【手続補正書】
【提出日】令和3年11月30日(2021.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）前記（ａ）の組成物を、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の混合物を、好適な条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）前記残留ホルムアルデヒドの存在について前記混合物を分析するステップと、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記（ａ）の組成物が、アジュバントを含み、好ましくは、前記アジュバントが、水酸化アルミニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）が、５０部の前記（ａ）の組成物を、１部の１５〜２５％（ｖ／ｖ）リン酸、及び２．５部の０．９〜１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨと混合することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、１８〜３０℃の温度で、たとえば２２℃の温度で、好ましくは１０〜３０分間で、たとえば２０分間でインキュベートされる、請求項１から３までのいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、ＨＰＬＣによって、好ましくは逆相ＨＰＬＣによって分析され、かつ、任意に、水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）が、ＨＰＬＣにおける移動相として使用される、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスが、不活性化されたジカウイルスであり、好ましくは、前記不活性化されたジカウイルスが、ホルムアルデヒドで処理されており、その際、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５〜０．５であり、
より好ましくは、前記不活性化されたジカウイルスは、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで、２２℃で１０日間処理されている、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
不活性化されたジカウイルスを含み、かつ、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法により決定された、５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有する、薬学的組成物。
【請求項８】
請求項７に記載の薬学的組成物であって、
（ｉ）培養された昆虫細胞、たとえばＣ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間、たとえば３〜７日間インキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞、たとえばベロ細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間、たとえば３〜１４日間インキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップとを含む、
ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を測定するための方法によって決定された、１．０  ＴＣＩＤ５０未満の残留複製ウイルス含有量を含む、前記薬学的組成物。
【請求項９】
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞、好ましくは非ヒト細胞、たとえばベロ細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が、前記ジカウイルス調製物を生成するために使用され、前記ジカウイルス調製物を単離することが、
（ｉ）深層ろ過、
（ｉｉ）バッファー交換及び／または希釈、
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップを含む、前記単離することと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５〜０．５である、前記処理することと、ならびに
残留する未反応のホルムアルデヒドを除去し、かつ、不活性化の完全性を決定することとを含み、その際、不活性化されたジカウイルス調製物は、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法により測定された５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有する、前記方法。
【請求項１０】
前記ジカウイルス調製物が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌から、および／または臨床単離株から、および／またはジカウイルスクローン単離株、好ましくはプラーク精製により得られたジカウイルスクローン単離株から得られ、その際、プラーク精製の前には、任意に複数の細胞が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌を接種されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ジカウイルス調製物が、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ジカウイルス調製物が、８〜１２日間ホルムアルデヒドで処理され、好ましくは、前記ジカウイルス調製物が、１０日間ホルムアルデヒドで処理される、請求項９から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ジカウイルス調製物が、１５℃〜３０℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理され、好ましくは、前記ジカウイルス調製物が、２２℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、請求項９から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記不活性化の完全性の決定が、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間、たとえば３〜７日間インキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成することと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間、たとえば３〜１４日間インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することと、を含み、
前記昆虫細胞が、任意に、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択され、前記哺乳動物細胞が、任意に、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記残留する未反応のホルムアルデヒドを、ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するか、透析するか、バッファー交換するか、あるいはタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）することによって除去する、請求項９から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記不活性化されたジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ（ｃ）をさらに含む、請求項９から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ジカウイルス調製物が、アジュバントと混合され、好ましくは、
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート物、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択され、より好ましくは、
前記アジュバントが、アルミニウム塩、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ジカウイルス調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、前記アジュバントに吸着される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項９〜１８のいずれか１項に記載の方法により得られる不活性化されたジカウイルスを含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１から６までのいずれか１項の方法により測定される、５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有する、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の薬学的組成物であって、
（ｉ）培養された昆虫細胞、たとえばＣ６／３６細胞に、不活性化ステップに供されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間、たとえば３〜７日間インキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞、たとえばベロ細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間、たとえば３〜１４日間インキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップとを含む、
ジカウイルス調製物の不活性化の完全性を測定するための方法によって決定された、１．０  ＴＣＩＤ５０未満の残留複製ウイルス含有量を含む、前記薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
２．４  ロバスト性
試料中のホルムアルデヒドの濃度が、試料調製中の実験パラメータの変動によってどのように影響されるかを決定するために、方法のロバスト性を評価した。誘導体化有効性への影響を考慮して、ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度を、この研究において監視されるパラメータとして選択した。ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度をそれぞれ±０．１ｍｇ／ｍＬ及び±５％変化させることによって、効果を試験した。各条件下で、２つの開発製剤ロットにおいてホルムアルデヒドを判定し、表１５に示される結果は、ＤＮＰＨ及びリン酸濃度の変動が、ホルムアルデヒドの決定に有意な影響を有さなかったことを提案する。
【表１７】
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更に、本発明の考えられうる好適な態様を以下に示す。
（項目１）
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）試験管内で培養された１つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が、前記ジカウイルス調製物を生成するために使用され、前記ジカウイルス調製物を単離することが、
（ｉ）深層ろ過、
（ｉｉ）バッファー交換及び／または希釈、
（ｉｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーから選択される１つ以上のステップを含む、前記単離することと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５〜０．５である、前記処理することとを含む、前記方法。
（項目２）
前記細胞が、非ヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、ベロ細胞である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ジカウイルス調製物が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌から得られる、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目５）
前記ジカウイルス調製物が、臨床単離株から得られる、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目６）
前記ジカウイルス調製物が、ジカウイルスクローン単離株から得られる、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目７）
前記ジカウイルスクローン単離株が、プラーク精製により得られる、項目６に記載の方法。
（項目８）
プラーク精製の前に、複数の細胞が、ジカウイルスの異種集団を含む種菌を接種される、項目７に記載の方法。
（項目９）
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）臨床単離株からジカウイルス調製物を得ることと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５〜０．５である、前記処理することとを含む、前記方法。
（項目１０）
ジカウイルス調製物を不活性化する方法であって、
（ａ）ジカウイルスの異種集団を含む種菌からジカウイルス調製物を得ることと、
（ｂ）前記ジカウイルス調製物をホルムアルデヒドで処理することであって、％（ｗ／ｖ）で測定されたホルムアルデヒド濃度と、日数で測定されたホルムアルデヒドを伴うインキュベーションの期間との乗算の数値結果が、０．０２５〜０．５である、前記処理することとを含む、前記方法。
（項目１１）
前記ジカウイルス調製物が、０．００５％（ｗ／ｖ）〜０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度のホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１２）
前記ジカウイルス調製物が、８〜１２日間ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１３）
前記ジカウイルス調製物が、１０日間ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１４）
前記ジカウイルス調製物が、１５℃〜３０℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１５）
前記ジカウイルス調製物が、２２℃の温度で、ホルムアルデヒドで処理される、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１６）
不活性化の完全性を決定するステップ（ｃ）をさらに含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目１７）
ステップ（ｃ）が、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成することと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートすることと、
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定することと、を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記昆虫細胞が、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の期間が、３〜７日である、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記哺乳動物細胞が、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される、項目１７〜１９のいずれか１に記載の方法。
（項目２１）
前記第２の期間が、３〜１４日である、項目１７〜２０のいずれか１に記載の方法。
（項目２２）
ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ（ｄ）をさらに含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目２３）
前記ホルムアルデヒド処理されたジカウイルス調製物が、ホルムアルデヒド処理の少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、または少なくとも１４日後に中和される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記不活性化されたジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ（ｅ）をさらに含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目２５）
前記ジカウイルス調製物が、アジュバントと混合される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トル様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣体または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、乳剤、ビロソーム、コクリエート物、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）からなる群から選択される項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５などのアルミニウム塩である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記ジカウイルス調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が、前記アジュバントに吸着される、項目２５〜２７のいずれか１に記載の方法。
（項目２９）
前記ジカウイルスが、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含む、先行項目のいずれか１に記載の方法。
（項目３０）
前記変異が、配列番号１におけるＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ジカウイルスが、エンベロープタンパク質（Ｅ）に変異を含まない、項目２９または３０に記載の方法。
（項目３２）
前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号２の対応する配列と同じである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
項目１〜３２のいずれか１に記載の方法により得られる不活性化されたジカウイルスを含む、薬学的組成物。
（項目３４）
不活性化されたジカウイルスを含み、かつ５０μｇ／ｍｌ未満の残留ホルムアルデヒド含有量を有する、薬学的組成物。
（項目３５）
項目１〜３２のいずれか１に記載の方法により得られる、項目３４に記載の薬学的組成物。
（項目３６）
アルボウイルス調製物の不活性化の完全性を決定するための方法であって、
（ｉ）培養された昆虫細胞に、不活性化ステップに供されたアルボウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を最第１の期間でインキュベートし、それにより昆虫細胞上清を生成するステップと、
（ｉｉ）（ｉ）で生成された前記昆虫細胞上清を培養された哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間でインキュベートするステップと、
（ｉｉｉ）前記アルボウイルス調製物が、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むかを決定するステップと、を含む、前記方法。
（項目３７）
前記アルボウイルスが、フラビウイルスまたはアルファウイルスである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記アルボウイルスが、ジカウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、またはマヤロウイルスである、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記アルボウイルス調製物が、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、二成分エチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンを用いた処理に供された、項目３６〜３８のいずれか１に記載の方法。
（項目４０）
前記昆虫細胞が、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、項目３６〜３９のいずれか１に記載の方法。
（項目４１）
前記第１の期間が、３〜７日である、項目３６〜４０のいずれか１に記載の方法。
（項目４２）
前記哺乳動物細胞が、ベロ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載される寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ベロ細胞から選択される、項目３６〜４１のいずれか１に記載の方法。
（項目４３）
前記第２の期間が、３〜１４日である、項目３６〜４２のいずれか１に記載の方法。
（項目４４）
前記方法が、前記アルボウイルスの１．０  ＴＣＩＤ５０未満を検出することが可能である、項目３６〜４３のいずれか１に記載の方法。
（項目４５）
不活性化されたウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルムアルデヒド含有量を決定する方法であって、
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されているウイルスを含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）前記（ａ）の組成物を、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の混合物を、好適な条件下でインキュベートするステップと、
（ｄ）前記残留ホルムアルデヒドの存在について前記混合物を分析するステップと、を含む、前記方法。
（項目４６）
前記（ａ）の組成物が、アジュバントを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記アジュバントが、水酸化アルミニウムである、項目４６記載の方法。
（項目４８）
前記（ａ）の組成物が、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムをアジュバントとして含む、項目４５〜４７のいずれか１に記載の方法。
（項目４９）
ステップ（ｂ）が、５０部の前記（ａ）の組成物を、１部の１５〜２５％（ｖ／ｖ）リン酸、及び２．５部の０．９〜１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨと混合することを含む、項目４５〜４８のいずれか１に記載の方法。
（項目５０）
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、室温でインキュベートされる、項目４５〜４９のいずれか１に記載の方法。
（項目５１）
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、１０〜３０分間でインキュベートされる、項目４５〜５０のいずれか１に記載の方法。
（項目５２）
前記（ａ）の組成物と、リン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との前記混合物が、ＨＰＬＣによって分析される、項目４５〜５１のいずれか１に記載の方法。
（項目５３）
前記ＨＰＬＣが、逆相ＨＰＬＣである、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
水及びアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）が、ＨＰＬＣにおける移動相として使用される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ウイルスが、不活性化されたジカウイルスである、項目４５〜５４のいずれか１に記載の方法。
（項目５６）
前記不活性化されたジカウイルスが、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで、２２℃で１０日間処理されている、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ジカウイルスが、配列番号１の９８位に、または配列番号１の９８位に対応する位置に変異を含み、例えば、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異などである、項目５５または５６に記載の方法。