(57)【要約】本発明は、ヒスチジン緩衝液、無機塩類、炭水化物及びポリソルベートを含んでなる、硝子体内投与のためのＶＥＧＦアンタゴニストの液体医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼内血管新生性疾患の治療に使用するための液体医薬組成物であって、
ａ）ヒスチジン含有緩衝液と、
ｂ）非イオン系界面活性剤と、
ｃ）ＶＥＧＦアンタゴニストと、
ｄ）無機塩類と、
ｅ）炭水化物と
を含んでなる医薬組成物。
【請求項２】
組成物のｐＨは６．０〜６．５、好ましくは６．２〜６．５である、請求項１の使用のための医薬組成物。
【請求項３】
ヒスチジン含有緩衝液はＬ−ヒスチジン／塩酸ヒスチジンである、請求項１〜２のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項４】
ヒスチジン含有緩衝液は１ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項５】
非イオン系界面活性剤はポリソルベート２０である、請求項１〜４のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項６】
非イオン系界面活性剤は０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
無機塩類はＮａＣｌである、請求項１〜６のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項８】
無機塩類は２０〜１００ｍＭ、好ましくは４０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項９】
ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体若しくはそのような抗体の抗原結合性フラグメント又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質である、請求項１〜８のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項１０】
ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプト又はラニビズマブである、請求項１〜９のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項１１】
ＶＥＧＦアンタゴニストは６〜４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜１０のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項１２】
炭水化物はスクロースである、請求項１〜１１のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項１３】
炭水化物は３〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１〜１２のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項１４】
塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、アフリベルセプト、スクロース及び水で構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有している、眼内血管新生性疾患の治療に使用される液体医薬組成物。
【請求項１５】
１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有している、請求項１４の使用のための医薬組成物。
【請求項１６】
眼内血管新生性疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害、網膜静脈閉塞症（分枝ＲＶＯ若しくは中心ＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫による視力障害、又は病的近視に続発する脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）による視力障害である、請求項１〜１５のいずれか１項の使用のための医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に定義されるような医薬組成物を含有する充填済みシリンジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒスチジン含有緩衝液、無機塩類、炭水化物及びポリソルベートを含んでなる、硝子体内投与のためのＶＥＧＦアンタゴニストの液体医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管発生（すなわち新しい血管のデノボ形成）及び血管新生（すなわち先在する血管からの新しい血管の形成）を促進するタンパク質である。ＶＥＧＦの少なくとも６つのサブタイプ、すなわちＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ウイルスＶＥＧＦ−Ｅ及び胎盤ＶＥＧＦ（ＰＩＧＦ）が存在する。ＶＥＧＦ−Ａは、血管透過性の増大及び細胞外マトリクスの変性に関係している。ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じるＶＥＧＦ−Ａの４つの異性体が、ヒトにおいて報告されている（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８４、ＶＥＧＦ２０６）（非特許文献１）。さらに、ＶＥＧＦ１１０が、ＶＥＧＦ１６５からプロテアーゼ切断によって生じる。ＶＥＧＦ−Ａは受容体ＶＥＧＦｒ−１及びＶＥＧＦｒ−２に結合する（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００３】
内皮細胞に対するＶＥＧＦの作用の特異性は、異常な血管成長及び血管漏出の過程において重要な役割を支えている。抗ＶＥＧＦ剤は、動物モデル及び臨床試験の両方で脈絡膜新生血管形成の低減における効能を実証済みである（非特許文献４；非特許文献５）。具体的には、抗ＶＥＧＦ抗体が眼内血管新生性障害の治療の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）に使用されてきた。
【０００４】
現在利用可能な抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブ及びラニビズマブである。ベバシズマブは、ＶＥＧＦの全てのアイソフォームを認識する完全長のヒト化型マウスモノクローナル抗体である。ラニビズマブは、ベバシズマブを作出するために使用されるヒト化型マウスモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントであり、かつベバシズマブよりも顕著に高い親和性でＶＥＧＦ−Ａに結合するように親和性成熟がなされている。ラニビズマブ及びベバシズマブは、まれな有害事象がベバシズマブでより多く生じるようであるものの、血管新生性の加齢黄斑変性症の治療において類似の効能プロファイルを有するようである（非特許文献６）。
【０００５】
別の部類のＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦ受容体の一部とヒト免疫グロブリンのＦｃ部分との融合タンパク質によって代表される。特に、Ｅｙｌｅａ（登録商標）という名前で市販されているアフリベルセプトは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ部分に融合したヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインに由来するＶＥＧＦ結合部分で構成されている、組換え融合タンパク質である。これは、滲出型黄斑変性症及びいくつかのさらなる眼疾患の治療用に承認されている。
【０００６】
医療目的では、安定な医薬組成物、特に使用前に溶解又は再構成を必要としない使用準備済の溶液は、大変興味深い。そのような液体組成物の主な問題は、製造中の繰り返される凍結／融解サイクルの間の不溶性粒子の形成に起因する活性成分の含量減少、又は長期保管の間のタンパク質の分解及び分解産物の形成である。
【０００７】
特許文献１は、ヒスチジン緩衝液、塩化ナトリウム、スクロース及びポリソルベート２０を含んでなる、皮下又は静脈内送達のためのアフリベルセプトの液体医薬製剤を開示している。
【０００８】
特に、硝子体内注射用の医薬組成物のような、眼に送達されるように意図された医薬組成物については、不溶性粒子の量を最少レベルに維持することが重要であるが、これは眼内に注射された時に粒子状物質が刺激や炎症を引き起こすかもしれないからである。
【０００９】
特許文献２及び特許文献３は、眼科的使用に適している、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗ＰＤＧＦアプタマーを含んでなる製剤を開示している。これらの製剤は、ｐＨ５．０〜８．０の緩衝液及び張度調整剤を含んでなる。
【００１０】
特許文献４は、リン酸ナトリウム緩衝液、塩化ナトリウム、スクロース及びポリソルベート２０を含んでなるアフリベルセプトの液体医薬組成物について述べており、この製剤は眼への使用に適している。
【００１１】
特許文献５は、緩衝液、非イオン系界面活性剤、及び任意選択で無機塩類を含んでなる、硝子体内注射のためのラニビズマブの液体医薬製剤であって、該組成物が糖類を含有しないものを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００６／１０４８５２Ａ２号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／１５７７０９Ａ１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１５／１８２６２３Ａ１号明細書
【特許文献４】国際公開第２００７／１４９３３４Ａ２号
【特許文献５】国際公開第２０１５／０７１３４８Ａ１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）及びデイビス  スマイス（Ｄａｖｉｓ  Ｓｍｙｔｈ）、エンドクライン・レビューズ（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ）、１９９７年、第１８巻、ｐ．１−２２
【非特許文献２】カイダニウク（Ｋａｊｄａｎｉｕｋ）ら、エンドクライノロギア・ポルスカ（Ｅｎｄｏｋｒｙｎｏｌ  Ｐｏｌ）、２０１１年、第６２巻、第５号、ｐ．４４４−５５
【非特許文献３】カイダニウク（Ｋａｊｄａｎｉｕｋ）ら、エンドクライノロギア・ポルスカ、２０１１年、第６２巻、第５号、ｐ．４５６−６４
【非特許文献４】オカモト（Ｏｋａｍｏｔｏ）ら、１９９７年、アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ）、第１５１巻、ｐ．２８１−９１
【非特許文献５】アダミス（Ａｄａｍｉｓ）ら、１９９６年、アーカイブス・オブ・オフタルモロジー（Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ）、第１１４巻、ｐ．６６−７１
【非特許文献６】ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）及びシャルマ（Ｓｈａｒｍａ）、カレント・オピニオン・イン・オフタルモロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ）、２０１３年、第２４巻、第３号、ｐ．２０５−１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、低いタンパク質凝集体含量を有し従って硝子体内注射に適しており、かつ液体形態で安定な医薬組成物が、依然として必要とされている。好ましくは、そのような組成物はＡＭＤの治療に適しており、かつ充填済みシリンジとして製剤化される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ヒスチジン緩衝液、非イオン系界面活性剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、無機塩類及び炭水化物を含んでなる液体組成物が、驚くほど低レベルの粒子状物質を有し、かつ従って硝子体内注射及び血管新生性の眼内疾患の治療に特に適している、ということを見出した。
【００１６】
本発明において使用される液体医薬組成物のさらなる利点は、該組成物が凍結乾燥のステップを必要とせず、よってより短時間かつ低費用で生産されるということである。別の利点は、該組成物が６．０〜６．５の範囲のｐＨ、すなわち生理的ｐＨに近いｐＨを有するということである。
【００１７】
本発明の目的は独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施形態は従属請求項から明白である。
従って、１つの実施形態では、本発明は、眼内血管新生性疾患の治療に使用するための液体医薬組成物であって、
ａ）ヒスチジン含有緩衝液と、
ｂ）非イオン系界面活性剤と、
ｃ）ＶＥＧＦアンタゴニストと、
ｄ）無機塩類と、
ｅ）炭水化物と
を含んでなる組成物を提供する。
【００１８】
組成物のｐＨは、６．０〜６．５、好ましくは６．２〜６．５であってよい。さらに好ましくは、ｐＨは６．２又は６．５である。
ヒスチジン含有緩衝液はＬ−ヒスチジン／塩酸ヒスチジンであってよく、かつ／又は、１ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭの濃度で存在することができる。
【００１９】
非イオン系界面活性剤はポリソルベート２０であってよく、かつ／又は、０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することができる。
無機塩類はＮａＣｌであってよく、かつ／又は、２０〜１００ｍＭ、好ましくは４０ｍＭの濃度で存在することができる。
【００２０】
ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体若しくはそのような抗体の抗原結合性フラグメント又はＶＥＧＦ受容体融合タンパク質であってよく、好ましくはアフリベルセプト又はラニビズマブであってよい。
【００２１】
ＶＥＧＦアンタゴニストは６〜４５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
炭水化物はスクロースであってよく、かつ／又は、３〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在することができる。
【００２２】
本発明はさらに、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、アフリベルセプト、スクロース及び水で構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有している、眼内血管新生性疾患の治療に使用される液体医薬組成物に関する。
【００２３】
本発明はさらに、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、アフリベルセプト、スクロース及び水で構成されており、かつ６．２のｐＨを有している、眼内血管新生性疾患の治療に使用される液体医薬組成物に関する。
【００２４】
本発明はさらに、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、アフリベルセプト、スクロース及び水で構成されており、かつ６．５のｐＨを有している、眼内血管新生性疾患の治療に使用される液体医薬組成物に関する。
【００２５】
好ましくは、液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有する。
【００２６】
同様に好ましくは、液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、６．２のｐＨを有する。
【００２７】
同様に好ましくは、液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、６．５のｐＨを有する。
【００２８】
本発明はさらに、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有している液体医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明はさらに、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．２のｐＨを有している液体医薬組成物に関する。
【００３０】
本発明はさらに、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．５のｐＨを有している液体医薬組成物に関する。
【００３１】
本発明はさらに、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、組換えタンパク質、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有している液体医薬組成物に関する。
【００３２】
本発明はさらに、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、組換えタンパク質、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．２のｐＨを有している液体医薬組成物に関する。
【００３３】
本発明はさらに、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％のポリソルベート２０（ｗ／ｖ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、組換えタンパク質、５％のスクロース及び水で構成されており、かつ６．５のｐＨを有している液体医薬組成物に関する。
【００３４】
眼内血管新生性疾患は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害、網膜静脈閉塞症（分枝ＲＶＯ若しくは中心ＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫による視力障害、又は病的近視に続発する脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）による視力障害であってよい。
【００３５】
本発明はさらに、本明細書中に定義されるような医薬組成物を含有する充填済みシリンジに関する。
本発明の典型的な実施形態について、以下の図面を参照して下記に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】様々な条件に供された試料Ｆ１〜Ｆ７を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子量種の検出を示す図。ａ）ストレス条件（３回の凍結／融解サイクル又は７日間の振盪）に供された試料の分析。
【図１ｂ】様々な条件に供された試料Ｆ１〜Ｆ７を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子量種の検出を示す図。ｂ）５℃で１か月又は３か月間保管された試料の分析。
【図１ｃ】様々な条件に供された試料Ｆ１〜Ｆ７を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子量種の検出を示す図。ｃ）２５℃／６０％相対湿度で２週間、１か月、２か月又は３か月間保管された試料の分析。
【図１ｄ】様々な条件に供された試料Ｆ１〜Ｆ７を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによる高分子量種の検出を示す図。ｄ）４０℃／７５％相対湿度で２週間、１か月、２か月又は３か月間保管された試料の分析。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、２５℃／６０％相対湿度又は４０℃／７５％相対湿度で３か月間の保管の後の試料Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５及びＦ７におけるタンパク質断片化の分析について示す図。
【図３】４０℃／７５％相対湿度で３か月間インキュベートされた試料Ｓ６及びＳ２の非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【図４】４０℃／７５％相対湿度で３か月間のインキュベーション後の表９に示された試料（ａ）〜（ｄ）の非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【図５】４０℃／７５％相対湿度で３か月間のインキュベーション後の表９に示された試料（ａ）〜（ｄ）の還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以降に例証として説明されるような本発明は、本明細書中で具体的には開示されていない任意の１又は複数の要素、１又は複数の限定が存在しない状態で、適切に実行可能である。
【００３８】
本発明は特定の実施形態に関して説明されることになるが、しかし本発明はそれに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
用語「〜を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本節の説明及び特許請求の範囲において使用される場合、該用語は他の要素を排除しない。本発明の目的上、用語「〜で構成されている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、用語「〜を含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。本明細書中以下において、群が少なくともある一定数の実施形態を含んでなるものと定義される場合、これは、それらの実施形態のみで構成されていることが好ましい群を、開示するようにも理解されることになっている。
【００３９】
本発明の目的上、用語「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」は、用語「入手可能である（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。本明細書中以下において、例えば細胞又は生物体が固有の方法によって入手可能であると定義される場合、これはその方法によって得られる細胞又は生物体を開示するようにも理解されることになっている。
【００４０】
単数名詞を指すときに、不定冠詞又は定冠詞、例えば「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」又は「その（ｔｈｅ）」が使用される場合、これは何か他のことが具体的に記述されないかぎりその名詞の複数形を含んでいる。
【００４１】
本明細書中で使用されるような用語「医薬組成物」は、化学物質又は活性成分を含んでなる任意の組成物であって、該組成物は疾患の医学的な療法、治療、又は予防において使用するためのものであり、かつ活性成分が有効であることを可能にするような形態である、組成物を指す。特に、医薬組成物は、該組成物が投与されることになっている対象者にとって許容しがたいほど有毒な添加剤を含有しない。医薬組成物は、滅菌状態である、すなわち無菌でありかつ全ての生きた微生物及びその胞子を含まない。本発明で使用される医薬組成物は液体でありかつ安定である。
【００４２】
「液体組成物」において、薬学的に活性な作用薬、例えばＶＥＧＦアンタゴニストは、保管後も安定で活性のある薬剤を保証するために、様々な添加剤と組み合わせることが可能である。本発明で使用される液体医薬組成物はどの時点においても凍結乾燥されない、すなわち生産方法は凍結乾燥ステップを含まず、かつ組成物は保管のために凍結乾燥されない。液体組成物は、バイアル、ＩＶバッグ、アンプル、カートリッジ、及び充填済み又は使用準備済のシリンジの中で保管可能である。
【００４３】
「安定な」液体組成物とは、その中に含有されるＶＥＧＦアンタゴニストがある一定期間にわたり保管されたときにその物理安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を本質的に保持しているものである。好ましくは、該組成物は、保管時にその物理的及び化学的安定性、並びにその生物学的活性を本質的に保持している。タンパク質の安定性を計測するための様々な分析技法が当分野において利用可能であり、かつ例えばビンセント・リー（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ）編「ペプチド及びタンパク薬物送達（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、ニューヨーク州ニューヨークのマルセル・デッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ）、Ｐｕｂｓ、１９９１年、ｐ．２４７−３０１、及びジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ）、１９９３年、第１０巻、ｐ．２９−９０において、論評されている。例えば、安定性は選択された時間の間選択された温度で計測可能である。安定性は、様々な異なる方法で、例えば凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用するもの、濁度の計測によるもの、及び／又は目視検査によるもの）、陽イオン交換クロマトグラフィー又はキャピラリーゾーン電気泳動を使用して電荷の不均一性を評価すること、アミノ末端又はカルボキシ末端配列分析、質量分光分析、凝集した分子又は断片化した分子を検出するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ペプチドマップ（例えば、トリプシン消化又はＬＹＳ−Ｃ）分析、アンタゴニストの生物学的活性又は結合を評価すること等により、定性的に及び／又は定量的に、評価することが可能である。
【００４４】
好ましくは、医薬組成物は約４０℃の温度で少なくとも１〜２週間安定である、及び／又は約５℃の温度で少なくとも３か月間安定である、及び／又は約２５℃の温度で少なくとも２週間又は１か月間安定である。さらに、該製剤は好ましくは、本明細書中実施例に記載されるような該製剤の凍結（例えば−２０℃まで）及び２５℃での融解の後、例えば１、２、３又は４サイクルの凍結融解の後に、安定である。
【００４５】
例えば、本発明で使用される医薬組成物において、サイズ排除クロマトグラフィーによって計測されるようなＶＥＧＦアンタゴニストの総量に対する高分子量種の割合（％）は、５℃で３か月間の該組成物の保管後に、４％以下、好ましくは３．５％又は３．２５％以下、より好ましくは３．０％又は２．７５％以下、及び最も好ましくは２．５％以下である。
【００４６】
「緩衝液」とは、弱酸及びその共役塩基、又はその逆のものの混合物で構成されている水溶液であって、そのｐＨの変化に抵抗しその結果としてｐＨをほぼ一定の値に維持する水溶液である。本発明の緩衝液は、約６．０〜約７．０、好ましくは約６．１〜約６．８、より好ましくは約６．０〜６．５、さらにより好ましくは約６．２〜６．５の範囲のｐＨを有することが好ましく、最も好ましくは約６．２又は６．５のｐＨを有する。
【００４７】
本発明で使用される緩衝液はヒスチジン含有緩衝液である。好ましくは、ヒスチジン含有緩衝液は本発明の液体製剤中に存在する唯一の緩衝液である。
「ヒスチジン含有緩衝液」及び「ヒスチジン緩衝液」という用語は本明細書中で互換的に使用されており、ヒスチジンを含んでなる緩衝液を指す。ヒスチジン緩衝液の例には、ヒスチジンクロリド、塩酸ヒスチジン、酢酸ヒスチジン、リン酸ヒスチジン及び硫酸ヒスチジンが含まれる。本発明の好ましいヒスチジン緩衝液はさらにＬ−ヒスチジンを含んでなる。さらにより好ましくは、本発明のヒスチジン緩衝液は塩酸ヒスチジンを含んでなり、最も好ましくは塩酸ヒスチジン及びＬ−ヒスチジンを含んでなる。好ましくは、ヒスチジン緩衝液又は塩酸ヒスチジン緩衝液若しくは塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン緩衝液は、約６．０〜約７．０、好ましくは約６．１〜約６．８、より好ましくは約６．０〜６．５、さらにより好ましくは約６．２〜６．５の範囲のｐＨを有し、最も好ましくは約６．２又は６．５のｐＨを有する。
【００４８】
特定の好ましい実施形態において、ヒスチジン含有緩衝液は、１ｍＭ〜４０ｍＭ、好ましくは２ｍＭ〜３５ｍＭ、より好ましくは３ｍＭ〜３０ｍＭ、さらにより好ましくは５ｍＭ〜２０ｍＭ、及び最も好ましくは８ｍＭ〜１５ｍＭの範囲の濃度で塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジンを含んでなる。
【００４９】
別の特定の好ましい実施形態では、緩衝液は１０ｍＭの濃度の塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジンである。
別の特定の好ましい実施形態では、緩衝液は、１０ｍＭの濃度であり６．２又は６．５のｐＨを有する塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジンである。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、炭水化物、好ましくはスクロース、及び無機塩類、好ましくは塩化ナトリウムを水に溶解した後に、非イオン系界面活性剤、好ましくはポリソルベート２０を添加し、次にＶＥＧＦアンタゴニストを添加することにより、調製されることが好ましい。
【００５１】
本明細書中で使用されるような「界面活性剤」は、両親媒性化合物、すなわち疎水基及び親水基の両方を含有する化合物であって２つの液体の間又は液体と固体との間の表面張力（若しくは界面張力）を低下させる化合物を指す。「非イオン系界面活性剤」はその頭部に荷電した基を有していない。抗体を含有する組成物の凍結／融解サイクル中の不溶性粒子の形成は、界面活性剤の添加によって著しく阻害することが可能である。「非イオン系界面活性剤」の例には、例えばポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、例えばオクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテルなど；ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル；グルコシドアルキルエーテル、例えばデシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシドなど；ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、例えばｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００など；ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、例えばノノキシノール９など；グリセロールアルキルエステル、例えばラウリン酸グリセリルなど；ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、例えばポリソルベートなど；ソルビタンアルキルエステル、例えばスパン（登録商標）など；コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド；ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのブロックコポリマー、例えばポロキサマーなど；並びにポリエトキシ化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）が挙げられる。本発明の医薬組成物はこれらの界面活性剤のうち１つ以上を組み合わせて含有することが可能である。
【００５２】
本発明の医薬組成物で使用される好ましい非イオン系界面活性剤は、ポリソルベート２０、４０、６０又は８０のようなポリソルベートであり、特にポリソルベート２０（すなわちＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）である。
【００５３】
非イオン系界面活性剤の濃度は、組成物の全体積に対して０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）の範囲内、好ましくは０．０１５〜０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲内、より好ましくは０．０２〜０．０４％（ｗ／ｖ）の範囲内にあり、最も好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）である。
【００５４】
好ましい実施形態において、非イオン系界面活性剤は、組成物の全体積に対して０．０１５〜０．０６％（ｗ／ｖ）の範囲内、より好ましくは０．０２〜０．０４％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度のポリソルベート２０であり、最も好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０である。
【００５５】
特に好ましい実施形態では、非イオン系界面活性剤は、組成物の全体積に対して０．０３％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０である。
本明細書中において、「無機塩類」は、浸透圧調節性を有するイオン化合物を指す。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）のような無機塩類は溶液中で解離してその成分イオンとなる、すなわちＮａＣｌは解離してＮａ＋及びＣｌ−イオンとなり、これらはいずれも溶液の浸透圧すなわちモル浸透圧濃度に影響する。本発明の医薬製剤において使用される好ましい無機塩類は、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム及び重炭酸ナトリウムである。好ましくは、無機塩類はナトリウム塩であり、より好ましくは塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。
【００５６】
本発明で使用される医薬組成物中の無機塩類の濃度は、好ましくは２０〜１００ｍＭの範囲内、より好ましくは２５〜８０ｍＭの範囲内にあり、さらにより好ましくは無機塩類は３０〜６０ｍＭ又は３５〜４５ｍＭの範囲内の濃度を有し、最も好ましくは濃度は４０ｍＭである。
【００５７】
特定の好ましい実施形態では、無機塩類は２０〜１００ｍＭの範囲内、より好ましくは２５〜８０ｍＭの範囲内の濃度のＮａＣｌであり、さらにより好ましくは無機塩類は３０〜６０ｍＭ又は３５〜４５ｍＭの範囲内の濃度を有し、最も好ましくは濃度は４０ｍＭである。
【００５８】
最も好ましい実施形態では、無機塩類は４０ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
さらなる実施形態では、医薬組成物は、無機塩類、好ましくはＮａＣｌを、好ましくは４０ｍＭの濃度で、ポリソルベート２０を０．０３％（ｗ／ｖ）の濃度で、スクロースを５％（ｗ／ｖ）の濃度で、並びに１０ｍＭの濃度及び６．５のｐＨの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン緩衝液、又は１０ｍＭの濃度及び６．２のｐＨの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン緩衝液を、含んでなる。
【００５９】
用語「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、ＶＥＧＦと特異的に相互作用し、かつその生物学的活性のうち１以上、例えばその細胞分裂促進活性、血管形成活性及び血管透過活性のうち少なくともいずれかを阻害する分子を指す。該用語は、抗ＶＥＧＦ抗体及び該抗体の抗原結合性フラグメント並びに非抗体ＶＥＧＦアンタゴニストの両方を含むように意図されている。
【００６０】
非抗体ＶＥＧＦアンタゴニストには、アフリベルセプト、ペガプタニブ及び抗体ミメティックが挙げられる。好ましくは、非抗体ＶＥＧＦアンタゴニストはアフリベルセプトである。現在Ｅｙｌｅａ（登録商標）という名称で市販されておりＶＥＧＦトラップとしても知られているアフリベルセプトは、ＶＥＧＦ受容体１の第２免疫グロブリン様ドメイン及びＶＥＧＦ受容体２の第３免疫グロブリン様ドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合している、組換えヒト可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質である（ホラシュ（Ｈｏｌａｓｈ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２００２年、第９９巻、第１７号、ｐ．１１３９３−１１３９８；国際公開第００／７５３１９Ａ１号）。アフリベルセプトのＣＡＳ番号は８６２１１１−３２−８である。同剤は、滲出型加齢黄斑変性症、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害及び糖尿病性の黄斑浮腫の患者における糖尿病性網膜症の治療について販売承認を受けている。現在の市販のアフリベルセプト製剤は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベート２０、スクロース及び注射用水を含有し、かつ４０ｍｇ／ｍｌの濃度で供給される。
【００６１】
Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）という名称で現在市販されているペガプタニブは、ＰＥＧ化された抗血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）アプタマーである（ベル（Ｂｅｌｌ）ら、イン・ビトロ・セルラー・アンド・ディベロプメンタル・バイオロジー−アニマル（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．）、１９９９年、第３５巻、第９号、ｐ．５３３−４２）。ＶＥＧＦアンタゴニストである抗体ミメティックには、ＶＥＧＦに結合してその受容体への結合を阻害するアンキリンリピートドメインを含んでなる結合タンパク質、例えばＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＭＰ０１１２が挙げられる（国際公開第２０１０／０６０７４８号及び国際公開第２０１１／１３５０６７号も参照されたい）。
【００６２】
用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、本明細書中では最も広い意味で使用され、かつ完全長の抗体、遺伝子操作された抗体、組換え抗体、多価抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び機能性を維持しかつ所望の生物学的活性を示す限りはそのような抗体のフラグメント、が挙げられる。抗体の「生物学的活性」とは、該抗体が抗原に結合し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで計測可能な生物学的応答を生じる能力を指す。
【００６３】
完全長の抗体は、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の抗原結合可変領域、軽鎖定常領域（ＣＬ）並びに重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでなる。
用語「抗体フラグメント」又は「抗原結合性フラグメント」は、本明細書中では最も広い意味で使用され、かつ完全長の抗体の一部分であって、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含んでなるものを、含んでなる。抗体フラグメントは、もとの免疫グロブリンの元の特異性を保持している。抗体フラグメントの例には、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状の抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。好ましくは、抗体フラグメントはＦａｂフラグメントである。
【００６４】
「モノクローナル抗体」とは、抗原の単一のエピトープに特異的な、すなわち抗原上の単一の決定基に対する、抗体である。モノクローナル抗体を生産する方法は当業者に既知である。
【００６５】
用語「組換え抗体」は、遺伝子組換え手段によって調製、発現、作出又は単離された全ての抗体、例えば遺伝子導入された宿主細胞（例えばＮＳ０若しくはＣＨＯ細胞）から、若しくは免疫グロブリン遺伝子に関して遺伝子導入された動物から単離された抗体、又は宿主細胞（例えばＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞）にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体から単離された抗体を指す。
【００６６】
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部分（ＣＤＲ）がマウスなどヒト以外の生物種に由来し、よってもとの免疫グロブリンとは異なる特異性を有している、ヒト抗体である。ＣＤＲタンパク質配列は、ヒトにおいて自然状態で生産される抗体バリアントとの類似性を高めるために改変されることが可能である。
【００６７】
用語「抗ＶＥＧＦ抗体」とは、ＶＥＧＦに特異的に結合してその生物学的活性のうち１以上、例えばＶＥＧＦの細胞分裂促進活性、血管形成活性及び血管透過活性のうち少なくともいずれかを阻害する、抗体又は抗体フラグメント、例えばＦａｂ若しくはｓｃＦＶフラグメントを指す。抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば、細胞の受容体へのＶＥＧＦの結合を妨害することにより、細胞の受容体へのＶＥＧＦ結合後の血管内皮細胞の活性化を妨害することにより、又は、ＶＥＧＦによって活性化された細胞を殺滅することにより、作用する。抗ＶＥＧＦ抗体には、例えば抗体Ａ４．６．１、ベバシズマブ、ラニビズマブ、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３、並びにその他の、例えば国際公開第９８／４５３３１号、米国特許出願公開第２００３／０１９０３１７号明細書、米国特許第６，５８２，９５９号明細書、米国特許第６，７０３，０２０号明細書、国際公開第９８／４５３３２号、国際公開第９６／３００４６号、国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号、欧州特許第０６６６８６８Ｂ１号、国際公開第２００９／１５５７２４号及びポプコフ（Ｐｏｐｋｏｖ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．）、２００４年、第２８８巻、ｐ．１４９−６４に記載されるようなものが挙げられる。好ましくは、本発明で使用される医薬組成物中に存在する抗ＶＥＧＦ抗体又はその抗原結合性フラグメントは、ラニビズマブ又はベバシズマブである。最も好ましくは、該抗体又はその抗原結合性フラグメントはラニビズマブ又はその抗原結合性フラグメントである。
【００６８】
「ラニビズマブ」は、国際公開第９８／４５３３１号の配列番号１１５及び１１６並びにチェン（Ｃｈｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１９９９年、第２９３巻、ｐ．８６５−８１に記載されているような、Ｙ０３１７の軽鎖及び重鎖可変ドメイン配列を有しているＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化モノクローナルＦａｂフラグメントである。ラニビズマブのＣＡＳ番号は３４７３９６−８２−１である。ラニビズマブは内皮細胞の増殖及び新生血管形成を阻害し、血管新生性の（滲出型）加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害の治療、網膜静脈閉塞症（分枝ＲＶＯ若しくは中心ＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫による視力障害の治療、又は病的近視に続発する脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）による視力障害の治療用に承認済みである。ラニビズマブはベバシズマブと関連がありベバシズマブと同じ親マウス抗体に由来するが親分子よりもはるかに小さく、かつＶＥＧＦ−Ａへのより強い結合を提供するように親和性成熟が施されている。ラニビズマブは、例えば国際公開第９８／４５３３１Ａ２号に記載されたようにして、大腸菌で組換え生産される。現在の市販のラニビズマブ製剤は、α，α−トレハロース二水和物、塩酸ヒスチジン一水和物、ヒスチジン、ポリソルベート２０及び注射用水を含有しており、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で供給される。
【００６９】
「ベバシズマブ」は、ＶＥＧＦの全てのアイソフォームを認識し、かつラニビズマブの親抗体である、完全長のヒト化型ネズミ科動物モノクローナル抗体である。ベバシズマブのＣＡＳ番号は２１６９７４−７５−３である。ベバシズマブは血管新生を阻害し、かつ目下様々な種類のがんの治療について承認されている。しかしながら、加齢黄斑変性症のような眼科疾患においても適応外使用で用いられる。現在の市販のベバシズマブ製剤は、α，α−トレハロース二水和物、リン酸ナトリウム、ポリソルベート２０及び注射用水を含有しており、２５ｍｇ／ｍｌの濃度の濃縮物として供給される。
【００７０】
１つの実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは製剤中の唯一の薬理活性物質である。代替実施形態では、製剤はＶＥＧＦアンタゴニストに加えて１以上の薬理活性物質を含有する。薬理活性物質は、対象者に投与された時に薬理学的な効果を及ぼすことができる。好ましくは、追加の薬理活性物質はＰＤＧＦアンタゴニスト又はＡｎｇ２アンタゴニストである。より好ましくは、ＰＤＧＦアンタゴニストはリヌクマブ（ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）のような抗ＰＤＧＦ抗体又はＦｏｖｉｓｔａ（登録商標）として市販されているＥ１００３０のようなアプタマーである。最も好ましくは、ＰＤＧＦアンタゴニストは、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９６年、第３５巻、ｐ．１４４１３；米国特許第６，２０７，８１６号明細書；米国特許第５，７３１，１４４号明細書；米国特許第５，７３１，４２４号明細書；及び米国特許第６，１２４，４４９号明細書に記載されているＥ１００３０である。同様により好ましくは、Ａｎｇ２抗体は抗Ａｎｇ２抗体であり、最も好ましくはネスバクマブである。
【００７１】
医薬組成物中のＶＥＧＦアンタゴニストの濃度は、典型的には５〜８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは７〜６０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは８〜５０ｍｇ／ｍｌ、及び最も好ましくは１０又は４０ｍｇ／ｍｌである。ＶＥＧＦアンタゴニストがアフリベルセプトならば、ＶＥＧＦアンタゴニストすなわちアフリベルセプトの濃度は好ましくは４０ｍｇ／ｍｌである。ＶＥＧＦアンタゴニストがラニビズマブならば、ＶＥＧＦアンタゴニストすなわちラニビズマブの濃度は好ましくは６又は１０ｍｇ／ｍｌである。
【００７２】
用語「炭水化物」は、炭素、水素、及び酸素のみを含んでなり、通常は２：１の水素：酸素原子比率でありかつ実験式Ｃｍ（Ｈ２Ｏ）ｎの有機化合物を指す。用語「炭水化物」には、単糖類、二糖類、オリゴ糖類及び多糖類が含まれる。炭水化物の例には、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボース、スクロース、マンノース、ラクトース、マルトース、トレハロース、でんぷん及びグリコーゲンが挙げられる。様々な他の形態の糖質が知られており、例えば糖アルコール、例えばグリセロール、マンニトール、ソルビトール、及びキシリトールなど；糖酸、例えばアスコルビン酸のようなアルドン酸、酒石酸のようなアルダル酸；還元糖、例えばグルコース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、ラクトース、及びマルトース；アミノ糖類、例えばＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、グルコサミン、及びシアル酸；又はスルホキノボース、グルコースのスルホン酸誘導体である。
【００７３】
本発明で使用される医薬組成物は、希釈剤、可溶化剤、等張化剤、添加剤、ｐＨ改変剤、無痛化剤、緩衝剤、硫黄含有還元剤、酸化防止剤又はその他同種のものをさらに含有しうる。本発明で使用される医薬組成物はＰＥＧ３３５０及び／又はグリシンを含有しない。
【００７４】
好ましくは、本発明で使用される医薬組成物は、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、スクロース、水及びアフリベルセプトを含有し、かつさらなる構成成分又は活性物質は含有しない、すなわち、該医薬組成物は、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、スクロース、水及びアフリベルセプトで構成されている。より好ましくは、本発明で使用される医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、水及び４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトで構成されている。
【００７５】
同じく好ましくは、本発明で使用される医薬組成物は、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、スクロース、水及びラニビズマブを含有し、かつさらなる構成成分又は活性物質は含有しない、すなわち、該医薬組成物は、塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、ポリソルベート２０、ＮａＣｌ、スクロース、水及びラニビズマブで構成されている。より好ましくは、本発明で使用される医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、水及び１０ｍｇ／ｍｌのラニビズマブで構成されている。
【００７６】
「眼内血管新生性疾患」とは眼内の新生血管形成を特徴とする疾患である。眼内血管新生性疾患の例には、例えば増殖性網膜症、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性及びその他虚血関連の網膜症、糖尿病性の黄斑浮腫、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼ヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、網膜静脈分枝閉塞症（ＢＲＶＯ）、角膜新生血管形成、並びに網膜新生血管形成が挙げられる。用語「加齢黄斑変性症」とは、通常は高齢者が罹患し、網膜の損傷により視野の中心（黄斑）における視力喪失を生じる医学的状態を指す。
【００７７】
本発明で使用される医薬組成物中に存在するＶＥＧＦアンタゴニストがアフリベルセプトである場合、該医薬組成物は好ましくは、血管新生性の（滲出型）加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（分枝ＲＶＯ若しくは中心ＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫による視力障害、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害又は近視性脈絡膜新生血管形成（近視性ＣＮＶ）による視力障害の治療に使用するためのものである。
【００７８】
本発明で使用される医薬組成物中に存在するＶＥＧＦアンタゴニストがラニビズマブである場合、該医薬組成物は好ましくは、血管新生性の（滲出型）加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害の、網膜静脈閉塞症（分枝ＲＶＯ若しくは中央ＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫による視力障害の、又は病的近視（ＰＭ）に続発する脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）による視力障害の、治療に使用するためのものである。
【００７９】
用語「硝子体内注射」は、物質が眼の中に直接注射される医薬組成物の投与を指す。より具体的には、物質は、ヒト及び他の脊椎動物の眼球のレンズと網膜との間の空間を満たす透明なゲルである硝子体液（硝子体又は単にガラス質とも呼ばれる）の中に注入される。
【００８０】
本発明の医薬組成物は、バイアル、アンプル若しくはシリンジのような規定の容積を有するか又はボトルのような大容積を有している、密封及び滅菌されたプラスチック、ガラス又はその他の適切なコンテナに入れて供給可能である。
【００８１】
ＶＥＧＦアンタゴニスト、好ましくはアフリベルセプト又はラニビズマブを含有する液体医薬組成物は、充填済みシリンジに入れて供給されることが好ましい。「使用準備済シリンジ（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ｓｙｒｉｎｇｅ）」又は「充填済みシリンジ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）」とは、充填された状態で供給されるシリンジである、すなわち投与される医薬組成物が既にシリンジの中にあって投与の準備ができている。充填済みシリンジには、別々に提供されるシリンジ及びバイアルと比較して、高い利便性、手頃な価格、正確性、滅菌状態、及び安全性など数多くの有益性がある。充填済みシリンジの使用は、投与量の正確さを高め、バイアルから薬剤を取り出す間に生じうる針刺し損傷の可能性を低下させ、投与量を計量済みとして薬剤の再構成及びシリンジ内への吸引のうち少なくともいずれか一方の必要性に起因する投薬過誤を低減し、かつ、シリンジの過剰充填を少なくして薬物の無駄を最小限にすることによる費用低減の助けになる。充填済みシリンジの外筒はガラス製又はプラスチック製であってよい。好ましくは、充填済みシリンジの外筒はプラスチック製であり、より好ましくは環状オレフィンポリマー製である。充填済みシリンジの外筒はシリコーンでコーティングされないことが好ましい。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明で使用される液体医薬組成物のｐＨは、約６．０〜約７．０、好ましくは約６．１〜約６．８、より好ましくは約６．０〜６．５、さらにより好ましくは約６．２〜６．５の範囲内にあり、最も好ましくは約６．２又は６．５のｐＨを有している。
【００８３】
本発明で使用される液体医薬組成物は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のような眼内血管新生性疾患の治療、糖尿病性の黄斑浮腫（ＤＭＥ）による視力障害の治療、網膜静脈閉塞症（分枝ＲＶＯ若しくは中心ＲＶＯ）に続発する黄斑浮腫による視力障害の治療、又は病的近視に続発する脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）による視力障害の治療に使用されることになる。
【００８４】
特に、本発明は、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される液体医薬組成物であって、ヒスチジン含有緩衝液、非イオン系界面活性剤、無機塩類、炭水化物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含んでなる組成物に関する。
【００８５】
本発明の１つの実施形態では、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、ヒスチジン含有緩衝液、非イオン系界面活性剤、無機塩類、炭水化物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含んでなる。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態において、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１ｍＭ〜４０ｍＭの濃度のヒスチジン含有緩衝液、０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度の非イオン系界面活性剤、２０〜１００ｍＭの濃度の無機塩類、３〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度の炭水化物及びＶＥＧＦアンタゴニストを含んでなる。
【００８７】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１ｍＭ〜４０ｍＭの濃度の塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０、２０〜１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、３〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及びアフリベルセプトを含んでなる。
【００８８】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及びアフリベルセプトを含んでなる。
【００８９】
本発明の別の好ましい実施形態では、眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトを含んでなる。
【００９０】
本発明の別の好ましい実施形態では、眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトで構成されている。
【００９１】
本発明の別の好ましい実施形態では、眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトで構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有する。
【００９２】
本発明の別の好ましい実施形態において、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１ｍＭ〜４０ｍＭの濃度の塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート２０、２０〜１００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、３〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度のスクロース及びラニビズマブを含んでなる。
【００９３】
本発明の別の好ましい実施形態では、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及びラニビズマブを含んでなる。
【００９４】
本発明の別の好ましい実施形態では、眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び６又は１０ｍｇ／ｍｌのラニビズマブを含んでなる。
【００９５】
本発明の別の好ましい実施形態では、眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び６又は１０ｍｇ／ｍｌのラニビズマブで構成されている。
【００９６】
本発明の別の好ましい実施形態では、眼内血管新生性疾患の治療に使用される硝子体内投与用の液体医薬組成物は、１０ｍＭの塩酸ヒスチジン／Ｌ−ヒスチジン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び６又は１０ｍｇ／ｍｌのラニビズマブで構成されており、かつ６．２又は６．５のｐＨを有する。
【００９７】
さらに、本発明は、ＡＭＤのような眼内血管新生性疾患を治療するための、本発明の液体医薬組成物の有効な量での対象者への硝子体内投与を包含する。好ましい実施形態では、硝子体内投与のための本発明の液体医薬組成物は充填済みシリンジ中に存在する。
【００９８】
本発明について、図面及び前述の説明において詳細に例証及び説明してきたが、そのような例証及び説明は事例的又は典型的なものであって限定的ではないとみなされるべきである。本発明は開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態についての他の変形形態は、特許請求の範囲に記載された発明を実行する際に当業者が、図面、開示内容及び従属請求項の検討から、理解及び達成することが可能である。
【００９９】
詳細な説明は、単に全くの典型例にすぎず、適用及び用途を限定するようには意図されない。以降の実施例は本発明をさらに例証するが、ただし本発明の範囲を該実施例に限定するものではない。当業者は本発明の説明に基づいて様々な変更及び改変を行なうことが可能であり、そのような変更及び改変も本発明に含まれている。
【実施例】
【０１００】
実施例１．１〜１．４は、以下の表１の７つの組成物を用いて実施された第１組の安定性試験に関する。実施例２．１〜２．６は、充填済みシリンジ中の表２に記載の試料２及び６の安定性試験の結果を示す。実施例３．１〜３．９は、表９の４つの組成物を用いて実施された第２組の安定性試験に関する。
【０１０１】
実施例１：第１組の安定性試験
［実施例１．１：試料の調製］
アフリベルセプトの様々な製剤を表１に従って調製した。
【０１０２】
【表１】
2019504882.tif 000002
【０１０３】
上記に列挙された医薬組成物はすべて４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトを含有していた。
医薬組成物はアフリベルセプトを含めずに調製し、アフリベルセプトは後に透析によって該組成物中に含めた。添加剤であるスクロース、可能性として塩化ナトリウム及び界面活性剤のポリソルベート２０を、表示された濃度の、緩衝作用を有する構成要素であるＬ−ヒスチジン及びＬ−塩酸ヒスチジン又はクエン酸三ナトリウム及びクエン酸にそれぞれ溶解した。緩衝液の塩基性成分及び酸性成分の比率により、６．２または６．５のｐＨがそれぞれもたらされた。浸透圧重量モル濃度はゴノテック（Ｇｏｎｏｔｅｃ）のＯｓｍｏｍａｔ（登録商標）０３０によって測定した。全ての製剤を、等張に達するように３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ±２０ｍＯｓｍ／ｋｇに調整した。
【０１０４】
透析の前に、透析チューブをＨ２Ｏで水和した。プールしたアフリベルセプトの透析は、分子量カットオフが１２ｋＤａ〜１４ｋＤａの再生セルロース膜によって６℃で一晩実施した。透析の後、アフリベルセプトの濃度をＭＷＣＯが５０ｋＤａの遠心濾過機Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）６により４０ｍｇ／ｍＬ±２ｍｇ／ｍＬに調整し、該アフリベルセプト製剤を、滅菌濾過し（０．２μｍのＰＶＤＦ膜シリンジフィルタ）、かつ予め滅菌された２ｍＬのＦＩＯＬＡＸ（登録商標）タイプＩガラスバイアル中に無菌的に充填した。
【０１０５】
［実施例１．２：試験条件］
最も安定した製剤を同定するために、試料を様々な条件に供した後に分析した。
一方の組の実験では、試料を様々なストレス条件に供した。これらのストレス条件はアフリベルセプトの化学的及び物理的な分解経路を強制的に進めるように選ばれており、次の条件すなわち：
ａ）振盪（試料を３００ｒｐｍで２５℃にて７日間振盪した）、及び
ｂ）凍結／融解（試料を±１℃／分の速さで３回凍結及び融解（２５℃〜−２０℃）し；各冷却／加熱ステップの後、温度（それぞれ２５℃及び−２０℃）を１０分間一定に保った）
を備えたものであった。
【０１０６】
別の組の実験では、試料を５℃の温度で１か月間若しくは３か月間、又は２５℃の温度及び６０％の相対湿度若しくは４０℃及び７５％の相対湿度で２週間、１か月間、２か月間若しくは３か月間、保管した。
【０１０７】
試料を上記に概説されるような様々な条件に供した後、部分標本を採取し、分析、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びサイズ排除クロマトグラフィーによる分析に供した。
【０１０８】
［実施例１．３：サイズ排除クロマトグラフィーによる分析］
サイズ排除クロマトグラフィーを、高分子量種（ＨＭＷＳ）すなわちアフリベルセプトの凝集体を検出するために使用した。
【０１０９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、様々な大きさの分子を分離するために多孔性粒子を使用する。同法は一般に、生体分子をその分子質量及び希釈溶液中での形状に従って分離するために使用される。固定相は調節された孔径の球状多孔性粒子で構成されており、該固定相を通って生体分子がその分子サイズの差に基づいて様々な程度に拡散する。小さな分子は細孔内まで自由に拡散し、カラムを通る該分子の移動に遅れが出る一方、大きな分子は細孔に入ることができず、従ってより早く溶出される。このように、分子は分子質量が減少する順に分離され、最も大きな分子が最初にカラムから溶出する。
【０１１０】
安定性プログラムの試料を、ＳＥＣの溶離液で終濃度０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＳＥＣの計測まで６℃でＨＰＬＣバイアル中に保管した。
サイズ排除クロマトグラフィーの条件は以下すなわち：
カラム：              ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬ
流量：                １．０ｍＬ／分、均一濃度溶離
カラム温度：          ２５℃
オートサンプラー温度：６℃
検出：                ＵＶ  ２１４ｎｍ／２８０ｎｍ
注入量：              ２０μＬ（ｃ＝０．５ｍｇ／ｍＬ）
溶離剤：              ０．０２Ｍリン酸ナトリウム＋０．８Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０
実行時間：            ２０分
とした。
【０１１１】
２１４ｎｍでの検出の結果を評価に使用した。主ピーク及び全ての他の信号対雑音比≧１０の試料特異的なピークを評価した。特定のピーク、例えば凝集分子種の面積を、Ｓ／Ｎ≧１０を備えた全ての試料特異的なピークの合計と比較し、相対比率を得た。
【０１１２】
この分析の結果は図１に示されている。２５℃又は４０℃で３か月間保管された場合、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン／塩酸ヒスチジン、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％のスクロース及び０．０３％のポリソルベート２０を含んでなり、かつそれぞれ６．２及び６．５のｐＨを有している製剤Ｆ３及びＦ５は、最も少ない量の高分子量種、すなわち凝集タンパク質を示した。特に、製剤Ｆ３及びＦ５における高分子量種の量は、市販のアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））製剤よりも低かった。このように、これらの製剤は市販のアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））製剤よりも安定していると考えることが可能である。
【０１１３】
［実施例１．４：ＳＤＳ  ＰＡＧＥ］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、表１の様々な製剤１〜７におけるアフリベルセプトの断片化及びオリゴマー化のような物理的変化を測定した。
【０１１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元条件下で実施した。試料を水で０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、さらに還元性のＳＤＳ試料用バッファーで０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。該試料を９５℃で５分間インキュベートした。試料ウェルを泳動用バッファーで洗浄してから試料（ｎ＝２）を投入した。泳動の実行後、ゲルを水で洗浄し、クマシーで一晩染色した。脱色の後、ゲルを走査してＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して分析した。
【０１１５】
泳動条件は以下すなわち：
電圧：      １２５Ｖ
電流：      ３５ｍＡ
電力：      ５Ｗ
時間：      １１０分
であった。
【０１１６】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果は図２に示されている。
２５℃又は４０℃で３か月間インキュベートされた全ての試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、アフリベルセプトの断片を表わすバンドを見ることができた。最も少ない量のフラグメントは、１０ｍＭのＬ−ヒスチジン／塩酸ヒスチジン、ｐＨ６．５、４０ｍＭのＮａＣｌ、５％のスクロース及び０．０３％のポリソルベート２０を含有する製剤Ｆ５について検出された。
【０１１７】
実施例２：充填済みシリンジ中のアフリベルセプト製剤の安定性
［実施例２．１：アフリベルセプト製剤を含有している充填済みシリンジの調製］
４０ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦアンタゴニストであるアフリベルセプト、及び１０ｍＭのヒスチジン緩衝液、４０ｍＭの塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含有している溶液（ｐＨ６．２）を１６５μｌ、表２に列挙したようなシリンジ中に充填した。
【０１１８】
【表２】
2019504882.tif 000003
【０１１９】
表２に列挙したシリンジを、５℃、２５℃／６０％相対湿度、及び４０℃／７５％相対湿度で、１か月間及び３か月間インキュベートした。
その後、試料を、タンパク質濃度についてはＵＶ−Ｖｉｓ法により、高分子量種（ＨＭＷＳ）の存在についてはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び非対称流フィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）により、断片及びＨＭＷＳの存在については非還元下硫酸ドデシルナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、メチオニン酸化及び脱アミド化の存在については還元型ペプチドマッピングにより、分析した。等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、アフリベルセプトの電荷バリアントを生じる化学修飾について試料を分析するために使用した。ｐＨについても全インキュベーション期間の範囲内でモニタリングした。
【０１２０】
安定性プログラム全体を通して、全ての試料においてタンパク質濃度（２８０ｎｍにおける分光学的定量；ｎ＝３）においてもｐＨ（ｎ＝２）においても同じように、有意な変化は検出されなかった。
【０１２１】
［実施例２．２：充填済みシリンジ中で保管されたアフリベルセプト製剤のＡＦ４分析］
非対称流フィールドフローフラクショネーション（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｆｌｏｗ  ｆｉｅｌｄ  ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）（ＡＦ４）は、アフリベルセプトの高分子量種をその大きさに基づいて同定及び定量する技法である。この分離は、チャネルを横切る液体の流れによって引き起こされた流動場における移動度（拡散係数）の違いによって得られる。濃度依存性の検出器としてのＭＡＬＳ（多角度光散乱）及びＵＶ（２８０ｎｍ）の組み合わせで、アフリベルセプト凝集体を特徴付けして定量することが可能である。
【０１２２】
２０μｇのアフリベルセプトを、１５．５ｃｍの分離チャネル１５．５ｃｍ（短チャネル）にＷ４９０分離スペーサ（いずれもワイアット・テクノロジー（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））及びＰＬＧＣ  １０ｋＤ  ＳＣ−５メンブレン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を組み合わせたものに装荷した。タンパク質を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．０２％のアジ化ナトリウムを使用して、分離時のクロスフロー及びフォーカスフローを表している表３に示した溶離条件に従って溶離させた（チャネルフロー：０．８ｍＬ／分）。
【０１２３】
溶出された分子種を波長２８０ｎｍで検出し、溶出分子種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロファイルは、凝集していないタンパク質を有する主ピークと、より高い分子量の形態のタンパク質を表わしているいくつかのさらなるタンパク質のピークとを示した。対応する分子量はＭＡＬＬＳ検出器で計算した。
【０１２４】
【表３】
2019504882.tif 000004
【０１２５】
表４は、４０℃／７５％相対湿度で１か月間及び３か月間インキュベートされた表２のシリンジについての、溶出された分子種の合計ピーク面積に対する高分子量種のピーク面積の割合（％）を示している。特に明記されないかぎり、各試料は２連の計測で検査された。全ての他の温度（５℃及び２５℃／６０％相対湿度）では、出発物質と比較して保管中に高分子量種の有意な増加は示されなかった。
【０１２６】
【表４】
2019504882.tif 000005
【０１２７】
ＡＦ４−ＭＡＬＳによって測定されたＨＭＷＳの生成は、４０℃／７５相対湿度で最大３か月間のインキュベーション中、２つのシリンジＳ２（ガラスシリンジ）及びＳ６（ＣＯＰ）の間で非常に類似していた。高分子量種の同一性及び温度依存的な反応速度論の両方が、この２つの一次包装システムの間で類似していた。
【０１２８】
［実施例２．３：充填済みシリンジ中で保管されたアフリベルセプト製剤のＳＥＣ分析］
シリンジのタンパク質試料を、アフリベルセプトの高分子量種を検出するためにＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー（Ｔｏｓｏｈ）、３００×７．８ｍｍ、５μｍ）カラムに装荷した。
【０１２９】
タンパク質は、２５℃にて１．０ｍＬ／分の流量で０．０２Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．８Ｍの塩化ナトリウムを使用して、均一濃度溶離によって溶出させた。溶出された分子種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を２１４ｎｍの波長で検出し、溶出分子種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶出プロファイルは、凝集していないタンパク質を有する主ピークと、より高い分子量の形態のタンパク質を表わしているいくつかのさらなるタンパク質のピークとを示した。全てのピークの面積を測定した。表５は、表２のシリンジについて、溶出された分子種の合計ピーク面積に対する凝集体のピーク面積の割合（％）を示す。各試料を２連の計測で検査した。
【０１３０】
【表５】
2019504882.tif 000006
【０１３１】
ＳＥＣによって測定されたＨＭＷＳの生成は、全てのインキューベーションパラメータ（温度、保管時間）にわたって、２つのシリンジＳ２（ガラスシリンジ）及びＳ６（ＣＯＰ）の間で非常に類似していた。高分子量種の同一性及び温度依存的な反応速度論の両方が、この２つの一次包装システムの間で類似していた。
【０１３２】
［実施例２．４：充填済みシリンジ中で保管されたアフリベルセプト製剤の非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析］
非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、表２による様々なシリンジシステム中でのアフリベルセプトの断片化及びオリゴマー化のような物理的変化を測定した。
【０１３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４〜１２％トリス−グリシンゲル中で非還元条件下にて実施した。試料を水で０．４ｍｇ／ｍｌに予備希釈し、さらにＳＤＳ試料用バッファーで０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。該試料を９５℃で５分間インキュベートした。
【０１３４】
泳動後、ゲルを１００ｍＬの脱イオン水で３回すすぎ、クマシーを用いて室温で一晩染色した。脱色の後、ゲルを走査してＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用して分析した。
【０１３５】
泳動条件は以下すなわち：
電圧：      １２５Ｖ
電流：      ３５ｍＡ
電力：      ５Ｗ
時間：      １３０分
とした。
【０１３６】
非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、上記に列挙されたすべての温度で３か月間インキュベートされた試料について実施した。５℃での試料の保管は、全ての一次包装システムにおいてバンド生成パターンの有意な変化をもたらさず、新しい不純物バンドの生成又は既存の不純物バンドの有意な増加は、インキュベーション期間全体にわたっていずれのシリンジ材料においても検出不可能であった。２５℃／６０％相対湿度での試料の保管は、より強い不純物バンドをもたらし、４０℃／７５％相対湿度で３か月インキュベートされた試料の非還元下ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果は図３に示されている。
【０１３７】
４０℃／７５相対湿度で３か月間インキュベートされた全ての試料の非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、アフリベルセプトの断片及び高分子量種を表わすバンドが見て明らかであった。３か月のインキュベーションの間の断片及びＨＭＷＳの生成は、反応速度論及び不純物の同一性において、表２に示された両方の一次包装システムで非常に類似していた。
【０１３８】
［実施例２．５：充填済みシリンジ中で保管されたアフリベルセプト製剤のＩＥＦ分析］
等電点電気泳動法（ＩＥＦ）は、例えば脱アミド化によるその等電点の違いに起因する、アフリベルセプトの様々なアイソフォームを分離する。使用準備済みＩＥＦゲル（セルバ（Ｓｅｒｖａ）のフォーカスゲル（Ｆｏｃｕｓ  Ｇｅｌ）（ｐＨ６−１１）、Ｎｏ．４３３２９．０１）は、ゲル内にｐＨ勾配を含有している。投入後、タンパク質はその総電荷によりｐＨ勾配の中を、該タンパク質の等電点（ＩＥＰ、ＩＰ）と等しいｐＨに達するまで移動する。
【０１３９】
アフリベルセプト試料を超純水で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。そのうち１０μｌ（５μｇのアフリベルセプトに相当）をフォーカスゲルに投入した。各試料を２連として分析した。泳動後、タンパク質を、１２％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸及び３．５％の５−スルホサリチル酸二水和物（ｗ／ｖ）を含有する溶液中で６０分間固定し、脱イオン水で３回すすぎ、クマシーを用いて室温で一晩染色した。２０％エタノールを用いた脱色の後、ゲルをバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）のＧＳ８００デンシトメータで走査して分析した。表６は電気泳動（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）条件を示す。
【０１４０】
【表６】
2019504882.tif 000007
【０１４１】
このＩＥＦでは、全ての温度で、１か月間の保管後に全ての一次包装システムにおいて、基準物と比較したアフリベルセプトのバンド生成パターンの変化は検出不可能であった。３か月後には、５℃及び２５℃／６０％でインキュベートされた試料のみが基準に適合し、出発物質と比較して変質を示さなかった。４０℃／７５％相対湿度でインキュベートされた試料は、全ての試験した一次包装材料中で類似した酸性の分子種へのシフトを示し、表２に示された異なる一次包装材料に関しては、違いはなかった。
【０１４２】
［実施例２．６：充填済みシリンジ中で保管されたアフリベルセプト製剤の還元型ペプチドマッピング分析］
還元型ペプチドマッピングにより、脱アミド化及びメチオニン酸化に関するアフリベルセプトの純度を、トリプシン消化及び質量分析に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ）の後に分析した。
【０１４３】
還元及びアルキル化の後、タンパク質を、トリプシンを用いる酵素的切断に供した。結果として生じるペプチドをＲＰ−ＵＰＬＣ（登録商標）−ＭＳによって分析した。クロマトグラフィーの間、移動相を極性のより高いもの（トリフルオロ酢酸を水に含めたもの）から極性のより低いもの（トリフルオロ酢酸をアセトニトリル中に含めたもの）へと変化させることによりペプチドを溶離させ、質量分析（Ｘｅｖｏ（登録商標）Ｇ２−ＸＳ  ＱＴＯＦ）によって分析した。ペプチドデータを処理し、酸化及び脱アミド化を検出するために理論上のタンパク質配列及び基準試料と比較した。
【０１４４】
表２に示されたシリンジについて、５℃、２５℃／６０％相対湿度及び４０℃／７５相対湿度で３か月間のインキュベーションの後に単回計測として分析し、出発物質ｔ０と比較した。
【０１４５】
試料を変性バッファー（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）で１．２５ｍｇ／ｍＬのアフリベルセプト濃度に希釈した。希釈した試料のうち８０μｌを１０μｌの０．５％ＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）製、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンに溶解）と混合し、９５℃で５分間インキュベートした。４．５μｌの０．０２Ｍ  ＤＴＴ（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンに溶解）を還元のために添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。アフリベルセプトの消化については、５μｌの１ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（５０ｍＭ酢酸に溶解）を添加し、３７℃でさらに３時間インキュベートした。この反応を、２０μｌの２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸及び３７℃で３０分間のインキュベーションにより停止させた。上清を、ペプチドの分析用に５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンで０．１２５ｍｇ／ｍＬに希釈した。
【０１４６】
［ＵＰＬＣのパラメータ］
シリンジ由来の消化されたタンパク質試料を、ウォーターズ製のアクイティ（ＡＣＱＵＩＴＹ）ＵＰＬＣ−ＣＳＨ（商標）Ｃ−１８カラム、１００ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍに装荷した。消化された試料０．２５μｇを、以下の表７に従った溶離剤Ａ（水）、溶離剤Ｂ（アセトニトリル）、溶離剤Ｃ（０．２５％トリフルオロ酢酸）及びＤ（ｎ−プロパノール）の勾配を用いて６５℃で溶離させた。
【０１４７】
【表７】
2019504882.tif 000008
【０１４８】
［質量分析用の方法パラメータ］
イオン化法：    ＥＳＩ              極性：              ポジティブ
分析器モード：  感度                実験タイプ：        ＭＳ
開始時質量：    ５０ｍ／ｚ          コーンガス流：      ３０Ｌ／ｈ
終了時質量：    ２０００ｍ／ｚ      脱溶媒和ガス流：    １０００Ｌ／ｈ
ソース温度：    １２０℃            走査時間：          ０．５ｓ
脱溶媒和温度：  ４５０℃            キャピラリー電圧：  ３．０ｋＶ
コーン電圧：    ３５Ｖ
［ＬｏｃｋＳｐｒａｙ（商標）のプロファイル］
基準化合物：        ロイシンエンケファリン
ＭＳロックマス：    ５５６．２７６６ｍ／ｚ
走査時間：          ０．５ｓ
間隔：              ３０ｓ
アフリベルセプト中の４つの酸化したメチオニン残基をペプチド中に同定することができたが（１：Ｔ１＿ＡＳ２０、１：Ｔ２２、１：Ｔ２８、１：Ｔ４８）、これらを全体の酸化の評価のためにまとめた（表８を参照）。アフリベルセプトの６つの脱アミド化部位をペプチド中に同定することができたが（１：Ｔ１０＿ＡＳ１２；１：Ｔ１１；１：Ｔ１０＿ＡＳ１２；１：Ｔ１２＿ＡＳ３；１：Ｔ１２＿ＡＳ３；１：Ｔ３０＿ＡＳ１２；１：Ｔ３０＿ＡＳ？；１：Ｔ３３＿ＡＳ１４）、これらを全体の脱アミド化の評価のためにまとめた（表８を参照）。
【０１４９】
【表８】
2019504882.tif 000009
【０１５０】
表２に示されたいずれのシリンジも、メチオニン酸化及び脱アミド化に関して同じ安定性を備えている。全ての温度条件において、メチオニン酸化の有意な増加はいずれのシリンジ材料（ガラス対ＣＯＰ）においても検出不可能であったが、脱アミド化の増加は温度依存的であった。いずれのシリンジシステムも、安定性プログラムにおいて脱アミド化の同等な増加を伴っていた。
【０１５１】
示された結果から、充填済みのプラスチック製シリンジ（シリンジ６）の中の本発明のアフリベルセプト製剤の安定性は、試験した条件下ではガラス製シリンジ（シリンジ２）の中の安定性と少なくとも同等であることが明白である。
【０１５２】
実施例３：第２組の安定度試験
［実施例３．１：試料調製］
ＥＵ市販品のＥｙｌｅａ（登録商標）由来のアフリベルセプトを、３ステップ透析により、３つの異なる製剤であって表９に示されるように（ａ）１０ｍＭヒスチジン／塩酸ヒスチジン、４０ｍＭ塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ６．２（ｂ）１０ｍＭヒスチジン／塩酸ヒスチジン、４０ｍＭ塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ６．５及び（ｃ）１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ６．２を含有している製剤中に移行させた。
【０１５３】
透析されたアフリベルセプトを４０ｍｇ／ｍＬ±１０％に調整し、ガラスバイアル中にて５℃、２５℃／６０％相対湿度及び４０℃／７５％相対湿度で最大３か月間保管した。加えて、様々な製剤中のアフリベルセプトに、５回の凍結／融解サイクルによってストレスをかけた。
【０１５４】
ＥＵ市販品のＥｙｌｅａ（登録商標）を、対照試料（ｄ）として安定性プログラムに含めた（表９を参照）。
【０１５５】
【表９】
2019504882.tif 000010
【０１５６】
その後、表９の試料を、タンパク質濃度についてはＵＶ−Ｖｉｓ法により、高分子量種（ＨＭＷＳ）の存在についてはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、断片及びＨＭＷＳの存在については還元／非還元下の硫酸ドデシルナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）より、分析した。メチオニン酸化及び脱アミド化のような化学修飾は、還元型ペプチドマッピングにより定量した。二次構造の変化はＦＴＩＲ分析によってモニタリングした。試料中のアフリベルセプトの活性は、力値測定ＥＬＩＳＡ（Ｐｏｔｅｎｃｙ  ＥＬＩＳＡ）により、またバイオレイヤー干渉法によるＦｃＲＮへの結合により、測定した。
【０１５７】
［実施例３．２：ＵＶ−Ｖｉｓ法］
安定性プログラム全体をとおして、タンパク質濃度（２８０ｎｍでの分光学的定量；ｎ＝３）及び外観（目に見える粒子状物質、変色）の著しい変化はいずれの試料においても検出されなかった。
【０１５８】
［実施例３．３：サイズ排除クロマトグラフィー］
安定性研究のタンパク質試料を、アフリベルセプトの高分子量種を検出するためにＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー、３００×７．８ｍｍ、５μｍ）カラムに装荷した。
【０１５９】
タンパク質を、０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）及び０．８Ｍ塩化ナトリウムを２５℃、流量１．０ｍＬ／分で使用して、均一濃度溶離によって溶離させた。溶出された分子種を２１４ｎｍの波長で検出し、溶出分子種の濃度対時間を示すグラフに表示した。溶離プロファイルは、凝集していないタンパク質を有する主ピークと、より高い分子量の形態のタンパク質を表わしているいくつかのさらなるタンパク質のピークとを示した。全てのピークの面積を測定した。表１０は、表９の試料について、溶出された分子種の合計ピーク面積に対する凝集体のピーク面積の割合（％）を示す。各試料を２連の計測で検査し、平均値及び標準偏差を算出した。
【０１６０】
【表１０】
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ＳＥＣにより測定されるようなＨＭＷＳの生成は、全てのインキュベーションパラメータ（温度、保管時間）について様々な製剤の間で同等であった。高分子量種の同一性及び温度依存的な反応速度論の両方が、様々な試料の間で同等であった。
【０１６１】
［実施例３．４：非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、各々の保管温度で３か月間保管された試料を用いて実施例２．４に記載の条件を使用して実施した。
【０１６２】
５℃又は２５℃／６０％相対湿度での試料の保管は、全ての製剤においてバンド生成パターンの著明な変化をもたらさなかった。特に、新しい不純物バンド又は既存の不純物バンドの有意な増加は、全インキュベーション期間にわたって表９に示した全ての試料で検出不可能であった。４０℃／７５％相対湿度での試料の保管は、より低い温度で保管された試料と比較してより強い不純物バンドをもたらした。４０℃／７５％相対湿度で３か月間インキュベートされた試料の非還元下ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果は、図４に示されている。全ての試料をゲル中の２連の計測として評価した。
【０１６３】
４０℃／７５％相対湿度で３か月間インキュベートされた全試料の非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では、アフリベルセプトの断片及び高分子量種を表わすバンドが見て明らかであった。３か月のインキュベーション中の断片及びＨＭＷＳの生成は、表９に示された全ての試験した製剤の間で、反応速度論及び不純物の同一性において同等であった。
【０１６４】
［実施例３．５：還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、表９の様々な製剤におけるアフリベルセプトの断片化及びオリゴマー化のような物理的変化を測定した。
【０１６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜１２％トリス−グリシンゲルにて還元条件下で実施した。試料を水で０．４ｍｇ／ｍｌに予備希釈し、ＤＴＴを含有するＳＤＳ試料用バッファーでさらに０．２ｍｇ／ｍｌに希釈した。該試料を９５℃で５分間インキュベートした。電気泳動後、ゲルを１００ｍＬの脱イオン水で３回すすぎ、クマシーを用いて室温で一晩染色した。脱色の後、ゲルを走査してＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェアを使用して分析した。
【０１６６】
泳動条件は以下のとおり、すなわち：
電圧：    １２５Ｖ
電流：    ３５ｍＡ
電力：    ５Ｗ
時間：    ２００分
とした。
【０１６７】
非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、各々の保管温度で３か月間保管された試料を用いて実施した。
５℃又は２５℃／６０％相対湿度での試料の保管は、全ての製剤においてバンド生成パターンの著明な変化をもたらさなかった。特に、新しい不純物バンドの生成又は既存の不純物バンドの有意な増加は、全インキュベーション期間にわたって表９に示した全ての試料で検出不可能であった。４０℃／７５％相対湿度での試料の保管は、より低い温度で保管された試料と比較してより強い不純物バンドをもたらした。これらの不純物バンドは、反応速度論及び不純物の同一性のいずれにおいても表９に示された全ての試験した製剤の間で同等であった。４０℃／７５％相対湿度で３か月間インキュベートされた試料の還元下ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果は図５に示されている。
【０１６８】
［実施例３．６：ＦＴＩＲ］
ＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）分光法は、タンパク質の二次構造についての情報を提供し、赤外線照射を用いた試料の励起及びタンパク質に吸収された波長の検出によって機能する。
【０１６９】
タンパク質はそれぞれ、その赤外線スペクトルに固有の一連の吸収帯を有している。タンパク質及びポリペプチドの赤外線スペクトルに見出される特性吸収帯には、アミドＩ及びアミドＩＩ領域が挙げられる。これらは、タンパク質主鎖においてアミノ酸を連結するペプチド結合から生じている。二次構造の構成要素であるαらせん及びβシートをモニタリングするために、アミドＩバンドをこのアッセイにおいて評価した。
【０１７０】
安定性研究からの試料を、そのアフリベルセプトを含まない対応する製剤（偽薬製剤）を用いて１０ｍｇ／ｍＬアフリベルセプトの濃度に希釈し、ミクロ・ビオリティクス（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃｓ）製のＡｑｕａＳｐｅｃ（商標）セルの中でブルカー・オプティクス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）製のＦＴＩＲ  Ｔｅｎｓｏｒ２７によって分析した。データ分析はＯｐｕｓ６．５ソフトウェア（ブルカー・オプティクス）を用いて実施した。１０回の計測を２．０μｌの注入量で実施し、二次微分スペクトルを１７００〜１６００ｃｍ−１のアミドＩ吸収領域において分析した。アフリベルセプトを含まない製剤の分析はバックグラウンドの計測値としての役割を果たし、その信号をタンパク質のスペクトルから差し引いた。
【０１７１】
ＦＴＩＲのためのデバイスの設定
分解能：                        ４ｃｍ−１
試料の走査時間：                ３０スキャン
バックグラウンドの走査時間：    ３０スキャン
結果のスペクトル：              吸収度
光源の設定：                    ＭＩＲ
ビームスプリッタ：              ＫＢｒ
検出器の設定：                  ＬＮ−ＭＣＴ光起電力型１２Ｈ
走査器速度：                    ２０ｋＨｚ
水バッチ（Water batch ）：      ２５℃
表９に示されたアフリベルセプト含有製剤のＦＴＩＲによる二次構造に関する分析からは、安定性プログラム全体を通して変質は明らかにならなかった。全ての試料が約１０％のαらせん及び４０％のβシートという同等の一定した割合（％）を示した。
【０１７２】
［実施例３．７：還元型ペプチドマッピング］
還元型ペプチドマッピングによって、アスパラギン脱アミド化及びメチオニン酸化に関するアフリベルセプトの純度を、様々な温度で３か月間保管されたか又は５回の凍結／融解サイクルに供された表９の全ての製剤について分析した。分析の条件は実施例２．６で使用されたものと同一とした。
【０１７３】
アフリベルセプト中の５つの酸化したメチオニンを同定することができたが（ＡＡ２０；ＡＡ１６３；ＡＡ１９２、ＡＡ２３７、ＡＡ４１３）、これらを全体のメチオニン酸化の評価のためにまとめた（表１１を参照）。５つのアスパラギンの脱アミド化を同定することができたが（ＡＡ８４；ＡＡ９１；ＡＡ９９；ＡＡ２７１；ＡＡ３００）、これらを全体の脱アミド化の評価のためにまとめた（表１１を参照）。
【０１７４】
【表１１】
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【０１７５】
表９に示された製剤は、メチオニン酸化及びアスパラギンの脱アミド化に関して同等の安定性を示した。全ての温度条件で、様々な製剤におけるメチオニン酸化のごく軽微な増加が検出されたが、脱アミド化の増加は著しく温度依存的であった。表９のアフリベルセプト含有製剤は全て、２５℃／６０％相対湿度又は４０℃／７５％相対湿度で３か月間保管されたときに脱アミド化の同程度の増加を示した。凍結／融解は、全ての試験した製剤においてメチオニン酸化及びアスパラギン脱アミド化のいずれに対する影響も示さなかった。
【０１７６】
［実施例３．８：相対的な力値］
アフリベルセプトの相対的な力値を、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）へのアフリベルセプトの結合に基づくＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって測定した。
【０１７７】
試験の試料は全て、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）（ＰＢＳ）ブロッキング・バッファー（サーモ・フィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎｏ．３７５３８）を用いて１．７ｐＭアフリベルセプトのアッセイ濃度に希釈し、ＶＥＧＦ−Ａ１６５（２．５ｎｇ／ｍＬのアッセイ濃度）と混合し、４℃で一晩インキュベートした。１００μｌの該試料を、抗ＶＥＧＦ抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートに移した。中和されていないＶＥＧＦは、マイクロタイターウェル内にコーティングされた抗ＶＥＧＦ抗体に結合し、その一方でアフリベルセプト／ＶＥＧＦの複合体はＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０を用いた３回の洗浄ステップ（各３００μｌ）によって除去された。マイクロタイタープレートを粘着性ホイルで密閉し、適度に振盪しながら室温で１５分間インキュベートした。追加の洗浄ステップ（３×３００μｌのＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０）の後、ＶＥＧＦの結合を、ビオチン化ポリクローナル抗ＶＥＧＦ１６５抗体の添加（２００μｇ／ｍＬ溶液を１００μｌ）、密閉、暗所でさらに１２０分間のインキュベーションにより検出し、そしてストレプトアビジン−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）コンジュゲートを使用して３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の酸化を介して視覚化した。比色定量反応は暗所で２０分のインキュベーション後に硫酸と共に適度に振盪することにより停止させ、吸収をマイクロタイタープレート用の蛍光読取り装置（テカン（Ｔｅｃａｎ）のＩｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００Ｐｒｏ）を用いて４５０ｎｍの波長で計測し、アフリベルセプト標準品と比較した。
【０１７８】
試験の試料は全て２連として分析した。
５℃及び２５℃／６０％相対湿度での３か月のインキュベーションの間、相対的な力値の有意な喪失は出発物質と比較した表９に示す全ての製剤において検出不可能であった。凍結／融解サイクルも、試験した製剤の各々においてアフリベルセプトの相対的な力値に影響を及ぼさなかった。４０℃／７５％相対湿度での３か月間のインキュベーションは、全ての製剤において相対的な力値の同程度の減少をもたらした。
【０１７９】
［実施例３．９：ＦｃＲＮへの結合］
安定性アッセイの際の、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と表９に示す製剤中のアフリベルセプトとの間の相互作用に関する、バイオレイヤー干渉法技術（ポール・フォルテバイオ（Ｐａｌｌ−ＦｏｒｔｅＢＩＯ）のＯｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６）を使用した速度論的パラメータ（ＫＤ、ｋｏｎ、ｋｄｉｓ）の評価は、同様の状況を示した。
【０１８０】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）は、生体分子相互作用を計測するための、標識を用いない技術である。同法は、２つの表面すなわちバイオセンサチップ上の固定化タンパク質の層及び内部基準層から反射された白色光の干渉縞を分析する光学的分析技法である。ニッケルでチャージされたトリス−ＮＴＡ（ポール・フォルテバイオのＮｏ．１８−５１０１）でコーティングされたＮｉ−ＮＴＡバイオセンサの表面に固定化されたＨＩＳタグ付き胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ、シノバイオロジカル社（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）のＮｏ．ＣＴ００９−Ｈ０８Ｈ）と、アフリベルセプトとの間の結合は、バイオセンサチップにおける光学的厚さの増大を引き起こし、これが波長シフトをもたらし、この波長シフトは、生物学的な層の厚さの変化の直接的尺度であり、かつ結合特異性並びに会合及び解離の速さを測定する能力を提供する。
【０１８１】
表９の試料を、５℃及び４０℃／７５％相対湿度で３か月のインキュベーションの後に分析し、出発物質と比較した。試料を、そのアフリベルセプトを含まない対応する製剤（偽薬製剤）を用いて１０ｍｇ／ｍＬアフリベルセプトに希釈し、速度論用バッファー（ＤＰＢＳ／０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０／０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）を用いてさらに０．７０４μｇ／ｍＬ、０．３５２μｇ／ｍＬ及び０．１７６μｇ／ｍＬアフリベルセプトに希釈した。Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサを２００μｌの速度論用バッファーで水和した。各ウェルを、以下の表１２のスキームに従って２００μｌの速度論用バッファー、リガンド溶液及び被検体溶液で満たした。
【０１８２】
【表１２】
2019504882.tif 000014
【０１８３】
行Ｄには、基準物としての役割を果たすように被検体の代わりに速度論用バッファーをピペットで注入した。
計測パラメータ：
＊プレート温度：３０℃
＊振盪速度：１０００ｒｐｍ
＊取得速度：標準的反応速度論（５．０Ｈｚ、２０で平均化）。
【０１８４】
試料の信号を表１３に従って記録した。
【０１８５】
【表１３】
2019504882.tif 000015
【０１８６】
データをＯｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアで分析して速度論的パラメータＫＤ、ｋｏｎ及びｋｄｉｓ値を得た。
【０１８７】
【表１４】
2019504882.tif 000016
【０１８８】
速度論的パラメータ（ＫＤ、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ）は、全ての製剤について５℃で３か月のインキュベーションの後も開始時の状態と同様であった。４０℃／７５％相対湿度で３か月間の試料の保管は、主として解離速度ｋｄｉｓの低下に起因するＫＤの低下をもたらした。この低下は表９の全ての試験した製剤について同程度であった。
【０１８９】
まとめると、５℃、２５℃／６０％相対湿度及び４０℃／７５％相対湿度で３か月間保管されるか又は凍結／融解サイクルで処理されたとき、表９に示された製剤の間の有意差は物理的及び化学的安定性のいずれに関しても検出不可能であり、さらに生物学的活性における傾向も製剤間に違いはなかった。示された結果から、本発明のヒスチジン系製剤（ａ及びｂ）におけるアフリベルセプトの安定性は、試験した条件下において、リン酸緩衝液を用いる製剤（ｃ）又はＥＵで市販されるＥｙｌｅａ（登録商標）の製剤中の安定性と、少なくとも同等である。
【図１ａ】
2019504882.tif 000017
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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