(57)【要約】  本発明は敗血症および敗血症関連急性腎障害（ＳＡ−ＡＫＩ）の処置に関する。より詳しくは、哺乳類を対象とする、敗血症および／またはＳＡ−ＡＫＩを処置しその関連死亡率を低下させる方法のために用いられるシラスタチンに関する。さらに敗血症および／またはＳＡ−ＡＫＩを処置する方法、並びに本発明の当該方法のために用いられる医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類を対象とする敗血症を処置する予防または治療方法のために用いられるシラスタチン（ただし、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はベータラクタム抗生物質ではない）。
【請求項２】
哺乳類を対象とする敗血症関連急性腎障害（ＳＡ−ＡＫＩ）を処置する治療方法のために用いられるシラスタチン。
【請求項３】
哺乳類を対象とするＳＡ−ＡＫＩを処置する予防または治療方法のために用いられるシラスタチン（ただし、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はベータラクタム抗生物質ではない）。
【請求項４】
前記対象は重症敗血症および／または敗血症性ショックを患っている、請求項１から３のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項５】
前記対象はヒトである、請求項１から４のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項６】
シラスタチンは経口、舌下、経皮または非経口経路；好ましくは筋肉内、腹腔内または血管内経路によって；より好ましくは静脈内経路によって投与される、請求項１から５のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項７】
シラスタチンは、１０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは２０〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくはヒト成人では２２〜２６ｍｇ／ｋｇ体重およびヒト子供では３４〜３８ｍｇ／ｋｇ体重の用量で非経口経路によって投与される、請求項１から６のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項８】
シラスタチンは別の薬物と併用して投与される、請求項１から７のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項９】
シラスタチンは抗菌薬物と併用して投与される、請求項１から８のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項１０】
前記抗菌薬物は、ベータラクタム抗生物質、ゲンタマイシン；カナマイシン；トブラマイシン；アミカシン；ネチルマイシン；バシトラシン；ネオマイシン；メトロニダゾール；ポリミキシンＢ；ポリミキシンＥ（コリスチン）、トリメトプリム；スルフィソキサゾール；スルファメトキサゾール；メテナミン；バンコマイシン；スペクチノマイシン；クロラムフェニコール；アンフォテリシンＢ、ペンタミジン、ペンタミジンイソエチオネート；アトバコン；リファンピン；パラアミノサリチル酸；イソニアジド；カプレオマイシン；アシクロビル；ＡＺＴ；３ＴＣ；ビダラビン；シドフォビル；ラミブジン；サキナビルおよびバラシクロビルよりなる群から選択される腎毒性抗菌薬物ではない、請求項９に記載のシラスタチン。
【請求項１１】
前記抗菌薬物は腎毒性抗菌薬物ではない、請求項９または１０に記載のシラスタチン。
【請求項１２】
シラスタチンおよび前記他の薬物は同じ医薬組成物の一部である、請求項８から１１のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項１３】
シラスタチンおよび前記他の薬物は異なる医薬組成物の一部である、請求項８から１１のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項１４】
シラスタチンは単一の薬剤として投与される、請求項１から７のいずれかに記載のシラスタチン。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれかに記載のシラスタチンを備え、さらに薬学的に許容される賦形剤を備えた医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医療および薬学分野に関し、特に敗血症および敗血症関連急性腎障害（ＳＡ−ＡＫＩ）の処置のための新薬の研究および開発の分野に関する。詳しくは、哺乳類を対象とする、敗血症および／またはＳＡ−ＡＫＩを処置しその関連死亡率を低下させる方法で用いるシラスタチンに関する。さらに敗血症および／またはＳＡ−ＡＫＩを処置する方法、並びに本発明の当該方法のために用いる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は感染への有害な全身性炎症反応である。敗血症から重症敗血症（感染の確認または疑いに続いて起こる急性臓器機能不全）および敗血症性ショック（重症敗血症プラス急速輸液によっても戻らない低血圧）までの範囲の連続重症度がある。これは世界的な罹患率および死亡率の主要な原因である（Ａｎｇｕｓ  ＤＣら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１３；３６９（２１）：２０６３、Ｊａｗａｄら、Ｊ．Ｇｌｏｂ．Ｈｅａｌｔｈ、２０１２；２（１）：１０４０４、Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ  Ｃら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１６；１９３（３）：２５９−７２）。米国では、敗血症は年間死亡数ほぼ２５０，０００人の第１０番目の死亡原因であり、著しい経済的損失の原因となっている（Ａｎｇｕｓ  ＤＣら、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００１；２９（７）：１３０３−１０）。
【０００３】
敗血症患者の迅速な認知が重要であり、敗血症の連続した病気（すなわち、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック）に沿った早期の症状診断を行うことが早期の管理目標を明確にする助けとなる。重症敗血症または敗血症性ショックを患うすべての患者において第１に優先すべきことは呼吸の安定化である。次に抹消組織への灌流を回復させ、抗生物質を投与すべきである（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１２：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｃｍ．ｏｒｇ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ＳＳＣ−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｐｄｆ）。
【０００４】
重症敗血症および／または敗血症性ショックの環境では、抗生物質投与の遅れは死亡率増加と明らかに関連していることが示されている。従って、重症敗血症および敗血症性ショックの管理のための国際指針では、認知から１時間以内に有効な抗菌剤の静脈内投与を行うことを治療の目標として確立し、さらにすべての予想される病原体（細菌および／または真菌および／またはウイルス）に対して活性を持ちまた敗血症の源であると予想される組織に十分な濃度で浸透する１つまたはそれ以上の薬剤の最初の経験的抗感染療法を推薦する（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１２、Ｔｕｐｃｈｏｎｇら、Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１５、５、１２７−１３５）。
【０００５】
抗生物質、および感染源の根絶、血圧、臓器血流量、および通気の維持に重点を置く敗血症に対する現在の処置は、上述のように依然として非常に高い敗血症関連の死亡率を低下させるのにそれほど有効ではないことを示している。従って、敗血症の処置のための革新的かつ効果的な療法を早急に開発する必要がある。
【０００６】
敗血症反応は典型的には微生物感染により始まる。トール様受容体（ＴＬＲ）（ＴａｋｅｕｃｈｉおよびＡｋｉｒａ、２００１）による、リポ多糖類（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン、リポタイコ酸、および非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡなどの微生物成分の認知が、先天性免疫反応の急速な活性化、およびグルココルチコイド、カテコールアミン、および腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、およびＩＬ−６のような近位炎症促進性サイトカインを含む多様な体液性メディエーターの放出を引き起こす。この炎症促進状態が全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）であると定義されている。
【０００７】
炎症促進性サイトカインの過剰産生、および酸化窒素、血小板活性化因子、およびプロスタグランジンなどのより遠位のメディエーターの誘発が、内皮変化、および多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）に関連する低血圧、臓器灌流不全、および壊死細胞死を引き起こす凝血促進状態の誘発に係わっている。しかしほとんどの患者はこの初期ＳＩＲＳ事象を生き残り、炎症促進状態は最終的には解消する。その後、患者は、最近は代償性抗炎症反応症候群（ＣＡＲＳ）と呼ばれている免疫学的状態に入ることが多い（図１およびＯｂｅｒｈｏｌｚｅｒら、２００１；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１５（６）：８７９−９２参照）。
【０００８】
多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）は敗血症の最も致命的な合併症の１つであると識別されている。全身性炎症反応における様々なステップを標的とする多くの薬剤がここ数年にわたって開発されているが、これらのほとんどは臨床試験で有効性をほとんどまたは全く示していない（Ｚａｒｊｏｕら、２０１１、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２：９９９−１００６；Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）：３８−５４）。
【０００９】
実際には、唯１つの治療薬である、組み換え型ヒト活性化プロテインＣとしても知られる活性型ドロトレコジンアルファが、重症敗血症および敗血症性ショックの患者における生存率を向上させると示されている（Ｚａｒｊｏｕら、２０１１、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２：９９９−１００６）。活性成分として活性型ドロトレコジンアルファを含有するＸｉｇｒｉｓ（商標）は、最善の標準的ケアに加えて、多臓器不全の成人の患者での重症敗血症の処置に対して、２００２年例外的環境の下で欧州連合において認可された。２０１１年１０月２５日、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．は、主要な研究が敗血症の処置に対する効能を示さなかった後、Ｘｉｇｒｉｓを市場から撤収した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｄｏｃｓ／ｅｎ＿ＧＢ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ＿ｌｉｂｒａｒｙ／Ｐｒｅｓｓ＿ｒｅｌｅａｓｅ／２０１１／１０／ＷＣ５００１１６９７０．ｐｄｆ）。
【００１０】
この多臓器不全の状況では、急性腎障害（ＡＫＩ）は、重症敗血症の患者での特に重篤な合併症として報告されており、これは重病患者の間では死の主要な原因であり（Ｅｍｌｅｔ  ＤＲら、Ｓｅｍｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２０１５；３５（１）：８５−９５、Ｚａｒｂｏｃｋ  Ａら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．２０１４；２０（６）：５８８−９５、Ｓｃｈｒｉｅｒ  ＲＷら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００４；３５１（２）：１５９−６９）５０％から８０％という高い死亡率である。ＡＫＩを患う敗血症患者の死亡率は約７５％であり、一方ＡＫＩのない重症敗血症患者の場合は２７から３２％の間である（Ｈｏｓｔｅ  ＥＡら、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ．２００６；１０（３）：Ｒ７３）。
【００１１】
敗血症性ＡＫＩ（ＳＡ−ＡＫＩ）は敗血症のないＡＫＩとは異なると述べられている。注目すべきは、ＳＡ−ＡＫＩは多数の特徴的な病態生理学的メカニズムによって駆り立てられ、独自のタイミングプロファイル（発現、持続時間）を持ち、また非敗血症性ＡＫＩと比べて異なる短期的および長期的結果に関連すると報告されている（Ａｌｏｂａｉｄｉら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）、２−１１；Ｚａｒｊｏｕら、２０１１、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２：９９９−１００６）。敗血症でのＡＫＩの病態生理学は複雑で多元的である。これは、腎内血流力学の変化、内皮機能不全、腎実質での炎症細胞の浸潤、糸球体内血栓、および壊死細胞およびデブリによる尿細管の閉塞を含む。図１参照（Ｚａｒｊｏｕら、２０１１、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２：９９９−１００６；Ｗａｎら、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２００８、３６：Ｓ１９８−Ｓ２０３）。
【００１２】
さらに、ＳＡ−ＡＫＩは、非敗血症性ＡＫＩと比べると、病気の急性進行および重症度がより高くなり、予後がより悪化し、そして死亡率が上昇することに関連すると述べられている（Ａｌｏｂａｉｄｉら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）、２−１１；およびＧｏｄｉｎら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）、１２−２２；Ｂａｇｓｈａｗら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  ２００８、１２：Ｒ４７；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ  Ｔｒａｕｍａ  Ａｃｕｔｅ  Ｃａｒｅ  Ｓｕｒｇ．２０１３、７５：４３２−８）。
【００１３】
Ｇｏｄｉｎら（Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）、１２−２２）は特に、敗血症患者では損傷のメカニズムが持続するため敗血症が制御されない場合腎回復は全くありそうにないという事実を指摘している。敗血症がいったん消散するとしても、臨床現場では、腎臓は敗血症によって生じる多臓器不全の患者において回復する最後の臓器の１つであることが多く、腎回復の見込みは、患者の内在する特質、内在する損傷（例えば、血流力学の変化、感染の重症度および多臓器機能不全）の重症度、およびケアの過程に関連する医原性損傷（例えば、腎毒性抗生物質および造影剤）などの多数の要因に依存する。
【００１４】
これは、利尿薬、ドーパミン、アンギオテンシン転換酵素の阻害剤、カスパーゼの阻害剤などの腎保護薬においてこれまでのところ思わしくない結果が得られているという事実と一致する（Ｒｏｎｃｏら、Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００８、３：５３１−５４４）。初期炎症の標的化、晩期免疫抑制、酸化ストレスおよび細胞回復の分子メカニズムを含む、敗血症および敗血症性ＡＫＩを処置するいくつかの新しい治療アプローチが提案されている（例えば、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ  Ｓら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）：３８−５４参照）。全身性抗炎症効果を持つ新薬のいくつかは（肝臓、肺および／または腎臓を含む）多臓器保護効果を持ち、また動物敗血症モデルにおいて死亡率を低下させると報告されている。これらは例えばＣＫＤ−７１２（Ｐａｒｋら、Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ  ３４、Ｎｏ  ３、４８５−４９４、２０１１）およびカリスタチン（Ｌｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ２０１５、１９：２００）である。
【００１５】
ペプチド結合の加水分解およびラクタム環の開放を防ぐデヒドロペプチダーゼＩ（ＤＨＰ−Ｉ）の拮抗阻害剤として、シラスタチンが先ず記載された。シラスタチンの存在下ではデヒドロペプチダーゼＩはイミペネムのラクタム環を開放せずその吸収を防ぎ、またイミペネムの尿中排泄を増やして尿細管細胞におけるその濃度を低下させた（Ｃｌｉｓｓｏｌｄ、Ｄｒｕｇｓ  １９８７；３３（３）：１８３−２４１、Ｂｉｒｎｂａｕｍ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８５；７８（６Ａ）：３−２１）。
【００１６】
従って、シラスタチンは、イミペネム（ベータラクタム抗生物質）をＤＨＰ−Ｉから保護しその抗菌効果を延ばすために、イミペネムとの併用で伝統的に用いられてきた。しかし、シラスタチンはそれ自体および自然にはいかなる抗菌活性も持たない。例えば、スペインでは、イミペネム／シラスタチン（１：１）を含有する５００ｍｇ用量の静脈内投与用製剤として製品名Ｔｉｅｎａｍ（登録商標）の下で商品化されている。Ｔｉｅｎａｍ（登録商標）は、併発腹内感染；院内および人工呼吸器関連の肺炎を含む重度の肺炎；分娩時および産後感染；併発尿路感染；および併発皮膚および軟組織の感染を含む、成人および１才以上の子供における感染の処置用に認可されている。さらに前記感染のいずれかに関連して起きる、または関連すると疑われる細菌性敗血症の患者の処置用にも認可されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｅｍｐｓ．ｇｏｂ．ｅｓ／ｃｉｍａ／ｐｄｆｓ／ｅｓ／ｆｔ／５７３２９／ＦＴ＿５７３２９．ｐｄｆ）。米国ではこれはＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．によって、細菌性敗血症に対して認可された商品名Ｐｒｉｍａｘｉｎ（登録商標）、例えば医薬形態Ｐｒｉｍａｘｉｎ  Ｉ．Ｖ．２５０およびＰｒｉｍａｘｉｎ  Ｉ．Ｖ．５００として市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２００８／０５０５８７ｓ０６５，０５０６３０ｓ０２８ｌｂｌ．ｐｄｆ）。最後に、Ｄｅｌ  Ｖａｌｌｅ  Ｊら（Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｓｕｐｐｌ  １９８７、５２：２０−５）およびＫｕｏ  Ｂｌら（Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ（Ｔａｉｐｅｉ）２０００、６３（５）：３６１−７）もまた敗血症の処置におけるイミペネム／シラスタチンの使用について報告している。従って、シラスタチン／イミペネムはこれまでに敗血症の処置に用いられている。しかし、敗血症性ＡＫＩの処置では用いられておらず、実際には腎不全の徴候が現れるとシラスタチン／イミペネムの用量を減らすことが推奨されていた。より最近では、Ｋａｂｂａｒａ  Ｗ．Ｋ．ら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ２０１５（８）、３１−３８）は、レバノンの専門治療病院でのイミペネム／シラスタチンの使用が現存の指針および文献と一致するかどうかを評価する研究を出版した。
【００１７】
さらに、Ｎａｇａｎｏら（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９７、４１（１０）、２２７８−２２８１）は、敗血症の処置において別のカルバペネブ系抗生物質、つまりジチオカルバメートカルバペネブ（ＢＯ−３４８２）との併用でのシラスタチンの生体内実験について報告した。
【００１８】
シラスタチンはその後ベータラクタム以外の腎毒性薬剤の腎障害を減少させると述べられている（ＷＯ９７／３７６４９）。より詳しくは、本発明者らは、シスプラチン、シクロスポリンＡまたはバンコマイシンなどのヒト臨床環境において用いられる通常の腎毒性薬剤に対する、それらの治療活性を低下させることもない、シラスタチンのインビトロおよび生体内での有益な効果について報告している（Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０１２；８２（６）：６５２−６６３、Ｍｏｒｅｎｏ−Ｇｏｒｄａｌｉｚａ  Ｅら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１；８３（２０）：７９３３−７９４０、Ｃａｍａｎｏ  Ｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１０；３３４（２）：４１９−４２９、Ｐｅｒｅｚ  Ｍら、Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００４；１９（１０）：２４４５−２４５５、Ｌａｚａｒｏ  Ａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｇａｌｌｅｌｌｉ  Ｌ編、ｃｈａｐｔｅｒ  １８．Ｒｉｊｅｋａ，Ｃｒｏａｔｉａ：ＩｎＴｅｃｈ；２０１２．ｐｐ．３８１−３９６，Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１５；２０１５：７０４３８２、ＵＳ２０１１／０１６５２６４）。実際には、本発明者らは、以前の研究において、シラスタチンは、腎近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）の刷子縁のコレステロールラフトに存在するＤＨＰ−Ｉの阻害剤であると述べ（Ｃａｍａｎｏ  Ｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１０；３３４（２）：４１９−４２９）、ＰＴＥＣの刷子縁のＤＨＰ−Ｉにシラスタチンを結合することにより脂質ラフトの自由な移動を妨害し、これにより腎毒性薬剤により誘発されるアポトーシスによる酸化ストレスおよび細胞死に対する保護効果により、アポトーシスの外因経路の主要段階が減少または解消されると報告した（Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０１２；８２（６）：６５２−６６３、Ｃａｍａｎｏ  Ｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．２０１０；３３４（２）：４１９−４２９、Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１５；２０１５：７０４３８２）。
【発明の概要】
【００１９】
薬剤誘発腎毒性に対するシラスタチンの保護効果はこれまでは、腎臓の腎近位尿細管上皮細胞（ＲＰＴＥＣ）の刷子縁に位置するＤＨＰ−Ｉに結合することで得られると述べられてきた。ＤＨＰ−Ｉは、重症敗血症および敗血症性ショックを特徴付ける多臓器不全に典型的に関与する臓器のうちの、肺、心臓または肝臓などの他の臓器に発現すると報告されてはいない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ００００００１５４１３−ＤＰＥＰ１／ｔｉｓｓｕｅ）。
【００２０】
長期にわたる低血圧、微生物感染、および現存の多臓器不全などの腎損傷の内在メカニズムを先ず解決することなく敗血症の複雑な生理病理学的環境での腎回復を得るのは非常に困難であるという定着した仮説とは反対に、今では驚くべきことに、シラスタチンがＳＡ−ＡＫＩの処置および敗血症関連の死亡率の低下に成功していることが本発明者らによって見出されている。
【００２１】
この意味において、本発明者らは、単一薬剤としてのシラスタチンによる処置は、盲腸結紮穿刺モデル（ＣＬＰ）誘発敗血症によって生じる複数菌感染に対して際立った保護効果を有し、致死を防ぎまたラットの敗血症誘発腎障害を改善することを示した。これは死亡率の３０％低下（図１３）によって証明される。得られた実験データはまた、以前敗血症により上昇したクレアチニンまたは血中尿素窒素レベル（ＢＵＮ）などの腎機能パラメータの向上（図２）、ＡＫＩの新規の初期生体指標であるＫＩＭ−１のレベルの一部回復（図３）、並びに腎組織の損傷の減少（図４）を示した。さらに、シラスタチンはＳＡ−ＡＫＩで生じる腎臓壊死を減らし（図５〜７）、腎臓細胞の抗酸化能力を増大させ（図８）そして脂質過酸化を減らす（図９）ことを示した。加えて、シラスタチンは敗血症誘発炎症の処置に効果を示した。特に、単球／マクロファージの動員および腎臓への浸潤を減らし（図１０）、白血球の血管内皮への付着を媒介するＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１分子の発現を減らす（図１１）。シラスタチンはさらに敗血症動物の線維化促進ＴＧＦβサイトカインのレベルを著しく低下させると示されている（図１２）。
【００２２】
これらの発見は、敗血症および敗血症誘発腎障害の処置における予防または治療薬としてのシラスタチンの使用を支持する。敗血症誘発動物モデルの死亡率の著しい低下は、単一療法として、すなわち内在する感染を処置する抗菌療法の共同投与は行わないでシラスタチンを投与することで得られたということは特に注目に値する。従って、シラスタチンは敗血症患者を処置する新しい治療方針として本発明者らによって識別された。
【００２３】
本発明の第１の局面は、哺乳類を対象とする敗血症を処置する予防または治療方法で用いるシラスタチンであって、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はイミペネムではない（すなわち、シラスタチンはイミペネムと併用して投与されない）という条件で、シラスタチンに関する。
【００２４】
加えて、本発明は、このような処置を必要とする対象に、予防上または治療上有効な量のシラスタチンを、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はイミペネムではない（すなわち、シラスタチンはイミペネムと併用して投与されない）という条件で、投与することを包含する敗血症を処置する方法を提供する。
【００２５】
さらに、敗血症の予防または治療処置のための薬剤の製造においてシラスタチンを、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はイミペネムではない（すなわち、シラスタチンはイミペネムと併用して投与されない）という条件で、使用することを提供する。
【００２６】
上記のいずれかの特定の実施形態では、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はベータラクタム抗生物質ではない。
【００２７】
第２の局面では、本発明は、哺乳類を対象とする敗血症関連急性腎障害（ＳＡ−ＡＫＩ）を処置する予防または治療方法で用いるシラスタチンに関する。
【００２８】
加えて、本発明は、このような処置を必要とする対象に、予防上または治療上有効な量のシラスタチンを投与することを包含するＳＡ−ＡＫＩを処置する方法を提供する。
【００２９】
さらに、ＳＡ−ＡＫＩの予防または治療処置のための薬剤の製造においてシラスタチンを使用することを提供する。
【００３０】
第３の局面では、本発明は、敗血症を患うまたは患う恐れがある、好ましくはＳＡ−ＡＫＩを患うまたは患う恐れがある哺乳類対象の死亡率を減らす処置方法で用いるシラスタチンに関する。
【００３１】
加えて、本発明は、敗血症を患うまたは患う恐れがある、好ましくはＳＡ−ＡＫＩを患うまたは患う恐れがある哺乳類対象の死亡率を減らす方法であって、このような処置が必要な対象に、予防上または治療上有効な量のシラスタチンを投与することを包含する方法を提供する。
【００３２】
さらに、敗血症を患うまたは患う恐れがある、好ましくはＳＡ−ＡＫＩを患うまたは患う恐れがある哺乳類対象の死亡率を減らすための薬剤の製造においてシラスタチンを使用することを提供する。
【００３３】
上記のいずれかの特定の実施形態では、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは、前記別の薬物はベータラクタム抗生物質ではない。
【００３４】
別の局面では、本発明は、上記の局面のいずれかに記載の処置方法で用いるシラスタチンを備え、さらに薬学的に許容される担体、添加物および／または賦形剤を備える医薬組成物に関する。特定の実施形態では、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは、前記別の薬物はベータラクタム抗生物質ではない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】敗血症の臨床経過に関与し敗血症性ＡＫＩの病態生理学にも係わりを持つ主要病原経路。Ｚａｒｊｏｕら、２０１１、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２２：９９９−１００６から
【図２】ラットの敗血症誘発腎毒性へのシラスタチンの効果。敗血症の誘発後４８時間での腎機能のパラメータ。（Ａ）血清クレアチニン（疑似：０．４５±０．０１：疑似＋ｃｉｌ：０．４６±０．０１；敗血症：０．５４±０．０４；敗血症＋ｃｉｌ：０．３８±０．０２）、（Ｂ）血中尿素窒素（疑似：８１±３；疑似＋ｃｉｌ：８１±４；敗血症：１０６±１２；敗血症＋ｃｉｌ：７５±７）、（Ｃ）糸球体濾過量（疑似：０．４４±０．０３；疑似＋ｃｉｌ：０．３８±０．０６；敗血症：０．２１±０．０３；敗血症＋ｃｉｌ：０．４５±０．０７）、（Ｄ）タンパク尿（疑似：１９２０±４２０；１９８３±２２６；３３１６±６８２；１８８９±３４７）。敗血症は、疑似群に比べて、血清クレアチニン、血中尿素窒素および尿中タンパク質排出を増大させ、糸球体濾過量を減少させる。シラスタチンはすべてのパラメータを著しく向上させた。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。†ｐ≦０．０２５、＊ｐ＜０．０３５、＃ｐ＜０．０５対全群。Ｃｉｌ＝シラスタチン。
【図３】腎不全生体指標ＫＩＭ−１の腎臓組織レベルへのシラスタチンの効果。腎臓切片でのＫＩＭ−１の局所化：（Ａ）疑似、（Ｂ）敗血症、（Ｃ）疑似＋シラスタチン、（Ｄ）敗血症＋シラスタチン（倍率２０Ｘ）、バー＝１００μｍ。シラスタチンは、ＣＬＰ誘発敗血症によって生じるＫＩＭ−１の増加を著しく減らした；（Ｅ）腎細胞でのＫＩＭ−１免疫染色の半定量化。（Ｆ）腎皮質でのＫＩＭ−１の代表的ウェスタンブロット、および（Ｇ）ＫＩＭ−１のウェスタンブロットの濃度分析。シラスタチンはＣＬＰ誘発敗血症によって生じるＫＩＭ−１の増加を著しく減らした。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。†ｐ≦０．０１、＊ｐ＜０．００１対全群。ＫＩＭ−１（腎障害分子１）；Ｃｉｌ（シラスタチン）；ａ．ｕ．（任意単位）。
【図４】組織病理学的敗血症関連腎障害。ＣＬＰ手術誘発敗血症後２日の腎臓病理学の代表的画像（ヘマトキシリン−エオシン染色、倍率Ｘ２０）。Ａ）疑似ラット、Ｂ）疑似＋シラスタチン、Ｃ）敗血症群、およびＤ）敗血症＋シラスタチン。対照群は正常な腎構造を示す；ＣＬＰ誘発敗血症腎臓は刷子縁の白血球浸潤（星印）損失による際立った障害、尿細管の膨張、および管内円柱形成（矢印）を示す。これらの変化はシラスタチンによる処置によって著しく減少した。Ｅ〜Ｈ）疑似群、（Ｅ）、疑似＋シラスタチン（Ｆ）、敗血症群（Ｇ）、および敗血症＋シラスタチン（Ｈ）の糸球体の詳細。糸球体の主要な毛管鬱血を敗血症群で観察することができる。シラスタチンは損傷を減らした。Ａ〜Ｄ画像、バー＝１００μｍ；Ｅ〜Ｈ画像、バー＝５０μｍ。Ｉ）半定量化腎障害スコア。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊ｐ＜０．０１対全群。Ｃｉｌ、シラスタチン。
【図５】敗血症誘発カスパーゼ３発現へのシラスタチンの効果。腎臓切片での活性切断カスパーゼ３の局所化。Ａ）疑似；Ｂ）およびＣ）敗血症群；Ｄ）疑似＋シラスタチン；およびＥ）敗血症＋シラスタチン。腎尿細管の細胞核が敗血症動物でのカスパーゼ３活性化の主要サイトであることに注目（倍率、Ｘ２０）。シラスタチンは敗血症（矢印）によって誘発される活性カスパーゼ３の発現を著しく減らした。バー、１００μｍ。Ｆ）腎臓試料での切断カスパーゼ３免疫染色の半定量化。Ｇ）腎皮質での切断カスパーゼ３の代表的ウェスタンブロット。Ｈ）活性切断カスパーゼ３のウェスタンブロットの濃度分析。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊Ｐ≦０．００５対すべての他の群。Ｃｉｌ、シラスタチン；ａ．ｕ．、任意単位。
【図６】敗血症誘発カスパーゼ８発現へのシラスタチンの効果。Ａ）各群の腎皮質でのＦａｓＬの代表的ウェスタンブロット。Ｂ）ＦａｓＬのウェスタンブロットの濃度分析。Ｃ）各群の腎皮質での切断カスパーゼ８の代表的ウェスタンブロット。Ｂ）活性切断カスパーゼ８のウェスタンブロットの濃度分析。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊Ｐ≦０．００５；†≦０．０１；‡≦０．０５対すべての他の群。Ｃｉｌ、シラスタチン；ａ．ｕ．、任意単位。
【図７】シラスタチンは敗血症ラットの腎臓での尿細管細胞壊死を減らす。Ａ）各群の腎臓でのＴＵＮＥＬ染色の顕微鏡写真。緑色蛍光染色はＴＵＮＥＬ陽性核を示し、青色染色（ＤＡＰＩ）は試料中のすべての核を表す（倍率２０Ｘ）。Ｂ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量分析。結果は、平均±ＳＥＭ；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊Ｐ≦０．０５対すべての他の群。
【図８】シラスタチンは敗血症誘発酸化ストレスを減らし抗酸化防衛を増大させる。腎臓切片でのＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の局所化。Ａ）疑似；Ｂ  敗血症群；Ｃ）疑似＋シラスタチン；およびＤ）敗血症＋シラスタチン。シラスタチンは、敗血症によってこれまでに減少したＣｕ／ＺｎＳＯＤの発現を著しく増大させた（倍率、Ｘ２０）。Ｅ）腎臓切片でのＣｕ／ＺｎＳＯＤ免疫染色の半定量化。Ｆ）各群の腎皮質でのＣｕ／ＺｎＳＯＤの代表的ウェスタンブロット。Ｇ）特定のＥＬＩＳＡキットによる尿中の抗酸化能力の測定。抗酸化能力濃度は、シラスタチンにより処置した敗血症ラットおよび対照ラットより敗血症ラットの方が低かった。すべての結果は、平均±ＳＥＭ、各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊Ｐ≦０．００１、‡Ｐ≦０．０５対すべての他の群；†Ｐ＜０．０５対疑似群。バー、１００μｍ。
【図９】シラスタチンは敗血症誘発脂質過酸化を減らす。Ａ）疑似、Ｂ）敗血症群、Ｃ）疑似＋シラスタチン、およびＤ）敗血症＋シラスタチンの腎臓切片での４−ＨＮＥの局所化。敗血症＋シラスタチンおよび疑似ラットと比べて、敗血症ラットでは尿細管染色が増大したことに注目（倍率、Ｘ２０）。Ｅ）腎細胞での４−ＨＮＥ免疫染色の半定量化。すべての結果は、平均±ＳＥＭ；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊Ｐ＜０．０００１対すべての他の群。バー、１００μｍ。
【図１０】敗血症誘発単球／マクロファージ浸潤へのシラスタチンの効果。（Ａ）疑似ラット、（Ｂ）敗血症、（Ｃ）疑似＋シラスタチン、および（Ｄ）敗血症＋シラスタチンの腎臓切片でのＣＤ６８（単球／マクロファージ）の局所化。敗血症＋シラスタチンおよび疑似ラットと比べて、敗血症ラットでは染色が増大したことに注目（矢印；倍率２０Ｘ）；バー＝１００μｍ。（Ｅ）腎細胞でのＣＤ６８免疫染色の半定量化。すべての結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊ｐ＜０．００１対全群。Ｃｉｌ、シラスタチン。
【図１１】腎ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１での敗血症およびシラスタチンの効果。Ａ）腎臓切片でのＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１それぞれの局所化。敗血症＋シラスタチンおよび対照群と比べて、敗血症ラットでは両分子で腎染色が増大したことに注目（倍率２０Ｘ）。ＢおよびＣ）それぞれ腎細胞でのＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１免疫染色の半定量化。すべての結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊ｐ≦０．０１対疑似および疑似＋シラスタチン群。†ｐ＜０．０５対敗血症群；‡ｐ＜０．００１対すべての他の群。Ｃｉｌ、シラスタチン。
【図１２】敗血症誘発ＴＧＦβ増加へのシラスタチンの効果。Ａ）腎臓切片でのＴＧＦβおよび線維症（シリウスレッド染色による）それぞれの局所化。敗血症＋シラスタチンおよび疑似ラットと比べて、敗血症ラットでは尿細管ＴＧＦβ染色が増大（矢印）したことに注目（倍率２０Ｘ）；バー＝１００μｍ。コラーゲン線維はすべての群で同様であった（倍率１０Ｘ、バー、１００μｍ）。ＢおよびＣ）それぞれ腎細胞でのＴＧＦβおよびシリウスレッド免疫染色の半定量化。すべての結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．；各群動物数ｎ＝８〜１０として示す。＊Ｐ＜０．０５対全群。Ｃｉｌ、シラスタチン。
【図１３】盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）後のラット死亡率。シラスタチン処置はＣＬＰ誘発敗血症に罹ったラットの生存率を向上させる。死亡率はＣＬＰ処置後４８時間監視した。結果は各群の死亡率％として示す：死亡率（％）：敗血症：８３％；敗血症＋Ｃｉｌ：５０％。各群６匹のラット。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
本明細書で用いる用語「敗血症」は、感染への有害な全身性炎症反応のことを言い、正式には感染の全身症状と共に感染の（推定または確認された）存在として定義される（「重症敗血症および敗血症性ショックの管理のための国際指針２０１２」からの以下の表１を参照）。本明細書で用いる用語敗血症は、「重症敗血症」および「敗血症性ショック」などのその合併症を包含する。
【表１】
2019525954.tif 000002
【００３７】
本明細書で用いる用語「重症敗血症」は、敗血症プラス敗血症誘発臓器機能不全または組織低灌流として定義される（「重症敗血症および敗血症性ショックの管理のための国際指針２０１２」からの以下の表２を参照）。
【表２】
2019525954.tif 000003
【００３８】
敗血症誘発低血圧は、他の低血圧理由がない場合に、収縮期血圧（ＳＢＰ）＜９０ｍｍＨｇまたは平均動脈圧（ＭＡＰ）＜７０ｍｍＨｇまたはＳＢＰ低下＞４０ｍｍＨｇもしくは年齢相応の正常値より２標準偏差値を超えて低いと定義される。敗血症性ショックは、十分な急速輸液にもかかわらず持続する敗血症誘発低血圧と定義される。
【００３９】
敗血症誘発組織低灌流は感染誘発低血圧、乳酸塩上昇、または乏尿と定義される。
【００４０】
本明細書で用いる用語「敗血症関連急性腎障害（ＳＡ−ＡＫＩ）または「敗血症性ＡＫＩ」は、敗血症の存在下での急性腎障害（ＡＫＩ）のことを言う。
【００４１】
本明細書で用いる用語「処置」は、予防および／または治療処置のことを言う。
【００４２】
本明細書で用いる用語「治療処置」は、身体を病理学的状態または疾患からその正常な健康な状態へ戻すことを言う。特に、他に言及がなければ、疾患または不調の改善、治癒、および／または治癒の維持（すなわち、再発の防止または遅延）を含む。不調が始まった後の処置は、その不調および／またはその関連する症状を減らす、緩和する、改善するまたは完全に除去すること、これが悪化するのを防ぐこと、進行速度を緩めること、または当初は除去されても不調がぶり返すのを防ぐ（すなわち、再発を防ぐ）ことを目的とする。本明細書で用いるこの用語は、本明細書で定義する用語「予防処置」を含むとは理解されない。
【００４３】
本明細書で用いる用語「予防処置」は病理学的状態を防ぐことを言う。本明細書で用いるこの用語は、本明細書で定義する用語「治療処置」を含むとは理解されない。
【００４４】
本明細書で用いる用語「有効量」は、疾患、不調または病理学的症状の予防または治療処置において対象（ヒト患者など）への単一または多数用量投与の際の有効な量のことを言う。
【００４５】
本明細書で用いる用語「対象」は、哺乳類対象のことを言う。好ましくは、ヒト、ペット、非家庭用家畜または動物園の動物から選択される。例えば、対象はヒト、マウス、ラット、犬、猫、畜牛、豚、羊、馬、熊などから選択され得る。好適な実施形態では、前記哺乳類対象はヒト対象である。
【００４６】
本明細書を通じて用いられる用語「併用」または「併用療法」は、言及された治療薬剤を疾患、不調または病理学的症状を患う対象に、同じまたは別の薬学的製剤でそして同じまたは異なるときに投与することを包含する。治療薬剤を異なるときに投与する場合は、時間的に十分に近いときに投与して、増強または相乗反応が生じるようにすべきである。このような場合では、典型的には両治療薬剤を互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に投与することが考えられる。いくつかの状況では、しかし、処置の期間を著しく延ばして、各投与間を数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）とすることが望ましいかもしれない。他の状況では、投与間の時間を減らして、両治療薬剤を数秒または数分から数時間以内、好ましくは互いから約６時間以内、より好ましくは約１または３時間以内に投与することが望ましいかもしれない。
【００４７】
本明細書で用いる用語「単一の薬剤」は、増強または相乗反応が生じるのを防ぐために活性成分を別の活性成分から時間的に十分離して使用することに関する。より詳しくは、「単一の薬剤」としての使用は「併用療法」としての使用を包含しない。
【００４８】
本明細書で用いる用語「活性成分」は、薬理学的活性を提供する成分のことを言う。
【００４９】
本明細書で用いる用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で述べる化合物の比較的非毒性の無機および有機酸添加塩のことを言う。これらの塩は、化合物の最終単離および精製中に現場で、または遊離塩基形態の精製化合物を適切な有機または無機酸と個別に反応させこのようにして形成した塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩（ｌａｃｔｏｂｓｏｎａｔｅ）、およびラウリルスルホン酸塩などがある。これらはナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、並びに非毒性アンモニウム、第４級アンモニウム、およびアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれらに限定されないアミンカチオンなどのアルカリおよびアルカリ性土類金属に基づくカチオンを含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅ  Ｓ．Ｍ．ら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９７７；６６：１−１９を参照、これは本明細書において参照によって援用される）。
【００５０】
本明細書で用いる用語「プロドラッグ」は、本明細書で述べる化合物の非活性生体可逆性誘導体のことを言う。一般に、これらはインビボで酵素的および／または化学的形質転換を受けて活性ペアレント化合物を放出し、これが次に体内にその所望の薬理学的効果を引き出すことができる。プロドラッグは典型的には製剤、送達、および毒性問題を克服するように設計される。プロドラッグについての十分な議論は、Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ、“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”、ｔｈｅ  Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ第１４巻；Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｅｄｗａｒｄ  Ｂ．  Ｒｏｃｈｅ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＲａｕｔｉｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００８、７、２５５−２７０に提供されている。
【００５１】
用語「薬剤」および「薬物」はここでは同じ意味で用いられる。
【００５２】
詳細な説明
本発明の第１の局面は、哺乳類を対象とする敗血症を処置する予防または治療方法で用いるシラスタチンであって、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はイミペネムではない（すなわち、シラスタチンはイミペネムと併用して投与されない）という条件で、シラスタチンに関する。好適な実施形態では、本発明は、敗血症の治療処置のための方法でのシラスタチンの使用に関する。
【００５３】
加えて、本発明は、このような処置を必要とする対象に、予防上または治療上有効な量のシラスタチンを、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はイミペネムではない（すなわち、シラスタチンはイミペネムと併用して投与されない）という条件で、投与することを包含する敗血症を処置する方法を提供する。
【００５４】
さらに、敗血症の予防または治療処置のための薬剤の製造においてシラスタチンを、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はイミペネムではない（すなわち、シラスタチンはイミペネムと併用して投与されない）という条件で、使用することを提供する。
【００５５】
上記のいずれかの特定の実施形態において、シラスタチンが別の薬物と併用して投与されるときは前記別の薬物はベータラクタム抗生物質ではない。
【００５６】
本明細書で用いる用語「シラスタチン」は、以下の化学式の（Ｚ）−７−［（２Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−オキソプロピル］スルファニル−２−｛［（１Ｓ）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボニル］アミノ｝ヘプト−２−エン酸のことを言う。
【化１】
2019525954.tif 000004
【００５７】
これはその結晶形態およびいかなる薬学的塩、媒体和物またはプロドラッグをも包含する。典型的には、シラスタチンはナトリウム塩形態で用いられてきた。シラスタチンおよび関連するデヒドロペプチダーゼＩ（ＤＨＰ−Ｉ）阻害剤は例えば米国特許第４，６６８，５０４号で開示されており、本文献は本明細書において参照によって援用される。
【００５８】
本明細書で用いる用語「イミペネム」は、以下の化学式のベータラクタム抗生物質（５Ｒ，６Ｓ）−６−［（１Ｒ）−１−ヒドロキシエチル］−３−（｛２−［（イミノメチル）アミノ］エチル｝チオ）−７−オキソ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプト−２−エネ−２−カルボン酸のことを言う。
【化２】
2019525954.tif 000005
【００５９】
これはその結晶形態およびいかなる薬学的塩または媒体和物をも包含する。典型的には、イミペネムは、イミペネム一水和物の形態で用いられてきた。例えば、Ｔｉｅｎａｍ（登録商標）５００ｍｇは、５００ｍｇのイミペネムに相当するイミペネム一水和物および５００ｍｇのシラスタチンに相当するシラスタチンのナトリウム塩を含有した。
【００６０】
「重症敗血症」および「敗血症性ショック」と呼ばれる敗血症およびその合併症について上述した。本発明の処置方法の特定の実施形態では、前記対象は重症敗血症および／または敗血症性ショックを患うまたは患う恐れがある。好ましくは、前記患者は重症敗血症（例えば、多臓器不全の重症敗血症）および／または敗血症性ショックを患う。
【００６１】
重症程度にかかわらず、前記敗血症（ｓｅｐｓｉｓまたはｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）は細菌、真菌および／またはウイルス起源を持ち得る。また、敗血症は単一の微生物種によって、または１種より多い微生物種によって引き起こされ得、後者は複数菌による敗血症、例えば複数菌による菌血症と呼ばれる。好適な実施形態では、前記敗血症は複数菌による敗血症である。
【００６２】
上記に言及したように、敗血症は、特に重症敗血症および／または敗血症性ショックに進行した場合は、高い死亡率によって特徴付けられ、重症敗血症の発現後速やかに施行される治療の速度および適切性が良好な結果にとって重要であると述べられている。シラスタチンは、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）誘発敗血症モデルでの敗血症に関連する死亡率を著しく低下させることが示されている（実施例３および図１３参照）。
【００６３】
敗血症の重症度に関係なく（好ましくは、重症敗血症および／または敗血症性ショックの環境で）、本発明の敗血症を処置する方法の特定の実施形態では、シラスタチンは敗血症による死を防ぐかまたは減らすことができる。好適な実施形態では、これは盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）誘発敗血症動物モデルでの敗血症による死を防ぐかまたは減らすことができる。ＣＬＰモデルは、盲腸の穿孔により糞便物質の動物の腹膜腔への放出を可能にして複数菌による感染によって誘発される免疫反応の悪化を生成することを包含する。ＣＬＰモデルはこれまではヒト敗血症の研究のための好適な動物モデルとして述べられてきた。実際において、リポ多糖類の単純投与よりもより厳密にヒト敗血症を再現し、末梢血管抵抗の減少および心拍出量の増加を特徴とする初期運動過多段階を誘発すると報告されている（Ｒｏｎｃｏら、Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００８、３：５３１−５４４；Ｔｏｓｃａｎｏ  Ｍ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．２０１１、５１、ｅ２８６０）。
【００６４】
上記に言及したように、本発明者らは、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）誘発敗血症モデルでの敗血症性ＡＫＩの処置においてシラスタチンの良好な効果を示した。特に、媒体により処置した敗血症モデルは敗血症の誘発後４８時間で、疑似手術の対照ラットに対して、血清クレアチニン、ＢＵＮおよび尿中タンパク質レベルの上昇、および糸球体濾過量の低下を示した。反対に、シラスタチンは、敗血症によって既に上昇したクレアチニンまたはＢＵＮなどの腎機能指標（図２）、並びにＫＩＭ−１つまり敗血症患者でレベルが上昇するＡＫＩの新規の初期生体指標（Ｔｕ  Ｙら、Ｒｅｎ  Ｆａｉｌ．２０１４；３６（１０）：１５５９−６３）（図３）を低下させることが示された。加えて、シラスタチンは腎組織の組織学的損傷を著しく減らした（図４）。これはさらに、アポトーシスを減らし（図５〜７）、腎臓細胞抗酸化能力を改善し（図８〜９）、そして炎症（図１０〜１１）および線維症（図１２）を減らす効果を示している。
【００６５】
本発明の処置方法の特定の実施形態では、シラスタチンは敗血症性ＡＫＩを患うまたは患う恐れがある対象に投与される。敗血症の環境における急性腎障害（ＡＫＩ）をここでは「敗血症性ＡＫＩ」または「敗血症関連ＡＫＩ（ＳＡ−ＡＫＩ）」と呼ぶ。より特定の実施形態では、シラスタチンは敗血症を患う対象または敗血症性ＡＫＩを患う恐れがある対象に投与される。
【００６６】
好適な実施形態では、シラスタチンは敗血症性ＡＫＩを防ぐまたは減らすことができる。より好適な実施形態では、これは盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）誘発敗血症動物モデルでの敗血症性ＡＫＩを防ぐまたは減らすことができる。
【００６７】
本発明はまた、哺乳類対象の敗血症関連急性腎障害を処置する予防または治療方法で用いるシラスタチンに関する。好ましくは、これは敗血症性ＡＫＩを処置する方法であって、前記方法は死亡率を減らすことを特徴とする方法に関する。好適な特徴および実施形態は本発明の他の局面に対して本明細書で定義される通りである。
【００６８】
本発明はさらに、敗血症を患うまたは患う恐れがある、好ましくは、ＳＡ−ＡＫＩを患うまたは患う恐れがある哺乳類対象の死亡率を減らす方法で用いるシラスタチンに関する。好適な特徴および実施形態は本発明の他の局面に対して本明細書で定義される通りである。
【００６９】
本発明は哺乳類対象の処置に関する。好ましくは、前記哺乳類対象はヒト対象である。このヒト対象は成人対象でも子供でもよい。子供集団は典型的には、１８歳より下の患者として定義される。特定の実施形態では、前記患者は０歳から１５歳の間であり、より好ましくは２歳から１２歳の間である。敗血症を患う高齢患者はＳＡ−ＡＫＩの高リスク集団として識別されている（Ａｌｏｂａｉｄｉら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）、２−１１）。本発明の処置方法の特定の実施形態では、対象はヒト成人、好ましくは６０歳より上、より好ましくは６５歳より上である。
【００７０】
他の疾患、特に慢性腎臓病、糖尿病、高血圧、心不全、悪性腫瘍、および肝臓病を患う敗血症患者はまた、敗血症性ＡＫＩへの高い罹病性を示すと述べられている（Ｂａｇｓｈａｗら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  ２００８、１２：Ｒ４７；Ｂａｇｓｈａｗら、Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００７；２：４３１−９）。従って、本発明の処置方法の特定の実施形態では、シラスタチンは共存症を患うまたは患った対象、好ましくは、慢性腎臓病、糖尿病、高血圧、心不全、癌、および肝臓病よりなる群から選択される疾患を患うまたは患った対象に投与される。
【００７１】
敗血症は様々な感染一次起源を有し得る。敗血症性ＡＫＩを患う恐れが高いことはまた感染の一次起源に関連している。特に、血流感染、腹部および尿生殖器敗血症、および感染性心内膜炎は、ＡＫＩを発現させる高い可能性に関連している（Ｇｏｄｉｎら、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  ２０１５、３５（１）、１２−２２；Ｂａｇｓｈａｗら、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００９；３５：８７１−８１）。本発明の処置方法の特定の実施形態では、敗血症は、血液、腹腔、尿生殖路または心臓より成る群から選択される感染の一次部位によって特徴付けられる。好ましくは、感染の前記一次部位は腹腔および／または胃腸管である。
【００７２】
本発明の処置方法で用いる医薬組成物
本発明はまた、本明細書で定義する処置方法で用いる、シラスタチンおよび薬学的に許容される賦形剤を備える医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、前記医薬組成物はシラスタチンを単一の活性成分として備える。
【００７３】
別の特定の実施形態では、前記医薬組成物はシラスタチンおよび別の薬物、好ましくはイミペネム以外の別の薬物を備える。医薬組成物でシラスタチンと併用され得る薬物のリストは特に制限されない。薬物併用の例示的な限定されない例を以下に提供する。
【００７４】
好適な実施形態では、前記他の薬物は抗菌薬剤、好ましくはイミペネム以外の抗菌薬剤である。前記抗菌薬剤は腎毒性であってもなくてもよい。
【００７５】
より好適な実施形態では、好ましくはイミペネム以外の前記抗菌薬剤は、ポリミキシン、ベータラクタム、アミノグリコシド、グリコペプチド、およびポリエンよりなる群から選択される腎毒性抗菌薬剤ではないという条件で腎毒性抗菌薬剤である。より好適な実施形態では、前記腎毒性抗菌薬剤はベータラクタム抗生物質ではない。用語「ベータラクタム腎毒性抗菌薬剤」および「ベータラクタム抗生物質」はここでは区別なく用いられる。
【００７６】
別のより好適な実施形態では、好ましくはイミペネム以外の前記抗菌薬剤は、ゲンタマイシン；カナマイシン；トブラマイシン；アミカシン；ネチルマイシン；バシトラシン；ネオマイシン；メトロニダゾール；ポリミキシンＢ；ポリミキシンＥ（コリスチン）、トリメトプリム；スルフィソキサゾール；スルファメトキサゾール；メテナミン；バンコマイシン；スペクチノマイシン；クロラムフェニコール；アンフォテリシンＢ、ペンタミジン、ペンタミジンイソエチオネート；アトバコン；リファンピン；パラアミノサリチル酸；イソニアジド；カプレオマイシン；アシクロビル；ＡＺＴ；３ＴＣ；ビダラビン；シドフォビル；ラミブジン；サキナビルおよびバラシクロビルよりなる群から選択される腎毒性抗菌薬剤ではないという条件で腎毒性抗菌薬剤である。
【００７７】
併用処置の他の実施形態を以下に示す。
【００７８】
薬学的に許容される賦形剤としては、ガム、澱粉（例えば、コーンスターチ、アルファ化澱粉）、砂糖（例えば、乳糖、マンニトール、蔗糖、ブドウ糖）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルクまたはこれらの混合物などの担体または希釈剤；結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、じゃがいも澱粉、アルギン酸、二酸化珪素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、澱粉グリコール酸ナトリウム）、様々なｐＨおよびイオン強度の緩衝剤（例えば、トリス−ＨＣＩ、酢酸塩、燐酸塩、重炭酸塩）；表面への吸収を防ぐアルブミンまたはゼラチンなどの添加物；洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、胆汁酸塩）；プロテアーゼ阻害剤；界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）；透過促進剤；可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール）；安定剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増粘剤（例えば、カルボマー、コロイド状二酸化珪素、エチルセルロース、グアーガム）；甘味料（例えば、アスパルテーム、クエン酸）；保存料（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）；滑剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）；流動助剤（例えば、コロイド状二酸化珪素）、可塑剤（例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）；乳化剤（例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）；ポリマー塗膜（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）；塗膜および膜形成剤（例えば、エチルセルロース、アクリル酸、ポリメタクリル酸）；水性（塩類および緩衝媒質を含む、水、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液）または非水（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチルなどの注入可能有機エステル）溶液、懸濁液、乳液またはオイルなどの液状製剤のための薬学的に許容される担体；および水、オイル、食塩水、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖液および他の糖溶液を含むがこれらに限定されない非経口媒体（例えば、皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）を含むがこれらに限定されない。薬学的に許容される賦形剤はまた、カチオン高分子電解質（例えば、ゼラチン）およびアニオン高分子電解質（例えば、アラビアゴム）などのナノカプセル化目的の賦形剤も含む。
【００７９】
特定の実施形態では、前記製剤はシラスタチンおよび緩衝剤として重炭酸ナトリウムを備えるまたはこれらよりなる。
【００８０】
投与経路
本発明の処置方法で用いるシラスタチンは典型的には、意図する投与経路と適合する医薬組成物として製剤される。投与を実現する方法は当業者には既知である。これは、例えば、静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、心室内、硬膜内などの非経口経路、並びに経口、舌下、経鼻、眼、直腸、経皮または局所による注射または注入を含む。持続放出投与もまた、例えば蓄積注射または侵食性移植として特別に考慮される。局所送達は、例えば、腎動脈または目的の局所部位に供給を行う血管など１つまたはそれ以上の動脈へのカテーテルを介しての送達として特別に考慮される。
【００８１】
特定の実施形態では、シラスタチンは経口、舌下、経皮または非経口経路によって投与される。好ましくは、シラスタチンは筋肉内、腹腔内または血管内投与経路によって、例えば静脈内経路によって投与される。血管内経路による投与は、静脈へと挿入した針またはカテーテルを通して流体を容器から患者の血管系へ投与するために用いられる、当業者には周知の装置を用いて実行される。装置は、針またはカテーテル、管系、流量調整弁、点滴チャンバー、注入ラインフィルター、ＩＶセット栓、流体送達管系、セットの部品間のコネクター、注射部位として働くキャップ付き側管、および管系をＩＶバッグまたは他の注入流体容器へと貫通および接続させる中空スパイクを含み得る。
【００８２】
好ましくは、前記組成物は血管内投与に適した形態である。好適な実施形態では、前記組成物は水性組成物、より好ましくは安定水性組成物である。本明細書で用いる用語「安定組成物」は、内部の活性成分が、貯蔵によりその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持する製剤のことを言ってもよい。
【００８３】
典型的には、シラスタチンは、ｐＨ６．５〜８．５の範囲に調整された緩衝溶液にて、好ましくは単一の薬剤または単一の活性成分として製剤される。適切な希釈剤としては、０．９％塩化ナトリウム注射液；５％または１０％ブドウ糖注射液；５％ブドウ糖および０．９％塩化ナトリウム注射液；０．２２５％または０．４５％食塩水付き５％ブドウ糖注射液；０．１５％塩化カリウム溶液付き５％ブドウ糖注射液；マンニトール５％および１０％を含むがこれらに限定されない。好適な実施形態では、前記希釈剤は０．９％塩化ナトリウム注射液；または５％ブドウ糖注射液である。
【００８４】
このような組成物のいくつかの実施形態は凍結乾燥製剤によって提供してもよい。前記凍結乾燥製剤は、本発明の組成物を血管内注射用に用意された溶液の形態で与えるように再構成および希釈することができる。例としては、限定するものではないが、本発明による冷凍乾燥製剤の実施形態は上述のようなある体積の希釈液により再構成される。好ましくは、前記冷凍乾燥製剤は単一用量（典型的には、シラスタチン２５０ｍｇまたは５００ｍｇ）容器で提供される。容器の中身は５から５０００ｍＬの体積の希釈剤、好ましくは１０から１０００ｍＬの希釈剤、より好ましくは５０から５００ｍＬの希釈剤、さらに好ましくは２０から２００ｍＬの希釈剤、最も好ましくはおよそ１００ｍＬの希釈剤で希釈するとよい。
【００８５】
本発明の再構成した実施形態は、所望であればさらに希釈することができる。このさらなる希釈は好ましくは本明細書で述べる水性希釈剤により実行される。再構成溶液は、再構成溶液での濃度および希釈溶液での所望の濃度に依存して希釈されることになる。
【００８６】
特定の実施形態では、冷凍乾燥製剤（好ましくは２５０ｍｇまたは５００ｍｇのシラスタチン）は水性希釈剤の体積およそ１０ｍＬで再構成され、さらに最終体積１００ｍＬへと希釈される。別の特定の実施形態では、水性希釈剤の体積およそ１００ｍＬで直接再構成される。
【００８７】
典型的には、シラスタチンは、０．５から２５ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは０．７５から１０ｍｇ／ｍＬの範囲、最も好ましくはおよそ２．５ｍｇ／ｍＬまたはおよそ５ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤されることになる。
【００８８】
投与スケジュールおよび用量
シラスタチンは単一の時間で投与することができる。また処置方法の期間を通じて定期的に、例えば、１日１回、２回、３回、４回、またはそれ以上の回数で、１日おき、毎週、隔週、３週間毎、または毎月、投与してもよい。好適な実施形態では、シラスタチンは、敗血症または敗血症の疑いと診断されてから敗血症の弛張まで、毎日、好ましくは１日３または４回投与される。シラスタチンはまた対象に連続して（例えば、静脈内にまたは移植、ポンプ、徐放性製剤などからの放出によって）投与してもよい。
【００８９】
投与すべき用量は、疾患のタイプおよび重症度を含む多数の要因および／または全体的な健康状態、年齢、性別、体重および薬物耐性などの対象の特質に依存し、必要に応じて個別の必要および専門的な判断により調整すべきである。用量はまた、投与経路、処置レジメン、標的部位、または他の投与療法などの要因により変動し得る。当業者であればこれらのおよび他の要因に依存して適切な用量を決定することができるであろう。予防上または治療上有効な量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇ体重から約４０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量を含むとよいがこれらに限定されない。
【００９０】
特定の実施形態では、シラスタチンは、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくはヒト成人では約２２〜約２６ｍｇ／ｋｇ体重およびヒト子供では約３４〜約３８ｍｇ／ｋｇ体重の用量で非経口投与経路（好ましくは静脈内）によって投与される。
【００９１】
ヒト成人に対する好適な用量および投与スケジュールは、非経口経路（好ましくは静脈内）によって、６時間毎に２５０ｍｇ、６時間または８時間毎に５００ｍｇ、または６時間または８時間毎に１グラムを与えるなどによって、毎日１グラムから４グラムの用量を投与することである。
【００９２】
シラスタチンは、単独で（単一薬剤として）またはイミペネム以外の別の薬物との併用で投与するとよい。
【００９３】
本発明の処置方法で用いる併用療法
本発明はまた、投与を別の薬物、好ましくはイミペネム以外の別の薬物との併用で行う本発明の処置方法で用いるシラスタチンまたはその医薬組成物に関する。
【００９４】
シラスタチンは典型的には抗菌療法との併用で用いられよう。重症敗血症および／または敗血症性ショックを患う患者で補助療法として他の薬物が用いられることが多く、本発明においても、急速輸液および昇圧治療では血流力学的安定性を回復することができない場合に、例えばｉ）６５ｍｍＨｇより高い平均動脈圧を目標とするノルエピネフリン、エピネフリン、バソプレシン、および／またはドーパミンなどの昇圧剤；ｉｉ）心筋機能不全の存在または低灌流の徴候においてのドブタミンなどのイオンチャンネル型薬剤；およびｉｉｉ）ヒドロコルチゾンなどのコルチコステロイドが用いられ得る（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１２）。
【００９５】
特定の実施形態では、シラスタチンは本明細書で述べた抗菌療法または薬物との併用で投与される。本明細書で用いる用語「抗菌療法」は、抗ウイルス、抗菌および抗真菌薬物などの活動性感染の処置のための薬物のことを言う。これらは当業者には周知である（例えば、“Ｇｉｄｅｏｎ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ”Ｂｅｒｇｅｒ  Ｓ、２０１５  Ｇｉｄｅｏｎ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；“Ｓｅｐｓｉｓ，ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ”、Ｒｅｌｌｏ  Ｊ．およびＲｅｓｔｒｅｐｏ  Ｍ．、２００８  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ参照）。
【００９６】
抗菌療法、好ましくは静脈内、は典型的には、適切な培養物を得た後最初の６時間以内またはそれより早く（例えば、１時間以内）に開始される。何故なら抗菌療法を早く開始することで死亡率が低くなるからである。抗生物質の選択は複雑であり、患者の病歴（例えば、最近投入した抗生物質）、共存症、臨床状況（例えば、地域感染または院内感染）、グラム染色データ、および局部抵抗パターンを考慮すべきである。考慮し得る他のパラメータとしては、初期感染の部位および原因、感染臓器および損傷の程度がある（ｗｗｗ．ｎｈｓ．ｕｋ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ／ｂｌｏｏｄ−ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ／Ｐａｇｅｓ／Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ａｓｐｘ）。
【００９７】
潜在病原体または感染源が直ちに明らかにならないときは、グラム陽性およびグラム陰性菌の両方に向けた広域の抗菌カバレッジが、典型的には、各患者の現存の病気および感染の局所パターンに基づいて用いられるとよい。敗血症患者で実験的に用いるときは、細菌感受性プロファイルが分かり次第、最も適切な抗菌療法のための段階的縮小が推奨される（Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１２）。
【００９８】
本発明の処置方法で用いる併用療法は様々なクラスの抗生物質、典型的には、少なくとも２つの異なるクラスの抗生物質の使用を含んでもよい。これは同時投与の２つまたは３つの抗生物質の併用を含む。敗血症の処置に典型的に用いられる抗生物質としては、アミノグリコシド、マクロライド、ベータラクタム（例えば、ペニシリン；第１、第２、第３および第４世代のセファロスポリン、およびカルバペネブ）、グリコペプチド、リンコサミドおよび／またはフルオロキノロンがある。例えば、マクロライド、フルオロキノロンまたはアミノグリコシドと共にベータラクタム薬剤（例えば、第３または第４世代セファロスポリン）が広域カバレッジのために一般に用いられる。加えて、併用はまた、多くのＭＲＳＡ感染を処置するためにバンコマイシンを含んでもよい。一般に用いられる抗生物質および抗生物質併用物のいくつかとしては次のものがある。
・セフトリアキソン
・メロペネム
・セフタジジム
・セフォタキシム
・セフェピム
・ピペラシリンおよびタゾバクタム
・アンピシリンおよびスルバクタム
・レボフロキサシン
・クリンダマイシン
【００９９】
Ｔｈｅ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｃａｍｐａｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ２０１２は重症敗血症（グレード２Ｂ）の好中球減少症患者および、アシネトバクターおよびシュードモナス種（グレード２Ｂ）などの処置の難しい多剤耐性病原菌を持つ患者に対して併用経験的療法を示唆している。呼吸不全および敗血症性ショックに関連した重症感染症の選択された患者に対しては、拡大域ベータラクタムとアミノグリコシドかまたはフルオロキノロンのいずれかとの併用療法が緑膿菌菌血症（グレード２Ｂ）に対して示唆される。同様に、ベータラクタムおよびマクロライドのより複雑な併用が、菌血症性肺炎連鎖球菌感染症（グレード２Ｂ）からの敗血症性ショックの患者に対して示唆される。
【０１００】
抗生物質療法は一般に７〜１０日の期間を有する。好中球減少症の患者では、抗生物質処置は典型的には、好中球減少症が消散するかまたは計画した抗生物質コースが完了するかいずれか長い方が終わるまで続け、一方、感染が除外される非好中球減少症患者では、抗生物質耐性の生成を避けるために抗生物質は一般に中止される。
【０１０１】
腎毒性ベータラクタム抗生物質は急性近位尿細管壊死を引き起こし得ることが報告されている。腎毒性はペニシリンでは珍しくセファロスポリンでは稀であったが、ペネムでは発生率がより高かった。特に、第１世代セファロスポリン、セファロリジンおよびセファログリシン；並びにカルバペネブ、イミペネムおよびパニペネムは腎毒性であると述べられている。実際において、イミペネムおよびパニペネムは腎保護性の腎輸送阻害剤との、すなわちそれぞれシラスタチンおよびベタミプロンとの併用で市販されている（Ｔｕｎｅ  Ｂ．、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  １９９７、１１（６）、７６８−７７２）。シラスタチンはこれらの薬剤のいずれとも併用で使用され得る。
【０１０２】
特定の実施形態では、シラスタチンはイミペネムまたはパニペネムと併用して投与されない。別の特定の実施形態では、シラスタチンは、イミペネム、パニペネム、セファロリジンおよびセファログリシンよりなるリストから選択される抗生物質と併用して投与されない。好ましくは、シラスタチンは、カルバペネブ抗生物質および／または第１世代セファロスポリンと併用して投与されない。より特定の実施形態では、シラスタチンは、ベータラクタム腎毒性抗菌薬剤と併用して投与されない。
【０１０３】
別の特定の実施形態では、シラスタチンが併用で投与されるときは、ベータラクタム腎毒性抗菌薬剤および／または、ゲンタマイシン；カナマイシン；トブラマイシン；アミカシン；ネチルマイシン；バシトラシン；ネオマイシン；メトロニダゾール；ポリミキシンＢ；ポリミキシンＥ（コリスチン）、トリメトプリム；スルフィソキサゾール；スルファメトキサゾール；メテナミン；バンコマイシン；スペクチノマイシン；クロラムフェニコール；アンフォテリシンＢ、ペンタミジン、ペンタミジンイソエチオネート；アトバコン；リファンピン；パラアミノサリチル酸；イソニアジド；カプレオマイシン；アシクロビル；ＡＺＴ；３ＴＣ；ビダラビン；シドフォビル；ラミブジン；サキナビルおよびバラシクロビルよりなる群から選択される非ベータラクタム腎毒性抗菌薬剤と併用して投与されない。
【０１０４】
好ましくは、シラスタチンはベータラクタム、ポリミキシン、アミノグリコシド、グリコペプチド、スルホンアミド、ニトロイミダゾール、およびポリエンよりなる群から選択される腎毒性抗菌薬剤と併用して投与されない。より好ましくは、シラスタチンは、腎毒性抗生物質などの腎毒性抗菌薬剤と併用して投与されない。
【０１０５】
本明細書で用いる用語「腎毒性抗菌薬剤」は、微生物の成長を止めるまたは遅らせる薬物、化学物質、または他の物質のことを言い、副作用として腎毒性を持つ。抗菌薬剤としては、抗細菌薬物（例えば、バンコマイシン、ゲンタマイシン、ポリミキシンＥ）、抗ウイルス薬剤（例えば、ホスカビル、アデホビル、およびテノホビル、並びにビスフォスフォネートパミドロネート）、抗真菌薬剤（例えば、アンフォテリシンＢ）、および抗寄生虫薬物（例えば、スルファジアジン）がある。
【０１０６】
さらなる特定の実施形態では、シラスタチンは、抗菌薬剤、好ましくはイミペネム以外の抗菌薬剤と併用して投与され、より好ましくは、前記抗菌薬剤は腎毒性抗菌薬剤ではない。
【０１０７】
追加のさらなる特定の実施形態では、シラスタチンは、腎毒性抗菌薬剤、より好ましくはイミペネム以外の腎毒性抗菌薬剤と併用して投与される。
【０１０８】
シラスタチンおよび前記他の薬物、好ましくはイミペネム以外の別の薬物は、同じまたは別の医薬組成物で、そして同じ時間に（同時に）または異なる時間に（シラスタチンを前記他の薬物の前または後に投与）投与することができる。併用療法の投与スケジュールについてのさらなる詳細は上述している。
【０１０９】
特定の実施形態では、シラスタチンの投与は、同じまたは別の組成物の一部として前記他の薬物の投与と同時である。別の特定の実施形態では、シラスタチンの投与は前記他の薬物の投与に連続している（前または後である）。
【０１１０】
本明細書で述べるいずれの実施形態も、本発明のいかなる医学的用途、医薬組成物、処置方法、薬剤を製造する方法および併用療法に関しても実現させることができ、逆もまた同様であることが考えられる。本明細書で述べる特定の実施形態は例示のために示されるものであって本発明を制限するものではないことは理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から外れることなく様々な実施形態において使用することができる。当業者であれば、本明細書で述べる特定の手順の数多くの等価物を単なる日常の実験を用いて認識しまたは解明することができるであろう。このような等価物は本発明の範囲内であると考えられまた請求の範囲によって保護される。
【０１１１】
本明細書で言及するすべての出版物および特許出願は、本発明が関連する分野の当業者の熟練度を示す。すべての出版物および特許出願は本明細書において、個々の出版物および特許出願が特別におよび個別に参照によって援用されると示されたのと同じ程度に参照によって援用される。
【０１１２】
用語「ａ」または「ａｎ」の使用は「１つ」を意味し得るが、これはまた「１つまたはそれ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより多い」の意味と一致する。用語「別の」の使用はまた１つまたはそれ以上のことを言う場合もある。請求の範囲での用語「または」の使用は、二者択一のみに言及するよう明確に示されていない場合、または二者択一が相互に排他的ではない場合は「および／または」を意味するように用いられる。
【０１１３】
本明細書および請求の範囲で用いられる用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇのいずれの語形も）、「持つ（ｈａｖｉｎｇ）」（および「ｈａｖｅ」および「ｈａｓ」などのｈａｖｉｎｇのいずれの語形も）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのｉｎｃｌｕｄｉｎｇのいずれの語形も）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「ｃｏｎｔａｉｎｓ」および「ｃｏｎｔａｉｎ」などのｃｏｎｔａｉｎｉｎｇのいずれの語形も）は包括的または無制限であって、追加の非言及の要素または方法ステップを除外しない。用語「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」はまた、用語「よりなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「本質的によりなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」を包含しまたこれらを明確に広げる。本明細書で用いる語句「本質的によりなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求の範囲を特定の材料またはステップおよび本発明の基本的且つ新規の特性に実質的に影響を与えないものに制限する。本明細書で用いる語句「よりなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）は、例えばその要素または制限と通常関連する不純物以外、請求の範囲で特定されないいかなる要素、ステップまたは成分も除外する。
【０１１４】
本明細書で用いる用語「またはその組み合わせ」は、本用語に先行する列挙項目のすべての順列と組み合わせのことを言う。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣの少なくとも１つを、また特定の状況において順序が重要な場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢもまた含むよう意図される。この例で続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなど、１つまたはそれ以上の項目または項の繰り返しを含有する組み合わせが明確に含まれる。当業者であれば、状況から他に明らかでない限り、典型的にはいかなる組み合わせにも項目または項の数に制限はないことが理解されよう。
【０１１５】
本明細書で用いる「約（ａｂｏｕｔ）」、「およそ（ａｒｏｕｎｄ）」「ほぼ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などであるがこれらに制限されない近似の語は、そのように修正されると、必ずしも絶対または完全ではないと理解される状況ではあるが、当業者にとってその状態が存在していると示すのを保証するのに十分に近いとみなされ得る状態のことを言う。記述が変動し得る程度は、どのような大きな変化が導入されそして当業者に修正された特徴が非修正の特徴の必要な特性および能力を依然として持っていると認めさせることができるかに依存するであろう。一般には、しかし上述の議論に従えば、「約」などの近似の語によって修正される本明細書での数値は、表示された値から±１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５％変動してもよい。好ましくは、用語「約」はちょうど示された値（±０％）を意味する。
【０１１６】
以下の実施例は本発明を例示するように働くものであって、その範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１７】
実施例１−材料および方法
薬物
結晶性シラスタチンはＡＣＳ  Ｄｏｂｆａｒ（Ｍｉｌａｎ、イタリア）によって提供され０．９％生理食塩水（媒体）に溶解させた。
【０１１８】
動物
体重３２０〜３７０ｇ生後８〜９週間の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ、米国）において研究を行った。動物は制御された光（１２時間の明暗サイクル）、温度、および湿度の下で食料および水は随意にフリーアクセスで飼育し、また１週間、隔日に代謝ケージで調整した。この研究はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｂｏａｒｄ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓによって承認された。動物は常に、担当の獣医の直接の監視の下で、実験および他の科学的目的で使用される動物の保護についてのＲｏｙａｌ  Ｄｅｃｒｅｅ  ５３／２０１３およびＤｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０１０／６３／ＵＥの適用法的規制に従って扱った。
【０１１９】
敗血症の誘発：盲腸結紮穿刺モデル
いくつかの論文に記載されているように盲腸結紮穿刺モデル（ＣＬＰ）によって敗血症を発現させた（Ｌｉ  Ｇら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；４１（７）：４５９−６８、Ｓｅｉｊａ  Ｍら、Ｓｈｏｃｋ．２０１２；３８（４）：４０３−１０）。動物にケタミン（Ｋｅｔｏｌａｒ  ５０ｍｇ／ｍｌ）９０ｍｇ／ｋｇ腹腔内（ｉｐ）およびジアゼパム（バリウム１０ｍｇ／２ｍＬ）５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐにより麻酔をかけた。無菌状態下で３ｃｍ正中線開腹を行って盲腸を露出させ、４−０絹糸による結紮を盲腸先端から０．７５ｃｍの位置で行った。それを１４ゲージ針で一度穿刺した。第２の結紮を第１の結紮に近く回盲弁には遠い１．５ｃｍの位置で行って腸閉塞を避けた。盲腸の２つの結紮の間に１６ゲージ針で３カ所穿刺した。１ｍｍ柱の糞便物質が外部に出るまで盲腸を優しく絞った。次に腸を腹部に戻し、切り口を層状に閉じた。疑似手術（開腹および盲腸露出、他の手術無し）を対照として行った。手術の終わりに、生理食塩水（５０ｍｌ／ｋｇ体重）を単一用量で皮下注射、および手術後直ちに致死の日まで１２時間毎にブプレノルフィン（ｂｕｐｒｅｘ  ０．３ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｇ／ｋｇによる鎮痛剤処置により、すべてのラットを蘇生させた。
【０１２０】
ＣＬＰ誘発敗血症のラットモデルが選ばれたのは、これがヒトの疾患の多くの病理学的特徴および臨床経過に似ているからである。ＣＬＰ誘発敗血症は血清クレアチニン、ＢＵＮの上昇、および糸球体濾過量の減少を引き起こし（Ｃａｄｉｒｃｉ  Ｅら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１；１６６（３）：３７４−８４、Ｌｉ  Ｐら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ（２０１５）１９：２００）、従って敗血症の損傷効果の防止および処置のための新規の薬理学的アプローチを調査するために広く用いられてきた（Ｈｕｂｂａｒｄ  ＷＪら、Ｓｈｏｃｋ  ２００５；２４（Ｓｕｐｐｌ．１）：５２−７、Ｄｏｉ  Ｋら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００９；１１９：２８６８−７８）。
【０１２１】
腎機能監視
血清クレアチニン、血中尿素窒素レベル（ＢＵＮ）、タンパク質および他のパラメータをＤｉｍｅｎｓｉｏｎ  ＲｘＬ自動分析装置（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を用いて測定した。糸球体濾過量を、クレアチニンクリアランス率を用いて計算した。
【０１２２】
腎組織病理学的研究
光学顕微鏡検査のため、パラフィン包理の腎切片（４ｍｍ厚）をヘマトキシリン−エオシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。腎障害スコアを前述の半定量化インデックス（Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０１２；８２（６）：６５２−６６３）を用いて以下のように計算した：０、変化なし；１、試料の２５％に関与する限局性変化；２、＞２５から５０％に影響を与える変化；３、＞５０から７５％に関与する変化；４、＞７５％に影響を与える損傷。障害スコアは、糸球体損傷（メサンギウム細胞増殖および行列展開）、尿細管間質障害（尿細管拡張および／または萎縮）、間質性線維症、および炎症性細胞浸潤の半定量化評価の総計によって計算した。２人の独立した病理学者が盲検により腎障害を採点した。
【０１２３】
免疫組織化学
上述のように免疫組織化学を実行した（Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０１２；８２（６）：６５２−６６３）。使用した一次抗体は、ポリクローナルヤギ抗ラットＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ（１：２０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；抗切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）（１：５０；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）マウスモノクローナル抗４−ＨＮＥ（１：７５；Ｏｘｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；ポリクローナルラビット抗Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ（１：１０００；Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ、米国）；モノクローナルマウス抗ＣＤ６８（単球／マクロファージ、１：１２５、Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄ、英国）；ポリクローナルヤギ抗ＶＣＡＭ−１（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、米国）；ポリクローナルラビット抗ＴＧＦβ１抗体（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；モノクローナルマウス抗ＩＣＡＭ−１（１：１００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）であった。抗体の特異性は、一次抗体がなくバックグラウンドを生成しない対照によって検証した。抗体によって標識された表面領域は、上述した定量的画像分析によって評価した（Ｌａｚａｒｏ  Ａら、Ａｎｔｉｏｘ  Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌ．２００５；７：１２８５−１２９３）。手短に言えば、染色領域のパーセンテージを、適切な二値閾値化画像と全視野領域との比率として計算した。各試料に対しては、平均染色領域を試料全体の分析によって得た。
【０１２４】
ウェスタンブロット分析
上述のようにウェスタンブロットを行った（Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０１２；８２（６）：６５２−６６３）。一次抗体は以下とした：ヤギ抗腎障害分子１（ＫＩＭ−１）ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，米国；希釈１：２０００）；ラビット抗切断カスパーゼ３ポリクローナル抗体（Ａｓｐ１７５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、希釈１：１０００）；マウス抗ＦａｓＬモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、米国、希釈１：２００）；ラビット抗ローデント切断カスパーゼ８（Ａｓｐ３８７）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、希釈１：１０００）；ラビット抗Ｃｕ／ＺｎＳＯＤポリクローナル抗体（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ、米国、希釈１：２５００）。内部標準として、膜をマウスモノクローナル抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ）により再精査して各系でタンパク質負荷が等しいことを検証した。すべての信号をＡｌｌｉａｎｃｅ  ４．７（Ｕｖｉｔｅｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）により視覚化し、濃度測定走査によって分析した（ＩｍａｇｅＪ；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。結果を任意単位（ａ．ｕ．）で表した。
【０１２５】
アポトーシスの現場分析
アポトーシスのインデックスとしてＤＮＡ断片化を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ＦｒａｇＥＬ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて製造業者のプロトコルに従って、パラフィン包埋腎組織切片での末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰ切れ目端部標識化によって検出した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞をＬｅｉｃａ−ＳＰ２共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により可視化した。各腎切片に対して、アポトーシス中の細胞を、２０Ｘ倍率で見た３０個の非重複無作為の視野でのすべての陽性アポトーシス細胞を数えることによって盲検により数値化した。
【０１２６】
抗酸化能力の尿レベル
抗酸化能力の尿レベルを、市販のＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて製造業者のプロトコルに従って測定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｙｍａｎｃｈｅｍ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／７０９００１）。全体的な抗酸化能力は、血漿および体液に存在するすべての抗酸化物質の累積効果を考慮するため、個々の成分の測定によって得られるものに比べて、より関連した生物学的情報を与え得る。Ｃａｙｍａｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌのＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔは、生物学的試料の全抗酸化能力を測定する。アッセイは、メトミオグロビンによる、試料中の抗酸化物質のＡＢＴＳ（登録商標）（２，２‘−アジノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）のＡＢＴＳ（登録商標）＋への酸化を阻害する能力に依存する（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｊ．、Ｒｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ，Ｃ．、Ｄａｖｉｅｓ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，８４，４０７−４１２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｊ．およびＲｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ，Ｃ．Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９７，２６，１９５−１９９）。試料中の抗酸化物質のＡＢＴＳ酸化を防止する能力は、溶性トコフェノール類似体であるトロロックスに匹敵し、モルトロロックス等量として数値化される。
【０１２７】
シリウスレッド染色
コラーゲン線維を、上述したようにシリウスレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色することによって線維症のインデックスとして測定した（Ｌａｚａｒｏ  Ａら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１６；２０１６：２５１８６２６）。染色スコアを以下の半定量化スケールを用いて盲検で計算した：０、なし；１、０から２５％の間の染色；２、２５から５０％の間の染色；３、５０から７５％の間の染色；４、＞７５％の染色。
【０１２８】
統計分析
量的変数を平均±ｓ．ｅ．ｍ．として集約した。等分散性をルビーン検定した。正規分布した等分散による連続変数を分散分析により分析した。分散が等しくない場合はクラスカル−ワリス検定を行った。両側（ｂｉｌａｔｅｒａｌ）α値＜０．０５に対して差異は統計的に有意であるとみなされた。試験はＳＰＳＳ１１．５ソフトウェアパッケージ（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて行った。
【０１２９】
実施例２−敗血症関連腎障害に与えるシラスタチンの効果
実験設計
動物を無作為に４つの群に割り当てた（各群ｎ＝１０）：
ｉ．疑似手術群
ｉｉ．ＣＬＰ群
ｉｉｉ．疑似手術群＋シラスタチン、および
ｉｖ．ＣＬＰ群＋シラスタチン
【０１３０】
処置群では、ラットをシラスタチン１５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐで敗血症の誘発または疑似手術後直ちにおよび２４時間後に処置した。非処置群ではシラスタチンを媒体（０．５ｍＬ／１００ｇ）で代用した。シラスタチンの用量は、シラスタチンがシスプラチン誘発腎毒性を減らすことを示したこれまでの経験に基づいて選択した（Ｈｕｍａｎｅｓ  Ｂら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．２０１２；８２（６）：６５２−６６３、Ｍｏｒｅｎｏ−Ｇｏｒｄａｌｉｚａ  Ｅら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１１；８３（２０）：７９３３−７９４０）。次にすべての動物を２４時間採尿のため代謝ケージに置いた。
【０１３１】
敗血症誘発／疑似手術の４８時間後、すべてのラットをケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびジアゼパム（４ｍｇ／ｋｇ）により麻酔をかけそして殺した。カニューレを腹大動脈に挿入して血液試料を採取し、ＡＣＵＥＴＴＥ（登録商標）Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ管（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）にて２０００ｒｐｍで４℃、１５時間の遠心分離によって血清を単離し、次に使用まで−８０℃で保存した。腎臓を冷食塩水で灌流し直ちに移した。腎臓試料を液体窒素で急速冷凍し−８０℃に保つかまたは４％パラホルムアルデヒドで固定し（２４時間）様々な研究用にパラフィン包埋した。
【０１３２】
結果
典型的腎機能指標での敗血症およびシラスタチンの効果
敗血症は、疑似群に比べて、血清ＢＵＮおよびクレアチニンレベルを上昇させ、また糸球体濾過量を低下させた（図２）。しかし、これらの機能不全はシラスタチンによって敗血症動物では全体的に防御された。タンパク質排出もまたＣＬＰ群では増加したがシラスタチンによって有意に減少した（図２Ｄ）。シラスタチンのみでは、疑似群に比べて、これらのパラメータに何の影響も与えなかった。
【０１３３】
急性腎障害生体指標ＫＩＭ−１での敗血症およびシラスタチンの効果
免疫組織化学（図３Ａ〜Ｅ）およびウェスタンブロット（図３Ｆ〜Ｇ）によって決定されたタンパク質レベルでの急性腎障害生体指標ＫＩＭ−１の増加によって、敗血症の腎効果を確認した。シラスタチン（敗血症＋ｃｉｌ）は部分的にタンパク質を対照（疑似）レベルへと回復させた。図３Ｅおよび３Ｇに示すように、ＫＩＭ−１タンパク質レベルの低下は、処置なしの敗血症動物群に対して統計的に有意であった。一方、シラスタチンのみ（疑似＋ｃｉｌ）では腎ＫＩＭ−１に何の効果も与えなかった。
【０１３４】
シラスタチンが組織病理学的敗血症関連腎障害を改善した
疑似群からの腎臓は正常な糸球体および尿細管組織学を示した（図４Ａおよび４Ｅ）。対照的に、敗血症群の腎臓は軽度の白血球浸潤、尿細管細胞の膨張、間質の鬱血および腎尿細管内の刷子縁損失および硝子円柱を特徴とする構造的損傷を示した（図４Ｃ）。さらに、ボーマン嚢拡大の敗血症動物の腎臓では、毛細血管鬱血および糸球体タフト崩壊が観察された（図４Ｃおよび４Ｇ）。疑似群と比べて、シラスタチンのみでは腎形態に効果は与えなかった（図４Ｂおよび４Ｆ）が、敗血症群で使用すると腎障害の症状の多くを低下させることが分かった（図４Ｄおよび４Ｈ）。半定量化組織学損傷スコアは、対照より敗血症誘発ラットの方が有意に高かった。シラスタチンのみでは疑似群の腎形態に効果は与えなかったが、敗血症誘発ラットでの腎障害スコアを低下させた。（図４Ｉ）。
【０１３５】
シラスタチンは敗血症誘発アポトーシスを減らす
アポトーシスのミトコンドリアおよび外因経路での分子レベルの発現
敗血症群からの腎切片は、非処理腎臓およびシラスタチンのみで処理した腎臓に比べて、腎尿細管での活性化切断カスパーゼ３染色の増加を示した（図５）。シラスタチンは、免疫組織化学（図５Ｅおよび５Ｆ）および腎皮質のウェスタンブロット（図５Ｇおよび５Ｈ）の両方による評価で、上昇したカスパーゼ３レベルを優位に下げた。一方、腎皮質ＦａｓＬおよび切断カスパーゼ８もまた敗血症の結果として際立って増大したが、両方ともシラスタチン処置によって弱まった（図６）。
【０１３６】
アポトーシスの現場検出
腎臓でのアポトーシスを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰ切れ目端部標識化（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いて評価した。敗血症は対照および対照プラスシラスタチン群に比べて、アポトーシス核の数を増大させた（図７Ａ）。シラスタチンはＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を優位に減らした（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１３７】
シラスタチンの敗血症誘発酸化ストレスに与える効果
シラスタチンは抗酸化防衛を高める
敗血症誘発酸化ストレスに対処するシラスタチンの役割を評価するために、尿中の抗酸化能力を測定した。敗血症ラットからの尿は、対照群に比べて、抗酸化能力の低下を示し、これはシラスタチンによって向上した（図８Ｇ）。この抗酸化防衛に関与する酵素の１つはＣｕ／ＺｎＳＯＤである。Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ発現は敗血症ラットの腎皮質で減少し、一方シラスタチンは、免疫組織化学およびウェスタンブロットによって示されるように、その発現を回復することができた（図８Ａ〜Ｆ）。
【０１３８】
シラスタチンは脂質過酸化を減らす
４−ヒドロキシ−２−ノネナール（４−ＨＮＥ）は脂肪酸酸化の産物である。敗血症は対照と比べて腎臓の４−ＨＮＥ染色を高めた（図９Ａ〜Ｃ）。これはシラスタチンによって完全に防止された（図９Ｄおよび９Ｅ）。シラスタチンのみでは対照群と比べてこの変数を修正しなかった。
【０１３９】
敗血症誘発炎症に与えるシラスタチンの効果
シラスタチンは腎炎症細胞湿潤を改善する
免疫組織化学研究では、敗血症ラットの腎臓試料では、対照におけるより（ＣＤ６８による標識化によって証明されるように）単球／マクロファージのより大きな動員が見られた（図１０Ａ〜Ｃ）。シラスタチン処置ラットは敗血症群に比べて、ＣＤ６８陽性細胞が少なかった（図１０ＤおよびＥ）。
【０１４０】
接着分子は白血球の血管内皮への接着の媒介において非常に重要である。図１０は免疫組織化学によるＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の腎染色を示す。敗血症は対照群に比べてＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の両方の発現を増大させた。シラスタチンによる処置は敗血症誘発変化を有意に減らした。シラスタチンのみでは腎組織上のＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１の存在に効果は与えなかった（図１１）。
【０１４１】
シラスタチンはＴＧＦβの発現の増加を減らす
ＴＧＦβは腎損傷の悪化に貢献する線維化促進サイトカインである。免疫組織化学により、敗血症ラットの腎組織には対照群より高いレベルのＴＧＦβが観察された。シラスタチン処理は敗血症動物のＴＧＦβ１レベルを有意に低下させた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【０１４２】
一方、シリウスレッド染色により同じ動物の線維症の出現およびそのＴＧＦβレベルとの関連を分析した。図１２Ａおよび１２Ｃに見られるように、敗血症動物では線維症発現がより高い傾向はあるが、統計的有意性には至らなかった。これは、これら動物は手術後４８時間で犠牲にしたという事実によって説明され得るが、線維化促進メカニズムが既に始まっているということが観察される。
【０１４３】
実施例３−ＣＬＰ誘発敗血症死亡率に与えるシラスタチンの効果
実験設計
敗血症過程４８時間での死亡率およびシラスタチン処置後に得られる生存率を決定するために別の実験モデルを行った。敗血症の誘発は、盲腸の２つの結紮間の３カ所の穿刺は１４ゲージ針で行い、もう１つの穿刺（盲腸先端）は１６ゲージ針で行った以外は上述と同じとした。これにより、より悪性の敗血症モデルとなった。
【０１４４】
合計１２匹の動物を使用し、無作為に各群試料動物数ｎ＝６よりなる２つの群に分けた。従って研究群およびこれらの処置は以下の通りである。
−  ＣＬＰ（敗血症）群：ＣＬＰ手術によって悪性敗血症を誘発した動物、プラス、ＣＬＰ＋シラスタチン群と同じ方法および量のシラスタチンの媒体。
−  ＣＬＰ＋シラスタチン群：ＣＬＰによって悪性敗血症を誘発した動物、プラス、敗血症誘発後直ちにおよび２４時間後１５０ｍｇ／ｋｇ／体重の用量のシラスタチン（食塩水血清中に溶解）。
敗血症の誘発後４８時間で両群の生存動物を数値化した。
【０１４５】
結果
敗血症の死亡は非常に一般的な事実である。敗血症の悪性モデルでは６匹の動物のうち５匹がＣＬＰ手術後４８時間に達する前に死亡した。シラスタチンによる処理は死亡率を３３％低下させた（図１３）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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