内毒素、ウイルス性混入物、細胞培養培地構成成分、カルボキシペプチダーゼＢ、ゲンタマイシンなどのうちの１つ以上を含み得る。ある特定の実施形態では、プロセス特異的不純物は、例えば、原核生物細胞、細菌性細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞など）、昆虫細胞、真核細胞、真菌細胞、酵母細胞、鳥類細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）であり得る。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、浸出されたプロテインＡのレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び浸出されたプロテインＡを含む組成物から除去及び低減する。浸出されたプロテインＡは、それが結合されている固相から分離また洗浄されたプロテインＡである。例えば、浸出されたプロテインＡは、プロテインＡクロマトグラフィーカラムから浸出され得る。プロテインＡの量は、ＷＯ２０１１／１５０１１０に記載されているように、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。ある特定の実施形態では、浸出されたプロテインＡの存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の浸出されたプロテインＡの量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中の浸出されたプロテインＡの量と比較することによって測定される。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及びＨＣＰを含む組成物から除去及び低減する。ＨＣＰは、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）が産生された宿主細胞からのタンパク質である。ある特定の実施形態では、ＨＣＰタンパク質は、原核生物細胞からのタンパク質である。ある特定の実施形態では、ＨＣＰは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞からのタンパク質である（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質またはＥＣＰ）。原核生物ＨＣＰ（ＥＣＰなど）の例としては、これらに限定されないが、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及びＤｓｂＣなどの原核生物シャペロンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＨＣＰは、本明細書の他の箇所で説明されるものなどの真核宿主細胞からのタンパク質である。ある特定の実施形態では、ＨＣＰ、ＣＨＯ細胞タンパク質などの哺乳動物細胞からのタンパク質である（すなわち、チャイニーズハムスター卵巣タンパク質またはＣＨＯＰ）。ある特定の実施形態では、ＨＣＰ（例えば、ＥＣＰ、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、もしくはＤｓｂＣ、または、例えば、ＣＨＯＰ）の量は、酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）によって測定される。例えば、抗体は、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、またはＤｓｂＣの超高純度組成物に対して産生され得る。ある特定の実施形態では、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及び／またはＤｓｂＣの量は、質量分析によって測定される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＨＣＰ（例えば、ＥＣＰ、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、もしくはＤｓｂＣ、または、例えば、ＣＨＯＰ）の量。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物（クロマトグラフィーの画分など）中のＨＣＰ（例えば、ＥＣＰ、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、もしくはＤｓｂＣ、または、例えば、ＣＨＯＰ）の量は、約１００ｐｐｍ、約７５ｐｐｍ、約５０ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約５、ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、または約１ｐｐｍ未満に低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。いくつかの実施形態では、組成物（クロマトグラフィーの画分など）中のＨＣＰ（例えば、ＥＣＰ、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、もしくはＤｓｂＣ、または、例えば、ＣＨＯＰ）は、約１００ｐｐｍ未満、約７５ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約２５ｐｐｍ未満、約２０ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、約５ｐｐｍ未満、約２ｐｐｍ未満、または約１ｐｐｍ未満に低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、ＨＣＰ（例えば、ＥＣＰ、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、もしくはＤｓｂＣ、または、例えば、ＣＨＯＰ）の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中のＨＣＰの量（クロマトグラフィーの画分など）を精製ステップ（複数可）の前に組成物中のＨＣＰの量と比較することによって測定される。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、核酸（宿主細胞ＤＮＡ及び／またはＲＮＡなど）のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び核酸を宇組む組成物から除去または低減する。核酸（宿主細胞ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ）を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＷＯ２０１１／１５０１１０に記載されている。そのような方法は、例えば、宿主細胞ＤＮＡまたはＲＮＡのＰＣＲを含む。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の核酸の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の核酸の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中の核酸の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、核酸の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の核酸の量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中の核酸の量と比較することによって測定される。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、細胞培養培地構成成分のレベルを多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び細胞培養培地構成成分を含む組成物から除去または低減する。「細胞培養培地構成成分」とは、細胞培養培地中に存在する構成成分を指す。ある特定の実施形態では、「細胞培養培地」とは、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）またはそのアームを発現する宿主細胞（複数可）が採取される時点での細胞培養培地を指す。ある特定の実施形態では、細胞培養培地構成成分は、インスリン、またはテトラサイクリンである。ある特定の実施形態では、インスリン、またはテトラサイクリンの量は、ＥＬＩＳＡによって測定される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかのある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の細胞培養培地構成成分の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％のうちのいずれかを超えて低減され、これらの値の間のいずれかの範囲を含む。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、１つ以上の精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の細胞培養培地構成成分の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０〜約９５％、約１０％〜約９９％、約２０％〜約９５％、約２０％〜約９９％、約３０％〜約９５％、約３０％〜約９９％、約４０％〜約９５％、約４０％〜約９９％、約５０％〜約９５％、約５０％〜約９９％、約６０％〜約９５％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９５％、約７０％〜約９９％、約８０％〜約９５％、約８０％〜約９９％、約９０％〜約９５％、または約９０％〜約９９％のうちのいずれかに低減される。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞培養培地構成成分の量（クロマトグラフィーの画分など）は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％のうちのいずれかに低減される。ある特定の実施形態では、細胞培養培地構成成分の存在またはレベルの低減は、精製ステップ（複数可）から回収される組成物中の細胞培養培地構成成分の量（クロマトグラフィーの画分など）を、精製ステップ（複数可）の前に組成物中の細胞培養培地構成成分の量と比較することによって測定される。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、第１のアーム及び第２のアーム含む二重特異性抗体を精製する方法が本明細書に提供され、第１及び第２のアームは、別々に生成され、方法は、第１及び第２のアームを結合及び溶出モードで操作される捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて、第１及び第２の捕獲溶出物を生成すること；多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で第１及び第２の捕獲溶出物を含む混合物を形成すること；多重特異性抗体を含む組成物を結合及び溶出モードでアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑセファロース（登録商標）ファストフロー（ＱＳＦＦ）クロマトグラフィー）にかけて、溶出が勾配溶出であるアニオン交換溶出物を生成すること；アニオン交換溶出物を結合及び溶出モードでアニオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー）にかけて、溶出が勾配溶出である第１の混合モード溶出物を生成すること；ならびに第１の混合モード溶出物を結合及び溶出モードでカチオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）にかけて、溶出が勾配溶出である第２の混合モード溶出物を生成し、二重特異性抗体を含む画分を収集すること、を含み、方法は、第１及び第２のアームを含む混合物に対して画分中の不純物の量を低減する。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、第１のアーム及び第２のアーム含む二重特異性抗体を精製する方法が本明細書に提供され、第１及び第２のアームは、別々に生成され、方法は、第１及び第２のアームを結合及び溶出モードで捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて、第１及び第２の捕獲溶出物を生成することと；多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で第１及び第２の捕獲溶出物を含む混合物を形成すること；多重特異性抗体を含む組成物を結合及び溶出モードでカチオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）にかけて第１の混合モード溶出物を生成することとを含み、溶出は、ｐＨ及び塩の段階溶出であり、方法はさらに、第１の混合モード溶出物をフロースルーモードでアニオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー）にかけて、第２の混合モード溶出物を生成することと、二重特異性抗体を含む画分を収集することと、を含み、方法は、第１及び第２のアームを含む混合物に対して画分中の不純物の量を低減する。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、第１のアーム及び第２のアーム含む二重特異性抗体を精製する方法が本明細書に提供され、第１及び第２のアームは、別々に生成され、方法は、第１及び第２のアームを結合及び溶出モードで捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて、第１及び第２の捕獲溶出物を生成すること；多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で第１及び第２の捕獲溶出物を含む混合物を形成すること；多重特異性抗体を含む組成物を、溶出が段階溶出である結合及び溶出モードでアニオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー）にかけて、第１の混合モード溶出物を生成すること；第１の混合モード溶出物を結合及び溶出モードでカチオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）にかけて、溶出が段階溶出である第２の混合モード溶出物を生成し、第２の混合モード溶出物をフロースルーモードで疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、へキシル−６５０Ｃクロマトグラフィー）にかけて、疎水性相互作用溶出物を生成すること；ならびに二重特異性抗体を含む画分を収集すること、を含み、方法は、第１及び第２のアームを含む混合物に対して画分中の不純物の量を低減する。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、第１のアーム及び第２のアームを含む二重特異性抗体（二重特異性Ｆ（ａｂ’）２など）を精製する方法が本明細書に提供され、第１及び第２のアームは、別々に生成され、方法は、第１のアームを結合及び溶出モードで操作される捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて第１の捕獲溶出物を生成すること；第１の捕獲溶出物を結合及び溶出モードでカチオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）にかけて第１の混合モード溶出物を生成すること；第２のアームを結合及び溶出モードで操作される捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて第２の捕獲溶出物を生成すること；多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で第１の混合モード溶出物及び第２の捕獲溶出物を含む混合物を形成すること；多重特異性抗体を含む組成物をアニオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーなど）にかけて第２の混合モード溶出物を生成すること；ならびに第２の混合モード溶出物を結合及び溶出モードでカチオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０ＨＳクロマトグラフィー）にかけてカチオン交換溶出物を生成すること；カチオン交換溶出物を結合及び溶出モードで逐次的なカチオン交換混合モードクロマトグラフィーにかけて第３の混合モード溶出物を生成すること；ならびに二重特異性抗体を含む画分を収集すること、を含み、方法は、第１及び第２のアームを含む混合物に対して画分中の不純物の量を低減する。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、第１のアーム及び第２のアームを含む二重特異性抗体（二重特異性Ｆ（ａｂ’）２など）を精製する方法が本明細書に提供され、第１及び第２のアームは、別々に生成され、方法は、第１のアームを結合及び溶出モードで捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて、第１の捕獲溶出物を生成すること；第１の捕獲溶出物を結合及び溶出モードでカチオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）にかけて、第１の混合モード溶出物を生成すること；第２のアームを結合及び溶出モードで操作される捕獲クロマトグラフィー（本明細書の他の箇所で説明される捕獲クロマトグラフィーのステップのうちのいずれか１つまたは組み合わせなど）にかけて、第２の捕獲溶出物を生成すること；多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で第１の混合モード溶出物及び第２の捕獲溶出物を含む混合物を形成すること；多重特異性抗体を含む組成物をアニオン交換混合モードクロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーなど）にかけて第２の混合モード溶出物を生成すること；ならびに第２の混合モード溶出物を結合及び溶出モードでカチオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー）にかけて、第３の混合モード溶出物を生成すること；ならびに二重特異性抗体を含む画分を収集すること、を含み、方法は、第１及び第２のアームを含む混合物に対して画分中の不純物の量を低減する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ウイルス濾過によってさらに精製される。ウイルス濾過は、ポリペプチド精製供給流中のウイルス性混入物の除去である。ウイルス濾過の例は、例えば、限外濾過及び精密濾過が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、パルボウイルスフィルターを使用して精製される。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、クロマトグラフィー後（例えば、第２の混合モードクロマトグラフィー後、または第２の混合モードクロマトグラフィー後に行われるクロマトグラフィーのステップのうちの１つ以上の後）に濃縮される。濃縮方法の例は、当該技術分野で既知であり、これらに限定されないが、例えば、限外濾過及び透析濾過（ＵＦＤＦ）を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、第１の精密濾過、透析濾過、及び第２の限外濾過によって濃縮される。いくつかの実施形態では、限外濾過及び／または透析濾過は、約５ｋＤａｌ、約１０ｋＤａｌ、約１５ｋＤａｌ、約２０ｋＤａｌ、または約２５ｋＤａｌもしくは約３０ｋＤａｌのうちのいずれか未満の切断を有するフィルターを使用する。いくつかの実施形態では、第１の限外濾過の保持物は、薬学的製剤に透析濾過される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、濃縮後の多重特異性抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、または約３００ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体の濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ〜約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ〜約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ〜約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ〜約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ〜約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ〜約１９０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬまたは約３００ｍｇ／ｍＬのうちのいずれかである。
【０１９２】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体を用いる精製の方法の精製されたポリペプチドを組み合わせることをさらに含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、限外濾過／透析濾過によって薬学的製剤に製剤化される。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のうちのいずれかを超えて純粋である多重特異性抗体を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、組成物中の多重特異性抗体は、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちのいずれかを超えて純粋である。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下の非対抗体のアームを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下のホモ二量体を含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、または約５％のうちのいずれか以下の凝集体化タンパク質を含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下のＨＭＷＳを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下のＬＭＷＳを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のうちのいずれか以下の酸性バリアントを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下の塩基性バリアントを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍのうちのいずれか以下の浸出されたプロテインＡを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ、または約３５ｐｐｍのうちのいずれか以下のＨＣＰを含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍのうちのいずれか以下の核酸を含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、０ｐｐｍ以下の核酸を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物中の核酸は、検出のレベル未満である。ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下の細胞培養培地構成成分を含む多重特異性抗体を含む組成物を生成する。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれか１つに従って精製される多重特異性抗体を含む組成物が提供される。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、組成物中の多重特異性抗体は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のうちのいずれかを超えて純粋である。ある特定の実施形態では、組成物中の多重特異性抗体は、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちのいずれかを超えて純粋である。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下の非対抗体のアームを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下のホモ二量体を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、または約５％のうちのいずれか以下の凝集体化タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下のＨＭＷＳを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下のＬＭＷＳを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のうちのいずれか以下の酸性バリアントを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下の塩基性バリアントを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍのうちのいずれか以下の浸出されたプロテインＡを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ、または約３５ｐｐｍのうちのいずれか以下のＨＣＰを含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ、または約３５ｐｐｍのうちのいずれか以下の核酸を含む。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物は、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下の細胞培養培地構成成分を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、多重特異性抗体を含む組成物が提供され、組成物は、ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、ｂ）約１％〜約５％未満の非対抗体のアーム、ｃ）約１％〜約５％未満の抗体ホモ二量体、ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び／またはｆ）約５％以下の３／４抗体を含む。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法のうちのいずれか１つに従って精製される二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。
【０２００】
ある特定の実施形態では、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％のうちのいずれかを超えて純粋である二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、組成物中の二重特異性抗体は、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちのいずれかを超えて純粋である。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下の非対抗体のアームを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下のホモ二量体を含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、または約５％のうちのいずれか以下の凝集体化タンパク質を含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下のＨＭＷＳを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％のうちのいずれか以下のＬＭＷＳを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のうちのいずれか以下の酸性バリアントを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下の塩基性バリアントを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍのうちのいずれか以下の浸出されたプロテインＡを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、約０．７ｐｐｍ、約０．８ｐｐｍ、約０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約１．５ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ、約１５ｐｐｍ、約２０ｐｐｍ、約２５ｐｐｍ、約３０ｐｐｍ、または約３５ｐｐｍのうちのいずれか以下のＨＣＰを含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、約２ｐｐｍ、約２．５ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約３．５ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、約４．５ｐｐｍ、約５ｐｐｍ、約５．５ｐｐｍ、約６ｐｐｍ、約６．５ｐｐｍ、約７ｐｐｍ、約７．５ｐｐｍ、約８ｐｐｍ、約８．５ｐｐｍ、約９ｐｐｍ、約９．５ｐｐｍ、または約１０ｐｐｍのうちのいずれか以下の核酸を含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体を含む組成物は、０ｐｐｍ以下の核酸を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体を含む組成物中の核酸は、検出のレベル未満である。ある特定の実施形態では、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、または約３５％のうちのいずれか以下の細胞培養培地構成成分を含む二重特異性抗体を含む組成物が提供される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体を含む組成物が提供され、組成物は、ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の二重特異性抗体、ｂ）約１％〜約５％未満の非対抗体のアーム、ｃ）約１％〜約５％未満の抗体ホモ二量体、ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び／またはｆ）約５％以下の３／４抗体を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ノブインホール（ＫｉＨ）抗体、例えば、ＫｉＨ二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である。
【０２０３】
本明細書に報告される一態様は、マルチステップクロマトグラフィー方法でＦｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドを精製するための方法であり、方法は、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続く２つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、それによって、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、方法は、ｉ．親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、またはｉｉ．親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む。
【０２０５】
本明細書に報告される一態様は、ｉ．Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップ、ｉｉ．Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドを細胞または培養培地から回収するステップ、ｉｉｉ．本明細書に報告される方法でＦｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドを精製し、それによってＦｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質を生成するステップを含むＦｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドを生成する方法である。抗体精製プロセスの性能は、用いられるクロマトグラフィーのステップの配列によることが見出されている。クロマトグラフィーのステップのある特定の配列／順序を選択することによって、改善されたプロセスが得られ得る。
【０２０６】
本明細書に提供される方法は、少なくとも部分的には、（最初の）親和性クロマトグラフィーのステップの（直）後かつマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップの前に、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを行うことによって、限外濾過／透析濾過のステップが省略され得るという知見に基づく。このステップは、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップが、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップの前に行われる場合に必要である。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法は、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む。
【０２０８】
本明細書に記載される方法で、良好な純度及び収率が、３つのクロマトグラフィーのステップのみで達成され得ることが見出されている。
【０２０９】
ある特定の実施形態では、マルチステップクロマトグラフィー方法は、正確に３つのクロマトグラフィーのステップを含む。
【０２１０】
宿主細胞タンパク質の除去は、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー方法／ステップが、フロースルーモードで行われる場合に改善され得ることが見出されている。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー方法／ステップは、フロースルーモードで行われる。
【０２１１】
マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップの装填物のｐＨが、生成物及びＤＮＡ除去によってＨＣＰに影響を与えることが見出されている。全ての態様のうちの１つの好ましい実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップは、約７．０のｐＨで行われる。
表１
2019521986.tif 000003
【０２１２】
溶液の伝導度は、精製プロセスの間に異なるパラメータへの影響を有し得る。ここでは、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップの装填物中の低い伝導値（すなわち、クロマトグラフィー材料に適用されるＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを含む溶液）が、改善されたＨＣＰ及びＤＮＡの除去をもたらすことが見出されている。
表２
2019521986.tif 000004
【０２１３】
ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導値を有する溶液中に適用される。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、６ｍＳ／ｃｍ未満の伝導値を有する溶液中に適用される。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約６ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約５ｍＳ／ｃｍ〜約４ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導値を有する溶液中に適用される。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導性及び約７のｐＨを有する溶液中に適用される。
【０２１５】
本明細書に提供される方法は、少なくとも部分的には、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップのタンパク質の装填物もまた、精製プロセスの性能に影響を与えること見出すことに基づく。装填物が、定義された範囲にある場合、全体の精製プロセスは、例えば、ＤＮＡ混入の除去が改善される。
表３：ＤＮＡの開始量：８０ｐｇ／ｍｇ
2019521986.tif 000005
【０２１６】
ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、クロマトグラフィー材料の１リットル当たり約１００ｇ〜約３００ｇの範囲で適用され、すなわち、装填物は、約１００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌの範囲である。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、クロマトグラフィー材料の１リットル当たり約１２０ｇ〜約２４０ｇの範囲で適用される。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、クロマトグラフィー材料の１リットル当たり約１６０ｇ〜約２００ｇの範囲で適用される。
【０２１７】
ある特定のマルチモーダル樹脂材料が、本明細書に報告される方法において適用されるとき、特に有用であることが見出されている。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料は、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料は、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び０．０８〜０．１１ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍＬ培地のイオン容量を有する。ある特定の実施形態では、マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料は、「Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓ」である。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィー培地は、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィー培地である。ある特定の実施形態では、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィー培地は、高流量アガロースマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び２５〜３９μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する。ある特定の実施形態では、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィー培地は、「Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓ」。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィー方法／ステップは、結合及び溶出モードで行われる。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップは、プロテインＡクロマトグラフィーのステップ、またはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Ｆｖリガンド親和性クロマトグラフィー、またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦｃＸＬクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップは、プロテインＡクロマトグラフィーのステップである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）クロマトグラフィーのステップである。ある特定の実施形態では、親和性クロマトグラフィーのステップは、プロテインＡクロマトグラフィーのステップである。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドは、抗体、二重特異性抗体、またはＦｃ−融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドは、二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドは、ＣｒｏｓｓＭａｂである。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドは、Ｆｃ−融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドは、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、ａ）第１の抗原を特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびにｂ）第２の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含み、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられる。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体タンパク質／ポリペプチドは、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合するＣｒｏｓｓＭａｂである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂである。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、ならびに配列番号１１のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む。配列番号１〜１６のアミノ酸配列は、以下の表４に提供される。
表４
2019521986.tif 000006
2019521986.tif 000007
2019521986.tif 000008
【０２２５】
ある特定の実施形態では、精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約５％以下の３／４抗体を含む。ある特定の実施形態では、精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約４％以下の３／４抗体を含む。ある特定の実施形態では、精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約３％以下の３／４抗体を含む。ある特定の実施形態では、精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約２％以下の３／４抗体を含む。ある特定の実施形態では、精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドは、約１％以下の３／４抗体を含む。
【０２２６】
本明細書に報告される一態様は、マルチステップクロマトグラフィー方法でＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を精製するための方法であり、方法は、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、それによって、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を精製し、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含むか、または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む。
【０２２７】
一実施形態では、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびにｂ）第２の抗原結合部位を含む全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含み、定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられる。
【０２２８】
本明細書に報告される一態様は、Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のための、本明細書に報告される方法の使用である。
【０２２９】
本明細書に報告される一態様は、Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、本明細書に報告される方法の使用である。
【０２３０】
本明細書に報告される一態様は、がんまたは眼疾患の治療のための医薬品の製造のための、本明細書に報告される方法で得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドである。
【０２３１】
本明細書に報告される一態様は、がんまたは眼疾患の治療における使用のための、本明細書に報告される方法で得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドである。
【０２３２】
ポリペプチド
モノクローナル抗体
いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に同種の抗体の集団から得られ、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じる想定される変異体は除外され、そのような変異体は、概して、少量で存在する。したがって「モノクローナル」という修飾語は、個別のまたはポリクローナル抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。
【０２３３】
例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されるハイブリドーマ法により作製されてもよいし、組換えＤＮＡ法によって作製されてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【０２３４】
ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物が本明細書に記載されるように免疫化されて、免疫化に使用されるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。次いで、ポリエチレングリコールなどの適した融剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【０２３５】
このように調製されたハイブリドーマ細胞は、播種され、融合されていない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地で成長する。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻止する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を示すものである。これらの中で、いくつかの実施形態では、骨髄腫細胞株は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するものなどのマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について説明されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２３７】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地は、抗原に対して指向されたモノクローナル抗体の産生に関してアッセイされる。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、または放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって測定される。
【０２３８】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード解析によって測定され得る。
【０２３９】
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され、標準的な方法によって成長され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この目的に好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてインビボで成長し得る。
【０２４０】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、ポリペプチドＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーなどによって、培養培地、腹水、または血清から好適に分離される。
【０２４１】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源としての機能を果たす。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター内に置かれ得て、その後、これが宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンポリペプチドを産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２（１９９３）及びＰｌuｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．，１３０：１５１−１８８（１９９２）が挙げられる。
【０２４２】
さらなる実施形態では、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技法を使用して作製された抗体ファージライブラリーから単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）は、それぞれ、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記載する。その後の刊行物は、非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに組み合わせ感染及びインビボ組換えによる高い親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生を記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体を単離するための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術の実行可能な代替案である。
【０２４３】
ＤＮＡはまた、例えば、コード配列を、相同的なマウス配列の代わりに、ヒトの重及び軽鎖の定常ドメインに置換することによるか（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより修飾されてもよい。
【０２４４】
典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインの代わりに置換されるか、またはそれらが、抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対して特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０２４５】
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭである。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧモノクローナル抗体である。
【０２４６】
抗体断片
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体断片である。抗体断片を産生するための様々な技法が開発されている。従来、これらの断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化により得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２４：１０７−１１７（１９９２）及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞により直接産生され得る。例えば、抗体断片は、上記で考察される抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的にカップリングされて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−１６７（１９９２）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片を産生するための他の技法が、当業者には明らかであろう。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５、米国特許第５，５７１，８９４号、及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、「線状抗体」でもあり得る。そのような線状抗体断片は、単一特異性または二重特異性であり得る。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体の断片が提供される。いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、及びダイアボディからなる群から選択される。
【０２４８】
ポリペプチドバリアント及び修飾
ある特定の実施形態では、本明細書におけるタンパク質のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、タンパク質の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。タンパク質のアミノ酸配列バリアントは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、タンパク質のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが行われて、最終構築に到達することができるが、但し、最終構築物が所望の特性を有することを条件とする。
【０２４９】
「ポリペプチドバリアント」とは、ポリペプチドの全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する本明細書に定義されるポリペプチド、例えば、活性ポリペプチドを意味する。そのようなポリペプチド変異体としては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が完全長天然アミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に付加または欠失されたポリペプチドが挙げられる。通常、ポリペプチドバリアントは、全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、シグナルペプチドを有するかまたは有しないポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％のうちのいずれかのアミノ酸配列同一性を有する。任意に、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して１つ以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは天然ポリペプチド配列と比較して約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個のうちの任意の以下の保存的アミノ酸置換を有する。
【０２５０】
変異体ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端で切断され得るか、または例えば、全長天然ポリペプチドと比較して、内部残基を欠き得る。ある特定の変異体ポリペプチドは、所望の生物学的活性にとって不可欠ではないアミノ酸残基を欠き得る。切断、欠失、及び挿入を有するこれらの変異体ポリペプチドは、いくつかの従来の技法のうちのいずれかによって調製され得る。所望の変異体ポリペプチドは、化学的に合成されたものであり得る。別の好適な技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって所望の変異体ポリペプチドをコードする核酸断片の単離及び増幅することを伴う。核酸断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマー及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、変異体ポリペプチドは、本明細書に開示される天然ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／または免疫学的活性を共有する。
【０２５１】
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドの範囲の長さを有するアミノ末端及び／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を有する抗体、または細胞毒性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体としては、抗体の血清半減期を増大する酵素またはポリペプチドへの抗体のＮ末端またはＣ末端の融合が挙げられる。
【０２５２】
例えば、ポリペプチドの結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸に導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾としては、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／またはそれへの挿入、及び／またはその置換が挙げられる。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物に到達するためになされるが、但し、最終構築物が所望の特徴を有することを条件とする。アミノ酸変化は、ポリペプチド（例えば、抗体）の翻訳後プロセスも改変することができ、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化することができる。
【０２５３】
どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を及ぼすことなく挿入、置換、または欠失され得るかを決定する際の手引きは、ポリペプチドの配列を同種の既知のポリペプチド分子の配列と比較し、かつ相同性の高い領域のアミノ酸配列変化の数を最小限に抑えることによって見出され得る。
【０２５４】
変異誘発の好ましい位置であるポリペプチド（例えば、抗体）のある特定の残基または領域の特定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）によって説明される「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、残基または標的残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が特定され、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置き換えられて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで、置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置は、さらなるまたは他の変異体を置換部位に、またはそこの代わりに導入することにより洗練される。したがって、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されている一方で、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異生成が標的コドンまたは領域で行われ、発現された抗体変異体が所望の活性に関してスクリーニングされる。
【０２５５】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基に置き換えられた抗体分子内に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発に関する最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も企図される。そのような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表５に「例示的な置換」と表示されるか、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるより実質的な変化が導入され、産物がスクリーニングされ得る。
表５
2019521986.tif 000009
【０２５６】
ポリペプチドの生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートもしくは螺旋立体配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、を維持するそれらの効果において大いに異なる置換を選択することによって達成される。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従って群分けされ得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５））。
【０２５７】
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
【０２５８】
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
【０２５９】
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
【０２６０】
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）
【０２６１】
あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群分けされ得る。
【０２６２】
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
【０２６３】
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
【０２６４】
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
【０２６５】
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
【０２６６】
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
【０２６７】
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【０２６８】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのあるメンバーと別のクラスとの交換を伴うことになる。
【０２６９】
抗体の適切な立体配座の維持に関与しない任意のシステイン残基も概してセリンで置換されて、分子の酸化的安定性が改善され、異常な架橋が阻止され得る。逆に、システイン結合（複数可）がポリペプチドに付加されて、その安定性を改善することができる（具体的には、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
【０２７０】
置換バリアントの一例は、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。概して、さらなる開発のために選択されて得られた変異体（複数可）は、それらが生成される親抗体に対して改善された生物学的特性を有する。そのような置換変異体を生成するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟を伴う。簡潔には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７つの部位）は、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成するために変異される。このように生成された抗体変異体は、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として糸状ファージ粒子からの一価様式で表示される。その後、ファージディスプレイされた変異体は、本明細書に開示されるそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を特定するために、アラニンスキャニング変異生成が行われ、抗原結合に著しく寄与する超可変領域残基が特定され得る。あるいは、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と標的との間の接触点を特定することが有益であり得る。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述される技法に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルが本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体がさらなる開発のために選択され得る。
【０２７１】
ポリペプチドの別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。ポリペプチドは、非アミノ酸部分を含み得る。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化され得る。そのようなグリコシル化は、宿主細胞または宿主生物でのポリペプチドの発現中に天然に生じ得るか、またはヒト介入に起因する計画的な修飾であり得る。改変とは、ポリペプチドに見られる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／またはポリペプチド中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。
【０２７２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０２７３】
グリコシル化部位のポリペプチドへの付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。改変は、（Ｏ結合グリコシル化部位のための）元の抗体の配列への１つ以上のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によっても行われ得る。
【０２７４】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的もしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的としての機能を果たすアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって達成され得る。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成され得る。
【０２７５】
他の修飾としては、それぞれ、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基それぞれへの脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のγ−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０２７６】
キメラポリペプチド
本明細書に記載のポリペプチドは、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するための方法で修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に位置する。そのようなエピトープタグ形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。エピトープタグの提供により、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用してポリペプチドが親和性精製によって容易に精製されることも可能になる。
【０２７７】
多重特異性抗体
特定の実施形態において、本明細書に提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、結合特異性の一方は、ｃ−ｍｅｔに対するものであり、他方は、任意の他の抗原に対するものである。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ｃ−ｍｅｔの２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、細胞毒性薬を、ｃ−ｍｅｔを発現する細胞に限局させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
【０２７８】
多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、静電ステアリング効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体またはフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体フラグメントを作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ならびに三重特異性抗体を調製すること（例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）によって作製され得る。
【０２７９】
本明細書における抗体または断片はまた、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ２０１０／１４５７９３に記載される多重特異性抗体を含む。
【０２８０】
「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０２８１】
本明細書における抗体または断片はまた、第１のエピトープ（例えば、第１の抗原上）、ならびに別の異なるエピトープ（例えば、第１の抗原または第２の異なる抗原上）に結合する抗原結合部位を含む「二重作用Ｆａｂ」または「二重作用Ｆａｂ”」（ＤＡＦ）を含む（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０、Ｂｏｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，５９２１，１６１０−１６１４を参照されたい）。
【０２８２】
二重特異性抗体の作製方法が、当該技術分野で既知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）が１０個の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、それらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。親和性クロマトグラフィーステップによって通常行われる正しい分子の精製は幾分面倒であり、産物収率は低い。同様の手順が、１９９３年５月１３日公開のＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に開示されている。
【０２８３】
異なるより好ましいアプローチに従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。融合物のうちの少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物と、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖とをコードするＤＮＡは、別個の発現ベクターに挿入され、好適な宿主生物に共トランスフェクトされる。これにより、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の不等比が最適収率をもたらす実施形態では、３つのポリペプチド断片の相互比率の調整において優れた柔軟性が提供される。しかしながら、等比での少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高収率がもたらされる場合、またはそれらの比が特に重要ではない場合に、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０２８４】
このアプローチの好ましい一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方のアームにある（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から成る。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が分離の容易な方法を提供するため、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の望ましくない免疫グロブリン鎖組み合わせからの分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０２８５】
ノブインホール
別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面が操作されて、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１つ以上の小さいアミノ酸側鎖は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる（ノブまたは隆起）。大きい側鎖（複数可）と同一または同様の大きさの補償「空洞」（ホール）は、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって第２の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物を上回るヘテロ二量体の収率を増大するための機序を提供する。ノブ及びホールは、本明細書にさらに記載されている。
【０２８６】
多重特異性抗体及び／または一アーム抗体及び／またはイムノアドヘシンの産生方法としてノブイントゥホール（Ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）を使用することは、当該技術分野で周知である。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに割り当てられ、１９９８年３月２４日に承認された米国特許第５，７３１，１６８号、Ａｍｇｅｎに割り当てられ、２００９年７月１６日に公開されたＰＣＴ公開第ＷＯ２００９０８９００４号、及びＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓに割り当てられた、２００９年７月１６日に公開された米国特許公開第２００９／０１８２１２７号を参照されたい。Ｍａｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｃｉａ（２００５）２６（６）：６４９−６５８及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２００５）Ａｃｔａ  Ｐｈａｒａｃｏｌ．Ｓｉｎ．，２６：１−９もまた参照されたい。簡潔な考察が本明細書に提供されている。
【０２８７】
「隆起」は、第１のポリペプチドの界面から突出し、したがって、隣接界面（すなわち、第２のポリペプチドの界面）の補償空洞内に位置付け可能となることで、例えば、ヘテロ多量体を安定させ、それによりホモ多量体形成よりもヘテロ多量体形成が好都合になる、少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。隆起は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。通常、第１のポリペプチドの界面をコードする核酸は、隆起をコードするように改変される。これを達成するために、第１のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも大きい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードする核酸で置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解されるだろう。置き換えられる元の残基の数の上限は、第１のポリペプチドの界面における残基の総数である。様々なアミノ残基の側鎖体積が以下の表に示される。
表６：アミノ酸の特性
2019521986.tif 000010
ａアミノ酸の分子量から水の分子量を差し引いたもの。Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，４３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｕｂｂｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９６１からの値。
ｂＡ．Ａ．Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：１０７−１２３，１９７２からの値。
ｃＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１−１４，１９７５からの値。接書可能表面領域は、この参考文献の図６〜２０に定義されている。
【０２８８】
隆起の形成に好ましい移入残基は、一般に、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択される。トリプトファン及びチロシンが最も好ましい。一実施形態では、隆起を形成するための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、またはバリンなどの小さい側鎖体積を有する。隆起を形成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｗ置換が挙げられるが、これに限定されない。
【０２８９】
「空洞」は、第２のポリペプチドの界面から凹んでおり、したがって、隣接する第１のポリペプチドの界面上の対応する隆起を収容する少なくとも１つのアミノ酸側鎖を指す。空洞は、元の界面に存在し得るか、または合成的に（例えば、界面をコードする核酸を改変することによって）導入され得る。通常、第２のポリペプチドの界面をコードする核酸は、空洞をコードするように改変される。これを達成するために、第２のポリペプチドの界面の少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基をコードする核酸が、元のアミノ酸残基よりも小さい側鎖体積を有する少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基をコードするＤＮＡで置き換えられる。２つ以上の元の残基及び対応する移入残基が存在し得ることが理解されるだろう。置き換えられる元の残基の数の上限は、第２のポリペプチドの界面における残基の総数である。様々なアミノ残基の側鎖体積が上の表２に示されている。空洞の形成に好ましい移入残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びバリン（Ｖ）から選択される。セリン、アラニン、またはトレオニンが最も好ましい。一実施形態では、空洞を形成するための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの大きい側鎖体積を有する。空洞を生成するためのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｌ３６８Ａ置換、及びＹ４０７Ａ置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
「元の」アミノ酸残基とは、元の残基よりも小さいまたは大きい側鎖体積を有し得る「移入」残基に置き換えられるものである。移入アミノ酸残基は、天然に存在するか、または天然に存在しないアミノ酸残基であり得るが、好ましくは、天然に存在するアミノ酸残基である。「天然に存在する」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによってコードされ、上の表２に列記される残基である。「天然に存在しない」アミノ酸残基とは、遺伝子コードによってコードされないが、ポリペプチド鎖内の隣接するアミノ酸残基（複数可）に共有結合することができる残基を意味する。天然に存在しないアミノ酸残基の例は、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及び他のアミノ酸残基類似体、例えば、Ｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されるものなどである。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の手順が使用され得る。簡潔には、これは、天然に存在しないアミノ酸残基を有するサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化、その後のＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を伴う。本明細書に提供される方法は、少なくとも１つの元のアミノ酸残基の置き換えを伴うが、２つ以上の元の残基が置き換えられ得る。通常、第１または第２のポリペプチドの界面における合計残基より多くが、置き換えられる元のアミノ酸残基を含むことはない。典型的には、置き換えられる元の残基は「埋められる」。「埋められる」とは、残基が溶媒に本質的にアクセス不能であることを意味する。一般に、移入残基は、ジスルフィド結合の起こり得る酸化または誤対合を阻止するために、システインではない。
【０２９１】
隆起は、空洞内で「位置付け可能」であり、これは、それぞれ、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドの界面の隆起及び空洞の空間的位置、ならびに隆起及び空洞の大きさが、界面での第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの正常な会合を著しく乱すことなく隆起が空洞内に位置し得るようなものであることを意味する。Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐなどの隆起が、典型的には、界面の軸から垂直に延びず、好ましい立体配座を有しないため、隆起と対応する空洞との整列は、Ｘ線結晶学または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって得られるものなどの三次元構造に基づく隆起／空洞対のモデリングに依存する。これは、当該技術分野で広く受け入れられている技術を使用して達成され得る。
【０２９２】
「元のまたは鋳型核酸」とは、隆起または空洞をコードするように「改変され」得る（すなわち遺伝子操作され得るか、または変異させられ得る）目的とするポリペプチドをコードする核酸を意味する。元のまたは開始核酸は、天然に存在する核酸であり得るか、または事前改変されている核酸（例えば、ヒト化抗体断片）を含み得る。核酸を「改変する」とは、元の核酸が目的とするアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンの挿入、欠失、または置き換えによって変異させられることを意味する。通常、元の残基をコードするコドンは、移入残基をコードするコドンに置き換えられる。この様式でのＤＮＡを遺伝子的に修飾するための技術は、Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｄ．，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ．（１９９１）に概説されており、例えば、部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）変異誘発を含む。元の／鋳型核酸を変異させることによって、元の／鋳型核酸によってコードされた元の／鋳型ポリペプチドがそれに従って対応して改変される。
【０２９３】
隆起または空洞は、合成手段によって、例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成、前述の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するための技法、ペプチドの酵素または化学的カップリング、またはこれらの技法のいくつかの組み合わせによって、第１または第２のポリペプチドの界面に「導入され」得る。したがって、「導入される」隆起または空洞は、「天然に存在しない」または「非天然」であり、これは、それが天然または元のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）には存在しないことを意味する。
【０２９４】
一般に、隆起を形成するための移入アミノ酸残基は、比較的小数の「回転異性体」（例えば、約３〜６つ）を有する。「回転異性体」とは、アミノ酸側鎖のエネルギー的に好ましい立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数は、Ｐｏｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１９３：７７５−７９１（１９８７）に概説されている。
【０２９５】
一実施形態では、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドは、界面で接触する／相互作用する。第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドが界面で接触するいくつかの実施形態では、第２のＦｃポリペプチドの界面（配列）は、第１のＦｃポリペプチドの界面（配列）の空洞（「ホール」とも称される）内に位置付け可能な隆起（「ノブ」とも称される）を含む。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、または第２のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、またはこれらの両方である。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されており、第２のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されている。一実施形態では、第２のＦｃポリペプチドの界面は、第１のＦｃポリペプチドの界面の空洞内に位置付け可能な隆起を含み、空洞もしくは隆起、またはこれらの両方が、それぞれ、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの界面に導入されている。第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドが界面で接触するいくつかの実施形態では、第１のＦｃポリペプチド（配列）の界面は、第２のＦｃポリペプチドの界面（配列）の空洞内に位置付け可能な隆起を含む。一実施形態では、第２のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、または第１のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されているか、またはこれらの両方である。一実施形態では、第２のＦｃポリペプチドが、空洞をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されており、第１のＦｃポリペプチドが、隆起をコードするように鋳型／元のポリペプチドから改変されている。一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドの界面は、第２のＦｃポリペプチドの界面の空洞内に位置付け可能な隆起を含み、隆起もしくは空洞、またはこれらの両方が、それぞれ、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの界面に導入されている。
【０２９６】
一実施形態では、隆起及び空洞は各々、天然に存在するアミノ酸残基を含む。一実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの界面由来の元の残基を、元の残基よりも大きい側鎖体積を有する移入残基で置き換えることによって生成される。一実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、ポリペプチドの界面由来の元の残基をコードするポリヌクレオチドが元の残基よりも大きい側鎖体積を有する移入残基をコードするポリヌクレオチドで置き換えられるステップを含む方法によって生成される。一実施形態では、元の残基は、トレオニンである。一実施形態では、元の残基は、Ｔ３６６である。一実施形態では、移入残基は、アルギニン（Ｒ）である。一実施形態では、移入残基は、フェニルアラニン（Ｆ）である。一実施形態では、移入残基は、チロシン（Ｙ）である。一実施形態では、移入残基は、トリプトファン（Ｗ）である。一実施形態では、移入残基は、Ｒ、Ｆ、ＹまたはＷである。一実施形態では、隆起は、鋳型／元のポリペプチドの２つ以上の残基を置き換えることによって生成される。一実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンのトリプトファンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｐｐ．６８８−６９６ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１（１９９１；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、鋳型／元のポリペプチドの界面の元の残基を、元の残基よりも小さい側鎖体積を有する移入残基で置き換えることによって生成される。例えば、空洞を含むＦｃポリペプチドは、ポリペプチドの界面由来の元の残基をコードするポリヌクレオチドが元の残基よりも小さい側鎖体積を有する移入残基をコードするポリヌクレオチドで置き換えられるステップを含む方法によって生成され得る。一実施形態では、元の残基は、トレオニンである。一実施形態では、元の残基は、ロイシンである。一実施形態では、元の残基は、チロシンである。一実施形態では、移入残基は、システイン（Ｃ）ではない。一実施形態では、移入残基は、アラニン（Ａ）である。一実施形態では、移入残基は、セリン（Ｓ）である。一実施形態では、移入残基は、トレオニン（Ｔ）である。一実施形態では、移入残基は、バリン（Ｖ）である。空洞は、鋳型／元のポリペプチドの１つ以上の元の残基を置き換えることによって生成され得る。例えば、一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、トレオニン、ロイシン、及びチロシンからなる群から選択される２つ以上の元のアミノ酸の置き換えを含む。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群から選択される２つ以上の移入残基を含む。いくつかの実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、トレオニン、ロイシン、及びチロシンからなる群から選択される２つ以上の元のアミノ酸の置き換えを含み、元のアミノ酸は、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群から選択される移入残基で置き換えられる。いくつかの実施形態では、置き換えられる元のアミノ酸は、Ｔ３６６、Ｌ３６８、及び／またはＹ４０７である。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンのセリンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、３６８位のロイシンのアラニンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、４０７位のチロシンのバリンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。一実施形態では、空洞を含むＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸置き換えを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。これらの抗体断片のいくつかの実施形態では、隆起を含むＦｃポリペプチドは、３６６位のトレオニンのトリプトファンでの置き換えを含む（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）のＥＵ番号付けスキームに従うアミノ酸番号付け）。
【０２９８】
一実施形態では、本抗体は、ＷＯ２００５／０６３８１６に記載されるように「ノブ」及び「ホール」を構成するＦｃ変異を含む。例えば、ホール変異は、ＦｃポリペプチドにおけるＴ３６６Ａ、Ｌ３６８Ａ、及び／またはＹ４０７Ｖのうちの１つ以上であり得、ノブ変異は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４骨格においてＴ３６６Ｗであり得る。当業者であれば、他の免疫グロブリンアイソタイプにおける同等の変異を作製することができる。さらに、当業者であれば、二重特異性に使用される２つの半抗体が同じアイソタイプのものであることが好ましいことを容易に理解するであろう。
【０２９９】
ＣｒｏｓｓＭａｂ技術
Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）は、人工的なリンカーを使用することなく、ヒト二価の二重特異性ＩｇＧ抗体として、２つの存在する抗体に由来する２つの重鎖及び２つの軽鎖を発現するための方法を記載する（ＰＮＡＳ（２０１１）１０８（２７）：１１１８７−１１１９２及びＵＳ２００９／０２３２８１１）。方法は、２分の１の二重特異性抗体の抗原結合断片（Ｆａｂ）内で１つ以上の重鎖及び軽鎖ドメインを交換することを含む（ＣｒｏｓｓＭａｂ）。軽鎖及びそれらの同種重鎖の正しい会合は、二重特異性抗体の２分の１の抗原結合断片（Ｆａｂ）内での重鎖及び軽鎖ドメインの交換によって達成される。この「クロスオーバー」は、抗原結合親和性を保持するが、２つのアームを異なるようにするため軽鎖の誤対合はもはや生じ得ない。ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ２０１０／１４５７９３を参照されたく、各々がその全体において参照により本明細書に組み込まれる。例えば、多重特異性抗体の「ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ）」（ＫｉＨ）または「ＣｒｏｓｓＭａｂ」技術発現のような方法論の開発に起因する、これらの最近の利点は、依然として、それらの生成に特異的に関連する生成物−特異的不純物の所望でない形成をもたらし得る。これらの生成物−特異的不純物は、例えば、１／２抗体（単一の重鎖／軽鎖対を含む）、３／４抗体（単一の軽鎖を欠乏する完全抗体を含む）、または生成物５／４抗体（追加の重鎖または軽鎖可変ドメインを含む）を含み得る。
【０３００】
ＢｉＴＥ技術
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子に使用される別の形式（例えば、Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ１０：１２３７−１２４４）は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）モジュールに基づく。ｓｃＦｖは、柔軟なリンカーを介して融合された抗体の軽鎖及び重鎖可変領域からなり、それは、概して、適切に折り畳むことができるため、領域は同種抗原を結合し得る。ＢｉＴＥは、一本鎖上でタンデムにおける２つのｓｃＦｖの異なる特異性を連結する。この構成は、同じ重鎖可変領域の２つのコピーを有する分子の生成を排除する。加えて、リンカー構成は、それぞれの軽鎖及び重鎖の正しい対合を確実にするために設計されている。
【０３０１】
他の二重特異性抗体形式
Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（Ｒｉｎａｔ−Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）は、対象の２つの抗体を別々に発現及び精製し、次いで、特定の酸化還元条件下でそれらを一緒に混合することによって安定な二重特性抗体を生成する方法を記載する（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２０：２０４−１９）。
【０３０２】
ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を断然好む他のヘテロ二量体化ドメインは、本多重特異性抗原結合タンパク質へ組み込まれ得る。例示としての例は、これらに限定されないが、例えば、ＷＯ２００７／１４７９０１（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．−Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ（イオン相互作用について説明））、ＷＯ２００９０８９００４（Ｋａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．−Ａｍｇｅｎ（静電ステアリング効果について説明））、ＷＯ２０１０／０３４６０５（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．−Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（コイルドコイルについて説明））を含む。例えば、Ｐａｃｋ，Ｐ．＆Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１，１５７９−１５８４（１９９２）（ロイシンジッパーについて説明）、またはＰａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，１２７１−１２７７（１９９３）（ヘリックスターンヘリックスモチーフについて説明）も参照されたい。「ヘテロ多量体化ドメイン」及び「ヘテロ二量体化ドメイン」という語句は、本明細書で同義に使用される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質は、１つ以上のヘテロ二量体化ドメインを含む。
【０３０３】
Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、定常ドメインが完全に欠けているバリアントドメイン抗体断片からなるダイアボディ構築物のＶＬ／ＶＨ界面において変異を操作し、ヘテロ二量体ダイアボディを生成した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）６：７８１−７８８）。同様に、Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｕｇａｉ）はまた、選択的な発現を促進し、ダイアボディの構造異性化を阻害するために、一本鎖ダイアボディのＶＬ／ＶＨ界面において、変異を操作した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１０）２３：６６７−６７７）。
【０３０４】
米国特許公開第２００９／０１８２１２７号（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｉｎｃ．）は、他の対の重鎖で相互作用させるために一対の軽鎖の能力を低減する軽−重鎖対のＦｃ界面及びＣＨ１：ＣＬ界面においてアミノ酸残基を修飾することによって二重特異性抗体の生成を記載する。
【０３０５】
二重特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方がアビジンにカップリングし得、他方がビオチンにカップリングし得る。そのような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞の標的とするために（米国特許第４，６７６，９８０号）、かつＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤が当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技法とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０３０６】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技法もこの文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を使用して調製され得る。Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順について記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、隣接ジチオールを安定させ、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片は、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つが、メルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合されて、二重特異性抗体が形成される。産生された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化のための薬剤として使用され得る。
【０３０７】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製及び単離するための様々な技法についても記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）．Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）により記載される「ダイアボディ」技法は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機序を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、１つの断片のＶＨ及びＶＬドメインが別の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対合させられ、それにより２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【０３０８】
様々な二重特異性及び多重特異性抗体の概説は、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ｍＡｂｓ４：６，６５３−６６３、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ａｎｄｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊａｎｕａｒｙ２７，２０１５、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２０１５．０１．００３、及びＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ２０，８３８−８４７に提供される。
【０３０９】
ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、及び組換え方法
本明細書に記載される精製の方法で使用される多重特異性抗体は、組換え方法を含む、当技術分野で周知の方法を使用して得られてもよい。以下のセクションは、これらの方法に関する手引きを提供する。
【０３１０】
ポリヌクレオチド
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
【０３１１】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルでそれを発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーを含むが、これに限定されない、任意の供給源から得られ得る。したがって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。ポリペプチドコード遺伝子はまた、ゲノムライブラリーから、または既知の合成手順（例えば、自動核酸合成）によっても得られ得る。
【０３１２】
例えば、ポリヌクレオチドは、軽鎖または重鎖などの全体の免疫グロブリン分子鎖をコードし得る。完全な重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）だけでなく、重鎖定常領域（ＣＨ）も含み、これは典型的には３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３；及び「ヒンジ」領域を含む。場合によっては、定常領域の存在が望ましい。
【０３１３】
ポリヌクレオチドによってコードされ得る他のポリペプチドには、抗原結合抗体断片、例えば、単一ドメイン抗体（「ｄＡｂ」）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、ならびに「ミニボディ」が含まれる。ミニボディは、（典型的には）ＣＨ１及びＣＫまたはＣＬドメインが切除されている二価抗体断片である。ミニボディは、従来の抗体より小さいので、それらは臨床／診断用途では良好な組織浸透を達成するはずであるが、ｄＡｂのような一価抗体断片よりも高い結合親和性を保持しなければならない二価である。したがって、別途文脈が規定しない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、全ての抗体分子だけでなく、上記で考察される型の抗原結合抗体断片も包含する。好ましくは、コードされたポリペプチド中に存在する各フレームワーク領域は、対応するヒト受容体フレームワークに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。したがって、例えば、フレームワーク領域は、受容体フレームワーク領域に対して、合計で３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸置換を含み得る。
【０３１４】
好適には、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、単離及び／または精製され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
【０３１５】
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、分子がその正常または天然環境から除去もしくは分離されるか、または、その正常もしくは天然環境に存在しない方法で生成されたことを示すように意図される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、精製されたポリヌクレオチドである。精製されたという用語は、少なくともいくつかの混入分子または基質が除去されていることを示すように意図される。
【０３１６】
好適には、ポリヌクレオチドは、関連ポリヌクレオチドが、組成物中に存在する優性（すなわち、最も豊富な）ポリヌクレオチドを構成するように実質的に精製される。
【０３１７】
ポリヌクレオチドの発現
以下の説明は、主に、ポリペプチドコードポリヌクレオチドを含むベクターで転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによるポリペプチドの生成に関する。当然、当該技術分野で周知の代替的な方法が、ポリペプチドを調製するために用いられ得ることが企図される。例えば、適切なアミノ酸配列またはその部分は、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって産生され得る（Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照されたい）。インビトロタンパク質合成は、手動技法を使用して、または自動で行われ得る。自動合成は、例えば、製造業者の指示を使用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を使用して達成され得る。ポリペプチドの様々な部分が別個に化学的に合成され、化学的または酵素的方法を使用して組み合わせられて、所望のポリペプチドを産生することができる。
【０３１８】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ポリペプチドの生成のために発現ベクター（複数可）へ挿入される。「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における、操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。制御配列は、これらに限定されないが、プロモーター（例えば、天然に関連するまたは異種プロモーター）、シグナル配列、エンハンサー要素、及び転写終結配列を含む。
【０３１９】
ポリヌクレオチドは、それが別のポリヌクレオチド配列と機能的な関係性に置かれるとき、「操作可能に連結」されている。例えば、プレ配列または分泌リーダーの核酸は、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドの核酸に操作可能に連結しているか、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に操作可能に連結しているか、あるいはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結」されるとは、連結している核酸配列が連続的であること、及び分泌リーダーの場合、連続しており、リーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続していなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣例に従って使用される。
【０３２０】
抗体について、軽鎖及び重鎖は、同じまたは異なる発現ベクター中でクローン化され得る。免疫グロブリン鎖をコードする核酸セグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数可）における制御配列に操作可能に連結されている。
【０３２１】
４つの異なるポリペプチド鎖を含むＣｒｏｓｓＭａｂには、４つの発現価セットが使用される。これらは、２つまたは４つの異なる発現ベクター中でクローン化され得る。免疫グロブリン鎖をコードする核酸セグメントの各々は、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター（複数可）における制御配列に操作可能に連結されている。２つ以上の発現価セットが、同じ発現ベクター上で含まれる場合、これらは、一方向性または双方向性に組織化され得る。
【０３２２】
ポリヌクレオチド配列（例えば、配列及び任意の発現制御配列をコードする可変重鎖及び／または可変軽鎖）を含むベクターは、周知の方法によって宿主細胞へ移されることができ、それは、細胞宿主の型に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、一般に、原核生物細胞に利用されるが、リン酸塩カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃、またはウイルス性に基づくトランスフェクションは、他の細胞宿主のために使用され得る。（概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８９を参照されたい）。哺乳動物細胞を転換するために使用される他の方法は、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、及び微量注入を含む。トランスジェニック動物の生成のために、導入遺伝子は、受精卵母細胞に微量注入されるか、または胚性幹細胞のゲノム、及び除核された卵母細胞に移されたそのような細胞の細胞核に組み込まれ得る。
【０３２３】
ベクター
「ベクター」という用語は、発現ベクター、ならびに形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
【０３２４】
「発現ベクター」という用語は、インビボまたはインビトロ発現が可能な構築物を意味する。
【０３２５】
「形質転換ベクター」という用語は、１つの主体から別の主体へ移されることができる構築物を意味し、それは、その種であり得るか、または異なる種であり得る。構築物は、１つの主体から別の主体、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉプラスミドからバチルス属などの細菌へなどに移されることができる場合、次いで形質転換ベクターは、時折「シャトルベクター」と称される。それは、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドからアグロバクテリウム、植物へ移されることができる構築物であり得る。
【０３２６】
ベクターは、本明細書に記載されるように、好適な宿主細胞へ転換され、ポリペプチドの発現を提供し得る。様々なベクターが、公的に利用可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージであり得る。適切な核酸配列は、様々な手順によってベクターへ挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。これらの構成要素のうちの１つ以上を含む好適なベクターの構築物は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を用いる。
【０３２７】
ベクターは、例えば、複製起点で提供されるプラスミド、ウイルス、またはファージベクター、任意にポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意にプロモーターのレギュレーターであり得る。ベクターは、当該技術分野で周知の１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。
【０３２８】
これらの発現ベクターは、典型的には、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主生物中で複製可能である。
【０３２９】
多重特異性抗体の生成について、多重特異性抗体（または、多重特異性抗体のアーム、すなわち、重鎖／軽鎖対）をコードする核酸（複数可）は、典型的には、さらなるクローン化、増幅、及び／または発現のために単離され、複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離及び配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得、そのような定常領域が任意のヒトまたは動物種から得られ得ることが理解される。
【０３３０】
宿主細胞
宿主細胞は、例えば、細菌細胞、酵母細胞、または他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞であり得る。
【０３３１】
遺伝子的に操作されているトランスジェニック多細胞宿主生物は、ポリペプチドを生成するために使用され得る。生物は、例えば、トランスジェニック哺乳類生物（例えば、トランスジェニックヤギまたはマウス株）であり得る。
【０３３２】
好適な原核生物には、これらに限定されないが、グラム陰性またはグラム陽性の生物などの真正細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ．などのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅが挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）などの様々なＥ．ｃｏｌｉ株が公的に利用可能である。他の好適な原核生物宿主細胞としては、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）などのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は、限定するものではなく、例示するものである。株Ｗ３１１０は、それが組換えポリヌクレオチド生成物の発酵に対して一般的な宿主株であるため、１つの特に好ましい宿主または親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に対して内因性であるポリペプチドをコードする遺伝子において遺伝子変異に影響を与えるように修飾され得、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株１Ａ２、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株９Ｅ４、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎ’を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）、完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ｉｌｖＧ  ｋａｎ’を有するＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株３７Ｄ６、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する株３７Ｄ６であるＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株４０Ｂ４、及び変異体ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。代替的には、クローン化のインビトロ方法、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が好適である。いくつかの実施形態では、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞）は、１つ以上のシャペロンを発現し、抗体の折り畳み及びアセンブリを容易にする。いくつかの実施形態では、シャペロンは、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、またはＤｓｂＣのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、シャペロンは、内因性シャペロン遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、シャペロンは、外因性シャペロン遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、シャペロン遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉシャペロン遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＦｋｐＡ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤｓｂＡ遺伝子、及び／またはＥ．ｃｏｌｉ  ＤｓｂＣ遺伝子）である。
【０３３３】
これらの原核生物宿主において、１つは発現ベクターを作製することができ、それは、典型的には、宿主細胞と適合性のある発現制御配列を含む（例えば、複製起点）。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージのプロモーター系などの任意の数の様々な周知のプロモーターが存在するであろう。プロモーターは、典型的には、発現を制御し、任意にオペレーター配列を有し、転写及び翻訳の開始及び完了のためにリボソーム結合部位配列などを有する。
【０３３４】
真核微生物は、発現のために使用され得る。糸状真菌または酵母などの真核微生物が、ポリペプチドコードベクターに好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用されるより低次の真核宿主微生物である。他のものとしては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍなどの糸状真菌、及びＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主が挙げられる。メチロトローフ酵母は、本明細書において好適であり、これらに限定されないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属から選択されるメタノール上での成長が可能である酵母を含む。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、所望のとおり発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製起点、終結配列などを有する好適なベクターを有する、好ましい酵母宿主である。典型的なプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の解糖酵素を含む。誘導酵母プロモーターは、数ある中でも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソシトクロムＣ、ならびにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素を含む。
【０３３５】
微生物に加えて、哺乳動物組織細胞培養はまた、本明細書に記載されるようにポリペプチドを発現及び生成するために使用され得、いくつかの例では好ましい（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照されたい）。いくつかの実施形態について、異種ポリペプチド（例えば、無傷免疫グロブリン）を分泌することが可能であるいくつかの好適な宿主細胞株が、当該技術分野で開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは、骨髄腫細胞株、または形質転換Ｂ−細胞もしくはハイブリドーマを含むため、真核細胞が好ましくあり得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞である。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）によって転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養物中での成長のためにサブクローン化された２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯまたはＣＨＯ−ＤＰ−１２株）；マウスセルトリ細胞；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０３３７】
原核生物宿主細胞を使用した多重特異性抗体の生成
ベクター構築
本明細書に提供される方法に従って精製される多重特異性抗体のポリペプチド構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を使用して得られることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞などの抗体産生細胞から単離及び配列決定され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技術を使用して合成され得る。得られた時点で、ポリペプチド（２つ以上の重鎖及び／または２つ以上の軽鎖）をコードする配列は、宿主細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ細胞など）で異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組換えベクターに挿入される。利用可能であり、当該技術分野で既知である多くのベクターが、本明細書に提供される方法及び組成物の目的のために使用され得る。適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸の大きさ及びベクターで形質転換される特定の宿主細胞に主に依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはこれらの両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に応じて種々の成分を含有する。ベクター成分としては、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入、及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３８】
一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を持つ。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、典型的には、ｐＢＲ３２２、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミド、を使用して転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性をコードする遺伝子を含み、それ故に形質転換細胞を特定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その誘導体、または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージはまた、内因性タンパク質の発現のための微生物によって使用され得るプロモーターも含有し得るか、またはそれを含有するように修飾され得る。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例は、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。
【０３３９】
加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ＧＥＭ（商標）−１１などのバクテリオファージが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２などの感受性宿主細胞を形質転換するために使用され得る組換えベクターを作製する際に利用され得る。
【０３４０】
発現ベクターは、ポリペプチド構成成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス、誘導プロモーター及び構成プロモーターに分けられる。誘導プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在もしくは不在、または温度の変化に応答してその制御下で増加したレベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
【０３４１】
様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、かつ単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに操作可能に結合し得る。天然プロモーター配列も多くの異種プロモーターもいずれも、標的遺伝子の増幅及び／または発現を誘導するために使用され得る。いくつかの実施形態では、異種プロモーターが一般に天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して発現された標的遺伝子のより大きい転写及びより高い収率をもたらすため、異種プロモーターが利用される。
【０３４２】
原核生物宿主との使用に好適なプロモーターとしては、ＰｈｏＡプロモーター、−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、細菌において機能的な他のプロモーター（他の既知の細菌またはファージプロモーターなど）も好適である。それらのヌクレオチド配列が公開されており、それにより、当業者が、任意の必要な制限部位を提供するためにリンカーまたはアダプターを使用して、それらを標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンに操作可能にライゲーションすることを可能にする（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ２０：２６９）。
【０３４３】
翻訳開始領域（ＴＩＲ）は、タンパク質の全体の翻訳レベルの主要な決定因子である。ＴＩＲは、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含み、シャイン・ダルガノ配列の直上流から開始コドンのおよそ２０ヌクレオチド下流まで延びている。一般に、このベクターは、ＴＩＲを含み、ＴＩＲ及びバリアントＴＩＲは、当該技術分野で既知であり、ＴＩＲの生成方法は、当該技術分野で既知である。一連の核酸配列バリアントがある範囲の翻訳強度で作製され、それにより多くの異なるポリペプチドの最適な分泌のためにこの因子を調整するための便利な手段を提供することができる。ＰｈｏＡなどのこれらのバリアントに融合するレポーター遺伝子の使用により、異なる翻訳開始領域の相対翻訳強度の定量方法が提供される。バリアントまたは変異体ＴＩＲがプラスミドベクターのバックグラウンドに提供され、それにより、成熟ポリペプチドの最大発現の翻訳強度の最適範囲を確立するように目的とする遺伝子が挿入される一組のプラスミド及び測定されるその発現を提供することができる。バリアントＴＩＲは、ＵＳＰ８，２４１，９０１に開示されている。
【０３４４】
一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜にわたる発現ポリペプチドの転位を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。選択されたシグナル配列は、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。異種ポリペプチドに特有のシグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は、原核生物シグナル配列により置換される。そのような配列は、当該技術分野において周知である。加えて、ベクターは、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群から選択されるシグナル配列を含み得る。
【０３４５】
一態様では、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）が、抗体を集合的にコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、抗体の軽鎖をコードし、別個のポリヌクレオチドが、抗体の重鎖をコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、抗体の軽鎖及び重鎖をコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）が、一アーム抗体を集合的にコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、（ａ）一アーム抗体の軽鎖及び重鎖、ならびに（ｂ）Ｆｃポリペプチドをコードする。一実施形態では、単一のポリヌクレオチドが、一アーム抗体の軽鎖及び重鎖をコードし、別個のポリヌクレオチドが、Ｆｃポリペプチドをコードする。一実施形態では、別個のポリヌクレオチドが、それぞれ、一アーム抗体の軽鎖成分、一アーム抗体の重鎖成分、及びＦｃポリペプチドをコードする。一アーム抗体の産生については、例えば、ＷＯ２００５０６３８１６に記載されている。
【０３４６】
抗体を発現するために好適な原核生物宿主細胞としては、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などのＡｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉａ及びＥｕｂａｃｔｅｒｉａが挙げられる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、またはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態では、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、宿主細胞として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、株Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７），ｐｐ．１１９０−１２１９、ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）及びその誘導体が挙げられ、遺伝子型Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する株３３Ｄ３、ならびに株６３Ｃ１及び６４Ｂ４を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ株は、６２Ａ７（ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＬ８、ｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ΔｄｅｇＰ  ｉｌｖＧ修復型）と名付けられたＷ３１１０誘導体である。他の株及びその誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉλ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）も好適である。これらの例は、限定するものではなく、例示するものである。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちのいずれかの誘導体の構築方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）に記載されている。一般に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製可能性を考慮して適切な細菌を選択することが必要である。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０などの周知のプラスミドを使用してレプリコンを提供する場合、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が宿主として好適に使用され得る。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素しか分泌すべきでなく、追加のプロテアーゼ阻害剤が細胞培養物に組み込まれることが望ましくあり得る。
【０３４７】
細菌培養におけるポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、細菌細胞が修飾され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリ及び折り畳みを改善するために、細菌宿主細胞は、宿主原核生物細胞を共形質転換するために使用され得るＦｋｐＡタンパク質及びＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）などのシャペロンタンパク質を発現する追加のベクターを含み得る。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解を容易にすることが実証されている。
【０３４８】
多重特異性抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように修飾された従来の栄養素培地で培養される。
【０３４９】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外要素として、または染色体組み込み体によってのいずれかで複製可能になるように、ＤＮＡを原核生物宿主に導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換がそのような細胞に適切な標準の技術を使用して行われる。一般に、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞に使用される。形質転換の別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、電気穿孔法である。
【０３５０】
ポリペプチドを産生するために使用される原核生物細胞は、当該技術分野で既知の、かつ選択された宿主細胞の培養に好適な培地で成長させられる。好適な培地の例としては、必要な栄養素補充物を含むルリアブロス（ＬＢ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、発現ベクターを含有する原核生物細胞の成長を選択的に許容するために、発現ベクターの構築に基づいて選択された選択剤も含有する。例えば、アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞を成長させるための培地に添加される。
【０３５１】
炭素、窒素、及び無機リン酸塩源に加えて、任意の必要な補助剤も、単独で、または複合窒素源などの別の補助剤もしくは培地との混合物として導入される適切な濃度で含まれ得る。任意に、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール、及びジチオスレイトールから成る群から選択される１つ以上の還元剤を含有し得る。
【０３５２】
原核生物宿主細胞は、好適な温度で培養される。Ｅ．ｃｏｌｉ成長の場合、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃の範囲、より好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０３５３】
誘導プロモーターが発現ベクターに使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に好適な条件下で誘導される。一態様では、ＰｈｏＡプロモーターは、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換宿主細胞は、誘導のためにリン酸塩制限培地で培養される。好ましくは、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２），２６３：１３３−１４７を参照のこと）、またはＷＯ２００２／０６１０９０に記載の培地である。様々な他の誘導因子が、当該技術分野で既知の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。
【０３５４】
一実施形態では、発現ポリペプチドは、宿主細胞のペリプラズムに分泌され、それから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による微生物の破壊を伴う。細胞が破壊されると、細胞残屑または全細胞は、遠心分離または濾過によって除去され得る。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製される。あるいは、タンパク質は、培養培地に輸送され、その中で単離され得る。細胞が培養物から除去され得、培養上清が、産生されたタンパク質のさらなる精製のために濾過及び濃縮される。発現ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなどの一般に既知の方法を使用してさらに単離及び特定され得る。
【０３５５】
一態様では、抗体産生は、発酵プロセスによって大量に行われる。様々な大規模供給バッチ発酵手技が組換えポリペプチドの産生に利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。これらの発酵槽は、酸素及び栄養素、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分布させるために撹拌インペラーを使用する。小規模発酵とは、一般に、容積がおよそ１００リットル以下であり、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽での発酵を指す。
【０３５６】
発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０になるまで好適な条件下で成長した後に開始され、その段階で、細胞は、初期静止期にある。様々な誘導因子が、当該技術分野で既知の上述の用いられるベクター構築物に従って使用され得る。細胞は、誘導前により短い期間成長し得る。細胞は、通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間も使用され得る。
【０３５７】
ポリペプチドの産生収率及び品質を改善するために、様々な発酵条件が修正され得る。例えば、分泌抗体ポリペプチドの適切なアセンブリ及び折り畳みを改善するために、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及び／またはＤｓｂＣなどのシャペロンタンパク質を発現する追加のベクターを使用して、宿主原核生物細胞を共形質転換することができる。シャペロンタンパク質が細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解を容易にすることが実証されている。いくつかの実施形態では、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及び／またはＤｓｂＣは、細菌宿主細胞において発現される。
【０３５８】
発現異種タンパク質（特にタンパク質分解感受性のもの）のタンパク質分解を最小限に抑えるために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株が使用され得る。例えば、宿主細胞株は、既知の細菌プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びそれらの組み合わせをコードする遺伝子において遺伝子変異（複数可）をもたらすように修飾され得る。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損株が利用可能であり、例えば、Ｊｏｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）（上記を参照）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２：６３−７２（１９９６）に記載されている。
【０３５９】
一実施形態では、タンパク質分解酵素が欠損し、かつ１つ以上のシャペロンタンパク質を発現するプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株が、発現系における宿主細胞として使用される。
【０３６０】
真核宿主細胞を使用した多重特異性抗体の生成
シグナル配列構成成分
真核宿主細胞において使用するためのベクターもまた、目的とする成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドを含有してもよい。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。そのような前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、所望のヘテロ多量体タンパク質（例えば、抗体）をコードするＤＮＡにライゲーションされる。
【０３６１】
複製起点
一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点が典型的に使用され得るが、これは単に、ＳＶ４０起点が初期プロモーターを含有するためである。
【０３６２】
選択遺伝子構成要素
発現及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンへの耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するか（関連性のある場合）、または（ｃ）複合培地から入手不可能な必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【０３６３】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子を用いた形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、したがって選択レジメンで生き残るタンパク質を産生する。そのような優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。
【０３６４】
哺乳類細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどの、抗体核酸を取り込むための細胞成分の特定を可能にするものである。
【０３６５】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、最初に、ＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全ての形質転換体を培養することによって特定される。野生型ＤＨＦＲが用いられるときに適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）である。
【０３６６】
代替的に、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などの別の選択可能なマーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などの選択可能なマーカー用の選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。
【０３６７】
プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、所望のヒンジ含有ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体）核酸に操作可能に連結されるプロモーターを含有する。真核生物のためのプロモーター配列が既知である。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始する部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列は全て、真核発現ベクターに好適に挿入される。
【０３６８】
哺乳類宿主細胞中のベクターからの所望の重鎖及び／または軽鎖の転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０３６９】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号で開示される。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載される。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞内のヒトｂ−インターフェロンｅＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。
【０３７０】
エンハンサー要素構成成分
より高次の真核生物による、所望のヒンジ含有ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体）をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加され得る。哺乳類遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン遺伝子）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。また、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用してもよい。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化を強化するための要素の説明に関しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、エンハンサーが達成される限り、抗体ポリペプチドコード配列の５’位側でも３’位側でもベクターへとスプライシングされ得るが、一般には、プロモーターから５’部位に位置する。
【０３７１】
転写終結構成成分
原核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。そのような配列は、一般に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時に、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結構成成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこで開示される発現ベクターを参照されたい。
【０３７２】
宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中のＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞としては、脊椎動物宿主細胞を含む本明細書に記載のより高次の真核生物細胞が挙げられる。培養物（組織培養物）中での脊椎動物細胞の繁殖は、日常的な手技になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養物中での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒａｌ．３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ／．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＯＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０３７３】
宿主細胞は、所望のヒンジ含有ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体）産生のために、上述の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換対の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された従来の栄養素培地中で培養される。
【０３７４】
宿主細胞の培養
多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販されている培地は、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、または米国特許再発行第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量要素（マイクロモルの範囲の最小濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかであろう。
【０３７５】
多重特異性抗体の形成／アセンブリ
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体を産生する方法が、本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、多重特異性抗体は、半抗体を別々に産生することによって産生され、各半抗体は、特定のエピトープ（例えば、単一標的上で異なるエピトープ、または２つ以上の標的上で異なるエピトープ）を結合するＶＨ／ＶＬ単位を含む。いくつかの実施形態では、各半抗体は、宿主細胞中で別々に産生される。いくつかの実施形態では、半抗体の各々は、同じ宿主細胞中で産生され得る。半抗体は、混合され、多重特異性抗体をアセンブリングすることを可能にされる。いくつかの実施形態では、半抗体の各々は、同じ宿主細胞中で一緒に産生される。いくつかの実施形態では、宿主細胞（原核生物宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞など）は、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、及び／またはＤｓｂＣなどのシャペロンを発現し、半抗体の折り畳みを容易にする。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、ノブまたはホール変異のいずれかを含む半抗体は、細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて重鎖及び軽鎖の構築物を発現することによって、別々の培養物中に生成される。各半抗体は、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって別個に精製することができる。ノブ及びホール半抗体から浄化された細胞抽出物は、プロテインＡカラムによって精製され得る。異なる特異性を持つタンパク質Ａ精製半抗体をアセンブリングして、還元剤の存在下でのインビトロの酸化還元反応において二重特異性抗体を形成することができる。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、ノブまたはホール変異のいずれかを含む半抗体は、同じ細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞またはＣＨＯ宿主細胞において重鎖及び軽鎖の構築物を発現することによって、同じ培養物中に生成される。半抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。ノブ及びホール半抗体から浄化された細胞抽出物は、プロテインＡカラムによって精製され得る。異なる特異性を持つタンパク質Ａ精製半抗体をアセンブリングして、還元剤の存在下でのインビトロの酸化還元反応において二重特異性抗体を形成することができる。
【０３７８】
任意の好適な方法を使用して、所望の還元条件を調製することができる。例えば、所望の還元条件は、還元体／還元剤を反応物（本明細書に記載されるアセンブリ混合物など）に添加することによって調製し得る。好適な還元体としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、チオグリコール酸、アスコルビン酸、チオール酢酸、グルタチオン（ＧＳＨ）、ベータ−メルカプトエチルアミン、システイン／シスチン、ＧＳＨ／グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）、システアミン／シスタミン、グリシルシステイン、及びベータ−メルカプトエタノールが挙げられるが、これらに限定されず、好ましくは、ＧＳＨである。ある特定の実施形態において、還元体は、弱還元体であり、弱還元体としては、ベータ−メルカプトエチルアミン、システイン／シスチン、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、システアミン／シスタミン、グリシルシステイン、及びベータ−メルカプトエタノールが挙げられるが、これらに限定されず、好ましくは、ＧＳＨである。ある特定の好ましい実施形態において、還元体はＧＳＨである。ある特定の実施形態において、還元体はＤＴＴではない。所望の還元条件を反応において達成するのに好適な実験条件下で好適な濃度の好適な還元体を選択することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、２０℃の二重特異性抗体タンパク質濃度が１０ｇ／Ｌである溶液中の１０ｍＭのＬ還元グルタチオンは、約−４００ｍＶの開始酸化還元電位をもたらすことになる。例えば、アセンブリ混合物に添加するグルタチオンは、ノブ−イン−ホール二重特異性アセンブリに有利な弱還元条件を創出する。ＢＭＥＡ（ベータ−メルカプトエチルアミン）などの類似のクラスの他の還元体は、類似の効果を有し得る。全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０５５９５８を参照されたい。反応の還元条件は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して推定及び測定することができる。例えば、還元条件は、レザズリンインジケータ（還元条件における青から無色への変色）を使用して測定し得る。より正確に測定するためには、酸化還元電位メータ（ＢＲＯＡＤＬＥＹ  ＪＡＭＥＳ（登録商標）によって作製されるＯＲＰ電極など）を使用することができる。
【０３７９】
ある特定の実施形態において、還元条件は弱還元条件である。本明細書で使用される「弱還元体」または「弱還元条件」という用語は、２５℃で負の酸化電位を有する還元剤によって調製される還元剤または還元条件を指す。還元剤の酸化電位は、ｐＨが７〜９でありかつ温度が１５℃〜３９℃である場合に、好ましくは、−５０〜−６００ｍＶ、−１００〜−６００ｍＶ、−２００〜−６００ｍＶ、−１００〜−５００ｍＶ、−１５０〜−３００ｍＶ、より好ましくは、約−３００〜−５００ｍＶ、最も好ましくは、約−４００ｍＶである。当事者は、所望の還元条件を調製するために好適な還元体を選択することができるであろう。当業者であれば、強還元体、すなわち、同じ濃度、ｐＨ、及び温度に対して、上述した還元体よりも大きい負の酸化電位を有するものを、より低い濃度で使用しても良いことを認識するであろう。好ましい実施形態において、タンパク質は、上述した条件下でインキュベートする場合に、還元剤の存在下でジスルフィド結合を形成することができる。弱還元体の例としては、グルタチオン、ベータ−メルカプトエチルアミン、シスチン／システイン、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ、システアミン／シスタミン、グリシルシステイン、及びベータ−メルカプトエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、ＧＳＨ：抗体の２００倍のモル比のものと類似した酸化電位を、他の還元体を使用する効率的なアセンブリが期待できる弱還元条件についての基準点として使用することができる。
【０３８０】
グルタチオン濃度は、モル濃度の観点から、またはアセンブリ混合物中に存在する半抗体の量に対するモル比またはモル過剰の観点から表され得る。還元体の標的モル比を使用することでアセンブリ混合物中のタンパク質濃度が制御され、これにより、様々なタンパク質濃度による還元過剰または還元不足を防止する。ある特定の他の実施形態において、還元体は、半抗体の全量に対して、２〜６００倍、２〜２００倍、２〜３００倍、２〜４００倍、２〜５００倍、２〜２０倍、２〜８倍、２０〜５０倍、５０〜６００倍、５０〜２００倍、または１００〜３００倍のモル過剰、好ましくは５０〜４００倍または５０〜１５０倍、より好ましくは１００〜３００倍、最も好ましくは２００倍または１００倍のモル過剰でアセンブリ混合物に添加される。ある特定の実施形態において、アセンブリ混合物のｐＨは、７〜９、好ましくはｐＨ８．５または８．３である。
【０３８１】
例えば、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはその断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）などの細胞毒性薬にコンジュゲートされる本明細書に記載の抗体のうちのいずれかを含む免疫コンジュゲート（同義に「抗体−薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」と称される）もまた提供される。
【０３８２】
抗原／標的分子
本明細書に記載される方法に従って精製される多重特異性抗体によって標的とされ得る分子の例としては、これらに限定されないが、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、ならびにタンパク質（例えば、アドヘシン）を結合する他の膜が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って精製される多重特異性抗体は、１つ、２つ、または２つ超のサイトカイン、サイトカイン−関連タンパク質、ならびに８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３３、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ−β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯからなる群から選択されるサイトカイン受容体を結合することが可能である。
【０３８３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って精製される多重特異性抗体は、ケモカイン、ケモカイン受容体、またはＣＣＬＩ（１−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲＢ  ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫｏｒ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン−関連タンパク質を結合することが可能である。
【０３８４】
ある特定の実施形態では、本明細書で説明される方法に従って精製される多重特異性抗体は、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＺＧＰ１（亜鉛−α−糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ）；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡ１２５；ＣＡ１５−３；ＣＡ１９−９；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１−３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ−２）；ＳＬＣ；エクソダス−２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ−Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ−Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ−ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）；ＣＤ１１ａ；ＣＤ１３；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３０；ＣＤ３１；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ３５；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３９；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４１；ＣＤ４４；ＬＣＡ／ＣＤ４５；ＣＤ４５ＲＡ；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ４５ＲＯ；ＣＤ５；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７；ＣＤ７１；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤ８；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤ９５／Ｆａｓ；ＣＤ９９；ＣＤ１００；ＣＤ１０６；ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）；ＣＤ９／ｐ２４；ＣＤＨ１０；ＣＤ１１ａ；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１３；ＣＤ１４；ＣＤ１９、ＣＤ２０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤ���２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＡ；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン−７）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラステリン）；Ｃ−ＭＥＴ；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＳＦＩ（Ｍ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ−カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＴＳＤ（カテプシンＤ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ／ＩＰ−９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｓ；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ−２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；エストロゲン受容体；プロゲステロン受容体；ＥＳＲ２；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ１；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）；フィブリン；ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ−１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ−６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ−ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミン及びヒス��ミン受容体；ＨＬＡ−Ａ；ＨＬＡ−ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＰＶタンパク質；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ−ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＩＴＧＢ７；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ−ｌを含むＩＬ１−ＩＬ３６またはそれらの受容体などのインターロイキン；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ−１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０ＲＡ；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ３３；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；Ｐ−糖タンパク質；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ケラチン；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ  Ｂｏｘ  ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；カッパ軽鎖；ラムダ軽鎖；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；Ｌｉｎｇｏ−ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ−Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ−ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＥＷＩＳ−ｘＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧまたはＯｍｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ−Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＩＢ１；メラノソームタンパク質；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ−２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ−６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン−１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ−Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ−Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ−ｐ７５；ＮｇＲ−Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ���Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；Ｐ２ＲＸ７；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡ；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）；ＰＴＮ；ｐ５３；ＲＡＣ２（ｐ２１Ｒａｃ２）；ＲＡＳ；Ｒｂ；ＲＡＲＢ；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；Ｓ−１００ＳＤＦ２；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ−１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ；ＳＴＥＡＰ２；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＵＳＰ７，５２１，５４１に記載されるＴＡＡなどの膜貫通または細胞葉面腫瘍特性抗原（ＴＡＡ）；ＴＡＵ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン−１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ−１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；
ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；Ｔｎ抗原ＴＮＦ；ＴＮＦ−ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；ユビキチン；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ  Ｃ５；ビメンチン；ＶＬＡ−４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；ならびにＺＦＰＭ２からなる群から選択される１つ以上の標的を結合することが可能である。
【０３８５】
ある特定の実施形態では、本明細書に従って精製された多重特異性抗体の標的分子は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４などのＣＤタンパク質；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体などのＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ６４、ＣＤ２００メンバー；ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファｖ／ベータ３インテグリン（それらのアルファサブユニットまたはベータサブユニットを含む）（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）などの細胞接着分子；ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ＦＧＦＲ、Ａｎｇ１、ＫＬＢ、ＶＥＧＦ−Ｃなどの成長因子；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−Ｓ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ−１Ｓ、ＩＬ１３などのインターロイキン；ＩＬ−１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ１４ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体の受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、プロテインＣ、ＢＲ３などを含む。
【０３８６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って精製される多重特異性抗体の標的分子は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）−１またはＬＲＰ−８またはトランスフェリン受容体、ならびに１）ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、２）アルファ−セクレターゼ、３）ガンマ−セクレターゼ、４）タウ−セクレターゼ、５）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、６）細胞死受容体６（ＤＲ６）、７）アミロイドベータペプチド、８）アルファ−シヌクレイン、９）パーキン、１０）ハンチンチン、１１）ｐ７５ＮＴＲ、及び１２）カスパーゼ−６からなる群から選択される少なくとも１つの標的を含む。
【０３８７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って精製される多重特異性抗体の標的分子は、ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１Ｓ；ＩＬ−１３及びＩＬ−９；ＩＬ−１３及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−５；ＩＬ−５及びＩＬ−４；ＩＬ−１３及びＩＬ−１ベータ；ＩＬ−１３及びＩＬ−２５；ＩＬ−１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ−１３及びＭＤＣ；ＩＬ−１３及びＭＥＦ；ＩＬ−１３及びＴＧＦ−〜；ＩＬ−１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ−１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ−１３及びＣＬ２５；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ−１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ−１３及びＡＤＡＭＳ、ＩＬ−１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１３及びＩＬ１７；ＩＬ１３及びＩＬ４；ＩＬ１３及びＩＬ３３；ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ−Ｓ及びＩＬ−６；ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１ベータ；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−３；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−４；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−５；ＴＮＦアルファ及びＩＬ６；ＴＮＦアルファ及びＩＬ８；ＴＮＦアルファ及びＩＬ−９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ−２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ−１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ−４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦ  ａ及びＩＬ−１２ｐ４０、ＦＧＦＲ１及びＫＬＢ；ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２，ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５，ＶＥＧＦ及びＩＬ−８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ−１４及びＩＬ−１３、ＩＬ−１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ−６Ｒ及びＴＮＦＲ１及びＩＬ−１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ  Ａ；ＣＴＬＡ−４及びＢＴＮ０２��ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭ  Ａ；ＮｇＲ及びＲＧＭ  Ａ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ  Ａ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭ  Ａ；ＰＯＬ−ｌ及びＣＴＬＡ−４；ならびにＲＧＭ  Ａ及びＲＧＭ  Ｂからなる群から選択される少なくとも２つの標的分子を含む。
【０３８８】
他の分子に任意にコンジュゲートされる可溶性抗原またはその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子の場合、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。そのような細胞は、天然源（例えば、がん細胞株）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するように組換え技法により形質転換されている細胞であり得る。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。
【０３８９】
製剤及び製剤の作製方法
製剤及び本明細書に記載される方法によって精製される多重特異性抗体を含む製剤を作製する方法もまた本明細書に提供される。例えば、精製されたポリペプチドは、薬学的に許容される担体と組み合わされ得る。
【０３９０】
いくつかの実施形態におけるポリペプチドの製剤は、所望の純度を有するポリペプチドを、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。
【０３９１】
本明細書で使用される「担体」は、用いられる投与量及び濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物に非毒性の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。
【０３９２】
許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、レシピエントに対し、用いられる投与量及び濃度で非毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド製剤中のポリペプチドは、機能的活性を維持する。
【０３９４】
インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されてなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０３９５】
本明細書の製剤は、治療されている特定の適応症に対して必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する活性化合物を含有してもよい。例えば、ポリペプチドに加えて、１つの製剤中に、追加のポリペプチド（例えば、抗体）を含むことが望ましい場合がある。代替的に、または加えて、組成物は、化学治療剤、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／または心臓保護剤をさらに含んでもよい。そのような分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせで好適に存在する。
【０３９６】
製品
本明細書に記載の方法によって精製される多重特異性抗体及び／または本明細書に記載の方法によって精製されるポリペプチドを含む製剤は、製品に含まれ得る。製品は、ポリペプチド及び／またはポリペプチド製剤を含む容器を含み得る。好ましくは、製品は、（ａ）本明細書に記載のポリペプチド及び／またはポリペプチド製剤を含む組成物を容器内に含む容器、ならびに（ｂ）製剤を対象に投与するための指示を有する添付文書を含む。
【０３９７】
製造品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、製剤を保持または収容し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈用溶液袋またはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、ポリペプチドである。ラベルまたは添付文書は、提供されているポリペプチド及び任意の他の薬物の投与量及び間隔についての具体的な指示による、患者における組成物の使用を示す。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、容器は、シリンジである。いくつかの実施形態では、シリンジは、注入デバイス内にさらに収容される。いくつかの実施形態では、注入デバイスは、自己注入器である。
【０３９８】
「添付文書」は、そのような治療薬の適応症、使用法、投与量、投与、禁忌症についての情報、パッケージ製品と組み合わされる他の治療薬、及び／またはその使用に関する警告を含む、治療薬の商用のパッケージに通例含まれる指示書を指すように使用される。
【０３９９】
本明細書に開示される特徴は全て、任意の組み合わせで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替の特徴に置き換えられてもよい。したがって、別途明確に示されない限り、開示される各特徴は、一般的な一連の同等または同様の特徴の一例にすぎない。
【０４００】
前述の記述は、当業者が方法を実施し、及び／または本明細書に記載される組成物を得ることを可能にするのに十分であると見なされる。以下の実施例及び詳細な説明は、限定するものではなく、例証として提供されている。
【０４０１】
本明細書における全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表の説明
【０４０２】
配列番号１  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＶＥＧＦ＞の可変重鎖ドメインＶＨ
【０４０３】
配列番号２  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＶＥＧＦ＞の可変軽鎖ドメインＶＬ
【０４０４】
配列番号３  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＡＮＧ−２＞の可変重鎖ドメインＶＨ
【０４０５】
配列番号４  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＡＮＧ−２＞の可変軽鎖ドメインＶＬ
【０４０６】
配列番号５  ＲＧ７７１６の＜ＶＥＧＦ＞の可変重鎖ドメインＶＨ
【０４０７】
配列番号６  ＲＧ７７１６の＜ＶＥＧＦ＞の可変軽鎖ドメインＶＬ
【０４０８】
配列番号７  ＲＧ７７１６の＜ＡＮＧ−２＞の可変重鎖ドメインＶＨ
【０４０９】
配列番号８  ＲＧ７７１６の＜ＡＮＧ−２＞の可変軽鎖ドメインＶＬ
【０４１０】
配列番号９  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＡＮＧ−２＞の重鎖
【０４１１】
配列番号１０  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＶＥＧＦ＞の重鎖
【０４１２】
配列番号１１  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂの＜ＡＮＧ−２＞の軽鎖
【０４１３】
配列番号１２  ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ’の＜ＶＥＧＦ＞の軽鎖
【０４１４】
配列番号１３  ＲＧ７７１６の＜ＶＥＧＦ＞の重鎖
【０４１５】
配列番号１４  ＲＧ７７１６の＜ＡＮＧ−２＞の重鎖
【０４１６】
配列番号１５  ＲＧ７７１６の＜ＶＥＧＦ＞の軽鎖
【０４１７】
配列番号１６  ＲＧ７７１６の＜ＡＮＧ−２＞の軽鎖
【実施例】
【０４１８】
実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。実際、本明細書に示され、記載される修正に加えて、種々の修正が前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０４１９】
実施例１：抗Ｘ１／抗Ｙ１二重特異性抗体のアセンブリ及び精製
標的タンパク質Ｘ１及びＹ１−抗Ｘ１／抗Ｙ１二重特異性抗体またはａＸ１／Ｙ１二重特異性に対する二重特異性抗体は、以下のとおりにアセンブリングされた。各半抗体（ａＸ１（ノブ）及びａＹ１（ホール）は独立して、プロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して親和性クロマトグラフィーのステップにかけられた。プロテインＡのステップは独立して、類似のプロセス条件を使用して各半抗体を完了するが、異なる装填物密度の標的である。プロテインＡカラムは、周囲温度（１５〜３０℃）で行われ、装填物は、１２〜１８℃に冷却された。プロテインＡカラムは、溶出緩衝液の３つのカラムの体積、その後に再生成緩衝液の３つのカラムの体積を適用させることによって調製された。カラムは、次いで、装填材料を処理するのに十分なサイクルで平衡化、装填、３回洗浄（平衡化緩衝液洗浄、リン酸塩カリウム洗浄、平衡化緩衝液洗浄）、溶出、及び再生成された。プロテインＡカラムのプールされた材料は、調節されたｐＨであり、必要な場合、溶出緩衝液の添加によってｐＨ≦３．６０を達成し、最低１２０分間維持する。このステップの後に、プールされた材料のｐＨは、さらなるプロセスのためにｐＨ５．０±０．３に調節された。
【０４２０】
次いで、プロテインＡクロマトグラフィーのステップから得られた半抗体のプールは、１：１のモル比で組み合わされ、ｐＨは、ｐＨ８．２に調節された。２００ｍＭのＬ−グルタチオン（９１／９％ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）緩衝液は、組み合わされたプールに添加され、形成されている二重特異性の１モル当たり１６５モルのＬ−グルタチオンの比率を達成した。物質は、３２．０±２．０℃まで８〜２４時間加熱された。得られたアセンブリングされたプールは、１５〜２５℃まで冷却され、次いで、ｐＨ５．５に調節された。
【０４２１】
次いで、ｐＨ調節されたアセンブリングされたプールは、結合及び溶出モードでＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂を使用してマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーにかけられた。カラムは、１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で平衡化された。調節されたアセンブリプールは、４５ｇ／Ｌ樹脂にカラム上に装填され、その後に平衡化緩衝液及び、ｐＨ８．０で２５ｍＭの酢酸ナトリウムを有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳの第２の洗浄相で洗浄された。二重特異性抗体は、ｐＨ８．０で２４５ｍＭの酢酸ナトリウムを有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳを使用して、段階溶出で塩及びｐＨの両方を増加させることによってカラムから溶出された。カチオン交換プールは、２８０ｎｍの吸光度に基づいて開始及び終結された。
【０４２２】
マルチモーダルカチオンクロマトグラフィーのステップからの溶出物は、次いで、フロースルーモードでＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂を使用してマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーにかけられた。Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅカラムは、５０ｍＭのトリス、８５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ８．０）で平衡化された。先行のステップからの生成物プールは、精製水で９．０ｍＳ／ｃｍの伝導度に調節され、カラム上に装填された。二重特異性抗体は、カラムを通して流れ、カラムは、次いで、平衡化緩衝液で洗浄された。アニオン交換プールは、２８０ｎｍの吸光度に基づいて開始及び終結された。上記に記載される精製スキームは、図１Ａに示される。
【０４２３】
第３のクロマトグラフィーのステップは、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、及び内毒素、ならびに半抗体、ホモ二量体、及び凝集体を含む生成物−バリアントのような残留不純物を除去した。Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ装填物は、２０％のａＹ１ホモ二量体が添加され、クロマトグラフィープロセスは、ａＹ１ホモ二量体をおおよそ２倍（ＭＳによって８％、及び生成物−関連不純物を検出するための細胞に基づくアッセイによって１０％）減少させた。
【０４２４】
図１Ａ）に示される精製スキームの、従来式カチオン交換（ＣＥＸ）樹脂（ＰＯＲＯＳ  ＸＳ）（図１Ｂを参照されたい）を使用した精製スキームとの比較は、マルチモーダル樹脂の使用が、二重特異性抗体の生成物−関連バリアント、特にホモ二量体からの分離を改善したことを示した。したがって、親和性クロマトグラフィーのステップからのプールされた材料は、２０％のホールホモ二量体が添加され、マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーは、ホールホモ二量体を、生成物−関連不純物について質量分析（ＭＳ）によって２％未満、及び細胞に基づくアッセイによって定量下限の０．５％未満に減少させた。
表７：抗Ｘ１／抗Ｙ１二重特異性抗体の宿主細胞−関連不純物及び生成物−関連不純物からの分離（ＰＯＲＯＳ  ＸＳ樹脂、結合／溶出モード）
2019521986.tif 000011
表８：二重特異性抗体の宿主細胞−関連不純物及び生成物−関連不純物からの分離（Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ樹脂、結合／溶出モード）
2019521986.tif 000012
ＣＨＯＰ＝ＣＨＯ細胞タンパク質；ＨＭＷＳ＝高分子量種；１５０ｋＤ＝二重特異性及びホモ二量体；７５ｋＤ＝半抗体；ＬＭＷＳ＝低分子量種
【０４２５】
表９及び１０に示されるように、従来式アニオン交換（ＡＥＸ）樹脂（ＱＳＦＦ）（図１Ｃを参照されたい）とマルチモーダルＡＥＸ樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ）（図１Ａを参照されたい）との比較は、マルチモーダルＡＥＸ樹脂が、従来のＡＥＸ  ＱＳＦＦ樹脂と比較して二重特異性抗体の生成物−関連不純物からの著しくより良好な分離を達成したことを実証した。半抗体（７５ｋｄ）及び凝集体、すなわち、高分子量種（ＨＭＷＳ）の除去に起因して、ＱＳＦＦは、主ピーク１％高め、Ａｄｈｅｒｅは、主ピークを１０％高めた。同じＣａｐｔｏ  ＭＭＣプールを使用したＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ及びＱＳＦＦの直接比較は、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ樹脂が、ＱＳＦＦ（表１１）と比較して、サイズ−バリアント、半抗体を含む生成物関連バリアント、及び宿主細胞タンパク質の浄化のより良好な浄化を達成したことを示した。
表９：二重特異性抗体の宿主細胞−関連不純物及び生成物−関連不純物からの分離
（ＱＳＦＦ樹脂、フロースルーモード）
2019521986.tif 000013
ＣＨＯＰ＝ＣＨＯ細胞タンパク質；ＨＭＷＳ＝高分子量種；１５０ｋＤ＝二重特異性及びホモ二量体；７５ｋＤ＝半抗体；ＬＭＷＳ＝低分子量種
表１０：二重特異性抗体の
宿主細胞−関連不純物及び生成物−関連不純物からの分離（Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂、フロースルーモード）
2019521986.tif 000014
ＣＨＯＰ＝ＣＨＯ細胞タンパク質；ＨＭＷＳ＝高分子量種；７５ｋＤ＝半抗体；ＬＯＱ＝定量下限
表１１：Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ及びＱＳＦＦの比較
2019521986.tif 000015
ＣＨＯＰ＝ＣＨＯ細胞タンパク質；ＨＭＷＳ＝高分子量種；７５ｋＤ＝半抗体；ＬＯＱ＝定量下限
【０４２６】
上記に記載される実験は、図１Ａに示される精製スキームが、図１Ｂまたは図１Ｃ中の精製スキームと比較して、ａＸ１／Ｙ１二重特異性抗体の生成物−関連不純物からの著しくより良好な分離を達成したことを実証した。最初に、親和性クロマトグラフィーのステップからのプールされた材料は、２０％のホールホモ二量体が添加され、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ（すなわち、マルチモーダルカチオン交換樹脂）は、ホールホモ二量体を、生成物−関連不純物について質量分析（ＭＳ）によって２％未満、及び細胞に基づくアッセイによって定量下限の０．５％未満に減少させた。（表７及び８を参照されたい）。そのような分離は、ＰＯＲＯＳ  ＸＳ、すなわち、従来式カチオン交換樹脂を使用して達成されなかった。加えて、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ（すなわち、マルチモーダルアニオン交換樹脂）は、半抗体（７５ｋＤ）及び凝集体などの高分子量種の除去に起因して、主ピークを１０％高めたが、ＱＳＦＦ（すなわち、従来式アニオン交換樹脂）は、主ピークを１％のみ高めた。さらに、２つの多様型樹脂の組み合わせである、マルチモーダルカチオン樹脂（ＣａｐｔｏＭＭＣ）、その後に続くマルチモーダルアニオン樹脂ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅは、マルチモーダルカチオン樹脂、その後に続く従来式アニオン交換樹脂、ＱＳＦＦの組み合わせと比較して、サイズ−バリアント、半抗体を含む生成物関連バリアント、及び宿主−細胞タンパク質の浄化のより良好な浄化を達成した（例えば、表１１を参照されたい）。
【０４２７】
生成物−関連バリアント及びサイズバリアントの除去の類似の改善は、マルチモーダル樹脂の順序が逆であったときに見出された。別々の実験では、ａＸ１／Ｙ１二重特異性抗体の生成物−関連不純物からのより良好な分離はまた、プールされた材料をまず親和性クロマトグラフィーのステップからマルチモーダルアニオン樹脂、その後に続くマルチモーダルカチオン樹脂にかけることによって達成された。
【０４２８】
実施例２：Ｆ（ａｂ’）２二重特異性のアセンブリ及び精製
９０％純粋のＦ（ａｂ’）２二重特異性を達成するための最初の試みは、低い収率（１０％未満の開始材料）をもたらした。純度の損失なく許容可能な収率を維持する問題に加えることは、いくつかの困難であり、プロセス中間体の不安定性と、ホモ二量体、遊離軽鎖及び重鎖、ならびに未反応Ｆａｂ’脱離基などの生成物−関連バリアントの存在とを含む。新規の単位操作は、所望の二重特異性Ｆ（ａｂ’）２の効率的なアセンブリ及び精製を達成するために開発された。２つの異なるＦａｂ’分子を含む二重特異性Ｆ（ａｂ’）２は、図２に提供される概略図に示されるようにアセンブリング及び精製された。
【０４２９】
最初に、捕獲ステップが以下のとおりに実行された。各Ｆａｂ’は、まず別々のＥ．ｃｏｌｉ抽出物上清から捕獲された。２つのＦａｂ’半分子のうちの１つを含む上清は、ＣａｐｔｏＬプロテインＬ親和性クロマトグラフィー樹脂を使用して捕獲ステップにかけられた。カラムは、２５ｍＭのトリス塩化ナトリウム平衡化緩衝液（ｐＨ７．７）を使用して平衡化された。装填物材料のカラムへの適用の後、カラムは、平衡化緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄され、その後に０．４Ｍのリン酸塩カリウム（ｐＨ７）での洗浄、システインキャップを除去するための還元体での洗浄、及び平衡化緩衝液（ｐＨ７．７）での追加の洗浄が続いた。次いで、対象のＦａｂ’生成物は、０．１Ｍの酢酸（ｐＨ２．９）の溶出緩衝液を使用してＣａｐｔｏＬカラムから溶出された。生成物は、２８０ｎｍの吸光度を使用して収集された。
【０４３０】
第１のＦａｂ’半分子（Ｆａｂ’Ａ）を含むＣａｐｔｏＬクロマトグラフィーのステップからのプールは、ｐＨ５．５に調節された。ＤＰＤＳ（ジピリジルジスルフィド）は、ｐＨ５．５まで添加され、ＣａｐｔｏＬプールを調節した。ＤＰＤＳは、Ｆａｂ’分子中で、遊離ヒンジシステインと反応し、利用可能なＦａｂ’遊離チオールと反応するピリジル化Ｆａｂ’を形成し、それによって、Ｆ（ａｂ’）２ヘテロ二量体の形成を促進する。一旦形成されると、ピリジル化Ｆａｂ’Ａは、精製のために第２のクロマトグラフィーカラム上に装填された。
【０４３１】
ピリジル化Ｆａｂ’が不純物（すなわち、Ｆａｂ’ホモ二量体、高分子量種（ＨＭＷＳ）、Ｆａｂ’単量体）から分離され得る条件下でのクロマトグラフィーの条件を特定するために、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ樹脂上のＦａｂ’ホモ二量体、高分子量種（ＨＭＷＳ）、Ｆａｂ’単量体、及びピリジル化Ｆａｂ’（ｐｙｒ−Ｆａｂ’）の結合挙動は、クロマトグラフィー樹脂結合条件の９６ポイントの分配係数スクリーニングで特徴付けられた。ピリジル化Ｆａｂ’プールは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂に装填された。Ｆａｂ’単量体は、勾配ｐｙｒ−Ｆａｂ’でより早く溶出することが予測されたが、ＨＭＷＳ及びＦａｂ’ホモ二量体は、勾配でより遅く溶出することが予測された。第２のＦａｂ’分子、Ｆａｂ’Ｂは、ＣａｐｔｏＬクロマトグラフィー樹脂から溶出され、次いで、酸化された。
【０４３２】
次いで、ピリジル化Ｆａｂ’Ａ及び酸化Ｆａｂ’Ｂを含む２つのＦａｂ’プールは、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性分子のアセンブリに好適な条件に晒された。ピリジル化Ｆａｂ’Ａ及び酸化Ｆａｂ’Ｂ  ＣａｐｔｏＬプールは組み合わされた。組み合わされたプールは、最小限のアセンブリのために保持され、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性の形成を可能にした。次いで、アセンブリプールは、次のクロマトグラフィーカラム上に装填するために条件付けされた。
【０４３３】
低解像度Ｋｐ（すなわち、分配係数）スクリーニングは、異なるクロマトグラフィー樹脂上のＦ（ａｂ’）２アセンブリ混合物の結合挙動を特徴付けるために行われた。アセンブリ混合物（ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定された場合、０％凝集体、２１．５％Ｆａｂ’Ａホモ二量体、４３．９％Ｆ（ａｂ’）２、１０．３％Ｆａｂ’Ａ単量体、８．８％ピリジル化Ｆａｂ’Ａ、及び１５．５％Ｆａｂ’Ｂ単量体）は、以下の樹脂上：Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂、ＱＳＦＦ樹脂、またはＰＯＲＯＳ（登録商標）５０ＨＳ樹脂に、５ｇ／Ｌ樹脂装填物密度で装填することによって試験された。各フロースループレートのタンパク質組成物及びタンパク質濃度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを介して分析された。これらのデータは、デコンボリューションされ、試験条件下で４つの樹脂の各々においてＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’Ａホモ二量体、Ｆａｂ’Ｂホモ二量体、Ｆａｂ’Ａ単量体、及びＦａｂ’Ｂ単量体の挙動に対応する等高線プロットを生成するために使用された。
【０４３４】
等高線プロットに基づいて、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅは、Ｆａｂ’Ａ単量体、Ｆａｂ’Ａホモ二量体、及びＦａｂ’Ｂホモ二量体を分解することが予測された。具体的には、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂上の結合及びｐＨ勾配溶出では、Ｆａｂ’Ａ単量体及びＦａｂ’Ｂホモ二量体は、Ｆ（ａｂ’）２の主ピークより早く溶出することが予期されたが、Ｆａｂ’Ａホモ二量体は、樹脂に結合したままであることが予測された。ＱＳＦＦの等高線プロットは、いずれの種も、試験されるｐＨ範囲についてＱＳＦＦ樹脂を結合することを予測されず、Ｆ（ａｂ’）２生成物−関連不純物からの分離はＱＳＦＦクロマトグラフィーを介して達成されないことを示すことを示した。混合モード樹脂は、実験条件下でＦ（ａｂ’）２の生成物関連不純物からの最良の分離を提供した。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ等高線プロットは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣが、ｐＨ５．５でＦ（ａｂ’）２をその生成物−特異的不純物から効果的に分離することが予測された。
【０４３５】
Ｆ（ａｂ’）２二重特異性のアセンブリの後、アセンブリプールは、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ樹脂を使用してマルチモーダルＡＥＸクロマトグラフィーにかけられる。アセンブリプールはｐＨ７．５に滴定され、≦５．５ｍＳ／ｃｍの伝導度に希釈される。カラムは、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）平衡化緩衝液で平衡化された。アセンブリプールは、２５ｇ／Ｌ樹脂の装填物密度でカラム上に装填される。次いで、カラムは、平衡化緩衝液で洗浄される。カラムは、２５ｍＭの酢酸ナトリウム、４５ｍＭのＭＥＳ、５ｍＭトリス（ｐＨ５．５）溶出緩衝液を使用して溶出され、及び溶出プールは、Ａ２８０の吸光度によってプールされる。
【０４３６】
その後に、マルチモーダルＡＥＸである、材料は、結合及び溶出モードで操作されるＰｏｒｏｓ５０ＨＳ樹脂上に装填される。Ｐｏｒｏｓ５０ＨＳカラムは、５２ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）で平衡化される。装填物は、ｐＨ５及び伝導度≦３．３ｍＳ／ｃｍに条件付けされる。カラムは、平衡化緩衝液で洗浄される。次いで、カラムは、１６９ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）で洗浄される。カラムは、２４７ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）溶出緩衝液を使用して段階溶出を使用して溶出される。プールは、Ａ２８０によって収集される。
【０４３７】
次いで、ＰＯＲＯＳ５０ＨＳのステップからのプール、ＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂を使用してマルチモーダルＣＥＸクロマトグラフィーにかけられる。マルチモーダルＣＥＸステップは、結合及び溶出モードで操作される。カラムは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）平衡化緩衝液を使用して平衡化される。装填物は、ｐＨ５．０及び伝導度≦５ｍＳ／ｃｍに調製され、１５ｇ／Ｌの装填物密度にカラム上に装填される。カラムは、平衡化緩衝液で洗浄される。次いで、カラムは、１４０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）洗浄２緩衝液で洗浄される。カラムは、平衡化緩衝液及び３５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）溶出緩衝液を使用して勾配溶出で溶出される。プールは、Ａ２８０によって収集される。
【０４３８】
表１２に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質からの対象のＦ（ａｂ’）２二重特異性生成物（１００ｋＤ）、及び７１ｋＤの誤形成ジスルフィド生成物関連バリアントの改善された分離は、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ樹脂を使用するときと比較しＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂を使用したときに達成された。ＳＥＣによって測定される９５％超のＦａｂ’２の純度は、４番目のカラムとしてＣａｐｔｏＭＭＣ使用して達成された。５％未満の７１ｋＤ誤形成ジスルフィド生成物はまた、４番目のカラムとしてＣａｐｔｏＭＭＣを使用して達成された。
表１２：Ｆ（ａｂ’）２の宿主細胞−関連不純物及び生成物−関連不純物からの分離（ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ樹脂、結合及び溶出モード対Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、結合及び溶出モード）
2019521986.tif 000016
Ｆ（ａｂ’）２％＝ＳＥＣによって測定された二重特異性％；１００ｋＤ＝ＣＥ−ＳＤＳによって測定された対象のＦ（ａｂ’）２二重特異性生成物；７１ｋＤ＝ＣＥ−ＳＤＳによって測定された誤形成ジスルフィドを有する生成物関連バリアント；ＥＣＰ＝Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質
【０４３９】
したがって、図２に示される精製スキームは、装填物材料と比較して、純粋Ｆ（ａｂ’）２を著しく改善し、精製されたＦ（ａｂ’）２のプール中で宿主細胞タンパク質の量を９９％以上低減した。
【０４４０】
実施例３：抗Ｘ２／抗Ｙ２二重特異性抗体のアセンブリ及び精製
別の実施例では、二重特異性抗体は、以下のとおりに精製された。各半抗体は、別々に生成され、親和性クロマトグラフィーにかけられ、その後に上記に記載されるアセンブリが続いた。アセンブリ後に、アセンブリ材料は、結合及び溶出モードでＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂を使用して、まずマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーにかけられた。アセンブリ材料は、ｐＨ７．５に調節され、１５０ｍＭの酢酸塩／トリス緩衝液（ｐＨ７．５）で事前平衡化されたカラム上に装填された。装填後に、カラムは、平衡化緩衝液で洗浄され、結合タンパク質は、２５ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５．０）で溶出された。溶出プールの収集は、Ａ２８０ｎｍのシグナルに基づいて引き起こされた。次いで、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ溶出プールは、結合及び溶出モードでＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂を使用してマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーにかけられた。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ溶出プールは、ｐＨ６．５に調節され、２５ｍＭの酢酸塩、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）緩衝液中に事前平衡化されたＣａｐｔｏ  ＭＭＣカラム上に装填された。装填後に、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムは、平衡化緩衝液で洗浄され、結合タンパク質は、１５０ｍＭのＮａ−酢酸塩、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）で溶出された。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ溶出緩衝液。プール収集は、Ａ２８０ｎｍのシグナルに基づいた。この精製スキームは、図３Ａに示される。
【０４４１】
表１３及び表１４に示されるとおり、二重特異性抗体の、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質及びシャペロン（例えば、ｆｋｐＡ、ｄｓｂＡ、及びｄｓｂＣ）などのプロセス特異的不純物からのより優れた分離は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの後にＱＳＦＦクロマトグラフィーが続く（図３Ｂを参照されたい）ときと比較して、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの後にＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーが続く（図３Ａを参照されたい）ときに達成された。さらに、二重特異性抗体の、超高分子量種（ｖＨＭＷＳ）、高分子量種（ＨＭＷＳ）、及び低分子量種（ＬＭＷＳ）などの生成物−特異的不純物からのより優れた分離は、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの後にＱＳＦＦクロマトグラフィーが続く（図３Ｂを参照されたい）ときと比較して、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの後にＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーが続く（図３Ａを参照されたい）ときに達成された。（表１３及び１４を参照されたい）。
表１３：抗Ｘ２／Ｙ２プロセスにおいてＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ−ＱＳＦＦステップで達成されるプロセス特異的不純物及び生成物−特異的不純物の浄化
2019521986.tif 000017
表１４：抗Ｘ２／Ｙ２プロセスにおいてＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ−Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣステップで達成される
プロセス特異的不純物及び生成物特異的不純物の浄化
2019521986.tif 000018
【０４４２】
上記に記載される実験は、図３Ａに示される精製スキーム（すなわち、そこでマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーの後にマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーが続いた）が、図３Ｂに示される精製スキーム（すなわち、そこでマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーの後に従来式カチオン交換クロマトグラフィーが続いた）と比較して、抗Ｘ２Ｙ２二重特異性抗体の、プロセス関連生成物及び生成物関連不純物からの改善された分離を達成したことを実証した。さらに、図３Ａに示される精製スキームはまた、図３Ｂに示される精製スキームと比較して、抗Ｘ２Ｙ２二重特異性抗体の改善された収率を達成した。
【０４４３】
実施例４：抗Ｘ３／抗Ｙ３二重特異性抗体のアセンブリ及び精製
抗Ｘ３ノブ半抗体は、プロテインＡカラム上で捕捉された。カラムは、最初に、２５ｍＭのトリス、２５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．７）平衡化緩衝液を使用して平衡化された。次いで、抗Ｘ３半抗体を含むＥ．ｃｏｌｉ抽出物上清は、カラム上に装填された。抽出物上清の装填後に、カラムは、平衡化緩衝液、その後に０．４Ｍのリン酸塩（ｐＨ７）洗浄緩衝液で洗浄され、次いで、平衡化緩衝液で洗浄された。次いで、抗Ｘ３半抗体は、０．１５Ｍの酢酸（ｐＨ２．９）溶出緩衝液を使用して溶出された。溶出プールは、Ａ２８０によって収集された。溶出プールは、ｐＨ５．０に滴定され、次いで、抗Ｙ３ホール半抗体との組み合わせまで保管された。抗Ｙ３ホール半抗体は、抗Ｘ３半抗体について記載される同じプロテインＡを使用して捕捉された。
【０４４４】
２つの半抗体は、１：１の質量比で組み合わされた。アルギニンは、５０ｍＭの最終濃度までアセンブリプールに添加される。組み合わされた半抗体のプールは、２００ｍＭのヒスチジン、８％のＰＶＰ（ｐＨ８）で１：１に希釈された。Ｌ還元グルタチオンは、２つの半抗体をアセンブリングするために２００倍（二重特異性抗体のモル当たり、２００モルのグルタチオン）のモル過剰に添加された。アセンブリプールは、ｐＨ８．０に滴定され、次いで、摂氏３５度まで６時間加熱された。次いで、プールは、室温に冷却され、次のクロマトグラフィーカラム上で装填のために調節された。
【０４４５】
アセンブリプールは、ＱＳＦＦアニオン交換カラム上に装填された。カラムは、最初に、２５ｍＭのトリス、３５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ９．１）、その後の２５ｍＭのトリス、７０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ９．１）平衡化緩衝液で事前平衡化された。次いで、調節された装填物は、ｐＨ８．５、伝導度≦４．９ｍＳ／ｃｍでカラムに適用された。次いで、カラムは、平衡化緩衝液で洗浄された。次いで、プールは、平衡化緩衝液及び２５ｍＭのトリス、３５０ｍＭの塩化ナトリウム溶出緩衝液を使用して溶出された。溶出プールは、Ａ２８０によって収集された。
【０４４６】
次いで、ＱＳＦＦプールは、次のカラム上に装填するために調節された。ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅマルチモーダルアニオン交換カラムは、５００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）事前平衡化緩衝液で事前平衡化され、その後に５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）平衡化緩衝液の８カラム体積で平衡化された。ｐＨ６．０、伝導度≦１２ｍＳ／ｃｍで調節された装填物は、カラムに適用された。次いで、カラムは、平衡化緩衝液、その後に０．１Ｍのアルギニン（ｐＨ７．０、伝導度７．５ｍＳ／ｃｍ）洗浄緩衝液で洗浄され、次いで平衡化緩衝液で洗浄された。次いで、カラムは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）溶出緩衝液を使用して勾配溶出で溶出された。溶出プールは、Ａ２８０によって収集された。
【０４４７】
次いで、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅプールは、次のカラム上に装填するために調節された。ＣａｐｔｏＭＭＣマルチモーダルカチオン交換カラムは、３５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）事前平衡化緩衝液で事前平衡化され、その後に５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）平衡化緩衝液で平衡化された。ｐＨ６．０、伝導度≦６．５ｍＳ／ｃｍで調節された装填物は、カラムに適用された。次いで、カラムは、８０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）洗浄緩衝液で洗浄された。次いで、カラムは、３５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）溶出緩衝液を使用して勾配溶出で溶出された。溶出プールは、Ａ２８０によって収集された。この精製スキームは、図４に示される。
【０４４８】
表１５に以下に示されるように、１つのみのマルチモーダルカラムを含む３カラムプロセス（すなわち、プロテインＡ、その後のＱＳＦＦ、その後のＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ）は、十分なＥＣＰ除去を達成しなかった。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーを使用してＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーの溶出物を第４のクロマトグラフィーカラムにかけることは、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のレベルをＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅプールに対して３倍超を低減し、ＨＭＷＳを１％未満に低下させ、二重特異性含量を１００％に増加させた。
表１５
2019521986.tif 000019
ＨＭＷＳ＝ＳＥＣによって測定された高分子量種；二重特異性％＝逆相ＨＰＬＣによって測定された二重特異性抗体の％；ＥＣＰ＝Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞タンパク質
【０４４９】
実施例５：実施例６及び７の材料及び方法
抗体
実施例６〜７は、ＷＯ２０１１／１１７３２９もしくは配列番号１〜配列番号４に記載されるＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体−Ａ（抗Ａｎｇ２／ＶＥＧＦ−Ａ抗体；ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ；ＲＧ７２２１）、またはＷＯ２０１４／００９４６５もしくは配列番号５〜配列番号８に記載されるＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２に対する二重特異性抗体（抗ＶＥＧＦ−Ａ／Ａｎｇ２抗体；ＲＧ７７１６）を含む様々な例示的な抗体を使用する。また以下の実施例に記載されるように、いくつかの抗体が本明細書に含まれる。
【０４５０】
本明細書に記載または参照される技法及び手順は、当業者には概して十分に理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、及びＴｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）に記載される幅広く利用される方法論などの、当業者による従来の方法論を使用して用いられる。
【０４５１】
ＳＥ（サイズ排除）ＨＰＬＣによる純度
ＳＥ  ＨＰＬＣは、ＳＥ  ＨＰＬＣカラムを用いることによって天然の条件下でサイズ異種性を監視するために使用され、抗体凝集体、単量体、及び断片を分離する。溶出物は、ＵＶ吸光度によって監視される。純度は、検出される全てのタンパク質のピークの合計に対して主ピーク、ＨＭＷＳ形態の合計、及びＬＭＷＳ形態の合計の百分率（領域）で決定される。
【０４５２】
ＩＥ（イオン交換）ＨＰＬＣによる純度
勾配イオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換カラムを用いることによってカルボキシペプチダーゼＢで処理される試料の荷電異種性を定量的に監視するために使用され、試料を主ピーク、酸性領域、及び塩基性領域に分離する。検出は、ＵＶ吸光度によって行われる。純度は、検出される全てのタンパク質のピークの合計に対して主ピーク、酸性領域、及び塩基性領域の百分率（領域）で決定される。
【０４５３】
ＣＥ−ＳＤＳ（カリパス）による純度
タンパク質の電気泳動分離のための従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法は、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＧＸＩＩ／ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸアッセイシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．／Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）におけるチップ形式に移行されている。タンパク質は、それらの相対的なサイズによって分離される。試料は、製造者の指示に従って検出及び分析され得る蛍光色素で標識することによって分離前に調製される。
【０４５４】
純度及び抗体完全性は、マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を使用してＣＥ−ＳＤＳによって各精製ステップ後に分析された。したがって、分析物溶液は、調製され、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｈｉｐを使用してＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム上で分析された。データは、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸソフトウェアを使用して分析された。
【０４５５】
ＵＶによるタンパク質含量
試料のタンパク質濃度は、ＵＶによって決定される。タンパク質吸収は、２８０ｎｍの吸収から３２０ｎｍの吸収を差し引くことによって修正した。この吸光値は、タンパク質濃度に直接正比例する。タンパク質濃度は、１．５ｍＬｍｇ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して計算される。
【０４５６】
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及びＤＮＡ含量の検出方法
ａ）ＣＨＯ  ＨＣＰアッセイ
プロセス試料中の残留ＣＨＯ  ＨＣＰ含量は、ｃｏｂａｓ  ｅ４１１免疫分析装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）によって測定される。
【０４５７】
アッセイは、ヒツジのポリクローナル抗ＣＨＯ  ＨＣＰ抗体を使用したサンドイッチ法に基づく。
【０４５８】
第１のインキュベーション：１５μＬ試料（そのまま及び／または希釈された）からのチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質（ＣＨＯ  ＨＣＰ）及びビオチン複合化ポリクローナルＣＨＯ  ＨＣＰ特異的抗体は、サンドイッチ複合体を形成し、それは、ストレプトアビジンを有するビオチンの相互作用を介してストレプトアビジンコーティング微粒子に結合するようになる。
【０４５９】
第２のインキュベーション：ルテニウム複合体（トリス（２，２｀−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）−複合体）で標識されたポリクローナルＣＨＯ  ＨＣＰ特異的抗体の添加後、三元サンドイッチ複合体は、微粒子上で形成される。
【０４６０】
反応混合物を測定セルに吸引し、ここで、微粒子が電極の表面に磁気的に補足される。次いで、未結合の基質は、洗浄ステップで除去される。その後、電圧を電極に適用することで化学発光放出が誘導され、これを光電子増倍管によって測定する。
【０４６１】
試験試料中のＣＨＯ  ＨＣＰの濃度は、最後に、既知の濃度のＣＨＯ  ＨＣＰの標準曲線から計算される。
【０４６２】
ｂ）ＤＮＡ含量
ｑ  ＰＣＲに基づくアッセイは、ＣＨＯ  ＤＮＡの検出及び定量化に使用される。試料からのＤＮＡは、シリカゲルに基づく膜を使用して商用のＲＮＡ抽出キットで抽出される。抽出されたＤＮＡは、配列検出システムでＰＣＲプライマー及びプローブを使用して定量的リアルタイムＰＣＲにかけられる。アンプリコン（増幅産物）は、ＤＮＡ増幅の間に連続的に測定された蛍光発光の増加に対して正比例して定量化される。標準曲線は、試料中のＣＨＯ細胞ＤＮＡの量を定量化するために使用される。
【０４６３】
実施例６：ＡＮＧ２及びＶＥＧＦ−Ａを結合する二重特異性抗体（ＷＯ２０１１／１１７３２９に記載される抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体）の精製
ＣＨＯ発現培養から採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）は、結合溶出モードでＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ親和性クロマトグラフィーによって処理された。３８ｇｍＡｂ／ｌ樹脂の最大装填物密度までのカラム上へのＨＣＣＦの装填後、カラムは、５カラム体積に対して２５ｍＭのトリス、２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄された。次いで、５カラム体積に対して０．７Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）で追加の洗浄が行われた。第３の洗浄ステップは、高純度精製水または１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を使用して行われた。カラム結合抗体は、５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ３．４）を使用して溶出された。溶出プールは、最大３カラム体積にわたる５００〜２５０ｍＡＵ（路長１ｃｍ）のＯＤ２８０に基づいて収集された。
【０４６４】
親和性溶出プールは、酢酸でｐＨ３．５に調節され、３０分間保持された。プールは、１．５Ｍのトリス塩基でｐＨ５．０に条件付けされ、深層濾過によって浄化された。深層濾過プールは、１．５Ｍのトリス塩基を使用してｐＨ７に条件付けされ、マルチモーダルアニオン交換樹脂Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓを使用する第２のクロマトグラフィーのステップのために供給原料として役立った。
【０４６５】
Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓカラムは、５０ｍＭのトリス酢酸塩（ｐＨ７．０）で平衡化された。平衡化されたカラムは、１８０ｇｍＡｂ／ｌ樹脂の最大装填物密度まで装填され、２０ｍＭのトリス酢酸塩（ｐＨ７．０）で洗浄された。溶出プールは、１０００〜４０００ｍＡＵ（路長１ｃｍ）のＯＤ２８０に基づいて収集された。
【０４６６】
第２のクロマトグラフィーのステップのプールは、酢酸でｐＨ５．０に条件付けされ、マルチモーダルカチオン交換樹脂Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓを使用する最終の第３のクロマトグラフィーのステップのために供給原料として役立った。第３のクロマトグラフィーのステップは、結合及び溶出モードで行われた。Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓカラムは、３０ｍＭのトリス／酢酸塩（ｐＨ５．０）（平衡化緩衝液）で平衡化された。平衡化されたカラムは、５カラム体積に対して４５ｇｍＡｂ／ｌ樹脂の最大装填物密度まで装填され、平衡化緩衝液で洗浄された。第２の洗浄は、１０カラム体積に対して３０ｍＭのトリス／酢酸塩（ｐＨ６．８）、その後に５カラム体積に対して平衡化緩衝液を使用して行われた。最終の洗浄ステップは、１０カラム体積に対して３０ｍＭのトリス／酢酸塩（ｐＨ４．９）、５００ｍＭのリン酸ナトリウムを使用して行われた。カラム結合抗体は、３０ｍＭのトリス／酢酸塩（ｐＨ６．０）、５００ｍＭのリン酸ナトリウムを使用して溶出された。溶出プールは、３６００〜１０００ｍＡＵ（路長１ｃｍ）のＯＤ２８０に基づいて収集された。
【０４６７】
第３のクロマトグラフィーのステップのプールは、濃縮され、製剤緩衝液に緩衝液交換された。上記に記載される精製スキームは、図５Ａに示される。
表１６：それぞれのクロマトグラフィーのステップ後の生成物−特異的不純物及びプロセス特異的不純物の分析的データ
2019521986.tif 000020
2019521986.tif 000021
表１７：親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む４つのクロマトグラフィーカラムを使用するプロセス（４カラム（４Ｃ）プロセス）との比較
2019521986.tif 000022
【０４６８】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ及びＣａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓ  ＨＨＬ、３／４抗体、前ピーク、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳなどの生成物−関連不純物、ならびにＨＣＰ及びＤＮＡなどのプロセス関連不純物を含む３つのカラムプロセスを使用することは、捕獲クロマトグラフィー、従来式カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び従来式アニオン交換クロマトグラフィーを含む４つのカラムプロセスを使用することと比較して、低減され得ることが見られ得る。
【０４６９】
実施例７：ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２に対する二重特異性抗体（ＷＯ２０１４／００９４６５に記載される抗ＶＥＧＦ−Ａ／抗Ａｎｇ２抗体）の精製
ＣＨＯ発現培養から採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）は、結合溶出モードでＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＦｃＸＬ親和性クロマトグラフィーによって処理された。２５ｇｍＡｂ／ｌ樹脂の最大装填物密度までのカラム上へのＨＣＣＦの装填後、カラムは、２カラム体積に対して２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、２５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で洗浄された。次いで、５カラム体積に対して精製水ＰＷＩＩで追加の洗浄が行われた。カラム結合抗体は、３０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ３．２）を使用して溶出された。溶出プールは、２５００〜１０００ｍＡＵ（路長１ｃｍ）のＯＤ２８０に基づいて収集された。
【０４７０】
親和性溶出プールは、酢酸でｐＨ３．４に調節され、６０分間保持された。プールは、１．５Ｍのトリス塩基でｐＨ５．０に条件付けされ、深層濾過によって浄化された。深層濾過プールは、１．５Ｍのトリス塩基を使用してｐＨ７に条件付けされ、マルチモーダルアニオン交換樹脂Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅを使用する第２のクロマトグラフィーのステップのために供給原料として役立った。装填物の伝導度は、＜５ｍＳ／ｃｍであり、伝導度の調節は必要でなかった。
【０４７１】
Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅカラムは、５０ｍＭのトリス／酢酸塩（ｐＨ７．０）で平衡化された。平衡化されたカラムは、１７０ｇｍＡｂ／ｌ樹脂の最大装填物密度まで装填され、５０ｍＭのトリス酢酸塩（ｐＨ７．０）（＝平衡化緩衝液）で洗浄された。溶出プールは、最大３カラム体積の洗浄にわたる１０００〜２５００ｍＡＵ（路長１ｃｍ）のＯＤ２８０に基づいて収集された。
【０４７２】
第２のクロマトグラフィーのステップのプールは、酢酸でｐＨ５．０に条件付けされ、マルチモーダルカチオン交換樹脂Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓを使用する最終の第３のクロマトグラフィーのステップのために供給原料として役立った。第３のクロマトグラフィーのステップは、結合及び溶出モードで行われた。ＣａｐｔｏＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓカラムは、３０ｍＭのトリス／酢酸塩、３０ｍＭのトリス／クエン酸塩（ｐＨ５．０）で平衡化された。平衡化されたカラムは、５カラム体積に対して３０ｇｍＡｂ／ｌ樹脂の最大装填物密度まで装填され、平衡化緩衝液で洗浄された。第２の洗浄は、１０カラム体積に対して３０ｍＭのトリス／酢酸塩、３０ｍＭのトリス／クエン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）、その後に５カラム体積に対して平衡化緩衝液を使用して行われた。最終の洗浄ステップは、１０カラム体積に対して３０ｍＭのトリス／酢酸塩、３０ｍＭのトリス／クエン酸塩、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．５）を使用して行われた。カラム結合抗体は、４０カラム体積で０〜５０％ＢのｐＨ／塩勾配を使用して溶出された。緩衝液Ａは、平衡化緩衝液、３０ｍＭのトリス／酢酸塩、３０ｍＭのトリス／クエン酸塩（ｐＨ５．０）であり、緩衝液Ｂは、３０ｍＭのトリス／Ａｃｅｔａｔｅ、３０ｍＭのトリス／クエン酸塩、１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）であった。溶出プールは、２５０〜４５００ｍＡＵ（路長１ｃｍ）のＯＤ２８０に基づいて収集された。
表１８：それぞれのクロマトグラフィーのステップ後の生成物−特異的不純物及びプロセス特異的不純物の分析的データ
2019521986.tif 000023
表１９：親和性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びアニオン交換クロマトグラフィーを含む４つのクロマトグラフィーカラムを使用するプロセス（４カラム（４Ｃ）プロセス）との比較
2019521986.tif 000024
【０４７３】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ及びＣａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓ  ＨＨＬ、３／４抗体、前ピーク、ＨＭＷＳ、ＬＭＷＳなどの生成物−関連不純物、ならびにＨＣＰ及びＤＮＡなどのプロセス関連不純物を使用することは低減され得ることが見られ得る。
【０４７４】
実施例８：抗Ｘ１／抗Ｙ１二重特異性抗体のアセンブリ及び精製
標的タンパク質Ｘ１及びＹ１−抗Ｘ１／抗Ｙ１二重特異性抗体またはａＸ１／Ｙ１二重特異性に対する二重特異性抗体は、以下のとおりにアセンブリングされる。各半抗体（ａＸ１（ノブ）及びａＹ１（ホール）は独立して、実施例１に記載のように、プロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して親和性クロマトグラフィーのステップにかけられる。
【０４７５】
次いで、プロテインＡクロマトグラフィーのステップから得られた半抗体のプールは、１：１のモル比で組み合わされ、実施例１に記載のようにアセンブリングされた。次いで、ｐＨ調節されたアセンブリングされたプールは、フロースルーモードでＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂を使用してマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーにかけられる。Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅカラムは、実施例１に記載されるように記載されるように平衡化される。二重特異性アセンブリのステップからの生成物プールは、精製水で９．０ｍＳ／ｃｍの伝導度に調節され、カラム上に装填される。二重特異性抗体は、カラムを通して流れ、次いで、平衡化緩衝液で洗浄される。アニオン交換プールは、２８０ｎｍの吸光度に基づいて開始及び終結される。
【０４７６】
次いで、マルチモーダルアニオンクロマトグラフィー生成物のプールは、結合及び溶出モードでＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂を使用してマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーにかけられる。カラムは、実施例１に記載されるように平衡化される。マルチモーダルアニオンクロマトグラフィー生成物のプールは、実施例１に記載されるように装填及び洗浄される。二重特異性抗体は、実施例１に記載されるように、段階溶出で塩及びｐＨの両方を増加させることによってカラムから溶出される。カチオン交換プールは、２８０ｎｍの吸光度に基づいて開始及び終結される。上記に記載される精製スキームは、図７Ａに示される。
【０４７７】
図７Ａに示される精製スキームを使用して達成される二重特異性抗体の生成物−関連不純物及びプロセス関連不純物からの分離の程度は、図７Ｂ及び７Ｃに示される精製スキームを使用して達成されるものと比較される。
【０４７８】
上記に記載される実験は繰り返され、親和性クロマトグラフィーのステップからプールされた材料は、２０％のホールホモ二量体が添加される。図７Ａに示される精製スキームを使用して達成される二重特異性抗体の生成物−関連不純物及びプロセス関連不純物からの分離の程度は、図７Ｂ及び７Ｃに示される精製スキームを使用して達成されるものと再び比較される。
実施形態の一覧
１．多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがＶＨ／ＶＬ単位を含み、前記方法が、逐次的な、
ａ）前記組成物を捕獲クロマトグラフィーにかけて、捕獲クロマトグラフィー溶出物を生成するステップと、
ｂ）前記捕獲クロマトグラフィー溶出物を第１の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第１の混合モード溶出物を生成するステップと、
ｃ）前記第１の混合モード溶出物を第２の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第２の混合モード溶出物を生成するステップと、
ｄ）前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
２．前記捕獲クロマトグラフィー溶出物が、前記第１の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはＨＩＣクロマトグラフィーにかけられる、実施形態１に記載の方法。
３．多重特異性抗体を、前記多重特異性抗体及び不純物を含む組成物から精製するための方法であって、前記多重特異性抗体が複数のアームを含み、各アームがＶＨ／ＶＬ単位を含み、前記多重特異性抗体の各アームが別々に生成され、前記方法が、逐次的な、
ａ）前記多重特異性抗体の各アームを捕獲クロマトグラフィーにかけて、前記多重特異性抗体の各アームに対する捕獲溶出物を生成するステップと、
ｂ）前記多重特異性抗体を含む組成物を生成するのに十分な条件下で、前記多重特異性抗体の各アームの捕獲溶出物を含む混合物を形成するステップと、
ｃ）前記多重特異性抗体を含む前記組成物を第１の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第１の混合モード溶出物を生成するステップと、
ｄ）前記第１の混合モード溶出物を第２の混合モードクロマトグラフィーにかけて、第２の混合モード溶出物を生成することと、
ｅ）前記多重特異性抗体を含む画分を収集するステップと、を含み、
前記方法が、前記組成物の生成物特異的不純物の量を低減する、前記方法。
４．前記多重特異性抗体を含む前記組成物が、前記第１の混合モードクロマトグラフィーの前にイオン交換またはＨＩＣクロマトグラフィーにかけられる、実施形態３に記載の方法。
５．前記捕獲クロマトグラフィーが、親和性クロマトグラフィーである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＬクロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ及びプロテインＧクロマトグラフィーである、実施形態５に記載の方法。
７．前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＡクロマトグラフィーである、実施形態５または実施形態６に記載の方法。
８．前記捕獲クロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．前記第１の混合モードクロマトグラフィー及び前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、連続的である、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードカチオン交換クロマトグラフィーである、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１３．前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、混合モードアニオン交換クロマトグラフィーである、実施形態１〜１０及び１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．溶出が勾配溶出である、実施形態１４に記載の方法。
１６．前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、結合及び溶出モードで実施される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記溶出が勾配溶出である、実施形態１７に記載の方法。
１９．前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、フロースルーモードで実施される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
２０．前記第２の混合モード溶出物を限外瀘過するステップをさらに含む実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．前記限外濾過が、逐次的に、第１の限外濾過、透析濾過、及び第２の限外濾過を含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．前記プロテインＡクロマトグラフィーが、アガロースに連結されたプロテインＡを含む、実施形態７〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記プロテインＡクロマトグラフィーが、
ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ及びＭＡｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ  ＬＸ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ、Ｐｒｏｓｅｐ−ＶＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、プロテインＡセファロースファストフロー、またはＴｏｙｏｐｅａｒｌプロテインＡクロマトグラフィーである、実施形態７〜２１のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記プロテインＡクロマトグラフィーが、プロテインＡ平衡化緩衝液、プロテインＡ装填緩衝液、またはプロテインＡ洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記平衡化緩衝液、装填緩衝液、及び／または洗浄緩衝液が、約ｐＨ７〜約ｐＨ８である、実施形態７〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記プロテインＡ平衡化緩衝液が、約ｐＨ７．７である、実施形態２４に記載の方法。
２６．前記プロテインＡ平衡化緩衝液が、約２５ｍＭのトリス及び約２５ｍＭのＮａＣｌを含む、実施形態２４または実施形態２５に記載の方法。
２７．前記プロテインＡクロマトグラフィーが、装填後に平衡化緩衝液で洗浄される、実施形態２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記多重特異性抗体が、ｐＨ段階溶出によってプロテインＡクロマトグラフィーから溶出される、実施形態７〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．前記多重特異性抗体が、低いｐＨを有するプロテインＡ溶出緩衝液を前記プロテインＡクロマトグラフィーに適用することによって前記プロテインＡから溶出される、実施形態７〜２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．前記プロテインＡ溶出緩衝液が、約１５０ｍＭの酢酸、約ｐＨ２．９を含む、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記プロテインＡ溶出物がプールされ、前記溶出物のＯＤ２８０が約０．５を超える、実施形態７〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、第四級アミン及び疎水性部分を含む、実施形態１０〜３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前記アニオン交換混合モードクロマトグラフィーが、高架橋アガロースに連結された第四級アミン及び疎水性部分を含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．前記混合モードクロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ（商標）ＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである、実施形態３３に記載の方法。
３５．前記カチオン交換混合モードクロマトグラフィーが、Ｎ−ベンジル−ｎ−メチルエタノールアミンを含む、実施形態１１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記混合モードクロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、前記混合モード装填緩衝液、及び／または前記混合モード洗浄緩衝液は、約ｐＨ６〜約ｐＨ７である、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、混合モード事前平衡化緩衝液、混合モード平衡化緩衝液、混合モード装填緩衝液、または混合モード洗浄緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液が、約ｐＨ５〜約ｐＨ８である、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．前記混合モード事前平衡化緩衝液、前記混合モード平衡化緩衝液、及び／または混合モード洗浄緩衝液が、約ｐＨ６．５である、実施形態３７または実施形態３８に記載の方法。
４０．前記混合モード事前平衡化緩衝液が、約５００ｍＭの酢酸塩を含む、実施形態３７〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．前記混合モード平衡化緩衝液が、約５０ｍＭの酢酸塩を含む、実施形態３７〜４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記第１の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、実施形態３７〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記第２の混合モードクロマトグラフィーが、装填後に洗浄緩衝液で洗浄される、実施形態３７〜４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記多重特異性抗体が、ｐＨ勾配によって前記第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態１５及び１８〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記多重特異性抗体が、低いｐＨを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モードイオン交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第１の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態１５及び実施形態１８〜４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．前記多重特異性抗体が、ｐＨ勾配によって前記第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態１５及び１８〜４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．前記多重特異性抗体が、低いｐＨを有する混合モード溶出緩衝液を前記混合モード交換クロマトグラフィーに適用することによって、前記第２の混合モードクロマトグラフィーから溶出される、実施形態１５及び実施形態１８〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．前記イオン交換クロマトグラフィーが、第四級アミンを含む、実施形態２及び４〜４７のいずれか１つに記載される方法。
４９．前記イオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換クロマトグラフィーであり、前記アニオン交換クロマトグラフィーが、架橋アガロースに連結された第四級アミンを含む、実施形態４８に記載の方法。
５０．前記混合モードアニオン交換クロマトグラフィーが、ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅクロマトグラフィーである、実施形態４９に記載の方法。
５１．前記アニオン交換クロマトグラフィーが、アニオン交換事前平衡化緩衝液、アニオン交換平衡化緩衝液、またはアニオン交換装填緩衝液のうちの１つ以上を使用し、前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び／またはアニオン交換装填緩衝液が、約ｐＨ６〜約ｐＨ８である、実施形態４８〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記アニオン交換事前平衡化緩衝液、前記アニオン交換平衡化緩衝液、及び／または前記アニオン交換装填物が、約ｐＨ６．５である、実施形態５１に記載の方法。
５３．前記アニオン交換事前平衡化緩衝液が、約５０ｍＭのトリス、５００ｍＭの酢酸ナトリウムを含む、実施形態５１または実施形態５２に記載の方法。
５４．前記アニオン交換平衡化緩衝液が、約５０ｍＭのトリスを含む、実施形態５１〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．前記アニオン交換クロマトグラフィーが、装填後にアニオン交換平衡化緩衝液で洗浄される、実施形態５１〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．前記多重特異性抗体が、塩勾配によって前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、実施形態５１〜５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．前記多重特異性抗体が、増加した塩濃度を有するアニオン交換溶出緩衝液を前記アニオン交換クロマトグラフィーに適用させることによって、前記アニオン交換クロマトグラフィーから溶出される、実施形態５１〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．前記アニオン交換溶出緩衝液が、約５０ｍＭのトリス、１００ｍＭの酢酸ナトリウムを約ｐＨ８．５で含む、実施形態５７に記載の方法。
５９．前記アニオン交換溶出物がプールされ、前記溶出物のＯＤ２８０が約０．５〜約２．０を超える、実施形態５１〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記多重特異性抗体のアームが、細胞中で産生される、実施形態１〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．前記細胞が、原核生物細胞である、実施形態６０に記載の方法。
６２．前記原核生物細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記細胞が、１つ以上のシャペロンを発現するように操作される、実施形態６１または実施形態６２に記載の方法。
６４．前記シャペロンが、ＦｋｐＡ、ＤｓｂＡ、またはＤｓｂＣのうちの１つ以上である、実施形態６３に記載の方法。
６５．前記シャペロンが、Ｅ．ｃｏｌｉシャペロンである、実施形態６３または実施形態６４に記載の方法。
６６．前記細胞が、真核細胞である、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６７．前記真核細胞が、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、実施形態６６に記載の方法。
６８．前記真核細胞が、ＣＨＯ細胞である、実施形態６６または実施形態６７に記載の方法。
６９．前記細胞が、捕獲クロマトグラフィーの前に、溶解され、前記多重特異性抗体または前記多重特異性抗体のアームを含む細胞溶解液を生成する、実施形態６０〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．前記細胞が、微小流動化剤を使用して溶解される、実施形態６９に記載の方法。
７１．ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が、クロマトグラフィーの前に前記細胞溶解液に添加される、実施形態６９または実施形態７０に記載の方法。
７２．前記方法が、前記組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、浸出されたプロテインＡ、核酸、細胞培養培地構成成分、またはウイルス性不純物のうちのいずれか１つの量を低減する、実施形態１〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態１〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．前記二重特異性抗体が、ノブインホール（ＫｉＨ）二重特異性抗体である、実施形態７３に記載の方法。
７５．前記二重特異性抗体が、ＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体である、実施形態７３または実施形態７４に記載の方法。
７６．前記画分が、少なくとも約９５％の多重特異性抗体を含む、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．前記生成物特異的不純物が、非対抗体のアーム、抗体ホモ二量体、凝集体、高分子量種（ＨＭＷＳ）、低分子量種（ＬＭＷＳ）、酸性バリアント、または塩基性バリアントのうちの１つ以上である、実施形態１〜７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．前記画分が、約５％以下の非対抗体のアームを含む、実施形態７７に記載の方法。
７９．前記画分が、約５％以下の抗体ホモ二量体を含む、実施形態７７または実施形態７８に記載の方法。
８０．前記画分が、約２％以下の凝集体または高分子量種（ＨＭＷＳ）を含む、実施形態７７〜７９のいずれか１つに記載の方法。
８１．前記画分が、約２％以下のＬＭＷＳを含む、実施形態７７〜８０のいずれか１つに記載の方法。
８２．前記画分が、約５０％以下の酸性バリアントを含む、実施形態７７〜８１のいずれか１つに記載の方法。
８３．前記画分が、約３５％以下の塩基性バリアントを含む、実施形態７７〜８２のいずれか１つに記載の方法。
８４．前記画分が、約５％以下の３／４抗体を含む、実施形態７７〜８３のいずれか１つを含む方法。
８５．前記画分が、
ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、
ｂ）約１％〜約５％以下の非対抗体のアーム、
ｃ）約１％〜約５％以下の抗体ホモ二量体、
ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、
ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び
ｆ）約５％以下の３／４抗体を含む、実施形態７７に記載の方法。
８６．実施形態１〜８５のいずれか１つに記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
８７．がんまたは眼疾患の治療のための、実施形態１〜８５のいずれか１つに記載の方法によって精製された多重特異性抗体を含む組成物。
８８．マルチステップクロマトグラフィー方法でＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップを含み、２つの異なるマルチモーダルイオン交換クロマトグラフィーのステップが後に続き、
それによって、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製する、前記方法。
８９．前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、
ｉ．親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、
または
ｉｉ．親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、実施形態８８に記載の方法。
９０．前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含む、実施形態８８〜８９のいずれか１つに記載の方法。
９１．前記マルチステップクロマトグラフィー方法が、正確に３つのクロマトグラフィーのステップを含む、実施形態８８〜９０のいずれか１つに記載の方法。
９２．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、フロースルーモードで行われる、実施形態８９〜９１のいずれか１つに記載の方法。
９３．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、７ｍＳ／ｃｍ未満の伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態８９〜９２のいずれか１つに記載の方法。
９４．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約６ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの範囲の伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態８９〜９３のいずれか１つに記載の方法。
９５．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導値を有する溶液中に適用される、実施形態８９〜９４のいずれか１つに記載の方法。
９６．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、約７のｐＨで行われる、実施形態８９〜９５のいずれか１つに記載の方法。
９７．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約４．５ｍＳ／ｃｍの伝導性及び約７のｐＨを有する溶液中に適用される、実施形態８９〜９６のいずれか１つに記載の方法。
９８．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップにおいて、前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、クロマトグラフィー材料の、１リットル当たり約１００ｇ〜約３００ｇの範囲で適用される、実施形態８９〜９７のいずれか１つに記載の方法。
９９．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である、実施形態８９〜９８のいずれか１つに記載の方法。
１００．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィー材料が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル強アニオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び０．０８〜０．１１ｍｍｏｌ  Ｃｌ−／ｍＬの培地のイオン容量を有する、実施形態８９〜９９のいずれか１つに記載の方法。
１０１．前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィーの培地である、実施形態８９〜１００のいずれか１つに記載の方法。
１０２．前記マルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーの培地が、高流量アガロースのマトリックス、リガンドとしてのマルチモーダル弱カチオン交換、３６〜４４μｍの平均粒子サイズ、及び２５〜３９μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する、実施形態８９〜１０１のいずれか１つに記載の方法。
１０３．前記マルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップが、結合及び溶出モードで行われる、実施形態８９〜１０２のいずれか１つに記載の方法。
１０４．前記親和性クロマトグラフィーが、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、またはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、または一本鎖Ｆｖリガンド親和性クロマトグラフィー、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップ、またはＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＦｃＸＬクロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、実施形態８８〜１０３のいずれか１つに記載の方法。
１０５．前記親和性クロマトグラフィーのステップが、プロテインＡクロマトグラフィーのステップである、実施形態８８〜１０４のいずれか１つに記載の方法。
１０６．前記親和性クロマトグラフィーのステップが、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）クロマトグラフィー材料を用いるクロマトグラフィーのステップである、実施形態８８〜１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、抗体、二重特異性抗体、またはＦｃ−融合タンパク質である、実施形態８８〜１０６のいずれか１つに記載の方法。
１０８．前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、二重特異性抗体である、実施形態８８〜１０７のいずれか１つに記載の方法。
１０９．前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、ＣｒｏｓｓＭａｂである、実施形態９０〜１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０．前記Ｆｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、
ａ）第１の抗原を特異的に結合する第１の全長抗体の重鎖及び軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、第２の抗原を特異的に結合する全長抗体の修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む二重特異性抗体である、実施形態９０〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
１１１．前記二重特異性抗体が、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する、実施形態１０８〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１２．前記ＣｒｏｓｓＭａｂが、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦを結合する、実施形態１０８〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
１１３．前記二重特異性抗体が、ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂである、実施形態１０８〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１４．前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含む、実施形態１０８〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１５．前記二重特異性抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、ならびに配列番号１１のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む、実施形態１０８〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１６．前記二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む、実施形態１０８〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１７．前記二重特異性抗体が、配列番号１３のアミノ酸配列を有する第１の重鎖、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する第２の重鎖、ならびに配列番号１５のアミノ酸配列を有する第１の軽鎖、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する第２の軽鎖を含む、実施形態１０８〜１１２のいずれか１つに記載の方法。
１１８．精製されたＦｃ領域含有ヘテロ二量体ポリペプチドが、約５％以下の３／４抗体を含む、実施形態１０８〜１１７のいずれか１つに記載の方法。
１１９．マルチステップクロマトグラフィー方法でＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を精製するための方法であって、前記方法が、親和性クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルアニオン交換クロマトグラフィーのステップ、その後に続くマルチモーダルカチオン交換クロマトグラフィーのステップを含み、
それによって、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体を精製し、
二重特異性抗体が、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号１、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号２を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号３、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号４を含む第２の抗原結合部位を含むか、
または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号５、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号６を含む第１の抗原結合部位、ならびに重鎖可変ドメイン（ＶＨ）として配列番号７、及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）として配列番号８を含む第２の抗原結合部位を含む、前記方法。
１２０．ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体が、
ａ）前記第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、前記第２の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態１１９に記載の方法。
１２１．二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも約９５％、二重特異性抗体を含む、前記組成物。
１２２．前記組成物が、約５％以下の非対抗体のアームを含む、実施形態１２１に記載の組成物。
１２３．前記組成物が、約５％以下の抗体ホモ二量体を含む、実施形態１２１または１２２に記載の組成物。
１２４．ＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を含む組成物であって、前記組成物が、少なくとも９５％のＣｒｏｓｓＭａｂ抗体を含む、前記組成物。
１２５．前記組成物が、約２％以下の凝集体または高分子量種（ＨＭＷＳ）を含む、実施形態１２１〜１２４のいずれか１つに記載の組成物。
１２６．前記組成物が、約２％以下の低分子量種（ＬＭＷＳ）を含む、実施形態１２１〜１２５のいずれか１つに記載の組成物。
１２７．前記組成物が、約５０％以下の酸性バリアントを含む、実施形態１２１〜１２６のいずれか１つに記載の組成物。
１２８．前記組成物が、約３５％以下の塩基性バリアントを含む、実施形態１２１〜１２７のいずれか１つに記載の組成物。
１２９．前記組成物が、約５％以下の３／４抗体を含む、実施形態１２１〜１２８のいずれか１つに記載の組成物。
１３０．前記組成物が、
ａ）少なくとも約９５％〜約１００％の多重特異性抗体、
ｂ）約１％〜約５％以下の非対抗体のアーム、
ｃ）約１％〜約５％以下の抗体ホモ二量体、
ｄ）約１％または約２％以下のＨＭＷＳ、
ｅ）約１％または約２％以下のＬＭＷＳ、及び
ｆ）約５％以下の３／４抗体を含む、実施形態１２１または実施形態１２２に記載の組成物。
１３１．前記二重特異性抗体が、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する、実施形態１２１〜１３０のいずれか１つに記載の組成物。
１３２．ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体が、
ａ）前記第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、前記第２の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態１３１に記載の組成物。
１３３．ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を含む組成物であって、前記組成物が、約５％以下、約４％、約３％、約２％、または約１％の３／４抗体を含む、前記組成物。
１３４．ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体が、
ａ）前記第１の抗原結合部位を含む第１の全長抗体の前記重鎖及び前記軽鎖、ならびに
ｂ）前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられる、前記第２の抗原結合部位を含む全長抗体の前記修飾された重鎖及び修飾された軽鎖を含む、実施形態１３３に記載の組成物。
１３５．前記組成物が、実施形態１１９に記載の方法を使用して得られる、実施形態１３３または１３４に記載の組成物。
１３６．Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドの精製のための、実施形態８８〜１１８のいずれか１つに記載の方法の使用。
１３７．Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド関連不純物の低減のための、実施形態８８〜１１８のいずれか１つに記載の方法の使用。
１３８．がんまたは眼疾患の前記治療のための医薬品の製造のための、実施形態に８８〜１１８のいずれか１つに記載の方法で得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または実施形態１１９〜１２０のいずれか１つに記載の方法を使用して得られるＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体。
１３９．がんまたは眼疾患の前記治療における使用のための、実施形態８８〜１１８のいずれか１つに記載の方法から得られるＦｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチド、または実施形態１１９〜１２０のいずれか１つに記載の方法を使用して得られるＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体。
１４０．Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する方法であって、
ｉ．Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ｉｉ．前記Ｆｃ−含有ヘテロ二量体タンパク質を細胞または培養培地から回収するステップと、
ｉｉｉ．実施形態８８〜１１８のいずれか１つに記載の方法で前記Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを精製するステップと、を含み、
それによって、前記Ｆｃ−含有ヘテロ二量体ポリペプチドを生成する、前記方法。
１４１．実施形態１１９〜１２０のいずれか１つに記載の方法を使用して得られるＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する二重特異性抗体を産生する方法であって、
ｉ．前記二重特異性抗体をコードする核酸を含む細胞を培養するステップと、
ｉｉ．前記二重特異性抗体を前記細胞または前記培養培地から回収するステップと、
ｉｉｉ．実施形態１１９〜１２０のいずれか１つに記載の方法で前記二重特異性抗体を精製するステップと、を含み、
それによって、ＡＮＧ−２及びＶＥＧＦを結合する前記二重特異性抗体を生産する、前記方法。
【図１Ａ】
2019521986.tif 000025
【図１Ｂ】
2019521986.tif 000026
【図１Ｃ】
2019521986.tif 000027
【図２】
2019521986.tif 000028
【図３Ａ】
2019521986.tif 000029
【図３Ｂ】
2019521986.tif 000030
【図４】
2019521986.tif 000031
【図５Ａ】
2019521986.tif 000032
【図５Ｂ】
2019521986.tif 000033
【図６Ａ】
2019521986.tif 000034
【図６Ｂ】
2019521986.tif 000035
【図７Ａ】
2019521986.tif 000036
【図７Ｂ】
2019521986.tif 000037
【図７Ｃ】
2019521986.tif 000038
【配列表】
2019521986000001.app
【国際調査報告】
2019521986.tif 000039
2019521986.tif 000040
2019521986.tif 000041
2019521986.tif 000042
2019521986.tif 000043
2019521986.tif 000044