(57)【要約】本発明は、ある特定の障害および状態、例えば、脳傷害、例えば、脳卒中または外傷性脳傷害の処置のための化合物およびその使用方法に関する。本発明は、例えば、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、神経変性状態、または心疾患もしくは心血管疾患から選択される傷害、疾患、または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニストを投与するステップを含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、神経変性状態、または心疾患もしくは心血管疾患から選択される傷害、疾患、または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニストを投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
化合物が、
【化７８】
2019515920.tif 000099
または薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が、
【化７９】
2019515920.tif 000100
または薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記傷害、疾患、または状態が、ＴＢＩである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＴＢＩが、脳振盪、爆傷、戦闘関連傷害、または頭部への軽度、中程度もしくは重度の衝撃から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記傷害、疾患、または状態が、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、くも膜下出血、脳血管攣縮、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）から選択される脳卒中である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者の神経保護または神経修復が、未処置患者と比較して増大する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはウイルス、アルコール依存症、腫瘍、毒素もしくは反復性脳傷害によって引き起こされた神経変性状態から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記傷害、疾患、または状態が、アルツハイマー病、片頭痛、脳手術、またはがん化学療法と関連する神経学的副作用である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＢＩ、脳卒中、心虚血、または心筋梗塞後の回復期間が、未処置患者と比較して短縮される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記心疾患または心血管疾患が、心虚血、心筋梗塞、心筋症、冠動脈疾患、不整脈、心筋炎、心膜炎、アンギナ、高血圧性心疾患、心内膜炎、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記心疾患または心血管疾患が、心虚血または心筋梗塞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が、脳卒中、心虚血、または心筋梗塞を処置するために、前記傷害が生じた後、その傷害が回復する期間中、慢性的に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ａ３Ｒが、部分的にアゴナイズされる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、または神経変性状態から選択される傷害、疾患、または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニストを投与するステップを含み、前記Ａ３Ｒが、他のＡ３Ｒ媒介性経路の活性化をほとんど伴わない、もしくはまったく伴わない細胞内カルシウム動員の優先的な活性化によって、またはＧｑ１１媒介性細胞内カルシウム動員、ｃＡＭＰ生成のＧｉ媒介性モジュレーションもしくはＥＲＫ１／２およびＡｋｔのＧｉ媒介性リン酸化の優先的な活性化によって、前記Ａ３Ｒ受容体の神経保護機能に向けてバイアスされた方式でアゴナイズされる、方法。
【請求項１７】
前記傷害、疾患、または状態が、ＴＢＩである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＢＩが、脳振盪、爆傷、戦闘関連傷害、または頭部への軽度、中程度もしくは重度の衝撃から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記傷害、疾患、または状態が、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、くも膜下出血、脳血管攣縮、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）から選択される脳卒中である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
神経変性疾患が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはウイルス、アルコール依存症、腫瘍、毒素もしくは反復性脳傷害によって引き起こされた神経変性状態から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記傷害、疾患、または状態が、アルツハイマー病、片頭痛、脳手術、またはがん化学療法と関連する神経学的副作用である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者の神経保護または神経修復が、未処置患者と比較して増大する、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ａ３Ｒが、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された神経保護機能または神経修復機能を伴って部分的にアゴナイズされる、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
心疾患または心血管疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニストを投与するステップを含み、前記アゴニストが、以下のＡ３Ｒ媒介性経路：Ｇｑ１１媒介性細胞内カルシウム動員の活性化、ｃＡＭＰ生成のＧｉ媒介性モジュレーション、ＥＲＫ１／２およびＡｋｔのＧｉ媒介性リン酸化、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルのモジュレーション、またはベータ−アレスチン活性化のモジュレーションの１つまたは複数の優先的な活性化によって、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された心臓保護機能を有するＡ３Ｒのバイアスアゴニストである、方法。
【請求項２６】
前記患者が、心虚血または心筋梗塞に罹患している、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者の心臓保護または損傷した心臓組織の再生を増大する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＢＩ、脳卒中、心虚血、または心筋梗塞後の回復期間が、未処置患者と比較して短縮される、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物が、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された心臓保護機能を有する前記Ａ３Ｒの部分アゴニストである、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年４月２１日に出願された米国仮出願第６２／３２５，８６０号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、脳、中枢神経系（ＣＮＳ）、または心血管系のある特定の状態、例えば脳傷害、神経変性状態、または心虚血の処置、軽減または回復の促進のための化合物およびその使用方法に関する。
【０００３】
政府援助の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された補助金番号第ＮＳ０９３７５６号のもとの政府援助により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
脳傷害は、非常に苦痛を伴う、よく見られる病状であり、世界的に罹患率および死亡率の主な原因の１つである。特に、ニューロンは修復能が限られているので、脳は傷害を受けやすい。個体が誕生するとき、脳は、生涯で備える本質的にすべてのニューロンを既に備えている。ニューロンは、体内の他の細胞とは異なり、生後すぐに再生を停止する。これらの細胞は、傷害を受けるか、または死滅しても置き換えられず、しばしば、ヒトの認知能力および感覚運動能力に障害を与え、主に不可逆的に悪化させる。神経細胞死および損傷をもたらす状態は、虚血エピソード（例えば、脳卒中）および外傷から変性障害（例えば、アルツハイマー病）に及ぶ。
【０００５】
中枢神経系（ＣＮＳ）への傷害は、世界的に、死亡および能力障害の実質的な原因である。例えば、ＣＤＣによれば、年間およそ１７０万人が外傷性脳傷害（ＴＢＩ）を受けており、医療費および生産性損失に関して年間６００億ドルを超える費用を米国経済にもたらしている（Finkelstein,  E；Corso,  P；Miller,  T、The  Incidence  and  Economic  Burden  of  Injuries  in  the  United  States、Oxford  University  Press：New  York、２００６年）。さらに、能力障害の主な原因である脳卒中は、米国において年間推定発症数７９５，０００の症例を伴う第３位の死亡原因であり、年間３４０億ドルを超える費用を米国経済にもたらしている（NINDS、２０１４年；stroke.nih.gov；およびMozaffarian  D、Benjamin  EJ,  Go  ASら、「Heart  disease  and  stroke  statistics-2015  update：a  report  from  the  American  Heart  Association」、Circulation.  ２０１５年；ｅ２９〜３２２頁）。
【０００６】
急性状況では、２４時間以内に患者を処置する機会により、損傷の程度を制限することができる。虚血または出血性脳卒中の直後、脳内の傷害を受けた部位は、典型的に、不可逆的に損傷を受けた組織の核を含有しており、生存可能であるが危険に曝された、周辺部と呼ばれる組織領域も含有している。この期間中、脳細胞への酸素およびグルコースの供給が不十分であれば、周辺部にさらなる二次傷害が生じる。酸素およびグルコースが欠乏すると、細胞ミトコンドリアによるエネルギー生成が低減する。このエネルギー枯渇の即効作用は、イオンポンプの不全であり、それによって、細胞外カリウム（Ｋ＋）イオン増大により脳組織内で反復して広がる脱分極波が生じる。同時に、細胞にナトリウム（Ｎａ＋）イオンが流入し、その後塩化物（Ｃｌ−）イオンが流入することによって、浸透圧上昇に起因する細胞膨潤が生じ、隣接するニューロンおよびそれらの突起が圧迫され、最終的には溶解（細胞破裂）および炎症応答が生じる。一般に、このイオンホメオスタシスの崩壊によって、興奮毒性、細胞膨潤および細胞死が生じ、それが損傷を隣接組織にまで与え、二次機構によって病変を拡大する。ストレスを受けた脳細胞を保護するためには、最初の２４時間の間に有効な処置を行うことが必要である。脳卒中における脳損傷の波及は、脳傷害の他の形態、例えば外傷および脳振盪に観測されるものと類似している。
【０００７】
有効な星状膠細胞機能は、急性処置にとどまらず、脳に傷害を受けた後２４〜９６時間、アルツハイマー病などの神経変性の患者、または最も一般的には高齢個体では数ヶ月〜数年間で、より広範に神経を修復する非常に重要な役割を果たす。脳細胞が再生できなくなると、任意の機能喪失を回復させるために、残りの無傷の脳組織が再編成する必要がある。この神経が再編成する潜在可能性は、より高齢の個体で低下する。
【０００８】
ＧＰＣＲ受容体は、心臓保護的効果を媒介することが示唆されている。したがって、これらの受容体のモジュレーションを介する類似の作用機序によって、心臓および心血管の状態を処置できる潜在可能性がある。
脳傷害、ＣＮＳ傷害、心疾患および心血管疾患、ならびに関連状態をより有効に処置し、アルツハイマー病などの神経変性状態を有する患者の神経修復を促進する、医療上の切迫した緊急の必要性は、まだ満たされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Finkelstein,  E；Corso,  P；Miller,  T、The  Incidence  and  Economic  Burden  of  Injuries  in  the  United  States、Oxford  University  Press：New  York、２００６年
【非特許文献２】Mozaffarian  D、Benjamin  EJ,  Go  ASら、「Heart  disease  and  stroke  statistics-2015  update：a  report  from  the  American  Heart  Association」、Circulation.  ２０１５年；ｅ２９〜３２２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
一態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、神経変性状態、または心疾患もしくは心血管疾患から選択される傷害、疾患、または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
一態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、神経変性状態、または心疾患もしくは心血管疾患から選択される傷害、疾患、または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、
【化１】
2019515920.tif 000002
から選択される、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニスト、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）または脳卒中から選択される脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、
【化２】
2019515920.tif 000003
から選択される有効量の化合物、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、
【化３】
2019515920.tif 000004
【化４】
2019515920.tif 000005
からなる群から選択される化合物（ここで、各化合物は、Ｎｏｒｔｈ型もしくはＳｏｕｔｈ型のコンフォメーションであってよく、またはメタノカルバ糖は、Ｄ−リボ糖で置き換えられてもよい）、または薬学的に許容されるその塩、またはその一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸体、または一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸体の薬学的に許容される塩を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、放射線損傷、脳卒中、片頭痛、心疾患もしくは心血管疾患、または神経変性障害を処置または軽減する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、放射線損傷、脳卒中、片頭痛、心疾患もしくは心血管疾患、または神経変性障害を処置または軽減する方法であって、それを必要とする患者に、アデノシン、ＡＤＰ、２−メチルチオ−ＡＤＰ三ナトリウム塩、ＡＴＰ、ＡＴＰ二ナトリウム塩、α，β−メチレンＡＴＰ、α，β−メチレンアデノシン５’−三リン酸三ナトリウム塩、２−メチルチオアデノシン三リン酸四ナトリウム塩、２−ＭｅＳＡＴＰ、ＢｚＡＴＰトリエチルアンモニウム塩、イノシン、シチジン、アシル化シチジン、シチジン−一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ＣＤＰ−コリン、ＣＭＰ−コリン、デヌホソル、デヌホソル四ナトリウム、ＧＴＰ、ＩＴＰ、ＭＲＳ５４１、ＭＲＳ５４２、ＭＲＳ１７６０、ＭＲＳ２１７９、ＭＲＳ２２７９、ＭＲＳ２３４１、ＭＲＳ２３６５、ＭＲＳ２５００、ＭＲＳ２６９０、ＭＲＳ２６９８、ＭＲＳ３５５８、ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ５１５１、ＭＲＳ５６７６、ＭＲＳ５６７８、ＭＲＳ５６９７、ＭＲＳ５６９８、ＭＲＳ５９２３、ＭＲＳ５９３０、ベンジル−ＮＥＣＡ、ＩＢ−ＭＥＣＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＬＪ５２９、ＤＰＭＡ、ＣＣＰＡ、ＤＢＸＲＭ、ＨＥＭＡＤＯ、ＰＥＭＡＤＯ、ＨＥＮＥＣＡ、ＰＥＮＥＣＡ、ＣＰ６０８，０３９、ＣＰ５３２，９０３、ＣＧＳ２１６８０、ＡＲ１３２、ＶＴ７２、ＶＴ１５８、ＶＴ１６０、ＶＴ１６３、ＰＳＢ０４７４、ウリジン５’−二リン酸（ＵＤＰ）、ＵＤＰ−グルコース、ウリジンβ−チオ二リン酸（ＵＤＰβＳ）、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）、ウリジンγ−チオリン酸（ＵＴＰγＳ）、２−チオＵＴＰ四ナトリウム塩、ＵＴＰγＳ三ナトリウム塩、ウリジン−５’−ジホスホグルコース、ジウリジン三リン酸、２−（ヘキシルチオ）（ＨＴ）−ＡＭＰ、ジアデノシン五リン酸、２’−デオキシ−２’−アミノ−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、トリアセチルウリジン、ジアセチル／アシルウリジン、ウリジン、スラミン、ジピリダモール類似体、ジアデノシン四リン酸Ａｐ４Ｕ、Ａｐ４Ａ、ＩＮＳ３６５、ＩＮＳ３７２１７もしくはＩＮＳ４８８２３から選択される有効量の化合物（ここで、各糖は、Ｎｏｒｔｈ型もしくはＳｏｕｔｈ型のコンフォメーションのメタノカルバ糖で置き換えられてよく、または各糖は、Ｄ−リボ糖で置き換えられてよい）、または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、腹腔内投与後のマウスにおけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳内の濃度−時間プロファイルを示す図である。図１Ｂは、静脈内投与後のブタ新生仔におけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳細胞外液内の濃度−時間プロファイルを示す図である。
【００１７】
【図２】図２は、ＭＲＳ２３６５の腹腔内投与後のマウスにおけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳内の濃度−時間プロファイルを示す図である。
【００１８】
【図３】図３は、ＥＤＴＡで処理したマウス血漿におけるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。
【００１９】
【図４】図４は、ＥＤＴＡで処理したヒト血漿におけるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。
【００２０】
【図５】図５は、ＥＤＴＡで処理したマウス全血におけるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。
【００２１】
【図６】図６は、ＥＤＴＡで処理したヒト全血におけるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。
【００２２】
【図７】図７は、ＥＤＴＡで処理したマウス血漿およびヘパリンで処理したマウス血漿における、９０秒間のインキュベート期間にわたるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。
【００２３】
【図８】図８は、ＥＤＴＡで処理したヒト血漿およびヘパリンで処理したヒト血漿における、９０秒間のインキュベート期間にわたるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を示す図である。
【００２４】
【図９】図９は、ヘパリン処理したヒト血漿における、３０分間のインキュベート後のＭＲＳ２３６５代謝産物の正イオンＬＣ／ＭＳ−ＭＳイオンクロマトグラムおよび生成物のイオンスペクトルを示す図である。
【００２５】
【図１０】図１０は、ヘパリン処理したヒト全血における、３０分間のインキュベート後のＭＲＳ２３６５代謝産物の正イオンＬＣ／ＭＳ−ＭＳイオンクロマトグラムおよび生成物のイオンスペクトルを示す図である。
【００２６】
【図１１】図１１は、ヘパリン処理したヒト血漿および全血において正イオンおよび負イオンＬＣ／ＭＳ−ＭＳによって検出されたＭＲＳ２３６５の代謝産物を表すスキームを示す図である。ヒト全血および血漿（抗凝固剤としてリチウムヘパリン）中、１００μＭでインキュベートした後、ＭＲＳ２３６５の２つの代謝産物が観測された。ＭＲＳ２３６５の部分的に脱リン酸化された代謝産物として同定されたＭ２（すなわち、リン酸基が１つ残っている、ＭＲＳ２３４７）、およびＭＲＳ２３６５の完全に脱リン酸化された代謝産物として同定されたＭ１（すなわちＭＲＳ４３２２）。
【００２７】
【図１２】図１２Ａ〜Ｄは、ＴＢＩまたはシャム（対照実験）に曝露したマウスに対するＭＲＳ４３２２、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡおよびＭＲＳ２３６５による処置の結果を示す図である。ＴＢＩは、普通、ＧＦＡＰ発現の増大を誘導する。マウスは、シャムまたはＴＢＩ（脳の同側上）を受け、ＴＢＩの３０分後、ラベルした通り処置を受けた。傷害後７日目に、マウスから血漿を得、次にマウスを屠殺して、同側（「Ｉｐｓｉ」）および対側（「Ｃｎｔｒ」）半球（中央３分の１）から脳ホモジネートを得た。ウエスタンブロット分析を、アクチンに対して正規化した。（図１２Ａおよび１２Ｃ）７日目の同側脳ホモジネートおよび血漿の代表的なブロットを示す。ＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５の投与によって、ＴＢＩに曝露したマウスにおけるＧＦＡＰ発現の脳内レベルが低下した。（図１２Ｂおよび１２Ｄ）３つの別個の実験から得られたデータをプールし（Ｎ＝処置ごとのマウスの数）、対照＋／−ＳＥＭの平均として示される棒ヒストグラムとしてプロットした。未処置ＴＢＩからの＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１（赤色バー）。
【００２８】
【図１３】図１３Ａ〜Ｄは、光血栓（photothrombosis）誘導性の脳卒中梗塞実験の結果、ならびにＭＲＳ４３２２および／または特異的アデノシンタイプＡ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３の投与の効果を示す図である。ＭＲＳ４３２２は、脳卒中梗塞の作用を低減したが、これらの作用は、ＭＲＳ１５２３によって覆された。（図１３Ａ）光血栓で脳卒中を生じたマウス脳の、ビヒクル（生理食塩水を注射した）、および処置した（ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ２３６５、ラベルした通り）マウスにおける冠状断（各群の薄片は、単一マウス由来のものである）。脳卒中を生じたマウスは、虚血後３０分以内にビヒクルまたは処置（ＩＰ注射）のいずれかを受けた。次に、脳卒中が生じてから２４時間後にマウスを屠殺し、それらの脳を取り出し、薄片を作製し、ＴＴＣで染色した。（図１３Ｂ）Ａ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３を予め注射した、脳卒中を生じたマウスの冠状断。（図１３Ｃ）ラベルしたＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ２３６５、ＭＲＳ５６９８およびＣｌ−ＩＢＭＥＣＡの、ＴＴＣで染色した脳卒中の平均体積。（図１３Ｄ）示される通り、Ａ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３で予め処置したマウスにおける脳卒中の体積。２回の実験から得られたデータをプールし（Ｎ＝処置ごとのマウスの数）、平均＋／−ＳＥＭとしてプロットした。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２９】
【図１４】図１４Ａ〜Ｂは、光血栓誘導性の脳卒中梗塞実験の結果、およびＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ１８７３、またはビヒクルの投与の効果を示す図である。光血栓誘導性の脳卒中梗塞は、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３によって低減される。（図１４Ａ）光血栓で脳卒中になった脳の、ビヒクル（生理食塩水を注射した）、および処置した（ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３、ラベルした通り）マウスにおける冠状断。脳卒中を生じたマウスは、虚血後３０分以内にビヒクルまたは処置（ＩＰ注射）のいずれかを受けた。次に、脳卒中が生じてから２４時間後にマウスを屠殺し、それらの脳を取り出し、薄片を作製し、ＴＴＣで染色した。（図１４Ｂ）ＴＴＣで染色した脳卒中の平均体積（ラベルした通り）。３回の実験から得られたデータをプールし（Ｎ＝処置ごとのマウスの数）、平均＋／−ＳＥＭとしてプロットした。＊＊ｐ＜０．０１。
【００３０】
【図１５】図１５は、特許請求される本発明において使用するのに適した、ある特定の化合物の構造を示す図である。
【００３１】
【図１６】図１６は、静脈内投与後のブタ新生仔におけるＭＲＳ４３２２の脳および脳脊髄液中の濃度−時間プロファイルを示す図である。ＭＲＳ４３２２の濃度は、ブタ新生仔への静脈内投与後に、血漿、脳、脳細胞外液および脳脊髄液試料において検出可能であった。
【００３２】
【図１７】図１７は、ＣＨＯ細胞において発現されたヒトＡ３受容体における、Ａ３アゴニスト放射性リガンド［３Ｈ］ＮＥＣＡ（１０ｎＭ）に対するＭＲＳ４３２２の競合結合実験を示す図である。ＭＲＳ４３２２について算出されたＫｉ値は、１４９０±４１０ｎＭであった。
【００３３】
【図１８】図１８は、ＣＨＯ細胞において発現されたマウスＡ３受容体における、Ａ３アゴニスト放射性リガンド［３Ｈ］ＮＥＣＡ（１０ｎＭ）に対するＭＲＳ４３２２の競合結合実験を示す図である。ＭＲＳ４３２２について算出されたＫｉ値は、４９４０±９７４ｎＭであった。
【００３４】
【図１９】図１９は、ＣＨＯ細胞において発現されたヒトＡ３受容体における、ＭＲＳ４３２２およびＮＥＣＡのｃＡＭＰ蓄積実験を示す図である。ＭＲＳ４３２２について算出されたＥＣ５０値は、３６３０±３７０ｎＭであり、ＮＥＣＡについては、ＥＣ５０値は４１．８±６．３ｎＭであると決定された。
【００３５】
【図２０】図２０は、ＣＨＯ細胞において発現されたマウスＡ３受容体におけるＭＲＳ４３２２およびＮＥＣＡのｃＡＭＰ蓄積実験を示す図である。ＭＲＳ４３２２について算出されたＥＣ５０値は、７５９±１７０ｎＭであり、ＮＥＣＡについては、ＥＣ５０値は６．８５±０．８８ｎＭであると決定された。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明のある特定の実施形態の詳細な説明
１．脳、ＣＮＳ、心血管、ならびに他の傷害および状態
一部の実施形態では、本発明は、急性脳外傷と関連する脳損傷、ならびに脳およびＣＮＳの長期疾患、ならびに心臓および心血管の疾患および状態を防止および／または処置するための新しい手法を提供する。一態様では、本発明は、現在、ニューロンの非常に重要な自然の世話役である細胞として理解されている星状膠細胞、ならびに脳のエネルギーのかなりの部分を供給する星状膠細胞ミトコンドリアによって媒介される神経保護効果および神経修復効果を利用することによって、このような傷害、疾患、および状態を処置する方法を提供する。別の態様では、本発明は、Ａ３Ｒ受容体によって媒介される心臓保護および再生効果によって、このような傷害、疾患、および状態を処置する方法を提供する。神経保護効果および神経修復効果に関して、理論にも拘泥するものではないが、Ａ３Ｒおよび／またはＰ２Ｙ１受容体によって媒介される星状膠細胞のエネルギー代謝の選択的増強により、世話役としての星状膠細胞の機能、例えばそれらの神経保護機能および神経修復機能が促進され、それによって、急性傷害および長期ストレスの両方に対するニューロンおよび他の細胞の抵抗性が増強されると考えられる。ある場合には、Ａ３Ｒおよび／またはＰ２Ｙ１受容体によって媒介される１つまたは複数の経路を、バイアス式に、すなわち選択的または優先的に達成することが有利になる場合があり、ここで、１つまたは複数の望ましくない経路は、活性化されないか、または度合いは比較的低いが活性化される。星状膠細胞に加えて、または星状膠細胞の代替として、グリア、ミクログリア、ニューロン、内皮細胞、ならびに他の脳細胞および／またはＣＮＳ細胞型の神経保護機能または神経修復機能が活性化され得る。したがって一態様では、本発明は、例えば星状膠細胞、グリア、ミクログリア、ニューロン、内皮細胞、あるいは脳および／またはＣＮＳの他の細胞によって媒介される神経保護効果および／または神経修復効果を増大することによって、脳傷害などの脳または中枢神経系（ＣＮＳ）のある特定の状態を処置し、軽減し、またはそれらからの回復を促進するための化合物、およびその使用方法を提供し、その方法は、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む。
【００３７】
星状膠細胞は、ニューロンを補助し保護する、非常に重要な役割を果たしており、脳損傷、例えば虚血傷害を引き起こす脳傷害の転帰に決定的に影響を及ぼす。星状膠細胞ミトコンドリア自体がこれらの脳機能において果たす中心的役割は、十分に理解されていない。例えば、星状膠細胞ミトコンドリアが阻害されると、膨潤が増大し、壊死性細胞死に至る。ニューロンは、星状膠細胞ミトコンドリアが機能しない場合に限り反復して広がる脱分極によって永久的に損傷を受け、星状膠細胞ミトコンドリアは、細胞外Ｋ＋が病態生理学的に上昇し、それによって脱分極が広がり始めるのを低減するのに必要である。星状膠細胞上のプリン作動性受容体の活性化は、ミトコンドリアＣａ２＋を増大し、ミトコンドリアＣａ２＋は、ミトコンドリアクエン酸回路機能を増強し、呼吸およびＡＴＰ生成を増大する。したがって一態様では、本発明は、星状膠細胞のプリン受容体を活性化すると、脳細胞生存シグナル伝達経路が増強され、酸化ストレス中の星状膠細胞およびニューロンの両方が生存できるようになるという発見に関する。さらに、活性化された星状膠細胞は、酸化ストレスに対する星状膠細胞およびニューロンの両方の抵抗性の一助になる非常に重要な抗酸化物質である還元グルタチオンを産生し、供給する。したがって一態様では、本発明は、星状膠細胞のプリン受容体をモジュレートして、酸化ストレス、例えば脳傷害、虚血再灌流または神経変性状態によって引き起こされた酸化ストレス後の患者の脳内の、１つまたは複数の細胞型の生存および生存率を促進する方法であって、それを必要とする患者に、開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３８】
一部の実施形態では、星状膠細胞の活性化は、アデノシン受容体（ＡＲ）などの１つまたは複数のプリン受容体、例えば星状膠細胞と会合しているか、または星状膠細胞によって発現される受容体を、開示される化合物と接触させ、したがって１つまたは複数の受容体の活性をモジュレートすることによって達成される。一部の実施形態では、化合物は、星状膠細胞上のアデノシン受容体、例えばＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３の効果によって星状膠細胞を活性化して、１つまたは複数の開示される疾患または状態を処置する。一部の実施形態では、開示される化合物は、それを必要とする患者に投与された後、グルタミン酸の取込み、反応性グリオーシス、膨潤、ならびに代謝ストレスに影響を有する神経栄養因子および神経毒性因子の放出などの１つまたは複数の機能に影響を及ぼし、したがってその結果、１つまたは複数の疾患または状態を処置する。一部の実施形態では、化合物は、ＡＲアゴニストである。一部の実施形態では、プリン受容体は、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）である。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３Ｒアゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体（Ａ３Ｒ）、例えばヒトＡ３受容体（ｈＡ３Ｒ）における部分アゴニストまたはバイアスアゴニストまたはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００３９】
Ｐ２Ｙ受容体は、Ｇタンパク質共役受容体であり、これらの受容体の様々なサブタイプは、シナプス連絡、細胞分化、イオン流動、血管拡張、血液脳関門透過性、血小板凝集およびニューロモジュレーションなどの過程において重要な役割を有する。プリン作動性Ｐ２Ｙ受容体ファミリーの特徴付けられたメンバーには、アデニンヌクレオチドに結合する哺乳動物Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２およびＰ２Ｙ１３受容体、ウラシルヌクレオチドに結合するＰ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、およびＰ２Ｙ１４受容体、ならびに混合型の選択性を有するＰ２Ｙ２およびげっ歯類Ｐ２Ｙ４受容体が含まれる。一部の実施形態では、星状膠細胞の活性化は、１つまたは複数のプリン受容体、例えばＰ２Ｙ受容体、例えば星状膠細胞と会合しているか、または星状膠細胞によって発現される受容体を、開示される化合物と接触させ、したがって１つまたは複数の受容体の活性をモジュレートすることによって達成される。一部の実施形態では、化合物は、星状膠細胞と会合しているか、または星状膠細胞によって発現されるＰ２Ｙ受容体、例えばＰ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ１１、Ｐ２Ｙ１２およびＰ２Ｙ１３受容体に対して効果を及ぼすことによって星状膠細胞を活性化して、１つまたは複数の開示される疾患または状態を処置する。一部の実施形態では、Ｐ２Ｙ受容体は、Ｐ２Ｙ１受容体である。一部の実施形態では、Ｐ２Ｙ１受容体は、細胞内ミトコンドリア膜上に位置する。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙアゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、例えばヒトＰ２Ｙ１受容体におけるＰ２Ｙ１アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体、例えばヒトＰ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩である。
【００４０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における脳傷害、例えばＴＢＩまたは進行性神経変性障害から生じる脳傷害を処置または軽減する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、ＴＢＩ、脳振盪、脳卒中、部分的もしくは全体的脊髄離断、または栄養障害に罹患している。他の実施形態では、対象は、毒性神経障害、髄膜脳炎（meningoencephalopathies）、遺伝的障害によって引き起こされた神経変性、加齢性神経変性もしくは血管疾患、または参照によって本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９１，７７５に開示されている別の疾患に罹患している。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における脳傷害、例えばＴＢＩまたは進行性神経変性障害から生じる脳傷害を処置または軽減する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における脳傷害、例えばＴＢＩまたは進行性神経変性障害から生じる脳傷害を処置または軽減する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００４１】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における星状膠細胞媒介性神経保護または神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における星状膠細胞媒介性神経保護または神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者における星状膠細胞媒介性神経保護または神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００４２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者におけるニューロン、グリア細胞、内皮細胞または他の脳細胞、例えば虚血性周辺部の脳細胞の生存を促進する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者におけるニューロン、グリア細胞、内皮細胞または他の脳細胞、例えば虚血性周辺部の脳細胞の生存を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者におけるニューロン、グリア細胞または他の脳細胞、例えば虚血性周辺部の脳細胞の生存を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００４３】
さらなる実施形態では、患者は、脳傷害、例えば下記の脳傷害を有しているか、またはそれを受ける危険性がある。したがって、以下に論じられる状態を処置する方法も提供される。
外傷性脳傷害
【００４４】
外傷性脳傷害（ＴＢＩ）は、非常に苦痛を伴う、よく見られる病状であり、世界的に、２０２０年までには罹患率および死亡率の第３位の主な原因になると予想される。ＴＢＩに対して承認されている処置は存在せず、ほとんどのＴＢＩ患者は、薬理学的処置を受けずに退院する（Witt  ２００６年）。反復性ＴＢＩ、例えば脳振盪は、数十年間にわたって様々な症状および能力障害をもたらす、加齢に関連する神経変性を誘発するおそれがある（McKee  ２０１３年）。ＴＢＩは、スポーツに関係する傷害、自動車両事故、落下、爆発衝撃、物理的暴行等によって生じるおそれがある。傷害は、それらの複雑度および重症度が多種多様であり、精神状態、認知困難または意識喪失の短時間の変化を伴う「軽度」の脳振盪から、傷害後に長期間の意識不明および／または記憶喪失を伴う「重症」にわたる。米国では、年間およそ１７０万人が、ＴＢＩをもたらす傷害を有しており、医学的介入を求めており（ＵＳＣＳＦおよびＣＤＣ）、ＣＤＣは、病院または救急科を訪れていない年間１６０〜３８０万人のさらなる脳振盪発生が、スポーツおよび他の娯楽活動で生じていると推定している（ＣＤＣ；Langlois  ２００６年）。各スポーツシーズンで、選手のおよそ５〜１０％が脳振盪を起こす（Ｓｐｏｒｔｓ  Ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ２０１２年）。フットボールは、男性で脳振盪の危険性が最も高いスポーツであり（脳振盪の可能性７５％）、サッカーは、女性で脳振盪の危険性が最も高いスポーツである（脳振盪の可能性５０％）。ＴＢＩは、子どもおよび若年成人における死亡および能力障害の主な原因であり（ＣＤＣ）、その大部分は、一般的に軍事に関係する傷害を受けていた。２００３年以来配置された米国軍人のおよそ２０％が、少なくとも１つの持続的ＴＢＩを有している（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＣＥＮＣ）；Warden  ２００６年；Scholten  ２０１２年；Taylor  ２０１２年；Gavett  ２０１１年；Guskiewicz  ２００５年；Omalu  ２００５年）。ＴＢＩに関係する間接的および直接的医療費全体は、年間７７０億ドルと推定されている（ＵＣＳＦおよびＣＤＣ）。少なくとも５００万人のアメリカ人は、ＴＢＩの結果、活動を実施するのに毎日の継続的支援を必要としている（ＣＤＣおよびThurman  １９９９年）。
【００４５】
本発明による星状膠細胞の活性化は、このような状態の新しい処置選択肢になる。したがって、本明細書の一態様では、ＴＢＩを処置するか、またはＴＢＩからの回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、ＴＢＩは、脳への外傷（例えば、脳振盪、爆傷、戦闘関連傷害）または脊髄への外傷（例えば、部分的または全体的脊髄離断）から選択される。一部の実施形態では、ＴＢＩは、頭部への軽度、中程度もしくは重度の衝撃から生じ、開放性もしくは閉鎖性頭部創傷を含み、または頭部への穿通性もしくは非穿通性衝撃から生じる。一部の実施形態では、本発明は、ＴＢＩを処置するか、またはＴＢＩからの回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＴＢＩを処置するか、またはＴＢＩからの回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
脳卒中
【００４６】
脳卒中は、脳に酸素および栄養分を輸送する血管が、虚血性ブロックに起因して、または脳内血管の出血性破裂により破壊され、脳の破壊領域内のニューロン、グリアおよび内皮細胞を死滅させる場合に生じる。脳卒中の転帰は、損傷の場所および幅に応じて変わり、その損傷の影響は、損傷した脳領域によって調節される身体機能において観測される。脳卒中は、片側または両側の麻痺、発語および言語能力障害、記憶喪失、行動学的変化、ならびにさらには死亡を引き起こすおそれがある。脳卒中は、米国において第４位の主な死亡原因であり、成人における能力障害の主な原因である。毎年、約８００，０００人が、新しいまたは再発性の脳卒中を経験している。毎日、２０００人を超えるアメリカ人が脳卒中を生じ、これらの発生のうち４００人超が死亡する。脳卒中は、米国において２０１０年には死亡者１９人当たり約１人に上った。≧２０歳の推定６８０万人のアメリカ人が、脳卒中を生じていた（ＡＨＡおよびGo  ２０１４年）。２０１０年現在、脳卒中の直接的および間接的年間費用は、３６５億ドルと推定された。脳卒中が生じてから数分以内に、血流が不足し、脳組織の核に永久的に損傷を与える。この損傷した核と正常な脳組織との間は、周辺部として公知の組織領域であり、この組織は、血流が少なくなり、エネルギー代謝がいくらか破壊されることによる段階的ストレスを受ける。脳卒中発生から最初の２４〜４８時間にわたって、周辺部のニューロン細胞およびグリア細胞にかかるストレスは、いくらかの回復またはさらなる細胞死のいずれかによって解消する。
【００４７】
一態様では、本発明は、脳卒中の患者を神経保護的に治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、このような治療は、可能な限り多くの周辺部を救済し、かつ／またはさらなる急性組織損傷を制限し、かつ／またはニューロンの回復を促進する。別の態様では、脳卒中を処置するか、または脳卒中からの回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。別の態様では、脳卒中を処置するか、または脳卒中からの回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本発明は、脳卒中を処置するか、または脳卒中からの回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩である。
【００４８】
一部の実施形態では、脳卒中は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、くも膜下出血、脳血管攣縮、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）から選択される。一部の実施形態では、脳卒中は、虚血である。一部の実施形態では、脳卒中は、出血である。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後４８時間以内に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後２４時間以内に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後１６時間以内に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後８時間、４時間、２時間、または１時間以内に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後少なくとも最初の１〜７２時間に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後少なくとも最初の８〜５２時間に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後少なくとも最初の８〜４８時間に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中後少なくとも最初の２４〜４８時間に投与される。一部の実施形態では、化合物は、脳卒中が生じた場合、脳卒中を処置するために慢性的に投与される。一部の実施形態では、化合物は、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を処置するために慢性的に投与される。
【００４９】
一部の実施形態では、化合物は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、くも膜下出血、脳血管攣縮、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を処置するか、または脳卒中の危険性が高い患者、例えば過去に脳卒中を生じたことがある患者、およびさらなる脳卒中の危険性がある患者、例えば年齢が４０歳、４５歳、５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳もしくは８０歳を超える患者を処置するために、慢性的に投与される。
【００５０】
一部の実施形態では、化合物は、脳卒中によって引き起こされた虚血再かん流傷害を処置する。
神経変性疾患
【００５１】
神経変性疾患は、脳および脊髄内のニューロンの進行性変性および／または死滅から生じる、不治であり、進行性の、最終的に衰弱させる症候群である。神経変性は、運動障害（失調症）および／または認知機能障害（認知症）をもたらし、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）などの多種多様な疾患を含む。多くの神経変性疾患は、主に遺伝的な由来のものであり、他の原因には、ウイルス、アルコール依存症、腫瘍または毒素が含まれ、現在明らかになっている通り、反復性脳傷害も含まれ得る。
【００５２】
ニューロンは、上記の因子に起因して細胞損傷を経時的に蓄積し、これは一般に、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの持続的細胞ストレスと関連する多くの神経変性疾患が、高齢個体において生じる理由であるとみなされている。認知症は、ＡＤを有する神経変性疾患の主な転帰であり、症例のおよそ６０〜７０％に相当する（Kandale  ２０１３年）。先に論じられる通り、神経保護機構および神経修復機構の活性化は、１つまたは複数の神経変性疾患の進行を軽減することができる。したがって一態様では、本発明は、神経変性疾患を処置するか、または神経変性疾患の回復を促進する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。
【００５３】
一態様では、本発明は、神経変性疾患に罹患している患者における神経保護または神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、神経変性疾患に罹患している患者における神経保護または神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法が提供される。他の実施形態では、神経変性疾患に罹患している患者における神経保護または神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩である。
アルツハイマー病（ＡＤ）
【００５４】
２０１４年には、すべての年齢の推定５２０万人のアメリカ人が、ＡＤを有していた。６５歳およびそれを超える年齢の集団の１１％が、ＡＤを有している（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）。２０５０年までには、ＡＤを有する６５歳およびそれを超える年齢の人の数は、ほぼ３倍の推定１３８０万人になると推定される。米国では、ＡＤ患者を看護する費用は、年間約２１４０億ドルであり、この費用の７０％は、メディケアおよびメディケイドが負担している。現在の傾向では、これらの費用は、２０５０年までには年間１．２兆ドルに至ると推定され得る。
【００５５】
本発明による星状膠細胞の活性化、ならびに神経保護および神経修復の促進は、ＡＤの新しい処置選択肢になる。したがって、本明細書の一態様では、ＡＤに罹患している患者におけるＡＤを処置するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本発明は、ＡＤに罹患している患者におけるＡＤを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＡＤに罹患している患者におけるＡＤを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩である。
パーキンソン病（ＰＤ）
【００５６】
１００万人ものアメリカ人がＰＤを伴って生活しており、毎年およそ６０，０００人のアメリカ人が新しく診断を受けているが、これには、検出されていない数千の症例が含まれていない（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。医学的処置、社会保障費および損失利益を含むＰＤの直接的および間接的費用を組み合わせた費用全体は、米国で年間ほぼ２５０億ドルになると推定される（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎおよびHuse  ２００５年）。
【００５７】
本発明による神経保護および神経修復の活性化は、ＰＤの新しい処置選択肢である。したがって、本明細書の一態様では、ＰＤに罹患している患者におけるＰＤを処置するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本発明は、ＰＤに罹患している患者におけるＰＤを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＰＤに罹患している患者におけるＰＤを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
多発性硬化症（ＭＳ）
【００５８】
米国では、４００，０００を超える人がＭＳを有している。若年成人では、ＭＳは、中枢神経系の最も一般的な疾患である（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）。星状膠細胞は、ＭＳによって引き起こされる神経細胞ミエリンコーティングの破壊を、それらの神経修復効果によって好転させ、ＭＳ患者の損傷したＣＮＳの治癒を促進する潜在的能力を有する。
【００５９】
したがって、本発明によるＣＮＳの神経保護および神経修復の活性化は、ＭＳの新しい処置選択肢である。したがって、本明細書の一態様では、ＭＳに罹患している患者におけるＭＳを処置するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本発明は、ＭＳに罹患している患者におけるＭＳを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＭＳに罹患している患者におけるＭＳを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）／ルー・ゲーリック疾患
【００６０】
米国では、毎年およそ５，６００人がＡＬＳの診断を受けており、３０，０００人ものアメリカ人が、同時に疾患を有しているおそれがある（ＡＬＳ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）。星状膠細胞の活性化は、ＡＬＳ患者におけるニューロンの回復および修復、ならびにニューロンの結合を刺激することができる。
【００６１】
したがって、本明細書の一態様では、ＡＬＳに罹患している患者におけるＡＬＳを処置するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。また他の実施形態では、ＡＬＳ患者におけるニューロンの回復および修復、ならびにニューロンの結合を刺激する方法であって、患者に、有効量の本明細書に開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、本発明は、ＡＬＳに罹患している患者におけるＡＬＳを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＡＬＳに罹患している患者におけるＡＬＳを処置するか、または神経保護もしくは神経回復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩である。
慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）
【００６２】
ＣＴＥ（タウオパチーの形態）は、頭部に１つまたは複数の（しばしば複数の、または時間経過と共に反復される）重症の衝撃を受けた個体において見出される進行性神経変性疾患である。ＣＴＥは、ほとんどの場合、脳外傷および／または脳振盪の反復を経験している、アメリカンフットボール、サッカー、ホッケー、プロレスリング、スタント、雄牛乗りおよびロデオ、モトクロス、ならびに他の接触型スポーツのプロ選手において診断される。ＣＴＥに罹患したヒトの部分集合は、ＡＬＳに似た運動ニューロン疾患症状によって特徴付けられる慢性外傷性脳筋症（ＣＴＥＭ）を有する。進行性筋力低下、ならびに運動および歩行異常は、ＣＴＥＭの初期徴候であると考えられる。ＣＴＥの第１段階の症状には、進行性注意欠陥、見当識障害、浮動性めまい、および頭痛が含まれる。第２段階の症状は、記憶喪失、社会的不安定、移り気な行動、および判断低下を含む。第３および第４段階では、患者は、進行性認知症、動作緩慢、振戦、軽躁病（hypomimia）、回転性めまい、言語障害、聴覚消失、および自殺傾向を患い、さらには、構音障害、嚥下障害、および眼の異常、例えば下垂が含まれ得る。
【００６３】
したがって、本明細書の一態様では、ＣＴＥに罹患している患者のＣＴＥを処置もしくは防止するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。また他の実施形態では、ＣＴＥ患者のニューロンの回復および修復、ならびにニューロンの結合を刺激する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、化合物は、ＣＴＥの第１段階、第２段階、第３段階、または第４段階の１つまたは複数の症状を処置する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＴＥに罹患している患者のＣＴＥを処置するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量のＡ３Ｒアゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＣＴＥに罹患している患者のＣＴＥを処置するか、または神経保護もしくは神経修復を促進する方法であって、患者に、有効量のＰ２Ｙ１アゴニストを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００６４】
顕微鏡尺度では、この病理には、神経細胞死、タウの蓄積、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）ベータ−アミロイドの蓄積、白質変化、および他の異常が含まれる。タウの蓄積には、高密度神経原線維変化（ＮＦＴ）、神経突起、ならびに星状膠細胞および他のグリア細胞から構成されるグリア濃縮体の存在の増大が含まれる。したがって一部の実施形態では、この方法は、神経細胞死、タウの蓄積、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ４３）ベータ−アミロイドの蓄積、白質変化、およびＣＴＥと関連する他の異常を処置し、排除を増強し、または防止する。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明は、神経変性疾患、例えば先および以下に論じられる疾患を処置するための、本明細書で開示される化合物、例えばＡ３Ｒのバイアスアゴニスト、部分アゴニストもしくはバイアス部分アゴニスト、またはＰ２Ｙ１のバイアスアゴニスト、部分アゴニストもしくはバイアス部分アゴニストの長期間投与を提供する。
心血管疾患
【００６６】
開示される化合物はまた、様々な心血管疾患および状態の処置に有用である。一部の実施形態では、本発明は、心疾患または心血管疾患、例えば心虚血、心筋梗塞、心筋症、冠動脈疾患、不整脈、心筋炎、心膜炎、アンギナ、高血圧性心疾患、心内膜炎、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物、例えばＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、開示される化合物は、例えばＡ３Ｒ受容体のバイアスアゴニズム、部分アゴニズム、またはバイアス部分アゴニズムによる、ＡＴＰ感受性カリウムチャネルのモジュレーションを提供する。
【００６７】
一部の実施形態では、心疾患または心血管疾患は、心虚血または心筋梗塞である。
他の疾患
【００６８】
例えば星状膠細胞ミトコンドリアの活性を増大することによって、神経保護などの有益な効果をモジュレートする化合物は、様々な他の疾患を処置する潜在可能性も有する。例えば、本発明で開示される神経保護における星状膠細胞の役割に起因して、例えばＡ３Ｒおよび／またはＰ２Ｙ１受容体のモジュレーションによる星状膠細胞の活性化は、以下に論じられる様々な疾患および状態の処置に有用となり得る。したがって、一部の実施形態では、本発明は、疾患または状態に罹患している患者の神経保護または神経再生を処置または促進する方法であって、患者に、有効量の開示される化合物、例えばＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、ならびに／または移植片拒絶反応および移植片対宿主病から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＷＯ２００７／２００１８を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、高眼圧および／または緑内障から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＷＯ２０１１／７７４３５を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、匂い感受性および／または嗅覚障害から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＥＰ１６２４７５３を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、２型糖尿病および／または疼痛管理から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＵＳ２０１０／０２５６０８６を参照されたい）。
【００６９】
他の実施形態では、疾患または状態は、呼吸器疾患および／または心血管（ＣＶ）疾患から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばFASEB  J.（２０１３年）２７巻：１１１８．４頁（会議抄録）を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、ＣＮＳ機能障害、学習障害および／または認知欠損から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばNeuropsychopharmacology.  ２０１５年１月；４０巻（２号）：３０５〜１４頁.  doi:  10.1038/npp.2014.173.  Ｅｐｕｂ２０１４年７月１５日、「Impaired  cognition  after  stimulation  of  a  P2Y1  receptor  in  the  rat  medial  prefrontal  cortex」、Koch,  H.ら、PMID:  25027332を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、プリオン病、および／または筋萎縮性側索硬化症から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＵＳ８，６９１，７７５を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、耳の障害、メニエール病、内リンパ水腫、進行性聴覚消失、浮動性めまい、回転性めまい、耳鳴症、がんの放射線治療と関連する付帯的脳損傷、および／または片頭痛処置から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、例えばそのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００９／０３０６２２５、ＵＹ３１７７９、およびＵＳ８，３９９，０１８を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、病理学的睡眠撹乱、うつ病、高齢者における睡眠障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、統合失調症、および／またはアルコール依存症からの回復によって経験する症状から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＵＳ２０１４／０２４１９９０を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、手術中の末梢神経系のニューロンまたは神経への損傷から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＵＳ８，６８５，３７２を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、がん、例えば前立腺がんである（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばBiochem  Pharmacol.  ２０１１年８月１５日；８２巻（４号）：４１８〜４２５頁、doi:10.1016/j.bcp.2011.05.013.「Activation  of  the  P2Y1  Receptor  Induces  Apoptosis  and  Inhibits  Proliferation  of  Prostate  Cancer  Cells」、Qiang  Weiらを参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、１つまたは複数の胃腸管の状態、例えば便秘および／または下痢から選択される（こ��らの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばActa  Physiol  (Oxf).  ２０１４年１２月；２１２巻（４号）：２９３〜３０５頁、doi:  10.1111/apha.12408.  「Differential  functional  role  of  purinergic  and  nitrergic  inhibitory  cotransmitters  in  human  colonic  relaxation」、Mane  N1、Gil  V、Martinez-Cutillas  M、Clave  P、Gallego  D、Jimenez  M.；およびNeurogastroenterol.  Motil.  ２０１４年１月；２６巻（１号）：１１５〜２３頁、doi:  10.1111/nmo.12240.  Ｅｐｕｂ２０１３年１０月８日、「Calcium  responses  in  subserosal  interstitial  cells  of  the  guinea-pig  proximal  colon」、Tamada  H.、Hashitani  H.  PMID:  24329947を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、ＣＮＳによって媒介される疼痛、例えば神経障害性疼痛、炎症性疼痛、および／または急性疼痛から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばBr  J  Pharmacol.  ２０１０年３月；１５９巻（５号）：１１０６〜１７頁、doi：10.1111/j.1476-5381.2009.00596.x.  Ｅｐｕｂ２０１０年２月５日、「A  comparative  analysis  of  the  activity  of  ligands  acting  at  P2X  and  P2Y  receptor  subtypes  in  models  of  neuropathic,  acute  and  inflammatory  pain.」Ando  RD1、Mehesz  B、Gyires  K、Illes  P、Sperlagh  B.  PMID:  20136836を参照されたい）。
【００７０】
他の実施形態では、疾患または状態は、脳のがん、例えば膠芽腫から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばPurinergic  Signal.  ２０１５年９月；１１巻（３号）：３３１〜４６頁、doi:  10.1007/s11302-015-9454-7.  Ｅｐｕｂ２０１５年５月１５日、「Potentiation  of  temozolomide  antitumor  effect  by  purine  receptor  ligands  able  to  restrain  the  in  vitro  growth  of  human  glioblastoma  stem  cells.」D'Alimonte,  I.ら、PMID:  25976165を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、疼痛である（疼痛の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、例えばそのそれぞれが参照によって本明細書に組み込まれる、Pharmacol  Biochem  Behav.  ２０１５年１月；１２８巻：２３〜３２頁、doi:  10.1016/j.pbb.2014.11.001、Ｅｐｕｂ２０１４年１１月６日、「Participation  of  peripheral  P2Y1,  P2Y6  and  P2Y11  receptors  in  formalin-induced  inflammatory  pain  in  rats.」Barragan-Iglesias  P.ら、PMID:  25449358；およびNeuropharmacology.  ２０１４年４月；７９巻：３６８〜７９頁、doi:  10.1016/j.neuropharm.2013.12.005、Ｅｐｕｂ２０１３年１２月１２日、「Blockade  of  peripheral  P2Y1  receptors  prevents  the  induction  of  thermal  hyperalgesia  via  modulation  of  TRPV1  expression  in  carrageenan-induced  inflammatory  pain  rats:  involvement  of  p38  MAPK  phosphorylation  in  DRGs.」Kwon  SG、Roh  DH、Yoon  SY、Moon  JY、Choi  SR、Choi  HS、Kang  SY、Han  HJ、Beitz  AJ、Lee  JH.  PMID:  24333674を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、胃腸管障害、例えば下痢から選択される（これらの状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばActa  Physiol  (Oxf).  ２０１４年１２月；２１２巻（４号）：２９３〜３０５頁、doi:  10.1111/apha.12408.「Differential  functional  role  of  purinergic  and  nitrergic  inhibitory  cotransmitters  in  human  colonic  relaxation」、Mane  N.、Gil  V、Martinez-Cutillas  M、Clave  P、Gallego  D、Jimenez  M.を参照されたい）。他の実施形態では、疾患または状態は、認知障害である（この状態の処置における、ある特定のヌクレオシドおよびヌクレオチド化合物の使用については、参照によって本明細書に組み込まれる、例えばNeuropsychopharmacology.  ２０１５年１月；４０巻（２号）：３０５〜１４頁、doi:  10.1038/npp.2014.173、Ｅｐｕｂ２０１４年７月１５日、「Impaired  cognition  after  stimulation  of  P2Y1  receptors  in  the  rat  medial  prefrontal  cortex」、Koch  H、Bespalov  A、Drescher  K、Franke  H、Krugel  U.  PMID:  25027332を参照されたい）。
【００７１】
一部の実施形態では、本発明は、脳傷害または神経変性状態と関連する疾患または状態、例えばてんかん、片頭痛、がんの放射線治療と関連する付帯的脳損傷、うつ病、気分もしくは行動の変化、認知症、移り気な行動、自殺傾向、振戦、ハンチントン舞踏病、運動協調の喪失、聴覚消失、発語障害、ドライアイ、軽躁病、注意欠陥、記憶喪失、認知困難、回転性めまい、構音障害、嚥下障害、眼の異常、または見当識障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３Ｒアゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００７２】
さらなる実施形態では、本発明は、それを必要とする患者におけるアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、およびプリオン病からなる群から選択される神経変性疾患を処置する方法であって、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３Ｒアゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストもしくはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、ＭＲＳ４３２２もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩である。
【００７３】
一部の実施形態では、認知または神経の機能の改善は、改訂版ウエクスラー記憶尺度の言語想起タスク遅延において、約１％〜２０％の間のスコア増大として測定される。例えば、認知機能の改善は、約１％〜１０％の間、または約１％〜５％の間のスコア増大として測定され得る。
２．本発明のある特定の化合物の説明
【００７４】
一態様では、本発明は、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）のある特定の状態、例えば脳傷害または神経変性状態の処置、軽減または回復の促進のために有用な化合物を提供する。一部の実施形態では、開示される化合物は、星状膠細胞によって媒介される神経保護および神経再生を増大し、それによって状態を処置し、軽減し、または回復を促進する。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体に対して選択的であり、例えば他のアデノシン受容体と比較して、Ａ３受容体に対して少なくとも１０倍選択的であり、または他のアデノシン受容体と比較して、例えば２５倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍を超えて選択的である。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体を選択的にモジュレートする。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体における選択的アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体における選択的部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、バイアス完全またはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、バイアス完全またはバイアス部分アンタゴニストである。
【００７５】
さらなる実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体に対して選択的であり、例えば他のＰ２Ｙ受容体と比較して、Ｐ２Ｙ１受容体に対して少なくとも１０倍選択的であり、または他のＰ２Ｙ受容体と比較して、例えば２５倍、５０倍、１００倍、５００倍もしくは１０００倍を超えて選択的である。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体を選択的にモジュレートする。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体における選択的アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体における選択的部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、バイアス完全またはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、バイアス完全またはバイアス部分アンタゴニストである。
【００７６】
「バイアス（された）」という用語は、受容体と関連する経路のすべてではないが１つまたは複数を、優先的にモジュレートし、活性化し、アゴナイズし、またはアンタゴナイズする化合物を指す。
【００７７】
理論にも拘泥するものではないが、バイアス完全またはバイアス部分アゴニズムまたはバイアスアンタゴニズムによって、Ａ３またはＰ２Ｙ１受容体と関連する１つまたは複数の経路の選択的モジュレーションが可能になり、それによって、疾患または状態の処置を改善し、経路の望ましくないモジュレーション（副作用を生じるおそれがある）を回避することができると考えられる。選択的モジュレーションは、本明細書で開示される通り、星状膠細胞を優先的に活性化して、例えば脳傷害、または神経変性疾患もしくは状態を処置することができる。したがって、一部の実施形態では、開示される化合物は、アデノシンＡ３受容体またはＰ２Ｙ１受容体と関連する、１つまたは複数のＧ共役経路またはＧ非依存経路のバイアス完全またはバイアス部分アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３またはＰ２Ｙ１受容体によって媒介される経路、例えばベータ−アレスチン活性化、細胞内カルシウム動員、ｃＡＭＰモジュレーション、ＡＴＰ依存性カリウムチャネル活性化もしくはＥＲＫ１／２リン酸化、またはこのような経路と関連する他の下流細胞活性を、選択的にモジュレートする。一部の実施形態では、経路は、神経保護もしくは神経修復、または心臓保護もしくは心臓再生を増大するか、またはそれらに関係する。一部の実施形態では、化合物は、（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシド、例えばＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００７８】
「メタノカルバヌクレオシド」という用語は、本明細書で使用される場合、リボース糖のテトラヒドロフラン環中に存在する酸素が、メチレン単位で置き換えられ、得られた炭素環式環が、シクロプロピル環に縮合して、ビシクロ［３．１．０］ヘキサン、例えば構造
【化５】
2019515920.tif 000006
を形成する、ヌクレオシド類似体を指す。理論に拘泥するものではないが、メタノカルバヌクレオシドは、ある特定の受容体サブタイプによって好まれると考えられる糖コンフォメーションまたは疑似コンフォメーションを模倣すると考えられる。一部の実施形態では、Ｎｏｒｔｈ型メタノカルバヌクレオシドは、Ｃ３’−ｅｎｄｏ／Ｃ２’−ｅｘｏ糖コンフォメーションを模倣するか、または好むメタノカルバヌクレオシドであり、Ｓｏｕｔｈ型メタノカルバヌクレオシドは、Ｃ３’−ｅｘｏ／Ｃ２’−ｅｎｄｏコンフォメーションを模倣するか、または好むメタノカルバヌクレオシドである。一部の実施形態では、（Ｎ）−メタノカルバ（「Ｎｏｒｔｈ型」メタノカルバ）糖は、以下の構造を有する。
【化６】
2019515920.tif 000007
一部の実施形態では、（Ｎ）−メタノカルバ糖は、本明細書において「Ｄ−（Ｎ）−メタノカルバ糖」と呼ばれる以下の構造を有する。
【化７】
2019515920.tif 000008
他の実施形態では、メタノカルバ糖は、Ｓｏｕｔｈ型、または（Ｓ）−メタノカルバ立体配置である。一部の実施形態では、このようなメタノカルバ糖は、以下の構造によって表される。
【化８】
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一部の実施形態では、（Ｓ）−メタノカルバ糖は、本明細書において「Ｄ−（Ｓ）−メタノカルバ糖」と呼ばれる以下の構造を有する。
【化９】
2019515920.tif 000010
【００７９】
一部の実施形態では、化合物は、Ａ３またはＰ２Ｙ１受容体において機能的に選択的であり、すなわち、例えば１つもしくは複数の経路をモジュレートし、他はモジュレートしないことによって、または１つもしくは複数の経路を活性化し、他の１つもしくは複数の経路を不活化することによって、Ａ３またはＰ２Ｙ１受容体によって媒介される経路を選択的に識別する。一部の実施形態では、化合物は、ｃＡＭＰシグナル伝達によって測定される通り、アンタゴニストであるが、β−アレスチン動員については部分アゴニストである。他の実施形態では、化合物は、Ｇｑ／１１媒介性Ｃａ２＋動員のアゴニストであり、アレスチン動員の部分アゴニストまたはアンタゴニストである。一部の実施形態では、本発明は、バイアスされたまたは機能的に選択的なＡ３受容体モジュレーション（例えば、先に列挙したものなどの経路における選択的アゴニズムまたはアンタゴニズムによって）によって、脳傷害、または神経変性疾患もしくは状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の開示される化合物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、化合物は、ＤＭＰＡ、ＣＣＰＡ、ＭＲＳ１７６０、またはＭＲＳ５４２から選択される（Verzijl  Dら、「Functional  selectivity  of  adenosine  receptor  ligands」、Purinergic  Signaling  ７巻：１７１〜１９２頁（２０１１年）を参照されたい）。一部の実施形態では、化合物は、ＤＢＸＲＭである。一部の実施形態では、化合物は、（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシド、例えばＭＲＳ４３２２または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００８０】
驚くべきことに、ある特定のプリンヌクレオシドの一リン酸、二リン酸、および三リン酸体、例えば本明細書で詳説されるものは、場合により細胞膜表面、ならびに血液および血漿における循環の両方に存在する、ヌクレオチドの脱リン酸化に関与する酵素であるエクトヌクレオチダーゼによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて急速に脱リン酸化されることが見出された（Ziganshinら、Pflugers  Arch.（１９９５年）４２９巻：４１２〜４１８頁を参照されたい）。どのヌクレオチド類似体が、エクトヌクレオチダーゼのための基質であり、したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで脱リン酸化されると予測されるかを予想することは、しばしば極めて困難である。一部の実施形態では、脱リン酸化された化合物は、治療有効性に関与する。したがって、一部の実施形態では、対応するリン酸化された一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸体、またはリン酸エステル、例えばそのアルキルもしくはフェニルエステルは、治療効果に関与する薬剤のプロドラッグまたは前駆体である。
【００８１】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。「血液脳関門」または「ＢＢＢ」という用語は、本明細書で使用される場合、厳密な意味でのＢＢＢならびに血液脊髄関門を指す。脳内血管の内皮、基底膜および神経膠細胞からなる血液脳関門は、脳内への物質の透過を制限するように作用する。一部の実施形態では、全薬物の脳／血漿比は、患者に投与（例えば経口または静脈内投与）した後、少なくともおよそ０．０１である。一部の実施形態では、全薬物の脳／血漿比は、少なくともおよそ０．０３である。一部の実施形態では、全薬物の脳／血漿比は、少なくともおよそ０．０６である。一部の実施形態では、全薬物の脳／血漿比は、少なくともおよそ０．１である。一部の実施形態では、全薬物の脳／血漿比は、少なくともおよそ０．２である。
【００８２】
原型のアデノシンＡ３アゴニスト、例えばＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡおよびＭＲＳ５６９８は、典型的に＞２のｃＬｏｇＰ値を有する、低溶解度の親油性化合物である。この親油性は、これらの化合物の高い血漿タンパク質結合、高い脳結合に寄与し、脳内でＡ３受容体と相互作用するのに利用可能な薬物の遊離画分を低減する、主な因子である。一部の実施形態では、本発明の化合物、例えばＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３の、例えば神経学的および神経変性状態、物理化学特性は、実質的に異なる。これらの化合物および関連化合物は、ｃＬｏｇＰ＜０を有する親水性化合物であり、溶解度を増大し、血漿および脳結合を低減し、Ａ３受容体と相互作用するのに利用可能な非結合薬物濃度を増大する。
【００８３】
したがって、一部の実施形態では、化合物は、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１、約０．０５、約０．０１、または約０．００５未満のｃＬｏｇＰを有する。一部の実施形態では、化合物は、約０未満、例えば約−０．１、−０．２、−０．３、−０．４、−０．５、−０．６、−０．７、−０．８、または−０．９またはそれ未満のｃＬｏｇＰを有する。一部の実施形態では、化合物は、血漿中で約０．５〜０．９の非結合画分を有する。一部の実施形態では、化合物は、血漿中で約０．６〜０．８５、０．７〜０．８、または約０．７５の非結合画分を有する。一部の実施形態では、化合物は、脳内で少なくとも約０．０２、または少なくとも約０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１５もしくは０．１７もしくはそれを超える非結合画分を有する。一部の実施形態では、化合物は、血漿中で約０．６〜０．８５、０．７〜０．８もしくは約０．７５の非結合画分を有し、かつ／または脳内で少なくとも０．０８の非結合画分を有する。
【００８４】
本発明の化合物は、当技術分野で公知の方法を使用し、日常的な実験方法だけを使用して調製され得る。例えば、本発明のある特定の化合物は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８７，５８９号（およびそれに記載されている参考文献）において提示されている手順に従って調製され得る。
【００８５】
一部の実施形態では、化合物は、アデノシン、ＡＤＰ、２−メチルチオ−ＡＤＰ三ナトリウム塩、ＡＴＰ、ＡＴＰ二ナトリウム塩、α，β−メチレンＡＴＰ、α，β−メチレンアデノシン５’−三リン酸三ナトリウム塩、２−メチルチオアデノシン三リン酸四ナトリウム塩、２−ＭｅＳＡＴＰ、ＢｚＡＴＰトリエチルアンモニウム塩、イノシン、シチジン、アシル化シチジン、シチジン−一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ＣＤＰ−コリン、ＣＭＰ−コリン、デヌホソル、デヌホソル四ナトリウム、ＧＴＰ、ＩＴＰ、ＭＲＳ５４１、ＭＲＳ５４２、ＭＲＳ１７６０、ＭＲＳ２１７９、ＭＲＳ２２７９、ＭＲＳ２３４１、ＭＲＳ２３６５、ＭＲＳ２５００、ＭＲＳ２６９０、ＭＲＳ２６９８、ＭＲＳ３５５８、ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ５１５１、ＭＲＳ５６７６、ＭＲＳ５６７８、ＭＲＳ５６９７、ＭＲＳ５６９８、ＭＲＳ５９２３、ＭＲＳ５９３０、ベンジル−ＮＥＣＡ、ＩＢ−ＭＥＣＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＬＪ５２９、ＤＰＭＡ、ＣＣＰＡ、ＤＢＸＲＭ、ＨＥＭＡＤＯ、ＰＥＭＡＤＯ、ＨＥＮＥＣＡ、ＰＥＮＥＣＡ、ＣＰ６０８，０３９、ＣＰ５３２，９０３、ＣＧＳ２１６８０、ＡＲ１３２、ＶＴ７２、ＶＴ１５８、ＶＴ１６０、ＶＴ１６３、ＰＳＢ０４７４、ウリジン５’−二リン酸（ＵＤＰ）、ＵＤＰ−グルコース、ウリジンβ−チオ二リン酸（ＵＤＰβＳ）、ウリジン５’−三リン酸（ＵＴＰ）、ウリジンγ−チオリン酸（ＵＴＰγＳ）、２−チオＵＴＰ四ナトリウム塩、ＵＴＰγＳ三ナトリウム塩、ウリジン−５’−ジホスホグルコース、ジウリジン三リン酸、２−（ヘキシルチオ）（ＨＴ）−ＡＭＰ、ジアデノシン五リン酸、２’−デオキシ−２’−アミノ−ＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、トリアセチルウリジン、ジアセチル／アシルウリジン、ウリジン、スラミン、ジピリダモール類似体、ジアデノシン四リン酸Ａｐ４Ｕ、Ａｐ４Ａ、ＩＮＳ３６５、ＩＮＳ３７２１７もしくはＩＮＳ４８８２３（ここで、各糖は、Ｎｏｒｔｈ型もしくはＳｏｕｔｈ型のコンフォメーションのメタノカルバ糖で置き換えられてよく、または各糖は、Ｄ−リボ糖で置き換えられてよい）、または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００８６】
一部の実施形態では、２−メチルチオ−ＡＤＰまたは薬学的に許容されるその塩は、本発明の方法において有用である。理論にも拘泥するものではないが、２−ＭｅＳ  ＡＤＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏで２−メチルチオアデノシンに急速に加水分解され、そこでＡ３Ｒのバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストになると考えられる。２−メチルチオアデノシンは、ＭＲＳ４３２２のデータに非常に類似している受容体データを有すると考えられる。
【００８７】
一部の実施形態では、化合物は、Ａ３Ｒアゴニスト、例えばＮ６−ベンジルアデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド、例えばＮ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（ＩＢ−ＭＥＣＡまたはＣａｎ−Ｆｉｔｅ  ＣＦ−１０１としても公知である）もしくは２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−アデノシン−５’−Ｎ−メチルウロンアミド（２−ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡまたはＣａｎ−Ｆｉｔｅ  ＣＦ−１０２としても公知である）、（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシド、例えば（１Ｒ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−４−（２−クロロ−６−（（３−クロロベンジル）アミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，３−ジ−ヒドロキシ−Ｎ−メチルビシクロ［３．１．０］ヘキサン−１−カルボキサミド（ＣＦ５０２、Ｃａｎ−Ｆｉｔｅ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、ＭＡとしても公知である）、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３−アミノ−５−［６−（２，５−ジクロロベンジルアミノ）プリン−９−イル］−４−ヒドロキシ−テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルアミド（ＣＰ５３２，９０３としても公知である）、（１’Ｓ，２’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ，５’Ｓ）−４−（２−クロロ−６−（３−クロロベンジルアミノ）−９Ｈ−プリン−９−イル）−２，３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルビシクロ［３．１．０］ヘキサン−１−カルボキサミド（ＭＲＳ３５５８としても公知である）、２−（１−ヘキシニル）−Ｎ−メチルアデノシン、（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−（６−（（３−ヨードベンジル）アミノ）−４Ｈ−プリン−９（５Ｈ）−イル）−Ｎ−メチルシクロペンタンカルボキサミド（ＣＦ１０１、Ｃａｎ−Ｆｉｔｅとしても公知である）、（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ）−４−（２−クロロ−６−（（３−ヨードベンジル）アミノ）−４Ｈ−プリン−９（５Ｈ）−イル）−２，３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルシクロペンタンカルボキサミド（ＣＦ１０２、Ｃａｎ−Ｆｉｔｅとしても公知である）、（１’Ｒ，２’Ｒ，３’Ｓ，４’Ｒ，５’Ｓ）−４−｛２−クロロ−６−［（３−ヨードフェニルメチル）アミノ］プリン−９−イル−｝−１−（メチルアミノカルボニル）−ビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２，３−ジオール（ＭＲＳ１８９８としても公知である）もしくは（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシドの２−ジアルキニル誘導体、または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、ＩＢ−ＭＥＣＡ（ＣＦ１０１としても公知である）もしくはＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（ＣＦ１０２としても公知である）、または薬学的に許容されるその塩から選択される。一部の実施形態では、化合物は、上記に開示されるものなどの（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシドまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００８８】
天然リガンドの存在下で受容体活性を増強するＡ３Ｒアロステリックモジュレーター、例えば２−シクロヘキシル−Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（ＣＦ６０２、Ｃａｎ−Ｆｉｔｅとしても公知である）も含まれる。しかし、先に列挙したＡ３Ｒアゴニストは、決して排他的なものではなく、このような他のアゴニストを使用することもできる。ポリマーに共有結合しているＡ３Ｒアゴニストの投与も企図される。例えば、Ａ３Ｒアゴニストは、アゴニストがポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーに結合しているコンジュゲートの形態で投与され得る。
【００８９】
理論にも拘泥するものではないが、ある特定のウリジン類似体によるバイアスアゴニズムを含む完全または部分アゴニズムによって、開示される疾患または状態の処置を改善し、望ましくない経路のモジュレーション（副作用をもたらすおそれがある）を回避することができる１つまたは複数の経路の選択的モジュレーションが可能になると考えられる。一部の実施形態では、選択的モジュレーションは、優先的に、星状膠細胞または他のグリア細胞、例えばミクログリアおよびオリゴデンドロサイトを活性化して、開示される脳傷害または神経変性疾患もしくは状態を処置する。本発明における使用に適した、ある特定のウリジン類似体化合物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／１６０５０２に開示されている。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３Ｒアゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、アデノシン受容体、例えばＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢまたはＡ３受容体におけるバイアスアゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ａ３受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、Ｐ２Ｙ１受容体におけるバイアスアゴニスト、部分アゴニスト、またはバイアス部分アゴニストである。一部の実施形態では、化合物は、
【化１０】
2019515920.tif 000011
【化１１】
2019515920.tif 000012
【化１２】
2019515920.tif 000013
もしくはそのリン酸化類似体、または薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【００９０】
一部の実施形態では、化合物は、以下から選択される。
【化１３】
2019515920.tif 000014
（Beukers  MWら、（２００４年）「New,  non-adenosine,  high-potency  agonists  for  the  human  adenosine  A2B  receptor  with  an  improved  selectivity  profile  compared  to  the  reference  agonist  N-ethylcarboxamidoadenosine」、J.  Med.  Chem.４７巻（１５号）：３７０７〜３７０９頁を参照されたい）、
【化１４】
2019515920.tif 000015
（Devine  SMら、「Synthesis  and  Evaluation  of  new  A3R  agonists」、Bioorg  Med  Chem  １８巻、３０７８〜３０８７頁、２０１０年；およびMuller  CE、Jacobson  KA.「Recent  Developments  in  adenosine  receptor  ligands  and  their  potential  for  novel  drugs」、Biochimica  et  Biophysica  Acta  １８０８巻、１２９０〜１３０８頁、２０１１年を参照されたい）、
【化１５】
2019515920.tif 000016
（Ben  DDら、「Different  efficacy  of  adenosine  and  NECA  derivatives  at  the  human  A3  receptor:  Insight  into  the  receptor  activation  switch」、Biochem  Pharm  ８７巻、３２１〜３３１頁、２０１４年；およびCamaioni  E、Di  Francesco  E、Vittori  S、Volpini  R、Cristalli  G.「Adenosine  receptor  agonists:  synthesis  and  biological  evaluation  of  the  diastereoisomers  of  2-(3-hydroxy-3-phenyl-1-propyn-1-yl)  NECA」、Bioorg  Med  Chem  １９９７年；５巻：２２６７〜７５頁を参照されたい）、
【化１６】
2019515920.tif 000017
（Klotz,  K.N.「2-Substituted  N-ethylcarboxamidoadenosine  derivatives  as  high-affinity  agonists  at  human  A3  adenosine  receptors」、Naunyn  Schmiedebergs  Arch  Pharmacol.  １９９９年８月；３６０巻（２号）：１０３〜８頁；およびCristalli  Gら（１９９５年）「2-Aralkynyl  and  2-heteroalkynyl  derivatives  of  adenosine-5'-N-ethyluronamide  as  selective  A2a  adenosine  receptor  agonists」、J  Med  Chem  ３８巻：１４６２〜１４７２頁を参照されたい）、
【化１７】
2019515920.tif 000018
（Kim  Sら、「3D  quantitative  SAR  at  A3R」、J  Chem  Inf.  Model  ４７巻、１２２５〜１２３３頁、２００７年を参照されたい）、
【化１８】
2019515920.tif 000019
（Lee,  K.ら、「Ring-Constrained  (N)-Methanocarba  Nucleosides  as  Adenosine  Receptor  Agonists」、Bioorg  Med  Chem  Lett  ２００１年、１１巻、１３３３〜１３３７頁を参照されたい）、
【化１９】
2019515920.tif 000020
（Kenneth  A.  Jacobsonら、第６章、A3  Adenosine  Receptor  Agonists:  History  and  Future  Perspectives  ９６〜９７頁、Book-Springer:  A3  Adenosine  Receptors  from  Cell  Biology  to  Pharmacology  and  Therapeutics、２００９年を参照されたい）、
【化２０】
2019515920.tif 000021
（Lee  Kら、「Ring-Constrained  (N)-Methanocarba  Nucleosides  as  Adenosine  Receptor  Agonists」、Bioorg  Med  Chem  Lett  ２００１年、１１巻、１３３３〜１３３７頁；およびGaoら、「Structural  Determinants  of  A3R  Activation:  Nucleoside  Ligands  at  the  Agonist/Antagonist  Boundary」、J.  Med.  Chem.、２００２年、４５巻、４４７１〜４４８４頁を参照されたい）、
【化２１】
2019515920.tif 000022
（Muller  CE、Jacobson  KA、「Recent  Developments  in  adenosine  receptor  ligands  and  their  potential  for  novel  drugs」、Biochimica  et  Biophysica  Acta  ２０１１巻、１８０８頁、１２９０〜１３０８頁を参照されたい）、
【化２２】
2019515920.tif 000023
（ＭＲＳ５９３０；Jacobson  KAら、「John  Daly  Lecture:  Structure-guided  Drug  Design  for  Adenosine  and  P2Y  Receptors」、Comp.  and  Struct.  Biotechnology  Jour  １３巻、２８６〜２９８頁、２０１５年を参照されたい）、
【化２３】
2019515920.tif 000024
（ＭＲＳ５９２３；Jacobson  KAら、「John  Daly  Lecture:  Structure-guided  Drug  Design  for  Adenosine  and  P2Y  Receptors」、Comp.  and  Struct.  Biotechnology  Jour  １３巻、２８６〜２９８頁、２０１５年を参照されたい）、
【化２４】
2019515920.tif 000025
ＣＰ５３２，９０３（Tracey  WRら、「Novel  n6-substitued  adenosine  5'-N-methyluronamides  with  high  selectivity  for  human  A3R  reduce  ischemic  myochardial  injury」、Am  J  Physiol  Heart  Circ  Physiol  ２８５巻、２００３年；Muller  CE、Jacobson  KA、「Recent  Developments  in  adenosine  receptor  ligands  and  their  potential  for  novel  drugs」、Biochimica  et  Biophysica  Acta  １８０８巻、１２９０〜１３０８頁、２０１１年；およびWan  TCら、「The  A3R  Agonist  CP-532,903  Protects  against  Myocardial  Ischemia/Reperfusion  Injury」、J.  of  Pharmacology  and  Exptl  Therapies  ３２４巻、１号、２００８年を参照されたい）、
【化２５】
2019515920.tif 000026
（Volpini  Rら、「HEMADO  as  Potent  and  Selective  Agonists  of  hA3R」、J  Med  Chem  ４５巻、３２７１〜３２７９頁、２００２年；Muller  CEら、「Recent  Developments  in  adenosine  receptor  ligands  and  their  potential  for  novel  drugs」、Biochimica  et  Biophysica  Acta  １８０８巻、１２９０〜１３０８頁、２０１１年；およびVolpini  Rら、「Synthesis  and  Evaluation  of  Potent  and  Highly  Selective  Agonists  for  hA3R」、J  of  Med  Chem  ５２巻、７８９７〜７９００頁、２００９年を参照されたい）、
【化２６】
2019515920.tif 000027
（Muller  CE、Jacobson  KA.「Recent  Developments  in  adenosine  receptor  ligands  and  their  potential  for  novel  drugs」、Biochimica  et  Biophysica  Acta  １８０８巻、１２９０〜１３０８頁、２０１１年を参照されたい）、
【化２７】
2019515920.tif 000028
（式中、Ｒは、Ｈまたはシクロペンチルメチルである）
【化２８】
2019515920.tif 000029
（式中、Ｒは、Ｈ、ブチル、またはピリジン−２−イルである）（Cosyn  L.ら、「2-triazole-substituted  adenosines」、J  Med  Chem  ２００６年、４９巻、７３７３〜７３８３頁を参照されたい）、
【化２９】
2019515920.tif 000030
（Muller  CE、Jacobson  KA.「Recent  Developments  in  adenosine  receptor  ligands  and  their  potential  for  novel  drugs」、Biochimica  et  Biophysica  Acta  １８０８巻、１２９０〜１３０８頁、２０１１年を参照されたい）、
【化３０】
2019515920.tif 000031
（Jacobson  KAら、「John  Daly  Lecture:  Structure-guided  Drug  Design  for  Adenosine  and  P2Y  Receptors」、Comp.  and  Struct.  Biotechnology  Jour  １３巻、２８６〜２９８頁、２０１５年を参照されたい）、
【化３１】
2019515920.tif 000032
（式中、Ａｒは、フェニル、ｐ−ＣＨ３ＣＯ−フェニル、ｐ−フルオロフェニル、または２−ピリジルから選択される）（Volpini  Rら、「Synthesis  and  Evaluation  of  Potent  and  Highly  Selective  Agonists  for  hA3R」、J  Med  Chem  ５２巻、７８９７〜７９００頁、２００９年を参照されたい）、
【化３２】
2019515920.tif 000033
（Pugliese  AMら、「Role  of  A3R  on  CA1  hippocampal  neurotransmission  during  OGD」、Biochem  Pharmacology  ７４巻、２００７年を参照されたい）、
【化３３】
2019515920.tif 000034
【化３４】
2019515920.tif 000035
（Klotz  KN「Adenosine  receptors  and  their  ligands  NS's」、Arch  Pharmacol.  ３６２巻、３８２〜３９１頁、２０００年を参照されたい）、または薬学的に許容されるその塩。一部の実施形態では、化合物は、上記に開示されるものなどの（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシドまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００９１】
一部の実施形態では、化合物は、
【化３５】
2019515920.tif 000036
【化３６】
2019515920.tif 000037
【化３７】
2019515920.tif 000038
または薬学的に許容されるその塩から選択される。一部の実施形態では、化合物は、上記に開示されるものなどの（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシドまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００９２】
一部の実施形態では、化合物は、
【化３８】
2019515920.tif 000039
または薬学的に許容されるその塩から選択される。一部の実施形態では、化合物は、
【化３９】
2019515920.tif 000040
（ここで、各化合物は、Ｎｏｒｔｈ型もしくはＳｏｕｔｈ型のコンフォメーションであってよく、またはメタノカルバ糖は、Ｄ−リボ糖で置き換えられてもよい）または薬学的に許容されるその塩、またはその一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸体、または一リン酸、二リン酸もしくは三リン酸体の薬学的に許容される塩からなる群から選択される。一部の実施形態では、メタノカルバ糖は、Ｄ−（Ｎ）−メタノカルバ糖である。一部の実施形態では、メタノカルバ糖は、Ｄ−（Ｓ）−メタノカルバ糖である。
【００９３】
一部の実施形態では、化合物は、
【化４０】
2019515920.tif 000041
【化４１】
2019515920.tif 000042
【化４２】
2019515920.tif 000043
または薬学的に許容されるその塩から選択される。一部の実施形態では、化合物は、上記に開示されるものなどの（Ｎ）−メタノカルバヌクレオシドまたは薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００９４】
一部の実施形態では、化合物は、
【化４３】
2019515920.tif 000044
または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００９５】
一部の実施形態では、化合物は、
【化４４】
2019515920.tif 000045
または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【００９６】
一部の実施形態では、化合物は、
【化４５】
2019515920.tif 000046
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化４６】
2019515920.tif 000047
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化４７】
2019515920.tif 000048
または薬学的に許容されるその塩である。
【００９７】
一部の実施形態では、化合物は、
【化４８】
2019515920.tif 000049
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化４９】
2019515920.tif 000050
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化５０】
2019515920.tif 000051
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化５１】
2019515920.tif 000052
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化５２】
2019515920.tif 000053
である。
【００９８】
一態様では、本発明は、開示される化合物または薬学的に許容されるその塩および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、化合物は、
【化５３】
2019515920.tif 000054
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化５４】
2019515920.tif 000055
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化５５】
2019515920.tif 000056
または薬学的に許容されるその塩である。一部の実施形態では、化合物は、
【化５６】
2019515920.tif 000057
である。
【００９９】
一部の実施形態では、化合物は、図１５に記載される化合物または薬学的に許容されるその塩から選択される。一部の実施形態では、化合物は、
【化５７】
2019515920.tif 000058
【化５８】
2019515920.tif 000059
（ＭＲＳ１８９８）もしくはＭＲＳ１８７３または薬学的に許容されるその塩から選択される。
【０１００】
一態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）または脳卒中から選択される脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、
【化５９】
2019515920.tif 000060
から選択される有効量の化合物、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１０１】
一部の実施形態では、化合物は、
【化６０】
2019515920.tif 000061
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１０２】
一部の実施形態では、化合物は、
【化６１】
2019515920.tif 000062
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１０３】
一部の実施形態では、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害または状態は、ＴＢＩである。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＴＢＩは、脳振盪、爆傷、戦闘関連傷害、または頭部への軽度、中程度もしくは重度の衝撃から選択される。
【０１０５】
一部の実施形態では、化合物は、ＴＢＩまたは脳卒中後２４時間以内に投与される。
【０１０６】
一部の実施形態では、化合物は、ＴＢＩまたは脳卒中後８時間以内に投与される。
【０１０７】
一部の実施形態では、化合物は、ＴＢＩまたは脳卒中後少なくとも最初の８〜４８時間の間に投与される。
【０１０８】
一部の実施形態では、脳または中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害または状態は、脳卒中である。
【０１０９】
一部の実施形態では、化合物は、脳卒中を処置するために、脳卒中が生じた後、脳卒中が回復する期間中、慢性的に投与される。
【０１１０】
一部の実施形態では、患者の神経保護または神経修復は、未処置患者と比較して増大する。
【０１１１】
一部の実施形態では、化合物は、ヒトＡ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）におけるバイアス部分アゴニストである。
【０１１２】
一部の実施形態では、Ａ３Ｒは、Ａ３Ｒ受容体の神経保護機能に向けてバイアスされた方式で部分的にアゴナイズされる。
【０１１３】
一部の実施形態では、化合物は、経口、静脈内、または非経口投与される。
【０１１４】
一態様では、本発明は、ＴＢＩまたは脳卒中に罹患している患者の神経保護または神経修復を増大する方法であって、それを必要とする患者に、
【化６２】
2019515920.tif 000063
から選択される有効量の化合物、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１１５】
一部の実施形態では、化合物は、
【化６３】
2019515920.tif 000064
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１１６】
一部の実施形態では、化合物は、
【化６４】
2019515920.tif 000065
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１１７】
一部の実施形態では、神経保護または神経修復は、ＴＢＩまたは脳卒中後の回復期間を、未処置患者と比較して短縮する。
【０１１８】
一部の実施形態では、化合物は、ヒトＡ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）におけるバイアス部分アゴニストであり、Ａ３Ｒは、Ａ３Ｒ受容体の神経保護機能に向けてバイアスされた方式で部分的にアゴナイズされる。
【０１１９】
一部の実施形態では、化合物は、経口、静脈内、または非経口投与される。
【０１２０】
一部の実施形態では、化合物または薬学的に許容されるその塩は、血漿中で少なくとも０．７の非結合画分を有するか、または脳内で少なくとも０．０８の非結合画分を有するか、またはその両方である。
【０１２１】
一部の実施形態では、化合物または薬学的に許容されるその塩は、血漿中で少なくとも０．７の非結合画分を有するか、または脳内で少なくとも０．０８の非結合画分を有するか、またはその両方である。
【０１２２】
一態様では、本発明は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、脳卒中、神経変性状態、または心疾患もしくは心血管疾患から選択される傷害、疾患、または状態を処置する方法であって、それを必要とする患者に、
【化６５】
2019515920.tif 000066
から選択される、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニスト、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１２３】
一部の実施形態では、化合物は、
【化６６】
2019515920.tif 000067
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１２４】
一部の実施形態では、化合物は、
【化６７】
2019515920.tif 000068
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１２５】
一部の実施形態では、傷害、疾患、または状態は、ＴＢＩである。
【０１２６】
一部の実施形態では、ＴＢＩは、脳振盪、爆傷、戦闘関連傷害、または頭部への軽度、中程度もしくは重度の衝撃から選択される。
【０１２７】
一部の実施形態では、傷害、疾患、または状態は、虚血性脳卒中、出血性脳卒中、くも膜下出血、脳血管攣縮、または一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）から選択される脳卒中である。
【０１２８】
一部の実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはウイルス、アルコール依存症、腫瘍、毒素もしくは反復性脳傷害によって引き起こされた神経変性状態から選択される。
【０１２９】
一部の実施形態では、傷害、疾患、または状態は、パーキンソン病である。
【０１３０】
一部の実施形態では、傷害、疾患、または状態は、アルツハイマー病、片頭痛、脳手術、またはがん化学療法と関連する神経学的副作用である。
【０１３１】
一部の実施形態では、心疾患または心血管疾患は、心虚血、心筋梗塞、心筋症、冠動脈疾患、不整脈、心筋炎、心膜炎、アンギナ、高血圧性心疾患、心内膜炎、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症から選択される。
【０１３２】
一部の実施形態では、心疾患または心血管疾患は、心虚血または心筋梗塞である。
【０１３３】
一部の実施形態では、化合物は、脳卒中、心虚血、または心筋梗塞を処置するために、傷害が生じた後、その傷害が回復する期間中、慢性的に投与される。
【０１３４】
一部の実施形態では、患者の神経保護または神経修復は、未処置患者と比較して増大する。
【０１３５】
一部の実施形態では、Ａ３Ｒは、他のＡ３Ｒ媒介性経路の活性化をほとんど伴わない、もしくはまったく伴わない細胞内カルシウム動員の優先的な活性化によって、またはＧｑ１１媒介性細胞内カルシウム動員、ｃＡＭＰ生成のＧｉ媒介性モジュレーションもしくはＥＲＫ１／２およびＡｋｔのＧｉ媒介性リン酸化の優先的な活性化によって、Ａ３Ｒ受容体の神経保護機能に向けてバイアスされた方式でアゴナイズされる。
【０１３６】
一部の実施形態では、Ａ３Ｒは、他のＡ３Ｒ媒介性経路の活性化をほとんど伴わない、もしくはまったく伴わない細胞内カルシウム動員の優先的な活性化によって、またはＧｑ１１媒介性細胞内カルシウム動員、ｃＡＭＰ生成のＧｉ媒介性モジュレーションもしくはＥＲＫ１／２およびＡｋｔのＧｉ媒介性リン酸化の優先的な活性化によって、Ａ３Ｒ受容体の心臓保護機能に向けてバイアスされた方式で部分的にアゴナイズされる。
【０１３７】
一部の実施形態では、この方法は、がん化学療法または脳手術と関連するか、またはそれから生じる神経学的状態に罹患している患者の神経保護または神経修復を増大する。
【０１３８】
一部の実施形態では、化合物は、経口投与される。
【０１３９】
一態様では、本発明は、ＴＢＩまたは脳卒中に罹患している患者の神経保護または神経修復を増大し、それによってＴＢＩまたは脳卒中を処置する方法であって、それを必要とする患者に、
【化６８】
2019515920.tif 000069
から選択される、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニスト、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１４０】
一態様では、本発明は、心虚血または心筋梗塞に罹患している患者の損傷した心臓組織の心臓保護または再生を増大し、それによって心虚血または心筋梗塞を処置する方法であって、それを必要とする患者に、
【化６９】
2019515920.tif 000070
から選択される、Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）の有効量のアゴニスト、薬学的に許容されるその塩、またはそれを含む薬学的に許容される組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１４１】
一部の実施形態では、化合物は、
【化７０】
2019515920.tif 000071
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１４２】
一部の実施形態では、化合物は、
【化７１】
2019515920.tif 000072
または薬学的に許容されるその塩である。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＴＢＩ、脳卒中、心虚血、または心筋梗塞後の回復期間は、未処置患者と比較して短縮される。
【０１４４】
一部の実施形態では、Ａ３Ｒは、Ａ３Ｒ受容体の神経保護機能に向けてバイアスされた方式で部分的にアゴナイズされる。
【０１４５】
一部の実施形態では、Ａ３Ｒは、Ａ３Ｒ受容体の心臓保護機能に向けてバイアスされた方式で部分的にアゴナイズされる。
【０１４６】
一部の実施形態では、化合物は、経口投与される。
【０１４７】
一部の実施形態では、化合物は、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された心臓保護機能を有するＡ３Ｒのバイアスアゴニストである。
【０１４８】
一部の実施形態では、化合物は、以下のＡ３Ｒ媒介性経路：Ｇｑ１１媒介性細胞内カルシウム動員の活性化、ｃＡＭＰ生成のＧｉ媒介性モジュレーション、ＥＲＫ１／２およびＡｋｔのＧｉ媒介性リン酸化、またはベータ−アレスチン活性化のモジュレーションの１つまたは複数の優先的な活性化によって、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された心臓保護機能を有するＡ３Ｒのバイアスアゴニストである。
【０１４９】
一部の実施形態では、化合物は、その他のＡ３Ｒ媒介性経路の活性化をほとんど伴わない、またはまったく伴わない細胞内カルシウム動員の優先的な活性化によって、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された心臓保護機能を有するＡ３Ｒのバイアスアゴニストである。
【０１５０】
一部の実施形態では、化合物は、完全なＡ３Ｒアゴニストと比較して改善された心臓保護機能を有するＡ３Ｒの部分アゴニストである。
【０１５１】
開示される方法において使用するための組成物または開示される医薬組成物中に存在するべき開示される化合物（すなわち、活性薬剤）の量は、一般に、治療有効量である。「治療有効量」または用量（または「有効量」）は、所望の治療結果、例えば神経保護、神経再生の活性化、および／または認知機能もしくは神経学的機能の改善をもたらすのに十分な活性薬剤の量を指す。活性剤の組成物の毒性および治療有効性は、当技術分野で公知の手順によって、例えばＬＤ５０（試験群の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（試験群の５０％において治療上有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物で決定することができる。毒性対治療効果の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比と表すことができる。高い治療指数を示す組成物が有利である。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するために、ある範囲の投与量の決定において使用され得る。一部の実施形態では、このような組成物の投与量は、毒性をほとんどまたはまったく伴わないＥＤ５０を含む循環濃度のある範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。
【０１５２】
一部の実施形態では、有効用量および／または所望の治療結果は、少なくとも２回の測定について試験対象または患者の認知機能または別のパラメータを比較することによって確立されるが、２回を超える測定を使用してもよい。初期認知機能測定によって、試験対象または患者の初期ベースラインが確立される。認知機能は、確立された認知試験、例えば改訂版ウエクスラー記憶尺度の言語想起タスク遅延を使用して測定され得る。処置後、認知試験を用いるさらなる試験によって、第２の測定値が確立される。有効量は、第２の測定値を第１の測定値と比較して、少なくとも約１％改善されることが実証される場合に確立される。一部の実施形態では、改訂版ウエクスラー記憶尺度の言語想起タスク遅延によって測定される認知機能の改善は、約１％〜２０％の間である。一部の実施形態では、改善は、約１％〜１０％の間である。一部の実施形態では、改善は、約１％〜５％の間である。認知症の段階を測定するものでない限り、認知機能の改善を決定する他の方法も同様に適用できることを、当業者は理解されたい。
【０１５３】
したがって、本発明は、それを必要としている対象に有効量の開示される化合物を投与することによって認知機能または神経学的機能を改善する方法を包含し、ここで、神経学的機能および認知機能の増強は、改訂版ウエクスラー記憶尺度の言語想起タスクスコアの遅延における１％〜２０％の間のスコア増大と測定される。
【０１５４】
開示される処置方法は、所望の治療効果を得るために、開示される化合物の投与を必要に応じて包含し得る。組成物は、所望の治療効果を維持するために、必要な限り投与され得る。一部の実施形態では、化合物は、約１カ月〜１２カ月の間投与される。一部の実施形態では、化合物は、１カ月〜６カ月の間投与される。一部の実施形態では、化合物は、１カ月〜３カ月の間投与される。
【０１５５】
本発明の一態様では、開示される化合物は、約５ｍｇ／日〜１０ｇ／日の間の量で投与される。一部の実施形態では、化合物の各用量は、約５ｍｇ／用量〜１０ｇ／用量の間の量である。例えば、満足な結果は、１日１回または２〜４回の分割用量で投与される約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の間、約０．１〜７．５ｍｇ／ｋｇ／日の間、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ／日の間、または０．５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で、開示される本発明の化合物を経口投与することによって得られる。例えばｉ．ｖ．点滴または注入による非経口投与では、約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の間、約０．０５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日の間、および約０．１〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日の間の投与量が使用され得る。したがって、患者に適した１日投与量は、ｐ．ｏ．で約２．５〜５００ｍｇの間、ｐ．ｏ．で約５〜２５０ｍｇの間、ｐ．ｏ．で約５〜１００ｍｇの間、またはｉ．ｖ．で約０．５〜２５０ｍｇの間、ｉ．ｖ．で約２．５〜１２５ｍｇの間およびｉ．ｖ．で約２．５〜５０ｍｇの間である。
３．使用、製剤化および投与
薬学的に許容される組成物
【０１５６】
別の実施形態によれば、本発明は、開示される化合物、および薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む組成物を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、このような組成物を必要とする患者に投与するために製剤化される。一部の実施形態では、本発明の組成物は、患者に経口投与するために製剤化される。
【０１５７】
「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０１５８】
「薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、共に製剤化される化合物の薬理学的活性を破壊しない非毒性の担体、アジュバントまたはビヒクルを指す。本発明の組成物において使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルには、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５９】
「薬学的に許容される誘導体」は、レシピエントに投与されると、本発明の化合物、または阻害活性がある（inhibitorily  active）その代謝産物もしくは残基を直接的または間接的に提供することができる、本発明の化合物の任意の非毒性の塩、エステル、エステルの塩または他の誘導体を意味する。
【０１６０】
本発明の組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸内、経鼻、口腔内頬側、膣内、または埋込型リザーバーによって投与され得る。「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。一部の実施形態では、組成物は、経口、腹腔内または静脈内投与される。本発明の組成物の注入可能な滅菌形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、当技術分野で公知の技術に従って、適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して製剤化され得る。注入可能な滅菌調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の注入可能な滅菌溶液または懸濁液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル溶液および等張食塩水が含まれる。さらに従来、溶媒または懸濁化媒体として、滅菌固定油が用いられている。
【０１６１】
この目的では、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定油を用いることができる。自然の薬学的に許容される油、例えばオリーブ油またはヒマシ油、特にポリオキシエチレン化されたものと同様に、脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、注射剤の調製において有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的に許容される剤形の製剤において一般に使用される、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えばカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散化剤を含有することもできる。他の一般に使用される界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓ、および薬学的に許容される固体、液体または他の剤形の製造において一般に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤も、製剤化の目的で使用され得る。
【０１６２】
本発明の薬学的に許容される組成物は、それに限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁液剤または溶液剤を含む任意の経口的に許容される剤形で、経口投与され得る。経口で使用するための錠剤の場合、一般に使用される担体には、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムも典型的に添加される。カプセルの形態で経口投与するために有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。水性懸濁液剤が、経口で使用するのに必要とされる場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と合わされる。所望に応じて、ある特定の甘味剤、香味剤または着色剤も添加され得る。
【０１６３】
あるいは、本発明の薬学的に許容される組成物は、直腸投与のために、坐剤の形態で投与され得る。これらは、薬剤を、室温では固体であるが直腸温度では液体になり、したがって直腸で溶融して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによって調製され得る。このような材料には、カカオバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１６４】
本発明の薬学的に許容される組成物は、特に処置標的が、局所適用によって容易に到達可能な、目、皮膚、または下部腸管の疾患を含む領域または器官を含む場合、局所投与することもできる。適切な局所製剤は、これらの領域または器官のそれぞれに合わせて容易に調製される。
【０１６５】
下部腸管のための局所適用は、直腸坐剤製剤（先を参照）または適切な浣腸製剤で行うことができる。局所経皮パッチを使用することもできる。
【０１６６】
局所適用では、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の担体に懸濁または溶解させた活性な構成成分を含有する適切な軟膏として製剤化され得る。本発明の化合物を局所投与するための担体には、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋および水が含まれるが、それらに限定されない。あるいは、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の担体に懸濁または溶解させた活性な構成成分を含有する適切なローション剤またはクリーム剤として製剤化され得る。適切な担体には、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６７】
眼科で使用するために、提供される薬学的に許容される組成物は、保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム（benzylalkonium）を伴って、または伴わずに、ｐＨ調整された等張滅菌生理食塩水中の微粒子化懸濁液として、またはｐＨ調整された等張滅菌生理食塩水中の溶液として製剤化され得る。あるいは、眼科で使用するために、薬学的に許容される組成物は、軟膏、例えばワセリンとして製剤化され得る。
【０１６８】
本発明の薬学的に許容される組成物は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。このような組成物は、医薬製剤分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤、フッ化炭素、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散化剤を用いて、生理食塩水溶液として調製され得る。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、経口投与のために製剤化される。このような製剤は、食品と共にまたは食品なしに投与され得る。一部の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食品なしに投与される。他の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、食品と共に投与される。
【０１７０】
他の実施形態では、本発明の薬学的に許容される組成物は、静脈内（ＩＶ）投与のために製剤化される。
【０１７１】
単一剤形の組成物を生成するために担体材料と合わせることができる本発明の化合物の量は、処置を受ける宿主、特定の投与方法に応じて変わる。好ましくは、提供される組成物は、１日当たり、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇの間の投与量の阻害剤を、これらの組成物を受ける患者に投与できるように製剤化されるべきである。
【０１７２】
任意の特定の患者のための具体的な投与量および処置レジメンは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、排出速度、薬物の組合せ、ならびに処置を行う医師の判断および処置を受ける特定の疾患の重症度を含む様々な因子に応じて変わることも理解されたい。組成物中の本発明の化合物の量は、組成物における特定の化合物によっても変わる。
化合物および薬学的に許容される組成物の使用
【０１７３】
本明細書に記載される化合物および組成物は、一般に、様々な疾患および状態、例えば脳傷害および神経変性状態の処置、ならびに本明細書で開示される様々な方法に有用である。
【０１７４】
本発明において利用される化合物の活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは細胞株でアッセイされ得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイには、タンパク質のモジュレーションまたはタンパク質との結合を決定するアッセイが含まれる。化合物をアッセイするための詳細な条件は、以下の実施例に記載される。
【０１７５】
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置する」および「処置すること」は、本明細書に記載される通り、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状を好転させ、緩和し、発症を遅延し、または進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、処置は、１つまたは複数の症状が発症した後に投与され得る。他の実施形態では、処置は、症状がなくても投与され得る。例えば、処置は、症状の発症前に（例えば、症状の病歴に照らして、かつ／または遺伝的もしくは他の感受性因子に照らして）、罹患しやすい個体に投与され得る。処置は、例えばそれらの再発を防止または遅延するために、症状が回復した後も継続され得る。
【０１７６】
本発明の方法による化合物および組成物は、開示される疾患もしくは状態、または関連する状態もしくは症候の処置または重症度の低下に有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全体的な状態、疾患または状態の重症度、特定の薬剤、その投与方法等に応じて対象ごとに変わる。本発明の化合物は、好ましくは投与を簡単にし、投与量を均一にするために、単位剤形で製剤化される。「単位剤形」という表現は、本明細書で使用される場合、処置を受ける患者に適した薬剤の物理的に別個の単位を指す。しかし、本発明の化合物および組成物の１日総使用量は、良好な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されると理解されよう。任意の特定の患者または生物のための具体的な有効用量レベルは、処置を受ける障害および障害の重症度、用いられる具体的な化合物の活性、用いられる具体的な組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食事、用いられる具体的な化合物の投与時間、投与経路および排出速度、処置期間、用いられる具体的な化合物と合わせてまたは同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知の類似の因子を含む様々な因子に応じて変わる。「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、動物を意味し、一部の実施形態では、哺乳動物を意味し、またはある特定の他の実施形態では、ヒトを意味する。
【０１７７】
本発明の薬学的に許容される組成物は、ヒトおよび他の動物に、処置を受ける疾患または状態の重症度に応じて、経口、舌下、直腸内、非経口、嚢内、腟内、腹腔内、局所（散剤、軟膏、または点滴剤として）、眼内（例えば、点眼薬）、口腔内頬側に、または経口もしくは鼻腔用スプレーとして、等により投与され得る。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために１日１回または複数回で、対象の体重１ｋｇ当たり１日当たり約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇまたは約１ｍｇ〜約２５ｍｇの投与レベルで経口または非経口投与され得る。
【０１７８】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン剤、マイクロエマルジョン剤、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれるが、それらに限定されない。液体剤形は、活性な化合物に加えて、当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含有し得る。経口組成物は、不活性希釈剤に加えて、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、ならびに賦香剤を含むこともできる。
【０１７９】
注射可能な調製物、例えば、注入可能な滅菌水性または油性懸濁液は、公知の技術に従って、適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して製剤化され得る。注入可能な滅菌調製物は、例えば１，３−ブタンジオール溶液としての、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の注入可能な滅菌溶液、懸濁液またはエマルジョンであってもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張食塩水が含まれる。さらに従来、溶媒または懸濁化媒体として、滅菌固定油が用いられている。この目的では、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定油を用いることができる。さらに、注射剤の調製では、脂肪酸、例えばオレイン酸が使用される。
【０１８０】
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の注入可能な滅菌媒体に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌され得る。
【０１８１】
本発明の化合物の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を緩徐することがしばしば望ましい。これは、水溶度が低い結晶性または非晶質材料の懸濁液を使用することによって達成され得る。次に、化合物の吸収速度は、その溶解速度に応じて変わり、溶解速度は、結晶の大きさおよび結晶形に応じて変わり得る。あるいは、非経口投与される化合物形態の遅延吸収は、化合物を油性ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成される。注射可能なデポー形態は、生分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド中で化合物のマイクロ封入マトリックスを形成することによって作製される。化合物の放出速度は、ポリマーに対する化合物の比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて制御され得る。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射可能な製剤はまた、化合物を、身体組織と適合性があるリポソームまたはマイクロエマルジョンに捕捉することによって調製される。
【０１８２】
直腸または膣内投与のための組成物は、好ましくは、本発明の化合物を、周囲温度で固体であるが体温で液体であり、したがって直腸または膣腔内で溶融し、活性化合物を放出する、適切な非刺激性の賦形剤または担体、例えばカカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスと混合することによって調製され得る坐剤である。
【０１８３】
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が含まれる。このような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、ならびに／またはａ）充填剤もしくは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、ｂ）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアなど、ｃ）保湿剤、例えばグリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、バレイショデンプンもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤、例えばパラフィン、ｆ）吸収促進物質、例えば第四級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど、ｈ）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土、ならびにｉ）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含むこともできる。
【０１８４】
類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることもできる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティングおよび医薬製剤技術分野で周知の他のコーティングを用いて調製され得る。それらの固体剤形は、任意選択で乳白剤を含有することができ、活性成分（複数可）が腸管だけで、または腸管のある特定の部分において、任意選択で遅延方式により放出される組成であってもよい。使用され得る包埋組成物の例として、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレン（polethylene）グリコールなどの賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いることもできる。
【０１８５】
活性な化合物は、先に記載される通り、１つまたは複数の賦形剤を用いるマイクロ封入化形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば腸溶コーティング、制御放出コーティングおよび医薬製剤技術分野で周知の他のコーティングを用いて調製され得る。このような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性希釈剤、例えばスクロース、ラクトースまたはデンプンと混合され得る。このような剤形は、通常の慣行通り、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、打錠滑沢剤および他の錠剤助剤、例えばステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースを含むこともできる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含むこともできる。このような剤形は、任意選択で乳白剤を含有することができ、活性成分（複数可）が腸管だけで、または腸管のある特定の部分において、任意選択で遅延方式により放出される組成であってもよい。使用され得る包埋組成物の例として、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０１８６】
本発明の化合物の局所投与または経皮投与のための剤形には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、溶液剤、スプレー剤、吸入剤またはパッチ剤が含まれる。活性な構成成分は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体および必要とされ得る場合には任意の必要な防腐剤または緩衝液と混合される。眼科用製剤、点耳薬、および点眼薬も、本発明の範囲内に含まれることが企図される。さらに本発明は、経皮パッチの使用を企図し、これは、身体への化合物の送達を制御できるというさらなる利点を有する。このような剤形は、化合物を適切な媒体に溶解または懸濁させることによって作製され得る。皮膚を介する化合物流量を増大するために、吸収増強剤を使用することもできる。吸収速度は、律速膜を提供するか、または化合物をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散させることによって制御され得る。
【０１８７】
処置される特定の状態または疾患に応じて、その状態を処置するために通常投与される追加の治療剤が、本発明の組成物中に存在することもできる。本明細書で使用される場合、特定の疾患または状態を処置するために通常投与される追加の治療剤は、「処置を受ける疾患または状態に適している」ことが公知である。
【０１８８】
以下の実施例に示される通り、ある特定の例示的な実施形態では、化合物は、以下の一般手順に従って調製され、使用される。本発明のある特定の化合物の合成を一般法によって示しているが、以下の一般法および当業者に公知の他の方法も、本明細書に記載される通り、すべての化合物、ならびにこれらの化合物のそれぞれのサブクラスおよび種に適用され得ることを理解されよう。
【０１８９】
本明細書に記載されるそれぞれの文書の内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１９０】
（実施例１）
マウスへの腹腔内投与後のＭＲＳ４３２２の薬物動態
目的
この研究は、光血栓および外傷性脳傷害のマウスモデルにおいて使用した用量の腹腔内投与後のＭＲＳ４３２２の血漿および脳内濃度を決定するために設計した。
方法
【０１９１】
化学物質：ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。分析グレードのトルブタミドを、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＯ）の商業的供給品から得た。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【０１９２】
動物：テキサス大学ヘルスサイエンスセンター（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）によって供給された、体重およそ０．０２ｋｇの雌性Ｃ５７６ＢＬ／６Ｊマウスを、この研究で使用した。すべての研究を、承認されたテキサス大学ヘルスサイエンスセンターのＩＡＣＵＣプロトコールの下で実施した。
【０１９３】
薬物投与：ＭＲＳ４３２２をＤＭＳＯに可溶化し、次に生理食塩水で希釈して、投与溶液を調製した。ＭＲＳ４３２２の最終的な投与溶液中濃度は、１００μＭであった。体重２０グラム当たり体積１００μＬの投与溶液を、各マウスに腹腔内投与し、ＭＲＳ４３２２を、０．１６ｍｇ／ｋｇまたは０．５μｍｏｌ／ｋｇで腹腔内投与した。３匹のマウスに、試料採取時点ごとにＭＲＳ４３２２を投与した。
【０１９４】
組織試料採取：血液および脳試料を、投与後０時間目、０．０８３時間目、０．２５時間目、０．５時間目、１時間目、２時間目および８時間目に得た。各時点において、マウス（１時点当たり３匹）を一酸化炭素チャンバ内で安楽死させた。全血を心臓穿刺によって得、ヘパリンを含有するＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に入れ、血漿を調製するために、すぐに遠心分離し、血漿を−８０℃で保存した。各時点において、断頭によって全脳試料を得、氷冷リン酸緩衝食塩水ですすぎ、秤量した。次に、脳試料を液体窒素ですぐに急速冷凍し、−８０℃で保存した。
生物分析
【０１９５】
ＭＲＳ４３２２の血漿および脳内濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、トルブタミドを内部標準物質として利用して決定した。以下の表に、用いたＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件をまとめる。
【表１−１】
2019515920.tif 000073
【表１−２】
2019515920.tif 000074
【０１９６】
組織マトリックスごとに標準曲線を作製し、ＬＬＯＱ／ＵＬＯＱ濃度を決定した。ＭＲＳ４３２２の血漿中濃度の標準曲線の較正範囲は、２．４２〜２４２ｎｇ／ｍＬであった。ＭＲＳ４３２２の脳内濃度の較正範囲は、２．４１〜２３３ｎｇ／ｍＬであった。
【０１９７】
ＭＲＳ４３２２の脳内濃度の生物分析のために、脳試料を、氷冷リン酸緩衝食塩水中、４倍希釈でホモジナイズした。得られた希釈脳ホモジネートの一定分量を、アセトニトリルで処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。４倍のホモジネート希釈なので、ＭＲＳ４３２２の脳内標準曲線の較正範囲は、９．６４〜９３２ｎｇ／ｇｍに変換された。いくつかの試料において、ＭＲＳ４３２２が検出可能であり、脳内ＬＬＯＱは９．６４ｎｇ／ｇｍ未満に低下したが、バックグラウンドは超えていた。これらの場合、最終的に記録された脳内濃度を、ＭＳピークの高さに基づいて外挿した。
結果
【０１９８】
マウスへの腹腔内投与後、ＭＲＳ４３２２の濃度は、血漿および脳試料の両方において検出可能であった（図１Ａおよび表２）。以下の実施例１１に記載され、図１Ｂおよび１６に示される通り、ＭＲＳ４３２２の濃度は、ブタ新生仔の血漿および脳試料において検出可能であったことに留意されたい。ブタ新生仔への静脈内投与後、ＭＲＳ４３２２の濃度は、血漿、脳、脳細胞外液および脳脊髄液試料において検出可能であった（図１Ｂおよび図１６、表１３）。
【表２】
2019515920.tif 000075
血漿中濃度によって、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、半減期およびＡＵＣの初期推定値を得ることができた（表３）。
【表３】
2019515920.tif 000076
【０１９９】
脳内濃度は検出可能であったが、データは、半減期、またはＣｍａｘおよびＴｍａｘ以外の他の薬物動態パラメータを推定するには不十分であった。しかし、利用可能な血漿および脳内データに基づくと、全薬物の脳／血漿比は、血漿および脳内の平均Ｃｍａｘ濃度に基づいて、およそ０．０６であると推定された。
【０２００】
これらの結果によって、ＭＲＳ４３２２の循環血漿中濃度は、光血栓および外傷性脳傷害のモデルで使用した投与条件下で、マウスへの腹腔内投与後に検出可能であり、ＭＲＳ４３２２は、これらの投与条件下で脳に分布することが確認される。
（実施例２）
マウスへのＭＲＳ２３６５の腹腔内投与後のＭＲＳ４３２２の薬物動態
目的
【０２０１】
この研究は、光血栓および外傷性脳傷害のマウスモデルにおいて使用した用量のＰ２Ｙ１アゴニストであるＭＲＳ２３６５の腹腔内投与後の、ＭＲＳ４３２２の血漿および脳内濃度を決定するために設計した。
方法
【０２０２】
化学物質：ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。ＭＲＳ２３６５を、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）から得た。分析グレードのトルブタミドを、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＯ）の商業的供給品から得た。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【０２０３】
動物：テキサス大学ヘルスサイエンスセンター（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）によって供給された、体重およそ０．０２Ｋｇの雌性Ｃ５７６ＢＬ／６Ｊマウスを、この研究で使用した。すべての研究を、承認されたテキサス大学ヘルスサイエンスセンターのＩＡＣＵＣプロトコールの下で実施した。
【０２０４】
薬物投与：ＭＲＳ２３６５をリン酸緩衝食塩水に可溶化し、次にリン酸緩衝食塩水で希釈して、投与溶液を調製した。ＭＲＳ２３６５の最終的な投与溶液中濃度は、１００μＭであった。体重２０グラム当たり体積１００μＬの投与溶液を、各マウスに腹腔内投与し、ＭＲＳ２３６５を、０．５μｍｏｌ／ｋｇまたは０．２４ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。３匹のマウスに、試料採取時点ごとにＭＲＳ２３６５を投与した。
【０２０５】
組織試料採取：血液および脳試料を、投与後０時間目、０．０８３時間目、０．２５時間目、０．５時間目、１時間目、２時間目および８時間目に得た。各時点において、マウス（１時点当たり３匹）を一酸化炭素チャンバ内で安楽死させた。全血を心臓穿刺によって得、ヘパリンを含有するＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に入れ、血漿を調製するために、すぐに遠心分離し、血漿を−８０℃で保存した。各時点において、断頭によって全脳試料を得、氷冷リン酸緩衝食塩水ですすぎ、秤量した。次に、脳試料を液体窒素ですぐに急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【０２０６】
生物分析：過去の研究では、ＭＲＳ２３６５の検出可能な循環濃度および脳内濃度は、腹腔内または静脈内投与後には観測されないことが実証されており、したがって、この研究は、その代謝産物であるＭＲＳ４３２２の検出および定量だけに焦点を当てた。ＭＲＳ４３２２の血漿および脳内濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、トルブタミドを内部標準物質として利用して決定した。以下の表に、用いたＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件をまとめる。
【表４】
2019515920.tif 000077
【０２０７】
組織マトリックスごとに標準曲線を作製し、ＬＬＯＱ／ＵＬＯＱ濃度を決定した。ＭＲＳ４３２２の血漿中濃度の標準曲線の較正範囲は、２．２６〜２４１ｎｇ／ｍＬであった。ＭＲＳ４３２２の脳内濃度の較正範囲は、２．３５〜２４２ｎｇ／ｍＬであった。
【０２０８】
ＭＲＳ４３２２の脳内濃度の生物分析のために、脳試料を、氷冷リン酸緩衝食塩水中、４倍希釈でホモジナイズした。得られた希釈脳ホモジネートの一定分量を、アセトニトリルで処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。４倍のホモジネート希釈なので、ＭＲＳ４３２２の脳内標準曲線の較正範囲は、９．４０〜９６８ｎｇ／ｇｍに変換された。いくつかの試料において、ＭＲＳ４３２２が検出可能であり、脳内ＬＬＯＱは９．４０ｎｇ／ｇｍ未満に低下したが、バックグラウンドは超えていた。これらの場合、最終的に記録された脳内濃度を、ＭＳピークの高さに基づいて外挿した。
結果
【０２０９】
マウスへのＭＲＳ２３６５の腹腔内投与後、ＭＲＳ４３２２の濃度は、血漿および脳試料の両方において検出可能であった（図２および表５）。
【表５】
2019515920.tif 000078
血漿中濃度によって、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、半減期およびＡＵＣの初期推定値を得ることができた（表６）。
【表６】
2019515920.tif 000079
【０２１０】
脳内濃度は検出可能であったが、データは、半減期、またはＣｍａｘおよびＴｍａｘ以外の他の薬物動態パラメータを推定するには不十分であった。しかし、利用可能な血漿および脳内データに基づくと、全薬物の脳／血漿比は、血漿および脳内の平均Ｃｍａｘ濃度に基づいて、およそ０．１０であると推定された。
【０２１１】
これらの結果によって、ＭＲＳ４３２２の循環血漿中濃度は、光血栓および外傷性脳傷害のモデルで使用した投与条件下で、マウスへのＰ２Ｙ１アゴニストであるＭＲＳ２３６５の腹腔内投与後に検出可能であり、ＭＲＳ４３２２は、これらの投与条件下で脳に分布することが確認される。
【０２１２】
ＭＲＳ４３２２の血漿および脳内の濃度を、ＭＲＳ４３２２自体の腹腔内投与後（実施例１を参照されたい）、およびＰ２Ｙ１アゴニストであるＭＲＳ２３６５の腹腔内投与後の２つの異なる研究で決定した。これらの両方の研究では、ＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５を、０．５μｍｏｌ／ｋｇの等モル用量で投与した。両方の研究結果を比較すると、観測されたＭＲＳ４３２２の血漿中濃度は、事実上同一であり、ＭＲＳ４３２２の脳内濃度は、非常に類似していた（図１および２を比較）。等モル用量のＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５を投与した後、ＭＲＳ４３２２の半減期およびＡＵＣ値に統計的有意差はなかった。これらのデータは、ＭＲＳ２３６５が、マウスへの腹腔内投与後に、ＭＲＳ４３２２に急速に完全に代謝され、ＭＲＳ４３２２の血漿および脳内薬物動態が、ＭＲＳ４３２２自体の腹腔内投与後の薬物動態に非常に類似していることを示している。
（実施例３）
マウスにおけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳結合
目的
【０２１３】
この研究は、マウスにおけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳内遊離画分を決定し、遊離画分を原型のアデノシンＡ３受容体アゴニストであるＭＲＳ５６９８の遊離画分と比較するために設計した。ＭＲＳ５６９８は、以下の化学構造を有する。
【化７２】
2019515920.tif 000080
方法
【０２１４】
化学物質：ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。ＭＲＳ５６９８を、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）から得た。分析グレードのスルファメトキサゾールおよびワルファリンを、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＯ）の商業的供給品から得た。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【０２１５】
動物および組織の調製：雄性ＣＤ−１マウスの血漿を、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）から得、使用するまで−８０℃で保存した。雄性ＣＤ−１マウス脳を、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）から得た。
【０２１６】
血漿限外濾過液のブランク試料を、凍結した血漿を解凍し、次に加湿５％ＣＯ２チャンバ内で３７℃において６０分間、血漿を予め加温することによって調製した。一定分量８００μＬを、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ遠心フィルター（Ｕｌｔｒａｃｅｌ再生セルロース（ＮＭＷＬ３０，０００ａｍｕ）Ｌｏｔ  Ｒ５ＪＡ３１７３６）に移し、２９００ＲＰＭで３７℃において１０分間、遠心分離した。血漿水の濾液を収集し、標準物質、ブランク、およびＱＣ標準物質の調製に使用した。
【０２１７】
脳を秤量し、Ｏｍｎｉ組織ホモジナイザーを使用して、１：９リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４と共にホモジナイズした。４匹のマウスからの脳をホモジナイズし、プールし、混合して、１つの試料を形成した。
【０２１８】
血漿結合決定：ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ５６９８、スルファメトキサゾール（sulfamethaxazole）およびワルファリンを、ＤＭＳＯに可溶化し、次に１：１アセトニトリル：水で希釈して、１００μＭ透析原液を調製した。スルファメトキサゾールおよびワルファリンを、公知の血漿結合値を有する研究標準物質として利用した。血漿試料を、３７℃に維持した加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で６０分間、予め加温した。予め加温した血漿の一定分量３ｍＬに、化合物ごとに１００μＭの原液を使用して、それぞれＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ５６９８、スルファメトキサゾールまたはワルファリンをスパイク添加して、最終試験濃度を１μＭにした。スパイク添加された血漿試料を、３７℃の加湿５％ＣＯ２チャンバ内で、回転ミキサー上で最小６０分間インキュベートした。６０分後、各試料の３つの一定分量８００μＬを、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ遠心フィルターに添加した。フィルターを、２９００ｒｐｍで３７℃において１０分間、遠心分離した。残留血漿の３つの一定分量１００μＬを、生物分析のために限外濾過液と共に収集した。
【０２１９】
脳結合決定：ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ５６９８、スルファメトキサゾールおよびワルファリンを、ＤＭＳＯに可溶化し、１：１アセトニトリル：水で希釈して、１００μＭ透析原液を調製した。プールしておいたホモジナイズした脳を、３７℃に維持した加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で６０分間、予め加温した。脳ホモジネートの一定分量３ｍＬに、化合物ごとに１００μＭの原液を使用して、それぞれＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ５６９８、スルファメトキサゾールまたはワルファリンをスパイク添加して、最終スパイク添加濃度を１μＭにした。プールしておいたスパイク添加された脳ホモジネートを、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で、Ｎｕｔａｔｏｒミキサー上に６０分間置いた。６０分後、各試料の３つの一定分量８００μＬを、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ遠心フィルターに添加した。フィルターを、２９００ｒｐｍで３７℃において１０分間、遠心分離した。残留脳ホモジネートおよび限外濾過液の一定分量を、生物分析のために収集した。
生物分析
【０２２０】
スパイク添加された血漿、脳ホモジネートおよび関連する限外濾過液におけるＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ５６９８の血漿および脳内濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、トルブタミドを内部標準物質として利用して決定した。スルファメトキサゾールおよびワルファリンの関連濃度も、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって標準条件を使用して決定した（データ示さず）。以下の表に、用いたＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件をまとめる（表７および８）。生物分析法は、すべてのマトリックスについて同一であった。標準曲線の統計（例えばフィット、切片、傾き、相関係数）を、マトリックスごとに決定したが有意差はなく、したがってマトリックスごとには示していない。
【表７】
2019515920.tif 000081
【表８】
2019515920.tif 000082
【０２２１】
組織マトリックスごとに標準曲線を作製し、ＬＬＯＱ／ＵＬＯＱ濃度を決定した。ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ５６９８の血漿中濃度の標準曲線の較正範囲は、４００〜１２００ｎＭであった。ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ５６９８の血漿限外濾過液の標準曲線の較正範囲は、１００〜１２００ｎＭであった。ＭＲＳ４３２２の脳ホモジネートおよび脳ホモジネート限外濾過液の標準曲線の較正範囲は、それぞれ４００〜１２００ｎＭおよび１００〜１２００ｎＭであった。ＭＲＳ５６９８の脳ホモジネートおよび脳ホモジネート限外濾過液の標準曲線の較正範囲は、それぞれ４００〜１２００ｎＭおよび１〜５００ｎＭであった。
結果
【０２２２】
血漿結合および遊離画分を、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ５６９８について血漿限外濾過を利用して決定した。血漿結合は、ＭＲＳ４３２２については２５．８％であり、関連する遊離画分は、０．７４２であった（表９）。
【０２２３】
ＭＲＳ５６９８の濃度は、血漿限外濾過液中で検出されなかった。ＭＲＳ５６９８は、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅデバイスのドナー側から得られた、スパイク添加された残留血漿試料において完全に回収された（データ示さず）。このことは、限外濾過液中、ＭＲＳ５６９８の濃度が低かったことが、化合物の分析のための回収量が少なかったことに起因していなかったことを示す。全体的に、これらのデータは、文献に記録されているマウス血漿および組織におけるＭＲＳ５６９８の高タンパク質結合（９９．８８％）と一致している（Tosh,  D.K.ら、Purinergic  Signalling（２０１５年）１１巻：３７１〜３８７頁）。研究標準物質であるスルファメトキサゾールおよびワルファリンの結合は、文献の値と一致していた。
【表９】
2019515920.tif 000083
【０２２４】
脳結合および遊離画分を、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ５６９８について脳ホモジネート限外濾過を利用して決定した。脳結合は、ＭＲＳ４３２２については８７％であり、関連する遊離画分は、０．１３であった（表１０）。
【０２２５】
ＭＲＳ５６９８の濃度は、脳ホモジネート限外濾過液中で検出されなかった。推定する目的で、ＭＲＳ５６９８の脳ホモジネート限外濾過液のＬＬＯＱを利用して、脳結合値を算出した。得られた脳結合値は９９．９９％であった。全体的に、これらのデータは、文献に記録されているマウス血漿および組織におけるＭＲＳ５６９８の高タンパク質結合（９９．８８％）と一致している（Tosh,  D.K.ら、Purinergic  Signalling（２０１５年）１１巻：３７１〜３８７頁）。研究標準物質であるスルファメトキサゾールおよびワルファリンの結合は、文献の値と一致していた。
【表１０】
2019515920.tif 000084
【０２２６】
全体的に、これらのデータは、血漿および脳の両方において、ＭＲＳ４３２２が、アデノシンＡ３アゴニストであるＭＲＳ５６９８よりも実質的に高い遊離画分を有し、より低いタンパク質結合を有していることを示している。これらのデータは、所与の全血漿または脳内濃度について、ＭＲＳ５６９８の場合に利用可能となり得る濃度よりも実質的に高い濃度のＭＲＳ４３２２が、エフェクター部位と相互作用するのに利用可能となり得ることを示している。
（実施例４）
マウスおよびヒトの血液および血漿におけるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性および代謝
目的
【０２２７】
この研究は、マウスおよびヒトの血液および血漿におけるＰ２Ｙ１アゴニストであるＭＲＳ２３６５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性および代謝運命を決定するために設計した。
方法
【０２２８】
化学物質：ＭＲＳ２３６５を、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）から得た。ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。エナラプリルおよびプロカインを、それぞれマウスおよびヒトの血漿および血液安定性の標準物質として使用した。
【０２２９】
組織の調製：雄性ＣＤ−１マウスおよびヒトの血漿を、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ）から得、使用するまで−８０℃で保存した。全血を、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＯ）において雄性ＣＤ−１マウスおよびヒトボランティアから得た。血漿および血液試料は、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）またはリチウムヘパリンのいずれかを抗凝固剤として使用して調製した。
【０２３０】
血漿安定性の決定：ＭＲＳ２３６５、エナラプリルおよびプロカインを、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４に可溶化した。血漿試料（ＥＤＴＡまたはリチウムヘパリンのいずれかを抗凝固剤として用いて血液から調製した）を、３７℃に維持した加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で６０分間、予め加温した。安定性についてのインキュベートを、ＭＲＳ２３６５（最終濃度１μＭ）を添加して開始した。ＥＤＴＡを用いて作製した血漿における安定性の初期評価では、０分、１０分、３０分、６０分、１２０分および２４０分のインキュベート時点を利用した（図３および４）。ＥＤＴＡを用いて作製した血漿およびヘパリンを用いて作製した血漿を比較するその後の研究では、０分、１分、２．５分、５分、７．５分、１０分および３０分のインキュベート時点を利用した（図７）。ＥＤＴＡを用いて作製した血漿およびヘパリンを用いて作製した血漿を比較する、血漿安定性についての追加のインキュベートを、０秒、５秒、１０秒、２０秒、３０秒、４５秒、６０秒および９０秒の時点を使用して実施した（図８）。代謝産物の探索分析のために、ＭＲＳ２３６５を、ヘパリン処理したヒト血漿中、濃度１００μＭで１０分間または３０分間インキュベートした（図９）。すべての研究において、血漿を、すぐにｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に入れ、ドライアイス上で凍結させ、分析まで−８０℃で保存した。
【０２３１】
血液安定性の決定：ＭＲＳ２３６５、エナラプリルおよびプロカインを、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４に可溶化した。血液試料（ＥＤＴＡまたはリチウムヘパリンで処理した）を、３７℃に維持した加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で６０分間、予め加温した。安定性についてのインキュベートを、ＭＲＳ２３６５（最終濃度１μＭ）を添加して開始した（図５および６）。血液試料の一定分量を、０分、１分、２．５分、７．５分、１０分および３０分において得、ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に入れた。代謝産物の探索分析のために、ＭＲＳ２３６５を、ヘパリン処理したヒト全血中、濃度１００μＭで１０分間または３０分間インキュベートした（図１０）。すべての研究において、血漿を、４℃で遠心分離によってすぐに調製し、ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ管に入れ、ドライアイス上で凍結させ、分析まで−８０℃で保存した。
生物分析
【０２３２】
ＭＲＳ２３６５の血漿および血液中濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、トルブタミドを内部標準物質として利用して決定した。以下の表に、用いたＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件をまとめる（表１１）。生物分析法は、すべてのマトリックスについて同一であった。標準曲線の統計（例えばフィット、切片、傾き、相関係数）を、マトリックスごとに決定したが有意差はなく、したがってマトリックスごとには示していない。
【表１１】
2019515920.tif 000085
【０２３３】
組織マトリックスごとに標準曲線を作製し、ＬＬＯＱ／ＵＬＯＱ濃度を決定した。ＭＲＳ２３６５の血漿および血液内濃度の標準曲線の較正範囲は、５〜５０００ｎｇ／ｍＬであった。品質管理のための試料を、３２ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬおよび４０００ｎｇ／ｍＬの濃度で利用した。
【０２３４】
血漿および血液試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの「代謝産物探索」プロトコールを利用して、ＭＲＳ２３６５代謝産物について質的にも分析した。他のヌクレオチド（例えばＡＴＰ、ＡＤＰ）の代謝経路の見直しによって、ＭＲＳ２３６５の最もありそうな代謝産物は、脱リン酸化（すなわち、一リン酸）代謝産物（ＭＲＳ２３４７、ｍｗ＝４０３．０７）および／または完全に脱リン酸化されたリボシド代謝産物（ＭＲＳ４３２２、ｍｗ＝３２３．１０）となるはずであるという仮説を立てた。リン酸化化合物は、優先的に負イオンを生じるはずであり、リボシドであるＭＲＳ４３２２は、優先的に正イオンを生じるはずであると理解されるので、血液および血漿試料を、親化合物および代謝産物について正イオンおよび負イオンＬＣ／ＭＳ−ＭＳの両方によって分析した。ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ２３４７についてそれぞれ探索するために、正イオンモードでは、抽出されたイオンクロマトグラムによって、３２３．７〜３２４．７および４０３．７〜４０４．７の範囲の質量がモニタリングされた。これらの範囲における任意のイオンピークをさらに分析して、これらのイオンクロマトグラムピークについて生成物のイオンスペクトルを作製した。ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ２３４７およびＭＲＳ２３６５についてそれぞれ探索するために、負イオンモードでは、抽出イオンクロマトグラムによって、３２１．７０〜３２２．７０、４０１．７０〜４０２．７０および４８１．７０〜４８２．７０の範囲の質量がモニタリングされた。ピークをさらに分析して、生成物のイオンスペクトルを作製した。ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ２３４７の真性標準は利用不可能だったため、イオンピークの高さ／面積は、イオン化効率における電位差のために比較できなかったが、代謝産物の質的な同定だけを行うことができた。
結果
【０２３５】
マウスおよびヒト血漿におけるＭＲＳ２３６５の血漿安定性を評価するために、２つの時間経過プロトコールを利用した。ＥＤＴＡを用いて調製した血漿によって、２４０分の時間経過にわたって予備データを作製した。その後の研究では、インキュベート後１分〜３０分の時点を利用し、最終研究では、インキュベート後５秒〜９０秒のより短い時間経過を利用した。すべてのプロトコールにおいて、血漿安定性を、ＥＤＴＡまたはリチウムヘパリンのいずれかを抗凝固剤として用いて血液から調製した血漿中で分析した。血漿および全血におけるエナラプリル（マウス）およびプロカイン（ヒト）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性データは、公開されている値と一致した（データ示さず）。
【０２３６】
ＥＤＴＡを用いて調製した血漿を利用した血漿安定性研究では、ＭＲＳ２３６５は、インキュベート後２４０分間までのインキュベート過程にわたって、本質的に安定であった（図３および４）。半減期値は、インキュベートの時間経過にわたって算出することができず、したがって＞２４０分であった。その後の代謝産物の探索分析では、ＭＲＳ２３４７もＭＲＳ４３２２も検出できなかった。これらのデータによって、ＭＲＳ２３６５は、マウスおよびヒト血漿においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定であったことが示唆された。
【０２３７】
ＥＤＴＡを抗凝固剤として用いて処理したマウスおよびヒトの全血においてＭＲＳ２３６５の安定性を評価すると、類似の観測が得られた（図５および６）。それらの研究では、ＥＤＴＡで処理したマウス全血におけるＭＲＳ２３６５の半減期は４７分であったが、これによって、ＥＤＴＡが、このマトリックスにおけるＭＲＳ２３６５のクリアランスを完全には阻害しなかったことが示唆された。しかしＭＲＳ２３６５は、ＥＤＴＡで処理したヒト全血においても完全に安定であり、推定半減期は＞２４０分であった。これらの全血研究では、代謝産物は検出されなかった。
【０２３８】
これらのデータは、血漿を調製するために血液抗凝固剤としてヘパリンを利用したマウスにおけるＭＲＳ２３６５の初期ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態評価と一致しており、ここで、ＭＲＳ２３６５は、心拍出に近似する速度で急速にクリアランスされるように見え、化合物の広範な肝外クリアランスが示唆された。ＥＤＴＡは、細胞膜表面、ならびに血液および血漿における循環の両方に存在する、ヌクレオチドの脱リン酸化に関与する酵素であるエクトヌクレオチダーゼの酵素活性に必要とされる二価のカチオンをキレートすることが公知である（Ziganshinら、Pflugers  Arch.（１９９５年）４２９巻：４１２〜４１８頁を参照されたい）。したがって、Ｐ２Ｙ１アゴニストであるヌクレオチド類似体ＭＲＳ２３６５の主な代謝経路は、上記の研究で血漿および全血を調製するために使用したＥＤＴＡによって完全に阻害された可能性があった。
【０２３９】
この可能性を調査するために、追加の安定性の研究を実施して、ＥＤＴＡ、またはエクトヌクレオチダーゼに対して阻害作用が報告されていない抗凝固剤であるリチウムヘパリンのいずれかによって作製した血漿におけるＭＲＳ２３６５の安定性を比較した。研究を、まず、ヘパリン処理した血漿および全血を用いて、０〜３０分の時間経過にわたって実施した。ＭＲＳ２３６５濃度の定量によって、すべての時点において極めて低い濃度のＭＲＳ２３６５が明らかになったが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期を算出するにはデータが不十分であった（データ示さず）。この研究の最短時点（０分および１分）でも、低い／検出不可能なＭＲＳ２３６５濃度が観測されたので、ＥＤＴＡで処理した血漿およびヘパリンで処理した血漿の両方におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を比較し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期の算出を試みるために、著しくより短い時間経過（０〜９０秒）を用いて研究を反復した。このより短時間の研究では、ＭＲＳ２３６５は、ＥＤＴＡで処理したマウスおよびヒト血漿において相対的に安定であった（図５および６）。ＭＲＳ２３６５濃度の変動性は、短い時間経過の開始時に混合が不完全であったこと、および９０秒間のインキュベート時間経過にわたって複数の試料採取時点に変動があったことに起因する可能性が高かった。しかし、ヘパリンで処理した血漿中のＭＲＳ２３６５濃度は、最も短い（０秒および５秒）時点でも極めて低かった。ＭＲＳ２３６５は、リン酸緩衝食塩水でインキュベートした場合に完全に安定であった。
【０２４０】
全体として、これらのデータによって、ＭＲＳ２３６５は溶液中で本来的に安定であるが、ＥＤＴＡによって阻害される過程によってマウスおよびヒト血漿および血液中で急速に分解されることが示唆される。ＭＲＳ２３６５は、ヌクレオチド類似体であり、ＥＤＴＡは、ヌクレオチドを脱リン酸化するエクトヌクレオチダーゼの公知の阻害剤であることを考慮すると、これらのデータによって、ＭＲＳ２３６５は、血漿および全血中で急速な脱リン酸化を受けやすいことが強力に示唆され、このことは、マウスにおいてＭＲＳ２３６５について作製されたｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態データと一致している。
【０２４１】
マウスおよびヒト血漿および全血における不安定性の原因としてのＭＲＳ２３６５の脱リン酸化の可能性をさらに調査するために、ＭＲＳ２３６５を１００μＭで１０分間または３０分間インキュベートした後、代謝産物の探索を、ヘパリン処理したヒト血漿および血液において実施した。形成された任意の代謝産物を確実に検出するために、より高い基質濃度を使用した。正イオン化条件下での代表的なイオンクロマトグラムおよび生成物のイオンスペクトルを示す（図７および８）。負イオン化クロマトグラムおよび生成物イオンスペクトルによって、類似の結果が得られた（データ示さず）。化学標準が存在しないため、代謝産物の絶対濃度を決定することができなかったが、インキュベートの１０〜３０分後に、代謝産物Ｍ２と比較して代謝産物Ｍ１の相対的存在量は増大した。代謝産物Ｍ２およびＭ１の親イオンクロマトグラム、ならびに両方のイオン化条件下で得られた生成物イオンスペクトルは、それぞれ脱リン酸化一リン酸代謝産物であるＭＲＳ２３４７および完全に脱リン酸化されたリボシド代謝産物であるＭＲＳ４３２２の質量および構造と一致していた（図９）。両方の代謝産物の検出、および代謝産物Ｍ２（ＭＲＳ２３４７）と比較した代謝産物Ｍ１（ＭＲＳ４３２２）の相対的存在量の増大によって、ヒト血漿および血液中でＭＲＳ２３６５が段階的に脱リン酸化され、その脱リン酸化は、一リン酸化中間体であるＭＲＳ２３４７を経て進行し、次にＭＲＳ２３４７は、非リン酸化リボシドであるＭＲＳ４３２２にさらに脱リン酸化されることが示唆された。
【０２４２】
全体として、これらのデータによって、ＭＲＳ２３６５は、親化合物を脱リン酸化し、最終的に非リン酸化リボシドであるＭＲＳ４３２２をもたらす循環エクトヌクレオチダーゼによって、血漿および血液中で急速に代謝されるという仮説が裏付けられる。この過程は、エクトヌクレオチダーゼ活性に必要とされる二価のカチオンをキレートすることが公知の作用物質であるＥＤＴＡによって阻害される。
（実施例５）
マウスにおけるＴＢＩ後のＭＲＳ４３２２の神経保護有効性
目的
【０２４３】
この研究は、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）を受けたマウスにおけるＭＲＳ４３２２の神経保護有効性を決定し、ＭＲＳ２３６５およびアデノシンＡ３受容体の完全なアゴニストであるＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡで処置した外傷性脳傷害のないマウスを比較するために設計した。
方法
【０２４４】
化学物質：ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡは、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）およびいくつかの他の売主から商業的に利用可能である。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【０２４５】
動物および外傷性脳傷害（ＴＢＩ）：ＴＢＩを、Talley-Wattsら、２０１２年（J.  Neurotrauma  ３０巻、５５〜６６頁）に記載されている通り、制御閉鎖性頭蓋傷害モデルを用いて生じさせた。本明細書に記載される方法に従って、空気衝撃デバイスを使用して中程度のＴＢＩを作製し、頭蓋および硬膜は無傷のままにした。これを達成するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、１００％酸素中、イソフルラン（導入３％、維持１％）で麻酔した。温度制御下で加熱した外科手術台を使用して、３７℃の体温を維持した。無菌外科手技を使用して、頭皮に小さい正中切開を施した。５ｍｍのステンレス鋼ディスクを頭蓋上に置き、体性感覚皮質にわたるブレグマとラムダとの間の右頭頂骨上に、強力瞬間接着剤を使用して固定した。次にマウスを、空気衝撃先端部分の直下の台上に置いた。較正済みの衝撃を、深さ２ｍｍにより４．５ｍ／ｓで与え、それによってマウスに中程度の傷害をもたらした。頭皮切開部を、４−０のナイロン編糸を使用して縫合し、抗生物質軟膏を切開部に塗布した。マウスをＴｈｅｒｍｏ−Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｕｎｉｔ（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃモデルＦＶ−１；３７℃；２７％Ｏ２）に入れ、完全に目が覚め、自由に動き回るまでモニタリングした。傷害またはシャム（未損傷）の３０分後、マウスを、ビヒクル（生理食塩水）または薬物（ＭＲＳ４３２２、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡまたはＭＲＳ２３６５）のいずれかで処置した。ＭＲＳ４３２２、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡおよびＭＲＳ２３６５の用量は、それぞれ０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．２４ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇであり、それぞれおよそ０．５μｍｏｌ／ｋｇの等モル用量に等価であった。
【０２４６】
ＧＦＡＰのためのウエスタンブロット分析：選択された生存期間で、マウスをイソフルランで麻酔し、屠殺した。脳を取り出し、衝撃を受けた脳半球と受けていない脳半球とに切開するために氷上に置いた。単離した組織を、氷上でＷｈｅａｔｏｎガラス製ダウンス型を使用して（往復２０回）、冷却したホモジナイズ用緩衝液（０．３２Ｍのスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ＝７．８）中で急速にホモジナイズした。ホモジネートを、２ｍＬ管に移し、４℃において１０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集し、分析した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイによって１：５０希釈を使用して決定した。タンパク質１００μｇを、試料ごとに一定分量として取り出し、β−メルカプトエタノールを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加し、試料を９５℃の熱ブロックに３分間入れた。試料を１２％ゲル上にロードし、８０Ｖで２０分間泳動させた後、１３０Ｖで４０分間泳動させた。試料を、１００Ｖで１時間にわたってニトロセルロース膜に転写した。膜を、ＴＢＳ−Ｔ中５％乳で３０分間ブロックした。ＧＦＡＰ（１：１０００−Ｉｍｇｅｎｅｘ  ＩＭＧ−５０８３−Ａ）を添加し、４℃で一晩置いた。膜を、１０分間、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＧＦＡＰのための二次抗体（コンジュゲートロバ抗ラビットＨＲＰ（ＩｍｍｕｎｏＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；７１１−０３５−１５２；１：２００００）を、室温で１時間適用した。膜をＴＢＳ−Ｔで１５分間洗浄し（３回）、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ−ＥＣＬキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を使用して製造会社の指示に従って展開した。
結果
【０２４７】
ＭＲＳ４３２２は、ＴＢＩ後のマウス脳におけるＧＦＡＰ発現を低減する。グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現を、ＴＢＩ後の反応性グリオーシスのためのバイオマーカーとして使用した（Talley-Wattsら、２０１２年；Sofroniew、２００５年）。本発明者らは、傷害後７日目に屠殺した、シャム、ＴＢＩまたは再処置されたＴＢＩ（ＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５）マウスにおけるＧＦＡＰ発現のために、ウエスタンブロット分析を実施した。まず、ウエスタンブロット分析によって、傷害後７日目に脳の同側（中央に衝撃が与えられた側）および対側の両方において、ＴＢＩがＧＦＡＰ発現の著しい増大を誘導したことが確認された（図１２Ａ）。ＧＦＡＰ発現は、初期外傷の３０分以内に注射したＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５で処置したマウスからのブロットにおいて著しく低かった（図１２Ａ）。ローディング対照では、ベータ−アクチンウエスタンブロットを使用し、それぞれのレーンの下に示した。図１２Ａに示されるウエスタンブロットは、すべて代表的な実験から得られ、同じゲルで泳動させたものであった。３回の別個の実験から平均した、ＧＦＡＰ／アクチン比の相対的変化を示すデータ（Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアで測定したバンド強度）は、図１２Ｂに平均＋／−ＳＥＭとして提示されている。データを統合するために、値を７日目のＴＢＩレベルに正規化した（１００％）。所与の実験的な処置のためのマウスの総数は、図１２ＢにおいてＮによって示されている。
【０２４８】
ＭＲＳ４３２２およびアデノシンＡ３受容体アゴニストは、ＴＢＩ後のマウス血漿におけるＧＦＡＰ発現を低減する。血漿におけるＧＦＡＰレベルは、外傷後の血液脳関門（ＢＢＢ）が崩壊するのでＴＢＩのバイオマーカーとしても使用されている。結果的に、本発明者らは、７日目にＴＢＩマウスから血漿試料を収集した。本発明者らは、ＧＦＡＰレベルが、脳組織と類似して、７日目にウエスタンブロット分析によって容易に検出されたことを見出した（図１２Ｃ）。より重要なことには、本発明者らは、ＭＲＳ４３２２またはＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（アデノシンＡ３受容体アゴニスト）のいずれかで処置されたＴＢＩマウスの血漿から得られたウエスタンブロットによって、アクチンと比較してＧＦＡＰレベルの著しい低下が示されたことを見出した（図１２Ｃ）。実験条件ごとの平均ＧＦＡＰ／アクチン比のヒストグラムプロットは、図１２Ｄに提示されている。実験処置ごとのマウスの総数は、Ｎ値によって示される。
【０２４９】
ＭＲＳ４３２２は、マウスにおけるＡ３受容体の低親和性（４９００ｎＭ）アゴニストである。それとは逆に、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡは、マウスにおける高親和性（０．１８ｎＭ）アゴニストであり、これらの２つの化合物の親和性の差は、およそ２５，０００倍である。しかし、光血栓脳卒中およびＴＢＩのマウスモデルでは、ＭＲＳ４３２２が著しい有効性を示しているが、この有効性はＡ３アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３によってブロックされ、一方でＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡは、不活性であるか（脳卒中）、または弱い活性を有する（ＴＢＩ、図１２）。このことは明らかに、受容体親和性の観点からは自明でない結果である。この知見についての本発明者らの現在の説明は、ＭＲＳ４３２２およびＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡについて作製された、本発明者らが有する独自のＡＤＭＥ／ＰＫデータに基づくものである。Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡは、血漿タンパク質に高度に結合し（遊離画分０．００２）、脳組織に非特異的に高度に結合する（遊離画分０．００２）、親油性化合物（ｃＬｏｇＰおよそ２．５）である。ＭＲＳ４３２２は、血漿（０．７４）および脳（０．１３）内で非常に多い非結合画分を有する、非常に親水性の化合物（ｃＬｏｇＰ＜０）である。非結合薬物だけが、膜透過分布および受容体との相互作用に利用可能である。したがって、ＭＲＳ４３２２の受容体親和性はより低いにもかかわらず、これらのマウスモデルにおけるＡ３受容体との相互作用に利用可能なＭＲＳ４３２２の画分は、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡの画分よりも少なくとも１０００倍多い。本発明者らは、化合物の物理化学特性およびＡＤＭＥ／ＰＫの特徴のこれらの有意差が、これらのマウスモデルにおいて、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（および別の親油性の高度に結合した／高親和性の完全なＡ３ＲアゴニストであるＭＲＳ５６９８）と比較してＭＲＳ４３２２の自明でない有効性に寄与すると考える。
【０２５０】
バイアスアゴニズム。アデノシンＡ３受容体は、Ｇタンパク質に共役している多面的受容体であり、すなわちこの受容体のアゴニズムは、複数のＧタンパク質ならびにベータ−アレスチンを介して複数の下流経路を潜在的に活性化する可能性がある。Ａ３受容体アゴニズムによって活性化される経路は、現在同定されているが、Ｇｑ１１媒介性細胞内カルシウム動員、ｃＡＭＰ生成のＧｉ媒介性モジュレーション、ならびにＥＲＫ１／２およびＡｋｔのＧｉ媒介性リン酸化に限定することはできない。本発明者らの発見の一態様は、星状膠細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ生成の促進をもたらす、細胞内カルシウムのＡ３媒介性動員にある。
【０２５１】
受容体薬理学における新しい概念は、バイアスアゴニズムである。この概念は、多面的受容体について、実際に異なるクラスのアゴニストが存在し、そのうちのいくつかは、あらゆる下流経路を活性化することができると同時に、その他は、下流経路の部分集合の活性化においてバイアスを示すことを提示している。薬物発見および受容体薬理学において、バイアスアゴニズムは、オフターゲット効果を抑え、すなわち副作用を抑えながら経路活性化の特異性を増大する可能性を導入する。Ａ３受容体のバイアスアゴニズムに関する証拠が存在している。しかし、原型の高親和性アゴニスト、例えばＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡおよびＭＲＳ５６９８は、前述の下流経路活性化のバイアスを示さない完全なアゴニストである。したがって、いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、ＭＲＳ４３２２は、細胞内カルシウム動員を優先的に活性化するが、その他のＡ３媒介性経路はほとんど／まったく活性化しないバイアスアゴニストであると考えられる。この知見によって、ＭＲＳ４３２２は、脳卒中およびＴＢＩのマウスモデルにおいて、完全／非バイアスアゴニストであるＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡおよびＭＲＳ５６９８と比較して有効性が観測されたことの説明がつく。
（実施例６）
マウスにおける脳卒中後のＭＲＳ４３２２の神経保護有効性
目的
【０２５２】
この研究は、脳卒中を生じたマウスにおけるＭＲＳ４３２２の神経保護有効性を決定し、ＭＲＳ２３６５で処置されたマウスを、Ａ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３が存在する状態および存在しない状態で、完全なＡ３ＲアゴニストであるＭＲＳ５６９８およびＣｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡとの比較において比較するために設計した。ＭＲＳ１５２３は、以下の化学構造を有する。
【化７３】
2019515920.tif 000086
方法
【０２５３】
化学物質：ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＭＲＳ５６９８およびＭＲＳ２３６５は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）およびいくつかの他の売主から商業的に利用可能である。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【０２５４】
光血栓誘導性の脳卒中：光血栓を、Zhengら、２０１０年（PloS  One  ５巻（１２号）：ｅ１４４０１頁）に記載されている通り生じさせた。手短には、ローズベンガルは、脈管構造に注射され、励起されると、内皮壁に損傷を与え、局所性血栓症（血餅）を誘導する一重項酸素を生じる蛍光色素である。この技術を使用して、マウスに、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中滅菌ローズベンガル（ＲＢ、Ｓｉｇｍａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）０．１ｍＬを尾静脈注射した。ＲＢ濃度は、２０ｍｇ／ｍＬであった。皮質領域を画像化フィールドの中心に置き、０．８−ＮＡの４０倍水浸レンズ（ニコン、東京）を使用して緑色レーザー（５４３ｎｍ、５ｍＷ）を照射した。血餅形成を、標的血管または下流毛細血管がしっかりと閉塞されるまで、リアルタイムでモニタリングした。その後、安定な血餅を、高度蛍光性領域で終わる非蛍光性血管の区分けによって同定した。対照実験では、レーザー照射またはローズベンガル自体のいずれによっても血餅を形成しなかった。処置としてＭＲＳ４３２２（０．１６ｍｇ／ｋｇ；０．５μｍｏｌ／ｋｇ）またはＭＲＳ２３６５（０．２４ｍｇ／ｋｇ；０．５μｍｏｌ／ｋｇ）を、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって導入した。Ａ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３を用いる実験では、研究中ずっと受容体アンタゴニズムを確保するために、マウスに０時間目および２時間目の時点で腹腔内注射（２ｍｇ／ｋｇ）により投与した。
【０２５５】
動物および光血栓誘導性の脳卒中：脳卒中を、Zhengら、２０１０年（PloS  One  ５巻（１２号）：ｅ１４４０１頁）に記載されている通り生じさせた。この研究では、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（４〜６カ月齢）を使用した。この原稿文書の方法によって、マウスを、ノーズコーンを介して１００％酸素により３％イソフルランで麻酔し、その後１％イソフルランで維持した。麻酔深度をモニタリングし、生命徴候、つねりからの逃避反応（pinch  withdrawal）および瞬目に従って調節した。体温を、フィードバック制御加熱パッド（Ｇａｙｍａｒ  Ｔ／Ｐｕｍｐ）によって３７℃で維持した。酸素飽和、呼吸数、および心拍を含む生命徴候を、ＭｏｕｓｅＯｘ系（ＳＴＡＲＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって連続的にモニタリングした。各マウスの頭部の毛を刈り、頭皮を小さく切開して頭蓋を曝露した。特注のステンレス鋼プレートを、ＶｅｔＢｏｎｄ組織接着剤（３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を用いて頭蓋に接着した。頭蓋の厚さを薄くした頭蓋部画像化窓を、実験に応じて右の一次体性感覚皮質（ブレグマから約１．５ｍｍ後部および正中線から２ｍｍ外側）にわたって作製した。手短には、頭蓋の広範な領域を、まず電気ドリルで薄くし、次に手術用の刃でさらに薄くした。薄くした頭蓋の最終的な厚さは、およそ５０μｍであった。頭蓋部画像化窓が作製された後、マウスを顕微鏡台に移し、光血栓または画像化実験のために使用した。反復画像化実験では、プレートを頭蓋から注意深く剥離し、頭皮を縫合した（Ｅｔｈｉｃｏｎの６−０絹（sild）縫合糸）。各実験後、マウスを、次の時点までまたは屠殺するまで、ケージに戻しておいた。すべての手順は、サンアントニオのテキサス大学ヘルスサイエンスセンターの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。脳卒中またはシャム（未損傷）の３０分後、マウスを、ビヒクル（生理食塩水）または薬物（ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ２３６５、ＭＲＳ５６９８またはＣｌ−ＩＢＭＥＣＡ）のいずれかで処置した。
【０２５６】
光血栓梗塞後の評価。脳梗塞のサイズを、Zhengら、２０１０年（PloS  One  ５巻（１２号）：ｅ１４４０１頁）に記載されている通り、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物（ＴＴＣ）染色を使用して評価した。手短には、脳スライス内のＲＢ誘導性病変を、ＴＴＣで染色した。ＴＴＣは、ミトコンドリア酵素であるスクシニルデヒドロゲナーゼによって還元されると健康な脳組織を赤色に染色する、無色色素である（Bederson  JBら、１９８６年）。次に、壊死組織に染色が存在しないことを使用して、脳梗塞領域を画定する。マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、それらの脳を取り出し、次に氷冷ＨＢＳＳに３分間入れた。その後、脳を脳型（ＫＯＰＦ）に移し、１ｍｍの薄片にスライスし、３７℃の２％ＴＴＣ（５分）に浸漬させた。薄片を、１０％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中で４℃において一晩固定した。スライスを、病変サイズの分析のために平台走査装置（ＨＰ  ｓｃａｎｊｅｔ  ８３００）により１２００ｄｐｉで画像化した。
結果
【０２５７】
ＭＲＳ４３２２による処置によって、脳卒中後の脳梗塞が低減される。多枝光血栓脳卒中を、前述の通りマウスにおいて、尾静脈を使用してＲＢと共に注射して誘導した。血餅形成後３０分以内に、マウスに、ビヒクル（生理食塩水対照）、ＭＲＳ４３２２（０．１６ｍｇ／ｋｇ；０．５μｍｏｌ／ｋｇ）またはＭＲＳ２３６５（０．２４ｍｇ／ｋｇ；０．５μｍｏｌ／ｋｇ）のいずれかを腹腔内注射した。初期脳卒中が生じてから２４時間後に、脳梗塞のサイズを、前述の通りＴＴＣ染色を用いて評価した。ＴＴＣで染色された代表的な脳スライスは、図１３Ａに提示されている。本発明者らは、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ２３６５の両方によって、脳梗塞のサイズが著しく低減したことを見出した。ビヒクル、ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ２３６５、ＭＲＳ５６９８またはＣｌ−ＩＢＭＥＣＡで処置したマウスの脳梗塞の平均サイズのヒストグラムプロットは、図１３Ｃに提示されている。これらのデータは、２回の独立な実験からプールしたものである。Ｎは、試験したマウスの総数を指す。
【０２５８】
Ａ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３は、脳卒中後、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ２３６５による処置の神経保護を阻害する。多枝光血栓脳卒中を、前述の通りマウスにおいて誘導した。しかしこの実験では、受容体アンタゴニズムを確保するために、マウスに０時間目および２時間目の時点でＡ３受容体アンタゴニストであるＭＲＳ１５２３（２ｍｇ／ｋｇ）により腹腔内注射で処置した。次に、マウスに、ビヒクル、ＭＲＳ４３２２、ＭＲＳ２３６５、ＭＲＳ５６９８またはＣｌ−ＩＢＭＥＣＡのいずれかを、血餅形成後３０分以内に前述の濃度で注射した。２４時間後、脳梗塞のサイズを、ＴＴＣ染色を用いて評価した。ＴＴＣで染色された代表的な脳スライスは、図１３Ｂに提示されている。本発明者らは、ＭＲＳ１５２３を用いて予め処置したマウスにおける脳梗塞のサイズが、ＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５またはＭＲＳ５６９８のいずれかによる処置では低減しなかったことを見出した。これらの実験の脳梗塞の平均サイズのヒストグラムプロットは、図１３Ｄに提示されている。データは、２回の独立な実験からプールしたものである。Ｎは、試験したマウスの総数を指す。
（実施例７）
マウスにおける脳卒中後のＭＲＳ１８７３の神経保護有効性
目的
【０２５９】
この研究は、ＭＲＳ４３２２の対応する２−クロロ類似体であるＭＲＳ１８７３の神経保護有効性を決定するために設計した。実験を、脳卒中を生じたマウスで実施し、ＭＲＳ４３２２で処置したマウスおよびビヒクルで処置したマウスを比較した。
方法
【０２６０】
化学物質：ＭＲＳ１８７３およびＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。ＭＲＳ１８７３は、以下の構造を有する。
【化７４】
2019515920.tif 000087
【０２６１】
光血栓誘導性の脳卒中：光血栓を、Zhengら、２０１０年（PloS  One  ５巻（１２号）：ｅ１４４０１頁）に記載されている通り生じさせた。手短には、ローズベンガルは、脈管構造に注射され、励起されると、内皮壁に損傷を与え、局所性血栓症（血餅）を誘導する一重項酸素を生じる蛍光色素である。この技術を使用して、マウスに、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）中滅菌ローズベンガル（ＲＢ、Ｓｉｇｍａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）０．１ｍｌを尾静脈注射した。ＲＢ濃度は２０ｍｇ／ｍｌであった。皮質領域を画像化フィールドの中心に置き、０．８−ＮＡの４０倍水浸レンズ（ニコン、東京）を使用して緑色レーザー（５４３ｎｍ、５ｍＷ）を照射した。血餅形成を、標的血管または下流毛細血管がしっかりと閉塞されるまで、リアルタイムでモニタリングした。その後、安定な血餅を、高度蛍光性領域で終わる非蛍光性血管の区分けによって同定した。対照実験では、レーザー照射またはローズベンガル自体のいずれによっても血餅を形成しなかった。処置としてＭＲＳ１８７３（１００ｕＭの１００ｕｌ）またはＭＲＳ４３２２（１００ｕＭの１００ｕｌ）を、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって導入した。
【０２６２】
動物および光血栓誘導性の脳卒中：脳卒中を、Zhengら、２０１０年（PloS  One  ５巻（１２号）：ｅ１４４０１頁）に記載されている通り生じさせた。この研究では、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（４〜６カ月齢）を使用した。この原稿文書の方法によって、マウスを、ノーズコーンを介して１００％酸素により３％イソフルランで麻酔し、その後１％イソフルランで維持した。麻酔深度をモニタリングし、生命徴候、つねりからの逃避反応および瞬目に従って調節した。体温を、フィードバック制御加熱パッド（Ｇａｙｍａｒ  Ｔ／Ｐｕｍｐ）によって３７℃で維持した。酸素飽和、呼吸数、および心拍を含む生命徴候を、ＭｏｕｓｅＯｘ系（ＳＴＡＲＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することによって連続的にモニタリングした。マウスの頭部の毛を刈り、頭皮を小さく切開して頭蓋を曝露した。特注のステンレス鋼プレートを、ＶｅｔＢｏｎｄ組織接着剤（３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を用いて頭蓋に接着した。頭蓋の厚さを薄くした頭蓋部画像化窓を、実験に応じて右の一次体性感覚皮質（ブレグマから約１．５ｍｍ後部および正中線から２ｍｍ外側）にわたって作製した。手短には、頭蓋の広範な領域を、まず電気ドリルで薄くし、次に手術用の刃でさらに薄くした。薄くした頭蓋の最終的な厚さは、およそ５０μｍであった。頭蓋部画像化窓が作製された後、マウスを顕微鏡台に移し、光血栓または画像化実験のために使用した。反復画像化実験では、プレートを頭蓋から注意深く剥離し、頭皮を縫合した（Ｅｔｈｉｃｏｎの６−０絹縫合糸）。各実験後、マウスを、次の時点までまたは屠殺するまで、ケージに戻しておいた。すべての手順は、サンアントニオのテキサス大学ヘルスサイエンスセンターの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。脳卒中またはシャム（未損傷）の３０分後、マウスを、ビヒクル（生理食塩水）または薬物（ＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ２３６５）のいずれかで処置した。
【０２６３】
光血栓梗塞後の評価。脳梗塞のサイズを、Zhengら、２０１０年（PloS  One  ５巻（１２号）：ｅ１４４０１頁）に記載されている通り、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩化物（ＴＴＣ）染色を使用して評価した。手短には、脳スライス内のＲＢ誘導性病変を、ＴＴＣで染色した。ＴＴＣは、ミトコンドリア酵素であるスクシニルデヒドロゲナーゼによって還元されると健康な脳組織を赤色に染色する、無色色素である（Bederson  JBら、１９８６年）。次に、壊死組織に染色が存在しないことを使用して、脳梗塞領域を画定する。マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、それらの脳を取り出し、次に氷冷ＨＢＳＳに３分間入れた。その後、脳を脳型（ＫＯＰＦ）に移し、１ｍｍの薄片にスライスし、３７℃の２％ＴＴＣ（５分）に浸漬させた。薄片を、１０％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中で４℃において一晩固定した。スライスを、病変サイズの分析のために平台走査装置（ＨＰ  ｓｃａｎｊｅｔ  ８３００）により１２００ｄｐｉで画像化した。
結果
【０２６４】
ＭＲＳ１８７３による処置によって、脳卒中後の脳梗塞が低減される。多枝光血栓脳卒中を、前述の通りマウスにおいて、尾静脈を使用してＲＢと共に注射して誘導した。血餅形成後３０分以内に、マウスに、ビヒクル（生理食塩水対照）、ＭＲＳ１８７３（１００ｕＭの１００ｕｌ）またはＭＲＳ４３２２（１００ｕＭの１００ｕｌ）のいずれかを腹腔内注射した。初期脳卒中が生じてから２４時間後に、脳梗塞のサイズを、前述の通りＴＴＣ染色を用いて評価した。ＴＴＣで染色された代表的な脳スライスは、図１４Ｂに提示されている。本発明者らは、ＭＲＳ１８７３およびＭＲＳ４３２２の両方によって、脳梗塞のサイズが著しく低減したことを見出した。ビヒクル、ＭＲＳ１８７３およびＭＲＳ４３２２で処置したマウスの脳梗塞の平均サイズのヒストグラムプロットは、図１４Ｂに提示されている。これらのデータは、３回の独立な実験からプールしたものである。Ｎは、試験したマウスの総数を指す。
薬物動態および有効性の理論的根拠
【０２６５】
ＭＲＳ１８７３は、ＭＲＳ４３２２の２−Ｃｌ類似体であり、アデノシンＡ３アゴニストでもある。ＭＲＳ１８７３の物理化学特性は、低分子量、親水性（ｃＬｏｇＰ＜０）およびトポロジカル極性表面積に関して、ＭＲＳ４３２２のものと同一である。ＡＤＭＥ／ＰＫパラメータ、例えば血漿および脳結合、クリアランスおよび分布体積は、これらの物理化学特性によって決まるので、本発明者らは、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３について類似の薬物動態を実証した。さらに本発明者らは、脳卒中の光血栓マウスモデルにおいて、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３について類似の有効性を実証した。
（実施例８）
Ａ３アデノシン受容体（Ａ３Ｒ）における化合物のバイアスアゴニズムを決定するための実験プロトコール
【０２６６】
以下のアッセイは、開示される化合物、例えばＭＲＳ４３２２またはＭＲＳ１８７３が、Ａ３受容体においてバイアスアゴニズム（機能的選択性またはアゴニスト輸送としても公知である）を示すかどうかを決定するために使用することができる。
【０２６７】
材料。Ｆｌｕｏ−４、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、およびペニシリン−ストレプトマイシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入することができる。アデノシン脱アミノ酵素（ＡＤＡ）およびハイグロマイシン−Ｂは、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入することができる。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ＴｈｅｒｍｏＴｒａｃｅ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入することができる。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ  ＳｕｒｅＦｉｒｅ細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）、Ａｋｔ１／２／３、ならびにｃＡＭＰキットは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から得ることができる。頭文字ＭＲＳで示されるすべての化合物は、既に記載されている通り合成することができる（Toshら、２０１２年ａ、ｂ）。他のすべての試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【０２６８】
細胞培養。ヒトＡ３Ｒの配列を、既に記載されている方法（Stewartら、２００９年）を使用して、ＧａｔｅｗａｙエントリーベクターであるｐＤＯＮＲ２０１にクローニングし、次にＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクターであるｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ｄｅｓｔに移すことができる。Ａ３−ＦｌｐＩｎ−ＣＨＯ細胞は、既に記載されている方法（Mayら、２００７年）を使用して作製し、５％ＣＯ２を含有する加湿インキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳおよび選択抗生物質であるハイグロマイシン−Ｂ（５００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃で維持することができる。細胞生存、ＥＲＫ１／２リン酸化、Ａｋｔ１／２／３リン酸化、およびカルシウム動員アッセイでは、細胞を４×１０４個の細胞／ウェルの密度で９６ウェル培養プレートに播種することができる。６時間後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、５％ＣＯ２中、無血清ＤＭＥＭにおいて３７℃で１２〜１８時間維持した後、アッセイする。ｃＡＭＰアッセイでは、細胞を９６ウェル培養プレートに２×１０４個の細胞／ウェルの密度で播種し、５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートした後、アッセイすることができる。
【０２６９】
細胞生存アッセイ。培地を除去し、Ａ３Ｒリガンドが存在しない状態および存在する状態で、ＡＤＡ（１Ｕ／ｍｌ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（０．０５Ｕ／ｍｌ）を含有するＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水溶液（１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１４６ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＤ−グルコース、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、および１．５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４５）で置き換える。次に、プレートを加湿インキュベーター中３７℃で２４時間維持した後、５ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを細胞に添加する。次にプレートを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、励起および発光をそれぞれ３２０ｎｍおよび６１５ｎｍに設定して読み取ることができる。データを、それぞれＨＥＰＥＳ緩衝液中ｔ＝０時間およびＭｉｌｌｉ−Ｑ水中ｔ＝２４時間において決定される、１００％細胞生存および０％細胞生存に対して正規化する。
【０２７０】
ＥＲＫ１／２およびＡｋｔ１／２／３リン酸化アッセイ。リガンドごとのＥＲＫ１／２およびＡｋｔ１／２／３リン酸化の濃度応答曲線を、１Ｕ／ｍｌのＡＤＡを含有する無血清ＤＭＥＭ中で得ることができる（３７℃で５分間の曝露）。アゴニストによる刺激は、培地を除去し、ＳｕｒｅＦｉｒｅ溶解緩衝液１００ｍｌを各ウェルに添加することによって終了させることができる。次に、プレートを５分間かき混ぜる。ｐＥＲＫ１／２の検出では、３８４ウェルのＰｒｏｘｉＰｌａｔｅ中総体積１１ｍｌの、溶菌液：活性化緩衝液：反応緩衝液：ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズ：ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズの８０：２０：１２０：１：１ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ希釈物を用いることができる。プレートを暗所で３７℃において１時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、励起および発光をそれぞれ６３０ｎｍおよび５２０〜６２０ｎｍに設定して蛍光測定を行うことができる。Ａｋｔ１／２／３リン酸化の検出では、３８４ウェルのＰｒｏｘｉｐｌａｔｅ中総体積９ｌの、溶菌液：活性化緩衝液：反応緩衝液：ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズの４０：９．８：３９．２：１ｖ／ｖ／ｖ／ｖ希釈物を用いることができる。プレートを、暗所で室温において２時間インキュベートした後、総体積１１μｌの、希釈緩衝液：ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズの１９：１ｖ／ｖ希釈物を添加することができる。プレートを室温でさらに２時間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、励起および発光をそれぞれ６３０ｎｍおよび５２０〜６２０ｎｍに設定して蛍光測定を行うことができる。アゴニストの濃度応答曲線を、１０％ＦＢＳによって媒介されるリン酸化（５分間の刺激）に正規化する。
【０２７１】
カルシウム動員アッセイ。培地を９６ウェルプレートから除去し、１Ｕ／ｍｌのＡＤＡ、２．５ｍＭのプロベネシド、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および１ＭのＦｌｕｏ４を含有するＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水溶液で置き換えることができる。プレートを、暗所で、加湿インキュベーター内で３７℃において１時間インキュベートすることができる。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、アゴニストが存在しない状態および存在する状態でＨＥＰＥＳ−緩衝食塩水溶液を添加し、７５秒間、１．５２秒ごとに蛍光を測定することができる（励起、４８５ｎｍ；発光、５２０ｎｍ）。ピーク蛍光およびベースライン蛍光の間の差は、細胞内Ｃａ２＋動員のマーカーとして測定することができる。Ａ３Ｒアゴニストの濃度応答曲線を、１００μＭのＡＴＰによって媒介された応答に正規化して、細胞数およびローディング効率の差を説明することができる。
【０２７２】
ｃＡＭＰ蓄積阻害のアッセイ。培地を、刺激緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、０．８ＭのＭｇＳＯ４、０．２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．４４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、５．６ｍＭのＤ−グルコース、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、１Ｕ／ｍｌのＡＤＡ、および１０μＭのロリプラム、ｐＨ７．４５）で置き換え、３７℃で１時間インキュベートすることができる。ｃＡＭＰ蓄積の阻害は、Ａ３−ＦｌｐＩｎ−ＣＨＯ細胞をＡ３Ｒアゴニストと共に１０分間プレインキュベートした後、３μＭのフォルスコリンを添加して、さらに３０分間置くことによって評価することができる。緩衝液を速やかに除去し、氷冷１００％エタノール５０μｌを添加することによって、反応を終了させることができる。エタノールを蒸発させた後、検出緩衝液５０μｌ（０．１％ＢＳＡ、０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４５）を添加する。プレートを１０分間かき混ぜた後、溶菌液１０μｌを３８４ウェルのＯｐｔｉｐｌａｔｅに移した。検出には、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアクセプタービーズ：刺激緩衝液の１：４９ｖ／ｖ希釈物５μｌの添加を用いることができる。この後、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎドナービーズ：検出緩衝液：３．３Ｕ／μｌのビオチン化ｃＡＭＰの１：１４６：３ｖ／ｖ／ｖ希釈物１５μｌを添加して、総体積３０μｌを形成した。ドナービーズ／ビオチン化ｃＡＭＰ混合物は、添加の前に３０分間平衡化することができる。プレートを、暗所で室温において一晩インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により、励起および発光をそれぞれ６３０ｎｍおよび５２０〜６２０ｎｍに設定して蛍光測定を行うことができる。アゴニストの濃度応答曲線を、３μＭのフォルスコリン（０％）または緩衝液（１００％）単独によって媒介された応答に正規化することができる。
【０２７３】
分子モデル化。ドッキングシミュレーションを、この研究で調査したすべての化合物について、ヒトＡ３Ｒの相同性モデルを使用して実施することができる。特に、既に報告されている以下の３つのモデルを使用することができる。アゴニスト結合ｈＡ２ＡＡＲ結晶構造を完全にベースとするモデル（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＱＡＫ）、ハイブリッドＡ２ＡＡＲ−β２アドレナリン受容体鋳型をベースとするモデル、およびハイブリッドＡ２ＡＡＲ−オプシン鋳型をベースとするモデル（β２アドレナリン受容体Ｘ線構造ＰＤＢ  ＩＤ：３ＳＮ６；オプシン結晶Ｘ線結晶構造ＰＤＢ  ＩＤ：３ＤＱＢ）（Toshら、２０１２年ａ）。ハイブリッド鋳型をベースとするモデルは、Ａ２ＡＡＲベースのモデルと比較して、外側へのＴＭ２の移動を示す。Ａ３Ｒリガンドの構造は、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ一式（Schrodinger  Release  ２０１３−３、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０１３年）で実施されるＢｕｉｌｄｅｒおよびＬｉｇＰｒｅｐツールを使用して構築し、ドッキングのために準備することができる。Ａ３Ｒモデルにおけるリガンドの分子ドッキングは、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ一式のＧｌｉｄｅパッケージ部分を用いることによって実施することができる。特に、Ｇｌｉｄｅ  Ｇｒｉｄを、アデノシン受容体の結合ポケットのいくつかの非常に重要な残基、すなわち、Ｐｈｅ（ＥＬ２）、Ａｓｎ（６．５５）、Ｔｒｐ（６．４８）、およびＨｉｓ（７．４３）の重心の中心に置くことができる。Ｇｌｉｄｅ  Ｇｒｉｄは、１４Å×１４Å×１４Åの内箱（リガンド直径の中間点にある箱）、および内箱から各方向に２５Å拡大した外箱（中にすべてのリガンド原子が含有されていなくてはならない箱）を使用して構築することができる。リガンドのドッキングは、ＸＰ（超精密）手順を使用して硬い結合部位で実施することができる。リガンドごとのトップスコアのドッキングコンフォメーションに、視覚的検査およびタンパク質−リガンド相互反応の分析を行って、実験データと一致する、提案される結合コンフォメーションを選択することができる。
【０２７４】
データ分析。統計分析および曲線フィッティングは、Ｐｒｉｓｍ  ６（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施することができる。シグナル伝達バイアスを定量するために、アゴニストの濃度応答曲線を、既に記載されている通り、非線形回帰によって、アゴニズムのＢｌａｃｋ−Ｌｅｆｆ操作モデルの誘導を使用して分析することができる（Kenakinら、２０１２年；Woottenら、２０１３年；van  der  Westhuizenら、２０１４年）。変換係数、τ／ＫＡ［対数、Ｌｏｇ（τ／ＫＡ）として表される］を使用して、バイアスアゴニズムを定量することができる。アゴニスト応答に対する細胞依存的効果を説明するために、変換率を、参照アゴニストであるＩＢ−ＭＥＣＡについて得られた値に対して正規化して、ＡＬｏｇ（τ／ＫＡ）を作製することができる。異なるシグナル伝達経路におけるアゴニストごとのバイアスを決定するために、ＡＬｏｇ（τ／ＫＡ）を、参照経路であるｐＥＲＫ１／２に対して正規化して、ＡＡＬｏｇ（τ／ＫＡ）を作製する。バイアスは、１０ＡＡＬｏｇ（τ／ＫＡ）と定義することができ、ここで、バイアスが欠如していると、１から統計的に異なることはなく、または対数として表される場合には０から統計的に異なることはない値が得られる。すべての結果は、平均６Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表すことができる。統計分析には、Ｆ試験または一元配置分散分析が、Ｐ、０．０５と決定される統計的有意性によりＴｕｋｅｙまたはＤｕｎｎｅｔｔ事後試験と共に含まれ得る。
（実施例９）
ＭＲＳ４３２２の合成経路
【０２７５】
ＭＲＳ４３２２および類似の化合物、例えばＭＲＳ１８７３を、当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。例えば、ＭＲＳ４３２２は、Choi,  W.  J.ら、J.  Org.  Chem.  ２００４年、６９巻、２６３４〜２６３６頁、Tosh,  D.  K.ら、Purinergic  Signalling  ２０１５年、１１巻、３７１〜３８７頁；およびChem.  Eur.  J.、２００９年、１５巻、６２４４〜６２５７頁に記載されている以下の経路によって、Ｄ−リボースから調製することができる。以下のスキーム１および２は、合成経路を示す。
【化７５】
2019515920.tif 000088
【０２７６】
Ｚｈａｎ触媒−１Ｂは、以下の構造を有する。
【化７６】
2019515920.tif 000089
【０２７７】
スキーム２は、合成の残りを示す。
【化７７】
2019515920.tif 000090
（実施例１０）
開示される化合物の心臓保護についての理論的根拠
【０２７８】
本発明者らは、アデノシンＡ３アゴニストであるＭＲＳ４３２２などの化合物へのＰ２Ｙ１アゴニストの極めて急速な定量的脱リン酸化を実証した。これらのアデノシンＡ３アゴニストは、驚くべきことに、本明細書に記載される通り脳卒中および外傷性脳傷害の複数のマウスモデルにおいて有効であることが見出された。いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３などの本明細書で説明されるＡ３アゴニストは、心臓保護的薬剤として有効であると考えられる。
【０２７９】
ＭＲＳ４３２２およびＭＲＳ１８７３などの化合物への、ＭＲＳ２３６５および関連するリン酸化ヌクレオシドの急速な定量的脱リン酸化を示す本発明者らのデータは、主張されるこれらのＰ２Ｘ４アゴニストの心臓保護的有効性が、それらの脱リン酸化代謝産物のアデノシンＡ３アゴニズムに実際に起因しているという本発明者らの主張を裏付けている。実際、本発明者らは、ＭＲＳ１８７３が、脳卒中および外傷性脳傷害モデルにおいて有効なアデノシンＡ３アゴニストであることを実証した。
（実施例１１）
ブタ新生仔への静脈内投与後のＭＲＳ４３２２の薬物動態および結合
目的
【０２８０】
この研究は、ブタ新生仔への静脈内投与後のＭＲＳ４３２２の血漿、脳およびＣＳＦ内濃度を決定するために設計した。
方法
【０２８１】
化学物質。ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。
【０２８２】
動物。この研究では、ペンシルベニア大学のバイオエンジニアリング学部（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）によって供給された、体重およそ７．５Ｋｇの４週齢の雌性ブタ新生仔を使用した。研究中、動物に脳の微小透析プローブを装備して、薬物濃度を決定するための脳細胞外液試料を得た。すべての研究を、承認されたペンシルベニア大学のＩＡＣＵＣプロトコールの下で実施した。
【０２８３】
薬物投与：ＭＲＳ４３２２をＤＭＳＯに可溶化し、次に生理食塩水で希釈して、投与溶液を調製した。体積１０ｍＬの投与溶液を、各ブタ新生仔（ｎ＝３）に静脈内ボーラス投与することによって投与した。
【０２８４】
組織試料採取：血液試料を、投与後０．２５時間目、０．５時間目、１時間目、２時間目、４時間目および６時間目に得た。脳細胞外液試料を、埋め込まれた微小透析プローブから、投与後１時間目、４時間目および６時間目に得た。全血（１ｍＬ）を各時点に得、ヘパリンを含有するバキュテナー管に入れ、血漿を調製するためにすぐに遠心分離し、血漿を−８０℃で保存した。脳細胞外および脳脊髄液試料を−８０℃で保存した。安楽死の時点で（投与後６時間目）、脳脊髄液試料を得、凍結させ、一方、皮質および海馬由来の脳試料は断頭によって得、氷冷リン酸緩衝食塩水ですすぎ、秤量した。次に、脳試料を液体窒素ですぐに急速冷凍し、−８０℃で保存した。
生物分析
【０２８５】
ＭＲＳ４３２２の血漿、脳、脳細胞外液および脳脊髄液中濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、トルブタミドを内部標準物質として利用して決定した。以下の表に、用いたＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件をまとめる。
【表１２】
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【０２８６】
組織マトリックスごとに標準曲線を作製し、ＬＬＯＱ／ＵＬＯＱ濃度を決定した。ＭＲＳ４３２２のマトリックスの標準曲線のすべての較正範囲は、０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０２８７】
ＭＲＳ４３２２の脳内濃度の生物分析のために、脳試料を、氷冷リン酸緩衝食塩水中、４倍希釈でホモジナイズした。得られた希釈脳ホモジネートの一定分量を、アセトニトリルで処理し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
結果
【０２８８】
ブタ新生仔への静脈内投与後、ＭＲＳ４３２２の濃度は、血漿、脳、脳細胞外液および脳脊髄液試料において検出可能であった（図１Ｂおよび図１６、表１３）。
【表１３】
2019515920.tif 000092
【表１４】
2019515920.tif 000093
【０２８９】
血漿中濃度によって、Ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、血漿クリアランス、分布体積、半減期およびＡＵＣの初期推定値を得ることができた（表１４）。
【０２９０】
ＭＲＳ４３２２の脳、脳細胞外液および脳脊髄液中の濃度は検出可能であったが、データは、半減期、またはＣｍａｘおよびＴｍａｘ以外の他の薬物動態パラメータを推定するには不十分であった。しかし、すべてのマトリックスについて試料が得られた投与後６時間目の利用可能な血漿および脳内データに基づくと、全薬物の脳／血漿比は、血漿および脳内の平均濃度に基づいて、およそ０．３であると推定された。
【０２９１】
これらの結果によって、ＭＲＳ４３２２の循環血漿中濃度は、ブタ新生仔への腹腔内投与後に検出可能であり、ＭＲＳ４３２２は、これらの投与条件下で脳に十分に分布することが確認される。
（実施例１２）
ブタ新生仔におけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳結合
目的
【０２９２】
この研究は、ブタ新生仔におけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳内遊離画分を決定するために設計した。
方法
【０２９３】
化学物質。ＭＲＳ４３２２を、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のＫｅｎ  Ｊａｃｏｂｓｏｎ博士の厚意によって得た。分析グレードのスルファメトキサゾールおよびワルファリンを、Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｗａｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＯ）の商業的供給品から得た。他のすべての化学物質を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。
【０２９４】
動物および組織の調製。雌性ブタ新生仔の血漿および脳試料を、ペンシルベニア大学から得、使用するまで−８０℃で保存した。
【０２９５】
血漿限外濾過液のブランク試料を、凍結した血漿を解凍し、次に加湿５％ＣＯ２チャンバ内で３７℃において６０分間、血漿を予め加温することによって調製した。一定分量８００ｕｌを、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌフィルター（Ｕｌｔｒａｃｅｌ再生セルロース（ＮＭＷＬ３０，０００ａｍｕ）Ｌｏｔ  Ｒ５ＪＡ３１７３６）に移し、２９００ＲＰＭで３７℃において１０分間、遠心分離した。血漿水の濾液を収集し、標準物質、ブランク、およびＱＣ標準物質の調製に使用した。
【０２９６】
脳を秤量し、Ｏｍｎｉ組織ホモジナイザーを使用して、１：９リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４と共にホモジナイズした。４匹のマウスの脳をホモジナイズし、プールし、混合して、１つの試料を形成した。
【０２９７】
血漿結合決定。ＭＲＳ４３２２、スルファメトキサゾールおよびワルファリンを、ＤＭＳＯに可溶化し、次に１：１アセトニトリル：水で希釈して、１００ｕＭ透析原液を調製した。スルファメトキサゾールおよびワルファリンを、公知の血漿結合値を有する研究標準物質として利用した。血漿試料を、３７℃に維持した加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で６０分間、予め加温した。予め加温した血漿の一定分量３ｍｌに、化合物ごとに１００ｕＭの原液を使用して、それぞれＭＲＳ４３２２、スルファメトキサゾールまたはワルファリンをスパイク添加して、最終試験濃度を１ｕＭにした。スパイク添加された血漿試料を、３７℃の加湿５％ＣＯ２チャンバ内で、回転ミキサー上で最小６０分間インキュベートした。６０分後、各試料の３つの一定分量８００ｕｌを、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ遠心フィルターに添加した。フィルターを、２９００ｒｐｍで３７℃において１０分間、遠心分離した。残留血漿の３つの一定分量１００ｕｌを、生物分析のために限外濾過液と共に収集した。
【０２９８】
脳結合決定：ＭＲＳ４３２２、スルファメトキサゾールおよびワルファリンを、ＤＭＳＯに可溶化し、１：１アセトニトリル：水で希釈して、１００ｕＭ透析原液を調製した。プールしておいたホモジナイズした脳を、３７℃に維持した加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で６０分間、予め加温した。脳ホモジネートの一定分量３ｍｌに、化合物ごとに１００ｕＭの原液を使用して、それぞれＭＲＳ４３２２、スルファメトキサゾールまたはワルファリンをスパイク添加して、最終スパイク添加濃度を１ｕＭにした。プールしておいたスパイク添加された脳ホモジネートを、３７℃の加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で、Ｎｕｔａｔｏｒミキサー上に６０分間置いた。６０分後、各試料の３つの一定分量８００ｕｌを、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ遠心フィルターに添加した。フィルターを、２９００ｒｐｍで３７℃において１０分間、遠心分離した。残留脳ホモジネートおよび限外濾過液の一定分量を、生物分析のために収集した。
生物分析
【０２９９】
スパイク添加された血漿、脳ホモジネートおよび関連する限外濾過液におけるＭＲＳ４３２２の血漿および脳内濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、トルブタミドを内部標準物質として利用して決定した。スルファメトキサゾールおよびワルファリンの関連濃度も、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって標準条件を使用して決定した（データ示さず）。以下の表に、用いたＬＣおよびＭＳ／ＭＳ条件をまとめる（表１５および１６）。生物分析法は、すべてのマトリックスについて同一であった。標準曲線の統計（例えばフィット、切片、傾き、相関係数）を、マトリックスごとに決定したが有意差はなく、したがってマトリックスごとには示していない。
【表１５】
2019515920.tif 000094
【０３００】
組織マトリックスごとに標準曲線を作製し、ＬＬＯＱ／ＵＬＯＱ濃度を決定した。ＭＲＳ４３２２の血漿中濃度の標準曲線の較正範囲は、５〜１０００ｎＭであった。ＭＲＳ４３２２の血漿限外濾過液の標準曲線の較正範囲は、５〜１０００ｎＭであった。ＭＲＳ４３２２の脳ホモジネートおよび脳ホモジネート限外濾過液の標準曲線の較正範囲は、それぞれ５〜１０００ｎＭおよび５〜１０００ｎＭであった。
結果
【０３０１】
血漿結合および遊離画分を、ＭＲＳ４３２２について、血漿限外濾過を利用して決定した。血漿結合は、ＭＲＳ４３２２について２１．６％であり、関連する遊離画分は、０．７８４であった（表１６）。研究標準物質であるスルファメトキサゾールおよびワルファリンの結合は、文献の値と一致していた。
【表１６】
2019515920.tif 000095
【０３０２】
脳結合および遊離画分を、ＭＲＳ４３２２について脳ホモジネート限外濾過を利用して決定した。脳結合は、ＭＲＳ４３２２については７４．７％であり、関連する遊離画分は、０．２５３であった（表１７）。研究標準物質であるスルファメトキサゾールおよびワルファリンの結合は、文献の値と一致していた。
【表１７】
2019515920.tif 000096
【０３０３】
これらのデータは、所与の全血漿または脳内濃度について、ＭＲＳ４３２２の実質的な非結合薬物濃度が、アデノシンＡ３受容体との相互作用のために脳内で利用可能であることを示している。これらの知見は、マウスにおいて観測されたものとも一致している。
（実施例１３）
ＭＲＳ４３２２の薬理学的特徴付け
【０３０４】
化合物ＭＲＳ４３２２を、細胞膜調製物を使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換えで発現されたヒトおよびマウスＡ３アデノシン受容体における競合結合研究で調査した。［３Ｈ］ＮＥＣＡを、Ａ３アゴニスト放射性リガンドとして用いた。ＣＨＯ細胞は、アデノシン受容体を自然には発現しないので、非選択的アゴニストであるＮＥＣＡを使用することができた。ＭＲ４３２２による放射性リガンドの濃度依存性の置換えを決定した。
【０３０５】
さらにｃＡＭＰ実験を、それぞれヒトＡ３またはマウスＡ３アデノシン受容体を組換えで発現するＣＨＯ細胞において実施した。非選択的アゴニストであるＮＥＣＡを、対照として使用した。
結果
【０３０６】
ＭＲＳ４３２２は、放射性リガンド結合研究で、［３Ｈ］ＮＥＣＡに対して、ヒトＡ３受容体において１４９０±４１０ｎＭのＫｉ値を示し、マウスＡ３受容体において４９４０±９７４ｎＭのＫｉ値を示した。
【０３０７】
Ａ３アデノシン受容体を発現するＣＨＯ細胞における機能的ｃＡＭＰ蓄積実験では、ＭＲＳ４３２２は、ヒトＡ３受容体において３６３０±３７０ｎＭのＥＣ５０値を有し、マウスＡ３受容体において７５９±１７０ｎＭのＥＣ５０値を有するアゴニスト活性を示した。ＧＰＣＲにおけるアゴニストのＥＣ５０値は、受容体発現レベルに依存して決まる。ヒトＡ３受容体細胞株は、より高いＥＣ５０値が観測されるので、マウスＡ３受容体を含む細胞株よりも発現レベルが低いと思われ、そのことは、対照アゴニストであるＮＥＣＡについても該当していた。
【表１８】
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【表１９】
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【０３０８】
図１７は、ＣＨＯ細胞において発現されたヒトＡ３受容体における、Ａ３アゴニスト放射性リガンド［３Ｈ］ＮＥＣＡ（１０ｎＭ）に対するＭＲＳ４３２２の競合結合実験を示す。ＭＲＳ４３２２について算出されたＫｉ値は、１４９０±４１０ｎＭであった。
【０３０９】
図１８は、ＣＨＯ細胞において発現されたマウスＡ３受容体における、Ａ３アゴニスト放射性リガンド［３Ｈ］ＮＥＣＡ（１０ｎＭ）に対するＭＲＳ４３２２の競合結合実験を示す。ＭＲＳ４３２２について算出されたＫｉ値は、４９４０±９７４ｎＭであった。図１９は、ＣＨＯ細胞において発現されたヒトＡ３受容体における、ＭＲＳ４３２２およびＮＥＣＡのｃＡＭＰ蓄積実験を示す。ＭＲＳ４３２２について算出されたＥＣ５０値は、３６３０±３７０ｎＭであり、ＮＥＣＡについては、ＥＣ５０値は４１．８±６．３ｎＭであると決定された。図２０は、ＣＨＯ細胞において発現されたマウスＡ３受容体におけるＭＲＳ４３２２およびＮＥＣＡのｃＡＭＰ蓄積実験を示す。ＭＲＳ４３２２について算出されたＥＣ５０値は、７５９±１７０ｎＭであり、ＮＥＣＡについては、ＥＣ５０値は６．８５±０．８８ｎＭであると決定された。
【０３１０】
これらの結果は、ＭＲＳ１８７３について公知の結合データよりも低いが、そのデータと関係している。J.  Med.  Chem.  ２００２年、４５巻：４４７１〜４４８４頁、「Structural  Determinants  of  A3  Adenosine  Receptor  Activation:  Nucleoside  Ligands  at  the  Agonist/Antagonist  Boundary」、Gao,  Z-Gらによって公開されているヒトＡ３、Ｋｉデータ：ＭＲＳ１８７３Ｋｉ＝３５３ｎＭ；ＥＣ５０＝８０３ｎＭ。
【０３１１】
より初期の文書では、ヒトＡ３のＫｉは８５ｎＭであると記載されている。Bioorganic  and  Medicinal  Chemistry  Letters  ２００１年、１１巻：１３３３〜１３３７頁、「Ring-Constrained  (N)-Methanocarba  Nucleosides  as  Adenosine  Receptor  Agonists:  Independent  5'-Uronamide  and  2'-Deoxy  Modifications」、Lee,  K.ら。
【０３１２】
本発明のいくつかの実施形態が記載されているが、上記の特定の実施例は、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供するために、日常的な実験方法を使用して変えることができると理解される。したがって、本発明の範囲は、提供されている具体的な実施形態ではなく、以下の特許請求の範囲だけによって定義されるべきであることを理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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