(57)【要約】  効率的で正確な膀胱がん検出のための方法が記載される。とりわけ、該方法は、患者からの対となる頬側及び尿サンプルを用いて、膀胱がんマーカーのマイクロサテライト解析を、ヘテロ接合性の喪失又はマイクロサテライト不安定性の存在を決定するために用いる。いくつかのがんマーカーパネルにおいて、ヘテロ接合性の喪失又はマイクロサテライト不安定性が２つのマーカーについて検出されると、膀胱がんの表示である可能性がある。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中のヘテロ接合性の喪失を検出する方法であって、
ａ）膀胱サンプル及び対になる対照サンプルからのマイクロサテライトマーカーのセットを増幅して増幅生成物のセットを生成するステップであって、該マーカーのセットが、ＦＧＡ、Ｄ９Ｓ７４７、ＭＢＰ、Ｄ９Ｓ１６２、ＴＨＯ１、ＩＦＮ−Ａ、Ｄ２１Ｓ１２４５及びＤ２０Ｓ４８を含むステップと、
ｂ）増幅生成物を検出するステップと、
ｃ）膀胱サンプルからの増幅生成物と対になる対照サンプルからの増幅生成物を比較するステップと、
ｄ）膀胱サンプル中のマーカーのすべてにヘテロ接合性の喪失が存在するか否かを決定するステップを含む、方法。
【請求項２】
マーカーセットの増幅が少なくとも２つのマルチプレックス増幅反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マーカーセットの増幅が３つのマルチプレックス増幅反応を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１のマルチプレックス増幅反応のテンプレートが、ＦＧＡ及びＤ９Ｓ７４７マーカーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第２のマルチプレックス増幅反応のテンプレートが、Ｄ９１６２、ＭＢＰ、ＩＦＮ−Ａ及びＴＨＯ１マーカーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第３のマルチプレックス増幅反応のテンプレートが、Ｄ２１Ｓ１２４５及びＤ２０Ｓ４８マーカーを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
各マーカーがプライマー対を用いて増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
各プライマー対の１つのプライマーが蛍光色素を用いて標識される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標識のためのそれぞれの蛍光色素が、異なる最大蛍光発光波長を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子解析装置を用いて、増幅生成物を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子解析装置がアガロースゲルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子解析装置がキャピラリー電気泳動を用いて増幅生成物を分離し、ＣＣＤカメラを用いて該生成物からの蛍光発光を検出する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
８つのマーカーの内２つについてのヘテロ接合性の喪失が、膀胱がんを表示する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
膀胱サンプルが尿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
膀胱サンプルが、膀胱生検材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
対になる対照サンプルが、血液、血清、頬側細胞、毛嚢、唾液、皮脂、皮膚、汗、又は涙である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
対になる対照サンプルが頬側細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
マイクロサテライトマーカーのセットが更に、Ｄ４Ｓ２４３、Ｄ１７Ｓ６５４、Ｄ１７Ｓ６９５、Ｄ１６Ｓ３１０、Ｄ９Ｓ１７１及びＤ１６Ｓ４７６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
マーカーセットの増幅が、３つのマルチプレックス増幅反応を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１のマルチプレックス反応が、Ｄ４Ｓ２４３、ＦＧＡ、Ｄ９Ｓ７４７、Ｄ１７Ｓ６５４及びＤ１７Ｓ６９５マーカーを増幅する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第２のマルチプレックス反応が、Ｄ９１６２、ＭＢＰ、ＩＦＮ−Ａ、ＴＨＯ１及びＤ１６Ｓ３１０マーカーを増幅する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第３のマルチプレックス反応が、Ｄ２１Ｓ１２４５、Ｄ２０Ｓ４８、Ｄ９Ｓ１７１及びＤ１６Ｓ４７６マーカーを増幅する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
核酸配列ＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧを含むプライマー；
核酸配列ＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧを含むプライマー；
核酸配列ＧＣＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣを含むプライマー；
核酸配列ＣＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴを含むプライマー；
核酸配列ＧＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＴＴＡＧＧＧを含むプライマー；
核酸配列ＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＣを含むプライマー；
核酸配列ＧＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴを含むプライマー；
核酸配列ＡＴＣＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣを含むプライマー；
核酸配列ＡＧＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴを含むプライマー；
核酸配列ＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴを含むプライマー；
核酸配列ＴＧＣＧＣＧＴＴＡＡＧＴＴＡＡＴＴＧＧＴＴを含むプライマー；
核酸配列ＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴを含むプライマー；
核酸配列ＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＣＡＴＧＡＡＧＧＡを含むプライマー；
核酸配列ＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡを含むプライマー；
核酸配列ＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧを含むプライマー；  
核酸配列ＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧを含むプライマー；及び
該プライマーのためのパッケージングを含む、キット。
【請求項２４】
核酸配列ＴＣＡＧＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＣＡを含むプライマー；
核酸配列ＴＡＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴを含むプライマー；
核酸配列ＡＣＣＴＡＧＧＣＣＡＴＧＴＴＣＡＣＡＧＣを含むプライマー；
核酸配列ＧＡＧＣＡＧＡＡＴＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＧを含むプライマー；
核酸配列ＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴを含むプライマー；
核酸配列ＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＡＧＴＣを含むプライマー；
核酸配列ＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴを含むプライマー；
核酸配列ＡＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＴＴＡＴＣＣを含むプライマー；
核酸配列ＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＡＣＡを含むプライマー；
核酸配列ＧＡＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＡを含むプライマー；
核酸配列ＧＧＣＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＣＣを含むプライマー；  
核酸配列ＧＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＣＣＣＴＡＴＣＴＧを含むプライマー；及び、
該プライマーのためのパッケージングを更に含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
核酸配列ＧＡＣＡＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＴＧＧを含むプライマー；
核酸配列ＣＴＴＣＴＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＧを含むプライマー；
核酸配列ＧＣＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣを含むプライマー；  
核酸配列ＣＡＧＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴを含むプライマー；及び、該プライマーのためのパッケージングを含む、キット。
【請求項２６】
核酸配列ＧＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＧＧＴＴＡＧＧＧを含むプライマー；
核酸配列ＴＣＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＣを含むプライマー；
核酸配列ＧＧＡＣＣＴＣＧＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴを含むプライマー；
核酸配列ＡＴＣＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＴＣＣを含むプライマー；
核酸配列ＡＧＧＣＴＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＴを含むプライマー；
核酸配列ＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴを含むプライマー；
核酸配列ＴＧＣＧＣＧＴＴＡＡＧＴＴＡＡＴＴＧＧＴＴを含むプライマー；
核酸配列ＧＴＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＣＣＡＣＴを含むプライマー；及び、
該プライマーのためのパッケージングを含む、キット。
【請求項２７】
核酸配列ＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＡＣＡＣＡＴＧＡＡＧＧＡを含むプライマー；
核酸配列ＴＴＧＴＴＧＡＧＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＣＡを含むプライマー；
核酸配列ＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧを含むプライマー；  
核酸配列ＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧを含むプライマー；及び、
該プライマーのためのパッケージングを含む、キット。
【請求項２８】
対象中の膀胱がんを検出する方法であって、
膀胱サンプル及び対照サンプルからのマイクロサテライトマーカーのセットを、請求項２３から２７のいずれか１項に記載のキットを含むプライマーを用いて増幅するステップと、
反応生成物を検出するステップと、及び
２以上のマイクロサテライトマーカーがヘテロ接合性の喪失又はマイクロサテライト不安定性を膀胱サンプル中で提示するか否かを決定するステップであって、少なくとも２つのマイクロサテライトマーカーがヘテロ接合性の喪失又は不安定性を提示することが、膀胱がんを表示することであるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年１２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２６４，５０４号の開示に依るとともにその出願日の利益を請求するものであり、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本明細書において開示されるのは、膀胱がんの検出に有用な組成物及び方法である。
（発明の背景）
膀胱がんは米国人男性及び女性にとってそれぞれ第４位、第７位を占める最も一般的な悪性腫瘍である。年間、６０，０００及び１８，０００の新しい膀胱がんの症例が米国人男性及び女性のそれぞれについて診断されている。約７５％の患者は表面的な形態の病気を有し、そのうち１５％の患者について浸潤的な形態へと病気が進行するリスクにさらされている。表面的な形態の病気の患者のうち約７０％が１０年以内に病気の再発を経験し、その再発の大半が最初の診断から２年以内に検出されている。これらの理由により、表面的な形態の病気を有する患者は、病気の進行と再発についてモニタリングすることを必要とする。
現状、膀胱がんの監視に係る標準的なケアとしては、膀胱鏡検査及び尿細胞診を３カ月ごとに２年間行い、続いて毎年、膀胱鏡検査、尿細胞診及び上部尿路のX線評価（radiographic evaluation）を行うことが挙げられる。しかしながら、この管理アプローチは、細胞診の感度及び特定性がそれぞれわずか２５−５０％及び９０−１００％であるため、最適ではない。膀胱鏡検査の感度はより高い（９０−１００％）が、これは高価な手続きであり、複雑な器具類と無菌環境を必要とする。そして、その侵襲的な性質から、該手続きは、損傷、合併症及び感染症の内在的リスクを有している。
したがって、病気に対して感度及び特定性がよく、他の検出方法よりも合併症のリスクが低い膀胱がんを検出する方法に対するニーズが存在する。開示される方法及びキットは、これら及びその他の重要なニーズに向けられている。
【０００３】
（発明の概要）
特に上述のまだ満たされていないニーズに対応するため、本明細書において開示されるのは、対象中のヘテロ接合性の喪失を検出する方法であり、増幅生成物のセットを生成するため膀胱サンプル及び対となる対照サンプルからのマイクロサテライトマーカーのセットを増幅すること（該マーカーのセットは、ＦＧＡ、Ｄ９Ｓ７４７、ＭＢＰ、Ｄ９Ｓ１６２、ＴＨＯ１、ＩＦＮ−Ａ、Ｄ２１Ｓ１２４５及びＤ２０Ｓ４８を含む）、増幅生成物を検出すること、膀胱サンプルからの増幅生成物と対となる対象サンプルからの増幅生成物を比較すること、及び膀胱サンプル中のマーカーのすべてにおいてヘテロ接合性喪失が存在するか決定することを含む。
方法はまた、対象中の膀胱がんを検出するために提供され、本明細書に記載されたプライマーを用いて膀胱サンプル及び対照サンプルからのマイクロサテライトマーカーのセットを増幅させること、反応生成物を検知すること、及び２以上のマイクロサテライトマーカーが、ヘテロ接合性喪失又はマイクロサテライトの不安定性を膀胱サンプル中で示すかを決定することを含み、少なくとも２つのマイクロサテライトマーカーがヘテロ接合性の喪失又は不安定性を示す場合、膀胱がんを示す。
また、本明細書では、特定の核酸配列を有するプライマーと前述のプライマーのためのパッケージングを含むキットが開示される。
【０００４】
概要及び下記詳細な説明は、添付の図面とともに読むことにより更に理解される。開示される方法とキットを例示するために、図中に該方法及びキットの例示的な実施形態が示される。しかしながら、該方法及びキットは開示される特定の実施形態に限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、ＩＦＮ−Ａ遺伝子座におけるＬＯＨを示す。
【図２】図２は、追加的な対立遺伝子が、Ｄ９Ｓ１７１遺伝子座中に検出されたことを示す。
【図３】図３は、Ｄ９Ｓ１７１遺伝子座中に検出されたアーチファクトである。
【図４】図４は、９ｑ３２に位置するＳＴＲマーカーにおけるＬＯＨを表す電気泳動図である。
【図５】図５は、膀胱がんを有する試験対象の特徴及び紐づけられたサンプル番号の概要を提供する。
【図６Ａ】図６Ａは、対照患者Ｎ１のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは対照患者Ｎ２のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは対照患者Ｎ３のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは対照患者Ｎ４のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは対照患者Ｎ５のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは膀胱がん患者Ｃ１のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｇ】図６Ｇは膀胱がん患者Ｃ２のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｈ】図６Ｈは膀胱がん患者Ｃ３のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｉ】図６Ｉは膀胱がん患者Ｃ４のＭＳＡプロファイルを示す。
【図６Ｊ】図６Ｊは膀胱がん患者Ｃ５のＭＳＡプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（例示的な実施形態について詳細な説明）
開示される方法及びキットは、本件開示の一部を構成する添付図面とともに理解される下記詳細な説明を参照することによって、よりたやすく理解されよう。開示される方法及びキットは、本明細書に記載及び／又は示される特定の方法及びキットに限定されるものではなく、本明細書において用いられる用語は、例としてのためだけの特定の実施形態を記述するためのものであり、特許請求の範囲に記載される方法及びキットを限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
別途特定的に述べられない限り、あり得るメカニズム、作用機序、又は改善理由に関するいかなる記述も例示に過ぎず、開示される方法及びキットは、そのような任意の示唆されるメカニズム、作用機序又は改善理由の、正確又は不正確に縛られるものではない。
この文書を通じて、その記載は、組成物又は該組成物を用いた方法について参照する。本開示が記述又は請求する組成物に関連する特徴又は実施形態は、該組成物を用いる方法にも同様に適用できる。同様に、本開示が記述又は請求する組成物を用いる方法に関連する特徴又は実施形態は、等しく該組成物に適用できる。
【０００７】
ある範囲の値が表現される場合、別の実施形態は、ある特定の値から及び／又は他の特定の値を含む。更に、範囲で示される値の参照には、範囲内の各全ての値が含まれる。全ての範囲は包括的であり、組み合わせることができる。値が近似値で表現される場合、「約」という先行詞を用いることで、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。特定の数値の参照は、文脈から明らかにそうではないと指示されない限り、少なくともその特定の値を含む。
開示される方法及びキットの、明確性のため本明細書において別の実施形態の文脈で記述されるある特徴は、ある単一の実施形態において組み合わせで提供されてもよいことが理解されよう。反対に、開示される方法及びキットの、簡潔さのためある単一の実施形態の文脈で記述される様々な特徴は、別々に又は任意の部分的組合せで提供されてもよい。
【０００８】
本明細書で用いられる場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数を含む。
態様の記述に関連する様々な用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通じて用いられる。そのような用語は、別途示されない限り、当該技術分野における通常の意味が与えられる。その他の特に定義される用語は、本明細書において提供される定義と整合的なやり方で解釈される。
本明細書において用いられる場合、「マイクロサテライト」（「単純反復配列（ＳＳＲ）」及び「縦列型反復配列（ＳＴＲ）」と互換的に用いられる）は、２から６塩基対から成る塩基ユニットの連続的な反復を有する核酸の部分を指す。マイクロサテライトは一般に１００から４００塩基対の長さである。したがって、マイクロサテライトの塩基ユニットが４塩基対であれば、該塩基ユニットの約２５から１００の連続的反復があるだろう。
「マイクロサテライト不安定性」は、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）が適切に機能しない時に細胞中のマイクロサテライトの核酸配列に起こる変化を指す。マイクロサテライトの特徴的な反復単位は、ＤＮＡポリメラーゼの固有のミスマッチを正すための校正能力の欠如によって、誤りをおかす傾向がある。核塩基の挿入又は削除の積み重ねは、タンパク質の発現に有害作用を有し得るフレームシフト変異につながり得る。ＭＭＲシステムは、ＤＮＡポリメラーゼによって検出されないそのようなミスマッチエラーがＭＭＲによって修正されるため、フェイルセーフシステムとして見ることができる。ＭＭＲシステムをコード化する遺伝子の変異は、マイクロサテライトの複写監視の欠如という結果になり、不安定性を結果としてもたらし得る。がん抑制遺伝子において発生するマイクロサテライト不安定性は、がんの表現形質と関連づけられている。
「ヘテロ接合性の喪失」又はＬＯＨという用語は、ＤＮＡの区分の喪失を指し、一つの染色体糸にはあるが他にはない転写エラーによる可能性が極めて高い。いくつかのがんでは、失われた遺伝子物質ががん抑制タンパク質、細胞増殖機械（cellular reproduction machinery）又は安定な細胞増殖に必要なその他のタンパク質の全部または一部をコード化している場合、ＬＯＨはとりわけ問題となりうる。残されたコピーが失われた対立遺伝子によって引き起こされる如何なる有害な効果をも妨げるために十分であるとしても、ＬＯＨは、残されたコピーが有害な効果を妨げるため不十分な場合、又は、コード化されたタンパク質が野生型のタンパク質のように機能しないよう残されたコピーが変異誘発されている場合、がんの表現形質をもたらす、あるいは少なくともそれに貢献する。マイクロサテライト対立遺伝子におけるＬＯＨはがんと結びついている可能性がある。残されたマイクロサテライト対立遺伝子は、引き続き変異しやすく、とりわけ完全に機能するＭＭＲシステムが欠けている細胞中では特にそうであり、更なる変異又は変形をして、それにより機能しないタンパク質が得られる可能性がある。もし機能しないタンパク質ががん抑制タンパク質であれば、がんの表現形質のリスクが高まる。
【０００９】
毎年約８０，０００件が新たに膀胱がんと診断されることに加えて、年間約１２，０００人の男性及び４，５００人の女性がこの病気で死亡している。米国及び海外における病気の有病率のため、該病気の一因となるあるいは該病気を示すであろう遺伝成分を明らかにするために多くの研究が行われている。この研究は、数多くの、ある程度病気に関連するがんマーカーを明らかにし、過去１０年間で、いくつかのがんマーカーが、膀胱腫瘍検出のためのインビトロ診断アッセイの中に組み込まれてきた。現在、ＢＴＡ（登録商標）、ＢＴＡ（登録商標）Ｓｔａｔ、ＦＤＰ（登録商標）、及びＮＭＰ−２２（登録商標）が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、細胞学及び細胞診の付属物として認可されており、これらの試験は通常、抗体媒介性の腫瘍マーカーを検出するものである。これらのアッセイの感度及び選択性プロファイルは、これらのマーカーの検出方法が、現代的な侵襲的検出手続きを増加させる可能性があるにもかかわらず、これらの感度及び選択性プロファイルは、コンパニオン診断抜きでは信頼できないことを示唆している（Halachmi et al., Molecular Urology, 1(4):309-314 (1997); Han and Schoenberg, Urologic Oncology, 5(3):87-92 (2000)）。例えば、ＢＬＡ  Ｓｔａｔ試験の感度は、病気のステージにも依るが、５１％程度の低さ、ステージ１のがんの場合は４２％程度の低さとなり得る。
【００１０】
本発明は、対照的に、侵襲的な技法又は診断結果を組合わせるアプローチを必要とせずに膀胱がんを検出する方法である。より具体的には、本発明は、膀胱細胞中のＬＯＨ又はＭＳＩを、膀胱標本からの特定のマイクロサテライトマーカーのセットを解析することで検出するものであり、膀胱サンプル中の２つのマーカーに検出されたＬＯＨは病気であることを示す。該病気は、本発明のいくつかの実施形態においては、膀胱がんである。
試験標本を得るために侵襲的な技法が必要ではない一方、本発明は、非侵襲的な由来のサンプルにのみ限定されるわけではない。生体組織検査、手術、及び検死からでさえ、得られたサンプルは、ここに記載される技法を用いて膀胱がんを検出するために用いることができる。本発明のいくつかの態様において、膀胱サンプルは、尿サンプルであり得て、その他の態様において、膀胱サンプルは膀胱生検材料であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、対となる対照サンプルは血液、血清、口腔細胞、毛嚢、唾液、皮脂、皮膚、汗又は涙である。いくつかの態様において、対となる対照サンプルは口腔細胞である。
【００１１】
マイクロサテライトが特定の病気と関連付けられている場合、マイクロサテライトは病気の検出、診断、及び／又は研究のためのマーカーとして用いることができる。本発明は、マイクロサテライトマーカーのパネル中で変化を検出する方法を開示する。これらのマーカーを検出するため、膀胱標本からの核酸が単離されなければならない。マイクロサテライトを増幅することにより、当業者はマイクロサテライトの存在、不存在又は変化を検出することができる。マイクロサテライトは、マイクロサテライトの増幅に用いるためのプライマーをデザインするために用いられ得る配列によって並べられる。このように、本発明のいくつかの態様において、各マーカーはプライマーの対を用いて増幅される。表１に、本発明のある実施形態において各マーカーを増幅するために用いられるプライマーを列挙する。
核酸の増幅は、例えば、核酸を実質的に等温で増幅させる等温増幅反応、又は異なる温度の複数のサイクルを用いてテンプレートとなる核酸を変性させ、プライマーをアニーリングし、初期の一本鎖核酸を延長するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸を増幅させることのできる任意の技法を用いて達成される。ＰＣＲ反応は、伝統的なＰＣＲ、リアルタイム（ＲＴ）ＰＣＲ、及び定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含むが、これらに限られるものではない。サイズに基づいて増幅された核酸の識別が可能な任意の増幅プロトコルが本発明において想定される。本発明のある実施形態において、マイクロサテライトマーカーは、尿サンプル及び口腔サンプルから得られる核酸から増幅される。結果として得られる増幅された核酸は、予期された長さを有するであろうし、増幅生成物を全く含まないものを含む任意の予期された長さからの派生物は、マイクロサテライト不安定性又はヘテロ接合性の喪失を表すであろう。
【００１２】
本発明のある実施形態は、増幅生成物を生成するため膀胱サンプル及び対となる対照サンプルからマイクロサテライトマーカーを増幅すること（該マーカーはＦＧＡ、Ｄ９Ｓ７４７、ＭＢＰ、Ｄ９Ｓ１６２、ＴＨＯ１、ＩＦＮ−Ａ、Ｄ２１Ｓ１２４５及びＤ２０Ｓ４８を含む）、増幅生成物を検出すること、膀胱サンプルからの増幅生成物と対となる対照サンプルからの増幅生成物とを比較すること、及びヘテロ接合性の喪失が膀胱サンプルの中のマーカーのすべてにおいて存在するか否かを決定することを含む、対象中のＬＯＨを検出する方法を提供する。
増幅された核酸は当該技術分野において既知の分子的方法を用いて解析することができ、例えば、以下に限定されるものではないが、アガロースゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、及び高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。膀胱サンプルからの単増幅生成物と対照サンプルからの単増幅生成物を比較すると、アガロースゲル電気泳動法は、サンプルがマーカー核酸を有するかどうか視覚的に決定することを可能にする。キャピラリー電気泳動法はまた、異なるサイズの増幅生成物を自動化されたやり方で解析することを可能にし、この方法は特に複数の増幅生成物を単一のキャピラリー中で解析するのに適する。
【００１３】
本発明のいくつかの態様は、単一の増幅反応において複数のマーカーを増幅することを提供する。そのようなアプローチは、適切な反応条件（例えば、プライマーの組合せ、イオン強度、温度条件等）を決定することが必要である。いくつかのマーカーは効率的に増幅し、増幅後明確に同定できない、又は限られた量しか存在しないので、２以上の増幅反応が必要となるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、マーカーの増幅は少なくとも２つのマルチプレックス増幅反応を含む。いくつかの態様においては、マーカーの増幅は、３つのマルチプレックス増幅反応を含む。本発明のいくつかの実施形態においては、マーカーの増幅は３つの増幅反応を含み、1つのマルチプレックス増幅反応で増幅されるマーカーは、ＦＧＡ及びＤ９Ｓ７４７を含む。いくつかの実施形態において、１つのマルチプレックス増幅反応において増幅されるマーカーは、Ｄ９１６２、ＭＢＰ、ＩＦＮ−Ａ及びＴＨＯ１又はそれらの任意の部分的組合せを含む。例えば、１つのマルチプレックス増幅反応はＤ９１６２及びＭＢＰのみを含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つのマルチプレックス増幅反応により増幅されるマーカーは、Ｄ２１Ｓ１２４５及びＤ２０Ｓ４８を含む。
マルチプレックス増幅反応はマーカーのＬＯＨ又はＭＳＩを検出するために効率的なメカニズムであろうが、各マーカーは個別に増幅されてもよい。個別増幅反応生成物は、ＬＯＨ又はＭＳＩのための事前解析に組み合わされてもよい。各増幅生成物はまた、ＬＯＨ又はＭＳＩが存在するか決定するために個別に解析されてもよい。
【００１４】
表１は、マーカー名を含む３つのマルチプレックス反応（ＭＰ１、ＭＰ２及びＭＰ３）の属性、各マーカーが属する染色体（Ｃｈｒ）、各マーカーの縦列型反復配列、フォワード及びリバースプライマー、並びにフォワードプライマーに共役した色素を列挙している。例えば、マーカーＤ４Ｓ２４３のためのＳＴＲは（ＡＴＡＧ）nであり、「ＡＴＡＧ」は反復単位であり、「ｎ」は、該単位が繰り返される数である。Ｄ４Ｓ２４３は第４染色体上に位置し、フォワードプライマーは６−ＦＡＭで標識される。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
増幅された核酸は、ある増幅生成物を他と区別する一助とするため、本発明においては標識することができる。本発明のいくつかの態様においては、プライマー対の一方が蛍光色素で標識される。表１は、フォワードプライマーの５’末端に結合した蛍光色素（「６ＦＡＭ」、「ＶＩＣ」、「ＮＥＤ」及び「ＰＥＴ」）を明らかにしている。色素の最大励起は明確であり（それぞれ５２０ｎｍ、５５４ｎｍ、５７５ｎｍ及び５９５ｎｍである）、似たようなサイズの増幅生成物の間で区別することを可能にしている。蛍光色素が一度結合すると、しばしばオリゴヌクレオチドの最大励起がシフトする。しかしながら、参照されるいずれの最大励起も、製造者が接合しない色素について列挙する最大励起であろう。他の蛍光色素で、核酸プライマーに結合することができるものは、本発明において用いられている。いくつかの態様において、プライマーを標識するため用いられる蛍光色素の少なくとも２つは、異なる最大蛍光発光波長を有する。
蛍光標識されたプライマーがマイクロサテライトマーカーを増幅するために用いられる場合、本発明の一つの態様においては、蛍光発光を検出可能な遺伝子解析装置を用いる。いくつかの態様において、遺伝子解析装置は、キャピラリー電気泳動を増幅生成物を分離するために、ＣＣＤカメラを該生成物からの蛍光発光検出のために用いる。例えば、ＡＢＩ３１３０遺伝子解析装置は、増幅生成物をサイズで分離するためにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いる。この装置はまた、蛍光色素を励起するためのレーザー光源を有し、蛍光標識された増幅生成物を検出するためのＣＣＤカメラを有する。ＣＥ装置からの出力はしばしば電気泳動図の形式であり、それは電気泳動の間に検出された光の図面表示であり、観測者が速やかに、予期するピークの存在、不存在又は変化を明らかにすることができる。
【００１７】
図１はＩＦＮ−Ａの遺伝子座の電気泳動図を描写している。上の電気泳動図は、標識された頬側スワッブ由来の増幅生成物から描かれたものであり、下の電気泳動図は、標識された尿サンプル由来の増幅生成物から描かれたものである。頬側サンプル及び尿サンプルは同じ対象からであり、膀胱サンプル中のＬＯＨ又はＭＳＩの獲得の決定を可能とする。例えば図１の電気泳動図は、膀胱サンプル中のＬＯＨを示す。頬側サンプルの最後の主要なピークは、その前のピークのほぼ同じ大きさである。これら２つのピークは、マイクロサテライトの遺伝子座の２つの対立遺伝子を表す。図１の電気泳動図の膀胱サンプルには１つしか主要なピークがなく、これはその遺伝子座におけるＬＯＨを示している。
規定されたシグナル収集箱（signal collection bins）を用いることによりＳＴＲ対立遺伝子を識別するソフトウェアが、また利用可能である。「箱（bin）」は、増幅生成物が検出されると予想される特定の領域に対応する。図１の該箱は、電気泳動図上の薄い長方形で図示され、予期される増幅生成物は１３２及び１５２塩基対の間の範囲であろうことを示している。ＩＦＮ−Ａ対立遺伝子は、該箱中の主要なピークである。しかしながら、いくつかのマイクロサテライトにとり、対立遺伝子は、割り当てられた箱の外側で検出される得る。例えば、Ｄ９Ｓ１７１マイクロサテライト中のホモ接合型の対立遺伝子は、図２の下側の電気泳動図中のＤ９Ｓ１７１の箱の外で検出される。
【００１８】
図３は、増幅生成物中のアーチファクトの存在を示す。このアーチファクトはＤ１６Ｓ４７６遺伝子座のための箱の外側の小さなピークである。サンプルをＤ１６Ｓ４７６遺伝子座中のＭＳＩ又はＬＯＨについて解析すると、このアーチファクトは別の対立遺伝子とは考えられないであろう。増幅反応のアーチファクトは、膀胱及び頬側スワッブサンプルの増幅生成物中に最もしばしば存在するであろう。図３に示すように、アーチファクトは、両サンプルにおいて一定である。
【実施例】
【００１９】
以下の実施例は本明細書において開示されるいくつかの実施形態について更に記載するため提供される。実施例は、例示のためであり、開示された実施形態を限定することを意図するものではない。
【００２０】
（実施例１）頬側スワッブの抽出とゲノムＤＮＡの抽出
試薬の調製と頬側スワッブの処理
ａ）調製ステップ
頬側スワッブからのゲノムＤＮＡを商業的に入手可能なプロトコルを用いて抽出した。
ｂ）サンプルのクロスコンタミネーションを避け、スワッブを微量遠心管チューブに移す方法
クロスサンプルコンタミネーショの可能性を減少又は除去するため、洗浄試薬を添加する際１つのチューブのみを一度に開け、いかなる液体サンプルであっても接触するようになった時には手袋を交換した。頬側スワッブを適切に標識された１．５ｍｌの微量遠心機チューブに配置し、心棒が先端と出会う先端の付け根の上で蓋を閉めた。心棒を壊してバイオハザードゴミ容器に捨て、微量遠心管チューブを閉じた。スワッブ心棒は要すればハサミで切断したが、このような場合、サンプルとサンプルの間で、ハサミは１０％ＮａＣｌＯ（漂白剤）で除染した。
ｃ）頬側スワッブからのＤＮＡ抽出
４００μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を各サンプルチューブに添加した。該チューブは５０秒間激しくボルテックスし、スワッブが完全に浸されることを確実にした。チューブを１０回逆さにして、ＰＢＳがチューブの全ての領域に確実に接触するようにした。２０μｌのQiagen Proteinase Kストック溶液及び４００μｌのBuffer ALを各サンプルチューブに添加し、該チューブを７５回さかさまにした。該サンプルは適切な溶解を確保するため５０秒間、徹底的にボルテックスし、５６℃で６０分間培養した。該チューブは短時間遠心分離し、濃縮物を除去した。
４００μｌの１００％エタノールを各サンプルに添加し、チューブを５０回又は１分間逆さにして、その後５０秒間激しくボルテックスした。該チューブは濃縮物を除去するため短時間遠心分離した。
７００μｌの溶菌液をエタノールとともに、対応するQIAampスピンカラムに縁を濡らすことなく適用し、蓋を閉めた。QIAamp膜にピペットの先端が触れることは避けた。該チューブは８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を含むチューブは捨てた。QIAampスピンカラムを清浄な２ｍｌ採取チューブに置いた。ナイロンスワッブを１．５ｍｌチューブから外し、適切に標識されたスピンカラムの中に置いた。ＤＮＡをコットンスワッブから抽出する際、該スワッブをカラムのへりで垂直にこすって、コットン繊維を木部からほぐし、スワッブが棒から外れてカラム内に残るようにした。該チューブは６０００ｘｇ（８０００ｒｐｍ）で１分間遠心分離し、濾液を含むチューブは捨てた。
５００μｌのBuffer AW1を各カラムにへりを濡らすことなく添加した。蓋を閉めて、チューブを室温で５分間培養した。チューブを８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、濾液を含むチューブは捨てた。ＱＩＡａｍｐスピンカラムを清浄な２ｍｌのコレクションチューブの中に置いた。
５００μｌのBuffer AW2を各カラムにへりを濡らすことなく添加した。蓋を閉めて、チューブを１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ナイロン／コットンスワッブをカラムから外した。ＱＩＡａｍｐスピンカラムを新たなコレクションチューブの中に置き、１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。濾液を含むチューブは捨てた。
ＱＩＡａｍｐスピンカラムを清浄な標識された１．５ｍｌコレクションチューブの中に置いて、サンプルを６０℃で２０−２５分間、蓋を開けた状態で培養した。５０μｌのBuffer AE（あらかじめ６５℃に温めたもの）を各カラムに添加し、サンプルを室温で５分間培養した。該チューブは８０００ｒｐｍで、カラムからＤＮＡが溶出するよう遠心分離し、サンプルを４℃で貯蔵した。
【００２１】
（実施例２：膀胱サンプルのＤＮＡ抽出）
ａ）尿サンプルからのＤＮＡ抽出
対照及び試験対象から尿を採取することにより膀胱サンプルを得た。尿サンプルは室温（１５−２５℃）と平衡させた。サンプルを旋回させ、血液の存在を試験するため、尿中潜血検査用試験紙（Hemastix）の小片を速やかに尿に浸した。Hemastix試験の結果は１分後に読み取られ、記録された。
尿サンプルを標識した50mLコニカルチューブに移し、３５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄みを除いて、ペレットの長さをコニカルチューブの底から測った。もし、コニカルチューブの底からのペレットの長さが２ｍｍ未満であれば、２５０μｌのＤＮＡグレードの水を、ペレットを浮かせるために添加した。もしペレットが２ｍｍを超える長さであれば、１ｍｌのＤＮＡグレードの水をペレットを浮かせるために添加した。
サンプルをボルテックスし、２５０μｌの各サンプルを１．５ｍｌの微量遠心機チューブに等分した。２５０μｌを超えるサンプルがある場合、余剰サンプルは−１８±２℃で貯蔵した。尿とペレットを浮かせるために用いられた水の全体の体積を記録し、等分量のサンプルを−１８±２℃で、抽出の準備ができるまで貯蔵した。
サンプルを室温で解かし、１１２０μｌのBuffer AVL／キャリアＲＮＡを各２５０μｌの等分量に添加した。サンプルを１５秒間ボルテックスし、室温（１５−２５℃）で１０分間培養した。
【００２２】
各サンプル等分量を二つの微量遠心機チューブ（各６８５μｌ）に分け、５６０μｌの９６−１００％エタノールを各チューブに添加した。チューブを１５秒間ボルテックスして、蓋の内側から液滴を取り除いた。
各サンプルの第１の微量遠心機チューブからの溶液の６２２μｌを対応するＱＩＡａｍｐスピンカラムに適用し、該チューブを８０００ｒｐｍを超える速度で１分間遠心分離し、濾液を捨てた。各サンプルの第１の微量遠心機チューブからの残った６２３μｌを対応するカラムに添加し、該チューブを８０００ｒｐｍを超える速度で１分間遠心分離し、濾液を捨てた。各サンプルの第２微量遠心機チューブからの溶液６２２μｌを、対応するＱＩＡａｍｐスピンカラムに適用し、該チューブは８０００ｒｐｍを超える速度で１分間遠心分離し、濾液を捨てた。各サンプルの第２微量遠心機チューブからの残った６２３μｌを同じカラムに添加し、該チューブは８０００ｒｐｍを超える速度で１分間遠心分離して、濾液を捨てた。
【００２３】
５００μＬのBuffer AW1をスピンカラムに添加し、該チューブは８０００ｒｐｍを超える速度で１分間遠心分離し、濾液を捨てた。
５００μｌのBuffer AW2をスピンカラムに添加し、該チューブをフルスピード（≧１４０００ｒｐｍ）で３分間遠心分離し、濾液を捨てた。該チューブを再度フルスピードで１分間遠心分離した。
ＱＩＡａｍｐスピンカラムを微量遠心機チューブに置いて、３０μｌの予め温めた（７０℃）ＤＮＡグレードの水をカラムに添加した。該サンプルを室温（１５−２５℃）で５分間培養した。ＤＮＡをカラムから溶出するため、該チューブを８０００ｒｐｍ超で２分間遠心分離し、溶出液をＳｐｅｅｄＶａｃ中、低温で２０分間、又は液体が蒸発するまで乾燥させ、該ＤＮＡを３０μｌのＤＮＡグレードの水に溶解した。ＤＮＡサンプルを−１８℃±２℃の短期貯蔵庫に（６カ月まで）、又は−６５℃以下で無期限に、貯蔵した。作業場所を１０％の漂白剤、次いで脱イオン水で清浄にした。
【００２４】
ｄ）尿素ＤＮＡの定量
ヒトゲノムＤＮＡを定量するためにQuantifiler（登録商標）ヒトＤＮＡ定量キットを用いた。キットは、Taqman技術に基づいており、２つの特定の５’ヌクレアーゼアッセイを用いる。１つはヒトＤＮＡ全体又はＹ染色体（男性）のためのターゲット特定的なアッセイであり、第２は、多すぎるＤＮＡ又は一般的なＰＣＲ阻害剤による阻害を検知するインターナルＰＣＲコントロール（ＩＰＣ）である。ＩＰＣの成分はＩＰＣテンプレートＤＮＡ、天然にはみられない合成配列、２つのプライマー及び筆頭のＶＩＣ標識されたプローブから成る。ターゲット特定的アッセイ成分は、標的ＤＮＡを増幅するための２つのプライマー及びTaqmanＭＧＢプローブから成る。これは、５’末端にカップリングした６−カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）レポーター色素と、非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）が３’末端とカップリングした小溝結合剤（ＭＧＢ）を含む。ＭＧＢはプローブの融点をその長さを増やすことなく増加させる。Quantifiler（登録商標）ヒトＤＮＡ定量プライマー及びプローブは、染色体位置５ｐ１５．３３に位置するヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）を標的とする；アンプリコンの長さは６２塩基である。Quantifiler-Y（登録商標）定量プライマーは、染色体位置Ｙｐ１１．３のＹ遺伝子（ＳＲＹ）の性決定領域を標的とする。アンプリコンの長さは６４塩基である。ＰＣＲの間、TaqManプローブは、フォワードプライマーとリバースプライマーの間の特定の領域をアニールする。プローブが無傷な場合、クエンチャーは、レポーターの蛍光を抑制するのに十分レポーター分子の近くに存在する。ＤＮＡ−ポリメラーゼがプライマーの間を伸長するに従い、レポーター分子はプローブから開裂し、蛍光増加をもたらす。蛍光増加は、産生されたＰＣＲ生成物の量に比例する。全体及びＹ−特定ＤＮＡの両方について、Quantifiler（登録商標）アッセイは、検量線からそれらの量を内挿することにより、未知のサンプルを定量するために用いられる。アッセイは６３ｐｇから１００ｎｇのヒトＤＮＡを正確に定量することができる。
【００２５】
ｅ）調製ステップ
全てのラック、ベンチトップ、及び機器を１０％漂白剤で除染し、徹底的に乾かした。器具及びピペットを１０％漂白剤、次いで水、１００％メタノールで清浄にし、徹底的に乾かした。該当する場合、全ての機器は品質管理の最低水準に合致することが確保された。増幅後の部屋から増幅前の部屋に持ってこられた任意の支給品又は機器は、動かす前に１０％漂白液で殺菌され、増幅前の部屋の中で用いる前に再度殺菌された。
試験サンプルと対になる対照サンプルの間のクロスコンタミネーションの可能性を最小化するため、試薬は決して増幅後の部屋から増幅前の部屋へと移されることはなかった。分取された試薬が元の貯蔵容器に戻されることはなかった。
Quantifiler（登録商標）ヒトＤＮＡ標準は毎日新鮮なものが調製され、５℃±３℃で貯蔵された。 Quantifiler（登録商標）キットとともに供給されたＤＮＡの貯蔵溶液は２００ｎｇ／μｌであった。次の量が検量線を作成するために用いられた：５０ｎｇ／μＬ、１６．７ｎｇ／μＬ、５．５６ｎｇ／μＬ、１．８５ｎｇ／μＬ、０．６２０ｎｇ／μＬ、０．２１０ｎｇ／μＬ、０．０６８ｎｇ／μＬ及び０．０２３ｎｇ／μＬ。
【００２６】
適切な量の滅菌水及びQuantifiler（登録商標）ヒトＤＮＡ標準を各チューブに添加し、チューブを徹底的に混ぜるため３０秒間ボルテックスした。
陰性（テンプレート無し）対照を、テンプレートＤＮＡの代わりの２μＬの滅菌水とともに調製した。適切なプライマーミックスを冷凍庫から動かし、解かし、混ぜるためにボルテックスして、短時間遠心分離した。Quantifiler（登録商標）ＰＣＲ反応ミックスを冷蔵庫から動かして、混合するためにピペットを上下させた。
ＰＣＲマスターミックスは以下のとおり調製した。
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＊ｎは反応ウェルの総数、１．１は１０％過剰を意味する。
【００２７】
２３μｌのマスターミックスを全てのウェルに等分した。サンプルをボルテックスした後、２μｌの各検量線サンプルを９６ウェルプレートの適切な試験ウェルに添加した。全ての検量線サンプルが添加された後、２μｌの陰性（テンプレート対照−水なし）を適切なウェルに添加し、２μｌの未知サンプルを適切な試験ウェルに添加した。プレートを粘着テープで覆い、ボルテックスし、泡を除くためたたいた。あるいは、該サンプルプレートを３０００−４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、内容物がウェルの底にくるようにして、全ての泡を取り除いた。該プレートをＡＢＩプリズム７５００及び７５００高速リアルタイムＰＣＲシステムに解析のために置いた。
【００２８】
ｃ）リアルタイムＰＣＲ解析
各サンプル内に存在するＤＮＡの量は、そのシグナル強度をヒトＤＮＡ標準対照によって作成された検量線の強度と比較し、ｎｇ／μｌ単位で結果を得るため該数値を２で割ることで決定した。検量線の結果については、定量化標準反応の結果の質を評価するため検討した。
検量線は、最初の標準の量に対してプロットされた定量化標準反応のＣＴのグラフである。ソフトウェアは、定量化標準データ点のベストフィットを計算することによって回帰直線を計算する。Ｒ２値は検量線回帰直線と個別の定量化標準反応のＣＴデータ点との間のフィットの近接性の指標である。値が１．００のものは、回帰直線とデータ点とが完全にフィットすることを示す。
Ｒ２値は０．９８超となることを確保した。Ｒ２値が０．９８未満の場合、以下について確認した。１）定量化標準の段階希釈の調製、２）定量化標準のための反応の装填、及び３）定量化標準を含む反応の失敗。
−３．３に近い傾きは、最適な（１００％）ＰＣＲ増幅効率を示す。Quantifilerヒトキットについての典型的な傾きの範囲は、−２．９から−３．３であり、平均が−３．１である。検量線がガイドラインに従っていない場合、はずれ値のデータ点が２つ以下であれば、それらのウェルは用いられなかったものとして除くことができた。プレートドキュメント中のはずれ値のデータ点に対応するウェルは取り除かれ、その変化を取り込んでプレートを再解析した。これらデータ点の除去によっても検量線が改善されない場合、定量は無効であると考えられ、再度繰り返されなければならなかった。
陽性の対照は、実際の濃度の±１０％であった。
【００２９】
（実施例３：マイクロサテライト遺伝子座の増幅）
ａ）ＭＳＡに用いられる最適ＤＮＡ量
尿サンプルから抽出されたＤＮＡ量は、どのようにアッセイが実施されるかを指示する。最適には、２つのマルチプレックスＰＣＲを用いて完全な試験を行うことが試みられた。１５μlの水中、０．５ｎｇ／μｌ程度の低濃度を、各マルチプレックス中の名目ＤＮＡ濃度の半分を用いて、全てのマルチプレックスの試験に用いることができた。
抽出された全ＤＮＡが８ｎｇ未満である場合、以下のガイドラインが、アッセイを進めるため用いられた。もし２．００−３．９９ｎｇのＤＮＡが尿サンプルから得られた場合、各ＰＣＲ１、２及び３に２ｎｇのＤＮＡを用いた。もし４．００−６．９９ｎｇのＤＮＡが尿サンプルから得られた場合は、３．５ｎｇのＤＮＡを各ＰＣＲ１、２及び３に用いた。もし７．００−８．９９ｎｇのＤＮＡが尿サンプルから得られた場合は、４ｎｇのＤＮＡを各ＰＣＲ１、２及び３に用いた。
頬側ＤＮＡがより多く存在するか否かに関わらず、同量のＤＮＡを頬側サンプルの解析及び尿サンプルの解析を行うのに用いた。
患者の対の頬側及び尿ＤＮＡを、同時に同じ実験で同じサーマルサイクラーで同じ条件下でＰＣＲ増幅した。
【００３０】
ｂ）ＭＳＡのためのＰＣＲ：プライマー配列
ＭＳＡアッセイのためのＰＣＲプライマー対を表１に示す。３つのマルチプレックス（ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３）を１４の標的を増幅するためにデザインした。
ｃ）ＭＳＡのためのＰＣＲ：ＰＣＲプライマーマスターミックス
各プライマーアッセイマスターミックスについて、各プライマーを最終作業濃度である２ｐｍｏｌまで希釈した。ＰＣＲ１で増幅された遺伝子座はＤ４Ｓ２４３、ＦＧＡ、Ｄ９Ｓ７４７、Ｄ１７Ｓ６５４及びＤ１７Ｓ６９５であった。ＰＣＲ２で増幅された遺伝子座はＤ９Ｓ１６２、ＭＢＰ、ＩＦＮ−Ａ、ＴＨＯ１及びＤ１６Ｓ３１０であった。ＰＣＲ３で増幅された遺伝子座はＤ２１Ｓ１２４５、Ｄ２０Ｓ４８、Ｄ９Ｓ１７１及びＤ１６Ｓ４７６であった。
シングルプレックス反応を繰り返すため、プライマーを８７．５μｌのＤＮＡグレードの水と６．２５μｌのフォワード及びリバースプライマーを組み合わせて５μＭまで希釈した。
プライマーアッセイマスターミックスを各プライマーミックスのため１００μｌ調製し、更に等分量を作るためスケールアップした。
ＰＣＲ１について、１４５μｌのＰＣＲグレードの水を微量遠心機チューブに添加した。５μｌのフォワード及びリバースプライマーをＤ９Ｓ７４７、Ｄ１７Ｓ６４及びＤ１７Ｓ６９５のために添加した。
別の微量遠心機チューブにおいて、５μｌのＰＣＲグレードの水に５μｌのプライマーを添加することでD4S243のためのフォワード及びリバースプライマーを２倍に希釈し、５μｌの希釈されたフォワード及びリバースプライマーをプライマーミックスに添加した。７．５μｌのＦＧＡのためのフォワード及びリバースプライマーをプライマーミックスに添加し、プライマーマスターミックスをよく混ぜた。シングルユースの３０μｌ等分量のプライマーアッセイマスターミックスを作った。
ＰＣＲ２について、１５０μｌのＰＣＲグレードの水を微量遠心機チューブに添加した。５μｌのD9S162、MBP、IFN-Aのためのフォワード及びリバースプライマーを添加した。別の微量遠心機チューブにおいて、５μｌのＰＣＲグレードの水に５μｌのプライマーを添加することでD16S310及びTHO1のフォワード及びリバースプライマーを２倍に希釈し、５μｌの希釈されたフォワード及びリバースプライマーをプライマーミックスに添加し、プライマーマスターミックスをよく混ぜた。
ＰＣＲ３について、１５０μｌのＰＣＲグレードの水を微量遠心機チューブに添加した。５μｌのD21S1245及びD20S48のためのフォワード及びリバースプライマーを添加した。別の微量遠心機チューブにおいて、５μｌのＰＣＲグレードの水に５μｌのプライマーを添加することでD9S171及びD16S476のフォワード及びリバースプライマーを、２倍に希釈し５μｌの希釈されたフォワード及びリバースプライマーをプライマーミックスに添加し、プライマーマスターミックスをよく混ぜた。
【００３１】
ｄ）ＭＳＡのためのＰＣＲ：ＰＣＲ
試薬量に、サンプルと陽性及び陰性対照の数を乗じ、マスターミックスのために必要な体積を計算した。１０サンプルごとに、ピペッティングにより失われる量のため１０％足した。ロット番号をＭＳＡ増幅ワークシートに記録した。ＰＣＲ１、２及び３のための反応混合物をつくるために、次の試薬を組合せた。１２．５μｌ２Ｘ FastStart Taqmanプローブマスター、１μｌのプライマーマスターミックス（１、２又は３）及び７．５μｌの水で、全体２１μｌとした。
２１μｌのマスターミックスをＰＣＲ１及びＰＣＲ２のための各ウェルに等分した。対照反応のため、４μｌ（マルチプレックス１、２、３）の対照ＤＮＡを陽性対照のためにウェルに添加し、４μｌ（マルチプレックス１、２、３）の水を陰性対照のためにウェルに添加した。各患者のサンプル反応のため、４ｎｇ（４μｌ）のＤＮＡをＰＣＲ１、ＰＣＲ２及びＰＣＲ３に添加した。繰り返し反応についてシングルプレックスＰＣＲによって患者サンプルを解析するため、１ｎｇ（１μｌ）のＤＮＡをＰＣＲ１及びＰＣＲ２に添加した。ＰＣＲプレート（又は９６ウェルＰＣＲラック中のＰＣＲチューブ）を短時間、３０００ｒｐｍで約１分間遠心分離し、全ての内容物をプレートの底に持っていった。
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった。９５℃で１１分間を１サイクル、９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１分間を３２サイクル、６０℃で４５分間を１サイクル、及び最後に４℃でホールドした。続いてサンプルを−４℃で短期間貯蔵又は−１８℃で長期間貯蔵、で貯蔵した。ＰＣＲセットアップエリアを１０％漂白剤で清浄にし、次いで水拭きし、５分間ＵＶランプを照射した。
【００３２】
（実施例４：ＡＢＩ３１３０遺伝子解析機によるヒトＤＮＡ同定
ａ）遺伝子解析機のためのＰＣＲ反応のサンプル調製
ホルムアミド（８．７μｌ）及びＬＩＺ（０．３μｌ）サイズ標準（ウェルごとに合計９．０μｌ）を含むサンプル装填緩衝液を調製した。全てのプレートカラム中の用いられなかったウェルを１０μｌのホルムアミド／ＬＩＺマスターミックスで満たし、偶数を振られたカラムに隣接する全てのウェルを１０μｌのホルムアミドで満たした。１．３μｌの各ＰＣＲ反応をサンプルプレートの適切なウェルに添加し、該プレートを短時間遠心分離して、内容物を各ウェルの底に持っていき、泡を取り除いた。
サンプルを、ヒートブロック上、９５℃で３分間加熱し、次いで氷の上で、−１８±２℃、コールドブロック又はサーマルサイクラーブロック上で４℃で２分間、置いた。プレートは、サンプルプレート中に隔壁を挿入し、プレートベースにサンプルを注入し、プレート保持器に留めつけることによって、試験のために組み立てられた。
ポジション１の緩衝液貯蔵器に、新鮮な１×遺伝子解析緩衝液（１０Ｘ３１３０ＥＤＴＡ緩衝液から調製された１：１０希釈のもの）を満たし、ポジション２−４の貯蔵器を水で満たした。
ＡＢＩ３１３０遺伝子解析機は、解析ホルダーごと降順に１６ウェルを２カラムのセット中の断片データについて解析する。患者の対の頬側及び尿サンプルを、同じ試験で、同じホルダー中の１６ウェルの解析で電気泳動させた。
【００３３】
ａ）遺伝子解析機のソフトウェアのセットアップ
本発明にしたがって開発されたソフトウェアは、ＰＹソフトウェアと呼ばれ、ＡＢＩ３１３０遺伝子解析機に基づいている。GeneMapperID ver 3.2又はそれ以上のものを開くことによって作動し、ユーザーＩＤ（gmid）とパスワードを入力し、「ツール」ボタンの下の「パネルマネージャー」を選択して、「ファイル」の下の「新しいキット」を選択し、「マイクロサテライト」を選択し、パネルを「ＰＹテストパネル」と名付け、ＯＫをクリックし、「ＰＹテストキット」と名付けられた新しいキットに矢印を合わせ、「ファイル」の下の「新しいパネル」を選択し、「箱（Bins）」の下の「新しい箱（New Bins）」を選択し、新しいBinsetを名付けて、「ファイル」の下の「新しいパネル」を選択し、パネル「マルチプレックス１」の名前を変え、マルチプレックス１を選択し、チャート中の各マーカーについて情報を入力する。同じステップをマルチプレックス２及びマルチプレックス３について繰り返した。
解析方法を作りだすため、「ツール」の下のGenemapper managerを選択し、解析方法エディターを選択し、次いでＮＥＷを選択し、新しい解析方法をGeneralタブ上で「ＰＹ  ＳＯＰ」と名付け、「ＰＹ  ＴＥＳＴ」を Alleleタブ上のBinsetの下で選択する。Ranger Filerボタンを選択し、１８６．５−１８８からラベルを除くため赤いチャンネルをセットする。Peak Detector、Peak Quality及びQualityタブをセットする。
【００３４】
サイズ標準は、ツールの下のGene mapper managerを選択し、サイズ標準タブを選択し、GS500LIZ標準を選択して開くことによって設定される。標準中の数値を１００、１３９、１５０、１６０、２００、３００、３４０、３５０、４００、４５０、４９０、５００として入力し、保存すべきである。
３１３０解析機のためのインスツルメントプロトコルは３１３０データ収集ソフトウェアを開き、「モジュールマネージャー」を選択し、「Ｎｅｗ」を選択し、「FragmentAnalysis36_POP4」をテンプレートとして選択して、新しい名前、例えばFragmentAnalysis36_POP4、をモジュールのために作ることによって設定される。
試験のセッティングは以下のとおり設定される。オーブン温度６０℃、試験前電圧１５、試験前時間１８０秒、注入電圧３．１Ｋボルト、注入時間８秒（又は、サンプルの再注入のため５秒）、電圧ステップ数１０ＮＫ、電圧ステップ間隔６０秒、データ遅延時間１秒、試験電圧１５ボルト、試験時間１５００秒。
【００３５】
プロトコルマネージャーを選択し、「Ｎｅｗ」を選択し、たとえば「新テストプロトコル」のようなプロトコルの名前を作り、タイプとして「レギュラー」を選択し、試験モジュールを３１３０解析機のために上記のとおり作られたモジュールに設定して、DyesetをＧ５に設定する。
サンプルシートを調製するため、Applied Biosystems−Data Collection−Run Data Collector 2.0を選択し、ＧＡ３１３０フォルダーを開いて、「Plate Manager」を選択し、オプションを選んで、「Ｎｅｗ」を選択し、プレートの名前を入力し、MSA PCR増幅ワークシートに記録した。「GeneMapper-(コンピューターの名前)」をアプリケーションから選択し、オーナー名とオペレーター名を記入する。GeneMapperプレートエディタースクリーン上に、サンプル名を入力し、優先順位を１００に設定し、サンプルタイプを選択し、サイズ標準をテスト標準セッティングに設定し、テストパネル／マルチプレックス１（ＰＣＲ１）又は、マルチプレックス２（ＰＣＲ２）のいずれかをどちらのマルチプレックスを試験するかによって選択し、解析方法を「新しいテストを選択する」に設定し、ＳＮＰとタイトルがつけられたセクションをスキップして、ユーザー定義１、２及び３を設定し、結果グループ１をＳＴＲに設定し、インスツルメントプロトコル１をテストプトロコルに設定する。
試験を行うため、「３１３０」と題されたフィルダーを開き、Run Schedulerを選択し、「Find All」を選択し、関心のある試験を選択し、所望のプレートをハイライトし、試験が開始される。２レーンの試験を行うのに約４５分かかり、試験が完了したら、プレートを取り除き、Costar Thermowellシーラーで封をして、−１８±２℃で１週間まで貯蔵した。
【００３６】
４−Ｃ：ＰＹソフトウェアによるＭＳＡデータの解析
データをGeneMapperID ver 3.2又はそれ以上にインポートして、プログラムで解析した。サンプルのマニュアル編集を必要に応じて行った。ＳＱコラムに赤又は黄色のフラッグが立っているサンプルをマニュアル編集するため、サイズマッチエディター（サイズ標準ピークによって選定された）を選択し、不正確なピークサイズをマニュアルで「Override SQ」と「適用」を押して変更し、その後サンプルを再解析した。
【００３７】
ｃ）ＭＳＡピークサイズの決定
各解析は、患者の対の頬側ＤＮＡ及び尿ＤＮＡのサンプルのデータを含んでいた。これらを一緒に見た（すなわち、ＰＣＲ１に２サンプル、ＰＣＲ２に２サンプル及びＰＣＲ３に２サンプル）。サイズ調整される２サンプルをハイライトし、「Display Plots」を選択した。プロットは、各マルチプレックス反応について頬側サンプルと尿サンプルを比較することによって見直した。各チャンネル（青、赤、黄色、緑）を、各サンプル及び各マルチプレックスについて見直した。ピークを割り当てるにあたり、対立遺伝子特異的な考慮が行われた。IFN-α、D9S171及びD16S476についてのパターンの例が図１−３に示されている。サイジングの完了に伴い、Genotype Tabを選択し、「MSA ANALYSISフォーマット」を選択し、認容基準についての統計的解釈のために遺伝子型情報が用いられる。
【００３８】
ｄ）３１３０遺伝子解析機上の断片サイズ解析の解釈
各サンプルの解析は１人の解析者によって行われ、データ入力は２人目の解析者によって検証された。GeneMapperピークサイズ及び高さのデータテーブルにアクセスが行われ、４０を超える外科的に切除された膀胱がんサンプル及びその対照を用いて、認容基準が確立されたところ、これを表２に示す。
【００３９】
【表２】
2019504639.tif 000005
【００４０】
サンプルが「正常」と呼ばれるためには、増幅生成物は、表２に示されるサイズ（±１ｂｐ）及び色において合致しなければならず、各ヘテロ接合性対立遺伝子について最低１００相対蛍光単位（ＲＦＵ）、各ホモ接合性対立遺伝子について最低２００相対蛍光単位（ＲＦＵ）有さなければならなかった。陰性対照は任意の遺伝子座について、ＰＣＲ生成物を生産しなかった（ＲＦＵ＜１００）。
サンプルが「がん」と呼ばれるためには、増幅生成物は表２に示されるサイズ（±１ｂｐ）及び色において合致しなければならなかった。頬側サンプルについて「がん」と呼ばれるためには、増幅生成物は、各ヘテロ接合性対立遺伝子について最低１００相対蛍光単位（ＲＦＵ）、ホモ接合性対立遺伝子について最低２００相対蛍光単位（ＲＦＵ）有さなければならなかった。尿サンプルについて「がん」と呼ばれるためには、増幅生成物は、少なくとも１つの対立遺伝子について最低１００相対蛍光単位（ＲＦＵ）を有し、２つのピークについて対立遺伝子として考えられ、ＲＦＵが互いに４０％以内でなければならなかった。対立遺伝子の最大ＲＦＵは５０００ＲＦＵであった。各マーカーについてＬＯＨを決定するためのカットオフ値は、掲載されたデータ及びここに行われた解析に基づき、表３に示されている。
【００４１】
【表３】
2019504639.tif 000006
【００４２】
ｅ）ＭＳＡに基づく頬側スワッブからのデータ解析
サンプルデータは、解析のため、順序対である。サンプルは降順に以下のとおりであった：頬側１（マルチプレックス１中の各遺伝子座の結果）、尿１（マルチプレックス１中の各遺伝子座の結果）、頬側１（マルチプレックス２中の各遺伝子座の結果）、尿１（マルチプレックス２中の各遺伝子座の結果）、頬側３（マルチプレックス３中の各遺伝子座の結果）、尿３（マルチプレックス３中の各遺伝子座の結果）。ＨＬ６０データは以下のとおり構成された：マルチプレックス１、マルチプレックス２及びマルチプレックス３。遺伝子座は頬側と同じ順番で記録された。スプレッドシートの列の表題は以下のとおりであった。サンプルＩＤ、遺伝子座、対立遺伝子１サイズ、対立遺伝子２サイズ、空欄二列、対立遺伝子１ピーク高さ、対立遺伝子２ピーク高さ。データは解析のためエクセルにインポートされた。
【００４３】
データが認容基準をパスしたかしなかったか決定するため、データは上記認容基準と比較された。もしサンプルが認容基準をパスしなかった場合、評価に使われなかった。サンプルのステータスを決定するため、データはエクセルスプレッドシート「MSA Sample spreadsheet.xls」に入力した。このスプレッドシートは、頬側と尿のピーク高さの比率を決定するため、以下の計算を用いている。比率＝（尿１対立遺伝子１ピーク高さ／尿１対立遺伝子２ピーク高さ）／頬側１対立遺伝子得１ピーク高さ／頬側１対立遺伝子２ピーク高さ。比率及びＭＳＩ又はＬＯＨマーカーステータスの陰性／陽性は、各遺伝子座についての認容基準に基づいた計算を用いて、自動的に決定された。
（対立遺伝子の喪失を通じて）ＬＯＨを示す遺伝子座は、遺伝子座の完全な喪失を示す比率については計算できないが、ＬＯＨについて陽性であると考えられた。比率はヘテロ接合性遺伝子座及び完全なデータセットを有する遺伝子座についてのみ計算した。比率をカットオフデータと比較した。カットオフ範囲外の比率は、ＬＯＨについて陽性と考えた。該範囲内の比率は、ＭＳＩ／ＬＯＨについて陰性とした。追加的な又はシフトした対立遺伝子が尿中に検出された場合、追加的な又はシフトした対立遺伝子が箱から±３ｂｐシフトされたものであり、追加的な又はシフトした対立遺伝子が最小ピーク高さ１００ＲＦＵを有していれば、遺伝子座はＭＳＩについて陽性と決定された。
【００４４】
ｆ）３１３０遺伝子解析機からの結果の評価：試験反復基準
アッセイを試験するに十分なＤＮＡが残っていた場合、試験を繰り返すとの反復基準を確立した。十分なＤＮＡが存在しなかった場合、オリジナル試験からの結果をアッセイについての認容基準に合致する全ての遺伝子座について有効であると考え、報告した。ＨＬ６０マルチプレックス陽性対照全体が認容基準に合致しなかった場合、失敗した遺伝子座を含有するマルチプレックスについてのサンプルデータは評価せず、適切なＨＬ６０及びサンプルマルチプレックスを当初のＤＮＡ濃度で繰り返した。ＨＬ６０対照マルチプレクスの１以上の遺伝子座が認容基準に合致しなかった場合、失敗した遺伝子座に対応する遺伝子座のサンプルデータは評価しなかった。適切なＨＬ６０及びサンプルマルチプレックスを当初のＤＮＡ濃度で繰り返し、最初の試験の間に失敗した遺伝子座についての結果のみをＭＳＡサンプルスプレッドシートに報告した。最初の試験で認容基準をパスした遺伝子座からのデータは、２回目の試験ではサンプルシートから除かれた。全てのサンプルマルチプレックスが認容基準を超えなかった場合、当初濃度のＤＮＡを用いてマルチプレックスを繰り返した。サンプルが単一遺伝子座について陽性の結果を有していた場合、その遺伝子座について、１ｎｇのＤＮＡ及び５μｍの各プライマーを用いてシングルプレックスを繰り返し、両方の試験からの結果を報告した。マイクロサテライト不安定性を示す追加的な尿ピークを含む遺伝子座は、上述のとおり追加的なピークを確認するため、シングルプレックスを繰り返した。遺伝子座中の任意の対立遺伝子が５０００を超える（オフスケール）ピーク高さを有した場合、遺伝子座は、マルチプレックスに注入時間５秒で再注入することによって再評価した。
どちらの遺伝子座を再注入評価に含めるかを決定するために決定フローチャートを用いた。ホモ接合性対立遺伝子でピーク高さ５０００超の範囲にあるものは、他の遺伝子座の評価能力を邪魔しない限り、再注入しなかった。再注入値が用いられた場合、再注入サンプルの頬側及び尿の値の両方を、頬側及び尿の最初の試験で得られたオフスケール又は不明瞭なピークの場所に報告した。引き続きオフスケール又は不明瞭であれば、その結果は評価しなかった。
【００４５】
ｇ）サンプル結果の最終報告
全ての再注入又は反復結果に続いて、サンプルの各遺伝子座の最終決定を、マルチプレックスデータを含む当初のサンプルスプレッドシートに報告した。
【００４６】
（実施例５：臨床試験−尿沈渣のＭＳＡによる膀胱がんの検出
ａ）サンプル
ＰＹＳＯＰ及びＰＹ試験を、ヒト生体試料中に膀胱がんが存在するかしないかを予見するために用いた。５つの対になった「正常」患者からの頬側スワッブ及び尿サンプルと５つの対になった膀胱がん患者からの頬側スワッブ及び尿サンプルを、陽性及び陰性ＤＮＡサンプル対照及びテンプレートなし陰性対照とともに解析した。各サンプルを、指定されたＣＬＩＡ試験ラボ（ＤＣＴＬ）サンプル受入れグループによって割り当てられた固有の標本ＩＤで識別した。全ての標本は、試験プロセスを通じてサンプル追跡性を確保しつつ、ＣＡＰ及びＣＬＩＡ規則に従って取り扱われた。
【００４７】
ｂ）ＭＳＡのためのＰＣＲ
ＭＳＡアッセイを行った。アッセイは、ＤＮＡ抽出、規格化、及び対になる頬側スワッブ及び尿沈渣のゲノムＤＮＡのＳＴＲマーカーのＰＣＲ増幅から成っていた。ＰＣＲは、標的ＳＴＲを１４マイクロサテライト遺伝子座で並べるプライマーセットを用いて行われた。各プライマー対の５’末端は、キャピラリー電気泳動によってＰＣＲ断片の検出が可能となるよう蛍光標識された。上記表１のプライマー対を用いた。
ＰＣＲアンプリコンは、サイズを検出し、各断片の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を決定するキャピラリーベースのゲル電気泳動システム上で解析された。
頬側スワッブＤＮＡ中で検出されたヘテロ接合性対立遺伝子のＲＦＵは、対になる尿サンプル中で検出されたＲＦＵと比較し、尿の対立遺伝子と血液対立遺伝子のＲＦＵの比率を計算した。正常サンプルで認められた比率の外の値を示したマーカーは、ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を示したと言われ、膀胱がんのインジケーターとして働いた。電気泳動図の例として、図４を参照されたい。
【００４８】
ｃ）対照のＭＳＡアッセイ
各サンプル及び対照は、各ＰＣＲ生成物の断片サイズを計算するために用いられたサイズ標準の存在下で電気泳動された。陽性対照ゲノムＤＮＡは米国組織培養保存機関（ＡＴＣＣ）及びApplied Biosystemsから得た。対照は、サンプルの臨床評価において決定された検出下限値の濃度で試験された。
ｄ）装置及びソフトウェア
アッセイに用いられた装置は、Applied Biosystemsの３１３０Ｘｌ遺伝子解析機であり、１時間で遺伝子解析データを生成することができる１６キャピラリーの装置である。３１３０Ｘｌ遺伝子解析機は、ＤＮＡ塩基配列、ＳＮＰ遺伝子型判定及び断片解析を含む幅広い範囲の遺伝子検出アッセイを取扱う。３１３０Ｘｌ遺伝子解析機は、21 C.F.R. Part 11に準拠したGenemapper Software v2.0を用いて作動する。ＣＡＰ規制に従って、該装置はスペクトル及び空間測定について、半年ベースで較正された。
【００４９】
ｅ）サンプル収集及び調製
２つの標本タイプが収集された：頬側スワッブと尿沈渣である。頬側スワッブは指定されたＣＬＩＡ試験ラボ（ＤＣＴＬ）によって、収集キットを用い、明確に規定された収集インストラクションに従って収集された。簡単に説明すると、（１）頬側スワッブは４℃で１週間安定である、（２）一度ＤＣＴＬで受領されたら、各ケースは受け入れられ、抽出プロセス全体を通じてサンプルに付き従う固有の識別子を割り当てられた、（３）ゲノムＤＮＡはＣＡＰ−認証ラボにおいてサンプルから抽出された。サンプル中のヒトＤＮＡはApplied BiosystemsのQuantifilerリアルタイムＰＣＲキットを用いて定量され、ゲノムＤＮＡは１ｎｇ／μｌに規格化された。
尿沈渣はＤＣＴＬによって収集キットを用い、明確に規定された収集インストラクションに従って収集された。簡単に言うと、（１）尿は滅菌収集カップ中に収集され、尿中のＤＮＡを安定化させるために保存料が添加された。尿と保存料は混合され、尿核酸及びタンパク質が室温で出荷のため保存された。（２）ゲノムＤＮＡは、Norgen Biotechの尿ＤＮＡ単離Maxiキットを用いて尿沈渣から精製された。該キットは高分子量ＤＮＡ（サイズにして１ｋｂを超えるもの。ほとんど細胞が結合）及び低分子量ＤＮＡ（１５０−２５０ｂｐ。循環由来）の両方を２５ｍｌから８０ｍｌの尿より単離する。サンプル中のヒトＤＮＡはApplied BiosystemsのQuantifilerリアルタイムＰＣＲキットを用いて定量され、ゲノムＤＮＡは１ｎｇ／μｌに規格化された。
【００５０】
対になる尿と頬側スワッブの標本セットを膀胱がんと診断された５患者から、対になる標本セットを５人の正常−健康な患者から得た。該サンプルは、Bioreclaimation LLCから得た。正常患者から２つの頬側スワッブが収集され、がん患者から１つの頬側スワッブが収集された。サンプルは、Bioreclaimation社によって、任意のＨＩＰＰＡセンシティブ情報を取り除いて個人が識別されないようされ、各標本にサンプルＩＤがBioreclaimation社によって割り当てられた。
各標本のバイオメトリックデータを図５に提供し、サンプル番号を表４に示す。
【００５１】
【表４】
2019504639.tif 000007
【００５２】
ｆ）サンプルからのＤＮＡ抽出
尿サンプルは遠心分離してペレット細胞とした。尿は上澄みを移し、ペレットを再度水に懸濁させた。２５０μｌの尿沈渣スラリーをマイクロチューブにピペットで移し取り、尿沈渣の残りを取っておいて、−２０℃±２℃で貯蔵した。Buffer AVL／キャリアＲＮＡを各サンプルに添加した。サンプルをボルテックスし、室温で１０分間培養した。ゲノムＤＮＡ抽出のため、QIA amp Viral RNAミニキットのインストラクションに従った。
【００５３】
ｇ）ＤＮＡの定量及び規格化
リアルタイムＰＣＲ（TaqMan定量PCR）を抽出サンプル中のヒトＤＮＡ濃度を、ＯＤ２６０によって定められているとおり１ｎｇのＤＮＡの直接アッセイによって決定するために用いた（CBI DNASEQ00035を参照）。ヒトβアクチン遺伝子がTaqmanアッセイの標的である。既知の濃度のヒトＤＮＡ標準の検量線を、サンプル抽出物からの結果と比較し、濃度を決定するために用いた。Taqmanはわずかな濃度の違いも決定することが可能であり、ＤＮＡ分子の１０コピーまで感度がある。一度サンプルＤＮＡの濃度が決定されたら、サンプルを１ｎｇ／μｌに規格化した。サンプル中のＤＮＡ濃度を表５に示す。
【００５４】
【表５】
2019504639.tif 000008
【００５５】
ｈ）ＭＳＡ  ＰＣＲ及び解析
ＭＳＡ  ＰＣＲを実施例３に記載のとおり、Amplitaq goldを酵素として用いて行った。実施例３に記載され、表２に示された認容基準を用いた。解析は実施例４に記載のとおり行われ、表３に提示されたカットオフ値がＬＯＨ及びＭＳＩを検出するため用いられた。実施例４ｆに示された基準が、ＬＯＨ又はＭＳＩを分類するのに用いられた。
ｉ）結果
表６はサンプル対ＩＤ及びそれらに対応するBioreclamation社により提供される尿及び頬側スワッブのサンプルＩＤを提供する。
【表６】
2019504639.tif 000009
【００５６】
図６ａ−６ｅはそれぞれ、表６に規定されたサンプル対ＩＤ、Ｎ１−Ｎ５の生ＭＳＡデータを示す。図６ｆ−６ｊは、それぞれ、表６に規定されたサンプル対ＩＤ、Ｃ１−Ｃ５の生ＭＳＡデータを示す。
表７は、「Ｎ」＝正常（ＬＯＨ無し）、「ＬＯＨ」＝対の頬側及び尿サンプルの間でヘテロ接合性の喪失あり、及び「ＭＳＩ」＝マイクロサテライト不安定性が対の頬側及び尿サンプルで観察されたとして、ＭＳＡを行った結果を示す。「最終コール」は、２未満の遺伝子座がＬＯＨ又はＭＳＩを提示した場合「Ｎ」と考えられ、２以上の遺伝子座がＬＯＨ又はＭＳＩを提示した場合、がん性「Ｃ」と考えられる。
【００５７】
【表７】
2019504639.tif 000010
【００５８】
まとめると、臨床診断され、膀胱鏡検査で確認されたサンプルが、ここに提示されるＭＳＡ方法によって病気について陽性と決定された。各正常対照は、試験された１４マーカーの全てについて、ＭＳＩ及びＬＯＨにつき陰性であった。膀胱がんサンプルについては、少なくとも８つ中２つの特定のマーカーがＬＯＨについて陽性であった。８つのマーカーは、FGA、D98747、MBP、D98162、THO1、IFN-A、D21S1245及びD20S48であった。したがって、ここに提示された頬側に基づくＭＳＡ解析は、膀胱がんを正確に検出するのに、たった８つのマーカーの使用しか必要としない。
【００５９】
当業者は、数多くの変更及び修正が、本発明の好ましい実施形態について行うことが可能であり、そのような変更及び修正は、本発明の精神から離れることなく行うことが可能であることを理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本願の真の精神及びスコープの範囲内の全てのそのような均等な変化形をカバーするものであることが意図されている。  
この文書において引用又は記載された各特許、特許出願及び出版物の開示はここに参照によってその全体が援用される。
【図１】
2019504639.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
2019504639.tif 000014
【図５】
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【図６Ａ】
2019504639.tif 000016
【図６Ｂ】
2019504639.tif 000017
【図６Ｃ】
2019504639.tif 000018
【図６Ｄ】
2019504639.tif 000019
【図６Ｅ】
2019504639.tif 000020
【図６Ｆ】
2019504639.tif 000021
【図６Ｇ】
2019504639.tif 000022
【図６Ｈ】
2019504639.tif 000023
【図６Ｉ】
2019504639.tif 000024
【図６Ｊ】
2019504639.tif 000025
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019504639.tif 000027
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