(57)【要約】  本発明は、対象においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、式Iの化合物：【化１】2019520344.tif 000013又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、前記方法に関する（式中、R1は-NHC(O) C3-6シクロアルキルであり、かつR2は水素であり；又はR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されており；  R3及びR4は水素、ハロゲン、C1-3アルキル、OC1-3アルキル、NO2、SC1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、OC1-3ハロアルキル、及びSC1-3ハロアルキルを含む群から独立に選択される。）。【選択図】なし
2019520344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物：
【化１】
2019520344.tif 000011
を投与することを含む、前記方法
（式中、R1は-NHC(O) C3-6シクロアルキルであり、かつR2は水素であり；
又はR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されており；
R3及びR4は水素、ハロゲン、C1-3アルキル、OC1-3アルキル、NO2、SC1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、OC1-3ハロアルキル、及びSC1-3ハロアルキルを含む群から独立に選択される。）。
【請求項２】
対象におけるパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、パーキンソン病に罹患しているか、又はパーキンソン病を発症するリスクのある対象を選択すること、及び治療有効量の式Iの化合物：
【化２】
2019520344.tif 000012
を投与することを含む、前記方法
（式中、R1は-NHC(O) C3-6シクロアルキルであり、かつR2は水素であり;
又はR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されており；
R3及びR4は水素、ハロゲン、C1-3アルキル、OC1-3アルキル、NO2、SC1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、OC1-3ハロアルキル、及びSC1-3ハロアルキルを含む群から独立に選択される。）。
【請求項３】
式Iの化合物中のR3及びR4が、ハロゲン及びC1-3アルキルから選択される、請求項1又は2記載のパーキンソン病を治療又は予防する方法。
【請求項４】
式Iの化合物中のR1が、-NHC(O)シクロプロピルであり、かつR2が水素である、請求項1〜3のいずれか1項記載のパーキンソン病を治療又は予防する方法。
【請求項５】
式Iの化合物中のR1及びR2が、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されている、請求項1〜4のいずれか1項記載のパーキンソン病を治療又は予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は2016年6月2日に出願されたインド特許出願第IN 201621019087号及び2016年6月2日に出願された第IN 201621019185号の恩典を主張するものである；これらは参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、対象においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、式Iの化合物：
【化１】
2019520344.tif 000003
又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、前記方法に関する
（式中、R1は-NHC(O) C3-6シクロアルキルであり、かつR2は水素であり；
又はR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されており；
R3及びR4は水素、ハロゲン、C1-3アルキル、OC1-3アルキル、NO2、SC1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、OC1-3ハロアルキル、及びSC1-3ハロアルキルを含む群から独立に選択される。）。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
c-Ablは、細胞の生存、成長、及び運動性の調節を含む様々な細胞過程に関与している非受容体型タンパク質チロシンキナーゼである。c-Ablキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブ（Gleevec（登録商標））、ニロチニブ（Tasigna（登録商標））、ダサチニブ（Sprycel（登録商標））、及びポナチニブ（Iclusig（登録商標））は、慢性骨髄性白血病の治療における臨床使用のために開発されて市販されている。
【０００４】
最近の研究により、c-Ablが酸化ストレス誘発性神経細胞死において重要な役割を果たすことが示されている（Wuらの文献、Cell Death Differ., 2016; 23:542-552）。c-Ablが、パーキンソン病に関与することが、報告されている（Gonfloniらの文献、Int. J. Cell Biol., 2012; 2012:1-7）。また、c-Ablは、ドーパミン因性ストレス及びドーパミン作動性神経毒、すなわち1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP、インビボで酵素によりその活性化形態MPP＋へと変換される）によって活性化されることが知られている。MPTPは、parkinのチロシンリン酸化を引き起こして、parkinのE3リガーゼ活性を喪失させる。これにより様々なparkinの基質が蓄積され、最終的にドーパミン作動性神経細胞の死に至る（Koらの文献、PNAS, 2010; 107:16691-16696）。
【０００５】
パーキンソン病（PD）は、レヴィ小体と呼ばれる細胞内含有物中のタンパク質の蓄積及びレヴィ神経炎と、それに続くドーパミン作動性神経細胞の喪失を特徴とする一般的な神経変性疾患である。稀な家族性突然変異により、この慢性的な進行性神経変性疾患についての見識が提供されている。例えば、α-シヌクレイン及びLRRK2中の突然変異は常染色体優性PDを引き起こし、一方DJ-1、PINK1、及びparkin中の突然変異は常染色体劣性PDをもたらす。parkinはE3ユビキチンリガーゼであり、家族性突然変異は、parkinのE3リガーゼ活性を低下させると考えられている（Koらの文献、PNAS, 2010; 107:16691-16696）。
【０００６】
c-Ablは、PDの病因に関与する2つのタンパク質、すなわちparkin及びα-シヌクレインの分解を調節することが示されている（Mahul-Mellierらの文献、Hum. Mol. Genet., 2014; 23:2858-2879）。c-Ablはparkinをチロシン143上でリン酸化する。このリン酸化によりparkinのE3ユビキチンリガーゼ活性が阻害され、その結果AIMP2及びFBP1（parkinの基質）が蓄積し、parkinの細胞保護機能が喪失して細胞死に至る（Koらの文献、PNAS, 2010; 107:16691-16696; Imamらの文献、J. Neurosci., 2011; 31:157-163）。さらに、c-AblはPDの病因に強く結び付けられているシナプスタンパク質であるα-シヌクレインの除去を調節する。α-シヌクレイン及びc-Ablの間にはインビボにおける双方向性の関係があることが記載されており、ここでα-シヌクレインの発現の増加によりそのリン酸化及びそれに続くc-Ablの活性化が促進される。反対に、c-Ablの発現が増加及び活性化すると、α-シヌクレインが蓄積し、かつ凝集する。このことから、c-Ablの阻害はドーパミン作動性神経細胞をPDにおいて蓄積されるα-シヌクレインの毒性から保護するための興味深い戦略を構成する可能性があることが示唆される（Hebronらの文献、Hum. Mol. Genet., 2013; 22:3315-3328; Hebronらの文献、Autophagy, 2013; 9:1249-1250）。
【０００７】
ニロチニブのようなc-Abl阻害剤は、1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（本明細書においてMPTPと呼ぶ)によって誘発されたPDのマウスモデルにおいて、血液脳関門を通過して、ドーパミン作動性神経細胞を保護することが知られている（Karuppagounderらの文献、Sci. Rep. 2014; 4:4874）。ニロチニブは、このPDのマウスモデルにおいてオートファジー経路を介してα-シヌクレインの除去を増加させ、かつα-シヌクレインの蓄積によって誘発されるドーパミン作動性神経細胞の喪失から保護することが示されている（Hebronらの文献、Hum. Mol. Genet., 2013; 22:3315-3328; Imamらの文献、J. Neurosci., 2011; 31:157-163）。さらに、US20150087653では、神経変性疾患を治療する方法であって、ニロチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤を投与することを含む、前記方法が開示されている。しかしながら、ニロチニブはいくつかの重度の薬物関連有害作用を有する。USFDAは、Tasigna（登録商標）カプセルに対し箱書きの警告文を公表しているが、これはそれによる処置が、患者における潜在的に重篤な心臓副作用（QT延長）及び突然死と関連付けられるためである。ダサチニブは胸水及び出血を引き起こすことが知られている。また、ポナチニブは血栓塞栓症及び血管閉塞を含む重篤な有害作用と関連付けられる。イマチニブはAblキナーゼの強力な阻害剤ではない。さらに、イマチニブ及びダサチニブは両方ともP-糖タンパク質（p-gp）の基質となるため、乏しい脳内濃度を示す。従って、血液脳関門を通過し、かつ心血管系への副作用を生じない強力なAblキナーゼ阻害剤が求められている。
【発明の概要】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、対象においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物：
【化２】
2019520344.tif 000004
又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、前記方法を提供する
（式中、R1は-NHC(O) C3-6シクロアルキルであり、かつR2は水素であり；
又はR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されており；
R3及びR4は水素、ハロゲン、C1-3アルキル、OC1-3アルキル、NO2、SC1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、OC1-3ハロアルキル、及びSC1-3ハロアルキルを含む群から独立に選択される。）。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
（図面の説明）
【図１】チロシンヒドロキシラーゼ（TH）陽性神経細胞を示す冠状切片からの光学顕微鏡写真であり、式I.aの化合物による神経変性の防止を示している。
【図２】式I.aの化合物の投与の際のTH陽性神経細胞の面積の割合である。
【図３】式I.aの化合物の投与の際のTH免疫反応の積分濃度である。
【図４】チロシンヒドロキシラーゼ（TH）陽性神経細胞を示す冠状切片からの光学顕微鏡写真であり、式I.b.の化合物による神経変性の防止を示している。
【図５】式I.b.の化合物の投与の際のTH陽性神経細胞の面積の割合である。
【図６】式I.b.の化合物の投与の際のTH免疫反応の積分濃度である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
一態様において、本発明は、対象においてパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物：
【化３】
2019520344.tif 000005
又はその医薬として許容し得る塩を投与することを含む、前記方法を提供する
（式中、R1は-NHC(O) C3-6シクロアルキルであり、かつR2は水素であり；
又はR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されており；
R3及びR4は水素、ハロゲン、C1-3アルキル、OC1-3アルキル、NO2、SC1-3アルキル、C1-3ハロアルキル、OC1-3ハロアルキル、及びSC1-3ハロアルキルを含む群から独立に選択される。）。
【００１１】
別の態様において、本発明は対象におけるパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、パーキンソン病に罹患しているか、又はパーキンソン病を発症するリスクのある対象を選択すること、及び治療有効量の式Iの化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００１２】
本明細書で使用する語句「治療有効量の式Iの化合物」は、式Iの化合物を、それを目的として投与する治療効果を誘発する、式Iの化合物の量を指す。
【００１３】
「アルキル」という用語は、骨格中に炭素及び水素原子のみを含み、直鎖でも分岐鎖でもよく、単結合によって分子の残りの部分と結合している飽和炭化水素鎖ラジカル、例えばメチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル(イソプロピル)、n-ブチル、及びn-ペンチルを指す。
【００１４】
「C1-6アルキル」のような語句の中の数字は、アルキル鎖中に1〜6個の炭素原子が存在することを指す。
【００１５】
「C3-6シクロアルキル」という用語は、炭素原子が3〜6個の非芳香族単環系を指す。単環には、シルコプロピル（cylcopropyl）、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロへキシルがある。
【００１６】
「ハロアルキル」という用語は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、及びフッ化物から選択される1以上のハロゲンラジカルで置換されたアルキル鎖を指す。
【００１７】
一実施態様において、本発明は、パーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物（ここで、式Iの化合物のR1は-NHC(O)シクロプロピルであり、かつR2は水素である。）を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明はパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物（ここで、式Iの化合物のR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素、ハロゲン、及びC1-6アルキルから選択される1以上の基で置換されている。）を投与することを含む、前記方法を提供する。好ましくは、芳香環は水素で置換されている、すなわち、置換されていない。
【００１９】
別の実施態様において、本発明はパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物（ここで、式Iの化合物のR1及びR2は、それらが結合している炭素原子とともに6員の芳香環を形成し、ここで該環は水素で置換されており、すなわち、置換されておらず；R3はクロロであり、かつR4はメチルであり、かつ環内の2位及び6位の置換基として存在する。）を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００２０】
別の実施態様において、本発明はパーキンソン病を治療又は予防する方法であって、治療有効量の式Iの化合物（ここで、式Iの化合物のR3及びR4はハロゲン及びC1-6アルキルから選択される。）を投与することを含む、前記方法を提供する。好ましい実施態様において、R3及びR4はハロゲン及びメチルであり、かつ環内の2位及び6位の置換基として存在する。
【００２１】
いくつかの好ましい式Iの化合物の化学名を、以下表1で提供する。
【００２２】
表1：
【表１】
2019520344.tif 000006
【００２３】
本発明の化合物の好適な医薬として許容し得る塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、及びリン酸など、あるいは有機酸、例えば酢酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、グリコール酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸、リンゴ酸、酒石酸、又はアミノ酸、例えばグルタミン酸若しくはアスパラギン酸などの塩とし得る。式Iの化合物の1以上の水素原子は、重水素化される、すなわち重水素原子で置換されていてもよい。
【００２４】
WIPO公報WO2012098416（‘416公報）では、c-Ablキナーゼ阻害剤としての活性を有する化合物のマーカッシュ群及び慢性骨髄性白血病（CML）のような癌の治療に向けたそれらの有用性が開示されている。本発明の式Iの化合物は、参照により本明細書に組み込まれているWO2012098416及びWO2016185490に記載された過程によって調製することができる。
【００２５】
本発明者らは、本発明の式Iの化合物が強力なAblキナーゼ阻害剤であり、有利には血液脳関門を効果的に通過し、高い式Iの化合物の脳対血漿濃度比及び高い治療指数をもたらすことを見出した。
【００２６】
特に、本発明者らは治療有効用量の式Iの化合物には、そのインビトロでのhERGチャネルへの作用並びに覚醒ビーグル犬及びモルモットにおけるそのインビボでのQT間隔、QTC間隔、QTcf間隔のようなECGパラメータ及び心拍数への作用について試験した際に、心血管系の副作用がないことを見出した。式Iの化合物は、それらが本明細書の実施例に記載されたように、ECGパラメータ及び心拍数への過度な作用を何ら示さなったため、安全であることが見出された。
【００２７】
式Iの化合物は、好適な剤形の形態で経口投与することができる。好適な剤形としては、錠剤、ペレット、カプセル剤、サシェ剤、サシェ剤中のペレット、カプセル剤中のペレット、散剤、及び顆粒剤などを挙げることができる。式Iの化合物は、当業者の一般知識の範囲内の医薬として許容し得る賦形剤を含み得る経口剤形へと製剤化することができる。「レミントン薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」第16版、E. W. Martin編（Mack Publishing社, Easton, Pa., 1980）には、好適な剤形の調製に使用することができる医薬として許容し得る担体が開示されている。
【００２８】
以下の実施例は、本発明をその範囲内に限定することなく、本発明を例示する役割を果たす。
【実施例】
【００２９】
（実施例1）
（Ablキナーゼの阻害）
最終反応体積を25 μLとして、Abl（ヒト）（5〜10 mU）を8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、50 μM EAIYAAPFAKKK、10 mM Mg(OAc)2、及び[γ-33P-ATP]とともにインキュベートする（比活性はおよそ500 cpm/pmol、濃度は必要なだけ）。MgATPミックスを加えることにより、反応を開始させる。室温での40分間のインキュベーションの後、5 μLの3％リン酸溶液の追加によって反応を停止させる。続いて反応物10 μLをP30フィルターマット上に滴下し（spotted）、75 mMリン酸中で5分間の洗浄を3回及びメタノール中での洗浄を1回行い、その後乾燥させ、シンチレーション計数を行う。
【００３０】
代表的な式Iの化合物についての結果を表2で提供する。
【００３１】
表2：c-Ablに対するチロシンキナーゼ阻害剤の効力の比較
【表２】
2019520344.tif 000007
【００３２】
（実施例2）
（脳/血漿薬物動態試験）
式I.aの化合物が血液脳関門を通過するかどうかを決定するため、C57BL6マウスに30 mg/kgの式I.aの化合物、100 mg/kgのニロチニブ、又は30 mg/kgのダサチニブを経口投与した。処置後1、4、及び8時間の時点で、マウスをイソフルランで麻酔し、0.4 mLの血液を後眼窩静脈叢（retro-orbital plexus）から採取して抗凝固剤である8 μLのヘパリンナトリウム（100 IU/ml）を含むエッペンドルフチューブに取り、冷却容器に移した。血液試料をすぐに8500 rpm、4℃で7分間遠心分離した。血漿を予めラベルを貼ったエッペンドルフチューブに分け、さらなる解析まで-70℃で保存した。その後すぐに、マウスを屠殺し、全脳を摘出して氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすいで付着した血液を除き、吸取紙上で乾燥させた（blot-dried）。脳組織試料を計量し、組織ホモジェナイザーを用いて1:2体積のPBS中でホモジェナイズし、さらなる解析までラベルを貼ったバイアル中-70℃で保存した。脳及び血漿中の式I.aの化合物の濃度をLC-MS技術を用いて決定した。
【００３３】
式I.aの化合物の脳対血漿比は、ニロチニブ又はダサチニブの脳対血漿比と比較して、有意に高いことが見出された（表3を参照されたい）。
【００３４】
表3：脳及び血漿における化合物の濃度
【表３】
2019520344.tif 000008
【００３５】
（実施例3）
（パーキンソン病の動物モデルにおける式I.aの化合物の有効性）
C57BL/6マウス（6〜8週齢、25〜30 g体重）に式I.aの化合物（1日1回、10又は30 mg/kg）をビヒクルとともに7日間にわたり経口投与した。第7日に、これらの動物に生理食塩水中の神経毒1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン（MPTP-HCl；17 mg/kg遊離塩基；Sigma)を、2時間の間隔を空けて4回腹腔内注射した。最後にMPTPを注射した後さらに7日間にわたり、化合物の投与を毎日継続した。簡潔に述べると、MPTPの投与前6日間、MPTPの投与の日、及びMPTPの投与後7日間にわたり化合物を投与した。全ての動物をMPTPの投与から7日後に屠殺し、脳組織を免疫組織化学による評価のために処理した。チロシンヒドロキシラーゼ（TH）の免疫組織学的検出には、標準的なアビジン-ビオチン法（Bennoらの文献、Brain Res., 1982; 246:225-236）を使用した。まず、クリオスタットを使用して脳を黒質緻密部（SNPc）の水準で薄切し、スライドグラスに貼りつけた。脳切片のついたスライドを0.1 M PBS中で3×5分間すすいだ。切片をまず室温で0.3％ Triton X-100を含む0.1 M PBS中の正常ブロッキング血清により30分間インキュベートし、正常ブロッキング血清を含む0.1 M PBS中1:1000に希釈したマウスチロシンヒドロキシラーゼに対するウサギポリクローナル抗体（Invitrogen）でさらに2時間インキュベートした。切片のついたスライドを0.1 M PBS中さらに3×5分間すすぎ、室温でビオチン標識抗ウサギ抗体（Vectastain（登録商標）ABCキット）により1時間インキュベートした。切片を0.1 M PBS中3×5分間すすぎ、室温で0.1 M PBS中1:50に希釈したA及びB溶液（Vectastain（登録商標）ABCキット）により1時間インキュベートした。1時間後、切片を0.1 M PBS中3×5分間すすぎ、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）/H2O2溶液（Sigma）中およそ5〜8分間インキュベートした（発色の過程を顕微鏡下で確認して、シグナル対ノイズ比を最適化した）。切片をまず0.1 M PBS中2×5分間すすぎ、続いてMilli-Q水で3×5分間すすいだ。スライドをグリセロール-ゼラチン溶液で封入し、室温で一晩置いて乾燥させ、その後染色された脳切片の画像を顕微鏡に取り付けられたカメラを用いて取り込み、NIH ImageJ（登録商標）software（NIH, Bethesda, MD）を使用して解析した。画像を8ビットの解像度及び最適な輝度/コントラストへと変換することによって解析した。個々の画像上でバックグラウンドシグナル及びシュードシグナルを除去し、細胞体及び線維がカバーする面積を測定した。全画像面積と比較した面積の割合及び積分濃度を算出した。GraphPad Prism（登録商標）6.0を使用して、得られた結果をあらゆる群間又は群内ばらつき及び統計的有意差について比較した。TH陽性神経細胞を示す冠状切片からの光学顕微鏡写真（図1）、TH陽性神経細胞の面積の割合の測定値（図2）、及びTH免疫反応の積分濃度（図3）から分かるように、式I.aの化合物の経口投与により、MPTPによって誘発される神経変性が有意に予防された。
【００３６】
（実施例4）
（パーキンソン病の動物モデルにおける式I.bの化合物の有効性）
パーキンソン病を治療するための式I.bの化合物の有効性を、上記実施例3で式I.aの化合物について記載したものと同じ方法によって試験した。
【００３７】
GraphPad Prism（登録商標）6.0を使用して、得られた結果をあらゆる群間又は群内ばらつき及び統計的有意差について比較した。TH陽性神経細胞を示す冠状切片からの光学顕微鏡写真（図4）、TH陽性神経細胞の面積の割合の測定値（図5）、及びTH免疫反応の積分濃度（図6）から分かるように、式I.bの化合物の経口投与により、MPTPによって誘発される神経変性が有意に予防された。
【００３８】
（実施例5）
（電気生理学的手順―hERG K＋チャネルへの作用）
式I.a及びI.bの化合物を、hERG K＋チャネルの阻害率を測定するためのインビトロ試験において、心血管系への安全性について試験した。式I.a及びI.bの化合物は、試験した濃度でhERGによる電流の有意な阻害を一切示さなかった。
【００３９】
式I.a及びI.bの化合物の、ヒトether-a-go-go関連遺伝子（hERG）を安定発現する電位固定されたヒト胎児腎細胞（HEK293）におけるイオン電流へのインビトロ作用を調べた。2つの濃度（1及び10 μM）の式I.a及びI.bの化合物を生理的温度近傍で試験した。
【００４０】
細胞を記録チャンバに移し、ビヒクル対照溶液（HEPES緩衝生理食塩水溶液＋1％ジメチルスルホキシド＋1％ウシ血清アルブミン）を注いだ。全細胞パッチクランプ記録のためのマイクロピペット溶液は：アスパラギン酸カリウム、130 mM; MgCl2、5 mM; EGTA、5 mM; ATP、4 mM; HEPES、10 mM（pHは10N KOHにより7.2に調整した）で構成されていた。マイクロピペット溶液はバッチごとに調製し、分注し、凍結保存し、かつ各日に新鮮なアリコートを融解させた。記録は直列に結合させた溶液プレヒータ、チャンバヒータ、及びフィードバック温度制御器を使用して33〜35℃の温度で実施した。温度は記録チャンバ内でサーミスタプローブを使用して測定した。パッチクランプ記録のためのマイクロピペットは、ガラスキャピラリーチューブからP-97マイクロピペットプラー（Sutter Instruments, Novato, CA）を使用して作製した。市販のパッチクランプ増幅器を全細胞記録に使用した。デジタル化の前に、電流記録をサンプリング周波数の5分の1でローパスフィルタに通した。
【００４１】
hERGを安定発現する細胞を、-80 mVに固定した。試験化合物（式I.a及びI.b）による開始状態及び安定状態のhERGカリウム電流の阻害は、固定振幅でのパルスパターン（1秒間の+20 mV調整プレパルス；5秒間隔で反復される-80 mVへの再分極試験スロープ（-0.5 V/秒））を使用して測定した。各記録は最後に超最大濃度の参照基質（E-4031、500 nM）を適用し、内因の電流の寄与を評価することにより終了した。残りの阻害されていない電流を、オフラインでデータからデジタル式に差し引いて、試験化合物のhERGの阻害効力を決定した。
【００４２】
ビヒクル対照においてhERG電流が（平均±SEM）1.0±0.6％（n＝3）阻害されたのと比較して、式I.aの化合物によりhERG電流は1 μMで2.1±0.4％（n＝3）、10 μMで9.7±0.4％（n＝3）阻害された（表4参照）。10 μMより高い式I.aの化合物の濃度は試験しなかった。それは、ビヒクル対照中の化合物の溶解度に限界があったためである。同様の条件下で、陽性対照（テルフェナジン、60 nM）によりhERGカリウム電流は（平均±SEM；n＝2）82.8±1.2％阻害され、その濃度が非常に高い式I.aの化合物のhERG K＋チャネルにおける作用はわずかであることが確認された。比較として、ニロチニブは1 μMの濃度でほぼ90％の阻害を示す（表5）。
【００４３】
表4：式I.a及びI.bの化合物の各濃度でのhERG電流の平均阻害率
【表４】
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【００４４】
表5：ニロチニブによるhERG電流の阻害率＃
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【００４５】
（実施例6）
（覚醒ビーグル犬におけるQT、QTc間隔、及び心拍数への式I.aの化合物の作用）
式I.aの化合物を、覚醒ビーグル犬におけるQT、QTcb、及びQTcf間隔並びに心拍数へのその作用を決定するためのインビボ試験に付した。
【００４６】
遠隔測定機器を装着した覚醒雄及び雌ビーグル犬において、式I.aの化合物を3つの用量レベル：5、15、及び30 mg/kgで経口（p.o.）経路により投与した。30 mg/kgの用量群の式I.aの化合物で処置した動物のうち2頭（1頭の雄及び1頭の雌）において投薬後14分で嘔吐が起こった。そのため、30 mg/kgの用量で処置した群はデータ解析について検討しなかった。5及び15 mg/kgの用量では嘔吐は観察されなかった。
【００４７】
ECGパラメータ（QT間隔、QTcb間隔、QTcf間隔）及び心拍数の測定を、薬物投与の2時間前（ベースライン）及び継続して投与後24時間までの期間実施し、記録した。各動物にビヒクル（プラセボ）及び3つの異なる用量の式I.aの化合物の両方を、最低96時間の休薬期間を設けてラテン方陣式に異なる日に与えた。別の日に式I.aの化合物の追加の経口投薬を1回実施し、異なる時点での式I.aの化合物の血漿濃度を評価して、薬物動態（PK）パラメータを導いた。
【００４８】
ECGパラメータ（QT間隔、QTcb間隔、QTcf間隔）及び心拍数のデータを以下のように統計的に比較した：0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12、及び24時間の時点でのプラセボ群のデータを同群のベースラインデータと比較した。式I.aの化合物で処置された異なる群のデータを、プラセボ群の対応するデータと比較した。
【００４９】
プールされた雄及び雌イヌのデータに基づくECGの解析から、ベースラインと比較して、プラセボ処置はECGパラメータ（QT間隔、QTcb間隔、QTcf間隔）及び心拍数のいずれにも統計的に有意な作用を有さないことが示された。式I.aの化合物は、5及び15 mg/kgの用量ではプラセボと比較してQT、QTcb、QTcf、持続性に対する作用を有さなかった。さらに、心拍数などの他のパラメータは変化しないままであった。
【００５０】
PK解析から、異なる用量の式I.aの化合物を投与された動物への式I.aの化合物の用量依存的全身曝露量が示された。5、15、及び30 mg/kgの用量の式I.aの化合物によるAUC0-infは、それぞれ1925〜4824、6776〜12756、及び25927〜46749時間×ng/mLの範囲であった。5、15、及び30 mg/kgの用量の式I.aの化合物によるCmaxは、それぞれ1218〜2033、2723〜5323、及び9825〜9967 ng/mLの範囲であった。
【００５１】
本試験の結果から、最大15 mg/kgの用量の式I.aの化合物の単回の経口投与には、覚醒ビーグル犬において心血管系機能への作用がないことが示された。式I.aの化合物はいずれの用量レベルでもECGの形を変化させなかった。処置によるECGパラメータ及び心拍数への作用に性差はなかった。
【００５２】
（実施例7）
（麻酔下モルモットにおけるQT、QTc間隔及び心拍数への式I.bの化合物の作用）
QT、QTc間隔及び心拍数への式I.bの化合物の作用を麻酔下モルモットにおいて試験した。体重300〜400 gの範囲の雄ダンキン-ハートレー種モルモットをウレタン（1.5 g/kg）の腹腔内注射によって麻酔した。気管切開術を実施して、実験の間中動物に自発的に呼吸をさせた。薬物投与のために、左頸静脈にヘパリン含有生理食塩水溶液（100 IU/ mL）を満たしたポリエチレンカテーテルを使用してカテーテル挿入した。リードIIの位置（lead II position）に電極を配置し、ベースラインECGを記録した。
【００５３】
異なる動物に対し、体重に合わせて式I.bの化合物の用量を量り取り、0.5 mLのDMSO中で調製して、10分間の期間にわたって投与を行う低速の静脈内輸液によって投与した。最大0.5時間の輸液の間及びその完了後にECGを記録した。QT間隔及びRR間隔をPowerLab 4SP（登録商標）ソフトウェアを使用して測定した。輸液の間1、5、及び10分の時点で、及び輸液後5、10、15、及び30分の時点で9回の拍動の平均を取ってデータを解析した。
【００５４】
1 mg/kgの静脈内用量の式I.bの化合物を投与しても、QT間隔は変化しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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