(57)【要約】本発明は、タンパク質をコードする外来性ＲＮＡを含む赤血球細胞に関連する組成物及び方法を含む。外来性ＲＮＡは、調節エレメントを含む異種非翻訳領域を含むことができる。代替的に又は組み合わせて、外来性ＲＮＡは、化学修飾を含むことができる。外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、ａ）成熟段階における赤血球細胞を提供することと、ｂ）前記赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることを含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させること
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【請求項２】
前記赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡを取込む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、前記赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させることとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記赤血球細胞の集団の前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡをそれぞれ取込む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡの取込み後、前記細胞又は前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞又は前記複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
成熟段階における前記赤血球細胞の集団は、成熟培地中で３〜７日間、例えば４〜５又は４〜６日間にわたって拡大された細胞の集団である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ｅ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｆ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｇ）前記分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記分化している赤血球細胞の集団の前記複数の細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと、
（ｈ）前記分化している赤血球細胞の集団の前記複数の細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
【請求項９】
前記更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：
ｉ．ａ）前記集団における前記細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）前記細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）前記細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）前記細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）前記細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又は
ｉｉｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、前記集団における前記細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、前記複数の細胞は、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団から分離され、例えば、前記複数の細胞は、脱核状態に基づいて前記集団から分離される（例えば、前記複数の細胞は、有核細胞であり、及び前記集団の残りのものは、脱核細胞である）、請求項３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の細胞を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、例えば前記集団を脱核の阻害剤（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、又はプロテアソーム阻害剤）と共にインキュベートすることにより、例えば前記集団の成長、発達、ヘモグロビン合成、又は脱核プロセスを停止させることにより、前記赤血球細胞の集団又は前記分化している赤血球細胞の集団を同期させることを含む、請求項３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
停止は、前記集団における前記細胞の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０％超の脱核前に行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ｉ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｊ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｋ）前記分化している赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、前記分化している赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、前記分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われる、接触させることと、
（ｌ）前記分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、前記外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
【請求項２５】
前記更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記接触は、前記分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、（ａ）赤血球前駆体細胞の集団を提供することと、（ｂ）前記赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、（ｃ）前記分化している赤血球細胞を、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含み、改善は、前記接触が、前記分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われることを含む、方法。
【請求項２８】
前記接触は、前記分化している赤血球細胞の集団が細胞分裂におけるプラトーの前に３、２、又は１未満の集団の倍加を有するときに行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記接触は、前記分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
異種非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含み、前記異種ＵＴＲは、調節エレメントを含む、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
【請求項３１】
表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
【請求項３２】
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることと、
ｂ）前記接触された赤血球細胞を前記外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
【請求項３３】
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡと接触させることと、
ｂ）前記接触された赤血球細胞を前記外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
【請求項３４】
脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ、
ｂ）前記赤血球細胞を前記外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、前記外来性タンパク質を生成する、方法。
【請求項３５】
脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ、
ｂ）前記赤血球細胞を前記外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、前記外来性タンパク質を生成する、方法。
【請求項３６】
外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を前記対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
【請求項３７】
外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を前記対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
【請求項３８】
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する方法であって、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞、例えば前記有核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する、方法。
【請求項３９】
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する方法であって、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞、例えば前記有核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、前記赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又は前記細胞のバッチ）を評価する、方法。
【請求項４０】
前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記ｍＲＮＡと接触させてから５日後に前記外来性タンパク質を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記集団における前記細胞は、例えば、前記ｍＲＮＡとの前記接触から５日後に前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、前記ｍＲＮＡと接触させた後、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間にわたって前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば前記反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、ｍＲＮＡの分解を阻害する条件下で提供することと、
前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で前記反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【請求項４４】
赤血球細胞の集団を提供することと、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させることとを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記集団の複数の赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む、請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
赤血球細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを更に含む、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞を前記ｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、前記細胞の集団を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
成熟段階の４、５、又は６日目に前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞は、成熟段階にある、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が、以下の特性：
ｉ．ａ）前記集団における前記細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）前記細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）前記細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）前記細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）前記細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又は
ｉｉｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項４３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイにより）前記細胞が、以下の特性：
前記集団における前記細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であること、又は
前記集団における前記細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記リボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、請求項４３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである、請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記集団の前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である、請求項４３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記集団の前記細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている、請求項４３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている前記細胞の割合は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である、請求項４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む、請求項４３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する、請求項４３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質を発現する、請求項４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、請求項４３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞の集団は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い前記外来性タンパク質を含む、請求項４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤を含む反応混合物。
【請求項６９】
前記ｍＲＮＡは、前記赤血球細胞内にある、請求項６８に記載の反応混合物。
【請求項７０】
複数の赤血球細胞を含む、請求項６８又は６９に記載の反応混合物。
【請求項７１】
リボヌクレアーゼ阻害剤のための外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、前記反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
【請求項７２】
前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記比較に応答して、
前記集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、前記必須要件は、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を上回る場合、前記集団が、続く精製ステップに好適であるとき、前記集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
前記集団を、治療としての使用に好適である、又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、前記リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合、前記集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リボヌクレアーゼ阻害剤は、ＲＮＡｓｉｎ  Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、又はＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈｕｍａである、請求項４３〜７３のいずれか一項に記載の反応混合物又は方法。
【請求項７５】
外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば前記反応混合物中にプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
前記赤血球細胞による前記ｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で前記反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【請求項７６】
赤血球細胞の集団を提供することと、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする前記ｍＲＮＡと接触させることとを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記集団の複数の赤血球細胞は、前記外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む、請求項７５又は７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を発現する、請求項７５〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞又は複数の細胞は、前記外来性タンパク質を含む、請求項７５〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、請求項７５〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
赤血球細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを更に含む、請求項７５〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞を前記ｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、例えば前記細胞を前記ｍＲＮＡと接触させる０．５〜２日前又は後に前記細胞の集団を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項７５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
成熟段階の４、５、又は６日目に前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項７５〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞は、成熟段階にある、請求項７５〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が、以下の特性：
ｉ．ａ）前記集団における前記細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）前記細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）前記細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）前記細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）前記細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）前記細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）前記集団は、前記集団が前記集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）前記集団における前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）前記集団における前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又は
ｉｉｉ．ｆ）前記集団における前記細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項７５〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイにより）前記細胞が、以下の特性：
前記集団における前記細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であること、
前記集団における前記細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であること、
前記集団における前記細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であること、又は
前記集団における前記細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）を含む時点で前記細胞を前記プロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、請求項７５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである、請求項７５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である、請求項７５〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記集団の前記細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている、請求項７５〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている細胞の割合は、前記プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である、請求項７５〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む、請求項７５〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記細胞の集団は、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する、請求項７５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質を発現する、請求項７５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、前記細胞が前記ｍＲＮＡと接触されてから５日後に前記外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、請求項７５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞の集団は、前記プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い前記外来性タンパク質を含む、請求項７５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）プロテアソーム阻害剤を含む反応混合物。
【請求項１０１】
前記ｍＲＮＡは、前記赤血球細胞内にある、請求項１００に記載の反応混合物。
【請求項１０２】
複数の赤血球細胞を含む、請求項１００又は１０１に記載の反応混合物。
【請求項１０３】
プロテアソーム阻害剤のための外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、前記反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
【請求項１０４】
前記プロテアソーム阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記比較に応答して、
前記集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、前記必須要件は、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を上回る場合、前記集団が、続く精製ステップに好適であるとき、前記集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
前記集団を、治療としての使用に好適である、又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、前記プロテアソーム阻害剤のレベルが前記基準値を下回る場合、前記集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記プロテアソーム阻害剤は、２０Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばＭＧ−１３２若しくはカルフィルゾミブ、又は２６Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブである、請求項７５〜１０５のいずれか一項に記載の反応混合物又は方法。
【請求項１０７】
第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞を、前記第１の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び前記第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、前記赤血球細胞による前記第１のｍＲＮＡ及び前記第２のｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、前記第１のｍＲＮＡ及び前記第２のｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【請求項１０８】
前記赤血球細胞は、例えば、前記ｍＲＮＡとの前記接触から５日後に前記第１の外来性タンパク質及び前記第２の外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現する赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、
ｂ）前記赤血球細胞の集団を、第１の外来性タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ及び第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法であって、前記集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、前記第１のｍＲＮＡ及び前記第２のｍＲＮＡの両方を含む、方法。
【請求項１１０】
前記赤血球細胞の集団は、例えば、前記ｍＲＮＡとの前記接触から５日後に１細胞当たり前記第１の外来性タンパク質及び前記第２の外来性タンパク質の少なくとも平均１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記接触は、電気穿孔を行うことを含む、請求項１０７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞の集団は、細胞が前記第１及び第２のｍＲＮＡと接触された後、少なくとも５日間にわたって前記細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％において前記第１の外来性タンパク質及び前記第２の外来性タンパク質を含む、請求項１０９〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現し、前記集団は、前記細胞を、前記第１又は第２の外来性タンパク質をコードするＤＮＡと接触させることによって作製されたものではない、赤血球細胞の集団。
【請求項１１４】
１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を生成する方法であって、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることを含み、それにより、前記所定の量の前記外来性タンパク質を含む前記赤血球細胞を作製する、方法。
【請求項１１５】
前記複数の赤血球細胞（例えば、脱核赤血球細胞）の１つ以上を評価して、前記外来性タンパク質の量を決定することを更に含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞のサンプル中の外来性タンパク質の量を評価する方法であって、
１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、前記複数の赤血球細胞は、前記集団を、前記外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることによって作製されたものである、提供することと、
前記複数の赤血球細胞における前記外来性タンパク質の量を決定することと
を含む方法。
【請求項１１７】
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．６±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の１，０００，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．４±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の８７０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．２±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の６１０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．１±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の２７０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．０５±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の１００，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、又は
前記細胞集団を、前記集団における５Ｅ６細胞当たり０．０２５±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり前記外来性タンパク質の４３，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出する、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記集団の前記細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、前記細胞が前記外来性タンパク質と接触されてから１日後に前記外来性タンパク質を発現する、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年７月７日出願の米国特許出願第６２／３５９４１６号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、配列表を含み、この配列表は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１７年７月７日に作製された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｒ２０８１−７０１５ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、９２１バイトのサイズを有する。
【背景技術】
【０００３】
赤血球細胞は、例えば、有毒な代謝産物を分解するか又は生体異物を不活性化するための薬物送達システム、及び他の生物医学的用途における薬物送達システムとしての使用が考えられている。改善された赤血球細胞ベースの薬物送達システムが当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、外来性ＲＮＡ（例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡ）を含む赤血球細胞に関連する組成物及び方法を含む。外来性ＲＮＡは、コード領域及び異種非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば調節エレメントを含むＵＴＲを含むことができる。代替的に又は組み合わせて、外来性ＲＮＡは、化学修飾を含むことができる。代替的に又は組み合わせて、外来性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ等の調節ＲＮＡであり得る。理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態において、外来性ＲＮＡは、例えば、安定性又は対照に対して増大された翻訳等の改善されたパラメーターを有する。
【０００５】
特定の態様において、本開示は、異種非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含む脱核赤血球細胞を提供する。
【０００６】
特定の態様において、本開示は、異種非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含む脱核赤血球細胞を提供し、異種ＵＴＲは、調節エレメントを含む。
【０００７】
特定の態様において、本開示は、１つ以上の化学修飾ヌクレオチド（例えば、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせ）を含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を提供する。
【０００８】
本開示は、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法も提供し、方法は、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることと、
ｂ）接触された赤血球細胞を外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する。
【０００９】
本開示は、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法も提供し、方法は、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡと接触させることと、
ｂ）接触された赤血球細胞を外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する。
【００１０】
本開示は、脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法を更に提供し、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ
ｂ）赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、外来性タンパク質を生成する。
【００１１】
本開示は、脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法を更に提供し、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ
ｂ）赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、外来性タンパク質を生成する。
【００１２】
特定の態様において、本開示は、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法を提供し、方法は、
調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する。
【００１３】
特定の態様において、本開示は、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法を提供し、方法は、
赤血球細胞、例えば表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する。
【００１４】
いくつかの態様において、本開示は、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する方法を提供し、方法は、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を提供することと、
ｂ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する。
【００１５】
いくつかの態様において、本開示は、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する方法を提供し、方法は、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する。
【００１６】
特定の態様において、本開示は、外来性タンパク質を含む複数の脱核赤血球細胞を生成する方法を提供し、方法は、ａ）赤血球細胞を、コード領域及び異種ＵＴＲを含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることと、ｂ）赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養することとを含み、それにより、外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を生成する。
【００１７】
いくつかの態様において、本開示は、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾若しくは表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む脱核赤血球細胞を提供する。
【００１８】
いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質を含む複数の脱核赤血球細胞を生成する方法を提供し、方法は、
ａ）赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードする、本明細書に記載される外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることであって、外来性ｍＲＮＡは、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾若しくは表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、接触させることと、
ｂ）赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を生成する。
【００１９】
特定の態様において、本開示は、ａ）赤血球細胞膜貫通タンパク質、例えばＧＰＡ又はＫｅｌｌをコードするコード領域、及びｂ）異種ＵＴＲ、例えば１つ以上の調節エレメントを含むＵＴＲ又はヘモグロビン３’ＵＴＲを含むＲＮＡ分子を提供する。
【００２０】
特定の態様において、本開示は、ａ）赤血球細胞膜貫通タンパク質、例えばＧＰＡ又はＫｅｌｌをコードするコード領域、及びｂ）本明細書に記載される１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば表１、２、又は３のヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を提供する。
【００２１】
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される赤血球細胞を生成する方法を提供し、赤血球細胞、例えば赤血球細胞前駆体を、本明細書に記載される１つ以上の核酸と接触させることと、核酸の発現を可能にする条件下に細胞を配置することとを提供する。
【００２２】
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される複数の赤血球細胞、例えば少なくとも１０８、１０９、１０１０、１０１１、又は１０１２細胞を含む製剤、例えば医薬製剤を提供する。
【００２３】
いくつかの態様において、本開示は、成熟段階中、例えば成熟段階の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日間中に赤血球細胞を外来性ｍＲＮＡと接触させる方法を提供する。
【００２４】
本明細書の任意の態様、例えば上記の態様は、本明細書の実施形態の１つ以上、例えば下記の実施形態により特徴付けることができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書の方法は、
ｃ）外来性ＲＮＡの取込み後に赤血球細胞を培養するステップ
を含む。
【００２６】
実施形態において、ＵＴＲは、対象コード領域以外のコード領域に天然に作動可能に結合された状態で生じ、又はそのような天然に生じるＵＴＲに対して少なくとも７０、８０、９０、９５、９９、又は１００％相同性を有する。実施形態において、ＵＴＲは、対象コード領域を伴って天然に生じず、例えば、対象コード領域と天然に作動可能に結合された状態で生じるＵＴＲからのそのヌクレオチドと少なくとも１ヌクレオチド、例えば少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％異なる。実施形態において、ＵＴＲは、天然に存在しない。
【００２７】
実施形態において、ＵＴＲは、３’ＵＴＲを含む。実施形態において、ＵＴＲは、５’ＵＴＲを含む。実施形態において、異種ＵＴＲは、５’ＵＴＲであり、外来性ｍＲＮＡは、異種３’ＵＴＲを更に含む。実施形態において、ＵＴＲは、イントロンに対応する領域を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、選択的スプライシングを受けることが可能であり得、例えば複数のスプライスアイソフォームをコードする。実施形態において、選択的スプライシングは、エクソンスキッピング、選択的５’供与部位使用、選択的３’受容部位使用、又はイントロン保持を含む。一実施形態において、ＵＴＲは、コード領域内のイントロンを含む。一実施形態において、コード領域内のイントロンは、ＵＴＲを含む。一実施形態において、ＵＴＲは、イントロンを含む５’ＵＴＲである。
【００２８】
実施形態において、脱核赤血球細胞は、第２のＵＴＲを更に含む。実施形態において、脱核赤血球は、３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲを含む。
【００２９】
実施形態において、ＵＴＲは、野生型ヒト細胞内に天然に生じる。実施形態において、ＵＴＲは、野生型ヒト細胞に天然に生じない。
【００３０】
実施形態において、コード領域は、野生型ヒト細胞内に天然に生じ、及び／又は野生型ヒト細胞内に天然に生じるタンパク質をコードする。実施形態において、コード領域は、野生型ヒト細胞内に天然に生じず、及び／又は野生型ヒト細胞内に天然に生じないタンパク質をコードする。実施形態において、ＵＴＲは、野生型赤血球細胞内に発現したコード領域、例えばヘモグロビンコード領域と作動可能に結合された状態で天然に生じる。
【００３１】
実施形態において、ＵＴＲは、グロビンＵＴＲ、例えばヘモグロビンＵＴＲであり、例えば配列番号１の配列、又は配列番号１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を有する。
【００３２】
実施形態において、コード領域は、酵素、抗体分子、補体調節タンパク質、キレート剤、又は表４に列挙したタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）又はフェニルアラニン−代謝断片又はその変異体を含む。
【００３３】
実施形態において、細胞は、外来性ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質を更に含む。実施形態において、細胞は、外来性ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含まない。
【００３４】
いくつかの実施形態において、細胞は、低張負荷されておらず、又は低張負荷されない。
【００３５】
実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、化学的バックボーン修飾若しくは修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。実施形態において、複数における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は８５％、外来性タンパク質を生成する。実施形態において、細胞集団は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の細胞生存率を有する。
【００３６】
実施形態において、方法は、遺伝子導入、電気穿孔、低張負荷、細胞圧の変化、細胞変形（例えば、細胞圧迫（ＣｅｌｌＳｑｕｅｅｚｅ））、又は細胞膜を破裂させて外来性ＲＮＡを細胞に進入させる他の方法を含む。
【００３７】
実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、同様の赤血球細胞内の化学修飾を欠いた対応するｍＲＮＡの半減期よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ長い、又は２倍、５倍、１０倍、２０倍、若しくは１００倍だけ長い半減期を有する。実施形態において、ｍＲＮＡの導入後に同様の時点で測定した場合、外来性ｍＲＮＡは、他に同様の赤血球細胞における化学修飾を欠いている同一の配列のｍＲＮＡのレベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ高い、又は２倍、５倍、１０倍、２０倍、若しくは１００倍だけ高いレベルで赤血球細胞内に存在する。
【００３８】
実施形態において、外来性タンパク質は、ｍＲＮＡの導入後に同様の時点で測定した場合、他に同様の赤血球細胞における化学修飾を欠いている同一の配列のｍＲＮＡにより生成されるタンパク質のレベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ高い、又は２倍、５倍、１０倍、２０倍、若しくは１００倍だけ高いレベルで赤血球細胞内に存在する。実施形態において、時点は、細胞がｍＲＮＡと接触してから１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、又は２８日後である。実施形態において、化学修飾は、シュードウリジンを含む。実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップを更に含む。実施形態において、ｍＲＮＡは、ポリＡテイルを更に含む。
【００３９】
実施形態において、外来性タンパク質は、ｍＲＮＡの導入後に同様の時点で測定した場合、他に同様の赤血球細胞におけるポリＡテイルを欠いている同一の配列のｍＲＮＡにより生成されるタンパク質のレベルよりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ高い、又は２倍、５倍、１０倍、２０倍、若しくは１００倍だけ高いタンパク質のレベルで赤血球細胞内に存在する。実施形態において、時点は、細胞がｍＲＮＡと接触してから１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、又は２８日後である。
【００４０】
実施形態において、本明細書に記載される細胞は、異種ＵＴＲ、例えば調節エレメントを含む異種ＵＴＲと、更に化学修飾とを含み、例えば表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される接触ステップ（例えば、赤血球細胞をｍＲＮＡと接触させること）は、細胞の脱核前に行われ、別の実施形態では、接触ステップは、細胞の脱核後に行われる。実施形態において、接触ステップは、複数の脱核細胞及び複数の有核細胞を含む細胞の集団に対して行われる。細胞の集団は、例えば、主として有核であるか又は主として脱核され得る。実施形態において、方法は、細胞を脱核に好適な条件下で培養することを含む。
【００４２】
本明細書の任意の方法のいくつかの実施形態において、提供は、赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることを含む。実施形態において、提供は、赤血球細胞を他の主体から受容することを含む。
【００４３】
実施形態において、本明細書に記載されるパラメーターは、外来性タンパク質を発現する能力；外来性タンパク質の構造若しくは機能；内在性ｍＲＮＡを含む細胞の割合；内在性タンパク質を含む細胞の割合；細胞内の外来性ｍＲＮＡのレベル；細胞内の外来性タンパク質のレベル；細胞増殖率；又は細胞分化状態から選択される。実施形態において、方法は、予め選択されたパラメーターに関する値を参照と比較することを含む。実施形態において、方法は、パラメーターに関する値又は参照との値の比較に応答して、細胞又は細胞のバッチを分類、容認又は拒絶することを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される細胞は、細胞の集団内に配置されている。実施形態において、細胞の集団は、本明細書に記載される複数の細胞を含み、任意選択的に、１つ以上の他の細胞、例えば外来性ｍＲＮＡを欠いている野生型赤血球細胞、有核赤血球細胞、又は非赤血球細胞を更に含む。実施形態において、細胞の集団は、少なくとも、第１の外来性ＲＮＡを含む第１の細胞及び第２の外来性ＲＮＡを含む第２の細胞を含む。実施形態において、細胞の集団は、少なくとも、第１の外来性ＲＮＡ及び第２の外来性ＲＮＡを含む第１の細胞を含む。
【００４５】
実施形態において、ＲＮＡは、インビトロ転写又は固相化学合成によって生成される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、例えば成熟段階中に赤血球細胞を外来性ｍＲＮＡと接触させることを含む実施形態では、接触は、電気穿孔を含む。いくつかの実施形態において、接触は、成熟の６〜８、５〜９、４〜１０、３〜１１、２〜１２、又は１〜１３日目に行われる。いくつかの実施形態において、接触は、成熟の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３若しくは１４日目又はその後に行われる。いくつかの実施形態において、方法は、接触後に細胞を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０日間にわたって培養することを更に含む。いくつかの実施形態において、方法は、接触後、例えば細胞をｍＲＮＡと接触させてから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日後に遺伝子導入ｍＲＮＡの発現を試験すること、例えば遺伝子導入ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベルを検出することを更に含む。
【００４７】
いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を製造する方法を提供し、方法は、
ａ）成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させる（例えば、電気穿孔する）ことと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を製造する。
【００４８】
実施形態において、方法は、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、集団を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含む。実施形態において、集団の複数の赤血球細胞は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む。実施形態において、細胞は、外来性タンパク質を発現する。実施形態において、細胞は、外来性タンパク質を含む。実施形態において、集団における複数の細胞は、外来性タンパク質を発現する。実施形態において、成熟段階における細胞の集団は、成熟培地中で３〜７日間、例えば４〜５又は４〜６日間にわたって拡大された細胞の集団である。実施形態において、成熟段階における細胞の集団は、例えば、特定のパーセントの脱核、翻訳活性、又は細胞表面マーカー発現を有する、本明細書に記載される集団である。
【００４９】
実施形態において、集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、ｍＲＮＡと接触させてから５日後に外来性タンパク質を含む。実施形態において、集団における細胞は、例えば、ｍＲＮＡとの接触から５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。実施形態において、細胞は、ｍＲＮＡと接触させた後、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間にわたって外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。実施形態において、細胞は、ｍＲＮＡと接触させた後、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間にわたって外来性タンパク質の少なくとも１，０００コピーを含む。
【００５０】
いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を製造する方法を提供し、方法は、
ａ）成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下において、赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を製造する。
【００５１】
実施形態において、方法は、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、赤血球細胞の集団の複数の細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含む。実施形態において、成熟段階における赤血球細胞の集団は、成熟培地中で３〜７日間、例えば４〜５又は４〜６日間にわたって拡大された細胞の集団である。実施形態において、赤血球細胞の集団は、以下の特性：
ｉ．ａ）集団における細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）集団における細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）集団における細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）集団は、集団が集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）集団における細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、又は
ｉｉｉ．ｆ）集団における細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又はそれを超える）を含む赤血球細胞の集団である。
【００５２】
実施形態において、複数の細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、複数の細胞は、赤血球細胞の集団から分離され、例えば複数の細胞は、脱核状態に基づいて集団から分離される（例えば、複数の細胞は、有核細胞であり、及び集団の残りのものは、脱核細胞である）。
【００５３】
実施形態において、複数の細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、方法は、例えば、集団を脱核の阻害剤（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、又はプロテアソーム阻害剤）と共にインキュベートすることにより、例えば集団の成長、発達、ヘモグロビン合成、又は脱核プロセスを停止させることにより、赤血球細胞の集団の分化ステージを同期させることを更に含む。実施形態において、停止は、集団における細胞の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０％超の脱核前に行われる。
【００５４】
いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法を提供し、方法は、
（ａ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｂ）赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｃ）分化している赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、分化している赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われる、接触させることと、
（ｄ）分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する。
【００５５】
実施形態において、更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む。実施形態において、接触は、分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる。
【００５６】
いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法を提供し、方法は、（ａ）赤血球前駆体細胞の集団を提供することと、（ｂ）赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、（ｃ）分化している赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含み、改善は、接触が、分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われることを含む。
【００５７】
実施形態において、接触は、分化している赤血球細胞の集団が細胞分裂におけるプラトーの前に３、２、又は１未満の集団の倍加を有するときに行われる。実施形態において、接触は、分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる。
【００５８】
いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法を提供し、方法は、
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、ｍＲＮＡの分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する。
【００５９】
実施形態において、方法は、赤血球細胞の集団を提供することと、集団を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含む。実施形態において、集団の複数の赤血球細胞は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む。実施形態において、細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を発現する。実施形態において、細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を含む。実施形態において、方法は、細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む。実施形態において、方法は、赤血球細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを更に含む。実施形態において、方法は、細胞をｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む。実施形態において、方法は、成熟段階の４、５、又は６日目に細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む。実施形態において、細胞は、成熟段階にある。実施形態において、成熟段階における細胞の集団は、例えば、特定のパーセント脱核、翻訳活性、又は細胞表面マーカー発現を有する、本明細書に記載される集団である。
【００６０】
実施形態において、ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである。
【００６１】
実施形態において、集団の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％（及び任意選択的に９５％まで）は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能（例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色により決定して）である。実施形態において、集団の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている。実施形態において、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている細胞の割合は、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である。実施形態において、細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む。実施形態において、細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質を発現する。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００コピーを含む。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１０，０００コピーを含む。実施形態において、細胞の集団は、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い外来性タンパク質を含む。
【００６２】
本開示は、いくつかの態様において、ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤を含む反応混合物も提供する。
【００６３】
実施形態において、ｍＲＮＡは、赤血球細胞内にある。実施形態において、反応混合物は、複数の赤血球細胞を含む。
【００６４】
本開示は、いくつかの態様において、リボヌクレアーゼ阻害剤に関する外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法も提供し、方法は、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む。
【００６５】
実施形態において、方法は、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルを基準値と比較することを含む。
【００６６】
実施形態において、方法は、比較に応答して、
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、必須要件は、例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む。
【００６７】
実施形態において、リボヌクレアーゼ阻害剤は、ＲＮＡｓｉｎ  Ｐｌｕｓ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａより）、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（例えば、Ｓｉｇｍａより）、又はＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈｕｍａ（例えば、Ｓｉｇｍａより）である。
【００６８】
本開示は、いくつかの態様において、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法を提供し、方法は、
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にプロテアーゼ阻害剤、例えばプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する。
【００６９】
実施形態において、方法は、赤血球細胞の集団を提供することと、集団を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含む。実施形態において、集団の複数の赤血球細胞は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む。実施形態において、細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を発現する。実施形態において、細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を含む。実施形態において、方法は、細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む。実施形態において、方法は、赤血球細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを更に含む。実施形態において、方法は、細胞をｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、例えば細胞をｍＲＮＡと接触させる０．５〜２日前又は後に細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む。実施形態において、方法は、細胞をｍＲＮＡと接触させる０．５〜２日前に赤血球細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む。実施形態において、方法は、電気穿孔前にプロテアソーム阻害剤を除去する（例えば、細胞を洗浄することにより）ことを含む。
【００７０】
実施形態において、方法は、成熟の３〜７日目、例えば成熟段階の４、５、又は６日目に細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む。実施形態において、細胞は、成熟段階にある。実施形態において、成熟段階における細胞の集団は、例えば、特定のパーセント脱核、翻訳活性、又は細胞表面マーカー発現を有する、本明細書に記載される集団である。
【００７１】
実施形態において、ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である。実施形態において、集団の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている。実施形態において、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている細胞の割合は、プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である。実施形態において、細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む。
【００７２】
実施形態において、細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質を発現する。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００コピーを含む。実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１０，０００コピーを含む。実施形態において、細胞の集団は、プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い外来性タンパク質を含む。
【００７３】
いくつかの態様において、本開示は、ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）プロテアソーム阻害剤を含む反応混合物を提供する。
【００７４】
実施形態において、ｍＲＮＡは、赤血球細胞内にある。実施形態において、反応混合物は、複数の赤血球細胞を含む。
【００７５】
本開示は、いくつかの態様において、プロテアソーム阻害剤に関する外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法も提供し、方法は、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む。
【００７６】
実施形態において、方法は、プロテアソーム阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む。
【００７７】
実施形態において、方法は、比較に応答して、
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、必須要件は、例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む。
【００７８】
実施形態において、プロテアソーム阻害剤は、２０Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばＭＧ−１３２若しくはカルフィルゾミブ、又は２６Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブである。
【００７９】
実施形態において、第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞を、第１の外来性タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ及び第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、赤血球細胞による第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法である。
【００８０】
実施形態において、赤血球細胞は、例えば、ｍＲＮＡとの接触から５日後に第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。
【００８１】
本開示は、いくつかの態様において、第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現する赤血球細胞の集団を生成する方法も提供し、方法は、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞の集団を、第１の外来性タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ、及び第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製し、集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡの両方を含む。
【００８２】
実施形態において、赤血球細胞の集団は、例えば、ｍＲＮＡとの接触から５日後に１細胞当たり第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質の少なくとも平均１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。
【００８３】
実施形態において、接触は、電気穿孔を行うことを含む。
【００８４】
実施形態において、細胞の集団は、細胞を第１及び第２のｍＲＮＡと接触させた後、少なくとも５日間にわたって細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％において第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を含む。実施形態において、細胞の集団は、細胞を第１及び第２のｍＲＮＡ接触させた後、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、又は１４日間にわたって細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％において第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を含む。実施形態において、細胞の集団は、細胞を第１及び第２のｍＲＮＡとさせた後、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、又は１４日間にわたって細胞の少なくとも８０％において第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を含む。
【００８５】
実施形態において、第１の外来性タンパク質は、第２の外来性タンパク質よりも１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下だけ長いアミノ酸長を有する。いくつかの実施形態において、赤血球細胞集団における第２の外来性タンパク質の平均レベルは、第１の外来性タンパク質のレベルの１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％以下である。
【００８６】
実施形態において、第１の外来性タンパク質は、第２の外来性タンパク質のアミノ酸長よりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％だけ長い、又は第２の外来性タンパク質のアミノ酸長の２倍、若しくは３倍だけ長いアミノ酸長を有する。いくつかの実施形態において、赤血球細胞集団における第２の外来性タンパク質の平均レベルは、第１の外来性タンパク質のレベルよりも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％だけ高いか、又は第１の外来性タンパク質のレベルの２倍、若しくは３倍だけ高い。
【００８７】
本開示は、特定の態様において、集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現し、集団が、細胞を第１又は第２の外来性タンパク質をコードするＤＮＡと接触させることによって作製されたものではない、赤血球細胞の集団も提供する。
【００８８】
本開示は、特定の態様において、１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を生成する方法も提供し、方法は、集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることを含み、それにより、所定の量の外来性タンパク質を含む赤血球細胞を作製する。実施形態において、方法は、複数の赤血球細胞（例えば、脱核赤血球細胞）の１つ以上を評価して、外来性タンパク質の量を決定することを更に含む。
【００８９】
いくつかの態様において、本開示は、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞のサンプル中の外来性タンパク質の量を評価する方法を提供し、方法は、
１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、赤血球細胞は、集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることによって作製されたものである、提供することと、
複数の赤血球細胞における外来性タンパク質の量を決定することと
を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、方法は、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．６±５０％、±２０％又は±１０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることが、１細胞当たり外来性タンパク質の１，０００，０００±５０％、±２０％又は±１０％のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．４±５０％、±２０％又は±１０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることが、１細胞当たり外来性タンパク質の８７０，０００±５０％、±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．２±５０％、±２０％又は±１０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることが、１細胞当たり外来性タンパク質の６１０，０００±５０％、±２０％、又は±１０％のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．１±５０％、±２０％又は±１０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることが、１細胞当たり外来性タンパク質の２７０，０００±５０％、±２０％、又は±１０％のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．０５±５０％、±２０％又は±１０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることが、１細胞当たり外来性タンパク質の１００，０００±５０％、±２０％、又は±１０％のコピーを発現する細胞の集団を産出すること、又は
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．０２５±５０％、±２０％又は±１０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることが、１細胞当たり外来性タンパク質の４３，０００±５０％、±２０％、又は±１０％のコピーを発現する細胞の集団を産出すること
を含む。
【００９１】
実施形態において、集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、細胞が外来性タンパク質と接触されてから１日後に外来性タンパク質を発現する。
【００９２】
本明細書の任意の態様のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される赤血球細胞の集団（例えば、ｍＲＮＡと接触された細胞の集団）は、
集団における細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
集団における細胞の３％、５％、１０％、２０％、又は３０％未満は、脱核されていること、
集団における細胞の０を超え（例えば、０．１％、０．２％、０，５％）且つ５０％（４０％、３０％、２０％、１８％、１５％、１２％、１０％）以下は、脱核されていること、
細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
細胞の集団は、最大脱核の６％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％未満に到達していること、
細胞の集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、少なくとも６００，０００、８００，０００、１，０００、０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，２００，０００、又は２，４００，０００の翻訳活性を有すること、
細胞の集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、６００，０００〜２，４００，０００、８００，０００〜２，２００，０００、１，０００、０００〜２，０００，０００、１，２００，０００〜１，８００，０００、又は１，４００，０００〜１，６００，０００の翻訳活性を有すること、
成熟段階における細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を有し、最大翻訳活性は、同様の数の、成熟段階における細胞の前駆体又は前駆細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の最大翻訳活性を指すこと、
集団における細胞の０．１〜２５％は、脱核され、細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから１、２又は３未満だけ倍加した集団であること、
細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
集団は、集団が集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
集団における細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定して）であること、
集団における細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定して）であること、
集団における細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定して）であること、
集団における細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定して）であること、
集団における細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定して）であること、
集団における細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定して）であること、
集団における細胞の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％）は、α４インテグリン陽性及びバンド３陽性であること、又は
集団における細胞の少なくとも５０％の細胞は、バンド３陽性であり、及び少なくとも９０％〜９５％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８又はそれを超える）である、赤血球細胞の集団である。
【００９３】
本開示は、前述した態様及び／又は実施形態の任意の１つ以上の全ての組み合わせ、並びに本明細書及び実施例に詳細した任意の実施形態の任意の１つ以上との組み合わせを想定している。
【００９４】
本明細書に記載したものと類似の又は均等な方法及び材料を本発明の実践又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により組み込まれる。例えば、例として本明細書の任意の表において本明細書に引用した全てのジェンバンク、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれる。特に明記しない限り、本明細書（本明細書の任意の表内を含む）に特定した配列受入番号は、２０１６年７月７日現在最新のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質が複数の配列受入番号を参照する場合、配列変異体の全てが包含される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】レンチウイルス形質導入後のＫ５６２赤白血病細胞に関する異なるサイズの様々なコンストラクトの発現を示すプロットである。各データ点は、特有のコンストラクトを表す。発現は、各コンストラクトが適切なエピトープタグを含むため、抗ＨＡ抗体を用いてフローサイトメトリーによって測定する。コンストラクトは、プロウイルス長により整列され、ウイルス長は、標的細胞ゲノムに組み入れられるウイルスゲノム（導入遺伝子自体を含む）における核酸の長さである。
【図２】プロウイルスがおよそ３．５ｋｂ〜およそ８．５ｋｂの範囲であるように、様々な長さの導入遺伝子を含むレンチウイルス粒子の特徴付けを示すプロットである。ｙ軸は、ｐ２４の１ｕｇ当たりのＲＮＡコピーを示す。ウイルスゲノム上清の１ｍＬ当たりのＲＮＡコピー数は、ｑＰＣＲにより測定する。ウイルスゲノム上清の１ｍＬ当たりのｐ２４（ｕｇ）の量は、ｐ２４に対するＥＬＩＳＡにより測定する。２つの測定値の比は、ｐ２４の質量当たりのＲＮＡコピー数を与える。
【図３】Ｋ５６２細胞に対して最適化した条件を用いた、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の電気穿孔から２４時間後の、フローサイトメトリーにより測定した初代前駆細胞から培養したＫ５６２細胞及び赤血球細胞におけるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｃは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の電気穿孔から２４時間後の、フローサイトメトリーにより測定した初代前駆細胞から培養した赤血球細胞におけるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。１２の異なる条件を示す（番号１〜１２）。第１の列では、ＧＦＰ蛍光が検出される。第２の列では、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ生／死染色を用いて細胞生存率が測定され、死細胞が染料により染色され、従って生細胞の百分率は１００％−％蛍光細胞である。
【図４Ｂ】図４Ａ−Ｃは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の電気穿孔から２４時間後の、フローサイトメトリーにより測定した初代前駆細胞から培養した赤血球細胞におけるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。１２の異なる条件を示す（番号１〜１２）。第１の列では、ＧＦＰ蛍光が検出される。第２の列では、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ生／死染色を用いて細胞生存率が測定され、死細胞が染料により染色され、従って生細胞の百分率は１００％−％蛍光細胞である。
【図４Ｃ】図４Ａ−Ｃは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の電気穿孔から２４時間後の、フローサイトメトリーにより測定した初代前駆細胞から培養した赤血球細胞におけるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。１２の異なる条件を示す（番号１〜１２）。第１の列では、ＧＦＰ蛍光が検出される。第２の列では、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ生／死染色を用いて細胞生存率が測定され、死細胞が染料により染色され、従って生細胞の百分率は１００％−％蛍光細胞である。
【図５】ＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の電気穿孔から２４時間後の、フローサイトメトリーにより測定した、分化の様々なステージにおける初代前駆細胞から培養した赤血球細胞におけるＧＦＰの発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。非遺伝子導入細胞がＧＦＰ  ｍＲＮＡ遺伝子導入細胞と比較される。列は、遺伝子導入前の赤血球分化の日数を指す。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ生／死染色を用いてパーセント生存率を測定し、生存可能細胞、即ち染料に関して負に染色された細胞の％として報告する。
【図６】ＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の電気穿孔から２４時間後の、フローサイトメトリーにより測定した、初代前駆細胞から培養した赤血球細胞におけるＧＦＰの発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムを示す。培養の９日目に細胞に遺伝子導入し、次いで分化培地に戻し、１３日目に再分析した。１３日目にＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いて細胞を再び電気穿孔し、２４時間後に発現に関して分析した。
【図７Ａ−Ｃ】インビトロ分化の開始後の異なる時点で電気穿孔されたＧＦＰ陽性赤血球細胞のパーセントを示す。図７Ａは、拡大、分化、及び成熟段階を示す。図７Ｂは、成熟の９日目までアッセイした際の、分化の９日目の電気穿孔後のＧＦＰ陽性細胞の百分率を示す。図７Ｃは、成熟の１６日目までアッセイした際の、成熟の７日目の電気穿孔後のＧＦＰ陽性細胞の百分率を示す。「ＥＰなし」は、電気穿孔されていない対照を示す。「Ｐ１〜Ｐ４」は、４つの電気穿孔条件を示す。
【図８Ａ−Ｂ】成熟のＭ４〜Ｍ７日に、赤血球細胞がＧＦＰをコードするｍＲＮＡを用いて電気穿孔された際の示された時点でのＧＦＰを発現する赤血球細胞におけるＧＦＰ発現を示すグラフである。図８Ａは、ＧＦＰを発現する細胞の百分率を示し、図８Ｂは、細胞の平均蛍光強度を示す。
【図９】赤血球細胞成熟の時間経過を示すグラフである。円は、ＡＨＡ強度／組み入れにより測定した翻訳のレベルを示す。四角は、脱核レベルを示す。
【図１０】赤血球細胞成熟の時間経過を示すグラフであり、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞の百分率をｙ軸上に示す。ＥＰ、電気穿孔対照（ＲＮａｓｉｎなし）。ＥＰなしＵＴ、非遺伝子導入対照、電気穿孔なし。ＥＰ＋ＲＮａｓｉｎ  ０．５、０．５Ｕ／ｕｌ  ＲＮａｓｉｎで処理した電気穿孔サンプル。ＥＰ＋ＲＮａｓｉｎ  １、１Ｕ／ｕｌ  ＲＮａｓｉｎで処理した電気穿孔サンプル。ＥＰ＋ＲＮａｓｉｎ  ２、２Ｕ／ｕｌ  ＲＮａｓｉｎで処理した電気穿孔サンプル。
【図１１】有効な発現（平均蛍光強度×蛍光細胞の数）／１×１０６）対異なる時点においてプロテアソーム阻害剤で処理した細胞の時間を示すグラフである。
【図１２】Ｍ４日にＧＦＰ−ＰＡＬネイキッドｍＲＮＡ、ＧＦＰ−ＰＡＬポリＡキャップｍＲＮＡ、ＧＦＰ−ＰＡＬネイキッド修飾ｍＲＮＡ、又はＧＦＰ−ＰＡＬポリＡキャップ修飾ｍＲＮＡを用いて電気穿孔した細胞に関する、ＧＦＰ陽性細胞の百分率を示すグラフである。ＧＦＰ発現は、Ｍ５（２４時間後）、Ｍ６、Ｍ７、及びＭ１０日にフローサイトメトリーによって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００９６】
定義
本明細書で使用するとき、用語「抗体分子」は、タンパク質、例えば少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む免疫グロブリン鎖又はその断片を指す。用語「抗体分子」は、抗体及び抗体断片を包含する。一実施形態において、抗体分子は、多特異性抗体分子、例えば二重特異性抗体分子である。抗体分子の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）等の単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片等の抗体断片から形成された多特異性抗体、抗体の単離されたエピトープ結合断片、マキシボディ（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖが挙げられる。
【００９７】
本明細書で使用するとき、「分化条件」は、典型的にはエリスロポエチン及び他の成長因子の添加を伴って、その下でエクスビボ培養物中において赤血球前駆体細胞、例えばＨＳＣ、又はＣＤ３４＋細胞が増幅し、脱核赤血球細胞（例えば、脱核網状赤血球又は赤血球）に分化する条件である。このプロセスは、典型的には、増殖／拡大段階、分化段階、及び成熟段階（その間に細胞がそれらの核を喪失する）を含む。分化条件は、当技術分野で既知である。例えば、Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ，Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  ＣＤ３４−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ，Ｙｏｌｋ  Ｓａｃ，Ｆｅｔａｌ  Ｌｉｖｅｒ，Ｃｏｒｄ  Ｂｌｏｏｄ，ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１２  Ａｕｇ；１（８）：６０４−６１４、及びそれに引用される参考文献を参照されたい。本明細書で使用される「赤血球細胞」は、造血性幹細胞（ＨＳＣｓ）等の赤血球前駆体細胞、及びＣＤ３４＋細胞等の有核赤血球前駆体細胞、有核赤血球細胞前駆体、脱核赤血球細胞（例えば、網状赤血球又は赤血球）、及び赤血球前駆体細胞と脱核赤血球との間の任意の中間体等を含む赤血球系列の細胞である。一実施形態において、赤血球細胞は、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染赤芽球、正染性赤芽球、網状赤血球、又は赤血球である。一実施形態において、赤血球細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血性幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、骨髄系共通前駆（ＣＭＰ）細胞、未分化胚細胞コロニー形成細胞、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤血球前駆（ＭＥＰ）細胞、赤血球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、網状赤血球、赤血球、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、又はそれらの組み合わせである。
【００９８】
実施形態において、赤血球細胞は、不死若しくは不死化細胞であり、又は不死若しくは不死化細胞から誘導される。例えば、不死化赤芽球細胞は、ＣＤ３４＋造血性前駆細胞のレトルウイルス形質導入により生成されて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現し、ＴＰ５３を抑制し得る（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｒ、印刷前の電子出版、９月３日に記載されているように）。加えて、細胞は自家使用に意図され、又は同種血輸血の供給源を提供し得る。いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、培養される。
【００９９】
本明細書で使用するとき、「脱核されている」は、核を欠いた細胞、例えば成熟赤血球細胞への分化により、その核を喪失した細胞を指す。
【０１００】
「外来性ポリペプチド」は、外来性ポリペプチドを含む細胞のタイプの野生型細胞により生成されないポリペプチド、又は外来性ポリペプチドを含む細胞内よりも低いレベルで野生型細胞内に存在するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドは、細胞内に導入された核酸によりコードされるポリペプチドであり、その核酸は、任意選択的に、細胞によって保持されない。
【０１０１】
ｍＲＮＡを修飾するのに使用される際の用語「外来性」は、ｍＲＮＡと、選択された対象細胞、例えば赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞との間の関係を指す。外来性ｍＲＮＡは、対象細胞内に天然に存在しない。一実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、選択された対象細胞内で天然に生じないポリペプチド（外来性ポリペプチド）を発現する。実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、選択された対象細胞内で天然に生じない第１の部分と、選択された対象細胞内で天然に生じない第２の部分とを含む。
【０１０２】
非翻訳領域（ＵＴＲ）を修飾するのに使用される際の用語「異種」は、ＵＴＲと、ＵＴＲが作動可能に結合されたコード領域（対象コード領域）との間の関係を指す。ＵＴＲは、以下の特性の１つ以上を有する場合、異種ＵＴＲである：ｉ）天然に存在しない；ｉｉ）対象コード領域を伴って天然に生じない、例えば対象コード領域と作動可能に結合された状態で天然に生じるＵＴＲと少なくとも１ヌクレオチド異なる、例えばそのヌクレオチドの少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％が異なる；又はｉｉｉ）ＵＴＲが、対象コード領域に作動可能に結合された状態で天然に生じないが、対象コード領域以外のコード領域と作動可能に結合された状態で天然に生じる、又はそのような天然に生じるＵＴＲに対して少なくとも少なくとも７０、８０、９０、９５、９９、又は１００％相同性を有する。
【０１０３】
核酸に関連して本明細書で使用される「修飾された」は、標準型核酸と異なる核酸の構造的特徴を指す。これは、核酸又はヌクレオチドの任意の特定の作製プロセスを示唆するものではない。
【０１０４】
ＲＮＡ配列に関連して本明細書で使用される用語「調節エレメント」は、例えば、小分子、ＲＮＡ結合タンパク質、又はｍｉＲＮＡ等の調節ＲＮＡの存在又はレベルに応答して、ＲＮＡの特性（例えば、安定性又は翻訳可能性、例えば調節エレメントが作動可能に結合されたコード領域の翻訳レベル）を調節（例えば、上方調節又は下方調節）することが可能な配列を指す。
【０１０５】
化学修飾核酸
外来性ＲＮＡは、非修飾又は修飾核酸塩基を含むことができる。天然に生じるＲＮＡは、４つの塩基性リボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰから合成されるが、転写後に修飾されたヌクレオチドを含むことができる。更に、およそ１００の異なるヌクレオシド修飾がＲＮＡで特定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ  ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９  ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：１９６−１９７）。ＲＮＡは、天然に生じない完全合成ヌクレオチドも含むことができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、化学修飾は、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１６／０３２４５４号明細書、米国特許出願公開第２００９０２８６８５２号明細書、国際出願国際公開第２０１２／０１９１６８号パンフレット、国際公開第２０１２／０４５０７５号パンフレット、国際公開第２０１２／１３５８０５号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８７３６号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９８５７号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９８６１号パンフレット、国際公開第２０１３／０５２５２３号パンフレット、国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット、国際公開第２０１３／０９６７０９号パンフレット、国際公開第２０１３／１０１６９０号パンフレット、国際公開第２０１３／１０６４９６号パンフレット、国際公開第２０１３／１３０１６１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７２号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６７号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１４／０２８４２９号パンフレット、国際公開第２０１４／０８１５０７号パンフレット、国際公開第２０１４／０９３９２４号パンフレット、国際公開第２０１４／０９３５７４号パンフレット、国際公開第２０１４／１１３０８９号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４７１１号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４７６７号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４０３９号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２５４０号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０３１号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０２７号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２２１１号パンフレット、国際公開第２０１４／１５８７９５号パンフレット、国際公開第２０１４／１５９８１３号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット、国際公開第２０１５／００６７４７号パンフレット、国際公開第２０１５／０３４９２８号パンフレット、国際公開第２０１５／０３４９２５号パンフレット、国際公開第２０１５／０３８８９２号パンフレット、国際公開第２０１５／０４８７４４号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１２１４号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１１７３号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１１６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０５８０６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０８５３１８号パンフレット、国際公開第２０１５／０８９５１１号パンフレット、国際公開第２０１５／１０５９２６号パンフレット、国際公開第２０１５／１６４６７４号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１３０号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１２８号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１１８号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１２２６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１２２２号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１３０６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４８４６号パンフレット、国際公開第２０１６／０２２９１４号パンフレット、国際公開第２０１６／０３６９０２号パンフレット、国際公開第２０１６／０７７１２５号パンフレット、国際公開第２０１６／０７７１２３号パンフレットに提供されているものである。ポリヌクレオチドへの化学修飾ヌクレオチドの組み込みは、ヌクレオチド内の修飾の位置に応じて、核酸塩基、バックボーン、又はその両方に組み込まれた修飾をもたらし得ることが理解される。いくつかの実施形態では、バックボーン修飾はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第２８１３５７０号明細書に提供されているものである。いくつかの実施形態において、修飾キャップは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０２８７５３９号明細書に提供されているものである。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡ：アンチリバースキャップアナログ（ｍ２７．３’−ＯＧＰ３Ｇ）、ＧＰ３Ｇ（非メチル化キャップアナログ）、ｍ７ＧＰ３Ｇ（モノメチル化キャップアナログ）、ｍ３２．２．７ＧＰ３Ｇ（トリメチル化キャップアナログ）、ｍ５ＣＴＰ（５’−メチル−シチジン三リン酸）、ｍ６ＡＴＰ（Ｎ６−メチル−アデノシン−５’−三リン酸）、ｓ２ＵＴＰ（２−チオ−ウリジン三リン酸）、及びΨ（シュードウリジン三リン酸）の１つ以上を含む。実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、Ｎ６−メチルアデノシンを含む。実施形態において、修飾ｍＲＮＡは、シュードウリジンを含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、外来性ＲＮＡは、バックボーン修飾、例えばバックボーンにおける糖又はリン酸基に対する修飾を含む。いくつかの実施形態において、外来性ＲＮＡは、核酸塩基修飾を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップを含む。例えば、いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、２つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれを超える）異なるタイプの化学修飾を含む。一例として、外来性ｍＲＮＡは、例えば、例として表１において本明細書に記載される、２つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれを超える）異なるタイプの修飾された核酸塩基を含むことができる。代替的に又は組み合わせて、外来性ｍＲＮＡは、例えば、例として表２において本明細書に記載される、２つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれを超える）異なるタイプのバックボーン修飾を含むことができる。代替的に又は組み合わせて、外来性ｍＲＮＡは、例えば、例として表３において本明細書に記載される、２つ以上の（例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれを超える）異なるタイプの修飾キャップを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、１つ以上のタイプの修飾核酸塩基及び１つ以上のタイプのバックボーン修飾；１つ以上のタイプの修飾核酸塩基及び１つ以上の修飾キャップ；１つ以上のタイプの修飾キャップ及び１つ以上のタイプのバックボーン修飾；又は１つ以上のタイプの修飾核酸塩基、１つ以上のタイプのバックボーン修飾、及び１つ以上のタイプの修飾キャップを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれを超える）修飾核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの全核酸塩基は、修飾されている。いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、バックボーンにおける１つ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれを超える）位置が修飾されている。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡの全バックボーン位置が修飾されている。
【０１１１】
異種非翻訳領域
本明細書に記載される外来性ｍＲＮＡは、１つ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれを超える）異種ＵＴＲを含むことができる。ＵＴＲは、例えば、３’ＵＴＲ又は５’ＵＴＲであり得る。実施形態において、異種ＵＴＲは、真核生物、例えば動物、例えば哺乳動物、例えばヒトＵＴＲ配列、又は前述のいずれかの一部若しくは変異体を含む。実施形態において、異種ＵＴＲは、合成配列を含む。実施形態において、異種ＵＴＲは、ウイルスＵＴＲ以外、例えば肝炎ウイルスＵＴＲ以外、例えばＷｏｏｄｃｈｕｃｋ肝炎ウイルスＵＴＲ以外である。
【０１１２】
理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、翻訳中のリボソームの走査時間を短縮するために短い。実施形態において、非翻訳領域は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、又は５ヌクレオチド未満の長さを有する。実施形態において、５’ＵＴＲは、天然に生じる５’ＵＴＲからの１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、又は５以下の連続ヌクレオチドを有する配列を含む。実施形態において、ＲＮＡは、５’ＵＴＲを欠いている。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、開始コドン（ｕＡＵＧ）の上流にＡＵＧを含まない。本明細書の非限定的な学説によれば、天然に生じるいくつかの５’ＵＴＲは、コードされた遺伝子の翻訳を調節、例えば低減し得る１つ以上のｕＡＵＧｓを含む。ときに、ｕＡＵＧｓは、終止コドンと対合されてｕＯＲＦｓを形成する。従って、いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、天然に生じる５’ＵＴＲと類似した配列を有するが、天然に生じる５’ＵＴＲに対して１つ以上のｕＡＵＧｓ又はｕＯＲＦｓを欠いている。１つ以上のｕＡＵＧｓは、例えば、欠失又は置換突然変異により除去され得る。
【０１１４】
本明細書に提供する異種ＵＴＲは、例えば、赤血球細胞を、異種ＵＴＲを含むｍＲＮＡと接触させることにより、精製ＲＮＡの一部として提供され得ることが理解される。本明細書の異種ＵＴＲは、例えば、細胞が異種ＵＴＲを含むＲＮＡにＤＮＡを転写できるようにする条件下で赤血球細胞をＤＮＡと接触させることにより、ＤＮＡを介して提供することもできる。
【０１１５】
実施形態において、３’ＵＴＲは、ポリＡテイル、例えば少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００アデノシンを含む。
【０１１６】
実施形態において、外来性ＲＮＡは、下流エレメントへの上流エレメントの直接又は間接的な結合によるＲＮＡの環状化を可能にする５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。実施形態において、外来性ＲＮＡは、環状化に関与する５’キャップを含む。
【０１１７】
調節エレメントを含むＵＴＲ
実施形態において、ＵＴＲは、調節エレメントを含む。調節エレメントは、それが作動可能に結合されたコード領域の特性（例えば、安定性又は翻訳レベル）を調節（例えば、上方調節又は下方調節）することができる。いくつかの実施形態において、調節エレメントは、ＲＮＡの翻訳のタイミングを制御する。例えば、ＲＮＡは、細胞周期の段階、病原体（例えば、細胞に侵入するウイルス）の存在若しくはレベル、赤血球細胞分化のステージ、細胞内の分子（例えば、代謝産物、シグナル伝達分子、又はｍｉＲＮＡ等のＲＮＡ）の存在若しくはレベル、又は細胞外の分子（例えば、赤血球細胞の表面上の受容体により結合されたタンパク質）の存在若しくはレベルに応答して翻訳され得る。
【０１１８】
実施形態において、調節エレメントは、Ｃａｌｌｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｃｋｉｎｇ，ｔｕｎｉｎｇ，ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｂｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ”ＰＮＡＳ  １０７：３６，ｐ．１５８９８−１５９０３に記載されているようなリボレギュレーターを含む。実施形態において、リボレギュレーターは、リボソーム結合部位を遮蔽することによりｍＲＮＡの翻訳を抑止するヘアピンを含む。実施形態において、トランス活性化ＲＮＡは、ヘアピンに結合し、ヘアピンを開放し、リボソーム結合部位を露出し、ｍＲＮＡの翻訳を可能にする。実施形態において、リボソーム結合部位は、ＩＲＥＳ、例えばＰｅｄｅｒｓｅｎ，ＳＫ、ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００２  Ａｐｒ  １；３６３（Ｐｔ  １）：３７−４４に記載されているヒトＩＧＦ−ＩＩ  ５’ＵＴＲ由来ＩＲＥＳである。
【化１】
2019520829.tif 000002
【０１１９】
実施形態において、調節エレメントは、例えば、国際公開第２０１２０５８４８８号パンフレットに記載されているようなトーホールドスイッチを含む。実施形態において、トーホールドは、リボレギュレーターのように機能し、更に、トーホールドと称される短い一本鎖配列を含み、配列は、トランス−調節ＲＮＡに対する相同性を有する。実施形態において、トーホールドは、異なる結合パートナーをサンプリングすることにより、トランス−調節ＲＮＡが存在するか否かをより迅速に検出することができる。
【０１２０】
実施形態において、調節エレメントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｒａｕｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｅｆｏｒｅ  Ｉｔ  Ｇｅｔｓ  Ｓｔａｒｔｅｄ：  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ５’  ＵＴＲ”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０１２（２０１２），Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４７５７３１，８  ｐａｇｅｓに記載されているものである。
【０１２１】
実施形態において、調節エレメントは、上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含む。ｕＯＲＦは、ｕＡＵＧと、ｕＡＵＧと共にインフレームの終止コドンとを含む。ｕＯＲＦｓは、多くの場合、リボソームがｕＯＲＦを翻訳した後、終止コドンで停止した際、下流コード領域に到達することなく、翻訳のネガティブレギュレーターとして作用する。例示的なｕＯＲＦｓは、真菌アルギニンアテニュエータペプチド（ＡＡＰ）に見出されるものであり、これは、アルギニン濃度により調節される。別の例示的なｕＯＲＦは、酵母ＧＣＮ４に見出され、ここで、翻訳は、アミノ酸飢餓条件下で活性化される。他のｕＯＲＦは、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ｃ（ＣＰＴ１Ｃ）ｍＲＮＡに見出され、ここで、抑止は、ブドウ糖欠乏に応答して緩和される。いくつかの実施形態において、ｕＯＲＦは、合成ｕＯＲＦである。いくつかの実施形態において、ｕＯＲＦは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤タンパク質（ＣＤＫＮ２Ａ）、トロンボポエチン、無毛相同体、ＴＧＦ−β３、ＳＲＹ、ＩＲＦ６、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＳＰＩＮＫ１、又はＨＢＢに関するｍＲＮＡの５’ＵＴＲに見出されるものである。
【０１２２】
実施形態において、調節エレメントは、ヘアピン等の二次構造を含む。実施形態において、ヘアピンは、約−３０、−４０、−５０、−６０、−７０、−８０、−９０、又は−１００ｋｃａｌ／モル又はそれを超える自由エネルギーを有し、ヘアピンを欠いたｍＲＮＡに比較してｍＲＮＡの翻訳を低減するのに十分である。実施形態において、二次構造は、ＹＢ−１に結合するＴＧＦ−β１  ｍＲＮＡ、又はその断片若しくは変異体に見出されるものである。
【０１２３】
実施形態において、調節エレメントは、ＲＰＢ（ＲＮＡ結合タンパク質）結合モチーフを含む。実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＨｕＲ、Ｍｕｓａｓｈｉ、ＩＲＰ（例えば、ＩＲＰ１又はＩＲＰ２）、ＳＸＬ、又はｌｉｎ−１４を含む。実施形態において、調節エレメントは、ＩＲＥ、ＳＸＬ結合モチーフ、ｐ２１  ５’ＵＴＲ  ＧＣ−リッチステムループ、又はｌｉｎ−４モチーフを含む。ＩＲＰ１及びＩＲＰ２は、鉄応答エレメント（ＩＲＥ）と称されるステムループ配列に結合し、この結合は、翻訳に対する立体的遮断を形成する。ＳＸＬタンパク質は、ＳＸＬ結合モチーフ、例えば５’ＵＴＲ内のイントロン内のポリＵストレッチに結合し、イントロン保持をもたらす。ＳＸＬタンパク質は、３’ＵＴＲ内のポリＵ領域にも結合して、前開始複合体のリクルートメントを遮断し、翻訳を抑止する。ＳＸＬはまた、ｕＯＲＦの翻訳を促進し、主なコード領域の翻訳を抑止する。ｐ２１  ５’ＵＴＲ  ＧＣ−リッチステムループは、ＣＵＧＢＰ１（翻訳活性化因子）又はカルレティキュリン（ＣＲＴ、翻訳リプレッサー）により結合される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、調節エレメントは、トランス作動性ＲＮＡに関する結合部位を含む。いくつかの実施形態において、トランス作動性ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。実施形態において、非翻訳領域は、ＲＮＡ結合配列、例えばｌｉｎ−１４  ３’ＵＴＲを含み、これは、ｌｉｎ−４  ＲＮＡにより結合されて、それによりｌｉｎ−１４  ＲＮＡの翻訳を下方調節する保存配列を含む（Ｗｉｇｈｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．７５，８５５-８６２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３，１９９３）。
【０１２５】
実施形態において、調節エレメントは、リボソームＲＮＡに結合する、例えばリボソームの短絡を促進して５’ＵＴＲのセグメントを迂回し、開始コドンに到達する配列を含む。実施形態において、短絡を促進する調節配列は、カリフラワーモザイクウイルス又はアデノウイルスに見出される配列である。
【０１２６】
赤血球細胞タンパク質のＵＴＲ
いくつかの実施形態において、非翻訳領域は、野生型赤血球細胞、例えば成熟赤血球細胞内で発現するＲＮＡのＵＴＲである。実施形態において、ＵＴＲは、Ｉ型赤血球細胞膜貫通タンパク質（例えば、グリコホリンＡ）、ＩＩ型赤血球細胞膜貫通タンパク質（例えば、Ｋｅｌｌ又はＣＤ７１）、又はＧＬＵＴ１等のＩＩＩ型赤血球細胞膜貫通タンパク質に関する遺伝子のＵＴＲである。実施形態において、ＵＴＲは、ＣＤ２３５ａ、ｃ−Ｋｉｔ、ＧＰＡ、ＩＬ３Ｒ、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ７１、バンド３、ヘモグロビン、及びα４インテグリン等の赤血球細胞タンパク質のＵＴＲである。実施形態において、ＵＴＲは、スペクトリン、アンキリン、４．１Ｒ、４．２、ｐ５５、トロポモジュリン、又は４．９に関する遺伝子のＵＴＲである。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、非翻訳領域は、ヘモグロビンＵＴＲ、例えば配列番号１：
【化２】
2019520829.tif 000003
の３’ヘモグロビンＵＴＲを含む。実施形態において、非翻訳領域は、配列番号１の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、又は１３０ヌクレオチドストレッチを含む。実施形態において、非翻訳領域は、配列番号１の配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、異種３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、異種５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、外来性ｍＲＮＡは、異種３’ＵＴＲ及び異種５’ＵＴＲを含む。
【０１２９】
調節ＲＮＡ
本発明は、いくつかの態様において、調節ＲＮＡを含む赤血球細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、外来性ｍＲＮＡを更に含む。
【０１３０】
関連する態様において、本発明は、赤血球細胞を調節ＲＮＡと接触させる方法を含む。実施形態において、方法は、細胞を外来性ｍＲＮＡと接触させることを更に含む。実施形態において、細胞は、調節ＲＮＡと接触する前、接触中、又は接触した後、外来性ｍＲＮＡと接触する。
【０１３１】
関連する態様において、本発明は、（ｉ）調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ又は抗ｍｉＲ）、及び（ｉｉ）本明細書に記載される外来性ｍＲＮＡ、例えばヒト細胞（例えば、ヒト赤血球細胞）内での発現にコドン最適化されたｍＲＮＡ、赤血球細胞膜貫通セグメントを含むｍＲＮＡ、又は本明細書に記載される異種ＵＴＲ（ヘモグロビンＵＴＲ又は他の赤血球細胞タンパク質からのＵＴＲ等）を含むｍＲＮＡを含む組成物（例えば、精製又は単離された組成物）を含む。
【０１３２】
実施形態において、調節ＲＮＡは、外来性ｍＲＮＡの特性（例えば、安定性又は翻訳）を調節する。いくつかの実施形態において、調節ＲＮＡは、赤血球細胞に影響を与え、例えばその増殖又は分化に影響する。いくつかの実施形態において、影響された増殖は、出発細胞が行う分裂（例えば、培養物中）の数を増大させること、及び／又は出発細胞若しくは集団から生成される細胞の総数を増大させることを含む。いくつかの実施形態において、分化の制御は、成熟及び／又は脱核を促進することを含む。いくつかの実施形態において、調節ＲＮＡは、ＥＰＯをコードし、例えば赤血球細胞の増殖を刺激する。
【０１３３】
実施形態において、調節ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ヒトｍｉＲＮＡ、例えば本明細書の表１２に列挙されるｍｉＲＮＡ、例えば「ＭＩＲ」で始まる命名を有する、表１２のエレメントの１つ、又はそれに対する１、２、３、４、若しくは５以下の変更（例えば、置換、挿入、又は欠失）を有する配列である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、調節ＲＮＡは、抗ｍｉＲである。いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲは、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズし、ｍｉＲＮＡがその標的ｍＲＮＡに結合することを防止することにより、ｍｉＲＮＡ（内在性ｍｉＲＮＡ等）を阻害する。いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲは、ヒトｍｉＲＮＡ、例えば本明細書の表１２に列挙されるｍｉＲＮＡ、例えば「ＭＩＲ」で始まる命名を有する、表１２のエレメントの１つ、又はそれに対する１、２、３、４、若しくは５以下の変更（例えば、置換、挿入、又は欠失）を有する配列に結合し及び／又はｍｉＲＮＡに対して相補性を有する。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、調節ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンス分子である。実施形態において、ｓｉＲＮＡは、互いにハイブリダイズすることができるセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡと更にハイブリダイズすることができ；１つ又は２つの平滑末端を有することができ；３’ｄＴｄＴオーバーハング等の１つ又は２つのオーバーハングを有することができ；化学修飾を含むことができ；キャップを含むことができ；及びコンジュゲートを含むことができる。実施形態において、ｓｈＲＮＡは、センス領域、アンチセンス領域、及びループ領域を有するヘアピン構造を含み、センス領域及びアンチセンス領域は、互いにハイブリダイズすることができ、アンチセンス領域は、標的ｍＲＮＡに更にハイブリダイズすることができ；平滑末端を有することができ；オーバーハングを有することができ；化学修飾を含むことができ；キャップを含むことができ；及びコンジュゲートを含むことができる。実施形態において、アンチセンス分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる単鎖を含み；化学修飾を含むことができ；キャップを含むことができ；及びコンジュゲートを含むことができる。
【０１３６】
脂質ナノ粒子方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して、例えば遺伝子導入により赤血球細胞内に導入される。従って、いくつかの態様において、本開示は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを赤血球細胞内に導入する方法を提供し、方法は、赤血球細胞をｍＲＮＡ及びＬＮＰ、例えば本明細書に記載されるＬＮＰと接触させることを含む。本開示は、赤血球細胞、ｍＲＮＡ、及びＬＮＰを含む反応混合物も提供する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ＬＮＰと複合体化される。実施形態において、ＬＮＰと接触する細胞の集団は、少なくとも１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、又は５×１０９、１×１０１０、２×１０１０、又は５×１０１０細胞を含む。
【０１３７】
例示的なＬＮＰは、カチオン性トリアルキル脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート及びリン脂質）、及び脂質粒子中にカプセル化されたｍＲＮＡ分子を含む。実施形態において、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、又はそれらの混合物を含む。実施形態において、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ−リン脂質コンジュゲート、ＰＥＧ−セラミド（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される。実施形態において、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジデシルオキシプロピル（Ｃ１０）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）コンジュゲート、及びそれらの混合物からなる群から選択される。実施形態において、ＬＮＰは、コレステロールを更に含む。更なるＬＮＰは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６０２５６５６７号明細書に記載されている。
【０１３８】
別の例示的なＬＮＰは、構造式（Ｉ）：
【化３】
2019520829.tif 000004
を有する脂質、又はその塩を含むことができ、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、水素、任意選択的に置換されたＣ７−Ｃ３０アルキル、任意選択的に置換されたＣ７−Ｃ３０アルケニル及び任意選択的に置換されたＣ７−Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され；
但し、（ａ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも２つは、水素ではなく、（ｂ）水素ではないＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８の少なくとも２つの２つは、互いに対して１、３配置、１、４配置又は１、５配置で存在することを条件とし；
Ｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル及びＣ２−Ｃ６アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１は、独立して、水素、任意選択的に置換されたＣ１−Ｃ７アルキル、任意選択的に置換されたＣ２−Ｃ７アルケニル及び任意選択的に置換されたＣ２−Ｃ７アルキニルからなる群から選択され、但し、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１の１つは、存在しなくてもよいことを条件とし；
ｎ及びｍは、各々独立して０又は１である。
【０１３９】
例えば、脂質は、下記の構造：
【化４】
2019520829.tif 000005
の１つを含むことができる。
【０１４０】
実施形態において、ＬＮＰは、リン脂質、コレステロール、又はリン脂質とコレステロールとの混合物等の非カチオン性脂質を更に含む。実施形態において、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、又はそれらの混合物を含む。更なるＬＮＰは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３００６４８９４号明細書に記載されている。
【０１４１】
別の例示的なＬＮＰは、（ａ）核酸、例えばｍＲＮＡ；（ｂ）粒子中に存在する総脂質の５０モル％〜６５モル％（例えば、５２モル％〜６２モル％）を構成するカチオン性脂質；（ｃ）リン脂質とコレステロール又はその誘導体との混合物を含む非カチオン性脂質（リン脂質は、粒子中に存在する総脂質の４モル％〜１０モル％を構成し、コレステロール又はその誘導体は、粒子中に存在する総脂質の３０モル％〜４０モル％を構成する）；及び（ｄ）粒子中に存在する総脂質の０．５モル％〜２モル％を構成する、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート化脂質を含む。実施形態において、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、又はそれらの混合物を含む。実施形態において、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート化脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質コンジュゲートを含む。実施形態において、ＰＥＧ−脂質コンジュゲートは、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＡＧ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＡＡ）コンジュゲート、又はそれらの混合物を含む。実施形態において、ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＭＡ）コンジュゲート、ＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（ＰＥＧ−ＤＳＡ）コンジュゲート、又はそれらの混合物を含む。更なるＬＮＰは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０５８，０６９号明細書に記載されている。
【０１４２】
赤血球細胞を製造する方法
赤血球前駆体細胞の成熟赤血球細胞への分化方法は、既知である。例えば、Ｄｏｕａｙ＆Ａｎｄｒｅｕ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｍｅｄ  Ｒｅｖ．２００７  Ａｐｒ；２１（２）：９１−１００；Ｇｉａｒｒａｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５  Ｊａｎ；２３（１）：６９−７４；Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１２  Ａｕｇ；１（８）：６０４−６１４、及びそれに引用される参考文献を参照されたい。
【０１４３】
外来性ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む（例えば、発現する）赤血球細胞を製造する方法は、例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット及び国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載されており、それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、造血性前駆細胞、例えばＣＤ３４＋造血性前駆細胞を、１つ以上の外来性ポリペプチドをコードする核酸（１つ又は複数）と接触させ、細胞を培養物中で増殖及び分化させる。
【０１４５】
実施形態において、方法は、例えば、本明細書に記載されるように細胞を電気穿孔するステップを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、少なくとも１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００倍（及び任意選択的に１００，０００、２００，０００、又は５００，０００倍まで）だけ増殖する。細胞の数は、いくつかの実施形態において、自動細胞計数装置を使用して計測される。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞の集団は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９８％（及び任意選択的に約８０、９０、又は１００％まで）の脱核細胞を含む。いくつかの実施形態において、赤血球細胞の集団は、１％未満の生きている脱核細胞を含み、例えば検出可能な生きている脱核細胞を含まない。脱核は、いくつかの実施形態において、核染色を用いてＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態において、集団における赤血球細胞の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０％（及び任意選択的に約７０、８０、９０、又は１００％まで）は、外来性ＲＮＡ及び／又はポリペプチドを含む。外来性ポリペプチドの発現は、いくつかの実施形態において、ポリペプチドに対する標識抗体を使用してＦＡＣＳにより測定される。いくつかの実施形態において、脱核細胞の集団は、約１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、２×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜２×１０１１、２×１０１１〜５×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜２×１０１２、２×１０１２〜５×１０１２、又は５×１０１２〜１×１０１３細胞を含む。
【０１４８】
例示的な外来性ポリペプチド及びその使用
外来性タンパク質の１つ以上は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞の翻訳後修飾特性を有し得る。いくつかの実施形態において、外来性タンパク質の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）は、グリコシル化され、リン酸化され、又はそれらの両方である。糖タンパク質のインビトロ検出は、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロットで日常的に達成される。糖タンパク質の細胞局在化は、当技術分野で既知のレクチン蛍光コンジュゲートを利用して達成することができる。リン酸化は、リン酸化特異的抗体を使用したウェスタンブロットにより評価することができる。
【０１４９】
翻訳後修飾は、疎水性基に対するコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、又はグリピエーション（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ））、補因子に対するコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮ又はＦＡＤ）、ヘムＣ結合、ホスホパンテテイニル化、又はレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ハイプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ−アシル化、Ｎ−アシル化、又はＳ−アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化又はエチル化）、アミド化、ブチリル化、γ−カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、例えばＡＤＰ−リボシル化、酸化、リン酸エステル（Ｏ−結合）又はホスホロアミデート（Ｎ−結合）形成等のヌクレオチド付加、（例えば、リン酸化又はアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオニル化、Ｓ−ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ＩＳＧイル化、ＳＵＭＯイル化、ユビキチン化、ＮＥＤＤ化、又はアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、エリミニル化、又はカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニン、又はメチオニンの）も含む。実施形態において、グリコシル化は、糖タンパク質をもたらすアルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、又はトリプトファンへのグリコシル基の付加を含む。実施形態において、グリコシル化は、例えば、Ｏ−結合グリコシル化又はＮ−結合グリコシル化を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドの１つ以上は、融合タンパク質であり、例えば内在性赤血球細胞タンパク質又はその断片、例えば膜貫通タンパク質、例えばＧＰＡ又はその膜貫通断片との融合物である。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、外来性ポリペプチドに関するコード領域は、ポリペプチドが発現される細胞、例えば哺乳動物赤血球細胞、例えばヒト赤血球細胞に対してコドン最適化されている。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、１細胞当たり外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む。実施形態において、外来性タンパク質のコピー数は、例えば、定量的ウェスタンブロットによって又はフローサイトメトリーアッセイで標準化蛍光マイクロスフェア（例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより）を使用して決定することができる。例えば、外来性タンパク質が蛍光タンパク質であるいくつかの実施形態では、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、例えばサンプルのＭＦＩを決定し、同様のサンプルにおける蛍光タンパク質のコピー数を定量化し（例えば、定量的ウェスタンブロットにより）、ＭＦＩとタンパク質コピー数との間の変換率を計算することにより、タンパク質コピー数を見積もることができる。
【０１５３】
脱核赤血球細胞の物理的特性
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される赤血球細胞は、本明細書に記載される１つ以上の（例えば、２、３、４、又はそれを超える）物理的特性、例えば浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度、又はホスファチジルセリン含有量を有する。理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態において、外来性タンパク質を発現する脱核赤血球細胞は、野生型の未処理赤血球細胞（例えば、低張透析に供されていない赤球細胞）に類似した物理的特性を有する。対照的に、低張負荷されたＲＢＣは、ときに、浸透圧脆弱性の増大、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の低下、又は細胞膜外葉のホスファチジルセリンレベルの増大等、物理的特性の変化を示す。
【０１５４】
浸透圧脆弱性
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、外来性ポリペプチドを含まない、単離された未培養赤血球細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、又は０．５％  ＮａＣｌでの５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞の集団は、水中０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、又は０．５％  ＮａＣｌからなる溶液中で５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、いくつかの実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５９の方法を用いて決定される。
【０１５５】
細胞サイズ
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、野生型の未処理網状赤血球とほぼ同じ直径又は容積を有する。いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、約１５０ｆＬ、例えば約１４０〜１６０、１３０〜１７０、又は１２０〜１８０ｆＬの容積を有する。いくつかの実施形態において、集団は、約１５０ｆＬ、約１４０〜１６０、１３０〜１７０、１２０〜１８０、１１０〜１９０、又は１００〜２００ｆＬの平均細胞容積を有する。いくつかの実施形態において、集団における少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の細胞は、約１４０〜１６０、１３０〜１７０、１２０〜１８０、１１０〜１９０、又は１００〜２００ｆＬの容積を有する。いくつかの実施形態において、赤血球細胞の平均赤血球容積の容積は、１０ｆＬ、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬを超え、又は１５０ｆＬを超える。一実施形態において、赤血球細胞の平均赤血球容積は、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ未満、又は２００ｆＬ未満である。一実施形態において、赤血球細胞の平均赤血球容積は、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、又は４００〜５００フェムトリットル（ｆＬ）である。いくつかの実施形態において、赤血球細胞の集団は、この段落に示す平均赤血球容積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５、又は２ｆＬ未満である。容積は、いくつかの実施形態において、血液系分析機器、例えばコールターカウンターを使用して測定される。
【０１５６】
ヘモグロビン濃度
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、野生型の未処理赤血球細胞、例えば成熟ＲＢＣと同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％を超える、又は１０％を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、又は３０ｐｇ、及び任意選択的に約３０ｐｇまでの総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態において、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例３３のＤｒａｂｋｉｎ試薬方法を用いて決定される。
【０１５７】
ホスファチジルセリン含有量
いくつかの実施形態において、脱核赤血球細胞は、野生型の未処理ＲＢＣとほぼ同じホスファチジルセリン含有量をその細胞膜外葉に有する。ホスファチジルセリンは、野生型の未処理ＲＢＣｓの細胞膜の内葉に優勢に存在し、低張負荷は、外葉にホスファチジルセリンを分布させ得、そこでホスファチジルセリンが免疫応答を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、ＲＢＣの集団は、約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２、又は１％未満の、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色に対して陽性の細胞を含む。いくつかの実施形態において、集団における脱核細胞の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、外来性タンパク質を発現しない他に同様の培養赤血球細胞と同じホスファチジルセリン暴露のレベルを有する。ホスファチジルセリン暴露は、いくつかの実施形態において、ＰＳに選択的に結合するＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＩＴＣに関する染色、及び例えば国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５４の方法を用いてフローサイトメトリーによりＦＩＴＣ蛍光を測定することによって評価される。
【０１５８】
他の特徴
いくつかの実施形態において、赤血球細胞の集団は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％（及び任意選択的に９０又は１００％まで）の、ＧＰＡに対して陽性の細胞を含む。ＧＰＡの存在は、いくつかの実施形態において、ＦＡＣＳを使用して検出される。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、対象内で少なくとも３０、４５、又は９０日の半減期を有する。
【０１６０】
赤血球細胞の分化及び成熟の段階
実施形態において、脱核赤血球細胞は、ＣＤ３４＋幹細胞を次の３つの条件に暴露することにより生成される：最初に増殖条件、次いで分化条件、及び最終的に成熟条件。例示的な増殖、分化、及び成熟条件は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの段落［１２２１］の実施例３にそれぞれステップ１、２、及び３として記載されている。実施形態において、増殖段階は、増殖培地（例えば、上記のステップ１の培地）中で細胞を培養することを含み、分化段階は、分化培地（例えば、上記のステップ２の培地）中で細胞を培養することを含み、成熟段階は、成熟培地（例えば、上記のステップ３の培地）中で細胞を培養することを含む。
【０１６１】
実施形態において、成熟段階は、例えば、フローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における約８４％の細胞がＧＰＡに対して陽性であるときに開始する。実施形態において、成熟段階の開始時、細胞の集団は、例えば、フローサイトメトリーアッセイによって測定されて、約５４％バンド３陽性である。実施形態において、成熟段階の開始時、細胞の集団は、例えば、フローサイトメトリーアッセイによって測定されて約９８％α４インテグリン陽性である。一実施形態において、成熟段階は、赤血球細胞集団における約５３％の細胞がバンド３及びα４インテグリンの両方に対して陽性であるときに開始する。実施形態において、成熟段階は、細胞集団が優勢に前赤芽球及び好塩基性赤芽球であるときに開始する。
【０１６２】
実施形態において、本明細書に記載される赤血球細胞集団における細胞の約９９％は、ＧＰＡに対して陽性である。一実施形態において、赤血球細胞集団における細胞の約９８％は、バンド３に対して陽性である。一実施形態において、赤血球細胞集団における細胞の約９１％は、α４インテグリンに対して陽性である。一実施形態において、赤血球細胞集団における細胞の約９０％は、バンド３及びα４インテグリンの両方に対して陽性である。実施形態において、細胞集団は、優勢に多染性赤芽球及び正染性赤芽球である。実施形態において、細胞集団は、約３％脱核されている。実施形態において、細胞集団は、最大脱核の約６％であり、最大脱核は、細胞集団が培養の終了時に到達する脱核の百分率である。実施形態において、細胞集団は、例えば、実施例１０に記載されているように、ＢＯＮＣＡＴアッセイにおいて約２，４１０，０００のＡＨＡ強度／組み入れ値を有する。実施形態において、このステージは、細胞が成熟条件に３日間（Ｍ３日）暴露された際に到達する。
【０１６３】
実施形態において、本明細書に記載される赤血球細胞集団における細胞の約９９．５％は、ＧＰＡに対して陽性である。一実施形態において、赤血球細胞集団における細胞の約１００％は、バンド３に対して陽性である。一実施形態において、赤血球細胞集団における細胞の約８４．２％は、α４インテグリンに対して陽性である。一実施形態において、赤血球細胞集団における細胞の約８４．２％は、バンド３及びα４インテグリンの両方に対して陽性である。実施形態において、細胞集団は、優勢に正染性赤芽球及び網状赤血球である。実施形態において、細胞集団は、約１１％脱核されている。実施形態において、細胞集団は、最大脱核の約２２％である。実施形態において、細胞集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイにおいて約１，８７０，０００のＡＨＡ強度／組み入れ値を有する。実施形態において、このステージは、細胞が成熟条件に５日間（Ｍ５日）暴露された際に到達する。
【０１６４】
実施形態において、細胞集団は、約３４％脱核されている。実施形態において、細胞集団は、最大脱核の約６８％である。実施形態において、細胞集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイにおいて約６１５，０００のＡＨＡ強度／組み入れ値を有する。実施形態において、このステージは、細胞が成熟条件に７日間（Ｍ７日）暴露された際に到達する。
【０１６５】
実施形態において、細胞集団は、約４３％脱核されている。実施形態において、細胞集団は、最大脱核の約８６％である。実施形態において、細胞集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイにおいて約１８９，０００のＡＨＡ強度／組み入れ値を有する。実施形態において、このステージは、細胞が成熟条件に９日間（Ｍ９日）暴露された際に到達する。
【０１６６】
実施形態において、赤血球細胞は、前赤芽球、早期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網状赤血球、又は赤血球から選択される。
【０１６７】
本明細書の組成物、例えば赤血球細胞を用いた処置方法
外来性ＲＮＡ及び／又はタンパク質を含む（例えば、発現する）赤血球細胞を投与する方法は、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット及び国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載されている。
【０１６８】
実施形態において、本明細書に記載される赤血球細胞は、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与される。処置され得る例示的な哺乳動物としては、非限定的に、ヒト、飼育動物（例えば、犬、猫等）、家畜（例えば、雌牛、羊、豚、馬等）及び実験動物（例えば、猿、ラット、マウス、兎、モルモット等）が挙げられる。本明細書に記載される方法は、ヒト治療及び獣医学用途の両方に適用可能である。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞は、１、２、３、４、５、又は６カ月毎に患者に投与される。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、赤血球細胞の用量は、約１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、２×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜２×１０１１、２×１０１１〜５×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜２×１０１２、２×１０１２〜５×１０１２、又は５×１０１２〜１×１０１３細胞を含む。
【０１７１】
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される疾病又は状態を処置する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される組成物、例えば本明細書に記載される脱核赤血球細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、疾病又は状態は、癌、感染症（例えば、ウイルス又は細菌感染症）、炎症性疾病、自己免疫性疾病、又は代謝欠損である。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される疾病又は状態を処置するための本明細書に記載される赤血球細胞の使用を提供する。いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載される疾病又は状態を処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載される赤血球細胞の使用を提供する。
【０１７２】
癌のタイプとしては、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳腫瘍、乳癌、原発不明癌、骨への癌の伝播、脳への癌の伝播、肝臓への癌の伝播、肺への癌の伝播、カルチノイド、頸部癌、絨毛癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、妊娠性絨毛性腫瘍（ＧＴＴ）、毛様細胞白血病、頭部及び頸部癌、ホジキンリンパ腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫皮膚癌、中皮腫、男性の癌、奇胎妊娠、口腔及び中咽頭癌、骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、希少癌、直腸癌、唾液腺癌、二次癌、皮膚癌（非黒色腫）、軟組織肉腫、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、原発不明癌、子宮癌、膣癌、並びに外陰癌が挙げられる。
【０１７３】
ウイルス感染症としては、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、水痘−帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、はしかウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、狂犬病ウイルス、及び風疹ウイルスが挙げられる。他のウイルス標的としては、パラミクソウイルス科（例えば、ニューモウイルス、モルビリウイルス、メタニューモウイルス、レスピロウイルス又はルブラウイルス）、アデノウイルス科（例えば、アデノウイルス）、アレナウイルス科（例えば、リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス等のアレナウイルス）、アルテリウイルス科（例えば、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス又はウマ動脈炎ウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、フレボウイルス又はハンタウイルス）、カリシウイルス科（例えば、ノーウォークウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス又はトロウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラ様ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、ヘパシウイルス又はフラビウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、シンプレックスウイルス、バリセロウイルス、サイトメガロウイルス、ロゼオロウイルス、又はリンホクリプトウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス又はソゴトウイルス）、パルボウイルス科（例えば、パルボウイルス）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エンテロウイルス又はヘパトウイルス）、ポックスウイルス科（例えば、オルソポックスウイルス、トリポックスウイルス、又はレポリポックスウイルス）、レトロウイルス科（例えば、レンチウイルスレンチウイルス又はスプーマウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、リッサウイルス、ノビラブドウイルス、又はルビウイルス）、及びトガウイルス科（例えば、αウイルス又はルビウイルス）が挙げられる。これらのウイルスの特定の例としては、ヒト呼吸器コロナウイルス、Ａ〜Ｃ型インフルエンザウイルス、Ａ〜Ｇ型肝炎ウイルス、及び単純ヘルペスウイルス１〜９型が挙げられる。
【０１７４】
細菌感染症としては、限定されるものではないが、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）；ヤギ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）；カンピロバクター空腸（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）；プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）；プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；及び肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。
【０１７５】
炎症性疾病としては、細菌性敗血症、関節リウマチ、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、全身性エリトマトーデス（結合組織の炎症性疾患）、糸球体腎炎（腎臓の毛細管の炎症）、クローン病、潰瘍性大腸炎、腹腔疾病、又は他の突発性炎症性腸疾患、及びアレルギー性喘息が挙げられる。
【０１７６】
自己免疫性疾病としては、全身性エリトマトーデス、糸球体腎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、及び１型糖尿病が挙げられる。
【０１７７】
代謝欠損としては、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏−重症複合型免疫不全症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）、原発性高シュウ酸尿症、アルカプトン尿症、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）が挙げられる。
【０１７８】
例示的な更なる特徴及び実施形態を、以下に提供する：
１．外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡと、赤血球細胞による核酸、例えばｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【０１７９】
２．赤血球細胞は、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡを取込む、実施形態１の方法。
【０１８０】
３．成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、赤血球細胞の集団の複数の細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡと接触させることとを含む、実施形態１の方法。
【０１８１】
４．赤血球細胞の集団の複数の細胞は、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡをそれぞれ取込む、実施形態３の方法。
【０１８２】
５．外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡの取込み後、細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を発現する、実施形態１〜４のいずれかの方法。
【０１８３】
６．細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を含む、実施形態５の方法。
【０１８４】
７．成熟段階における赤血球細胞の集団は、成熟培地中で３〜７日間、例えば４〜５又は４〜６日間にわたって拡大された細胞の集団である、実施形態３〜６のいずれかの方法。
【０１８５】
８．外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ａ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｂ）赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｃ）分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡと、分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞による核酸、例えばｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと、
（ｄ）分化している赤血球細胞の集団の複数の細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
【０１８６】
９．更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む、実施形態８の方法。
【０１８７】
１０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：
ｉ．ａ）集団における細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）集団における細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下の細胞は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）集団における細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）集団は、集団が集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）集団における最大脱核の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）集団における最大脱核の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）集団における最大脱核の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）集団における最大脱核の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）集団における最大脱核の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｆ）集団における最大脱核の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｖ．ａ）細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％を有すること、
ｉｖ．ｂ）細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％を有すること、
ｉｖ．ｃ）細胞の集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、少なくとも６００，０００、８００，０００、１，０００、０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，２００，０００、又は２，４００，０００の翻訳活性を有すること、又は
ｉｖ．ｄ）細胞の集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、６００，０００〜２，４００，０００、８００，０００〜２，２００，０００、１，０００、０００〜２，０００，０００、１，２００，０００〜１，８００，０００、又は１，４００，０００〜１，６００，０００の翻訳活性を有すること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又はそれを超える）を含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜９のいずれかの方法。
【０１８８】
１１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１８９】
１２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９０】
１３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９１】
１４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９２】
１５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９３】
１６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９４】
１７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９５】
１８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９６】
１９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９７】
２０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性、ｉｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０の方法。
【０１９８】
２１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０１９９】
２２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２００】
２３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０１】
２４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０２】
２５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０３】
２６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０４】
２７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０５】
２８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０６】
２９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０７】
３０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０８】
３１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２０９】
３２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１０】
３３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１１】
３４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１２】
３５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１３】
３６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１４】
３７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１５】
３８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１６】
３９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１７】
４０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１８】
４１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２１９】
４２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２０】
４３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２１】
４４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２２】
４５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２３】
４６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２４】
４７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２５】
４８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２６】
４９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２７】
５０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２８】
５１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２２９】
５２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３０】
５３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３１】
５４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３２】
５５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３３】
５６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３４】
５７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３５】
５８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉｉ．ｂ．実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３６】
５９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３７】
６０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３８】
６１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２３９】
６２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４０】
６３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４１】
６４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４２】
６５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４３】
６６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４４】
６７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４５】
６８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４６】
６９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４７】
７０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４８】
７１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２４９】
７２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５０】
７３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５１】
７４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５２】
７５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５３】
７６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５４】
７７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５５】
７８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５６】
７９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５７】
８０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５８】
８１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２５９】
８２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６０】
８３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉｉ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６１】
８４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６２】
８５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６３】
８６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６４】
８７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６５】
８８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６６】
８９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６７】
９０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６８】
９１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２６９】
９２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉｉ．ｅを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７０】
９３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７１】
９４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７２】
９５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７３】
９６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７４】
９７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７５】
９８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７６】
９９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７７】
１００．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７８】
１０１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｉｉ．ｆを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２７９】
１０２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８０】
１０３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８１】
１０４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８２】
１０５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８３】
１０６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８４】
１０７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８５】
１０８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８６】
１０９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８７】
１１０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８８】
１１１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２８９】
１１２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９０】
１１３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９１】
１１４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９２】
１１５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９３】
１１６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９４】
１１７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９５】
１１８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９６】
１１９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９７】
１２０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９８】
１２１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０２９９】
１２２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３００】
１２３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０１】
１２４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０２】
１２５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０３】
１２６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０４】
１２７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０５】
１２８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０６】
１２９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ａ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０７】
１３０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｂ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０８】
１３１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｃ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３０９】
１３２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｄ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１０】
１３３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｅ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１１】
１３４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｆ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１２】
１３５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｇ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１３】
１３６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｈ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１４】
１３７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉ．ｉ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１５】
１３８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１６】
１３９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１７】
１４０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１８】
１４１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３１９】
１４２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２０】
１４３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｉ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２１】
１４４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、．
【０３２２】
１４５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２３】
１４６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２４】
１４７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２５】
１４８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２６】
１４９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｉ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２７】
１５０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２８】
１５１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３２９】
１５２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３０】
１５３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３１】
１５４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３２】
１５５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｉ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３３】
１５６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３４】
１５７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３５】
１５８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３６】
１５９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３７】
１６０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３８】
１６１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３３９】
１６２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４０】
１６３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４１】
１６４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４２】
１６５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４３】
１６６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４４】
１６７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４５】
１６８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４６】
１６９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４７】
１７０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４８】
１７１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３４９】
１７２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５０】
１７３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５１】
１７４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ａ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５２】
１７５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｂ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５３】
１７６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｃ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５４】
１７７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｄ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５５】
１７８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｅ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５６】
１７９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉｉ．ｆ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５７】
１８０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ａ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５８】
１８１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｂ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３５９】
１８２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｃ及びｉｖ．ａを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６０】
１８３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ａ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６１】
１８４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｂ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６２】
１８５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｃ及びｉｖ．ｂを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６３】
１８６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ａ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６４】
１８７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｂ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６５】
１８８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｃ及びｉｖ．ｃを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６６】
１８９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ａ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６７】
１９０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｂ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６８】
１９１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：ｉｉ．ｃ及びｉｖ．ｄを含む赤血球細胞の集団である、実施形態１０〜２０のいずれかの方法。
【０３６９】
１９２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜１９１のいずれかの方法。
【０３７０】
１９３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜１９１のいずれかの方法。
【０３７１】
１９４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜１９１のいずれかの方法。
【０３７２】
１９５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜１９１のいずれかの方法。
【０３７３】
１９６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％の細胞は、α４インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜１９１のいずれかの方法。
【０３７４】
１９７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、以下の特性：例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイによって測定されて、集団における細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の細胞は、α４インテグリン陽性であることを含む赤血球細胞の集団である、実施形態３〜１９１のいずれかの方法。
【０３７５】
１９８．複数の細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、複数の細胞は、赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団から分離され、例えば、複数の細胞は、脱核状態に基づいて集団から分離される（例えば、複数の細胞は、有核細胞であり、及び集団の残りのものは、脱核細胞である）、実施形態３〜１９７のいずれかの方法。
【０３７６】
１９９．複数の細胞を、外来性タンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡと接触させる前又は接触させた後、例えば集団を脱核の阻害剤（ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣの阻害剤）の阻害剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の阻害剤、又はプロテアソーム阻害剤）と共にインキュベートすることにより、例えば集団の成長、発達、ヘモグロビン合成、又は脱核プロセスを停止させることにより、赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団を同期させることを含む、実施形態３〜１９７のいずれかの方法。
【０３７７】
２００．停止は、集団における細胞の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０％以下の脱核前に行われる、実施形態１９９の方法。
【０３７８】
２０１．外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、
（ｅ）赤血球前駆体細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供することと、
（ｆ）赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、
（ｇ）分化している赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと、分化している赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることであって、分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われる、接触させることと、
（ｈ）分化している赤血球細胞を更に培養して、網状赤血球の集団を提供することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する、方法。
【０３７９】
２０２．更なる培養は、３、２、又は１未満の集団の倍加を含む、実施形態２０１の方法。
【０３８０】
２０３．接触は、分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる、実施形態２０１又は２０２の方法。
【０３８１】
２０４．外来性タンパク質を発現する網状赤血球の集団を製造する方法であって、（ａ）赤血球前駆体細胞の集団を提供することと、（ｂ）赤血球前駆体細胞の集団を分化条件下で培養して、分化している赤血球細胞の集団を提供することと、（ｃ）分化している赤血球細胞を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含み、改善は、接触が、分化している赤血球細胞の集団が０．１〜２５％脱核されている（例えば、０．１〜２０％脱核されている、０．１〜１５％脱核されている、０．１〜１２％脱核されている、又は０．１〜１０％脱核されている）ときに行われることを含む、方法。
【０３８２】
２０５．接触は、分化している赤血球細胞の集団が細胞分裂におけるプラトーの前に３、２、又は１未満の集団の倍加を有するときに行われる、実施形態２０４の方法。
【０３８３】
２０６．接触は、分化している赤血球細胞の少なくとも５０％（少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％）が正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すときに行われる、実施形態２０４又は２０５の方法。
【０３８４】
２０７．異種非翻訳領域（ＵＴＲ）に作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含み、異種ＵＴＲは、調節エレメントを含む、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
【０３８５】
２０８．表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞。
【０３８６】
２０９．赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）と接触させることと、
ｂ）接触された赤血球細胞を外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
【０３８７】
２１０．赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する方法であって、
ａ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を、表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡと接触させることと、
ｂ）接触された赤血球細胞を外来性ｍＲＮＡの取込みに好適な条件下で維持することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞を生成する、方法。
【０３８８】
２１１．脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供し、且つ
ｂ）赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養し、それにより、外来性タンパク質を生成する、方法。
【０３８９】
２１２．脱核赤血球細胞における外来性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞を外来性タンパク質の生成に好適な条件下で培養することと
を含み、それにより、外来性タンパク質を生成する、方法。
【０３９０】
２１３．外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡ（例えば、単離ＲＮＡ又はインビトロ転写ＲＮＡ）を含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
【０３９１】
２１４．外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する方法であって、
赤血球細胞、例えば表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む外来性ｍＲＮＡを含む有核赤血球細胞を対象に投与すること
を含み、それにより、外来性タンパク質を対象に提供するか、外来性タンパク質を生成することができる脱核赤血球細胞を対象に提供するか、又は対象を処置する、方法。
【０３９２】
２１５．赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する方法であって、
ａ）調節エレメントを含む異種ＵＴＲに作動可能に結合されたコード領域を含む外来性ｍＲＮＡを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を提供することと、
ｂ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する、方法。
【０３９３】
２１６．赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する方法であって、
ａ）表１の１つ以上の化学修飾ヌクレオチド、表２の１つ以上の化学的バックボーン修飾、表３の１つ以上の化学修飾キャップ、又はそれらの任意の組み合わせを含む赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞、例えば有核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を、予め選択されたパラメーターに関して評価することと
を含み、それにより、赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞（又はそのような細胞のバッチ）を評価する、方法。
【０３９４】
２１７．集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、ｍＲＮＡと接触させてから５日後に外来性タンパク質を含む、実施形態２０７の方法。
【０３９５】
２１８．集団における細胞は、例えば、ｍＲＮＡとの接触から５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、実施形態２０７の方法。
【０３９６】
２１９．細胞は、ｍＲＮＡと接触させた後、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５日間にわたって外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、実施形態２０７の方法。
【０３９７】
２２０．外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にリボヌクレアーゼ阻害剤を含めることにより、ｍＲＮＡの分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【０３９８】
２２１．赤血球細胞の集団を提供することと、集団を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含む、実施形態２２０の方法。
【０３９９】
２２２．集団の複数の赤血球細胞は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む、実施形態２２０又は２２１の方法。
【０４００】
２２３．細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を発現する、実施形態２２０〜２２２のいずれかの方法。
【０４０１】
２２４．細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を含む、実施形態２２０〜２２３のいずれかの方法。
【０４０２】
２２５．細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、実施形態２２０〜２２４のいずれかの方法。
【０４０３】
２２６．赤血球細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを更に含む、実施形態２２０〜２２５のいずれかの方法。
【０４０４】
２２７．細胞をｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後に、細胞の集団をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、実施形態２２０〜２２６のいずれかの方法。
【０４０５】
２２８．成熟段階の４、５、又は６日目に細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態２２０〜２２７のいずれかの方法。
【０４０６】
２２９．細胞は、成熟段階にある、実施形態２２０〜２２８のいずれかの方法。
【０４０７】
２３０．細胞が、以下の特性：
ｉ．ａ）集団における細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）集団における細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）集団における細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）集団は、集団が集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）集団における細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｄ）集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｆ）集団における細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｖ．ａ）細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％を有すること、
ｉｖ．ｂ）細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％を有すること、
ｉｖ．ｃ）ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、細胞の集団は、少なくとも６００，０００、８００，０００、１，０００、０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，２００，０００、又は２，４００，０００の翻訳活性を有すること、又は
ｉｖ．ｄ）ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、細胞の集団は、６００，０００〜２，４００，０００、８００，０００〜２，２００，０００、１，０００、０００〜２，０００，０００、１，２００，０００〜１，８００，０００、又は１，４００，０００〜１，６００，０００の翻訳活性を有すること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又はそれを超える）を含む時点で細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、実施形態２２０〜２２９のいずれかの方法。
【０４０８】
２３１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４０９】
２３２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１０】
２３３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１１】
２３４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１２】
２３５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１３】
２３６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１４】
２３７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１５】
２３８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１６】
２３９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１７】
２４０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性、ｉｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２３０の方法。
【０４１８】
２４１．（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイにより）細胞が、以下の特性：
集団における細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であること、
集団における細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であること、
集団における細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であること、
集団における細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であること、
集団における細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であること、又は
集団における細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）を含む時点で細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤と接触させることを含む、実施形態２２０〜２４０のいずれかの方法。
【０４１９】
２４２．ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである、実施形態２２０〜２４１のいずれかの方法。
【０４２０】
２４３．集団の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である、実施形態２２０〜２４２のいずれかの方法。
【０４２１】
２４４．集団の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている、実施形態２２０〜２４３のいずれかの方法。
【０４２２】
２４５．細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている細胞の割合は、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である、実施形態２２０〜２４４のいずれかの方法。
【０４２３】
２４６．細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む、実施形態２２０〜２４５のいずれかの方法。
【０４２４】
２４７．細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する、実施形態２２０〜２４６のいずれかの方法。
【０４２５】
２４８．集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質を発現する、実施形態２２０〜２４７のいずれかの方法。
【０４２６】
２４９．集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、実施形態２２０〜２４８のいずれかの方法。
【０４２７】
２５０．細胞の集団は、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い外来性タンパク質を含む、実施形態２２０〜２４９のいずれかの方法。
【０４２８】
２５１．ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）リボヌクレアーゼ阻害剤を含む反応混合物。
【０４２９】
２５２．ｍＲＮＡは、赤血球細胞内にある、実施形態２５１の反応混合物。
【０４３０】
２５３．複数の赤血球細胞を含む、実施形態２５１又は２５２の反応混合物。
【０４３１】
２５４．リボヌクレアーゼ阻害剤に関する外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
【０４３２】
２５５．リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、実施形態２５４の方法。
【０４３３】
２５６．比較に応答して、
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、必須要件は、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む、実施形態２５５の方法。
【０４３４】
２５７．リボヌクレアーゼ阻害剤は、ＲＮＡｓｉｎ  Ｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮＡｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、又はＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｈｕｍａである、実施形態２２０〜２５６のいずれかの反応混合物又は方法。
【０４３５】
２５８．外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
赤血球細胞及び外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む反応混合物を、例えば反応混合物中にプロテアソーム阻害剤を含めることにより、タンパク質分解を阻害する条件下で提供することと、
赤血球細胞によるｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で反応混合物を維持することと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【０４３６】
２５９．赤血球細胞の集団を提供することと、集団を、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡと接触させることとを含む、実施形態２５８の方法。
【０４３７】
２６０．集団の複数の赤血球細胞は、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡをそれぞれ取込む、実施形態２５８又は２５９の方法。
【０４３８】
２６１．細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を発現する、実施形態２５８〜２６０のいずれかの方法。
【０４３９】
２６２．細胞又は複数の細胞は、外来性タンパク質を含む、施形態２５８〜２６１のいずれかの方法。
【０４４０】
２６３．細胞又は細胞の集団を電気穿孔することを更に含む、実施形態２５８〜２６２のいずれかの方法。
【０４４１】
２６４．赤血球細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを更に含む、実施形態２５８〜２６３のいずれかの方法。
【０４４２】
２６５．細胞をｍＲＮＡと接触させる前、接触させている間、又は接触させた後、例えば細胞をｍＲＮＡと接触させる０．５〜２日前又は後に細胞の集団をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態２５８〜２６４のいずれかの方法。
【０４４３】
２６６．成熟段階の４、５、又は６日目に細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態２５８〜２６５のいずれかの方法。
【０４４４】
２６７．細胞は、成熟段階にある、実施形態２５８〜２６６のいずれかの方法。
【０４４５】
２６８．細胞が、以下の特性：
ｉ．ａ）集団における細胞の２〜４０％、３〜３３％、５〜３０％、１０〜２５％、又は１５〜２０％は、脱核されていること、
ｉ．ｂ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、２％、３％、４％、又は５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｃ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、６％、１０％、１５％、２０％、又は２５％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｄ）集団における細胞の０％、０．１％、０．２％、又は０．５％を超えるが、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％未満は、脱核されていること、
ｉ．ｅ）集団における細胞の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｆ）集団における細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下は、脱核されていること、
ｉ．ｇ）細胞の集団は、最大脱核の６〜７０％、１０〜６０％、２０〜５０％、又は３０〜４０％に到達していること、
ｉ．ｈ）細胞の集団は、最大脱核の１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、又は２０％以下に到達していること、
ｉ．ｉ）細胞の集団は、最大脱核の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、又は６０％以下に到達していること、
ｉｉ．ａ）細胞の集団は、細胞分裂におけるプラトーから３、２、又は１未満だけ倍加した集団であること、
ｉｉ．ｂ）細胞の集団は、３、２、又は１未満の集団の倍加が可能であること、
ｉｉ．ｃ）集団は、集団が集団における細胞の少なくとも７０％の脱核レベルに到達する前に１．５、２、又は３倍以下だけ増大すること、
ｉｉｉ．ａ）集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｂ）集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｃ）集団における細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）であること、
ｉｉｉ．ｄ）集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｅ）集団における細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、又は７９％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｉｉ．ｆ）細胞の３０〜９０％、４０〜９０％、５０〜９０％、６０〜９０％、又は７０〜９０％は、正赤芽球（例えば、多染性又は正染性正赤芽球）の形態を示すこと、
ｉｖ．ａ）細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、又は９０％を有すること、
ｉｖ．ｂ）細胞の集団は、最大翻訳活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、又は５０％を有すること、
ｉｖ．ｃ）細胞の集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、少なくとも６００，０００、８００，０００、１，０００、０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，２００，０００、又は２，４００，０００の翻訳活性を有すること、又は
ｉｖ．ｄ）細胞の集団は、ＢＯＮＣＡＴアッセイ、例えば実施例１０の翻訳アッセイによって測定されて、６００，０００〜２，４００，０００、８００，０００〜２，２００，０００、１，０００、０００〜２，０００，０００、１，２００，０００〜１，８００，０００、又は１，４００，０００〜１，６００，０００の翻訳活性を有すること、
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又はそれを超える）を含む時点で細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態２５８〜２６７のいずれかの方法。
【０４４６】
２６９．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４４７】
２７０．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４４８】
２７１．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４４９】
２７２．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５０】
２７３．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５１】
２７４．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉｉの特性及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５２】
２７５．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｉｉの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５３】
２７６．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５４】
２７７．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉの特性、ｉｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５５】
２７８．赤血球細胞の集団又は分化している赤血球細胞の集団は、ｉｉの特性、ｉｉｉの特性、及びｉｖの特性を含む赤血球細胞の集団である、実施形態２６８の方法。
【０４５６】
２７９．（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例１０のフローサイトメトリーアッセイにより）細胞が、以下の特性：
集団における細胞の８４〜９９％、８５〜９５％、又は約９０％は、ＧＰＡ陽性であること、
集団における細胞の少なくとも８４％、８５％、９０％、９５％、又は９９％は、ＧＰＡ陽性であること、
集団における細胞の５４〜９９％、５５〜９８％、６０〜９５％、６５〜９０％、７０〜８５％、又は７５〜８０％は、バンド３陽性であること、
集団における細胞の少なくとも５４％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％は、バンド３陽性であること、
集団における細胞の９６〜１００％、９７〜９９％、又は約９８％は、α４インテグリン陽性であること、又は
集団における細胞の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、α４インテグリン陽性であること
の１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれを超える）を含む時点で細胞をプロテアソーム阻害剤と接触させることを含む、実施形態２５８〜２７８のいずれかの方法。
【０４５７】
２８０．ｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである、実施形態２５８〜２７９のいずれかの方法。
【０４５８】
２８１．集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に生存可能である、実施形態２５８〜２８０のいずれかの方法。
【０４５９】
２８２．集団の細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている、実施形態２５８〜２８１のいずれかの方法。
【０４６０】
２８３．細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に脱核されている細胞の割合は、プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団における脱核されている細胞の割合の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％である、実施形態２５８〜２８２のいずれかの方法。
【０４６１】
２８４．細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触される時点で少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、又は１×１０８細胞を含む、実施形態２５８〜２８３のいずれかの方法。
【０４６２】
２８５．細胞の集団は、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日以内に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％だけ拡大する、実施形態２５８〜２８４のいずれかの方法。
【０４６３】
２８６．集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質を含む、実施形態２５８〜２８５のいずれかの方法。
【０４６４】
２８７．集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、例えば、細胞がｍＲＮＡと接触されてから５日後に外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、実施形態２５８〜２８６のいずれかの方法。
【０４６５】
２８８．細胞の集団は、プロテアソーム阻害剤で処理されていない他に同様の細胞の集団よりも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、若しくは９０％だけ多い、又は少なくとも２倍、３倍、４倍、若しくは５倍だけ多い外来性タンパク質を含む、実施形態２５８〜２８７のいずれかの方法。
【０４６６】
２８９．ｉ）赤血球細胞、ｉｉ）外来性タンパク質を含むｍＲＮＡ、及びｉｉｉ）プロテアソーム阻害剤を含む反応混合物。
【０４６７】
２９０．ｍＲＮＡは、赤血球細胞内にある、実施形態２８９の反応混合物。
【０４６８】
２９１．複数の赤血球細胞を含む、実施形態２８９又は２９０の反応混合物。
【０４６９】
２９２．プロテアソーム阻害剤に関する外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物をアッセイする方法であって、
外来性タンパク質を含む脱核赤血球細胞を含む反応混合物を提供することと、
例えば、反応混合物のアリコートにおける例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、又は質量分析により、プロテアソーム阻害剤の存在又はレベルに関してアッセイすることと
を含む方法。
【０４７０】
２９３．プロテアソーム阻害剤のレベルを基準値と比較することを更に含む、実施形態２９２の方法。
【０４７１】
２９４．比較に応答して、
集団を、例えば必須要件を満たすか又は必須要件を満たさないとして分類することであって、例えば、必須要件は、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合に満たされる、分類すること、
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を上回る場合、集団が、続く精製ステップに好適であるとき、集団を、続く処理ステップに好適であるか又は好適でないとして分類すること、
集団を、治療としての使用に好適であるか又は好適でないとして分類すること、又は
例えば、プロテアソーム阻害剤のレベルが基準値を下回る場合、集団又はそのアリコートを治療的使用のために処方又は包装すること
の１つ以上を更に含む、実施形態２９３の方法。
【０４７２】
２９５．プロテアソーム阻害剤は、２０Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばＭＧ−１３２若しくはカルフィルゾミブ、又は２６Ｓプロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブである、実施形態２５８〜２９４のいずれかの反応混合物又は方法。
【０４７３】
２９６．第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞を提供することと、
ｂ）赤血球細胞を、第１の外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと、赤血球細胞による第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡの取込みを可能にする条件下で接触させることと
を含み、それにより、第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法。
【０４７４】
２９７．赤血球細胞は、例えば、ｍＲＮＡとの接触から５日後に第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質の少なくとも１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、実施形態２９６の方法。
【０４７５】
２９８．第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現する赤血球細胞の集団を生成する方法であって、
ａ）例えば、成熟段階における赤血球細胞の集団を提供することと、
ｂ）赤血球細胞の集団を、第１の外来性タンパク質をコードする第１のｍＲＮＡ、及び第２の外来性タンパク質をコードする第２のｍＲＮＡと接触させることと
を含み、それにより、外来性タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む赤血球細胞を作製する、方法であって、集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１のｍＲＮＡ及び第２のｍＲＮＡの両方を含む、方法。
【０４７６】
２９９．赤血球細胞の集団は、例えば、ｍＲＮＡとの接触から５日後に１細胞当たり第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質の少なくとも平均１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００コピーを含む、実施形態２９８の方法。
【０４７７】
３００．接触は、電気穿孔を行うことを含む、実施形態２９６〜２９９のいずれかの方法。
【０４７８】
３０１．細胞の集団は、細胞が第１及び第２のｍＲＮＡと接触されてから少なくとも５日後に細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％において第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を含む、実施形態２９８〜３００のいずれかの方法。
【０４７９】
３０２．集団における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、第１の外来性タンパク質及び第２の外来性タンパク質を発現し、集団は、細胞を第１又は第２の外来性タンパク質をコードするＤＮＡと接触させることによって作製されたものではない、赤血球細胞の集団。
【０４８０】
３０３．１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を生成する方法であって、集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることを含み、それにより、所定の量の外来性タンパク質を含む赤血球細胞を作製する、方法。
【０４８１】
３０４．複数の赤血球細胞（例えば、脱核赤血球細胞）の１つ以上を評価して、外来性タンパク質の量を決定することを更に含む、実施形態３０３の方法。
【０４８２】
３０５．赤血球細胞、例えば脱核赤血球細胞のサンプル中の外来性タンパク質の量を評価する方法であって、
１細胞当たり外来性タンパク質の所定の数のコピーを含む複数の赤血球細胞を提供することであって、赤血球細胞は、集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることにより作製されたものである、提供することと、
複数の赤血球細胞における外来性タンパク質の量を決定することと
を含む方法。
【０４８３】
３０６．細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．６±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり外来性タンパク質の１，０００，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．４±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり外来性タンパク質の８７０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．２±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり外来性タンパク質の６１０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．１±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり外来性タンパク質の２７０，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．０５±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり外来性タンパク質の１００，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出し、又は
細胞集団を、集団における５Ｅ６細胞当たり０．０２５±２０％ｕｇのｍＲＮＡと接触させることは、１細胞当たり外来性タンパク質の４３，０００±２０％のコピーを発現する細胞の集団を産出する、実施形態３０３〜３０５のいずれかの方法。
【０４８４】
３０７．集団の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、又は９５％は、細胞が外来性タンパク質と接触されてから１日後に外来性タンパク質を発現する、実施形態３０３〜３０６のいずれかの方法。
【実施例】
【０４８５】
実施例１：外来性修飾又は非修飾ＲＮＡの送達方法
レンチウイルス形質導入Ｋ５６２細胞の場合、導入遺伝子に含まれるエピトープタグ（ＨＡタグ）の発現は、プロウイルス長に逆相関し、およそ６ｋｂを超えるプロウイルスコンストラクトでは、ＨＡタグを発現する細胞のパーセントにおいておよそ１−ｌｏｇ低下している（図１を参照されたい）。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、形質導入効率の低下の理由は、より長いプロウイルス配列のレンチウイルス内のパッケージング効率の低下が関与すると考えられる。３．６ｋｂ〜８．２ｋｂの範囲のプロウイルス長のレンチウイルスコンストラクトのセットを試験した（図２を参照されたい）。ＥＬＩＳＡで測定したｐ２４カプシドタンパク質の数を用いて、生成されたレンチウイルス粒子の数を定量化した。プロウイルスＲＮＡのコピーの数を定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により測定した。正規化により、プロウイルス長の関数としてのｐ２４カプシドタンパク質の１マイクログラム当たりのＲＮＡコピーの数量化が提供された。実験では、プロウイルス長＜５ｋｂの場合、ｐ２４の１マイクログラム当たり約３×１０９のＲＮＡコピーが観察された。コンストラクト＞６ｋｂの場合、ｐ２４カプシドの１マイクログラム当たり約８×１０８超のＲＮＡコピーを示すウイルス製剤は存在しなかった。形質導入効率の低下をもたらす、ＲＮＡ含有ウイルス製剤とＲＮＡ欠損ウイルス製剤との間のサイズ依存性相違が認められる。
【０４８６】
２６０Ｖ／１５０μＦの単一パルスによる、Ｋ５６２細胞の電気穿孔、及び赤血球細胞（初代細胞からの）と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡとの培養を行った（図３を参照されたい）。ＧＦＰからの蛍光を読み取ることにより遺伝子導入の成功を測定し、この成功は、ｍＲＮＡが細胞に進入した後、タンパク質に翻訳されることを必要とする。Ｋ５６２細胞の電気穿孔の成功をもたらす文献の条件（Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００１  ９８（１）：４９−５６）は、培養した赤血球細胞（初代前駆細胞由来の）への外来性核酸の有効な送達には不十分である。初代前駆細胞由来の培養赤血球細胞の電気穿孔に関する５０を超える異なる条件を試験した。遺伝子導入効率は、０．１％の遺伝子導入細胞〜８５％超の遺伝子導入細胞の範囲であった（図４Ａ〜４Ｃを参照されたい）。図４Ａ〜４Ｃは、１２の異なる条件に関する分化８日目の、初代前駆細胞由来の培養赤血球細胞の電気穿孔後のｍＲＮＡからのＧＦＰの翻訳を示す。生存率は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの生／死染色を使用して測定し、染色が陰性であった細胞は、生存可能であると見なされた。条件１は、非遺伝子導入対照に対応する（０．２１％  ＧＦＰ、９７．３９％生存率）。用いた電気穿孔条件に応じて、細胞は、非常に良好なｍＲＮＡの取込み（８６．９％）及び高い生存率（９２．６％）を有し（例えば、条件２）、又は乏しいｍＲＮＡの取込み（３０．９％）及び乏しい生存率（４２．７％）を有した（例えば、条件９）。
【０４８７】
細胞が継続的に分化するにつれて、高い生存率を維持すると共に良好な導入遺伝子取込み及び発現を達成するために、異なる電気穿孔条件を必要とする。およそ２０日の分化培養の過程にわたって細胞に対する５０を超える条件を試験して、良好な遺伝子導入及び良好な生存率を促す条件を特定した。図５は、３つの異なる時点−８日目、１３日目、及び１５日目における、電気穿孔によるＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いた細胞の遺伝子導入の成功を示す。好適な条件を表５〜７にまとめる。培養赤血球細胞は分化の１０日目及び１２日目にも電気穿孔によりＧＦＰ  ｍＲＮＡを遺伝子導入され、ＧＦＰ発現をもたらした（データは示さず）。
【０４８８】
本明細書に開示した条件下における、初代前駆細胞から培養した赤血球細胞の電気穿孔は、高分化する細胞の能力を損なわないように思われることも認められた。一度電気穿孔された細胞は、再び電気穿孔され、再び導入遺伝子を問題なく取込み、翻訳した。図６は、９日目に電気穿孔され４日間分裂させた、初代前駆細胞から培養した赤血球細胞の集団を示し、その４日間の間、おそらく細胞分裂によるｍＲＮＡ及びタンパク質の希釈に起因して、ＧＦＰ蛍光の量が低下し、１３日目に再び電気穿孔された。
【０４８９】
培養赤血球細胞を、細胞が比較的未分化である増殖段階中である、分化の４日目にＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いて電気穿孔した。分化の８日目に、細胞は、ＧＦＰ蛍光を示し、表８に示すように、７ＡＡＤ染色による高い生存率を示した。表８において、Ｐ１は、細胞を構成する主要集団の百分率を示し（例えば、、高いＰ１値は、低いデブリレベルを意味する）；％  ＧＦＰは、ＧＦＰ蛍光を示すＰ１における細胞のパーセントを示し、ＭＦＩは、ＧＦＰ＋細胞の蛍光強度を意味し、％ＡＡＤ−は、ＡＡＤ陰性である細胞のパーセントを示し、ここで、生存可能細胞は、ＡＡＤ陰性である。
【０４９０】
実施例２：ＥＬＩＳＡ
市販のキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造両者のプロトコルに従ってＰ２４タンパク質を定量化した。手短には、ウイルス上清を、２０ｕＬ溶解緩衝液を有するチューブ内に分配し、３７Ｃで６０分間インキュベートした後、マイクロタイタープレートに移動した。マイクロタイタープレートを洗浄し、１００μｌの抗ｐ２４（ビオチンコンジュゲート）検出器抗体と共に３７Ｃで６０分間インキュベートした。洗浄後、プレートを１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートと共に室温で３０分間インキュベートした後、再び洗浄した。１２。基質溶液をプレートに加え、室温（１８〜２５℃）で２０（±２）分間インキュベートした。反応を停止溶液により停止し、４５０ｎｍでの光吸収により比色分析読み取りを検出した。
【０４９１】
実施例３：ｑＰＣＲ
市販のレンチウイルスベクターｑＲＴ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ウイルスＲＮＡコピーを定量化した。手短には、ＲＮＡウイルス精製キットを使用して、レンチウイルス上清からＲＮＡを抽出した。ウイルスゲノム上の保存配列を認識し、ベクターによりコードされる特定の導入遺伝子に依存しない、標準的なレンチウイルスプライマー（フォワード及びリバース）を用いてＰＣＲ反応を行った。４２Ｃで５分間のインキュベーション、次いで９５℃で１０秒間のインキュベーション、次いで９５Ｃで５秒間及び６０Ｃで３０秒間の４０サイクルによりＲＴ反応を行った。使用した機器は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏであった。
【０４９２】
実施例４：インビトロ転写によるｍＲＮＡの生成
ｍＲＮＡのインビトロ生成のためのキットは、市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＭＡｘｉｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット）。手短には、関心対象の遺伝子を、標準的な分子生物学的技術により、適切なＴ７プロモーターを含有するプラスミドＤＮＡにクローン化する。転写反応を１ｕｇ  ＤＮＡ鋳型、２ｕＬ  １０×転写緩衝液、各々１ｕＬの１０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ、２ｕＬのＴ７ポリメラーゼ酵素ミックスを用いて総容積２０ｕＬで設定する。反応物を徹底的に混合し、３７Ｃで１時間インキュベートする。汚染する残留プラスミドＤＮＡを除去するために、１ｕＬターボＤＮＡｓｅを加え、反応物を３７Ｃで１５分間インキュベートする。１ｕＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡを加えて反応を停止する。転写産物をゲル電気泳動又はスピンカラム精製により精製する。
【０４９３】
実施例５：電気穿孔
細胞をＲＰＭＩ緩衝液中で洗浄し、１０ｕＬの総容積中の密度１×１０７細胞／ｍＬでＬｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＮｅｏｎ電気穿孔機器に負荷し、以下の条件で電気穿孔した：１０００Ｖの１パルス、５０ｍｓのパルス幅。
【０４９４】
実施例６：化学修飾ｍＲＮＡを用いた電気穿孔
ＧＦＰをコードする化学修飾ｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋから購入した。ＲＮＡは、シュード−ウリジン及び５−メチルシトシンを含む。分化している赤血球細胞を、分化の４、８、１０、又は１２日目に電気穿孔した。試験した全ての分化の日、試験した異なる電気穿孔条件下でＧＦＰ蛍光を観察した。表９は、４日目に電気穿孔され、８日目に観察した際のＧＦＰ蛍光レベルを示す。表１０は、細胞が１２日目に電気穿孔され、１５日目に観察した際のＧＦＰ蛍光レベルを示す。分化の８日目又は１０日目に電気穿孔された細胞におけるＧＦＰ蛍光も観察した（データは示さず）。
【０４９５】
トリパンブルー染色を用いて、電気穿孔細胞における細胞生存率及び増殖能を測定した。細胞を分化の８日目に、非修飾ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、又はシュード−ウリジン及び５−メチルシトシンを含むＴｒｉＬｉｎｋ化学修飾ＲＮＡを用いて電気穿孔した。９日目に、非修飾又は修飾ＲＮＡを受容した細胞におけるＧＦＰ蛍光を観察した（データは示さず）。また、９日目に細胞の総数、生細胞の数、及び細胞生存率を測定した。非修飾ｍＲＮＡを用いて電気穿孔したサンプルでは、生細胞の数は、外来性核酸を加えずに電気穿孔した対照細胞における生細胞の数よりも少なかった（表１１を参照されたい）。この減少は、修飾ＲＮＡを使用した場合、部分的に逆転した（表１１）。これは、非修飾ＲＮＡを用いた電気穿孔が細胞の成長又は生存率を低下させ得、修飾ＲＮＡの使用が成長又は生存率を少なくとも部分的に救い得ることを示す。
【０４９６】
実施例７：異種非翻訳領域
ヘモグロビン３’ＵＴＲ配列が追加されたインビトロ転写ＧＦＰ  ｍＲＮＡ（「Ｈｅｍｏ−ＧＦＰ」）を用いて赤血球細胞を電気穿孔した。ｍＲＮＡは、化学的に修飾されていなかった。次いで、電気穿孔から２日後に細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ蛍光に関してアッセイした。５９．７％の細胞は、ＧＦＰ陽性であった。ＧＦＰ陽性細胞の平均蛍光強度は、３５０６９単位であった。
【０４９７】
実施例８：成熟段階中のｍＲＮＡ電気穿孔
図７Ａに示すように、赤血球細胞分化は、３つの段階に分割することができる：増殖（増殖の０〜５日目、これは全体の０〜５日目に対応する）、分化（分化の１〜９日目、これは全体の６〜１４日目に対応する）、及び成熟（成熟の１〜１４日目、これは全体の１５〜２８日目に対応する）。増殖は、初期培養物を増幅して臨床的用量の必須要件を満たすための非分化環境内での造血性前駆細胞の単離及び増殖の段階を説明する。分化は、赤血球生成を誘導し、赤血球細胞機能に特殊化させるための成長因子及び培地添加物の使用を説明する。成熟は、赤血球細胞が最初に核を、続いてそれらのミトコンドリア及びリボソーム内容物を喪失する最終ステージを指す。成熟赤血球細胞は、新たなｍＲＮＡ合成又はタンパク質翻訳の能力を有さない。
【０４９８】
赤血球細胞分化は、インビトロで行い、細胞は異なる時点においてＧＦＰ  ｍＲＮＡを用いて電気穿孔された。細胞が分化の９日目（全体の１４日目）に電気穿孔された際、ＧＦＰ発現は、当初観察されたが、実験の９日間の過程にわたって減少した（図７Ｂ）。細胞が成熟の７日目（全体の２１日目）に電気穿孔された際、ＧＦＰ発現は、実験の９日間の過程全体に延長した（図７Ｃ）。４つの異なる電気穿孔プロトコル（Ｐ１〜Ｐ４）の下で、結果は同様であり、この効果は、電気穿孔条件に比較的依存しないことが示された。
【０４９９】
このような後期ステージでの電気穿孔が、電気穿孔が機能した場合と同様に機能したことは驚くべきことであった。Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）に引用されているように、成体赤血球は、気体輸送におけるその役割のために合成ヘモグロビンを搬送するよう組織化され；核、タンパク質合成の能力、及びその機能を多様化する能力が、生物学的に経済的な手段を介したヘモグロビン輸送の最終目的のために放棄されている」。当技術分野では、一般に、成熟は、赤血球細胞が脱核し、リボソーム及びミトコンドリアが脱落するときの段階と考える。リボソームの脱落は、成熟段階の赤血球細胞の翻訳が乏しくなり、従って新たなタンパク質合成が不可能な筈であるという予想をもたらす。
【０５００】
そのため、成熟段階の赤血球細胞が少なくとも分化段階の赤血球細胞と同様に遺伝子導入ｍＲＮＡを翻訳できることは驚くべきことであり、また、成熟段階の赤血球細胞が分化段階の赤血球細胞よりも持続したレベルの遺伝子導入タンパク質を生成したことは更に驚くべきことであった。これは、従来のモデルに反する赤血球発達の独特のステージを特定し、ステージでは、外来的に提供されたＲＮＡからの新たなタンパク質合成が脱核赤血球細胞内で達成され得る。これは、後期ステージの赤血球細胞生成物における安定なタンパク質生成を達成するための未知の経路をここに特定する。
【０５０１】
実施例９：電気穿孔のタイミング
成熟条件下での赤血球細胞の集団へのレポータータンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡの電気穿孔に関して、いくつかの異なる時点を試験した。詳細には、電気穿孔を成熟の４、５、６、及び７日目に試験した。電気穿孔後、細胞をフローサイトメトリーにより、少なくとも６日間、２４時間毎にＧＦＰ発現に関してアッセイした。好適な電気穿孔条件は、例えば、本明細書の実施例１、及びその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願国際公開第２０１６／１８３４８２号パンフレットに記載されている。
【０５０２】
図８Ａに示すように、全ての時点の電気穿孔細胞は、延長されたＧＦＰ発現を与えた。しかしながら、Ｍ４及びＭ５日に電気穿孔された細胞は、Ｍ６又はＭ７に電気穿孔された細胞よりも高い百分率のＧＦＰを発現する細胞を与えた。この実験は、特に導入遺伝子の発現に適した赤血球細胞成熟の窓口（ｗｉｎｄｏｗ）を示す。図８Ｂは、集団におけるＧＦＰレベルが、時間の経過と共に、Ｍ４又はＭ５で遺伝子導入された細胞において幾分減少していることを示す。しかしながら、これらの細胞におけるＧＦＰ発現は、対照細胞と、後の時点で電気穿孔された細胞とのＧＦＰ発現よりも依然として高い。
【０５０３】
理論に束縛されるものではないが、窓口は、細胞の翻訳機構が依然として喪失されていない、成熟における十分早期であるが、外来性ｍＲＮＡ及びコード化タンパク質が続く細胞分裂により過度に希釈されていない、成熟における十分後期である時点を示し得る。この窓口は、実施例１０に記載されるように更に特徴付けられる。
【０５０４】
実施例１０：成熟している赤血球細胞の特徴付け
次に、成熟している赤血球細胞をそれらの翻訳活性及び脱核レベルに関していくつかの時点で特徴付けた。翻訳活性は、生体直交型非標準アミノ酸タグ化、即ちＢＯＮＣＡＴにより測定した。好適なＢＯＮＣＡＴアッセイは、例えば、Ｈａｔｚｅｎｐｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）１６（８），２５６８−２５９０に記載されている。このアッセイは、Ｌ−メチオニンの代理、非標準アミノ酸Ｌ−アジドホモアラニン（ＡＨＡ）のインビボ組み入れと、その後の組み入れられたＡＨＡ細胞タンパク質のクリックケミストリーによる蛍光標識化とに基づく。このプロトコルを修正し、ＡＨＡ濃度を１ｍＭから２ｍＭに増大させ、インキュベーション時間を３時間に最適化し、ゲル電気泳動及び赤外線撮像による分析を可能にするジベンゾシクロオクチン基（ＤＢＣＯ）を使用した銅フリークリックケミストリーにより、哺乳動物初代細胞、特にヒト赤血球前駆細胞に対して最適化した。赤血球細胞の集団を拡大、分化、及び成熟条件に暴露し、３×１０６細胞のサンプルをＭ３、Ｍ５、Ｍ７、Ｍ９、Ｍ１１、Ｍ１５、及びＭ１６日に収集した。図９に示すように、細胞の翻訳活性は、時間の経過と共に劇的に減少し、赤血球細胞が翻訳機構を喪失したことが示された。同じ時間の経過と共に、集団における脱核細胞の割合は、劇的に上昇した。
【０５０５】
細胞表面マーカーも、成熟の異なるステージにおいて、赤血球細胞内でフローサイトメトリーによりアッセイした。表１３に示すように、ＧＰＡ陽性細胞及びバンド３陽性細胞の百分率は、成熟中に上昇し、Α４インテグリン陽性の百分率は、時間的経過全体において高いままであった。
【０５０６】
実施例１１：リボヌクレアーゼ阻害剤は、電気穿孔赤血球細胞内のタンパク質発現を増大させる
この実験は、赤血球細胞をリボヌクレアーゼ阻害剤に暴露すると、導入遺伝子の発現が増大することを示す。
【０５０７】
赤血球細胞を分化させ、成熟条件に暴露し、レポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするｍＲＮＡを用いてＭ４日に電気穿孔した。２×１０６細胞をＲＮａｓｉｎで処理した後、ｍＲＮＡを０．５Ｕ／ｕＬ、１Ｕ／ｕＬ、若しくは２Ｕ／ｕＬレベルで細胞に加え、又はＲＮａｓｉｎなしを対照とした。非電気穿孔対象も含まれていた。細胞をＭ５、Ｍ７、Ｍ９、及びＭ１１日にアッセイした。図１０に示すように、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞の百分率は、特にＭ１１日の時点で、ＲＮａｓｉｎで処理しなかった細胞内よりもＲＮａｓｉｎで処理した細胞内で高かった。ＲＮａｓｉｎ処理は、細胞生存率又は脱核に負の影響を与えなかった（データは示さず）。
【０５０８】
実施例１２：プロテアソーム阻害剤は、電気穿孔赤血球細胞内のタンパク質発現を増大させる
この実験は、赤血球細胞をプロテアーゼ阻害剤に暴露すると、導入遺伝子の発現が増大することを示す。
【０５０９】
赤血球細胞を分化させ、成熟条件に暴露し、レポーター遺伝子（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡを用いてＭ５日に電気穿孔した。細胞をＭＧ−１３２、ボルテゾミブ、及びカルフィルゾミブから選択されたプロテアソーム阻害剤でＭ４、Ｍ５、又はＭ６日に処理した。全ての細胞サンプルは、Ｍ７、Ｍ９、及びＭ１１にアッセイした際、７５％を超える高いＧＦＰ陽性細胞の百分率をもたらした（データは示さず）。図１１に示すように、電気穿孔前の２０Ｓプロテアソーム阻害剤、ＭＧ−１３２又はボルテゾミブを用いた処理は、１つ以上の時点でＧＦＰの有効な発現の増大をもたらした。ボルテゾミブ処理は、プロテアソーム阻害剤で処理されなかった細胞と比較して、有効なＧＦＰ発現の４倍の増大をもたらした。電気穿孔前の２０Ｓプロテアソーム阻害剤を用いた処理も、正常な脱核をもたらした（データは示さず）。
【０５１０】
実施例１３：２つ以上のＲＮＡの共発現
この実施例は、赤血球細胞内での２つ以上のｍＲＮＡの共発現を示す。
【０５１１】
最初に、ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡ単独（表１４、第１のデータ列）、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ単独（表１４、第２のデータ列）、又は両方のｍＲＮＡ（表１４、第３のデータ列）を用いて赤血球細胞をＭ５日に電気穿孔した。フローサイトメトリーによりＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をＭ６、Ｍ１１、Ｍ１８、及びＭ１８日にアッセイした。ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの両方）．を発現する細胞の百分率は、時点全体において一貫して高く（６６．０５％〜８６．５５％）、１つのみのｍＲＮＡを用いて電気穿孔した後の細胞の蛍光発光のパーセントと同等であった。この実験は、２つのｍＲＮＡを同時に均一に発現させることが可能であることを示す。
【０５１２】
発現レベルもアッセイした。Ｍ１３日に、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡのみを用いて電気穿孔した細胞内のｍＣｈｅｒｒｙの有効な発現は、１１７であり、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの両方を用いて電気穿孔した細胞内のｍＣｈｅｒｒｙの有効な発現は、８５であった。ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡのみを用いて電気穿孔した細胞内のＥＧＦＰの有効な発現は２１９であり、ｍＣｈｅｒｒｙ  ｍＲＮＡ及びＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの両方を用いて電気穿孔した細胞内のＥＧＦＰの有効な発現は２０１であった。そのため、発現レベルは、１つ又は２つのｍＲＮＡを用いて電気穿孔した細胞内で同様であった。
【０５１３】
生存率は、２つのｍＲＮＡを用いて共電気穿孔した細胞では、いずれかのｍＲＮＡ単独を用いて電気穿孔した細胞におけるもの以上であった（データは示さず）。
【０５１４】
ＨＡ−タグ化ｍ４−１ＢＢＬ及びＦＬＡＧ−タグ化アベルマブをコードする他のｍＲＮＡの対を赤血球細胞内で共発現させた。ＲＮＡを分化の６日目（Ｄ６）又は分化の７日目（Ｄ７）に、２５×１０６赤血球細胞に濃度０．６又は０．８ｍｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡで加えた。外来性タンパク質を、抗ＨＡ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体を使用してフローサイトメトリーにより検出した。表１５に示すように、タンパク質の共発現は、５８．５％の細胞において達成され、この数は、１つのみのｍＲＮＡを用いて電気穿孔したサンプルにおけるいずれかのタンパク質単独を発現した細胞の数と同等であった。
【０５１５】
実施例１４：用量−発現研究
この実験は、所定の量の外来性タンパク質が、赤血球細胞の集団を、外来性タンパク質をコードする所定の量のｍＲＮＡと接触させることにより生成し得ることを示す。
【０５１６】
成熟の４日目の５×１０６細胞を異なる量のｍＲＮＡ（サンプル当たりＲＮＡ０．００２５〜０．６ｕｇ）と接触させ、電気穿孔した。電気穿孔から２４時間後にタンパク質発現をアッセイした。外来性タンパク質を、抗ＨＡ抗体を使用してフローサイトメトリーにより定量化した。細胞当たりのタンパク質の平均数を計算した。これを表１６に示す。外来性タンパク質を発現する細胞のパーセントも表１６に示す。注目すべきことに、試験した全ｍＲＮＡレベルにおいて、外来性タンパク質を発現する細胞のパーセントは高い。しかしながら、１細胞当たりのコピーの数は、使用したｍＲＮＡの量と共にほぼ線形に上昇する。そのため、所望のタンパク質発現の量は、適切なｍＲＮＡを選択すると共に、細胞の集団全体で均一な発現を維持することによって得ることができる。
【０５１７】
実施例１５：修飾ＲＮＡからの発現
５’キャップ（ＡＲＣＡ）、ポリＡテイル、及びシュードウリジンの１つ以上を含む修飾ｍＲＮＡを生成した。ｍＲＮＡは、翻訳を促進するためのＩＲＥＳ、検出を促進するためのＨＡ−コード領域、並びにＧＦＰ及びＰＡＬ（フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）の融合をコードする領域を含む。ｍＲＮＡを電気穿孔によりＭ４日に赤血球細胞に導入し、Ｍ５（２４時間後）、Ｍ６、Ｍ７、及びＭ１０日に分析した。ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定した。図１２に示すように、シュードウリジンｍＲＮＡを発現する細胞は、完全に非修飾のＲＮＡを発現する細胞よりも高いＧＦＰ陽性細胞の百分率を有した。ポリＡテイル及びキャップの付加は、ＧＦＰ陽性細胞の百分率を更に増大させた。最終的に、ＧＦＰレポーターの発現を示す細胞の百分率は、キャップ、ポリ−Ａテイル、及びシュードウリジン組み入れを有するｍＲＮＡと接触させた細胞で最大であった。
【０５１８】
表
【０５１９】
【表１】
2019520829.tif 000006
【０５２０】
【表２】
2019520829.tif 000007
【０５２１】
【表３】
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【０５２２】
【表４】
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【０５２３】
【表５】
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【０５２４】
【表６】
2019520829.tif 000011
【０５２５】
【表７】
2019520829.tif 000012
【０５２６】
【表８】
2019520829.tif 000013
【０５２７】
【表９】
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【０５２８】
【表１０】
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【０５２９】
【表１１】
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【０５３０】
【表１２】
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【０５３１】
【表１３】
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【０５３２】
【表１４】
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【０５３３】
【表１５】
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【０５３４】
【表１６】
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【０５３５】
【表１７】
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【０５３６】
【表１８】
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【０５３７】
【表１９】
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【０５３８】
【表２０】
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【０５３９】
【表２１】
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【０５４０】
【表２２】
2019520829.tif 000027
【０５４１】
【表２３】
2019520829.tif 000028
【０５４２】
【表２４】
2019520829.tif 000029
【０５４３】
【表２５】
2019520829.tif 000030
【０５４４】
【表２６】
2019520829.tif 000031
【０５４５】
【表２７】
2019520829.tif 000032
【０５４６】
【表２８】
2019520829.tif 000033
【０５４７】
【表２９】
2019520829.tif 000034
【０５４８】
【表３０】
2019520829.tif 000035
【０５４９】
【表３１】
2019520829.tif 000036
【０５５０】
【表３２】
2019520829.tif 000037
【０５５１】
【表３３】
2019520829.tif 000038
【０５５２】
【表３４】
2019520829.tif 000039
【０５５３】
【表３５】
2019520829.tif 000040
【０５５４】
【表３６】
2019520829.tif 000041
【０５５５】
【表３７】
2019520829.tif 000042
【０５５６】
【表３８】
2019520829.tif 000043
【０５５７】
【表３９】
2019520829.tif 000044
【０５５８】
【表４０】
2019520829.tif 000045
【０５５９】
【表４１】
2019520829.tif 000046
【０５６０】
【表４２】
2019520829.tif 000047
【０５６１】
前述した本発明は、理解を深める目的で解説及び例により幾分詳細に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の教示を考慮して特定の変更形態及び修正形態がなされ得ることが当業者に容易に明らかになるであろう。
【図１】
2019520829.tif 000048
【図２】
2019520829.tif 000049
【図３】
2019520829.tif 000050
【図４Ａ】
2019520829.tif 000051
【図４Ｂ】
2019520829.tif 000052
【図４Ｃ】
2019520829.tif 000053
【図５】
2019520829.tif 000054
【図６】
2019520829.tif 000055
【図７Ａ−Ｃ】
2019520829.tif 000056
【図８Ａ−Ｂ】
2019520829.tif 000057
【図９】
2019520829.tif 000058
【図１０】
2019520829.tif 000059
【図１１】
2019520829.tif 000060
【図１２】
2019520829.tif 000061
【配列表】
2019520829000001.app
【国際調査報告】
2019520829.tif 000062
2019520829.tif 000063
2019520829.tif 000064
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2019520829.tif 000067
2019520829.tif 000068