(57)【要約】  生物由来原料から得られる脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に酸を加え脂肪族カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および含窒素組成物を安定的かつ効率的に回収する方法を提供することを課題とする。  生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程、晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程、および固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルし、且つリサイクルする晶析母液の量は晶析母液全量ではないことを特徴とする晶析母液リサイクル工程を含むことを特徴とする含窒素組成物の製造方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸塩および硫酸のアンモニウム塩から選ばれる少なくとも１つを回収するとともに含窒素組成物を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする含窒素組成物の製造方法。
（１）硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程
（２）晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程
（３）固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルし、且つリサイクルする母液の量は母液全量ではないことを特徴とする晶析母液リサイクル工程
【請求項２】
固液分離工程で得られた晶析母液を乾燥機で蒸発乾固し、硫酸のアンモニウム塩を回収する晶析母液乾燥工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項３】
生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加えた後、該水溶液と相分離可能な溶剤とを混合し接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる相分離工程とを含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項４】
相分離工程後の水溶液を蒸留し、水溶液から溶剤を除去する有機溶剤除去工程を含むことを特徴とする、請求項３に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項５】
有機溶剤除去後の水溶液を濃縮し、水溶液中の硫酸のアンモニウム塩の濃度を増加させる濃縮工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項６】
相分離工程後の水溶液にアルカリを加え、ｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を含むことを特徴とする、請求項３から請求項５のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項７】
抽残相中和工程で用いるアルカリが、アンモニアであることを特徴とする請求項６に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項８】
抽残相中和工程が、有機溶剤除去工程の後に行われることを特徴とする、請求項６または請求項７に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項９】
抽残相中和工程が、濃縮工程の前に行われることを特徴とする、請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項１０】
前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする晶析母液に含まれる、有機酸、糖類、アミノ酸およびタンパク質の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１５重量％以下であることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項１１】
前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする晶析母液に含まれる、有機酸の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、請求項１０に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする晶析母液の量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、１０％重量以上８０重量％未満であることを特徴とする、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の含窒素組成物の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法で製造された含窒素組成物であって、該含窒素組成物に含まれる全窒素の量が、１５重量％以上２１重量％未満で、かつ全窒素の９０重量％以上がアンモニウム性窒素であることを特徴とする含窒素組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の含窒素組成物を含む肥料原料。
【請求項１５】
請求項１３に記載の含窒素組成物を含む肥料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖およびセルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族カルボン酸アンモニウムを含む水溶液に硫酸を加え脂肪族カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および発酵副産物を含む含窒素組成物の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸およびアジピン酸などの脂肪族カルボン酸は、食品、医薬品およびその他化学品の合成原料として広く用いられている。これらの脂肪族カルボン酸は、従来、石油由来の原料より、工業的に製造されてきた。しかし、近年では、微生物を用いた発酵操作により、広い生物由来原料から高い炭素収率で、種々の脂肪族カルボン酸を製造することができる。例えば、コハク酸およびアジピン酸などは、発酵により製造することができる。【０００３】
発酵による脂肪族カルボン酸の製造において、原料となるのは、一般に糖類であり、グルコース、ブドウ糖およびセルロースなどである。しかし、多糖類が不純物として含まれる場合や、原料の糖類が微生物に完全に資化されずに残り、脂肪族カルボン酸に糖類が混入することがある。また、微生物を用いた発酵で、アンモニアを中和剤として用いることが広く知られているが、その場合、アミノ酸も副生する。【０００４】
アンモニアを中和剤として用いた場合、発酵液中の脂肪族カルボン酸はアンモニウム塩として存在するが、脂肪族カルボン酸を回収するには、酸で塩交換する必要がある。ここで酸として硫酸を用いると脂肪族カルボン酸とともに硫酸のアンモニウム塩が副生する。【０００５】
脂肪族カルボン酸の回収方法は多くの報告がある。一方、副生する硫酸のアンモニウム塩は、発酵副生物も多く含み、肥料として有用であるにもかかわらず、その回収方法について報告されたものはほとんどない。【０００６】
硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液からの硫酸のアンモニウム塩の回収方法としては晶析法が一般的であり、通常は充分な硫酸のアンモニウム塩の回収率を得るために、晶析母液のリサイクルを伴うことが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ただし、発酵副産物を含む硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から晶析により硫酸のアンモニウム塩を回収し、その母液をリサイクルすると、発酵副産物がリサイクル系内に蓄積し、液粘性を増加させるなど、晶析、後に続く固液分離において悪影響をおよぼす。【０００８】
一方、母液をリサイクルせずに硫酸のアンモニウム塩を回収しようとすると、その水溶液を直接乾燥することになるが、水溶液を直接乾燥するには乾燥機が限定されるばかりか、能力的に限界もあった。【０００９】
本発明は、生物由来原料であるグルコース、ブドウ糖およびセルロースなどから微生物変換によって得られる脂肪族カルボン酸アンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加え脂肪族カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および発酵副産物を含む含窒素組成物を安定的かつ効率的に回収する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に記載する本発明の製造方法により上記課題を解決できることを見出した。さらに本発明の製造方法で得られた含窒素組成物が含窒素肥料として有用なことを確認し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明の要旨は以下の［１］から［１２］にある。
［１］生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸塩、および硫酸のアンモニウム塩から選ばれる少なくとも１つを回収するとともに含窒素組成物を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むことを特徴とする含窒素組成物の製造方法。
（１）硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程
（２）晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程
（３）固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルし、且つリサイクルする母液の量は母液全量ではないことを特徴とする晶析母液リサイクル工程
［２］固液分離工程で得られた晶析母液を乾燥機で蒸発乾固し、硫酸のアンモニウム塩を回収する晶析母液乾燥工程を含むことを特徴とする、［１］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［３］生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液に硫酸を加えた後、該水溶液と相分離可能な溶剤とを混合し接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる相分離工程を含むことを特徴とする、［１］または［２］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［４］相分離工程後の水溶液を蒸留し、水溶液から溶剤を除去する有機溶剤除去工程を含むことを特徴とする、［３］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［５］有機溶剤除去後の水溶液を濃縮し、水溶液中の硫酸のアンモニウム塩の濃度を増加させる濃縮工程を含むことを特徴とする、［４］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［６］相分離工程後の水溶液にアルカリを加え、ｐＨを４以上８以下の範囲にする抽残相中和工程を含むことを特徴とする、［３］から［５］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。
［７］抽残相中和工程で用いるアルカリが、アンモニアであることを特徴とする［６］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［８］抽残相中和工程が、有機溶剤除去工程の後に行われることを特徴とする、［６］または［７］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［９］抽残相中和工程が、濃縮工程の前に行われることを特徴とする、［６］から［８］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。  
［１０］前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸、糖類、アミノ酸およびタンパク質の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１５重量％以下であることを特徴とする、［１］から［９］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。
［１１］前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、０．１重量％以上１０重量％以下であることを特徴とする、［１０］に記載の含窒素組成物の製造方法。
［１２］前記晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液の量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、１０％重量以上８０重量％未満であることを特徴とする、［１］から［９］のいずれか１つに記載の含窒素組成物の製造方法。
［１３］［１］から［１２］いずれか１に記載の製造方法で製造された含窒素組成物であって、該含窒素組成物に含まれる全窒素が、１５重量％以上２１重量％未満で、かつ全窒素の９０重量％以上がアンモニウム性窒素であることを特徴とする含窒素組成物。
［１４］［１３］に記載の含窒素組成物を含む肥料原料。
［１５］［１３］に記載の含窒素組成物を含む肥料。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪酸カルボン酸を回収する方法において、副生した硫酸のアンモニウム塩および発酵副産物を含む含窒素組成物を効率的かつ安定的に脂肪族カルボン酸を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、含窒素組成物の製造方法の一形態を示す図面である。
【図２】図２は、プラスミドｐＭＪＰＣ１７．２の構築手順を示す図であって、下線の数字は当該配列番号の配列からなるプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態につき詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は本発明の実施形態の代表例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変形して実施することができる。
【００１５】
本発明の含窒素組成物の製造方法は、生物由来原料から得られた脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、脂肪族カルボン酸、脂肪族カルボン酸塩、および硫酸のアンモニウム塩から選ばれる少なくとも１つを回収するとともに含窒素組成物を製造する方法であって、以下の工程（１）〜（３）を含むものである。
（１）硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する晶析工程
（２）晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩を固液分離する固液分離工程
（３）固液分離工程で得られた晶析母液を、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルすることを特徴とする晶析母液リサイクル工程
【００１６】
＜晶析工程＞
晶析工程では、硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から、硫酸のアンモニウム塩を濃縮晶析する。濃縮晶析では、硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液から水を蒸発させ、硫酸のアンモニウム塩を飽和溶解度以上に濃縮することで、硫酸のアンモニウム塩を析出させる。
【００１７】
晶析は常圧で行っても、減圧で行ってもよいが、減圧で行えば、水の気化熱による硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液の冷却を伴い、硫酸のアンモニウム塩の飽和溶解度の温度依存性による析出も期待でき、収率の観点から好ましい。
【００１８】
特に、晶析圧力は１〜５０ｋＰａとすることが好ましく、２〜２０ｋＰａとすることがより好ましい。また、晶析温度は操作圧力で決まり、５〜８０℃とすることが好ましく、１０〜６０℃とすることがより好ましい。
【００１９】
晶析圧力を１ｋＰａ以上とすることにより、減圧のための設備を小さくすることができ、蒸発した水を凝縮回収が容易となる。また、晶析圧力を５０ｋＰａ以下とすることにより、晶析温度が高くなるのを防ぎ、硫酸のアンモニウム塩の収率を向上することができる。
【００２０】
減圧の発生装置は特に限定するものではないが、保守および管理の面から、水またはスチームエゼクターが好ましい。また、蒸発水の凝縮にはバロメトリックコンデンサーが広く用いられる。
【００２１】
晶析操作はバッチ操作であっても連続操作であっても構わないが、硫酸のアンモニウム塩を効率的に晶析するとともに晶析のために要するエネルギーを小さく生産でき、且つ結晶サイズのばらつきを小さくできるなどの理由により、連続操作が好ましい。また晶析装置は特殊な晶析槽である必要は無く、公知の攪拌槽を用いることができる。
【００２２】
＜固液分離工程＞
晶析で得られた硫酸のアンモニウム塩スラリーは固液分離操作により硫酸のアンモニウム塩結晶および母液を分離する。分離方法は特に限定するものではなく、例えば、ろ過分離および沈降分離などが挙げられる。また操作はバッチでも連続でもよい。
【００２３】
効率の良い固液分離機として、例えば、連続式の遠心ろ過機およびデカンター等の遠心沈降機などが挙げられる。また、求められる硫酸のアンモニウム塩の純度により、固液分離操作で回収したウェットケーキは、冷水等でリンスすることができる。
【００２４】
さらに、回収した硫酸のアンモニウム塩結晶は通常乾燥する。乾燥方法は特に限定するものではないが、例えば、バンド式乾燥機、回転式乾燥機および流動層式乾燥機などが挙げられる。また、後述する晶析母液乾燥工程で得られる硫酸のアンモニウム塩と乾燥機内で混合することを考えると、回転式乾燥機および流動層式乾燥機などが好ましい。
【００２５】
＜晶析母液リサイクル工程＞
固液分離工程で得られた晶析母液の少なくとも一部は、晶析工程および晶析工程より前の工程から選ばれる少なくとも１の工程にリサイクルすることができる。ただし本発明の製造方法においては、リサイクル量は晶析母液全量ではない。
【００２６】
晶析母液のリサイクル量は晶析母液の組成、性状によるので一概に決められるものではないが、晶析母液の１０重量％以上であることが好ましく、２０重量％以上であることがより好ましく、３０重量％以上であることが更に好ましく、４０重量％以上であることが特に好ましい。また、９９重量％未満であることが好ましく、９０重量％未満であることがより好ましく、８０重量％未満であることが更に好ましく、７５重量％未満であることが特に好ましい。
【００２７】
晶析母液中には、硫酸のアンモニウム塩だけでなく発酵由来の種々共存物、例えば、リンゴ酸などの有機酸、アラニンおよびバリンなどのアミノ酸、タンパク質並びに糖類などを含んでいる。晶析母液全量をリサイクルすると、これら共存物がリサイクル系内に蓄積し、リサイクル系内の液粘性が増加していき、晶析工程、固液分離工程に支障をきたす。
【００２８】
また、共存物を除去するために活性炭で処理したり、母液のリサイクル量を少なくすると、製造する含窒素組成物の量が少なくなったり、処理工程が増えたりすることにより、製造効率が低下して好ましくない。
【００２９】
このため、晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸、糖類、アミノ酸およびタンパク質の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、全リサイクル工程を通して０．１重量％以上１５重量％以下であることが好ましく、１０重量％以下であることがより好ましい。
【００３０】
更に、晶析母液リサイクル工程においてリサイクルする母液に含まれる、有機酸の合計量が、固液分離工程で得られた晶析母液に対して、全リサイクル工程を通して０．１重量％以上１０重量％以下であることが好ましく、８重量％以下であることがより好ましい。
【００３１】
晶析母液の粘度は、リサイクル量を制御することにより、晶析する際の温度において、０．５〜１００ｃＰとなるよう制御することが好ましく、１〜５０ｃＰであることがより好ましく、１〜２０ｃＰであることがさらに好ましい。
【００３２】
晶析母液の粘度を１００ｃＰ以下とすることにより、特に固液分離工程に悪影響がおよぶのを防ぐ。例えばデカンターのような連続式遠心沈降機で固液分離を行う場合に、晶析母液の粘度が高くなりすぎるのを防ぎ、結晶沈降速度の低下を抑制し、固液分離ができなくなるのを防ぐ。晶析母液の粘度の上昇を抑えるには、晶析母液中の硫酸のアンモニウム塩以外の非揮発性成分濃度を３０重量％以下に制御することが好ましい。
【００３３】
＜晶析母液乾燥工程＞
分離した母液は硫酸のアンモニウム塩の他発酵由来の種々不純物、例えば、有機酸、アミノ酸、タンパク質および糖類などを含んでおり液肥もしくはその原料として有効であるが、直接乾燥して粉体として回収することもできる。
【００３４】
乾燥方法は特に限定するものではないが、液状物から粉体を回収する方法として、例えば、スプレードライヤーおよびディスクドライヤーなどの乾燥機が好ましい。また、回収した硫酸のアンモニウム塩を含む組成物は、晶析工程で得られた硫酸のアンモニウム塩と混合することもできる。
【００３５】
＜接触工程と相分離工程＞
本発明の脂肪族カルボン酸の製造方法では、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる接触工程と、接触工程後に液を相分離させる相分離工程を有する。
【００３６】
相分離工程において、溶剤相（以下、抽出相と記載することがある）、相界面に生成する固形分を含む相（以下、中間相と記載することがある）、水溶液相（以下、抽残相という記載することがある）は、以下のように回収することができる。
【００３７】
接触工程をバッチ操作により行う場合には、例えば、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液に該水溶液と相分離可能な溶剤を加え、接触させて充分混合した後に、相分離工程において、抽出相、中間相および抽残相を、各相付近から排出口により取出す方法、および前記接触を行った容器の底部から順次取り出す方法等により、それぞれ分離回収することができる。固形分を多く含む中間相は抽出相とともに取り出すことも可能であるし、抽残相とともに取り出すことも可能である。
【００３８】
また、例えば、接触工程を連続操作により行う場合には、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触混合するミキサーを有するミキサー部と、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させる工程（以下、相分離工程と記載することがある）に適用するセトラーを有するセトラー部とからなる、接触装置（以下、ミキサーセトラー型抽出機と記載することがある）を用いた相分離工程において、セトラー部で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収することができる。
【００３９】
（接触装置）
接触装置は脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と溶剤との接触、溶剤相および水溶液相の回収、並びに固形分の除去ができればどのような装置であってもかまわないが、装置が簡単で操作も容易な、上記のミキサーセトラー型抽出装置が好ましい。
【００４０】
ミキサーは、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とが充分混合すれば如何なる方式でもよく、例えば、攪拌装置を有する容器およびスタティックミキサーなどが挙げられる。
【００４１】
ただし攪拌装置を有する容器を用いるケースにおいては、攪拌により容器内に巻き込まれた空気などの気泡が発生した固形分に付着し、後続のセトラー部における固形分の相分離を著しく阻害するので、空気などを巻き込まない条件で攪拌することが好ましい。操作許容範囲の広さおよび設備費用の観点から、ミキサーはスタティックミキサーとするのが好ましい。
【００４２】
（相分離装置）
セトラーは、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させた後の液を相分離することが可能なものであれば如何なる方式であってもよい。例えば、一槽で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するもの、並びに多槽式で抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ回収するもの、回転装置による遠心分離により各相を回収するもの、などが挙げられる。
【００４３】
固形物を多く含む中間相は、通常、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を含むため、中間相を固液分離し、抽出相の液および抽残相の液から選ばれる少なくとも１種の液を分離し、回収することができる。
【００４４】
回収した液は、相分離工程以降の工程に再利用することもできるし、接触工程以前の工程に再利用することもできる。再利用することで脂肪族カルボン酸および／または硫酸のアンモニウム塩の製造効率を高めることができるので好ましい。
【００４５】
固液分離方法は特に限定されるものではなく、沈降分離、ろ過分離などの方法を用いることができる。沈降分離においては、重力場で固形分を沈降分離しても、また遠心力場において固形分を沈降分離してもよい。沈降速度を高めるため、遠心沈降分離が望ましい。
【００４６】
固液分離の操作の方式は、バッチ操作でも連続操作でも構わない。連続式の遠心沈降機としては、例えば、スクリューデカンターおよび分離板式遠心沈降機が挙げられる。ろ過分離において、その方法は、ろ材、ろ過圧力、連続操作・バッチ操作などで分類されるが、いずれも固形分を抽出相および／または抽残相と分離できれば特に限定するものではない。
【００４７】
ただし、ろ材の目開きは０．１μｍ以上１０μｍ以下が好ましい。０．１μｍ以下では、透過流束が小さくなりすぎるため、ろ過に時間がかかりすぎる虞がある、一方１０μｍ以上では、固形分の分離が不十分となる虞がある。
【００４８】
また、ろ材の材質は溶剤に不溶である必要があり、テトラフルオロエチレンなどのフッ素系樹脂からなるものを用いることが好ましい。ろ過は、真空式、加圧式および遠心式のいずれも用いることができる。さらに、その方式は、連続式およびバッチ式のいずれでも構わない。
【００４９】
（溶剤）
接触工程において使用される溶剤は、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液と相分離するものであれば特に制限は無いが、無機性値／有機性値の比（以下、Ｉ／Ｏ値と略記することがある）が０．２以上２．３以下であることが好ましく、Ｉ／Ｏ値が０．３以上２．０以下であることがより好ましい。溶剤のＩ／Ｏ値を当該範囲とすることにより、脂肪族カルボン酸を選択的に抽出して、効率よく夾雑不純物および硫酸のアンモニウム塩と分離できる。
【００５０】
また、常圧（１気圧）における溶剤の沸点は、４０℃以上であることが好ましく、６０℃以上であることがより好ましい。また、１２０℃以下であることが好ましく、１００℃以下であることがより好ましく、９０℃以下であることが特に好ましい。
【００５１】
溶剤の沸点を前記範囲とすることにより、溶剤が気化して引火する危険性、溶剤が気化して脂肪族カルボン酸の抽出効率が低下するという問題、および溶剤のリサイクルがしにくいといった問題を回避することができる。また、使用後の溶剤を蒸留などの方法により分離したり、精製して再利用したりする際の必要熱量が少なくてすむという利点がある。
【００５２】
無機性値及び有機性値は、有機概念図論［「系統的有機定性分析」藤田穆、風間書房（１９７４）］により提案されており、有機化合物を構成する官能基に対して予め設定された数値を基に有機性値及び無機性値を算出し、その比を求めて得られる。
【００５３】
Ｉ／Ｏ値が０．２以上２．３以下であり、常圧で沸点が４０℃以上の溶剤としては、例えば、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンおよびアセトン等のケトン系溶媒、テトラヒドロフランおよびジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトニトリル等のニトリル系溶媒、並びにプロパノール、ブタノールおよびオクタノール等の炭素鎖３以上のアルコールが挙げられる。
【００５４】
各溶剤のＩ／Ｏ値および沸点を以下の表に示す。
【００５５】
【表１】
2011087062.tif 000003
【００５６】
本接触工程により、脂肪族カルボン酸を選択的に溶剤中に抽出し、糖類、アミノ酸類および無機塩類を主に水溶液相に分配することで、両者を効率的に分離することができる。硫酸のアンモニウム塩は、ほぼ全てが水溶液相に回収される。
【００５７】
硫酸のアンモニウム塩は、水溶液相に回収されたアミノ酸および糖類とともに、濃縮、晶析および乾燥等の処理により、アミノ酸および糖類を、有機分を含む硫酸のアンモニウム塩として回収することができる。該硫酸のアンモニウム塩は、有機物を適度に含むことから肥料として有用である。
【００５８】
（接触操作）
接触工程における、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と、該水溶液と相分離可能な溶剤とを接触させる操作は、一段で行っても、多段で行ってもよいが、多段で行うことが好ましい。また、溶剤は、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液に対して並流で流しても、向流で流しても構わない。
【００５９】
接触工程は連続的に行ってもよいし、回分的に行っても構わない。特に好ましい形態を、図１に示す。図１に示すように、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含む水溶液と溶剤とをミキサーセトラーで混合した後に液々分離し、抽出相、中間相および抽残相をそれぞれ分離回収し、中間相を固液分離し、分離回収した液を必要に応じて相分離した後に、相分離工程以後の工程に戻す形態が好ましい。
【００６０】
上記のような溶剤と、脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液とを接触させる接触工程により、脂肪族カルボン酸を溶剤に抽出する。ここで、溶剤は、脂肪族カルボン酸を含有する水溶液の接触時の温度における容積１に対し０．５〜５の容積で加えることが好ましく、容積１に対し１〜３の容積で加えることがより好ましい。
【００６１】
溶剤と脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩を含有する水溶液とを接触させる際の温度は、脂肪族カルボン酸が抽出される温度であれば特に限定されないが、３０〜６０℃が好ましい。接触温度を３０℃以上とすることにより、溶剤の粘度が上昇するのを抑え、生成した固形分の沈降に要する時間が短くなり、固形分が溶剤相に浮遊するのを防ぎ、溶剤相に固形分が混入するのを防ぐことができる。一方、接触温度を６０℃以下とすることにより、脂肪族カルボン酸の溶剤相への移行率が高くなり、抽出率が高く、効率が良い。
【００６２】
接触する際の時間は、脂肪族カルボン酸が充分に抽出される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件にもよるが通常１秒〜５時間程度が好ましい。接触時間を１秒以上とすることにより、脂肪族カルボン酸の溶剤相への抽出が十分となる。また、接触時間を５時間以下とすることにより、接触装置が無用に大きくなるのを防ぎ、効率的であるとともに、脂肪族カルボン酸に共存するタンパク質類の溶剤による変性を抑え、固形分量を低減することができる。
【００６３】
接触する際の圧力は、脂肪族カルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作することが好ましい。
【００６４】
（相分離操作）
相分離工程における相分離操作は、槽で一定時間静置することでも可能であるし、遠心分離装置により行うこともできる。上記のようなミキサーセトラー型抽出機では、接触混合することにより得られた混合液を静置することで相分離させるセトラー部を有している。該セトラー部において、液を一定時間静置することにより相分離することができる。相分離工程は連続的に行ってもよいし、回分的に行ってもよい。
【００６５】
相分離する際の温度は、各相が分離可能な温度であれば特に限定されないが、３０〜６０℃が好ましく、かつ接触操作と同程度の温度で処理することが好ましい。相分離温度を３０℃以上することにより、液粘性が高くなるのを防ぎ固形分の分離が容易となるとともに、溶剤相に固形分が混入するのを防ぎ、固形分に混入する溶剤量が抑えることができる。また、相分離温度を６０℃以下とすることにより、相分離の過程で脂肪族カルボン酸が水溶液中に逆抽出されるのを防ぐことができる。
【００６６】
相分離する際の時間は、各相が相分離される時間であれば特に限定されず、接触装置、接触条件、相分離方法にもよるが通常１分〜５時間程度が好ましい。相分離時間を１分以上とすることにより、相分離が十分となり、溶剤相への水溶液または固形分の混入を防ぐとともに、水溶液相への溶剤または固形分の混入を防ぐ。一方、分離時間を５時間以下とすることにより、相分離装置が無用に大きくなるを防ぎ、効率的である。
【００６７】
また相分離する際の圧力は、脂肪族カルボン酸が充分に抽出される圧力であれば特に限定されないが、連続的に行う場合には、通常大気圧で操作することが好ましい。
【００６８】
＜有機溶剤除去工程＞
回収された抽残相には数％の溶剤が含まれるため、除去する必要がある。すなわち抽出工程で得られた抽残相は蒸留操作により溶剤を除去する。蒸留方法、操作条件は特に限定されるものではないが、最終的に蒸留後の釜残液中の溶剤が１重量％以下であることが好ましく、０．１重量％以下であることがより好ましく、０．０１重量％以下であることがさらに好ましい。
【００６９】
すなわち、用いる溶剤により単蒸留で溶剤を留去してもいいし、蒸留塔で還留をかけながら留去してもいい。またその操作は常圧で行っても、減圧で行ってもいい。さらにその操作は連続でも、バッチでも構わない。回収した溶剤は抽出溶剤として再利用できる。
【００７０】
＜濃縮工程＞
有機溶剤除去工程後の水溶液において硫酸のアンモニウム塩の濃度は、一般にその濃度が低いので晶析工程飽和溶解度近くまで濃縮することが望ましい。濃縮は有機溶剤除去と共に行っても良いし、有機溶剤除去後に行っても良い。ただし濃縮を有機溶剤の除去と共に行なうと蒸留装置が大きくなるため、有機溶剤を蒸留塔で留去した後に濃縮する方法が好ましい。
【００７１】
濃縮方法、装置は特に限定されるものではない。例えば、操作条件は常圧でも、減圧でも構わない。さらに、その操作は連続でも、バッチでも構わない。また、装置としては、例えば、加熱缶タイプおよび薄膜蒸発タイプなどが挙げられる。さらに省エネルギーの観点から、多重効用缶およびヒートポンプなども利用できる。
【００７２】
＜抽残相中和工程＞
通常、抽残相は酸性であるので、回収した硫酸のアンモニウムの塩を肥料または肥料原料として用いるには、アルカリを添加することで中性付近まで中和することが好ましい。ここではアルカリとしてアンモニアを用い、ｐＨを４〜８程度に調整するのが好ましい。
【００７３】
中和はいずれの工程で行ってもよいが、酸性の抽残相を高温でハンドリングする工程においては装置の腐食の懸念があるため、極力はやい工程で中和するのが好ましい。ただし、中和処理を溶剤除去工程前に行うと、回収した溶剤が着色するため、中和は溶剤除去後に行うのがより好ましい。ここで、中和後に溶剤除去を行ったときに回収された溶剤が着色する原因は不明である。
【００７４】
＜その他の工程＞
（脂肪族カルボン酸アンモニウム塩の硫酸による塩交換）
脂肪族カルボン酸は発酵液中では脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩の形で存在する。発酵液から脂肪族カルボン酸を回収するには、先ず脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩を脂肪族カルボン酸へ変換することが好ましい。すなわち、脂肪族カルボン酸のアンモニウム塩に硫酸を加え、塩交換することで脂肪族カルボン酸および硫酸のアンモニウム塩に変換することが好ましい。
【００７５】
＜含窒素組成物＞
本発明で製造する含窒素組成物は、硫酸のアンモニウム塩だけでなく、発酵由来に必然的に共存する種々の化合物、例えば、有機酸、アミノ酸、タンパク質および糖類などを含んでおり、肥料等の原料として有用である。また、これら硫酸のアンモニウム塩には、発酵で用いられた微生物の乾燥処理品なども混合することも有効である。
【００７６】
＜脂肪族カルボン酸＞
本発明の脂肪族カルボン酸としては、具体的には、例えば、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、セバシン酸、リンゴ酸、フマル酸、オキザロ酢酸、２−オキソグルタル酸、シス−アコニット酸およびドデカン二酸等の、炭素数が２以上４０以下の鎖状カルボン酸が挙げられる。これらの中では、アジピン酸およびコハク酸が好ましい。
【００７７】
本発明において、これらの脂肪族カルボン酸は、生物由来原料から誘導されるものである。生物由来原料としては、例えば、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙、製紙残渣、水産物残渣、家畜排泄物、下水汚泥および食品廃棄物等が挙げられる。
【００７８】
この中でも、木材、稲わら、籾殻、米ぬか、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、おから、コーンコブ、タピオカカス、バガス、植物油カス、芋、そば、大豆、油脂、古紙および製紙残渣等の植物資源が好ましい。
【００７９】
より好ましくは、木材、稲わら、籾殻、古米、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバ、サゴヤシ、芋、油脂、古紙および製紙残渣であり、最も好ましくは、とうもろこし、サトウキビ、キャッサバおよびサゴヤシである。
【００８０】
これらの生物由来原料は、一般に、窒素元素、Ｎａ、Ｋ、ＭｇおよびＣａ等の多くのアルカリ金属並びにアルカリ土類金属を含有する。  
【００８１】
そしてこれらの生物由来原料は、特に限定はされないが、例えば、酸またはアルカリ等の化学処理、微生物を用いた生物学的処理、および物理的処理等の公知の前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。
【００８２】
前記工程には、特に限定はされないが、例えば、生物由来原料をチップ化する、削るおよび擦り潰す等の前処理による微細化工程が含まれる。必要に応じて、更にグラインダーやミルでの粉砕工程が含まれる。
【００８３】
こうして微細化された生物由来原料は、更に前処理・糖化の工程を経て炭素源へ誘導される。その具体的な方法としては、例えば、硫酸、硝酸、塩酸および燐酸等の強酸での酸処理、アルカリ処理、アンモニア凍結蒸煮爆砕法、溶媒抽出、超臨界流体処理および酸化剤処理等の化学的方法、微粉砕、蒸煮爆砕法、マイクロ波処理および電子線照射等の物理的方法、並びに微生物または酵素処理による加水分解等の生物学的処理が挙げられる。
【００８４】
上記の生物由来原料から誘導される炭素源としては、通常、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボースおよびタガトース等のヘキソース、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロースおよびリブロース等のペントース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、澱粉およびセルロース等の２糖・多糖類、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノクチン酸、アラキジン酸、エイコセン酸、アラキドン酸、ベヘニン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リグノセリン酸およびセラコレン酸等の脂肪酸、グリセリン、マンニトール、キシリトールおよびリビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられる。このうちグルコース、マルトース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロースおよびセルロースが好ましい。
【００８５】
本発明においては、これらの生物由来原料から誘導される炭素源から脂肪族カルボン酸が誘導される。具体的には、例えば、これらの炭素源を用いて、微生物変換による発酵法、および加水分解・脱水反応・水和反応・酸化反応・還元反応等の反応工程を含む化学変換法並びにこれらの発酵法と化学変換法の組み合わせによりカルボン酸が合成される。これらの中でも脂肪族カルボン酸生産能を有する微生物を利用した微生物変換による発酵法が好ましい。
【００８６】
脂肪族カルボン酸生産能を有する微生物は脂肪族カルボン酸生産能を有する微生物であるかぎり特に制限されないが、例えば、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌、バチルス属細菌およびコリネ型細菌などが挙げられ、好気性微生物、通性嫌気性微生物または微好気性微生物を使用することが好ましい。
【００８７】
好気性微生物としては、例えば、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌などが挙げられる。中でもコリネ型細菌がより好ましい。
【００８８】
コリネ型細菌は、これに分類されるものであれば特に制限されないが、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌などが挙げられる。このうち、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）に分類される細菌がより好ましい。
【００８９】
脂肪族カルボン酸生産菌としてコハク酸生産菌を用いる場合、後述の実施例に記載のように、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が増強され、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下した株を用いることが好ましい。
【００９０】
微生物変換における反応温度および圧力等の反応条件は、選択される菌体およびカビなど微生物の活性に依存することになるが、カルボン酸を得るための好適な条件を各々の場合に応じて選択すればよい。
【００９１】
微生物変換においては、ｐＨが低くなると微生物の代謝活性が低くなったり、または微生物が活動を停止するようになり、製造歩留まりが悪化したり、微生物が死滅するため、通常は中和剤を使用することが好ましい。通常はｐＨセンサーによって反応系内のｐＨを計測し、所定のｐＨ範囲となるように中和剤の添加によりｐＨを調節することが好ましい。
【００９２】
ｐＨ値は、用いる菌体、カビ等の微生物の種類に応じて、その活性が最も有効に発揮される範囲に調整することが好ましい。中和剤の添加方法については特に制限はなく、連続添加であっても間欠添加であってもよい。
【００９３】
本発明において中和剤としては、例えば、アンモニアおよび炭酸アンモニウムなどが挙げられる。
【００９４】
本発明においては、微生物変換後の発酵液は、その後の精製工程での操作性や効率性を考慮して適宜濃縮してもよい。濃縮方法としては、特に限定されないが、例えば、不活性ガスを流通させる方法、加熱により水を留去させる方法および減圧で水を留去させる方法並びにこれらを組み合わせる方法などが挙げられる。
【００９５】
尚、本発明の方法において発酵液を用いる場合、微生物を除去した後の発酵液を用いることが好ましい。微生物の除去方法は特に限定は無いが、沈降分離、遠心分離およびろ過分離並びにそれらを組み合わせた方法などが用いられる。
【００９６】
工業的には、遠心分離および膜ろ過分離などの方法で行うことが好ましい。遠心分離においては、遠心沈降および遠心ろ過などを用いることができる。
【００９７】
遠心分離において、その操作条件は特に限定されるものではないが、通常１００Ｇ〜１００，０００Ｇの遠心力で分離することが好ましい。またその操作は連続式でも、バッチ式でも使用できる。
【００９８】
また膜ろ過分離においては、精密ろ過および／または限外ろ過等を使用することが出来る。膜の材質は特に限定は無く、例えば、ポリオレフィン、ポリスルフィン、ポリアクリロニトリルおよびポリフッ化ビニリデン等の有機膜でも、セラミック等の無機材質の膜でも使用できる。また操作方法としては、デッドエンド型およびクロスフロー型のいずれでも用いることができる。
【００９９】
膜ろ過分離では、微生物が膜に目詰まりすることが多いので、遠心分離などで微生物を粗取りを行ってから膜ろ過を行うなどの方法も用いられる。尚、分離された微生物は単独で、または本法で規定する含窒素組成物に混合し肥料とすることも可能である。
【実施例】
【０１００】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。本実施例における酸類、糖類の定量分析は、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を用い、アミノ酸の定量分析はアミノ酸分析計を用い以下の条件で測定を行った。またタンパク質の定量は試料を塩酸により加水分解処理し、加水分解前後の総アミノ酸量の増分をタンパク質量と見なした。【０１０１】
＜酸類、糖類の分析＞
カラム；信和化工（株）製  ＵＬＴＲＯＮ  ＰＳ−８０Ｈ  ８．０ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ
溶離液：水（過塩素酸）（過塩素酸６０％水溶液１．８ｍｌ／１Ｌ−Ｈ２Ｏ）
温度：６０℃【０１０２】
＜アミノ酸の分析＞
装置：日立アミノ酸分析計  Ｌ−８９００
分析条件：生体アミノ酸分離条件−ニンヒドリン発色法（５７０ｎｍ，４４０ｎｍ）
標準品：ＰＦ（和光アミノ酸混合液ＡＮＩＩ型０．８ｍｌ＋Ｂ型０．８ｍｌ→１０ｍｌ）
注入量：１０μｌ【０１０３】
＜タンパク質定量のための加水分解処理＞
試料１０ｍｇ或いは１００ｍｇを精秤し、純水で１ｍｌ定容としたものを、２００ｕｌ分注、乾固し、塩酸雰囲気下１５０℃、１時間加熱し、タンパク質を加水分解処理した。
これを乾固させた後純水２００ｕｌを加えて再溶解させ、０．４５ｕｍフィルターでろ過後、ろ液をアミノ酸の分析に供した。【０１０４】
＜コハク酸発酵菌株の作製＞
（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３は、１９７５年４月２８日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−３０６８として寄託され、１９８１年５月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７の受託番号で寄託されている。【０１０５】
Ａ培地［尿素  ２ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ＭｎＳＯ４・４−５Ｈ２Ｏ６ｍｇ、ビオチン  ２００μｇ、チアミン  ２００μｇ、イーストエキストラクト  １ｇ、カザミノ酸  １ｇ、グルコース  ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍｌに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ  ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍｌに懸濁した。【０１０６】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。【０１０７】
前記溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００Ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。
遠心分離（１５，０００Ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。【０１０８】
（Ｂ）ＰＣプロモーター置換用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のＮ末端領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６のＣｇｌ０６８９）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１および配列番号２）を用いたＰＣＲによって行った。尚、配列番号１のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。【０１０９】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。【０１１０】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で１分らなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は４分とした。【０１１１】
増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．９ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。【０１１２】
一方、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来で構成的に高発現するＴＺ４プロモーター断片はプラスミドｐＭＪＰＣ１（日本国特開２００５−９５１６９号公報）を鋳型とし、配列番号３および配列番号４に記載の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲにより調製した。尚、配列番号４のＤＮＡは５’末端がリン酸化されたものを用いた。【０１１３】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、  ０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。【０１１４】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒分らなるサイクルを２５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は３分とした。【０１１５】
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．５ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行い、これをＴＺ４プロモーター断片とした。【０１１６】
上記にて調製したＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とＴＺ４プロモーター断片を混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結後、制限酵素ＰｓｔＩで切断し、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収し、これをＴＺ４プロモーター：ＰＣ遺伝子Ｎ末端断片とした。さらにこのＤＮＡ断片と大腸菌プラスミドｐＨＳＧ２９９（宝酒造製）をＰｓｔＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。【０１１７】
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  カナマシンおよび５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断することにより、約１．０ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．１と命名した。【０１１８】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の５’上流領域のＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５および配列番号６）を用いたＰＣＲによって行った。【０１１９】
反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．３μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。【０１２０】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。【０１２１】
増幅産物の確認は、１．０％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約０．７ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。【０１２２】
回収したＤＮＡ断片は、Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ：宝酒造製）により５’末端をリン酸化した後、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて大腸菌ベクターｐＵＣ１１９（宝酒造製）のＳｍａＩ部位に結合し、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。【０１２３】
この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌ  アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、配列番号７および配列番号６で示した合成ＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲ反応に供した。【０１２４】
反応液組成：上記プラスミド１ｎｇ、Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）  ０．２μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．２μＭ各々プライマー、０．２５μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を２０μＬとした。【０１２５】
反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で５０秒からなるサイクルを２０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は５分とした。【０１２６】
このようにして挿入ＤＮＡ断片の有無を確認した結果、約０．７ｋｂの増幅産物を認めるプラスミドを選抜し、これをｐＭＪＰＣ５．１と命名した。【０１２７】
次に、上記ｐＭＪＰＣ１７．１およびｐＭＪＰＣ５．１をそれぞれ制限酵素ＸｂａＩで切断後混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。これを制限酵素ＳａｃＩおよび制限酵素ＳｐｈＩで切断したＤＮＡ断片を０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離し、約１．７５ｋｂのＤＮＡ断片をＱＩＡＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて回収した。【０１２８】
このＰＣ遺伝子の５’上流領域とＮ末端領域の間にＴＺ４プロモーターが挿入されたＤＮＡ断片を、ｓａｃＢ遺伝子を含むプラスミドｐＫＭＢ１（日本国特開２００５−９５１６９号公報）をＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造製）を用いて連結した。【０１２９】
得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌカナマシンおよび５０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより、約１．７５ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＭＪＰＣ１７．２と命名した（図２）。【０１３０】
（Ｃ）ＰＣ増強株の作製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ＬＤＨ活性が低下した株：日本国特開２００５−９５１６９号公報）の形質転換に用いるプラスミドＤＮＡは、ｐＭＪＰＣ１７．２のプラスミドＤＮＡ用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から再調製した。【０１３１】
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ株の形質転換は電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１４４，ｐ．１８１−１８５，１９９３）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン  ２５μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ寒天培地［トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、グルコース  ２０ｇ、及び寒天１５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］に塗抹した。【０１３２】
この培地上に生育した株は、ｐＭＪＰＣ１７．２がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのＰＣ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。【０１３３】
次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした。結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。【０１３４】
この様にして得られた株の中には、そのＰＣ遺伝子の上流にｐＭＪＰＣ１７．２に由来するＴＺ４プロモーターが挿入されたものと野生型に戻ったものが含まれる。ＰＣ遺伝子がプロモーター置換型であるか野生型であるかの確認は、ＬＢＧ培地にて液体培養して得られた菌体を直接ＰＣＲ反応に供し、ＰＣ遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。【０１３５】
ＴＺ４プロモーターおよびＰＣ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号８および配列番号９）を用いて分析すると、プロモーター置換型では６７８ｂｐのＤＮＡ断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、ＴＺ４プロモーターが挿入された株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−５／ΔＬＤＨと命名した。【０１３６】
＜ジャーファーメンターによるコハク酸発酵液の調製＞
（Ａ）種培養
尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇを蒸留水に溶解、１０００ｍｌに調整した培地１００ｍｌを５００ｍｌの三角フラスコにいれ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍｌ添加し、上記で構築したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ−５／ΔＬＤＨ株を接種して１６時間３０℃にて振とう（１６０ｒｐｍ）培養した。【０１３７】
（Ｂ）本培養
硫酸アンモニウム：３．０ｇ、８５％リン酸：６．７ｇ、塩化カリウム：４．９ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：１２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：１２０ｍｇ、コーンスティープリカー（王子コーンスターチ社製）３０．０ｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：１１．０ｇ、消泡剤（ＣＥ４５７：日本油脂製）：２．５ｇを蒸留水に溶解して調整した培地２．０Ｌを５Ｌの発酵糟に入れ、１２１℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やしてから２８％アンモニア水を加えてｐＨを７．０に調整した後、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：１５ｍｌ、及びあらかじめ滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：１１０ｍｌを添加した。これに前述の種培養液を１００ｍｌ加えて、３０℃に保温した。【０１３８】
ｐＨは２８％アンモニア水を用いて７．２以下にならないように保ち、通気は毎分３．０Ｌ、背圧は０．０５ＭＰａ、攪拌は毎分７５０回転で本培養を開始した。溶存酸素濃度がほぼ０まで低下した後、再び上昇を開始して１ｐｐｍに達したところであらかじめ滅菌した７２％ショ糖水溶液を約５．３ｇ添加したところ、再び０まで低下した。溶存酸素濃度が再び上昇するごとに上記の方法にてショ糖水溶液添加を繰り返して、培養開始後１９時間まで継続した。【０１３９】
（Ｃ）コハク酸生成反応
８５％リン酸：１．６ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：１．１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４３ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４３ｍｇ、１０Ｎ水酸化カリウム水溶液：２．８６ｇを蒸留水に溶解、４２ｍｌに調整後、１２１℃、２０分加熱滅菌処理し、反応濃縮培地を作製した。【０１４０】
室温まで冷やした上記反応濃縮培地：４２ｍｌ、及び予め滅菌した７２０ｇ／Ｌショ糖水溶液：５３０ｍｌ、滅菌水：１．２Ｌ、予めフィルター滅菌したＤ−ビオチン、塩酸チアミン各０．２ｇ／Ｌ水溶液：２０ｍｌ、上記本培養により得られた培養液６７５ｍｌを５Ｌのジャーファーメンターに加え反応を開始した。【０１４１】
反応温度は４０℃、攪拌回転数は毎分１５０、ｐＨは中和剤（炭酸水素アンモニウム：１７１ｇ、２８％アンモニア水：３５４ｇ、蒸留水：５２９ｇ）の逐次添加によって７．３５に調整しながら反応を継続し、反応液中の残存ショ糖が０．１ｇ／Ｌ以下になったところで終了した。【０１４２】
このようにして調整したコハク酸発酵液を遠心分離（１５，０００Ｇ、５分）処理して得られた上澄み液を得た（以下、コハク酸発酵液と記載することがある）。【０１４３】
下記表２にこの上澄み液の組成分析結果を示す。【０１４４】
【表２】
2011087062.tif 000004
【０１４５】
実施例１
＜プロトン化＞
上述のコハク酸発酵液１５００ｇに９８％硫酸を加えｐＨを２．５と調整した。ここで９８％硫酸添加量は１５０ｇであった。【０１４６】
＜抽出＞
硫酸添加後のコハク酸水溶液は、ジャケット付スタティックミキサー（ノリタケ１／４（１）−Ｎ４０−１７４−０（内径Φ５ｍｍ、エレメント数２４））および各槽が６００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌのジャケット付３槽式のセトラーを用い、メチルエチルケトン（以下、ＭＥＫと略記することがある）と混合、液々分離することでコハク酸を連続抽出した。【０１４７】
すなわちコハク酸水溶液１６５０ｇおよび予め水を添加した１０％含水ＭＥＫ溶液８２５ｇ（ＭＥＫ溶液（重量）／コハク酸水溶液（重量）＝０．５（重量／重量））を、それぞれ２０ｇ／分、１０ｇ／分の速度でジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御されたスタティックミキサーへ供給し、抜き出した懸濁液はジャケットに３０℃の温水を流すことで温度制御された３槽式のセトラーの第１槽へ供給し、液々分離され第１槽のボトムから抽残相を連続的に抜き出した。【０１４８】
抽出相は第１槽と第２槽間の堰をオーバーフローし、第２槽へ供給された。第２槽では第１槽で分離できなかった不溶成分をボトムに沈降させ、清澄な抽出相のみを第２槽と第３槽間の堰をオーバーフローさせ第３槽へ供給させた。さらに第３槽では液界面近傍から清澄な抽出相をオーバーフローさせて抽出相を回収した。【０１４９】
連続抽出終了後、それぞれの槽に残った抽出相および抽残相さらには第１槽中間相、第２槽ボトムに残った不溶成分を回収した。回収した抽出相、抽残相、中間相はそれぞれ６８８ｇ、抽残相１６１３ｇ、中間相１７３ｇであった。【０１５０】
回収した抽残相１６１３ｇは内径Φ２０ｍｍ高さ２ｍのジャケット付攪拌型連続抽出塔（理論段１０段）を用い連続抽出しコハク酸を回収した。ここで抽残相は２００ｇ／時間で塔頂部から供給し、塔底から予め含水量１０重量％に調整したＭＥＫ溶液を２００ｇ／時間で供給し連続抽出した。【０１５１】
連続相は抽残相、分散相はＭＥＫ相とした（軽液分散）。また抽出塔の温度はジャケットに温水を通液することで３０℃に制御した。最終的に抽出相は１７７７ｇ、抽残相は１４４９ｇ回収した。【０１５２】
抽残相の組成を分析したところ下記表３に示すような結果であった。【０１５３】
【表３】
2011087062.tif 000005
【０１５４】
＜蒸留＞
Φ５ｍｍのコイルパックを高さ３０ｃｍに充填した、内径Φ２０ｍｍの充填カラムと５００ｍｌの丸底フラスコ、さらには還留器を備えた常圧連続蒸留装置を用い、抽残相に微量溶解したＭＥＫを蒸留により留去した。抽残相は５００ｍｌ丸底フラスコへ約３００ｍｌ添加後、丸底フラスコをオイルバスで加熱しながら炊上げ、全還留をかけながら系内を安定させた。ここでオイルバスの温度は１１０℃とした。ここで塔頂温度は７４℃（共沸温度）、塔底温度は１０２℃であった。【０１５５】
塔内が安定したのを確認後、還留比を１に設定し、留出液を連続的に抜出すとともに供給液を充填塔中段へ連続供給し、釜残液も連続的に抜出しを開始した。供給液は予熱器であらかじめ６０℃まで加熱した後、充填塔へ供給した。蒸留後の釜残液は１３７９ｇであり、ＭＥＫは４５ｐｐｍまで低下していた。【０１５６】
一方、回収された留出液はわずかに黄色く着色したＭＥＫ、水からなる共沸組成物（ＭＥＫ８９重量％、水１１重量％）であった。【０１５７】
＜中和＞
ＭＥＫを蒸留除去した後の液のｐＨを測定したところ約３であったので、２６重量％アンモニア水でｐＨ６に調整した。【０１５８】
＜濃縮＞
中和液をエバポレータで濃縮し、硫酸アンモニウム濃度４１重量％の濃縮液４７６ｇを回収した。【０１５９】
＜晶析＞
濃縮液はジャケット付１０００ｍｌ攪拌槽へ移した。ジャケットに４５℃の温水を流すとともに、攪拌下晶析槽内圧力を７ｋＰａまで徐々に減圧していき、７ＫＰａ（内温約４０℃）に到達後圧力を制御しながら水を９５ｇ留出させ（仕込液に対し２０重量％）、硫酸アンモニウムを析出させた。所定量の水が留出した後、晶析槽内の圧力を大気圧に戻し、ジャケットに流す温水温度を４０℃とし約１時間熟成した。【０１６０】
得られた硫酸アンモニウムスラリーを減圧濾過し、ウェットケーキおよび母液に分離した。得られたウェットケーキはさらに８０℃温風乾燥機で約７時間乾燥し、硫酸アンモニウム８７ｇ、母液２８８ｇを回収した。【０１６１】
硫酸アンモニウムの組成の分析結果を下記表４に、母液の組成の分析結果を下記表５それぞれの組成を下に示す。【０１６２】
【表４】
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【０１６３】
【表５】
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【０１６４】
回収した母液の半分は、リサイクルに用いた。また残りの半分は１５０℃に加熱したホットプレート上で乾燥させたところ茶褐色の硫酸アンモニウム粉体６７ｇを回収した。【０１６５】
得られた硫酸アンモニウムの組成の分析結果を下記表６に示す。【０１６６】
【表６】
2011087062.tif 000008
【０１６７】
実施例２
＜プロトン化・抽出・中和・濃縮＞
実施例１で用いたコハク酸発酵液１５００ｇを１０００ｇにする以外は同じ方法で、コハク酸発酵液をプロトン化し、プロトン化した液を引き続きＭＥＫ溶液で抽出した。【０１６８】
抽残相は蒸留、中和を行い、さらに硫酸アンモニウム濃度４０重量％まで濃縮を行い、濃縮液３２９ｇを回収した。【０１６９】
＜晶析＞
上記濃縮液、および実施例１の晶析工程で回収した母液の半分にあたる１４４ｇを混合し、実施例１と同様の手順で晶析、濾過、乾燥処理を行い、硫酸アンモニウム８６ｇ、母液２８８ｇを回収した。【０１７０】
得られた硫酸アンモニウムの組成の分析結果を表７に、得られた母液の組成の分析結果を表８に示す。【０１７１】
【表７】
2011087062.tif 000009
【０１７２】
【表８】
2011087062.tif 000010
【０１７３】
回収した母液の半分はリサイクルに用いた。また残りの半分は１５０℃に加熱したホットプレート上で乾燥させたところ茶褐色の硫酸アンモニウム粉体６５ｇを回収した。【０１７４】
得られた硫酸アンモニウムの組成を下記表９に示す。【０１７５】
【表９】
2011087062.tif 000011
【０１７６】
実施例３
実施例２と同じ手順で晶析母液の半分をリサイクルしながら、抽出〜晶析操作をさらに５回繰り返した。【０１７７】
晶析で得られた硫酸アンモニウム、母液の乾燥で得られた硫酸アンモニウム、およびそれぞれの母液の組成の分析結果を下記表１０に示す。【０１７８】
【表１０】
2011087062.tif 000012
【０１７９】
回収した全ての硫酸アンモニウムを混合した含窒素組成物を、対照肥料として試薬硫酸アンモニウム（試薬特級品）を用い、こまつなの発芽および発芽後の生育への支障の有無およびその程度を検証するため、幼植物試験を実施したところ、有害物による植物の生育上の異常症状は見られなかった。【０１８０】
下記表１１に混合した含窒素組成物の肥料としての組成分析結果を示す。【０１８１】
【表１１】
2011087062.tif 000013
【０１８２】
実施例４
実施例１の方法において、蒸留と中和の順序を入れ替える以外は同じ方法に従い、硫酸アンモニウムを回収した。各操作におけるハンドリング性、回収された硫酸アンモニウムはいずれも実施例１とほぼ同等であったが、蒸留で得られた留出物（ＭＥＫと水からなる共沸組成物）は黄色く着色していた。【０１８３】
比較例１
実施例１の方法において、晶析母液を全量リサイクルする以外は同じ方法に従い、晶析母液をリサイクルしながら抽出〜晶析操作を５回繰り返し、硫酸アンモニウムを回収した。結果を下記表１２に示す。リサイクルを重ねるごとに硫酸アンモニウムスラリーの減圧ろ過［ろ紙（５Ｃ）］に要する時間が長くなり、リサイクル５回目においては減圧ろ過では固液分離できず、卓上式遠心ろ過機（ろ布）を用い、約３０００Ｇで固液分離を行った。【０１８４】
晶析で得られた硫酸アンモニウム、母液の乾燥で得られた硫酸アンモニウム、およびそれぞれの母液の組成の分析結果を下記表１２に示す。【０１８５】
【表１２】
2011087062.tif 000014
【０１８６】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１０年１月１５日付で出願された日本特許出願（特願２０１０−００７３０６）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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