(57)【要約】  本発明は、組換えカプシド−ディスプレイアデノウイルスベクターに基づく、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染に対する新規なワクチンに関する。マイナーカプシドタンパク質ＩＸを介して複数のＨＰＶ  Ｌ２抗原断片をコード及び表示するカプシド改変複製欠損アデノウイルス粒子、及び複数のＨＰＶタイプによる感染に対する防御を提供するために、免疫応答を誘発するためのそれらの使用が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に融合されたカプシドタンパク質ＩＸを含む組換えアデノウイルスベクターであって、前記抗原が連続する３〜５個のアミノ酸モチーフを含み、各モチーフが約２０〜約４０アミノ酸長であり、各モチーフが、異なるＨＰＶタイプ由来のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の抗原断片を含む、組換えアデノウイルスベクター。
【請求項２】
少なくとも１つのモチーフが、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む抗原断片を含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項３】
前記ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のタイプが、ＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５２、５６、５８、６８、７３及び８２からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項４】
前記抗原が連続する３個のアミノ酸モチーフを含み、前記モチーフが、それぞれ前記ＨＰＶタイプ４５、１８及び１６のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項５】
前記抗原が配列番号１を含む、請求項４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
前記抗原が連続する４個のアミノ酸モチーフを含み、前記モチーフが、それぞれ前記ＨＰＶタイプ３１、４５、１８及び１６；それぞれ３３、４５、１８及び１６；それぞれ６、３１、３３及び１６、又はそれぞれ１１、５２／５８、４５及び１８のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記抗原が、配列番号２、配列番号３、配列番号６又は配列番号７を含む、請求項６に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記抗原が連続する５個のアミノ酸モチーフを含み、前記モチーフが、それぞれ前記ＨＰＶタイプ３３、３１、４５、１８及び１６又はそれぞれ５２、３１、４５、１８及び１６のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記抗原が、配列番号４又は配列番号５を含む、請求項８に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前記アミノ酸モチーフが約３０アミノ酸残基を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
各モチーフが、前記ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の約１０〜約４０アミノ酸残基を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
前記抗原が連続する４個のアミノ酸モチーフを含み、第１のモチーフが前記ＨＰＶタイプ３１のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含み、第２のモチーフがＨＰＶ  Ｌ２タイプ４５タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１を含み、第３のモチーフがＨＰＶ  Ｌ２タイプ１８タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含み、第４のモチーフがＨＰＶ  Ｌ２タイプ１６タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
前記抗原が配列番号８を含む、請求項１２に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
ｐＩＸタンパク質及び前記抗原が、リンカー又はスペーサーによって互いに連結されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
前記リンカーが、グリシンの連続する３個のフレキシブルな残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
前記ベクターが、ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９、ＨＡｄＶ５０、非ヒト霊長類ベクター及びキメラベクターからなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
前記アデノウイルスベクターがＨＡｄＶ２６又はＨＡｄＶ３５である、請求項１４に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
前記ベクターが更に、導入遺伝子としての１つ以上の異種タンパク質をコードする核酸を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１９】
少なくとも２つの、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の異なる組換えアデノウイルスベクターの組み合わせを含む組成物。
【請求項２０】
２つの、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを含む組成物であって、前記第１のベクターの前記抗原断片が配列番号６を含み、前記第２のベクターの前記抗原断片が配列番号７を含む、組成物。
【請求項２１】
更に薬学的に許容され得る賦形剤を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター又は請求項１９若しくは２０に記載の組成物を含むワクチン。
【請求項２２】
対象における免疫応答の誘導方法であって、請求項２１に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチンの分野に関する。より詳細には、本発明は、そのマイナーカプシドタンパク質ＩＸ上でＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の複数の抗原断片を表示する、組換えにより生成されたカプシド−ディスプレイアデノウイルスベクターの使用に関し、前記ベクターは、ＨＰＶ感染に対するワクチンの開発のためのＨＰＶ抗原決定基の担体として使用される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、女性の子宮頸癌の原因として知られるが、陰茎、肛門、外陰、膣及び中咽頭癌の原因でもあり得る（Ｆｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ）。２つの予防的ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）ベースのワクチンは、発癌の危険性が高いＨＰＶ  １６及び１８タイプによる感染を予防することが示されている（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ）。これらの１つは、ＨＰＶ  ６及び１１タイプに対する防御も提供する（Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ）。
【０００３】
これらのワクチンは、世界中で子宮頸癌のケースのおよそ７０％の原因となるＨＰＶ  １６及び１８感染の予防に非常に有効であるが、１３の他のＨＰＶタイプも同様に発癌性として知られている。重要度が高い順に、遺伝子型ＨＰＶ  ４５、ＨＰＶ  ３１、ＨＰＶ  ３３、ＨＰＶ  ５２、ＨＰＶ  ５８、ＨＰＶ  ３５、ＨＰＶ  ５６、ＨＰＶ  ５１、ＨＰＶ  ３９、ＨＰＶ  ６８、ＨＰＶ  ７３及びＨＰＶ  ８２は、世界中で報告されている子宮頸癌のケースの残りの３０％の原因となる（Ｈａｎｎａ  Ｓｅｉｔｚ，２０１４））。比較的低頻度のＨＰＶタイプに対する防御を確実にするために、９価Ｌ１  ＶＬＰベースワクチンが開発されており、該ワクチンは、ＨＰＶ  ６、１１、１６及び１８に加えてＨＰＶタイプ３１、３３、４５、５２及び５８に対する防御の提供も目的としている（Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。言及した遺伝子型による感染を効果的に予防するにも関わらず、Ｌ１  ＶＬＰベースのワクチンは、限られた交差防御を提供し、またその製造は非常に高価である。このことが、該ワクチンの地球規模の実施、特にＨＰＶの８０％のケースが発生する発展途上世界での実施を妨げている（Ｐａｒｋｉｎ＆Ｂｒａｙ，２００６；Ｓｃｈｉｌｌｅｒ＆Ｌｏｗｙ，２０１２）。従って、多数のＨＰＶタイプに対して防御的な免疫原性ワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、抗原に融合されたカプシドタンパク質ＩＸを含む組換えアデノウイルスベクターに関し、前記抗原は、連続する３〜５個のアミノ酸モチーフを含み、各モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸長であり、各モチーフは、異なるＨＰＶタイプ由来のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の抗原断片を含む。好ましくは、前記モチーフの少なくとも１つは、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む抗原断片を含む。ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質は、任意のＨＰＶタイプに由来し得る。より好ましくは、前記ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質タイプは、ＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５２、５６、５８、６８、７３及び８２からなる群から選択される。
【０００５】
本発明の好ましい実施形態では、前記抗原は、連続する３個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、それぞれＨＰＶタイプ４５、１８及び１６のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む。好ましくは、前記抗原は、配列番号１を含む。
【０００６】
より好ましい実施形態では、前記抗原は、連続する４個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、それぞれＨＰＶタイプ３１、４５、１８及び１６；それぞれ３３、４５、１８及び１６；それぞれ６、３１、３３及び１６、又はそれぞれ１１、５２／５８、４５及び１８のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む（ＨＰＶタイプ５２及び５８のＬ２タンパク質は、選択された１０〜４０アミノ酸において同一である）。好ましくは、前記抗原は、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号６又は配列番号７を含む。本発明の別の好ましい実施形態では、前記抗原は、連続する５個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、それぞれＨＰＶタイプ３３、３１、４５、１８及び１６、又はそれぞれ５２、３１、４５、１８及び１６のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の１７〜３６アミノ酸残基を含む。好ましくは、前記抗原は、それぞれ配列番号４又は配列番号５を含む。
【０００７】
好ましくは、前記アミノ酸モチーフは、約３０アミノ酸残基を含む。本発明の好ましい実施形態では、各モチーフは、前記ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の約１０〜約４０アミノ酸残基を含む。本発明の別の実施形態では、３〜５アミノ酸モチーフの１つは、アミノ酸残基１７〜３６の代わりに、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１、又はＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む。本発明の別の実施形態では、３〜５アミノ酸モチーフの１つは、アミノ酸残基１７〜３６の代わりに、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１を含み、３〜５アミノ酸モチーフの１つは、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む。
【０００８】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記抗原は、連続する４個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフのそれぞれは約２０〜約４０アミノ酸長を有し、前記第１のモチーフはＨＰＶ  Ｌ２タイプ３１タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含み、前記第２のモチーフはＨＰＶ  Ｌ２タイプ４５タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１を含み、前記第３のモチーフはＨＰＶ  Ｌ２タイプ１８タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含み、前記第４のモチーフはＨＰＶ  Ｌ２タイプ１６タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む。好ましくは、前記アミノ酸モチーフは、約３０アミノ酸残基を含む。より好ましくは、前記抗原は、配列番号８を含む。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、ｐＩＸタンパク質及び抗原は、リンカー又はスペーサーによって互いに連結されている。別の好ましい実施形態では、リンカーは、グリシン及び／又はセリンの連続する２〜１５個のフレキシブルな残基を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態では、リンカーは、グリシンの連続する３個のフレキシブルな残基（ＧＧＧ）を有するアミノ酸配列を含む。更なる別の好ましい実施形態では、スペーサーは、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本発明のより好ましい実施形態では、前記アデノウイルスベクターは：ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９、ＨＡｄＶ５０、非ヒト霊長類ベクター及びキメラベクターからなる群から選択される。好ましくは、組換えアデノウイルスベクターは、ＨＡｄＶ２６又はＨＡｄＶ３５である。
【００１１】
別の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスベクターは更に、導入遺伝子としての１つ以上の異種タンパク質をコードする核酸を含む。好ましくは、前記核酸は、アデノウイルスのＥ１領域内に位置する。
【００１２】
本発明の別の態様は、少なくとも２つの異なる本発明による組換えアデノウイルスベクターの組み合わせを含む組成物に関する。好ましい実施形態では、前記組成物は、抗原が配列番号６を含む第１の組換えアデノウイルスベクターと、抗原が配列番号７を含む第２の組換えアデノウイルスベクターとを含む。
【００１３】
本発明の別の態様は、更に薬学的に許容され得る賦形剤を含む、本発明による組換えアデノウイルスベクター又は組成物を含むワクチンに関する。
【００１４】
更に、本発明は、ＨＰＶの治療的、予防的又は診断的処置における、本発明によるワクチンの使用に関する。本発明はまた、本明細書で上述したアデノウイルスベクター又はワクチンを投与することを含む、対象における免疫応答の誘導方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】Ｌ２抗原及びベクター設計。（Ａ）ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質（Ｎ及びＣ末端）及びその高く保存された線状ＱＬＹ＋ＴＣＫＱＡＧＴＣＰＰＤ（＋は、ヒトＨＰＶタイプ間で可変のアミノ酸である）１７〜３６アミノ酸（ａ．ａ．）（配列番号１４）、ＲＴＧＹＩＰＬＧＴＲＰＰＴ  ６９〜８１ａ．ａ．（配列番号１５）及びＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ  １０８〜１２０ａ．ａ．（配列番号１６）中和抗体（ｎＡｂ）エピトープの概略図。２つの異なるＨＰＶ  Ｌ２抗原断片、１０〜４０ａ．ａ．（１７〜３６ａ．ａ．ｎＡｂエピトープを含む）のみならず、６０〜９０ａ．ａ．及び１００〜１３０ａ．ａ．（６９〜８１ａ．ａ．又は１０８〜１２０ａ．ａ．ｎＡｂエピトープを含む）も含む（Ｓ）−設計、又は１０〜８９ａ．ａ．（１７〜３６ａ．ａ．及び６９〜８１ａ．ａ．ｎＡｂエピトープを含む）を含む（Ｌ）−設計を、タンパク質ＩＸに遺伝的に融合して、ｐＩＸ−Ｌ２カプシドディスプレイアデノウイルスベクターを生成した。（Ｂ）‘空’Ｅ１カセット（ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリＡシグナル）及び天然タンパク質ＩＸプロモーター（Ｐ）を有するヒトアデノウイルス３５（ＨＡｄＶ３５）ｐＩＸ−Ｌ２カプシドディスプレイベクター。３ａ．ａ．グリシンリンカー（ｇｌｙ）を介してｐＩＸに融合した、ＨＰＶタイプ１６、１８及び４５（Ｓｘ３）、（Ｓｘ３）ｘ３の（Ｓ）設計１０〜４０ａ．ａ．コンカテマー（即ち、反復）、（Ｌ）設計１０〜８９ａ．ａ．コンカテマー（Ｌｘ３）、又は（Ｓ）及び（Ｌ）設計（Ｓｘ２＋Ｌ）の組み合わせを遺伝子コードするＨＡｄＶ３５ベクターの概略図。（Ｃ）‘空’Ｅ１カセット（ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリＡシグナル）及び天然タンパク質ＩＸプロモーター（Ｐ）を有するヒトアデノウイルス２６（ＨＡｄＶ２６）ｐＩＸ−Ｌ２カプシドディスプレイベクター。３ａ．ａ．グリシンリンカー（ｇｌｙ）を介してタンパク質ＩＸに融合した異なるＨＰＶタイプの（Ｓ）設計１０〜４０ａ．ａ．ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質コンカテマーを遺伝子コードするＨＡｄＶ２６ベクターの概略図。ＨＡｄＶ２６  Ｓｘ３ベクターは、ＨＰＶタイプ１６、１８及び４５の１０〜４０ａ．ａ．を含み、Ｓｘ４ベクターは、ＨＰＶタイプ１６、１８、３３及び４５又は１６、１８、３１及び４５のいずれかを含み、Ｓｘ５ベクターは、ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３及び４５又は１６、１８、３１、４５及び（５２）５８のいずれかを含み、Ｓｘ６ベクターは、ＨＰＶタイプ１６、１８、３１、３３、４５及び５２（５８）を含む。ＨＰＶタイプ５２及び５８の配列は、１０〜４０ａ．ａ．ＨＰＶ  Ｌ２領域内で同一である。（Ｄ）（Ｓ）３ａ．ａ．グリシンリンカー（ｇｌｙ）を介してタンパク質ＩＸに融合した４つの異なるＨＰＶタイプ６、１６、３１、３３又は１１、１８、４５及び（５２）５８の設計１０〜４０ａ．ａ．ＨＰＶ  Ｌ２コンカテマーを遺伝子コードするＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−Ｌ２ディスプレイベクターの概略図。２つの異なるＳｘ４ベクターは、両方とも‘空’Ｅ１カセット（ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリＡシグナル）及び天然タンパク質ＩＸプロモーター（Ｐ）を含む。
【図１Ｂ】（上記の通り。）
【図１Ｃ】（上記の通り。）
【図１Ｄ】（上記の通り。）
【図２Ａ】ＨＰＶ  Ｌ２（Ｓｘ３）設計のカプシド取り込み。（Ａ）ｐＩＸ−Ｓｘ３カプシド取り込みをウェスタンブロットによって決定した。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）精製ベクター製剤（３つの異なる濃度：１．５ｘ１０１０、１ｘ１０１０及び０．１７ｘ１０１０  ＶＰ／ウェルの）の３つの異なるバッチを、ゲル上で分離し、ブロットし、抗ｐＩＸ（６７４０）モノクローナル抗体（ｐＩＸ−Ｓｘ３、２５ｋＤａ）及びローディングコントロール（３５ｋＤａ）としての抗ファイバー抗体（ＨＡｄＶファイバーノブ、４Ｄ２）で染色した。（Ｂ）ＲＰ−ＵＰＬＣ分析によって決定したｐＩＸ−Ｓｘ３カプシド取り込み。精製ＨＡｄＶ３５．空（非改変タンパク質ＩＸ）及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｓｘ３（２．５ｘ１０１１  ＶＰ）をＣ４カラム（ＡＣＮ＋０．１７％  ＴＦＡ勾配）に負荷し、ＯＤ２８０吸収単位（ＡＵ）にて測定した。精製ＨＡｄＶ３５．空非改変ｐＩＸ対照（上部パネル）ベクター及びＨＡｄＶ３５  Ｓｘ３  ｐＩＸ−Ｌ２  ４５．１８．１６（下部パネル）のＲＰ−ＵＰＬＣプロテオーム分析。検出したウイルスタンパク質を、それらの溶出時間（ｘ軸）（分における）及びＯＤ２８０吸収単位（ＡＵ）（ｙ軸）に従って、ローマ数字（ＩＩ〜Ｘ）により示す。２つの矢印（数字１及び２）は、対照ＨＡｄＶ３５．空ベクターで検出されなかったピークを示す。
【図２Ｂ】（上記の通り。）
【図３Ａ】ＨＰＶ  Ｌ２（Ｓｘ４）設計のカプシド取り込み。（Ａ）ｐＩＸ−Ｓｘ４カプシド取り込みをウェスタンブロットによって決定した。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６の精製ベクター製剤におけるｐＩＸ−Ｓｘ４のレベルを、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６の精製製剤におけるｐＩＸ−Ｓｘ３のレベルと比較した。３つの異なる濃度：１．５ｘ１０１０、１ｘ１０１０及び０．１７ｘ１０１０  ＶＰ／ウェルのＳｘ４及びＳｘ３  ｐＩＸ改変ベクターをゲル上で分離し、ブロットし、抗Ｌ２血清（ｐＩＸ−Ｓｘ３：２５ｋＤａ、ｐＩＸ−Ｓｘ４：２８ｋＤａ）（ＨＰＶ  １６陽性マウス血清）及びローディングコントロール抗ファイバーモノクローナル抗体（ＨＡｄＶ５ファイバーノブ、４Ｄ２、３５ｋＤａ）で染色した。ＨＡｄＶ３５．空を非改変ｐＩＸ  Ｌ２陰性対照として使用した。（Ｂ）ｐＩＸ−Ｓｘ４（ミックス）ＨＰＶエピトープカプシド取り込みをウェスタンブロットによって決定した。ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４．ミックス）３１，４５．１８．１６の精製ベクター製剤におけるｐＩＸ−Ｓｘ４−ミックスのレベルを、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６の精製製剤におけるＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）３３．４５．１８．１６及びｐＩＸ−Ｓｘ３と比較した。３つの異なる濃度：１．５ｘ１０１０、１ｘ１０１０及び０．１７ｘ１０１０  ＶＰ／ウェルのＳｘ４及びＳｘ３  ｐＩＸ改変ベクターをゲル上で分離し、ブロットし、抗Ｌ２血清（ｐＩＸ−Ｓｘ３：２５ｋＤａ、ｐＩＸ−Ｓｘ４：２８ｋＤａ）（ＨＰＶ  １６陽性マウス血清）及びローディングコントロール抗ファイバーモノクローナル抗体（ＨＡｄＶ５ファイバーノブ、４Ｄ２、３５ｋＤａ）で染色した。ＨＡｄＶ２６．空を非改変ｐＩＸ  Ｌ２陰性対照として使用した。
【図３Ｂ】（上記の通り。）
【図４Ａ】マウスにおけるＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６（Ｓｘ３）ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６及びｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８（Ｓｘ４）ベクターに対する液性応答。（Ａ）免疫化スケジュールの概略図。８匹のＣＢ６Ｆ１マウス（ｎ＝８）の４つのグループを、１ｘ１０１０  ＶＰのＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８又はＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６＆ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８のミックスのそれぞれで刺激した。負の対照として、ＨＡｄＶ３５．空ベクター（ｎ＝３、１ｘ１０１０  ＶＰ）を第５のグループに投与した。８週後、同じベクター（同じ濃度の）でマウスを追加免疫し、これは刺激免疫化の間に投与された。４週後、追加免疫マウスを犠牲にした（１２週目）。マウスの血清を、ＨＰＶ  ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡにおけるＨＰＶタイプ特異的抗体応答分析のために２週間隔で収集した（＊）。（Ｂ）ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによって測定した９つの異なるＨＰＶタイプ（６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２／５８及び５９）に対する８週目及び１２週目における血清中の抗体応答。それぞれのベクター又はベクターミックスで誘導したＨＰＶタイプ特異的応答を、グラフにプロットする（ｌｏｇ１０）。点線は、最小及び最大ｌｏｇ１０  ＥＬＩＳＡ力価を示す。ボンフェローニ補正及び試験を、５％有意レベル（＜０．０５）にて行った。（Ｃ）発光Ｌｏｇ１０表現にて表示したＨＰＶ  １６、１８、３１及び５９のインビトロでのシュードビリオンウイルス（ＰｓＶ）中和アッセイ（ＶＮＡ）。１ｘ１０１０  ＶＰ／マウス  ＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１６、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１８及びｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１６  ＆  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１８のミックスで免疫化したマウスの血清を、インビトロＰｓＶウイルス中和アッセイにて分析した。ＨＰＶ  １６及び１８に関する正の中和対照として、４価ガーダシル（ＨＰＶ  ６、１１、１６、１８）免疫化マウスの血清を共に使用する。発光の正の対照として、それぞれのＨＰＶシュードビリオンを共に使用する。横線は、グループの平均を示す。各グラフ内の点線は、フューリンなしでのＰｓＶｓの平均を示す。３倍ボンフェローニ補正を用いてＰ値を調整し、試験は５％有意レベル（＜０．０５）で行った。
【図４Ｂ】（上記の通り。）
【図４Ｃ】（上記の通り。）
【図５Ａ】ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞におけるｐＩＸ−Ｌ２ディスプレイベクターの遺伝的安定性。（Ａ）ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞における延長された継代後のウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析による小規模遺伝的安定性試験の概略図。ウイルス継代数（ＶＰＮ）１４は、想定される商業規模プロセスを４継代超えた継代を表す。バッチ又はプラークを接着ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（ａｄＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）内でおよそ７ＶＰＮまでアップスケール／継代する。次いで、１ｘ１０６生細胞／ｍｌ（ｖｃ／ｍｌ）を３５（ＨＡｄＶ３５）又は９００（ＨＡｄＶ２６）ＶＰ／細胞のいずれかで感染させることにより、制御条件下で継代を縣濁液ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（ｓＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）内で更に７ＶＰＮ継続する。各ＶＰＮにおいて粗材料に関して感染前にＶＰ力価をウイルス粒子定量ＰＣＲ（ＶＰ−ＱＰＣＲ）によって決定した。ウイルスＤＮＡを単離し、ＨＡｄＶゲノム内のｐＩＸ−改変領域に隣接するプライマーを用いてｐＩＸ−ＰＣＲを行い、配列決定により確認する。（Ｂ）ＶＰＮ１４におけるＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６ベクターのそれぞれの５つのプラーク（１〜５）のｐＩＸ−ＰＣＲのアガロースゲル分析。＋は、正のプラスミド対照（９４２ｂｐ）を指し、（−）は、非改変ｐＩＸプラスミド対照（５７０ｂｐ）を指し、Ｈ２０は、ＰＣＲ水対照を指す。Ｍは、分子量マーカーを表す。星印は、ｐＩＸ−ＰＣＲで検出された非特異的バンドを示す。
【図５Ｂ】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、抗原に融合されたカプシドタンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）を含む組換えアデノウイルスベクターに関し、前記抗原は連続する３〜５個のアミノ酸モチーフを含み、各モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸長であり、各モチーフは、異なるＨＰＶタイプ由来のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の抗原断片を含む。好ましくは、前記モチーフの少なくとも１つは、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む抗原断片を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、抗原は、連続する３、４、又は５個のアミノ酸モチーフを含む。アミノ酸モチーフは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又は４１アミノ酸の長さを有することができる。本明細書で使用される用語「モチーフ」は、構造的及び通常は機能的な類似性を共有する、アミノ酸の短いクラスターを意味する。本発明に関して定義されるアミノ酸モチーフは、例えば、非限定的に、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６、アミノ酸残基６９〜８１及びアミノ酸残基１０８〜１２１等の、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の抗原（アミノ酸）断片を含む、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質由来のアミノ酸部分である。
【００１８】
本明細書で使用される用語「組換え」は、人為的に改変されていることを意味し、例えば、その中にクローン化された改変末端を有し、及び／又は、異種遺伝子を含み、即ち、天然に存在する野生型アデノウイルスではない。異種遺伝子は、該遺伝子がアデノウイルス上に天然に存在せず、即ち、該遺伝子がアデノウイルス遺伝子ではないことを意味する。
【００１９】
本発明による組換えアデノウイルスベクターは、以前に定義した抗原（又はポリペプチド）に融合したアデノウイルスカプシドタンパク質ＩＸを含むアデノウイルスベクターである。抗原は、アデノウイルスカプシドタンパク質ＩＸを用いて、アデノウイルスベクターの表面において、マイナーカプシドタンパク質ＩＸ上に表示される。抗原は、マイナーカプシドタンパク質ＩＸのＣ末端に融合される。ｐＩＸの抗原との融合は、確立した分子技術を用いてアデノウイルスゲノム内の２つの遺伝子を遺伝子融合することにより行われる。
【００２０】
タンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）という用語は、正二十面体アデノウイルスカプシドを安定化する主な機能を有するマイナーカプシドタンパク質を指す（Ｒｏｓａ−Ｃａｌａｔｒａｖａ，Ｇｒａｖｅ，Ｐｕｖｉｏｎ−Ｄｕｔｉｌｌｅｕｌ，Ｃｈａｔｔｏｎ，＆Ｋｅｄｉｎｇｅｒ，２００１）。
【００２１】
ｐＩＸは、アデノウイルスタイプ特異的であり、各アデノウイルスタイプは、異なるカプシドｐＩＸを有し、即ち、アデノウイルス３５（ＨＡｄＶ３５）のｐＩＸは、アミノ酸配列  配列番号１２を含み；一方、アデノウイルス２６（ＨＡｄＶ２６）のｐＩＸは、アミノ酸配列  配列番号１３を含む。
【００２２】
「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型及び／又は指向性の決定に関与する、アデノウイルスのカプシド上のタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、典型的にはファイバー、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含む。本発明による特定の血清型の（又は「血清型に基づく」アデノウイルスは、典型的には、特定の血清型のファイバー、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含み、好ましくは特定の血清型のファイバー、ペントン及びヘキソンタンパク質を含む。これらのタンパク質は、典型的には、組換えアデノウイルスのゲノムによりコードされている。特定の血清型の組換えアデノウイルスは、場合により他のアデノウイルス血清型由来の他のタンパク質を含み及び／又はコードし得る。従って、非限定的な例として、ＨＡｄＶ３５のヘキソン、ペントン及びファイバーを含む組換えアデノウイルスは、ＨＡｄＶ３５に基づく組換えアデノウイルスと見なされる。
【００２３】
ＨＰＶマイナーＬ２タンパク質は、カプシド形成に関与する後期タンパク質である。Ｌ２タンパク質は、ＨＰＶ感染に必要である。Ｌ２タンパク質は、その高く保存されたＮ末端領域を用いてウイルス受容体に結合する（Ｒｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。Ｌ２  Ｎ末端ペプチドを用いた免疫化は、異なる動物モデルにおいて（交差）防御中和抗体を誘導することが示されている（Ｋａｒａｎａｍ，Ｊａｇｕ，Ｈｕｈ，＆Ｒｏｄｅｎ，２００９）。Ｌ２  Ｎ末端（ポリ）ペプチドを用いた免疫化後の観察された防御は、主として、この領域内に特定された高く保存された中和及びおそらく結合エピトープに起因する。Ｎ末端領域内の特定されたＬ２中和抗体（ｎＡｂｓ）エピトープは、高く保存されたａ．ａ．残基１７〜３６、ａ．ａ．残基６９〜８１及びａ．ａ．残基１０８〜１２０を含む（Ｋａｒａｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００２４】
本発明によれば、ＨＰＶマイナーＬ２タンパク質は、任意のＨＰＶタイプに由来してもよい。Ｌ２タンパク質は、好ましくはＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８、４５、３１、３３、３５、５２、５８、３５、５６、５１、３９、６８、７３又は８２遺伝子型からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、ｐＩＸに融合された抗原は、連続する３個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、それぞれＨＰＶタイプ４５、１８及び１６のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む。好ましくは、前記抗原断片は、配列番号１を含む。
【００２６】
より好ましい実施形態では、前記抗原は、連続する４個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、それぞれＨＰＶタイプ３１、４５、１８及び１６；それぞれ３３、４５、１８及び１６；それぞれ６、３１、３３及び１６、又はそれぞれ１１、５２／５８、４５及び１８のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含む。好ましくは、前記抗原は、それぞれ配列番号２、配列番号３、配列番号６又は配列番号７を含む。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記抗原は、連続する５個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフは、約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、それぞれＨＰＶタイプ３３、３１、４５、１８及び１６又はそれぞれ５２、３１、４５、１８及び１６のＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の１７〜３６アミノ酸残基を含む。好ましくは、前記抗原は、それぞれ配列番号４又は配列番号５を含む。
【００２８】
好ましくは、前記アミノ酸モチーフは、約３０アミノ酸残基を含む。本発明の好ましい実施形態では、各モチーフは、前記ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の約１０〜約４０アミノ酸残基を含む。本発明の別の実施形態では、３〜５アミノ酸モチーフの１つは、アミノ酸残基１７〜３６の代わりに、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１、又はＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む。本発明の別の実施形態では、３〜５アミノ酸モチーフの１つは、アミノ酸残基１７〜３６の代わりに、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１を含み、３〜５アミノ酸モチーフの１つは、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態では、前記抗原は連続する４個のアミノ酸モチーフを含み、該モチーフのそれぞれは約２０〜約４０アミノ酸の長さを有し、前記第１のモチーフはＨＰＶ  Ｌ２タイプ３１タンパク質のアミノ酸残基１７〜３６を含み、前記第２のモチーフは、ＨＰＶ  Ｌ２タイプ４５タンパク質のアミノ酸残基６９〜８１を含み、前記第３のモチーフは、ＨＰＶ  Ｌ２タイプ１８タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含み、前記第４のモチーフは、ＨＰＶ  Ｌ２タイプ１６タンパク質のアミノ酸残基１０８〜１２１を含む。好ましくは、前記アミノ酸モチーフは、約３０アミノ酸残基を含む。より好ましくは、前記抗原は、配列番号８を含む。
【００３０】
用語「リンカー」及び「スペーサー」は、タンパク質ドメイン間、例えば抗原とｐＩＸとの間に配置され得る短いペプチド配列を指す。リンカーは、異なるサイズ範囲のグリシン（ｇｌｙ）及び／又はセリン等のフレキシブルな残基から構成され、異なるドメインの互いに対する自由な移動を確実にする。リンカーの例としては、３−Ｇｌｙ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）及び中間リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）ｘ２が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による好ましい一実施形態では、グリシンリンカーは、連続する２〜１５個のグリシン及び／又はセリン残基を有するアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、リンカーは、グリシンの連続する３個のフレキシブルな残基を有するアミノ酸配列を含む。
【００３１】
本発明では数個のスペーサー、即ち、ヒトＡｐｏＥ４タンパク質起源のＡｐｏＥ４タンパク質α−ヘリカル４５Åスペーサー（Ｖｅｌｌｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）；スペーサー１（ＳＰ１）、ＲＳＶ融合タンパク質；スペーサー２（ＳＰ２）、インフルエンザＡ  ＨＡ；スペーサー３（ＳＰ３）、流行性耳下腺炎融合タンパク質も使用することができる。ＳＰ１〜ＳＰ３スペーサーは、ウイルス起源であり、それぞれアミノ配列配列番号９、配列番号１０、配列番号１１を含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、組換えアデノウイルスは、少なくとも配列において野生型から誘導することにより、アデノウイルスに「基づいている」。該誘導は、出発物質として野生型ゲノム又はその一部を使用した分子クローニングにより達成することができる。野生型アデノウイルスゲノムの既知の配列を使用して、デノボＤＮＡ合成によりゲノム（その一部）を生成することも可能であり、該合成は、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野を手掛けているサービス会社（例えばＧｅｎｅＡｒｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、日常的な手順を用いて行うことができる。
【００３３】
本発明の組換えアデノウイルスは、好ましくは：ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ５、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９及びＡｄ５０からなる群から選択される血清型由来のアデノウイルスに基づく。好ましくは、前記血清型は、ＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９及びＨＡｄＶ５０の群から選択される。本発明に適した他の可能なタイプのアデノウイルスには、非限定的に：イヌアデノウイルス、チンパンジーアデノウイルス、ゴリラアデノウイルス及びキメラアデノウイルスが含まれる。より好ましくは、本発明による組換えアデノウイルスベクターは、ＨＡｄＶ２６又はＨＡｄＶ３５である。
【００３４】
本発明の別の態様は、少なくとも２つの異なる本発明による組換えアデノウイルスベクターの組み合わせを含む組成物に関する。好ましい実施形態では、前記組成物は、抗原が配列番号６を含む第１の組換えアデノウイルスベクターと、抗原が配列番号７を含む第２の組換えアデノウイルスベクターとを含む。両方のアデノウイルスベクターは、同じ血清型に由来し又は異なる血清型に由来し得る。好ましくは、組換えアデノウイルスベクターは、両方とも、血清型ＨＡｄＶ２６又はＨＡｄＶ３５に由来するアデノウイルスに基づいている。
【００３５】
より好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも２つの異なる組換えＨＡｄＶ３５アデノウイルスベクターの組み合わせを含み、第１の組換えアデノウイルスベクターは、配列番号６を含む抗原断片を含み、第２の組換えアデノウイルスベクターは、配列番号７を含む抗原断片を含む。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、組成物は、少なくとも２つの異なる組換えＨＡｄＶ２６アデノウイルスベクターの組み合わせを含み、第１の組換えアデノウイルスベクターは、配列番号６を含む抗原を含み、第２の組換えアデノウイルスベクターは、配列番号７を含む抗原を含む。本明細書の配列は、当技術分野で慣習的なように、５’から３’の方向に提供されている。
【００３７】
本発明による複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、異種抗原（又はポリペプチド）をコードする異種核酸を更に含むことができる。
【００３８】
遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチド及び核酸が同じポリペプチドをコードし得ることが当業者により理解される。当業者は日常的な技術を用いて、記述されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることも理解される。従って、特に特定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重版であり、同じアミノ酸配列をコードする全ヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列及びＲＮＡは、イントロンを含み得る。
【００３９】
本発明の特定の一態様では、本発明による組換えウイルスベクターは、抗原決定基、又はその免疫原性部分をコードする核酸を含む。好ましくは、前記異種核酸は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける発現の向上のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、必要なアミノ酸含有量、関心対象の哺乳動物における一般的かつ最適なコドン使用、及び適切な発現を確実にするために避けるべき多数の局面の提供に基づくものである。そのような局面は、スプライス供与部位又はスプライス受容部位、終止コドン、Ｃｈｉ部位、ポリ（Ａ）ストレッチ、ＧＣ−及びＡＴ−リッチ配列、内部ＴＡＴＡボックス等であり得る。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明は、前記異種核酸中のアデニン＋チミン含有量が、シトシン＋グアニン含有量と比較して８７％未満であり、好ましくは８０％未満であり、より好ましくは５９％未満であり、最も好ましくはおよそ４５％に等しい、本発明による複製欠損組換えウイルスベクターに関する。
【００４１】
当業者は、例えば日常的な分子生物学的手順を用いて、例えばアミノ酸置換、欠失、付加等によりタンパク質を変化させることができることも認識するであろう。一般に、ポリペプチドの機能又は免疫原性を喪失させることなく、保存的アミノ酸置換を適用することができる。これは当業者に周知の日常的な手順に従って調べることができる。
【００４２】
本発明のベクターは、組換えアデノウイルスであり、組換えアデノウイルスベクターとも称される。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当技術分野で周知である。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明によるアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部において欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とにおいて欠損している。アデノウイルスベクターは、「乗算欠損」であり得、これはアデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損又はＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子、及び／又はＥ２領域の少なくとも１つの必須遺伝子（例えば、Ｅ２Ａ領域及び／又はＥ２Ｂ領域）において更に欠損し得る。
【００４４】
アデノウイルスベクター、その構築方法、及びその増殖方法は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、同第６，１１３，９１３号明細書、及び同第８，９３２，６０７号明細書、並びにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ」，それぞれＣｈａｐｔｅｒｓ  ６７及び６８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）に、並びに本明細書に言及した他の参考文献に記載されている。典型的には、アデノウイルスベクターの構築は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２），及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、及び本明細書に言及した他の参考文献に記載されているもの等の標準的な分子生物学技術の使用を含む。
【００４５】
本発明によれば、アデノウイルスベクターは、好ましくはＨＡｄＶ４、ＨＡｄＶ１１、ＨＡｄＶ２６、ＨＡｄＶ３５、ＨＡｄＶ４８、ＨＡｄＶ４９、ＨＡｄＶ５０、非ヒト霊長類ベクター及びキメラベクターの群から選択される。本発明によるアデノウイルスベクターは、一般に、ヒト集団において低い血清有病率、及び／又は低い既存の中和抗体力価を有する。異なる導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスベクターは、臨床試験において評価されており、これまでの所、卓越した安全性プロファイルを有することが示されている。ＨＡｄＶ２６ベクターの調製は、例えば国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット及びＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ  ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。ＨＡｄＶ２６の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入ＥＦ  １５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１に見出される。ＨＡｄＶ３５ベクターの調製は、例えば米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、及びＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（１５）：８２６３−７１に記載されている。ＨＡｄＶ３５の例示的なゲノム配列は、ジェンバンク受入ＡＣ＿００００１９及び国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６に見出される。本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテント又は複製欠損であり得る。
【００４６】
特定の実施形態において、アデノウイルスは複製欠損であり、例えばこれは該アデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に既知であるように、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域でコードされた機能は、好ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要があり、即ちＥ１、Ｅ２及び／又はＥ４領域の一部又は全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらはプロデューサー細胞内に存在する必要があり、例えばそのゲノムに統合され、又はいわゆるヘルパーアデノウイルス若しくはヘルパープラスミドの形態で、統合される必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内に欠失も有し、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要はない。
【００４７】
使用し得るプロデューサー細胞（時々、当技術分野及び本明細書で「パッケージング細胞」又は「補完細胞」又は「宿主細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖できる任意のプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内の欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書参照）、Ｅ１−形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書参照）、Ｅ１−形質転換Ａ５４９細胞（例えば国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２１３−２１９）、２９３等の任意のＥ１−補完プロデューサー細胞を使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、又は９１１細胞、又はＩＴ２９３ＳＦ細胞等である。
【００４８】
ＨＡｄＶ３５（サブグループＢ）又はＨＡｄＶ２６（サブグループＤ）等の非サブグループＣ  Ｅ１−欠損アデノウイルスの場合、これらの非サブグループＣアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、ＨＡｄＶ５等のサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが好ましい。これにより、例えば２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞等の、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の補完細胞株におけるそのようなアデノウイルスの増殖が可能となる（例えばＨａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット参照）。特定の実施形態において、ワクチン組成物中のアデノウイルスは、Ｅ１領域内に欠失を有し、ＨＡｄＶ５のＥ４−ｏｒｆ６領域を有する、血清型３５のヒトアデノウイルスである。特定の実施形態においては、使用し得るアデノウイルスは、Ｅ１領域内に欠失を有し、ＨＡｄＶ５のＥ４−ｏｒｆ６領域を有する、血清型２６のヒトアデノウイルスである。
【００４９】
代替的な実施形態では、異種Ｅ４−ｏｒｆ６領域（例えばＨＡｄＶ５の）をアデノウイルスベクター内に配置する必要はなく、代わりにＥ１欠失非サブグループＣベクターを、Ｅ１及び適合性のＥ４−ｏｒｆ６の両方を発現する細胞株、例えばＥ１及びＡｄ５からのＥ４−ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株内で増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成を記載するＢｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：６４９７−５０１；Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：８９４６−５１及びＮａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：３２６−３６参照。これらはそれぞれ、そのような細胞株を使用したＥ１欠失非サブグループＣアデノウイルスベクターの生成を記載する）。
【００５０】
代替的に、増殖させるべき血清型由来のＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレット参照）。
【００５１】
Ｅ１領域内に欠失を有するＨＡｄＶ３５等のサブグループＢアデノウイルスの場合、アデノウイルス内のＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端、例えばｐＩＸオープンリーディングフレームの１６６ｂｐ直接上流、又はこれを含む断片、例えばｐＩＸ開始コドンの直接上流の２４３ｂｐ断片等（ＨＡｄＶ３５ゲノム内のＢｓｕ３６Ｉ制限部位により５’末端に標識（ｍａｒｋ）される）を保持することが好ましく、これは、この領域内にｐＩＸ遺伝子のプロモーターが部分的に存在するため、このことがアデノウイルスの安定性を増大させるためである（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；国際公開第２００４／００１０３２号パンフレット参照）。
【００５２】
特定の実施形態において、本発明の組換えＨＡｄＶ２６又はＨＡｄＶ３５ベクターは、５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列：ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。これらの実施形態は、そのようなベクターが、元の５’末端配列（一般にＣＡＴＣＡＴＣＡ）を有するベクターと比較して、生成プロセスにおける複製の改善を示し、均質性が改善されたアデノウイルスのバッチをもたらすため有利である（Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂ．Ｖ．の名義で２０１２年３月１２日に出願された「Ｂａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄｓ」と題された特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５４８４６号明細書及び米国特許第１３／７９４，３１８号明細書も参照されたい）、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。従って、本発明は、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の抗原断片又はその一部をコードする組換えアデノウイルスのバッチも提供し、ここでアデノウイルスはヒトアデノウイルス血清型４、１１、２６、３５、４８、４９、５０であり、本質的にバッチ中の全て（例えば少なくとも９０％）のアデノウイルスは、末端ヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを有するゲノムを含む。
【００５３】
本開示に使用される数値に関する用語「約」は、値±１０％を意味する。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明は、ＨＰＶに対するワクチンの作製方法を提供し、該方法は、ＨＰＶのＬ２タンパク質の抗原断片を含む抗原に融合したカプシドタンパク質ＩＸを含む組換えアデノウイルスベクターを提供することと、前記組換えアデノウイルスを宿主細胞の培養液中で増殖させることと、組換えアデノウイルスを単離及び精製することと、組換えアデノウイルスを薬学的に許容され得る組成物とすることとを含む。
【００５５】
組換えアデノウイルスは、アデノウイルスで感染させた宿主細胞の細胞培養を含む、周知の方法に従って宿主細胞内で調製及び増殖され得る。細胞培養は、接着細胞培養、例えば培養器の表面又はマイクロキャリアに付着した細胞、及び懸濁培養を含む任意のタイプの細胞培養であってよい。
【００５６】
殆どの大規模懸濁培養は、バッチ又は供給バッチプロセスとして操作され、これは、それらの操作及び規模拡大が最も容易であるためである。最近、灌流原理に基づいた連続プロセスがより一般的となり始め、好適でもある（例えば、大量の組換えアデノウイルスの獲得及び精製に好適な方法を記載する、両方とも参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレット及び国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレット参照）。
【００５７】
プロデューサー細胞は培養されて、細胞及びウイルスの数、並びに／又はウイルス力価を増大させる。細胞の培養は、本発明による関心対象のウイルスの代謝、及び／又は成長、及び／又は分裂、及び／又は生成を可能にするように行われる。このことは、当業者に周知の方法等により達成することができ、非限定的に、例えば適切な培地中に細胞用の栄養素を提供することを含む。好適な培地は当業者に周知であり、一般に、商業的供給源から大量に得られ、又は標準的なプロトコルに従って誂えることができる。培養は、例えば、バッチ、供給バッチ、連続システム等を用いて、シャーレ、ローラーボトル又はバイオリアクター内で行うことができる。細胞の培養に好適な条件は、既知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９参照）。
【００５８】
典型的には、アデノウイルスは、培養液中の適切なプロデューサー細胞に暴露され、ウイルスが組み込まれる。通常、最適な撹拌は約５０〜３００ｒｐｍ、典型的には約１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは６．７〜７．７であり、最適温度は３０〜３９℃、例えば３４〜−３７℃であり、最適ＭＯＩは５〜１０００、例えば約５０〜３００である。典型的には、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自発的に感染し、プロデューサー細胞を組換えアデノウイルス粒子に接触させることは、細胞を感染させるのに十分である。一般に、アデノウイルスのシードストック（ｓｅｅｄ  ｓｔｏｃｋ）が培養液に添加されて感染を開始させ、続いてアデノウイルスはプロデューサー細胞内で増殖する。これらは全て当業者には日常的である。
【００５９】
アデノウイルスによる感染後、ウイルスは細胞内で複製することより増幅され、このプロセスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称される。アデノウイルス感染は最終的には、細胞の溶解をもたらす。従ってアデノウイルスの溶解特性はウイルス産生の２つの異なるモードを可能にする。第１のモードは、細胞を溶解するのに外部因子を使用する細胞溶解に先立ってウイルスを回収することである。第２のモードは、生成されたウイルスによる（殆ど）完全な細胞溶解後にウイルス上清を回収することである（例えば、外部因子による、宿主細胞を溶解しないアデノウイルスの回収を記載している米国特許第６，４８５，９５８号明細書参照）。外部因子を使用して、細胞を能動的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
【００６０】
能動的な細胞溶解に使用し得る方法は、当業者に既知であり、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８〜３５に論じられている。これに関して有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張及び／又は低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせ等である。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１種の洗浄剤を使用して溶解される。溶解のための洗浄剤の使用は、方法が容易であること、及び容易に拡大可能であることの利点を有する。
【００６１】
使用できる洗浄剤、及びその使用方法は、一般に当業者に既知である。数個の例が、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２９〜３３に論じられている。洗浄剤は、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性及び非イオン性洗浄剤を含むことができる。洗浄剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変動してもよい。一実施形態において、使用される洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００６２】
ヌクレアーゼを使用して、混入、即ち、殆どプロデューサー細胞由来の、核酸を除去することができる。本発明での使用に好適な例示的なヌクレアーゼには、ベンゾナーゼ（登録商標）、プルモザイム（登録商標）、又は当技術分野において通常使用される任意の他のデオキシリボヌクレアーゼ及び／又はリボヌクレアーゼが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはベンゾナーゼ（登録商標）であり、これは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合を加水分解することにより核酸を急速に加水分解して、細胞溶解物の粘度を低下させる。ベンゾナーゼ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（コードＷ２１４９５０）から商業的に得ることができる。ヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。ヌクレアーゼ処理の代わりに又はこれに加えて、アデノウイルス精製中に、ドミフェン臭化物等の選択的沈殿剤を使用して、アデノウイルス製剤から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿させることも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；Ｇｏｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１：１２−２１；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレット参照）。
【００６３】
プロデューサー細胞の培養液からのアデノウイルスの回収方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範に記載されている。
【００６４】
特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスは、更に精製される。アデノウイルスの精製は、数個の工程で行うことができ、該工程は、例えば参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０５／０８０５５６号パンフレットに記載されている清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション又はクロマトグラフィーを用いた分離を含む。清澄化は、ろ過工程により行われ、細胞溶解物から細胞デブリ及び他の不純物を除去することができる。限外ろ過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用したダイアフィルトレーション、又は緩衝液交換は、塩、糖等の除去及び交換のための一方法である。当業者は、各精製工程の最適な条件を規定する方法を知っている。その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９８／２２５８８号パンフレットも、アデノウイルスベクターの生成及び精製方法を記載している。該方法は、宿主細胞を成長させ、該宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、該宿主細胞を回収及び溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、該溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフィーを用いてウイルスを更に精製することを含む。
【００６５】
精製は、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１〜７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程を用いることが好ましい。アデノウイルスの更なる精製に関して多数のプロセスが記載されており、該プロセスにはクロマトグラフィー工程が含まれている。当業者は、これらのプロセスに気づき、正しいクロマトグラフ工程に使用方法を変更して、プロセスを最適化することができる。例えば陰イオン交換クロマトグラフィー工程によりアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレット及びＫｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：１３４６−１３５３を参照されたい。多数の他のアデノウイルス精製方法が記載されており、これらは当業者の手の届く範囲にある。アデノウイルスの更なる生成及び精製方法は、例えば（国際公開第００／３２７５４号パンフレット；国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット；米国特許第５，８３７，５２０号明細書；同第６，２６１，８２３号明細書；国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレット；Ｋｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４３４：１３−２３；Ａｌｔａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：１９３−２６０）に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
本発明の別の態様は、更に薬学的に許容され得る賦形剤を含む、本発明による組換えアデノウイルスベクター又は組成物を含むワクチンに関する。
【００６７】
用語「ワクチン」は、特定の病原体又は疾病に対する治療程度の免疫を対象において誘導するのに有効な活性成分を含む薬剤又は組成物を指す。本発明では、ワクチンは、有効量の組換えアデノウイルスを含み、該組換えアデノウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｌ２タンパク質の抗原断片を含む抗原に融合したカプシドタンパク質ＩＸを含み、その結果、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質に対する免疫応答がもたらされる。本発明による用語「ワクチン」は、それが医薬組成物であることを暗示し、従って典型的には薬学的に許容され得る希釈剤、担体又は賦形剤を含む。ワクチンは、更なる活性成分を含んでも又は含まなくてもよい。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば他のタンパク質及び／又は他の感染病原体に対する免疫応答を誘導する他の成分を更に含む組み合わせワクチンであってもよい。
【００６８】
ヒトへの投与のために、本発明は、アデノウイルス及び薬学的に許容され得る担体又は賦形剤を含む医薬組成物を使用することができる。本明細書の文脈において、用語「薬学的に許容され得る」は、担体又は賦形剤が、使用される投与量及び濃度において、それらが投与される対象に任意の望ましくない又は有害な効果を生じないことを意味する。それらの薬学的に許容され得る担体及び賦形剤は、当技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］参照）。精製Ａｄは、好ましくは滅菌溶液として調製及び投与されるが、凍結乾燥製剤を使用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過、又はそれ自体が当技術分野で既知の他の方法により調製される。次いで、溶液は凍結乾燥され又は医薬品投与容器（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）内に満たされる。溶液のｐＨは、一般にｐＨ  ３．０〜９．５、例えばｐＨ  ５．０〜７．５の範囲内である。Ａｄは、典型的には、薬学的に許容され得る好適な緩衝液を有する溶液中にあり、Ａｄの溶液は、塩も含み得る。場合によりアルブミン等の安定化剤が存在してもよい。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、Ａｄは注射用製剤に調製され得る。これらの製剤は、有効な量のＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液又は凍結乾燥型のいずれかであり、場合により安定剤又は賦形剤を含む。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエアロゾル化されてもよい（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレット参照）。
【００６９】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ用にも使用される緩衝液中で保存されてもよい（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍａｒｃｈ  ２００２，ｐ．４３−４８）：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール。ヒトへの投与に好適な、有用な別の製剤緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ショ糖１０％  ｗ／ｖ、ポリソルベート−８０  ０．０２％  ｗ／ｖである。多数の他の緩衝液を使用できることは明らかであり、精製（アデノ）ウイルス製剤の保存及び医薬品投与に好適な製剤の数個の例は、例えば欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書及び国際特許出願国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見出すことができる。
【００７０】
特定の実施形態において、アデノウイルスを含む組成物は、更に１つ以上のアジュバントを含む。アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答を更に増大することで当技術分野で既知であり、アデノウイルス及び好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレットに開示されている。用語「アジュバント」及び「免疫刺激剤」は、本明細書で交換可能に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質として定義される。この状況において、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターの免疫応答を向上させるために使用される。好適なアジュバントの例には、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩；ＭＦ５９（例えば国際公開第９０／１４８３７号パンフレット参照）等のスクアレン−水エマルションを含む油エマルション組成物（又は水中油組成物）；例えばＱＳ２１等のサポニン製剤及び免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）（例えば米国特許第Ｓ５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレット参照）；細菌又は微生物誘導体、その例は、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素又はその変異体（ｍｕｔａｎｔ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ等が挙げられる。例えば、関心対象の抗原に対するＣ４−結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの融合物をコードする異種核酸を使用することによって、ベクター−コードアジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、又はそれらの組み合わせの形態のアルミニウムをアジュバントとして、用量当たりのアルミニウム含有量が０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇの濃度で含む。
【００７１】
別の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。本発明によれば、更なる活性成分を、本発明によるワクチンと組み合わせて投与することも可能である。そのような更なる活性成分は、例えば他のＨＰＶ抗原又はこれらをコードする核酸を含むベクターを含むことができる。そのようなベクターは、非アデノウイルス性又はアデノウイルス性であってもよく、この後者は任意の血清型であってもよい。他のＨＰＶ抗原の例には、ＨＰＶタンパク質又はその免疫学的に活性な部分が挙げられる。更なる活性成分は、例えばウイルス、細菌、寄生虫等の他の病原体に由来する非ＨＰＶ抗原も含み得る。更なる活性成分の投与は、例えば、別々の投与により又は本発明のワクチンの製品と更なる活性成分との組み合わせの投与により行うことができる。特定の実施形態では、更なる非アデノウイルス抗原が、本発明のベクター内にコードされ得る。従って、特定の実施形態では、単一のアデノウイルスから１種を超えるタンパク質の発現が望ましい可能性があり、そのような場合、例えばより多くのコード配列が結合されて、単一の発現カセットから単一の転写産物が形成され得るか、又は、アデノウイルスゲノムの異なる部分内にクローン化された２つの別個の発現カセット内に存在し得る。
【００７２】
本発明の更なる態様は、ＨＰＶの治療的、予防的又は診断的処置における本発明によるワクチンの使用に関する。本発明は、対象における免疫応答の誘導方法にも関し、該方法は、本明細書に記載したアデノウイルスベクター又はワクチンを投与することを含む。アデノウイルス組成物は、対象、例えばヒト対象に投与され得る。１回の投与で対象に提供されるアデノウイルスの総用量は、熟練者に既知のように様々であり得、一般に１ｘ１０７ウイルス粒子（ＶＰ）〜１ｘ１０１２  ＶＰ、好ましくは１ｘ１０８  ＶＰ〜１ｘ１０１１  ＶＰ、例えば３ｘ１０８〜５ｘ１０１０  ＶＰ、例えば１０９〜３ｘ１０１０  ＶＰである。
【００７３】
アデノウイルス組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて行うことができる。非限定的な実施形態は、例えば注射による非経口投与、例えば皮内、筋内等、又は皮下、経皮、又は粘膜投与、例えば鼻腔内、経口等を含む。本発明によれば、ワクチンを筋内投与することが好ましい。筋内投与の利点は、単純かつ安定しており、６カ月未満の乳児における鼻腔内適用に安全性の懸念を有さないことである。一実施形態において、組成物は、筋内注射により、例えば腕の三角筋、又は大腿の外側広筋内に投与される。当業者は、ワクチン中の抗原（複数可）に対する免疫応答を誘導するための組成物、例えばワクチンの投与の様々な可能性を知っている。
【００７４】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、コットンラット、又は非ヒト−霊長類、又はヒトである。好ましくは、対象はヒト対象である。対象は、任意の年齢、例えば約１カ月〜１００歳、例えば約２カ月〜約８０歳、例えば約１カ月〜約３歳、約３歳〜約５０歳、約５０歳〜約７５歳等であり得る。
【００７５】
本発明の１つ以上のアデノウイルスワクチンの１つ以上の追加免疫投与を提供することも可能である。追加免疫ワクチン接種を行う場合、典型的には、そのような追加免疫ワクチン接種は、組成物を対象に最初に投与した後（これは、この場合、「刺激ワクチン接種」と称される）、１週間〜１か月、好ましくは２週間〜４カ月の時点で、同じ対象に投与されるであろう。代替的な追加免疫レジメンでは、異なるベクター、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、又はＭＶＡ等の他のベクター、又はＤＮＡ、又はタンパク質を、刺激ワクチン接種の後に、対象に投与することも可能である。例えば本発明による組換えアデノウイルスベクターを刺激として対象に投与し、ＨＰＶタンパク質を含む組成物で追加免疫することが可能である。
【００７６】
特定の実施形態において、投与は、刺激投与及び少なくとも１回の追加免疫投与を含む。その特定の実施形態では、刺激投与は、本発明によるＨＰＶタンパク質をコードする核酸を含むＨＡｄＶ３５を用い、追加免疫投与は、前記ＨＰＶタンパク質をコードする核酸を含むＨＡｄＶ２６を用いる。その別の実施形態では、刺激投与はＨＡｄＶ２６を用い、追加免疫投与はＨＡｄＶ３５を用いる。別の実施形態では、刺激投与及び追加免疫投与の両方がＨＡｄＶ３５を用いる。特定の実施形態では、刺激投与はＨＡｄＶ３５を用い、追加免疫投与はＨＰＶタンパク質を用いる。これらの全実施形態において、同じ又は他のベクター又はタンパク質を用いて更なる追加免疫投与を提供することが可能である。
【００７７】
特定の実施形態において、投与は、更なる（追加免疫）投与なしでの、本発明による組換えアデノウイルスの単独投与を含む。そのような実施形態は、刺激−追加免疫レジメンと比較して、単独投与レジメンで複雑性及び費用が低減されている点で有利である。本明細書の実施例のコットンラットモデルでは、追加免疫投与なしでの本発明の組換えアデノウイルスベクターの単独投与後の完全な防御が既に観察されている。
【００７８】
本発明を以下の実施例で更に説明する。実施例は本発明を如何様にも限定するものではない。これらは本発明を明確にする役割を果たす。
【実施例】
【００７９】
実施例１：カプシド取り込みによりｐＩＸに融合したＨＰＶ  Ｌ２抗原コンカテマー
ｐＩＸ−Ｓｘ３及びｐＩＸ−Ｓｘ４  ＨＰＶ  Ｌ２コンカテマーの効率的なカプシド取り込み。
異なるＨＰＶ  Ｌ２コンカテマーがｐＩＸに融合し、カプシドに効率的に取り込まれるか否かを評価するために、カプシド取り込みのための数個の異なるｐＩＸ改変ＨＰＶ  Ｌ２ディスプレイベクターを設計、生成及び評価した（図１）。
【００８０】
抗原設計
ヒトパピローマウイルスＬ２タンパク質コンカテマー（即ち、モチーフ）をゲノム内にコードし、アデノウイルスカプシド上のタンパク質ＩＸ（ｐＩＸ）を介して表示する。異なるＨＰＶタイプのＬ２タンパク質断片、（Ｓ）１０〜４０アミノ酸モチーフ（又は６０〜９０／１００〜１３０ａ．ａ．）、（Ｌ）１０〜８９アミノ酸モチーフ又はそれらの組み合わせ（ＳＳＬ）のいずれかを使用して、Ｌ２コンカテマーを生成する。次いでこれらのコンカテマーを、連続する３個のグリシンアミノ酸（３−Ｇｌｙ）からなる小さいヒンジリンカーを介してｐＩＸに融合する。Ｌ２タンパク質からの選択領域は、ＨＰＶ感染に対するＬ２ベース防御の生成に必要であると以前に示された、１つ又は２つの保存された線状中和抗体エピトープ（又は抗原断片）、即ちアミノ酸残基１７〜３６（Ｓ及びＬ設計）又はアミノ酸残基６９〜８１（Ｌ設計）（図１Ａ）のいずれかを含む（ｒｅｖｉｅｗ：Ｋａｒａｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２００９）。
【００８１】
組換えヒトアデノウイルスベクター（ＨＡｄＶ）生成
ｐＩＸ−Ｌ２コンカテマーをコード及び表示する複製欠損組換えヒトアデノウイルス３５（ＨＡｄＶ−３５）及びヒトアデノウイルス２６（ＨＡｄＶ−２６）ベクターを、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．２００６により以前に記載されたように生成する。ＨＡｄＶ−ゲノムの左部分（ｐＡｄａｐｔ３５．Ｂｓｕ／ｐＳｈｕｔｔｌｅ２６プラスミド）にｐＩＸ−Ｌ２改変を遺伝的に挿入する。続いて、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて線状化ｐＡｄａｐｔ又はｐＳｈｕｔｔｌｅ及びコスミド（ゲノムの右部分）をトランスフェクトすることにより、ベクターの救出をＥ１補完ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株内で行った。続いて、ベクターをプラーク精製し、１０％のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）及び１０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２で補充したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞上で増殖させた。異なるＨＰＶ  Ｌ２コンカテマーをコード及び表示するＨＡｄＶ−３５又はＨＡｄＶ−２６ベクターのいずれかの大パネルを生成し、セシウム精製し、特徴付けた。ウイルス力価、ウイルス粒子（ＶＰ）／ｍｌ、感染単位（ＩＵ）／ｍｌ、並びに対応するＶＰ／ＩＵ比及びＶＰ／ｃｍ２を、各精製バッチに関して決定した。これらの特徴は、対応する対照ベクター（即ち、非改変ｐＩＸ）と同等であった。従ってｐＩＸ−改変ベクターの産生能は、Ｌ２コンカテマーの付加により影響を受けないことが示される（データは示さず）。
【００８２】
ｐＩＸ−Ｌ２カプシド取り込み効率
ｐＩＸ−Ｌ２  ＨＰＶカプシド取り込み効率を評価して、非改変ｐＩＸベクターと同等の取り込み効率を有するベクターを生成する見地から、どのｐＩＸ−融合タンパク質設計が最適であるかを決定した。それを理由として、ｐＩＸ−Ｌ２ベクターを非改変ｐＩＸ対照ベクター（ＨＡｄＶ．空）と比較した。ウイルスカプシド内のｐＩＸ−Ｌ２含有量とカプシド取り込みの効率とを決定するために、精製ウイルスバッチに関してウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及びＵＰＬＣ／ＭＳ分析を含む数個の分析を行った。
【００８３】
最初に、最適なＨＰＶ  Ｌ２コンカテマー設計を決定した。これを目的として、ｐＩＸ−Ｇｌｙ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６（９３アミノ酸）、ｐＩＸ−Ｇｌｙ−Ｌ２（Ｓｘ３）ｘ３）４５．１８．１６（２７３アミノ酸）ｐＩＸ−Ｇｌｙ−Ｌ２（Ｌｘ３）４５．１８．１６（２３８アミノ酸）及びｐＩＸ−Ｇｌｙ−Ｌ２（Ｓｘ２＋Ｌ）４５．１８．１６（４１８アミノ酸）をコードするＨＡｄＶ−３５ベクターを生成し（図１Ｂ）、精製した。続いて、精製ウイルス粒子をウェスタンブロットにより分析し、超高速液体クロマトグラフィー／質量分析ＵＰＬＣ／ＭＳにより確認して、カプシド内のｐＩＸ−Ｌ２タンパク質の正確な含有量を決定した。
【００８４】
カプシド取り込みｐＩＸ−Ｌ２融合タンパク質のウェスタンブロット分析
精製ウイルス粒子を還元及び変性し、ウェル当たり１．５ｘ１０１０、０．５ｘ１０１０及び０．１７ｘ１０１０ウイルス粒子（ＶＰ／ウェル）の濃度でゲル上に負荷することによって、カプシド取り込みｐＩＸ−Ｌ２変異体のウェスタンブロット（ＷＢ）分析を行った。次いで、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のプレキャスト１２％  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ  Ｎｕ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にて１７５  Ｖ、５００ｍＡでウイルス粒子を分離した。続いて、サイズ分離タンパク質を、ｉＢｌｏｔ（登録商標）転写スタック（ｉＢｌｏｔ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者の推奨に従ってニトロセルロース膜に転写した。抗Ｌ２特異的血清（ＨＰＶ  １６マウス血清）又は抗ｐＩＸモノクローナル抗体（６７４０）及びローディングコントロールとしての抗ファイバーモノクローナル抗体（Ａｄ５  ４Ｄ２、Ａｂｃａｍ）を５％脱脂粉乳（ＢｉｏＲａｄ）／トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で用いて膜を１時間染色することにより、ｐＩＸ−Ｌ２タンパク質含有量を決定した。蛍光標識された２次抗体ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（登録商標）１：１００００ヤギ抗マウスを用いて染色することにより関心対象のタンパク質を可視化し、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）（Ｌｉ−Ｃｏｒ）上に記録した。
【００８５】
Ｇｌｙリンカーを介してｐＩＸに融合したＨＰＶ  Ｌ２  ４５．１８．１６コンカテマーＳｘ３、（Ｓｘ３）ｘ３、Ｌｘ３、（Ｓｘ２）＋Ｌの間でカプシド取り込みにおける大きな相違がウェスタンブロット（表１）で観察された。ベクター間の直接比較により、Ｓｘ３変異体の良好なカプシド取り込みが示される。（Ｓｘ３）ｘ３及びＬｘ３変異体を精製バッチ中で検出したが、遥かに低い程度であった。対照的に、（Ｓｘ２）＋ＬはＬ２−特異的マウス血清を使用したウェスタンブロット分析では全く検出されなかった（表１）。これらの観察事項により、ｐＩＸに融合したＨＰＶ  Ｌ２コンカテマーのタイプは、カプシド取り込み効率に影響を与えることが示される。サイズ及びおそらく電荷がカプシド取り込み効率に重要な役割を果たすと思われる。（Ｓｘ３）９３アミノ酸配置が最も効率よく取り込まれ、一方（Ｓｘ２）＋Ｌ  ４１８アミノ酸配置は全く取り込まれなかった。効率的なカプシド取り込みに基づいて、Ｇｌｙリンカーを介してｐＩＸに融合したＨＰＶ  ４５、１８及び１６  Ｌ２タンパク質の１０〜４０アミノ酸を含むＬ２コンカテマー（Ｓｘ３）は、最適であるとして選択された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  １）。
【００８６】
【表１】
2019525754.tif 000002
【００８７】
選択されたｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６  ＨＡｄＶ−３５ベクターをウェスタンブロットにより更に分析して、カプシド取り込み効率の見地からバッチ間の変動を決定した。これを目的として、２つの追加のバッチを生成し、精製し、個別にＨＡｄＶ３５．空ベクターと（データは示さず）及び互いに比較した。抗ｐＩＸモノクローナル抗体（６７４０）及び抗ファイバーモノクローナル抗体（４Ｄ２）（約３５ｋＤａ）で染色した後、３つの全バッチの間でｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６（約２５ｋＤａ）の同等のバンド強度が観察された（図２Ａ）。従って、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６の３つの全バッチ間で、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）カプシド取り込み効率の点で明白なバッチ間の変動は観察されなかった。
【００８８】
カプシド取り込み効率を確認するためのＨＡｄＶ−３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６の逆相ＵＰＬＣ分析
ウェスタンブロット分析で観察されたＨＡｄＶ３５．空（非改変ｐＩＸ）及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６における天然ｐＩＸの同等のレベルを確認するために、ベクターを逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＵＰＬＣ）により並行して試験した。ここでは合計２．５ｘ１０１１  ＶＰ／ｍｌ精製バッチを、アセトニトリル（ＡＣＮ）＋０．１７％及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）勾配を有するＲＰ−ＵＰＬＣ  Ｃ４カラムに負荷した。吸収を２８０ｎｍで測定した。得られたＨＡｄＶ３５プロテオーム（各ピークがウイルスタンパク質に対応する）及びその対応する溶出時間を図２Ｂに示す。非改変ｐＩＸ  ＨＡｄＶ３５．空対照（上部パネル）の分析により、約１４分の溶出時間のｐＩＸピークがはっきり示される。予想通り、このｐＩＸピークはＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６分析（下部パネル）では検出されない。代わりに、約１３分で溶出した２つの追加のピークが観察された（下部グラフに矢印で示す）。これらはｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６タンパク質を表すと予想される（図２Ｂ）。全ウイルスタンパク質の量（ピーク領域の合計）を決定し、ｐＩＸ量（ピーク領域）の百分率を計算することによってｐＩＸ及びｐＩＸ−Ｌ２（ピーク領域）の相対的な量（百分率で）を計算した。負荷はペントン塩基（タンパク質ＩＩＩ）ピーク領域（約１２分で溶出）を用いた補正により調節された。ＨＡｄＶ３５．空では、ｐＩＸは総ウイルスタンパク質の２．７％を構成した。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６では、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）メジャーピークは総ウイルスタンパク質の２．１％を占め、マイナーピークは０．４％を占めた（合計２．５％）。手短に言えば、この分析によりＨＡｄＶ３５．空及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６の両方における同等のレベルのｐＩＸ（２．７対２．５％）の存在が確認される。従って、Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６  ＨＰＶコンカテマーの付加は、効率的なｐＩＸ−Ｌ２カプシド取り込みを可能にする。
【００８９】
ＬＣ−ＭＳ分析によるＨＡｄＶ−３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６マイナーバンド確認
ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６のウェスタンブロット及びＲＰ−ＵＰＬＣ分析の両方が第２のマイナーバンド／ピークを示したため、このバンドの正確な配列を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析により決定した。精製ＨＡｄＶ３５．空及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した後、ＭＳ互換性ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）染色（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の推奨に従って行った。プールしたｐＩＸバンドのトリプシンによるゲル内消化を、製造業者による推奨の通りに行った（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。次いで、消化されたバンドを２〜５０％  ＡＣＮ＋０．１％  ＦＡ勾配を有する逆相Ｃ１８  ＢＥＨ３００カラム上で分離し、ＭＳＥ分析をＳｙｎａｐｔ  Ｇ２  ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析計上で行った。結果は、メジャーバンド／ピーク（ウェスタンブロットでの２５ｋＤａ及びＲＰ−ＵＰＬＣでの約１３分の溶出時間）が実際に完全ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６であることを示す。マイナーバンド／ピーク（ウェスタンブロットでの約２４ｋＤａ及びＲＰ−ＵＰＬＣでの約１３．５分の溶出時間）は、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８であると決定された。これらの結果は、少量のカプシド取り込みｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）において、先端に配向したＨＰＶ  １６  １０〜４０アミノ酸配列が欠けており又はおそらく切断されていることを示す。
【００９０】
強い線状１７〜３６アミノ酸Ｂ細胞エピトープに加えて、ＨＰＶ  １６  Ｌ２タンパク質の１０〜４０アミノ酸は‘．ＴＫＲ／ＡＳＡ’配列も含み、該配列は完全フューリン認識部位ＲＴＫＲ／ＡＳＡからＰ４において１つのアルギニン（Ｒ）が足りない（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。この部分的フューリン認識部位（即ち、．ＴＫＲ／ＡＳＡ）の存在は、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６コンカテマーのｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８及びＨＰＶ  １６  １０〜４０アミノ酸（フューリンにより接近可能な先端ＨＰＶ  １６断片）への不完全な消化に寄与し、またより低い程度で、フューリンによるＨＰＶ  １８及び４５  １０〜４０アミノ酸の切断に寄与する（フューリン切断に関して比較的接近可能ではないカプシドに対する近接さに起因して）という可能性が最も高い。
【００９１】
Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６コンカテマーに対する追加のＨＰＶタイプの付加による、ＨＡｄＶ２６ベクターにおけるｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）設計の拡張
Ｇｌｙリンカーを介してｐＩＸに融合したＨＰＶ  ４５、１８及び１６を含むＬ２タンパク質１０〜４０アミノ酸（Ｓｘ３）コンカテマー設計が、最適及び自然なｐＩＸカプシド負荷を確実にすることを決定したため、本発明者らは：（１）異なるＨＰＶタイプ由来のいくつの追加のＬ２  １０〜４０アミノ酸配列がｐＩＸに融合でき、依然として効率的なカプシド負荷を確実にするかを評価し；及び（２）同じ改変が他のアデノウイルスタイプ（例えばＨＡｄＶ−２６）に首尾よく導入できるか否かを評価することを目標とした。これを目的として、ＨＡｄＶ−２６ベクターを上記に示したように生成し、ウェスタンブロットによりカプシド取り込み効率に関して評価した。ｐＩＸ−Ｌ２（（Ｓｘ３）ｘ３）４５．１８．１６がカプシド取り込みの低下を示すことをＨＡｄＶ３５において観察したため（表１）、ＨＡｄＶ２６にて試験した最大（Ｓ）−変異体をＳｘ６に低減した。ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）３１．４５．１８．１６、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）３３．４５．１８．１６、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ５）３３．３１．４５．１８．１６、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ５）５２＊．３１．４５．１８．１６（＊ＨＰＶタイプ５２及び５８は、Ｌ２タンパク質１０〜４０アミノ酸領域において同一である）、及びｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ５）５２＊．３３．３１．４５．１８．１６：を含むＨＡｄＶ２６ベクターを生成した（図１Ｃ）。臨床的に関連した癌の原因となるＨＰＶタイプのみを使用して、ｐＩＸ−Ｌ２ベクターを生成した。抗Ｌ２  ＨＰＶ  １６マウス血清及びローディングコントロールとしての抗ファイバーモノクローナル抗体（４Ｄ２）を使用したカプシド取り込み評価は、取り込み効率におけるベクター間の幾分かの相違を示した（表１）。ベクターをＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６ベクターと比較し、また互いの間で比較して、ｐＩＸ−Ｌ２含有量のレベルを決定した。ｐＩＸ−Ｌ２含有量の点で、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６の両方は、ウェスタンブロットにて同等である（表１）。この観察により、アデノウイルスタイプに関わらず、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６はアデノウイルスベクターに効率的に取り込まれるという結論が導かれる。
【００９２】
加えて、ウェスタンブロット分析により、２つのＳｘ４ベクター（ＨＡｄＶ−２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）３１．４５．１８．１６（配列番号２）及びＨＡｄＶ−２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）３３．４５．１８．１６（配列番号３）が互いに及び最も重要なことにはＳｘ３変異体と同等のｐＩＸ含有量を有することが示される（表１）。Ｓｘ５変異体（ＨＡｄＶ−２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ５）３３．３１．４５．１８．１６（配列番号４）及びＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ５）５２＊．３１．４５．１８．１６）（配列番号５）は、Ｓｘ４及びＳｘ３ベクターを比較して僅かに低下したカプシド取り込みを示すが、これらは依然として効率的に取り込まれる。最少のｐＩＸ−Ｌ２含有量がＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ６）５２．３３．３１．４５．１８．１６ベクターにおいてＳｘ６ベクターに関して観察された。Ｓｘ６ベクターは（（Ｓｘ３）ｘ３）、Ｌｘ３又は（（Ｓｘ２）＋Ｌ））ベクターと共に、乏しい取り込みを示した（表１）。異なる（Ｓ）−変異体ベクターのカプシド取り込みは、ｐＩＸ−Ｌ２含有量の点で、Ｓｘ４変異体、すぐに続いてＳｘ５変異体が、Ｓｘ３改変ベクターと最も同等であることを示す。この観察により、Ｓｘ３設計と非常に近いＳｘ４及びＳｘ５変異体がアデノウイルスカプシドに効率的に取り込まれることが示唆される。
【００９３】
予防的ＨＰＶ  ＨＡｄＶ−３５  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ベースワクチンのカプシド取り込み
ｐＩＸに融合した４つの異なる１０〜４０アミノ酸ＨＰＶ  Ｌ２断片を含むコンカテマーが、ＨＡｄＶカプシドに効率的に取り込まれることを確認したため、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６及びｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１１．５２／５８．４５．１８をコード及び表示する２つのＨＡｄＶ３５ベクターを生成して、臨床的に関連した９つのＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５及び５２／５８に対する防御を確認した。これは、パンＨＰＶ  Ｌ２ベース予防的ワクチンのために両方のベクターを１つの最終的なワクチン製剤中に混合することを目標としている。
【００９４】
これらのベクターを、上記に示したように、Ｅ１補完ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で生成し、前記に論じた全ｐＩＸ−改変ベクターと同じように、コードされたｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）改変に加えて‘空’Ｅ１−カセット（ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０ポリＡシグナル）も含む。精製ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８ベクターを特徴付け、ウイルス力価（ＶＰ及びＩＵ／ｍｌ）、ＶＰ／ＩＵ及びＶＰ／ｃｍ２の点で非改変対照ベクターと同等であることと見出した（データは示さず）。ウェスタンブロット及び抗Ｌ２マウス血清（ＨＰＶ  １６特異的）を用いた染色によるカプシド取り込みの評価は、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６＆ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８がｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６対照ベクターと同様に効率的に取り込まれることを示す。加えて、ウェスタンブロット分析は、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６とｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８との間の同等のカプシド取り込みを示す（図３Ａ）。各ＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）変異体の追加のバッチを生成し、カプシド取り込みを含む全特徴に関して同等であることを示した（データは示さず）。まとめると、このデータは、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ６）及びｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８（配列番号７）が、バッチ間の明白で確かな任意の変動を有することなく、ＨＡｄＶ３５カプシド内に効率的に取り込まれることを示す。
【００９５】
異なるＬ２エピトープ断片を含むｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ミックスのカプシド取り込み
ｐＩＸ設計に融合したＨＰＶ  Ｌ２  １０〜４０アミノ酸断片を含むコンカテマーを用いて、効率的なカプシド取り込みが確認されたため、１つのコンカテマー内に異なるＬ２エピトープ断片、ＨＰＶ３１（１７〜３６アミノ酸）、ＨＰＶ４５（６９〜８１アミノ酸）、ＨＰＶ１８（１０８〜１２０アミノ酸）、及びＨＰＶ１６（１０８〜１２０アミノ酸）（配列番号８）を表示するＨＡｄＶ２６ベクターに拡張した。これを目的として、ＨＡｄＶ２６．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ミックス．３１．４５．１８．１６ベクターをＥ１補完ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で上記に示したように生成した。ウェスタンブロットと、抗Ｌ２マウス血清（ＨＰＶ１６特異的）及び抗ｐＩＸモノクローナルを用いた染色によるカプシド取り込みの評価は、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ミックス．３１．４５．１８．１６がカプシド内に取り込まれたことを示す（図３Ｂ）。ウェスタンブロット分析では、２８ｋＤａ  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ミックス．３１．４５．１８．１６タンパク質に加えて複数のバンドが検出され、以前に認められたＬ２−コンカテマーのタンパク質切断が示唆される。とはいえ、このデータは、ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ミックス．３１．４５．１８．１６（配列番号８）がＨＡｄＶ２６カプシドに取り込まれ得ることを示す。
【００９６】
実施例２：免疫原性ｐＩＸ−Ｌ２改変ベクター
単一のＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１１．５２／５８．４５．１８、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）６．３１．３３．１６及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）ベクターと同じ実験において、２つのｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ディスプレイベクターのミックスを含む９価Ｌ２ベース予防的ＨＰＶワクチンを、ＨＰＶタイプ特異的抗体（ワクチンに含まれる抗原に対する）及び交差反応性抗体（ワクチンに含まれない抗原に対する）の誘導に関して評価した。（１ｘ１０１０  ＶＰ／ベクター）ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６単独、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８単独、ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）４５．１８．１６単独（正の対照）及びＨＡｄＶ３５．空（負の対照）のミックスを用いて、マウス（ＣＢ６Ｆ１）を筋肉内ＩＭ免疫化した（刺激）。刺激から８週後、同じベクターを用いて同じ濃度（１ｘ１０１０  ＶＰ／ベクター）でマウスを追加免疫した。それぞれ２週間隔で、マウスを出血させ、刺激から１２週後に最終的に犠牲にした（図４Ａ）。９価ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡアッセイ（ＥＬＩＳＡ力価ＥＣ５０  Ｌｏｇ１０）を用いて液性応答を測定した。各ＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５及び５２／５８及びＨＰＶタイプ５９に対して刺激から８週後及び１２週後（追加免疫から４週後）に誘導された抗体応答を測定した。データは、８週目の１ｘ１０１０  ＶＰ／ベクターの１回の投与後（刺激のみ）：全ての単一のベクター及び２つのベクターのミックスが、ＨＰＶタイプ（ＨＰＶ  ５９）がワクチンに含まれていない場合でも、ＨＰＶタイプ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２／５８及び５９に対する抗体応答を誘導することを示す（図４Ｂ）。それぞれの単一のベクター及び２つのベクターのミックスに関して、ＨＰＶタイプ特異的抗Ｌ２応答を１２週目に追加免疫した（図４Ｂ）。たとえ単一のベクターがｐＩＸ−Ｌ２コンカテマーに含まれていないタイプに対する免疫応答を誘導できても、例えばＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６ベクターで免疫化されたマウスにおいてＨＰＶタイプ６、１１及び３３に対する応答を誘導しても、応答は１２週目に、Ｓｘ４ベクター単独（ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１１．５２／５８．４５．１８又はＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）６．３１．３３．１６）又は２つのＳｘ４ベクターのミックスのいずれと比較してもかなり低いように思われる（図４Ｂ）。概して、２つのＳｘ４ベクターＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１１．５２／５８．４５．１８及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）６．３１．３３．１６のミックスは、ＨＡｄ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ３）４５．１８．１６ベクター対照と比較した場合、試験した全ＨＰＶタイプに対する、より高い免疫応答を誘導し、またいくつかのＨＰＶタイプに関しても、単一のＳｘ４ベクター（ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）１１．５２／５８．４５．１８又はＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）６．３１．３３．１６）よりも高い免疫応答を誘導する。交差反応性結合抗体は全ｐＩＸ−Ｌ２ディスプレイベクターにより生成されるけれども、９価ベクターミックスを用いて達成される、より高い抗体免疫応答は、複数のＨＰＶタイプからの数種のＬ２抗原断片を含めることの重要性を示している。
【００９７】
血清中のＨＰＶ中和抗体（ｎＡｂ）応答が、ＨＰＶ防御に相関すると見なされるため（Ｐａｓｔｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ｎＡｂ応答を誘導するｐＩＸ−Ｌ２の能力を決定した。これを目的として、上述した免疫化からの血清（図４Ａ）を、ＨＰＶシュードビリオンウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）においてＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１及びＨＰＶ５９特異的ｎＡｂ応答に関して試験し、アッセイにおいて４価ガーダシルワクチン接種マウスと比較した。
【００９８】
ＨＰＶシュードビリオン生成及びＶＮＡ
ＨＰＶシュードビリオン生成及びＶＮＡは、基本的に前述されたように行ったが（Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、フューリン産生細胞からの上清の代わりに組換えフューリンを使用した。手短に言えば、ＨＰＶシュードビリオン産生ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を使用した（ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））。これを目的として、ＨＰＶ  Ｌ１−Ｌ２カプシド−コードｐｃＤＮＡ２００４Ｎｅｏ（−）．ＨＰＶｘ．Ｌ１Ｓ．ＩＲＥＳ．Ｌ２．ＷＰＲＥプラスミドとホタルルシフェラーゼ及びｅＧＦＰタンパク質をコードするプラスミドとを用いてトランスフェクションを行った。細胞形質導入の前に、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするＨＰＶシュードビリオンを、免疫化マウスからの血清と共にインキュベートした。中和能力の読み取りとして、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して相対発光量（ＲＬＵ）を測定した。
【００９９】
単一のベクター及びミックスによってＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に対するｎＡｂ免疫応答を誘導し、該応答は、４価−ガーダシル（ＨＰＶ  ６、１１、１６及び１８）によって誘導された応答と同等であった（図４Ｃ）。また、全Ｌ２ディスプレイベクターによってＨＰＶ３１及び５９のｎＡｂ中和力価を誘導した（図４Ｃ）。結論として、全ｐＩＸ−Ｌ２ディスプレイベクターはＨＰＶタイプ特異的ｎＡｂ免疫応答を誘導し、そのうちＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８免疫応答は、４価ガーダシルと同等であった。
【０１００】
実施例３：ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）プロデューサー細胞株における遺伝的に安定なｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）改変ベクターの生成
アデノウイルスベクターは遺伝的に安定と見なされていても（Ｂｅｔｔ，Ｐｒｅｖｅｃ，＆Ｇｒａｈａｍ，１９９３；Ｋｉｎｇ，Ｔｅｅｒｔｓｔｒａ，Ｂｌａｎｃｏ，Ｓａｌａｓ，＆ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ，１９９７）、通常、欠失変異体が選択的成長優位を示す場合、突然変異及び／又は欠失が認められている（Ｈａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。異なるＨＰＶタイプ間の、ＨＡｄＶゲノム内にコードされたＬ２タンパク質１０〜４０アミノ酸コンカテマーにおける比較的高い相同性（約６５〜７０％）に起因して、ベクター生成中の遺伝的不安定性が生じる場合がある（Ｂｚｙｍｅｋ＆Ｌｏｖｅｔｔ，２００１）。
【０１０１】
プロデューサーＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での産生後、高度反復Ｌ２コンカテマーをコードするｐＩＸ−改変ベクターの遺伝的安定性プロファイルを決定するために、予測される商業的プロセスを超える４回のウイルス継代（ＶＰＮ）まで、５つのクローン（即ち、プラーク）をＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）内で増殖させた。遺伝的安定性を評価するための延長された継代アッセイとその後のｐＩＸ−改変領域のＰＣＲ増幅を、Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌにより以前記載されたように行った（Ｖｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７））。接着ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ａｄ  ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標））細胞内のみでの継代の実施の代わりに、ウイルス継代数７（ＶＰＮ７）において縣濁液中でのＥＲ．Ｃ６（登録商標）（ｓＰＥＲ．Ｃ６（登録商標））細胞内の延長された継代を継続した（図５Ａ）。ｓＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での継代を固定３５ＶＰ／細胞（ＨＡｄＶ３５）にて制御条件下で行い、各継代に関して感染（ＤＰＩ）から３日後に回収した。ウイルスＤＮＡをＶＰＮ７及びＶＰＮ１４で単離して、ｐＩＸ−領域の完全性を決定した。ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）コンカテマーを含むＨＡｄＶ３５ベクターを、上記に示したように、３つのプラスミドのトランスフェクションにより生成したが、にも関わらず高度反復Ｌ２コンカテマーの効果は、ベクター生成中のｐＩＸ−Ｌ２の遺伝的安定性に悪影響を有し得る。遺伝子レベルでのＳｘ４コンカテマー内のＬ２相同性の効果を軽減するために、哺乳動物タンパク質発現に関するコドン最適化を用いて、ＤＮＡレベルでの相同性を低減させることによりＬ２コンカテマーを合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。この誂えのコドン最適化は、約２〜３％の総相同性の低下をもたらした一方、哺乳動物細胞内での発現のための最適なコドン使用を依然として保持した。ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８ベクターの５つのプラーク（ｎ＝５）をＶＰＮ１４まで継代した（図５Ｂ）。非低減ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ＨＡｄＶ３５（即ち、コドン最適化されたが、ＨＰＶタイプ１０〜４０アミノ酸断片間の相同性が低減されていない）も、延長された継代後、遺伝的に安定であることが見出された（表２）。Ｓｘ４コンカテマー内のＬ２相同性に関わらず（低減対非低減）、ＨＡｄＶ３５  ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓｘ４）ベクターの全クローンは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内での延長された継代中、遺伝的に安定な状態を維持した。加えて、（低減されたＬ２コンカテマー相同性）ＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）６．３１．３３．１６及びＨＡｄＶ３５．空．ｐＩＸ−Ｌ２（Ｓ）１１．５２／５８．４５．１８ベクターの上述した少量の精製ベクター製剤をＰＣＲによって遺伝的安定性に関して試験し、遺伝的に安定であることが示され、ベクター生成中の「スケール」アップは遺伝的に安定なｐＩＸ−Ｌ２ベクターを提供することが示された。まとめると、遺伝的にコードされたＬ２コンカテマーに融合したタンパク質ＩＸの高度反復性にも関わらず、ベクターはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内で遺伝的に安定な状態を維持する。
【０１０２】
【表２】
2019525754.tif 000003
【０１０３】
参考文献
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【０１０４】
配列表
配列番号１  Ｓｘ３  ＨＰＶ  ４５．１８．１６（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化１】
2019525754.tif 000004
配列番号２  Ｓｘ４  ＨＰＶ  ３１．４５．１８．１６（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化２】
2019525754.tif 000005
配列番号３  Ｓｘ４  ＨＰＶ  ３３．４５．１８．１６（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化３】
2019525754.tif 000006
配列番号４  Ｓｘ５  ＨＰＶ  ３１．３３．４５．１８．１６（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化４】
2019525754.tif 000007
配列番号５  Ｓｘ５  ＨＰＶ  ５２／５８．３１．４５．１８．１６（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化５】
2019525754.tif 000008
配列番号６  Ｓｘ４  ＨＰＶ  ６．３１．３３．１６（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化６】
2019525754.tif 000009
配列番号７  Ｓｘ４  ＨＰＶ  １１．５２／５８．４５．１８（Ｌ２タンパク質の１０〜４０残基）
【化７】
2019525754.tif 000010
配列番号８  Ｓｘ４  ＨＰＶ  ３１（１１〜４０）．４５（６０〜８９）．１８（１００〜１２９）．１６（１０１〜１３０）
【化８】
2019525754.tif 000011
配列番号９（スペーサー１）
ＣＮＧＴＤＡＫＩＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＳＴ
配列番号１０（スペーサー２）
ＴＮＥＫＦＨＱＩＥＫＥＦＳＥＶＥＧＲＩＱＤＬＥＫＹＶＥＤＴＫＩＤＬ
配列番号１１（スペーサー３）
ＱＴＮＡＲＡＩＡＡＭＫＮＳＩＱＡＴＮＲＡＩＦＥＶＫＥＧＴＱＱ
配列番号１２（ＨＡｄＶ−３５ｐＩＸ）
【化９】
2019525754.tif 000012
配列番号１３（ＨＡｄＶ−２６ｐＩＸ）
【化１０】
2019525754.tif 000013
配列番号１４（エピトープ１）
ＱＬＹ＋ＴＣＫＱＡＧＴＣＰＰＤ
配列番号１５（エピトープ２）
ＲＴＧＹＩＰＬＧＴＲＰＰＴ
配列番号１６（エピトープ３）
ＬＶＥＥＴＳＦＩＤＡＧＡＰ
【図１Ａ】
2019525754.tif 000014
【図１Ｂ】
2019525754.tif 000015
【図１Ｃ】
2019525754.tif 000016
【図１Ｄ】
2019525754.tif 000017
【図２Ａ】
2019525754.tif 000018
【図２Ｂ】
2019525754.tif 000019
【図３Ａ】
2019525754.tif 000020
【図３Ｂ】
2019525754.tif 000021
【図４Ａ】
2019525754.tif 000022
【図４Ｂ】
2019525754.tif 000023
【図４Ｃ】
2019525754.tif 000024
【図５Ａ】
2019525754.tif 000025
【図５Ｂ】
2019525754.tif 000026
【配列表】
2019525754000001.app
【国際調査報告】
2019525754.tif 000027
2019525754.tif 000028
2019525754.tif 000029
2019525754.tif 000030