(57)【要約】ヒトジストロフィン遺伝子の選択した標的部位に相補的でありエクソン４５スキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーが記載されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１０１】
2019525742.tif 000110
のアンチセンスオリゴマーであって、
式中、
各Ｎｕが、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｚが２０〜２６の整数であり；
Ｔが：
【化１０２】
2019525742.tif 000111
から選択される部分であり；
式中、Ｒ３がＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２が、Ｈ、アセチル、トリチルおよび４−メトキシトリチルから選択され、
該標的化配列が、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるエクソン４５標的領域に相補的である、アンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載のアンチセンスオリゴマーであって、前記標的化配列が、
ａ）Ｚが２４である配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）；
ｂ）Ｚが２０である配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）；
ｃ）Ｚが２３である配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｄ）Ｚが２６である配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；および
ｅ）Ｚが２６である配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）
から選択される、アンチセンスオリゴマー。
【請求項３】
Ｔが
【化１０３】
2019525742.tif 000112
である、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項４】
Ｒ２がＨである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項５】
Ｚが２４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項６】
Ｚが２０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項７】
Ｚが２３である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項８】
Ｚが２６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項９】
前記標的化配列が配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）であり、Ｚが２４である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１０】
前記標的化配列が配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）であり、Ｚが２０である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１１】
前記標的化配列が配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）であり、Ｚが２３である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１２】
前記標的化配列が配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）であり、Ｚが２６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１３】
前記標的化配列が配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）であり、Ｚが２６である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１４】
【化１０４】
2019525742.tif 000113
（表中の、１〜２６および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２１】
2019525742.tif 000114
）
および
【化１０５】
2019525742.tif 000115
（表中の、１〜２２および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２２】
2019525742.tif 000116
）
および
【化１０６】
2019525742.tif 000117
（表中の、１〜２５および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２３】
2019525742.tif 000118
）
および
【化１０７】
2019525742.tif 000119
（表中の、１〜２８および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２４】
2019525742.tif 000120
）
および
【化１０８】
2019525742.tif 000121
（表中の、１〜２８および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２５】
2019525742.tif 000122
）
からなる群より選択され、
化合物１〜５それぞれの表中、Ａが
【化１０９】
2019525742.tif 000123
であり、Ｃが
【化１１０】
2019525742.tif 000124
であり、Ｇが
【化１１１】
2019525742.tif 000125
であり、Ｔが
【化１１２】
2019525742.tif 000126
である、
請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１５】
【化１１３】
2019525742.tif 000127
（表中の、１〜２２および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２６】
2019525742.tif 000128
から選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴマー。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療またはジストロフィンの産生のための薬物の製造のための請求項１〜５のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴマーの使用であって、該対象が、エクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本特許出願は、２０１６年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３５６，９２３号および２０１６年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３５７，０７２号の利益を主張するものである。上記参照仮特許出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
本願には、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表が含まれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１７年６月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＡＶＮ−０２５ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、大きさが２，５９７バイトである。
【０００３】
（本開示の分野）
本開示は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン４５スキッピングに適した新規なアンチセンスオリゴマーおよびその医薬組成物に関する。本開示は、新規なアンチセンスオリゴマーを用いてエクソン４５スキッピングを誘導する方法、エクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有する対象にジストロフィンを産生させる方法およびエクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有する対象を治療する方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
様々な異なるレベル（転写、スプライシング、安定性、翻訳）で遺伝子発現に影響を及ぼす一連の化学的性質を用いてアンチセンス技術が開発されている。その研究の多くが、多岐にわたる適応症における異常遺伝子または疾患関連遺伝子を修正または代償するアンチセンス化合物の使用に焦点を当てたものである。アンチセンス分子は遺伝子発現を特異的に阻害することが可能であり、このため、遺伝子発現のモジュレーターとしてのオリゴマーに関する研究努力の多くが標的遺伝子の発現またはシス作用エレメントの機能を阻害することに焦点を当てたものである。アンチセンスオリゴマーは通常、センス鎖（例えば、ｍＲＮＡ）または一部のウイルスＲＮＡ標的の場合はマイナス鎖のＲＮＡに対するものである。特定の遺伝子をダウンレギュレートする所望の効果を得るには一般に、オリゴマーにより標的ｍＲＮＡの崩壊、ｍＲＮＡの翻訳阻止またはシス作用ＲＮＡエレメントの機能阻止を促進し、それにより標的タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ合成またはウイルスＲＮＡの複製を効率的に妨害する。
【０００５】
しかし、目的が天然タンパク質の産生をアップレギュレートすることまたは翻訳の中途終止を誘導するナンセンス変異もしくはフレームシフト変異などの変異を代償することである場合、このような技術は有効ではない。このような場合、欠陥遺伝子の転写物が標的化分解も立体阻害も受けてはならず、このため、アンチセンスオリゴマーの化学的性質が標的ｍＲＮＡの崩壊を促進することも、翻訳を阻止することもあってはならない。
【０００６】
様々な遺伝性疾患では、スプライシング過程で標的エクソンスキッピングの過程を介して最終的な遺伝子発現に対する変異の作用を調節することができる。スプライシング過程は複数の構成要素からなる複雑な機序により方向付けられ、この機序により、プレｍＲＮＡの隣接したエクソン・イントロン接合部が接近してイントロン末端でホスホジエステル結合が切断されたのち、一緒にスプライスされるエクソン同士の間で再編成が起こる。この複雑で精度の高い過程は、プレｍＲＮＡ内にあり、のちにスプライシング反応に関与する様々な核内スプライシング因子が結合する準保存的ＲＮＡセグメントである、比較的短い配列モチーフにより媒介される。スプライシング機序がプレｍＲＮＡのプロセシングに関与するモチーフを読み取る、または認識する仕組みを変化させることにより、差次的にスプライスされたｍＲＮＡ分子を作製することが可能である。これまでに、ヒト遺伝子の大部分は正常な遺伝子発現の過程で選択的にスプライスされることが認められているが、それに関与する機序は明らかにされていない。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ媒介性切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を用いる野生型細胞内ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節について記載している。これは、選択的スプライシングを受け特定のエクソンを欠くｍＲＮＡ（例えば、（Ｓａｚａｎｉ，Ｋｏｌｅら，２００７）により記載されている）を作製することが可能であるという点で、膜貫通ドメインをコードするエクソンを欠く可溶性ＴＮＦスーパーファミリー受容体の作製に有用である。
【０００７】
通常に機能するタンパク質がその変異により中途終止する場合、アンチセンス技術により一部の機能性タンパク質の産生を回復させる手段がスプライシング過程への介入により可能であり、また、一部の遺伝子から病原変異に関連するエクソンを特異的に削除することができれば、天然タンパク質と同じ生物学的特性を有するか、エクソンに関連する変異によって引き起こされる疾患を改善できる程度の生物活性を有する短いタンパク質産物の産生が可能であることが示されている（例えば、Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ，Ｓａｍｂａｄｅら，１９９６；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄら，１９９９；ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ，Ｂｒｅｍｍｅｒ−Ｂｏｕｔら，２００１；Ｌｕ，Ｍａｎｎら，２００３；Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ，Ｊａｎｓｏｎら，２００４を参照されたい）。Ｋｏｌｅら（米国特許第５，６２７，２７４号；同第５，９１６，８０８号；同第５，９７６，８７９号；および同第５，６６５，５９３号）には、標的プレｍＲＮＡの崩壊を促進しない修飾アンチセンスオリゴマー類似体を用いて異常なスプライシングを除去しようとする方法が開示されている。Ｂｅｎｎｅｔｔら（米国特許第６，２１０，８９２号）は、同じく標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅＨ媒介性切断を誘導しないアンチセンスオリゴマー類似体を用いる野生型細胞内ｍＲＮＡプロセシングのアンチセンス調節について記載している。
【０００８】
標的エクソンスキッピングの過程は、エクソンおよびイントロンが多数存在する、エクソンの遺伝子構成に冗長性がある、または１つもしくは複数の特定のエクソンがなくてもタンパク質が機能することができる長い遺伝子に特に有用である可能性がある。様々な遺伝子の変異を原因とする短縮に関連する遺伝性疾患の治療のために遺伝子プロセシングを再指令するこれまでの努力は、（１）スプライシング過程に関与するエレメントと全部もしくは一部が重複している；または（２）そのエレメントと十分に近い位置でプレｍＲＮＡに結合して、通常そのエレメントで起こる特定のスプライシング反応を媒介するかのいずれかの、スプライシング因子の結合および機能を阻害するアンチセンスオリゴマーの使用に焦点を当てたものである。
【０００９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、タンパク質ジストロフィンの発現の欠陥を原因とするものである。このタンパク質をコードする遺伝子では、ＤＮＡの２００万個を超えるヌクレオチドにわたって７９のエクソンが散在している。エクソンのリーディングフレームが変化する、停止コドンが導入される、あるいは１つもしくは複数のフレームエクソンの完全な除去または１つもしくは複数のエクソンの重複と特徴とするエクソン変異があれば、機能的ジストロフィンの産生が阻害されてＤＭＤが起こる可能性がある。
【００１０】
比較的重症度の低い筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）は、変異、通常１つまたは複数のエクソンの欠失によりジストロフィン転写物全体にわたって正しいリーディングフレームが生じるため、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳が中途終止しない場合に起こることがわかっている。変異したジストロフィンプレｍＲＮＡのプロセシングで上流と下流のエクソンが連結されることにより正しい遺伝子のリーディングフレームが維持されれば、その結果として短い内部欠失があり一部の活性を保持するタンパク質をコードするｍＲＮＡが生じ、ベッカー型表現型となる。
【００１１】
長年、ジストロフィンタンパク質のリーディングフレームが変化しない１つまたは複数のエクソンの欠失があればＢＭＤ型表現型が生じるのに対し、フレームシフトを引き起こすエクソン欠失ではＤＭＤが生じることが知られている（Ｍｏｎａｃｏ，Ｂｅｒｔｅｌｓｏｎら，１９８８）。一般に、リーディングフレームが変化し、ひいては適切なタンパク質翻訳を妨げる点変異およびエクソン欠失を含めたジストロフィン変異があるとＤＭＤが生じる。また、ＢＭＤ患者およびＤＭＤ患者の一部には複数のエクソンにわたるエクソン欠失がみられることにも注目するべきである。
【００１２】
アンチセンスオリゴリボヌクレオチドによる変異体ジストロフィンプレｍＲＮＡのスプライシングの調節がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で報告されている（例えば、Ｍａｔｓｕｏ，Ｍａｓｕｍｕｒａら，１９９１；Ｔａｋｅｓｈｉｍａ，Ｎｉｓｈｉｏら，１９９５；Ｐｒａｍｏｎｏ，Ｔａｋｅｓｈｉｍａら，１９９６；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｅｐｅｒｏｎら，１９９７；Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍａｎｏｈａｒａｎら，１９９８；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｌｌｏｙｄら，１９９９；Ｍａｎｎ，Ｈｏｎｅｙｍａｎら，２００２；Ｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｎｎら，２００３を参照されたい）。
【００１３】
プレｍＲＮＡの特定の領域、通常はエクソンを標的としてＤＭＤ遺伝子の変異のスキッピングを誘導し、それによりこれらのアウトオブフレーム変異をインフレームに戻して内部が短縮しているが機能的なジストロフィンタンパク質の産生を可能にするアンチセンスオリゴマーが特異的に設計されている。このようなアンチセンスオリゴマーは、完全にエクソンの内部（いわゆるエクソン内部配列）またはエクソンからイントロンの一部分にわたるスプライスドナーもしくはスプライスアクセプター接合部を標的とすることが知られている。
【００１４】
このようなＤＭＤに対するアンチセンスオリゴマーの発見および開発がこれまでの研究の分野である。このような開発としては：（１）西オーストラリア大学およびＳａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社（本願の譲受人）：国際公開第２００６／００００５７号；国際公開第２０１０／０４８５８６号；国際公開第２０１１／０５７３５０号；国際公開第２０１４／１００７１４号；国際公開第２０１４／１５３２４０号；国際公開第２０１４／１５３２２０号；（２）Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ  Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ  Ｌｅｉｄｅｎ／Ｐｒｏｓｅｎｓａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（現ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社）：国際公開第０２／２４９０６号；国際公開第２００４／０８３４３２号；国際公開第２００４／０８３４４６号；国際公開第２００６／１１２７０５号；国際公開第２００７／１３３１０５号；国際公開第２００９／１３９６３０号；国際公開第２００９／０５４７２５号；国際公開第２０１０／０５０８０１号；国際公開第２０１０／０５０８０２号；国際公開第２０１０／１２３３６９号；国際公開第２０１３／１１２０５３号；国際公開第２０１４／００７６２０号；（３）Ｃａｒｏｌｉｎａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ：国際公開第２０１２／１０９２９６号；（４）ロイヤルホロウェイ：特許ならびにその利益を主張する米国特許出願第６１／０９６，０７３号および同第６１／１６４，９７８号を含めた出願；（４）ＪＣＲ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社およびＭａｔｓｕｏ：米国特許第６，６５３，４６６号；特許ならびにその利益を主張する特願２０００−１２５４４８号を含めた出願、例えば米国特許第６，６５３，４６７号；特許ならびにその利益を主張する特願２０００−２５６５４７号を含めた出願、例えば米国特許第６，７２７，３５５号；国際公開第２００４／０４８５７０号；（５）日本新薬社：国際公開第２０１２／０２９９８６号；国際公開第２０１３／１００１９０号；国際公開第２０１５／１３７４０９号；国際公開第２０１５／１９４５２０号；ならびに（６）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｍｙｏｌｏｇｉｅ／ピエール・マリー・キュリー大学／ベルン大学／フランス国立科学研究センター／Ｓｙｎｔｈｅｎａ  ＡＧ：国際公開第２０１０／１１５９９３号；国際公開第２０１３／０５３９２８号のものが挙げられる。
このような成功にもかかわらず、ジストロフィンを産生させＤＭＤを治療する治療法に潜在的に有用なエクソン４５を標的とする改善されたアンチセンスオリゴマーならびにそれに対応する医薬組成物が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６２７，２７４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９１６，８０８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９７６，８７９号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６６５，５９３号明細書
【特許文献６】米国特許第６，２１０，８９２号明細書
【特許文献７】国際公開第２００６／００００５７号
【特許文献８】国際公開第２０１０／０４８５８６号
【特許文献９】国際公開第２０１１／０５７３５０号
【特許文献１０】国際公開第２０１４／１００７１４号
【特許文献１１】国際公開第２０１４／１５３２４０号
【特許文献１２】国際公開第２０１４／１５３２２０号
【特許文献１３】国際公開第２００２／０２４９０６号
【特許文献１４】国際公開第２００４／０８３４３２号
【特許文献１５】国際公開第２００４／０８３４４６号
【特許文献１６】国際公開第２００６／１１２７０５号
【特許文献１７】国際公開第２００７／１３３１０５号
【特許文献１８】国際公開第２００９／１３９６３０号
【特許文献１９】国際公開第２００９／０５４７２５号
【特許文献２０】国際公開第２０１０／０５０８０１号
【特許文献２１】国際公開第２０１０／０５０８０２号
【特許文献２２】国際公開第２０１０／１２３３６９号
【特許文献２３】国際公開第２０１３／１１２０５３号
【特許文献２４】国際公開第２０１４／００７６２０号
【特許文献２５】国際公開第２０１２／１０９２９６号
【特許文献２６】米国特許出願公開第６１／０９６，０７３号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第６１／１６４，９７８号明細書
【特許文献２８】米国特許第６，６５３，４６６号明細書
【特許文献２９】米国特許第６，６５３，４６７号明細書
【特許文献３０】米国特許第６，７２７，３５５号明細書
【特許文献３１】国際公開第２００４／０４８５７０号
【特許文献３２】国際公開第２０１２／０２９９８６号
【特許文献３３】国際公開第２０１３／１００１９０号
【特許文献３４】国際公開第２０１５／１３７４０９号
【特許文献３５】国際公開第２０１５／１９４５２０号
【特許文献３６】国際公開第２０１０／１１５９９３号
【特許文献３７】国際公開第２０１３／０５３９２８号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一態様では、本開示は、選択した標的と結合してヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導することが可能な長さ２２〜３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーを提供し、ここでは、アンチセンスオリゴマーは、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるエクソン４５標的領域に相補的な一続きの塩基を含み、オリゴマーの塩基はモルホリノ環構造と結合しており、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素と、隣接する環構造の５’環外炭素とを連結するリン（phosphorous）含有サブユニット間結合により連結されている。一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜５と命名される一続きの塩基を含む。別の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、長さ約２２〜２８サブユニットまたは長さ約２２〜２４サブユニットである。
【００１７】
別の態様では、本開示は、式（Ｉ）：
【化１】
2019525742.tif 000002
のアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を提供し、式中：
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｚは２０〜２６の整数であり；
Ｔは：
【化２】
2019525742.tif 000003
から選択される部分であり；
式中、Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、アセチル、トリチルおよび４−メトキシトリチルから選択され、
標的化配列は、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるエクソン４５標的領域に相補的である。
【００１８】
例えば式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、エクソン４５に標的化した例示的アンチセンスオリゴマーとしては、以下で識別される標的化配列を有するものが挙げられる：
ａ）上式のＺが２４であるＨ４５Ａ（−０６＋２０）配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）；
ｂ）上式のＺが２０であるＨ４５Ａ（−０３＋１９）配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）；
ｃ）上式のＺが２３であるＨ４５Ａ（−０９＋１６）配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｄ）上式のＺが２６であるＨ４５Ａ（−０９＋１９）配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；および
ｅ）上式のＺが２６であるＨ４５Ａ（−１２＋１６）配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）。
【００１９】
ある特定の実施形態では、チミン塩基をウラシル塩基に置き換えることができる。
【００２０】
ある特定の実施形態では、Ｔは
【化３】
2019525742.tif 000004
である。いくつかの実施形態では、Ｒ２はＨである。いくつかの実施形態では、Ｚは２４であり、いくつかの実施形態では、Ｚは２０である。いくつかの実施形態では、Ｚは２３である。いくつかの実施形態では、Ｚは２６である。
【００２１】
さらなる実施形態では、Ｔは
【化４】
2019525742.tif 000005
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２４である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５】
2019525742.tif 000006
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２０である。他の実施形態では、Ｔは
【化６】
2019525742.tif 000007
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２３である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化７】
2019525742.tif 000008
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２６である。
【００２２】
例えば式（Ｉ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、Ｔは
【化８】
2019525742.tif 000009
であり、標的化配列は配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）であり、Ｚは２４である。他の実施形態では、Ｔは
【化９】
2019525742.tif 000010
であり、標的化配列は配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）であり、Ｚは２０である。他の実施形態では、Ｔは、
【化１０】
2019525742.tif 000011
であり、標的化配列は配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）であり、Ｚは２３である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化１１】
2019525742.tif 000012
であり、標的化配列は配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）であり、Ｚは２６である。他の実施形態では、Ｔ
【化１２】
2019525742.tif 000013
であり、標的化配列は配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）であり、Ｚは２６である。
【００２３】
別の態様では、本開示は：
【化１３】
2019525742.tif 000014
（表中の、１〜２６および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表１】
2019525742.tif 000015
）
および
【化１４】
2019525742.tif 000016
（表中の、１〜２２および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表２】
2019525742.tif 000017
）
および
【化１５】
2019525742.tif 000018
（表中の、１〜２５および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表３】
2019525742.tif 000019
）
および
【化１６】
2019525742.tif 000020
（表中の、１〜２８および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表４】
2019525742.tif 000021
）
および
【化１７】
2019525742.tif 000022
（表中の、１〜２８および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表５】
2019525742.tif 000023
）
からなる群より選択されるアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を提供し、化合物１〜５それぞれについて、Ａは
【化１８】
2019525742.tif 000024
であり、Ｃは
【化１９】
2019525742.tif 000025
であり、Ｇは
【化２０】
2019525742.tif 000026
であり、Ｔは
【化２１】
2019525742.tif 000027
である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化２２】
2019525742.tif 000028
である。
【００２５】
一実施形態では、本開示は構造：
【化２３】
2019525742.tif 000029
のアンチセンスオリゴマーＳＲＰ−４０４５（ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎ）を提供する。
【００２６】
明確にするため、例えば上のｃａｓｉｍｅｒｓｅｎの構造を含めた本開示の構造は５’から３’まで連続したものであり、構造全体をコンパクトな形態で図示する都合上、「中断Ａ」および「中断Ｂ」と表示される様々な図の中断が含まれている。当業者であれば理解されるように、例えば「中断Ａ」という表示はそれぞれ、構造の図がその地点で連続していることを示す。当業者には、上の構造の「中断Ｂ」の場合もそれぞれ同じことが当てはまることが理解される。しかし、図の中断はいずれも、上の構造が実際に不連続であることを示すことを意図するものではなく、また当業者にも、図の中断がそのような意味を有するものと理解されるものではない。
【００２７】
別の実施形態では、本開示は、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるアニーリング部位と命名されるジストロフィン遺伝子のエクソン４５標的領域に相補的な少なくとも１０個、１１個、１２個、１５個、１７個、２０個、２２個、２５個、２６個、２８個または３０個の連続する塩基を含む長さ２２〜３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーに関するものであり、ここでは、アンチセンスオリゴマーはエクソン４５スキッピングを誘導するアニーリング部位に相補的である。
【００２８】
別の態様では、本開示は、配列番号１〜５からなる群より選択される配列の少なくとも１０個、１１個、１２個、１５個、１７個、２０個、２２個、２５個、２６個、２８個または３０個の連続する塩基を含む長さ２２〜３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーに関するものであり、ここでは、アンチセンスオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５標的領域に相補的であり、エクソン４５スキッピングを誘導する。一実施形態では、配列番号１〜５の中のチミン塩基は必要に応じてウラシルである。
【００２９】
本開示は、エクソン４５に標的化した例示的アンチセンスオリゴマー、例えば以下で識別される標的化配列を有するものなどを含む。
ａ）Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）；
ｂ）Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）；
ｃ）Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｄ）Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｅ）Ｈ４５Ａ（−１２＋１６）配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）。
【００３０】
一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１などのアニーリング部位Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）に相補的である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号２などのアニーリング部位Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）に相補的である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号３などのアニーリング部位Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）に相補的である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号４などのアニーリング部位Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）に相補的である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号５などのアニーリング部位Ｈ４５Ａ（−１２＋１６）に相補的である。
【００３１】
別の態様では、本開示は、上記のアンチセンスオリゴマーと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のアンチセンスオリゴマーと、リン酸緩衝剤を含む食塩溶液とを含む、医薬組成物を提供する。
【００３２】
別の態様では、本開示は、特定のタンパク質をコードする遺伝子に変異がありエクソンスキッピングによって変異の作用を打ち消すことができる遺伝性疾患に罹患している患者を治療する方法であって、（ａ）本明細書に記載される方法に従ってアンチセンス分子を選択するステップ；および（ｂ）そのような治療を必要とする患者にその分子を投与するステップを含む、方法を提供する。本開示は、遺伝性疾患の治療のための薬物の製造への本開示の精製したアンチセンスオリゴマーの使用にも対処する。
【００３３】
別の態様では、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）またはベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを特徴とする状態を治療する方法であって、患者の特定の遺伝子病変に対して適宜設計した本開示のアンチセンスオリゴマーをその患者に有効量投与することを含む、方法を提供する。さらに、本開示は、アンチセンスオリゴマーまたはこれらの生物学的分子を１つもしくは複数含む医薬組成物を患者に有効量投与することにより患者に予防的治療を実施して、デュシェンヌ型筋ジストロフィーまたはベッカー型筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーを予防する、または最小限に抑える方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする対象のデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法を提供し、ここでは、対象はエクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、対象に本開示のアンチセンスオリゴマーを投与することを含む。
【００３５】
別の態様では、本開示は、エクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有する対象にジストロフィンを産生させる方法であって、対象に本開示のアンチセンスオリゴマーを投与することを含む、方法を提供する。
【００３６】
別の態様では、本開示は、遺伝性疾患を治療するためのキットも提供し、このキットは、適切な容器に包装された少なくとも１つの本開示のアンチセンスオリゴマーと、その使用のための指示とを含む。
【００３７】
上記およびその他の目的および特徴については、以下の本開示の詳細な説明を図面と併せて読めばさらに十全に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】正常なジストロフィンプレｍＲＮＡのセクションを示す図である。
【図２】異常なジストロフィンプレｍＲＮＡ（ＤＭＤの例）のセクションを示す図である。
【図３】エクソン５１をスキップし、プレｍＲＮＡの「インフレーム」リーディングを回復させるよう設計したｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（開示の詳細な説明）
本開示の諸実施形態は一般に、ヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導するよう特異的に設計された改善されたアンチセンス化合物およびその使用方法に関する。ジストロフィンは筋肉の機能に極めて重要な役割を果たしており、筋肉に関連する様々な疾患は変異型のジストロフィン遺伝子を特徴とする。このため、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される改善されたアンチセンス化合物は、変異型のヒトジストロフィン遺伝子、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）にみられる変異ジストロフィン遺伝子などにエクソンスキッピングを誘導するものである。
【００４０】
これらの変異ヒトジストロフィン遺伝子は、変異により引き起こされる異常なｍＲＮＡスプライシング事象により、欠陥のあるジストロフィンタンパク質を発現するか、測定可能なジストロフィンを全く発現せず、ある状態が様々な形態の筋ジストロフィーをもたらす。この状態を治療するため、本開示のアンチセンス化合物は変異ヒトジストロフィン遺伝子のプロセシング前のＲＮＡの選択した領域とハイブリダイズし、別途異常にスプライスされるジストロフィンｍＲＮＡにエクソンスキッピングおよび差次的スプライシングを誘導し、それにより筋細胞に機能性ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ転写物を産生させる。ある特定の実施形態では、得られるジストロフィンタンパク質は必ずしも「野生型」のジストロフィンであるわけではなく、むしろ短縮されているが、それでも機能型または半機能型のジストロフィンである。
【００４１】
筋細胞内の機能性ジストロフィンタンパク質のレベルを増大させることにより、これらおよび関連する実施形態は筋ジストロフィー、特に、異常なｍＲＮＡスプライシングに起因する欠陥ジストロフィンタンパク質の発現を特徴とするＤＭＤおよびＢＭＤなどの形態の筋ジストロフィーの予防および治療に有用である。本明細書に記載される特異的オリゴマーはさらに、使用におけるジストロフィンエクソン特異的標的化が他のオリゴマーより改善されており、それにより、関連する形態の筋ジストロフィーの別の治療方法より重要性および実用性の面で優れた利点をもたらす。
【００４２】
したがって、本開示は、選択した標的と結合してヒトジストロフィン遺伝子にエクソンスキッピングを誘導することが可能な長さ２２〜３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーに関するものであり、ここでは、アンチセンスオリゴマーは、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるエクソン４５標的領域に相補的な一続きの塩基を含み、オリゴマーの塩基はモルホリノ環構造と結合しており、モルホリノ環構造は、１つの環構造のモルホリノ窒素と、隣接する環構造の５’環外炭素とを連結するリン含有サブユニット間結合により連結されている。一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号１〜５と命名される一続きの塩基を含む。
【００４３】
本開示は、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるアニーリング部位と命名されるジストロフィン遺伝子のエクソン４５標的領域に相補的な少なくとも１０個、１２個、１５個、１７個、２０個またはそれより多い連続する塩基を含む、長さ２２〜３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーにも関する。
【００４４】
本開示のその他のアンチセンスオリゴマーは、長さ２２〜３０サブユニットであり、配列番号１〜５の少なくとも１０個、１２個、１５個、１７個、２０個またはそれより多い連続する塩基を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１〜５の中のチミン塩基は必要に応じてウラシルである。
【００４５】
本開示の例示的アンチセンスオリゴマーには、以下に記載されるものがある：
ａ）Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）；
ｂ）Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）；
ｃ）Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｄ）Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｅ）Ｈ４５Ａ（−１２＋１６）配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）。
【００４６】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施または検査には、本明細書に記載されるものと類似した、または等価の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料を記載する。本開示を目的として、これより以下の用語を以下で定義する。
【００４７】
Ｉ．定義
「約」は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％だけばらつきのある数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量または長さを意味する。
【００４８】
本明細書で対象または患者に関して使用される「エクソン４５スキッピングを受け易い」は、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５のスキッピングがないとリーディングフレームがアウトオブフレームになり、それによりプレｍＲＮＡの翻訳が妨害され、対象または患者がジストロフィンを産生することができなくなる、ジストロフィン遺伝子に１つまたは複数の変異を有する、対象および患者を包含するものとする。エクソン４５スキッピングを受け易い以下のジストロフィン遺伝子のエクソンの変異の非限定的な例としては、例えば、エクソン７〜４４、エクソン１２〜４４、エクソン１８〜４４、エクソン４４、エクソン４６、エクソン４６〜４７、エクソン４６〜４８、エクソン４６〜４９、エクソン４６〜５１、エクソン４６〜５３、エクソン４６〜５５、エクソン４６〜５７、エクソン４６〜５９、エクソン４６〜６０、エクソン４６〜６７、エクソン４６〜６９、エクソン４６〜７５またはエクソン４６〜７８の欠失が挙げられる。ある患者がエクソンスキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有するかどうかの判定は、当業者の理解の範囲内に十分に収まるものである（例えば、Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら，（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．３０：２９３−２９９，Ｇｕｒｖｉｃｈら，Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２００９；３０（４）６３３−６４０およびＦｌｅｔｃｈｅｒら，（２０１０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８（６）１２１８−１２２３を参照されたい）。
【００４９】
「アンチセンスオリゴマー」および「オリゴマー」という用語は互換的に使用され、サブユニット間結合によって連結した一続きの環状サブユニットを指し、各環状サブユニットは：（ｉ）リボース糖またはその誘導体；および（ｉｉ）塩基対形成部分の順序がワトソン・クリック型塩基対形成により核酸（通常、ＲＮＡ）内の標的配列に相補的な塩基配列を形成して標的配列内で核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成するよう、それと結合した塩基対形成部分からなる。ある特定の実施形態では、オリゴマーはＰＭＯである。他の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは２’−Ｏ−メチルホスホロチオアートである。他の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋化核酸（ＥＮＡ）などの架橋化核酸（ＢＮＡ）である。ほかの例示的実施形態については以下に記載する。
【００５０】
以前はコード名「ＳＰＲ−４０４５」で知られていた「ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎ」とは、塩基配列５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号２）を有するＰＭＯのことである。ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎはＣＡＳ登録番号１４２２９５９−９１−８で登録されている。化学名としては：ａｌｌ−Ｐ−ａｍｂｏ−［Ｐ，２’，３’−トリデオキシ−Ｐ−（ジメチルアミノ）−２’，３’−イミノ−２’，３’−ｓｅｃｏ］（２’ａ→５’）（Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ）５’−［４−（｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ｝カルボニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルピペラジン−１−ホスホノアミダート（phosphonamidate）］が挙げられる。ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎは以下の化学構造：
【化２４】
2019525742.tif 000030
；および
【化２５】
2019525742.tif 000031
（表中の、１〜２２および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表６】
2019525742.tif 000032
）
および
【化２６】
2019525742.tif 000033
を有する。
【００５１】
配列５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’は配列番号２として記載される。
【００５２】
「相補的」および「相補性」という用語は、ワトソン・クリック型塩基対形成の法則により互いに関連し合う２個以上のポリヌクレオチド（すなわち、一続きのヌクレオチド）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’→３’）」は配列「Ａ−Ｃ−Ｔ（３’→５’）」に相補的である。相補性は「部分的」なものであり得、この場合、所与の標的化ポリヌクレオチドの全部に満たない数の核酸塩基が塩基対形成の法則に従って標的ポリヌクレオチドとマッチする。あるいは、所与の標的化ポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとの間に「全面的」または「完全」な（１００％の）相補性が存在し、例が続くこともある。核酸鎖間の相補性の高さは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに大きな影響を及ぼす。
【００５３】
「有効量」または「治療有効量」は、単回投与として、または一連の投与の一部として哺乳動物対象に投与され、所望の治療効果を得るのに有効なアンチセンスオリゴマーなどの治療用化合物の量を指す。アンチセンスオリゴマーでは、この効果は通常、選択した標的配列の翻訳または自然なスプライスプロセシングの阻害によってもたらされる。
【００５４】
アンチセンスオリゴマーでは、この効果は通常、選択した標的配列の翻訳もしくは自然なスプライスプロセシングの阻害または臨床的に意義のある量のジストロフィンの産生（統計的有意）によってもたらされる。いくつかの実施形態では、有効量は、対象を治療する一定期間の間、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。いくつかの実施形態では、対象のジストロフィン陽性線維の数を正常の少なくとも２０％まで増大させる有効量は、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。ある特定の実施形態では、患者の歩行距離を例えば６  ＭＷＴで健常な同等者に対して２０％の不足から安定化、維持または改善する有効量は、アンチセンスオリゴマーを含む少なくとも２０ｍｇ／ｋｇの組成物である。様々な実施形態では、有効量は、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、有効量は、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇである。別の態様では、有効量は、少なくとも２４週間、少なくとも３６週間または少なくとも４８週間にわたって少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇであり、それにより、対象のジストロフィン陽性線維の数が正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％に増大し、患者の歩行距離が例えば６  ＭＷＴで健常な同等者に対して２０％の不足から安定化または改善する。いくつかの実施形態では、治療により患者のジストロフィン陽性線維の数が正常の２０〜６０％または３０〜５０％に増大する。
【００５５】
「増強する」もしくは「増強すること」、「増大させる」もしくは「増大させること」または「刺激する」もしくは「刺激すること」は一般に、１つまたは複数のアンチセンス化合物または医薬組成物が、アンチセンス化合物がない場合に、または対照化合物によって引き起こされる反応と比較して、細胞または対象の生理反応（すなわち、下流の作用）の増大を生じさせる、または引き起こすことができることを指す。測定可能な生理反応としては、当該技術分野での理解および本明細書の記載から明らかな反応の中でも特に、機能型ジストロフィンタンパク質の発現増大または筋組織のジストロフィン関連生物活性の増大を挙げ得る。筋機能の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大または改善を含めた筋機能の増大も測定することができる。筋線維のジストロフィン発現の約１％、２％、％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％の増大を含めた機能性ジストロフィンを発現する筋線維の割合も測定することができる。例えば、線維の２５〜３０％がジストロフィンを発現すれば、筋機能に約４０％の改善がみられることが示されている（例えば、ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１２９７９−１２９８４，２００２を参照されたい）。「増大した」または「増強された」量は通常、「統計的に有意な」量であり、アンチセンス化合物がない場合に（薬剤の不在下で）または対照化合物によってもたらされる量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれより高い倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（間のおよび１より大きいあらゆる整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増大がこれに含まれ得る。
【００５６】
本明細書で使用される「機能」および「機能性」などの用語は、生物学的、酵素的または治療的機能を指す。
【００５７】
「機能性」ジストロフィンタンパク質は一般に、通常ＤＭＤまたはＢＭＤを有する特定の対象に存在する変化型または「欠陥」型のジストロフィンタンパク質と比較して、筋ジストロフィーの別の特徴である進行性の筋組織分解を抑えるのに十分な生物活性を有するジストロフィンタンパク質を指す。ある特定の実施形態では、機能性ジストロフィンタンパク質は、当該技術分野で日常的な技術による測定で、野生型ジストロフィンのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（間のあらゆる整数を含む）の生物活性を有し得る。一例として、筋管の大きさ、筋原線維の組織化（または組織崩壊）、収縮活動およびアセチルコリン受容体の自発的クラスター形成により筋培養物のジストロフィン関連活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１１２：２０９−２１６，１９９９を参照されたい）。動物モデルも疾患の病因の研究に価値ある資源であり、ジストロフィン関連活性を試験する手段を提供する。ＤＭＤの研究に最も広く用いられている２種類の動物モデルが、ｍｄｘマウスとゴールデンレトリーバー筋ジストロフィー（ＧＲＭＤ）イヌであり、ともにジストロフィン陰性である（例えば、ＣｏｌｌｉｎｓおよびＭｏｒｇａｎ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ  ８４：１６５−１７２，２００３を参照されたい）。上記およびその他の動物モデルを用いて様々なジストロフィンタンパク質の機能活性を測定することができる。短縮型のジストロフィン、例えば本開示の特定のエクソンスキッピングアンチセンス化合物によって生じる短縮型が含まれる。
【００５８】
「ミスマッチ（１つまたは複数）」という用語は、ポリヌクレオチド配列内にあり塩基対形成の法則に従い標的ポリヌクレオチドとマッチしない１個または複数個のヌクレオチド（連続しているか、分離しているかを問わない）を指す。完全な相補性が望まれることが多いが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して１つまたは複数、好ましくは６つ、５つ、４つ、３つ、２つまたは１つのミスマッチを含み得る。オリゴマー内の任意の位置にある変種（variation）が含まれる。ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、内部の末端の変種付近の配列に変種を含み、それが存在する場合、通常、５’末端および／または３’末端の約６個、５個、４個、３個、２個または１個以内のヌクレオチドである。
【００５９】
「モルホリノ」、「モルホリノオリゴマー」または「ＰＭＯ」という用語は、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されている以下の一般構造：
【化２７】
2019525742.tif 000034
のホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを指す。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造のあらゆる立体異性体および立体配置を包含するものとする。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性については米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、上記の特許はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、モルホリノをオリゴマーの５’末端または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートして、その安定性および／または溶解性を増大させる。例示的テールとしては：
【化２８】
2019525742.tif 000035
が挙げられる。
【００６１】
「薬学的に許容される」という語句は、物質または組成物が、製剤を構成する他の成分および／またはそれで治療する対象と化学的かつ／または毒物学的に適合性があるものでなければならないことを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、任意のタイプの無毒性で不活性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、封入材料または製剤助剤を意味する。薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例として、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；セルロースおよび、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；無発熱物質水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液ならびにその他の無毒性で適合性のある滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどがあり、製剤者の判断により、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および着香剤、保存剤および抗酸化剤が組成物中に存在してもよい。
【００６３】
ジストロフィンの合成または産生の「回復」という用語は一般に、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーで治療した後、筋ジストロフィー患者に短縮型のジストロフィンを含めたジストロフィンタンパク質が産生されることを指す。いくつかの実施形態では、治療により患者の新たなジストロフィン産生が１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％（間のあらゆる整数を含む）増大する。いくつかの実施形態では、治療により対象のジストロフィン陽性線維の数が正常の少なくとも２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９５％〜１００％まで増大する。他の実施形態では、治療により対象のジストロフィン陽性線維の数が正常の約２０％〜約６０％または約３０％〜約５０％まで増大する。治療後の患者のジストロフィン陽性線維のパーセントは、既知の技術を用いて筋生検により求めることができる。例えば、患者の上腕二頭筋などの適切な筋肉から筋生検試料を採取し得る。
【００６４】
治療前および／または治療後あるいは治療過程全体を通じた複数の時点でジストロフィン陽性線維の割合の解析を実施し得る。いくつかの実施形態では、治療前の生検と反対側の筋肉から治療後の生検試料を採取する。ジストロフィンに適した任意のアッセイを用いて治療前および治療後のジストロフィン発現試験を実施し得る。いくつかの実施形態では、筋生検から得た組織切片にジストロフィンのマーカーとなるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの抗体を用いて免疫組織化学的検出を実施する。例えば、高感度のジストロフィンマーカーであるＭＡＮＤＹＳ１０６抗体を使用することができる。任意の適切な二次抗体を使用し得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、陽性線維の数をカウントした総線維数で除することによりジストロフィン陽性線維のパーセントを算出する。正常な筋試料ではジストロフィン陽性線維が１００％である。したがって、ジストロフィン陽性線維のパーセントを正常に対する割合で表すことができる。治療前の筋肉および復帰変異体線維中の微量のジストロフィンの存在について検査して、治療後の筋肉中のジストロフィン陽性線維をカウントする際に、各患者の治療前の筋肉の切片を用いてベースラインを設定することができる。これをその患者の治療後の筋肉の切片に存在するジストロフィン陽性線維をカウントする際の閾値として使用し得る。他の実施形態では、Ｂｉｏｑｕａｎｔ画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ社、ナッシュビル、テネシー州）を用いるジストロフィン定量に抗体で染色した組織切片を使用することもできる。総ジストロフィン蛍光シグナル強度を正常に対する割合で報告することができる。さらに、モノクローナルまたはポリクローナル抗ジストロフィン抗体によるウエスタンブロット解析を用いてジストロフィン陽性線維の割合を求めることができる。例えば、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ社の抗ジストロフィン抗体ＮＣＬ−Ｄｙｓ１を使用し得る。サルコグリカン複合体（β、γ）および／またはニューロンＮＯＳの成分の発現を求めることによりジストロフィン陽性線維の割合を解析することもできる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーでの治療により、治療を実施しない場合にＤＭＤ患者に予想される進行性の呼吸筋機能障害および／または呼吸筋不全が緩徐化または軽減される。いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーでの治療により、治療を実施しない場合に予想される呼吸補助の必要性が軽減または除去され得る。いくつかの実施形態では、疾患の経過を追跡する呼吸機能測定値および治療的介入の可能性の評価に最大吸気圧（ＭＩＰ）、最大呼気圧（ＭＥＰ）および努力肺活量（ＦＶＣ）を含める。ＭＩＰおよびＭＥＰはそれぞれ、人が吸息時および呼息時に発生させることができる圧力のレベルを測定するものであり、感度の高い呼吸筋力の尺度である。ＭＩＰは横隔膜筋力低下の尺度の１つである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＭＩＰおよびＦＶＣを含めた他の肺機能検査値が変化する前にＭＥＰが低下し得る。ある特定の実施形態では、ＭＥＰを呼吸機能障害の初期の指標とし得る。ある特定の実施形態では、ＦＶＣを用いて、最大吸息後の努力呼息時に排出される空気の総体積を測定し得る。ＤＭＤ患者では、１０代前半までＦＶＣが身体成長に伴って増大する。しかし、疾患進行により成長の低下または成長停止が起こると、筋力低下が進行し、肺活量が下降期に入り、１０〜１２歳を過ぎてから年間約８〜８．５パーセントの平均速度で低下する。ある特定の実施形態では、ＭＩＰの予測パーセント（体重に合わせて調整したＭＩＰ）、ＭＥＰの予測パーセント（年齢に合わせて調整したＭＥＰ）およびＦＶＣの予測パーセント（年齢および身長に合わせて調整したＦＶＣ）を補助的解析とする。
【００６８】
本明細書で使用される「対象」は、本開示のアンチセンス化合物で治療することができる症状を呈するか、そのような症状を呈するリスクがある任意の動物、例えばＤＭＤもしくはＢＭＤまたはこれらの状態に関連するいずれかの症状（例えば、筋線維の減少）を有するか、これを有するリスクがある対象を包含する。適切な対象（患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、家畜および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が挙げられる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者が含まれる。エクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子に変異を有する対象にジストロフィンを産生させる方法も含まれる。
【００６９】
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」とは、対象または細胞の自然な過程を変化させるために用いる任意のタイプの介入のことである。治療は、特に限定されないが、オリゴマーまたはその医薬組成物の投与を含み、予防として、または病的事象の開始もしくは病原体との接触の後に実施し得る。治療には、特定の形態の筋ジストロフィーのようなジストロフィンタンパク質に関連する疾患または状態の症状または病変に対する任意の所望の効果が含まれ、例えば、治療する疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の変化または改善が含まれ得る。治療する疾患もしくは状態の進行速度の低下、その疾患もしくは状態の発症の遅延またはその発症の重症度の軽減を対象とし得る「予防的」治療も含まれる。「治療」または「予防」は、必ずしも疾患もしくは状態またはその関連症状を完全に根絶、治癒または予防することを表すものではない。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーでの治療により、治療を実施しない場合に予想される、または治療を実施しない場合に予想される新たなジストロフィン産生が増大し、疾患進行が遅延し、歩行能力低下の緩徐化もしくは軽減がみられ、筋炎が軽減され、筋肉損傷が軽減され、筋機能が改善され、肺機能低下が軽減され、かつ／または筋再生が増強される。いくつかの実施形態では、治療により疾患進行が維持される、遅延する、または緩徐化する。いくつかの実施形態では、治療により歩行が維持される、または歩行低下が軽減される。いくつかの実施形態では、治療により肺機能が維持される、または肺機能低下が軽減される。いくつかの実施形態では、治療により、例えば６分間歩行検査（６ＭＷＴ）により測定される患者の安定歩行距離が維持される、または増大する。いくつかの実施形態では、治療により、１０メートル歩く／走るのにかかる時間（すなわち、１０メートル歩行／走検査）が維持または短縮される。いくつかの実施形態では、治療により、仰臥位から起立するのにかかる時間（すなわち、起立時間検査）が維持または短縮される。いくつかの実施形態では、治療により、４段の標準階段を昇るのにかかる時間（すなわち、４段昇段検査）が維持または短縮される。いくつかの実施形態では、治療により、例えばＭＲＩ（例えば、脚筋のＭＲＩ）により測定される患者の筋炎が維持または軽減される。いくつかの実施形態では、ＭＲＩによりＴ２および／または脂肪含有率を測定して筋変性を確認する。ＭＲＩにより炎症、浮腫、筋損傷および脂肪浸潤を原因とする筋肉の構造および組成の変化を確認することができる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーでの治療により新たなジストロフィン産生が増大し、治療を実施しない場合に予想される歩行低下が緩徐化または軽減される。例えば、治療により対象の歩行能力が安定化し得る、維持され得る、改善され得る、または増大し得る（例えば、歩行の安定化）。いくつかの実施形態では、治療により、例えばＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ，２０１０；４２：９６６−７４、参照により本明細書に組み込まれる）により記載されている６分間歩行検査（６ＭＷＴ）により測定される患者の安定歩行距離が維持される、または増大する。６分間歩行距離（６ＭＷＤ）の変化は絶対値、割合の変化または％予測値の変化で表され得る。いくつかの実施形態では、治療により、６ＭＷＴでの患者の安定歩行距離が健常な同等者に対して２０％の不足から維持または改善される。％予測値を算出することにより、６ＭＷＴでの健常な同等者の典型的な成績と比較したＤＭＤ患者の成績を求めることができる。例えば、男性には以下の方程式：１９６．７２＋（３９．８１×年齢）−（１．３６×年齢２）＋（１３２．２８×身長（メートル））を用いて％予測６ＭＷＤを算出し得る。女性には以下の方程式：１８８．６１＋（５１．５０×年齢）−（１．８６×年齢２）＋（８６．１０×身長（メートル））を用いて％予測６ＭＷＤを算出し得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎら，ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーでの治療により、患者の安定歩行距離がベースラインから３メートル、５メートル、６メートル、７メートル、８メートル、９メートル、１０メートル、１５メートル、２０メートル、２５メートル、３０メートルまたは５０メートル（間のあらゆる整数を含む）超まで増大する。
【００７２】
ＤＭＤ患者の筋機能低下は、正常な小児の成長および発育を背景に起こり得る。実際、ＤＭＤを有する低年齢の小児では、進行性の筋機能障害があるにもかかわらず、約１年間にわたって６ＭＷＴでの歩行距離の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＤ患者の６ＭＷＤを通常の発育がみられる対照被験者ならびに年齢および性別が一致する被験者の既存の標準データと比較する。いくつかの実施形態では、年齢と身長に基づく方程式を標準データに当てはめて用い、正常な成長および発育を説明することができる。このような方程式を用いて、ＤＭＤを有する被験者の６ＭＷＤをパーセント予測（％予測）値に変換することができる。ある特定の実施形態では、％予測６ＭＷＤデータの解析が正常な成長および発育を説明する方法を表わし、低年齢（例えば、７歳以下）時の機能増大が、ＤＭＤ患者の能力の改善ではなく安定を表すことを示すものとなり得る（Ｈｅｎｒｉｃｓｏｎら，ＰＬｏＳ  Ｃｕｒｒ．，２０１２，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
異なるアンチセンス分子を識別するため、アンチセンス分子の命名法が提唱され公開されている（Ｍａｎｎら，（２００２）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｅｄ  ４，６４４−６５４を参照されたい）。この命名法は、いずれも下に示す同じ標的領域に向けられたわずかに異なる複数のアンチセンス分子を試験する際に特に適当なものとなった：
Ｈ＃Ａ／Ｄ（ｘ：ｙ）。
【００７４】
１番目の文字は種（例えば、Ｈ：ヒト、Ｍ：マウス、Ｃ：イヌ）を表す。「＃」は標的ジストロフィンエクソンの番号を表す。「Ａ／Ｄ」は、エクソンの先頭および末尾にあるアクセプタースプライス部位またはドナースプライス部位をそれぞれ表す。（ｘ  ｙ）はアニーリング座標を表し、座標中、「−」または「＋」はそれぞれイントロン配列またはエクソン配列を表す。例えば、Ａ（−６＋１８）は、標的エクソンに先行するイントロンの最後の６塩基および標的エクソンの最初の１８塩基を表す。最も近いスプライス部位がアクセプターであると、その座標の前には「Ａ」が記載される。ドナースプライス部位でのアニーリング座標を記述すればＤ（＋２−１８）となり、座標中、最後の２個のエクソン塩基および最初の１８個のイントロン塩基がアンチセンス分子のアニーリング部位に対応する。全体がエクソンでありＡ（＋６５＋８５）により表されるアニーリング座標は、そのエクソンの先頭から６５番目のヌクレオチドと８５番目のヌクレオチドの間にある部位である。
【００７５】
ＩＩ．アンチセンスオリゴマー
Ａ．エクソン４５スキッピングを誘導するよう設計したアンチセンスオリゴマー
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５標的領域に相補的であり、エクソン４５スキッピングを誘導する。特に、本開示は以下のもの：Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）から選択されるアニーリング部位と命名されるジストロフィン遺伝子のエクソン４５標的領域に相補的な少なくとも１０個、１２個、１５個、１７個、２０個、２５個またはそれより多い連続するヌクレオチドを含む、長さ２２〜３０サブユニットのアンチセンスオリゴマーに関する。アンチセンスオリゴマーはアニーリング部位に相補的であり、エクソン４５スキッピングを誘導する。
【００７６】
本開示のアンチセンスオリゴマーは、ジストロフィンプレｍＲＮＡを標的としてエクソン４５のスキッピングを誘導し、このため、スプライスされた成熟ｍＲＮＡ転写物からエクソン４５が排除またはスキップされる。エクソン４５をスキップすることにより、崩壊していたリーディングフレームがインフレーム変異に回復する。ＤＭＤは様々な遺伝子サブタイプからなるが、本開示のアンチセンスオリゴマーはジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４５をスキップするよう特異的に設計されたものである。エクソン４５のスキッピングを受け易いＤＭＤ変異は、エクソン４５に隣接するエクソンの欠失を含み（すなわち、エクソン４４またはエクソン４６の欠失を含む）、ＤＭＤ患者の１つのサブグループ（８％）を構成する。
【００７７】
エクソン４５スキッピングを誘導するＰＭＯの配列は、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４５内にある特定の標的配列に相補的になるよう設計されている。ＰＭＯ内の各モルホリノ環は、例えばＤＮＡにみられる核酸塩基（アデニン、シトシン、グアニンおよびチミン）を含めた核酸塩基と結合している。
【００７８】
Ｂ．オリゴマーの化学的特徴
本開示のアンチセンスオリゴマーは様々なアンチセンス化学を用いることができる。オリゴマー化学の例としては、特に限定されないが、モルホリノオリゴマー、ホスホロチオアート修飾オリゴマー、２’Ｏ−メチル修飾オリゴマー、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオアートオリゴマー、２’Ｏ−ＭＯＥ修飾オリゴマー、２’−フルオロ修飾オリゴマー、２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン−架橋化核酸（ＥＮＡ）、トリシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡホスホロチオアートヌクレオチド、２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］修飾オリゴマーが挙げられ、上記のいずれかのものの組合せもこれに含まれる。ホスホロチオアート化学と２’−Ｏ−Ｍｅ−修飾化学を組み合わせて２’Ｏ−Ｍｅ−ホスホロチオアート主鎖を作製することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１３／１１２０５３号および同第２００９／００８７２５号を参照されたい。本開示のオリゴマー化学の例示的実施形態について以下でさらに記載する。
【００７９】
１．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
ペプチド核酸（ＰＮＡ）とは、主鎖がデオキシリボース主鎖と構造的に同形であり、ピリミジン塩基またはプリン塩基が結合したＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなるＤＮＡ類似体のことである。天然のピリミジン塩基およびプリン塩基が含まれるＰＮＡは、ワトソン・クリック型塩基対形成の法則に従い相補的なオリゴマーとハイブリダイズし、塩基対認識の点でＤＮＡを模倣する（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｂｕｃｈａｒｄｔら，１９９３）。ＰＮＡの主鎖はホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成され、このため、ＰＮＡはアンチセンス用途によく適している（下の構造を参照されたい）。主鎖は非荷電であるため、通常よりも高い熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖が生じる。ＰＮＡはヌクレアーゼにもプロテアーゼにも認識されない。ＰＮＡの非限定的な例を下に図示する：
【化２９】
2019525742.tif 000036
【００８０】
ＰＮＡは、天然の構造への根本的な構造変化であるにもかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡと配列特異的にらせん形に結合することができる。ＰＮＡの特徴としては、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、単一塩基ミスマッチによる不安定化作用、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する耐性、塩濃度とは無関係なＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーションおよびホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が挙げられる。ＰＡＮＡＧＥＮＥ（商標）社は、その専有のＢｔｓ  ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール−２−スルホニル基）および専有のオリゴマー化プロセスを開発した。Ｂｔｓ  ＰＮＡモノマーを用いるＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリングおよびキャッピングの反復サイクルからなるものである。ＰＮＡは、当該技術分野で公知の任意の技術を用いて合成により作製することができる。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、同第７，２１１，６６８号、同第７，０２２，８５１号、同第７，１２５，９９４号、同第７，１４５，００６号および同第７，１７９，８９６号を参照されたい。ＰＮＡの調製については、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号も参照されたい。さらに、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００，１９９１にはＰＮＡ化合物の教示をみることができる。上記のものはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
【００８１】
２．ロックト核酸（ＬＮＡ）
アンチセンスオリゴマー化合物には「ロックト核酸」サブユニット（ＬＮＡ）も含まれ得る。「ＬＮＡ」は、架橋化核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾クラスのメンバーである。ＢＮＡは、リボース環の立体配座をＣ３０−ｅｎｄｏ（ノーザン）糖パッカリングに固定する共有結合を特徴とする。ＬＮＡでは、架橋が２’−Ｏ位と４’−Ｃ位の間のメチレンからなる。ＬＮＡは、主鎖の事前組織化および塩基スタッキングを促進してハイブリダイゼーションおよび熱安定性を増大させる。
【００８２】
ＬＮＡの構造は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷｅｎｇｅｌら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９８）４５５；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８）５４：３６０７，およびＡｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９９）３２：３０１）；Ｏｂｉｋａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９７）３８：８７３５；（１９９８）３９：５４０１およびＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１６：９２３０にみることができる。ＬＮＡの非限定的な例を下に図示する：
【化３０】
2019525742.tif 000037
【００８３】
本開示の化合物は１つまたは複数のＬＮＡが組み込まれていてよく；いくつかの場合には、化合物は完全にＬＮＡからなるものであってよい。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成およびオリゴマーへのそれの組込みの方法は、例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれる米国特許第７，５７２，５８２号、同第７，５６９，５７５号、同第７，０８４，１２５号、同第７，０６０，８０９号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第６，７９４，４９９号および同第６，６７０，４６１号に記載されている。典型的なサブユニット間リンカーとしてはホスホジエステル部分およびホスホロチオアート部分が挙げられ；あるいは、非リン含有リンカーを用いてもよい。さらなる実施形態は、各ＬＮＡサブユニットがＤＮＡサブユニットによって隔てられているＬＮＡ含有化合物を含む。特定の化合物は、交互に並ぶＬＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットとからなり、サブユニット間リンカーがホスホロチオアートである。
【００８４】
２’Ｏ，４’Ｃ−エチレン−架橋化核酸（ＥＮＡ）はＢＮＡクラスのまた別のメンバーである。非限定的な例を下に図示する：
【化３１】
2019525742.tif 000038
【００８５】
ＥＮＡオリゴマーおよびその調製については、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＯｂｉｋａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｔｔ  ３８（５０）：８７３５に記載されている。本開示の化合物は１つまたは複数のＥＮＡサブユニットが組み込まれていてよい。
【００８６】
３．ホスホロチオアート
「ホスホロチオアート」（またはＳオリゴ）は、非架橋酸素の１つが硫黄に置き換わった通常のＤＮＡのバリアントである。ホスホロチオアートの非限定的な例を下に図示する：
【化３２】
2019525742.tif 000039
【００８７】
ヌクレオチド間結合の硫化により、５’〜３’および３’〜５’ＤＮＡ  ＰＯＬ  １エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１およびＰ１、ＲＮａｓｅ、血清ヌクレアーゼならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含めたエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの作用が低下する。ホスホロチオアートは、２つの主要な経路によって、すなわち、二硫化炭素中の元素硫黄の溶液のホスホン酸水素に対する作用によって、または亜リン酸トリエステルをテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ−１，２−ベンソジチオール（ｂｅｎｓｏｄｉｔｈｉｏｌ）−３−オン１，１−ジオキシド（ＢＤＴＤ）で硫化する方法によって作製される（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＩｙｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，４６９３−４６９９，１９９０を参照されたい）。後者の方法では、元素硫黄が大部分の有機溶媒に不溶性であることおよび二硫化炭素の毒性という問題点が回避される。ＴＥＴＤ法およびＢＤＴＤ法でもさらに高純度のホスホロチオアートが得られる。
【００８８】
４．トリシクロ−ＤＮＡおよびトリシクロ−ホスホロチオアートヌクレオチド
トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃ−ＤＮＡ）は、主鎖の配座柔軟性を制限し、ねじれ角γの主鎖構造を最適化するため各ヌクレオチドがシクロプロパン環の導入により修飾されている、制約のあるＤＮＡ類似体のクラスである。ホモ塩基性のアデニン含有ｔｃ−ＤＮＡおよびチミン含有ｔｃ−ＤＮＡは、相補的なＲＮＡと極めて安定なＡ−Ｔ塩基対を形成する。トリシクロ−ＤＮＡおよびその合成については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１０／１１５９９３号に記載されている。本開示の化合物は１つまたは複数の三環ＤＮＡヌクレオチドが組み込まれていてよく；いくつかの場合には、化合物は完全に三環ＤＮＡヌクレオチドからなるものであってよい。
【００８９】
トリシクロ−ホスホロチオアートヌクレオチドはホスホロチオアートサブユニット間結合を有するトリシクロ−ＤＮＡヌクレオチドである。トリシクロ−ホスホロチオアートヌクレオチドおよびその合成については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０５３９２８号に記載されている。本開示の化合物は１つまたは複数の三環ＤＮＡヌクレオチドが組み込まれていてよく；いくつかの場合には、化合物は完全に三環ＤＮＡヌクレオチドからなるものであってよい。三環ＤＮＡ／三環ホスホチオアートヌクレオチドの非限定的な例を下に図示する：
【化３３】
2019525742.tif 000040
【００９０】
５．２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥおよび２’−Ｆオリゴマー
「２’−Ｏ−Ｍｅオリゴマー」分子はリボース分子の２’−ＯＨ残基にメチル基を有するものである。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡもＤＮＡと同じ（または類似した）挙動を示すが、ヌクレアーゼによる分解から保護されている。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡは、さらに安定化させるためにホスホロチオアートオリゴマー（ＰＴＯ）と組み合わせることもできる。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマー（ホスホジエステルまたはホスホチオアート）は当該技術分野で日常的な技術により合成することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＹｏｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：２００８−１６，２００４を参照されたい）。２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
【化３４】
2019525742.tif 000041
【００９１】
２’Ｏ−メトキシエチルオリゴマー（２’−Ｏ  ＭＯＥ）は２’Ｏ−Ｍｅオリゴマーと同じように、リボース分子の２’−ＯＨ残基にメトキシエチル基を有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｒｔｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７８，４８６−５０４，１９９５で論じられている。２’Ｏ−ＭＯＥヌクレオチドの非限定的な例を下に図示する：
【化３５】
2019525742.tif 000042
【００９２】
２’−フルオロオリゴマーは前述のアルキル化２’ＯＨリボース誘導体とは対照的に、２’ＯＨの代わりに２’位にフルオロラジカルを有する。２’−Ｆオリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
【化３６】
2019525742.tif 000043
２’−フルオロオリゴマーについては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００４／０４３９７７号にさらに記載されている。
【００９３】
２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥおよび２’−Ｆオリゴマーは、下に図示するように１つまたは複数のホスホロチオアート（ＰＳ）結合も含み得る：
【化３７】
2019525742.tif 000044
【００９４】
さらに、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥおよび２’−Ｆオリゴマーは、例えば下に図示する２’Ｏ−メチルＰＳオリゴマーのドリサペルセンのように、オリゴマー全体にＰＳサブユニット間結合を含み得る：
【化３８】
2019525742.tif 000045
【００９５】
あるいは、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥおよび／または２’−Ｆオリゴマーを含むオリゴマーは、下に図示するようにオリゴマーの末端にＰＳ結合を含み得る：
【化３９】
2019525742.tif 000046
【００９６】
本開示のアンチセンスオリゴマーは、１つまたは複数の２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥおよび２’−Ｆサブユニットが組み込まれていてよく、ここに記載したサブユニット間結合のいずれかを用いたものであり得る。いくつかの場合には、本開示の化合物は、完全に２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥまたは２’−Ｆサブユニットからなるものであり得る。本開示の化合物の１つの実施形態は、完全に２’Ｏ−メチルサブユニットからなるものである。
【００９７】
６．２’−Ｏ−［２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル］オリゴマー（ＭＣＥ）
ＭＣＥは、本開示の化合物に有用な２’Ｏ修飾リボヌクレオシドの別の例である。ここでは、２’ＯＨを２−（Ｎ−メチルカルバモイル）エチル部分に誘導体化してヌクレアーゼ耐性を増大させる。ＭＣＥオリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
【化４０】
2019525742.tif 000047
ＭＣＥおよびその合成については、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＹａｍａｄａら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７６（９）：３０４２−５３に記載されている。本開示の化合物は１つまたは複数のＭＣＥサブユニットが組み込まれていてよい。
【００９８】
７．立体特異的オリゴマー
立体特異的オリゴマーとは、実質的に純粋な単一のオリゴマーが得られる合成方法により各リン含有結合の立体化学が固定されたオリゴマーのことである。立体特異的オリゴマーの非限定的な例を下に図示する：
【化４１】
2019525742.tif 000048
【００９９】
上の例では、オリゴマーの各リン含有結合（phosphorous）は同じ立体化学を有する。ほかの例としては、上記のオリゴマーが挙げられる。例えば、ＬＮＡ、ＥＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ＭＣＥ、２’Ｏ−メチル、２’Ｏ−ＭＯＥ、２’−Ｆおよびモルホリノ系オリゴマーを立体特異的リン含有ヌクレオシド間結合、例えば、ホスホロチオアート結合、ホスホジエステル結合、ホスホロアミダート（phosphoramidate）結合、ホスホロジアミダート結合またはその他のリン（phorous）含有ヌクレオシド間結合などにより調製することができる。立体特異的オリゴマー、このようなオリゴマーの調製に用いる調製方法、チロル（ｃｈｉｒｏｌ）制御合成、キラルの設計およびキラル補助剤については、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５１０７４２５号、同第２０１５１０８０４８号、同第２０１５１０８０４６号、同第２０１５１０８０４７号、同第２０１２０３９４４８号、同第２０１００６４１４６号、同第２０１１０３４０７２号、同第２０１４０１０２５０号、同第２０１４０１２０８１号、同第２０１３０１２７８５８号および同第２０１１００５７６１号に詳述されている。
【０１００】
８．モルホリノオリゴマー
本開示の例示的実施形態は、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．ら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７：１８７−１９５（１９９７）の図２に記載されている以下の一般構造：
【化４２】
2019525742.tif 000049
のホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーに関する。本明細書に記載されるモルホリノは、上記の一般構造のあらゆる立体異性体および立体配置を包含するものとする。モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性については米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号、同第８，０７６，４７６号および同第８，２９９，２０６号に詳述されており、上記の特許はいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、モルホリノをオリゴマーの５’末端または３’末端で「テール」部分とコンジュゲートして、その安定性および／または溶解性を増大させる。例示的テールとしては：
【化４３】
2019525742.tif 000050
が挙げられる。
【０１０２】
様々な実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは式（Ｉ）：
【化４４】
2019525742.tif 000051
のもの、またはその薬学的に許容される塩であり得、式中：
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｚは２０〜２６の整数であり；
Ｔは：
【化４５】
2019525742.tif 000052
から選択される部分であり；
式中、Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈ、アセチル、トリチルおよび４−メトキシトリチルから選択され、
標的化配列は、Ｈ４５Ａ（−０６＋２０）、Ｈ４５Ａ（−０３＋１９）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１６）、Ｈ４５Ａ（−０９＋１９）およびＨ４５Ａ（−１２＋１６）からなる群より選択されるエクソン４５標的領域に相補的である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、標的化配列は：
ａ）上式のＺが２４である配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）；
ｂ）上式のＺが２０である配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）；
ｃ）上式のＺが２３である配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｄ）上式のＺが２６である配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；および
ｅ）上式のＺが２６である配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）
から選択される。
【０１０４】
様々な実施形態では、Ｔは
【化４６】
2019525742.tif 000053
である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、Ｒ２はＨである。ある特定の実施形態では、Ｚは２４である。いくつかの実施形態では、Ｚは２０である。いくつかの実施形態では、Ｚは２３である。いくつかの実施形態では、Ｚは２６である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化４７】
2019525742.tif 000054
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２４である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化４８】
2019525742.tif 000055
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２０である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化４９】
2019525742.tif 000056
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２３である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５０】
2019525742.tif 000057
であり、Ｒ２はＨであり、Ｚは２６である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５１】
2019525742.tif 000058
であり、標的化配列は配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）であり、Ｚは２４である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５２】
2019525742.tif 000059
であり、標的化配列は配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）であり、Ｚは２０である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５３】
2019525742.tif 000060
であり、標的化配列は配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）であり、Ｚは２３である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５４】
2019525742.tif 000061
であり、標的化配列は配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）であり、Ｚは２６である。いくつかの実施形態では、Ｔは
【化５５】
2019525742.tif 000062
であり、標的化配列は配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）であり、Ｚは２６である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーは式（ＩＩ）：
【化５６】
2019525742.tif 000063
のもの、またはその薬学的に許容される塩であり、式中：
各Ｎｕは、一緒になって標的化配列を形成する核酸塩基であり；
Ｘは２１〜２９の整数であり、
標的化配列は：
ａ）Ｘが２５である配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３’）；
ｂ）Ｘが２１である配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’）；
ｃ）Ｘが２４である配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；
ｄ）Ｘが２７である配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３’）；および
ｅ）Ｘが２７である配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３’）
から選択される。
【０１０９】
例えば式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号１（５’−ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡ−３）であり、Ｘは２５である。例えば式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号２（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧ−３）であり、Ｘは２１である。例えば式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号３（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３）であり、Ｘは２４である。例えば式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号４（５’−ＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴ−３）であり、Ｘは２７である。例えば式（ＩＩ）のアンチセンスオリゴマーの実施形態を含めたいくつかの実施形態では、標的化配列は配列番号５（５’−ＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣ−３）であり、Ｘは２７である。
【０１１０】
本開示の一実施形態では、アンチセンスオリゴマーはｃａｓｉｍｅｒｓｅｎである。
【０１１１】
９．核酸塩基の修飾および置換
ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴマーはＲＮＡ核酸塩基およびＤＮＡ核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ぶことが多い）からなる。ＲＮＡ塩基は一般に、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）として知られている。ＤＮＡ塩基は一般に、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）として知られている。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、オリゴマー中の１つまたは複数のＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基をＲＮＡ塩基またはＤＮＡ塩基以外の塩基で修飾または置換し得る。修飾または置換された塩基が含まれるオリゴマーとしては、核酸に最もよくみられる１つまたは複数のプリン塩基またはピリミジン塩基が、まれな塩基または非天然の塩基に置き換わったオリゴマーが挙げられる。
【０１１３】
プリン塩基は一般式：
【化５７】
2019525742.tif 000064
によって表されるように、イミダゾール環と縮合したピリミジン環を含む。アデニンおよびグアニンは核酸に最もよくみられる２つのプリン核酸塩基である。これらは、特に限定されないが、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチンおよび７−メチルグアニンを含めた他の天然に存在するプリンで置換され得る。
【０１１４】
ピリミジン塩基は、一般式：
【化５８】
2019525742.tif 000065
によって表されるように、６員ピリミジン環を含む。シトシン、ウラシルおよびチミンは核酸に最もよくみられるピリミジン塩基である。これらは、特に限定されないが、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、プソイドウラシルおよび４−チオウラシルを含めた他の天然に存在するピリミジンで置換され得る。一実施形態では、本明細書に記載されるオリゴマーは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含む。
【０１１５】
その他の修飾または置換された塩基としては、特に限定されないが、２，６−ジアミノプリン、オロト酸、アグマチジン、ライシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇクランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ、Ｓｕｐｅｒ  ＡおよびＮ４−エチルシトシンまたはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、プソイドウラシルまたはその誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンのような変性塩基もしくはユニバーサル塩基または無塩基部位のような非存在塩基（absent  base）（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、１−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素に置き換わっているピロリジン誘導体（アザリボース））が挙げられる。Ｓｕｐｅｒ  Ａ、Ｓｕｐｅｒ  ＧおよびＳｕｐｅｒ  Ｔの誘導体の例は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８３，１７３号（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にみることができる。ｃＰｅｎｔ−Ｇ、ｃＰｅｎｔ−ＡＰおよびＰｒ−ＡＰは、ｓｉＲＮＡに組み込むと免疫刺激効果が低下することが示された（Ｐｅａｃｏｃｋ  Ｈ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９２００）。プソイドウラシルは、ウリジンのような通常のＮ−グリコシドではなくＣ−グリコシドを有する天然に存在する異性化型のウラシルである。プソイドウリジンを含有する合成ｍＲＮＡは、ウリジンを含有するｍＰｖＮＡと比較して改善された安全性プロファイルを有し得る（その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９１２７２３０号）。
【０１１６】
ある特定の修飾または置換された核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴマーの結合親和性を増大させるのに特に有用である。このようなものとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルならびに５−プロピニルシトシンを含めた５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており、現時点で好ましい、さらにより具体的には２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせると好ましい塩基置換である。
【０１１７】
１０．水素の同位体
本発明の化合物中には、ある原子のいずれかの天然の同位体がその天然に存在する存在量で存在するか、１つまたは複数の位置のある同位体が富化されていてよい。例えば、本発明の範囲内では、ある位置に水素原子を有することが確認された化合物は、その位置に１Ｈ−（プロチウム）、２Ｈ−（ジュウテリウムまたはＤ）および３Ｈ−（トリチウムまたはＴ）を有し得るか、あるいはある位置の炭素原子が１２Ｃ−、１３Ｃ−または１４Ｃ−炭素であり得る。
【０１１８】
１つまたは複数の位置の１つまたは複数の同位体を富化すると、その同位体を有する化合物の質量および／または不安定な同位体に関する組成物の放射活性の変化に起因して組成物の放射能（activity）が促進され、これにより組成物もしくは代謝産物の存在の検出が容易になり得る。
【０１１９】
最も存在量の多い水素の同位体は１Ｈであり、天然の存在量が９９．９８％を超える。ジュウテリウムは天然では、水素６，０００個中約１個を占める、つまり存在量が０．０１５％である。本発明のいくつかの化合物では、ある位置のジュウテリウムの量が天然のジュウテリウム存在量の最大６，０００倍富化され得る、つまり、その位置の水素原子の約１００％がジュウテリウムであり得る。本発明のいくつかの実施形態では、組成物中のジュウテリウムの富化は、１，０００倍、２，０００倍、３，０００倍（ジュウテリウムは約５０％）またはそれより高い倍数であり得る。あるいは、ジュウテリウムの富化により、１つまたは複数の位置で約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％超となる組成物が生じ得る。
【０１２０】
１１．オリゴマーの薬学的に許容される塩
本明細書に記載されるオリゴマーの特定の実施形態は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含み得るものであり、したがって、薬学的に許容される酸とともに薬学的に許容される塩を形成することができる。これに関して、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の比較的無毒性の無機または有機酸付加塩を指す。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形の製造工程の現場で調製するか、個々に、精製した遊離塩基形態の本開示の化合物と適切な有機酸または無機酸とを反応させ、このようにして形成された塩をのち精製過程で分離することにより調製することができる。代表的な塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅら，（１９７７）「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。
【０１２１】
対象オリゴマーの薬学的に許容される塩としては、化合物の従来の無毒性塩または第四級アンモニウム塩、例えば無毒性の有機酸または無機酸由来の塩が挙げられる。例えば、このような従来の無毒性塩としては、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などに由来する塩；および有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などから調製される塩が挙げられる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本開示のオリゴマーは、１つまたは複数の酸性官能基を含み得るものであり、したがって、薬学的に許容される塩基とともに薬学的に許容される塩を形成することができる。この場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示の化合物の比較的無毒性の無機および有機塩基付加塩を指す。これらの塩も同様に、投与ビヒクルまたは剤形の製造工程の現場で調製するか、個々に、遊離酸形態の精製化合物を適切な塩基、例えば薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機第一級、第二級または第三級アミンと反応させることにより調製することができる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンとしては、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる。（例えば、Ｂｅｒｇｅら，上記を参照されたい）。
【０１２３】
ＩＩＩ．製剤および投与様式
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーの治療的送達に適した製剤または医薬組成物を提供する。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、治療有効量の１つまたは複数の本明細書に記載されるオリゴマーを含み、１つもしくは複数の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤とともに製剤化された薬学的に許容される組成物を提供する。本開示のオリゴマーを単独で投与することも可能であるが、化合物を医薬製剤（組成物）として投与するのが好ましい。
【０１２４】
核酸分子を送達する方法については、例えば、Ａｋｈｔａｒら，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２：１３９；およびＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｋｈｔａｒ編；Ｓｕｌｌｉｖａｎら，ＰＣＴ国際公開第９４／０２５９５号に記載されている。これらおよびその他のプロトコルを本開示のオリゴマーを含めた実質的に任意の核酸分子の送達に用いることができる。
【０１２５】
下に詳述するように、本開示の医薬組成物は特に、以下のものに適合したものを含めた固体または液体形態で投与するよう製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水溶液または懸濁液）、錠剤、例えばバッカル、舌下および全身吸収を目的とするもの、巨丸剤、散剤・粉剤（powder）、顆粒剤、舌に塗布するパスタ剤；（２）例えば、例えば無菌液剤もしくは懸濁剤として皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射または徐放性製剤による非経口投与；（３）例えば、皮膚に塗布するクリーム剤、軟膏剤または放出制御貼付剤もしくはスプレー剤としての局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリーム剤またはフォームとして経膣または経直腸；（５）舌下；（６）眼に；（７）経皮；あるいは（８）経鼻。
【０１２６】
薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料の一部の例としては、非限定的に：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（３）セルロースおよび、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱物質水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカルボナートおよび／またはポリ酸無水物；ならびに（２２）医薬製剤に用いられる、その他の無毒性で適合性のある物質が挙げられる。
【０１２７】
本開示のアンチセンスオリゴマーとの製剤化に適した剤のほかの非限定的な例としては：薬物が様々な組織の中に侵入するのを促進することができるＰＥＧコンジュゲート核酸、リン脂質コンジュゲート核酸、親油性部分を含む核酸、ホスホロチオアート、Ｐ糖タンパク質阻害剤（プルロニックＰ８５など）；生分解性ポリマー、例えば埋込み後に徐放送達させるためのポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）マイクロスフェア（Ｅｍｅｒｉｃｈ，Ｄ  Ｆら，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）；および薬物を、血液脳関門を横断して送達することができ、ニューロンによる取込み機序を変化させることができる充填ナノ粒子、例えばポリブチルシアノアクリラート製のもの（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）が挙げられる。
【０１２８】
本開示は、ポリ（エチレングリコール）脂質を含有する表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾、分岐鎖状および非分岐鎖状もしくはその組合せまたは長時間循環リポソームあるいはステルスリポソーム）を含む組成物の使用も特徴とする。本開示のオリゴマーは、共有結合した様々な分子量のＰＥＧ分子も含み得る。これらの製剤は、標的組織への薬物の蓄積を増大させる方法を提供する。このクラスの薬物担体は、オプソニン化および単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）による除去に耐性を示し、それにより封入薬物の血中循環時間を延ばし組織への曝露を増大させることができる（Ｌａｓｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。このようなリポソームは、推測ではあるが、血管新生した標的組織での血管外漏出および捕捉により、腫瘍に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長時間循環リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を増強する（Ｌｉｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉら，国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／１０３９１号；Ａｎｓｅｌｌら，国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／１０３９０号；Ｈｏｌｌａｎｄら，国際ＰＣＴ公開国際公開第９６／１０３９２号）。長時間循環リポソームは、それが肝臓および脾臓などの代謝活動が盛んなＭＰＳ組織への蓄積を回避することが可能であることに基づけば、薬物をヌクレアーゼ分解から保護する作用がカチオン性リポソームより強いという可能性もある。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本開示は、米国特許第６，６９２，９１１号、同第７，１６３，６９５号および同第７，０７０，８０７号に記載される送達に合わせて調製したオリゴマー医薬組成物を含む。この点に関して、一実施形態では、本開示は、リジンとヒスチジンのコポリマー（ＨＫ）（米国特許第７，１６３，６９５号、同第７，０７０，８０７号および同第６，６９２，９１１号に記載されている）を単独で、またはＰＥＧ（例えば、分岐鎖もしくは非分岐鎖ＰＥＧまたはその両方の混合物）と組み合わせて、ＰＥＧおよび標的化部分と組み合わせて、あるいは架橋剤と組み合わせた上記のいずれかのもの、を含む組成物の形で本開示のオリゴマーを提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、グルコン酸修飾ポリヒスチジンまたはグルコニル化ポリヒスチジン／トランスフェリン−ポリリジンを含む医薬組成物の形でアンチセンスオリゴマーを提供する。当業者には、組成物内でＨｉｓおよびＬｙｓと特性が類似したアミノ酸が置換され得ることも認識されよう。
【０１３０】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および着香剤、保存剤および抗酸化剤が組成物中に存在してもよい。
【０１３１】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０１３２】
本開示の製剤は、経口投与、経鼻投与、局所（バッカルおよび舌下を含む）投与、直腸投与、膣投与および／または非経口投与に適した製剤を含む。製剤は、単位剤形で提供するのが好都合であり得、薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。担体材料と組み合わせて単一剤形を作製することができる有効成分の量は、治療する宿主、具体的な投与様式に応じて異なる。担体材料と組み合わせて単一剤形を作製することができる有効成分の量は一般に、治療効果が得られる化合物の量となる。この量は一般に、１００パーセントのうち約０．１パーセント〜約９９パーセントの有効成分、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲となる。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、本開示の製剤は、シクロデキストリン、セルロース、リポソーム、ミセル形成剤、例えば、胆汁酸およびポリマー担体、例えばポリエステルおよびポリ酸無水物から選択される賦形剤と；本開示のオリゴマーとを含む。ある特定の実施形態では、上記の製剤は、本開示のオリゴマーを経口的に生体利用可能にするものである。
【０１３４】
これらの製剤または医薬組成物を調製する方法は、本開示のオリゴマーと、担体および必要に応じて１つまたは複数の補助成分とを組み合わせるステップを含む。製剤は一般に、本開示の化合物と、液体担体もしくは微粉化した固体担体またはその両方とを均一かつ密に組み合せ、次いで必要な場合製品を成形することにより調製される。
【０１３５】
経口投与に適した本開示の製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（風味を付けた基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムもしくはトラガントを用いるもの）、散剤・粉剤、顆粒剤の形態、または水性液体もしくは非水性液体の液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または香錠剤（ゼラチンとグリセリンもしくはスクロースとアラビアゴムなどの不活性な基剤を用いるもの）としておよび／または洗口剤としてなどであり得、それぞれ有効成分として所定量の本開示の化合物を含有する。本開示のオリゴマーを巨丸剤、舐剤またはパスタ剤として投与してもよい。
【０１３６】
経口投与用の本開示の固形剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤・粉剤、顆粒剤、トローチ剤（ｔｒｏｕｃｈ）など）では、有効成分をクエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウムなどの１つもしくは複数の薬学的に許容される担体および／または以下のうちいずれかのもの：（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴムなど；（３）グリセロールなどの保湿剤；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物ならびにポロキサマーおよびラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、グリセロールモノステアラートおよび非イオン界面活性剤など；（８）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸着剤；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸およびその混合物；（１０）着色剤；ならびに（１１）クロスポビドンまたはエチルセルロースなどの放出制御剤と混合し得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固形医薬組成物をラクトースまたは乳糖などの賦形剤および高分子ポリエチレングリコールなどを用いた軟殻および硬殻ゼラチンカプセル剤に充填剤として用いてもよい。
【０１３７】
錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の補助成分とともに圧縮または成形することにより作製され得る。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤を用いて調製され得る。成形錠剤は、粉末化し不活性な液体希釈剤で湿潤させた化合物の混合物を適切な機械で成形することにより作製され得る。
【０１３８】
本開示の医薬組成物の錠剤およびその他の固形剤形、例えば糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、必要に応じて、コーティング剤および殻、例えば医薬製剤技術分野で周知の腸溶性コーティング剤およびその他のコーティング剤を用いて割線を入れる、または調製してよい。それらは、例えば、所望の放出プロファイルが得られる様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、その他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いて、その中の有効成分の徐放または制御放出がもたらされるよう製剤化してもよい。それらは、速放されるよう製剤化する、例えば凍結乾燥させてよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターでろ過することにより、または使用直前に滅菌水もしくは何らかの他の無菌注射媒体に溶かすことができる無菌固形医薬組成物の形態に滅菌剤を組み込むことにより、滅菌してよい。これらの医薬組成物は、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また有効成分（１つまたは複数）を、必要に応じて遅延させ、消化管の特定の部分でのみ、またはそこで優先的に放出する組成物のものであってよい。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー性物質またはロウが挙げられる。有効成分は、必要な場合上記の１つまたは複数の賦形剤を含む、マイクロカプセル化形態であってもよい。
【０１３９】
本開示の化合物の経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルション剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。液体剤形は、有効成分に加えて、当該技術分野でよく用いられる不活性希釈剤、例えば、水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにその混合物などを含有し得る。
【０１４０】
経口医薬組成物は、不活性希釈剤以外にも、補助剤、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色剤、着香剤および保存剤も含み得る。
【０１４１】
懸濁剤は、活性化合物に加えて、懸濁化剤を、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガントならびにその混合物として含有し得る。
【０１４２】
直腸または膣投与用の製剤は、坐剤として提供してよく、坐剤は、１つまたは複数の本開示の化合物と、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチラートを含む１つまたは複数の適切な無刺激性の賦形剤または担体とを混合することにより調製され得るものであり、また室温では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔の中で融解して活性化合物を放出する。
【０１４３】
本明細書に提供されるオリゴマーの局所または経皮投与用の製剤または剤形としては、散剤・粉剤、スプレー剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、貼付剤および吸入剤が挙げられる。活性なオリゴマーを薬学的に許容される担体および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤または噴射剤と無菌条件下で混合し得る。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤およびゲル剤は、本開示の活性化合物に加えて、賦形剤、例えば動物性および植物性脂肪、油、ロウ、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはその混合物を含有し得る。
【０１４４】
散剤・粉剤およびスプレー剤は、本開示のオリゴマーに加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末または上記の物質の混合物を含有し得る。スプレー剤はさらに、通常の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を含有し得る。
【０１４５】
経皮貼付剤には、身体への本開示のオリゴマーの制御送達がもたらされるというさらなる利点がある。このような剤形は、オリゴマーを適切な媒体に溶解または分散させることにより作製することができる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通過する薬剤の流動を増大させてもよい。このような流動速度は、当該技術分野で公知の方法のなかでも特に、速度制御膜を設けるか、ポリマーマトリックスまたはゲルに薬剤を分散させることにより制御することができる。
【０１４６】
非経口投与に適した医薬組成物は、１つまたは複数の本開示のオリゴマーと、１つあるいは複数の薬学的に許容される無菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳液あるいは使用直前に無菌注射用溶液または分散液に再構成され得る無菌粉末とを組み合わせて含み得、該組成物は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を目的とするレシピエントの血液と等張にする溶質または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る。本開示の医薬組成物に使用され得る適切な水性または非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物、オリーブ油などの植物油ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液剤の場合は必要な粒子径を維持することにより、また界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１４７】
これらの医薬組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤も含有し得る。対象オリゴマーに対する微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸（ｐｈｅｎｏｌ  ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）などを含ませることにより確保され得る。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めるのも望ましいことであり得る。さらに、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含ませることにより、注射用医薬形態の持続的吸収がもたらされ得る。
【０１４８】
いくつかの場合には、薬物の効果を持続させるため、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を低下させるのが望ましい。このことは、当該技術分野で公知の方法のなかでも特に、水への溶解性が低い結晶性または非晶質物質の液体懸濁液の使用により達成され得る。このため、薬物の吸収速度はその溶解速度に左右され、ひいては結晶の大きさおよび結晶の形態に左右され得る。あるいは、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることにより、非経口投与する薬物形態の遅延吸収が達成される。
【０１４９】
注射デポ剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーで対象オリゴマーのマイクロ封入マトリックスを形成することにより作製され得る。ポリマーに対するオリゴマーの比および用いる具体的なポリマーの性質に応じて、オリゴマー放出速度が制御され得る。その他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が挙げられる。デポ剤注射製剤は、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を封入することにより調製してもよい。
【０１５０】
本開示のオリゴマーを医薬品としてヒトおよび動物に投与する場合、それ自体を、または薬学的に許容される担体と組み合わせて有効成分を例えば０．１〜９９％（より好ましくは１０〜３０％）含有する医薬組成物として投与することができる。
【０１５１】
上記のように、本開示の製剤または調製物を経口的に、非経口的に、局所的にまたは直腸に投与し得る。通常、各投与経路に適した形態でそれらを投与する。例えば、それらを錠剤またはカプセル形態で、注射、吸入、アイローション、軟膏剤、坐剤などにより、注射、注入または吸入による投与により；ローションまたは軟膏剤により局所的に；および坐剤により直腸に投与する。
【０１５２】
本明細書で使用される「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語句は、経腸および局所投与以外の通常は注射による投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、真皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内への注射および注入が非限定的に含まれる。
【０１５３】
本明細書で使用される「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」および「末梢に投与する」という語句は、化合物、薬物またはその他の物質を中枢神経系内に直接投与するのではなく、患者の全身に入り、したがって、代謝およびその他の同様の過程を受けるように投与すること、例えば皮下投与を意味する。
【０１５４】
選択する投与経路に関係なく、適切な水和形態で使用され得る本開示のオリゴマーおよび／または本開示の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化され得る。本開示の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、具体的な患者、組成物および投与様式に関して、患者に対して許容されない毒性を示さずに所望の治療反応を得るのに効果的な有効成分の量になるよう変化させ得る。
【０１５５】
選択する投与量レベルは、用いる具体的な本開示のオリゴマーまたはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる具体的なオリゴマーの排泄または代謝の速度、吸収の速度および程度、治療の持続期間、用いる具体的なオリゴマーと併用する他の薬物、化合物および／または材料、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康状態および以前の既往歴ならびに医学分野で周知のこれと同様の因子を含めた様々な因子に左右される。
【０１５６】
通常の技術を有する医師または獣医師であれば、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医師であれば、医薬組成物に用いる本開示の化合物の用量を所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルから開始し、所望の効果が得られるまで用量を漸増させることができる。本開示の化合物の適切な１日量は一般に、治療効果を得るのに有効な最小用量である化合物量となる。このような有効量は一般に、上記の因子に左右される。必要な効果を得るのに使用する場合、本開示の化合物の患者に対する経口、静脈内、脳室内および皮下の用量は一般に、体重１キログラム当たり１日約０．０００１〜約１００ｍｇの範囲となる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴマーを一般に約２０〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの場合には、１００ｍｇ／ｋｇを超える用量が必要となり得る。いくつかの実施形態では、ｉ．ｖ．投与の用量は約０．５ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、オリゴマーを間のあらゆる整数を含めた約２０ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５１ｍｇ／ｋｇ、５２ｍｇ／ｋｇ、５３ｍｇ／ｋｇ、５４ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、５６ｍｇ／ｋｇ、５７ｍｇ／ｋｇ、５８ｍｇ／ｋｇ、５９ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、８５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、９５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを３０ｍｇ／ｋｇで投与する。いくつかの実施形態では、オリゴマーを５０ｍｇ／ｋｇで投与する。
【０１５８】
必要なら、有効な１日量の活性化合物を必要に応じて単位剤形で、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多いサブ用量として１日を通して適切な間隔を空けて別々に投与し得る。ある特定の状況下では、投与を１日１回の投与とする。ある特定の実施形態では、所望の機能性ジストロフィンタンパク質発現を維持するため、投与を必要に応じて２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、または１週間毎、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、９週間毎、１０週間毎、１１週間毎、１２週間毎または１か月毎、２か月毎、３か月毎、４か月毎、５か月毎、６か月毎、７か月毎、８か月毎、９か月毎、１０か月毎、１１か月毎、１２か月毎に１回または複数回の投与とする。
【０１５９】
核酸分子は、特に限定されないが、リポソームへの封入を含めた当業者に公知の様々な方法により、イオン導入法により、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着マイクロスフェアなどの本明細書に記載されるおよび当該技術分野で公知の他のビヒクルへの組込みにより細胞に投与することができる。ある特定の実施形態では、マイクロエマルション化技術を用いて親油性（不水溶性）医薬品のバイオアベイラビリティを改善し得る。例としては、Ｔｒｉｍｅｔｒｉｎｅ（Ｄｏｒｄｕｎｏｏ，Ｓ．Ｋ．ら，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１７（１２），１６８５−１７１３，１９９１）およびＲＥＶ  ５９０１（Ｓｈｅｅｎ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８０（７），７１２−７１４，１９９１）が挙げられる。有益性のなかでも特に、マイクロエマルション化は、循環系の代わりにリンパ系に優先的に吸収させ、それにより肝臓を迂回し、肝胆道循環中での化合物の破壊を防ぐことによりバイオアベイラビリティを増大させる。
【０１６０】
本開示の一態様では、製剤は、本明細書に提供されるオリゴマーと少なくとも１つの両親媒性担体とから形成されるミセルを含有し、このミセルは平均直径が約１００ｎｍ未満である。より好ましい実施形態では、平均直径が約５０ｎｍ未満のミセルが提供され、さらにより好ましい実施形態では、平均直径が約３０ｎｍ未満またはさらには約２０ｎｍ未満のミセルが提供される。
【０１６１】
あらゆる適切な両親媒性担体が企図されるが、現時点で好ましい担体は一般に、一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ−Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ−ａｓ−Ｓａｆｅ）（ＧＲＡＳ）ステータスを有し、本開示の化合物を可溶化するとともに、のちの段階で溶液が複合水相（ヒトの胃腸管にみられるものなど）と接触するときに同化合物をマイクロエマルション化し得るものである。これらの必要条件を満たす両親媒性成分は通常、ＨＬＢ（親水性と親油性のバランス）値が２〜２０であり、その構造にはＣ−６〜Ｃ−２０の範囲内の直鎖脂肪族ラジカルが含まれている。例として、ポリエチレン−グリコール化脂肪グリセリドおよびポリエチレングリコールがある。
【０１６２】
両親媒性担体の例としては、飽和および単不飽和ポリエチレングリコール化脂肪酸グリセリド、例えば完全水素化または部分水素化された様々な植物油から得られるものなどが挙げられる。このような油は、トリ脂肪酸グリセリド、ジ脂肪酸グリセリドおよびモノ脂肪酸グリセリドと、カプリン酸４〜１０％、カプリン酸３〜９％、ラウリン酸４０〜５０％、ミリスチン酸１４〜２４％、パルミチン酸４〜１４％およびステアリン酸５〜１５％を含む特に好ましい脂肪酸組成を有する、対応する脂肪酸のジポリエチレングリコールエステルおよびモノポリエチレングリコールエステルとから有利に構成され得る。また別の有用なクラスの両親媒性担体としては、飽和または単不飽和脂肪酸との部分エステル化ソルビタンおよび／またはソルビトール（ＳＰＡＮシリーズ）またはこれに相当するエトキシ化類似体（ＴＷＥＥＮシリーズ）が挙げられる。
【０１６３】
Ｇｅｌｕｃｉｒｅシリーズ、Ｌａｂｒａｆｉｌ、ＬａｂｒａｓｏｌまたはＬａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（いずれもフランス、サン＝プリエストのＧａｔｔｅｆｏｓｓｅ社が製造および流通を行っている）、ＰＥＧ−モノ−オレアート、ＰＥＧ−ジ−オレアート、ＰＥＧ−モノ−ラウラートおよびジ−ラウラート、レシチン、ポリソルベート８０など（米国および世界にある多数の会社が製造および流通を行っている）を含めた市販の両親媒性担体が特に有用であり得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物を適切な宿主細胞に導入するため、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用による送達を実施し得る。具体的には、本開示の医薬組成物を送達するため、これを脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに封入して製剤化し得る。製剤化およびそのような送達ビヒクルの使用は、既知の従来技術を用いて実施することができる。
【０１６５】
本開示での使用に適した親水性ポリマーは、易水溶性であり、小胞を形成する脂質と共有結合することができ、毒性作用がなくｉｎ  ｖｉｖｏでの耐容性がある（すなわち、生体適合性である）ものである。適切なポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ポリラクチドとも呼ばれる）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも呼ばれる）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマーおよびポリビニルアルコールが挙げられる。ある特定の実施形態では、ポリマーは、約１００もしくは１２０ダルトンから約５，０００もしくは１０，０００ダルトンまで、または約３００ダルトン〜約５，０００ダルトンの分子量を有する。他の実施形態では、ポリマーは、約１００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するか、約３００〜約５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。ある特定の実施形態では、ポリマーは７５０ダルトンのポリエチレングリコール（ＰＥＧ（７５０））である。ポリマーは、その中に含まれるモノマーの数によっても定義され得るものであり；本開示の好ましい実施形態では、少なくとも約３つのモノマーからなるポリマーを用い、このようなＰＥＧポリマーは３つのモノマーからなる（約１５０ダルトン）。
【０１６６】
本開示での使用に適し得るその他の親水性ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミドおよびヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられる。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本開示の製剤は、ポリアミド、ポリカルボナート、ポリアルキレン、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコ−ポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリラートならびにその配合物、混合物またはコポリマーからなる群より選択される生体適合性ポリマーを含む。
【０１６８】
シクロデキストリンは、６個、７個または８個のグルコース単位からなり、それぞれα、βまたはγのギリシャ文字で命名される環状オリゴ糖である。グルコース単位はα−１，４−グルコシド結合によって結合している。糖単位がいす形配座であるため、（Ｃ−２、Ｃ−３の）第二級ヒドロキシル基がいずれも環の一方に位置し、Ｃ−６の第一級ヒドロキシル基がいずれも他方に位置している。その結果、外面が親水性となり、それによりシクロデキストリンが水溶性となる。これとは対照的に、シクロデキストリンの空洞は、Ｃ−３およびＣ−５原子の水素およびエーテル様酸素に覆われているため疎水性となる。これらのマトリックスにより、例えば１７α−エストラジオールなどのステロイド化合物を含めた相対的に疎水性が強い様々な化合物との複合体形成が可能となる（例えば、ｖａｎ  Ｕｄｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓ．Ｏｒｇ．Ｃｕｌｔ．３８：１−３−１１３（１９９４）を参照されたい）。複合体形成はファンデルワールス相互作用および水素結合形成によって起こる。シクロデキストリンの化学的性質に関する概説についてはＷｅｎｚ，Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：８０３−８２２（１９９４）を参照されたい。
【０１６９】
シクロデキストリン誘導体の物理化学的特性はその種類および置換度に大きく左右される。例えば、それらの水への溶解性は不溶性（例えば、トリアセチル−ベータ−シクロデキストリン）〜１４７％の可溶性（ｗ／ｖ）（Ｇ−２−ベータ−シクロデキストリン）の範囲内にある。さらに、それらは多数の有機溶媒に可溶性である。このシクロデキストリンの特性は、その溶解性を増大または低下させることにより様々な製剤成分の溶解性を制御することを可能にする。
【０１７０】
シクロデキストリンおよびその調製方法が多数記載されている。例えば、Ｐａｒｍｅｔｅｒ（Ｉ）ら（米国特許第３，４５３，２５９号）およびＧｒａｍｅｒａら（米国特許第３，４５９，７３１号）は電気的に中性のシクロデキストリンについて記載した。その他の誘導体としては、カチオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩ），米国特許第３，４５３，２５７号］、不溶性架橋シクロデキストリン（Ｓｏｌｍｓ，米国特許第３，４２０，７８８号）およびアニオン特性を有するシクロデキストリン［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ），米国特許第３，４２６，０１１号］が挙げられる。アニオン特性を有するシクロデキストリン誘導体には、親シクロデキストリンにカルボン酸、亜リン酸、亜ホスフィン酸、ホスホン酸、リン酸、チオホスホン酸、チオスルフィン酸およびスルホン酸を付加したものがある［Ｐａｒｍｅｔｅｒ（ＩＩＩ）、上記を参照されたい］。さらに、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン誘導体がＳｔｅｌｌａらにより記載されている（米国特許第５，１３４，１２７号）。
【０１７１】
リポソームは、水性内部区画を取り囲む少なくとも１つの脂質二重層膜からなるものである。リポソームは膜のタイプおよび大きさにより特徴付けられ得る。小さい単層小胞（ＳＵＶ）は、単一の膜を有し、通常、直径が０．０２〜０．０５μｍの範囲内にあるものであり；大きい単層小胞（ＬＵＶ）は通常、０．０５μｍより大きいものである。オリゴラメラの大きい小胞および多重膜小胞は、通常は同心円状の膜層を複数有し、通常、０．１μｍより大きい。同心円状でない複数の膜を有するリポソーム、すなわち、大きい小胞の中にそれより小さい複数の小胞が含まれたものを多胞小胞（multivesicular  vesicle）と呼ぶ。
【０１７２】
本開示の一態様は、本開示のオリゴマーを含有するリポソームを含み、運搬能が増大したリポソームが得られるようリポソーム膜が製剤化された製剤に関する。これに代えて、または加えて、本開示の化合物をリポソームのリポソーム二重層の中に含ませても、リポソーム二重層上に吸着されてもよい。本開示のオリゴマーを脂質界面活性剤で凝集させ、リポソームの内部空間内に運搬してもよく；このような場合、活性薬剤−界面活性剤凝集体の破壊作用に耐性を示すようリポソーム膜を製剤化する。
【０１７３】
本開示の一実施形態では、ＰＥＧ鎖が脂質二重層の内表面からリポソームに取り囲まれた内部空間内に伸長し、脂質二重層の外側から周囲環境内に伸長するように、リポソームの脂質二重層にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化された脂質が含まれている。
【０１７４】
本開示のリポソーム内に含まれている活性薬剤は可溶化形態である。界面活性剤と活性薬剤の凝集体（目的の活性薬剤が含まれたエマルションまたはミセルなど）が本開示によるリポソームの内部空間内に封入され得る。界面活性剤は、活性薬剤を分散および可溶化させる作用を示し、特に限定されないが様々な鎖長（例えば、約Ｃ１４〜約Ｃ２０）の生体適合性リゾホスファチジルコリン（ＬＰＧ）を含めた任意の適切な脂肪族、脂環式または芳香族界面活性剤から選択され得る。ＰＥＧ脂質などのポリマー誘導体化脂質は、それがミセル／膜融合を阻害する作用を示し、界面活性剤分子へのポリマー付加が界面活性剤のＣＭＣを低下させ、ミセル形成を促進することから、ミセル形成にも使用し得る。好ましいのはマイクロモルの範囲内のＣＭＯを有する界面活性剤であるが、これよりＣＭＣが高い界面活性剤を用いて、本開示のリポソーム内に封入されたミセルを調製してもよい。
【０１７５】
本開示によるリポソームは、当該技術分野で公知の様々な技術のいずれかにより調製され得る。例えば、米国特許第４，２３５，８７１号；公開されたＰＣＴ出願  国際公開第９６／１４０５７号；Ｎｅｗ  ＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ  ３３−１０４；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９３を参照されたい。例えば、本開示のリポソームは、予め形成したリポソームを脂質グラフトポリマーからなるミセルに曝露することなどにより、親水性ポリマーで誘導体化した脂質を、リポソームに望まれる誘導体化脂質の最終モルパーセントに相当する脂質濃度で、予め形成したリポソーム内に分散させることにより調製され得る。親水性ポリマーを含有するリポソームは、当該技術分野で公知のホモジナイゼーション技術、脂質領域水和技術または押出し技術により形成することもできる。
【０１７６】
また別の例示的製剤化方法では、最初に、活性薬剤を超音波処理により、疎水性分子を容易に可溶化するリゾホスファチジルコリンまたはその他の低ＣＭＣ界面活性剤（ポリマーグラフト脂質を含む）に分散させる。次いで、得られた活性薬剤のミセル懸濁液を用いて、適切なモルパーセントのポリマーグラフト脂質またはコレステロールを含有する乾燥脂質試料を再水和する。次いで、当該技術分野で公知の押出し技術を用いて脂質と活性薬剤の懸濁液をリポソームにし、得られたリポソームを標準的なカラム分離により未封入溶液から分離する。
【０１７７】
本開示の一態様では、選択した大きさの範囲内の実質的に均一な大きさになるようリポソームを調製する。ある有効なサイズ決定方法では、リポソームの水性懸濁液を選択した均一な細孔径を有する一連のポリカルボナート膜に通して押し出し；膜の細孔径は、その膜に通して押し出すことによって得られるリポソームの最大の大きさにほぼ相当する。例えば、米国特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）などの試薬を用いてポリヌクレオチドまたはタンパク質を細胞内に導入し得る。
【０１７８】
本開示の製剤の放出特性は、封入材料、封入薬物の濃度および放出調節剤の存在に左右される。例えば、例えば胃内のような低ｐＨまたは腸内のようなより高いｐＨでのみ放出するｐＨ感受性コーティング剤を用いて、放出をｐＨ依存性になるよう操作することができる。腸溶性コーティング剤を用いて、胃を通過するまで放出が起こらないようにすることができる。複数のコーティング剤または様々な材料で封入したシアナミドの混合物を用いて、最初に胃内で放出させたのち、そのあと腸内で放出させることができる。水の取込みまたはカプセルからの拡散による薬物の放出を増大させることができる塩または細孔形成剤を含ませることによって放出を操作することもできる。薬物の溶解性を改変する賦形剤を用いて放出速度を制御することもできる。マトリックスの分解またはマトリックスからの放出を促進する剤を組み込むこともできる。これらは化合物に応じて、薬物に添加することも、分離相として（すなわち、微粒子として）添加することも、あるいはポリマー相に共溶解させることもできる。ほとんどの場合、その量は０．１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）にするべきである。分解促進剤のタイプとしては、硫酸アンモニウムおよび塩化アンモニウムなどの無機塩、クエン酸、安息香酸およびアスコルビン酸などの有機酸、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛および水酸化亜鉛などの無機塩基、および硫酸プロタミン、スペルミン、コリン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンなどの有機塩基ならびにＴｗｅｅｎ（登録商標）およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの界面活性剤が挙げられる。マトリックスに微細構造を与える細孔形成剤（すなわち、無機塩および糖などの水溶性化合物）を微粒子として添加する。その範囲は通常、１〜３０パーセント（ｗ／ｗポリマー）である。
【０１７９】
粒子の消化管内での滞留時間を変化させることにより取込みを操作することもできる。これは例えば、粒子を粘膜付着性ポリマーでコーティングするか、封入材料に粘膜付着性ポリマーを選択することにより達成することができる。例としては、遊離カルボキシル基を有する大部分のポリマー、例えばキトサン、セルロース、特にポリアクリラート（本明細書で使用される場合、ポリアクリラートは、アクリラート基ならびにシアノアクリラートおよびメタクリラートなどの修飾アクリラート基を含めたポリマーを指す）が挙げられる。
【０１８０】
オリゴマーを外科もしくは医療デバイスまたは埋植物の中に収まるよう製剤化する、あるいは外科もしくは医療デバイスまたは埋植物により放出されるよう適合させ得る。ある特定の態様では、埋植物をオリゴマーでコーティングするか、別の方法によりオリゴマーで処理することができる。例えば、ヒドロゲルまたはその他のポリマー、例えば生体適合性ポリマーおよび／または生分解性ポリマーを用いて、埋植物を本開示の医薬組成物でコーティングし得る（すなわち、ヒドロゲルまたはその他のポリマーを用いることにより、組成物を医療デバイスでの使用に適合させ得る）。医療デバイスを薬剤でコーティングするためのポリマーおよびコポリマーは当該技術分野で周知である。埋植物の例としては、特に限定されないが、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管グラフト、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植込み型除細動器、ＩＶ針、ピン、スクリュー、プレートなどの骨の固定および形成のためのデバイスならびに創傷治癒のためのその他のデバイスおよび人工組織マトリックスが挙げられる。
【０１８１】
本明細書に提供される方法に加えて、本開示に従って使用するオリゴマーを他の医薬品から類推してヒト医療または獣医療に使用するのに好都合な任意の方法で投与するよう製剤化し得る。アンチセンスオリゴマーおよびその対応する製剤を単独で、または筋ジストロフィー治療の他の治療戦略、例えば筋芽細胞移植、幹細胞療法、アミノグリコシド系抗生物質の投与、プロテアソーム阻害剤およびアップレギュレーション療法（例えば、ジストロフィンの常染色体パラログであるユートロフィンのアップレギュレーション）と組み合わせて投与し得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴマーの投与の前に、それと同時に、またはその後に追加の治療薬を投与し得る。例えば、オリゴマーをステロイドおよび／または抗生物質と組み合わせて投与し得る。ある特定の実施形態では、バックグランドステロイド療法（例えば、間欠的または長期的／継続的バックグランドステロイド療法）を受けている患者にオリゴマーを投与する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、アンチセンスオリゴマーの投与の前に副腎皮質ステロイドによる治療を受けており、そのステロイド治療を受け続ける。いくつかの実施形態では、ステロイドはグルココルチコイドまたはプレドニゾンである。
【０１８３】
当業者であれば任意の特定の動物および状態に対して最適な投与経路および任意の投与量を容易に決定することが可能であるため、記載した投与経路は単なる指針に過ぎない。機能性の遺伝物質をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に新たに導入する方法が複数試みられている（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１２７５−１２８０）。これらの方法には、発現させる遺伝子を改変レトロウイルス内に組み込むこと（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）上記；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１（１８），ｓｕｐｐｌ．：５０７４Ｓ−５０７９Ｓ）；非レトロウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）への組込み（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：４３１−４３４）；または異種プロモーター−エンハンサーエレメントと連結した導入遺伝子をリポソームにより送達すること（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９），上記；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８−２８１；Ｎａｂｅｌら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１２８５−１２８８；Ｈａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，４：２０６−２０９；ならびにＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８４：７８５１−７８５５）；リガンド特異的カチオンに基づく輸送系と連動した導入遺伝子の送達（ＷｕおよびＷｕ（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４）またはネイキッドＤＮＡ、発現ベクターの使用（Ｎａｂｅｌら（１９９０），上記）；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５−１４６８）が含まれる。導入遺伝子を組織内に直接注入すれば局所発現のみが起こる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９２）上記）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）上記；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）上記；Ｎａｂｅｌ（１９９０）上記；およびＨａｚｉｎｓｋｉら（１９９１）上記）。Ｂｒｉｇｈａｍらのグループ（Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）２９８：２７８−２８１およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３９（ａｂｓｔｒａｃｔ））は、ＤＮＡリポソーム複合体をマウスの静脈内または気管内に投与すると肺のみにｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクションが起こることを報告している。ヒト遺伝子治療の方法に関する総説の例にはＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３がある。
【０１８４】
ＩＶ．使用方法
エクソンスキッピングを用いるジストロフィンリーディングフレームの回復
ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異を原因とするＤＭＤの治療に有望な治療方法が、インフレーム変異を原因とするＢＭＤとして知られる比較的軽度の型のジストロフィン異常症によって示唆されている。アウトオブフレーム変異をインフレーム変異に変換することができれば、仮説上はｍＲＮＡリーディングフレームを保存し、内部が短縮されてはいるが機能性であるジストロフィンタンパク質を産生させることができる。本開示のアンチセンスオリゴマーは、このことを達成するため設計したものである。
【０１８５】
ＰＭＯと標的プレｍＲＮＡ配列がハイブリダイズすると、プレｍＲＮＡスプライシング複合体の形成が阻害され、成熟ｍＲＮＡからエクソン４５が欠失する。本開示のアンチセンスオリゴマーの構造および立体配座は相補的配列との配列特異的塩基対形成を可能にするものである。例えば、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１をスキップするよう設計されたＰＭＯであるｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎは、これと同様の機序により、ジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン５１に含まれる相補的配列との配列特異的塩基対形成を可能にする。
【０１８６】
７９エクソンがすべて含まれる正常なジストロフィンｍＲＮＡからは正常なジストロフィンタンパク質が産生される。図１の図は、ジストロフィンのプレｍＲＮＡおよび成熟ｍＲＮＡエクソン４７からエクソン５３までの小さいセクションを示している。各エクソンの形状は、コドンがエクソン間でどのように分割されているかを示しており；注目すべきなのは、各コドンが３個のヌクレオチドからなることである。長方形のエクソンは、完全なコドンで始まり、完全なコドンで終わっている。矢印形のエクソンは、完全なコドンで始まるが、コドンのヌクレオチド＃１のみが含まれる分割されたコドンで終わっている。このコドンのヌクレオチド＃２および＃３は、山形で始まる次のエクソンに含まれている。
【０１８７】
通常、ジストロフィン遺伝子からエクソン全体が失われたジストロフィンｍＲＮＡがあるとＤＭＤが生じる。図２の図は、ＤＭＤが生じることが知られている遺伝子変異のタイプ（エクソン５０の欠失）を示している。エクソン４９は完全なコドンで終わり、エクソン５１はコドンの２番目のヌクレオチドで始まるため、エクソン４９の後のリーディングフレームがシフトし、それによりアウトオブフレームのｍＲＮＡリーディングフレームおよび変異下流の誤ったアミノ酸の組込みが生じる。その結果、機能性Ｃ末端ジストログリカン結合ドメインが欠如して不安定なジストロフィンタンパク質が産生される。
【０１８８】
ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎはエクソン５１をスキップしてｍＲＮＡリーディングフレームを回復させる。エクソン４９は完全なコドンで終わり、エクソン５２はコドンの１番目のヌクレオチドで始まるため、エクソン５１が欠失すればリーディングフレームが回復し、それにより「インフレーム」ＢＭＤ変異と同じくインタクトのジストログリカン結合部位を有し内部が短縮したジストロフィンタンパク質が産生される（図３）。
【０１８９】
エクソンスキッピングを用いジストロフィンｍＲＮＡオープンリーディングフレームを回復させてＤＭＤ表現型を改善することが実現可能であることは、非臨床研究により裏付けられている。ＤＭＤのジストロフィー動物モデルにおける多数の試験でエクソンスキッピングによるジストロフィン回復により筋力および筋機能が確実に回復することが示されている（Ｓｈａｒｐ  ２０１１；Ｙｏｋｏｔａ  ２００９；Ｗｕ  ２００８；Ｗｕ  ２０１１；Ｂａｒｔｏｎ−Ｄａｖｉｓ  １９９９；Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ  ２００４；Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  ２００６；Ｙｕｅ  ２００６；Ｗｅｌｃｈ  ２００７；Ｋａｗａｎｏ  ２００８；Ｒｅａｙ  ２００８；ｖａｎ  Ｐｕｔｔｅｎ  ２０１２）。このことに関する説得力のある例の１つは、エクソンスキッピング（ＰＭＯを使用）療法後のジストロフィンレベルを同じ組織の筋機能と比較した試験に由来する。ジストロフィーｍｄｘマウスでは、マウス特異的ＰＭＯで処置した前脛骨（ＴＡ）筋がストレス誘導性収縮後にその最大許容荷重（maximum  force  capacity）の約７５％を維持したのに対し、反対側の未処置ＴＡ筋はその最大許容荷重の約２５％を維持するにとどまった（ｐ＜０．０５）（Ｓｈａｒｐ  ２０１１）。また別の試験では、２〜５か月齢のジストロフィーＣＸＭＤイヌ３例にその遺伝子変異に特異的なＰＭＯを用いたエクソンスキッピング療法を週１回で５〜７週間または隔週で２２週間受けさせた。エクソンスキッピング療法を実施した後、犬３例全例で全身の骨格筋にジストロフィンの盛んな発現がみられたほか、ベースラインと比較して歩行（１５ｍ走検査）の維持または改善がみられた。これとは対照的に、月齢の一致する未処置ＣＸＭＤイヌには、試験期間を通じて歩行の著明な低下がみられた（Ｙｏｋｏｔａ  ２００９）。
【０１９０】
ＰＭＯはｍｄｘマウスでも、ヒトＤＭＤ転写物全体を発現するヒト化ＤＭＤ（ｈＤＭＤ）マウスモデルでも、等モル濃度でのエクソンスキッピング活性がホスホロチオアートより高いことが示された（Ｈｅｅｍｓｋｉｒｋ  ２００９）。正常ヒト骨格筋細胞またはエクソン５１スキッピングを受け易い様々な変異を有するＤＭＤ患者由来筋細胞に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびウエスタンブロット（ＷＢ）を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験では、ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ（ＰＭＯ）がエクソン５１スキッピングの強力な誘導因子であることが明らかになった。ｈＤＭＤマウスモデルではｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ誘導エクソン５１スキッピングがｉｎ  ｖｉｖｏで確認されている（Ａｒｅｃｈａｖａｌａ−Ｇｏｍｅｚａ  ２００７）。
【０１９１】
ヒトジストロフィンプレｍＲＮＡのエクソン４５の標的領域に相補的でありエクソン４５スキッピングを誘導するアンチセンスオリゴマーの効果を解析するための臨床転帰としては、パーセントジストロフィン陽性線維（ＰＤＰＦ）、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）、歩行能力低下（ＬＯＡ）、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）、肺機能検査（ＰＦＴ）、外からの支援を受けずに起立する能力（仰臥位からの）、ｄｅ  ｎｏｖｏのジストロフィン産生量およびその他の機能尺度が挙げられる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本開示は、エクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有する対象にジストロフィンを産生させる方法であって、対象に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、エクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を有する対象にｍＲＮＡリーディングフレームを回復させてジストロフィンタンパク質産生を誘導する方法を提供する。タンパク質産生は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ウエスタンブロット解析または免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定することができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本開示は、必要とする対象のＤＭＤを治療する方法を提供し、ここでは、対象はエクソン４５スキッピングを受け易いジストロフィン遺伝子の変異を有し、方法は、対象に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。様々な実施形態では、対象の治療を疾患進行の遅延により測定する。いくつかの実施形態では、対象の治療を対象の歩行の維持または対象の歩行低下の抑制により測定する。いくつかの実施形態では、６分間歩行検査（６ＭＷＴ）を用いて歩行を測定する。ある特定の実施形態では、Ｎｏｒｔｈ  Ｓｔａｒｔ  Ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＮＳＡＡ）を用いて歩行を測定する。
【０１９４】
様々な実施形態では、本開示は、ＤＭＤを有する対象の肺機能を維持する、または肺機能低下を抑制する方法を提供し、ここでは、対象はエクソン４５スキッピングを受け易いＤＭＤ遺伝子の変異を有し、方法は、対象に本明細書に記載されるアンチセンスオリゴマーまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。いくつかの実施形態では、肺機能を最大呼気圧（ＭＥＰ）として測定する。ある特定の実施形態では、肺機能を最大吸気圧（ＭＩＰ）として測定する。いくつかの実施形態では、肺機能を努力肺活量（ＦＶＣ）として測定する。
【０１９５】
研究４０４５−３０１（要点）：
研究４０４５−３０１は、ＤＭＤ患者におけるＳＲＰ−４０４５（ｃａｓｉｍｅｒｓｅｎ）およびＳＲＰ−４０５３（ｇｏｌｏｄｉｒｓｅｎ）に関する試験である。この試験は、ＳＲＰ−４０４５およびＳＲＰ−４０５３の有効性および安全性を評価する二重盲検、プラセボ対照、多施設の４８週間にわたる試験である。エクソン４５またはエクソン５３のスキッピングにより修正され得るアウトオブフレーム欠失を有する適格患者を無作為化により割り付け、３０ｍｇ／ｋｇのＳＲＰ−４０４５または３０ｍｇ／ｋｇのＳＲＰ−４０５３の静脈内（ＩＶ）注入をそれぞれ週１回（混合活性物質群、６６例）またはプラセボの静脈内（ＩＶ）注入を週１回（３３例）、４８週間にわたって受けさせる。定期的な指定の試験来院時に６分間歩行検査などの機能有効性を含めた臨床効果を評価する。いずれの患者も、ベースライン時に筋生検を実施し、試験期間中に２回目の筋生検を実施する。試験期間を通じて有害事象（ＡＥ）、臨床検査値、心電図（ＥＣＧ）、心エコー図（ＥＣＨＯ）、バイタルサインおよび身体検査値の収集により安全性を評価する。試験期間を通じて定期的に血液試料を採取し、両薬の薬物動態を評価する。主要転帰尺度には６分間歩行検査（６ＭＷＴ）のベースラインからの変化［時間枠：ベースラインから第４８週］を含み、二次転帰尺度には、ジストロフィン陽性線維の割合［時間枠：ベースラインから第２４週および第４８週］および予測最大吸気圧（ＭＩＰ）％、予測最大呼気圧（ＭＥＰ）％のベースラインからの変化［時間枠：ベースラインから第４８週］を含む。この試験に関するさらなる詳細はｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｏｒｇ（ＮＣＴ０２５００３８１）に見出される。
【０１９６】
Ｖ．キット
本開示は、遺伝性疾患を有する患者を治療するためのキットも提供し、このキットは、適切な容器に包装された少なくとも１つのアンチセンス分子（例えば、配列番号１〜５で記載されるアンチセンスオリゴマー）をその使用のための指示とともに含む。キットは、例えば、バッファ、安定剤などの周辺試薬も含み得る。当業者は、上の方法の適用が他の多くの疾患の治療に使用するのに適したアンチセンス分子の特定に広い適用範囲を有することを理解するべきである。
【実施例】
【０１９７】
上記の開示は、明確な理解を目的として図および例によってある程度詳細に記載されているが、本開示の教示を踏まえれば、添付の「特許請求の範囲」の趣旨も範囲も逸脱することなく本開示に特定の改変および修正を施し得ることが当業者に容易に明らかになるであろう。以下の実施例は単に説明を目的とするものであって、限定を目的とするものではない。当業者には、改変または修正を施しても実質的にほぼ同じ結果が得られ得る様々な重要性の低いパラメータが容易に認識されよう。
【０１９８】
材料および方法
細胞および組織の培養処理条件
組織培養処理したＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ社）内のＬ−グルタミン（ＨｙＣｌｏｎｅ社）、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質溶液（ＣｅｌＧｒｏ社）を含む温ＤＭＥＭ  ２４ｍＬにヒト横紋筋腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１３６；ＲＤ細胞）を１．５×１０６細胞／フラスコで播種し；２４時間後、培地を吸引し、細胞を温ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮な培地を加えた。細胞を３７℃、５．０％ＣＯ２の恒温器内で８０％のコンフルエンスまで増殖させ、トリプシンを用いて回収した。凍結乾燥したホスホロジアミダートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）を無ヌクレアーゼ水に約０．５〜２．０ｍＭで再懸濁させ；モル濃度を確認するため、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＰＭＯ溶液を測定した。製造業者の指示に従ったヌクレオフェクションおよびＳＧキット（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＰＭＯをＲＤ細胞に送達した。示される様々な濃度（例えば、２．５マイクロモル濃度、５マイクロモル濃度、１０マイクロモル濃度、１２．５マイクロモル濃度、２０マイクロモル濃度および２５マイクロモル濃度）のＰＭＯを試験した。１２ウェルまたは２４ウェルプレートの１ウェル当たり約２〜３×１０５個の細胞でヌクレオフェクション（ｎ＝２または３）を実施した後、細胞を２４時間インキュベートし、次いで、以下に記載するようにＲＮＡ抽出に供した。
【０１９９】
ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅
ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＲＮＡｓｐｉｎ  ９６ウェルＲＮＡ単離キットを用いてＰＭＯ処理細胞（ＲＤ細胞または初代ヒト筋芽細胞）からＲＮＡを抽出し、標準的技術および以下のプライマーペアを用いたネステッドＲＴ−ＰＣＲに供した。外側プライマー：順方向５’−ＣＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号６）、逆方向５’−ＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＧ−３’（配列番号７）；内側プライマー：順方向５’−ＧＴＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号８）、逆方向５’−ＧＣＡＡＴＧＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣ−３’（配列番号９）。Ｃｙ５標識アクリルアミドゲル電気泳動のデンシトロメトリー（ｄｅｎｓｉｔｒｏｍｅｔｒｙ）によりエクソンスキッピングを測定した。各バンドに予想される長さおよびＧＣ含有量についての生シグナル強度を補正した後、スキップのあるバンドおよびスキップのないバンドの強度を定量することにより、エクソンスキッピングの割合（すなわち、完全長ＰＣＲ産物に対するエクソンスキップ産物のバンド強度）を算出した。予想されたＰＣＲ産物を以下の表に示す：
【表７】
2019525742.tif 000066
エクソンスキッピング活性をスキップのある予想産物とスキップのない予想産物の総強度に対する割合として算出した。
【０２００】
修飾サブユニット間結合を有するモルホリノサブユニット、ＰＭＯおよびＰＭＯの調製
【化５９】
2019525742.tif 000067
【０２０１】
Ｂが塩基対形成部分を表すスキーム１を参照すると、図のように、対応するリビヌクレオシド（ｒｉｂｉｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）（１）からモルホリノサブユニットを調製し得る。必要に応じて、適切な保護基前駆体、例えば塩化トリチルとの反応によりモルホリノサブユニット（２）を保護し得る。下でさらに詳細に記載するように、３’保護基は一般に固相オリゴマー合成の過程で除去される。塩基対形成部分は固相オリゴマー合成に適した方法で保護し得る。適切な保護基として、アデニンおよびシトシンにはベンゾイル、グアニンにはフェニルアセチル、ヒポキサンチンにはピバロイルオキシメチルが挙げられる（Ｉ）。ピバロイルオキシメチル基はヒポキサンチン複素環式塩基のＮ１位上に導入することができる。保護されていないヒポキサンチンサブユニットを用いてもよいが、塩基が保護されているときの方が活性化反応の収率がはるかに優れている。その他の適切な保護基としては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，０７６，４７６号に開示されているものが挙げられる。
【０２０２】
３と活性化リン化合物４との反応により、所望の結合部分５を有するモルホリノサブユニットが得られる。
【０２０３】
構造４の化合物は当業者に公知のいくつもの方法を用いて調製することができる。次いで、上に概説したようにモルホリノ部分とのカップリングが進行する。
【０２０４】
サブユニット間結合を含むオリゴマーの調製には、構造５の化合物を固相オリゴマー合成に用いることができる。このような方法は当該技術分野で周知である。簡潔に述べれば、構造５の化合物の５’末端を固体支持体に対するリンカーが含まれるよう修飾し得る。支持されたのち、５の保護基（例えば、３’末端のトリチル）を除去し、遊離アミンを第二の構造５の化合物の活性化リン部分と反応させる。この配列を所望の長さのオリゴが得られるまで繰り返す。終末の３’末端にある保護基は、除去しても、あるいは３’修飾を望む場合は残してもよい。オリゴは、いくつもの方法または固体支持体との結合を切断する塩基を用いる例示の処理により固体支持体から切り離すことができる。
【０２０５】
モルホリノオリゴマー全般および本開示の特定のモルホリノオリゴマーの調製について実施例でさらに詳細に記載する。
【０２０６】
実施例１
モルホリノオリゴマーの調製
スキーム２による以下のプロトコルを用いて本開示の化合物の調製を実施する：
【化６０】
2019525742.tif 000068
【０２０７】
トリチルピペラジンフェニルカルバマート３５の調製：冷却した化合物１１のジクロロメタン（６ｍＬ／ｇ１１）懸濁液に炭酸カリウム（３．２ｅｑ）の水溶液（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）を加えた。この２相混合物にクロロギ酸フェニル（１．０３ｅｑ）のジクロロメタン溶液（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）を徐々に加えた。反応混合物を２０℃に温めた。反応終了時（１〜２時間）、層を分離した。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウムで乾燥させた。生成物３５を晶析によりアセトニトリルから単離した。
【０２０８】
カルバミン酸アルコール３６の調製：水素化ナトリウム（１．２ｅｑ）を１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）に懸濁させた。この懸濁液にトリエチレングリコール（１０．０ｅｑ）および化合物３５（１．０ｅｑ）を加えた。得られたスラリーを９５℃に加熱した。反応終了時（１〜２時間）、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）および水を加えた。生成物が含まれる有機層をＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で連続的に洗浄した。生成物３６を晶析によりジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンから単離した。
【０２０９】
テール酸３７の調製：化合物３６のテトラヒドロフラン溶液（７ｍＬ／ｇ３６）に無水コハク酸（２．０ｅｑ）およびＤＭＡＰ（０．５ｅｑ）を加えた。混合物を５０℃に加熱した。反応終了時（５時間）、混合物を２０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調整した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加え、生成物を水層内に抽出した。ジクロロメタンを加え、クエン酸水溶液で混合物をｐＨ３に調整した。生成物が含まれる有機層をｐＨ＝３のクエン酸緩衝液と飽和塩化ナトリウム水溶液の混合物で洗浄した。この３７のジクロロメタン溶液を単離せずに化合物３８の調製に用いた。
【０２１０】
３８の調製：化合物３７の溶液にＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２ｅｑ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４ｅｑ）、次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１ｅｑ）を加えた。混合物を５５℃に加熱した。反応終了時（４〜５時間）、混合物を２０℃に冷却し、１：１の０．２Ｍクエン酸／ブラインおよびブラインで連続的に洗浄した。ジクロロメタン溶液にアセトン、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドへの溶媒交換を実施し、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから飽和塩化ナトリウム水溶液中への沈殿により生成物を単離した。粗生成物を水で数回再スラリー化して残存するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび塩を除去した。
【０２１１】
固相合成過程のサブユニットの組込みに用いた方法により、アンカーを担持した樹脂（anchor-loaded  resin）への活性化「テール」の導入をジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中で実施した。
【０２１２】
【化６１】
2019525742.tif 000069
【０２１３】
この方法は、Ｎ２をフリットまたは真空抽出に通して泡立たせるための粗多孔性（４０〜６０μｍ）ガラスフリット、オーバーヘッドスターラーおよび三方Ｔｅｆｌｏｎ活栓を備えたシラン処理ジャケット式ペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ社、ニュージャージー州、米国）内で実施した。
【０２１４】
以下の方法の樹脂の処理／洗浄ステップは、樹脂流動化または攪拌床反応器および溶媒／溶液抽出の２つの基本操作からなる。樹脂流動化では、Ｎ２がフリットを通って上向きに流れるよう活栓を配置し、反応器に指定の樹脂処理／洗浄剤を加え、樹脂に浸透させて完全に湿らせた。次いで、攪拌を開始し、樹脂スラリーを指定の時間にわたって混合した。溶媒／溶液抽出では、混合およびＮ２流を停止し、真空ポンプを起動し、次いで、樹脂処理／洗浄剤を排出して廃棄するよう活栓を位置させた。別途言及されない限り、樹脂処理／洗浄剤の体積はいずれも、樹脂１ｇ当たり１５ｍＬとした。
【０２１５】
シラン処理ジャケット式ペプチド容器に入ったアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ；窒素置換に基づく担持量（load）約１．０ｍｍｏｌ／ｇ；７５ｇ、１ｅｑ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ社、イギリス、パート番号１４６４−Ｘ７９９）に１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ；２０ｍｌ／ｇ樹脂）を加え、樹脂を１〜２時間混合して膨潤させた。膨潤溶媒を排出した後、樹脂をジクロロメタン（２×１〜２分）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分）およびジクロロメタン（２×１〜２分）で洗浄した。最後の洗浄剤を排出した後、樹脂をジスルフィドアンカー３４の１−メチル−２−ピロリジノン溶液（０．１７Ｍ；１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５ｅｑ）で処理し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応終了時、加熱をやめ、アンカー溶液を排出し、樹脂を１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分）およびジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂を１０％（ｖ／ｖ）ジエチルジカルボナートのジクロロメタン溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分）で処理し、次いでジクロロメタン（６×１〜２分）で洗浄した。樹脂３９をＮ２流下で１〜３時間、次いで真空下で一定重量（±２％）になるまで乾燥させた。収率：元の樹脂重量の１１０〜１５０％。
【０２１６】
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の担持量の決定：樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基の数に関する分光アッセイにより樹脂の担持量（利用可能であると考えられる反応部位の数）を決定する。
【０２１７】
既知の重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン処理２５ｍｌメスフラスコに移し、２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液約５ｍＬを加える。内容物を穏やかにかき混ぜて混合し、次いで３０分間静置する。追加の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液で体積を２５ｍＬにし、内容物を十分に混合する。ポジティブディスプレイスメント式ピペットを用いて、一定量のトリチル含有溶液（５００μＬ）を１０ｍＬメスフラスコに移し、メタンスルホン酸で体積を１０ｍＬにする。
【０２１８】
最終溶液中のトリチルカチオン含有量を４３１．７ｎｍでのＵＶ吸光度により測定し、適切な体積、希釈率、吸光係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）および樹脂重量を用いて、樹脂の担持量を樹脂１ｇ当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）として算出する。アッセイは三重反復で実施し、平均担持量を算出する。
【０２１９】
この実施例の樹脂担持法では、樹脂の担持量が約５００μｍｏｌ／ｇとなる。ジスルフィドアンカー組込みステップを室温で２４時間実施した場合、μｍｏｌ／ｇで３００〜４００の担持量が得られた。
【０２２０】
テール担持：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ装置および体積を用いて、テールを固体支持体に導入することができる。最初にアンカー担持樹脂を酸性条件下で脱保護し、得られた材料をカップリング前に中和する。カップリングステップでは、ジスルフィドアンカー溶液の代わりに４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含有する３８のＤＭＩ溶液（０．２Ｍ）を使用した。４５℃で２時間経過した後、樹脂３９を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に無水安息香酸（０．４Ｍ）とＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を加えた。２５分後、反応器のジャケットを室温に冷却し、樹脂を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中５％のジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで８回洗浄した。樹脂４０をろ過し、高真空下で乾燥させた。樹脂４０の担持量をテール担持に使用した元のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂３９の担持量と定義する。
【０２２１】
固相合成：Ｇｉｌｓｏｎ  ＡＭＳ−４２２  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いてモルホリノオリゴマーを２ｍＬ  Ｇｉｌｓｏｎポリプロピレン反応カラム（パート番号３９８０２７０）中で調製した。カラムを合成装置に置く際に、水流用のチャネルを有するアルミニウムブロックをその周囲に置いた。ＡＭＳ−４２２は試薬／洗浄溶液を選択的に加え、指定の時間にわたって保持し、真空を用いてカラムを空にする。
【０２２２】
長さが約２５サブユニットまでの範囲のオリゴマーには、樹脂の担持量が約５００μｍｏｌ／ｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。これより大きいオリゴマーには、樹脂の担持量が３００〜４００μｍｏｌ／ｇのアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂が好ましい。５’テールを有する分子を望む場合、テールが担持された樹脂を同じ担持指針で選択する。
【０２２３】
以下の試薬溶液を調製した：
・脱トリチル化溶液：４：１のジクロロメタン／アセトニトリル中１０％のシアノ酢酸（ｗ／ｖ）；
・中和溶液：３：１のジクロロメタン／イソプロパノール中５％のジイソプロピルエチルアミン；
・カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン中、所望の塩基と結合タイプの０．１８Ｍ（または２０サブユニットより長く伸長したオリゴマーには０．２４Ｍ）活性化モルホリノサブユニットおよび０．４Ｍ  Ｎエチルモルホリン。
【０２２４】
異なる試薬溶液の洗浄液を分離する移行洗浄剤としてジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いた。
【０２２５】
合成装置では、ブロックを４２℃に設定し、アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂（またはテール樹脂）３０ｍｇの入った各カラムに１−メチル−２−ピロリジノン２ｍＬを加え、室温で３０分間静置した。ジクロロメタン２ｍＬで２回洗浄した後、以下の合成サイクルを用いた：
【表８】
2019525742.tif 000070
【０２２６】
各カラムに適切なカップリング溶液（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｉ）が適切な順序で入るよう個々のオリゴマーの配列を合成装置にプログラムした。カラム内のオリゴマーにその最後のサブユニットが完全に組み込まれたとき、カラムをブロックから取り外し、０．８９Ｍの４−エチルモルホリンを含有する４−メトキシトリフェニルメチルクロリド（ＤＭＩ中０．３２Ｍ）からなるカップリング溶液を用いて最後のサイクルを手動で実施した。
【０２２７】
樹脂からの切断ならびに塩基および主鎖保護基の除去：メトキシトリチル化の後、樹脂を１−メチル−２−ピロリジノン２ｍＬで８回洗浄した。１−メチル−２−ピロリジノン中０．１Ｍの１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と０．７３Ｍのトリエチルアミンとからなる切断溶液１ｍＬを加え、カラムにキャップをし、室温で３０分間静置した。その時間ののち、溶液を１２ｍＬのＷｈｅａｔｏｎバイアルの中に注いだ。大幅に収縮した樹脂を切断溶液３００μＬで２回洗浄した。溶液に濃アンモニア水溶液（−２０℃で保管したもの）４．０ｍＬを加え、バイアルに（Ｔｅｆｌｏｎで内張りしたスクリューキャップで）きつくキャップをし、混合物をかき混ぜて溶液を混合した。バイアルを４５℃のオーブンの中に１６〜２４時間置いて塩基および主鎖保護基の切断を実施した。
【０２２８】
粗生成物の精製：バイアルに入った加アンモニア分解溶液をオーブンから取り出し、室温まで冷却させた。溶液を０．２８％アンモニア水溶液２０ｍＬで希釈し、Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ  ＨＱ樹脂（ＢｉｏＲａｄ社）の入った２．５×１０ｃｍのカラムに通した。塩勾配（Ａ：０．２８％アンモニアとＢ：０．２８％アンモニア中１Ｍの塩化ナトリウム；６０分間で０〜１００％のＢ）を用いて、メトキシトリチルが含まれるピークを溶離した。合わせた画分をプールし、所望の生成物に応じてさらに処理した。
【０２２９】
モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化：Ｍａｃｒｏｐｒｅｐによる精製でプールした画分を１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で処理してｐＨを２．５に低下させた。最初の混合の後、試料を室温で４分間静置し、その時点で２．８％アンモニア／水を用いて試料をｐＨ１０〜１１に中和する。生成物を固相抽出（ＳＰＥ）により精製した。
【０２３０】
ＳＰＥカラムの充填およびコンディショニング：２０ｍＬのフリットカラム（ＢｉｏＲａｄ  Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（７３２−１０１１））にＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ−３００Ｍ（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ社；フィラデルフィア、ペンシルベニア州）（３ｍＬ）を充填し、樹脂を３ｍＬの以下のもの：０．２８％ＮＨ４ＯＨ／８０％アセトニトリル；０．５Ｍ  ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；５０ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４／８０％アセトニトリル；水；０．５ＮａＯＨ／２０％エタノール；水；０．２８％ＮＨ４ＯＨですすいだ。
【０２３１】
ＳＰＥ精製：脱メトキシトリチル化で得た溶液をカラムにかけ、樹脂を０．２８％アンモニア水溶液３〜６ｍＬで３回すすいだ。Ｗｈｅａｔｏｎバイアル（１２ｍＬ）をカラムの下に置き、０．２８％アンモニア水溶液中４５％のアセトニトリル２ｍＬで２回洗浄することにより生成物を溶離した。
【０２３２】
生成物の単離：溶液をドライアイスで凍結させ、バイアルを凍結乾燥機の中に置いて、綿毛状の白色粉末を得た。試料を水に溶かし、シリンジを用いて０．２２ミクロンフィルター（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、０．２ミクロンＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ膜を有するＡｃｒｏｄｉｓｃ  ２５ｍｍシリンジフィルター）に通してろ過し、ＵＶ分光光度計で光学密度（ＯＤ）を測定して存在するオリゴマーのＯＤ単位を求め、試料を解析用に分注した。次いで、溶液をＷｈｅａｔｏｎバイアルに戻して凍結乾燥させた。
【０２３３】
ＭＡＬＤＩによるモルホリノオリゴマーの解析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて、精製で得た画分の組成を明らかにし、オリゴマーの同一性（分子量）を示す証拠を得た。試料をマトリックスとしての３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸（シナピン酸）、３，４，５−トリヒドキシアセトフェノン（ｔｒｉｈｙｄｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）（ＴＨＡＰ）またはアルファ−シアノ−４−ヒドキシケイ皮酸（ｈｙｄｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）（ＨＣＣＡ）の溶液で希釈した後、試験した。
【０２３４】
実施例２
実施例１に記載したプロトコルを用いて以下のＰＭＯを合成し、実施例に使用した。
【化６２】
2019525742.tif 000071
表中の、１〜２６および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表９】
2019525742.tif 000072
表中、Ａは
【化６３】
2019525742.tif 000073
であり、Ｃは
【化６４】
2019525742.tif 000074
であり、Ｇは
【化６５】
2019525742.tif 000075
であり、Ｔは
【化６６】
2019525742.tif 000076
である。
ＨＰＬＣ：７８．６０％；条件：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ（ＤＮＸ＃９７）勾配：０分に７５％Ａ＋２０％Ｂ＋５％Ｃ；２０分に５０％Ａ；２１分に２５％Ａ＋７５％Ｃ；移動相Ａ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｃ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＮａＣＬ。カラム温度：４５℃；流速１．０ｍＬ／分。
ＭＡＬＤＩ質量分析で確認した質量：８９０８．２
【０２３５】
実施例３
実施例１に記載したプロトコルを用いて以下のＰＭＯを合成し、実施例に使用した。
【化６７】
2019525742.tif 000077
表中の、１〜２２および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表１０】
2019525742.tif 000078
表中、Ａは
【化６８】
2019525742.tif 000079
であり、Ｃは
【化６９】
2019525742.tif 000080
であり、Ｇは
【化７０】
2019525742.tif 000081
であり、Ｔは
【化７１】
2019525742.tif 000082
である。
ＨＰＬＣ：７１．８５％；条件：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ（ＤＮＸ＃９７）勾配：０分に７５％Ａ＋２０％Ｂ＋５％Ｃ；２０分に５０％Ａ；２１分に２５％Ａ＋７５％Ｃ；移動相Ａ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｃ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＮａＣＬ。カラム温度：４５℃；流速１．０ｍＬ／分。
ＭＡＬＤＩ質量分析で確認した質量：７５８８．３９
【０２３６】
実施例４
実施例１に記載したプロトコルを用いて以下のＰＭＯを合成し、実施例に使用した。
【化７２】
2019525742.tif 000083
表中の、１〜２５および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表１１】
2019525742.tif 000084
表中、Ａは
【化７３】
2019525742.tif 000085
であり、Ｃは
【化７４】
2019525742.tif 000086
であり、Ｇは
【化７５】
2019525742.tif 000087
であり、Ｔは
【化７６】
2019525742.tif 000088
である。
ＨＰＬＣ：７８．００％；条件：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ（ＤＮＸ＃９７）勾配：０分に７５％Ａ＋２０％Ｂ＋５％Ｃ；２０分に５０％Ａ；２１分に２５％Ａ＋７５％Ｃ；移動相Ａ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｃ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＮａＣＬ。カラム温度：４５℃；流速１．０ｍＬ／分。
ＭＡＬＤＩ質量分析により確認した質量：８６２３．８４
【０２３７】
実施例５
実施例１に記載したプロトコルを用いて以下のＰＭＯを合成し、実施例に使用した。
【化７７】
2019525742.tif 000089
表中の、１〜２８および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表１２】
2019525742.tif 000090
表中、Ａは
【化７８】
2019525742.tif 000091
であり、Ｃは
【化７９】
2019525742.tif 000092
であり、Ｇは
【化８０】
2019525742.tif 000093
であり、Ｔは
【化８１】
2019525742.tif 000094
である。
ＨＰＬＣ：７１．８４％；条件：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ（ＤＮＸ＃９７）勾配：０分に７５％Ａ＋２０％Ｂ＋５％Ｃ；２０分に５０％Ａ；２１分に２５％Ａ＋７５％Ｃ；移動相Ａ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｃ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＮａＣＬ。カラム温度：４５℃；流速１．０ｍＬ／分。
ＭＡＬＤＩ質量分析により確認した質量：９６１６．５０
【０２３８】
実施例６
実施例１に記載したプロトコルを用いて以下のＰＭＯを合成し、実施例に使用した。
【化８２】
2019525742.tif 000095
表中の、１〜２８および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表１３】
2019525742.tif 000096
表中、Ａは
【化８３】
2019525742.tif 000097
であり、Ｃは
【化８４】
2019525742.tif 000098
であり、Ｇは
【化８５】
2019525742.tif 000099
であり、Ｔは
【化８６】
2019525742.tif 000100
である。
ＨＰＬＣ：７５．１５％；条件：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ（ＤＮＸ＃９７）勾配：０分に７５％Ａ＋２０％Ｂ＋５％Ｃ；２０分に５０％Ａ；２１分に２５％Ａ＋７５％Ｃ；移動相Ａ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｃ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＮａＣＬ。カラム温度：４５℃；流速１．０ｍＬ／分。
ＭＡＬＤＩ質量分析により確認した質量：９５９３．６４
【０２３９】
実施例７
実施例１に記載したプロトコルを用いて以下のＰＭＯを合成し、実施例に使用した。
【化８７】
2019525742.tif 000101
表中の、１〜３０および５’〜３’の各Ｎｕは以下の通りである：
【表１４】
2019525742.tif 000102
表中、Ａは、
【化８８】
2019525742.tif 000103
であり、Ｃは
【化８９】
2019525742.tif 000104
であり、Ｇは
【化９０】
2019525742.tif 000105
であり、Ｔは
【化９１】
2019525742.tif 000106
である。
ＨＰＬＣ：７５．１５％；条件：Ｄｉｏｎｅｘ  ＤＮＡＰａｃ（ＤＮＸ＃９７）勾配：０分に７５％Ａ＋２０％Ｂ＋５％Ｃ；２０分に５０％Ａ；２１分に２５％Ａ＋７５％Ｃ；移動相Ａ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ；Ｃ：１０ｍＭ  ＮａＯＨ／０．５Ｍ  ＮａＣＬ。カラム温度：４５℃；流速１．０ｍＬ／分。
ＭＡＬＤＩ質量分析により確認した質量：１０２７１．３９
【０２４０】
実施例８
エクソン４５スキッピング
下の表に記載するヒトジストロフィンエクソン４５を標的とする、実施例２〜６に記載した一連のアンチセンスオリゴマーを調製し、エクソン４５スキッピングの誘導能を評価した。
【０２４１】
【表１５】
2019525742.tif 000107
【０２４２】
具体的には、ヒト横紋筋肉腫細胞を用いて、化合物１〜５の様々な濃度（すなわち、１２．５μｍ、２．５μｍ、０．５μｍおよび０．２５μｍ）でのエクソン４５スキッピング誘導能を求めた。ヌクレオフェクションから２４時間後、ＲＮＡを収集し、ネステッドＲＴ−ＰＣＲに供した。Ｃｙ５標識アクリルアミドゲル電気泳動を用いて試料を解析し、パーセントエクソンスキッピングを算出した。その結果を下の表に示す：
【表１６】
2019525742.tif 000108
【０２４３】
結果から、全被験ＰＭＯのエクソン４５スキッピングのレベルに用量反応が示された。驚くべきことに、化合物２は他の被験ＰＭＯと比較して、濃度１２．５μｍおよび２．５μｍで最も高い百分率のエクソン４５スキッピングを誘導した。具体的には、化合物２は濃度１２．５μｍで化合物６より８２％高いエクソン４５スキッピングを誘導した。
【０２４４】
本明細書で引用される刊行物および特許出願はいずれも、個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることをそれぞれ具体的かつ個別に示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４５】
（参考文献）
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Ｍａｔｓｕｏ，Ｍ．，Ｔ．Ｍａｓｕｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）．“Ｅｘｏｎ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍＲＮＡ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｄｕｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｔｒａｅｘｏｎ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｋｏｂｅ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８７（６）：２１２７−３１．
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Ｓａｚａｎｉ，Ｐ．，Ｒ．Ｋｏｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｓｐｌｉｃｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＣＴ  ＷＯ２００７０５８８９４，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ
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【０２４６】
【表１７】
2019525742.tif 000109
【図１】
2019525742.tif 000129
【図２】
2019525742.tif 000130
【図３】
2019525742.tif 000131
【配列表】
2019525742000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月4日(2019.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019525742000001.app
【国際調査報告】
2019525742.tif 000132
2019525742.tif 000133
2019525742.tif 000134
2019525742.tif 000135