(57)【要約】  本発明は、タウに対する抗体を提供する。この抗体は、タウ関連症状およびタウに関連する病状悪化を抑制するか、または遅延させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２２と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項２】
配列番号１５の３つのカバットＣＤＲおよび配列番号２２の３つのカバットＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１の少なくとも１つが、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦによって占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも２つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも３つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３が、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２２と少なくとも９５％同一である成熟軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１５および２２由来のそれぞれ前記成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける何らかの違いが、位置Ｈ６０〜Ｈ６５中に存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５と命名されたアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号２１、２２、または２３と命名されたアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５と命名されたアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が配列番号２２と命名されたアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合され、前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されている、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
前記重鎖定常領域が、天然のヒト定常領域と比較して、Ｆｃγ受容体への結合が低減した前記天然のヒト定常領域の変異型である、請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプ、場合により配列番号２９であるが、但し、Ｃ末端リシンがなくてもよく、前記軽鎖定常領域がカッパ、好ましくは配列番号３２であるという条件の場合である、請求項１１または１２のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされている、請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体がＦａｂフラグメントである、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１〜１５に記載の抗体の前記重鎖および／または軽鎖をコードする核酸。
【請求項１７】
アルツハイマー病を処置または予防する方法であって、請求項１〜１５のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、アルツハイマー病の処置または予防をすることを含む方法。
【請求項１８】
前記患者がＡｐｏＥ４保因者である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タウに関連する疾患を処置または予防する方法であって、請求項１〜１５のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、前記疾患の処置または予防をすることを含む方法。
【請求項２０】
前記疾患が神経疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タウの異常伝播を減らす方法であって、請求項１〜１５のいずれか定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの伝播を減らすことを含む方法。
【請求項２２】
タウの食作用を誘導する方法であって、請求項１〜１５のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの食作用を誘導することを含む方法。
【請求項２３】
前記疾患が神経疾患である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
タウの凝集または沈着を抑制する方法であって、請求項１〜１５のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの凝集または沈着を抑制することを含む方法。
【請求項２５】
前記疾患が神経疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
タウの濃縮体の形成を抑制する方法であって、請求項１〜１５のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与することを含む方法。
【請求項２７】
前記疾患が神経疾患である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
配列番号１５の配列を有する重鎖可変領域をコードするセグメントを含む核酸。
【請求項２９】
ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントをさらに含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
前記ＩｇＧ１定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ１定常領域が配列番号２９の配列を有するが、Ｃ末端リシンがなくてもよいことが前提である、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
前記ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントが、配列番号３０のヌクレオチド配列を有する、請求項３１に記載の核酸。
【請求項３３】
前記重鎖可変領域および前記ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントを連結するイントロンをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれかに記載の核酸。
【請求項３４】
前記ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントが、配列番号３１のヌクレオチド配列を有する、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
配列番号１５の前記重鎖可変領域および／または配列番号２１、２２または２３の前記軽鎖可変領域をコードする核酸（単一または複数）。
【請求項３６】
配列番号３５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号３６または配列番号３９と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域を含む抗体であって、位置Ｈ１がＥであり、および／または位置Ｌ９がＳであることが前提条件である抗体。
【請求項３７】
配列番号１５の３つのカバットＣＤＲおよび配列番号２２の３つのカバットＣＤＲを含む、請求項３６に記載の抗体。
【請求項３８】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１の少なくとも１つが、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦによって占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項３６または３７に記載の抗体。
【請求項３９】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも２つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも３つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３が、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３が、それぞれＤ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
位置Ｈ１がＥにより占められる、請求項３６〜４２のいずれかに記載の抗体。
【請求項４４】
位置Ｌ９がＳにより占められる、請求項３６〜４３のいずれかに記載の抗体。
【請求項４５】
配列番号３５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号３６または配列番号３９と少なくとも９５％同一である成熟軽鎖可変領域を含む、請求項３６〜４４のいずれかに記載の抗体。
【請求項４６】
前記成熟重鎖可変領域が重鎖定常領域に融合され、前記成熟軽鎖可変領域が軽鎖定常領域に融合されている、請求項３６〜４５のいずれかに記載の抗体。
【請求項４７】
前記重鎖定常領域が、天然のヒト定常領域と比較してＦｃγ受容体への結合が低減した前記天然のヒト定常領域の変異型である、請求項３６〜４６のいずれかに記載の抗体。
【請求項４８】
前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１アイソタイプ、場合により配列番号２０であり、前記軽鎖定常領域がカッパ軽鎖、好ましくは配列番号３２である、請求項３６〜４７のいずれかに記載の抗体。
【請求項４９】
配列番号１５および２２由来のそれぞれ前記成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲにおける何らかの違いが、位置Ｈ６０〜Ｈ６５中に存在する、請求項３６〜４８のいずれかに記載の抗体。
【請求項５０】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号３５と命名されたアミノ酸配列を有し、前記成熟軽鎖可変領域が、配列番号３６と命名されたアミノ酸配列を有する、請求項３６〜４９のいずれかに記載の抗体。
【請求項５１】
前記抗体が、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートされている、請求項３６〜５０のいずれかに記載の抗体。
【請求項５２】
前記抗体がＦａｂフラグメントである、請求項３６〜５１のいずれかに記載の抗体。
【請求項５３】
請求項３６〜４９に記載の抗体の前記重鎖および／または軽鎖をコードする核酸。
【請求項５４】
ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントをさらに含む、請求項５３に記載の核酸。
【請求項５５】
前記ＩｇＧ１定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である、請求項５４に記載の核酸。
【請求項５６】
前記ＩｇＧ１定常領域が、配列番号２９の配列を有するが、Ｃ末端リシンがなくてもよいことが前提である、請求項３４に記載の核酸。
【請求項５７】
前記ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントが、配列番号３０のヌクレオチド配列を有する、請求項５６に記載の核酸。
【請求項５８】
前記重鎖可変領域および前記ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントを連結するイントロンをさらに含む、請求項５３〜５７のいずれかに記載の核酸。
【請求項５９】
前記ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントが、配列番号３１のヌクレオチド配列を有する、請求項５８に記載の核酸。
【請求項６０】
カッパ定常領域をコードするセグメントをさらに含む、請求項５３〜５９のいずれかに記載の核酸。
【請求項６１】
前記カッパ定常領域がヒトカッパ定常領域である、請求項６０に記載の核酸。
【請求項６２】
前記カッパ定常領域が配列番号３２の配列を有する、請求項６１に記載の核酸。
【請求項６３】
前記カッパ定常領域をコードする核酸が、配列番号３３の配列を有する、請求項６２に記載の核酸。
【請求項６４】
前記軽鎖可変領域をコードするセグメントを前記カッパ定常領域をコードするセグメントに連結するイントロンをさらに含む、請求項６３に記載の核酸。
【請求項６５】
前記カッパ定常領域をコードするセグメントが配列番号３４の配列を有する、請求項６４に記載の核酸。
【請求項６６】
請求項３６〜５２のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項６７】
アルツハイマー病を処置または予防する方法であって、請求項３６〜５２のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、アルツハイマー病の処置または予防をすることを含む方法。
【請求項６８】
前記患者がＡｐｏＥ４保因者である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
タウに関連する疾患を処置または予防する方法であって、請求項３６〜５２のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、前記疾患の処置または予防をすることを含む方法。
【請求項７０】
前記疾患が神経疾患である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
タウの異常伝播を減らす方法であって、請求項３６〜５２のいずれか定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの伝播を減らすことを含む方法。
【請求項７２】
タウの食作用を誘導する方法であって、請求項３６〜５２のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの食作用を誘導することを含む方法。
【請求項７３】
前記疾患が神経疾患である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
タウの凝集または沈着を抑制する方法であって、請求項３６〜５２のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの凝集または沈着を抑制することを含む方法。
【請求項７５】
前記疾患が神経疾患である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
タウの濃縮体の形成を抑制する方法であって、請求項３６〜５２のいずれかで定義される抗体の有効な投与計画を投与することを含む方法。
【請求項７７】
前記疾患が神経疾患である、請求項７６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月２日出願の米国特許仮出願第６２／３３０，７８６号優先権を主張するものであり、また、２０１３年３月１３日出願の米国特許仮出願第６１／７８０，６２４号および２０１３年３月１５日出願の同第６１／８００，３８２号、ならびに米国特許出願第１４／７７６，７２４号の関連特許である。これらそれぞれは、本出願において、その全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、本出願と共に提出された配列表を、２０１７年５月２日に作成され、５４，３０９バイトの「４９７１０６＿ＳＥＱＬＳＴ．ＴＸＴ」という名称のテキストファイルとして含む。このテキストファイルに含まれるデータは、参照により、その全体が本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
タウは、リン酸化型で存在し得るよく知られたヒトタンパク質である（例えば、Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４０５１−４０５５（１９８８）；Ｇｏｅｄｅｒｔ，ＥＭＢＯ  Ｊ．８：３９３−３９９（１９８９）；Ｌｅｅ，Ｎｅｕｒｏｎ  ２：１６１５−１６２４（１９８９）；Ｇｏｅｄｅｒｔ，Ｎｅｕｒｏｎ  ３：５１９−５２６（１９８９）；Ａｎｄｒｅａｄｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１０６２６−１０６３３（１９９２）を参照されたい）。タウは、特に中枢神経系における微小管の安定化に関与すると報告されている。総タウ（ｔ−タウ、すなわちリン酸化型、および非リン酸化型）ならびにリン酸化タウ（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｔａｕ）（ｐ−タウ、すなわち、リン酸化されたタウ）は、神経損傷および神経変性に応答して脳によって放出され、一般集団と比べて、アルツハイマー病患者のＣＳＦにおいてレベルが増加していることが報告されている（Ｊａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ９：１１９−２８（２０１０））。
【０００４】
タウは、神経原線維濃縮体の主要な構成成分であり、プラークと共にアルツハイマー病の顕著な特徴である。濃縮体は、８０ｎｍの規則的な周期で螺旋状に巻かれたペアで生じる直径１０ｎｍの異常な原線維で構成されている。神経原線維濃縮体内のタウは、分子上の特定の部位に結合したリン酸基で異常にリン酸化（高リン酸化）されている。アルツハイマー病における神経原線維濃縮体の強い関与は、嗅内皮質層ＩＩニューロン、海馬のＣＡ１領域および海馬台領域、扁桃体、ならびに新皮質のより深い層（層ＩＩＩ、Ｖ、および表面のＶＩ）に見られる。高リン酸化タウはまた、微小管アセンブリーを妨害することが報告されており、これは神経回路網の破壊を促進し得る。
【０００５】
タウ封入体は、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺およびピック病を含むいくつかの神経変性疾患の神経病理を特徴付ける要素である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号１５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２２と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。場合により、配列番号１５の３つのカバットＣＤＲおよび配列番号２２の３つのカバットＣＤＲ。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１の少なくとも１つが、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦによって占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも２つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも３つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３が、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、抗体は、配列番号１５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号２２と少なくとも９５％同一である成熟軽鎖可変領域を含む。場合により、配列番号１５および２２由来の成熟重鎖可変領域および成熟軽鎖可変領域のＣＤＲ内の何らかの差異が、それぞれ、位置Ｈ６０〜Ｈ６５の中に存在する。場合により、成熟重鎖可変領域は配列番号１５と命名されたアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は、配列番号２１、２２、または２３と命名されたアミノ酸配列を有する。場合により、成熟重鎖可変領域は配列番号１５と命名されたアミノ酸配列を有し、成熟軽鎖可変領域は、配列番号２２と命名されたアミノ酸配列を有する。
【０００７】
本発明は、配列番号３５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号３６と少なくとも９０％同一である成熟軽鎖可変領域を含む抗体をさらに提供する。但し、位置Ｈ１がＥであり、および／または位置Ｌ９がＳであるという条件の場合である。場合により、抗体は、配列番号１５の３つのカバットＣＤＲおよび配列番号２２の３つのカバットＣＤＲを含む。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１の少なくとも１つが、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦによって占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３の少なくとも１つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも２つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３のうちの少なくとも３つが、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３が、それぞれＮ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１３、Ｈ２８、Ｈ４８およびＨ９１が、それぞれＫ、Ｐ、Ｍ、およびＦにより占められ、位置Ｌ１、Ｌ４、Ｌ３６およびＬ４３が、それぞれＤ、Ｌ、ＦおよびＳによって占められる。場合により、位置Ｈ１がＥにより占められる。場合により、位置Ｌ９がＳにより占められる。場合により、位置Ｈ１がＥであり、位置Ｌ９がＳである。場合により、抗体は、配列番号３５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する成熟重鎖可変領域および配列番号３６と少なくとも９５％同一である成熟軽鎖可変領域を含む。
【０００８】
いくつかの抗体では、成熟重鎖可変領域は重鎖定常領域に融合され、成熟軽鎖可変領域は軽鎖定常領域に融合されている。場合により、重鎖定常領域は、天然のヒト定常領域と比較して、Ｆｃγ受容体への結合が低減した天然のヒト定常領域の変異型である。場合により、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、場合により配列番号２９である。但し、Ｃ末端リシンがなくてもよく、軽鎖定常領域はカッパ、好ましくは配列番号３２であるという条件の場合である。
【０００９】
いくつかの抗体は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤にコンジュゲートさせることができる。いくつかの抗体はＦａｂフラグメントである。
【００１０】
本発明は、上記抗体のいずれかで記載の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、アルツハイマー病を処置するまたは予防する方法をさらに提供し、該方法は、いずれかの上記抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、アルツハイマー病の処置または予防をすることを含む。場合により、患者はＡｐｏＥ４保因者である。
【００１２】
本発明は、タウに関連する疾患を処置または予防する方法をさらに提供し、該方法は、いずれかの上記抗体において定義される抗体の有効な投与計画を投与することを含む。場合により、疾患は神経疾患である。
【００１３】
本発明は、タウの異常伝播を減らす方法をさらに提供し、該方法は、いずれかの上記抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの伝播を減らすことを含む。
【００１４】
本発明は、タウの食作用を誘導する方法をさらに提供し、該方法は、いずれかの上記抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの食作用を誘導することを含む。場合により、疾患は神経疾患である。
【００１５】
本発明は、タウの凝集または沈着を抑制する方法を提供し、該方法は、いずれかの上記抗体の有効な投与計画を投与し、それにより、タウの凝集または沈着を抑制することを含む。場合により、疾患は神経疾患である。
【００１６】
本発明は、タウの濃縮体の形成を抑制する方法をさらに提供し、該方法は、いずれかの上記の抗体の有効な投与計画を投与することを含む、方法。場合により、疾患は神経疾患である。
【００１７】
本発明は、配列番号１５または配列番号３５の配列を有する重鎖可変領域をコードするセグメントを含む核酸をさらに提供する。場合により、核酸は、ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントをさらに含む。場合により、ＩｇＧ１定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域である。場合により、ＩｇＧ１定常領域は、コードする核酸は、配列番号２９の配列を有する。但し、Ｃ末端リシンを省くことができるという条件の場合である。場合により、ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントは、配列番号３０のヌクレオチド配列を有する。場合により、核酸は、重鎖可変領域およびＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントを連結するイントロンをさらに含む。場合により、ＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントは、配列番号３１のヌクレオチド配列を有する。場合により、核酸は、カッパ定常領域をコードするセグメントをさらに含む。場合により、カッパ定常領域は、ヒトカッパ定常領域である。場合により、カッパ定常領域は、配列番号３２の配列を有する。場合により、カッパ定常領域をコードする核酸は、配列番号３３の配列を有する。場合により、核酸は、カッパ定常領域をコードするセグメントに軽鎖可変領域をコードするセグメントを連結するイントロンをさらに含む。場合により、カッパ定常領域をコードするセグメントは、配列番号３４の配列を有する。
【００１８】
本発明は、配列番号１５の重鎖可変領域および／または配列番号２１、２２または２３の軽鎖可変領域をコードする核酸（単一または複数）をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】１６Ｂ５モノクローナル抗体が結合するエピトープ（単一または複数）をマッピングするために設計した実験の結果を示す。完全長タウまたはタウの欠失変異体（Δ５−２４またはΔ２５〜４４）を含むウェスタンブロットを１６Ｂ５抗体（左パネル）またはタウ４６抗体（右パネル）で染色した。タウ４６抗体は、タウのＣ末端エピトープに結合する。
【図２】１６Ｂ５モノクローナル抗体が結合するエピトープ（単一または複数）をマッピングするために設計した実験の結果を示す。完全長タウまたはタウの欠失変異体を含むウェスタンブロットを１６Ｂ５抗体（左パネル）またはタウ４６抗体（右パネル）で染色した。１６Ｂ５抗体で染色したブロットのより長い露光を左下のパネルに示す。この実験で分析したタウの欠失変異体には、Δ２５−４４、Δ５−２４、Δ２３−３２、Δ３０−３９、およびΔ３７−４６が含まれる。
【図３】１６Ｂ５モノクローナル抗体が結合するエピトープ（単一または複数）をマッピングするために設計したアラニンスキャニング実験の結果を示す。野生型タウ（ＷＴ）またはタウのアラニン点変異体を含むウェスタンブロットを、１６Ｂ５抗体（左パネル）またはタウ４６抗体（右パネル）で染色した。この実験で分析したタウのアラニン変異体には、Ｔ３０Ａ、Ｍ３１Ａ、Ｈ３２Ａ、Ｑ３３Ａ、Ｄ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｅ３６Ａ、Ｇ３７Ａ、Ｄ３８Ａ、Ｔ３９Ａ、Ｄ４０Ａ、Ａ４１Ｌ、およびＧ４２Ａが含まれる。
【図４】ヒトタウ．Ｐ３０１Ｌタンパク質を発現する遺伝子導入マウスの脳幹のサルコシル不溶性画分で検出されたタウタンパク質の相対量を示す。マウスに、１６Ｂ５抗体または非免疫性ＩｇＧ１アイソタイプコントロールの６Ｆ１０抗体のいずれかで受動免疫した。試料を、ウェスタンブロット法、抗体染色、結果として生じるシグナルの定量によって分析した。タウを検出するために使用した抗体には、抗リン酸化タウ特異的抗体（ＡＴ８、左上のパネル；ＡＴ１００、左下のパネル；または１Ｆ５、右上のパネル）、およびパンタウ抗体（ＨＴ７、右下のパネル）を含めた。
【図５】ヒトタウ．Ｐ３０１Ｌタンパク質を発現する遺伝子導入マウスの全脳幹ホモジネート中で検出された総タウ蛋白質（左パネル）および総タウの正規化した量（右パネル）に対するリン酸化タウの比率を示す。マウスに、１６Ｂ５抗体または非免疫性ＩｇＧ１アイソタイプコントロールの６Ｆ１０抗体のいずれかで受動免疫した。試料を、ウェスタンブロット法、抗体染色、結果として生じるシグナルの定量によって分析した。ＡＴ８抗体を用いてリン酸化タウを検出し、ＨＴ７抗体を用いて総タウを検出した。抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いて、コントロール６Ｆ１０抗体で処置したマウスで検出されたタウの量に対して、１６Ｂ５抗体で処置したマウスで検出されたタウの量を正規化した。
【図６】ヒトタウ．Ｐ３０１Ｌタンパク質を発現する遺伝子導入マウスの、ＡＴ８抗リン酸化タウ抗体を用いて免疫組織化学染色した小脳核の切片を示す。マウスに、１６Ｂ５抗体（左上パネル）または非免疫性ＩｇＧ１アイソタイプコントロールの６Ｆ１０抗体（左下パネル）のいずれかで受動免疫した。１６Ｂ５または６Ｆ１０抗体で受動免疫したマウスの小脳の挿入核、前方および後方部、アネックス外側小脳核（ＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴ）ならびに視床下核アネックス不確帯（ＳＴＨ／ＺＩ））におけるＡＴ８抗体で検出したタウ染色の量の定量化を上部の棒グラフのパネルで示す。１６Ｂ５または６Ｆ１０抗体で受動免疫したマウスのＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴおよびＳＴＨ／ＺＩ切片にＡＴ１００抗リン酸化タウ抗体を用いて検出したリン酸化タウ染色の量の定量化を、下の棒グラフのパネルに示す。統計的有意性をスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５を用いて評価した。
【図７】キメラ１６Ｂ５抗体およびヒト化１６Ｂ５抗体（Ｈ１Ｌ２およびＨ１Ｌ３バージョン）で得られたタウ免疫沈降の結果を示す。アルツハイマー病患者から得られた死後前頭皮質試料の可溶性画分および不溶性画分の両方からタウを免疫沈降した。ブロットした免疫沈降物中のタウ存在を、ポリクローナル抗タウ抗体（タウｐＡｂ）を用いて検出した。
【図８】ヒト化Ｈ１、Ｈ２、および１６Ｂ５重鎖の配列アライメントおよびヒト化Ｌ２、Ｌ４、およびキメラ１６Ｂ５軽鎖の配列アライメントを示す。
【図９】Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ４、およびＨ２Ｌ４の熱安定性分析を示す。示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて熱安定性を分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
モノクローナル抗体および他の治療薬は通常、単離形態で提供される。これは、薬剤が通常、干渉タンパク質およびその製造または精製から生じる他の混入物に対して少なくとも５０％ｗ／ｗの純度であることを意味するが、その薬剤が、過剰の薬学的に許容されるキャリア（単一または複数）またはその使用を容易にすることが意図される他のビークルと組み合わされる可能性を排除するものではない。時には、モノクローナル抗体（または他の治療薬）は、干渉タンパク質および製造または精製から生じる他の混入物に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％ｗ／ｗの純度である。
【００２１】
本発明の抗体は通常、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の結合定数でその指定された標的に結合する。このような結合は、それが大きさにおいて検出可能なほど高く、かつ少なくとも１つの無関係な標的に生じる非特異的結合と区別できるという点で特異的結合である。特異的結合は、特定の官能基または特定の空間的嵌合（例えば、ロック・アンド・キータイプ）間の結合の形成の結果であり得るが、非特異的結合は、通常、ファンデルワールス力の結果である。しかし、特異的結合は、必ずしもモノクローナル抗体が一つの、および唯一の標的に結合することを意味するものではない。
【００２２】
基本的な抗体構造単位は、サブユニットの四量体である。四量体はそれぞれ、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０個またはそれを超えるアミノ酸の可変領域を含む。切断可能なシグナルペプチドに連結されたこの可変領域が、最初に発現される。シグナルペプチドを含まない可変領域は、しばしば成熟可変領域と呼ばれる。したがって、例えば、軽鎖の成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを含まない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。定常領域は、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域のいずれかまたは全てを含み得る。
【００２３】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結されており、重鎖はまた、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。（概論としては、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，Ｃｈ．７（本出願において、参照によりその全体が組み込まれる））。
【００２４】
各軽鎖／重鎖対の成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同一である。鎖の全ては、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる、３つの高頻度可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。各対の２つの鎖のＣＤＲはフレームワーク領域により整列され、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバットのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｋａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７  ａｎｄ  １９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。カバットはまた、異なる重鎖間または異なる軽鎖間の対応する残基に同じ番号が割り当てられる、広く使用されているナンバリング規則（カバットナンバリング）を提供する。
【００２５】
「抗体」という用語は、完全な抗体およびその結合フラグメントを含む。典型的には、フラグメントは、標的への特異的結合のために誘導された完全な抗体と競合する。フラグメントは、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体を含む。単一（可変）ドメイン抗体は、従来の抗体のＶＬパートナーから分離されたＶＨ領域（またはその逆）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）ならびにＶＨ領域がＶＬ領域と結合していないラクダ科または軟骨魚類（例えば、テンジクザメ）などの種由来の（時にはＶＨＨとして知られる）ＶＨ領域を含む（例えば、国際公開第９４０４６７８号を参照されたい）。１つの鎖がその天然のパートナーから分離された単一ドメイン抗体は、時にはＤａｂとして知られておりラクダ科または軟骨魚類由来の単一ドメイン抗体は、時にはナノボディとして知られる。定常領域または定常領域の部分は、単一ドメイン抗体中に存在してもまたはしなくてもよい。例えば、ラクダ科由来の天然単一可変領域の抗体は、ＶＨＨ可変領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。単一ドメイン抗体は、従来の抗体と類似の方法によってヒト化の対象となり得る。Ｄａｂタイプの抗体は、通常、ヒト起源の抗体から得られる。ナノボディタイプの抗体はラクダ科またはサメ由来のものであり、ヒト化の対象となり得る。フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的分離により産生できる。用語「抗体」はまた、二重特異性抗体も含む。二重特異性または二価抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照されたい）。
【００２６】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位を意味する。エピトープは、連続アミノ酸または１つもしくは複数のタンパク質の３次折り畳み構造によって並置された非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒での処理で失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間高次構造において少なくとも３個以上、通常は少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を含む。エピトープがタンパク質中のアミノ酸残基の範囲内（例えば、タウの残基２５〜４４内）にあると言われるとき、その範囲はその境界を定義する残基を含む。範囲内の特定の残基はエピトープに寄与するが、その他は寄与しない場合がある。エピトープを形成する残基は、互いに連続してもまたはしなくてもよい。同様に、抗体が、アミノ酸の特定の範囲内に見出されるエピトープに結合する場合、抗体は範囲内の全てのアミノ酸残基と接触する必要はなく、抗体と接触するエピトープの残基は、互いに隣接していてもまたはしていなくてもよい。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００２７】
同じまたは重複するエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対して他方の抗体の結合と競合する一方の抗体の能力を示す簡単な免疫アッセイで特定できる。抗体のエピトープはまた、接触残基を同定するために、その抗原に結合した抗体のＸ線結晶学によって明確化することもできる。あるいは、一方の抗体の結合を低減または解消する抗原内の全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減または解消する場合は、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または解消するいくつかのアミノ酸変異が、他方抗体の結合を低減または解消する場合は、２つの抗体は重複するエピトープを有する。本発明は、１６Ｂ５と競合するか、および／または１６Ｂ５と同じタウ上のエピトープに結合する抗体を含む。
【００２８】
抗体間の競合は、試験抗体が共通抗原への参照抗体（例えば、１６Ｂ５）の特異的結合を抑制するアッセイによって決定される（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０、を参照されたい）。競合結合アッセイで測定したとき、過剰（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍）の試験抗体が参照抗体の結合を少なくとも５０％，好ましくは７５％、９０％または９９％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および立体障害が起こるために、参照抗体が結合するエピトープに十分近位にある隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。
【００２９】
「患者」という用語は、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
【００３０】
アミノ酸置換を保存的または非保存的アミノ酸置換として分類する目的のために、アミノ酸は次のようにグループ化される：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ族（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラスのアミノ酸間の置換を含む。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することである。
【００３１】
パーセント配列同一性は、カバットナンバリング規則により最大限整列させた抗体配列を用いて決定される。整列後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全体の成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較する場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセント配列同一性は、対象抗体領域と参照抗体領域の両方において同じアミノ酸が占められる位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数（ギャップはカウントしない）で割り、１００を乗じてパーセンテージに変換したものである。
【００３２】
用語「アジュバント」は、抗原と共に投与した場合、抗原に対する免疫応答を増大および／または再指示するが、単独で投与した場合には、抗原に対する免疫応答を生じさせない化合物を意味する。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかのメカニズムによって免疫応答を増強できる。
【００３３】
疾患を有する患者集団の脳内においてタウのレベルが増加するか、タウ沈着もしくは封入体が増加するか、脳内にタウの濃縮体が存在するか、脳内のタウのリン酸化（タウ１分子あたりリン酸基の平均数）が増加するか、または神経疾患を有することが知られていない対象集団と比較して、タウの細胞間もしくは細胞内伝播が異常である場合に、疾患はタウと関連する。タウ遺伝子のバリアント型を有する患者が、野生型（ヒト集団において最も頻繁に発生するバリアント）のタウ遺伝子を有する患者と比較して、疾患を発症するリスクが増加している場合に、疾患は同様にタウと関連する。
【００３４】
対象が、少なくとも１つの既知のリスク因子（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、状況暴露）を有し、そのリスク因子を有する個体で、そのリスク因子がない個体よりも疾患を発症するリスクが統計的に有意に高くなる場合、個体は疾患のリスクが高い。
【００３５】
用語「症状」は、患者が気付くような歩調の変化などの疾患の主観的証拠を意味する。「徴候」は、医師が認めるような疾患の客観的証拠を意味する。
【００３６】
統計的有意性とは、ｐ≦０．０５を意味する。
【００３７】
詳細な説明
Ｉ．全般
本発明は、タウに結合する抗体を提供する。いくつかの抗体、配列番号１の残基２３〜４６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体はリン酸化状態に関係なくタウに結合する。本発明のいくつかの抗体は、タウに関連する病態および関連する病状悪化を抑制するかまたは遅らせるのに役立つ。機序を理解することは本発明の実施に必要ではないが、数ある機序の中でも特に、抗体が、タウの食作用を誘導する、タウの分子間もしくは分子内凝集を抑制する、細胞間伝播を阻止する、細胞への結合を阻止する、タウ取り込みを阻止する、もしくは他の分子に対する結合を抑制する、非毒性高次構造を安定化する、または病原性タウ形態の細胞間もしくは細胞内伝播を抑制する結果として、毒性の低下が生じ得る。このような抗体を誘導する本発明の抗体または薬剤は、アルツハイマー病およびタウと関連する他の疾患の処置法または予防法に使用できる。
【００３８】
ＩＩ．タウ
文脈から別義が明らかな場合を除き、タウへの言及は、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、糖化、またはアセチル化）が存在するか否かにかかわらず、全てのアイソフォームを含む天然のヒト型タウを意味する。ヒトの脳ではタウの６つの主要なアイソフォーム（スプライスバリアント）が生じる。これらのバリアントの最長のものは、最初のメチオニン残基が切断された４４１個のアミノ酸を有する。残基は、４４１アイソフォームに従って番号が付けられている。したがって、例えば、位置４０４でのリン酸化への言及は、４４１アイソフォームの位置４０４、または４４１アイソフォームと最大限整列させた場合には任意の他のアイソフォームの対応する位置を意味する。アイソフォームのアミノ酸配列およびスイスプロット番号を以下に示す。
Ｐ１０６３６−８（配列番号１）
１０                  ２０                  ３０
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
４０                  ５０                  ６０
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴ  ＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧ
７０                  ８０                  ９０
ＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰ  ＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶ  ＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡ
１００                １１０                １２０
ＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧ  ＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤ  ＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧ
１３０                １４０                １５０
ＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫ  ＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫ  ＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫ
１６０                １７０                １８０
ＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰ  ＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲ  ＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫ
１９０                ２００                ２１０
ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫ  ＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰ  ＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳ
２２０                ２３０                ２４０
ＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴ  ＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲ  ＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫ
２５０                ２６０                ２７０
ＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ  ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩ  ＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰ
２８０              ２９０                ３００
ＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫ  ＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫ  ＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶ
３１０                ３２０                ３３０
ＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹ  ＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳ  ＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨ
３４０                ３５０                ３６０
ＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫ  ＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶ  ＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩ
３７０                ３８０                ３９０
ＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫ  ＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥ  ＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡ
４００                ４１０                ４２０
ＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳ  ＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮ  ＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶ
４３０                ４４０
ＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤ  ＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧ  Ｌ
Ｐ１０６３６−７（配列番号２）
１０                  ２０                  ３０
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
４０                  ５０                  ６０
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴ  ＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧ
７０                  ８０                  ９０
ＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰ  ＴＡＥＡＥＥＡＧＩＧ  ＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡ
１００                １１０                １２０
ＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳ  ＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤ  ＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴ
１３０                １４０                １５０
ＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰ  ＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴ  ＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰ
１６０                １７０                １８０
ＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰ  ＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳ  ＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲ
１９０                ２００                ２１０
ＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰ  ＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ  ＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡ
２２０                ２３０                ２４０
ＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰ  ＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫ  ＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱ
２５０                ２６０                ２７０
ＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮ  ＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳ  ＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨ
２８０              ２９０                ３００
ＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶ  ＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴ  ＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨ
３１０                ３２０                ３３０
ＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶ  ＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲ  ＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮ
３４０              ３５０                ３６０
ＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫ  ＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲ  ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧ
３７０                ３８０                ３９０
ＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶ  ＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳ  ＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭ
４００                ４１０
ＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡ  ＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱ  ＧＬ
Ｐ１０６３６−６（配列番号３）
１０                  ２０                  ３０
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
４０                  ５０                  ６０
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＡＥＥＡＧＩ  ＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡ
７０                  ８０                  ９０
ＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶ  ＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤ  ＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫ
１００                １１０                １２０
ＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡ  ＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡ  ＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡ
１３０                １４０                １５０
ＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰ  ＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳ  ＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳ
１６０                １７０                １８０
ＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰ  ＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶ  ＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳ
１９０                ２００                ２１０
ＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶ  ＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳ  ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨ
２２０                ２３０                ２４０
ＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩ  ＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱ  ＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫ
２５０                ２６０                ２７０
ＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩ  ＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶ  ＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩ
２８０                ２９０                ３００
ＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥ  ＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤ  ＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤ
３１０                ３２０                ３３０
ＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮ  ＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦ  ＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨ
３４０                ３５０                ３６０
ＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶ  ＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬ  ＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤ
３７０                ３８０
ＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬ  ＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫ  ＱＧＬ
Ｐ１０６３６−５（配列番号４）
１０                  ２０                  ３０
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
４０                  ５０                  ６０
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴ  ＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧ
７０                  ８０                  ９０
ＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰ  ＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶ  ＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡ
１００                １１０                １２０
ＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧ  ＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤ  ＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧ
１３０                １４０                １５０
ＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫ  ＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫ  ＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫ
１６０                １７０                １８０
ＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰ  ＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲ  ＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫ
１９０                ２００                ２１０
ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫ  ＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰ  ＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳ
２２０                ２３０                ２４０
ＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴ  ＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲ  ＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫ
２５０                ２６０                ２７０
ＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭ  ＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩ  ＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰ
２８０                ２９０                ３００
ＧＧＧＫＶＱＩＶＹＫ  ＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫ  ＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫ
３１０                ３２０                ３３０
ＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳ  ＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱ  ＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴ
３４０                ３５０                ３６０
ＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩ  ＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮ  ＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥ
３７０                ３８０                ３９０
ＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧ  ＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶ  ＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤ
４００                ４１０
ＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥ  ＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
Ｐ１０６３６−４（配列番号５）
１０                  ２０                  ３０
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
４０                  ５０                  ６０
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴ  ＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧ
７０                  ８０                  ９０
ＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰ  ＴＡＥＡＥＥＡＧＩＧ  ＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡ
１００                １１０                １２０
ＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳ  ＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤ  ＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴ
１３０                １４０                １５０
ＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰ  ＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴ  ＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰ
１６０                １７０                １８０
ＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰ  ＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳ  ＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲ
１９０                ２００                ２１０
ＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰ  ＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ  ＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡ
２２０                ２３０                ２４０
ＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰ  ＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫ  ＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱ
２５０                ２６０                ２７０
ＰＧＧＧＫＶＱＩＶＹ  ＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳ  ＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨ
２８０                ２９０                ３００
ＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫ  ＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶ  ＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩ
３１０                ３２０                ３３０
ＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫ  ＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥ  ＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡ
３４０                ３５０                ３６０
ＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳ  ＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮ  ＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶ
３７０                ３８０
ＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤ  ＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧ  Ｌ
Ｐ１０６３６−２（配列番号６）
１０                  ２０                  ３０
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
４０                  ５０                  ６０
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＡＥＥＡＧＩ  ＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡ
７０                  ８０                  ９０
ＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶ  ＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤ  ＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫ
１００                １１０                １２０
ＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡ  ＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡ  ＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡ
１３０                １４０                １５０
ＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰ  ＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳ  ＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳ
１６０                １７０                １８０
ＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰ  ＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶ  ＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳ
１９０                ２００                ２１０
ＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶ  ＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳ  ＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨ
２２０                ２３０                ２４０
ＱＰＧＧＧＫＶＱＩＶ  ＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴ  ＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨ
２５０                ２６０                ２７０
ＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶ  ＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲ  ＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮ
２８０                ２９０                ３００
ＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫ  ＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲ  ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧ
３１０                ３２０                ３３０
ＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶ  ＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳ  ＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭ
３４０                ３５０
ＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡ  ＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱ  ＧＬ
【００３９】
タウへの言及は、スイスプロットデータベースおよびその順列に列挙されている約３０個の既知の天然の多様性、ならびに認知症、ピック病、核上性麻痺などのタウ病理と関連する変異を含む（例えば、スイスプロットデータベースおよびＰｏｏｒｋａｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．４３：８１５−８２５（１９９８）を参照されたい）。４４１アイソフォームにより番号付けられたタウ変異のいくつかの例としては、アミノ酸残基２５７におけるリシンからスレオニンへの変異（Ｋ２５７Ｔ）、アミノ酸位置２６０におけるイソロイシンからバリンへの変異（Ｉ２６０Ｖ）、アミノ酸位置２７２におけるグリシンからバリンへの変異（Ｇ２７２Ｖ）、アミノ酸位置２７９におけるアスパラギンからリシンへの変異（Ｎ２７９Ｋ）、アミノ酸位置２９６におけるアスパラギンからヒスチジンへの変異（Ｎ２９６Ｈ）、アミノ酸位置３０１におけるプロリンからセリンへの変異（Ｐ３０１Ｓ）、アミノ酸位置３０３におけるグリシンからバリンへの変異（Ｇ３０３Ｖ）、位置３０５におけるセリンからアスパラギンへの変異（Ｓ３０５Ｎ）、アミノ酸位置３３５におけるグリシンからセリンへの変異（Ｇ３３５Ｓ）、位置３３７におけるバリンからメチオニンへの変異（Ｖ３３７Ｍ）、位置３４２におけるグルタミン酸からバリンへの変異（Ｅ３４２Ｖ）、アミノ酸位置３６９におけるリシンからイソロイシンへの変異（Ｋ３６９Ｉ）、アミノ酸位置３８９におけるグリシンからアルギニンへの変異（Ｇ３８９Ｒ）、位置４０６におけるアルギニンからトリプトファンへの変異（Ｒ４０６Ｗ）が挙げられる。
【００４０】
タウは、アミノ酸位置１８、２９、９７、３１０、および３９４におけるチロシン、アミノ酸位置１８４、１８５、１９８、１９９、２０２、２０８、２１４、２３５、２３７、２３８、２６２、２９３、３２４、３５６、３９６、４００、４０４、４０９、４１２、４１３、および４２２におけるセリン、ならびにアミノ酸位置１７５、１８１、２０５、２１２、２１７、２３１、および４０３におけるスレオニンを含む１つまたは複数のアミノ酸残基がリン酸化され得る。
【００４１】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．結合特異性および機能特性
本発明は、タウに結合する抗体を提供する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２３〜４６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２５〜４４内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２８〜４１内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３０〜３９内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３０〜３６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３３〜３９内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基３３〜３６内のエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体は、配列番号１の残基２８〜３０、２８〜３１、２８〜３２、２８〜３３、２８〜３４、２８〜３５、２８〜３６、２８〜３７、２８〜３８、２８〜３９、２８〜４０、２８〜４１、２９〜３１、２９〜３２、２９〜３３、２９〜３４、２９〜３５、２９〜３６、２９〜３７、２９〜３８、２９〜３９、２９〜４０、２９〜４１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３０〜３９、３０〜４０、３０〜４１、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３１〜３９、３１〜４０、３１〜４１、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３２〜３９、３２〜４０、３２〜４１、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３３〜３９、３３〜４０、３３〜４１、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３４〜３９、３４〜４０、３４〜４１、３５〜３７、３５〜３８、３５〜３９、３５〜４０、３５〜４１、３６〜３８、３６〜３９、３６〜４０、３６〜４１を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの抗体はリン酸化状態に関係なくタウに結合する。いくつかの抗体は、リン酸化を受ける残基を含まないエピトープに結合する。これらの抗体は、天然源から精製するかまたは組換え発現させたタウポリペプチドで免疫することにより取得できる。抗体は、非リン酸化型のタウ、およびリン酸化を受けやすい１つもしくは複数の残基がリン酸化された形態のタウへの結合に関してスクリーニングできる。このような抗体は、好ましくは、非リン酸化タウと比較して、区別できない親和性で結合するか、またはリン酸化タウに少なくとも１．５倍、２倍または３倍の係数の範囲内で結合する（すなわち、「パン特異的である」）。１６Ｂ５は、パン特異的モノクローナル抗体の一例である。本発明はまた、例えば、１６Ｂ５のエピトープなどの上記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗体を提供する。また、例えば、１６Ｂ５と競合するものなどの上記の抗体のいずれかとタウへの結合について競合する抗体も含まれる。
【００４２】
他の抗体は、１６Ｂ５などの代表的な抗体の重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡの変異誘発によって取得できる。成熟重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１６Ｂ５と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であり、その機能特性を保持するモノクローナル抗体、および／または少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失、もしくは挿入によってそれぞれの抗体とは異なるモノクローナル抗体も本発明に含まれる。カバットによって定義されるような、１６Ｂ５の対応するＣＤＲと９０％、９５％、９９％または１００％同一である少なくとも１つ、好ましくは全６つのＣＤＲ（単一または複数）を有するモノクローナル抗体も含まれる。
【００４３】
Ｃ．ヒト化抗体
ヒト化抗体は遺伝子改変抗体であり、非ヒト「ドナー」抗体（例えば、１６Ｂ５）のＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列にグラフト化されている（例えば、Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号；Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｒｔｅｒの米国特許第６，４０７，２１３号、Ａｄａｉｒの米国特許第５，８５９，２０５号、同第６，８８１，５５７号、Ｆｏｏｔｅの米国特許第６，８８１，５５７号を参照されたい）。アクセプター抗体の配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域の配列であり得る。したがって、ヒト化抗体は、完全にもしくは実質的にドナー抗体由来の一部または全てのＣＤＲ、存在する場合には、完全にもしくは実質的にヒト抗体配列由来の可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にもしくは実質的にドナー抗体重鎖由来の少なくとも１つ、２つ、通常は全３つのＣＤＲ、存在する場合には、実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列由来の重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にもしくは実質的にドナー抗体軽鎖由来の少なくとも１つ、２つ、通常は全３つのＣＤＲ、存在する場合には、実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外に、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体中のＣＤＲは、（カバットの定義により）対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、または１００％がそれぞれのＣＤＲ間で同一である場合に、実質的に非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、カバットによって定義される対応する残基の少なくとも８５、９０、９５または１００％が同一である場合に、それぞれ実質的にヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。
【００４４】
ヒト化抗体は、マウス抗体由来の（好ましくはカバットによって定義されるような）全６つのＣＤＲを包含する場合が多いが、マウス抗体由来の全てのＣＤＲ未満（例えば、少なくとも３、４、または５個のＣＤＲ）でも作製できる（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【００４５】
いくつかの抗体では、ＣＤＲの一部のみ、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる結合に必要なＣＤＲ残基のサブセットが、ヒト化抗体において結合を保持するために必要とされる。抗原に接触せず、ＳＤＲ中に存在しないＣＤＲ残基は、以前の研究に基づいて（例えば、ＣＤＲ  Ｈ２中の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要とされない場合が多い）、コチア高頻度可変性ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）の外側にあるカバットＣＤＲの領域から分子モデリングおよび／もしくは経験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４に記載の通りに特定することができる。このようなヒト化抗体において、１個または複数個のドナーＣＤＲ残基が存在しないか、またはドナーＣＤＲ全体が除去されている位置において、その位置を占めるアミノ酸は、アクセプター抗体配列中の（カバットナンバリングによる）対応する位置を占めるアミノ酸であり得る。ＣＤＲ中に包含するドナーアミノ酸のためのアクセプターのこのような置換の数は、競合する考慮事項のバランスを反映している。このような置換は、潜在的に、ヒト化抗体中のマウスアミノ酸の数を減少させ、結果として潜在的な免疫原性を減少させる点で都合がよい。しかし、置換はまた、親和性の変化を生ずることがあり、親和性の顕著な低下は避けるのが好ましい。ＣＤＲ内の置換の位置および置換するアミノ酸も経験的に選択できる。
【００４６】
ヒトアクセプター抗体配列は、ヒトアクセプター配列の可変領域フレームワークとドナー抗体鎖の対応する可変領域フレームワークとの間に高度な配列同一性（例えば、６５〜８５％の同一性）を提供するために、必要に応じて、多くの既知のヒト抗体配列の中から選択できる。
【００４７】
ヒト可変領域フレームワーク残基由来の特定のアミノ酸は、ＣＤＲ高次構造および／または抗原への結合に対するそれらの影響の可能性に基づいて置換に関し選択できる。このような可能な影響の研究は、モデリング、特定の位置でのアミノ酸の特徴の試験、または特定のアミノ酸の置換もしくは変異誘発の効果の経験的観察によるものである。
【００４８】
例えば、アミノ酸がマウス可変領域フレームワーク残基と選択したヒト可変領域フレームワーク残基との間で異なる場合、ヒトフレームワークアミノ酸は、マウス抗体の等価のフレームワークアミノ酸によって置換でき、この場合、そのアミノ酸が：（１）非共有結合で直接抗原と結合する、（２）ＣＤＲ領域に隣接している、（３）そうでなければＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、ＣＤＲ領域の約６Å内である）、（例えば、相同な既知免疫グロブリン鎖の解析された構造上で軽鎖または重鎖をモデリングすることにより識別される）、および（４）ＶＬ−ＶＨ界面に関与する残基である、ことは合理的に予想される。
【００４９】
Ｑｕｅｅｎの米国特許第５，５３０，１０１号によって定義されるとおり、クラス（１）〜（３）のフレームワーク残基は、代わりに、正準およびバーニア（ｖｅｒｎｉｅｒ）残基と呼ばれることもある。ＣＤＲループの立体構造を決定するドナーＣＤＲループの正準クラスを定義するフレームワーク残基は、正準残基と呼ばれることもある（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７（１９８７），Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＆  Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３，８００−８１５，１９９６）。抗原に対する抗体の適合を微調整する役割を果たす抗原結合ループの高次構造を支持するフレームワーク残基の層は、バーニア残基と呼ばれることもある（Ｆｏｏｔｅ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．２２４，４８７−４９９）。置換の他の候補は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す残基である。置換の他の候補は、ヒト免疫グロブリンとしてはその位置が通常とは異なるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価位置のアミノ酸またはより典型的なヒト免疫グロブリンの等価位置由来のアミノ酸で置換できる。置換の他の候補は、ヒト免疫グロブリンとしてはその位置が通常とは異なるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。
【００５０】
本発明は、マウス１６Ｂ５抗体のヒト化型を提供する。マウス抗体は、配列番号１０および１６をそれぞれ含むアミノ酸配列を有する成熟重鎖および軽鎖の可変領域を含む。本発明は、２つの代表的なヒト化成熟重鎖可変領域（Ｈ１およびＨ２）および５つの代表的なヒト化成熟軽鎖可変領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５）を提供する。Ｈ１は４つの逆突然変異を含む。Ｈ２は、同じ４つの逆突然変異に加えて、安定性を改善するための追加のＱ１Ｅ変異（逆突然変異ではない）を含む。Ｌ１は３つの逆突然変異を有し、Ｌ２は４つの逆突然変異を有し、Ｌ３は３つの逆突然変異を有し、Ｌ４は５つの逆突然変異（Ｌ２と同じ逆突然変異に加えて、タンパク分解部位を除くためにＤ９Ｓ変異）を有し、Ｌ５は、位置Ｌ１がＤにより占められること以外は、Ｌ４と同じ逆突然変異を有する。Ｈ１Ｌ２バリアントは、キメラ１６Ｂ５と同じまたはより良好な親和性を有し、８個の逆突然変異を有する。Ｈ１Ｌ１およびＨ１Ｌ３は、キメラ１６Ｂ５と類似の親和性を有し、７個の逆突然変異を有する。Ｈ１Ｌ４バリアント、Ｈ２Ｌ４バリアントおよびＨ２Ｌ２バリアントは、１６Ｂ５の２倍以内の親和性を有し、それぞれ９、１０または８個の変異を有する（Ｈ２のＱ１Ｅを除いて、これらは全て逆突然変異である）。これらのバリアントは、改善された安定性（Ｈ２のＱ１Ｅに由来する）、もしくはタンパク分解部位の除去（Ｌ４）の利益があるか、または両方の利益がある。全てのヒト化抗体は、ヒト生殖系列配列に少なくとも８５％の配列同一性を有し、したがって、ヒト化抗体として呼称するためのＩＮＮ基準を満たす。
【００５１】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が配列番号１５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖成熟可変領域が配列番号２２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すＨ１Ｌ２ヒト化１６Ｂ５抗体のバリアントを提供する。好ましくは、このような抗体において、Ｈ１Ｌ２内の逆突然変異の一部または全てが保持される。すなわち、少なくとも１、２、３、または４個の位置において、位置Ｈ１３はＫにより占められ、位置Ｈ２８は占められ、位置Ｈ４８はＭにより占められ、位置Ｈ９１はＦにより占められる。好ましくは、少なくとも１、２、３個または４個全ての位置において、位置Ｌ１はＮにより占められ、位置Ｌ４はＬにより占められ、位置Ｌ３６はＦにより占められ、位置Ｌ４３はＳにより占められる。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、好ましくは、Ｈ１Ｌ２のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり、マウスドナー抗体のものと同じである。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア）によって定義できるが、好ましくはカバットによって定義されるものである。
【００５２】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が配列番号１５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖成熟可変領域が配列番号３６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すＨ１Ｌ４ヒト化１６Ｂ５抗体のバリアントを提供する。好ましくは、このような抗体において、Ｈ１Ｌ４内の逆突然変異の一部または全てが保持される。すなわち、次の位置の少なくとも１、２、３個または４個は次のように占められる：位置Ｈ１３はＫにより占められ、位置Ｈ２８はＰにより占められ、位置Ｈ４８はＭにより占められ、位置Ｈ９１はＦにより占められる。好ましくは、少なくとも１、２、３、４個または５個全ての位置において、位置Ｌ１はＮにより占められ、位置Ｌ４はＬにより占められ、位置Ｌ９はＳにより占められ、位置Ｌ３６はＦにより占められ、位置Ｌ４３はＳにより占められる。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、好ましくは、Ｈ１Ｌ４のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり、マウスドナー抗体のものと同じである。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア）によって定義できるが、好ましくはカバットによって定義されるものである。
【００５３】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が配列番号３５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖成熟可変領域が配列番号２２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すＨ２Ｌ２ヒト化１６Ｂ５抗体のバリアントを提供する。好ましくは、このような抗体において、Ｈ２Ｌ４内の変異の一部または全てが保持される。すなわち、次の位置の少なくとも１、２、３、４個または５個は次のように占められる：位置Ｈ１はＥにより占められ、位置Ｈ１３はＫにより占められ、位置Ｈ２８はＰにより占められ、位置Ｈ４８はＭにより占められ、位置Ｈ９１はＦにより占められる。好ましくは、次の位置の少なくとも１、２、３個または４個全ては次に示すように占められる：位置Ｌ１はＮにより占められ、位置Ｌ４はＬにより占められ、位置Ｌ３６はＦにより占められ、位置Ｌ４３はＳにより占められる。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、好ましくは、Ｈ２Ｌ３のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり、マウスドナー抗体のものと同じである。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア）によって定義できるが、好ましくはカバットによって定義されるものである。
【００５４】
本発明は、ヒト化成熟重鎖可変領域が配列番号３５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し、ヒト化成熟軽鎖成熟可変領域が配列番号３６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示すＨ２Ｌ４ヒト化１６Ｂ５抗体のバリアントを提供する。好ましくは、このような抗体において、Ｈ２Ｌ４内の逆突然変異およびその他の変異の一部または全てが保持される。すなわち、次の位置の少なくとも１、２、３、４個または５個は次のように占められる：位置Ｈ１はＥにより占められ、位置Ｈ１３はＫにより占められ、位置Ｈ２８はＰにより占められ、位置Ｈ４８はＭにより占められ、位置Ｈ９１はＦにより占められる。好ましくは、次の位置の少なくとも１、２、３、４個または５個全ては次に示すように占められる：位置Ｌ１はＮにより占められ、位置Ｌ４はＬにより占められ、位置Ｌ９はＳにより占められ、位置Ｌ３６はＦにより占められ、位置Ｌ４３はＳにより占められる。このようなヒト化抗体のＣＤＲ領域は、好ましくは、Ｈ１Ｌ４のＣＤＲ領域と同一または実質的に同一であり、マウスドナー抗体のものと同じである。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（例えば、コチア）によって定義できるが、好ましくはカバットによって定義されるものである。
【００５５】
１６Ｂ５バリアントのさらなる多様性の１つの可能性は、可変領域フレームワークにおける追加の逆突然変異である。ヒト化ｍＡｂ中のＣＤＲと接触していないフレームワーク残基の多くは、ドナーマウスｍＡｂまたは他のマウスもしくはヒトの抗体の対応する位置のアミノ酸の置換に順応でき、さらに多くの潜在的なＣＤＲ接触残基もまた置換の影響を受けやすいか、またはＣＤＲ内のアミノ酸でさえ、例えば、可変領域フレームワークを提供するために使用されるヒトアクセプター配列の対応する位置に見られる残基で変更され得る。さらに、例えば、重鎖および／または軽鎖に対し、別のヒトアクセプター配列が使用できる。異なるアクセプター配列が使用される場合、対応するドナーおよびアクセプター残基は逆突然変異なしでもすでに同じものであるため、上記で推奨する逆突然変異の内の１つまたは複数は実施されなくてもよい。例えば、位置Ｈ１３がすでにＫによって占められている重鎖アクセプター配列を用いる場合、逆突然変異は必要ではない。
【００５６】
本発明はまた、成熟軽鎖および重鎖可変領域が、ヒト化１６Ｂ５  Ｈ１Ｌ１抗体の成熟軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ配列番号１５および２１）またはヒト化１６Ｂ５  Ｈ１Ｌ３抗体（それぞれ配列番号１５および２３）と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を示すヒト化抗体も含む。
【００５７】
本発明はまた、成熟軽鎖および重鎖可変領域が、ヒト化１６Ｂ５  Ｈ２Ｌ１抗体の成熟軽鎖および重鎖可変領域（それぞれ配列番号Ｘおよび２１）、ヒト化１６Ｂ５  Ｈ２Ｌ２抗体（それぞれ配列番号Ｘおよび２２）、またはヒト化１６Ｂ５  Ｈ２Ｌ３抗体（それぞれ配列番号Ｘおよび２３）と少なくとも９０、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を示すヒト化抗体も含む。
【００５８】
Ｆ．定常領域の選択
キメラ抗体、（ベニヤ抗体を含む）ヒト化抗体、またはヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結できる。定常領域の選択は、一部は、抗体依存性補体および／または細胞媒介性細胞傷害性が所望されるか否かに依存する。例えば、ヒトアイソタイプのＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体媒介細胞傷害性を有するが、ヒトアイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、補体媒介細胞傷害性が不十分であるかまたはそれを全く有していない。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖および軽鎖の可変領域がスペーサーを介して連結されている単鎖抗体として発現させることができる。
【００５９】
ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ多様性およびイソアロタイプ多様性を示す。すなわち、定常領域は、１つまたは複数の多型位置で別々の個体において異なり得る。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清が１つまたは複数の他のアイソタイプの非多型領域に結合する点で、アロタイプとは異なる。ヒト定常領域への言及は、任意の天然のアロタイプもしくは天然のアロタイプ中の多型位置を占める残基の任意の順列または以下に記載のエフェクター機能を減少または増加させるための最大で３、５もしくは１０個の置換を有する定常領域を含む。
【００６０】
重鎖のＣ末端リシンなどの軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における１つまたはいくつかのアミノ酸は、分子の一部または全てを欠損していても、または誘導体化されていてもよい。置換は、補体媒介性細胞傷害もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を低減または増加させるために（例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，６２４，８２１号、Ｔｓｏらの米国特許第５，８３４，５９７号、およびＬａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：４００５，２００６を参照されたい）、またはヒトにおける半減期を延長するために定常領域で行われ得る（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照されたい）。抗体の半減期を増加させるための代表的な置換には、位置２５０におけるＧｌｎおよび／または位置４２８におけるＬｅｕが含まれる（定常領域のＥＵナンバリングがこの段落で使用される）。位置２３４、２３５、２３６および／もしくは２３７のいずれかまたは全ての置換は、Ｆｃγ受容体、特に、ＦｃγＲＩ受容体に対する親和性を低下させる（例えば、米国特許第６，６２４，８２１号を参照されたい）。ヒトＩｇＧ１の位置２３４、２３５および２３７でのアラニン置換は、エフェクター機能を低下させるのに好ましい。必要に応じて、ヒトＩｇＧ２中の２３４、２３６および／または２３７はアラニンと置換され、位置２３５はグルタミンと置換されている。（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号を参照されたい）
【００６１】
Ｇ．組換え抗体の発現
キメラ抗体、（ベニヤを含む）ヒト化抗体およびヒト抗体は通常、組換え発現によって産生される。抗体をコードする核酸は、所望の細胞型（例えば、ＣＨＯまたはＳｐ２／０）での発現のためにコドン最適化できる。本明細書に開示されるヒト化１６Ｂ５重鎖および軽鎖の可変領域をコードする核酸は、例えば、（Ｈｕ１６Ｂ５  Ｈ１をコードする）配列番号２５、（Ｈｕ１６Ｂ５  Ｌ１をコードする）配列番号２６、（Ｈｕ１６Ｂ５  Ｌ２をコードする）配列番号２７、または（Ｈｕ１６Ｂ５  Ｌ３をコードする）配列番号２８を含むかまたはそれらからなる配列を有する。配列番号１０および１６などのシグナルペプチドを含む可変領域については、核酸は、シグナルペプチドの有無にかかわらず、可変領域をコードすることができる。重鎖および軽鎖をコードする核酸セグメントは、同一の連続した核酸分子上または別々の分子上に存在できる。重鎖および軽鎖は、同一のベクターまたは異なるベクターから発現させることができる。核酸は通常、単離された形態で提供される。
【００６２】
ヒト化１６Ｂ５重鎖可変領域をコードする核酸は、例えば、配列番号３０の配列を有する、ヒトＩｇＧ１定常領域をコードする核酸セグメントに連結できる。このような核酸はまた、重鎖可変領域をコードするセグメントとＩｇＧ１定常領域をコードするセグメントの間、すなわち、定常領域をコードするセグメントの５’側に位置するイントロンも含むことができる。ヒトＩｇＧ１定常領域をコードし、その５’末端にマウスイントロンを有する代表的な核酸配列を配列番号３１に示す。
【００６３】
ヒト化１６Ｂ５軽鎖可変領域をコードする核酸は、例えば、配列番号３３の配列を有するヒトカッパ定常領域をコードする核酸セグメントに連結できる。このような核酸はまた、軽鎖可変領域をコードするセグメントとカッパ定常領域をコードするセグメントの間（すなわち、カッパ定常領域の５’側）にイントロンを含むこともできる。ヒトカッパ定常領域をコードし、その５’末端にヒトイントロンを有する代表的な核酸配列を配列番号３４に示す。
【００６４】
組換えポリヌクレオチド構築物は通常、天然に連結されたまたは異種のプロモーター領域を含む抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換または遺伝子導入することができるベクター中の真核生物プロモーター系である。ベクターが適切な宿主に組み込まれた後、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、ならびに交差反応抗体の収集および精製に適する条件下で維持される。抗体鎖をコードするベクター（単一または複数）はまた、抗体鎖をコードする核酸のコピー数の増幅を可能にするために、ジヒドロ葉酸還元酵素またはグルタミン合成酵素などの選択可能な遺伝子を含むこともできる。
【００６５】
大腸菌は、抗体、特に、抗体フラグメントを発現させるのに特に有用な原核生物宿主である。酵母などの微生物も発現に有用である。サッカロミセス属は、必要に応じて、発現制御配列、複製起点、および終止配列などを有する適切なベクターを有する好ましい酵母宿主である。代表的なプロモーターには、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーターが含まれる。
【００６６】
哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好ましい宿主である。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照されたい。完全な異種タンパク質を分泌することができるいくつかの適切な宿主細胞株には、当技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳＰ２／０およびＮＳ０を含む非抗体産生骨髄腫が含まれる。好ましくは、細胞は非ヒトである。これらの細胞用の発現ベクターは、複製起点、プロモーター、エンハンサーなどの発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列などの必要な情報処理部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、およびウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Ｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照されたい。
【００６７】
細胞培養物中に抗体の重鎖および軽鎖をコードするベクター（単一または複数）を導入し、無血清培地中で増殖生産性および製品品質に関して細胞プールをスクリーニングできる。その後、最良の産生細胞プールをＦＡＣＳベースの単細胞クローニングに供し、モノクローナル株を生成できる。７．５ｇ／Ｌ超の培養物の製品力価に相当する、一日あたり細胞あたり５０ｐｇまたは１００ｐｇを上回る比生産性が好ましい。単細胞クローンにより産生された抗体はまた、濁度、濾過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶスキャン、ＨＰ−ＳＥＣ、炭水化物−オリゴ糖マッピング、質量分析、およびＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの結合アッセイの試験を行い得る。その後、選択されたクローンは、複数のバイアルに入れ、後の使用のために凍結保存できる。
【００６８】
発現させると、抗体は、プロテインＡ捕獲、カラムクロマトグラフィー（例えば、疎水性相互作用またはイオン交換）、およびウイルス不活性化のための低ｐＨなどを含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製できる（一般に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰｕｒｉｆｉｃａＴｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照されたい）。
【００６９】
コドン最適化、プロモーターの選択、転写エレメント、およびターミネーター、無血清の単細胞クローニング、細胞バンク、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネーター、無血清単細胞クローニング、タンパク質力価の改善を含む抗体の商業生産のための方法を用いることができる（例えば、米国特許第５，７８６，４６４号、同第６，１１４，１４８号、同第６，０６３，５９８号、同第７，５６９，３３９号、国際公開第２００４／０５０８８４号、同第２００８／０１２１４２号、同第２００８／０１２１４２号、同第２００５／０１９４４２号、同第２００８／１０７３８８号、および同第２００９／０２７４７１号、ならびに米国特許第５，８８８，８０９号を参照されたい）。
【００７０】
ＩＶ．能動免疫原
能動免疫に使用される薬剤は、上記の受動免疫に関連して説明した同じ種類の抗体を患者に誘導するのに役立つ。能動免疫に使用される薬剤は、実験動物内でモノクローナル抗体を生成するために使用される同じ種類の免疫原、例えば、配列番号１の残基２３〜４６、２５〜４４、２８〜４１または３０〜３９に対応するタウの領域由来の３〜１５もしくは３〜１２もしくは５〜１２、または５〜８個の連続アミノ酸のペプチド、例えば、配列番号１の残基２８〜３０、２８〜３１、２８〜３２、２８〜３３、２８〜３４、２８〜３５、２８〜３６、２８〜３７、２８〜３８、２８〜３９、２８〜４０、２８〜４１、２９〜３１、２９〜３２、２９〜３３、２９〜３４、２９〜３５、２９〜３６、２９〜３７、２９〜３８、２９〜３９、２９〜４０、２９〜４１、３０〜３２、３０〜３３、３０〜３４、３０〜３５、３０〜３６、３０〜３７、３０〜３８、３０〜３９、３０〜４０、３０〜４１、３１〜３３、３１〜３４、３１〜３５、３１〜３６、３１〜３７、３１〜３８、３１〜３９、３１〜４０、３１〜４１、３２〜３４、３２〜３５、３２〜３６、３２〜３７、３２〜３８、３２〜３９、３２〜４０、３２〜４１、３３〜３５、３３〜３６、３３〜３７、３３〜３８、３３〜３９、３３〜４０、３３〜４１、３４〜３６、３４〜３７、３４〜３８、３４〜３９、３４〜４０、３４〜４１、３５〜３７、３５〜３８、３５〜３９、３５〜４０、３５〜４１、３６〜３８、３６〜３９、３６〜４０、３６〜４１を含むペプチドであり得る。１６Ｂ５と同じまたは重複するエピトープに結合する抗体を誘導するために、これらの抗体のエピトープ特異性を（例えば、タウ全体にわたる一連の重複ペプチドへの結合を試験することによって）マッピングできる。その後、エピトープからなるかまたはそれを含むもしくは重複するタウのフラグメントを免疫原として使用できる。このようなフラグメントは通常、非リン酸化形態で使用される。
【００７１】
異種キャリアおよびアジュバントは、用いる場合、モノクローナル抗体を生成するために使用されるものと同じであってもよいが、ヒトへの使用のためにより良い医薬適合性に関して選択されてもよい。適切なキャリアには、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、またはジフテリア（例えば、ＣＲＭ１９７）、大腸菌、コレラ、もしくはＨ．ピロリなどの他の病原性細菌由来のトキソイド、または弱毒化毒素誘導体が含まれる。Ｔ細胞エピトープも好適なキャリア分子である。一部のコンジュゲートは、免疫刺激性ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）、またはグルカン（ａβ１→２ポリマー））、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１βペプチド、ＩＬ−２、γ−ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ１−αおよびＭＩＰ１−β、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に本発明の薬剤を連結することにより形成できる。免疫原は、スペーサーアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）の有無に関わらずキャリアに連結してよい。さらなるキャリアにはウイルス様粒子が含まれる。偽ビリオンまたはウイルス由来粒子とも呼ばれるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、複数コピーのウイルスキャプシドおよび／または定義される球対称のＶＬＰ内でインビボで自己集合可能なエンベロープタンパク質で構成されるサブユニット構造を示す（Ｐｏｗｉｌｌｅｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２（５）：ｅ４１５．）。あるいは、ペプチド免疫原を、パンＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）などのＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分に結合可能な少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープに連結できる。ＰＡＤＲＥは、米国特許第５，７３６，１４２号、国際公開第９５／０７７０７号、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１：７５１−７６１（１９９４）に記載されている。能動免疫原は、複数コピーの免疫原および／またはそのキャリアが単一共有結合分子として存在する多量体形態で存在できる。
【００７２】
フラグメントは、薬学的に許容できるアジュバントと共に投与される場合が多い。アジュバントは、ペプチドが単独で使用された場合の状況に比べて、誘導された抗体の力価および／または誘導された抗体の結合親和性を増加させる。様々なアジュバントは、免疫応答を誘発するためにタウの免疫原性フラグメントと組み合わせて使用できる。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響を与える免疫原の立体構造変化を引き起こすことなく、免疫原に対する固有の応答を増大させる。好ましいアジュバントには、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ２２２０２１１（ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ（現在はＣｏｒｉｘａの一部）を参照されたい）が含まれる。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は、南米で見つかったキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から単離されるトリテルペングリコシド、すなわちサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号を参照されたい）、（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ（現在は、Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。他のアジュバントは、必要に応じ、モノホスホリル脂質Ａ（Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）を参照されたい）、プルロニックポリマー、および死滅させたマイコバクテリアなどの免疫刺激剤と組み合わせた（スクアレンまたはピーナッツ油などの）水中油型エマルジョンである。リビアジュバントは、水中油型エマルジョンである。リビは、Ｔｗｅｅｎ８０を含む生理食塩水で乳化した代謝可能な油（スクアレン）を含む。リビはまた、免疫賦活剤として機能する精製されたマイコバクテリア生成物および細菌モノホスホリル脂質Ａも含む。別のアジュバントはＣｐＧ（国際公開第９８／４０１００号）である。アジュバントは、活性剤と共に治療組成物の成分として投与されるか、または別々に治療薬の投与前、それと同時、もしくはその後に投与できる。
【００７３】
タウに対する抗体を誘導するタウの天然フラグメントの類似体も使用できる。例えば、１つもしくは複数または全てのＬ−アミノ酸は、そのようなペプチド中のＤ−アミノ酸で置換できる。また、アミノ酸の順序は逆にすることができる（レトロペプチド）。必要に応じて、ペプチドは、逆の順序で全てのＤ−アミノ酸を含む（レトロインベルソペプチド）。ペプチドおよび他の化合物は、タウペプチドと大きなアミノ酸配列類似性を有する必要性は必ずしもないが、それにもかかわらず、タウペプチドの模倣体として機能し、同様の免疫応答を誘発する。上記のようにタウのモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体も使用できる。このような抗Ｉｄ抗体は、抗原を模倣し、それに対する免疫応答をもたらす（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｉｔ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  ６ｔｈ  ｅｄ．，ｐ．１８１、を参照されたい）。
【００７４】
ペプチド（および必要に応じてペプチドに融合されたキャリア）はまた、ペプチドをコードする核酸の形態で投与して、患者の体内でインサイツ発現させることができる。免疫原をコードする核酸セグメントは通常、患者の意図される標的細胞内でＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーなどの調節エレメントに連結されている。そのままでの免疫応答の誘導に望ましい、血液細胞中での発現には、軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーエレメントまたはＣＭＶ主要中初期プロモーターおよびエンハンサーが発現を誘導するのに適している。連結された調節エレメントおよびコード配列は、多くの場合、ベクターに挿入される。抗体はまた、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸の形態で投与できる。重鎖および軽鎖の両方が存在する場合、鎖は好ましくは、単鎖抗体として連結される。受動的投与のための抗体はまた、例えば、ペプチド免疫原で処置した患者の血清からアフィニティークロマトグラフィーにより調製できる。
【００７５】
ＤＮＡは裸の形態で（すなわち、コロイド状またはカプセル化材料なしで）送達できる。別の選択肢としては、レトロウイルス系（例えば、Ｌａｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｔｕｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３，１０２−１０９（１９９３）参照）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５９１１（１９９３）参照）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１８６７（１９９４）参照）；ワクシニアウイルスおよびトリのポックスウイルスを含むポックスファミリーのウイルスベクター、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルス由来のものなどのアルファウイルス属のウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，５０８−５１９（１９９６）参照）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号参照）および水疱性口内炎ウイルスなどのラブドウイルス（国際公開第９６／３４６２５号参照）ならびにパピローマウイルス（Ｏｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，３２５−３３３（１９９５）；Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ，国際公開第９４／１２６２９号およびＸｉａｏ  ＆  Ｂｒａｎｄｓｍａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４，２６３０−２６２２（１９９６））を含むいくつかのウイルスベクター系が使用できる。
【００７６】
免疫原をコードするＤＮＡ、またはそれを含有するベクターは、リポソームにパッケージすることができる。適切な脂質および関連類似体は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号および同第５，２８３，１８５号に記載されている。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡはまた、微粒子キャリアに吸着または結合させることもでき、その例として、ポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドならびにポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が挙げられる（例えば、ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏ  Ｅｎｃａｐ．１９９６を参照されたい）。
【００７７】
Ｖ．スクリーニング法
上記のように、抗体は、最初に目的とする結合特異性に関しスクリーニングされ得る。能動免疫原は、同様に、このような結合特異性を有する抗体を誘導する能力に関しスクリーニングされ得る。この場合、能動免疫原を用いて実験動物を免疫し、得られた血清は目的にかなった結合特異性に関して試験される。
【００７８】
その後、目的とする結合特異性を有する抗体を、細胞および動物モデルで試験できる。このようなスクリーニングに使用される細胞としては神経細胞を優先すべきである。神経芽腫細胞に、必要に応じてタウ病理と関連する変異と共に、タウの４リピートドメインを遺伝子導入したタウ病理の細胞モデルが報告されている（例えば、デルタＫ２８０、Ｋｈｌｉｓｔｕｎｏｖａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，５４４−５４６（２００７）を参照されたい）。別のモデルでは、ドキシサイクリンを添加することにより、タウが神経芽細胞腫Ｎ２ａ細胞株中で誘導される。この細胞モデルは、可溶性または凝集状態で細胞に対するタウの毒性、タウ遺伝子発現のスイッチをオンにした後のタウ凝集体の外観、再び遺伝子発現のスイッチをオフにした後のタウ凝集体の溶解、ならびにタウ凝集体の形成抑制またはそれらを脱凝集における抗体の効率を研究するのを可能にする。
【００７９】
抗体または能動免疫原はまた、タウと関連する疾患の遺伝子導入動物モデルでスクリーニングできる。このような遺伝子導入動物は、タウ導入遺伝子（例えば、ヒトアイソフォームのいずれか）および必要に応じて、とりわけタウ、ＡｐｏＥ、プレセニリンまたはアルファ−シヌクレインをリン酸化するキナーゼなどのヒトＡＰＰ導入遺伝子を含み得る。このような遺伝子導入動物は、タウと関連する疾患の少なくとも１つの徴候または症状を発症するように処理されている。
【００８０】
代表的な遺伝子導入動物は、マウスのＫ３株である（Ｉｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５（４１）：１５９９７−６００２（２００８））。これらのマウスは、Ｋ３６９Ｉ変異（この変異はピック病と関連している）およびＴｈｙ１．２プロモーターを有するヒトタウ導入遺伝子を有する。このモデルは、神経変性、運動障害ならびに求心性繊維および小脳顆粒細胞の変性の急速な経過を示す。別の代表的な動物は、マウスのｐＲ５株である。これらのマウスは、Ｐ３０１Ｌ変異（この変異は前頭側頭型認知症と関連している）およびＴｈｙ１．２プロモーターを有するヒトタウ導入遺伝子を有する（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．，Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２５：４０２−４０５（２０００））。これらのマウスは、神経変性のより緩やかな経過を有する。このマウスは、いくつかの脳領域および脊髄における神経原線維濃縮体を成長させる。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これは、濃縮体の形成の因果関係を研究するため、およびこれらの凝集体の生成を抑制し得る治療法をスクリーニングするための優れたモデルである。これらの動物の別の利点は、病変の比較的早期の発症である。ホモ接合系統では、タウ病態と関連する行動異常は、少なくとも、３ヶ月目の早期に観察できるが、これらの動物は少なくとも生後８ヶ月まで比較的健康を維持する。つまり、８ヶ月の時点で、これらの動物は歩き回り、それら自体で摂食し、処置効果の監視を可能にするのに十分なほど行動タスクを実行できる。６〜１３ヶ月間、これらのマウスをＡＩ  ｗＩ  ＫＬＨ−ＰＨＦ−１で能動免疫することにより、約１，０００の力価を生じ、未処置のコントロールマウスと比較して神経原線維濃縮体はより少なく、ｐＳｅｒ４２２も、体重減少も低下した。
【００８１】
抗体または活性剤の活性は、総タウまたはリン酸化タウの量の減少、Αβのアミロイド沈着物などの他の病理学的特徴の減少、および行動欠陥の抑制もしくは遅延を含む様々な基準によって評価できる。能動免疫原はまた、血清中の抗体の誘導に関し試験され得る。受動と能動の両方の免疫原は、遺伝子導入動物の血液脳関門から脳内への抗体の通過に関し試験され得る。抗体または抗体を誘発するフラグメントはまた、天然または誘導を介してタウを特徴とする疾患の症状を発症する非ヒト霊長類で試験され得る。抗体または活性剤の試験は通常、抗体または活性剤が存在しない（例えば、ビヒクルで置き換えられる）ことを除いて並列に行われるコントロール実験と同時に実行される。その後、試験中の抗体または活性剤に起因する疾患の徴候または症状の減少、遅延または抑制がコントロールと比較して評価され得る。
【００８２】
ＶＩ．治療に適する患者
神経原線維濃縮体の存在は、アルツハイマー病、ダウン症候群、軽度認知障害、原発性年齢関連タウオパチー、脳炎後パーキンソニズム、外傷後認知症またはボクサー認知症、ピック病、Ｃ型ニーマン・ピック病、核上性麻痺、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、嗜銀性顆粒病、ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｇｌｉａｌ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ、グァム筋萎縮性側索硬化症−パーキンソン病／認知症複合；大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、レビー小体型痴呆、レビー小体型アルツハイマー病（ＬＢＶＡＤ）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）を含むいくつかの疾患で認められている。本投与計画はまた、これらの疾患のいずれかの処置または予防にも使用できる。神経疾患および病状とタウの間の広範囲に及ぶ関係のために、本投与計画は、神経疾患のない個体の平均値と比較して、（例えば、ＣＳＦ内の）タウもしくはリン酸化タウのレベルの上昇を示す任意の対象の処置または予防に使用できる。本投与計画は、神経疾患と関連するタウの変異を有する個体における神経疾患の処置または予防にも使用できる。本方法は、アルツハイマー病、および特に患者における処置または予防に特に適している。
【００８３】
処置の対象となる患者は、疾患のリスクはあるが、症状を示さない個体および現在症状を示す患者を含む。疾患のリスクのある患者には、疾患の既知の遺伝的リスクを有する患者が含まれる。このような個体には、この疾患を経験している親族を有する個体、およびそのリスクが遺伝子マーカーまたは生化学的マーカーの分析によって特定されている個体が含まれる。リスクの遺伝子マーカーには、上述したものなどのタウの変異、ならびに神経疾患と関連する他の遺伝子の変異が含まれる。例えば、ホモ接合型はもちろんだがヘテロ接合型のＡｐｏＥ４対立遺伝子も、アルツハイマー病のリスクと関連している。アルツハイマー病のリスクの他のマーカーには、ＡＰＰ遺伝子の変異、特に位置７１７での変異およびハーディ変異およびスウェーデン変異と呼ばれるそれぞれ位置６７０および６７１での変異、プレセニリン遺伝子のＰＳ１およびＰＳ２の変異、ＡＤ、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の家族歴が含まれる。現在アルツハイマー病に罹患している個体は、特徴的な認知症、および上述の危険因子の存在から、ＰＥＴイメージングによって認識できる。さらに、いくつかの診断テストは、ＡＤを有する個体を同定するために利用可能である。これらには、ＣＳＦタウまたはリン酸化タウおよびΑβ４２レベルの測定が含まれる。タウまたはリン酸化タウのレベルの上昇およびΑβ４２レベルの低下は、ＡＤの存在を意味する。いくつかの変異はパーキンソン病と関連する。Ａｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３、またはロイシンリッチリピートキナーゼのＰＡＲＫ８などの他の遺伝子の変異は、パーキンソン病と関連する。個体はまた、ＤＳＭ  ＩＶ  ＴＲの基準によって、上述の神経疾患のいずれかであると診断され得る。
【００８４】
無症状の患者では、処置は任意の年齢（例えば、１０、２０、３０）で開始できる。しかし、通常、患者が４０、５０、６０または７０歳に達するまでは処置を開始する必要はない。処置は通常、一定の期間にわたり複数投薬を必要とする。処置は、経時的に抗体レベルをアッセイすることにより監視できる。応答が低下した場合は、追加免疫投与が必要である。潜在的なダウン症候群患者の場合には、母親に治療薬を投与することによって処置を出生前に開始するか、または出生直後に開始できる。
【００８５】
ＶＩＩ．医薬組成物および処置法
予防的適用では、抗体もしくは抗体を誘導するための薬剤またはその医薬組成物は、疾患（例えば、アルツハイマー病）に罹患しやすい患者、あるいは、疾患のリスクのある患者に、疾患のリスクを低減する、疾患の重症度を軽減する、または疾患の少なくとも１つの徴候もしくは症状の発症を遅延させるのに有効な投与計画（投与の用量、頻度および経路）で投与される。特に、投与計画は、脳内でタウもしくはリン酸化タウおよびそれから形成されるフィラメント対を抑制もしくは遅延させるか、および／またはその毒性作用を抑制もしくは遅延させるか、および／または行動欠陥の発症を抑制もしくは遅延させるのに有効であるのが好ましい。治療適用では、抗体または抗体を誘発する薬剤は、疾患の少なくとも１つの徴候または症状の改善または少なくともさらなる悪化を抑制するのに効果的な投与計画（投与の用量、頻度および経路）で疾患（例えば、アルツハイマー病）の疑いのある患者、または既に疾患に罹患している患者に投与される。特に、この投与計画は、タウ、リン酸化タウ、もしくはそれから形成されるフィラメント対のレベルのさらなる上昇、関連する毒性および／または行動障害を低減または少なくとも抑制するのに効果的であるのが好ましい。
【００８６】
個々の処置された患者が、本発明の方法によって処置されない同等の患者のコントロール集団における平均的な治療成績よりも良好な治療成績を達成した場合、または比較臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）で、コントロール患者に対する処置患者のより良好な治療成績がｐ＜０．０５または０．０１、あるいはさらには０．００１のレベルで示される場合には、投与計画は治療的または予防的に効果的であると見なされる。
【００８７】
多くの異なる要因、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がＡｐｏＥ保因者であるか否か、患者がヒトまたは動物であるか否か、他の薬剤が投与されるか、処置が予防的または治療的であるか否かに応じて、有効用量は変化する。
【００８８】
抗体の代表的な用量範囲は、約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ−患者体重であり、より一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ−患者体重または０．１〜３ｍｇ／ｋｇ−患者体重または０．１５〜２ｍｇ／ｋｇ−患者体重または０．１５〜１．５ｍｇ／ｋｇ−患者体重である。抗体は、このような用量で毎日、一日置きに、毎週、隔週、毎月、四半期ごと、または実証的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与できる。代表的な処置は、長期間にわたって、例えば、少なくとも６ヶ月間、複数回投与での投与を必要とする。さらなる代表的な投与計画は、２週間毎に１回、または月に１回、または３〜６ヶ月毎に１回の投与を必要とする。
【００８９】
能動投与のための薬剤の量は、患者あたり０．１〜５００μｇで、より一般的にはヒトへの投与のための注射あたり１〜１００または１〜１０μｇと変化する。注射のタイミングは、１日に１回から１年に１回、１０年に１回と大きく変化し得る。典型的な投与計画は、免疫化に続いて６週間間隔または２ヶ月などの時間間隔でのブースター注射からなる。別の投与計画は、免疫化に続いて１、２および１２ヶ月後のブースター注射からなる。別の投与計画は、生きている間、２ヶ月毎の注射を伴う。あるいは、免疫応答の監視によって必要とされる場合、ブースター注射は不定期であり得る。
【００９０】
抗体または抗体を誘導するための薬剤は、好ましくは末梢経路（すなわち、投与または誘導される抗体が血液脳関門を通過し、脳内の意図された部位に到達する経路）を介して投与される。投与経路には、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内、眼内、髄腔内または筋肉内投与が含まれる。好ましい抗体の投与経路は、静脈内および皮下経路である。能動免疫に好ましい経路は、皮下および筋肉内経路である。この種の注射は、最も典型的には、腕または脚の筋肉に行われる。いくつかの方法では、薬剤は、沈着物が蓄積した特定の組織に直接注射、例えば、頭蓋内注射される。
【００９１】
非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張で、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための投与量）で提供され得る。医薬組成物は、１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて処方できる。製剤は、選択された投与経路に依存する。注射のために、抗体は、水溶液で、好ましくは、（注射部位での不快感を軽減するために）ハンクス液、リンゲル液、もしくは生理食塩水または酢酸緩衝液などの生理的に適合性のある緩衝液で処方できる。溶液は、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有できる。あるいは、抗体は、使用前に適切なビークル、例えば、無菌で発熱物質を含まない水で構成するために凍結乾燥形態であり得る。
【００９２】
本投与計画は、処置される疾患の処置または予防に有効な別の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、アルツハイマー病の場合、本投与計画は、Ａβ（国際公開第２０００／０７２８８０号）、コリンエステラーゼ阻害剤もしくはメマンチンに対する免疫療法と組み合わせることができ、またはパーキンソン病の免疫療法の場合には、α−シヌクレイン（国際公開第２００８／１０３４７２号）、レボドパ、ドーパミン作動薬、ＣＯＭＴ阻害剤、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、アマンタジン、もしくは抗コリン薬に対する免疫療法と組み合わせることができる。
【００９３】
ＶＩＩＩ．インビボイメージング、診断方法、および最適化免疫療法
本発明は、患者のタウタンパク質沈着物（例えば、神経原線維濃縮体およびタウ封入体）をインビボイメージングする方法を提供する。本方法は、タウに結合する抗体（例えば、マウス、ヒト化、キメラまたはベニヤ１６Ｂ５抗体）などの薬剤を患者に投与し、その後、タウに結合した薬剤を検出することによって機能する。アミノ酸２４〜４６内のタウのエピトープに結合する抗体が好ましい。いくつかの方法では、抗体は、アミノ酸２５〜４４内またはアミノ酸３０〜３９内のエピトープに結合する。投与した抗体の除去反応は、Ｆａｂなどの完全長の定常領域を欠く抗体フラグメントを使用することによって回避または低減することができる。いくつかの方法では、同一の抗体が、処置および診断試薬の両方として機能し得る。
【００９４】
診断試薬は、患者の体内への静脈内注射によって、または頭蓋内注射によるかもしくは、頭蓋骨に孔を穿孔することによって脳に直接投与できる。試薬の投与量は、処置方法の場合と同じ範囲内である必要がある。典型的には、試薬は標識されるが、いくつかの方法では、タウに対する親和性を有する一次試薬は標識されず、一次試薬に結合する二次標識剤が使用される。標識の選択は検出の手段に依存する。例えば、蛍光標識は光学的検出に適する。常磁性標識の使用は、外科的介入を用いない断層撮影検出に適する。放射性標識はまた、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴを用いて検出できる。
【００９５】
タウタンパク質沈着物のインビボイメージングの方法は、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺およびピック病、またはそのような疾患に対する感受性などのタウオパチーを診断するのに、またはその診断を確定するのに有用である。例えば、本方法は、認知症の症状を示す患者に使用できる。患者に異常な神経原線維濃縮体がある場合、その患者は、アルツハイマー病を罹患している可能性がある。別の選択肢としては、患者に異常なタウ封入体がある場合には、封入体の位置に応じて、その患者は前頭側頭葉変性症に罹患している可能性がある。本方法はまた、無症状の患者にも使用できる。異常なタウタンパク質沈着物の存在は、将来、症候性疾患に罹りやすいことを示す。この方法はまた、以前にタウ関連疾患と診断された患者における疾患の進行および／または処置に対する応答を監視するのに有用である。
【００９６】
診断は、標識された遺伝子座の数、サイズ、および／または強度を対応するベースライン値と比較することによって行われ得る。ベースライン値は、非疾患個体集団における平均レベルを表し得る。ベースライン値はまた、同じ患者で決定された以前のレベルを表し得る。例えば、患者のベースライン値は、タウ免疫療法処置を開始する前に測定することができ、その後、測定値をベースライン値と比較できる。ベースラインシグナルに対する値の減少は、処置に対する陽性反応を示す。
【００９７】
一部の患者では、タウオパチーの診断は、ＰＥＴスキャンを実行することによって支援され得る。ＰＥＴスキャンは、例えば、従来のＰＥＴ撮像装置および補助装置を用いて実施され得る。スキャンは通常、タウタンパク質沈着物と関連することが一般に知られている脳の１つまたは複数の領域、およびあったとしても少数の沈着物が通常、存在してコントロールとしての役割を果たす１つまたは複数の領域を含む。
【００９８】
ＰＥＴスキャンで検出したシグナルは、多次元画像として表すことができる。多次元画像は、二次元では脳の断面を表し、三次元では三次元脳を表すか、または四次元では三次元脳の経時的変化を表し得る。カラースケールは、異なる色を用いて行うことができ、異なる標識量および検出される推定タウタンパク質沈着物を示す。スキャンの結果はまた、検出される標識の量およびその結果としてのタウタンパク質沈着物の量と関連する数で数値的に提示できる。特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）の、沈着物と関連することが知られている脳の領域に存在する標識は、前者の領域内における沈着物の程度を表す比率を提供するために、沈着物と関連することが知られていない領域内に存在する標識と比較できる。同じ放射性標識リガンドに対するこのような比率は、タウタンパク質沈着物の比較可能な尺度および異なる患者間でのその変化を与える。
【００９９】
いくつかの方法では、ＰＥＴスキャンは、ＭＲＩまたはＣＡＴスキャンと同時に、またはＭＲＩまたはＣＡＴスキャンと同じ患者の訪問で実施される。ＭＲＩまたはＣＡＴスキャンは、ＰＥＴスキャンよりも脳のより解剖学的詳細を提供する。しかし、ＰＥＴスキャンからの画像は、脳内の解剖学的構造に対するＰＥＴリガンドおよび推定タウ沈着物の位置をより正確に示すＭＲＩまたはＣＡＴスキャン画像上に重ね合わせることができる。一部の装置は、スキャンの間に患者が位置を変えることなく患者のＰＥＴスキャンとＭＲＩまたはＣＡＴスキャンの両方を実行し、画像の重ね合わせを容易にすることできる。
【０１００】
適切なＰＥＴリガンドは、本発明の抗体（例えば、マウス、ヒト化、キメラまたはベニヤ１６Ｂ５抗体）の放射性標識抗体を含む。使用される放射性同位体は、例えば、Ｃ１１、Ｎ１３、Ｏ１５、Ｆ１８、またはＩ１２３であり得る。ＰＥＴリガンドの投与と、スキャンを実行する間隔は、ＰＥＴリガンド、特に脳への取り込み速度および除去速度、ならびにその放射性標識物の半減期に依存し得る。
【０１０１】
ＰＥＴスキャンはまた、無症状の患者または軽度認知障害の症状を有するが、タウオパチーと診断されておらず、それでもタウオパチーを発症するリスクが高い患者で予防処置として実施することもできる。無症状の患者では、スキャンは、家族歴、遺伝的もしくは生化学的危険因子または熟年のためにタウオパチーのリスクが高いと考えられる個体に特に有用である。予防的スキャンは、例えば、４５〜７５歳の年齢の患者で開始できる。一部の患者では、最初のスキャンは５０歳で行われる。
【０１０２】
予防的スキャンは、例えば、６ヶ月〜１０年、好ましくは、１〜５年の間隔で行われ得る。一部の患者では、予防的スキャンが毎年行われる。予防的措置として行われるＰＥＴスキャンが異常に高いレベルのタウタンパク質沈着物を示す場合、免疫療法が開始され、その後、ＰＥＴスキャンが、タウオパチーと診断された患者と同様に開始できる。予防処置として行われるＰＥＴスキャンが正常レベル内にあるタウタンパク質沈着物のレベルを示す場合、さらにＰＥＴスキャンが、前述のように、６ヶ月〜１０年、好ましくは、１〜５年の間隔で、またはタウオパチーもしくは軽度認知障害の徴候および症状の出現に応答して行われ得る。上記の正常レベルのタウタンパク質沈着物が検出される場合、予防的スキャンとタウ標的化免疫療法の投与を組み合わせることによって、タウタンパク質沈着物のレベルは正常レベルまで低下するかもしくはそれにより近いレベルになるか、または少なくともさらに増加するのを防ぐことができ、患者は、予防的スキャンおよびタウ標的化免疫療法を受けていない場合よりも長い期間（例えば、少なくとも５、１０、１５もしくは２０年、または患者の残りの人生の間）、タウオパチーのない状態のままでとどまり得る。
【０１０３】
正常レベルのタウタンパク質沈着物は、特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）と診断されておらず、このような疾患を発症するリスクが高いとみなされていない母集団の個体の代表的な試料（例えば、年齢が５０歳未満の無病の個体の代表的な試料）の脳内における神経原線維濃縮体またはタウ封入体の量によって決定され得る。あるいは、タウタンパク質沈着物が生じることが知られている脳の領域における、本発明の方法によるＰＥＴシグナルが、このような沈着物が通常生じることが知られている脳の領域からのシグナルと（測定の精度内で）異なっていない場合には、正常なレベルが個々の患者で認識され得る。個体におけるレベルの上昇は、正常レベルとの比較（例えば、平均＋標準偏差の分散の外側のレベル）によってまたは、単に、沈着物と関連することが知られていない領域と比較したタウタンパク質沈着物と関連する脳の領域における実験誤差を超えて上昇したシグナルから認識され得る。個体および集団におけるタウタンパク質沈着物のレベルを比較する目的の場合、タウタンパク質沈着物は、好ましくは、脳の同じ領域（単一または複数）において決定されるべきであり、これらの領域は、特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）と関連するタウタンパク質沈着物を形成することが知られている少なくとも１つの領域を含む。タウタンパク質沈着物のレベルが上昇した患者は、免疫療法を開始するための候補である。
【０１０４】
免疫療法を開始した後のタウタンパク質沈着物のレベルの低下は、最初に、処置が所望の効果を有していることを示すものとして見ることができる。観察された減少は、例えば、ベースライン値の１〜１００％、１〜５０％、または１〜２５％の範囲内であり得る。このような効果は、沈着物を形成することが知られている脳の１つまたは複数の領域で測定できるか、またはそのような領域の平均値から測定できる。処置の総合効果は、処置しない場合に、平均的な非処置患者で生じるタウタンパク質沈着物の増加にベースラインに対する減少率を加えることによって概算できる。
【０１０５】
タウタンパク質沈着物のほぼ一定のレベルでの維持またはタウタンパク質沈着物が少しでも増加することは、準最適な応答ではあるが、処置に対する応答の指標となり得る。このような応答は、免疫療法がタウタンパク質沈着物のさらなる増加を抑制する効果を有するか否かを決定するために、処置を受けていない特定のタウオパチー（例えば、アルツハイマー病）を有する患者におけるタウタンパク質沈着物のレベルの時間経過と比較できる。
【０１０６】
タウタンパク質沈着物の変化の監視により、その処置に応答した免疫療法または他の治療計画の調整が可能になる。ＰＥＴ監視は、処置に対する応答の性質および程度の指標を提供する。その後、処置の調整を行うべきか否かを判断することができ、必要であれば、処置はＰＥＴ監視に応じて調整できる。したがって、他のバイオマーカー、ＭＲＩまたは認知の測定が検出可能なほど応答する前に、ＰＥＴ監視によって、タウ標的化免疫療法または他の処置の投与計画の調整が可能になる。著しい変化は、ベースに対する処置後のパラメータの値を比較することで、処置が有益な効果をもたらしたかまたはもたらしていないといういくつかの証拠が得られることを意味する。いくつかの事例では、患者自身におけるパラメータの値の変化から、処置が有益な効果をもたらしたかまたはもたらしていないという証拠が得られる。他の例では、患者における値の変化がある場合、免疫療法を受けていない患者の代表的なコントロール集団における値の変化がある場合にはその変化と比較される。特定の患者の応答とコントロール患者の正常な応答との差異（例えば、平均値プラス標準偏差の分散）はまた、免疫療法の投与計画が患者において有益な効果を達成しているかまたはしていないかという証拠を提供することができる。
【０１０７】
一部の患者では、監視によって、タウタンパク質沈着物の検出可能な低下が示されるが、タウタンパク質沈着物のレベルは正常を上回ったままである。このような患者では、許容できない副作用がない場合、そのままの投与頻度および／もしくは用量で、または最大推奨用量でない場合は、投与頻度および／もしくは用量を増加させて、治療計画を継続することができる。
【０１０８】
監視によって、患者におけるタウタンパク質沈着物のレベルが正常またはほぼ正常まで低下したことが示される場合は、免疫療法の投与計画は、誘導の投与計画（すなわち、タウタンパク質沈着物のレベルを低下させる計画）から維持の投与計画（すなわち、ほぼ一定のレベルでタウタンパク質沈着物を維持する計画）に調整できる。このような投与計画は、免疫療法の用量および／または投与頻度を減少させることによって行われ得る。
【０１０９】
他の患者では、監視は、免疫療法がいくつかの有益な効果を有しているが準最適な効果であることを示し得る。最適な効果は、治療の開始後の所定の時点で免疫療法を受けているタウオパチー患者の代表的な試料の（タウタンパク質沈着物が形成することが知られているその全体脳もしくは代表的な領域（単一または複数）にわたって測定または計算された）タウタンパク質沈着物の変化の上半分または四分位内のタウタンパク質沈着物のレベルの減少率として定義され得る。タウタンパク質沈着物が少し低下した患者、またはタウタンパク質沈着物が一定のままの患者、または増加するが、免疫療法の非存在下で（例えば、免疫療法を投与されていない患者のコントロール群から推測したときに）予想される値よりも低い程度までの増加である患者は、陽性ではあるが準最適な反応を経験する患者として分類され得る。このような患者には、必要に応じて、薬剤の用量および／または投与頻度を増加させる投与計画の調整が施され得る。
【０１１０】
一部の患者では、タウタンパク質沈着物は、免疫療法を受けていない患者におけるタウ沈着と同様にまたはそれを上回って増加し得る。このような増加が、１８ヶ月または２年などの期間にわたって継続する場合は、薬剤の頻度または用量が増加した後であっても、必要に応じて、他の処置を優先して免疫療法が中断され得る。
【０１１１】
タウオパチーの診断、監視、および処置の調整に関する前述の説明は、主にＰＥＴスキャンの使用に焦点を置いてきた。しかし、本発明のタウ抗体（例えば、マウス、ヒト化、キメラもしくはベニヤ１６Ｂ５抗体）の使用の影響を受けやすいタウタンパク質沈着物の視覚化および／または測定ための任意の他の技術が、このような方法を実行するためのＰＥＴスキャンの代わりに使用できる。
【０１１２】
実施例
実施例１．抗体１６Ｂ５の生成
リン酸化されているタウまたはリン酸化されていないタウを認識するパン抗体１６Ｂ５を、精製したタウに対して産生し、ＥＬＩＳＡアッセイでの高い親和性捕捉特性に基づいて選択した。
【０１１３】
実施例２．抗体１６Ｂ５のクローニングおよび配列決定
ＲＮＡを、トリゾールＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１６Ｂ５抗体を発現するペレット化細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度を、Ｑｕａｎｔ−ＩＴキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定した。
【０１１４】
５’−ＲＡＣＥを利用して、Ｓｍａｒｔ  ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＩｇＧのｍＲＮＡの５’末端を増幅した。約１μｇのＲＮＡをＲＴ反応に使用し、Ｓｍａｒｔ  ＲＡＣＥキットのユニバーサルプライマーおよびＥｘｏｎＢＩＯで設計した遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を用いて、ｃＤＮＡプールをさらに増幅した。
【０１１５】
プライマー配列：
ユニバーサルプライマー：ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ（配列番号７）
ＧＡＰ：
ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ：ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣ（配列番号８）
ＩｇＧ２ｂ：ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＧＣ（配列番号９）
【０１１６】
ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＳＵＰＥＲ−ブラントベクター（Ａｄｅｘｏｎ、ｗｗｗ．ａｄｅｘｏｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）に挿入した。重鎖に対しては、１５個のコロニーをミニプレップし、配列決定した。軽鎖に関しては、コロニーＰＣＲを行い、内因性の異常な軽鎖を区別し、コロニーＰＣＲから増幅されなかったクローンのみの配列決定を行った。配列決定の結果は、ＮＴＩベクター上で分析した。アダプターおよびＧＳＰのプライマー配列をマップ上にマークした。アダプターとＧＳＰ配列の間の領域は、リーダー、シグナルペプチドおよびＶ−領域、ならびに定常領域の一部を含むＩｇＧ重鎖配列である。ＯＲＦをマップ上にマークした。
【０１１７】
実施例３．抗体１６Ｂ５のエピトープマッピング
ペプチドフラグメント分析によるエピトープの特定．Ｎ末端インサートを含まず、４つの微小管結合リピートおよびＰ３０１Ｌ変異（ｒタウ）を含むヒトのタウ配列を大腸菌内で発現させ、精製した。タウのこの形態は、（タウの最長のアイソフォームに基づくナンバリング規則を使用してＰ３０１Ｌに相当する）位置２４３のプロリンをロイシンで置換した配列番号３の配列を有する。２００ｕｇのタウの酵素消化を次の４つの異なるプロテアーゼのいずれかを用いて行った：（アルギニンおよびリシンのカルボキシル末端で切断する）トリプシン、（チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびロイシンのカルボキシル末端で主として切断する）キモトリプシン、（リシンのカルボキシル末端で切断する）ＬｙｓＣ、または（グルタミン酸残基およびまれにアスパラギン残基の後ろで切断する）ＧｌｕＣ。全てのプロテアーゼをＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、消化を３７℃で１６時間行った。得られたペプチドフラグメントを１０μｇの１６Ｂ５と共にインキュベートし、プロテインＧ磁気ビーズ（ＮＥＢ）を用いて沈殿させた。沈殿物を完全に３００ｍＭのＮａＣｌおよび０．５％ＮＰ−４０を含有するＰＢＳ中で洗浄し、次いで、１００ｍＭグリシン中１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ２．８）で溶出した。溶出物を減圧下で乾燥し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に再懸濁した。再懸濁した溶出液を４．６ｘ５０ｍｍのＣ１８カラムにロードし、その後、０．０７５％ＴＦＡとアセトニトリルの直線勾配を用いてＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステム）により分画した。ピーク画分を収集し、乾燥し、蒸留水に再懸濁した。ペプチドの質量および同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって決定した。配列番号１の残基２５〜４４に対応するピークは、ＬｙｓＣのＭＳスペクトルで同定された。配列番号１の残基２５〜４４および２４〜４４に対応するピークは、トリプシンのＭＳスペクトルで同定された。キモトリプシンおよびＧｌｕＣ消化物からのシグナルが得られなかったことは、いくつかのエピトープが、配列番号１の残基２９および／または配列番号１の残基３７を含むことができることを示唆する。
【０１１８】
変異分析によるエピトープの特定．（上述の）ペプチドフラグメント分析によって決定された結果を用いて、ｒタウの欠失変異誘発を標準的な分子生物学的方法を用いる全プラスミドの増幅により行った。タンパク質を少量の細菌培養物中で発現させ、清澄化した細菌溶解物の等容量を電気泳動し、ブロットし、１６Ｂ５抗体で染色した。試料のローディングを考慮に入れるために、タウのＣ末端領域（Ｃ末端エピトープ）に特異性を有する抗体のタウ４６を用いて、二通りのブロットを染色した。両方の抗体を０．２μｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ蛍光スキャナーを用いて画像を取得した。タウの次の欠失変異体を作製し、このようにして分析した：Δ５−２４、Δ２３−３２、Δ２５−４４、Δ３０−３９、およびΔ３７−４６。図１および図２に示すように、タウのΔ２５−４４およびΔ３０−３９欠失変異体は１６Ｂ５抗体により検出されず、１６Ｂ５によって認識されるエピトープがそれらの残基内にある証拠が得られた。タウのΔ３７−４６欠失変異体は１６Ｂ５でごくわずかに検出可能であり、３７−４６内の残基のいくつか（例えば、残基３７）が１６Ｂ５のタウへの結合において役割を果たし得るという証拠が得られた。１６Ｂ５抗体は、タウのΔ２３−３２欠失変異体をΔ５−２４欠失変異体より少ない程度、かつΔ２５−４４およびΔ３０−３９欠失変異体よりも多い程度に染色し、１６Ｂ５がまた、残基３３〜３６、３０〜３６、３３〜３７、３０〜３７または３３〜３９を含むペプチドに結合することができるという証拠が得られた。全体として、タウ欠失変異体から得られたデータは、１６Ｂ５により認識されるエピトープが配列番号１の残基２３〜３２の一部または全部および配列番号１の残基３７〜４６の一部または全部を含み得ることを示唆する。例えば、１６Ｂ５は、配列番号１の残基３２〜３８または２８〜４１内のエピトープを認識できる。
【０１１９】
アラニンスキャニングによるエピトープの特定．次に、残基３０〜４２の範囲のタウの領域内の単一残基を、ＰＣＲ変異誘発を用いてアラニンに変異させた。変異したタンパク質を発現させ、上記のように溶解物を電気泳動によって分離し、１６Ｂ５抗体またはタウ４６抗体のいずれかを用いてブロットした。この分析の結果を図３に示す。Ｔ３０Ａ、Ｍ３１Ａ、Ｈ３２Ａ、Ｑ３３Ａ、Ｄ３４Ａ、Ｑ３５Ａ、Ｅ３６Ａ、Ｇ３７Ａ、Ｄ３８Ａ、Ｔ３９Ａ、Ｄ４０Ａ、Ａ４１Ｌ、およびＧ４２Ａを含む分析した特定の点変異体をブロット上に示した。特に関心のある残基を各ブロット上にボックスで囲んである。１６Ｂ５の検出可能な結合は、Ｑ３３Ａタウ変異によって完全に除去され、Ｇ３７Ａタウ変異によって実質的に減少し、残基３３およびより少ない程度の残基３７が１６Ｂ５によって認識されるエピトープの重要な構成要素であり得る証拠が得られた。他の残基は、Ｂｉａｃｏｒｅ分析において１６Ｂ５によって認識されるエピトープの重要な構成要素であり得る。
【０１２０】
実施例４．タウオパチーのｈタウ．Ｐ３０１Ｌ遺伝子導入マウスモデルにおける受動免疫
免疫化．ＦＶＢ／Ｎ遺伝的バックグラウンドの３ヶ月齢のｈタウ．Ｐ３０１Ｌ−Ｔｇの雌マウスをこの研究に使用した。１０ｍｇ／ｋｇの試験抗体およびコントロール抗体の投与を、週に一度、腹腔内に行った。処置期間は約５ヶ月であった。２３回の注射の後、マウスを屠殺して本研究を終えた。本研究で投与した試験抗体およびコントロール抗体を表１に記載する。
【表１】
2019521649.tif 000003
【０１２１】
早死には、遺伝子導入マウスのタウオパチーのモデルで観察された表現型である。本研究で用いた特定のモデルは、発症の変動が高いが、６ヶ月の年齢で高リン酸化タウを生じる。このマウスはまた、下肢の握り行動のような運動欠陥を患い、全般的な移動性が低減し、８〜１１ヶ月の年齢で早期に死亡する（ｒｅＭＹＮＤ未発表データ、Ｔｅｒｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。握り行動表現型および体重減少の存在によって特徴付けられる末期の病徴を呈するマウスを屠殺した。予想外に多い数のマウスが、これらの症状の存在なしに早期に死亡した。そのような場合の死の原因は、後期タウオパチーまたは試験抗体とは無関係であると考えられ、その代わりに近交系ＦＶＢ／Ｎバックグラウンドと関連すると考えられる。
【０１２２】
表２は、本研究の過程における全てのマウスの全生存期間の概要を示す。
【表２】
2019521649.tif 000004
＊Ｋ群の１匹のマウスは研究の開始時に入れ替える必要があった。この入れ替えマウスに含めて、または含めないでデータを解析できる。
【０１２３】
屠殺後、マウスを解剖し、ポッター型メカニカルホモジナイザー（ＶＯＳ  １４  Ｓ４０、速度７５０ｒｐｍ、ＶＷＲ）を用いて、２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．１）；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｍｅｒｃｋ）；１ｍＭのエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；５ｍＭのピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）；３０ｍＭのフッ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；１ｍＭのＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）；２ｍＭのバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）；１０ｍＭの１，１０−オルト−フェナントロリン一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；５μｇ／ｍｌの大豆トリプシン阻害剤；５μｇ／ｍｌのペプスタチン；およびプロテイナーゼ阻害剤のカクテル（ＣＰＩ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を含む１０重量体積の氷冷トリスプロテイナーゼ−ホスファターゼ−阻害剤の緩衝液（ＴＰＰＩ−緩衝液）中で脳幹および中脳をホモジナイズした。それぞれ１４０μｌおよび１００μｌの脳幹および中脳ホモジネート（ＴｏｔＨ）の固定体積（総容積の約半分）を４℃で６０分間、１３６０００ｘｇで遠心分離（ＴＬＡ−５５ローター、ＯｐｔｉｍａＴＭＴＬＸ超遠心機、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）し、トリス可溶性画分（ＳＦ）を作製し、全ホモジネートの残りを−８０℃で保存した。遠心分離機ホルダの数（Ｎ＝１２）が限られているため、試料を無作為化して、遠心分離を均等にし、異なる処置群を異なる遠心分離セッションにわたって分割した。
【０１２４】
上清（Ｓ１、「可溶性画分」または「ＳＦ」とも呼ばれる）を、ペレット（Ｐ１）から分離し、等分して、−８０℃で保存した。Ｐ１ペレットを１０重量体積の高塩溶液（０．８５ＭのＮａＣｌ含有ＴＰＰＩ緩衝液）に可溶化し、４℃で３０分間、２００００ｘｇで遠心分離した。得られた高塩ペレット（Ｐ２）を−８０℃で保存した。上清（Ｓ２）を１０％サルコシルの１０分の１の１％サルコシルに入れ、トップオーバートップロータリータンブラー（ｔｏｐ−ｏｖｅｒ−ｔｏｐ  ｒｏｔａｒｙ  ｔｕｍｂｌｅｒ）で６０分間室温でインキュベートし、その後、４℃で６０分間、１３６０００ｘｇで遠心分離した。サルコシル可溶性上清（Ｓ３）を−８０℃で保存し、サルコシル不溶性ペレット（Ｐ３、「不溶性画分」または「ＩＦ」とも呼ばれる）を、３０μｌのＴＰＰＩ緩衝液に再懸濁し、分注した。上記の分画プロトコルによって作製した全ホモジネート（ＴｏｔＨ）、トリス可溶性（ＳＦ）、およびサルコシル不溶性（ＩＦ）の脳幹画分を、その後のポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング分析に使用した。
【０１２５】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティング。従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングの適用のために、試料を変性させ、１０分間９５℃でインキュベートすることによって還元し、７．５％のＴｒｉｓ−ＨＣｌゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＸＴプレキャストゲル、２６ウェルコーム、１５μｌ、１．０ｍｍ；Ｂｉｏｒａｄ）上で分離した。ＰＶＤＦ−膜（ｉＢｌｏｔ（商標）ゲルトランスファースタック（Ｇｅｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋ）、ＰＶＤＦ、レギュラー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を乾燥電気泳動転写（ｉＢｌｏｔ（商標）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））した後、膜を３０分間、０．４％ＰＦＡ中で洗浄し、その後、トリス緩衝食塩水で洗浄した。次に、膜を５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ、ｐＨ７．６）中で１時間インキュベートした。ブロットを、表３に示した作業濃度で、様々な抗タウ一次抗体と一晩インキュベートした。洗浄し、抗マウスまたは抗ウサギＨＲＰ標識二次抗体（ヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＤＡＫＯ）とインキュベートした後に、ブロットをＥＣＬ検出システム（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、製品番号３４０９６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で現像した。異なる露光時間で画像をデジタル記録（ＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋｓ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ、ＵＶＰ）し、専用ソフトウェア（ＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＵＶＰ）をブロットの分析のために使用した。比較のために、インターゲルリファレンスゲルの泳動を行い、比較のために一定分量の４画分を各ゲル上で移動させた。検出のために使用した抗タウ一次モノクローナル抗体には、ＡＴ１００（リン酸化タウ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、希釈１：２５０）、ＡＴ８（リン酸化タウ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、希釈１：５００）、ＨＴ７（パンタウ、Ｐｉｅｒｃｅ、希釈１：１０００）、および１Ｆ５（試験施設には知られていないエピトープ、Ｎｅｏｔｏｐｅ、希釈３：５００）を含めた。ブロットを、ローディングコントロールとして抗ＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ９４８５；希釈１：２５００）で再プローブした。パンタウ抗体は、リン酸化タウに特異的ではない。
【表３】
2019521649.tif 000005
＊ＩｇＧ２ｂアイソタイプ、ＪＨ１３１−１Ｆ５．４．１ハイブリドーマ、ロット番号ＮＢ−００８１
【０１２６】
図４に示すように、６Ｆ１０コントロール抗体で治療した動物と比較して、タウの量の統計的に有意な減少が、１６Ｂ５抗体で処置した動物由来のサルコシル不溶性脳幹画分で観察された。統計的有意性をスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５を用いて評価した。この減少は、リン酸化タウ特異的抗体（ＡＴ８、左上のパネル；ＡＴ１００、左下のパネル；１Ｆ５、右上のパネル）およびパン−タウ抗体（ＨＴ７、右下のパネル）の両方で観察された。全ホモジネートのウェスタンブロットはまた、リン酸特異的抗体で検出した場合、６Ｆ１０抗体で治療したコントロール動物と比較して１６Ｂ５処置動物における総タウに対するリン酸化タウの比率の有意な低下を示した。（ＨＴ７パンタウ抗体で検出されたシグナルで割ったＡＴ８抗リン酸化タウ抗体で検出されたシグナルを示す）図５の左パネルを参照されたい。対照的に、６Ｆ１０抗体で治療したコントロール動物と比較して１６Ｂ５で治療した動物の全ホモジネートにおけるＧＡＰＤＨレベルに対する総タウの比率において有意な変化はなかった。（ＧＡＰＤＨ抗体で検出されたシグナルで割ったＨＴ７パンタウ抗体で検出されたシグナルを示す）図５の右パネルを参照されたい。これらのデータは、ホモジネート中の総タウではなくリン酸化タウのレベルが低下したという証拠を提供する。
【０１２７】
組織学的分析．視床下核アネックス不確帯（ＳＴＨ／ＺＩ）および小脳の挿入核、前方および後方部、アネックス外側小脳核（ＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴ）において、抗リン酸化タウ抗体を用いた免疫組織化学的分析を行った。矢状ビブラトーム切片（４０μｍ）を０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中で、使用するまで４℃で保存した。示したブレグマで、マウスあたり８つの切片をｍＡｂのＡＴ８、ＡＴ１００または１Ｆ５でフリーフローティング染色した。切片を、以下の表４に示した抗体を用いた染色用に選択した。特定の染色用として選択した全ての動物の切片を、染色および盲検定量化のために無作為化した。
【０１２８】
フリーフローティング切片を、Ｎｅｔｗｅｌｌｓ（商標）中でインキュベートした。次いで、切片をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳおよびメタノール（１：１）中の１．５％過酸化水素で２０分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。０．１％トリトンＸ１００を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で切片を３回洗浄した後、切片をＰＢＳＴ中１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中で３０分間ブロッキングし、その後、１０％ＦＣＳを有するＰＢＳＴ中、それぞれ０．４μｇ／ｍｌおよび０．０５μｇ／ｍｌの濃度を使用して一次抗体ＡＴ８、ＡＴ１００（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一晩インキュベートした。洗浄後、切片をヤギ抗マウスペルオキシダーゼ標識（ＧＡＭＰＯ）二次抗体（ＤＡＫＯ、ＰＢＳＴ中１／５００、１０％ＦＣＳ）でインキュベートし、シグナルを３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ、１０ｍｌあたり３μｌのＨ２Ｏ２を有する１０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌあたり１錠）で発色させた。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、エタノールおよびキシレン（Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ）中で５ステップ（５０、７０、９５および２ｘ１００％）で脱水し、Ｄｅｐｅｘ（Ｄｅｐｅｘ封入剤、ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でマウントした。
【表４】
2019521649.tif 000006
【０１２９】
カラービューＩＩオリンパスカメラを装着したオリンパスＢＸ４１顕微鏡を用いて画像を取得し、ＡｎａｌｙＳＩＳ  Ｆｉｖｅ−Ｃｅｌｌ＾Ｄソフトウェアを用いてコンピュータで分析した。顕微鏡のための光強度およびコンデンサーの設定は、画像取得プロセス中一定に維持した。全ての取得画像を同じコンピュータサブルーチンに供し、調査者による偏りを最小限にした。解析の間中、密度スライス閾値処理を均等に適用した。
【０１３０】
以下に定義するような関心領域を、染色シグナル（単一または複数）の自動定量化のために選択した。視床下核および不確帯は、それぞれ大脳脚により腹側に、および白質によって背側に、さらに細胞密度の違いに基づいて区切られた（矢状小脳切片、ブレグマ１、３２−１、９２）。小脳の挿入核、前方および後方部分、ならびに横小脳核は、白質および細胞密度の変化ならびに第三脳室によって区切られた（矢状小脳切片、ＬＡＴについてはブレグマ１、９２−２、６４およびＩｎｔＡ／Ｐについては０、８４−１、８）。それぞれの染色について、マウスあたりＳＴＨ／ＺＩを含む６個の脳切片およびＩｎｔＡ／Ｐ／ＬＡＴを含む１６個の切片を分析に含めた。
【０１３１】
図６に示すように、１６Ｂ５抗体で処置した動物の小脳核および視床下部領域で検出されたリン酸化タウの量は、６Ｆ１０抗体で処置したコントロール動物の同じ構造で検出されたリン酸化タウの量と比較して有意に減少した。統計的有意性をスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５を用いて評価した。
【０１３２】
実施例５．１６Ｂ５のヒト化
配列解析により、１６Ｂ５抗体が、マウスカバットサブグループ１に属し、ヒトカバットサブグループ４に対応する配列番号１６の配列を有する可変カッパ（Ｖｋ）ドメインを有することが示される。カバットＣＤＲには下線が引いてある。１６Ｂ５抗体の可変重鎖（Ｖｈ）ドメインは、マウスカバットサブグループ２ｂに属し、ヒトカバットサブグループ１に対応する配列番号１０の配列を有する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ＮＩＨ出版物番号９１−３２４２）。カバットＣＤＲには下線が引いてある。
【０１３３】
１６Ｂ５ Ｖｋドメインは、１７残基のＣＤＲ−Ｌ１配列（ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ、配列番号１７）、７残基のＣＤＲ−Ｌ２配列（ＷＡＳＴＲＥＳ、配列番号１８）、および８残基のＣＤＲ−Ｌ３（ＫＱＳＹＴＬＲＴ、配列番号１９）を含む。ＣＤＲ−Ｌ１配列は正準クラス３に属し、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３配列はクラス１に属する（Ｍａｒｔｉｎ  ＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５）。
【０１３４】
１６Ｂ５  Ｖｈドメインは、カバットナンバリングに基づいて５残基のＣＤＲ−Ｈ１配列（ＹＨＧＭＤ、配列番号１１）またはカバットとコチアとの組み合わせナンバリングに基づいて１０残基のＣＤＲ−Ｈ１配列（ＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤ、配列番号２４）、１７残基のＣＤＲ−Ｈ２配列（ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧ、配列番号１２）、および８残基のＣＤＲ−Ｈ３配列（ＲＲＤＦＴＭＤＦ、配列番号１３）を含む。ＣＤＲ−Ｈ１配列は、正準クラス１に属し、ＣＤＲ−Ｈ２配列はクラス２に属する（Ｍａｒｔｉｎ  ＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５）。ＣＤＲ−Ｈ３配列は正準クラスを有していないが、おそらく、白井ら（（１９９９），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５５：１８８−９７）の規則に従ってねじれベースを有している。
【０１３５】
ＶｋおよびＶｈドメイン間の界面における残基は、マウスのこれらの位置にとって通常の残基である。
【０１３６】
１６Ｂ５抗体の大まかな構造モデルを提供する構造を見つけるために、ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５：１８２０−３３）中のタンパク質配列に対し検索を行った。抗コレラ毒素抗体ＦａｂフラグメントＴｅ３３（ｐｄｂコード１ＺＥＡ＿Ｈ）の構造を、ＶＬのために１．７８Ａの分解能で使用した。これは、ループに関して１６Ｂ５と同じ正準構造を保持していた。Ｄｓｂｂ−Ｆａｂ複合体（ｐｄｂコード２ＺＵＱ＿Ｂ）でのＦａｂ結晶構造を用いて、１６Ｂ５のＶＨドメインをモデル化した。これは、３．３Ａの分解能で解析すると、ＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｈ２に対して同じ正準構造を含み、またねじれベースを有する同じ長さのＣＤＲ−Ｈ３を含んでいた。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅプログラムを用いて、１６Ｂ５  Ｆｖの大まかな構造をモデル化した。
【０１３７】
ＣＤＲ「Ｘ」化（ＣＤＲ“Ｘ”ｅｄ）１６Ｂ５  Ｆｖ配列を用いたＮＣＢＩの非冗長タンパク質配列データベースの検索により、マウスＣＤＲをグラフト化するのに好適するヒトフレームワークの選択が可能になった。Ｖｋについては、ＮＣＢＩアクセッションコードＡＣＪ７１７１８．ｐｒｏを有するヒトカッパ軽鎖を選択した（配列番号２０）。このヒトカッパ軽鎖配列は、ＣＤＲ−Ｌ２およびＬ３について同じ正準クラスを有する。Ｖｈについては、ヒトＩｇ重鎖ＢＡＣ０２００２．１を選択した（配列番号１４）。これは１６Ｂ５  ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２の正準形を共有し、Ｈ３は予測されるねじれベースを有する８残基長である。
【０１３８】
ヒト化重鎖および軽鎖の設計ならびにこれらのヒトフレームワークに基づく逆突然変異を、それぞれ表５および表６に示す。
【０１３９】
配列番号１５の配列を有するヒト化１６Ｂ５可変重鎖（Ｈ１）を設計した。設計は次の４つの逆突然変異を含む：Ｒ１３Ｋ；Ｓ２８Ｐ，Ｖ４８Ｍ；およびＹ９１Ｆ。ヒトにおいてＲよりも高頻度であるため、位置１３にはＫを選択した。位置Ｓ２８のＰは、それがコチアＣＤＲ領域内にあるために、選択した。ヒトにおいてＶよりも高頻度であるため、位置４８にはＭを選択した。界面に位置しており、マウス残基を保持することが望ましいので、位置９８にはＦを選択した。
【０１４０】
配列番号３５の配列を有するヒト化１６Ｂ５可変重鎖（Ｈ２）を設計した。設計は次の４つの逆突然変異を含む：Ｒ１３Ｋ；Ｓ２８Ｐ，Ｖ４８Ｍ；およびＹ９１Ｆ。これらの変異の各々についての理論的根拠は、Ｈ１の場合と同様である。この設計はまた、安定性の改善の可能性があるために、Ｑ１Ｅ変異を含む。
【０１４１】
４つのヒト化１６Ｂ５可変軽鎖配列を設計した：バージョン１（Ｌ１）は、配列番号２１の配列を有し、３つの逆突然変異：Ｄ１Ｎ；Ｍ４Ｌ；およびＹ３６Ｆを含む。ＨＣＤＲ２のＮ６１との水素結合形成の可能性があるため、位置１にＮを選択した。ＬＣＤＲ３のＫ９６、Ｑ９７およびＳ９８と接触するので、位置４にＬを選択した。位置４はＦ１０４の界面残基とも接触する。ＦはＨＣＤＲ３のＤ１０６と水素結合できないが、Ｙはそれが可能なので、位置３６にＦを選択した。水素結合は、ＨＣＤＲ３機能に影響を与える可能性がある余分な相互作用を構成し、したがって、回避されるのが好ましい。
【０１４２】
バージョン２（Ｌ２）は、配列番号２２の配列を有し、４つの逆突然変異：Ｄ１Ｎ；Ｍ４Ｌ；Ｙ３６Ｆ；およびＰ４３Ｓを含む。Ｄ１Ｎ、Ｍ４Ｌ、およびＹ３６Ｆの論理的根拠はバージョン１と同じである。ＳはＶＨ中のＱ１１０と水素結合を形成し、ＨＣＤＲ３に近いので、位置４３にはＳを選択した。
【０１４３】
バージョン３（Ｌ３）は、配列番号２３の配列を有し、３つの逆突然変異のＭ４Ｌ；Ｙ３６Ｆ；およびＰ４３Ｓを含む。これらの変異の各々についての理論的根拠は、バージョン１および２と同様である。
【０１４４】
バージョン４（Ｌ４）は、配列番号３６の配列を有し、バージョン２の４つの逆突然変異に加えてＤ９Ｓを含む。Ｄ９Ｓは、タンパク分解部位を除去するために含めた。
【０１４５】
バージョン５（Ｌ５）は、配列番号３９の配列を有し、位置Ｌ１がＤにより占められることを除いて、バージョン４の逆突然変異を含む。
【表５】
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2019521649.tif 000009
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【表６】
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【０１４６】
実施例６．ヒト化１６Ｂ５抗体のタウ親和性
Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ４、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ４設計を有するヒト化１６Ｂ５抗体の結合データを下表７に示す。比較のために、キメラ１６Ｂ５の結合データも示す。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ装置を用いて生成した。
【０１４７】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて表面プラズモン共鳴測定を行った。全ての実験を、抗マウスまたは抗ヒト捕捉抗体をアミン結合することにより調製したＣＭ５センサーチップ上で、３０μｌ／分で１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０の移動相を用いて実施した。１６Ｂ５（キメラ型またはヒト化型）を固定した捕捉抗体に結合させ、精製した種々濃度の組換えｈタウ−Ｐ３０１Ｌを、逐次反復で抗体複合体に適用した。反復ステップは、高塩または低ｐＨの再生ステップで分離した。抗体と抗原の異なる調製物を用いて実験を繰り返した。分析は、搭載されているＢｉａｃｏｒｅソフトウェアを用いて実施した。Ｈ１Ｌ１型は、キメラ抗体の約１／３の解離定数であった。他の型は、表７に示すように、キメラ抗体と同等かまたは少なくともキメラ抗体の２倍以内の解離定数であった。
【表７】
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【０１４８】
実施例７．ヒト化１６Ｂ５抗体によるタウの免疫沈降検出
６のＢｒａａｋスコアを有するアルツハイマー病患者の前頭皮質の死後試料を、次の順序で、可溶化力が次第に増加する緩衝液で連続的に抽出した：（ｉ）高塩緩衝液（２０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％スクロース、７５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４）、（ｉｉ）トリトン緩衝液（２０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％スクロース、１％のトリトンＸ１００、５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４）、（ｉｉｉ）サルコシル緩衝液（１０ｍＭのトリス、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％スクロース、５００ｍＭのＮａＣｌ、１％サルコシル、ｐＨ７．４）。  
【０１４９】
各試料について、高塩可溶性画分２００マイクログラム、またはサルコシル不溶性画分２０マイクログラムを、４００マイクロリットルの免疫沈降緩衝液（１０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のトリトンＸ１００、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に希釈した。試料を、プロテインＧ磁気ビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）でプレクリアし、抗体５マイクログラムを各チューブに添加した。使用した抗体には次のものが含まれる：１）コントロールとしてのマウスの非免疫ＩｇＧ抗体（ｍＩｇＧ）；２）コントロールとしてのヒト非免疫ＩｇＧ抗体（ｈＩｇＧ）；３）キメラ１６Ｂ５抗体（Ｃｈｉ１６Ｂ５）；４）ヒト化１６Ｂ５、バージョンＨ１Ｌ２（ｈ１６Ｂ６−Ｈ１Ｌ２）；およびヒト化１６Ｂ５、バージョンＨ１Ｌ３（ｈ１６Ｂ６−Ｈ１Ｌ３）。プレクリアしたライセートおよび抗体を４℃で２時間インキュベートした。抗体／抗原複合体を、プロテインＧ磁気ビーズを用いて沈殿させ、沈殿物をＰＢＳ／３５０ｍＭのＮａＣｌで十分に洗浄した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を用いて溶出した後、溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ポリクローナル抗タウ抗体（ＤＡＫＯ）を用いてブロットした。
【０１５０】
図７に示すように、キメラ１６Ｂ５およびヒト化１６Ｂ５  Ｈ１Ｌ２およびＨ１Ｌ３は、アルツハイマー脳からの可溶性画分と不溶性画分の両方でタウを認識した。
【０１５１】
実施例８．アルツハイマー病の脳に対するマウスおよびヒト化１６Ｂ５タウ抗体の免疫組織化学的特性評価
マウスモノクローナル抗タウ抗体１６Ｂ５ならびにその２つのヒト化バリアントであるｈ１６Ｂ５−Ｈ１Ｌ２およびｈ１６Ｂ５−Ｎ１Ｄを、アルツハイマー病のドナーおよび非罹患高齢者コントロールからのヒト脳皮質の新しい凍結切片上で免疫組織化学的試験を同様に実施した。
【０１５２】
方法：
ヒト脳組織
前頭皮質を、Ｓｕｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。症例には、アルツハイマー病と診断され、死後の神経病理学的評価で確認された６人の患者（平均年齢８６．８±０．４０ＳＥＭ）、および３人の非罹患高齢者コントロール（平均年齢７７±９．７ＳＥＭ）が含まれた。症例の人口統計学データを以下の表８に記載する。免疫組織化学的検査を、スライドにマウントし、軽くアセトン固定した１０ｕｍの凍結切片で実施した。
【表８】
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【０１５３】
免疫組織化学的検査
免疫ペルオキシダーゼ法は、ヤギ抗マウス免疫グロブリンにコンジュゲートしたペルオキシダーゼ標識ポリマー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システムＨＲＰ標識ポリマー；Ｄａｋｏ  Ｋ４００１）または直接ビオチン化したヒト化抗体用のベクターＡＢＣ増幅システム（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ；ＰＫ−６１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のいずれかからなる主要な検出システムであった。染色をＤＡＢ色原体（液体ＤＡＢ＋基質色素原システム；Ｄａｋｏ  Ｋ３４６８）を用いて可視化し、これにより褐色の沈着物が生成した。
【０１５４】
ネガティブコントロールは、ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体を用いるか、または一次抗体を省略して隣接切片上で全免疫組織化学的手順を実施することから構成された。
【０１５５】
免疫蛍光標識
二重免疫蛍光染色を行い、抗体のマウスバリアントおよびヒト化バリアント、種々のリン酸化エピトープを認識する他のタウ抗体と、アミロイドベータの関係を決定した。組織切片を、ビオチン化またはＦＩＴＣタグ付きヒト化１６Ｂ５バリアント（１uｇ／ｍＬ）およびマウス抗体（モノクローナル１６Ｂ５（１uｇ／ｍＬ）、ＡＴ８（１：１０００）、ＡＴ１００（１：１０００）、または３Ｄ６（１uｇ／ｍＬ）のいずれか）を含む抗体カクテルで並行して染色した。マウス抗体は、４８８または６３５フルオロフォア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体で検出した。ビオチニル化ヒト化抗体は、ストレプトアビジン６３５で検出した。
【０１５６】
前吸収
標的抗原に対する抗体の特異性を評価するために、１uｇ／ｍＬの１６Ｂ５抗体を４℃で一晩、５０uｇ／ｍＬの精製ヒトＰ３０１Ｌタウまたは野生型シヌクレイン（無関係なタンパク質）で前吸収処理を実施した。次いで、これらの抗体を組織に適用し、上記のように免疫組織化学的手順を行った。
【０１５７】
画像解析
スライドをオリンパスＢＸ６１顕微鏡、オリンパスＮａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ２．０ＨＴ、またはライカＳＰＥスペクトル共焦点システムのいずれかを用いて画像化した。画像は、ＴＩＦＦファイルとして収集した。
【０１５８】
結果
以下の表９に示すように、マウスモノクローナル抗体１６Ｂ５および両方のヒト化バリアントは、アルツハイマー病の組織に対し反応性を示し、神経網スレッドを顕著に、神経原線維濃縮体（主に球形）およびいくつかのタウ陽性老人斑をある程度染色した。ほとんどの１６Ｂ５  ＡＤ−線維性病変は灰白質に限られていたが、ある程度の応答性が白質でも検出された。対照的に、非疾患コントロール組織は、拡散背景反応性を示したが、ＡＤ組織で検出される病状については陰性であった。
【０１５９】
二重標識実験を、１６Ｂ５のマウスモノクローナルバージョンならびに（１）両方のヒト化バリアント、（２）様々なリン酸化エピトープでタウを認識する抗体、および（３）ベータアミロイドを用いて行い、抗体バリアントによって認識される病変をさらに特徴付けた。
【０１６０】
ｈ１６Ｂ５−Ｈ１Ｌ２とｈ１６Ｂ５−Ｎ１Ｄの両方は、ＡＤ−原線維病理学的構造において高度の一致を示すモノクローナル１６Ｂ５抗体と共局在化した。ｈ１６Ｂ５−Ｈ１Ｌ２はまた、セリン２０２およびトレオニン２０５（ＡＴ８）、セリン２１２およびトレオニン２１４（ＡＴ１００）、およびセリン３９６（自社開発抗体、２０Ｈ１）を含む様々なリン酸化タウエピトープに免疫応答性であることが示された病態も検出した。最後に、Ｎ末端アミノ酸配列（３Ｄ６；ａａ１−５）を認識するアミロイドβ抗体と１６Ｂ５で二重標識すると、アミロイド斑上にΑβ構造と１６Ｂ５免疫応答性構造の間にほとんど共局在性がないことが示された。
【０１６１】
１６Ｂ５の免疫応答性を、十分に特徴付けられた市販のモノクローナル抗タウ抗体（Ｄａｋｏ）と比較した場合、両方ともタウ陽性老人斑、神経網スレッド、および神経原線維濃縮体を含む原線維ＡＤ病理を染色した。
【０１６２】
抗体の特異性は、精製した組換えＰ３０１Ｌタウによる前吸収により評価した。１６Ｂ５をＰ３０１Ｌタウで前吸収させた時に、染色の減少が観察されたが、抗体を同じモル濃度で無関係なタンパク質（野生型シヌクレイン）で前吸収させた時には、染色は影響を受けなかった。
【０１６３】
ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体と一次抗体の省略セクションの両方は、試験した全ての組織全体の染色について陰性であった。
【表９】
2019521649.tif 000017
【０１６４】
実施例９．熱安定性分析
抗体などの治療分子がインビボで有用であるか否かの観点から、高い熱安定性は重要である。このため、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いてＨ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ４、およびＨ２Ｌ４の熱安定性を分析した。
【０１６５】
図９および表１０に示すように、Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ４、およびＨ２Ｌ４は全て十分な熱安定性を示すが、Ｈ１Ｌ４が最も高い（すなわち、＞７５℃）。
【表１０】
2019521649.tif 000018
【０１６６】
実施例１０．凝集可能性の分析
凝集は、治療抗体の長期保存安定性にとって問題である。このため、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いてＨ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ２、Ｈ１Ｌ４、およびＨ２Ｌ４の凝集の可能性を分析した。表１１に示すように、Ｈ１Ｌ２、Ｈ２Ｌ２、Ｈ１Ｌ４、およびＨ２Ｌ４の凝集の可能性は、大きく異ならない。
【表１１】
2019521649.tif 000019
【０１６７】
引用した（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号などを含む）全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許および特許出願が全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが具体的に、個別に示される場合と同程度に、本出願においてその全体が参照により組み込まれる。ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの受入番号などに関連する配列中でいかなる差異が発生した場合にも、本出願は、実際の出願日を意味する本出願の有効出願日時点か、または関連する受入番号を開示する優先権出願の日付より早くに引用された受入番号と関連する配列を指す。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態、または態様は、特に別義が示されない限り、任意の他のものと組み合わせて使用できる。本発明は、明確さおよび理解の目的のために例示および実施例によっていくらか詳細に説明してきたが、特定の変更および修正が、添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
【０１６８】
配列表
配列番号１  タウＰ１０６３６−８
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
配列番号２  タウＰ１０６３６−７
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
配列番号３  タウＰ１０６３６−６
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
配列番号４  タウＰ１０６３６−５
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
配列番号５  タウＰ１０６３６−４
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
配列番号６  タウＰ１０６３６−２
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶ  ＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬ  ＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴ
ＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤ  ＡＧＬＫＡＥＥＡＧＩ  ＧＤＴＰＳＬＥＤＥ
ＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭ  ＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳ  ＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧ
ＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡ  ＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮ  ＡＴＲＩＰＡＫＴＰ
ＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧ  ＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧ  ＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰ
ＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰ  ＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶ  ＡＶＶＲＴＰＰＫＳ
ＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴ  ＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮ  ＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮ
ＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶ  ＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳ  ＫＶＴＳＫＣＧＳＬ
ＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧ  ＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤ  ＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧ
ＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧ  ＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫ  ＬＴＦＲＥＮＡＫＡ
ＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹ  ＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳ  ＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴ
ＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱ  ＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡ  ＳＬＡＫＱＧＬ
配列番号７
ＣＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  Ｃ
配列番号８
ＣＴＣ  ＡＡＴ  ＴＴＴ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣ
配列番号９
ＣＴＣ  ＡＡＧ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＧＣ
配列番号１０−１６Ｂ５−ＨＣ
【化１】
2019521649.tif 000020
配列番号１１−１６Ｂ５  ＣＤＲ−Ｈ１（Ｋａｂａｔナンバリング）
ＹＨＧＭＤ
配列番号１２−１６Ｂ５  ＣＤＲ−Ｈ２
ＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧ
配列番号１３−１６Ｂ５  ＣＤＲ−Ｈ３
ＲＲＤＦＴＭＤＦ
配列番号１４−Ｈｕ  ＶＨアクセプターＦＲ（Ａｃｃ＃ＢＡＣ０２００２．１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＲＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＳＦＴＳＹＡＶＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＮＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＴＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＲＧＱＮＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１５−１６Ｂ５重鎖ヒト化設計ｖ１（Ｒ１３Ｋ、Ｓ２８Ｐ、Ｖ４８Ｍ、Ｙ９１Ｆ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＲＤＦＴＭＤＦＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号１６−１６Ｂ５−ＬＣ
【化２】
2019521649.tif 000021
配列番号１７−１６Ｂ５−ＬＣ  ＣＤＲ−Ｌ１
ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡ
配列番号１８−１６Ｂ５−ＬＣ  ＣＤＲ−Ｌ２
ＷＡＳＴＲＥＳ
配列番号１９−１６Ｂ５−ＬＣ  ＣＤＲ−Ｌ３
ＫＱＳＹＴＬＲＴ
配列番号２０−Ｈｕ  ＶＬアクセプターＦｒ（Ａｃｃ＃ＡＣＪ７１７１８．１）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＮＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＱＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号２１−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ１（Ｄ１Ｎ、Ｍ４Ｌ、Ｙ３６Ｆ）
ＮＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号２２−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ２（Ｄ１Ｎ、Ｍ４Ｌ、Ｙ３６Ｆ、Ｐ４３Ｓ）
ＮＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号２３−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ３（Ｍ４Ｌ、Ｙ３６Ｆ、Ｐ４３Ｓ）
ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号２４−１６Ｂ５  ＣＤＲ−Ｈ１（カバットとコチアとの組み合わせナンバリング）
ＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤ
配列番号２５−１６Ｂ５重鎖ヒト化設計ｖ１をコードする核酸
ＣＡＧｇＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧｇｔｇＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧｃｇｔＣＡＧＧＣＴＣＣＴｇｇｔｃａＧＧＧＴｔｔａＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＡＴＴＴＧｔｇＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡｃＡＣＣＴＣＴＧＴＣｔｃｔＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＣｔｃｔｔｃｔＣＴＣＡＡＡｇｃｃＧＡＧＧＡＣａｃｇＧＣＣｇｔｇＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２６−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ１をコードする核酸
ＡＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＧＴ
配列番号２７−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ２をコードする核酸
ＡＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＧＴ
配列番号２８−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ３をコードする核酸
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＧＴ
配列番号２９−ヒトＩｇＧ１定常領域（Ｃ末端リシンは除外できる）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＶＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３０−ヒトＩｇＧ１定常領域ｃＤＮＡ
ＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ
配列番号３１−５’イントロンを有するヒトＩｇＧ１定常領域ｃＤＮＡ
ＧＧＴＧＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＧＡ
配列番号３２−ヒトカッパ定常領域
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３３−ヒトカッパ定常領域ｃＤＮＡ
ＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３４−５’イントロンを有するヒトカッパ定常領域ｃＤＮＡ
ＧＴＣＧＧＡＴＧＡＣＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＡＧＧＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＴＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＴＴＧＣＴＡＴＡＡＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＣＴＡＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
配列番号３５−１６Ｂ５重鎖ヒト化設計ｖ２
ＥＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＲＤＦＴＭＤＦＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３６−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ４
ＮＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号３７：１６Ｂ５重鎖ヒト化設計ｖ２をコードする核酸
ＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＴＡＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＣＡＡＣＡＴＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＴＡＣＡＡＴＧＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号３８−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ４をコードする核酸
ＡＡＣＡＴＴＧＴＴＴＴＧａＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＴＣＡＣｔＡＧＧＡＧＡＧＡｇＧＧｃＣＡＣＴＡＴｃＡａＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＧＴＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＴＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡｇｃＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴｃＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣｇＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡｇｇＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴ
配列番号３９−１６Ｂ５軽鎖ヒト化設計ｖ５
ＤＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号４０−図８からの軽鎖ｍａｊｏｒｉｔｙ配列
ＮＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号４１−図８からの重鎖ｍａｊｏｒｉｔｙ配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＳＥＬＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＶＦＳＬＤＴＳＶＳＴＡＹＬＱＩＳＳＬＫＡＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＲＲＤＦＴＭＤＦＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４２−図８からのＣｈｉ１６Ｂ５重鎖配列
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＹＨＧＭＤＷＶＫＱＡＰＷＧＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＫＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＶＧＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＮＥＤＴＡＴＹＦＣＡＲＲＲＤＦＴＭＤＦＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
配列番号４３−図８からのＣｈｉ１６Ｂ５軽鎖配列
ＮＩＶＬＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＰＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＲＴＲＫＮＹＬＡＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＫＱＳＹＴＬＲＴＦＧＧＧＴＮＬＥＩＫＲ
【図１】
2019521649.tif 000022
【図２】
2019521649.tif 000023
【図３】
2019521649.tif 000024
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019521649.tif 000029
【図９】
2019521649.tif 000030
【配列表】
2019521649000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月21日(2019.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019521649000001.app
【国際調査報告】
2019521649.tif 000039
2019521649.tif 000040
2019521649.tif 000041