(57)【要約】  本発明は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片と抗ウイルス剤とを含む組み合せと、前記組み合わせを、任意選択的に医薬的に許容される賦形剤と一緒に含む医薬製剤と、性器ヘルペス、ＨＳＶ歯肉口内炎、及び再発性口唇ヘルペス、単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）、新生児ＨＳＶ、免疫不全宿主におけるＨＳＶ疾患、及びＨＳＶ角膜炎又は角結膜炎を含むヘルペスウイルス感染の予防及び／又は治療におけるその使用とに関する。  【選択図】図１
2019525928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）重鎖（ＶＨ）可変領域及び軽鎖（ＶＬ）可変領域と配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）との両方を含む、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片、及び
ｂ）抗ウイルス剤
を含み；成分ａ）と成分ｂ）との間の重量比が１０００〜０．０１であることを特徴とする組み合わせ。
【請求項２】
成分ａ）と成分ｂ）との間の重量比が、１００〜０．０１、好ましくは１０〜０．１であることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項３】
逐次投与、同時投与、又は別々の投与のためのものである、請求項１又は２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
前記重鎖（ＶＨ）可変領域が、配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０からなる群から選択されるか、又はそれらの相同体であることを特徴とする、先の請求項の何れかに記載の組み合わせ。
【請求項５】
前記軽鎖（ＶＬ）可変領域が、配列番号２、配列番号５、配列番号８及び配列番号１１からなる群から選択されるか、又はそれらの相同体であることを特徴とする、先の請求項の何れかに記載の組み合わせ。
【請求項６】
ＨＳＶ−１及び／若しくはＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片が、ＩｇＧ１重鎖定常領域又はＩｇＧ２重鎖定常領域を有することを特徴とする、先の請求項の何れかに記載の組み合わせ。
【請求項７】
抗ウイルス剤が、アシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、イバシタビン、シドフォビル、バルガンシクロビル、バラシクロビル又はファムシクロビルから選択され、好ましくはアシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル又はホスカルネットから選択されることを特徴とする、先の請求項の何れかに記載の組み合わせ。
【請求項８】
医薬としての使用のための、先の請求項の何れかに記載の組み合わせ。
【請求項９】
性器ヘルペス、ＨＳＶ歯肉口内炎、再発性口唇ヘルペス、単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）、新生児ＨＳＶ、免疫不全宿主におけるＨＳＶ疾患、及びＨＳＶ角膜炎又は角結膜炎から選択される、ヘルペスウイルス感染症の治療における、請求項８に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項１０】
モノクローナル抗体又はその断片が、筋肉内、静脈内若しくは皮下注射の形態で、０．１μｇ／Ｋｇ〜５０μｇ／Ｋｇ体重の範囲の投与量で全身投与され、抗ウイルス剤は、２５〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜２５００ｍｇ、より好ましくは２５０〜２０００ｍｇの範囲の投与量で経口投与され、又は１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で非経口投与されることを特徴とする、請求項８又は９に記載の使用のための組み合わせ。
【請求項１１】
モノクローナル抗体又はその断片が、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤などから選択される液体又は半固体製剤の形態で局所投与されることを特徴とする、請求項８から１０の何れかに記載の使用のための組み合わせ。
【請求項１２】
抗ウイルス剤が、経口組成物又は非経口液剤の形態で全身投与される、請求項９から１１の何れかに記載の使用のための組み合わせ。
【請求項１３】
抗ウイルス剤が、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤などから選択される液体又は半固体製剤の形態で局所投与されることを特徴とする、請求項８から１０の何れかに記載の使用のための組み合わせ。
【請求項１４】
モノクローナル抗体又はその断片と抗ウイルス剤が同じ製剤中で全身的又は局所的に投与されることを特徴とする、請求項８から１０の何れかに記載の使用のための組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染関連疾患は、一般集団の感染率が高いために世界的な健康上の問題である。臨床症状には、皮膚、口、唇、目、又は生殖器に影響を及ぼす小さな、痛みを伴う疱疹、並びに発熱及び倦怠感などの全身症状が含まれる。罹患臓器によると、ヘルペスウイルス感染症は、性器ヘルペス、ＨＳＶ歯肉口内炎及び再発性口唇ヘルペス、単純ヘルペス脳炎、新生児ＨＳＶ、免疫不全宿主におけるＨＳＶ疾患、及びＨＳＶ角膜炎又は角結膜炎に分類される。ＨＳＶは、宿主の生涯にわたって感覚神経節及び自律神経節に持続し、定期的に再活性化する。臨床的再発は、ストレス、月経周期、発熱又は病気、日光への曝露、又は日焼けなどのいくつかの刺激によって引き起こされる。
【０００２】
ＨＳＶ感染の臨床経過は、宿主の免疫状態によって強く影響され、新生児及び免疫不全の患者には重篤かつ生命を脅かす感染が生じる。
【０００３】
性器ヘルペスは慢性的な生涯にわたるウイルス感染症である。ＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の２つの型のＨＳＶが性器ヘルペスを引き起こし得る。再発性性器ヘルペスのほとんどの症例はＨＳＶ−２によって引き起こされ、米国では約５０００万人がこのタイプの性器ヘルペスに感染している（１）。しかしながら、肛門性器ヘルペス感染症の割合の増加はＨＳＶ−１感染に起因するとされており、これは若い女性及び男性と性行為を有する男性（ＭＳＭ）の間で特に顕著である（２−４；）。ＨＳＶ−２に感染したほとんどの人は症状が診断されていないので、ほとんどの性器ヘルペス感染症は感染に気づかない人又は感染が起きたときに無症状の人によって伝播される。性器ＨＳＶの管理は、性器病変の急性エピソードの治療のみに焦点を合わせるのではなく、疾患の慢性的な性質に対処する必要がある（５）。
【０００４】
抗ウイルス化学療法は、ほとんどの症状のある患者に臨床上の利点を提供し、管理の柱である。性器ヘルペスの自然経過、性的及び出生時感染、並びに感染を減らす方法に関するカウンセリングは、臨床管理に不可欠である。
【０００５】
全身性抗ウイルス薬は、最初の臨床的及び再発性のエピソードを治療するために使用されるとき、又は日々の抑制療法として使用されるときに、性器ヘルペスの徴候及び症状を部分的に制御することができる。しかしながら、これらの薬物は潜伏性ウイルスを根絶することも、薬物が中止された後の再発の危険性、頻度、又は重症度に影響を及ぼすこともない。無作為化試験では、３つの抗ウイルス薬：アシクロビル、バラシクロビル、及びファムシクロビルが性器ヘルペスに臨床的利益をもたらすことが示されている（６−１４）。バラシクロビルはアシクロビルのバリンエステルであり、経口投与後に吸収を増強する。
【０００６】
ファムシクロビルはまた、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。これらの薬は治療的ではないが、ヘルペスの発生の痛みを軽減し、ウイルス排出の期間を短縮する可能性がある。抗ウイルス薬による局所療法は、最小限の臨床上の利益を提供し、推奨されていない。
【０００７】
症候性の最初のエピソードの性器ＨＳＶ−２感染を伴うほとんど全ての人が、その後に性器病変の再発性エピソードを経験し；再発は最初の性器ＨＳＶ−１感染後は頻度が少ない。間欠性の無症候性の排出は、性器のＨＳＶ−２に感染している人で、たとえ長年の又は臨床的に無症状な感染をしている人でも起こる。再発性器ヘルペスの抗ウイルス療法は、再発の頻度を減らすため、又は一時的に（ｅｐｉｓｏｄｉｃａｌｌｙ）改善するか若しくは病変の持続期間を短縮するための抑制療法として投与することができる。軽度又は低頻度の再発を伴う患者を含む一部の患者は、一時的な（ｅｐｉｓｏｄｉｃ）抗ウイルス療法の恩恵を受ける。多くの人が抑制療法を好むが、それには感染しやすいパートナーへの性器ＨＳＶ−２感染のリスクを減らすというさらなる利点がある（１５、１６）。抑制療法は、頻繁に再発する患者で性器ヘルペス再発の頻度を７０〜８０％減少させ（１２〜１５）、このような治療報告を受けている多くの人は、症状の発生を経験していない。アシクロビルによる療法を６年間、バラシクロビル又はファムシクロビルによる療法を１年間毎日受けている患者の有効性が実証されている。一時的（ｅｐｉｓｏｄｉｃ）治療ではなく抑制療法を受ける、頻繁に再発する多くの患者で生活の質が改善される（１７−１８）。
【０００８】
毎日のバラシクロビル５００ｍｇによる治療は、感染源のパートナーが性器ＨＳＶ−２感染の既往歴を有する、不一致な（discordant）、異性カップルにおいてＨＳＶ−２の感染を低下させる。
【０００９】
静脈内（ＩＶ）アシクロビル療法は、重度のＨＳＶ疾患又は入院を必要とする合併症（例えば、播種性感染症、肺炎、又は肝炎）又はＣＮＳ合併症（例えば、髄膜脳炎）を有する患者に提供されるべきである。
【００１０】
抗ウイルス治療を受けている患者において病変が持続又は再発する場合は、ＨＳＶ耐性が疑われるべきであり、ウイルス分離株が感受性試験のために得られる。交差耐性はアシクロビル、バラシクロビル及びファムシクロビルの間で知られている。アシクロビルに対する耐性がある場合は、ホスカルネットが代替となり得る。実際、この薬は異なる作用機序を有し（ウイルスＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ阻害剤）、交差耐性の可能性が低い。抗ウイルス薬耐性の臨床管理は、ＨＩＶ感染者の間で依然として困難であり、他の予防的アプローチを必要とする。
【００１１】
妊娠中の性器ヘルペス：出産時期近くで性器ヘルペスに感染した女性の間で、感染した母親から新生児への伝染のリスクは高く（３０％−５０％）、再発性ヘルペスの出生前の既往歴がある女性、又は妊娠の前半に性器ＨＳＶに感染した女性（１９−２０）の間で低い（１％未満）。出産時の母体病変の母体ウイルス学的検査により実証され、又は母体病変の観察によって推定されるような出生時にＨＳＶに曝露された新生児は、皮膚や粘膜に限定された疾患、又は中枢神経系も関与する高リスクの播種性疾患を発症する可能性がある。
【００１２】
新生児ヘルペスの予防は、妊娠後期の性器ＨＳＶ感染の獲得の予防と、出産時の新生児のヘルペス性病変及びウイルス排出への曝露の回避の両方に依存する。
【００１３】
帝王切開分娩は新生児へのＨＳＶ感染のリスクを完全に排除するわけではないが、分娩開始時に性器ヘルペス病変が再発した女性は新生児ＨＳＶ感染のリスクを減らすために帝王切開分娩によって分娩するべきである。
【００１４】
アシクロビルは、初期症状の性器ヘルペス又は再発性ヘルペスの妊婦に経口投与することができ、重症のＨＳＶ感染症の妊婦には静脈内投与する必要がある。妊娠後期のアシクロビルの抑制的治療は、満期時の再発頻度を減らすことによって、性器ヘルペスを再発している女性の帝王切開分娩の頻度を減らす。しかしながら、そのような治療は全ての場合において新生児への感染を予防することはできない（２１）。
【００１５】
結論として、抗ウイルス療法はＨＳＶ感染を治療するために利用可能であるが、これは患者の８０％でのみ有効であり、それは耐性を誘発し、交差耐性が、ＨＳＶのＳＴＤ治療ガイドラインで推奨されているたった３種類の抗ウイルス製品、すなわち、アシクロビル、バラシクロビル及びファムシクロビル、及び第４の製品、第２選択としてのホスカルネットの間で報告されている。ペンシクロビル及びガンシクロビルなどの他の抗ウイルス剤が最近市販されるようになったが、それらの新しい薬剤は満たされていない医学的必要性を完全には満たしていないようである。さらに、これらの製品は、用量及び時間に関連した重症度により、腎臓毒性、肝臓毒性、及び神経毒性を含む、いくつかの臓器に対する一定レベルの毒性を有する。これは、抑制療法を達成するために患者を生涯にわたって治療する必要性を考えると、さらに問題となり得る。従って、有効性と安全性の両方の観点から新しいアプローチが必要である。
【００１６】
特に抗ウイルス薬に対する耐性の場合に、抗ＨＳＶ療法を改善する方法が、ＨＳＶ１ウイルスを、実験室株又は臨床分離株の何れかで、アシクロビル、シドフォビル又はホスカルネットに対するそれらの感受性又は耐性とは無関係に、中和することができるマウスヒト化抗ＨＳＶ抗体を構築したＫｒａｗｃｚｙｋら（２２）により提案されている。その抗体はそれらの患者の治療を改善するかもしれないが、しかしそれは２つの未解決の問題を残す：第１に、それは、ＨＳＶ２ウイルス、実験室株及び臨床分離株の両方に対して活性が低く、ＨＳＶ２を中和するためにＨＳＶ１よりも高い濃度を必要とする。さらに、マウスのヒト化抗体であるため、ヒトに固有の免疫原性を与えられており、長期使用の可能性は予測できない。
【００１７】
それゆえ、ヘルペス感染症との闘いにおける新規な戦略及び選択肢の必要性がますます感じられている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＩｇＧＡが異なる濃度のＡＣＶの阻害効果をどのように有意に増大させるかを示すグラフである。
【図２】図２は、ＩｇＧＡとＡＣＶの組み合わせの相乗作用を示す。
【図３】図３は、異なる薬物の組み合わせに関連した異なるＣＩ値を示す表である。
【図４】図４は、好ましい用量減少をもたらすＩｇＧＡ／ＡＣＶの組み合わせを示すグラフである。
【図５】図５は、ＨＳＶ−１におけるＩｇＧＡとホスカルネットの異なる薬物の組み合わせに関連するＣＩ値を示す。
【図６】図６は、ＨＳＶ−２におけるＩｇＧＡとホスカルネットの異なる薬物の組み合わせに関連するＣＩ値を示す。
【図７】図７は、ＨＳＶ−１におけるＩｇＧＡとペンシクロビルの異なる薬物の組み合わせに関連するＣＩ値を示す。
【図８】図８は、ＨＳＶ−２におけるＩｇＧＡとペンシクロビルの異なる薬物の組み合わせに関連するＣＩ値を示す。
【図９】図９は、ＨＳＶ−１におけるＩｇＧＡとガンシクロビルの異なる薬物の組み合わせに関連するＣＩ値を示す。
【図１０】図１０は、ＨＳＶ−２におけるＩｇＧＡとガンシクロビルの異なる薬物の組み合わせに関連するＣＩ値を示す。
【００１９】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法及び他の科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図している。いくつかの場合において、一般に理解されている意味を有する用語は、本明細書において明確さのために及び／又は容易に参照するために定義される。従って、本明細書中のそのような定義の包含は、当該技術分野において一般に理解されているものに対する実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
【００２０】
本明細書における「生理学的に許容される賦形剤」という用語は、それ自体のいかなる薬理学的効果も持たず、哺乳動物、好ましくはヒトに投与したときに有害反応を生じない物質を指す。生理学的に許容される賦形剤は当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第６版２００９に開示されている。
【００２１】
本明細書における「同時、別々又は逐次投与」という用語は、第一及び第二化合物を同時に若しくは２つの化合物が同時に患者の体内で作用するように投与すること、又は１つの化合物を他の化合物の後に治療効果を提供するように投与することを指す。いくつかの実施態様では、化合物は食事と共に摂取される。他の実施態様では、化合物は食事の後、例えば食事の３０分後又は６０分後に摂取される。いくつかの実施態様では、一つの化合物をある期間にわたって患者に投与し、続いて他の化合物を投与する。
【００２２】
本明細書で使用される場合用語「ＨＳＶ」は、単純ヘルペスウイルスを指す。２つの型のＨＳＶ、すなわち、類似の特徴を示すＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２がある。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体及びその断片は、ＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２に結合し、そしてＨＳＶ感染を阻害し得る。
【００２４】
ＨＳＶ−１及び／又はＨＡＳ−２に結合する抗体の「断片」という用語は、Ｆａｂ、又は対応する抗体に対してより小さいサイズを有する単鎖抗体断片「ｓｃＦｖ断片」を指す。
【００２５】
「Ｆａｂ断片」（断片抗原結合）及び「Ｆａｂ２断片」という用語は、隣接する重鎖のＦｃ断片に結合した軽鎖からなる免疫グロブリン断片をいい、そのような断片は一価抗体である。Ｆａｂ部分が対になっているとき、その断片はＦａｂ２と呼ばれる。
【００２６】
用語「ｓｃＦｖ断片」（単鎖可変断片）は、関係する抗原とのみ結合することができる免疫グロブリン断片を指す。ＳｃＦｖ断片はまた、ペプチドリンカーを用いて二量体（ダイアボディ）、三量体（トリアボディ）及び四量体（テトラボディ）に合成され得る。
【００２７】
本発明の目的のために、各抗体領域は以下の対応する配列番号を有する。
配列番号１は、Ｆａｂ  Ｅｘ２としても同定されるＶＨ１抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号２は、Ｆａｂ  Ｅｘ２としても同定されるＶＨ１抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号３は、Ｆａｂ  Ｅｘ２としても同定されるＶＨ１抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号４は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｂとしても同定されるＶＨ３抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列に対応し、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｉとしても同定されるＶＨ５１の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号５は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｂとしても同定されるＶＨ３抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号６は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｂとしても同定されるＶＨ３抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応し、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｉとしても同定されるＶＨ５１の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号７は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｃとしても同定されるＶＨ５抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号８は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｃとしても同定されるＶＨ５抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号９は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｃとしても同定されるＶＨ５抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１０は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｈとしても同定されるＶＨ４７抗体の重鎖（ＶＨ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１１は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｈとしても同定されるＶＨ４７抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１２は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｈとしても同定されるＶＨ４７抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列に対応する；
配列番号１３は、Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｉとしても同定されるＶＨ５１抗体の軽鎖（ＶＬ）可変領域のアミノ酸配列に対応する。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
重鎖及び軽鎖がそれぞれ単鎖抗体中に存在する順序は逆転してもよく、従って、単鎖抗体は、重鎖−軽鎖又は軽鎖−重鎖によって形成され得、その活性を鎖の並び順に基づいて先験的に予想することはできない。
【００３０】
発明の説明
本発明者らはこの程、驚くべきことに、非常に低い濃度でＨＳＶ１及びＨＳＶ２の両方に結合し中和することができる完全ヒトモノクローナル抗体と抗ウイルス剤を含む組み合わせは、性器ヘルペス感染症の治療に特に有効であることを実証した。
【００３１】
特に、本発明において開示された実験の結果は、特定濃度のヒトモノクローナル抗体と抗ウイルス剤の併用投与は、組み合わせの効果が単独でとられた２つの有効成分の効果の合計より優れているという意味で相乗的であることを示している。
【００３２】
投与されたヒトｍＡｂが動物由来ｍＡｂと比較して副作用をもたらす非自己分子として認識され得るという非常に低い危険性を与える完全ヒトｍＡｂは、動物由来ｍＡｂより確実に好ましい。さらに、ウイルスに感染した対象によって産生された抗体は、真の複製形態のウイルスによって誘発されるが、動物の免疫化は、通常、精製タンパク質又は非複製形態のウイルスの注射からなる。結果として、天然宿主において誘発された抗体は、通常、より強い活性を有し、そして立体構造エピトープに対するものであり、通常はウイルスエスケープ変異体の出現の影響を受けにくい。
【００３３】
従って、本発明の実施態様は、
ａ）重鎖（ＶＨ）可変領域及び軽鎖（ＶＬ）可変領域と配列番号３、配列番号６、配列番号９及び配列番号１２からなる群から選択される相補性決定領域（ＣＤＲ）の両方を含む、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片、及び
ｂ）及び抗ウイルス剤
を含み；成分ａ）と成分ｂ）との間の重量比が１０００〜０．０１であることを特徴とする組み合わせである。
【００３４】
好ましくは成分ａ）と成分ｂ）との間の重量比は１００〜０．１、より好ましくは１０〜０．１である。
【００３５】
好ましい実施態様では、本発明の組み合わせは、逐次投与、同時投与、又は別々の投与のためのものである。
【００３６】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片における本発明のさらに好ましい態様において、前記重鎖（ＶＨ）可変領域は、配列番号１、配列番号４、配列番号７及び配列番号１０からなる群から選択されるか、又はそれらの相同体である。
【００３７】
本発明によれば、重鎖可変領域の相同体は、好ましくは前記ＶＨ可変領域と少なくとも９５％の全配列類似性、相同性又は同一性を有する配列を指す。前記相同体は、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の全配列類似性又は相同性を有する。
【００３８】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片における本発明のさらに好ましい実施態様では、前記軽鎖（ＶＬ）可変領域は、配列番号２、配列番号５、配列番号８及び配列番号１１からなる群から選択されるか、又はそれらの相同体である。
【００３９】
本発明によれば、軽鎖可変領域の相同体とは、好ましくは前記ＶＬ可変領域と少なくとも９５％の全配列類似性、相同性又は同一性を有する配列を指す。前記相同体は、少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％の全配列類似性又は相同性を有する。
【００４０】
好ましくは、前記抗体は、配列番号１の重鎖（ＶＨ）可変領域及び配列番号２の軽鎖（ＶＬ）可変領域を有する。
【００４１】
さらに好ましい実施態様では、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２結合モノクローナル抗体又はその断片は、ＩｇＧ  １重鎖定常領域又はＩｇＧ  ２重鎖定常領域を有する。
【００４２】
好ましくは前記モノクローナル抗体はヒト抗体である。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様では、抗ウイルス剤は、アシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル、ホスカルネット、イバシタビン、シドフォビル、バルガンシクロビル、バラシクロビル又はファムシクロビルから選択され、好ましくはアシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル又はホスカルネットから選択される。
【００４４】
さらなる実施態様は、医薬として使用のための本発明による組み合せである。
【００４５】
さらなる実施態様は、性器ヘルペス、ＨＳＶ歯肉口内炎、及び再発性口唇ヘルペス、単純ヘルペス脳炎（ＨＳＥ）、新生児ＨＳＶ、免疫不全宿主におけるＨＳＶ疾患、及びＨＳＶ角膜炎又は角結膜炎から選択されるヘルペスウイルス感染症の治療における本発明の組み合わせの使用である。
【００４６】
好ましくは、前記ヘルペスウイルス感染症は、ＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２関連疾患である。さらなる実施態様では、本発明による組み合せの有効成分は、ＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２関連疾患の治療における使用のために同時に、別々に又は逐次的に投与することができる。すなわち、本発明の組み合せの有効成分は、各有効成分について異なる投与経路及び各有効成分について異なる投与時間に従っても、同時に、別々に又は逐次的に投与することができる。
【００４７】
一実施態様では、本発明の組み合わせは、経口的に、直腸的に、非経口的に又は全身的に投与される。
【００４８】
さらなる実施態様では、本発明による組み合せの有効成分は、同じ投与経路を用いて、又は異なる投与経路を用いて一緒に投与することができ、そうでなければ、それらは同じ投与経路又は異なる投与経路で別々に投与することができる。
【００４９】
好ましい実施態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、月に１回の注射で非経口投与され、抗ウイルス剤は、１日に５回まで、３０日間、好ましくは１０から１５日間、より好ましくは一週間経口投与される。
【００５０】
好ましい実施態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、筋肉内、静脈内若しくは皮下注射の形態で、０．１μｇ／Ｋｇ〜５０μｇ／Ｋｇ体重の範囲の投与量で全身投与され、抗ウイルス剤は、２５〜５０００ｍｇ、好ましくは１００〜２５００ｍｇ、より好ましくは２５０〜２０００ｍｇの範囲の投与量で経口投与され、又は１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で、好ましくは５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で非経口投与される。
【００５１】
好ましくは、モノクローナル抗体又はその断片は、１μｇ／Ｋｇから１５μｇ／Ｋｇ体重の範囲の投与量で筋肉内又は皮下に投与される。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様では、抗ウイルス剤はアシクロビルであり、それは毎日１０００〜１６００ｍｇの範囲の投与量で経口的に、又は５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で非経口投与される。
【００５３】
さらに好ましい実施態様では、抗ウイルス剤はバラシクロビルであり、それは１日１０００〜２０００ｍｇの範囲の投与量で投与される。
【００５４】
本発明によれば、抗ウイルス剤がホスカルネットである場合、４０〜６０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の投与量で静脈内投与され、抗ウイルス剤がファムシクロビル又はペンシクロビルである場合、１日２５０〜１０００ｍｇの範囲の投与量で経口投与され、抗ウイルス剤がガンシクロビルであるとき、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量で投与される。
【００５５】
さらなる実施態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤などから選択される液体又は半固体製剤の形態で局所投与される。
【００５６】
好ましい実施態様では、抗ウイルス剤は経口組成物又は非経口液剤の形態で全身投与される。
【００５７】
さらに好ましい実施態様では、抗ウイルス剤は、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤などから選択される液体又は半固体製剤の形態で局所投与される。
【００５８】
さらなる実施態様では、モノクローナル抗体又はその断片と抗ウイルス剤の両方を同じ製剤中で全身的又は局所的に投与することができる。
【００５９】
これらの製剤の例は、注射用バイアル又は液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤などを含む局所製剤であり得る。
【００６０】
以下の実施例は本発明を説明するために含められ、本発明を限定するものではない。
【００６１】
実験セクション
以下の実験のセクションで、我々は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に結合し中和するモノクローナル抗体の同定を開示する。手順は次のように要約できる：
１．対象のポリクローナル血清の分析；
２．ＩｇＧ２画分の精製；
３．血清から精製されたＩｇＧ２の量の評価；
４．ＨＳＶに対するＩｇＧ２結合及び中和活性の評価；
５．対象の選択；
６．選択された対象からのＩｇＧ２ライブラリー構築；
７．ライブラリーの検証及びバイオパニングの最適化；
８．凍結及び解凍におけるＦａｂ産生後に選択されたＩｇＧ２抗体クローンの予備スクリーニング；
９．Ｆａｂ  ＩｇＧ２クローンの精製、配列決定及びＨＳＶに対する中和活性の予備評価；
１０．Ｆａｂ  ＩｇＧ１へのクローンの変換；
１１．ＩｇＧ１形質転換クローンの精製及び配列決定；それらの中和活性の網羅的かつ定量的な評価（全てのクローンについて中和活性を評価したが、中和活性の網羅的かつ詳細な評価はＦａｂ−Ｅｘ２についてのみ行われた）。  
【００６２】
対象の選択：基準及び結果
選択した対象コホート由来の末梢血サンプルから、ＩｇＧ２画分を収集し、検出し、精製した。  
【００６３】
選択基準は以下のとおりであった：
１）ＩｇＧ２の高含有量、２）ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２を認識する能力、及び３）ＨＳＶ再活性化の病歴。  
【００６４】
対象番号１８からの血清は、全ての前述の第一の選択基準を満たすことができる唯一のサンプルであった。対象番号１８は、最近の、かつ自発的な臨床的改善と共に、口唇ＨＳＶの頻繁な再活性化の以前の病歴を報告した。  
【００６５】
選択された対象からのＩｇＧ２画分の精製及び特徴づけ
対象番号１８の血清から精製された大量のＩｇＧ２、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＨＳＶ−１及び２の両方を認識するその能力を考慮して、この対象の精製ＩｇＧ２のＨＳＶ−１及び２感染を中和する能力を調べるために、この対象を選択した。ドナー番号１８からのＩｇＧ２画分を、下記の材料及び方法セクションに記載のプロトコル（ＩｇＧ２精製及び定量プロトコル）を用いて精製した。  
【００６６】
【表２】
2019525928.tif 000004
【００６７】
対象番号１８由来のＩｇＧ２画分（ｐＩｇＧ２−１８）は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方に対して異常な中和活性を示した。特に、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２試験ウイルスに対するｐＩｇＧ２−１８中和活性を、定性アッセイ（明視野位相差光学顕微鏡及び免疫蛍光アッセイによる合胞体形成評価）及び定量アッセイ（プラーク減少アッセイ及び間接免疫蛍光（ＩＩＦ）による定量的中和活性評価）の両方を用いて評価及び確認した。
【００６８】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２抗原に対する抗ＨＳＶヒトモノクローナル抗体Ｆａｂ断片の選択と生成及び配列特徴づけ
ａ．選択された対象からのファージミドＩｇＧ２  Ｆａｂライブラリーの構築
対象番号１８は、その血清から精製されたＩｇＧ２画分により示される、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２試験分離株に対する高い中和活性、並びにＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２感染ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞における合胞体形成の阻害のためにＢリンパ球供給源として選択された。
【００６９】
対象番号１８から、そのＢリンパ球を単離するために、新しい血液サンプルを採取した。これらの細胞からｍＲＮＡを抽出して逆転写した後、ＩｇＧ２  ＨＣ（重鎖）及びＬＣ（軽鎖）をファージミドベクターにクローニングした（Ｌ  Ｓｏｌｆｏｒｏｓｉら、「ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの生成及びモノクローナル抗体断片の分子クローニングのために最適化されたファージディスプレイベクター」（２０１２）Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ３５（３）、２８９−２９４）。
【００７０】
ヒトコンビナトリアルファージディスプレイ抗体ライブラリーは、下記の材料及び方法のセクションに記載のようにして得た。
【００７１】
ｂ．ライブラリーバイオパニング条件：ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方を認識し中和することができる抗ＨＳＶヒトモノクローナル抗体の分子選択、並びにクローニングを可能にするバイオパニング条件の開発
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方を交差認識し中和することができるヒトＦａｂ断片のクローニングは、そのような生物学的特性を特徴とするヒトＦａｂの分子クローニングを可能にする最適化バイオパニング手順によって得られた。選択ラウンドのスクリーニングは、以下の材料及び方法のセクションに記載されるように凍結融解手順によって行った。
【００７２】
この選択戦略から、５つのヒトモノクローナルＩｇＧ２  Ｆａｂ断片、すなわち以下が生成された。
Ｆａｂ  Ｅｘ２：配列番号１及び配列番号２に対応する；
Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｂ：配列番号４及び配列番号５に対応する；
Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｃ：配列番号７及び配列番号８に対応する；
Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｈ：配列番号１０及び配列番号１１に対応する；
Ｆａｂ  Ｅｘ２Ｉ：配列番号４及び配列番号１３に対応する。
【００７３】
これら５つのモノクローナルＩｇＧ２  Ｆａｂ断片を選択し、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２感染細胞に対するＩＩＦにおいて試験した。選択されたクローンは全てＨＳＶ−１とＨＳＶ−２の両方の感染細胞を選択的に認識した。
【００７４】
選択されたＩｇＧ２（Ｇ２）Ｆａｂの産生及びアフィニティークロマトグラフィー精製
選択されたＦａｂを原核生物系で産生させ、以下の材料及び方法のセクションに記載のようにアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【００７５】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対する精製選択クローンの生物活性評価
精製Ｆａｂ（Ｅｘ２（Ｇ２）、Ｅｘ２Ｂ（Ｇ２）、Ｅｘ２Ｃ（Ｇ２）、Ｅｘ２Ｈ（Ｇ２）及びＥｘ２Ｉ（Ｇ２）を標準量のＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２分離株と共にプレインキュベートした（１０μｇ／ｍＬ）。適切な実験対照も含まれた。異なる「感染混合物（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｍｉｘ）」を用いてＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を感染させた（培地交換前に２時間吸着）。
【００７６】
２０時間後、細胞単層を、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２分離株の両方に対するＦａｂの生物学的活性の初期定性的評価を可能にするクリスタルバイオレット含有溶液を用いて、固定し、透過処理した（材料及び方法のセクションに記載の手順）。合胞体形成の減少を明視野位相差光学顕微鏡により評価した。既に述べたように、このアッセイはＦａｂ効力の初期評価を可能にした。全てのＦａｂは、ＨＳＶ−１及び２分離株の両方に対して良好な中和活性を示した。Ｅｘ２Ｃ（Ｇ２）及びＥｘ２Ｈ（Ｇ２）のみが、Ｅｘ２（Ｇ２）及び他のＦａｂと比較した場合、ＨＳＶ−２に対してより低い効力を示した。
【００７７】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２（５つのＦａｂ）の両方に対するＩｇＧ２選択Ｆａｂ断片のＩｇＧ１  Ｆａｂへの変換、発現及び産生
原核生物及び真核生物（全ＩｇＧ１）産生系の両方において発現率を最適化するために、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方に対する全ての選択されたＩｇＧ２−ＦａｂをＩｇＧ１  Ｆａｂに首尾よく変換した。選択されたＦａｂに属する重鎖（ＨＣ）及びＬＣ上の可変領域は、ＩｇＧ１の定常領域（ＣＨ１）を含有する修飾ベクターへのクローニングに成功した（材料及び方法のセクションに記載の手順）。明示的に又は（Ｇ２）によって示されていない場合、この特許に記載されているＦａｂは、記載されているようにＩｇＧ１に変換されたＩｇＧ２  Ｆａｂである。
【００７８】
ＩｇＧ２選択Ｆａｂを特徴づけるために使用された全ての手順は、選択されたＦａｂのＩｇＧ１形態を特徴づけるために繰り返され、ＩｇＧ２及びＩｇＧ１  Ｆａｂフォーマットのそれぞれの生物学的特性を比較することを可能にした。
【００７９】
生物学的活性アッセイから、ＩｇＧ１変換Ｆａｂが依然として高い効力でＨＳＶ−１及び２分離株の両方を認識及び中和することができることを実証することが可能であった。さらに、Ｆａｂ  Ｅｘ２のＩｇＧ１フォーマットがその元のクローンフォーマットと比較して増加した効力でＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方を中和することを示すことが可能であった。
【００８０】
実施された生物学的アッセイを以下に示す：
【００８１】
合胞体形成評価：ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対するＩｇＧ１フォーマットのＦａｂクローンの活性を評価するために行われた定性的アッセイ。
定性的アッセイ（材料及び方法のセクションに記載）が、選択された抗ＨＳＶ−１及び２  ＦａｂのＩｇＧ１フォーマットに対して行われた（図１１）。これらのアッセイは、選択されたＦａｂのＩｇＧ１フォーマットもまたＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方を中和することができることを示した（表２）。
【００８２】
【表３】
2019525928.tif 000005
【００８３】
抗ＨＳＶ−１及び２中和Ｆａｂ（ＩｇＧ１フォーマット）を用いて実施した定量アッセイ
これらのアッセイは、選択された抗ＨＳＶ  Ｆａｂパネルの効力を定量するために行われた。ＨＳＶ−１及び２に対する全てのＦａｂ生物学的活性は、ＩＩＦ分析によって最初に評価された。
【００８４】
Ｆａｂ  Ｅｘ２、Ｅｘ２Ｂ、Ｅｘ２Ｃ、Ｅｘ２Ｈ及びＥｘ２Ｉの中和活性を、全ＦａｂのＩＣ  ５０を計算し、用量反応曲線を得るために、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒ自動計数システムを使用して評価した。用量反応曲線を得るために、異なるＦａｂのいくつかの希釈物を使用した。生物学的化合物限界希釈を使用することでのみウイルス感染を阻害することができる正確な量のＦａｂを得ることが可能であったので、中和実験の全てのセットにおいて、数回のＦａｂ希釈を実施した。
【００８５】
さらに、同じ「用量反応」曲線により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦａｂ効力を効果的に表すＦａｂ  ＩＣ５０の計算が可能になった。ＩＣ５０は、標準量のウイルス（ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２）による細胞単層の感染に起因する細胞損傷を５０％減少させることができるＦａｂ濃度である。
【００８６】
言い換えれば、低いＩＣ５０は、ウイルス感染を阻害するために非常に少量のＦａｂが必要とされることを意味する（データ非表示）。
【００８７】
Ｆａｂ  Ｅｘ２のＩＣ５０を以下に要約する：
【００８８】
【表４】
2019525928.tif 000006
【００８９】
ＩｇＧ１  Ｆａｂ  Ｅｘ２中和活性の網羅的試験
Ｆａｂ  Ｅｘ２は、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２に対して最も有望な結果を示した。
【００９０】
その生物学的活性をさらに特徴づけそして確認するために、以下の材料及び方法のセクションに記載される手順に従っていくつかの中和実験を行った。
【００９１】
合胞体形成アッセイによる定性的中和活性評価
このアッセイは、Ｆａｂ  Ｅｘ２の存在下又は非存在下で細胞変性効果（細胞形態の完全な破壊）の存在／非存在を評価することを可能にするＦａｂの有効な効力を示す。
【００９２】
Ｆａｂ  Ｅｘ２の効力を評価するために、異なる希釈を用いた定性的アッセイを実施した。３つの異なる濃度のＥｘ２（１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び２．５μｇ／ｍｌ）を合胞体形成アッセイによりＨＳＶ−１及び２に対して試験した。Ｆａｂ  Ｅｘ２は、ＨＳＶ−１感染により引き起こされる細胞破壊及び合胞体形成を用量依存的に強く阻害することができ、そして非常に低い濃度でＨＳＶ−２感染を完全に阻害することができた。
【００９３】
細胞単層の感染前にＦａｂ  Ｅｘ２を同じ感染量のＨＳＶ−１又は２に異なる濃度で添加した場合、細胞形態破壊はＦａｂ  Ｅｘ２濃度に明らかに反比例した。
【００９４】
合胞体形成アッセイの阻害に関してＦａｂ  Ｅｘ２について観察された極めて良好な結果は、下記のＦａｂ  Ａ中和効力の定量的評価と一致する。
【００９５】
プラーク減少アッセイによる定量的中和活性評価
用量反応定量アッセイ：Ｆａｂ  Ｅｘ２の存在下又は非存在下でのＨＳＶ感染による細胞単層上の溶解プラークの存在を評価することによって、Ｆａｂ  Ｅｘ２のＨＳＶ感染を阻害する能力を評価した。ＩＩＦ中和データを確認するために、定量的評価としてプラーク減少アッセイを実施した。
【００９６】
文献に広く記載されているように、プラークアッセイは、ＨＳＶ感染に対する中和活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価のための選択実験として考えられ、現在ｍＡｂ  ＩＣ５０の評価のための至適基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）である。
【００９７】
ＨＳＶ−１及び２に対するＦａｂ  Ｅｘ２の生物学的活性の用量依存的な定量的評価は、前述の定性的結果を裏付けるだけでなく、Ｆａｂ  Ｅｘ２の効力が予想外に高いことも示した。実際、グラフに明らかに示されているように、非常に低い濃度（１μｇ／ｍＬ）でさえも、Ｆａｂ  Ｅｘ２は、ＰＦＵ（プラーク形成単位）として測定されたＨＳＶ−１プラーク形成を阻害した。さらに、ＨＳＶ−１中和アッセイは、定性的用量依存アッセイによって既に証明されているように、Ｆａｂ  Ｅｘ２用量反応効果を示した。        
【００９８】
Ｆａｂ  Ｅｘ２の非常に高い効力のために、用量反応効果は、ＨＳＶ−２分離株を用いて行われた中和アッセイによって測定することができなかった。
【００９９】
選択されたＦａｂクローンの配列研究及び遺伝子使用分析
選択されたＦａｂからのＨＣ及びＬＣの両方の配列は、全ての鎖が正しくフレーム上にあり、それらの発現レベルに影響を及ぼし得る終始コドンがないことが明らかにされた。
【０１００】
免疫グロブリン配列の参照データベース（ＩＭＧＴ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を用いて行われた遺伝子使用分析は、選択されたクローンの、それらの生殖系列配列と比較した場合の変異率の予備試験を可能にした（表４）。
【０１０１】
それぞれの生殖系列配列と比較した場合、選択された全てのＦａｂクローンは、それらのＣＤＲ（相補性決定領域）において変異している。これは、異なるクローンが抗原との接触後に成熟する独特の体細胞変異を示すことを意味する。
【０１０２】
これは、通常、より特異的な抗原認識を可能にする。
【０１０３】
【表５】
2019525928.tif 000007
【０１０４】
ＩｇＧＡとして同定された、完全ＩｇＧ１へのＩｇＧ１  Ｆａｂ  Ｅｘ２の変換
単鎖抗体Ａ（ＳｃＦｖＡ）の産生及び評価
ＩｇＧＡのＳｃＦｖ遺伝子を首尾よく構築し、発現ベクターにクローニングした。ＩｇＧＡのＳｃＦｖフォーマットの小規模生産を行った。ＳｃＦｖ  Ａの結合活性は、ＨＳＶ感染細胞に対するＩＩＦアッセイによって評価した。ＳｃＦｖ  ＡはＨＳＶ感染細胞を認識することができた。しかしながら、ＳｃＦｖ  Ａは、高いＩＩＦバックグラウンドシグナル及び低い結合を示した。
【０１０５】
Ｆａｂ  Ｅｘ２：配列番号１及び配列番号２に対応する。
【０１０６】
ＩｇＧＡの生物学的活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
臨床分離株に対する中和活性
ＦａｂＡ又はＩｇＧＡの中和活性は、ＩｇＧＡをウイルスと共にプレインキュベート（３７℃で１時間）し、ＩｇＧＡ／ウイルス混合物を細胞単層に添加することにより、評価した。
結果
ＩｇＧ  Ａは、試験した全てのＨＳＶ−１及び２試験分離株を強力に中和する。重要なことには、中和アッセイを実施するために使用されたＨＳＶ分離株は、アシクロビル（ＡＣＶ）抗ＨＳＶ薬に対する異なる感受性を与えられていた。ＩｇＧＡが前述のＨＳＶ分離株を中和する能力は、ＩｇＧＡの異常な生物学的活性が異なるＨＳＶ試験分離株によって示されるＡＣＶに対する感受性とは完全に無関係であることを示し、ＡＣＶ耐性分離株によって引き起こされるＨＳＶ感染の治療に対するＩｇＧＡの使用の可能性を示唆する。
【０１０７】
感染の吸着後阻害の評価
宿主内でのウイルス能動的複製の開始後に、ＨＳＶ感染の治療のためのＩｇＧ  Ａの可能な投与について推測するために、吸着後アッセイが開発されてきた。  
【０１０８】
ＦａｂＡ又はＩｇＧＡのＨＳＶ後吸着評価を含む実験的アプローチの第一段階は、ＦａｂＡ又はＩｇＧＡで以前に処理されていない標準量のＨＳＶでのＶＥＲＯ  Ｅ６細胞の感染である。
【０１０９】
ＦａｂＡ又はＩｇＧＡは、ウイルス感染から３０分後に感染した細胞に添加される。次いで、ＶＥＲＯ  Ｅ６細胞上のＨＳＶ溶解プラークを評価するために、感染を４８時間実施する。実験結果は、ウイルス実験陽性対照と比較して、（ＨＳＶ感染後）ＦａｂＡ又はＩｇＧＡを受けた感染細胞についてプラークを数えることによって評価した。
【０１１０】
吸着後アッセイで試験したＦａｂは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２で試験した分離株に対してそれぞれ５０及び２００μｇ／ｍＬの濃度で使用されている＊。
【０１１１】
吸着後アッセイで試験したＩｇＧはＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２で試験した分離株に対してそれぞれ２５及び１００μｇ／ｍＬの濃度で使用されている＊。
＊科学文献から推定されるｍＡｂ濃度
【０１１２】
結果
吸着後アッセイによって実証されるように、ＩｇＧＡは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方の新規感染事象について強力に阻害し、またウイルス対照と比較してプラークをもたらす感染病巣の数も阻害する。ＩｇＧＡ阻害強度は、ＦａｂＡで観察されたものよりも高かった（図１５Ｂ）。
【０１１３】
細胞間感染メカニズムの阻害
ＨＳＶ感染戦略のうち、重要なものはいわゆる「細胞間」感染戦略である。
【０１１４】
ＦａｂＡ又はＩｇＧＡで処理又は未処理の感染細胞から生じるプラーク領域を測定することにより、「細胞間」感染の阻害におけるＩｇＧＡの寄与を評価するために、吸着後アッセイを行った。吸着後の細胞間感染阻害アッセイで試験されたＦａｂもまた、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２で試験された分離株に対してそれぞれ５０及び２００μｇ／ｍＬの濃度で予備的に使用されている＊。
【０１１５】
吸着後の「細胞間」感染阻害アッセイで試験したＩｇＧも、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２で試験された分離株に対してそれぞれ２５及び１００μｇ／ｍＬの濃度で予備的に使用されている＊。
＊科学文献から推定されるｍＡｂ濃度
【０１１６】
結果
吸着後アッセイによって実証されるように、Ｆａｂ  Ａは、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の両方についてプラーク領域を阻害する。プラーク領域のＩｇＧＡ阻害は、Ｆａｂ  Ａ阻害活性よりもさらに高い。これらのデータは、ＩｇＧＡ感染後投与が「細胞間」ＨＳＶ感染もまたいかに強力に阻害し得るかを明らかに実証した。
【０１１７】
ｍＡｂＡの選択圧下におけるエスケープ変異体の出現の評価  
ＩｇＧＡの選択圧下で生成されたエスケープウイルス変異体の存在を評価するために、ＨＳＶ−１感染ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞を漸増濃度のＦａｂ  Ａで処理した。より詳細には、ＶＥＲＯ細胞は、以前の報告（「ウイルス増殖技術」）で広く記載されている実験条件でＴ２５フラスコ中で培養された。次に細胞単層を５０ｐｆｕ／ｍＬの無細胞ウイルスを用いてＨＳＶ−１  ＨＦ株に感染させた。ウイルスが完全に吸着した後、感染した細胞を０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬのＩｇＧＡで３日間処理した。実験対照、無関係のＩｇＧ（０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬの濃度）及びウイルス「単独」も実験に含められた。新しい細胞感染ラウンドのために培地遠心上清を使用するために、３日後に感染細胞培地を集めそして遠心分離した。これらの新しい感染ラウンドは、０．２μｇ／ｍＬ及び１μｇ／ｍＬのＩｇＧＡ及び実験対照の存在下で行われた。上記の２つの濃度のＩｇＧＡ及び対照ＩｇＧの存在下で５回の連続した同一の感染ラウンドが行われた。次いで、最後の感染ラウンドの細胞上清を遠心分離し、そして増加した濃度のＩｇＧＡ（５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬ）の存在下で５回の新しい感染ラウンドを行うために使用した。ＩｇＧＡの一定の存在下で培養されたウイルスがＩｇＧＡ阻害活性からエスケープする能力を試験するために、ＩｇＧＡの存在下での最終感染に属する無細胞上清を、高ＩｇＧＡ濃度の存在下で３７℃で１時間インキュベートした。プレインキュベーション後、中和混合物を使用して、新たなＶＥＲＯ−Ｅ６細胞を感染させた。
【０１１８】
結果
ＨＳＶとプレインキュベートしたＩｇＧＡは依然としてウイルス分離株を中和することができ、これは５及び１０μｇ／ｍＬのＩｇＧＡ選択圧下で「エスケープ変異体」が生成されていないことを示している。
【０１１９】
これは、これらの実験で試験されたＨＦ  ＨＳＶ−１分離株は、（アッセイを実施するために使用された２つの濃度のＩｇＧＡの存在下で）我々の抗体によって認識される領域において、ＩｇＧ  Ａの抗ウイルス活性からのそのエスケープを可能にするアミノ酸変異をほとんど受けないことを示している。
【０１２０】
結論
ＩｇＧＡ選択圧下で「エスケープ変異体」は生成されなかった。この結果について考えられる説明は、次のようにまとめることができる：これらの実験で試験されたＨＦ  ＨＳＶ−１分離株は、（アッセイを実施するために使用された２つの濃度のＩｇＧＡの存在下で）ＩｇＧＡの抗ウイルス活性からのエスケープを可能にするアミノ酸変異を受けにくい。
【０１２１】
材料及び方法
真核細胞及びウイルス
ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞株を用いて、真核細胞での全ての実験手順を実施した。
ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞で培養したＨＳＶ−１分離株：ＨＦ株（ＶＲ−２６０  ＡＴＣＣ）
ＶＥＲＯ−Ｅ６細胞で培養したＨＳＶ−２分離株：ＭＳ株（ＶＲ−５４０  ＡＴＣＣ）。
【０１２２】
ＩｇＧ２画分検出プロトコールのためのＥＬＩＳＡ：
−  マイクロタイター９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ）を、陰性対照を含む、ＰＢＳで希釈した回収した血清でコーティングした（４℃で一晩）。
−  １％ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でプレートを（３７℃で１時間）インキュベートすることにより、非特異的部位をブロックした。
−  （０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ溶液）で洗浄後、市販のマウス抗ヒトＩｇＧ２特異的モノクローナル抗体を、製造業者の指示プロトコールに従って添加した（３７℃で１時間）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。
−  ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した（３７℃で４５分）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、ＴＭＢ基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、プレートを３７℃で５分間インキュベートした。
−  その後、１Ｎ硫酸を添加して、反応を停止させた。
−  シグナルを、４５０ｎｍの波長で検出した。
【０１２３】
ＩｇＧ２画分検出プロトコールのためのウェスタンブロット：
−  集めた血清を、２つの異なる希釈液（それぞれ１：１０及び１：１００）で、８％トリス−グリシンゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で分析した。
−  タンパク質を、４℃で３０Ｖで１５時間、ＰＶＤＦ膜（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に転写した。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含むＰＢＳ溶液中、４℃で一晩、膜をインキュベートすることにより、非特異的部位をブロックした。
−  ヒトＩｇＧ２に特異的な市販のマウスｍＡｂを、室温で１時間のインキュベーションのための一次試薬として使用した。
−  ０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。
−  ブロットを、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてプローブした（室温で４５分）。
−  ペルオキシダーゼ結合Ａｂを、スーパーシグナルウエストピコケミルミネセント基質（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて検出した。
【０１２４】
ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２被覆不活性化ウイルスに対するＥＬＩＳＡアッセイ
−  マイクロタイター９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ）を、陰性対照を含む、ＥＣＢで（１：１０）希釈した熱不活性化ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２でコーティングした（４℃で一晩）。
−  １％ＰＢＳ／ＢＳＡ溶液でプレートを（３７℃で１時間）インキュベートすることにより、非特異的部位をブロックした。
−  （０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ溶液）で洗浄後、ＰＢＳ／ＢＳＡで（１：２００）希釈した回収した血清を添加した（３７℃で１時間）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄する。
−  ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した（３７℃で４５分）。
−  ０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液で洗浄後、ＴＭＢ基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、プレートを３７℃で５分間インキュベートした。
−  次いで１Ｎ硫酸を添加し、反応を停止させた。
−  シグナルを、４５０ｎｍの波長で検出した。
【０１２５】
ＩｇＧ２精製及び定量プロトコール：
ＩｇＧ２画分を精製及び分析するために、選択した血清を２つの異なる工程を用いて精製した。初めに、全量のＩｇＧを、アフィニティーカラムを用いて精製した。次に、溶出した全ＩｇＧ含量を、ＩｇＧ２画分に特異的なアフィニティーカラムを用いてさらに精製した。
【０１２６】
ａ）全ＩｇＧアフィニティー精製カラムの調製：カラム１調製プロトコール
−  １ｍＬのｇａｍｍａｂｉｎｄセファロース樹脂（ＰＢＳ  １Ｘ−エタノール２０％中４℃で保存）を、３０−４０ｍＬのＰＢＳ  １Ｘで３回洗浄して、過剰のエタノールを除去した（室温で２５００ｒｐｍで５分間遠心し、２〜３回の加速及び減速）。
−  抗ヒトＩｇＧ（Ｃｆ＝４ｍｇ／ｍＬ）を樹脂に添加し、室温で９０分間穏やかに撹拌した。
−  樹脂を、１０容量（１容量＝樹脂１ｍＬ）の０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）で３回洗浄した。２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
−  最初の遠心分離の後、上清をさらなる分析のために回収した。
−  樹脂を１０容量の０．２Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）に再懸濁し、振とうした（ｓｈａｃｋｅｄ）。
−  プレ架橋結合試験のために少量のビーズを取り出した。
−  ＤＭＰ（ジメチル−ピメリミデート）を２０ｍＭ（最終濃度）まで添加した。この工程では、ＩｇＧと樹脂のタンパク質Ｇとの間で架橋が生じる。室温で３０分間穏やかに撹拌する。
−  ポスト架橋結合試験のために少量のビーズを取り出した。
−  １５分間遠心分離（２５００ｒｐｍ）した後、上清を除去し、樹脂を２０容量のエタノールアミン０．２Ｍ  ｐＨ８で洗浄した。
−  この工程を３回繰り返した。この工程は、新たな共有結合の安定化を可能にする。
−  次に樹脂を２０容量のエタノールアミン（０．２Ｍ、ｐＨ８）で洗浄し、室温で１２０分間穏やかに撹拌した。
−  １５分間の遠心分離（２５００ｒｐｍ）後、上清を除去し、樹脂を３０ｍＬ  ＰＢＳ  １Ｘで３回洗浄した。
−  １５分間の遠心分離（２５００ｒｐｍ）後、上清を除去し、ＮａＮ３（終濃度０．０５％）を添加した２０ｍＬのＰＢＳ  １Ｘを添加した。
−  樹脂を最後にクロマトグラフィーカラムに充填し、次いで４℃で保存した。
【０１２７】
ｂ）ＩｇＧ２画分アフィニティー精製カラムの調製：カラム２調製プロトコール
上記の全ＩｇＧ−アフィニティー精製カラムの調製のためのプロトコールを使用して、ＩｇＧ２画分の精製を可能にする新しいカラムを調製した。１つの改変をそのプロトコールに行った（上記のカラム１調製プロトコールの第２工程）。
特に：
−  市販のマウス抗ヒトＩｇＧ２Ｆｃモノクローナル抗体（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を、最終濃度３ｍｇ／ｍＬで樹脂に添加し、室温で９０分間穏やかに撹拌した。
【０１２８】
ｃ）アフィニティー精製法：カラム１／カラム２の工程
−  回収した血清を、「カラム番号１」（全ＩｇＧ精製カラム）において最初に精製した。簡単に言うと、異なる血清を室温でインキュベートした後、カラムをＰＢＳ１Ｘで洗浄して、非特異的血清タンパク質を溶出させた。次いで、カラムのｐＨを変えることによって（ｐＨ２．２）ＩｇＧ画分を溶出した。
−  溶出後、全ＩｇＧ含有溶液を中和し（ｐＨ７．０）、再び「カラム番号２」（ＩｇＧ２画分精製カラム）に充填した。カラム１の精製について記載したように、カラム２溶出サンプルを中和し、さらに分析するために４℃で保存した。
【０１２９】
ｄ）精製ＩｇＧ２の評価
上記のアフィニティーカラムは、ヒト血清からのＩｇＧ２の精製を可能にした。精製されたサンプルの質を評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを行い、続いてクマシー染色を行った：
−  サンプルを、４−１５％トリス−グリシンプレキャスト−ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分析した。
−  電気泳動を２００Ｖで１時間行った。
−  電気泳動ゲルを、クーマシーブルー溶液で２０分間染色した。
−  クマシー染色したゲルを、脱染色剤含有溶液中で２時間洗浄し、次いで、きれいな水道水で洗浄した。
【０１３０】
明視野位相差光学顕微鏡プロトコールによる合胞体形成評価：
−  １０４  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを、完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、９６ウェルプレート中にて、１００％コンフルエントまで増殖させた。
−  ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液（それぞれ３倍及び２倍希釈）を、３７℃で５％ＣＯ２下で１時間、最終容量１００μＬの完全ＤＭＥＭ中、異なる濃度（１０、５及び２．５μｇ／ｍＬ）の目的の精製Ｆａｂとプレインキュベートした。
−  実験対照も加えられた。
−  細胞をＰＢＳ  １Ｘ溶液で洗浄後、ウイルス溶液を単層に添加し、３７℃で５％ＣＯ２下で２時間、吸着のためにインキュベートした。
−  各ウェルをＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳを添加した完全ＤＭＥＭを各ウェルに添加して、３７℃で５％ＣＯ２下で２２時間インキュベートした。
−  細胞単層を固定し、７０％メタノール及び１％クリスタルバイオレットの１ｍＬの水性溶液で染色した。５分間インキュベート後に固定／染色溶液を除去し、次いで、細胞単層をＨ２Ｏで１回洗浄して乾燥させた。
−  合胞体形成の減少を、明視野位相差光学顕微鏡で評価した。特に、Ｆａｂ又はＩｇＧ１  Ｆａｂで処理したウイルスで感染させた細胞単層において観察された細胞形態を、ウイルス対照（精製ＩｇＧ２を含まない同量のウイルス）感染細胞の形態と比較した。
【０１３１】
定性免疫蛍光（ＩＩＦ）アッセイプロトコール：
−  １０４  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを、完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、９６ウェルプレート中にて、１００％コンフルエントまで増殖させた。
−  細胞を、中和アッセイで用いたのと同じＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液で感染させて、その後、ウイルス滴定について前述したように吸着及びインキュベーションを行った。
−  培地を除去し、細胞単層をＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、２００μＬ／ウェルの１：１＝アセトン：メタノール氷冷溶液で固定した。固定溶液を除去した。プレートを−２０℃で保存した。
−  ＩＩＦ染色を、市販の抗ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２  ｇＤ２タンパク質ｍＡｂを添加することによって行った（暗い多湿チャンバー中、３７℃で１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ１Ｘ中、５分）。
−  ＦＩＴＣ結合二次ｍＡｂを、一次染色液に添加した（暗い多湿チャンバー中、３７℃で１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ１Ｘ中、５分）。
−  核染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液を添加することによって行った（暗い多湿チャンバー中、３７℃で１５分）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ１Ｘ中、５分）。
−  感染病巣を、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒシステムで解析した。
【０１３２】
プラーク減少アッセイプロトコールによる定量中和活性評価：
−  ７ｘ１０５  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＣＳを補充した適切な完全培地中で増殖させた。実験は１００％コンフルエントの細胞を用いて行った。
−  ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液（それぞれ５倍及び４倍希釈）を、最終容量８００μＬの完全ＤＭＥＭ中、異なる濃度（５、２．５及び１μｇ／ｍＬ）で、目的の精製Ｆａｂと共に、３７℃で５％ＣＯ２下で１時間、プレインキュベートした。
−  実験対照も加えられた。
−  細胞をＰＢＳ  １Ｘ溶液で洗浄後、ウイルス溶液を単層に添加し、吸着のために３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。
−  各ウェルをＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳ及び１％アガロースを添加した２ｍＬの完全ＤＭＥＭを各ウェルに添加して、３７℃で５％ＣＯ２で４６時間インキュベートした。
−  アガロース層を除去し、細胞単層を固定し、７０％メタノール及び１％クリスタルバイオレットの１ｍＬの水性溶液で染色した。５分間インキュベート後に固定／染色溶液を除去し、次いで、細胞単層をＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、乾燥させた。
−  次いで、プラーク形成単位（ＰＦＵ）を計数することによって中和活性を評価した。特に、Ｆａｂ処理したウイルスで感染させた細胞単層におけるＰＦＵ数を、ウイルス対照（同量のウイルス）について計数したＰＦＵと比較した。
【０１３３】
間接免疫蛍光（ＩＩＦ）アッセイプロトコールによる定量中和活性評価：
−  １０４  Ｖｅｒｏ細胞／ウェルを、完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、９６ウェルプレート中にて、１００％コンフルエントまで増殖させた。
−  ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ウイルスストック希釈液（それぞれ４倍及び２倍希釈）を、３７℃及び５％ＣＯ２下で１時間、最終容量１００μＬの完全ＤＭＥＭ中、異なる濃度の目的の精製Ｆａｂと共にプレインキュベートした。
−  実験対照も加えられた。
−  細胞をＰＢＳ  １ｘ溶液で洗浄後、ウイルス溶液を単層に添加し、３７℃で５％ＣＯ２下で２時間、吸着のためにインキュベートした。
−  各ウェルをＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、次いで、２％ＦＣＳを添加した完全ＤＭＥＭを各ウェルに添加して、３７℃で５％ＣＯ２下で２２時間インキュベートした。
−  培地を除去し、細胞単層をＰＢＳ  １Ｘで１回洗浄し、２００μＬ／ウェルの１：１＝アセトン：メタノール氷冷溶液で固定した。固定溶液を除去した。プレートを−２０℃で保存した。
−  ＩＩＦ染色を、市販の抗ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２ｍＡｂを添加することによって行った（暗い多湿チャンバー中、３７℃で１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ  １Ｘ中、５分）。
−  ＦＩＴＣ結合二次ｍＡｂを、一次染色液に添加した（暗い多湿チャンバー中、３７℃で１時間）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ  １Ｘ中、５分）。
−  核染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ溶液を添加することによって行った（暗い多湿チャンバー中、３７℃で１５分）。
−  プレートを２回洗浄した（ＰＢＳ  １Ｘ中、５分）。
−  次いで、ＩｎＣｅｌｌＡｎａｌｙｚｅｒシステムで免疫蛍光感染病巣を計数することにより中和活性を評価した。
−  異なるＦａｂ調製物で処理したウイルスで感染させた細胞単層における感染病巣の数を、ウイルス対照（同量のウイルス）について計数した感染病巣と比較した。
−  次いで、中和の割合を評価し、平均からの標準偏差も計算した（実験をトリプリケートで行った）。
【０１３４】
ヒトコンビナトリアルファージディスプレイ抗体ライブラリー構築プロトコール：
血液細胞分離のために設計されたフィコールグラディエント（ｆｉｃｏｌｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）溶液であるＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（Ｓｉｇｍａ）を用いて、血液サンプルからＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を分離した。
Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、単離したリンパ球からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ  ＡＭＶ（Ｒｏｃｈｅ）用のトランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キットを製品マニュアルの指示に基づいて用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【０１３５】
以前に得られたｃＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして用いた。特に、Ｓｏｌｆｏｒｏｓｉら（２０１２）の、「ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製及びモノクローナル抗体断片の分子クローニングのために最適化されたファージディスプレイベクター」Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ３５（３），２８９−２９４に記載の特定のプライマーセットを用いて、ＩｇＧ２サブクラスに属する免疫グロブリンの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）の増幅を行った（プライマー配列についてはＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  １のセクションを参照のこと）。
【０１３６】
全ての増幅されたＨＣ及びＬＣを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた電気泳動アガロースゲル「泳動」の後に精製した。精製工程後、両鎖も定量し（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００、ハイスループット、全スペクトルマイクロボリュームＵＶ−Ｖｉｓ測定、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、選択された制限酵素で消化して（酵素消化反応混合物を説明する次の２つの表で強調されている通り）、それらを既に記載したプロトコールに従って、ｐＣＭベクターにクローニングした（Ｓｏｌｆｏｒｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）「ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製及びモノクローナル抗体断片の分子クローニングに最適化されたファージディスプレイベクター」Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ３５（３），２８９−２９４）。
【０１３７】
より詳細には、ＬＣ及びｐＣＭを、表５に示すプロトコールに従って、ＳａｃＩ及びＸｂａＩ制限酵素（ＮＥＢ）で消化した：
【０１３８】
【表６】
2019525928.tif 000008
【０１３９】
消化は、３７℃で、それぞれ４５分（ベクター）及び３時間（ＬＣ）行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ  Ｓａｆｅ染色によって調べた。
正しい分子量（それぞれ３５００及び６７０ｂｐ）を示す消化されたｐＣＭ及びＬＣ  ＤＮＡを、アガロースゲルから抽出し、精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）し、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温にて２時間）。次いで、ライゲーション産物を用いて、エレクトロコンピテント細胞（大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。
【０１４０】
次いで、ＬＣを含むｐＣＭ（ｐＣＭＬｃ）を、形質転換細胞から精製した（ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  キット、Ｑｉａｇｅｎ）。
【０１４１】
消化条件を示す次の表で説明するように、ｐＣＭＬｃベクター及び以前に増幅したＨＣも消化した。
【０１４２】
ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）を、以下の表６のように用いた。
【０１４３】
【表７】
2019525928.tif 000009
【０１４４】
消化を、３７℃で、それぞれ４５分（ベクター）及び３時間（ＨＣ）行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ  Ｓａｆｅ染色によって調べた（図１０）。
【０１４５】
正しい分子量（それぞれ４０００及び７３０ｂｐ）を示す、消化したｐＣＭ及びＨＣ  ＤＮＡを、アガロースゲルから抽出し、精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）し、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温で２時間）。次いで、ライゲーション産物を用いて、「自家製（ｈｏｍｅｍａｄｅ）」ＸＬ−１  Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞を形質転換した。
【０１４６】
その後、形質転換された細胞から、ＬＣ及びＨＣを含むｐＣＭ（ｐＣＭＬｃＨｃ）を精製した（ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  キット、Ｑｉａｇｅｎ）。
【０１４７】
バイオパニングプロトコル：
１日目
−  ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞のアリコートを、ライブラリーＤＮＡで形質転換する。
−  ２ｍＬのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び２０ｍＭ  グルコース）中で撹拌しながら３７℃で６０分間回収した後、それを、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び２０μｇ／ｍＬのアンピシリン（「Ｌｏｗ  Ａｍｐ」）を含む１０ｍＬのＳＢ培地（３．２％トリプトン、２％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム−ｐＨ：７．０±０．２）に添加する。
−  ライブラリー滴定：Ｔｅｔ−Ａｍｐ寒天プレート上に１０−２から始まって１０−５まで連続希釈して播種。
−  ３７℃で６０分間、撹拌しながらＬｏｗ  Ａｍｐをインキュベートする。
−  １００μｇ／ｍＬのアンピシリン（「Ｈｉｇｈ  Ａｍｐ」）を含む５０ｍＬのＳＢ培地を添加し、３７℃で６０分間、撹拌しながらインキュベートする。
−  １０１２ＰＦＵ（プラーク形成単位：単位体積当たりにプラークを形成することができる粒子の数の測定）のヘルパーファージ（自家製の生産及び滴定）を添加し、３７℃で６０分間、撹拌しながらインキュベートする。
−  ７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加し、３０℃で一晩（ＯＮ）インキュベートする。
−  ファージの親和性選択のためのプレート調製
Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞をＣｏｓｔａｒ（商標）９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、４ｘ１０４細胞／ウェルで、各感染について４ウェル、播種し、３７℃で５％ＣＯ２下で一晩（ＯＮ）インキュベートする。翌日、ＨＳＶ−１（ＨＦ株）ストックを、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭで１０−２希釈し、細胞上に播種して２時間吸収させる。次いで、培地含有培地をＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳと交換し、プレートを、３７℃で、５％ＣＯ２下で、２０時間インキュベートした。感染した細胞を、室温で１５分間、４０μＬ／ウェルのパラホルムアルデヒド溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＣ固定緩衝液−ＦＢ００１）を用いて固定した。インキュベーション時間の後、溶液を１００μＬ／ウェルのＰＢＳと交換した。
【０１４８】
２日目
−  次の式を用いて１日目のファージ力価を計算する：１０４ｘ（希釈係数）ｘプレート上の（コロニー数）／μＬ。
−  １０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＳＢにＸＬ１−Ｂｌｕｅコロニーを接種し（各抗原について４ｍＬ、Ｏｕｔｐｕｔファージでの感染用に２ｍＬ及びＩｎｐｕｔファージ感染用に２ｍＬ）、３７℃で撹拌しながら、５５０ｎｍの波長での光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまで、インキュベートする。
【０１４９】
ファージ調製：
−  一晩（ＯＮ）の細菌培養増殖物の遠心分離（４℃で４０分間、ＲＣＦ：１５４０ｘｇ）後、８ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を含む滅菌５０ｍＬチューブに上清を注ぎ、氷上で３０分間インキュベートして、ファージを沈殿させる。
−  遠心分離後（４℃で２５分間、ＲＣＦ：１２１３０ｘｇ）、上清を捨て、１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ  １％溶液でペレットを静かに再懸濁する。
−  遠心分離後（室温にて５分間、ＲＣＦ：２１３８０ｘｇ）、上清（「パニングされていない（ｕｎｐａｎｎｅｄ）ファージ」）を回収する。
【０１５０】
選択解除プロセス：
−  １００％コンフルエントのＴ７５フラスコから得られたＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の懸濁液を、室温にて１５分間、５００μＬのパラホルムアルデヒド溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＣ固定緩衝液−ＦＢ００１）を用いて固定した。インキュベーション時間後、細胞をＰＢＳ溶液で洗浄した。処理したＨＳＶ感染細胞を含むプレートに再懸濁したファージを添加する（選択工程）前に、ファージ溶液を、３７℃で６０分間、撹拌しながら、１．５ｘ１０６細胞／ウェルでプレインキュベートした（選択解除工程）。遠心分離後（室温にて２分間、ＲＣＦ：２１３８０ｘｇ）、次いで上清を回収し、固定され透過処理されたＨＳＶ感染細胞と共にプレートに添加した。
【０１５１】
パニング：
−  ３７℃で１２０分間、７０μＬ／ウェルのパニングされていないファージをインキュベートする。
−  各抗原の４つのウェルから「インプット（Ｉｎｐｕｔ）」として上清を集め、氷上で保存する。
−  ウェル毎に１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ０．５％溶液で、３７℃で、各１０回ピペッティングして１０回洗浄する。
−  ５０μＬ／ウェルの溶出緩衝液（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２）を添加し、１分間インキュベートし、ウェルの底から剥がし取る（ｓｃｒａｐｅ）。
−  溶出したファージを中和緩衝液（２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を用いて「アウトプット（Ｏｕｔｐｕｔ）」として集め、氷上で保存する。
【０１５２】
ＦａｂのＤＮＡライブラリーから得られたファージ集団から有意な抗原結合活性を有するクローンを高親和性選択で得るためには、通常５回の選択ラウンド（６日間）が必要である。
【０１５３】
重要なことに、最初のパニング選択ラウンドにおけるＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２感染細胞上のファージ抗体ライブラリーの交差選択を行った。
【０１５４】
凍結及び融解手順を用いるスクリーニングプロトコール：
１日目：
−  ４及び５ラウンドのＨｉｇｈ  Ａｍｐから得られたＤＮＡを抽出し、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）で、３７℃で６０分間、二重消化する。
−  Ｆａｂに予め融合させたファージタンパク質（ｃｐＩＩＩ）から目的のＤＮＡ（ＨＣ及びＬＣの両方を含むプラスミド）を分離し、アガロース１％ゲル電気泳動（８５Ｖで３時間）を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて抽出する。
−  抽出したＤＮＡをＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションし、ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント（ｅｌｅｔｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞のアリコートを形質転換する。
−  ＳＯＣ培地での回収後、ＬＢ寒天上に播種する。
２日目：
−  １日目に得られたコロニーを、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬのＳＢ培地に１つずつ接種する。陰性対照として、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンのみを含む３ｍＬのＳＢ培地に、形質転換していないＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント（ｅｌｅｔｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞のコロニーを添加する。接種物を、３７℃で撹拌しながら、５５０ｎｍの波長での光学密度（ＯＤ）が０．５に達するまでインキュベートする。
−  ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド−Ｓｉｇｍａ  Ｉ６７５８）を１：１０００の推奨希釈で添加してＦａｂの産生を誘導し、３０℃で撹拌しながら、一晩（ＯＮ）インキュベートする。
３日目：
−  一晩（ＯＮ）の細菌培養物の遠心分離（４℃で２０分間、ＲＣＦ：１５４０ｘｇ）後、上清を捨て、ペレットを１ｍＬのＰＢＳに再懸濁する。
−  プロテアーゼ阻害剤を添加し、凍結及び融解手順に従って３回行う。
○  完全凍結するまでドライアイス上でインキュベートする
○  完全に融解するまで、３７℃で撹拌しながらインキュベートする。
−  遠心分離（室温にて１０分間、ＲＣＦ：２１３８０ｘｇ）後、タンパク質（Ｆａｂ）発現スクリーニングのために上清を使用し、ペレットをＤＮＡ抽出及び分析のために使用する。
【０１５５】
バイオパニング手順プロトコール中に選択されたＦａｂクローンの精製：
１日目
−  １０μＬのアンピシリン（Ｃｆ＝５０μｇ／ｍＬ、Ｃ．ストック＝１００ｍｇ／ｍＬ）及び２０μＬのテトラサイクリン（Ｃｆ＝１００μｇ／ｍＬ、Ｃ．ストック＝５ｍｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのＳＢ（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）に新鮮なプレートコロニーを接種し、回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）中、３７℃で一晩、インキュベートする。
２日目
−  ５００μＬのアンピシリン（Ｃｆ＝５０μｇ／ｍＬ、Ｃ．ストック＝１００ｍｇ／ｍＬ）及び１ｍＬのテトラサイクリン（Ｃｆ＝１００μｇ／ｍＬ、Ｃ．ストック＝５ｍｇ／ｍＬ）を含む５００ｍＬのＳＢ（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）に、５ｍＬの接種物を継代接種し（Ｓｕｂ−ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）、回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）中、３７℃で６−８時間、インキュベートする。
−  培養ＯＤが０．８−１（指数関数的増殖）に達したとき、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を、最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌで添加する。
−  回転シェーカー（１８０ｒｐｍ）中、３０℃で一晩インキュベートする。
３日目
−  清潔な２５０ｍＬボトルに細菌培養物を移す。
−  ４℃又は室温にて、遠心分離する（３５００−４５００ｒｐｍで２０−３０分間）。
−  細胞ペレットを最終容量２５ｍＬのＰＢＳ１Ｘに再懸濁し、ファルコン５０ｍＬチューブに入れ、プロテアーゼ阻害剤を添加し、ファルコンを４℃に置く。
−  ファルコンを氷上で維持し、細胞懸濁液を９０秒間超音波処理し、６０秒間休止する。これを３−４回繰り返す。
−  細菌溶解物をボトル（３０ｍＬ）に移す。４℃で１５，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離することにより細胞片を除去する。
−  シリンジ５０ｍＬを用いて上清を、０．４５μｍ、次いで０．２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ濾過する。濾液をファルコン５０ｍＬに集める。
−  ４℃で保存する。
【０１５６】
免疫アフィニティークロマトグラフィーでＦａｂを精製する：
−  ２０ｍＬ  ＰＢＳ１Ｘでカラムを洗浄する。２回繰り返す。
−  １０ｍＬの溶出緩衝液ｐＨ２．２で溶出する。
−  ＰＢＳ  １ＸでカラムのｐＨを再調整し、ｐＨを調べる。
−  カラムキャップを閉める。カラムにサンプルを、一度に２−４ｍＬ充填する。数分待って、カラムを再度開く。
−  ５０ｍＬのＰＢＳ１Ｘでカラムを洗浄する。
−  カラムキャップを閉じる。カラムに１０ｍＬの溶出緩衝液ｐＨ２．２を、一度に２−４ｍＬ充填する。数分待ち、カラムを再度開く。
−  中和緩衝液ｐＨ１１を含むファルコンに溶出液を集める。
−  ｐＨを確認し、中和緩衝液ｐＨ１１を用いて溶液を中和する（ｐＨ７−８）。
−  ＰＢＳ１ＸでカラムのｐＨを再調整する。
−  １０ｍＬの溶出緩衝液ｐＨ２．２で溶出する。
−  ＰＢＳ１ＸでカラムのｐＨを再調整し、ｐＨを確認する。
−  ２０ｍＬのＰＢＳ１Ｘ＋２００μＬのＮａＮ３１００Ｘを添加し、カラムを４℃で保存する。
【０１５７】
ＰＢＳ１ＸでＣｅｎｔｒｉｃｏｎを洗浄する：４０００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離する。その後、４０００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離して、Ｆａｂを濃縮する。
フィルターによって保持された精製されたＦａｂを採取し、４℃で保存する。
精製Ｆａｂの正確な発現及び濃度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／クマシー染色によって（ＩｇＧ２精製及び定量プロトコールで既に記載されているように）それぞれ計算した。
【０１５８】
ＩｇＧ２  Ｆａｂ断片のＩｇＧ１  Ｆａｂへの変換プロトコール
このクローニング手順は、ＩｇＧ１抗体のＨＣ及びＬＣ配列を既に含むｐＣＭベクター（Ｓｏｌｆｏｒｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）「ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの作製及びモノクローナル抗体断片の分子クローニングのために最適化されたファージディスプレイベクター」Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ  ３５（３），２８９−２９４）を用いて実行された。ＮｈｅＩ制限部位を、上記ＩｇＧ１−ＦａｂのＶＨ配列とＣＨ１配列の間に導入して、ＨＣのＶＨ断片のみの分子クローニングを可能にした。
【０１５９】
選択された抗ＨＳＶ  ＦａｂのＶＨ配列を、ＩｇＧ１−ＣＨ１とインフレームでクローン化した。より詳しくは、ＮｈｅＩ制限部位を、制限部位を含む特異的に設計されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、選択されたＦａｂ  ＶＨ配列の３’末端に付加した。
【０１６０】
全ての増幅したＶＨを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製工程後、ＶＨ鎖をまた定量し（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００、ハイスループット、ハイスループット、全スペクトルマイクロボリュームＵＶ−Ｖｉｓ測定器、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、選択された制限酵素で消化して、それらを既に記載したプロトコールに従って、発現ベクターにクローニングした。
【０１６１】
より詳しくは、増幅されたＶＨ及びベクターの両方を、表７のプロトコールに従って、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ制限酵素（ＮＥＢ）で消化した：
【０１６２】
【表８】
2019525928.tif 000010
【０１６３】
消化は３７℃で１時間行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ  Ｓａｆｅ染色で検査した。
正確な分子量（ＶＨ消化ベクターについて４４７４ｂｐ及びＶＨについて４２６ｂｐ）を示す消化産物を、アガロースゲルから抽出し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温で１０分間）。その後、ライゲーション産物を使用して、エレクトロコンピテント細胞（大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。
【０１６４】
その後、ＩｇＧ１−ＣＨ１（ｐＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ１）とインフレームにライゲーションされたＶＨを含むプラスミドを、形質転換細胞から精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、正しい挿入を、プライマーの特定のサブセットで目的の部分を配列決定して分析した。
【０１６５】
ｐＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ１構築物及びＨＳＶ  Ｆａｂパネルに属するＬＣもまた、消化条件を示す表８で説明したように消化した。
【０１６６】
【表９】
2019525928.tif 000011
【０１６７】
消化は３７℃で１時間行い、次いで、消化産物をＳｙｂｒ  Ｓａｆｅ染色で検査した。
正確な分子量を示す消化ｐＶＨ−ＣＨ１−ＩｇＧ１及びＬＣ  ＤＮＡ（それぞれ４２３０ｂｐ及び６７０ｂｐ）を、アガロースゲルから抽出し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、その後、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてライゲーションした（室温で１０分間）。その後、ライゲーション産物を使用して、ＸＬ−１  Ｂｌｕｅエレクトロコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。次いで異なる抗ＨＳＶクローン（ｐＶＨ−ＣＨ１＿ＬＣ−ＩｇＧ１Ｆａｂ）のＬＣ及びＨＣを含むプラスミドを、形質転換細胞から精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、正しい挿入を、プライマーの特定のサブセットで目的の部分を配列決定して分析した。
【０１６８】
クローニングプロトコールの段落に記載の通り、ＶＨ−ＨＣ及びＬＣの正しい挿入をチェックするために、全ての新しいＩｇＧ１  Ｆａｂクローンを配列決定した。
【０１６９】
ＳｃＦｖＡの構築
種々の形式のｍＡｂ  Ａ（又はＥｘ２）の特徴を広範囲に特徴づけるために、ｍＡｂを、単鎖抗体Ａ（ＳｃＦｖＡ）としても発現させた。
Ｆａｂ  Ａの可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）を増幅させ、単鎖（ＳｃＦｖ）の構築に用いた。
【０１７０】
ＳｃＦｖ遺伝子カセットは、以下からなる：
ａ）Ｆａｂ  Ａ  ＶＬ及びＶＨをコードするＤＮＡ
ｂ）リンカー領域［（Ｇｌｙｘ３Ｓｅｒ）ｘ３］をコードするＤＮＡ
ｃ）タンパク質ｔａｇ（ポリ−ヒスチジン）をコードするＤＮＡ。
【０１７１】
ＳｃＦｖ  Ｆａｂ  Ａ（Ｆａｂ  Ｅｘ２）遺伝子カセットを、以下の通りに構築した：
ａ）Ｆａｂ  Ａ  ＶＬ及びＶＨをコードするＤＮＡ
上記のように、軽鎖及び重鎖（それぞれＶＬ及びＶＨ）のＦａｂ  Ａ可変領域を、ｍＡｂ  Ａ軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡテンプレートからＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により首尾よく増幅させた。ＤＮＡテンプレートからｍＡｂ  Ａ  ＬＣ及びＨＣを増幅するために用いたプライマーは以下を含んでいた：
５’ＶＬ末端に、ＳｃＦｖ遺伝子カセット全体をベクターに挿入するために用いられる、制限部位ＳａｃＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）。
３’ＶＬ末端に、リンカー領域（リンカー重複領域）をコードするＤＮＡ配列の一部
５’ＶＨ部分に、リンカー領域（リンカー重複領域）をコードするＤＮＡ配列の一部
３’ＶＨ部分に、Ｈｉｓタグ及び発現ベクターへのＳｃＦｖ遺伝子カセット全体の挿入に使用するための制限部位ＳｐｅＩ（ＮＥＢ）をコードするＤＮＡ配列。上記の通り増幅された全ての遺伝子断片を、全長ＳｃＦｖ遺伝子カセットを構築するために重複ＰＣＲを実施するのに使用した。
【０１７２】
ｂ）リンカー領域［（Ｇｌｙｘ３Ｓｅｒ）ｘ３］をコードするＤＮＡ
リンカー領域（ＬＣとＨＣとの間）の主な機能は、構造的であり、特に［（Ｇｌｙ）３Ｓｅｒ］３からなるリンカー領域は、発現後に適当なＳｃＦｖ折り畳みを可能にする高い柔軟性を特徴とする。リンカー領域は、ＰＣＲ重複技術によってＶＬとＶＨとの間に付加されている。
ｃ）タンパク質タグ（ポリ−ヒスチジン）をコードするＤＮＡ
ポリ−ヒスチジンタグ領域（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）は、アフィニティークロマトグラフィーによるＳｃＦｖ精製の基本である。特に、この領域は、Ｈｉｓタグ含有タンパク質を精製するために常套的に使用されるＮｉ２＋ＮｉＮｔａ樹脂（市販されている、ＱＩＡＧＥＮ）によって選択的に結合される。ＨｉｓタグＤＮＡ配列は、ＳｐｅＩ制限部位を既に含む３’ＶＨプライマーにポリＨｉｓ  ＤＮＡをコードする配列を導入するＳｃＦｖ遺伝子カセットに付加されている。
【０１７３】
次いで、以下のプロトコールを用いて、遺伝子カセットをベクターにクローニングし、ＳｃＦｖＡを産生した：
１．ＳｃＦｖ含有ベクターによる細菌（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換
ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細菌を、ＳｃＦｖ  Ａ遺伝子カセットを含むベクターで（エレクトロポレーションにより）形質転換した。
２．ＳｃＦｖベクターを含む細菌の選択的培養
ＳｃＦｖベクターで正しく形質転換されたＸＬ１  Ｂｌｕｅ細菌を培養し、ベクターにより担持されるａｍｐｒ（アンピシリン耐性遺伝子）耐性マーカーにより、抗生物質（アンピシリン）で選択した。
３．ＳｃＦｖ発現誘導
ＳｃＦｖ  Ａの発現を、いわゆる「誘導因子」（ＩＰＴＧ）を、ＳｃＦｖ形質転換細菌を含む培養液に添加することによって誘導した。
４．培養細菌の超音波処理
誘導工程後に細菌によって産生されたＳｃＦｖを集めるために、ＳｃＦｖＡ発現細菌を超音波処理して、細菌壁を破壊し、細菌によって産生されたＳｃＦｖＡを放出させた。
５．無細胞上清を遠心分離して細胞片をペレット化する。超音波処理された細菌産物を、細菌細胞片をペレット化するために、完全に遠心分離した。
６．Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィー精製
工程５で得られた上清を回収し、ＨｉｓタグによりＳｃＦｖを精製するために、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーカラムに充填した。
７．ＳｃＦｖ収集
その後、精製ＳｃＦｖを集め、−２０℃で保存した。
【実施例】
【０１７４】
実施例１
ＩｇＧＡの選択圧下でのエスケープ変異体の出現の評価
５０ｐｆｕ／ｍＬの無細胞ウイルスを用いてＶＥＲＯ−Ｅ６単層をＨＳＶ−１  ＨＦ株に感染させた。ウイルスを完全に吸着させた後、感染した細胞を抑制濃度以下のＩｇＧＡ、すなわち０．２ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌで３日間処理した。
【０１７５】
実験対照は無関係のＩｇＧ（０．２ｍｇ／ｍｌ及び１ｍｇ／ｍｌの濃度で）又は無処置であった。３日後、感染した細胞培地を回収し、遠心分離し、そして上清を新しい細胞感染ラウンドのために合計５回の連続ラウンドで使用した。最後の感染ラウンドの細胞上清を遠心分離し、より高濃度のＩｇＧＡ（５ｍｇ／ｍｌ及びｍｇ／ｍｌ）の存在下で５回の新しい感染ラウンドを行うために使用した。最終感染ラウンドに属する無細胞上清を、高ＩｇＧＡ濃度の存在下、３７℃で１時間インキュベートした後、新しいＶＥＲＯ−Ｅ６細胞を感染させるために使用した。
【０１７６】
得られた結果は、ＨＳＶとプレインキュベートしたＩｇＧＡが依然としてウイルス分離株を中和することができることを実証し、５及び１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧＡ選択圧下で「エスケープ変異体」が生成されなかったことを示している。
【０１７７】
実施例２
ＩｇＧＡとアシクロビルの相乗作用の評価
ＩｇＧＡとアシクロビル（ＡＣＶ）の相乗作用を調べるために、異なる濃度のアシクロビルとＩｇＧＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで二重曲線アッセイで組み合わせて試験した。
【０１７８】
簡単に説明すると、異なるＩｇＧＡ濃度（０、１、１０、２５、５０μｇ／ｍｌ）を異なるＡＣＶ濃度（０、０．２５、０．５、１μｇ／ｍｌ）と混合し、ＨＳＶ感染の３０分後にＶＥＲＯ  Ｅ６細胞に添加した。４８時間インキュベートした後、感染細胞をクリスタルバイオレット／ＥｔＯＨで染色し、溶解プラークを数えた。結果は、アシクロビルと組み合わせたＩｇＧＡが、試験した異なる濃度でアシクロビルの阻害効果を有意に増大させることができることを示している（図１）。
【０１７９】
次いで、二重曲線アッセイで得られた結果をコンボシン（ＣｏｍｂｏＳｙｎ）分析（ニューヨーク州ニューヨークのメモリアルスローンケタリングがんセンターのＴｉｎｇ−Ｃｈａｏ  Ｃｈｏｕ及びマサチューセッツ州ケンブリッジのマサチューセッツ工科大学のＮｉｃｋ  Ｍａｒｔｉｎによる、薬物併用及び一般的な用量効果分析のためのＣｏｍｐｕＳｙｎ）でコンピュータ内で分析して、組み合わせ指数（ＣＩ）及び用量減少指数（ＤＲＩ）の計算を通して、ＩｇＧＡとＡＣＶとの間の潜在的相乗作用を評価した。
【０１８０】
Ｃｈｏｕ  ２００６（２３）による組み合わせ指数（ＣＩ）は、０．９〜１．１の範囲のほぼ相加的作用、０．９未満の相乗作用、０．１〜０．３の強い相乗作用及び０．１未満の非常に強い相乗作用を示す。１．１を超えるＣＩの値は拮抗作用を示す。
【０１８１】
ＣＩ計算は、ＩｇＧとＡＣＶとの全ての組み合わせが相乗作用をもたらすことを実証した（図２及び３）。この実験で得られた結果は、中程度から多量のＩｇＧＡと低用量のＡＣＶとの組み合わせにおける相乗作用を実証し、特にＡＣＶ腎毒性を患っている患者においてより低い濃度でのＡＣＶの有望な潜在的使用を示唆する。
【０１８２】
さらに、用量減少指数（ＤＲＩ）の結果は、ＩｇＧＡとアシクロビルの両方にとって非常に好ましい用量減少を示している（図４）。
【０１８３】
以下の実施例において、ＩｇＧＡ／ＡＣＶ混合物について以前に観察されたＩｇＧＡの相乗作用の評価は、ＦＯＳ（ホスカルネット）、ＰＣＶ（ペンシクロビル）及びＧＣＶ（ガンシクロビル）のような他の抗ヘルペス薬にも拡張されている。重要なことに、ウイルス感染後に使用する場合、相乗作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでウイルス播種及び細胞損傷を減少させるためのｍＡｂ／薬物混合物の能力を模倣した社内最適化ウイルス侵入後阻害アッセイを使用してＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２感染細胞に対して評価されている。
【０１８４】
実施例３
ＩｇＧＡとホスカルネットの相乗作用の評価
抗ＨＳＶ薬ホスカルネット（ＦＯＳ）と組み合わせたＩｇＧＡの可能な使用を試験するために、ＩｇＧＡ／ＦＯＳの組み合わせをＨＳＶ侵入後アッセイ（ウイルス侵入を可能にする３７℃で行われるアッセイ）で試験した。
【０１８５】
ＩｇＧＡ／ＦＯＳ併用活性評価における第一段階は、実施例２に既に使用されている２つの選択されたＨＳＶ分離株についての薬物感受性の評価であった。相乗的アッセイＦＯＳ／ｍＡｂを実施するために選択されたＦＯＳ濃度は、ＨＳＶ−１  ＬＶに対して０．５、２５及び１００ｍｇ／ｍｌ、そしてＨＳＶ−２  ＭＳに対して５、１０及び２５ｍｇ／ｍｌであった。ＩｇＧＡとＦＯＳとの間の相乗作用を評価するために、実施例２と同様に組み合わせ指数を計算した。
ＣＩ：組み合わせ指数
組み合わせ指数計算は、薬物の組み合わせの１つのみがＣＩ＞１を示したように、ＩｇＧＡとＦＯＳとの組み合わせが１つを除いて全て、ＨＳＶ−１試験分離株に対して相乗作用をもたらすことを実証した（図５）。さらに、低用量のＦＯＳと組み合わせて中程度から大量のＩｇＧＡを使用することによって相乗作用が得られる可能性があり、ＦＯＳ毒性を患っている患者にとって低濃度でのＦＯＳの使用の可能性を示唆している。
【０１８６】
組み合わせ指数計算は、ＩｇＧとＦＯＳとの組み合わせが３つを除いて全て、ＨＳＶ−２試験分離株に対して相乗作用をもたらすことを実証した（図６）。さらに、低用量のＦＯＳと組み合わせて大量のＩｇＧＡを使用することによって強力な相乗作用が達成される可能性があり、ＨＳＶ−２感染に対しても低濃度のＦＯＳの可能な使用を示している。これに関して、ＨＳＶ−２感染の７０％の阻害が、ＩｇＧＡ  ＭＩＣ  ５０（ＥＤ５０）にほぼ対応するＩｇＧＡの用量とＦＯＳのほぼ無効な用量（０．５μｇ／ｍＬ）とを組み合わせることによって達成されたことを指摘することは重要である。
【０１８７】
実施例４
ＩｇＧＡとペンシクロビルの相乗作用の評価
抗ＨＳＶ薬ペンシクロビル（ＰＣＶ）と組み合わせたＩｇＧＡの可能な使用を試験するために、いくつかのアッセイが行われた。重要なことには、上記の実験と同様に、組み合わせはＨＳＶ侵入後アッセイで試験されている。
【０１８８】
ＩｇＧＡ／ＰＣＶ併用活性評価の最初の工程は、２つの選択されたＨＳＶ分離株（ＨＳＶ−１  ＬＶとＨＳＶ−２  ＭＳ）の薬剤感受性の評価であった。相乗的アッセイを実施するために選択されたＰＣＶ濃度ＰＣＶ／ｍＡｂは、ＨＳＶ−１  ＬＶに対して０．５、０．７５及び１．５μｇ／ｍＬ、そしてＨＳＶ−２ＭＳに対して１．５、２、５及び７μｇ／ｍＬであった。ＩｇＧＡとＰＣＶとの間の相乗作用を評価するために、実施例２と同様に組み合わせ指数を計算した。
ＣＩ：組み合わせ指数
組み合せ指数計算は、ＩｇＧＡとＰＣＶとの全ての組み合わせがＨＳＶ−１に対して相乗作用をもたらすことを実証した（図７）。一つの組み合わせが強い相乗作用をもたらした。中程度から多量のＩｇＧＡを低用量のＰＣＶと組み合わせて使用することにより、高レベルの相乗作用を達成することができ、これはＨＳＶ−１に対する低濃度でのＰＣＶの治療的使用の可能性を示している。
【０１８９】
ＨＳＶ−２に対するｍＡｂＡ／ＰＣＶ「コンボ（ｃｏｍｂｏ）」活性からの組み合わせ指数計算は、ＩｇＧＡとＰＣＶとのほぼ全ての組み合わせが相乗作用をもたらすことを実証した：１つの非常に強い相乗効果と３つの強い相乗作用；２つの薬物の組み合わせのみがＣＩ＞１を示した（図８）。
【０１９０】
実施例５
ＩｇＧＡとガンシクロビルの相乗作用の評価
抗ＨＳＶ薬ガンシクロビル（ＧＣＶ）と組み合わせたＩｇＧＡの可能な使用を試験するために、いくつかのアッセイが行われた。重要なことには、上記の実験と同様に、組み合わせはＨＳＶ後吸着アッセイで試験されている。
【０１９１】
ＩｇＧＡ／ＧＣＶ併用活性評価の最初の工程は、２つの選択されたＨＳＶ分離株の薬剤感受性の評価であった。詳細には、ＨＳＶ−１  ＬＶ及びＨＳＶ−２  ＭＳは既に相乗作用試験に使用されているので選択されている。相乗的アッセイＧＣＶ／ｍＡｂを実施するために選択されたＧＣＶ濃度は、ＨＳＶ−１  ＬＶに対して０．０５、０．２５及び０．７５ｍｇ／ｍｌ、ＨＳＶ−２  ＭＳに対して０．０１、０．１及び０．５ｍｇ／ｍｌであった。実施例２に従って組み合わせ指数を計算した。
ＣＩ：組み合わせ指数
組み合せ指数計算は、ＩｇＧＡとＧＣＶとの組み合わせの、１つを除く全てがＨＳＶ−１に対する相乗作用をもたらすことを実証した（図９）。薬物の組み合わせの１つが、ＣＩ＞１を示した。さらに、異なる薬物コンボ（ｃｏｍｂｏ）について異なる相乗的レベルを同定することが可能であり、そのうちの４つは非常に強い相乗作用として分類された。しかしながら、この効果は、最高試験用量のＧＣＶと組み合わせて中程度から多量のＩｇＧＡを使用することによって達成することができた。
【０１９２】
ＨＳＶ−２について得られた組み合せ指数は、ＩｇＧＡとＧＣＶとの組み合せの大部分が相乗作用をもたらすことを実証しており（図１０）、特にＧＣＶ毒性を患っている患者において、低濃度でのＧＣＶの使用の可能性を示している。
【０１９３】
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【図１】
2019525928.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019525928.tif 000019
【図９】
2019525928.tif 000020
【図１０】
2019525928.tif 000021
【配列表】
2019525928000001.app
【国際調査報告】
2019525928.tif 000022
2019525928.tif 000023
2019525928.tif 000024