(57)【要約】  脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から、特定の界面活性剤存在下に、有機溶媒を混合して、有機溶媒相に脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする脂溶性生理活性物質の製造方法を提供する。当該製造方法によれば、特殊な脱水、乾燥設備を用いることなく、また溶媒と菌体成分との分離性悪化による収率低下を招くことなく抽出し、効率的に工業生産できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤及びアルキルエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤存在下に、
有機溶媒と混合し、
脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする、
脂溶性生理活性物質の製造方法。
【請求項２】
脂溶性生理活性物質が、補酵素Ｑ１０であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
補酵素Ｑ１０が、還元型補酵素Ｑ１０、又は、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤が、少なくともポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤の添加量が、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対して、０．０１重量％以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
有機溶媒が、疎水性有機溶媒であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
さらに親水性有機溶媒を併用することを特徴とする請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
抽出は、連続抽出であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性生理活性物質の製造方法に関する。詳しくは、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液から脂溶性生理活性物質を抽出することによる脂溶性生理活性物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に有用な脂溶性生理活性物質は数多く知られている。そのうち、補酵素Ｑは、細菌から哺乳動物まで広く生体に分布する必須成分であり、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として知られている。補酵素Ｑは、ミトコンドリア内において酸化と還元を繰り返すことで、電子伝達系における伝達成分としての機能を担っているほか、補酵素Ｑのうち還元型補酵素Ｑは抗酸化作用を持つことが知られている。ヒトでは補酵素Ｑの側鎖が繰り返し構造を１０個持つ補酵素Ｑ１０が主成分であり、生体内においては、通常、４０〜９０％程度が還元型として存在している。補酵素Ｑの生理的作用としては、ミトコンドリア賦活作用によるエネルギー生産の活性化、心機能の活性化、細胞膜の安定化効果、抗酸化作用による細胞の保護効果等が挙げられている。【０００３】
補酵素Ｑ１０のうち、酸化型補酵素Ｑ１０は、従来、鬱血性心不全薬や健康食品として用いられており、近年では、より高い生理活性作用を持つ還元型補酵素Ｑ１０が知られるようになってきている。
補酵素Ｑ１０などの脂溶性生理活性物質は、例えば、合成、発酵、天然物から抽出することなどによって得ることができる。また必要に応じ、得られた抽出物を、クロマトグラフィーにより精製したり、晶析により結晶化してより純度の高いものを得ることもできる。例えば、補酵素Ｑ１０を得るにあたっては、補酵素Ｑ１０を産生する微生物を培養し、その微生物の懸濁液から有機溶媒を用いて微生物中の補酵素Ｑ１０を抽出する方法が一般的となっている。【０００４】
従来、微生物細胞中に含まれている有用成分を抽出する操作においては、培養した微生物の水性懸濁液を脱水し、湿菌体としたうえで有機溶媒に接触させる方法、水性懸濁液を脱水後さらに乾燥し、乾燥菌体として有機溶媒に接触させる方法、水性懸濁液をそのまま有機溶媒に接触させ、液−液間で抽出する方法が知られている。【０００５】
特許文献１では、培養したファフィア酵母の懸濁液を遠心処理して菌体を回収し、回収した菌体を噴霧乾燥した後、ヘキサン、エタノール等の混合溶媒で破砕しながら菌体中のアスタキサンチンを抽出した例が記載されている。その他にも、モルティエレラ属の菌体を培養し、菌体懸濁液を脱水、乾燥した後にヘキサンによりアラキドン酸含有油を抽出した例（特許文献２）、ムコール属の菌体を培養した培養液を破砕し、凍結乾燥した後、ヘキサン等の溶媒によりγ−リノレン酸を抽出した例（特許文献３）が知られている。これらの抽出方法では、乾燥菌体と抽出溶剤である有機溶媒を混合し、抽出操作が完了した後に固液分離して菌体残渣を除去し、目的物質の含まれた有機相を得ることができる。【０００６】
特許文献４では、補酵素Ｑ１０含有微生物の湿菌体、又は乾燥菌体を低温下でメタノールと接触させ、菌体内外の夾雑物を除去した後に、次は、高温下でメタノールと接触させ、補酵素Ｑ１０を抽出した例が開示されている。このような固−液抽出操作においては、菌体と抽出溶剤との比重差が大きいため、抽出後の固液分離が容易であり、目的物質のロスが少なく、高い効率で抽出できる利点を持つ。
しかし、これらの方法では、抽出前に、培養した微生物の水性懸濁液から大量の水分を、遠心分離、スプレードライヤー、凍結乾燥機等の装置により脱水、乾燥する工程が必要となるうえ、菌体中に残存する含水率によっては十分な抽出率が得られない場合があるほか、装置コスト、運転コストが大きくなる等の問題があった。【０００７】
微生物の水性懸濁液を脱水、乾燥することなく抽出した例として、培養した微生物の破砕懸濁液をそのままヘキサン、２−プロパノール等の有機溶媒と接触させ、菌体内の補酵素Ｑ１０を抽出した例が知られている（特許文献５）。このような液−液抽出操作においては、微生物を脱水、乾燥することなく、高い収率、大きな処理量にて目的物質の抽出が可能であるが、微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液、特に該細胞破砕物の水性懸濁液、とりわけ物理的処理による該細胞破砕物の水性懸濁液から有機溶媒を用いて抽出する場合、一部タンパク質等の細胞成分の存在により乳化現象等が生じやすく、微生物細胞の破砕懸濁液中に、目的物質を含んだ有機相が多量にトラップされ、有機相が効率良く分離できなくなり、収率低下を招くだけでなく、使用した抽出溶媒の回収率が低いという問題がある。また、疎水性有機溶媒の他にも親水性有機溶媒をある程度以上の量を使用する必要がある等、操作の煩雑化、コストの増大が問題であった。
また従来、界面活性剤を液−液抽出に使用した場合では、界面効果により水相と有機溶媒相の親和性が高くなるため、均相化が生じやすく、水相と有機溶媒相の分離に長時間を要したり、又は時間をかけても分離しないことが多く、場合によっては遠心分離等の操作により強制的に分離させる必要があった。そのため、一般的な液−液抽出では、抽出工程における界面活性剤の使用は好ましくないと考えられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平７−４１６８７号公報
【特許文献２】特開２００９−１２０８４０号公報
【特許文献３】特開平５−１７７９６号公報
【特許文献４】特許第４２７５６２１号公報
【特許文献５】特開２００８−２５３２７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の微生物細胞中からの脂溶性生理活性物質などの有用成分の抽出操作においては、抽出前に微生物の脱水や乾燥等に特殊な設備が必要であったり、抽出後において有用成分を含んだ溶媒と菌体成分との分離性が悪く、収率が不十分であったりするほか、複数の溶媒の使用が必要であるなど、操作の煩雑化、コストの増大を招くという問題があった。
本発明は、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞中から、脂溶性生理活性物質を、特殊な脱水、乾燥設備を用いることなく、また溶媒と菌体成分との分離性悪化による収率低下を招くことなく抽出し、効率的に工業生産できる製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、脂溶性生理活性物質を含有した微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に、特定の界面活性剤を存在させて、有機溶媒を用いて抽出操作を行うことで、有機溶媒と水性懸濁液の親和性が向上するだけでなく、混合・静置後には、油水分離が速やかに進み、脂溶性生理活性物質を効率的に抽出でき、工業生産にも適していることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち本発明は、以下の通りである。
［１］脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤及びアルキルエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤存在下に、
有機溶媒と混合し、
脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする脂溶性生理活性物質の製造方法。
［２］脂溶性生理活性物質が、補酵素Ｑ１０であることを特徴とする［１］に記載の製造方法。
［３］補酵素Ｑ１０が、還元型補酵素Ｑ１０、又は、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物であることを特徴とする［２］に記載の製造方法。
［４］非イオン性界面活性剤が、少なくともポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか１項に記載の製造方法。
［５］非イオン性界面活性剤の添加量が、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対して、０．０１重量％以上であることを特徴とする［１］〜［４］のいずれか１項に記載の製造方法。
［６］有機溶媒が、疎水性有機溶媒であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１項に記載の製造方法。
［７］さらに親水性有機溶媒を併用することを特徴とする［６］に記載の製造方法。
［８］抽出は、連続抽出であることを特徴とする［１］〜［７］のいずれか１項に記載の製造方法。
［９］脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤及びアルキルエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤存在下に、
有機溶媒と混合し、
脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする脂溶性生理活性物質の精製方法。
［１０］脂溶性生理活性物質が、補酵素Ｑ１０であることを特徴とする［９］に記載の精製方法。
［１１］補酵素Ｑ１０が、還元型補酵素Ｑ１０、又は、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物であることを特徴とする［１０］に記載の精製方法。
［１２］非イオン性界面活性剤が、少なくともポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤であることを特徴とする［９］〜［１１］のいずれか１項に記載の精製方法。
［１３］非イオン性界面活性剤の添加量が、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対して、０．０１重量％以上であることを特徴とする［９］〜［１２］のいずれか１項に記載の精製方法。
［１４］有機溶媒が、疎水性有機溶媒であることを特徴とする［９］〜［１３］のいずれか１項に記載の精製方法。
［１５］さらに親水性有機溶媒を併用することを特徴とする［１４］に記載の精製方法。
［１６］抽出は、連続抽出であることを特徴とする［９］〜［１５］のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の効果】
【００１２】
従来の微生物細胞中からの有用成分の抽出法では、設備、製造コスト面、操作安定性に課題があり、脂溶性生理活性物質の製造方法としても同様の問題を有しているが、本発明の製造方法によれば、液−液抽出操作によって脂溶性生理活性物質の抽出を効率的に行うことができ、工業生産にも適している。
更に、本発明で見出した好ましい特定の界面活性剤を液−液抽出操作時に用いることで、抽出時に目的物質を含んだ分散相を抽出溶媒中に微細分散化させ、目的物質の抽出溶媒中への移動を促進するとともに、有機相と水相を静置した際の油水分離も速やかに行えるため、安定的に高い収率で脂溶性生理活性物質の製造が可能となるだけでなく、水相への有機相の移行による抽出溶媒の損失も抑制できる。また、従来、より高収率で目的物質を得るためには抽出操作に複数種の抽出溶媒が必要であった場合に対しても、本発明では単一溶媒のみでも高収率の操作を行うことができるため、装置、操作の簡素化が図れるうえ、溶媒回収にかかるエネルギーの削減、環境負荷低減等の効果も得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明は、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から、後述する特定の非イオン性界面活性剤存在下に有機溶媒を混合し、有機溶媒相に脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする脂溶性生理活性物質の製造方法である。
【００１４】
本発明の製造方法において、抽出の対象となる脂溶性生理活性物質としては、微生物細胞中に産出され、有機溶媒に対して親和性を有し（脂溶性）、生体にとって有用な生理活性物質であれば、特に限定されない。その具体例としては、例えば、補酵素Ｑ１０などの補酵素Ｑ類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥやビタミンＫなどのビタミン類、カロチン、アスタキサンチンやフコキサンチンなどのカロテノイド類、脂溶性ポリフェノール類、フラボノイド類、エルゴステロールなどのステロール類、α−リポ酸、Ｌ−カルニチンなどが挙げられる。なかでも、補酵素Ｑ１０やアスタキサンチン、エルゴステロールなどが好ましく、補酵素Ｑ１０が特に好ましい。
【００１５】
補酵素Ｑ１０には、上述したように、酸化型と還元型が存在する。本発明は、補酵素Ｑ１０として、酸化型補酵素Ｑ１０、還元型補酵素Ｑ１０のいずれをも対象とするが、還元型補酵素Ｑ１０を含む補酵素Ｑ１０、すなわち、還元型補酵素Ｑ１０単独か、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物である補酵素Ｑ１０を対象とするのが好ましい。なお、本明細書において、補酵素Ｑ１０とのみ記載した場合は、酸化型補酵素Ｑ１０、還元型補酵素Ｑ１０を問わず、両者が混在する場合には混合物全体も表すものである。
【００１６】
本発明で用いる脂溶性生理活性物質を含有する微生物としては、目的とする脂溶性生理活性物質又はその前駆体を菌体内に産生する微生物又は該物質をもともと一定量以上含んでいる微生物であれば、細菌、酵母、カビのいずれも制限無く使用することができる。なかでも該脂溶性生理活性物質を菌体内に産生する微生物が好ましい。
【００１７】
上記微生物としては、具体的には、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、アミノバクター（Aminobacter）属、アグロモナス（Agromonas）属、アシディフィラム（Acidiphilium）属、ブレロミセス（Bulleromyces）属、ブレラ（Bullera）属、ブレブンジモナス（Brevundimonas）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キオノスファエラ（Chionosphaera）属、カンジタ（Candida）属、セリノステルス（Cerinosterus）属、エキソフィアラ（Exisophiala）属、エキソバシジウム（Exobasidium）属、フィロミセス（Fellomyces）属、フィロバシジエラ（Filobasidiella）属、フィロバシジウム（Filobasidium）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、グラフィオラ（Graphiola）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、コッコバエラ（Kockovaella）属、クルツマノミセス（Kurtzmanomyces）属、ララリア（Lalaria）属、ロイコスポリジウム（Leucosporidium）属、レギオネラ（Legionella）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ミコプラナ（Mycoplana）属、オースポリジウム（Oosporidium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュドジマ（Psedozyma）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ペトロミセス（Petromyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、リゾモナス（Rhizomonas）属、ロドビウム（Rhodobium）属、ロドプラネス（Rhodoplanes）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリジオボラス（Sporidiobolus）属、サイトエラ（Saitoella）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、スポロトリクム（Sporotrichum）属、シンポジオミコプシス（Sympodiomycopsis）属、ステリグマトスポリジウム（Sterigmatosporidium）属、タファリナ（Tapharina）属、トレメラ（Tremella）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、チレチアリア（Tilletiaria）属、チレチア（Tilletia）属、トリポスポリウム（Tolyposporium）属、チレチオプシス（Tilletiopsis）属、ウスチラゴ（Ustilago）属、ウデニオミセス（Udeniomyces）属、キサントフィロミセス（Xanthophllomyces）属、キサントバクター（Xanthobacter）属、ペキロマイセス（Paecilomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ハイホモナス（Hyhomonus）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ファフィア（Phaffia）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属等の微生物を挙げることができる。培養の容易さや生産性の観点からは、細菌又は酵母が好ましく、細菌では非光合成細菌がより好ましく、さらには、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ロドバクター（Rhodobacter）属等が、酵母ではシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、サイトエラ（Saitoella）属、ファフィア（Phaffia）属等が特に好ましい例として挙げられる。
なお脂溶性生理活性物質を菌体外に産生する、すなわち培養液中に当該物質を産生する微生物も本発明に包含される。
【００１８】
脂溶性生理活性物質を産生する微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物の目的とする脂溶性生理活性物質の生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変あるいは改良した変異体や組換え体も好ましく使用することができる。
上記微生物を培養することで、補酵素Ｑ１０などの脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞を得ることができる。培養方法は特に限定されず、対象となる微生物に適した、あるいは目的とする脂溶性生理活性物質の産生に適した培養方法が適宜選択しうる。培養期間も特に限定されず、微生物細胞中に所望の量の目的とする脂溶性生理活性物質が産生されればよい。その場合の脂溶性生理活性物質の産生量（含有量）としては、目的により特に限定されないが、例えば培地あたりの脂溶性生理活性物質の含有量として、例えば０．５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは２μｇ／ｍＬ以上である。
【００１９】
本発明の製造方法においては、上記脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞から脂溶性生理活性物質を抽出するに際して、微生物細胞から直接抽出することもできるが、所望により前記微生物細胞を破砕して微生物細胞破砕物とし、該破砕物から抽出することもできる。細胞の破砕は、微生物細胞中に産生・蓄積された脂溶性生理活性物質の効率的な抽出に寄与する。細胞破砕処理は、細菌では必ずしも必要ではない場合もあるが、酵母やカビの細胞を使用する場合、細胞破砕処理をするのが特に好ましい。酵母やカビの細胞を使用する場合、細胞が破砕されていないと、細胞中に産生・蓄積された脂溶性生理活性物質の回収効率は低下する。言うまでもなく、細胞の破砕と抽出とを同時に行っても良い。
なお、本発明の「破砕」においては、目的とする脂溶性生理活性物質の抽出が可能となる程度に細胞壁等の表面構造が損傷を受ければよく、必ずしも微生物細胞が破れる、あるいは断片化される必要はない。
【００２０】
本願において、「微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液」とは、微生物細胞又はその微生物細胞破砕物が、水、生理食塩水、緩衝液、培地などの水性溶媒に懸濁されたものであり、好ましくは、水及び／又は培地に懸濁されたものである。
【００２１】
上記細胞破砕の対象となる微生物細胞の形態は、微生物細胞の水性懸濁液、培養液、培養液を濃縮したもの、培養液から微生物細胞を湿菌体として採取したもの、これらを洗浄したもの、湿菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの、前記の湿菌体を乾燥させた乾燥菌体、乾燥菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの等であってもよいが、好ましくは微生物細胞の水性懸濁液、培養液、培養液を濃縮したものや、これらを洗浄したものであり、操作性等の面から、より好ましくは、培養液、培養液を濃縮したものや、これらを洗浄したものである。
【００２２】
上記微生物細胞の破砕は、以下の１つ又は幾つかの破砕方法を任意の順序で行うことにより行われる。破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理の他、加熱処理、自己消化、浸透圧溶解、原形質溶解等を挙げることができる。
【００２３】
上記物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、あるいは、これらの組み合わせを挙げることができる。
【００２４】
上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。
【００２５】
上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、ノボザイム、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法を挙げることができ、適宜これらを組み合わせて用いても良い。
【００２６】
上記加熱処理としては、例えば、６０〜１４０℃で３０分〜３時間程度の処理を挙げることができる。
【００２７】
上記自己消化としては、例えば、酢酸エチル等の溶媒による処理を挙げることができる。
また、細胞内の塩濃度と異なる溶液で処理することにより、細胞の浸透圧溶解や原形質溶解を引き起こすこともできる。但し、この方法のみでは細胞破砕効果が不十分な場合が多いため、上記のような物理的処理、化学的処理、酵素的処理、加熱処理、自己消化等と合わせて用いるのが好ましい。
【００２８】
本発明において、脂溶性生理活性物質の抽出・回収の前処理としての細胞破砕方法としては、上記破砕方法の中でも、物理的処理、化学的処理（特に酸処理、好ましくは強酸（例えば、水溶液中におけるｐＫａが２．５以下の酸）処理）や加熱処理が好ましく、破砕効率の点から物理的処理がより好ましい。
【００２９】
本発明においては、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞、または上記のようにして得られる脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞の破砕物を、水性懸濁液とした状態で、脂溶性生理活性物質の抽出を行う。本発明において、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液を調製する方法は特に限定されないが、例えば、脂溶性生理活性物質を産生する微生物の培養後の培養液、該培養液を濃縮及び／又は洗浄したものや、該微生物細胞の湿菌体や乾燥菌体を水や水性溶媒に懸濁させて調製する。あるいは微生物細胞の水性懸濁液を上記の方法によって破砕して調製することができる。
【００３０】
本発明の製造方法において、抽出の対象となる微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液中の菌体濃度は、特に制限されないが、菌体の乾燥重量に換算して通常１〜２５重量％の範囲であり、経済的には１０〜２０重量％の範囲で実施するのが好ましい。
【００３１】
本発明の製造方法では、特定の非イオン性界面活性剤存在下に、前記脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液と、有機溶媒を混合し、液−液抽出によって有機溶媒相に脂溶性生理活性物質を抽出することで、好ましくは強制油水分離の工程を必要とすることなく、混合液を静置して油水分離し、分離した有機溶媒相から脂溶性生理活性物質の回収を行う。すなわち、当該水性懸濁液と有機溶媒の混合液から脂溶性生理活性物質を抽出する工程、混合液を静置して油水分離する工程を連続して行うことにより効率的に該物質を得ることもできる。
【００３２】
本発明の製造方法においては、抽出時に用いる非イオン性界面活性剤として、グリセリン脂肪酸エステル類、ショ糖脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤又はアルキルエーテル型界面活性剤を使用することが必要である。またこれらの非イオン性界面活性剤を２種以上併用することもできるし、これらの非イオン性界面活性剤とそれ以外の界面活性剤を併用してもかまわない。
【００３３】
上記グリセリン脂肪酸エステル類としては、例えば、脂肪酸の部分グリセリド、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル等を挙げることができる。脂肪酸の部分グリセリドとしては、例えば、モノグリセリンモノカプリル酸エステル、モノグリセリンモノカプリン酸エステル、モノグリセリンジカプリル酸エステル、モノグリセリンジカプリン酸エステル、モノグリセリンジラウリン酸エステル、モノグリセリンジミリスチン酸エステル、モノグリセリンジステアリン酸エステル、モノグリセリンジオレイン酸エステル、モノグリセリンジエルカ酸エステル、モノグリセリンジベヘニン酸エステル等のモノグリセリン脂肪酸エステル；モノグリセリンカプリル酸コハク酸エステル、モノグリセリンステアリン酸クエン酸エステル、モノグリセリンステアリン酸酢酸エステル、モノグリセリンステアリン酸コハク酸エステル、モノグリセリンステアリン酸乳酸エステル、モノグリセリンステアリン酸ジアセチル酒石酸エステル、モノグリセリンオレイン酸クエン酸エステル等のモノグリセリン脂肪酸有機酸エステル等を挙げることができる。ポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば、重合度が２から１０のポリグリセリンを主成分とするポリグリセリンに、ポリグリセリンの水酸基の１つ以上に炭素数が各々６〜２２の脂肪酸がエステル化したものが挙げられる。具体的には、例えば、ヘキサグリセリンモノカプリル酸エステル、ヘキサグリセリンジカプリル酸エステル、デカグリセリンモノカプリル酸エステル、トリグリセリンモノラウリン酸エステル、テトラグリセリンモノラウリン酸エステル、ペンタグリセリンモノラウリン酸エステル、ヘキサグリセリンモノラウリン酸エステル、デカグリセリンモノラウリン酸エステル、トリグリセリンモノミリスチン酸エステル、ペンタグリセリンモノミリスチン酸エステル、ペンタグリセリントリミリスチン酸エステル、ヘキサグリセリンモノミリスチン酸エステル、デカグリセリンモノミリスチン酸エステル、ジグリセリンモノオレイン酸エステル、トリグリセリンモノオレイン酸エステル、テトラグリセリンモノオレイン酸エステル、ペンタグリセリンモノオレイン酸エステル、ヘキサグリセリンモノオレイン酸エステル、デカグリセリンモノオレイン酸エステル、ジグリセリンモノステアリン酸エステル、トリグリセリンモノステアリン酸エステル、テトラグリセリンモノステアリン酸エステル、ペンタグリセリンモノステアリン酸エステル、ペンタグリセリントリステアリン酸エステル、ヘキサグリセリンモノステアリン酸エステル、ヘキサグリセリントリステアリン酸エステル、ヘキサグリセリンジステアリン酸エステル、デカグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンジステアリン酸エステル、デカグリセリントリステアリン酸エステル等が挙げられる。ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステルとしては、例えば、ポリグリセリンの平均重合度が２〜１０、ポリリシノレイン酸の平均縮合度（リシノレイン酸の縮合数の平均）が２〜４であるものが挙げられ、例えば、テトラグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ペンタグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ヘキサグリセリン縮合リシノレイン酸エステル等が挙げられる。
【００３４】
上記ショ糖脂肪酸エステル類としては、ショ糖の水酸基の１つ以上に炭素数が各々６〜１８、好ましくは６〜１２の脂肪酸をエステル化したものが挙げられる。具体的には、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。
【００３５】
上記ソルビタン脂肪酸エステル類としては、ソルビタン類の水酸基の１つ以上に炭素数が各々６〜１８、好ましくは６〜１２の脂肪酸をエステル化したものが挙げられる。具体的には、ソルビタンモノステアリン酸エステル、ソルビタンモノオレイン酸エステル等が挙げられる。
【００３６】
上記ポリエーテルポリオール型の界面活性剤としては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のアデカノールＬＧシリーズ（ＬＧ−１０９、ＬＧ−１２６、ＬＧ−２９４、ＬＧ−２９５Ｓ、ＬＧ−２９９、ＬＧ−８０５）等が挙げられる。
【００３７】
上記ポリオキシエチレンアルキルエーテル型の界面活性剤としては、炭素数１２〜２２の脂肪族アルコールに酸化エチレンを付加重合して得られるものが好ましく、例えば、花王株式会社製のエマルゲンシリーズ（１０３、１０４Ｐ、１０５、１０６、１０８、１０９Ｐ、１２０、１２３Ｐ、１４７、１５０、２１０、２２０、３０６Ｐ、３２０Ｐ、３５０、４０４、４０８、４０９ＰＶ、４２０、４３０、７０５、７０７、７０９、１１０８）等が挙げられる。
【００３８】
上記ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤としては、ポリプロピレングリコールの両端に酸化エチレンを付加させて得られるブロックコポリマーである、エチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間に、プロピレンオキサイド（ＰＯ）鎖を有するもの（ＥＯｘＰＯｙＥＯｚ）の他、リバースタイプのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、エチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなども含まれる。
【００３９】
上記エチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間に、プロピレンオキサイド（ＰＯ）鎖を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとしては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のプルロニックＬシリーズ（Ｌ−３１、Ｌ−３４、Ｌ−４４、Ｌ−６１、Ｌ−６２、Ｌ−６４、Ｌ−７１、Ｌ−７２、Ｌ−１０１、Ｌ−１２１）、プルロニックＰシリーズ（Ｐ−６５、Ｐ−８４、Ｐ−８５、Ｐ−１０３、Ｐ−１０５、Ｐ−１２３）、プルロニックＦシリーズ（Ｆ−６８、Ｆ−１０８、Ｆ−１２７）やＢＡＳＦ社製のプルロニックＰＥシリーズ等が挙げられる。
【００４０】
上記リバースタイプのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとしては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のプルロニックＲシリーズ（２５Ｒ−１、２５Ｒ−２、１７Ｒ−２、１７Ｒ−３、１７Ｒ−４）やＢＡＳＦ社製のプルロニックＲＰＥシリーズ等が挙げられる。
【００４１】
上記エチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとしては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のプルロニックＴＲシリーズ（ＴＲ−７０１、ＴＲ−７０２、ＴＲ−７０４）やＢＡＳＦ社製のテトロニックシリーズ（ポロキサミン）等が挙げられる。
【００４２】
さらに、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤と類似の構造を持つ、２つのエチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間に、ブチレンオキサイド（ＢＯ）鎖を有するトリブロックコポリマー型の界面活性剤（ＥＯｘＢＯｙＥＯｚ）も、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤と同様、本発明の製造方法において使用できる。
【００４３】
上記これらのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤（及びその類似体）のなかでも、質量平均分子量が５００〜８０００の範囲にある界面活性剤が好ましく、質量平均分子量が１０００〜４０００の範囲にある界面活性剤がより好ましい。
【００４４】
上記アルキルエーテル型の非イオン性界面活性剤としては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のアデカトールＬＢシリーズ（ＬＢ−５３Ｂ、ＬＢ−７２０、ＬＢ−８２０、ＬＢ−５４Ｃ、ＬＢ−８３、ＬＢ−９３、ＬＢ−１０３、ＬＢ−１２２０、ＬＢ−１５２０）、アデカトールＬＡシリーズ（ＬＡ−６７５Ｂ、ＬＡ−７７５、ＬＡ−８７５、ＬＡ−９７５、ＬＡ−１２７５）等が挙げられる。
【００４５】
言うまでもなく、ここで示した非イオン性界面活性剤は２種以上を合わせて使用することもできる。
上記非イオン性界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤を少なくとも使用するのが好ましい。その場合、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤１種を単独で使用することもできるが、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤を２種以上組み合わせて使用するか、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤とそれ以外の非イオン性界面活性剤を組み合わせて使用するのが特に好ましい。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤に組み合わせる非イオン性界面活性剤としては、上述したような非イオン性界面活性剤、すなわち、グリセリン脂肪酸エステル類、ショ糖脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、アルキルエーテル型界面活性剤が挙げられる。そのなかでも、２種のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤の組み合わせや、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤とショ糖脂肪酸エステル類の組み合わせが好ましく、２種のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤の組み合わせがより好ましく、エチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間にプロピレンオキサイド（ＰＯ）鎖を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとエチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーの組み合わせが特に好ましい。
【００４６】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤とそれ以外の非イオン性界面活性剤を組み合わせる場合、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤の使用量は、それ以外の非イオン性界面活性剤よりも多い方が好ましく、例えば、使用する非イオン性界面活性剤の合計量に対して５０重量％以上が好ましく、６０重量％以上がより好ましく、７５重量％以上がさらに好ましい。
【００４７】
このような界面活性剤を液−液抽出操作に用いることで、抽出時に、目的物質である脂溶性生理活性物質を含んだ分散相を、抽出溶剤である有機溶媒中に微細分散化させることができる。その結果、抽出溶剤と脂溶性生理活性物質との接触効率が向上し、脂溶性生理活性物質の有機溶媒相への移動が促進される。一方、従来、界面活性剤を液−液抽出に使用した場合では、界面効果により水相と有機溶媒相の親和性が高くなるため、均相化が生じやすく、水相と有機溶媒相の分離に長時間を要したり、又は時間をかけても分離しないことが多く、場合によっては遠心分離等の操作により強制的に分離させる必要があった。そのため、いままで、一般的な液−液抽出では、抽出工程における界面活性剤の使用は好ましくないと考えられていた。しかし、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から、有機溶媒を用いて、有機溶媒相に脂溶性生理活性物質を液―液抽出する場合、上記の特定の界面活性剤、特にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤を抽出時に共存させると、有機溶媒と水性懸濁液の親和性が向上するだけでなく、混合・静置後には、油水分離が速やかに進むことが、本発明で初めて見出された。従って本発明の製造方法では、安定的に高い収率で目的物質である脂溶性生理活性物質の溶解した有機溶媒相を回収することができる。
【００４８】
また、本発明の製造方法において、ペースト状及びフレーク状の非イオン性界面活性剤を使用する場合には、界面活性剤を溶解するための溶媒を使用するのが好ましい。また、液状の界面活性剤を使用する場合でも、その粘性が高い場合に溶媒を使用するのが好ましい。その際用いる溶媒としては、水やアルコール類が望ましく、それぞれ単独で用いてもよいし、水とアルコールの混合溶媒として用いてもよい。
【００４９】
本発明の製造方法においては、抽出操作時における上記特定の非イオン性界面活性剤の使用量は、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対する濃度として、０．０１重量％以上であることが好ましく、０．０１〜１０重量％の範囲内にあることがさらに好ましく、０．１〜５重量％の範囲内にあることがより好ましく、０．５〜５重量％の範囲内であることが特に好ましい。上記界面活性剤の添加量が０．０１重量％以下の場合、有機溶媒中における水性懸濁液の微細分散化が進まず、十分な抽出効率を確保できない。一方で、上記界面活性剤の添加量が１０重量％を超える場合、有機溶媒と水性懸濁液の親和性が必要以上に高くなるため、有機溶媒中における水性懸濁液の微細分散化は促進されるものの、混合状態にある有機溶媒と水性懸濁液を静置した際の油水分離性が悪化することがある。
【００５０】
本発明の製造方法において、上記特定の非イオン性界面活性剤存在下に抽出を行う方法としては特に限定されず、抽出時の水性懸濁液と有機溶媒の混合液中に所定量の界面活性剤が共存されうる方法であれば特に制限は無く、抽出前に微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に界面活性剤を添加する方法、抽出に使用する有機溶媒に界面活性剤を添加する方法、有機溶媒と水性懸濁液の混合液に界面活性剤を添加する方法の他、予め微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液の調製時や調製前に界面活性剤を添加しておく方法、あるいは微生物細胞の破砕に使用した界面活性剤をそのまま抽出時にも利用する方法等が挙げられる。
【００５１】
本発明の製造方法において、抽出に用いる有機溶媒としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００５２】
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。このなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
【００５３】
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等である。
【００５４】
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
【００５５】
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。
【００５６】
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
【００５７】
プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
【００５８】
酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
【００５９】
ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
【００６０】
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
【００６１】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
【００６２】
これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
【００６３】
１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、２−プロパノールである。
【００６４】
２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
【００６５】
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
【００６６】
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
【００６７】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
【００６８】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
【００６９】
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類やニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることができる。
【００７０】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
【００７１】
上記有機溶媒の中でも、沸点、融点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。例えば、沸点としては、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶媒の乾燥除去や晶析濾液等からの溶媒回収の行いやすさという観点から、１気圧下、約３０〜１５０℃の範囲であるのが好ましく、融点としては、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくいという観点から、約２０℃以下、好ましくは約１０℃以下、より好ましくは約０℃以下であり、粘性としては、例えば２０℃において約１０ｃｐ以下など低い方が好ましい。
【００７２】
上記有機溶媒のうち、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から、脂溶性生理活性物質を抽出し回収する目的においては、２相系での液−液抽出を行うという観点から、抽出溶媒として疎水性有機溶媒又は疎水性有機溶媒を含有するものを用いるのが好ましい。
【００７３】
この場合に使用される疎水性有機溶媒としては、特に制限されず、上述の有機溶媒のうち水と完全に混和せず２相系となる疎水性のものを使用できるが、好ましくは、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類等の疎水性有機溶媒であり、さらに好ましくは炭化水素類、より好ましくは脂肪族の炭化水素類を用いることができる。脂肪族炭化水素類のなかでも、炭素数５〜８のものが好適に用いられる。上記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素類の具体例としては、例えば、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等を挙げることができる。特に好ましくは、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくは、ヘキサン、ヘプタンである。
【００７４】
本発明の製造方法では、界面活性剤存在下に抽出を行うことで、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液と上記疎水性有機溶媒との親和性を向上させ、十分な抽出効率を得ることが可能であるが、抽出時に使用される有機溶媒として上記疎水性有機溶媒に加えて、親水性有機溶媒を補助的に併用することで、有機溶媒中での水性懸濁液の更なる微細化の促進と、静置時においては高い油水分離の安定性向上を付加することができ、より好ましい。
【００７５】
本発明の製造方法において、疎水性有機溶媒と組み合わせて用いられる親水性有機溶媒としては、特に制限されず、上述の有機溶媒のうち親水性のものを使用しうるが、好ましくは、アルコール類である。アルコール類のなかでも、炭素数１〜５の１価アルコールが好適に用いられる。これらの具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等を挙げることができる。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、最も好ましくは、２−プロパノールである。
【００７６】
本発明の製造方法において、抽出溶媒として使用する疎水性有機溶媒の使用量としては、特に制限はされないが、抽出時の濃度として、抽出系の全溶液（微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液、抽出溶媒、非イオン性界面活性剤などの混合溶液）の容量に対して、２５〜８０容量％の範囲で使用するのが好ましく、５０〜７５容量％の範囲で使用するのがより好ましい。また、上記のように親水性有機溶媒を併用する場合の親水性有機溶媒の使用量は、２相系が維持できる範囲であれば特に限定されないが、全溶液の容量に対して０．１〜５０容量％の範囲で使用するのが好ましく、０．１〜１０容量％の範囲で使用するのがより好ましく、０．２〜５容量％の範囲で使用するのがさらに好ましい。親水性有機溶媒の使用量が、全溶液の容量に対して０．２〜２容量％といったごくわずかの量であっても、本発明においてはその効力を発揮しうる。
【００７７】
本発明の製造方法において、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒を併用する場合のそれぞれの溶媒の添加方法は特に限定されず、親水性有機溶媒と疎水性有機溶媒を適宜混合してから抽出溶媒として使用しても良いし、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に親水性有機溶媒を添加してから疎水性有機溶媒を添加してもよいし、その逆でも良い。
【００７８】
本発明の製造方法において、抽出時の温度は、特に制限されないが、通常０〜６０℃、好ましくは２０〜５０℃の範囲で実施できる。
【００７９】
抽出方法としては、回分抽出、連続抽出のどちらの方法でも行うことができるが、工業的には連続抽出が生産性の面で好ましく、連続抽出の中でも向流多段抽出が特に好ましい。回分抽出の場合の撹拌時間は、特に制限されないが、通常５分以上であり、連続抽出の場合の平均滞留時間は、特に制限されないが、通常１０分以上である。
【００８０】
本発明の製造方法においては、通常、微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液と有機溶媒、及び上記界面活性剤を所定時間混合して抽出を実施した後、これら混合液を静置させ、水相と、脂溶性生理活性物質を含んだ有機溶媒相とを分離させるが、油水界面の分離が著しく遅い場合においては、遠心分離機、連続遠心機、液体サイクロン等を用いて強制的に分離させることもできる。
【００８１】
上記のような本発明の製造方法を採用することで、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液中に含まれる脂溶性生理活性物質を高い効率で抽出することが可能である。本発明の製造法における抽出率は、通常７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、更に好ましくは９０％以上である。
ここでいう抽出率は、抽出前の微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液中に含まれる脂溶性生理活性物質の総量に対する、抽出操作終了後の抽出液に含まれる脂溶性生理活性物質の量の割合であり、具体的には後述する実施例のようにして求めることができる。
【００８２】
本発明の製造方法においては、以上の操作によって、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物から、有機溶媒中に脂溶性生理活性物質を抽出することで脂溶性生理活性物質を単離・回収できる。得られた脂溶性生理活性物質を含む有機溶媒溶液は、そのまま利用することもできるし、引き続き通常の精製方法に付すことによりさらに高度に精製することができる。
例えば、活性炭や白土等の吸着剤で精製した後、有機溶媒を留去して、脂溶性生理活性物質を含む抽出物あるいは脂溶性生理活性物質の精製物とすることもできる。また通常使用されるカラムクロマトグラフィーや液−液分配、その他水や有機溶媒による洗浄などの精製処理に付してもよい。なお、これらの精製処理は、単独もしくは数種組み合わせて行うこともできる。また必要に応じて、鹸化、酸化、還元、その他合成反応処理などの工程を加えることもできる。また晶析操作などで目的とする脂溶性生理活性物質を結晶体として得ることもできる。
【００８３】
例えば、目的とする脂溶性生理活性物質が補酵素Ｑ１０の場合には、本発明の製造方法によって、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物から、有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、得られた補酵素Ｑ１０を含有する抽出液を自体公知の方法により精製し補酵素Ｑ１０を得ることができる。例えば、所望により活性炭や白土等の吸着剤処理やカラムクロマトグラフィー等を用いて精製し、その前後で必要に応じて酸化又は還元処理を行い、晶析操作を用いて、高純度の補酵素Ｑ１０の結晶を取得することができる。
【００８４】
本発明の別の態様としては、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤及びアルキルエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤存在下に、有機溶媒と混合し、脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする脂溶性生理活性物質の精製方法が挙げられる。各定義や条件等は上記に挙げたものと同様である。
【実施例】
【００８５】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００８６】
各実施例における抽出率は以下のようにして算出した。抽出を行う前の補酵素Ｑ１０含有微生物細胞破砕液１ｍＬに、メタノール−クロロホルム（３：１）混合液を加えて総量５０ｍＬとし、２５℃で３０分攪拌後、菌体由来の固形物を固液分離し、得られた液層部分の補酵素Ｑ濃度を下記ＨＰＬＣ条件で測定して、抽出対象の微生物細胞破砕液中に含まれていた補酵素Ｑ量を算出した。同様に、抽出操作後の抽出液中の補酵素Ｑ濃度を下記ＨＰＬＣ条件で測定し、抽出された補酵素Ｑ量を算出し、以下の式により抽出率を求めた。
抽出率（％）＝抽出液に含まれる補酵素Ｑの重量／抽出前の微生物細胞破砕液中に含まれていた補酵素Ｑの重量×１００【００８７】
（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ４．６×２５０ｍｍ（ＹＭＣ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）
移動相：メタノール／ｎ−ヘキサン＝８５／１５
流速：１ｍＬ／分
検出：ＵＶ２７５ｎｍ【００８８】
（実施例１）
補酵素Ｑ１０を産生するサイトエラ・コンプリカタ（Saitoella complicata）ＩＦＯ１０７４８株を、１０Ｌの培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、マルトエキス３ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０）を用いて、好気的に２５℃で７２時間培養した。得られた微生物菌体を含む培養液を、圧力式ホモジナイザー（ラニー社製）により破砕圧力８０ＭＰａで２回破砕し、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞破砕液を調製した。
得られた微生物細胞破砕液に、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、ＡＤＥＫＡ社製）を３．３重量％の濃度となるよう添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、混合液の全液量に対する抽出残渣（下層の微生物由来固形物を含む水相部分）の容量比は０．３７であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は９０．８％であった。【００８９】
（実施例２）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、ＡＤＥＫＡ社製）を１．３重量％の濃度となるよう添加したもの３０容量部に、ヘキサン６９容量部、２−プロパノール１容量部をそれぞれ混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３３であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は９２．５％であった。【００９０】
（実施例３）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、ポリエーテルポリオール型の界面活性剤（アデカノールＬＧ−１２６、ＡＤＥＫＡ社製）を３．３重量％の濃度となるよう添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３９であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は７９．５％であった。【００９１】
（実施例４）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、アルキルエーテル型の界面活性剤（アデカトールＬＡ−７７５、ＡＤＥＫＡ社製）を３．３重量％の濃度となるよう添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３５であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８５．３％であった。【００９２】
（実施例５）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、アルキルエーテル型の界面活性剤（アデカトールＬＡ−１２７５、ＡＤＥＫＡ社製）を０．３重量％の濃度となるよう添加したものを３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたのちに、遠心分離機による強制油水分離を実施した。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は７１．３％であった。【００９３】
（実施例６）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、ＡＤＥＫＡ社製）を１．３重量％、ショ糖ステアリン酸エステル（Ｓ−１６７０、三菱化学フーズ社製）を０．３重量％の濃度となるようそれぞれ添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３２であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８４．６％であった。【００９４】
（実施例７）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、ＡＤＥＫＡ社製）を１．３重量％、エチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー型界面活性剤（プルロニックＴＲ−７０２、ＡＤＥＫＡ社製）を０．３重量％の濃度となるようそれぞれ添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３０であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８３．０％であった。【００９５】
（実施例８）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、ＡＤＥＫＡ社製）を１．３重量％、エチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー型界面活性剤（プルロニックＴＲ−７０１、ＡＤＥＫＡ社製）を０．３重量％の濃度となるようそれぞれ添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３１であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８９．９％であった。【００９６】
（実施例９）
エルゴステロールを産生するサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＩＦＯ０３０９株を、１０Ｌの培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、マルトエキス３ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０）を用いて、好気的に２８℃で７２時間培養した。得られた微生物菌体を、圧力式ホモジナイザー（ラニー社製）により破砕圧力８０ＭＰａで２回破砕し、エルゴステロールを含有する微生物細胞破砕液を調製した。
得られた微生物細胞破砕液に、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、ＡＤＥＫＡ社製）を３．３重量％の濃度となるよう添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３５であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、エルゴステロールの抽出率は８９．１％であった。【００９７】
（比較例１）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離を確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３５であったが、分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は６０．２％であった。【００９８】
（比較例２）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、リゾレシチン（デグサ社製）を０．７重量％の濃度となるよう添加したもの３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたが、油水分離が進まなかったため、遠心分離機による強制油水分離を実施した。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は６２．２％であった。【００９９】
（比較例３）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液に、ポリビニルアルコール（和光純薬社製）を３．３重量％の濃度となるよう添加したものを３０容量部に、ヘキサン７０容量部を混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３５であったが、分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は６１．９％であった。【０１００】
（参考例）
実施例１と同様に調製した菌体破砕液３０容量部に、ヘキサン５２容量部、２−プロパノール１８容量部の割合で混合し、４５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認されたが、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．４８と、使用した抽出溶媒の水相への移行量がかなり多い結果となった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は９１．５％であった。【０１０１】
表１に実施例１〜９、比較例１〜３、及び参考例における仕込み条件と、脂溶性生理活性物質の抽出率、及び抽出残渣の容量比の結果を示す。【０１０２】
【表１】
2012011589.tif 000002
【０１０３】
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は日本で出願された特願２０１０−１６４５３１を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【手続補正書】
【提出日】平成24年4月16日(2012.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ポリエーテルポリオール型界面活性剤及びアルキルエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤存在下に、
有機溶媒と混合し、
脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする、
脂溶性生理活性物質の製造方法であって、有機溶媒が、疎水性有機溶媒又は疎水性有機溶媒を含有するものであることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
脂溶性生理活性物質が、補酵素Ｑ１０であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
補酵素Ｑ１０が、還元型補酵素Ｑ１０、又は、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤が、少なくともポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
非イオン性界面活性剤が、２種類以上のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤を組み合わせた界面活性剤、又は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤ならびにショ糖脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ポリエーテルポリオール型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤及びアルキルエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤を組み合わせた界面活性剤であることを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤の添加量が、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対して、０．０１重量％以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
さらに親水性有機溶媒を併用することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
抽出は、連続抽出であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2012011589.tif 000003
2012011589.tif 000004
2012011589.tif 000005