(57)【要約】本発明は、ＤＮＡを細胞中に導入するための系および方法に関する。特に、本発明は、単一コピーまたは多コピーの目的のＤＮＡ配列または遺伝子を細胞中に導入するための方法であって、以下：ａ）“コピーアンドペースト”トランスポザーゼ；ならびにｂ）“コピーアンドペースト”トランスポゾン末端配列、例えばＬＴＳまたはＲＴＳに隣接する目的のＤＮＡ配列または遺伝子を含むコンストラクトを提供することを含む方法に関する。Ｈｅｌｉｔｒｏｎファミリーの新規の“コピーアンドペースト”トランスポゾンが、ＤＮＡを細胞中に導入するため、例えばタンパク質生成、細胞および遺伝子療法における使用のための、または参照標準としての使用のための細胞株を生成するための方法において対応するトランスポザーゼを用いるための系と共に記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一コピーまたは多コピーの目的遺伝子を細胞に導入するための方法であって、以下：
ａ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼ；および
ｂ）ＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼＬＴＳ配列を含むコンストラクト
を提供することを含む、上記方法。
【請求項２】
ｂ）におけるコンストラクトが、ＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼＬＴＳ配列に隣接している目的遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
単一コピーまたは多コピーの目的遺伝子を真核細胞に導入するための方法であって、以下：
ａ）“コピーアンドペースト”トランスポザーゼ；および
ｂ）“コピーアンドペースト”トランスポゾンＬＴＳ配列に隣接する目的遺伝子を含むコンストラクト；
を提供することを含む、上記方法。
【請求項５】
真核細胞が、植物細胞、酵母細胞または哺乳類細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、ヒト、ラットまたはマウスの細胞である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
“コピーアンドペースト”トランスポザーゼがＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼであり、ＬＴＳがＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンに由来する、請求項４〜６に記載の方法。
【請求項８】
ＬＴＳ配列が、ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
目的遺伝子が、ＲＴＳ配列にも隣接している、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ＲＴＳ配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
トランスポザーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
トランスポザーゼおよび目的遺伝子を含むコンストラクトが、２つの別々の実体として提供される、請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
トランスポザーゼ、目的遺伝子およびＬＴＳが、単一のコンストラクトとして提供される、請求項２〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
目的遺伝子が内在性遺伝子であり、多コピーの該内在性遺伝子またはｃＤＮＡ配列が導入される、請求項２〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
目的遺伝子が、非内在性遺伝子またはｃＤＮＡ配列である、請求項２〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、細胞株を生成するために用いられる、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞株が、多コピーの目的遺伝子を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の工程：
ａ）少なくとも１個のＨｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列に隣接する目的遺伝子をコードする核酸配列を含む第１コンストラクトを提供し；
ｂ）該第１コンストラクトを細胞に導入し；
ｃ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む第２コンストラクトを提供し；
ｄ）該第２コンストラクトをｂ）において得られた細胞に導入し；
ｅ）ｄ）において得られた細胞をトランスポザーゼ活性に関する条件下で培養し；そして
ｆ）多コピーの目的遺伝子を検出する；
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１コンストラクトが、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳおよびＲＴＳ配列を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１コンストラクトが、好ましくはプログラム可能なヌクレアーゼ技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼを用いるゲノム工学により生成される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
既知のコピー数を有するクローンを選択することをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
目的遺伝子が、療法的タンパク質をコードしている、請求項２〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法により生成された、細胞株。
【請求項２４】
参照標準として使用するための、請求項２３に記載の細胞株。
【請求項２５】
目的のタンパク質の生成における使用のための、請求項２３に記載の細胞株。
【請求項２６】
療法における使用のための、請求項２３に記載の細胞株。
【請求項２７】
細胞株が、ＣＨＯ細胞株である、請求項２３〜２６のいずれかに記載の細胞株。
【請求項２８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されている配列に対して８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたアミノ酸配列であって、該配列がＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードしている、上記アミノ酸配列。
【請求項２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載の単離されたアミノ酸配列。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項３１】
配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む、請求項３０に記載の単離された核酸配列。
【請求項３２】
配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されている核酸配列である、請求項３１に記載の単離された核酸配列。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項３７】
少なくともＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている配列またはそれに対して８０％の同一性を有する配列を含むＬＴＳ  ＨｅｌＲａｉｓｅｒ末端配列に隣接している目的遺伝子の核酸配列を含む、単離された核酸。
【請求項３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている配列またはそれに対して８０％の同一性を有する配列を含むＲＴＳ  ＨｅｌＲａｉｓｅｒ末端配列をさらに含む、請求項３７に記載の単離された核酸。
【請求項３９】
請求項３０〜３８のいずれかに記載の核酸配列を含む、発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３７または請求項３８に記載の核酸配列を含む発現ベクターであって、以下：
ａ）ＬＴＳおよびＲＴＳに隣接する一般的なｇＲＮＡ認識部位、好ましくはＴｉａ１Ｌ；
ｂ）プロモーター配列であって、目的遺伝子が該プロモーターの制御下にあるように配置されたプロモーター配列；
ｃ）該目的遺伝子に続くポリアデニル化カセット；
の少なくとも１つをさらに含む、上記発現ベクター。
【請求項４１】
請求項３０〜３８のいずれかに記載の核酸配列、または請求項３９もしくは４０に記載の発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
【請求項４２】
宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４３】
目的のタンパク質を生成する方法であって、請求項２５、請求項４１または請求項４２に記載の細胞を適切な培地で培養し、該目的タンパク質を該細胞または適切な培地から回収することを含む、上記方法。
【請求項４４】
目的遺伝子をそれを必要とする対象に提供することにより疾患を処置するための方法であって、以下の工程：
ａ）該対象における使用に適した細胞株を単離し；
ｂ）請求項３３、３７もしくは３８に記載の単離された核酸、または請求項３９もしくは４０に記載の発現ベクターを該細胞株に導入し、ここで、前記の核酸または発現ベクターは、目的のタンパク質に対応する目的遺伝子を含み；
ｃ）請求項２８もしくは請求項２９に記載のアミノ酸配列、請求項３０、３１もしくは３３に記載の核酸配列、または請求項３９もしくは４０に記載の発現ベクターを、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移事象が生じて目的遺伝子を含む組み換え細胞株を生成するように導入し；
ｄ）該組み換え細胞株を細胞培養において拡張して組み換え細胞の集団を提供し；そして
ｅ）該組み換え細胞を該対象に導入する；
を含む、上記方法。
【請求項４５】
細胞株が、Ｔ細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、骨髄性−赤血球系前駆（ＣＭＥＰ）細胞またはリンパ球共通前駆（ＣＬＰ）細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
それを必要とする対象において疾患を処置するための方法であって、以下の工程：
ａ）請求項３３、３７または３８に記載の単離された核酸を含む第１発現ベクターを提供し；
ｂ）請求項３０、３１または３３に記載の核酸配列を含む第２発現ベクターを提供し；
ｃ）該第１および第２発現ベクターを対象に導入する；
を含む、上記方法。
【請求項４７】
請求項３３、３７または３８に記載の単離された核酸を含む第１発現ベクター、および請求項３０、３１または３３に記載の核酸配列を含む第２発現ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項４８】
ＬＴＳおよび／またはＲＴＳに隣接するレポーター遺伝子をコードする供与体と合わせてのＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼの使用であって、該レポーターの複数のゲノム組み込み事象を含有する細胞株のライブラリーを生成するための、上記使用。
【請求項４９】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移法由来の細胞株を検出するための方法であって、請求項３３または請求項３４に記載のＬＴＳおよび／またはＲＴＳ配列の存在に関して細胞株を分析することを含む、上記方法。
【請求項５０】
細胞株を生成するための方法であって、以下の工程：
ａ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎ  ＬＴＳ配列を含むコンストラクトを提供し；そして
ｂ）該コンストラクトを細胞株に導入する；
を含む、上記方法。
【請求項５１】
部分ａ）におけるコンストラクトが、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ  ＲＴＳ配列をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＬＴＳおよび／またはＲＴＳが、目的のＤＮＡ配列に対して標的化されている、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５０〜５２に記載の方法により生成された、細胞株。
【請求項５４】
多コピーの目的ＤＮＡ配列を含む細胞株を生成するための方法であって、以下の工程：
ａ）請求項５３に記載の細胞株を準備し；
ｂ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼをトランスポザーゼ活性のための条件下で導入し；
ｃ）多コピーの該ＤＮＡ配列を有するクローン細胞株を単離する
を含む、上記方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法により生成された、単離されたクローン細胞株。
【請求項５６】
参照標準として使用するための、請求項５５に記載の単離されたクローン細胞株。
【請求項５７】
細胞株が、ＣＨＯ細胞株またはＨＡＰ１もしくはｅＨＡＰ細胞株である、請求項５３、５５または５６のいずれかに記載の単離された細胞株。
【請求項５８】
単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を有する細胞を生成するための、真核細胞におけるコピーアンドペーストトランスポゾンの使用。
【請求項５９】
単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を有する細胞を生成するための、原核細胞または真核細胞におけるＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡを細胞に導入するための系および方法に関する。本発明は、単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を細胞内で生成するための系に関する。その系は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼならびにそのトランスポザーゼにより認識されるＲＴＳおよびＬＴＳ配列を有するＤＮＡ配列の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子および細胞工学のためのトランスポゾン系の使用が、記載されてきた（例えばIvics and Izsvak, Mobile DNA 2010, 1:25 doi:10.1186/1759-8753-1-25において総説されている）。これらの系は、トランスポゾン、例えばｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）（例えば米国特許第６，４８９，４５９号参照）およびＰｉｇｇｙＢａｃを使用し、それは、遺伝子重複および発現のためにカット／ペースト機序を使用する。これらの系の欠点は、一度宿主のゲノム中に挿入されると、それらはそれらが送達したカーゴのコピー数を増幅できないことである。
【０００３】
従って、新規のトランスポゾンベースの系に関する必要性が、存在する。
【０００４】
真核生物界全体に広く行き渡っており、Ｈｅｌｉｔｒｏｎと名付けられたＤＮＡトランスポゾンの新規の群が、インシリコゲノム配列分析により発見された（Kapitonov VV, Jurka J. Helitrons on a roll: eukaryotic rolling-circle transposons. Trends Genet 23, 521-529 (2007)およびThomas J, Pritham EJ. Helitrons, the Eukaryotic Rolling-circle Transposable Elements. Microbiology spectrum 3, (2015)において総説されている）。
【０００５】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンは、ＤＮＡトランスポゾンに普通ではないいくつかの特徴、例えば標的部位重複（ＴＳＤ）の欠如を示す（Kapitonov et al. (2007)およびThomas et al. (2015)において総説されている）。さらに、推定上のＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＲＮアーゼＨ様触媒ドメインを含有しない（Dyda F, Hickman AB, Jenkins TM, Engelman A, Craigie R, Davies DR. Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases. Science 266, 1981-1986 (1994)）が、複製開始因子（Ｒｅｐ）およびＤＮＡヘリカーゼ（Ｈｅｌ）ドメインにより構成される“ＲｅｐＨｅｌ”モチーフをコードしている（Kapitonov et al. (2007); Thomas et al. (2015)およびKapitonov VV, Jurka J. Rolling-circle transposons in eukaryotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 8714-8719 (2001)）。Ｒｅｐは、ヌクレアーゼのＨＵＨスーパーファミリーに属するヌクレアーゼドメインであり、それは、ヌクレオチド鎖内切断、ＤＮＡ転移およびライゲーションに関する触媒反応に関わっている（Ilyina TV, Koonin EV. Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res 20, 3279-3285 (1992)およびKoonin EV, Ilyina TV. Computer-assisted dissection of rolling circle DNA replication. Biosystems 30, 241-268 (1993)）。ＨＵＨヌクレアーゼは、排他的にｓｓＤＮＡを切断し、特定のバクテリオファージ、例えばΦＸ１７４（van Mansfeld AD, van Teeffelen HA, Baas PD, Jansz HS. Two juxtaposed tyrosyl-OH groups participate in phi X174 gene A protein catalysed cleavage and ligation of DNA. Nucleic Acids Res 14, 4229-4238 (1986)）、ｓｓＤＮＡウイルス、および細菌性プラスミド（Chandler M, de la Cruz F, Dyda F, Hickman AB, Moncalian G, Ton-Hoang B. Breaking and joining single-stranded DNA: the HUH endonuclease superfamily. Nature reviews Microbiology 11, 525-538 (2013)において総説されている）の“ローリングサークル複製”（ＲＣＲ）の開始において、ならびにＩＳ９１ファミリー細菌性トランスポゾンの“ローリングサークル”（ＲＣ）転移（del Pilar Garcillan-Barcia M, Bernales I, Mendiola MV, de la Cruz F. Single-stranded DNA intermediates in IS91 rolling-circle transposition. Molecular microbiology 39, 494-501 (2001); Garcillan-Barcia MP, de la Cruz F. Distribution of IS91 family insertion sequences in bacterial genomes: evolutionary implications. FEMS microbiology ecology 42, 303-313 (2002)およびMendiola MV, Bernales I, de la Cruz F. Differential roles of the transposon termini in IS91 transposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 1922-1926 (1994)）において重要な役割を有する。
【０００６】
提唱されたＲＣ転移機序（Mendiola MV, de la Cruz F. IS91 transposase is related to the rolling-circle-type replication proteins of the pUB110 family of plasmids. Nucleic Acids Res 20, 3521 (1992)）の重要な要素は、ＩＳ９１のＨＵＨトランスポザーゼの活性部位における２つのチロシン（Ｔｙｒ）残基を含む（del Pilar Garcillan-Barcia et al. (2001)）。簡潔には、そのモデルは、トランスポゾンの５’末端における部位特異的ニックを提唱しており、トランスポザーゼは、５’−ホスホチロシン中間体を形成する。ニックにおける３’−ＯＨは、一方のトランスポゾンＤＮＡ鎖が剥がれている間にＤＮＡ合成を開始する役目を果たす。おそらく第２の活性部位のＴｙｒにより標的ＤＮＡ中に生成されたニックは、５’−ホスホチロシンの分解をもたらす。一度トランスポゾン全体が複製されたら、トランスポザーゼは、トランスポゾンの３’末端にニックを入れてそれを標的部位の５’末端に繋げることにより第２鎖転移事象を触媒する（Kapitonov et al. (2007); Chandler et al. (2013)およびMendiola et al. (1994)）。
【０００７】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎは最初の真核生物ＲＣトランスポゾンであることが、示唆されており（Kapitonov et al. (2001)）、一方で、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンは、真核生物において遺伝子フラグメントを捕捉して可動化することができ、それらの転移機序に関わる明確な情報は、いずれかの種から単離された活性要素の欠如、すなわち誰も以前に細胞内で活性に複製することができるＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンを単離することができていないため、理解し難いままである。代わりに、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンに関する我々の知識の全ては、機能が損なわれたＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンまたはトランスポゾン断片のゲノム配列残遺物の生物情報学的分析に由来する。
【０００８】
配列決定された哺乳類ゲノム中で見付かった唯一のＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンは、ヒナコウモリ科のコウモリからのものである（Pritham EJ, Feschotte C. Massive amplification of rolling-circle transposons in the lineage of the bat Myotis lucifugus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 1895-1900 (2007); Thomas J, Phillips CD, Baker RJ, Pritham EJ. Rolling-circle transposons catalyze genomic innovation in a Mammalian lineage. Genome biology and evolution 6, 2595-2610 (2014)およびThomas J, Sorourian M, Ray D, Baker RJ, Pritham EJ. The limited distribution of Helitrons to vesper bats supports horizontal transfer. Gene 474, 52-58 (2011)）。コウモリＨｅｌｉｔｒｏｎによりコードされる予測されるトランスポザーゼは、典型的な“ＲｅｐＨｅｌ”モチーフを含有し、その要素は、逆向き反復配列を含有しないが３’末端の上流に位置する短い回文構造モチーフを有する５’−ＴＣおよびＣＴＲＲ−３’末端を特徴とし、挿入は、正確に宿主のＡＴ標的部位における５’−ＡおよびＴ−３’ヌクレオチドの間で起こった（Pritham et al. (2007)）。Ｈｅｌｉｔｒｏｎファミリーの大多数は、それらの３’末端において短い回文構造配列を有する（Kapitonov et al. (2001); Coates BS, Hellmich RL, Grant DM, Abel CA. Mobilizing the genome of Lepidoptera through novel sequence gains and end creation by non-autonomous Lep1 Helitrons. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19, 11-21 (2012); Du C, Fefelova N, Caronna J, He L, Dooner HK. The polychromatic Helitron landscape of the maize genome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 19916-19921 (2009); Lal SK, Giroux MJ, Brendel V, Vallejos CE, Hannah LC. The maize genome contains a helitron insertion. The Plant cell 15, 381-391 (2003); Xiong W, He L, Lai J, Dooner HK, Du C. HelitronScanner uncovers a large overlooked cache of Helitron transposons in many plant genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 10263-10268 (2014)）が、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移におけるこれらの配列の役割は、不明である。
【０００９】
ゲノムデータは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移がしばしば宿主のゲノムフラグメントの捕捉および可動化（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）と関係しており、結果としてゲノムの調節要素のばら撒き（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）（Pritham et al. (2007)およびThomas et al. (2014)）、遺伝子フラグメントの重複（Morgante M, Brunner S, Pea G, Fengler K, Zuccolo A, Rafalski A. Gene duplication and exon shuffling by helitron-like transposons generate intraspecies diversity in maize. Nature genetics 37, 997-1002 (2005)）、キメラ転写産物の生成（Thomas et al. (2014)およびMorgante et al. (2005)）および推定される調節ＲＮＡの作製（Thomas et al. (2014)およびMorgante et al. (2005)）をもたらすことを、示唆している。いくつかの機序が、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ遺伝子捕捉を説明するために提唱されてきた（Kapitonov et al. (2007); Thomas et al. (2015); Coates et al. (2012); Dong Y, et al. Structural characterization of helitrons and their stepwise capturing of gene fragments in the maize genome. BMC genomics 12, 609 (2011); Toleman MA, Bennett PM, Walsh TR. ISCR elements: novel gene-capturing systems of the 21st century? Microbiol Mol Biol Rev 70, 296-316 (2006); Yassine H, et al. Experimental evidence for IS1294b-mediated transposition of the blaCMY-2 cephalosporinase gene in Enterobacteriaceae. The Journal of antimicrobial chemotherapy 70, 697-700 (2015); Brunner S, Pea G, Rafalski A. Origins, genetic organization and transcription of a family of non-autonomous helitron elements in maize. The Plant journal : for cell and molecular biology 43, 799-810 (2005); Feschotte C, Wessler SR. Treasures in the attic: rolling circle transposons discovered in eukaryotic genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 8923-8924 (2001)およびTempel S, Nicolas J, El Amrani A, Couee I. Model-based identification of Helitrons results in a new classification of their families in Arabidopsis thaliana. Gene 403, 18-28 (2007)）が、細胞内で複製することができる活性なＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンの欠如のため、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンのプロセスおよび制御は両方とも不可解なままであった。間に挟まっているゲノム内容物の複製を可能にする機能する末端配列と合わせた活性なトランスポザーゼ酵素により定義される活性なＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンが、以前に単離されていないため、Ｈｅｌｉｔｒｏｎの生物学に関して今日までに知られている全ては、インシリコまたは遺伝子分析に由来する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，４８９，４５９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ivics and Izsvak, Mobile DNA 2010, 1:25 doi:10.1186/1759-8753-1-25
【非特許文献２】Kapitonov VV, Jurka J. Helitrons on a roll: eukaryotic rolling-circle transposons. Trends Genet 23, 521-529 (2007)
【非特許文献３】Thomas J, Pritham EJ. Helitrons, the Eukaryotic Rolling-circle Transposable Elements. Microbiology spectrum 3, (2015)
【非特許文献４】Dyda F, Hickman AB, Jenkins TM, Engelman A, Craigie R, Davies DR. Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases. Science 266, 1981-1986 (1994)
【非特許文献５】Kapitonov VV, Jurka J. Rolling-circle transposons in eukaryotes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 8714-8719 (2001)
【非特許文献６】Ilyina TV, Koonin EV. Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res 20, 3279-3285 (1992)
【非特許文献７】Koonin EV, Ilyina TV. Computer-assisted dissection of rolling circle DNA replication. Biosystems 30, 241-268 (1993)
【非特許文献８】van Mansfeld AD, van Teeffelen HA, Baas PD, Jansz HS. Two juxtaposed tyrosyl-OH groups participate in phi X174 gene A protein catalysed cleavage and ligation of DNA. Nucleic Acids Res 14, 4229-4238 (1986)
【非特許文献９】Chandler M, de la Cruz F, Dyda F, Hickman AB, Moncalian G, Ton-Hoang B. Breaking and joining single-stranded DNA: the HUH endonuclease superfamily. Nature reviews Microbiology 11, 525-538 (2013)
【非特許文献１０】del Pilar Garcillan-Barcia M, Bernales I, Mendiola MV, de la Cruz F. Single-stranded DNA intermediates in IS91 rolling-circle transposition. Molecular microbiology 39, 494-501 (2001)
【非特許文献１１】Garcillan-Barcia MP, de la Cruz F. Distribution of IS91 family insertion sequences in bacterial genomes: evolutionary implications. FEMS microbiology ecology 42, 303-313 (2002)
【非特許文献１２】Mendiola MV, Bernales I, de la Cruz F. Differential roles of the transposon termini in IS91 transposition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91, 1922-1926 (1994)
【非特許文献１３】Mendiola MV, de la Cruz F. IS91 transposase is related to the rolling-circle-type replication proteins of the pUB110 family of plasmids. Nucleic Acids Res 20, 3521 (1992)
【非特許文献１４】Pritham EJ, Feschotte C. Massive amplification of rolling-circle transposons in the lineage of the bat Myotis lucifugus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 1895-1900 (2007)
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【発明の概要】
【００１２】
本明細書で記載されるように、本発明は、本明細書において“Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ”と名付けられた自律性Ｈｅｌｉｂａｔ１トランスポゾンの活性コピーの復活ならびにインビトロおよびエキソビボでのヒト細胞におけるその転移の特性付けに関する。
【００１３】
コウモリゲノムからの古代の要素であるＨｅｌｒａｉｓｅｒは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移の機序を解明するための実験ツールとして用いられてきた。そのトランスポゾンの３’末端に近いヘアピンは、転移ターミネーターとして機能する。しかし、３’末端は、トランスポザーゼにより迂回され、結果として隣接配列の新しいゲノム位置への伝達（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）をもたらす。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移は、共有結合的に閉じられた環状中間体を生成し（複製型転移機序を示唆する）、それは、捕捉された転写調節シグナルをゲノムにわたってばら撒くための強力な手段を提供する。Ｈｅｌｉｔｒｏｎプロモーター捕捉による新規の転写産物の生成は、実験的におよびコウモリにおけるトランスクリプトーム分析によっての両方で、記載されている。これらの結果は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移およびゲノムシャッフリングによる遺伝子機能の多様化に対するその影響への機序的洞察を提供し、転移の分子的要求、標的部位選択特性、ならびに細胞培養における、およびコウモリにおいてインビボでの遺伝子捕捉への実験的洞察も提供する。
【００１４】
重要なことだが、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、適切な配列に隣接された供与体ＤＮＡと合わせて用いられた場合、トランスでのＤＮＡ転移を触媒することができる。
【００１５】
この系は、単一コピーまたは多コピーの供与体ＤＮＡを細胞のゲノムに導入するために用いられることができる。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒを他のトランスポゾン系（例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃ）と区別するものは、それが重複のためにこれらの他の系に特徴的なカット／ペースト機序ではなくコピー／ペースト機序を使用することであり、これは、重複／複製の増殖性作用が開始するために存在するわずか単一コピーの可動性要素を用いて達成されることができることを意味する。これは、多コピーの好ましい領域を担持するような細胞株の操作における適用を有する。それは、追加の転移のラウンドによる受容細胞におけるＤＮＡカーゴの段階的増幅も可能にする。
【００１６】
従って、一側面において、コピー／ペーストトランスポザーゼおよびそのトランスポザーゼにより認識される供与体ＤＮＡを含む単離された細胞または培養細胞において単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を生成するための系が、提供される。適切には、“ＤＮＡ配列”は、“目的遺伝子”（すなわち目的のタンパク質をコードしている遺伝子）であり得る目的のＤＮＡ配列であり、ここで、前記の用語は、ゲノム領域（例えばエンハンサー、リプレッサー、ＣｐＧアイランド等を含むゲノムの領域）も含む。用語“供与体ＤＮＡ”は、本明細書で用いられる際、コンストラクト、例えば発現ベクター中で提供され、場合によりトランスポザーゼに媒介される転移事象が発生することを可能にする適切な上流および／または下流の末端配列と共に配置された目的遺伝子、またはゲノム領域を指す。
【００１７】
別の側面において、単一コピーまたは多コピーの目的のＤＮＡ配列または遺伝子を細胞に導入するための方法であって、以下：ａ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼ；およびｂ）ＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼＬＴＳ配列を含むコンストラクトを提供することを含む方法が、提供される。一態様において、ｂ）におけるコンストラクトは、さらにＨｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳ配列に隣接する目的のＤＮＡ配列または遺伝子を含む。適切には、細胞は、原核細胞または真核細胞であることができる。
【００１８】
別の側面において、単一コピーまたは多コピーの目的のＤＮＡ配列または遺伝子を真核細胞に導入するための方法であって、以下：ａ）“コピーアンドペースト”トランスポザーゼ；およびｂ）“コピーアンドペースト”トランスポゾン末端配列、例えばＬＴＳまたはＲＴＳに隣接する目的のＤＮＡ配列または遺伝子を含むコンストラクトを提供することを含む方法が、提供される。適切な“コピーアンドペースト”トランスポザーゼは、本明細書で記載されるようなＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼを含むＨｅｌｉｔｒｏｎファミリーのトランスポザーゼを含む。適切なＨｅｌｉｔｒｏｎファミリーのトランスポザーゼは、例えばKapitonov and Jurka (2007)およびThomas et al. (2015)において記載されている。適切なＬＴＳおよびＲＴＳは、特定のコピーアンドペーストトランスポゾン、例えばＨｅｌｉｔｒｏｎを補完することが同定されているＬＴＳおよびＲＴＳである。本発明のあらゆる側面の一態様において“コピーアンドペースト”トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼであり、ＬＴＳは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンに由来する。適切には、目的のＤＮＡ配列または遺伝子は、細胞のゲノムに導入される。
【００１９】
好都合には、“コピー／ペースト”トランスポザーゼは、転移することができる活性要素である。一態様において、“コピー／ペースト”トランスポザーゼは、原核生物性、例えば細菌性“コピー／ペースト”トランスポゾンではない。適切には、“コピー／ペースト”トランスポザーゼは、真核生物ゲノムから復活させられたものである。
【００２０】
本発明のあらゆる側面の一態様において、トランスポゾン末端配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＨｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳ配列である。
【００２１】
好都合には、ＬＴＳ配列の挿入だけで、トランスポゾン供与体配列の簡単な生成を可能にし、ここで、下流のゲノム内容物は、トランスポザーゼの添加により開始される転移を受けることができる。これは、ＬＴＳおよびＲＴＳの連続的な導入が行いにくい場合に、例えば真核細胞内のゲノム内容物を増幅することを目的とし、ＬＴＳおよび／またはＲＴＳが従来のゲノム操作技術、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮｓ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼに基づく技術により導入されなければならない場合に、特に有利である。
【００２２】
別の態様において、目的遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むＲＴＳ配列にも隣接している。本明細書で記載される際、（例えば図３Ａ参照）、単一のＬＴＳ配列は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼによる下流のＤＮＡカーゴの転移を誘発するために十分であり得るが、転移速度は、所望の遺伝子またはゲノム領域がＬＴＳおよびＲＴＳ配列の両方に隣接している場合に、より高い。好都合には、ＲＴＳの追加は、どこでトランスポザーゼ活性が終結するべきであるかを定めるのを助け、従ってより制御された転移を提供する。一態様において、好ましくは目的遺伝子がトランスポザーゼによりコピーされて組み込まれることができるが可動化されることはできないように変異したＲＴＳが、用いられることができる。
【００２３】
適切には、供与体ＤＮＡは、右および左末端配列（ＲＴＳおよびＬＴＳ配列）の間に位置するＤＮＡ配列、例えば標的遺伝子に関するＤＮＡ配列を含み、例えばここで、標的遺伝子は、目的のタンパク質をコードしている。一態様において、ＲＴＳは、３’末端にＣＴＡＧを含む核酸配列を有し、一方でＬＴＳは、５’末端にＴＣを含む核酸配列を有する。適切には、ＬＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むか、または有し、一方でＲＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する。
【００２４】
一側面において、真核生物由来、例えば哺乳類由来のコピー／ペーストトランスポザーゼおよびそのトランスポザーゼにより認識される供与体ＤＮＡを含む単離または培養された哺乳類細胞において単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を生成するためのインビトロ系が、提供される。
【００２５】
適切には、“コピー／ペースト”トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ（またはローリングサークル）トランスポゾンおよびトランスポザーゼは、例えばKapitonov et al. (2007)において記載されている。本発明のあらゆる側面の一態様において、トランスポザーゼは、Ｓｅｑ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである（表６：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの表を参照；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列である）。別の態様において、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９５％の同一性を有するトランスポザーゼである。Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の形態で提供されることができる。一態様において、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼである。適切には、トランスポザーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列に由来するか、またはそれを有する。一態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されている核酸配列（表６：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの表を参照；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードする核酸配列である；図８も参照）またはそのコドン最適化バージョン、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されている核酸配列によりコードされている。
【００２６】
一態様において、トランスポザーゼおよび目的遺伝子を含むコンストラクトは、２つの別々の実体として提供される。適切には、実体は、ＤＮＡコンストラクト、例えば発現ベクターまたはプラスミドであることができるが、トランスポザーゼがネイキッドＤＮＡ、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として提供されることができることも、想定されている。一態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列（単数または複数）に隣接する目的の遺伝子またはゲノム領域を含むコンストラクトは、細胞株内で作製される、または細胞株内に存在することができ、それは、その後トランスポザーゼをコードするコンストラクトをトランスフェクションされる。別の態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列（単数または複数）に隣接する目的遺伝子を含むコンストラクトは、トランスポザーゼをコードするコンストラクトとの同時トランスフェクションのための別々のプラスミドの一部であることができる。別の態様において、トランスポザーゼ、目的遺伝子およびＬＴＳは、単一のコンストラクト中のトランスポゾンとして提供される。
【００２７】
本発明のあらゆる側面の一態様において、トランスポザーゼは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンによりコードされていることができる。例えば、トランスポザーゼは、トランスポゾン核酸配列、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されているＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾン核酸配列によりコードされていることができる（表６：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの表を参照；図８も参照）。本発明の一側面によれば、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンが、提供される。従って、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されている単離された核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を提供する。適切には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に対して少なくとも８０、８５、９０、９５もしくは９５％の同一性を有する核酸配列、またはそのコドン最適化バージョンが、提供される。一態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５において示されている配列を有する単離された核酸が、提供される。
【００２８】
一態様において、目的の標的遺伝子／ＤＮＡ配列は、内在性遺伝子であることができる。別の態様において、標的ＤＮＡ配列は、目的のゲノム領域、例えば対象のエンハンサー、リプレッサー、ＣｐＧアイランドまたはあらゆる非コード要素であることができる。これらの態様の両方において、本発明の方法は、参照細胞株として用いられることができる細胞株を生成するために、多コピーの内在性遺伝子を生成するために用いられることができる。別の態様において、目的遺伝子は、ｃＤＮＡ配列として提供されることができる。
【００２９】
ＬＴＳおよびＲＴＳの間に位置するＤＮＡ配列は、好ましくは目的のＤＮＡ配列、例えば細胞株における発現のための目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供するＤＮＡ配列である。
【００３０】
好都合には、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼ系、例えば本明細書で記載されるＨｅｌｒａｉｓｅｒの使用は、供与体ＤＮＡの複製およびゲノム内の多数の部位へのその導入を促進する。従って、本発明に従う方法または系は、単一コピーまたは多コピーの目的の標的遺伝子を導入するために用いられることができる。
【００３１】
一態様において、本発明の方法における使用のための細胞または単離もしくは培養された細胞は、原核細胞、例えば細菌である。別の態様において、細胞は、真核細胞、例えば昆虫、酵母、植物または哺乳類細胞であることができる。適切な培養細胞は、当業者には馴染みがある。一態様において、細胞は、哺乳類細胞、例えばマウス、ラットまたはヒト細胞、例えばＣＨＯ細胞、２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、ヒトもしくはマウス胚性幹細胞、造血幹細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞である。細胞が哺乳類またはヒト細胞である場合、それは、療法における使用のための細胞であることができる。別の態様において、細胞は、参照細胞株を生成するために用いられることができる細胞型、例えば腫瘍細胞株、ＨＡＰ１またはｅＨＡＰ細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨＥＫ２９３細胞等であることができる。別の態様において、細胞は、タンパク質生成に適していることができる。例えば、細胞は、ＨｅＬａ、２９３Ｔ細胞、ＣＨＯ細胞または他の適切な哺乳類細胞株であることができる。哺乳類タンパク質生成に関する適切な細胞株は、当業者には既知であり、例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３および２９３Ｔ細胞を含むであろう。
【００３２】
一態様において、本発明の方法は、細胞株を生成するために用いられることができる。そのような細胞株は、一過性または安定であることができる。
【００３３】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移に関する１つの適切な系が、本明細書で実施例において、そして図１Ｂに関連して記載されている。
【００３４】
別の態様において、トランスポザーゼをコードする核酸は、細胞のゲノム中に組み込まれる。別の態様において、供与体ＤＮＡは、プラスミドまたは組み換えウイルスベクターの一部である。さらなる態様において、供与体ＤＮＡは、オープンリーディングフレームの少なくとも一部を含む。さらに別の態様において、供与体ＤＮＡは、少なくとも遺伝子の調節領域、例えば転写調節領域を含み、それは、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、遺伝子座制御領域、および境界要素からなる群から選択されることができる。適切には、供与体ＤＮＡは、オープンリーディングフレームの少なくとも一部に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたプロモーターを含む。
【００３５】
トランスポザーゼ配列を含む供与体ＤＮＡおよび／またはコンストラクトは、以下からなる群から選択される方法を用いて細胞に導入されることができる：微粒子銃；電気穿孔法；マイクロインジェクション；核酸フラグメントの脂質含有ベシクルまたはＤＮＡ凝縮試薬との組み合わせ；ならびに核酸フラグメントのウイルスベクターへの組み込みおよびそのウイルスベクターの細胞との接触。本発明のあらゆる側面の一態様において、トランスポザーゼは、ｍＲＮＡ分子として導入されることができる。
【００３６】
別の側面において、多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それによりＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼおよび供与体ＤＮＡが細胞に導入される方法が、提供される。一態様において、トランスポザーゼおよび供与体ＤＮＡは、別々に供給される。別の態様において、トランスポザーゼおよび供与体ＤＮＡは、同じＤＮＡコンストラクト上で供給される。好都合には、トランスポザーゼが別々のコンストラクト中で供給される場合、それは、それが細胞内に存在する場合にのみ発現されて有効であることができる。これは、それが望ましい場合に転移事象が限定されることを可能にすることができる。別の態様において、トランスポザーゼは、ＲＮＡまたはタンパク質の形態で導入される。
【００３７】
別の側面において、多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それにより供与体ＤＮＡがまず細胞のゲノムに導入された後Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼが導入される方法が、提供される。
【００３８】
別の側面において、多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それによりＲＴＳおよびＬＴＳ配列が内在性遺伝子に隣接する方法が、提供される。本発明は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳ配列に隣接するＤＮＡ配列を含むコンストラクトを提供することにより単一コピーまたは多コピーの目的のＤＮＡ配列または遺伝子を細胞に導入するための方法も提供する。一態様において、ＲＴＳは、３’末端においてＣＴＡＧを含む核酸配列を有し、一方でＬＴＳは、５’末端においてＴＣを含む核酸配列を有する。適切には、ＬＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有し、一方でＲＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を有する。適切には、その方法は、内在性細胞遺伝子がトランスポザーゼによる増殖に関する標的とされるようにＲＴＳおよびＬＴＳをそれらが目的の内在性細胞遺伝子の両側に位置するような方式で導入するために細胞ゲノムを改変することを含む。一態様において、ＲＴＳおよび／またはＬＴＳ配列は、ゲノムターゲティングまたはゲノム工学の方法を用いて導入される。一態様において、ゲノム編集法、例えばＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（例えばTrends in Biotechnology, Volume 31, Issue 7, p397-405, July 2013においてGajらにより総説されている）、他のプログラム化可能なヌクレアーゼ技術、またはｒＡＡＶ技術が、ＲＴＳおよび／またはＬＴＳを導入するために用いられることができる。
【００３９】
本発明のあらゆる側面の一態様において、方法は、以下の工程を含む：
ａ）少なくとも１個のＨｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列に隣接する目的遺伝子をコードする核酸配列を含む第１コンストラクトを提供し；
ｂ）前記の第１コンストラクトを細胞に導入し；
ｃ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む第２コンストラクトを提供し；
ｄ）前記の第２コンストラクトをｂ）において得られた前記の細胞に導入し；
ｅ）ｄ）において得られた細胞をトランスポザーゼ活性に関する条件下で培養し；そして
ｆ）多コピーの前記の目的遺伝子を検出する。
【００４０】
別の側面において、多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それによりＤＮＡ配列がランダムにゲノム中に挿入されてＲＴＳおよびＬＴＳに隣接し、続いてＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼが導入される方法が、提供される。本発明のあらゆる側面の一態様において、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、本明細書で記載されたＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼである。本発明のあらゆる側面の一態様において、標的遺伝子のコピー数は、多数ラウンドのトランスポザーゼ伝達により調節されることができる。
【００４１】
本発明のあらゆる側面の一態様において、ゲノムは、哺乳類ゲノム、適切にはＣＨＯゲノムからなる。あらゆる側面の別の態様において、ゲノムは、ハプロイドのヒトゲノムである。適切なハプロイドゲノムは、ＫＢＭ−７細胞（例えばKotecki et al. 1999 Nov 1;252(2):273-80により記載されているＫＢＭ−７細胞）またはＨＡＰ１細胞（例えばCarette JE et al. Nature. 2011 August 24; 477(7364): 340-343により記載されているＨＡＰ１細胞）において観察されるハプロイドゲノムである。
【００４２】
別の側面において、本明細書で記載されるあらゆる側面または態様における系により導入された多コピーのＤＮＡ配列を含有する細胞が、提供される。適切には、細胞は、哺乳類細胞である。
【００４３】
別の側面において、本発明に従う方法により生成された細胞株が、提供される。好都合には、本発明に従うＨｅｌｉｔｒｏｎ転移事象（単数または複数）を用いて生成された細胞株は、細胞株をそのゲノム内のＨｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳおよび／またはＲＴＳ  ＤＮＡ配列の存在に関して分析することにより容易に検出されることができる。検出のための適切な方法は、ＰＣＲを含む。一態様において、細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。
【００４４】
一態様において、そのような細胞株は、参照標準としての使用のためのものである。適切には、本発明に従う哺乳類細胞は、ＤＮＡ分子参照標準の役目を果たすＤＮＡを抽出するために用いられることができる。適切には、本発明に従う哺乳類細胞は、免疫組織化学に関して標的遺伝子／タンパク質、例えばＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２およびＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１の様々な発現レベルを有する参照物質を提供するために用いられることもできる。参照標準の使用の記載は、例えばＨｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの製品カタログ(www.horizondiscovery.com)において見付けられることができる。ここで、そのような適用において有用であり得る遺伝子配列の例も、記載されている。
【００４５】
本発明に従う細胞株は、目的のタンパク質の生成における使用のためのものであることもできる。従って、別の態様において、哺乳類細胞は、ＤＮＡ配列によりコードされているタンパク質、すなわち目的遺伝子によりコードされている目的のタンパク質の生成のために用いられることができる。従って、一態様において、生物療法的分子としての組み換えタンパク質、例えばモノクローナル抗体候補を生成する安定な宿主細胞である本発明に従う哺乳類細胞が、提供される。適切には、生物療法物質、例えば抗体または抗体もしくはそのフラグメントを含む組成物を生成するために、目的遺伝子を含む多数のコンストラクトが、同じ細胞に導入されることができる。そのような生物療法的分子を生成するための適切な方法は、本明細書で記載されている。
【００４６】
別の態様において、本発明は、療法における使用のための本発明の方法に従って生成された細胞株を提供する。適切には、前記の細胞株は、遺伝子療法、細胞療法、組織療法または免疫療法における使用のためのものであることができる。
【００４７】
別の側面において、本発明に従う細胞から単離された核酸が、提供される。
【００４８】
ＲＴＳおよびＬＴＳの間に位置する核酸配列を含む核酸も、提供され、ここで、ＲＴＳおよびＬＴＳは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質に結合することができ、ここで、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＲＴＳおよびＬＴＳに結合し、単離された細胞においてＤＮＡ中への核酸の組み込みを触媒する。適切には、本発明のあらゆる側面に従う核酸は、プラスミドの一部である。
【００４９】
加えて、本発明は、Ｈｅｌｒａｉｓｅタンパク質をコードする核酸を提供し、ここで、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列を有する。適切には、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質は、単離された細胞においてＲＴＳおよび／またはＬＴＳに結合して核酸のＤＮＡ中への組み込みを触媒する。適切には、ＲＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列を有し、ＬＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列を有する。本発明は、さらに、核酸を含むベクターおよびその核酸またはベクターを含む細胞を提供する。
【００５０】
従って、一側面において、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列に対して８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたアミノ酸配列を提供し、ここで、前記の単離されたアミノ酸配列は、本明細書において“Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ”トランスポザーゼと記載されるＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼをコードしている。一態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９５％の同一性を有するトランスポザーゼである。別の態様において、アミノ酸配列は、本明細書で記載されるように、Ｎ末端核内局在配列、ジンクフィンガー様モチーフおよびＲｅｐＨｅｌ酵素コアを含み、それは、今度はＨＵＨモチーフおよびヘリカーゼドメインを有するＲｅｐヌクレアーゼドメインを含む。別の態様において、アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列を含む。
【００５１】
適切には、トランスポザーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列に由来するか、またはそれを有する。
【００５２】
別の側面において、本発明に従うアミノ酸配列をコードする核酸を含む単離された核酸配列が、提供される。適切には、前記の単離された核酸配列は、本発明に従うＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードする。一態様において、核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されている配列とのあるレベルの相同性示す。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されている配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されている配列と同じアミノ酸配列をコードするようにコドン最適化されていることができる。一態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において示されている核酸配列によってもコードされている（表６：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの表を参照；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードする核酸配列である；図８も参照）。別の態様において、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、コドン最適化された配列の一例であるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されている核酸配列によりコードされている。
【００５３】
重要なことだが、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、適切な配列に隣接する供与体ＤＮＡと合わせて用いられた際、トランスでのＤＮＡ転移を触媒することができる。この機能活性を決定するための適切な方法は、本明細書において例えば実施例１において記載されている。
【００５４】
別の側面において、本発明は、ＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンによるＤＮＡ転移を触媒するための適切な配列を含む単離された核酸分子を提供する。従って、本発明は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ左末端配列（ＬＴＳ）を含む単離された核酸配列を提供する。一態様において、ＬＴＳは、５’末端においてヌクレオチドＴＣを有する核酸配列を含む。適切には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む核酸が、提供される。別の態様において、本発明は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ右末端配列（ＲＴＳ）を含む単離された核酸配列を提供する。一態様において、ＲＴＳは、３’末端においてＣＴＡＧを含む核酸配列を有する。適切には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている核酸配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む核酸が、提供される。一態様において、本発明に従うＬＴＳまたはＲＴＳ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されているアミノ配列と少なくとも８０、８５、９０、９５または９５％の同一性を有し、かつ目的遺伝子に隣接している場合に、本発明に従うＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンと目的遺伝子のＤＮＡ転移が触媒されるように相互作用することができる機能活性を保持している配列である。
【００５５】
本発明の別の側面において、少なくともＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されている配列またはそれに対して８０％の同一性を有する配列を含むＬＴＳ  Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列に隣接する目的遺伝子の核酸配列を含む単離された核酸が、提供される。一態様において、単離された核酸は、さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されている配列またはそれに対して８０％の同一性を有する配列を含むＲＴＳ  Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列を含む。そのような核酸は、供与体ＤＮＡとしても言及され得る。
【００５６】
別の側面において、本発明に従う核酸配列を含む発現ベクターが、提供される。従って、一態様において、本発明は、（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３または４において示されている）ＬＴＳまたは／およびＲＴＳ配列をそれぞれ含む発現ベクターならびに本発明に従うトランスポザーゼをコードする配列を含む発現ベクターを提供する。
【００５７】
一態様において、発現ベクターは、さらに以下の少なくとも１つを含むことができる：
ａ）ＬＴＳおよびＲＴＳに隣接する一般的なｇＲＮＡ認識部位、好ましくはＴｉａ１Ｌ；
ｂ）プロモーター配列であって、目的遺伝子が前記のプロモーターの制御下にあるように配置されたプロモーター配列；
ｃ）前記の目的遺伝子に続くポリアデニル化カセット。
【００５８】
別の側面において、本発明は、本発明に従う核酸配列または発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞は、本明細書において記載されており、例えばＣＨＯ細胞を含む。
【００５９】
別の側面において、本発明は、本発明の方法に従って生成された細胞または本発明に従う組み換え宿主細胞を適切な培地で培養し、細胞または適切な培地から目的のタンパク質を回収することを含む、目的のタンパク質の生成の方法を、提供する。
【００６０】
別の側面において、目的遺伝子をそれを必要とする対象に提供することにより疾患を処置するための方法であって、以下の工程を含む方法が、提供される：
ａ）前記の対象における使用に適した細胞株を単離し；
ｂ）本発明に従う単離された核酸または発現ベクターを前記の細胞株に導入し、ここで、前記の核酸または発現ベクターは、前記の目的のタンパク質に対応する目的遺伝子を含み；
ｃ）本発明に従うアミノ酸配列、核酸配列または発現ベクターを、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移事象が生じて前記の目的遺伝子を含む組み換え細胞株を生成するように導入し；
ｄ）前記の組み換え細胞株を細胞培養において拡張して組み換え細胞の集団を提供し；そして
ｅ）前記の組み換え細胞を前記の対象に導入する。
【００６１】
従って、適切には、対象において疾患を処置するエキソビボの方法が、提供される。この態様において、目的遺伝子は、目的のタンパク質をコードしていることができ、それは、組み換え細胞内で発現されてそのタンパク質を対象または患者に提供する。その細胞株は、例えば、Ｔ細胞、マクロファージ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、骨髄性−赤血球系前駆（ＣＭＥＰ）細胞またはリンパ球共通前駆（ＣＬＰ）細胞であることができる。
【００６２】
別の側面において、本発明は、それを必要とする対象において疾患を処置するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
ａ）本発明に従う目的遺伝子を提供する単離された核酸を含む第１発現ベクターを提供し；
ｂ）本発明に従うトランスポザーゼをコードする核酸を含む第２発現ベクターを提供し；
ｃ）前記の第１および第２発現ベクターを前記の対象に導入する。
【００６３】
従って、適切には、対象において疾患を処置するインビボの方法が、提供される。
【００６４】
さらなる側面において、本発明は、本発明に従う目的遺伝子を提供する単離された核酸を含む第１発現ベクターおよびトランスポザーゼを含む医薬組成物を提供する。一態様において、トランスポザーゼは、本発明に従うトランスポザーゼをコードする核酸配列を含む第２発現ベクター内で提供されることができる。別の態様において、トランスポザーゼは、ｍＲＮＡまたはタンパク質として提供されることができる。
【００６５】
本発明は、療法における使用のための本発明のあらゆる側面に従う細胞株を提供する。さらなる側面は、疾患の処置における使用のための医薬品の製造における本発明に従う細胞株の使用を含む。
【００６６】
本発明の別の側面は、ランダム変異誘発における本発明のあらゆる側面または態様に従うトランスポゾンまたはトランスポザーゼまたは方法の使用を提供する。適切な方法は、本明細書において記載されている。例えば、実施例８を参照。特に、ハプロイド細胞の背景における挿入変異誘発に関する方法における本発明に従うトランスポゾン、トランスポザーゼまたは方法の使用が、提供される。そのような技法により得られたライブラリーの使用は、例えばCarette et al. Nature Biotechnology, ページ542-546; Vol. 29 (6), 2011およびMoriarity et al. Nature Genetics 2015, doi:10.1038/ng.3293において記載されている。
【００６７】
従って、本発明は、レポーターの様々なゲノム組み込み事象を含有する細胞株のライブラリーを生成するための、ＬＴＳおよび／またはＲＴＳに隣接するレポーター遺伝子をコードする供与体と合わせてのＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼの使用も提供する。
【００６８】
別の側面において、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移法由来の細胞株を検出するための方法であって、前記の細胞株を本発明に従うＬＴＳおよび／またはＲＴＳの存在に関して分析することを含む方法が、提供される。
【００６９】
さらに別の側面において、本発明は、以下の工程を含む、細胞株を生成するための方法を提供する：
ａ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎ  ＬＴＳ配列を含むコンストラクトを提供し；そして
ｂ）前記のコンストラクトを細胞株に導入する。
【００７０】
適切には、部分ａ）における前記のコンストラクトは、さらにＨｅｌｉｔｒｏｎ  ＲＴＳ配列を含む。一態様において、前記のＬＴＳおよび／またはＲＴＳは、目的のＤＮＡ配列に対して標的化されている。本発明は、この側面に従う方法により生成された細胞株も提供する。
【００７１】
別の側面において、以下の工程を含む、多コピーの目的のＤＮＡ配列を含む細胞株を生成するための方法が、提供される：
ａ）本発明に従うＨｅｌｉｔｒｏｎ  ＬＴＳ配列を含む細胞株を選び；
ｂ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼをトランスポザーゼ活性のための条件下で導入し；
ｃ）多コピーの前記のＤＮＡ配列を有するクローン細胞株を単離する。
【００７２】
本発明は、さらに、この側面に従う方法により生成された単離されたクローン細胞株を提供する。そのような細胞株は、ＣＨＯ細胞株、ＨＡＰ１またはｅＨＡＰ細胞株であることができる。本発明の別の側面において、単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を有する細胞を生成するための真核細胞におけるコピーアンドペーストトランスポゾンの使用が、提供される。本発明のさらに別の側面において、単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列を有する細胞を生成するための原核細胞または真核細胞におけるＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンの使用が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１−１】ヒトＨｅＬａ細胞におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの特徴。Ａ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの図式的表現。ＬＴＳおよびＲＴＳ末端配列は、大文字であり、隣接しているＡおよびＴ宿主標的部位配列は、小文字である。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼ内の保存されたアミノ酸モチーフが、下に示されている。Ｂ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒコロニー形成効率。示されているのは、染色されたピューロマイシン耐性ＨｅＬａ細胞コロニーを含有する細胞培養プレートである。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ供与体（ｐＨｅｌＲ）およびヘルパー（ｐＦＨｅｌＲ）プラスミド。ｐＨｅｌＲ：ＲＴＳ内の白い三角形：ヘアピンを表す；ｐＦＨｅｌＲ：黒い矢印：トランスポザーゼ発現を駆動するプロモーターを表す；黒丸：ポリＡシグナルを表す；これらの注釈は、全ての図において一貫して用いられている。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。Ｃ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移は、正準的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）挿入を生成する。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳまたはＲＴＳ対ゲノム接合部が、１０の独立したトランスポゾン挿入に関して示されている。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ配列は、大文字で、黒い背景での保存された５’および３’末端配列と共に示されており、隣接する宿主ゲノム配列は、小文字で示されている。隣接するｐＨｅｌＲプラスミド配列（上線（ｕｐｐｅｒ  ｌｉｎｅ））は、斜体である。Ｄ）ＨｅＬａ細胞におけるコロニー形成により測定されたＨｅｌｒａｉｓｅｒおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）の相対的転移効率。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。Ｅ）Ｈｅｌｉｂａｔ１および非自律性サブファミリーであるＨｅｌｉｂａｔＮ１、ＨｅｌｉｂａｔＮ２およびＨｅｌｉｂａｔＮ３の相対的転移効率。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図２−１】ＨＵＨヌクレアーゼおよびＳＦ１Ｂヘリカーゼドメインの機能分析。Ａ）１００％に設定されたＨｅｌＲ（ＷＴ）と比較したＨｅＬａ細胞におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼ変異体の転移活性。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。Ｂ）インビトロでのＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼによる一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切断。Ｃ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼならびにその点変異体および切り詰められた誘導体によるＤＮＡ結合アッセイ。Ｄ）野生型（ＷＴ）およびＫ１０６８Ｑ変異体トランスポザーゼタンパク質を用いた比色定量ＡＴＰアーゼアッセイ。データは、平均±ＳＤとして表されている。それぞれの処理（ＡＴＰ＋ｄｓＤＮＡ、ＡＴＰ＋ｓｓＤＮＡまたはＡＴＰ単独）に関して、一番左の棒は、０．０２ｕＭ  ＷＴに関するデータを示し、中央の棒は、０．０８ｕＭ  ＷＴに関するデータを示し、一番右の棒は、０．３ｕＭ  Ｋ１０６８Ｑに関するデータを示す。
【図２−２】同上。
【図３−１】Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移における３’末端配列およびヘアピン構造の役割。Ａ）ｐＨｅｌＲ、ｐＨｅｌＲΔＬＴＳ、ｐＨｅｌＲΔＲＴＳおよびｐＨｅｌＲΔＨＰ供与体プラスミドのコロニー形成効率。データは、平均±ＳＤとして表されている。それぞれの供与体プラスミドに関して、データは、‘供与体＋ヘルパー’（左側の棒）および‘供与体＋対照’（右側の棒）に関して示されている。Ｂ）平均コロニー数により標準化されたＨｅｌＲ、ＨｅｌＲΔＲＴＳおよびＨｅｌＲΔＨＰトランスポゾンのクローンあたりの平均トランスポゾンコピー数および転移効率（挿入図）。ＨｅｌＲΔＲＴＳおよびＨｅｌＲΔＨＰトランスポゾンの転移効率における差は、統計的に有意ではなく、独立ｔ検定で＊ｐ＞０．０５である。データは、平均±ＳＤとして表されている。Ｃ）ＨｅｌＲ、ＨｅｌＲＡＴＨ、ＨｅｌＲＳｔｅｍＸおよびＨｅｌＲＬｏｏｐＸヘアピンのＭ−ｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ，２００３）で予測された構造。Ｄ）ヘアピン変異体の相対的コロニー形成活性。棒（左から右へ）は、それぞれＨｅｌＲ、ＤＨＰ、ＡＴＨ、ＳｔｅｍＸおよびＬｏｏｐＸを表す。データは、平均±ＳＤとして表されている。
【図３−２】同上。
【図４−１】Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環。Ａ）Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環供与体プラスミド（ｐＨｅｌＲＣＤ）およびＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼが生成したＨｅｌｉｔｒｏｎ環（ｐＨｅｌＲＣ）。白い矢印は、Ａｍｐ／ＳＶ４０プロモーターを表す；白い丸は、ポリＡシグナルを表す。Ｂ）形成されたコロニーの数により測定されたｐＨｅｌＲＣＤ（グラフの左手側）またはｐＨｅｌＲＣＤ（グラフの右手側）から生成されたＨｅｌｉｔｒｏｎ環の転移。それぞれの供与体プラスミドに関して、データは、供与体＋ヘルパー（左側の棒）および供与体＋対照（右側の棒）に関して示されている。Ｃ）ＨｅｌＲ、ＨｅｌＲＭｕｔおよびＨｅｌＲΔＨＰトランスポゾンにより生成されるＨｅｌｉｔｒｏｎ環のＰＣＲ検出。ＨｅｌＲＭｕｔ、回文の最後の９ｎｔが欠失しているトランスポゾン欠失バージョン；Ｈ２Ｏ、鋳型なしの対照。Ｄ）ｐＨｅｌＲＣｐｕｒｏ（グラフの左手側）およびｐＨｅｌＲＣΔＨＰｐｕｒｏ（グラフの右手側）の相対的転移効率。それぞれの供与体プラスミドに関して、データは、供与体＋ヘルパー（左側の棒）および供与体＋対照（右側の棒）に関して示されている。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。ｐＨｅｌＲＣｐｕｒｏおよびｐＨｅｌＲＣΔＨＰｐｕｒｏプラスミドの概略図が、グラフの下に示されている。
【図４−２】同上。
【図５−１】ヒトゲノムにおける新規のＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入のゲノムワイド分析。Ａ）配列ロゴは、ＷｅｂＬｏｇｏ（http://weblogo.berkeley.edu）を用いて作製された。トランスポゾン組み込みは、位置−１および１の間である。下のパネルは、組み込み部位におけるジヌクレオチドの分布を示す。Ｂ）ランダムなゲノム部位（それぞれの対の前の棒）およびＨｅｌｒａｉｓｅｒ組み込み部位の塩基組成特徴を模倣した対照部位（それぞれの対の後ろの棒）と比較した相対的組み込み頻度の富化倍率（Ｆｏｌｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）。上の（Ｔｏｐ）遺伝子は、最高の発現レベルを有する５００遺伝子である。サイレント遺伝子のプロモーター領域およびＨ３Ｋ９ｍｅ３領域中への組み込み頻度は、対照と有意に異なっていなかった；全ての他の差は、統計的に有意であった（フィッシャーの正確確率検定のｐ値＜＝０．０５）。Ｃ）ランダムなゲノム部位（それぞれの対の前の棒）およびＨｅｌｒａｉｓｅｒ組み込み部位の塩基組成特徴を模倣した対照部位（それぞれの対の後ろの棒）と比較した染色体あたりの相対的組み込み頻度の富化倍率。Ｄ）１３３のＨｅｌｒａｉｓｅｒ再転移事象の染色体分布（染色体の上の矢印）。染色体８、２０および２１の下の矢印は、元の染色体供与体部位の位置を表す。
【図５−２】同上。
【図６−１】Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ遺伝子捕捉の機序。Ａ）ｐＨｅｌＲΔＲＴＳおよびｐＨｅｌＲΔＨＰ転移により生成された新規の３’末端配列の同定。ｐＨｅｌＲ、ｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳ転移において生成された正準的および新規３’末端の相対的位置が、以下のように示されている：ｐＨｅｌＲ  ＲＴＳの末端における矢印（正準的ＲＴＳ）、ｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳにおけるｐｕｒｏｒおよびｐｏｌｙＡシグナルの間の矢印（切断）ならびにｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳにおけるＬＴＳの上流の矢印（読み過ごし）。新規トランスポゾン３’末端対ゲノム接合を表す配列が、右に示されている。Ｂ）ネオマイシン耐性カセットの伝達により測定されたＨｅｌＲおよびＨｅｌＲΔＨＰトランスポゾンの遺伝子捕捉効率。それぞれのプラスミドに関して、左側の棒は、ピューロマイシンのみを用いて生成されたデータを示しており、右側の棒は、ピューロマイシンおよびネオマイシンを用いて生成されたデータを示す。データは、平均±ＳＥＭとして表されている。Ｃ）ＨｅｌｉｂａｔＮ３転移による新規転写産物の新規形成。［ｉ］ＨｅｌｉｂａｔＮ３トランスポゾンは、プロモーターおよびコード領域の小さい断片、続いてスプライス供与配列（ＳＤ）を含有するＮＵＢＰＬ遺伝子のフラグメントをトランスポゾンの左および右末端配列（ＬＴＳおよびＲＴＳ）の間に含有する。［ｉｉ］ピューロマイシン耐性選択可能マーカーでタグ付けされたＨｅｌｉｂａｔＮ３トランスポゾン。Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列は、より信頼できるピューロマイシン発現を可能にする一次融合タンパク質のプロセシングを可能にする。２つの例は、強いられたスプライシングによる非コードＲＮＡのエキソン化およびｍＲＮＡの切り詰めを示す。ＭＥＤ２７、メディエーター複合体サブユニット２７遺伝子；ＧＲＥＢ１Ｌ、乳癌におけるエストロゲンによる増殖制御（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）様遺伝子。
【図６−２】同上。
【図７−１】Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移の提唱されたモデル。Ａ）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼ（楕円）は、ＬＴＳに結合し、ｓｓＤＮＡ供与体部位にニックを入れてＨＵＨヌクレアーゼ活性部位中のチロシン残基およびトランスポゾン末端の間で５’ホスホチロシン中間体を生成する。Ｂ）供与体部位における遊離の３’−ＯＨ基は、あるタイプの予定外のＤＮＡ合成を誘発し（ｐｒｉｍｅｓ）、一方でヘリカーゼドメインは、ｄｓＤＮＡらせんを５’から３’の方向で解く。Ｃ）［図の左半分］ＲＴＳ中のヘアピン構造は、ＨＵＨドメインの第２チロシンによるＲＴＳにおけるＣＴＡＧ−３’の４残基の認識およびニック入れに必要なヘリカーゼの停止を誘導する。これは、トランスポゾンのＲＴＳにおいて遊離の３’−ＯＨ基を生成し、それは、第１の５’ホスホチロシン結合を攻撃して遊離のｓｓＤＮＡ環を生成する。ｓｓＤＮＡ環は、おそらくさらなる転移のラウンドのために用いられるｄｓＤＮＡ環へと変換される。［図の右半分］あるいは、トランスポザーゼは、ＲＴＳを読み過ごし、宿主の隣接配列を可動化し、それにより代替の新規３’末端を生成する。正準的トランスポゾンおよび捕捉された宿主配列を含有するトランスポゾンの転移におけるさらなる段階は、同一である。Ｄ）ヌクレアーゼ活性部位中の２個のチロシン残基は、ｓｓ標的ＤＮＡおよびＨｅｌｉｔｒｏｎ環の切断を触媒し、鎖転移反応を媒介する。Ｅ）［図の左半分］標的に共有結合したｓｓトランスポゾンＤＮＡは、細胞周期のＤＮＡ合成期の間に受動的に複製され、ｄｓ形態へと変換され、それは宿主ゲノム中のトランスポゾン数の増幅および宿主ゲノム配列の伝達につながる。［図の右半分］新規の３’末端が生成された場合の転移の代わりの結果（図７Ｄ、右半分参照）。
【図７−２】同上。
【図８−１】ＤＮＡ配列。コンセンサスＨｅｌｉｂａｔ１（Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ）トランスポゾンの完全なＤＮＡ配列、ならびにトランスポゾン供与体コンストラクトにおいて用いられた自律性および非自律性トランスポゾンのコンセンサス左末端および右末端配列。５’−ＴＣおよびＣＴＡＧ−３’末端配列が、太字で表記されている。
【図８−２】同上。
【図９−１】タンパク質配列アラインメントおよびドメインマッピング。Ａ）Ｍ．ルシフガス（Ｍ．ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）からのＨｅｌｒａｉｓｅｒの、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、Ｔ．カスタネウム（Ｔ．ｃａｓｔａｎｅｕｍ）、Ｐ．インフェスタンス（Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、Ｌ．コリムビフェラ（Ｌ．ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、Ａ．サリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）およびＯ．サティバ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）からのＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼ配列との全タンパク質配列アラインメント。トリプシン消化により決定されたドメインは、配列の下の着色された棒として表されている。予測された核局在シグナルおよびジンクフィンガーモチーフは、それぞれ配列の下のオレンジ色および青紫色の棒により示されている。Ｂ）精製されたＨｅｌｒａｉｓｅｒの増大する量のトリプシンによる消化物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ｎ末端配列決定は、アミノ酸８１１〜１４９６を包含するヘリカーゼフラグメント、アミノ酸４９１〜７４５を含有するＨＵＨヌクレアーゼフラグメントおよびアミノ酸２５１〜４８１に及ぶＮ末端フラグメントを同定した。
【図９−２】同上。
【図１０−１】Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼドメインの構造的および機能的特性。
【００７４】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒヘリカーゼドメインは、ＳＦ１Ｂサブファミリー群のメンバーと整列し（ａｌｉｇｎｓ）、相同組み換えおよび停止した複製フォークの分解に関わるヘリカーゼのファミリーであるＰｉｆ１ヘリカーゼに近縁であり（Sabouri N, McDonald KR, Webb CJ, Cristea IM, Zakian VA. DNA replication through hard-to-replicate sites, including both highly transcribed RNA Pol II and Pol III genes, requires the S. pombe Pfh1 helicase. Genes & development 26, 581-593 (2012); Steinacher R, Osman F, Dalgaard JZ, Lorenz A, Whitby MC. The DNA helicase Pfh1 promotes fork merging at replication termination sites to ensure genome stability. Genes & development 26, 594-602 (2012); Wilson MA, et al. Pif1 helicase and Poldelta promote recombination-coupled DNA synthesis via bubble migration. Nature 502, 393-396 (2013))、これは以前に認められたＨｅｌｉｔｒｏｎ類の特徴である（Pritham et al. (2007))。Ａ）ヘリカーゼ配列のアラインメント。二次構造特徴は、ベータストランドを矢印として、らせんを渦巻き線として示している。上：大腸菌からのＲｅｃＤヘリカーゼ、ＨｅｌｉｔｒｏｎヘリカーゼおよびＧ．ステアロサーモフィルス（Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からのＰｃｒＡヘリカーゼのリボンモデルが、それぞれ左、中央および右に示されている。それぞれのヘリカーゼの４個のドメインが、標識されている。下：Ｍ．ルシフガス（Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ）、Ａ．サリアナおよびＯ．サティバからのＨｅｌｉｔｒｏｎヘリカーゼの、ＳＦ１Ｂヘリカーゼ［（Ｐｉｆ１（出芽酵母）、Ｄｎａ２（出芽酵母）、Ｄｄａ（Ｅ．ファージＴ４）、ＴｒａＩ（大腸菌）およびＲｅｃＤ（大腸菌）］（左側）およびＳＦ１Ａヘリカーゼ［Ｒｅｐ（大腸菌）、ＵｖｒＤ（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）亜種サブティリス株１６８）およびＰｃｒＡ（Ｇ．ステアロサーモフィルス）］（右側）との全タンパク質配列アラインメント。保存されたＳＦ１ヘリカーゼモチーフが、強調されている。Ｂ）５’または３’末端の上鎖および下鎖のインビトロ切断ｓｓＤＮＡ。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼによる５’ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド切断の１５％ＴＢＥ−尿素ゲル。右側のＤＮＡの概略図は、４種類のｓｓＤＮＡ基質を示しており、５’および３’末端配列は、太字であり、隣接配列は、通常の文字であり、３’ヘアピンは、下線が引かれている。矢印は、切断部位を示し、数は、配列決定されたｓｓＤＮＡ断片を示している。
【図１０−２】同上。
【図１１−１】ミオティス属（Ｍｙｏｔｉｓ）のゲノムにおけるＨｅｌｉｔｒｏｎの３’末端の多様化の例。Ａ）新規のＨｅｌｉｔｒｏｎ末端の獲得。切断された５’末端を有するＨｅｌｉｔｒｏｎに隣接するＨｅｌｉｔｒｏｎコピーの挿入は、新規の３’末端の獲得をもたらし得る。Ｂ）互いにすぐ隣り合ったＨｅｌｉｔｒｏｎの挿入。宿主の５’−ＡおよびＨｅｌｉｔｒｏｎのＴ−３’の間のＨｅｌｉｔｒｏｎの挿入は、結果として、一方のＨｅｌｉｔｒｏｎの３’末端が別のＨｅｌｉｔｒｏｎの５’末端に隣接する挿入をもたらし得る。Ｃ）おそらく３’末端の切断による新規の末端の生成。Ｄ）（Ａ〜Ｃから記載された）Ｈｅｌｉｔｒｏｎ挿入を有する宿主配列およびオーソロガスな空の（挿入のない）部位の比較。最初の線は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ挿入に隣接する宿主配列である。第２の線は、オーソロガスな空の部位である。左および右側末端における配列は、宿主配列を表し、一方で縦線の間の配列は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ配列を表す。受入番号および座標が、示されている。Ｅ）終結迂回による新規末端の生成［ｉ］上のカートゥーン（ｃａｒｔｏｏｎ）は、ＨｅｌｉｂａｔＮ５４２コンセンサスの構造を示している。コンセンサスの末端配列が、カートゥーンに隣接して示されている。末端内の回文は、灰色で示されており、回文の幹を含む配列は、下線が引かれている。［ｉｉ］結果として異なる３’末端をもたらす回文構造配列を欠くＨｅｌｉｂａｔＮ５４２コピーの構造のカートゥーン表現。新規３’末端の配列が、カートゥーンの隣に示されている。［ｉｉｉ］ゲノム中の２個のＨｅｌｉｂａｔＮ５４２コピーの位置。（破線として示されている）１コピーの転移は、結果としてＣＴＡＧ−３’末端の終結迂回をもたらし、後ろに短い回文があるランダムな配列において終結する。次いで、そのコピーは、ゲノム中の異なる位置（）に挿入される。回文を含む新規末端配列が、カートゥーンの隣に示されている。［ｉｖ］最初の線は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ挿入および新規末端を有する宿主配列である。第２の線は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎおよび新規末端を有するパラロガスなコピーである。左および右側末端における配列は、隣接する宿主配列を表し、一方で縦線の間の配列は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎおよび捕捉された宿主配列を表す。受入番号および座標が、示されている。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１２−１】ＲＩＮＴ１、ＡＲＭＣ９およびＲＮＦ１０座位（Ｍ．ブランデティ（Ｍ．ｂｒａｎｄｔｉｉ））。Ａ）ＲＩＮＴ１座位。Ｂ）ＡＲＭＣ９座位。Ｃ）ＲＮＦ１０座位。それぞれのパネルの上部に示されているのは、我々のトランスクリプトームアセンブリにより決定された完全遺伝子モデルのＩＧＶゲノムブラウザのスナップショットである（０．５より大きいＦＰＫＭを有する転写産物アセンブリのみが示されている）。拡大版は、ＮＵＢＰＬに駆動される転写産物を含有する遺伝子モデルの領域を表す。拡大版において、上部のトラック（ｔｒａｃｋｓ）は、その遺伝子モデルに関するＲＮＡ−ｓｅｑの読み取りを完全にカバーしたものを表し、下部のトラックは、その領域に整列する読み取りの部分集合を示す。第３のトラックは、リピートおよび転移性要素の位置（濃い灰色の棒）、ならびにＮＵＢＰＬフラグメントの位置（薄い灰色の棒）を示す。下部のトラックは、対象の転写産物を含む転写産物アセンブリ（ＦＰＫＭ＞０．５）を含有する（ＲＩＮＴ１に関するａｓｍｂｌ＿７０２５３０、ＡＲＭＣ９に関するａｓｍｂｌ＿１１１８５２およびＲＮＦ１０に関するａｓｍｂｌ＿６８０９４０）。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞のＡＡＶＳ１座位中へのＨｅｌＲａｉｓｅｒ転移によるＴｕｒｂｏ  ＧＦＰ供与体の組み込み：（Ａ）ＡＡＶＳ１座位におけるＴｕｒｂｏ  ＧＦＰ供与体およびＣＲＩＳＰＲに媒介される挿入の図式的描写。ＨｅｌＲａｉｓｅｒ  ＬＴＳおよびＲＴＳ配列は、ＴｕｒｂｏＧＦＰカセットに隣接し、それは、ＥＦ１Ａプロモーターおよびポリアデニル化シグナルも含有する。ＡＡＶＳ１座位におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に媒介される組み込みを可能にするため、供与体配列は、ｔｉａ１Ｌ特異的ｇＲＮＡの同時発現の際に組み込みを誘発するｔｉａ１Ｌ認識部位にも隣接している。（Ｂ）予測されるｇＲＮＡ切断部位におけるＴｕｒｂｏＧＦＰ供与体のＡＡＶＳ１座位中への正確な挿入を実証する、代表的な標的クローンにおける挿入部位のＤＮＡ配列決定。
【図１４】ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼは、組み込まれたＴｕｒｂｏＧＦＰ供与体のコピー数を増大させる。（Ａ）図１３において記載された単一コピーのＴｕｒｂｏＧＦＰタグ付けカセットを含有するＨＥＫ２９３細胞が、ＨｅｌＲａｉｓｅｒ転移を受けた。個々のクローンは、限界希釈により単離され、トランスポザーゼプラスミドのトランスフェクションの前（−）および後（＋）のＴｕｒｂｏＧＦＰのコピー数を定量化するためにｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析により分析された。（Ｂ）ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼ発現プラスミドのトランスフェクションの前（黒いヒストグラム）および後（白いヒストグラム）の、ＨｅｌＲａｉｓｅｒ  ＴｕｒｂｏＧＦＰ供与体を有するＨＥＫ２９３クローンにおけるＴｕｒｂｏＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析。
【図１５】多数の安定して組み込まれた目的遺伝子のコピーを有する細胞株を生成するためのＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼの使用。ＨＥＫ２９３細胞が、ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼおよびピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）遺伝子を包含するトランスポゾン末端配列（ＬＴＳおよびＲＴＳ）を含有する供与体プラスミドをトランスフェクションされた。ＰｕｒｏＲ遺伝子のＨＥＫ２９３中へのトランスフェクションおよび組み込みの後、細胞は、１μｇ／ｍｌピューロマイシンを１週間適用することにより選択された。単一のクローンが、限界希釈により得られ、拡張された。選択されたクローンからのゲノムＤＮＡが、ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析され、ＰｕｒｏＲ遺伝子のコピー数を定量化した。陽性対照（（＋）対照）として、２コピーのＰｕｒｏＲ遺伝子を有する参照細胞株が、含まれていた。陰性対照（（−）対照）として、親ＨＥＫ２９３細胞が、含まれていた。
【００７５】
表
表１．Ｍ．ブランデティにおけるＴＳＳ周辺の＋／−１ｋｂの領域におけるＨｅｌｉｔｒｏｎ富化分析に関する偶然性（Ｃｏｎｔｉｎｇｅｎｃｙ）計数表。
【００７６】
＊  ＨｅｌｉｔｒｏｎがＴＳＳ周辺の＋／−１ｋｂの領域と重複する回数
【００７７】
【化１】
2019504646.tif 000002
Ｈｅｌｉｔｒｏｎと重複しないＴＳＳ周辺の＋／−１ｋｂの領域の数
【００７８】
【化２】
2019504646.tif 000003
ＴＳＳ周辺の＋／−１ｋｂの領域と重複しないＨｅｌｉｔｒｏｎの数
＋  ＨｅｌｉｔｒｏｎまたはＴＳＳ周辺の＋／−１ｋｂの領域のどちらとも重複しない（と推定される）領域の数
〇  左のｐ値は、ＨｅｌｉｔｒｏｎがＴＳＳ周辺の＋／−１ｋｂの領域において枯渇している確率を示す。右のｐ値は、富化の確率を示し、Ｈｅｌｉｔｒｏｎの両側確率は、偶然により期待される確率と異なっている。
【００７９】
表２．ミオティス属のゲノムにおける最近活性なＨｅｌｉｔｒｏｎの３’末端の分析。
【００８０】
表３．候補となるＮＵＢＰＬに駆動される転写産物。この表は、それぞれの候補となるＮＵＢＰＬに駆動される転写産物に関する情報を、そのＩＤ、それが属する遺伝子の名前、その転写産物の骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）および座標、ならびに（ある場合は）その組織特異的発現を含め列挙している。特定のＮＵＢＰＬプロモーター挿入に関する情報は、表の右側に列挙されており、供与体Ｈｅｌｉｔｒｏｎ要素、要素のＴＳＳからの距離（我々のトランスクリプトームアセンブリに基づいて注釈が付けられている；正の数は、それがＴＳＳと重複していることを示す）、および方法において記載されるように決定されたそのおおよその年齢を含む。緑で標識された転写産物は、そのＴＳＳがＮＵＢＰＬ−プロモーターを含有する挿入により与えられている転写産物である。数１および２は、転写産物の方向を示す。１を与えられた転写産物は、ＮＵＢＰＬプロモーターにより正準的方向で駆動され、一方で２を与えられた転写産物は、逆方向で駆動される。これらの挿入の多く（１１）は、他の３種の配列決定されたヒナコウモリ科のコウモリ（Ｍ．ルシフガス、Ｍ．ダヴィディー（Ｍ．ｄａｖｉｄｉｉ）、エプテシクス・フスクス（Ｅｐｔｅｓｉｃｕｓ  ｆｕｓｃｕｓ））のゲノム中に存在するが、Ｍ．ブランデティに特異的であるＦＯＸＪ２およびＳＴＸ１０遺伝子における挿入を含め、いくつかの（１２）系統特異的挿入が、存在し、それは、ヒナコウモリの多様化全体にわたるＨｅｌｉｂａｔ活性と一致する（Thomas et al. (2014)）。９個の挿入は、それらの転写産物を正準的方向で駆動するようであり、一方で８個の挿入は、転写産物を逆方向で駆動するようであり、これは、捕捉されたＮＵＢＰＬプロモーターが両方向性であることを示唆している。これは、捕捉されたプロモーター配列の両方の鎖における多くの特徴的なプロモーター配列特徴（ＴＡＴＡ、ＣＡＡＴ、およびＧＣボックスならびに予測されるＴＦ結合部位／大きな比率を占める部位）の存在（データは示されていない）により、さらに支持される。小さいセットにもかかわらず、これらの遺伝子は、いくつかのＧＯタームに関して富化されている：タンパク質ユビキチン化（ＧＯ：００１６５６７；ｐ＝１．２９５ｅ−０２）、有糸分裂のＧ２  ＤＮＡ損傷チェックポイントに関わるシグナル伝達の制御（ＧＯ：１９０２５０４；ｐ＝１．４８１ｅ−０２）、小さいタンパク質のコンジュゲーションによるタンパク質修飾（ＧＯ：００３２４４６；ｐ＝１．６６ｅ−０２）、小さいタンパク質のコンジュゲーションまたは除去によるタンパク質修飾（ＧＯ：００７０６４７；ｐ＝３．１０４ｅ−０２）、オルガネラの組織化（ＧＯ：０００６９９６；ｐ＝３．３１２ｅ−０２）、細胞周期（ＧＯ：０００７０４９；ｐ＝４．０８２ｅ−０２）、およびアクチン重合依存性細胞運動性（ＧＯ：００７０３５８；ｐ＝４．４３９ｅ−０２）。
【００８１】
表４．プライマーのリスト。逆方向プライマーが順方向プライマー配列の逆相補配列であるプライマー対に関しては、順方向プライマーの配列のみが示されている。
【００８２】
表５は、実施例２において記載されているＴｉａ１Ｌ−ＬＴＳ−ＥＦ１Ａ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ−ＲＴＳ−Ｔｉａ１Ｌを有するタグ付けカセットの配列を示す。
【００８３】
表６は、配列およびそれらの対応するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：のリストを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本明細書において記載されるように、本発明は、単一コピーまたは多コピーのＤＮＡ配列の細胞への導入のための方法、系および分子を提供する。ＤＮＡ配列は、目的の遺伝子を含むことができ、またはゲノム配列もしくは所望されるより短い核酸配列であることもできる。目的遺伝子は、目的のタンパク質をコードしていることができる。
【００８５】
核酸の細胞のＤＮＡへの導入のためのトランスポゾンベースの系は、例えば米国特許第６，４８９，４５８号において記載されている。
【００８６】
本明細書において言及される用語“コンストラクト”は、発現コンストラクト、例えば発現ベクターを含み、それは、プラスミドであることができ、またはウイルスベクター（例えばレトロウイルス性、アデノウイルス性、例えばｒＡＡＶ）へのパッケージングのための配列であることもできる。本発明の方法における使用のための適切なコンストラクトは、当業者には馴染みであると考えられ、本明細書で例示されるコンストラクトを含むであろう。当業者は、追加の構成要素、例えばプロモーター配列が、組み込まれることができることも、認識しているであろう。適切なプロモーターは、構成的発現を可能にすることができ、または誘導可能な発現を可能にすることができる。
【００８７】
本発明に従うＤＮＡ分子、コンストラクト、発現ベクター、プラスミド等は、例えば電気穿孔法、微量注入法、陽イオン性脂質ベシクル、ＤＮＡ凝縮試薬との組み合わせ、ＤＮＡナノ粒子または沈殿技法およびウイルスベクターへの組み込みを含むあらゆる数の手段により細胞に導入されることができる。
【００８８】
適切には、トランスポザーゼ発現ヘルパープラスミドとしてのトランスポザーゼおよび（ＬＴＳおよびＲＴＳに隣接する目的遺伝子を含む）タグ付けされたトランスポゾンを含む対応するコンストラクトは、タグ付けされたトランスポゾンおよびトランスポザーゼ発現ヘルパープラスミドを含む二構成要素転移系において提供される。あるいは、一構成要素系、例えばＬＴＳ／ＲＴＳに隣接するトランスポゾン上に存在するトランスポザーゼが、提供されることができる。一構成要素系は、送達するのがより容易であり得るが、二構成要素系は、トランスポザーゼ酵素およびトランスポザーゼ基質が空間的に分離されているため、安全性の観点から好ましい可能性がある。結果として、二構成要素系を用いると、一度トランスポザーゼプラスミドが消滅し、トランスポゾンがもはや細胞内に存在しなければ、転移反応は終了する。これは、そうでなければ制御されない様式で起こり得る継続的な転移を防ぐことができる。
【００８９】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移の使用
一態様において、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼをコードするプラスミドが、哺乳類細胞に導入されてトランスポザーゼタンパク質の発現をもたらす。ＲＴＳおよびＬＴＳ配列に隣接するＤＮＡの領域（単一コピーまたは多コピーのそのＤＮＡがゲノム内で所望される）をコードするＤＮＡ配列を含む供与体ＤＮＡも、添加されるか、または既に存在しているかのどちらでもよい。トランスポザーゼの導入後、供与体ＤＮＡは、複製され、ゲノム内の多数の部位に導入される。従って、一側面において、本発明は、単一コピーまたは多コピーが必要とされるＤＮＡの領域を含む供与体ＤＮＡを提供し、ここで、前記の供与体ＤＮＡは、ＬＴＳ配列に隣接している。一態様において、供与体ＤＮＡは、ＬＴＳおよびＲＴＳ配列に隣接している。
【００９０】
参照標準
供与体ＤＮＡは、参照標準を生成するために用いられることができる細胞株を生成するために用いられることができる。従って、本発明は、多コピーの目的遺伝子を含む細胞株を生成するための方法を提供し、ここで、まず単一コピーの目的遺伝子を有する細胞株が、生成され、ここで、目的遺伝子は、少なくともＬＴＳ  Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列に（そして場合によりＲＴＳにも）隣接している。一態様において、目的遺伝子は、その中に隣接するＬＴＳおよびＲＴＳが遺伝子編集技法により導入されている内在性遺伝子であることができる。別の態様において、目的遺伝子は、導入された、または非内在性遺伝子であることができる。適切には、“目的遺伝子”は、それ自体を複製することが分かっている遺伝子またはその一部であることができる。従って、別の態様において、供与体ＤＮＡは、癌のような特定の疾患においてそれ自体を複製することが分かっており、その存在が疾患に関する診断を提供するのを助けるために用いられることができるＤＮＡの領域を表す。参照標準として有用であり得る遺伝子の例は、ＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２、ＭＥＴ、ＣＤＫ４またはＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１を含む。
【００９１】
参照標準を生成するため、本発明に従う方法は、好ましくは既知のコピー数を有するクローンを選択することおよび／または定められたコピー数が得られるような方式で細胞を生成することを含むことができる。参照標準を生成するために用いられることができる細胞株は、例えばＣＨＯ細胞、ＨＡＰ１またはｅＨＡＰ細胞株を含む。
【００９２】
タンパク質生成
バイオ医薬（Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｒｕｇ）の開発は、哺乳類細胞ベースの製造プラットフォームにおける組み換えタンパク質の発現に頼っている。これらの安定して発現している宿主細胞の生成は、複雑であり、面倒なスクリーニング方法論を必要とする。以前の技術は、組み換え導入遺伝子カセットの標的哺乳類細胞のゲノム中へのランダム挿入に頼っている。構築された細胞は、広い範囲の発現、増殖および安定性特徴を有する。商業的に実現可能な生産宿主細胞を得るために、数百のクローンが、スクリーニングされる。加えて、関係する耐性遺伝子、例えばグルタミンシンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼの選択圧を増大させることによる導入遺伝子の増幅のプロセスが、用いられることができる。このプロセスは、導入遺伝子カセットの増幅の間に不正確さを生じやすく、導入遺伝子発現における不安定性を引き起こす。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、依然として療法用生物製剤の製造に関するデフォルトの発現宿主であるが、いくつかの他の適切な細胞株が、当業者に馴染みであると考えられ、それはＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、メイディン・ダービー・ウシ腎臓細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞、ＶＥＲＯ細胞を含むであろう。
【００９３】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質は、スクリーニングに関して低減した細胞のパネルを効率的に生成するための以前の系を超える利点を提供する。単一の工程において、ＲＴＳおよび／またはＬＴＳに隣接する導入遺伝子の多数のコピーが、標的細胞のゲノム中に高頻度で組み込まれることができる。組み込みは、標的細胞のゲノム内の既知のホットスポットに対して標的化され得る。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質のコピーアンドペースト活性は、以前にゲノム中に組み込まれた配列をさらに増幅するために利用されることができる。これは、化学的処理、例えばメチオニンスルホキシイミンまたはメトトレキセートを必要とせずに、単一の組み込み部位または多数の部位からであることができる。面倒なスクリーニング工程の排除は、所望の増殖および安定性特徴を有するより生産性の高い（ｈｉｇｈｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）細胞がより迅速に同定されることを可能にする。一例において、この系は、確立された生物生産ラインにおいて既存の導入遺伝子を増幅するために用いられることができる。
【００９４】
従って、別の態様において、供与体ＤＮＡは、トランスポザーゼにより組み込まれた多コピーのタンパク質を有する細胞により生成される抗体のような療法的タンパク質をコードしていることができる。抗体を含む発現カセットにＲＴＳおよびＬＴＳ配列を隣接させ、それを適切な細胞型（例えばＣＨＯ）にトランスポザーゼを用いて導入することにより、カセットの多数のコピーがゲノム中に挿入され、結果として単一の挿入事象と比較してより高レベルの発現がもたらされる。
【００９５】
細胞および遺伝子療法
一態様において、本発明は、目的の核酸または遺伝子をその核酸を必要とする対象に導入する系を提供する。適切には、対象は、あらゆる真核細胞、例えば植物、哺乳類、ヒト細胞等であることができる。
【００９６】
対象、例えばヒト患者が機能喪失変異と関係する病理を有する場合、遺伝子療法は、健康を回復させる可能性を有する。遺伝子療法は、発現コンストラクトの患者の細胞への導入を含む。これは、エキソビボまたはインビボで実施されることができ、エキソビボの適用は、より安全であり、より単純である。
【００９７】
適切なトランスポザーゼの存在下で、ＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンからのＬＴＳおよびＲＴＳ配列に隣接する配列は、（図１において示されているように）染色体ＤＮＡ中に効率的に組み込まれる。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンのコピーアンドペースト特性は、（図３および１５において示されているように）結果として多コピーの導入遺伝子配列を有する伝達された細胞の高い割合をもたらす。
【００９８】
従って、本発明は、組み換え細胞を生成するために用いられることができる系および方法を記載し、それは、一度患者の中に再導入されると、既存の技法において必要とされるよりも低い割合の編集された細胞を用いて処置されている病理に関する失われている機能の回復を達成することができる。従って、本発明は、失われている分泌タンパク質により駆動される病理を、これが酵素、ホルモン、成長因子、サイトカインまたは凝固因子であろうと、処置することができる組み換え細胞を生成するために用いられることができる。
【００９９】
加えて、療法用抗体の導入は、細胞シグナル伝達が混乱している状況において有益であり得る。組み換え細胞は、患者内の適切な位置において療法用抗体を分泌するために用いられることができ、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ系の多コピー組み込みに関する傾向は、以前に報告された系よりも高いレベルの発現を与える。
【０１００】
本発明に従う方法における使用に関する適切な細胞は、標的とするのが好都合である細胞（すなわち標的細胞）のタイプに依存し、それは今度は、処置されるべき疾患に依存し得る。適切なヒト標的細胞は、肝細胞、膵臓細胞、骨格筋細胞、線維芽細胞、網膜細胞、滑膜関節細胞、聴覚プロセスに関わる細胞、肺細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、神経細胞、グリア細胞、幹細胞、内皮細胞および癌細胞を含む。従って、対象における使用に適した細胞株の単離への言及は、外部の源から入手可能な適切な細胞株を選択することまたは処置を必要とする対象から細胞株を生成することを指し得る。
【０１０１】
一態様において、本発明の方法は、療法用細胞、例えばＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するために適用可能であることができる。
【０１０２】
適切な幹細胞は、造血性、神経、胎児性、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、間葉系、中胚葉系、肝臓、膵臓、筋肉、腎臓等の幹細胞を含む、哺乳類、例えばヒトの幹細胞を含む。適切な哺乳類幹細胞、例えばマウス胎児性幹細胞を含むマウス幹細胞も、含まれる。
【０１０３】
本発明は、目的遺伝子の対象、例えばヒト患者への導入を可能にする系も提供し、従って疾患を処置するための方法および医薬組成物を提供する。好都合には、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ系は、ウイルスに置き換わることができ、製造するためにかかる費用がより少なく、免疫原性がより低く、より後成的サイレンシングを生じにくい。
【０１０４】
他の使用
本明細書で記載されるコピーアンドペーストトランスポゾンを含むトランスポゾン系または方法は、変異誘発技法のための手段として用いられることもできる。
【０１０５】
本発明の側面および態様は、以下の項目においても述べられている：
１．コピー／ペーストトランスポザーゼおよび該トランスポザーゼにより認識される供与体ＤＮＡを含む単離された細胞または培養細胞において多コピーのＤＮＡ配列を生成するための系。
【０１０６】
２．項目１において請求されている系であって、該トランスポザーゼがＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンによりコードされている系。
【０１０７】
３．項目１または項目２において特許請求されている系であって、該トランスポザーゼがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼである系。
【０１０８】
４．いずれかの先行する項目において特許請求されている系であって、該ドナーＤＮＡが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において示されているＬＴＳ核酸配列およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４において示されているＲＴＳ核酸配列に隣接している系。
【０１０９】
５．いずれかの先行する項目において特許請求されている系であって、該トランスポザーゼが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１において示されているアミノ酸配列を有するＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼである系。
【０１１０】
６．多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それによりＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼおよび供与体ＤＮＡが細胞に導入される方法。
【０１１１】
７．項目６において特許請求されている方法であって、該トランスポザーゼおよび供与体ＤＮＡが、別々に供給される方法。
【０１１２】
８．項目６において特許請求されている方法であって、該トランスポザーゼおよび供与体ＤＮＡが、同じＤＮＡコンストラクト上で供給される方法。
【０１１３】
９．項目６において特許請求されている方法であって、該トランスポザーゼが、ＲＮＡまたはタンパク質形態で導入される方法。
【０１１４】
１０．多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それにより供与体ＤＮＡがまず細胞のゲノムに導入され、続いてＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼが導入される方法。
【０１１５】
１１．多コピーのＤＮＡ配列をゲノムに導入するための方法であって、それにより該ＲＴＳおよびＬＴＳ配列が内在性遺伝子に隣接する方法。
【０１１６】
１２．項目１１において特許請求されている方法であって、それにより該ＲＴＳ配列が、ゲノムターゲッティング法を用いて導入される方法。
【０１１７】
１３．項目１１において特許請求されている方法であって、該方法が、該ＲＴＳを導入するためにＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはｒＡＡＶ技術を用いる方法。
【０１１８】
１４．項目１１において特許請求されている方法であって、それにより該ＬＴＳ配列が、ゲノムターゲッティング法を用いて導入される方法。
【０１１９】
１５．項目１４において特許請求されている方法であって、該方法が、該ＬＴＳを導入するためにＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはｒＡＡＶ技術を用いる方法。
【０１２０】
１６．多コピーの好ましいＤＮＡをゲノムに導入するための方法であって、それにより該好ましいＤＮＡが、ランダムに該ゲノム中に挿入されてＲＴＳおよびＬＴＳに隣接し、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼが、続いて導入される方法。
【０１２１】
１７．項目６〜１６のいずれかにおいて特許請求されている方法であって、該ゲノムが、哺乳類ゲノムからなる方法。
【０１２２】
１８．項目１７において特許請求されている方法であって、それにより該ゲノムが、ＣＨＯゲノムである方法。
【０１２３】
１９．項目６〜１６のいずれかにおいて特許請求されている方法であって、該ゲノムが、ハプロイドゲノムである方法。
【０１２４】
２０．項目１〜５のいずれかの系または項目６〜１９のいずれかの方法により導入された多コピーの好ましいＤＮＡを含有する哺乳類細胞。
【０１２５】
２１．ＤＮＡまたはＲＮＡ分子参照標準として用いられる項目２０の哺乳類細胞。
【０１２６】
２２．ＩＨＣ参照標準として用いられる項目２０の哺乳類細胞。
【０１２７】
２３．該好ましいＤＮＡによりコードされるタンパク質の生成のために用いられる項目２０の哺乳類細胞。
【０１２８】
２４．項目２０の細胞から単離された核酸。
【０１２９】
本発明の様々なさらなる側面および態様が、本開示を考慮して当業者には明らかであろう。
【０１３０】
本明細書において言及された全ての文献は、参照によりそのまま本明細書に援用される。
【０１３１】
“および／または”は、本明細書において用いられる場合、２つの明記された特徴または構成要素のそれぞれの、他方を伴う、または伴わない具体的な開示として受け取られるべきである。例えば、“Ａおよび／またはＢ”は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）あたかもそれぞれが本明細書において個々に述べられたかのようにＡおよびＢのそれぞれの具体的な開示として受け取られるべきである。
【０１３２】
別途文脈が指示しない限り、上記で述べられた特徴の記載および定義は、本発明のいずれかの特定の側面または態様に限定されず、かつ記載されている全ての側面および態様に等しく適用される。
【０１３３】
本発明の特定の側面および態様は、ここで例として、そして上記の図および下記の表を参照して説明されるであろう。
【実施例】
【０１３４】
実施例１−Ｈｅｌｒａｉｓｅｒの特性付け
方法
コンストラクトおよびＰＣＲ
トランスポゾンの詳細なクローニング手順およびトランスポザーゼ発現ベクターならびにＰＣＲに関するプライマー配列が、以下のように提供される：
トランスポザーゼベクター。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼのコード領域が、ヒトコドン最適化の後ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成され、ＳｐｅＩ／ＸｈｏＩにより発現ベクターＦＶ４ａ（Liu ZJ, Moav B, Faras AJ, Guise KS, Kapuscinski AR, Hackett PB. Development of expression vectors for transgenic fish. Bio/technology 8, 1268-1272 (1990))中にクローニングされて、トランスポザーゼヘルパープラスミドｐＦＨｅｌＲを生成した。Ｎ末端２ＸＨＡタグが、ＭＹＰＹＤＶＰＤＹＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡをコードする合成二本鎖オリゴヌクレオチドとしてｐＦＨｅｌＲのＳｐｅＩ部位中に挿入されて、ｐＦ−ＨＡ−ＨｅｌＲを生成した。ＣＭＶプロモーターに駆動されるトランスポザーゼ発現プラスミドｐＣＨｅｌＲが、ｐＦＨｅｌＲのＳｐｅＩ／ＸｈｏＩ断片をｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位中に挿入することにより生成された。ｐＣＨｅｌＲＧＦＰプラスミドを作製するため、ｐＭＳＣＶ２０Ｉｒｅｓ−ＧＦＰ（Ｂ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，ＭＤＣからのもの）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ断片が、ｐＣＨｅｌＲのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位中に挿入された。トランスポザーゼ触媒変異体発現プラスミドが、ｐＣＨｅｌＲを鋳型として用いる変異誘発ＰＣＲにより生成された。昆虫細胞におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒタンパク質発現のために用いられたトランスポザーゼベクターは、ＧＥＮＥＡＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成されたＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼコード配列をｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いてサブクローニングすることにより生成された。
【０１３５】
トランスポゾンベクター
ＳＶ４０−ｐｕｒｏまたはＳＶ４０−ｎｅｏ選択カセットが、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔにより合成されたＨｅｌｉｂａｔ１（ｐＨｅｌＲ）、ＨｅｌｉｂａｔＮ１、ＨｅｌｉｂａｔＮ２およびＨｅｌｉｂａｔＮ３のコンセンサスＬＴＳおよびＲＴＳ配列の間にクローニングされた（図８）。トランスポゾン供与体ベクターｐＨｅｌＲΔＨＰ、ｐＨｅｌＲＭｕｔ、ｐＨｅｌＲＡＴＨ、ｐＨｅｌＲＳｔｅｍＸおよびｐＨｅｌＲＬｏｏｐＸが、トランスポゾンの３’末端における回文構造配列の削除または置換により生成された。ｐＨｅｌＲＭｕｔおよびｐＨｅｌＲΔＨＰベクターが、それぞれ以下のプライマー対を用いた削除ＰＣＲにより作製された：Ｈｅｌ−Ｍｕｔ  ｆｗｄ／Ｈｅｌ−Ｍｕｔ  ｒｅｖ、ならびにＨｅｌＲＤｅｌＨ  ｆｗｄおよびＨｅｌＲＤｅｌＨ  ｒｅｖ。ｐＨｅｌＲＡＴＨおよびｐＨｅｌＲＬｏｏｐＸ供与体プラスミドを生成するため、それぞれ４種類のオリゴヌクレオチドＡＴＨ１、ＡＴＨ２、ＡＴＨ３、ＡＴＨ４およびＬＸ１、ＬＸ２、ＬＸ３、ＬＸ４が、等モル比でアニーリングされた（０．８μＭのそれぞれのオリゴ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物および１μｌ  ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ融合ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）／５０μｌの反応）。オリゴアニーリング反応に関する温度プロフィールは、９５℃で２０秒、７２℃で１０秒を１０サイクルであった。アニーリング反応の１μｌが、それぞれＡＴＨ５／ＡＴＨ６およびＬＸ５／ＬＸ６プライマー対を用いたＡＴＨまたはＬＸ断片のＰＣＲ増幅のために用いられた。最終工程において、ＡＴＨおよびＬＸ  ＰＣＲ断片が、ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化され、ｐＨｅｌＲのＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングされた。ｐＨｅｌＲＳｔｅｍＸトランスポゾン供与体プラスミドを生成するため、ｐＨｅｌＲＡＴＨが、変異誘発ＰＣＲにおいて鋳型としてプライマーＳＸ  ｆｗｄおよびＳＸ  ｒｅｖと一緒に用いられた。ＰＣＲ反応後、線状断片の末端が、一緒にライゲーションされ、それによりｐＨｅｌＲＳｔｅｍＸを生成した。ｐＨｅｌＲΔＲＴＳを作製するため、ｐＨｅｌＲが、ＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で消化された。制限部位は、Ｋｌｅｎｏｗ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により平滑化され、再度ライゲーションされた。ｐＨｅｌＲΔＬＴＳ供与体プラスミドが、Ｈｅｌ１Ｃ骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）のＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ消化、続いて制限部位のＫｌｅｎｏｗ処理ならびにベクター骨格の再ライゲーションにより生成された。ｐＨｅｌＲＰＮおよびｐＨｅｌＲΔＨＰＮ供与体プラスミドが、ｐＵＣ１９ＳＢｎｅｏ(Grabundzija I、et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Mol Ther 18、1200-1209 (2010))ベクターからのＳｐｅＩ断片をそれぞれｐＨｅｌＲおよびｐＨｅｌＲΔＨＰベクターのＳｐｅＩ部位中に挿入することにより生成された。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環供与体プラスミドｐＨｅｌＲＣＤを生成するため、まずｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターが、ｐＷＡＳ−ＥＧＦＰのＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングすることにより構築された。次いで、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミ���のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片が、ｐＨｅｌＲプラスミドのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローニングされ、それによりｐＨｅｌＲＣＤを作製した。ｐＨｅｌＲＣｎｅｏベクターは、ｐＨＣプラスミド（ＨｅＬａ細胞におけるｐＨｅｌＲＣＤ供与体プラスミドからのＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移により生成された）からのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片をｐｃＤＮＡ３．１（−）のＢａｍＨＩ／ＭｆｅＩ部位中に挿入することにより作製された。次の工程において、ｐＨｅｌＲＣｎｅｏ中のｎｅｏコード配列が、ｐＨｅｌ１Ｃプラスミドからのｐｕｒｏコード配列と、ＡｖｒＩＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を用いて交換され、それによりｐＨｅｌＲＣｐｕｒｏベクターを生成した。トランスポゾンの３’末端における回文構造配列の欠失を有するＨｅｌｉｔｒｏｎ環ベクターであるｐＨｅｌＲＣΔＨＰｐｕｒｏが、鋳型としてのｐＨｅｌＲＣｐｕｒｏおよびＨｅｌ−Ｍｕｔ  ｆｗｄ／Ｈｅｌ−Ｍｕｔ  ｒｅｖプライマー対を用いる部位特異的変異誘発ＰＣＲにより生成された。ＰＣＲにより生成された全てのコード配列およびトランスポゾンコンストラクトの完全性が、ＤＮＡ配列決定により検証された。
【０１３６】
細胞およびトランスフェクション
２×１０５個のＨｅＬａ細胞が、トランスフェクションの１日前に６ウェルプレート上に蒔かれた。２μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）および２００μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥ緩衝液が、１μｇのＤＮＡをトランスフェクションするために用いられた（それぞれのトランスフェクション反応は、５００ｎｇのトランスポゾン供与体および５００ｎｇのトランスポザーゼヘルパーまたはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有していた）。トランスフェクションの４８時間後、トランスフェクションされた細胞のある割合（１０または２０％）が、１００ｍｍディッシュ上に再度蒔かれ、トランスポゾンの組み込みに関して選択された（２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏまたは２μｇ／ｍｌ  ｐｕｒｏおよび１．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８）。２〜３週間の選択の後、コロニーが、選び取られ、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で固定され、コロニーの計数および分析のためにＰＢＳ中でメチレンブルーにより染色された。
【０１３７】
スプリンケレット（ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ）ＰＣＲによる挿入部位およびコピー数の分析
トランスポゾンのコピー数が、以下のようにスプリンケレットＰＣＲにより決定された：
ＨｅＬａ細胞のクローンが、６ウェルプレート上でコンフルエントまで増殖させられ、ＰＢＳで洗浄され、溶解緩衝液（１００ｍＭトリスｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ、２００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１００μｇ／μｌプロテイナーゼＫ）中で振盪しながら５５℃で一夜培養された。ＨｅＬａのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が、溶解した細胞から標準的なフェノール／クロロホルム抽出により単離された。５μｇのｇＤＮＡが、ＦｓｐＢＩで４時間消化された後、エタノール沈殿が行われた。次の工程において、試料は、２０μｌの反応中でＢｆａＩスプリンケレットアダプター（１００ｐｍｏｌ）にライゲーションされた（３００ｎｇ）。３マイクロリットルのライゲーション反応が、プライマー（リンカープライマーおよびＨｅｌ１）を用いた第１ＰＣＲに関して用いられた。第１ＰＣＲラウンドに関する温度プロフィールは、以下の通りであった：９４℃で３分間を１サイクル、続いて９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１５サイクル；９４℃で３０秒間、６３℃で３０秒間および７２℃で２秒間（サイクルごとに２秒間の増加）を５サイクル；９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１２秒間（サイクルごとに２秒間の増加）を５サイクル；９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間および７２℃で２２秒間（サイクルごとに２秒間の増加）を５サイクル；ならびに９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を５サイクル。ネステッドＰＣＲが、プライマーＮｅｓｔｅｄおよびＨｅｌ２を用いて実施され、５０μｌの反応あたり１μｌの第１ＰＣＲの１：１００希釈物が、用いられた。ネステッドＰＣＲに関する温度プロフィールは、９４℃で３分間を１サイクルで開始し、続いて９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１０サイクル、そして９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間を２０サイクルであった。最後の伸長は、７２℃で５分間実施された。
【０１３８】
ｐＨｅｌＲ、ｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳトランスポゾンにより生成されたＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入の３’末端におけるトランスポゾン−ゲノム接合部位を分析するため、まずトランスポゾン挿入のゲノム位置を決定するために左末端スプリンケレットＰＣＲが、ＨｅＬａクローンから単離されたｇＤＮＡを用いて実施された。次の工程において、それぞれのトランスポゾン挿入から５０〜１００ｂｐ下流に位置するゲノム配列に相補的な特異的プライマーが、設計され（ＷＴ６ａ、ＷＴ６ｂ、ＷＴ６ｃ、ＷＴ６ｄ、ＤｅｌＨ２、ＤｅｌＨ１４、ＤｅｌＨ１９、ＤｅｌＲＴＳ２、ＤｅｌＲＴＳ１５ａ）、ゲノムＰＣＲにおいてＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの５’末端における配列に相補的なＨｅｌＣＤ１プライマーと一緒に用いられた。ＰＣＲに関する温度プロフィールは、以下の通りであった：９５℃で２分間、続いて９５℃で２０秒間、５７℃で２０秒間、７２℃で９０秒間を４０サイクル。最後の伸長工程は、７２℃で５分間実施された。ゲノムＰＣＲにおいて得られたＰＣＲ産物が、配列決定および分析された。
【０１３９】
環検出アッセイ
低分子量ＤＮＡが、トランスフェクションされたＨｅＬａ細胞から単離され、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環を検出するために改変された逆ＰＣＲプロトコルにおいて用いられた。
【０１４０】
ＨｅＬａ細胞におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒ環形成は、環検出ＰＣＲにより確証された。まず、２×１０５個のＨｅＬａ細胞が、トランスフェクションの１日前に６ウェルプレート上に蒔かれた。トランスフェクションの４８時間後、プラスミドが、細胞溶解工程においてＰ２緩衝液の代わりに５０μｇのプロテイナーゼＫを補った３００μｌの１．２％ＳＤＳを用いる改変されたＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐプロトコルを用いて細胞から単離された。プラスミド単離手順の残りの部分は、製造業者のプロトコルに従って実施された。１５０ｎｇの単離されたプラスミドが、プライマーＨｅｌ１およびＨｅｌ５を用いたＰＣＲに関して用いられた。ＰＣＲに関する温度プロフィールは、以下の通りであった：９８℃で２分間、続いて９８℃で１０秒間、５９℃で１５秒間、７２℃で１０秒間を３４サイクル。最後の伸長は、７２℃で５分間実施された。
【０１４１】
ＨｅＬａ細胞におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒの再転移
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼを発現している細胞が、４個のマッピングされたＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入を含有するＨｅＬａ由来トランスポゾン供与体Ｈ１細胞株にｐＣＨｅｌＲＧＦＰヘルパープラスミドを繰り返しトランスフェクションしてＧＦＰ＋の細胞を選別することにより富化された。次いで、我々は、富化された細胞集団のプールされたＤＮＡに対してトランスポゾン挿入部位の高スループット配列決定を行った。
【０１４２】
再転移アッセイのため、Ｈ１細胞が、１００ｍｍプレート（２μｇ／ｍｌピューロマイシン）上でコンフルエントまで増殖させられた。トランスフェクションの１日前に、２×１０６個の細胞が、新しい１００ｍｍプレート上に蒔かれた。２０μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥトランスフェクション試薬および５００μｌのｊｅｔＰＲＩＭＥ緩衝液が、３．５μｇのｐＣＨｅｌＲＧＦＰプラスミドを細胞にトランスフェクションするために用いられた。トランスフェクションの４８時間後、細胞は、ＧＦＰ発現に関してＦＡＣＳで選別され、５×１０５個のＧＦＰ陽性細胞が、１５０ｍｍプレート（２μｇ／ｍｌピューロマイシン）上に蒔かれ、１週間増殖させられた。その手順が、サイクルの間に７日間空けてさらに２回繰り返され、そのたびに前の週にＦＡＣＳで選別された細胞をトランスフェクションのために用いた。３回目に細胞がトランスフェクションされ、ＦＡＣＳで選別された後、それらは、１５０ｍｍプレート（２μｇ／ｍｌピューロマイシン）上でコンフルエントまで増殖させられ、ゲノムＤＮＡの単離および挿入部位の分析のためにプールされた。
【０１４３】
ゲノム全体での挿入部位分析
ＨｅＬａ細胞が、前に記載されたようにｐＣＨｅｌＲおよびｐＨｅｌＲをトランスフェクションされた。トランスフェクションの３週間後、ピューロマイシン耐性コロニーがプールされ、ｇＤＮＡが単離された。トランスポゾン末端に隣接するＤＮＡ配列が、Ｂｏｗｔｉｅ（Langmead B, Trapnell C, Pop M, Salzberg SL. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome biology 10, R25 (2009)）により１個までのミスマッチを許容してヒトゲノム（ｈｇ１９）に対してマッピングされた。エラーなしでゲノムにマッチしている独特にマッピングされた読みのみが、維持された。同じゲノムの位置に対する冗長な読みのマッピングは、一緒に統合された。我々は、トランスポゾン末端の最後の４塩基にマッチするゲノムの位置への全ての組み込みを、これらの部位はミスプライムによる人為産物である可能性もあるため、破棄した。さらなる詳細が、下記で提供されている。
【０１４４】
組み込み部位および融合転写産物ライブラリーの構築
挿入部位および融合転写産物ライブラリーの生成は、コンピューター支援半特異的ＰＣＲスキームに基づいていた。ＰＣＲアッセイは、それらの３’末端において４個のみの特異的ヌクレオチド（４塩基長）、続いてランダム配列および特異的オーバーハングを有する半特異的プライマー(Ewing AD, Kazazian HH, Jr. High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes. Genome research 20, 1262-1270 (2010))の使用に頼った。これらのプライマーは、ネステッドＰＣＲ増幅のためにこれらの座位にタグ付けするために、鋳型ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのそれぞれトランスポゾン−ゲノムまたはトランスポゾン−ゲノム転写産物の接合部の近隣にアニーリングするはずである。半特異的プライマーの４塩基長は、コンピューターで設計された。可能性のある４塩基長は、ヒトゲノムまたはトランスクリプトーム中のそれらの提示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）によりランク付けされ、トランスポゾン配列上またはプライマーオーバーハング上で望ましくない増幅産物を生じ得る４塩基長は、除外した。同様に、アルゴリズムが、それらの６つの４塩基長の組み合わせを予測するために実施され、それは、結果としてヒトゲノムまたはトランスクリプトームに関する最も包括的なライブラリーおよび用いられるトランスポゾンベクターをもたらす。次に、多工程ＰＣＲスキームが、指標付きのＩｌｌｕｍｉｎａフローセル適合性融合トランスクリプトームまたはインテグローム（ｉｎｔｅｇｒｏｍｅ）ライブラリーを得るために実施された。
【０１４５】
挿入ライブラリーの調製およびヒトゲノム中のＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンの組み込み部位の高スループット配列決定
ピューロマイシン耐性ＨｅＬａコロニーのプールから単離された３００ｎｇのｇＤＮＡが、６種類の異なる半特異的プライマーを含有する以下の条件：５’Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾン末端に関して：９５℃で１分間、４０サイクルの（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、２サイクルの（９４℃で３０秒間、２５℃で１分間、０．２℃／秒で７２℃までランプ（ｒａｍｐ）、７２℃で１分間）での最初の６つの並行したＰＣＲ反応のための鋳型として、５’−Ｈｅｌｉｔｒｏｎ配列に特異的な５ｐｍｏｌのＨｅｌ＿Ｌｆｔ＿１または３’−トランスポゾン末端に特異的な５ｐｍｏｌのＨｅｌ＿３Ｐ＿１（６２℃のアニーリング温度を使用する以外は同じプログラムを使用）と共に使用された。第１ＰＣＲ反応は、それぞれ５’−トランスポゾン末端に関する１５ｐｍｏｌのＨｅｌ＿Ｌｆｔ＿２および３’−トランスポゾン末端に関する１５ｐｍｏｌのＨｅｌ＿３Ｐ＿２を含有する２５μｌのＰＣＲマスター混合物を補われた。５’末端に関するＰＣＲプログラムは、以下の通りであった：１５上位サイクル（ｓｕｐｅｒ−ｃｙｃｌｅｓ）の［３サイクルの（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）、１サイクルの（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）］。３’末端に関して、６２℃のアニーリング温度が、３サイクルに関して用いられた。ＰＣＲ産物は、カラム精製され、３０μｌの溶離物の内の２μｌが、プライマーＰＥ＿ｆｉｒｓｔならびに５’トランスポゾン末端に関してＨｅｌ＿Ｌ＿ｂｃおよび３’トランスポゾン末端に関してＨｅｌ＿３Ｐ＿ｂｃをそれぞれ用いる、以下のサイクル条件を用いる第１指数関数的ＰＣＲのために用いられた：９５℃で３０秒間、２０サイクルの９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間。３’トランスポゾン末端に関して、アニーリング温度は、５８℃であった。１μｌの１０倍希釈された第１指数関数的ＰＣＲ産物が、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターを増幅産物に付加するために用いられ、Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、これらのサイクル条件で用いた：９５℃で３０秒間、２０サイクルの９４℃で１５秒間、６８℃で１分間。最終的なＰＣＲ産物が、アガロースゲル上で泳動され、２００〜５００ｂｐの増幅産物が、切り出され、カラム精製された（ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。結果として得られたライブラリーの配列決定は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓの米国マサチューセッツ州ダンバースの配列決定施設においてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００機器上で実施された。
【０１４６】
生の読みは、以下のようにマッピングのために処理された。プライマー、トランスポゾン、および右Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターに関連する配列が、トリミングされた。結果として得られた読みは、‘Ｎ’塩基を含有する読みを省くことにより、そして５塩基の内の端から２塩基がｐｈｒｅｄスコア２０未満の品質エンコード（ｑｕａｌｉｔｙ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ）を有する読みをトリミングすることにより、品質を選別された。２４塩基より短い全てのトリミングされた読みは、除かれた。残りの配列が、Ｂｏｗｔｉｅ(Langmead et al. (2009))によりｈ１９ヒトゲノムアセンブリに対してマッピングされた。
【０１４７】
タンパク質の発現および精製
点変異が、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発法（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて作られた。バキュロウイルスの産生およびタンパク質発現は、国立癌研究所のタンパク質発現研究所により以下のように実施された：
細胞のペレットが、ニッケル親和性カラム結合緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で再懸濁された。全てのその後の工程は、４℃で実施された。溶解は、細胞を氷上で３０分間インキュベートし、次いでＭｉｓｏｎｉｘ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ  ３０００で超音波処理（３分間の休止を伴う５×２０秒間の８２ワットのパルス）することにより行われた。可溶性画分が、２０，０００×ｇでの遠心分離により分離され、ニッケル親和性カラム結合緩衝液中で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＣＨｅＬａｔｉｎｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填され、溶離緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）による線形勾配を用いて溶離された。溶離されたタンパク質は、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ中で一夜透析され、１ｍｇ／ｍｌ  ＴＥＶプロテアーゼが、１：１００  プロテアーゼ：タンパク質の体積比で添加された。生成物は、ヘパリンカラム結合緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）で予め平衡化されたＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填され、溶離緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．０、２Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）による線形勾配を用いて溶離された。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼが、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＴＣＥＰで平衡化されたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填され、精製されたタンパク質を含有する画分が、１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。全ての点変異体が、同じ方式で精製され、発現または精製挙動（＞９０％の均質性）のどちらにおいても、野生型トランスポザーゼの発現または精製挙動からの変化を示さなかった。同じ手順が、トランスポザーゼの切断されたバージョンを精製するためにも用いられた。
【０１４８】
切断アッセイおよび切断産物の配列決定
ＤＮＡ切断が、６−ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（ＢｉｏＴｅＺ  Ｂｅｒｌｉｎ−Ｂｕｃｈ  ＧＭＢＨ）を用いて測定された。反応は、一般に５ｍＭ  ＭｎＣｌ２を含むかまたは含まない緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＴＤＡ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中５００ｎＭのＤＮＡ基質および５００ｎＭのタンパク質で構成されていた。さらなる詳細は、以下のように提供される：
切断は、３７℃で１時間行われ、２μｌのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）および２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加により停止された。５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む反応に関して、反応は、３７℃で一夜行われた。プロテイナーゼＫ消化は、４５℃で３０分間であり、その後、同体積の装填色素（８０％ホルムアミド、１ｍｇ／ｍｌキシレンシアノール、１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）が添加され、反応は、２２℃で１５分間、次いで９５℃で５分間インキュベートされた後、１５％トリス／ボレート／ＥＤＴＡ／尿素ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にゲル装填された。結果は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化された。
【０１４９】
ゲルは、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡゲル染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色され、青色光により可視化され、それぞれのバンドが切り出された。ｓｓＤＮＡの抽出は、ゲルを破砕し、抽出緩衝液（０．５Ｎ  ＮＨ４Ａｃ、１０ｍＭ  ＭｇＡｃ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ）中で３７℃で一夜振盪することにより行われた。あらゆる残っている混入物質を除去するため、溶液は、４℃において１４，０００×ｇで２分間遠心分離され、上清は、さらにＩｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて塩類を除去された。ｓｓＤＮＡは、ｓｓＤＮＡリガーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて次のオリゴヌクレオチドにライゲーションされた：
５’／５ｒＡｐｐ／ＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＧ／３ＳｐＣ３／−３’。次いで、ＰＣＲならびに５’末端の配列の既知の部分に関して設計されたプライマーおよび上記のオリゴヌクレオチドに対する逆方向プライマーを用いて、断片が増幅された。結果として得られたｄｓＤＮＡが、ｐＵＣ１９中にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いてクローニングされ、ＦＤＡ−ＦＢＲ施設において配列決定された。
【０１５０】
プロテアーゼ消化およびＮ末端配列決定
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼが、２０ｍｌの消化緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中において１ｍｇ／ｍｌで希釈され、一連のトリプシン希釈物が、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度まで添加された。試料は、３７℃で１時間インキュベートされ、反応は、ＮｕＰＡＧＥ装填色素（Ｎｏｖｅｘ）および９５℃で５分間の煮沸により停止された。次いで、試料は、すぐに４〜１２％  ＮｕＰＡＧＥビストリスゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に装填された。バンドは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｉＢｌｏｔキットを用いてブロット用紙に転写され、それぞれのＮ末端配列の配列が、ＦＤＡ−ＦＢＲ施設により決定された。
【０１５１】
ＥＭＳＡ
ＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼのそれぞれのＤＮＡオリゴヌクレオチドへの結合が、６％  ＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるＥＭＳＡにより測定された。１５ｎＭ〜１５０ｎＭの精製されたタンパク質が、室温で結合緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＥＴＤＡ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）中で５０ｎＭの６−ＦＡＭ標識されたオリゴヌクレオチドと共に３０分間インキュベートされた。ＤＮＡゲル装填溶液（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ＩＮＣ）の添加後、試料は、６％  ＴＢＥゲル上で泳動され、可視化された。
【０１５２】
結果
復活したＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの構造的特徴
自律性Ｈｅｌｉｂａｔ要素のモデルを構築するため、Ｍ．ルシフガスのゲノムに対して生物情報学的分析が行われた（下記参照）。結果として得られた５２９６ｂｐのＨｅｌｒａｉｓｅｒコンセンサス配列（図８）は、配列分析により同定された自律性Ｈｅｌｉｔｒｏｎの既知の特徴（Kapitonov et al. (2007)およびThomas et al. (2015)において総説されている）の全てを含有する。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼの１４９６アミノ酸（ａａ）長のコード配列は、それぞれＬＴＳおよびＲＴＳと名付けられたトランスポゾンの左および右末端配列に隣接しており（図１Ａおよび図８）、それは、Ｈｅｌｉｂａｔ１ファミリーに特徴的な保存された５’−ＴＣ／ＣＴＡＧ−３’モチーフで終結している(Pritham et al. (2007))。一本鎖の際にヘアピン構造を形成する可能性を有する１９塩基対長の回文構造配列が、ＲＴＳ末端の１１ヌクレオチド上流に位置している（図１Ａおよび図８）。
【０１５３】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼは、推定上のＮ末端核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびジンクフィンガー様モチーフ、続いてＲｅｐＨｅｌ酵素コア(Kapitonov et al. (2001)およびPritham et al. (2007))を含有する。ＲｅｐＨｅｌは、保存されたＨＵＨモチーフおよび２個の活性部位のＴｙｒ残基を特徴とする約３００アミノ酸長のＲｅｐヌクレアーゼドメインならびにＳＦ１スーパーファミリーのＤＮＡヘリカーゼに特徴的な８個の保存されたモチーフを含有する約６００アミノ酸のヘリカーゼドメインからなる（図１Ａ、図９Ａおよび１０ＡＡ）。
【０１５４】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの分子再構成
植物および後生動物における多様な既知のＨｅｌｉｔｒｏｎによりコードされているＲｅｐＨｅｌタンパク質中に存在する保存されたローリングサークル複製開始因子ドメイン（Ｒｅｐ）に対応する約３００アミノ酸タンパク質配列のセットを用いて、我々は、このドメインをコードする全てのコウモリ配列を、それらをＧｅｎＢａｎｋミオティス・ルシフガス（Ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）アセンブリに対するＣｅｎｓｏｒ（Jurka J、Klonowski P、Dagman V、Pelton P. CENSOR--a program for identificationおよびelimination of repetitive elements from DNA sequences. Computers & chemistry 20、119-121 (1996)）検索におけるクエリーとして用いることにより同定した。同定されたＤＮＡ配列が異なるファミリーから構成されている可能性があるかどうかを調べるため、我々は、ＢＬＡＳＴＣＬＵＳＴ（スタンドアローンのＢｌａｓｔ、ＮＣＢＩ）によるそれらのクラスタリングを実施した。クラスタリングの結果に基づいて、我々は、コウモリゲノムが１個のみの主な自律様Ｈｅｌｉｔｒｏｎのファミリーを含有していると結論付けた。全てのこれらの配列は、未成熟停止コドンおよび短い挿入欠失が混入している配列でさえも、触媒ドメインをコードする約９００ｂｐのＲｅｐコンセンサス配列を得るために用いられた。次の工程において、Ｒｅｐコンセンサスの２００ｂｐの５’および３’末端部分に９０％を超えて同一なゲノム配列が、末端のそれぞれ２ｋｂ上流および下流まで拡張された。拡張された配列の２セットの多重アラインメントに関して、２つのコンセンサス配列が、得られた。これらの２つの末端コンセンサスおよびＲｅｐコンセンサスが、一緒に１つの長い拡張されたコンセンサスへと組み立てられた。この手順は、コウモリの自律様Ｈｅｌｉｔｒｏｎの両方の末端が同定されるまで反復して繰り返され、自律性コウモリコンセンサス配列の第１バージョン（Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１＿ＭＬ）が、構築された。
【０１５５】
次に、Ｃｅｎｓｏｒを用いることにより、我々は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１＿ＭＬに９０％を超えて同一なＭ．ルシフガスゲノム中の全てのコピーを収集した。両方向に１ｋｂ拡張された収集された配列の対でのアラインメントに基づいて、我々は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎのそれらの転移による増殖に直接関係ない長い分節重複（互いに９０％を超えて同一）により生成された全てのコピーを除去した。結果として、我々は、５００コピーのＨｅｌｉｔｒｏｎ−１＿ＭＬからなる最終的なセットを収集した。全てのこれらの配列およびＨｅｌｉｔｒｏｎ−１＿ＭＬの多重アラインメントの後、我々は、コンセンサスの第２バージョンである、１４５８アミノ酸のＲｅｐＨｅｌタンパク質をコードしており収集された５００コピーに約９５％同一な５３０１−ｂｐのＨｅｌｉｔｒｏｎ−１ａ＿ＭＬを得た。
【０１５６】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１ａ＿ＭＬコピーの連続した分析は、コピーの大部分が実際には２つの非自律性Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１Ｎ１＿ＭＬおよびＨｅｌｉｔｒｏｎ−２Ｎ２＿ＭＬトランスポゾンである場合、ゲノムは少数の自律様コピーのみを含有している、ということを明らかにした。２４３７−ｂｐのＨｅｌｉｔｒｏｎ−１Ｎ１＿ＭＬおよび２１４４−ｂｐのＨｅｌｉｔｒｏｎ−１Ｎ２＿ＭＬコンセンサス配列は、それぞれＨｅｌｉｔｒｏｎ−１ａ＿ＭＬ  ＲｅｐＨｅｌタンパク質の６１０アミノ酸のＮ末端部分および３９０アミノ酸のＣ末端部分をコードしていた。おそらく、これらの非自律性トランスポゾンは、一部の自律性Ｈｅｌｉｔｒｏｎにより発現されたＲｅｐＨｅｌトランスポザーゼにより転移させられた。従って、我々は、ＲｅｐＨｅｌの残遺物（ｒｅｍｎａｎｔｓ）をコードしている非自律性トランスポゾン中の領域は、非自律性要素のコピーから再構成されたタンパク質の適正な機能を破壊または損傷し得る変異を含有している可能性があると結論付けた。この問題を回避するため、非自律性トランスポゾンのコピーは、“５００の断片”のセットから除外された。結果として、おそらく実際の自律性Ｈｅｌｉｔｒｏｎの断片である４６個のみの配列が、修正されたセット中に残った。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１ａ＿ＭＬコンセンサス配列のこれらの４６個の配列との再アラインメントに基づいて、１４９４アミノ酸のＲｅｐＨｅｌタンパク質をコードしている新規の５２９５−ｂｐのＨｅｌｉｔｒｏｎ−１ｂ＿ＭＬコンセンサス配列が、得られた（コンセンサスおよび４６個の配列の間で約９５％の同一性）。
【０１５７】
この点において、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１ｂ＿ＭＬおよびＨｅｌｉｔｒｏｎ−１ａ＿ＭＬコンセンサス配列は、９８．８１％同一であり、これらのコンセンサス配列によりコードされるＲｅｐＨｅｌタンパク質は、互いに１３アミノ酸の置換により、そしてＨｅｌｉｔｒｏｎ−１ｂ＿ＭＬコード配列に付加された３６アミノ酸のＣ尾部により異なっていた。
【０１５８】
元の“５００断片”のセット中の配列は、他の転移可能な要素の挿入により、そして内部の欠失により生成された長い自律性Ｈｅｌｉｔｒｏｎの短い断片を含有していなかったため、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１ｂ＿ＭＬが得られた４６のコード配列のそれぞれに関して、全ての末端および追加の内部断片が、手作業で追加され、それにより１７７の断片のセットを作り出した。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ−１ｂ＿ＭＬコンセンサスのこれらの断片全てとの再アラインメントに基づいて、我々がＨｅｌｒａｉｓｅｒと名付けた５２９６ｂｐの自律性コンセンサス配列の最終バージョンが、得られた（図８）。
【０１５９】
ヒト細胞におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移
我々は、トランスポゾンの機能的構成要素（すなわちトランスポザーゼならびにＬＴＳおよびＲＴＳ配列）を合成し、ピューロマイシン遺伝子（ｐｕｒｏ）でタグ付けされたトランスポゾン（ｐＨｅｌＲと名付けられた）およびトランスポザーゼ発現ヘルパープラスミド（ｐＦＨｅｌＲと名付けられた、図１Ｂ）からなる２構成要素転移系を生成した。図１Ｂにおいて示されているように、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ系のヒトＨｅＬａ細胞へのトランスフェクションは、トランスポザーゼの非存在下でのプレートあたり約１００個のコロニーと対比して、平均でプレートあたり約３４００個のピューロマイシン耐性コロニーを生成した。従って、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾン系は、ヒト細胞における転移活性に必要とされる決定因子の全てを含有しているようである。
【０１６０】
スプリンケレットＰＣＲにより回収された１０の独立したＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入の配列分析（方法“スプリンケレットＰＣＲによる挿入部位およびコピー数の分析”を参照）は、全ての場合において、トランスポゾンＬＴＳ  ５’−ＴＣモチーフのＡヌクレオチドに対する、そしてＲＴＳ  ＣＴＡＧ−３’モチーフのＴヌクレオチドに対する直接的な正準的接合が存在することを明らかにした（図１Ｃ）。従って、ＡＴジヌクレオチド標的部位へのＨｅｌｉｔｒｏｎ転移は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒにより忠実に再現された。
【０１６１】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒの相対的転移効率を評価するため、我々は、それを最も活性な脊椎動物のカットアンドペーストトランスポゾンの１つであるＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙの超反応性バリアント（ＳＢ１００Ｘ）(Mates L, et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature genetics 41, 753-761 (2009))と比較した。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒは、ヒトＨｅＬａ細胞においてＳＢ１００Ｘよりも約２倍だけ低いコロニー形成活性を示し（図１Ｄ）、これは、最適化なしでさえも比較的高い転移活性を示している。
【０１６２】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼの非自律性トランスポゾンＨｅｌｉｂａｔＮ１、ＨｅｌｉｂａｔＮ２およびＨｅｌｉｂａｔＮ３を交差可動化する（ｃｒｏｓｓ−ｍｏｂｉｌｉｚｅ）能力を試験するため、それらのコンセンサスＬＴＳおよびＲＴＳ配列が、合成され、ネオマイシン（ｎｅｏ）またはピューロマイシン抗生物質耐性遺伝子でタグ付けされ、それらの転移活性が、上記のようにアッセイされた。ＨｅｌｉｂａｔＮ１は、最も活性であり（野生型Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの活性の約２８％）；ＨｅｌｉｂａｔＮ３は、検出可能な活性を示し（約２％）、一方でＨｅｌｉｂａｔＮ２は、これらの実験条件下では明らかに不活性であった（図１Ｅ）。これらのデータは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒが、おそらくＭ．ルシフガスゲノム中の最も豊富な非自律性Ｈｅｌｉｔｒｏｎサブファミリーの少なくとも一部の可動化および増殖の原因であった古代のＨｅｌｉｂａｔ１トランスポザーゼに相当することを、示している。
【０１６３】
ＨＵＨヌクレアーゼおよびＳＦ１Ｂヘリカーゼドメインの機能分析
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼの保存されたアミノ酸の一部の機能的重要性を決定するため、我々は、ＨＵＨヌクレアーゼドメイン中のＨ５９３およびＨ５９５の両方ならびに推定上の触媒性Ｙ７２７およびＹ７３１残基（両方を個々に、および一緒に）、ならびにＷａｌｋｅｒ  ＡモチーフのＫ１０６８およびヘリカーゼドメインのモチーフＶＩ中に位置するアルギニンフィンガーＲ１４５７残基を変異させた（図２Ａ）。これらの変異のそれぞれが、結果としてＨｅＬａ細胞における転移活性の喪失をもたらし（図２Ａ）、これは、ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性の両方が転移に必要であることを示唆している。
【０１６４】
精製されたＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼを用いたインビトロアッセイは、ｓｓＤＮＡ（Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ  ＬＴＳおよびＲＴＳの４０塩基＋隣接するＤＮＡの１０塩基に相当する）の切断を示した（図２Ｂ）が、ｄｓＤＮＡの切断は示さなかった（データは示されていない）。最も顕著な切断産物（１〜４と標識されている、図１０Ｂ）の配列決定は、上のＬＴＳ鎖上の隣接するＤＮＡおよびＨｅｌｒａｉｓｅｒ５’−ＴＣジヌクレオチドの間の切断（レーン２）、ＬＴＳの下の鎖上の内部ＡＴジヌクレオチドの間の切断（レーン４）、ならびにＲＴＳの両方の鎖における正確にトランスポゾンの末端での切断（レーン６および８）を明らかにした。これらの結果は、トランスポゾンの末端の正確な切断に関するトランスポゾン配列決定因子は、それぞれの末端における末端４０ｂｐ以内に位置していることを示している。
【０１６５】
ＨＵＨヌクレアーゼから予想されるように、切断活性は、二価金属イオンを必要とし（レーン２および３を比較、図２Ｂ）、Ｍｎ2+を用いるとＭｇ２＋を用いるよりも効率的であった［レーン３（３７℃で１時間）および１１（３７℃で一夜）を比較］。我々は、ＨＵＨモチーフのＨｉｓ−＞Ａｌａ変異体を用いた場合（レーン４）または両方のＴｙｒ残基が同時に変異していた場合（レーン５）のどちらに関しても、ＬＴＳの上の鎖においてｓｓＤＮＡの切断を検出しなかった。我々は、２個のＴｙｒ残基が個々に変異していた場合に顕著な差を観察した：第１Ｔｙｒの変異（Ｙ７２７Ｆ）は、切断に対して作用を有さず（レーン６）、一方で第２Ｔｙｒの変異（Ｙ７３１Ｆ）は、切断活性の喪失をもたらした（レーン７）。ヘリカーゼドメイン中のＫ１０６８Ｑ変異は、ｓｓＤＮＡの切断に対して作用を有しなかった（レーン８）。まとめると、これらの結果は、ＨＵＨドメインの保存された残基がｓｓＤＮＡの切断に重要であること、そして活性部位の２個のＴｙｒ残基はＨｅｌｉｔｒｏｎ転移において異なる役割を有することを示している。
【０１６６】
精製されたＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼに対する限定的なタンパク質分解は、結果としてＮ末端、ヌクレアーゼおよびヘリカーゼドメインに対応する３つの安定な断片をもたらした（図９Ｂ）。我々は、これらの実験的に決定されたドメインの境界を用いて、Ｎ末端ドメインを欠いておりヌクレアーゼ（ＨｅｌＲ４９０−７４５）またはヌクレアーゼ−ヘリカーゼ（ＨｅｌＲ４９０−１４８６）ドメインを包含する切り詰められたトランスポザーゼを設計した。精製された切り詰められたトランスポザーゼ断片のいずれも、ＤＮＡを切断することができず（図２Ｂ、レーン９および１０）、これは、Ｎ末端ドメインがＤＮＡ結合に関わっている可能性があることを示唆している。実際、図２Ｃにおいて示されているように、野生型Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼ（レーン１〜１２）および完全性Ｈｉｓ−＞Ａｌａ変異体（レーン１３〜１４）は、両方とも切断アッセイにおいて用いられるオリゴヌクレオチドに結合することができるが、Ｎ末端の４８９アミノ酸を欠いている切り詰められたバージョンは、ＤＮＡに結合しなかった（レーン１５〜２０）。これらのデータは、予測されるジンクフィンガー様モチーフ(Pritham et al. (2007))を含有するＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼのＮ末端は、ＤＮＡ結合ドメインをコードしており、それは、そのｓｓＤＮＡに結合して切断する能力のために決定的に重要であることを、示している。
【０１６７】
ヘリカーゼ活性と一致して、精製されたトランスポザーゼは、ＡＴＰを４６  ＋／−  ３．３μＭのＫｍおよび６．８  ＋／−０．１１  ｓ−１のｋｃａｔで加水分解する（図２Ｄ中の挿入図）。重要なことだが、ＡＴＰの加水分解速度は、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡのどちらかの添加により劇的に刺激され（図２Ｄ）、これは他のＳＦ１ヘリカーゼで見られる作用である(Bird LE, Subramanya HS, Wigley DB. Helicases: a unifying structural theme? Curr Opin Struct Biol 8, 14-18 (1998))。Walker AモチーフＫ１０６８の変異は、ＡＴＰの加水分解を消失させた（図２Ｄ）。
【０１６８】
比色定量ＡＴＰアーゼアッセイ
ＡＴＰの加水分解が、Baykov et al. (Baykov AA, Evtushenko OA, Avaeva SM. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal Biochem 171, 266-270 (1988))から適合された手順を用いて時間の関数としての遊離ホスフェート（Ｐｉ）の形成を測定することにより分析された。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼまたは変異体タンパク質が、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で０．３〜１μＭの終濃度に希釈され、次いで３７℃に１０分間加熱された。反応は、１８０μｌの総体積中１ｍＭの終濃度または０．００７８〜１ｍＭの濃度範囲のどちらかまでのＡＴＰ（Ｊｅｎａ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加により開始された。試料（２０μｌ）が、様々な時点において取り出され、すぐにそれぞれが５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを含有する９６ウェルプレートのウェル中で停止された。１ｍＭマラカイトグリーンストック溶液の分割量（１５０μｌ）が、それぞれのウェルに添加され、６５０ｎｍにおける吸光度が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーを用いて測定された。放出されたホスフェートの量が、ＫＨ２ＰＯ４を用いて生成された標準曲線に対する比較により計算された。ＡＴＰ加水分解のＤＮＡ刺激が、同じ緩衝液およびタンパク質濃度範囲（０．３、０．０８、０．０２？Ｍ）およびＡＴＰ（１ｍＭ）を用いて、しかしＡＴＰの添加の前に１μＭの５０塩基長ｓｓＤＮＡまたは５０ｂｐ長ｄｓＤＮＡのどちらかを添加して測定された。Ｋｍおよびｋｃａｔの計算は、ＥＸＣＥＬ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ４．０において行われた。
【０１６９】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移における末端配列および３’ヘアピン構造の役割
転移におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒの末端配列の重要性を調べるため、我々は、トランスポゾンベクターｐＨｅｌＲΔＬＴＳおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳの変異体を、ＬＴＳまたはＲＴＳ配列のどちらかを削除することにより作製した。ＬＴＳの存在は、その欠失がＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移を消失させる（ＨｅＬａ細胞におけるトランスポザーゼの存在および非存在下での区別不能なコロニー数により判断された）ため、必須であった。驚くべきことに、ＲＴＳの存在は、必須ではなかったが、その除去は、結果としてコロニー形成活性の完全なトランスポゾンの約２４％までの低下をもたらした（図３Ａ）。
【０１７０】
ＲＴＳの役割をさらに調べるため、我々は、ヘアピン（“ＨＰ”）構造を形成することが予測される１９ｂｐの回文構造配列が削除されたトランスポゾンベクターｐＨｅｌＲΔＨＰを作製した。図３Ａにおいて示されているように、ｐＨｅｌＲΔＨＰは、完全なトランスポゾンのトランスポゾンコロニー形成活性の約３５％をもたらした。特に、これは、ＲＴＳ全体が削除されたｐＨｅｌＲΔＲＴＳにより生成されたコロニーの数と比較可能である。野生型Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンにより得られた５１個のＨｅＬａコロニーからのトランスポゾン挿入部位のスプリンケレットＰＣＲ分析は、４の平均コピー数を示し、クローンあたり１〜１０の範囲のトランスポゾン挿入を有していた（挿入図、図３Ｂ）。ｐＨｅｌＲΔＨＰにより生成された１６クローンおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳにより生成された１５クローンの同じ分析は、両方の変異体トランスポゾンは平均してクローンあたり１個の挿入をもたらすことを明らかにした（図３Ｂ）。従って、ＨｅｌＲΔＨＰおよびＨｅｌＲΔＲＴＳトランスポゾン変異体の補正された転移効率は、野生型トランスポゾンにより得られた転移効率のそれぞれ９．９％および６％である（挿入図、図３Ｂ）。
【０１７１】
ＨｅｌｒａｉｓｅｒのＲＴＳヘアピンの役割をより深く調べるため、我々は、ヘアピン配列が異なる方式で変異している３種類の改変されたトランスポゾン供与体ベクター（ｐＨｅｌＲＡＴＨ、ｐＨｅｌＲＳｔｅｍＸ、ｐＨｅｌＲＬｏｏｐＸ）を生成した（図３Ｃ）。ｐＨｅｌＲＡＴＨにおいて、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒヘアピン配列は、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）におけるＨｅｌｉｔｒｏｎ１トランスポゾンファミリー(Kapitonov et al. (2001))のヘアピン配列で置き換えられていた。ｐＨｅｌＲＳｔｅｍＸは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒのヘアピンのループを保持していたが、ステムの配列は、Ａ．サリアナのヘアピンの配列と交換されていた。ｐＨｅｌＲＬｏｏｐＸにおいて、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒのヘアピンのステムの配列は、保持されていたが、ループ中のＡＴＴヌクレオチドは、ＣＧＧで置き換えられており、ループの基部におけるＨｅｌｒａｉｓｅｒのＡ−Ｔｂｐは、Ａ−Ａに変えられていた。
【０１７２】
ｐＨｅｌＲＡＴＨおよびｐＨｅｌＲＬｏｏｐＸは、両方とも、完全な回文構造が欠失しているｐＨｅｌＲΔＨＰに類似の転移活性を示した（図３Ｄ）。対照的に、ｐＨｅｌＲＳｔｅｍＸは、野生型の転移活性の約９０％を示した。これらの結果は、たとえＲＴＳの回文構造がＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移に絶対に必要であるわけではないとしても、回文構造配列は転移の制御に重要である、ということを示唆した。
【０１７３】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移は、トランスポゾン環を生成する
逆ＰＣＲを用いたＨｅｌｒａｉｓｅｒの挿入部位の分析の間に、我々は、しばしば顕著な約１５０ｂｐのＰＣＲ産物を観察した（データは示されていない）。これらのＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列決定は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾン末端の正確なヘッドトゥーテール接合（ＬＴＳの５’−ＴＣジヌクレオチドが、ＲＴＳのＣＴＡＧ−３’テトラヌクレオチドに直接かつ正確に接合されている）を明らかにした（図４Ａ）。これらのデータは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移における環状中間体の形成を示唆した。
【０１７４】
トランスポゾン環が転移の間に生成されたことを確証するため、我々は、プラスミドレスキューＨｅｌｒａｉｓｅｒ供与体ベクターｐＨｅｌＲＣＤ（“ＣＤ”：環供与体）を構築し、ここで、トランスポゾンのＬＴＳおよびＲＴＳ配列が、プラスミドの複製起点およびｋａｎ／ｎｅｏ選択カセットに隣接していた（図４Ａ）。ＨｅＬａ細胞のｐＨｅｌＲＣＤおよびトランスポザーゼヘルパープラスミドとの同時トランスフェクションの後、低分子量ＤＮＡが、単離され、電気穿孔法で大腸菌細胞内に入れられ、それに対してカナマイシン選択が行われた。５０個の大腸菌コロニーの内の１個が、完全なトランスポゾン配列およびＨｅｌｒａｉｓｅｒのＬＴＳおよびＲＴＳの完全なヘッドトゥーテール接合で構成されるＨｅｌｒａｉｓｅｒ由来のＨｅｌｉｔｒｏｎ環（“ｐＨｅｌＲＣ”と名付けられた）を含有していた（図４Ａ）。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環は、転移的に活性であり；ｐＨｅｌＲＣの転移は、平均でプレートあたり約３６０個のコロニーを生成し、それは、プラスミドベースのｐＨｅｌＲＣＤ  Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環供与体ベクターのコロニー形成効率の約５１％を構成する（図４Ｂ）。
【０１７５】
回文構造が完全または部分的に削除されているｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲＭｕｔＨベクターはＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼの存在下で環を生成する能力があったため、ＨｅｌｒａｉｓｅｒのＲＴＳ中の回文構造は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環の形成に必要とされない（図４Ｃ）。興味深いことに、トランスポザーゼの存在下でｐＨｅｌＲＣｐｕｒｏおよびｐＨｅｌＲＣＤΔＨＰｐｕｒｏを用いて得られた類似のコロニー数により証明されるように、回文構造の欠失は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ環の転移に対して、プラスミド供与体を用いた場合と同じ有害な作用を有しなかった（図４Ｄ）。この結果は、接合された末端を有するトランスポゾン環の状況では、供与体ＤＮＡ中に１個のニックが作られさえすればよく、従ってトランスポゾンの３’末端を合図する（ｓｉｇｎａｌ）必要がないことを示唆している。要するに、その結果は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移の中間体としてのトランスポゾン環の生成を示している。
【０１７６】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ挿入のゲノム全体での分析
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ挿入のパターンは、多くの真核生物種のゲノムにおいて広く分析されてきた(Pritham et al. (2007); Thomas et al. (2014); Coates et al. (2012); Du et al. (2009); Morgante et al. (2005); Dong Y, et al. Structural characterization of helitrons and their stepwise capturing of gene fragments in the maize genome. BMC genomics 12, 609 (2011); Han MJ, Shen YH, Xu MS, Liang HY, Zhang HH, Zhang Z. Identification and evolution of the silkworm helitrons and their contribution to transcripts. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 20, 471-484 (2013); Yang L, Bennetzen JL. Structure-based discovery and description of plant and animal Helitrons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 12832-12837 (2009) and Yang L, Bennetzen JL. Distribution, diversity, evolution, and survival of Helitrons in the maize genome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 19922-19927 (2009))が、これらのパターンは、少なくとも部分的に宿主の種のレベルでの自然選択および遺伝的浮動により形作られている。対照的に、培養細胞において回収された新規の転移事象は、ほとんど一切の選択または浮動を受けず、従ってトランスポゾンの組み込みの選好性をより直接的に反映する。ヒトゲノム中での新規のＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移事象を特性付けるため、我々は、ＨｅＬａ細胞において回収された１７５１のＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入を生成し、マッピングし、生物情報学的に注釈を付けた。標的部位の配列ロゴ分析は、以前にコウモリおよび他の真核生物ゲノムにおける内在性Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンに関して観察されたように(Kapitonov et al. (2007); Thomas et al. (2015); Kapitonov et al. (2001)およびPritham et al. (2007))、組み込みに関する高度に好まれる部位としてのＡＴ標的ジヌクレオチド（図５Ａ）を確証した。しかし、挿入に関するＡＴジヌクレオチドの標的化は、絶対ではなかった：４６の挿入は、他の配列中に起こっており、ＴＴ、ＡＣおよびＡＡは、最も顕著な代替のジヌクレオチドであった（図５Ａ）。中心的なＡＴジヌクレオチドに加えて、我々は、実際の組み込み部位の周囲の約２０ｂｐ以内のＡＴに富むＤＮＡ配列に関する強い選好性を観察しており；この選好性は、組み込まれたトランスポゾンの３’末端に隣接する配列に対して最も顕著であった（図５Ａ）。
【０１７７】
我々は、次に、ランダムに選ばれたかまたはトランスポゾン挿入において観察される塩基組成を考慮することにより設計された（下記参照）かのどちらかである、コンピューターで生成されたゲノム部位の対照データセットに対する異なるゲノム特徴中へのＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入の相対的頻度を分析した。図５Ｂは、ＧＥＮＣＯＤＥカタログ(Harrow J, et al. GENCODE: the reference human genome annotation for The ENCODE Project. Genome research 22, 1760-1774 (2012))により定められたプロモーター領域（すなわち転写開始部位の５ｋｂ上流〜２ｋｂ下流）および遺伝子本体（それらのプロモーター領域を含まない転写単位）へのＨｅｌｒａｉｓｅｒの組み込みの、対照部位と比較したそれぞれ有意な２．５倍および１．８倍の富化を示している。両方に関して、５００の最も高度に発現される遺伝子のプロモーターにおける７．３倍の富化および本体における２．１倍の富化により証明されるように、ＨｅＬａ細胞における高度に発現される遺伝子は、より高頻度でＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入の標的となっているため、転写活性は、組み込み事象と正に相関するようである（図５Ｂ）。加えて、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒは、ＣｐＧアイランド（塩基組成を補正した対照部位を用いることによる）、ＣｐＧショア（ＣｐＧアイランドに隣接する５ｋｂの窓（ｗｉｎｄｏｗｓ）における対照部位と比較した２．６倍の富化）、エンハンサー領域（ＣＡＧＥピークに由来する(Andersson R, et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature 507, 455-461 (2014))、７．１倍の富化）、ヒストン修飾に関して富化された染色体領域Ｈ３Ｋ２７ａｃ（エンハンサー、５．６倍）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１（エンハンサー、３．８倍）、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（活性なプロモーター、３．４倍）、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３（転写される遺伝子本体、２．１倍）ならびにＤＮアーゼＩフットプリンティング、ＦＡＩＲＥおよびＣｈＩＰ−Ｓｅｑ実験により定められるようなオープンクロマチン領域（ＵＣＳＣ  Ｏｐｅｎ  Ｃｈｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈ  ｔｒａｃｋから得られた領域、１４．２倍）への組み込みに関して強い６．９倍の富化を示す。一方で、我々は、ヘテロクロマチンマークＨ３Ｋ９ｍｅ３またはＨ３Ｋ２７ｍｅ３により特性付けられる染色体領域への転移に関する選好性の明確な欠如およびラミナ会合ドメインへの挿入の有意な２．２倍の提示不足（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）(Guelen L, et al. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature 453, 948-951 (2008))を検出した（図５Ｂ）。最後に、トランスポゾン挿入部位の富化および遺伝子密度の間の相関は、存在しなかった（図５Ｃ）。
【０１７８】
転移がゲノム供与体部位から開始した場合にＨｅｌｒａｉｓｅｒがｃｉｓ連結座位中への可動化に関する選好性（しばしば多くの‘カットアンドペースト’トランスポゾンに関して見られ、‘ローカルホッピング’と呼ばれる(Carlson CM, Dupuy AJ, Fritz S, Roberg-Perez KJ, Fletcher CF, Largaespada DA. Transposon mutagenesis of the mouse germline. Genetics 165, 243-256 (2003); Fischer SE, Wienholds E, Plasterk RH. Regulated transposition of a fish transposon in the mouse germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 6759-6764 (2001); Luo G, Ivics Z, Izsvak Z, Bradley A. Chromosomal transposition of a Tc1/mariner-like element in mouse embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 10769-10773 (1998)およびTower J, Karpen GH, Craig N, Spradling AC. Preferential transposition of Drosophila P elements to nearby chromosomal sites. Genetics 133, 347-359 (1993)）を示すかどうかを試験するため、我々は、４つの同定された染色体Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ供与体部位を含有するトランスポゾン供与体細胞株を用いて、新しい染色体部位への二次転移事象を駆動するためにこれらの細胞にトランスポザーゼヘルパープラスミドを再トランスフェクションした。再転移挿入部位の分析は、元の供与体部位の周囲の新しいトランスポゾン挿入のクラスタリングを明らかにしなかった（図５Ｄ）。
【０１７９】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ挿入部位の分析
我々は、１７５１の独立した組み込み事象を同定した。統計分析に関して、我々は、２つの異なる背景モデルに従ってランダムに選択されたゲノム部位のセットを作製した。モデル（‘ランダム’）は、ＨｅＬａ細胞の異常な核型と比較して正常化されている。第２モデル（‘対照’）は、配列決定の読みのマッピング可能性（ｍａｐｐａｂｉｌｉｔｙ）も説明しており、組み込み部位における塩基組成を模倣している。ＨｅＬａ細胞の核型を決定するため、我々は、Ｂｒｏａｄ／ＭＧＨ  ＥＮＣＯＤＥ群により生成されたＣｈＩＰ−Ｓｅｑ入力データセットを用いた。これらのデータセットは、特異的に結合する抗体の適用なしで生成されたため、読みの密度は、基礎となるゲノム領域の相対的コピー数に関する推定値として用いられることができる。ＨｅＬａ細胞に関する、ならびに正常な核型を有する１２の他の細胞型に関する２つの生物学的複製のマッピングされた配列決定の読みは、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのウェブサイト(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db=hg19&g=wgEncodeBroadHistone)からダウンロードされた。我々は、ＨｅＬａ細胞および正常細胞のそれぞれのデータセット対に関して、それぞれが正常細胞のデータセットからの１０００の連続する読みをカバーするスライディングウィンドウ中の読みの計数の倍率変化を計算した。結果として得られた倍率変化は、ＨｅＬａ細胞の仮定された平均倍数性（すなわち３）を掛けられ、正常細胞の倍数性（すなわち、非性染色体に関して２、ならびに対照細胞データセットの性別に応じてＸ染色体およびＹ染色体）で割られ、次いで窓サイズ３００００の移動メジアンフィルターで均され（ｓｍｏｏｔｈｅｄ）、最後に最も近い整数値へと丸められた。次いで、ＨｅＬａ細胞および正常細胞のデータセットの全ての対からの結果は、中央値を計算することにより結び付けられた。正常細胞由来のデータに対して試験され、その方法は、正常な核型を正確に予測した（データは示されていない）。‘ランダムな’バックグラウンドモデルに関して、我々は、ゲノム中の５０００００のランダムな位置を、ゲノム位置を選択する確率がその染色体断片の倍数性に比例する方式で標本抽出した。‘対照の’バックグラウンドモデルは、以下のように生成された。まず、我々は、１億のランダムなゲノム位置を、ゲノム位置を選択する確率がその染色体断片の倍数性に比例する方式で標本抽出した。これらの位置から、我々は、トランスポゾン組み込み部位にマッピングされた実際の配列決定の読みと同じ長さの分布を有するモックの配列決定の読みを標本抽出した。次いで、そのモックの読みが、前記の配列決定の読みのように処理された。結果として得られたモックの部位が、組み込み部位における塩基組成に由来する位置特異的重み行列（ＰＷＭ）を用いて採点された（図５Ａ）。モックの部位から、我々は、１００，０００の対照部位を、それらのＰＷＭスコア分布が実際の組み込み部位のＰＷＭスコア分布に似るような方式で標本抽出した。遺伝子発現レベル、ヒストン修飾およびクロマチン接近可能性、ならびにＣｐＧ島のゲノム位置およびラミナ会合ドメインに関する情報は、ＵＣＳＣ(http://genome.ucsc.edu)からダウンロードされた。オープンクロマチン領域は、ＤＮアーゼＩ  ＨＳデータ、ＦＡＩＲＥデータおよびＣｈＩＰデータから得られ、検証された領域は、ＵＣＳＣ  Ｏｐｅｎ  Ｃｈｒｏｍ  Ｓｙｎｔｈ  ｔｒａｃｋ、リリース２（２０１２年２月）から得られた。
【０１８０】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒによる遺伝子捕捉
図３Ａにおいて示されている我々の結果は、たとえＲＴＳ全体が失われていても一部の転移が起こり得ることを実証した。これは、何の配列決定因子が可動化されたＤＮＡ分節の３’末端を定めるのかという疑問を提起する。
【０１８１】
ｐＨｅｌＲ、ｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳにより生成された挿入部位のＤＮＡ配列決定は、３種類のトランスポゾン全てに関するＬＴＳ  ５’−ＴＣ配列のゲノム標的部位におけるＡヌクレオチドへの正準的接合を明らかにし、これは、これらの組み込み体が、実際にはＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼに媒介される産物であったことを示している。ＲＴＳ−ゲノム接合部の配列分析は、ｐＨｅｌＲに関するＴヌクレオチドに隣接する正準的ＣＴＡＧ−３’配列を明らかにした（図６Ａ；挿入図“Ｈ１−２”）。対照的に、ｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳベクターにより生成された一部の挿入は、３つの異なるゲノム標的部位においてＴヌクレオチドのすぐ隣りに挿入されたＣＴＴＧ−３’テトラヌクレオチド（トウモロコシＨｅｌｉｔｒｏｎでも見られる（Dong et al. (2011)）で終わっていた（図６Ａ；赤で示されている）。新規のトランスポゾン末端は内部的にＳＶ４０ポリＡ配列の開始点から６ｂｐ下流に位置するため、これらのトランスポゾン挿入は、元のトランスポゾン配列の切断を表していた。加えて、ＨｅｌＲΔＨＰおよびＨｅｌＲΔＲＴＳにより生成された２つの挿入は、それぞれＣＴＡＣ−３’およびＡＡＴＧ−３’で終わっていた（図６Ａ；緑で示されている）。これらの事象は、代替のトランスポゾンＲＴＳに相当する独特の外部配列が転移に利用されている３’導入事象であると考えられ得る。両方の場合において、トランスポゾンＲＴＳ中の最後の２ヌクレオチドが、ゲノムＨｅＬａ標的部位における最初の２ヌクレオチドと重複しており（ＩＳ９１要素の一末端（ｏｎｅ−ｅｎｄｅｄ）転移でも見られる(Mendiola et al. (1994)）、実際のＲＴＳの正確な同定を不可能にしている。以前の観察(Han et al. (2013))と一致して、新規のＲＴＳに相当するその５つの配列のいずれも、最後の３０ｂｐ内に同定可能な回文構造を含有していなかった（データは示されていない）。
【０１８２】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移の間に生じる３’導入事象の頻度および程度をさらに調べるため、我々は、ＳＶ４０−ｎｅｏ−ポリＡ選択カセットをｐＨｅｌＲおよびｐＨｅｌＲΔＨＰベクター中にトランスポゾンＲＴＳのすぐ下流に導入した（それぞれｐｕｒｏおよびｎｅｏに関して“ｐＨｅｌＲｐｎ”および“ｐＨｅｌＲΔＨＰｐｎ”と新たに命名された；図６Ｂ）。この方法で、ｎｅｏカセット全体を捕捉する読み過ごし事象が、定量化されることができる。図６Ｂにおいて示されているように、完全なＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンは、転移事象の約１１．７％において隣接するＤＮＡ配列を捕捉するようである。対照的に、転移の全体的な頻度は、より低いが、ｐＨｅｌＲΔＨＰｐｎで生じた転移事象の少なくとも３６％が、結果としてトランスポゾンの下流の１．６ｋｂのｎｅｏカセット全体の転移をもたらした。この実験設定は、それが１．６ｋｂのｎｅｏカセット全体の捕捉を必要とするため、おそらく３’導入の頻度の過小な見積もりを与えた。
【０１８３】
ミオティスゲノムにおけるＨｅｌｉｔｒｏｎ３’末端の多様化
上記の実験は、回文構造またはＲＴＳの欠失により生じた未成熟な切り詰めおよび読み過ごし事象が、新規の３’末端の生成をもたらすことを実証した。そのような事象がインビボでも起っていたかどうかを調べるため、我々は、最近活性なＨｅｌｉｂａｔＮ５４１、ＨｅｌｉｂａｔＮ５４２およびＨｅｌｉｂａｔＮ５８０サブファミリーの３９５コピー（それぞれ２６、３３９および３０コピー）を分析し、新規の３’末端を有する（コンセンサスの最後の３０ｂｐと比較して２０％を超えて逸脱していた）３９の標本を見付けた（表１）。これらの標本は、おそらく１）予め存在している５’を切断されたＨｅｌｉｔｒｏｎに隣接する挿入（図１１Ａ）、２）１つのＨｅｌｉｔｒｏｎの５’末端が他のＨｅｌｉｔｒｏｎの３’末端に隣接する、別のＨｅｌｉｔｒｏｎのすぐ隣りへの挿入（図１１Ｂ）、および３）３’末端の最後の３０ｂｐ以内での欠失または変異（図１１Ｃ）により生成された。空の部位の証拠は、これらが実際に本物の挿入事象であることを示唆している（図１１Ｄ）。最も興味深いことには、ｐＨｅｌＲΔＨＰトランスポゾンの挿入＃２（図６Ａ）に類似して、我々は、新規の３’末端が回文構造を欠くＲＴＳ中のＣＴＡＧ−３’配列の迂回を通して生成された１つの標本を同定した（図１１Ｅ）。従って、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移における３’末端の迂回および結果としてもたらされる新規のトランスポゾン末端の出現（図６Ａ、Ｂ）は、天然のプロセスを忠実に再現している。
【０１８４】
ミオティスゲノム中の最近活性なＨｅｌｉｔｒｏｎの３’末端の分析
配列決定されたゲノム中のＨｅｌｉｔｒｏｎによる新規の末端の獲得のパターンを理解するため、我々は、ミオティス系列における３つのＨｅｌｉｂａｔ標本のコピー（ＨｅｌｉｂａｔＮ５４１、ＨｅｌｉｂａｔＮ５４２およびＨｅｌｉｂａｔＮ５８０）を分析した。そのコピーは、最近活性であり（コンセンサスに対して９８〜９９％同一）、それは、どのように配列のサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）が解釈されるかに対する選択の影響を最小限にする。ＨｅｌｉｂａｔＮ５４１コピーは、Ｍ．ルシフガス系列に特有であり（Thomas et al. (2014)）、ＨｅｌｉｂａｔＮ５８０コピーは、Ｍ．ブランデティ系列に特有であり、ＨｅｌｉｂａｔＮ５４２コピーは、両方の系列において見られる。コンセンサスに対して９８〜９９％同一であるＨｅｌｉｂａｔ標本のコピー（ＨｅｌｉｂａｔＮ５４１およびＨｅｌｉｂａｔＮ５８０）が、それらのそれぞれのゲノムから抽出された。コンセンサスに対して９５％を超えて同一であり、完全な５’末端を有するＨｅｌｉｂａｔＮ５４２のコピーが、Ｍ．ルシフガスのゲノムから抽出された。ＨｅｌｉｂａｔＮ５４２のコピーは、比較的古いため、我々は、異なるカットオフを用いた。それぞれのコピーの最後の３０ｂｐが、それらのそれぞれのコンセンサスに対してＭＵＳＣＬＥ（Edgar RC. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res 32, 1792-1797 (2004)）を用いてアラインメントされた。コンセンサスから２０％を超えて逸脱した末端または整列しない（新規の）末端を有するコピーは、３’末端の起源および進化への洞察を得るために、相同性ベースのツール（ＢＬＡＳＴツール(Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403-410 (1990)）を用いて注意深く分析された。我々は、偽陽性を排除するために他のコウモリの全ゲノム配列を用いる比較ゲノム解析アプローチも用いた。例えば、あるコウモリゲノム中のコピーが新規の３’末端を有し、かつオルソロガスなコピーがコンセンサスに相同な末端を有する場合、それらの変化は、挿入後に起こったと推定された。加えて、空の部位（挿入のない部位）が、要素の境界を確証するために用いられた。
【０１８５】
ＨｅｌｉｂａｔＮ３トランスポゾンによる新規のキメラ転写産物の新規生成
Ｍ．ルシフガスゲノムにおいて、１５の異なる遺伝子からのプロモーター配列が、Ｈｅｌｉｔｒｏｎにより捕捉され、４６９０コピーまで増幅された(Thomas et al. (2014))。例えば、ＨｅｌｉｂａｔＮ３サブファミリーは、ゲノム捕捉事象から進化し、ここで、転移する要素は、プロモーター、ＮＵＢＰＬのＮ末端の６アミノ酸に関するコード配列およびスプライス供与（ＳＤ）配列を含有するＮＵＢＰＬ（ヌクレオチド結合タンパク質様）遺伝子の断片を拾い上げた［図６Ｃ（ｉ）］(Pritham et al. (2007))。従って、ＨｅｌｉｂａｔＮ３要素が遺伝子のイントロン中に正しい方向で飛び込んだ場合、それは、トランスポゾン中のＳＤ配列および最も近い下流のスプライス受容配列（ＳＡ）の間でのスプライシングによりその遺伝子のＮ末端を切断された派生物を異所性に発現する能力を有するであろう（図６Ｃ）。
【０１８６】
転写的エキソン捕捉事象を実証するため、我々は、選択可能なｐｕｒｏ抗生物質耐性遺伝子をＮＵＢＰＬプロモーターおよびＳＤの間に挿入し［図６Ｃ（ｉｉ）］、このトランスポゾンをＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼにより可動化してＨｅＬａ細胞のゲノムに入れた。ピューロマイシン耐性細胞から調製されたｃＤＮＡの配列分析は、トランスポゾンに含有されるＳＤおよびヒト転写産物中に存在するＳＡ部位の間でのスプライシングを明らかにした。これらのデータは、トランスポゾン挿入の下流のエキソン配列の捕捉を示した（図６Ｃ）。さらに、我々は、ＳＤが明らかに非コードＲＮＡ中の潜在性スプライス部位に対してスプライシングされ、結果として非コード遺伝情報のエキソン化をもたらしたキメラ転写産物も発見した（図６Ｃ）。
【０１８７】
Ｍ．ブランデティにおけるＮＵＢＰＬに駆動される転写産物およびそれらの遺伝子
上記のデータは、ＨｅｌｉｂａｔＮ３要素がＨｅＬａ細胞において実験的に可動化された際に強力なエキソントラップとして作用することを示唆している。内在性Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移のインビボで新規の転写産物を生成する能力を実証するため、我々は、コウモリ（ミオティス・ブランデティ）におけるＨｅｌｉｔｒｏｎに捕捉されたＮＵＢＰＬプロモーターに駆動される転写産物に注釈を付けた。我々は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎに捕捉されたＮＵＢＰＬプロモーターの挿入は、２３の注釈を付けられた遺伝子に関して少なくとも１個の注釈を付けられた転写開始部位（ＴＳＳ）の１ｋｂ上流の範囲内に存在することを見出し；これらの挿入は、合計４６の転写産物を駆動すると予想され［ＦＰＫＭ（マッピングされた１００万の断片あたりのエキソン１キロ塩基あたりの断片）＞０．５］、その内の３つは、挿入により供給されたＴＳＳを有する（表２）。４６の転写産物の内の４は、コードしていると予測され、それらの親遺伝子とは対照的に、４６の転写産物の内の３５は、試験された組織においていくらかの組織特異性を示している（その組織においてのみＦＰＫＭ＞０．５）（表２）。
【０１８８】
それに関して予測されたＴＳＳがＨｅｌｉｔｒｏｎ挿入と重複していたそれらの候補となるＮＵＢＰＬに駆動される転写産物は、本物のＮＵＢＰＬに駆動される転写産物であると考えられた。３つの転写産物が、この基準を満たし、遺伝子ＲＩＮＴ１（図１２Ａ）、ＡＲＭＣ９（図１２Ｂ）、およびＲＮＦ１０（図１２Ｃ）が関係していることを示した。これらの内で、ＲＩＮＴ１（腎臓）およびＲＮＦ１０（調べられた組織において構成的に発現されていた）転写産物は、コードしており（完全なオープンリーディングフレームが存在する）、ＡＲＭＣ９（脳）は、コードしていないと予測された（表２）。まとめると、Ｈｅｌｉｔｒｏｎは、転写レベルで遺伝的新規性に影響を及ぼし、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒは、この生物学的現象を忠実に再現することができる。
【０１８９】
ＮＵＢＰＬプロモーターに駆動される融合転写産物の検出
ピューロマイシン耐性ＨｅＬａコロニーから精製された５００ｎｇの総ＲＮＡが、Ｍａｘｉｍａ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびオリゴｄＴプライマーを５０℃で３０分間用いて逆転写された。熱不活性化後、逆転写反応が、繰り返された。ＲＮＡは、５分の１の体積の１Ｎ  ＮａＯＨおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡを６５℃で１５分間用いて加水分解された。ｃＤＮＡは、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製され、２μｌの溶離物が、以下の条件：９５℃で１分、４０サイクルの（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、２サイクルの（９４℃で３０秒間、２５℃で１分間、７２℃まで０．２℃／秒でランプ、７２℃で１分間）でのＨｅｌｉｔｒｏｎベクター配列に特異的なプライマーＰｕｒｏ１およびヒトトランスクリプトーム全体における高提示に関してコンピューターで予測された４塩基長の半特異的プライマーを用いる６つの独立したＰＣＲ増幅に関して用いられた。第１ＰＣＲ反応は、以下の条件：１０回の上位サイクルの［３サイクルの（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）、１サイクルの（９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４０秒間）］でのその後の非対称ＰＣＲ反応を実施するためにベクター特異的オリゴＰｕｒｏ２を含有する２５μｌのＰＣＲマスター混合物を補われた。ＰＣＲ産物は、カラム精製され、３０μｌの溶離物の内の２μｌが、トランスポゾン特異的オリゴＴ２ａ＿ＳＤ＿ｂｃおよび半特異的プライマーのオーバーハングに特異的なＰＥ＿ｆｉｒｓｔを用いる第１指数関数的ＰＣＲのために用いられた。ＰＣＲ産物は、精製され、ｐＧＥＭ−Ｔベクターシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＴＡ−クローニングされ、配列決定された。融合転写産物は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾン内のスプライス供与部位に続く配列をＵＣＳＣゲノムブラウザのＢＬＡＴツールを用いてアラインメントすることにより決定された。
【０１９０】
Ｍ．ブランデティのゲノムにおけるＨｅｌｉｔｒｏｎの注釈付け（座標、おおよその年齢、および相対的方向）
Ｈｅｌｉｔｒｏｎの挿入が、Ｍ．ブランデティのゲノムアセンブリ（ＫＥ１６１０３４−ＫＥ３３２３７６、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）におけるＧｅｎＢａｎｋからの１７１３４３スキャフォールド(Seim I, et al. Genome analysis reveals insights into physiology and longevity of the Brandt's bat Myotis brandtii. Nature communications 4, 2212 (2013)))において以前に記載された５ミオティス特異的Ｈｅｌｉｔｒｏｎリピートライブラリーを用いて同定された(RepeatMasker v.4.0.5 http://www.repeatmasker.org)。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ挿入の保存は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ  ＤＮＡ配列＋２００ｂｐの隣接する配列を得て、ＮＣＢＩ  ｗｇｓデータベースのｂｌａｓｔｎクエリーを実施してその挿入が他の配列決定されたヒナコウモリ科（Ｖｅｓｐｅｒｔｉｌｉｏｎｉｄａｅ）のコウモリ（Ｅ．フスクス、Ｍ．ルシフガスおよびＭ．ブランデティ）中に存在するかどうかを決定することにより決定された。所与の種においてクエリー配列の全長に対するヒットが存在した場合、それは、その種に存在する（保存されている）と考えられた。Ｈｅｌｉｔｒｏｎに対するヒットのみが存在した、またはヒットしなかった場合、それは、存在しないと考えられた。この情報をそのコウモリの既知の分岐時間と組み合わせることにより、我々は、それぞれの挿入に関するおおよその年齢を得た。遺伝子モデル中に挿入しているＨｅｌｉｔｒｏｎの方向において偏りが存在するかどうかを決定するため、我々は、以前に記載されたパイプライン(Kapusta A, et al. Transposable elements are major contributors to the origin, diversification, and regulation of vertebrate long noncoding RNAs. PLoS genetics 9, e1003470 (2013))を用いて、イントロン、エキソンと重複しているか、または注釈を付けられた遺伝子モデルの１ｋｂ上流もしくは下流の領域中にあるかのいずれかであるＨｅｌｉｔｒｏｎを同定した。それらの標的遺伝子と同じ方向および逆方向で挿入されているＨｅｌｉｔｒｏｎの両方が、定量化され、両側２標本Ｔ検定を用いて比較された（α＝０．０５）。
【０１９１】
Ｍ．ブランデティトランスクリプトームアセンブリ、オルタナティブスプライシング分析、存在度の概算、および遺伝子割り当て
高いカバー度を有する数多くの高品質な方向性ＲＮＡ−ｓｅｑが、公的に利用可能であり、ゲノムが、約２０００のＨｅｌｉｔｒｏｎに捕捉されたＮＵＢＰＬの挿入を含有するため、Ｍ．ブランデティが、これらの分析のために用いられた。Ｍ．ブランデティの腎臓、肝臓および脳組織からのＩｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−ｓｅｑの読み（２００ｂｐ、対）（ＳＲＡ０６１１４０）(Seim et al. (2013))が、プールされ、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ(Lohse M, et al. RobiNA: a user-friendly, integrated software solution for RNA-Seq-based transcriptomics. Nucleic Acids Res 40, W622-627 (2012))を用いて品質でトリミングされ、Ｔｒｉｎｉｔｙ（ｒ２０１４０４１３(Grabherr MG, et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature biotechnology 29, 644-652 (2011))）を用いて（新規で、およびゲノムに導かれて）組み立てられ、Ｔｒｉｎｉｔｙ（ｒ２０１４０４１３(Grabherr MG, et al. and Haas BJ, et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature protocols 8, 1494-1512 (2013))を用いて（新規で、およびゲノムに導かれて）組み立てられた。２つの分析からの結果として得られたアセンブリは、組み合わせられ、オルタナティブスプライシング分析が、スプライシングされたアラインメントを組み立てるためのプログラム（Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）（ＰＡＳＡ＿ｒ２０１４０４１７）(Haas BJ, et al. Improving the Arabidopsis genome annotation using maximal transcript alignment assemblies. Nucleic Acids Res 31, 5654-5666 (2003) and Campbell MA, Haas BJ, Hamilton JP, Mount SM, Buell CR. Comprehensive analysis of alternative splicing in rice and comparative analyses with Arabidopsis. BMC genomics 7, 327 (2006))を用いて実施された。それぞれの転写産物の相対的存在度（ＦＰＫＭ）が、期待値最大化によるＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｂｙ  Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ−Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）（ＲＳＥＭ；ｖ．１．２．１２）(Li B, Dewey CN. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC bioinformatics 12, 323 (2011))を用いて決定された。スプライシング情報（および従って方向性の情報）を欠いている、ＦＰＫＭ＜０．５の存在度である、そして合計の長さが２００ｂｐ未満である転写産物は、アセンブリから除外され、結果として最終的なＭ．ブランデティのトランスクリプトームアセンブリをもたらした。スプライシング情報（および従って方向性の情報）を欠いている、ＦＰＫＭ＜０．５の存在度である、そして合計の長さが２００ｂｐ未満である転写産物は、アセンブリから除外され、結果として最終的なＭ．ブランデティのトランスクリプトームアセンブリをもたらした。転写産物は、ゲノム座標を最新のゲノム注釈と交差させる（ｉｎｔｅｒｓｅｃｔ）（Ｂｅｄｔｏｏｌｓ；ｖ．２．２２．１(Quinlan AR, Hall IM. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics (Oxford, England) 26, 841-842 (2010)）ことにより、そしてＢＬＡＳＴを用いてその遺伝子の既知の転写産物に対する相同性を検証することにより遺伝子に割り当てられた。それぞれの転写産物に関するコードしている可能性が、１００アミノ酸より大きい予測されるＯＲＦを有するものとして決定された(Haas et al. (2013))。それぞれの転写産物に関する組織特異性��、決定され、転写産物は、３つの調べられた組織の内の１つまたは２つにおいてのみＦＰＫＭ値が０．５より大きい場合に、組織特異的であると考えられた。
【０１９２】
Ｍ．ブランデティにおけるＨｅｌｉｔｒｏｎに捕捉されたＮＵＢＰＬプロモーター（ＮＵＢＰＬ−ＨＣＰ）に駆動される転写産物の同定
捕捉されたＮＵＢＰＬプロモーターを含有するＨｅｌｉｔｒｏｎのゲノム座標が、組み立てられた転写産物の座標と交差させられた。我々は、転写産物が検出可能であること（ＦＰＫＭ＞０．５）、それが鎖特異性を有すること、そしてＮＵＢＰＬプロモーター自体がＴＳＳ(Andersson et al. (2014))の上流１ｋｂ以内であることを確実にするために、ストリンジェントな基準を用いた。ＮＵＢＰＬプロモーターを含有するＨｅｌｉｔｒｏｎが位置する転写産物は、候補となるＮＵＢＰＬ−ＨＣＰに駆動される転写産物として分類された。ＴＳＳがＮＵＢＰＬプロモーターを含有するＨｅｌｉｔｒｏｎにより提供される転写産物は、本物であることが証明されたＮＵＢＰＬ−ＨＣＰに駆動される転写産物であると考えられた。Ｈｅｌｉｔｒｏｎにより駆動されると推定される少なくとも１つの転写産物を有する遺伝子は、ＧＯターム分析富化分析（ＧＯ  Ｔｅｒｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）中に含められ、タームは、それらのｐ値が０．０５未満である場合、有意であると考えられた(Mi H, Muruganujan A, Thomas PD. PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees. Nucleic Acids Res 41, D377-386 (2013)およびAshburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nature genetics 25, 25-29 (2000))。ＦＰＫＭ＞０．５を有する転写産物のＴＳＳの１ｋｂ以内のそれぞれのＮＵＢＰＬプロモーターは、プロモーターモチーフ、例えばＴＡＴＡ、ＣＡＡＴ、およびＧＣボックス、ならびに予測される転写因子（ＴＦ）結合部位に関してＧＰＭｉｎｅｒ(Lee TY, Chang WC, Hsu JB, Chang TH, Shien DM. GPMiner: an integrated system for mining combinatorial cis-regulatory elements in mammalian gene group. BMC genomics 13 Suppl 1, S3 (2012))を用いて分析された。
【０１９３】
Ｍ．ブランデティにおける転写開始部位（ＴＳＳ）に対して＋／−１ｋｂの領域におけるＨｅｌｉｔｒｏｎの富化／枯渇の決定
Ｍ．ブランデティ遺伝子のＴＳＳを中心とした２ｋｂの区間に対応する座標を得るために、我々は、我々のＭ．ブランデティ遺伝子アセンブリからＴＳＳに関する−１ｋｂおよび＋１ｋｂに関する座標を抽出した。次いで、我々は、これらの座標をＢｅｄｔｏｏｌｓを用いてＭ．ブランデティにおける既知のＨｅｌｉｔｒｏｎ挿入の座標（ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ、上記参照）と交差させ、フィッシャーの正確確率検定（α＝０．０５）(Quinlan et al. (2010))により富化または枯渇を決定した。結果は、両側ｐ値が０．０５未満である場合に有意であると考えられ、有意性の方向（富化されたか枯渇したか）が、適切な片側検定のｐ値により決定された。
【０１９４】
論考
コウモリＭ．ルシフガスのゲノムからの活性なＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンが、復活させられ、この新規のトランスポゾンＨｅｌｒａｉｓｅｒが、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移の機序およびゲノム的影響を探求するために用いられてきた。
【０１９５】
他のＨＵＨヌクレアーゼドメインの既知の特性(Chandler et al. (2013))と一致して、ヌクレアーゼ活性は、インビトロでＨｅｌｒａｉｓｅｒのＬＴＳおよびＲＴＳに由来するｓｓＤＮＡ断片に対してのみ検出された。これは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒが切断に利用可能なｓｓＤＮＡを作るために何らかの細胞プロセスに頼っていることを示している可能性がある。例えば、ＨＵＨヌクレアーゼをコードする十分に特性付けられた原核生物性トランスポザーゼであるＩＳ６０８の転移は、ｓｓＤＮＡを生成するためにラギング鎖ＤＮＡ複製に依存している(Ton-Hoang B, Guynet C, Ronning DR, Cointin-Marty B, Dyda F, Chandler M. Transposition of ISHp608, member of an unusual family of bacterial insertion sequences. EMBO J 24, 3325-3338 (2005) and Ton-Hoang B, et al. Single-stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell 142, 398-408 (2010))。あるいは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移の最初の段階に必要なｓｓＤＮＡは、ＡＴに富む領域においてｄｓＤＮＡの局所的な融解を誘導することが示されている負のスーパーコイル形成により利用可能になり得る(Dayn A, Malkhosyan S, Mirkin SM. Transcriptionally driven cruciform formation in vivo. Nucleic Acids Res 20, 5991-5997 (1992); Krasilnikov AS, Podtelezhnikov A, Vologodskii A, Mirkin SM. Large-scale effects of transcriptional DNA supercoiling in vivo. J Mol Biol 292, 1149-1160 (1999)およびStrick TR, Allemand JF, Bensimon D, Croquette V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical journal 74, 2016-2028 (1998))。真核細胞において、ＤＮＡの負のスーパーコイル形成は、転写複合体の上流で起こり(Liu LF, Wang JC. Supercoiling of the DNA template during transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 84, 7024-7027 (1987)およびRahmouni AR, Wells RD. Direct evidence for the effect of transcription on local DNA supercoiling in vivo. J Mol Biol 223, 131-144 (1992))、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移に必要な一本鎖のパッチを生成し得る(Parsa JY, et al. Negative supercoiling creates single-stranded patches of DNA that are substrates for AID-mediated mutagenesis. PLoS genetics 8, e1002518 (2012))。さらに、ＡＴに富む領域は、局所的なＤＮＡの融解を促進する可能性があり、おそらくそれは、コンセンサスＬＴＳが切断部位付近にＡＴに富む領域を含有する（図８）ことと偶然一致したわけではない。ＨｅｌｒａｉｓｅｒのヘリカーゼドメインおよびＰｉｆ１の間の相同性（図１０Ａ）ならびに転移に関するヘリカーゼ機能の決定的な必要性（図２）は、両方とも、ヘリカーゼドメインの役割が、一度トランスポゾン末端においてｓｓＤＮＡが生成したらＤＮＡをｓｓＤＮＡ−ｄｓＤＮＡ接合部において解くことである、というモデルを支持する。
【０１９６】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移が環状中間体を通して進行することを示唆するデータは、他の既知の真核生物ＤＮＡトランスポゾンと比較した際に、決定的な違いを明らかにする。Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移は、一部のｓｓＤＮＡベースの原核生物性転移系(del Pilar Garcillan-Barcia et al. (2001))と、または特定のｓｓＤＮＡウイルス複製プロセス(Faurez F, Dory D, Grasland B, Jestin A. Replication of porcine circoviruses. Virology journal 6, 60 (2009))と機序的に関連している可能性がある。転移がゲノム供与体座位から開始した場合のトランスポゾン挿入の局所的ホッピングおよびランダム分布の欠如（図５）は、エピソーム性転移中間体の考えを強く支持する。
【０１９７】
以下の観察は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転移の修正されたローリングサークルモデルと一致する：１）Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ転移は、ＬＴＳを必要とするが、ＲＴＳは、厳密には必要ではない（図３）、２）ヘアピンは、その削除またはＲＴＳ全体の削除が転移に対して類似の作用を有するため、ＲＴＳの最も重要な構成要素であるようである（図３）、そして３）トランスポゾンの切断およびＲＴＳに隣接する配列の伝達の両方が、エキソビボで起こり、これらの非正準的転移事象の頻度は、ヘアピンが削除されている場合に有意に増大する（図６）。まとめると、データは、ＲＴＳ中のヘアピン構造は、転移終結シグナルの役目を果たすことによりＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移において重要な制御的役割を果たすことを示唆している。我々の観察は、トランスポゾンに隣接するＤＮＡ配列を捕捉する“読み過ごし”モデルを支持する：ヘアピンがＲＴＳから失われている、または転移機構により認識されない場合、トランスポザーゼは、トランスポゾンの３’末端を迂回し、さらに下流の代わりの転移終結因子配列を見付け、結果として隣接する宿主配列の伝達をもたらす(Feschotte et al. (2001) (図７))。
【０１９８】
ＲＴＳの比較的緩い機能的定義が、なぜＨｅｌｉｔｒｏｎは効率的に下流の宿主ゲノム配列を伝達することができるかの中核的な理由である可能性が最も高い。遺伝子捕捉は、新規のＨｅｌｉｔｒｏｎファミリーの出現および多様化に、そして新規の細胞転写産物の生成に寄与している可能性がある。例えば、捕捉されたＮＵＢＰＬ遺伝子断片は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼにより可動化されてヒト細胞のゲノム中に入った場合、強いられた転写およびスプライシングにより新規のコードおよび非コード転写産物をもたらす（図６Ｃ）。細胞遺伝子の転写を駆動するいくつかのＨｅｌｉｂａｔ挿入が、同定され（表２）、ＮＵＢＰＬ挿入内で開始する転写産物が、同定された。これらの本物のＮＵＢＰＬに駆動される転写産物の全ては、エキソビボでのＨｅｌｒａｉｓｅｒに触媒される挿入の一部で見られるように（図６Ｃ）、Ｎ末端が切断されており、エキソン化された非コード配列を有し、結果として新規の５’−ＵＴＲをもたらしている頻度が最も高かった（図１２および表２）。
【０１９９】
ＴＥは、数百万年の間ゲノムの構造および機能を形作っており、それらの宿主の進化の軌道に強い影響を及ぼしてきた（Feschotte C. Transposable elements and the evolution of regulatory networks. Nature reviews Genetics 9, 397-405 (2008)において総説されている）。代替のプロモーター、エンハンサー要素、ポリアデニル化シグナルおよびスプライス部位を提供することが記述されている最も顕著な因子は、レトロトランスポゾンである。加えて、コメゲノムにおいて、約１０００の細胞性遺伝子断片が、カットアンドペーストＰａｃｋ−ＭＵＬＥ  ＤＮＡトランスポゾンにより捕捉されていたことが示されており、これは、これらのトランスポゾンが植物における遺伝子の進化において重要な役割を果たしていた可能性があることを示唆している(Jiang N, Bao Z, Zhang X, Eddy SR, Wessler SR. Pack-MULE transposable elements mediate gene evolution in plants. Nature 431, 569-573 (2004))。Ｈｅｌｉｔｒｏｎは、ゲノムのバリエーションを生成する深い（ｐｒｏｆｏｕｎｄ）可能性も有するようである。実際、トウモロコシＨｅｌｉｔｒｏｎの約６０％は、捕捉された遺伝子断片を有することが分かっており、それはＨｅｌｉｔｒｏｎ転移によりトウモロコシゲノムにわたってばら撒かれた合計数万の遺伝子断片になっていた(Yang et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 19922-19927 (2009))。最も捕捉された遺伝子断片は、明らかにトウモロコシにおけるランダム浮動を経ているが、それらの約４％は、純化選択の下にあると推定され、これは、宿主に関する有益な作用を示唆している。従って、３’導入およびその後のコピーアンドペースト転移による捕捉された遺伝子断片または遺伝的全体のゲノム全体へのばら撒きの分子機序は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎを広く届く生物学的結果を有する強力なゲノムシャッフリング因子として独特に位置付けている。
【０２００】
実施例２：ゲノム内容物を増幅するためのＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼの使用
ＨｅｌＲａｉｓｅｒは、複製のためにコピーアンドペースト機序を使用し、真核細胞において作動する最初のトランスポゾンである。このトランスポゾンの分子生物学ツールとしての１つの魅力的な適用は、多コピーの目的遺伝子またはゲノム領域を含有する細胞株が作製されるようなゲノム内容物の増幅である。これを例示するため、ＨｅｌＲａｉｓｅｒ末端配列（ＬＴＳおよびＲＴＳ）に隣接する“モデル遺伝子”（ＴｕｒｂｏＧＦＰ）の定められた単一コピーの組み込みを有する細胞株が、出発点として用いられた。次いで、これらの細胞は、ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼを導入され、ＴｕｒｂｏＧＦＰがコピーアンドペースト機序により置き換えられたかどうかに関して評価された。
【０２０１】
定められたコピー数のＬＴＳ−ＥＦ１Ａ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ−ＲＴＳを有する細胞株を生成するため、供与体（ここではＬＴＳ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ−ＲＴＳ）がＴｉａ１Ｌと呼ばれる一般的ｇＲＮＡ認識部位に隣接しているインサイチュライゲーションアプローチが、用いられた（ｇＲＮＡ配列：ＧＧＴＡＴＧＴＣＧＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＣ；ｇＲＮＡ認識部位：ＧＧＴＡＴＧＴＣＧＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧ、ＰＡＭ配列に下線が引かれている）。このアプローチの詳細な記載が、最近公開されている（Lackner, D.H. et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat. Commun. 6:10237 doi: 10.1038/ncomms10237 (2015)）。タグ付けカセットは、ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポゾンからの末端配列（ＬＴＳおよびＲＴＳ）を包含しているＴｉａ１Ｌ部位を含有する。ＴｕｒｂｏＧＦＰは、ＥＦ１Ａプロモーターから発現され、ポリアデニル化カセットが後に続いている（図１３Ａ）。
【０２０２】
ＨＥＫ２９３細胞が、電気穿孔法によりＣａｓ９、ＡＡＶＳ１セーフハーバー座位を標的とするｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ配列：ＧＴＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴＡＧ）および上記のタグ付けカセットをトランスフェクションされた。このカセットは、Ｕ６プロモーターからＴｉａ１Ｌ  ｇＲＮＡも発現することを特筆する。ＡＡＶＳ１座位の切断は、タグ付けプラスミドのＴｉａ１Ｌ切断により遊離したタグ付けカセットの挿入を誘発するであろう。次に、ＴｕｒｂｏＧＦＰを発現している単一細胞クローンが、ＦＡＣＳ選別により得られた。クローンは、カセットのゲノムとの５’または３’接合部のどちらかを増幅する二重戦略により遺伝子型決定された：
５’接合部のＰＣＲに関するプライマー対ＡＡＶＳ１−ＥＦ１Ａ
順方向：ＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＡ、逆方向：ＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧ
３’接合部のＰＣＲに関するプライマー対ＴｕｒｂｏＧＦＰ−ＡＡＶＳ１
順方向：ＡＧＧＡＧＧＡＴＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣ、逆方向：ＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＡＧＡＣ
上記の遺伝子型決定ＰＣＲの両方が陽性であるいくつかのクローン細胞株が、得られた。ＡＡＶＳ１座位におけるタグ付けカセットの組み込みを疑いの余地なく確証するために、これらの内の選ばれたものが、サンガー配列決定によっても分析された（図１３Ｂ）。
【０２０３】
次に、タグ付けカセットを有する単一細胞クローンが、ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析された。ｄｄＰＣＲは、細胞内の所与の座位のコピー数を決定するための強力な方法である。この目的のため、それぞれのクローンからの５０ｎｇのゲノムＤＮＡが、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ２ＸｄｄＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（２０μｌの総反応体積）に、ＴａｑＭａｎプライマー（９００ｎＭの終濃度で）および対象の座位に特異的なプローブ（２５０ｎＭの終濃度で）と共に添加された：
ＴｕｒｂｏＧＦＰプライマー／プローブ配列
順方向プライマー  ５’−ＣＴＧＣＡＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＡ−３’
逆方向プライマー  ５’−ＡＡＧＣＣＧＧＴＧＣＣＣＡＴＣＡ−３’
プローブ  ＦＡＭ−ＣＣＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＧＡＣＴＴ−ＭＧＢ
増幅産物の長さ  ７４ｂｐ
ＴｕｒｂｏＧＦＰのコピー数を参照座位に関連付けることを可能にするため、ヒトＲｎａｓｅＰ遺伝子に関するプローブセットが、含められた（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのカタログ番号４４０３３２６）。このアッセイは、１４番染色体上のリボヌクレアーゼＰ  ＲＮＡ構成要素Ｈ１（Ｈ１ＲＮＡ）を検出する：
アッセイ座位：１４番染色体：２０８１１５６５
ビルド：ＮＣＢＩ  ビルド３７
遺伝子記号：ＲＰＰＨ１
プローブ修飾：ＶＩＣ色素（５’）、ＴＡＭＲＡクエンチャー（３’）
増幅産物の長さ：８７ｂｐ
液滴は、ＤＧ８カートリッジおよび７０μｌのオイルを用いて生成され、９６ウェルＰＣＲプレートに移された。次に、ＰＣＲが、以下の条件を用いて液滴に対して実施された：
【０２０４】
【表１】
2019504646.tif 000004
ＰＣＲ反応の後、次いで、ＰＣＲプレートは、液滴を自動的に測定してそれらを４つの異なる集団に分類するＱＸ１００液滴リーダーに移された。次いで、データは、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェアを用いて分析された。
【０２０５】
将来の実験のために、ＦＡＣＳにより示されるようにＴｕｒｂｏＧＦＰを検出可能なレベルまで発現する（図１４Ｂ）単一コピーのＴｕｒｂｏＧＦＰカセットを有する２つのクローン（図１４Ａ）が、選択された。ＴｕｒｂｏＧＦＰカセットを可動化および増幅するため、ＨＥＫ２９３細胞が、ＣＭＶプロモーターから（ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から）発現されるＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）をトランスフェクションされた。トランスフェクション後、単一細胞クローンが、単離され、ＴｕｒｂｏＧＦＰのコピー数が、上記のｄｄＰＣＲアッセイを用いて定量化された。アッセイは、ここで示された両方のクローン（図１４Ａにおけるクローン１および２）におけるコピー数の増加を明確に示した。クローン２において、コピー数は、１ｎから４ｎへと上昇し、それは、注目に値し、ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼの非常に高い活性を示唆している。他のクローンでは、増加は観察されなかった（データは示されていない）。
【０２０６】
次に、コピー数における増加がＴｕｒｂｏＧＦＰ発現の増大に変換されるかどうかが、評価された。この目的のため、クローンは、トランスポザーゼの導入の前後にＦＡＣＳ分析により分析された。注目すべきことに、ＴｕｒｂｏＧＦＰ発現における有意な増大が、トランスポザーゼの導入の後に観察された（図１４Ｂ）。これは、ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼの活性が、ＴｕｒｂｏＧＦＰカセットをコピーしてそれを別のゲノム座位においてペーストするのに十分であることを示唆している。以前の文献(Grabundzija et al. Nat Commun. 2016 Mar 2;7:10716. doi: 10.1038/ncomms10716.)から、挿入はゲノム全体にわたってランダムに（標的部位におけるＡＴジヌクレオチドに関する選好性を伴って）起こるであろうと推定される。
【０２０７】
要するに、この実験は、ＨｅｌＲａｉｓｅｒ末端配列に隣接している遺伝子またはゲノム領域が、ＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼの添加後に増幅され得ることを示している。これは、単にここでモデル遺伝子（ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡＡＶＳ１座位に単一コピーで挿入されている）を用いて例示されただけであるが、内在性遺伝子がＬＴＳおよびＲＴＳでタグ付けされていた場合に類似の増幅が観察され得ると予想することは、容易である。従って、このアプローチは、ゲノム増幅を有する細胞株を生成するように適合させられる。そのような細胞株は、特定の処置が標的遺伝子（例えば乳癌におけるＨｅｒ２）の増幅の程度に基づいて層別化される、そして適切な参照標準が欠けている腫瘍学において、特に興味深い可能性がある。
【０２０８】
実施例３：２つの内在性のヒトの座位：ＣＤＫ４およびＣＤ８１のゲノム増幅
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの、細胞における遺伝子増幅のために用いられた場合の効率を測定するため、Ｈａｐ１細胞が、目的の内在性遺伝子に隣接するトランスポザーゼ認識部位（ＬＴＳおよびＲＴＳ）を含有するように操作される。一度これらの細胞株が操作されると、トランスポザーゼは、これらの細胞で発現され、遺伝子座位がトランスポザーゼのコピー−ペースト活性によりコピー数において増加するかどうかが、観察される。２つの遺伝子が、この概念実証実験のために選択されている：サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）および表面抗原分類８１（ＣＤ８１）。
【０２０９】
転移に必要とされる左末端配列（ＬＴＳ）および右末端配列（ＲＴＳ）をゲノム中に挿入するため、確立された非相同性末端連結タグ付け法が、用いられる。ゼブラフィッシュｔｉａ１Ｌ  ｇＲＮＡ認識部位およびこのゼブラフィッシュｔｉａ１Ｌ  ｇＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモーターに隣接するＬＴＳまたはＲＴＳ配列を含有するプラスミドが、構築される。ＬＴＳおよびＲＴＳカセットは、ｔｉａ１Ｌ  ｇＲＮＡ部位におけるＣａｓ９切断の際にプラスミドから遊離するであろう。対象のゲノム座位を特定するｇＲＮＡも、提供され、ＬＴＳまたはＲＴＳカセットは、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡの切断後にこの部位に挿入されるであろう。ＬＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ３において明記されており、ＲＴＳは、ＳＥＱ  ＩＤ４において明記されている。
【０２１０】
理想的には、天然のＨｅｌｒａｉｓｅｒ転移事象はＡＴジヌクレオチドにおいて起こり、ここで、ＬＴＳ−供与体−ＲＴＳ配列がＡおよびＴの間に挿入される、という事実を反映するため、ＬＴＳは、上流のＡに隣接しており、ＲＴＳは、下流のＴに隣接している。
【０２１１】
細胞株（ＣＤＫ４に関して１つおよびＣＤ８１に関して１つ）を操作するため、ｇＲＮＡが、ＣＤＫ４およびＣＤ８１ゲノム座位の上流および下流に設計された。ＬＴＳカセットは、遺伝子の上流（５’）に挿入されなければならず、ＲＴＳカセットは、下流（３’）に挿入されなければならない。それぞれの細胞株は、２つの異なる座位（ＬＴＳ上流およびＲＴＳ下流）に組み込まれたカセットを有する必要があるため、２つの連続的な操作工程が、実施される。設計されたｇＲＮＡが、下記の表において示されている：
【０２１２】
【表２】
2019504646.tif 000005
Ｈａｐ１細胞は、リポフェクションによりＣａｓ９を発現するプラスミド、タグ付けされたプラスミド（ＬＴＳまたはＲＴＳのどちらか）、対応する遺伝子特異的ｇＲＮＡプラスミドおよびブラストサイジン耐性を与えるプラスミドをトランスフェクションされる。トランスフェクション後、細胞は、トランスフェクションされた細胞を富化するためにブラストサイジンにより短時間選択される。３日間の回復後、細胞は、クローン系列を単離するために単一細胞希釈される。クローンは、ＬＴＳまたはＲＴＳカセットを組み込まれているクローンを同定するためにＰＣＲおよびサンガー配列決定により分析される。ＰＣＲおよびサンガー配列決定に関して用いられたプライマーが、下記の表において示されている：
【０２１３】
【表３】
2019504646.tif 000006
ＬＴＳまたはＲＴＳのどちらかを正しい座位に含有するクローン細胞株が同定された後、これらの細胞は、他方の配列（ＬＴＳまたはＲＴＳのどちらか）を挿入するために再度標的化される。最初の標的化実験に関して記載されたものと同じ手順が、繰り返されるが、ＬＴＳを含有する細胞株はＲＴＳを含有するように操作されることおよびその逆を確実にする。ＬＴＳおよびＲＴＳ配列の両方を所望の位置に有する第２標的化実験からの正しく編集されたクローン細胞株が、ここで、トランスポザーゼの活性を試験するために用いられる。
【０２１４】
ＣＤＫ４  ＬＴＳ／ＲＴＳおよびＣＤ８１  ＬＴＳ／ＲＴＳ細胞株が、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼを発現するプラスミドを電気穿孔法で導入される。この発現プラスミドは、トランスポザーゼをコードする配列をＣＭＶプロモーターの下に含有し、それは、トランスポザーゼの高い発現レベルを確実にする。トランスポザーゼのコード配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６において示されている。操作されたＣＤＫ４  ＬＴＳ／ＲＴＳおよびＣＤ８１  ＬＴＳ／ＲＴＳ  Ｈａｐ１細胞が、トランスポザーゼプラスミドを、Ｌｏｎｚａ  ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎシステムをＳＥ緩衝液およびプログラムＤＳ１２０と共に用いて電気穿孔法で導入される。多くの転移事象が起こることを可能にするため、細胞は、各ラウンド間に４日間の回復を有する５ラウンドの電気穿孔法を受ける。電気穿孔法の５番目および最後のラウンドの後、細胞株は、クローン細胞株を単離するために単一細胞希釈される。クローンは、ＣＤＫ４およびＣＤ８１遺伝子のコピー数を評価するために、商業的に入手可能なアッセイ（例えばＢｉｏ−ＲａｄからのＰｒｉｍｅＰＣＲ（商標）  ｄｄＰＣＲ（商標）  コピー数アッセイ：ＣＤＫ４、ヒト；アッセイＩＤ  ｄＨｓａＣＰ２５００３７４）を用いて、ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析される。コピー数における増大が検出されているクローン細胞株に関して、細胞株は、増大したｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルの存在を確証するためにｑＰＣＲおよびウェスタンブロットにより分析される。
【０２１５】
実施例４：ＤＮＡカーゴを送達し、多コピーの標的遺伝子を有する細胞株を確立するためのＨｅｌＲａｉｓｅｒの使用。
【０２１６】
トランスポゾンの１つの可能性のある適用は、トランスポザーゼがランダムな高コピー数の組み込みを媒介する標的細胞へのＤＮＡカーゴの送達である。これは、トランスポゾンが療法的状況においてＤＮＡカーゴを送達するために適用され得る場合に特に興味深い。加えて、これは、ＣＨＯ細胞工学に関連し、ここで、ＣＨＯ細胞は、抗体および他の生物学的物質を生成するためのバイオリアクターとして用いられる。
【０２１７】
我々の実験は、（図１Ｄにおいて示されているように）ＨｅｌＲａｉｓｅｒが、目的の導入遺伝子を安定して含有する確立された細胞株において非常に効率的であることを示唆している。実際、上記のように、ＨｅｌＲａｉｓｅｒは、天然存在の系よりも１００倍活性が高いＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（従って、それはＳＢ１００と呼ばれる）の組み換えバージョンとほぼ同じくらい活性である。しかし、これらの実験から、細胞あたりどれだけ多くの導入遺伝子のコピーを期待できるかは、これはスプリンケレットＰＣＲ（図３）によってのみ定量化されており、ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ＰＣＲによっては定量化されていないため、完全には明らかではなかった。
【０２１８】
この問題に取り組むため、ＨＥＫ２９３細胞が、ＨｅｌＲａｉｓｅｒ供与体をトランスフェクションされ、ここで、ピューロマイシン耐性遺伝子が、ＳＶ４０プロモーターから発現され、プラスミドからＨＥＫ２９３細胞のゲノム中への転移を可能にするためにＨｅｌＲａｉｓｅｒ末端配列に隣接している。転移は、ＣＭＶプロモーターから発現されるＨｅｌＲａｉｓｅｒトランスポザーゼをコードするプラスミドを同時トランスフェクションすることにより触媒された。トランスフェクション後、細胞は、標的遺伝子（ＰｕｒｏＲ）の安定組み込みを有する細胞に関して富化するために１μｇ/ｍｌピューロマイシンを適用することにより選択された。次に、単一細胞クローンが、限界希釈により単離され、これらのクローンが、ゲノムＤＮＡを抽出するために拡張された。
【０２１９】
次いで、選択された単一細胞クローンが、ｄｄＰＣＲアッセイにより分析され、ここで、ＰｕｒｏＲ遺伝子のコピー数が、以下のアッセイにより決定された：
ＰｕｒｏＲプライマー／プローブ配列
順方向プライマー  ５’−ＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧ−３’
逆方向プライマー  ５’−ＧＣＴＣＧＴＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧ−３’
プローブ  ＶＩＣ−ＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴ−ＭＧＢ
増幅産物の長さ  １１８ｂｐ
ＰｕｒｏＲのコピー数を参照座位に関連付けることを可能にするため、ヒトＥＧＦＲ遺伝子に関するプローブセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのカタログ番号４４００２９１）が、含められた。このアッセイは、７番染色体上のＥＧＦ受容体を検出する。
【０２２０】
ｄｄＰＣＲは、本質的に実施例２において記載された通りに実施された。図１５は、安定なＰｕｒｏＲ組み込みを有するクローンの選択されたものからのｄｄＰＣＲの結果を示す。注目すべきことに、いくつかのクローンは、導入遺伝子の高いコピー数を含有していた（例えば、クローン５Ｅ１１は、１２のコピー数を有し；クローン５Ｆ１０は、１５のコピー数を有し；クローン１０Ｂ１は、１４のコピー数を有する）。これらの実験は、抗生物質選択後および限界希釈後に実施され、それらは、（プラスミドの持ち越しではなく）真のゲノム組み込み事象を表すようである。
【０２２１】
要するに、この実験は、ＨｅｌＲａｉｓｅｒが、カーゴを受容細胞に送達し、高いコピー数の導入遺伝子を有する細胞株を確立するための強力なツールであることを示唆している。興味深いことに、ここで得られたコピー数は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙの組み換えバージョンに関して報告されたコピー数を超えている（PMID 22402491; Kacherovsky N et al., Combination of Sleeping Beauty transposition and chemically induced dimerization selection for robust production of engineered cells. Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 11 e85 doi:10.1093/nar/gks213の図６を比較）。これは、遺伝子送達ビヒクルとしてのＨｅｌＲａｉｓｅｒの有用性を強調し、上記で概説された目的に関するその適用可能性を強く示唆している。
【０２２２】
実施例５−Ｈｅｌｒａｉｓｅｒのバイオプロセス適用に関する適用
本明細書で記載されたＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼのバイオプロセス適用に関する適切性を評価するため、以下の実験的検証が、実施された。
【０２２３】
産業的に関連性のある組み換えタンパク質、例えば抗ＨＥＲ２抗体をコードするカセットを含有する、適切な選択カセットを有する供与体ベクターが、構築された。技術を検証するための適切なベクターは、以下のものをコードするベクターを含む：
対照ＧＦＰベクター−ＲＴＳおよびＬＴＳに隣接するピューロマイシン耐性選択カセットを伴うｅＧＦＰ（ベクター（１））。
【０２２４】
ＩｇＧ１  ＨＣ供与体−ＲＴＳおよびＬＴＳに隣接するグルタミンシンターゼ選択カセットを伴う抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ１重鎖（ベクター（２））。
【０２２５】
ＩｇＧ１  ＬＣ供与体−ＲＴＳおよびＬＴＳに隣接するグルタミンシンターゼ選択カセットを伴う抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ１軽鎖（ベクター（３））。
【０２２６】
多遺伝子ＩｇＧ１供与体−ＲＴＳおよびＬＴＳに隣接するグルタミンシンテターゼ選択カセットを伴う抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ１重鎖、抗ＨＥＲ２  ＩｇＧ１軽鎖（ベクター（４））。
【０２２７】
組み換えタンパク質、例えばＧＦＰのＨｅｌｒａｉｓｅｒを用いる組み込み
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質および供与体対照ＧＦＰベクター（上記のベクター（１））が、Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒの標準化されたＣＨＯ手順を用いて電気穿孔法により細胞内に送達される。７２時間後、細胞は、トランスフェクションの効率を決定するために、陽性ＧＦＰ細胞の数に関してフローサイトメトリーにより分析される。細胞は、２個のＥ１２５エルレンマイヤーフラスコ中に蒔かれる（０．５×１０６細胞／ｍＬ）。第１フラスコ（ａ）中の細胞は、２週間ピューロマイシン選択下に置かれ、一方で第２フラスコ（ｂ）中の細胞は、振盪しながら２週間継代される（最大細胞密度は４．０×１０６細胞／ｍＬ）。２週間後、選択圧は、フラスコ（ａ）から除去され、両方のフラスコ中の細胞が、ＧＦＰの安定組み込みを有する細胞の百分率を決定するためにフローサイトメトリーにより分析される。フラスコ（ａ）では１００％の細胞がＧＦＰを発現しており、これは、選択下でのＧＦＰ遺伝子の１００％の細胞中への組み込みを示している。フラスコ（ｂ）は、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼがカセットを選択なしで組み込む効率の尺度を提供する。フラスコ（ａ）中のピューロマイシンで選択された細胞は、組み込みの数およびそれらの位置を決定するためのＣｅｒｇｅｎｔｉｓによる標的化された座位の増幅（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｌｏｃｕｓ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＬＡ）評価のために回収される。
【０２２８】
ＧＦＰ陽性細胞は、ＦＡＣＳを用いて１細胞/ウェルで３８４ウェルプレート中に蒔かれる。集団の分布は、単一の組み込みから多数の組み込みを有する細胞までに及ぶある範囲の組み込み頻度を有する細胞を捕捉するように選択される。細胞は、２週間増殖させられ、ＧＦＰ蛍光の強度が、決定される。低、中および高蛍光の細胞が、選び取られ、さらなる分析のために培養される。これらのクローンは、ｄｄＰＣＲを用いて組み込みの数に関して評価される。単一の組み込みを有するクローンは、増幅プロトコルを評価するために用いられた。組み込みの位置が、最高のシグナルを示すクローンにおいてＴＬＡにより決定される。クローンは、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼの使用により引き起こされたゲノムに対するあらゆる望ましくない修正を決定するために、ＮＧＳにより配列決定される。この情報は、特定のゲノムＨｅｌｒａｉｓｅｒ組み込み事象は、それらが細胞の成長、増殖または安定性に影響を及ぼすために避けられ得るため、規制当局の認可のために重要である。
【０２２９】
単一のＧＦＰ組み込みを有するクローンは、増幅の効率を決定するためにＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼタンパク質に曝露される。細胞は、蛍光シグナルにおける変化を決定するためにフローサイトメトリーにより分析される。細胞は、クローニングされ、組み込み数が、ｄｄＰＣＲにより決定される。クローンは、低（５コピー未満）、中（１０〜２０コピー）および高（２０〜１００コピー）蛍光に分類される。転移性要素の完全性の評価は、ＴＬＡを用いてなされる。プロトコルは、１０〜２０コピーのＧＦＰカセットを有するクローンの生成を増大させるように最適化される。
【０２３０】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒを用いる大きい多遺伝子カセット（モノクローナル抗体重鎖および軽鎖）の組み込み。
【０２３１】
２つのトランスフェクションが、単一遺伝子供与体（別々のＩｇＧ１  ＨＣおよびＩｇＧ１  ＬＣ供与体）対二重遺伝子供与体（１つのカセット中で組み合わせられた多遺伝子ＩｇＧ１供与体）による多遺伝子カーゴの送達の効率を比較するために設定される。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポザーゼおよび供与体は、Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒの標準化されたＣＨＯ手順を用いて電気穿孔法により細胞内に送達される。３つのプールが、生成される：プール（ａ）は、上記の単一遺伝子供与体ベクター（２）および（３）をトランスフェクションされ、プール（ｂ）は、上記の二重遺伝子供与体ベクター（４）をトランスフェクションされ、プール（ｃ）は、モック対照（供与体なし）である。７２時間後、細胞は、Ｈｏｒｉｚｏｎの標準的手順に従ってＴフラスコ中でＬ−グルタミン欠損条件下で選択される。１０日間の選択後、プール（ａ）および（ｂ）からの細胞は、１０日間の流加培養における産生能に関して評価される。これは、グラム量の生成物を生成するために用いられることができる高発現プールの生成におけるトランスポザーゼの効率を決定する。同時に、プール（ａ）および（ｂ）からの細胞は、１０００クローンを生成するために３８４ウェルプレート中に蒔かれる。１０００クローンは、９６ウェルプレート中に蒔かれ、５日間の培養後に、ＩｇＧ１産生能を決定するために上清がそれらから回収される。クローンは、増殖およびＩｇＧ１の産生（低、中および高）に基づいて選択される。プールおよびクローンは、細胞を６０世代培養することにより安定性に関して評価される。この期間の終了時に、細胞は、産生能に関して１０日間の流加培養により評価される。この情報は、規制当局の認可のために重要である。
【０２３２】
バイオプロセス適用における使用に関するトランスポザーゼの評価のため、以下の指標が、考慮されるべきである：
１）選択されたプールが、組み換えタンパク質を２ｇ／Ｌより大きい濃度で生成する。
【０２３３】
２）生成物の力価が、安定な細胞株の世代１および世代６０の間で＋／−３０％異なっていない。
【０２３４】
実施例６：ＤＮＡカーゴを療法目的のためにエキソビボでヒト細胞内に送達するためのＨｅｌＲａｉｓｅｒの使用。
【０２３５】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンを用いて成し遂げられるエキソビボ遺伝子療法。
【０２３６】
標的とされる病理に適した細胞のタイプおよび数が、患者、提供者または移植片対宿主疾患を制限し、宿主による拒絶を予防／低減するように適切に操作されたｉＰＳＣ細胞由来の集団から単離される。ＬＴＳ配列、対象の細胞内で作動する適切なプロモーターおよび／またはエンハンサー、場合によりプロモーター／エンハンサーの隣接する遺伝子も活性化する能力を抑制する遮蔽配列、目的のタンパク質（またはＲＮＡ）をコードするｃＤＮＡ、適切な転写終結配列ならびにＲＴＳ配列を含有するＤＮＡベクターが、組み立てられる。細胞は、適切な細胞培養培地中で、所望の数の細胞が得られるまで培養される（そして必要であれば拡張される）。上記のベクター（ＬＴＳ−目的ｃＤＮＡ−ＲＴＳ）が、電気穿孔法またはトランスフェクションにより受容細胞に導入される。あるいは、ベクターは、活性なウイルスが生成されるリスクを排除するように設計されたパッケージング系から得られたウイルス粒子により導入されることができる。さらなる代替案において、ベクターは、宿主細胞と融合するのに適した特性を有する非ウイルス性粒子、例えばリポソームにおいて導入される。
【０２３７】
全ての場合において、宿主細胞は、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼを（少なくとも一過性に）ベクターが細胞に導入される時点において／その周辺で発現することも必要である。Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＤＮＡとして（遊離のプラスミドとして、トランスフェクション／電気穿孔法によるか、またはウイルスもしくは非ウイルス性粒子を用いた導入によるかのどちらでもよい）、トランスポザーゼをコードするｍＲＮＡとして、またはトランスポザーゼタンパク質として導入されることができる。
【０２３８】
導入された細胞集団は、トランスポザーゼの源が系から除去されるまで培養される。トランスポザーゼの存在／非存在は、ＰＣＲによりトランスポゾンのヌクレオチド配列に向けられたプライマーを用いて決定されることができる。
【０２３９】
組み換え細胞の試料は、どれだけ効率的にそれらが導入されたか、組み込まれた所望の遺伝子配列の数、そしてまたコピー数が細胞の間でどれだけ多く異なるかを理解するために調べられる。操作事象が、細胞の完全性を保持する方式でフローサイトメトリーにより観察されることができる表現型を作り出す場合、所望の挙動を有する集団が、ＦＡＣＳ選別により富化されることができる。次いで、細胞は、療法に関する適切な数に到達するまで細胞培養で拡張される。凍結保存が、次の（ｆｏｌｌｏｗ−ｏｎ）処置のための集団を保管するために、または既製の療法製品を作製するために用いられることができる。
【０２４０】
トランスフェクションされた細胞は、体の適切な組織への、または末梢血液循環への注射により患者に導入される。ある場合には、宿主組織（例えば骨髄）が切除され、それにより導入された組み換え細胞の体内に存在する野生型細胞に対する比率を増大させている場合、増大した療法的利益が、達成されるであろう。患者の病理学的表現型が、組み換え細胞の導入から生じる療法的利益を測定するために評価される。ある場合には、一度の処置が最適である可能性があり、他の場合には、組み換え細胞のさらなる導入が、有益であろう。
【０２４１】
実施例７：ＤＮＡカーゴを療法目的のためにインビボでヒト細胞内に送達するためのＨｅｌＲａｉｓｅｒの使用。
【０２４２】
インビボ遺伝子療法は、病理学的状況を正常な機能へと回復させるための別のアプローチである。当業者には、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンが以下の工程を用いることによりインビボ遺伝子療法のために用いられることができるであろうことは、明らかである。
【０２４３】
まず、ＬＴＳ配列、対象の細胞株内で作動する適切なプロモーターおよび／またはエンハンサー、場合によりプロモーター／エンハンサーの隣接する遺伝子を活性化する能力を抑制する遮蔽配列、目的のタンパク質（またはＲＮＡ）をコードするｃＤＮＡ、適切な転写終結配列ならびにＲＴＳ配列を含有するＤＮＡベクターが、組み立てられる。
【０２４４】
次に、療法的用量のＬＴＳ−目的ｃＤＮＡ−ＲＴＳベクターが、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポゾンをインビボで細胞に導入することができる系と共に調製される。ＤＮＡベクターは、プラスミドとして調製されることができ（それらが内毒素を含まないことを確実にするために十分な注意が払われる）、またはそれらは、感染を維持することができる生ウイルスの生成を防ぐパッケージング系において生成された適切なウイルス粒子中にパッケージングされていることができ、またはそれらは、適切な脂質もしくはポリマー粒子に基づいて構築された非ウイルス性送達系においてパッケージングされることができる。ある場合には、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、コードしているｍＲＮＡの形態で、あるいは適切な純度の組み換えタンパク質の形態で送達され得る。
【０２４５】
第３に、上記のＬＴＳ−目的ｃＤＮＡ−ＲＴＳベクターおよびトランスポザーゼの導入系が、所望の組織または器官への注射により患者の体内に導入される。用いられる用量および方法は、マウス、ラットおよび／または非ヒト霊長類を含み得るがそれらに限定されない前臨床モデルにおいて用いられた場合に許容可能な安全性で療法的利益をもたらした用量および方法から選択されている（そして大きさおよび生理における違いを説明する（ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ）ために適切に調整されている）であろう。
【０２４６】
実施例８：変異体のライブラリーを生成するためのＨｅｌｉｔｒｏｎの使用
遺伝子トラップは、対象の遺伝子の発現を破壊するために様々な種にわたって頻繁に用いられている合成的遺伝要素である(引用PMID 18370072; Floss T and Schnuetgen F; Chromosomal Mutagenesis, Humana Press, 編者 Davis GD and Kayser KJ (2008)における第９章)。それらは、レポーター遺伝子、例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＰｕｒｏＲまたはＢｌａＲに融合した強いスプライス受容配列、続いて強い転写終結シグナルを含有する（引用PMID 19965467; Carette JE et al. (2009) Science  Vol. 326, Issue 5957, pp. 1231-1235 DOI: 10.1126/science.1178955）。そのような遺伝子トラップカセットが遺伝子の発現される部分内に挿入された場合、それは、そのスプライス受容配列により転写産物を捕捉し、この遺伝子の転写を特異的に抑止するであろう融合転写産物を作り出すであろう。これは、様々な生物（例えばマウス、ゼブラフィッシュ；引用PMID 15167922; International Gene Trap Consortium, Skarnes WC et al. (2004). Nature Genetics, 36(6), 543-544. http://doi.org/10.1038/ng0604-543）において機能喪失（ＬＯＦ）モデルを作り出すために利用されてきた。
【０２４７】
遺伝子トラップの大量並行送達は、遺伝子スクリーニングを受けることができる変異体のライブラリーを作り出すためのアプローチとして用いられることができる。これは、酵母およびハプロイドヒト細胞においてうまく例証されており(Carette et al. (2009))、それは、単一セットの染色体／遺伝子を含有し、従って“ホモ接合性”ＬＯＦ変異を得ることが容易である。それは、より低い頻度でありおそらくより低い“変換率”ではある（ヘテロ接合性ＬＯＦ変異体が最も優勢であり得る）が、他の細胞および生物においても可能である（引用PMID 25961939; Moriarity BS et al. (2015). Nature Genetics, 47(6), 615-624. http://doi.org/10.1038/ng.3293）。
【０２４８】
そのようなスクリーニングは、高効率での細胞の導入および大量並行アプローチでの数千の遺伝子の同時不活性化を必要とする。歴史上、これは、レトロウイルス、レンチウイルスまたはトランスポゾン（大部分はＰｉｇｇｙＢａｃ、Ｔｏｌ２およびＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ）を用いて達成されてきた。これらのアプローチの全てが実行可能であるが、レトロウイルスは、それらの組み込みパターンが遺伝子および転写開始部位に向けて偏っており(引用PMID 16175173; Bushman F et al. (2005) Nat Rev Microbiol. Nov;3(11):848-58.)、レトロウイルスの組み込み部位は後成的機序によりサイレンシングされる(引用PMID 26022416; Tchasovnikarova IA et al. (2015) GENE SILENCING. Science. 2015 Jun 26;348(6242):1481-5. doi: 10.1126/science.aaa7227. Epub 2015 May 28)という特定の欠点を有する。レンチウイルスは、偏りがより小さいが、なおサイレンシングを受ける。トランスポゾンは、魅力的な代替案であり、生成するのがはるかに容易であるが、それらの少なくとも一部は、ゲノム全体にわたる偏りのない分布とは対照的に、“局所的ホッピング”を好むようである(引用PMID 19391106; Liang Q et al. (2009) Genesis. 2009 Jun;47(6):404-8. doi: 10.1002/dvg.20508)。
【０２４９】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾン系は、数万（１００万に至るまで）の独立したＨｅｌｒａｉｓｅｒ組み込み事象を含有する細胞のライブラリーを作り出すための魅力的な手段である。細胞は、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するスプライス受容配列からなる遺伝子トラップカセットがＨｅｌｒａｉｓｅｒ末端配列ＬＴＳおよびＲＴＳに隣接している供与体を導入される。トランスポザーゼ発現プラスミドの（例えばトランスフェクションによる）同時適用は、その遺伝子トラップをプラスミドから可動化して多くの異なる挿入変異体を含有する細胞株のライブラリーを作り出す。それらのライブラリーの大きさは、あらゆる単一のヒト遺伝子がトランスポゾン挿入により不活性化されているライブラリーが作り出されるように、用いられる細胞の数および転移活性に比例する。導入後、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ組み込み事象を含有する細胞は、場合によりピューロマイシン選択により富化される。
【０２５０】
次に、それらのライブラリーは、当業者に既知の方法を用いる遺伝子スクリーニングを受ける。細胞の集団内の生存しているトランスポゾン変異体を決定するため、トランスポゾン組み込み部位は、以下に概説されるようなスプリンケレットＰＣＲによりマッピングされる：
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾン挿入を含有する細胞からの５μｇのゲノムＤＮＡが、ＦｓｐＢＩで４時間消化された後、エタノール沈殿が行われる。次の工程において、試料は、２０μｌの反応中でＢｆａＩスプリンケレットアダプター（１００ｐｍｏｌ）にライゲーションされる（３００ｎｇ）。３マイクロリットルのライゲーション反応が、プライマー（リンカープライマーおよびＨｅｌ１）（表４参照）を用いる第１ＰＣＲのために用いられる。第１ＰＣＲラウンドに関する温度プロフィールは、以下の通りである：１サイクルの９４℃で３分間、続いて９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１５サイクル；９４℃で３０秒間、６３℃で３０秒間および７２℃で２秒間（サイクルごとに２秒間の増加）を５サイクル；９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１２秒間（サイクルごとに２秒間の増加）を５サイクル；９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間および７２℃で２２秒間（サイクルごとに２秒間の増加）を５サイクル、そして９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を５サイクル。ネステッドＰＣＲが、プライマーＮｅｓｔｅｄおよびＨｅｌ２（表４参照）を用いて実施され（表４参照）、５０μｌの反応あたり１μｌの第１ＰＣＲの１：１００希釈物が、用いられる。ネステッドＰＣＲに関する温度プロフィールは、１サイクルの９４℃で３分間で開始し、続いて９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１０サイクル、そして９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で２分間を２０サイクルである。最終的な伸長は、７２℃で５分間実施される。
【０２５１】
ｐＨｅｌＲ、ｐＨｅｌＲΔＨＰおよびｐＨｅｌＲΔＲＴＳトランスポゾンにより生成されたＨｅｌｒａｉｓｅｒ挿入の３’末端におけるトランスポゾン−ゲノム接合部位を分析するため、まず左末端スプリンケレットＰＣＲが、トランスポゾン挿入のゲノム位置を決定するために細胞から単離されたゲノムＤＮＡを用いて実施される。次の工程において、それぞれのトランスポゾン挿入から５０〜１００ｂｐ下流に位置するゲノム配列に相補的な特異的プライマー（ＷＴ６ａ、ＷＴ６ｂ、ＷＴ６ｃ、ＷＴ６ｄ、ＤｅｌＨ２、ＤｅｌＨ１４、ＤｅｌＨ１９、ＤｅｌＲＴＳ２、ＤｅｌＲＴＳ１５ａ；表４参照）が、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンの５’末端における配列に相補的なＨｅｌＣＤ１プライマーと一緒にゲノムＰＣＲにおいて用いられる。ＰＣＲに関する温度プロフィールは、以下の通りである：９５℃で２分間、続いて４０サイクルの９５℃で２０秒間、５７℃で２０秒間、７２℃で９０秒間。最後の伸長工程は、７２℃で５分間実施される。ゲノムＰＣＲにおいて得られたＰＣＲ産物が、配列決定され、分析される。
【０２５２】
【表４】
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【０２５３】
【表５】
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【０２５４】
【表６】
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【０２５５】
【表７−１】
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【０２５６】
【表７−２】
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【０２５７】
【表７−３】
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【０２５８】
【表８−１】
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【０２５９】
【表８−２】
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【０２６０】
【表８−３】
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【０２６１】
【表８−４】
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【０２６２】
【表９−１】
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【０２６３】
【表９−２】
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【０２６４】
【表９−３】
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【０２６５】
【表９−４】
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【０２６６】
【表９−５】
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【０２６７】
【表９−６】
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【０２６８】
【表９−７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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