(57)【要約】  アミノ酸配列が例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されたアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ（１）と、乳酸連鎖球菌骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ（２）と、遠心し、沈殿したものを取るステップ（３）と、を含む口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法を提供し、当該精製と濃縮方法は、口蹄疫ウイルス不活化抗原を効率よく精製し、不純物を効率よく除去することができ、抗原回収効率が高く、濃縮率が高く、設備に求められる要件が低く、操作が簡単であり、コストが低い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ（１）と、
乳酸連鎖球菌骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ（２）と、
遠心し、沈殿したものを取るステップ（３）と、
を含むことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項２】
ステップ（１）におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が２０〜２５℃であり、インキュベート時間が４５分〜６０分である、ことを特徴とする請求項１に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項３】
ステップ（２）におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が２０〜２５℃であり、インキュベート時間が２５分〜３５分である、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項４】
１０８．７ＴＣＩＤ５０〜１０９．２ＴＣＩＤ５０の口蹄疫ウイルス不活化抗原に、４０〜６０μｇの割合でアダプタータンパク質を加える、ことを特徴とする請求項３に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項５】
１０８．７ＴＣＩＤ５０〜１０９．２ＴＣＩＤ５０の口蹄疫ウイルス不活化抗原に２．４×１０９〜２．６×１０９個の割合で精製担体を加える、ことを特徴とする請求項４に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項６】
前記アダプタータンパク質は、前記アダプタータンパク質をコードする遺伝子を担持する組換え菌を誘導発現して得られるものである、ことを特徴とする請求項５に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項７】
前記組換え菌は、発現担体ｐＥＴ３２におけるＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉの酵素切断点の間にアダプタータンパク質をコードする遺伝子を挿入し、次いで大腸菌を導入することにより得られる、ことを特徴とする請求項６に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項８】
前記組換え菌を３５〜３７℃で１〜２時間培養し、２４〜２６℃で２〜４時間培養し、１５〜１７℃で１０〜２０分静置し、次いで最終濃度が０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピルチオガラクトシドを加えて１５〜１７℃で１８〜２２時間誘導培養することにより、アダプタータンパク質を得る、ことを特徴とする請求項７に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項９】
前記乳酸連鎖球菌骨格は、乳酸連鎖球菌を塩酸で沸騰させ、洗浄して得えられたものである、ことを特徴とする請求項１に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法により得られた沈殿を含む、ことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に関し、具体的には、口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ−ｄｉｓｅａｓｅ，ＦＭＤ）は、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ−ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ，ＦＭＤＶ）による急性、熱性、高度な接触性感染症であり、主に、豚、牛、羊、駱駝などの偶蹄類動物が感染する。現在、Ｏ、Ａ、Ｃ、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３及びＡｓｉａ１の７つの血清型が発見され、各血清型の間に保護上の交差がないため、口蹄疫の防除の難易度が高くなっている。いったん発生すると、養殖業界に深刻な経済的損失を及ぼすことから、国際獣疫事務局（ＯＩＥ）に通報すべきウイルスとして取り上げられている。中国国内でも最も優先的に防除すべきＡ類ウイルスとされている。中国では、主に不活化ワクチンを接種する方法でこの病が抑制されている。中国では、口蹄疫ワクチンの生産がすでに大規模化されている。しかし、ほとんどの口蹄疫ワクチンが、いずれも粗製ワクチンであり、抗原含有量が低く、異種タンパク質（細胞タンパク質、ウシ血清タンパク質、非構造タンパク質及び内毒素）含有量が９５％以上であり、広い面積にわたって接種すると激しい副作用が生じるため、口蹄疫防除に影響を及ぼす。
【０００３】
ＦＭＤＶ不活化抗原ワクチンの製造過程における抗原含有量が足りず、純度が低いという問題に対し、現在、生産に用いられている大規模濃縮と精製方法には、膜ろ過精製技術に中空繊維濃縮技術などの物理的精製プロセスが加えられている。このようなプロセスは、ある程度抗原を濃縮し、一部のハイブリッドタンパク質を除去することで、ワクチン抗原の純度及び含有量を高めることが可能である。しかし、操作が複雑で、技術設備に求められる要件が高く、精製と濃縮コストが高く、且つ抗原回収率及び濃縮率が低く、抗原中のハイブリッドタンパク質の除去量が少ないなどの欠陥がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、口蹄疫ウイルス不活化抗原を効率よく精製し、不純物を効率よく除去でき、抗原回収効率が高く、濃縮率が高く、設備に求められる要件が低く、操作が簡単で、コストが低い口蹄疫不活化抗原の精製と濃縮方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の技術的解決手段により実現する。
【０００６】
口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法は、
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ（１）と、
乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｌａｃｔｉｓ）骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ（２）と、
遠心し、沈殿したものを取るステップ（３）と、を含むがそれに限定されない。
【０００７】
本発明において、ステップ（１）におけるインキュベート条件はインキュベート中に振とうし、インキュベート温度が２０〜２５℃であり、インキュベート時間が４５分〜６０分である。
【０００８】
本発明において、ステップ（２）におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が２０〜２５℃であり、インキュベート時間が２５分〜３５分である。
【０００９】
好ましい技術的解決手段においては、アダプタータンパク質を加える割合は、１０８．７ＴＣＩＤ５０〜１０９．２ＴＣＩＤ５０の口蹄疫ウイルス不活化抗原に、４０〜６０μｇであるがそれに限定されない。
【００１０】
好ましい技術的解決手段においては、精製担体を加える割合は、１０８．７ＴＣＩＤ５０〜１０９．２ＴＣＩＤ５０の口蹄疫ウイルス不活化抗原に２．４×１０９〜２．６×１０９個であるが、それに限定されない。
【００１１】
本発明において、前記アダプタータンパク質は、前記アダプタータンパク質をコードする遺伝子を担持する組換え菌を誘導発現して得られるものであるが、それに限定されない。
【００１２】
本発明において、前記組換え菌は、発現担体ｐＥＴ３２におけるＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉの酵素切断点の間にアダプタータンパク質をコードする遺伝子を挿入し、次いで大腸菌を導入することにより得られるが、それに限定されない。
【００１３】
本発明においては、前記組換え菌を３５〜３７℃で１〜２時間培養し、２４〜２６℃で２〜４時間培養し、１５〜１７℃で１０〜２０分静置し、次いで最終濃度が０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピルチオガラクトシドを加えて１５〜１７℃で１８〜２２時間誘導培養することにより、アダプタータンパク質を得る。
【００１４】
本発明において、前記乳酸連鎖球菌骨格は、乳酸連鎖球菌を塩酸で沸騰させ、洗浄して得られたものであるが、それに限定されない。
【００１５】
本発明は、上記方法で得られた沈殿を含むがそれに限定されない口蹄疫ウイルス不活化ワクチンをさらに提供する。
【発明の効果】
【００１６】
従来技術に対する本発明の有益な効果は以下になる。本発明の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法において、アダプタータンパク質が口蹄疫ウイルス不活化抗原及び乳酸連鎖球菌骨格に特異的に結合することができる。したがって簡単な遠心ステップによって沈殿の方式で濃縮された口蹄疫ウイルス不活化抗原を得ることができる。このため、本発明の方法は、口蹄疫ウイルス不活化抗原を効率よく精製し、不純物を効率よく除去することができ、抗原回収効率が高く、濃縮率が高く、設備に求められる要件が低く、操作が簡単であり、コストが低い。本発明の方法は、口蹄疫ウイルス不活化抗原の回収効率が９９％を超え、ハイブリッドタンパク質の除去効率が９０％を超えるため、得られる抗原は、保存しやすく、口蹄疫の多価ワクチンの調製を容易にする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】組換え発現プラスミドｐＥＴ−ＰＦＬ酵素切断の鑑定結果を示す図である。ここでＭはＤＮＡ標準分子量であり、泳動路１、２、３は組換えプラスミドｐＥＴ−ＰＦＬのＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉの二重酵素切断生成物である。
【図２】各条件下でアダプタータンパク質を誘導発現したＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果を示す図である。（Ａ）は実施例２の条件下でのタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動鑑定を示す図である。Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路１は誘導後のｐＥＴ／ＢＬ２１全菌であり、泳動路２は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌であり、泳動路３は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１溶解物上清であり、泳動路４が誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１溶解物沈殿である。（Ｂ）は実施例３条件下でのタンパク質発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動鑑定を示す図である。Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路１は誘導後のｐＥＴ／ＢＬ２１全菌であり、泳動路２は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌であり、泳動路３は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１溶解物沈殿であり、泳動路４が誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１溶解物上清である。
【図３】アダプタータンパク質のウエスタンブロットの鑑定結果を示す図である。Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路１は誘導後のｐＥＴ／ＢＬ２１全菌であり、泳動路２は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌であり、泳動路３は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１溶解物上清であり、泳動路４は誘導後のＰＦＬ／ＢＬ２１溶解物沈殿である。
【図４】アダプタータンパク質と精製担体との結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分解の鑑定結果を示す図である。Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路１は上清１であり、泳動路２は沈殿１であり、泳動路３は沈殿２であり、泳動路４は上清２である。
【図５】Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の鑑定結果を示す図である。（Ａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の鑑定結果を示す図である。泳動路１は上清３であり、Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路２は未精製のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原コントロールであり、泳動路３は沈殿３である。（Ｂ）はウエスタンブロットの鑑定結果を示す図である。泳動路１は沈殿３であり、Ｍが着色標準タンパク質分子量であり、泳動路２は上清３であり、泳動路３は未精製のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原コントロールである。
【図６】Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の鑑定結果を示す図である。（Ａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の鑑定結果を示す図である。ここで泳動路１は沈殿４であり、Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路２は上清４であり、泳動路３が未精製のＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原コントロールである。（Ｂ）はウエスタンブロットの鑑定結果を示す図である。泳動路１は沈殿４であり、Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路２は上清４であり、泳動路３は未精製のＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原コントロールである。
【図７】Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の鑑定結果を示す図である。（Ａ）はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の鑑定結果を示す図である。ここで泳動路１は未精製のＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原コントロールであり、Ｍは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路２は沈殿５であり、泳動路３は上清５である。（Ｂ）はウエスタンブロットの鑑定結果を示す図である。ここでＭは着色標準タンパク質分子量であり、泳動路１は沈殿５であり、泳動路２が上清５であり、泳動路３は未精製のＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原コントロールである。
【図８】Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化ワクチン免疫動物の２８日目の抗体レベルでのＥＬＩＳＡ遮断の検出結果を示す図である。
【図９】Ａ型ＦＭＤＶ不活化ワクチン抗原免疫動物の２８日目の抗体レベルでＥＬＩＳＡ遮断の検出結果を示す図である。
【図１０】Ｏ型ＦＭＤＶ不活化ワクチン免疫動物の２８日目の抗体レベルでＥＬＩＳＡ遮断の検出結果を示す図である。
【図１１】ＢＣＡタンパク質定量検出の結果を示す標準曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（実施例１）  組換え発現菌ＰＦＬ／ＢＬ２１の構築及び鑑定
アダプタータンパク質を設計した。アダプタータンパク質のアミノ酸の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す通りである。該アダプタータンパク質は２つの機能識別領域を含む融合タンパク質であり、口蹄疫ウイルス不活化抗原及び乳酸連鎖球菌骨格をそれぞれ特異的に識別することができる。該アダプタータンパク質をコードする遺伝子の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す通りである。アダプタータンパク質の鑑定を容易にするため、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す配列におけるカルボキシ基末端に６個のＨｉｓタグタンパク質（ＨＨＨＨＨＨ）を加える場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列における３’−末端終止コドンの前に、Ｈｉｓタグタンパク質をコードする遺伝子の配列を加えた後の配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す通りである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す５’−末端にＮｄｅ  Ｉ酵素切断部位、３’−末端にＸｈｏ  Ｉ酵素切断部位を設計し、金斯瑞社に送って合成した。合成した遺伝子断片をｐＵＣ５７担体に挿入し、組換えプラスミドｐＵＣ−ＰＦＬを得た。
【００１９】
制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉを採用して組換えプラスミドｐＵＣ−ＰＦＬ及び原核発現担体ｐＥＴ３２ａについて二重酵素切断を行った。酵素切断系は以下になる。
ｐＵＣ−ＰＦＬ及びｐＥＴ３２ａプラスミド二重酵素切断系（３０μＬ）：
１０×Ｑ．ｃｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ                              ３μＬ，
Ｑ．ｃｕｔ  Ｎｄｅ  Ｉ                                      １μＬ，
Ｑ．ｃｕｔ  Ｘｈｏ  Ｉ                                      １μＬ，
ｐＵＣ−ＰＦＬ又はｐＥＴ３２ａプラスミド                    ８μＬ，
ｄＨ２Ｏ                                体積を３０μＬまで補完する。
【００２０】
ここで、１０×Ｑ．ｃｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｑ．ｃｕｔ  Ｎｄｅ  Ｉ（品番１６２１）及びＱ．ｃｕｔ  Ｘｈｏ  Ｉ（品番１６３５）は大連宝生物有限会社から購入した。
【００２１】
二重酵素切断系を均一に混ぜた後に３７℃条件下で３０分反応させ、アガロースゲル電気泳動によりバンドを分離し、ゲルを切断し、ＡＸＹＧＥＮゲル回収キットの説明に従って、それぞれ目的断片ＰＦＬ及び担体断片ｐＥＴ３２ａを回収し、Ｔ４連結酵素により連結した。
【００２２】
Ｔ４連結酵素の連結系は以下になる（２５μＬ）。
１０×Ｔ４  ｌｉｇａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ                  ２．５μＬ，
目的断片ＰＦＬ                                            １２μＬ，
担体断片                                                    ３μＬ，
Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ                                  １μＬ，
ｄＨ２Ｏ                                体積を２５μＬまで補完する。
【００２３】
上記連結系を１６℃条件下に放置し、１２〜１６時間で連結し、連結生成物を得た。
【００２４】
上記連結生成物をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１感受性細胞に転換し、５０ｍｇ／ｍＬのアンモニアベンジルシロマイシンを含むＬＢ平板に塗布し、３７℃条件下で一晩静置培養した。単一のクローンを取って５０ｍｇ／ｍＬのアンモニアベンジルシロマイシンを含むＬＢ液体培地で一晩培養し、ＡＸＹＧＥＮプラスミド抽出キットの取扱説明に従って、プラスミドを抽出した。Ｑ．ｃｕｔ  Ｎｄｅ  Ｉ及びＱ．ｃｕｔ  Ｘｈｏ  Ｉ二重酵素切断で鑑定し、酵素切断生成物を電気泳動して図１を得た。図１から分かるように、陽性組換えプラスミドを二重酵素切断すると、大きさが５３８９ｂｐ及び９８１ｂｐの２本の目的バンドが得られた。鑑定に成功した陽性組換えプラスミドをｐＥＴ−ＰＦＬと称し、陽性組換え菌をＰＦＬ／ＢＬ２１と称する。同時に、ｐＥＴ３２ａプラスミド変換ＢＬ２１（ＤＥ３）のコントロールを行い、コントロール菌株ｐＥＴ／ＢＬ２１を得た。
【００２５】
（実施例２）  アダプタータンパク質の誘導発現１
１．組換え発現菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１誘導発現
（１）菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１及びコントロール菌株ｐＥＴ／ＢＬ２１の単一のクローンを取り、それぞれ５０ｍｇ／ｍＬのアンモニアベンジルシロマイシンを含むＬＢ液体培地を接種し、３７℃、２００ｒｐｍ条件下で一晩培養し、母液を得た。
【００２６】
（２）上記各菌株の母液を１：２００の割合で新鮮なＬＢ液体培地（５０ｍｇ／ｍＬのアンモニアベンジルシロマイシンを含む）に接種し、３５℃、１８０ｒｐｍ条件下で１時間培養し、２４℃、１８０ｒｐｍの条件下で２時間培養し、そして１５℃で１０分静置して培養物を得た。
【００２７】
（３）ステップ（２）で得られた培養物に最終濃度０．１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を加えて、誘導温度を１５℃、誘導培養時間を１８時間としてタンパク質誘導を行い、誘導した後の菌液を得た。
【００２８】
（実施例３）  アダプタータンパク質の誘導発現２
１．組換え発現菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１誘導発現
（１）菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１及びコントロール菌株ｐＥＴ／ＢＬ２１の単一のクローンを取り、それぞれ５０ｍｇ／ｍＬのアンモニアベンジルシロマイシンを含むＬＢ液体培地を接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で一晩培養し、母液を得た。
【００２９】
（２）上記各菌株の母液を１：２００の割合で新鮮なＬＢ液体培地（５０ｍｇ／ｍＬのアンモニアベンジルシロマイシンを含む）に接種し、３７℃、１８０ｒｐｍの条件下で２時間培養し、２５℃、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養し、そして１６℃で１５分静置して培養物を得た。
【００３０】
（３）ステップ（２）で得られた培養物に最終濃度０．２ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を加えて、誘導温度を１６℃、誘導培養時間を１８時間としてタンパク質誘導を行い、誘導した後の菌液を得た。
【００３１】
（実施例４）  アダプタータンパク質誘導発現解析
（１）上記実施例２及び実施例３において誘導した後の菌液をそれぞれ収集し、８０００ｇ、４℃条件下で１０分遠心し、菌体を得た。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜７．４、０．１ｍｏｌ／Ｌ）で菌体を２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させて菌体懸濁液を得た。
【００３２】
（２）菌体懸濁液を４℃条件下で、圧力８００ＭＰａの分解条件下で高圧分解を行い、３〜５サイクルで分解して菌体分液を得た。
【００３３】
（３）菌体分解液を４℃、１２０００ｒｐｍ条件下で１５分遠心し、分解液の上清及び沈殿をそれぞれ収集し、上清と等量のＰＢＳ緩衝液に沈殿を再懸濁させた。
【００３４】
以上、全ての操作は、いずれもクリーンな環境下で行い、温度１２１℃、圧力１０３．４Ｋｐａ、時間２０分の処理条件下で、使用される試薬、容器をいずれも高圧無菌処理し、高圧破砕には試薬無菌供給、サンプルポンプを用いた。
【００３５】
（４）２種類の発現条件下での組換え発現菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１の発現の様子を解析した。上記実施例２において誘導した後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌並びにその分解液の上清及び沈殿をそれぞれ８０μＬ取り、２０μＬの５×ＳＤＳタンパク質ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で１０分沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ鑑定を行った。ここで、誘導した後のｐＥＴ／ＢＬ２１全菌をコントロールとして、図２（Ａ）を得た。上記実施例３において誘導した後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌並びにその分解液の上清及び沈殿をそれぞれ８０μＬ取り、２０μＬの５×ＳＤＳタンパク質ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で１０分沸騰させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ鑑定を行った。ここで、誘導した後のｐＥＴ／ＢＬ２１全菌をコントロールとして、図２（Ｂ）を得た。図２（Ａ）及び図２（Ｂ）から分かるようにコントロール菌に比べ、誘導した後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌並びにその分解液の上清及び沈殿の泳動路は３６ＫＤにいずれも目的バンドが現われた。ここで、分解液上清における、可溶目的タンパク質量は総目的タンパク質の５０％〜６０％であり、２種類の発現条件下で、総タンパク質の含有量が若干異なっても、発現した目的タンパク質の含有量はほとんど一定であった。
【００３６】
本実施例に係る方法により組換え発現菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１を用いてアダプタータンパク質の発現を誘導する。発現を誘導した後の組換え菌を高圧分解し、分解液の上清を取れば、アダプタータンパク質溶液が得られる。
【００３７】
本実施例で得られた組換え発現菌株ＰＦＬ／ＢＬ２１は、連続３０回の継代誘導によって、タンパク質発現量が安定となり、繰り返し操作が可能である。
【００３８】
（実施例５）  アダプタータンパク質の発現鑑定
アダプタータンパク質を鑑定するために、そのカルボキシ基末端のＨｉｓタグタンパク質により、誘導した後のＰＦＬ／ＢＬ２１全菌並びにその分解液の上清及び沈殿を取ってウエスタンブロット鑑定を行った。ここで、誘導した後のｐＥＴ／ＢＬ２１全菌をコントロールとした。具体的には、各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果を硝酸セルロース膜上に転写し、そして５％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ封止緩衝液で室温にて転写フィルムを１時間封止し、ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、１：５０００倍希釈したマウス由来Ｈｉｓモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ社から購入し、品番はａｂ１５１４９である）と３７℃条件下で１時間インキュベートした。次に再びＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄し、３７℃条件下で１：１００００に希釈したヒツジ抗マウスＨＲＰ−ＩｇＧ２次抗体（ＫＰＬ社から購入た品番が５１０−０１８３であるホースラディッシュペルオキシダーゼ標識のヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体である）を４５分インキュベートし、インキュベートが終了した後、ＴＢＳＴ緩衝液で３回洗浄した。ＤＡＢ発色キットを用いて発色を行い、写真を撮って保存した。その結果、図３に示すように、誘導した後のＰＦＬ／ＢＬ２１分解液の上清の泳動路の３６ＫＤの位置に１本の明瞭なバンドが現われ、アダプタータンパク質の発現に成功したことが証明された。
【００３９】
Ｈｉｓ（ヒスチジン）タグタンパク質は、発明のタンパク質の鑑定を容易にするためであり、タンパク質の発現及びその機能の発揮には影響を与えない。実際の生産プロセスにおいては、ｐＥＴ３２ａにアダプタータンパク質をコードする遺伝子を挿入し、そしてＢＬ２１（ＤＥ３）内に導入し、陽性組換え菌を選別すれば、アダプタータンパク質の生産に用いることができる。
【００４０】
（実施例６）  アダプタータンパク質の定量解析
１．精製担体の調製
新鮮なＧＭ１７培地で、３０℃条件下で乳酸連鎖球菌ＩＬ１４０３（Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ  ＩＬ１４０３、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０．１１０１／ｇｒ．１６９７０１．）を静置培養した。培養時間は１６〜１８時間とした。培養液を８０００ｒｐｍ条件下で５分遠心し、菌体を収集し、ＰＢＳ緩衝液で沈殿を１回洗浄し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え、３０分沸騰させ、８０００ｒｐｍ条件下で５分遠心した。そしてＰＢＳ緩衝液で沈殿を３回洗浄し、最後にＰＢＳ緩衝液に再懸濁させ、乳酸連鎖球菌骨格、すなわち精製担体を得た。精製担体を血球板計数し、２．５×１０９個の精製担体を１単位とした。
【００４１】
２．タンパク質の解離
実施例２における方法に従ってアダプタータンパク質溶液を調製した。２ｍＬのアダプタータンパク質溶液（総タンパク質含有量は４．２ｍｇである）に、過剰の精製担体（１０×１０９個）を加え、３０分インキュベートすることにより、アダプタータンパク質を精製担体と完全に結合させた。９０００ｒｐｍで３分遠心し、上清１及び沈殿１を得た。沈殿１には精製担体及びそれとアダプタータンパク質との複合体が含まれる。沈殿１を４００μＬのＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。
【００４２】
沈殿１の再懸濁液に最終濃度１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、１００℃で１０分沸騰させ、アダプタータンパク質と精製担体とを解離させた。そして１２０００ｒｐｍで１０分遠心し、上清液２と沈殿２とを得た。沈殿２を上清２と同量のＰＢＳ緩衝液に再懸濁させた。
【００４３】
３．タンパク質解離の鑑定
アダプタータンパク質が精製担体と完全に解離しているか否かを解析するために、上清１、沈殿１、上清２及び沈殿２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で解析した。その結果、図４に示すように、解離した後、すべてのアダプタータンパク質が上清２（泳動路４）中にあった。
【００４４】
４．有効アダプタータンパク質含有量の測定
上清２における総タンパク質含有量をＢＣＡタンパク質定量キットで測定した。その結果は２ｍＬのアダプタータンパク質溶液（実施例２に記載の方法で調製した）におけるアダプタータンパク質の総量である。検出結果は表３に示す通りである。計算の結果から分かるように、１ミリリットルのＬＢ培地毎に最終的に約９０μｇのアダプタータンパク質が得られた。
【００４５】
使用の便宜上、アダプタータンパク質溶液中のアダプタータンパク質の濃度が５０μｇ／ｍＬになるように無菌ＰＢＳ緩衝液にて調製を行った。
【００４６】
表３はＢＣＡタンパク質定量の検出結果である。その標準曲線は図１１に示す通りである。
【００４７】
【表１】
2019518061.tif 000002
【００４８】
ここで、上清２におけるタンパク質含有量の平均値は４５２．６５μｇ／ｍＬであり、２ｍＬのアダプタータンパク質の総含有量は４５２．６５μｇ／ｍＬ×０．４ｍＬ＝１８１．０６μｇである。
【００４９】
（実施例７）  Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮
１．抗原調製
Ｏ型ＦＭＤＶをＢＨＫ細胞により増殖し、そして培養物を繰り返して凍結融解し、遠心により上清液を取り、不活化した後、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原を得た。抗原滴定濃度は１０８．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、１４６Ｓ含有量は５．６μｇ／ｍＬであり、総タンパク質濃度は７１６．４μｇ／ｍＬであった。
【００５０】
２．Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮
（１）無菌条件下で、アダプタータンパク質溶液（実施例４中の方法で調製した）におけるアダプタータンパク質濃度を５０μｇ／ｍＬに調整し、そして精製対象のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原に加えた。加える割合は滴定濃度１０８．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原５ｍＬ当たりに５０μｇのアダプタータンパク質とした。加えてから十分に混合した。
【００５１】
（２）上記混合物を２５℃で、回転数１５０ｒｐｍのシェーカーに入れ、５０分振とうさせながらインキュベートすることにより、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原をアダプタータンパク質と完全に結合させた。
【００５２】
（３）無菌条件下で、実施例６で調製した精製担体を加えた。加える割合は１０８．５ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原５ｍＬ当たりに２．５×１０９個の精製担体とした。加えてから十分に撹拌混合した。
【００５３】
（４）上記混合物を２５℃で、回転数１５０ｒｐｍのシェーカーに入れ、３０分振とうさせながらインキュベートすることにより、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原が結合されたアダプタータンパク質を精製担体と完全に結合させた。
【００５４】
（５）無菌条件下で、９０００ｒｐｍで５分遠心し、上清３及び沈殿３を得た。
【００５５】
沈殿３はＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体である。Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体はＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原、アダプタータンパク質及び乳酸連鎖球菌骨格の複合体である。Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体を形成する原理は、アダプタータンパク質がＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原及び乳酸連鎖球菌骨格と同時に特異的に結合できることにある。したがって、本実施例のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮方法による最終生成物は、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体、すなわち沈殿３である。
【００５６】
原ウイルス体積（約０．５ｍＬ）の０．１倍のＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む水溶液、ｐＨ８．０）に沈殿３を再懸濁させた。
【００５７】
精製中に、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原が完全に回収されるように、乳酸連鎖球菌骨格及びアダプタータンパク質は、いずれも過剰に加えた。したがって、本実施例における、精製と濃縮方法により得られたＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿３）にはさらに乳酸連鎖球菌骨格及びそれとアダプタータンパク質との複合体が少量含まれる。
【００５８】
以下、「Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体」はいずれも沈殿３を指す。
【００５９】
３．Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の鑑定
本実施例に係る方法によりＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の目的を達成したことを検証するために、本実施例で得られた上清３及び沈殿３についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びウエスタンブロット鑑定解析を行い、図５（Ａ）及び図５（Ｂ）を得た。
【００６０】
精製前のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原、沈殿３、上清３についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動鑑定を行い、図５（Ａ）を得た。且つ上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動結果についてＦＭＤＶ  Ｏ型ウイルス特異性ウエスタンブロット鑑定を行い、図５（Ｂ）を得た。ウエスタンブロットの具体的な操作ステップは以下の通りである。
【００６１】
（１）転写  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動終了後、湿式法によりＰＶＤＦ膜（ポリフッ化ビニリデン膜）にタンパク質を転写した。転写膜の条件は定電圧１００Ｖ、時間４５分である。
【００６２】
（２）封止  ５％脱脂乳を含むＴＢＳＴ緩衝液（ｐＨ８．０）でＰＶＤＦ膜を４℃条件下で一晩封止した。
【００６３】
（３）１次抗体とインキュベートし、上記ＰＶＤＦ膜を洗浄し、２％のＢＳＡを含むＴＢＳＴ溶液で１：４０に希釈したウシＦＭＤＶ  Ｏ型ウイルス高密度無血清（高密度無血清はＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原免疫ウシにより得られる）に浸し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００６４】
（４）洗浄し、ＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＢＳＴ緩衝液で１回当たり８分、４回濯いだ。
【００６５】
（５）２次抗体とインキュベートし、２％のＢＳＡを含むＴＢＳＴ溶液で希釈したＨＰＲ−抗ウシのヤギ２次抗体（ＫＰＬ社から購入し、品番は５２１０−０６１９のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の抗ウシのヤギＩｇＧ抗体であり、希釈度は１：４０００である）にＰＶＤＦ膜を浸し、３７℃で４５分インキュベートした。
【００６６】
（６）（４）と同様に洗浄し、ＤＡＢ発色キットで発色させた。
【００６７】
図５（Ａ）及び図５（Ｂ）の結果が示すように、精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットは上清３において抗原バンドが検出されなかった。抗原は主に沈殿３、すなわちＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体に濃縮されており、大きさが約２５ＫＤａであった。図に示すように、精製した後、ほとんどのハイブリッドタンパク質が除去され、抗原純度が著しく向上した。
【００６８】
４．Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の効率測定
（１）本実施例に係る方法によるウイルス不活化抗原を精製する効率を検出するために、ＦＭＤＶ  Ｏ型抗体でＥＬＩＳＡを遮断する検出キット（蘭州獣医研究所から提供された抗体コーティングプレート）によりＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原（本実施例の標題１）及び上清３中の抗原含有量を検出した。検出結果のデータによれば、上清３中の抗原残存量は２８（２５６）倍希釈されたＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原の抗原含有量を下回り、それは精製によって、上清３中のウイルス残存量が原ウイルス抗原含有量の１％より少なく、すなわち本実施例中の精製方法による抗原の回収効率が９９％を超えていることを示している。
【００６９】
（２）Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体中の抗原純度を解析するために、実施例３の標題２の方法を用いて沈殿３を解離し、且つ沈殿３から解離された上清及び未精製のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原（本実施例の標題１）に対しＢＣＡタンパク質定量キットを用いて総タンパク質含有量を測定した。測定の結果、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原中の総タンパク質含有量は７１６．４μｇ／ｍＬ×５ｍＬ＝３５８２μｇ、沈殿３から解離された上清中のタンパク質総含有量は４９０μｇ／ｍＬ×０．５ｍＬ＝２４５μｇであった。従って、ハイブリッドタンパク質除去率＝［１−（２４５／３５８２）］×１００％は、９０％を超えている。抗原回収効率＞９９％の計算によれば、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿３）中の１４６Ｓ含有量は約５．６μｇ／ｍＬ×５ｍＬ×９９％≒２８μｇであり、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体中の抗原純度＝（２８／２４５）×１００％であり、抗原純度＞１０％であった。
【００７０】
（実施例８）  Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮
Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原を精製と濃縮する方法は以下のステップを含む。
【００７１】
１．抗原調製
Ａ型ＦＭＤＶをＢＨＫ細胞で増殖させ、そして培養物を繰り返して凍結融解し、遠心により上清液を取り、不活化した後、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原を得た。抗原滴定濃度は１０８．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬで、１４６Ｓ含有量は５．２μｇ／ｍＬであり、総タンパク質濃度は６８０μｇ／ｍＬであった。
【００７２】
２．Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮
（１）無菌条件下で、アダプタータンパク質溶液（実施例４中の方法で調製した）におけるアダプタータンパク質濃度を５０μｇ／ｍＬに調整し、そして精製対象のＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原に加えた。加える割合は滴定濃度が１０８．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原５ｍＬ当たりに５０μｇのアダプタータンパク質とした。加えてから十分に混合した。
【００７３】
（２）上記混合物を２５℃で、回転数１５０ｒｐｍのシェーカーに入れ、５５分振とうさせながらインキュベートすることにより、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原をアダプタータンパク質と完全に結合させた。
【００７４】
（３）無菌条件下で、精製担体（実施例６で調製した）を加えた。加える割合は滴定濃度が１０８．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原５ｍＬ当たりに２．５×１０９個の精製担体とした。加えてから十分に撹拌混合した。
【００７５】
（４）上記混合物を２５℃で、回転数１５０ｒｐｍのシェーカーに入れ、３０分振とうさせながらインキュベートすることにより、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原のアダプタータンパク質を精製担体と完全に結合させた。
【００７６】
（５）無菌条件下で、９０００ｒｐｍで５分遠心し、上清４及び沈殿４を得た。
【００７７】
沈殿４はＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体である。原ウイルス体積（約０．５ｍＬ）の０．１倍のＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む水溶液、ｐＨ８．０）に再懸濁させた。Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体はＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原、アダプタータンパク質及び乳酸連鎖球菌骨格の複合体である。Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体を形成する原理は、アダプタータンパク質がＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原及び乳酸連鎖球菌骨格と同時に特異的に結合できることにある。したがって、本実施例のＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮方法による最終生成物は、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体、すなわち沈殿４である。
【００７８】
精製中に、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原が完全に回収されるように、乳酸連鎖球菌骨格及びアダプタータンパク質は、いずれも過剰に加えた。したがって、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿４）にはさらに乳酸連鎖球菌骨格及びそれとアダプタータンパク質との複合体が少量含まれる。
【００７９】
３．Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の鑑定
本実施例に係る方法によりＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の目的を達成したことを検証するために、精製前のＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原、本実施例の標題２で得られた上清４及び沈殿４に対しＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びウエスタンブロット鑑定解析を行い、図６（Ａ）及び図６（Ｂ）を得た。
【００８０】
ウエスタンブロットの操作ステップは実施例４と同様であり、相違点は１次抗体をＦＭＤＶ  Ａ型ウイルス高濃度無血清に変えたことである。ＦＭＤＶ  Ａ型抗原の高濃度無血清の調製方法は、ＦＭＤＶ  Ａ型不活化抗原免疫ウシのうち、抗体価が認められたウシから血液を採取して分離し、高濃度無血清を得た。
【００８１】
図６（Ａ）及び図６（Ｂ）に示すように、上清４ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにおいて抗原バンドが検出されず、抗原は主に沈殿４、すなわちＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体に濃縮されており、大きさが約２５ＫＤａであった。図に示すように、精製した後、ほとんどのハイブリッドタンパク質が除去され、抗原純度が著しく向上した。
【００８２】
４．Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の効率測定
（１）本実施例に係る方法によるウイルス不活化抗原を精製と濃縮する効率を検出するために、ＦＭＤＶ  Ａ型抗体でＥＬＩＳＡを遮断する検出キット（蘭州獣医研究所から提供された抗体コーティングプレート）によりＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原及び上清４中の抗原含有量を検出した。検出結果のデータによれば、上清４中の抗原残存量は２８（２５６）倍希釈されたＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原の抗原含有量を下回った。それは精製によって、上清４におけるウイルス残存量が原ウイルス抗原含有量の１％よりも少なくなったことを示す。すなわち本実施例の精製と濃縮方法による抗原の回収効率が９９％を超えていることが示された。
【００８３】
（２）Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体中の抗原純度を解析するために、実施例３の標題２の方法を用いて沈殿４を解離し、且つ沈殿４から解離された上清及び未精製のＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原に対しＢＣＡタンパク質定量キットを用いて総タンパク質含有量を測定した。その結果、未精製抗原の総タンパク質含有量が６８０μｇ／ｍＬ×５ｍＬ＝３４００μｇ、沈殿４のタンパク質総含有量が４５６μｇ／ｍＬ×０．５ｍＬ＝２２８μｇであった。従って、ハイブリッドタンパク質除去率＝［１−（２２８／３４００）］×１００％は、９０％を超えていた。抗原回収効率＞９９％の計算によれば、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿４）中の１４６Ｓ含有量は約５．２μｇ／ｍＬ×５ｍＬ＝２６μｇであり、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿４）中の抗原純度＝（２６／２２８）×１００％は、１０％を超えていた。
【００８４】
（実施例９）  Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮
１．抗原調製
ＦＭＤＶ  Ａｓｉａ１型ウイルスをＢＨＫ細胞で増殖し、そして培養物を繰り返して凍結融解し、遠心により上清液を取り、不活化した後、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原を得た。抗原滴定濃度は１０８．２ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、１４６Ｓ含有量は５．３μｇ／ｍＬであり、総タンパク質濃度は６５８μｇ／ｍＬであった。
【００８５】
２．Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮
（１）無菌条件下で、アダプタータンパク質溶液（実施例４中の方法で調製した）におけるアダプタータンパク質の濃度を５０μｇ／ｍＬに調整し、そして精製対象のＦＭＤＶ  Ａｓｉａ１型ウイルス不活化抗原に加えた。加えた割合は滴定濃度１０８．２ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原５ｍＬ当たりに５０μｇのアダプタータンパク質とした。加えてから十分に混合した。
【００８６】
（２）上記混合物を２５℃で、回転数１５０ｒｐｍのシェーカーに入れ、４５分振とうさせながらインキュベートすることにより、ＦＭＤＶ型ウイルス不活化抗原をアダプタータンパク質と結合させた。
【００８７】
（３）無菌条件下で、実施例６で調製した精製担体を加えた。加えた割合は滴定濃度１０８．２ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原５ｍＬ当たりに２．５×１０９個の精製担体とした。加えてから十分に撹拌混合した。
【００８８】
（４）上記混合物を２５℃で、回転数１５０ｒｐｍのシェーカーに入れ、３０分振とうさせながらインキュベートすることにより、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原が結合したアダプタータンパク質を精製担体と完全に結合させた。
【００８９】
（５）無菌条件下で、９０００ｒｐｍで５分遠心し、上清５及び沈殿５を得た。
【００９０】
沈殿５はＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体である。原ウイルス体積（０．５ｍＬ）の０．１倍のＴＥ緩衝液に再懸濁させた。Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体はＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原、アダプタータンパク質及び乳酸連鎖球菌骨格の複合体である。Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体を形成する原理は、アダプタータンパク質がＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原及び乳酸連鎖球菌骨格と同時に特異的に結合できることにある。したがって、本実施例のＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮方法による最終生成物は、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体、すなわち沈殿５である。
【００９１】
精製中に、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原が完全に回収されるように、乳酸連鎖球菌骨格及びアダプタータンパク質は、いずれも過剰に加えた。したがって、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿５）にはさらに乳酸連鎖球菌骨格及びそれとアダプタータンパク質との複合体が少量含まれる。
【００９２】
３．Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の鑑定
本実施例に係る方法によりＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の目的を達成したことを検証するために、上清５及び沈殿５に対しＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びウエスタンブロット鑑定解析を行い、図７（Ａ）及び図７（Ｂ）を得た。
【００９３】
ウエスタンブロットの操作ステップは実施例４と同様であり、相違点は１次抗体をウシＦＭＤＶ  Ａｓｉａ１型ウイルス高濃度無血清に変えたことである。ウシＦＭＤＶ  Ａｓｉａ１型抗原の高濃度無血清の調製方法では、ＦＭＤＶ  Ａｓｉａ１型不活化抗原ウシ免疫から、認定された抗体のウシ収集血液を取り、分離することで高濃度無血清が得られた。
【００９４】
図７（Ａ）及び図７（Ｂ）に示すように、上清５ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットの抗原バンドが検出されなかった。抗原は主に沈殿５、すなわちＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体に濃縮されており、大きさが約２５ＫＤａであった。図に示すように、精製した後、ほとんどのハイブリッドタンパク質が除去され、抗原純度が著しく向上した。
【００９５】
４．Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の精製と濃縮の効率測定
（１）本実施例に係る方法によるウイルス不活化抗原を精製する効率を検出するために、ＦＭＤＶ  Ａｓｉａ１型抗体でＥＬＩＳＡを遮断する検出キット（蘭州獣医研究所から提供された抗体コーティングプレート）によりＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原及び上清５中の抗原含有量を検出した。データ検出結果によれば、上清５中の抗原残存量は２７（１２８）倍希釈されたＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原の抗原含有量を下回った。それは精製した後、ウイルス残存量が原ウイルス抗原含有量の１％よりも少なくなったことを示す。従って抗原の回収効率が９９％を超えていることが示された。
【００９６】
（２）Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体中の抗原純度を解析するために、実施例３の標題２の方法を用いて沈殿５を解離し、且つ沈殿５から解離された上清及び未精製のＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原に対しＢＣＡタンパク質定量キットを用いて総タンパク質含有量を測定した。測定の結果、未精製抗原の総タンパク質含有量が６５８μｇ／ｍＬ×５ｍＬ＝３２９０μｇ、沈殿５のタンパク質総含有量が４１６μｇ／ｍＬ×０．５ｍＬ＝２０８μｇであった。従って、ハイブリッドタンパク質除去率＝［１−（２０８／３２９０）］×１００％は、９０％を超えていた。抗原回収効率＞９９％の計算によれば、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿５）中の１４６Ｓ含有量は約５．３μｇ／ｍＬ×５ｍＬ＝２６．５μｇであり、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（沈殿５）中の抗原純度＝（２６．５／２０８）×１００％は、１０％を超えていた。
【００９７】
（実施例１０）  ＦＭＤＶ精製と濃縮した不活化抗原の免疫効果の鑑定
ＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０）によりＡｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原（実施例９における標題１）、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（実施例９の標題２における沈殿５）の１４６Ｓ濃度をそれぞれ５．３μｇ／ｍＬに希釈した。実施例３で調製した精製担体の含有量を約５×１０８個とし、そして２０６アジュバント（フランスＳｅｅｐｉｃから購入）と体積比４６：５４で混合し、乳化することにより、Ａｓｉａ１型不活化ワクチン及びそのコントロールワクチンをそれぞれ得た。
【００９８】
ＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０）によりＡ型ＦＭＤＶ不活化抗原（実施例８の標題１）、Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（実施例８の標題２における沈殿４）の１４６Ｓ濃度をそれぞれ５．２μｇ／ｍＬに希釈した。実施例３で調製した精製担体の含有量を約５×１０８個とし、そして２０６アジュバント（フランスＳｅｅｐｉｃから購入）と体積比４６：５４で混合し、乳化することにより、Ａ型不活化ワクチン及びそのコントロールワクチンをそれぞれ得た。
【００９９】
ＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０）によりＯ型ＦＭＤＶ不活化抗原（実施例７の標題１）、Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体（実施例７の標題２における沈殿３）の１４６Ｓ濃度をそれぞれ５．６μｇ／ｍＬに希釈した。実施例６で調製した精製担体の含有量を約５×１０８個とし、そして２０６アジュバント（フランスＳｅｅｐｉｃから購入）と体積比４６：５４で混合し、乳化することにより、Ｏ型不活化ワクチン及びそのコントロールワクチンをそれぞれ得た。
【０１００】
実施例７の標題２中の方法に従ってアダプタータンパク質溶液と精製担体とを混合し、インキュベートし、ＦＭＤＶウイルス不活化抗原を加えないことの他、その他の条件を変えず、沈殿を取ってＴＥ緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０の水溶液）を希釈して実施例６で調製した精製担体を５×１０８個含有するようにした。そして２０６アジュバント（フランスＳｅｅｐｉｃから購入）と体積比４６：５４で混合し、乳化することにより、コントロールワクチン１を得た。
【０１０１】
コントロールワクチン２：１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む、ｐＨ８．０の水溶液。
【０１０２】
各ワクチンの番号及び含まれている抗原は表１の通りである。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
（１）免疫効果試験
４０〜４５日齢の口蹄疫抗体が陰性の健康な子豚８０頭を表２の方法に従ってランダムに８組に分け、頸部筋肉に注射する方式で免疫した。免疫線量は２ｍＬ／頭とし、各組の免疫のワクチンは表２に示す通りとした。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
免疫した後、２８日で採血し、血清を分離し、液相ブロック抗体のレベルを検出し、抗原複合体の免疫原性を評価した。図８、９、１０に示すように、コントロールワクチン１（Ｇ７組）とコントロールワクチン２（Ｇ８組）の免疫組の抗体レベルは陰性であった。それは精製中に導入した精製担体、アダプタータンパク質及びＴＥ緩衝液がワクチン抗体レベルに影響しないことを示している。３種類のＦＭＤＶサブ型ウイルスが精製された抗原複合体を免疫した後の抗体レベルは、未精製抗原から調製されたワクチンより顕著に高かった。ここで、Ａｓｉａ１型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体の免疫組（Ｇ１）は、そのコントロール組（Ｇ２）の平均抗体レベルよりも１滴定濃度が高かった。Ａ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体の免疫組（Ｇ３）は、そのコントロール組（Ｇ４）の平均抗体レベルよりも０．７滴定濃度が高かった。Ｏ型ＦＭＤＶ不活化抗原複合体の免疫組（Ｇ５）はそのコントロール組（Ｇ６）の平均抗体レベルよりも２滴定濃度が高かった。３種類のＦＭＤＶサブ型ウイルス不活化抗原複合体を免疫した後の抗体滴定濃度の上昇レベルは一致しなかった。抗原や生体免疫環境と関係あるかも知れないが、抗体の向上傾向全体には影響しなかった。それは、本発明の精製と濃縮方法で調製したＦＭＤＶウイルス不活化抗原複合体が、抗原純度が高く、免疫効果の良い単価又は多価の口蹄疫ワクチンの調製に使用可能であることを示している。
【０１０７】
（２）副反応試験
Ｇ１−Ｇ８組を免疫した後、直ちに体温、食、精神状態などを含め子豚の免疫ストレス反応を観察しながら記録し、且つ免疫した後の２８日内の子豚の成長状況（食、体重、毛など）を観察しながら記録した。その結果、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５、Ｇ７組とＧ８コントロール組は免疫した後、体温、食はいずれも正常であり、明らかな異常反応がなく、成長状況がよかった。Ｇ２、Ｇ４組は免疫した後、それぞれ１頭の子豚に０．５時間で興奮ストレスが現われ、Ｇ２組は１頭、Ｇ４、Ｇ６組はそれぞれ２頭に体温上昇、食量低下などのストレス反応が起こった。その結果として、Ｇ１、Ｇ３、Ｇ５組に免疫したワクチンは、そのＦＭＤＶ抗原複合体の純度が著しく向上しているため、ワクチンの免疫ストレス反応が著しく軽減されている。Ｇ７のコントロール組に免疫してから検出終了まで明らかな異常反応が起こらなかった。これは精製中に導入した精製担体とアダプタータンパク質が生体に被毒副作用を与えず、生体の正常な成長に影響しないことを示している。
【０１０８】
（付記）
（付記１）
アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアダプタータンパク質を口蹄疫ウイルス不活化抗原に加え、混合し、インキュベートするステップ（１）と、
乳酸連鎖球菌骨格である精製担体を加え、混合し、インキュベートするステップ（２）と、
遠心し、沈殿したものを取るステップ（３）と、
を含むことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１０９】
（付記２）
ステップ（１）におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が２０〜２５℃であり、インキュベート時間が４５分〜６０分である、ことを特徴とする付記１に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１０】
（付記３）
ステップ（２）におけるインキュベート条件は、インキュベート中に振とうし、インキュベート温度が２０〜２５℃であり、インキュベート時間が２５分〜３５分である、ことを特徴とする付記１又は２に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１１】
（付記４）
１０８．７ＴＣＩＤ５０〜１０９．２ＴＣＩＤ５０の口蹄疫ウイルス不活化抗原に、４０〜６０μｇの割合でアダプタータンパク質を加える、ことを特徴とする付記３に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１２】
（付記５）
１０８．７ＴＣＩＤ５０〜１０９．２ＴＣＩＤ５０の口蹄疫ウイルス不活化抗原に２．４×１０９〜２．６×１０９個の割合で精製担体を加える、ことを特徴とする付記４に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１３】
（付記６）
前記アダプタータンパク質は、前記アダプタータンパク質をコードする遺伝子を担持する組換え菌を誘導発現して得られるものである、ことを特徴とする付記５に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１４】
（付記７）
前記組換え菌は、発現担体ｐＥＴ３２におけるＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉの酵素切断点の間にアダプタータンパク質をコードする遺伝子を挿入し、次いで大腸菌を導入することにより得られる、ことを特徴とする付記６に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１５】
（付記８）
前記組換え菌を３５〜３７℃で１〜２時間培養し、２４〜２６℃で２〜４時間培養し、１５〜１７℃で１０〜２０分静置し、次いで最終濃度が０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピルチオガラクトシドを加えて１５〜１７℃で１８〜２２時間誘導培養することにより、アダプタータンパク質を得る、ことを特徴とする付記７に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１６】
（付記９）
前記乳酸連鎖球菌骨格は、乳酸連鎖球菌を塩酸で沸騰させ、洗浄して得えられたものである、ことを特徴とする付記１に記載の口蹄疫ウイルス不活化抗原の精製と濃縮方法。
【０１１７】
（付記１０）
付記１に記載の方法により得られた沈殿を含む、ことを特徴とする口蹄疫ウイルス不活化ワクチン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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