(57)【要約】本発明は、合成染色体を用いて受容細胞に生合成経路からの複数の遺伝子を送達し、発現させることが可能な組成物及び方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容細胞に生合成経路を構築する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子を含む送達ベクターを前記受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記送達ベクターが少なくとも１つの部位特異的組換え部位を含むステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、生合成経路を実現する能力を有する前記複数の遺伝子が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記生合成経路を発現する合成染色体が作製されるステップ；及び
前記生合成経路を発現する前記合成染色体を含む受容細胞を単離するステップ
を含む方法。
【請求項２】
生合成経路を実現する能力を有する前記複数の遺伝子が、トリプトファン生合成に必要な遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリプトファン生合成に必要な前記遺伝子が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるトリプトファンの合成に必要な５つの遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記送達ベクターが、ａ）腫瘍細胞が免疫細胞周期進行を阻害する能力を妨害又は遮断する１つ以上の遺伝子、ｂ）免疫細胞の活性化及び成長を亢進させる因子をコードする１つ以上の遺伝子、又はｃ）発生中の腫瘍に対する免疫細胞の特異性を増加させる１つ以上の遺伝子を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記送達ベクターが、ａ）、ｂ）又はｃ）のうちの少なくとも２つを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記送達ベクターが、ａ）、ｂ）及びｃ）の３つ全てを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生合成経路を発現する前記合成染色体を単離するステップ；及び
前記合成染色体を第２の受容細胞にトランスファーするステップ
を更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の第２の受容細胞。
【請求項９】
前記第２の受容細胞が、万能供血者Ｔ細胞又は患者自己Ｔ細胞から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の第２の受容細胞。
【請求項１１】
部位特異的組込みを可能にする前記核酸配列が、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ又は突然変異型のａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記送達ベクターがＢＡＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の生合成経路を発現する合成染色体。
【請求項１４】
請求項１に記載の生合成経路を発現する合成染色体を含む受容細胞。
【請求項１５】
第２の生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子を含む第２の送達ベクターを前記受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記第２の送達ベクターが少なくとも１つの部位特異的組換え部位を含むステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第２の生合成経路を実現する能力を有する前記複数の遺伝子が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記第２の生合成経路を発現する合成染色体が作製されるステップ；及び
前記第２の生合成経路を発現する前記合成染色体を含む受容細胞を単離するステップ
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の第２の生合成経路を発現する合成染色体。
【請求項１７】
前記第２の生合成経路を発現する前記合成染色体を単離するステップ；及び
前記第２の生合成経路を発現する前記合成染色体を第２の受容細胞にトランスファーするステップ
を更に含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の第２の受容細胞。
【請求項１９】
前記第２の受容細胞が、万能供血者Ｔ細胞又は患者自己Ｔ細胞から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の第２の受容細胞。
【請求項２１】
受容免疫細胞に生合成経路を構築する方法であって、
標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を受容細胞株にトランスフェクトするステップ；
複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；
生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子を含む送達ベクターを前記受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、前記送達ベクターが少なくとも１つの部位特異的組換え部位を含むステップ；
前記合成プラットフォーム染色体と前記送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、生合成経路を実現する能力を有する前記複数の遺伝子が前記合成プラットフォーム染色体にロードされて、前記生合成経路を発現する合成染色体が作製されるステップ；
前記生合成経路を発現する前記合成染色体を含む受容細胞を単離するステップ；
前記生合成経路を発現する前記合成染色体を単離するステップ；及び
前記合成染色体を第２の受容細胞にトランスファーするステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、合成染色体を操作して生合成経路からの複数の遺伝子を受容細胞に送達することを可能にする方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
以下の考察では、背景及び導入として特定の物及び方法が記載される。本明細書に含まれるいかなる事項も、先行技術の「承認」と解釈されてはならない。本出願人は、適宜、本明細書で参照されるそれらの物及び方法が適用法規条項に基づく先行技術をなすものではないことを立証する権利を明示的に留保する。
【０００３】
複数の遺伝子、例えば、アミノ酸、核酸、糖タンパク質などの細胞代謝産物の産生能を細胞に付与する遺伝子を取り込んで発現するように細胞を操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）現在の方法は、ウイルスベース又はプラスミドベースのいずれかの核酸送達技術に頼る。しかしながら、多くの場合に、細胞がかかる代謝産物を産生可能であるためには、生化学的な代謝産物合成経路を構成する複数の遺伝子産物の発現及び機能的な編成が必要である。例えば、多くの哺乳類細胞は、必須アミノ酸を作るのに要求される必要酵素を欠いている。細胞がこれらのアミノ酸を作ることができるようにするには、真菌又は細菌に見られる異種遺伝子を発現するように細胞を操作しなければならない；しかしながら、ウイルス及びプラスミド核酸ベクター送達システムのペイロード容量は限られているため、受容細胞に生化学的経路又は生合成経路全体を作り出すには、トランスフェクション又は形質導入イベントを複数回繰り返す必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
完全に機能的な哺乳類合成染色体を作成可能であるということは、遺伝的障害を細胞ベースで修正し、及び生物学的経路を作製する強力なシステムを意味する。完全に機能的な哺乳類合成染色体は、細菌ベース及びウイルスベースの送達システムと比べて、ペイロードサイズの増加、染色体外に維持されるため宿主細胞破壊の可能性が回避されること、導入された遺伝子の転写サイレンシング及び免疫学的合併症の可能性の回避を含め、幾つかの利点をもたらし、及び哺乳類合成染色体は、その合成染色体を挿入しようとする種から誘導し、それに合わせて作ることができる。当該技術分野では、細胞において生合成経路からの複数の遺伝子を送達して発現させることにより代謝産物の産生を可能にする組成物及び方法が必要とされている。本発明は、この必要性に応える方法及び組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本概要は、以下で詳細な説明に更に説明する概念のうちの選ばれた幾つかを簡潔な形で紹介するため提供される。本概要は、特許請求される主題の主要な又は必須の特徴を特定しようと意図するものではなく、また特許請求される主題の範囲を限定するために用いられることを意図するものでもない。特許請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に例示される、且つ添付の特許請求の範囲に定義される態様を含め、以下の記載の詳細な説明から明らかであろう。
【０００６】
本発明は、合成染色体を用いて受容細胞に１つ以上の生合成経路からの複数の遺伝子を送達して発現させる組成物及び方法を包含する。経路には、１）特異的最終産物を産生することが知られるもの；２）最終産物を産生する細胞型にとって新規であり得る特異的最終産物を産生する、既存の遺伝子の新規組み合わせでの取込み及び／又は既存の遺伝子の新規細胞型での発現によって作り出される新規経路；又は３）新規最終産物を産生する、新規遺伝子の単独での、又は既存の遺伝子と組み合わせた取込みによって作り出される新規経路が含まれ得る。
【０００７】
従って、一実施形態において、本発明の方法は、受容細胞に生合成経路を構築する方法を提供し、この方法は、標的核酸配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列を含む合成染色体作製構成要素を受容細胞株にトランスフェクトするステップ；複数の部位特異的組換え部位を有する合成プラットフォーム染色体を作製するステップ；生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子を含む送達ベクターを受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、送達ベクターが少なくとも１つの部位特異的組換え部位を含むステップ；合成プラットフォーム染色体と送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子が合成プラットフォーム染色体にロードされて、生合成経路を発現する合成染色体が作製されるステップ；及び生合成経路を発現する合成染色体を含む受容細胞を単離するステップを含む。
【０００８】
この実施形態の一部の態様において、生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子はトリプトファン生合成に必要な遺伝子を含み、及び一部の態様において、トリプトファン生合成に必要な遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるトリプトファンの合成に必要な５つの遺伝子を含む。
【０００９】
この実施形態の一部の態様において、生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子を送達することに加えて、送達ベクターは、ａ）腫瘍細胞が免疫細胞周期進行を阻害する能力を妨害又は遮断する１つ以上の遺伝子、ｂ）免疫細胞の活性化及び成長を亢進させる因子をコードする１つ以上の遺伝子、又はｃ）発生中の腫瘍に対する免疫細胞の特異性を増加させる１つ以上の遺伝子のうちの１つ以上を更に含む。
【００１０】
この実施形態の更に他の態様において、本方法は、生合成経路を発現する合成染色体を単離するステップ；及び合成染色体を第２の受容細胞にトランスファーするステップを更に含む。一部の態様において、第２の受容細胞は、万能供血者Ｔ細胞又は患者自己Ｔ細胞から選択される。本発明の他の態様は、生合成経路を発現する合成染色体を提供し、及び更なる他の態様は第２の受容細胞を提供する。
【００１１】
本発明の一部の態様において、部位特異的組込みを可能にする核酸配列は、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ又は突然変異型のａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲを含む。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、第２の生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子を含む第２の送達ベクターを受容細胞株にトランスフェクトするステップであって、第２の送達ベクターが少なくとも１つの部位特異的組換え部位を含むステップ；合成プラットフォーム染色体と第２の送達ベクターとの間の部位特異的組換えを活性化させるステップであって、第２の生合成経路を実現する能力を有する複数の遺伝子が合成プラットフォーム染色体にロードされて、第２の生合成経路を発現する合成染色体が作製されるステップ；及び第２の生合成経路を発現する合成染色体を含む受容細胞を単離するステップを更に含む。この実施形態の一部の態様は、第２の生合成経路を発現する合成染色体を単離するステップ；及び第２の生合成経路を発現する合成染色体を第２の受容細胞にトランスファーするステップを更に含む。
【００１３】
詳細な説明に本発明の上記及び他の態様及び使用を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の方法の一実施形態の簡略化した概略図であり、ここでは合成染色体からの生合成経路代謝産物の産生によって細胞生理が増強される。
【図２】ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈを示す図。
【図３】ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書に記載される方法は、特に指示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学、及び細胞工学技術の従来技術及び記載を用いることもあり、それらは全て当業者の技能の範囲内にある。かかる従来技術には、オリゴヌクレオチド合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及びライゲーション、細胞の形質転換及び形質導入、組換えシステムの操作、トランスジェニック動物及び植物の作出、及びヒト遺伝子療法が含まれる。好適な技法の具体的な例示については、本明細書の例を参照することができる。しかしながら、当然ながら、等価な従来手順を用いることもできる。かかる従来技術及び記載は、「ゲノム解析：実験マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）」、第Ｉ〜ＩＶ巻、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら編、１９９９年；「遺伝的変異：実験マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、ワイナー（Ｗｅｉｎｅｒ）ら編、２００７年；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング：実験マニュアルからの要約プロトコル（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、２００６年；及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）及びラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）著、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、２００２年（全てコールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）発行）；「タンパク質方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ボラグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９６年；「遺伝子療法用の非ウイルスベクター（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）ら編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９９年；「ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」、カプリフト（Ｋａｐｌｉｆｔ）及びローウィ（Ｌｏｅｗｙ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年；「免疫学方法マニュアル（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ）」、レフコビッツ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年；「遺伝子療法テクニック、研究室から臨床への応用及び規制（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）」、ミーガ（Ｍｅａｇｅｒ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９９年；Ｍ・ジャッカ（Ｍ．Ｇｉａｃｃａ）著、「遺伝子療法（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２０１０年；「遺伝子療法プロトコル（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、レドゥー（ＬｅＤｏｕｘ）編、シュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、２００８年；「細胞及び組織培養：バイオテクノロジーにおける実験室手順（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）及びグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、１９９８年；「哺乳類染色体エンジニアリング−方法及びプロトコル（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｇ・ハドラツキー（Ｇ．Ｈａｄｌａｃｚｋｙ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年；「基本的幹細胞方法（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びクリマンスカヤ（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１１年；「幹細胞療法：臨床供与のクオリティ及び安全性の確保に向けた好機：合同ワークショップ要旨（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｆｆｅｒｉｎｇｓ：Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ａ  Ｊｏｉｎｔ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）」、ヘルスサイエンス政策委員会（Ｂｏａｒｄ  ｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｏｌｉｃｙ）、ナショナル・アカデミー・プレス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１４年；「幹細胞生物学の基礎（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第３版、ランツァ（Ｌａｎｚａ）及びアタラ（Ａｔａｌａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１３年；及び「幹細胞ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）」、アタラ（Ａｔａｌａ）及びランツァ（Ｌａｎｚａ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、２０１２年（これらは全て、本明細書においてあらゆる目的から全体として参照により援用される）などの標準的な実験マニュアルに見出すことができる。本組成物、研究ツール及び方法を説明する前に、本発明は記載される特定の方法、組成物、標的及び使用に限定されず、従って当然ながら異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するために過ぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものである本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。
【００１６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含むことに留意されたい。従って、例えば「組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」と言うとき、それは１つの組成物又は組成物の混合物を指し、及び「アッセイ（ａｎ  ａｓｓａｙ）」と言うとき、それは当業者に公知の均等なステップ及び方法への言及を含むなどである。
【００１７】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及される全ての刊行物は、その刊行物中で説明されている、且つ本明細書に記載する発明との関連で使用し得る装置、配合及び方法論を説明及び開示する目的で参照により本明細書に援用される。
【００１８】
値の範囲が提供される場合、当該の範囲の上限と下限との間にある各中間値及び当該の明記される範囲にある任意の他の明記される値又は中間値が本発明の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、明記される範囲における任意の具体的に除外される限界値を条件として、独立にそのより小さい範囲に含まれ得る。明記される範囲が限界値の両方を含む場合、それらの含まれる限界値のうち一方のみを除く範囲もまた本発明に含まれる。
【００１９】
以下の説明においては、本発明のより完全な理解を提供するため多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、当業者には、本明細書を読めば、それらの具体的な詳細の１つ以上がなくても本発明を実施し得ることは明らかであろう。他の場合には、本発明が曖昧になることがないよう、当業者に周知された周知の特徴及び手順は説明していない。
【００２０】
定義
明示的に定めない限り、本明細書で使用される用語は、当業者が理解するとおりの平易な且つ通常の意味を有することが意図される。以下の定義は読者が本発明を理解する助けとなることを意図するものであり、具体的に指示されない限り、かかる用語の意味を変更したり、又は他の形で限定したりする意図はない。
【００２１】
「結合している」は、本明細書で使用されるとき（例えば、ポリペプチドの核酸結合ドメインに関連して）、ポリペプチドと核酸との間の非共有結合性相互作用を指す。非共有結合性相互作用と言うとき、ポリペプチド及び核酸は「会合している」、「相互作用している」、又は「結合している」と言われる。結合相互作用は概して１０−６Ｍ未満〜１０−１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は結合の強度を指し、高い結合親和性ほど、より低いＫｄと関連付けられる。
【００２２】
「結合ドメイン」とは、非共有結合的に別の分子に結合可能なポリペプチド又はタンパク質ドメインが意味される。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。
【００２３】
「セントロメア」は、染色体が細胞分裂を通じて娘細胞に分離する能力を付与する任意の核酸配列である。セントロメアは、セントロメアを含有する合成染色体を含め、核酸配列の有糸分裂及び減数分裂を通じた安定な分離をもたらし得る。セントロメアは、必ずしもそれが導入される細胞と同じ種に由来する必要はないが、好ましくはセントロメアは、当該の種の細胞におけるＤＮＡ分離を促進する能力を有する。「二動原体」染色体は、２つのセントロメアを含む染色体である。「以前二動原体であった染色体（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｄｉｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）」は、二動原体染色体が断片化すると生じる染色体である。「染色体」は、細胞の分裂時に細胞内で複製及び分離する能力を有する核酸分子−及び関連するタンパク質−である。典型的には、染色体は、セントロメア領域、複製起点、テロメア領域及びセントロメア領域とテロメア領域との間にある核酸領域を含む。「アクロセントリック染色体」は、腕の長さが不均等な染色体を指す。
【００２４】
「コード配列」又はペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下に置かれたとき生体内で転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）されてポリペプチドになる核酸分子である。コード配列の境界は、典型的には５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンとによって決まる。
【００２５】
用語ＤＮＡ「制御配列」は、まとめて、プロモータ配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位、エンハンサーなどを指し、これらはまとめて受容細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供する。選択のコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写及び翻訳されることが可能である限り、この種の制御配列が全て存在する必要はない。
【００２６】
用語の生合成経路を「実現する」とは、既知の生合成経路を再現すること、並びに新規生合成経路を作成及び実行することを指す。
「内因性染色体」は、合成染色体の作成又は導入前に細胞に見られる染色体を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「ユークロマチン」は、散在性に染色される、典型的には遺伝子を含有するクロマチンを指し、「ヘテロクロマチン」は、通常凝縮したままで、転写的に不活性と考えられるクロマチンを指す。セントロメアを取り囲むヘテロクロマチンの領域には、通常、高度に反復性のＤＮＡ配列（サテライトＤＮＡ）が位置する。
【００２８】
用語「異種ＤＮＡ」又は「外来ＤＮＡ」（又は「異種ＲＮＡ」又は「外来ＲＮＡ」）は同義的に使用され、天然ではその所在であるゲノムの一部として存在しない、或いはゲノム又は細胞において、それが天然に存在する場合と異なる１つ又は複数の位置に及び／又は量で見られるＤＮＡ又はＲＮＡを指す。異種ＤＮＡの例としては、限定はされないが、１つ又は複数の目的の遺伝子産物をコードするＤＮＡが挙げられる。異種ＤＮＡの他の例としては、限定はされないが、追跡可能なマーカタンパク質をコードするＤＮＡ並びに調節ＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「代謝産物」は、天然代謝産物（例えばコレステロールなど）、異種代謝産物（例えばヒトにおけるトリプトファンなど）、操作された代謝産物（即ち、キメラタンパク質などの新規の人工代謝産物又は操作されたＲＮＡ干渉分子）又は例えば生合成経路の亢進又は阻害によって改変された機能を細胞に付与する任意の他の代謝産物を指す。
【００３０】
「作動可能に連結された」は、そのように記載される構成要素がその通常の機能を果たすように構成されるエレメントの配置を指す。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、そのコード配列の発現を生じさせる能力を有する。制御配列は、それがコード配列の発現を導く働きをする限り、コード配列に連続している必要はない。従って、例えば、プロモータ配列とコード配列との間に、翻訳はされないが転写はされる介在配列が存在してもよく、それでもなお、そのプロモータ配列はコード配列に「作動可能に連結されている」と見なすことができる。事実、かかる配列は同じ連続するＤＮＡ分子（即ち染色体）上にある必要はなく、それでもなお、調節の変化をもたらす相互作用を有し得る。
【００３１】
「プロモータ」又は「プロモータ配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合して、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子若しくは核小体ＲＮＡ又は任意のクラスの任意のＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩによって転写される任意の種類のＲＮＡなど、ポリヌクレオチド又はポリペプチドコード配列の転写を開始させる能力を有するＤＮＡ調節領域である。
【００３２】
受容細胞は、合成染色体、合成プラットフォーム染色体又は所与の一組のＤＮＡエレメントを含むようにバイオエンジニアリングを受けた合成プラットフォーム染色体を作成するための構成要素が入る細胞である。受容細胞のタイプには、限定はされないが、幹細胞、間葉系幹細胞、成人由来幹細胞、Ｔ細胞、免疫細胞、人工多能性幹細胞、線維芽細胞、内皮細胞、中胚葉、外胚葉及び内胚葉の細胞が含まれ得る。また、腫瘍細胞、細胞培養株、初代細胞、及び生殖細胞も含まれ得る。次に細胞は、例えば、培養する、移植用に調製する、全トランスジェニック動物の作出に使用するなどすることができる。
【００３３】
「認識配列」は、タンパク質、ＤＮＡ、又はＲＮＡ分子、又はこれらの組み合わせ（限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼ又はリコンビナーゼなど）が認識して結合する特定のヌクレオチド配列である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列は、２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として働く）とそれに隣接する８塩基対のコアを含む、ｌｏｘＰと称される３４塩基対配列である（例えば、サウアー（Ｓａｕｅｒ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第５巻、ｐ．５２１〜５２７、１９９４年を参照のこと）。認識配列の他の例としては、限定はされないが、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ、ａｔｔＲ及びａｔｔＬ並びにその他の、リコンビナーゼ酵素バクテリオファージλインテグラーゼによって認識されるものが挙げられる。ａｔｔＢと称される組換え部位は、２つの９塩基対のコア型Ｉｎｔ結合部位及び７塩基対のオーバラップ領域を含む約３３塩基対配列である；ａｔｔＰは、コア型Ｉｎｔ結合部位及びアーム型Ｉｎｔ結合部位並びに補助タンパク質ＩＨＦ、ＦＩＳ、及びＸｉｓに対する部位を含む約２４０塩基対配列である（例えば、ランディ（Ｌａｎｄｙ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、ｐ．６９９〜７０７１、１９９３年を参照のこと）。
【００３４】
「リコンビナーゼ」は、特定の組換え部位におけるＤＮＡセグメントの交換を触媒する酵素である。インテグラーゼとは、通常はウイルス又はトランスポゾン、並びに恐らくは古代ウイルスにも由来するリコンビナーゼを指す。「組換えタンパク質」には、１つ以上の組換え部位を用いた組換え反応に関与する切出しタンパク質、組込みタンパク質、酵素、補因子及び関連タンパク質が含まれる（ランディ（Ｌａｎｄｙ）著、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第３巻、ｐ．６９９〜７０７、１９９３年を参照のこと）。本明細書の方法において使用される組換えタンパク質は、プラスミドなど、適切なベクター上の発現カセットを介して細胞に送達することができる。他の実施形態において、組換えタンパク質は、所望の１つ又は複数の核酸の送達に用いられる同じ反応混合物中においてタンパク質の形態で細胞に送達することができる。更に他の実施形態において、リコンビナーゼはまた、細胞にコードし、厳密に制御された誘導性プロモータを用いて必要に応じて発現させてもよい。
【００３５】
「リボソームＲＮＡ」（ｒＲＮＡ）は、リボソームの構造の一部を形成してタンパク質合成に関与する特殊なＲＮＡである。リボソームＲＮＡは、真核細胞では複数のコピーで存在する遺伝子の転写によって産生される。ヒト細胞では、一倍体ゲノム当たり約２５０コピーのｒＲＮＡ遺伝子（即ち、ｒＲＮＡをコードする遺伝子）が少なくとも５つの異なる染色体（１３番、１４番、１５番、２１番及び２２番染色体）上にクラスターを成して分散している。ヒト細胞では、高度に保存されたｒＲＮＡ遺伝子の複数のコピーが、一連のタンデムに並んだｒＤＮＡ単位に位置し、ｒＤＮＡ単位は概して約４０〜４５ｋｂ長であり、転写領域と、長さ及び配列が様々であり得るスペーサ（即ち遺伝子間スペーサ）ＤＮＡとして知られる非転写領域とを含む。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「選択可能マーカ」は、細胞、特に本発明の文脈では培養下の細胞に導入される、人為淘汰に好適な形質を付与する遺伝子を指す。一般的用途の選択可能マーカは当業者に周知である。好ましい実施形態において、ヒト合成染色体システムに用いられる選択可能マーカはヒトにおいて非免疫原性でなければならず、限定はされないが、ヒト神経成長因子受容体（米国特許第６，３６５，３７３号明細書に記載されるように、ＭＡｂで検出される）；トランケート型ヒト成長因子受容体（ＭＡｂで検出される）；突然変異型ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ；蛍光ＭＴＸ基質利用可能）；分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ；蛍光基質利用可能）；ヒトチミジル酸シンターゼ（ＴＳ；抗癌剤フルオロデオキシウリジン耐性を付与する）；ヒトグルタチオンＳ−トランスフェラーゼα（ＧＳＴＡ１；グルタチオンを幹細胞選択的アルキル化薬ブスルファンにコンジュゲートする；ＣＤ３４＋細胞における化学保護的選択可能マーカ）；造血幹細胞におけるＣＤ２４細胞表面抗原；Ｎ−ホスホノアセチル（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｃｅｔｙｌ）−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）に対する耐性を付与するヒトＣＡＤ遺伝子；ヒト多剤耐性１（ＭＤＲ−１；薬剤耐性の増加によって選択可能な、又はＦＡＣＳによってエンリッチされるＰ糖タンパク質表面タンパク質）；ヒトＣＤ２５（ＩＬ−２α；Ｍａｂ−ＦＩＴＣによって検出可能）；メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ；カルムスチンによって選択可能）；及びシチジンデアミナーゼ（ＣＤ；Ａｒａ−Ｃによって選択可能）が挙げられる。ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、テトラサイクリンなど、薬物選択可能なマーカもまた利用し得る。加えて、ＦＡＣｓソーティングを用いて任意の蛍光マーカ遺伝子をポジティブ選択に使用してもよく、化学発光マーカ（例えばＨａｌｏｔａｇ）なども同様に使用し得る。
【００３７】
「部位特異的組換え」は、単一の核酸分子上の２つの特異的部位間又は２つの異なる分子間で生じる、インテグラーゼ又はリコンビナーゼなどの外因性タンパク質の存在が必要な部位特異的組換えを指す。特定の部位特異的組換えシステムを用いてＤＮＡを特異的に欠失させ、逆位させ、又は挿入することができ、正確なイベントはそれらの特異的部位の向き、具体的なシステム及びアクセサリータンパク質又は因子の存在によって制御される。加えて、染色体間でＤＮＡのセグメントを交換することができる（染色体腕の交換）。
【００３８】
「合成染色体」（「人工染色体」とも称される）は、異種遺伝子を受け入れてそれを発現させる能力を有する、且つ細胞において内因性染色体と共に安定に複製及び分離する核酸分子、典型的にはＤＮＡ分子である。「哺乳類合成染色体」は、１つ又は複数の活性な哺乳類セントロメアを有する染色体を指す。「ヒト合成染色体」は、ヒト細胞で機能するセントロメアを含み、且つ好ましくはヒト細胞で産生される染色体を指す。例示的な人工染色体については、例えば、米国特許第８，３８９，８０２号明細書；同第７，５２１，２４０号明細書；同第６，０２５，１５５号明細書；同第６，０７７，６９７号明細書；同第５，８９１，６９１号明細書；同第５，８６９，２９４号明細書；同第５，７２１，１１８号明細書；同第５，７１２，１３４号明細書；同第５，６９５，９６７号明細書；及び同第５，２８８，６２５号明細書並びに国際公開第９７／４０１８３号及び同第９８／０８９６４号を参照のこと。
【００３９】
用語「対象」、「個体」又は「患者」は本明細書では同義的に使用されてもよく、哺乳類、及び一部の実施形態ではヒトを指し得る。
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルスコンストラクト、コスミド、細菌人工染色体、Ｐ−１由来人工染色体又は酵母人工染色体など、別のＤＮＡセグメントを付加し得るレプリコンである。一部の例では、ベクターは、組換え部位を含むように操作された１つの内因性染色体から合成染色体に腕を交換する場合のような染色体であってもよい。ベクターは、細胞におけるＤＮＡセグメントの形質導入及び発現に使用される。
【００４０】
発明
本発明は、細胞において生合成経路からの複数の遺伝子を送達して発現させることにより代謝産物の作製を可能にする組成物及び方法を包含する。合成染色体はその大きい運搬能力をもって複数の遺伝子産物−詳細には、１つ以上の生合成経路からの複数の遺伝子−を運搬して発現させることができ、それによりウイルスベース及びプラスミドベースの核酸送達の限界を回避し得る。本発明は、生化学的経路内の複数の遺伝子の協調した発現及び機能がその合成に必要な代謝産物（又は２つ以上の代謝産物）の作製を可能にして、それにより受容細胞の細胞生理を増強し、亢進させる方法及び組成物を提供する。経路には、１）特異的最終産物を産生することが知られるもの；２）最終産物を産生する細胞型にとって新規であり得る特異的最終産物を産生する、既存の遺伝子の新規組み合わせでの取込み及び／又は既存の遺伝子の新規細胞型での発現によって作り出される新規経路；又は３）新規最終産物を産生する、新規遺伝子の単独での、又は既存の遺伝子と組み合わせた取込みによって作り出される新規経路が含まれ得る。従って、本発明の方法及び組成物は、細胞に存在しない又は準最適レベルで合成される代謝産物を合成するように細胞を操作することが可能であり、「トップダウン」手法、「ボトムアップ」手法、天然に存在するミニ染色体の操作、及び特定の染色体セグメントのターゲット増幅による誘導性デノボ染色体生成（これらは全て以下に更に詳細に考察する）を含めたあらゆる合成染色体作製方法に適用可能である。
【００４１】
図１は、細胞の生合成能力を機能的に亢進させるための本発明の方法の一実施形態の簡略化した概略図である。図１は、細胞内にある合成プラットフォーム染色体を示す。生合成経路の遺伝子を担持する送達ベクターが細胞に送達され、生合成経路からの遺伝子が合成プラットフォーム染色体（以下に更に詳細に記載される）「にロード」される。次に、合成染色体にロードされた遺伝子が細胞内で発現する。次に、合成染色体からの遺伝子の転写及び翻訳によって発現したタンパク質が協調して働き、生合成複合体（即ち、一連の酵素反応）を通じて１つ以上の代謝産物を産生する。
【００４２】
細胞機能を亢進させるため合成プラットフォーム染色体を用いることの有用性の一例は、必須アミノ酸トリプトファンを合成させる免疫系細胞の操作である。腫瘍成長中、腫瘍細胞は局所腫瘍環境から大量のトリプトファンを取り入れ、これが腫瘍細胞成長を阻害する免疫細胞の飢餓及び続く停止につながり、飢餓免疫細胞には成長中の腫瘍細胞を阻害する能力がなくなる。トリプトファンは必須アミノ酸−即ち、ヒトがデノボ合成できないアミノ酸−であり、トリプトファンの食事による摂取は、腫瘍細胞によって誘導されるトリプトファン飢餓を軽減することができない。しかしながら、トリプトファン生合成につながる異種遺伝子を発現する合成染色体を含有する免疫細胞は選択的利点を有し、腫瘍細胞と相互作用する間の、又は腫瘍細胞環境内での「トリプトファン不足」による死を免れる。例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、トリプトファンの合成に必要な５つの遺伝子（ＴＲＰ１〜５）を発現する。これらの遺伝子の各々は哺乳類プロモータ（構成的に発現するか、又は調節性プロモータから発現するかのいずれか）から単離及び制御して、合成プラットフォーム染色体（以下に記載する）に複数の遺伝子を送達する又は「ロードする」ように操作された細菌人工染色体（ＢＡＣ）などの大量のＤＮＡを担持し得る細菌ベクターに置くことができる。次に、トリプトファン生合成遺伝子を含む合成染色体は、続いて免疫腫瘍学的細胞ベース療法のため免疫細胞（例えば、万能供血者Ｔ細胞又は患者自己Ｔ細胞）に導入されてもよい。
【００４３】
「トリプトファン不足」による死に対する抵抗性を付与することに加え、合成染色体の大きい運搬能力は更に、限定はされないが、１）腫瘍細胞が免疫細胞周期進行を阻害する能力を妨害又は遮断する遺伝子、例えば抗ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）又は抗ＣＴＬＡ−４（中枢Ｔ細胞活性化及び阻害４）分子の発現；２）免疫細胞の活性化及び成長を亢進させる因子（例えば、インターロイキン２又は他のかかるサイトカイン）；及び／又は３）発生中の腫瘍に対する操作免疫細胞の特異性を増加させる因子、例えば、腫瘍への免疫細胞ホーミング又は特異的腫瘍マーカへの免疫細胞結合を増加させる因子の追加を含め、腫瘍細胞阻害を遮断する他の生合成経路の遺伝子を操作することを可能にする。従って、追加的な経路及び／又は因子と共にトリプトファン生化学的経路を操作することは、免疫細胞ベースの抗癌治療法用の合成プラットフォーム染色体（即ち、「免疫／腫瘍（ｉｍｍｕｎｏ／ｏｎｃ）合成染色体又は免疫／腫瘍（ｉｍｍｕｎｏ／ｏｎｃ）ＳｙｎＣ」）と区別される。
【００４４】
合成染色体の作製
合成染色体は培養細胞で作成される。一部の実施形態において、操作を受ける、及び／又は合成染色体を産生する細胞は、その合成染色体からの遺伝子又は調節配列が最終的に発現することになる対象（ヒト患者、動物又は植物）に天然に存在する細胞であってもよい。かかる細胞は、個体に特異的な合成染色体作製用に樹立された初代培養細胞株であってもよい。他の実施形態において、操作を受ける、及び／又は合成染色体を産生する細胞は、樹立細胞株からのものである。組織培養用の多種多様な細胞株が当該技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定はされないが、ヒト細胞株、例えば、２９３−Ｔ（胎児由来腎臓）、７２１（メラノーマ）、Ａ２７８０（卵巣）、Ａ１７２（膠芽腫）、Ａ２５３（癌腫）、Ａ４３１（上皮）、Ａ５４９（癌腫）、ＢＣＰ−１（リンパ腫）、ＢＥＡＳ−２Ｂ（肺）、ＢＲ２９３（乳房）、ＢｘＰＣ３（膵癌）、Ｃａｌ−２７（舌）、ＣＯＲ−Ｌ２３（肺）、ＣＯＶ−４３４（卵巣）、ＣＭＬ  Ｔ１（白血病）、ＤＵＩ４５（前立腺）、ＤｕＣａＰ（前立腺）、ＦＭ３（リンパ節）、Ｈ１２９９（肺）、Ｈ６９（肺）、ＨＣＡ２（線維芽細胞）、ＨＥＫ０２９３（胎児由来腎臓）、ＨｅＬａ（頸部）、ＨＬ−６０（骨髄芽球）、ＨＭＥＣ（上皮）、ＨＴ−２９（結腸）、ＨＵＶＥＣ（臍帯静脈上皮）、ジャーカット（Ｔ細胞白血病）、ＪＹ（リンパ芽球様）、Ｋ５６２（リンパ芽球様）、ＫＢＭ−７（リンパ芽球様）、Ｋｕ８１２（リンパ芽球様）、ＫＣＬ２２（リンパ芽球様）、ＫＧＩ（リンパ芽球様）、ＫＹＯ１（リンパ芽球様）、ＬＮＣａｐ（前立腺）、Ｍａ−Ｍｅｌ（メラノーマ）、ＭＣＦ−７（乳腺）、ＭＤＦ−１０Ａ（乳腺）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、−４６８及び−４３５（乳房）、ＭＧ６３（骨肉腫）、ＭＯＲ／０．２Ｒ（肺）、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６（白血球細胞）、ＭＲＣ５（肺）、ＮＣＩ−Ｈ６９（肺）、ＮＡＬＭ−１（末梢血）、ＮＷ−１４５（メラノーマ）、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ（前立腺）、ピア（Ｐｅｅｒ）（白血病）、ラージ（Ｒａｊｉ）（Ｂリンパ腫）、Ｓａｏｓ−２（骨肉腫）、Ｓｆ２１（卵巣）、Ｓｆ９（卵巣）、ＳｉＨａ（子宮頸癌）、ＳＫＢＲ３（乳癌）、ＳＫＯＶ−２（卵巣癌腫）、Ｔ−４７Ｄ（乳腺）、Ｔ８４（肺）、Ｕ３７３（膠芽腫）、Ｕ８７（膠芽腫）、Ｕ９３７（リンパ腫）、ＶＣａＰ（前立腺）、ＷＭ３９（皮膚）、ＷＴ−４９（リンパ芽球様）、ＹＡＲ（Ｂ細胞）、胚細胞株、多能性細胞株、成人由来幹細胞、再プログラム化細胞株、任意の種の汎用動物細胞株又は広義に胎児性の若しくは再プログラム化される細胞、患者自己細胞株が挙げられ、一部の好ましい実施形態では、ＨＴ１０８０ヒト細胞株が利用される。これらの細胞株及び他の細胞株は当業者に公知の種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）を参照）。
【００４５】
生化学的経路又は生合成経路内の複数の遺伝子を発現させるための合成染色体の操作は、当該技術分野で用いられる「トップダウン」、「ボトムアップ」、ミニ染色体の操作、及び誘導性デノボ染色体生成方法の全てに適用可能である。合成染色体形成の「ボトムアップ」手法は、テロメアＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ有り又は無しの、典型的な宿主細胞に適切なセントロメア及び１つ又は複数の選択可能マーカ遺伝子を含むクローニングされたαサテライト配列による許容的細胞株のトランスフェクション後の細胞介在性デノボ染色体形成に頼るものである。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、ハリントン（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１５巻、ｐ．３４５〜５５、１９９７年；イケノ（Ｉｋｅｎｏ）ら著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、第１６巻、ｐ．４３１〜３９、１９９８年；マスモト（Ｍａｓｕｍｏｔｏ）ら著、クロモソーマ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ）、第１０７巻、ｐ．４０６〜１６、１９９８年、エバーソール（Ｅｂｅｒｓｏｌｅ）ら著、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅ．）、第９巻、ｐ．１６２３〜３１、２０００年；ヘニング（Ｈｅｎｎｉｎｇ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第９６巻、ｐ．５９２〜９７、１９９９年；グライムス（Ｇｒｉｍｅｓ）ら著、エンボ・リポーツ（ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．）、第２巻、ｐ．９１０〜１４、２００１年；メヒア（Ｍｅｊｉａ）ら著、ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、第７９巻、ｐ．２９７〜３０４、２００２年；及びグライムス（Ｇｒｉｍｅｓ）ら著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第５巻、ｐ．７９８〜８０５、２００２年を参照）。酵母人工染色体、細菌人工染色体又はＰ１由来人工染色体ベクターにクローニングされた合成の及び天然に存在するαサテライトアレイの両方が、当該技術分野でデノボ合成染色体形成に用いられている。ボトムアップアセンブリの産物は線状又は環状であってもよく、αサテライトＤＮＡベースのセントロメアを有する単純化した及び／又はコンカテマー化した入力ＤＮＡを含み、及び典型的にはサイズが１〜１０Ｍｂの範囲であり得る。ボトムアップ由来の合成染色体はまた、合成染色体への標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にする核酸配列も取り込むように操作される。
【００４６】
合成染色体を作製する「トップダウン」手法には、先在している染色体腕のランダム及び／又はターゲットトランケーションの連続ラウンドによって、セントロメア、テロメア、及びＤＮＡ複製起点を含む合成染色体に切り詰めることが関わる。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、ヘラー（Ｈｅｌｌｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第９３巻、ｐ．７１２５〜３０、１９９６年；サフェリー（Ｓａｆｆｅｒｙ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第９８巻、ｐ．５７０５〜１０、２００１年；チュウ（Ｃｈｏｏ）著、トレンズ・イン・モレキュラー・メディシン（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第７巻、ｐ．２３５〜３７、２００１年；バーネット（Ｂａｒｎｅｔｔ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．）、第２１巻、ｐ．２７〜３６、１９９３年；ファー（Ｆａｒｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ）、第８８巻、ｐ．７００６〜１０、１９９１年；及びカトウ（Ｋａｔｏｈ）ら著、ビオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、第３２１巻、ｐ．２８０〜９０、２００４年を参照）。「トップダウン」合成染色体は、最適には天然に存在する発現遺伝子を欠くように構築され、例えば部位特異的ＤＮＡインテグラーゼによって媒介される、トランケート型染色体への標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にするＤＮＡ配列を含むように操作される。
【００４７】
当該技術分野において公知の合成染色体を作製する第３の方法は、天然に存在するミニ染色体の操作である。この作製方法には、典型的には、セントロメア機能を有するがαサテライトＤＮＡ配列は欠いている機能性の、例えばヒト新生セントロメアを含み、且つ非必須ＤＮＡは持たないように操作された染色体の放射線照射誘導性の断片化が関わる。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、オリッシュ（Ａｕｒｉｃｈｅ）ら著、エンボ・リポーツ（ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．）、第２巻、ｐ．１０２〜０７、２００１年；モラーリ（Ｍｏｒａｌｌｉ）ら著、サイトジェネティクス・アンド・セル・ジェネティクス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．）、第９４巻、ｐ．１１３〜２０、２００１年；及びカリーヌ（Ｃａｒｉｎｅ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１５巻、ｐ．４４５〜４６０、１９８９年を参照）。合成染色体を生成する他の方法と同様に、操作されたミニ染色体は、標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にするＤＮＡ配列を含むように操作することができる。
【００４８】
合成染色体を作製する第４の好ましい手法には、特定の染色体セグメントのターゲット増幅による誘導性デノボ染色体生成が関わる。この手法には、アクロセントリック染色体に位置する動原体周囲／リボソームＤＮＡ領域の大規模増幅が関わる。増幅は、リボソームＲＮＡなど、染色体の挟動原体領域（ｐｅｒｃｅｎｔｒｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）に特異的な過剰のＤＮＡを、標的ＤＮＡ配列の部位特異的組込みを可能にするＤＮＡ配列（ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＬ、ａｔｔＲなど）、及び任意選択で選択可能マーカと共に（これらの全てが染色体の挟動原体領域に組み込まれる）コトランスフェクトすることによって惹起される。（これらの方法のプロトコル及び詳細な説明については、例えば、クソンカ（Ｃｓｏｎｋａ）ら著、ジャーナル・オブ・セル・サイエンス（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ）、第１１３巻、ｐ．３２０７〜１６、２００２年；ハドラツキー（Ｈａｄｌａｃｚｋｙ）ら著、カレント・オピニオン・イン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第３巻、ｐ．１２５〜３２、２００１年；及びリンデンバウム（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ）及びパーキンス（パーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ））ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ．Ａｃ．Ｒｅｓ．）、第３２巻、第２１号、ｐ．ｅｌ７２、２００４年を参照）。この過程では、コトランスフェクトされたＤＮＡによるアクロセントリック染色体の挟動原体領域へのターゲティングが大規模染色体ＤＮＡ増幅、セントロメア配列の複製／活性化、並びに続く二動原体染色体の切断及び分割を誘導し、その結果、複数の部位特異的組込み部位を含むサテライトＤＮＡベースの合成染色体の「離脱（ｂｒｅａｋ−ｏｆｆ）」がもたらされる。
【００４９】
合成プラットフォーム染色体技術の不可欠な部分は、合成染色体に選択の遺伝子を「ロードする」又は置くことを可能にする部位特異的組換えシステムである。本発明の好ましい実施形態において、合成プラットフォーム染色体は、その各々に１つ又は数個の目的遺伝子が挿入され得る複数の部位特異的組換え部位を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ファージＰ１からのＣＲＥリコンビナーゼを使用したＣｒｅ／ｌｏｘ組換えシステム（例えば、サウアー（Ｓａｕｅｒ）著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第２２５巻、ｐ．８９０〜９００、１９９３年及び米国特許第５，６５８，７７２号明細書を参照）；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μエピソームからのＦＬＰリコンビナーゼを使用した酵母のＦＬＰ／ＦＲＴシステム（例えば、コックス（Ｃｏｘ）著、米国科学アカデミー紀要（ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８０巻、ｐ．４２２３、１９８３年及び米国特許第５，７４４，３３６号明細書を参照）；リゾルベース、例えば、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ（メイザー（Ｍａｅｓｅｒ）ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．）、第２３０巻、ｐ．１７０〜１７６、１９９１年）、Ｃｉｎ、Ｈｉｎ、αδ、Ｔｎ３；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ（例えば、エノモト（Ｅｎｏｍｏｔｏ）ら著、ジャーナルジャーナル・オブ・バクテリド（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｄ．）、第６巻、ｐ．６６３〜６６８、１９８３年を参照）；ザイゴサッカロミセス・ロウキシイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）のｐＳＲｌプラスミドのＲ／ＲＳシステム（例えば、アラキ（Ａｒａｋｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２２５巻、ｐ．２５〜３７、１９９２年を参照）；クルイベロミセス・ドロソフィラリウム（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｉｕｍ）（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第３１４巻、ｐ．４４７１〜４４８１、１９８６年を参照）及びクルイベロミセス・ワルチイ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉ）（例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第１３８巻、ｐ．３３７〜３４５、１９９２年を参照）からの部位特異的リコンビナーゼ；及び当業者に公知の他のシステムを含め、任意の公知の組換えシステムを使用することができ；しかしながら、追加的な因子の必要なしに動作する−又は突然変異のおかげで追加的な因子が不要な−組換えシステムが好ましい。一例示的実施形態において、バクテリオファージλインテグラーゼ（ｂａｃｔｉｏｐｈａｇｅ  ｌａｍｂｄａ  ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）のリコンビナーゼ活性を用いた配列特異的組換えによって核酸を合成プラットフォーム染色体に挿入するための方法が提供される。
【００５０】
λファージによってコードされるインテグラーゼ（「Ｉｎｔ」と称される）は、インテグラーゼファミリーのプロトタイプメンバーである。Ｉｎｔは、ａｔｔＢ／ａｔｔＰ及びａｔｔＬ／ａｔｔＲと称される付着部位の対間の組換えによってファージの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムへの組込み及びそこからの切出しを生じさせる。各ａｔｔ部位は、２つの逆位の９塩基対コアＩｎｔ結合部位、及び野生型ａｔｔ部位と同一の７塩基対オーバラップ領域を含む。Ｉｎｔは、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐ−ＦＲＴリコンビナーゼシステムと同様に、組込み及び切出し組換えの間に秩序立った逐次的な対の鎖交換を実行する。Ｉｎｔの天然の標的配列対、ａｔｔＢ及びａｔｔＰ又はａｔｔＬ及びａｔｔＲは同じ又は異なるＤＮＡ分子に位置し、それぞれ分子内又は分子間組換えをもたらす。例えば、分子内組換えはそれぞれ逆向きのａｔｔＢ及びａｔｔＰ間、又はａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列間で起こり、介在するＤＮＡセグメントの逆位をもたらす。野生型Ｉｎｔは組込み及び切出し組換えに追加的なタンパク質因子を必要とし、及び組込み組換えに負の超らせん形成を必要とするが、突然変異Ｉｎｔタンパク質は、ヒト細胞におけるコトランスフェクションアッセイで分子内組込み及び切出し組換えを実施するのにアクセサリータンパク質は不要であり（ロールバッハ（Ｌｏｒｂａｃｈ）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２５巻、第２９６号、ｐ．１１７５〜１１８１、２０００年を参照）、本発明の方法に好ましい。
【００５１】
生合成経路内の複数の遺伝子を送達する送達ベクター
生合成経路内の複数の遺伝子を合成プラットフォーム染色体に送達又は「ロード」するために使用する送達ベクターの選択は、伝播が所望される細胞のタイプなど、種々の要因に依存することになる。適切な送達ベクターの選択は十分に当業者の技能の範囲内にあり、多くのベクターが市販されている。送達ベクターの調製には、複数の遺伝子が、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位への遺伝子配列のライゲーションを用いてベクターに挿入される。或いは、所望のヌクレオチド配列が相同組換え又は部位特異的組換えによって挿入されてもよい。典型的には相同組換えは、ベクターに相同性領域を所望のヌクレオチド配列（例えば、ｃｒｅ−ｌｏｘ、ａｔｔ部位等）に隣接して付加することにより達成される。かかる配列を含む核酸は、例えばオリゴヌクレオチドのライゲーションによるか、又は相同性領域及び所望のヌクレオチド配列の一部分の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって付加することができる。使用し得る例示的送達ベクターとしては、限定はされないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡに由来するものが挙げられる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９／１８、ｐＵＣ１１８、１１９などのプラスミドベクター及びＭ１３  ｍｐ系ベクターを使用してもよい。バクテリオファージベクターとしては、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８〜２３、λＺＡＰ／Ｒ及びＥＭＢＬ系バクテリオファージベクターを挙げることができる。利用し得るコスミドベクターとしては、限定はされないが、ｐＪＢ８、ｐＣＶ１０３、ｐＣＶ１０７、ｐＣＶ１０８、ｐＴＭ、ｐＭＣＳ、ｐＮＮＬ、ｐＨＳＧ２７４、ＣＯＳ２０２、ＣＯＳ２０３、ｐＷＥ１５、ｐＷＥ１６及びシャロミド９系ベクターが挙げられる。更なるベクターとしては、機能性稔性プラスミド（Ｆプラスミド）ベースのバクテリア人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びＰ１バクテリオファージのＤＮＡに由来するＤＮＡコンストラクトであるＰ１由来人工染色体（ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）（ＰＡＣ）が挙げられる。或いは、及び好ましくは、限定はされないが、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス又はウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来するものを含め、組換えウイルスベクターが操作されてもよい。ＢＡＣベクターは、大量の核酸、即ち複数の遺伝子を担持する能力があるため本発明に好ましい送達ベクターである。或いは、複数の遺伝子は、複数の送達ベクターを使用した逐次ローディングによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよい；即ち、第１の遺伝子が第１の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、第２の遺伝子が第２の送達ベクターによって合成プラットフォーム染色体にロードされてもよく、以下同様である。２０１６年４月１２日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、米国仮特許出願第６２／３２１，７１１号明細書が、単一の選択可能マーカを再利用しながら複数の送達ベクターを逐次ロードすることについて記載してい��。
【００５２】
生合成経路からの遺伝子の各々は、構成的に発現するか、又は調節可能なプロモータから発現するかのいずれかの哺乳類プロモータから単離及び制御することができる。送達ベクターを含む細胞の選択を促進するため、発現宿主で作動可能な選択可能マーカが任意選択で存在してもよい。加えて、送達ベクターは追加的なエレメントを含み得る；例えば、送達ベクターが１つ又は２つの複製システムを有してもよく；ひいては送達ベクターを生物に維持する、例えば発現のため哺乳類細胞に、並びにクローニング及び増幅のため原核生物宿主に維持することが可能になる。
【００５３】
λインテグラーゼ介在性部位特異的組換え−又は任意の他のリコンビナーゼ介在性部位特異的組換え−を用いて、標的遺伝子が送達ベクターから合成プラットフォーム染色体に導入又は「ロード」される。合成プラットフォーム染色体は複数の部位特異的組換え部位を含むため、複数の遺伝子が単一の合成プラットフォーム染色体にロードされる。部位特異的組換えに介在するリコンビナーゼは、送達ベクターにリコンビナーゼの遺伝子をコードすることによって細胞に送達されてもよく、又は精製若しくはカプセル化リコンビナーゼタンパク質が標準的な技術を用いて受容細胞に送達されてもよい。複数の標的遺伝子の各々は、その独自のプロモータの制御下にあってもよく；或いは、複数の標的遺伝子の発現は、ウイルスベースのエレメント又はヒト配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントによって協調的に調節されてもよい（例えば、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）ら著、トレンド・イン・バイオケミカル・サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．）、第１５巻、ｐ．４７７〜８３、１９９０年；及びウマール（Ｏｕｍａｒｄ）ら著、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）、第２０巻、ｐ．２７５５〜２７５９、２０００年を参照）。加えて、標的遺伝子から下流の蛍光マーカ−例えば、緑色、赤色又は青色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ）−に連結されたＩＲＥＳ型エレメントを使用すると、組み込まれた１つ又は複数の標的遺伝子を発現する合成プラットフォーム染色体を同定することが可能になる。それに代えて又は加えて、ＰＣＲによる組込みの検出用にプライマーを設計することにより、合成染色体上での部位特異的組換えイベントを迅速にスクリーニングし得る。
【００５４】
合成染色体作製細胞への構成要素の送達
合成染色体作製に適切な構成要素及び１つ又は複数の送達ベクターは、当該技術分野において公知の任意の方法により受容細胞に送達することができる。用語のトランスフェクション及び形質転換は、任意のコード配列が実際に発現するか否かに関わらず、外因性核酸、例えば発現ベクターが宿主細胞によって取り込まれることを指す。例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介在性形質転換、プロトプラスト形質転換（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性形質転換、電気穿孔、プロトプラスト融合、及びマイクロセル融合を含む）、脂質介在性送達、リポソーム、電気穿孔、ソノポレーション、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント及び炭化ケイ素ウイスカ介在性形質転換及びこれらの組み合わせ（例えば、パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）、第３巻、ｐ．２７１７〜２７２２、１９８４年；ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）ら著、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１９９巻、ｐ．１６９〜１７７、１９８５年；ライヒ（Ｒｅｉｃｈ）ら著、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、ｐ．１００１〜１００４、１９８６年；クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２７巻、ｐ．７０〜７３、１９８７年；米国特許第６，１４３，９４９号明細書；パシュコフスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ）ら著、「植物の細胞培養及び体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」、第６巻、「植物核遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ）」、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）及びバシル（Ｖａｓｉｌ）編、アカデミック・パブリッシャーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９８９年；及びフレーム（Ｆｒａｍｅ）ら著、プラント・ジャーナル（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．）、第６巻、ｐ．９４１〜９４８、１９９４年を参照）；リン酸カルシウムを使用した直接取込み（ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第７６巻、ｐ．１３７３〜１３７６、１９７９年）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）介在性ＤＮＡ取込み；リポフェクション（例えば、シュトラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）著、メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第５４巻、ｐ．３０７〜３２７、１９９６年を参照）；マイクロセル融合（ランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、第８８巻、ｐ．５９０７〜５９１１、１９９１年；米国特許第５，３９６，７６７号明細書；ソーフォード（Ｓａｗｆｏｒｄ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．）、第１３巻、ｐ．２７９〜２８４、１９８７年；ダール（Ｄｈａｒ）ら著、ソマティック・セル・アンド・モレキュラー・ジェネティクス（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇ���ｎｅｔ．）、第１０巻、ｐ．５４７〜５５９、１９８４年；及びマクニール＝キラリー（ＭｃＮｅｉｌｌ−Ｋｉｌｌａｒｙ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ）、第２５４巻、ｐ．１３３〜１５２、１９９５年）；脂質介在性担体システム（例えば、テイフェル（Ｔｅｉｆｅｌ）ら著、バイオテクニクス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第１９巻、ｐ．７９〜８０、１９９５年；アルブレヒト（Ａｌｂｒｅｃｈｔ）ら著、アニュアルズ・オブ・ヘマトロジー（Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第７２巻、ｐ．７３〜７９、１９９６年；ホルメン（Ｈｏｌｍｅｎ）ら著、インビトロ・セルラー・アンド・デベロップメンタル・バイオロジー・アニマル（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．）、第３１巻、ｐ．３４７〜３５１、１９９５年；レミー（Ｒｅｍｙ）ら著、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．）、第５巻、ｐ．６４７〜６５４、１９９４年；ル・ボルシュ（Ｌｅ  Ｂｏｌｃｈ）ら著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、第３６巻、ｐ．６６８１〜６６８４、１９９５年；及びレフラー（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ）ら著、メソッド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．ＥｎｚｙｍｏＬ）、第２１７巻、ｐ．５９９〜６１８、１９９３年を参照）；又は他の好適な方法による数多くのトランスフェクション方法が当業者に公知である。合成染色体の送達方法はまた、米国特許出願第０９／８１５，９７９号明細書にも記載されている。トランスフェクションの成功は、概して、トランスフェクト細胞内における異種核酸の存在の検出、例えば、異種核酸の何らかの視覚化、選択可能マーカの発現又は宿主細胞内での合成プラットフォーム染色体又は送達ベクターの作動の何らかの指標などによって認識される。本発明の実施において有用な送達方法の説明については、米国特許第５，０１１，７７６号明細書；米国特許第５，７４７，３０８号明細書；米国特許第４，９６６，８４３号明細書；米国特許第５，６２７，０５９号明細書；米国特許第５，６８１，７１３号明細書；キム（Ｋｉｍ）及びエーベルワイン（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）著、アナリティカル・アンド・バイオアナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、第３９７巻、第８号、ｐ．３１７３〜３１７８、２０１０年を参照のこと。
【００５５】
受容免疫細胞の視覚化、単離、及びトランスファー
本発明の合成プラットフォーム染色体の作製及びローディングは、様々な方法によってモニタすることができる。リンデンバウム（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ）及びパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら著、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第３２巻、第２１号、ｐ．ｅｌ７２、２００４年は、先行技術のテクノロジーを用いた哺乳類サテライトＤＮＡベースの人工染色体発現（ＡＣＥ）システムの作製について記載している。この先行技術のシステムでは、ＰＣＲ生成したプローブ又はニック翻訳を受けたプローブを使用して従来の単色及び二色ＦＩＳＨ分析並びに高分解能ＦＩＳＨが行われた。テロメア配列の検出のため、有糸分裂スプレッドが、市販品から入手されたペプチド核酸プローブとハイブリダイズされた。蛍光顕微鏡法を用いて顕微鏡法が実施された。或いは、２０１６年２月９日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１７１７９号明細書が、２つの標識したタグ：合成プラットフォーム染色体の作製に使用する細胞株内の内因性染色体に特異的な１つの標識タグ、及び作製しようとする合成染色体上の配列に特異的な１つの異なる標識のタグを用いて標準化された蛍光技術による合成染色体形成のリアルタイムモニタリングを可能にする組成物及び方法について記載している。
【００５６】
合成染色体の単離及びトランスファーには、典型的には、微小核細胞融合（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＭＭＣＴ）技術又は色素依存的染色体染色と、続くフローサイトメトリーベースのソーティングが関わる。ＭＭＣＴ技術では、ドナー細胞が化学的に誘導されてその染色体が多核化され、続いて微小細胞にパッケージングされ、最終的に受容細胞に融合される。合成染色体が受容細胞にトランスファーされたことの確認は、薬物選択及びＦＩＳＨによって確かめられる、トランスファーされた染色体のインタクトな送達により行われる。或いは、フローサイトメトリーベースのトランスファーを用いてもよい。フローサイトメトリーベースのトランスファーについては、有糸分裂を停止させた染色体が単離され、ＤＮＡ特異的色素で染色され、及びサイズ及び異なる色素染色に基づきフローソーティングされる。フローソーティングされた染色体は、次に標準的なＤＮＡトランスフェクション技術によって受容細胞に送達され、インタクトな染色体の送達がＦＩＳＨによって判定される。更に別の代替例では、２０１６年２月９日に出願されたパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）及びグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、ＰＣＴ／ＵＳ１６／１７１７９号明細書に記載される合成染色体作製の視覚化及びモニタリングに加え、合成染色体タグを使用してフローサイトメトリーによって合成染色体作製細胞から合成染色体を単離し、並びに受容細胞（即ち免疫細胞）への合成染色体のトランスファーをモニタすることができる。
【００５７】
（実施例）
実施例１：サテライトＤＮＡベースの人工染色体のデノボ作成
合成染色体（ｃｈｒｏｍｏｍｓｏｍｅ）のデノボ作製のため、外因性ＤＮＡ配列をＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株に導入し、それがアクロセントリック染色体のセントロメア周辺ヘテロクロマチン領域に組み込まれると、アクロセントリック染色体の短腕（ｒＤＮＡ／セントロメア領域）の大規模増幅が惹起された。増幅イベントの間にセントロメアが複製されて２つの活性セントロメアを有する二動原体染色体になった。続く有糸分裂イベントによって二動原体染色体の切断及び分離が起こり、主にサテライト反復配列を含む約２０〜１２０Ｍｂサイズの離脱につながり、そこには増幅されたｒＤＮＡコピーも含み得る共増幅されたトランスフェクト導入遺伝子のサブドメインが含まれた。新規に作成された合成染色体は、内因性染色体タグ及びＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株内に操作された合成染色体タグを用いた蛍光染色体ペイント（又はＦＩＳＨ）の観察によってバリデートされる。
【００５８】
トランスフェクションの前日、ＨＴ１０８０合成染色体生成細胞株の細胞を約２．０〜８．０×１０４接着細胞密度となるように２４ウェル組織培養ディッシュに分け、外来ＤＮＡを含むベクターを精製し（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）エンドフリー・プラスミド・マキシキット（ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ）を使用）、線状化し、及びトランスフェクション用にベクターの濃度を決定した。培養ＨＴ１０８０細胞は、トランスフェクション前に３〜５時間フィードした。標準的なトランスフェクション試薬、例えば、サーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のビアフェクト（Ｖｉａｆｅｃｔ）、又はインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のリン酸カルシウムトランスフェクションキットを使用したＨＴ１０８０細胞のトランスフェクションには、２４ウェルセミコンフルエント組織培養ディッシュ当たり２２５ｎｇのｐＳＴＶ２８ＨｕｒＤＮＡベクター及び１２．５ｎｇ  ｐ１５Ａ７２４８ｌａｃＥＦ１ａｔｔＰＰｕｒｏベクターを使用した。ｐＳＴＶ２８ＨｕｒＤＮＡベクターはリボソームＤＮＡ配列を含む。ｐ１５Ａ７２４８ｌａｃＥＦ１ａｔｔＰＰｕｒｏベクターは、部位特異的組換えシステムの構成要素、ＬａｃＯリピート並びにアンピシリン及びピューロマイシン耐性遺伝子を含む。細胞をトランスフェクション後１〜３日間維持した時点でそれらをトリプシン処理し、１０ｃｍディッシュにリプレーティングした。プレーティング時又はプレーティングの１〜３日後に１０ｃｍディッシュに選択培地を加えた。２〜３日おきに培地を交換しながら選択的条件を１０〜２１日間維持した。コロニーが直径２〜３ｍｍに達したところで抗生物質耐性クローンをピックした。十分に離れているコロニーが好ましかった。クローニングシリンダ及びトリプシンを使用して細胞を剥がし取り、２４ウェルプレートに移して増殖させた。
【００５９】
実施例２：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリプトファン経路送達ベクターの作成
ＢＬｏＶｅＬ−ＴＴＳベクターを骨格送達ベクターとして使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリプトファン経路の５つの遺伝子（Ｔｒｐ１〜Ｔｒｐ５）を合成染色体に挿入する。これらの５つのトリプトファン遺伝子は、２Ａペプチド又はＩＲＥＳエレメントのいずれかをコードするＤＮＡ配列によって隔てられて、５つの遺伝子を含有する単一の転写物を形成し、それによりトリプトファン合成に必要なタンパク質の発現レベルがほぼ同等になる。利用し得る２Ａ自己切断ペプチドとしては、限定はされないが：ブタテッショウウイルス１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ  ２Ａ）、及び軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）が挙げられる（下記参照）。データが示すところによれば、短い３アミノ酸ペプチド（グリシン−セリン−グリシン）が自己切断ペプチドのＮ末端に付加されると自己切断が改善する。従って、本例はまた、２Ａ自己切断ペプチド活性の効率を改善する僅かな修飾も包含する。
【００６０】
【表１】
2019511235.tif 000002
利用し得る内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントとしては、限定はされないが、ウイルス性及び細胞性ＩＲＥＳエレメントが挙げられる。ウイルス性ＩＲＥＳエレメントは４種類に分類される。Ｉ型はエンテロウイルス（ＥＶ、ＰＶ、ＨＲＶ）、ＩＩ型はカルジオウイルス（ＥＭＣＶ）及びアフトウイルス（口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶ）を含み、ＩＩＩ型はＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に用いられ、及びＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）様ＩＲＥＳはＩＶグループに適合する（パチェコ（Ｐａｃｈｅｃｏ）及びマルチネーゼ＝サラス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ）著、ジャーナル・オブ・バイオメディシン・アンド・バイオテクノロジー（Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、２０１０年２月２日、ｐ．４５８９２７、ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１０／４５８９２７、ＰＭＩＤ：２０１５０９６８；及びヘレン（Ｈｅｌｌｅｎ）及びサルナウ（Ｓａｒｎｏｗ）著、ジーンズ・アンド・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）、第１５巻、第１３号、ｐ．１５９３〜６１２、２００１年を参照）。
【００６１】
ＢＬｏＶｅＬ−ＴＴＳをＥｃｏ５３ＫＩで消化して送達ベクター骨格を線状化する。５つのＴｒｐ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｓ２８８ｃゲノムＤＮＡから、線状化ＢＬｏＶｅＬ−ＴＴＳベクターへの５つの遺伝子及び選択のプロモータのＩＮ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｔａｋａｒａ）用に設計されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅するか、或いは合成する。
【００６２】
【表２】
2019511235.tif 000003
プロモータは、天然に見られるもの又は人工的にアセンブルしたプロモータから選択され得る。特定の経路及び適用に構成的プロモータが好ましいか、それとも誘導性プロモータが好ましいかは、所望の発現制御によって決まる。例えば、細胞内の特定の代謝産物のレベルに応じて転写を誘導又は抑制するフィードバック機構を提供し得るプロモータを利用してもよい。
【００６３】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）生合成経路内の５つのＴｒｐ遺伝子は、以下の変更を伴い合成する：１）Ｔｒｐ１、Ｔｒｐ２、Ｔｒｐ３、Ｔｒｐ４遺伝子を終止コドンなしに合成する；２）Ｐ２ＡスペーサをＴｒｐ２遺伝子の上流にコードし、及びグリシン−セリン−グリシンスペーサ＋１５ｂｐのＴ２Ａスペーサを最後のＴｒｐ２アミノ酸コドンの下流にコードする；３）Ｔ２ＡスペーサをＴｒｐ３遺伝子の上流にコードし、及びグリシン−セリン−グリシンスペーサ＋１５ｂｐのＥ２Ａスペーサを最後のＴｒｐ３アミノ酸コドンの下流にコードする；４）Ｅ２ＡスペーサをＴｒｐ４遺伝子の上流にコードし、及びグリシン−セリン−グリシンスペーサ＋１５ｂｐのＦ２Ａスペーサを最後のＴｒｐ４アミノ酸コドンの下流にコードする；及び５）Ｆ２ＡスペーサをＴｒｐ５遺伝子の上流にコードし、及びポリアデニル化シグナルをＴｒｐ５遺伝子の下流にコードする。
【００６４】
ＰＣＲプライマーは、線状化ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳベクター骨格へのＩＮ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング用に５つの合成ＤＮＡエレメント並びにヒトＥＦ１αプロモータ（ｐＥＦ１ｈｒＧＦＰから増幅される）をＰＣＲ増幅するように設計する。得られるコンストラクト、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈを図２に示す。（ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈには、以下のエレメントが存在する：ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、及びｓｏｐＣ＝プラスミド分割タンパク質；ＳＶ４０ｐＡｎ＝ＳＶ４０ポリＡ；ＴＴＳ＝転写終結シグナル；ａｔｔＢ＝部位特異的組換え部位；ｌｏｘ＝部位特異的組換え部位；ｅＧＦＰ＝蛍光タンパク質；Ｂｓｒ＝ブラストサイジン耐性遺伝子；ｒｅｐＥ＝複製開始部位；Ｏｒｉ２＝複製起点；ＣｍＲ＝クロラムフェニコール耐性遺伝子；ポリＡｎ＝ポリＡ；ＥＦ１αＰｒ＝プロモータ；ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３  ＴＲＰ４、及びＴＲＰ５＝トリプトファン遺伝子１〜５；Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、及びＦ２Ａ＝自己切断ペプチド）。ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈ送達ベクターが構築されたところで、合成染色体を含有する細胞にそれをトランスフェクトする。
【００６５】
実施例３：合成染色体へのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリプトファン経路遺伝子のローディング
ＢＬｏＶｅＬ−ＴＴＳベクターを送達ベクターとして使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリプトファン経路からの５つの遺伝子（Ｔｒｐ１〜Ｔｒｐ５）を合成染色体に挿入する。０日目、合成染色体（ｈＳｙｎＣ）を含有する受容細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）を２４ウェルディッシュの１ウェル当たり約４Ｅ４細胞で播種し、ウェルが１日目に約７０％コンフルエントになる。適切な培地（例えば、ＨＴ１０８０についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）中において細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、製造者の指示に従い（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）、プラス（Ｐｌｕｓ）試薬含有）、送達ベクター（例えば、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈ）及び組換えタンパク質をコードするプラスミド（例えばｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ）の両方をＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）をオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）培地に希釈し（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする２４ウェルディッシュの各ウェルにつき１．５μｌ  ＬＴＸ／５０μｌ  オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ））、オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中５０μｌの希釈ＬＴＸに２５０ｎｇ  ＤＮＡ（例えば１２５ｎｇ  ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈプラスミド及び１２５ｎｇ  ｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ／ウェル）を加える。各約５０μｌ  ＤＮＡ−ＬＴＸ−オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に０．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、各試料を室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地を使用して培地を交換する。この細胞にＤＮＡ−脂質複合体を加えて、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【００６６】
２〜２４日目、薬物選択を実施する。デュプリケート２４ウェルのウェルのうちの１つからの細胞をトリプシン処理し、薬物選択（例えば、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン又は３μｇ／ｍｌのブラストサイジン）を含む新鮮培地が入った１０ｃｍディッシュに移す。次に細胞を適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、コロニー形成に関してモニタする。培地は約７２時間毎に交換する。個別コロニーが形成されたら（約１０日）、各コロニーをガラスシリンダによって単離し、トリプシン処理して、２４ウェルディッシュのウェルに移す。次に、クローンを低温貯蔵下に置いてＰＣＲ分析用のゲノムＤＮＡを単離するのに十分な細胞が利用可能になるまで、これらの「クローン」を培養下で増殖させる（約２週間；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウィザードＳＶ（Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ）ゲノムＤＮＡ精製）。
【００６７】
或いは、デュプリケートウェルの細胞をトリプシン処理して、薬物選択を含まない新鮮培地が入った６ｃｍディッシュに置き、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしてもよい。３又は４日目、６ｃｍディッシュ内の細胞をトリプシン処理し、セルソータにかけることにより、ベクターが組み込まれた、且つ送達ベクター上の蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ；ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈ）を発現する蛍光細胞をシングルセルソーティングする。ソータは合成染色体への組込み後のインフレームＧＦＰ陽性組換え体を同定することに留意されたく、これは本発明の方法のユニークな側面の一つである。目的の遺伝子／ＤＮＡエレメントを含有する送達ベクターの組込みは、適切なＰＣＲプライマーを使用した合成染色体と送達ベクター（ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈ）との間の組換え部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の産生によって同定される。試験ゲノムＤＮＡ試料と併せて、水と宿主ゲノムＤＮＡ（例えばＨＴ１０８０）との陰性対照ＰＣＲ反応を実施する。ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈベクター組込みからのジャンクションＰＣＲ産物の増幅に使用するＰＣＲプライマーは、ジャンクション１−予想産物サイズ３９２ｂｐ（ＡＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣ［配列番号５］及びｃｔｃｇｃｃｇｃａｇｃｃｇｔｇｔａａ［配列番号６］）；ジャンクション２−予想産物サイズ４０１ｂｐ（ｇｃｇｃｔａａｔｇｃｔｃｔｇｔｔａｃａｇｇｔ［配列番号７］及びＧＧＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧ［配列番号８］）である。
【００６８】
正しいジャンクションＰＣＲ産物サイズの候補クローンの同定後、更なるＰＣＲ反応を実施して、当初送達ベクターにロードされた、今は合成染色体上にある目的のＤＮＡエレメント（例えばＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、ＴＲＰ４及びＴＲＰ５）の存在が確認される。加えて、トリプトファン産生に関する試験が実施され、これは幾つもの方法で決定することができる。初めに、細胞がアミノ酸トリプトファンを含まない細胞培養培地で成長する能力に関して、これらの細胞の成長をトリプトファン含有の細胞培養培地で成長する細胞と比較して試験し得る。トリプトファン合成に関する別の試験は、ブリッジ・イット（Ｂｒｉｄｇｅ−ｉｔ）Ｌ−トリプトファン蛍光アッセイキット（メディオミクス社（Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓ，ＬＬＣ））で溶解細胞ペレット中のトリプトファンレベルをアッセイすることであり得る。トリプトファンレベルは、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、ＴＲＰ４及びＴＲＰ５遺伝子を担持する独立した培養物でトリプリケートで測定され、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈを含有する合成染色体を有しない細胞の培養物と比較される。
【００６９】
実施例４：トリプトファン経路への芳香族アミノ酸経路の付加
酵母のトリプトファン経路は、ヒト細胞におけるトリプトファン生合成経路の前駆体を提供するのにＡＲＯ経路も更に必要とし得る。トリプトファン生合成経路に入る前駆分子はコリスミ酸であり、これは芳香族アミノ酸経路（シキミ酸（ｓｈｉｋａｍａｔｅ）経路とも称される）によって産生される。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びエリトロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）からコリスミ酸への変換に４つの遺伝子が関与する：
【００７０】
【表３】
2019511235.tif 000004
ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、ＴＲＰ４及びＴＲＰ５遺伝子を含有する細胞の同定後、ＣＲＥ−ｌｏｘ組換えを用いて選択可能マーカカセット（ｅＧＦＰ−ＢＳＲ）を除去する。合成染色体を含有する細胞株にＣＲＥ発現プラスミドをトランスフェクトする。０日目、細胞を６ｃｍ細胞培養ディッシュ当たり２Ｅ５細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、ＣＲＥ発現プラスミド（例えばＰＳＦ−ＣＭＶ−ＣＲＥ−ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクター；シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を製造者のプロトコルに従いリポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）で細胞株（ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、Ｔｒｐ４及びＴＲＰ５遺伝子を含有する）にトランスフェクトする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）はオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）培地に希釈し（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする各６ウェルディッシュにつき７．２５μｌ  ＬＴＸ／５００μｌオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ））、オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中の５００μｌ希釈ＬＴＸに１．２５μｇ  ＤＮＡを加える（例えば６ｃｍディッシュ当たりのＰＳＦ−ＣＭＶ−ＣＲＥ−ＣＲＥリコンビナーゼ発現ベクター）。次に各約５００μｌ  ＤＮＡ−ＬＴＸ−オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に１．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地に交換する。細胞にＤＮＡ−脂質複合体を加え、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。２日目、６ｃｍディッシュからＣＲＥトランスフェクト細胞をトリプシン処理によって回収し、ゲーティングにより非蛍光細胞を収集する。非蛍光細胞はＣＲＥ−ｌｏｘ組換えを受けており、ｅＧＦＰ−ＢＳＲカセットの除去が生じている。非蛍光細胞は９６ウェルディッシュにシングルセルソーティングしてもよく、及び／又はチューブにバルクソーティングして、次に細胞培養ディッシュ（例えば６ｃｍディッシュ）にプレーティングしてもよい。次に細胞が培養下で増殖するときの蛍光に関して細胞をモニタする。蛍光を示さない単細胞クローンを低温貯蔵及びゲノムＤＮＡ単離用に培養下で増殖させる。ＰＣＲによる正しいＣＲＥ−ｌｏｘ組換えイベントの確認は、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳベースのベクターの以下のプライマーを用いて決定する：Ｌｏｘカセットフォワード：
（ＡＧＣＣＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＧＣＡＴＡＧｔｇａａｇｃｃｔｇｃｔｔｔｔｔｔａｔａｃｔａａｃｔｔｇａｇｃｇａａ［配列番号９］）Ｌｏｘカセットリバース：
（ＣＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＡＧＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＧ［配列番号１０］）
４６２ｂｐ産物を示す候補がｅＧＦＰ−ＢＳＲカセットの正しい切出しを示し、一方、１，８１９ｂｐ産物は切出しが起こらなかったことを示す。正しいＰＣＲ産物の候補をＰＣＲによって更に試験して、目的のＤＮＡエレメントの存在を確認する。
【００７１】
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）生合成経路の４つのＡＲＯ遺伝子は、以下の変更を伴い合成する：１）ＡＲＯ１、ＡＲＯ２、ＡＲＯ３遺伝子を終止コドンなしに合成する；２）Ｐ２ＡスペーサをＡＲＯ２遺伝子の上流にコードし、及びグリシン−セリン−グリシンスペーサ＋１５ｂｐのＴ２Ａスペーサを最後のＡＲＯ２アミノ酸コドンの下流にコードする；３）Ｔ２ＡスペーサをＡＲＯ３遺伝子の上流にコードし、及びグリシン−セリン−グリシンスペーサ＋１５ｂｐのＥ２Ａスペーサを最後のＡＲＯ３アミノ酸コドンの下流にコードする；及び４）Ｅ２ＡスペーサをＡＲＯ４遺伝子の上流にコードし、及びポリアデニル化シグナルをＡＲＯ４遺伝子の下流にコードする。ｐＧＬｕｃ−Ｂａｓｉｃ＿２（ＮＥＢ）から新規合成ポリアデニル化部位をコピーした。ＰＣＲプライマーは、線状化ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ送達ベクター骨格へのＩＮ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング用にこれらの４つの合成ＤＮＡエレメント並びにＥＦ１αプロモータ（ｐＥＦ１ｈｒＧＦＰから増幅される）を増幅するように設計する。得られるコンストラクト、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈを図３に示す。（ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈには、以下のエレメントが存在する：ｓｏｐＡ、ｓｏｐＢ、及びｓｏｐＣ＝プラスミド分割タンパク質；ＳＶ４０ｐＡｎ＝ＳＶ４０ポリＡ；ＴＴＳ＝転写終結シグナル；ａｔｔＢ＝部位特異的組換え部位；ｌｏｘ＝部位特異的組換え部位；ｅＧＦＰ＝蛍光タンパク質；Ｂｓｒ＝ブラストサイジン耐性遺伝子；ｒｅｐＥ＝複製開始部位；Ｏｒｉ２＝複製起点；ＣｍＲ＝クロラムフェニコール耐性遺伝子；ポリＡｎ＝ポリＡ；ＥＦ１αＰｒ＝プロモータ；ＡＲＯ１、ＡＲＯ２、ＡＲＯ３、及びＡＲＯ４＝芳香族アミノ酸遺伝子１〜４；Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、及びＥ２Ａ＝自己切断ペプチド）。ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、Ｔｒｐ４及びＴＲＰ５遺伝子が既にロードされた合成染色体を含有する細胞にＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈベクターをトランスフェクトする。
【００７２】
０日目、合成染色体（ｈＳｙｎＣ）を含有する受容細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）を２４ウェルディッシュの１ウェル当たり約４Ｅ４細胞で播種して、ウェルが１日目に約７０％コンフルエントになり、適切な培地（例えば、ＨＴ１０８０についてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ３）中において３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。１日目、製造者の指示に従い（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）、プラス（Ｐｌｕｓ）試薬含有）、送達ベクター（例えば、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈ）及び組換えタンパク質をコードするプラスミド（例えばｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ）の両方をＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションは典型的にはデュプリケートで実施して、薬物選択の比較及び直接的な細胞ソーティングを行うことができるようにする。リポフェクタミンＬＴＸ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ）をオプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）培地に希釈し（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）；トランスフェクトする２４ウェルディッシュの各ウェルにつき１．５μｌ  ＬＴＸ／５０μｌ  オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ））、オプティメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中５０μｌの希釈ＬＴＸに２５０ｎｇ  ＤＮＡ（例えば１２５ｎｇ  ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈプラスミド及び１２５ｎｇ  ｐＣＸＬａｍＩｎｔＲ／ウェル）を加える。各約５０μｌ  ＤＮＡ−ＬＴＸ−オプティメム（Ｏｐｔｉ＿ＭＥＭ）試料に０．２５μｌのプラス（ＰＬＵＳ）試薬を加え、室温で５分間インキュベートする。次に、この５分間のインキュベーション中に、０日目にプレーティングした細胞から培地を取り除き、新鮮培地に交換する。この細胞にＤＮＡ−脂質複合体を加えて、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
【００７３】
２〜２４日目、薬物選択を実施する。デュプリケート２４ウェルのウェルのうちの１つからの細胞をトリプシン処理し、薬物選択（例えば、５μｇ／ｍｌのピューロマイシン又は３μｇ／ｍｌのブラストサイジン）を含む新鮮培地が入った１０ｃｍディッシュに移す。次に細胞を適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、コロニー形成に関してモニタする。培地は約７２時間毎に交換する。個別コロニーが形成されたら（約１０日）、各コロニーをガラスシリンダによって単離し、トリプシン処理して、２４ウェルディッシュのウェルに移す。次に、クローンを低温貯蔵下に置いてＰＣＲ分析用のゲノムＤＮＡを単離するのに十分な細胞が利用可能になるまで、これらの「クローン」を培養下で増殖させる（約２週間；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウィザードＳＶ（Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ）ゲノムＤＮＡ精製）。
【００７４】
或いは、デュプリケートウェルの細胞をトリプシン処理して、薬物選択を含まない新鮮培地が入った６ｃｍディッシュに置き、適切な培地中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートしてもよい。３又は４日目、６ｃｍディッシュの細胞をトリプシン処理し、セルソータにかけることにより、ベクターが組み込まれた、且つ標的ベクター上の蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈ）を発現する蛍光細胞をシングルセルソーティングする。目的の遺伝子／ＤＮＡエレメントを含有する送達ベクターの組込みは、適切なＰＣＲプライマーを使用した合成染色体と送達ベクター（ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈ）との間の組換え部位にわたるユニークなＰＣＲ産物の産生によって同定される。試験ゲノムＤＮＡ試料と併せて、水と宿主ゲノムＤＮＡ（例えばＨＴ１０８０）との陰性対照ＰＣＲ反応を実施する。ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈ送達ベクター組込みからのユニークなジャンクションＰＣＲ産物の増幅に使用するＰＣＲプライマーは、ジャンクション１−予想産物サイズ４０１ｂｐ（ｇｃｇｃｔａａｔｇｃｔｃｔｇｔｔａｃａｇｇｔ［配列番号７］及びＧＧＡＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧ［配列番号８］）である。正しいジャンクションＰＣＲ産物サイズの候補クローンの同定後、更なるＰＣＲ反応を実施して、当初送達ベクターにロードされた（ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＴＲＰ３、Ｔｒｐ４及びＴＲＰ５遺伝子）、現在合成染色体上にある（例えば、ＡＲＯ１、ＡＲＯ２、ＡＲＯ３及びＡＲＯ４）目的のＤＮＡエレメントの存在が確認される。２回目のジャンクションＰＣＲは、合成染色体への２回目のローディングでもはやユニークでないことに留意されたい：ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈとＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＴｒｐＰａｔｈとの両方のターゲット組込みイベントによって共有されるジャンクション−予想産物サイズ３９２ｂｐ（ａｃｃｇａｇｃｔｇｃａａｇａａｃｔｃｔｔｃｃｔｃ［配列番号５］及びｃｔｃｇｃｃｇｃａｇｃｃｇｔｇｔａａ［配列番号６］）。加えて、コリスミ酸産生に関する試験が実施される。これは幾つもの方法で決定することができる。例えば、細胞が、アミノ酸トリプトファンを含まない細胞培養培地で成長する能力及びトリプトファンを含有する細胞培養培地で成長する細胞と比較した成長に関して試験されてもよい。これらの細胞はここでトリプトファン及び芳香族アミノ酸生合成経路の両方を有する。後者の経路は前者の経路によるトリプトファン産生のためのコリスミ酸基質を産生するはずである。別のトリプトファン合成試験は、ブリッジ・イット（Ｂｒｉｄｇｅ−ｉｔ）Ｌ−トリプトファン蛍光アッセイキット（メディオミクス社（Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓ，ＬＬＣ））で溶解細胞ペレット中のトリプトファンレベルをアッセイすることであり得る。トリプトファンレベルは、トリプトファンを担持する独立した培養物に関してトリプリケートで測定され、ＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ＿ＡｒｏＰａｔｈを含有する合成染色体を有しない細胞の培養物並びにＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ−ＡｒｏＰａｔｈ及びＢＬｏＶｅＬ−ＴＳＳ−ＴｒｐＰａｔｈの両方の組込みイベントを欠く培養物と比較される。
【００７５】
上記は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載又は図示されないものの本発明の原理を具体化し、且つその趣旨及び範囲内に含まれる様々な変形例を考案可能であることが理解されるであろう。更に、本明細書に記載される例及び条件付きの文言は全て、主として、本発明の原理及び本発明者らが当該技術分野の拡大に寄与する概念についての読者の理解の助けとなることを意図し、かかる具体的に記載される例及び条件に限定されないものと解釈されなければならない。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態並びにその具体的な例を記載する本明細書における記述は全て、その構造的均等物及び機能的均等物の両方を包含することが意図される。加えて、かかる均等物は、現在公知の均等物、及び将来開発される均等物、即ち構造に関わらず同じ機能を果たす開発される任意の要素の両方を含むことが意図される。従って本発明の範囲が、本明細書に図示及び記載される例示的実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって具体化される。以下の特許請求の範囲においては、用語「手段」が使用されない限り、そこに記載されるいかなる特徴又は要素も、米国特許法第１１２条第１６段落に準ずるミーンズ・プラス・ファンクション限定と解釈されてはならない。
【図１】
2019511235.tif 000005
【図２】
2019511235.tif 000006
【図３】
2019511235.tif 000007
【配列表】
2019511235000001.app
【国際調査報告】
2019511235.tif 000008