(57)【要約】本発明は、ペプチド模倣大環状分子での疾患の処置のために、野生型ｐ５３およびｐ５３関連の変異を検出するための診断ツール、システム、および方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体における状態を処置するための方法であって、ａ）ｐ５３経路をモジュレートする、被験体の遺伝子の変異ステータスを決定するためにアッセイを実施するステップと、ｂ）被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップとを含む方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
状態の処置を必要とする被験体における状態を処置するための方法であって、
ａ）アッセイを実施して、前記被験体のｐ５３経路をモジュレートする遺伝子の変異ステータスを決定するステップと、
ｂ）前記被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ペプチド模倣大環状分子が、ｐ５３のサブ配列と少なくとも６０％同一である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２、ＨＤＭ２、ＭＤＭＸ、またはＨＤＭＸに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子がＴＰ５３である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記変異ステータスが、フレームシフトである変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記変異ステータスが、スプライス部位変異である変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記変異ステータスが、挿入である変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記変異ステータスが、欠失である変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記変異ステータスが、置換である変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異ステータスが、コピー数喪失である変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異ステータスが、一塩基多型である変異に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイが次世代配列決定である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイがＤＮＡ配列決定である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アッセイがＲＮＡ配列決定である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記状態ががんである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチド模倣大環状分子が、表９〜２４のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸配列と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペプチド模倣大環状分子が、表９〜２４のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチド模倣大環状分子が、表９〜２４のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチド模倣大環状分子が、表９〜２４のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチド模倣大環状分子が、表９〜２４のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸配列であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチド模倣大環状分子が、表９〜２４のアミノ酸配列のうちのあるアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年３月２１日に出願された米国仮出願第６２／３１１，０７１号の利益を主張し、本明細書において、参照によりその全体を援用する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍サプレッサーｐ５３は、ＤＮＡ損傷および細胞ストレスに応答して細胞周期停止、老化、およびアポトーシスを媒介することによって、がんの発症を予防する。Ｅ３ユビキチンリガーゼＭＤＭ２（ＨＤＭ２）は、ユビキチン化−プロテアソーム経路（ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）を介してｐ５３機能を負に調節する。欠失、変異、またはＭＤ
Ｍ２過剰発現のいずれかによるｐ５３活性の損失は、ヒトがんにおいて最も一般的な欠陥である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体における状態を処置するための方法であって、ａ）ｐ５３経路をモジュレートする、被験体の遺伝子の変異ステータスを決定するためにアッセイを実施するステップと、ｂ）被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップとを含む方法を提供する。
参照による援用
【０００４】
本明細書に記述されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的および個々に示されていることによって、参照により組み込まれているかのように本明細書中に参照により組み込まれている。
【０００５】
本発明の新規の特色は、添付の特許請求の範囲に特殊性と共に示されている。本発明の特色および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態および以下の添付の図を示している詳細な記載を参照して得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、Ｆｍｏｃ−Ｍｅ−６−クロロ−トリプトファンおよびＦｍｏｃ−６−クロロ−トリプトファンの合成について記載している。
【０００７】
【図２】図２は、ヒト野生型Ｐ５３コードおよびタンパク質配列を示している。
【０００８】
【図３】図３は、ＭＤＭＸ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ７ＺＵＷ７；Ｅｎｔｒｙ  ＭＤＭ４＿ＤＡＮＲＥ）と共に複合体を形成したペプチド模倣大環状分子４６（表１４）、ｐ５３ペプチド模倣大環状分子の構造を示している。
【０００９】
【図４】図４は、ＭＤＭＸ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  受託番号Ｑ７ＺＵＷ７；Ｅｎｔｒｙ  ＭＤＭ４＿ＤＡＮＲＥ）に結合したｐ５３ペプチド模倣大環状分子１４２（表１４）およびＳＰ４３のオーバーレイ構造を示している。
【００１０】
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｆは、本発明の例示的ペプチド模倣大環状分子に対する、細胞生存度アッセイ、競合ＥＬＩＳＡアッセイ、ＧＲＩＰアッセイ、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化アッセイ、蛍光偏光法競合結合および環状ヘリシティデータの結果を記載している。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図５−６】同上。
【００１１】
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｄは、様々なペプチド模倣大環状分子からのデータを提供している。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【００１２】
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｂは、様々なペプチド模倣大環状分子からのデータを提供している。
【図７−２】同上。
【００１３】
【図８】図８は、マウスＭＣＦ−７異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対するＳＰ１５４、ペプチド模倣大環状分子の作用を示している。
【００１４】
【図９】図９は、マウスＭＣＦ−７異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対するＳＰ２４９、ペプチド模倣大環状分子の作用を示している。
【００１５】
【図１０】図１０は、マウスＭＣＦ−７異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対するＳＰ３１５、ペプチド模倣大環状分子の作用を示している。
【００１６】
【図１１】図１１は、マウスＭＣＦ−７異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対するＳＰ２５２の作用、ＳＰ１５４の点変異の作用を示している。
【００１７】
【図１２】図１２は、ヒト変異体および野生型ｐ５３に対する化合物１の半数効果濃度（ＥＣ５０）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ヒト転写因子タンパク質ｐ５３は、ＤＮＡ損傷および細胞ストレスに応答して、細胞周期の停止およびアポトーシスを誘導し、それによって悪性形質転換から細胞を保護するのに非常に重要な役割を果たしている。Ｅ３ユビキチンリガーゼＭＤＭ２（ＨＤＭ２としても公知）は、ｐ５３トランス活性化活性を中和する直接結合の相互作用を介してｐ５３機能を負に制御し、核からｐ５３タンパク質を輸出し、ユビキチン化−プロテアソーム経路を介してｐ５３を分解の標的とする。欠失、変異、またはＭＤＭ２過剰発現のいずれかによるｐ５３活性の喪失は、ヒトのがんにおいて最も一般的な欠損である。野生型ｐ５３を発現する腫瘍は、活性ｐ５３の濃度を安定化または増大する薬理学的薬剤に対して脆弱である。この文脈において、ＭＤＭ２活性の阻害は、ｐ５３活性を修復し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞をアポトーシスに再感受性にし得る。
【００１９】
最近になって、ＭＤＭＸ（ＭＤＭ４）は、ｐ５３の類似の負の制御因子として同定されており、その研究では、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸのｐ５３結合界面間の有意な構造的相同性が明らかになっている。ｐ５３−ＭＤＭ２およびｐ５３−ＭＤＭＸのタンパク質−タンパク質相互作用は、ｐ５３の同じ１５残基のアルファヘリカルトランス活性化ドメインによって媒介され、そのドメインは、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸの表面上の疎水性間隙に挿入される。ｐ５３のこのドメインにおける３つの残基（Ｆ１９、Ｗ２３、およびＬ２６）は、ＭＤＭ２およびＭＤＭＸとの結合に必須である。
【００２０】
ｐ５３の活性をモジュレートするｐ５３ベースのペプチド模倣大環状分子が本明細書で提供される。ｐ５３、ＭＤＭ２および／またはＭＤＭＸタンパク質の間の相互作用を阻害するｐ５３ベースのペプチド模倣大環状分子もまた本明細書で提供される。さらに、それらに限定されるものではないが、がんおよび他の過剰増殖性疾患を含む疾患を処置するために使用することができるｐ５３ベースのペプチド模倣大環状分子が本明細書に提供される。
【００２１】
本明細書で使用される用語「大環状分子」は、共有結合により結合している少なくとも９個の原子によって形成された環またはサイクルを含む化学的構造を有する分子を指す。
【００２２】
本明細書で使用される用語「ペプチド模倣大環状分子」または「架橋ポリペプチド」は、複数のペプチド結合および少なくとも１つの大環状分子を形成するリンカーによって連結した複数のアミノ酸残基を含み、それによって、第１の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸残基（または類似体）と、同じ分子内の第２の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸残基（または類似体）の間に大環状分子を形成する化合物を指す。ペプチド模倣大環状分子は、大環状分子を形成するリンカーが、第１のアミノ酸残基（または類似体）のα炭素を、第２のアミノ酸残基（または類似体）のα炭素に結合している実施形態を含む。ペプチド模倣大環状分子は、任意選択で、１つまたは複数のアミノ酸残基および／またはアミノ酸類似体残基の間に１つまたは複数の非ペプチド結合を含み、任意選択で、大環状分子を形成する任意のものに加えて、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基またはアミノ酸類似体残基を含む。「対応する未架橋ポリペプチド」は、ペプチド模倣大環状分子の文脈で言及される場合、大環状分子と同じ長さであり、大環状分子に対応する野生型配列の等価な天然アミノ酸を含むポリペプチドに関すると理解される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、用語「安定性」は、円二色性、ＮＭＲまたは別の生物物理の尺度、またはタンパク質分解に対する耐性をｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定して、本発明のペプチド模倣大環状分子により定義された二次構造が溶液中で維持されることを指す。本発明において想定される二次構造の非限定的な例は、αヘリックス、βターン、およびβプリーツシートである。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「ヘリックスの安定性」は、円二色性またはＮＭＲによって測定して、本発明のペプチド模倣大環状分子によりαヘリックス構造が維持されることを指す。例えば、一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、円二色性によって決定して、対応する未架橋大環状分子と比較して、αらせん度の少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍または２倍の増大を呈する。
【００２５】
用語「αアミノ酸」または単に「アミノ酸」は、α炭素と指定された炭素に結合したアミノ基およびカルボキシル基の両方を含有する分子を指す。適切なアミノ酸として、制限なしで、天然に存在するアミノ酸のＤ異性体およびＬ異性体の両方、ならびに有機合成または他の代謝経路によって調製された天然に存在しないアミノ酸が挙げられる。文脈が具体的に他を示さない限り、用語、アミノ酸は、本明細書で使用される場合、アミノ酸類似体を含むことを意図する。
【００２６】
用語「天然に存在するアミノ酸」は、天然に合成されたペプチドに一般に見出され、一文字略語Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、ＹおよびＶによって公知の２０種のアミノ酸のいずれか１つを指す。
【００２７】
以下の表は天然アミノ酸の特性の概要を示す：
【表Ａ】
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【００２８】
「疎水性アミノ酸」には、小さい疎水性アミノ酸および大きい疎水性アミノ酸が含まれるが、それらに限定されない。「小さい疎水性アミノ酸」は、グリシン、アラニン、プロリン、およびそれらの類似体である。「大きい疎水性アミノ酸」は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびそれらの類似体である。「極性アミノ酸」は、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、チロシン、およびそれらの類似体である。「荷電アミノ酸」は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびそれらの類似体である。
【００２９】
用語「アミノ酸類似体」は、構造的にアミノ酸に類似しており、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸を置換することができる分子を指す。アミノ酸類似体には、β−アミノ酸、およびアミノ基またはカルボキシ基が同様に反応基によって置換されている（例えば第一級アミンが第二級もしくは第三級アミンで置換されている、またはカルボキシ基がエステルで置換されている）アミノ酸が含まれるが、それらに限定されない。
【００３０】
用語「アミノ酸類似体」または「非天然アミノ酸」は、アミノ酸に構造的に類似しており、ペプチド模倣大環状分子の形成においてアミノ酸の代わりに使用することができる分子を指す。アミノ酸類似体として、制限なしで、アミノとカルボキシル基との間に１つまたは複数の追加のメチレン基を包含すること（例えば、αアミノβカルボキシ酸）を除いて、または同様に反応性のある基によってアミノ基もしくはカルボキシ基が置換されること（例えば、第二級または第三級アミンによる第一級アミンの置換、またはエステルによるカルボキシ基の置換）を除いて、本明細書で定義されたようなアミノ酸と構造的に同一の化合物が挙げられる。非天然アミノ酸は、以下による構造を含む：
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【００３１】
「非必須」アミノ酸残基とは、その必須の生物学的活性または生化学的活性（例えば、受容体結合または活性化）を消失することも、実質的に改変することもなく、ポリペプチドの野生型配列から変更することができる残基である。「必須」アミノ酸残基とは、ポリペプチドの野生型配列から変更した場合、結果として、ポリペプチドの必須の生物学的活性または生化学的活性を消失する、または実質的に消失することになる残基である。
【００３２】
「保存アミノ酸の置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、Ｈ）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ）が挙げられる。よって、ポリペプチドにおける予測される非必須アミノ酸残基は、例えば、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えられている。許容される置換の他の例は、等比体積的考察に基づく置換（例えば、メチオニンに対するノルロイシン）または他の特性に基づく置換（例えば、フェニルアラニンに対する２−チエニルアラニン）である。
【００３３】
アミノ酸類似体には、β−アミノ酸類似体が含まれる。β−アミノ酸類似体の例として、環式β−アミノ酸類似体；β−アラニン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；（Ｒ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｒ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｒ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−イソキノリン−３−酢酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（１−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−フリル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−ナフチル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（２−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジクロロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３，４−ジフルオロフェニル）酪酸；（Ｓ）−３−��ミノ−４−（３−ベンゾチエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−チエニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（３−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ブロモフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−クロロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−シアノフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−フルオロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ヨードフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ニトロフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−ピリジル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−（４−トリフルオロメチルフェニル）−酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−４−ペンタフルオロ−フェニル酪酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキセン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−ヘキシン酸；（Ｓ）−３−アミノ−５−フェニルペンタン酸；（Ｓ）−３−アミノ−６−フェニル−５−ヘキセン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−３−カルボン酸；１，２，５，６−テトラヒドロピリジン−４−カルボン酸；３−アミノ−３−（２−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（２−チエニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（３−ブロモフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−クロロフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）−プロピオン酸；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−アミノアジピン酸；Ｄ−β−フェニルアラニン；β−ロイシン；Ｌ−β−ホモアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ベンジルエステル；Ｌ−β−ホモイソロイシン；Ｌ−β−ホモロイシン；Ｌ−β−ホモメチオニン；Ｌ−β−ホモフェニルアラニン；Ｌ−β−ホモプロリン；Ｌ−β−ホモトリプトファン；Ｌ−β−ホモバリン；Ｌ−Ｎω−ベンジルオキシカルボニル−β−ホモリシン；Ｎω−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモヒドロキシプロリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ベンジル−Ｌ−β−ホモチロシン；γ−トリチル−Ｌ−β−ホモアスパラギン；（Ｒ）−β−フェニルアラニン；Ｌ−β−ホモアスパラギン酸γ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−β−ホモグルタミン酸δ−ｔ−ブチルエステル；Ｌ−Ｎω−β−ホモリシン；Ｎδ−トリチル−Ｌ−β−ホモグルタミン；Ｎω−２，２，４，６，７−ペンタメチル−ジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル−Ｌ−β−ホモアルギニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモヒドロキシ−プロリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモセリン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモトレオニン；Ｏ−ｔ−ブチル−Ｌ−β−ホモチロシン；２−アミノシクロペンタンカルボン酸；および２−アミノシクロヘキサンカルボン酸が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
アミノ酸類似体には、アラニン、バリン、グリシンまたはロイシンの類似体が含まれる。アラニン、バリン、グリシン、およびロイシンのアミノ酸類似体の例として、α−メトキシグリシン；α−アリル−Ｌ−アラニン；α−アミノイソ酪酸；α−メチル−ロイシン；β−（１−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（１−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ナフチル）−Ｌ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（２−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｄ−アラニン；β−（２−チエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｄ−アラニン；β−（４−ピリジル）−Ｌ−アラニン；β−クロロ−Ｌ−アラニン；β−シアノ−Ｌ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｄ−アラニン；β−シクロヘキシル−Ｌ−アラニン；β−シクロペンテン−１−イル−アラニン；β−シクロペンチル−アラニン；β−シクロプロピル−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアンモニウム塩；β−ｔ−ブチル−Ｄ−アラニン；β−ｔ−ブチル−Ｌ−アラニン；γ−アミノ酪酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；２，４−ジニトロ−フェニルグリシン；２，５−ジヒドロ−Ｄ−フェニルグリシン；２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸；２−フルオロ−フェニルグリシン；３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ−酪酸；３−フルオロ−バリン；４，４，４−トリフルオロ−バリン；４，５−デヒドロ−Ｌ−ｌｅｕ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアンモニウム塩；４−フルオロ−Ｄ−フェニルグリシン；４−フルオロ−Ｌ−フェニルグリシン；４−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルグリシン；５，５，５−トリフルオロ−ロイシン；６−アミノヘキサン酸；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアンモニウム塩；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｄ−α−アミノ酪酸；Ｄ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｄ−（２−チエニル）グリシン；Ｄ−（３−チエニル）グリシン；Ｄ−２−アミノカプロン酸；Ｄ−２−インダニルグリシン；Ｄ−アリルグリシン・ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｄ−シクロヘキシルグリシン；Ｄ−ノルバリン；Ｄ−フェニルグリシン；β−アミノ酪酸；β−アミノイソ酪酸；（２−ブロモフェニル）グリシン；（２−メトキシフェニル）グリシン；（２−メチルフェニル）グリシン；（２−チアゾイル）グリシン；（２−チエニル）グリシン；２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；Ｌ−α−アミノ酪酸；Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン；Ｌ−（３−チエニル）グリシン；Ｌ−２−アミノ−３−（ジメチルアミノ）−プロピオン酸；Ｌ−２−アミノカプロン酸ジシクロヘキシル−アンモニウム塩；Ｌ−２−インダニルグリシン；Ｌ−アリルグリシン・ジシクロヘキシルアンモニウム塩；Ｌ−シクロヘキシルグリシン；Ｌ−フェニルグリシン；Ｌ−プロパルギルグリシン；Ｌ−ノルバリン；Ｎ−α−アミノメチル−Ｌ−アラニン；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；β−シクロプロピル−Ｌ−アラニン；（Ｎ−β−（２，４−ジニトロフェニル））−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−β−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−４−メチルトリチル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；（Ｎ−γ−アリルオキシカルボニル）−Ｌ−α，γ−ジアミノ酪酸；Ｄ−α，γ−ジアミノ酪酸；４，５−デヒドロ−Ｌ−ロイシン；シクロペンチル−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨ；シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ；Ｄ−アリルグリシン；Ｄ−ホモシクロヘキシルアラニン；Ｌ−１−ピレニルアラニン；Ｌ−２−アミノカプロン酸；Ｌ−アリルグリシン；Ｌ−ホモシクロヘキシルアラニン；およびＮ−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−ＯＨが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３５】
アミノ酸類似体には、アルギニンまたはリシンの類似体がさらに含まれる。アルギニンおよびリシンのアミノ酸類似体の例として、シトルリン；Ｌ−２−アミノ−３−グアニジノプロピオン酸；Ｌ−２−アミノ−３−ウレイドプロピオン酸；Ｌ−シトルリン；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＯＨ；Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン；α−メチル−オルニチン；２，６−ジアミノヘプタン二酸；Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキサ−１−イリデン）エチル）−Ｌ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｄ−オルニチン；（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｌ−オルニチン；Ｄ−オルニチン；Ｌ−オルニチン；Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（非対称）；Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ（対称）；Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ；Ｌｙｓ（Ｍｅ）２−ＯＨ・ＨＣｌ；Ｌｙｓ（Ｍｅ３）−ＯＨクロリド；Ｎω−ニトロ−Ｄ−アルギニン；およびＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３６】
アミノ酸類似体には、アスパラギン酸またはグルタミン酸の類似体が含まれる。アスパラギン酸およびグルタミン酸のアミノ酸類似体の例として、α−メチル−Ｄ−アスパラギン酸；α−メチル−グルタミン酸；α−メチル−Ｌ−アスパラギン酸；γ−メチレン−グルタミン酸；（Ｎ−γ−エチル）−Ｌ−グルタミン；［Ｎ−α−（４−アミノベンゾイル）］−Ｌ−グルタミン酸；２，６−ジアミノピメリン酸；Ｌ−α−アミノスベリン酸；Ｄ−２−アミノアジピン酸；Ｄ−α−アミノスベリン酸；α−アミノピメリン酸；イミノ二酢酸；Ｌ−２−アミノアジピン酸；トレオ−β−メチル−アスパラギン酸；γ−カルボキシ−Ｄ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；γ−カルボキシ−Ｌ−グルタミン酸γ，γ−ジ−ｔ−ブチルエステル；Ｇｌｕ（ＯＡｌｌ）−ＯＨ；Ｌ−Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ；およびピログルタミン酸が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３７】
アミノ酸類似体には、システインおよびメチオニンの類似体が含まれる。システインおよびメチオニンのアミノ酸類似体の例として、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（ファルネシル）−ＯＭｅ、α−メチル−メチオニン、Ｃｙｓ（２−ヒドロキシエチル）−ＯＨ、Ｃｙｓ（３−アミノプロピル）−ＯＨ、２−アミノ−４−（エチルチオ）酪酸、ブチオニン、ブチオニンスルホキシミン、エチオニン、メチオニンメチルスルホニウムクロリド、セレノメチオニン、システイン酸、［２−（４−ピリジル）エチル］−ＤＬ−ペニシラミン、［２−（４−ピリジル）エチル］−Ｌ−システイン、４−メトキシベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メトキシベンジル−Ｌ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｄ−ペニシラミン、４−メチルベンジル−Ｌ−ペニシラミン、ベンジル−Ｄ−システイン、ベンジル−Ｌ−システイン、ベンジル−ＤＬ−ホモシステイン、カルバモイル−Ｌ−システイン、カルボキシエチル−Ｌ−システイン、カルボキシメチル−Ｌ−システイン、ジフェニルメチル−Ｌ−システイン、エチル−Ｌ−システイン、メチル−Ｌ−システイン、ｔ−ブチル−Ｄ−システイン、トリチル−Ｌ−ホモシステイン、トリチル−Ｄ−ペニシラミン、シスタチオニン、ホモシスチン、Ｌ−ホモシスチン、（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン、セレノ−Ｌ−シスチン、シスタチオニン、Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ、およびアセトアミドメチル−Ｄ−ペニシラミンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３８】
アミノ酸類似体には、フェニルアラニンおよびチロシンの類似体が含まれる。フェニルアラニンおよびチロシンのアミノ酸類似体の例として、β−メチル−フェニルアラニン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、α−メチル−３−メトキシ−ＤＬ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、α−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、２，４−ジクロロ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、２−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、２−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、２−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、２−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、２；４；５−トリヒドロキシ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４，５−トリフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３，４−ジフルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４−ジメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン、３，５−ジヨード−Ｄ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロシン、３，５−ジヨード−Ｌ−チロニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、３−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、３−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−クロロ−Ｌ−チロシン、３−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、３−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−フルオロ−チロシン、３−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、３−ヨード−Ｌ−チロシン、３−メトキシ−Ｌ−チロシン、３−メチル−Ｄ−フェニルアラニン、３−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｄ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン、４−（トリフルオロメチル）−Ｄ−フェニルアラニン、４−（トリフルオロメチル）−Ｌ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｄ−フェニルアラニン、４−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビス（２−クロロエチル）アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｄ−フェニルアラニン、４−ブロモ−Ｌ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｄ−フェニルアラニン、４−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオロ−Ｄ−フェニルアラニン、４−フルオロ��Ｌ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｄ−フェニルアラニン、４−ヨード−Ｌ−フェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、チロキシン、３，３−ジフェニルアラニン、チロニン、エチル−チロシン、およびメチル−チロシンが挙げられる。
【００３９】
アミノ酸類似体には、プロリンの類似体が含まれる。プロリンのアミノ酸類似体の例として、３，４−デヒドロ−プロリン、４−フルオロ−プロリン、シス−４−ヒドロキシ−プロリン、チアゾリジン−２−カルボン酸、およびトランス−４−フルオロ−プロリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４０】
アミノ酸類似体には、セリンおよびスレオニンの類似体が含まれる。セリンおよびスレオニンのアミノ酸類似体の例として、３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸、２−アミノ−３−エトキシブタン酸、２−アミノ−３−メトキシブタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−ベンジルオキシプロピオン酸、２−アミノ−３−エトキシプロピオン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシブタン酸、およびα−メチルセリンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４１】
アミノ酸類似体には、トリプトファンの類似体が含まれる。トリプトファンのアミノ酸類似体の例として、α−メチル−トリプトファン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｄ−アラニン；β−（３−ベンゾチエニル）−Ｌ−アラニン；１−メチル−トリプトファン；４−メチル−トリプトファン；５−ベンジルオキシ−トリプトファン；５−ブロモ−トリプトファン；５−クロロ−トリプトファン；５−フルオロ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−トリプトファン；５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メトキシ−トリプトファン；５−メトキシ−Ｌ−トリプトファン；５−メチル−トリプトファン；６−ブロモ−トリプトファン；６−クロロ−Ｄ−トリプトファン；６−クロロ−トリプトファン；６−フルオロ−トリプトファン；６−メチル−トリプトファン；７−ベンジルオキシ−トリプトファン；７−ブロモ−トリプトファン；７−メチル−−トリプトファン；Ｄ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−１−カルボン酸；７−アザトリプトファン；Ｌ−１，２，３，４−テトラヒドロ−ノルハルマン−３−カルボン酸；５−メトキシ−２−メチル−トリプトファン；および６−クロロ−Ｌ−トリプトファンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００４２】
一部の実施形態では、アミノ酸類似体は、ラセミである。一部の実施形態では、アミノ酸類似体のＤ異性体が使用される。一部の実施形態では、アミノ酸類似体のＬ異性体が使用される。他の実施形態では、アミノ酸類似体は、ＲまたはＳ立体配置中にあるキラル中心を含む。さらに他の実施形態では、β−アミノ酸類似体のアミノ基（複数可）は、保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トシル等で置換されている。さらなる他の実施形態では、β−アミノ酸類似体のカルボン酸官能基は、例えばそのエステル誘導体として保護される。一部の実施形態では、アミノ酸類似体の塩が使用される。
【００４３】
用語「キャッピング基」は、主題であるペプチド模倣大環状分子のポリペプチド鎖のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに存在する化学的部分を指す。カルボキシ末端のキャッピング基には、非修飾カルボン酸（すなわち−ＣＯＯＨ）または置換基を有するカルボン酸が含まれる。例えば、カルボキシ末端は、アミノ基で置換されると、Ｃ末端にカルボキサミドをもたらし得る。様々な置換基には、第一級アミンおよびペグ化第二級アミンを含めた第二級アミンが含まれるが、それらに限定されない。Ｃ末端の代表的な第二級アミンキャッピング基には、
【化４】
2019520304.tif 000007
が含まれる。
【００４４】
アミノ末端のキャッピング基として、非修飾アミン（すなわち−ＮＨ２）または置換基を有するアミンが挙げられる。例えば、アミノ末端は、アシル基により置換されて、Ｎ末端でカルボキサミドを生成することができる。様々な置換基として、Ｃ１〜Ｃ６カルボニル、Ｃ７〜Ｃ３０カルボニル、およびペグ化カルバメートを含めた、置換アシル基が挙げられるが、それらに限定されない。Ｎ末端の代表的なキャッピング基として、以下が挙げられる：
【化５】
2019520304.tif 000008
【００４５】
大環状分子または大環状分子を形成するリンカーと共に本明細書で使用される用語「員」は、大環状分子を形成するか、または形成することができる原子を指し、置換基または側鎖原子を除外する。水素またはフルオロ置換基またはメチル側鎖は、大環状分子の形成には関与しないので、シクロデカン、１，２−ジフルオロ−デカンおよび１，３−ジメチルシクロデカンは、すべて類似性によって１０員の大環状分子とみなされる。
【００４６】
記号
【化６】
2019520304.tif 000009
は、分子構造の一部として使用される場合、単結合、またはトランスもしくはシス二重結合を指す。
【００４７】
用語「アミノ酸側鎖」は、アミノ酸のα−炭素に結合している部分を指す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖は、メチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖は、フェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖は、チオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖は、カルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は、４−ヒドロキシフェニルメチルである等である。また、他の天然に存在しないアミノ酸の側鎖、例えば天然に存在するもの（例えばアミノ酸代謝産物）または合成により作製されたもの（例えばα，α二置換アミノ酸）が含まれる。
【００４８】
用語「α，α二置換アミノ」酸は、２つの天然または非天然アミノ酸側鎖に結合している炭素（α−炭素）に結合したアミノ基とカルボキシル基の両方を含有する分子または部分を指す。
【００４９】
用語「ポリペプチド」は、共有結合（例えば、アミド結合）によって連結した２つまたはそれを超える数の天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を包含する。本明細書に記載のポリペプチドには、全長タンパク質（例えば完全にプロセシングされたタンパク質）ならびにより短いアミノ酸配列（例えば、天然に存在するタンパク質の断片または合成ポリペプチドの断片）が含まれる。
【００５０】
用語「第１のＣ末端アミノ酸」は、Ｃ末端に最も近接しているアミノ酸を指す。用語「第２のＣ末端アミノ酸」は、第１のＣ末端アミノ酸のＮ末端に結合しているアミノ酸を指す。
【００５１】
本明細書で使用される用語「大環状化試薬」または「大環状分子形成試薬」は、２つの反応基間の反応を媒介することによって本発明のペプチド模倣大環状分子を調製するために使用され得る任意の試薬を指す。反応基は、例えばアジドおよびアルキンであってよく、その場合、大環状化試薬には、それらに限定されるものではないが、Ｃｕ試薬、例えば反応性Ｃｕ（Ｉ）種をもたらす試薬、例えばＣｕＢｒ、ＣｕＩまたはＣｕＯＴｆ、ならびに還元剤、例えばアスコルビン酸またはアスコルビン酸ナトリウムを添加することによって活性なＣｕ（Ｉ）試薬にｉｎ  ｓｉｔｕで変換することができるＣｕ（ＩＩ）塩、例えばＣｕ（ＣＯ２ＣＨ３）２、ＣｕＳＯ４、およびＣｕＣｌ２が含まれる。大環状化試薬には、さらに、例えば当技術分野で公知のＲｕ試薬、例えばＣｐ＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ３）２、［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］４または反応性Ｒｕ（ＩＩ）種をもたらすことができる他のＲｕ試薬が含まれ得る。他の場合には、反応基は、末端オレフィンである。このような実施形態では、大環状化試薬または大環状分子形成試薬は、それらに限定されるものではないが、安定化された後期遷移金属カルベン錯体触媒、例えばＶＩＩＩ群の遷移金属カルベン触媒を含めたメタセシス触媒である。例えば、このような触媒は、＋２酸化状態、電子計数１６を有し、五配位されているＲｕおよびＯｓ金属中心である。追加の触媒が、Ｇｒｕｂｂｓら、「Ｒｉｎｇ  Ｃｌｏｓｉｎｇ  Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  １９９５年、２８巻、４４６〜４５２頁、米国特許第５，８１１，５１５号に開示されている。さらに他の場合には、反応基は、チオール基である。このような実施形態では、大環状化試薬は、例えば２つのチオール反応基、例えばハロゲン基で官能化されているリンカーである。
【００５２】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素もしくはヨウ素、またはそれらのラジカルを指す。
【００５３】
用語「アルキル」は、指示数の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖である炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１０は、その基が１〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。「アルキル」は、任意の数が指定されない場合、１〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００５４】
用語「アルキレン」は、二価のアルキル（すなわち−Ｒ−）を指す。
【００５５】
用語「アルケニル」は、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖である炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は、指示数の炭素原子を含有する。例えば、Ｃ２〜Ｃ１０は、その基が２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。用語「低級アルケニル」は、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル鎖を指す。「アルケニル」は、任意の数が指定されない場合、２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００５６】
用語「アルキニル」は、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖である炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は、指示数の炭素原子を含有する。例えば、Ｃ２〜Ｃ１０は、その基が２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。用語「低級アルキニル」は、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル鎖を指す。「アルキニル」は、任意の数が指定されない場合、２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分岐鎖）である。
【００５７】
用語「アリール」は、６個の炭素の単環式または１０個の炭素の二環式芳香族環系を指し、ここで各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基によって置換されている。アリール基の例として、フェニル、ナフチル等が挙げられる。用語「アリールアルキル」または用語「アラルキル」はアリールで置換されたアルキルを指す。用語「アリールアルコキシ」は、アリールで置換されているアルコキシを指す。
【００５８】
「アリールアルキル」は、アリール基の水素原子の１つが、上で定義のＣ１〜Ｃ５アルキル基で置き換えられている、上で定義のアリール基を指す。アリールアルキル基の代表例として、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２−プロピルフェニル、３−プロピルフェニル、４−プロピルフェニル、２−ブチルフェニル、３−ブチルフェニル、４−ブチルフェニル、２−ペンチルフェニル、３−ペンチルフェニル、４−ペンチルフェニル、２−イソプロピルフェニル、３−イソプロピルフェニル、４−イソプロピルフェニル、２−イソブチルフェニル、３−イソブチルフェニル、４−イソブチルフェニル、２−ｓｅｃ−ブチルフェニル、３−ｓｅｃ−ブチルフェニル、４−ｓｅｃ−ブチルフェニル、２−ｔ−ブチルフェニル、３−ｔ−ブチルフェニルおよび４−ｔ−ブチルフェニルが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
「アリールアミド」は、アリール基の水素原子の１つが、１つまたは複数の−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基で置き換えられている、上で定義のアリール基を指す。アリールアミド基の代表例として、２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−フェニル、３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−フェニル、４−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−フェニル、２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−ピリジル、３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−ピリジル、および４−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−ピリジルが挙げられる。
【００６０】
「アルキル複素環」は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基の水素原子の１つが、複素環で置き換えられている、上で定義のＣ１〜Ｃ５アルキル基を指す。アルキル複素環基の代表例として、−ＣＨ２ＣＨ２−モルホリン、−ＣＨ２ＣＨ２−ピペリジン、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−モルホリン、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−イミダゾールが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６１】
「アルキルアミド」は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基の水素原子の１つが、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基で置き換えられている、上で定義のＣ１〜Ｃ５アルキル基を指す。アルキルアミド基の代表例として、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）ＣＨ２ＣＨ３、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３−ＣＨ３、および−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ２が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６２】
「アルカノール」は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基の水素原子の１つが、ヒドロキシル基で置き換えられている、上で定義のＣ１〜Ｃ５アルキル基を指す。アルカノール基の代表例として、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３および−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＯＨが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６３】
「アルキルカルボキシ」は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基の水素原子の１つが、−−ＣＯＯＨ基で置き換えられている、上で定義のＣ１〜Ｃ５アルキル基を指す。アルキルカルボキシ基の代表例として、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３および−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＯＯＨが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
本明細書で用いられる用語「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、より好ましくは３〜６個の炭素を有する飽和および部分的に不飽和の環式炭化水素基を含み、ここでシクロアルキル基は、任意選択でさらに置換されている。いくつかのシクロアルキル基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが含まれるが、それらに限定されない。
【００６５】
用語「ヘテロアリール」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子を有し、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子を有し、または三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、または１１〜１４員の三環式環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子およびそれぞれ単環式、二環式または三環式の場合には、Ｏ、ＮまたはＳの１〜３個、１〜６個または１〜９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基によって置換されている。ヘテロアリール基の例として、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等が挙げられる。
【００６６】
用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを指す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」は、ヘテロアリールで置換されているアルコキシを指す。
【００６７】
用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを指す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」は、ヘテロアリールで置換されているアルコキシを指す。
【００６８】
用語「ヘテロシクリル」は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子を有し、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子を有し、または三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する、非芳香族の５〜８員の単環式、８〜１２員の二環式、または１１〜１４員の三環式環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子およびそれぞれ単環式、二環式または三環式の場合には、Ｏ、ＮまたはＳの１〜３個、１〜６個または１〜９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２または３個の原子は、置換基によって置換されている。ヘテロシクリル基の例として、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
【００６９】
用語「置換基」は、任意の分子、化合物または部分上の第２の原子または基、例えば水素原子を置き換える基を指す。適切な置換基には、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリール、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、およびシアノ基が含まれるが、それらに限定されない。
【００７０】
一部の実施形態では、１つまたは複数の本発明の化合物は１つまたは複数の不斉中心を含有し、よって、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマーの混合物として存在する。一実施形態では、これらの化合物の異性体の形態は、他に明示的に提供されない限り、本発明に含まれる。一部の実施形態では、１つまたは複数の本発明の化合物はまた複数の互変異性体の形態で表され、そのような事例において、１つまたは複数の本発明の化合物は、本明細書に記載の化合物のすべての互変異性体の形態を含む（例えば、環系のアルキル化が複数の部位でアルキル化をもたらす場合、１つまたは複数の本発明の化合物はすべてのこのような反応生成物を含む）。このような化合物のすべてのこのような異性体の形態は、他に明示的に提供されない限り、本発明に含まれる。本明細書に記載の化合物のすべての結晶形は、他に明示的に提供されない限り、本発明に含まれる。
【００７１】
本明細書で使用される用語「増加」および「低減」は、それぞれ、少なくとも５％の統計的に有意な（すなわちｐ＜０．１）増加または低減を引き起こすことを意味する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、変数に対する数値的な範囲の列挙は、本発明が、その範囲内の値のいずれかと等しい変数を用いて実施されてもよいことを伝えることが意図されている。したがって、本質的に別々の変数に関して、その変数は、範囲の終点を含めた数値範囲内の任意の整数値に等しい。同様に、本質的に連続している変数に関して、その変数は、範囲の終点を含めた数値範囲内の任意の真の値に等しい。一例として、限定されるものではないが、０と２の間の値を有すると記載される変数は、その変数が本質的に別々である場合には、０、１または２の値をとり、変数が本質的に連続している場合には、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値もしくは≧０および≦２の任意の他の真の値をとる。
【００７３】
別段具体的に示されない限り、本明細書で使用される「または」という用語は、「および／または」の包括的な意味で使用され、「いずれか／または」の排他的意味では使用されない。
【００７４】
用語「平均で」は、データ点ごとに少なくとも３つの独立な反復を実施することから得られた平均値を表す。
【００７５】
用語「生物活性」は、本発明の大環状分子の構造的および機能的特性を包含する。生物活性は、例えば構造的安定性、アルファ−ヘリシティ、標的に対する親和性、タンパク分解による分解に対する抵抗性、細胞透過性、細胞内安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、またはそれらの任意の組合せである。
【００７６】
用語「結合親和性」は、例えばペプチド模倣大環状分子と標的の間の結合相互作用の強度を指す。結合親和性は、例えば平衡解離定数（「ＫＤ」）として表すことができ、この定数は、濃度の尺度である単位（例えばＭ、ｍＭ、μＭ、ｎＭ等）で表される。数的には、結合親和性およびＫＤ値は反比例し、したがって、より低い結合親和性は、より高いＫＤ値に相当し、より高い結合親和性は、より低いＫＤ値に相当する。高い結合親和性が望ましい場合、「改善された」結合親和性は、より高い結合親和性を指し、したがってより低いＫＤ値を指す。
【００７７】
用語「結合親和性比」は、最初の結合相互作用の解離定数（ＫＤ値）（分子）と、第２の結合相互作用（分母）との比を指す。結果的に、標的１と標的２との「結合親和性比の減少」とは、ＫＤ（標的１）／ＫＤ（標的２）として表現された比に対してより低い値を指す。この概念はまた、標的１対標的２に対する「改善された選択性」として特徴付けることができ、標的１に対するＫＤ値の低減または標的２に対するＫＤ値の増大のいずれかによるものである可能性がある。
【００７８】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性」は、ペプチド模倣大環状分子などの試験化合物が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系またはアッセイにおいて有益な結果をもたらす程度を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性は、例えば、試験系において最大効果の５０％をもたらす試験化合物の濃度を表す「ＩＣ５０」または「ＥＣ５０」値として測定され得る。
【００７９】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の比」または「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効率」は、第１のアッセイ（分子）対第２のアッセイ（分母）から得られたＩＣ５０またはＥＣ５０値の比を指す。結果的に、アッセイ１対アッセイ２の改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効率は、ＩＣ５０（アッセイ１）／ＩＣ５０（アッセイ２）または、あるいはＥＣ５０（アッセイ１）／ＥＣ５０（アッセイ２）として表される比に関するより低い値を指す。またこの概念は、アッセイ１対アッセイ２において「改善された選択性」と特徴付けることができ、標的１に関するＩＣ５０もしくはＥＣ５０値の低下、または標的２に関するＩＣ５０もしくはＥＣ５０値の増大のいずれかに起因し得る。
【００８０】
本発明の１つまたは複数の特定の実施形態の詳細は添付の図および以下の記載に示されている。本発明の他の特色、目的、および利点は、説明および図、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【００８１】
一部の実施形態では、ペプチド配列はｐ５３タンパク質から誘導される。
【００８２】
本発明における使用に適切なｐ５３ペプチドの非限定的な例示リストが以下に付与される。
【表１】
2019520304.tif 000010
【表２】
2019520304.tif 000011
【表３】
2019520304.tif 000012
ペプチド模倣大環状分子
【００８３】
一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、式：
【化７】
2019520304.tif 000013
（式中、
各Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立に、天然または非天然アミノ酸であり、
Ｂは、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、
【化８】
2019520304.tif 000014
、［−ＮＨ−Ｌ３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ３−ＳＯ２−］、または［−ＮＨ−Ｌ３−］であり、
末端ＤおよびＥは、独立にキャッピング基を任意選択で含み、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルであり（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、
Ｌは、式−Ｌ１−Ｌ２−の大環状分子を形成するリンカーであり、
各ＬおよびＬ’は、独立に、式
【化９】
2019520304.tif 000015
の大環状分子を形成するリンカーであり、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれＲ５により任意選択で置換されており、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＤ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ８は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
ｖおよびｗは、独立に、１〜１０００、例えば１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０、または１〜１０の整数であり、
ｕは、１〜１０、例えば１〜５、１〜３または１〜２の整数であり、
ｘ、ｙおよびｚは、独立に、０〜１０の整数であり、例えば、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は２、３、または６であり、
ｎは１〜５の整数である）を有する。
【００８４】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、式：
【化１０】
2019520304.tif 000016
（式中、
各Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立に、アミノ酸であり、
Ｂはアミノ酸、
【化１１】
2019520304.tif 000017
［−ＮＨ−Ｌ４−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ４−ＳＯ２−］、または［−ＮＨ−Ｌ４−］であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであるか（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、またはＲ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、前記ＤまたはＥアミノ酸のうちの１つのアルファ位に連結している大環状分子を形成するリンカーＬ’を形成し、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれ非置換であるか、またはＲ５で置換されており、
各ＫはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＤ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ８は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
ｖおよびｗは、独立に、１〜１０００、例えば、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０または１〜１０の整数であり、
ｕは、１〜１０、例えば、１〜５、１〜３または１〜２の整数であり、
ｘ、ｙおよびｚは、独立に、０〜１０の整数であり、例えば、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は２、３、または６であり、
ｎは１〜５の整数である）を有する。
【００８５】
一部の実施形態では、ｖおよびｗは１〜３０の整数である。一部の実施形態では、ｗは３〜１０００、例えば、３〜５００、３〜２００、３〜１００、３〜５０、３〜３０、３〜２０、または３〜１０の整数である。一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３または６である。一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３である。他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は６である。
【００８６】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ｕ＝１およびｗ＝２の場合、Ｅで表される第１のＣ末端アミノ酸がアルギニン（Ｒ）ではなく、および／またはＥで表される第２のＣ末端アミノ酸がスレオニン（Ｔ）ではないことを条件として、特許請求される。例えば、ｕ＝１およびｗ＝２の場合、Ｅで表される第１のＣ末端アミノ酸および／または第２のＣ末端アミノ酸は、正電荷側鎖または極性無電荷側鎖を含まない。一部の実施形態では、ｕ＝１およびｗ＝２の場合、Ｅで表される第１のＣ末端アミノ酸および／または第２のＣ末端アミノ酸は疎水性側鎖を含む。例えば、ｗ＝２の場合、Ｅで表される第１のＣ末端アミノ酸および／または第２のＮ末端アミノ酸は疎水性側鎖、例えば、大きな疎水性側鎖を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、ｗは３と１０００との間である。例えば、Ｅで表される第３のアミノ酸は大きな疎水性側鎖を含む。
【００８８】
開示された任意のペプチド模倣大環状分子の一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、単独でまたは組み合わせて、全炭化水素鎖またはチオエーテルを形成しない。開示された任意のペプチド模倣大環状分子の他の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、単独でまたは組み合わせて、全炭化水素鎖またはトリアゾールを形成しない。
【００８９】
１つの例では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。別の例では、Ｒ１およびＲ２の両方は、独立に、アルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。一部の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはメチルである。他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はメチルである。
【００９０】
一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも３である。他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３または６である。一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３である。他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は６である。大環状分子または大環状分子前駆体に存在するＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのそれぞれは独立に選択される。例えば、式［Ａ］ｘで表される配列は、ｘが３の場合、アミノ酸が同一ではない実施形態、例えばＧｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ、ならびにアミノ酸が同一である実施形態、例えばＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを包含する。これは、示された範囲内のｘ、ｙ、またはｚのうちの任意の値に対して適用される。同様に、ｕが１より大きい場合、各化合物は、同じまたは異なるペプチド模倣大環状分子を包含することができる。例えば、化合物は、異なるリンカー長または化学組成を含むペプチド模倣大環状分子を含むことができる。
【００９１】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、αヘリックスである二次構造を含み、Ｒ８は−Ｈであり、ヘリックス内の水素結合を可能にする。一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つはα，α二置換アミノ酸である。１つの例では、Ｂはα，α二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。他の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは、
【化１２】
2019520304.tif 000018
である。
【００９２】
他の実施形態では、第１のＣαから第２のＣαまで測定される大環状分子を形成するリンカーＬの長さは、所望の二次ペプチド構造、例えば、必ずしもこれに限定されないが、第１のＣαから第２のＣαまでの間のものを含めた、ペプチド模倣大環状分子の残基により形成されるαヘリックス等を安定化するように選択される。
【００９３】
式：
【化１３】
2019520304.tif 000019
（式中、
Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のそれぞれが個々にアミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも３つが配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸であり、各Ｘはアミノ酸であり、
各ＤおよびＥは、独立に、アミノ酸であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであるか（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、またはＲ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、前記ＤまたはＥアミノ酸のうちの１つのアルファ位に連結している大環状分子を形成するリンカーＬ’を形成し、
各ＬまたはＬ’は、独立に、式−Ｌ１−Ｌ２−の大環状分子を形成するリンカーであり、
Ｌ１およびＬ２は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれＲ５により任意選択で置換されており、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＤ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ８は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
ｖは、１〜１０００、例えば１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０または１〜１０の整数であり、
ｗは、３〜１０００、例えば、３〜５００、３〜２００、３〜１００、３〜５０、３〜３０、３〜２０、または３〜１０の整数であり、
ｎは１〜５の整数である）のペプチド模倣大環状分子もまた提供される。
【００９４】
一部の実施形態では、ｖおよびｗは１〜３０の整数である。一部の実施形態では、ｗは３〜１０００、例えば、３〜５００、３〜２００、３〜１００、３〜５０、３〜３０、３〜２０、または３〜１０の整数である。一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３または６である。一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は３である。他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚの合計は６である。
【００９５】
本明細書に記載の任意の式の一部の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも３つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも４つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも５つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０の少なくとも６つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０の少なくとも７つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。
【００９６】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、式：
【化１４】
2019520304.tif 000020
（式中、
Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のそれぞれは、個々にアミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０の少なくとも３つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸であり、ここで、各Ｘはアミノ酸であり、
各Ｄは、独立に、アミノ酸であり、
各Ｅは、独立に、アミノ酸であり、例えば、Ａｌａ（アラニン）、Ｄ−Ａｌａ（Ｄ−アラニン）、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ｓａｒ（Ｎ−メチルグリシン）、およびＳｅｒ（セリン）から選択されるアミノ酸であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであるか（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、またはＲ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、前記ＤまたはＥアミノ酸のうちの１つのアルファ位に連結している大環状分子を形成するリンカーＬ’を形成し、
各ＬまたはＬ’は、独立に、式−Ｌ１−Ｌ２−の大環状分子を形成するリンカーであり、
各ＬおよびＬ’は、独立に、式；
【化１５】
2019520304.tif 000021
の大環状分子を形成するリンカーであり、
Ｌ１およびＬ２は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれがＲ５により任意選択で置換されており、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＤ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ８は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
ｖは、１〜１０００、例えば１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜−５０、１〜３０、１〜２０、または１〜１０の整数であり、
ｗは、３〜１０００、例えば、３〜５００、３〜２００、３〜１００、３〜５０、３〜３０、３〜２０、または３〜１０の整数であり、
ｎは１〜５の整数である）を有する。
【００９７】
上記式の一部の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも３つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。上記式の他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも４つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。上記式の他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも５つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。上記式の他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも６つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。上記式の他の実施形態では、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも７つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸である。
【００９８】
一部の実施形態では、ｗは、３〜１０、例えば３〜６、３〜８、６〜８、または６〜１０の整数である。一部の実施形態では、ｗは３である。他の実施形態では、ｗは６である。一部の実施形態では、ｖは１〜１０、例えば、２〜５の整数である。一部の実施形態では、ｖは２である。
【００９９】
本明細書に記載の式のいずれかの一実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、単独でまたは組み合わせて、トリアゾールまたはチオエーテルを形成しない。
【０１００】
１つの例では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。別の例では、Ｒ１およびＲ２の両方は、独立に、アルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。一部の実施形態では、Ｒ１およびＲ２の少なくとも１つはメチルである。他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はメチルである。
【０１０１】
本発明の一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも３である。本発明の他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。本発明の大環状分子または大環状分子前駆体に存在するＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのそれぞれは、独立に、選択される。例えば、式［Ａ］ｘで表される配列は、ｘが３である場合、アミノ酸が同一でない実施形態、例えばＧｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ、ならびにアミノ酸が同一の実施形態、例えばＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを包含する。これは、示された範囲内のｘ、ｙ、またはｚのうちの任意の値に対して適用される。同様に、ｕが１より大きい場合、本発明の各化合物は、同じまたは異なるペプチド模倣大環状分子を包含し得る。例えば、本発明の化合物は、異なるリンカー長または化学組成を含むペプチド模倣大環状分子を含み得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、αヘリックスである二次構造を含み、Ｒ８は−Ｈであり、ヘリックス内の水素結合を可能にする。一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つはα，α二置換アミノ酸である。１つの例では、Ｂはα，α二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。他の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは、
【化１６】
2019520304.tif 000022
である。
【０１０３】
他の実施形態では、第１のＣαから第２のＣαまで測定される大環状分子を形成するリンカーＬの長さは、所望の二次ペプチド構造、例えば、必ずしもこれに限定されないが、第１のＣαから第２のＣαまでの間のものを含めた、ペプチド模倣大環状分子の残基により形成されるαヘリックス等を安定化するように選択される。
【０１０４】
一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、
【化１７】
2019520304.tif 000023
（式中、各Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている））である。
【０１０５】
関連した実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、
【化１８】
2019520304.tif 000024
【化１９】
2019520304.tif 000025
である。
【０１０６】
式：
【化２０】
2019520304.tif 000026
（式中、
Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のそれぞれは、個々に、アミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも３つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０−Ｘ１１−Ｓｅｒ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸であり、各Ｘはアミノ酸であり、
各ＤおよびＥは、独立に、アミノ酸であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであるか（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、またはＲ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、前記ＤまたはＥアミノ酸のうちの１つのアルファ位に連結している大環状分子を形成するリンカーＬ’を形成し、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレンまたは［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれが非置換であるか、またはＲ５で置換されており、
各ＫはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＤ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ８は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
ｖは、１〜１０００、例えば、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０または１〜１０の整数であり、
ｗは、３〜１０００、例えば３〜５００、３〜２００、３〜１００、３〜５０、３〜３０、３〜２０、または３〜１０の整数であり、
ｎは１〜５の整数である）のペプチド模倣大環状分子もまた提供される。
【０１０７】
式：
【化２１】
2019520304.tif 000027
（式中、
Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のそれぞれは、個々にアミノ酸であり、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、およびＸａａ１０のうちの少なくとも３つは、配列Ｐｈｅ３−Ｘ４−Ｇｌｕ５−Ｔｙｒ６−Ｔｒｐ７−Ａｌａ８−Ｇｌｎ９−Ｌｅｕ１０／Ｃｂａ１０−Ｘ１１−Ａｌａ１２の対応する位置のアミノ酸と同じアミノ酸であり、各Ｘはアミノ酸であり、
各ＤおよびＥは、独立にアミノ酸であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであるか（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、またはＲ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、前記ＤまたはＥアミノ酸のうちの１つのアルファ位に連結している大環状分子を形成するリンカーＬ’を形成し、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれが非置換であるか、またはＲ５で置換されており、
各Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＤ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ８は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであるか（Ｒ５により任意選択で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
ｖは、１〜１０００、例えば、１〜５００、１〜２００、１〜１００、１〜５０、１〜３０、１〜２０、または１〜１０の整数であり、
ｗは、３〜１０００、例えば３〜５００、３〜２００、３〜１００、３〜５０、３〜３０、３〜２０、または３〜１０の整数であり、
ｎは１〜５の整数である）のペプチド模倣大環状分子もまた提供される。
【０１０８】
一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、
【化２２】
2019520304.tif 000028
（式中、各Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている））である。
【０１０９】
関連した実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、
【化２３】
2019520304.tif 000029
（式中、各Ｒ１’およびＲ２’は、独立にアミノ酸である）である。
【０１１０】
他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は以下に示す式のいずれかの化合物である：
【化２４】
2019520304.tif 000030
【化２５】
2019520304.tif 000031
（式中、「ＡＡ」は、天然または非天然のアミノ酸側鎖を表し、
【化２６】
2019520304.tif 000032
は、上で定義されたような［Ｄ］ｖ、［Ｅ］ｗであり、ｎは０と２０、５０、１００、２００、３００、４００または５００との間の整数である）。一部の実施形態では、ｎは０である。他の実施形態では、ｎは５０未満である。
【０１１１】
大環状分子を形成するリンカーＬの例示的な実施形態が以下に示されている。
【化２７】
2019520304.tif 000033
【化２８】
2019520304.tif 000034
【化２９】
2019520304.tif 000035
【０１１２】
他の実施形態では、化合物中のＤおよび／またはＥは、細胞の取り込みを促進するためにさらに改変される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子の脂質化またはＰＥＧ化は、細胞の取り込みを促進し、バイオアベイラビリティーを増大し、血液循環を増大し、薬物動態を変化させ、免疫原性を低減し、および／または必要とされる投与頻度を低減する。
【０１１３】
他の実施形態では、開示された式の化合物の［Ｄ］および［Ｅ］のうちの少なくとも１つは、ペプチド模倣大環状分子が少なくとも２つの大環状分子を形成するリンカーを含むように、追加の大環状分子を形成するリンカーを含む部分を表す。特定の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２つの大環状分子を形成するリンカーを含む。一実施形態では、ｕは２である。
【０１１４】
本発明のペプチド模倣大環状分子において、本明細書に記載の大環状分子を形成するリンカーのいずれかは、表１〜３、９〜１３、２３〜２５、２７〜２８に示された配列のいずれかとの、さらに本明細書で示されたＲ置換基のいずれかとの任意の組合せで使用することができる。
【０１１５】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は少なくとも１つのαヘリックスモチーフを含む。例えば、開示された化合物中のＡ、Ｂおよび／またはＣは、１つまたは複数のαヘリックスを含む。一般的事項として、αヘリックスは、１つのターン当たり３〜４個の間のアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子のαヘリックスは、１〜５のターンを含み、したがって、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、αヘリックスは、１つのターン、２つのターン、３つのターン、４つのターン、または５つのターンを含む。一部の実施形態では、大環状分子を形成するリンカーは、ペプチド模倣大環状分子内に含まれるαヘリックスモチーフを安定化させる。よって、一部の実施形態では、第１のＣαから第２のＣαまでの大環状分子を形成するリンカーＬの長さは、αヘリックスの安定性を増大させるように選択される。一部の実施形態では、大環状分子を形成するリンカーは、１ターン〜５ターンのαヘリックスをスパンする。一部の実施形態では、大環状分子を形成するリンカーは、およそ１ターン、２ターン、３ターン、４ターン、または５ターンのαヘリックスをスパンする。一部の実施形態では、大環状分子を形成するリンカーの長さは、αヘリックスの１ターン当たりおよそ５Å〜９Å、またはαヘリックスの１ターン当たりおよそ６Å〜８Åである。大環状分子を形成するリンカーがおよそ１ターンのαヘリックスをスパンする場合、その長さは、およそ５個の炭素−炭素結合〜１３個の炭素−炭素結合、およそ７個の炭素−炭素結合〜１１個の炭素−炭素結合、またはおよそ９個の炭素−炭素結合と等しい。大環状分子を形成するリンカーがおよそ２ターンのαヘリックスをスパンする場合、その長さは、およそ８個の炭素−炭素結合〜１６個の炭素−炭素結合、およそ１０個の炭素−炭素結合〜１４個の炭素−炭素結合、またはおよそ１２個の炭素−炭素結合と等しい。大環状分子を形成するリンカーが、およそ３ターンのαヘリックスをスパンする場合、その長さは、およそ１４個の炭素−炭素結合〜２２個の炭素−炭素結合、およそ１６個の炭素−炭素結合〜２０個の炭素−炭素結合、またはおよそ１８個の炭素−炭素結合と等しい。大環状分子を形成するリンカーが、およそ４ターンのαヘリックスをスパンする場合、その長さは、およそ２０個の炭素−炭素結合〜２８個の炭素−炭素結合、およそ２２個の炭素−炭素結合〜２６個の炭素−炭素結合、またはおよそ２４個の炭素−炭素結合と等しい。大環状分子を形成するリンカーがおよそ５ターンのαヘリックスをスパンする場合、その長さは、およそ２６個の炭素−炭素結合〜３４個の炭素−炭素結合、およそ２８個の炭素−炭素結合〜３２個の炭素−炭素結合、またはおよそ３０個の炭素−炭素結合と等しい。大環状分子を形成するリンカーがおよそ１ターンのαヘリックスをスパンする場合、この連結は、およそ４個の原子〜１２個の原子、およそ６個の原子〜１０個の原子、またはおよそ８個の原子を含有する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ２ターンのαヘリックスをスパンする場合、この連結は、およそ７個の原子〜１５個の原子、およそ９個の原子〜１３個の原子、またはおよそ１１個の原子を含有��る。大環状分子を形成するリンカーがおよそ３ターンのαヘリックスをスパンする場合、その連結は、およそ１３個の原子〜２１個の原子、およそ１５個の原子〜１９個の原子、またはおよそ１７個の原子を含有する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ４ターンのαヘリックスをスパンする場合、その連結はおよそ１９個の原子〜２７個の原子、およそ２１個の原子〜２５個の原子、またはおよそ２３個の原子を含有する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ５ターンのαヘリックスをスパンする場合、その連結はおよそ２５個の原子〜３３個の原子、およそ２７個の原子〜３１個の原子、またはおよそ２９個の原子を含有する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ１ターンのαヘリックスをスパンする場合、生成した大環状分子は、およそ１７員〜２５員、およそ１９員〜２３員、またはおよそ２１員を含有する環を形成する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ２ターンのαヘリックスをスパンする場合、得られる大環状分子は、およそ２９員〜３７員、およそ３１員〜３５員、またはおよそ３３員を含有する環を形成する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ３ターンのαヘリックスをスパンする場合、得られる大環状分子は、およそ４４員〜５２員、およそ４６員〜５０員、またはおよそ４８員を含有する環を形成する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ４ターンのαヘリックスをスパンする場合、得られる大環状分子は、およそ５９員〜６７員、およそ６１員〜６５員、またはおよそ６３員を含有する環を形成する。大環状分子を形成するリンカーがおよそ５ターンのαヘリックスをスパンする場合、得られる大環状分子は、およそ７４員〜８２員、およそ７６員〜８０員、またはおよそ７８員を含有する環を形成する。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明はペプチド模倣大環状分子を提供する：
【化３０】
2019520304.tif 000036
（式中、
各Ａ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、独立に、天然または非天然アミノ酸であり、末端ＤおよびＥは、独立に、キャッピング基を任意選択で含み、
Ｂは、天然もしくは非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、
【化３１】
2019520304.tif 000037
、［−ＮＨ−Ｌ３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ３−ＳＯ２−］、または［−ＮＨ−Ｌ３−］であり、
Ｒ１およびＲ２は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクロアルキルであるか（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）、またはＥ残基を有する環式構造の一部であり、
Ｒ３は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
Ｌは、式−Ｌ１−Ｌ２−の大環状分子を形成するリンカーであり、
Ｌ１およびＬ２は、独立に、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、または［−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−］ｎであり、それぞれがＲ５により任意選択で置換されており、
各Ｒ４は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンであり、
各Ｋは、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＯＮＲ３であり、
各Ｒ５は、独立に、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ６、−Ｎ（Ｒ６）２、−ＳＲ６、−ＳＯＲ６、−ＳＯ２Ｒ６、−ＣＯ２Ｒ６、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
各Ｒ６は、独立に、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光部分、放射性同位体または治療剤であり、
Ｒ７は、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、またはヘテロシクロアリールであり（Ｒ５により任意選択で置換されている）、
ｖおよびｗは、独立に、１〜１０００の整数であり、
ｕは１〜１０の整数であり、
ｘ、ｙおよびｚは、独立に、０〜１０の整数であり、
ｎは１〜５の整数である）。
【０１１７】
１つの例では、Ｌ１およびＬ２は、単独でまたは組み合わせて、トリアゾールまたはチオエーテルを形成しない。
【０１１８】
１つの例では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。別の例では、Ｒ１およびＲ２の両方は、独立にアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。一部の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはメチルである。他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はメチルである。
【０１１９】
本発明の一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも１である。本発明の他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも２である。本発明の他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。本発明の大環状分子または大環状分子前駆体に存在するＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのそれぞれは、独立に選択される。例えば、式［Ａ］ｘで表される配列は、ｘが３の場合、アミノ酸が同一ではない実施形態、例えばＧｌｎ−Ａｓｐ−Ａｌａならびにアミノ酸が同一である実施形態、例えばＧｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎを包含する。これは、示された範囲内のｘ、ｙ、またはｚのうちの任意の値に対して適用される。
【０１２０】
一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、αヘリックスである二次構造を含み、Ｒ８は−Ｈであり、ヘリックス内の水素結合を可能にする。一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つはα，α二置換アミノ酸である。１つの例では、Ｂはα，α二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。他の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは、
【化３２】
2019520304.tif 000038
である。
【０１２１】
他の実施形態では、第１のＣαから第２のＣαまで測定される大環状分子を形成するリンカーＬの長さは、所望の二次ペプチド構造、例えば、必ずしもこれに限定されないが、第１のＣαから第２のＣαまでの間のものを含めた、ペプチド模倣大環状分子の残基により形成されるαヘリックス等を安定化するように選択される。
【０１２２】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ＭＤＭ２またはＭＤＭＸに対する改善された結合親和性を有する。他の事例では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ＭＤＭＸ対ＭＤＭ２に対するより低い結合親和性比を有する。また他の事例では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ｐ５３陽性腫瘍細胞株に対する改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性を有する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ｐ５３陽性腫瘍細胞株において改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアポトーシス誘導を示す。他の事例では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ｐ５３陽性対ｐ５３陰性または変異腫瘍細胞株に対する改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性比率を有する。また他の事例では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ｐ５３陽性腫瘍に対する改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を有する。また他の事例では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ｐ５３陽性腫瘍において改善されたｉｎ  ｖｉｖｏアポトーシス誘導を有する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、改善された細胞浸透率を有する。他の場合には、ペプチド模倣大環状分子は、ｗが０、１または２である対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、改善された溶解度を有する。
【０１２３】
一部の実施形態では、Ｘａａ５はＧｌｕまたはそのアミノ酸類似体である。一部の実施形態では、Ｘａａ５はＧｌｕまたはそのアミノ酸類似体であり、ペプチド模倣大環状分子は、Ｘａａ５がＡｌａである対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、改善された特性、例えば、改善された結合親和性、改善された溶解度、改善された細胞の有効性、改善された細胞浸透率、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍有効性、または改善されたアポトーシス誘導等を有する。
【０１２４】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、Ｘａａ５がＡｌａである対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ＭＤＭ２またはＭＤＭＸに対する改善された結合親和性を有する。他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、Ｘａａ５がＡｌａである対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、ＭＤＭＸ対ＭＤＭ２に対するより低い結合親和性比を有する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、Ｘａａ５がＡｌａである対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、改善された溶解度を有するか、またはペプチド模倣大環状分子は、Ｘａａ５がＡｌａである対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、改善された細胞の有効性を有する。
【０１２５】
一部の実施形態では、Ｘａａ５はＧｌｕまたはそのアミノ酸類似体であり、ペプチド模倣大環状分子は、Ｘａａ５がＡｌａである対応するペプチド模倣大環状分子と比較して、改善された生物学的活性、例えば、改善された結合親和性、改善された溶解度、改善された細胞の有効性、改善されたヘリシティ、改善された細胞浸透率、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗腫瘍有効性、または改善されたアポトーシス誘導等を有する。
【０１２６】
一実施形態では、本明細書で開示されている化合物は、このような化合物を構成する原子の１つまたは複数において、非天然的割合の原子同位体を含有することができる。例えば、化合物は、放射性同位体、例えば、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）または炭素１４（１４Ｃ）等で放射標識することができる。別の実施形態では、本明細書で開示されている化合物は、１個または複数の炭素原子をケイ素原子で置き換えることができる。本明細書で開示されている化合物のすべての同位体の変化形は、放射性であろうとなかろうと、本明細書で想定される。
【０１２７】
用語「液性がん」は、本明細書で使用される場合、体液、例えば血液、リンパおよび骨髄中に存在するがん細胞を指す。液性がんには、白血病、骨髄腫、および液性リンパ腫が含まれる。液性リンパ腫には、嚢胞または液体領域を含有するリンパ腫が含まれる。液性がんは、本明細書で使用される場合、固形腫瘍、例えば肉腫および癌、または嚢胞もしくは液体領域を含有しない固形リンパ腫が含まれない。
【０１２８】
用語「有害事象」（ＡＥ）は、本明細書で使用される場合、被験薬の投与と時間的に関連しているか否かに関わらず、および被験薬と関係するとみなされるか否かに関わらず、臨床研究の任意の相で生じる身体的徴候、症状、および／または臨床検査値の変化によって示される、解剖学的、生理学的、または代謝的機能の任意の有害な、病理学的な、または意図されない変化を含む。この定義には、既存の病状もしくは事象の増悪、介在性疾病、過敏反応、薬物相互作用、または臨床的に有意な臨床検査所見が含まれる。ＡＥには、以下は含まれない。（ｉ）医学的または外科的手技、例えば抜歯、輸血、外科手術（その手技に至る病状は、ＡＥとして記録されるべきである）、（ｉｉ）研究の開始時に存在していたまたは検出された、悪化しない既存の状態または手技、（ｉｉｉ）待機的外科手術または有害な医学的事象が生じていない他の状況のための入院、（ｉｖ）治験責任医師に従って臨床的に有意でない場合を除き、介入が必要となる、または研究薬物投与の遅延、中断もしくは変更をもたらす異常臨床検査値、（ｖ）徴候／症状が伴わない、過量の研究薬物または併用医薬（徴候／症状が生じる場合、最終的な診断は、ＡＥとして記録されるべきである）、（ｖｉ）妊娠中に合併症が生じて入院に至らない限り、妊娠それ自体（この場合、入院に至る病状は、ＡＥとして記録されるべきである）、および（ｖｉｉ）この研究において有効性パラメーターとして捕捉され、したがってＡＥとしては記録されない、調査中の疾患の重大な悪化。
【０１２９】
重篤な有害事象（ＳＡＥ）という用語は、本明細書で使用される場合は、以下の結果のいずれかをもたらす有害事象を指す。（ｉ）死亡、（ｉｉ）生命を危うくする有害な経験（すなわち事象が生じた場合、その事象による差し迫った死亡の危険性。この事象には、より重篤な形態で生じ、死亡を引き起こしたかもしれない有害事象は含まれない）、（ｉｉｉ）持続的なまたは重大な障害／無能力（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ／ｉｎｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ）、（ｉｖ）入
院または現在の入院の延長、および（ｖ）先天性異常／出生時欠損。死亡をもたらさず、生命を危うくせず、または入院を必要とし得ない重要な医学的事象は、医学的判断に基づいて、それらが患者を危険に曝すおそれがあるか、またはこの定義において列挙された結果の１つを防止するために医学的もしくは外科的介入を必要とし得る場合、重篤であるとみなされ得る。基礎疾患に起因する入院は、研究薬物との因果関係が疑われる理由がない限り、ＳＡＥとして記録されない。
【０１３０】
ＡＥまたは疑わしい有害反応は、ペプチド模倣大環状分子の治験薬概要書（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ’ｓ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ）に列挙されていないか、または観測された特異性もしくは重症度に列
挙されていないか、またはプロトコルなどに記載の危険性情報と一致しない場合、「予期されない」とみなされる（予期されない有害事象（ＵＡＥ）と呼ばれる。例えば、この定義によれば、治験薬概要書に、肝酵素の上昇または肝炎だけが言及されている場合、肝臓壊死は予期されないものとなり得る（重症度がより高いことによる）。同様に、治験薬概要書に、脳血管事故だけが列挙されている場合、脳血栓塞栓症および脳血管炎は予期されないものとなり得る（特異性がより高いことによる）。またこの定義で使用される「予期されない」は、治験薬概要書において、あるクラスの薬物により生じるものとして、またはペプチド模倣大環状分子の薬理学的特性から予期されるものとして言及されているが、ペプチド模倣大環状分子により生じるものとして具体的に言及されていないＡＥまたは疑わしい有害反応を指す。
【０１３１】
「用量制限毒性」（ＤＬＴ）とは、本明細書で使用される場合、以下の例外を除いて、場合により、おそらく、または確定的に、研究薬物に関係していると考えられる任意のグレード≧３のＡＥであると定義される：（１）悪心、催吐、下痢、発疹、または粘膜炎に対する標準的な支持的／薬理学的処置に対しては、４８時間以内に応答しない、グレード≧３ＡＥのみがＤＬＴと考えられる；（２）電解質不均衡に対しては、矯正に対して２４時間以内に応答しない、グレード≧３ＡＥのみがＤＬＴと考えられる；（３）点滴反応に対しては、入院が必要となるグレード３の反応またはグレード４のみがＤＬＴと考えられる。加えて、特定の血液系ＤＬＴは、以下の通り定義される：
【０１３２】
血小板減少症−任意の期間のグレード４、≧７日のグレード３、または臨床的に有意な出血と関連しているグレード３
【０１３３】
好中球減少症−≧３日のグレード４、または任意のグレード≧３の発熱性好中球減少症
【０１３４】
先の判定基準を使用して、治験の全期間にわたる用量の低減、中断または中止に関する決定を個々の患者に対して行うことができるが、サイクル１中に生じたＤＬＴは、用量漸増を決定するための安全性および忍容性評価を知らせるために使用される。ＤＬＴを評価可能な集団は、処置の最初のサイクル中、ＤＬＴを経験する第１相用量漸増のあらゆる患者を含む。
【０１３５】
「最大耐用量」（ＭＴＤ）は、本明細書で使用される場合、６人の患者のうち≦１人が、ＤＬＴと評する処置関連毒性を経験する用量と定義され、２番めに多い用量は、６人までの患者のうち≧２人がＤＬＴを経験する用量である。ＭＴＤは、コホートに登録したすべての患者が、サイクル１を完了したか、処置を中止したか、または用量を低減したときまで、確立することはできない。既に確立されている用量レベルの忍容性は、ＤＬＴが後のサイクルで観測される場合に、再評価されることになる。
【０１３６】
「最適生物学的用量」（ＯＢＤ）とは、本明細書で使用される場合、各治療群に対して、ＭＴＤに到達する前に安全性審査委員会（ｓａｆｅｔｙ  ｒｅｖｉｅｗ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）が特定する用量と定義される。このようなＯＢＤは、研究の用量漸増部分からの、利用可能な安全性、ＰＫ、ＰＤ、および／または初期の有効性についての情報の評価から誘導されることになる。
【０１３７】
「測定可能疾患」（ＭＤ）とは、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの測定可能なＣＴＣまたはＭＮＢＣの存在により定義される。
【０１３８】
測定可能なＣＴＣおよびＭＮＢＣとは、正確に計数することができる生体試料からのものと定義される。
【０１３９】
「測定不可能な疾患」とは、本明細書で使用される場合、すべての他の病変を含む。
【０１４０】
「完全奏効」（ＣＲ）とは、本明細書で使用される場合、すべての標的ＣＴＣおよび／またはＭＮＢＣの消失と定義される。
【０１４１】
「部分奏効（ＰＲ）」とは、本明細書で使用される場合、ＣＴＣおよび／またはＭＮＢＣの数における少なくとも３０％の低減と定義される。
【０１４２】
「進行性疾患（ＰＤ）」とは、本明細書で使用される場合、ＣＴＣおよび／またはＭＮＢＣの数の少なくとも２０％の増大と定義される。
【０１４３】
「安定疾患」（ＳＤ）とは、本明細書で使用される場合、ＰＲと認定するのに十分な収縮も、ＰＤと認定するのに十分な増大もないと定義され、研究中は最小の直径和として言及される。
【０１４４】
用語「被験体」または「患者」は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例として、ヒト；非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種；家畜動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ；飼育動物、例えばウサギ、イヌ、およびネコ；げっ歯類、例えばラット、マウスおよびモルモット等を含む実験動物が挙げられるが、それらに限定されない。非哺乳動物の例として、鳥、魚等が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で提供される方法および組成物の一実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１４５】
別段指定されない限り、任意の化合物（ペプチド模倣大環状分子、大環状分子前駆体、および他の組成物を含む）はまた、１つまたは複数の同位体的に富化された原子の存在だけが異なっている化合物を包含することを意味する。例えば、重水素もしくはトリチウムによって水素が置き換えられているか、または１３Ｃ−もしくは１４Ｃが富化された炭素によって炭素が置き換えられていることを除いて、記載の構造を有する化合物は、本開示の範囲に含まれる。
【０１４６】
一部の実施形態では、本明細書に開示の化合物は、このような化合物を構成する原子の１つまたは複数において、非天然の割合の原子の同位体を含有することができる。例えば、化合物は、例えばトリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）または炭素−１４（１４Ｃ）などの放射性同位体で放射標識することができる。他の実施形態では、１つまたは複数の炭素原子は、ケイ素原子で置き換えられる。放射性であろうと放射性でなかろうと、本明細書に開示の化合物のあらゆる同位体変形形態が、本明細書において企図される。
【０１４７】
ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約１〜２４時間であり得る。例えば、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約２〜２４時間、４〜２４時間、６〜２４時間、８〜２４時間、１０〜２４時間、１２〜２４時間、１４〜２４時間、１６〜２４時間、１８〜２４時間、２０〜２４時間、２２〜２４時間、１〜２０時間、４〜２０時間、６〜２０時間、８〜２０時間、１０〜２０時間、１２〜２０時間、１４〜２０時間、１６〜２０時間、１８〜２０時間、１〜１６時間、４〜１６時間、６〜１６時間、８〜１６時間、１０〜１６時間、１２〜１６時間、１４〜１６時間、１〜１２時間、４〜１２時間、６〜１２時間、８〜１２時間、１０〜１２時間、１〜８時間、４〜８時間、６〜８時間、または１〜４時間であり得る。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約１〜１２時間、例えば約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間であり得る。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約２時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約４時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約６時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約８時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約１０時間である。
【０１４８】
生体組織中のペプチド模倣大環状分子の半減期は、約１〜２４時間であり得る。例えば、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約１〜２４時間、５〜２４時間、１０〜２４時間、１５〜２４時間、２０〜２４時間、１〜２２時間、５〜２２時間、１０〜２２時間、１５〜２２時間、２０〜２２時間、１〜２０時間、５〜２０時間、１５〜２０時間、１〜１８時間、５〜１８時間、１０〜１８時間、１５〜１８時間、１〜１６時間、５〜１６時間、１０〜１６時間、１５〜１６時間、１〜１４時間、５〜１４時間、１０〜１４時間、１〜１２時間、５〜１２時間、１０〜１２時間、１〜１０時間、５〜１０時間、１〜８時間、５〜８時間、１〜６時間、５〜６時間、または１〜４時間であり得る。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約５〜２０時間、例えば約５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間または２０時間であり得る。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約２時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約４時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約６時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約８時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約１０時間である。
【０１４９】
ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、生体組織におけるペプチド模倣大環状分子の半減期を超えるか、それに等しいか、またはそれ未満であり得る。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、生体組織におけるペプチド模倣大環状分子の半減期を超え得る。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、生体組織におけるペプチド模倣大環状分子の半減期と等しい場合がある。いくつかの例では、生体組織中のペプチド模倣大環状分子の半減期は、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期を超える。これによって、ペプチド模倣大環状分子をより低い用量および／またはより低い頻度で投与することが容易になり得る。一部の実施形態では、生体組織中のペプチド模倣大環状分子の半減期は、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期よりも少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、または少なくとも１２時間長い。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約４時間であり、生体組織の半減期は、約１０時間である。いくつかの例では、ヒト血中のペプチド模倣大環状分子の循環半減期は、約６時間であり、生体組織中の半減期は、約１０時間である。
【０１５０】
本発明の１つまたは複数の特定の実施形態の詳細は、添付の図および以下の説明に示されている。本発明の他の特色、目的、および利点は、説明および図から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。
ペプチド模倣大環状分子の調製
【０１５１】
本発明のペプチド模倣大環状分子は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって調製することができる。例えば、表１〜３および９の「Ｘ」により示される残基のいずれかは、同じ分子の第２の残基と共にクロスリンカーを形成することができる残基またはこのような残基の前駆体で置換され得る。
【０１５２】
ペプチド模倣大環状分子は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって調製することができる。例えば、表１０〜１３の「＄」または「＄ｒ８」により示される残基のいずれかは、同じ分子の第２の残基と共にクロスリンカーを形成することができる残基またはこのような残基の前駆体で置換され得る。
【０１５３】
ペプチド模倣大環状分子を形成する様々な方法が、当技術分野で公知である。例えば、開示されたペプチド模倣大環状分子の調製は、Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２巻：５８９１〜５８９２頁（２０００年）；ＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＶｅｒｄｉｎｅ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２巻：５８９１頁（２００５年）；Ｗａｌｅｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５巻：１４６６〜１４７０頁（２００４年）；米国特許第７，１９２，７１３号およびＰＣＴ出願ＷＯ２００８／１２１７６７号に記載されている。引用参考文献に開示されているα，α−二置換アミノ酸およびアミノ酸前駆体は、ペプチド模倣大環状分子の前駆体ポリペプチドの合成に用いることができる。例えば、「Ｓ５−オレフィンアミノ酸」は、（Ｓ）−α−（２’−ペンテニル）アラニンであり、「Ｒ８オレフィンアミノ酸」は、（Ｒ）−α−（２’−オクテニル）アラニンである。このようなアミノ酸を前駆体ポリペプチドに組み込んだ後、末端オレフィンをメタセシス触媒と反応させて、ペプチド模倣大環状分子を形成させる。様々な実施形態では、以下のアミノ酸：
【化３３】
2019520304.tif 000039
は、ペプチド模倣大環状分子の合成に用いることができる。
【０１５４】
開示された大環状分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第７，２０２，３３２号に記載されている。本発明を実施するのに適していると想定されるペプチド模倣大環状分子を形成する追加の方法には、Ｍｕｓｔａｐａ，  Ｍ．、Ｆｉｒｏｕｚ  Ｍｏｈｄ  ら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ、（２００３年）、６８巻、８１９３〜８１９８頁；Ｙａｎｇ，  Ｂｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、（２００４年）、１４巻、１４０３〜１４０６頁；米国特許第５，３６４，８５１号；米国特許第５，４４６，１２８号；米国特許第５，８２４，４８３号；米国特許第６，７１３，２８０号；および米国特許第７，２０２，３３２号に開示の方法が含まれる。このような実施形態では、アルファ位に追加の置換基Ｒ−を含有するアミノ酸前駆体が使用される。このようなアミノ酸は、大環状分子前駆体の所望の位置に組み込まれ、それによって、クロスリンカーが置換される位置、または、あるいは大環状分子前駆体の配列の他所に存在し得る。次に、示された方法に従って、前駆体の環化は影響される。
【０１５５】
開示されたペプチド模倣大環状分子は、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって調製することができる。例えば、表２３〜２５の「＄４ｒｎ６」または「＄４ａ５」によって示される残基を有する大環状分子は、同じ分子の第２の残基と共にクロスリンカーを形成することができる残基またはこのような残基の前駆体で置換され得る。
【０１５６】
一部の実施形態では、これらのペプチド模倣大環状分子の合成は、アジド部分およびアルキン部分を含有するペプチド模倣前駆体を合成し、これに続いて、ペプチド模倣前駆体を大環状化試薬に接触させることによって、トリアゾール連結したペプチド模倣大環状分子を生成することを特徴とする多段階方法を含む。このような方法は、例えば、２００８年２月２５日に出願した米国出願第１２／０３７，０４１号に記載されている。大環状分子または大環状分子前駆体は、例えば、溶液相または固相方法で合成され、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方を含有することができる。例えば、Ｈｕｎｔ、「Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、Ｇ．Ｃ．  Ｂａｒｒｅｔｔ編、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、１９８５年を参照されたい。
【０１５７】
開示された大環状分子の一部の実施形態では、アジドは残基のα炭素に連結しており、アルキンは別の残基のα炭素に結合している。一部の実施形態では、アジド部分はアミノ酸Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、アルファ−メチル−Ｌ−リシン、アルファ−メチル−Ｄ−リシン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、アルファ−メチル−Ｌ−オルニチンまたはアルファ−メチル−Ｄ−オルニチンのアジド類似体である。別の実施形態では、アルキン部分はＬ−プロパルギルグリシンである。さらに他の実施形態では、アルキン部分は、Ｌ−プロパルギルグリシン、Ｄ−プロパルギルグリシン、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−５−ヘキシン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−ヘキシン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−７−オクチン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−７−オクチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−８−ノニン酸および（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−８−ノニン酸からなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１５８】
一部の実施形態では、開示されたペプチド模倣大環状分子を合成するための方法であって、式：
【化３４】
2019520304.tif 000040
のペプチド模倣前駆体を、大環状化試薬と接触させるステップを含み
（式中、ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８、Ｌ１およびＬ２は上で定義された通りであり、大環状化試薬がＣｕ試薬の場合、Ｒ１２は−Ｈであり、大環状化試薬がＲｕ試薬の場合、Ｒ１２は−Ｈまたはアルキルである）、さらに前記接触させるステップが前駆体内のアルキンとアジド部分との間に形成される共有結合をもたらす方法が本明細書に提供されている。例えば、大環状化試薬がＲｕ試薬の場合、Ｒ１２はメチルであってよい。
【０１５９】
一部の実施形態では、開示されたペプチド模倣大環状分子を合成するための方法であって、式：
【化３５】
2019520304.tif 000041
のペプチド模倣前駆体を、式Ｘ−Ｌ２−Ｙの化合物と接触させるステップを含み
（式中ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８、Ｌ１およびＬ２は以前に開示された化合物に対して定義されている通りであり、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、チオール基と反応することができる反応性基である）、
さらに前記接触させるステップが２個のチオール基の間に形成される共有結合をもたらす方法が本明細書に提供されている。
【０１６０】
本明細書で開示されているペプチド模倣大環状分子において、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。一部の実施形態では、Ｒ１およびＲ２の両方が、独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。一部の実施形態では、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つはα，α二置換アミノ酸である。１つの例では、Ｂはα，α二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥのうちの少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。
【０１６１】
例えば、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも１つはアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。別の例では、Ｒ１およびＲ２の両方は、独立にアルキルである（非置換であるか、またはハロ−で置換されている）。一部の実施形態では、Ｒ１およびＲ２のうち少なくとも１つはメチルである。他の実施形態では、Ｒ１およびＲ２はメチルである。大環状化試薬はＣｕ試薬またはＲｕ試薬であってよい。
【０１６２】
一部の実施形態では、ペプチド模倣前駆体は、接触させるステップの前に精製される。他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、接触させるステップの後に精製される。さらに他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、接触させるステップの後でリフォールディングされる。該方法は、溶液中で実施してもよいし、または、あるいは該方法は固体支持体上で実施してもよい。
【０１６３】
前記結合に有利な条件下、ペプチド模倣前駆体またはペプチド模倣大環状分子に結合する標的巨大分子の存在下で、本明細書で開示されている方法を実施することもまた本明細書で想定される。一部の実施形態では、前記結合に有利な条件下、ペプチド模倣前駆体またはペプチド模倣大環状分子に優先的に結合する標的巨大分子の存在下で、該方法は実施される。該方法はまた、ペプチド模倣大環状分子のライブラリーを合成するために適用されてもよい。
【０１６４】
一部の実施形態では、開示された化合物を作製するためのペプチド模倣前駆体のアルキン部分は、Ｌ−プロパルギルグリシン、Ｄ−プロパルギルグリシン、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−５−ヘキシン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−５−ヘキシン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−７−オクチン酸、（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−７−オクチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−８−ノニン酸、および（Ｒ）−２−アミノ−２−メチル−８−ノニン酸からなる群から選択されるアミノ酸の側鎖である。他の実施形態では、開示された化合物を作製するためのペプチド模倣前駆体のアジド部分は、ε−アジド−Ｌ−リシン、ε−アジド−Ｄ−リシン、ε−アジド−α−メチル−Ｌ−リシン、ε−アジド−α−メチル−Ｄ−リシン、δ−アジド−α−メチル−Ｌ−オルニチン、およびδ−アジド−α−メチル−Ｄ−オルニチンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖である。
【０１６５】
一部の実施形態では、開示された化合物を作製するためのペプチド模倣前駆体のチオール基は、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、Ｌ−Ｎ−メチルシステイン、Ｄ−Ｎ−メチルシステイン、Ｌ−ホモシステイン、Ｄ−ホモシステイン、Ｌ−Ｎ−メチルホモシステイン、Ｄ−Ｎ−メチルホモシステイン、α−メチル−Ｌ−システイン、α−メチル−Ｄ−システイン、α−メチル−Ｌ−ホモシステイン、α−メチル−Ｄ−ホモシステイン、Ｌ−ペニシラミン、Ｄ−ペニシラミン、Ｌ−Ｎ−メチルペニシラミン、Ｄ−Ｎ−メチルペニシラミンおよび液相または固相ペプチド合成に対して適切に保護されたすべての形態からなる群から選択されるアミノ酸の側鎖である。
【０１６６】
一部の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは３であり、Ａ、ＢおよびＣは、独立に天然または非天然アミノ酸である。他の実施形態では、ｘ＋ｙ＋ｚは６であり、Ａ、ＢおよびＣは独立に天然または非天然アミノ酸である。
【０１６７】
一部の実施形態では、接触させるステップは、プロトン性溶媒、水性溶媒、有機溶媒、およびこれらの混合物からなる群から選択される溶媒中で実施される。例えば、溶媒は、Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、ｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ、ＤＭＦ、ＤＩＰＥＡ、ＣＨ３ＣＮまたはＣＨ２Ｃｌ２、ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌまたはこれらの混合物からなる群から選択することができる。溶媒は、ヘリックス形成に有利な溶媒であってよい。
【０１６８】
代替ではあるが、同等の保護基、脱離基または試薬は置換されており、ある特定の合成ステップは、代替の配列または順序で実施することによって、所望の化合物を生成することができる。本明細書に記載の化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基方法論（保護および脱保護）は、例えば、Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、（１９８９年）；ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、（１９９１年）；Ｆｉｅｓｅｒ  および  Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、（１９９４年）；およびＰａｑｕｅｔｔｅ編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、（１９９５年）、およびその後の版等に記載されているものが含まれる。
【０１６９】
本明細書で開示されているペプチド模倣大環状分子は、例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、第３章、Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．  Ｙ．、１９９２年、７７頁等に記載されている化学合成方法で作製される。したがって、例えば、自動化されたペプチドシンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州、フォスターシティ）、Ｍｏｄｅｌ４３０Ａ、４３１、または４３３）上で、側鎖保護されたアミノ酸を使用するｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学反応のいずれかにより保護されたアミンを用いた固相合成の自動化されたメリフィールド技法を使用してペプチドは合成される。
【０１７０】
本明細書に記載のペプチド模倣前駆体およびペプチド模倣大環状分子を生成する１つの方式は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用する。Ｃ末端アミノ酸は、リンカー分子との酸不安定結合を介して架橋したポリスチレン樹脂に結合している。この樹脂は合成のために使用される溶媒に不溶性であり、これによって、過剰の試薬および副産物を比較的簡単に、素早く洗い流すことができる。Ｎ末端はＦｍｏｃ基で保護されており、Ｆｍｏｃ基は、酸性で安定しているが、塩基で除去可能である。側鎖官能基は、必要に応じて、塩基安定基、酸不安定基を用いて保護される。
【０１７１】
より長いペプチド模倣前駆体は、例えば、天然の化学物質ライゲーションを使用して、個々の合成ペプチドを結合することにより生成される。別法として、より長い合成ペプチドは、周知の組換え型ＤＮＡおよびタンパク質発現技術により生合成される。このような技術は、詳細なプロトコルを有する周知の標準的マニュアルにおいて提供されている。本明細書で開示されているペプチド模倣前駆体をコードしている遺伝子を構築するために、アミノ酸配列は、逆翻訳されることによって、好ましくは、遺伝子が発現されることになる生物に対して最適なコドンを有する、アミノ酸配列をコードする核酸配列が得られる。次に、合成遺伝子は通常、ペプチドおよび必要に応じて、任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作製される。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入する。次に、選択された発現系および宿主に対して適当である、適切な条件下でペプチドを発現させる。ペプチドを精製し、標準的方法で特徴付ける。
【０１７２】
ペプチド模倣前駆体は、例えば、ハイスループットなポリチャネルの組合せ式シンセサイザー（例えば、Ｔｈｕｒａｍｅｄ  ＴＥＴＲＡＳマルチチャネルペプチドシンセサイザー、ＣｒｅｏＳａｌｕｓ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ製、またはＭｏｄｅｌ  Ａｐｅｘ  ３９６マルチチャネルペプチドシンセサイザー、ＡＡＰＰＴＥＣ，Ｉｎｃ．、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ製）を使用して、ハイスループットな、組合せ形式で作製される。
【０１７３】
以下の合成スキームは、本発明を例示するためだけに提供されるもので、本明細書に記載の本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１７４】
合成スキーム１〜５は、開示されたペプチド模倣大環状分子の調製について記載している。図を簡略化するため、例示的スキームは、アジドアミノ酸類似体、ε−アジド−α−メチル−Ｌ−リシンおよびε−アジド−α−メチル−Ｄ−リシン、ならびにアルキンアミノ酸類似体、Ｌ−プロパルギルグリシン、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、および（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸を表している。よって、以下の合成スキームでは、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７およびＲ８は−Ｈであり、各Ｌ１は−（ＣＨ２）４−であり、各Ｌ２は−（ＣＨ２）−である。しかし、上記の詳細な説明の全体にわたって記述されているように、多くの他のアミノ酸類似体を利用することができ、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８、Ｌ１およびＬ２は、本明細書で開示されている様々な構造から独立に選択することができる。
【化３６】
2019520304.tif 000042
【０１７５】
合成スキーム１は、本明細書で開示されている化合物を調製するのに有用ないくつかの化合物の調製について記載している。キラル補助基（Ｓ）−２−［Ｎ−（Ｎ’−ベンジルプロリル）アミノ］ベンゾフェノン（ＢＰＢ）およびアミノ酸、例えば、グリシンまたはアラニン等から誘導されたシッフ塩基のＮｉ（ＩＩ）複合体は、Ｂｅｌｏｋｏｎら、（１９９８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｙｍｍ．、９巻：４２４９〜４２５２頁に記載の通り調製される。続いて、生成した複合体を、アジドまたはアルキニル部分を含むアルキル化試薬と反応させることによって、本明細書で開示されている、エナンチオマーを豊富に含む化合物を生成する。所望する場合、生成した化合物は、ペプチド合成における使用のために保護することができる。
【化３７】
2019520304.tif 000043
【０１７６】
合成スキーム２に示されている、開示されたペプチド模倣大環状分子の合成のための一般的な方法では、ペプチド模倣前駆体は、アジド部分およびアルキン部分を含有し、市販のアミノ酸Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンならびにＮ−α−Ｆｍｏｃ−保護された形態のアミノ酸（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−６−ヘプチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、Ｎ−メチル−ε−アジド−Ｌ−リシン、およびＮ−メチル−ε−アジド−Ｄ−リシンを使用して、溶液相または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。次に、ペプチド模倣前駆体は、標準的条件（例えば、強酸、例えば、９５％ＴＦＡ等）で脱保護し、固相樹脂から切断させる。ペプチド模倣前駆体は、粗原料混合物として反応させるか、または有機溶液もしくは水溶液中で、Ｃｕ（Ｉ）等の大環状化試薬との反応前に精製される（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、４１巻：２５９６〜２５９９頁；Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２年）、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、６７巻：３０５７〜３０６４頁；Ｄｅｉｔｅｒｓら、（２００３年）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２５巻：１１７８２〜１１７８３頁；Ｐｕｎｎａら、（２００５年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、４４巻：２２１５〜２２２０頁）。一実施形態では、トリアゾール形成反応は、αヘリックス形成に有利な条件下で実施される。一実施形態では、大環状化ステップは、Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＦ、ＤＩＰＥＡ、ｔＢｕＯＨまたはこれらの混合物からなる群から選択される溶媒中で実施される。別の実施形態では、大環状化ステップはＤＭＦ中で実施される。一部の実施形態では、大環状化ステップは、緩衝化された水性溶媒または部分的水性溶媒中で実施される。
【化３８】
2019520304.tif 000044
【０１７７】
合成スキーム３に示されている、開示されたペプチド模倣大環状分子の合成のための一般的な方法では、ペプチド模倣前駆体は、アジド部分およびアルキン部分を含有し、市販のアミノ酸Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンならびにＮ−α−Ｆｍｏｃ−保護された形態のアミノ酸（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−６−ヘプチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、Ｎ−メチル−ε−アジド−Ｌ−リシン、およびＮ−メチル−ε−アジド−Ｄ−リシンを使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。ペプチド模倣前駆体は、樹脂上で粗混合物としてＣｕ（Ｉ）試薬等の大環状化試薬と反応させる（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、４１巻：２５９６〜２５９９頁；Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２年）、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６７巻：３０５７〜３０６４頁；Ｄｅｉｔｅｒｓら、（２００３年）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２５巻：１１７８２〜１１７８３頁；Ｐｕｎｎａら、（２００５年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、４４巻：２２１５〜２２２０頁）。次に、生成したトリアゾール含有ペプチド模倣大環状分子は、標準的条件（例えば、強酸、例えば、９５％ＴＦＡ等）で脱保護し、固相樹脂から切断される。一部の実施形態では、大環状化ステップは、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＮＭＰ、ＤＩＰＥＡ、２，６−ルチジン、ピリジン、ＤＭＳＯ、Ｈ２Ｏまたはこれらの混合物からなる群から選択される溶媒中で実施される。一部の実施形態では、大環状化ステップは緩衝化された水性溶媒または部分的水性溶媒中で実施される。
【化３９】
2019520304.tif 000045
【０１７８】
合成スキーム４に示されている、開示されたペプチド模倣大環状分子の合成のための一般的な方法では、ペプチド模倣前駆体は、アジド部分およびアルキン部分を含有し、市販のアミノ酸Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンならびにＮ−α−Ｆｍｏｃ−保護された形態のアミノ酸（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−６−ヘプチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、Ｎ−メチル−ε−アジド−Ｌ−リシン、およびＮ−メチル−ε−アジド−Ｄ−リシンを使用して、溶液相または固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。次に、ペプチド模倣前駆体は、標準的条件（例えば、強酸、例えば、９５％ＴＦＡ等）で脱保護し、固相樹脂から切断する。ペプチド模倣前駆体は、粗混合物として反応させるか、または大環状化試薬、例えば、Ｃｐ＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ３）２もしくは［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］４等のＲｕ（ＩＩ）試薬との反応前に精製する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、（２００７年）、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．、９巻：５３３７〜５３３９頁；Ｚｈａｎｇら、（２００５年）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２７巻：１５９９８〜１５９９９頁）。一部の実施形態では、大環状化ステップは、ＤＭＦ、ＣＨ３ＣＮおよびＴＨＦからなる群から選択される溶媒中で実施される。
【化４０】
2019520304.tif 000046
【０１７９】
合成スキーム５に示されている、開示されたペプチド模倣大環状分子の合成のための一般的な方法では、ペプチド模倣前駆体は、アジド部分およびアルキン部分を含有し、市販のアミノ酸Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロパルギルグリシンならびにＮ−α−Ｆｍｏｃ−保護された形態のアミノ酸（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−４−ペンチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−６−ヘプチン酸、（Ｓ）−２−アミノ−２−メチル−６−ヘプチン酸、Ｎ−メチル−ε−アジド−Ｌ−リシン、およびＮ−メチル−ε−アジド−Ｄ−リシンを使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。ペプチド模倣前駆体は、粗混合物として樹脂上でＲｕ（ＩＩ）試薬等の大環状化試薬と反応させる。例えば、試薬は、Ｃｐ＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ３）２または［Ｃｐ＊ＲｕＣｌ］４であってよい（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、（２００７年）、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．、９巻：５３３７〜５３３９頁；Ｚｈａｎｇら、（２００５年）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２７巻：１５９９８〜１５９９９頁）。一部の実施形態では、大環状化ステップは、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＦ、およびＴＨＦからなる群から選択される溶媒中で実施される。
【０１８０】
一部の実施形態では、開示されたペプチド模倣大環状分子は、トリアゾール部分上のハロゲン基置換、例えば、ヨード置換を含む。このようなペプチド模倣大環状分子は、部分的構造を有する前駆体から、本明細書で教示された架橋方法を使用して調製することができる。このような置換を含む、本明細書に記載の任意の長さのクロスリンカーを調製することができる。一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、以下に示すスキームに従い調製される。反応は、例えば、ＣｕＩおよびアミンリガンド、例えば、ＴＥＡまたはＴＴＴＡ等の存在下で実施される。例えば、Ｈｅｉｎら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、２００９年、４８巻、８０１８〜８０２１頁を参照されたい。
【化４１】
2019520304.tif 000047
【０１８１】
他の実施形態では、ヨード置換トリアゾールを以下に示すスキームに従い生成する。例えば、以下の反応スキームの第２のステップを、ＴＨＦの存在下で、例えば、ＣｕＩおよびＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を使用して実施される（例えば、Ｚｈａｎｇら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、２００８年、７３巻、３６３０〜３６３３頁を参照されたい）。他の実施形態では、以下に示す反応スキームの第２のステップは、例えば、ＣｕＩおよびＩＣｌ等のヨウ素化剤を使用して実施される（例えば、Ｗｕら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２００５年、１３１４〜１３１８頁を参照されたい）。
【化４２】
2019520304.tif 000048
【０１８２】
一部の実施形態では、ヨード置換トリアゾール部分を、ＳｕｚｕｋｉまたはＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリング等のクロスカップリング反応において使用することによって、置換されたクロスリンカーを含むペプチド模倣大環状分子を生成する。以下に示されているようなアルキンを使用してＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリングを、例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２、ＣｕＩ等のパラジウム触媒の存在下で、およびトリエチルアミン等の塩基の存在下で実施することができる。以下に示されているようなアリールボロン酸または置換アルケニルボロン酸を使用するＳｕｚｕｋｉカップリングは、例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４等の触媒の存在下で、およびＫ２ＣＯ３等の塩基の存在下で実施することができる。
【化４３】
2019520304.tif 000049
【０１８３】
ヨード置換トリアゾールと反応する任意の適切なトリアゾール置換基を、本明細書に記載のＳｕｚｕｋｉカップリングに使用することができる。Ｓｕｚｕｋｉカップリングに使用するための例示のトリアゾール置換基を以下に示す：
【化４４】
2019520304.tif 000050
（式中、「Ｃｙｃ」は適切なアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基である（非置換であるか、または以下に記載されているＲａもしくはＲｂ基により任意選択で置換されている））。
【０１８４】
一部の実施形態では、置換基は、
【化４５】
2019520304.tif 000051
である。
【０１８５】
ヨード置換トリアゾールと反応する任意の適切な置換基は、本明細書に記載のＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリングにおいて使用することができる。Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリングにおける使用のための例示のトリアゾール置換基を以下に示す：
【化４６】
2019520304.tif 000052
（式中、「Ｃｙｃ」は、適切なアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基である（非置換であるか、または以下に記載されているＲａもしくはＲｂ基により任意選択で置換されている））。
【０１８６】
一部の実施形態では、トリアゾール置換基は、
【化４７】
2019520304.tif 000053
である。
【０１８７】
一部の実施形態では、上記に示されているＣｙｃ基は、少なくとも１つのＲａまたはＲｂ置換でさらに置換されている。一部の実施形態では、ＲａおよびＲｂのうちの少なくとも１つは、独立に、
【化４８】
2019520304.tif 000054
である。
【０１８８】
他の実施形態では、トリアゾール置換基は、
【化４９】
2019520304.tif 000055
であり、ＲａおよびＲｂのうちの少なくとも１つはアルキル（水素、メチル、またはエチルを含む）、または：
【化５０】
2019520304.tif 000056
である。
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載の、開示されたペプチド模倣大環状分子の合成における天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸類似体の使用を想定している。ペプチド模倣大環状分子を含有する安定したトリアゾールの合成のために利用される合成法に適している任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を本発明に使用することができる。例えば、Ｌ−プロパルギルグリシンは、本発明において有用なアミノ酸として想定される。しかし、異なるアミノ酸側鎖を含有する他のアルキン含有アミノ酸もまた本発明において有用である。例えば、Ｌ−プロパルギルグリシンは、アミノ酸のα炭素と、アミノ酸側鎖のアルキンとの間に１つのメチレン単位を含有する。本発明はまた、α炭素とアルキンとの間に複数のメチレン単位を有するアミノ酸の使用を想定している。また、アミノ酸Ｌ−リシン、Ｄ−リシン、アルファ−メチル−Ｌ−リシン、およびアルファ−メチル−Ｄ−リシンのアジド類似体は、本発明において有用なアミノ酸として想定される。しかし、異なるアミノ酸側鎖を含有する他の末端アジドアミノ酸もまた本発明において有用である。例えば、Ｌ−リシンのアジド類似体は、アミノ酸のα炭素とアミノ酸側鎖の末端アジドとの間に４つのメチレン単位を含有する。本発明はまた、α炭素と末端アジドとの間に４つ未満または４つ超のメチレン単位を有するアミノ酸の使用を想定する。以下の表４は、本明細書で開示されているペプチド模倣大環状分子の調製に有用ないくつかのアミノ酸を示す。
【表４】
2019520304.tif 000057
【０１９０】
一部の実施形態では、アミノ酸およびアミノ酸類似体はＤ−配置のものである。他の実施形態では、アミノ酸およびアミノ酸類似体はＬ−配置のものである。一部の実施形態では、ペプチド模倣体中に含有されるアミノ酸およびアミノ酸類似体のいくつかはＤ−配置のものであり、アミノ酸およびアミノ酸類似体のいくつかはＬ−配置のものである。一部の実施形態では、アミノ酸類似体は、α−メチル−Ｌ−プロパルギルグリシン、α−メチル−Ｄ−プロパルギルグリシン、ε−アジド−アルファ−メチル−Ｌ−リシン、およびε−アジド−アルファ−メチル−Ｄ−リシン等のα，α二置換のものである。一部の実施形態では、アミノ酸類似体は、Ｎ−アルキル化された、例えば、Ｎ−メチル−Ｌ−プロパルギルグリシン、Ｎ−メチル−Ｄ−プロパルギルグリシン、Ｎ−メチル−ε−アジド−Ｌ−リシン、およびＮ−メチル−ε−アジド−Ｄ−リシン等である。
【０１９１】
開示された大環状分子の調製は、例えば、２００７年１２月１７日に出願された米国出願第１１／９５７，３２５号に記載され、本明細書中に参照により組み込まれている。合成スキーム６〜９は、開示されたこのような化合物の調製について記載している。図を簡略化するため、例示的スキームは、Ｌ１およびＬ３が両方とも−（ＣＨ２）−であるＬ−システインまたはＤ−システイン由来のアミノ酸類似体を表している。しかし、上記の詳細な説明の全体にわたって記述されているように、多くの他のアミノ酸類似体を利用することができ、Ｌ１およびＬ３は、本明細書で開示されている様々な構造から独立に選択することができる。「［ＡＡ］ｍ」、「［ＡＡ］ｎ」、「［ＡＡ］ｏ」という記号は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸等のアミド結合により連結した部分の配列を表す。以前に記載された通り、存在する「ＡＡ」のそれぞれは、存在する任意の他の「ＡＡ」とは無関係であり、「［ＡＡ］ｍ」等の式は、例えば、非同一のアミノ酸の配列ならびに同一のアミノ酸の配列を包含する。
【化５１】
2019520304.tif 000058
【０１９２】
スキーム６では、ペプチド模倣前駆体は２つの−ＳＨ部分を含有し、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃアミノ酸、例えば、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｌ−システインまたはＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｄ−システイン等を使用して固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。アルファ−メチル化バージョンのＤ−システインまたはＬ−システインは、公知の方法（Ｓｅｅｂａｃｈら、（１９９６年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３５巻：２７０８〜２７４８頁、およびその中の参考文献）により生成され、次に公知の方法（その全内容が参照により本明細書に組み込まれている「Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９８年）により適切に保護されたＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−トリチルモノマーに変換される。次に、前駆体ペプチド模倣体は、標準的条件（例えば、強酸例えば、９５％ＴＦＡ等）で脱保護し、固相樹脂から切断される。前駆体ペプチド模倣体は、粗混合物として反応させるか、または有機溶液もしくは水溶液中でＸ−Ｌ２−Ｙとの反応前に精製される。一部の実施形態では、アルキル化反応は、大環状化に有利な、重合を回避する希釈条件下（すなわち０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ）で実施される。一部の実施形態では、アルキル化反応は、液体ＮＨ３等の有機溶液中で実施される（Ｍｏｓｂｅｒｇら、（１９８５年）、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０７巻：２９８６〜２９８７頁；Ｓｚｅｗｃｚｕｋら、（１９９２年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４０巻：２３３〜２４２頁）、ＮＨ３／ＭｅＯＨまたはＮＨ３／ＤＭＦ（Ｏｒら、（１９９１年）、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５６巻：３１４６〜３１４９頁）。他の実施形態では、アルキル化は、６ＭグアニジウムＨＣｌ、ｐＨ８等の水溶液中で実施される（Ｂｒｕｎｅｌら、（２００５年）、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、（２０巻）：２５５２〜２５５４頁）。他の実施形態では、アルキル化反応に対して使用される溶媒はＤＭＦまたはジクロロエタンである。
【化５２】
2019520304.tif 000059
【０１９３】
スキーム７では、前駆体ペプチド模倣体は２つまたはそれを超える−ＳＨ部分を含有し、このうちの２つは特別に保護され、これによって、大環状分子形成のためのこれらの選択的脱保護およびその後のアルキル化が可能となる。前駆体ペプチド模倣体は、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃアミノ酸、例えば、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｐ−メトキシトリチル−Ｌ−システインまたはＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｐ−メトキシトリチル−Ｄ−システイン等を使用する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。アルファ−メチル化バージョンのＤ−システインまたはＬ−システインは、公知の方法で生成され（Ｓｅｅｂａｃｈら、（１９９６年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３５巻：２７０８〜２７４８頁、およびその中の参考文献）、次に、公知の方法で、適切に保護されたＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｐ−メトキシトリチルモノマーに変換される（全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９８年）。次にペプチド模倣前駆体のＭｍｔ保護基は、標準的条件（例えば、弱酸、例えば、ＤＣＭ中１％ＴＦＡ等）で選択的に切断される。次に、前駆体ペプチド模倣体を、樹脂上で有機溶液中、Ｘ−Ｌ２−Ｙと反応させる。例えば、反応は、ジイソプロピルエチルアミン等の束縛塩基の存在下で起きる。一部の実施形態では、アルキル化反応は、液体ＮＨ３等の有機溶液中で実施される（Ｍｏｓｂｅｒｇら、（１９８５年）、Ｊ．  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０７巻：２９８６〜２９８７頁；  Ｓｚｅｗｃｚｕｋら、（１９９２年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４０巻：２３３〜２４２頁）、ＮＨ３／ＭｅＯＨまたはＮＨ３／ＤＭＦ（Ｏｒら、（１９９１年）、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５６巻：３１４６〜３１４９頁）。他の実施形態では、アルキル化反応は、ＤＭＦまたはジクロロエタン中で実施される。次に、ペプチド模倣大環状分子は、標準的な条件（例えば、強酸、例えば、９５％ＴＦＡ等）で脱保護され、固相樹脂から切断される。
【化５３】
2019520304.tif 000060
【０１９４】
スキーム８では、ペプチド模倣前駆体は、２つまたはそれを超える−ＳＨ部分を含有し、これらのうちの２つは特別に保護され、これによって、大環状分子形成のためのこれらの選択的脱保護およびその後のアルキル化が可能となる。ペプチド模倣前駆体は、市販のＮ−α−Ｆｍｏｃアミノ酸、例えば、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｐ−メトキシトリチル−Ｌ−システイン、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｐ−メトキシトリチル−Ｄ−システイン、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−Ｓ−ｔ−ブチル−Ｌ−システイン、およびＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−Ｓ−ｔ−ブチル−Ｄ−システイン等を使用して、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により合成される。アルファメチル化バージョンのＤ−システインまたはＬ−システインは公知の方法で生成され（Ｓｅｅｂａｃｈら、（１９９６年）、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、３５巻：２７０８〜２７４８頁、およびその中の参考文献）、次に、公知の方法で、適切に保護されたＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｐ−メトキシトリチルまたはＮ−α−Ｆｍｏｃ−Ｓ−Ｓ−ｔ−ブチルモノマーに変換される（全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：１９９８年）。ペプチド模倣前駆体のＳ−Ｓ−ｔブチル保護基は、公知の条件で選択的に切断される（例えば、ＤＭＦ中２０％２−メルカプトエタノール、参考文献：Ｇａｌａｎｄｅら、（２００５年）、Ｊ．  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．、７巻：１７４〜１７７頁）。次に、前駆体ペプチド模倣体を樹脂上、有機溶液中でモル過剰のＸ−Ｌ２−Ｙと反応させる。例えば、反応は、ジイソプロピルエチルアミン等の束縛塩基の存在下で起きる。次に、ペプチド模倣前駆体のＭｍｔ保護基が標準的な条件で選択的に切断される（例えば、弱酸、例えば、ＤＣＭ中１％ＴＦＡ等）。次に、ペプチド模倣前駆体は、樹脂上で、有機溶液中、束縛塩基を用いた処置により環化される。一部の実施形態では、アルキル化反応は、ＮＨ３／ＭｅＯＨまたはＮＨ３／ＤＭＦ等の有機溶液中で実施される（Ｏｒら、（１９９１年）、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５６巻：３１４６〜３１４９頁）。次に、ペプチド模倣大環状分子は、標準的条件（例えば、強酸、例えば、９５％ＴＦＡ等）で脱保護し、固相樹脂から切断される。
【化５４】
2019520304.tif 000061
【０１９５】
スキーム９では、ペプチド模倣前駆体は２つのＬ−システイン部分を含有する。ペプチド模倣前駆体は、生細胞中で公知の生物学的な発現系により、または公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏの無細胞発現方法により合成される。前駆体ペプチド模倣体は、粗混合物として反応させるか、または有機溶液もしくは水溶液中でＸ−Ｌ２−Ｙとの反応前に精製される。一部の実施形態では、アルキル化反応物は、大環状化に有利な、重合を回避する希釈条件下（すなわち０．１５ｍｍｏｌ／Ｌ）で実施される。一部の実施形態では、アルキル化反応は、液体ＮＨ３（Ｍｏｓｂｅｒｇら、（１９８５年）、Ｊ．  Ａｍ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０７巻：２９８６〜２９８７頁；Ｓｚｅｗｃｚｕｋら、（１９９２年）、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４０巻：２３３〜２４２頁）、ＮＨ３／ＭｅＯＨ、またはＮＨ３／ＤＭＦ（Ｏｒら（１９９１年）、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５６巻：３１４６〜３１４９頁）等の有機溶液中で実施される。他の実施形態では、アルキル化は、例えば、６ＭグアニジウムＨＣｌ、ｐＨ８等の水溶液中で実施される（Ｂｒｕｎｅｌら、（２００５年）、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、（２０巻）：２５５２〜２５５４頁）。他の実施形態では、アルキル化は、ＤＭＦまたはジクロロエタン中で実施される。別の実施形態では、アルキル化は、非変性水溶液中で実施され、さらに別の実施形態では、アルキル化はαヘリックス構造形成に有利な条件下で実施される。さらに別の実施形態では、アルキル化は、前駆体ペプチド模倣体の別のタンパク質への結合に有利な条件下で実施され、これによって、アルキル化の間に結合αヘリックス立体構造の形成が誘発される。
【０１９６】
チオール基との反応に適した、ＸおよびＹに対する様々な実施形態が想定される。一般的に、各ＸまたはＹは、独立に、表５に示されている一般的なカテゴリーから選択される。例えば、ＸおよびＹは、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉ等のハロゲン化物である。本明細書に記載の任意の大環状分子を形成するリンカーは、示されている任意の配列との任意の組合せ、さらに本明細書で示されている任意のＲ置換基との任意の組合せでも使用することができる。
【表５】
2019520304.tif 000062
【０１９７】
本発明は、開示されたペプチド模倣大環状分子の合成において、天然に存在する、および天然に存在しないアミノ酸およびアミノ酸類似体の両方を使用することを想定している。安定したビス−スルフヒドリル含有ペプチド模倣大環状分子の合成に利用される合成法に適した任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を、本発明において使用することができる。例えば、システインは、本発明における有用なアミノ酸として想定される。しかし、異なるアミノ酸側鎖を含有するシステイン以外の硫黄含有アミノ酸もまた有用である。例えば、システインは、アミノ酸のα炭素と、アミノ酸側鎖の末端−ＳＨとの間に１つのメチレン単位を含有する。本発明はまた、α炭素と末端−ＳＨとの間に複数のメチレン単位を有するアミノ酸の使用も想定している。非限定的な例には、α−メチル−Ｌ−ホモシステインおよびα−メチル−Ｄ−ホモシステインが含まれる。一部の実施形態では、アミノ酸およびアミノ酸類似体はＤ−配置のものである。他の実施形態では、アミノ酸およびアミノ酸類似体はＬ−配置のものである。一部の実施形態では、ペプチド模倣体に含有されるアミノ酸およびアミノ酸類似体の一部はＤ−配置のものであり、アミノ酸およびアミノ酸類似体の一部はＬ−配置のものである。一部の実施形態では、アミノ酸類似体は、例えば、α−メチル−Ｌ−システインおよびα−メチル−Ｄ−システイン等のα，α二置換のものである。
【０１９８】
本発明は、大環状分子を形成するリンカーを使用することによって、ペプチド模倣前駆体内の２つまたはそれを超える−ＳＨ部分を連結させて、本明細書で開示されているペプチド模倣大環状分子を形成する、大環状分子を含む。上に記載されているように、大環状分子を形成するリンカーは、立体構造の剛性、代謝安定性の増加および／または細胞浸透性の増加を付与する。さらに、一部の実施形態では、大環状分子を形成する連結は、ペプチド模倣大環状分子のαヘリックス二次構造を安定化させる。大環状分子を形成するリンカーは、上で定義された式Ｘ−Ｌ２−Ｙ（式中、ＸおよびＹの両方とも同じまたは異なる部分である）のものである。ＸおよびＹの両方とも、１つの大環状分子を形成するリンカー−Ｌ２−による、ビス−スルフヒドリル含有ペプチド模倣前駆体のビスアルキル化を可能にするという化学的特徴を有する。上で定義された通り、リンカー−Ｌ２−は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、またはヘテロシクロアリーレン、または−Ｒ４−Ｋ−Ｒ４−を含み、これらのすべては、上で定義された、Ｒ５基で任意選択で置換されていてもよい。さらに、スルフヒドリル含有アミノ酸の−ＳＨに結合している炭素以外の、大環状分子を形成するリンカー−Ｌ２−内の１個〜３個の炭素原子は、Ｎ、ＳまたはＯ等のヘテロ原子により任意選択で置換されている。
【０１９９】
大環状分子を形成するリンカーＸ−Ｌ２−ＹのＬ２構成成分は、とりわけ、ペプチド模倣大環状分子を形成するために使用された２つのアミノ酸類似体の位置の間の距離に応じて長さが変化し得る。さらに、大環状分子を形成するリンカーのＬ１構成成分および／またはＬ３構成成分の長さが変化するので、安定したペプチド模倣大環状分子を形成するのに適当な全長のリンカーを作り出すためにＬ２の長さもを変化させてもよい。例えば、使用されるアミノ酸類似体が、追加のメチレン単位をＬ１およびＬ３のそれぞれに添加することによって変化した場合、Ｌ２の長さは、Ｌ１およびＬ３の増加した長さを埋め合わせるために、およそ２つのメチレン単位と等しい長さだけ低減する。
【０２００】
一部の実施形態では、Ｌ２は、式−（ＣＨ２）ｎ−のアルキレン基（式中、ｎは約１〜約１５の間の整数である）である。例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。他の実施形態では、Ｌ２はアルケニレン基である。また他の実施形態では、Ｌ２はアリール基である。
【０２０１】
表６は、Ｘ−Ｌ２−Ｙ基の追加の実施形態を示している。この表において、各ＸおよびＹは、例えば、独立に、Ｃｌ−、Ｂｒ−またはＩ−である。
【表６−１】
2019520304.tif 000063
【０２０２】
適切であると想定されるペプチド模倣大環状分子を形成する追加の方法には、Ｍｕｓｔａｐａ，  Ｍ．  Ｆｉｒｏｕｚ  Ｍｏｈｄら、Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ（２００３年）、６８巻、８１９３〜８１９８頁；Ｙａｎｇ，  Ｂｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．（２００４年）、１４巻、１４０３〜１４０６頁；米国特許第５，３６４，８５１号；米国特許第５，４４６，１２８号；米国特許第５，８２４，４８３号；米国特許第６，７１３，２８０号；および米国特許第７，２０２，３３２号に開示の方法が含まれる。このような実施形態では、アルファ位に追加の置換基Ｒ−を含有するアミノ酸前駆体が使用される。このようなアミノ酸は、大環状分子前駆体の所望の位置に組み込まれ、それによって、該アミノ酸は、クロスリンカーが置換される位置、または、あるいは大環状分子前駆体の配列の他所に存在し得る。次に、示されている方法に従って、前駆体を環化する。
【０２０３】
一部の実施形態では、アミノ酸の−ＮＨ部分は、制限なしで−Ｆｍｏｃおよび−Ｂｏｃを含む保護基を使用して保護されている。他の実施形態では、アミノ酸は、ペプチド模倣大環状分子の合成前に保護されていない。
アッセイ
【０２０４】
本発明のペプチド模倣大環状分子の特性は、例えば下記の方法を使用することによってアッセイされる。一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、本明細書に記載の置換基を有していない対応するポリペプチドと比較して、改善された生物学的特性を有する。
α−ヘリシティを決定するためのアッセイ
【０２０５】
溶液中、α−ヘリカルドメインを有するポリペプチドの二次構造は、ランダムコイル構造とα−ヘリカル構造の間の動的平衡に達し、これはしばしば「ヘリシティパーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｈｅｌｉｃｉｔｙ）」と表される。したがって、例えばアルファ−ヘリカルドメインは
、溶液中、α−ヘリカル含量が通常２５％未満の、主にランダムコイルである。他方では、最適化リンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば対応する未架橋のポリペプチドのアルファ−ヘリシティの少なくとも２倍のアルファ−ヘリシティを有する。一部の実施形態では、大環状分子は、５０％超のアルファ−ヘリシティを有する。ペプチド模倣大環状分子のヘリシティをアッセイするために、化合物を、水溶液に溶解させる（例えばｐＨ７の５０ｍＭリン酸カリウム溶液、または蒸留水で、濃度２５〜５０μＭまで）。円二色性（ＣＤ）スペクトルを、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０）で、標準測定パラメーター（例えば、温度、２０℃；波長、１９０〜２６０ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；積算回数（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）、１０；レスポンス、１秒；バンド幅、１ｎｍ；路長、０．１ｃｍ）を使用して得る。各ペプチドのα−ヘリカル含量は、平均残基楕円率（例えば［Φ］２２２ｏｂｓ）を、モデルヘリカルデカペプチドについて記録された値で割ることによって算出される（Ｙａｎｇら（１９８６年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １３０巻：２０８頁））。
融解温度（Ｔｍ）を決定するためのアッセイ
【０２０６】
α−ヘリックスなどの二次構造を含む本発明のペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する未架橋ポリペプチドよりも高い融解温度を呈する。典型的に、本発明のペプチド模倣大環状分子は、＞６０℃のＴｍを呈し、これは、水溶液中で高度に安定な構造を表している。融解温度に対する大環状分子の形成の効果をアッセイするために、ペプチド模倣大環状分子または非修飾ペプチドを、蒸留水に溶解させ（例えば最終濃度５０μＭ）、Ｔｍを、分光偏光計（例えば、Ｊａｓｃｏ  Ｊ−７１０）で、標準パラメーター（例えば、波長２２２ｎｍ；ステップ分解能、０．５ｎｍ；速度、２０ｎｍ／秒；積算回数、１０；レスポンス、１秒；バンド幅、１ｎｍ；温度上昇速度：１℃／分；路長、０．１ｃｍ）を使用して、ある温度範囲（例えば４〜９５℃）にわたって楕円率の変化を測定することによって決定する。
プロテアーゼ抵抗性アッセイ
【０２０７】
ペプチド骨格のアミド結合は、プロテアーゼによる加水分解を受けやすく、それによってペプチド化合物がｉｎ  ｖｉｖｏで急速に分解されやすくなる。しかし、ペプチドがヘリックスを形成すると、典型的にアミド骨格が隠され、したがってアミド骨格がタンパク分解的切断から保護され得る。本発明のペプチド模倣大環状分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトリプシンによるタンパク質分解に供して、対応する未架橋ポリペプチドと比較して分解速度の任意の変化について評価することができる。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応する未架橋ポリペプチドを、トリプシンアガロースと共にインキュベートし、遠心分離によって様々な時点で反応をクエンチし、その後ＨＰＬＣ注入処理して、２８０ｎｍの紫外吸収によって残留基質を定量する。簡潔には、ペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣前駆体（５ｍｃｇ）を、トリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ約１２５）と共に０分間、１０分間、２０分間、９０分間、および１８０分間インキュベートする。反応を、高速の卓上遠心分離によってクエンチし、分離された上清中の残留した基質を、２８０ｎｍにおけるＨＰＬＣベースのピーク検出によって定量する。タンパク分解的反応は、一次反応速度を呈し、速度定数ｋは、ｌｎ［Ｓ］対時間のプロットから決定される（ｋ＝−１Ｘ勾配）。
ｅｘ  ｖｉｖｏ安定性アッセイ
【０２０８】
最適化リンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する未架橋ポリペプチドのｅｘ  ｖｉｖｏ半減期の少なくとも２倍のｅｘ  ｖｉｖｏ半減期を有し、１２時間またはそれを超えるｅｘ  ｖｉｖｏ半減期を有する。ｅｘ  ｖｉｖｏ血清安定性研究のために、様々なアッセイを使用することができる。例えば、ペプチド模倣大環状分子および対応する未架橋ポリペプチド（２ｍｃｇ）を、新鮮なマウス、ラットおよび／またはヒトの血清（２ｍＬ）と共に３７℃で０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、および２４時間インキュベートする。無傷化合物のレベルを決定するために、以下の手順を使用することができる。試料を、血清１００μｌを２ｍｌ遠心管に移した後、５０％ギ酸１０μＬおよびアセトニトリル５００μＬを添加し、４±２℃において１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離することによって抽出する。次に、上清を新しい２ｍｌ管に移し、Ｔｕｒｂｏｖａｐで、Ｎ２＜１０ｐｓｉの下で３７℃において蒸発させる。試料を、５０：５０アセトニトリル：水１００μＬで再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に付す。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
【０２０９】
アクセプタータンパク質へのペプチド模倣大環状分子およびペプチド模倣前駆体の結合および親和性を評価するために、例えば蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）が使用される。ＦＰＡ技術により、偏光および蛍光トレーサーを使用して分子の配向および可動性を測定する。見かけの高い分子量を有する分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きいタンパク質に結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、偏光で励起されると、より小さい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離状態であるＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較して回転速度が低いことに起因して、より高レベルの偏光蛍光を放射する。
【０２１０】
例えば、フルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子（２５ｎＭ）を、結合バッファー（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）中、アクセプタータンパク質（２５〜１０００ｎＭ）と共に室温で３０分間インキュベートする。結合活性を、例えば発光分光光度計（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ）で蛍光偏光によって測定する。Ｋｄ値は、非線形回帰分析によって、例えばＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して決定することができる。本発明のペプチド模倣大環状分子は、一部の例では、対応する未架橋ポリペプチドに類似の、またはそれよりも低いＫｄを示す。ペプチド−タンパク質相互作用のアンタゴニストを特徴付けるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏディスプレイスメントアッセイ
【０２１１】
ペプチドとアクセプタータンパク質の間の相互作用を拮抗する化合物の結合および親和性を評価するために、例えばペプチド模倣前駆体配列から得られた、フルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子を利用する蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）が使用される。ＦＰＡ技術により、偏光および蛍光トレーサーを使用して分子の配向および可動性を測定する。見かけの高い分子量を有する分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、ＦＩＴＣ）（例えば、大きいタンパク質に結合したＦＩＴＣ標識ペプチド）は、偏光で励起されると、より小さい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、溶液中で遊離状態であるＦＩＴＣ標識ペプチド）と比較して回転速度が低いことに起因して、より高レベルの偏光蛍光を放射する。フルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子とアクセプタータンパク質との間の相互作用を拮抗する化合物は、競合的結合ＦＰＡ実験で検出される。
【０２１２】
例えば、推定上のアンタゴニスト化合物（１ｎＭ〜１ｍＭ）およびフルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子（２５ｎＭ）を、結合バッファー（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）中、アクセプタータンパク質（５０ｎＭ）と共に室温で３０分間インキュベートする。アンタゴニスト結合活性を、例えば発光分光光度計（例えばＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ）で蛍光偏光によって測定する。Ｋｄ値は、非線形回帰分析によって、例えばＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して決定することができる。
【０２１３】
このアッセイでは、小さい有機分子、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質などの任意のクラスの分子を、推定上のアンタゴニストとして調査することができる。
親和性選択−質量分析によるタンパク質−リガンド結合のためのアッセイ
【０２１４】
タンパク質に対する試験化合物の結合および親和性を評価するために、例えば親和性選択質量分析アッセイを使用する。タンパク質−リガンド結合実験は、システム全体の対照実験について概説されている以下の代表的手順に従って、１μＭのペプチド模倣大環状分子と５μＭのｈＭＤＭ２を使用して実施する。ペプチド模倣大環状分子の４０μＭ原液のＤＭＳＯアリコート１μＬを、ＰＢＳ１９μＬ（リン酸緩衝食塩水：１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭ、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液）に溶解させる。得られた溶液を、反復ピペット操作によって混合し、１００００ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化する。得られた上清のアリコート４μＬに、ＰＢＳ中１０μＭのｈＭＤＭ２  ４μＬを添加する。したがって、実験試料各８．０μＬは、ＰＢＳ中５．０μＭ濃度のタンパク質４０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）と、１μＭペプチド模倣大環状分子および２．５％ＤＭＳＯを含有している。こうして濃度点ごとに調製した二つ組の試料を、室温で６０分間インキュベートし、次に４℃に冷やした後、５．０μＬ注入のサイズ排除クロマトグラフィー−ＬＣ−ＭＳ分析を行う。標的タンパク質、タンパク質−リガンド複合体、および非結合化合物を含有する試料を、ＳＥＣカラム上に注入し、そこで迅速なＳＥＣステップによって複合体を非結合構成成分から分離する。ＳＥＣカラム溶離液を、ＵＶ検出器を使用してモニタして、ＳＥＣカラムのボイドボリュームに溶出する初期溶出タンパク質画分が、カラム上に保持されている非結合構成成分から十分に分離されることが確認される。タンパク質およびタンパク質−リガンド複合体を含有するピークは、一次ＵＶ検出器から溶出した後、試料ループに入り、そこでＳＥＣ段階のフローストリームから切り離され、弁機序を介してＬＣ−ＭＳに直接移される。ペプチド模倣大環状分子の（Ｍ＋３Ｈ）３＋イオンを、ＥＳＩ−ＭＳによって、予測されるｍ／ｚにおいて観測し、タンパク質−リガンド複合体の検出を確実にする。
タンパク質−リガンドＫｄ滴定実験のためのアッセイ
【０２１５】
タンパク質に対する試験化合物の結合および親和性を評価するために、例えば、タンパク質−リガンドのＫｄ滴定実験を実施する。タンパク質−リガンドのＫｄ滴定実験を、以下の通り実施する。滴定剤ペプチド模倣大環状分子の連続希釈原液（５、２．５、．．．、０．０９８ｍＭ）のＤＭＳＯアリコート２μＬを調製し、次にＰＢＳ３８μＬに溶解させる。得られた溶液を、反復ピペット操作によって混合し、１００００ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化する。得られた上清のアリコート４．０μＬに、ＰＢＳ中１０μＭのｈＭＤＭ２  ４．０μＬを添加する。したがって、実験試料各８．０μＬは、ＰＢＳ中５．０μＭ濃度のタンパク質４０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）、様々な濃度（１２５、６２．５、．．．、０．２４μＭ）の滴定剤ペプチドおよび２．５％ＤＭＳＯを含有している。こうして濃度点ごとに調製した二つ組の試料を、室温で３０分間インキュベートし、次に４℃に冷やした後、２．０μＬ注入のＳＥＣ−ＬＣ−ＭＳ分析を行う。（Ｍ＋Ｈ）１＋、（Ｍ＋２Ｈ）２＋、（Ｍ＋３Ｈ）３＋、および／または（Ｍ＋Ｎａ）１＋イオンは、「Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｔｏ  Ｒａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｖｓ．  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ．」Ａｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ａ．；Ｎａｚｅｆ，  Ｎ．；Ｃｈｕａｎｇ，  Ｃ．  Ｃ．；Ｓｃｏｔｔ，  Ｍ．  Ｐ．；Ｎａｓｈ，  Ｈ．  Ｍ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００４年、１２６巻、１５４９５〜１５５０３頁；また「ＡＬＩＳ：  Ａｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｄ．  Ａ．  Ａｎｎｉｓ、Ｃ．−Ｃ．  Ｃｈｕａｎｇ、およびＮ．  Ｎａｚｅｆ．  Ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｗａｎｎｅｒ  Ｋ、Ｈｏｅｆｎｅｒ  Ｇ編：  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；２００７年：１２１〜１８４頁。Ｍａｎｎｈｏｌｄ  Ｒ、Ｋｕｂｉｎｙｉ  Ｈ、Ｆｏｌｋｅｒｓ  Ｇ（シリーズ編者）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに記載の通り、ＥＳＩ−ＭＳによって観測し、抽出されたイオンクロマトグラムを定量し、次に結合親和性Ｋｄを得るための等式にフィットさせる。
親和性選択−質量分析による競合結合実験のためのアッセイ
【０２１６】
タンパク質に競合的に結合する試験化合物の能力を決定するために、例えば親和性選択質量分析アッセイを実施する。構成成分１つ当たり４０μＭのリガンド混合物を、３種の化合物のそれぞれの４００μＭ原液のアリコート２μＬをＤＭＳＯ１４μＬと混ぜ合わせることによって調製する。次に、構成成分の混合物１つ当たりこの４０μＭのアリコート１μＬを、滴定剤ペプチド模倣大環状分子の連続希釈原液（１０、５、２．５、．．．、０．０７８ｍＭ）のＤＭＳＯアリコート１μＬと混ぜ合わせる。これらの試料２μＬを、ＰＢＳ３８μＬに溶解させる。得られた溶液を、反復ピペット操作によって混合し、１００００ｇで１０分間遠心分離することによって清澄化する。得られた上清のアリコート４．０μＬに、ＰＢＳ中１０μＭのｈＭＤＭ２  ４．０μＬを添加する。したがって、実験試料各８．０μＬは、ＰＢＳ中５．０μＭ濃度のタンパク質４０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）と、０．５μＭのリガンド、２．５％ＤＭＳＯ、および様々な濃度（１２５、６２．５、．．．、０．９８μＭ）の滴定剤ペプチド模倣大環状分子を含有している。こうして濃度点ごとに調製した二つ組の試料を、室温で６０分間インキュベートし、次に４℃に冷やした後、２．０μＬ注入のＳＥＣ−ＬＣ−ＭＳ分析を行う。これらおよび他の方法のさらなる詳細は、「Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｔｏ  Ｒａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｖｓ．  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ．」Ａｎｎｉｓ，  Ｄ．  Ａ．；Ｎａｚｅｆ，  Ｎ．；Ｃｈｕａｎｇ，  Ｃ．  Ｃ．；Ｓｃｏｔｔ，  Ｍ．  Ｐ．；Ｎａｓｈ，  Ｈ．  Ｍ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００４年、１２６巻、１５４９５〜１５５０３頁；また「ＡＬＩＳ：  Ａｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｄ．  Ａ．  Ａｎｎｉｓ、Ｃ．−Ｃ．  Ｃｈｕａｎｇ、およびＮ．  Ｎａｚｅｆ．  Ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｗａｎｎｅｒ  Ｋ、Ｈｏｅｆｎｅｒ  Ｇ編：  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ；２００７年：１２１〜１８４頁。Ｍａｎｎｈｏｌｄ  Ｒ、Ｋｕｂｉｎｙｉ  Ｈ、Ｆｏｌｋｅｒｓ  Ｇ（シリーズ編者）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに提示されている。
無傷細胞における結合アッセイ
【０２１７】
無傷細胞における、ペプチドまたはペプチド模倣大環状分子とそれらの天然アクセプターの結合を、免疫沈降実験によって測定することが可能である。例えば、無傷細胞は、血清がない状態でフルオレセイン化（ＦＩＴＣ標識された）化合物と共に４時間インキュベートした後、血清代替物と共に、４〜１８時間、さらにインキュベートする。次に、細胞をペレット化し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．６］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＣＨＡＰＳおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で４℃において１０分間インキュベートする。抽出物を、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を収集し、ヤギ抗−ＦＩＴＣ抗体１０μｌと共に２時間インキュベートし、４℃で回転させた後、タンパク質Ａ／Ｇセファロース（５０％ビーズスラリー５０μｌ）と共に４℃でさらに２時間インキュベートする。急速遠心分離した後、ペレットを、漸増塩濃度（例えば、１５０ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ）を含有する溶解緩衝液で洗浄する。次に、ビーズを１５０ｍＭのＮａＣｌで再平衡化した後、ＳＤＳを含有する試料緩衝液を添加し、煮沸させる。遠心分離した後、上清を、任意選択で４％〜１２％勾配のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを使用して電気泳動させた後、イモビロン−Ｐ膜に移す。ブロッキングした後、ブロットを、任意選択でＦＩＴＣを検出する抗体と共にインキュベートし、また、ペプチド模倣大環状分子に結合するタンパク質を検出する１種または複数種の抗体と共にインキュベートする。細胞透過性アッセイ
【０２１８】
ペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する未架橋大環状分子と比較して、細胞透過性がより高い。最適化リンカーを有するペプチド模倣大環状分子は、例えば、対応する未架橋大環状分子の少なくとも２倍の細胞透過性を有し、適用したペプチド模倣大環状分子のしばしば２０％またはそれ超が、４時間後に細胞を透過したことが観察される。ペプチド模倣大環状分子および対応する未架橋大環状分子の細胞透過性を測定するために、無傷細胞を、フルオレセイン化ペプチド模倣大環状分子または対応する未架橋大環状分子（１０μＭ）と共に、無血清培地中で３７℃において４時間インキュベートし、培地で２回洗浄し、トリプシン（０．２５％）と共に３７℃で１０分間インキュベートする。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させる。細胞の蛍光を、例えば、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターまたはＣｅｌｌｏｍｉｃｓ’  ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（登録商標）ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒのいずれかを使用することによって分析する。
細胞の有効性アッセイ
【０２１９】
ある特定のペプチド模倣大環状分子の有効性を、例えば細胞ベースの殺滅アッセイにおいて、様々な腫瘍形成細胞株および非腫瘍形成細胞株、ならびにヒトまたはマウス細胞集団から得られた初代細胞を使用して決定する。細胞生存率を、例えば、ペプチド模倣大環状分子（０．５〜５０μＭ）と共に２４〜９６時間かけてインキュベートしてモニタして、ＥＣ５０＜１０μＭで死滅させる細胞を同定する。細胞生存率を測定するいくつかの標準アッセイは、市販されており、任意選択でペプチド模倣大環状分子の有効性を評価するために使用される。さらに、アネキシンＶおよびカスパーゼ活性化を測定するアッセイは、任意選択でペプチド模倣大環状分子が、アポトーシス機構を活性化することによって細胞を死滅させるかどうかを評価するために使用される。例えば、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−ｇｌｏアッセイを使用し、それによって、細胞生存率を細胞内ＡＴＰ濃度の関数として決定する。
ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性アッセイ
【０２２０】
ペプチド模倣大環状分子のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を調査するために、化合物を、例えば０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの濃度でＩＶ、ＩＰ、ＰＯまたは吸入経路によってマウスおよび／またはラットに投与し、注射の０分後、５分後、１５分後、３０分後、１時間後、４時間後、８時間後および２４時間後に血液被検物を得る。次に、新鮮な血清２５μＬ中の無傷化合物のレベルを、上の通りＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定する。
動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
【０２２１】
ペプチド模倣大環状分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍形成活性を決定するために、化合物を、例えば単独で（ＩＰ、ＩＶ、ＰＯ、吸入、または経鼻経路によって）、または最適以下の用量の関連化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）と組み合わせて投与する。一例では、ルシフェラーゼを安定に発現する５×１０６個のＲＳ４；１１細胞（急性リンパ芽球性白血病の患者の骨髄から樹立された）を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを全身照射に付した３時間後に尾静脈注射する。この白血病の形態は、処置せずにおくと、このモデルでは３週間で致死的なものになる。該白血病は、例えばマウスにＤ−ルシフェリン（６０ｍｇ／ｋｇ）を注射し、麻酔下の動物を画像化することによって（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ホプキントン）、容易にモニタされる。全身バイオルミネセンスは、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ホプキントン）により、光量子束（ｐｈｏｔｏｎｉｃ  ｆｌｕｘ）（光子／秒）の積分によって定量される。ペプチド模倣大環状分子は、単独で、または最適以下の用量の関連化学療法剤と組み合わせて、例えば白血病マウス（バイオルミネセンス範囲１４〜１６で、注射／実験１日目の１０日後）に、尾静脈またはＩＰ経路によって、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で７〜２１日間投与される。任意選択で、マウスを、実験中２日ごとに画像化し、実験期間中、生存を毎日モニタする。死亡したマウスは、任意選択で実験の終了時に剖検する。別の動物モデルは、安定にルシフェラーゼを発現する、ヒト濾胞性リンパ腫から得られた細胞株であるＤｏＨＨ２の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへの移植である。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ試験により、任意選択で薬物動態学的、薬力学的および毒性学的な予備データを作成する。
臨床試験
【０２２２】
ヒトを処置するためのペプチド模倣大環状分子の適合性を決定するために、臨床試験を実施する。例えば、がんを有すると診断され、処置が必要な患者を選択し、処置群と１つまたは複数の対照群に分離され、ここで処置群には本発明ペプチド模倣大環状分子を投与し、対照群にはプラセボまたは公知の抗がん薬物を投与する。したがって、本発明のペプチド模倣大環状分子の処置の安全性および有効性は、生存および生活の質などの因子に関して患者群を比較することによって評価することができる。この例では、ペプチド模倣大環状分子で処置した患者群は、プラセボで処置した患者対照群と比較して、改善された生存期間の延長を示す。
医薬組成物および投与経路
【０２２３】
本発明のペプチド模倣大環状分子はまた、薬学的に許容される誘導体またはそのプロドラッグも含む。「薬学的に許容される誘導体」とは、レシピエントへの投与の際、本発明の化合物を（直接的にまたは間接的に）提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩、エステル、エステルの塩、プロドラッグまたは他の誘導体を意味する。特に好ましい薬学的に許容される誘導体は、哺乳動物に投与される場合、本発明の化合物のバイオアベイラビリティーを増加させるか（例えば、経口投与された化合物の血液中への吸収を増加させることによって）、または親種と比較して、生物学な区画（例えば、脳またはリンパ系）への活性化合物の送達を増加させるものである。一部の薬学的に許容される誘導体は、消化管粘膜の全域で水性溶解度または活発な輸送を増加させる化学基を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、選択的生物学的特性を増強するために、適当な官能基を共有結合または非共有結合により連結することによって改変される。このような改変として、所与の生物学的区画（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透性を増大させる、経口利用の可能性を増大させる、溶解度を増大させて注射による投与を可能にする、代謝を変化させる、および排出速度を変化させることが挙げられる。
【０２２５】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩として、薬学的に許容される無機の酸および塩基ならびに有機の酸および塩基由来の塩が挙げられる。適切な酸性塩の例として、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられる。適当な塩基由来の塩として、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）、アンモニウムおよびＮ−（アルキル）４＋塩が挙げられる。
【０２２６】
本発明の化合物から医薬組成物を調製するための、薬学的に許容されるキャリアとして、固体または液体のいずれかのキャリアが挙げられる。固体形態調製物として、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、坐剤、および分散性粒剤が挙げられる。固体キャリアは、希釈剤、香味剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、または封入材料としても作用する１種または複数種の物質であることができる。製剤および投与のための技術に関する詳細は、科学文献および特許文献に十分に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡの最新版を参照されたい。
【０２２７】
粉末において、キャリアは、微粉化した活性成分と混合されている微粉化した固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合特性を有するキャリアと、適切な割合で混合され、所望の形状およびサイズに圧縮される。
【０２２８】
適切な固体賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤であり、これには、それらに限定されるものではないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；セルロース、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等；ならびにアラビアおよびトラガントを含むゴム；ならびにタンパク質、例えば、ゼラチンおよびコラーゲン等が含まれる。所望する場合、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤または可溶化剤を加える。
【０２２９】
液体形態の調製物として、液剤、懸濁剤、および乳剤、例えば、水または水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口注射用に、液体調製物は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液の中で製剤化することができる。
【０２３０】
薬学的調製物は好ましくは単位剤形である。このような形態では、調製物は、適当な量の活性成分を含有する単位用量へと分割される。単位剤形は、バイアルまたはアンプル中に小分けした錠剤、カプセル剤、および粉末等、別個の量の調製物を含有するパッケージである、パッケージされた調製物であることができる。また、単位剤形は、それ自体カプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはロゼンジ剤であってもよいし、またはこれらのうちのいずれかの適当な数のパッケージ化形態であってもよい。
【０２３１】
本発明の組成物がペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療剤または予防剤の組合せを含む場合、化合物および追加の薬剤の両方は、単剤治療レジメンにおいて通常投与される用量の約１〜１００％の間、より好ましくは約５〜９５％の間の用量レベルで存在すべきである。一部の実施形態では、追加の薬剤は、複数回用量レジメンの一部として、本発明の化合物とは別々に投与される。あるいは、これらの薬剤は単一剤形の一部であり、単一の組成物中で本発明の化合物と一緒に混合される。
使用の方法
【０２３２】
一態様では、本発明は、ペプチド模倣大環状分子がモデリングされる、タンパク質またはペプチドの天然リガンド（複数可）に結合する薬剤を特定するために競合的結合アッセイにおいて有用な新規のペプチド模倣大環状分子を提供する。例えば、ｐ５３／ＨＤＭＸ系では、ｐ５３に基づく、標識されたペプチド模倣大環状分子を、ＨＤＭＸに競合的に結合する小分子と共にＨＤＭＸ結合アッセイに使用することができる。競合的結合研究により、ｐ５３／ＨＤＭＸ系に特異的な薬物候補の迅速なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの評価および判定が可能となる。このような結合研究は、本明細書で開示されているペプチド模倣大環状分子のいずれかおよびこれらの結合パートナーを用いて実施してもよい。
【０２３３】
ペプチド模倣大環状分子に対する抗体を生成するための方法がさらに提供される。一部の実施形態では、これらの抗体は、ペプチド模倣大環状分子、およびペプチド模倣大環状分子が関連するｐ５３等の前駆体ペプチドの両方に特異的に結合する。このような抗体は、例えば、天然タンパク質−タンパク質の相互作用、例えば、ｐ５３とＨＤＭＸの間の結合を破壊する。
【０２３４】
他の態様では、本発明は、ｐ５３、ＨＤＭ２またはＨＤＭＸを含む分子の異常な（例えば、不十分または過剰な）発現または活性を伴う障害のリスクがある（または罹りやすい）またはその障害を有する被験体を処置する予防法および治療方法の両方を提供する。
【０２３５】
別の実施形態では、障害は、少なくとも部分的に、異常なレベルのｐ５３もしくはＨＤＭ２もしくはＨＤＭＸ（例えば、過剰発現または過小発現）により、または異常な活性を呈するｐ５３もしくはＨＤＭ２もしくはＨＤＭＸの存在により引き起こされる。よって、ｐ５３由来のペプチド模倣大環状分子により、ｐ５３もしくはＨＤＭ２もしくはＨＤＭＸのレベルおよび／もしくは活性の減少、またはｐ５３もしくはＨＤＭ２もしくはＨＤＭＸのレベルおよび／もしくは活性の増強を使用して、例えば、障害の有害症状を好転または減少させる。
【０２３６】
別の態様では、本発明は、例えば、ｐ５３とＨＤＭ２またはｐ５３とＨＤＭＸとの間の結合パートナーの間の相互作用または結合を妨げることによって、過剰増殖性疾患および炎症性障害を含む疾患を処置または予防するための方法を提供する。これらの方法は、有効量の本発明の化合物を、ヒトを含む温血動物に投与することを含む。一部の実施形態では、本発明の化合物の投与は、細胞成長停止またはアポトーシスを誘発する。
【０２３７】
本明細書で使用される場合、用語「処置」は、疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を回復させる、治癒する、軽減する、緩和する、変化させる、治す、好転させる、改善するまたは影響を与えるという目的で、その疾患、疾患の症状または疾患に対する素因を有する患者への治療剤の適用もしくは投与、またはその患者から単離した組織または細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義される。
【０２３８】
一部の実施形態では、本発明のペプチド模倣大環状分子を使用して、がんおよび新生物性状態を処置、予防および／または診断する。本明細書で使用される場合、用語「がん」、「過剰増殖性」および「新生物性」は、自律的増殖能、すなわち、急速に増殖する細胞成長により特徴付けられる異常な状況または状態を有する細胞を指す。過剰増殖性および新生物性疾患の状況は、病的なもの、すなわち、疾患の状況を特徴付けるまたは構成するものとして分類してもよいし、または非病的なもの、すなわち、正常な状態から逸脱しているが、疾患の状況を伴わないものとして分類してもよい。この用語は、病理組織学的タイプまたは侵襲性のステージに関係なく、すべての種類のがんの成長または発がんプロセス、転移性組織もしくは悪性形質転換細胞、組織、もしくは器官を含むことを意図する。転移性腫瘍は、乳房、肺、肝臓、結腸および卵巣の起源の腫瘍を含むがそれらに限定されない、複数の原発性腫瘍型から生じる可能性がある。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長により特徴付けられる疾患の状況において発生する。非病的過剰増殖性細胞の例として、創傷修復に伴う細胞の増殖が挙げられる。細胞増殖性障害および／または分化性障害の例として、がん、例えば、癌腫、肉腫、または転移性障害が挙げられる。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、このようながんの転移等を制御するための新規の治療剤である。
【０２３９】
がんまたは新生物性状態の例として、線維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃がん、食道がん、直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮がん、頭頸部のがん、肺がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、脳がん、扁平上皮癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣がん、小細胞肺癌、肺非小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、グリア細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽腫、白血病、リンパ腫、またはカポジ肉腫が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４０】
増殖性障害の例として、造血性新生物性障害が挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「造血性新生物性障害」は、造血系起源の、例えば、骨髄性、リンパ系または赤血球系、またはその前駆細胞から生じる過形成／新生物細胞を伴う疾患を含む。好ましくは、疾患は、低分化型急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。追加の例示的な骨髄性障害として、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ、（１９９１年）、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．、１１巻：２６７〜９７頁に概説されている）が挙げられるが、それらに限定されない。リンパ系悪性腫瘍として、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ細胞系ＡＬＬおよびＴ細胞系ＡＬＬを含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、それらに限定されない。追加の形態の悪性リンパ腫として、非ホジキンリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびＲｅｅｄ−Ｓｔｅｍｂｅｒｇ病が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４１】
乳房の細胞増殖性障害および／または分化性障害の例として、増殖性乳房疾患、例えば、上皮過形成、硬化性腺症、および小管乳頭腫を含めたもの等；腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、および肉腫等の間質腫瘍、ならびに大管乳頭腫等の上皮腫瘍；上皮内腺管癌（パジェット病を含む）および上皮内小葉癌を含む上皮内（非侵襲性）癌を含む乳房の癌、ならびに、侵襲性（浸潤性）癌、例えば、それらに限定されるものではないが、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液性）癌、管状腺癌、および侵襲性乳頭状癌を含めたもの、ならびに混合型悪性新生物が挙げられるが、それらに限定されない。男性乳房の障害として、女性化乳房および癌が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４２】
皮膚の細胞増殖性障害および／または分化性障害として、増殖性皮膚疾患、例えば、黒色腫、例えば、粘膜黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、黒子（例えば、悪性黒子、悪性黒子由来黒色腫、または端部黒子様黒色腫）、無色素性黒色腫、線維形成性黒色腫、スピッツ母斑を特徴とする黒色腫、小母斑様細胞を有する黒色腫、ポリープ状黒色腫、および軟部組織黒色腫を含めたもの等；基底細胞癌、例えば、小結節性基底細胞癌、表在性扁平型基底細胞上皮腫、結節性基底細胞癌（げっ歯類潰瘍）、嚢胞性基底細胞癌、瘢痕性基底細胞癌、色素沈着型基底細胞癌、異常な基底細胞癌、浸潤型基底細胞癌、母斑様基底細胞癌症候群、ポリープ状基底細胞癌、孔様基底細胞癌、およびピンカスの線維上皮腫を含めたもの等；扁平細胞癌、例えば、棘細胞腫（大細胞棘細胞腫）、腺様扁平上皮癌、類基底細胞扁平上皮癌、明細胞扁平上皮癌、印環細胞扁平上皮癌、スピンドル細胞扁平上皮癌、マルジョラン潰瘍、ケーラー紅色肥厚症、およびボーエン病を含めたもの等；または他の皮膚腫瘍もしくは皮下腫瘍が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４３】
肺の細胞増殖性障害および／または分化性障害の例として、気管支原性肺癌、例えば、腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞癌、神経内分泌腫瘍を含めたもの、例えば、気管支カルチノイド、混合型腫瘍、および転移性腫瘍等；胸膜の病態、例えば、炎症性胸膜滲出、非炎症性胸膜滲出、気胸、および胸膜腫瘍を含めたもの、例えば、孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）を含めたもの等、ならびに悪性中皮腫が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４４】
結腸の細胞増殖性障害および／または分化性障害の例として、非新生物性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４５】
肝臓の細胞増殖性障害および／または分化性障害の例として、結節性過形成、腺腫、および悪性腫瘍、例えば、肝臓の原発性癌および転移性腫瘍を含めたもの等が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４６】
卵巣の細胞増殖性障害および／または分化性障害の例として、卵巣腫瘍、例えば、体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫、ブレンナー腫瘍、表面上皮腫瘍；胚細胞腫瘍、例えば、成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未成熟型悪性奇形腫、未分化胚細胞腫、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌等；性索間質性腫瘍、例えば、顆粒膜夾膜細胞腫、莢膜細胞腫線維腫、アンドロブラストーマ、ヒル細胞腫瘍、および性腺芽腫等；ならびに転移性腫瘍、例えば、クルーケンベルグ腫瘍等が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４７】
他のまたはさらなる実施形態では、本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子を使用して、過活動性細胞死または生理学的傷害等による細胞死によって特徴付けられる状態を処置、予防または診断する。早発性または望ましくない細胞死により特徴付けられる状態、またはあるいは、望ましくないまたは過剰な細胞増殖のいくつかの例として、低細胞性／低形成性、無細胞性／無形成性、または細胞過多／過形成の状態が挙げられるが、それらに限定されない。一部の例として、血液系障害、例えば、ファンコーニ貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少、および骨髄形成異常を含めたもの等が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４８】
他のまたはさらなる実施形態では、アポトーシスが低減するように作用する本発明のペプチド模倣大環状分子を使用して、望ましくないレベルの細胞死に伴う障害を処置する。よって、一部の実施形態では、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子を使用して、ウイルス感染症、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染に伴う感染症に伴う細胞死をもたらすもの等の障害を処置する。多種多様な神経疾患は、特定のセットのニューロンを徐々に喪失することを特徴とする。１つの例はアルツハイマー病（ＡＤ）である。アルツハイマー病は、大脳皮質およびある特定の皮質下領域内でのニューロンおよびシナプシスの喪失により特徴付けられる。この喪失は、罹患した領域全体の萎縮をもたらす。アミロイド斑および神経原繊維変性の両方が、ＡＤに罹患した脳に現れる。アルツハイマー病は、異常に折り畳まれたＡ−ベータおよびタウタンパク質の脳内の蓄積に起因する、タンパク質ミスフォールディング疾患と特定されてきた。斑は、βアミロイドで作られている。βアミロイドは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きなタンパク質由来の断片である。ＡＰＰは、ニューロン成長、生存および損傷後の修復に重要である。ＡＤでは、未知のプロセスにより、ＡＰＰがタンパク質分解を介して酵素により小さな断片へと切断される。これらの断片の１つがβアミロイドの原線維であり、これは、老人斑として公知の、密集した形成物としてニューロンの外側に沈着する凝集塊を形成する。斑は、多くの場合タングルと呼ばれる、神経細胞内の不溶性のねじれた線維へと成長し続ける。したがって、βアミロイドとその天然の受容体との間の相互作用の破壊は、ＡＤの処置に重要である。一部の実施形態では、本発明の抗アポトーシス性ペプチド模倣大環状分子を、ＡＤおよび細胞アポトーシスに伴う他の神経学的障害の処置に使用する。このような神経学的障害として、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜色素変性症、脊髄性筋萎縮症、および様々の形態の小脳変性症が挙げられる。これらの疾患における細胞喪失は、炎症性応答を誘発せず、アポトーシスが細胞死の機序であるようにみえる。
【０２４９】
加えて、いくつかの血液系疾患は、血液細胞産生の低減を伴う。これらの障害として、慢性疾患に伴う貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少症、および骨髄異形成症候群が挙げられる。血液細胞産生の障害、例えば、骨髄異形成症候群および一部の形態の再生不良性貧血等は、骨髄内のアポトーシス細胞死の増加を伴う。これらの障害は、アポトーシスを促進する遺伝子の活性化、間質細胞もしくは造血性生存因子の後天性欠乏、または毒素および免疫応答の伝達物質の直接的作用に起因する可能性がある。細胞死に伴う２つの一般的な障害は心筋梗塞および脳卒中である。両方の障害において、急激な血流の喪失という事象において生じる虚血の中心領域内の細胞は、壊死の結果として急速に死滅するようにみえる。しかし、中心虚血性の外側域では、細胞は、より長い期間にわたり死滅し、形態学的には、アポトーシスにより死滅するようにみえる。他のまたはさらなる実施形態では、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子を使用して、望ましくない細胞死に伴うすべてのこのような障害を処置する。
【０２５０】
本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で処置される神経性障害の一部の例として、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型遺伝性脳溢血アミロイドーシス、反応性アミロイドーシス、じんま疹および難聴を伴う家族性アミロイド腎症、マックルウェルズ症候群、特発性骨髄腫；マクログロブリン血症関連の骨髄腫、家族性アミロイド多発ニューロパシー、家族性アミロイド心筋症、孤立性心アミロイド、全身性老年性アミロイドーシス、成人発症糖尿病、インスリノーマ、孤立性心房性アミロイド、甲状腺の髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳溢血、家族性アミロイド性多発ニューロパシー、スクラピー、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマンストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、プリオン媒介性疾患、およびハンチントン病が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２５１】
別の実施形態では、本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子を使用して、炎症性障害を処置、予防または診断する。多くの種類の炎症性障害が存在する。ある特定の炎症性疾患は、免疫系、例えば、自己免疫疾患に伴う。自己免疫疾患は、体内に通常存在する物質および組織、すなわち自己抗原に対して身体の過活動性免疫応答から生じる。言い換えると、免疫系が自己の細胞を攻撃する。自己免疫疾患は免疫媒介性疾患の主な原因である。関節リウマチは自己免疫疾患の一例であり、関節リウマチにおいて、免疫系は関節部を攻撃し、これが炎症（すなわち関節炎）および破壊を引き起こす。これはまた、肺および皮膚等の一部の器官も損傷し得る。関節リウマチは、機能性および可動性の実質的な喪失をもたらし得る。関節リウマチは、血液検査、特にリウマチ因子試験で診断される。本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で処置される自己免疫疾患の一部の例として、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、チャーグストラウス症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、皮膚筋炎、１型糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、間質性膀胱炎、エリテマトーデス、モルフェア、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経ミオトニー、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても公知）、高安動脈炎、血管炎、尋常性白斑、およびヴェグナー肉芽腫症が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２５２】
本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で処置される他の種類の炎症性障害の一部の例として、アレルギー、例えば、アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー（じんま疹／発疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎）、食物アレルギー、薬物アレルギー、昆虫アレルギーを含めたもの、および稀なアレルギー性疾患、例えば、肥満細胞症等、喘息、骨関節炎、関節リウマチ、および脊椎関節症を含む関節炎、ＣＮＳの原発性血管炎、サルコイドーシス、臓器移植拒否反応、線維筋痛、線維症、膵炎、および骨盤腹膜炎が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２５３】
本発明のペプチド模倣大環状分子で処置または予防される心血管障害（例えば、炎症性障害）の例として、大動脈弁狭窄、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、心臓突然死、高血圧性心疾患；非冠動脈疾患、例えば、細動脈硬化症、小血管疾患、腎症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧症、肺気腫および慢性肺疾患等；または新脈管形成術後の再狭窄、シャント、ステント、合成もしくは天然切除移植片、留置カテーテル、弁または他の埋め込み型デバイスの留置等の介入処置に伴う心血管状態（「処置による血管外傷」）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい心血管障害として、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、動脈瘤、および脳卒中が挙げられる。
【０２５４】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態は単なる例示を提供しているにすぎないことは当業者には明らかである。多くの変化形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、現在当業者に生じている。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する上で利用することができることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲ならびにこれらの特許請求の範囲およびここで網羅されているこれらの同等物の範囲内にある方法および構造を定義することを意図する。
製剤および投与
投与方法
【０２５５】
本開示の有効量のペプチド模倣大環状分子は、許容される投与方法のいずれかによって単回または複数回用量のいずれかで投与され得る。一部の実施形態では、本開示のペプチド模倣大環状分子は、例えば皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内または硬膜外注射によって非経口投与される。例えば、ペプチド模倣大環状分子は、静脈内、動脈内、皮下または注入によって投与される。いくつかの例では、ペプチド模倣大環状分子は、静脈内投与される。いくつかの例では、ペプチド模倣大環状分子は、動脈内投与される。
【０２５６】
選択された投与経路に関わらず、本開示のペプチド模倣大環状分子、および／または本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される剤形に製剤化される。本開示によるペプチド模倣大環状分子は、他の医薬品と類似して、ヒトまたは動物の医療において使用するのに好都合な任意の方式で投与するために製剤化され得る。
【０２５７】
一態様では、本開示は、１種または複数種の薬学的に許容されるキャリア（添加物）および／または賦形剤と一緒に製剤化された、治療上有効な量の上記のペプチド模倣大環状分子の１つまたは複数を含む医薬製剤を提供する。一実施形態では、本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子の１つまたは複数は、非経口投与のために非経口投与のために製剤化され、本明細書に開示の１つまたは複数のペプチド模倣大環状分子は、水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくは乳濁液として、または使用直前に注入可能な滅菌溶液もしくは分散液に再構成することができる滅菌粉末として製剤化され得る。このような製剤は、糖、アルコール、抗酸化剤、バッファ、静菌剤、製剤を所期のレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含むことができる。また、これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤などのアジュバントを含有することができる。対象化合物に対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール  ソルビン酸等を含むことによって確保することができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤等を組成物に含むことも望ましい。さらに、注射可能な医薬形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。所望に応じて、製剤は、例えば等張食塩水またはブドウ糖溶液を用いて、使用前に希釈することができる。いくつかの例では、ペプチド模倣大環状分子は、水溶液として製剤化され、静脈内投与される。
投与量および投与頻度
【０２５８】
投与量は、様々な技術を使用して決定され得る。選択される投与量レベルは、用いられる特定のペプチド模倣大環状分子の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定のペプチド模倣大環状分子の排泄または代謝速度、処置期間、用いられる特定のペプチド模倣大環状分子と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康状態および過去の既往歴、ならびに医療分野で周知の同様の因子を含めた様々な因子に応じて決まり得る。また投与量の値は、軽減される予定の状態の重症度と共に変わり得る。任意の特定の被験体のために、個々の必要性、および組成物を投与または投与を監督するヒトの専門的判断に従って、特異的な投与レジメンを経時的に調整することができる。
【０２５９】
医師または獣医師は、有効量の必要な医薬組成物を処方することができる。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物を用いて、本開示の化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増大することができる。
【０２６０】
一部の実施形態では、本開示のペプチド模倣大環状分子の適切な日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最少用量であるペプチド模倣大環状分子の量であり得る。このような有効用量は、一般に、上記の因子に依存する。所与の患者において最も有効な処置をもたらす任意の特定のペプチド模倣大環状分子の正確な投与時間および量は、特定のペプチド模倣大環状分子の活性、薬物動態およびバイオアベイラビリティ、患者の身体状態（年齢、性別、疾患のタイプおよびステージ、全体的な身体状態、所与の投与量に対する応答性、ならびに薬物療法のタイプを含む）、投与経路等に依存する。
【０２６１】
投与量は、患者の体重１ｋｇ当たりのペプチド模倣大環状分子の量に基づくことができる。あるいは、本開示の投与量は、ペプチド模倣大環状分子の血漿濃度を参照することによって決定され得る。例えば、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）および時間０から無限までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を使用することができる。
【０２６２】
一部の実施形態では、被験体は、ヒト被験体であり、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり０．０１〜１００ｍｇである。例えば、様々な例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．０１〜５０ｍｇ、約０．０１〜２０ｍｇ、約０．０１〜１０ｍｇ、約０．１〜１００ｍｇ、約０．１〜５０ｍｇ、約０．１〜２０ｍｇ、約０．１〜１０ｍｇ、約０．５〜１００ｍｇ、約０．５〜５０ｍｇ、約０．５〜２０ｍｇ、約０．５〜１０ｍｇ、約１〜１００ｍｇ、約１〜５０ｍｇ、約１〜２０ｍｇ、約１〜１０ｍｇである。一実施形態では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５ｍｇ〜１０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．１６ｍｇ、約０．３２ｍｇ、約０．６４ｍｇ、約１．２８ｍｇ、約３．５６ｍｇ、約７．１２ｍｇ、約１４．２４ｍｇ、または約２０ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．１６ｍｇ、約０．３２ｍｇ、約０．６４ｍｇ、約１．２８ｍｇ、約３．５６ｍｇ、約７．１２ｍｇ、または約１４．２４ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．１６ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．３２ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．６４ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２８ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約３．５６ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約７．１２ｍｇである。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１４．２４ｍｇである。
【０２６３】
一部の実施形態では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約２０ｍｇまたは約０．５〜約１０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週２回投与される。例えば、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約１ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、約０．５〜約１５ｍｇ、約１〜約５ｍｇ、約１〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約１〜約２０ｍｇ、約５〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約５〜約２０ｍｇ、約１０〜約１５ｍｇ、約１０〜約２０ｍｇ、または約１５〜約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週約２回投与される。いくつかの例では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１ｍｇ、約１．２５ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．７５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．７５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．２５ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．２５ｍｇ、約４．５ｍｇ、約４．７５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．２５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約５．７５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．２５ｍｇ、約６．５ｍｇ、約６．７５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．２５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約７．７５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．２５ｍｇ、約８．５ｍｇ、約８．７５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．２５ｍｇ、約９．５ｍｇ、約９．７５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１０．２５ｍｇ、約１０．５ｍｇ、約１０．７５ｍｇ、約１１ｍｇ、約１１．２５ｍｇ、約１１．５ｍｇ、約１１．７５ｍｇ、約１２ｍｇ、約１２．２５ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１２．７５ｍｇ、約１３ｍｇ、約１３．２５ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１３．７５ｍｇ、約１４ｍｇ、約１４．２５ｍｇ、約１４．５ｍｇ、約１４．７５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１５．２５ｍｇ、約１５．５ｍｇ、約１５．７５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１６．５ｍｇ、約１７ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約１８ｍｇ、約１８．５ｍｇ、約１９ｍｇ、約１９．５ｍｇ、または約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週２回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、週２回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、週２回投与される。
【０２６４】
一部の実施形態では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約２０ｍｇまたは約０．５〜約１０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週１回投与される。例えば、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約１ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、約０．５〜約１５ｍｇ、約１〜約５ｍｇ、約１〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約１〜約２０ｍｇ、約５〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約５〜約２０ｍｇ、約１０〜約１５ｍｇ、約１０〜約２０ｍｇ、または約１５〜約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週１回投与される。いくつかの例では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１ｍｇ、約１．２５ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．７５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．７５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．２５ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．２５ｍｇ、約４．５ｍｇ、約４．７５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．２５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約５．７５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．２５ｍｇ、約６．５ｍｇ、約６．７５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．２５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約７．７５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．２５ｍｇ、約８．５ｍｇ、約８．７５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．２５ｍｇ、約９．５ｍｇ、約９．７５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１０．２５ｍｇ、約１０．５ｍｇ、約１０．７５ｍｇ、約１１ｍｇ、約１１．２５ｍｇ、約１１．５ｍｇ、約１１．７５ｍｇ、約１２ｍｇ、約１２．２５ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１２．７５ｍｇ、約１３ｍｇ、約１３．２５ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１３．７５ｍｇ、約１４ｍｇ、約１４．２５ｍｇ、約１４．５ｍｇ、約１４．７５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１５．２５ｍｇ、約１５．５ｍｇ、約１５．７５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１６．５ｍｇ、約１７ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約１８ｍｇ、約１８．５ｍｇ、約１９ｍｇ、約１９．５ｍｇ、または約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週１回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、週１回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、週１回投与される。
【０２６５】
一部の実施形態では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約２０ｍｇまたは約０．５〜約１０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週に３回、４回、５回、６回、または７回投与される。例えば、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約１ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、約０．５〜約１５ｍｇ、約１〜約５ｍｇ、約１〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約１〜約２０ｍｇ、約５〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約５〜約２０ｍｇ、約１０〜約１５ｍｇ、約１０〜約２０ｍｇ、または約１５〜約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週に３回、４回、５回、６回、または７回投与される。いくつかの例では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１ｍｇ、約１．２５ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．７５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．７５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．２５ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．２５ｍｇ、約４．５ｍｇ、約４．７５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．２５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約５．７５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．２５ｍｇ、約６．５ｍｇ、約６．７５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．２５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約７．７５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．２５ｍｇ、約８．５ｍｇ、約８．７５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．２５ｍｇ、約９．５ｍｇ、約９．７５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１０．２５ｍｇ、約１０．５ｍｇ、約１０．７５ｍｇ、約１１ｍｇ、約１１．２５ｍｇ、約１１．５ｍｇ、約１１．７５ｍｇ、約１２ｍｇ、約１２．２５ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１２．７５ｍｇ、約１３ｍｇ、約１３．２５ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１３．７５ｍｇ、約１４ｍｇ、約１４．２５ｍｇ、約１４．５ｍｇ、約１４．７５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１５．２５ｍｇ、約１５．５ｍｇ、約１５．７５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１６．５ｍｇ、約１７ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約１８ｍｇ、約１８．５ｍｇ、約１９ｍｇ、約１９．５ｍｇ、または約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、週に３回、４回、５回、６回、または７回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、週に３回、４回、５回、６回、または７回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、週に３回、４回、５回、６回、または７回投与される。
【０２６６】
一部の実施形態では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約２０ｍｇまたは約０．５〜約１０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、２週、３週、または４週ごとに１回投与される。例えば、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約０．５〜約１ｍｇ、約０．５〜約５ｍｇ、約０．５〜約１０ｍｇ、約０．５〜約１５ｍｇ、約１〜約５ｍｇ、約１〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約１〜約２０ｍｇ、約５〜約１０ｍｇ、約１〜約１５ｍｇ、約５〜約２０ｍｇ、約１０〜約１５ｍｇ、約１０〜約２０ｍｇ、または約１５〜約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、２週または３週ごとに３，４，５，６または７回、１回投与される。いくつかの例では、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１ｍｇ、約１．２５ｍｇ、約１．５ｍｇ、約１．７５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約２．７５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．２５ｍｇ、約３．５ｍｇ、約３．７５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．２５ｍｇ、約４．５ｍｇ、約４．７５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．２５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約５．７５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．２５ｍｇ、約６．５ｍｇ、約６．７５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．２５ｍｇ、約７．５ｍｇ、約７．７５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．２５ｍｇ、約８．５ｍｇ、約８．７５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．２５ｍｇ、約９．５ｍｇ、約９．７５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１０．２５ｍｇ、約１０．５ｍｇ、約１０．７５ｍｇ、約１１ｍｇ、約１１．２５ｍｇ、約１１．５ｍｇ、約１１．７５ｍｇ、約１２ｍｇ、約１２．２５ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１２．７５ｍｇ、約１３ｍｇ、約１３．２５ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１３．７５ｍｇ、約１４ｍｇ、約１４．２５ｍｇ、約１４．５ｍｇ、約１４．７５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１５．２５ｍｇ、約１５．５ｍｇ、約１５．７５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１６．５ｍｇ、約１７ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約１８ｍｇ、約１８．５ｍｇ、約１９ｍｇ、約１９．５ｍｇ、または約２０ｍｇのペプチド模倣大環状分子が、２週または３週ごとに１回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、２週ごとに１回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、２週ごとに１回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、または約２０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、３週ごとに１回投与される。いくつかの例では、投与されるペプチド模倣大環状分子の量は、ヒト被験体の体重１キログラム当たり約１．２５ｍｇ、約２．５ｍｇ、約５ｍｇまたは約１０ｍｇであり、該ペプチド模倣大環状分子は、３週ごとに１回投与される。
【０２６７】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ある一定期間かけて徐々に投与される。所望の量のペプチド模倣大環状分子は、例えば約０．１時間〜２４時間かけて徐々に投与され得る。ある場合には、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、０．１時間、０．５時間、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、または２４時間かけて徐々に投与される。いくつかの例では、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、０．２５〜１２時間かけて、例えば０．２５〜１時間、０．２５〜２時間、０．２５〜３時間、０．２５〜４時間、０．２５〜６時間、０．２５〜８時間、０．２５〜１０時間かけて徐々に投与される。いくつかの例では、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、０．２５〜２時間かけて徐々に投与される。いくつかの例では、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、０．２５〜１時間かけて徐々に投与される。いくつかの例では、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、０．２５時間、０．３時間、０．４時間、０．５時間、０．６時間、０．７時間、０．８時間、０．９時間、１．０時間、１．１時間、１．２時間、１．３時間、１．４時間、１．５時間、１．６時間、１．７時間、１．８時間、１．９時間、または２．０時間かけて徐々に投与される。いくつかの例では、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、１時間かけて徐々に投与される。いくつかの例では、所望の量のペプチド模倣大環状分子は、２時間かけて徐々に投与される。
【０２６８】
ペプチド模倣大環状分子の投与は、必要な限り継続することができる。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のペプチド模倣大環状分子は、１日超、１週超、１カ月超、２カ月超、３カ月超、４カ月超、５カ月超、６カ月超、７カ月超、８カ月超、９カ月超、１０カ月超、１１カ月超、１２カ月超、１３カ月超、１４カ月超、１５カ月超、１６カ月超、１７カ月超、１８カ月超、１９カ月超、２０カ月超、２１カ月超、２２カ月超、２３カ月超、または２４カ月超投与される。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のペプチド模倣大環状分子は、１週未満、１カ月未満、２カ月未満、３カ月未満、４カ月未満、５カ月未満、６カ月未満、７カ月未満、８カ月未満、９カ月未満、１０カ月未満、１１カ月未満、１２カ月未満、１３カ月未満、１４カ月未満、１５カ月未満、１６カ月未満、１７カ月未満、１８カ月未満、１９カ月未満、２０カ月未満、２１カ月未満、２２カ月未満、２３カ月未満、または２４カ月未満投与される。
【０２６９】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目および２８日目に投与される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目および２８日目に投与され、投与は、２つのサイクルの間継続される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目および２８日目に投与され、投与は、３つのサイクルの間継続される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目および２８日目に投与され、投与は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるサイクルの間継続される。
【０２７０】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目および２１日目に投与される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目および２１日目に投与され、投与は、２つのサイクルの間継続される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目および２１日目に投与され、投与は、３つのサイクルの間継続される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目および２１日目に投与され、投与は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるサイクルの間継続される。
【０２７１】
一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のペプチド模倣大環状分子は、慢性的に、継続ベースで投与される。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のペプチド模倣大環状分子の投与は、疾患の進行、許容されない毒性、または患者もしくは医師による投与中断の決定が記載されるまで継続する。
方法および使用
【０２７２】
一態様では、本開示は、被験体におけるがんを処置する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法を提供する。
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子はｐ５３とＭＤＭ２およびＭＤＭＸとの間の相互作用を破壊することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法による処置は、ヒト被験体において、ｐ５３経路を再活性化し、がん細胞の増殖を低減し、ｐ５３タンパク質を増大し、ｐ２１を増大し、かつ／またはアポトーシスを増大し得る。
【０２７３】
一態様では、本開示は、被験体においてｐ５３非活性化変異が欠如していると決定されたがんを処置する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法を提供する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ｐ５３とＭＤＭ２およびＭＤＭＸとの間の相互作用を妨害し得る。該方法は、ペプチド模倣大環状分子を投与する前の被験体におけるｐ５３非活性化変異の欠如を確認するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法による処置は、ヒト被験体において、ｐ５３経路を再活性化し、がん細胞の増殖を低減し、ｐ５３タンパク質を増大し、ｐ２１を増大し、かつ／またはアポトーシスを増大し得る。
【０２７４】
一態様では、本開示は、野生型ｐ５３を発現する被験体におけるがんを処置する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法を提供する。
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、ｐ５３とＭＤＭ２およびＭＤＭＸとの間の相互作用を破壊することができる。該方法は、ペプチド模倣大環状分子を投与する前の被験体における野生型ｐ５３ステータスを確認するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書に開示の方法による処置は、ヒト被験体において、ｐ５３経路を再活性化し、がん細胞の増殖を低減し、ｐ５３タンパク質を増大し、ｐ２１を増大し、かつ／またはアポトーシスを増大し得る。
【０２７５】
一部の実施形態では、本明細書で提供される液性がんを処置する方法は、がんと関連するがん細胞を、阻害、低減、減少、抑止、または安定化する。他の実施形態では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がんと関連する症状またはその２つもしくはそれ超の症状を、阻害、低減、減少、抑止、または安定化する。いくつかの例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がん細胞の数および／またはがんと関連する１つもしくは複数の症状の退行を引き起こす。他の例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がん細胞の数を維持し、したがってがん細胞の数は、例えば当業者に利用可能な従来の方法、例えば超音波、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、ダイナミック造影ＭＲＩ、またはＰＥＴスキャンによって測定して増大しないか、または標準治療の投与後のいくつかのがん細胞の増大ほど増大しない。いくつかの例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がん細胞の数を低減する。いくつかの例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がん細胞の形成を低減する。いくつかの例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がんと関連する原発性、局所性および／または転移性がん細胞を、根絶、除去、または調節する。いくつかの例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、がんと関連する転移の数またはサイズを低減する。いくつかの例では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、例えばＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＤＣＥ−ＭＲＩ、またはＰＥＴスキャンによって評価して、ペプチド模倣大環状分子の投与前の被験体におけるがん細胞の数と比較して、被験体におけるがん細胞の数を、約５〜約１０％、約５〜約２０％、約１０〜約２０％、約１５〜約２０％、約１０〜約３０％、約２０〜約３０％、約２０〜約４０％、約３０〜約４０％、約１０〜約５０％、約２０〜約５０％、約３０〜約５０％、約４０〜約５０％、約１０〜約６０％、約２０〜約６０％、約３０〜約６０％、約４０〜約６０％、約５０〜約６０％、約１０〜約７０％、約２０〜約７０％、約３０〜約７０％、約４０〜約７０％、約５０〜約７０％、約６０〜約７０％、約１０〜約８０％、約２０〜約８０％、約３０〜約８０％、約４０〜約８０％、約５０〜約８０％、約６０〜約８０％、約７０〜約８０％、約１０〜約９０％、約２０〜約９０％、約３０〜約９０％、約４０〜約９０％、約５０〜約９０％、約６０〜約９０％、約７０〜約９０％、約８０〜約９０％、約１０〜約１００％、約２０％〜約１００％、約３０〜約１００％、約４０〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％の範囲、またはその間の任意の範囲の量、低減する。ある特定の実施形態では、本明細書の方法は、例えばＣＴスキャン、ＭＲＩ、ＤＣＥ−ＭＲＩ、またはＰＥＴスキャンによって評価して、ペプチド模倣大環状分子の投与前のがん細胞の数と比較して、被験体におけるがん細胞の数を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％、低減する。
【０２７６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えばＭＲＩ、ＤＣＥ−ＭＲＩ、またはＰＥＴスキャンによって評価して、ペプチド模倣大環状分子の投与前のがん細胞灌流と比較して、被験体におけるがん細胞灌流を、約５〜約１０％、約５〜約２０％、約１０〜約２０％、約１５〜約２０％、約１０〜約３０％、約２０〜約３０％、約２０〜約４０％、約３０〜約４０％、約１０〜約５０％、約２０〜約５０％、約３０〜約５０％、約４０〜約５０％、約１０〜約６０％、約２０〜約６０％、約３０〜約６０％、約４０〜約６０％、約５０〜約６０％、約１０〜約７０％、約２０〜約７０％、約３０〜約７０％、約４０〜約７０％、約５０〜約７０％、約６０〜約７０％、約１０〜約８０％、約２０〜約８０％、約３０〜約８０％、約４０〜約８０％、約５０〜約８０％、約６０〜約８０％、約７０〜約８０％、約１０〜約９０％、約２０〜約９０％、約３０〜約９０％、約４０〜約９０％、約５０〜約９０％、約６０〜約９０％、約７０〜約９０％、約８０〜約９０％、約１０〜約１００％、約２０％〜約１００％、約３０〜約１００％、約４０〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％の範囲、またはその間の任意の範囲の量、低減する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えばＭＲＩ、ＤＣＥ−ＭＲＩ、またはＰＥＴスキャンによって評価して、ペプチド模倣大環状分子の投与前のがん細胞灌流と比較して、被験体における液性がん細胞灌流を、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％、低減する。
【０２７７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えばＭＲＩ、ＤＣＥ−ＭＲＩ、またはＰＥＴスキャンによって評価して、ペプチド模倣大環状分子の投与前のがん細胞代謝と比較して、被験体におけるがん細胞代謝を、約５〜約１０％、約５〜約２０％、約１０〜約２０％、約１５〜約２０％、約１０〜約３０％、約２０〜約３０％、約２０〜約４０％、約３０〜約４０％、約１０〜約５０％、約２０〜約５０％、約３０〜約５０％、約４０〜約５０％、約１０〜約６０％、約２０〜約６０％、約３０〜約６０％、約４０〜約６０％、約５０〜約６０％、約１０〜約７０％、約２０〜約７０％、約３０〜約７０％、約４０〜約７０％、約５０〜約７０％、約６０〜約７０％、約１０〜約８０％、約２０〜約８０％、約３０〜約８０％、約４０〜約８０％、約５０〜約８０％、約６０〜約８０％、約７０〜約８０％、約１０〜約９０％、約２０〜約９０％、約３０〜約９０％、約４０〜約９０％、約５０〜約９０％、約６０〜約９０％、約７０〜約９０％、約８０〜約９０％、約１０〜約１００％、約２０％〜約１００％、約３０〜約１００％、約４０〜約１００％、約５０〜約１００％、約６０〜約１００％、約７０〜約１００％、約８０〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％の範囲、またはその間の任意の範囲、阻害または低減する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、例えばＰＥＴスキャンによって評価して、被験体におけるがん細胞代謝を阻害または低減する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ペプチド模倣大環状分子の投与前のがん細胞代謝と比較して、被験体におけるがん細胞代謝を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％、阻害または低減する。
【０２７８】
他の態様では、本開示は、ｐ５３非活性化変異が欠如していると決定されたがんおよび／または野生型ｐ５３を発現するがんを有する被験体の生存期間を延長する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法を提供する。いくつかの例では、被験体の生存期間は、該被験体が本明細書で提供される方法に従って処置されなかった場合の該被験体の予測生存期間よりも、少なくとも３０日長い。いくつかの例では、被験体の生存期間は、被験体が本明細書で提供される方法に従って処置されなかった場合の該被験体の予測生存期間よりも、１カ月〜約５年長い。例えば、被験体の生存期間は、該被験体が本明細書に開示の方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）に従って処置さ
れなかった場合の該被験体の予測生存期間よりも、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも９カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１５カ月、少なくとも１８カ月、少なくとも２１カ月、または少なくとも２４カ月長い。
【０２７９】
一態様では、本開示は、がんに罹患している被験体におけるバイオマーカーの存在、非存在または量を評価する方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓｅｄ）を提供する。いくつかの
例では、バイオマーカーには、患者のバイオマーカー、例えば被験体におけるｐ５３ステータス、ならびに被験体におけるＭＤＭ２およびＭＤＭＸ発現レベルが含まれる。
【０２８０】
本開示の方法はまた、任意選択で、被験体における本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子の安全性および／または忍容性を研究かつ／または評価するステップを含み得る。
【０２８１】
また本明細書では、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがんを有する被験体において、ｐ５３経路を再活性化する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法が提供される。
【０２８２】
また本明細書では、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがんを有するヒト被験体において、がん細胞の増殖を低減する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法が提供される。
【０２８３】
また本明細書では、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがんを有する被験体において、ｐ５３タンパク質を増大する方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法が提供される。
【０２８４】
また本明細書では、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがんを有する被験体において、ｐ２１を増大する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法が提供される。
【０２８５】
また本明細書では、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがんを有する被験体において、アポトーシスを増大する方法であって、該被験体に、治療有効量のペプチド模倣大環状分子または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含み、該ペプチド模倣大環状分子が、ＭＤＭ２タンパク質および／またはＭＤＭＸタンパク質に結合する方法が提供される。
【０２８６】
一部の実施形態では、本開示はまた、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがん（例えば、リンパ腫）を有している被験体における、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子の用量制限毒性（ＤＬＴ）および／または最大耐用量（ＭＴＤまたはＯＢＤ）または最適な生物学的用量（ＯＢＤ）を決定する方法を提供する。
【０２８７】
本開示の方法は、任意選択で、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子の薬物動態分析を含み得る。したがって、該方法は、１つまたは複数の特定の時点において被験体から１つまたは複数の生体試料を収集し、ペプチド模倣大環状分子および／またはその（ｉｔ）代謝産物のレベルについて該１つまたは複数の生体試料を分析するステップをさらに含み得る。生体試料は、被験体の血液試料、例えばヒト被験体の血液試料であり得る。１つまたは複数の特定の時点は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、投与した後、および／または投与している最中の時点が含まれ得る。一部の実施形態では、１つまたは複数の生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体にそれぞれ投与する前および投与した後に収集された生体試料を含む。一部の実施形態では、薬物動態分析のための生体試料は、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、およびペプチド模倣大環状分子を被験体にそれぞれ投与した後の１つまたは複数の時点で収集される。ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前に収集される生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与し始める前、０〜２４時間以内に収集され得る。例えば、生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、２４時間以内、２３時間以内、２２時間以内、２１時間以内、２０時間以内、１９時間以内、１８時間以内、１７時間以内、１６時間以内、１５時間以内、１４時間以内、１３時間以内、１２時間以内、１１時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分間以内、１５分間以内、または直前に収集され得る。ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与した後に収集される１つまたは複数の生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与してから、例えば０分後、５分後、１０分後、２０分後、３０分後、４５分後、６０分後、１．２５時間後、１．５時間後、１．７５時間後、２．０時間後、２．２５時間後、２．５時間後、２．７５時間後、３．０時間後、３．２５時間後、３．５時間後、３．７５時間後、４．０時間後、４．２５時間後、４．５時間後、４．７５時間後、５．０時間後、５．２５時間後、５．５時間後、５．７５時間後、６．０時間後、６．２５時間後、６．５時間後、６．７５時間後、７．０時間後、７．２５時間後、７．５時間後、７．７５時間後、８．０時間後、８．２５時間後、８．５時間後、８．７５時間後、９．０時間後、９．２５時間後、９．５時間後、９．７５時間後、１０．０時間後、１０．２５時間後、１０．５時間後、１０．７５時間後、１１．０時間後、１１．２５時間後、１１．５時間後、１１．７５時間後、１２．０時間後、２０時間後、２４時間後、２８時間後、３２時間後、３６時間後、４０時間後、４４時間後、４８時間後、５２時間後、５６時間後、６０時間後、６４時間後、６８時間後、７２時間後、または０〜７２時間後に収集され得る。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目に投与され、生体試料は、１日目の投与前、１日目の投与後（複数の生体試料を、例えば投与の約０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約４時間後、約８時間後、約２４時間後、および４８時間後に収集することができる）、８日目の投与前、８日目の投与後（複数の生体試料を、例えば投与の約０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、および約４時間後に収集することができる）、１５日目の投与前、および１５日目の投与後（複数の生体試料を、例えば投与の約０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約４時間後、約８時間後、および約２４時間後に収集することができる）に収集される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目に投与され、生体試料は、１日目の投与前、１日目の投与後（複数の生体試料を、例えば投与の約０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約４時間後、約８時間後、約２４時間後、および４８時間後に収集することができる）、８日目の投与前、８日目の投与後（複数の生体試料を、例えば投与の約０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、および約４時間後に収集することができる）、１１日目の投与前、および１１日目の投与後（複数の生体試料を、例えば投与の約０分後、約３０分後、約１時間後、約２時間後、約４時間後、約８時間後、および約２４時間後に収集することができる）に収集される。
【０２８８】
本開示の方法は、任意選択で、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子の薬力学的分析を含み得る。したがって、該方法は、薬力学的分析のために、１つまたは複数の特定の時点において被験体から１つまたは複数の生体試料を収集するステップを含み得る。薬力学的分析は、生体試料のＭＩＣ−１、ｐ５３、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ｐ２１および／または症例を含むバイオマーカーのレベルの分析を含み得る。生体試料中のバイオマーカーの検出は、例えば、直接測定、免疫組織化学検査、免疫ブロット、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｓｅ）、免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｃｅ）、免疫沈降、タンパク質アレイ、蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ）インサイツハイブリダイゼーション、ＦＡＣＳ分析、ハイブリダイゼーション、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、サザンブロット、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射イムノアッセイ、遺伝子アレイ／チップ、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、または細胞遺伝学的分析によって実施され得る。薬力学的分析のための生体試料は、被験体由来の血液試料またはがん細胞被検物であってよく、例えば薬力学的分析のための生体試料は、ヒト被験体由来の血液試料またはがん細胞被検物であってよい。ペプチド模倣大環状分子の薬力学的分析のための生体試料は、該ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、投与している最中、または投与した後の任意の時間に収集され得る。一部の実施形態では、薬物動態分析のための血液試料は、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、およびペプチド模倣大環状分子を被験体にそれぞれ投与した後の１つまたは複数の時点に収集される。ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前に収集される血液試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与し始める前、０〜２４時間以内に収集され得る。例えば、生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、２４時間以内、２３時間以内、２２時間以内、２１時間以内、２０時間以内、１９時間以内、１８時間以内、１７時間以内、１６時間以内、１５時間以内、１４時間以内、１３時間以内、１２時間以内、１１時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、１５分以内、または直前に収集され得る。ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与した後に収集される薬力学的分析のための１つまたは複数の血液試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与してから０〜約７２時間後、例えば約１２時間後、約２４時間後、約３６時間後または約４８時間後に収集され得る。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目に投与され、薬力学的分析のための血液試料は、１日目の投与前、１日目の投与後（複数の試料を、例えば投与の約２４時間後および４８時間後に収集することができる）、８日目の投与前、８日目の投与後（複数の試料を、例えば、投与の約１時間で（ｗｉｔｈ  ａｂｏｕｔ  １  ｈ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）収集することができる）、１５日目の投与前、および１５日目の投与後（複数の試料を、例えば、投与後約１時間���よび約４８時間で収集することができる）、ならびに２２日目に収集される。薬力学的分析の生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、投与した後、または投与している最中の任意の時間に収集され得る。例えば、ペプチド模倣大環状分子は、２８日サイクルの１日目、８日目、１５日目に投与することができ、薬力学的分析のためのがん細胞試料は、１日目の投与前、および１４日目〜１８日目、例えば１６日目に（ｏｆ  ｄａｙ  １６）収集される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目に投与され、薬力学的分析のための血液試料は、１日目の投与前、１日目の投与後（複数の試料を、例えば投与してから約２４時間後および４８時間後に収集することができる）、８日目の投与前、８日目の投与後（複数の試料を、例えば、投与の約１時間で収集することができる）、１１日目の投与前、および１１日目の投与後（複数の試料を、例えば、投与後約１時間および約４８時間で収集することができる）、ならびに２２日目に収集される。薬力学的分析のための生体試料は、ペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、投与した後、または投与している最中の任意の時間に収集され得る。例えば、ペプチド模倣大環状分子は、２１日サイクルの１日目、８日目、１１日目に投与することができ、薬力学的分析のためのがん細胞試料は、１日目の投与前、および１０日目〜１４日目、例えば１２日目に収集される。
【０２８９】
本開示の方法は、任意選択で、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子の臨床活性分析を含み得る。したがって、該方法は、１つまたは複数の特定の時点において被験体から収集された１つまたは複数の生体試料を分析するステップを含み得る。任意の適切な分析手順を、生体試料の分析のために使用することができる。例えば、Ｘ線写真、超音波、Ｃ
Ｔスキャン、ＰＥＴスキャン、ＭＲＩスキャン、胸部Ｘ線、腹腔鏡検査、全血算（ＣＢＣ）検査、骨スキャンおよび便潜血検査のような画像化技術を使用することができる。使用され得るさらなる分析手順には、血液化学分析、染色体転座分析、針生検、組織生検、蛍光インサイツハイブリダイゼーション、臨床検査バイオマーカー分析、免疫組織化学的染色法、フローサイトメトリー、またはそれらの組合せが含まれる。該方法は、分析手順の結果を作表および／または作図するステップをさらに含み得る。
【０２９０】
例えば、薬力学は、がん細胞組織におけるｐ２１、カスパーゼおよびＭＤＭ２、ならびに利用可能な場合にはペプチド模倣大環状分子で処置する前および処置した後の血中のＣＴＣおよびＭＩＣ−１のレベルを含むｐ５３活性化のいくつかのバイオマーカーの検査室ベースの評価によって評価され得る。
【０２９１】
過去の遺伝的試験およびバイオマーカー試験、ならびにペプチド模倣大環状分子の安全性および有効性に関連するバイオマーカーに関する血液およびがん細胞試料（ｔ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｓａｍｐｌｅ）の追加の試験から利用可能な結果は、患者の結果との可能
な相関について調査され得る。
【０２９２】
例えば、臨床活性または奏効は、標準画像化評価、例えばコンピューター断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および骨スキャンによって評価され得る。さらに、［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコースおよび［１８Ｆ］−フルオロチミジン陽電子放出断層撮影（それぞれＦＤＧ−ＰＥＴおよびＦＬＴ−ＰＥＴ）、または患者の特定の疾患タイプに臨床的に適しているとみなされる他の技術が使用され得る。ＣＴ−画像化は、例えばサイクル２の終了時、およびその後ＤＲ−Ａのために２サイクルごと（例えばサイクル４および６）、ならびにサイクル３の最終注入後、およびその後ＤＲ−Ｂにおいて３サイクルごと（例えばサイクル６および９）に実施され得る。抗がん細胞活性は、リンパ腫を有する患者のためのＩＷＧ（２０１４年）（付録Ｈ）判定基準を使用して評価され得る。さらに、ＦＤＧ集積型のリンパ腫を有する患者では、ＩＷＧ  ２０１４に概説されている通り、ベースラインおよびベースライン後にＦＤＧ−ＰＥＴ画像化が実施され得る。ＦＬＴ−ＰＥＴ画像化は、一般にＦＬＴトレーサーの十分な取込みを示すがん細胞を有する患者、例えばリンパ腫を有する患者では、ベースラインで実施され得る。例えば、ベースラインにおいて≧５の標準取込み値（ＳＵＶ）を示す、ＤＲ−Ａに割り当てられた患者では、サイクル１における被験薬の最終注入の１日後、すなわち１６日目に、反復ＦＬＴ画像を得てよい。例えば、ベースラインにおいて≧５の標準取込み値（ＳＵＶ）を示すＤＲ−Ｂ患者では、サイクル１における被験薬の最終注入の１日後、すなわち１２日目に、反復ＦＬＴ画像を得てよい。
生体試料
【０２９３】
本出願で使用される場合、「生体試料」は、正常なまたは疾患状態にある被験体の身体から導出された任意の体液または他の材料、例えば血液、血清、血漿、リンパ、尿、唾液、涙、脳脊髄液、乳、羊水、胆汁、腹水、膿汁等を意味する。また、用語「生体試料」の意味には、器官または組織抽出物、ならびに被験体由来の任意の細胞または組織調製物をインキュベートした培養液が含まれる。生体試料は、遺伝子材料をそれから得ることができる任意の試料であり得る。また、生体試料には、固形もしくは液性がん細胞試料または被検物が含まれ得る。がん細胞試料は、がん細胞組織試料であり得る。一部の実施形態では、がん細胞組織試料は、外科的に切除された組織から得ることができる。生体試料の例示的な供給源として、細針吸引、コア針生検、真空補助下生検、切開生検、切除生検、パンチ生検、薄片生検または皮膚生検が挙げられる。場合によっては、生体試料は、細針吸引試料を含む。一部の実施形態では、生体試料は、例えば、切除生検、切開生検、または他の生検を含めた組織試料を含む。生体試料は、２つまたはそれを超える供給源、例えば、細針吸引物および組織試料の混合物を含み得る。また、組織試料および細胞試料は、侵襲的な外科手術を用いずに、例えば細針を用いて胸壁もしくは腹壁を穿刺し、または乳房、甲状腺もしくは他の部位の塊から穿刺し、細胞材料を取り出すことによって得ることができる（細針吸引生検）。一部の実施形態では、生体試料は骨髄吸引試料である。生体試料は、当技術分野で公知の方法、例えば、本明細書で提供される生検方法、スワブ、擦過、静脈切開、または任意の他の適切な方法によって得ることができる。
【０２９４】
得られた生体試料は、試料の性質、使用されるアッセイ、および実務者の利便性に応じて、新鮮な、凍結した、または固定した（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋した）形態で使用され得る。新鮮な、凍結した、および固定した材料は、様々なＲＮＡおよびタンパク質アッセイに適しているが、一般に、活性のｅｘ  ｖｉｖｏ測定には、新鮮な組織が好ましい場合がある。
【０２９５】
固定組織試料を用いることもできる。生検によって得られた組織は、通常、例えばホルマリン、ホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）によって、またはアルコール浸漬によってしばしば固定される。固定生体試料は、しばしば脱水され、パラフィンまたは他の固体支持体に包埋される。参考文献として、Ｐｌｅｎａｔら、２００１年、Ａｎｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１巻：２９〜４７頁を参照されたい。本発明の方法では、非包埋固
定組織および包埋固定組織が使用され得る。固定組織を包埋するための固体支持体は、有機溶媒を用いて除去して、その後、保存組織の再水和を可能にすることができる。
【０２９６】
ある場合には、アッセイは、細胞または組織の培養ステップを含む。例えば、生検由来の細胞は、酵素（例えば、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ）およびまたは細胞を解離させるための物理的妨害（例えば２５ゲージ針を繰り返し通過させる）を使用して脱凝集させ、遠心分離によって収集し、培養、即時分析またはさらなる処理のために所望の緩衝液または培養培地に再懸濁させることができる。
被験体／患者集団
【０２９７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、がんを有するか、または有すると診断されたヒトである。他の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、がんの素因があるか、または罹患しやすいヒトである。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、がんを発症する危険性があるヒトである。
【０２９８】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現すると決定されたがんを有しているか、または有していると診断されたヒトである。他の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現すると決定されたがんの素因があるか、または罹患しやすいヒトである。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現すると決定されたがんを発症する危険性があるヒトである。ｐ５３非活性化変異は、本明細書で使用される場合、ｐ５３のｉｎ  ｖｉｔｒｏアポトーシス活性の喪失（または低減）をもたらす任意の変異である。ｐ５３非活性化変異の非限定的な例は、表１に含まれている。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）と調和するがんを有する被験体は、ｐ５３非活性
化変異、例えば表７に示されている非活性化変異が欠如していると決定されたがんを有するか、または有すると診断されたヒトである。
【０２９９】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、優性ｐ５３非活性化変異が欠如していると決定されたがんを有するか、または有すると診断されたヒトである。優性ｐ５３非活性化変異または優性ネガティブ変異は、本明細書で使用される場合、変異型ｐ５３が、野生型ｐ５３遺伝子の活性を阻害または妨害する変異である。
【表７−１】
2019520304.tif 000064
【表７−２】
2019520304.tif 000065
【０３００】
表７は、図１に示した野生型ヒトＴＰ５３腫瘍タンパク質ｐ５３の配列を指す。アミノ酸変化は、置換されるアミノ酸、その後に野生型ｐ５３配列における置換されるアミノ酸の位置、その後に置換のために使用されるアミノ酸として記録される。例えば、Ｌ３４４Ｐは、野生型配列の３４４位におけるロイシン残基（Ｌ）が、プロリン残基（Ｐ）によって置き換えられることを示す。
【０３０１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、難治性患者である。ある特定の一実施形態では、難治性患者は、標準治療（例えば、外科手術、放射線、抗アンドロゲン治療および／または薬物治療、例えば化学療法）に対して難治性の患者である。ある特定の実施形態では、がんを有する患者は、がんが、著しく根絶されなかった、かつ／または１つもしくは複数の症状が、著しく軽減されなかった場合、治療に対して難治性である。患者が難治性かどうかの決定は、がんの処置の有効性をアッセイするために、当技術分野で公知の任意の方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで行うことができる。様々な実施形態では、がんを有する患者は、がんと関連するＣＴＣまたはＭＮＢＣの数が、低減しないか、または増大した場合、難治性である。様々な実施形態では、がんを有する患者は、１つまたは複数のがん細胞が、転移し、かつ／または別の器官に拡大する場合、難治性である。
【０３０２】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんが処置される被験体は、本開示のペプチド模倣大環状分子による処置以外の治療に対して難治性であることが証明されたが、もはやこれらの治療を受けていないヒトである。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従ってがんを処置される被験体は、１つまたは複数の従来の抗がん治療、例えば外科手術、薬物治療、例えば化学療法、抗アンドロゲン治療または放射線を既に受けているヒトである。これらの患者には、難治性患者、従来の治療を受けるには若すぎる患者、および既存の治療による処置を受けたにも関わらずがん細胞を再発した患者が含まれる。
【０３０３】
一部の実施形態では、被験体は、がんの少なくとも１つの過去の処置および／または治療が不成功に終わっているヒトである。
野生型ｐ５３および／またはｐ５３変異を検出する方法
【０３０４】
一部の実施形態では、ｐ５３非活性化変異が欠如している被験体は、本発明の化合物を用いるがん処置の候補である。ｐ５３非活性化変異および／または野生型ｐ５３の発現を決定するために、患者群から得られたがん細胞は、本発明の化合物を用いる処置の前にアッセイされるべきである。
【０３０５】
ｐ５３経路の活性は、例えば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＱ、ＧＮＡＳ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）、ＭＥＴ、ＨＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＦ１、ＰＴＥＮ、ＲＡＣ１、ＲＢ１、ＮＴＲＫ３、ＳＴＫ１１、ＰＩＫ３Ｒ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＲＥＴ、ＴＰ５３、およびＶＨＬを含めた、ｐ５３経路に関与している遺伝子の変異ステータスによって決定され得る。例えば、キナーゼ：ＡＢＬ１、ＪＡＫ１、ＪＡＡＫ２、ＪＡＫ３；受容体チロシンキナーゼ：ＦＬＴ３およびＫＩＴ；受容体：ＣＳＦ３Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＭＰＬ、およびＮＯＴＣＨ１；転写因子：ＢＣＯＲ、ＣＥＢＰＡ、ＣＲＥＢＢＰ、ＥＴＶ６、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ２、ＭＬＬ、ＫＺＦ１、ＰＡＸ５、ＲＵＮＸ１、ＳＴＡＴ３、ＷＴ１、およびＴＰ５３；エピジェネティック因子：ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２、ＫＤＭ６Ａ（ＵＴＸ）、ＳＵＺ１２、ＴＥＴ２、ＰＴＰＮ１１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ３５、ＺＲＳＲ２；ＲＡＳタンパク質：ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、およびＮＲＡＳ；アダプターＣＢＬおよびＣＢＬ−Ｂ；ＦＢＸＷ７、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、およびＮＰＭ１を含めた、ｐ５３の活性をモジュレートする遺伝子を評価することもできる。
【０３０６】
がん細胞試料は、例えば固形腫瘍または液性腫瘍から、原発性もしくは転移性腫瘍切除（例えば肺切除術、肺葉切除術、楔状切除術、および開頭手術）、原発性もしくは転移性疾患の生検（例えば、経気管支または針コア）、胸膜または腹水（例えば、ＦＦＰＥ細胞ペレット）、骨髄吸引物、骨髄クロット、および骨髄生検、または腫瘍が多量に存在する領域（固形腫瘍）のマクロ解剖により、得ることができる。
【０３０７】
組織におけるｐ５３野生型遺伝子および／またはｐ５３非活性化変異の欠如を検出するために、がん組織を周囲の正常組織から単離することができる。例えば、組織は、パラフィンまたはクリオスタット切片から単離することができる。がん細胞はまた、正常細胞からフローサイトメトリーによって分離することができる。がん細胞組織が正常細胞によって高度に汚染されている場合、変異の検出はより困難となり得る。
【０３０８】
野生型ｐ５３および／またはｐ５３変異を分析するための様々な方法およびアッセイが、本発明において使用するのに適している。アッセイの非限定的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、マイクロアレイ、サザンブロット、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、イースタンブロット、Ｈ＆Ｅ染色、腫瘍の顕微鏡的評価、次世代ＤＮＡ配列決定（ＮＧＳ）（例えば、ＤＮＡの抽出、精製、定量、および増幅、ライブラリー調製）、免疫組織化学検査および蛍光のインサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が挙げられる。
【０３０９】
マイクロアレイによって、研究者は、表面、例えばガラスもしくはケイ素、またはポリマー性ビーズもしくは樹脂でできているＤＮＡチップに結合している複数のＤＮＡ配列を調査することができる。ＤＮＡ配列は、蛍光プローブまたは発光プローブとハイブリダイズされる。マイクロアレイは、試料配列をプローブとハイブリダイズした後、洗浄し、その後プローブを検出することに基づいて、試料中のオリゴヌクレオチド配列の存在を示すことができる。蛍光または発光シグナルの定量によって、試料中の公知のオリゴヌクレオチド配列の存在が示される。
【０３１０】
ＰＣＲは、ＤＮＡオリゴマーを急速に増幅させ、試料中のオリゴヌクレオチド配列を同定するために使用することができる。ＰＣＲ実験は、オリゴヌクレオチド試料を、標的配列に相補的なプライマー、１種または複数種のＤＮＡポリメラーゼ酵素、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およびｄＣＴＰを含めたデオキシヌクレオチド（ｄｅｏｘｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）三リン酸（ｄＮＴＰ）基本要素、ならびに適切な緩衝剤、塩、および添加物を含有するＰＣＲ混合物と接触させることを含む。試料が、一対のプライマーに相補的なオリゴヌクレオチド配列を含有する場合、実験によって試料配列を増幅し、それを収集し、同定することができる。
【０３１１】
一部の実施形態では、アッセイは、がん試料から得られた生体分子を増幅させることを含む。生体分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸分子であり得る。一部の実施形態では、アッセイは、核酸分子を環状化し、その後、環状化された核酸分子を消化することを含む。
【０３１２】
一部の実施形態では、アッセイは、生物、または生物から収集された生化学試料、例えば、核酸試料を、オリゴヌクレオチドのライブラリー、例えばＰＣＲプライマーと接触させることを含む。ライブラリーは、任意の数のオリゴヌクレオチド分子を含有し得る。オリゴヌクレオチド分子は、個々のＤＮＡモチーフもしくはＲＮＡモチーフ、または本明細書に記載のモチーフの任意の組合せに結合し得る。モチーフは、任意の距離を隔てて存在することができ、その距離は、公知または未知であり得る。一部の実施形態では、同じライブラリーの２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドが、親核酸配列において公知の距離を隔てて存在するモチーフに結合する。親配列とのプライマーの結合は、親配列に対するプライマーの相補性に基づいて起こり得る。結合は、例えば、アニーリング下、またはストリンジェントな条件下で起こり得る。
【０３１３】
一部の実施形態では、アッセイの結果を使用して、将来使用するための新しいオリゴヌクレオチド配列を設計する。一部の実施形態では、アッセイの結果を使用して、将来使用するための新しいオリゴヌクレオチドライブラリーを設計する。一部の実施形態では、アッセイの結果を使用して、既存のオリゴヌクレオチドライブラリーを将来使用するために改訂、改良または更新する。例えば、アッセイによって、以前に未記載の核酸配列が、標的材料の存在と関連することを明らかにすることができる。この情報を使用して、核酸分子およびライブラリーを設計または再設計することができる。
【０３１４】
一部の実施形態では、ライブラリーにおける１つまたは複数の核酸分子は、バーコードタグを含む。一部の実施形態では、ライブラリーにおける核酸分子の１つまたは複数は、増幅試料の核酸配列を環状化し、切断するのに適したＩ型またはＩＩ型制限部位を含む。このようなプライマーを使用して、ＰＣＲ産物を環状化し、そのＰＣＲ産物を切断して、試料生物に生来の核酸配列とは異なって組織化された配列を有する核酸配列産物をもたらすことができる。
【０３１５】
ＰＣＲ実験の後、増幅した配列の存在を検証することができる。増幅した配列を見出すための方法の非限定的な例として、ＤＮＡ配列決定、全トランスクリプトームショットガン配列決定（ＷＴＳＳ、またはＲＮＡ−ｓｅｑ）、質量分析（ＭＳ）、マイクロアレイ、パイロシーケンシング、カラム精製分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、およびインデックスタグ付きプライマーから作成されたＰＣＲ産物のインデックスタグ配列決定が挙げられる。
【０３１６】
一部の実施形態では、試料生物中の２つ以上の核酸配列が増幅される。ＰＣＲ産物混合物中の異なる核酸配列を分離する方法の非限定的な例として、カラム精製、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＨＰＬＣ／ＭＳ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、サイズ排除クロマトグラフィーが挙げられる。
【０３１７】
増幅した核酸分子は、配列決定によって同定され得る。核酸配列決定は、自動計測手段で行うことができる。配列決定実験を並行して行って、同時に数十、数百、または数千の配列を分析することができる。配列決定技術の非限定的な例を以下に記載する。
【０３１８】
パイロシーケンシングでは、ＤＮＡは、油溶液中、プライマーでコーティングしたビーズに結合した単一ＤＮＡ鋳型を含有する水滴内で増幅される。ヌクレオチドを付加して、配列を成長させ、各塩基の付加は、可視光によって証明される。
【０３１９】
イオン半導体配列決定は、合成中に遊離した水素イオンと関連する電気シグナルとして、核酸残基の付加を検出する。鋳型を含有する反応ウェルを、４種類のヌクレオチド基本要素で一度に１つ満たす。電気シグナルのタイミングにより、どの基本要素が付加されたかを同定し、鋳型中の対応する残基を同定する。
【０３２０】
ＤＮＡナノボールは、ローリングサークル複製を使用して、ＤＮＡをナノボールへと増幅させる。ナノボールのライゲーションによる非鎖状配列決定によって、ＤＮＡ配列が明らかになる。
【０３２１】
可逆的色素による手法では、核酸分子は、スライド上でプライマーにアニーリングされ、増幅される。天然核酸塩基にそれぞれ相補的な４種類の蛍光色素残基が付加され、核酸配列における次の塩基に相補的な残基が付加され、組み込まれなかった色素はスライドからすすがれる。４種類の可逆的なターミネーター塩基（ＲＴ塩基）が付加され、組み込まれなかったヌクレオチドは洗い流される。蛍光は、色素残基の付加を示し、したがって鋳型配列における相補的塩基を同定する。色素残基は、化学的に除去され、このサイクルが反復される。
【０３２２】
点変異の検出は、がん細胞組織中に存在するｐ５３対立遺伝子（複数可）の分子クローニング、およびその対立遺伝子（複数可）の配列決定によって達成され得る。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、がん細胞組織由来のゲノムＤＮＡ調製物からｐ５３遺伝子配列を直接的に増幅することができる。次に、増幅した配列のＤＮＡ配列を決定することができる。例えば、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、４８７頁、１９８８年；米国特許第４，６８３，２０２号、および米国特許第４，６８３，１９５号を参照されたい。また、ｐ５３遺伝子の特異的欠失を検出することができる。例えば、ｐ５３遺伝子または周囲のマーカー遺伝子のための制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを使用して、ｐ５３対立遺伝子の喪失を記録することができる。
【０３２３】
また、野生型ｐ５３遺伝子の喪失は、該ｐ５３遺伝子の野生型発現産物の喪失に基づいて検出することができる。このような発現産物には、ｍＲＮＡならびにｐ５３タンパク質産物自体の両方が含まれる。点変異は、ｍＲＮＡを直接的に配列決定することによって、またはｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングを介して検出することができる。クローン化ｃＤＮＡの配列は、ＤＮＡ配列決定技術を使用して決定され得る。また、ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して配列決定され得る。
【０３２４】
あるいは、ミスマッチ検出を使用して、ｐ５３遺伝子またはｍＲＮＡ産物における点変異を検出することができる。該方法は、ヒト野生型ｐ５３遺伝子に相補的な標識リボプローブの使用を含み得る。リボプローブおよびがん細胞組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを、一緒にアニーリングし（ハイブリダイズし）、その後、二本鎖ＲＮＡ構造において一部のミスマッチを検出することができる酵素ＲＮａｓｅ  Ａを用いて消化する。ミスマッチがＲＮａｓｅ  Ａによって検出される場合、その酵素が、ミスマッチ部位で切断する。したがって、アニーリングされたＲＮＡ調製物が電気泳動ゲルマトリックスで分離される場合、ミスマッチがＲＮａｓｅ  Ａによって検出され、切断されると、ＲＮＡ産物は、リボプローブについての全長二本鎖ＲＮＡおよびｐ５３のｍＲＮＡまたはＤＮＡよりも小さいことがわかる。リボプローブは、ｐ５３のｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はないが、いずれかのセグメントであり得る。リボプローブが、ｐ５３のｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントだけを含む場合、いくつかのこれらのプローブを使用して、全長ｍＲＮＡ配列をミスマッチについてスクリーニングすることが望ましい。
【０３２５】
同様に、ＤＮＡプローブを使用して、酵素的または化学的切断を介してミスマッチを検出することができる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻、４３９７頁、１９８８年；および  Ｓｈｅｎｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７２巻、９８９頁、１９７５年を参照。あるいは、ミスマッチは、マッチ二本鎖に対するミスマッチ二本鎖の電気泳動移動度の変化によって検出することができる。例えば、Ｃａｒｉｅｌｌｏ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４２巻、７２６頁、１９８８年参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いて、変異を含有する可能性がある細胞ｍＲＮＡまたはＤＮＡを、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲを使用して増幅することができる（以下参照）。
【０３２６】
また、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することによって、増幅されたがん細胞組織由来のｐ５３遺伝子のＤＮＡ配列は、対立遺伝子に特異的なプローブを使用してスクリーニングすることができる。これらのプローブは、そのそれぞれが、公知の変異を有するｐ５３遺伝子配列領域を含有する核酸オリゴマーである。例えば、あるオリゴマーは、ｐ５３遺伝子配列の一部分に対応する約３０ヌクレオチド長であり得る。ｐ５３遺伝子の１７５番目のコドンをコードする位置において、オリゴマーは、野生型コドンであるバリンではなく、アラニンをコードする。一連のこのような対立遺伝子に特異的なプローブを使用することによって、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングして、ｐ５３遺伝子においてに既に同定された変異の存在を同定することができる。対立遺伝子に特異的なプローブと増幅ｐ５３配列とのハイブリダイゼーションは、例えばナイロンフィルター上で実施され得る。特定のプローブとのハイブリダイゼーションによって、対立遺伝子に特異的なプローブなどのように、がん細胞組織において同じ変異の存在が示される。
【０３２７】
がん細胞におけるｓｐ５３遺伝子の構造変化の同定は、多様な一連の高分解能ハイスループットマイクロアレイプラットフォームを適用することによって容易になり得る。本質的に、２つのタイプのアレイは、クローン化核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ、コスミド）由来のＰＣＲ産物を担持するもの、オリゴヌクレオチドを使用するものを含む。該方法は、ゲノムワイドのＤＮＡコピー数異常および発現レベルを調査して、同じ試料中で過剰発現および過少発現する遺伝子を有するがん細胞における喪失、獲得および増幅の間の相関を得るための方式を提供することができる。がん細胞におけるｍＲＮＡレベルを推定する遺伝子発現アレイは、両方の遺伝子発現レベル、代替スプライシング事象およびｍＲＮＡプロセシング変化を同定し得るエクソンに特異的なアレイを生じた。
【０３２８】
オリゴヌクレオチドアレイを使用して、連鎖および関連研究のためにゲノム全般にわたって一塩基多型（ＳＮＰ）を調べるために使用することができ、これらは、コピー数異常およびヘテロ接合事象の喪失を定量するために適合されている。ＤＮＡシークエンシングアレイは、染色体領域および全ゲノムを並べ直すことができる。
【０３２９】
ＳＮＰベースのアレイまたは他の遺伝子アレイまたはチップによって、野生型ｐ５３の対立遺伝子の存在および変異の構造を決定することができる。ＤＮＡにおける単一部位の変化である一塩基多型（ＳＮＰ）は、ゲノムにおいて最も頻繁に生じるタイプの変化である。例えば、ヒトゲノムでは推定５００万〜１０００万のＳＮＰが存在する。ＳＮＰは、同義または非同義置換であり得る。同義ＳＮＰ置換は、遺伝子暗号の縮重に起因してタンパク質におけるアミノ酸の変化を生じさせないが、他の方式で機能に影響を及ぼし得る。例えば、膜輸送タンパク質をコードする遺伝子における外見的にサイレントな変異は、翻訳を減速させ、ペプチド鎖をミスフォールドさせ、機能的でない変異体膜輸送タンパク質を産生する場合がある。非同義ＳＮＰ置換は、ミスセンス置換またはナンセンス置換であり得る。ミスセンス置換は、単一の塩基の変化がタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす場合に生じ、その機能不全は疾患を生じる。ナンセンス置換は、点変異が早計の終止コドン、または転写ｍＲＮＡにおいてナンセンスコドンをもたらす場合に生じ、それによって切断型の、通常は非機能性タンパク質産物が生じる。ＳＮＰは、集団内で進化全体を通して高度に保存されているので、ＳＮＰのマップは、研究のための優れた遺伝子型マーカーとして働く。ＳＮＰアレイは、全ゲノムを研究するための有用な手段である。
【０３３０】
さらに、ＳＮＰアレイを使用して、ヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）を研究することができる。ＬＯＨは、対立遺伝子の完全な喪失から、または一方の対立遺伝子の他方の対立遺伝子に対するコピー数の増大から生じ得る対立遺伝子不均衡の形態である。他のチップベースの方法（例えば、比較ゲノムのハイブリダイゼーションは、ゲノムの獲得または欠失だけを検出することができる）に対して、ＳＮＰアレイには、片親性ダイソミー（ＵＰＤ）に起因するコピー数中性ＬＯＨを検出できるというさらなる利点がある。ＵＰＤでは、一方の親からの１つの対立遺伝子または全染色体が欠損して、他方の親の対立遺伝子の繰り返しをもたらす（片親性＝一方の親由来、ダイソミー＝重複）。疾患の状況において、この発生は、野生型対立遺伝子（例えば、母親由来）が欠損し、その代わりにヘテロ接合性対立遺伝子（例えば、父親由来）の２つのコピーが存在する場合に、病的であり得る。ＬＯＨは、ほとんどのヒトのがんの顕著な特徴なので、このＳＮＰアレイの使用には、がん診断において大いなる潜在性がある。ＳＮＰアレイ技術は、がん（例えば、胃がん、肝がん等）および血液系悪性腫瘍（ＡＬＬ、ＭＤＳ、ＣＭＬ等）が、ゲノムの欠失またはＵＰＤおよびゲノム獲得に起因して高い率のＬＯＨを有することを示した。本開示では、ＬＯＨを検出するために高密度ＳＮＰアレイを使用することにより、対立遺伝子不均衡のパターンを同定して、野生型ｐ５３対立遺伝子の存在を決定することができる（Ｌｉｐｓら、２００５年；  Ｌａｉら、２００７年）。
【０３３１】
ｐ５３遺伝子配列および一塩基多型アレイの例として、ｐ５３  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州、サンタクララ）、Ｒｏｃｈｅ  ｐ５３  Ａｍｐｌｉ−Ｃｈｉｐ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、プレザントン）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍａｐｐｉｎｇアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州、サンタクララ）、ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州、サンタクララ）、ＢｅａｄＡｒｒａｙｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州、サンディエゴ）等が挙げられる。
【０３３２】
また、野生型ｐ５３遺伝子の変異は、該ｐ５３遺伝子の野生型発現産物の変異に基づいて検出することができる。このような発現産物には、ｍＲＮＡならびにｐ５３タンパク質産物自体の両方が含まれる。点変異は、ｍＲＮＡを直接的に配列決定することによって、またはｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの分子クローニングを介して検出することができる。クローン化ｃＤＮＡの配列は、ＤＮＡ配列決定技術を使用して決定され得る。また、ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して配列決定され得る。ｐ５３機能に関与するエピトープのそれぞれがモノクローナル抗体によって表されるモノクローナル抗体のパネルを使用することができる。そのパネルのモノクローナル抗体の結合の喪失または攪乱は、ｐ５３タンパク質の、したがってｐ５３遺伝子自体の変異変化を示し得る。また、変異体ｐ５３遺伝子または遺伝子産物は、例えば、血清、糞便、尿、および喀痰を含む身体試料において検出され得る。組織中の変異体ｐ５３遺伝子または遺伝子産物の検出について上記で論じたものと同じ技術を、他の身体試料に適用することができる。
【０３３３】
また、野生型ｐ５３遺伝子の喪失は、野生型ｐ５３タンパク質機能の喪失についてスクリーニングすることによって検出され得る。ｐ５３タンパク質が疑いの余地なく有する機能のすべてはまだ解明されていないが、少なくとも２つの特異的な機能が公知である。タンパク質ｐ５３は、ＳＶ４０ラージＴ抗原ならびにアデノウイルスＥ１Ｂ抗原に結合する。ｐ５３タンパク質がこれらの抗原のいずれかまたは両方に結合する能力の喪失は、タンパク質の変異変化を示すが、その変化は、その遺伝子自体の変異による変化を反映している。あるいは、ｐ５３機能に関与するエピトープのそれぞれがモノクローナル抗体によって表されるモノクローナル抗体のパネルを使用することができる。そのパネルのモノクローナル抗体の結合の喪失または攪乱は、ｐ５３タンパク質の、したがってｐ５３遺伝子自体の変異による変化を示している。変化したｐ５３タンパク質を検出するための任意の方法を使用して、野生型ｐ５３遺伝子の喪失を検出することができる。
【０３３４】
がんを有する被験体におけるｐ５３非活性化変異の欠如および／または野生型ｐ５３の発現の決定は、ペプチド模倣大環状分子を投与する前、投与している最中または投与した後に実施され得る（ｃａｎ  ｂｅ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄｄ）。一部の実施形態では、ｐ５３非活性化変異の欠如および／または野生型ｐ５３の発現の決定は、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、例えば、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する約５年〜約１カ月前、約４年〜約１カ月前、約３年〜１カ月前、約２年〜約１カ月前、約１年〜約１カ月前、約５年〜約１週前、約４年〜約１週前、約３年〜約１カ月前、約２年〜約１週前、約１年〜約１週前、約５年〜約１日前、約４年〜約１日前、約３年〜約１日前、約２年〜約１日前、約１年〜約１日前、約１５カ月〜約１カ月前、約１５カ月〜約１週前、約１５カ月〜約１日前、約１２カ月〜約１カ月前、約１２カ月〜約１週前、約１２カ月〜約１日前、約６カ月〜約１カ月（１  ａｂｏｕｔ  ｍｏｎｔｈ）前、約６カ月〜約１週前、約６カ月〜約１日前、約３カ月〜約１カ月前、約３カ月〜約１週前、または約３カ月〜約１日前に実施される。いくつかの例では、ｐ５３非活性化変異の欠如および／または野生型ｐ５３の発現の確認は、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する最長６年前、５年前、４年前、３年前、２４カ月前、２３カ月前、２２カ月前、２１カ月前、２０カ月前、１９カ月前、１８カ月前、１７カ月前、１６カ月前、１５カ月前、１４カ月前、１３カ月前、１２カ月前、１１カ月前、１０カ月前、９カ月前、８カ月前、７カ月前、６カ月前、５カ月前、４カ月前、３カ月前、２カ月前、１カ月前、４週（２８日）前、３週（２１日）前、２週（１４日）前、１週（７日）前、６日前、５日前、４日前、３日前、２日前または１日前までに実施される。いくつかの例では、ｐ５３非活性化変異の欠如の確認は、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、１カ月以内に実施される。いくつかの例では、ｐ５３非活性化変異の欠如の確認は、最初にペプチド模倣大環状分子を被験体に投与する前、２１日以内に実施される。
がん
【０３３５】
本発明の方法で処置され得る固形がんとして、骨腫瘍（例えば骨肉腫、軟骨芽細胞腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫）、胚細胞腫瘍、腎臓腫瘍（例えばウィルムス腫瘍、悪性ラブドイド腫瘍）、肝臓腫瘍（例えば、肝芽腫および肝細胞癌）、神経芽細胞腫、黒色腫、副腎皮質癌、鼻咽頭癌、甲状腺癌、網膜芽腫、肉腫および軟組織腫瘍（例えば、横紋筋肉腫、類腱腫、線維肉腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、および末梢神経鞘腫瘍（神経線維肉腫）が含まれるが、それらに限定されない。
【０３３６】
本発明の方法によって処置され得る液性がんには、リンパ腫、白血病、および骨髄腫が含まれるが、それらに限定されない。記載の方法に従って処置され得るリンパ腫および白血病の例として、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（例えば、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、脾性辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着症、重鎖病、ｍａｌｔリンパ腫とも呼ばれる節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ｎｍｚｌ）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大型顆粒リンパ球性白血病、侵攻性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、鼻型、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症／セザリー症候群、原発性皮膚ＣＤ３０陽性Ｔ細胞リンパ増殖性障害、原発性皮膚未分化大細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、分類不能未分化大細胞型リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型、リンパ球減少型または非減少型）、および結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫が挙げられるが、それらに限定されない。
【０３３７】
本開示の方法によって処置され得るがんの例として、例えば骨髄性、リンパ性もしくは赤血球性系統、またはそれらの前駆体細胞から生じた、造血性起源の過形成／新生物細胞を伴うがんが挙げられる。例示的な障害として、急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病が挙げられる。追加の例示的な骨髄性障害として、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，  Ｌ．（１９９１年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．、１１巻：２６７〜９７頁に総説されている）が挙げられるが、それにらに限定されない。リンパ系悪性腫瘍には、Ｂ系統ＡＬＬおよびＴ系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、多発性骨髄腫（ｍｙｌｅｎｏｍａ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるが、それらに限定されない。悪性リンパ腫の追加の形態には、非ホジキンリンパ腫およびそのバリアント、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード−シュテルンベルク病が含まれるが、それらに限定されない。例えば、がんには、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、過好酸球増加症／慢性好酸球増加症、およびバーキットリンパ腫が含まれるが、それらに限定されない。
【０３３８】
一部の実施形態では、本開示の方法によって処置されるがんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、またはＴ細胞リンパ腫である。様々な実施形態では、液性がんは、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫−ＤＬＢＣＬ、Ｂ細胞リンパ腫−ＤＬＢＣＬ−胚中心様、Ｂ細胞リンパ腫−ＤＬＢＣＬ−活性化Ｂ細胞様、またはバーキットリンパ腫であり得る。
【０３３９】
一部の実施形態では、本明細書に開示の方法によって処置されるがんには、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）と関連することが公知のがんは含まれない。
【０３４０】
本明細書に開示の方法によるがん処置の有効性および／または奏効は、任意の適切な方法によって決定され得る。奏効は、完全奏効であり、処置に対する客観的奏効、臨床的奏効、または病理学的奏効であり得る。例えば、奏効は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるリンパ腫患者のための改訂版国際ワーキンググループ奏効基準（ｒｅｖｉｓｅｄ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）（ＩＷＧ  ２０１４年）に記載されているか、またはそれによるがんの処置に対する奏効を評価するための技術に基づいて決定され得る。奏効は、生存期間（またはこのような持続時間の見込み）または無増悪の間隔であり得る。このような事象のタイミングまたは持続時間は、およそ診断時から、または処置のおよそ開始時から、または処置のおよそ終了時から（ペプチド模倣大環状分子の最終投与など）決定され得る。あるいは、奏効は、がん細胞の数、単位体積当たりのがん細胞の数、もしくはがん細胞代謝の低減に基づくか、または全体的ながん細胞負荷に基づくか、または特に病状において上昇した場合の血清マーカーレベルに基づき得る。
【０３４１】
個々の患者における奏効は、完全奏効、部分奏効、安定疾患、および進行性疾患として特徴付けることができる。一部の実施形態では、奏効は、完全奏効（ＣＲ）である。完全奏効は、一部の例では、すべての循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の消失と定義付けることができ、すなわち任意の病理学的リンパ節（標的であろうと、または非標的であろうと）において、短軸が＜１０ｍｍまで低減しなければならない。ある特定の実施形態では、奏効は、部分奏効（ＰＲ）である。部分奏効は、ベースライン直径和を参照として、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の直径の和が少なくとも３０％低減することを意味すると定義付けることができる。
一部の実施形態では、奏効は、進行性疾患（ＰＤ）である。進行性疾患は、研究中の最小数（ｔｈｅ  ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｎｕｍｂｅｒ）を参照として（これは、最小値である場合のベースライン数を含む）、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の数の少なくとも２０％増大、および少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個またはそれを超える循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または単核血球（ＭＮＢＣ）の絶対的増加と定義付けることができる。１つまたは複数の新しい病変の出現も、進行とみなされ得る。一部の実施形態では、上記疾患は、安定疾患（ＳＤ）であり得る。安定疾患は、研究中のＣＴＣおよび／またはＭＮＢＣの最小数を参照としてＰＲの条件を満たすほどがん細胞の数が十分に減少せず、かつＰＤの条件を満たすほど十分に増加しないことによって特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、奏効は、病理学的な完全奏効である。例えば、外科手術または生検時に除去された組織の試験後に病理学者によって決定される病理学的な完全奏効は、一般に、外科手術被検物における侵襲性および／または非侵襲性がん細胞の組織学的証拠が存在しないことを指す。
組合せ処置
【０３４２】
また本明細書では、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子を、１種または複数種の追加の治療と組み合わせて、ｐ５３非活性化変異が欠如している、かつ／または野生型ｐ５３を発現すると決定されたがんを有する被験体に投与することを含む、がんの処置のための併用治療が提供される。本明細書の特定の実施形態では、有効量のペプチド模倣大環状分子を、有効量の別の治療と組み合わせて、ｐ５３非活性化変異が欠如していると決定されたがん、かつ／または野生型ｐ５３を発現するがんを有する被験体に投与することを含む、がんの処置のための併用治療が提供される。
【０３４３】
本明細書で使用される場合、用語「組み合わせて」は、ペプチド模倣大環状分子の投与の文脈では、がんの処置に使用するための１種または複数種の追加の治療（例えば、薬剤、外科手術、または放射線）の投与前、投与と同時、または投与後に、ペプチド模倣大環状分子を投与することを指す。用語「組み合わせて」の使用は、ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療が、被験体に投与される順序を制限しない。特定の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子の投与と、１種または複数種の追加の治療の投与の間の時間間隔は、約１〜約５分、約１〜約３０分、約３０分〜約６０分、約１時間、約１〜約２時間、約２〜約６時間、約２〜約１２時間、約１２〜約２４時間、約１〜約２日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約１週、約２週、約３週、約４週、約５週、約６週、約７週、約８週、約９週、約１０週、約１５週、約２０週、約２６週、約５２週、約１１〜約１５週、約１５〜約２０週、約２０〜約３０週、約３０〜約４０週、約４０〜約５０週、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１年、約２年、またはその間の任意の期間であり得る。ある特定の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療は、１日未満、１週未満、２週未満、３週未満、４週未満、１カ月未満、２カ月未満、３カ月未満、６カ月未満、１年未満、２年未満、または５年未満、隔てて投与される。
【０３４４】
一部の実施形態では、本明細書で提供される併用治療は、ペプチド模倣大環状分子を週１〜２回、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、７週ごとに１回、または８週ごとに１回投与し、１種または複数種の追加の治療を、週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１カ月ごとに１回、２カ月（例えば、およそ８週）ごとに１回、３カ月（例えば、およそ１２週）ごとに１回、または４カ月（例えば、およそ１６週）ごとに１回投与することを含む。ある特定の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療は、被験体に周期的に投与される。周期的治療は、ある期間にわたってペプチド模倣大環状分子化合物を投与した後、ある期間にわたって１種または複数種の追加の治療を投与し、この逐次的な投与を反復することを含む。また、ある特定の実施形態では、周期的治療は、ペプチド模倣大環状分子または追加の治療が、ある期間にわたって（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１週、２週、３週、４週、５週、１０週、２０週、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、２年、または３年）投与されない、休薬期間を含み得る。一実施形態では、投与されるサイクルの数は、１〜１２サイクル、２〜１０サイクル、または２〜８サイクルである。
【０３４５】
一部の実施形態では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、ペプチド模倣大環状分子を追加の治療と組み合わせて投与する前、ある一定期間、ペプチド模倣大環状分子を単剤として投与することを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるがんを処置する方法は、ペプチド模倣大環状分子を追加の治療と組み合わせて投与する前、ある一定期間、追加の治療だけを投与することを含む。
【０３４６】
一部の実施形態では、本明細書に提示の方法によるペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療の投与は、ペプチド模倣大環状分子だけ、または前記１種もしくは複数種の追加の治療だけの投与と比較して、相加効果を有する。一部の実施形態では、本明細書に提示の方法によるペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療の投与は、ペプチド模倣大環状分子だけ、または前記１種もしくは複数種の追加の治療だけの投与と比較して、相乗効果を有する。
【０３４７】
本明細書で使用される場合、用語「相乗的」は、ペプチド模倣大環状分子を１種または複数種の追加の治療（例えば、薬剤）と組み合わせて投与する効果を指し、その組合せは、任意の２種またはそれを超える単一の治療（例えば、薬剤）の相加効果よりも有効である。特定の一実施形態では、併用治療の相乗効果によって、より低い投与量（例えば、最適以下の用量）のペプチド模倣大環状分子もしくは追加の治療を使用することができ、かつ／またはペプチド模倣大環状分子もしくは追加の治療の被験体への投与頻度を低減することができる。ある特定の実施形態では、より低い投与量のペプチド模倣大環状分子もしくはより低い投与量の追加の治療を利用できること、および／またはペプチド模倣大環状分子もしくは前記追加の治療の投与頻度を低減できることにより、がんの処置におけるペプチド模倣大環状分子の有効性または前記追加の治療の有効性を低減せずに、被験体にそれぞれペプチド模倣大環状分子または前記追加の治療を投与することに関連する毒性がそれぞれ低減される。一部の実施形態では、相乗効果によって、がんの処置におけるペプチド模倣大環状分子および前記追加の治療のそれぞれの有効性が改善される。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療の組合せの相乗効果は、任意の単一治療の使用と関連する有害な、または望ましくない副作用を回避または低減する。
【０３４８】
ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療の組合せは、同じ医薬組成物で被験体に投与することができる。あるいは、ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療は、別々の医薬組成物で被験体に同時に投与することができる。ペプチド模倣大環状分子および１種または複数種の追加の治療は、別々の医薬組成物で被験体に逐次的に投与することができる。また、ペプチド模倣大環状分子化合物および１種または複数種の追加の治療は、同じまたは異なる投与経路によって被験体に投与することができる。
【０３４９】
本明細書で提供される併用治療は、それを必要とする被験体に、ペプチド模倣大環状分子を、がんを処置するための従来のまたは公知の治療と組み合わせて投与することを含む。がんまたはそれと関連する状態のための他の治療は、１つまたは複数の症状を調節または軽減することを目的とする。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される併用治療は、それを必要とする被験体に、疼痛軽減剤、あるいはそれと関連する１つもしくは複数の症状またはそれと関連する状態を軽減または調節する目的の他の治療を投与することを含む。
【０３５０】
ペプチド模倣大環状分子と組み合わせて使用することができる抗がん剤の非限定的な具体例として、ホルモン剤（例えば、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、およびエストロゲン受容体アンタゴニスト）、化学療法剤（例えば、微小管分解遮断薬、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、およびＤＮＡクロスリンカーまたは損傷剤）、抗抗原剤（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニスト、受容体アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、血管標的化剤（ＶＴＡ）／血管破壊剤（ＶＤＡ））、放射線治療、および従来の外科手術が挙げられる。
【０３５１】
ペプチド模倣大環状分子と組み合わせて使用することができるホルモン剤の非限定的な例として、アロマターゼ阻害剤、ＳＥＲＭ、およびエストロゲン受容体アンタゴニストが挙げられる。アロマターゼ阻害剤であるホルモン剤は、ステロイド系または非ステロイド系であり得る。非ステロイド系ホルモン剤の非限定的な例として、レトロゾール、アナストロゾール、アミノグルテチミド、ファドロゾール、およびボロゾールが挙げられる。ステロイド系ホルモン剤の非限定的な例として、アロマシン（エキセメスタン）、フォルメスタン、およびテストラクトンが挙げられる。ＳＥＲＭであるホルモン剤の非限定的な例として、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、アフィモキシフェン、アルゾキシフェン、バゼドキシフェン、クロミフェン、フェマレレ（ｆｅｍａｒｅｌｌｅ）、ラソフォキシフェン、オルメロキシフェン、ラロキシフェン
、およびトレミフェンが挙げられる。エストロゲン受容体アンタゴニストであるホルモン剤の非限定的な例として、フルベストラントが挙げられる。他のホルモン剤として、アビラテロンおよびロナプリサンが挙げられるが、それらに限定されない。
【０３５２】
ペプチド模倣大環状分子と組み合わせて使用することができる化学療法剤の非限定的な例として、微小管分解遮断薬、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、およびＤＮＡクロスリンカーまたは損傷剤が挙げられる。微小管分解遮断薬である化学療法剤には、タキサン（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、ドセタキセル、アブラキサン、ラロタキセル、オルタタキセル、およびテセタキセル）；エポチロン（例えば、イクサベピロン）；およびビンカアルカロイド（例えば、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）として商標が付され／販売されている））が含まれるが、それらに限定されない。
【０３５３】
代謝拮抗剤である化学療法剤には、葉酸代謝拮抗剤（ａｎｉｔｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）（例えば、メトトレキセート、アミノプテリン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）；プリン代謝拮抗剤（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニン）；ピリミジン代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、カペシタビン（ｃａｐｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、シタラビン
、デシタビン、フロクスウリジン、テガフール）；およびデオキシリボヌクレオチド代謝拮抗剤（例えば、ヒドロキシ尿素）が含まれるが、それらに限定されない。
【０３５４】
トポイソメラーゼ阻害剤である化学療法剤には、クラスＩ（カンプトテカ）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）として商標が付され／販売されている）  イリノテカン、ルビテカン、およびベロテカン）；クラスＩＩ（ポドフィルム）トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドまたはＶＰ−１６、およびテニポシド）；アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキシル、アクラルビシン、アムルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、およびゾルビシン）；およびアントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン、およびピクサントロン）が含まれるが、それらに限定されない。
【０３５５】
ＤＮＡクロスリンカー（またはＤＮＡ損傷剤）である化学療法剤には、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、トロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、カルボコン、Ｎ，Ｎ’Ｎ’−トリエチレンチオホスホラミド、トリアジコン、トリエチレンメラミン）；アルキル化様薬剤（例えば、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、シスプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、トリプラチン四硝酸塩、サトラプラチン、ピコプラチン）；非古典的ＤＮＡクロスリンカー（例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、アルトレタミン、ミトブロニトール）；および挿入剤（例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシン）が含まれるが、それらに限定されない。
【０３５６】
ペプチド模倣大環状分子と組み合わせて被験体に投与することができる他の治療の非限定的な例として、（１）スタチン、例えばロバスタチン（ｌｏｖｏｓｔａｔｉｎ）（例えば、ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（２）ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンとしても公知のシロリムス（例えば、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、テムシロリムス（例えば、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、エベロリムス（ｅｖｏｒｏｌｉｍｕｓ）（例えば、ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）として商標が付され／販売されている）、およびデフォロリムス；（３）ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばチピファルニブ；（４）抗線維化剤、例えばピルフェニドン；（５）ペグ化インターフェロン、例えばＰＥＧ−インターフェロンアルファ−２ｂ；（６）ＣＮＳ刺激剤、例えばメチルフェニデート（ＲＩＴＡＬＩＮ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（７）ＨＥＲ−２アンタゴニスト、例えば抗ＨＥＲ−２抗体（例えば、トラスツズマブ）およびキナーゼ阻害剤（例えば、ラパチニブ）；（８）ＩＧＦ−１アンタゴニスト、例えば抗ＩＧＦ−１抗体（例えば、ＡＶＥ１６４２およびＩＭＣ−Ａ１１）またはＩＧＦ−１キナーゼ阻害剤；（９）ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１アンタゴニスト、例えば抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｍａｂ））またはＥＧＦＲキナーゼ阻害剤（例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ）；（１０）ＳＲＣアンタゴニスト、例えばボスチニブ；（１１）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤、例えばセリシクリブ；（１２）ヤヌスキナーゼ２阻害剤、例えばレスタウルチニブ；（１３）プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブ；（１４）ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばアナグレリド；（１５）イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤、例えばチアゾフリン；（１６）リポキシゲナーゼ阻害剤、例えばマソプロコール；（１７）エンドセリンアンタゴニスト；（１８）レチノイド受容体アンタゴニスト、例えばトレチノインまたはアリトレチノイン；（１９）免疫モジュレーター、例えばレナリドミド、ポマリドミド、またはサリドマイド；（２０）キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）阻害剤、例えばイマチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ラパチニブ、またはＴＧ１００８０１；（２１）非ステロイド系抗炎症剤、例えばセレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（２２）ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、例えばフィルグラスチム（ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（２３）フォリン酸またはロイコボリンカルシウム；（２４）インテグリンアンタゴニスト、例えばインテグリンα５β１−アンタゴニスト（例えば、ＪＳＭ６４２７）；（２５）核内因子カッパベータ（ＮＦ−κβ）アンタゴニスト、例えばＯＴ−５５１（抗酸化剤でもある）、（２６）ヘッジホッグ阻害剤、例えばＣＵＲ６１４１４、シクロパミン、ＧＤＣ−０４４９、および抗ヘッジホッグ抗���；（２７）ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えばＳＡＨＡ（ボリノスタットとしても公知（ＺＯＬＩＮＺＡとして商標が付され／販売されている））、ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ９３９、ＣＨＲ−３９９６、ＣＲＡ−０２４７８１、ＩＴＦ２３５７、ＪＮＪ−２６４８１５８５、またはＰＣＩ−２４７８１；（２８）レチノイド、例えばイソトレチノイン（例えば、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（２９）肝細胞成長因子／分散因子（ＨＧＦ／ＳＦ）アンタゴニスト、例えばＨＧＦ／ＳＦモノクローナル抗体（例えば、ＡＭＧ  １０２）；（３０）合成化学物質、例えばアンチネオプラストン；（３１）抗糖尿病薬、例えばロシグリタゾン（ｒｏｓａｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（例えば、ＡＶＡＮＤＩＡ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（３２）抗マラリア薬および殺アメーバ薬、例えばクロロキン（例えば、ＡＲＡＬＥＮ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；（３３）合成ブラジキニン、例えばＲＭＰ−７；（３４）血小板由来成長因子受容体阻害剤、例えばＳＵ−１０１；（３５）Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２、ＦＧＦＲ１およびＰＤＧＦＲベータの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばＳＵ５４１６およびＳＵ６６６８；（３６）抗炎症剤、例えばスルファサラジン（例えば、ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥ（登録商標）として商標が付され／販売されている）；ならびに（３７）ＴＧＦ−ベータアンチセンス治療が挙げられる。
【０３５７】
一部の実施形態では、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子は、臨床的に関連し得る濃度で、１種または複数種の輸送体酵素（例えば、ＯＡＴＰ１Ｂ１、ＯＡＴＰ１Ｂ３、ＢＳＥＰ）を阻害することができる。したがって、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子は、主に肝胆道輸送体によって除去される医薬と相互作用し得る。特に、メトトレキセートおよびスタチン（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン  ロバスタチン、ピタバスタチン  プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチン）は、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子を投与して４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、または１２時間以内（例えば、２４時間以内）に投与することができない。本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子との共投与によって影響を受け得る医薬の例を、以下に列挙する。様々な実施形態では、表８から選択される医薬の１つまたは複数は、本明細書に開示のペプチド模倣大環状分子を投与して４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、または１２時間以内（例えば、２４時間以内）に投与されない。
【０３５８】
表８において開示されるペプチド模倣大環状分子との共投与によって影響を受け得る例示的な医薬
【表８】
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【実施例】
【０３５９】
（実施例１）
６−クロロトリプトファンＦｍｏｃアミノ酸の合成
【化５５】
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Ｔｅｒｔ−ブチル６−クロロ−３−ホルミル−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート、１。乾燥ＤＭＦ（１２ｍＬ）の撹拌溶液に、アルゴン下０℃でＰＯＣｌ３（３．９２ｍＬ、４３ｍｍｏｌ、１．３当量）を滴下添加した。溶液を同じ温度で２０分間撹拌した後、６−クロロインドール（５．０ｇ、３３ｍｍｏｌ、１当量）の乾燥ＤＭＦ（３０ｍＬ）中溶液を滴下添加した。生成した混合物を室温まで温め、追加の２．５時間撹拌した。水（５０ｍＬ）を添加し、溶液を水性の４Ｍ  ＮａＯＨ（ｐＨ約８）で中和した。生成した固体を濾別し、水で洗浄し、減圧下で乾燥させた。この材料を追加の精製をせずに次のステップでそのまま使用した。粗原料ホルミルインドール（３３ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｎ２下、室温でＢｏｃ２Ｏ（７．９１ｇ、３６．３ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ、０．１当量）を逐次的に添加した。生成した混合物を室温において１．５時間撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残基をＥｔＯＡｃ中に溶解し、１Ｎ  ＨＣｌで洗浄し、乾燥させ、濃縮させて、ホルミルインドール１（９ｇ、２ステップにわたり９８％）を白色の固体として得た。
【化５６】
2019520304.tif 000068
【０３６０】
Ｔｅｒｔ−ブチル６−クロロ−３−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート、２。化合物１（８．８６ｇ、３２ｍｍｏｌ、１当量）のエタノール（１５０ｍＬ）中溶液に、ＮａＢＨ４（２．４ｇ、６３ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応物を室温で３時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残基をジエチルエーテルおよび水に注ぎ入れた。有機層を分離し，硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮することによって、白色の固体を得た（８．７ｇ、９８％）。この材料を、追加の精製なしでそのまま次のステップで使用した。
【化５７】
2019520304.tif 000069
【０３６１】
Ｔｅｒｔ−ブチル３−（ブロモメチル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート、３。化合物２（４．１ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン（５０ｍＬ）中溶液に、アルゴン下、−４０℃で、トリフェニルホスフィン（４．５９ｇ、１７．５ｍｍｏｌ、１．２当量）のジクロロメタン（５０ｍＬ）中溶液を添加した。反応液を４０℃でさらに３０分間撹拌した。次に、ＮＢＳ（３．３８ｇ、１９ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加した。生成した混合物を、室温まで温め、終夜撹拌した。ジクロロメタンを蒸発させ、四塩化炭素（１００ｍＬ）を添加し、混合物を１時間撹拌し、濾過した。濾液を濃縮し、シリカプラグを設定し、ヘキサン中２５％ＥｔＯＡｃを用いてすばやく溶出した。溶液を濃縮することによって、白色の泡状物質を得た（３．８４ｇ、７７％）。
【化５８】
2019520304.tif 000070
【０３６２】
αＭｅ−６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ、４。Ｓ−Ａｌａ−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ（２．６６ｇ、５．２ｍｍｏｌ、１当量）およびＫＯ−ｔＢｕ（０．８７ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１．５当量）に、アルゴン下で５０ｍＬのＤＭＦを添加した。ＤＭＦ（５．０ｍＬ）溶液中のブロミド誘導体化合物３（２．６８ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１．５当量）をシリンジを介して添加した。反応混合物を周辺温度で１時間撹拌した。次に、溶液を５％水性酢酸でクエンチし、水で希釈した。所望の生成物をジクロロメタン中で抽出し、乾燥させ、濃縮させた。ＥｔＯＡｃおよびヘキサンを溶離液として使用する順相上でのフラッシュクロマトグラフィーで、油性の生成物４を精製する（固体充填）ことによって、赤色の固体を得た（１．７８ｇ、４５％収率）。
【化５９】
2019520304.tif 000071
【０３６３】
Ｆｍｏｃ−αＭｅ−６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、６。３Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（１／３、１５ｍＬ）の溶液に、化合物４（１．７５ｇ、２．３ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ（５ｍｌ）中溶液を５０℃で滴下添加した。出発材料は３〜４時間以内に消滅した。次に、氷浴を用いて酸性溶液を０℃に冷却し、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１．２１ｇ、１１．５ｍｍｏｌ、５当量）でクエンチした。メタノールを除去し、Ｎａ２ＣＯ３（１．９５ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）をもう８当量懸濁液に添加した。次に、ニッケルスカベンジングＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（１．６８ｇ、４．５ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、懸濁液を２時間撹拌した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（０．８４ｇ、２．５ｍｍｏｌ、１．１当量）のアセトン（５０ｍＬ）中溶液を添加し、反応物を終夜撹拌した。その後、反応物をジエチルエーテルおよび１Ｎ  ＨＣｌで希釈した。次に、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。アセトンおよびジクロロメタンを溶離液として使用する順相上で所望の生成物６を精製することによって、白色の泡状物質を得た（０．９ｇ、７０％収率）。
【化６０】
2019520304.tif 000072
【０３６４】
６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ、５。Ｇｌｙ−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ（４．６ｇ、９．２ｍｍｏｌ、１当量）およびＫＯ−ｔＢｕ（１．１４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、１．１当量）に、アルゴン下で９５ｍＬのＤＭＦを添加した。ＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液中のブロミド誘導体化合物３（３．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を、シリンジを介して添加した。反応混合物を周辺温度で１時間撹拌した。次に、溶液を５％水性酢酸でクエンチし、水で希釈した。所望の生成物をジクロロメタン中で抽出し、乾燥させ、濃縮させた。ＥｔＯＡｃおよびヘキサンを溶離液として使用する順相上で、油性生成物５をフラッシュクロマトグラフィーで精製する（固体充填）ことによって、赤色の固体を得た（５ｇ、７１％収率）。
【化６１】
2019520304.tif 000073
【０３６５】
Ｆｍｏｃ−６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、７。３Ｎ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（１／３、４４ｍＬ）の溶液に、化合物５（５ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中溶液を５０℃で滴下添加した。出発材料は３〜４時間以内に消滅した。次に、氷浴を用いて酸性溶液を０℃に冷却し、Ｎａ２ＣＯ３水溶液（３．４８ｇ、３３ｍｍｏｌ、５当量）でクエンチした。メタノールを除去し、Ｎａ２ＣＯ３（５．５７ｇ、５２ｍｍｏｌ）をもう８当量懸濁液に添加した。ニッケルスカベンジングＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（４．８９ｇ、１３．１ｍｍｏｌ、２当量）および懸濁液を２時間撹拌した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２．２１ｇ、６．５５ｍｍｏｌ、１．１当量）のアセトン（１００ｍＬ）中溶液を添加し、反応物を終夜撹拌した。その後、反応物をジエチルエーテルおよび１Ｎ  ＨＣｌで希釈した。次に、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。アセトンおよびジクロロメタンを溶離液として使用する順相上で所望の生成物７を精製することによって、白色の泡状物質を得た（２．６ｇ、６９％収率）。
【化６２】
2019520304.tif 000074
【０３６６】
実施例１の反応が図１に示されている。
（実施例２）
本発明のペプチド模倣大環状分子
【０３６７】
ペプチド模倣大環状分子を、既に記載されており、以下に記載されている通りに合成し、精製し、分析した（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２巻：５８９１〜５８９２頁（２０００年）；ＳｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒおよびＶｅｒｄｉｎｅ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２２巻：５８９１頁（２００５年）；Ｗａｌｅｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５巻：１４６６〜１４７０頁（２００４年）；および米国特許第７，１９２，７１３号）。ペプチド模倣大環状分子は、２つまたはそれを超える天然に存在するアミノ酸を対応する合成アミノ酸で置き換えることによって設計した。置換は、ｉおよびｉ＋４位置、ならびにｉおよびｉ＋７位置で行った。ペプチド合成を、手動または自動化ペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、モデル４３３Ａ）のいずれかで、固相条件、ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＡＭ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＦｍｏｃ主鎖保護基化学を使用して実施した。天然Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）のカップリングのために、１０当量のアミノ酸および１：１：２モル比のカップリング試薬ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）／ＤＩＥＡを用いた。非天然アミノ酸（４当量）を、１：１：２モル比のＨＡＴＵ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡとカップリングさせた。合成ペプチドのＮ−末端を、アセチル化し、Ｃ−末端をアミド化した。
【０３６８】
完全に保護された樹脂結合ペプチドを、ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（負荷０．６２ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．１ｍｍｏｌのスケールで合成する。一時的Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ＮＭＰ中２５％（ｖ／ｖ）ピペリジンで樹脂結合ペプチドを２×２０分間処理することによって達成する。ＮＭＰおよびジクロロメタンで十分に洗い流した後、連続的な各アミノ酸のカップリングを、予め活性化させた適切なＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体と共に１×６０分間インキュベーションして達成した。すべての保護アミノ酸（１ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ中に溶解させ、ＨＣＴＵ（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）で活性化させた後、カップリング溶液を脱保護された樹脂結合ペプチドに移した。カップリングが完了した後、樹脂を、次の脱保護／カップリングサイクルに備えて十分に洗い流した。アミノ末端のアセチル化を、ＮＭＰ／ＮＭＭ中、無水酢酸／ＤＩＥＡの存在下で実施した。各カップリングの完了を検証するために、完全に構築された樹脂結合ペプチドのアリコートから得た、切断し脱保護した試料のＬＣ−ＭＳ分析を達成した。
【０３６９】
架橋化合物の精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｖａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ）によって、逆相Ｃ１８カラム（Ｖａｒｉａｎ）上で達成して、純粋な化合物を得た。純粋な生成物の化学組成を、ＬＣ／ＭＳ質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ系と連結させたＭｉｃｒｏｍａｓｓＬＣＴ）およびアミノ酸分析（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、モデル４２０Ａ）によって確認した。
【０３７０】
以下のプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を、ＳＰ６６２、ＳＰ６６３およびＳＰ６６４を含むジアルキン架橋ペプチド模倣大環状分子の合成において使用した。完全に保護された樹脂結合ペプチドを、ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（負荷０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．２ｍｍｏｌのスケールで合成した。一時的Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで樹脂結合ペプチドを３×１０分間処理することによって達成した。ＮＭＰ（３×）、ジクロロメタン（３×）およびＮＭＰ（３×）で洗浄した後、連続的な各アミノ酸のカップリングを、予め活性化させた適切なＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体と共に１×６０分間インキュベーションして達成した。すべての保護アミノ酸（０．４ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ中に溶解させ、ＨＣＴＵ（０．４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．８ｍｍｏｌ）で活性化させた後、カップリング溶液を脱保護した樹脂結合ペプチドに移した。カップリングが完了した後、樹脂を、次の脱保護／カップリングサイクルに備えて洗浄した。アミノ末端のアセチル化を、ＮＭＰ中、無水酢酸／ＤＩＥＡの存在下で実施した。各カップリングの完了を検証するために、完全に構築された樹脂結合ペプチドのアリコートから得た、切断し脱保護した試料のＬＣ−ＭＳ分析を達成した。典型的な例では、テトラヒドロフラン（４ｍｌ）およびトリエチルアミン（２ｍｌ）を、４０ｍｌのガラスバイアルに入れたペプチド樹脂（０．２ｍｍｏｌ）に添加し、１０分間振とうした。次に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）２Ｃｌ２（０．０１４ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）およびヨウ化銅（０．００８ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を、大気に開放した状態で機械的に１６時間振とうした。ジイン環化樹脂結合ペプチドを脱保護し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５／５／５  ｖ／ｖ）で室温において２．５時間処理することによって、固体支持体から切断した。樹脂を濾過した後、ＴＦＡ溶液を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、それを遠心分離して、所望の生成物を固体として得た。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣによって精製した。
【０３７１】
典型的な例では、ペプチド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭで洗浄した。一時的なＭｍｔ基の脱保護を、２％ＴＦＡ／ＤＣＭ５％  ＴＩＰＳで樹脂結合ペプチドを３×３分間処理することによって達成し、次にオレンジ色が濾液中に観察されなくなるまで３０分間処理した。処理と処理との間、樹脂をＤＣＭで十分に洗い流した。Ｍｍｔの除去を完了した後、樹脂を５％ＤＩＥＡ／ＮＭＰ溶液で３回洗浄し、ビスチオエーテルカップリングに対する準備が整ったと考えた。樹脂を反応バイアルに充填した。ＤＣＭ／ＤＭＦ１／１を反応容器に添加し、これに続いてＤＩＥＡ（２．４当量）を添加した。５分間よく混合した後、４，４’−ビス（ブロモメチル）ビフェニル（１．０５当量）（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｂ１９２１）を添加した。次に、反応物を室温で終夜、機械的に撹拌した。必要に応じて、反応にさらなる時間を与えて完了に到達させた。類似の手順を、５−メチレン、６−メチレンまたは７−メチレンクロスリンカー（「％ｃ７」、「％ｃ６」、または「％ｃ５」）の調製に使用することができる。
【０３７２】
ビスチオエーテル樹脂結合ペプチドを室温で３時間、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４／３／３ｖ／ｖ）で処理することによって、脱保護し、固体支持体から切断した。樹脂を濾過した後、ＴＦＡ溶液を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離して、所望の生成物を固体として得た。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣによって精製した。表２０は、ペプチド模倣大環状分子の一覧を示す。
【０３７３】
以下のプロトコルを、ＳＰ６６５を含む単一のアルキン架橋ペプチド模倣大環状分子の合成に使用した。完全に保護された樹脂結合ペプチドを、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（負荷０．６２ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．１ｍｍｏｌのスケールで合成した。一時的なＦｍｏｃ基の脱保護を、ＮＭＰ中２５％（ｖ／ｖ）ピペリジンで樹脂結合ペプチドを２×２０分間処理することによって達成した。ＮＭＰおよびジクロロメタンで十分に洗い流した後、連続的な各アミノ酸のカップリングを、予め活性化させた適切なＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体と共に１×６０分間インキュベーションして達成した。すべての保護アミノ酸（１ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ中に溶解させ、ＨＣＴＵ（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）で活性化させた後、カップリング溶液を脱保護した樹脂結合ペプチドに移した。カップリングが完了した後、樹脂を、次の脱保護／カップリングサイクルに備えて十分に洗い流した。アミノ末端のアセチル化を、ＮＭＰ／ＮＭＭ中、無水酢酸／ＤＩＥＡの存在下で実施した。各カップリングの完了を検証するために、完全に構築された樹脂結合ペプチドのアリコートから得た、切断し脱保護した試料のＬＣ−ＭＳ分析を達成した。典型的な例では、ペプチド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭで洗浄した。樹脂を、マイクロ波バイアルに入れた。容器を排気し、窒素でパージした。ヘキサカルボニルモリブデン（０．０１当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  １９９９５９）を添加した。無水クロロベンゼンを、反応容器に添加した。次に、２−フルオロフェノール（１当量、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｆ１２８０４）を添加した。次に、反応物をマイクロ波バイアルに入れ、１３０℃で１０分間保持した。反応は、完了するためにその後の時間進める必要がある場合がある。アルキンメタセシス化された（ｍｅｔａｔｈｅｓｉｚｅｄ）樹脂結合ペプチドを脱保護し、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４／３／３  ｖ／ｖ）で室温において３時間処理することによって、固体支持体から切断した。樹脂を濾過した後、ＴＦＡ溶液を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離して、所望の生成物を固体として得た。粗製生成物を、分取ＨＰＬＣによって精製した。
【０３７４】
表９は、調製した本発明のペプチド模倣大環状分子の一覧を示す。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
2019520304.tif 000078
【表９−５】
2019520304.tif 000079
【表９−６】
2019520304.tif 000080
【表９−７】
2019520304.tif 000081
【表９−８】
2019520304.tif 000082
【表９−９】
2019520304.tif 000083
【表９−１０】
2019520304.tif 000084
【表９−１１】
2019520304.tif 000085
【表９−１２】
2019520304.tif 000086
【表９−１３】
2019520304.tif 000087
【表９−１４】
2019520304.tif 000088
【表９−１５】
2019520304.tif 000089
【表９−１６】
2019520304.tif 000090
【表９−１７】
2019520304.tif 000091
【０３７５】
上記および他の箇所に示されている配列では、以下の略語が使用される：「Ｎｌｅ」はノルロイシンを表し、「Ａｉｂ」は２−アミノイソ酪酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表し、および「Ｐｒ」はプロピオニルを表す。「＄」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素ｉ〜ｉ＋４のクロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＳ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ５」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素のｉ〜ｉ＋４クロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＲ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｓ８」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素ｉ〜ｉ＋７のクロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＳ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ８」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素ｉ〜ｉ＋７のクロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＲ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｈｘ」は、アミノシクロヘキシルリンカーを表す。クロスリンカーは、各アミノ酸のアルファ炭素間に８または１１個の炭素原子を含む、直鎖の全炭素クロスリンカーである。「＄／」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＳ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ５」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＲ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｓ８」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＳ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ８」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＲ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｍｗ」として表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅトリプトファンアミノ酸である。「Ａｍｌ」として表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅロイシンアミノ酸である。「２ｆｆ」として表されるアミノ酸は、２−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「３ｆｆ」として表されるアミノ酸は、３−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「Ｓｔ」として表されるアミノ酸は、それぞれが、示された別のアミノ酸に架橋している２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含む、アミノ酸である。「Ｓｔ／／」として表されるアミノ酸は、架橋していない２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「％Ｓｔ」として表されるアミノ酸は、それぞれが完全に飽和した炭化水素の架橋を介して、示された別のアミノ酸に架橋している２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。
【０３７６】
例えば、ＳＰ−７２、ＳＰ−５６およびＳＰ−１３８として表される化合物は、以下の構造を有する：
【化６３】
2019520304.tif 000092
【０３７７】
例えば、追加の化合物は、以下の構造を有する：
【化６４】
2019520304.tif 000093
【化６５】
2019520304.tif 000094
【化６６】
2019520304.tif 000095
【０３７８】
表１０〜１３は、ペプチド模倣大環状分子の選択を示している。
【表１０−１】
2019520304.tif 000096
【表１０−２】
2019520304.tif 000097
【表１０−３】
2019520304.tif 000098
【表１０−４】
2019520304.tif 000099
【表１０−５】
2019520304.tif 000100
【表１０−６】
2019520304.tif 000101
【表１０−７】
2019520304.tif 000102
【表１０−８】
2019520304.tif 000103
【表１０−９】
2019520304.tif 000104
【表１０−１０】
2019520304.tif 000105
【表１０−１１】
2019520304.tif 000106
【表１０−１２】
2019520304.tif 000107
【表１０−１３】
2019520304.tif 000108
【表１０−１４】
2019520304.tif 000109
【表１０−１５】
2019520304.tif 000110
【表１０−１６】
2019520304.tif 000111
【表１０−１７】
2019520304.tif 000112
【表１０−１８】
2019520304.tif 000113
【表１０−１９】
2019520304.tif 000114
【表１０−２０】
2019520304.tif 000115
【表１０−２１】
2019520304.tif 000116
【表１０−２２】
2019520304.tif 000117
【表１１】
2019520304.tif 000118
【表１２】
2019520304.tif 000119
【０３７９】
上および他所に示されている配列には、以下の略語が使用される。「Ｎｌｅ」はノルロイシンを表し、「Ａｉｂ」は２−アミノイソ酪酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表し、「Ｐｒ」はプロピオニルを表す。「＄」と表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素クロスリンカーによって結合しているアルファ−Ｍｅ  Ｓ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ５」と表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素によって結合しているアルファ−Ｍｅ  Ｒ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｓ８」と表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素クロスリンカーによって結合しているアルファ−Ｍｅ  Ｓ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ８」と表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素クロスリンカーによって結合しているアルファ−Ｍｅ  Ｒ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｈｘ」は、アミノシクロヘキシルリンカーを表す。クロスリンカーは、各アミノ酸のアルファ炭素の間に８個または１１個の炭素原子を含む、直鎖全炭素クロスリンカーである。「＄／」と表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−Ｍｅ  Ｓ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ５」と表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−Ｍｅ  Ｒ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｓ８」と表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−Ｍｅ  Ｓ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ８」と表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−Ｍｅ  Ｒ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｍｗ」と表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅトリプトファンアミノ酸である。「Ａｍｌ」と表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅロイシンアミノ酸である。「Ａｍｆ」と表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅフェニルアラニンアミノ酸である。「２ｆｆ」と表されるアミノ酸は、２−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「３ｆｆ」と表されるアミノ酸は、３−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「Ｓｔ」と表されるアミノ酸は、それぞれが示されている通り別のアミノ酸に架橋されている２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「Ｓｔ／／」と表されるアミノ酸は、架橋されていない２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「％Ｓｔ」と表されるアミノ酸は、それぞれが示されている通り完全に飽和した炭化水素架橋を介して別のアミノ酸に架橋されている２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「Ｂａ」と表されるアミノ酸は、ベータ−アラニンである。架橋アミノ酸の命名（例えば「＄ｅｒ８」または「＄ｚｒ８」）における小文字「ｅ」または「ｚ」は、二重結合の立体配置を表す（それぞれＥまたはＺ）。他の文脈では、「ａ」または「ｆ」などの小文字は、Ｄアミノ酸（例えば、それぞれＤ−アラニンまたはＤ−フェニルアラニン）を表す。「ＮｍＷ」と指定されるアミノ酸は、��−メチルトリプトファンを表す。「ＮｍＹ」と指定されるアミノ酸は、Ｎ−メチルチロシンを表す。「ＮｍＡ」と指定されるアミノ酸は、Ｎ−メチルアラニンを表す。「Ｋｂｉｏ」は、リシン残基の側鎖アミノ基に結合しているビオチン基を表す。「Ｓａｒ」と指定されるアミノ酸は、サルコシンを表す。「Ｃｈａ」と指定されるアミノ酸は、シクロヘキシルアラニンを表す。「Ｃｐｇ」と指定されるアミノ酸は、シクロペンチルグリシンを表す。「Ｃｈｇ」と指定されるアミノ酸は、シクロヘキシルグリシンを表す。「Ｃｂａ」と指定されるアミノ酸は、シクロブチルアラニンを表す。「Ｆ４Ｉ」と指定されるアミノ酸は、４−ヨードフェニルアラニンを表す。「７Ｌ」は、Ｎ１５同位体ロイシンを表す。「Ｆ３Ｃｌ」と指定されるアミノ酸は、３−クロロフェニルアラニンを表す。「Ｆ４ｃｏｏｈ」と指定されるアミノ酸は、４−カルボキシフェニルアラニンを表す。「Ｆ３４Ｆ２」と指定されるアミノ酸は、３，４−ジフルオロフェニルアラニンを表す。「６ｃｌＷ」と指定されるアミノ酸は、６−クロロトリプトファンを表す。「＄ｒｄａ６」と指定されるアミノ酸は、第２のアルキニルアミノ酸とのジアルキン結合を介して架橋されたアルファ−Ｍｅ  Ｒ６−ヘキシニル−アラニンアルキニルアミノ酸を表す。「＄ｄａ５」と指定されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅ  Ｓ５−ペンチニル−アラニンアルキニルアミノ酸を表し、ここでアルキンは、第２のアルキニルアミノ酸とのジアルキン結合の半分を形成する。「＄ｒａ９」と指定されるアミノ酸は、第２のアルキニルアミノ酸とのアルキンメタセシス反応を介して架橋されたアルファ−Ｍｅ  Ｒ９−ノニニル−アラニンアルキニルアミノ酸を表す。「＄ａ６」と指定されるアミノ酸は、第２のアルキニルアミノ酸とのアルキンメタセシス反応を介して架橋されたアルファ−Ｍｅ  Ｓ６−ヘキシニル−アラニンアルキニルアミノ酸を表す。名称「ｉｓｏ１」または「ｉｓｏ２」は、ペプチド模倣大環状分子が、単一異性体であることを示す。
【０３８０】
「Ｃｉｔ」と指定されるアミノ酸は、シトルリンを表す。「Ｃｏｕ４」、「Ｃｏｕ６」、「Ｃｏｕ７」および「Ｃｏｕ８」と指定されるアミノ酸は、それぞれ以下の構造を表す：
【化６７】
2019520304.tif 000120
【０３８１】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、例えば、クロスリンカーの構造内の二重結合の立体配置に起因する２つ以上の異性体において得られる（Ｅ対Ｚ）。このような異性体は、従来のクロマトグラフィー法により分離可能であってもなくてもよい。一部の実施形態では、一方の異性体は、他方の異性体よりも良い生物学的特性を有する。一実施形態では、ペプチド模倣大環状分子のＥクロスリンカーオレフィン異性体は、そのＺの対応物と比べてより良い溶解度、より良い標的親和性、より良いｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性、より高いヘリシティ、または改善された細胞透過性を有する。別の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子のＺクロスリンカーオレフィン異性体は、そのＥの対応物と比べてより良い溶解度、より良い標的親和性、より良いｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性、より高いヘリシティ、または改善された細胞浸透率を有する。
【表１３−１】
2019520304.tif 000121
【表１３−２】
2019520304.tif 000122
【表１３−３】
2019520304.tif 000123
【表１３−４】
2019520304.tif 000124
【表１３−５】
2019520304.tif 000125
【表１３−６】
2019520304.tif 000126
【表１３−７】
2019520304.tif 000127
【０３８２】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表１４に示されているペプチド模倣大環状分子を除外する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表１４に示されているペプチド模倣大環状分子構造を含まない。
【表１４−１】
2019520304.tif 000128
【表１４−２】
2019520304.tif 000129
【０３８３】
表１５は、Ｄアミノ酸を含む非架橋ポリペプチドの例を示している。
【表１５】
2019520304.tif 000130
【０３８４】
ペプチド模倣大環状分子は、本明細書およびその全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００８年２月２５日に出願した、審議中の米国特許出願第１２／０３７，０４１号に記載されている通りに調製される。
【０３８５】
一般的に、完全に保護された樹脂結合ペプチドを、ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（負荷０．４５ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．５ｍｍｏｌスケールで合成した。一時的Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで樹脂結合ペプチドを３×１０分間処理することによって達成した。ＮＭＰ（３×）、ジクロロメタン（３×）およびＮＭＰ（３×）で洗浄した後、連続的な各アミノ酸のカップリングを、予め活性化させた適切なＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体と共に１×６０分間インキュベーションして達成した。すべての保護アミノ酸（１．０ｍｍｏｌ）をＮＭＰ中に溶解させ、ＨＣＴＵ（１．０ｍｍｏｌ）、Ｃｌ−ＨＯＢｔ（１．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）で活性化させた後、カップリング溶液を脱保護された樹脂結合ペプチドに移した。カップリングが完了した後、樹脂を、次の脱保護／カップリングサイクルに備えて洗浄した。アミノ末端のアセチル化を、ＮＭＰ中、無水酢酸／ＤＩＥＡの存在下で実施した。各カップリングの完了を検証するために、完全に構築された樹脂結合ペプチドのアリコートから得た、切断し脱保護した試料のＬＣ−ＭＳ分析を達成した。
【０３８６】
１，４−トリアゾール基（例えばＳＰ１５３）を含むペプチド模倣大環状分子の調製に対する典型的な例では、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）２，６−ルチジンを、４０ｍｌガラスバイアルに入れたペプチド樹脂（０．５ｍｍｏｌ）に添加し、１０分間振とうした。次に、アスコルビン酸ナトリウム（０．２５ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．２２ｍｌ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、これに続いてヨウ化銅（Ｉ）（０．２４ｇ、１．２５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を、周辺温度で１６時間機械的に振とうした。
【０３８７】
１，５−トリアゾール基（ＳＰ９３２、ＳＰ９３３）を含むペプチド模倣大環状分子の調製に対する典型的な例では、ペプチド樹脂（０．２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭで洗浄した。樹脂をマイクロ波バイアルに充填した。容器を真空排気し、窒素でパージした。クロロ（ペンタ−メチルシクロペンタジエニル）ビス（トリフェニルホスフィン）ルテニウム（ＩＩ）、１０％負荷、（Ｓｔｒｅｍ４４−０１１７）を添加した。無水トルエンを反応容器に添加した。次に、反応物をマイクロ波内に充填し、９０℃で１０分間保持した。反応は、完了するためにその後の時間進める必要がある場合がある。他の場合では、クロロ（１，５シクロオクタジエン）（ペンタメチルシクロペンタ−ジエニル）ルテニウム（「Ｃｐ＊ＲｕＣｌ（ｃｏｄ）」）を、例えば室温で、トルエンを含む溶媒中で使用することができる。
【０３８８】
ヨード置換トリアゾール基を含むペプチド模倣大環状分子（例えばＳＰ４５７）の調製に対する典型的な例では、ＴＨＦ（２ｍｌ）を、４０ｍｌガラスバイアルに入れたペプチド樹脂（０．０５ｍｍｏｌ）に添加し、１０分間振とうした。次に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ｂｒｏｍｏｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）（０．０４ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．０５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０４ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を、周辺温度で１６時間機械的に振とうした。ヨード−トリアゾールクロスリンカーは、例えばボロン酸とのカップリング反応によりさらに置換されることによって、ＳＰ４６５などのペプチド模倣大環状分子をもたらすことができる。典型的な例では、ＤＭＦ（３ｍｌ）を、４０ｍｌのガラスバイアルに入れたヨード−トリアゾールペプチド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）に添加し、１０分間振とうした。次に、フェニルボロン酸（０．０４ｇ、０．３ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．００６ｇ、０．００５ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（０．０８３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を、７０℃で１６時間機械的に振とうした。また、ヨード−トリアゾールクロスリンカーは、例えば末端アルキンとのカップリング反応（例えばＳｏｎｏｇａｓｈｉｒａカップリング）によりさらに置換されることによって、ＳＰ４６８などのペプチド模倣大環状分子をもたらすこともできる。典型的な例では、２：１ＴＨＦ：トリエチルアミン（３ｍｌ）を、４０ｍｌのガラスバイアルに入れたヨード−トリアゾールペプチド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）に添加し、１０分間振盪した。Ｎ−ＢＯＣ−４−ペンチン−１−アミン（０．０４ｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびビス（トリフェニルホスフィン）パラジウムクロリド（０．０１４ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を添加し、５分間振とうした。次に、ヨウ化銅（Ｉ）（０．００４ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応混合物を、７０℃で１６時間機械的に振とうした。
【０３８９】
トリアゾール環化樹脂結合ペプチドを、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５／５／５ｖ／ｖ）で室温において２．５時間処理することによって、脱保護し、固体支持体から切断した。樹脂を濾過した後、ＴＦＡ溶液を冷ジエチルエーテル中で沈殿し、それを遠心分離して、所望の生成物を固体として得た。粗製生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。
【０３９０】
表１６は、ペプチド模倣大環状分子の一覧を示す。
【表１６−１】
2019520304.tif 000131
【表１６−２】
2019520304.tif 000132
【表１６−３】
2019520304.tif 000133
【表１６−４】
2019520304.tif 000134
【表１６−５】
2019520304.tif 000135
【表１６−６】
2019520304.tif 000136
【表１６−７】
2019520304.tif 000137
【表１６−８】
2019520304.tif 000138
【表１６−９】
2019520304.tif 000139
【表１７】
2019520304.tif 000140
【０３９１】
上記および他の箇所に示されている配列では、以下の略語が使用される：「Ｎｌｅ」はノルロイシンを表し、「Ａｉｂ」は２−アミノイソ酪酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表し、「Ｐｒ」はプロピオニルを表す。「＄」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素クロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＳ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ５」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素によって結合しているアルファ−ＭｅＲ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｓ８」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素クロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＳ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ８」として表されるアミノ酸は、１つの二重結合を含む全炭素クロスリンカーによって結合しているアルファ−ＭｅＲ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｈｘ」はアミノシクロヘキシルリンカーを表す。クロスリンカーは、各アミノ酸のアルファ炭素間に８または１１個の炭素原子を含む直鎖の全炭素クロスリンカーである。「＄／」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＳ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ５」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＲ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｓ８」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＳ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ８」として表されるアミノ酸は、いかなるクロスリンカーによっても結合していないアルファ−ＭｅＲ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸でる。「Ａｍｗ」として表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅトリプトファンアミノ酸である。「Ａｍｌ」として表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅロイシンアミノ酸である。「Ａｍｆ」として表されるアミノ酸は、アルファ−Ｍｅフェニルアラニンアミノ酸である。「２ｆｆ」として表されるアミノ酸は、２−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「３ｆｆ」として表されるアミノ酸は、３−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「Ｓｔ」として表されるアミノ酸は、それぞれが示されている別のアミノ酸に架橋している２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「Ｓｔ／／」として表されるアミノ酸は、架橋されていない２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「％Ｓｔ」として表されるアミノ酸は、それぞれが、完全に飽和した炭化水素架橋を介して示されている別のアミノ酸に架橋している２つのペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「Ｂａ」として表されるアミノ酸は、ベータ−アラニンである。架橋アミノ酸の命名における小文字「ｅ」または「ｚ」（例えば「＄ｅｒ８」または「＄ｚｒ８」）は、二重結合の立体配置（それぞれＥまたはＺ）を表す。他の文脈では、「ａ」または「ｆ」などの小文字はＤアミノ酸（例えば、それぞれＤ−アラニン、またはＤ−フェニルアラニン）を表す。「ＮｍＷ」として指定されたアミノ酸はＮ−メチルトリプトファンを表す。「ＮｍＹ」として指定されたアミノ酸はＮ−メチルチロシンを表す。「ＮｍＡ」として指定されたアミノ酸はＮ−メチルアラニンを表す。「Ｓａｒ」として指定されたアミノ酸はサルコシンを表す。「Ｃｈａ」として指定されたアミノ酸はシクロヘキシルアラニンを表す。「Ｃｐｇ」として指定されたアミノ酸はシクロペンチルグリシンを表す。「Ｃｈｇ」として指定されたアミノ酸はシクロヘキシルグリシンを表す。「Ｃｂａ」として指定されたアミノ酸はシクロブチルアラニンを表す。「Ｆ４Ｉ」として指定されたアミノ酸は４−ヨードフェニルアラニンを表す。「Ｆ３Ｃｌ」として指定されたアミノ酸は３−クロロフェニルアラニンを表す。「Ｆ４ｃｏｏｈ」として指定されたアミノ酸は４−カルボキシフェニルアラニンを表す。「Ｆ３４Ｆ２」として指定されたアミノ酸は３，４−ジフルオロフェニルアラニンを表す。「６ｃｌＷ」として指定されたアミノ酸は６−クロロトリプトファンを表す。「ｉｓｏ１」または「ｉｓｏ２」という命名は、ペプチド模倣大環状分子が単一の異性体であることを示す。「Ａｃ３ｃ」はアミノシクロプロパンカルボン酸残基を表す。
【０３９２】
アミノ酸を形成するクロスリンカーは、以下に示された説明文に従い表される。
【０３９３】
各アミノ酸のアルファ位における立体配置は、他に指摘されていない限り、Ｓである。「４Ｍｅ」と標識されたアミノ酸は、メチル置換した（内部アルキン）アルキンを含むアミノ酸を使用し、メチル基を４位に含むトリアゾール基を生成することにより調製した。「４Ｐｈ」と標識されたアミノ酸は、フェニル置換した（内部アルキン）アルキンを含むアミノ酸を使用し、フェニル基を４位に含むトリアゾール基を生成することにより調製した。アジドアミノ酸に対して、示された炭素原子の数は、アルファ炭素と末端アジドとの間のメチレン単位の数を指す。アルキンアミノ酸に対して、示された炭素原子の数は、アルファ位と、トリアゾール部分さらにアルキン由来のトリアゾール基内の２個の炭素原子との間のメチレン単位の数である。
＄５ｎ３  アルファ−Ｍｅアジド１，５トリアゾール（３炭素）
＃５ｎ３  アルファ−Ｈアジド１，５トリアゾール（３炭素）
＄４ａ５  アルファ−Ｍｅアルキン１，４トリアゾール（５炭素）
＄４ａ６  アルファ−Ｍｅアルキン１，４トリアゾール（６炭素）
＄５ａ５  アルファ−Ｍｅアルキン１，５トリアゾール（５炭素）
＄５ａ６  アルファ−Ｍｅアルキン１，５トリアゾール（６炭素）
＃４ａ５  アルファ−Ｈアルキン１，４トリアゾール（５炭素）
＃５ａ５  アルファ−Ｈアルキン１，５トリアゾール（５炭素）
＄５ｎ５  アルファ−Ｍｅアジド１，５トリアゾール（５炭素）
＄５ｎ６  アルファ−Ｍｅアジド１，５トリアゾール（６炭素）
＄４ｎ５  アルファ−Ｍｅアジド１，４トリアゾール（５炭素）
＄４ｎ６  アルファ−Ｍｅアジド１，４トリアゾール（６炭素）
＄４ｒａ５  アルファ−ＭｅＲ−アルキン１，４トリアゾール（５炭素）
＄４ｒａ６  アルファ−ＭｅＲ−アルキン１，４トリアゾール（６炭素）
＄４ｒｎ４  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，４トリアゾール（４炭素）
＄４ｒｎ５  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，４トリアゾール（５炭素）
＄４ｒｎ６  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，４トリアゾール（６炭素）
＄５ｒｎ５  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，５トリアゾール（５炭素）
＄５ｒａ５  アルファ−ＭｅＲ−アルキン１，５トリアゾール（５炭素）
＄５ｒａ６  アルファ−ＭｅＲ−アルキン１，５トリアゾール（６炭素）
＄５ｒｎ６  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，５トリアゾール（６炭素）
＃５ｒｎ６  アルファ−ＨＲ−アジド１，５トリアゾール（６炭素）
＄４ｒｎ５  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，４トリアゾール（５炭素）
＃４ｒｎ５  アルファ−ＨＲ−アジド１，４トリアゾール（５炭素）
４Ｍｅ＄５ｒｎ６  アルファ−ＭｅＲ−アジド１，５トリアゾール（６炭素）；４−Ｍｅ置換トリアゾール
４Ｍｅ＄５ａ５  アルファ−Ｍｅアルキン１，５トリアゾール（５炭素）；４−Ｍｅ置換トリアゾール
４Ｐｈ＄５ａ５  アルファ−Ｍｅアルキン１，５トリアゾール（５炭素）；４−フェニル置換トリアゾール
【０３９４】
「５Ｉ」、「５ｐｅｎＮＨ２」、「５ＢｎｚＮＨ２」、「５ｐｒｐＯＭｅ」、「５Ｐｈ」、および「５ｐｒｐ」として指定されたアミノ酸は、以下の例示的なペプチド模倣大環状分子に示されているタイプの架橋アミノ酸を指す：
【化６８】
2019520304.tif 000141
【０３９５】
上記構造において、Ｘは、例えば、以下の置換基のうちの１つである：
【化６９】
2019520304.tif 000142
（式中、「Ｃｙｃ」は、適切なアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリール、またはヘテロシクリル基である（非置換であるか、または上に記載のＲａまたはＲｂ基により任意選択で置換されている））。
【０３９６】
一部の実施形態では、トリアゾール置換基は、
【化７０】
2019520304.tif 000143
からなる群から選択される。
【０３９７】
表１８は、例示的ペプチド模倣大環状分子を示す：
【表１８−１】
2019520304.tif 000144
【表１８−２】
2019520304.tif 000145
【０３９８】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表１９に示されているペプチド模倣大環状分子を除外する。示されているペプチドは、キャッピング基とペプチド配列の開始点との間に、アセチルなどのＮ末端キャッピング基またはベータ−アラニンなどの追加のリンカーを含み得る。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表１９に示されているペプチド模倣大環状分子構造を含まない。
【表１９−１】
2019520304.tif 000146
【表１９−２】
2019520304.tif 000147
【０３９９】
完全に保護された樹脂結合ペプチドをＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（負荷０．６２ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．１ｍｍｏｌスケールで合成する。一時的Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ＮＭＰ中２５％（ｖ／ｖ）ピペリジンで樹脂結合ペプチドを２×２０分間処理することによって達成する。ＮＭＰおよびジクロロメタンで十分に洗い流した後、連続的な各アミノ酸のカップリングを、適当な予め活性化させた適切なＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体と共に１×６０分間インキュベーションして達成した。すべての保護アミノ酸（１ｍｍｏｌ）を、ＮＭＰ中に溶解させ、ＨＣＴＵ（１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）で活性化させた後、カップリング溶液を脱保護された樹脂結合ペプチドに移した。カップリングが完了した後、樹脂を、次の脱保護／カップリングサイクルに備えて十分に洗い流した。アミノ末端のアセチル化を、ＮＭＰ／ＮＭＭ中、無水酢酸／ＤＩＥＡの存在下で実施した。各カップリングの完了を検証するために、完全に構築された樹脂結合ペプチドのアリコートから得た、切断し脱保護した試料のＬＣ−ＭＳ分析を達成した。
【０４００】
典型的な例では、ペプチド樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭで洗浄した。一時的Ｍｍｔ基の脱保護を、２％ＴＦＡ／ＤＣＭ５％ＴＩＰＳで樹脂結合ペプチドを３×３分間処理することによって達成し、次に、オレンジ色が濾液中に観察されなくなるまで３０分間処理した。処理と処理の間、樹脂はＤＣＭで十分に洗い流した。Ｍｍｔの除去を完了した後、樹脂を５％ＤＩＥＡ／ＮＭＰ溶液で３回洗浄し、ビスチオエーテルカップリングに対する準備が整ったと考えた。樹脂を反応バイアルに充填した。ＤＣＭ／ＤＭＦ１／１を反応容器に添加し、これに続いて、ＤＩＥＡ（２．４当量）を添加した。５分間よく混合した後、４，４’−ビス（ブロモメチル）ビフェニル（１．０５当量）（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｂ１９２１）を添加した。次に、反応物を室温で終夜機械的に撹拌した。必要に応じて、反応にさらなる時間を与えて完了に到達させた。類似の手順を、５−メチレン、６−メチレンまたは７−メチレンクロスリンカー（「％ｃ７」、「％ｃ６」、または「％ｃ５」）の調製に使用することができる。
【０４０１】
ビスチオエーテル樹脂結合ペプチドを室温で３時間、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９４／３／３ｖ／ｖ）で処理することによって、脱保護し、固体支持体から切断した。樹脂を濾過した後、ＴＦＡ溶液を冷ジエチルエーテル中で沈殿させ、遠心分離して、所望の生成物を固体として得た。粗製生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。表６は、ペプチド模倣大環状分子の一覧を示す。
【表６−２−１】
2019520304.tif 000148
【表６−２−２】
2019520304.tif 000149
【表６−２−３】
2019520304.tif 000150
【表６−２−４】
2019520304.tif 000151
【表６−２−５】
2019520304.tif 000152
【表６−２−６】
2019520304.tif 000153
【表６−２−７】
2019520304.tif 000154
【表６−２−８】
2019520304.tif 000155
【表６−２−９】
2019520304.tif 000156
【０４０２】
表２１は、例示的なペプチド模倣大環状分子を示す：
【表２１】
2019520304.tif 000157
【０４０３】
選択された例示的なペプチド模倣大環状分子の部分的な構造を以下に示す：
【化７１】
2019520304.tif 000158
【０４０４】
例示的なペプチド模倣大環状分子の構造を以下に示す：
【化７２】
2019520304.tif 000159
【０４０５】
例示的なペプチド模倣大環状分子の別の構造を以下に示す：
【化７３】
2019520304.tif 000160
【０４０６】
「＃ｃｓ５」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の５−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−システインである。「＃ｃ５」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、５−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−システインである。「＃ｃｓ６」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、６−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−システインである。「＃ｃ６」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、６−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−システインである。「＃ｃｓ７」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、７−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−システインである。「＃ｃ７」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、７−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−システインである。「＃ｃｓ８」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、８−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−システインである。「＃ｃ８」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、８−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−システインである。「％ｃｓ７」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、７−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｄ−システインである。「％ｃ７」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、７−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｌ−システインである。「％ｃｓ８」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、８−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｄ−システインである。「％ｃ８」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、８−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｌ−システインである。「％ｃｓ９」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の，９−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｄ−システインである。「％ｃ９」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、９−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｌ−システインである。「％ｃｓ１０」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、１０−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｄ−システインである。「％ｃ１０」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、１０−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｌ−システインである。「ｐｅｎ８」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、８−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−ペニシラミンである。「Ｐｅｎ８」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、８−メチレンクロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−ペニシラミンである。「＃ｃｓＢｐｈ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｈ（４，４’−ビスメチル−ビフェニル）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−システインである。「＃ｃＢｐｈ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｈ（４，４’−ビスメチル−ビフェニル）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−システインである。「％ｃｓＢｐｈ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｈ（４，４’−ビスメチル−ビフェニル）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｄ−システインである。「％ｃＢｐｈ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｈ（４，４’−ビスメチル−ビフェニル）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｌ−システインである。「＃ｃｓＢｐｙ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｙ（６，６’−ビスメチル−［３，３’］ビピリジン）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＤ−システインである。「＃ｃＢｐｙ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｙ（６，６’−ビスメチル−［３，３’］ビピリジン）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているＬ−システインである。「％ｃｓＢｐｙ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｙ（６，６’−ビスメチル−［３，３’］ビピリジン）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｄ−システインである。「％ｃＢｐｙ」として表されるアミノ酸は、ｉ〜ｉ＋７の、Ｂｐｙ（６，６’−ビスメチル−［３，３’］ビピリジン）クロスリンカーにより別のチオール含有アミノ酸に結合しているアルファ−メチル−Ｌ−システインである。上で示されたメチレン単位の数は、クロスリンカーの２つのチオール基の間のメチレン単位の数を指す。
【０４０７】
一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表２２に示されているペプチド模倣大環状分子を除外する。示されているペプチドは、アセチルなどのＮ末端キャッピング基またはβ−アラニンなどの追加のリンカーを、キャッピング基と、ペプチド配列の開始点との間に含み得る。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表２２に示されているペプチド模倣大環状分子構造を含まない。
【表２２】
2019520304.tif 000161
【０４０８】
他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表２３に示されているペプチド模倣大環状分子を除外する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表２３に示されているペプチド模倣大環状分子構造を含まない。
【表２３−１】
2019520304.tif 000162
【表２３−２】
2019520304.tif 000163
【０４０９】
他の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表２４に示され、Ｍｕｐｐｉｄｉら、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、（２０１１年）ＤＯＩ：  １０．１０３９／ｃ１ｃｃ１３３２０ａに開示されたペプチド模倣大環状分子を除外する。一部の実施形態では、ペプチド模倣大環状分子は、表２４に示されているペプチド模倣大環状分子構造を含まない。
【表２４−１】
2019520304.tif 000164
【表２４−２】
2019520304.tif 000165
（実施例３）
競合的結合ＥＬＩＳＡ（ＨＤＭ２およびＨＤＭＸ）
【０４１０】
ｐ５３−Ｈｉｓ６タンパク質（３０ｎＭ／ウェル）を、９６−ウェルＩｍｍｕｌｏｎプレートのウェルに室温で終夜コーティングした。実験当日、自動化ＥＬＩＳＡプレートウォッシャーを使用して、プレートを１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で洗浄し、ＥＬＩＳＡ  Ｍｉｃｒｏ  ｗｅｌｌ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇを用いて、室温で３０分間遮断する。１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）でプレートを洗浄することによって、過剰な遮断剤を洗い流す。ペプチドを、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストックから５００μＭ作業ストックへと滅菌水中で希釈し、０．５％ＤＭＳＯ中でさらに希釈して、ＤＭＳＯ濃度を試料全域で一定に保つ。ペプチドを、２×所望の濃度で、５０μｌの量でウェルに添加し、これに続いて、希釈したＧＳＴ−ＨＤＭ２またはＧＳＴ−ＨＭＤＸタンパク質（最終濃度：１０ｎＭ）を添加する。試料を室温で２時間インキュベートし、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で洗浄した後、ＨＲＰ−安定化緩衝液中で０．５μｇ／ｍｌに希釈した１００μｌのＨＲＰ−コンジュゲート抗−ＧＳＴ抗体［Ｈｙｐｒｏｍａｔｒｉｘ、ＩＮＣ］を添加する。検出抗体とのインキュベーションの３０分後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ−Ｅ基質溶液１ウェル当たり１００μｌで、３０分間までインキュベートし、１Ｍ  ＨＣｌを使用して反応を停止し、ミクロプレートリーダー上、４５０ｎｍで吸光度を測定する。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウエアを使用してデータを分析する。
（実施例４）
ＳＪＳＡ−１細胞生存度アッセイ
【０４１１】
アッセイ前日、ＳＪＳＡ１細胞を、細胞５０００個／１００μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種する。実験当日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で１回洗浄し、９０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を細胞に添加する。ペプチドを、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストックから５００μＭの作業ストックへと滅菌水中で希釈し、０．５％ＤＭＳＯ中でさらに希釈して、ＤＭＳＯ濃度を試料全域で一定に保つ。最終濃度範囲μＭは、ペプチドに対して１ウェル当たり１００μＬ最終容量中５０、２５、１２．５、６．２５、３．１、１．５６、０．８および０μＭである。最も高い最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であり、これを陰性対照として使用する。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ（−）−Ｎｕｔｌｉｎ−３（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。１０×所望の濃度のペプチド１０μｌと同じ希釈スキームを使用して希釈したＮｕｔｌｉｎを、適当なウェルに添加して、所望の最終濃度を達成する。次に、５％ＣＯ２の加湿大気中、３７℃で２０〜２４時間ペプチドと共に細胞をインキュベートする。インキュベーション後の期間、製造業者の指示に従いＰｒｏｍｅｇａＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を使用して細胞生存度を測定する。
（実施例５）
ＳＪＳＡ−１ｐ２１上方調節アッセイ
【０４１２】
アッセイ前日、ＳＪＳＡ１細胞を、細胞８００，０００個／２ｍｌ／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種する。実験当日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で１回洗浄し、１３５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を細胞に添加する。ペプチドを、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストックから５００μＭ作業ストックへと滅菌水で希釈し、０．５％ＤＭＳＯでさらに希釈して、ＤＭＳＯ濃度を試料の全域で一定に保つ。最も高い最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であり、これを陰性対照として使用する。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ（−）−Ｎｕｔｌｉｎ−３（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。１０×所望の濃度のペプチド１５０μｌと同じ希釈スキームを使用して希釈したＮｕｔｌｉｎを、適当なウェルに添加して、所望の最終濃度を達成する。次に、５％ＣＯ２の加湿大気中、３７℃で１８〜２０時間、ペプチドと共に細胞をインキュベートする。インキュベーション後の期間に、細胞を収集し、１×ＰＢＳ（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋なし）で洗浄し、氷上で、１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １０×緩衝液を、１×に希釈し、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補充）中に３０分間溶解する。微量遠心管内、１３０００ｒｐｍの速度で、４０℃で８分間、溶解物を遠心分離する。透明な上清を収集し、さらに使用するときまで−８０℃で貯蔵する。Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製のＢＣＡタンパク質検出キットおよびＢＳＡ標準を使用して、溶解物の全タンパク質含量を測定する。ｐ２１検出ＥＬＩＳＡアッセイに対して、２５μｇの全タンパク質を使用する。各条件は、ＥＬＩＳＡプレートに対して三重反復試験で設定する。製造者の指示書の通り、ＥＬＩＳＡアッセイプロトコルに従う。各ウェルに対して２５μｇの全タンパク質を使用し、三重反復試験に対して各ウェルを配置する。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウエアを使用してデータを分析する。
（実施例６）
ｐ５３  ＧＲＩＰアッセイ
【０４１３】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＊  ＢｉｏＩｍａｇｅ  ｐ５３−Ｈｄｍ２再分布アッセイは、薬物化合物または他の刺激に応答して、Ｈｄｍ２と、ＧＦＰタグを付けたｐ５３の細胞転座とがタンパク質相互作用するのをモニターする。組換え型ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞は、増強したグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＣ末端に縮合したヒトｐ５３（１−３１２）およびＰＤＥ４Ａ４−Ｈｄｍ２（１−１２４）、すなわちＰＤＥ４Ａ４とＨｄｍ２（１−１２４）との間の融合タンパク質を安定的に発現する。これらは、ｐ５３とＨｄｍ２の相互作用に対する実験条件の作用を測定するためのすぐに使えるアッセイ系を提供する。ＨＣＳプラットフォームを用いて、画像化および分析を実施する。
【０４１４】
ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞を、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、０．５ｍｇ／ｍｌジェネテシン、１ｍｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎおよび１０％ＦＢＳを補充したＨａｍのＦ１２培地中で定期的に維持する。細胞を、１ウェル当たり細胞７０００個／１００μｌの密度で、１８〜２４時間９６ウェルプレートに播種した後、培地を使用してアッセイを行う。翌日、培地をリフレッシュし、ＰＤ１７７を、最終濃度３μＭになるまで細胞に添加して、病巣形成物を活性化させる。対照ウェルは、ＰＤ−１７７溶液なしで保つ。ＰＤ１７７での刺激から２４時間後、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で１回洗浄し、ＰＤ−１７７（６μＭ）を補充した５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を細胞に添加する。ペプチドを、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストックから５００μＭ作業ストックへと滅菌水中で希釈し、０．５％ＤＭＳＯ中でさらに希釈して、ＤＭＳＯ濃度を試料全域で一定に保つ。最も高い最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％であり、これを陰性対照として使用する。Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓａｙ（−）−Ｎｕｔｌｉｎ−３（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。２×所望濃度のペプチド５０μｌと同じ希釈スキームを使用して希釈したＮｕｔｌｉｎを、適当なウェルに添加して、所望の最終濃度を達成する。次に、５％ＣＯ２の加湿大気中、３７℃で６時間、細胞をペプチドと共にインキュベートする。インキュベーション後の期間、培地を穏やかに吸引し、１ウェル当たり１５０μｌの定着液を室温で２０分間添加することによって、細胞を固定する。固定した細胞を、毎回１ウェル当たり２００μｌのＰＢＳで４回洗浄する。最後の洗浄の終わりに、１００μｌの１μＭのＨｏｅｃｈｓｔ染色剤溶液を添加する。密閉したプレートを、暗所で少なくとも３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄して、過剰の染色剤を除去し、ＰＢＳを各ウェルに添加する。プレートは、暗所で、４℃で３日間まで貯蔵することができる。ＨｏｅｃｈｓｔおよびＧＦＰ用の１０×対物レンズ、ＸＦ−１００フィルターセットを使用するＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙｓｃａｎ装置上で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ転座モジュールを使用して、ｐ５３／ＨＤＭ２の転座を画像化する。出力パラメーターは、Ｍｅａｎ−ＣｉｒｃＲＩＮＧＡｖｅＩｎｔｅｎＲａｔｉｏ（核および細胞形質の平均蛍光強度の比率（ウェル平均））であった。画像分析用に使用される１ウェル当たりの最小限に許容される細胞数を細胞５００個と設定した。
（実施例７）
アルファ−ヘリシティの円二色性（ＣＤ）分析
【０４１５】
Ｊａｓｃｏ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｖｅｒ．２系ソフトウエアを用いたＪａｓｃｏ  Ｊ−８１５分光偏光計（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｃ．、メリーランド州、イーストン）を使用するＣＤ分光法によりペプチド溶液を分析した。Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラーを使用して、光学的細胞の温度制御を維持した。結果は平均モル楕円率［θ］（ｄｅｇ  ｃｍ２ｄｍｏｌ−１）として表現され、これは、方程式［θ］＝θｏｂｓ・ＭＲＷ／１０＊ｌ＊ｃ（式中、θｏｂｓは、実測された楕円率（単位：ミリ度）であり、ＭＲＷは、ペプチドの平均残基重量（ペプチド分子量／残基の数）であり、ｌは、細胞の光学経路長（単位：センチメートル）であり、ｃはペプチド濃度（単位：ｍｇ／ｍｌ）である）から計算したものである。ペプチド濃度はアミノ酸分析により決定された。ペプチドのストック溶液を良性ＣＤ緩衝液（２０ｍＭリン酸、ｐＨ２）中に調製した。ストックを使用して、１０ｍｍ経路長の細胞において、分析用の５０％トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を有する良性のＣＤ緩衝液中またはＣＤ緩衝液中の０．０５ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を調製した。ペプチド溶液の波長可変測定を、４℃で、１９５ｎｍから２５０ｎｍまで、０．２ｎｍずつ増加させながら、毎分スキャン速度５０ｎｍでスキャンした。６回のスキャンの平均が報告された。
【０４１６】
表２５は、選択されたペプチド模倣大環状分子に対する円二色性データを示す：
【表２５】
2019520304.tif 000166
（実施例８）
蛍光偏光法（ＦＰ）を用いた直接的結合アッセイＭＤＭ２
【０４１７】
以下の一般的なプロトコルに従いアッセイを実施した：
１．ＭＤＭ２（インハウス、４１ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩分緩衝液−２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）中に入れて希釈し、１０μＭ作業ストック溶液を生成する。
２．３０μｌの１０μＭのタンパク質ストック溶液を９６ウェルブラックＨＥマイクロプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＡ１ウェルおよびＢ１ウェルに添加する。
３．３０μｌのＦＰ緩衝液をカラムＡ２〜Ａ１２、Ｂ２〜Ｂ１２、Ｃ１〜Ｃ１２、およびＤ１〜Ｄ１２に充填する。
４．タンパク質ストックの２または３倍希釈系列、Ａ１、Ｂ１からＡ２、Ｂ２；Ａ２、Ｂ２からＡ３、Ｂ３；…と、最後希釈点において１桁のｎＭ濃度に到達するまで希釈する。
５．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ中）のＦＡＭ標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭに希釈する（希釈１：１０）。次に、水で１００μＭから１０μＭに希釈し（希釈１：１０）、次に、ＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭに希釈する（希釈１：２５０）。これは、ウェル中１０ｎＭ濃度（希釈１：４）となる作業用溶液である。希釈されたＦＡＭ標識したペプチドは、使用時まで暗所で保存する。
６．１０μｌの１０ｎＭのＦＡＭ標識したペプチドを各ウェルに添加し、インキュベートし、異なる時点で読み取る。
【０４１８】
５−ＦＡＭ−ＢａＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ−ＮＨ２を有するＫｄは約１３．３８ｎＭである。
（実施例９）
ＭＤＭ２に対する競合的蛍光偏光法アッセイ
【０４１９】
以下の一般的なプロトコルに従い、アッセイを実施した：
１．ＭＤＭ２（インハウス、４１ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩分緩衝液−２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）の中に入れて希釈し、８４ｎＭ（２×）作業ストック溶液を生成する。
２．２０μｌの８４ｎＭ（２×）のタンパク質ストック溶液を９６ウェルブラックＨＥマイクロプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の各ウェルに添加する。
３．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ中）のＦＡＭ標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭに希釈する（希釈１：１０）。次に、水で１００μＭから１０μＭに希釈し（希釈１：１０）、次に、ＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭに希釈する（希釈１：２５０）。これは、ウェル中１０ｎＭの濃度となる（希釈１：４）作業用溶液である。希釈されたＦＡＭ標識したペプチドは、使用時まで暗所で保存する。
４．１μＭのペプチド（最終）から開始して、ＦＰ緩衝液を用いて、非標識のペプチド投与プレートを生成し、以下の希釈スキームを使用して、６つの点に対して５倍段階希釈を生成する。
５．ＤＭＳＯで１０ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ中）を５ｍＭに希釈する（希釈１：２）。次に、Ｈ２Ｏで５ｍＭから５００μＭに希釈し（希釈１：１０）、次に、ＦＰ緩衝液で５００μＭから２０μＭに希釈する（希釈１：２５）。６点に対して５倍段階希釈を４μＭ（４×）から生成する。
６．１０μｌの段階希釈した非標識のペプチドを各ウェルに移し、各ウェルに２０μｌの８４ｎＭのタンパク質を充填する。
７．１０μｌの１０ｎＭ（４×）のＦＡＭ標識したペプチドを各ウェルに添加し、３時間インキュベートして読み取る。
【０４２０】
実施例８および９から得た結果は、図６Ａ〜６ＤのＨＤＭ２データにおいて提供されている。
（実施例１０）
蛍光偏光法（ＦＰ）を用いた直接的結合アッセイＭＤＭＸ
【０４２１】
以下の一般的なプロトコルに従いアッセイを実施した：
１．ＭＤＭＸ（インハウス、４０ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩分緩衝液−２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）の中に入れて希釈し、１０μＭ作業ストック溶液を生成する。
２．３０μｌの１０μＭのタンパク質ストック溶液を９６ウェルブラックＨＥマイクロプレートＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）のＡ１およびＢ１ウェルに添加する。
３．３０μｌのＦＰ緩衝液をカラムＡ２〜Ａ１２、Ｂ２〜Ｂ１２、Ｃ１〜Ｃ１２、およびＤ１〜Ｄ１２へと充填する。
４．タンパク質ストックの２または３倍希釈系列をＡ１、Ｂ１からＡ２、Ｂ２；Ａ２、Ｂ２からＡ３、Ｂ３；…と、最後希釈点において１桁のｎＭ濃度に到達するまで希釈する。
５．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ中）のＦＡＭ標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭに希釈する（希釈１：１０）。次に、水で１００μＭから１０μＭ（希釈１：１０）に希釈し、次に、ＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭに希釈する（希釈１：２５０）。これは、ウェル中１０ｎＭ濃度となる作業用溶液である（希釈１：４）。希釈されたＦＡＭ標識したペプチドは、使用時まで暗所で保存する。
６．１０μｌの１０ｎＭのＦＡＭ標識したペプチドを各ウェルに添加し、インキュベートし、異なる時点で読み取る。
【０４２２】
５−ＦＡＭ−ＢａＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ−ＮＨ２を用いたＫｄは約５１ｎＭである。
（実施例１１）
競合的蛍光偏光法アッセイＭＤＭＸ
【０４２３】
このアッセイを以下の一般的なプロトコルに従い実施した：
１．ＭＤＭＸ（インハウス、４０ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩分緩衝液−２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５．）中に入れて希釈して、３００ｎＭ（２×）作業ストック溶液を生成する。
２．２０μｌの３００ｎＭ（２×）のタンパク質ストック溶液を９６ウェルブラックＨＥマイクロプレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）に添加する。
３．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ中）のＦＡＭ標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭに希釈する（希釈１：１０）。次に、水で１００μＭから１０μＭに希釈し（希釈１：１０）、次に、ＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭに希釈する（希釈１：２５０）。これは、ウェル中１０ｎＭ濃度となる作業用溶液である（希釈１：４）。希釈されたＦＡＭ標識したペプチドは、使用時まで暗所で保存する。
４．５μＭ（最終）のペプチドから開始して、ＦＰ緩衝液を有する非標識のペプチド投与プレートを生成し、以下の希釈スキームを使用して、６点に対して５倍段階希釈を生成する。
５．ＤＭＳＯで１０ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ中）を５ｍＭに希釈する（希釈１：２）。次に、Ｈ２Ｏで５ｍＭから５００μＭに希釈し（希釈１：１０）、次にＦＰ緩衝液で５００μＭから２０μＭに希釈する（希釈１：２５）。２０μＭ（４×）から６点に対して５倍段階希釈を生成する。
６．１０μｌの段階希釈した非標識のペプチドを各ウェルに移し、各ウェルに２０μｌの３００ｎＭのタンパク質を充填する。
７．１０μｌの１０ｎＭ（４×）のＦＡＭ標識したペプチドを各ウェルに添加し、３時間インキュベートして、読み取る。
【０４２４】
実施例１０および１１から得た結果は、図６Ａ〜６ＤのＨＤＭＸデータにおいて提供されている。実施例１１から得た結果は表２６Ａに示されている。以下のスケールを使用している：「＋」は１０００ｎＭを超える値を表し、「＋＋」は１００を超え、１０００ｎＭ未満またはこれと等しい値を表し、「＋＋＋」は１０ｎＭを超え、１００ｎＭ未満またはこれと等しい値を表し、「＋＋＋＋」は１０ｎＭ未満またはこれと等しい値を表す。
【表２６Ａ−１】
2019520304.tif 000167
【表２６Ａ−２】
2019520304.tif 000168
【表２６Ａ−３】
2019520304.tif 000169
【表２６Ａ−４】
2019520304.tif 000170
【表２６Ａ−５】
2019520304.tif 000171
【表２６Ａ−６】
2019520304.tif 000172
【０４２５】
また、実施例１１から得た結果は表２６Ｂに示されている。ＩＣ５０およびＫｉ値に対して以下のスケールを使用している：「＋」は１０００ｎＭを超える値を表し、「＋＋」は１００を超え、１０００ｎＭ未満またはこれと等しい値を表し、「＋＋＋」は１０ｎＭを超え、１００ｎＭ未満またはこれと等しい値を表し、「＋＋＋＋」は１０ｎＭ未満またはこれと等しい値を表す。
【表２６Ｂ】
2019520304.tif 000173
（実施例１２）
細胞生存度アッセイ
【０４２６】
以下の一般的なプロトコルに従いこのアッセイを実施した：
細胞プレーティング：トリプシン処理し、計数し、アッセイ前日、予め決定された密度で、９６ウェルプレートに細胞を播種する。使用した各細胞株に対して以下の細胞密度を使用する：ＳＪＳＡ−１：細胞７５００個／ウェル、ＲＫＯ：細胞５０００個／ウェル、ＲＫＯ−Ｅ６：細胞５０００個／ウェル、ＨＣＴ−１１６：細胞５０００個／ウェル、ＳＷ−４８０：細胞２０００個／ウェル、およびＭＣＦ−７：細胞５０００個／ウェル。
【０４２７】
実験当日、室温で、培地を、１１％ＦＢＳ（アッセイ培地）を有する新鮮な培地と置き換える。１ウェル当たり１８０μＬのアッセイ培地を添加する。細胞を有さない対照ウェルには、２００μｌの培地を入れる。
【０４２８】
ペプチド希釈：すべての希釈物は、室温で生成され、細胞に室温で添加される。ＤＭＳＯ中ペプチドの１０ｍＭストックを調製する。１：３希釈スキームを使用して、ストックを連続希釈することによって、ＤＭＳＯを希釈剤として使用して、１０、３．３、１．１、０．３３、０．１１、０．０３、０．０１ｍＭ溶液を得る。滅菌水を使用して、連続的にＤＭＳＯ希釈したペプチドを３３．３回希釈する。これによって、１０×作業ストックの範囲が得られる。また、対照ウェル用にＤＭＳＯ／滅菌水（３％ＤＭＳＯ）の混合物を調製する。したがって、作業ストックの濃度範囲μＭは、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０μＭとなる。マルチチャネルを使用して各希釈ステップで十分混合する。列Ｈは対照を有する。Ｈ１〜Ｈ３には、２０μｌのアッセイ培地を入れる。Ｈ４〜Ｈ９には、２０μｌの３％ＤＭＳＯ−水ビヒクルを入れる。Ｈ１０〜Ｈ１２は、細胞を有さない、培地のみの対照を有する。陽性対照：ＨＤＭ２小分子阻害剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。ペプチドと同じ希釈スキームを使用してＮｕｔｌｉｎを希釈した。
【０４２９】
作業ストックの細胞への添加：１０×所望の濃度の２０μｌを適当なウェルに添加して、ウェル中全容量２００μｌ中で最終濃度を達成する。（培地中、２０μｌの３００μＭペプチド＋１８０μｌの細胞＝ウェル中、２００μｌ容量中の最終濃度３０μＭ）。ピペットを使用して、穏やかに数回混合する。したがって、使用した最終濃度範囲は、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３および０μＭとなる（強力なペプチドに対する、さらなる希釈が含まれる）。対照は、ペプチドを含まないが、ペプチドを含有するウェルと同じ濃度のＤＭＳＯを含有するウェル、および細胞を含有しないウェルを含む。５％ＣＯ２の加湿大気中、３７℃で７２時間インキュベートする。Ｐｒｏｍｅｇａ製のＭＴＴ試薬を使用して、細胞の生存率を決定する。ＳＪＳＡ−１、ＲＫＯ、ＲＫＯ−Ｅ６、ＨＣＴ−１１６細胞の生存率を３日目、ＭＣＦ−７細胞の生存率を５日目、およびＳＷ−４８０細胞の生存率を６日目に決定する。指定されたインキュベーション時間の終わりに、プレートを室温に戻す。８０μｌのアッセイ培地を各ウェルから除去する。１５μｌの解凍したＭＴＴ試薬を各ウェルに添加する。５％ＣＯ２の加湿大気中、プレートを３７℃で２時間インキュベートさせ、１００μｌの可溶化試薬を製造業者のプロトコル通り添加する。室温で１時間撹拌しながらインキュベートし、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｂｉｏｔｅｋマルチプレートリーダー上で、５７０ｎＭでの吸光度を読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ分析ツールを使用して、ＤＭＳＯ対照に対する細胞生存度を分析する。試薬：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  細胞培養物培地、Ｆａｌｃｏｎ  ９６ウェル明細胞培養物処理したプレート（Ｎｕｎｃ３５３０７２）、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ  ２６５０）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ７２４００）、およびＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ４０００）。装置：吸光度読出し用のマルチプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２）。
【０４３０】
実施例４および５から得た結果は、図６Ａ〜６ＤのＳＪＳＡ−１  ＥＣ５０データにおいて提供されている。
【０４３１】
細胞生存度アッセイから得た結果は、表２７および表２８に示されている。以下のスケールを使用している：「＋」は３０μＭを超える値を表し、「＋＋」は１５μＭを超え、３０μＭ未満またはこれと等しい値を表し、「＋＋＋」は５μＭを超え、１５μＭ未満またはこれと等しい値を表し、「＋＋＋＋」は５μＭ未満またはこれと等しい値を表す。「ＩＣ５０比」は、ｐ５３＋／＋細胞中の平均ＩＣ５０と、ｐ５３−／−細胞中の平均ＩＣ５０との比を表す。
【表２７−１】
2019520304.tif 000174
【表２７−２】
2019520304.tif 000175
【表２７−３】
2019520304.tif 000176
【表２７−４】
2019520304.tif 000177
【表２７−５】
2019520304.tif 000178
【表２７−６】
2019520304.tif 000179
【表２７−７】
2019520304.tif 000180
【表２７−８】
2019520304.tif 000181
【表２７−９】
2019520304.tif 000182
【表２８−１】
2019520304.tif 000183
【表２８−２】
2019520304.tif 000184
【表２８−３】
2019520304.tif 000185
（実施例１３）
Ｐ２１  ＥＬＩＳＡアッセイ
【０４３２】
以下の一般的プロトコルに従いこのアッセイを実施した：
細胞プレーティング：トリプシン処理し、計数し、アッセイ前日、ＳＪＳＡ１細胞を、細胞７５００個／１００μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種する。実験当日、培地を新鮮なＲＰＭＩ−１１％ＦＢＳ（アッセイ培地）と置き換える。１ウェル当たり９０μＬのアッセイ培地を添加する。細胞を有さない対照ウェルには１００μｌ培地を入れる。
【０４３３】
ペプチド希釈：ＤＭＳＯ中ペプチドの１０ｍＭストックを調製する。１：３希釈スキームを使用してストックを連続希釈することによって、ＤＭＳＯを希釈剤として使用して１０、３．３、１．１、０．３３、０．１１、０．０３、０．０１ｍＭ溶液を得る。滅菌水を使用して、ＤＭＳＯ−希釈されたペプチドを３３．３回連続希釈する。これによって、１０×作業ストックの範囲が得られる。また、対照ウェル用にＤＭＳＯ／滅菌水（３％ＤＭＳＯ）の混合物を調製する。したがって、作業ストックの濃度範囲μＭは、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０μＭとなる。マルチチャネルを使用して各希釈ステップで十分混合する。列Ｈは対照を有する。Ｈ１〜Ｈ３には、１０μｌのアッセイ培地を入れる。Ｈ４〜Ｈ９には、１０μｌの３％ＤＭＳＯ−水ビヒクルを入れる。Ｈ１０〜Ｈ１２は、細胞を有さない、培地のみの対照を有する。陽性対照：ＨＤＭ２小分子阻害剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。ペプチドと同じ希釈スキームを使用してＮｕｔｌｉｎを希釈した。
細胞への作業ストックの添加：１０×所望の濃度の１０μｌを適当なウェルに添加して、ウェル中全容量１００μｌ中で最終濃度を達成する。（培地中、１０μｌの３００μＭペプチド＋９０μｌの細胞＝ウェル中、１００μｌ容量中の３０μＭ最終濃度）。したがって、使用した最終濃度範囲は、３０、１０、３、１、０．３および０μＭとなる。対照は、ペプチドを含まないが、ペプチドを含有するウェルと同じ濃度のＤＭＳＯを含有するウェル、および細胞を含有しないウェルを含む。インキュベーションから２０時間後、培地を吸引する。細胞を１×ＰＢＳ（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋なし）で洗浄し、氷上で、３０分間、６０μｌの１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの１０×緩衝液、１×に希釈し、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を補充）に溶解する。５０００ｒｐｍの速度で、４℃で８分間プレートを遠心分離する。透明な上清を収集し、さらに使用するまで−８０℃で冷凍する。タンパク質の評価：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製のＢＣＡタンパク質検出キットおよびＢＳＡ標準物質を使用して溶解物の全タンパク質含有量を測定する。通常、１ウェル当たり約６〜７μｇのタンパク質が予想される。１ウェル当たり５０μｌの溶解物を使用して、ｐ２１  ＥＬＩＳＡを配置する。ヒト全ｐ２１  ＥＬＩＳＡ：製造者の指示書の通り、ＥＬＩＳＡアッセイプロトコルに従う。５０μｌの溶解物を各ウェルに対して使用し三重反復試験に対して、各ウェルを配置する。試薬：細胞ベースのアッセイ（−）−Ｎｕｔｌｉｎ−３（１０ｍＭ）：Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−カタログ＃６０００３４、ＯｐｔｉＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃５１９８５、細胞シグナル伝達溶解緩衝液（１０×）、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−カタログ＃９８０３、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（小）、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−カタログ＃０４６９３１２４００１、ホスファターゼ阻害剤カクテル錠剤、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ−カタログ＃０４９０６８３７００１、Ｈｕｍａｎ  ｔｏｔａｌ  ｐ２１  ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹＣ１０４７−５、および停止液（１Ｍ  ＨＣｌ）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−カタログ＃７００２。装置：吸光度読出しのための、Ｍｉｃｒｏ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｄおよびマルチプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２）。実施例１３から得た結果は図６Ａ〜６Ｄのｐ２１データにおいて提供されている。
（実施例１４）
Ｃａｓｐａｓｅ３検出アッセイ
【０４３４】
以下の一般的プロトコルに従いアッセイを実施した。
【０４３５】
細胞プレーティング：トリプシン処理し、計数し、アッセイ前日、ＳＪＳＡ１細胞を細胞７５００個／１００μｌ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種する。実験当日、培地を新鮮なＲＰＭＩ−１１％ＦＢＳ（アッセイ培地）と置き換える。１ウェル当たり１８０μＬのアッセイ培地を添加する。細胞を有さない対照ウェルには、２００μｌ培地を入れる。
【０４３６】
ペプチド希釈：
・ＤＭＳＯ中でペプチドの１０ｍＭストックを調製する。１：３希釈スキームを使用してストックを連続希釈することによって、希釈剤としてＤＭＳＯを使用して１０、３．３、１．１、０．３３、０．１１、０．０３、０．０１ｍＭ溶液を得る。滅菌水を使用して、ＤＭＳＯ希釈されたペプチドを３３．３回連続希釈する。これによって、１０×作業ストックの範囲が得られる。また、対照ウェル用にＤＭＳＯ／滅菌水（３％ＤＭＳＯ）混合物を調製する。
・したがって、作業ストック濃度範囲μＭは３００、１００、３０、１０、３、１、０．３および０μＭとなる。マルチチャネルを使用して各希釈ステップで十分混合する。２０μｌの１０×作業ストックを適当なウェルに添加する。
・列Ｈは対照を有する。Ｈ１〜Ｈ３には、２０μｌのアッセイ培地を入れる。Ｈ４〜Ｈ９には２０μｌの３％ＤＭＳＯ−水ビヒクルを入れる。Ｈ１０〜Ｈ１２は、細胞を有さない、培地のみの対照を有する。
・陽性対照：ＨＤＭ２小分子阻害剤、Ｎｕｔｌｉｎ−３ａ（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。ペプチドと同じ希釈スキームを使用して、Ｎｕｔｌｉｎを希釈した。
【０４３７】
細胞への作業ストックの添加：
・１０μｌの１０×所望の濃度を適当なウェルに添加して、ウェル中全容量１００μｌ中で最終濃度を達成する。（培地中、１０μｌの３００μＭペプチド＋９０μｌの細胞＝ウェル中、１００μｌ容量中の最終濃度３０μＭ）。したがって、使用される最終濃度範囲は３０、１０、３、１、０．３および０μＭである。
・対照は、ペプチドを含まないが、ペプチドを含有するウェルと同じ濃度のＤＭＳＯを含有するウェル、および細胞を含有しないウェルを含む。
・インキュベーションから４８時間後、各ウェルから８０μｌの培地を吸引し、１ウェル当たり、１００μｌのＣａｓｐａｓｅ３／７Ｇｌｏアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｓｐａｓｅ  ３／７ｇｌｏアッセイ系、Ｇ８０９２）を添加し、室温で１時間穏やかに振盪しながらインキュベートする。発光についてＳｙｎｅｒｇｙ  Ｂｉｏｔｅｋマルチプレートリーダーで読み取る。ＤＭＳＯ処理した細胞上でのＣａｓｐａｓｅ３活性化としてデータを分析する。
【０４３８】
実施例１３および１４から得た結果は、図６Ａ〜６Ｄおよび表２９のｐ２１データにおいて提供されている。
【表２９−１】
2019520304.tif 000186
【表２９−２】
2019520304.tif 000187
（実施例１５）
ＭＤＭＸとの複合体中のペプチド模倣大環状分子のＸ線共結晶学
【０４３９】
ペプチド４６との共結晶化に対して（表９）、ＤＭＳＯ中１００ｍＭストック溶液からの化学量論的量の化合物をゼブラフィッシュＭＤＭＸタンパク質溶液に添加し、４℃で終夜静置させた後、結晶化実験を始める。手順は、以下に記述されているような一部の変更はあるが、Ｐｏｐｏｗｉｃｚらにより記載された手順と類似のものであった。ｐＥＴ１５ｂベクターを使用して、タンパク質（残基１５〜１２９、Ｌ４６Ｖ／Ｖ９５Ｌ）をＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）発現系から得た。細胞を３７℃で成長させ、ＯＤ６００、０．７で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘発した。細胞を、２３℃でさらに１８時間成長させた。Ｎｉ−ＮＴ  Ａｇａｒｏｓｅ、これに続いて、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＴＣＥＰで緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５を使用してタンパク質を精製し、次に２４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。結晶化実験のため、緩衝液を２０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＴに交換した。最初の結晶は、Ｎｅｘｔａｌ（Ｑｉａｇｅｎ）ＡＭＳスクリーニング＃９４を用いて得たが、最終の最適化リザーバーは２．６Ｍ  ＡＭＳ、７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５であった。結晶が、規定通りに４℃で薄いプレートとして増大し、これらを、濃縮（３．４Ｍ）マロン酸塩を含有する溶液に通すことによって冷凍保護し、これに続いて、フラッシュ冷却し、貯蔵し、液体窒素中で出荷する。
【０４４０】
ＡＰＳで、ビームライン３１−ＩＤ（ＳＧＸ−ＣＡＴ）で、１００Ｋおよび波長０．９７９２９Åにおいて、データ収集を実施した。ビームラインは、Ｒａｙｏｎｉｘ  ２２５−ＨＥ検出器を備えていた。データ収集のため、０．８秒の曝露時間を使用して、結晶を、１°増加させながら１８０°回転させた。データを処理し、Ｍｏｓｆｌｍ／ｓｃａｌａを使用して（ＣＣＰ４；Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．    Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ５０巻、７６０〜７６３頁（１９９４年）；  Ｐ．Ｒ．    Ｅｖａｎｓ．  Ｊｏｉｎｔ  ＣＣＰ４  ａｎｄ  ＥＳＦ−ＥＡＣＢＭ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、３３巻、２２〜２４頁（１９９７年）を参照されたい）、空間群Ｃ２において縮小した（単位格子：ａ＝１０９．２７８６、ｂ＝８１．０８３６、ｃ＝３０．９０５８Å、α＝９０、β＝８９．８５７７、γ＝９０°）。プログラムＭｏｌｒｅｐを用いた分子の置換（ＣＣＰ４；Ａ．ＶａｇｉｎおよびＡ．  Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ．  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｃｒｙｓｔ．、３０巻、１０２２〜１０２５頁（１９９７年）を参照されたい）を、Ｐｏｐｏｗｉｃｚら、（２Ｚ５Ｓ；  Ｇ．Ｍ．  Ｐｏｐｏｗｉｃｚ、Ａ．  Ｃｚａｒｎａ、Ｕ．  Ｒｏｔｈｗｅｉｌｅｒ、Ａ．  Ｓｚｗａｇｉｅｒｃｚａｋ、Ｍ．    Ｋｒａｊｅｗｓｋｉ、Ｌ．  ＷｅｂｅｒおよびＴ．Ａ．  Ｈｏｌａｋ．、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ６巻、２３８６〜２３９２頁（２００７年）を参照されたい）により決定された構造のＭＤＭＸ構成成分を用いて実施し、非対称的単位内の２個の分子で同定した。プログラムＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４；  Ｇ．Ｎ．  Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ、Ａ．Ａ．  ＶａｇｉｎおよびＥ．Ｊ．  Ｄｏｄｓｏｎ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ５３巻、２４０〜２５５頁（１９９７年）参照されたい）を用いたゼブラフィッシュＭＤＭＸのうちの分子２個だけの最初の精密化は、０．３４２４のＲ因子（Ｒｆｒｅｅ＝０．３７１２）、結合に対するｒｍｓｄ値（０．０１８Å）および角度（１．６９８°）をもたらした。Ｇｌｎ１９から開始し、全脂肪族ステープルを含む、ステープルドペプチド構成成分に対する電子密度は非常に明白であった。データを使用して、ＣＮＸ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を用いて２．３Å分解能までさらに精密化することによって、十分に精製されている（Ｒｆ＝０．２６０１、Ｒｆｒｅｅ＝０．３１６２、ｒｍｓｄ結合＝０．００７Åおよびｒｍｓｄ角度＝０．９１６°）モデル（ＭＤＭＸ由来の１４４８個の原子、ステープルドペプチド由来の２７２個の原子および４６個の水分子で構成される）が生じた。実施例１５から得た結果は図３および図４に示されている。
（実施例１６）
ペプチド模倣大環状分子による細胞溶解
【０４４１】
１日前に、透明な平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３５３０７２）内に、１００ｕｌ／ウェルの成長培地と共に、細胞７５００個／ウェルのＳＪＳＡ−１細胞をプレーティングし、横列Ｈ縦列１０〜１２は、培地のみとなるように空にしておいた。アッセイ当日、培地を、ＲＰＭＩ  １％ＦＢＳ培地、１ウェル当たり９０μｌの培地と交換した。
【０４４２】
ペプチド模倣大環状分子の１０ｍＭストック溶液を１００％ＤＭＳＯ中に調製した。次に、ペプチド模倣大環状分子を１００％ＤＭＳＯ中で連続希釈し、次に、滅菌水中でさらに２０倍希釈することによって、５％ＤＭＳＯ／水中の各ペプチド模倣大環状分子の作業ストック溶液を５００μＭ〜６２．５μＭの範囲の濃度で調製した。
【０４４３】
１０μｌの各化合物を９０μｌのＳＪＳＡ−１細胞に添加することによって、０．５％ＤＭＳＯ含有培地内で最終濃度５０ｕＭ〜６．２５ｕＭをもたらした。陰性対照（非溶解）試料は０．５％ＤＭＳＯ単独であり、陽性対照（溶解）試料は、１０ｕＭ  Ｍｅｌｉｔｔｉｎおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。
【０４４４】
細胞プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、細胞の形態を顕微鏡で調査し、次に、プレートを１２００ｒｐｍで、室温で５分間、遠心分離した。各ペプチド模倣大環状分子に対する上清４０μｌおよび対照試料を透明なアッセイプレートに移した。Ｃａｙｍｅｎ製、ＬＤＨ  細胞毒性アッセイキット、カタログ＃１０００８８２を使用して、ＬＤＨ放出を測定する。結果は表３０に示されている。
【表３０−１】
2019520304.tif 000188
【表３０−２】
2019520304.tif 000189
【表３０−３】
2019520304.tif 000190
（実施例１７）
ＳＰ３１５、ＳＰ２４９およびＳＰ１５４を使用した、ＭＣＦ−７乳がん実験
【０４４５】
ＭＣＦ−７乳がん異種移植片モデルの無胸腺マウスにおいて、異種移植片実験を実施して、腫瘍成長の阻害におけるＳＰ３１５、ＳＰ２４９およびＳＰ１５４の有効性を検査した。また、陰性対照であるステープルドペプチド、ＳＰ２５２、すなわちＳＰ１５４の点変異（位置１９において、ＦからＡに変異）を１つの群で検査した。このペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生存率アッセイにおいて、ＳＪＳＡ−１における活性を示さなかった。腫瘍細胞インプランテーションの１日前（−１日目）、遅延放出９０日、０．７２ｍｇの１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、フロリダ州サラソータ）を頸部の首筋に皮下移植した（ｓｃ）。０日目には、ＭＣＦ−７腫瘍細胞を雌ヌード（Ｃｒｌ：ＮＵ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）マウスの側腹部にｓｃ移植した。１８日目、キャリパを使用して、生成したｓｃ腫瘍を測定することによって、これらの長さおよび幅を決定し、マウスを秤量した。式（長さ×幅２）／２を使用して腫瘍サイズを計算し、立方体ミリメートル（ｍｍ３）として表現した。８５．３ｍｍ３よりも小さい、または４１７．４ｍｍ３よりも大きな腫瘍を持つマウスは、その後の群形成から除外した。群の平均腫瘍サイズが本質的に等しくなるように（群の平均値±群の標準偏差＝１８０．７±１７．５ｍｍ３）ランダム化することによって、１３のマウスの群（１群当たりマウス１０匹）が形成された。
【０４４６】
ＳＰ３１５、ＳＰ２４９、ＳＰ１５４およびＳＰ２５２の投薬溶液を、ｐＨ７の１０ｍＭヒスチジン緩衝化食塩水中、ＭＰＥＧ（２Ｋ）−ＤＳＰＥを濃度５０ｍｇ／ｍＬで含有するビヒクル内で配合したペプチドから調製した。この配合物を実験期間の間１回調製した。その後の実験において、このビヒクルをビヒクル対照として使用した。
【０４４７】
各グループに、異なる処置レジメンを割り当てた。群１には、ビヒクル陰性対照群として、静脈内に（ｉｖ）週３回、第１８日〜３９日まで、８ｍＬ／ｋｇ（体重）のビヒクル投与を施した。群２および３には、ＳＰ１５４は、それぞれ３０ｍｇ／ｋｇを週３回または４０ｍｇ／ｋｇを週２回、ｉｖ注射を施した。群４には、６．７ｍｇ／ｋｇのＳＰ２４９を、週３回、ｉｖ注射を施した。群５、６、７および８には、ＳＰ３１５のｉｖ注射は、２６．７ｍｇ／ｋｇを週３回、２０ｍｇ／ｋｇを週２回、３０ｍｇ／ｋｇを週２回、または４０ｍｇ／ｋｇを週２回それぞれ施した。群９には、３０ｍｇ／ｋｇのＳＰ２５２を週３回のｉｖ注射として施した。
【０４４８】
投薬期間中、マウスを秤量し、腫瘍を週１〜２回測定した。腫瘍容積という点からの結果が図８〜図１１に示されており、ビヒクル群と比較して、腫瘍成長阻害、体重変化および≧２０％の体重の減少があった、または死亡したマウスの数が表３１に示されている。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を、％ＴＧＩ＝１００−［（ＴｕＶｏｌ処置日ｘ−ＴｕＶｏｌ処置日１８）／（ＴｕＶｏｌビヒクル陰性対照−ｘ日−ＴｕＶｏｌビヒクル陰性対照−１８日）＊１００、（式中、ｘ＝処置の作用が評価された日）として計算した。群１、ビヒクル陰性対照群は、本腫瘍モデルに対して良好な腫瘍成長速度を示した。
【０４４９】
ＳＰ１５４については、４０ｍｇ／ｋｇが週２回投与された群において、２匹のマウスが処置中に死亡し、これは、この投与レジメンは忍容されなかったことを示している。３０ｍｇ／ｋｇのＳＰ１５４を週３回という投与レジメンは十分忍容され、８４％のＴＧＩが生じた。
【０４５０】
ＳＰ２４９は、６．７ｍｇ／ｋｇが週３回投与された群において、４匹のマウスが処置中に死亡し、これは、この投与レジメンが忍容されなかったことを示している。
【０４５１】
ＳＰ３１５に対して使用したすべての投与レジメンは、体重の減少または死亡は観察されず、良好な忍容性を示した。４０ｍｇ／ｋｇのＳＰ３１５週２回の投薬は、最も高いＴＧＩ（９２％）をもたらした。２６．７ｍｇ／ｋｇを週３回、２０ｍｇ／ｋｇを週２回、３０ｍｇ／ｋｇを週２回のＳＰ３１５の投与レジメンは、それぞれ８６、８２、および８５％のＴＧＩをもたらした。
【０４５２】
ＳＰ２５２、すなわち、ＳＰ１５４の点変異については、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、感知できるほどの活性を示さず、３０ｍｇ／ｋｇの週３回の投薬は、体重減少または死亡が観察されず、十分忍容されるものであった。ＴＧＩ８８％が３２日目に観察されたが、そのＴＧＩは３９日目までに４１％まで減少した。
【０４５３】
実施例１７から得た結果は図８〜図１１に示され、表３１に要約されている。
【表３１−１】
2019520304.tif 000191
【表３１−２】
2019520304.tif 000192
（実施例１８）
化合物１のヒト突然変異体および野生型ｐ５３への結合親和性
【０４５４】
本発明のステープルドペプチド模倣大環状分子である化合物１をヒト被験体に使用して、ヒトがん細胞株由来のｐ５３タンパク質変種への結合親和性を評価した。
【０４５５】
候補患者のがん試料から得たＤＮＡを配列決定することによって、ＴＰ５３エクソン、イントロン、およびスプライス部位を含む、全ｐ５３コード領域を決定した。機能不全のｐ５３を、置換の同定、インデル、フレームシフト変異、スプライス部位変異、挿入または欠失、コピー数の変化、大きな欠失、または多形性から推測した。最低限の腫瘍含有量は２０％であった。平均読み深度は、約７５０回の読取り／アンプリコンであった。検出の下限は、アンプリコン１つ当たり≧４５０回の平均読み深度において、５％の変異体対立遺伝子であった。平均読み深度がアンプリコン１つ当たり＜４５０回の読取りであった場合、検出限界は１５％の変異体対立遺伝子であった。
【０４５６】
ＴＰ５３遺伝子コピー数の検出は、１４個の正常なＤＮＡ試料の全域での平均数の読取りと比較した場合の、腫瘍のＴＰ５３アンプリコン数の読取りに基づいた。アッセイの限界：１つまたは複数の対立遺伝子の喪失は、腫瘍含有量が＞６０％である場合（９９％感受性）、決定することができる。２つの対立遺伝子の喪失は、腫瘍試料含有量が＞３０％（９９％感受性）である場合、決定することができる。野生型ＴＰ５３を有する１０％を超える腫瘍は、０．５未満（＜０．５）のコピー数を有する。
【０４５７】
半数効果濃度（ＥＣ５０）として測定される、化合物１のｐ５３に対する結合親和性は、図１２に示されている通り、変異体ｐ５３と比較して、野生型ｐ５３に対して有意により大きかった。一般的に、化合物１は、変異ｐ５３よりも、野生型ｐ５３に優先的に結合する。しかし、変異体ｐ５３の亜集団はまた、化合物１に対して強い親和性を呈し、野生型ｐ５３の亜集団は化合物１に対して弱い親和性を呈する。
【図１】
2019520304.tif 000193
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
2019520304.tif 000199
【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
2019520304.tif 000206
【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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