(57)【要約】  本発明は、補正した特許請求の範囲において定義するように、式（I）の化学物質、その製造、及び癌の治療における使用に係る。 式（I）【化１】2019520345.tif 000058
2019520345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）
【化１】
2019520345.tif 000054
［式中、
R1及びR2は、各々、独立して、Ｈ、及びC1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、及び4-8ヘテロシクロアルキルからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R3は、Ｈ、及びC1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、4-8ヘテロシクロアルキル、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール、及び９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R4は、Ｈ、及びC1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、及び4-8ヘテロシクロアルキルからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R5は、独立して、OAr及び
【化２】
2019520345.tif 000055
から選ばれ；
Arは、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール、及び９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる］
の化合物、又はその薬学上許容される塩、エステル、エステルの塩、溶媒和化合物、プロドラッグ、又はプロドラッグの塩。
【請求項２】
式（I）の化合物が、式（II）
【化３】
2019520345.tif 000056
の化合物である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Arがフェニルである請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
Arがナフチルである請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Arが１−ナフチルである請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
式（I）の化合物が、式（III）
【化４】
2019520345.tif 000057
の化合物である請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
R1及びR2が、各場面で、それぞれ独立して、Ｈ、C1-4-アルキル、及び-CH2-フェニルから選ばれるものである請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
R1がＨであり、R2がMeである請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
R3が、各場面で、独立して、ベンジル、C3-7シクロアルキル、及びC1-6アルキルから選ばれるものである請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
R3がベンジルである請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
R4がＨである請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ar、R1、R2、R3、及びR4が未置換である請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物。    
【請求項１３】
式（I）の化合物が、
シクロヘキシル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテート；
ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテート；
(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート；
(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート；
(2S)-ペンチル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート；
5’-([(エチルオキシ-L-アラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-アラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ペント-1-イルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(エチルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(シクロヘキシルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(エチルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル) 8-クロロアデノシン；
5’-([(ペント-1-イルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ペント-1-イルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(エチルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-D-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(イソプロピルオキシ-L-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ネオペンチルオキシ-2,2-ジメチルグリシン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(メチルオキシ-L-メチオニン-N-イル)フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
5’-([(ベンジルオキシ-L-バリン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシン；
8-クロロアデノシン5’-O-ビス(ベンジルオキシ-L-アラニン-N-イル)ホスフェート；及び
8-クロロアデノシン5’-O-ビス(ベンジルオキシ-グリシン-N-イル)ホスフェート
から選ばれる化合物である請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
式（I）の化合物が、(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートである請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
式（I）の化合物が、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形の(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)-(Sp)-ホスホリル)アミノ)プロパノエートである請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
式（I）の化合物が、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形の(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)-(Rp)-ホスホリル)アミノ)プロパノエートである請求項１４に記載の化合物。
【請求項１７】
式（I）の化合物が、ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートである請求項１３に記載の化合物。
【請求項１８】
式（I）の化合物が、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形のベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)-(Sp)-ホスホリル)アミノ)アセテートである請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
式（I）の化合物が、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形のベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)-(Rp)-ホスホリル)アミノ)アセテートである請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
医療用の請求項１〜１９のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
癌の治療における使用のための請求項１〜１９のいずれかに記載の化合物。
【請求項２２】
癌が、白血病、多発性骨髄腫、肺癌、肝癌、乳癌、頭頚部癌、神経芽細胞腫、甲状腺癌、皮膚癌、口腔扁平上皮癌、膀胱癌、ライディッヒ細胞腫、結腸癌、結腸直腸癌、及び婦人科系の癌からなる群から選ばれるものである請求項２１に記載の使用のための化合物。
【請求項２３】
癌が白血病である請求項２２に記載の使用のための化合物。
【請求項２４】
白血病が、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病、及びヘアリー細胞白血病からなる群から選ばれるものである請求項２３に記載の使用のための化合物。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれかに記載の化合物及び薬学上許容される添加剤を含んでなる医薬製剤。
【請求項２６】
さらに、極性の非プロトン性有機溶媒を含んでなる請求項２５に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
極性の非プロトン性有機溶媒がジメチルアセトアミドである請求項２６に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学物質、その製造、及び癌の治療における使用に係る。特に（必ずしも、排他的ではない）、本発明は、ヒトにおける白血病の治療に有用な化学物質に係る。
【背景技術】
【０００２】
国際特許出願第2006/100439号は、クラドリビン、イソクラドリビン、フルダラビン及びクロファラビンのホスホルアミデート及び癌標的化におけるそれらの使用を開示している。
【０００３】
８−クロロアデノシン（8-Cl-A）は、白血病を含む多くの癌において、いくらかの細胞毒活性を有するヌクレオシドアナログである。8-Cl-Aは、現在、慢性リンパ性白血病についてのフェーズＩ臨床試験下にある。8-Cl-Aは、８位に結合した塩素基を有するアデニン塩基から構成されている。8-Cl-Aは、Ｇ２／Ｍフェーズにおける細胞周期停止を生じ、破局的な有糸分裂を仲介し、これによって、アポトーシス及びオートファジーを惹起することによって細胞毒性を発揮すると考えられる。
【０００４】
細胞における8-Cl-Aの摂取は、受動拡散型ヌクレオシドトランスポーター（ENT）タイプ及び集中的ヌクレオシドトランスポーター（CNT）タイプのようなヌクレオシドトランスポーターによって仲介される。ENT（ヒトENT1（hENT1）を含む）は、医薬が治療上効果的であるためには重要である。8-Cl-Aは、癌細胞内において、アデノシンキナーゼ（ＡＫ）によって、一連のリン酸化工程を受けると、活性な抗癌代謝物である８−クロロ−アデノシントリホスフェート（8-Cl-ATP）を形成する。アデノシンデキナーゼ（ＡＫ）は、γ−ホスフェートを、ATPから8-Cl-Aのアデノシンの５'−ヒドロキシルに転移させて、８−クロロ−アデノシンモノホスフェート（8-Cl-AMP）を生成することによって、8-Cl-Aをリン酸化し、その結果、8-Cl-Aは活性化され、最終的に8-Cl-ATPを生成する。従って、8-Cl-ATPが蓄積するにつれて、細胞内のATPプールが減少する。結果として、細胞内における8-Cl-ATP／ATPの比率が増大し、8-Cl-ATPのDNAへの偽ヌクレオシドとしての取り込みを支持して、DNAにおける二重鎖切断を生じ及び修復を阻止し、最終的に、アポトーシスを介する細胞死につながる。
【０００５】
8-Cl-Aに対する癌細胞の抵抗機構の発生は、その有効性を制限する。抵抗性を生ずるいくつかの機構、すなわち、限定された細胞摂取（hENT1）；乏しい活性化（ＡＫ）；アデノシンデアミナーゼ（ADA）による広範な分解が提案されている。
【０００６】
hENT1
癌細胞はhENT1を下方制御するか、又は低機能性又は非機能性である成熟型のタンパク質を発現できる。例えば、シングルミスセンス変異は、hENT1の膜貫通１ドメインにおける２４位（G24）のグリセリンのアルギニンへの置換を導くことができ、ヌクレオシドアナログに結合できない異常型タンパク質を生成する。それ故、変異hENT1タンパク質は、細胞膜を通る癌細胞への8-Cl-Aの摂取を仲介できない。
【０００７】
ＡＫ
癌細胞は、ＡＫの触媒コアにおける突然変異を発生させることができ、効果的な8-Cl-Aの結合及びリン酸化を阻止する。それ故、8-Cl-Aは、細胞内に、不活性な非リン酸化型として多量に残り、もはや、その細胞毒効果を発揮できない。インビトロ研究では、ＡＫが阻害される際には、細胞は8-Cl-Aに対して退行性となり、検知可能な8-Cl-ATPは生成されない。それ故、8-Cl-Aをリン酸化及び活性化させるためには、アデノシンキナーゼは必要とされる。
【０００８】
ADA
アデノシンデアミナーゼは、血漿内においてかつ細胞内で8-Cl-Aを分解し、これによって、薬剤レベルを低減させ、抗癌効果を制限する。
【０００９】
癌幹細胞の推定上の存在は、白血病及び固形腫瘍を含む多くのヒト癌において示唆されている。癌幹細胞の仮説は、腫瘍細胞の小さいサブ集団のみが、腫瘍の大部分の形成及び維持を担っているとみなしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の特定の具体例の目的は、使用した際、癌の予防又は治療において、治療上の効力、特に、増大されは治療上の効力を有する治療剤を提供することにある。
【００１１】
本発明の特定の具体例の目的は、癌細胞に8-Cl-ATPを送達する手段を提供することにある。本発明の特定の具体例の目的は、少なくとも部分的に、上記8-Cl-Aに対する抵抗性機構を克服する8-Cl-ATPを発生させる手段を提供することにある。
【００１２】
本発明の特定の具体例の目的は、癌幹細胞に対して治療上の効力を有する治療剤を提供することにある。
【００１３】
本発明の特定の具体例は、上述の目的のいくつか又は全てを解決する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の第１の態様によれば、式（I）の化合物、又はその薬学上許容される塩、エステル、エステルの塩、溶媒和化合物、プロドラッグ又はプロドラッグの塩が提供される。
式（I）
【化１】
2019520345.tif 000003
［式中、
R1及びR2は、各々、独立して、Ｈ、及びC1-20アルキル、C6-30アリールC1-6アルキル、C2-20アルケニル、C1-20アルコキシC1-20アルキル、C1-20アルコキシC6-30アリール、C2-20アルキニル、C3-20シクロアルキル、C3-20シクロアルキルC6-30アリール、及び4-20ヘテロシクロアルキルからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R3は、Ｈ、及びC1-20アルキル、C6-30アリールC1-20アルキル、C2-20アルケニル、C1-20アルコキシC1-20アルキル、C1-20アルコキシC6-30アリール、C2-20アルキニル、C3-20シクロアルキル、C3-20シクロアルキルC6-30アリール、5-20ヘテロシクロアルキル、C6-30アリール、及び5-30ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R4は、Ｈ、及びC1-20アルキル、C6-30アリールC1-20アルキル、C2-20アルケニル、C1-20アルコキシ、C1-20アルコキシC1-20アルキル、C3-20シクロアルキル、C1-20アルコキシC6-30アリール、C2-20アルキニル、C3-20シクロアルキルC6-30アリール、C6-30アリールオキシ、5-20ヘテロシクロアルキル、C6-30アリール、及び5-30ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R5は、独立して、OAr及び
【化２】
2019520345.tif 000004
から選ばれ；
Arは、C6-30アリール及び5-30ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる。］
【００１５】
驚くべきことには、本発明のホスホルアミデート化合物は、親ヌクレオシド8-Cl-Aと比較して、IC50又はEC50アッセイによって測定されるように、増大された抗−増殖効果を示す。驚くべきことには、本発明のホスホルアミデート化合物の少なくともいくつかは、親ヌクレオシド8-Cl-Aと比較して、増大された抗−癌幹細胞活性を示す。このように、本発明のホスホルアミデート化合物は、親ヌクレオシド8-Cl-Aと比較して、癌幹細胞を標的化する能力と組み合わせて、IC50又はEC50アッセイによって測定されるように、増大された抗−増殖効果を示す。
【００１６】
本発明を具現化する化合物は、特に、ヒトにおける癌の治療に適している。
【００１７】
特定の好適な具体例では、Arは、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール、及９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる。
【００１８】
R1及びR2の各々は、独立して、Ｈ、及びC1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、及び4-8ヘテロシクロアルキルからなる群（いずれも任意に置換されるから選ばれる）から選ばれ；
R3は、Ｈ、及びC1-8アルキニル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキル、C3-8シクロアルキル、4-8ヘテロシクロアルキル、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール、及び９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれ；
R4は、Ｈ、及びC1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、及び4-8ヘテロシクロアルキルからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる。
【００１９】
１具体例では、式（I）の化合物は、式（II）
【化３】
2019520345.tif 000005
の化合物である。
【００２０】
１具体例では、式（I）の化合物は、式（III）
【化４】
2019520345.tif 000006
の化合物である。
【００２１】
以下の具体例は、式（I）〜（III）のいずれかの化合物に当てはまる。これらの具体例は、独立したもの又は交換可能である。いずれかの具体例は、他のいずれかの具体例と組み合わされる（化学的に可能でる場合）。換言すれば、下記の具体例に記載の特徴のいずれかは、１以上の他の具体例に記載の特徴と組み合わされる（化学的に可能である場合）。特に、化合物が、本明細書において例示又は説明される場合、以下に記載し、一般的レベルで表現する具体例のいずれか２つ以上は、化合物が組み合わされて、本発明の開示の一部を形成する更なる具体例を提供できることを包含するものである。
【００２２】
Arは、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール及び９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる。
【００２３】
Arは、未置換でもよい。Arは、置換されてもよい。Arが置換される場合、１、２、３、４、又は５個の置換基で置換されうる。
【００２４】
Ar（置換又は未置換）は、ナフチル、フェニル、キノリル、及びピリジルからなる群から選ばれる。Arは、ナフチル及びフェニルからなる群から選ばれる。Arがナフチルである場合、ナフチルの１位において-O-Pに結合していてもよい。Arは、未置換のナフチル又は未置換のフェニルから選ばれる。好適な具体例では、Arは、未置換のナフチルであり、ナフチルの１位において-O-Pに結合している。
【００２５】
R1及びR2は、それぞれ、未置換でもよい。
【００２６】
R1及びR2は、-CR1R2COO-が、タンパク新生のαアミノ酸又はそのＤ−エナンチオマー（ここで、タンパク新生のαアミノ酸はグリシンではない）の相当部分を表すように選択される。
【００２７】
このように、R1及びR2の一方がＨであり、他方が、各場面で独立して、Ｈ、及びC1-C4アルキルから選ばれもよく、前記C1-C4-アルキルは、任意に、フェニル（任意に、ただ１つのヒドロキシル置換基によって置換される）、イミダゾール、インドール、SRa、ORa、CO2Ra、CO2NRaRa、NRaRb及びNH(=NH)NH2からなる群から選ばれる置換基によって置換される（ここで、Raは、各場面で独立して、Ｈ、及びC1-C4-アルキルから選ばれ；及びRbは、各場面で独立して、Ｈ、及びC1-C4-アルキル及びC(O)-C1-C4-アルキルから選ばれる）。
【００２８】
このように、R1がＨであり、及びR2が、各場面で独立して、Ｈ、CH2-フェニル（任意に、ただ１つのヒドロキシル置換基によって置換される）及びC1-C4-アルキルから選ばれてもよく、前記C1-C4-アルキルは、任意に、イミダゾール、インドール、SRa、ORa、CO2Ra、CO2NRaRa,、NRaRb及びNH(=NH)NH2から選ばれる基によって置換される。
【００２９】
R1及びR2は、それぞれ、独立して、Ｈ、C1-C4アルキル及びCH2-フェニルから選ばれてもよい。
【００３０】
特定の好適な具体例では、R1及びR2は、各場面で独立して、Ｈ、-CH3、-CH2-Ph、及び-CH2CH(CH3)2からなる群から選ばれる。
【００３１】
R1及びR2は、各場面で独立して、CH3及びＨから選ばれてもよい。特定の好適な具体例では、R1及びR2の１つがCH3であり、及びR1及びR2の１つがＨである。このように、更なる好適な具体例では、R2がCH3であり、及びR1がＨである（すなわち、R1及びR2を有するＣ原子は、Ｌ−アラニンと同じ絶対配置を有する）。
【００３２】
R1及びR2の１つがＨであり、及びR1及びR2の１つが、-CH2-CH(CH3)2又は-CH2-Phであってもよい。
【００３３】
R1及びR2の各々がＨであってもよい。
【００３４】
本明細書では、用語「タンパク新生のαアミノ酸」は、真核生物の遺伝子コードによって、タンパク質合成のために、直接コード化される２１個のアミノ酸の１つを意味する。このように、タンパク新生のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、システイン、及びメチオニンから選ばれるアミノ酸を意味する。本明細書では、天然のαアミノ酸の側鎖は、このように、Ｈ、CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、-CH2Ph、-CH2Ph-OH、-CH2SH、-CH2CH2SCH3、-CH2OH、-CH(CH3)(OH)、-CH2CH2CH2CH2NH3+、-CH2CH2CH2NHC(=NH2+)NH2、-CH2C(O)O-、-CH2CH2C(O)O-、-CH2C(O)NH2、-CH2CH2C(O)NH2、
【化５】
2019520345.tif 000007
【化６】
2019520345.tif 000008
からなる群から選ばれるものである。
【００３５】
R3は未置換でもよい。
【００３６】
R3は、各場面で独立して、C6-30アリールC1-6アルキル、及び未置換のC1-20アルキルから選ばれる。R3は、各場面で独立して、ベンジル、C3-7シクロアルキル、及びC1-6アルキルから選ばれる。このように、R3は、各場面で独立して、未置換のベンジル、未置換のC3-7シクロアルキル、及び未置換のC1-6アルキルから選ばれる（いずれも任意に置換される）。特定の好適な具体例では、R3は、各場面で独立して、ベンジル（-CH2-Ph）、未置換のメチル（-CH3）、未置換のn-フェニル（-n-C5H11）、未置換のシクロヘキシル（-C6H11）、及び未置換のエチル（-CH2CH3）からなる群から選ばれる。特定の好適な具体例では、R3はベンジルである。
【００３７】
R3は、Ｈ、及びC1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、C4-8ヘテロシクロアルキル、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール、及び９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる。R3は、C1-8アルキル、ベンジル、C2-8アルケニル、C1-4アルコキシC1-4アルキル、C2-8アルキニル、C3-8シクロアルキル、4-8ヘテロアリール、フェニル、ナフチル、５員又は６員単環式ヘテロアリール、及び９員又は１０員二環式ヘテロアリールからなる群（いずれも任意に置換される）から選ばれる。R3は、H、C1-20アルキル、C6-30アリールC1-6アルキル、C2-10アルケニル、C1-10アルコキシC1-10アルキル、C1-10アルコキシC6-10アリール、C2-10アルキニル、C3-20シクロアルキル、C3-20シクロアルケニル、C8-20シクロアルキニル、及び4-20ヘテロシクロアルキルからなる群から選ばれてもよい。
【００３８】
特定の好適な具体例では、R3は、Ｈ、C1-20アルキル、C6-30アリールC1-6アルキル、及びC3-20シクロアルキルからなる群から選ばれる。このように、R3は、Ｈ、C1-6アルキル、ベンジル及びC3-6シクロアルキルから選ばれてもよい。このように、R3は、C1-6アルキル、ベンジル、及びC3-6シクロアルキルからなる群から選ばれてもよい。R3は、C6-30アリールC1-6アルキル及び未置換のC1-20アルキルからなる群から選ばれてもよい。このように、R3は、C1-6アルキル及びベンジルから選ばれてもよい。更なる好適な具体例では、R3は、ベンジル（-CH2Ph）、未置換のメチル（-CH3）、及び未置換のn-ペンチル（-n-C5H11）からなる群から選ばれる。さらに他の好適な具体例では、R3はベンジルである。
【００３９】
特定の好適な具体例では、R4はＨである。
【００４０】
R4は、任意に、置換されていなくてもよい、すなわち、R4は未置換でもよい。
【００４１】
R4は、各場面で独立して、Ｈ、C1-20アルキル、C6-30アリールC1-6アルキル、C2-10アルケニル、C1-10アルコキシ、C1-10アルコキシC1-10アルキル、C1-10アルコキシC6-10アリール、C2-10アルキニル、C3-20シクロアルキル、C3-20シクロアルケニル、C8-20シクロアルキニル、及び4-20ヘテロシクロアルキルからなる群から選ばれる。
【００４２】
特定の好適な具体例では、R4は、各場面で独立して、Ｈ、C1-18アルキル、C6-30アリールC1-6アルキル、C3-20シクロアルキニル、及び4-20ヘテロシクリルからなる群から選ばれる。このように、R4は、各場面で独立して、Ｈ、C1-8アルキル、ベンジル、C3-8シクロアルキル、及び4-8ヘテロシクリルからなる群から選ばれる。更なる好適な具体例では、R4は、各場面で独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、及びシクロヘキシルからなる群から選ばれる。
【００４３】
特定の特別な具体例では、Arは、フェニル（C6H5-）及びナフチル（C10H7-）から選ばれ（それぞれ、任意に、置換される）； R1及びR2は、それぞれ、独立して、Ｈ及びメチル（CH3-）（ここで、メチルは、任意に、置換される）から選ばれ；R3は、ベンジル（Ph-CH2-）、及びn-ペンチル（n-C5H11-）（それぞれ任意に置換される）から選ばれ；及びR4はＨである。
【００４４】
特定の特別な具体例では、Arは、未置換のナフチル（C10H7-）から選ばれ；R1及びR2は、それぞれ、独立して、Ｈ及びメチル（CH3-）（ここで、メチルは、任意に、置換される）から選ばれ；R3は、ベンジル（Ph-CH2-）及びn-ペンチル（n-C5H11-）（それぞれ、任意に、置換される）から選ばれ；及びR4はＨである。
【００４５】
特定の特別な具体例では、Arは1-ナフチル（任意に置換される）であり；R1及びR2は、それぞれ、独立して、Ｈ及びメチル（CH3-）（ここで、メチルは、任意に置換される）から選ばれ；R3は、ベンジル（Ph-CH2-）及びn-ペンチル（n-C5H11-）（それぞれ、任意に、置換される）から選ばれ；及びR4はＨである。
【００４６】
特定の特別な具体例では、Arは未置換のフェニル（C6H5-）であり；R1及びR2は、それぞれ、独立して、Ｈ及びメチル（CH3-）（ここで、メチルは、任意に置換される）から選ばれ；R3は、ベンジル（Ph-CH2-）及びn-ペンチル（n-C5H11-）（それぞれ、任意に、置換される）から選ばれ；及びR4はＨである。
【００４７】
特定の特別な具体例では、Arは、フェニル（C6H5-）及びナフチル（C10H7-）（それぞれ、任意に、置換される）から選ばれ； R1及びR2の１つはMeであり、及びR1及びR2の１つはＨであり（これにより、R1及びR2を有するＣ原子は、天然のアラニンのようにキラリティーを有する）；R3は、ベンジル（Ph-CH2-）及びn-ペンチル（n-C5H11-）（それぞれ任意に置換される）から選ばれ；及びR4はＨである。
【００４８】
特定の特別な具体例では、Arは、フェニル（C6H5-）（任意に、置換される）から選ばれ； R1及びR2は、それぞれ、Ｈであり；R3は、ベンジル（Ph-CH2-）及びn-ペンチル（n-C5H11-）（それぞれ、任意に、置換される）から選ばれ；及びR4はＨである。
【００４９】
特定の特別な具体例では、Arは、ペンチル（C6H5-）及びナフチル（C10H7-）（それぞれ任意に置換される）から選ばれ；R1及びR2は、それぞれ、独立して、Ｈ及びメチル（CH3-）（ここで、メチルは、任意に、置換される）から選ばれ；R3は未置換のベンジル（Ph-CH2-）であり；及びR4はＨである。
【００５０】
Ar、R1、R2、R3及びR4は、それぞれ、１、２、３、４又は５個の置換基によって置換される。或いは、Ar、R1、R2、R3、及びR4 は、それぞれ、未置換でもよい。
【００５１】
化合物は、実施例に記載する化合物Ａ〜ACの１以上の群から選ばれてもよい。
【００５２】
特定の好適な具体例では、化合物は、(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート（下記実施例からの化合物Ｄ）である。
【００５３】
化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形の(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)-(Sp)-ホスホリル)アミノ)プロピオネートであってもよい。
【００５４】
化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形の(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ) (ナフタレン-1-イルオキシ)-(Rp)-ホスホリル)アミノ)プロパノエートであってもよい。
【００５５】
化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形の(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートの異性体Ａであってもよい。このように、化合物は、NMRスペクトルが、202MHz NMR 装置において、CD3OD中で得られる際、3.93±0.04に31P NMRピークを有する(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートの異性体であってもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。化合物は、分析用HPLCを、Varian Pursuit XRs 5 C18, 150×4.6mmにおいて、３０分で100／１０から０／100へのH2O/CH3CNにて、１ml/分で溶離して実施した際に、保持時間16.43±0.10分を有する(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートの異性体でもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。
【００５６】
化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形の(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートの異性体Ｂであってもよい。このように、化合物は、NMRスペクトルが、202MHz NMR装置において、CD3OD中で得られる際、3.83±0.04に31P NMRピークを有する(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートの異性体であってもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。化合物は、分析用HPLCを、Varian Pursuit XRs 5 C18, 150×4.6mmにおいて、３０分で100／１０から０／100へのH2O/CH3CNにて、１ml/分で溶離して実施した際に、保持時間16.59±0.10分を有する(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートの異性体でもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。
【００５７】
特定の好適な具体例では、化合物は、ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテート（下記実施例からの化合物Ｂ）である。
【００５８】
化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形のベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)フェノキシ)-(Sp)-ホスホリル)アミノ)アセテートでもよい。
【００５９】
化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形のベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)フェノキシ)-(Rp)-ホスホリル)アミノ)アセテートでもよい。
【００６０】
化合物は、ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ) アセテートの異性体Ａであってもよい。このように、化合物は、NMRスペクトルが、202MHz NMR 装置において、CD3OD中で得られる際、4.64±0.04に31P NMRピークを有するベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ) アセテートの異性体であってもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。化合物は、分析用HPLCを、Varian Pursuit XRs 5 C18, 150×4.6mmにおいて、３０分で100／１０から０／100へのH2O/CH3CNにて、１ml/分で溶離して実施した際に、保持時間12.58±0.10分を有するベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートの異性体でもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。
【００６１】
化合物は、ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートの異性体Ｂであってもよい。このように、化合物は、NMRスペクトルが、202MHz NMR装置において、CD3OD中で得られる際、3.57±0.04に31P NMRピークを有するベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートの異性体であってもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。化合物は、分析用HPLCを、Varian Pursuit XRs 5 C18, 150 x 4.6mmにおいて、３０分で100／１０から０／100へのH2O/CH3CNにて、１ml/分で溶離して実施した際に、保持時間12.88±0.10分を有するベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートアセテートの異性体でもよく、前記異性体は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形である。
【００６２】
本発明の第１の態様の前記の特別な具体例による化合物は、驚くべきことには、８−クロロアデノシンと比較して、増大された癌幹細胞の標的化を提供することを示した。
【００６３】
本発明の第２の態様によれば、治療方法における使用のための本発明の化合物が提供される。
【００６４】
特定の具体例では、癌の予防又は治療における使用のための本発明の化合物が提供される。
【００６５】
本発明の第３の態様によれば、癌の予防又は治療のための医薬の製造における、本発明の化合物の使用が提供される。
本発明の第４の態様によれば、癌を予防又は治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、本発明の化合物の効果的な用量を投与することを含んでなる方法が提供される。
【００６６】
本発明の第２、第３及び第４の態様は、それぞれ、他の癌治療と組み合わせて使用される癌を治療するための具体例を含んでなることができる。
【００６７】
他の癌治療の例としては、放射線療法及び／又は化学療法が含まれる。
【００６８】
本発明の第２、第３及び第４の各態様に関して、本発明の具体例は、血液腫瘍及び固形腫瘍から選ばれる癌を含んでなる。特に、癌は、白血病、多発性骨髄腫、肺癌、肝癌、乳癌、頭頚部癌、神経芽細胞腫、甲状腺癌、皮膚癌（メラノーマを含む）、口腔扁平上皮癌、膀胱癌、ライディッヒ細胞腫、結腸癌、結腸直腸癌、及び婦人科系の癌（卵巣癌、子宮癌、卵管癌及び子宮頸癌（上皮子宮頸癌を含む））からなる群から選ばれる。好適な具体例では、癌は白血病であり、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（急性ミエロイド白血病又は急性非リンパ性白血病としても知られている）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性ミエロイド白血病、慢性骨髄球性白血病、又は慢性顆粒球性白血病としても知られている）、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病、及びヘアリー細胞白血病からなる群から選ばれる。さらに好適な具体例では、癌は、急性リンパ性白血病である。
【００６９】
本発明を具現化する特定の化合物は、８−クロロアデノシンと比べて、白血病とともに、固形腫瘍の治療において増大された抗癌活性を有することが認められた。本発明の化合物による治療に適する固形腫瘍の例としては、乳癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、子宮頸癌、及びリンパ腫が含まれる。本発明の化合物による治療に適するリンパ腫の例としては、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれる。本発明の化合物による治療に適する白血病の例としては、ミエロイド白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、及び急性リンパ性白血病が含まれる。
【００７０】
本発明の化合物は、癌細胞に入り、細胞のRNA及び／又はDNAに組み入れられると考えられる。
【００７１】
いかなる理論によっても拘束されないが、本発明の化合物によって発揮される効力、特に抗癌効果は、本発明の化合物が８−クロロアデノシントリホスフェートにリン酸化されことを実証するものであり、トリホスフェートへのリン酸化前に、細胞内における酵素分解が、本発明に化合物を、直接、８−クロロアデノシンモノリン酸へ転化するものと考えられる。
【００７２】
本発明の化合物の抗癌能力は、さらに、その細胞膜透過性によるものと考えられる。
【００７３】
本発明は、癌幹細胞の標的化における使用のための本発明の化合物を提供する。
【００７４】
本発明は、癌幹細胞を標的とする医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【００７５】
本発明は、癌幹細胞を標的とする方法を提供するものであり、該方法は、癌幹細胞集団に、このような癌幹細胞を標的とするに十分な量の本発明の化合物を提供することを含んでなる。
【００７６】
本発明において言及する癌幹細胞を標的とすることは、癌の予防又は治療において使用される。このような具体例では、癌幹細胞集団は、このような標的化を必要とする患者において、癌又は前癌状態であり、当該方法は、患者に、治療上有効な量の本発明の化合物を投与することを含んでなる。
【００７７】
本発明は、抗−癌幹細胞薬としての使用のための本発明の化合物を提供する。この本発明の化合物の使用は、癌の予防又は治療においても使用される。
【００７８】
本発明は、癌患者又は前癌状態の患者が、本発明の化合物による予防又は治療から恩恵を受けるかどうかを決定する方法を提供するものであり、該方法は、患者における癌又は前癌状態を表す生体サンプルを、癌幹細胞の存在に関してアッセイすることを含んでなり、ここで、生体サンプルにおける癌幹細胞の存在は、患者が本発明の化合物による治療から恩恵を受けることを示す。
【００７９】
本発明は、癌患者又は前癌状態の患者のための好適な治療レジメンを決定する方法を提供するものであり、該方法は、患者における癌又は前癌状態を表す生体サンプルを、癌幹細胞の存在に関してアッセイすることを含んでなり、ここで、生体サンプルにおける癌幹細胞の存在は、好適な治療レジメンが、患者を本発明の化合物によって治療することを含んでなるものであることを示す。
【００８０】
本発明は、患者における癌又は前癌状態を表す生体サンプルを、癌幹細胞の存在に関してアッセイすることを含んでなる方法（ここで、生体サンプルにおける癌幹細胞の存在は、患者が本発明の化合物による治療に適していることを示す）によって治療が選択された患者における、癌の予防又は治療における使用のための本発明の化合物を提供する。
【００８１】
上記の方法は、さらに、本発明の化合物を使用する癌又は前癌状態の予防又は治療する工程を含むことができる。
【００８２】
本発明の方法の好適な具体例では、癌は、再発性又は難治性癌である。本発明の化合物は、このような再発性又は難治性癌の治療に使用される。
【００８３】
本発明は、対象における難治性癌の治療での使用のための本発明の化合物を提供する。対象は、ヒト患者であってもよい。
【００８４】
本発明は、ヒト患者における再発性又は難治性の治療のための医薬の製造における本発明の化合物を提供する。
【００８５】
本発明は、対象における再発性又は難治性癌の治療法を提供するものであり、該方法は、このような治療を必要とする対象に、治療上有効な量の本発明の化合物を提供することを含んでなる。
【００８６】
本発明の更なる態様によれば、予防又は治療法における使用のための本発明の化合物、予防又は治療法における使用のための医薬の製造における本発明の化合物の使用、及び患者の予防又は治療法であって、それを必要とする患者に、本発明の化合物を投与することを含んでなる方法（ここで、どの場合も、予防又は治療法は、骨髄異形成症候群の予防又は治療法を含んでなる）が提供される。
【００８７】
本発明の第５の態様によれば、薬学上許容されるキャリヤー、希釈剤、又は添加剤と組み合わせて、本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００８８】
本発明の第５の態様の特定の具体例によれば、薬学上許容されるキャリヤー、希釈剤、又は添加剤と組み合わせて、本発明の化合物及び第２の抗癌性化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００８９】
本発明の第６の態様によれば、本発明の化合物を、薬学上許容される添加剤、キャリヤー、又は希釈剤と合わせる工程を含んでなる医薬組成物の製法が提供される。
本発明の第７の態様によれば、式（II）
【化７】
2019520345.tif 000009
の化合物を、式（III）
【化８】
2019520345.tif 000010
の化合物と反応させることを含んでなる本発明の化合物の製法が提供される（ここで、Ar、R1、R2、R3、及びR4は、上記の意義を有し、及びここで、LGは離脱基である）。
【００９０】
好適な離脱基は、当業者には、よく知られているが、例えば、ハロゲン原子（例えば、Cl）、スルホネート、１以上の電子吸引性置換基で置換されたアリール基（例えば、フェニル）、又は１以上の電子吸引性置換基で置換されたヘテロアリール基（例えば、単環式C5員又はC6員ヘテロアリール基）が含まれる。好適な電子吸引性置換基としては、フッ素、塩素、ニトロ、シアノ、CO2-C1-C4アルキル、S(O)2-C1-C4アルキルが含まれる。好適な離脱基はClである。
【００９１】
式（I）の化合物を調製する方法は、好ましくは、好適な溶媒の存在下で行われる。
【００９２】
好適な溶媒としては、炭化水素溶媒、例えば、ヘキサン、ペンタン、シクロヘキサン、ベンゼン、及びトルエン；エーテルタイプ溶媒、例えば、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジフェニルエーテル、アニソール、及びジメトキシベンゼン；ハロゲン化炭化水素溶媒、例えば、塩化メチレン、クロロホルム、１,２−ジクロロエタン、及びクロロベンゼン；ケトンタイプ溶媒、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、及びメチルイソブチルケトン；アルコールタイプ溶媒、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、n-ブチルアルコール、及びt-ブチルアルコール；ニトリルタイプ溶媒、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、及びベンゾニトリル；エステルタイプ溶媒、例えば、酢酸エチル、及び酢酸ブチル；カーボネートタイプ溶媒、例えば、エチレンカーボネート、及びプロピレンカーボネート；等が含まれる。これらは、単独で使用され、又はその２以上を混合して使用される。
【００９３】
好ましくは、本発明の方法では、不活性溶媒が使用される。用語「不活性溶媒」とは、ここに合わせて記載する反応の条件下において不活性である溶媒を意味し、例えば、ベンゼン、トルエン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、塩化メチレン（又はジクロロメタン）、ジエチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトン、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、tert-ブタノール、ジオキサン、ピリジン、等を含む。
【００９４】
好ましくは、本発明の方法は、実質的に乾燥した条件下で行われる。
【００９５】
ホスホロクロリデートは、アリールオキシホスホロジクロリデート及び好適に保護化したアミノ酸誘導体から調製される。或いは、好適な縮合剤とともに、ホスフェート化学が使用される。
【００９６】
好ましくは、式（I）の化合物を調製する方法は、ホスホルアミデートが結合するもの以外のヌクレオシドにおいて、遊離のＯＨ基を保護する工程を含むことができる。
【００９７】
本発明の各種の態様は、本発明の化合物が、優先的に、癌幹細胞の数を低減できるとの知見に基づくものである。この知見は、癌幹細胞が多くの化学療法薬に対して耐性であることが知られており、本発明の化合物又は８−クロロアデノシン（本発明の化合物が誘導される親プロドラッグ化合物である）が癌幹細胞を標的化できるとの示唆が、以前にはなかった点で驚くべきことである。このように、本発明の化合物が、癌幹細胞を標的とすることができ、このようにして、その数を低減できるとの知見（発明者らは、広範囲の癌にわたって適用されることを確認している）は、本発明の化合物の新規の治療適用の範囲を可能にする驚くべきブレークスルーを示す。
【００９８】
本発明の化合物によって達成される生物活性は、それらが癌の治療において有用であることを表している。これらの活性は、癌の発生又は進行を阻害することにおいて有用であろう。特に、ここに開示する生物学的特性（これまでに報告されていない）は、これらの化合物が、再発性癌又は難治性癌の患者に効果的であと考えられる治療を提供できることを表している。本発明の化合物を使用するこの種の治療は、腫瘍サイズの減少及び／又は臨床的に関連するバイオマーカーの減少（いずれも、より有利な予後と関連する）をもたらすことができる。さらに、本発明の化合物による治療は、再発性癌又は難治性癌の患者において、腫瘍のサイズの低減を維持することに役立つことができる。従って、本発明の化合物を使用する治療は、再発性又は難治性癌の患者において、高度かつ恒久性の病勢コントロール率（DCR）を達成できる。
【００９９】
いかなる仮説によっても拘束されることを望まないが、発明者らは、癌幹細胞を標的化する本発明の化合物の能力が、再発性又は難治性癌の治療におけるこれら化合物の治療的有用性に寄与するものと考えている。
【０１００】
別に、文脈が要求する場合を除き、本明細書において、本発明に従って、本発明の化合物の「使用」についての言及は、ここに記載の本発明の化合物の医療での使用のいずれにも適用されるものとみなされる。同様に、本発明の化合物を使用する本発明の「方法」についての言及は、ここに記載の本発明の方法のいずれにも適用されるものとみなされる。
【０１０１】
癌幹細胞を標的化する本発明の化合物の能力は、治療が最も困難であると考えられ、及び多くの存在する癌治療の有効性を制限する抵抗性において重要な役割を果たすと考えられる癌幹細胞に対する新規の治療を提供する。この能力は、また、癌の発生、進行、再発及び増殖に関連すると考えられる細胞を標的化する方法を提供する。従って、本発明の化合物の抗−癌幹細胞活性は、新規かつ効果的な治療法が長期間模索されていた点で利益を生ずると認められるであろう。
【０１０２】
本発明の具体例を、添付図面を参照して、さらに、以下に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、急性骨髄性白血病細胞株KG1aにおける８−クロロアデノシン及び化合物Ｄ、Ｂ、及びＥに関するLD50値を比較する。すべてのデータが、３つの独立した実験の平均±標準偏差（±ＳＤ）である。
【図２】図２は、（i）において、８−クロロアデノシン及び化合物Ｄ、Ｂ、及びＥに関する個々のＳ字状用量反応曲線を示す。（ii）では、８−クロロアデノシン及び化合物Ｄに対する応答間の有意差（ｐ＜0.05）を強調するために、化合物Ｂ及びＥに関する用量曲線を削除している。
【図３】図３は、薬剤抵抗機構を模倣する、ヌクレオシドトランスポーター阻害剤NBTI及びアデノシンキナーゼ阻害剤A-134984の不存在下又は存在下における、白血病細胞HL-60における8-Cl-A（Ａ）、化合物Ａ（Ｂ）、化合物Ｂ（Ｃ）、及び化合物Ｄ（Ｄ）の細胞内濃度を示す。
【図４】図４は、阻害剤（NBTI、A-134984）の不存在下又は存在下における、白血病細胞CTBにおける8-Cl-A（Ａ）、化合物Ａ（Ｂ）、化合物Ｂ（Ｃ）、及び化合物Ｄ（Ｄ）の細胞内濃度を示す。
【図５】図５は、阻害剤（NBTI、A-134984）の不存在下又は存在下における、白血病細胞K-562における8-Cl-A（Ａ）、化合物Ａ、Ｂ、及びＤの細胞内濃度を示す。
【図６】図６は、アデノシンデアミナーゼ阻害剤EHNAの不存在下又は存在下における、ヒト血漿における8-Cl-A（Ａ）、化合物Ａ、Ｂ、及びＤの安定性（μg/ml）を示す。
【図７】図７は、化合物Ｅ、及び化合物Ｂ及びＤの異性体（Ａ及びＢ）、及び化合物ＡＣに関する個々のＳ字状用量反応曲線を示す。
【図８】図８は、化合物Ｅ、及び化合物Ｂ及びＤの異性体（Ａ及びＢ）、及び化合物ＡＣの癌幹細胞を選択的に標的とする能力を調査する研究の結果を示す。
【図９】図９は、(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート：Ａ）両異性体；Ｂ）異性体Ａ；及びＣ）異性体Ｂに関するHPLCトレースを示す。
【図１０】図１０は、ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテート：Ａ）両異性体；Ｂ）異性体Ａ；及びＣ）異性体Ｂに関するHPLCトレースを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
Arにおける置換基は、芳香族基のいずれの位置にも配置され、ここで、Arは６員環であり、置換基は、オルト−、メタ−、又はパラ−に配置される。Arにおける置換基は、独立して、ヒドロキシル、C1-6アシル、C1-6アシルオキシ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、C2-6エステル、C1-6アルデヒド、シアノ、C1-6アルキルアミノ、ジC1-6アルキルアミノ、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C1-6アルコキシC1-6アルキル、C1-6アルコキシC6-10アリール、C5-7シクロアルキル、C5-11シクロアルキルC1-6アルキル、C5-7シクロアルケニル、C8-12シクロアルキニル、C6-11アリールC1-6アルキル、C1-6アルキルC6-11アリール、C6-11アリール、C1-6フルオロアルキル、C2-6フルオロアルケニル、SO3H、SH、及びSR’（ここで、R’は、独立して、式（I）に関するR1と同一の基から選ばれる）からなる群から選ばれる。代表的には、各置換基は、それ自体は、未置換である。しかし、各置換基は、任意に、いずれかの他の置換基、例えば、上述置換基から選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基によって置換されていてもよい。
【０１０５】
R1、R2、R3、及びR4における置換基は、独立して、ヒドロキシル、C1-6アシル、C1-6アシルオキシ、ニトロ、アミノ、アミド、カルボキシ、C2-6エステル、C1-6アルデヒド、シアノ、C1-6アルキルアミノ、ジC1-6アルキルアミノ、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、C5-7シクロアルキル、C5-7シクロアルケニル、C8-12シクロアルキニル、C6-11アリールC1-6アルキル、C5-20複素環、SO3H、SH、及びSR’（ここで、R’は、独立して、式（I）に関するR1と同一の基から選ばれる）からなる群から選ばれる。代表的には、各置換基は、それ自体は、未置換である。しかし、各置換基は、任意に、いずれかの他の置換基、例えば、上述置換基から選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基によって置換されていてもよい。
【０１０６】
ここで使用するように、用語「アルキル」は、表示するような炭素数を有し（非環式アルキル基は、１〜２０、１〜１８、１〜１０、１〜６、又は１〜４個の炭素原子を有する）、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在しうる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換される、直鎖状又は分枝状、飽和、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の非環式炭化水素基を意味する。各アルキル基は未置換であってもよい。非限定的な例として例示すれば、アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ノニル、及びドデシルが含まれる。
【０１０７】
ここで使用するように、用語「シクロアルキル」は、表示するような炭素数を有し（シクロアルキル基は、３〜２０、３〜１０、又は３〜７の炭素数を有する；環状アルケニル基は、３〜２０又は５〜７個の炭素原子を有することができる；環状のアルキニル基は、８〜２０個の炭素原子を有することができる）、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在できる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換される、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の環式炭化水素基を意味する。シクロアルキル基は、飽和又は部分的に飽和であってもよく、このように、用語「シクロアルキル」は、シクロアルケニル基及びシクロアルキニル基を包含する。シクロアルキル基は、未置換であってもよい。非限定的な例として例示すれば、シクロアルキル基としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、及びシクロオクテニルが含まれる。
【０１０８】
ここで使用するように、用語「アルケニル」は、１以上のＣ=Ｃ二重結合を有し、表示するような炭素数を有し（又は、表示しない場合は、非環式アルケニル基は、２〜２０、２〜１０、２〜６、又は２〜４個の炭素原子を有する）、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在しうる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換される、直鎖状又は分枝状、不飽和、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の非環式炭化水素基を意味する。アルケニル基は、未置換であってもよい。非限定的な例として例示すれば、アルケニル基としては、ビニル、プロぺニル、ブテニル、ペンテニル、及びヘキセニルが含まれる。
【０１０９】
ここで使用するように、用語「アルキニル」は、１以上のＣ≡Ｃ三重結合を有し、表示するような炭素数を有し（又は、表示しない場合には、非環式アルキニル基は、２〜２０、２〜１０、２〜６、又は２〜４個の炭素原子を有する）、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在しうる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換される、直鎖状又は分枝状、不飽和、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の非環式炭化水素基を意味する。アルキニル基は、未置換であってもよい。非限定的な例として例示すれば、アルキニル基としては、-C≡CH、-CH2-C≡CH、-C≡C-CH2、-CH2-CH2-C≡CH、-CH2-C≡C-CH3 及び-CH(CH3)-C≡CHが含まれる。
【０１１０】
ここで使用するように、用語「アルコキシ」は、アルキル-O-基（ここで、アルキルは上記の定義の通りであり、アルキル部分は、アルキルについて上述したような１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい）を意味する。アルコキシ基は、未置換であってもよい。結合は-O-を介する。非限定的な例として例示すれば、アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、iso-プロポキシ、n-ブトキシ、iso-ブトキシ、n-ペントキシ、n-ヘキソキシ、及び１,２−ジメチルブトキシが含まれる。
【０１１１】
ここで使用するように、用語「アリールオキシ」は、アリール-O-基（ここで、アリールは上記の定義の通りであり、アリール部分は、基Ａｒについて上述したような１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい）を意味する。アリール基は、未置換であってもよい。結合は-O-を介する。非限定的な例として例示すれば、アリールオキシ基としては、フェニルオキシ、及びナフチルオキシが含まれる。
【０１１２】
ここで使用するように、用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ置換基を有するアルキル基を意味する。結合はアルキル基を介する。アルキル部分及びアルコキシ部分は、それぞれ、アルキル及びアルコキシの定義についてここで定義した通りである。アルコキシ及びアルキル部分は、それぞれ、アルキルの定義について上述したような１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。アルコキシアルキル基は、未置換であってもよい。非限定的な例として例示すれば、アルコキシアルキル基としては、-CH2-O-CH3、-CH2CH2-O-CH3及び-CH2-O-CH2CH3が含まれる。
【０１１３】
ここで使用するように、用語「アリールアルキル」は、アリール置換基を有するアルキル基を意味する。結合はアルキル基を介する。アリール部分及びアルキル部分は、それぞれ、アリール及びアルキルの定義についてここで定義した通りである。アリール及びアルキル部分は、それぞれ、１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよく、置換基は、アリール及びアルキルについて存在し得る置換基の定義についてここで定義する通りである。アリールアルキル基は、未置換であってもよい。好ましい具体例では、アリールアルキルは、ベンジル（Ph-CH2-）である。
【０１１４】
ここで使用するように、用語「アルコキシアリール」は、アルコキシ置換基を有するアリール基を意味する。結合はアリール基を介する。アルコキシ部分及びアリール部分は、それぞれ、アルコキシ及びアリールの定義についてここで定義した通りである。アルコキシ及びアリール部分は、それぞれ、１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよく、置換基は、アルコキシ及びアリールについて存在し得る置換基の定義についてここで定義する通りである。１具体例では、アルコキシアリールは未置換である。
【０１１５】
ここで使用するように、用語「シクロアルキルアリール」は、環状のアルキル置換基を有するアリール基を意味する。結合はアリール基を介する。シクロアルキル部分及びアリール部分は、それぞれ、シクロアルキル及びアリールの定義についてここで定義した通りである。シクロアルキル部分及びアリール部分は、それぞれ、シクロアルキル及びアリールの定義についてここで定義したように、１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。シクロアルキルアリール基は、未置換であってもよい。
【０１１６】
ここで使用するように、用語「アリール」は、１、２、３、４、５、又は６個の環を有し、表示するような炭素数を有する（又は、表示しない場合は、炭素原子６〜３０、６〜１２、又は６〜１１個）、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の芳香族（すなわち、環システムは、環（共役πシステムに寄与する全ての原子が同一平面内にある）内の共役πシステムにおいて、４ｎ＋２個の電子を有する）の炭素環式基を意味する。好適な具体例は、１、２、又は３個の環を有する。アリール基は、Arに存在し得る任意の置換基について上述したように、１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。好適な具体例では、アリール基としては、炭素原子６個を含有する芳香族単環式環；炭素原子７、８、９、又は１０個を含有する芳香族縮合二環式環、又は炭素原子１０、１１、１２、１３、又は１４個を含有する芳香族縮合三環式環が含まれる。好適な具体例では、アリール基の任意の置換基は、ヒドロキシル、C1-6アシル、C1-6アシルオキシ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、シアノ、C1-6アルキルアミノ、ジC1-6アルキルアミノ、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、SO3H、SH、及びSR’（ここで、R’は、独立して、式（I）に関するR1と同一の基から選ばれる）からなる群から選ばれる。アリール基は未置換であってもよい。
【０１１７】
ここで使用するように、用語「m-nヘテロアリール」は、１、２、３、４、５、又は６個の環を有し、少なくとも１個の環内に、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、１、２、又は３個のヘテロ原子）を含有する、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）、不飽和の芳香族（すなわち、環システムは、環（共役πシステムに寄与する全ての原子が同一平面内にある）内の共役πシステムにおいて、（４ｎ＋２）π−又はｎ−電子を有する）の複素環基を意味する。好適な具体例は、１、２、又は３個の環を有する。環システムにおける利用可能な炭素原子及び／又はヘテロ原子は、Ar基に存在し得る置換基について上述したように、１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。好適な具体例では、ヘテロアリール基は未置換である。ヘテロアリール基としては、５個の環メンバー（その内の、少なくとも１個の環メンバーは、Ｎ、Ｏ、又はＳ原子であり、任意に、１、２、又は３個の追加の環Ｎ原子を含有する芳香族単環式環システム；６個の環メンバー（その内の、１、２、又は３個の環メンバーはＮ原子である芳香族単環式環（この明細書では、６員単環式ヘテロアリール基とも称する）；９個の環メンバー（その内の少なくとも１個の環メンバーは、Ｎ、Ｏ、又はＳ原子であり、任意に、１、２、又は３個の追加の環Ｎ原子を含有する芳香族二環式縮合環システム（本明細書では、９員二環式ヘテロアリール基との称する）；又１０個の環メンバー（その内の１、２、又は３個の環メンバーはＮ原子である芳香族二環式縮合環システム（本明細書では、１０員−二環式ヘテロアリール基との称する）が含まれる。例としては、ピロール、フラン、チオフェン、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、トリアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾキサゾール、ベンズトリアゾール、ベンズイソキサゾール、プリン、キノリン、イソキノリン、シンオリン、キナゾリン、キノキサリン、プテリジン、フタラジン、ナフチリジンが含まれるが、これらに限定されない。好適な例としては、ピリジル及びキノリルが含まれる。
【０１１８】
ここで使用するように、用語「m-nヘテロシクロアルキル」は、ｍ〜ｎ個の環メンバー（少なくとも１個の環メンバー（例えば、１、２、又は３個の置換基）は、Ｎ、Ｏ、及びＳからなる群から選ばれる）を有する１価（別に、文脈が要求する場合を除く）、飽和又は部分的に不飽和の複素環を意味し、１、２、３、４、５、又は６個の環の形である。好適な具体例では、基は、１、２、又は３個の環を有する。好適な具体例では、基は５〜１０個の環メンバーを有する。ヘテロシクリル基としては、５個の環メンバー（その内の少なくとも１個の環メンバーは、Ｎ、Ｏ、又はＳ原子である）を有する単環式環システム（任意に、１個の追加のＯ原子、又は１、２、又は３個の追加の環Ｎ原子を含有する）；６個の環メンバー（その内の１、２、又は３個の環メンバーはＮ原子である）を有する単環式環システム（任意にＯ原子を含む）；９個の環メンバー（その内の少なくとも１個の環メンバーは、Ｎ、Ｏ、又はＳ原子である）を有する二環式縮合環システム（任意に、１、２、又は３個の追加の環Ｎ原子を含有する）；又は１０個の環メンバー（その内の１、２、又は３個の環メンバーはＮ原子である）を有する二環式縮合環システムが含まれる。例としては、アゼチジニル、ピロリニル、ピロリジニル、１,３−ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、又はピペラジニルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
上記の「ヘテロシクロアルキル」環システムの利用できる環炭素原子及び／又は環ヘテロ原子は、１、２、３、４、又は５個の置換基にて置換されてもよい。環が１以上のヘテロ原子で置換される場合には、ヘテロ原子置換基は、ハロゲン（Ｆ、Cl、Br、及びＩ）から、又は酸素、窒素、及びイオウから選ばれる（ここで、酸素、窒素、又はイオウは置換基部分の一部を形成する）。環が１以上のヘテロ原子にて置換される場合、好ましくは、酸素、窒素、イオウ、及びハロゲンからなる群から選ばれる１、２、３、又は４個のヘテロ原子置換基が存在する。複素環システムに存在できる置換基の例としては、独立して、ヒドロキシル、C1-6アシル、C1-6アシルオキシ、ニトロ、アミノ、カルボキシル、シアノ、C1-6アルキルアミノ、ジC1-6アルキルアミノ、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、SO3H、SH及びSR’（ここで、R’は、独立して、式（I）に関するR1と同一の基から選ばれる）から選ばれる。１具体例では、ヘテロシクリルは未置換である。
【０１２０】
ここで使用するように、用語「アシル」は、-C(=O)-を含み（ここで、結合は、-C(=O)-の-C-原子を介する）、表示するような炭素数を有する（又は表示しない場合には、アシル基は、１〜６、又は１〜４、又は１〜２個の炭素原子を有する（-C(=O)-のＣ原子を含む））、直鎖又分枝状、飽和又は不飽和、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の基を意味する。アシルは、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在できる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。アシル基は未置換でもよい。非限定的な例として例示すれば、アシル基としては、HC(=O)-、CH3C(=O)-、C2H5C(=O)-、C3H7C(=O)-、C4H9C(=O)-、及びC5H11C(=O)-が含まれる。
【０１２１】
ここで使用するように、用語「アシルオキシ」は、-C(=O)-を含み（ここで、結合は、-C(=O)-の-C-原子を介する）、表示するような炭素数（-C(=O)-のＣ原子を含む）を有する（又は表示しない場合には、アシル基は、１〜６、又は１〜４、又は１〜２個の炭素原子を有する（-C(=O)-のＣ原子を含む））、直鎖又分枝状、飽和又は不飽和、置換又は未置換、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の基を意味する。アシルオキシは、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在できる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。アシル基は未置換でもよい。非限定的な例として例示すれば、アシル基としては、HC(=O)-O-、CH3C(=O)-O-、C2H5C(=O)-O-、C3H7C(=O)-O-、C4H9C(=O)-O-、及びC5H11C(=O)-O-が含まれる。
【０１２２】
ここで使用するように、用語「C2-6エステル」は、R18C(=O)-O-R19（ここで、R18は、H及びC1-4アルキルからなる群から選ばれ、及びR19は、C1-5アルキルからなる群から選ばれる（ただし、R18C(=O)-O-R1のＣ原子の最大総数（-C(=O)-O-のＣ原子を含む）が６であることを条件として））を含んでなる置換又は未置換、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の基を意味する。結合は、R18又はR19を介し（各基のＨが存在せず、結合が生ずるアルキル基が２価である場合）、又はR18がＨである場合には、-C(=O)-Oを介する。好適な具体例では、C2-6エステル（-C(=O)-O-のＣ原子を含む）は２〜５個の炭素原子を有する。C2-6エステルは、任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在できる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。特別な具体例では、C2-6エステルは未置換である。非限定的な例として例示すれば、C2-6エステルは、-C2H4-C(=O)-O-C2H5（ここで、-C2H4-は-CH2-CH2-であり、及び結合は-C2H4-を介する）である。
【０１２３】
ここで使用するように、用語「アルデヒド」は、HC(=O)-R20を含んでなる直鎖又は分枝状、飽和又は不飽和、置換又は未置換、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の基（ここで、結合は-R20-を介する）を意味する。「アルデヒド」は、表示する炭素数（-C(=O)-のＣ原子を含む）を有し（又は表示しない場合には、アルデヒド基は、１〜６、又は１〜４、又は１〜２個の炭素原子（-C(=O)-のＣ原子を含む）を有する）、及び任意に、R1、R2、R3、及びR4に存在できる置換基について上述した群から独立して選ばれる１、２、３、４、又は５個の置換基（例えば、１、２、又は３個の置換基）にて置換されてもよい。アルデヒド基は未置換でもよい。非限定的な例として例示すれば、アルデヒド基としては、HC(=O)-CH2-、HC(=O)-C2H4-、HC(=O)-C3H6-、HC(=O)-C4H8-、及びHC(=O)-C5H10-が含まれる。
【０１２４】
ここで使用するように、用語「フルオロアルキル」は、１〜６個のＦ原子で置換されたアルキル基を意味し、ここで、アルキニル基は、表示する炭素数を有する（又は表示しない場合には、非環式アルケニル基は、１〜６又は１〜４個の炭素原子を有し、及び環状アルキル基は４〜６個の炭素原子を有する）直鎖又は分枝状、飽和、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の環状又は非環式炭化水素基である。非限定的な例として例示すれば、フルオロアルキル基としては、-CF3、-CHF2及び-CF2-CF3が含まれる。
【０１２５】
ここで使用するように、用語「フルオロアルケニル」は、１〜６個のＦ原子で置換されたアルケニル基を意味し、ここで、アルケニル基は、表示する炭素数を有する（又は表示しない場合には、非環式アルケニル基は、２〜６、又は２〜４個の炭素原子を有し、及び環状アルキル基は４〜６個の炭素原子を有する）直鎖又は分枝状、不飽和、１価（別に、文脈が要求する場合を除く）の非環式又は環状炭化水素基である。
【０１２６】
ここで使用するように、用語「立体異性体」は、結合の同一の配列によって結合された同一の原子からなるが、異なった三次元構造を有する（本発明の化合物も有する）すべての可能な化合物を定義する。
【０１２７】
本発明の化合物は、少なくとも１個のキラル中心を有し、従って、鏡像異性体として存在する。化合物が２つ以上のキラル中心を有する場合、化合物は、さらに、ジアステレオ異性体として存在する。本発明による化合物の製法により立体異性体の混合物が生ずる場合には、これらの異性体は、分取クロマトグラフィーのような一般的技術によって分離される。化合物は、立体化学的に混合した形で調製されるか、又は個々の鏡像異性体は、当業者に知られた標準的な技術、例えば、エナンチオ特異的合成又はラセミ分割、任意に、活性な酸との塩形成、続く、遊離塩基の分別結晶及び再生によって調製される。化合物は、ジアステレオ異性的エステル又はアミドの形成、続く、キラル補助のクロマトグラフ分離及び除去によっても、ラセミ分割される。或いは、化合物は、キラルHPLCカラムを使用してラセミ分割される。このような異性体及びその混合物はすべて、本発明の範囲内に包含されることが理解されなければならない。
【０１２８】
ホスフェート中心は、本発明の化合物においてキラルであり、化合物は、Rp及びSpジアステレオ異性体として存在できる。化合物の生成物は、Rp及びSpジアステレオ異性体の混合物であるか、又は１つの純粋なジアステレオ異性体でもよい。好適な具体例では、化合物は、実質的にジアステレオ異性的に純粋な形のRp又はSpのいずれかである。本明細書を通して、「実質的にジアステレオ異性的に純粋な形」とは、化合物が、Rp又はSpのいずれかのジアステレオ異性体９０％以上からなるものであることを意味する。他の具体例では、Rp：Spジアステレオ異性体の１：１混合物も存在する。或いは、化合物は、
Rp：Spジアステレオ異性体の比１：９０〜９０：１、１：５０〜５０：１、１：２０〜２０：１、１：１５〜１５：１、１：１０〜１０：１、１：９〜９：１、１：８〜８：１、１：７〜７：１、１：６〜６：１、１：５〜５：１、１：４〜４：１、１：３〜３：１、又は１：２〜２：１のRp及びSpジアステレオ異性体の混合物を含んでなることもできる。好適な具体例では、本発明の化合物は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、 １：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：５０、１：９０、１：９５又は１：９９又はその逆より大のRp：Spジアステレオ異性体の比を有することができる。
【０１２９】
式（I）の化合物はRpジアステレオ異性体であってもよい。式（I）の化合物は、少なくとも９８質量％のRpジアステレオ異性体からなることができる。式（I）の化合物はSpジアステレオ異性体であってもよい。式（I）の化合物は、少なくとも９８質量％のSpジアステレオ異性体からなることができる。
【０１３０】
用語「溶媒和化合物」は、結晶格子に好適な溶媒の分子が組み込まれた、ここで定義する式（I）の化合物を意味する。好適な溶媒は、薬剤投与にあたり、生理的に耐性である。好適な溶媒の例は、エタノール、水、等である。溶媒が水である場合、分子は水和物と称される。
【０１３１】
本発明の化合物は、薬学上許容される塩の形で存在することもできる。医薬品での使用について、本発明の化合物の塩を、「薬学上許容される塩」と称する。FDAが認可している薬学上許容される塩の形としては、薬学上許容される酸性／アニオン性及び／又は塩基性／カチオン性塩が含まれる（International J. Pharm. 1986, 33, 201-217; J. Pharm. Sci., 1977, Jan., 66 (1)参照）。
【０１３２】
薬学上許容される酸性／アニオン性塩としては、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、酒石酸水素塩、臭化水素酸塩、エデト酸カルシウム塩、 カンシラート塩、炭酸塩、塩化物塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート塩、エシレート塩、フマル酸塩、グリセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、ヘキシルレゾルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物塩、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、及びトリエチイドダイド（triethiodide）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
薬学上許容される塩基性／カチオン性塩としては、アルミニウム塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、クロロプロカイン塩、コリン塩、二エタノールアミン塩、エチレンジアミン塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、プロカイン塩、ナトリウム塩、及び亜鉛塩が含まれる。
【０１３４】
本発明は、その範囲内に、本発明の化合物のプロドラッグを包含する。一般に、このようなプロドラッグは、インビボで、所望の化合物に容易に変換される化合物の官能性誘導体である。このように、本発明の治療方法において、用語「投与すること」とは、記載する各種の疾患障害を、具体的に開示する化合物での、又は具体的には開示されていないが、対象に投与後、インビボで、特定の化合物に変換される化合物での治療を包含する。好適なプロドラッグ誘導体の選択及び調製のための一般的な方法は、例えば、「プロドラッグのデザイン」, H. Bundgaard編、Elsevier, 1985に記載されている。
【０１３５】
式（I）の化合物のプロドラッグの例は、式（I）の化合物のエステル及びアミドである。例えば、式（I）の化合物がカルボキシル基（-COOH）を含有する場合、カルボキシル基の水素原子は、エステルを形成するために置き換えられる（例えば、水素原子は、C1-6アルキルによって置き換えられる）。式（I）の化合物がアルコール基（-OH）を含有し得る場合、アルコール基の水素原子は、エステルを形成するために置き換えられる（例えば、水素原子は、-C(O)C1-6アルキルによって置き換えられる）。式（I）の化合物が１級又は２級アミノ基を含有する場合、アミノ基の１以上の水素原子は、アミドを形成するために置き換えられる（例えば、１以上の水素原子が、-C(O)C1-6アルキルによって置き換えられる）。本発明による使用のための医薬組成物は、薬学上使用される製剤への活性物質の加工を容易にする添加剤及び補助剤を含んでなる１以上の生理学的に許容されるキャリヤーを使用して、一般的な様式で処方される。これらの医薬組成物は、それ自体公知の様式で、例えば、一般的な混合、溶解、整粒、糖衣錠製造、摩砕，乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥法によって製造される。適切な処方は、選択する投与ルートに左右される。
【０１３６】
本発明による化合物又は組成物は、各種の好適な手段によって、患者（ヒト又は他の動物）に投与される。
【０１３７】
本発明で使用される薬は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、エアーウエイ（エーロゾル）、直腸、膣内、及び局所（バッカル及び舌下を含む）投与を含む経口又は非経口ルートによって投与される。
【０１３８】
経口投与について、本発明の化合物は、一般に、錠剤又はカプセルの形で、粉末又は顆粒として、又は水溶液又は懸濁液として提供される。
【０１３９】
経口使用のための錠剤は、薬学上許容される添加剤、例えば、不活性な希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味料、香料、着色料、及び保存料と混合された活性成分を含むことができる。好適な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム、及び乳糖が含まれ、一方、コーンスターチ及びアルギン酸は好適な崩壊剤である。結合剤としては、デンプン及びゼラチンが含まれ、一方、存在する場合、滑沢剤は、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクである。必要であれば、錠剤を、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリンのような物質にて被覆して、消化管における吸収を遅らせることができる。
【０１４０】
経口用のカプセルとしては、硬ゼラチンカプセル（内部で、活性成分が固体希釈剤と混合される）、及び軟ゼラチンカプセル（内部で、活性成分が、水、又は落花生油、液体パラフィン、又はオリーブ油のような油と混合される）が含まれる。
【０１４１】
直腸内投与用の処方は、例えば、カカオ脂又はサリチル酸エステルを含んでなる好適な基剤を含む坐剤として提供される。
【０１４２】
膣内投与に適する処方は、活性成分に加えて、当分野において、好適であるとして知られているようなキャリヤーを含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、泡沫、又はスプレー剤として提供される。
【０１４３】
筋肉内、腹腔内、皮下、及び静脈内投与については、本発明の化合物は、一般に、好適なpH及び等張性に緩衝化した無菌の水溶液又は懸濁液として提供される。好適な水性ビヒクルとしては、リンゲル溶液及び等張食塩水が含まれる。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、及びトラガントゴムのような懸濁剤、及びレシチンのような湿潤剤を含むことができる。水性懸濁液用の好適な保存料としては、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル及びｎ-プロピルが含まれる。
【０１４４】
処方（及び特に、静脈内投与用の処方）は、極性の非プロトン性有機溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）、Ｎ-メチルピロリジノン（NMP）、又はＮ,Ｎ-ジメチルアセトアミド（DMA）を含んでなる。処方（例えば、静脈内投与用の処方）は、DMAを含んでなる。
【０１４５】
本発明の化合物は、リポソーム製剤としても提供される。
【０１４６】
一般に、好適な用量は、０.１〜350 mg/Kg（レシピエントの体重）/１日の範囲である。より好適な用量は、０.５〜150 mg/Kg（レシピエントの体重）/１日の範囲、０.５〜100 mg/Kg（レシピエントの体重）/１日の範囲、１〜５０mg/Kg（レシピエントの体重）/１日の範囲、又は１〜１０mg/Kg（レシピエントの体重）/１日の範囲である。好適なより少ない用量は、０.５mg/Kg（レシピエントの体重）/１日、又は１mg/Kg（レシピエントの体重）/１日である。或いは、好適な用量は、１〜100 mg/m2（レシピエントの体表面積）/１日の範囲、又は５〜５０mg/m2（レシピエントの体表面積）/１日の範囲である。好適な用量は、６、１２、２４、又は４８mg/m2（レシピエントの体表面積）/１日でもよい。所望の用量は、シングル日用量として、又は１日を通して好適な間隔で投与される２、３、４、５、又は６回以上のサブ用量として提供され、投与される。用量は、例えば、単位剤形当たり、活性成分１０〜1500 mg、好ましくは、２０〜1000 mg、及び最も好ましくは、５０〜700 mgを含有する単位剤形として投与される。１日当たりの総用量は、シングル日用量として、又は１日を通しての一定間隔でのサブ用量としてにかかわらず、適宜、1000〜3000 mgである。
「癌幹細胞」
癌幹細胞（他に、しばしば、「腫瘍始原細胞」と称される）は、当業者にとっては周知である。ここで使用するように、用語「癌幹細胞」とは、その広く許容されている意味に従って、非対称性分裂を介して自己再生し、腫瘍形成を開始し、及び分化によって、より成熟した非−幹細胞癌子孫を生じさせる能力を有する細胞であると解釈される。
【０１４７】
癌幹細胞は、癌の発生、進行、再発及び増殖において重要な役割を果たす。従って、本発明の化合物が、癌幹細胞を標的とし、これによって、その数を低減できるとの知見は、これらの活性を予防又は治療することにおける治療上の可能性を提供する。
【０１４８】
明細書の他の部分において詳しく検討するように、癌幹細胞は、前癌状態で認められ、その存在が、このような状態を癌に進行させることに寄与すると考えられる。従って、本発明の治療方法及び医薬の使用（癌細胞を標的化するために、本発明の化合物が使用される）は、前癌状態（例えば、骨髄異形成症候群、又は明細書の他の部分で考察する他の状態）の癌幹細胞の数を低減し、このようにして、このような前癌状態の癌への進行を阻止するために使用される。
【０１４９】
上記のように、癌幹細胞の非対称性細胞分裂は、分化した非−幹癌細胞を生じさせる。このように、癌幹細胞は、腫瘍の大部分の形成及び維持を担当する。
【０１５０】
このような非−幹癌細胞の蓄積は、癌の進行に大きな役割を果たす。本発明化合物による癌幹細胞の標的化は、癌幹細胞の数を低減でき、続いて、非−幹癌細胞子孫の数を低減する。このように、本発明による治療方法及び本発明の化合物の医療での使用は、癌の進行を阻止することによって、癌治療において利益が得られる。このような具体例は、本明細書における他の部分において、より詳しく記載されている。
【０１５１】
癌幹細胞は、寛解後における癌の再発の原因となる癌細胞のリザーバーとして作用できる。患者の癌細胞の大部分が除去され（例えば、手術、放射線治療、又は化学療法の単独又は組み合わせによって）、その結果、癌の兆候が観察されないままである場合でも、癌幹細胞の持続した存在は、経時的に癌の再発の核となることがある。本発明の化合物による癌幹細胞の標的化は、癌幹細胞の数を低減させ、癌幹細胞を死滅させる新たなモードを提供する。従って、及び明細書の他の部分において詳しく検討するように、好適な具体例では、本発明は、本発明の化合物が癌の再発を予防又は遅らせる方法及び医療での使用を提供する。
【０１５２】
さらに、癌の位置から身体内の他の位置への癌幹細胞の移動は、例えば、転移を生じさせることによって、癌の増殖に寄与する。その結果、本発明の化合物の癌幹細胞を標的とする能力は、癌の増殖の予防及び治療における新規の治療方法及び医療での使用を提供する。
【０１５３】
その生物学的活性に加えて、癌幹細胞は、特定の特徴的な細胞表面マーカーの発現によって同定される。血液系腫瘍において同定されている癌幹細胞は、代表的には、CD34+であり、一方、固形腫瘍では、CD44+、CD133+、及びCD90+が、癌幹細胞マーカーとして同定されている。下記の表は、既知の癌幹細胞表面マーカーの例を要約するものである。これらの形の癌幹細胞の各々が、本発明に従って、本発明の化合物を使用して標的化され、本発明の化合物を使用する方法及び使用は、これらのマーカーセットのいずれかを発現する癌幹細胞と関連する癌の予防又は治療において使用される。
【０１５４】
【表１】
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【０１５５】
実施例に示すデータは、本発明の化合物が、白血病幹細胞株の癌幹細胞、特に、急性骨髄性白血病細胞株KG1aに存在する癌幹細胞を標的とすることができることを証明している。この細胞株は、本発明の化合物によって標的とされる、はっきりと異なった免疫表現型（Lin-/CD34+/CD38-/CD123+）を有するマイナーの幹細胞様コンパートメントを明示する。従って、本発明によれば、本発明の治療方法及び本発明の化合物の医療における使用は、白血病又はこれらの特徴的なマーカーを発現する癌幹細胞に関連する他の癌の予防又は治療のために使用される。
【０１５６】
本発明は、患者の癌又は前癌状態を表す生体サンプルにおける癌幹細胞の存在の同定に基づき、本発明の化合物を使用して、癌の予防又は治療のために、患者を選別する方法及び医療での使用も提供する。上述のマーカーセットは、本発明のこのような具体例に従って、癌幹細胞の存在を同定するために使用される好適な例を提供する。生体サンプルにおいて、これらのマーカーの発現を検査できる好適な技術は、さらに、本明細書の他の部分において検討している。
【０１５７】
「癌幹細胞の標的化」
本発明は、本発明の化合物が癌幹細胞の標的化に使用されるとの第１の指示を提供する。癌幹細胞を標的とする本発明の化合物の能力は、本明細書に開示する実施例において説明する。
【０１５８】
実施例から、本発明の化合物が癌幹細胞を含有する癌細胞集団に提供される際、存在する癌幹細胞を標的とし、これにより、癌細胞の総数及び癌幹細胞の表現型マーカーを示す総癌細胞の割合が低減されることが理解される。
【０１５９】
親プロドラッグ化合物８−クロロアデノシンは、特定の、より高い濃度で、癌幹細胞を標的とすることができるが、本発明の化合物は、広範囲の濃度にわたって、このような標的化を達成する能力を示す。とりわけ、インビトロ研究（その結果を本願において報告する）は、本発明の化合物が、低濃度において、８−クロロアデノシンよりも効果的に、癌幹細胞を標的とすることができることを示している。１×１０−６〜５×１０−６の範囲の濃度では、癌幹細胞の標的化における改善は、本発明の化合物にて処置した細胞集団において残留する癌幹細胞の割合が、８−クロロアデノシンで処置した細胞集団についてよりも有意に低くなることである。低い細胞毒性薬剤濃度において、癌幹細胞の効果的な標的化を達成できる能力は、望ましくない副作用の可能性を低減できるため、一般的に望ましいことが理解されるであろう。
【０１６０】
本発明の化合物は、癌細胞に入り込み、核酸（RNA及び／又はDNA）に組み込まれると考えられる。理論によって拘束されるものではないが、本発明の化合物によって発揮される効力、特に、抗癌効力は、本発明の化合物がリン酸化されて、８−クロロアデノシントリホスフェートとなることを証明しており、トリホスフェートへのリン酸化に先立って、細胞内での酵素的開裂により、本発明の化合物が、直接、８−クロロアデノシンモノホスフェートに転化されると考えらえる。
【０１６１】
また、本発明の化合物は、増大された細胞膜透過性を有する（８−クロロアデノシンと比べて）と考えられ、これは、本発明の化合物が誘導された親と比べて、本発明の化合物の増大された抗癌能力に寄与すると考えられる。
【０１６２】
いかなる仮説によっても拘束されることを望まないが、発明者らは、癌幹細胞数の減少が、癌細胞集団の中の癌幹細胞の標的化死滅の結果として生ずると考えている。すなわち、本発明の化合物は、非−幹癌細胞の死滅と比べて、優先的に、癌幹細胞を死滅させることが明らかであり、これによって、癌幹細胞の死滅、及び総癌細胞集団の中の癌幹細胞の割合の低減を生ずる。
【０１６３】
発明者らは、本発明の化合物が、非−幹癌細胞と比べて、優先的に癌幹細胞を死滅させると考えているが、本発明の化合物のこれら細胞の標的化によって生ずる癌幹細胞の割合の低減には、他の機構も寄与しているであろう。
【０１６４】
単に例示すれば、本発明の化合物での治療は、癌幹細胞の分化における増大を生じ、これによって、癌幹細胞の数、及び癌幹細胞によって表される総癌細胞の割合を低減させる。或いは、本発明の化合物は、癌幹細胞が、その幹細胞表現型を失う原因となり、例えば、その自己再生能力を失わせ、これによって、癌幹細胞の数を低減させる。
【０１６５】
従って、本発明の開示では、癌幹細胞の標的化が論及されていることが理解されるべきである。当該開示の目的について、癌幹細胞の「標的化」は、本発明の化合物が、インビボ又はインビトロにかかわらず、細胞集団に存在する癌幹細胞の割合を低減する全ての機構を包含するものとして理解される。特に、癌幹細胞の標的化は、他の細胞型と比べて、特に、非−幹癌細胞と比べて、優先的に癌幹細胞を死滅させることを包含するものとして理解される。
【０１６６】
「癌の予防又は治療」
本発明は、本発明の化合物を癌の予防又は治療のために使用する医療での使用又は治療方法を提供する。本発明の文脈において、癌の「予防」とは、癌が発生する前に、及び癌の発生を阻止する目的で使用する本発明の化合物の予防的適用に関するものとして考えらえるべきである。一方、癌の「治療」とは、癌の発生後に、癌細胞の増殖及び腫瘍の成長を遅らせる又は阻止することによって、癌を寛解させることを目的として、本発明の化合物を使用することに関するものとして理解される。有利には、癌の治療は、癌細胞の数及び腫瘍のサイズの部分的又は完全な低減を生ずる。癌の効果的な治療は、RECIST（固形癌治療効果判定基準）に従って、「安定」又は「奏功」の病状をもたらす。
【０１６７】
以下に詳細に記載するように、本発明による癌の予防は、癌を発生させる可能性を増大させる前癌状態の患者にとって、格別の利益をもたらす。
【０１６８】
「癌の予防」
本発明による癌の予防は、ここに記載する本発明の各種の態様又は具体例に従って、本発明の化合物を使用する前癌状態の治療によって達成される。
【０１６９】
特に、癌の予防（本発明の文脈における）は、本発明の化合物を前癌状態の患者に提供する本発明の方法又は医療での使用によって達成される。この具体例による治療方法又は医療での使用は、処置した前癌状態から癌への進行を阻止し、これによって、癌の効果的な予防を提供する。
【０１７０】
本発明の文脈における癌の予防の論及は、本発明の化合物の他の予防的適用も包含するものである。例えば、癌幹細胞を標的化する本発明の化合物の能力は、これによって、癌の発生を阻止し、及び／又は癌の進行を阻止し、及び／又は癌の再発を阻止し、及び／又は癌の増殖を阻止する。
【０１７１】
「前癌状態」
癌に先立って、しばしば、前癌状態が発生することがあるが、前癌状態は、それ自体、癌に罹った状態ではないが、癌のリスクの増大に関連する。遺伝子の又はエピジェネティックな変化の蓄積は、以前は正常であった細胞を、表現型の癌幹細胞へ発展させる。従って、癌幹細胞は、癌に罹った状態と同様に、このような前癌状態においても存在する。
【０１７２】
前癌状態における癌幹細胞の存在は、これらの状態から癌への進行に寄与すると考えられる。本発明の方法及び医療での使用は、前癌状態において存在する癌幹細胞を標的とし、これによって、このような状態を治療するために使用される。本発明の化合物が癌幹細胞を標的とするとの新たなかつ予想外の知見は、このような化合物による前癌状態の治療が、治療した状態の癌への進行を予防することを意味するものと理解されるであろう。これは、本明細の他の部分で検討するように、本発明化合物が、癌の予防において、医学的に使用される方法を表している。
【０１７３】
本発明に従って治療される前癌状態の例としては、萎縮性胃炎、胃潰瘍、悪性貧血、胃断端、胃ポリープ、及びメネトリエ病のような胃の前癌状態とともに、光線性角化症、バレット食道、萎縮性胃炎、先天性角化異常症、鉄欠乏性嚥下困難、扁平苔癬、口腔粘膜下線維症、日光弾力線維症、子宮頚部異形成、白板症、紅板症、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（MGUS）、単クローン性Ｂ細胞リンパ球増加症（MBL）、骨髄異形成がなる群から選ばれるものが含まれる（ただし、これらに限定されない）。前記の胃の前癌状態の中でも、萎縮性胃炎、悪性貧血、胃断端、及び特定のタイプの胃ポリープは、特に高い癌に進行するリスクを有する。
【０１７４】
前癌状態は、しばしば、形成異常細胞又は過形成細胞を含んでなる障害の形をとる。従って、発現されたマーカー又は癌幹細胞の表現型特性を有する細胞の存在の代わりに又は加えて、異形成又は過形成の存在は、前癌状態の同定において使用される。
【０１７５】
異形成の重篤性は、異なる前癌状態の間で、経時的な単一の前癌状態の進行とともに変化する。一般に、前癌状態と関連する異形成が進行すればするほど、前癌状態が癌により進行しがちとなる。異形成は、代表的には、温和、中位、又は重篤として分類される。重篤な異形成は、治療しないで放置すれば、通常、癌に進行する。好適には、本発明の化合物を使用する治療方法又は医療での使用は、従って、重篤な異形成に関連する前癌状態を有する患者を治療するために使用される。
【０１７６】
本発明の好適な具体例では、本発明の化合物は、重篤な子宮頚部異形成を有する患者を治療するために使用される。重篤な子宮頚部異形成は、塗抹試験によって診断される。本発明の他の具体例では、本発明の化合物は、重篤な食道異形成（「バレット食道」）を治療するために使用される。重篤な食道異形成は、組織生検によって診断される。
【０１７７】
最近、前悪性は、癌を有することが不明の個人において、細胞における体細胞突然変異を検出することによって同定されることが報告されている。特に、加齢に伴うクローン造血は、増大する全死亡率及び増大する心血管代謝疾患のリスクに関連する共通の前悪性状態であることが報告されている。血液細胞中で検出される突然変異の大部分は、３つの遺伝子：DNMT3A、TET2及びASXL1において生ずる。従って、癌幹細胞を標的とし、これによって、前癌状態を治療するために、本発明の化合物を使用することによって利益を得られる患者は、血液細胞を含んでなるサンプルを、DNMT3A、及び／又はTET2、及び／又はASXL1の少なくとも１つにおいて、前癌状態を示す遺伝子の突然変異の存在についてアッセイすることによって同定される。
【０１７８】
本明細書の他の部分において検討するように、本発明に従って、癌幹細胞を標的とするために、本発明の化合物を使用する治療から恩恵を受けられる患者は、癌幹細胞に特有のマーカー又は癌幹細胞表現型の発現に基づく技術のいずれかを参照して、癌幹細胞の存在を検出することによって同定される。
【０１７９】
「癌の治療」
当業者であれば、癌の「治療」をアッセイする多くの測定法が存在することを認識するであろう。単なる例として述べれば、癌の効果的な治療を示すために、癌の発生、癌の進行、癌の再発、又は癌の増殖のいずれかの低減又は予防が検討される。
【０１８０】
特定の具体例では、本発明の化合物は、癌細胞集団における癌幹細胞の割合を低減するため、及び／又は腫瘍の生長を阻害するため、及び／又は催腫瘍性を低減するため、及び／又は原発癌を予防又は治療するため、及び／又は再発癌を予防又は治療するため、及び／又は転移又は二次癌を予防又は治療するため、及び／又は転移又は再発を予防又は阻害するため、及び／又は難治性癌を治療又は予防するために使用される。
【０１８１】
本発明の化合物を使用する癌治療が、治療の間／治療の後に、腫瘍サイズの低減をもたらす能力、及び腫瘍サイズにおける低減を維持する能力は、効果的な癌治療の特に適切な指標を表す。実施例に提示するように、本発明の治療又は医療での使用は、驚くべきことには、既に、他の治療法での治療に対して耐性であった再発性又は難治性の癌を代表する細胞を使用するモデルにおいてさえも、この態様では、有効であることが証明された。
【０１８２】
実施例に示すデータは、本発明の化合物での治療が、癌細胞集団における癌幹細胞の割合を低減することを表している。癌幹細胞が同定される特徴的な生物学的活性又は細胞表面マーカーについては、明細書の他の部分において記載している。好適な具体例では、本発明による癌治療は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％の、患者の癌に存在する癌幹細胞の割合の低減を生ずる。好適な具体例では、本発明による癌治療は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の、患者の癌に存在する癌幹細胞の割合の低減を生ずる。本発明による癌治療は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、患者の癌に存在する癌幹細胞の割合の低減を生ずることができる。実際、本発明による癌治療は、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は100％（実質的に癌幹細胞は生き残れない）もの、患者の癌に存在する癌幹細胞の割合の低減を生ずることができる。
【０１８３】
癌幹細胞の非対称分裂は、腫瘍の生長に寄与する。本発明に従って、本発明の化合物での癌治療は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％の腫瘍生長阻害率を生ずることができる。本発明による好適な癌治療は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の腫瘍生長阻害率を生ずることができる。本発明による癌治療は、そのように治療した患者において、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の腫瘍生長阻害率を生ずることができる。実際、本発明による癌治療は、治療した癌において、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は100％もの腫瘍生長阻害率を生ずることができる。
【０１８４】
腫瘍生長は、腫瘍のサイズを経時的にアッセイするいずれかの好適な方法によっても、アッセイされる。好適には、癌治療前の腫瘍サイズを、癌治療中又は癌治療後の同じ腫瘍のサイズと比較する。腫瘍サイズをアッセイする多数の方法が公知である。例えば、腫瘍のサイズは、患者において、「その場での」腫瘍の画像撮影によってアッセイされる。画像撮影技術のような好適な技術により、腫瘍のサイズを測定でき、腫瘍のサイズの変化をアッセイすることが可能である。
【０１８５】
本明細書の実施例に示す結果において示されるように、本発明の化合物での治療法及び医療での使用は、腫瘍の生長を阻止できるだけでなく、実際には、再発又は難治性癌に罹った患者を含め癌患者において、腫瘍のサイズの低減をもたらすこともできる。本発明による好適な治療は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％の腫瘍サイズの低減率を生ずることができる。好適な具体例では、本発明による癌治療は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の腫瘍サイズの低減率を生ずることができる。本発明による癌治療は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の腫瘍サイズの低減率を生ずることができる。実際、本発明による癌治療は、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は100％もの腫瘍サイズの低減率を生ずることができる。
【０１８６】
上記の種類の腫瘍サイズにおける低減率は、好適なコントロールに対して算定される。例えば、好適な動物モデルにおいて、インビトロ又はインビボで行われる研究では、腫瘍サイズの低減率は、本発明の化合物で治療した腫瘍のサイズと、コントロール腫瘍（未処置の、又は本発明の化合物以外の治療を受けている）のサイズとの直接比較によって測定される。腫瘍の治療の欠落を要求するこのような方法は、臨床治験又は患者の治療管理の点で倫理的に許容できないものであると考えられ、このケースでは、腫瘍サイズの低減率は、治療した腫瘍のサイズを、治療前の同じ腫瘍のサイズと、又は治療が行われなかった腫瘍によって達成されるはずの予測されるサイズとを比較することによってアッセイされる。
【０１８７】
治療方法及び本発明の化合物の医療での使用は、癌を表示するバイオマーカーの低減をもたらす。このようなバイオマーカーの低減は、癌の効果的な治療を証明する更なるアッセイ法を提供する。このようなバイオマーカーの好適な例は、治療されるべき癌のタイプに基づいて選択される。婦人科癌の場合、CA125はバイオマーカーであり、一方、膵癌又は胆道癌の場合、CA19.9がバイオマーカーであり、結腸直腸癌の場合、CEAが好適なバイオマーカーである。
【０１８８】
好適には、本発明による好適な治療は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％の、癌バイオマーカー発現レベルの低減率を生ずることができる。好適な具体例では、本発明による癌治療は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％の、癌バイオマーカー発現レベルの低減率を生ずることができる。本発明による癌治療は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、癌バイオマーカー発現レベルの低減率を生ずることができる。実際、本発明による癌治療は、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は100％もの、癌バイオマーカー発現レベルの低減率を生ずることができる。
【０１８９】
本発明による癌の治療において観察される有利な効果、例えば、存在する癌幹細胞の割合の低減、腫瘍生長の低減、腫瘍サイズ又は癌バイオマーカー発現レベルの低減は、少なくとも１か月間は維持される。好適には、このような有利な効果は、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、又は少なくとも６か月間維持される。実際、このような有利な効果は、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、又は少なくとも２４か月間維持される。好適には、このような有利な効果は、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、又は少なくとも１０年間又はそれ以上維持される。
【０１９０】
本発明の好適な具体例では、本発明の化合物は、癌幹細胞を標的にすることによって、癌又は前癌状態を予防又は治療する方法において使用される。好適な具体例では、本発明は、癌又は前癌状態予防又は治療する方法（該方法は、１以上の癌幹細胞の催腫瘍性を低減する）における本発明の化合物の使用を提供する。好適には、このような方法は、癌の増殖を予防し、又は腫瘍の生長を阻害する。
【０１９１】
本発明の化合物を、癌の増殖を予防又は治療するために、本発明の方法又は医療での使用において使用する際、このような予防又は治療は、癌の増殖を減速し、遅延させ、又は完全に停止させる。
【０１９２】
癌の進行は、代表的には、癌にステージを指定することによって決定される。ステージ化は、通常、癌にI〜IVの数値を付すことによって行われるが、Iは、隔離された癌を表し、IVは、アッセイ測定限界まで広がっている癌を表す。ステージの細目は癌の間で変化するが、一般に、ステージは、腫瘍のサイズ、隣接する器官を浸潤しているかどうか、
いくつの局所（近くの）リンパ節に広がっているか（あれば）、及びより遠い位置に認められるかどうか（転移）を考慮するものである。
【０１９３】
一般に、ステージIは、身体の１か所に局在化し、外科的削除によって治療される（十分に小さい固形腫瘍について）。ステージIIは、局所的に進行し、化学療法、放射線療法、手術、又はその組み合わせによって治療可能である。ステージIIIも局所的に進行したものであり、ステージII又はステージIIIの指定は、ステージIIIが「遅発性」の局部的進行と認められるが、癌の特殊タイプに左右される。ステージIVは、しばしば、第２の器官に転移している。本発明の化合物を使用する癌の治療又は本発明の医療での使用は、癌幹細胞を標的とすることによって、ステージI、II、III、又はIVの癌を治療するために使用される。本発明の化合物での治療は、１のステージから次のステージへの癌の進行を予防するために使用される。１具体例では、本発明の化合物での治療は、ステージIからステージIIへの進行を阻止するために使用される。他の具体例では、本発明の化合物での治療は、ステージIIからステージIIIへの進行を阻止するために使用される。さらに他の具体例では、本発明の化合物での治療は、ステージIIIからステージIVへの進行を阻止するために使用される。
【０１９４】
癌の進行を予防すること又は阻害することは、癌の拡大、例えば、ステージIからステージII（癌が局所的に広がっている）への進行、又はステージIIIからステージIV（癌が他の器官に転移している）への進行を予防するために特に重要である。癌幹細胞は、催腫瘍性であり、従って、局部的及び転移的の両方での癌の拡大において重要な役割を果たすと考えられる。従って、本発明の化合物を使用する治療方法及び医療での使用は、催腫瘍性の癌幹細胞を標的とし、このようにして、その数を低減することによって、癌の拡大を予防するために使用される。
【０１９５】
「癌」
本発明の化合物は、それらが由来する８−クロロアデノシンと比較して、増大された抗癌活性を発揮する。抗癌活性におけるこの増大は、癌幹細胞及び非―幹癌細胞の両方に対して、増大された活性の結果として提供されることが明らかである。
【０１９６】
癌幹細胞は、広い範囲の癌の生物学的活性において役割を果たす。従って、本発明に従って予防又は治療される癌は広範囲に存在する。
【０１９７】
ここ以外の部分で検討するように、癌幹細胞は、液性腫瘍（白血病、リンパ腫のような血液系腫瘍を含む）及び固形腫瘍（例えば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、皮膚癌、膀胱癌、胆道癌及び膵臓癌）を含む多くの腫瘍タイプにおいて存在することが知られている。従って、癌幹細胞を標的とするための治療方法及び本発明の化合物の医療での使用は、このような癌の予防又は治療において有用であることが期待される。
【０１９８】
好適には、本発明の化合物は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、肺癌、肝癌、乳癌、頭頚部癌、神経芽細胞腫、甲状腺癌、皮膚癌（メラノーマを含む）、口腔扁平上皮癌、膀胱癌、ライディッヒ細胞腫、胆道癌（例えば、胆管細胞癌又は胆管癌）、膵癌、結腸癌、結腸直腸癌、及び婦人科系の癌（卵巣癌、子宮内膜癌、卵管癌、子宮癌、及び子宮頸癌（上皮子宮頸癌を含む））からなる群から選ばれる癌の予防又は治療に使用される。好適な具体例では、癌は白血病であり、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（急性ミエロイド白血病又は急性非リンパ性白血病としても知られている）、急性前骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（慢性ミエロイド白血病、慢性骨髄球性白血病、又は慢性顆粒球性白血病としても知られている）、慢性リンパ性白血病、単芽球性白血病、及びヘアリー細胞白血病からなる群から選ばれる。さらに好適な具体例では、癌は、急性リンパ性白血病である。好適な具体例では、癌は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、及び小リンパ球性リンパ腫からなる群から選ばれるリンパ腫である。
【０１９９】
好適には、このような癌における癌幹細胞の標的化は、癌の発生を予防し又は治療することによって、癌の進行を予防又は治療することによって、癌の再発を予防又は治療することによって、又は癌の増殖を予防又は治療することによって、有効な癌治療を達成する。
【０２００】
好適な具体例では、本発明は、転移性癌の予防又は治療での癌幹細胞の標的化における使用のための本発明の化合物を提供する。
【０２０１】
好適な具体例では、本発明は、再発性又は難治性癌の治療での癌幹細胞の標的化における使用のための本発明の化合物を提供する。
【０２０２】
好適な具体例では、本発明は、原発癌の治療での癌幹細胞の標的化における使用のための本発明の化合物を提供する。好適には、治療される原発癌は、二次原発癌でもよい。
【０２０３】
本発明は、二次癌の治療での癌幹細胞の標的化における使用のための本発明の化合物を提供する。好適な具体例では、二次癌は転移性癌である。
【０２０４】
好適な具体例では、本発明は、癌幹細胞の標的化における使用のための本発明の化合物を提供し、ここで、癌幹細胞の標的化は、（i）癌の再発、（ii）二次原発癌の発生、又は（iii）癌の転移を予防又は阻止する。
【０２０５】
癌幹細胞を標的とする能力に基づいて、本発明の化合物が使用される治療方法又は医療での使用は、再発性又は難治性癌の治療において使用される。このような具体例における再発性又は難治性癌についての考察は、他の方法において背景が要求する場合を除いて、本発明の他の態様に関連する再発性又は難治性癌の治療についてと同じである。
【０２０６】
「再発性又は難治性癌」
上述のように、本発明の特定の態様及び具体例は、特に、再発性又は難治性癌の治療における本発明の化合物の使用に関する。
【０２０７】
本発明の目的に関して、本発明の化合物を使用する方法以外の抗癌治療によっては治療に抵抗性を示す癌として、難治性癌を取り上げることができる。例えば、本発明の化合物は、放射線療法での治療には抵抗性である難治性癌の治療において使用される。或いは、又は加えて、本発明の化合物は、癌治療において使用される生物学的作用物質に抵抗性である難治性癌の治療において使用される。好適な具体例では、本発明の化合物は、本発明の化合物以外の化学療法薬での治療に抵抗性である難治性癌の治療において使用される。
【０２０８】
特に、本発明の化合物を使用する本発明の治療方法又は医療での使用から利益が得られる難治性癌としては、８−クロロアデノシンに対して抵抗性の癌も含まれる。
【０２０９】
再発性癌（又は再発癌）は、寛解の期間（その間は、癌が検知されない）の後に再発する癌である。癌の再発は、元の癌の位置（癌の局所再発）、元の癌の位置に近い位置（癌の局在性再発）、元の癌の位置から離れた位置（癌の遠位再発）で起こり得る。癌幹細胞は、癌の再発の一因となり、再発性癌の細胞が発生する源を提供すると考えられる。従って、本発明による治療方法及び本発明の化合物の医療での使用（癌幹細胞を標的することができる）は、再発性癌との関連で、非常に有効であろう。本発明の化合物の癌幹細胞を標的とする能力は、再発を生ずるような細胞の集団を低減し、又は除去して、再発性癌の発生を予防するために使用される。本発明の化合物の抗−癌幹細胞活性は、潜在的に、非−幹癌細胞に対して細胞毒性効果を及ぼし、これによって、再発性癌の治療を提供するとともに、再発した癌において、癌幹細胞を標的とするためにも使用される。
【０２１０】
従って、本発明の化合物は、再発性癌の予防又は治療のために、本発明の方法又は使用において使用されることが理解されるであろう。本発明の化合物は、局所、局在性、又は遠位の再発性癌の予防又は治療のために、本発明の方法又は使用おいて使用される。
【０２１１】
本発明の化合物は、少なくとも２カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月、又は少なくとも３０カ月の寛解を提供することによって、癌の再発を予防するために、本発明の方法又は使用において使用される。実際、本発明の化合物は、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、又は少なくとも１０年の寛解を提供することによって、癌の再発を予防するために使用される。
【０２１２】
本発明の化合物は、少なくとも２カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２４カ月、又は少なくとも３０カ月の寛解の後に再発した再発性癌を治療するために、本発明の方法又は使用において使用される。実際、本発明の化合物は、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、又は少なくとも１０年の寛解の後に再発した再発性癌を治療するために使用される。
【０２１３】
本発明の化合物の癌幹細胞を標的とする能力は、本発明の医療での使用又は治療方法に従って癌を予防又は治療するこれら化合物の能力を生ずる。しかし、本発明の化合物は、腫瘍の容積を形成する非−幹癌細胞に対して直接の細胞毒性を及ぼすことに留意しなければならない。癌幹細胞の活性は、再発性又は難治性癌を治療困難なものとする根底をなすものであり、一方、非−幹癌細胞は、このような再発性又は難治性癌の主要な構成成分でもある。
【０２１４】
本発明の特定の化合物は、非−幹癌細胞に対して、８−クロロアデノシン（本発明の化合物が誘導される化学療法薬分子である）よりも大きい細胞毒性を及ぼす。従って、本発明の化合物が、再発性又は難治性癌の治療において作用する機構は、この化合物の抗−癌幹細胞活性だけに限定されるものではなく、非−幹癌細胞に対しても、本発明の化合物の作用を使用することもできる。このような使用では、本発明の化合物での治療は、癌幹細胞及び非−幹癌細胞の両方の総数を低減させるが、治療後に生き残る癌幹細胞の割合を優先的に低減させる。
【０２１５】
「本発明の化合物の治療上効果的な用量」
本発明の化合物の治療上効果的な量は、癌細胞の死滅を誘発するに十分な量である。本発明の化合物の治療上効果的な量は、癌幹細胞の死滅を誘発するに十分な量である。いくつかの具体例では、特に、再発性又は難治性癌の治療に係る量については、本発明の化合物の治療上効果的な量は、癌幹細胞の死滅を誘発する及び非−幹癌細胞の死滅も誘発するに十分な量である。
【０２１６】
患者に投与されるべき治療上効果的な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を算定し及び表示する多数の各種の方法がある。癌の予防又は治療用の薬剤の用量について、特に好適と考えられる１つのこのような方法は、患者の身体の単位表面積当たりの投与される薬剤の量である。このような用量は、代表的には、表面積平方メートル（m2）当たりの薬剤の量（質量によって測定される）の単位で表示される。
【０２１７】
癌の予防又は治療のための本発明の化合物の使用では、250〜1000 mg/m2の週用量が使用される。このような治療は、375〜900 mg/m2の週用量を使用する。例えば、再発性又は難治性癌の効果的な治療は、約500〜825mg/m2の範囲にある本発明化合物の週用量によって提供される。
【０２１８】
いかなる仮説によっても拘束されることを望まないが、発明者らは、癌幹細胞を標的する本発明の化合物の能力により、他の場合に予想されるよりも少ない用量で当該化合物を使用することによって、治療効果を達成できると考えている。単なる例示として述べれば、本発明の化合物の使用及び方法では、825 mg/m2、750 mg/m2、600 mg/m2、又は500 mg/m2程度の低い本発明の化合物の週用量が、治療上有効であることが証明される。
【０２１９】
選択した本発明の化合物の週用量は、１週間の内に、１回の投与で、又は複数回の投与で提供される。例えば、本発明の化合物の週用量は、２回の投与、３回の投与、又はそれ以上で提供される。このように、週用量が750 mg/m2である場合、これは、１週間の治療単位全体で、250 mg/m2の３回の投与、又は１週間の内に、375 mg/m2の２回の投与によって達成されてもよい。同様に、週用量が600 mg/m2である場合、これは、１週間の治療単位全体で、200 mg/m2の３回の投与、又は１週間の内に、300 mg/m2の２回の投与によって達成されてもよい。１週間の治療単位全体で、本発明の化合物の所望の用量を提供するために、１回の治療で投与されるべき当該化合物の好適な量は、約100〜300 mg/m2であろう。
【０２２０】
提供される本発明の化合物の週用量は、治療の過程で低減されてもよい。例えば、治療を、約1000 mg/m2、900 mg/m2、825 mg/m2、750 mg/m2、又は725 mg/m2で開始することができ、及び治療の過程で、必要な用量を、約750 mg/m2（初期用量が上記の量である場合）、約650 mg/m2、約625 mg/m2、又は約500 mg/m2、又は約375 mg/m2に減少できる。
【０２２１】
本発明の化合物の用量は、もちろん、他の様式でも表される。最も一般的なものは、単位体重当たりの提供されるべき活性剤の量である。平均的なヒトについて、１mg/m2の用量は、約0.025 mg/Kg（体重）に相当するものとして算定されている。従って、データは、本発明の化合物が、約6.25〜約２５mg/Kgの範囲の用量で、再発性又は難治性癌の治療に有効であることを示している。例えば、好適な用量は、約９.５〜22.5 mg/Kgである。好適な具体例では、本発明の化合物は、約12.5〜20.5 mg/Kgの範囲の週用量で患者に提供される場合、再発性又は難治性癌の効果的な治療を達成する。
【０２２２】
本発明の予防又は治療法及び医療での使用における使用について適する本発明の化合物の処方に関する考察については、本明細書の他の部分で記載する。本発明の化合物の注射製剤の場合には、これらは静脈内投与される。静脈内投与は、いかなる好適な時間枠において、例えば、１０分間の点滴等で達成される。
【０２２３】
治療のタイプ
好適な具体例では、本発明の化合物は、癌の第一選択治療として、癌幹細胞を標的化するために使用される。
【０２２４】
しかし、本発明の化合物が、癌幹細胞を標的化することができ、これによって、再発性又は難治性癌を治療できるとの知見は、本発明の化合物が、他の治療法が無効であることが証明されている癌を効果的に治療する方法を提供できることを示す。従って、好適な具体例では、本発明は、癌の第二選択治療として、癌幹細胞を標的化するための本発明の化合物を提供する。実際、好適な具体例では、本発明は、癌の第三選択、又はそれ以降の選択治療として、癌幹細胞を標的化するための本発明の化合物を提供する。
【０２２５】
好適な具体例では、癌の治療におけるネオアジュバントとしての使用のための本発明の化合物が提供される。ネオアジュバントは、「主」抗癌療法、例えば、癌の摘出に先立って、腫瘍のサイズを低減させるために、患者に提供される薬剤である。本発明の化合物は、続いて、癌の外科的治療及び／又は癌の放射線治療を受ける患者のためのネオアジュバント療法として使用される。
【０２２６】
或いは、又はさらに、本発明は、癌の治療におけるネオアジュバントとしての使用のための本発明の化合物を提供する。ネオアジュバントは、「主」抗癌療法、例えば、癌の摘出後の腫瘍の再発を防止するために、患者に提供される薬剤である。本発明の化合物は、続いて、癌の外科的治療及び／又は癌の放射線治療を受けた患者のためのネオアジュバント療法として使用される。
【０２２７】
本発明の化合物は、単独療法（本発明の化合物が、予防又は治療において使用される治療剤の実質的に全てを提供する）における本発明の方法及び使用において使用される。
【０２２８】
或いは、本発明の方法又は使用は、併用療法において、本発明の化合物を使用する。このような具体例では、本発明の化合物は、少なくとも１つの他の癌療法と併用して使用される。他の癌療法としては、外科的療法及び／又は放射線療法がある。さらに、又は或いは、他の癌療法としては、癌の予防又は治療の達成に寄与する少なくとも１つの他の治療薬の使用がある。好適には、このような薬剤は、癌の予防又は治療において使用される化学療法薬又は生物学的製剤である。
【０２２９】
併用療法の好適な具体例では、本発明の化合物及び他の治療薬は、同時に、患者に提供される。好適な例では、本発明の化合物及び他の治療薬は、同一の医薬組成物の部分として処方される。或いは、本発明の化合物及び他の治療薬は、実質的に同時に患者に提供されるように、別々に処方される。必要な本発明の化合物の量は、このような具体例において化合物が使用される際には、実質的に低減される。
【０２３０】
併用療法の他の好適な具体例では、本発明の化合物及び他の治療薬は、異なった時間に、患者に提供されてもよい。本発明の化合物及び他の治療薬は、連続して、患者に提供される。例えば、本発明の化合物は、他の治療薬の提供に先立って、患者に提供される。或いは、本発明の化合物は、他の治療薬の提供後に、患者に提供されてもよい。
【０２３１】
「他の治療薬」
本発明の化合物は、癌の予防又は治療のために、広範囲の他の治療薬と組み合わせて使用される。他の治療薬としては、癌の予防又は治療のため使用される生物学的製剤、免疫治療薬、及び化学療法剤が含まれる。
【０２３２】
好適な他の薬剤の特別な例については、以降の段落において検討するが、これらは、本発明の化合物との使用に好適な他の治療薬の範囲を限定するものではない。実際、本発明の化合物の癌幹細胞を標的化する能力は、他の治療薬が、癌幹細胞、非−幹癌細胞、又は他の細胞、又は癌の発生、転移、再発及び増殖に関与する成分を標的化するか否かにかかわらず、癌の予防又は治療において使用される各種の他の治療薬と組み合わせて有利に使用されることを表している。
【０２３３】
本発明の化合物と併用される他の治療薬の例としては、
（ａ）抗血管新生薬（任意に、ここで、抗血管新生薬は、（i）VEGF経路阻害剤、任意に、ベバシズマブ；（ii）チロシンキナーゼ阻害剤、任意に、ソラフェニブ、スニチニブ、又はパゾパニブ；又は（iii）mTOR阻害剤、任意に、エベロリムスである）；
（ｂ）アルキル化剤；
（ｃ）代謝拮抗薬；
（ｄ）抗腫瘍抗生物質；
（ｅ）トポイソメラーゼ阻害薬；
（ｆ）有糸分裂阻害剤
（ｇ）モノクロナール抗体；
（ｈ）金属剤
（ｉ）能動又は受動免疫療法薬
が含まれる。
【０２３４】
他に文脈が要求する場合を除き、上述のリストに挙げた他の治療薬は、全て、上述の本発明の化合物との併用療法の具体例のいずれかにおける使用に適していると考えられる。
【０２３５】
「患者の選択」
本発明の化合物が癌幹細胞を標的化できるとの本発明者らの知見は、特別な患者が、癌、例えば、再発性又は難治性癌の予防又は治療において、本発明の化合物を投与されることにより、恩恵を受け易いかどうかを測定できる多くの方法を可能にする。
【０２３６】
従って、本発明は、癌の患者又は前癌状態の患者が、本発明の化合物での癌の予防又は治療から恩恵を受けるかどうかを測定する方法を提供するものであり、該方法は、患者における癌又は前癌状態を表す生体サンプルを、癌幹細胞の存在に関してアッセイすることを含んでなり、ここで、生体サンプルにおける癌幹細胞の存在は、患者が本発明の化合物による治療から恩恵を受けることを表示する。
【０２３７】
本発明は、さらに、癌患者又は前癌状態の患者のための好適な治療レジメンを決定する方法を提供するものであり、該方法は、患者における癌又は前癌状態を表す生体サンプルを、癌幹細胞の存在に関してアッセイすることを含んでなり、ここで、生体サンプルにおける癌幹細胞の存在は、好適な治療レジメンが、患者を本発明の化合物によって治療することを含んでなるものであることを表示する。
【０２３８】
本発明は、また、患者における癌又は前癌状態を表す生体サンプルを、癌幹細胞の存在に関してアッセイすることを含んでなる方法（ここで、生体サンプルにおける癌幹細胞の存在は、患者が本発明の化合物による治療から適していることを表示する）によって治療が選択された患者における、癌の予防又は治療における使用のための本発明の化合物を提供する。
【０２３９】
好適な具体例では、生体サンプルにおける癌幹細胞は、既に明細書において検討されたマーカーの特徴的なパターンの発現によって同定される。
【０２４０】
当業者であれば、上述したような本発明の具体例において使用される生体サンプルの好適な例が多数存在することは認識されるであろう。好ましくは、このようなサンプルとしては、癌状態又は前癌状態からの細胞が含まれる。好適な生体サンプルは、組織サンプル、例えば、組織学において使用されるサンプルである。このようなサンプル中の細胞は、上述の癌幹細胞マーカーの発現について、直接、アッセイされる。
【０２４１】
或いは／又は加えて、好適な生体サンプルは、癌状態又は前癌状態の細胞による遺伝子発現を表す標的分子を含んでなることができる。このような標的分子の例としては、遺伝子の発現を表すタンパク質又は核酸、例えば、mRNAが含まれる。
【０２４２】
癌幹細胞マーカーの発現をアッセイできる技術の好適な例は、サンプルのタイプと関連して選択される。発現されたマーカーを調査する技術は、しばしば、臨床アッセイにおいて使用され（例えば、診断又は予後を目的とする）、及びそれらの使用は、本発明において、それらを実施するために必要とされるものと見られる。単に例示すれば、タンパク質を含有するサンプルでは、癌幹細胞マーカーの存在は、問題の癌幹細胞マーカーと反応する抗体を使用する好適な技術によってアッセイされる。このようなタンパク質癌幹細胞マーカーを含有するサンプルの例としては、組織学的サンプル（マーカーの存在が、好適な免疫細胞化学技術によって可視化される）、又は循環に由来するサンプルが含まれる。ここで、循環する癌幹細胞（転移を介する癌の増殖に寄与すると考えられる）の存在は、フローサイトメトリーのような技術を使用してアッセイされる。
【０２４３】
癌幹細胞マーカーの発現を表す核酸を含有するサンプルでは、このような発現は、好適な分子生物学的手法によって、例えば、好適なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、又はRNAscope原位置ハイブリッド形成技術によってアッセイされる。
【０２４４】
合成例
次に、本発明の実施例について、添付図面を参照して記載する。本発明の化合物は、下記の実施例に従って又は同様にして製造される。
【０２４５】
一般的実験
溶媒及び試薬：
次の無水溶媒をSigma-Aldrichから入手した：ジクロロメタン（CH2Cl2）、トリメチルスルホネート（(CH3O)3PO）。市販のアミノ酸エステルを、Sigma-Aldrichから入手した。全ての市販の試薬について、さらに精製することなく使用した。
【０２４６】
薄層クロマトグラフィー（TLC）：
プレコートアルミニウムプレート（60F254、厚さ０.２mm、Merck）を、短波及び長波紫外線の両方（254及び366 nm）の下で可視化するか、又は次のTLC指示薬：（i）モリブデン酸塩・硫酸アンモニウム・セリウム（molybdate ammonium cerium sulphate）；（ii）過マンガン酸カリウム溶液を使用して発色させることによって可視化した。調製TLCプレート（２０cm×２０cm、500〜2000μm）をMerckから入手した。
【０２４７】
フラッシュクロマトグラフィー：
Fisherによって供給されたシリカゲル（60A、３５〜７０μm）を使用して、フラッシュクロマトグラフィーを行った。好適な溶離液を使用してガラスカラムにスラリーを充填し、サンプルを、同じ溶離液における濃縮溶液として負荷するか、又はシリカゲル上に予め吸着させた。生成物を含有するフラクションをTLCによって同定し、溶媒を真空下で除去した。別法では、ダイレクト相クロマトグラフィー用のプレ充填SNAP KP又はSNAPウルトラシリカゲルカラム；逆相クロマトグラフィー用のSNAP Ultra C-18を使用するBiotage Isolera自動化精製システムにて、フラッシュクロマトグラフィーを実施した。
【０２４８】
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）：
I）ThermoSCIENTIFIC、SPECTRA SYSTEM P4000、検出器SPECTRA SYSTEM UV2000、Varian Pursuit XRs 5 C18、150×４.６mm（分析カラムとして）、又はII）Varian Prostar（LC Workstation-Varian Prostar 335 LC検出器）、Thermo SCIENTIFIC Hypersil Gold C18、５μ、150×４.６mm（分析カラムとして）を使用するHPLCによって、最終化合物の純度が＞９５％であることを確認した。
【０２４９】
核磁気共鳴（NMR）：
分光計Bruker Avance 500MHzにおいて、２５℃で、1H-NMR（500MHz)、13C-NMR（125MHz)、31P-NMR（202MHz）及び19F-NMR（470MHz）を記録した。化学シフト（δ）を、内標準物質MeOH-d4に対して（δ3.34 1H-NMR、δ49.86 13C-NMR）及びCHCl3-d4に対して（δ7.26 1H-NMR、δ77.36 13C-NMR）又は外標準物質８５％H3PO4に対して（δ0.00 31P-NMR）、百万分率（ppm）で示した。カップリング定数（J）をヘルツで測定した。NMRシグナルの指定において、次の省略記号を使用する：s（一重線）、d（二重線）、t（三重線）、q（四重線）、m（多重線）bs（広い一重線）、dd（二重の二重線）、dt（二重の三重線）、app（明白な）。1H NMR及び13C NMRにおけるシグナルの指定を、カップリング定数及び追加の二次元実験（COSY、HSQC、HMBC、PENDANT）の分析に基づき実施した。
【０２５０】
質量分析（ＭＳ）：
Bruker Daltonics microToF-LC（大気圧イオン化エレクトロスプレイ質量分析装置）において、パッシブモード又はネガティブモードで、低分解能マススペクトルを実施した。
【０２５１】
最終化合物の純度：HPLC分析を使用して、全ての最終化合物が純度≧９５％であることを確認した。
【実施例１】
【０２５２】
シクロヘキシル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ) (フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートA
【化９】
2019520345.tif 000012
A
８−クロロアデノシン
【化１０】
2019520345.tif 000013
方法１：アデノシン（1.97g、7.37ミリモル）を無水のDMF（２０ml）に懸濁化し、及びBzCl（０.９ml、７.７ミリモル）を添加した。mCPBA（７０〜７５％、2.03 g、８.６ミリモル）を、無水のDMF（１０ml）に溶解し、１滴ずつ添加した。氷冷水（100 ml）に注加し、濾過する前に、反応混合物を、室温において、２０分間撹拌した。濾液を、Et2O（３×100 ml）にて抽出した。合わせた水相を減圧下で蒸発させて、オイルを得た。オイルをシリカに吸着させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＣ）（５％MeOH／CHCl3に充填し、７％MeOH／CHCl3にて溶離した）にて精製して、白色の固体を得た（0.53 g、２４％)。
方法２：アデノシン（1.09 g, 4.08ミリモル）をDMF（５０ml）に懸濁化し、及び氷酢酸（１０ml）を添加した。N-クロロスクシンイミド（２g、１５ミリモル）のDMF（１５ml）溶液を、１滴ずつ添加した。反応混合物を、室温において、４８時間撹拌し、揮発物を、真空下で蒸発させて、黄色ゴムを得た。粗製物をシリカに吸着させ、シリカゲルＣＣ（５％MeOH／CHCl3に充填し、７％MeOH／CHCl3にて溶離した）にて精製して、白色の粉末を得た（0.65 g、５２％)。
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)：δ8.16 (s, 1H, H-2), 7.55 (br s, 2H, NH2), 5.86 (d, J=6.8Hz, 1H, H1’), 5.48 (d, J=6.2Hz, 1H, 2’OH), 5.45 (d, J=4.0Hz, 1H, 5’-OH), 5.23 (d, J= 4.6Hz, 1H, 3’OH), 5.08-5.06 (m, 1H, H-2’), 4.23-4.18 (m, 1H, H3’), 4.01-3.96 (m, 1H, H4’), 3.72-3.65 (m, 1H, H5’), 3.57-3.50 (m, 1H, H5’)
5-([シクロヘキシルオキシグリシン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンAを、次の方法に従って調製した：８−クロロアデノシン（0.21 g、0.70ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.70ミリモル、0.70 ml）を１滴ずつ添加し、続いて、無水THF（５ml）に溶解したフェニル-1-イル-L-グリシンシクロヘキシルエステルホスホロクロリデート（0.88 g、2.65ミリモル）の溶液を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜５％MeOH／CH2Cl2）による第１の精製及び調製TLC（１０％MeOH／DCM）による第２の精製によって、所望の化合物５５mgを、白色の固体として得た（収率＝１４％）。
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.7 (s), 4.6 (s)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.19 (s, 0.5H, H2), 8.17 (s, 0.5H, H2), 7.38-7.27 (m, 3H, Ph), 7.24-7.12 (m, 2H, Ph), 6.05 (d, J=4.9Hz, 1H, H1'), 6.03 (d, J=4.9Hz, 1H, H1'), 5.34 (t, J=5.2Hz, 0.5H, H-2'), 5.31 (t, J=5.2Hz, 0.5H, H-2'), 4.71 (m, 1H, CHシクロヘキシル), 4.66 (t, J=5.2Hz, 0.5H, H-3'), 4.60 (t, J=5.2Hz, 0.5H, H-3'), 4.53-4.33 (m, 2H, H5'), 4.24-4.17 (m, 1H, H4'), 3.71-3.57 (m, 2H, CH2 gly), 1.93-1.21 (m, 10H, CH2 gly)
HPLC：H2O／CH3OH（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.50分、tR 18.12分を有する２つのピーク
【実施例２】
【０２５３】
ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテートB
【化１１】
2019520345.tif 000014
B
5-([ベンジルオキシグリシン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンBを、次の方法に従って調製した：８−クロロアデノシン（0.15 g、0.50ミリモル）を、無水THF（２０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.50ミリモル、0.50 ml）を１滴ずつ添加し、続いて、無水THF（５ml）に溶解したフェニル-1-イル-L-グリシンベンジルエステルホスホロクロリデート（1.08 g、3.05ミリモル）の溶液を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜７％MeOH／CH2Cl2）による第１の精製及び調製TLC（１０％MeOH／DCM）による第２の精製によって、所望の化合物８２mgを、白色の固体として得た（収率＝２８％）。
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.6 (br s)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.18 (s, 0.5H, H2), 8.16 (s, 0.5H, H2), 7.36-7.14 (m, 10H, Ph), 6.04 (d, J=5.2Hz, 1H, H1'), 6.02 (d, J=5.2Hz, 1H, H1'), 5.34 (t, J=5.3Hz, 0.5H, H-2'), 5.31 (t, J=5.3Hz, 0.5H, H-2'), 5.16-5.09 (m, 2H, OCH2Ph), 4.64 (t, J=5.1Hz, 0.5H, H-3'), 4.61 (t, J=5.1Hz, 0.5H, H-3'), 4.49-4.30 (m, 2H, H5'), 4.23-4.17 (m, 1H, H4'), 3.74-3.65 (m, 2H, CH2 gly)
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 11.30分、tR 11.01分を有する２つのピーク
【実施例３】
【０２５４】
(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートC
【化１２】
2019520345.tif 000015
C
5-([ベンジルオキシ-L-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンCを、次の方法に従って調製した：８−クロロアデノシン（0.23 g、0.76ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.76ミリモル、0.76 ml）を１滴ずつ添加し、続いて、無水THF（５ml）に溶解したフェニル-1-イル-L-アラニンベンジルエステルホスホロクロリデート（1.08 g、3.05ミリモル）の溶液を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜７％MeOH／CH2Cl2）による第１の精製及び調製TLC（７％MeOH／DCM）による第２の精製によって、所望の化合物９mgを、白色の固体として得た（収率＝２％）。
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.5 (s), 3.4 (s)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.18 (s, 0.5H, H2), 8.15 (s, 0.5H, H2), 7.44-7.10 (m, 10H, Ph), 6.05-6.00 (m, 1H, H1'), 5.34 (t, J=5.2Hz, 0.5H, H-2'), 5.28 (t, J=5.2Hz, 0.5H, H-2'), 5.12-5.05 (m, 2H, OCH2Ph), 4.66 (t, J=5.4Hz, 0.5H, H-3'), 4.63 (t, J=5.4Hz, 0.5H, H-3'), 4.45-4.25 (m, 1H, H5'), 4.23-4.15 (m, 2H, H4', H5'), 3.95-3.86 (m, 1H, CH L-Ala), 1.30-1.21 (m, 3H, CH3 L-Ala)
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 11.30分、tR 11.01分を有する２つのピーク
【実施例４】
【０２５５】
(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートD
【化１３】
2019520345.tif 000016
D
5-([ベンジルオキシ-L-アラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンDを、次の方法に従って調製した：８−クロロアデノシン（0.40 g、1.33ミリモル）を、アセトン（３０ml）に懸濁化し、HClO4（７０％、０.２ml）を１滴ずつ添加した。NaHCO3によって中和する前に、室温において、混合物を３０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製物を、シリカゲルＣＣ（３％MeOH／CHCl3）によって精製して、2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシンを白色の固体として得た（0.36 g、７９％）。
ついで、2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（157 mg、0.52ミリモル）を、無水THF（２４ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、３当量、1.56 ml、1.56当量）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（１.５ml）に溶解したナフチ-1-イル-L-アラニンベンジルエステルホスホロクロリデート（540 mg、1.04ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜５％MeOH／DCM）による精製により、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、第１にシリカゲルＣＣ（０〜７％MeOH／CH2Cl2）によって、第２に調製TLC（７％MeOH／DCM）によって精製して、６７を白色の泡沫として得た（５３mg、収率＝２つの工程全体として１７％）。
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.8 (s), 3.9 (s)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.12-8.03 (m, 3H, H2, Nap), 7.81-7.83 (m, 1H, Nap), 7.66-7.61 (m, 1H, Nap, Ph), 7.52-7.18 (m, 9H, Nap, Ph) 6.05-6.01 (m, 1H, H1'), 5.35-5.31 (m, 0.5H, H-2'), 5.30-5.26 (m, 0.5H, H-2'), 5.05-4.91 (m, 2H, OCH2Ph), 4.69-4.63 (m, 1H, H3'), 4.53-4.45 (m, 1H, H5') 4.43-4.34 (m, 1H, H5'), 4.26-4.20 (m, 1H, H4'), 4.08-4.00 (m, 0.5H, CH ala), 3.97-3.89 (m, 0.5H, CH Ala), 1.28-1.14 (m, 3H, CH3 ala)
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 16.48分、tR 17.07分を有する２つのピーク
【実施例５】
【０２５６】
(2S)-フェニル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシ-テトラヒドロフラン-2-イル)メトキシナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエートE
【化１４】
2019520345.tif 000017
E
5'-([(ペンチル-1-オキシ-L-アラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンEを、次の方法に従って調製した：８−クロロアデノシン（0.40 g、1.33ミリモル）を、アセトン（３０ml）に懸濁化し、HClO4（７０％、０.２ml）を１滴ずつ添加した。NaHCO3によって中和する前に、室温において、混合物を３０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製物を、シリカゲルＣＣ（３％MeOH／CHCl3）によって精製して、2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシンを白色の固体として得た（0.36 g、７９％）。
ついで、2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（200 mg、0.59ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、2.93ミリモル、2.93 ml）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（５ml）に溶解したナフタレン-1-イル-L-アラニンペント-1-イルエステルホスホロクロリデート（674.7 mg、1.76ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜３％MeOH／DCM）による第１の精製及び調製TLC（３％MeOH／DCM）による第２にの精製によって残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、調製TLC（１０％MeOH／DCM）によって精製して、白色の固体を得た（１５mg、収率＝２つの工程全体として４％）。
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.8 (s), 3.9 (s)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.13 (s, 0.5H, H2) 8.12-8.09 (m, 1H, Nap), 8.06 (s, 0.5 H, H2), 7.88-7.85 (m, 1H, Nap), 7.68 (d, J=8.18Hz, 1H, Nap), 7.55-7.48 (m, 2H, Nap), 7.45-7.33 (m, 2H, Nap), 6.04 (d, J=4.7Hz, 0.5H, H1'), 6.03 (d, J=4.7Hz, 0.5H, H1'), 5.36-5.32 (m, 0.5H, H2'), 5.30-5.27 (m, 0.5 H, H2'), 4.69-4.64 (m, 1H, H3'), 4.55-4.49 (m, 1H, H5'), 4.45-4.36 (m, 1H, H5'), 4.27- 4.22 (m, 1H, H4'), 4.02-3.83 (m, 3H, CH ala, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 1.55-1.46 (m, 2H, CH3 ala), 1.32-1.16 (m, 7H, CH3 ala, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.86 (t, J=6.9Hz, 1.5H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.82 (t, J=6.9Hz, 1.5H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen)
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 18.44分、tR 17.79分を有する２つのピーク
【実施例６】
【０２５７】
5’-([(エチルオキシ-L-アラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンF
【化１５】
2019520345.tif 000018
F
2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン
【化１６】
2019520345.tif 000019
方法：８−クロロアデノシン（0.40 g、1.33ミリモル）を、アセトン（３０ml）に懸濁化し、HClO4（７０％、０.２ml）を１滴ずつ添加した。NaHCO3によって中和する前に、室温において、混合物を３０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗製物を、シリカゲルＣＣ（３％MeOH／CHCl3）によって精製して、白色の固体を得た（0.36 g、７９％）。
1H NMR (500MHz, MeOD)：δ8.18 (s, 1H, H2), 7.58 (br s, 2H, NH2), 6.05 (d, J=2.5Hz, 1H, H1’), 5.68 (dd, J=6.3, 2.5Hz, 1H, H2’), 5.07 (t, J=5.9Hz, OH-5’), 5.04 (dd, J=6.3, 3.1Hz, 1H, H3’), 4.23-4.18 (m, 1H, H-3’), 4.18-4.14 (m, 1H, H-4’), 3.54-3.48 (m, 1H, H5’), 3.46-3.41 (m, 1H, H5’), 1.55 (s, 3H, CH3), 1.34 (s, 3H, CH3)
ついで、2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（234 mg、0.69ミリモル）を、無水THF（３１ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、3.41ミリモル、3.41 ml）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（２ml）に溶解した５２（510 mg、1.49ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜５％MeOH／DCM）によって残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、５ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、調製TLC（１０％MeOH／DCM）によって２回精製して、5’-([(エチルオキシ-L-アラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンFを白色の固体として得た。
収量：２６mg、２つの工程全体として７.４％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.12 (s, 0.5H, H2) 8.11-8.07 (m, 1H, Naph) 8.05 (s, 0.5 H, H2), 7.87-7.84 (m, 1H, Nap), 7.67 (d, J=8.1 1H, Nap), 7.54-7.31 (m, 6H, Nap), 6.05-6.02 (m, 1H, H1’), 5.36-5.32 (m, 0.5H, H2’), 5.31-5.28 (m, 0.5H, H2’), 4.72-4.66 (m, 1H, H-3’), 4.55-4.49 (m, 1H, H5’) 4.46-4.37 (m, 1H, H5’), 4.28-4.22 (m, 1H, H4’), 4.06-3.91 (m, 2.5H, CH ala, CH2CH3 Et), 3.87-3.79 (m, 0.5H, CH ala), 1.28-1.25 (m, 1H, CH3 ala), 1.19-1.08 (m, 5H, CH3 ala, CH2CH3 Et)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3. 98 (s), 3.80 (s)
MS (ES+) m/z：実測値629.14 (M+Na+), 645.11 (M+K+), C25H28ClN6O8P理論値(M+) 606.95
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 14.43分、tR 13.73分を有する２つのピーク
【実施例７】
【０２５８】
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-アラニン-N-イルl)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンG
【化１７】
2019520345.tif 000020
G
方法：一般的方法Ｄ.２に従って調製した。2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（220 mg、0.64ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、1.93 ml、1.93ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（１.５ml）に溶解したナフチ-1-イル(シクロヘキシルオキシ-L-アラニル)ホスホロクロリデート（510 mg、1.29ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜２.５％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、２０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、シリカゲルＣＣ（０〜４％MeOH／DCM）によって精製して、６９を白色の固体として得た。
収量：293 mg、２つの工程全体として７５％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.13 (s, 0.5H, H2) 8.11-8.07 (m, 1H, Nap), 8.06 (s, 0.5 H, H2), 7.83 (d, J=8.3Hz, 1H, Nap), 7.64 (d, J=8.3Hz, 1H, Nap), 7.52-7.39 (m, 3H, Nap), 7.37-7.30 (m, 1H, Nap), 6.06-6.02 (m, 1H, H1’), 5.35-5.31 (m, 0.5H, H2’), 5.30-5.27 (m, 0.5 H, H2’), 4.70-4.65 (m, 1H, H3’), 4.65-4.38 (m, 3H, H5’, Ch CHex), 4.29-4.23 (m, 1H, H4’), 4.00-3.92 (m, 0.5H, CH ala), 3.91-3.83 (m, 0.5H, CH ala), 1.79-1.13 (m, 13H, CH3 ala, CH2 cHex)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3. 93 (s), 3.90 (s)
MS (ES+) m/z：実測値683.19 (M+Na+), 699.17 (M+K+), C29H34ClN6O8P理論値(M+) 660.19
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.36分、tR 17.93分を有する２つのピーク
【実施例８】
【０２５９】
5’-([(ベンジルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンH
【化１８】
2019520345.tif 000021
H
方法：一般的方法Ｄ.２に従って調製した。2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（200 mg、0.59ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、３当量、1.76 ml、1.76当量）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（３ml）に溶解したナフチ-1-イル-L-ロイシンベンジルエステルホスホロクロリデート（657.67 mg、1.47ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜４％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、第１にシリカゲルＣＣ（３〜６％MeOH／CH2Cl2）によって、第２に調製TLC（１０％MeOH／DCM）によって精製して、生成物を白色の泡沫として得た。
収量：110 mg、２つの工程全体として２６％
1H-NMR (500MHz, MeOD)：δ8.10 (s, 0.5H, H2) 8.09-8.05 (m, 1H, H8 Nap), 8.04 (s, 0.5 H, H2), 7.83-7.79 (m, 1H, H5 Nap), 7.62 (d, J=8.37Hz, 1H, H4 Nap), 7.49- 7.38 (m, 3H, H2, H6, H7 Nap), 7.32-7.19 (m, 6H, H3 Nap, Ph), 6.07-6.02 (m, 1H, H1’), 5.36-5.32 (m, 0.5H, H2’), 5.29-5.25 (m, 0.5H, H2’), 5.02-4.91 (m, 2H, CH2Ph), 4.67-4.60 (m, 1H, H3’), 4.55-4.41 (m, 2.5H, H5’), 4.40-4.33 (m, 0.5H, H5’), 4.29-4.22 (m, 1H, H4’), 3.99-3.86 (m, 1H, CH leu), 1.65-1.54 (m, 0.5H, CH leu), 1.51-1.31 (m, 2.5 H, CH leu, CH2 leu, CH3 Pen), 0.80-0.62 (m, 6H, CH3 leu)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.13 (s), 3.95 (s)
MS (ES+) m/z：実測値733.20 (M+Na+), 749.19 (M+K+)、C33H36ClN6O8P理論値(M+) 711.10
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 19.33分、tR 18.93分を有する２つのピーク
【実施例９】
【０２６０】
5’-([(ペンチ-1-イルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンI
【化１９】
2019520345.tif 000022
I
方法：一般的方法Ｄ.２に従って調製した。2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（180 mg、0.53ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、1.59 ml、1.59ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（３ml）に溶解したナフチ-1-イル-L-ロイシンペンチ-1-イルエステルホスホロクロリデート（677.16 mg、1.59ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜３％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、２０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、シリカゲルＣＣ（０〜６％MeOH／DCM）によって精製して、白色の泡沫を得た。
収量：132 mg、２つの工程全体として３６％
1H-NMR (500MHz, MeOD)：δ8.12 (s, 0.5H, H2) 8.11-8.06 (m, 1H, H8 Nap), 8.06 (s, 0.5H, H2), 7.84-7.79 (m, 1H, H5 Nap), 7.65-7.60 (m, 1H, H4 Nap), 7.51-.40 (m, 3H, H2, H6, H7 Nap), 7.32 (t, J=8.0Hz, 1H, H3 Nap), 6.07-6.03 (m, 1H, H1’), 5.37-5.33 (m, 0.5H, H2’), 5.30-5.26 (m, 0.5H, H2’), 4.69-4.62 (m, 1H, H-3’), 4.57-4.46 (m, 1.5H, H5’), 4.42-4.36 (m, 0.5H, H5’), 4.32-4.24 (m, 1H, H4’), 3.95-3.89 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 3.89-3.83 (m, 1H, CH leu), 1.70-1.57 (m, 0.5H, CH leu), 1.52-1.35 (m, 4.5H, CH2 leu, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen, CH leu), 1.26-1.15 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.85-0.80 (m, 3H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.80-0.68 (m, 6H, CH3 leu)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.06 (s), 4.02 (s)
MS (ES+) m/z：実測値713.24 (M+Na+), 729.20 (M+K+)、C31H40ClN6O8P理論値(M+) 691.11
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 21.33分、tR 20.87分を有する２つのピーク
【実施例１０】
【０２６１】
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンJ
【化２０】
2019520345.tif 000023
J
方法：一般的方法Ｄ.２に従って調製した。2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（６４mg、0.19ミリモル）を、無水THF（１５ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.57 ml、0.57ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（１.５ml）に溶解したナフチ-1-イル-L-ロイシンシクロヘキシルエステルホスホロクロリデート（250 mg、0.57ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜３％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、調製TLC（０〜５％MeOH／DCM）によって２回精製して、白色の固体を得た。
収量：１０mg、２つの工程全体として８％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.13 (s, 0.5H, H2) 8.12-8.07 (m, 1H, H8 Nap), 8.07 (s, 0.5 H, H2), 7.89-7.84 (m, 1H, H5 Nap), 7.69-7.64 (m, 1H, H4 Nap), 7.54-7.40 (m, 3H, H2, H6, H7 Nap), 7.37-7.32 (m, 1H, H3 Nap), 6.06-6.02 (m, 1H, H1’), 5.36-5.32 (m, 0.5H, H2’), 5.29-5.25 (m, 0.5H, H2’), 4.67-4.45 (m, 4.5H, H3’, H5’, CH cHex), 4.41-4.34 (m, 0.5H, H5’), 4.30-4.21 (m, 1H, H4’), 3.91-3.79 (m, 1H, CH leu), 1.74-1.22 (m, 13H, CH2CH leu, CH2 cHex), 0.85-0.70 (m, 6H, CH3 leu)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.12 (s), 4.02 (s)
MS (ES-VE) m/z：実測値701.21 (M-H+), 737.19 (M+Cl-)、C32H40ClN6O8P理論値(M+) 702.2
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 20.53分、tR 20.00分を有する２つのピーク
【実施例１１】
【０２６２】
5’-([(エチルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンK
【化２１】
2019520345.tif 000024
K
方法：2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（８０mg、0.23ミリモル）を、無水THF（１５ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.69 ml、0.69ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（１.５ml）に溶解したナフチ-1-イル-L-ロイシンエチルエステルホスホロクロリデート（254.5 mg、0.69ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜３％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、粗製物を、調製TLC（１０％MeOH／DCM）によって２回精製して、白色の固体を得た。
収量：３０mg、２つの工程全体として３５％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.12 (s, 0.5H, H2) 8.10-8.06 (m, 1H, H8 Nap), 8.05 (s, 0.5H, H2), 7.86-7.82 (m, 1H, H5 Nap), 7.67-7.63 (m, 1H, H4 Nap), 7.53-7.39 (m, 3H, H2, H6, H7 Nap), 7.36-7.31 (m, 1H, H3 Nap), 6.06-6.03 (m, 1H, H1’), 5.36-5.33 (m, 0.5H, H2’), 5.30-5.27 (m, 0.5H, H2’), 4.68-4.62 (m, 1H, H3’), 4.57-4.46 (m, 1.5H, H5’), 4.41-4.35 (m, 0.5H, H5’), 4.30-4.23 (m, 1H, H4’), 4.02-3.92 (m, 2H, CH2CH3 Et), 3.91-3.81 (m, 1H, CH leu), 1.70-1.61 (m, 0.5H, CH leu), 1.50-1.35 (m, 2.5H, CH2CH leu), 1.16-1.08 (m, 3H, CH2CH3 Et), 0.84-0.68 (m, 6H, CH3 leu)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.11 (s), 4.04 (s)
MS (ES-VE) m/z：実測値647.22 (M-H+), 683.14 (M + Cl-)、C28H34ClN6O8P理論値(M+) 649.03
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.88分、tR 17.43分を有する２つのピーク
【実施例１２】
【０２６３】
5’-([(ベンジルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンL
【化２２】
2019520345.tif 000025
L
方法：８−クロロアデノシン（150 mg、0.50ミリモル）を、無水THF（４０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１当量、0.50 ml、0.50当量）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（５ml）に溶解したナフチ-1-イル-グリシンベンジルエステルホスホロクロリデート（779.54 mg、２ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。第１にシリカゲルＣＣ（０〜６％MeOH／DCM）によって、及び第２に調製TLC（５％MeOH／DCM）によって、７６を白色の粉末として得た。
収量：１３mg、４％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.13-8.06 (m, 1.5H, H2, H8 Nap), 8.05 (s, 0.5H, H2), 7.87-7.84 (m, 1H, H5 Nap), 7.68-7.64 (m, 1H, H4 Nap), 7.53-7.26 (m, 9H, H2, H6, H7, H3 Nap, Ph), 6.04 (d, J=5.1Hz, 1H, H1’), 6.02 (d, J=5.1Hz, 1H, H1’), 5.33-5.28 (m, 1H, H2’), 5.10-5.01 (m, 2H, CH2Ph), 4.67-4.63 (m, 0.5H, H3’), 4.63-4.59 (m, 0.5H, H3’), 4.55-4.48 (m, 1H, H5’), 4.48-4.40 (m, 1H, H5’), 4.26-4.20 (m, 1H, H4’), 3.79-3.71 (m, 2H, CH2 gly)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.93 (s)
MS (ES-VE) m/z：実測値653.19 (M-H+), 688.64 (M+Cl-)、C29H28ClN6O8P理論値(M+) 654.99
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 15.84分、tR 15.33分を有する２つのピーク
【実施例１３】
【０２６４】
5’-([(シクロヘキシルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンM
【化２３】
2019520345.tif 000026
M
方法：2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（100 mg、0.29ミリモル）を、無水THF（２０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.88 ml、0.88ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（１.５ml）に溶解したナフタレン-1-イルグリシンシクロヘキシルエステルホスホロクロリデート（335 mg、0.88ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜３％MeOH／CH2Cl2）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、生成物を、調製TLC（１０％MeOH／CH2Cl2）によって２回精製して、生成物を白色の固体として得た。
収量：７mg、２つの工程全体として４％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.15-8.04 (m, 2 H, H2, H8 Nap), 7.89-7.85 (m, 1H, H5 Nap), 7.70-7.65 (m, 1H, H4 Nap), 7.55-7.44 (m, 3H, H2, H6, H7 Nap), 7.42-7.33 (m, 1H, H3 Nap), 6.04 (d, J=6.0Hz, 0.5 H, H1’), 6.02 (d, J=6.0Hz, 0.5H, H1’),  5.32-5.28 (m, 1H, H2’), 4.70-4.63 (m, 1.5H, H3’, CH cHex), 4.61-4.58 (m, 1H, H3’), 4.57-4.50 (m, 1H, H5’), 4.49-4.42 (m, 1H, H5’), 4.27-4.23 (m, 1H, H4’), 3.72-3.62 (m, 2H, CH2 gly), 1.81-1.64 (m, 4H, CH2 cHex), 1.56-1.49 (m, 1H, CH2 gly), 1.39-1.22 (m, 5H, CH2 gly)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.96 (s), 4.94 (s)
MS (ES+) m/z：実測値669.01 (M+Na+), 685.12 (M+K+)、C28H32ClN6O8P理論値(M+) 647.02
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.52分、tR 17.00分を有する２つのピーク
【実施例１４】
【０２６５】
5’-([(エチルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンN
【化２４】
2019520345.tif 000027
N
方法：８−クロロアデノシン（100 mg、0.33ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.33 ml、0.33ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（３ml）に溶解したナフチ-1-イル-グリシンエチルエステルホスホロクロリデート（434.5 mg、1.33ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。第１にシリカゲルＣＣ（０〜６％MeOH／DCM）によって、及び第２に調製TLC（５％MeOH／DCM）によって、白色の固体を得た。
収量：７mg、４％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.15-8.07 (m, 1.5H, H2, H8 Nap), 8.05 (s, 0.5 H, H2), 7.89-7.85 (m, 1H, H5 Nap), 7.69-7.66 (m, 1H, H4 Nap), 7.55-7.33 (m, 4H, H2, H6, H7, H3 Nap), 6.04 (d, J=5.1Hz, 0.5H, H1’), 6.02 (d, J=5.1Hz, 0.5H, H1’), 5.35-5.29 (m, 1H, H2’), 4.69-4.66 (m, 0.5H, H3’), 4.64-4.61 (m, 0.5H, H3’), 4.56-4.50 (m, 1H, H5’), 4.49-4.43 (m, 1H, H5’), 4.27-4.22 (m, 1H, H4’), 4.10-4.00 (m, 2H, CH2 Et), 3.73-3.62 (m, 2H, CH2 gly), 1.21-1.13 (m, 3H, CH3 Et)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.96 (s), 4.94 (s)
MS (ES -VE) m/z：実測値591.10 (M-H+), 627.08 (M+Cl-)、C24H26ClN6O8P理論値(M+) 592.93
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 13.88分を有する２つのピーク
【実施例１５】
【０２６６】
5’-([(ペンチ-1-イルオキシ-グリシン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンO
【化２５】
2019520345.tif 000028
O
方法：８−クロロアデノシン（130 mg、0.43ミリモル）を、無水THF（４０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１当量、0.43 ml、0.43当量）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（５ml）に溶解したナフチ-1-イル-グリシンペント-1-イルエステルホスホロクロリデート（637.36 mg、1.72ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。第１にシリカゲルＣＣ（０〜６％MeOH／DCM）によって、及び第２に調製TLC（７％MeOH／DCM）によって、生成物を白色の固体として得た。
収量：３９mg、１５％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.15-8.07 (m, 1.5H, H2, H8 Nap), 8.05 (s, 0.5H, H2), 7.87-7.82 (m, 1H, H5 Nap), 7.68-7.64 (m, 1H, H4 Nap), 7.54-.42 (m, 3H, H2, H6, H7 Nap), 7.35 (t, J=8.0Hz, 1H, H3 Nap), 6.04 (d, J=4.7Hz, 1H, H1’), 6.02 (d, J=4.7Hz, 1H, H1’), 5.37-5.25 (m, 1H, H2’), 4.69-4.65 (m, 0.5H, H3’), 4.64-4.60 (m, 0.5H, H3’), 4.58-4.50 (m, 1H, H5’), 4.50-4.41 (m, 1H, H5’), 4.29-4.22 (m, 1H, H4’), 4.03-9.94 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 3.75-3.64 (m, 2H, CH2 gly), 1.57-1.47 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 1.31-1.22 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.86 (t, J=6.9 Hz, 3H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.93 (s)
MS (ES+) m/z：実測値657.19 (M+Na+)、C27H32ClN6O8P理論値(M+) 635.01
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.91分、tR 17.39分を有する２つのピーク
【実施例１６】
【０２６７】
5’-([(ベンジルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンP
【化２６】
2019520345.tif 000029
P
方法：2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（100 mg、0.29ミリモル）を、無水THF（２０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.88 ml、0.88ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（２.５ml）に溶解したナフタレン-1-イルフェニルアラニンシクロヘキシルエステルホスホロクロリデート（422 mg、0.88ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜２％MeOH／CH2Cl2）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、生成物を、調製TLC（７％MeOH／CH2Cl2）によって２回精製して、白色の泡沫を得た。
収量：１２mg、２つの工程全体として６％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.08 (s, 0.5H, H2), 8.03 (s, 0.5H, H2), 8.00-7.97 (m, 1H, H8 Naph), 7.85-7.82 (m, 1H, H5 Nap), 7.64-7.61 (m, 1H, H4 Nap), 7.52-7.47 (m, 1H, H2 Nap), 7.44-7.38 (m, 1H, H6 Nap), 7.28-7.20 (m, 5H, Ph), 7.19-7.11 (m, 5H, Ph), 7.05-7.02 (m, 1H, H7 Nap), 7.00-6.96 (m, 1H, H3 Nap), 6.02-6.00 (m, 1 H, H1’), 5.32-5.25 (m, 1H, H2’), 4.98-4.88 (m, 2H, CH2Ph), 4.58-4.54 (m, 0.5H, H3’), 4.52-4.49 (m, 0.5H, H3’), 4.34-4.10 (m, 4H, H4’, H5’, CH phe), 3.01-2.90 (m, 1H, CH2 phe), 2.83-2.76 (m, 1H, CH2 phe)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.66 (s), 3.46 (s)
MS (ES+) m/z：実測値767.21 (M+Na+)、C36H34ClN6O8P理論値(M+) 745.12
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 20.48分、tR 20.03分を有する２つのピーク
【実施例１７】
【０２６８】
5’-([(ペンチル-1-イルオキシ-Lフェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンQ
【化２７】
2019520345.tif 000030
Q
方法：2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（100 mg、0.29ミリモル）を、無水THF（２０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、0.88 ml、0.88ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（２ml）に溶解したナフタレン-1-イルフェニルアラニン-1-ペンチルエステルホスホロクロリデート（404 mg、0.88ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜２％MeOH／CH2Cl2）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、生成物を、調製TLC（７％MeOH／CH2Cl2）によって２回精製して、白色の泡沫を得た。
収量：２０mg、２つの工程全体として１０％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.11 (s, 0.5H, H2),8.05 (s, 0.5H, H2), 8.04-8.00 (m, 1H, H8 Nap), 7.87-7.83 (m, 1H, H5 Nap), 7.67-7.61 (m, 1H, H4 Nap), 7.54-7.43 (m, 2H, H2, H6 Nap), 7.32-7.26 (m, 2H, Ph), 7.22-7.12 (m, 3H, Ph), 7.11-7.08 (m, 1H, H7 Nap), 7.07-7.04 (m, 1H, H3 Nap), 6.04-6.00 (m, 1H, H1’), 5.32-5.26 (m, 1H, H2’), 4.58-4.54 (m, 0.5H, H3’), 4.53-4.50 (m, 0.5H, H3’), 4.37-4.31 (m, 0.5H, H5’), 4.29-4.24 (m, 0.5H, H5’), 4.18-4.05 (m, 3H, H5’, H4’, CH phe), 3.90-3.79 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 3.00-2.90 (m, 1H, CH2 phe), 2.85-2.78 (m, 1H, CH2 phe), 1.45-1.35 (m, 2H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 1.25-1.09 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.83 (t, J=7.2Hz, 3H, CH2CH2CH2CH2CH3 Pen), 0.80 (t, J =7.2 Hz, 3H, C2CH2CH2CH2CH3 Pen)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：3.72 (s), 3.39 (s)
MS (ES+) m/z：実測値747.23 (M+Na+)、C34H38ClN6O8P 理論値(M+) 725.13
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 22.04分、tR 21.48分を有する２つのピーク
【実施例１８】
【０２６９】
5’-([(シクロヘキシルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンR
【化２８】
2019520345.tif 000031
R
方法：2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（123 mg、0.36ミリモル）を、無水THF（２０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１.１ml、１.１ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（２ml）に溶解したナフタレン-1-イルフェニルアラニンシクロヘキシルエステルホスホロクロリデート（498 mg、１.１ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜２.５％MeOH／CH2Cl2）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、生成物を、調製TLC（７％MeOH／CH2Cl2）によって２回精製して、白色の泡沫を得た。
収量：５３mg、２つの工程全体として２１％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.10 (s, 0.5H, H2), 8.05 (s, 0.5H, H2), 8.04-8.00 (m, 1H, H8 Nap), 7.86-7.82 (m, 1H, H5 Nap), 7.65-7.61 (m, 1H, H4 Nap), 7.53-7.48 (m, 1H, H2), 7.47-7.42 (m, 1H, H6), 7.32-7.22 (m, 2H, Ph), 7.21-7.12 (m, 3H, Ph), 7.11-7.08 (m, 1H, H7 Nap), 7.07-7.04 (m, 1H, H3 Nap), 6.04-6.01 (m, 1H, H1’), 5.32-5.27 (m, 1H, H2’), 4.59-4.50 (m, 2H, H3’, CH cHex), 4.39-4.26 (m, 1H, H5’), 4.20-4.04 (m, 3H, H5’, H4’, CH phe), 2.99-2.90 (m, 1H, CH2 phe), 2.86-2.78 (m, 1H, CH2 phe), 1.69-1.52 (m, 4H, CH2 cHex), 1.50-1.41 (m, 1H, CH2 cHex), 1.32-1.12 (m, 5H, CH2 cHex)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.73 (s), 3.74 (s)
MS (ES+) m/z：実測値759.19 (M+Na+)、C35H38ClN6O8P理論値(M+) 737.14
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 21.81分、tR 21.27分を有する２つのピーク
【実施例１９】
【０２７０】
5’-([(エチルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-ナフチ-1-イル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンS
【化２９】
2019520345.tif 000032
S
方法：2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（170 mg、0.50ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１.５ml、１.５ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（２ml）に溶解したナフタレン-1-イルフェニルアラニン-1-エチルエステルホスホロクロリデート（1.05 g、２.５ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜２％MeOH／CH2Cl2）によって精製して、残渣を得て、これを、HCOOH／H2O（３／２、１０ml）中、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、生成物を、調製TLC（７％MeOH／CH2Cl2）によって２回精製して、白色の泡沫を得た。
収量：９０mg、２つの工程全体として２６％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.09 (s, 0.5H, H2), 8.04 (s, 0.5H, H2), 8.00 (d, J=8.4Hz, 1H, H8 Nap), 7.80 (d, J=8.2Hz, 1H, H5 Nap), 7.62-7.58 (m, 1H, H4 Nap), 7.50-7.40 (m, 2H, H2, H6), 7.32-7.23 (m, 1H, Ph), 7.20-7.07 (m, 4H, H7, Ph), 7.05-7.01 (m, 1H, H3 Nap), 6.05-6.01 (m, 1H, H1’), 5.33-5.28 (m, 1H, H2’), 4.60-4.53 (m, 1H, H3’), 4.38-4.31 (m, 0.5H, H5’), 4.30-4.24 (m, 0.5H, H5’), 4.20-4.10 (m, 4.5H, H5’, H4’, CH phe, CH2 Et), 4.09-4.03 (m, 0.5H, H5’), 3.97-3.85 (m, 2H, CH2 phe), 1.07-0.98 (m, 3H, CH3 Et)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.73 (s), 3. 42 (s)
MS (ES+) m/z：実測値705.18 (M+Na+)、C31H32ClN6O8P理論値(M+) 683.05
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.00分、tR 16.53分を有する２つのピーク
【実施例２０】
【０２７１】
5’-([(ベンジルオキシ-D-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンT
【化３０】
2019520345.tif 000033
T
８−クロロアデノシン（0.31 g、1.03ミリモル）を、Ar雰囲気下、無水THFに溶解し、室温において、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１当量、１.２ml、１.２ミリモル）を、１滴ずつ添加した。好適なホスホロクロリデート（0.91 g、2.57ミリモル）のTHF溶液を添加する前に、混合物を１０分間撹拌した。混合物を一夜撹拌し、シリカゲルＣＣ（３〜５％MeOH／DCM）によって精製し、続いて、別のＣＣ（４％MeOH／CHCl3）及び調製TLC（移動相：５％MeOH／DCM）及びEtOAc／H2O洗浄を行った。
収量：６２mg、１１％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.18, 8.16 (2 x s, 1H, H-2), 7.36-7.07 (m, 10H, Ar), 6.05, 6.02 (2 x d, J=4.6, 5.0, 1H, H-1’), 5.32 (m, 1H, H-2’), 5.14-4.46 (m, 2H, CH2 (Bn)), 4.67, 4.61 (2 x t, J=5.3, 5.2, 1H, H-3’), 4.46-4.26 (m, 2H, H-5’), 4.21 (m, 1H, H-4’), 3.89 (m, 1H, CHCH3), 1.24, 1.21 (2 x d, J=7.3, 7.0, 3H, CH3)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.6, 3.4 (2 x s, ジアステレオ異性体)
HR-MS (ES+) m/z：実測値(M+H+)619.1490、C26H28ClN6O8P理論値(M+) 619.1473
HPLC：H2O／CH3OH（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 17.00分を有する１つのピーク
HPLC：H2O／CH3CN（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 11.6分を有する１つのピーク
【実施例２１】
【０２７２】
5’-([(ベンジルオキシ-L-フェニルアラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンU
【化３１】
2019520345.tif 000034
U
2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（0.25 g、0.73ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、６当量、４.４ml、４.４ミリモル）を添加した。好適なホスホロクロリデート（1.61 g、3.75ミリモル）のTHF（３ml）溶液を添加し、混合物を一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させた。シリカゲルＣＣ（３％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これをHCOOH／H2O（３０＋２０ml）中、室温において、一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（３〜５.５％MeOH／DCM）、続く、調製TLC（１０％MeOH／DCM）によって、所望の化合物を得た。
収量：７６mg、２つの工程全体として１５％
1H-NMR (500MHz, MeOD)：δ8.17, 8.15 (2 x s, 1H, H-2), 7.38-7.25, 7.20-7.09 (2 x m, 10H, Ar), 6.03 (m, 1H, H-1’), 5.35, 5.27 (2 x t, J=5.4, 5.1, 1H, H-2’), 5.11-5.04 (m, 2H, CH2 (Bn)), 4.61, 4.57 (2 x t, J=5.3, 5.1, 1H, H-3’), 4.45-4.24 (m, 2H, H-5’), 4.19 (m, 1H, H-4’), 3.88 (m, 1H, CHNH), 1.71-1.38 (m, 3H, CH2CH(CH3)2), 0.86, 0.83, 0.79, 0.76 (4 x d, J=6.7, 6.6, 6.3, 6.2, 6H, CH(CH3)2, ジアステレオ異性体)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.8, 3.6 (2 x s, ジアステレオ異性体)
HR-MS (ES+) m/z：実測値(M+H+)661.1965、C29H34ClN6O8P理論値(M+) 661.1943
【実施例２２】
【０２７３】
5’-([(ベンジルオキシ-L-ロイシン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンV
【化３２】
2019520345.tif 000035
V
2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（８０mg、0.23ミリモル）を、無水THF（３０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、６当量、１.４ml、１.４ミリモル）を添加した。好適なホスホロクロリデート（0.49 g、1.24ミリモル）のTHF（３ml）溶液を添加し、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（２％MeOH／DCM）によって精製して、残渣を得て、これをHCOOH／H2O（１８＋１２ml）中、室温において、一夜撹拌した。生成物を、調製TLC（３〜3.55％MeOH／DCM）によって精製した。
収量：８３mg、２つの工程全体として５５％
1H-NMR (500MHz, MeOD)：δ8.17, 8.15 (2 x s, 1H, H-2), 7.38-7.25, 7.20-7.09 (2 x m, 10H, Ar), 6.03 (m, 1H, H-1’), 5.35, 5.27 (2 x t, J=5.4, 5.1, 1H, H-2’), 5.11-5.04 m, 2H, CH2 (Bn)), 4.61, 4.57 (2 x t, J=5.3, 5.1, 1H, H-3’), 4.45-4.24 (m, 2H, H-5’), 4.19 (m, 1H, H-4’), 3.88 (m, 1H, CHNH), 1.71-1.38 (m, 3H, CH2CH(CH3)2), 0.86, 0.83, 0.79, 0.76 (4 x d, J=6.7, 6.6, 6.3, 6.2, 6H, CH(CH3)2, ジアステレオ異性体)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.8, 3.6 (2 x s, ジアステレオ異性体)
HR-MS (ES+) m/z：実測値(M+H+)661.1965、C29H34ClN6O8P理論値(M+) 661.1943
HPLC：H2O／CH3CN（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 13.7分、tR 13.9分を有する２つのピーク
【実施例２３】
【０２７４】
5’-([(イソプロピルオキシ-L-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンW
【化３３】
2019520345.tif 000036
W
８−クロロアデノシン（0.30 g, 0.99ミリモル）を、無水のピリジン及びTHFの混合物（８＋１２ml）に溶解した。溶液を０℃に冷却し、NMI（０.４ml、５.０ミリモル）を、１滴ずつ添加した。無水のTHF（２ml）に溶解したホスホロクロリデート（1.26 g、4.12ミリモル）をゆっくりと添加する前に、混合物を１０分間撹拌した。一夜撹拌した後、追加のNMI（０.４ml、５.０ミリモル）を添加し、混合物を４８時間撹拌した。t-BuMgCl （０.１M THF溶液、１.０ml、１.０ミリモル）及びホスホロクロリデート（1.33 g、4.35ミリモル）を添加し、混合物を２４時間撹拌した。溶媒を蒸発させた。残渣を、シリカゲルＣＣ（５〜１０％MeOH／DCM及び４〜５％MeOH／DCM）によって２回、続いて、調製TLC（４×５％MeOH／DCM）によって精製した。所望の生成物をEtOAcに溶解した水で洗浄した。
収量；１５mg、２％
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.60, 3.55 (2 x s, ジアステレオ異性体)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ7.35-7.27, 7.19-7.13 (2 x m, 6H, Ph, H-2), 6.04 (m, 1H, H-1’), 5.34, 5.29 (2 x t, J=5.0, 4.9, 1H, H-2’, ジアステレオ異性体), 4.91 (m, 1H, CH (iPr)), 4.66 (m, 1H, H-3’), 4.45, 4.33 (2 x m, 2H, H-5’), 4.22 (m, 1H, H-4’), 3.85, 3.77 (2 x m, 1H, CH (Ala), ジアステレオ異性体), 1.34-1.27, 1.23-1.17 (2 x m, 9H, 3 x CH3)
HPLC：H2O／CH3OH（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 15.1分、tR 15.9分を有する２つのピーク
【実施例２４】
【０２７５】
5’-([(シクロヘシルオキシ-L-アラニン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンX
【化３４】
2019520345.tif 000037
X
８−クロロアデノシン（0.21 g, 0.70ミリモル）を、無水のピリジン及び無水のTHFの混合物（８＋１２ml）に溶解し、０℃において、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、０.７ml、０.７ミリモル）を、１滴ずつ添加し、混合物を１０分間撹拌した。好適なホスホロクロリデート（０.５g、１.４ミリモル）を無水のTHF（２ml）に溶解し、ゆっくりと混合物に添加した。溶媒を蒸発させる前に、 混合物を２４時間撹拌した。残渣を、シリカゲルＣＣ（５％MeOH／DCM）、続く、調製TLC（５％MeOH／DCM）によって精製した。続いて、さらに、調製TLC（１０％MeOH／DCM）及び続くEtOAc／H2O洗浄を行った。
収量；８mg、２％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.19, 8.17 (2 x s, H-2, ジアステレオ異性体), 7.34-7.27 (m, 2H, Ph), 7.19-7.13 (m, 3H, Ph.), 6.04 (d, J=4.5, 1H, H-1‘), 5.35, 5.29 (2 x m, 1H, H-2’, ジアステレオ異性体), 4.73-4.62 (m, 2H, H-3’, CH (cHx)), 4.45, 4.34 (2 x m, 2H, H-5’), 4.22 (m, 1H, H-4’), 3.88, 3.80 (2 x m, 1H, CH (Ala)), 1.82-1.67, 1.54, 1.46-1.31 (3 x m, 10H, cHx), 1.29, 1.22 (2 x d, J=7.0, 7.1, 3H, CH3)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.6, 3.5 (2 x s, ジアステレオ異性体)
HPLC：H2O／CH3OH（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 18.0分、tR 18.6分を有する２つのピーク
【実施例２５】
【０２７６】
5’-([(ネオペンチルオキシ-2,2-ジメチルグリシン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンY
【化３５】
2019520345.tif 000038
Y
８−クロロアデノシン（0.30 g, 0.99ミリモル）を、無水のピリジン及び無水のTHFの混合物（２＋３）に溶解し、０℃において、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１.０ml、１.０ミリモル）を、１滴ずつ添加し、混合物を１０分間撹拌した。好適なホスホロクロリデート（１.６g、４.５ミリモル）を無水のTHFに溶解し、ゆっくりと混合物に添加した。室温において、混合物を４８時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を、シリカゲルＣＣ（３％MeOH／DCM）、調製TLC（移動相：１０％MeOH／DCM）及びEtOAc／H2O洗浄によって精製した。続いて、調製TLC（移動相：１０％MeOH／DCM）を行って、所望の生成物を得た。
収量；１３mg、２％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.2, 8.1 (2 x s, 1H, H-2, ジアステレオ異性体), 7.33-7.27 (m, 2H, Ph), 7.19-7.12 (m, 3H, Ph), 6.04 (m, 1H, H-1’), 5.33, 5.28 ( 2 x t, J=5.2, 4.9, 1H, H-2’) 4.67, 4.63 (2 x t, J=5.4, 5.2, 1H, H-3’), 4.46, 4.37 (2 x m, 2H, H-5’), 4.22 (m, 1H, H-4’), 3.79-3.76 (m, 2H, CH2tBu), 1.45, 1.44, 1.43, 1.41 (4 x s, CH3 ジメチルグリシン, ジアステレオ異性体), 0.94 (s, 9H, tBu)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ2.0, 1.9 (2 x s, ジアステレオ異性体)
HPLC：H2O／CH3OH（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 18.5分、tR 18.8分を有する２つのピーク
【実施例２６】
【０２７７】
5’-([(メチルオキシ-L-メチオニン-N-イル)フェニル]-pホスファチル)8-クロロアデノシンZ
【化３６】
2019520345.tif 000039
Z
2',3'-O-イソプロピリデン-8-クロロアデノシン（0.18 g、0.49ミリモル）を、無水THF（２０ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、１０当量、５.０ml、５.０ミリモル）を添加した。ホスホロクロリデート（1.26 g、3.73ミリモル）の無水THF（３ml）溶液を添加し、混合物を一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させた。シリカゲルＣＣ（３％MeOH／DCM）後に得られた残渣を、HCOOH／H2O混合物（６＋４ml）中で、室温において、一夜撹拌した。溶媒の蒸発によって残渣を得て、これを、調製TLC（５％MeOH／DCM、１０％MeOH／DCM）によって精製し、EtOAcに溶解し、H2Oにて洗浄した。
収量：１５mg、２つの工程全体として５％
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ3.63, 3.61 (2 x s, ジアステレオ異性体)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.20, 8.17 (2 x s, 1H, H-2, ジアステレオ異性体), 7.36-7.28 (m, 2H, Ph), 7.21-7.14 (m, 3H, Ph), 6.05, 6.03 (2 x d, J=5.0, 4.7, 1H, H-1’), 5.37, 5.30 (2 x t, J=5.3, 5.1, 1H, H-2’), 4.65 (t, J=5.2, 1H, H-3’), 4.51-4.29 (m, 2H, H-5’), 4.24, 4.20 (2 x q, J=4.6, 4.9, 1H, H-4’), 4.03, 3.93 (2 x m, 1H, CH (Met)), 3.653, 3.646 (2 x s, 3H, CH3O), 2.51-2.44, 2.40-2.28 (2 x m, 2H, CH2S), 2.01, 1.98 (2 x s, 3H, CH3S), 1.95-1.81, 1.79-1.70 (2 x m, 2H, CH2CH (Met))
HR-MS (ES+) m/z：実測値(M+Na+) 625.1006、C22H28ClN6O8P理論値(M+Na+) 625.1013
【実施例２７】
【０２７８】
5’-([(ベンジルオキシ-L-バリン-N-イル)-フェニル]-ホスファチル)8-クロロアデノシンAA
【化３７】
2019520345.tif 000040
AA
2',3'-O-シクロペンチリデン-8-クロロアデノシン（0.15 g、0.41ミリモル）を、無水THF（１５ml）に溶解し、t-BuMgCl（１.０M THF溶液、３当量、１.２ml、１.２ミリモル）をゆっくりと添加し、続いて、無水THF（３ml）に溶解したホスホロクロリデート（0.89 g、2.33ミリモル）を添加した。室温において、混合物を一夜撹拌した。シリカゲルＣＣ（０〜２.５％MeOH／DCM）によって、残渣を得て、これをHCOOH／H2O混合物（６＋４ml）中で、室温において、一夜撹拌した。溶媒を真空下で蒸発させ、シリカゲルＣＣ（４％MeOH／DCM、３.５〜４％MeOH／DCM）によって２回精製した。
収量：0.11 g、２つの工程全体として４１％
MS：m/z=[M(35Cl)+H]+  理論値／実測値：647.1786／647.1786
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ4.3, 4.2 (2 x s, ジアステレオ異性体)
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.17, 8.15 (2 x s, 1H, H-2, ジアステレオ異性体), 7.45-7.08 (m, 10H, Ar), 6.04 (m 1H, H-1’), 5.34, 5.28 (2 x m, 1H, H-2’), 5.11-5.03 (m, 2H, CH2 (Bn)), 4.65, 4.61 (2 x t, J=5.3, 5.2, 1H, H-3’), 4.42, 4.31 (2 x m, 2H, H-5’), 4.20 (m, 1H, H-4’), 3.64 (m, 1H, CHNH (Val)), 1.94 (m, 1H, CH(CH3)2), 0.84, 0.81, 0.77, 0.76 (4 x d, J=6.8, 6.8, 5.4, 6H, 2 x CH3, ジアステレオ異性体)
HR-MS (ES+) m/z：実測値(M+H+) 647.1786、C28H32ClN6O8P理論値(M+) 647.1786
HPLC：H2O／CH3OH（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 19.0分を有する１つのピーク
HPLC：H2O／CH3CN（３０分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、λ=254 nm）、tR 13.1分を有する２つのピーク
【実施例２８】
【０２７９】
8-クロロアデノシン5’-O-ビス(ベンジルオキシ-L-アラニン-N-イル) ホスフェートAB
【化３８】
2019520345.tif 000041
AB
方法：８−クロロアデノシン（250 mg、0.83ミリモル）を無水の(CH3)3PO3（５ml）に懸濁化し、及び−５℃において、POCl3（77.36μl、0.83ミリモル）を１滴ずつ添加した。反応混合物を、室温において、４時間撹拌させた。無水のCH2Cl2（５ml）に溶解したL-アラニン-O-ベンジルエステルp-TSA塩（1.46 g、4.15ミリモル）の溶液を添加し、続いて、−７８℃において、ジイソプロピルエチルアミン（1.45 ml、８.３ミリモル）を添加した。室温において、２０時間撹拌した後、水を添加し、相を分離した。水相をジクロロメタンにて抽出し、有機相を塩水にて洗浄した。合わせた有機相を、Na2SO4にて乾燥し、濃縮した。残渣を、カラムクロマトグラフィー（CH2Cl2／MeOH＝９６／４から９３／７への勾配溶離）によって精製して、白色の泡沫を得た。
収量：245 mg、２つの工程全体として４２％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.21 (s, 1H, H2), 7.36-7.26 (m, 10H, Ph), 6.02 (d, J=4.8Hz, 1H, H1’), 5.30 (t, J=5.5Hz, 1H, H2’), 5.14-5.02 (m, 4H, CH2Ph), 4.62 (dd, J=7.5, 5.0Hz, 1H, H3’), 4.31-4.24 (m, 1H, H5’), 4.18-4.11 (m, 2H, H5’, H4’), 3.95-3.82 (m, 2H, CH ala), 1.28 (d, J=7.2 Hz, 3H, CH3 ala), 1.23 (d, J=7.2Hz, 3H, CH3 ala)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ13.54 (s)
MS (ES+) m/z：実測値704.1 (M+H+), 726.1 (M+Na+)、C30H35ClN7O9P理論値(M+) 704.07
HPLC：H2O／CH3CN（３５分で９０／１０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml/分、l=254）
【実施例２９】
【０２８０】
8-クロロアデノシン5’-O-ビス(ベンジルオキシ-グリシン-N-イル)ホスフェートAC
【化３９】
2019520345.tif 000042
AC
方法：８−クロロアデノシン（100 mg、0.33ミリモル）を無水の(CH3)3PO3（５ml）に懸濁化し、及び−５℃において、POCl3（30.89μl、0.33ミリモル）を１滴ずつ添加した。反応混合物を、室温において、４時間撹拌させた。無水のCH2Cl2（５ml）に溶解したグリシン-O-ベンジルエステル塩酸塩（333 mg、1.65ミリモル）の溶液を添加し、続いて、−７８℃において、ジイソプロピルエチルアミン（0.57 ml、３.３ミリモル）を添加した。室温において、２０時間撹拌した後、水を添加し、相を分離した。水相をジクロロメタンにて抽出し、有機相を塩水にて洗浄した。合わせた有機相を、Na2SO4にて乾燥し、濃縮した。残渣を、カラムクロマトグラフィー（CH2Cl2／MeOH＝９６／４から９３／７への勾配溶離）によって精製して、白色の泡沫を得た。
収量：６０mg、２つの工程全体として２７％
1H-NMR (500MHz, CD3OD)：δ8.23 (s, 1H, H2), 7.35-7.26 (m, 10H, Ph), 6.03 (d, J=5.1Hz, 1H, H1’), 5.31 (dd, J=5.5, 5.1Hz, 1H, H2’), 5.11-5.08 (m, 4H, CH2Ph), 4.59 (t, 5.5, 5.1Hz, 1H, H3’), 4.34-4.28 (m, 1H, H5’), 4.27-4.16 (m, 2H, H5’, H4’), 3.70-3.64 (m, 4H, CH2 gly)
31P-NMR (202MHz, CD3OD)：δ15.96 (s)
MS (ES+) m/z：実測値704.1 (M+H+), 726.1 (M+Na+)、C28H31ClN7O9P理論値(M+) 676.01
HPLC：H2O／CH3OH（３５分で100／０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml／分、λ=254 nm）、tR 23.23分を有する１つのピーク
【０２８１】
立体化学及び決定方法
異性体の分離及び同定
ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテート（化合物B）及び(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート（化合物Ｄ）の両方は、他のproTide、例えば、NUC-1031（Acelarin）が、キラルリン原子の存在のため、そうであるように、ジアステレオマー型として存在できる。合成の間に、典型的には、カップリング反応が、新しいキラル中心の形成に関与し、上記２つのproTideは、それぞれ、２つのジアステレオ異性体の混合物として形成される。本明細書に記載の他の化合物についても同様である。
【０２８２】
本発明の化合物において、ホスフェート中心がキラルであり、化合物が、独立して、Rp及びSpジアステレオ異性体として存在するため、化合物は、混合したRp及びSpジアステレオ異性体又は一方の純粋なジアステレオ異性体として存在できる。
【０２８３】
ジアステレオ異性体は、独立して、31P-NMRによって検出され、クロマトグラフィーによって分離され、各単離されたピークが、混合物中に存在する２つの31P-NMRシグナルの１つを提供する。
【０２８４】
分離技術は、クロマトグラフィー、例えば、カラムクロマトグラフィー、調製薄層クロマトグラフィー、調製HPLC又はBiotage Isolera（商標名）によるフラッシュ精製である。分離技術が調製HPLCである場合、逆相カラムC-18を使用できる。逆相カラムの例は、Varian Pursuit XRs 5 C-18である。分離技術がBiotage Isolera（商標名）である場合、逆相カートリッジを使用できる。逆相カートリッジの例は、SNAP Ultra C-18である。
【０２８５】
31P化学シフト、1H-NMRスペクトル、及びHPLCの保持時間と、文献において既知の他のProTideのものとの比較に基づき、化合物Ｂの異性体Ａを、仮に、Rp異性体とし、化合物Ｂの異性体Ｂを、仮に、Sp異性体とした。同様に、化合物Ｄの異性体Ａを、仮に、Rp異性体とし、化合物Ｄの異性体Ｂを、仮に、Sp異性体とした。絶対構造も、一般的なＸ線結晶解析によって決定される。
【０２８６】
２つの化合物の(Rp)及び(Sp)異性体を、下記の条件において、調製HPLCによって分離した：
装置：Varian Prostar （LC Worksttion-Varian Prostar 335 LC検出器）
流速：２０ml／分
カラム：Varian Pursuit XRs 5 C-18、150×２１
温度：室温
供給：MeOHに溶解
負荷：２０mg
溶媒：均一５５％MeOH水溶液
【０２８７】
各化合物の(Rp)及び(Sp)異性体を、下記の条件において、Isolera Biotageによって分離した：
装置：Isolera Biotage（商標名）
流速：１２ml／分
カラム：SNAP Ultra C-18 １２g
温度：室温
供給：MeOHに溶解
負荷：５０mg
溶媒：均一５５％MeOH水溶液
【０２８８】
支持する実験による証拠を、以下に示す。
【０２８９】
(2S)-ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ナフタレン-1-イルオキシ)ホスホリル)アミノ)プロパノエート（化合物Ｄ）のHPLCトレースを図９に示す。
【０２９０】
化合物Ｄの異性体Ａ
1H-NMR (500MHz; MeOD-d4)：δH 8.07 (1H, d J=8.5Hz, H-Napht), 8.05 (1H, s, 2-H), 7.87 (1H, d J=8.5Hz, H-Napht), 7.67 (1H, d J=8.5Hz, H-Napht) 7.54-7.48 (2H, m, H-Napht), 7.41-7.30 (1H, m, H-Napht), 7.36-7.33 (1H, m, H-Napht), 7.26-7.22 (5H, m, -CH2Ph), 6.03 (1H, d J=5.0Hz, H-1’), 5.33 (1H, t J=5.0Hz, H-2’), 5.01, 4.98 (AB, JAB=12.3Hz, CH2Ph), 4.65 (1H t J=5.5Hz, H-3’), 4.49-4.45 (1H, m, Ha-5’), 4.41-4.36 (1H, m, Hb-5’), 4.22-4.20 (1H, m, H-4’), 3.94-3.90 (1H, m, -CHCH3), 1.17 (1H, d J=7.0Hz, CH3)
31P-NMR (202MHz, MeOD-d4)：δP 3.93 (1P, s)
H2O／CH3CN（３０分で100／０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml／分、λ=254 nm）は、tR＝16.43分を有するピークを示した。
31P NMR (202 MHz, MeOD-d4)：δP 3.93
【０２９１】
化合物Ｄの異性体Ｂ
1H-NMR (500MHz; MeOD-d4)：δH 8.10 (1H, s, H-2), 8.08 (1H, d J=8.5Hz, H-Napht), 7.87 (1H, d J=8.5Hz, H-Napht), 7.67 (1H, d J=8.5Hz, H-Napht), 7.53-7.50 (1H, m, H-Napht), 7.48-7.44 (1H, m, H-Napht), 7.40-7.38 (1H, m, H-Napht), 7.33-7.27 (6H, m, H-Napht及び-CH2Ph), 6.02 (1H, d J=5.0Hz, H-1’), 5.28 (1H, t J= 5.0Hz, H-2’), 5.04, 5.02 (AB, JAB=12.2Hz, CH2Ph), 4.63 (1H t J=5.5Hz, H-3’), 4.48-4.46 (1H, m, Ha-5’), 4.38-4.35 (1H, m, Hb-5’), 4.23-4.20 (1H, m, H-4’), 4.05-4.01 (1H, m, -CHCH3), 1.17 (1H, d J=7.0Hz, CH3)
31P-NMR (202MHz, MeOD-d4)：δP 3.83 (1P, s)
HPLC：H2O／CH3CN（３０分で100／０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml／分、λ=254 nm）は、tR＝16.59分を有するピークを示した。
31P NMR (202MHz, MeOD-d4)：δP 3.83
【０２９２】
ベンジル2-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-8-クロロ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(フェノキシ)ホスホリル)アミノ)アセテート（化合物Ｂ）のHPLCトレースを図１０に示す。
【０２９３】
化合物Ｂの異性体Ａ
1H-NMR (500MHz; MeOD-d4)：δH 8.03 (1H, s, H-2), 8.23-7.13 (7H, m, CH2Ph及びPh), 7.05-6.99 (3H, m, Ph), 5.90 (1H, d J=5.0Hz, H-1’), 5.22 (1H, t J=5.0Hz, H-2’), 5.01, 4.97 (AB, JAB=12.2Hz, CH2Ph), 4.48 (1H t J=5.5Hz, H-3’), 4.53-4.47 (1H, m, Ha-5’), 4.23-4.18 (1H, m, Hb-5’), 4.08-4.050 (1H, m, H-4’), 3.56 (1H, d J=8.5Hz, -CH2aNH2), 3.54 (1H, d J=8.5Hz, -CH2aNH2)
31P-NMR (202MHz, MeOD-d4)：δP 4.63 (1P, s)
31P-NMR (202MHz, MeOD-d4)：δP 4.64
HPLC：H2O／CH3CN（３０分で100／０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml／分、λ=254 nm）は、tR＝12.58分を有するピークを示した。
【０２９４】
化合物Ｂの異性体Ｂ
1H-NMR (500MHz; MeOD-d4)：δH 8.06 (1H, s, 2-H), 7.23-7.16 (7H, m, -CH2Ph及びPh), 7.05-6.99 (3H, m, Ph), 5.92 (1H, d J=5.0Hz, H-1’), 5.20 (1H, t J=5.0Hz, H-2’), 5.01, 4.99 (AB, JAB=12.2Hz, CH2Ph), 4.53 (1H t J=5.5Hz, H-3’), 4.33-4.23 (2H, m, H-5’), 4.12-4.07 (1H, m, H-4’), 361-3.53 (2H, m, -CH2NH2)
31P NMR (202MHz, MeOD-d4)：δP 4.57 (1P, s)
H2O／CH3CN（３０分で100／０から０／100へ）にて溶離する逆相HPLC（１ml／分、λ=254 nm）は、tR＝12.88分を有するピークを示した。
【０２９５】
２．生物学的実験例
本発明を具現化する例示した化合物を、それらの癌幹細胞を標的化する能力及びそれらの抗癌効力についてアッセイした。
【実施例３０】
【０２９６】
インビトロ細胞毒分析
後述の表２に示す実験データでは、次の細胞株を使用している：
Lovo：結腸癌患者における転移部に由来する細胞株
MCF7：ヒトエストロゲン感受性乳腺上皮細胞株
PC3：ヒト前立腺癌細胞株
A549：癌性肺組織由来細胞
L1210：リンパ性白血病のマウスに由来するリンパ芽球細胞株
FM3A：乳癌マウス細胞
CEM：急性リンパ性白血病の患者の血液に由来するヒトＴ-リンパ芽球
HeLa：子宮頸部腺癌の患者に由来する上皮細胞
本発明のいくつかの化合物を、下記のアッセイ法に従って、癌細胞株におけるそれらの細胞毒活性についてアッセイした。
【０２９７】
L1210、CEM及びHeLa細胞株の細胞毒性アッセイ法
マウス白血病L1210、ヒトＴ-リンパ球CEM、及びヒト子宮頸癌細胞を、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC）（ロックビル、MD）から得た。全ての細胞を、１０％ウシ胎児血清（FBS）（Biochrom AG、ベルリン、独国）、１０mM Hepes、及び１mMピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）を含むDulbecco改変Eagle培地（DMEM）（Invitrogen、カルルスバド、CA）に維持した。細胞を、５％ＣＯ２の気相を有する加湿インキュベーターにおいて、３７℃で生育させた。単層細胞（HeLa及びHeLa）を、９６ウエルマイクロタイタープレート（Nunc、ロスキルド、デンマーク国）に、10000個細胞／ウエルで播種した。２４時間後、テスト化合物を含有する等容量の新鮮な培地を添加した。５日の時点で、細胞をトリプシン処理し、Coulterカウンター（Analis、Suarlee、ベルギー国）で計数した。懸濁液の細胞（L1210、CEM）を、所定量のテスト化合物の存在下、９６ウエルマイクロタイタープレート（Nunc）に、60000個細胞／ウエルで、播種した。４８時間（L1210）又は７２時間（CEM）、細胞を増殖させ、ついで、Coulterカウンターで計数した。５０％阻害濃度（IC50）は、細胞の増殖を５０％低減させるために必要な化合物の濃度として定義される。上に概説したように、３日後に、化合物の細胞分裂阻止活性を測定した。
【０２９８】
MCF7、LoVo、A549及びPC3細胞株の細胞毒性アッセイ法
MTTアッセイ法によって、MCF7、LoVo、A549及びPC3細胞株における抗腫瘍性の評価を行った。化合物をDMSOに溶解して、０.１〜100 mMストック溶液を調製し、−２０℃において保存した。細胞を、９６ウエルマイクロタイタープレートに、５×１０３個細胞／穴の濃度で播種した。各アッセイ直前に、化合物の希釈系列を調製した（最終濃度０.１〜100μM）。実験培地は、DMEM+１０%FCS（PC3及びLovo）又はRPMI+１０％熱不活性化FCS（A549及びMCF7）であった。３７℃、５％ＣＯ２において、９６時間、化合物に曝露した後、各ウエルにMTT試薬（Sigma-Aldrich）を添加した（最終濃度０.５mg/ml）。３７℃において、４時間インキュベーションして、生存細胞によってMTTを還元させて、不溶性のホルマザンとした。MTTを除去し、Triton X-100の１０％PBS溶液を添加して、ホルマザンを可溶化した。細胞の生存率の測定法として、分光光度計Tecan Sunriseにおいて、540 nmにおける吸光度を測定した。このようにして、コントロールに対する阻害率を測定した（IC50）。
【０２９９】
初期スクリーニングの結果を表２に示す。Ａは、０.１〜５の絶対IC50を表示し、Ｂは、５より大、１５以下の絶対IC50を表示し、Ｃは、１５より大、100以下の絶対IC50を表示し、及びＤは、100より大の絶対IC50を表示する。
【表２】
2019520345.tif 000043
テストした化合物の全てが、いくつかの細胞株に対する阻害活性を示した。
【実施例３１】
【０３００】
更なるインビトロ細胞毒性分析
ついで、下記のアッセイ法を使用して、本発明の化合物のサブセットを、幅広い各種の固体腫瘍及び血液系腫瘍におけるそれらの細胞毒活性についてアッセイした。
【０３０１】
固体腫瘍及び血液系腫瘍アッセイ
選択した細胞株における細胞の生存性に対する化合物の効果をアッセイするために、CellTiterGlo（CTG、Promega-G7573）アッセイを使用して、７２時間にわたって、インビトロ生存率測定を行った。９６ウエルプレートにおいて、９点、3.16倍の用量設定での化合物の処理により、〜７２時間まで、テストを二重で実施した。化合物の開始濃度は、198μMである。９６ウエルプレートにおけるCellTiterGloを使用する細胞生存性アッセイを行った。化合物処理７２時間（標準生育条件）を、２回繰り返した。化合物を、解凍100％にて４０mMに溶解した。化合物を、解凍したDMSOに、3.16倍で連続して希釈し、培地（２μl＋200μl)）に溶解する前に、３７℃に加温した。化合物が培地に溶解した後、インキュベーターにおいて、化合物を含有する培地を３７℃に加温し、ついで、培地中の化合物を、二重に、細胞プレート（５０μl＋５０μl）に添加した。化合物の最終濃度は、198μMから19.9 nMまでであった。すべての化合物の溶解度をチェックし、再度、記録し、ついで、直ちに、プレートをＣＯ２組織培養インキュベーターに移し、３日間インキュベートした。DMSOの最終濃度は０.５％である。
【０３０２】
以下の細胞株をテストし、下記の表３に示す。
【表３】
2019520345.tif 000044
【０３０３】
更なるスクリーニングの結果を表４に示す。Ａは、０.１〜５の絶対IC50を表示し、Ｂは、５より大、１５以下の絶対IC50を表示し、Ｃは、１５より大、100以下の絶対IC50を表示し、及びＤは、100より大の絶対IC50を表示する。
【表４−１】
2019520345.tif 000045
【表４−２】
2019520345.tif 000046
【表４−３】
2019520345.tif 000047
【０３０４】
化合物Ｄの異性体Ａ及びＢを別々にテストし、結果を表５に示す。
【表５】
2019520345.tif 000048
【実施例３２】
【０３０５】
細胞毒性及び癌幹細胞活性のアセスメント
拡張した用量範囲にわたっての化合物の毒性について、更なる比較分析を行い、KGla細胞株内の白血病幹細胞コンパートメントに対する化合物の相対効果を、全用量範囲で評価した。このように、白血病細胞株における癌幹細胞を標的化する能力を評価するために、本発明の化合物のいくつかについて、実験テストを行った。幹細胞コンパートメントに対する化合物の相対効果を評価するために、急性骨髄性白血病（AML）細胞株KGlaを使用した。KGlaを選択した理由は、KGlaが、異なる免疫表現型（Lin-/CD34+/CD38-/CD123+）を有するマイナーの幹細胞様コンパートメントを示すことにある。
【０３０６】
材料及び方法
KGlaの細胞培養条件
ペニシリン100単位、ストレプトマイシン100μg/ml、及び２０％ウシ胎児血清を補足したPRMI培地（Invitrogen、ペーズリー、英国）に、KGla細胞株の細胞を維持した。その後、９６ウエルプレートに細胞を一定量で分注し（１０５個細胞／100μl）、各一連の化合物について実験的に決定された濃度のヌクレオシドアナログ及びそれらの各ヌクレオチドアナログ（ProTideとして知られている）の存在下、加湿５％二酸化炭素雰囲気中、３７℃において、７２時間、インキュベートした。さらに、薬剤を何ら添加しないコントロールの培養を行った。その後、遠心分離によって、細胞を採取し、Annexin Vアッセイ法を使用して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０３０７】
インビトロアポトーシスの測定
培養した細胞を、遠心分離によって採取し、ついで、カルシウム−リッチ緩衝液195μlに再懸濁化した。続いて、Annexin V（Caltag Medsystems、ボトルフ・クレイドン、英国）５μlを細胞懸濁液に添加し、洗浄する前に、１０分間、暗所で、細胞をインキュベートした。最終的に、細胞を、ヨウ化プロピジウム１０μlとともに、カルシウム−リッチ緩衝液190μlに再懸濁化した。既に記載したように、２色免疫蛍光フローサイトメトリーによってアポトーシスをアセスした。その後、各ヌクレオシドアナログ及びProTideについて、LD50値（培地中の細胞の５０％を死滅させるために必要な用量）を算定した。
【０３０８】
白血病幹細胞コンパートメント免疫表現型の同定
広範囲の濃度の各被アッセイ化合物の存在下、KGLa細胞を７２時間培養した。ついで、細胞を採取し、抗−系統抗体（PE-cy7）、抗-CD34（FITC）、抗-CD38（PE）、及び抗-CD123（PERCP cy5）のカクテルによって標識化した。その後、白血病幹細胞（LSC）表現型を発現するサブ−集団を同定し、培地中に残された全ての生存細胞の百分率として表した。残留する幹細胞の百分率を、用量応答グラフにプロットし、化合物の効果を、８−クロロアデノシンと比較した。
【０３０９】
統計学的分析
これらの実験で得られたデータを、一元配置分散分析を使用して評価した。すべてのデータを、Ｋ二乗検定を使用して、ガウス又はガウス近似として確認した。ジグモイド用量応答曲線の非直線回帰及び線最適分析から、LD50値を算定した。ソフトウエアGraphpad Prism 6.0（Graphpad Software Inc.、サンディエゴ、CA）を使用して、全ての統計学的分析を行った。
【０３１０】
結果
インビトロ細胞毒性
Annexin V／ヨウ化プロピジウムアッセイを使用して、インビボ薬物感受性を測定した。
図１は、KGla細胞の未ソート集団における８−クロロアデノシン及び化合物Ｄ、Ｂ及びＥに関するLD50値を比較する。この図から理解されるように、化合物Ｄが、親プロドラッグ化合物８−クロロアデノシンよりも、全体として、癌細胞集団について、有意に（Ｐ＜0.0001）、より細胞毒性である。算定したLD50値も、表６に示す。
【表６】
2019520345.tif 000049
【０３１１】
抗−癌幹細胞活性
８−クロロアデノシン及びホスホルアミデート化合物Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥの白血病幹細胞（LSC）標的化能力を、図２におけるとともに、表６に示す。表及び図に示すデータはすべて、３つの独立した実験の平均（±SD）である。
【０３１２】
図２は、８−クロロアデノシン及びホスホルアミデート化合物Ｄ、Ｂ及びＥについての個々のシグモイド用量応答曲線を示す。
特定の用量でテストした化合物の全てが（８−クロロアデノシンを含む）、KGla集団の間に存在する白血病幹細胞（LSC）の割合を低減させた。これらの化合物の内、Ｂ及びＤは、８−クロロアデノシンと比較する場合、特に効果的なLSCの優先的標的化を示した。これらの効果は、１μlまでの濃度で観察された。図２(i)に示す濃度でLSCを枯渇させるＢ及びＤの能力においては、相互の間に、有意差はない。
化合物Ｄと８−クロロアデノシンとの間の抗‐癌幹細胞選択性の有意差は、図２(ii)（化合物Ｂ及びＥの各々で生じた効果がグラフから省略されている）において、明確に示されている。化合物Ｄによる癌幹細胞の標的化は、濃度１×１０−６及び５×１０−６Mでの化合物Ｄ又は８−クロロアデノシンによる治療後に存在するLSCの集団における統計学的に優位な低減を導く。
化合物AC及びＥ、及び両化合物Ｂ及びＤｎｏ異性体Ａ及びＢの抗‐癌幹細胞活性の更なる調査の結果を、図7及び8に示す。図7に示す結果から、化合物Ｂの異性体Ａが、８−クロロアデノシン又は化合物Ｂの異性体Ｂよりも、有意に、有力であったことが理解される。同様に、化合物Ｄの異性体Ａが、８−クロロアデノシン又は化合物Ｄの異性体Ｂよりも、有意に、有力であった。化合物Ｅは、８−クロロアデノシンよりも能力に劣り、一方、化合物ACは、化合物Ｂの異性体Ａ、又は化合物Ｄの異性体Ａほど細胞毒性ではない。
【０３１３】
図８に示した癌幹細胞の標的化についての研究の結果は、化合物Ｂの異性体Ａ及び化合物Ｄの異性体Ａの両方が、８−クロロアデノシンと比べて、統計学的には有意に増大された癌幹細胞を標的とする能力を有することを示す。化合物Ｄの異性体Ａと比べて、化合物Ｂの異性体Ａの癌幹細胞の標的化活性には、統計学的な有意差は存在しない。これに対して、化合物ACは、癌幹細胞を標的とする能力の証拠を示さなかった。
【０３１４】
表７は、本発明の化合物Ｄによって示された幹細胞の制御を、クロファラビン及びクラドリビン（それぞれ、対照化合物１及び２；国際公開第2006/100439号）と比較する。
対照化合物１
【化４０】
2019520345.tif 000050
対照化合物２
【化４１】
2019520345.tif 000051
理解されるように、化合物Ｄは、クロファラビン又はクラドリビン等価物よりも良好な癌幹細胞の制御を提供する。
【表７】
2019520345.tif 000052
【実施例３３】
【０３１５】
正常条件下及び誘導された抵抗性下の両方での細胞毒性評価
本発明の３つの化合物に関する細胞毒性及び8-Cl-Aの細胞内蓄積を、正常条件下及び誘導された抵抗性下（すなわち、阻害剤による）の両方で8-Cl-Aと比較した。
【０３１６】
細胞培養
HL-60、CTS、及びK-562は、白血病細胞株であり、これらをアメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC；ミドルセックス州）から入手した。HL-60細胞株は、急性前骨髄球性白血病のものであり、CTS細胞株は、急性骨髄性白血病のものであり、及びK-562細胞株は、慢性骨髄性白血病のものである。
HL-60、CTS、及びK-562細胞株を、１０％ウシ胎児血清（FBS）（PAA Laboratories）、１％アンホテリシンＢ（５.５ml）、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（５.５ml）（PAA Laboratories）を補足したRPMI-1640培地（Sigma-Aldrich、英国）において培養し、及び５％ＣＯ２を有するインキュベーターにおいて３７℃生育させた。
【０３１７】
細胞の処理及び抽出サンプル
細胞株３×１０６個細胞／mlを使用した。細胞を、２０μMの各8-Cl-A、化合物Ａ、化合物Ｂ、及び化合物Ｄの１μlにて処理し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で、２時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を遠心分離し（室温、1200 rpm、５分間）、上澄みを除去し、ペレットをPBS１mlで洗浄し、遠心分離した（室温、1200 rpm、５分間）。上澄みを除去し、ペレットをPBS 100μl及び０.８M過塩素酸100μlに再構成した。次いで、これを遠心分離し（室温、1200 rpm、５分間）、上澄み180μlを新しい管に移し、分析時まで、−８０℃において保存した。
阻害剤の研究のために、細胞株を、上記と同様にして、ただし、薬剤による処理前に処理を行い、多数の阻害剤を添加した：
１）ニトロベンジルチオイノシン（NBTI）（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO）は、hENT1を阻害する。
２）A-134974二塩酸塩水和物（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO）は、アデノシンキナーゼを阻害する。
３）EHNA塩酸塩（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO）は、アデノシンデアミナーゼを阻害する。
細胞を各阻害剤１０μMにて処理し、薬剤を添加する前に、５分間放置した。ついで、細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃において、２時間、インキュベートした。
【０３１８】
LC-MS/MS分析
Biobasic Ax5μmカラム（５０×２.１mm；Thermo Electron Corporation、マリエータ、CA、米国）、NH4Acの１０mM ACN/H2O（３０：７０v/v）溶液（pH６.０）（Ａ）及びNH4Acの１mM ACN/H2O（３０：７０v/v）溶液（pH10.5）（Ｂ）の混合物でなる移動相を具備する超高性能液体クロマトグラフィーシステム（Accela UPLC, Thermo Scientific、英国）を使用して、分析物を解析した。緩衝液Ａ＝９５％、０〜０.５分：1.25分にわたって９５から０％へ；1.75分間、０％で維持；０.１分にわたって０から９５％へ；２.９分間、９５％での溶離でなる移動相傾斜を使用した（いずれも流速は500μ1／分である）。
化合物の検出のために、エレクトロスプレーイオン源を具備するトリプルステージ四重極Vantage質量分析システム（Thermo Scientific、英国）を使用した。多重反応モニタリングにおいて、ネガティブイオンモード、スプレー電圧3000 Vで、サンプルを分析した。
【０３１９】
アデノシン5’-トリホスフェート（ATP）アッセイ
蛍光対応９６ウエルプレート（細胞の初期濃度は１×１０４個細胞／ウエルであった）における細胞を8-Cl-Aにて処理するために、ATP ViaLight（商標名）Plusアッセイキッド（Lonza、米国：製品No. LT07-121）を使用し、及び、それぞれ、濃度：０、０.１、０.５、１、５、及び１０μMのProTideを添加し、続いて、５％ＣＯ２を含むインキュベーターにおいて、３７℃で、７２時間、インキュベートした。
阻害剤の研究のため、薬剤よりも先に、濃度１０μMの各阻害剤を添加し、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で、７２時間、インキュベートした。
インキュベーション後、細胞溶解剤５０μlを、９６ウエルプレートに添加して、細胞内ATPを遊離させ、続いて、ATPモニタリング試薬（AMR）100μlを添加した。マイクロプレートリーダーFLUOstar OPTIMA（BMG Labtech）（酵素ルシフェラーゼを使用することによって、ATPを光に転換させる）を使用することによって、各ウエルの蛍光値を測定した。
【０３２０】
薬剤の安定性
ヒト血漿サンプル（Sera laboratories、英国）１０mlを、EHNA１μlにて処理した。濃度２０μMの各薬剤（8-Cl-A、化合物Ａ、化合物Ｂ、及び化合物Ｄ）１μlと一緒に、ここから１mlを取り出し、新しい管に添加し、及び５％ＣＯ２の存在下、３７℃で、２時間、インキュベートした。インキュベーション後、各サンプル100μlを取り出し、100％メタノールを添加し、氷上に３０分間放置した。３０分後、混合物を遠心分離し（14000 rpm、４℃、１０分）、上澄みを新しい管に移し、遠心濃縮機SpeedVacにて蒸発させた。ついで、乾燥ペレットを、１０％アセトニトリル溶液中において再構成し、UPLC-MS/MSシステムへのインジェクションのため、LC-MSバイアルに移した。
【０３２１】
統計学的分析
細胞の生存性対濃度の百分率の非線形回帰分析を使用して、薬剤の細胞毒性の用量応答曲線を測定し、及びEC50値を得た。各条件について、５回の繰り返しにおいて、細胞内アッセイを行った。8-Cl-ATP／ATP濃度の対応のあるＴ検定を使用して、細胞内アッセイを測定し、及びｐ値を得た。ヒト血漿における薬剤研究を、二元配置分散分析を使用して測定した。全ての分析について、Prism Softwareプログラム（GraphPad Software）を使用した。
【０３２２】
血液癌細胞株における細胞毒性アッセイ
阻害剤の存在下又は不存在下における細胞毒性アッセイの結果を、表８に要約した。
表８：HL-60、CTS、及びK-562細胞株を各種の条件下で処理する際の8-Cl-A及びProTideのEC50値
【表８】
2019520345.tif 000053
【０３２３】
血液癌細胞株における8-Cl-ATP／ATPの細胞内レベル
図３Ａは、HL-60細胞株を、8-Cl-A単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、8-Cl-Aで処理した後の活性な代謝物8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。8-Cl-A単独は、内因性代謝物ATPと等しい濃度の8-Cl-ATPを生成した。このように、生成された8-Cl-ATP/ATPの割合の平均は１に近いことが認められた。hENT1を阻害した後では、この割合は５０％減少され（p値=0.0156）、これは、hENT1の阻害が、細胞内への8-Cl-Aの取り込みを部分的に阻止したことを示している。しかし、アデノシンキナーゼを阻害した後では、割合はほぼ０であり（p値=0.0004）、これは、8-Cl-Aを活性化して、8-Cl-ATPとするためには、アデノシンキナーゼが必要であることを示している。
図３Ｂは、HL-60細胞株を、化合物Ａ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ａで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ａ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝0.02を生じた。hENT1の阻害は、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.9568）、これは、化合物Ａの取り込みが、hENT1に無関係であることを示している。アデノシンキナーゼをブロックすることは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.1016）、これは、化合物Ａの活性化が、アデノシンキナーゼとは無関係であることを示している。
図３Ｃは、HL-60細胞株を、化合物Ｂ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ｂで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ｂ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝0.13を生じた。hENT1をブロックすることは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.9064）、これは、化合物Ｂの取り込みが、hENT1に無関係であることを示している。しかし、アデノシンキナーゼを阻害した後では、この割合は５０％減少され（p値=0.0386）、これは、化合物Ｂの活性化が、部分的に、アデノシンキナーゼに依存することを示している。
図３Ｄは、HL-60細胞株を、化合物Ｄ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ｄで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ｄ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝０.６を生じた。hENT1を阻害することは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.4483）、これは、化合物Ｄの取り込みが、hENT1に無関係であることを示している。しかし、アデノシンキナーゼを阻害した後では、8-Cl-ATP/ATPの割合は５０％減少され（p値=0.0082）、これは、化合物Ｄの活性化が、部分的に、アデノシンキナーゼに依存することを示している。
【０３２４】
図４Ａは、CTS細胞株を、8-Cl-A単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、8-Cl-Aで処理した後の活性な代謝物8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。8-Cl-A単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝０．７を生じた。しかし、hENT1を阻害した後では、8-Cl-ATP/ATPの割合は５０％減少し（p値=0.0156）、これは、細胞内に侵入するためには、8-Cl-Aは、部分的にhENT1に依存することを示している。しかし、アデノシンキナーゼをA-134974で阻害した後では、この割合は、ほぼ０であり（p値=0.0004）、これは、8-Cl-Aは、8-Cl-ATPへの活性化には、アデノシンキナーゼを必要とすることを示している。
図４Ｂは、CTS細胞株を、化合物Ａ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ａで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ａ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝0.04を生じた。hENT1をブロックすることは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.2627）、これは、化合物Ａは、細胞内に侵入するためには、hENT1トランスポーターを必要としないことを示している。同様に、A-134974は、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.1588）、これは、化合物Ａの活性化が、アデノシンキナーゼとは無関係であることを示している。
図４Ｃは、CTS細胞株を、化合物Ｂ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ｂで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ｂ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝0.10を生じた。hENT1を阻害することは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.2725）、これは、hENT1を使用することなく、化合物Ｂが細胞に侵入することを示している。同様に、アデノシンキナーゼを阻害することは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.9138）、これは、化合物Ｂが、アデノシンキナーゼとは無関係に活性化されることを示している。
図４Ｄは、CTS細胞株を、化合物Ｄ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ｄで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ｄ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝０.８を生じた。hENT1を阻害することは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.1252）、これは、化合物Ｄが、hENT1を使用することなく、細胞膜を通ることを示している。しかし、アデノシンキナーゼをブロック阻害することは、8-Cl-ATP/ATPの割合を６０％減少させ（p値=0.0009）、これは、化合物Ｄの活性化が、部分的に、アデノシンキナーゼを必要とすることを示している。
【０３２５】
図５Ａは、K-562細胞株を、8-Cl-A単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、8-Cl-Aで処理した後の活性な代謝物8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。8-Cl-A単独は、内因性代謝物ATPと等しい濃度の8-Cl-ATPを生成し、割合は、ほぼ１であった。しかし、hENT1を阻害した後では、平均の8-Cl-ATP/ATPの割合は３０％減少され（p値=0.0149）、これは、8-Cl-Aが、部分的に、hENT1に依存することを示している。しかし、アデノシンキナーゼを阻害した後では、平均の8-Cl-ATP/ATPの割合は、ほぼ０であり（p値=0.0002）、これは、8-Cl-Aの活性化がアデノシンキナーゼを必要とすることを示している。
図５Ｂは、K-562細胞株を、化合物Ａ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ａで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ａ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝0.04を生じた。hENT1のブロックすることは、8-クロロATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.1960）、これは、化合物Ａが、hENT1とは無関係に、細胞に侵入することを示している。同様に、アデノシンキナーゼを阻害することは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.1061）、これは、化合物Ａの活性化が、アデノシンキナーゼとは無関係であることを示している。
図５Ｃは、K-562細胞株を、化合物Ｂ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ｂで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ｂ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝0.14を生じた。hENT1を阻害することは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.4797）、これは、化合物Ｂが、hENT1とは無関係に、細胞に侵入することを示している。しかし、アデノシンキナーゼを阻害することは、8-Cl-ATP/ATPのの割合を５０％減少させた（p値=0.0092）。これは、化合物Ｂの活性化が、部分的に、アデノシンキナーゼに依存することを示している。
図５Ｄは、K-562細胞株を、化合物Ｄ単独、又は阻害剤NBTI及びA-134974とともに、化合物Ｄで処理した後の8-Cl-ATPの細胞内蓄積を示す。化合物Ｄ単独は、8-Cl-ATP/ATPの割合＝０.６を生じた。hENT1をブロックすることは、8-Cl-ATPの内部蓄積における有意差を生ぜず（p値=0.5517）、これは、化合物Ｄが、hENT1とは無関係に、細胞に侵入することを示している。しかし、アデノシンキナーゼをブロックすることは、8-Cl-ATP/ATPの割合を５０％減少させた（p値＜0.0001）。これは、化合物Ｄの活性化が、部分的に、アデノシンキナーゼに依存することを示している。
【０３２６】
ヒト血漿における薬剤の安定性
図６は、アデノシンキナーゼを阻害しない場合のコントロールと比べて、アデノシンデアミナーゼを阻害剤EHNAによってブロックした場合、8-Cl-Aの血漿中濃度が、〜３倍増大されることを示している。化合物Ｄの血漿中濃度は、アデノシンデアミナーゼを阻害したか否かにかかわらず、全ての他の化合物と比べて、最も高い。これは、化合物Ｄが、アデノシンデアミナーゼによる分解に抵抗して、ヒト血漿中において、最も安定な化合物であることを示している。化合物Ｂは、他の化合物と比べて、EHNAの存在下で及びコントロールでは、低い血漿中濃度を有しており、これは、化合物Ａが、化合物よりも効果的に、アデノシンデアミナーゼ分解に抵抗することを示している。
HL-60細胞株では、化合物Ｄは、EC50 0.33μMを有しており、有望であることが認められた。しかし、化合物Ｄは、8-Cl-Aよりも低い細胞内8-Cl-ATP/ATPを生ずる（図３Ａ及び３Ｄ、コントロールと比較して）。
hENT1阻害剤NBTIを添加する場合、細胞毒性アッセイは、化合物Ｄが、CTS及びK-562細胞株において最も有望であることを示した。同様に、細胞内蓄積アッセイは、化合物Ｄが、CTS及びK-562細胞株において、より高い細胞内8-Cl-ATP/ATPを生じたことを示した。さらに、HL-60細胞株における8-Cl-A及び化合物Ｄの有効性を比較する場合、8-Cl-Aは、化合物Ｄ（1.23μM）よりも低いEC50値（0.96μM）を有するため、より有望であることが認められた。8-Cl-A及び化合物Ｄによって生じた8-Cl-ATPの細胞内蓄積を比較する場合、8-Cl-Aが、化合物Ｄよりもわずかに高い8-Cl-ATP/ATPの割合を有することが認められた。データは、化合物Ｄが、CTS及びK-562細胞株においては最も効果的であるが、HL-60では、効果が少ないことを示している。データは、化合物Ｄの細胞への取り込みが、膜トランスポーターhENT1には無関係であることを示している。従って、化合物Ｄは、非機能性hENT1トランスポーターを有する癌患者の治療には効果的であろう。
アデノシンキナーゼ阻害剤A-134974を添加する場合、細胞毒性アッセイは、化合物Ｂが、HL-60細胞株において最も有望であることを示した。同様に、細胞内蓄積アッセイは、化合物Ｂが、HL-60細胞株において、阻害剤の存在下において、他の化合物よりも高い8-Cl-ATP/ATPの割合を生じたことを示した。これは、化合物Ｂが有望であり、アデノシンキナーゼとは無関係に活性化されることを示す。しかし、細胞毒性アッセイ及び細胞内アッセイは、化合物Ｄが最も有望な薬剤である（CTS及びK-562細胞株においては高い8-Cl-ATP/ATPの割合を生じた）ことを示した。これは、化合物Ｄの活性化が、アデノシンキナーゼとは無関係であることを示している。低酸素はATPの枯渇を導き、アデノシンキナーゼの活性は、低酸素状態では低くなる。従って、化合物Ｄは、酸素欠乏腫瘍の患者の治療には有用であろう。
【０３２７】
薬剤安定性アッセイは、アデノシンデアミナーゼをEHNAによって阻害した場合、8-Cl-Aのヒト血漿中濃度が〜３倍増大したことを示した。これは、8-Cl-Aが、血漿中のアデノシンデアミナーゼについて、より強力な物質であるを示す（例えば、EHNAの不存在下における8-Cl-Aの血漿中濃度は３μg/mlであるが、EHNAの存在下では、１０μg/mlに増大する）。これは、患者への投与後、8-Cl-Aは、その効力を発揮するために組織に達する前に、広く分解されることを示唆している。従って、8-Cl-Aは、アデノシンデアミナーゼの高い血漿中の活性を有する患者においては、あまり有望ではないであろう。
【０３２８】
細胞毒性アッセイは、8-Cl-Aについで、化合物Ｂが、全ての細胞株において有望であることを示した。しかし、細胞内蓄積は、化合物Ｄが、全ての細胞株において、化合物Ｂよりも７０％高い8-Cl-ATP/ATPの割合を生じたことを示した。血漿中濃度についても、化合物Ｄが、他の化合物と比べる場合、最も高い血漿中濃度を有していたことを示した。テストした化合物の内、化合物Ａは、最も小さい8-Cl-ATP/ATPの細胞内蓄積を有する最も低い有効性を示した。一方、化合物Ｄは、最も高い8-Cl-ATP細胞内蓄積とともに、最も高い有効性を示した。
【０３２９】
結論
化合物Ｂ及び化合物Ｄの細胞取り込みは、hENT1ヌクレオシドトランスポータータンパク質と無関係である。両化合物の活性化は、アデノシンキナーゼとは無関係である。これは、本発明の化合物が、8-Cl-Aと関連する抵抗性機構を克服できることを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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