(57)【要約】  本発明は、心肥大および心筋リモデリングの治療および予防における式（Ｉ）のカウラン化合物の新規薬学的使用に関する。前記化合物はまた、肺高血圧を有意に改善し、血管肥大を予防することができる。前記化合物は、ｃＧＭＰまたはｃＡＭＰシグナル経路を調節すること、および／または、反応性酸素種（ＲＯＳ）を減少させることによって、線維症を抑制し、勃起不全、神経変性および他の関連疾患を治療するためにも使用することができる。ここで、Ｒ１は水素、ヒドロキシルまたはアルコキシである。Ｒ２はカルボキシル、カルボキシレート、ハロゲン化アシル、アルデヒド、メチル−ヒドロキシル、およびエステル、アシルアミド、カルボキシルに対して加水分解可能なアシルまたはエーテル基を含む。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８は独立して、酸素、ヒドロキシル、メチル−ヒドロキシル、およびメチル−ヒドロキシルに加水分解可能なエステルまたはアルコキシメチル基を含む。Ｒ７はメチル、ヒドロキシル、およびメチル−ヒドロキシルに加水分解可能なエステルまたはアルコキシメチルを含む。Ｒ９はメチレンまたは酸素を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−β、マイクロＲＮＡおよび新規ホスホジエステラーゼ変調、またはこれらの組み合わせによる、心筋症、心臓肥大、肺高血圧症または正常組織の線維症リモデリングおよびそれらに関連する他の疾患の治療または予防方法であって、
必要とする患者に投与される特定の医薬標準の固体または液体組成物の製造におけるカウラン化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の使用を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記心臓肥大は、心筋重量の増加、心筋のサイズの増加、交感神経の活動の増加、筋線維芽細胞の過剰生産、コラーゲンの過剰生産およびＢ型ナトリウム利尿ペプチドの過剰生産であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記心臓肥大は、高血圧、虚血、心筋症、糖尿病およびその他の心臓疾患の結果である、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記肺高血圧症は、内膜増殖、メジアン肥大および血管筋肥大を含む肺動脈疾患であるか、線維組織の増加、細胞外マトリックスの増加、およびコラーゲン産生の増加によるものである、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記肺高血圧症は、高血圧症、低酸素症または肺疾患の結果である、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記線維症リモデリングは、線維芽細胞の増加、および、細胞外マトリックスまたはコラーゲンの過剰発現である、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記線維症リモデリングは、肝臓又は腎臓硬変、網膜線維症、皮膚、腸、脳および他の器官、血管または冠状動脈形成術による手術または外傷からの創傷治癒を含む方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記疾患の治療および予防方法は、疾患の治療におけるｃＧＭＰ生成の刺激を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記心臓肥大疾患の治療および予防方法は、酸素消費量をさらに増加させることなく、かつ、既存のＥＣＧを悪化させることなく、心機能を改善することを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、
前記疾患の治療および予防方法は、疾患の処置におけるｃＧＭＰ生成および／またはマイクロＲＮＡ２１変調の刺激を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記疾患の治療および予防方法は、疾患の治療において、ｃＧＭＰ生成が増加し、かつ、細胞内の活性酸素レベルが減少することを特徴とする新規なホスホジエステラーゼ阻害剤を使用することを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記疾患の治療および予防方法は、疾患の治療において、細胞中における２’３’ｃＧＭＰ、３’５’ｃＧＭＰ、２’３’ｃＡＭＰおよび３’５’ｃＡＭＰの産生量、または、それらの割合を変化させる新規ホスホジエステラーゼモジュレータの使用を含む、方法。
【請求項１３】
前記その他の関連疾患は、勃起機能不全である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記その他の関連疾患は、神経変性疾患および代謝疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記その他の関連疾患は、長いＱＴセグメントを有する異常ＥＣＧ、または、細長い活動電位、脱分極およびＨＥＲＧ電流の抑制の結果として増加したＱＴ変化を伴う、異常なＥＣＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記その他の関連疾患は、増強された心臓交感神経活動である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記その他の関連疾患は、神経変性疾患、老人性認知症、アルツハイマー病および後期脳損傷を含むアストログリオーシスの活性化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物は、構造式（Ｉ）で示される化合物Ａである、請求項１に記載の方法。
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【請求項１９】
前記化合物は、構造式（ＩＩ）で示される化合物Ｂである、請求項１に記載の方法。
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【請求項２０】
前記固体医薬化合物は、経口、非経口またはインプラント使用のための、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、坐剤、軟膏および徐放性製剤からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記医薬化合物は、肺のためのまたは経鼻送達のためのスプレーのための、スプレー吸入ネブライザ、ＭＤＩまたは乾燥粉末からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記特定の医薬標準化合物は、生理食塩水および有機溶剤または溶質または可溶化剤としての混合溶媒からなるカテーテルを介して送達される医薬標準的な水性液体の注射可能な水性液体製剤または適切な剤形である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶媒は、エタノール、１，２−プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコールまたは他の医薬に適した有機溶媒であり、混合物中の溶媒のそれぞれの体積が５％〜９０％である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記可溶化は、アルコール類（クロロブタノール）、ジオキソラン、エーテル、グリセロール、アミド（ジメチルアセトアミド）、エステル類（エチルオリーブ）、植物油（大豆油）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシド）および高分子化合物（コリファーＲＨ４０）、および他の医薬に適した可溶化剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記特定の医薬標準的な製薬注射用の水性液体製剤は、米国、欧州連合、日本および中国の薬物当局によって公表された薬局方の安定性と生物学的安全性の要件を満たしている、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
心臓肥大は、圧力過負荷に対する代償としての応答である（Ｈｉｌｆｉｋｅｒ−Ｋｌｅｍｅｒら、ＪＡＣＣ  ２００６；４８（９）：Ａ５６−Ａ６６）。それは、最終的に心機能の低下とともに心不全の状態となる。増加した圧力の刺激の下で、心不全の状態への代償からの移行プロセスは、しばしば、心臓リモデリングを含む（Ｋｏｎｓｔａｍら、ＪＡＣＣ心臓血管撮影２０１１；４（１）：９８−１０８）。心臓リモデリングは、心筋細胞の過剰増殖または死、血管希薄化、線維症、炎症、および、進行性心機能不全を含む複雑なプロセスである（Ｂｕｒｃｈｆｉｅｌｄら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１３；１２８（４）：３８８−４００）。細胞外マトリックスおよび関連するコラーゲンネットワークに取り囲まれた各心筋細胞の増加は、心臓の硬度を高める。間質ネットワークおよび線維症の乱れは、収縮機能を損ない、高血圧性心疾患後の有害心筋リモデリングに寄与し、心臓中でもっとも多い細胞である（全細胞集団の三分の二を構成する）心臓線維芽細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を沈着し、足場心筋細胞を作り出す役割がある。活性化筋線維芽細胞は、間質および血管周囲腔中の、主たるコラーゲンタイプＩおよびＩＩＩであるＥＣＭの過剰生成につながる。過剰なコラーゲン沈着は、心筋硬直、心臓弛緩充満障害（拡張機能障害）、および心臓の過負荷につながる。
【０００２】
研究が示す通り、間質コラーゲンおよび心筋線維化の増加は、肥大による心機能不全に寄与する唯一の原因ではないかもしれない。交感神経活動の増加と迷走神経活動の撤退を伴う、神経ホルモンの活性化、電気生理学的リモデリングおよび自律神経失調といった他のメカニズムも心機能不全に寄与しうる。病的心臓肥大や心臓リモデリングを防止することは、劣化から心機能を維持するための重要な治療目標である。
【０００３】
シルデナフィルとともにＰＤＥ−５を遮断することによるｃＧＭＰの増加は、心室と心筋細胞肥大の両方を抑制し、公表されている慢性横断大動脈狭窄マウス生体内の心機能を向上させることが報告されている（Ｙｕａｎ  Ｆ．ＪＭＣＣ１９９７；２９（１０）：２８３７−４８）。シルデナフィルはまた、心室の機能を回復しながら、圧力負荷によって誘導される予め確立された肥大を好転させる。
【０００４】
また、ＴＡＣラットにおける左心の劣化は、順番に、低酸素症および肺動脈内圧力増加を引き起こし、血管リモデリングの原因となる（Ｃｈｅｎら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２０１２；５９：１１７０−１１７８）。
【０００５】
肺動脈の狭窄は、抵抗の増加をもたらし、肺高血圧症につながる。肺高血圧症（ＰＨ）は、後に右心不全につながる、肺血管系の急速進行性疾患である。ＰＨは、肺血管の構造的なリモデリングにつながる低酸素症に長期間さらされることによって誘発される。血管収縮および血管リモデリングの組み合わせは、内側の肥大、内膜増殖、および小筋性動脈の線維化、コラーゲンの合成および沈着、毛細血管前の筋肥大ならびに診断叢状病変によって特徴付けられるＰＨＴ  多因性肺動脈症につながる。肺は、豊富なＰＤＥ−５の発現を有する器官である（Ｂｕｒｃｈｆｉｅｌｄら  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１３；１２８（４）：３８８−４００）。シルデナフィル、ＰＤＥ−５阻害剤が、低酸素への慢性暴露前およびラットにおける低酸素誘導ＰＨＴ進行中に与えられたとき、肺動脈圧および血管リモデリングの上昇を減衰させることが示されている（Ｋｗｏｎｇら  Ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２０１５；２１（２）：２０６−１４）。ＰＨＴの患者の臨床試験はまた、シルデナフィル治療は、患者の状態を向上させることができることを示している。
【０００６】
ＰＤＥ−５は、生細胞における多様な生物学的プロセスを調節する不可欠な細胞内セカンドメッセンジャーであるサイクリックＧＭＰ（環状グアノシンーリン酸）の加水分解の触媒作用を及ぼす酵素である。ＰＤＥ−５−シルデナフィル、バルデナフィルおよびタダラフィルの三つの選択的阻害剤は、勃起不全の治療のために、世界中の何百万人の男性によって成功的に使用されている。上述したように、シルデナフィルおよびタダラフィルは、現在、心臓肥大、心筋症、肺高血圧症、他の循環障害の治療のために使用されている。最近の研究では、心臓肥大、心筋症、脳卒中、神経変性疾患を含む、ＰＤＥ−５阻害剤の潜在的神経学的アプリケーションを示唆している。
【０００７】
ＰＤＥ−５阻害剤はまた、脳卒中および他の神経変性疾患から脳を保護しうる。中大脳動脈閉塞の梗塞症２時間後または２４時間後に開始する７日間連続のシルデナフィルの経口投与は、梗塞体積への影響なく神経学的回復を大幅に強化する。著者は、シルデナフィル投与後のｃＧＭＰの皮質レベルの増加は、神経発生を誘発し、神経障害を低減しうることを提案した。
【０００８】
しかし、シルデナフィルは、患者に有害な影響を与えうる。高効率かつ低毒性を伴う心臓と肺組織における予防線維症のための次世代ＰＥＤの医学的必要性を満たさない。
【０００９】
化合物Ａは、その甘い味と、心臓血管系に効果のある南アメリカの伝統薬として知られているステビオサイド由来ベイエランジテルペンである（Ｇｅｕｎｓ  ＪＭＣ  Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ．  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００３；６４（５）：９１３−２１）。従来技術として、研究では、化合物Ａおよび化合物Ｂなどのカウラン様化合物は、急性虚血再かん流心臓損傷に心臓保護効果を有し、不整脈を減少させることが明らかにされている（Ｔａｎ、米国特許１１／５９６，５１４，２００６）。またイソステビオール（化合物Ａ）は、糖尿病に有益であり得ることが報告されている。しかしながら、血管肥大、血管筋肥大およびコラーゲン沈着によって特徴付けられる、心臓もしくは血管リモデリング、または、心臓肥大および肺高血圧症に対する化合物Ａのようなカウラン化合物の効果は、全く報告されていない。心臓肥大または線維症に関連する要因として知られるｃＧＭＰまたはＴＧＦ−βに対する式（Ｉ）の化合物およびイソステビオール（化合物Ａ）の効果は、従来技術において報告されている。
【００１０】
本発明において、化合物Ａのような、式（Ｉ）のカウラン様化合物は、ＴＡＣ誘発性肥大ラットにおける心臓肥大の治療に有用であることを、我々は、初めて発表した。また、線維症およびコラーゲン沈着ならびに心筋細胞の大きさを減らすことによって心臓リモデリングを防ぐことができる。加えて、化合物Ａのようなカウラン様化合物は、ＴＡＣ−誘発性肥大ラットにおける肺肥大も防止することができる。化合物Ａのようなカウラン様化合物の役割は、強化されたｃＧＭＰシグナル経路およびＲＯＳの捕捉の両方を含むものである。さらに、本発明は、他の薬剤に対して化合物Ａの優れた治療効果を開示するものであり、また、化合物Ａは、他のホスホジエステラーゼまたは機構を含むものである。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、心臓肥大および肺高血圧症の治療における式（Ｉ）のカウラン化合物の効果を開示するものである。式（Ｉ）の化合物は、天然、合成または半合成の化合物のクラスを示す。これらの化合物の多くは、公衆に知られている（Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ＡＤ，２００２，ｐ８６−１３７；Ｓｉｎｄｅｒ  ＢＢら，  １９９８；  Ｃｈａｎｇ  ＦＲら，１９９８；Ｈｓｕ，  ＦＬら，２００２）。式（Ｉ）の化合物は、１以上の不斉中心を有していてもよく、異なる立体異性体で存在していてもよい。
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【００１２】
式（Ｉ）において、
（ｉｉ）．  Ｒ１は、水素、ヒドロキシルまたはアルコキシのいずれかであり、
（ｉｉｉ）．  Ｒ２は、カルボキシル、カルボキシレート、ハロゲン化アシル、アルデヒド、メチル‐ヒドロキシル、エステル、アシルアミド、カルボキシルに加水分解しうるアシルまたはエーテル基のいずれかであり、
（ｉｖ）．  Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、および、Ｒ８は、独立して、酸素、ヒドロキシル、メチル‐ヒドロキシル、メチル‐ヒドロキシルに加水分解しうるエステルまたはアルコキシメチル、のいずれかであり、
（ｖ）．  Ｒ７は、メチル、ヒドロキシル、メチル‐ヒドロキシルに加水分解しうるエステルまたはアルコキシメチル、のいずれかであり、
（ｖｉ）．  Ｒ９は、メチレンまたは酸素である。
【００１３】
好ましい化合物の群は、式（Ｉ‘）に示される。前記化合物は、炭素１３に隣接する置換基および炭素１７および炭素１８に誘導体を伴って、カウラン構造を有する。これらの前記化合物は、複数の不斉中心を有していてもよいし、また、異なる立体異性体またはジアステレオ異性体として存在しうる。位置８および１３に関する絶対配置は（８Ｒ、１３Ｓ）または（８Ｓ、１３Ｒ）である。
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【００１４】
ここで、
（ｖｉｉ）．  Ｒ２は、カルボキシル、カルボキシレート、アルデヒド、メチル‐ヒドロキシル、メチルエステル、アシルメチルまたはハロゲン化アシルのいずれかであり、
（ｖｉｉｉ）．  Ｒ７は、メチル、メチル‐ヒドロキシルまたはメチルエーテルのいずれかであり、
（ｉｘ）．  Ｒ９は、メチレンまたは酸素である。
【００１５】
化合物Ａは、天然のステビオサイドを酸性加水分解することによって得ることができる。化合物Ｂは、グリコサイド化合物Ｂであるステビオサイドのアグリコンである。化合物ＡおよびＢは、異性体である。化合物Ｂは、ステビオサイドの加水分解および酸化の化学反応によって、または、動物の腸内細菌のカタナリシス反応によって得ることができる。
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【００１６】
化合物Ａは、分子式がＣ ２０ Ｈ ３０ Ｏ ３ であり、化学名が（４α、８β、１３β）−１３−メチル−１６−オキソ−１７−ノルカウラン−１８オイック酸である。化合物Ａは、エント−１６−ケトベイラン−１８オイック酸とも名付けられている。前記化合物は、炭素１３にメチル基が、炭素１６にカルボニック基が、および、炭素１８にカルボキシル基が置換基として配置され、不斉炭素の絶対配置が（４Ｒ、５Ｓ、８Ｒ、９Ｒ、１０Ｓ、１３Ｓ）である、カウラン構造を有する四環ジテルペンである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９８８）。
【００１７】
化合物Ｂは、分子式がＣ２０Ｈ３０Ｏ３であり、化学名がエント−１３−ヒドロキシカウル−１６−エン−１８オイック酸であり、ステビオールとも名付けられており、前記化合物は、炭素１３にヒドロキシル置換基を有し、炭素１６に隣接する二重結合によりメチレン基が付加されており、炭素１８はカルボキシル基であり、キラル炭素の絶対配置が（４Ｒ、５Ｓ、８Ｒ、９Ｒ、１０Ｓ、１３Ｓ）である、カウラン骨格を有する四環ジテルペンである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、１９９３）。
【００１８】
化合物ＡまたはＢは、位置１８におけるカルボキシレートが、ナトリウム、および基本的な金属またはクロライドおよびハロゲンであるカルボキシレートとして存在してもよい。化合物ＡおよびＢは、両方とも、カウラン構造を有し、カウラン化合物である。化合物Ａは、本発明においてより好ましい化合物である。本発明は、化合物ＡまたはＢが心臓肥大および肺高血圧症の治療および予防に同様の治療効果を有することを開示するものである。式（Ｉ）の他の全ての化合物もまた化合物Ａが発揮した効果と同様の治療効果を有することが推測される。大量の化合物Ｂが生体外の条件下で変異原性であり得ることが報告され、それゆえ、製薬治療での使用において、化合物Ｂに比べて、化合物Ａがより好ましい。
【００１９】
本発明に用いられる化合物のＡは、より良好な可溶性を有する化合物Ａのナトリウム塩である。
【００２０】
式（Ｉ）のカウラン化合物は、その生物学的および薬理学的効果の可能性について広く研究されている。代謝メカニズムにおけるカウラン化合物の役割が、ほとんどの研究の術的関心事項である（Ｋｉｎｇｈｏｒｎ，  ＡＤ．  ２００２，  Ｓｔｅｖｉａ，  ｂｙ  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｉｎｃ．）。
【００２１】
例えば、前記化合物は、細胞代謝産物、腸および炭水化物代謝におけるグルコース吸収、肝細胞のミトコンドリアにおけるエネルギー代謝、および、腎細胞における炭水化物および酸素の代謝物に影響を与えることが報告されている。また、前記化合物は、血管拡張および低血圧を引き起こすことが報告されている。さらに最近では、心臓や脳虚血、不整脈、虚血心臓における心筋収縮機能に対する化合物Ａの効果が明らかにされている。心臓肥大、線維症および肺高血圧についての式（Ｉ）のカウラン化合物または化合物Ａの効果を文書化した技術の研究はない。さらに、ホスホジエステラーゼ阻害剤またはＲＯＳスカベンジャーとして作用する式（Ｉ）のカウラン化合物を開示した従来技術はない。
【００２２】
本発明は、ＴＡＣがラットの心臓肥大および心筋リモデリングを誘発することを開示するものである。１）化合物Ａは、ＴＡＣの３週間後に、心臓肥大を有意に阻害することができ、２）化合物Ａは、細胞質のＣａ２＋が増加することなく、心機能を有意に改善することができ、電気生理学的リモデリングを有意に改善することができ、３）化合物Ａは、生体内での心筋線維症および生体外でのＴＧＦ−β１誘導線維芽細胞増殖を阻害することができ、４）化合物Ａは、肺血管のメディア肥大およびコラーゲンの産生を有意に阻害することが示されるＴＡＣの結果として、肺高血圧症を防止することができ、５）化合物Ａは、イソプロテレノールにより誘導される心筋の増加したサイズを有意に減少させることができ、６）化合物Ａは、ＰＥＤの阻害によるｃＧＭＰの上昇を介して作用し、７）化合物Ａの心臓保護作用は、追加の新規な機序を含むことが示されるＰＤＥ−５Ａ阻害剤シルデナフィルより優れている。８）化合物Ａはまた、繊維芽細胞または心筋細胞における２’３’サイクリックまたは３’５’サイクリック形成のいずれかでのｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方を変調することが見出された。
【００２３】
本発明は、化合物ＡがＴＡＣ誘発性心肥大および心筋拡張ならびに筋線維芽細胞の増殖の影響を低減することを開示するものである。心臓肥大の指標の一つである、心臓と体重の比（ＨＷ／ＢＷ）の有意な増加は、３週間のＴＡＣ群で観察された。ＨＷ／ＢＷの増加は、化合物Ａの投与を伴うＴＡＣにおいて大幅に減少した。ＨＷ／ＢＷの増加は、心筋細胞の断面において、３週間のＴＡＣラットがシャムラットと比較して７６％パーセント増の増加を伴うものであった。これは、収縮または拡張のいずれかの心臓機能の有意な改善を伴う、化合物Ａで処置した３週間のＴＡＣラットにおいて１０％だけ増加するものであった。心臓および心筋細胞肥大は、化合物Ａにより改善された。
【００２４】
肥大化と共通するのは、コラーゲン形成およびアクチンリモデリングである。ＴＡＣラットにおける十分に特徴付けられた組織構造の変化は、そのアクチン細胞骨格の動態、すなわち、Ｇ−アクチンよりもＦ−アクチン含有率が高いということである。ＴＡＣは、モノマー（Ｇ−アクチン）に対するポリマーの比（Ｆ−アクチン）を増加させるアクチンの極性形成を引き起こす。心室の圧力負荷もまた、間質性線維症、心臓のコラーゲン沈着の増加を引き起こす。
【００２５】
本発明は、化合物Ａの投与がＦ−アクチンレベルとコラーゲンの沈着を減少させることを開示するものである。また、本発明は、化合物Ａが上述したシルデナフィルの効果よりも効果的かつ強力であることを開示するものである。
【００２６】
線維症およびコラーゲン沈着の減少は、収縮と拡張の際に左心室の高い弾力性と低い硬度によって測定される血液ポンプとしての心臓の優れたパフォーマンスをもたらし、心筋コンプライアンスおよび収縮の増加をもたらすものである。
【００２７】
左心室の圧力と体積を同時に測定した。２つのパラメータは、前負荷または後負荷のいずれかの変化時の圧力と容積の関係を観察することにより導出することがでる。ＥＳＰＶＲは、収縮末期の圧力と容積の関係の勾配であり、収縮末期弾性体を表し、  ＥＤＰＶＲは、拡張末期の圧力と容積の関係の勾配であり、心臓の硬度を表す。ＴＡＣ後３または９週間の心臓肥大において、心臓のポンプ機能障害が有意なＥＳＰＶＲの減少およびＥＤＰＶＲの増加によって明らかとなった。本発明は、ＴＡＣラットにおける化合物Ａの投与がＥＳＰＶＲとＥＤＰＶＲの双方とも並びにシャム対照群ラットと比較して収縮および拡張機能の劣化を防止することを開示するものである。そのため、化合物Ａは、収縮時の正常な弾性を維持し、ＴＡＣラットのように高圧負荷を伴う拡張時の心臓の硬度を減少させるのに有用である。
【００２８】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、コラーゲン産生を仲介する、圧力負荷後の心筋線維症において重要な役割を果たしていることが実証されている。ｃＧＭＰのシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−βによって誘導される心臓線維症に対する重要な調節的役割を果たしている。
【００２９】
本発明は、化合物Ａが培養新生児ラット心臓線維芽細胞においてＴＧＦ−β誘導性増殖を防止することができることを開示するものである。さらに、本発明は、その抗肥大および抗線維化の役割に関連し、化合物Ａが心臓線維芽細胞に投与され、ｃＧＭＰレベルの有意な増加があったことを開示するものである。
【００３０】
さらに、本発明は、心臓線維症の促進剤として実証されているマイクロＲＮＡ２１が、虚血心の半影領域において、化合物Ａにより有意に減少したことを開示するものである。この変化は、マイクロＲＮＡ２１が同じ領域での線維症の有意な改善と一致する。化合物Ａのこの効果は、従来技術において報告されているものではない。
【００３１】
ＢＮＰは、肥大の重要な指標である。イソプロテレノール刺激に対する心筋細胞の肥大応答は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で実証されるようにＢＮＰのｍＲＮＡ発現、および、ウエスタンブロット法により示されるように、ＢＮＰタンパク質の増加を伴うものである。本発明は、化合物Ａの投与がＢＮＰの産生および心筋細胞におけるＢＮＰのｍＲＮＡ発現の両方の増加を大幅に減少させることができることを開示するものである。
【００３２】
ｃＧＭＰの増加は、ＢＮＰの刺激またはホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の阻害のいずれかの結果である得る。ＢＮＰが化合物Ａによって減少するため、化合物ＡによるｃＧＭＰの増強効果は、主としてＰＤＥの阻害によるものである。
【００３３】
ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの両方およびそれらの異性体が細胞内シグナル伝達経路における役割を果たしている可能性がある。ＨＰＬＣ−ＭＳ法を用いて、同時に異なる細胞によって産生されたｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの異性体を検出することができる。本発明は、化合物Ａの投与後、肥大心筋細胞、正常心筋細胞および線維芽細胞における３’５’ｃＧＭＰ、２’３’ｃＧＭＰ、３’５’ｃＡＭＰおよび、３’５’ｃＡＭＰレベルの有意な変化があったことを開示するものである。この変化は、化合物Ａを伴う培養時間の相違によって異なるものである。これらは、異なるｃＡＭＰまたはｃＧＭＰおよび異性体が、線維症、肥大および他の死亡の処置における化合物Ａの効果に関与することを示すものである。化合物Ａのこれらの効果は、従来技術において報告されているものではない。
【００３４】
本発明はまた、肺高血圧症の治療における化合物Ａの使用を開示するものである。ＴＡＣによって誘発される圧力の過負荷は、ラットにおける肺高血圧を誘導するための確立された方法の一つである。本発明は、上述と同様のＴＡＣ動物における肺高血圧症の損傷を実証した。中小（内径＜１００ｕｍ）肺動脈（直径＜１００ｕｍ）のいずれかにおいて内壁が肥厚した肺高血圧症ラットにおいて、かなりの肺血管リモデリングが明らかであった。本発明は、化合物Ａの投与が中小両方の動脈血管リモデリングを防止することを開示するものである。筋肥大の程度は、非筋肥大、部分的筋肥大、完全筋肥大に分類される。化合物Ａの投与後、肺高血圧症の改善を示す、非筋肥大の血管の数が増加した。この点において、化合物Ａは、シルデナフィルよりも効果的である。
【００３５】
本発明はまた、心臓肥大、線維症および心筋症および糖尿病における腎線維症の治療における化合物Ａの使用を開示するものである。
【００３６】
また、ミトコンドリア由来ＲＯＳは、シグナル伝達経路心臓肥大を調節するために、細胞内メッセンジャーとして機能することができる。ダオフ・ダイは、ミトコンドリアで直接生成されたＲＯＳがＧαｑ誘発性心臓肥大の中心的なメディエーターであるかもしれないことを報告した（ＤＡＩ  ＤＦ，  Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  Ｐ．  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ２０１１；７：９１７−９１８）。
【００３７】
本発明において、我々は、シルデナフィルのような古典的なＰＥＤ阻害剤は従来技術ではそのような効果が報告されていないながら、化合物Ａは、ＰＥＤの阻害に加えて、細胞質ゾルおよびミトコンドリアのいずれかでＲＯＳ（活性酸素種）を減少させることにより、心筋細胞肥大を抑制することができることを開示するものである。これは、肥大症および他の疾患の抑制において、シルデナフィルに対する化合物Ａの優位性を説明するものである。本発明は、従来技術で開示されているものとは異なる新規な機構を備えたＰＥＤ阻害剤としての化合物Ａの新しい使用を開示するものである。
【００３８】
本発明は、シルデナフィルが勃起不全のための第一線の製薬であるものの、化合物Ａが心臓肥大およびコラーゲン沈着ならびにｃＧＭＰ産生の刺激の抑制において、シルデナフィルよりも強力であることを示すものである。実施形態において、本発明は、化合物Ａの相対的に高用量での投与後の雄ラットおよび犬における長期的な陰茎勃起を開示するものである。本発明はまた、化合物Ａが勃起不全のために使用することができることを開示するものである。
【００３９】
本発明はまた、化合物Ａがアルツハイマー病の治療のために使用することができることを開示するものである。従来技術において、シルデナフィルによるｃＧＭＰのシグナル伝達経路の増強が報告されている（ＲＣ  Ｋｕｋｒｅｊａら、ｅｘｐ  ｃｌｉｎ  ｃａｒｄｉｏｌ  ２０１１；１６（４）：ｅ３０−ｅ３５）。我々の発明は、化合物ＡがｃＧＭＰの刺激においてシルデナフィルよりも強力であることを示すものである。本発明は、脳損傷ラットにおける、化合物Ａによる、化合物Ａの抗アストログリオーシスおよび抗瘢痕形成の効果を示すものである。本発明は、化合物Ａが神経変性疾患、アルツハイマー病などの認知症を予防するために用いることができることを開示するものである。
【００４０】
従来技術では、上述の化合物ＡまたはＢの治療効果が複数のメカニズムに関与し得ることが開示されている。Ｊｅｐｐｅｓｅｎ  ＰＢは、カリウムチャネルがインスリン分泌における化合物Ａの刺激効果に関与しないことを示したものの（Ｊｅｐｐｅｓｅｎ  ＰＢら、２０００）、Ｗａｎｇ  ＫＬは、化合物Ａの血圧降下作用が平滑筋細胞膜のカリウムチャネルに関与しうることを示唆した（Ｗａｎｇ  ＫＬら、２００４）。タンは、化合物ＡおよびＢが、カリウムＡＴＰチャンネルブロッカーである、５−ＯＨ−デクダノエートによって部分的にのみ遮断することができる虚血ミトコンドリアにおける保護の役割を果たしていることを開示した（Ｔａｎ、米国特許、１１／５９６，５４１，２００６）。したがって、従来技術においては、化合物ＡがＫＡＴＰチャネルと関連しているかどうか、およびどのように関連しているか、明らかにされていない。
【００４１】
本発明だけが、化合物Ａそれ自体が筋線維鞘またはミトコンドリアＫＡＴＰチャネルのいずれかに影響を及ぼさなかったことを開示するものである。代わりに、化合物Ａは、例えばピナシジルなどの既知のＫ  ＡＴＰチャネル開口薬およびＡＴＰの変化に対してより大きなＫＡＴＰチャネル応答を与える増感剤としてのみ作用するものである。
【００４２】
従来技術では、化合物Ａが、収縮性を強化し、および、虚血心筋を保護することができることが開示されている。しかし、すべての既知の心筋収縮力に影響を与える薬は、次には酸素の消費量を増やす、Ｃａ＋＋増加の拡大において心臓機能を強化するものである。したがって、心筋収縮力に影響を与える薬の使用は、ＥＣＧにおけるベースラインからのＳＴ波の下降または上昇によって示されるように、心臓の状態を悪化させうる。従来技術では、化合物Ａの心筋収縮力に影響を与える効果のみが開示されている。
【００４３】
本発明は、細胞質ゾルＣａ＋＋または酸素消費を増加させることなく、劣化し肥大した心臓における心機能を改善するために化合物Ａを使用することができる、選択的な強心薬の新規使用を開示するものである。さらに、肥大した心臓におけるＥＣＧを改善させる代わりに、ＥＣＧを悪化させるものではない。これは、化合物Ａが、心筋細胞の細胞質ゾルＣａ＋＋レベルを減少させる一方で、肥大心筋細胞内の各収縮中のＣａ＋＋過渡のピークのみを向上させることができることによるものである。この新しい発見は、化合物Ａを他の既知の伝統的なジギタリスなどの強心薬やエピネフリンなどのβアゴニストとは異なるものとするものである。
【００４４】
本発明はまた、モルモットからの心筋細胞において、化合物のＡが、ＱＴ延長セグメントおよびＱＴのばらつきの増加を低減することができ、さらに、長期の活動電位を防ぎ、静止電位を低減し、および、虚血および再灌流の結果としての抑制されたＨｅｒｇ（ｌｋｒ）電流（suppressed Herg (lkr) currents）を開示するものである。化合物Ａはまた、スカベンジャーとしてＲＯＳ（活性酸素種）を低減することができる。したがって、上記を伴う診断をしたクリニックにおけるＥＣＧ異常値の治療に使用すること、また、上述のメカニズムが関与しうる疾患または臨床診断法に使用することができる。
【００４５】
他の実施形態において、本発明は、化合物Ａがアストログリオーシスの阻害による後期または長期の脳損傷に対して有効であることを開示するものである。従来技術では、化合物Ａが阻害急性炎症およびアポトーシスによる２４時間以内の虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）脳損傷を保護することができることが報告されている（Ｘｕら、  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ２００８，  Ｖｏｌ．  ７４（８），  ｐｐ．  ８１６‐８２１）。
【００４６】
反応性アストログリオーシスは、さらなる神経の損傷を及ぼすＩ／Ｒ脳損傷の後期における一般的な病理学的プロセスである。また、それは、Ｉ／Ｒ脳損傷ラットに７日間連続して化合物Ａを与えた本発明において、アルツハイマー病などの神経変性疾患においても見られる。結果は、梗塞容積の減少、神経学的挙動および細胞形態の改善、ニューロンの生存および反応性アストログリオーシスの増強によって示されるように、化合物Ａが７日後の後期脳Ｉ／Ｒ脳損傷に対する保護効果を示したことを開示するものである。１回のまたは７回連続の化合物Ａの処置のいずれかの治療効果を分析し、Ｉ／Ｒ損傷の７日後において比較した。７回連続の化合物Ａの処置は、１回の処置と比較してＩ／Ｒ損傷を有意に改善した。活性化星状細胞の蓄積が、化合物Ａの連続投与によってＩ／Ｒ損傷が有意に阻害された後、７日目に確認された。
【００４７】
後期Ｉ／Ｒ損傷に対する化合物Ａの保護機構は、従来技術におけるその急性期とは異なるものである。後期における効用は、主に反応性アストログリオーシスの阻害を含むものである。上述したように、化合物Ａは、ＰＤＥの阻害によりｃＧＭＰを増加させることができる。既知の通り、化合物Ａの作用機序でありうる、ｃＧＭＰは、脳損傷によって誘発されるアストログリオーシスを阻害する。
【００４８】
式（Ｉ）の化合物Ｂは、化合物Ａと同様の効果を有するが、しばしば効力が弱い。
【００４９】
化合物ＡおよびＢを含む式（Ｉ）の化合物はまた、皮膚創傷治癒、コーナー回復、網膜損傷、肺線維症、肺気腫および肝硬変における瘢痕組織の形成を低減するなどの線維症またはコラーゲンの過剰生成に関連する他の疾患の治療に使用することができる。
【００５０】
化合物ＡおよびＢを含む式（Ｉ）の化合物は、塩基性金属（例えば、ナトリウム）およびハロゲンのような他の物質と医薬的に許容される塩を形成することができる。これらは、医薬組成物を構成するために医薬担体と結合させることができる。式（Ｉ）およびその医薬組成物の化合物は、経口、静脈注射、吸入、または他の経路により投与されることができるし、静脈および動脈へカテーテルを介して投与することができる。
【００５１】
他の実施形態において、ナトリウム化合物Ａは、圧縮空気（ＰＡＲＩネブライザー装置）によって動力を与えられたエアロゾライザーに接続された容器中の滅菌生理食塩水に溶解した。より良い肺沈着のため、エアロゾル粒子の大きさが製薬基準（ＦＤＡまたはＥＵ）を満たしていることを確認するために、生体内でインパクター（ＮＧＩ）を用いてエアロゾル液滴を評価した。モルモットを麻酔し、化合物Ａのエアロゾル噴霧液を、気管内チューブを経由して放出し、肺に吸入させた。肺機能、線維症または肺の炎症に対する化合物Ａの治療効果は、動物の傷付処理の前後において調査された。従来技術では、化合物Ａは、吸入薬として使用されていない。
【００５２】
さらに、本発明は、共溶媒技術を用いたナトリウム化合物Ａの液体製剤である、医療に適したナトリウム化合物Ａの静脈注射製剤を開示するものである。静脈内（ｉ．ｖ．）投与は、迅速な治療効果を発揮する。しかしながら、化合物Ａのようなテルペンの静脈内投与は、疎水性の炭化水素骨格を含むそれらの化学構造のためにそれらの低い水溶解度によって非常に限定される。静脈内投与のための十分な安定性および許容される安全性を伴う化合物Ａの液体医薬組成物は、従来技術において報告されていない。医療目的で、医薬注射製剤を、薬物当局の規制に従ったその毒性、過酷な条件下での溶解力および安定性を伴う適合性、ならびに、薬物動態に基づく厳格な試験に供するものである。化合物Ａの医療用として適した注射可能な医薬製剤は、従来技術において、開発されていない。本発明は、初めて、生理学的に許容されるｐＨ、希釈との相溶性、十分な物理的化学的安定性および生物学的安全性が証明されたプロファイルを有する化合物Ａの医薬製剤を発明したものである。
【００５３】
界面活性剤の使用、ナノ粒子系における疎水性化合物の結合（例えば、リポソーム、ミセルおよびマイクロエマルジョン）およびシクロデキストリンを含む、疎水性化合物のための可溶化方法の種類がある。しかし、界面活性剤は、その毒性のため、静脈内投与において非常に制限されており、ナノ微粒子系は、臨床応用において難解であることが知られている。
【００５４】
本発明においては、静脈投与のためのナトリウム化合物Ａの液体製剤は、ｐＨ値の調整および製薬業界や診療所において広く採用されている有機溶媒を少量使用することによって開発されたものである。
【００５５】
静脈内投与向けとしてＦＤＡによってすでに承認された唯一の有機溶媒が、化合物Ａの溶解度を増加させるために使用される。いくつかの溶媒の広範なスクリーニングの後、本発明は、ｐＨ１０．０の生理食塩水において、２５％のエタノールおよび２０％のプロピレングリコール（２％、ｗ／ｗ）（ナトリウム化合物Ａ）からなる化合物Ａの最適化された溶媒系を開示するものである。ナトリウム化合物Ａは、２０ｍｇまたは５０ｍｇ／ｍＬの最高濃度で、溶質の使用を最小限にし、副作用を避ける本発明の製剤によく可溶化されており、本発明のこの最適化された製剤は、高湿度および高温条件での加速試験中において結晶化または分解することなく、少なくとも９０または３０日間、物理化学的に安定であった。オートクレーブの滅菌は、静脈注射用製剤の安全性を確保するために行われ、ナトリウム化合物Ａは滅菌工程において適合的かつ安定であった。
【００５６】
この注射可能な製剤は、低温および高温での貯蔵中に安定であることが示された。ごくわずかな量の不純物が過酷な条件を含む加速および長期試験中に生成され、そして、不純物とその内容は、ＦＤＡガイドラインによれば、許容される範囲内であった。化合物Ａの溶血作用と細胞適合性は、本発明において検査されている。製剤は、９．１％（ｖ／ｖ）まで３時間、溶血作用を、また、Ｈ２Ｃ９細胞において５０μｇ／ｍｌまで、有意な細胞毒性のいずれも誘導しなかった。生体内研究では、有意な急性中毒は、製剤の過剰な量投与されたラットにおいて、観察されなかった。これらの試験は、本発明の注射可能な製剤が薬学的に許容される安全性を有することを示すものである。
【００５７】
本発明による式の化合物の薬学的に許容される塩は、従来の薬学的に許容される無機または有機酸と形成されるものを含み、例えば、ナトリウム、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸二水素、メタン、臭化物、メチル硫酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、グリコネート、グルコン酸、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸菌、ピルビンイセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩またはｐ−トルエンスルホン酸塩である。
【００５８】
上記が本発明の一般的な説明である。これらは当業者により行うことができるように、本発明にかかる方法および技術は、以下の実施例により、より好ましく説明されるものである。
【００５９】
本発明の方法および実施形態は、以下の実施例において詳細に提供されるものである。
例
【００６０】
さらに、本発明の目的を達成するために使用される技術を説明するために、本発明における医薬およびカウラン化合物の治療上の有用性を測定および特定することに関する詳細な方法、技法、手順および特別な特徴を以下に記載する。
【００６１】
実施例は、本発明の実施可能性をサポートするため、および、本発明で使用される動物モデルを検証するための実施方法および結果を提供するものである。適切なコントロールと統計テストは、本発明のすべての実施に使用されるものである。以下の実施例は、本発明の説明であり、これに制限されるものではない。実施例は、式（Ｉ）の化合物におけるいくつかのカウラン化合物の治療的使用を選定および決定するために利用される方法および技法を説明するものである。式（Ｉ）の他の化合物の治療的使用もまた同様に決定することができる。
実施材料
【００６２】
動物：成体雄のウィスターラット、体重２００グラム±２０グラム、９週齢、両性別とも。各ラットは、一定の温度と湿度、厳格な暗光管理下および標準的な実験用食を自由に与えられる、標準的な条件下において、個々のケージに収容される。化学：化合物Ａ（エント−１７−ノルカウラン−１６−オキソ−１８−オイック酸、分子式はＣ ２０ Ｈ ４０ Ｏ ３、分子量は３１８．５）を、ステビオサイドから酸加水分解、結晶化および精製を経て製造する。化合物Ａのナトリウム塩は、水酸化ナトリウムまたは他のナトリウム含有塩基を添加することによって形成することができる。化合物Ａの構造は、従来から公表されているデータと整合する、推論分析およびＮＭＲによって確認される。化合物Ａのナトリウム塩は、高速液体クロマトグラフィーによって９９％以上の純度であると測定された化合物Ａによって形成される。化合物Ｂ（エント−１３−ヒドロキシカウル−１６−エン−１８‐オイック酸）は、ステビオサイドの酸化、加水分解、酸性化、抽出、精製および結晶化を含む一連の工程を経て製造される。化合物Ｂの構造は、従来から公表されているデータと整合する、推論分析およびＮＭＲによって確認される（Ｍｏｓｅｔｔｉｇ  Ｅ．ら、１９６３）。高速液体クロマトグラフィーによって測定された化合物Ｂの純度は９９％以上である。試験化合物の投与：静脈内または腹腔内注射または経口。投与量：化合物Ａ：０．５ｍｇ／ｋｇ  から１０ｍｇ／ｋｇ（またはそのナトリウム塩）、化合物Ｂ：２ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ。
実験方法
【００６３】
心臓肥大（ＴＡＣ）動物モデルおよび実験プロトコルの確立
【００６４】
腕頭動脈と左頸動脈の間にＴＡＣを、３週間（３週間ＴＡＣ）または９週間（９週ＴＡＣ）、圧力の過負荷を誘導するために行った。シャム対照群動物に同様の手術を行ったが、大動脈収縮はない。すべての外科的処置は、３％ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射（腹腔内４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した動物に行われた。手術期間中、ラットに、ローデントベンチレーター（ハーバード社製、ホリストン、ＭＡ、ＵＳＡ）を挿管し、換気した。
【００６５】
３週間および９週間のＴＡＣ下にある両方のラットをランダムに、ＴＡＣ媒体対照群、化合物Ａ、低い（ＴＡＣ＋化合物Ａ（Ｌ）、１ｍｇ／ｋｇ／日）、中間（ＴＡＣ＋化合物Ａ（Ｍ）、２ｍｇ／ｋｇ／日）、高い（ＴＡＣ＋化合物Ａ（Ｈ）、８ｍｇ／ｋｇ／日）を含む、５グループ（ｎ＝８〜１０匹）に分け、それぞれのグループに投薬し、および、陽性対照グループとして、シルデナフィル（ＴＡＣ＋シル、７０ｍｇ／ｋｇ／日）を設けた。シャム対照群は、すべて媒体の処置がなされた。ＴＡＣ処置による急性および慢性の死亡率は５％未満であった。治療グループは、生理食塩水および同量の有機溶媒（１：１、０．５ｍｌ）および蒸留水に溶解したシルデナフィルの混合物に溶解した化合物Ａのナトリウム塩を胃内投与された。すべての薬および媒体の投与は、手術後３日間、計画通りに一日に二回与えられた。動物は手術後３週目および９週目に適切に検査された。観察期間の終了および生体内での血行動態測定後、全ての動物を犠牲にし、さらなる分析のために心臓を外植した。
【００６６】
心臓の動的パラメータの測定
【００６７】
心臓血行力学的分析は、圧力−容積（ＰＶ）カテーテルによって行われた。ラットに麻酔をかけ、温暖パッド（３７℃）上に配置した。気管開口術を受けた、ラットを、その後、室内空気を使用して、一回の呼吸量が４〜６ミリリットル／２００グラム、１分あたり７０回の呼吸で、正圧を使用して呼吸させた。右内頸動脈を特定し、頭側連結した。４電極の圧力−容積カテーテル（モデルＳＰＲ−８３８、ミラーインスツルメンツ社）を開胸せずに右頸動脈内に進めた後、安定したＰＶループが得られるまで左心室内に進めた。１０から１５分間の信号の安定化の後、ベースラインＰＶループは、定常状態で記録された。腹部は、その後、下側の大静脈および門脈を特定するために開腹された。大静脈閉塞時の前負荷は、綿棒で下側の大静脈の圧迫により変化した。データ収集時において、小動物人工呼吸器は、肺の動きによる不自然な結果を避けるために、５秒間停止した。データが定常状態の条件下で前負荷減少中に記録された後、並列コンダクタンス値は、４０μｌの高張食塩水（３０％）を右頸静脈に注入することにより得た。絶対容積に対する相対容積単位コンダクタンス信号からのキャリブレーションは、前記方法を用いて行った。生体内の左心室機能の測定時に、各動物の末梢抵抗の変化を調べた。縦鼠径部切開部を介して、圧力変換器に接続されたポリエチレン動脈カテーテル（ＰＥ１０）を、逆行性大腿動脈を介して遠位腹大動脈に挿入した。データは、ＰｏｗｅｒＬａｂ（登録商標）システムの別々のチャネルに記録された。カテーテルに血液凝固を防ぐためにヘパリン生理食塩水（１００Ｕ／ｍｌ）を充填した。
【００６８】
組織学研究
【００６９】
ラットの心臓の組織切片を１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、３ｍｍの連続切片に切断し、次いでヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ピクロシリウスレッドまたはファロイジンで染色した。ニコンシステムおよびツァイスの共焦点顕微鏡が、デジタル画像を記録するために使用された。Ｈ＆Ｅでの染色は、細胞の大きさを評価するためであり、ピクロシリウスレッド（シグマＣＡ）での染色は、標準的な手順を用いて線維症を試験するためであり、Ｆ−アクチンの部分は、ファロイジンで染色された。観察者が組織起源に関して盲検で、我々は、コンピュータ支援画像解析（イメージプロプラスソフトウェア）を用いて断面セル領域および間質コラーゲン画分を測定ないし究明した。少なくとも４〜５の異なる心臓が、分析のために定量化された。
【００７０】
心臓線維芽細胞の単離および培養
【００７１】
前述のとおり、新生児ラット心臓線維芽細胞が、１−２日齢のＳＤラットから単離された。簡潔に言えば、新生児１−２日齢のＳＤラットからの心臓を氷上で細分化し、細胞を３７℃でトリプシンでの培養により単離した。非心筋細胞は、差別的メッキ前処理により心筋細胞から分離した後、心筋細胞を培養皿に播種した線維芽細胞を用いて除去した。細胞は、０．０５％トリプシン溶液を使用して、３日後に継代した。細胞を、３７℃に維持し、５％のＣＯ ２条件下で、５％ウシ胎児血清を用いたＤＥＭＥ／Ｆ１２培地中で培養した。
【００７２】
細胞増殖
【００７３】
培養中の心臓線維芽細胞の生存率を、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）法を用いて評価した。この評価は、生細胞におけるＭＴＴ基質（黄色から青）を低減する活性ミトコンドリア酵素の能力を測定する。単離された一次心臓線維芽細胞を９６ウェルプレート上に無血清条件で播種した。培養の２４時間後、０．５ミリグラム／ｍｌのＭＴＴ基質を添加し、細胞をさらに４時間培養し、次いで、室温で１０分間、ＤＭＳＯで可溶化した。吸光度を４６０ｎｍで測定した。
【００７４】
統計分析
【００７５】
全てのデータは、平均±ＳＥＭとして示される。複数グループ間の差は、フィッシャーテストの前に、分散分析（一元配置分散分析）により比較される。すべてのＰ値は、両側ｐ値である。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると考えられる。
【実施例１】
【００７６】
本実施例は、ＴＡＣ誘発性心臓肥大および心筋細胞膨張の減少に対する化合物Ａの効果を説明するものである。
【００７７】
成体ウィスターラットを３週間ＴＡＣに付し、それぞれ、媒体、化合物Ａまたはシルデナフィルが投与された。心臓肥大の指標である、心臓体重比（ＨＷ／ＢＷ）の有意な増加は、心臓の断面積の増加（８１．６％の増加、Ｐ＜０．００１）を伴い、３週間ＴＡＣグループ（３４．６％の増加、Ｐ＜０．００１）で観察された。心臓および筋細胞肥大は、３週間ＴＡＣグループ（表１）において、化合物Ａまたはシルデナフィルによって改善した。心筋細胞の断面積の増加は、それぞれ、化合物Ａによって１５．１（１ｍｇ／ｋｇ）および４．１％（２ｍｇ／ｋｇ）、シルデナフィルによって１６．３％（７０ｍｇ／ｋｇ）、減少した。化合物Ａは、シルデナフィルより強力かつ有効である。
【００７８】
表１．ＴＡＣラットの体重に対する心臓重量における化合物Ａの効果（ｎ＝８）
2019504819.tif 000006
【実施例２】
【００７９】
本実施例では、アクチンリモデリングおよび線維形成を阻害する化合物Ａの効果について説明する。
【００８０】
肥大に重要ないくつかの転写因子は、遊離Ｇ−アクチンおよびポリマーＦ−アクチンにより制御されるアクチンダイナミクスに影響を及ぼす。Ｇ−アクチンよりもＦ−アクチン含量が高いことは、肥大経路の活性化の重要な結果である。心筋Ｆ−アクチンのレベルはＦＩＴＣファロイジン染色により測定された。ＴＡＣの代表的な免疫蛍光画像は、化合物Ａ（８ｍｇ／ｋｇ／日）またはシルデナフィル（７０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与によって対照条件に戻った、９週間後にＦアクチンの増感緑色染色を示した。ＴＡＣは、Ｆアクチンのレベルを増加させ、よって、アクチンダイナミクスを誘導した。化合物Ａおよびシルデナフィルの両方は、Ｆアクチンの発現を減少し、Ｆ／Ｇアクチンのバランスを維持することができる。
【００８１】
化合物ＡがＴＡＣ誘発性心臓線維症を減衰させるかどうかの測定にあたり、左心室における間質コラーゲン分布を検出するため、心臓組織をピクロシリウスレッドで染色した。３週間および９週間のＴＡＣグループの両方に、ＴＡＣは、有意な間質性線維症（Ｐ  ＜０．０５）を誘導した。コラーゲン含有量は、シャム対照グループと比較して、３週間および９週間ＴＡＣ対照グループで、それぞれ、５．７倍および７．５倍、増加した。化合物Ａ（８ｍｇ／ｋｇ／日）の投与は、３週間および９週間のＴＡＣグループにおける間質性線維症を、それぞれ、５８．２％および８０．８％、減少させた。シルデナフィルは、化合物Ａと比較して、心臓線維症の阻害効果が少ないことが示された。
【実施例３】
【００８２】
本実施例では、ｃＧＭＰの生成における化合物Ａの効果について説明する。
【００８３】
ｃＧＭＰの測定
【００８４】
媒体、化合物Ａまたはシルデナフィルの投与後の新生児ラットの線維芽細胞におけるｃＧＭＰレベルは、ＥＬＩＳＡキットを用い、その製造者の指示書に従い測定した。
静止状態の細胞は、異なる用量の化合物Ａ（１Ｍ、１０Ｍ）またはシルデナフィル（１００Ｍ）で３時間、培養された。処理後、細胞を０．１Ｎの塩化水素で溶解し、ｃＧＭＰ  ＥＬＩＳＡ分析を実施した。結果は以下の表に記載の通りである。
【００８５】
表１．化合物ＡおよびシルデナフィルによるｃＧＭＰの刺激生成（対照のパーセント）
2019504819.tif 000007
【実施例４】
【００８６】
本実施例では、化合物Ａが交感神経活動を抑制することによりＴＡＣによって損なわれた心臓自律神経バランスを安定させることについて説明するものである。
【００８７】
心電図のモニタリング
【００８８】
ＴＡＣ手術後３または９週間のラットをペントバルビタールナトリウム（腹腔、４０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。心電図（ＥＣＧ）をＩＩアイントホーフェン誘導を用いて測定した。３つのステンレス２２Ｇ針電極は、右前脚（Ｇ１）と左前脚（ＧＮＤ）、そして左後脚（Ｇ２）の差し込みに配置した。従って、１０分のＥＣＧの記録は、他の手順の前に、２ｋＨｚでデジタルに取得した。心拍変動スペクトル解析は、高速フーリエ変換を用いて行われた。振動成分は、非常に低い周波数（ＶＬＦ；＜０．０４Ｈｚ）、低周波（ＬＦ；０．０４から０．６Ｈｚ）、または高周波（ＨＦ；０．６から２．５Ｈｚ）の帯域に分離した。ＨＲＶ成分は、総電力パーセンテージとＶＬＦ成分の差分として正規化された単位（ｎ．ｕ．）で発現した。遠心性迷走副交感神経活性は、ＨＦ成分の主要な原因であり、交感神経と迷走神経の影響はＬＦ成分の原因となっており、従って、ＬＦのＨＦに対する比率は、通常、交感迷走神経バランスの尺度として用いられる。
【００８９】
心拍変動（ＨＲＶ）のパラメータは、心臓自律神経バランスの指標である。ＲＲ変動のパワースペクトル解析では、９週間ＴＡＣに曝されたラットは、ＨＲＶの相対スペクトル成分の分布において著しい変化を見せていることが示された。ＬＦ／ＨＦ比は、シャム対照と比較して際立って高かったが、化合物Ａ投与（Ｐ＜０．０１）によりＬＦ／ＨＦ比が正常に戻った。シルデナフィル投与では、ＬＦ／ＨＦ比が減少しなかった。本発明は、シルデナフィルでは効果がなかった交感神経活動の上昇抑制により心臓の自律神経バランスを回復するための新規な化合物Ａの使用を開示するものである。
【実施例５】
【００９０】
本実施例は、化合物ＡがＴＡＣにより誘導されたＥＣＧの変化を改善することについて説明するものである。
【００９１】
我々は、さらに心臓肥大における電気生理学的な変化における化合物Ａの効果を研究した。９週間ＴＡＣに曝されたラットは、より長いＱＲＳ期間およびより高いＲ振幅（Ｐ＜０．０５）を有した。化合物Ａまたはシルデナフィル投与後、ＱＲＳ期間とＲの振幅が正常に推移した。９週間後、心臓の不整脈の高リスクを示す、ＴＡＣ手術により誘導されたＱＴ分散（Ｐ＜０．０１）およびＱＴｃ分散（Ｐ＜０．０１）の大幅な増加があった。化合物Ａの投与ではこのような好転する効果があったが、シルデナフィルの投与は同様の保護効果を示さなかった。
【実施例６】
【００９２】
本実施例は、化合物Ａが心筋における心機能を改善し、心臓リモデリング、線維症および糖尿病損傷による炎症を防止することを説明するものである。
【００９３】
糖尿病の糖尿病性心筋症（ＤＣＭ）は、心筋の損傷を誘発した。ＤＣＭは、炎症、酸化ストレスおよび線維症のマーカーの発生に関連する変化を伴い、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）によって誘導される。ウィスターラットを、ランダムにグループＡ（正常対照）、グループＢ（糖尿病）、グループＣ（ＤＭ／ＳＴＶＮａ）およびグループＤ（ＤＭ／ＴＭＺ、トリメタジディン投与）の４つのグループに分けた。１２〜１６週間後、左心室機能を、圧力−容積システムにより測定した。心臓組織を、ヘマトキシリンおよびエオシン、シリウスレッド染色によって、組織学研究ならびに酸化ストレス分析のために調製した。酸化ストレス、炎症、および線維化マーカーは、分子生物学的手法により評価した。すべてのデータは、形態計測的に測定して統計学的に分析した。投与されたすべてのグループは、対照群と比べて、血糖値の有意な増加およびインスリン値の減少を示した。糖尿病グループは、心筋細胞肥大、炎症、間質性線維症、コラーゲンの体積分率の有意な増加、ＴＧＦβおよび心臓組織における酸化ストレスを示し、正常対照群と比較してスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ−２）の発現および活性が減少した。グループＣおよびＤにおける、化合物ＡならびにＴＭＺの投与により有意に阻害された心臓肥大、相対心臓重量および抗酸化活性は、対照群と同様であった。しかし、糖尿病グループ（Ｂ）と比べると、グループＢおよびＤにおける血糖値およびインスリン値に有意な変化は見られなかった。心機能はグループＢと比べ、グループＢとＤでは有意に改善された。
【００９４】
本発明は、化合物Ａが糖尿病により誘導される心臓損傷、心臓リモデリングおよび線維症を防ぐとともに、糖尿病による心筋の心機能を改善することができ、これらの効果がグルコースまたはインスリンのいずれの変化にも関連しないことを開示するものである。
【実施例７】
【００９５】
本実施例は、肺高血圧症の治療における化合物Ａの効果を説明するものである。
【００９６】
圧力過負荷誘発性肺高血圧症は、雄のウィスターラット（２００±２０グラム体重）における横大動脈狭窄によって誘導される。シャムラットを対照として用意した。化合物Ａの投与（毎日胃内洗浄し、２または４ｍｇ／ｋｇ体重）を、大動脈狭窄の３日後に開始し、９週間続けた。９週間後、動物を屠殺し、肺を固定し、パラフィン包埋し、分割し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。平均肉厚の盲検立体的解析と肺動脈血管の血管筋肉化を行った。コラーゲンＩは、免疫蛍光染色によって検証し、共焦点で可視化した。
結果
【００９７】
１）肺血管リモデリング
【００９８】
多量の肺血管リモデリングが、小（内径＜１００ｕｍ）、中肺動脈（直径＜１００ｕｍ）が内壁肥厚化した肺高血圧ラットにおいて明らかであった。化合物Ａは、中小動脈の血管リモデリングを防いだのである。
【００９９】
表１．内径＜１００ｕｍの肺動脈の平均血管壁の厚さの比較（ｘ±ＳＤ，ｎ＝３）
2019504819.tif 000008
注：＊＊シャムグループと比較してＰ＜０．０１。  ＃＃ ＴＡＣグループと比較してＰ＜０．０１。  ＆＆ シルデナフィルグループと比較してＰ＜０．０１。
【０１００】
表２．内径＞１００ｕｍ肺動脈の平均血管壁の厚さの比較（ｘ±ＳＤ，ｎ＝３）
2019504819.tif 000009
注：＊ シャムグループと比較してＰ＜０．０５。  ＃＃ ＴＡＣグループと比較してＰ＜０．０１。  ＆＆ シルデナフィルグループと比較してＰ＜０．０１。
【０１０１】
２）血管筋肥大
【０１０２】
肺血管の直径による、血管筋肥大、非筋肥大、部分的筋肥大および完全筋肥大の異なる程度がある。化合物Ａの投与後、肺高血圧症の改善を示す、非筋肥大血管の数が増加した。化合物Ａは、シルデナフィルグループに比べて、優位により強力で効果的である。
【０１０３】
表３．ラットの５つのグループ内における血管筋肥大の異なる程度の割合（ｘ±ＳＤ，ｎ＝３）
2019504819.tif 000010
注：＊ シャムグループと比較してｐ＜０．０５。  ＃ ＴＡＣグループと比較してｐ＜０．０５。  ＆ シルデナフィルグループと比較してｐ＜０．０５。
【０１０４】
３）コラーゲンＩの免疫蛍光染色
【０１０５】
肺のコラーゲンＩの発現は、シャムグループのそれと比較して、ＴＡＣグループの肺組織の顕著な増加を識別するコラーゲンＩの蛍光イメージングによって評価される。化合物治Ａの投与により、コラーゲンＩの生成は減少した。
【０１０６】
表４．異なるグループにおけるコラーゲンＩの蛍光強度
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月10日(2018.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象疾患の治療又は予防のための医薬であって、前記対象疾患は、心筋症、心臓肥大、肺高血圧症、正常組織の線維症リモデリング及びそれらに関連する他の疾患のいずれかであり、
前記医薬は、有効成分として、下記式（１）で示されるカウラン化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬。
【化１】
2019504819.tif 000014
（１）
式（１）中、Ｒ２は、カルボキシル基、カルボキシレート基、アルデヒド基、メチル−ヒドロキシル基、メチルエステル基、アシルメチル基またはハロゲン化アシル基のいずれかであり、
Ｒ７は、ヒドロキシ基、メチル基、メチル−ヒドロキシル基またはメチルエーテル基のいずれかであり、
Ｒ９は、メチレンまたは酸素である。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬であって、
前記カウラン化合物は、下記式（ＩＩ）で示される化合物Ａ又は下記式（ＩＩＩ）で示される化合物Ｂである、医薬。
2019504819.tif 000015
【請求項３】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、心臓肥大であり、
前記心臓肥大は、心筋重量の増加、心筋のサイズの増加、交感神経の活動の増加、筋線維芽細胞の過剰生産、コラーゲンの過剰生産およびＢ型ナトリウム利尿ペプチドの過剰生産である、医薬。
【請求項４】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、心臓肥大であり、
前記心臓肥大は、心臓疾患の結果である、医薬。
【請求項５】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、肺高血圧症であり、
前記肺高血圧症は、肺動脈疾患である、医薬。
【請求項６】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、肺高血圧症であり、
前記肺高血圧症は、高血圧症、低酸素症または肺疾患の結果である、医薬。
【請求項７】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、線維症リモデリングであり、
前記線維症リモデリングは、線維芽細胞の増加、および、細胞外マトリックスまたはコラーゲンの過剰発現である、医薬。
【請求項８】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、線維症リモデリングであり、
前記線維症リモデリングは、肝臓又は腎臓硬変、網膜線維症、皮膚、腸、脳および他の器官、血管または冠状動脈形成術による手術または外傷からの創傷治癒を含む、医薬。
【請求項９】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、前記他の関連疾患であり、
当該他の関連疾患は、勃起機能不全である、医薬。
【請求項１０】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、前記他の関連疾患であり、
当該他の関連疾患は、神経変性疾患又は代謝疾患である、請求項１に記載の医薬。
【請求項１１】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、前記他の関連疾患であり、
当該他の関連疾患は、長いＱＴセグメントを有する異常ＥＣＧ、または、増加したＱＴ変化を伴う異常なＥＣＧである、医薬。
【請求項１２】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、前記他の関連疾患であり、
当該他の関連疾患は、増強された心臓交感神経活動である、医薬。
【請求項１３】
請求項２に記載の医薬であって、
前記対象疾患は、前記他の関連疾患であり、
当該他の関連疾患は、アストログリオーシスの活性化、アルツハイマー病又は後期脳損傷である、医薬。
【国際調査報告】
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