(57)【要約】  高いフェノール含有量を有する液体および粉末のブドウ抽出物が提供される。抽出物は、ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせから作られ得る。ある場合には、抽出物は、ブドウ種子抽出物およびブドウの皮の抽出物のブレンドであってよい。そのような抽出物を製造する方法も提供される。そのような方法は、抽出物中のフェノール化合物の収量を増大するための制御された温度条件を伴う。高血圧と関連する終末器官損傷および癌の治療を含む、対象を治療するために抽出を使用する方法も提供される。
2019511514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせから、液体抽出物を製造する方法であって、前記方法は、
（ａ）ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせを提供するステップ；
（ｂ）前記のブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせを蒸留水と接触させて、抽出混合物を形成するステップ；
（ｃ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度で前記抽出混合物を加熱するステップ（その加熱するステップの間、追加の蒸留水が添加される）；
（ｄ）前記抽出混合物を冷却するステップ；
（ｅ）前記抽出混合物を濾過して固形物を除去し、それにより濾液を形成するステップ；
（ｆ）前記濾液に食品防腐剤を添加するステップ；
（ｇ）前記濾液を冷却して、冷却された濾液を形成するステップ；および
（ｈ）前記の冷却された濾液を濾過して、それにより前記液体抽出物を生産するステップ、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、
前記ブドウ種子、前記ブドウの皮、または、それらの組み合わせは、Ｖｉｔｉｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｖｉｔｉｓ  ｌａｂｒｕｓｃａ、Ｖｉｔｉｓ  ｒｉｐａｒｉａ、Ｖｉｔｉｓ  ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｕｌｐｉｎａ、および、Ｖｉｔｉｓ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓからなる群より選択されるブドウから採取される、
方法。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか一項の方法であって、
前記ブドウ種子、前記ブドウの皮、または、それらの組み合わせは、Ｖｉｔｉｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａブドウから採取される、
方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項の方法であって、
前記蒸留水は、分画蒸気圧縮蒸留水（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｐｏｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）である、
方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項の方法であって、
ブドウ種子が提供される、
方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウ種子を蒸留水と接触するステップは、約０．５  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂのブドウ種子から、約２．５  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂブドウ種子までの比を含む、
方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウ種子を蒸留水と接触するステップは、約１  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂのブドウ種子の比を含む、
方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項の方法であって、
前記の追加の蒸留水は、約０．９２  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子から、約４．６  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂブドウ種子までの比を達成するために添加される、
方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一項の方法であって、
ブドウの皮が提供される、
方法。
【請求項１０】
請求項１から４または９のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウの皮を蒸留水と接触させるステップは、約０．５  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮から、約１．２５  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮までの比を含む、
方法。
【請求項１１】
請求項１から４、９、または１０のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウの皮を蒸留水と接触させるステップは、約１  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮の比を含む、
方法。
【請求項１２】
請求項１から４または９から１１のいずれか一項の方法であって、
前記の追加の蒸留水は、約０．９２  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウの皮から、約４．６  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウの皮までの比を達成するために添加される、
方法。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれか一項の方法であって、
ブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせが提供される、
方法。
【請求項１４】
請求項１から４または１３のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせは、約５０％のブドウの皮に対して５０％のブドウ種子（重量／重量（ｗ／ｗ））から、約１５％のブドウの皮に対して８５％のブドウ種子の比を有する、
方法。
【請求項１５】
請求項１から４、１３、または１４のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせを蒸留水と接触させるステップの比は、約０．５  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂの前記のブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせから、約２．５  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂの前記のブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせまでの比を含む、
方法。
【請求項１６】
請求項１から４または１３から１５のいずれか一項の方法であって、
前記のブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせを蒸留水と接触させるステップは、約１．０  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂの前記のブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせの比を含む、
方法。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項の方法であって、
前記の加熱するステップは、約１〜約６時間行なわれる、
方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項の方法であって、
前記の加熱するステップは、約１〜約２時間行なわれる、
方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項の方法であって、
前記の追加の蒸留水は、前記の加熱するステップ中の複数の部分において前記抽出混合物に添加される、
方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法であって、
前記の追加の蒸留水の一部は、前記の加熱するステップの間、約５分毎から約６０分毎に前記抽出混合物に添加される、
方法。
【請求項２１】
請求項１９の方法であって、
前記の追加の蒸留水の一部は、前記の加熱するステップの間、約１５毎から約３０分毎に前記抽出混合物に添加される、
方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項の方法であって、
前記抽出混合物は、約４０華氏〜約１７０華氏の温度に冷却される、
方法。
【請求項２３】
請求項１から２２のいずれか一項の方法であって、
前記抽出混合物は、約２０ミクロン〜約５０ミクロンの篩サイズを有するフィルターを通して濾過される、
方法。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項の方法であって、
前記食品防腐剤は、約０．１％〜約２０％（重量／体積（ｗ／ｖ））の量で前記濾液に添加される、
方法。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項の方法であって、
前記食品防腐剤は、約０．１％〜約１％（ｗ／ｖ）の量で前記濾液に添加される、
方法。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項の方法であって、
前記防腐剤は、ソルビン酸カリウム、クエン酸、酢酸、またはビタミンＥの少なくとも１つを含む、
方法。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一項の方法であって、
前記濾液は、約３５華氏〜約４５華氏の温度で冷却される、
方法。
【請求項２８】
請求項１から２７のいずれか一項の方法であって、
前記濾液は、約２４時間〜約１２０時間、冷却される、
方法。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれか一項の方法であって、
前記濾液は、約２４時間、冷却される、
方法。
【請求項３０】
請求項１から２９のいずれか一項の方法であって、
前記の冷却された濾液を濾過するステップは、前記の冷却された濾液を、約１ミクロン〜約１０ミクロンの篩サイズを有するフィルターを通して濾過するステップを含む、
方法。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか一項の方法であって、
食品グレードエタノールが、ステップ（ｇ）の濾過された冷却された濾液に添加されて、それにより前記液体抽出物を生産する、
方法。
【請求項３２】
請求項３１の方法であって、
前記食品グレードエタノールは、約１９０プルーフ（９５％エタノール）である、
方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２の方法であって、
前記食品グレードエタノールは、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、またはブドウから作られる、
方法。
【請求項３４】
請求項３１から３３のいずれか一項の方法であって、
前記食品グレードエタノールは、有機の食品グレードエタノールである、
方法。
【請求項３５】
請求項３１から３４のいずれか一項の方法であって、
ステップ（ｇ）の濾過された冷却された濾液に添加される食品グレードエタノールの体積は、前記液体抽出物の体積の約２％〜約５％である、
方法。
【請求項３６】
ブドウ由来の液体抽出物を製造する方法であって、
（ａ）請求項１から８または１７から３５のいずれか一項の方法によって作られるブドウ種子の液体抽出物を提供するステップ；
（ｂ）請求項１から４、９から１２、または１７から３５のいずれか一項の方法によって作られるブドウの皮の液体抽出物を提供するステップ；
（ｃ）前記のブドウ種子の液体抽出物および前記のブドウの皮の液体抽出物を、約５０：５０〜約８５：１５（体積／体積（ｖ／ｖ））の比で組み合わせて、それにより前記のブドウ由来の液体抽出物を形成するステップ、
を含む、
方法。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか一項の方法によって作られる、
液体抽出物。
【請求項３８】
請求項３７の液体抽出物を噴霧乾燥するステップを含む、
ブドウ由来の粉末抽出物を製造する方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法によって作られる、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４０】
約２５％〜５０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４１】
少なくとも約３０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４２】
粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４３】
前記粉末抽出物のグラムあたり少なくとも約６ｍｇの濃度の少なくとも１つの没食子酸またはエラグ酸を含む、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４４】
請求項３９から４３のいずれか一項のブドウ由来の粉末抽出物であって、
前記抽出物は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析に供された場合に７０６および１０３３の分子質量を有する固有の構成要素を含む、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４５】
請求項３９から４４のいずれか一項のブドウ由来の粉末抽出物であって、
前記抽出物は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析に供された場合に７３０または１２８８の分子質量を有する構成要素を、前記分析から生じたクロマトグラフ上のピークの最も大きな３０％の中に７３０または１２８８の分子質量を有する構成要素を作る量で含まない、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４６】
請求項３９から４５のいずれか一項のブドウ由来の粉末抽出物であって、
前記抽出物の合計フェノール含有量は、少なくとも６ヶ月の期間にわたって安定のままであり、６ヶ月でたった１０％の合計フェノール含有量の減少によって特徴付けられる、
ブドウ由来の粉末抽出物。
【請求項４７】
疾患を有する、疾患のリスクが高い、または、再発のリスクがある対象を治療する方法であって、
前記方法は、薬学的に有効量の請求項３７の液体抽出物、請求項３９から４３のいずれか一項の粉末抽出物、または、いずれかを含む製剤を、対象に投与するステップを含む、
方法。
【請求項４８】
請求項４７の方法であって、
投与量あたりの前記の粉末抽出物または製剤の合計フェノール化合物の含有量は、約３０〜５０％（ｍｇ／ｍｇ）である、
方法。
【請求項４９】
請求項４７または４８の方法であって、
前記の粉末抽出物または製剤の投与量は、約１５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む、
方法。
【請求項５０】
請求項４７から４９のいずれか一項の方法であって、
前記対象は、ｋｇ体重あたり少なくとも約１０ｍｇの合計フェノール化合物を含む前記の液体抽出物または前記の粉末抽出物の１日の総投与量を投与される、
方法。
【請求項５１】
請求項４７から５０のいずれか一項の方法であって、
前記対象は、ｋｇ体重あたり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、または８０ｍｇの合計フェノール化合物を含む前記の液体抽出物または前記の粉末抽出物の１日の総投与量を投与される、
方法。
【請求項５２】
請求項４７から５１のいずれか一項の方法であって、
前記対象は、前記の粉末抽出物または製剤の投与量を、少なくとも１日に２回投与される、
方法。
【請求項５３】
請求項４７の方法であって、
投与量あたりの前記の液体抽出物または製剤の合計フェノール化合物含有量は、約２０ｍｇ／ｍＬである、
方法。
【請求項５４】
請求項４７または５３の方法であって、
前記の液体抽出物の投与量は、約２．５ｇ〜約３．５ｇの合計フェノール化合物を含む、
方法。
【請求項５５】
請求項４７から５４のいずれか一項の方法であって、
前記疾患は癌である、
方法。
【請求項５６】
請求項５５のいずれか一項の方法であって、
前記抽出物の投与は、癌関連の細胞の増殖または激増、血管新生、炎症、または線維症の少なくとも１つを阻害する、
方法。
【請求項５７】
請求項５５または５６の方法であって、
前記癌は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膠芽腫、肺癌、皮膚癌、白血病、または、リンパ腫の少なくとも１つを含む、
方法。
【請求項５８】
請求項５５から５７のいずれか一項の方法であって、
前記乳癌は、三種陰性乳癌、エストロゲン受容体陽性乳癌、または、ＨＥＲ２過剰発現乳癌の少なくとも１つである、
方法。
【請求項５９】
請求項５５から５８のいずれか一項の方法であって、
前記乳癌は、脳転移乳癌を含む、
方法。
【請求項６０】
請求項５５から５９のいずれか一項の方法であって、
前記抽出物は、化学療法剤または放射線療法の少なくとも１つと組み合わせて投与される、
方法。
【請求項６１】
請求項４７から５４のいずれか一項の方法であって、
前記疾患は、高血圧によって誘導される線維症である、
方法。
【請求項６２】
請求項４７から５４のいずれか一項の方法であって、
前記疾患は、放射線によって誘導される線維症である、
方法。
【請求項６３】
請求項４７から５４のいずれか一項の方法であって、
前記疾患は、放射線によって誘導される骨喪失である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１６年４月１日に出願された米国仮出願番号６２／３１６，９１８の優先権の利益を主張し、それはその全体で参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］ブドウを含む果物からジュースおよび栄養成分を抽出するための様々な方法が開発されている。しかしながら、そのような公知の方法は、果物から貴重な化合物を効率的に抽出または保存し得ない。
【０００３】
フェノール類、フラボノイド類およびレスベラトロールを含む抗酸化化合物は、ヒトの健康に有益であり得る。有益な効果は、例えば、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、糖尿病および一部の癌のような、酸化プロセスが生じる疾患に見られ得る。フラボノイド類は、フェニルプロパノイドパスウェイによって生産される天然のポリフェノール類の普及した一般的なグループを表す。それらは、ブドウ中の可溶性フェノール類の重要なグループであり、ブドウ由来製品の利益に対する主な貢献となっていると考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
植物、および具体的にはブドウからの、ポリフェノール類および他の植物由来の植物性化学物質の抽出の改善された方法、および、疾患を治療するためのそのような産物に関する用途に関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書において、ブドウから作られた抽出物およびその製剤が記載される。本開示の抽出物は、それから作られる液体抽出物および粉末抽出物を含む。異なる抽出物を生産するための様々な方法および癌に関する治療の方法も提供される。
【０００６】
一態様では、ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせから、液体抽出物を製造する方法が提供されて、当該方法は、（ａ）ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせを提供するステップ；（ｂ）ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせを蒸留水と接触させて、抽出混合物を形成するステップ；（ｃ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度で抽出混合物を加熱するステップ（その加熱するステップの間、追加の蒸留水が添加される）；（ｄ）抽出混合物を冷却するステップ；（ｅ）抽出混合物を濾過して固形物を除去し、それにより濾液を形成するステップ；（ｆ）濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｇ）濾液を冷却して、冷却された濾液を形成するステップ；および（ｈ）冷却された濾液を濾過して、それにより液体抽出物を生産するステップ、を含む。
【０００７】
別の態様では、ブドウ種子抽出物を生産する方法が提供されて、当該方法は、（ａ）ブドウ種子を、蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度でステップ（ａ）由来のブドウ種子および水を加熱するステップ（その間、追加の蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子および水を濾過して、ブドウ種子の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；および（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過して、それによりブドウ種子抽出物を生産するステップを含む。
【０００８】
別の態様では、ブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供されて、当該方法は、（ａ）ブドウの皮を蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度でステップ（ａ）由来のブドウの皮および水を加熱するステップ（その間、追加の蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウの皮および水を濾過して、ブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；および（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過して、それによりブドウの皮の抽出物を生産するステップを含む。
【０００９】
別の態様では、ブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供されて、当該方法は、（ａ）ブドウ種子およびブドウの皮を蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度でステップ（ａ）由来のブドウ種子およびブドウの皮および水を加熱するステップ（その間、追加の蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子およびブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子およびブドウの皮および水を濾過して、ブドウ種子およびブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；および（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過して、それによりブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産するステップを含む。
【００１０】
別の態様では、ブドウ由来の液体抽出物を製造する方法が提供されて、当該方法は、（ａ）上述の方法によって作られるブドウ種子の液体抽出物を提供するステップ；（ｂ）上述の方法によって作られるブドウの皮の液体抽出物を提供するステップ；（ｃ）ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物を約５０：５０〜約８５：１５（体積／体積（ｖ／ｖ））の比で組みわせて、それによりブドウ由来の液体抽出物を形成するステップを含む。
【００１１】
別の態様では、ブドウ由来の粉末抽出物を製造する方法が提供されて、当該方法は、上述のように、ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせから、ブドウ由来の液体抽出物を取得または製造して、およびそれから、液体抽出物を噴霧乾燥させて粉末抽出物を形成するステップを含む。
【００１２】
別の態様では、上記および本開示の他の箇所に記載の方法によって生産される液体抽出物を噴霧乾燥するステップを含む、粉末抽出物を生産する方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、ブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供されて、当該方法は、ブドウの皮の抽出物およびブドウ種子抽出物を組み合わせるステップを含む。
【００１４】
さらなる態様は、本開示に記載の方法を用いて生産される抽出物およびそれから生産される製剤を含む。一態様では、約２５％〜５０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む粉末抽出物または製剤が提供される。別の態様では、少なくとも約３０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む粉末抽出物または製剤が提供される。別の態様では、粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む抽出物が提供される。別の態様では、粉末抽出物のグラムあたり少なくとも約６ｍｇの濃度の少なくとも１つの没食子酸またはエラグ酸を含む粉末抽出物が提供される。任意の上述の抽出物のブレンドである抽出物および製剤も提供される。
【００１５】
一部の実施態様では、本開示において提供される製剤の合計フェノール含有量は、少なくとも６ヶ月の期間にわたって安定のままであり、６ヶ月でたった１０％の合計フェノール含有量の減少によって特徴付けられる。
【００１６】
本明細書において、対象における様々な疾患および症状を治療または予防する方法がさらに記載される。そのような疾患および症状を治療または予防する方法は、本開示に記載の有効量の抽出物を対象に投与するステップを含む。
【００１７】
別の態様では、疾患を有する、疾患のリスクが高い、または、再発のリスクがある対象を治療する方法が提供されて、当該方法は、本開示の先行するセクションにおいて記載される薬学的に有効量のブドウ由来の抽出物を対象に投与するステップを含む。ある場合には、当該方法は、液体抽出物または製剤を投与するステップを含む。ある場合には、当該方法は、粉末抽出物または製剤を投与するステップを含む。疾患は、任意の癌、高血圧によって誘導される線維症、放射線によって誘導される線維症、または放射線によって誘導される骨喪失を含んでよい。
【００１８】
１つまたは複数の態様および実施態様の詳細を、以下の説明および図面に示す。さらなる特徴、物、および利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ−１Ｂ】粉砕されたマスカディンブドウ種子（ＧＳ  Ｇｒｏｕｎｄ）を含む市販サプリメントと比較した、実施例１の方法に従って作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）のフェノール化合物含有量の評価を示す。図１Ａは、比色分析法を用いた合計フェノール化合物の分析を示し、図１Ｂは、ＵＰＬＣ−質量分析による選択の個々のフェノール化合物（カテキン、没食子酸、エピカテキン、エラグ酸、プロシアニジン（ｐｒｏｃｙａｎａｄｉｎ）、およびカテキン−没食子酸（ｃａｔ−ｇａｌｌ）の分析を示す。＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。
【図２Ａ−２Ｂ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウの皮の抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。ＬｎＣａＰ（図２Ａ）またはＰＣ３（図２Ｂ）ヒト前立腺癌細胞は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートされて、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。ｎ＝１２、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト前立腺癌細胞の増殖は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮から単離された抽出物によって阻害された。マスカディンブドウ種子と比較して、マスカディンブドウの皮由来の抽出物を用いた前立腺癌細胞の増殖に違いはなかった。
【図２Ｃ−２Ｅ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウ種子抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。ＺＲ−７５−１細胞は、ヒトエストロゲン受容体陽性乳癌細胞であり、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１は、ヒト三種陰性乳癌細胞であり、ＳＫＢＲ３細胞は、ヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ２）過剰発現乳癌細胞である。ＺＲ−７５−１、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１、およびＳＫＢＲ３細胞を、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートして、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。ＺＲ−７５−１細胞に関してｎ＝９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に関してｎ＝６、および、ＳＫＢＲ３細胞に関してｎ＝１８；コントロールと比較して、＊は、ｐ＜０．０５を表わし、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト乳癌細胞の増殖は、増加する濃度のいずれかの抽出物によって阻害された。
【図２Ｆ−２Ｇ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウ種子抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。Ａ５４９およびＳＫ−ＬＵ−１ヒト肺癌細胞を、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートして、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。Ａ５４９細胞に関してｎ＝１２およびＳＫ−ＬＵ−１細胞に関してｎ＝９；＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト肺癌細胞の増殖は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮から単離された抽出物によって阻害された。マスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物によって処理された肺癌細胞の増殖に違いはなかった。
【図２Ｈ−２Ｉ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウ種子抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。Ｕ８７およびＵ３７３ヒト膠芽腫を、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートして、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。Ｕ８７細胞に関してｎ＝１２およびＵ３７３細胞に関してｎ＝９；＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト膠芽腫の増殖は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮から単離された抽出物によって阻害された。マスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物によって処理された膠芽腫の増殖に違いはなかった。
【図２Ｊ−２Ｋ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウ種子抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９ヒト結腸癌細胞を、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートして、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。ＨＣＴ１１６細胞に関してｎ＝１５〜１８およびＨＴ２９細胞に関してｎ＝１２；＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト結腸癌細胞の増殖は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮から単離された抽出物によって阻害された。マスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物によって処理された結腸癌細胞の増殖に違いはなかった。
【図２Ｌ−２Ｍ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウ種子抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。ＳＫＭＥＬ２８およびＲＰＭＩ  ７９５１ヒト結腸癌細胞を、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートして、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。ＳＫＭＥＬ２８細胞に関してｎ＝６およびＲＰＭＩ  ７９５１細胞に関してｎ＝９；＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト皮膚癌細胞の増殖は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮から単離された抽出物によって阻害された。マスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物によって処理された皮膚細胞の増殖に違いはなかった。
【図２Ｎ−２Ｐ】本明細書に記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウ種子抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関する細胞増殖分析を説明するグラフを示す。ＴＨＰ−１−急性ヒト単球性白血病細胞、ＨＬ６０−急性ヒト前骨髄球性白血病細胞およびＫ５６２−慢性ヒト骨髄性白血病細胞を、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートして、ウェルあたりの細胞の数をカウントすることによって細胞増殖を定量化した。データは、いずれの抽出物によっても処理されなかったコントロール（Ｃｏｎ）の％として表される。ＴＨＰ−１細胞に関してｎ＝１２、ＨＬ６０に関してｎ＝１２、およびＫ５６２細胞に関してｎ＝１２；＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ヒト白血病細胞の増殖は、増加する濃度のマスカディンブドウ種子またはブドウの皮から単離された抽出物によって阻害された。マスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物によって処理された白血病細胞の増殖に違いはなかった。
【図３Ａ−３Ｂ】記載のものとは異なる方法を用いて作られたブドウの皮の抽出物またはブドウ種子抽出物によって処理された細胞株に関するＭＡＰキナーゼ活性を説明するグラフを示す。ＺＲ−７５−１ヒトエストロゲン受容体陽性乳癌およびＭＢＡ−ＭＤ−２３１ヒト三種陰性乳癌細胞を、５０μｇ／ｍＬマスカディンブドウ種子抽出物（ＧＳｅＥ）またはマスカディンブドウの皮の抽出物（ＧＳｋＥ）とともに４時間インキュベートして、ホスホ−ＥＲＫ（ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の両方）を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからの抗体を用いて測定した。ホスホ−ＥＲＫの量を、ローディングコントロールとしてβ−アクチンを用いてデンシトメトリーによって定量化した。代表的なゲルが含まれる。ｎ＝３〜７、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。マスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮からの抽出物の両方とも、乳癌細胞においてホスホ−ＥＲＫ１／ＥＲＫ２活性を減少させて、抽出物が乳癌細胞増殖を阻害することを示唆した。マスカディンブドウ種子抽出物またはマスカディンブドウの皮の抽出物による乳癌細胞の増殖における減少に違いはなかった。
【図４Ａ−４Ｃ】実施例１に示される、マスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における体重分析を説明するグラフを示す。マウスに、３週齢で開始して、それらの飲料水中にｌ−ＭＧＥを与えた。コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。マウスを、２５週後（図４Ａ）または３１週後（図４Ｂおよび図４Ｃ）に安楽死させて、それらの乳腺腫瘍を除去して計量した；マウスは、腫瘍あり（図４Ａおよび図４Ｂ）、または腫瘍なし（図４Ｃ）のいずれかで計量された。２５週齢マウス由来の腫瘍に関してｎ＝７〜１２および３１週齢マウスに関して７〜１０；＊は、ｐ＜０．０５を表す。通常の水またはｌ−ＭＧＥを２５週間飲んだｃ−ｎｅｕマウスの体重に違いはなかった。しかしながら、３１週齢では、ｌ−ＭＧＥを飲んでいるｃ−ｎｅｕマウスの体重には違いがあり、違いは、これらの動物における大きな腫瘍に起因した；腫瘍なしの体重に違いはなかった。
【図５Ａ−５Ｂ】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における心臓重量分析を説明するグラフを示す。マウスに、３週齢で開始して、それらの飲料水中にｌ−ＭＧＥを与えた。コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。マウスを、２５週後（図５Ａ）または３１週後（図５Ｂ）に安楽死させて、それらの心臓を除去して計量した。２５週齢マウス由来の腫瘍に関してｎ＝７〜１２および３１週齢マウスに関して７〜１０。通常の水またはｌ−ＭＧＥを２５または３１週間飲んだｃ−ｎｅｕマウスの心臓重量に違いはなく、抽出物は心臓重量に対して効果がないことを示唆した。
【図６Ａ−６Ｂ】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における腎臓重量分析を説明するグラフを示す。マウスに、３週齢で開始して、それらの飲料水中にｌ−ＭＧＥを与えた。コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。マウスを、２５週後（図６Ａ）または３１週後（図６Ｂ）に安楽死させて、それらの腎臓を除去して計量した。２５週齢マウス由来の腫瘍に関してｎ＝７〜１２および３１週齢マウスに関して７〜１０。通常の水またはｌ−ＭＧＥを２５または３１週間飲んだｃ−ｎｅｕマウスの腎臓の重量に違いはなく、抽出物は腎臓重量に対して効果がないことを示唆した。
【図７】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における腫瘍多重度を説明するグラフを示す。マウスに、３週齢で開始して、それらの飲料水中にｌ−ＭＧＥを与えた。コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。マウスを、２５週後に安楽死させて、乳腺腫瘍の数をカウントして、腫瘍多重度を決定した。個々の乳腺腫瘍を除去して計量して、腫瘍負荷を決定した（図８Ａ〜８Ｂに示される）。ｎ＝７〜１１；＊は、ｐ＜０．０５を表す。ｌ−ＭＧＥによるｃ−ｎｅｕマウスの処置は、水を飲んでいるマウスと比較して乳腺腫瘍の数を有意に減少させて、マスカディンブドウ由来の抽出物が腫瘍多重度を減少させることを示唆した。
【図８Ａ−８Ｂ】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における腫瘍重量分析を説明するグラフを示す。マウスに、３週齢で開始して、それらの飲料水中にｌ−ＭＧＥを与えた。コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。マウスを、２５週後（左）または３１週後（右）に安楽死させて、それらの乳腺腫瘍を除去して計量した。２５週齢マウス由来の腫瘍に関してｎ＝６〜１２および３１週齢マウスに関して７〜１０；＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ｌ−ＭＧＥによるｃ−ｎｅｕマウスの処置は、水を飲んでいるマウスと比較して腫瘍サイズを有意に減少させて、マスカディンブドウ由来の抽出物が腫瘍増殖を減少させることを示唆した。
【図９】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）由来の腫瘍の増殖の分析を示す。飲料水（コントロール）またはｌ−ＭＧＥを与えられた２５週齢マウス由来の腫瘍切片を、増殖性マーカーＫｉ６７に対する抗体とともにインキュベートした。Ｋｉ６７染色に関して陽性の細胞のパーセンテージを示すグラフを、代表的な顕微鏡画像の隣に提供する。ｎ＝８〜１０、＊は、ｐ＜０．０５を表す。ｌ−ＭＧＥによる２５週齢ｃ−ｎｅｕマウスの処置は、通常の水を飲んでいるｃ−ｎｅｕマウスと比較してＫｉ６７の量を有意に減少させて、マスカディンブドウ抽出物は、腫瘍細胞の増殖を低減させることによって、腫瘍増殖を減少させることを示唆した。
【図１０】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）由来の腫瘍における、活性ＥＲＫ１／２ＭＡＰキナーゼの活性の分析を示す。飲料水（コントロール）またはｌ−ＭＧＥを与えられた２５週齢ｃ−ｎｅｕマウス由来の腫瘍切片を、ホスホ−ＥＲＫ１／２に対する抗体とともにインキュベートした。ホスホ−ＥＲＫ陽性細胞のパーセンテージを示すグラフを、代表的な顕微鏡画像の隣に提供する。ｎ＝８〜１０、＊は、ｐ＜０．０５を示す。ｌ−ＭＧＥによる２５週齢ｃ−ｎｅｕマウスの処置は、通常の水を飲んでいるｃ−ｎｅｕマウスと比較してリン酸化ＥＲＫ１／２ＭＡＰキナーゼの量を有意に減少させて、ｌ−ＭＧＥは、増殖性タンパク質キナーゼ活性を低減させることによって、腫瘍増殖を減少させることを示唆した。
【図１１】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における、腫瘍内の血管新生の分析を示す。コントロールまたはｌ−ＭＧＥによって処置されたマウスｃ−ｎｅｕ由来の腫瘍切片を、ＣＤ３４に対する抗体とともにインキュベートして、陽性免疫反応性および形態学によって血管を同定した。血管密度を示すグラフを、代表的な顕微鏡画像の隣に提供する。ｎ＝６〜８、＊は、ｐ＜０．０５を示す。ｌ−ＭＧＥによるｃ−ｎｅｕマウスの処置は、コントロールマウスと比較して腫瘍内の血管の数を有意に減少させて、ブドウ抽出物は、血管新生を減少させて腫瘍サイズを減少させることを示唆した。
【図１２】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された乳癌マウスモデル（ｃ−ｎｅｕマウス）における、腫瘍内の線維症の分析を示す。３１週齢のコントロールまたはｌ−ＭＧＥによって処置されたｃ−ｎｅｕマウス由来の腫瘍切片を、ピクロシリウスレッドによって染色して、組織線維症を測定した。線維症／領域（％）を示すグラフを、代表的な顕微鏡画像の隣に提供する。ｎ＝６〜８、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。ｌ−ＭＧＥによる処置は、コントロールマウスと比較して、ｃ−ｎｅｕ乳房腫瘍におけるピクロシリウスレッドによる染色の量を有意に減少させて、ｌ−ＭＧＥは、腫瘍内の線維症を減少させることを示唆した。
【図１３Ａ−１３Ｂ】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された肺癌マウスモデルにおける、腫瘍数の分析を示す。３−メチルコラントレンによって処置された母親からの雌の子は、３週で開始して、それらの飲料水中にＭＧＥを受け取り、１年後に安楽死された。肺表面上の腫瘍の合計数（図１３Ａ）または癒合していない腫瘍の数（図１３Ｂ）をカウントした。ｎ＝２６〜３２。＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。ｌ−ＭＧＥを用いた、３−メチルコラントレンに対する子宮内曝露によって肺腫瘍を発症しやすい傾向を有するマウスの処置は、水を飲んでいるマウスと比較して肺腫瘍の数を有意に減少させて、マスカディンブドウ由来の抽出物が腫瘍多重度を減少させることを示唆した。
【図１４Ａ−１４Ｂ】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された肺癌マウスモデルにおける、腫瘍体積の分析を示す。３−メチルコラントレンによって処置された母親からの雌の子は、３週で開始して、それらの飲料水中にｌ−ＭＧＥを受け取り、１年後に安楽死された。肺表面上の合計腫瘍領域（左パネル）または癒合していない腫瘍の領域（右パネル）をカウントした。ｎ＝２６〜３２。＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。ｌ−ＭＧＥを用いた、３−メチルコラントレンに対する子宮内曝露によって肺腫瘍を発症しやすい傾向を有するマウスの処置は、水を飲んでいるマウスと比較して肺腫瘍の領域を有意に減少させて、マスカディンブドウ由来の抽出物が腫瘍体積を減少させることを示唆した。
【図１５】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された肺癌マウスモデルにおける、増殖の分析を示す。３−メチルコラントレンによって処置された母親の雌の子孫由来の腫瘍切片を、増殖マーカーである増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対する抗体とともにインキュベートして、領域あたりの陽性に染色された細胞の合計数をカウントした。ＰＣＮＡ／細胞のパーセンテージを示すグラフを、代表的な顕微鏡画像の隣に提供する。ｎ＝２６〜３２、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ｌ−ＭＧＥを用いた、３−メチルコラントレンに対する子宮内曝露によって肺腫瘍を発症しやすい傾向を有するマウスの処置は、増殖マーカーＰＣＮＡの量を有意に低減させて、ｌ−ＭＧＥは、雌マウスの発症している肺腫瘍内の腫瘍増殖を減少させることを示唆した。
【図１６】実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置された肺癌マウスモデルにおける、血管新生の分析を示す。３−メチルコラントレンによって処置された母親の雌の子孫由来の腫瘍切片を、ＣＤ３４に対する抗体とともにインキュベートして、陽性免疫反応性および形態学によって血管を同定して、領域あたりの陽性に染色された血管の合計数をカウントした。血管密度（ＣＤ３４免疫反応性）を示すグラフを、代表的な顕微鏡画像の隣に提供する。ｎ＝２６〜３２、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ｌ−ＭＧＥを用いた、３−メチルコラントレンに対する子宮内曝露によって肺腫瘍を発症しやすい傾向を有するマウスの処置は、血管の量を有意に減少させて、ｌ−ＭＧＥは、雌マウスの発症している肺腫瘍内の血管新生を減少させることを示唆した。
【図１７】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスに関する体重分析を示す。それぞれの処置群内のマウスを、処置期間の終わりに計量して、マウス重量に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定した。コントロールと比較して、最も多い投与量のｐ−ＭＧＥを用いたマウスの重量において、小さいが有意な低減があった。ｎ＝５、ｐ＜０．０５。４週の処置期間の終わりのマウスの重量は、コントロール群と比較して、３つの最も低い濃度のｐ−ＭＧＥと同様であった。最も高い濃度のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスは、合計体重において小さいが有意な低減があった（２８．６±１．２グラム〜２５．０±１．３グラム、それらの合計体重の１５％未満を表す）。
【図１８Ａ−１８Ｃ】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの食物摂取、糞便中排せつ、および尿容量の分析を示す。それぞれの処置群内のマウスを、食物摂取（図１８Ａ）、糞便中排せつ（図１８Ｂ）および尿容量（図１８Ｃ）を測定するために、処置の最後の週の間、代謝ケージ内に２４時間置いた。ｎ＝５。ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの食物摂取、糞便産生、または尿容量に違いはなかった。
【図１９】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの病理学的組織分析を示す。それぞれの処置群内のマウスの心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および脳を除去した。心臓、肺、肝臓、腎臓、および脾臓の切片は、固定されて、パラフィン内に包埋されて、切断されて、Ｈ＆Ｅによって染色されて、獣医病理学者によって試験された。
【図２０】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの心臓重量の分析を示す。それぞれの処置群内のマウスの心臓を、処置期間の終わりに除去して計量して、心臓重量に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定した。ｎ＝５。ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの心臓重量に違いはなかった。
【図２１】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの血圧の分析を示す。血圧は、無麻酔マウス（血圧測定のために１週間トレーニングされた）においてテールカフ・プレチスモグラフィーによって測定された。ｎ＝５。未処置マウス（コントロール）と比較して、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって４週間処置されたマウスにおける血圧に違いはなかった。
【図２２Ａ−２２Ｅ】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの心臓の心エコー検査を要約するグラフを示す。マウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔して、４週目のあいだに、ＶＥＶＯをＭおよびＢモードで用いて、駆出率（図２２Ａ）、短縮率（図２２Ｂ）、心拍出量（図２２Ｃ）、一回拍出量（図２２Ｄ）および心拍数（図２２Ｅ）を含む、様々な心臓パラメーターを計算した。ｎ＝５。増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスにおける、収縮期中に心臓から排出される血液の比率に違いはなかった。未処置マウスと比較して、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの心臓における、短縮率として測定される心収縮力に違いはなかった。未処置マウス（コントロール）およびｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスにおいて、どのくらい多くの血液が心臓によってくみ出されているかについての尺度としての心拍出量に違いはなかった。未処置マウス（コントロール）およびｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの間で、一回拍出量または心拍数に違いはなかった。
【図２３Ａ−２２Ｅ】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの臓器重量評価を要約するグラフを示す。処置期間の終わりに、それぞれの処置群内のマウスの選択臓器を除去して計量して、臓器重量に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定した（ｎ＝５）。ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの肺、腎臓、脾臓、または脳の重量に違いはなかった（図２３Ａ、２３Ｃ−２３Ｅ）。図２３Ｂに示されるように、コントロールと比較して、２番目に最も高い投与量のｐ−ＭＧＥを用いた肝臓の重量に、小さいが有意な増大があった（ｐ＜０．０５）。４週の処置期間の終わりのマウスの肝臓の重量は、コントロール群と比較して、２つの最も低い濃度で同様であった。２番目に高い濃度のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスは、コントロール群と比較して、肝臓重量において小さいが有意な増大があった。しかしながら、最も高い濃度のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの肝臓重量は、コントロールと異ならなかった。
【図２４Ａ−２４Ｂ】本開示の態様に係る、実施例１に記載の異なる投与量のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の影響を評価する毒性試験における、マウスの腎臓機能評価を要約するグラフを示す。未処置および処置されたマウスの尿中アルブミン量（処置の４週目のあいだに集めた）を、ラジオイムノアッセイによって測定して、尿クレアチニンの尺度として表した（ｎ＝５）。図２４Ａに示されるように、腎臓機能の尺度として、未処置マウスと比較して、４週間、増加する濃度で処置されたマウスの尿中の尿アルブミンの量に違いはなく、同動物の糸球体または尿細管においていかなる病理もないことと一致した。未処置マウス（コントロール）と比較して、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって４週間治療されたマウスの尿における腎臓損傷／機能の指標として、尿アンギオテンシノーゲン（Ａｏｇｅｎ）をラジオイムノアッセイによって測定した。尿中の尿クレアチニンも測定した。Ａｏｇｅｎの量は、Ａｏｇｅｎ（ｎｇ）／クレアチニン（ｍｇ）として表される。ｎ＝５。図２４Ｂに示されるように、未処置および処置されたマウスの間で尿Ａｏｇｅｎの量に違いはなく、ｐ−ＭＧＥは腎臓を損傷させないことを示唆し、病理学によって評価される腎臓糸球体および尿細管において病理がないことと一致した。
【図２５】本開示の態様に係る、血圧に対する実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果の分析を示す。収縮期血圧を、通常の飲料水（コントロール）、０．２ｍｇ／ｍＬ  ｐ−ＭＧＥ（ｐ−ＭＧＥ）、ＡｎｇＩＩ（埋め込まれた浸透圧ミニポンプを介して投与される２４μｇ／ｋｇ／ｈのＡｎｇＩＩ）、または、ＡｎｇＩＩおよびｐ−ＭＧＥによって４週間処置された、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて測定した。血圧は、テールカフ・プレチスモグラフィーによって毎週測定した。ｎ＝８、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００５を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。この試験では、ＡｎｇＩＩの投与は、４週の期間にわたってラットの血圧を上昇させた。ｐ−ＭＧＥは、通常の水を飲んでいるコントロールのラットまたはＡｎｇＩＩによって処置されたラットの血圧に対して効果がなく、ｐ−ＭＧＥは、高血圧を悪化させないことを示唆した。
【図２６】本開示の態様に係る、図２５に関して説明されたラットに関する体重の評価を示す。４週の処置期間の終わりに、ラットを計量して、ｐ−ＭＧＥによる処置が、正常血圧または高血圧ラットの体重に効果があるかどうかを決定した。ｎ＝８、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。ＡｎｇＩＩは、ｐ−ＭＧＥによる処置の存在または不存在において、ラットの体重を低減させた。ｐ−ＭＧＥによる処置は、正常血圧、未処置ラットまたはＡｎｇＩＩによって処置された高血圧のラットにおいて、体重に対して効果がなく、ｐ−ＭＧＥは体重に影響を及ぼさないことを示唆した。
【図２７Ａ−２７Ｂ】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／またはＡｎｇＩＩによって処置されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、心臓収縮期性の機能の評価を示す。ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ２１００  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（中央−乳頭レベルにおける、Ｍモード傍胸骨短軸像）を用いて測定された、ＡｎｇＩＩ、ｐ−ＭＧＥ、または両方によって４週間処置されたラットにおいて、図２７Ａは駆出率を示し、図２７Ｂは短縮率を示す。ｎ＝８。ＡｎｇＩＩとｐ−ＭＧＥのいずれも単独または組み合わせで、コントロールと比較して駆出率および短縮率を改変せず、ＡｎｇＩＩおよびｐ−ＭＧＥ投与は、心臓収縮期性の機能に対して効果がないことを示した。
【図２７Ａ−２７Ｂ】本開示の態様に係る、図２７Ａ−２７Ｂに関して説明されるラットにおける心臓の特性の分析を示す。ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ２１００  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて中央−乳頭レベルで、Ｍモード傍胸骨短軸像において評価された、ＡｎｇＩＩ、ｐ−ＭＧＥ、または両方によって４週間処置されたマウスにおいて、図２８Ａは、左後方壁の厚さの測定を示し、図２８Ｂは、拡張終期直径の測定を示し、図２８Ｃは、相対的な壁の厚さの測定を示す。ｎ＝８；コントロールと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＡｎｇＩＩは、左心室（ＬＶ）後方壁の厚さを増大させて、ＬＶの拡張終期内径を低減させて、相対的な壁の厚さを増大させて、ＡｎｇＩＩにより処置が、左心室の同心円状の再構築を誘導することを示唆した。ｐ−ＭＧＥは、ＡｎｇＩＩが介在する変化を悪化または減少させなかった。
【図２９Ａ−２９Ｂ】本開示の態様に係る、ＡｎｇＩＩ、ｐ−ＭＧＥ、または両方によって４週間処置された、図２８Ａ−２８Ｂに関して説明されるラットにおける、拡張期機能の評価を示す。図２Ａは、ＬＶ弛緩の尺度としてｅ’の評価を示し、図２９Ｂは、左心室充填圧力の示度としてＥ／ｅ’の評価を示す。ｎ＝８；コントロールと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＃ＡｎｇＩＩ単独と比較してｐ＜０．０５。ＡｎｇＩＩによって誘導される拡張期の機能障害は、損なわれた心室弛緩において反映されて、左心室充填圧力を増大させた。ｐ−ＭＧＥの同時投与は、Ａｎｇ−ＩＩが介在するＥ／ｅ’の増大を減少させて、ｅ’を増大させる傾向があり、ｐ−ＭＧＥが、ＡｎｇＩＩによって誘導される拡張期の機能障害を改善することを示唆した。
【図３０Ａ−３０Ｂ】本開示の態様に係る、ＡｎｇＩＩ、ｐ−ＭＧＥ、または両方によって４週間処置された、図２８Ａ−２８Ｂに関して説明されるラットにおける、高血圧によって誘導される心臓の損傷の評価を示す。心臓の左心室切片をピクロシリウスレッドで染色して合計コラーゲンを同定して、それぞれのラットの左心室由来の４つの画像において定量化した。ｎ＝８；＊＊＊＊コントロールと比較してｐ＜０．０００１；＃ＡｎｇＩＩと比較してｐ＜０．０５。ｐ−ＭＧＥ同時投与は、左心室において、ＡｎｇＩＩが介在する間質線維症の増大を改善させて、抽出物が、高血圧によって誘導される心臓の損傷を弱め得ることを示唆した。
【図３１Ａ−３１Ｂ】本開示の態様に係る、ＡｎｇＩＩ、ｐ−ＭＧＥ、または両方によって４週間処置された、図２８Ａ−２８Ｂに関して説明されるラットにおける、高血圧によって誘導される心臓の損傷の評価を示す。心臓の左心室の切片を小麦胚芽アグルチニンで染色して、心筋細胞の輪郭を描いた。平均断面積（ＭＣＳＡ）を、それぞれの動物由来の少なくとも４つの別個の画像から平均した。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５；＃ＡｎｇＩＩ単独と比較してｐ＜０．０５。ＡｎｇＩＩによって増大された心筋細胞ＭＣＳＡは、ｐ−ＭＧＥの同時投与により弱められて、心筋細胞肥大が、ｐ−ＭＧＥの投与によって改善され得ることを示唆した。
【図３２Ａ−３２Ｆ】本開示の態様に係る、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１三種陰性乳房腫瘍の増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を要約するグラフを示す。無胸腺マウス（ｎ＝８）に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注入して、４週間、それらの飲料水中に投与されたｐ−ＭＧＥによって処置した。腫瘍サイズを覚醒マウスにおいて１週間に２回測定して、腫瘍サイズを、半楕円に関する公式を用いて計算した。図３２Ａは、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによる４週の処置は、無胸腺マウスにおいてヒト三種陰性乳房腫瘍の体積を減少させたことを説明するグラフを示す。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。これらのマウス（ｎ＝８）由来の腫瘍を除去して計量した。図３２Ｂは、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによる処置が、未処置マウスと比較して、マウスにおける腫瘍の重量を減少させたことを説明するグラフを示し、ｐ−ＭＧＥの投与が、乳房腫瘍の増殖を減少させることを示唆する；＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。図３２Ｃ−３２Ｅは、図３２Ａおよび図３２Ｂに関して記載される、それらの飲料水中に０．１ｍｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスまたはコントロールマウスのＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍における、それぞれ、二重特異性ホスファターゼ１（ＭＡＰキナーゼホスファターゼ１（ＤＵＳＰ１／ＭＫＰ１）としても知られる）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤１（ｐ２１）の、ｍＲＮＡレベルの分析を示す。ＴＲＩｚｏｌを用いて腫瘍からＲＮＡを単離して、標的特異的なプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、および、１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部標準として用いて、ｍＲＮＡを定量化した。結果は、Ｃｔ値として定量化されて、ここで、Ｃｔは、増幅された産物が最初に検出されて相対的な遺伝子発現（標的／コントロールの比）として定義されるＰＣＲの閾値サイクルとして定義された。ｎ＝８、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。図３２Ｃは、ｐ−ＭＧＥによる処置が、ＤＵＳＰ１／ＭＡＫＰ１の相対的な発現を減少させたことを説明するグラフを示す。ＤＵＳＰ１／ＭＡＫＰ１は、癌細胞の増殖に関与することが知られるＥＲＫ１およびＥＲＫ２タンパク質キナーゼを脱リン酸化、したがって不活化することが知られている。ＤＵＳＰ１／ＭＡＫＰ１の増大は、ｐ−ＭＧＥによって処置されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞および抽出物によって処置された脳特異的乳癌細胞の両方において観察されたホスホ−ＥＲＫ１およびホスホ−ＥＲＫ２の減少の原因であり得る。図３２Ｄは、ｐ−ＭＧＥによる処置が、細胞増殖の制御に関与する主な増殖因子の１つであるＰＤＧＦの相対的発現を減少させたことを説明するグラフを示す。ｐ−ＭＧＥを用いた処置によるＰＤＧＦの減少は、ｐ−ＭＧＥによって誘導される、腫瘍増殖の減少に関与し得る。図３２Ｅは、ｐ−ＭＧＥによる処置が、サイクリン／サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）��合体を阻害するサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＫＩ）であるｐ２１の相対的発現を増大させたことを説明するグラフを示す。ｐ−ＭＧＥを用いた処置によるｐ２１の減少は、細胞周期が腫瘍増殖を減少させるのをｐ−ＭＧＥが阻害し得ることを示唆し、ｐ−ＭＧＥによって処置された脳特異的乳癌細胞において観察されたサイクリンＤの減少と一致する。図３２Ｆは、細胞増殖の制御に関与する細胞周期パスウェイを示し、円はこのプロセスにおけるｐ２１の役割を示している。ｐ−ＭＧＥによって誘導されるｐ２１の増大は、細胞周期を通して進行を減少させることによって、細胞増殖の制御に関与し得る。
【図３３Ａ−３３Ｂ】本開示の態様に係る、脳特異的転移乳癌細胞株の増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。細胞株４Ｔ１．ｌｕｃ．２Ｂｒ５またはＥｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５を、クローン原性密度でプレーティングして、指示された濃度のｐ−ＭＧＥに曝した（これらの図においてＭＧＥと標識される）。生じるコロニーを染色して定量化して、無（０）ｐ−ＭＧＥコントロールに対して標準化した。データは、３回の実験の平均＋／−ＳＥＭを表し、それぞれ少なくともトリプリケートで行なわれた。＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。ｐ−ＭＧＥは、三種陰性乳癌の親細胞株（４Ｔ１）およびＥＲ＋親細胞株（Ｅｏ７７１）から採取された２つの異なる脳特異的乳癌細胞株の増殖を減少させて、抽出物が、転移乳癌の増殖を阻害することを示唆した。
【図３４Ａ】本開示の態様に係る、脳特異的乳癌細胞株の増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。脳特異的乳癌細胞（４Ｔ１−Ｂｒ５、Ｅｏ７７１−Ｂｒ５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１Ｂｒ、およびＭＣＦ７．ＨＥＲ２．Ｂｒ３）を、示されたとおりに、１０μｇ／ｍＬ  ｐ−ＭＧＥとともに（Ｍ）、または、ｐ−ＭＧＥを伴わずに（コントロールのため、Ｃ）、インキュベートして、合計ＥＲＫ１／２と比較したリン酸化ＥＲＫ１／２（ｐＥＲＫ１／２）に関してウエスタンブロットにより分析した。示されるブロットは、３つの非依存性実験の代表であり；以下の定量化は、３つの非依存性実験からの平均値を表す。ｐ−ＭＧＥによる２４時間の処置後に、４Ｔ１−Ｂｒ５は、ＥＲＫ１／２リン酸化の有意な低減を示し（６８％低減、ｐ＜０．０５）、ＭＡＰキナーゼのリン酸化および活性化の減少が、ｐ−ＭＧＥによって誘導される細胞増殖の減少に関与し得ることを示唆した。対照的に、ホスホ−ＥＲＫ１／２は、Ｅｏ７７１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＭＣＦ−ＨＥＲ１脳特異的乳癌細胞で変わらず、異なるパスウェイが、異なるタイプの乳癌細胞における細胞増殖の阻害に関与し得ることを示唆した。
【図３４Ｂ】本開示の態様に係る、脳特異的乳癌細胞株の増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。脳特異的乳癌細胞（４Ｔ１−Ｂｒ５、Ｅｏ７７１−Ｂｒ５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１Ｂｒ、およびＭＣＦ７．ＨＥＲ２．Ｂｒ３）を、１０μｇ／ｍＬ  ｐ−ＭＧＥとともに（Ｍ）、または、ｐ−ＭＧＥを伴わずに（コントロールのため、Ｃ）、４時間または２４時間インキュベートして、それから、ウエスタンブロット分析によって、サイクリンＤ１に対する抗体を用いてプローブして；チューブリンをローディングコントロールとして用いた。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。ｐ−ＭＧＥは、４Ｔ１三種陰性、Ｅ０７７１ＥＲ＋、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三種陰性、およびＭＣＦ７．ＨＥＲ２ＥＲ＋／ＨＥＲ２過剰発現細胞株において、２４時間の処置後にサイクリンＤ１の低減を引き起こし、抽出物が、細胞周期を通した進行を減少させて増殖を減少させることを示唆した。
【図３５】本開示の態様に係る、脳特異的乳癌細胞株の増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。脳特異的乳癌細胞（４Ｔ１−Ｂｒ５、Ｅｏ７７１−Ｂｒ５、ＭＤＡ−ＭＢ２３１Ｂｒ、およびＭＣＦ７．ＨＥＲ２．Ｂｒ３）を、示されたとおりに、１０μｇ／ｍＬ  ｐ−ＭＧＥとともに（Ｍ）、または、ｐ−ＭＧＥを伴わずに（コントロールのため、Ｃ）、４または２４時間インキュベートして、ＰＡＲＰまたは開裂カスパーゼ３に関してウエスタンブロットにより分析して；β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。＊ＰＡＲＰ切断産物。示されるデータは、それぞれの細胞株に関する３つの非依存性実験の代表である。ｐ−ＭＧＥは、アポトーシスのマーカーとして、開裂ＰＡＲＰおよび開裂カスパーゼ３の増大によって検出される、脳特異的４Ｔ１細胞株におけるアポトーシスを刺激した。対照的に、アポトーシスは、他の３つの脳特異的細胞株では、ｐ−ＭＧＥによって増大されず、異なるメカニズムが、異なるタイプの転移乳癌における細胞増殖の減少の原因となっていることを示唆した。
【図３６Ａ−３６Ｂ】本開示の態様に係る、三種陰性乳癌細胞増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトＴＮＢＣ細胞を、製造元の指示に従って、Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ＮｕｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｒｅｄ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＥＦ１α、Ｐｕｒｏ）によってトランスフェクトして、細胞核を標識した。トランスフェクションを製造元の指示に従って行なって、トランスフェクトされた細胞を選択して、ピューロマイシンを用いて維持した。標識化された細胞を９６ウェルプレートに蒔いて、フェノール類（μｇ）／培地（ｍＬ）として計算される増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって処置した。細胞増殖をパネルＡに示されるように４８時間で測定して、パネルＢにおいて定量化した。４重でｎ＝３、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。ｐ−ＭＧＥは、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を有意に減少させて、腫瘍増殖の減少と一致した。
【図３７Ａ−３７Ｃ】本開示の態様に係る、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。細胞増殖を、増加する濃度のｐ−ＭＧＥに応じて、ＢＴ−５４９（図３７Ａ）、ＢＴ−２０（図３７Ｂ）、および４Ｔ１（図３７Ｃ）ＴＮＢＣ細胞株において測定した。４重でｎ＝３；＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す。ＢＴ−５４９およびＢＴ−２０ヒト三種陰性乳癌細胞および４Ｔ１マウスＴＮＢＣ細胞の増殖は、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって減少し、ＴＮＢＣが、ｐ−ＭＧＥによる処置に関する標的であることを示唆した。
【図３８Ａ−３８Ｄ】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）によって処置された三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞における、ＭＡＰキナーゼシグナリングの分析を示す。４Ｔ１細胞を、ｐ−ＭＧＥによって１２時間、１０μｇ／ｍＬまたは２０μｇ／ｍＬで処置して、細胞溶解物を、リン酸化および活性化ＭＡＰキナーゼｐ−ＥＲＫ１およびｐ−ＥＲＫ２およびＭＡＰキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２に関する抗体を用いたウエスタンブロットによる分析のために調製した。ホスホ−ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の量を、図３８Ａおよび図３８Ｂにそれぞれ示されるように、非リン酸化ＥＲＫ１および非リン酸化ＥＲＫ２の量に対して標準化して、代表的なブロット画像を図３８Ｃおよび図３８Ｄに示す。ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。ｐ−ＭＧＥは、細胞増殖の制御に関与しているＭＡＰキナーゼであるリン酸化活性化ＥＲＫ１およびＥＲＫ２の両方を有意に減少させて、ＥＲＫ１／２活性の減少が、細胞増殖および乳房腫瘍増殖の低減に関与することを示唆した。
【図３９】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）によって処置された三種陰性乳癌細胞における、示差的な遺伝子分析の結果を示す。４Ｔ１マウス三種陰性乳癌細胞を、２０μｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥとともに０、１、６または１２時間インキュベートして、ＴＲＩｚｏｌを用いて合計ＲＮＡを単離した。示差的な遺伝子発現を、Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて、ＲＮＡｓｅｑを用いて分析した。ＥＰＩＧ（Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅｓに関する方法）Ｇｌｏｂａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ分析を用いてデータを分析して、９個の別個のパターンにわたる２００９個の遺伝子の上方制御、下方制御または有意でない変化を示した。ｐ−ＭＧＥによって上方制御された遺伝子ファミリーは、炎症性またはリポ多糖（ＬＰＳ）応答に関与する２９個の遺伝子、ウイルス防御またはＩＦＮβ応答に関与する２７２個の遺伝子、および、自食作用または小胞体（ＥＲ）ストレス応答に関与する７４１個の遺伝子を含んだ。対照的に、ヌクレオソーム集合または先天性の免疫応答に関与する９６個の遺伝子、および、細胞周期または細胞分裂に関与する７４８個の遺伝子は、下方制御された。４つのさらなる遺伝子パターンは、有意な富化を示さなかった。
【図４０Ａ−４０Ｂ】本開示の態様に係る、三種陰性乳癌細胞の遊走に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞を、９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖させて、８００マイクロの領域を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（商標）を用いて露出させた。細胞をそれから、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって処置した（図に示されたとおり）。図４０Ａは、２４時間の処置期間のあいだに、露出領域へ遊走するために移動した距離を描く代表的な画像を示し、その期間、細胞は２５μｇのフェノール類／ｍＬの濃度でｐ−ＭＧＥによって処置された。図４０Ｂは、それぞれの濃度のｐ−ＭＧＥで、２４時間で細胞が遊走した定量化された距離を示す。４重でｎ＝３；＊＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。ｐ−ＭＧＥは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ細胞の遊走を阻害し、ｐ−ＭＧＥが、転移ＴＮＢＣに導く遊走のプロセスの一部としての浸潤を減少させることを示唆した。
【図４０Ｃ−４０Ｄ】本開示の態様に係る、三種陰性乳癌細胞の遊走に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。４Ｔ１  ＴＮＢＣ細胞を、９６ウェルプレート中でコンフルエンスまで増殖させて、８００μｍの領域を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（商標）を用いて露出させた。細胞を、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって処置して、創傷の近くに移動した距離を、図４０Ｃのグラフに示されるように、４８時間の処置期間のあいだ、計算した。２４時間で細胞が遊走した距離を、図４０Ｄのグラフに示されるように定量化した。４重でｎ＝３；＊＊は、ｐ＜０．００５を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。ｐ−ＭＧＥは、４Ｔ１  ＴＮＢＣ細胞の遊走を阻害して、ｐ−ＭＧＥが、浸潤および転移増殖のプロセスの一部としてのＴＮＢＣの遊走を減少させることを示唆した。
【図４１Ａ】本開示の態様に係る、ＨＥＲ２陽性乳癌細胞の増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。ＳＫＢｒ３ヒトＨＥＲ２乳癌細胞を、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって処置して、フェノール類（μｇ）／培地（ｍＬ）として計算した。細胞増殖を４８時間で測定して、コントロールの％として定量化した。４重でｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜００１を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜．０００１を表す。ｐ−ＭＧＥは、ヒトＳＫＢｒ３ヒトＨＥＲ２過剰発現細胞の増殖を有意に減少させて、抽出物が、ＨＥＲ２過剰発現乳房腫瘍の増殖を減少させ得ることを示唆した。
【図４１Ｂ−４１Ｄ】本開示の態様に係る、ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路におけるタンパク質のリン酸化状態に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。ＳＫＢｒ３ヒトＨＥＲ２細胞を、増加する期間、２０μｇ／ｍＬのｐＭＧＥによって処置して、ウエスタンブロットによる分析のために細胞溶解物を調製した。ＧｅｌＤｏｃによってゲルを分析して、免疫反応性バンドを、ローディングしたタンパク質の合計量／レーンの分析によって、ローディングに関して標準化した。代表的な画像をグラフの下に示す。ｎ＝５、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。図４１Ｂは、セリン４７３におけるＡＫＴリン酸化を示し、図４１Ｃは、トレオニン３０８におけるＡＫＴリン酸化を示し、図４１Ｄは、ｍ−ＴＯＲにおけるリン酸化（ｐ−ｍＴＯＲ）を示す。ｐ−ＭＧＥは、ＡＫＴおよびｍ−ＴＯＲのリン酸化および活性化を有意に減少させて、ＡＫＴパスウェイおよびｍＴＯＲの活性化が、ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞および腫瘍における増殖および生存の制御に関与することを示唆した。
【図４２Ａ−４２Ｄ】本開示の態様に係る、脳特異的転移乳癌細胞に関するコロニー増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／または放射線の効果を示す。４Ｔ１．ｌｕｃ２．Ｂｒ５またはＥｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５細胞を、クローン原性密度で一晩プレーティングして、ｐ−ＭＧＥ（図においてＭＧＥと示される）に２４時間曝して、示されたとおりに放射線照射した（ＩＲ）。コロニーを染色して、図４２Ａ（４Ｔ１．ｌｕｃ２．Ｂｒ５）および図４２Ｂ（Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５）に示されるように定量化した。生存率＝＃コロニー／プレーティングされた細胞数  ＊  シャム（ｓｈａｍ）の放射線照射細胞のプレーティング効率。データは、３〜４回の非依存性実験に関する平均±ＳＥＭを表し、それぞれトリプリケートで行なわれた。図４２Ｃは、４Ｔ１．ｌｕｃ２．Ｂｒ５細胞に関する相対的コロニー数を示す図４２Ａからのデータであり；ｐ−ＭＧＥおよびＩＲの組み合わせは、いずれかの条件単独よりも（ｔｈａｔ）大きな喪失をもたらす。＊＊は、シャムコントロールに対するｐ＜０．０１を表し；＊＊＊＊は、シャムコントロールに対するｐ＜０．００１を表し；ｂは、２Ｇｙコントロールと比較してｐ＜０．０５、ｐ−ＭＧＥシャムに対してｐ＜０．００１。トリプリケートで行なわれたｎ＝３実験。図４２Ｄは、Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５細胞による相対的コロニー数を示す図４２Ｂからのデータである；ｐ−ＭＧＥおよびＩＲの組み合わせは、いずれかの条件単独よりも大きな喪失をもたらす。＊は、シャムコントロールに対するｐ＜０．０５を表し；＊＊は、シャムコントロールに対するｐ＜０．０１を表し；ａは、２Ｇｙコントロールと比較してｐ＜０．０１、ｐ−ＭＧＥシャムに対してｐ＜０．００１。トリプリケートで行なわれたｎ＝４実験。転移脳腫瘍を有する患者を治療するために典型的に用いられる放射線とｐ−ＭＧＥの組み合わせは、ｐ−ＭＧＥまたは放射線いずれか単独よりも大きな増殖の減少をもたらし、放射線とｐ−ＭＧＥの同時投与が、腫瘍増殖の減少により効果的であり得ることを示唆した。
【図４３】本開示の態様に係る、ＥＲ＋乳癌腫瘍増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／またはタモキシフェンの効果を示す。無胸腺マウスの乳腺脂肪パッドに、ＺＲ−７５−１  ＥＲ＋細胞（１×１０６細胞）を注入して、カリパスを用いて３日ごとに腫瘍増殖を測定した。腫瘍が３０ｍｍ３のサイズに到達したときに、マウスを、水／通常の固形飼料（コントロール）、０．１ｍｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（図においてＭＧＥと標識）／通常の固形飼料、３２ｍｇ／ｋｇ／ｄのおよその投与量のタモキシフェン（ＴＡＭ、Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ由来の４００ｐｐｍ  ＴＡＭシトレートを含む固形飼料で投与される）／通常の水、または、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェン（図において、ＴＡＭ＋ＭＧＥ）を用いて、７週間処置した。半楕円に関する公式を用いて腫瘍サイズを計算した。＊は、ｐ＜０．０５を表す；ｎ＝７〜８。ｐ−ＭＧＥによる処置は、通常の水を飲んでいるマウスと比較して、７週の処置にわたって腫瘍体積を有意に減少させた。タモキシフェン単独による処置も、腫瘍サイズを減少させた。しかしながら、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンの組み合わせは、腫瘍体積の減少において相加的な効果を引き起こし、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェン単独と比較して有意であった。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥをタモキシフェンと組み合わせて用いて、ＥＲ＋腫瘍増殖を減少させることができることを示唆する。
【図４４】本開示の態様に係る、ＥＲ＋乳癌腫瘍重量に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／またはタモキシフェンの効果を示す。図４３に記載のように、ｐ−ＭＧＥおよび／またはタモキシフェンを用いてまたは用いずに処置されたＺＲ−７５−１腫瘍を、７週の処置後に除去して計量した。ｎ＝７〜８。ｐ−ＭＧＥによる処置は、通常の水を飲んでいるマウスと比較して、７週の処置にわたって腫瘍重量を有意に減少させた。タモキシフェン単独（ＴＡＭ）による処置も、腫瘍重量を減少させた。しかしながら、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンの組み合わせ（ＴＡＭ＋ＭＧＥ）は、腫瘍重量の減少において相加的な効果を引き起こし、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェン単独と比較して有意であった。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥをタモキシフェンと組み合わせて用いて、ＥＲ＋腫瘍増殖を減少させることができることを示唆する。
【図４５Ａ−４５Ｂ】本開示の態様に係る、ＥＲ＋乳癌腫瘍細胞増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／またはタモキシフェンの効果を示す。図４３に記載のように、タモキシフェンおよび／またはｐ−ＭＧＥ（図においてＴＡＭおよびＭＧＥと標識される）を用いてまたは用いずに処置されたＺＲ−７５−１腫瘍を、７週の処置後に除去して、ホルマリンに固定化して、パラフィン包埋して、切断した。切片を、増殖のマーカーであるＫｉ６７に対する抗体とともにインキュベートした。Ｋｉ６７細胞の数を領域あたりカウントして、図４５Ａに示されるように平均化した。それぞれの処置群からの代表的な写真を図４５Ｂに示す。＊は、ｐ＜０．０５を示す；ｎ＝７〜８。ｐ−ＭＧＥ単独による処置は、Ｋｉ６７免疫反応性を有意に減少させて、抽出物が、ＥＲ＋乳房腫瘍の増殖を阻害することを示唆した。エストロゲン受容体拮抗薬タモキシフェン（ＴＡＭ）も、増殖を有意に減少させた。ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェン（ＭＧＥ＋ＴＡＭ）による処置は、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェン単独による処置よりも有意に増殖を減少させた。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥをタモキシフェンと組み合わせて用いて、ＥＲ＋腫瘍増殖を減少させることができることを示唆する。
【図４６】本開示の態様に係る、ＥＲ＋乳癌腫瘍体積に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／またはタモキシフェンの効果を示す。無胸腺マウスの乳腺脂肪パッドに、ＭＣＦ７ヒトＥＲ＋細胞（１×１０６細胞）を注入して、カリパスを用いて３日ごとに腫瘍増殖を測定した。腫瘍が３０ｍｍ３のサイズに到達したときに、マウスを、水／通常の固形飼料（コントロール）、０．１ｍｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（図においてＭＧＥと標識される）／通常の固形飼料、３２ｍｇ／ｋｇ／ｄのおよその投与量のタモキシフェン（ＴＡＭ、Ｈａｒｌａｎ−Ｔｅｋｌａｄ由来の４００ｐｐｍ  ＴＡＭシトレートを含む固形飼料で投与される）（ＴＡＭ、それらの固形飼料で投与される）／通常の水、または、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェン（ＭＧＥ＋ＴＡＭ）によって５週間処置した。腫瘍サイズを、半楕円に関する公式を用いて計算した。＊は、ｐ＜０．０５を表し、ｎ＝７〜８。通常の水を飲んでいるマウスと比較して、ｐ−ＭＧＥによる処置は、処置の５週にわたってＭＣＦ７腫瘍体積を減少させた。タモキシフェン単独による処置も、腫瘍サイズを減少させた。しかしながら、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンの組み合わせは、腫瘍体積の低下において相加的な効果を引き起こし、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェン単独と比較して有意であった。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥをタモキシフェンと組み合わせて用いて、ＥＲ＋腫瘍増殖を減少させることができることを示唆する。
【図４７】本開示の態様に係る、ＥＲ＋乳癌腫瘍重量に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）および／またはタモキシフェンの効果を示す。図４６に記載のように処置されたＭＣＦ７ヒトＥＲ＋乳房腫瘍を、５週の処置後に除去して計量した。＊は、ｐ＜０．０５を表し、ｎ＝７〜８。ｐ−ＭＧＥによる処置は、通常の水を飲んでいるマウスと比較して、５週の処置にわたって腫瘍重量を有意に減少させた。タモキシフェン単独による処置も、腫瘍重量を減少させた。しかしながら、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンの組み合わせは、腫瘍重量の減少において相加的な効果を引き起こし、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェン単独と比較して有意であった。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥをタモキシフェンと組み合わせて用いて、ＥＲ＋腫瘍増殖を減少させることができることを示唆する。
【図４８】本開示の態様に係る、前立腺腫瘍サイズに対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。無胸腺マウスに、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞を注入して、それらの飲料水中に投与された増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって５週間処置した。５週の処置期間の終わりの腫瘍体積を覚醒マウスにおいて測定して、半楕円に関する公式を用いて腫瘍サイズを計算した。ｎ＝５〜６；＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を表す。増加する濃度のｐ−ＭＧＥにより処置は、無胸腺マウスにおけるヒト前立腺腫瘍のサイズの用量依存的減少を引き起こした。
【図４９】本開示の態様に係る、前立腺腫瘍増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。未処置（コントロール）または増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって処置された無胸腺マウス由来のＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を、５週の処置後に除去して計量した。ｎ＝５〜６、＊＊は、ｐ＜０．０１を表し、＊＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。増加する濃度のｐ−ＭＧＥによる処置は、未処置マウスと比較して、無胸腺マウスにおいてヒト前立腺腫瘍の重量の用量依存的な減少を引き起こし、ｐ−ＭＧＥの投与が、前立腺腫瘍増殖を減少させることを示唆した。
【図５０】本開示の態様に係る、前立腺腫瘍細胞増殖に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。未処置（コントロール）または０．１ｍｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（ｐ−ＭＧＥ）によって処置された無胸腺マウス由来のＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を、パラホルムアルデヒドに固定化して、パラフィン包埋して、切片に切断して、Ｋｉ６７に対する抗体を用いて染色した。グラフにおいて左側に示されるように、Ｋｉ６７陽性細胞／領域の数をカウントした。代表的な切片を右側に示す。ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を表す。ｐ−ＭＧＥによる処置は、増殖のマーカーであるＫｉ６７によって染色された細胞のパーセントを減少させて、抽出物が、前立腺腫瘍細胞の増殖を減少させることを示唆した。
【図５１】本開示の態様に係る、前立腺腫瘍内の血管数によって反映される血管新生に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。未処置（コントロール）または０．１ｍｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（ｐ−ＭＧＥ）によって処置された無胸腺マウス由来のＬＮＣａＰ前立腺腫瘍を、パラホルムアルデヒドに固定化して、パラフィン包埋して、０．５ｍｍ切片に切断して、内皮細胞を染色するＣＤ３４に対する抗体を用いて染色した。血管数／領域を、陽性免疫反応性および形態学の両方によって同定した。ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を表す。ｐ−ＭＧＥによる処置は、領域あたりの血管の数を減少させて、抽出物が、前立腺腫瘍における血管新生を阻害することを示唆した。
【図５２】本開示の態様に係る、前立腺腫瘍における、血管新生を調節する増殖因子であるＶＥＧＦおよびＰＬＧＦの発現に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。製造元の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、未処置（コントロール）または０．１ｍｇのフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（ｐ−ＭＧＥ）によって処置された無胸腺マウス由来のＬＮＣａＰ前立腺腫瘍から、ＲＮＡを単離した。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）を、ＶＥＧＦ−またはＰＬＧＦ−特異的なプライマー／プローブセット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および内部標準として働く１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いて定量化した。結果は、Ｃｔ値として定量化されて、ここで、Ｃｔは、増幅された産物が最初に検出されて相対的な遺伝子発現（標的／コントロールの比）として定義されるＰＣＲの閾値サイクルとして定義された。ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を表す。ｐ−ＭＧＥによる処置は、ＶＥＧＦおよびＰＬＧＦの両方の相対的発現を減少させて、それは、図５１に示される血管の数の減少と一致し、抽出物が、前立腺腫瘍における血管新生を妨げるというさらなる証拠を提供した。
【図５３】本開示の態様に係る、放射線治療に応答した筋原線維形成および免疫細胞浸潤に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。健康なマウスは、処置されず、または、放射線（ＩＲ）、ｐ−ＭＧＥ、または、放射線およびｐ−ＭＧＥを共に（ＩＲ＋ｐ−ＭＧＥ）によって６週間処置された。前脛骨筋を単離して、Ｈ＆Ｅによって染色して、筋組織の形態を可視化した。放射線治療を受けた筋肉は、有意な量の筋線維の再生（白の矢印）および免疫細胞の浸潤（黒の矢印）を示した。放射線によるマウスの後肢の処置は、筋原線維の再生および筋肉への免疫細胞の移動をもたらし、それは、ｐ−ＭＧＥの同時投与によって減少された。
【図５４】本開示の態様に係る、放射線によって誘導される線維症に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の効果を示す。健康なマウスは、処置されず、または、放射線（ＩＲ）、ｐ−ＭＧＥ、または、放射線およびｐ−ＭＧＥ（ＩＲ＋ｐ−ＭＧＥ）によって６週間処置された。前脛骨筋を単離して、マッソン三色染色法によって染色して、組織線維症の領域を特定した。組織における線維症のパーセントを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。放射線による処置は、線維症の領域を有意に増大させて、それはｐ−ＭＧＥの投与によって減少されたが、抽出物単独による処置は効果がなく、ｐ−ＭＧＥ処置が、放射線によって誘導される線維症を有意に減少させることを示唆した。
【図５５Ａ−５５Ｃ】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）によって処置されたマウスにおける、照射に応答した筋組織内のＴＧＢβ、ＣＴＧＦ、およびＳＭＡＤ２タンパク質レベルの評価を示す。健康なマウスは、週に２回、２週間、７．３Ｇｙ／分割の合計２回の分割が放射線照射されて（ヒトにおける放射線癌治療をモデルとするため）、そして、水（コントロール、放射線治療なし）、それらの飲料水中にｐ−ＭＧＥ（ｐ−ＭＧＥのみ）、放射線単独（放射線照射）、または、放射線およびｐ−ＭＧＥ（放射線照射＋ｐ−ＭＧＥ）が投与された。筋組織におけるＴＧＦβ、ＣＴＧＦまたはＳＭＡＤ２の濃度をＥＬＩＳＡによって測定して、コントロールまたはｐ−ＭＧＥ単独と比較した。照射は、ＴＧＦβ、ＣＴＧＦおよびＳＭＡＤ２の筋濃度を増大させた。ｐ−ＭＧＥ単独の投与は、任意の３つの因子に対して有意な効果がなかった。しかしながら、照射前、照射中、および照射後のｐ−ＭＧＥの投与は、ＴＧＦβおよびＣＴＧＦの組織レベルを、コントロールと異ならないレベルまで戻し、ＳＭＡＤ２は、ｐ−ＭＧＥ単独と異ならないレベルまで戻した。これらの結果は、放射線治療が、ＴＧＢβ／ＣＴＧＦ／ＳＭＡＤパスウェイを活性化して組織線維症を増大させること、および、ｐ−ＭＧＥが、このパスウェイを弱めることによって線維症を減少させることを示唆する。
【図５６】本開示の態様に係る、照射に応じた破骨細胞誘導に対する、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）による処置の効果を示す。ＲＡＷ２６４．７前破骨細胞を、０．０００１、０．０００２、および０．０００４μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによって、２Ｇｙ照射の前に２４時間処置して、破骨細胞の数を７日目にカウントした。ＮＲは、放射線なし；ＩＲは、２Ｇｙでの放射線；ＮＲ  ＭＧＥ  ０．０００１、０００２または０．０００４は、放射線なしおよび増加する濃度のｐ−ＭＧＥによる処置；および、ＩＲ  ＭＧＥ  ０．０００１、０．０００２または０．０００４は、２Ｇｙでの放射線および増加する濃度のｐ−ＭＧＥによる処置。リプリケートでｎ＝２；＊は、コントロール単独と比較してｐ＜０．０５を表す。２Ｇｙ単独による処置は、破骨細胞への前破骨細胞の変換を増大させた。放射線によって誘導される破骨細胞数の増大は、０．０００１、０．０００２、および０．０００４μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによる２４時間の事前処置によって防止されて、抽出物が、活性破骨細胞の増大から骨を保護することを示唆した。
【図５７】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）と比較した、様々な市販のマスカディンブドウ製品中のフェノール含有量の分析を示す。マスカディンブドウから作られた９個の異なる市販製品由来のカプセルのフェノール含有量は、比色Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法の改変および標準として没食子酸を用いた合計フェノール類の測定の前に、水に再懸濁されてＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズされて評価された。カプセルあたりのフェノール類の量が定量化された。それぞれの製品に関する情報およびこの図に用いられる略称を表３に提供する。ｐ−ＭＧＥを含むカプセルのフェノール含有量は、９個の試験された市販のマスカディンブドウ製品と比較して、最も高かった。
【図５８】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）と比較した、様々なマスカディンブドウ製品におけるフェノール化合物の分析を示す。図５７において評価されたマスカディンブドウ製品の３つおよびｐ−ＭＧＥを、個々のポリフェノール類に関してさらに分析した。サンプルを７０％メタノール／１％ギ酸中で抽出して、Ｑｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（商標）中でホモジナイズして；不溶性物質を、１００，０００×ｇで６０分間、遠心分離によって除去した。抽出物に、同位体的に標識されたカテキンを内部標準として混ぜて、２００ｐｇ／μＬの検出限界で１７のフェノール標準を分離するグラジエント条件を用いてＵＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために直接的にアプライした。主な構成要素（エピカテキン（ｅｐｉｔｃａｔｅｃｈｉｎ）、没食子酸、プロシアニジン、カテキンおよびカテキン−没食子酸）の同定を、標準との比較によって決定して定量した。ｐ−ＭＧＥは、Ｎａｔｕｒｅ’ｓ  Ｐｅａｒｌ、Ｂｉｏｐｏｗｅｒ、またはＭｕｓｃａｄｉｎｅｘによる製品と比較して、最も高い含有量のカテキン−没食子酸、プロシアニジン、エラグ酸、エピカテキン、没食子酸およびカテキンを含んだ。
【図５９】本開示の態様に係る、実施例１に記載のマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）およびマスカディンブドウ種子およびマスカディンブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）のクロマトグラフィー、質量分析の結果を示す。抽出物を、２００ｐｇ／μＬの検出限界で１７のフェノール標準を分離するグラジエント条件を用いてＵＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって評価した。およそ５００〜２０００分子量の製品の分析の分解能が高められた。抽出物の異なるフェノール組成物を表す特定の識別ピークを、点線ボックスによって示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ブドウから作られる抽出物およびその製剤が本明細書において記載される。本開示の抽出物は、それから作られる液体抽出物および粉末抽出物を含む。異なる抽出物を生産するための様々な方法および癌に関する治療の方法も提供される。既存のブドウ抽出物と比較して、本開示の抽出物はフェノール含有量が増加している。特に、本明細書に記載される製造方法は、抽出物のフェノール化合物含有量を維持するステップ（粉末および液体の両方）および不溶性含有量を最小限にするステップを含む。
【００２１】
本開示の態様および特徴は、以降に、本発明の実施態様が示される付随する図面および実施例に関して説明される。この説明は、本発明が実施され得る全ての異なる方法または本発明に加えられ得る全ての特徴の詳細なカタログであることを意図しない。例えば、一実施態様に関して示される特徴は、他の実施態様に取り込まれてよく、特定の実施態様に関して示される特徴は、その実施態様から消去されてよい。したがって、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせが、除外または省略され得ることを検討する。加えて、本明細書に示唆される様々な実施態様に対する非常に多くの変動および付加は、本開示に照らして当業者に明らかであり、本発明から逸脱しない。それ故に、以下の説明は、本発明の一部の特定の実施態様を説明することが意図されて、それらの全ての並べ替え、組み合わせおよび変動を徹底的に特定しないことが意図される。
【００２２】
別段の定義がされない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本開示において用いられる専門用語は、特定の実施態様および特徴を説明する目的のためのみであり、限定を意図しない。
【００２３】
文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に説明される様々な特徴および態様は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。さらにまた、本開示は、一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特徴または特徴の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討する。説明すると、組成物が、構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むと述べられる場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせが、単独でまたは任意の組み合わせで、省略および放棄され得ることが明確に意図される。
【００２４】
本開示および添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択肢で解釈された場合（「または」）は、組み合わせの欠失を指し、および包含する。
【００２５】
本明細書において用いられる用語「約」は、質量、投与量、時間、温度などの量のような測定可能な値に対する言及において用いられる場合、規定の量の０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６、％、７％、８％、９％、１０％、１５％または実に２０％の変動を指す。例えば、量が、「約５０％のＸ」を含むと説明される場合は、一部の実施態様では、組成物は５０％のＸを含み、一方で他の実施態様では、それは、例えば、４０％〜６０％のＸ（すなわち、５０±１０％）のどこかを含み得ることが理解されるべきである。
【００２６】
本明細書において用いられる用語「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択肢で（「または」）解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
【００２７】
本明細書において用いられる、「ＸおよびＹの間」および「約ＸおよびＹの間」のような語句は、ＸおよびＹを含むと解釈されるべきである。本明細書において用いられる「約ＸおよびＹの間」のような語句は、「約Ｘおよび約Ｙの間」を意味し、「約ＸからＹまで」のような語句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、エレメント、および／または、構成要素の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、エレメント、構成要素、および／または、それらのグループの存在または追加を排除しない。
【００２９】
用語「薬学的に有効量」は、本開示において「治療的に有効量」と相互交換可能に用いられて、対象において治療される疾患または状態の少なくとも１つの症候を、治療する、除去する、または緩和するのに効果的な薬理学的薬剤の量を指す。ある場合には、「治療的に有効量」または「有効量」は、対象において検出可能な治療的または阻害的効果を発揮するのに有用な機能性薬剤または医薬組成物の量を指してよい。効果は、当技術分野で知られている任意のアッセイ方法によって検出され得る。ある場合には、治療される疾患が癌である場合は、有効量は、細胞増殖、細胞遊走、血管新生、線維症、および炎症のいずれかの減少を含む抗癌応答を引き起こすのに効果的な量であってよい。
【００３０】
本明細書において用いられる、移行句「から本質的になる」は、クレームの範囲が、クレーム内に挙げられた規定の材料またはステップおよびクレームされた発明の基本的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈すべきであることを意味する。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明のクレームにおいて用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００３１】
本明細書において用いられる用語「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増大する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」、「増大した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」「増強した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」および「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」（およびそれらの文法的変形）は、コントロールと比べて、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％またはそれよりも高い上昇を表す。
【００３２】
本明細書において用いられる用語「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」および「低減する（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」（およびそれらの文法上の異形）は、コントロールと比べて、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも高い、特定のパラメーターの低減を指す。
【００３３】
本明細書において用いられる用語「絞りかす」は、果物からジュースが圧縮された後に残る果肉状物質を指す。絞りかすは、果物の果肉、種子および皮を含む。
【００３４】
Ｉ．抽出物の作製方法および処方
本明細書に記載される抽出物は、様々な方法で調製され得る。本明細書に記載される抽出物は、容易に利用可能な出発原料から調製され得る。
【００３５】
ブドウ種子、ブドウの皮またはそれらの組み合わせから、抽出物を生産する方法が提供される。ブドウ種子およびブドウの皮を抽出する前に、ブドウが圧縮されてジュースおよび絞りかすが生産されて、そして、絞りかすがジュースから分離される。一般に、ブドウの圧縮およびジュースからの絞りかすの分離は、室温（例えば、約７０華氏）で生じる。絞りかすは、少なくとも約−２０華氏から最大−５０華氏の範囲の温度まで冷却されて、それは、絞りかす内の酸素レベルをゼロまたはゼロ付近まで減少させて、それにより、絞りかすの安定性を増大させて（微生物汚染などを減少させる）、高いフェノールレベルを維持する。抽出の前に、絞りかすは解凍されて、それから乾燥される。乾燥された絞りかす中の皮および種子は、互いから分離される。任意選択で、皮および種子は、不要なデブリを除去するために洗浄されてよい。ある場合には、種子および皮は、再び組み合わせられて、それから抽出されてよい。他の例では、種子および皮は、さらに説明されるように別個に抽出され得る。任意選択で、種子および皮から作られる抽出物は、組み合わせられてよい。
【００３６】
一態様では、ブドウ種子およびブドウの皮を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｐｏｒ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来の水、ブドウ種子およびブドウの皮を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度（例えば、約１２０華氏、１２５華氏、１３０華氏、１３５華氏、１４０華氏、１４５華氏、１５０華氏、１５５華氏、１６０華氏、１６５華氏、１７０華氏、１７５華氏、１８０華氏、１８５華氏、１９０華氏、１９５華氏、２００華氏、または、その中の任意の範囲または値であるが２００華氏を超えない）で加熱するステップ（その時間のあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子、ブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子、ブドウの皮および水を濾過して、ブドウ種子および皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；および（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過して、それにより、ブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産するステップ、を含む、ブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、蒸留水中のブドウ種子およびブドウの皮をかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子、約２０％の皮に対して約８０％の種子、約２５％の皮に対して約７５％の種子、約３０％の皮に対して約７０％の種子、または、約３５％の皮に対して約６５％の種子であってよい。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約３０％の皮に対して約７０％の種子であってよい。さらなる実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子であってよい。
【００３７】
別の態様では、（ａ）ブドウ種子を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来のブドウ種子および水を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度（例えば、約１２０華氏、１２５華氏、１３０華氏、１３５華氏、１４０華氏、１４５華氏、１５０華氏、１５５華氏、１６０華氏、１６５華氏、１７０華氏、１７５華氏、１８０華氏、１８５華氏、１９０華氏、１９５華氏、２００華氏、または、その中の任意の範囲または値であるが２００華氏を超えない）で加熱するステップ（その時間のあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子および水を濾過して、ブドウ種子の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；および（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過して、それにより、ブドウ種子抽出物を生産するステップを含む、ブドウ種子抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、蒸留水中でブドウ種子をかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。
【００３８】
さらなる態様では、（ａ）ブドウの皮（種子または果肉がない）を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来のブドウの皮および水を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度で加熱するステップ（そのあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウの皮および水を濾過して、ブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；および（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過して、それにより、ブドウ種子抽出物を生産するステップを含む、ブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、ブドウの皮を蒸留水中でかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。この方法によって生産される抽出物中のフェノール類の濃度は、少なくとも約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌであってよい。
【００３９】
驚くべきことに、本明細書に記載の方法を用いて互いから別個にブドウ種子およびブドウの皮を抽出するステップは、減少された不溶性物質およびより高いポリフェノール含有量を有する抽出物を提供する。ブドウ種子およびブドウの皮は、１つまたは複数の適切なブドウ種から得ることができる。したがって、一部の態様では、ブドウ種子およびブドウの皮は、制限されないが、Ｖｉｔｉｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ（以降、「マスカディンブドウ」）、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ（以降、「ｖｉｎｉｆｅｒａブドウ」）、Ｖｉｔｉｓ  ｌａｂｒｕｓｃａ、Ｖｉｔｉｓ  ｒｉｐａｒｉａ、Ｖｉｔｉｓ  ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｕｌｐｉｎａ、および／またはＶｉｔｉｓ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓを含む、１つまたは複数のブドウ種から得ることができる。一部の実施態様では、ブドウ種子および／またはブドウの皮は、１つまたは複数のマスカディンブドウ品種から得ることができる。例えば、一部の実施態様では、ブドウ種子および／またはブドウの皮は、Ａｆｒｉｃａｎ  Ｑｕｅｅｎ、Ａｌａｃｈｕａ、Ａｌｂｅｒｍａｒｌｅ、Ｂｌａｃｋ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｂｌａｃｋ  Ｆｒｙ、Ｃａｒｌｏｓ、Ｃｏｗａｒｔ、Ｄａｒｌｅｎｅ、Ｄｉｘｉｅｌａｎｄ、Ｄｉｘｉｅ  Ｒｅｄ、Ｄｏｒｅｅｎ、Ｆｌｏｗｅｒｓ、Ｆｒｙ、Ｆｒｙ  Ｓｅｅｄｌｅｓｓ、ＧＡ−１、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｉｓｌｅｓ、Ｇｒａｎｎｙ  Ｖａｌ、Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｈｕｎｔ、Ｉｓｏｎ、Ｊａｍｅｓ、Ｊｕｍｂｏ、Ｍａｇｎｏｌｉａ、Ｍｅｍｏｒｙ、Ｍｉｓｈ、Ｎｅｓｂｉｔｔ、ＮＣ−１、Ｎｏｂｌｅ、Ｐｏｌｙａｎｎａ、Ｒｏｓａ、Ｒｅｄｇａｔｅ、Ｒｅｇａｌｅ、Ｓｃａｒｌｅｔｔ、Ｓｃｕｐｐｅｒｎｏｎｇ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｇａｒｇａｔｅ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｓｕｐｒｅｍｅ、Ｓｗｅｅｔ  Ｊｅｎｎｙ、Ｔａｒａ、Ｔａｒｈｅｅｌ、Ｔｈｏｍａｓ、Ｔｒｉｕｍｐｈおよび／またはＷｅｌｄｅｒマスカディンブドウ、または、それらの２以上のマスカディン品種の任意の組み合わせから得ることができる。
【００４０】
抽出物は、蒸留水を用いて調製され得る。用いられる蒸留水は、蒸留、逆浸透、活性炭濾過、イオン交換、またはそれらの組み合わせを含む、従来の技術を用いて調製され得る。ある場合には、「分画蒸気圧縮蒸留水」が用いられ得る。本明細書において用いられる用語「分画蒸気圧縮蒸留水」は、高純度蒸気蒸留水を意味する。分画蒸留システムは、有機化合物を排出する脱ガス設備を備え、それにより、未蒸留水を汚染し得る化学物質の分画を除去する。純水は、１１％水素および８９％酸素からなる。未蒸留水（例えば水道水または湧水）は、不純物（例えば、溶解された固形物および有機化合物）を含んでよく、一方で、分画蒸気圧縮蒸留水は、実質的に減少されたレベルのこれらの不純物を有する。ある場合には、分画蒸気圧縮蒸留水は、約１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、または約１０〜２０ｐｐｍまでを有してよい。ある場合には、分画蒸気圧縮蒸留水は、約９９．９％、９９．８％、９９．７％、９９．６％、９９．５％  ９９．４％、９９．３％、９９．２％、９９．１％、または９９％純水であってよい。一例として、分画蒸気圧縮蒸留水は、塩素を含まず、または、未蒸留水と比較して実質的に減少されたレベルの塩素を含む。塩素は、ポリフェノール化合物を破壊し得る強力な酸化剤であり、したがって、フェノール類の抽出を妨げ得る。また、分画蒸気圧縮蒸留水は、例えば、ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄および多くの他の無機元素のような、未蒸留水（例えば水道水または湧水）中に典型的に見られる減少されたレベルの溶解された固形物も含む。これらのような無機元素の存在は、抽出プロセスの効率に影響を及ぼし得て、したがって、本開示に記載の抽出プロセスは、最小限の汚染物質を含む水を用いる。
【００４１】
一部の態様では、ブドウ種子を、蒸留水と接触させるステップは、ブドウ種子を、約０．５  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂのブドウ種子から、約２．５  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂのブドウ種子まで（例えば、約０．１１  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子から、約０．５６  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子まで）の範囲内およびその中の任意の範囲または量の比で、蒸留水と接触させるステップを含む。代表的な実施態様では、比は、約０．２２  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子であってよい。他の態様では、ブドウの皮を蒸留水と接触させるステップは、ブドウの皮を、約０．５  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮から、約２．５  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮まで（例えば、約０．２５  ｇａｌに対して約１  ｌｂブドウの皮から、約１．２５  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウの皮まで）の比で、水と接触させるステップを含む。代表的な実施態様では、比は、約１  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮（例えば、約０．５  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウの皮）であってよい。一部の実施態様では、４５０  ｌｂのブドウ種子または約２００  ｌｂのブドウの皮が、合計約１４０ガロンの蒸留水と接触され得る。とりわけ、ポリフェノール類は、ブドウ種子およびブドウの皮が互いに別個に抽出されると、ブドウの皮およびブドウ種子からより効率的に抽出される。しかしながら、一部の実施態様では、種子および皮は、一緒に抽出されてよい。したがって、代表的な実施態様では、当該方法は、約３１４  ｌｂのブドウ種子および約５９  ｌｂのブドウの皮を、合計約１４０ガロンの分画蒸気圧縮蒸留水中で抽出するステップを含む。一例では、ブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせを蒸留水と接触させる比は、約０．５  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂのブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせから、約２．５  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂのブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせまでの比を含む。別の例では、ブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせを蒸留水と接触させるステップは、約１．０  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂのブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせの比を含む。
【００４２】
加熱するステップに用いられ得る様々な適切な容器が存在する。容器は、所望の量の水およびブドウ種子および／またはブドウの皮を保持する必要がある。したがって、例えば、適切な容器は、制限されないが、スチームケトルを含んでよい。一部の態様では、当該方法は、大気圧下で行なわれ得る。本発明者は、煮沸に加えて、高圧条件がポリフェノール化合物を破壊し得て、それにより、ブドウの皮／種子の抽出の効率を減少させることを見いだした。したがって、一部の実施態様では、圧力容器は、ブドウの皮および／または種子を抽出するための適切な容器ではない。ある場合には、容器は閉じた容器ではない。ある場合には、容器は、加熱するステップ中に容器の含有物を撹拌するための撹拌手段を備えてよく、または備え付けられてよい。
【００４３】
フェノール類、フラボノイド類、およびレスベラトロールを含む、ブドウの種子および皮に存在する抗酸化化合物は、高温によって破壊され得る。本明細書に開示される２００華氏の最大加熱温度は、抽出中の抗酸化化合物の破壊を最小限にする。一部の実施態様では、加熱するステップは、約１２０華氏〜最高２００華氏（例えば、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００華氏、およびその中の任意の範囲または値）の温度で、約１時間〜約６時間（例えば、約１時間〜約５時間、約１時間〜約４時間、約１時間〜約３時間、または約１時間〜約２時間、約１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、またはその中の任意の範囲または値）であってよい。ある場合には、加熱するステップは、１２０華氏から２００華氏までの範囲の温度で、１〜２時間であってよい。特定の例では、加熱するステップは、約１７５華氏から、せいぜい２００華氏の範囲の温度で、１〜２時間であってよい。
【００４４】
追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水は、ステップ（ｂ）において添加される（任意のブドウの皮の抽出、ブドウ種子の抽出、または、ブドウ種子およびブドウの皮の抽出方法に関して）。この追加の水は、一度に、または、加熱期間を通して増加的／定期的に添加され得る。増加的に添加される場合は、追加の水を添加する周期性は、加熱しながら、約５分ごと〜約６０分ごと（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、１５、４０、４５、５０、５５、６０分ごと、またはその中の任意の範囲または値）、またはそれらの一部の組み合わせであってよく、約０．９２  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子またはブドウの皮から、約４．６  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子またはブドウの皮までの範囲内の、種子および／または皮に対する水の合計量を達成する。したがって、一部の実施態様では、追加の分画蒸気圧縮蒸留水は、ステップ（ａ）由来の水およびブドウの皮またはブドウ種子が加熱される期間にわたって、約５分ごと〜約６０分ごと、またはそれらの一部の組み合わせで添加され得る。代表的な実施態様では、追加の分画蒸気圧縮蒸留水は、ステップ（ａ）由来の水およびブドウの皮またはブドウ種子が加熱される期間にわたって、約１５分ごと〜約３０分ごと、またはそれらの一部の組み合わせで添加され得る。
【００４５】
蒸留水とともにブドウ種子またはブドウの皮を加熱するステップの後および濾過の前に、蒸留水中のブドウ種子またはブドウの皮は、冷却され得る。一部の実施態様では、冷却するステップは、約４０華氏〜約１８０華氏の範囲（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０華氏、またはその中の任意の範囲または値）の温度であってよい。代表的な実施態様では、冷却するステップは、約１７０華氏〜約１８０華氏の範囲（例えば、１７０華氏、１７１華氏、１７２華氏、１７３華氏、１７４華氏、１７５華氏、１７６Ｆ、１７７華氏、１７８華氏、１７９華氏、１８０華氏、またはその中の任意の範囲または値）の温度であってよい。
【００４６】
一部の実施態様では、ブドウ種子および水、ブドウの皮および水、または、ブドウの皮、ブドウ種子および水を、濾過するステップは、約２０ミクロン〜約５０ミクロン（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ミクロン；例えば、約６００メッシュ〜約３００メッシュ（例えば、約６００、５００、４００、３００メッシュ））、およびその中の任意の範囲または値の篩サイズを通して濾過するステップを含む。
【００４７】
一部の実施態様では、用いられるフィルターは、プラスチックよりむしろステンレススチールからなり、それにより、プラスチック中に存在し得る化学物質が抽出物中に浸出するのを避ける。したがって、フィルターはプラスチックではない。同様に、このプロセスにおいて用いられる他のコンテナーおよび器具はプラスチックではない。例えば、濾液または抽出物を集めるための容器は、制限されないが、ステンレススチールバレルを含んでよい。
【００４８】
一部の実施態様では、食品防腐剤が、ブドウの皮の濾液またはブドウ種子の濾液に、約０．１％〜約２０％（重量／体積）（ｗ／ｖ））（例えば、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０％ｗ／ｖ）の量で添加され得る。一部の実施態様では、食品防腐剤は、ブドウの皮の濾液またはブドウ種子の濾液に、約０．１％〜約１５％、約０．１％〜約１０％、約０．１％〜約５％、約０．１％〜約１％、およびその中の任意の値または範囲の量で添加され得る。代表的な実施態様では、食品防腐剤は、ブドウ種子の濾液またはブドウの皮の濾液に、約０．１％〜約１．０％ｗ／ｖの量で添加され得る。一部の実施態様では、食品防腐剤は、制限されないが、ソルビン酸カリウム、クエン酸、酢酸、またはビタミンＥ（例えば、トコフェロール類、トコトリエノール類）の少なくとも１つを含んでよい。ある場合には、食品防腐剤は、ソルビン酸カリウムであってよい。特定の例では、食品防腐剤は、ブドウ種子の濾液、ブドウの皮の濾液、または、ブドウ種子およびブドウの皮の濾液に、約０．１％〜約１．０％ｗ／ｖの量で添加されたソルビン酸カリウムであってよい。
【００４９】
ブドウ種子の濾液、ブドウの皮の濾液、または、ブドウ種子およびブドウの皮の濾液への、食品防腐剤の添加に続いて、濾液は、それから、冷蔵または冷却され得る。ある場合には、濾液は、約３５華氏〜約４５華氏の範囲（例えば、約３５華氏、３６華氏、３７華氏、３８華氏、３９華氏、４０華氏、４１華氏、４２華氏、４３華氏、４４華氏、４５華氏、およびその中の任意の範囲または値）の温度まで冷却され得る。ある場合には、濾液は、約２４時間〜約１２０時間（すなわち、約１日〜約５日）（例えば、約２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０時間、またはその中の任意の範囲または値）、冷蔵（冷却）され得る。一部の実施態様では、冷却は、約２４時間〜約７２時間であってよい。代表的な実施態様では、ブドウ種子の濾液、ブドウの皮の濾液、または、ブドウ種子およびブドウの皮の濾液の冷却は、約２４時間であってよい。
【００５０】
冷蔵に続いて、冷却されたブドウ種子の濾液、冷却されたブドウの皮の濾液、または、冷却されたブドウ種子およびブドウの皮の濾液は、再び濾過され得る。一部の実施態様では、冷却された濾液を濾過するステップは、約１ミクロン〜約１０ミクロン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ミクロン）またはその中の任意の範囲または値（例えば、１２，０００メッシュ〜約１２５０メッシュ）の篩サイズを有するフィルターを通して濾過するステップを含む。
【００５１】
冷却されたブドウ種子の濾液、冷却されたブドウの皮の濾液、または、冷却されたブドウ種子およびブドウの皮の濾液の濾過の後に（ステップ（ｇ））、食品グレードエタノールが、防腐剤として濾液に添加され得る。ある場合には、エタノールは、抽出物の約２％〜約５％の量（ｖ／ｖ）（例えば、約２％、３％、４％、５％またはその中の任意の範囲または値）で添加され得る。特定の例では、エタノールは、抽出物の２％（ｖ／ｖ）の量まで添加され得る。添加される食品グレードエタノールは、約１９０プルーフ（すなわち、９５％エタノール）であり得る。一部の実施態様では、食品グレードエタノールは、制限されないが、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、および／またはブドウを含む任意の植物源から作られ得る。代表的な実施態様では、食品グレードエタノールは、有機エタノールであってよい。本明細書において用いられる用語「有機アルコール」は、例えば、有機トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、ブドウおよび／またはエタノールの他の有機源から作られるアルコールを指す。食品を有機とラベルするための要件は、米国農務省によって設定されている（ｗｗｗ．ａｍｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｒｕｌｅｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ／ｏｒｇａｎｉｃ／ｌａｂｅｌｉｎｇ）。
【００５２】
したがって、一部の態様では、ブドウ種子およびブドウの皮を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来の水、ブドウ種子およびブドウの皮を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度で加熱するステップ（その時間のあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子およびブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子、ブドウの皮および水を濾過して、ブドウ種子およびブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過するステップ；および（ｈ）ステップ（ｇ）由来の濾液に、食品グレードエタノールを添加して、それにより液体抽出物を生産するステップを含む、ブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、分画蒸気圧縮蒸留水中でブドウ種子およびブドウの皮をかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子、約２０％の皮に対して約８０％の種子、約２５％の皮に対して約７５％の種子、約３０％の皮に対して約７０％の種子、または、約３５％の皮に対して約６５％の種子であってよい。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約３０％の皮に対して約７０％の種子であってよい。さらなる実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子であってよい。
【００５３】
別の態様では、（ａ）ブドウ種子を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来のブドウ種子および水を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度（例えば、約１２０華氏、１２５華氏、１３０華氏、１３５華氏、１４０華氏、１４５華氏、１５０華氏、１５５華氏、１６０華氏、１６５華氏、１７０華氏、１７５華氏、１８０華氏、１８５華氏、１９０華氏、１９５華氏、２００華氏、または、その中の任意の範囲または値であるが２００華氏を超えない）で加熱するステップ（その時間のあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子および水を濾過して、ブドウ種子の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過するステップ；および（ｈ）ステップ（ｇ）由来の濾液に、食品グレードエタノールを添加して、それにより液体抽出物を生産するステップを含む、ブドウ種子抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、蒸留水中でブドウ種子をかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。
【００５４】
さらなる態様では、（ａ）ブドウの皮（種子または果肉がない）を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来のブドウの皮および水を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度で加熱するステップ（そのあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウの皮および水を濾過して、ブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過するステップ；および（ｈ）ステップ（ｇ）由来の濾液に、食品グレードエタノールを添加して、それにより液体抽出物を生産するステップを含む、ブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、ブドウの皮を蒸留水中でかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。
【００５５】
さらなる態様では、本明細書に記載される方法によって作られるブドウ種子の液体抽出物を提供するステップ；本明細書に記載される方法によって作られるブドウの皮の液体抽出物を提供するステップ；および、ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物を、約５０：５０〜約８５：１５（体積／体積（ｖ／ｖ））の比で組みわせて、それによりブドウ由来の液体抽出物を形成するステップを含む、ブドウの皮およびブドウ種子抽出物を生産する方法が提供される。ブドウの皮の抽出物に対するブドウ種子抽出物の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子抽出物、約２０％の皮の抽出物に対して約８０％の種子抽出物、約２５％の皮の抽出物に対して約７５％の種子抽出物、約３０％の皮の抽出物に対して約７０％の種子抽出物、または、約３５％の皮の抽出物に対して約６５％の種子抽出物であってよい。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約３０％の皮の抽出物に対して約７０％の種子抽出物であってよい。さらなる実施態様では、ブドウの皮の抽出物に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮の抽出物に対して約８５％の種子抽出物であってよい。
【００５６】
一例では、ブドウ種子およびブドウの皮を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来の水、ブドウ種子およびブドウの皮を、約１２０華氏〜最高２００華氏の温度で加熱するステップ（その時間のあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子およびブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子、ブドウの皮および水を濾過して、ブドウ種子およびブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過するステップ；（ｈ）ステップ（ｇ）由来の濾液に、食品グレードエタノールを添加して、それにより、液体抽出物を生産するステップ、および（ｈ）液体抽出物を噴霧乾燥して、粉末状のブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産するステップを含む、粉末状のブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、ブドウ種子およびブドウの皮を蒸留水中でかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子、約２０％の皮に対して約８０％の種子、約２５％の皮に対して約７５％の種子、約３０％の皮に対して約７０％の種子、または、約３５％の皮に対して約６５％の種子であってよい。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約３０％の皮に対して約７０％の種子であってよい。さらなる実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子であってよい。
【００５７】
別の例では、（ａ）ブドウ種子を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来のブドウ種子および水を、約１２０華氏から最高２００華氏までの温度（例えば、約１２０華氏、１２５華氏、１３０華氏、１３５華氏、１４０華氏、１４５華氏、１５０華氏、１５５華氏、１６０華氏、１６５華氏、１７０華氏、１７５華氏、１８０華氏、１８５華氏、１９０華氏、１９５華氏、２００華氏、または、その中の任意の範囲または値であるが２００華氏を超えない）で加熱するステップ（その時間のあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウ種子および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウ種子および水を濾過して、ブドウ種子の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過するステップ；（ｈ）ステップ（ｇ）由来の濾液に、食品グレードエタノールを添加して、それにより液体抽出物を生産するステップ、および（ｈ）液体抽出物を噴霧乾燥して粉末状のブドウ種子抽出物を生産するステップを含む、粉末状のブドウ種子抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、ブドウ種子を蒸留水中でかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。
【００５８】
さらなる例では、（ａ）ブドウの皮（種子または果肉がない）を、蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水と接触させるステップ；（ｂ）ステップ（ａ）由来のブドウの皮および水を、約１２０華氏〜最高２００華氏の範囲の温度で加熱するステップ（そのあいだ、追加の蒸留水、任意選択で、分画蒸気圧縮蒸留水が添加される）；（ｃ）ステップ（ｂ）由来のブドウの皮および水を冷却するステップ；（ｄ）ステップ（ｃ）由来のブドウの皮および水を濾過して、ブドウの皮の濾液を生産するステップ；（ｅ）ステップ（ｄ）由来の濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｆ）ステップ（ｅ）由来の濾液を冷却して、冷却された濾液を生産するステップ；（ｇ）ステップ（ｆ）由来の冷却された濾液を濾過するステップ；（ｈ）ステップ（ｇ）由来の濾液に、食品グレードエタノールを添加して、それにより液体抽出物を生産するステップ、および（ｈ）液体抽出物を噴霧乾燥させて粉末状のブドウの皮の抽出物を生産するステップを含む、粉末状のブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、加熱するステップ（ｂ）は、ブドウの皮を蒸留水中でかき混ぜるステップをさらに含んでよい。さらに、さらなる実施態様では、加熱するステップは、大気圧下で行なわれ得る。
【００５９】
液体抽出物を製造する方法に加えて、粉末抽出物を生産する方法も提供される。本開示の粉末状の抽出物は、本明細書に記載の液体抽出物を乾燥させることによって調製され得る。ある場合には、液体抽出物は、噴霧乾燥され得る。用語「噴霧乾燥」は、液体混合物を小さな液滴に崩壊させるステップ（微粒化）、および、混合物から溶媒を急速に除去するステップを含むプロセスを広く指す。典型的な噴霧乾燥器具では、強力な駆動力が溶媒を液滴から蒸発させて、それは、乾燥ガスを提供することによって与えられ得る。非限定的な例のみとして、典型的な噴霧乾燥器具は、乾燥チャンバー、溶媒を含む供給材料を乾燥チャンバーへ、微粒化するための微粒化手段、微粒化された溶媒を含む供給材料から溶媒を除去するために乾燥チャンバーに流れる乾燥ガス源、乾燥産物のための出口、および、乾燥チャンバーから下流に位置する産物回収手段を備える。典型的に、産物回収手段は、乾燥器具に接続されたサイクロンを備える。サイクロンにおいて、噴霧乾燥中に生産された粒子は、乾燥ガスから分離されて溶媒が蒸発されて、粒子が回収されるのを可能にする。噴霧乾燥によって生産された粒子を分離および回収するためにフィルターが用いられてもよい。
【００６０】
噴霧乾燥は、本明細書に記載の方法で、従来の様式で行なわれ得る。乾燥ガスは、任意の適切なガスであってよいが、不活性ガス、例えば、窒素、窒素濃縮空気；およびアルゴンが好ましい。一部の実施態様では、窒素ガスが用いられる。噴霧乾燥によって生産される非晶質の共沈殿物は、当該分野において一般に用いられる技術によって、例えばサイクロンまたはフィルターを用いて、回収され得る。
【００６１】
溶媒の除去は、例えば、粉末抽出物を得るための不活性雰囲気下で、実質的に完全な溶媒の蒸発、溶液の濃縮、または溶媒の蒸留によって達成されてもよい。
【００６２】
一実施態様では、乾燥するステップは、大気圧または減圧、例えば、約２００ｍｍＨｇよりも下、または約５０ｍｍＨｇよりも下で、約２５℃〜約９０℃のような温度で行なわれる。乾燥するステップは、所望の結果を達成する任意の所望の期間、例えば、約１〜２０時間、行なわれ得る。乾燥するステップは、産物の仕様に応じてより短いまたはより長い期間行なわれてもよい。温度および圧力は、用いられる溶媒の揮発性に基づいて選択されて、前述の条件は、一般的な手引きとしてのみ考慮されるべきである。乾燥するステップは、箱型乾燥器、真空オーブン、エアーオーブン内で、または、流動層乾燥機、スピンフラッシュ乾燥機、気流乾燥機などを用いて、適切に行われ得る。乾燥装置の選択は、十分に当業者の範囲内である。ある場合には、生じた粉末抽出物は、約３．０〜３．４％の残留水分量を有し得る。
【００６３】
一例では、液体抽出物は、４４インチ×３２インチの乾燥機に導入されたその噴霧によって微粒化され得て、１８，０００〜２２，０００ｃｆｍの流速で、約２００〜４００華氏（例えば、入口温度約４００華氏および出口温度約２００華氏）の範囲の温度で、加熱された天然ガスと混合する。
【００６４】
本開示の実施例１のような一例では、ブドウ種子およびブドウの皮を含む液体抽出物を微粒子化して噴霧を生産するステップ、および、噴霧を乾燥させるステップを含む、ブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を生産する方法が提供される。一部の実施態様では、乾燥するステップは、１８，０００〜２２，０００ｃｆｍの流速で天然ガスを用いて、乾燥機内で行なわれる。一部の実施態様では、乾燥するステップは、約２００〜４００華氏の範囲の温度で行なわれる。ある場合には、生産された粉末抽出物は、約３．０〜３．４％の残留水分量を有する。このプロセスによって形成される粉末抽出物は、カプセル化されてよく、または、再構成されて液体を形成してよい。ある場合には、粉末抽出物は、ヒプロメロースカプセル内に処方されてよい。抽出物、特に粉末抽出物は、期間の初めのフェノールレベルの少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である期間の終わりのフェノールレベルによって特徴付けられるように、少なくとも３、４、５、６、８、１０、１８、または２４ヶ月の期間のあいだ安定であり得る。
【００６５】
ある場合には、粉砕されたブドウ種子または皮（または両方）を含む公知の市販抽出物と比較して、上述の方法によって生産される抽出物は、一般に、粉砕されたブドウ種子を含む市販されるカプセルよりも、合計または個々に、より多くのフェノール類を含む。説明される抽出物内の、高められた（濃縮）フェノール類は、例えば、カテキン、没食子酸、エピカテキン、エラグ酸、プロシアニジン（ｐｒｏｃｙａｎａｄｉｎ）、およびカテキン−没食子酸（ｃａｔ−ｇａｌｌ）を含む。
【００６６】
本開示の実施例２のような一例では、開放されたスチームケトル中にブドウ種子を置くステップ、および、所望の量の分画蒸気圧縮蒸留水、例えば、４５０ポンドのブドウ種子に１００ガロンの分画蒸気圧縮蒸留水を添加するステップを含む、マスカディンブドウ種子抽出物を生産する方法が提供される。分画蒸気圧縮蒸留水中のブドウ種子は、約１７５〜２００華氏で約１〜２時間加熱されてよい。任意選択で、加熱中に、追加の分画蒸気圧縮蒸留水が、例えば、１５〜３０分ごとに５ガロンの増加量で、所望の合計量の水、例えば、１４０ガロンに到達するまで、添加されてよい。加熱するステップの後に、温度は、約１７０〜１８０華氏まで減少および冷却され得る。水中のブドウ種子は、それから、メッシュステンレススチール篩を通して濾過され得て、濾液が集められ得る。任意選択で、ソルビン酸カリウムがブドウ種子の濾液に添加されてよい。抽出物、特に粉末抽出物は、期間の初めのフェノールレベルの少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である期間の終わりのフェノールレベルによって特徴付けられるように、少なくとも３、４、５、６、８、１０、１８、または２４ヶ月の期間のあいだ安定であり得る。
【００６７】
本開示の実施例３のような一例では、開放されたスチームケトル中にブドウの皮を置くステップ、および、所望の量の分画蒸気圧縮蒸留水、例えば、４５０ポンドのブドウ種子に１００ガロンの分画蒸気圧縮蒸留水を添加するステップを含む、マスカディンブドウの皮の抽出物を生産する方法が提供される。分画蒸気圧縮蒸留水中のブドウの皮は、約１７５〜２００華氏で約１〜２時間加熱されてよい。任意選択で、加熱中に、追加の分画蒸気圧縮蒸留水が、例えば、１５〜３０分ごとに５ガロンの増加量で、所望の合計量の水、例えば、１４０ガロンに到達するまで、添加されてよい。加熱するステップの後に、温度は、約１７０〜１８０華氏まで減少および冷却され得る。水中のブドウの皮は、それから、メッシュステンレススチール篩を通して濾過され得て、濾液が集められ得る。任意選択で、ソルビン酸カリウムがブドウの皮の濾液に添加されてよい。抽出物、特に粉末抽出物は、期間の初めのフェノールレベルの少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である期間の終わりのフェノールレベルによって特徴付けられるように、少なくとも３、４、５、６、８、１０、１８、または２４ヶ月の期間のあいだ安定であり得る。
【００６８】
抽出物の組成物は、当技術分野で知られている任意の適切な方法に従って、本明細書に記載の方法の任意のステージで監視され得る。例えば、組成物は、分光学的手段、例えば、核磁気共鳴分光法（例えば１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外線分光法、分光光度法（例えばＵＶ可視）、質量分析によって、または、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィーによって、または、それらの組み合わせによって、監視され得る。
【００６９】
一態様では、ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせから、液体抽出物を製造する方法が提供されて、当該方法は、（ａ）ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせを提供するステップ；（ｂ）ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせを蒸留水と接触させて、抽出混合物を形成するステップ；（ｃ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度で抽出混合物を加熱するステップ（その加熱するステップの間、追加の蒸留水が添加される）；（ｄ）抽出混合物を冷却するステップ；（ｅ）抽出混合物を濾過して固形物を除去し、それにより濾液を形成するステップ；（ｆ）濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｇ）濾液を冷却して、冷却された濾液を形成するステップ；および（ｈ）冷却された濾液を濾過して、それにより液体抽出物を生産するステップを含む。
【００７０】
一部の実施態様では、ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせは、Ｖｉｔｉｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｖｉｔｉｓ  ｌａｂｒｕｓｃａ、Ｖｉｔｉｓ  ｒｉｐａｒｉａ、Ｖｉｔｉｓ  ａｅｓｔｉｖａｌｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｒｕｐｅｓｔｒｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｃｏｉｇｎｅｔｉａｅ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｕｌｐｉｎａ、および、Ｖｉｔｉｓ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓからなる群より選択されるブドウから採取される。特定の実施態様では、ブドウ種子、ブドウの皮、または、それらの組み合わせは、Ｖｉｔｉｓ  ｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａブドウから採取される。
【００７１】
一部の実施態様では、当該方法のためのブドウ種子が提供される。一実施態様では、蒸留水は、分画蒸気圧縮蒸留水である。一実施態様では、ブドウ種子を蒸留水と接触させるステップは、約０．５  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂのブドウ種子から、約２．５  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂブドウ種子までの比を含む。一実施態様では、ブドウ種子を蒸留水と接触させるステップは、約１  ｇａｌの水に対して約４．５  ｌｂのブドウ種子の比を含む。一実施態様では、追加の蒸留水は、約０．９２  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子から、約４．６  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウ種子までの比を達成するために添加される。
【００７２】
他の実施態様では、当該方法のためのブドウの皮が提供される。一実施態様では、ブドウの皮を蒸留水と接触させるステップは、約０．５  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮から、約１．２５  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮までの比を含む。一実施態様では、ブドウの皮を蒸留水と接触させるステップは、約１  ｇａｌの水に対して約２  ｌｂのブドウの皮の比を含む。一実施態様では、追加の蒸留水は、約０．９２  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウの皮から、約４．６  ｇａｌの水に対して約１  ｌｂのブドウの皮までの比を達成するために添加される。
【００７３】
他の実施態様では、当該方法に関してブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせが提供される。
【００７４】
一実施態様では、ブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせは、約５０％のブドウの皮に対して５０％のブドウ種子（重量／重量（ｗ／ｗ））から、約１５％のブドウの皮に対して８５％のブドウ種子までの比を有する。一実施態様では、ブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせを蒸留水と接触させるステップの比は、約０．５  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂのブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせから、約２．５  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂのブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせまでの比を含む。一実施態様では、ブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせを蒸留水と接触させるステップの比は、約１．０  ｇａｌの水に対して約３．７  ｌｂのブドウの皮およびブドウ種子の組み合わせの比を含む。
【００７５】
ある場合には、ブドウ種子、ブドウの皮、またはそれらの組み合わせの抽出物を製造する、提供される方法は、抽出混合物を約１〜約６時間加熱するステップを含む。ある場合には、加熱するステップは、約１〜約２時間行なわれる。一実施態様では、追加の蒸留水は、加熱するステップの間、複数の部分で抽出混合物に添加される。一実施態様では、加熱するステップの間、追加の蒸留水の一部が、約５分毎から約６０分毎に抽出混合物に添加される。一実施態様では、加熱するステップの間、追加の蒸留水の一部が、約１５毎から約３０分毎に抽出混合物に添加される．
【００７６】
一部の実施態様では、抽出混合物は、約４０華氏〜約１７０華氏の温度に冷却される。一部の実施態様では、抽出混合物は、約２０ミクロン〜約５０ミクロンの篩サイズを有するフィルターを通して濾過される。
【００７７】
一部の実施態様では、食品防腐剤は、約０．１％〜約２０％（重量／体積（ｗ／ｖ））の量で濾液に添加される。一実施態様では、食品防腐剤は、約０．１％〜約１％（ｗ／ｖ）の量で濾液に添加される。一実施態様では、防腐剤は、ソルビン酸カリウム、クエン酸、酢酸、またはビタミンＥの少なくとも１つを含む。
【００７８】
一部の実施態様では、濾液は、約３５華氏〜約４５華氏の温度で冷却される。一実施態様では、濾液は、約２４時間〜約１２０時間、冷却される。一実施態様では、濾液は、約２４時間、冷却される。一実施態様では、冷却された濾液を濾過するステップは、冷却された濾液を、約１ミクロン〜約１０ミクロンの篩サイズを有するフィルターを通して濾過するステップを含む。
【００７９】
一部の実施態様では、食品グレードエタノールが、ステップ（ｇ）の濾過された冷却された濾液に添加されて、それにより液体抽出物を生産する。一実施態様では、食品グレードエタノールは、約１９０プルーフ（９５％エタノール）である。一実施態様では、食品グレードエタノールは、トウモロコシ、コムギ、サトウキビ、またはブドウから作られる。一実施態様では、食品グレードエタノールは、有機の食品グレードエタノールである。一実施態様では、ステップ（ｇ）の濾過された冷却された濾液に添加される食品グレードエタノールの体積は、液体抽出物の体積の約２％〜約５％である。
【００８０】
別の態様では、（ａ）上述の方法によって作られるブドウ種子の液体抽出物を提供するステップ；（ｂ）上述の方法によって作られるブドウの皮の液体抽出物を提供するステップ；（ｃ）ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物を約５０：５０〜約８５：１５（体積／体積（ｖ／ｖ））の比で組みわせて、それによりブドウ由来の液体抽出物を形成するステップ、を含む、ブドウ由来の液体抽出物を製造する方法が提供される。
【００８１】
別の態様では、上述のブドウ種子、ブドウの皮、またはそれらの組み合わせからブドウ由来の液体抽出物を取得または製造して、それから、液体抽出物を噴霧乾燥させて粉末抽出物を形成するステップを含む、ブドウ由来の粉末抽出物を製造する方法が提供される。
【００８２】
ＩＩ．抽出物
本開示において、ブドウ種子、ブドウの皮、またはそれらの組み合わせから作られる抽出物も開示される。液体抽出物および粉末抽出物の両方が提供される。
【００８３】
本開示の抽出物は、セクションＩに記載の方法によって作られる抽出物である。一部の実施態様では、抽出物は、ブドウ種子から作られる。一部の実施態様では、抽出物は、ブドウ種子の液体または粉末抽出物である。一部の実施態様では、抽出物は、ブドウの皮から作られる。一部の実施態様では、抽出物は、ブドウの皮の液体または粉末抽出物である。一部の実施態様では、抽出物は、ブドウ種子およびブドウの皮から作られる。抽出物がブドウ種子および皮の粉末抽出物である場合は、ブドウ種子および皮の液体抽出物から作られた、粉末乾燥された粉末抽出物を含んでよい。あるいは、ブドウ種子および皮の粉末抽出物は、ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物のブレンドから作られた、噴霧乾燥された粉末抽出物を含んでよい。あるいは、ブドウ種子および皮の粉末抽出物は、ブドウ種子の液体抽出物から作られた噴霧乾燥された粉末抽出物、および、ブドウの皮の液体抽出物から作られた噴霧乾燥された粉末抽出物のブレンドを含んでよい。抽出物がブドウ種子および皮の液体抽出物である場合は、それは、ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物のブレンド、ブドウ種子の液体抽出物とブドウ種子の粉末抽出物のブレンド、ブドウの皮の抽出物とブドウの皮の粉末抽出物のブレンド、ブドウの皮の液体抽出物とブドウ種子の粉末抽出物のブレンド、ブドウ種子の液体抽出物とブドウの皮の粉末抽出物のブレンド、または、その中に溶解された少なくとも１つのブドウ種子の粉末抽出物またはブドウの皮の粉末抽出物を含む溶液を含んでよい。ある場合には、本開示のブドウ種子および皮の液体抽出物は、（ａ）ブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせを提供するステップ；（ｂ）ブドウ種子およびブドウの皮の組み合わせを蒸留水と接触させて、抽出混合物を形成するステップ；（ｃ）１２０華氏〜２００華氏の範囲の温度で抽出混合物を加熱するステップ（その加熱するステップの間、追加の蒸留水が添加される）；（ｄ）抽出混合物を冷却するステップ；（ｅ）抽出混合物を濾過して固形物を除去し、それにより濾液を形成するステップ；（ｆ）濾液に食品防腐剤を添加するステップ；（ｇ）濾液を冷却して、冷却された濾液を形成するステップ；および（ｈ）冷却された濾液を濾過して、それにより液体抽出物を生産するステップ、を含む方法によって作られる液体抽出物を含まない。
【００８４】
本発明は、本発明の方法によって作られる抽出物をさらに提供する。生産される抽出物中のポリフェノール類の最終濃度は、プロセスで用いられるブドウ種子または皮に対する水の比を調節することによって調節され得る。したがって、一部の態様では、約１４０ガロンの水を約４５０  ｌｂのブドウ種子とともに用いる場合、本発明の方法によって生産される抽出物は、１５〜２５ｇ／Ｌ（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｇ／Ｌおよびその中の任意の範囲または値）の合計ポリフェノール含有量を含んでよい。ある場合には、ブドウの皮から生産される抽出物中のポリフェノール類の最終濃度は、３ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌであってよい。
【００８５】
本明細書に記載の抽出物は、１００％ブドウ種子抽出物、１００％ブドウの皮の抽出物、１００％ブドウ種子およびブドウの皮の抽出物、またはそれらの任意の組み合わせを含んでよい。したがって、一部の態様では、ブドウの皮から生産される抽出物およびブドウ種子から生産される抽出物を組み合わせて、組み合わせられたブドウ種子およびブドウの皮の抽出物が生産され得る。ブドウの皮の抽出物に対するブドウ種子抽出物の比は、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０などであってよい。特定の態様では、ブドウの皮の抽出物に対するブドウ種子抽出物の比は、７０：３０であってよい。他の態様では、ブドウの皮の抽出物に対するブドウ種子抽出物の比は、８５：１５であってよい。
【００８６】
一例では、本開示に記載の抽出方法によって作られる液体抽出物が提供される。ある場合には、液体抽出物の合計フェノール化合物含有量は、約１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、２７５ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、およびその中の任意の値または範囲であってよい。ある場合には、液体抽出物は、約２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの合計フェノール化合物含有量を有してよい。
【００８７】
ある場合には、液体抽出物は、ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物のブレンドである。例えば、ブドウ種子の液体抽出物およびブドウの皮の液体抽出物は、約５０：５０〜約８５：１５（体積／体積（ｖ／ｖ））の比であってよい。ブドウの皮の抽出物に対するブドウ種子抽出物の比は、約１５％の皮に対して約８５％の種子抽出物、約２０％の皮の抽出物に対して約８０％の種子抽出物、約２５％の皮の抽出物に対して約７５％の種子抽出物、約３０％の皮の抽出物に対して約７０％の種子抽出物、または、約３５％の皮の抽出物に対して約６５％の種子抽出物であってよい。一部の実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比は、約３０％の皮の抽出物に対して約７０％の種子抽出物であってよい。さらなる実施態様では、ブドウの皮に対するブドウ種子の比抽出物は、約１５％の皮の抽出物に対して約８５％の種子抽出物であってよい。
【００８８】
別の例では、本開示に記載の抽出方法によって作られる粉末抽出物が提供される。ある場合には、粉末抽出物は、約２５％〜５０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む。別の例では、少なくとも約３０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む粉末抽出物が提供される。別の例では、粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を有する粉末抽出物が提供される。ある場合には、粉末抽出物は、粉末抽出物のグラムあたり少なくとも約６ｍｇの濃度の少なくとも１つの没食子酸またはエラグ酸を含んでよい。ある場合には、粉末抽出物は、約１５０ｍｇ／ｇ〜約６００ｍｇ／ｇ（例えば、約１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００ｍｇ／ｇ、およびその中の任意の値または範囲）の合計フェノール濃度を有する。代表的な実施態様では、粉末抽出物は、約２５０ｍｇ／ｇ〜約４００ｍｇ／ｇ、または約２７０ｍｇ／ｇ〜約３５０ｍｇ／ｇのフェノール類の濃度を有してよい。
【００８９】
ある場合には、抽出物は、ソルビン酸カリウム、クエン酸、酢酸、またはビタミンＥ（例えば、トコフェロール類、トコトリエノール類）のような食品防腐剤を含む。例えば、液体抽出物は、０．１％ｗ／ｖソルビン酸カリウムを含んでよい。ある場合には、抽出物は、食品グレードエタノールを含んでよい。例えば、液体抽出物は、液体抽出物体積の約２％〜約５％ｖ／ｖでエタノールを含んでよい。ある場合には、エタノールは、９５％エタノール（１９０プルーフ）である。
【００９０】
一部の実施態様では、ブドウ由来の粉末抽出物は、約２５％〜５０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む。
【００９１】
一部の実施態様では、ブドウ由来の粉末抽出物は、少なくとも約３０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む。
【００９２】
一部の実施態様では、ブドウ由来の粉末抽出物は、粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む。
【００９３】
一部の実施態様では、ブドウ由来の粉末抽出物は、粉末抽出物のグラムあたり少なくとも約６ｍｇの濃度の少なくとも１つの没食子酸またはエラグ酸を含む。
【００９４】
一部の実施態様では、ブドウ由来の粉末抽出物は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析に供された場合に７０６および１０３３の分子質量を有する固有の構成要素を含む。
【００９５】
一部の実施態様では、ブドウ由来の粉末抽出物は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析に供された場合に７３０または１２８８の分子質量を有する構成要素を、分析から生じたクロマトグラフ上のピークの最も大きな３０％の中に７３０または１２８８の分子質量を有する構成要素を作る量で含まない。
【００９６】
一部の実施態様では、本開示において提供される抽出物の合計フェノール含有量は、少なくとも６ヶ月の期間にわたって安定のままであり、６ヶ月でたった１０％の合計フェノール含有量の減少によって特徴付けられる。
【００９７】
ＩＩＩ．抽出物の特性化
実施例１〜３に記載の方法を用いて生産されるもののような、本開示によって提供されるマスカディンブドウ抽出物は、当技術分野でよく知られている方法を用いて、フェノール含有量について分析され得る。ある場合には、没食子酸は、フェノール含有量分析に関するアッセイの標準として用いられ得る。一実施態様では、フェノール含有量は、例えば実施例１に記載されるようなＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法によって評価され得る。粉末抽出物を評価する場合、粉末抽出物は、水または他の適切な溶媒中に再懸濁されてよく、その中に含まれるフェノール類の測定の前にホモジナイズされてよい。本開示に記載の方法に従って製造される抽出物は、本開示に記載の方法に従って製造されないマスカディンブドウ由来のサプリメントまたは抽出物のフェノール含有量と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも２０倍、より高いフェノール含有量を有してよい。一例では、抽出物は、１６２．３ｍｇのフェノール類／カプセルを有する、実施例１に記載の方法に従って作られたマスカディンブドウ種子および皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）である。そのようなサプリメントおよび抽出物の非限定的な例は、市販されるＰｒｅｍｉｕｍ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＮＰ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＭＮ」）、Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ（「ＮＦ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｂｅｒｒｉｅｓ（「ＥＮ」）、Ｂｉｏｐｏｗｅｒ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ由来のＭｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ（「ＢＰ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ  Ｈｅｒｂａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＶＩＴ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅｘ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＮＣＭＨ」）、Ｐｕｒｅ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ（「ＢＮ」）、および、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ（「ＦＨＮ」）を含む。一実施態様では、図５７に示されるように、ｐ−ＭＧＥのフェノール含有量は、ＢＰ製品のフェノール含有量の１６倍である。別の実施態様では、ｐ−ＭＧＥ製剤は、ＥＮ製品よりも、カプセルあたり１２．４倍、より多い合計フェノール含有量、および、フェノール類（ｍｇ）／粉末（グラム）に基づいて１４．９倍、より多い合計フェノール含有量を有する。
【００９８】
実施例１〜３に記載の方法に従って生産されるマスカディンブドウ抽出物は、１つまたは複数の個々のフェノール化合物に関して富化され得る。例えば、そのようなフェノール類は、限定されないが、エピカテキン（ｅｐｉｔｃａｔｅｃｈｉｎ）、没食子酸、プロシアニジンＢ、エラグ酸カテキンおよびカテキン没食子酸を含んでよい。ある場合には、提供される抽出物は、以前のパラグラフに記載のものを含むマスカディンブドウから製造される市販サプリメントと比較して、有意により高いレベルのそのような個々のフェノール類を有してよい。一部の実施態様では、例えば図５８に示されるように、マスカディンブドウ種子および皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、セクションＩＩＩの以前のパラグラフに記載されるもののような市販サプリメントに見られるよりも、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも２０倍高いレベルの少なくとも１つのタイプのフェノール化合物を含んでよい。富化フェノール化合物は、エピカテキン、没食子酸、プロシアニジンＢ、エラグ酸カテキンまたはカテキン没食子酸の１つまたは複数であってよい。この比較に用いられる市販サプリメントは、Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＮＰ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＭＮ」）、Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ（「ＮＦ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｂｅｒｒｉｅｓ（「ＥＮ」）、Ｂｉｏｐｏｗｅｒ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ由来のＭｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ（「ＢＰ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ  Ｈｅｒｂａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＶＩＴ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅｘ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（「ＮＣＭＨ」）、Ｐｕｒｅ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ（「ＢＮ」）、Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ（「ＦＨＮ」）のいずれか１つであってよい。ある場合には、市販サプリメントは、ＮＰ、ＢＰ、またはＮＣＭＨである。特定の一実施態様では、本明細書において提供されるｐ−ＭＧＥは、２２．０±０．７ｍｇ／ｇのエピカテキン、１３．５±０．６ｍｇ／ｇの没食子酸、７．１±０．３ｍｇ／ｇのプロシアニジンＢ、４．７±０．４ｍｇ／ｇのエラグ酸、２．７±０．１ｍｇ／ｇのカテキン、および１．８±０．１ｍｇ／ｇのカテキン没食子酸を含んでよい。
【００９９】
抽出物を分析するために質量分析（「ＭＳ」）を用いてもよい。一実施態様では、質量分析は、質量分析検出（ＵＨＰＬＣ−ＭＳ）と組み合わせられた島津超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である。ある場合には、実施例５に従って製造されたｌ−ＭＧＥは、実施例１に記載のように、抽出物の粉末状の形態（ｐ−ＭＧＥ）を生産するために噴霧膜方法によって処理されてよく、それから、カプセル化される。ある場合には、本明細書において提供されるｐ−ＭＧＥは、図５９に示されるように、質量分析によって７０６および１０３３の分子質量を有する化合物に関して富化されて、それらはｌ−ＭＧＥには不存在である（または実質的に減少している）。ある場合には、本明細書において提供されるｐ−ＭＧＥは、図５９に示されるように、ｌ−ＭＧＥ内に存在する７３０および１２８８の分子質量を有する化合物を含まない（または実質的に減少された量を含む）。
【０１００】
抽出物中のフェノール類は、経時的に低減し得る。実施例１〜３に従って生産されたブドウ抽出物は、市販目的に優れた安定性（貯蔵寿命）を示し得る。例えば、抽出物は、６５華氏〜７７華氏の範囲の周囲温度で、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、またはそれよりも長く安定したままであり得る。多くの標準が、本開示によって提供されるブドウ抽出物が安定であるかどうかを評価するために用いられ得る。ある場合には、ブドウ抽出物は、一定期間保管された後に、抽出物中の合計フェノール類含有量の低減がない、２％未満の低減、５％未満の低減、１０％未満の低減、１５％未満の低減、２０％未満の低減、または、２５％未満の低減のがある場合に、安定であるとみなされる。ある場合には、例えば、表４に示されるように、ｐ−ＭＧＥの合計フェノール類含有量は実質的に同一のままであり、例えば、１年後に、低減せず、または、５％未満、または３％未満の低減を示す。
【０１０１】
本開示に従って生産される抽出物は、一般に、生物学的にも安定であり、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１６ヶ月、または少なくとも１８ヶ月の期間にわたって、微生物増殖が低く、またはない。例えば、表５に示されるように、実施例１に記載の方法に従って作られたｐ−ＭＧＥ抽出物は、１６ヶ月の期間にわたって、大腸菌、黄色ブドウ球菌、および、サルモネラを含む微生物が存在しないままであり得る。他では、本開示の抽出物、具体的には、提供される粉末抽出物、より具体的には、実施例１に記載の方法に従って作られたｐ−ＭＧＥは、１６ヶ月後に、１０ｐｃｕ／ｇ未満の酵母およびカビの数および／または１０ｐｃｕ／ｇ未満の好気性菌数を有し得る。
【０１０２】
ＩＶ．製剤
本明細書に記載の抽出物は、医薬組成物（製剤）中に提供され得る。意図される投与モードに応じて、医薬組成物は、固体、半固体、液体の剤形、またはそれらの組み合わせ、例えば、好ましくは正確な用量の単回投与に適切な単位投与形態での、錠剤、坐薬、丸薬、カプセル、粉末、液体、または懸濁液の形態であってよい。組成物は、薬学的に有効量の本明細書に記載の抽出物、具体的にはその中のフェノール化合物を、薬学的に許容できる担体と組み合わせて含み、加えて、他の医学的薬剤、医薬品、担体、または希釈剤を含んでよい。用語「薬学的に許容できる」は、許容できない生物学的効果を引き起こさずに、または、それが含まれている医薬組成物の他の構成要素と有害な様式で相互作用せずに、選択された化合物と一緒に個体に投与され得る、生物学的または他の方法で望ましくないものでない物質を指す。
【０１０３】
ある場合には、液体医薬製剤中のフェノール化合物の濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、２７５ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬの範囲、またはその中の任意の値または範囲であってよい。ある場合には、製剤は、約２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの合計フェノール化合物含有量を有し得る。ある場合には、固体の医薬製剤中のフェノール化合物の量は、約１５０ｍｇ／ｇ〜約６００ｍｇ／ｇの範囲（例えば、約１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００ｍｇ／ｇ、またはその中の任意の値または範囲）であってよい。例えば、製剤は、粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を有してよい。一例では、製剤は、約２５０ｍｇ／ｇ〜約４００ｍｇ／ｇのフェノール濃度を有してよい。ある場合には、半固体の医薬製剤中のフェノール化合物の量は、約１５０ｍｇ／ｇ〜約６００ｍｇ／ｇの範囲（例えば、約１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００ｍｇ／ｇ、またはその中の任意の値または範囲）であってよい。例えば、製剤は、粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を有してよい。一例では、製剤は、約２５０ｍｇ／ｇ〜約４００ｍｇ／ｇのフェノール濃度を有してよい。
【０１０４】
本明細書において用いられる用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定化剤、可溶化剤、脂質、安定化剤、または、医薬製剤での使用に関して当技術分野でよく知られている他の材料を包含する。組成物における使用のための担体の選択は、組成物に関する意図される投与経路に依存する。薬学的に許容できる担体の製剤およびこれらの材料を含む処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０１２）に記載される。生理的に許容できる担体の例は、バッファー、例えば、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、および、他の有機酸を含むバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類、および、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／または、非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）を含む。
【０１０５】
記載される組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および調合剤のような、アジュバントを含んでもよい。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって促進され得る。等張剤、例えば、糖類、塩化ナトリウムなどが含まれてもよい。
【０１０６】
本明細書に記載の化合物またはその誘導体の経口投与のための固体剤形は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、および顆粒を含む。そのような固体剤形では、本明細書に記載の粉末抽出物は、少なくとも１つの不活性の習慣的な賦形剤（または担体）、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸ジカルシウム、または（ａ）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸（ａｌｉｇｎａｔｅｓ）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカでんぷん、アルギン酸、特定の複合シリケート、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、およびグリセロールモノステアレート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、および（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合されてよい。カプセル、錠剤、および丸薬の場合は、剤形は、緩衝剤を含んでもよい。
【０１０７】
同様のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールのような賦形剤を用いて、軟および硬−充填ゼラチンカプセル中に充填剤として用いられてもよい。
【０１０８】
錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒のような固体剤形は、腸溶性コーティングおよび当技術分野で知られている他のもののような、コーティングおよびシェルによって調製され得る。それらは乳白剤を含んでよく、遅延した様式で腸管の特定の部分において活性成分を放出する組成物であってもよい。用いられ得る包埋組成物の例は、重合体物質およびワックスである。活性化合物は、マイクロカプセル化された形態であってもよく、適切な場合は、１つまたは複数の上述した賦形剤を含む。ある場合には、コーティングまたはシェルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣまたはヒプロメロース）から作られるカプセルまたはシェルのような、植物由来であってよい。
【０１０９】
本明細書に記載の抽出物の経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容できるエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤を含む。抽出物に加えて、液体剤形は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類、特に、綿実油、粉砕された落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、および、ソルビタンの脂肪酸エステル、または、これらの物質の混合物などを含んでよい。
【０１１０】
そのような不活性希釈剤の他に、組成物は、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、または、芳香剤のような、さらなる薬剤を含んでもよい。
【０１１１】
懸濁液は、抽出物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール類、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル類、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天−寒天およびトラガカント、または、これらの物質の混合物などのような、さらなる薬剤を含んでよい。
【０１１２】
本明細書に記載の抽出物の局所投与のための剤形は、軟膏、粉末、噴霧、および吸入剤を含む。本明細書に記載の抽出物は、滅菌条件下で、生理的に許容できる担体および任意の防腐剤、バッファー、または噴霧剤と、必要であり得るように混合されてよい。眼科用の製剤、軟膏、粉末、および溶液も、組成物の範囲内であると考えられる。
【０１１３】
一部の実施態様では、粉末製剤は、約２５％〜５０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む。
【０１１４】
一部の実施態様では、粉末製剤は、少なくとも約３０％（重量／重量（ｗ／ｗ））の合計フェノール化合物を含む。
【０１１５】
一部の実施態様では、粉末製剤は、粉末抽出物のグラムあたり約２５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む。
【０１１６】
一部の実施態様では、粉末製剤は、粉末抽出物のグラムあたり少なくとも約６ｍｇの濃度の少なくとも１つの没食子酸またはエラグ酸を含む。
【０１１７】
一部の実施態様では、粉末製剤は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析に供された場合に７０６および１０３３の分子質量を有する固有の構成要素を含む。
【０１１８】
一部の実施態様では、粉末製剤は、高速液体クロマトグラフィー、質量分析に供された場合に７３０または１２８８の分子質量を有する構成要素を、分析から生じたクロマトグラフ上のピークの最も大きな３０％の中に７３０または１２８８の分子質量を有する構成要素を作る量で含まない。
【０１１９】
一部の実施態様では、本開示において提供される製剤の合計フェノール含有量は、少なくとも６ヶ月の期間にわたって安定のままであり、６ヶ月でたった１０％の合計フェノール含有量の減少によって特徴付けられる。
【０１２０】
Ｖ．治療の方法
提供される抽出物は、食品、飲料、化粧品、栄養補助食品、機能性食品などで用いられ得て、それにより、抗酸化含有量が増大した製品を提供する。
【０１２１】
マスカディンブドウによって生産されるいくつかの植物性化学物質、例えば、エラグ酸およびレスベラトロールは、それらの健康利益に関する広範囲の生物医学的な証拠資料を有する。フラボノイド類は、一般に良好な抗酸化であり、それらを作る植物は、抗酸化の保護のためにそれらを用いる。これらの化合物は、酸化的なフリーラジカルを直接的にクエンチングすることができる。フラボノイド類は、しばしばフリーラジカル産生のための触媒である金属イオンをキレートすることができる。これらの化合物は、有益な方法で遺伝子発現を調節するのを助け得る。慢性病状は、遺伝子発現の不利なパターンをしばしば伴う。フラボノイド類は、健全な遺伝子発現パターンの強力なレギュレーターである。
【０１２２】
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の抽出物を含む食品製品を提供し、ここで、食品製品は、液体（例えば、経腸栄養または静脈内投与のための飲料または液体）、固体（例えば、バー）、錠剤、および／または、粉末であってよい。一部の実施態様では、食品製品は、カプセル化された粉末であってよい。一部の実施態様では、食品製品は、例えば、液体、固体、粉末、または丸薬の形態で提供され得る医療食であってよい。
【０１２３】
本明細書において用いられる「医療食」は、Ｏｒｐｈａｎ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔのセクション５（ｂ）（３）（２１  Ｕ．Ｓ．Ｃ．３６０ｅｅ（ｂ）（３））に定義されるとおりであり、「医師の監督下で消費または経腸投与されるように処方される食品、および、独特の栄養要求が、認識された科学的原理に基づいて、医学的評価によって確立されている疾患または状態の特有の食事管理が意図される食品」を指す。
【０１２４】
ある場合には、提供される抽出物は、抗酸化組成物を調製するために用いられ得て、ここで、抗酸化組成物は、酸化ストレスおよび／または炎症と関連する疾患および障害を治療するために対象に投与される。したがって、一部の実施態様では、本発明の抽出物を含む治療的に有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、酸化ストレスおよび／または炎症と関連する疾患および障害を治療する方法が提供される。
【０１２５】
本明細書に記載の抽出物および製剤は、腫瘍学の領域において有用である。本明細書において、癌を有する対象を治療するための、記載される抽出物および製剤を用いる方法が提供される。癌のリスクが増大した対象を治療する方法も提供される。癌が再発するリスクのある対象を治療する方法も提供される。一般に、当該方法は、疾患または症状を有する対象に、本明細書に記載の有効量の抽出物または製剤を投与するステップを伴う。有効量は、提供される方法において投与される抽出物または製剤の量を説明するために用いられる場合、所望の薬理学的効果または他の生物学的効果を達成する抽出物または製剤のフェノール化合物含有量または抽出物の量を指す。
【０１２６】
ある場合には、対象に投与される抽出物中の合計フェノール化合物の１日の総投与量は、３００ｍｇ〜６０００ｍｇである。例えば、対象は、抽出物を介して、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ、４７５ｍｇ、５００ｍｇ、５２５ｍｇ、５５０ｍｇ、５７５ｍｇ、６００ｍｇ、６２５ｍｇ、６５０ｍｇ、６７５ｍｇ、７００ｍｇ、７２５ｍｇ、７５０ｍｇ、７７５ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、８７５ｍｇ、９００ｍｇ、９２５ｍｇ、９５０ｍｇ、９７５ｍｇ、１０００ｍｇ、１０２５ｍｇ、１０５０ｍｇ、１０７５ｍｇ、１１００ｍｇ、１１２５ｍｇ、１１５０ｍｇ、１１７５ｍｇ、１２００ｍｇ、１２２５ｍｇ、１２５０ｍｇ、１２７５ｍｇ、１３００ｍｇ、１３２５ｍｇ、１３５０ｍｇ、１３７５ｍｇ、１４００ｍｇ、１４２５ｍｇ、１４５０ｍｇ、１４７５ｍｇ、１５００ｍｇ、１５２５ｍｇ、１５５０ｍｇ、１５７５ｍｇ、１６００ｍｇ、１６２５ｍｇ、１６５０ｍｇ、１６７５ｍｇ、１７００ｍｇ、１７２５ｍｇ、１７５０ｍｇ、１７７５ｍｇ、または１８００ｍｇ（または任意のこれらの投与量の５％の量）の合計フェノール化合物の１日の総投与量を投与され得る。一部の例では、対象は、抽出物を介して、１８００ｍｇ、１９００ｍｇ、２０００ｍｇ、２１００ｍｇ、２２００ｍｇ、２３００ｍｇ、２４００ｍｇ、２５００ｍｇ、２６００ｍｇ、２７００ｍｇ、２８００ｍｇ、２９００ｍｇ、３０００ｍｇ、３１００ｍｇ、３２００ｍｇ、３３００ｍｇ、３４００ｍｇ、３５００ｍｇ、３６００ｍｇ、３７００ｍｇ、３８００ｍｇ、３９００ｍｇ、３９００ｍｇ、４０００ｍｇ、４１００ｍｇ、４２００ｍｇ、４３００ｍｇ、４４００ｍｇ、４５００ｍｇ、４６００ｍｇ、４７００ｍｇ、４８００ｍｇ、４９００ｍｇ、５０００ｍｇ、５１００ｍｇ、５２００ｍｇ、５３００ｍｇ、５４００ｍｇ、５５００ｍｇ、５６００ｍｇ、５７００ｍｇ、５８００ｍｇ、５９００ｍｇ、または６０００ｍｇ（または任意のこれらの投与量の５％の量）の合計フェノール化合物の１日の総投与量を投与され得る。特定の例では、対象は、抽出物を介して、３２４ｍｇ、６４８ｍｇ、７００ｍｇ、９７２ｍｇ、１４００、１６２０ｍｇ、２８００、または５６００ｍｇの抽出物中の合計フェノール化合物の１日の総投与量を投与され得る。本開示に記載のマウス研究は、ヒトのための投与を決定するのに有用であり得る。例えば、平均的なマウスは、０．０２５ｋｇの重量である。１日あたりのマウスあたり、例えば、実施例１に記載の方法に従って作られる粉末状のマスカディンブドウ種子および皮の抽出物のような抽出物を介した、０．２５、０．５、１および２ｍｇの合計フェノール類の投与は、１０、２０、４０、および８０ｍｇのフェノール類／ｋｇ／日の範囲の投与量に相当する。平均的なヒト成人が７０ｋｇの体重であると仮定すると、対応するヒト用量は、１日あたり、７００、１４００、２８００、および５６００ｍｇの合計フェノール類であろう。
【０１２７】
ある場合には、対象は、少なくとも１日２回の抽出物または製剤の投与量を投与される。例えば、ある場合には、対象は、１日２回、３回、４回、５回、または６回の抽出物または製剤の投与量を投与される。
【０１２８】
ある場合には、粉末抽出物、または粉末抽出物を含む製剤が、対象に投与される。ある場合には、投与量あたりの粉末抽出物または製剤の合計フェノール化合物含有量は、約３０〜５０％（ｍｇ／ｍｇ）であってよい。ある場合には、粉末抽出物または製剤の投与量は、約１５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む。
【０１２９】
ある場合には、対象は、ｋｇ体重あたり少なくとも約１０ｍｇの合計フェノール化合物を含む液体抽出物または粉末抽出物の１日の総投与量を投与され得る。例えば、対象は、ｋｇ体重あたり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、または８０ｍｇの合計フェノール化合物を含む液体抽出物または粉末抽出物の１日の総投与量を投与され得る。
【０１３０】
ある場合には、投与量あたりの液体抽出物または製剤の合計フェノール化合物含有量は、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬである。ある場合には、投与量あたりの液体抽出物または製剤の合計フェノール化合物含有量は、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、２７５ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、またはその中の任意の値または範囲であってよい。ある場合には、合計フェノール化合物含有量は、約２０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの範囲であってよい。一例では、液体抽出物の投与量は、約２．５ｇ〜約３．５ｇの合計フェノール化合物を含んでよい。
【０１３１】
本明細書において用いられる対象は、哺乳類および非哺乳類の両方を意味する。哺乳類は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、猿人類およびサル）、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラット、イヌ、ネコ、マウス、ブタ、およびヤギを含む。非哺乳類は、例えば、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類を含む。本明細書に記載の抽出物および製剤は、制限されずに小児および老年人口を含むヒト、および動物における疾患および状態の治療、たとえば獣医用途に関して、有用である。
【０１３２】
本明細書において用いられる用語「疾患または障害を、予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）、予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）、および予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、対象が疾患または障害の１つまたは複数の症候を示し始める前またはほぼ同時に生じる、疾患または障害の１つまたは複数の症候の発症または重症度を阻害または遅延させる、動作、例えば、組成物または治療的薬剤の投与を指す。
【０１３３】
本明細書において用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、治療する（ｔｒｅａｔ）、または、治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患または状態の１つまたは複数の症候を減少させる方法を指す。したがって、開示される方法において、治療は、疾患または状態の１つまたは複数の症候の重症度における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指し得る。例えば、疾患を治療する方法は、コントロールと比較した対象における疾患の１つまたは複数の症候または兆候（例えば、腫瘍サイズまたは腫瘍増殖速度）における１０％の減少が存在するならば、治療であると考えられる。本明細書において用いられる「コントロール」は、処置されていない状態を指す（例えば、化合物および本明細書に記載の組成物によって処置されていない腫瘍細胞）。したがって、減少は、ネイティブまたはコントロールのレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または、１０％と１００％との間の任意の％の減少であってよい。治療は、疾患、状態、または、疾患または状態の症候の、治癒または完全なアブレーションを必ずしも指さないことが理解される。本明細書において用いられる、低減（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）、減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、または阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）に対する言及は、コントロールレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも大きな変化を含む。そのような用語は、完全な除去を含んでよいが、必ずしも含まない。
【０１３４】
本明細書に記載の抽出物および製剤は、処置の予防的および治療的方法の両方に有用である。予防的用途については、本明細書に記載の薬学的に有効量の抽出物または製剤は、発症の前（疾患の明らかな兆候の前）、早期発症中（例えば、疾患の最初の兆候および症候の際）、または、疾患の進行後に対象に投与される。予防的投与は、疾患の症候の発現の数日から数年の間、生じ得る。治療的な処置は、疾患または状態が診断された後の、本明細書に記載の薬学的に有効量の化合物および組成物またはそれらの薬学的に許容できる塩の対象への投与を含む。
【０１３５】
例示的な投与経路は、限定されないが、経口、腸内、皮膚、注入（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、および腫瘍内）、舌下、経皮、鼻腔内、局所および吸入の経路を含む。そのような経路の議論は、セクションＩＩＩに記載の製剤に関して上記に提供される。
【０１３６】
本明細書に記載の組成物の投与は、疾患または状態を治療するのに効果的な期間のあいだ、薬学的に有効量を用いて行なわれ得る。本明細書に記載の有効量の抽出物および組成物は、当業者の一人によって決定され得て、１日あたり約６００ｍｇ〜６０００ｍｇ／ｋｇ体重の合計フェノール化合物の哺乳類に関する例示的な用量を含み、それは、単回投与で、または個々の分割された投与量の形態で、例えば少なくとも１日２回、投与され得る。対象の疾患または状態に応じて、薬学的に有効量の抽出物または組成物は、異なる治療的効果をもたらし得る。
【０１３７】
任意の特有の対象に関する特定の投与量レベルおよび用量の頻度は異なってよく、用いられる特定の抽出物または製剤の活性；その化合物の作用の代謝安定性および長さ；対象の種、年齢、体重、健康全般、性別および食事；投与のモードおよび時間；排泄率；薬物の併用；対象が経験する疾患または状態の性質、および、特有の疾患または状態の重症度を含む、様々な因子に依存することを、当業者は理解している。製剤中に用いられるべき正確な投与量は、投与経路、および、疾患または障害の重症度にも依存し、熟練者の判断およびそれぞれの対象の状況に従って決定されるべきである。効果的な投与量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られる投与量応答曲線から推定され得る。さらに、投与経路に応じて、当業者は、対象の細胞、組織および／または臓器における所望のレベルの応答のための血漿濃度をもたらす投与量をどのように決定するかを知っている。
【０１３８】
一態様では、本開示において提供される抽出物を投与するステップを含む、対象における癌を治療または寛解させる方法が、本明細書において提供される。本開示において提供される抽出物を投与するステップを含む、対象において生じる癌の可能性を予防または減少させる方法も提供される。本開示において提供される抽出物を投与するステップを含む、癌を有する対象において生じる転移の可能性を予防または減少させる方法も提供される。本開示において提供される抽出物を投与するステップを含む、対象における癌細胞の増殖または激増を阻害する方法、組織における血管新生を阻害する方法、および、組織における線維症を阻害する方法も提供される。ある場合には、対象における癌を治療する方法は、本開示において提供される有効量の抽出物または製剤を対象に投与するステップを含む。ある場合には、抽出物または製剤を投与するステップは、対象における癌細胞の増殖または激増を阻害する。ある場合には、抽出物または製剤を投与するステップは、腫瘍増殖、転移、または、腫瘍増殖および転移の両方の可能性を、予防または減少させる。ある場合には、抽出物または製剤を投与するステップは、癌細胞の増殖または激増、血管新生、炎症、または線維症の少なくとも１つを阻害する。ある場合には、抽出物または製剤を投与するステップは、内皮細胞の細胞増殖または激増を阻害する（インビボ、インビトロ）。
【０１３９】
一態様では、癌を有する対象、癌のリスクが高い対象、または、再発するリスクのある対象を治療する方法が提供されて、当該方法は、本開示に記載の薬学的に有効量の液体抽出物、粉末抽出物、またはいずれかを含む製剤を対象に投与するステップを含む。ある場合には、抽出物を投与するステップは、癌関連細胞の増殖または激増、血管新生、炎症、または線維症の少なくとも１つを阻害する。
【０１４０】
本開示によって提供される抽出物は、癌の治療に幅広い有用性がある。そのような癌は、制限されずに、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合タイプの癌を含む。一実施態様では、癌は、ユーイング肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫のような骨癌、および他の軟組織肉腫である。別の実施態様では、癌は、脳腫瘍、例えば、乏突起神経膠腫、上衣腫、髄膜腫（ｍｅｎｅｎｇｉｏｍａ）、リンパ腫、神経鞘腫、または髄芽腫である。ある場合には、癌はグリオーマである。別の実施態様では、癌は乳癌である。ある場合には、乳癌は、ＨＥＲ２過剰発現乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳癌、または、三種陰性乳癌である。ある場合には、癌は、脳特異的転移乳癌である。別の実施態様では、癌は、内分泌系の癌、例えば、副腎、膵臓、副甲状腺、下垂体、および甲状腺の癌である。別の実施態様では、癌は、胃腸の癌、例えば、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、肝臓、および小腸の癌である。例えば、癌は、胆道の癌腫または胆管細胞癌であってよい。一例では、癌は肝臓癌である。別の例では、癌は肝細胞の癌腫である。別の実施態様では、癌は、婦人科の癌、例えば、頸部、子宮内膜、子宮、卵管、妊娠性絨毛の疾患、絨毛癌、卵巣、膣、または外陰の癌である。別の実施態様では、癌は、頭頚部癌、例えば、喉頭、咽頭、食道、中咽頭、副甲状腺、または甲状腺癌である。別の実施態様では、癌は、メラノーマ、扁平上皮細胞癌腫、または基底細胞癌である。別の実施態様では、癌は、白血病性の癌、例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞白血病、または、骨髄増殖性の障害である。別の実施態様では、癌は、肺癌、例えば、中皮腫または、非小細胞肺癌である。別の実施態様では、癌は、リンパ腫、例えば、皮膚のＴ細胞リンパ腫、ホジキン病、または非ホジキン病である。別の実施態様では、癌は、骨髄腫、例えば、多発性骨髄腫である。別の実施態様では、癌は、陰茎癌である。別の実施態様では、癌は、前立腺癌である。別の実施態様では、癌は、精巣癌である。別の実施態様では、癌は、甲状腺癌、例えば、乳頭、小胞、髄質、退形成性、または未分化の甲状腺癌腫である。別の実施態様では、癌は、尿路癌、膀胱癌、または、腎臓癌および肝細胞癌腫のような腎癌である。ある場合には、癌は、尿生殖器癌である。ある場合には、癌は、腹膜癌である。別の例では、癌は、肉腫である。例えば、癌は、滑膜の癌腫であってよい。特定の実施態様では、癌は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膠芽腫、肺癌、皮膚癌、白血病、またはリンパ腫であってよい。別の実施態様では、癌は、例えば、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、結腸癌、前立腺癌、または膵癌のような、ＨＥＲ２過剰発現である。別の例では、癌は、転移性癌である。ある場合には、癌は、原発性癌である。
【０１４１】
対象における癌を治療または予防する方法は、治療的薬剤、放射線療法、またはそれらの組み合わせを、対象に投与するステップをさらに含んでよい。したがって、提供される組成物および方法は、１つまたは複数のさらなる薬剤を含んでよい。１つまたは複数のさらなる薬剤および本明細書に記載の抽出物または製剤は、随伴性、同時、または連続の投与を含む任意の順序で投与され得る。連続の投与は、数日まで空いた時間的に離された順序で投与され得る。当該方法は、前記の１つまたは複数のさらなる薬剤および／または本明細書に記載の抽出物または製剤の単回より多い投与を含んでもよい。１つまたは複数のさらなる薬剤および抽出物または製剤の投与は、同一または異なる経路によるものであってよく、同時または連続であってよい。
【０１４２】
さらなる治療的薬剤は、限定されないが、化学療法剤を含む。化学療法剤は、異常に増殖している細胞の増殖を阻害または阻止するのに効果的な化合物または組成物である。したがって、そのような薬剤は、癌ならびに異常な細胞増殖によって特色付けられる他の疾患を治療するために効果的に用いられ得る。化学療法化合物の例示的な例は、限定されないが、ベキサロテン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、イリノテカン、テモゾロミド、カルムスチン、ビノレルビン、カペシタビン、ロイコボリン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ボルテゾミブ、オブリメルセン、ヘキサメチルメラミン、イホスファミド、ＣＰＴ−１１、レフルノミド（ｄｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）、シクロヘキシミド、ダカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトタン（ｍｉｔｏｔａｎｔ）、ビンブラスチンサルフェート、カルボプラチン、コルヒチン、エトポシド、メルファラン、６−メルカプトプリン、テニポシド、ビンブラスチン、抗生物質誘導体（アントラサイクリン、例えば、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、およびジエチルスチルベストロールドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチノマイシンを含む）；抗アンドロゲン（例えば、エンザルタミド、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、およびＡＲＮ−５０９）；抗エストロゲン薬（例えばタモキシフェン）；代謝拮抗剤（例えば、フルオロウラシル（ＦＵ）、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インターフェロンα−２Ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルムスチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エストラムスチン、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シスプラチン、ビンクリスチンおよびビンクリスチンサルフェート）；ホルモン類（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンホスフェートナトリウム、エチニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテストステロン、ジエチルスチルベストロール二リン酸、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファレン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロラムブシル、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；Ａｋｔ阻害剤；グルココルチコイド受容体阻害剤（例えば、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、フルニソリド、フルチカゾン、ミフェプリストン、モメタゾン、およびトリアムシノロン）；および生存因子阻害剤（例えば、ニューロトロフィン、サイトカイン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ヘパリン−結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、神経鞘腫由来増殖因子（ＳＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、形質転換増殖因子−α（Ｔ��Ｆ−α）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ１−ＢＭＰ１５など）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）の阻害剤を含む。
【０１４３】
任意選択で、前記の１つまたは複数のさらなる薬剤は、抗体を含んでよい。抗体は、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含んでよく、免疫グロブリンは、様々なクラスおよびアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなどを含む。そのフラグメントは、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などを含んでよい。抗体は、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または、特定の結合部位に特異的な結合活性を保持する当業者に公知の任意の他の抗体誘導体であってもよい。加えて、免疫グロブリンの凝集体、ポリマー、およびコンジュゲート、またはそれらのフラグメントは、特定の結合部位に関する結合親和性が維持される限り、適切な場合に用いられ得る。例示的な抗体は、トラスツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ、ブリナツモマブ、ベバシズマブ、およびセツキシマブを含む。
【０１４４】
任意選択で、前記の１つまたは複数のさらなる薬剤は、例えば、転移前立腺癌を有する一部の人での使用のために、米国連邦医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｅｄｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって２０１０年に承認された、シプリューセル−Ｔ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ製）のような癌ワクチンを含んでよい。
【０１４５】
任意の前述のさらなる薬剤は、本明細書に記載の抽出物または製剤との任意の組み合わせで用いられ得る。組み合わせは、併用して（混合物など）、別個だが同時に（例えば、同一の対象への別個の静脈内ラインを介して）、または、連続して（例えば、化合物または薬剤の１つが最初に与えられて、その後に２つめが続けられる）、投与される。したがって、用語「組み合わせ」は、２以上の薬剤の随伴性、同時、または連続の投与を指すために用いられる。
【０１４６】
ある場合には、薬学的に有効量での、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の投与は、三種陰性乳房腫瘍の増殖を減少させることができる。ある場合には、腫瘍サイズの減少は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６６％、例えば、約６６％であり得る。治療的有効量は、対象の重量に依存し得る。例えば、２５ｍｇのマウスについては、用量は、０．５ｍｇ〜５ｍｇのフェノール類／日、例えば、０．５〜２ｍｇ／日であってよい。ある場合には、抽出物の治療的有効量は、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／ｋｇ／日、すなわち、患者の質量のｋｇそれぞれあたり、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の範囲であってよい。一例では、図３２Ａに示されるように、０．０５、０．１、０．２、または０．４ｍｇフェノール類／ｍＬの投与量での、ヒト三種陰性乳房腫瘍を保有するマウス（平均２５ｍｇ体重）へのｐ−ＭＧＥの投与は、０．２５、０．５、１、または２ｍｇフェノール類／日と同等であり、腫瘍体積を５０％〜６５％減少させることができる。一例では、図３２Ｂに示されるように、０．０５、０．１、０．２、または０．４でのｐ−ＭＧＥの投与は、０．２５、０．５、１、または２ｍｇのフェノール類／日と同等であり、３０日の処置期間の終わりに、未処置マウスと比較して、腫瘍重量を４０５〜７０％減少させることができる。一例では、図３２Ｃに示されるように、２５グラムのマウスに関する、０．５ｍｇフェノール類／日でのｐ−ＭＧＥの投与は、ＤＵＳＰ１（ＭＫＰ１）の発現を約５０％増大させることができ、リン酸化された、活性化されたＭＡＰキナーゼの量の減少をもたらす。一例では、図３２Ｄに示されるように、０．１ｍｇ／ｍＬでのｐ−ＭＧＥの投与は、２５グラムのマウスに関する０．５ｍｇのフェノール類／日と同等であり、ＰＤＧＦ発現を約５０％減少させる。別の例では、図３２Ｅに示されるように、０．１ｍｇ／ｍＬでのｐ−ＭＧＥの投与、すなわち、２５グラムのマウスに関する０．５ｍｇのフェノール類／日は、ｐ２１の発現を、未処置の対象の約２倍まで増大させる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、特に、対象の質量（体重）のｋｇあたり、１０〜８０、例えば、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与した場合、乳癌腫瘍体積または重量を、４０〜７０％減少させ得る。例えば、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、乳癌腫瘍体積または重量（または両方）を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、または７０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。
【０１４７】
ある場合には、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、薬学的に有効量での、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の投与は、前立腺腫瘍の増殖を減少させることができる。例えば、ｐ−ＭＧＥは、患者の質量のそれぞれのｋｇあたり、１０〜８０ｍｇ、例えば、２０ｍｇの合計フェノール類／日の範囲で投与されてよい。ある場合には、前立腺腫瘍の体積減少は、未処置コントロールと比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、例えば、約４６％、または約５２％であってよい。これの一例は、本明細書において図４８に関して説明される。ある場合には、ｐ−ＭＧＥ処置は、前立腺腫瘍細胞の増殖を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、または４０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させる。例えば、本明細書において図５０に説明されるように、前立腺腫瘍を保有するマウスに０．１ｍｇフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥを投与することは、領域あたりのＫｉ６７陽性細胞の数の３６％減少をもたらし、ｐ−ＭＧＥが、前立腺腫瘍細胞の増殖を減少させることを示唆した。別の例では、本明細書において図４８に関して説明されるように、前立腺腫瘍を保有するマウスを、０．５ｍｇフェノール類／日または２ｍｇフェノール類／日でｐ−ＭＧＥを用いて処置することは、未処置マウスと比較して、腫瘍体積をそれぞれ約５２％または７５％減少させることができる。ある場合には、前立腺腫瘍の重量減少は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、例えば、約５９％であってよい。これの一例は、本明細書において図４９に関して説明される。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、特に、対象の質量（重量）のｋｇあたり、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、前立腺癌の腫瘍体積または重量を４０％〜７５％減少させ得る。例えば、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、前立腺癌の腫瘍体積または重量（または両方）を、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、または７５％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。
【０１４８】
ある場合には、対象に投与される、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、前立腺腫瘍における血管新生を阻害し得る。ある場合には、ｐ−ＭＧＥは、前立腺腫瘍における血管の数を、未処置コントロールと比較して、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％減少させ得る。一例では、本明細書において図５１に関して説明されるように、前立腺腫瘍を保有するマウスを、ｐ−ＭＧＥ  ０．１ｍｇフェノール類／ｍＬ（０．５ｍｇフェノール類／日と同等である）によって処置することは、未処置マウスと比較して血管の数を約４２％減少させることができる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、血管形成を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。ある場合には、ｐ−ＭＧＥは、腫瘍細胞におけるＶＥＧＦおよびＰＬＧＦの両方（血管新生を調節する増殖因子）の相対的発現を、未処置コントロールと比較して、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、または少なくとも３０％減少させ得る。ある場合には、本明細書において図５２Ａ〜５２Ｂに関して説明されるように、前立腺腫瘍を保有するマウスを、０．１ｍｇフェノール類／ｍＬ（０．５ｍｇフェノール類／日と同等である）でｐ−ＭＧＥによって処置することは、ＶＥＧＦおよびＰＬＧＦの発現を約３０％〜４０％減少させることができる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、ＶＥＧＦ発現、ＰＬＧＦ発現、または両方を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。
【０１４９】
ある場合には、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、脳特異的転移乳癌細胞の増殖を阻害するために薬学的に有効量で投与され得る。これらの細胞は、脳に特異的に転移する三種陰性乳癌細胞（「ＴＮＢＣ」）であり得る。ある場合には、本明細書において図３３Ａ〜３３Ｂに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、三種陰性乳癌細胞、ＥＲ＋乳癌細胞、または両方に由来する脳特異的転移乳癌細胞の増殖を減少させ得る。例えば、ｐ−ＭＧＥは、三種陰性乳癌細胞株４Ｔ１またはＥＲ＋細胞株Ｅｏ７７１４Ｔ１に由来する細胞株と同様にふるまう癌に由来する脳特異的乳癌細胞の増殖を阻害し得る。別の例では、ｐ−ＭＧＥは、脳特異的乳癌細胞株ｌｕｃ．２Ｂｒ５、Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５、または両方と同様にふるまう脳特異的乳癌細胞の増殖を阻害し得る。ある場合には、粉末抽出物は、細胞周期の進行を阻害、および／または、脳特異的転移乳癌細胞のアポトーシスを誘導することができる。ある場合には、本明細書において図３４Ａに関して説明されるように、脳特異的乳癌細胞にｐ−ＭＧＥを投与することは、ＥＲＫ１／２リン酸化を有意に低減することができる。例えば、本明細書において図３４Ｂに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、例えば細胞内のサイクリンＤ１レベルを減少させることによって、細胞周期の進行の阻害を通して、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。加えて、一部の例では、本明細書において図３５に関して説明されるように、２４時間の１０μｇ／ｍＬでのｐ−ＭＧＥ処置は、カスパーゼ３の活性の開裂型および開裂ＰＡＲＰの存在によって示されるように、アポトーシスを誘導することができる。
【０１５０】
ある場合には、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、三種陰性乳癌細胞（ＴＮＢＣ）の増殖を減少させるために、薬学的に有効量で投与され得る。ある場合には、本開示によって提供される抽出物の治療的な量の投与は、ＴＮＢＣの一次増殖を減少させることができる。例えば、本明細書において図３６Ａ〜３６Ｂおよび図３７Ａ〜３７Ｃに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥは、５μｇ／ｍｌから、および２５μｇ／ｍｌの濃度（フェノール類／投与量）で、ＴＮＢＣの増殖を低減することができる。ある場合には、本明細書において図３８Ａ〜３８Ｄに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、リン酸化および活性化されたＥＲＫ１およびＥＲＫ２の両方を有意に減少することができて、それらは細胞増殖の制御に関与するＭＡＰキナーゼである。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与される場合、癌細胞の増殖を、具体的には乳癌細胞に関して、より具体的には三種陰性乳癌細胞に関して、８０％も減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物の投与は、癌細胞増殖、具体的には乳癌細胞、より具体的には三種陰性乳癌細胞を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させる。
【０１５１】
ある場合には、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、本明細書において図３９に関して説明されるように遺伝子パスウェイまたはファミリーを上方制御または下方制御するために、三種陰性乳癌を有する対象に薬学的に有効量で投与され得る。例えば、２０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（フェノール類／投与量）による三種陰性乳癌細胞の処置は、炎症性またはリポ多糖（ＬＰＳ）応答に関与する遺伝子、ウイルス防御またはインターフェロンβ（ＩＦＮβ）応答に関与する遺伝子、および、自食作用または小胞体（ＥＲ）ストレス応答に関与する遺伝子を、上方制御し得る。別の例では、２０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥ（フェノール類／投与量）による三種陰性乳癌細胞の処置は、ヌクレオソーム集合に関与する遺伝子、先天性の免疫応答に関与する遺伝子、および、細胞周期または細胞分裂に関与する遺伝子を、下方調節し得て、それは、ｐ−ＭＧＥによる処置の際に観察される細胞周期の制御に関与するタンパク質およびＭＡＰキナーゼシグナル伝達における変化の反映であり得る。
【０１５２】
ある場合には、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、ＨＥＲ２過剰発現（陽性）乳癌細胞の増殖を減少させるために、薬学的に有効量で投与され得る。ある場合には、本開示によって提供される治療的な量の抽出物の投与は、そのような細胞の一次増殖を減少させることができる。例えば、本明細書において図４１Ａに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥは、１０μｇ／ｍｌから、および４０μｇ／ｍｌの濃度（フェノール類／投与量）で、ＨＥＲ２過剰発現（陽性）乳癌細胞の増殖を低減させることができる。ある場合には、本明細書において図４１Ｂ〜４１Ｄに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、生理学における細胞増殖および生存ならびに癌のような病状に重要な細胞内シグナル伝達経路の重要な構成要素である、リン酸化された活性化されたＡＫＴおよびｍ−ＴＯＲを有意に減少させることができる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与される場合、具体的には乳癌細胞に関して、より具体的にはＨＥＲ２過剰発現（陽性）乳癌細胞に関して、癌細胞増殖を約６０％減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物の投与は、癌細胞の増殖、具体的には乳癌細胞、より具体的にはＨＥＲ２過剰発現（陽性）乳癌細胞を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させる。
【０１５３】
ある場合には、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、三種陰性乳癌細胞（ＴＮＢＣ）の遊走を減少させるために、薬学的に有効量で投与され得る。ある場合には、本開示によって提供される治療的な量の抽出物の投与は、ＴＮＢＣの浸潤性の増殖を減少させることができる。例えば、これは、そのような腫瘍細胞の浸潤性を減少させ得る。ある場合には、本明細書において図４０Ａ〜４０Ｄに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥは、１０μｇ／ｍＬおよび２５μｇ／ｍＬの合計用量に関して１０μｇ／ｍｌから、および２５μｇ／ｍｌ（フェノール類／投与量）の範囲の投与量で投与される場合、一次腫瘍からのＴＮＢＣの遊走を減少させる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与される場合、具体的には乳癌細胞に関して、より具体的には三種陰性乳癌細胞に関して、癌細胞の遊走を２５％〜５０％減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物の投与は、癌細胞の遊走、具体的には乳癌細胞、より具体的には三種陰性乳癌細胞を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５５％、または６０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させる。
【０１５４】
ある場合には、薬学的に有効量での、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の投与は、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）ヒト乳房腫瘍の増殖を減少させることができる。例えば、治療期間は、少なくとも６週、少なくとも７週、または少なくとも８週であってよい。ある場合には、ｐ−ＭＧＥの投与は、未処置のコントロール対象における腫瘍増殖と比較して、腫瘍増殖を少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％阻害し得る。ある場合には、ｐ−ＭＧＥは、ＥＲ＋ヒト乳房腫瘍を治療するためにエストロゲン受容体拮抗薬と組み合わせて対象に投与され得る。ある場合には、エストロゲン受容体拮抗薬は、タモキシフェンであってよい。ある場合には、ｐ−ＭＧＥおよびエストロゲン受容体拮抗薬による組み合わせ治療は、いずれかの治療単独よりも大きく腫瘍増殖を減少させ得る。一例では、本明細書において図４３、４４、４６、および４７に関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥは、２５グラムのマウスに関して、１日あたり０．５ｍｇフェノール類／マウスの投与量で、ＺＲ−７５−１細胞またはＭＣＦ７細胞によって形成されたＥＲ＋腫瘍を保有するＥＲ＋マウスに投与されて、腫瘍の増殖を有意に減少させて、腫瘍増殖の減少は、本明細書において図４５に関して記載されるように、増殖マーカーＫｉ６７に関して陽性である細胞の数の減少と関連する。したがって、ある場合には、対象の質量（重量）のｋｇあたり、２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与される場合、本開示によって提供される抽出物の投与は、単独または化学療法と組み合わせて、腫瘍増殖、腫瘍サイズ、または両方を、５０％〜９５％減少させ得る。ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、単独または化学療法と組み合わせて、腫瘍増殖、腫瘍サイズ、または両方を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。
【０１５５】
ある場合には、薬学的に有効量での、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、それらの疾患、例えば、癌の過程で患者を治療するために、放射線と組み合わせて投与されてよい。ある場合には、抽出物は、２Ｇｙ放射線と組み合わせて投与されてよい。ある場合には、組み合わせ治療は、放射線治療またはｐ−ＭＧＥ治療のいずれか単独よりも大きな程度まで、疾患細胞の増殖を阻害および／または疾患細胞を死滅させる。一例では、本明細書において図４２Ａ〜４２Ｂに関して説明されるように、放射線は、放射線感度を有意に増大させない。別の例では、本明細書において図４２Ｃ〜４２Ｄに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、いずれかの治療単独よりも、マウスの脳特異的転移乳癌細胞、例えば、４Ｔ１．ｌｕｃ２．ＢＲ５細胞またはＥｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５細胞の大きな減少を引き起こすことができる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、脳転移性癌細胞、具体的には脳転移乳癌細胞を、１５％〜５０％減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物の投与は、単独または化学療法と組み合わせて、腫瘍増殖、腫瘍サイズ、または両方を、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。ある場合には、放射線療法と合わせて、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、脳転移性癌細胞、具体的には脳転移乳癌細胞を、５０％〜８０％減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物の投与は、放射線療法と組み合わせて、脳転移性癌細胞、具体的には脳転移乳癌細胞を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。
【０１５６】
ある場合には、薬学的に有効量での、化学療法剤と組み合わせた、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の投与は、ブドウ抽出物または化学療法剤のいずれか単独の投与と比較して、ＥＲ＋腫瘍のより大きな増殖減少を引き起こすことができる。一実施態様では、化学療法剤は、タモキシフェンである。これの１つの例は、本明細書において図４３に関して説明される。ある場合には、本明細書において図４４に関して説明されるように、タモキシフェンと組み合わせてｐ−ＭＧＥを用いて、ＥＲ＋腫瘍を有する対象を治療することは、腫瘍増殖の阻害において相加的効果を有し、すなわち、その組み合わせは、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェンのいずれかの治療単独よりも大きな程度まで腫瘍重量を有意に減少させる。また、併用療法は、本明細書において図４５Ａ〜４５Ｂに関して説明されるように、いずれかの治療単独と比較して、Ｋｉ６７陽性腫瘍細胞のパーセントを低減させ得て、それは、ブドウ抽出物およびタモキシフェンの組み合わせが、いずれかの治療単独よりも大きな程度まで腫瘍細胞増殖を減少させることができることを示す。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物および化学療法剤の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、腫瘍サイズ（領域）を、具体的には乳癌腫瘍、より具体的にはＥＲ＋乳癌腫瘍を、抽出物単独よりも３０％〜４０％多く、化学療法単独よりも３０％〜５０％多く、または両方で、減少させ得る。例えば、化学療法剤とともに、本開示によって提供される抽出物は、腫瘍サイズ（領域）、具体的には乳癌腫瘍、より具体的にはＥＲ＋乳癌腫瘍を、抽出物単独、化学療法単独、または両方よりも少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％（または、これらの値の５％内の程度まで）多く、減少させ得る。ある場合には、本開示によって提供される抽出物および化学療法剤の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、腫瘍重量を、具体的には乳癌腫瘍、より具体的にはＥＲ＋乳癌腫瘍を、抽出物単独よりも２５％〜５０％多く、または、化学療法単独よりも１０％〜２０％多く、または両方で、減少させ得る。例えば、化学療法剤とともに、本開示によって提供される抽出物は、腫瘍重量を、具体的には乳癌腫瘍、より具体的にはＥＲ＋乳癌腫瘍を、抽出物単独、化学療法単独、または両方よりも、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％（または、これらの値の５％内の程度まで）多く、減少させ得る。ある場合には、本開示によって提供される抽出物および化学療法剤の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、腫瘍細胞増殖、例えば決定されるＫｉ６７陽性発現を、抽出物単独または化学療法単独のいずれか、または両方よりも２０％〜３０％多く、減少させ得る。
【０１５７】
別の態様では、本開示において提供される抽出物を投与するステップを含む、対象における放射線によって誘導される線維症および骨喪失を減少または改善する方法が本明細書において提供される。薬学的に有効量での、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の投与は、放射線によって誘導される線維症を減少させることができる。抽出物は、照射後の骨格筋線維症を防ぎ得て、放射線によって誘導される骨損傷を減少させ得て、または両方である。線維症の減少は、放射線照射された組織における炎症の減少によって説明／反映され得る。一実施態様では、線維症の減少は、組織染色、すなわち、マッソン三色染色法によって検出される。一実施態様では、本明細書において図５３および図５４に関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥによる治療は、放射線治療によって誘導された線維症を、放射線照射されていないレベルまで減少させることができる。抽出物は、本明細書において図５５Ａ〜５５Ｃに関して説明されるように、ＴＧＦβ、ＣＴＧＦ、またはＳＭＡＤ２の放射線によって誘導される産生を阻害することによって、線維症を減少させ得る。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、放射線に曝された対象の骨格筋における線維症を、８０％〜９０％減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物は、放射線に曝された対象の骨格筋における線維症を、抽出物を受けない対象と比較して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。一例では、本明細書において図５６および図５７に関して説明されるように、放射線と同時または放射線の前の、ｐ−ＭＧＥによる前破骨細胞の処置は、放射線単独と比較して、前破骨細胞によって形成される破骨細胞の数を減少させることができる。ブドウ抽出物による処置は、放射線に曝されるが本開示の抽出物は投与されない対象と比較して、放射線によって誘導される活性の破骨細胞の増大を減少させ得て、活性の破骨細胞の減少は、それにより、骨吸収を減少および骨喪失を防止する。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、骨喪失（骨密度の喪失、ミネラル含有量）を、前破骨細胞の数を減少または破骨細胞への前破骨細胞の成熟を減少させることによるものを含み、９５％〜１００％減少させ得る。例えば、本開示によって提供される抽出物は、骨喪失（骨密度の喪失、ミネラル含有量）を、抽出物を受けない対象と比較して、前破骨細胞の数を減少または破骨細胞への前破骨細胞の成熟を減少させることによるものを含み、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させ得る。
【０１５８】
別の態様では、本明細書に開示されるブドウ抽出物は、高血圧を有する患者を治療するために用いることができる。ある場合には、患者は、終末器官損傷のような臓器に対する高血圧の効果を減少させるように治療される。高血圧とは、動脈壁に対する長期の血液の力が異常に高いため、最終的に健康問題を引き起こし得る状態である。心疾患は、一般に高血圧と関連する。高血圧は、収縮期圧および拡張期圧を含む、水銀柱ミリメートル（ｍｍＨｇ）で与えられる血圧を測定することによって典型的に診断される。正常な血圧は、１２０／８０ｍｍＨｇよりも下であり、高血圧前症は、１２０〜１３９ｍｍＨｇの範囲の収縮期圧または８０〜８９ｍｍＨｇの範囲の拡張期圧を有する状態である。ステージ１高血圧は、１４０〜１５９ｍｍＨｇの範囲の収縮期圧または９０〜９９ｍｍＨｇの範囲の拡張期圧を有する状態である。より重度の高血圧であるステージ２高血圧は、１６０ｍｍＨｇ以上の収縮期圧または１００ｍｍＨｇ以上の拡張期圧を有する状態である。本明細書に開示されるブドウ抽出物の治療から恩恵を受け得る患者は、制限されないが、ステージ１およびステージ２高血圧患者を含む。特に、本開示によって提供される抽出物は、しばしば心筋において発生して筋肉の硬直および心機能の減少をもたらす線維症のような高血圧と関連する終末器官損傷を減少させるのに有用である。
【０１５９】
一部の実施態様では、実施例１〜３において生産されるマスカディンブドウ抽出物、例えば、実施例１に記載の方法に従って製造されるマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）は、ＡｎｇＩＩによって誘導される高血圧を悪化させずに、薬学的に効果的な投与量で、高血圧を有する患者に薬学的に有効量で投与され得る。例えば、ｐ−ＭＧＥは、１日あたり１０〜８０ｍｇの範囲の合計フェノール類／患者質量のｋｇ（１０〜８０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与量で投与され得る。ある場合には、本明細書において図２５に関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、Ａｎｇ−ＩＩによって誘導される高血圧を有する治療された対象およびｐ−ＭＧＥ処置によって治療されない対象において、収縮期血圧の実質的な変化がないことによって示されるとおり、高血圧を悪化させない。別の例では、本明細書において図２６に関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥ治療は、ＡｎｇＩＩによって誘導される体重の減少を悪化させない。これは、Ａｎｇ−ＩＩによって誘導される高血圧を有する治療された対象の重量が、ｐ−ＭＧＥ処置によって治療されない対象と実質的に同一であるという事実によって示される。別の例では、ｐ−ＭＧＥ処置は、本明細書において図２７Ａ〜２７Ｂに関して説明されるように、高血圧患者の心収縮力または左心室再構築に対して効果を有し得ない。ある場合には、本明細書において図２８Ａ〜２８Ｃに関して説明されるように、ＡｎｇＩＩによって誘導される増大された血圧を有する対象へのｐ−ＭＧＥの投与は、ｐ−ＭＧＥによって治療されない対象と比較して、左心室の壁の厚さまたは内径に対して効果を有さない。したがって、本開示の抽出物は、一般に、高血圧を悪化させない。しかしながら、一部の実施態様では、本明細書において図２９Ａ〜２９Ｂに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、ｐ−ＭＧＥによって治療されない対象と比較して、ＡｎｇＩＩによって誘導されるＥ／ｅ’値の増大を防ぐことができる。したがって、一部の実施態様では、ｐ−ＭＧＥは、ＡｎｇＩＩによって誘導される拡張期の機能障害を改善することができる。ある場合には、本明細書において図３１Ａ〜３１Ｂに関して説明されるように、高血圧を有する対象におけるｐ−ＭＧＥの投与は、例えば、左心室における筋細胞の平均断面積（サイズ）を低減させることによって、心臓肥大を低減させ得る。ある場合には、本明細書において図３０Ａ〜３０Ｂに関して説明されるように、ｐ−ＭＧＥの投与は、ＡｎｇＩＩによって仲介されるコラーゲンの増大を弱めることができ、それにより、左心室の剛性を低減させる。ある場合には、ｐ−ＭＧＥ治療は、心筋細胞肥大、拡張期の機能障害を有意に弱めることができ、心臓の間質線維症を減少させることができ、および／または、心筋細胞サイズを減少させることができる。したがって、ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、高血圧と関連する線維症を減少させ得て、具体的には、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合、心臓肥大を９０％〜１００％減少させる。例えば、本開示によって提供される抽出物は、高血圧と関連する線維症を減少させて、具体的には、抽出物を受けない対象と比較して、心臓肥大を少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させる。ある場合には、本開示によって提供される抽出物の投与は、高血圧と関連する線維症を減少させ得て、具体的には、対象の質量（重量）のｋｇあたり２０〜８０ｍｇの合計フェノール類／日の投与量で投与された場合に、コラーゲン産生を６０％〜７０％減少させる。例えば、本開示によって提供される抽出物は、高血圧と関連する線維症を減少させて、具体的には、抽出物を受けない対象と比較して、コラーゲン産生を、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％（または、これらの値の５％内の程度まで）減少させる。
【０１６０】
一部の実施態様では、実施例１〜３によって生産されるブドウ抽出物は、高血圧の治療に効果的な１つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて用いられ得る。前記の１つまたは複数のさらなる薬剤および本明細書に記載の抽出物または製剤は、随伴性、同時、または連続の投与を含む任意の順序で投与され得る。連続の投与は、数日まで空いた時間的に離された順序で投与され得る。当該方法は、前記の１つまたは複数のさらなる薬剤および／または本明細書に記載の抽出物または製剤の単回より多い投与を含んでもよい。１つまたは複数のさらなる薬剤および抽出物または製剤の投与は、同一または異なる経路によるものであってよく、同時または連続であってよい。そのような薬剤の非限定的な例は、利尿剤、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカー、カルシウムチャネルブロッカー、αブロッカー、α−２受容体アゴニスト、αおよびβ−ブロッカーの組み合わせ、中枢アゴニスト、末梢アドレナリン作動性阻害剤、血管ダイレータ（血管拡張剤）、およびβ−ブロッカーを含む。これらの薬剤の投与の仕方の方法および投与量レジメンは、当業者によく知られている。
【０１６１】
一般に、妊娠可能年齢の女性または妊婦へのｐ−ＭＧＥの投与は、実施例７において議論されるように、母親の心血管系機能（収縮機能および心収縮力の心血管系測定を含む）、血圧、体重、または臓器重量、または、子孫の数または長さに関して、母親または子孫の健康全般に悪影響を及ぼさない。
【０１６２】
一態様では、疾患を有する、疾患のリスクが高い、または、再発のリスクがある対象を治療する方法が提供されて、当該方法は、対象に、本開示の先行するセクションに記載の薬学的に有効量のブドウ由来抽出物を投与するステップを含む。ある場合には、当該方法は、液体抽出物または製剤を投与するステップを含む。ある場合には、当該方法は、粉末抽出物または製剤を投与するステップを含む。一部の実施態様では、対象は、粉末抽出物または製剤の投与量を、少なくとも１日に２回投与される。
【０１６３】
一部の実施態様では、投与量あたりの粉末抽出物または製剤の合計フェノール化合物含有量は、約３０〜５０％（ｍｇ／ｍｇ）である。一部の実施態様では、粉末抽出物または製剤の投与量は、約１５０〜５００ｍｇの合計フェノール化合物を含む。
【０１６４】
一部の実施態様では、対象は、ｋｇ体重あたり少なくとも約１０ｍｇの合計フェノール化合物を含む液体抽出物または粉末抽出物の１日の総投与量を投与される。一部の実施態様では、対象は、ｋｇ体重あたり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、または８０ｍｇの合計フェノール化合物を含む液体抽出物または粉末抽出物の１日の総投与量を投与される。一部の実施態様では、投与量あたりの液体抽出物または製剤の合計フェノール化合物含有量は、約２０ｍｇ／ｍＬである。一部の実施態様では、液体抽出物の投与量は、約２．５ｇ〜約３．５ｇの合計フェノール化合物を含む。
【０１６５】
一部の実施態様では、疾患は癌である。一部の実施態様では、抽出物の投与は、癌関連の細胞の増殖または激増、血管新生、炎症、または線維症の少なくとも１つを阻害する。一部の実施態様では、癌は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、膠芽腫、肺癌、皮膚癌、白血病、または、リンパ腫の少なくとも１つを含む。一部の実施態様では、乳癌は、三種陰性乳癌、エストロゲン受容体陽性乳癌、または、ＨＥＲ２過剰発現乳癌の少なくとも１つである。一部の実施態様では、癌は、脳転移乳癌を含む。一部の実施態様では、抽出物は、化学療法剤または放射線療法の少なくとも１つと組み合わせて投与される。
【０１６６】
一部の実施態様では、疾患は、高血圧によって誘導される線維症である。
【０１６７】
一部の実施態様では、疾患は、放射線によって誘導される線維症である。
【０１６８】
一部の実施態様では、疾患は、放射線によって誘導される骨喪失である。これは、骨強度の喪失および／または骨の脆さの増大、カルシウム含有量の低減、および骨質量の減少に反映され得る。
【０１６９】
ここで、本発明の態様は、その態様がより完全に理解および認識され得るように、以下の実施例において、および、添付図面を参照して、特定の好ましい実施態様に関して説明されるが、本発明をこれらの特定の実施態様に制限することを意図しない。それとは対照的に、本出願は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替、改変および等価物をカバーすることが意図される。したがって、好ましい実施態様を含む以下の実施例は、説明される組成物、方法、およびキットの実施を例示する役割を果たし、示される特定のものは、例としてのものであり、好ましい実施態様の例示的な議論の目的のためのみであり、そして、処方手順ならびに本発明の原理および概念的態様の便利かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供する理由で提供されることが理解される。本明細書に記載の発明は、その本質的な属性を逸脱せずに他の特定の形態で実現化され得ることは、当業者に明らかであり、したがって、この実施態様および実施例は、全ての点において、例示であり制限でないと考えられることが望まれて、したがって、前述の説明よりむしろ添付の特許請求の範囲に対してなされる参照、および、特許請求の範囲の意味および等価の範囲内である全ての変更は、その中に包含されることが意図される。
【実施例】
【０１７０】
実施例１：マスカディンブドウ種子およびブドウの皮の液体抽出物および粉末抽出物の生産
（１）３１４ポンドのブドウ種子および５９ポンドの皮を、オープンスチームケトル内に置いた。
【０１７１】
（２）１００ガロンの分画蒸気圧縮蒸留水を、容器内のブドウ種子およびブドウの皮に加えた。
【０１７２】
（３）分画蒸気圧縮蒸留水中のブドウ種子およびブドウの皮を、約１７５華氏〜最高２００華氏で約１時間〜約２時間加熱した。抽出を大気圧で行なった。沸騰はフェノール化合物を破壊させ得て最終抽出物中の全体的な合計フェノール化合物含有量を減少させるので、２００華氏の最高温度は、ブドウ種子、ブドウの皮および水を沸騰させるのを避けるように設定される。加熱のあいだ、さらなる分画蒸気圧縮蒸留水が、合計１４０ガロンの水に到達するまで、１５〜３０分ごとに５ガロンの増加で加えられた。加熱のあいだ、ブドウ種子、ブドウの皮、および分画蒸気圧縮蒸留水の混合物を、へらで撹拌することによってかき混ぜた。オープンスチームケトルを用いたが、所望の量の水およびブドウ種子および皮膚を大気圧で保持することのできる任意の容器が適切であり得る。
【０１７３】
（４）加熱後に、温度は低下されて、ケトルの含有物は約１７０華氏〜約１８０華氏に冷却されて、それから、６００メッシュのステンレススチール篩を通して濾過された。濾液をステンレススチールバレル内に集めた。
【０１７４】
（５）ソルビン酸カリウムを（３）のブドウ種子およびブドウの皮の濾液に０．１％ｗ／ｖまで添加した。
【０１７５】
（６）（５）の濾液を、約３５華氏〜約４０華氏の温度で少なくとも２４時間冷蔵して、それから、１ミクロンフィルターを通して濾過した。有機食品グレードアルコール（９５％）を抽出物の２％（ｖ／ｖ）まで添加して、ブドウ種子およびブドウの皮の液体抽出物を生産した。このプロセスによって形成された液体抽出物を、実施例５に記載の試験において用いた。
【０１７６】
以下のステップを行なって、ブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を生産した。
【０１７７】
（７）液体抽出物を噴霧乾燥によって粉末抽出物に処理した。液体抽出物を、４４インチ×３２インチの乾燥機に導入された噴霧によって微粒子化した。乾燥は、１８，０００〜２２，０００ｃｆｍの流速および約２００〜４００華氏の範囲（例えば、入口温度約４００華氏および出口温度約２００華氏）の温度で、天然ガスを用いて行なった。生じた粉末抽出物は、約３．０〜３．４％の残留水分量を有した。
【０１７８】
このプロセスによって形成された粉末抽出物は、例えば、カプセル化されてよく、または、再構成されて液体を形成してよい。実施例６および７に記載の試験のために、この実施例に記載のように作られた粉末抽出物を、ヒプロメロースカプセル中に処方した。
【０１７９】
室温でヒプロメロースカプセル中に処方された、粉末抽出物の安定性を、３〜６ヶ月にわたって評価した。最初の合計フェノールレベルは３０１．４±１８．０ｍｇ／ｇ（ｎ＝３）であり、３〜６ヶ月後には２９６．６±２２．５ｍｇ／ｇ（ｎ＝３）であった。６ヶ月保管後の微生物汚染の証拠はなかった。
【０１８０】
上述のように生産された液体抽出物の例示的な分析を表１に提供する。分析は、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）；脚注によって以下に記される方法論を用いて行なった。ＮＤは、「検出されず」を意味する。
【表１】
2019511514.tif 000003
【０１８１】
Ｆｔｎｔ１：Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  Ｆｒｕｉｔ  ｉｓ  Ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｅｈａｒｖｅｓｔ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ａｇｒｉ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００７，５５：８２６９−８２７４に従って行われた分析。検出限界：０．０５μｇ／ｍＬ。
【０１８２】
Ｆｔｎｔ２：Ｌｕｉ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｖｅｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｌａｖｏｎｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌｏｗｅｒｓ  ｏｆ  ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ  ｍａｎｉｈｏｔ  ｂｙ  ＨＰＬＣ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．２００９，４７：２０６−２１０に従って行われた分析。
【０１８３】
Ｆｔｎｔ３：Ｕｒｓｋａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅａｎ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｕｂｕｓ  ｅｌｌａｇｉｔａｎｎｉｎｓ  ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｂｙ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈａｎｏｌｙｓｉｓ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００６、５４：４４６９−４４７５に従って行われた分析。
【０１８４】
Ｆｔｎｔ４：Ｈｅｕｄｉ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｖｉｔａｍｉｎｓ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａ−ｖｉｏｌｅｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｏｌｙｖｉｔａｍｉｎａｔｅｄ  ｐｒｅｍｉｘｅｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ２００５，１０７０：４９−５６に従って行われた分析。検出限界：チアミン−０．２μｇ／ｍＬ、ニコチンアミド−０．２μｇ／ｍＬ、ピリドキサミン−０．１μｇ／ｍＬ。
【０１８５】
Ｆｔｎｔ５：Ｃｈｅｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｈｅｒｂｓ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００３，７３：１９−２６に従って行われた分析。
【０１８６】
Ｆｔｎｔ６：Ｓａｎｔａｓａｎｉａ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ  １９４−ＬＣ−ＭＳ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｔｅｃｈｉｎｓ  ｏｎ  Ａｓｃｅｎｔｉｓ（商標）ＲＰ−Ａｍｉｄｅ，２００４に従って行われた分析、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｓｕｐｅｌｃｏで入手可能。
【０１８７】
Ｆｔｎｔ７：Ｃｈｅｎｇ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ（ｐａｌ）ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ  ｆｒｕｉｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｏｒｔｉｃ．Ｓｃｉ．１９９１，１１６（５）：８６５−８６９に従って行われた分析。アントシアニンの結果は、リットルあたりのシアニジン−３−グルコシド（ミリグラム）当量として表される。
【０１８８】
Ｆｔｎｔ８：Ｃｈｅｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｎ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｉｎ  Ｉｘｅｒｉｄｉｕｍ  ｇｒａｃｉｌｅ（ＤＣ．）Ｓｈｉｈ  ｂｙ  Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｇｒａｐｈｙ，Ｊ．ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．２００９，９２：７７３−７７８に従って行われた分析。検出限界：０．１４μｇ／ｍＬ。
【０１８９】
Ｆｔｎｔ９：Ｌｉｎ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ  ｕｓｉｎｇ  ＨＰＬＣ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ＵＶ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００７，８５３：１７５−１８２に従って行われた分析。検出限界：０．１４μｇ／ｍＬ。
【０１９０】
Ｆｔｎｔ１０：Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｌａｖａｎｏｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ  ｉｎ  ｃｏｃｏａ  ａｎｄ  ｃｈｏｃｏｌａｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｇ．Ａ  ２００９，１２１６：４８３１−４８４０によって行われた分析。検出限界：０．９μｇ／ｍＬ。
【０１９１】
上述のように生産された粉末抽出物の例示的な分析を図１Ａ〜１Ｂに示す。粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）を、それが処方されたカプセルから除去した（４４６ｍｇの合計粉末抽出物）。市販される粉砕されたブドウ種子製品（Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｍｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ’ｓ  Ｐｅａｒｌ，Ａｄｖａｎｃｅ  ＮＣ）に対して、比較分析も行われた。合計フェノール類を、没食子酸を標準として用いて、比色Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法の改変を用いて測定した。市販製品由来の粉末および含有物を水中に再懸濁させて、ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズした。図１Ａにおいて、データは、粉末または固体のグラムあたりのフェノール類のｍｇとして表される。ｎ＝３、＊＊は、ｐ＜０．０１を表わる。本開示の粉末抽出物は、粉砕されたブドウ種子を含む市販されるカプセルよりも有意に多いフェノール類を含む。粉末抽出物および市販の粉砕されたブドウ種子カプセル中の、個々のポリフェノール類−カテキン、没食子酸、エピカテキン、エラグ酸、プロシアニジン、およびカテキン−没食子酸（ｃａｔ−ｇａｌｌ）−も、質量分析検出（ＵＰＬＣ−ＭＳ）と組み合わせた島津超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって測定されて、標準に対する比較によって同定された。図１Ｂにおいて、データは、粉末のグラムあたりｍｇとして表される。評価された個々のフェノール化合物は、２つの製品間で同等または本開示の粉末抽出物において実質的に上昇した。
【０１９２】
実施例２：マスカディンブドウ種子抽出物の生産
（１）４５０ポンドのブドウ種子を、オープンスチームケトル内に置いて、１００ガロンの分画蒸気圧縮蒸留水を加えた。実施例１のように、オープンスチームケトルを用いたが、所望の量の水およびブドウ種子および皮を大気圧で保持することのできる任意の容器が適切であり得る。
【０１９３】
（２）分画蒸気圧縮蒸留水中のブドウ種子を、約１７５華氏〜最高２００華氏で約１時間〜約２時間加熱した。沸騰はフェノール化合物を破壊させるので、２００華氏の最高温度は、ブドウ種子および水を沸騰させるのを避けるように設定される。加熱のあいだ、さらなる分画蒸気圧縮蒸留水が、合計１４０ガロンの水に到達するまで、１５〜３０分ごとに５ガロンの増加で加えられた。
【０１９４】
（３）加熱後に、温度は低下されて、水中のブドウ種子は約１７０華氏〜約１８０華氏に冷却されて、それから、６００メッシュのステンレススチール篩を通して濾過された。濾液をステンレススチールバレル内に集めた。
【０１９５】
（４）ソルビン酸カリウムを（３）のブドウ種子の濾液に０．１％ｗ／ｖまで加えた。
【０１９６】
（５）（４）の濾液を約３５華氏〜約４０華氏の温度で少なくとも２４時間冷蔵して、それから、１ミクロンフィルターを通して濾過した。有機食品グレードアルコールを抽出物の２％（ｖ／ｖ）まで加えて、ブドウ種子の液体抽出物を生産した。
【０１９７】
上記の方法を用いて調製されたブドウ種子の液体抽出物は、実施例３に記載の方法を用いて作られたブドウの皮の液体抽出物と組み合わせ（ブレンド）されてよい。実施例２に記載の方法を用いて作られたブドウの皮の液体抽出物およびブドウ種子の液体抽出物の組み合わせ、またはブドウの皮の液体抽出物は、粉末抽出物を生産するために実施例１に記載のように噴霧乾燥されてよく、それは、例えば、カプセル化されてよく、または再構成されて液体を形成してよい。
【０１９８】
実施例３：マスカディンブドウの皮の抽出物の生産
（１）２００ポンドのブドウの皮をオープンスチームケトル内において、１００ガロンの分画蒸気圧縮蒸留水を加えた。実施例１および２のように、オープンスチームケトルが用いられたが、所望の量の水およびブドウの種子および皮を大気圧で保持することのできる任意の容器が適切であり得る。
【０１９９】
（２）ブドウの皮を、約１７５華氏〜最高２００華氏で約１時間〜約２時間、分画蒸気圧縮蒸留水中で加熱した。最高温度の２００華氏は、ブドウの皮および水が沸騰してフェノール化合物を破壊するのを避ける。加熱のあいだ、さらなる分画蒸気圧縮蒸留水が、合計１４０ガロンの水の添加のために、１５〜３０分ごとに５ガロンの増加で添加される。
【０２００】
（３）加熱後、温度を低下させて、水中のブドウの皮を約１７０華氏〜約１８０華氏まで冷却させて、それから、６００メッシュのステンレススチール篩を通して濾過した。濾液をステンレススチールバレル内に集めた。
【０２０１】
（４）ソルビン酸カリウムを、それから、ブドウの皮の濾液に０．１％ｗ／ｖまで添加した。
【０２０２】
（５）濾液を、それから、約３５華氏〜約４０華氏の温度で少なくとも２４時間冷蔵して、それから、１ミクロンのフィルターを通して濾過した。有機食品グレードのアルコールを２％まで添加して、ブドウの皮の液体抽出物を生産した。
【０２０３】
一部の態様では、ブドウの皮の抽出物中の合計フェノール類は、少なくとも約３ｇ／Ｌ〜約８ｇ／Ｌであってよい。
【０２０４】
ブドウの皮の液体抽出物、単独、または実施例２に記載の方法を用いて作られたブドウ種子の液体抽出物の一部と組み合わせ。ブドウの皮の液体抽出物および実施例２に記載の方法を用いて作られたブドウ種子の液体抽出物の組み合わせ、または、ブドウの皮の液体抽出物を、実施例１に記載のように噴霧乾燥して粉末抽出物が生産され得て、それは、例えば、カプセル化されてよく、または再構成されて液体を形成してよい。
【０２０５】
実施例４：公知のマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の抽出物を用いたヒト癌細胞におけるインビトロ試験
この実施例に記載される試験は、本開示に記載のものとは異なる方法によって作られたマスカディンブドウ種子の液体抽出物またはマスカディンブドウの皮の液体抽出物を用いて行なわれた。具体的には、抽出プロセスは加圧容器内で行なわれて、抽出温度は、少なくとも２１２華氏（沸騰）に到達した。
【０２０６】
Ａ．マスカディンブドウ種子およびブドウの皮の抽出物による癌細胞増殖の阻害
活発に増殖しているヒト前立腺、乳房、肺、膠芽腫、結腸、皮膚および白血病細胞−２または３個の異なる細胞株−を、２４ウェルプレートの個々のウェル中に置いて、マスカディンブドウ種子または皮由来の増加する濃度の抽出物によって７日間処理して、抽出物が前立腺癌細胞の増殖を減少させるかどうかを決定した。ブドウ種子および皮の両方とも、抽出物は、ヒト前立腺癌（ＬｎＣａＰおよびＰＣ３細胞；図２Ａ〜２Ｂ）、乳癌（ＺＲ−７５−１エストロゲン受容体陽性乳癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三種陰性乳癌細胞およびＳＫＢＲ３  ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞；図２Ｃ〜２Ｅ）、肺癌（Ａ５４９およびＳＫ−ＬＵ−１細胞；図２Ｆ〜２Ｇ）、膠芽腫（Ｕ８７およびＵ３７３細胞；図２Ｈ〜２Ｉ）、結腸癌（ＨＣＴ１１６およびＨＴ２９細胞；図２Ｊ〜２Ｋ）、皮膚癌（ＳＫＭＥＬ２８およびＲＰＭＩ  ７９５１細胞；図２Ｌ〜２Ｍ）および白血病（ＴＨＰ−１急性ヒト単球性白血病細胞、ＨＬ６０急性ヒト前骨髄球性白血病細胞、およびＫ５６２慢性ヒト骨髄性白血病細胞；図２Ｎ〜２Ｐ）を含む全ての７つのタイプの癌の増殖を減少させた。応答は、用いられた抽出物の投与量に依存し、同様の応答は、ブドウの皮の抽出物と比較したブドウ種子抽出物によって得られた。
【０２０７】
Ｂ．マスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物によるＭＡＰキナーゼ活性の阻害
ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＺＲ−７５−１乳癌細胞を、増加する期間、５０μｇ／ｍＬのマスカディンブドウ種子またはブドウの皮の抽出物とともにインキュベートした。分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ活性を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ由来のホスホ−ＥＲＫ１／ＥＲＫ２に対する抗体を用いたウエスタンブロットハイブリダイゼーションによって、細胞抽出物において定量した。ホスホ−ＥＲＫ活性の低減を、ローディングコントロールとしてβ−アクチンを用いてデンシトメトリーによって計算した。図３Ａおよび図３Ｂにそれぞれ示されるように、マスカディンブドウ種子およびブドウの皮からの抽出物は両方とも、ホスホ−ＥＲＫの有意な減少を生じ、抽出物が増殖を有意に減少させることを示唆した。ブドウの皮の抽出物に対してブドウ種子の応答に有意差はなかった。
【０２０８】
まとめると、実施例４に記載のインビトロの結果は、マスカディンブドウ種子またはマスカディンブドウの皮から単離された抽出物が、前立腺癌、乳癌、肺癌、脳腫瘍（膠芽腫）、結腸癌、および皮膚癌ならびに白血病の細胞の増殖を阻害することを示す。乳癌細胞の増殖の減少は、成長促進タンパク質キナーゼ、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２の活性の低減と関連した。これらの結果は、マスカディンブドウ由来の抽出物が、腫瘍増殖を減少させ得ることを示唆する。
【０２０９】
実施例５：公知の液体マスカディンブドウ抽出物（ｌ−ＭＧＥ）による乳癌および肺癌の予防
この実施例に記載される試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の液体抽出物を用いて行なわれた。この液体抽出物は、以下、「ｌ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２１０】
パートＡ：ｃ−ｎｅｕマウスにおけるｌ−ＭＧＥによる乳房腫瘍形成の予防
マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーターの指揮下の活性化ラットＥｒｂｂ２（ｃ−ｎｅｕ）癌遺伝子が乳腺において特異的に発現された、雌ＦＶＢ−Ｔｇ（ＭＭＴＶ）ＮＫＡＭｕｌ／Ｊトランスジェニックマウス（ｃ−ｎｅｕマウス）は、６〜８月齢までには乳腺腫瘍（ヒト乳癌の同等物）を形成して、乳癌の予防のためのモデルとして用いられ得る。ｃ−ｎｅｕマウスを、３週齢（離乳時）に開始してマスカディンブドウ種子およびブドウの皮由来の液体抽出物（ｌ−ＭＧＥ）によって処置して、腫瘍が触知可能になるとすぐに（２５週齢のとき）、または腫瘍が癒合したとき（３１週齢のとき）に、屠殺した。ｌ−ＭＧＥの投与量は、１日あたり２５グラムのマウスに関しておよそ１．０ｍｇのフェノール類であった（７０ｋｇの男性に関して１日あたりおよそ大さじ１０杯または１４８ｍＬの液体抽出物および２０，０００ｍｇのフェノール類／リットルのｌ−ＭＧＥの平均濃度と同等である）。ｌ−ＭＧＥを飲料水に加えて、１週あたり２回取り替えた。ｌ−ＭＧＥを含む水と比較して、通常の水を受け取るマウスにおいて水または食物摂取の違いはなかった。２５または３１週の屠殺時に、乳房組織を除去して計量して、処置が、乳房腫瘍の増殖を減少させるかどうか決定した。加えて、マウスの総重量を決定して；組織学の後の評価のために心臓および腎臓も除去して計量した。
【０２１１】
１６匹（１６）のマウスを平均２１週間処置して、１８匹（１８）のマウスを平均３１週間処置した（３週齢、離乳時に処置を開始）。２１週齢マウスについては、１０匹のマウスが通常の飲料水（コントロール）を飲み、６匹のマウスがｌ−ＭＧＥを飲み；３１週マウスについては、１０匹のマウスが通常の飲料水（コントロール）を飲み、８匹のマウスがｌ−ＭＧＥを含む水を飲んだ。体重、心臓および腎臓の重量の一般的パラメーターを図４Ａ〜４Ｃ、図５Ａ〜５Ｂ、および図６Ａ〜６Ｂに示す。２５週齢において、処置されたマウスまたは未処置マウスにおいて体重に違いはなかった（図４Ａ）。３１週齢において、ｌ−ＭＧＥと比較して水を飲んでいるマウスの合計体重に有意差があった（図４Ｂ）。しかしながら、これは、マウスにおける大きいサイズの腫瘍に起因した；腫瘍なしの３１週齢マウスの重量に違いはなかった（図４Ｃ）。２５または３１週齢において、水を飲んでいるマウス（コントロール）またはｌ−ＭＧＥを飲んでいるマウスの心臓重量または腎臓重量には、図５Ａ〜５Ｂ、および図６Ａ〜６Ｂにそれぞれ示されるように、有意差はなかった。処置中、マウスの食事または飲料の習慣に変化はなく、体重、心臓または腎臓重量の肉眼的変化がないことと一致した。これらの結果は、ｌ−ＭＧＥによる処置がマウスによって十分に許容されたことを示唆する。
【０２１２】
腫瘍は、雌ｃ−ｎｅｕマウスの乳腺組織全体を通じて進行して、およそ２５週齢までには触知可能であった。２５週齢ｃ−ｎｅｕマウスにおける個々の乳腺腫瘍を数えて、除去して計量して、合計腫瘤を決定した。未処置の２５週齢ｃ−ｎｅｕマウスの乳腺組織には平均１１．８±２．１の腫瘍が存在し、一方で、腫瘍の数は、ｌ−ＭＧＥによって治療されたマウスの乳腺組織において５．４±０．９ｍまで減少して、図７に示されるように、５４％（ｐ＝０．０３２７）の減少であった。２５週例の未処置マウス由来の集められた腫瘍は１．３±０．３ｇの重量であり、一方で、ｌ−ＭＧＥによって治療された２５週齢マウス由来の集められた腫瘍は平均０．３±０．０８ｇの重量であって、図８Ａに示されるように、７７％の減少（ｐ＝０．０１３２）であった。３１週齢ｃ−ｎｅｕマウスにおける乳腺腫瘍が癒合して、合計腫瘤を除去および計量した。腫瘤は、ｌ−ＭＧＥによって処置された３１週齢ｃ−ｎｅｕマウスにおいても、平均９．２±１．２ｇから平均３．６±１．４ｇまで減少して、図８Ａに示されるように、６１％の減少（ｐ＝０．００１２）であった。このことは、ｌ−ＭＧＥが、乳房腫瘍の多重度および腫瘍負荷の両方を著しく減少させたことを示唆する。
【０２１３】
２５週齢で屠殺されたマウス由来の乳腺組織を、４％ホルマリン中に固定して、パラフィン包埋して、免疫組織化学分析のために５ミクロン切片に切断した。切片を、細胞増殖の尺度としてＫｉ６７に対する抗体とともにインキュベートした。図９に示されるように、ｌ−ＭＧＥを飲んだ２５週齢マウス由来の腫瘍は、未処置マウスと比較して増殖性細胞の数が有意に低減した。Ｋｉ６７に関して染色された細胞の数は、ｌ−ＭＧＥによって処置されたマウス由来の切片において領域あたり２．９±１．０細胞であるのに比較して、未処置マウス由来の切片において領域あたり６．８±１．４であり、５７％の減少であった（ｐ＝０．３８４）。これらの結果は、ｌ−ＭＧＥが細胞増殖を減少させることを示し、培養された乳癌細胞で観察された細胞数の減少と一致する。
【０２１４】
２５週齢で屠殺されたｃ−ｎｅｕマウス由来の乳腺組織の切片も、活性ＥＲＫ１／２ＭＡＰキナーゼ活性の尺度としてホスホ−ＥＲＫ１／２に対する抗体とともにインキュベートした。図１０に示されるように、リン酸化ＥＲＫ１／２は、ｌ−ＭＧＥによって処置されたｃ−ｎｅｕマウスにおいて、未処置マウス由来の組織での１０．５±３．１％から、２．９±０．９％に有意に減少して（ｎ＝７〜１２、ｐ＝０．０３７５）、７２％の減少であった。ＥＲＫ１／２は、活性化の際に自己リン酸化されるので、リン酸化ＥＲＫ１／２の減少は、ｌ−ＭＧＥによって処置されたマウスの腫瘍組織における増殖性ＭＡＰキナーゼ活性の低減を示す。
【０２１５】
通常の水（コントロール）またはｌ−ＭＧＥを飲んでいるｃ−ｎｅｕマウス由来の腫瘍切片を、内皮細胞マーカー、ＣＤ３４に対する抗体とともにインキュベートして、形態学および陽性ＣＤ３４免疫反応性の組み合わせによって血管を同定した。図１１に示されるように、ｌ−ＭＧＥを飲んでいるマウス由来の腫瘍は、未処置マウス由来の組織での５．７±０．６血管／領域から、３．６±０．６血管／領域に、通常の水を飲んでいるマウスよりも少ない血管を有し（ｎ＝７〜１２、ｐ＝０．０２２６）、３７％の減少であった。このことは、ブドウ抽出物が血管新生を阻害することを示唆する。
【０２１６】
間質腫瘍性線維症を、ｃ−ｎｅｕマウス由来の乳房腫瘍組織切片において定量化して、ピクロシリウスレッド、非特異コラーゲン染色によって染色した。コラーゲン反応産物は、コントロールと比較してｌ−ＭＧＥ投与によって著しく減少した（図１２）。ピクロシリウスレッド染色の相対量を定量化して、腫瘍内のコラーゲン量を領域あたりの線維症％として表した。ＭＧＥによる処置は、コントロールマウス由来の腫瘍における領域あたり２．７±０．７％線維症から、ｌ−ＭＧＥによって処置されたマウスの腫瘍における領域あたり０．１±０．０５％線維症まで、９０％よりも多く間質線維症を減少させて（ｎ＝７〜１２、ｐ＝０．０００５）、抽出物が乳房腫瘍において癌関連の線維症を減少させることを示した。合わせると、これらの試験は、ｌ−ＭＧＥが、乳房腫瘍の負荷および多重度の両方を、増殖、血管新生および線維症の低減を通して減少させることを示唆して、マスカディンブドウ由来の抽出物が、乳癌の予防のための新規の機能性食品を代表し得ることを示唆する。
【０２１７】
まとめると、ｌ−ＭＧＥによるｃ−ｎｅｕマウスの処置は、増殖性マーカーＫｉ６７、成長促進タンパク質キナーゼ活性、血管の数および組織線維症の減少を伴って、腫瘍負荷および多重度を減少させた。これらの結果は、マスカディンブドウ由来の抽出物が、乳癌を予防し得ることを示唆する。
【０２１８】
パートＢ：ｃ−ｎｅｕマウスにおけるｌ−ＭＧＥによる肺腫瘍形成の予防
発生中の胎児は、飲食物およびタバコの煙中の環境発癌物質の発癌性効果、焼成食品、および、経胎盤性の曝露後の空気汚染に非常に敏感である。母体および胎児の組織の両方による毒性物の酸化代謝は、ＤＮＡ損傷を引き起こし、小児癌の始まりを最終的にもたらし得る。癌形成の潜伏に起因して、発癌物質に対する子宮内曝露は、晩年に発生する癌にさえ個々をかかりやすくさせ得る。ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交尾させて、環境毒物に対する子宮内曝露に関するモデルとして用いた。妊娠マウスを、オリーブ油に溶解させた４５ｍｇ／ｋｇ投与量の３−メチルコラントレンの腹腔内注入によって、懐胎の１７日目に処置して、胎児において肺腫瘍を誘導した。オリーブ油ビヒクルの注入（０．５ｍＬ／０．３５ｋｇ）をコントロールとして用いた。０日目は、腟栓が検出された場合、１日目として考えた。離乳後、マウスのコホートは、飲料水単独またはｌ−ＭＧＥを含む水（およそ１．０ｍｇフェノール類／２５ｇマウス）を受け取り、１２月齢で屠殺された。
【０２１９】
全てのマウスが肺腫瘍を発生したが、腫瘍多重度は、図１３Ａ〜１３Ｂに示されるように、ｌ−ＭＧＥによって処置された動物と比較して、コントロールマウスにおいてより高かった（４．２±０．５の合計腫瘍に対して、６．８±０．４の合計腫瘍、ｎ＝２６〜３２、ｐ＝０．０００１）。ｌ−ＭＧＥは、図１４Ａ〜１４Ｂに示されるように、通常の水を飲んでいるコントロールマウスにおいて見られる合計腫瘍組織と比較して、雌マウスにおいて、合計腫瘍負荷も、およそ４８％有意に減少させた（１２．４±１．９ｇ対６．５±１．２ｇ、ｎ＝２６〜３２、ｐ＝０．０１４）。これらの結果は、ｌ−ＭＧＥが、３−メチルコラントレンに子宮内で曝露されたマウスの雌の子孫において肺腫瘍の多重度および負荷の両方を減少させることを示唆する。
【０２２０】
１年後に屠殺された雌マウス由来の肺組織を、４％ホルマリン中に固定して、パラフィン包埋して、免疫組織化学分析のために５ミクロンの切片に切断した。切片を、細胞増殖の尺度として増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に対する抗体とともにインキュベートした。図１５に示されるように、ｌ−ＭＧＥを投与されたマウス由来の腫瘍組織切片は、コントロール動物由来の腫瘍と比較してＰＣＮＡが有意に低減して（２２．４±１．８対１４．２±１．３、ｐ＝０．０００９）、ｌ−ＭＧＥは、腫瘍細胞増殖を低減させることよって、部分的に腫瘍付加を減少させることを示唆した。通常の水またはｌ−ＭＧＥを飲んでいる雌マウス由来の肺腫瘍切片を、内皮細胞マーカー、ＣＤ３４に対する抗体とともにインキュベートして、血管を形態学および陽性ＣＤ３４免疫反応性の組み合わせによって同定した。ｌ−ＭＧＥによる処置は、図１６に示されるように、通常の水を飲んでいる雌マウスと比較して、肺腫瘍組織における血管密度を有意に減少させて（２０．５±２．２対１１．３±１．３、ｐ＝０．００１２）、ブドウ抽出物が血管新生を阻害することを示した。
【０２２１】
まとめると、これらの結果は、ｌ−ＭＧＥは、母親が子宮において化学発癌物質によって処置されて子孫が肺癌を発症しやすくされた雌マウスにおいて、腫瘍負荷および多重度、増殖性マーカーＰＣＮＡ、および血管数を減少させることを示す。これらの結果は、マスカディンブドウから単離された抽出物が、環境毒物への子宮内曝露によって誘導される肺腫瘍の予防のための新規の機能性食品を代表し得ることを示唆する。
【０２２２】
実施例６：齧歯類におけるマスカディンブドウ粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の毒性評価
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２２３】
ｐ−ＭＧＥに対する齧歯類毒性試験の第一目標は、副作用を引き起こさない、または、生命を危うくする投与量の範囲を特定することであった。ｐ−ＭＧＥに対する毒性試験は、マウスにおいて行なわれて、マウスの健康全般ならびにそれらの心臓、肝臓、肺および腎臓に対する抽出物の効果を評価した。
【０２２４】
雄Ｃ５７黒マウス（８週齢）を、飲料水単独（コントロール）または合計フェノール類の測定によって決定されたｐ−ＭＧＥの合計フェノール含有量に基づいて４つの上昇する投与量で飲料水中のｐ−ＭＧＥを受け取る群にランダム化した。マウスの日々の観察は、重量喪失（急激または累進的な重量喪失）、衰弱性下痢、脱水または減少した皮膚弾力、浮腫、かなり大きな腹部の拡大または腹水、進行性の皮膚炎、身づくろい不足に起因する荒い被毛または乱れた外観、痛みを示す丸まった姿勢、欲求欠如に起因する無気力または持続的な横臥位（ｄｅｃｕｍｂｅｎｃｙ）、咳、努力呼吸、鼻汁、黄疸、チアノーゼ、蒼白／貧血、不適当なヘッドキャリッジまたは頭の振りによって示される神経学的兆候、任意のオリフィスからの出血、または、日々の活動（例えば、飲食、歩行、または排泄）を妨げる任意の状態の評価を含んだ。屠殺する前に、マウスを代謝ケージに２４時間置いて、食物摂取および糞便産生を測定して、尿を採取して腎臓損傷のマーカーを定量した。処置の４週目のあいだに、覚醒マウスにおいて血圧をテールカフ・プレチスモグラフィーによって決定して、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔したマウスにおいて非侵襲性の小動物ＶＥＶＯ超音波イメージングシステムをＭおよびＢモードで用いて心臓機能を評価して、駆出率、短縮率、一回拍出量、心拍数および心拍出量を測定または計算した。マウスを処置の１ヶ月後に屠殺して；組織（心臓、腎臓、肺、肝臓、脾臓および脳）を計量して、４％ホルマリン中に固定して、パラフィン包埋して、５ミクロンで切断して、我々の施設の動物資源プログラムにおける獣医病理学者による分析のためにヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色して、任意の全般的な構造上の異常を評価した。
【０２２５】
４つの濃度のｐ−ＭＧＥが試験された。試験される濃度の範囲は、ｌ−ＭＧＥによって慢性的に処置されたｃ−ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける乳房腫瘍の数およびサイズの有意な減少および実施例５に上述の肺癌の経胎盤性モデルにおける肺腫瘍のサイズおよび数の同様の減少を示す以前の試験に基づいた。これらの試験では、１日あたりのマウスあたりの液体マスカディンブドウ抽出物中の１ｍｇのフェノール類の毎日の濃度が、腫瘍の多重度および投与量を減らすのに効果的であった。マウスにおける毒性試験に関して、試験されたｐ−ＭＧＥの４つの投与量は、０．２５、０．５、１．０および２．０ｍｇフェノール類／マウス／日であり、マウスにそれらの飲料水中に投与された。この月齢の平均的なマウスは、およそ２５ｇまたは０．０２５ｋｇの重量であるので、これは、１０、２０、４０および８０ｍｇフェノール類／ｋｇ／日の投与量範囲に相当する。
【０２２６】
４つの投与量でのｐ−ＭＧＥの４週の投与のあいだ、下痢、脱水、浮腫、腹部の拡大、被毛の喪失、減少した毛づくろい、または低減したレベルの活性、欲求、飲料または呼吸の観察はなかった。蒼白（ｐａｌｏｒ）、黄疸またはチアノーゼまたは不快感（不適当なヘッドキャリッジまたは頭の振り）の任意の神経的兆候の示度はなかった。いかなるオリフィスからも出血または漏出はなかった。これらの結果は、マウスが、それらの正常な毎日の活動または健康に影響する任意の病理からフリーであったことを示唆する。
【０２２７】
マウスを処置期間の終わりに計量して、合計体重に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定した。より低い３つの濃度のｐ−ＭＧＥで処置されたマウスの体重に効果はなかったが、最も高い濃度のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの平均体重は、未処置のコントロール群と比較してわずかに減少した（図１７）。しかしながら、処置の最後の週の間に測定して、未処置マウスと比較して、食物摂取（図１８Ａ）、糞便産生（図１８Ｂ）または尿容量（図１８Ｃ）に効果はなく、飲食行動に対するｐ−ＭＧＥの効果をほとんど示唆しなかった。
【０２２８】
屠殺のときに、様々な臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および脳）を除去して計量して、それぞれの投与量のｐ−ＭＧＥによって処置したマウスの臓器重量を、未処置のコントロール群と比較した。それぞれの臓器の一部をホルマリン中に固定して、切断して、獣医病理学者による評価のためにＨ＆Ｅで染色した。
【０２２９】
屠殺のときに、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓および脳（皮質、小脳、視床下部および脳幹内の領域）の切片を除去して計量して、それぞれの投与量のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの臓器重量を、未処置のコントロール群と比較した。切片を４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定して、７０％エタノール中に２日間置いて、パラフィン包埋して、５ミクロンで切断して、Ｈ＆Ｅで染色した。スライドは、動物資源プログラムの病理学部門に提出されて、獣医病理学者によって盲検様式で試験された。試験の結果を以下の表２に作り、以下に要約する。図１９に代表的な画像も提供する。
【０２３０】
【表２】
2019511514.tif 000004
【０２３１】
全ての処置群内のマウスの心臓は、正常範囲内であるようだった；コントロールマウスの１つの心臓は、血管周囲リンパ球を有した。コントロール群および全ての治療群内のマウスの肺は、異常な肺病変を有する最も低い濃度のｐ−ＭＧＥで処置された群内の１匹のマウスを除いて正常範囲内であった。マウスの肝臓の大部分は正常であるようだったが、全ての群内のマウスは、コントロール群内のマウスでさえ、ある程度の髄外造血を有した；このタイプの造血はマウスの肝臓では珍しいことではない。加えて、一部のマウスは、ある程度まで生理学的であり損傷の示度でない肝臓の糖原病を有した。マウスの脾臓は一般に正常範囲内であり、最も高いｐ−ＭＧＥ処置群内の１匹のマウスは、いくらかの髄外造血を有した。マウスの脳の異なる領域が試験されて、一般に正常範囲内であったが、２匹のマウスは、それらの位置およびサイズから正常な神経機能を妨げ得る偶発的な良性過誤腫であると考えられる類表皮嚢胞（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ  ｃｙｓｔｓ）を有し；しかしながら、サイズの増大の遅さが占拠性病変（ｓｐａｃｅ−ｏｃｃｕｐｙｉｎｇ  ｍａｓｓ）の存在に対する神経系による適合および補償を可能にするので、これらは、通常は臨床上サイレントである。
【０２３２】
図２０に示されるように、増大する投与量のｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの心臓の重量に違いはなく、表２および図１９に示されるように、心臓の構造に対するいかなる効果もなかった。また、血圧も、治療およびコントロールマウス間で同様であった（図２１）。未処置マウスの心臓のうちの１つは血管周囲リンパ球を有したが、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウス由来の心臓は全て正常範囲内であった。心臓のパラメーター−駆出率、短縮率、心拍出量、一回拍出量および心拍数−は、全て、未処置のコントロールマウスと比較して、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスで同様であった（図２２Ａ〜２２Ｅに示される）。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、心臓または血管系の構造または機能に対して効果がなかったことを示唆する。
【０２３３】
未処置のコントロールマウスと比較して、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの肺の重量に違いはなく（図２３Ａ）、肺の構造は、異常な肺病変を有した最も低いｐ−ＭＧＥ治療群内の１匹のマウスを除いて、全て正常範囲内であった（表２を参照）。呼吸に対する抽出物のいかなる観察可能な効果もないことと組み合わせて、これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、肺の構造または機能に効果がなかったことを示唆する。
【０２３４】
２つの最も低いｐ−ＭＧＥ（０．２５および０．５ｍｇフェノール類／マウス／日）および最も高いｐ−ＭＧＥ（２．０ｍｇフェノール類／マウス／日）濃度で処置されたマウスの肝臓の重量は、未処置マウスの肝臓の重量と異ならなかった。しかしながら、１．０ｍｇフェノール類／マウス／日でのマウスの肝臓の重量は、コントロールと比較してわずかに増大した（図２３Ｂ）。マウスの肝臓の大部分は、正常な構造を有するように見えたが、全ての群内のマウスは、コントロール群でさえ、ある程度の髄外造血を有した；病理学者は、このタイプの造血はマウスの肝臓では珍しいことではないと示した（表２を参照）。加えて、一部のマウスは肝臓の糖原病を有し、病理学者はそれを、生理学的であり損傷の示度ではないと示した。
【０２３５】
マウスの腎臓を計量して、未処置マウスと比較して、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの腎臓重量に違いはなかった（図２３Ｃ）。上述のように、図１８Ｃに示されるように尿容量に違いはなかった。尿アルブミンおよび尿アンギオテンシノーゲン（Ａｏｇｅｎ）を測定して腎機能を評価して、それらの値を尿クレアチニンの機能として表した。腎機能の尺度として、未処置マウスと比較して、増加する濃度で４週間処置されたマウスの尿中の尿アルブミンの量に違いはなく（図２４Ａ）、同動物の糸球体または尿細管におけるいかなる病理のないことと一致した（表２）を参照。加えて、未処置および処置されたマウス間で尿Ａｏｇｅｎの量に違いはなく（図２４Ｂ）、ｐ−ＭＧＥは腎臓を傷つけないことを示唆し、病理学によって評価されたように腎臓糸球体および尿細管における病理がないことと一致した（表２を参照）。
【０２３６】
ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの脾臓重量は、未処置のコントロールマウスと有意に異ならず（図２３Ｄ）、マウスの脾臓は一般に正常範囲内であり、最も高いｐ−ＭＧＥ処置群内の１匹のマウスは、いくらかの髄外造血を有した（表２を参照）。
【０２３７】
ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの脳の重量は、未処置マウスと有意に異ならなかった（図２３Ｅ）。脳を４つの領域−皮質、小脳、視床下部および脳幹−に分けて、それぞれ獣医病理学者によって試験された。試験された全ての脳領域は正常範囲内であったが；２匹のマウスは、それらの位置およびサイズから正常な神経機能を妨げ得ると病理学者が示す偶発的な良性過誤腫であると考えられる類表皮嚢胞を有したが、サイズの増大の遅さが占拠性病変の存在に対する神経系による適合および補償を可能にするので、これらは、通常は臨床上サイレントである（表２を参照）。
【０２３８】
まとめると、これらの結果は、０．０５、０．１、０．２および０．４ｍｇフェノール類／ｍＬ／日のｐ−ＭＧＥの投与量によるマウスの４週の処置は、体重、臓器重量（心臓、肺、肝臓、腎臓、脳または脾臓）または構造、心機能および血圧、または腎機能に対して効果がなかったことを示す。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、試験された投与量でマウスによって十分に許容されたことを示唆する。
【０２３９】
マウスにおいて毒性試験のために用いられたｐ−ＭＧＥの投与量は、０．０５、０．１、０．２および０．４ｍｇフェノール類／ｍＬ／日であった。マウスは、およそ５ｍＬ／日を飲むので、これは、それらの飲料水中でマウスに投与された試験されたｐ−ＭＧＥの投与量が、０．２５、０．５、１．０および２．０ｍｇの合計フェノール類／マウス／日であったことに相当する。この月齢の平均的なマウスは、およそ２５ｇまたは０．０２５ｋｇの重量であるので、これは、１０、２０、４０および８０ｍｇの合計フェノール類／ｋｇ／日の範囲の投与量に相当する。ヒト成人患者に関して７０ｋｇの平均質量に基づいて、これは、ヒト成人に関して７００、１４００、２８００、および５６００ｍｇのフェノール類／日の投与量の範囲に対応する。ｐ−ＭＧＥカプセルは１６２ｍｇの合計フェノール類／カプセルを含むので、これは、５、１０、２１および４２カプセル／日を摂取することに対応する。マウスを治療するために用いられたフェノール類の量、および、これらの投与量で毒性がないことは、対応する数のカプセル中のフェノール類の量が、患者によって十分に許容されること示唆する。
【０２４０】
実施例７：妊娠に対するｐ−ＭＧＥの効果
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２４１】
妊娠ラットをｐ−ＭＧＥで処置して、母親およびそれらの子孫の両方の健康に対する抽出物の効果を測定して、妊娠可能年齢の女性および妊娠した母親へのｐ−ＭＧＥの投与の安全性を決定した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、交尾の１週前およびそれらの妊娠の時間全体を通して、ｐ−ＭＧＥ（それらの飲料水中、０．２ｍｇ／ｍＬ）を投与した。懐胎の１９日目に（ラットの通常の妊娠は２１日である）、妊娠ラットをＶＥＶＯ  ２１００でスキャンして、子宮および臍部の血流を測定して、心血管系の機能を決定した。ラットを代謝ケージ内に置いて、尿排泄作用、食事および水分の取り込みを、母体健康としての測定として測定した。懐胎の２１日目に、妊娠ラットの血圧を測定してラット／子ラットを屠殺して、子ラットの数、子ラットの重量および子ラットの健康を測定した。
【０２４２】
ｐ−ＭＧＥをそれらの飲料水中に投与された妊娠した母親の心臓の健康を、心臓の超音波によって評価した。通常の水を飲んでいる妊娠ラットと、妊娠した母親を比較して、心収縮力および収縮機能（一回拍出量、駆出率、短縮率または心拍出量）のパラメーターに対する、ｐ−ＭＧＥの効果はなかった。臍静脈を通る血流として測定された、成長中の子に対する血流にも効果がなかった。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、妊娠した母親の心血管系の健康を損なわないことを示唆する。妊娠した母親を懐胎の１０〜２０日目に代謝ケージ内に２４時間置くことによって測定された食事または水分の取り込みまたは尿容量に対しても、ｐ−ＭＧＥ処置の効果はなかった。テールカフ・プレチスモグラフィーによって測定された血圧も、通常の水またはｐ−ＭＧＥを飲んでいる妊娠ラットで異ならなかった。母親の様々な臓器（膵臓、肝臓、脾臓、肺、脳、心臓および腎臓）の重量は、通常の水またはｐ−ＭＧＥを飲んでいる妊娠した母親で異ならなかった。最後に、コントロールと比較して、ｐ−ＭＧＥを投与された母親からの子の長さ、または、ｐ−ＭＧＥを飲んでいる親に生まれた子の数に、違いはなかった。
【０２４３】
まとめると、これらの結果は、妊娠可能年齢の女性または妊婦へのｐ−ＭＧＥの投与は、母親の心血管系の機能、血圧、体重、または臓器重量、または、子の数または長さに関して、母親またはそれらの子孫の健康全般に負の影響を及ぼさないことを示唆する。子の内臓組織学的分析は、進行中である。
【０２４４】
実施例８：ＡｎｇＩＩによって誘導される高血圧に対するｐ−ＭＧＥの効果
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２４５】
高血圧および高血圧によって誘導される心臓損傷に対するｐ−ＭＧＥの効果を、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）によって誘導される高血圧を有するラットにおいて測定した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（雄、８〜１２週齢）を、通常の飲料水（コントロール）、ｐ−ＭＧＥ単独（それらの飲料水中に０．２ｍｇ／ｍＬの合計フェノール類）、ＡｎｇＩＩ単独（埋め込まれた浸透圧ミニポンプを介して２４μｇ／ｋｇ／ｈ）、または、ｐ−ＭＧＥおよびＡｎｇＩＩによって、４週間処置した。２５０ｇラットについて、この量のｐ−ＭＧＥは、およそ２０ｍｇフェノール類／ｋｇ／日に相当する。ｐ−ＭＧＥの投与は、ＡｎｇＩＩによる処置の１週間前に開始された。血圧を、同一の個体によって同じ時刻に、テールカフ・プレチスモグラフィーによって毎週記録した。イソフルランによって鎮静されたラットにおいて、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ２１００  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを２１ＭＨｚ周波数変換で用いて心エコー検査を行なった。心臓パラメーターを定量化するためのスキャンを、中央−乳頭レベルでＭモード傍胸骨短軸像において、組織ドップラーを、４チャンバービューにおいて僧帽弁輪で、および、脈波ドップラーを、４チャンバービューにおいて取得して、経僧帽弁流入を測定した。
【０２４６】
通常の水を飲んでいるラットの収縮期血圧は、４週の処置期間にわたって変わらなかった（ベースラインで１１８．６±２．４ｍｍＨｇおよび４週で１２３．１±２．３ｍｍＨｇ）。ＡｎｇＩＩによるインフュージョンは、収縮期血圧を、４週の期間にわたって１２０．４±２．４ｍｍＨｇから２１３．１±６．８ｍｍＨｇに有意に増大させた。飲料水へのｐ−ＭＧＥの添加は、図２５に示されるように、ＡｎｇＩＩによる処置を伴うまたは伴わないラットにおいて、４週の処置にわたって収縮期血圧を変えなかった。４週の処置の終わりに、ラットを計量して、ｐ−ＭＧＥが体重に対して有するかどうか決定した。ＡｎｇＩＩは４週の処置期間にわたって体重を減少させたが、ｐ−ＭＧＥは、図２６に示されるように、ＡｎｇＩＩの不存在または存在において体重に対して効果がなかった。屠殺のときに、心臓を除去して計量して、脛骨を解剖して測定して、心臓肥大の全体測定として心臓重量／脛骨長を決定した。いかなる処置群においても心臓重量／脛骨長に違いはなかった（データ示さず）。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥによる処置が、ＡｎｇＩＩによって誘導される高血圧またはＡｎｇＩＩによって誘導される体重の減少を悪化させないことを示す。
【０２４７】
心臓の駆出率および短縮率を、収縮機能の尺度として、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｖｅｖｏ  ２１００  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて中央−乳頭レベルでＭモード傍胸骨短軸像において測定した。図２７Ａ〜２７Ｂに示されるように、心臓の駆出率も短縮率も、正常血圧のラットと比較して、高血圧を有するラットにおいて異ならなかった。加えて、正常血圧または高血圧ラットの心臓の駆出率または短縮率に対するｐ−ＭＧＥの効果はなかった。このことは、ＡｎｇＩＩもｐ−ＭＧＥも、心収縮力に対して効果がないことを示唆する。
【０２４８】
左心室の再構築に対するｐ−ＭＧＥの効果を測定するために、左心室の後方壁の厚さ、拡張期の終わりの左心室の直径、および、左心室の壁の厚さを、ｐ−ＭＧＥによる４週の処置後に、中央−乳頭筋のレベルでＭモード傍胸骨短軸像を用いて正常血圧およびＡｎｇＩＩ依存性高血圧ラットにおいて測定した。図２８Ａ〜２８Ｃに示されるように、ＡｎｇＩＩは、左心室の後方壁の厚さ、ならびに、相対的な壁の厚さを増大させたが（パネルＡおよびＣ）、左心室の直径を低減させて（パネルＢ）、ＡｎｇＩＩまたはＡｎｇＩＩ依存性の血圧の増大が、左心室の肥大を引き起こして、壁の厚さを増大させて、心室の空洞を減少させることを示唆した。ｐ−ＭＧＥの同時投与は、正常血圧または高血圧ラットにおいて、壁の厚さまたは左心室の内径に効果がなかった。これらの結果は、ＡｎｇＩＩは左心室再構築を引き起こすが、ｐ−ＭＧＥの同時投与は左心室再構築を悪化も減少もしないことを示唆する。
【０２４９】
拡張期の機能をｅ’として測定して、左心室の弛緩を評価して、Ｅ／ｅ’を測定として、左心室の充填圧力を評価した。図２９Ａ〜２９Ｂに示されるように、ＡｎｇＩＩによる４週の処置は、ｅ’を減少させて、ＡｎｇＩＩまたはＡｎｇＩＩによって仲介される血圧増大は、左心室が拡張期中に弛緩する能力を減少させることを示唆した。ｐ−ＭＧＥによる処置は、ｅ’の減少を防ぐ傾向にあるが、結果は統計的有意性に到達しなかった。しかしながら、Ｅ／ｅ’は、ＡｎｇＩＩによる処置によって有意に増大して、Ｅ／ｅ’の増大は、ｐ−ＭＧＥの同時投与によって防止された。これらの結果は、ＡｎｇＩＩが拡張期の機能障害を引き起こすこと、および、ｐ−ＭＧＥの同時投与がＡｎｇＩＩによって誘導される拡張期の機能障害を改善することを示す。
【０２５０】
処置されたラットの心臓切片を、ホルマリン中に固定して、パラフィン包埋して、５ミクロンの切片に切断した。それぞれの心臓由来の切片をピクロシリウスレッドによって染色して、合計コラーゲン沈着を同定した。図３０Ａ〜３０Ｂに示されるように、ＡｎｇＩＩは、代表的な画像における赤染色の増大として示されてグラフにおいて定量化されるように、間質線維症の量を増大させた。ｐ−ＭＧＥによる同時投与は、ＡｎｇＩＩによって仲介されるコラーゲンの増大を弱めて、左心室の剛性を低減させる合計コラーゲン染色を減少させた。これは、抽出物が心室の剛性を低減させて拡張期の機能障害を減少させる能力の原因となり得る。
【０２５１】
処置されたラットの心臓切片を、小麦胚芽アグルチニンに対する抗体によっても染色して、個々の心筋細胞の細胞膜の輪郭を描いた。それから、図３１Ａ〜３１Ｂに示されるように平均断面積（ＭＣＳＡ）を決定した。ＡｎｇＩＩまたはＡｎｇＩＩによって仲介される高血圧は、左心室内の筋細胞のＭＣＳＡを増大させて、心臓肥大を引き起こした。ｐ−ＭＧＥの同時投与は、ＡｎｇＩＩによって仲介される筋細胞領域の増大を有意に弱めて、ｐ−ＭＧＥが心筋細胞肥大を減少させることを示した。心臓肥大におけるこの低減は、ｐ−ＭＧＥが拡張期の機能障害を減少させる能力にも寄与し得る。
【０２５２】
まとめると、これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、ＡｎｇＩＩによって誘導される高血圧および心臓損傷を悪化させないことを示す。さらに、抽出物は、心臓の間質線維症および心筋細胞サイズの減少を伴って、拡張期の機能障害を有意に弱めた。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、高血圧を有する患者において安全に用いられること、および、高血圧によって誘導される線維症および拡張期の機能障害から心臓を保護し得ることを示唆する。
【０２５３】
実施例９：乳房腫瘍におけるマスカディンブドウ種子および皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）の有効性
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２５４】
乳房腫瘍増殖に対するｐ−ＭＧＥの有効性を、増大する投与量でｐ−ＭＧＥによって処置された雌マウスにおいて腫瘍増殖を測定することによって決定した。無胸腺マウス（雌、１５〜２０ｇ、５〜６週齢）の第４鼠径部乳腺パッドに、３×１０６の活発に増殖しているＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト三種陰性乳癌細胞（マトリゲル中に５０：５０で懸濁される）を注入した。マウスは、１２時間の明暗サイクルでＨＥＰＡ濾過空気とともにケージ内に閉じ込められて、通常のラット固形飼料を適宜供給された群である。腫瘍サイズを、カリパスを用いて、意識のある動物において１週間に２回測定して、半楕円（４／３πｒ３）／２）］に関する式を用いて腫瘍体積を計算した。腫瘍が１００ｍｍ３のサイズに到達したときに、飲料水中に０．０５、０．１、０．２、または０．４ｍｇフェノール類／ｍＬのｐ−ＭＧＥによる処置のためにマウスを無作為化して（２５ｇマウスに関して０．２５、０．５、１および２ｍｇフェノール類／マウス／日の投与量に対応する）；コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。４週の処置後に、マウスを屠殺して腫瘍を計量した。
【０２５５】
無胸腺マウスにおいて増殖しているヒト三種陰性乳房腫瘍の体積は、４週の期間にわたって増大した。ｐ−ＭＧＥによる処置は、腫瘍体積の用量依存的な減少を引き起こし、それは、図３２Ａに示されるように、４週の処置後に、全ての４つの試験された投与量においてコントロールマウスと有意に異なった。腫瘍の重量も、図３２Ｂに示されるように、通常の水を飲んでいるマウス（コントロール）と比較して、投与量依存的に減少した。
【０２５６】
ｐ−ＭＧＥによる腫瘍増殖の減少に関するメカニズム（単数または複数）を同定するために、処置されなかった腫瘍（コントロール）および０．１ｍｇフェノール類／ｍＬによって処置された腫瘍からＲＮＡを単離して、細胞増殖に関与する重要なタンパク質および酵素をコードする遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。図３２Ｃに示されるように、二重特異性ホスファターゼ１（ＤＵＳＰ）としても知られる、分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼホスファターゼ（ＭＡＫＰ１）は、ｐ−ＭＧＥによる処置によって有意に増大した。ＤＵＳＰ１は、ＭＡＰキナーゼの活性を減少させるので、ＤＵＳＰ１の増大は、乳癌細胞において観察されるＭＡＰキナーゼ活性の減少の原因となり得る。対照的に、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、図３２Ｄに示されるように、コントロールマウスと比較して、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウス由来の腫瘍において、有意に減少された。ＰＤＧＦはＭＡＰキナーゼシグナリングに関与する主な成長因子なので、ｐ−ＭＧＥによって誘導されるＰＤＧＦの減少は、ｐ−ＭＧＥによる処置によって腫瘍増殖の減少にも関与し得る。細胞周期の制御も腫瘍増殖に重要でありかつ複雑であり、非常に多くの調節タンパク質、タンパク質キナーゼおよびサイクリンを伴う。ｐ−ＭＧＥは、図３２Ｅに示されるように、コントロールマウスの腫瘍と比較して、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスの腫瘍において、ｐ２１を有意に増大させた。図３２Ｆにおけるパスウェイに示されるように、ｐ２１はサイクリン依存性タンパク質キナーゼ／サイクリンの活性を調節する阻害剤であるので、ｐ−ＭＧＥによる処置によるその減少も、ｐ−ＭＧＥによって誘導される腫瘍サイズの減少に関与し得る。
【０２５７】
まとめると、これらの結果は、０．０５〜０．４ｍｇ／ｍＬの濃度のｐ−ＭＧＥは、無胸腺マウスにおいてヒト三種陰性乳房腫瘍の体積および重量を減少させたことを示す。ＭＡＰキナーゼホスファターゼＤＵＳＰ１の関係がある増大、成長因子ＰＤＧＦの減少、および、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ阻害剤ｐ２１の増大は、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスにおける乳房腫瘍増殖の減少に関与し得て、ｐ−ＭＧＥによる処置が、乳癌を有する女性のための新規の治療となり得ることを示唆する。
【０２５８】
実施例１０：脳特異的転移細胞に対するｐ−ＭＧＥの効果
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２５９】
脳に特異的に転移する三種陰性乳癌細胞株を開発して、脳特異的三種陰性乳癌に対するｐ−ＭＧＥの効果をインビトロおよびインビボで試験した。脳への三種陰性乳癌転移の２匹の同一遺伝子のマウスモデルを、動脈内の注入後に、同一遺伝子の宿主の、脳を通る細胞の連続的な選択（５×）を介して、Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおいて開発した（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて「三種陰性」４Ｔ１．ｌｕｃ２−Ｂｒ５およびＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいてＥＲ＋Ｅｏ７７１．ｌｕｃ−Ｂｒ５）。生じた細胞は、脳に高度に特異的であった。３つのさらなるヒト脳転移細胞株が得られた（ＨＥＲ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−３６１およびＭＣＦ７−ＨＥＲ２−Ｂｒ３は、Ｄｒ．Ｐａｔ  Ｓｔｅｅｇによって寄贈されて、「三種陰性」ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｂｒは、Ｄｒ．Ｊａｎｅｔ  Ｐｒｉｃｅによって寄贈された）。これらの細胞株を用いて、クローン原性増殖、激増、ＤＮＡ損傷およびアポトーシスを測定することによって、転移増殖に対するｐ−ＭＧＥの効果を試験した。
【０２６０】
４Ｔ１．ｌｕｃ２−Ｂｒ５およびＥＲ＋Ｅｏ７７１．ｌｕｃ−Ｂｒ５の細胞を、６ウェル組織培養プレート内にクローン原性密度で蒔いて一晩付着させて、その後にｐ−ＭＧＥによって処置して、細胞を１０〜１４日間増殖させた。クローン原性効率を、蒔かれた細胞のパーセンテージとして形成されたコロニーの数として計算して、それから、コントロールに対して標準化した。図３３に示されるように、７．５μｇ／ｍＬの投与量で、ｐ−ＭＧＥは、４Ｔ１．ｌｕｃ２−Ｂｒ５細胞のクローン原性生存を５０％低減させた。Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５細胞は、ｐ−ＭＧＥに対してわずかにより感受性であり、５μｇ／ｍＬで３３％阻害および７．５μｇ／ｍＬで９１％阻害を示した。
【０２６１】
転移脳細胞の増殖の阻害に関する分子メカニズムを同定し始めるために、細胞をｐ−ＭＧＥ（１０μｇ／ｍＬ、４または２４時間）とともにインキュベートして、細胞溶解物をウエスタンブロット分析によってプローブした。図３４Ａに示されるように、細胞溶解物は、活性化された分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ、リン酸化ＥＲＫ１／２に対する抗体を用いてプローブされた。全ＥＲＫ１／２タンパク質に対するＥＲＫ１／２の相対的リン酸化は、ＩｍａｇｅＪを用いてデンシトメトリーによって得られた。２４時間のｐ−ＭＧＥ処置は、４Ｔ１．ｌｕｃ２．Ｂｒ５細胞株において、その対応するコントロールと比較して、リン酸化ＥＲＫの６８±３％低減を引き起こし（ｐ＜０．０５）、一方で、ＥＲＫ１／２リン酸化における一貫した有意な変化は、Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｂｒ、またはＭＣＦ７．ＨＥＲ２．Ｂｒ３細胞株で観察されず、増殖性タンパク質キナーゼが、４Ｔ１三種陰性脳特異的細胞においては、ｐ−ＭＧＥによって誘導される細胞増殖の阻害に関与し得るが、全ての脳特異的転移乳癌細胞においては関与しないことを示唆した。
【０２６２】
脳特異的溶解物を、サイクリンＤ１に対する抗体によってもプローブして、ｐ−ＭＧＥが、細胞周期の減少によって細胞増殖を低減させるかどうか決定した。サイクリンＤ１は、細胞周期の進行および増殖の主な調節因子である。図３４Ｂに示されるように、データは、２４時間のｐ−ＭＧＥ処置は、サイクリンＤ１タンパク質レベルを、４Ｔ１．ｌｕｃ２．Ｂｒ５、Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｂｒ細胞において低減させたことを示唆し、抽出物が細胞周期を調節して増殖を減少させ得ることを示唆する。
【０２６３】
最後に、脳特異的乳癌細胞溶解物を、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３に対する抗体によってプローブして、ｐ−ＭＧＥが、乳癌細胞の増殖を減少させるメカニズムとしてアポトーシスを増大させるかどうか決定した。図３５に示されるように、ｐ−ＭＧＥ処置（１０μｇ／ｍＬ、２４時間）は、ウエスタンブロットによる開裂ＰＡＲＰならびにカスパーゼ３の活性の開裂型の検出によって示される、４Ｔ１．ｌｕｃ２．Ｂｒ５細胞のアポトーシスを誘導した。対照的に、ＰＡＲＰまたはカスパーゼ３切断は、これらの条件下では、Ｅｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｂｒ、またはＭＣＦ７．ＨＥＲ２．Ｂｒ３において観察されなかった（図３５および図示せず）。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、細胞増殖の減少に関するメカニズムの一部として、全てではないが一部の脳特異的乳癌細胞において、アポトーシスを刺激することを示唆する。
【０２６４】
実施例１１：乳癌増殖および遊走に対するｐ−ＭＧＥの効果［新］
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２６５】
Ａ．三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）
転移乳癌増殖に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定するために、我々は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍリアルタイムイメージングシステムを用いてインビトロ試験で、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞が増殖および遊走する能力を評価した。図３６Ａおよび図３６Ｂに示されるように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトＴＮＢＣ細胞の増殖は、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって用量依存的な様式で低減した。４８時間の処置後、２５μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥは、増殖を２．７±０．２から１．４±０．１細胞核／ｍｍ２まで減少させて、未処置またはコントロール細胞と比較して４８％の阻害であった。図３７Ａ〜３７Ｃに示されるように、同様の用量依存的な増殖の減弱が、３つのさらなるＴＮＢＣ細胞株で見られた：（１）ＢＴ５４９ヒトＴＮＢＣ細胞、４８時間の処置後、２５μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥは、増殖を１．６±０．１から０．９±０．１細胞核／ｍｍ２まで減少させて、未処置またはコントロール細胞と比較して４４％の阻害であった；（２）ＢＴ−２０ヒトＴＮＢＣ細胞、４８時間の処置後、２５μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥは、増殖を１．５±０．１から１．１±０．１細胞核／ｍｍ２まで減少させて、未処置またはコントロール細胞と比較して２７％の阻害であった；（３）４Ｔ１マウスＴＮＢＣ細胞、４８時間の処置後、２５μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥは、増殖を３．０±０．３から１．２±０．２％コンフルエンスまで減少させて、未処置またはコントロール細胞と比較して６０％の阻害であった。増加する濃度のｐ−ＭＧＥは、図３８Ａ〜３８Ｄに示されるように、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化および活性化を、１０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥで４０％、２０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥで８０％減少させて、ｐ−ＭＧＥがＭＡＰキナーゼ活性を低減させて、三種陰性乳癌細胞の増殖を減少させることを示唆した。
【０２６６】
ｐ−ＭＧＥによる三種陰性乳癌細胞増殖の阻害に関与するパスウェイを同定するために、４Ｔ１マウス三種陰性乳癌細胞を、減少した血清培地中で２４時間、事前インキュベートして、その後に、１から１２時間まで増大する期間のあいだ、２０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによってインキュベーションした。ＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＴＲＩｚｏｌにおいて単離して、ＲＮＡｓｅｑを用いた遺伝子発現プロファイリングの分析のためにＷａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅに提出した。多くの遺伝子が、１２時間の経過にわたってｐ−ＭＧＥによる処置によって変化した；ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタンブロットハイブリダイゼーションによるさらなる分析が、遺伝子発現におけるこれらの変化を実証するために必要である。これらの遺伝子アレイのＥＰＩＧ（マイクロアレイ遺伝子発現パターンを抽出し、同時発現された遺伝子を同定する（Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｇｅｎｅｓ）ための方法）ＧｌｏｂａｌＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ分析は、図３９に示されるように、ｐ−ＭＧＥを用いた処置によって上方制御される、下方制御される、または有意に変更されない、９個の別個のパターンにわたる２００９個の遺伝子を同定した。ｐ−ＭＧＥによって上方制御された遺伝子ファミリーは、炎症性またはリポ多糖（ＬＰＳ）応答に関与する２９個の遺伝子、ウイルス防御またはインターフェロンβ（ＩＦＮβ）応答に関与する２７２個の遺伝子、および、自食作用または小胞体（ＥＲ）ストレス応答に関与する７４１遺伝子を含んだ。対照的に、ヌクレオソーム集合または先天性の免疫応答に関与する９６個の遺伝子、および、細胞周期または細胞分裂に関与する７４８個の遺伝子は、下方制御された（細胞周期の制御に関与するタンパク質およびＭＡＰキナーゼシグナリングにおける変化と一致する）。４つのさらなる遺伝子パターンは、有意な富化を示さなかった。
【０２６７】
ＴＮＢＣは、肺、肝臓、骨および脳を含む体内の様々な臓器に転移する乳癌の侵襲性の形態であり、転移乳癌は、ＴＮＢＣを有する女性においてしばしば死亡原因となる。転移増殖につながるカスケードにおける第一ステップとして、ＴＮＢＣ細胞は、原発性腫瘍から離れて遊走して、血流中に血管内侵入して、離れた部位に移行して、組織中に血管外遊出して、増殖して転移腫瘍を形成する。ＴＮＢＣ細胞の遊走を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）Ｚｏｏｍシステムを用いて分析して、コンフルエントな細胞単一層の中央において８００μｍゾーンを露出させることによって作られた「創傷」への移動を測定した。試験された細胞株は、４Ｔ１細胞、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞、およびＢＴ−５４９細胞であった。ＭＢ−ＭＤＡ−２３１を用いて行われた実験に関する代表的な画像セットを図４０Ａに示す。露出領域は、それぞれの画像を横切る中央の淡い灰色の水平のストリップとして見られて、画像の上部および下部の中位の灰色の領域は、露出領域のそれぞれのサイドにおけるコンフルエントな細胞の領域である。それから、露出されたストリップの上部および下部から細胞が創傷へ移動した距離を記録して、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによる２４〜４８時間の処置期間にわたって２時間ごとに測定した。細胞の遊走は、ｔ＝１２時間およびｔ＝２４時間に関して、淡い灰色の露出領域へ侵入している最も濃い灰色ゾーンとして、画像中に可視化される。図４０Ｂに示されるように、露出されたゾーンへのＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトＴＮＢＣ細胞の移動は、時間とともに増加して；移動距離の減少は、ｐ−ＭＧＥの量に依存性であった。同様に、図４０Ｃおよび図４０Ｄに示されるように、４Ｔ１細胞は、処置期間中に創傷へ移動し、細胞遊走は用量依存的に減少した。同様の結果が、ＢＴ−５４９  ＴＮＢＣ細胞を評価する実験において得られた（データ示さず）。
【０２６８】
まとめると、これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、ＴＮＢＣ細胞の増殖および遊走を減少させて、離れた転移部位へのＴＮＢＣの遊走／侵襲を低減させることを示唆する。ｐ−ＭＧＥは、ＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２のリン酸化および活性化を減少させる。最近の遺伝子発現プロファイリングは、ｐ−ＭＧＥとともにインキュベートされた４Ｔ１三種陰性乳癌細胞において上方制御される、下方制御される、または変更されない数多くの遺伝子を同定していて、非常に多くのパスウェイが、抽出物による細胞増殖の制御に関与することを示唆する。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、乳癌のこの侵襲性形態における主な死亡原因であるＴＮＢＣにおける一次および侵襲性の増殖の両方を減少させ得ることを示す。
【０２６９】
Ｂ．ＨＥＲ２過剰発現乳癌
ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）過剰発現乳癌は、ＨＥＲ２の発現の増大によって特徴付けられる。ＨＥＲ２陽性乳癌は、乳癌の侵襲性の形態であり、肺、肝臓、骨および脳を含む体内の様々な臓器へしばしば転移する。エストロゲン受容体（ＥＲ）またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）が、ＨＥＲ２乳癌内に存在してよく、または存在しなくてよい。ＨＥＲ２過剰発現乳癌のための標的化療法は、ハーセプチン（登録商標）として市販される、モノクローナル抗体治療的なトラスツズマブを含むが、原発性疾患を有する患者の２０％および転移性疾患を有する患者の７０％は、この薬物に反応せず、初めに応答する７０％は、転移性疾患に進行する。したがって、原発性または転移ＨＥＲ２陽性乳癌を有する患者のためのさらなる薬物に関する明らかな必要性が存在する。この研究は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍリアルタイムイメージングシステムを用いて、ＨＥＲ２陽性ヒトＳＫＢｒ３乳房細胞がインビトロで増殖する能力に対するｐ−ＭＧＥの影響を評価した。細胞を９６ウェルプレートに蒔いて、フェノール類（μｇ）／培養培地（ｍＬ）として計算して増加する濃度のｐ−ＭＧＥで処置した。細胞増殖を４８時間に測定して、水のみで処置されたコントロールマウスにおける増殖のパーセントとして定量化した。図４１Ａに示されるように、ＳＫＢｒ３細胞の増殖は、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによって用量依存的な様式で低減されて；４０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによる処置は、コントロールと比較して、増殖を６０％減少させた。
【０２７０】
ＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞の阻害に関与する分子メカニズムを同定するために、ＳＫＢｒ３細胞を、増加する期間のあいだ、２０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥとともにインキュベートして、細胞溶解物を、（１）セリン４７３上のＡＫＴリン酸化に関する抗体、（２）トレオニン３０８上のＡＫＴリン酸化に関する抗体、および（３）リン酸化ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）に関する抗体を用いてウエスタンブロットによって分析した。ＧｅｌＤｏｃを用いてゲルを分析して、免疫反応性バンドを、ローディングしたタンパク質の合計量／レーンの分析によって、ローディングに関して標準化した。乳癌細胞および腫瘍において活性化される主なパスウェイの１つは、ＡＫＴ／タンパク質キナーゼＢパスウェイであり、増大した増殖および生存をもたらす。図４１Ｂおよび図４１Ｃに示されるように、２０μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによるＳＫＢｒ３細胞の処置は、セリン４７３またはトレオニン３０８のそれぞれに対してＡＫＴリン酸化の時間依存的な減少を引き起こした。１６時間の処置後、セリン４７３またはトレオニン３０８に対するＡＫＴのリン酸化は、ｐ−ＭＧＥによって６０％減少された。リン酸化Ａｋｔに応答して活性化される主な標的は、ラパマイシンの哺乳類の標的、ｍＴＯＲである。また、増加する濃度のｐ−ＭＧＥによるＳＫＢｒ３細胞の処置は、図４１Ｄに示されるように、リン酸化および活性化されたｍＴＯＲの用量依存的な増大をもたらした。１６時間の処置後、ｍＴＯＲのリン酸化は、ｐ−ＭＧＥによって５０％減少された。
【０２７１】
これらの結果は、ｐ−ＭＧＥによるＨＥＲ２過剰発現乳癌細胞の処置は、増殖の減少に関与し得るＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナリングを減少させることを示し、抽出物が、ＨＥＲ２乳癌を有する患者のための有用な治療となり得ることを示唆する。
【０２７２】
実施例１２：放射線と組み合わせたｐ−ＭＧＥの有効性
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２７３】
癌患者の３分の２よりも多くが、それらの疾患の経過中に放射線による治療を受ける。放射線療法は、部分的／全体的な脳放射線療法として、または標的化されたガンマナイフ療法として送達されるかにかかわらず、ときには外科的処置とともに、乳癌患者における脳転移病変の治療のための治療の標準のままである。我々は、放射線の存在下および不存在下でｐ−ＭＧＥを用いて脳特異的乳癌細胞を処置して、組み合わせた治療の効果を決定した。４Ｔ１．ｌｕｃ２．ＢＲ５またはＥｏ７７１．ｌｕｃ．Ｂｒ５細胞株のマウスの脳特異的転移乳癌細胞を、６ウェル培養プレート内にクローン原性密度で２４時間蒔いて、それから、ｐ−ＭＧＥによって２４時間処置した。２４時間の薬物処置後、細胞を、約４Ｇｙ／分の線量率で１〜６Ｇｙの１３７Ｃｓγ光線によってシャム放射線照射または放射線照射して、細胞をさらに１０〜１４日間インキュベートした。そのときに、コロニーをクリスタルバイオレットで染色して、≧５０細胞を含むコロニーをクローン原性生存数とスコアした。形成されたコロニーの数を、蒔かれた細胞の数で割って、シャム放射線照射細胞のプレーティング効率を掛けたものとして、生存率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ｆ）を計算した。組み合わせたモダリティ生存曲線を薬物単独の死滅に関して補正して、ｐ−ＭＧＥの放射線増感の潜在性を評価した。図４２Ａおよび図４２Ｂに示されるように、ｐ−ＭＧＥによる処置は、放射線感度を有意に増大させなかった。しかしながら、図４２Ｃおよび図４２Ｄに見られるように、ｐ−ＭＧＥおよび２Ｇｙ放射線（脳転移を有する患者の治療のための関連のある分割線量）の投与は、いずれかの処置単独よりも（ｔｈｅｎ）大きな低下をもたらし、相加的効果を示唆した。
【０２７４】
これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、放射線療法と組み合わせて安全に用いられ得ること、および、その併用療法が、個々の治療単独よりも効果的であり得ることを示唆する。
【０２７５】
実施例１３：タモキシフェンと組み合わせたｐ−ＭＧＥの有効性
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２７６】
乳房腫瘍の大部分は、腫瘍細胞の表面上のエストロゲン受容体（ＥＲ）の存在に基づき、ＥＲ＋サブタイプである。ＥＲ＋乳房腫瘍の増殖は、タモキシフェンのような受容体拮抗薬を用いたエストロゲン受容体のブロックによって、または、エストロゲンの産生をブロックする薬物（アロマターゼ阻害剤）によって、有意に減少され得て、それらは、ＥＲ＋乳癌の治療のための標準治療と日常的に用いられる。ＥＲ＋乳房腫瘍増殖の乳房腫瘍増殖の増殖を減少させるｐ−ＭＧＥの有効性を、ｐ−ＭＧＥによって単独またはマウス固形飼料中に投与されるＥＲ＋受容体拮抗薬タモキシフェンの存在下で処置された雌マウスにおけるＥＲ＋腫瘍増殖を測定することによって決定した。無胸腺マウス（雌、１５〜２０ｇ、５〜６週齢）の第４鼠径部乳腺パッドに、１×１０６の活発に増殖しているＺＲ−７５−１またはＭＣＦ７ヒトＥＲ＋乳癌細胞を注入した。マウスは、１２時間の明暗サイクルでＨＥＰＡ濾過空気とともにケージ内に閉じ込められて、通常のラット固形飼料を適宜供給された群である。腫瘍サイズを、カリパスを用いて、意識のある動物において１週間に２回測定して、半楕円（４／３πｒ３）／２）］に関する式を用いて腫瘍体積を計算した。腫瘍が３０ｍｍ３のサイズに到達したときに、０．１ｍｇフェノール類／ｍＬ飲料水（２５ｇのマウスに関して０．５ｍｇフェノール類／マウス／日の投与量に対応する）、３２ｍｇ／ｋｇ／ｄのおよその投与量のタモキシフェン（ＴＡＭ、通常のマウスの固形飼料を、タモキシフェンを含む固形飼料で置き換えることによって投与される）、または、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンの組み合わせのいずれかによる処置のためにマウスを無作為化して；コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。ＺＲ−７５−１ヒトＥＲ＋乳房腫瘍を含むマウスのための７週の処置、または、ＭＣＦ７  ＥＲ＋乳房腫瘍を含むマウスのための５週の処置の後に、マウスを屠殺して、腫瘍を除去して計量した。
【０２７７】
ＺＲ−７５−１  ＥＲ＋乳房腫瘍またはＭＣ７  ＥＲ＋腫瘍のサイズおよび重量は、それぞれ図４３および図４６に示されるように、処置の期間にわたって増大した。ｐ−ＭＧＥによる処置は、ＺＲ−７５−１またはＭＣＦ腫瘍の増殖を有意に減少させて、抽出物がＥＲ＋乳房腫瘍において効果的であることを示唆した。予期されたとおり、タモキシフェンは、エストロゲン受容体をブロックすることによりＥＲ＋腫瘍の両方の増殖を減少させて、増殖を減少させた。ＺＲ−７５−１およびＭＣＦ腫瘍の両方とも、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンの組み合わせは、ｐ−ＭＧＥまたはタモキシフェンのいずれか単独の効果と比較して、腫瘍増殖をさらに減少させた。腫瘍重量における同様の減少が、図４４および４７に示されるように、ＺＲ−７５−１およびＭＣＦ７腫瘍の両方で観察された。ｐ−ＭＧＥ、タモキシフェンまたは組み合わせを用いた処置によるＺＲ−７５−１腫瘍の腫瘍体積および重量の減少は、図４５に示されるように、増殖マーカーＫｉ６７に関して陽性である細胞数の減少と関連した。
【０２７８】
まとめると、これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、ＥＲ＋ヒト乳房腫瘍の増殖を減少させたことを示す。エストロゲン受容体拮抗薬タモキシフェンとｐ−ＭＧＥによる処置の組み合わせは、いずれかの処置単独と比較して、腫瘍増殖をさらに減少させて、ｐ−ＭＧＥおよびタモキシフェンが組み合わせで用いられ得ることを示唆した。これらの結果は、ｐ−ＭＧＥによる処置が、単独またはＥＲ＋乳癌を有する女性のための標準治療であるエストロゲン受容体拮抗薬タモキシフェンと組み合わせて、ＥＲ＋乳癌を有する女性のための新規の治療となり得ることを示唆する。
【０２７９】
実施例１４：ＬＮＣａＰ前立腺腫瘍に対するｐ−ＭＧＥの効果
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２８０】
ｐ−ＭＧＥの有効性を、増加する投与量でｐ−ＭＧＥによって処置されたマウスにおけるＬＮＣａＰ前立腺腫瘍増殖を測定することによって決定した。無胸腺マウス（雄、１５〜２０ｇ、５〜６週齢）に、１．６×１０６  ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞（マトリゲル中に５０：５０で懸濁される）を下側脇腹へ皮下注入した。マウスは、１２時間の明暗サイクルでＨＥＰＡ濾過空気とともにケージ内に閉じ込められて、通常のラット固形飼料を適宜供給された群である。腫瘍サイズを、カリパスを用いて、意識のある動物において１週間に２回測定して、半楕円（４／３πｒ３）／２）］に関する式を用いて腫瘍体積を計算した。腫瘍が１００ｍｍ３のサイズに到達したときに、０．０５、０．１、０．２および０．４ｍｇフェノール類／ｍＬ飲料水による増加する投与量のｐ−ＭＧＥによる処置のためにマウスを無作為化して（２５ｇのマウスに関して、０．２５、０．５、１および２ｍｇフェノール類／マウス／日に対応する）；コントロールのマウスは、通常の水を飲んだ。５週の処置後に、マウスを屠殺して腫瘍を計量した。
【０２８１】
ヌードマウスの脇腹で増殖する前立腺腫瘍の体積は、５週の処置期間にわたって未処置マウスにおいて７６５．２±１０１．８ｍｍ３まで増大したが、図４８に示されるように、０．１ｍｇフェノール類／ｍＬで処置されたマウスの腫瘍は、３６４．２±１０８．９ｍｍ３まで体積が増大して、０．４ｍｇフェノール類／ｍＬでは、１９０．２±２６．４ｍｍ３まで増大した。通常の水（コントロール）または増加する濃度のｐ−ＭＧＥのいずれかを飲んでいるマウス由来の前立腺腫瘍の重量も、図４９に示されるように減少した。腫瘍をパラホルムアルデヒドに固定して、パラフィン包埋して、切断して、増殖のマーカーとしてＫｉ６７に対する抗体によって染色した。図５０に示されるように、０．１ｍｇフェノール類／ｍＬによる処置は、領域あたりのＫｉ６７陽性細胞の数の３６％減少を引き起こし、ｐ−ＭＧＥが前立腺腫瘍細胞の増殖を減少させることを示唆した。
【０２８２】
腫瘍の切片を、内皮細胞を標識するＣＤ３４に対する抗体でも染色して、腫瘍内の血管を同定して、血管の数に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定した。図５１に示されるように、０．１ｍｇフェノール類／ｍＬによる処置は、血管の数を有意に減少させた。コントロールおよびｐ−ＭＧＥによって処置された腫瘍の両方からＲＮＡを単離して、血管新生因子血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）の相対的発現を、図５２に示されるように、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｐ−ＭＧＥによる処置は、コントロールと比較して、前立腺腫瘍におけるＶＥＧＦおよびＰＬＧＦの両方を減少させて、血管新生促進因子の減少は、ｐ−ＭＧＥによって誘導される血管の減少と関連することを示唆した。
【０２８３】
まとめると、これらの結果は、ｐ−ＭＧＥが、増殖および血管新生の減少を伴って、マウスモデルにおいてヒト前立腺腫瘍増殖を減少させることを示し、ｐ−ＭＧＥが前立腺癌のための効果的な治療となり得ることを示唆する。
【０２８４】
実施例１５：放射線によって誘導される線維症に対するｐ−ＭＧＥの効果
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２８５】
Ａ．ｐ−ＭＧＥおよび放射線によって誘導される筋線維症
癌を有する多くの患者は、彼らの治療の標準の一部として放射線治療を受ける。例えば、軟組織肉腫を有する患者は、放射線によって日常的に治療されて、骨格筋線維症および関節拘縮をもたらす。放射線による治療は、筋組織および隣接真皮内でコラーゲンの進行性の沈着を引き起こし得る。組織内のコラーゲン沈着の増大は、組織弾性を減少させて、機能硬直をもたらし、それは、放射線治療を受ける個々において、痛みおよび罹患の実質的かつ重大な原因である。
【０２８６】
Ｂ．ｐ−ＭＧＥは、照射後の骨格筋線維症骨格筋を予防する
軟組織肉腫のための放射線治療は、筋肉照射を含み、筋肉内のコラーゲンの沈着および肢硬直をもたらす。放射線によって誘導される骨格筋線維症に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定するために、１６週齢の雌Ｓｗｉｓｓ  Ａｌｂｉｎｏマウスの右後肢は、四肢肉腫を有するヒトの治療をモデル化する放射線療法の模擬的コースを受けた（７．３  Ｇｒａｙ（Ｇｙ）／分割の４つの合計分割は、２週のあいだ毎週２回与えられた。ｐ−ＭＧＥ（０．１ｍｇ／ｍＬ）が、放射線療法の前６日間および放射線療法が完了した後６週間、飲料水中で継続的に送達された。前脛骨筋（ＴＡ）の筋肉を組織学のために処理して、形態学における変化［ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色］および線維症（マッソン三色染色法）に関して試験した。放射線照射された筋肉は、活性の炎症の明瞭な領域を示し、それは、図５３に示されるように、主に筋内膜の空間に含まれた。定性的に、この炎症は、ｐ−ＭＧＥによって処置されたマウス由来の放射線照射された筋肉において小さくなったようであった。マッソン三色染色法を用いて組織線維症の領域を同定して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した。ｐ−ＭＧＥによる処置は、図５４に示されるように、放射線治療によって誘導される線維症を、放射線照射していないレベルまで減少させた。
【０２８７】
ｐ−ＭＧＥによって誘導される線維症の減少のメカニズム（単数または複数）を決定するために、８週齢の雌の無胸腺マウスの右後肢は、ヒトでの四肢肉腫の治療のために用いられるものに関して生物学的に同等の投与量を適用することによって、軟組織肉腫の治療を再度模した放射線療法のコースを受けた：７．３  Ｇｒａｙ（Ｇｙ）／分割の４つの合計分割が、２週間、毎週２回与えられて、ｐ−ＭＧＥは、放射線療法の開始前６日間および試験全体を通して、飲料水（０．１ｍｇ／ｍＬ）中で送達された。線維症およびコラーゲン沈着のバイオマーカーは、６週の放射線療法の完了のときに特徴付けられた。形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）は、コラーゲン産生の公知の促進因子であり、照射後のブタの骨格筋内で増大する。筋肉内ＴＧＦβの増大は、８週の放射線の終わりにマウスにおいて観察されて、ｐ−ＭＧＥ治療は、図５５Ａに示されるように、放射線によって誘導されるＴＧＦβ産生を有意に減少させた。ＴＧＦβシグナリングは、組織線維症の別の特徴である結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の産生を促進する。図５５Ｂに示されるように、放射線治療は、ＣＴＧＦの産生も増大させて、それは、ｐ−ＭＧＥの同時投与によって有意に減少された。ＴＧＦβは、ＳＭＡＤシグナリングも開始させて、それは、コラーゲン産生を増大させて；ＳＭＡＤタンパク質は、リン酸化の際に、核に入って線維症を進行させるタンパク質の産生を増大させる転写因子として作用する、タンパク質のファミリーである。放射線治療は、ＳＭＡＤ２の発現を増大させて、それは、図５５Ｃに示されるように、ｐ−ＭＧＥの投与によって有意に減少された。これらの結果は、放射線治療が、組織線維症を増大させるようにＴＧＢβ／ＣＴＧＦ／ＳＭＡＤパスウェイを活性化すること、および、ｐ−ＭＧＥが、このパスウェイを弱めることによって線維症を減少させることを示唆する。
【０２８８】
Ｃ．ｐ−ＭＧＥは、放射線によって誘導される骨損傷を減少させる
１７０万の新規の年１回の癌診断のおよそ半分は、治療的電離放射線によって治療される。癌のスクリーニングおよび治療の改善がほとんどのタイプの癌に関する患者死亡率を低減させたので、放射線療法によって誘導される骨折もまた、主な関心事である。特に、衰弱させるものは、頸部、直腸および肛門癌のための骨盤放射線療法を受ける患者において高い割合で生じる大腿および骨盤不足の骨折であり；放射線治療によって生じる顎のネクローシスも、頭頚部癌の生存者において生じる。放射線療法は、したがって、癌患者における骨損傷および骨折の主な危険因子であり、機能性障害、痛み、および死亡率の主な原因として作用する。臨床的に生じる放射線療法によって誘導される骨損傷の原因は不明であるが、歴史的には低い骨形成および骨ミネラル密度を導く骨芽細胞への持続的な損傷に起因する。しかしながら、放射線治療は、骨を再吸収する破骨細胞の数および活性も急速に増大させて、骨の損失を導く。
【０２８９】
破骨細胞の形成に対するｐ−ＭＧＥの効果を決定するために、前破骨細胞（ＲＡＷ２６４．７細胞）を、０．０００１、０．０００２、または０．０００４μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによる２４時間の事前処置後に、２Ｇｙの照射によって処置した。単一の２Ｇｙ線量の放射線は、曝露の第一週内の破骨細胞数を増大させることが知られる１分割の放射線療法の治療と同等であり、急性骨喪失をもたらし；この線量の放射線は、齧歯類において放射線照射された部位における重大な早期骨喪失および細胞培養モデルにおいて破骨細胞の形成の増大も誘導する。図５６に示されるように、２Ｇｙ照射前の２４時間の０．０００１、０．０００２、および０．０００４μｇ／ｍＬのｐ−ＭＧＥによる前破骨細胞ＲＡＷ２６４．７細胞の処置は、７日目に観察される早期の放射線によって誘導される破骨細胞数の増大を防いだ。このことは、ブドウ抽出物による処置が、放射線によって誘導される活性破骨細胞の増大を減少させて、骨吸収を減少させて骨喪失を防止し得ることを示唆する。
【０２９０】
これらの試験は、ｐ−ＭＧＥが、線維症を進行させるタンパク質の発現の増大をもたらすＴＧＢβ／ＣＴＧＦ／ＳＭＡＤパスウェイの減少を通して、放射線によって誘導される線維症から筋肉を保護することを示す。加えて、放射線によって誘導される骨芽細胞形成の増大は、ｐ−ＭＧＥによって減少される。これらの結果は、放射線療法によって治療された患者へのｐ−ＭＧＥの投与が、放射線によって誘導される線維症および骨芽細胞形成の増大を減少させ得て、関係がある筋硬直および骨喪失の低減をもたらすことを示唆する。
【０２９１】
実施例１６：他のマスカディンブドウ製品に対する比較における、ｐ−ＭＧＥの特性化
この実施例に記載の試験は、実施例１に記載の方法によって作られたマスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物を用いて行なわれた。具体的には、粉末抽出物は、実施例５に上述した液体抽出物から作られた。以下、液体抽出物は「ｌ−ＭＧＥ」と呼ばれ、粉末抽出物は「ｐ−ＭＧＥ」と呼ばれる。
【０２９２】
マスカディンブドウから作られた９個の異なる市販製品由来のカプセルの含有量を、比色Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法の改変および没食子酸を標準として用いて、合計フェノール含有量／カプセルについて分析した。カプセルを周囲温度（およそ６５華氏〜７２華氏の室温）で保管して、試験されるときに、カプセルの含有物を水中に再懸濁して、合計フェノール類の測定の前にＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてホモジナイズした。フェノール類の量を、図５７に示されるように、カプセルあたり定量化した。分析された市販製品を以下の表３に記載する。カプセルの合計フェノール含有量は、ｐ−ＭＧＥに関する１７８．９ｍｇ±６の高さから、Ｂｉｏｐｏｗｅｒ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（ＢＰ）由来のＭｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｇｒａｐｅ  Ｓｅｅｄ製品に関する１１．８ｍｇ±０．９まで多様であった。Ｅａｒｔｈ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ由来のＭｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｂｅｒｒｉｅｓ製品と比較して、ｐ−ＭＧＥ製剤は、カプセルあたり１２．４倍、より高い合計フェノール含有量、および、フェノール類（ｍｇ）／粉末（グラム）に基づいて１４．９倍、より高い合計フェノール含有量を有した。
【０２９３】
４つの製品−カテキン、没食子酸、エピカテキン、エラグ酸、プロシアニジン、およびカテキン−没食子酸（ｃａｔ−ｇａｌｌ）−に存在する個々のポリフェノール類を、質量分析検出（ＵＰＬＣ−ＭＳ）と組み合わせた島津超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）で測定して、標準との比較によって同定した。図５８に示されるように、個々のフェノール成分のＵＨＰＬＣ−ＭＳ分析は、ｐ−ＭＧＥが、主に、エピカテキン、没食子酸、プロシアニジン、カテキンおよびカテキン−没食子酸を含むことを示した。種子から作られたＮａｔｕｒｅ’ｓ  Ｐｅａｒｌ（ＮＰ）は、主に、エピカテキンおよび没食子酸を含み、一方で、皮から生産されたＭｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｎａｔｕｒａｌｓ由来のＭｕｓｃａｄｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、および、皮／種の製品であるＭｕｓｃａｄｉｎｅｘは、主に、エラグ酸および没食子酸を含んだ。ｐ−ＭＧＥは、他のサプリメントと比較して、有意により高いレベルのエピカテキン［２２．０±０．７ｍｇ／ｇ］、没食子酸［１３．５±０．６ｍｇ／ｇ］、プロシアニジンＢ［７．１±０．３ｍｇ／ｇ］、エラグ酸［４．７±０．４ｍｇ／ｇ］、カテキン［２．７±０．１ｍｇ／ｇ］およびカテキン没食子酸［１．８±０．１ｍｇ／ｇ］を含んだ。レスベラトロール、ケルセチンおよびミリセチンを含む他のフェノール類は、分析された４つの製品すべてにおいて、分析検出限界よりも下であった。試験されたマスカディン製品のうち、ｐ−ＭＧＥが、より高いレベルのエピカテキン、没食子酸、エラグ酸、カテキンおよびプロシアニジンを反映する、最も高い合計フェノール含有量を含んだ。
【０２９４】
【表３】
2019511514.tif 000005
2019511514.tif 000006
2019511514.tif 000007
【０２９５】
ｐ−ＭＧＥの調製中、液体製剤（ｌ−ＭＧＥ）は、噴霧膜の技術によって商業的に処理されて、ＭＧＥの粉末化された形態が生産されて、それから、カプセル化される。ｐ−ＭＧＥは、ＵＨＰＬＣ−ＭＳ分析によってｌ−ＭＧＥと比較された。およそ５００〜２０００の分子サイズで存在する種を拡大する図５９におけるトレーシングに示されるように、赤いボックスに可視化されるように２つの製剤の間には明らかな違いがあった。ｐ−ＭＧＥは、ｌ−ＭＧＥには明らかに存在しない７０６および１０３３の分子サイズにピークを有する成分を含み、一方で、ｌ−ＭＧＥは、ｐ−ＭＧＥには明らかに存在しない７３０および１２８８の分子サイズにピークを有する成分を含んだ。現在行われている試験は、これらのピークの同一性を評価している。
【０２９６】
ｐ−ＭＧＥの３つの異なる製剤中の合計フェノール類を、２年の期間にわたってＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法を用いて測定して、製品の安定性を決定した。試験されたロットは：Ｌｏｔ＃０１３−１（「ｐ−ＭＧＥ２」；ＤＯＭ：１／１３／１５）（実施例１８に記載のフェーズ１試験が行われている）；Ｌｏｔ＃０８６−１（「ｐ−ＭＧＥ３」；ＤＯＭ：３／２７／１５）；およびＬｏｔ＃２１９−１（「ｐ−ＭＧＥ４」；ＤＯＭ：８／７／１５）であった。以下の表４に示されるように、ｐ−ＭＧＥの３つの製剤のフェノール含有量は、試験の２年の期間にわたってかなり安定であった。
【０２９７】
【表４】
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【０２９８】
ｐ−ＭＧＥは、微生物含有量ならびに農薬および重金属について試験された。好気性菌数、酵母およびカビの数、大腸菌、黄色ブドウ球菌、サルモネラ、腸内細菌科および緑膿菌のカウントは、以下の表５に示されるように、１６ヶ月の期間にわたって、低いか、または存在しなかった。加えて、農薬、水銀、鉛、カドミウムおよびヒ素は、全て低くて、規制限度であった。
【０２９９】
【表５】
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【０３００】
実施例１８：進行性悪性腫瘍を有する対象におけるｐ−ＭＧＥによる治療を評価する臨床試験
Ａ．進行性悪性腫瘍におけるマスカディンブドウ種子および皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）のフェーズ１試験
２０１６年１月９日に開始されている、「進行性悪性腫瘍におけるマスカディンブドウ抽出物（ＭＧＥ）のフェーズ１試験」というタイトルのフェーズ１臨床試験（ＩＮＤ  １２８９３７）が進行中である（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２５８３２６９）。試験で用いられた医薬は、実施例１に記載の方法に従って製造されて、ヒプロメロースカプセル中に１６２ｍｇの合計フェノール類（４４０ｍｇの合計粉末抽出物）として処方された、マスカディンブドウ種子およびブドウの皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）である。試験デザインは、標準的な３＋３用量漸増統計デザインであり、１日あたり２個の丸薬の用量で始まり（朝および夕方）、段階的に１日あたり４、６、８および１０個の丸薬（半分を朝、残りを夕方）まで進める。患者集団は、標準的な治療を失敗または辞退した、転移または切除不能悪性腫瘍を有する成人患者である。この試験の目的は、この患者集団における成人患者へのｐ−ＭＧＥ投与の安全性および最大耐量を決定することである。第二の目的は、ｐ−ＭＧＥを摂取した患者における、フェノールレベル、サイトカイン、および増殖因子の変化を評価すること、全体的な奏効率、無増悪生存、および全生存を観察すること、全体的な生活の質および疲労を評価すること、および、ｐ−ＭＧＥ治療に対する順守（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）を評価することである。この試験状況は、開示されて登録されている。
【０３０１】
この試験に含まれるための基準は、転移または切除不能である固形腫瘍悪性腫瘍を有する１８才以上（１８＋）の任意の成人を含む。全ての患者は、標準的な治療を失敗または拒絶していなければならない。患者は、≦２のＥＣＯＧ状態、十分な臓器／髄質機能、絶対的な好中球カウントが＞１０００／ｍｃＬ、≧５０，０００／ｍｃＬの血小板カウント、通常の施設制限内の合計ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）（血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ［ＳＧＯＴ］／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）（血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ［ＳＧＰＴ］）が≦２．５×施設の上限または通常、クレアチニンクリアランスが≧４０ｍＬ／分、試験開始前２週間よりも長い安定したサプリメント使用および試験中に変更しない意欲、＞３ヶ月の平均余命、および、試験に参加する同意する意欲および能力を有している必要がある。除外基準は、登録の２週以内に任意の化学療法または放射線療法、任意の治験の癌に向けられた薬剤を受けること、ｐ−ＭＧＥまたは同様の化合物に対するアレルギー反応の病歴、経口薬剤の摂取不能または腸切除または胃腸疾患に起因する吸収不良の病歴、登録前２１日間の毎日の制吐治療を必要とする持続的な吐き気／嘔吐または無制御な下痢の存在、および、着床または妊娠または母乳哺育を制限し得る感染、鬱血性心不全、不安定な狭心症、心不整脈、精神医学的疾病／社会的状況を含む無制御な介入疾病を含む。原発性脳腫瘍を有する患者も除去された。
【０３０２】
患者は、試験の経過中、完全な支持療法を受ける（血液製剤の輸血、抗生物質、制吐剤、抗炎症剤または麻薬鎮痛剤、慢性の随伴性状態のための薬剤、生命を脅かす医学的問題のための治療）。
【０３０３】
一次成果の測定は、４週に評価される用量制限毒性（ＤＬＴ）である。有害事象／毒性は、４、８週目、および患者が治療を続ける場合はその後４週毎に評価される。
【０３０４】
試験は、記載されるように３＋３用量漸増試験として構成されて、進行中である。レベル１：三（３）患者は、１日あたり２カプセル（３２４ｍｇの合計フェノール類）で３０日間治療される。治療が十分に耐容されて、患者の腫瘍が進行していない場合は、これらの三患者は治療を続ける（さらに３０日間、それから、監視される）。レベル２：三患者の第二の群は、１日あたり４カプセル（６４８ｍｇの合計フェノール類）で治療されて、３０日後に評価される。この治療が十分に耐容されて、患者の腫瘍が進行していない場合は、これらの三患者は、再度、治療を続ける（さらに３０日間、それから、監視される）。レベル３：同じ形式が、１日あたり６カプセルの投与について従われる（９７２ｍｇの合計フェノール類）。同じ形式がレベル４に関して続けられて、１日あたり８カプセルを投与して（９７２ｍｇの合計フェノール類）（現在の登録）、続いて、レベル５は、１日あたり１０カプセルを投与する（１６２０ｍｇの合計フェノール類）。これらのいずれかの群が用量制限毒性を有する場合は、追加の三患者が、その投与量で治療される。追加の三患者が毒性を有さない場合は、その結果、次の投与量が試験において用いられた／用いられる。
【０３０５】
この単一サイト試験の１年目に、３人の女性および７人の男性の１０個人が登録された。これらのうち、９０％が７０歳以上であり、９０％は非ヒスパニック系白人であり、一方で、１０％は非ヒスパニック系黒人だった。最初の年１回の報告のときに（以下の表に要約されるように、２０１６年１月９日から２０１７年１月８日までの試験の１年目に報告）、９人の対象が治療を完了した。これらの９人のうち、２人は、早期に試験を終了し−１人は有害事象のせいでレベル２（４丸薬／日）−３人の追加の患者がレベル２で加えられた。臨床試験の２年目の最初の２ヶ月の間に、１年目の登録からの１０番目の患者が試験から外されて、４人の追加の患者が登録された。レベル１（ｎ＝３）は１０週で完了されて；レベル２（ｎ＝７）は２０週で完了されて、レベル３（ｎ＝３）は５週で完了された。１参与者以外、全ての患者は、彼らの投薬、約束、および家での丸薬日記の完成を順守したようであった。 
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【０３０６】
ｐ−ＭＧＥ投与による予期される有害事象（ＡＥ）は、鼓腸、下痢、吐き気、消化不良、および腹部痙攣である。最初の年１回の報告では、グレード２またはそれよりも高くてｐ−ＭＧＥに寄与すると考えられるたった２つのＡＥが報告されて；一方の対象は、グレード３の便秘を有し、他方はグレード２の下痢を有し、両方ともｐ−ＭＧＥに起因すると考えられた。グレード３の便秘を有する患者は、腸閉塞の疑いで入院した。さらなる精密検査によって、彼の症候が原因の可能性として疾患進行が明らかになった。患者は、進行性の転移性疾患を有することが最終的に決定されて、ｐ−ＭＧＥが彼の症候において役割を果たしたかどうか定かでなかった。ＩＮＤの安全性の報告は１年目のあいだ、提出されず、この試験の登録のあいだに死亡した参与者はいなかった。疾患進行を有する者は、ホスピスケアまたは死亡前にプロトコルによって試験から除外された。
【０３０７】
最初の９人の参与者に関する試験中の平均時間は７．４週であり、１〜２０週の範囲であった。試験を離れる理由は、疾患進行（１患者）、用量制限毒性（１患者）、ホスピス撤退（１患者）または服薬不履行（１患者）であった。最初の１４人の参与者の癌診断は、群によって：膵臓（３）、虫垂（ａｐｅｎｄｉｃｅａｌ）（１）、直腸（１）、肝内胆管（１）、尿生殖器／前立腺（４）、腹膜の肉腫（１）、肺（２）および胸腺腫（ｔｈｙｏｍａ）（１）を含む。
【０３０８】
患者の臨床評価は、血液検査によって評価される腫瘍マーカーの安定化によるｐ−ＭＧＥでの臨床改善および８週におけるイメージングにおける治療に対する混合された応答を経験した結腸直腸癌を有する１人の患者を含む。この患者は、最も低い投与量を受けて、腫瘍進行前に５ヶ月間、試験に残った。胃腸原発性腫瘍を有する第二の患者は、疾患進行の前に第二の投与量で６と１／２ヶ月の治療を完了した。フェーズ１臨床試験のこのステージでの結果は、ｐ−ＭＧＥが、９７２ｍｇの合計フェノール類の１日の総投与量に関して、６カプセル／日（午前中に３および午後に３）までの投与量で、十分に耐容であることを示唆する。
【０３０９】
全体的な奏効率（ＣＲ、ＰＲ、およびＳＤ）は、８週に評価される。無増悪生存および全生存は、進行まで６±２週毎のフォローアップとともに、カプラン・マイヤー法を用いて評価されて、生存試験エンドポイント（メジアン生存率および関係がある９５％信頼区間；最終コンタクトの日におけるセンサー）をモニタリングする。生活の質（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｇｅｎｅｒａｌ（ＦＡＣＴ−Ｇ）の測定、および、ＰＲＯＭＩＳ  Ｆａｔｉｇｕｅ−Ｓｈｏｒｔ  Ｆｏｒｍを用いた疲労も、治療レジメンに対する順守として（ａｓ  ｗｉｌｌ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）評価される。
【０３１０】
Ｂ．進行性前立腺および乳癌におけるマスカディンブドウ種子および皮の粉末抽出物（ｐ−ＭＧＥ）のフェーズ２試験
進行性前立腺および乳癌におけるｐ−ＭＧＥの効果に対する２つのフェーズ２臨床試験は、２０１７年に開始されることが予測されていて、ＦＤＡへのＩＮＤ申請の準備が進行中である。ｐ−ＭＧＥの同一の製剤は、第Ｉ相臨床試験に関するパートＡに記載のとおりに用いられる。
【０３１１】
前立腺癌患者におけるフェーズ２臨床試験は、無作為化された、二重盲検であり、生化学的に再発性の前立腺癌を有する男性における、ｐ−ＭＧＥ対プラセボの、プラセボがコントロールである試験である。患者集団は、決定的治療法が完了した、転移はないが前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）が増加している、前立腺癌を有する男性である。二百（２００）人の患者が、８カプセル／日を受けて３ヶ月ごとにフォローされるプラセボおよび治療群に無作為化されると予期される。主要エンドポイント評価は９ヶ月にされて、再発および生存を測定するための１２ヶ月までのフォローアップを伴う。一次成果は、無病生存率およびＰＳＡ増加率の減少である。ｐ−ＭＧＥを受けた患者におけるプラセボを受けた患者と比較したＰＳＡの増加率の有意な減少または無病生存率の長さの増加は、転移前立腺癌に対する抽出物のポジティブな影響として解釈される。
【０３１２】
乳癌患者におけるフェーズ２臨床試験は、無作為化された、二重盲検であり、以前の６ヶ月以内にアジュバント化学療法を完了している三種陰性乳癌を有する女性における、プラセボがコントロールである試験である。患者集団は、ステージ１〜３の三種陰性乳癌を有する女性（１６０人の患者）であり、プラセボまたはｐ−ＭＧＥ治療群（８カプセル／日のレベル）にランダム化される。主要エンドポイントは、６ヶ月において評価される疲労である。患者は、再発および生存成果に関して２４ヶ月までの間、６ヶ月毎にフォローされる。プラセボと比較して、ｐ−ＭＧＥを摂取している三種陰性乳癌を有する女性における、（ＰＲＯＭＩＳ−疲労として測定される疲労の有意な減少、ＣＥＳ−Ｄによって評価される改善された気分、ピッツバーグの睡眠の質の指標により評価されるより少ない睡眠障害、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ［ＦＡＣＴ］−Ｃｏｇによって評価されるより低い認知的苦情、全体的な健康に関連した生活の質（ＦＡＣＴ−Ｂ）の改善、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｂａｔｔｅｒｙに対する身体能力の改善、６分ウォーキングの体力、ＶＯ２ピークおよび二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）による脂肪症の低減は、転移三種陰性乳癌に対する抽出物のポジティブな影響として解釈される。
【０３１３】
本開示において参照される全ての印刷された特許および刊行物は、それらの全体で参照により本明細書中に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ−２Ｉ】
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【図２Ｊ−２Ｋ】
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【図２Ｌ−２Ｍ】
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【図２Ｎ−２Ｐ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ−３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ−３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３９】
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【図４０Ａ−４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ−Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【国際調査報告】
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