(57)【要約】本発明は、−セイヨウジュウニヒトエの抽出物であって、抽出物の重量に対して３０〜７０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドはフェニルプロパノイド総重量に対して１０〜５０％の量のトイポリオシドを含むセイヨウジュウニヒトエの抽出物と、−エピロビウムの抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、前記量のポリフェノールはポリフェノールの総量に対して最大３重量％のオエノテインＢを含むエピロビウムの抽出物とを含む医薬組成物に関する。さらに前立腺疾患、特に良性前立腺過形成の処置に使用される本発明の医薬組成物も記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  セイヨウジュウニヒトエ（Ａｊｕｇａ  ｒｅｐｔａｎｓ）の抽出物であって、前記抽出物の重量に対して３０〜７０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドはフェニルプロパノイド総重量に対して１０〜５０％のトイポリオシドを含む、セイヨウジュウニヒトエの抽出物、および
−  エピロビウムの抽出物であって、前記抽出物の重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、前記量のポリフェノールは前記ポリフェノールの総重量に対して最大３重量％のオエノテインＢを含む、エピロビウムの抽出物
を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物はメチルトイポリオシドおよびイソトイポリオシドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物は前記抽出物の重量に対して約５０重量％の量のフェニルプロパノイドを含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
フェニルプロパノイドの総量は前記フェニルプロパノイドの総量に対して約３０重量％のトイポリオシドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物は、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｃｈｅ（ＩＲＢ）Ｓ．ｐ．Ａ．によりＴｅｏｓｉｄｅ（商標）５０という商用名で販売されている抽出物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記エピロビウムの抽出物はヤナギラン（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）および／またはススヤアカバナ（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）により得られ、２０〜５０％のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは最大３％のオエノテインＢを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記エピロビウムの抽出物は、５０％のヤナギランおよび５０％のススヤアカバナの葉および茎の抽出物であり、前記抽出物は前記抽出物の重量に対して３０〜３３重量％のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは最大０．４重量％のオエノテインＢを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
前記エピロビウムの抽出物は、５０％のヤナギランおよび５０％のススヤアカバナの葉および茎の抽出物であり、前記抽出物は前記抽出物の重量に対して約３１．７重量％のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは約０．３１重量％のオエノテインＢを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物および前記エピロビウムの抽出物は１：１〜１：２０の範囲の重量比にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物および前記エピロビウムの抽出物は１：１〜１：１０の範囲、好ましくは１：６の重量比にある、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物。
【請求項１２】
前記調製物は経口投与のための調製物である、請求項１１に記載の医薬調製物。
【請求項１３】
１００〜２００ｍｇのエピロビウム抽出物であって、前記抽出物重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物と、１０〜１５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む１０〜４０ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物とを含む単位用量の形態の、請求項１１または１２に記載の医薬調製物。
【請求項１４】
１５０ｍｇのエピロビウム抽出物であって、前記抽出物重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物と、１２．５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む２５ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物とを含む単位用量の形態の、請求項１３に記載の医薬調製物。
【請求項１５】
１５０ｍｇのエピロビウム抽出物であって、前記抽出物重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物、および１２．５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む２５ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物、３ｍｇの亜鉛と同等の亜鉛−Ｌ−ピドレート、および２７．５μｇのセレンと同等の亜セレン酸ナトリウムを含む単位用量の形態の、請求項１４に記載の医薬調製物。
【請求項１６】
前立腺疾患の処置に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のセイヨウジュウニヒトエの抽出物およびエピロビウムの抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記前立腺疾患は良性前立腺過形成である、請求項１６に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３０％〜７０％の量のフェニルプロパノイドを有し、次に１０〜５０％の量のトイポリオシドを含むアジュガ（Ａｊｕｇａ）の抽出物と、２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に最大３％の量のオエノテインＢ（ｏｅｎｏｔｈｅｉｎ  Ｂ）を含むエピロビウム（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ）抽出物とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記組成物は、前立腺過形成の処置に使用するのに好適である。
【背景技術】
【０００２】
良性前立腺過形成（ＢＰＨ：ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）は、前立腺腺腫（ＢＥＰ−良性前立腺肥大（ｂｅｎｉｇｎ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ））とも呼ばれ、前立腺の体積増加を特徴とする状態である。体積増加は、腺の実質成分および間質成分の過形成（すなわち、細胞数の増加）による。
【０００３】
ＢＰＨの症状および発生には、アンドロゲン、エストロゲン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、炎症性サイトカインなどの多くのケミカルメディエーターが役割を果たす。これらのうち、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）は、最も重要なものの一つである。
【０００４】
ＤＨＴは、テストステロンの代謝物であり、前立腺成長の決定的に重要なメディエーターである。ＤＨＴは、循環しているテストステロンから前立腺において合成される。ＤＨＴは主に、前立腺結合組織の細胞に局在する。合成されたなら、ＤＨＴは上皮細胞に到達する。どちらの種類の細胞においても、ＤＨＴはアンドロゲン受容体に結合し、これら２種の細胞のマイトジェンに成長因子の転写のシグナルを伝達する。ＤＨＴの重要性は、５α−レダクターゼの阻害剤の投与が前立腺におけるＤＨＴ含量の著しい減少を引き起こす良性肥大の患者の臨床所見により裏付けられる。これらの患者では、前立腺の体積が縮小し、その結果肥大の症状が減少する［非特許文献１を参照されたい］。
【０００５】
良性前立腺過形成の治療は、様々な化合物：５−アルファ−レダクターゼ（５−ＡＲＩ）の阻害剤、たとえばデュタステリド、フィナステリド；アルファ遮断薬、たとえばアルフゾシン、ドキサゾシン、タムスロシン、テラゾシン、シロドシン；抗コリン薬の使用に基づく。５−アルファ−レダクターゼの阻害剤と共にアルファ遮断薬、またはさらに抗コリン薬と共にアルファ遮断薬などの併用療法さえも使用されてきた［非特許文献１］。
【０００６】
栄養補助食品アプローチを用いれば良性前立腺過形成に対して、より有益な作用を得ることができる（軽症例では単独で、中等度から重度疾患では標準治療と組み合わせて）。
【０００７】
最も使用される栄養補助食品は、ノコギリパルメット（Ｓｅｒｅｎｏａ  ｒｅｐｅｎｓ）、ピュゲウムアフリカナム（Ｐｙｇｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、セイヨウイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ）、ペポカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）の抽出物、ならびにイソフラボン、リコペン、セレンおよびβ−シトステロールなどの物質を含む（非特許文献２）。
【０００８】
さらに、良性前立腺過形成の処置として、オエノテインＢを活性成分として含むエピロビウム抽出物の使用も知られている。（非特許文献３）。
【０００９】
特許文献１には、２０〜９０％の範囲のタイター（ｔｉｔｌｅ）を有するトイポリオシドを含むフェニルプロパノイドを含むセイヨウジュウニヒトエ（Ａｊｕｇａ  ｒｅｐｔａｎｓ）の抽出物が、記載されている。この文書に述べられているように、セイヨウジュウニヒトエ抽出物は、５−アルファ−レダクターゼの活性化に依存する前立腺疾患の患者において活性を示してきた。
【００１０】
しかしながら、前立腺疾患の効果的処置剤を提供する必要が、特に良性前立腺過形成に対して依然として感じられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第１７３６１６６Ｂ１号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＡＵＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ（ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ  ２０１０）
【非特許文献２】Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．２０１４  Ｊｕｌ；２８（７）：９４９−５５．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．Ａ  ｍｉｎｉｒｅｖｉｅｗ．Ｐａｇａｎｏ  Ｅ，Ｌａｕｄａｔｏ  Ｍ，Ｇｒｉｆｆｏ  Ｍ，Ｃａｐａｓｓｏ  Ｒ
【非特許文献３】Ｇｒａｎｉｃａ  Ｓ，Ｐｉｗｏｗａｒｓｋｉ  ＪＰ，Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋａ  ＭＥ，Ｋｉｓｓ  ＡＫ．Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ２８；１５６：３１６−４６；ａｎｄ  Ｌｅｓｕｉｓｓｅ  Ｄ，Ｂｅｒｊｏｎｎｅａｕ  Ｊ，Ｃｉｏｔ  Ｃ，Ｄｅｖａｕｘ  Ｐ，Ｄｏｕｃｅｔ  Ｂ，Ｇｏｕｒｖｅｓｔ  ＪＦ，Ｋｈｅｍｉｓ  Ｂ，Ｌａｎｇ  Ｃ，Ｌｅｇｒａｎｄ  Ｒ，Ｌｏｗｉｎｓｋｉ  Ｍ，Ｍａｑｕｉｎ  Ｐ，Ｐａｒｅｎｔ  Ａ，Ｓｃｈｏｏｔ  Ｂ，Ｔｅｕｔｓｃｈ  Ｇ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．１９９６  Ｍａｙ；５９（５）：４９０−２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的は、
−  セイヨウジュウニヒトエの抽出物であって、抽出物の重量に対して３０〜７０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドはフェニルプロパノイド総重量に対して１０〜５０％のトイポリオシドを含む、セイヨウジュウニヒトエの抽出物と、
−  エピロビウムの抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、前記量のポリフェノールはポリフェノールの総量に対して最大３重量％のオエノテインＢを含む、エピロビウムの抽出物
を含む医薬組成物により達成された。
【００１４】
本発明の発明者らは驚くべきことに、前立腺疾患、特に良性前立腺過形成の処置においてセイヨウジュウニヒトエおよびエピロビウムの２つの特定の抽出物が相乗的な活性を示すことを見出した。
【００１５】
したがって、別の態様によれば、本発明は、前立腺疾患、特に良性前立腺過形成の処置に使用するための、３０％〜７０％の量のフェニルプロパノイドを含み、次に１０〜５０％のトイポリオシドを含むセイヨウジュウニヒトエの抽出物と、２０〜５０％のポリフェノールを含み、次に最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物とを含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例２と同様に処置したラットの前立腺の重量に関するグラフである。
【図２】実施例２と同様に処置したラットの前立腺の組織学的側面に関する。
【図３】実施例２と同様に処置したラットの前立腺におけるＰＧＥ２のレベルに関するグラフである。
【図４】実施例２と同様に処置したラットの前立腺における血中のＤＨＴレベルに関するグラフである。
【図５】実施例２に示したような、ＩκＢαの分解を受けたＮＦκＢの核内への移行の評価の結果を示す。
【図６】実施例２に示したようなｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現の評価の結果を示す。
【図７】実施例２に示したような脂質過酸化、マロンジアルデヒド量の評価の結果を示す。
【図８】実施例２に示したようなアポトーシスの評価の結果を示す。
【図９】実施例３と同様に処置したラットの前立腺の組織学的側面に関する。
【図１０】ＰＧＥ２レベルおよびＤＨＴレベルの調節における実施例３の調製物の作用を示す。
【図１１】ＩκＢ−αの発現およびＮＦ−κＢの核移行に対する実施例３の調製物の作用を示す。
【図１２】ＢＰＨ後のｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２の発現およびＭＤＡレベルに対する実施例３の調製物の作用を示す。
【図１３】アポトーシス経路の調節に対する実施例３の調製物の作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、したがって、
−  セイヨウジュウニヒトエの抽出物であって、抽出物の重量に対して３０〜７０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドはフェニルプロパノイド総重量に対して１０〜５０％のトイポリオシドを含む、セイヨウジュウニヒトエの抽出物と、
−  エピロビウムの抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、前記量のポリフェノールはポリフェノールの総量に対して最大３重量％のオエノテインＢを含む、エピロビウムの抽出物
を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明では、「フェニルプロパノイド」という用語が使用されるとき、以下の一般構造を有する化合物を意図している。
【００１９】
【化１】
2019504117.tif 000002
【００２０】
式中、Ｒ１は、水素原子あるいは５もしくは６個の炭素原子を有する単糖または１０もしくは１２個の炭素原子を有する二糖であり；
Ｒ２は、水素原子またはカフェオイル基（Ａ）もしくはフェルロイル基であり；
Ｒ３は、水素原子あるいは５もしくは６個の炭素原子を有する単糖または１０もしくは１２個の炭素原子を有する二糖あるいはカフェオイル基（Ａ）またはフェルロイル基（Ｂ）であり；
Ｒ４は、水素原子、あるいは１〜３個の炭素原子を有する、好ましくは１個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐アルキル基またはヒドロキシルであり；
Ｒ５は、水素原子、または１〜３個の炭素原子、好ましくは１個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐アルキル基であり；
ただし、Ｒ３がカフェオイル基（Ａ）またはフェルロイル基（Ｂ）である場合
【００２１】
【化２】
2019504117.tif 000003
【００２２】
Ｒ２は水素原子であり、その逆も同様であり、Ｒ４およびＲ５はどちらも互いに同一でもまたは異なってもよい。フェニルプロパノイドのファミリーでは、トイポリオシド化合物、イソトイポリオシド化合物およびメチルイソトイポリオシド化合物が知られている。これらは、以下の式を有する。
−トイポリオシド：
【００２３】
【化３】
2019504117.tif 000004
【００２４】
式中、Ｒ１はガラクトースであり、Ｒ２はカフェ酸であり、Ｒ３は水素であり、Ｒ４は水素であり、Ｒ５は水素である。
−メチルトイポリオシド
【００２５】
【化４】
2019504117.tif 000005
【００２６】
式中、Ｒ１はガラクトースであり、Ｒ２はフェルラ酸であり、Ｒ３は水素であり、Ｒ４は水素であり、Ｒ５は水素である。
−イソトイポリオシド
【００２７】
【化５】
2019504117.tif 000006
【００２８】
式中、Ｒ１はガラクトースであり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はカフェ酸であり、Ｒ４は水素であり、Ｒ５は水素である。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、セイヨウジュウニヒトエの抽出物であって、抽出物の重量に対して３０〜７０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドは、フェニルプロパノイド量に対して１０〜５０重量％の量のトイポリオシドを含むセイヨウジュウニヒトエの抽出物を含む。
【００３０】
好ましくは、前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物は、抽出物の重量に対して約５０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、一層好ましくは次にフェニルプロパノイド量に対して約３０重量％のトイポリオシドを含む。
【００３１】
本発明によれば、好ましく有利な一実施形態では、本発明の組成物のセイヨウジュウニヒトエの抽出物は、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｃｈｅ（ＩＲＢ）Ｓ．ｐ．Ａ．（Ａｌｔａｖｉｌｌａ  Ｖｉｃｅｎｔｉｎａ、イタリア）によりＴｅｏｓｉｄｅ（商標）５０という商用名で販売されている抽出物である。
【００３２】
本発明の好ましく有利な実施形態の抽出物は、抽出物の総重量に対して約５０％のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドは、約３０％のトイポリオシドを含む。前記抽出物中には、さらにメチルトイポリオシドおよびイソトイポリオシドも存在する。
【００３３】
本発明の組成物は、エピロビウムの抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウムの抽出物をさらに含む。
【００３４】
オエノテインＢは、その互変異性体および構造の配座異性体を含む以下の式を有する。
【００３５】
【化６】
2019504117.tif 000007
【００３６】
約２００種の異なるエピロビウムが存在する。エピロビウムは、ステロール、トリテルペン、フラボノイドおよびポリフェノールを含む。
【００３７】
したがって、一定量のポリフェノールを含む多くのエピロビウム抽出物が存在する。好ましくは、本発明のエピロビウムの抽出物は、ヤナギラン（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）および／またはススヤアカバナ（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）から得られ、２０〜５０％のポリフェノールを含み、次に最大３％のオエノテインＢを含む。
【００３８】
本発明の好ましく有利な実施形態では、医薬組成物は、５０％のヤナギランおよび５０％のススヤアカバナの葉および茎の抽出物を含み、前記抽出物は、抽出物の重量に対して３０〜３３重量％、一層好ましくは約３１．７％のポリフェノールを含み、次に最大０．４重量％のオエノテインＢ、一層好ましくは約０．３１％のオエノテインＢを含む。本発明のエピロビウム抽出物は、２０〜５０％のポリフェノールを含み、次に最大３％のオエノテインＢを含む乾燥抽出物を得るため、好ましくは温水により抽出し、次いでそうして得られた水溶液（水性抽出物）を乾燥させることにより得られる。
【００３９】
本発明の好ましく有利な実施形態では、エピロビウム抽出物は、ヤナギラン（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ  Ｌ．）およびススヤアカバナ（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ  Ｓｃｈｅｒｂ）の地上部の５０：５０混合物を温水で抽出することにより得た。
【００４０】
したがって、本発明の医薬組成物は、上記のセイヨウジュウニヒトエの抽出物および前述のエピロビウム抽出物を含む。好ましくは、医薬組成物は、エピロビウム抽出物に対してセイヨウジュウニヒトエ抽出物１：１〜１：２０、一層好ましくは１：１〜１：１０、なお一層好ましくは１：６の重量比を含む。
【００４１】
本発明の組成物は、医薬調製物を調製するため、マルトデキストリン、たとえばトウモロコシから得られたマルトデキストリン、充填剤、たとえばリン酸二カルシウム；亜鉛−Ｌ−ピドレート、凝結防止剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素；亜セレン酸ナトリウムをさらに含む。本発明による組成物、したがって医薬調製物は、任意の投与経路により、好ましくは経口投与により、一層好ましくはゼラチンカプセルの形態で投与することができる。
【００４２】
好ましくは、本発明の組成物は、１００〜２００ｍｇのエピロビウム抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物と、１０〜１５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む１０〜４０ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物とを含む調製物として、好ましくは経口的に、単位投薬量の形態で、たとえばカプセル剤または錠剤として投与される。
【００４３】
一層好ましくは本発明の組成物は、１５０ｍｇのエピロビウム抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物と、１２．５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む２５ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物とを含む調製物として単位用量の形態で、好ましくは経口的に、たとえばカプセル剤または錠剤として投与される。
【００４４】
なお一層好ましくは、本発明の組成物は、１５０ｍｇのエピロビウム抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物および１２．５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む２５ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物、３ｍｇの亜鉛と同等の亜鉛−Ｌ−ピドレートおよび２７．５μｇのセレンと同等の亜セレン酸ナトリウムを含む調製物として単位用量の形態で、好ましくは経口的に、たとえばカプセル剤または錠剤として投与される。
【００４５】
別の態様では、本発明は、前立腺疾患、特に良性前立腺過形成の処置に使用するための、セイヨウジュウニヒトエの抽出物であって、抽出物の重量に対して３０％〜７０％の量のフェニルプロパノイドを含み、次にフェニルプロパノイド総重量に対して１０〜５０％の量のトイポリオシドを含むセイヨウジュウニヒトエの抽出物と、エピロビウム抽出物であって、抽出物の重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物とを含む医薬組成物に関する。
【００４６】
２種の抽出物および医薬組成物に関する上記に示した好ましく有利な実施形態はすべて、前立腺疾患、特に良性前立腺過形成の処置における使用において同じである。
【００４７】
本発明のいくつかの例示的な実施形態および本発明の組成物から得られる相乗作用の評価を、本発明自体を限定するのではなく例示として以下に示す。
【実施例】
【００４８】
実施例１：本発明の組成物の調製
エピロビウムの抽出物を、ヤナギランおよびススヤアカバナの地上部の５０：５０混合物を温水で抽出することにより調製した。そのようにして得られた水溶液を乾燥させることで、最初の植物材料と比較して１／４重量の抽出物を得た。トウモロコシから得られたマルトデキストリンを３０％で賦形剤／補助物質として加えた。抽出物重量と比較した抽出物中のポリフェノールの量は約３１．７％であったのに対し、オエノテインＢ（没食子酸として表される）の量は全ポリフェノールの重量に対して約０．３１％であった。ポリフェノールの量はヨーロッパ薬局方第８版により定義された技法に従い測定し、オエノテインＢの量はＨＰＬＣ−ＭＣ−ＱＴＯＦにより測定した。
【００４９】
セイヨウジュウニヒトエの抽出物として、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｃｈｅ（ＩＲＢ）Ｓ．ｐ．Ａ．（Ａｌｔａｖｉｌｌａ  Ｖｉｃｅｎｔｉｎａ、イタリア）が販売するＴｅｏｓｉｄｅ（商標）５０という商用名の製品を使用した。Ｔｅｏｓｉｄｅ（商標）５０の抽出物は、抽出物の総重量に対して約５０％のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドは、約３０％のトイポリオシドを含む。
【００５０】
２種の抽出物を、エピロビウム／市販のＴｅｏｓｉｄｅ（商標）５０の抽出物比１２：２で組み合わせた。
【００５１】
実施例２：良性前立腺過形成を対象とした本発明による医薬組成物の評価
良性前立腺過形成の実験モデルについて、経口投与による処置の１４日後評価を行った。用量および投与モード（強制経口）は、上記の化合物の経口投与により引き起こされる作用を明らかにするように、および何らかの副作用を特定するように選択を行った。実験デザインは、生理学的変化と、血液学的および解剖病理学的変化との両方を確認できるように設定した。これらの変化の出現から、毒性作用もできる限り明らかにした。
【００５２】
評価は、Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃａｌｃｏ、ミラノ、イタリア）のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットで実施した。
【００５３】
ラットは実際に、前立腺過形成の研究に「好ましい選択の」動物種である。次いでラットの良性前立腺過形成に対する本発明調製物および比較調製物両方の作用を評価した。
【００５４】
試験の開始時に、動物は約生後３ヶ月、体重２２０〜２５０グラムであった。収容条件は、以下の通りであった。２１〜２３℃およびＲＨ５５±１０％の空調環境、１２時間の明暗周期。
【００５５】
動物を表記の条件で７日間飼育し、以下の獣医学的検査に供した。体重測定、摂水摂餌量、糞便および尿検査；到着した動物の５％の剖検（無作為）。
【００５６】
以下の実験群を準備した。ほこりの立たないわらくず（ほこりの立たないおがくず）を含む４２５×２６６×１８０ｍｍ  ｈｔの平底を有するｍａｋｒｏｌｏｎケージにおいて５匹の群で収容し、ペレット標準食餌（ＭＩＬマウスおよびラット）を与え、水道水を自由に与えた、動物５匹の３群。ラットを、毎日皮下投与した１００μｌの量中、３ｍｇ／ｋｇ用量にてトウモロコシ油で希釈したプロピオン酸テストステロンで処置した。
【００５７】
試験した調製物は以下であった。
−実施例１と同様に得たエピロビウム抽出物（１２ｍｇ／ｋｇ）、１４日間経口投与した；
−良性前立腺過形成の処置で知られる市販の製品であり、セレンと組み合わせた、Ｆａｒｍａｌａｂｏｒ  Ｌｔｄ．（Ｃａｎｏｓａ  ｄｉ  Ｐｕｇｌｉａ、イタリア）により販売される市販のセレノア（Ｓｅｒｅｎｏａ）の抽出物；セレン（０．００５ｍｇ／ｋｇ）＋セレノア（２８．５ｍｇ／ｋｇ）、１４日間経口投与した；（．）
−Ｔｅｏｓｉｄｅ（商標）５０（２ｍｇ／ｋｇ）およびエピロビウム抽出物（１２ｍｇ／ｋｇ）を含む、実施例１で得たような１４ｍｇ／ｋｇの本発明の組成物、１４日間経口投与した。
【００５８】
対照（シャム）は、実験の全期間キャリアで処置した。
【００５９】
投与の量、モードおよび頻度：
トウモロコシ油で希釈したプロピオン酸テストステロンの皮下投与は、１００μｌの量中、３ｍｇ／ｋｇの用量、様々な調製物の強制経口投与は、１４日間（１日１回）２５０μｌの経口量中、２ｍｇ／ｋｇの用量であった。
【００６０】
以下の測定を全実験群の動物について実施した。
・前立腺重量；
・前立腺の組織学的検査；
・プロスタグランジンＥ２の測定
・血中ＤＨＴの判定
・ウエスタンブロット解析による炎症性メディエーターの評価
前立腺の組織学的検査：１０％中性ホルマリンで固定、パラフィン包埋し、前立腺をヘマトキシリン−エオシンで染色。
【００６１】
血中のＤＨＴにおけるプロスタグランジンＥ２の測定：血清中のプロスタグランジンＥ２およびＤＨＴのレベルを、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【００６２】
結果
本調査から、本発明の組成物に相当する調製物およびセレン＋セレノア調製物は、１４日間連続の経口投与でラットにおいて忍容性が良好であり、良性前立腺過形成の症例でも、死亡および／または有意な体重の変化および／または有意な摂餌量の変化の症例の原因とまったくならないことが示された。行った研究からは、テストステロンの連日投与により前立腺の大きさの有意な増加が誘導されることがさらに明らかになった。図１から明らかなように、成長は、セレン＋セレノア調製物の投与後低下したが、本発明の生成物を用いた処置によりさらに低下した。
【００６３】
さらにヘマトキシリンおよびエオシンによる染色により、テストステロンおよび試験した調製物の連日投与により誘導される前立腺の形態変化に関する判定も行った。図２から明らかなように、本発明の生成物は、前立腺の組織形態変化を有意に、かつ比較セレン＋セレノア調製物よりも減少させ、腺房の規則性、細胞の形状および基底膜の完全性を回復させた。
【００６４】
同器官の組織学的変化の減少は、以下の表１からも明らかである。
【００６５】
【表１】
2019504117.tif 000008
【００６６】
テストステロンの連日投与により誘導された前立腺の形態変化を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により評価した。テストステロンの連日投与は、前立腺組織の完全な崩壊および著明な過形成を誘発することが観察された。表１に要約し、図２に示したように、テストステロンによる連日処置後、管腔内に絨毛突起を有する腺房の不規則な形状および上皮極性の喪失が観察された。上皮は立方状／円柱状のように見え、核は不規則に並んでいた。さらに図２および表１は、本発明の生成物による処置が、どのように前立腺の組織形態変化を減少させ、腺房の規則的な形状、上皮極性、基底膜の完全性を回復させ、管腔内の絨毛突起を減少させたかも示す（表１および図２）。
【００６７】
実験中、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）および血中ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）のレベルも判定した。図３および図４により示されるように、本発明の組成物に相当する調製物は、ＰＧＥ２およびＤＨＴの産生を有意に、かつ他の化合物より効果的に減少させた。
【００６８】
さらにテストステロンの連日投与後の炎症プロセスの発生も、ウエスタンブロット解析により評価した。特に、テストステロンの連日投与により誘導されたＩκＢαおよびＮＦκＢのレベルのほか、ＩκＢαの分解を受けたＮＦκＢの核内移行の有意な増加も観察した。図５から明らかなように、本発明の生成物はＩκＢαの分解を有意に減少させ、それを対照レベルに戻し、結果としてＮＦκＢの核内への移行を減少させることができた。
【００６９】
さらに、テストステロンの連日投与後の酸化ストレスおよび脂質過酸化の発生もｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２の解析およびマロンジアルデヒドの量により評価した。
【００７０】
図６および７に報告したように、これらの結果から、テストステロンの連日投与後にｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現の増加と脂質過酸化の増加が示された一方、本発明の生成物による処置はｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現と脂質過酸化との増加を有意に減少させた。
【００７１】
最後に、テストステロンの連日投与後のアポトーシス過程の発生を判定した。図８から明らかなように、テストステロンの連日投与は、Ｂａｘ、すなわちアポトーシス促進タンパク質のレベルを低下させることにより、アポトーシスの生理的学プロセスを有意に抑制した。本発明の生成物による処置は、Ｂａｘのレベルを回復させた。
【００７２】
実施例３：本発明の生成物の比較評価
この研究では、本発明の生成物の能力を、ＢＰＨの実験モデルを用いて評価した。
【００７３】
特に動物を以下の生成物で処置した。
−エピロビウム：実施例１と同様に得たエピロビウム抽出物（１２ｍｇ／ｋｇ）を使用した；
−ＴＥＯＳＩＤＥ（商標）５０：実施例１と同様のセイヨウジュウニヒトエの抽出物を使用した。Ｔｅｏｓｉｄｅ（商標）５０の抽出物は、抽出物の総重量に対して約５０％のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドは、約３０％のトイポリオシドを含む；
−実施例１と同様に調製し、Ｔｅｏｓｉｄｅ（商標）５０およびエピロビウム抽出物を含んだ本発明の生成物；および
−セレンと組み合わせた、「ＳｅＲ＋Ｓｅ」と略記される実施例２に記載されているようなセレノアの市販の抽出物、良性前立腺過形成の処置で知られる市販の製品である。
【００７４】
本試験の目的は、各生成物／製品の治療効果を判定し、それらの酸化防止剤および抗炎症剤としての有効性を検証することであった。
【００７５】
体重約２００ｇの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＥｎｖｉｇｏ（イタリア）から入手し、本研究に使用した。
【００７６】
動物管理および実験手順はすべて、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州）に記載された被験動物の管理および使用の基準に従い、Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｓｉｎａにより承認された。
【００７７】
本インビボ実験は、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）誘発にあった。
具体的には、１週間の実験室環境への馴化後、動物を以下の群に無作為に割り付けた。
シャム群：ラットをビヒクル（１００ｍＬのトウモロコシ油ｓ．ｃ．）で処置した；
ＢＰＨ−群：１００μｌの量中、トウモロコシ油で希釈した３ｍｇ／ｋｇの用量ｓ．ｃ．での、１４日間投与したプロピオン酸テストステロン投与によりラットにＢＰＨ肥大症を誘発した；
ＢＰＨ−Ｔｅｏｓｉｄｅ群：ラットを、既に記載したようにプロピオン酸テストステロンで処置し、ＴＥＯＳＩＤＥ（商標）５０（２５０μｌの量中２ｍｇ／ｋｇ）による処置を１４日間まで毎日経口にて行った；
ＢＰＨ−エピロビウム群：ラットを、既に記載したようにプロピオン酸テストステロンで処置し、エピロビウム（１２ｍｇ／ｋｇ）による処置を１４日間まで毎日経口にて行った；
ＢＰＨ−発明の生成物群：ラットを、既に記載したようにプロピオン酸テストステロンで処置し、実施例１の生成物（Ｔｅｏｓｉｄｅ５０％  ２ｍｇ／ｋｇおよびエピロビウム１２ｍｇ／ｋｇを含む１４ｍｇ／ｋｇ）による処置を１４日間まで毎日経口にて行った；
ＢＰＨ−ＳｅＲ＋Ｓｅ群：ラットを、既に記載したようにプロピオン酸テストステロンで処置し、ＳｅＲ（２８．５ｍｇ／ｋｇ）およびＳｅ（０．００５ｍｇ／ｋｇ）による処置を１４日間まで毎日経口にて行った。
【００７８】
実験の終了時、動物を麻酔下で屠殺し、その前立腺を直ちに除去してさらなる解析に使用した。
【００７９】
ＴＥＯＳＩＤＥ（商標）５０（ＩＲＢ）およびプロピオン酸テストステロン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリア）の場合、用量および投与経路は、既報の報告（Ａｌｔａｖｉｌｌａ  Ｄ，Ｍｉｎｕｔｏｌｉ  Ｌ，Ｐｏｌｉｔｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｃｏｘｉｄ，ａ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＣＯＸ  ａｎｄ  ５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅｓ，ｏｎ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１２；１６７：９５−１０８）に従って選択した。
【００８０】
前立腺を除去して秤量し、成長阻害のパーセンテージを、以下の通り計算した。１００−［（ＴＧ（処置群）−シャム）／（ＢＰＨ−シャム）×１００］、ＴＧは、処置群の値である。
【００８１】
組織切片をヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、組織学的研究について以前に記載された（Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ  Ｉ，Ｉｍｐｅｌｌｉｚｚｅｒｉ  Ｄ，Ｄｉ  Ｐａｏｌａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｉｎ−ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４；１１：６）ように、イメージングシステム（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｚｅｉｓｓ、ミラノ、イタリア）に連結された光学顕微鏡を用いて調査した。
【００８２】
ウエスタンブロット解析では、公表された手順（Ｃｏｒｄａｒｏ  Ｍ，Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ  Ｉ，Ｓｉｒａｃｕｓａ  Ｒ，Ｉｍｐｅｌｌｉｚｚｅｒｉ  Ｄ，Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｅ，Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ  Ｓ．ＫＵ００６３７９４，ａ  Ｄｕａｌ  ｍＴＯＲＣ１  ａｎｄ  ｍＴＯＲＣ２  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  Ａｆｔｅｒ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１６）をわずかに変更して細胞質抽出物および核抽出物を調製した。ＩκＢα、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２のレベルを細胞質画分で定量した。核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）ｐ６５は核画分で定量した。抗体は、抗ＩκＢα（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｉＮＯＳ（１：１０００、ＢＤ−トランスダクション（ＢＤ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ））、抗ＣＯＸ−２（１：１０００、セルシグナリング（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ））および抗ＢＡＸ（１：５００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（１：５００；セルシグナリング）、抗Ｂｃｌ−２抗体（１：５００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた。タンパク質バンドの相対発現量は、ＢＩＯＲＡＤ社製ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋ソフトウェアを用いてデンシトメトリーで定量し、β−アクチンレベルに対して標準化した。ブロットシグナルのイメージ（８ビット／６００ｄｐｉ解像度）を解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬ、ｖ２００３）にインポートした。
【００８３】
前立腺サンプルにおけるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルを、以前に記載されたように（Ｐａｔｅｒｎｉｔｉ  Ｉ，Ｇｅｎｏｖｅｓｅ  Ｔ，Ｍａｚｚｏｎ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｖｅｒ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｔｒａｕｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１０；１１２：６１１−６２４）脂質過酸化の指標として測定した。
【００８４】
前立腺組織におけるＰＧＥ２の評価を行った。この場合、前立腺サンプルをホモジナイズし、入手可能なＣａｙｍａｎ製ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ、Ａｒｃｏｒｅ、ミラノ、イタリア）を用いてＰＧＥ２についてアッセイした。
【００８５】
さらにジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）レベルの評価も行った。ＤＨＴレベルは、市販されているＥＬＩＳＡキット（Ｍｙ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）を用いて血漿サンプルにおいてアッセイした。
【００８６】
使用した他のすべての試薬および化合物は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミラノ、イタリア）から入手した。
【００８７】
図および以下の値はすべて、Ｎ個の観測値の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表した。本インビボ研究の場合、Ｎは、研究した動物の数を表した。組織像に関わる実験において示した図は、異なる実験日に実施した少なくとも３回の実験の代表例であった。結果は、１元配置分散分析、続いてボンフェローニの多重比較の事後検定により解析した。０．０５未満のｐ値を有意と見なした。
【００８８】
結果
前立腺組織像
図９では、上記調製物の作用を報告した。
【００８９】
ビヒクル処置ラット由来のシャム前立腺は、立方状および低円柱状の上皮を有し、円形の核が基底部への配列を示す定型的な腺房を示す（ａ、ａ１）。管腔に乳頭状突起が出た不規則な腺房の形状を示すＢＰＨ前立腺、および増大した過形成結節の病巣が明らかであった。上皮は高円柱状であり、多層の円形／卵形核が不規則に配列していた（ｂ、ｂ１）。エピロビウム、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置（それぞれｃ、ｃ１とｄ、ｄ１とｆ、ｆ１、デンシトメトリーｇを参照）は、組織学的パターンおよび著明な過形成を減少させた。
【００９０】
図９ｇは、異なる実験日に実施した少なくとも３回の実験の代表例であった。＊＊＊Ｐ＜０．０００１  テストステロン対シャム群；＃＃＃Ｐ＜０．０００１  エピロビウム、本発明の生成物、Ｓｅ＋Ｓｅｒ、Ｔｅｏｓｉｄｅ対テストステロン；°°°Ｐ＜０．０００１  本発明の生成物、Ｓｅ＋Ｓｅｒ、Ｔｅｏｓｉｄｅ対エピロビウム；
【００９１】
【数１】
2019504117.tif 000009
【００９２】
（二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ検定を用いて実施）。
【００９３】
さらに、ＢＰＨ処置ラットにおいて前立腺重量の有意な増加が観察された（ｈ）一方、エピロビウム、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、前立腺の成長を低下させた（ｈ）。
【００９４】
図９ｈは、異なる実験日に実施した少なくとも３回の実験の代表例である。＊＊＊Ｐ＜０．０００１  テストステロン対シャム群；＃＃＃Ｐ＜０．０００１  エピロビウム、本発明の生成物、Ｓｅ＋Ｓｅｒ、Ｔｅｏｓｉｄｅ対テストステロン；ｏＰ＜０．０５、本発明の生成物対エピロビウム；§§Ｐ＜０．００１  Ｔｅｏｓｉｄｅ対本発明の生成物。
【００９５】
対照群から採取した前立腺組織は、正常な前立腺構造および組織像を示した（図９およびａ１、デンシトメトリーｇを参照）一方、ＢＰＨ誘発後には、前立腺組織の完全な乱れ、深刻な過形成および著しい炎症が観察された（図９ｂおよびｂ１、デンシトメトリーｇを参照）。
【００９６】
エピロビウム、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置（それぞれ図９ｃ、ｃ１とｄ、ｄ１とｆ、ｆ１、デンシトメトリーｇを参照）は、テストステロン投与により誘発された著明な過形成を減少させた。本発明の生成物で処置した群ではむしろ、保護のより大きな傾向（図９ｅおよびｅ１、デンシトメトリーｇを参照）が観察された。
【００９７】
さらに、ＢＰＨ処置ラットで前立腺重量の増加（図９ｈ）が観察された一方、エピロビウム、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、過体重および前立腺の成長を有意に低下させた（図９ｈ）。本発明の生成物による処置後には、前立腺成長率のより大きな低下が観察された（図９ｈ）。
【００９８】
ＢＰＨ後のＰＧＥ２レベルおよびＤＨＴレベル
図１０では、ＰＧＥ２レベルおよびＤＨＴレベルの調節における上記調製物の作用を報告する。
【００９９】
シャム動物から採取した前立腺サンプルで基礎レベルのＰＧＥ２およびＤＨＴを観察した（それぞれ１０ａおよびｂ）。テストステロン投与がＰＧＥ２レベルおよびＤＨＴレベルの著明な増加を決定した（それぞれ１０ａおよびｂ）一方、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、ＰＧＥ２の増加レベルを有意に低下させた（それぞれ１０ａおよびｂ）。
【０１００】
結果は、各群の２０匹の動物の平均±ＳＤで表した。ＰＧＥ２レベル  ＊＊＊Ｐ＜０．０００１  テストステロン対シャム群；＃＃＃Ｐ＜０．０００１  エピロビウム、本発明の生成物、Ｓｅ＋Ｓｅｒ、Ｔｅｏｓｉｄｅ対テストステロン；ｏｏｏＰ＜０．０００１  本発明の生成物、Ｓｅ＋Ｓｅｒ、Ｔｅｏｓｉｄｅ対エピロビウム；§§§Ｐ＜０．０００１  Ｓｅ＋Ｓｅｒ、Ｔｅｏｓｉｄｅ対本発明の生成物；
【０１０１】
【数２】
2019504117.tif 000010
【０１０２】
シャム動物由来の前立腺組織のホモジネートは、基礎レベルのＰＧＥ２を有した（図１０ａ）。テストステロンを注入したＢＰＨ動物から採取した前立腺は、ＰＧＥ２レベルの著明な増加を示した（図１０ａ）。ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、ＰＧＥ２の増加レベルを有意に低下させた（図１０ａ）。本発明の生成物で処置した群では、保護のより顕著な傾向が観察された（図１０ａ）。
【０１０３】
現在のＢＰＨ処置におけるもう１つの重要なパラメーターは、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）のレベルである。本研究では対照群で基礎レベルのＤＨＴが観察された一方、ＢＰＨ−ラットでＤＨＴレベルの有意な増加が観察された（図１０ｂ）。
【０１０４】
エピロビウム、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、ＤＨＴレベルをかなり低下させ（図１０ｂ）、本発明の生成物投与により、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅと比較してより優れた保護が観察された（図１０ｂ）。
【０１０５】
ＢＰＨ後のＩκＢαおよびＮＦκＢの発現
図１１では、ＢＰＨ後の上記調製物のＩκＢα発現およびＮＦκＢ発現に対する作用を評価した。
【０１０６】
テストステロン誘発されたＢＰＨ後のエピロビウム、本発明の生成物、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋ＳｅのＩκＢ−α分解（Ａ）およびＮＦ−κＢ  ｐ６５移行（Ｂ）に対する作用を示す代表的なウエスタンブロットを得た。
【０１０７】
２０匹の動物／群から得たライセートの代表的なブロットを示し、全動物のデンシトメトリー解析を報告した。ＡおよびＢの結果は、各群の２０匹の動物の平均±ＳＤで表す。＊＊Ｐ＜０．０１対シャム群、＊＊＊Ｐ＜０．００１対シャム群；＃＃Ｐ＜０．０１対ＢＰＨ群；＃Ｐ＜０．０５対ＢＰＨ群。
【０１０８】
ＢＰＨの程度への炎症プロセスの関与をもっとよく評価するため、それでＩκＢαおよびＮＦκＢの発現を解析した。対照群で基礎レベルのＩκＢαが観察された一方、ＢＰＨ誘発後、図１１ａ、ａ１およびｂ、ｂ１に示したように、ＩκＢαレベルと共にその結果としてのＮＦκＢの核内の活性化／移行の有意な低下があった。本発明の生成物およびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、ＩκＢ−α分解（図１１ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）を有意に防ぎ、ＮＦκＢの核への移行をかなり減少させ（図１１ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）、その後の炎症促進性遺伝子の転写を妨げた。エピロビウム処置による保護は観察されなかった（図１１ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）。
【０１０９】
ＢＰＨ後のｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現誘導
ＢＰＨにおける酸化ストレスの役割を理解するため、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現レベルを解析した。結果を図１２に報告する。
【０１１０】
テストステロン投与後のエピロビウム、本発明の生成物、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅの処置のｉＮＯＳレベル（Ａ）、Ｃｏｘ−２レベル（Ｂ）に対する作用を示す代表的なウエスタンブロットを得た。さらに、エピロビウム、本発明の生成物、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋Ｓｅの処置後、ＭＤＡレベルは有意に低下した（ｃ）。
【０１１１】
２０匹の動物／群から得たライセートの代表的なブロットを示し、全動物のデンシトメトリー解析を報告する。Ａ、ＢおよびＣの結果は、各群の２０匹の動物の平均±ＳＤで表した。＊Ｐ＜０．００５対シャム群；＊＊Ｐ＜０．０１対シャム群；＊＊＊Ｐ＜０．００１対シャム群；＃＃Ｐ＜０．０１対ＢＰＨ群；＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＢＰＨ群。
【０１１２】
ＢＰＨ誘発後ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の両発現の有意な増加（図１２ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）が観察された一方、本発明の生成物およびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置から、ｉＮＯＳレベルおよびＣＯＸ−２レベルの有意な低下が立証され（図１２ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）、それらの抗酸化効力が確認された。
【０１１３】
さらに、酸化ストレスにより誘発され、ＭＤＡレベルにより測定した脂質過酸化の程度を評価した。ＢＰＨ−群においてＭＤＡレベルの増加（図１２ｃ）が観察された一方、本発明の生成物およびＳｅＲ＋Ｓｅの処置は、有意に脂質過酸化から保護し、図１２ｃに示したようにＭＤＡレベルを低下させた。エピロビウム処置により保護は観察されなかった（図１２ｃ）。
【０１１４】
ＢＰＨにおけるアポトーシスプロセス
図１３では、上記調製物のアポトーシス経路の調節に対する作用を報告する。
【０１１５】
具体的には、テストステロン誘発したＢＰＨ後、エピロビウム、本発明の生成物、ＴｅｏｓｉｄｅおよびＳｅＲ＋ＳｅのＢａｘ（Ａ）およびＢｃｌ−２（Ｂ）の発現に対する作用を示す代表的なウエスタンブロットを得た。
【０１１６】
２０匹の動物／群から得たライセートの代表的なブロットを示し、全動物のデンシトメトリー解析を報告する。Ａ、ＢおよびＣの結果は、各群の２０匹の動物の平均±ＳＤで表す。＊Ｐ＜０．０５対シャム群；＃＃Ｐ＜０．０１対ＢＰＨ群；＃＃＃Ｐ＜０．００１対ＢＰＨ群。
【０１１７】
ＢＰＨがアポトーシスプロセスをどのように調節し得るかを評価するため、ＢａｘおよびＢｃｌ２などのアポトーシス促進タンパク質および抗アポトーシスタンパク質の両方を観察した。
【０１１８】
得られた結果から、対照群の前立腺組織において検出可能なレベルのＢａｘおよびＢｃｌ−２が明らかになった（図１３ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）。ＢＰＨラット由来の前立腺組織は、Ｂｃｌ−２レベルのわずかな増加を示し、Ｂａｘの発現に変化はなかった（図１３ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）。
【０１１９】
本発明の生成物およびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、抗アポトーシスＢｃｌ−２のレベルを有意に低下させ、アポトーシス促進性のＢａｘの発現を増加させた（図１３ａ、ａ１およびｂ、ｂ１）。
【０１２０】
本研究では、本発明の生成物およびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置が比較的大きな抗炎症作用を引き起こし、１４日間のテストステロン投与により誘導されたＩκＢαの分解およびＮＦ−κＢの移行を減少させることが明らかに立証された。ＮＦ−κＢの活性化は、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ−１β）などの炎症促進性遺伝子のほか、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２などの炎症促進酵素のレベルの増加につながる。
【０１２１】
いくつかの炎症経路を介して、ＣＯＸ−２発現の増加およびＰＧＥ２レベルの増加と共に異常なアラキドン酸（ＡＡ）代謝がＢＰＨの発生と関係しているようである（Ｌａｒｒｅ  Ｓ，Ｔｒａｎ  Ｎ，Ｆａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ＰＧＥ２  ａｎｄ  ＬＴＢ４  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅｓ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ＆  ｏｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．２００８；８７：１４−１９）。前立腺過成長におけるＣＯＸ−２の役割を説明するため、いくつかのメカニズムが提案されており、これらの作用の一部は、ＣＯＸ−２による、ＰＧ合成における特にＰＧＥ２の増加に起因する可能性がある（Ｌａｒｒｅ  Ｓ，Ｔｒａｎ  Ｎ，Ｆａｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ＰＧＥ２  ａｎｄ  ＬＴＢ４  ｔｉｓｓｕｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅｓ．Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ＆  ｏｔｈｅｒ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．２００８；８７：１４−１９）。
【０１２２】
以上のように、本研究の結果から、ＢＰＨ誘発後、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のより高い発現がある一方、ＳｅＲ＋Ｓｅおよびエピロビウムによる処置は、ＢＰＨ後に生じたより高レベルのｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の両方と、脂質の過酸化を有意に低下させることが立証された。さらに、本発明の生成物が、ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のほか、ＭＤＡ産生の低下において最も効果的処置であることも示された。
【０１２３】
ＣＯＸ−２が抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２の発現を上方制御し、同時に前立腺組織のアポトーシスが減少すること；Ｂｃｌ−２およびＢａｘは、アポトーシス現象の重要な因子であり、前立腺癌を含む大部分の癌は一般に、Ｂａｘのアポトーシス作用を中和するＢｃｌ−２を過剰発現する（Ｒｅｖｅｌｏｓ  Ｋ，Ｐｅｔｒａｋｉ  Ｃ，Ｇｒｅｇｏｒａｋｉｓ  Ａ，Ｓｃｏｒｉｌａｓ  Ａ，Ｐａｐａｎａｓｔａｓｉｏｕ  Ｐ，Ｋｏｕｔｓｉｌｉｅｒｉｓ  Ｍ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ２  ｉｓ  ａｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒａｄｉｃａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅｃｔｏｍｙ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００５；２５：３１２３−３１３３）ことで、アポトーシスから逃れて治療効率を低下させること；これらのタンパク質が、細胞がアポトーシスを起こすかどうかを決定することも立証された。ここで本発明の生成物およびＳｅＲ＋Ｓｅによる処置は、ＢＰＨにおいて有意にＢｃｌ−２発現を減少させ、Ｂａｘのレベルを増加させることが示された。これらのデータから、前立腺においてＢａｘの発現を誘導し、もってアポトーシス機構を刺激する本発明の生成物処置は、Ｂａｘ／Ｂｃｌ２レベルの不均衡を引き起こすことが示唆される。
【０１２４】
さらに、これらの結果は、エピロビウムをＴｅｏｓｉｄｅと組み合わせた本発明の生成物処置が、ＢＰＨの組織学的特徴を予防するうえで他の単独処置より効果的である組織学的評価でも確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月21日(2018.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  セイヨウジュウニヒトエ（Ａｊｕｇａ  ｒｅｐｔａｎｓ）の抽出物であって、前記抽出物の重量に対して３０〜７０重量％の量のフェニルプロパノイドを含み、前記量のフェニルプロパノイドはフェニルプロパノイド総重量に対して１０〜５０％のトイポリオシドを含む、セイヨウジュウニヒトエの抽出物、および
−  エピロビウムの抽出物であって、前記抽出物の重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、前記量のポリフェノールは前記ポリフェノールの総重量に対して最大３重量％のオエノテインＢを含む、エピロビウムの抽出物
を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物はメチルトイポリオシドおよびイソトイポリオシドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物は前記抽出物の重量に対して約５０重量％の量のフェニルプロパノイドを含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
フェニルプロパノイドの総量は前記フェニルプロパノイドの総量に対して約３０重量％のトイポリオシドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物は、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｉ  Ｒｉｃｅｒｃｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｃｈｅ（ＩＲＢ）Ｓ．ｐ．Ａ．によりＴｅｏｓｉｄｅ（商標）５０という商用名で販売されている抽出物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記エピロビウムの抽出物はヤナギラン（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）および／またはススヤアカバナ（Ｅｐｉｌｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）により得られ、２０〜５０％のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは最大３％のオエノテインＢを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記エピロビウムの抽出物は、５０％のヤナギランおよび５０％のススヤアカバナの葉および茎の抽出物であり、前記抽出物は前記抽出物の重量に対して３０〜３３重量％のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは最大０．４重量％のオエノテインＢを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記エピロビウムの抽出物は、５０％のヤナギランおよび５０％のススヤアカバナの葉および茎の抽出物であり、前記抽出物は前記抽出物の重量に対して約３１．７重量％のポリフェノールを含み、前記ポリフェノールは約０．３１重量％のオエノテインＢを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物および前記エピロビウムの抽出物は１：１〜１：２０の範囲の重量比にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記セイヨウジュウニヒトエの抽出物および前記エピロビウムの抽出物は１：１〜１：１０の範囲、好ましくは１：６の重量比にある、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬調製物。
【請求項１２】
前記調製物は経口投与のための調製物である、請求項１１に記載の医薬調製物。
【請求項１３】
１００〜２００ｍｇのエピロビウム抽出物であって、前記抽出物重量に対して２０〜５０重量％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物と、１０〜１５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む１０〜４０ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物とを含む単位用量の形態の、請求項１１または１２に記載の医薬調製物。
【請求項１４】
１５０ｍｇのエピロビウム抽出物であって、前記抽出物重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物と、１２．５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む２５ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物とを含む単位用量の形態の、請求項１３に記載の医薬調製物。
【請求項１５】
１５０ｍｇのエピロビウム抽出物であって、前記抽出物重量に対して２０〜５０％の量のポリフェノールを含み、次に前記量のポリフェノールは、最大３％のオエノテインＢを含むエピロビウム抽出物、および１２．５ｍｇの量のポリプロパノイドを含む２５ｍｇのセイヨウジュウニヒトエの乾燥抽出物、３ｍｇの亜鉛と同等の亜鉛−Ｌ−ピドレート、および２７．５μｇのセレンと同等の亜セレン酸ナトリウムを含む単位用量の形態の、請求項１４に記載の医薬調製物。
【請求項１６】
前立腺疾患の処置に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のセイヨウジュウニヒトエの抽出物およびエピロビウムの抽出物を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記前立腺疾患は良性前立腺過形成である、請求項１６に記載の使用のための組成物。
【国際調査報告】
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