(57)【要約】  本発明は、（ａ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、及び（ｃ）細胞内シグナリングドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子に関する。本発明は、その核酸分子によってコードされるキメラ抗原受容体、その核酸分子を含むベクター、その核酸分子、ベクター又はＣＡＲを含む細胞、及び特にＣＬＥＣ１４Ａを発現する病態の治療におけるその核酸、ベクター又は細胞の治療的使用を更に提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子。
【請求項２】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を阻害する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａの残基９７〜１０８に結合し、ＣＬＥＣ１４Ａは、配列番号１に記載されるとおりのアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号２１３又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号２１５又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する、請求項１又は４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）（Ｓ／Ｔ）ＳＹＷ（Ｉ／Ｍ）（Ｅ／Ｈ）（配列番号１５０）、ＧＹＴＦ（Ｓ／Ｔ）ＳＹＷ（配列番号１５１）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）ＷＩＧ（Ｅ／Ａ）Ｉ（Ｌ／Ｙ）ＰＧ（Ｓ／Ｎ）（Ｇ／Ｓ）（Ｓ／Ｄ）Ｔ（Ｎ／Ｓ）（配列番号１５２）、Ｉ（Ｌ／Ｙ）ＰＧ（Ｓ／Ｎ）（Ｇ／Ｓ）（Ｓ／Ｄ）Ｔ（配列番号１５３）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）（Ａ／Ｔ）（Ｒ／Ｈ）（Ｇ／Ｘ）（Ｇ／Ｘ）（Ｄ／Ｘ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）（Ｅ／Ｇ）（Ｅ／Ｓ）（Ｙ／Ｄ）Ｙ（Ｖ／Ａ／Ｌ）ＭＤ（配列番号１５４）、（Ａ／Ｔ）（Ｒ／Ｈ）（Ｇ／Ｘ）（Ｇ／Ｘ）（Ｄ／Ｘ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）（Ｅ／Ｇ）（Ｅ／Ｓ）（Ｙ／Ｄ）Ｙ（Ｖ／Ａ／Ｌ）ＭＤＹ（配列番号１５５）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
（式中、Ｘは、アミノ酸残基なしである）
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４又は５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）Ｓ／Ｘ  Ｓ／Ｘ  Ｓ  Ｙ  Ｍ／Ｌ  Ｙ／Ｈ  Ｗ  Ｙ（配列番号１５６）、ＳＳＶＳ  Ｙ／Ｓ  Ｓ／Ｘ  Ｙ／Ｘ（配列番号１５７）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）Ｌ  Ｌ／Ｗ  ＩＹ  Ｄ／Ｓ  ＴＳＮＬＡ（配列番号１５８）、Ｄ／Ｓ  ＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）Ｑ／Ｈ  Ｑ  Ｗ／Ｙ  Ｓ／Ｈ  Ｓ／Ｒ  Ｙ／Ｓ  Ｐ  Ｌ／Ｒ（配列番号１６０）、Ｑ／Ｈ  Ｑ  Ｗ／Ｙ  Ｓ／Ｈ  Ｓ／Ｒ  Ｙ／Ｓ  Ｐ  Ｌ／Ｒ  Ｔ  Ｆ／Ｘ（配列番号１６１）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
（式中、Ｘは、アミノ酸なしである）
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１又は４〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号２０７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３２、配列番号４４又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３３、配列番号４５又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号３４、配列番号４６、配列番号１００、配列番号１０２又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号２０８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３５、配列番号４７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３６、ＤＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号３７、配列番号４９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３２、配列番号３３及び配列番号１１６、又は配列番号３２、３３及び／若しくは１１６のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号１１８、又は配列番号４４、４５及び／若しくは１１８のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｃ）配列番号３２、配列番号３３及び配列番号１００、又は配列番号３２、３３及び／若しくは１００のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｄ）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号１０２、又は配列番号４４、４５及び／若しくは１０２のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｅ）配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４、又は配列番号３２、３３及び／若しくは３４のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
（ｆ）配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６、又は配列番号４４、４５及び／若しくは４６のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、又は配列番号３５、３６及び／若しくは３７のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
（ｂ）配列番号４７、ＤＴＳ及び配列番号４９、又は配列番号４７、４９及び／若しくはＤＴＳのいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号１１６、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、又は配列番号３２、３３、１１６、３５、３６及び／若しくは３７のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号４４、配列番号４５、配列番号１１８、配列番号４７、ＤＴＳ及び配列番号４９、又は配列番号４４、４５、１１８、４７、４９及び／若しくはＤＴＳのいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｃ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号１００、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、又は配列番号３２、３３、１００、３５、３６及び／若しくは３７のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｄ）配列番号４４、配列番号４５、配列番号１０２、配列番号４７、ＤＴＳ及び配列番号４９、又は配列番号４４、４５、１０２、４７、４９及び／若しくはＤＴＳのいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、
（ｅ）配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７、又は配列番号３２、３３、３４、３５、３６及び／若しくは３７のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
（ｆ）配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、ＤＴＳ及び配列番号４９、又は配列番号４４、４５、４６、４７、４９及び／若しくはＤＴＳのいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１６又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２１８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１又は４〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号６４、配列番号７６又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６５、配列番号７７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号６６、配列番号７８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４〜７又は１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２２１又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４〜７、１５又は１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号６７、配列番号７９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号６８、ＳＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号６９、配列番号８１又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４〜７又は１５〜１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６、又は配列番号６４、６５及び／若しくは６６のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８、又は配列番号７６、７７及び／若しくは７８のいずれか１つ以上に１、２及び／又は３個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４〜７又は１５〜１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９、又は配列番号６７、６８及び／若しくは６９のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
（ｂ）配列番号７９、ＳＴＳ及び配列番号８１、又は配列番号７９、８１及び／若しくはＳＴＳのいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４〜７又は１５〜１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９、又は配列番号６４、６５、６６、６７、６８及び／若しくは６９のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体、又は
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、ＳＴＳ及び配列番号８１、又は配列番号７６、７７、７８、７９、８１及び／若しくはＳＴＳのいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体
を含むアミノ酸配列を有する、請求項１、４〜７又は１５〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
（ｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号１６７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｂ）配列番号１６８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｃ）配列番号１６９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｄ）配列番号１２９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、
（ｅ）配列番号６８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、及び／又は
（ｆ）配列番号１３０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ
の少なくとも１つを含む、核酸分子。
【請求項２３】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１２９、配列番号６８及び配列番号１３０、又は配列番号１２９、６８及び／若しくは１３０のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み、且つ／又は配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９、又は配列番号１６７、１６８及び／若しくは１６９のいずれか１つ以上に１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むアミノ酸配列を有する、請求項１又は２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号５６、配列番号１０４、配列番号１０６若しくは配列番号１２１、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
（ｂ）配列番号５７、配列番号１０５、配列番号１０７若しくは配列番号１２２、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２５】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号８８若しくは配列番号９０、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は
（ｂ）配列番号８９若しくは配列番号９１、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１、４〜７又は１５〜２１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１７３若しくはそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／又は配列番号１３３若しくはそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項２２又は２３に記載の核酸分子。
【請求項２７】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの重鎖可変領域と、３つのＣＤＲを含む少なくとも１つの軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２８】
前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号５８、配列番号１１２若しくは配列番号１２５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項１〜１４、２４又は２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２９】
前記ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号９６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む、請求項１、４〜７、１５〜２１又は２７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号３８、配列番号５０又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号３９、配列番号５１又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号４０、配列番号５２、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１１７、配列番号１２０又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含む、請求項１〜１４、２４、２７又は２８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号４１、配列番号５３又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号４２、ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号４３、配列番号５５又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含む、請求項１〜１４、２４、２７、２８又は３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号８２又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号８３又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号８４又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含む、請求項１、４〜７、１５〜２１、２７又は２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列
（ａ）配列番号８５又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）ＡＧＣＡＣＡＴＣＣ又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号８７又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含む、請求項１、４〜７、１５〜２１、２７、２９又は３２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号５９、配列番号１０８、配列番号１１０若しくは配列番号１２３、又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｂ）配列番号６０、配列番号１０９、配列番号１１１若しくは配列番号１２４、又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含む、請求項１〜１４、２４、２７、２８、３０又は３１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号６１、配列番号１１３若しくは配列番号１２６、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜１４、２４、２７、２８、３０、３１又は３４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号９２、配列番号９４又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｂ）配列番号９３、配列番号９５又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含む、請求項１、４〜７、１５〜２１、２７、２９、３２又は３３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号９７又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１、４〜７、１５〜２１、２７、２９、３２、３３又は３６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３８】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α又はＣＤ２８に由来し、且つ好ましくは配列番号１４６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζに由来し、且つ好ましくは配列番号１４８のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ及び／又はＢ７−Ｈ３のいずれか１つから好ましくは選択される少なくとも１つの共刺激ドメインを含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記膜貫通ドメイン及び前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８に由来する、請求項４０に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記ＣＡＲは、リーダー配列、好ましくは配列番号１３５のオンコスタチンＭリーダー配列、配列番号１６２によってコードされるＣＤ８αリーダー配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、及び／又は前記ＣＡＲは、好ましくはＣＤ８αに由来するヒンジ又はスペーサーを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記ＣＡＲは、
（ａ）配列番号６２、配列番号９８、配列番号１１４又は配列番号１２７のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、且つ／又は
（ｂ）配列番号６３、配列番号９９、配列番号１１５又は配列番号１２８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４４】
前記核酸分子は、ＲＮＡである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項４６】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の核酸分子を含み、且つ任意選択で、Ｔ細胞受容体分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター。
【請求項４７】
ウイルスベクター、好ましくはガンマレトロウイルスベクターである、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
自殺遺伝子、サイトカイン、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体及び／又はＣＤ３４分子、好ましくはトランケート型ＣＤ３４分子をコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項４６又は４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸、請求項４５に記載のＣＡＲ又は請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクターを含み、且つ任意選択で、Ｔ細胞受容体分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子又はベクターを含む細胞。
【請求項５０】
免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はナチュラルキラー細胞である、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
自殺遺伝子、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体又はサイトカインをコードする更なるポリヌクレオチド又はベクターを含む、請求項４９又は５０に記載の細胞。
【請求項５２】
療法における使用のための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５３】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患に対処するか又はそれを治療する方法。
【請求項５４】
ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態の治療における使用のための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態を治療する方法。
【請求項５６】
ＣＬＥＣ１４Ａ発現に関連する病態を治療するための医薬の製造における使用のための、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項５７】
前記ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態は、ＣＬＥＣ１４Ａを発現する固形腫瘍又は腫瘍血管新生である、請求項５４に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、請求項５５に記載の方法又は請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記核酸分子、ベクター又は細胞は、１つ以上の療法用薬剤、好ましくは（ｉ）抗癌剤、より好ましくはチラパザミン、（ｉｉ）ＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、（ｉｉｉ）（ｉｉ）の核酸分子を含むベクター、又は（ｉｖ）（ｉｉ）の核酸分子若しくは（ｉｉｉ）のベクターを含む細胞と併用して別個に、同時に又は逐次的に投与されるものである、請求項５４に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、請求項５５に記載の方法又は請求項５６に記載の使用。
【請求項５９】
前記ＴＣＲ分子は、ＷＴ１、好ましくはＨＬＡ  Ａ２／ＲＭＦＰＮＡＰＹＬに結合する、請求項５８に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、方法又は使用。
【請求項６０】
前記ＴＣＲ分子は、α鎖及びβ鎖であって、前記α鎖は、配列番号１９０のＣＤＲ１α、配列番号１９１のＣＤＲ２α及び配列番号１９２又は１９３のＣＤＲ３αを含み、前記β鎖は、配列番号１９４のＣＤＲ１β、配列番号１９５のＣＤＲ２β及び配列番号１９６又は１９７のＣＤＲ３βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、前記ＣＤＲの１つ以上は、１、２又は３個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含み、前記ＴＣＲ分子は、ＨＬＡ  Ａ２／ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ複合体への結合能を有する、請求項５９に記載の使用のための核酸分子、ベクター若しくは細胞、方法又は使用。
【請求項６１】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の細胞を含み、且つ任意選択で、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクター、又はＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子若しくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を含むベクターを含む細胞を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体、詳細にはＣＬＥＣ１４Ａに特異的に結合するキメラ抗原受容体に関する。本発明は、そのキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド並びにその受容体及び／又はそのコードポリヌクレオチドを含む細胞に更に関する。腫瘍血管新生及び／又は癌を阻害するための本発明のキメラ抗原受容体、ポリヌクレオチド及び／又は細胞の使用も包含される。
【背景技術】
【０００２】
血管の内側は、単層の内皮細胞で覆われており、これらの細胞が血流と周囲組織との界面を形成している。新生血管は、既存の小血管の壁から、血管新生と呼ばれる過程で内皮細胞が増殖することによって発達する。内皮細胞は、通常、創傷治癒における血管形成を除き、血管系の発達後に静止したままであり、新たな血管形成はない。しかしながら、固形腫瘍の成長中、新生毛細血管芽を作るよう内皮細胞の刺激を促す腫瘍による因子の分泌に応答して血管形成が起こり得る。腫瘍血管新生は、固形腫瘍の成長における律速過程として広く認識されており、従って腫瘍進行において重要な役割を果たす。血液供給を引き込まない腫瘍は、サイズが限られ、従って、このように腫瘍血管新生の防止又は制限は、固形腫瘍に対する治療選択肢となる。
【０００３】
腫瘍内の血管構造の内側を覆う内皮細胞は、正常組織の内皮細胞と比べて異なる細胞外環境に曝され得る。例えば、腫瘍の内皮細胞は、低酸素条件、栄養枯渇及び／又は高酸性条件を被り得る。更に、腫瘍内皮細胞は、血流速度の低下及び機械的圧迫の増加など、異なる機械的力を受け得る。腫瘍内皮細胞が異なる条件に曝される結果、正常組織の細胞と比べて異なるトランスクリプトームが呈示され、腫瘍内皮細胞において、正常な血管構造内の内皮細胞と比べて高いレベルで存在し得る腫瘍内皮マーカーの発現を伴うことになる。従って、腫瘍内皮細胞は、治療上、腫瘍内皮マーカーのターゲティングによって標的化し得る。
【０００４】
ＣＬＥＣ１４Ａは、１４型カルシウム依存性Ｃ型レクチンファミリーのメンバーであり（このファミリーには、エンドシアリン／ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、トロンボモジュリン及びＣＤ９３がメンバーとして更に含まれる）、シグナルペプチド（アミノ酸残基１〜２１）と、細胞外領域（アミノ酸残基２２〜３９８）と、膜貫通ドメイン（アミノ酸残基３９９〜４２１）と、細胞質ドメイン（アミノ酸残基４２２〜４９０）とを含む４９０アミノ酸長のＩ型１回膜貫通タンパク質である。ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域は、１つのＣ型レクチン様ドメイン（アミノ酸残基２２〜１７３）と、上皮成長因子様領域（アミノ酸残基２４５〜２８７）とを有する。ヒト及びマウスにおいて、ＣＬＥＣ１４Ａタンパク質は、６７％のアミノ酸配列同一性を示し、Ｃ型レクチン様及び上皮成長因子様ドメイン内で配列保存性がより高い。
【０００５】
本発明者らは、これまで、ＣＬＥＣ１４Ａが多くの一般的なヒト癌（乳癌、肝癌、前立腺癌、膵癌、膀胱癌及び卵巣癌を含む）の血管構造の内側を覆う内皮細胞の表面に高発現するが、健常組織の血管構造では発現が低いか又は検出不能であることを明らかにしている。血管の形成不良に起因して腫瘍血管構造に起こる低ずり応力条件がＣＬＥＣ１４Ａの上方制御の原因であり得ると考えられる。更に、ＣＬＥＣ１４Ａは、発芽血管新生において役割を果たすものとして、及びマウスにおける腫瘍成長を促進するものとして開示されている。従って、ＣＬＥＣ１４Ａは、これまで、腫瘍血管新生の阻害標的となり得る腫瘍内皮マーカーとして提案されている。
【０００６】
抗体又は免疫療法が幾つかの腫瘍型のターゲティングに有効であることが明らかになっている。１つのかかる免疫療法治療は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（腫瘍標的に特異的に結合することができ、且つ結合後に免疫細胞を活性化／刺激することができる受容体）による免疫細胞、詳細にはＴ細胞の修飾に基づくものである。原理的には、どのような細胞表面分子でもＣＡＲ免疫療法を用いて標的化することができ、従って自己抗原に対するトレランスを抑えて患者のＭＨＣ状態に依存しない治療を提供することができる。最近の試験では、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体を発現するように操作したＴ細胞を使用して、白血病及びリンパ腫患者において顕著な臨床応答が実証されている。ＣＡＲは、通常、可動性リンカーによってつながった重鎖と軽鎖とからなるモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が、次に膜貫通ドメインを介して細胞質シグナリングドメイン（通常ＣＤ３ζ鎖）に融合したものを含む。最近では、インビボでのＴ細胞生存を増強するため、これらの構築物にＣＤ２８又は４−１ＢＢなどの共刺激分子由来の追加的な細胞質ドメインが取り入れられている。共刺激分子由来の細胞質ドメインを１つ含むＣＡＲは、第２世代ＣＡＲとして知られ、各々が共刺激分子由来の細胞質ドメインを２つ含むＣＡＲは、第３世代ＣＡＲとして知られ、及び各々が共刺激分子由来の細胞質ドメインを２つ（又はそれを超えて）含むと共に、ＣＡＲをコードする核酸における追加的な遺伝子修飾の存在（例えば、サイトカイン遺伝子の存在）を伴うＣＡＲは、第４世代ＣＡＲとして知られる。他の遺伝子修飾、例えばサイトカイン遺伝子又は腫瘍部位における免疫抑制機構を回避するための遺伝子の付加もＣＡＲに対して行われている。ここで、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａを選択的に標的化するＣＡＲ免疫療法を開発した。これに関して、この免疫療法は、特にＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインに選択的に結合する抗体、詳細にはＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を妨げる抗体の結合ドメイン／活性を利用する。このように、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用が血管新生において重要な役割を果たすことを特定した（ＭＭＲＮ２は、ｅｍｉｌｉｎファミリーの内皮特異的マーカーであり、細胞外マトリックスの一成分である）。本発明者らは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン、詳細にはＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸残基９７〜１０８に結合する抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体によってＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を妨げ得ることを更に特定した。これに関して、本発明者らは、ＣＡＲ免疫療法においてＣＬＥＣ１４Ａのこれらのドメインを標的とする抗体の結合活性を主に用いており、例えば腫瘍サイズの低減において、かかる免疫療法を用いた有効な結果を実証している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様において、従って、本発明は、
（ｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有する、核酸分子を提供する。
【０００８】
詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を妨げる能力を有し得る。
【０００９】
従って、本発明によれば及び上記で考察したとおり、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインに結合する抗体の発見及び単離、並びにＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン内の特定のエピトープに結合する抗体がＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用（本発明者らが血管新生における関与を明らかにした）を妨げることが可能であるという知見に基づき、ＣＡＲ免疫療法が開発された。実施例において示すとおり、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインに結合する結合ドメインを組み込んだ幾つかのＣＡＲ免疫療法を作製して試験し、かかるＣＡＲ免疫療法が腫瘍サイズ及び容積の低減に有効であることを明らかにしている。４つの具体的な新規抗体（本明細書ではそれぞれＣＲＴ１、３、４及び５と記載され、そのＣＤＲ、重鎖及び軽鎖可変配列を表１に示す）が本発明者らによって同定されており（これらの抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有するものである）、本明細書に記載されるＣＡＲ免疫療法の開発では、本発明の具体的な療法例の提供にこれらの抗体のＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが用いられている。本発明のＣＡＲ療法を用いたときに生じる意外にも有効な結果は、ＣＡＲを用いたＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインのターゲティングが腫瘍血管新生に対する、従って癌に対する有効な治療をもたらし得ることを示している。更に、低ずり応力条件下におけるＣＬＥＣ１４Ａの上方制御の関連性により、本発明のＣＡＲ療法は、現在のところ有効な治療がほとんど利用可能でない血流が特に制限される腫瘍に対して、例えば膵腫瘍又は卵巣腫瘍において特に有効なものとなり得る。
【００１０】
本発明の更なる態様において、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａの外部領域に特異的に結合し、且つ本発明に係るＣＡＲに使用することのできる追加的な抗体を同定した。この特異抗体（本明細書ではＣＲＴ２と命名され、その軽鎖ＣＤＲ及び軽鎖可変配列について表１を参照し得る）は、ＣＬＥＣ１４Ａに有効に結合することができ、従ってこの抗体の抗原結合能を含むＣＡＲ免疫療法が本発明に包含される。
【００１１】
これに関して、第２の実施形態において、本発明は、
（ｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号１６７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｂ）配列番号１６８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｃ）配列番号１６９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｄ）配列番号１２９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、
（ｅ）配列番号６８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、及び／又は
（ｆ）配列番号１３０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ
の少なくとも１つを含む、核酸分子を更に提供する。
【００１２】
従って、上記に記載したとおりの本発明の核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチド配列を含む。「ＣＡＲ」又は「キメラ抗原受容体」は、本明細書では同義的に使用され、少なくとも３つのドメイン、即ち、抗原結合ドメイン（本発明では抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン）を含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナリングドメインを含む細胞内ドメインとを含む分子を指す。
【００１３】
従って、宿主細胞（以下で更に考察するとおり、詳細にはエフェクター細胞）でＣＡＲが発現したとき、抗原結合ドメインは、細胞外ドメイン内に又は細胞外ドメインとして存在することになる。典型的には、ほとんど又は全ての抗原結合ドメインが細胞外に存在して、標的抗原へのＣＡＲの結合を可能にすることになる（例えば、ＣＡＲが宿主細胞において発現し、細胞膜に運ばれて提示されたとき、抗原結合ドメインの少なくとも９０、９５、９７、９９又は１００％が細胞外に存在することになる）。
【００１４】
膜貫通ドメインは、抗原結合ドメイン（即ち、本発明における抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン）を含む細胞外ドメインを細胞内シグナリングドメインに連結し、ＣＡＲの発現及び膜標的化後、典型的には宿主細胞の細胞膜にわたって存在する。従って、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの発現及び膜標的化後に細胞膜を貫通する。膜貫通ドメインは、少なくとも１つの膜貫通ドメイン並びに／又は細胞外及び／若しくは細胞内部分を有するタンパク質に由来し、又はそれをベースとすることができ、従って、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端において、それが由来した又はそのベースとなった元のタンパク質の細胞外及び／又は細胞内配列／ポリペプチド／タンパク質に付加され得る。従って、膜貫通ドメインが既知の膜貫通タンパク質から得られたか又はそれに由来したものであるとき、膜を貫通するか又はそれにわたって存在する膜貫通ドメインと共に、それにＣＡＲを付加するための追加的な配列が細胞外及び／又は細胞内に存在してもよい。以下で更に考察するとおり、膜貫通ドメインは、膜貫通領域及び細胞内領域の両方を有するタンパク質又はタンパク質の一部分、例えばＣＤ２８に由来してもよく、及びこれらのドメイン又はその一部分の両方が本発明のＣＡＲ内に含まれ得る。
【００１５】
ＣＡＲの細胞内シグナリングドメインは、ＣＡＲの発現後、宿主細胞内に存在し（即ち、ＣＡＲの細胞内ドメイン内に含まれ）、典型的には細胞の細胞質内に存在する。このドメインは、ＣＡＲを発現させる宿主細胞の１つ以上の正常機能を活性化させる能力を有する。例えば、宿主細胞がＴ細胞である場合、細胞内シグナリングドメインは、Ｔ細胞の細胞溶解活性又はヘルパー活性を活性化させる能力を有し得る。本発明のＣＡＲは、加えて、以下で更に詳細に考察するとおりの更なるドメインを含み得る。
【００１６】
「抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン」は、本明細書で使用されるとき、ＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有するドメイン、詳細にはＣＡＲ内で発現して細胞表面上に提示されたときにＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有するドメインを指す。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、細胞の表面上に発現したＣＬＥＣ１４Ａへの結合能（例えば、フローサイトメトリー又は免疫組織化学によって評価されるとおり）、コンホメーション依存性の（例えば、非線状の）ＣＬＥＣ１４Ａエピトープへの結合能（例えば、ウエスタンブロッティングによって評価されるとおり）、遊離ＣＬＥＣ１４Ａ（例えば、固体支持体上に組換え発現したＣＬＥＣ１４Ａ）への結合能（例えば、ＥＬＩＳＡによって評価されるとおり）及び／又はヒトＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有する。より詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、細胞の表面上に発現したＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有する。
【００１７】
詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに選択的に結合し、従って他のタンパク質／分子に対するその結合親和性と比較したときにＣＬＥＣ１４Ａに対してより高い結合親和性を有する。好ましくは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、他のタンパク質に結合せず、又はＣＬＥＣ１４Ａへの結合と比較して大幅に低下した親和性（例えば、ＣＬＥＣ１４Ａに対するその親和性の少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００又は１００００分の１の親和性）で結合する。従って、本明細書において言及されるとおりの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、他のタンパク質へのその結合の少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００又は１００００倍の親和性でＣＬＥＣ１４Ａに結合し得る。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインの結合親和性は、Biacoreシステムなど、当該技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。
【００１８】
抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａと同様であるか若しくはそれとの同一性領域を有するタンパク質、又はＣＬＥＣ１４Ａの既知のホモログであるタンパク質に対する結合親和性が、ＣＬＥＣ１４Ａに対するその結合親和性と比較して低下していることが特に好ましい。従って、この抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、ＣＬＥＣ１４Ａと少なくとも６０、７０、８０、９０又は９５％の同一性を有するタンパク質、詳細にはＣＤ２４８／ＴＥＭ１／エンドシアリン、トロンボモジュリン及び／又はＣＤ９３に対する結合親和性が、ＣＬＥＣ１４Ａに対するその結合親和性と比較したときに低下している（例えば、結合親和性が少なくとも１０、５０、１００、１０００又は１００００分の１に低下している）はずである。別の見方をすれば、この抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、ＣＤ２４８／ＴＥＭ１／エンドシアリン、トロンボモジュリン及び／又はＣＤ９３に結合するその親和性の少なくとも１０、５０、１００、１０００又は１００００倍の親和性でＣＬＥＣ１４Ａに結合する。
【００１９】
抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに対して高い結合親和性を有してもよく、即ち１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ又は１０−９Ｍ又はそれ未満の範囲のＫｄを有し得る。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに対して、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ又は１０ｎＭ未満、より好ましくは１０、９．５、９、８．５、８、７．５、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５又は１ｎＭ未満、最も好ましくは０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２又は０．１ｎＭ未満のＫｄに対応する結合親和性を有し得る。
【００２０】
Ｋｄの決定には任意の適切な方法を用い得る。しかしながら、好ましくは、Ｋｄは、インビトロで様々な濃度の抗原（ＣＬＥＣ１４Ａ）に対して様々な濃度の試験抗体を試験して、例えばラインウィーバー・バーク法を用いて飽和曲線を作成することによるか、又はBIAcore 1000 Evaluationソフトウェアの１：１結合モデルなど、市販の結合モデルソフトウェアを使用することにより決定される。
【００２１】
Ｋｄ値の決定に関して、標的（例えば、ＣＬＥＣ１４Ａ）を発現する細胞を使用した結合実験から導き出される見かけのＫｄ値は、実験条件が見かけの結合親和性に影響を及ぼし得るため、親和性の絶対的な指示値と見なすことはできない点を当業者は理解するであろう。例えば、ＣＬＥＣ１４Ａの発現レベルは、細胞の培養条件に応じて変わり得ると共に、細胞型間の違いによっても異なり得る。結果的に、ある一組の実験の範囲内で得られた見かけのＫｄ値を比較する方がよく、ある一組の実験で得られたＫｄ値を別の一組の実験で得られたＫｄ値と比較するのは、特に実験条件が大きく変わる場合に必ずしも適切でないこともある。
【００２２】
本明細書における「ＣＬＥＣ１４Ａ」という表現は、ヒトＣＬＥＣ１４Ａと、他の種由来、例えばウマ、イヌ、ブタ、雌ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモット又は霊長類、例えばサル由来のＣＬＥＣ１４Ａのオルソログとの両方を指す。従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ヒトＣＬＥＣ１４Ａ及び／又は任意の種由来、例えばマウス由来のＣＬＥＣ１４Ａのオルソログへの結合能を有し得る。更に、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、好ましくは、ＣＬＥＣ１４Ａの天然に存在する変異体、例えばヒトＣＬＥＣ１４Ａの天然に存在する変異体への結合能を有する。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａオルソログに対してヒトＣＬＥＣ１４Ａへのその結合と異なる親和性で結合し得るが、ヒト及びマウスＣＬＥＣ１４Ａには同様の親和性で結合し得る。
【００２３】
「同様の親和性」とは、抗ＣＬＥＣ１４Ａドメイン、例えば抗体又はリガンドの結合親和性がヒトＣＬＥＣ１４Ａに対しても、他の目的とする種（例えば、マウス）の１つ以上に対しても同等であり、例えば差が２０倍を超えないことを意味する。より好ましくは、結合親和性の差は、１５倍未満、より好ましくは１０倍未満、最も好ましくは５、４、３又は２倍未満である。
【００２４】
しかしながら、詳細な実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ヒトＣＬＥＣ１４Ａ、詳細にはヒトＣＬＥＣ１４Ａの細胞外部分に結合する。ヒトＣＬＥＣ１４Ａは、概して４９０アミノ酸を有し、予測分子量が５１ｋＤａであり、１４ｑ２１．２に位置するｃｌｅｃ１４Ａ遺伝子によってコードされる。ヒトＣＬＥＣ１４Ａには、GenBank受託番号ＮＰ＿７７８２３０に見られるアミノ酸配列及びその天然に存在する変異体が含まれる。ヒトＣＬＥＣ１４Ａのアミノ酸配列は、（表１に示されるとおりの）配列番号１に記載されるとおりである。従って、詳細には、本発明において使用されるとおりの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列への結合能を有する。ヒトＣＬＥＣ１４Ａは、ＣＬＥＣ１４ＡのｍＲＮＡ配列に対応する配列番号２のｃＤＮＡ配列によってコードされ、及びヒトＣＬＥＣ４Ａのコード領域は配列番号３に示される。
【００２５】
詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、シグナルペプチド（これは、４９０アミノ酸ヒトポリペプチド配列の残基１〜２１に存在する）の除去後の成熟ＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドに結合する。（当該技術分野で利用可能なドメイン予測プログラムの違いにより、タンパク質内における特定のドメインの位置に僅かな差異、例えばＣＬＥＣ１４Ａにおけるドメイン位置に関して例えば１、２、３又は４アミノ酸残基の差異が生じ得ることが理解されるであろう。従って、シグナリングドメインは、例えば、残基１〜２２にあるものとして予測される可能性がある）。従って、典型的には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの場合、４６９（又は１〜２２のシグナルペプチドが予測される場合には４６８）アミノ酸の成熟ＣＬＥＣ１４Ａ配列（完全ポリペプチド配列の残基２２（又は２３）〜４９０）に結合する。上記で考察したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外領域に結合する。ヒトＣＬＥＣ１４Ａの場合、従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、配列番号１の４９０アミノ酸配列の残基２２（又は２３）〜３９６の範囲内にある領域（即ち、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの３７５（又は３７４）アミノ酸細胞外ドメインの範囲内にある領域）、例えば細胞外ドメインの残基２２〜１７３にある（又は別の見方をすれば残基２３〜１７３、２２〜１７５、２３〜１７５、３２〜１７３又は３２〜１７５にある）Ｃ型レクチンドメイン又は残基２４５〜２８７にあるＥＧＦ様領域に結合する。ヒトＣＬＥＣ１４Ａは、膜貫通ドメイン及び細胞質領域（それぞれ残基３９７〜４２５及び４２６〜４９０にある）を更に含み、本発明に使用される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインがこれらの領域に結合しないか、又は少なくとも、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインへの結合に加えて、上記で考察したとおりの親和性で結合するに過ぎないことが好ましい。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａの任意の他のドメイン、例えば膜貫通領域及び／又は細胞質領域に対するよりも高い親和性で細胞外ドメインに結合する（例えば、他のＣＬＥＣ１４Ａ領域に対するよりも少なくとも１０、５０、１００、１０００又は１００００倍高い親和性で細胞外ドメインに結合する）ことが好ましい。
【００２６】
本発明に使用される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインがヒトＣＬＥＣ１４Ａのオルソログ又は天然に存在する変異体への結合能を有する場合、結合ドメインが、オルソログ内又は変異体内における上記に定義するとおりのヒトＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対応する領域に結合することが好ましい。オルソロガスタンパク質内における対応する領域は、当該技術分野において周知の配列アラインメントプログラムを用いて容易に決定することができる。
【００２７】
上記で考察したとおり、本発明の第１の態様では、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインとの結合能を有する。このドメインは、ヒト４９０アミノ酸ＣＬＥＣ１４Ａタンパク質配列（配列番号１に示されるとおり）の残基２２〜１７３又は２２〜１７３から１〜４残基以内の位置、例えば残基２２〜１７５、２３〜１７３、２３〜１７５、３２〜１７３又は３２〜１７５に存在し得る。従って、本発明のこの態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、Ｃ型レクチンドメインのこの領域（ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインの範囲内に存在する）に対する又はその範囲内への結合能を有する。上記に指摘したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインがＣＬＥＣ１４Ａオルソログ又は変異体への結合能を有するとき、この態様では、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインの範囲内に存在するＣ型レクチンドメインに対応する領域に結合することが好ましい。かかる対応する領域は、配列アラインメントを用いて同定することができる。上記で考察したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、ＣＬＥＣ１４Ａにおける任意の他の領域に対するよりも（例えば、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの残基２４５〜２８７にあるＥＧＦ様領域に対するよりも）高い親和性（例えば、少なくとも１０、５０、１００、１０００又は１００００倍高い）でＣ型レクチンドメインに結合し得る。
【００２８】
詳細には、本発明の第１の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン内のエピトープへの結合能を有し得る。一部の例では、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ヒトＣＬＥＣ１４Ａの残基９７〜１０８に存在し、且つＥＲＲＲＳＣＨＴＬＥＮＥ（配列番号２４）のアミノ酸配列を有するエピトープ、又はＣＬＥＣ１４Ａオルソログ若しくは天然に存在する変異体の対応するエピトープへの結合能を有し得る。しかしながら、他の例では、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン内の異なるエピトープ又は領域に（即ち、残基９７〜１０８でなく）、例えば３３〜４４、４５〜５６、５７〜６８、６９〜８０、８１〜９２、１０９〜１２０、１２１〜１３２、１３３〜１４４、１４５〜１５６又は１５７〜１６８に、又はこの領域とオーバーラップする（９７〜１０８とオーバーラップする）領域に結合し得る。従って、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン内にある任意のエピトープ又は残基に結合することが可能である。
【００２９】
本発明の第２の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに結合するが、配列番号１の残基２２〜１７３にあるＣ型レクチンドメイン及び／又はそれから１〜４残基以内の位置、例えば配列番号１の２２〜１７５、２３〜１７３、２３〜１７５、３２〜１７３又は３２〜１７５には結合しないものであり得る。従って、第２の態様では、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、配列番号１のヒトＣＬＥＣ１４Ａの残基１７４〜３９６又は配列番号１のヒトＣＬＥＣ１４Ａの残基１７５若しくは１７６〜３９６に結合する）。詳細には、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１の残基１７４〜２４４（又はこの位置から１〜４アミノ酸残基以内、例えば１７５〜２４４又は１７６〜２４４）に存在するＣＬＥＣ１４ＡのＳｕｓｈｉドメイン（或いは補体制御タンパク質（ＣＣＰ）ドメインとして知られる）、又はＣＬＥＣ１４Ａオルソロガス配列若しくは天然に存在する変異体における均等な部分に結合し得る。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＳｕｓｈｉドメインのうちのＣ型レクチンドメインに隣接した部分、例えば残基１７４〜２１０、１７４〜２００又は１７４〜１９０に結合し得る。
【００３０】
本明細書に定義するとおりの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＡＲ分子内に存在するか又は含まれ、且つ適切な宿主細胞上に発現したとき、上記で考察したとおり、ＣＬＥＣ１４Ａに結合し得る。従って、詳細には、本発明のＣＡＲ又は本発明の核酸分子によってコードされるＣＡＲは、ＣＡＲの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインを介してＣＬＥＣ１４Ａに結合する能力を有することになる。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、単独で（例えば、リガンド又はリガンド分子の一部として）発現したとき、或いは抗体分子若しくはその断片又はｓｃＦｖの一部として発現したときに、上記で考察したとおりのＣＬＥＣ１４Ａ結合能を更に有し得る。
【００３１】
加えて、上記で詳しく考察したとおり、本発明の第１の態様に使用される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を妨げるか又は阻害する能力を有し得る。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ヒトＣＬＥＣ１４ＡとヒトＭＭＲＮ２との間の相互作用を妨げる能力を有してもよく、ここで、ＭＭＲＮ２のアミノ酸配列は、表１の配列番号２８（配列番号２９によってコードされる）に記載されるとおりである。従って、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、単離された形態で（又は抗体若しくはｓｃＦｖの一部として）利用されるときに相互作用を妨げる能力を有する。相互作用を妨げるとは、相互作用を形成するＣＬＥＣ１４Ａ及びＭＭＲＮ２分子の量の減少、即ちＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルの阻害を意味する。詳細には、本発明の第１の態様に使用される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の結合レベルを少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％阻害し得る。一態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間のいかなる相互作用も防ぐ能力を有することができ、従って相互作用を全て消失させ得る（即ち、ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との相互作用の１００％が阻害され得る）。しかしながら、詳細には、相互作用レベルは、検出不能レベルまで低下し得る。
【００３２】
別の見方をすれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａへの結合に関してＭＭＲＮ２と競合する能力を有し得る。
【００３３】
これに関して、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン内にあるＣＬＥＣ１４ＡポリペプチドのＭＭＲＮ２結合領域に結合し得る。所与のリガンド又は抗体がＭＭＲＮ２結合領域に選択的に結合するか否か、又はＣＬＥＣ１４Ａポリペプチドへの特異的結合に関してＭＭＲＮ２と競合するか否かは、エピトープマッピング、競合結合試験等、当該技術分野のルーチンの方法を用いて決定することができる。
【００３４】
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用レベルを決定する方法は、当該技術分野において公知であり、プルダウンアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法、酵母２ハイブリッド技術、及びファージディスプレイが挙げられる。ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との間の相互作用を検出する他の方法としては、限外ろ過とイオンスプレー質量分析／ＨＰＬＣとを合わせた方法又は他の物理的及び分析的方法が挙げられる。蛍光エネルギー共鳴移動法（ＦＲＥＴ）を用いてもよく、ここで、蛍光標識した２つの実体（即ち、ＣＬＥＣ１４Ａ及びＭＭＲＮ２又はその一部分、オルソログ又は変異体）の結合は、互いにごく近接しているときの蛍光標識の相互作用を計測することによって計測され得る。
【００３５】
以下に詳細に考察するとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体に由来しても、又はＣＬＥＣ１４Ａに結合する任意の他のリガンド（例えば、ペプチド又はポリペプチド）に由来してもよい。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＭＭＲＮ２（例えば、配列番号２８のヒトＭＭＲＮ２）に由来してもよく、上記に指摘したとおり、ＭＭＲＮ２は、ＣＬＥＣ１４Ａと相互作用し、従ってＣＬＥＣ１４Ａのリガンドである。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、（例えば、ヒトＭＭＲＮ２に関する配列番号２８の）完全長ＭＭＲＮ２アミノ酸配列又は少なくともその一部分を含んでもよく、前記一部分は、ＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有する。従って、詳細には、ＭＭＲＮ２の一部分は、完全長ＭＭＲＮ２としてのＣＬＥＣ１４Ａに対する親和性の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００％又はそれを超えるものを有し得る。別の見方をすれば、ＭＭＲＮ２の一部分は、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに関して上記で考察したとおりのＣＬＥＣ１４Ａに対する親和性を有し得る。
【００３６】
詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記で考察したとおり、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する能力及びＭＭＲＮ２とＣＬＥＣ１４Ａとの相互作用を妨げる能力を有するＭＭＲＮ２の一部分を含んでもよい。代替的に又は追加的に、ＭＭＲＮ２の少なくとも一部分は、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン、より詳細にはヒトＣＬＥＣ１４Ａの残基９７〜１０８に存在し、且つＥＲＲＲＳＣＨＴＬＥＮＥ（配列番号２４）のアミノ酸配列を有するエピトープ、又はＣＬＥＣ１４Ａオルソログ若しくは天然に存在する変異体における対応するエピトープへの結合能を有してもよい。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内に含まれるＭＭＲＮ２の一部分は、ＭＭＲＮ２からの少なくとも３つの連続アミノ酸、詳細には少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０又は２５アミノ酸を含んでもよい。
【００３７】
代替的に、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、完全長ＭＭＲＮ２又はその一部分の変異体を含んでもよく、前記変異体は、ＣＬＥＣ１４Ａに（例えば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに関して上記で考察したとおりの親和性で）結合する能力を有する。変異体は、完全長ＭＭＲＮ２又はＭＭＲＮ２の一部分と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有することができ、且つ上記に指摘したとおり、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する能力を保持している。別の見方をすれば、ＭＭＲＮ２変異体は、野生型ＭＭＲＮ２配列と比較したときに１個以上、例えば２、３、４、５、１０又は１５個のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加、例えば保存的置換を含んでもよい。ＭＭＲＮ２部分の変異体に行われるアミノ酸置換、欠失及び／又は付加の数は、その部分の長さに比例し得ることが理解され、ここで、部分が短いほど、長い部分と比べて少ないアミノ酸置換、付加及び／又は欠失を含み得る。
【００３８】
抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内に含まれるＭＭＲＮ２変異配列は、野生型ＭＭＲＮ２配列と比べてＣＬＥＣ１４Ａに対して異なる結合親和性、例えばより高い又はより低い結合親和性を有してもよく、又は変異体は、ＣＬＥＣ１４Ａに対して同じ又は実質的に同じ結合親和性（例えば、同等の親和性、例えば２０倍以下の差）を有してもよい。しかしながら、変異ＭＭＲＮ２又はＭＭＲＮ２の変異体を含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが、好ましくは先に考察したとおりのＣＬＥＣ１４Ａに対する結合親和性を有し得ることは理解されるであろう。
【００３９】
本発明の第１の態様に（例えば、本発明のＣＡＲに）使用されるとおりの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、その配列が上記で考察した結合活性を有する限り、即ち結合ドメインがＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインに結合し得る限り、いかなるアミノ酸配列を含むこともできる。しかしながら、詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有する少なくとも１つの重鎖又は軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。１つ以上のＣＤＲは、上記で考察したとおり（即ち、上記で考察したとおりの親和性及び特異性で）、ＣＬＥＣ１４Ａへの（即ち、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの）結合能を有する抗体の重鎖及び／又は軽鎖配列から予測し得る。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、表１に記載されるとおりの抗体ＣＲＴ１、３、４又は５のいずれか１つからのＣＤＲを１つ以上含み得る。
【００４０】
これとの関連において、本発明の第２の態様では、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１２９、配列番号６８若しくは配列番号１３０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つの変異体の重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲを含み、ここで、選択されたＣＤＲは、抗体ＣＲＴ２（これは、実施例で示すとおり及び表１に記載されるとおりＣＬＥＣ１４Ａに結合する）の軽鎖配列（配列番号１３３）及び重鎖配列（配列番号１７３）から予測することができる。
【００４１】
従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体から予測することができる少なくとも１つのＣＤＲ（又はかかる予測されたＣＤＲの変異体（例えば、１、２又は３個のアミノ酸置換を有する変異体））を含んでもよく、ここで、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、従って抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有する。
【００４２】
３つ以下のＣＤＲ領域（例えば、単一のＣＤＲ又は更にはその一部）を含有する分子が、そのＣＤＲの由来である抗体の抗原結合活性を保持する能力を有し得ることは理解されるであろう。２つのＣＤＲ領域を含有する分子が、例えばミニボディの形態の、標的抗原への結合能を有するものとして当該技術分野において記載されている（Vaughan and Sollazzo, 2001, Combinational Chemistry & High Throughput Screening, 4, 417-430）。単一のＣＤＲを含有する分子が記載されており、これは、標的への強力な結合活性を呈し得る（Laune et al, 1997, JBC, 272, 30937-44; Nicaise et al, 2004, Protein Science, 13: 1882-91）。
【００４３】
これに関して、本発明に使用される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、１つ以上の可変重鎖ＣＤＲ、例えば１、２又は３つの可変重鎖ＣＤＲを含んでもよい。代替的に又は追加的に、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、１つ以上の可変軽鎖ＣＤＲ、例えば１、２又は３つの可変軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。しかしながら、詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含むことができ（及びより詳細には重鎖可変領域が３つのＣＤＲを含み、且つ軽鎖可変領域が３つのＣＤＲを含む）、ここで、少なくとも１つのＣＤＲは、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体から予測し得るか、又は以下に提供するＣＤＲ配列の１つから選択し得る。
【００４４】
本発明の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、可変重鎖及び軽鎖ＣＤＲの任意の組み合わせ、例えば１つの可変重鎖ＣＤＲを１つの可変軽鎖ＣＤＲと一緒に、２つの可変重鎖ＣＤＲを１つの可変軽鎖ＣＤＲと一緒に、２つの可変重鎖ＣＤＲを２つの可変軽鎖ＣＤＲと一緒に、３つの可変重鎖ＣＤＲを１又は２つの可変軽鎖ＣＤＲと一緒に、１つの可変重鎖ＣＤＲを２又は３つの可変軽鎖ＣＤＲと一緒に、又は３つの可変重鎖ＣＤＲを３つの可変軽鎖ＣＤＲと一緒に含み得る。
【００４５】
抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内に存在する１つ以上のＣＤＲは、そのドメインが上記に記載した結合活性を有する限り、全て同じ抗体から予測されなくてもよい。従って、あるＣＤＲがＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の重鎖又は軽鎖から予測されてもよく、一方で別の存在するＣＤＲが異なる抗体から予測されてもよい。この場合、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体からＣＤＲ３が予測されることが好ましい場合もある。しかしながら、詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに２つ以上のＣＤＲが存在する場合、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体からそれらのＣＤＲが予測されることが好ましい。ＣＤＲは、同じＣＬＥＣ１４Ａ結合抗体からのものである必要はなく、異なるＣＬＥＣ１４Ａ抗体、詳細には同じ所望の領域又はエピトープに結合するＣＬＥＣ１４Ａ抗体からのＣＤＲの組み合わせが用いられてもよい。
【００４６】
詳細な実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の可変重鎖配列から予測される３つのＣＤＲと、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体（好ましくは同じ抗体）の可変軽鎖配列から予測される３つのＣＤＲとを含む。
【００４７】
抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の可変重鎖及び軽鎖を更に含んでもよく、詳細にはＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の可変重鎖及び軽鎖を含むｓｃＦｖを含んでもよい。
【００４８】
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という表現は、本明細書で使用されるとき、特異的抗原、例えばＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体内の超可変性領域を指す。従って、抗体のＣＤＲは、通常、抗体にその結合特異性を付与する。３つのＣＤＲは、インタクトな抗体分子（即ち、２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含む）の各重鎖の可変領域に存在してもよく、及び３つのＣＤＲは、各軽鎖の可変領域に存在してもよい（アミノ末端からカルボキシ末端へと付番して、重鎖ＣＤＲ１、２及び３並びに軽鎖ＣＤＲ１、２及び３）。抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲは、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列から、当該技術分野で利用可能な予測ソフトウェアを用いて、例えばAbysisアルゴリズム（www.bioinf.org.uk/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi）を用いるか、又はIMGT/V-QUESTソフトウェア、例えばwww.IMGT.orqで入手可能なIMGTアルゴリズム（ImMunoGeneTics）を用いて予測することができ、例えばLefranc et al, 2009 NAR 37:D1006-D1012及びLefranc 2003, Leukemia 17: 260-266を参照されたい。いずれのアルゴリズムによって同定されたＣＤＲ領域も、本発明での使用に等しく好適であると見なされる。ＣＤＲは、その予測の元になる抗体に応じて及び重鎖と軽鎖との間で長さが異なり得る。従って、インタクトな抗体の３つの重鎖ＣＤＲは、異なる長さであってもよく（又は同じ長さであってもよく）、インタクトな抗体の３つの軽鎖ＣＤＲは、異なる長さであってもよい（又は同じ長さであってもよい）。例えば、ＣＤＲは、２又は３アミノ酸長〜５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸長の範囲であり得る。詳細には、ＣＤＲは、３〜１４アミノ酸長、例えば３アミノ酸以上且つ２０アミノ酸未満であり得る。
【００４９】
重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲ（即ち、重鎖可変ＣＤＲ１、２及び３並びに軽鎖可変ＣＤＲ１、２及び３）は、通常、フレームワーク領域によって互いに分離されている。重鎖及び軽鎖可変領域の両方は、４つのフレームワーク領域（アミノ末端からカルボキシ末端へと付番して、ＦＲ１、２、３及び４）を含む。
【００５０】
用語「重鎖可変領域」（ＶＨドメイン）は、本明細書で使用されるとき、抗体分子の重鎖の可変領域を指す。
【００５１】
用語「軽鎖可変領域」（ＶＬドメイン）は、本明細書で使用されるとき、抗体分子の軽鎖の可変領域を指す。哺乳類抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列及びその可変ドメインのフレームワーク領域にある幾つかのアミノ酸に基づいて、明確に異なる２つのタイプ：カッパ及びラムダの一方に割り当てられる。
【００５２】
本明細書では、ＣＤＲの位置を定義するために必要に応じてKabat命名法に従うことに留意しなければならない（Kabat et al, 1991, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 647-669、参照により本明細書に援用される）。
【００５３】
「抗体」という表現には、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片及びＦａｂ発現ライブラリによって作製された断片が含まれる。かかる断片には、標的に対するその結合活性を保持している全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片、並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、融合タンパク質及び抗体の抗原結合部位を含む他のタンパク質が含まれる。この用語には、ファージディスプレイ技法、又は指定されたポリペプチド若しくはその特定の領域に結合する分子に関するランダム選択技法を用いて作製し得る他の抗体様分子も含まれる。従って、用語の抗体には、天然抗体の認識部位の一部（即ち、エピトープ又は抗原に結合するか又はそれと組み合わせになる抗体の一部）である構造を含有するあらゆる分子が含まれる。更に、抗体及びその断片は、ヒト化抗体であってもよく、ここで、フレームワーク領域、例えばＶＨ及び／又はＶＬのフレームワーク領域は、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域に対応するように、当該技術分野において公知の方法を用いて修飾されていてもよい。
【００５４】
「ｓｃＦｖ」又は「一本鎖可変断片」という表現は、本明細書で使用されるとき、抗体の可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）とが可動性オリゴペプチドによって連結されている分子を含む。従って、ｓｃＦｖは、少なくとも１つの可変重鎖と少なくとも１つの可変軽鎖との間の融合物である。通常、可変重鎖及び軽鎖を連結する可動性オリゴペプチドは、５アミノ酸長、特に８、９、１０又は１１アミノ酸〜２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸長、例えば１０〜２０、１２〜１８又は１４〜１７又は１４〜１６アミノ酸長であり得る。可動性オリゴペプチドは、グリシン、セリン及び／又はスレオニン残基を含んでもよく、詳細には少なくとも５０、６０、７０又は８０％のグリシン残基を含んでもよい。可動性リンカーは、概して可変重鎖のＣ末端を可変軽鎖のＮ末端につなぐか、又は可変軽鎖のＣ末端を可変重鎖のＮ末端につなぎ得る。ｓｃＦｖ抗体などの操作された抗体は、当該技術分野において公知の技法及び手法を用いて作製することができる。
【００５５】
Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｄＡｂ抗体は、全て大腸菌（E. coli）で発現させて、そこから分泌させることができ、これにより大量の抗体断片の作製が容易に可能になる。全抗体又はインタクトな抗体は、二価であり、即ち２つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びｄＡｂ断片は、通常、一価であり、従って、通常、抗原結合部位を１つのみ有する。従って、一価ｓｃＦｖは、１つの可変重鎖と１つの可変軽鎖とを含み得る。しかしながら、ｓｃＦｖが（一価に加えて）二価、三価又は四価であり得る可能性、及びｓｃＦｖが２つ以上の可変重鎖及び２つ以上の可変軽鎖、例えば２、３又は４つの可変重鎖又は可変軽鎖を含み得る可能性もある。２つ以上の可変重鎖及び／又は可変軽鎖は、同じであってもよく、又は異なる抗体由来であってもよい。ｓｃＦｖは、ダイアボディ、トリボディ又はテトラボディであってもよい。この態様において、用いられる可動性リンカーは、上記で一価ｓｃＦｖに用いられるとおりのものと比べて短いこともある。
【００５６】
「ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体」という表現は、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに関する上記の考察と同じＣＬＥＣ１４Ａに対する結合親和性を有する抗体を指す。詳細には、本発明の第１の態様において、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体は、既に定義したとおりＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインに結合する。
【００５７】
第１の態様の更なる実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１１又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には（Ｓ／Ｔ）ＳＹＷ（Ｉ／Ｍ）（Ｅ／Ｈ）（配列番号１５０）、ＧＹＴＦ（Ｓ／Ｔ）ＳＹＷ（配列番号１５１）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１２又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細にはＷＩＧ（Ｅ／Ａ）Ｉ（Ｌ／Ｙ）ＰＧ（Ｓ／Ｎ）（Ｇ／Ｓ）（Ｓ／Ｄ）Ｔ（Ｎ／Ｓ）（配列番号１５２）、Ｉ（Ｌ／Ｙ）ＰＧ（Ｓ／Ｎ）（Ｇ／Ｓ）（Ｓ／Ｄ）Ｔ（配列番号１５３）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２１３又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には（Ａ／Ｔ）（Ｒ／Ｈ）（Ｇ／Ｘ）（Ｇ／Ｘ）（Ｄ／Ｘ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）（Ｅ／Ｇ）（Ｅ／Ｓ）（Ｙ／Ｄ）Ｙ（Ｖ／Ａ／Ｌ）ＭＤ（配列番号１５４）、（Ａ／Ｔ）（Ｒ／Ｈ）（Ｇ／Ｘ）（Ｇ／Ｘ）（Ｄ／Ｘ）Ｙ（Ｄ／Ｙ）（Ｅ／Ｇ）（Ｅ／Ｓ）（Ｙ／Ｄ）Ｙ（Ｖ／Ａ／Ｌ）ＭＤＹ（配列番号１５５）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
（式中、Ｘは、アミノ酸残基なしである）
の少なくとも１つを含んでもよい。
【００５８】
従って、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０、１５１、１５２、１５３、１５４若しくは１５５のいずれか１つ以上、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有する配列番号１５０〜１５５のいずれか１つ以上の１つ以上の変異体を含んでもよい。本明細書に記載されるアミノ酸配列との関連において「／」の使用は、特定の位置に存在し得るアミノ酸残基の選択を指す。例えば「Ｓ／Ｔ」という表現は、その位置にＳ又はＴのいずれかの残基が存在し得ることを示し、及びＧＹＴＦ／Ｘという表現は、その位置にＧＹＴＦが存在し得るか、又はアミノ酸が存在しないかのいずれかであることを示している。従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０、１５２及び／若しくは１５４から選択されるか、又は配列番号１５１、１５３及び／若しくは１５５から選択される１つ以上のアミノ酸配列、或いは上記に定義したとおりのこれらの配列のいずれか１つ以上の変異体を含む。
【００５９】
詳細には、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に記載したＣＤＲの２又は３つを含んでもよい。より詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０若しくは１５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号１５２若しくは１５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び１５４若しくは１５５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、又は上記に定義したとおりのこれらの配列のいずれかの１つ以上の変異体を含んでもよく、例えば抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０、１５２及び１５４若しくは配列番号１５１、１５３及び１５５又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらのＣＤＲのいずれかの１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００６０】
更に、本発明の第１の態様、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）Ｓ／Ｘ  Ｓ／Ｘ  Ｓ  Ｙ  Ｍ／Ｌ  Ｙ／Ｈ  Ｗ  Ｙ（配列番号１５６）、ＳＳＶＳ  Ｙ／Ｓ  Ｓ／Ｘ  Ｙ／Ｘ（配列番号１５７）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１４又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細にはＬ  Ｌ／Ｗ  ＩＹ  Ｄ／Ｓ  ＴＳＮＬＡ（配列番号１５８）、Ｄ／Ｓ  ＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２１５又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細にはＱ／Ｈ  Ｑ  Ｗ／Ｙ  Ｓ／Ｈ  Ｓ／Ｒ  Ｙ／Ｓ  Ｐ  Ｌ／Ｒ（配列番号１６０）、Ｑ／Ｈ  Ｑ  Ｗ／Ｙ  Ｓ／Ｈ  Ｓ／Ｒ  Ｙ／Ｓ  Ｐ  Ｌ／Ｒ  Ｔ  Ｆ／Ｘ（配列番号１６１）又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
（式中、Ｘは、アミノ酸なしである）
の少なくとも１つを含んでもよい。
【００６１】
従って、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５６、１５７、１５８、１６０、１６１若しくはＤ／Ｓ  ＴＳのいずれか１つ以上、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５６、１５８及び／若しくは１６０から選択されるか、又は配列番号１５７、１６１及び／若しくはＤ／Ｓ  ＴＳから選択される１つ以上のアミノ酸配列、或いは上記に記載されるとおりのこれらの配列の１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００６２】
詳細には、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に記載されるＣＤＲの２又は３つ、例えば（ａ）から選択される１つのＣＤＲ、（ｂ）から選択される１つのＣＤＲ及び／又は（ｃ）から選択される１つのＣＤＲを含んでもよい。より詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５６又は１５７のＣＤＲ、配列番号１５８又はＤ／Ｓ  ＴＳのＣＤＲ及び１６０又は１６１のＣＤＲを含んでもよく、例えば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５６、１５８及び１６０若しくは配列番号１５７、１６１及びＤ／Ｓ  ＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらのＣＤＲのいずれかの変異体を含んでもよい。
【００６３】
第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０〜１５５のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ及び（／又は）配列番号１５６〜１６１のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、例えば配列番号１５０〜１５５からの２つのＣＤＲ及び配列番号１５６〜１６１からの２つのＣＤＲを含んでもよい。詳細には、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０若しくは１５１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号１５２若しくは１５３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号１５４若しくは１５５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号１５６若しくは１５７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号１５８若しくはＤ／Ｓ  ＴＳのアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び配列番号１６０若しくは１６１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つの１つ以上の変異体を含んでもよい。本発明の最も好ましい態様において、第１の態様に係る抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１５０、１５２、１５４、１５６、１５８及び／若しくは１６０のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号１５１、１５３、１５５、１５７、１６１及び／若しくはＤ／Ｓ  ＴＳのアミノ酸配列を有するＣＤＲ、或いは１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つの１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００６４】
第１の態様によれば、本発明は、より詳細には、
（ｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有し、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３２、配列番号４４、配列番号６４、配列番号７６又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３３、配列番号４５、配列番号６５、配列番号７７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２及び／又は
（ｃ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号６６、配列番号７８、配列番号３４、配列番号４６、配列番号１００、配列番号１０２又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含む核酸分子を提供する。
【００６５】
従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に記載される重鎖可変ＣＤＲ配列から選択される１、２又は３つのＣＤＲを含んでもよい。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、（ａ）に提供される配列から選択される１つのＣＤＲ、（ｂ）に提供される配列から選択される１つのＣＤＲ及び／若しくは（ｃ）に提供される配列からの１つのＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するそれらの配列の１つ以上の変異体を含んでもよい。例えば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び配列番号６６又は１１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００６６】
第１の態様によれば、本発明は、
（ｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び
（ｉｉｉ）細胞内シグナリングドメイン
を含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメインへの結合能を有し、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３５、配列番号４７、配列番号６７、配列番号７９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３６、ＤＴＳ、配列番号６８、ＳＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号３７、配列番号４９、配列番号６９、配列番号８１又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含む核酸分子を更に提供する。
【００６７】
従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に記載される軽鎖ＣＤＲ配列から選択される１、２又は３つのＣＤＲを含んでもよい。詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、（ａ）に提供される配列から選択される１つのＣＤＲ、（ｂ）に提供される配列から選択される１つのＣＤＲ及び／若しくは（ｃ）に提供される配列からの１つのＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するそれらの配列の１つ以上の変異体を含んでもよい。例えば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号６８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００６８】
第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３２、３３、３４、４４、４５、４６、１００、１０２、１１６、１１８、６４、６５、６６、７６、７７若しくは７８のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ及び（／又は）配列番号３５、３６、３７、４７、４９、６７、６８、６９、７９、８１、ＳＴＳ若しくはＤＴＳのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、例えば配列番号３２、３３、３４、４４、４５、４６、１００、１０２、１１６、１１８、６４、６５、６６、７６、７７又は７８からの２つのＣＤＲ及び配列番号３５、３６、３７、４７、４９、６７、６８、６９、７９８１、ＳＴＳ又はＤＴＳからの２つのＣＤＲを含んでもよい。詳細には、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３２、４４、６４若しくは７６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３３、４５、６５若しくは７７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３４、４６、１００、１０２、１１６、１１８、６６若しくは７８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３５、４７、６７若しくは７９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３６、６８、ＳＴＳ若しくはＤＴＳのアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び配列番号３７、４９、６９若しくは８１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つの１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００６９】
より詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２０９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号３２、配列番号４４又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号３３、配列番号４５又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２０７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号３４、配列番号４６、配列番号１００、配列番号１０２又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含んでもよい。
【００７０】
従って、上記に指摘したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上述のＣＤＲの２又は３つを含んでもよく、詳細には、（ａ）から選択される１つのＣＤＲ、（ｂ）から選択される１つのＣＤＲ及び／又は（ｃ）から選択される１つのＣＤＲを含んでもよい。従って、好ましくは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３２、３３及び／若しくは３４、配列番号４４、４５及び／若しくは４６、配列番号３２、３３及び／若しくは１００、配列番号４４、４５及び／若しくは１０２、配列番号３２、３３及び／若しくは１１６又は配列番号４４、４５及び／若しくは１１８、或いは１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つ以上の変異体から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを含んでもよい。
【００７１】
特に好ましい実施形態において、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４、
配列番号４４、配列番号４５及び配列番号４６、
配列番号３２、配列番号３３及び配列番号１００、
配列番号４４、配列番号４５及び配列番号１０２、
配列番号３２、配列番号３３及び配列番号１１６、又は
配列番号４４、配列番号４５及び配列番号１０２
（上記に挙げた配列のいずれも１、２又は３個のアミノ酸置換を含み得る）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００７２】
更に、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号３５、配列番号４７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号３６、ＤＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２０８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号３７、配列番号４９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含んでもよい。
【００７３】
従って、上記に指摘したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上述のＣＤＲの２又は３つを含んでもよく、詳細には、（ａ）から選択される１つのＣＤＲ、（ｂ）から選択される１つのＣＤＲ及び／又は（ｃ）から選択される１つのＣＤＲを含んでもよい。従って、好ましくは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３５、３６及び／若しくは３７、配列番号４７、４９及び／若しくはＤＴＳ又は配列番号４７及び／若しくはＤＴＳ、或いは１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つ以上の変異体から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。
【００７４】
特に好ましい実施形態において、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７又は配列番号４７、ＤＴＳ及び配列番号４９（上記の配列の任意の１つ以上が１、２又は３個のアミノ酸置換を有し得る）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００７５】
第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３２、３３、３４、４４、４５、４６、１００、１０２、１１６又は１１８のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ及び配列番号３５、３６、３７、４７若しくは４９又はＤＴＳのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、例えば配列番号３２、３３、３４、４４、４５、４６、１００、１０２、１１６又は１１８からの２つのＣＤＲ及び配列番号３５、３６、３７、４７若しくは４９又はＤＴＳからの２つのＣＤＲを含んでもよい。詳細には、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号３２若しくは４４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３３若しくは４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３４、４６、１００、１０２、１１６若しくは１１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３５若しくは４７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号３６若しくはＤＴＳのアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び配列番号３７若しくは４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つの１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００７６】
詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６及び／若しくは配列番号３７、
配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、ＤＴＳ及び／若しくは配列番号４９、
配列番号３２、配列番号３３、配列番号１００、配列番号３５、配列番号３６及び／若しくは配列番号３７、
配列番号４４、配列番号４５、配列番号１０２、配列番号４７、ＤＴＳ及び／若しくは配列番号４９、
配列番号３２、配列番号３３、配列番号１１６、配列番号３５、配列番号３６及び／若しくは配列番号３７、又は
配列番号４４、配列番号４５、配列番号１１８、配列番号４７、ＤＴＳ及び／若しくは配列番号４９
（上記の配列番号の任意の１つ以上が１、２又は３個のアミノ酸置換を含み得る）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００７７】
別の見方をすれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２０９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号２０７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３５又は４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号３６又はＤＴＳのアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｆ）配列番号２０８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含んでもよい。
【００７８】
代替的に、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１６又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号６４、配列番号７６又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２１７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号６５、配列番号７７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２１８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号６６、配列番号７８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含んでもよい。
【００７９】
この実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、（ａ）からの１つのＣＤＲ、（ｂ）からの１つのＣＤＲ及び／又は（ｃ）からの１つのＣＤＲ、例えば配列番号６４、配列番号６５及び配列番号６６から選択される少なくとも１つのＣＤＲ若しくは配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【００８０】
従って、好ましい実施形態において、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
配列番号６４、配列番号６５及び／又は配列番号６６、又は
配列番号７６、配列番号７７及び／又は配列番号７８
（上記に挙げた配列のいずれも１、２又は３個のアミノ酸置換を有し得る）の配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００８１】
更に、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号２１９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号６７、配列番号７９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号６８、ＳＴＳ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
（ｃ）配列番号２２１又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体（例えば、詳細には配列番号６９、配列番号８１又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
の少なくとも１つを含んでもよい。
【００８２】
この実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、詳細には、（ａ）からの１つのＣＤＲ、（ｂ）からの１つのＣＤＲ及び／又は（ｃ）からの１つのＣＤＲ、例えば配列番号６７、６８若しくは６９から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、又は配列番号７９、８１若しくはＳＴＳから選択される少なくとも１つのＣＤＲ、或いは１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【００８３】
従って、詳細には、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
配列番号６７、配列番号６８及び／又は配列番号６９、又は
配列番号７９、ＳＴＳ及び／又は配列番号８１
（上記の配列の任意の１つ以上が１、２又は３個のアミノ酸置換を含み得る）の配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００８４】
第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号６４、６５、６６、７６、７７及び７８のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ及び配列番号６７、６８、６９、７９、８１又はＳＴＳのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのＣＤＲ、例えば配列番号６４、６５、６６、７６、７７及び７８からの２つのＣＤＲ及び配列番号６７、６８、６９、７９、８１又はＳＴＳからの２つのＣＤＲを含んでもよい。詳細には、第１の態様の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号６４若しくは７６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号６５若しくは７７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号６６若しくは７８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号６７若しくは７９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、配列番号６８若しくはＳＴＳのアミノ酸配列を有するＣＤＲ及び配列番号６９若しくは８１のアミノ酸配列を有するＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つの１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００８５】
詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び／又は配列番号６９、又は
配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、ＳＴＳ及び／又は配列番号８１
（上記の配列の任意の１つ以上が１、２又は３個のアミノ酸置換を含み得る）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含んでもよい。
【００８６】
先に考察したとおり、本発明の第２の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号１６７又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｂ）配列番号１６８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｃ）配列番号１６９又は１、２、若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ、
（ｄ）配列番号１２９又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、
（ｅ）配列番号６８又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ、及び／又は
（ｆ）配列番号１３０又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ
の少なくとも１つを含む。
【００８７】
従って、第２の態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び／又は（ｆ）からの１、２又は３つのＣＤＲ、詳細には（ａ）からの１つのＣＤＲ、（ｂ）からの１つのＣＤＲ及び（ｃ）からの１つのＣＤＲ、並びに／若しくは（ｄ）からの１つのＣＤＲ、（ｅ）からの１つのＣＤＲ及び（ｆ）からの１つのＣＤＲ、又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するこれらの配列のいずれか１つ以上の変異体を含んでもよい。
【００８８】
従って、詳細には、第２の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１６７、配列番号１６８及び配列番号１６９並びに／又は配列番号１２９、配列番号６８及び配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
【００８９】
上記で考察したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記で考察したＣＤＲ配列のいずれかの変異配列を含んでもよい。これに関して、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに存在する任意のＣＤＲ配列の１つ以上が変異配列であってもよい。例えば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが可変重鎖抗体配列からの１〜３つのＣＤＲを含むとき、それらのＣＤＲのいずれか１つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。代替的に、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが軽鎖抗体配列からの１〜３つのＣＤＲを含むとき、それらのＣＤＲのいずれか１つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが６つのＣＤＲ（例えば、重鎖から３つ及び軽鎖から３つ）を含むとき、存在するＣＤＲ配列の１、２、３、４、５又は６つが変異配列であってもよく、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内の各個別のＣＤＲが１、２又は３個のアミノ酸置換を有し得る。抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、非変異ＣＤＲ配列及び変異ＣＤＲ配列の両方を含んでもよい。代替的に、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、全て変異ＣＤＲ配列を含んでもよく、又は変異ＣＤＲ配列を全く含まなくてもよい。
【００９０】
先に考察したとおり、変異ＣＤＲは、１、２又は３個のアミノ酸置換を含み得る。しかしながら、より短いＣＤＲ配列について、アミノ酸置換が少ない方が好ましい場合もあることは理解されるであろう。例えば、ＣＤＲ配列が僅か３アミノ酸長である場合、３個のアミノ酸置換が存在し得るが（例えば、保存的置換）、好ましくは、ＣＤＲは、３個より少ない置換、例えば２個、１個のアミノ酸置換を有するか、又はアミノ酸置換を全く有しないものであり得る。
【００９１】
以下で更に考察するとおり、変異体は、任意のアミノ酸置換を有し得るが、好ましくは保存的アミノ酸置換を有し得る。詳細には、変異ＣＤＲを含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン（及びそれを中に含むＣＡＲ）は、上記に定義したとおりＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を保持していなければならない。変異ＣＤＲを使用すると、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインの結合活性が変化し得る（例えば、ＣＬＥＣ１４Ａに対する結合親和性が増加又は減少し得るか、又は結合ドメインがＣＬＥＣ１４Ａの異なるエピトープを認識し得る）ことが理解されるであろう。しかしながら、前述のとおり、１つ以上の変異ＣＤＲ配列を使用してもなお、上記に定義したとおりのＣＬＥＣ１４Ａ結合が（その結合が１つ以上の非変異ＣＤＲを含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインの結合と同一でないとしても）可能でなければならない。代替的に、先述のとおり、結合親和性は同様であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａに対する結合親和性が低下した抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン（及び本発明のＣＡＲ）をもたらす１つ以上の変異ＣＤＲを抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに使用することが好ましい場合もあり得る。このようにしてオフターゲットＣＬＥＣ１４Ａ結合（例えば、非腫瘍組織への結合）を低減し、詳細には最小限に抑える一方、オンターゲット結合（即ち、腫瘍血管構造への結合）を最大化し得る。
【００９２】
従って、本発明の更なる実施形態では、ＣＬＥＣ１４Ａに対する結合親和性が低下した抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインを同定する方法が包含され、前記方法は、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内に含まれる本明細書に定義するとおりのＣＤＲ配列に１つ以上のアミノ酸置換（詳細には１、２又は３個のアミノ酸置換）を導入すること、及びＣＬＥＣ１４Ａに対するその結合親和性に関して変異ドメインを試験することを含む。
【００９３】
本発明は、上記に定義したＣＤＲ配列のいずれか１つ以上又はその変異体を含む重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインを更に提供する。従って、上記に定義したＣＤＲは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内の重鎖及び／又は軽鎖可変領域内に存在し得る。先に考察したとおり、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、３つのＣＤＲを有するＶＨ及び／又は３つのＣＤＲを有するＶＬを含んでもよく、これらのＣＤＲの少なくとも１つは、上記に記載されるＣＤＲ配列の１つ又は１、２若しくは３個のアミノ酸置換を有するその変異体から選択される。
【００９４】
本発明の第１の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号５６、
（ｂ）配列番号８８、
（ｃ）配列番号９０、
（ｄ）配列番号１０４
（ｅ）配列番号１０６、又は
（ｆ）配列番号１２１
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個のアミノ酸置換を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）のいずれか１つの変異体を含んでもよい。
【００９５】
本発明の第２の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１７３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。
【００９６】
従って、この態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に記載されるとおりの可変重鎖配列又は以下に更に定義するとおりそれと少なくとも８０％の同一性を有する、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。重鎖可変配列（例えば、配列番号５６、８８、９０、１０４、１０６、１２１及び１７３のもの）が１つ以上のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ）を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記の重鎖可変領域配列は、例えば、２０％まで（例えば、２０個のアミノ酸置換まで）改変し得るが、重鎖可変領域内に存在するいずれのＣＤＲも、各々最大３個のアミノ酸置換（例えば、１ＣＤＲ当たり１、２又は３個のアミノ酸置換）のみを受けることが好ましい。従って、配列番号５６に関して、それと少なくとも８０％の同一性を有する変異体が包含されるが、そこに含まれる配列番号３２、配列番号３３及び配列番号３４の配列は、アミノ酸置換を各々３個までのみ有することが好ましい。配列番号８８に関して、そこに含まれる配列番号６４、６５及び６６の配列は、アミノ酸置換を各々３個までのみ含むことが好ましい。これは、配列番号９０内に含まれる配列番号７６、７７及び７８、配列番号１０４内に含まれる配列番号３２、３３及び１００、配列番号１０６内に含まれる配列番号４４、４５及び１０２、配列番号１２１内に含まれる配列番号３２、３３及び１１６並びに配列番号１７３内に含まれる配列番号１６７、１６８及び１６９にも適用される。
【００９７】
本発明の第１の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号５７、
（ｂ）配列番号８９、
（ｃ）配列番号９１、
（ｄ）配列番号１０５、
（ｅ）配列番号１０７、又は
（ｆ）配列番号１２２
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個のアミノ酸置換を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）のいずれか１つの変異体を含んでもよい。
【００９８】
本発明の第２の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１３３のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。
【００９９】
従って、これらの態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に記載されるとおりの可変軽鎖配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０個のアミノ酸置換を有するその変異体を含んでもよい。軽鎖可変配列（例えば、配列番号５７、８９、９１、１０５、１０７若しくは１２２又は１３３のもの）が１つ以上のＣＤＲ（例えば、３つのＣＤＲ）を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記の軽鎖可変領域配列は、例えば、２０％まで改変し得るが、軽鎖可変領域内に存在するいずれのＣＤＲも、各々最大３個のアミノ酸置換（例えば、１ＣＤＲ当たり１、２又は３個のアミノ酸置換）のみを受けることが好ましい。従って、配列番号５７に関して、それと少なくとも８０％の同一性を有する変異体が包含されるが、そこに含まれる配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７の配列は、アミノ酸置換を各々３個までのみ含むことが好ましい。配列番号８９に関して、そこに含まれる配列番号６７、６８及び６９の配列は、アミノ酸置換を各々３個までのみ有することが好ましい。これは、配列番号９１内に含まれる配列番号７９、８１及びＳＴＳ、配列番号１０５内に含まれる配列番号３５、３６及び３７、配列番号１０７内に含まれる配列番号４７及び４９及びＤＴＳ、配列番号１２２内に含まれる配列番号３５、３６及び３７並びに配列番号１３３内に含まれる配列番号１２９、６８及び１３０にも適用される。
【０１００】
詳細には、本発明の第１の態様によれば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａ（即ち、ＣＬＥＣ１４Ａ上のＣ型レクチンドメイン）に結合する重鎖及び軽鎖可変配列を含んでもよい。従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号５６、８８、９０、１０４、１０６若しくは１２１のいずれか１つ又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体、及び配列番号５７、８９、９１、１０５、１０７若しくは１２２のいずれか１つ又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含んでもよい。従って、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号５６又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体及び配列番号５７又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体、
（ｂ）配列番号８８又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体及び配列番号８９又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体
（ｃ）配列番号９０又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体及び配列番号９１又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体、
（ｄ）配列番号１０４又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体及び配列番号１０５又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体、
（ｅ）配列番号１０６又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体及び配列番号１０７又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体、又は
（ｆ）配列番号１２１又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体及び配列番号１２２又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体
を含んでもよい。
【０１０１】
上記で考察したとおり、配列番号５６、５７、８８、８９、９０、９１、１０４、１０５、１０６、１０７、１２１及び１２２の重鎖及び軽鎖可変領域内に存在するいずれのＣＤＲも、アミノ酸置換を１ＣＤＲ当たり１、２又は３個までのみ有することが好ましい。
【０１０２】
本発明の第２の態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、ＣＬＥＣ１４Ａ（即ち、ＣＬＥＣ１４Ａ上のＣ型レクチンドメイン）に結合する重鎖及び軽鎖可変配列を含んでもよい。従って、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１７３の重鎖可変配列及び配列番号１３３の軽鎖可変配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するいずれか一方又は両方の配列の変異体を含んでもよい。
【０１０３】
先に考察したとおり、本発明に係る「変異」配列とは、定義された配列又は参照配列（即ち、配列番号によって提供されるもの）と比較したときに複数のアミノ酸置換を有する配列を指す。従って、変異配列は、元の配列と比較したときに異なるアミノ酸残基を有し得る。いかなるアミノ酸置換を行って変異配列を得てもよいが、先に考察したとおり、いずれのかかる変異配列も、元の配列の機能活性、例えば結合親和性をある程度保持していなければならない。従って、変異体は、元の配列と比較して増加した又は低下した機能活性（例えば、結合親和性）を有し得るが、一部の機能を保持していなければならない。変異ＣＤＲ又は変異重鎖若しくは軽鎖を含む本発明の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインの場合、変異配列を含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインがなおもＣＬＥＣ１４Ａに結合できることが好ましい。変異体の実際の結合親和性は、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインと異なり得るが（増加又は低下している）、ＣＬＥＣ１４Ａに対する結合は、なおも選択的に起こらなければならない。
【０１０４】
従って、変異配列（例えば、ＣＤＲ又は重鎖／軽鎖）を含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、好ましくは非変異配列を含む抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインと実質的に同じ結合親和性を有しなければならない。例えば、変異体は、非変異配列を有する抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインの結合親和性の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０又は１２５％又はそれを超えるものを有し得る。ＣＬＥＣ１４Ａに対する結合親和性の検出及び計測方法は、当該技術分野において公知である。例えば、プルダウンアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法、酵母２ハイブリッド技術及びファージディスプレイを用い得る。
【０１０５】
本明細書に記載されるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であってもよく、例えば、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基によって置き換えられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、システイン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含め、当該技術分野において定義されている。従って、保存的アミノ酸置換には、（元の残基⇔置換）Ａｌａ（Ａ）⇔Ｖａｌ、Ｇｌｙ又はＰｒｏ、Ａｒｇ（Ｒ）⇔Ｌｙｓ又はＨｉｓ、Ａｓｎ（Ｎ）⇔Ｇｌｎ、Ａｓｐ（Ｄ）⇔Ｇｌｕ、Ｃｙｓ（Ｃ）⇔Ｓｅｒ、Ｇｌｎ（Ｑ）⇔Ａｓｎ、Ｇｌｕ（Ｇ）⇔Ａｓｐ、Ｇｌｙ（Ｇ）⇔Ａｌａ、Ｈｉｓ（Ｈ）⇔Ａｒｇ、Ｉｌｅ（Ｉ）⇔Ｌｅｕ、Ｌｅｕ（Ｌ）⇔Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＭｅｔ、Ｌｙｓ（Ｋ）⇔Ａｒｇ、Ｍｅｔ（Ｍ）⇔Ｌｅｕ、Ｐｈｅ（Ｆ）⇔Ｔｙｒ、Ｐｒｏ（Ｐ）⇔Ａｌａ、Ｓｅｒ（Ｓ）⇔Ｔｈｒ又はＣｙｓ、Ｔｈｒ（Ｔ）⇔Ｓｅｒ、Ｔｒｐ（Ｗ）⇔Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（Ｙ）⇔Ｐｈｅ又はＴｒｐ、及びＶａｌ（Ｖ）⇔Ｌｅｕ又はＡｌａが含まれる。
【０１０６】
第１の態様の更なる実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に定義される重鎖及び軽鎖を含むｓｃＦｖを含んでもよく、ここで、前記重鎖及び軽鎖は、先に定義したとおりのリンカー配列によってつなぎ合わされる。詳細には、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、
（ａ）配列番号５８、
（ｂ）配列番号９６、
（ｃ）配列番号１１２、又は
（ｄ）配列番号１２５
のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【０１０７】
第２の態様の更なる実施形態において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、上記に定義される重鎖及び軽鎖（配列番号１３３及び１７３）を含むｓｃＦｖを含んでもよく、ここで、前記重鎖及び軽鎖は、先に定義したとおりのリンカー配列によってつなぎ合わされている。詳細には、この態様において、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【０１０８】
従って、当業者は、本発明の抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインにおいて配列番号５８、９６、１１２、１２５又は１７５のｓｃＦｖ配列に対する変異配列を使用することが可能であり得ることを理解するであろう。かかる変異体は、上記で考察したとおり、好ましくは非修飾ｓｃＦｖ配列の結合親和性を保持しているか、又は非修飾ｓｃＦｖ配列の結合親和性を実質的に保持している、例えば非修飾ｓｃＦｖ配列の結合親和性の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０又は１２０％を有し得る。
【０１０９】
非修飾アミノ酸又はヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性を有する本発明のアミノ酸又はヌクレオチド配列は、少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、配列番号５８、９６、１１２、１２５又は１７５の上記のｓｃＦｖ配列に関して、それと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する配列が包含される。配列同一性は、任意の好都合な方法によって評価し得る。しかしながら、配列間の同一性の程度の決定には、配列の多重アラインメントを行うコンピュータプログラム、例えばClustal Wが有用である。必要に応じて、Clustal WアルゴリズムをBLOSUM 62スコアリング行列及びギャップ開始ペナルティ１０及びギャップ伸長ペナルティ０．１と共に使用することができ、そのようにして、配列の一方の全長の少なくとも５０％がアラインメントに関与する２つの配列間の高次の一致が達成される。２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ同一性を計算する他の方法も一般に当該技術分野で認められており、例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projectsに記載されるものが挙げられる。
【０１１０】
概して、かかる計算にはコンピュータプログラムが利用されることになる。配列のペアを比較してアラインメントするプログラム、例えばALIGN、FASTA、ギャップ付きBLAST、BLASTP、BLASTN又はGCGもこの目的に有用である。更に、欧州バイオインフォマティクス研究所のDaliサーバは、構造ベースのタンパク質配列アラインメントを提供している。
【０１１１】
参考として、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％等の配列同一性を有する本発明に係る配列は、ALIGNプログラムをデフォルトパラメータで用いて決定し得る（例えば、インターネット上でGENESTREAMネットワークサーバ、IGH、モンペリエ、フランスにおいて利用可能）。
【０１１２】
上記で考察したとおり、本発明の定義された配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する変異配列は、好ましくは、そこに含まれる特定のＣＤＲ内にアミノ酸置換を３個までのみ有することになる。従って、変異体は、定義された配列とその長さ全体にわたって少なくとも８０％の同一性を示し得るが、好ましくは、そこに含まれるいずれのＣＤＲもアミノ酸置換を最大でも３個のみ有し、例えばアミノ酸置換を全く有しないか、１又は２個のみを有することになる。従って、この場合、任意のＣＤＲの外側、例えばフレームワーク領域内にある重鎖若しくは軽鎖可変鎖配列又はｓｃＦｖ配列の領域に変異が生じることが好ましい。任意のＣＤＲの外側、例えばフレームワーク領域における変異について、変異にはアミノ酸置換、欠失及び／又は付加が含まれ得る。
【０１１３】
例えば、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内にあるとおりのＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖに関して、変異にはフレームワーク領域のヒト化が含まれ得ることが理解されるであろう。ＶＨ、ＶＬ又はｓｃＦｖは、公知の方法で、例えばマウス配列のＣＤＲ領域をヒト抗体のフレームワークに挿入することによりヒト化し得る。ヒト化抗体は、Verhoeyen et al (1988) Science, 239, 1534-1536及びKettleborough et al, (1991) Protein Engineering, l4(7), 773-783に記載される技法及び手法を用いて作製することができる。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が対応する非ヒト残基に置き換えられる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又はほとんどが非ヒト免疫グロブリンのものに対応する可変ドメインと、実質的に又は完全にヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであるフレームワーク領域とを含有することになる。
【０１１４】
第１の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３８、配列番号５０、配列番号８２、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号３９、配列番号５１又は配列番号８３、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号４０、配列番号５２、配列番号８４、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１１７、配列番号１２０、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１１５】
上記に定義されるヌクレオチド配列は、それぞれ本明細書に記載される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内に存在し得る重鎖ＣＤＲをコードする。（ａ）に記載されるヌクレオチド配列は、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５の重鎖ＣＤＲ１配列をコードし（従って配列番号３８が配列番号３２をコードし、配列番号５０が配列番号４４をコードし、及び配列番号８２が配列番号７６をコードする）、（ｂ）に記載されるヌクレオチド配列は、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５の重鎖ＣＤＲ２配列をコードし（従って配列番号３９が配列番号３３をコードし、配列番号５１が配列番号４５をコードし、及び配列番号８３が配列番号７７をコードする）、及び（ｃ）に記載されるヌクレオチド配列は、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５の重鎖ＣＤＲ３配列をコードする（従って配列番号４０が配列番号３４をコードし、配列番号５２が配列番号４６をコードし、配列番号８４が配列番号７８をコードし、配列番号１０１が配列番号１００をコードし、配列番号１１７が配列番号１１６をコードし、及び配列番号１２０が配列番号１１８をコードする）。従って、ポリヌクレオチドは、定義されたヌクレオチド配列のいずれか１つ、例えばこれらの配列の２又は３つを含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、（ａ）からの１つ、（ｂ）からの１つ及び／又は（ｃ）からの１つのヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１１６】
更に縮重変異体が包含される。遺伝子コードの縮重に起因して幾つかの異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードし得ることは理解されるであろう。従って、特定のアミノ酸について、２つ以上のヌクレオチドコドンがそのアミノ酸をコードし得る。従って、縮重変異体には、配列番号によって定義されるヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド変異体が包含される。詳細には、縮重変異体にはコドン最適化変異体が包含されてもよく、ここで、コドン最適化は、特定の生物におけるコード配列の発現を増強するために行われ得る。これは、当該技術分野における標準的実践であり、当業者は、宿主に基づきヌクレオチド配列をコドン最適化する方法を十分に理解しているであろう。
【０１１７】
追加的に又は代替的に、第１の態様に定義されるとおりのポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号４１、配列番号５３、配列番号８５、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号４２、ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ、ＡＧＣＡＣＡＴＣＣ、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号４３、配列番号５５、配列番号８７、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１１８】
上記に定義されるヌクレオチド配列は、それぞれ本明細書に記載される抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン内に存在し得る軽鎖ＣＤＲをコードする。（ａ）に記載されるヌクレオチド配列は、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５の軽鎖ＣＤＲ１配列をコードし（従って配列番号４１が配列番号３５をコードし、配列番号５３が配列番号４７をコードし、及び配列番号８５が配列番号７９をコードする）、（ｂ）に記載されるヌクレオチド配列は、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５の軽鎖ＣＤＲ２配列をコードし（従って配列番号４２が配列番号３６をコードし、ＧＡＣＡＣＡＴＣＣがＤＴＳをコードし、及びＡＧＣＡＣＡＴＣＣがＳＴＳをコードする）、及び（ｃ）に記載されるヌクレオチド配列は、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５の軽鎖ＣＤＲ３配列をコードする（従って配列番号４３が配列番号３７をコードし、配列番号５５が配列番号４９をコードし、及び配列番号８７が配列番号８１をコードする）。従って、ポリヌクレオチドは、定義されたヌクレオチド配列のいずれか１つ、例えばこれらの配列の２又は３つを含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、（ａ）からの１つ、（ｂ）からの１つ及び／又は（ｃ）からの１つのヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１１９】
ポリヌクレオチド配列は、重鎖ＣＤＲをコードする配列番号３８、３９、４０、５０、５１、５２、８２、８３、８４、１０１、１０３、１１７又は１２０のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列及び軽鎖ＣＤＲをコードする配列番号４１、４２、４３、５３、５５、８５、８７、ＡＧＣＡＣＡＴＣＣ又はＧＡＣＡＣＡＴＣＣのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば配列番号３８、３９、４０、５０、５１、５２、８２、８３、８４、１０１、１０３、１１７又は１２０から選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列及び配列番号４１、４２、４３、５３、５５、８５、８７、ＡＧＣＡＣＡＴＣＣ又はＧＡＣＡＣＡＴＣＣから選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３８、５０又は８２の１つのヌクレオチド配列、配列番号３９、５１又は８３の１つのヌクレオチド配列、配列番号４０、５２、８４、１０１、１０３、１１７又は１２０の１つのヌクレオチド配列、４１、５３又は８５の１つのヌクレオチド配列、４２又はＡＧＣＡＣＡＴＣＣ若しくはＧＡＣＡＣＡＴＣＣの１つのヌクレオチド配列及び４３、５５又は８７の１つのヌクレオチド配列、或いは１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するこれらの配列の１つ以上の変異体を含んでもよい。
【０１２０】
より詳細には、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列
（ａ）配列番号３８、配列番号５０、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号３９、配列番号５１、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号４０、配列番号５２、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１１７、配列番号１２０、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１２１】
従って、上記に指摘したとおり、ポリヌクレオチドは、上述のヌクレオチド配列の２又は３つを含んでもよく、詳細には、（ａ）からの１つ、（ｂ）からの１つ及び／又は（ｃ）からの１つのヌクレオチド配列を含んでもよい。より詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３８、３９及び／若しくは４０、配列番号５０、５１及び／若しくは５２、配列番号３８、３９及び／若しくは１０１、配列番号５０、５１及び／若しくは１０３、配列番号３８、３９及び／若しくは１１７又は配列番号５０、５１及び／若しくは１２０又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するこれらの配列のいずれかの変異体を含んでもよい。
【０１２２】
特に好ましい実施形態において、第１の態様のポリヌクレオチドは、
配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０、
配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２、
配列番号３８、配列番号３９及び配列番号１０１、
配列番号５０、配列番号５１及び配列番号１０３、
配列番号３８、配列番号３９及び配列番号１１７、又は
配列番号５０、配列番号５１及び配列番号１２０
（上記の配列のいずれも１、２又は３個のヌクレオチド置換を含み得る）のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１２３】
更に、ポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列番号４１、配列番号５３、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号４２又はＧＡＣＡＣＡＴＣＣ、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号４３、配列番号５５、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１２４】
従って、上記に指摘したとおり、ポリヌクレオチドは、上述のヌクレオチド配列の２又は３つを含んでもよく、詳細には、（ａ）からの１つ、（ｂ）からの１つ及び／又は（ｃ）からの１つのヌクレオチドを含んでもよい。従って、好ましくは、ポリヌクレオチドは、配列番号４１、４２及び／若しくは４３から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、又は配列番号５３、５５及び／若しくはＧＡＣＡＣＡＴＣＣから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、或いは１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するこれらの配列のいずれか１つ以上の変異体を含んでもよい。
【０１２５】
詳細な実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４１、配列番号４２及び配列番号４３又は配列番号５３、ＧＡＣＡＣＡＴＣＣ及び配列番号５５（ヌクレオチド配列のいずれか１つ以上が１、２又は３個のアミノ酸置換を有し得るか、又は縮重配列であり得る）を含んでもよい。
【０１２６】
第１の態様のポリヌクレオチドは、配列番号３８、３９、４０、５０、５１、５２、１０１、１０３、１１７又は１２０のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列及び配列番号４１、４２、４３、５３若しくは５５又はＧＡＣＡＣＡＴＣＣのいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば配列番号３８、３９、４０、５０、５１、５２、１０１、１０３、１１７又は１２０のいずれか１つ以上から選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列及び配列番号４１、４２、４３、５３若しくは５５又はＧＡＣＡＣＡＴＣＣのいずれか１つ以上から選択される少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３８又は５０のヌクレオチド配列、配列番号３９又は５１のヌクレオチド配列、配列番号４０、５２、１０１、１０３、１１７又は１２０のヌクレオチド配列、配列番号４１又は５３のヌクレオチド配列、配列番号４２又はＧＡＣＡＣＡＴＣＣのヌクレオチド配列及び配列番号４３又は５５のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１２７】
詳細には、ポリヌクレオチド配列は、
配列番号３８、３９、４０、４１、４２及び４３、
配列番号５０、５１、５２、５３、５５及びＧＡＣＡＣＡＴＣＣ、
配列番号３８、３９、１０１、４１、４２及び４３、
配列番号５０、５１、１０３、５３、５５及びＧＡＣＡＣＡＴＣＣ、
配列番号３８、３９、１１７、４１、４２及び４３、又は
配列番号５０、５１、１２０、５３、５５及びＧＡＣＡＣＡＴＣＣ、
（上記の配列番号の任意の１つ以上が１、２又は３個のアミノ酸置換を有し得るか、又はその縮重配列であり得る）のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１２８】
代替的に、ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号８２、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号８３、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号８４、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１２９】
詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号８２、８３又は８４の配列の２つを含んでもよく、又は配列番号８２、８３及び８４の全てを含んでもよい。
【０１３０】
更に、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号８５、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）ＡＧＣＡＣＡＴＣＣ、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号８７、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有するその変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１３１】
詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号８５、８７又はＡＧＣＡＣＡＴＣＣの配列の２つを含んでもよく、又は配列番号８５、８７及びＡＧＣＡＣＡＴＣＣの全てを含んでもよい。第１の態様のポリヌクレオチド配列は、配列番号８２、８３及び８４のいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列及び配列番号８５、８７及びＡＧＣＡＣＡＴＣＣから選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列、例えば配列番号８２、８３及び８４からの２つのヌクレオチド配列及び配列番号８５、８７及びＡＧＣＡＣＡＴＣＣからの２つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号８２、８３、８４、８５、８７及びＡＧＣＡＣＡＴＣＣの全て（配列の任意の１つ以上が１、２又は３個のヌクレオチド置換を含み得る）を含んでもよい。
【０１３２】
本発明の第２の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１７０、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する変異体、
（ｂ）配列番号１７１、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号１７２、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１３３】
従って、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１７０、配列番号１７１及び配列番号１７２から選択される２つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、第２の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１７０、配列番号１７１及び配列番号１７２を含んでもよい。
【０１３４】
先に考察したとおり、本発明の第２の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１３１、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する変異体、
（ｂ）配列番号７４、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する変異体、及び／又は
（ｃ）配列番号１３２、その縮重変異体又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する変異体
の少なくとも１つを含んでもよい。
【０１３５】
従って、第２の態様では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１３１、配列番号７４及び配列番号１３２から選択される２つのヌクレオチド配列を含んでもよい。詳細には、第２の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１３１、７４及び１３２を含んでもよい。
【０１３６】
更に、第２の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１７０、１７１、１７２、１３１、７４及び／又は１３２のいずれか１つ以上を含んでもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１７０、１７１、１７２、１３１、７４及び１３２の全て、又はそれらの配列のいずれか１つ以上の縮重変異体、又は１、２若しくは３個のヌクレオチド置換を有する配列のいずれか１つ以上の変異体を含んでもよい。
【０１３７】
上記で考察したとおり、ポリヌクレオチド配列は、上記に記載されるヌクレオチド配列のいずれかの変異体を含んでもよい。これに関して、ヌクレオチド配列の１つ以上が変異配列であってもよい。例えば、ポリヌクレオチドが、重鎖ＣＤＲをコードする定義されたヌクレオチド配列の１〜３つを含むとき、それらの配列のいずれか１つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。代替的に、ポリヌクレオチド配列が、軽鎖ＣＤＲをコードする定義されたヌクレオチド配列の１〜３つを含むとき、それらの配列のいずれか１つが変異体であるか、全てが変異体であるか、又はいずれも変異体でないことがあり得る。従って、ポリヌクレオチドが、軽鎖及び重鎖ＣＤＲをコードする６つのヌクレオチド配列を含むとき（例えば、軽鎖をコードする３つ及び重鎖をコードする３つ）、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列の１、２、３、４、５又は６つが変異配列であってもよく、各個別のヌクレオチド配列が１、２又は３個のヌクレオチド置換を含み得る。ポリヌクレオチド配列は、変異ヌクレオチド配列及び非変異ヌクレオチド配列の両方を含んでもよく、代替的に全て変異ヌクレオチド配列を含んでもよく、又は変異ヌクレオチド配列を全く含まなくてもよい。
【０１３８】
当業者によれば、配列内のヌクレオチド置換は、核酸コードの縮重に起因して、コードされるタンパク質又はポリペプチド配列のアミノ酸変化をもたらすことも又はもたらさないこともあることは理解されるであろう。従って、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る。これに関して、本発明のヌクレオチド変異体は、非変異配列と同じアミノ酸配列をコードし得る。ヌクレオチド置換がアミノ酸置換をもたらす場合、上記で考察したとおり、置換が保存的であり（しかしながら、本発明は、保存的アミノ酸置換に限定されない）、及びコードされる抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが上記で先に考察した機能を有することが好ましい。
【０１３９】
本発明の第１の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５９、
（ｂ）配列番号９２、
（ｃ）配列番号９４、
（ｄ）配列番号１０８、
（ｅ）配列番号１１０、又は
（ｆ）配列番号１２３
のいずれか１つ、又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）若しくは（ｆ）のいずれか１つの変異体を含んでもよい。
【０１４０】
従って、本発明の第１の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、重鎖可変領域をコードする上記に記載したとおりのヌクレオチド配列又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体を含んでもよい。コードされる重鎖可変領域が少なくとも１つのＣＤＲ（特に３つのＣＤＲ）を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記のヌクレオチド配列は、１０ヌクレオチドまで異なり得るが、配列番号５９、９２、９４、１０８、１１０及び１２３のヌクレオチド配列のうちのＣＤＲをコードする部分は、１ＣＤＲ当たり３個までのヌクレオチド置換のみ異なることが好ましい。詳細には、配列番号５９、９２、９４、１０８、１１０及び１２３のうちのＣＤＲをコードする任意の領域の外側にあるヌクレオチド配列、例えば配列のうちのフレームワーク領域をコードする領域又は部分に任意の変異が生じることが好ましい。従って、配列番号５９について、この配列に対してヌクレオチド置換は１０個まで行われ得るが、配列番号５９内に含まれる配列番号３８、３９及び４０又は配列番号５０、５１及び５２の各々に最大で３個の置換が行われてもよい。配列番号９２について配列番号７０、７１又は７２の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号９４について配列番号８２、８３及び８４の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号１０８について配列番号３８、３９及び１０１の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号１１０について配列番号５０、５１及び５２の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、及び配列番号１２３について配列番号３８、３９及び１１７の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよい。
【０１４１】
第１の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号６０、
（ｂ）配列番号９３、
（ｃ）配列番号９５、
（ｄ）配列番号１０９、
（ｅ）配列番号１１１、又は
（ｆ）配列番号１２４
のいずれか１つ、又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のいずれか１つの変異体、又はその縮重変異体を含んでもよい。
【０１４２】
本発明の第２の態様によれば、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１７４及び／又は配列番号１３４又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体を含んでもよい。
【０１４３】
従って、ポリヌクレオチド配列は、軽鎖可変領域をコードする上記に記載したとおりのヌクレオチド配列（配列番号６０、９３、９５、１０９、１１１、１２４又は１３４）又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体を含んでもよい。コードされる軽鎖可変領域が少なくとも１つのＣＤＲ（特に３つのＣＤＲ）を含み得ることは理解されるであろう。これに関して、上記のヌクレオチド配列は、１０ヌクレオチドまで異なり得るが、配列番号６０、９３、９５、１０９、１１１、１２４又は１３４のヌクレオチド配列のうちのＣＤＲをコードする部分は、３個までのヌクレオチド置換のみ異なることが好ましい。詳細には、配列番号６０、９３、９５、１０９、１１１、１２４又は１３４のうちのＣＤＲをコードする任意の領域の外側にあるヌクレオチド配列、例えば配列のうちのフレームワーク領域をコードする領域又は部分に任意の変異が生じることが好ましい。従って、配列番号６０について、この配列に対してヌクレオチド置換は１０個まで行われ得るが、配列番号６０内に含まれる配列番号４１、４２及び４３又は配列番号５３、５５及びＧＡＣＡＣＡＴＣＣの各々に最大で３個の置換が行われてもよい。配列番号９３について配列番号７３、７４及び７５の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号９５について配列番号８５、８７及びＡＧＣＡＣＡＴＣＣの各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号１０９について配列番号４１、４２及び４３の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号１１１について配列番号５３、５５及びＧＡＣＡＣＡＴＣＣの各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、配列番号１２４について配列番号５３、５５及びＧＡＣＡＣＡＴＣＣの各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよく、及び配列番号１３４について配列番号１３１、７４及び１３２の各々に最大で３個のヌクレオチド置換が行われてもよい。
【０１４４】
本発明の詳細な実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＬＥＣ１４Ａ（本発明の第１の態様によればＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチンドメイン）に結合する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方をコードする配列を含んでもよい。従って、ポリヌクレオチドは、配列番号５９、９２、９４、１０８、１１０、１２３及び１７４のいずれか１つ又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体と、配列番号６０、９３、９５、１０９、１１１、１２４及び１３４のいずれか１つ又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体とを含んでもよい。従って、この態様において、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号５９、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号６０、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｂ）配列番号９２、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号９３、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｃ）配列番号９４、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号９５、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｄ）配列番号１０８、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号１０９、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｅ）配列番号１１０、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号１１１、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、
（ｆ）配列番号１２３、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号１２４、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体、又は
（ｇ）配列番号１７４、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体及び配列番号１３４、その縮重変異体又は１〜１０個のヌクレオチド置換を有するその変異体
を含んでもよい。
【０１４５】
これとの関連において、ポリヌクレオチドは、ＣＬＥＣ１４Ａに結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変鎖を含むｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、ここで、前記軽鎖と重鎖とは先に定義したとおりのリンカー配列によってつなぎ合わされていてもよい。詳細には、ポリヌクレオチド配列は、ｓｃＦｖをコードする以下の配列：
（ａ）配列番号６１、
（ｂ）配列番号９７、
（ｃ）配列番号１１３、
（ｄ）配列番号１２６、又は
（ｅ）配列番号１７６
の１つ、又はその縮重変異体又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【０１４６】
従って、当業者は、上記のｓｃＦｖコードヌクレオチド配列（配列番号６１、９７、１１３、１２６又は１７６）に対する変異配列を使用する可能性があってよく、上記で考察したとおりのかかる変異配列は、好ましくは、非修飾ｓｃＦｖの結合親和性を保持しているか又は非修飾ｓｃＦｖ配列の結合親和性を実質的に保持しているｓｃＦｖをコードすることになり、例えばｓｃＦｖ配列の結合親和性の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０又は１２０％を有し得ることを理解するであろう。詳細には、ｓｃＦｖは、上記で先に考察したとおりの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインの結合親和性を有し得る。
【０１４７】
本明細書で考察するとおり、定義されたヌクレオチド配列の縮重変異体も包含される。詳細には、特定の生物の細胞内での発現に最適化されたコドン最適化ヌクレオチド配列が包含される。例えば、ヒト又はマウス細胞における発現にコドン最適化されたポリヌクレオチド配列が開発されてもよく、及び本発明に包含される。
【０１４８】
より詳細には、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに含まれるｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列がコドン最適化され得る。これに関して、本明細書に定義するとおりの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５若しくは１８６のいずれか１つを含むポリヌクレオチド、又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する変異体によってコードされてもよく、又はそれによってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、ここで、前記変異体は、上記に定義したとおりの、ＣＬＥＣ１４Ａへの結合能を有するｓｃＦｖをコードする。この態様において、配列番号１７７及び１７８は、それぞれ配列番号６１のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、配列番号１７９及び１８０は、それぞれ配列番号１７６のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、配列番号１８１及び１８２は、それぞれ配列番号９７のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、配列番号１８３及び１８４は、それぞれ配列番号１１３のヒト及びマウスコドン最適化配列に関し、及び配列番号１８５及び１８６は、それぞれ配列番号１２６のヒト及びマウスコドン最適化配列に関する。
【０１４９】
配列同一性は、先に考察したとおり決定することができる。更に、既に考察したとおり、変異は、ヌクレオチド配列のうちのＣＤＲ領域をコードしない領域に生じることが好ましい。これらの領域については上記で考察したとおりである。
【０１５０】
上記に定義されるヌクレオチド配列はＤＮＡであるが、本発明の代替的実施形態では、ヌクレオチド配列はＲＮＡであってもよい。従って、本明細書に記載されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列が包含される。当業者は、上記に記載されるそれらのＤＮＡ配列と同じタンパク質／ポリペプチド産物をコードするＲＮＡ配列がどのように得られるかについて、例えば「Ｔ」を「Ｕ」に置き換えなければならないなどを理解しているであろう。
【０１５１】
用語「核酸配列」、又は「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」、又は「ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用されるとき、天然に存在する塩基、糖及び糖間（骨格）連結で構成されるヌクレオシド又はヌクレオチド単量体の配列を指す。この用語には、天然に存在しない単量体又はその一部分を含む修飾又は置換配列も含まれる。本発明の核酸、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）又はリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシルを含めた天然に存在する塩基を含み得る。配列は、修飾塩基も含有し得る。かかる修飾塩基の例としては、アザ及びデアザアデニン、グアニン、シトシン、チミジン及びウラシル、並びにキサンチン及びヒポキサンチンが挙げられる。核酸、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は二本鎖又は一本鎖であってもよい。核酸、ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列は、全体的に又は部分的に合成又は組換えであってもよい。
【０１５２】
上記で考察したとおり、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインと膜貫通ドメインと細胞内シグナリングドメインとを含むＣＡＲをコードする。
【０１５３】
本明細書で使用されるとおりの「膜貫通ドメイン」は、任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインをベースとし得るか、又はそれに由来し得る。典型的には、それは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３ζ  ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）及びＣＤ１５４、好ましくはヒトＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３ζ  ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４の膜貫通ドメインであり得るか、又はそれに由来し得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４又はＣＤ３ζ、好ましくはヒトＣＤ２８、ＣＤ４又はＣＤ３ζの膜貫通ドメインであり得るか、又はそれに由来し得る。別の実施形態において膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、それは、ロイシン及びバリンなどの主に疎水性の残基を含み得る。従って、膜貫通ドメインは、細胞の細胞膜にわたって又はその範囲内に存在することが可能である。上記で考察したとおり、膜貫通ドメインは、細胞外及び／又は細胞内部分を含むタンパク質に由来してもよく、従って、本明細書で使用されるとおりの膜貫通ドメインは、細胞膜内にあるか又はそれにわたる部分に加えて、元のタンパク質に由来する細胞外及び／又は細胞内残基に付加していてもよい。例えば、膜貫通ドメインは、元のタンパク質に由来するヒンジ又はスペーサー領域に付加していてもよく、例えば、ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来するスペーサー又はヒンジドメインに付加していてもよい。細胞膜内の膜貫通ドメインの存在は、蛍光顕微鏡法による蛍光標識を含め、当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて評価することができる。
【０１５４】
膜貫通ドメインは、一実施形態において、ＣＡＲの抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインを細胞内シグナリングドメインに連結してもよく、ここで、細胞内シグナリングドメインは、膜貫通ドメインと異なるタンパク質に由来してもよく、又は膜貫通ドメインと同じタンパク質に由来してもよい（例えば、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが、天然で同じタンパク質内に見られる膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインと同じ配列を有してもよい）。従って、一実施形態において、膜貫通ドメインと細胞内シグナリングドメインとは、同じタンパク質からのものであってよく、又は同じタンパク質に由来してもよい。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、同様に共刺激部分を含むタンパク質に由来してもよく、従って、ＣＡＲは、そのタンパク質からの膜貫通ドメインと、また共刺激シグナルを提供する能力を有する部分との両方を含んでもよい。
【０１５５】
本明細書で使用されるとおりの膜貫通ドメインは、そのドメインがなおも膜内に存在する能力を有する限り、天然に存在する膜貫通ドメインの配列と異なる配列を有してもよい。例えば、膜貫通ドメインは、その修飾ドメインが細胞膜にわたって存在する能力を有する限り、天然に存在するタンパク質の膜貫通ドメインと少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の配列同一性を有してもよい。配列同一性は、先に考察したとおり計測し得る。
【０１５６】
好ましい実施形態において膜貫通ドメインは、配列番号１４６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通ドメインである。別の見方をすれば、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１４７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１５７】
更なる実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１１９に記載されるヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるＣＤ８α膜貫通ドメインである。この膜貫通配列は、配列番号１６５又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列に示されるとおりのＣＤ８αからのヒンジドメインに更に付加されていてもよい。
【０１５８】
「細胞内シグナリングドメイン」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原（ＣＬＥＣ１４Ａ）への有効なＣＡＲ結合のメッセージを細胞（宿主細胞、例えば免疫エフェクター細胞）の内部に伝達して、細胞機能（例えば、エフェクター細胞機能）、例えば活性化、サイトカイン産生、増殖及びＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含めた細胞傷害活性、又は細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合によって生じる他の細胞応答を生じさせることに関与するＣＡＲタンパク質の一部を指す。
【０１５９】
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含めたヘルプ若しくは活性であり得る。従って、「エフェクター細胞」は、かかるエフェクター機能を有する細胞である。従って、用語「細胞内シグナリングドメイン」は、タンパク質のうちのエフェクター機能シグナルを伝達する一部分であって、且つ細胞が特殊化した機能を果たすように指図する一部分を指す。本発明では、天然に存在するタンパク質の細胞内シグナリングドメイン全体を用いることができるが、多くの場合にドメイン全体を使用する必要はない。天然に存在する細胞内シグナリングドメインの変異体、例えばトランケートされた一部分が使用される限りにおいて、それがエフェクター機能シグナルを伝達する、例えば完全長ドメインとしてのエフェクター機能伝達能力の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％を有するのであれば、かかる変異体（例えば、トランケートされた一部分）をドメイン全体の代わりに使用し得る。変異体の（例えば、トランケート型の）細胞内シグナリングドメインは、更にエフェクター機能シグナル伝達能力が増加していてもよく、例えば、完全長細胞内シグナリングドメインと比較して少なくとも１０５、１１０、１２０、１３０又は１４０％のエフェクター機能伝達能力を有してもよい。エフェクター機能伝達能力は、標的との作用後に細胞のエフェクター機能を計測すること、例えばサイトカイン放出、細胞増殖等を計測することによって計測し得る。従って、用語の細胞内シグナリングドメインには、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナリングドメインの任意のトランケートされた一部分が含まれることが意図される。
【０１６０】
変異細胞内シグナリングドメインは、天然に存在する細胞内シグナリングドメインと少なくとも７０、８０、９０又は９５％の配列同一性を有し得る。トランケート型ドメインが使用されている場合、％配列同一性は完全長配列と比較したときに７０％未満となり得ることが理解されるであろう。細胞内シグナリングドメインは、「シグナル伝達ドメイン」としても知られ、典型的にはヒトＣＤ３ζ又はＦｃＲｙ鎖の一部分に由来する。
【０１６１】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲに用いられる細胞内シグナリングドメインの他の例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及び抗原受容体会合後に協働して作用してシグナル伝達を惹起する共受容体の細胞質配列、並びに上記で考察したとおりのこれらの配列の任意の変異体が挙げられる。ＴＣＲ単独で生成されたシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には概して不十分であり、二次シグナル及び／又は共刺激シグナルも必要となり得ることが知られている。従って、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるシグナリング配列クラス：ＴＣＲ（細胞内シグナリングドメイン）を介して抗原依存性の一次活性化を惹起するもの及び抗原非依存的に作用して二次シグナル又は共刺激シグナルを提供するもの（共刺激ドメインなど）によって媒介されると言うことができる。共刺激ドメインは、エフェクター機能の活性化を促進し、またエフェクター機能の持続性及び／又は細胞の生存も促進し得る。
【０１６２】
刺激性の様式で作用する細胞内シグナリングドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナリングモチーフ（例えば、２、３、４、５個又はそれを超えるＩＴＡＭ）を含有し得る。例えば、ＣＤ３ζ、Ｆｃ受容体γ、Ｆｃ受容体β、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄは、１つ以上のＩＴＡＭを含む。従って、一実施形態において、本明細書において使用される細胞内シグナリングドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、Ｆｃ受容体γ、Ｆｃ受容体β、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄのいずれか１つ以上からの１つ以上のＩＴＡＭを含み得る。上記で考察したとおり、細胞内シグナリングドメインが先に考察したとおりのエフェクター機能の誘導能を有する限り、細胞内シグナリングドメイン内にＩＴＡＭの変異体を使用し得ることは理解されるであろう。
【０１６３】
詳細には、本明細書に定義するとおりのＣＡＲは、ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナリングドメイン、より詳細には配列番号１４８の配列若しくはそれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１４９のヌクレオチド配列若しくはそれと少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる細胞内シグナリングドメインを含み得る。
【０１６４】
先に指摘したとおり、ポリヌクレオチドは、追加的な部分又はドメインを含み、即ち、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナリングドメインに加えて含むＣＡＲをコードし得る。従って、詳細には、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激ドメインを更に含み得る。上記で考察したとおり、少なくとも１つの共刺激ドメインの存在は、多くの場合、ＣＡＲが発現する細胞からの最適なエフェクター機能の提供に好ましい。従って、ＣＡＲは、細胞内シグナリングドメインのみを含んでもよいが、詳細な実施形態では共刺激ドメインも存在し得る。
【０１６５】
「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部分又は一領域を指す。共刺激分子は、細胞が抗原に対して（例えば、免疫細胞が抗原に対して）効率的に応答するのに必要である、抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子であり得る。共刺激分子の例としては、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
【０１６６】
上記で考察したとおり、共刺激分子が膜貫通部分を更に含む場合、本明細書に記載されるＣＡＲの膜貫通ドメインと共刺激ドメインとは、同じタンパク質に由来し得る可能性がある。詳細な実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン及び共刺激ドメインを含んでもよい。
【０１６７】
本発明のＣＡＲ内に存在する細胞内シグナリングドメイン及び共刺激ドメインは、互いにいかなる順序で連結されていてもよい（例えば、ランダム又は特定の順序）。任意選択でショートオリゴペプチド又はポリペプチドリンカー、例えば２〜１０アミノ酸長（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長）が、細胞内シグナリングドメインの細胞内シグナリング配列と１つ以上の共刺激ドメインとの間の連結を形成し得る。一実施形態では、好適なリンカーとしてグリシン−セリンダブレットを使用することができる。別の実施形態では、好適なリンカーとして単一のアミノ酸、例えばアラニン又はグリシンを使用することができる。
【０１６８】
本発明の核酸によってコードされるＣＡＲは、２つ以上、例えば３、４、５つ又はそれを超える共刺激シグナリングドメインを含んでもよい。ある実施形態において、これらの共刺激シグナリングドメインは、上記に記載したとおりのリンカー、例えばグリシン又はアラニン残基によって分離されていてもよい。
【０１６９】
詳細には、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、例えばアミノ酸配列の配列番号１４８又はそれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、及びＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ又はＤＡＰ−１０の共刺激ドメインを含んでもよい。ＯＸ４０の共刺激ドメインは、詳細には、配列番号１６８に記載されるとおりのアミノ酸配列を有するか、又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する。別の見方をすれば、ＯＸ４０の共刺激ドメインは、配列番号４８に記載されるとおりのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされてもよい。４−１ＢＢの共刺激ドメインは、配列番号８０に記載されるとおりのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされてもよく、及びＣＤ２８の共刺激ドメインは、配列番号５４に記載されるとおりのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列によってコードされてもよい。より詳細には、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、例えばアミノ酸配列の配列番号１４８又はそれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むもの、並びにＣＤ２８及びＯＸ４０の共刺激ドメイン、ＣＤ２８及び４−１ＢＢの共刺激ドメイン又は４−１ＢＢ及びＯＸ４０の共刺激ドメインを含んでもよい。
【０１７０】
更に、本発明のポリヌクレオチドは、１）ＣＤ２８からの膜貫通及び共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、２）ＣＤ８αからの膜貫通ドメイン、４−１ＢＢからの共刺激ドメイン及びＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、３）ＣＤ８αからの膜貫通ドメイン、ＯＸ４０からの共刺激ドメイン及びＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、４）ＣＤ２８からの膜貫通ドメイン、ＣＤ２８及び４−１ＢＢからの共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、５）ＣＤ２８からの膜貫通ドメイン、ＣＤ２８及びＯＸ４０からの共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、６）ＣＤ８αからの膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＯＸ４０からの共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、７）ＣＤ８αからの膜貫通ドメイン、ＣＤ２８からの共刺激ドメイン及びＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、８）ＣＤ８αからの膜貫通ドメイン、ＣＤ２８及び４−１ＢＢからの共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメイン、又は９）ＣＤ８αからの膜貫通ドメイン、ＣＤ２８及びＯＸ４０からの共刺激ドメイン並びにＣＤ３ζからの細胞内シグナリングドメインを含むＣＡＲをコードしてもよい。詳細には、ＣＤ８αからの膜貫通ドメインを含むコンストラクトのいずれか１つは、同様にＣＤ８αに由来するヒンジ又はスペーサードメイン、例えば配列番号１６５又はそれと少なくとも９５％の同一性を有する配列に定義されるとおりのものを更に含んでもよい。
【０１７１】
ポリヌクレオチドは、リーダー配列を含むＣＡＲを更にコードしてもよい。用語「リーダー配列」は、ＣＡＲを細胞膜にターゲティングするペプチド配列を指す。リーダー配列は、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインのＮ末端に存在してもよく、及び／又は細胞プロセシング及び細胞膜へのＣＡＲの局在化中にリーダー配列がＣＡＲから切断されることが可能である。本明細書に記載されるとおりのＣＡＲに使用し得る典型的なリーダー配列は、配列番号１３５のオンコスタチンＭリーダー配列、配列番号１６２によってコードされるＣＤ８αリーダー配列又はそれと少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％の同一性を有するその変異体であって、ＣＡＲを細胞膜にターゲティングする能力を有するその変異体である。リーダー配列の必須部分は、典型的には、単一のα−ヘリックスを形成する傾向のある一続きの疎水性アミノ酸を含む。
【０１７２】
ＣＡＲは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジドメイン又はスペーサー領域（本明細書では同義的に使用される）を更に含んでもよい。ヒンジドメイン及び／又はスペーサーは、可動性を有してそれを様々な方向に配向させることが可能であってもよく、これは、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインへの抗原結合を促進し得る。特定の実施形態において、ヒンジ領域及び／又はスペーサーは、免疫グロブリンヒンジ領域であってもよく、野生型免疫グロブリンヒンジ領域又は改変された野生型免疫グロブリンヒンジ領域、例えばトランケート型ヒンジ領域であってもよい。使用し得る他の例示的ヒンジ領域及び／又はスペーサーとしては、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域及び／又はスペーサーが挙げられ、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域／スペーサーであってもよく、又は改変されてもよい。好ましくはヒンジ領域／スペーサーは、ヒトＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８又はＣＤ７のヒンジ領域／スペーサーであるか、又はそれに由来する。ＩｇＤ、ＣＨ３及びＦｃスペーサー又はヒンジも本発明のＣＡＲに使用し得る。
【０１７３】
「改変された野生型ヒンジ又はスペーサー領域」又は「改変されたヒンジ又はスペーサー領域」は、（ａ）３０％以下のアミノ酸変化（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％以下のアミノ酸変化、例えば置換又は欠失）を有する野生型ヒンジ／スペーサー領域、（ｂ）３０％以下のアミノ酸変化（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％以下のアミノ酸変化、例えば置換又は欠失）を有する少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４又は１５アミノ酸長）である野生型ヒンジ／スペーサー領域の一部分、又は（ｃ）コアヒンジ領域（これは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５又は少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸長であり得る）を含む野生型ヒンジ領域の一部分を指す。本明細書に記載されるキメラ抗原受容体においてＣＬＥＣ１４Ａ特異的結合ドメインと別の領域（例えば、膜貫通ドメイン）との間に改変された野生型ヒンジ領域が置かれてそれらを結び付けるとき、それにより、キメラ融合タンパク質は、ＣＬＥＣ１４Ａへの特異的結合を維持することが可能になる。
【０１７４】
特定の実施形態において、野生型免疫グロブリンヒンジ領域における１つ以上のシステイン残基が１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）に置換されてもよい。代替的に又は追加的に、改変された免疫グロブリンヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）によって置換されていてもよい。
【０１７５】
ＣＨ２及びＣＨ３定常領域ドメインを含むヒンジ領域が、ＣＡＲにおける使用に関して当該技術分野において記載されている（例えば、配列番号１６３に示されるとおりの、「Ｆｃヒンジ」又は「ＩｇＧヒンジ」と称されるＣＨ２ＣＨ３ヒンジ。別の見方をすれば、ＣＨ２ＣＨ３ヒンジは配列番号１６４によってコードされ得る。しかしながら、ヒンジドメインが免疫グロブリンをベースとするか又はそれに由来するとき、それはＣＨ３ドメインを含まないことが好ましく、例えば、それは、ＣＨ２ドメイン又はその断片若しくは一部を含み、又はそれからなり、ＣＨ３を含まないものであり得る。
【０１７６】
一実施形態においてヒンジドメインは、配列番号１６５のアミノ酸配列（ＣＤ８αのヒンジドメインに相当する）又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、又はそれを含む。
【０１７７】
別の好ましい実施形態において、ヒンジドメインは、配列番号１６６のアミノ酸配列（短縮型のＩｇＧヒンジに相当する）又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するか、又はそれを含む。
【０１７８】
ヒンジドメインは、リンカー配列によって膜貫通ドメインに付加されてもよく、リンカー配列は、上記に定義するとおりのリンカー配列であり得る。例示的リンカー配列は、ＫＤＰＫ（配列番号１５９）である。かかる配列又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列は、上記に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるＣＡＲに含まれてもよい。より詳細には、かかる配列は、細胞外ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ部分）と膜貫通ドメインとの間に含まれてもよい。特定のＣＡＲに使用するヒンジドメインは、実験的に決定し得る。
【０１７９】
本明細書で使用されるとおりのヒンジドメイン又はスペーサー領域は、少なくとも１０アミノ酸長、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００アミノ酸長であってもよい。
【０１８０】
本発明の詳細な実施形態において、ヒンジドメインは利用されなくてもよく、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインが膜貫通ドメインに直接付加されてもよい。
【０１８１】
従って、本発明の第１の態様によれば、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号６２、
（ｂ）配列番号９８、
（ｃ）配列番号１１４、又は
（ｄ）配列番号１２７
のいずれか１つの配列、又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含むＣＡＲをコードしてもよい。
【０１８２】
従って、ＣＡＲは、配列番号６２、９８、１１４又は１２７のいずれか１つと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有し得る。詳細には、変異ＣＡＲは、配列番号６２、９８、１１４又は１２７の配列を有するＣＡＲの活性を保持していなければならず、例えば非変異ＣＡＲの活性の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は９５％を有していなければならない。これは、ＣＡＲの結合親和性として計測されてもよく、結合親和性は、抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインに関して先に考察したとおり決定することができ、又は細胞内のエフェクター機能を刺激する能力として計測されてもよく、この能力は、細胞内シグナリングドメインに関して上記で考察したとおり決定し得る。
【０１８３】
別の見方をすれば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号６３、
（ｂ）配列番号９９、
（ｃ）配列番号１１５、又は
（ｄ）配列番号１２８
のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するその変異体を含んでもよい。
【０１８４】
上記で考察したとおり、変異体は、配列番号６３、９９、１１５又は１２８のいずれか１つと少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有してもよく、コードされたＣＡＲは、上記で考察したとおり、非変異配列によってコードされるＣＡＲの活性を保持していなければならない。
【０１８５】
本発明は、本発明の核酸分子によってコードされるＣＡＲ（ポリペプチド）を提供する。用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書では同義的に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化及びシグナル配列の付加又は欠失などの修飾を除外しない。従って、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、各鎖がペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸を含む１つ以上のアミノ酸鎖を意味する。
【０１８６】
本発明は、本発明の核酸を含むベクターを更に包含する。このベクターは、例えば、発現ベクター（例えば、ｍＲＮＡ発現ベクター又は免疫細胞へのトランスファー用の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター））又はクローニングベクターであってもよい。可能な発現ベクターとしては、そのベクターが使用する宿主細胞と適合性を有する限り、限定はされないが、トランスポゾン、コスミド、プラスミド又は修飾ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス及びレンチウイルス）が挙げられる。詳細には、発現ベクターは、Engels et al, Human Gene Therapy, 14:1155-1168, 2003又はSchambach et al, Mol. Ther. 2:435-445, 2000（これらは参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、ガンマレトロウイルスであってもよい。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に好適」であり、これは、発現ベクターが本発明の核酸分子と、核酸分子に作動可能に連結した、発現に使用する宿主細胞に基づき選択された調節配列とを含有することを意味する。作動可能に連結したとは、核酸が核酸の発現を可能にする方法で調節配列に連結されていることを意味するものと意図される。
【０１８７】
従って、本発明は、本発明の核酸分子と、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質配列の転写及び翻訳に必要な調節配列とを含有する組換え発現ベクターを企図する。
【０１８８】
好適な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳類又は昆虫遺伝子を含めた種々の供給源に由来し得る。適切な調節配列の選択は、以下で考察するとおり選択の宿主細胞に依存し、当業者は容易に実現し得る。かかる調節配列の例としては、翻訳開始シグナルを含めて、転写プロモーター及びエンハンサー又はＲＮＡポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列が挙げられる。加えて、選択の宿主細胞及び用いられるベクターに応じて、複製起点、追加的なＤＮＡ制限部位、エンハンサー、及び転写誘導能を付与する配列などの他の配列が発現ベクターに組み込まれ得る。
【０１８９】
細胞（哺乳類細胞）においてＣＡＲ分子を発現させる能力を有するプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーター又はＣＭＶプロモーターである。プロモーターの更なる例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ＨＩＶ長末端反復配列プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター又はＭＰＳＶ  ＬＴＲ（Engel et al、前掲に記載されるとおり）が挙げられる。
【０１９０】
上記に指摘したとおり、ＣＡＲの転写は、誘導性システムを用いて制御し得る。詳細には、誘導性プロモーターを使用してＣＡＲの発現を制御してもよく、例えば、発現は、小分子又は薬物（例えば、プロモーター、調節配列又は転写リプレッサー若しくはアクチベーター分子に結合するもの）によるか、又は環境的誘因を用いることにより誘導され得る。
【０１９１】
詳細には、ＣＡＲ発現はテトラサイクリン又はドキシサイクリンなどの誘導体、例えばＴｅｔオンシステムを用いて制御してもよく、ここで、１つ以上のｔｅｔオペレーター配列（例えば、少なくとも２、３、４又は５つ）がプロモーター中に又はその近傍に組み込まれ得る。次に、テトラサイクリン又はその誘導体の１つ（例えば、ドキシサイクリン）を加えることにより、それがテトラサイクリントランスアクチベータータンパク質に結合してｔｅｔオペレーター配列とのその会合が可能になり得ることで、プロモーターからの遺伝子発現が制御され得る。テトラサイクリントランスアクチベータータンパク質は、本発明のＣＡＲと同じベクター又は追加的なベクターから発現し得る。Ｔｅｔオンシステムの変形例は、当該技術分野において周知であり、本発明に利用し得る。
【０１９２】
更に、ＣＡＲ発現は、例えば、アクチベーターが変異ＥＲＴドメインに融合しているシステムを用いて、タモキシフェンを加えることにより制御し得る。これに関して、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステム、詳細にはこのシステムの改変バージョンを利用してもよく、ここで、Ｃｒｅがエストロゲン受容体（ＥＲＴ）の変異型のリガンド結合ドメインに融合しており、これはタモキシフェンにのみ結合する。この融合は、タモキシフェンが加わるまで不活性であり、タモキシフェンがＣｒｅを活性化してｌｏｘ  Ｐ部位間の組換えを可能にし、それによりＣＡＲの転写が可能となる。かかるシステムは、タモキシフェンを加えることによるＣＡＲの誘導性発現を可能にする。
【０１９３】
他の薬物誘導性システム、例えばポナステロンＡを加えると活性化されるシステム（例えば、エクジソン受容体の遺伝子及び受容体の結合部位を有するプロモーターを使用する）、クーママイシンを加えると活性化されるシステムが当該技術分野において周知であり、任意のかかるシステムを本発明においてＣＡＲ発現に使用することができる。
【０１９４】
上記で考察したとおり、ＣＡＲ発現が環境的誘因、例えば低酸素、放射線照射、昇温等によって制御される発現システムも本発明において利用し得る。詳細には、低酸素誘導性プロモーター、例えば低酸素応答性エレメントを含むキメラプロモーターが本発明におけるＣＡＲ発現に用いられてもよい。
【０１９５】
本発明における使用のため、新規誘導性プロモーター、例えば小分子又は薬物によって活性化される誘導性プロモーターが更に開発されてもよい。
【０１９６】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の組換え分子で形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を促進する選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。選択可能なマーカー遺伝子の例は、特定の薬物に対する耐性を付与するネオマイシン及びハイグロマイシン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ又は免疫グロブリン若しくはその一部分、例えば免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分などのタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能なマーカー遺伝子の転写は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ又はホタルルシフェラーゼなどの選択可能なマーカータンパク質の濃度の変化によってモニタされる。選択可能なマーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合、形質転換細胞は、Ｇ４１８で選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存し得るが、他の細胞は死滅し得る。これにより、本発明の組換え発現ベクターの発現を可視化してアッセイし、詳細には突然変異が発現及び表現型に及ぼす効果を決定することが可能になる。選択可能なマーカーは、目的の核酸と別個のベクターで導入し得ることは理解されるであろう。
【０１９７】
組換え発現ベクターは、組換えタンパク質の発現の増加、組換えタンパク質の溶解度の増加をもたらす融合部分をコードし、且つアフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより標的組換えタンパク質の精製を補助する遺伝子を含有してもよい（例えば、精製及び／又は同定を可能にする適切な「タグ」、例えばＨｉｓタグ又はｍｙｃタグが存在してもよい）。例えば、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を加えることにより、組換えタンパク質と融合部分との分離、続く融合タンパク質の精製が可能となり得る。典型的な融合発現ベクターとしては、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを組換えタンパク質に融合するpGEX（Amrad Corp.、メルボルン、オーストラリア）、pMal（New England Biolabs、ビバリー、ＭＡ）及びpRIT5（Pharmacia、ピスカタウェイ、ＮＪ）が挙げられる。
【０１９８】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換宿主細胞を作製することができる。用語「〜で形質転換された」、「〜をトランスフェクトされた」、「形質転換」、「形質導入」及び「トランスフェクション」は、当該技術分野において公知の多くの可能な技法の１つによる細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含することが意図される。用語「形質転換宿主細胞」又は「形質導入宿主細胞」は、本明細書で使用されるとき、本発明の組換え発現ベクターで形質転換されているグリコシル化能を有する細胞も含むように意図される。原核細胞は、例えば、電気穿孔又は塩化カルシウム媒介形質転換によって核酸で形質転換することができる。例えば、核酸は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔又はマイクロインジェクションなどの従来技術を用いて哺乳類細胞に導入することができる。宿主細胞の形質転換及びトランスフェクションに好適な方法については、Sambrook et al., 1989（前掲）及び他の実験テキストを参照することができる。
【０１９９】
本発明の核酸を含むベクターは、例えば、コードされたＣＡＲ分子のインビトロ研究を行うため、又は患者への投与用の細胞に形質導入する更なるベクター又はＲＮＡ／ウイルスベクターを作製するため、いかなる細胞型にも形質導入又はトランスフェクトし得る。例えば、ベクターは、多様な真核生物宿主細胞及び原核細胞、例えば酵母細胞又は哺乳類細胞又は大腸菌（Escherichia coli）に形質導入してもよい。従って、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含む細胞を更に提供する。本発明は、加えて、本発明のＣＡＲを含む細胞を提供する。
【０２００】
哺乳類細胞としては、とりわけ、ＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  １６５０又は１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ  ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）、ＮＳ−１細胞、ＮＳ０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１１７７）及びPer.C6（登録商標）（Crucell、ライデン、オランダ）を挙げることができる。哺乳類細胞における発現を指図するのに好適な発現ベクターは、概して、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０などのウイルス性物質に由来するもの又は任意のウイルスＬＴＲに由来するもの）、並びに他の転写及び翻訳制御配列を含む。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ及びｐＭＰ７１が挙げられる。
【０２０１】
治療用途には、本発明のベクターは、哺乳類細胞、特にＴ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）などの免疫細胞に形質導入され得る。哺乳類細胞への遺伝子トランスファー用に幾つものウイルスベースのシステムが開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子デリバリーシステムに好都合なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子は、当該技術分野において公知の技法を用いてベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、インビボ又はエキソビボのいずれかで対象の細胞に送達することができる。幾つものレトロウイルスシステム、例えばＨＩＶ、ＳＩＶ又はＦＩＶなどのレンチウイルスベクターが当該技術分野において公知である。詳細には、上記に指摘したとおり、ガンマレトロウイルスなどのレトロウイルスベクター、例えばＭＰ７１が用いられてもよい。
【０２０２】
本発明の核酸を含む本発明のベクターは、ＣＡＲ分子に加えて、更なるタンパク質又はポリペプチドをコードし得る追加的なヌクレオチド配列を更に含んでもよい。かかる追加的なタンパク質又はポリペプチドは、ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列と同じプロモーターの制御下又はＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列と異なるプロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列によってコードされ得る。追加的なタンパク質／ポリペプチドが、ＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列と同じプロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列によってコードされる場合（例えば、両方の配列がそのプロモーターの下流にある）、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と更なるタンパク質／ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に更なるヌクレオチド配列が存在してもよく、それにより発現後のその分離、例えばその切断が可能となる。かかる更なるヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知であり、インテインをコードするものが含まれる。代替的に、同じプロモーターからの発現が所望される場合、本発明のベクターにＩＲＥＳ又は２Ａペプチド配列を利用することができる。
【０２０３】
これに関して、本発明のＣＡＲ発現ベクターからポリペプチドを更に発現させて、細胞におけるＣＡＲの発現の検出を可能にすることが望ましい場合もある。従って、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列と同じ（又は異なるプロモーターの）制御下にある更なるポリペプチドの発現を検出することにより、ベクターによる細胞の形質導入の成功及びＣＡＲ分子の発現の成功を同定することが可能であり得る。詳細には、本発明のＣＡＲ分子は、ＣＤ３４分子又は修飾ＣＤ３４分子、例えばトランケート型ＣＤ３４分子を更に含んでもよく、ここで、かかる分子は、周知の技法、例えば好適な抗体及び標識を用いた免疫蛍光法によるその検出を可能にする細胞外部分を含む。詳細な実施形態において、本発明のベクターは、配列番号１４５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を更に含んでもよい。別の見方をすれば、ベクターは、配列番号１４４のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を更にコードしてもよい。本発明のＣＡＲ分子と共発現してＣＡＲが形質導入された細胞の同定を可能にし得る他の分子としては、ルシフェラーゼが挙げられる。
【０２０４】
これに関して、本発明は、詳細には、配列番号１３６、１３８、１４０若しくは１４２のいずれか１つの配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する（及び先述のとおり非修飾ＣＡＲの機能活性を保持している）配列を含むＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を包含する。より詳細には本発明の核酸分子は、配列番号１３７、１３９、１４１若しくは１４３のポリヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含んでもよい。詳細にはかかる修飾配列は、先述のとおり非修飾ＣＡＲの機能活性を保持している又は実質的に保持しているＣＡＲをコードすることになる。これらの配列を含むベクターも包含される。配列番号１３６、１３８、１４０又は１４２のいずれか１つの配列を含むＣＡＲは、オンコスタチンＭリーダー配列を含む。上記で考察したとおり、これは、別のリーダー配列に置換することができ、詳細にはＣＤ８αのリーダー配列に置換されてもよいことが理解されるであろう。従って、配列番号１３６、１３８、１４０又は１４２の配列は、配列番号１３５のオンコスタチンＭリーダー配列が配列番号１６２によってコードされるＣＤ８αリーダーに置換されるように修飾されてもよい。
【０２０５】
先に考察したとおり、本発明は、適切な細胞型に形質導入されたとき、ＣＬＥＣ１４Ａに結合することのできるＣＡＲ分子の発現能を有する核酸分子を提供する。従って、本発明の核酸分子は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現増加を伴う病態の治療に使用することができ、詳細には血管新生（例えば、腫瘍血管新生）の阻害に使用することができる。かかる病態の治療は、発現したＣＡＲ分子による、腫瘍血管構造内で発現する標的抗原への、即ちＣＬＥＣ１４Ａへの結合に依存するものである。ＣＡＲ分子による非標的ＣＬＥＣ１４Ａへの結合は望ましくないものであり得ること、及び患者への形質導入細胞の投与時点であるか又はそれ以降の時点であるかに関わらず、いかなるかかる結合も回避されるべきであることが理解されるであろう。これを達成するため、形質導入細胞が患者体内で（即ち、病態の治療後に）長期間生存しないこと、又はＣＬＥＣ１４Ａを標的化するＣＡＲ分子を形質導入細胞が一過性にのみ発現することのいずれかを確実にすることが望ましい場合もある。
【０２０６】
ＣＡＲ分子の一過性発現を達成するため、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲをコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を細胞に形質導入し、それらの細胞を患者への投与に使用することが可能である。ｍＲＮＡの産生用のｍＲＮＡ発現ベクターは、当該技術分野において公知の方法に従って（例えば、Gateway技術を用いて）調製してもよく、当該技術分野において公知である（例えば、pClpA102、Saeboee-Larssen et al, 2002, J. Immunol. Methods 259, p 191-203及びpCIpA120-G、Waelchli et al, 2011, PLoS ONE 6 (11) e27930）。これに関して、本発明は、詳細には、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲをコードするＲＮＡ分子を含む細胞を提供する。
【０２０７】
更に、ｍＲＮＡは、例えば、インビトロ転写によってインビトロで作製することができる。次に、ｍＲＮＡが例えばネイキッドｍＲＮＡとして、例えば電気穿孔によって免疫エフェクター細胞に導入されてもよい（例えば、Almasbak et al., Cytotherapy 2011, 13, 629-640、Rabinovich et al., Hum. Gene Ther., 2009, 20, 51-60及びBeatty et al., Cancer Immunol. Res. 2014, 2, 112-120に記載されるとおり）。
【０２０８】
代替的に又は追加的に、活性化すると細胞死をもたらすヌクレオチド配列（いわゆる「自殺遺伝子」）を細胞に形質導入することが望ましい場合もある。このようにして、細胞が病態の治療に用いられた後、自殺遺伝子が活性化して、ＣＡＲ発現細胞の死滅及び患者からの除去がもたらされ得る。自殺遺伝子は、本発明のＣＡＲ分子と同じベクターから、例えば先に考察したとおりのエレメント（別個のプロモーター、又はインテイン、ＩＲＥＳ又は２Ａペプチドと共に同じプロモーター）を用いて発現させてもよく、又は細胞に形質導入され得る異なるベクターから、ＣＡＲをコードするベクター若しくは核酸分子と同時に、その前に又はその後に発現させてもよい。本発明に使用し得る自殺遺伝子の例としては、カスパーゼ９、ＲＱＲ８及び／又はＴＫが挙げられる。これらの遺伝子の１つ以上は、ＣＡＲをコードするベクター内に含めて、又はＣＡＲをコードするベクター若しくは核酸分子と同時に、その前に若しくはその後に細胞に形質導入されてもよい。任意の自殺遺伝子の発現が誘導的に制御されることが望ましいことは理解されるであろう。
【０２０９】
また、本発明のベクター又は核酸を形質導入したか又は形質導入しようとする細胞に更なる修飾を行うことが望ましい場合もある。詳細には、ＣＬＥＣ１４Ａに対するその応答を延ばす又は増強する免疫細胞に対する修飾が望ましい場合もある。例えば、腫瘍によってＴＧＦβが分泌され、これは、Ｔ細胞の誘導を抑制し得ることが知られている。これに関して、本発明の修飾免疫細胞、例えばＴ細胞（即ち、本発明の核酸又はベクターを形質導入したもの）が、ＴＧＦβの効果を例えばドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩの発現によって中和する能力を有することが望ましい場合もある。追加的に又は代替的に、本発明の細胞には、サイトカイン、例えばＩＬ−１５又はＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２等をコードする核酸が形質導入されてもよく、これにより細胞のエフェクター機能を増強し得る。この場合にも、上記で考察したとおり、任意の追加的な核酸配列は、ＣＡＲ分子と同じ又は異なるベクターから発現させてもよい。
【０２１０】
更に、本発明の細胞が本発明の核酸又はベクターを２つ以上含み得ることが理解されるであろう。詳細には、本発明の細胞は、各々が異なるＣＡＲ分子を発現する本発明の核酸又はベクターを２、３、４又は５個又はそれを超えて含んでもよい。従って、本発明の細胞は、例えばｖＣＬＥＣ１４Ａ上の同じ又は異なる位置でＣＬＥＣ１４Ａに結合する能力を有する異なるＣＡＲ分子を含んでもよい。この態様において、本発明の細胞は、ＣＬＥＣ１４Ａに結合するｓｃＦｖを含むＣＡＲ分子と、ＣＬＥＣ１４Ａに結合するリガンド（例えば、ＭＭＲＮ２又はその一部分若しくは変異体）を含むＣＡＲ分子とを含んでもよい。
【０２１１】
更に、本発明の細胞は、発現した本発明のＣＡＲに加えて、少なくとも１つの他の受容体（詳細には外因性の）（例えば、複数の受容体）を含んでもよく、それらは、コンビナトリアル手法において標的細胞（例えば、ＣＬＥＣ１４Ａを発現する腫瘍血管構造）への結合のためにＣＡＲと共に用いられ得る。従って、かかる手法では、標的細胞に対する免疫応答を刺激するのにＣＡＲ及び少なくとも１つの他の受容体の両方が標的細胞に結合する必要があり得る（例えば、ＣＡＲ／受容体の各々は免疫細胞刺激の部分的なシグナルを提供し得るに過ぎず、単独では免疫細胞刺激に不十分であるが、一緒になると免疫細胞刺激が可能であり得る）。本発明の細胞がＴ細胞である場合、Ｔ細胞を刺激するのに、ＣＬＥＣ１４Ａ発現細胞上におけるＣＬＥＣ１４ＡへのＣＡＲ結合と、そのリガンドへの少なくとも１つの他の受容体結合の結合との両方が必要であり得る。少なくとも１つの他の受容体は、更なるＣＡＲ分子であってもよい。
【０２１２】
この実施形態の変形例において、本発明の細胞内のＣＡＲを誘導的に発現してもよい。詳細には、この実施形態では、この細胞上に発現する少なくとも１つの他の受容体のその標的への結合がＣＡＲ分子の発現を可能にし、又はそれを制御し得る。従って、この場合、ＣＡＲ発現が起こる前に少なくとも１つの他の受容体がそのリガンドに結合する必要があり、従って、免疫細胞刺激には、少なくとも１つの他の受容体のそのリガンドへの結合と、続くＣＡＲの標的細胞への結合とが必要である。かかる特定のシステムは、SynNotch受容体の追加的な発現を含んでもよく、これは、目的の抗原、例えばＣＤ１９に対する胞外リガンド結合ドメイン及び直交性の転写因子（例えば、ＴｅｔＲ又はＧａｌ４）で操作されるものである。目的の抗原が結合すると、SynNotch受容体のテールから直交性の転写因子が切断され、ＣＡＲの発現が活性化する。従って、本発明の細胞は、ＣＬＥＣ１４Ａ以外の抗原、詳細にはＣＬＥＣ１４Ａ以外の腫瘍関連抗原に結合する受容体をコードする核酸又はベクターを更に含んでもよい。
【０２１３】
代替的に、コンビナトリアル手法は、本発明のＣＡＲに加えて更なる受容体を本発明の細胞上に発現させる場合にも用いることができ、ここで、前記更なる受容体は、オフターゲット細胞又は組織（例えば、非腫瘍細胞）への結合能を有する。この場合、更なる受容体がそのリガンドに結合する場合、負のシグナルが生じ、免疫細胞刺激（例えば、Ｔ細胞刺激）が妨げられる。
【０２１４】
更なる組み合わせ手法は、本発明のＣＡＲと組み合わせて更なる受容体を使用してもよく、ここで、両方の受容体が異なる標的に結合し、異なる効果を誘導して腫瘍を治療する。従って、両方の抗腫瘍効果は、互いに完全に独立していてもよく、しかし、一緒になると腫瘍に対して有効な療法を呈し得る。これに関して、本発明のＣＡＲは、ＴＣＲ療法と組み合わせて用いられてもよく、ここで、免疫細胞に、本発明のＣＡＲと、腫瘍細胞上（例えば、特定のタイプの腫瘍細胞上又は任意の腫瘍細胞上）に存在し得る特定のＭＨＣ／ペプチドの組み合わせへの結合能を有するＴＣＲとをコードする１つ以上の核酸分子が形質導入され得る。代替的に、ＣＡＲをコードする核酸を形質導入された免疫細胞と、ＴＣＲをコードする核酸を形質導入された別個の免疫細胞集団とが別々に、逐次的に又は同時に提供されてもよい。本発明のＣＡＲ及び腫瘍ＭＨＣ／ペプチドの組み合わせを認識するＴＣＲをコードする１つ以上の核酸を用いた遺伝子療法治療も想定される。
【０２１５】
宿主細胞への外因性核酸の導入に用いられる方法に関わらず、細胞内における核酸の存在は、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなど、当該技術分野において周知の種々のアッセイを用いて決定することができる。更に、先に考察したとおり、ＣＡＲ又は他のポリペプチドの発現は、免疫蛍光技法、ＥＬＩＳＡを用いるか、又はウエスタンブロッティングによって検出し得る。
【０２１６】
これに関して、本発明は、細胞に本発明の核酸又はベクターを形質導入するステップを含む、ＣＡＲ分子を発現する細胞を作製する方法を更に提供する。
【０２１７】
先に考察したとおり、本発明の核酸、ベクター及び／又はＣＡＲを含む本発明の細胞は、免疫細胞、詳細にはヒト免疫細胞などの哺乳類免疫細胞であってもよい。免疫細胞は、先述のとおりエフェクター機能を有する能力を有し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、メモリーＴ細胞（例えば、幹細胞様特性を有するメモリーＴ細胞）を含め、任意のタイプのＴ細胞であってもよい。ＮＫ細胞は、インバリアントなＮＫ細胞であってもよい。
【０２１８】
用語「哺乳類」は、本明細書で使用されるとき、任意の哺乳類を指し、但し詳細には、ヒト、家庭用動物（例えば、ネコ、イヌ等）、ウマ、マウス、ラット、サルなどの霊長類、雌ウシ、ブタ等を指す。
【０２１９】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含め、幾つもの供給源から入手し得る。詳細には、本発明において、免疫細胞又はＴ細胞は、本発明の核酸、ベクター又は細胞で治療し得る病態を有する対象、例えばＣＬＥＣ１４Ａの発現レベルの増加に関連する病態、又はより詳細には腫瘍血管構造においてＣＬＥＣ１４Ａを発現する腫瘍を有する対象から入手し得る。Ｔ細胞（又は免疫細胞）は、当該技術分野において公知の任意の方法によって入手し得る。
【０２２０】
Ｔ細胞は、「既製品」を入手してもよく、従って必ずしも本発明の核酸、ベクター又は細胞で治療し得る病態を有する対象から入手されなくてもよい。従って、本発明に用いられるＴ細胞は、本発明の核酸又はベクターを形質導入する前に予め貯蔵及び／又は修飾されていてもよい。
【０２２１】
詳細には、Ｔ細胞は、フィコール分離法など、当該技術分野における任意の好適な技法を用いて対象から収集された血液（特に抗凝固処理血液）ユニットから入手してもよい。代替的に、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、対象（典型的には哺乳類対象）からアフェレーシスによって入手してもよく、ここで、アフェレーシス産物は、典型的にはリンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞及び血小板を含む）を含む。アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄することにより血漿画分が除去され、後の処理のために細胞が適切な緩衝液又は培地中に置かれてもよく、例えば、細胞は、ＰＢＳを使用するか、又は二価イオン不含、例えばカルシウム及び／又はマグネシウム不含の洗浄溶液を使用して洗浄され得ることが理解されるであろう。洗浄ステップは、当該技術分野において公知の方法により、例えば半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサー、Baxter CytoMate又はHaemonetics Cell Saver 5）を使用することにより達成し得る。洗浄後、細胞は、例えば、Ｃａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳ、PlasmaLyte A、RPMI 1640（Sigma）又はＰＢＳ又は緩衝液含有若しくは不含の他の生理食塩水など、種々の生体適合性緩衝液に再懸濁されてもよい。典型的には、英国では、輸血用細胞はhttp://www.transfusionguidelines.org.uk/red-bookに掲載されているガイドラインに従って処理される。欧州で認められている更なる手順については、Guide on the preparation, Use and Quality assurance of Blood Components, Current edition, EDQMを参照し得る。米国では、典型的にはＡＡＢＢの血液及び血液成分ガイドラインに従う。血液、血液成分及び血漿製剤の採取、処理ＱＣについては、ＷＨＯ要求事項も存在する。
【０２２２】
Ｔ細胞は末梢血リンパ球から、赤血球を溶解して、例えばPERCOLL（商標）グラジエントを用いた遠心によるか、又は向流式遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることにより単離し得る。本発明に使用する特定のＴ細胞集団を選択することが可能である。しかしながら、選択は必須でなく、混合細胞集団（例えば、異なる種類のＴ細胞を含む）に本発明の核酸又はベクター（例えば、対象の腫瘍血管新生の阻害に用いられる）を形質導入してもよい。選択され得る細胞のサブ集団としては、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞が挙げられる。特定の集団の選択は、Ｔ細胞集団上に発現する抗原に選択的に結合する抗体とカップリングしたビーズを使用して達成し得る。特にＴ細胞集団にユニークに発現する表面マーカーに対する抗体の組み合わせが選択に用いられてもよい。
【０２２３】
その使用前、詳細には本発明の治療方法における使用前に免疫細胞を貯蔵することが望ましい場合もある。これに関して、本発明の細胞を凍結し、又は（例えば、２〜１０℃のローテータ上で）インキュベートすることが可能である。細胞は、本発明の核酸又はベクターによる形質導入前及び／又は形質導入後のいずれでもかかる方法で貯蔵し得る。
【０２２４】
先に考察したとおり、本発明の形質導入免疫細胞は、治療上の有用性があり、詳細には腫瘍血管新生の阻害に用いられ得る。細胞を治療に使用する前に、当該技術分野において周知の方法を用いて細胞を活性化又は増殖ステップに供することが望ましい場合もある。任意のかかるステップが本発明の核酸又はベクターによる形質導入前又はその後に行われてもよい。Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを使用して増殖させてもよい。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下でＴ細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。
【０２２５】
本発明は、加えて、細胞集団であって、前記集団中の少なくとも１つの細胞が本発明の核酸又はベクターを含む、細胞集団を特に提供する。細胞集団は、様々な本発明の核酸又はベクターを含む細胞を含んでもよい。従って、集団中のある細胞が、第１のＣＡＲをコードする本発明の核酸を含んでもよく、且つ集団中の第２の細胞が、第２のＣＡＲをコードする本発明の核酸を含んでもよい。
【０２２６】
更に、本発明は、本発明の細胞（特にＴ細胞）（即ち、本発明の核酸又はベクターを含む）が後の使用（例えば、療法における）のために貯蔵されて提供され得る「既製品」の細胞製品を提供する。典型的には、かかる細胞は、同種異系免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）であってもよい。
【０２２７】
本発明は、本発明の核酸、ベクター、細胞又は細胞集団を含む組成物又は医薬組成物、及び更には療法（又は疾患への対処）における使用のための本発明の核酸、ベクター、細胞又は細胞集団を含む医薬組成物を更に提供する。本発明の組成物又は医薬組成物は、追加的な又は更なる活性（例えば、療法用）薬剤を含んでもよい。本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現レベルの増加に関連する病態の治療に使用されてもよく、詳細には、本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物は、腫瘍内（例えば、ここで、腫瘍血管構造がＣＬＥＣ１４Ａを発現する）における血管新生の阻害に使用されてもよい。従って、この態様において、本発明は、療法における使用のための本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物を提供する。更に、本発明は、疾患への対処における使用のための医薬の製造における本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物の使用を提供する。別の見方をすれば、本発明は、本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患に対処する方法を提供する。より詳細には、本発明は、ＣＬＥＣ１４の発現に関連する病態の治療における使用のための本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物を提供する。更に、本発明は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態の治療用医薬の製造における本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物の使用を提供する。別の見方をすれば、本発明は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態を治療する方法であって、本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞、細胞集団又は組成物を、それを必要とする対象、例えばその病態を有する対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２２８】
本発明の核酸及び／又はベクターは、上記に記載したとおり、例えば遺伝子療法的方法において患者を直接治療するのに使用することが可能であるが、詳細な実施形態では、本発明の核酸又はベクターを含む細胞が療法に使用される。かかる細胞は、免疫細胞、詳細にはＴ細胞であることが好ましい。従って、本発明は、詳細には、療法における使用のための、例えばＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態を治療するための本発明のベクター又は核酸を含むＴ細胞を提供する。
【０２２９】
「対処する」には、その方法を用いて障害の症状を軽減し得る（即ち、その方法が対症療法的に用いられる）か、又は障害を治療し得るか、又は障害を予防し得る（即ち、その方法が予防的に用いられる）という意味が含まれる。
【０２３０】
「ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態」は、ＣＬＥＣ１４Ａが発現する、治療、予防又は回復が所望される任意の疾患状態を指す。先に考察したとおり、正常な健常組織及び正常な血管構造におけるＣＬＥＣ１４Ａ発現は極めて低いか又は検出不能である。従って、概して、組織、詳細には血管構造におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現（即ち、任意の検出可能な発現）は、疾患状態に関連し得る。これに関して、ＣＬＥＣ１４Ａ発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質）の任意の検出が疾患の指標となり得る。ＣＬＥＣ１４Ａは、先述のとおり、例えば免疫蛍光法を用いて計測及び検出することができる。従って、ＣＬＥＣ１４Ａの発現の検出とは、健常対象において対応する組織に存在するＣＬＥＣ１４Ａ量と比較したときの対象の組織中におけるＣＬＥＣ１４Ａ量の増加の検出を指す。代替的に、ＣＬＥＣ１４Ａの発現の増加は、同じ対象における疾患前の、又は同じ対象の体内にある組織の非罹患部分におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現と比較した増加であってもよい。ＣＬＥＣ１４Ａのレベルは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００又は５００％増加してもよく、又は別の見方をすれば少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００倍増加してもよい。
【０２３１】
先に考察したとおり、ＣＬＥＣ１４Ａは、腫瘍血管構造内で発現して血管新生に関連し、従ってＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態には、望ましくない血管新生を含む任意の病態が含まれ得る。詳細には、病態には、固形腫瘍、（即ち、ＣＬＥＣ１４Ａを発現する固形腫瘍）、月経過多、子宮内膜症、関節炎（炎症性及びリウマチ性の両方）、黄斑変性症、パジェット病、網膜症及びその血管合併症（例えば、増殖性のもの並びに未熟児及び糖尿病性網膜症）、良性血管増殖、線維化、肥満症及び炎症の治療が含まれる。
【０２３２】
ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態の治療には、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する既存の病態の治療又はＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態の予防が含まれる。「治療」は、本明細書で使用されるとき、対象体内の病状の改善又はその悪化の予防を指す。例えば、治療には、腫瘍サイズの低減、腫瘍の成長速度の低減、腫瘍の転移速度の低減、又は腫瘍のサイズ、成長速度若しくは転移速度の維持が含まれる。「低減」とは、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％の低減が意味される。「維持」とは、実質的な増加がないこと、例えば１０、５、３、２又は１％以下の増加が意味される。腫瘍サイズは当該技術分野において公知の任意の方法、例えば適切な抗体による腫瘍イメージング、ＭＲＩ等により決定することができ、腫瘍成長速度は、時間の経過に伴う腫瘍サイズの増加を計測し、特定の期間にわたって腫瘍がどの程度成長するかを決定することにより決定し得る。転移速度は、対象体内の新しい部位で腫瘍成長が始まる期間を計測することにより決定し得る。
【０２３３】
「腫瘍」は、本明細書で使用されるとき、あらゆる形態の新生物性細胞成長を指し、詳細には固形腫瘍を含む。本発明において治療される固形腫瘍には、乳房、卵巣、肝臓、膀胱、前立腺、腎臓、膵臓、胃、食道、直腸、肺（例えば、中皮腫）、脳、子宮頸部、結腸、皮膚（例えば、黒色腫）、子宮、神経系（例えば、神経芽細胞腫）、甲状腺の腫瘍及び骨肉腫などの肉腫が含まれる。詳細には、本発明では、例えば本発明のＴ細胞を使用して膵腫瘍又は卵巣腫瘍が治療され得る。
【０２３４】
ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する病態の治療には血管新生の阻害が含まれる。用語「血管新生の阻害」は、血管新生の速度又はレベルを低減することを意味するものと意図される。低減は、血管新生の速度又はレベルの約１０％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％の低レベルの低減であってもよい。好ましくは、低減は、血管新生の速度又はレベルの約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％の低減の中レベルの低減である。より好ましくは、低減は、血管新生の速度又はレベルの約９０％、又は約９５％、又は約９９％、又は約９９．９％の高レベルの低減である。最も好ましくは、阻害には、血管新生の消失又はその検出不能なレベルに至るまでの低減も含まれ得る。血管新生の速度又はレベルを決定する方法及びアッセイ、従って抗体が血管新生を阻害するかどうか、及びそれがどの程度かを決定する方法及びアッセイは、当該技術分野において公知であり、本明細書において実施例に更に詳細に記載される。
【０２３５】
典型的には、阻害される血管新生は、腫瘍血管新生である。従って、個体は、腫瘍血管新生を阻害することによって治療し得る固形腫瘍を有してもよく、即ち固形腫瘍は新生血管の生成に関連する。
【０２３６】
先に考察したとおり、本発明の核酸又はベクターを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が本発明の治療方法において使用されることが好ましい。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、自己細胞又は同種異系細胞であってもよい。
【０２３７】
「自己」とは、治療方法又は使用において使用される（即ち、核酸又はベクターによって形質導入される）細胞が、治療方法が行われる対象に由来するか又はそれから得られることが意味される。従って、自己細胞は、対象から得られ、核酸又はベクターによって形質導入されて、同じ対象に戻される。
【０２３８】
「同種異系」とは、治療方法又は使用において使用される（即ち、核酸又はベクターによって形質導入される）細胞が、治療方法が行われる対象と異なる対象に由来するか又はそれから得られることが意味される。従って、同種異系細胞は、第１の対象から得られ、核酸又はベクターによって形質導入されて、第２の対象に投与される。
【０２３９】
細胞、詳細にはＴ細胞を対象に投与するための方法、製剤及び量は、当該技術分野において周知であり、以下で更に考察する。詳細には、Ｔ細胞は、腫瘍内に又はｉｖ（静脈内）注入によって投与されるものであり得る。典型的な用量は、１ｋｇ当たり１０６〜１０８細胞の範囲であり得る。本発明は、本発明の核酸、ベクター又は細胞を含む医薬組成物も提供する。
【０２４０】
用語「対象」は、本明細書で使用されるとき、ヒト又は非ヒト対象、例えば先に定義したとおりの哺乳類を指す。
【０２４１】
本発明の核酸、ベクター又は細胞は、単独で使用されるときに疾患への対処において有効であり得るが、本発明の核酸、ベクター又は細胞と組み合わせて更なる療法用薬剤を使用して疾患に対処することが可能である。詳細には、本発明の核酸、ベクター又は細胞を投与することによって腫瘍血管新生を阻害し、結果的に対象の腫瘍サイズを低減した後、続いて細胞傷害剤で腫瘍を治療することが望ましい場合もある。
【０２４２】
従って、本発明の更なる実施形態において、少なくとも１つの更なる又は追加的な療法用薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）が対象に投与されてもよい。従って、本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団と更なる療法用薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）とが対象に投与されてもよい。従って、本発明の組成物又は医薬組成物は、更なる活性薬剤又は療法用薬剤を本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞及び／又は細胞集団と共に含んでもよい。しかしながら、本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団と更なる療法用薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）とは別個に、例えば別個の投与経路によって投与されてもよいことは理解される。加えて、本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団と少なくとも１つの更なる療法用薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）とは、逐次的に又は（実質的に）同時に投与することができる。それらは、同じ医薬製剤中又は医薬中にあって投与されてもよく、又はそれらは別個に製剤化され、投与されてもよい。逐次投与について、更なる療法用薬剤は、核酸／ベクター／細胞の投与の少なくとも１分、１０分、１時間、６時間、１２時間、１日、５日、１０日、２週間、４週間又は６週間前又は後に投与されてもよい。
【０２４３】
詳細な実施形態において、本発明は、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する疾患又は病態に対処する方法、例えば血管新生、詳細には腫瘍血管新生の阻害方法、例えば癌を治療する方法を提供し、前記方法は、本明細書に定義するとおりの本発明の核酸／ベクター／ＣＡＲ／細胞／細胞集団、特に有効量の前記核酸／ベクター／ＣＡＲ／細胞／細胞集団を、それを必要とする対象に投与すること、及び１つ以上の追加的な活性（例えば、療法用）薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）を別個に、同時に又は逐次的に投与することを含む。
【０２４４】
別の見方をすれば、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する疾患又は病態への対処において使用される（例えば、血管新生の阻害において使用される）本明細書に定義するとおりの本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団が提供され、前記核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団は、１つ以上の追加的な活性（例えば、療法用）薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）と併用して別個に、同時に又は逐次的に投与されるものである。
【０２４５】
従って、ＣＬＥＣ１４Ａの発現に関連する疾患又は病態への対処において使用される、例えば血管新生、詳細には腫瘍血管新生の阻害用、例えば癌の治療用の医薬の製造における、本明細書に定義するとおりの本発明の核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団の使用が提供され、前記核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞又は細胞集団は、１つ以上の追加的な活性（例えば、療法用）薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）と併用して投与されるものである。
【０２４６】
従って、一実施形態において、本医薬は、１つ以上の追加的な活性（例えば、療法用）薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）を更に含んでもよい。追加的な活性薬剤は、更に免疫チェックポイント阻害薬であってもよい。
【０２４７】
本医薬は、本明細書に定義するとおりの本発明の核酸、ベクター、抗体又はリガンドベースのＣＡＲ又は免疫エフェクター細胞と、１つ以上の追加的な活性（例えば、療法用）薬剤（例えば、抗癌及び／又は抗血管新生化合物／薬剤）との両方を含む単一の組成物の形態であってもよく、又はそれらを別個に（例えば、同時に又は逐次的に）投与するように含むキット又は製品の形態であってもよい。
【０２４８】
一部の実施形態において、更なる療法用薬剤は、抗癌剤である。更なる抗癌剤は、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード類；ヘキサメチルメラミン、チオテパなどのエチレンイミン類及びメチルメラミン類；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル類；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）などのニトロソウレア類；及びデカルバジン（decarbazine）（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）などのトリアゼン類を含めたアルキル化剤；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；及びメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）及びペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）などのプリン類似体及び関連阻害薬を含めた代謝拮抗薬；ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイド；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン類；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン（マイトマイシンＣ）などの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；及びインターフェロンアルフェノム（interferon alphenome）などの生物学的反応修飾物質を含めた天然産物；シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ミトキサントロン及びアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシウレアなどの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；及びミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬を含めた他の薬剤；タキソール及び類似体／誘導体；細胞周期阻害薬；ボルテゾミブ（Velcade（登録商標））などのプロテオソーム阻害薬；イマチニブ（Glivec（登録商標））などのシグナルトランスダクターゼ（signal transductase）（例えば、チロシンキナーゼ）阻害薬、ＣＯＸ−２阻害薬、並びにフルタミド及びタモキシフェンなどのホルモン作動薬／拮抗薬から選択され得る。
【０２４９】
臨床で用いられている抗癌剤は、典型的には作用機序によって分類される：アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害薬、トポイソメラーゼＩＩ阻害薬、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬、ＤＮＡ代謝拮抗薬及び抗有糸分裂剤。米国ＮＩＨ／国立癌研究所のウェブサイトは、１２２個の化合物を挙げており（http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism.html）、その全てを本発明の抗体、組成物又は免疫エフェクター細胞と併せて使用し得る。それらには、アサレイ（Asaley）、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、カルボキシフタラート白金（carboxyphthalatoplatinum）、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シスプラチナム、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン（fluorodopan）、ヘプスルファム、ヒカントン、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド（mitozolamide）、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、テロキシロン、テトラプラチン、ピコプラチン（ＳＰ−４−３）（ｃｉｓ−アミンジクロロ（２−メチルピリジン）Ｐｔ（ＩＩ））、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、Ｙｏｓｈｉ−８６４を含めたアルキル化剤；アロコルヒチン、ハリコンドリンＢ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、メイタンシン、リゾキシン、タキソール、タキソール誘導体、チオコルヒチン、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチンを含めた抗有糸分裂剤；カンプトテシン、カンプトテシンＮａ塩、アミノカンプトテシン、２０種のカンプトテシン誘導体、モルホリノドキソルビシンを含めたトポイソメラーゼＩ阻害薬；ドキソルビシン、アモナファイド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、ミトキサントロン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、ＶＭ−２６、ＶＰ−１６を含めたトポイソメラーゼＩＩ阻害薬；Ｌ−アラノシン、５−アザシチジン、５−フルオロウラシル、アシビシン、３種のアミノプテリン誘導体、アンチフォール、ベーカーズ可溶性アンチフォール、ジクロルアリルローソン（dichlorallyl lawsone）、ブレキナル、フトラフル（プロドラッグ）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、メトトレキサート、メトトレキサート誘導体、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）、ピラゾフリン、トリメトレキサートを含めたＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗薬；３−ＨＰ、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、５−ＨＰ、α−ＴＧＤＲ、グリシン酸アフィディコリン、ａｒａ−Ｃ、５−アザ−２’−デオキシシチジン、β−ＴＧＤＲ、シクロシチジン、グアナゾール、ヒドロキシウレア、イノシングリコジアルデヒド、マクベシンＩＩ、ピラゾロイミダゾール、チオグアニン及びチオプリンを含めたＤＮＡ代謝拮抗薬が含まれる。
【０２５０】
一部の好ましい実施形態では、少なくとも１つの更なる抗癌剤は、シスプラチン；カルボプラチン；ピコプラチン；５−フルロウラシル（5-flurouracil）；パクリタキセル；マイトマイシンＣ；ドキソルビシン；ゲムシタビン；トムデックス；ペメトレキセド；メトトレキサート；イリノテカン、フルオロウラシル及びロイコボリン；オキサリプラチン、５−フルオロウラシル及びロイコボリン；並びにパクリタキセル及びカルボプラチンから選択される。
【０２５１】
更なる抗癌剤が特定の腫瘍型に特に有効であることが示されている場合、本発明の核酸、ベクター又は細胞がその更なる抗癌剤と併用してその特異的な腫瘍型の治療に使用されることが好ましい場合もある。
【０２５２】
一部の実施形態において、抗血管新生化合物は、以下のいずれか１つから選択され得る：ベバシズマブ（Avastin（登録商標））；イトラコナゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＴＮＰ−４７０（フマギリンの類似体）；ＣＭ１０１；ＩＦＮ−α；ＩＬ−１２；血小板因子４；スラミン；ＳＵ５４１６；トロンボスポンジン；ＶＥＧＦＲ拮抗薬；血管新生抑制ステロイド＋ヘパリン；軟骨由来血管新生阻害因子；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害薬；アンジオスタチン；エンドスタチン；２−メトキシエストラジオール；テコガラン；テトラチオモリブデート；サリドマイド；プロラクチン；αＶβ３阻害薬；リノミド；タスキニモド；ラニビズマブ；ソラフェニブ；（Nexavar（登録商標））；スニチニブ（Sutent（登録商標））；パゾパニブ（Votrient（登録商標））；及びエベロリムス（Afinitor（登録商標））。
【０２５３】
更なる療法用薬剤は、低酸素活性化型細胞傷害剤、例えばチラパザミン、又はＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞）の有効性／持続性／増殖を増強し得るサイトカインであってもよい。代替的に又は追加的に、更なる療法用薬剤は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を改善するものであってもよい。
【０２５４】
先述したとおり、更なる療法用薬剤は、免疫チェックポイント阻害薬であってもよい。かかる阻害薬は、概して、免疫細胞の刺激を妨げるか又は下方制御する免疫細胞と標的細胞（例えば、腫瘍細胞）との間の相互作用を遮断することによって機能する。詳細には、チェックポイント阻害薬は、Ｔ細胞上に発現するタンパク質と腫瘍細胞上に発現するタンパク質との間の相互作用（この相互作用は、Ｔ細胞の刺激を妨げるか又は低減し得る）を妨げるか又は低減する。チェックポイント阻害薬は、例えば、ＰＤ１とＰＤＬ１との間の相互作用を妨げてもよく、詳細にはＰＤ１に結合する薬剤で構成されてもよい。代替的に、チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ−４に結合してもよい。かかるチェックポイント阻害薬は、当該技術分野において周知であり、ペンブロリズマブ（Penbrolizumab）、ニボルマブ又はイピリムマブなどのモノクローナル抗体が含まれる。
【０２５５】
更なる活性薬剤は、スフィンゴシン−１−リン酸アゴニスト、例えばＦＴＹ７２０であってもよく、これは、スフィンゴシン−１リン酸受容体からのシグナルを遮断することによってリンパ系器官におけるリンパ球を隔離する能力を有する。このように、かかる化合物は、ＩＬ−７及びＩＬ−１５などのサイトカインに関する競合を制限することができ、従って投与されたＣＡＲ発現細胞療法の高い増殖を可能にし得る。詳細には、かかる化合物は、本発明の核酸、発現ベクター、ＣＡＲ又は細胞より前、例えば少なくとも１２時間、２４時間、３６時間又は４８時間前に投与されてもよい。
【０２５６】
加えて、更なる又は追加的な活性（例えば、療法用）薬剤は、ＴＣＲ分子（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞上に発現したか又は可溶性形態の）、ＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子又は前記核酸分子を含むベクターであってもよい。特に好ましい実施形態において、追加的な療法用薬剤は、ＴＣＲ分子をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ又はベクター）を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）である。従って、先に考察したとおり、本発明の詳細な実施形態において、本明細書に記載されるとおりのＣＡＲをコードする核酸、核酸を含むベクター、その核酸を含むか若しくは本発明のＣＡＲを発現する細胞又はＣＡＲ自体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子療法（例えば、遺伝子療法若しくは細胞療法として又は可溶性ＴＣＲとして）と併せた治療に有用であり得る。本発明のこの実施形態は、固形腫瘍のターゲティング能力が増強したものであり得る併用製剤を包含する。従って、詳細には、ＴＣＲ分子療法は、ＣＬＥＣ１４Ａを標的化する本発明のＣＡＲと異なる腫瘍関連抗原を標的化するものであってよく、従って、かかる併用製剤又は併用療法は、固形腫瘍の治療に特に有効な医薬を呈し得る。
【０２５７】
「ＴＣＲ」又は「Ｔ細胞受容体」分子は、本明細書で使用されるとき、Ｔ細胞の表面上に発現する能力を有する分子であって、特定のＭＨＣ又はＨＬＡ／抗原ペプチド複合体（例えば、抗原提示細胞又は腫瘍細胞の表面上に提示される）に結合する能力を有する分子を指す。従って、ＴＣＲは、通常、特定のＭＨＣ又はＨＬＡと複合体化して存在するときの抗原又は抗原断片を認識する。本明細書で使用されるとおりのＴＣＲ分子は、２つのタンパク質鎖又はポリペプチド鎖を含み得る（例えば、αＴＣＲ鎖及びβＴＣＲ鎖、又はγＴＣＲ鎖及びδＴＣＲ鎖を含み得る）か、又はＴＣＲは単鎖分子であってもよく、ここで、α及びβ鎖又はγ及びδ鎖が単一のタンパク質鎖又はポリペプチド鎖内に発現してそこに含まれる。単鎖ＴＣＲ分子については、Chung et al (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12654-12658（参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０２５８】
各ＴＣＲα、β、γ又はδ鎖は、概して可変領域を含み、各可変領域は、典型的には、腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体を認識してそれに結合する能力を有する少なくとも１つの相補性決定領域（例えば、２つ及び詳細には３つの相補性決定領域）を含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、１つ以上のフレームワーク領域（ＦＲ）によって互いに隔てられていてもよく、典型的には、本明細書に定義するとおりのＴＣＲα、β、γ又はδ鎖可変領域は、３つのＣＤＲと３つのＦＲとを含み得る。詳細には、本明細書に記載されるとおりのＴＣＲ分子は、Ｎ末端からＣ末端に順にＦＲ１α−ＣＤＲ１α−ＦＲ２α−ＣＤＲ２α−ＦＲ３α−ＣＤＲ３αを含むα鎖可変領域及びＮ末端からＣ末端に順にＦＲ１β−ＣＤＲ１β−ＦＲ２β−ＣＤＲ２β−ＦＲ３β−ＣＤＲ３βを含むβ鎖可変領域を含み得る。
【０２５９】
更に、α、β、γ又はδ鎖は、定常領域（例えば、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する）又は定常領域の一部分（例えば、細胞外ドメインのみを有する）を含み得る。詳細には、２つの別個のα／β又はγ／δポリペプチド鎖を含むＴＣＲは、前記鎖の一方又は両方が定常ドメインを有する（例えば、細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを有する）鎖を含み得る。詳細な実施形態では、α／β又はγ／δＴＣＲ鎖の両方が可変ドメイン及び定常ドメインを含む。
【０２６０】
本明細書で使用されるとおりの単鎖ＴＣＲは、単一の定常領域を含んでもよく、例えば単一のポリペプチド鎖内に含まれるα鎖可変領域、β鎖可変領域及びβ鎖定常領域、又はα鎖可変領域、β鎖可変領域及びα鎖定常領域を含んでもよい。
【０２６１】
本明細書に定義するとおりのＴＣＲ分子は、可溶性ＴＣＲ分子又は膜結合型ＴＣＲであってもよい。可溶性ＴＣＲ分子は、概してトランケートされた定常領域を含むか、又は定常領域を含まず、いかなるトランケーションも、定常領域の膜貫通部分を除去するのに十分である。膜貫通部分を欠く可溶性ＴＣＲは、腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞への他の分子のターゲティングにおいて有用であり得る。しかしながら、詳細には、膜結合型ＴＣＲが本発明の併用療法において使用されてもよい。従って、詳細には、本明細書に定義されるとおりのＴＣＲ分子は、定常領域膜貫通ドメイン（例えば、１つの膜貫通ドメイン又は各鎖に１つずつ含まれる２つの膜貫通ドメイン）を含んでもよい。
【０２６２】
ＴＣＲのα／β及びγ／δ鎖の定常領域は、ＴＣＲ間で比較的保存されていることが理解されるであろう。従って、天然ＴＣＲ分子には、僅か２つの変異β定常領域（これらは４アミノ酸だけ異なる）、単一のα及びδ鎖定常領域及び３つの変異γ定常領域があるに過ぎない。本明細書で使用されるとおりのＴＣＲ分子は、これらの天然定常領域のいずれを含んでもよいが、詳細には、ＴＣＲは、ＴＣＲ内に含まれる任意の定常領域又はその一部分に１つ以上の修飾を含み得る。ＴＣＲ鎖の対形成を改善する修飾又は可溶性若しくは単鎖ＴＣＲ分子の産生を改善する修飾が特に好ましい。
【０２６３】
本明細書で使用されるとおりのＴＣＲ分子は、α／β及びγ／δ鎖における１つ以上の残基がシステイン残基に置き換わることによる、天然に存在する分子内に存在しない追加的なｄｉ−Ｓ結合を含んでもよい。これに関して、β鎖定常領域におけるシステイン残基によるアミノ酸の置換及びα鎖定常領域におけるシステイン残基によるアミノ酸の置換により、置換されたシステイン残基間で天然に存在しないｄｉ−Ｓ結合の形成が可能となってもよく、これによりＴ細胞における内因性α及びβ鎖とのα及びβ鎖の対形成ミスが防止又は低減され得る。詳細には、この修飾は、ＴＣＲ内に含まれる両方の鎖の定常領域の細胞外部分に行われてもよい。
【０２６４】
より詳細には、本明細書で使用されるとおりのＴＣＲ分子は、α鎖の定常領域におけるＴｈｒ４８にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるＳｅｒ５７にシステインの置換、α鎖の定常領域におけるＴｈｒ４５にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるＳｅｒ７７にシステインの置換、α鎖の定常領域におけるＴｙｒ１０にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるＳｅｒ１７にシステインの置換、α鎖の定常領域におけるＴｈｒ４５にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるＡｓｐ５９にシステインの置換、及び／又はα鎖の定常領域におけるＳｅｒ１５にシステインの置換及びβ鎖の定常領域におけるＧｌｕ１５にシステインの置換を含み得る。
【０２６５】
従って、本明細書で使用されるとおりのＴＣＲ分子は、α鎖定常領域におけるＴｈｒ４８からシステインへの置換及びβ鎖定常領域におけるＳｅｒ５７からシステインへの置換を有し得る。α鎖及びβ鎖定常領域の天然に存在するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８７及び１８８に記載され、従って詳細には、上記に考察される修飾は、これらの配列内における記載の位置に行われ得る。
【０２６６】
他の修飾をＴＣＲに行い、鎖間の対形成を改善してもよい。例えば、ロイシンジッパーが利用されてもよく、鎖がマウス化されるか又は部分的にマウス化されてもよく、例えば少なくとも１又は２アミノ酸がマウス化されてもよく、ＴＣＲ様分子が構築されてもよく（例えば、ＴＣＲをＣＤ３ζと融合することにより）、又はα及びβ定常領域の接合点にあるアミノ酸対が逆に交換されてもよい。詳細には、逆に交換されたアミノ酸対は、α鎖及びβ鎖の天然ＴＣＲ定常領域におけるそれらの表面で互いに相互作用する。この相互作用するアミノ酸対は、α鎖定常ドメインのアミノ酸が天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に突出した基を有するアミノ酸に置き換わり、且つβ鎖定常ドメインのアミノ酸が天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に後退した基を有するアミノ酸に置き換わるような突然変異誘発（又は逆も同様であり、即ち、α鎖アミノ酸が立体的に後退した基を有するアミノ酸で置換されてもよく、及びβ鎖アミノ酸が立体的に突出した基を有するアミノ酸で置換されてもよい）に供され得る。天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に後退した基を有し得るアミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、バリン及びアラニンから選択され得る。天然に存在するアミノ酸と比較したときに立体的に突出した基を有し得るアミノ酸は、グルタミン、グルタミン酸、α−メチルバリン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン、トリプトファン、リジン、アルギニン、フェニルアラニン及びチロシンから選択され得る。詳細には、α定常領域のグリシン残基がアルギニンで置換されてもよく、及びβ定常領域のアルギニン残基がグリシン残基で置換されてもよく、例えばグリシンからアルギニンへの置換はα鎖定常領域における８５．１位で行われてもよく、及びアルギニンからグリシンへの置換はβ鎖定常領域における８８位で行われてもよい（ＴＣＲ定常ドメインの付番には、免疫遺伝学（ImMunoGeneTics）情報システム（ＩＭＧＴ）の命名法を使用する）。従って、アルギニンからグリシンへの置換は、配列番号１８８のβ定常領域の７３位に存在してもよい。
【０２６７】
更に、ＴＣＲ鎖間（例えば、α鎖とβ鎖との間）に存在する天然に存在するｄｉ−Ｓを除去することが望ましい場合もある。従って、ＴＣＲにおける鎖間天然ｄｉ−Ｓ結合が、その結合に関わるシステイン残基を例えばセリン又はアラニン残基に置換することによるか、又はそれらの残基を欠失させることにより除去されてもよい。望ましいものであり得る追加的な又は代替的な修飾は、天然βＴＣＲ鎖に存在する対を形成しないシステイン残基の除去又は置換である。かかる修飾は、ＴＣＲが単鎖ＴＣＲである場合に好ましいものであり得る。
【０２６８】
「腫瘍関連抗原」は、本明細書で使用されるとき、その発現が腫瘍（例えば、任意の腫瘍型又は２つ以上の腫瘍型）と関連付けられる任意の抗原を指す。従って、詳細には、腫瘍関連抗原の発現は、同じ型の健常組織又は細胞と比較したときに腫瘍又は腫瘍細胞で上方制御又は増強され得る。腫瘍関連抗原の発現は、同じ型の健常な組織又は細胞（例えば、同じ臓器から得られた同じ型の細胞又は組織由来のもの）におけるその抗原の発現と比較したときに腫瘍又は腫瘍細胞で少なくとも２、３、４、５、１０、２０、５０若しくは１００倍、又は別の見方をすれば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００％上方制御され得る。従って、組織又は細胞における腫瘍関連抗原の検出は、腫瘍の指標となり得る。詳細には、腫瘍関連抗原は、健常組織又は特定の臓器に関連する健常組織で極めて低いレベルでのみ発現し得るか、又は検出不能であり得る。
【０２６９】
腫瘍関連抗原の発現レベルとは、典型的には特定の細胞／組織で発現するタンパク質の量を指す。タンパク質発現レベルの計測方法又は過剰発現したタンパク質の検出方法は、当該技術分野において周知であり、例えばウエスタンブロッティング、免疫染色等が挙げられる。
【０２７０】
健常組織と比較したときに腫瘍細胞において上方制御されるか又は過剰発現する多くの腫瘍関連抗原が当該技術分野において公知であり、これらの抗原のいずれも、本発明の療法における追加的な療法用薬剤としてのＴＣＲによって標的化し得る。詳細には、本発明によれば、固形腫瘍を標的化することが望ましく、従って好ましくは、本明細書で考察するとおりのＴＣＲ分子は、固形腫瘍で過剰発現するか又は上方制御される腫瘍関連抗原を認識してそれに結合し得る。例えば、ＮＹ−ＥＳＯ（黒色腫及び精巣癌に関連する腫瘍関連抗原）、ＭＡＧＥＡファミリー（及び特にＭＡＧＥＡ  １０）（精巣癌に関連する腫瘍関連抗原）、ＡＦＰ（肝細胞癌に関連する腫瘍関連抗原）及びＷＴ１（幾つかの腫瘍型で発現する腫瘍関連抗原）が本発明の併用療法において標的化され得る。
【０２７１】
ＴＣＲ分子は、ペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体を認識してそれに結合し、従って本明細書で使用されるとおりのＴＣＲ分子は、典型的には腫瘍関連抗原の一部分又はペプチド断片を認識し得ることが理解されるであろう。かかるペプチド断片は、５〜２５アミノ酸長、例えば５〜１０、８〜１５、１０〜１８、１５〜２５アミノ酸長であってもよく、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５アミノ酸長であってもよく、典型的には腫瘍関連抗原内に含まれる連続ペプチド配列である。更に、ＴＣＲ分子は、特定のＭＨＣ又はＨＬＡ（例えば、ＭＨＣクラスＩ若しくはＩＩ又はＨＬＡ−Ａ１若しくはＨＬＡ−Ａ２）と組み合わせになったときの腫瘍関連抗原のペプチドのみを認識し得る。詳細には、本明細書に定義するとおりのＴＣＲ分子はＨＬＡ−Ａ２と組み合わせになったときのペプチド腫瘍関連抗原を認識し得る。
【０２７２】
ＴＣＲとペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体との結合は、当該技術分野において公知の様々な方法により、例えばＴＣＲがＴ細胞上に発現しているときにＴ細胞活性化に関連する様々なパラメータを計測することによるか、四量体アッセイによるか、又は細胞傷害性アッセイにより決定することができる。
【０２７３】
先に考察したとおり、本明細書において使用されるＴＣＲは、好ましくは、コードされるＣＡＲと異なる腫瘍関連抗原に結合し、即ち、ＴＣＲは、好ましくはＣＬＥＣ１４Ａに結合しない。
【０２７４】
本発明の詳細な実施形態において、ＴＣＲ分子は、ＷＴ１ペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体、より詳細にはＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ  Ａ２複合体を認識してそれに結合し得る。例えば、ＴＣＲは、ＷＴ１ペプチド２３５〜２４３（ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ）配列番号２０２−ＨＬＡ  Ａ＊２４０２の組み合わせに結合し得る。しかしながら、特に好ましい実施形態において、ＴＣＲは、ＷＴ１／ＨＬＡ  Ａ２複合体のＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８９）ペプチドを認識してそれに結合する。２つ以上のＴＣＲがこの複合体への結合能を有してもよく、かかるＴＣＲの１つ以上を本発明の併用療法で使用し得ることが理解されるであろう。更に、この態様との関連において、併用療法は、二重鎖ＴＣＲ（即ち、別個のα及びβ又はγ及びδ鎖を有する）及び／又は単鎖ＴＣＲを利用してＷＴ１複合体に結合し得る。
【０２７５】
従って、本明細書に記載される併用療法において（例えば、更なる療法用薬剤として）使用されるとおりのＴＣＲ分子は、α鎖及びβ鎖であって、α鎖は、配列番号１９０のＣＤＲ１α、配列番号１９１のＣＤＲ２α及び配列番号１９２又は１９３のＣＤＲ３αを含み、β鎖は、配列番号１９４のＣＤＲ１β、配列番号１９５のＣＤＲ２β及び配列番号１９６又は１９７のＣＤＲ３βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、ＣＤＲの１つ以上は、１、２又は３個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含んでもよく、前記ＴＣＲ分子は、ＨＬＡ  Ａ２／ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ複合体への結合能を有する。
【０２７６】
一部の命名方式では、β鎖のＣＤＲ３は、以下に記載する免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）データベースで使用される命名方式よりも長い定義となり得ることに留意しなければならない。加えて、一部の命名方式では、α鎖のＣＤＲ３は、ＩＭＧＴ方式よりも短い定義となり得る。同様に、定常領域は、命名方式の違いでＣＤＲ３領域に隣接するフレームワーク残基を含むことも又は含まないこともある。
【０２７７】
従って、ＩＭＧＴ方式を使用すると、ＣＤＲ３αは、配列番号１９２のアミノ酸配列を有することができ、定常領域は、フレームワークアミノ酸配列ＦＧＫＧＴＨＬＩＩＱＰを含む。
【０２７８】
別の命名方式（Garcia）（Garcia et al, 1999, Ann. Rev. Immunol. 17, 369-397、参照により本明細書に援用される）を使用すると、ＣＤＲ３αは、配列番号１９３のアミノ酸配列を有し、その直ちにＣ端側にあるフレームワーク領域は、ＦＧＫＧＴＨＬＩＩＱＰのアミノ酸配列を有し、定常領域は、アミノ酸配列ＹＩＱで始まる。
【０２７９】
ＩＭＧＴ命名方式を使用すると、ＣＤＲ３βは、アミノ酸配列の配列番号１９６を有することができ、その直ちにＣ端側にある定常領域は、フレームワークアミノ酸配列ＳＥＴを含む。
【０２８０】
Garcia命名方式を使用すると、ＣＤＲ３βは、アミノ酸配列の配列番号１９７を有し、その直ちにＣ端側にあるフレームワーク領域は、アミノ酸配列ＦＧＰＧＴＲＬＬＶＬを有し、直ちにＣ端側の定常領域は、アミノ酸配列ＥＤＬで始まる。
【０２８１】
当業者は、フレームワーク領域がＣＤＲと適合性を有するならば、いずれの命名方式を用いても本発明で使用するＴＣＲを容易に設計及び合成し得ることが理解されるであろう。アミノ酸配列は、多くのＴＣＲα鎖及びβ鎖の可変領域（従ってフレームワーク領域）を含め、当該技術分野において周知であり、その一部は、http://imgt.cines.frのＩＭＧＴ（免疫遺伝学）データベースに記載されている。この情報を例えばGarcia et al（前掲）と併せて用いることにより、ＣＤＲ及びＦＲを含むＴＣＲを設計及び作製し得る。
【０２８２】
上記に指摘したとおり、変異ＴＣＲが本発明に使用されてもよく、ここで、１つ以上のＣＤＲが１、２又は３個のアミノ酸置換を含み得る。本明細書で考察するとおり、ＣＡＲ配列に関して、詳細には置換は保存的置換であってもよく、いかなる変異体分子もＨＬＡ  Ａ２／ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ複合体への結合能を有しなければならない。変異体の結合の親和性は、上記に定義するとおりのＣＤＲを有するＴＣＲと比較したときに増加又は減少してもよいが、しかし、結合は、なおも起こらなければならない。ＴＣＲのその腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体標的への結合を検出する方法は、上記に記載される。
【０２８３】
詳細には、本発明に係る更なる療法用薬剤として使用されるＴＣＲ分子は、配列番号２００に記載されるとおりのＴＣＲα鎖及び配列番号２０１に記載されるとおりのＴＣＲβ鎖を含んでもよい。代替的に、ＴＣＲ分子は、配列番号１９８に記載されるとおりのＴＣＲα鎖及び配列番号１９９に記載されるとおりのＴＣＲβ鎖を含んでもよく、ここで、前記α鎖及びβ鎖配列は、前記α鎖及びβ鎖の対形成を安定化させるか又は増強するため更に修飾されてもよい。
【０２８４】
本明細書に記載されるとおりのＴＣＲ分子をコードする核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡの形態であってもよい。従って、本発明の組成物は、本発明のＣＡＲ及び本明細書に記載されるとおりのＴＣＲ分子をコードするＲＮＡ分子を含んでもよい。
【０２８５】
代替的に、ベクターは、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を含んでもよい。ＣＡＲの発現に好適なベクターは、本明細書に記載され、かかるベクターは、ＴＣＲ発現にも利用することができる。ＣＡＲ発現とＴＣＲ発現とに別個のベクターを用い得ることも想定されるが、あるベクターが本発明のＣＡＲとＴＣＲ分子との両方をコードし得ることが可能である。これに関して、各遺伝子の発現が異なるプロモーターによって制御されてもよく、又は本明細書の他の部分に記載されるとおり単一のプロモーターが利用されてもよい。
【０２８６】
これに関して、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含み、且つ腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体への結合能を有するＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが本発明によって提供される。
【０２８７】
更に、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む本発明の核酸分子と、腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体への結合能を有するＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子とを含む細胞が本発明によって提供される。本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターと、腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体への結合能を有するＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターとを含む細胞も包含される。
【０２８８】
本発明の細胞は、代替的に又は追加的に、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含み、且つ腫瘍関連抗原ペプチド／ＭＨＣ又はＨＬＡ複合体への結合能を有するＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含んでもよい。
【０２８９】
従って、細胞は、本発明のＣＡＲ分子及び本明細書に定義するとおりのＴＣＲ分子を（例えば、同じ又は異なるベクターから）発現し得る。
【０２９０】
細胞集団も本発明によって提供され、ここで、少なくとも１つの細胞が、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む本発明の核酸を含み、且つ少なくとも１つの細胞が、先に定義したとおりのＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む。従って、この実施形態において、細胞集団は、ＣＡＲ分子のみを発現する細胞と、ＴＣＲ分子のみを発現する細胞とを含んでもよい。加えて、かかる細胞集団は、ＣＡＲ分子とＴＣＲ分子との両方を発現する細胞を含んでもよい。
【０２９１】
典型的には、上記で考察したとおり、本発明の細胞は、免疫細胞、詳細にはＴ細胞であってもよい。
【０２９２】
本発明のこの態様は、ＣＡＲ分子及びＴＣＲ分子をコードする（別個のポリヌクレオチド配列として又は同じ若しくは異なるベクターからのいずれか）核酸分子又はベクターを含むキットを更に包含する。
【０２９３】
本発明の詳細な実施形態において、
（ｉ）ＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ＴＣＲ分子は、α鎖及びβ鎖であって、α鎖は、配列番号１９０のＣＤＲ１α、配列番号１９１のＣＤＲ２α及び配列番号１９２又は１９３のＣＤＲ３αを含み、β鎖は、配列番号１９４のＣＤＲ１β、配列番号１９５のＣＤＲ２β及び配列番号１９６又は１９７のＣＤＲ３βを含む、α鎖及びβ鎖、又はその変異体であって、ＣＤＲの１つ以上は、１、２又は３個のアミノ酸置換を含む、その変異体を含み、前記ＴＣＲ分子は、ＨＬＡ  Ａ２／ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ複合体への結合能を有する、核酸分子、及び
（ｉｉ）抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインと、膜貫通ドメインと、シグナリングドメインとを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記抗ＣＬＥＣ１４Ａ結合ドメインは、配列番号５８、９６、１１２、１２５若しくは１７５のアミノ酸配列（好ましくは配列番号５８、好ましくは配列番号９６若しくは好ましくは配列番号１２５）又は配列番号５８、９６、１１２、１２５若しくは１７５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性有するその変異体を含む、核酸分子
を含む組成物が提供される。
【０２９４】
上記の（ｉ）及び（ｉｉ）に定義されるとおりの核酸分子を含む細胞、特にＴ細胞が更に具体的に提供される。更に、細胞集団は、上記の（ｉ）に定義されるとおりの核酸を含む第１の細胞と、上記の（ｉｉ）に定義されるとおりの核酸を含む第２の細胞とを含んでもよい。
【０２９５】
上記の考察から、本発明が、本発明の核酸、ベクター、細胞又は細胞集団と薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤とを含む様々な組成物、例えば医薬組成物、療法用組成物を提供することは明らかであろう。これに関して、本発明の薬剤（即ち、核酸、ベクター又は細胞）は、典型的には医薬組成物としての個体（即ち、対象）への投与用に、即ち薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と共に製剤化され得ることが理解される。
【０２９６】
「薬学的に許容可能」には、製剤が無菌且つパイロジェンフリーであることが含まれる。好適な医薬担体、希釈剤及び賦形剤は薬学の技術分野において周知である。担体は、医薬と適合性があり、且つその被投与者にとって有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体は、無菌且つパイロジェンフリーの生理食塩水又は注入媒体（或いは注入用溶液と呼ばれる）であり得る。しかしながら、他の許容可能な担体が用いられてもよい。本発明の組成物は、好適な凍結保存剤、例えばＤＭＳＯを含んでもよい。
【０２９７】
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物又は製剤は、非経口投与用、より詳細には静脈内投与用である。好ましい実施形態において、医薬組成物は、患者への例えば注射による静脈内投与に好適である。
【０２９８】
非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び意図する被投与者の血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液、並びに水性滅菌懸濁液が含まれる。
【０２９９】
液体医薬組成物は、典型的には、プラズマライトＡ＋ＨＳＡ（例えば、４％）を含んでもよい注入媒体中に本発明の細胞、例えばＴ細胞を含み得る。本発明の細胞は、概して滅菌等張溶液を用いて注入される。非経口製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は、好ましくは無菌である。
【０３００】
本発明の医薬組成物は、治療（又は予防）しようとする疾患に適切な方法で投与され得る。投与の分量及び頻度は、患者の状態並びに患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決まり得るが、適切な投薬量は、臨床試験によって決定されてもよい。
【０３０１】
本発明の組成物は、単回投与又は複数回投与で投与されるものであり得る。詳細には、本組成物は、単回の一度限りの投与で投与されるものであり得る。
【０３０２】
本発明の薬剤又は組成物は、活性成分を含む医薬製剤の形態で任意の非経口経路によって投与されてもよい。治療する障害及び患者並びに投与経路に応じて、組成物は、様々な用量（例えば、細胞／ｋｇ又はｍ２単位で測られる）で投与され得る。いずれの場合にも、医師は、任意の個々の患者に最も好適となり得る実際の投薬量を決定することになり、それは、特定の患者の年齢、体重及び応答によって異なり得る。しかしながら、典型的には、本発明の細胞について、静脈内投与では１×１０９／ｋｇ以下の用量（又はｍ２単位での均等量）、例えば少なくとも１×１０８細胞／ｋｇの用量が提供され得る。腫瘍内投与では、１×１０１０細胞／ｋｇ以下の用量が想定される。
【０３０３】
ヒト療法では、本発明の薬剤又は組成物は、概して、意図される投与経路及び標準的薬学実践の点で選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤又は担体と混合して投与されることになる。典型的には、本発明の細胞は、注入用緩衝液中にあって投与されてもよい。
【０３０４】
本発明の薬剤又は組成物は、非経口的に、例えば静脈内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、脳室内に、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に又は皮下に投与することもでき、又は注入技法によって投与されてもよい。これらは、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態での使用が最も適している。水溶液は、必要に応じて好適に（好ましくは３〜９のｐＨに）緩衝されなければならない。無菌条件下における好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技法によって容易に達成される。
【０３０５】
製剤は、単位用量容器又は複数用量容器、例えば密封されたアンプル、バッグ及びバイアルに提供されてもよい。
【０３０６】
一部の実施形態において、本発明の薬剤又は組成物は、眼経路によって投与されてもよい。眼科使用には、本発明の薬剤又は組成物は、例えば、等張性のｐＨ調整済み滅菌生理食塩水中の微粒子化懸濁液として、又は好ましくは等張性のｐＨ調整済み滅菌生理食塩水中の溶液として、任意選択で塩化ベンジルアルコニウム（benzylalkonium chloride）などの保存剤と組み合わせて製剤化することができる。
【０３０７】
本発明の核酸分子薬剤（例えば、核酸分子、ベクター等）は、以下に記載するとおりの好適な遺伝子コンストラクトとして投与して患者に送達し、そこで発現させてもよい。典型的には、遺伝子コンストラクト中の核酸は、細胞において化合物を発現させることのできるプロモーターに作動可能に連結されている。本発明の遺伝子コンストラクトは、当該技術分野において例えばSambrook et al (2001)で周知の方法を用いて調製することができる。
【０３０８】
ポリヌクレオチドを送達するための遺伝子コンストラクトは、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。従って、対象への本発明の核酸分子又は発現ベクターの直接投与が関わる遺伝子療法的治療方法が本発明に包含される。更に、ＣＡＲの直接投与が関わる治療方法も包含される。かかる方法は、細胞をエキソビボで操作することが回避されるために有利であり得る。
【０３０９】
好ましくは、遺伝子コンストラクトは、ヒト細胞への送達に適合される。遺伝子コンストラクトを細胞に導入する手段及び方法は、当該技術分野において公知であり、免疫リポソーム、リポソーム、ウイルスベクター（ワクシニア、改良ワクシニア、レンチウイルス、パルボウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む）の使用、及びＤＮＡの例えば遺伝子銃及び電気穿孔を用いた直接送達によることが挙げられる。更に、治療のためにポリヌクレオチドを患者の標的組織に送達する方法も当該技術分野において周知である。代替的方法では、受容体介在性エンドサイトーシスを用いてＤＮＡ巨大分子を細胞に運び込む高効率核酸送達システムが用いられる。これは、核酸に結合するポリカチオンに鉄輸送タンパク質トランスフェリンをコンジュゲートすることにより達成される。Cotten et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6094-6098の方法によって作製された欠損の若しくは化学的に不活性なアデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を用いたＤＮＡコンストラクト、又は本発明の他の遺伝子コンストラクトの高効率受容体介在性送達も用いることができる。「ネイキッドＤＮＡ」並びにカチオン性及び中性脂質と複合体化したＤＮＡも、治療する個体の細胞に本発明のＤＮＡを導入するのに有用であり得ることが理解されるであろう。遺伝子療法の非ウイルス手法については、Ledley（1995, Human Gene Therapy 6, 1129-1144）に記載されている。
【０３１０】
特定の組織の癌／腫瘍には、ポリヌクレオチド阻害薬をコードするベクター内に組織特異的プロモーターを使用することが有用であり得るが、核酸分子薬剤が体内において癌／腫瘍以外の部位で発現するリスクは、癌／腫瘍に罹患している患者にとっての治療利益に比して許容可能であると思われるため、これは必須ではない。細胞におけるポリヌクレオチド阻害薬の発現を時間的に調節可能であることが望ましい場合もあるが、これも必須ではない。
【０３１１】
投与用の本発明の薬剤（例えば、核酸、ベクター、細胞又は細胞集団）は、医薬組成物における使用向けに適切に修飾されてもよい。例えば、薬剤は、例えば、塩又は非電解質、酢酸塩、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、トリス、リン酸塩又は酢酸塩緩衝液、マンニトール、グリシン、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）又はポリソルベートなどの適切な添加剤を使用することにより、本発明の組成物中で分解に対して安定化されてもよい。多数の安定化剤が当該技術分野において公知である。細胞は、詳細には凍結保存され、対象への注入前に適切な時点で解凍されてもよい。
【０３１２】
本発明は、本発明の核酸、ベクター、細胞又は組成物の１つ以上を含むキットを更に含む。好ましくは、前記キットは、本明細書に記載されるとおりの方法及び使用、例えば本明細書に記載されるとおりの治療方法に用いられるものであり、又はインビトロアッセイ又は方法に用いられるものである。好ましくは、前記キットは、キット構成要素の使用説明書を含む。
【０３１３】
本明細書における「腫瘍」といういかなる表現は、「癌」又は「癌腫」も指す。転移性癌も治療することができ、原発腫瘍からの転移を低減することもできる。術後患者に残るいわゆる微小残存病変（ＭＲＤ）が、本明細書に定義するとおりの薬剤による免疫療法に適していることもある。
【０３１４】
本願全体を通じて使用されるとき、用語「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、それらが、上限が後に具体的に記載される場合を除き、言及される構成要素又はステップの「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１つ以上」又は「複数」を意味するという意味で用いられる。従って、「抗体」は、本明細書で使用されるとき、「少なくとも第１の抗体」を意味する。併用の機能し得る限度及びパラメータは、任意の単剤の量と同様に本開示を踏まえて当業者に公知であり得る。
【０３１５】
本明細書に引用される文献は、参照により本明細書に援用される。
【０３１６】
ここで、以下の実施例及び図を参照して本発明を更に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０３１７】
【図１−１】Genbank受託番号ＮＰ＿７７８２３０からのヒトＣＬＥＣ１４Ａのポリペプチド配列（配列番号１）（図１Ａ）；Genbank受託番号ＮＭ＿１７５０６０からのヒトＣＬＥＣ１４ＡのｃＤＮＡ（配列番号２）（図１Ｂ）及びＮＭ＿１７５０６０の３４８〜１８２０位からのヒトＣＬＥＣ１４Ａ  ｃＤＮＡのコード領域（配列番号３）を示す。
【図１−２】Genbank受託番号ＮＰ＿７７８２３０からのヒトＣＬＥＣ１４Ａのポリペプチド配列（配列番号１）（図１Ａ）；Genbank受託番号ＮＭ＿１７５０６０からのヒトＣＬＥＣ１４ＡのｃＤＮＡ（配列番号２）（図１Ｂ）及びＮＭ＿１７５０６０の３４８〜１８２０位からのヒトＣＬＥＣ１４Ａ  ｃＤＮＡのコード領域（配列番号３）を示す。
【図２】ＨＵＶＥＣ及び他の初代細胞におけるＣＬＥＣ１４Ａの相対発現のグラフを示す。ＣＬＥＣ１４Ａは、内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で特異的に発現し、ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）、ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５０、ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）、ヘパトサイト又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）では発現しなかった。
【図３】創傷閉鎖の遅れを示す抗ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体ＣＲＴ−３によるＨＵＶＥＣ引っ掻き傷治癒アッセイのグラフ結果を示す。
【図４】ＣＬＥＣ１４Ａ抗体で処置したＨＵＶＥＣによる細管形成アッセイの分析を示す。ＨＵＶＥＣを２０μｇ／ｍｌ  ＣＲＴ２、３又は４又はマウスＩｇＧアイソタイプ対照で処置した。１６時間で細管の画像を撮り、細管の全長、ジャンクションの数、分岐の数、分岐の長さ、網目の数及び網目の総面積を分析した。図示するデータは、各々につき５つのデータ点を分析した３つの実験を表す。エラーバーはＳＥＭを示す。＊ｐ，０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。
【図５】内皮発芽におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を明らかにするＣＬＥＣ１４ＡのｓｉＲＮＡノックダウンを示す。図５Ａは、ＣＬＥＣ１４ＡのｓｉＲＮＡ二重鎖ターゲティングが、ｑＰＣＲによって決定するとき、ＨＵＶＥＣにおけるＣＬＥＣ１４Ａ  ｍＲＮＡ発現を効率的にノックダウンできることを示す。相対発現は発現をフロチリン２に対して正規化することにより決定した。図５Ｂは、ウエスタンブロット分析によるタンパク質レベルでのＣＬＥＣ１４Ａのノックダウンを示す。ローディング対照としてチューブリンを使用した。図５Ｃは、対照又はｃｌｅｃ１４ａ標的化ｓｉＲＮＡで処置したＨＵＶＥＣについての１６時間後の新芽成長の代表的な画像を示す。図５Ｄは、対照及びＣＬＥＣ１４ＡノックダウンＨＵＶＥＣについての２７個のスフェロイド（３つの臍帯からの９個のスフェロイド）の新芽の定量化を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図５Ｅは、混合した対照（緑色）及びｃｌｅｃ１４ａ標的化ｓｉＲＮＡで処置したＨＵＶＥＣ（赤色）についての２４時間後の新芽成長の代表的な画像を示す。図５Ｆは、対照（ＣＯＮ）及びＣＬＥＣ１４Ａノックダウン（ＫＤ）ＨＵＶＥＣに由来する先端細胞及び柄細胞のパーセンテージの定量化を示す；二元配置ＡＮＯＶＡ統計検定とボンフェローニ事後検定＊＊＊＝ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意差なし。
【図６−１】ＣＬＥＣ１４Ａの欠損がインビトロ及びインビボで発芽を阻害することを示す。図６Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６（ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋）又はＣ５７ＢＵ６（Ｃｌｅｃ１４ａｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇ）（ｃｌｅｃ１４ａ  −／−）マウスにおけるｃｌｅｃ１４ａ遺伝子の概略図を示す。図６Ｂは、ｃｌｅｃ１４ａの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、コード配列（ＣＤＳ）及び３’ＵＴＲについて３匹のｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋マウス（白色のバー）及び３匹のｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウス（黒色のバー）から生成されたｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析を示す。相対発現は、発現をフロチリン２に対して正規化することにより決定した。図６Ｃは、マウスＣＬＥＣ１４Ａに対するポリクローナル抗血清を用いたｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの肺ライセートにおけるＣＬＥＣ１４Ａタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。ローディング対照としてチューブリンを使用した。図６Ｄは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの大動脈リング発芽アッセイの代表的な画像を示す。図６Ｅは、１リング当たりに形成された管の定量化を示し、図６Ｆは、大動脈リングから内皮管によって移動した最大距離の定量化を示す、１遺伝子型当たり４８個のリング、各遺伝子型につき６匹のマウスからのデータ；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図６Ｇは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのスポンジ移植片のヘマトキシリン・エオシン染色切片の代表的な画像を示し、スポンジの中央部にある切片を分析した。図６Ｈは、図６Ｇに示すスポンジ移植片への細胞侵入の定量化を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．０５。図６Ｉは、血管密度の定量化を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図６Ｊは、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのｘ−ｇａｌで染色し、ヘマトキシリン・エオシンで対比染色した肝組織及びスポンジ組織の切片を示す。
【図６−２】ＣＬＥＣ１４Ａの欠損がインビトロ及びインビボで発芽を阻害することを示す。図６Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６（ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋）又はＣ５７ＢＵ６（Ｃｌｅｃ１４ａｔｍ１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇ）（ｃｌｅｃ１４ａ  −／−）マウスにおけるｃｌｅｃ１４ａ遺伝子の概略図を示す。図６Ｂは、ｃｌｅｃ１４ａの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、コード配列（ＣＤＳ）及び３’ＵＴＲについて３匹のｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋マウス（白色のバー）及び３匹のｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウス（黒色のバー）から生成されたｃＤＮＡの定量的ＰＣＲ分析を示す。相対発現は、発現をフロチリン２に対して正規化することにより決定した。図６Ｃは、マウスＣＬＥＣ１４Ａに対するポリクローナル抗血清を用いたｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの肺ライセートにおけるＣＬＥＣ１４Ａタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示す。ローディング対照としてチューブリンを使用した。図６Ｄは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの大動脈リング発芽アッセイの代表的な画像を示す。図６Ｅは、１リング当たりに形成された管の定量化を示し、図６Ｆは、大動脈リングから内皮管によって移動した最大距離の定量化を示す、１遺伝子型当たり４８個のリング、各遺伝子型につき６匹のマウスからのデータ；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図６Ｇは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのスポンジ移植片のヘマトキシリン・エオシン染色切片の代表的な画像を示し、スポンジの中央部にある切片を分析した。図６Ｈは、図６Ｇに示すスポンジ移植片への細胞侵入の定量化を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．０５。図６Ｉは、血管密度の定量化を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図６Ｊは、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのｘ−ｇａｌで染色し、ヘマトキシリン・エオシンで対比染色した肝組織及びスポンジ組織の切片を示す。
【図７】ＣＬＥＣ１４Ａの欠損が腫瘍成長を阻害することを示す。図７Ａは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋（実線と丸）及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−（実線と四角）マウスにおけるルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍成長を示す；二元配置ＡＮＯＶＡ統計分析、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。図７Ｂは、ＬＬＣ腫瘍の代表的な画像を示す。図７Ｃは、７匹のｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋（丸）及び７匹のｃｌｅｃ１４ａ  −／−（四角）マウスについてのエンドポイント腫瘍重量を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図７Ｄは、マウスＣＤ３１に関して染色したＬＬＣ腫瘍切片の免疫蛍光染色の代表的な画像を示す。図７Ｅは、血管密度の定量化を示し、及び図７Ｆは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからのパーセンテージ内皮被覆率を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．０００１。図７Ｇは、ｘ−ｇａｌで染色し、ヘマトキシリン・エオシンで対比染色したｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスからの肝組織及びＬＬＣ腫瘍組織の切片を示す。
【図８】ＭＭＲＮ２がＣＬＥＣ１４Ａに結合することを示す。図８Ａでは、２０μｇ  ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ又はＦｃを使用して相互作用パートナーを沈降させた。沈降物及びＨＵＶＥＣライセートをＳＤＳ−ＰＡＧ上で分離し、ＭＭＲＮ２（上のパネル）又はＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ（下のパネル）に関してブロットした。図８Ｂでは、ＣＬＥＣ１４Ａに対するポリクローナル抗血清を使用してＨＵＶＥＣライセートからＣＬＥＣ１４Ａを免疫沈降させた。免疫沈降物をＭＭＲＮ２（上のパネル）及びＣＬＥＣ１４Ａ（下のパネル）に関してウエスタンブロットによって分析した。
【図９】ＭＭＲＮ２−ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用遮断抗体が腫瘍成長を阻害することを示す。図９Ａは、ＬＬＣを注射したマウスを１００μｇのｍＩｇＧ１（実線と丸；ｎ＝７）又はＣ４抗体（実線と四角；ｎ＝７）の注射によって処置した結果を示す；二元配置ＡＮＯＶＡ統計分析、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。図９Ｂは、ＬＬＣ腫瘍の代表的な画像を示す。図９Ｃは、７匹のｍＩｇＧ１処置マウス（丸）及び７匹のＣ４抗体処置マウス（四角）についてのエンドポイント腫瘍重量を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。図９Ｄは、マウスＣＤ３１に関して染色したＬＬＣ腫瘍切片の免疫蛍光染色の代表的な画像を示す。図９Ｅは、血管密度の定量化を示し、及び図９Ｆは、ｍＩｇＧ１又はＣ４抗体で処置したマウスからのパーセンテージ内皮被覆率を示す；マン・ホイットニー統計検定ｐ＜０．００１。
【図１０】ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ４及びＣ５がＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用を遮断することを示す。ヒトＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−ＦｃをプロテインＡビーズに結合させて２０％ＦＣＳでブロックし、次に各遮断条件を伴いインキュベートした。次に、これを、Ｈｉｓタグ有する完全長ヒトＭＭＲＮ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞のライセートに加えた。ＣＲＴ１、ＣＲＴ４及びＣＲＴ５とプレインキュベートすると、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−ＦｃによってプルダウンされるＭＭＲＮ２レベルが低下した。
【図１１】ＭＭＲＮ２が非還元条件下でＣＬＥＣ１４ＡのＣ型レクチン又はｓｕｓｈｉドメインのいずれかに直接結合することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をモックトランスフェクトするか、又はＣＬＥＣ１４Ａ野生型（ＷＴ）又はＮ末端ＨＡタグを有する各主要ドメインが欠失した（Δ）コンストラクトを含有するｐＣＳ２ベクターでトランスフェクトした。ＭＭＲＮ２タンパク質ライセートでファーウエスタンブロッティングすると、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＴＬＤ）又はｓｕｓｈｉドメインが欠損しているものを除き、全ての突然変異体に結合が見られる。全ての突然変異タンパク質が発現したことを示すため、抗ＨＡブロットを含めた。
【図１２】キメラタンパク質キメラ５及びキメラ６のタンパク質配列を示す。
【図１３−１】フローサイトメトリーを用いたＣＲＴ抗体の結合の分析を示す。コンストラクトは、全てＣ末端ＧＦＰタグを有し、そのため、緑色の細胞をゲーティングし、赤色で染色した。全てのＣＲＴ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現するＣ末端ＧＦＰタグを有するＣＬＥＣ１４Ａ野生型に結合する。ＣＲＴ抗体のいずれも、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現するＧＦＰタグを有する野生型トロンボモジュリンに結合しない。
【図１３−２】フローサイトメトリーを用いたＣＲＴ抗体の結合の分析を示す。コンストラクトは、全てＣ末端ＧＦＰタグを有し、そのため、緑色の細胞をゲーティングし、赤色で染色した。全てのＣＲＴ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現するＣ末端ＧＦＰタグを有するＣＬＥＣ１４Ａ野生型に結合する。ＣＲＴ抗体のいずれも、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現するＧＦＰタグを有する野生型トロンボモジュリンに結合しない。
【図１４】ＣＤ１４１のＣＬＥＣ１４Ａ領域１〜４２；ＣＤ１４１のＣＬＥＣ１４Ａ領域９７〜１０８；及びＣＤ１４１のＣＬＥＣ１４Ａ領域１２２〜１４２のアラインメントを示す。
【図１５−１】キメラ５（トロンボモジュリンのＣＴＬＤ、残りはＣＬＥＣ１４Ａ）が、ＣＲＴ２での蛍光の僅かなシフトを除き、ＣＲＴ抗体のいずれによっても認識されないことを示す。キメラ６（ＣＬＥＣ１４ＡのＣＴＬＤの正しい折り畳みを確実にするトロンボモジュリンのＳｕｓｈｉ）は、ＣＲＴ２を除く全てのＣＲＴ抗体の結合をもたらす。
【図１５−２】キメラ５（トロンボモジュリンのＣＴＬＤ、残りはＣＬＥＣ１４Ａ）が、ＣＲＴ２での蛍光の僅かなシフトを除き、ＣＲＴ抗体のいずれによっても認識されないことを示す。キメラ６（ＣＬＥＣ１４ＡのＣＴＬＤの正しい折り畳みを確実にするトロンボモジュリンのＳｕｓｈｉ）は、ＣＲＴ２を除く全てのＣＲＴ抗体の結合をもたらす。
【図１６】残基９７〜１０８をトロンボモジュリンの対応する領域とスワップしたときの抗体ＣＲＴ１〜５による結合のフローサイトメトリー分析を示す。これは、ＣＲＴ２及びＣＲＴ３がなおも結合できるとおり、正しい折り畳みをもたらした。しかしながら、ＣＲＴ１、ＣＲＴ４及びＣＲＴ５はこの突然変異体を認識することができず、これが結合領域であることが示唆される。
【図１７】ＣＲＴ−４抗体薬物コンジュゲート治療を用いたときの肺癌の腫瘍重量の低下を示す。図１７Ａは、マウスの右側腹部に１００万個のルイス肺癌細胞を皮下注射して目に見えるサイズまで成長させたときの結果を示す。１ｍｇ／ｋｇの抗体ＣＲＴ４−ＡＤＣ（右の画像）又は対照Ｂ１２−ＡＤＣ（左の画像）を尾静脈注射によって投与した。マウスは、１時間観察し、２４時間後に殺処分した。臓器を全て解剖して固定した。ｎ＝１。図１７Ｂは、抗体薬物コンジュゲート治療のエンドポイント腫瘍重量を示す。Ｂ１２−ＡＤＣ処置群と比較したときのＣＲＴ４−ＡＤＣ処置群の湿重量間には有意な差があった。マン・ホイットニー検定ｐ＝０．０３１７。エラーバーＳＥＭ、ｎ＝５。データは、同じ方法の２つの別個の実験からプールしたものである。
【図１８】ＣＲＴ−３抗体薬物コンジュゲートのインターナリゼーション及び投与後２４時間にこれが腫瘍に及ぼす効果を示す。図１８Ａは、ＨＵＶＥＣにおけるＣＲＴ−３抗体薬物コンジュゲートのインターナリゼーションを示し、ここで、蛍光イメージングが０及び９０分後のＣＲＴ−３の局在を示し、及び図１８Ｂは、ＣＲＴ−３−ＡＤＣで処置したＨＵＶＥＣにおけるCell Titre Glo発光細胞生存アッセイによって計測した細胞傷害性を示す（ＩＣ５０＝１３７．６ｎｇ／ｍｌ）。図１８Ｃは、ＣＲＴ３−ＡＤＣ処置マウスにおける腫瘍の部位の広範な出血を示し、これは、対照にはなく、血管新生が腫瘍特異的に妨げられたことを実証している。
【図１９】トランケート型ＣＤ３４マーカー遺伝子とｓｃＦｖ断片／ＣＤ３ζ鎖キメラ受容体とを共発現するレトロウイルスＣＡＲベクター（ｐＭＰ７１ベース）を示す（図１９Ａ）。発現は、ＬＴＲプロモーターからドライブされ、２ＡペプチドリンカーがＣＤ３４及びＣＡＲの両方の等モル発現を確実にする。第２世代ＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ２８共刺激ドメインを含んだ。図１９Ｂは、フローサイトメトリーによって分析したＣＤ３４染色を示し、ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲを共発現するレトロウイルスコンストラクトを使用したＴ細胞の形質導入の成功を実証している。抗体ＣＲＴ３及びＣＲＴ５ベースの第１世代ＣＡＲは、それぞれＣＲＴ３．ｚ及びＣＲＴ５．ｚと称される。抗体ＣＲＴ３及びＣＲＴ５ベースの第２世代ＣＡＲは、それぞれＣＲＴ３．２８ｚ及びＣＲＴ５．２８ｚと称される。ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞サブセットで均等な発現が見られたことに留意されたい（データは示さず）。図１９Ｃは、ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃを用いてＣＡＲの発現に関して直接染色した細胞を示す（％値は、Ｆｃ単独によるバックグラウンド染色を差し引いたＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃの特異的結合を示す）。
【図２０】抗体ＣＲＴ３又はＣＲＴ５ベースの第１世代又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞が、（Ａ）プレート結合組換えＦｃ融合タンパク質として発現するか、（Ｂ）操作されたＣＨＯ細胞上に発現するか、又は（Ｃ）静置培養で成長したときにＣＬＥＣ１４Ａを天然に発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）上に発現するかのいずれかのＣＬＥＣ１４Ａに応答する能力を示す。Ｔ細胞応答は、インターフェロンγ産生に関してＥＬＩＳＡを用いて計測した。図示するデータは、３〜７つの反復実験から得られた代表的なものである。Ｔ細胞は、トランス遺伝子発現細胞の頻度が等しくなるように調整した。ヒストグラムは、全て平均応答＋ＳＤを示す。
【図２１−１】ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲを形質導入したＴ細胞の更なるインビトロ機能試験を示す。抗体ＣＲＴ３又はＣＲＴ５ベースの第１世代又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞、又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞について、以下の機能アッセイにおいてＣＬＥＣ１４Ａに対するその応答能力を試験した：（Ａ）細胞傷害性、ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現するように操作したＣＨＯ細胞を使用（ＣＨＯ単独（対照細胞）のバックグラウンド溶解レベルを差し引いた）。図示するデータは、５つの反復実験の代表的なものである。（Ｂ）増殖、本発明者らは、ＣＦＳＥ標識ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を使用して、ＨＵＶＥＣと４日間共培養したときのＣＡＲ＋（ＣＤ３４＋）及びＣＡＲ−（ＣＤ３４−）細胞サブセットの増殖を計測した。図示するデータは、２つの反復実験の代表的なものである。（Ｃ）ヒトＣＬＥＣ１４Ａ及びマウスＣＬＥＣ１４Ａの両方に対する（ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の応答を、インターフェロンγ放出を用いて評価した。Ｔ細胞は、トランス遺伝子発現細胞の頻度が等しくなるように調整した。図示するデータは、６つの反復実験の代表的なものである。ヒストグラムは、全て平均応答＋ＳＤを示す。
【図２１−２】ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲを形質導入したＴ細胞の更なるインビトロ機能試験を示す。抗体ＣＲＴ３又はＣＲＴ５ベースの第１世代又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞、又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞について、以下の機能アッセイにおいてＣＬＥＣ１４Ａに対するその応答能力を試験した：（Ａ）細胞傷害性、ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現するように操作したＣＨＯ細胞を使用（ＣＨＯ単独（対照細胞）のバックグラウンド溶解レベルを差し引いた）。図示するデータは、５つの反復実験の代表的なものである。（Ｂ）増殖、本発明者らは、ＣＦＳＥ標識ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を使用して、ＨＵＶＥＣと４日間共培養したときのＣＡＲ＋（ＣＤ３４＋）及びＣＡＲ−（ＣＤ３４−）細胞サブセットの増殖を計測した。図示するデータは、２つの反復実験の代表的なものである。（Ｃ）ヒトＣＬＥＣ１４Ａ及びマウスＣＬＥＣ１４Ａの両方に対する（ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の応答を、インターフェロンγ放出を用いて評価した。Ｔ細胞は、トランス遺伝子発現細胞の頻度が等しくなるように調整した。図示するデータは、６つの反復実験の代表的なものである。ヒストグラムは、全て平均応答＋ＳＤを示す。
【図２２】抗体ＣＲＴ１ベースの第３のＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲを形質導入したＴ細胞のインビトロ機能試験を示す。抗体ＣＲＴ１ベースの第１世代又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞、又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞について、（Ａ）操作されたＣＨＯ細胞又は（Ｂ）静置培養で成長したときにＣＬＥＣ１４Ａを天然に発現するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に発現するＣＬＥＣ１４Ａに対するその応答能力を試験した。Ｔ細胞応答は、インターフェロンγ産生に関してＥＬＩＳＡを用いて計測した。（Ｃ）細胞傷害性、ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現するように操作したＣＨＯ細胞を使用（ＣＨＯ単独（対照細胞）のバックグラウンド溶解レベルを差し引いた）。図示するデータは、少なくとも３つの反復実験から得られた代表的なものである。Ｔ細胞は、トランス遺伝子発現細胞の頻度が等しくなるように調整した。ヒストグラムは、全て平均応答＋ＳＤを示す。
【図２３−１】ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞を注射した健常Ｃ５７／ＢＬ６マウスを使用したインビボ毒性試験を示す。抗体ＣＲＴ３又はＣＲＴ５ベースの第１世代又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞、又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞を、Ｔ細胞生着を促進するため予め照射（４Ｇｙ）しておいた健常Ｃ５７ＢＬ６マウスの尾静脈に注射した。Ｔ細胞は、マーカーＣＤ４５．１を担持するＣ５７ＢＬ６コンジェニック系統（ＢｏｙＪ）に由来した。１マウス当たり２０００万個のＴ細胞（４００万個の操作されたＴ細胞が含まれる）を注入した。マウスを次の４５日間モニタし、目に見える毒性の徴候は見られなかった。（Ａ）この間、体重は正常に増加した。（Ｂ）週１回の尾採血では、注入したＣＤ４５．１＋  Ｔ細胞が注入後少なくとも５週間残存し、この間を通じてそれらが全循環Ｔ細胞プールの少なくとも３０％を占めたことが実証された（時間と共に宿主自身のＴ細胞が回復することに留意されたい）。（Ｃ）同じ試料をＣＤ３４並びにＣＤ４５．１に関して染色したところ、注入した全Ｔ細胞集団に対する操作した（ＣＤ３４＋）Ｔ細胞の割合が、この間、比較的一定のままであったことが実証された。（Ｄ）実験終了時、ＣＡＲで処置したマウスから脾細胞を採取し、免疫磁気ビーズ選択を用いてＣＤ３４＋細胞を単離した。これらの細胞を直ちにエキソビボで試験したところ、インターフェロンγ放出に関してＥＬＩＳＡによって計測したとき、それらがなおもヒトＣＬＥＣ１４Ａ及びマウスＣＬＥＣ１４Ａの両方に応答する能力を有したことが実証された。グラフＡ〜Ｃは、平均値＋ＳＥＭを示す。グラフＤは、平均値＋ＳＤを示す。
【図２３−２】ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞を注射した健常Ｃ５７／ＢＬ６マウスを使用したインビボ毒性試験を示す。抗体ＣＲＴ３又はＣＲＴ５ベースの第１世代又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞、又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞を、Ｔ細胞生着を促進するため予め照射（４Ｇｙ）しておいた健常Ｃ５７ＢＬ６マウスの尾静脈に注射した。Ｔ細胞は、マーカーＣＤ４５．１を担持するＣ５７ＢＬ６コンジェニック系統（ＢｏｙＪ）に由来した。１マウス当たり２０００万個のＴ細胞（４００万個の操作されたＴ細胞が含まれる）を注入した。マウスを次の４５日間モニタし、目に見える毒性の徴候は見られなかった。（Ａ）この間、体重は正常に増加した。（Ｂ）週１回の尾採血では、注入したＣＤ４５．１＋  Ｔ細胞が注入後少なくとも５週間残存し、この間を通じてそれらが全循環Ｔ細胞プールの少なくとも３０％を占めたことが実証された（時間と共に宿主自身のＴ細胞が回復することに留意されたい）。（Ｃ）同じ試料をＣＤ３４並びにＣＤ４５．１に関して染色したところ、注入した全Ｔ細胞集団に対する操作した（ＣＤ３４＋）Ｔ細胞の割合が、この間、比較的一定のままであったことが実証された。（Ｄ）実験終了時、ＣＡＲで処置したマウスから脾細胞を採取し、免疫磁気ビーズ選択を用いてＣＤ３４＋細胞を単離した。これらの細胞を直ちにエキソビボで試験したところ、インターフェロンγ放出に関してＥＬＩＳＡによって計測したとき、それらがなおもヒトＣＬＥＣ１４Ａ及びマウスＣＬＥＣ１４Ａの両方に応答する能力を有したことが実証された。グラフＡ〜Ｃは、平均値＋ＳＥＭを示す。グラフＤは、平均値＋ＳＤを示す。
【図２４】ＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞を注射した健常Ｃ５７／ＢＬ６マウスを使用したインビボ毒性試験を示す。実験終了時にマウスを殺処分し、主要臓器を摘出した。組織学的検査により、病変のエビデンスがないことが明らかになった。
【図２５】ルイス肺癌腫瘍を担持するマウスに注射したときのＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞の抗腫瘍応答を示す。Ｃ５７ＢＬ６マウスにルイス肺癌細胞（１００万細胞／マウス）を皮下注射し、４日後、マウスは、Ｔ細胞生着を促進するための４Ｇｙ全身照射を受けた。次に、抗体ＣＲＴ３又はＣＲＴ５ベースの第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞、又はモック形質導入（対照）Ｔ細胞を尾静脈に注射した。マウスは、合計２０００万個のＴ細胞を投与され（ＣＤ８：ＣＤ４＝５：２）、これらの細胞のうちの２２０万個及び１４０万個にＣＲＴ３．２８ｚ及びＣＲＴ５．２８ｚが発現した。次に、（Ａ）生物発光又は（Ｂ）ノギスを用いて腫瘍成長をモニタした。
【図２６】ルイス肺癌腫瘍を担持するマウスに注射したときのＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞の抗腫瘍応答を示す。実験終了時に腫瘍を切除して秤量した（Ａ）。組織学的分析から、ＣＡＲで処置したマウスの腫瘍が有意な血管密度の低下（Ｂ、ＭＥＣＡ−３２に関して染色）及びより高レベルの血管漏出（Ｃ、フィブリノゲンに関して染色）を示したことが実証された。
【図２７】ＲｉｐＴａｇ２マウスに注射したときのＣＬＥＣ１４Ａ特異的ＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞の抗腫瘍応答を示す（ここで、ラットインスリンプロモーター（ＲＩＰ）がＳＶ４０ラージＴ抗原トランス遺伝子（ＴＡｇ）の発現を膵島のβ細胞に仕向ける）。約１０週齢で腫瘍が発生し、通常、約１４週齢までに動物は死亡する。ＣＲＴ５ベースの第２世代ＣＡＲを発現するマウスＴ細胞（又はモック形質導入対照細胞）を１０週齢のｒｉｐｔａｇ２マウスに注入した。モック処置のマウスは、１４週齢で殺処分し、腫瘍サイズを計測した。ＣＡＲで処置したマウスは、２週間後（１６週齢）に殺処分し、同様に腫瘍サイズを計測した。結果から、モック形質導入Ｔ細胞で処置した動物と比較して、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスでは、腫瘍サイズの極めて有意な阻害が実証された（Ａ）。また、試験の各々において１２匹のマウスを処置し、モック形質導入Ｔ細胞を投与されたマウスのうちの４匹は、１４週齢までに死亡したが、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスは、１２匹全てが１４週齢の時点で生存しており、それらのうちの２匹を除く全ては２週間後にもなお生存していたことから、何らかの生存利益のエビデンスもあった。データは個々のマウスの腫瘍サイズを示す。水平のラインは、平均腫瘍サイズ＋ＳＥＭを示す。未処置マウスには照射しなかったことに留意されたい。
【図２８】ＣＡＲ−Ｔ細胞の静脈内注射後４週間のＲＩＰ−Ｔａｇ２腫瘍の共焦点イメージングを示す。このイメージングは、ＣＤ３４＋（ＣＡＲ形質導入）Ｔ細胞が腫瘍に蓄積することを示す。
【図２９】ＣＡＲで操作した（又はモック操作した）Ｔ細胞によって処置したＲｉｐＴａｇ２腫瘍の組織学的分析を示す。図２９Ａは、内皮マーカーＭＥＣＡ３２染色によって示されるとおり、ＣＡＲ−Ｔ細胞処置腫瘍では血管密度が低下することを示す。図２９Ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞対モックＴ細胞で処置した腫瘍における血管密度の概要を示す。図２９Ｃ及び図２９Ｄは、カスパーゼ３染色によって示されるとおり、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスが腫瘍におけるアポトーシス性血管の増加を呈することを示す。図２９Ｅ及び図２９Ｆは、ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスが腫瘍血管構造におけるフィブリノゲン染色の減少を呈することを示す。
【図３０】腫瘍内におけるＣＬＥＣ１４Ａを発現した血管のパーセンテージを計算する、ヒト腫瘍組織アレイにおけるＣＬＥＣ１４Ａ発現の更なる特徴付けを示す。ｎ＝各癌型についての調べた症例の数。各症例を丸で表し、水平のラインは各癌型についての平均パーセンテージ値＋ＳＥＭを示す。
【図３１】ＣＲＴ４  ＣＡＲによるＴ細胞の形質導入を示す。
【図３２】第１及び世代ＣＲＴ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方がＣＬＥＣ１４Ａを発現するＣＨＯ細胞の細胞溶解を媒介できることを示す。
【図３３】第１世代及び第２世代ＣＲＴ−１  ＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞の増殖活性を示す。
【図３４】第１世代及び第２世代ＣＲＴ−１  ＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞の、ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現するＣＨＯ細胞に応答したインターフェロンγ放出活性を示す（ＣＨＯ細胞単独に対する応答を差し引いている）。データは、７つの反復実験から求めた平均ＩＦＮγ濃度（＋ＳＥＭ）を示す。
【図３５】第１世代及び第２世代ＣＲＴ−１  ＣＡＲコンストラクトを発現するＴ細胞の、ヒト又はマウスＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合タンパク質（又はＦｃタンパク質単独）に応答したインターフェロンγ放出活性を示す。
【図３６】ヒトＴ細胞へのレトロウイルスＴＣＲ遺伝子トランスファー及び形質導入後のヒトＰＢＭＣにおけるＴＣＲ発現を示す。抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−７及びＩＬ−２を使用して末梢血リンパ球活性化を行い、続いて３日後にレトロウイルスベクター（ＷＴ１に特異的なＴＣＲをコードする）によって形質導入した。６日目、ＴＣＲ−Ｖ−β２．１抗体を使用してＴＣＲ発現をモニタした。モック形質導入Ｔ細胞を使用して、Ｖ−β２．１を発現する未操作のヒトＴ細胞のパーセンテージが示された。形質導入後、ＣＤ８陰性及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方でＶ−β２．１細胞のパーセンテージが増加した。
【図３７】ＷＴ１２６ペプチドを提示するＴ２細胞によるＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の反復刺激により、Ｖ−β２．１を発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖が達成されることを示す。従って、ＣＤ８＋−Ｖｂ２．１＋  Ｔ細胞の増加は、抗原刺激後に起こる。
【図３８】ＨＬＡ−Ａ２／ｐＷＴ１２６四量体及びＴＣＲ形質導入Ｔ細胞が一緒に染色されることを示す。
【図３９】ＴＣＲを形質導入したＴ細胞が、ＷＴ１２６ペプチドを提示するＴ２細胞を死滅させることが可能であり、しかし、ｐＷＴ２３５ペプチドを提示するＴ２細胞を死滅させることができないことを示す。形質導入Ｔ細胞は、ＷＴ１を内因的に発現するＨＬＡ−Ａ２  ＢＶ１７３白血病細胞も更に死滅させる。従って、ＴＣＲ形質導入バルクＴ細胞は、ｐＷＴ１２６特異的死滅活性を示す。
【図４０】ＷＴ１２６ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞は、精製ＴＣＲ形質導入ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって死滅するが、ＷＴ２３５ペプチドで被覆されたＴ２細胞は死滅しないことを示す。更に、ＣＤ８陽性形質導入Ｔ細胞は、ＷＴ１を内因的に発現するＨＬＡ−Ａ２  ＢＶ１７３白血病細胞も死滅させる。従って、形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ｐＷＴ１２６特異的死滅活性を示す。（凡例  −  白抜きの四角＝Ｔ２＋ｐＷＴ２３５、塗り潰した菱形＝Ｔ２＋ｐＷＴ１２６、白抜きの丸＝ＢＶ１７３）。
【図４１】少量の精製ＣＤ４陽性形質導入Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ２／ｐＷＴ１２６四量体と一緒に染色されることを示す。
【図４２】ＷＴ１２６ペプチドを提示するＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞は、精製ＴＣＲ形質導入ＣＤ４陽性Ｔ細胞によって死滅するが、ＷＴ２３５ペプチドで被覆されたＴ２細胞は死滅しないことを示す。更に、ＣＤ４陽性形質導入Ｔ細胞は、ＷＴ１を内因的に発現するＨＬＡ−Ａ２  ＢＶ１７３白血病細胞も死滅させる。
【図４３】ＷＴ１２６で被覆されたＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞による刺激後の精製ＴＣＲ形質導入ＣＤ８陽性細胞によってＩＦＮ−γが産生され、しかし、ｐＷＴ２３５ペプチドで被覆された均等な細胞によって産生されないことを示す。ＩＦＮ−γは、ＷＴ１を内因的に発現するＨＬＡ−Ａ２陽性ＢＶ１７３白血病細胞による刺激後のＣＤ８陽性形質導入Ｔ細胞によっても産生される。従って、ＴＣＲ形質導入ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ｐＷＴ１２６特異的ＩＦＮγ産生を示す。
【図４４−１】ＣＲＴ５  ＣＡＲが腫瘍担持マウスの創傷皮膚の治癒を妨害しないことを示す。
【図４４−２】ＣＲＴ５  ＣＡＲが腫瘍担持マウスの創傷皮膚の治癒を妨害しないことを示す。
【図４５】対照（ｎ＝５）又はＣＲＴ５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメインを含む）発現細胞による処置後３週間のＰＤＡＣ腫瘍容積を示す。
【図４６】滴定濃度のヒト及びマウス組換えＣＬＥＣ１４Ａに対するＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメインを含む）Ｔ細胞応答を示す。
【図４７】種々の共刺激ドメインを含むＣＡＲをコードするコンストラクトの設計を示す；１）ｔＣＤ３４−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８  ＴＭ−ＣＤ２８シグナル−ＣＤ３ζ、２）ｔＣＤ３４−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ−ＣＤ８  ＴＭ−４−１ＢＢシグナル−ＣＤ３ζ、３）ｔＣＤ３４−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ−ＣＤ８  ＴＭ−ＯＸ４０シグナル−ＣＤ３ζ、４）ｔＣＤ３４−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８  ＴＭ−ＣＤ２８シグナル−４−１ＢＢシグナル−ＣＤ３ζ、５）ｔＣＤ３４−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ−ＣＤ２８  ＴＭ−ＣＤ２８シグナル−ＯＸ４０シグナル−ＣＤ３ζ、６）ｔＣＤ３４−Ｆ２Ａ−ｓｃＦｖ−ＣＤ８  ＴＭ−４−１ＢＢシグナル−ＯＸ４０シグナル−ＣＤ３ζ。ｔＣＤ３４は、形質導入に成功した細胞を同定するために含まれ、従ってコンストラクトではこれ及びＦ２Ａを除いてもよい。加えて、ヒンジ又はスペーサー領域、例えばＣＤ８α由来のものが含まれてもよい。
【図４８−１】ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ対ＣＬＥＣ１４Ａを発現するマウス内皮細胞による細胞傷害性アッセイの結果を示す（図４８Ａ）。ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲの増殖性アッセイの結果は、図４８Ｂに示される。
【図４８−２】ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ対ＣＬＥＣ１４Ａを発現するマウス内皮細胞による細胞傷害性アッセイの結果を示す（図４８Ａ）。ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲの増殖性アッセイの結果は、図４８Ｂに示される。
【図４８−３】ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ対ＣＬＥＣ１４Ａを発現するマウス内皮細胞による細胞傷害性アッセイの結果を示す（図４８Ａ）。ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲの増殖性アッセイの結果は、図４８Ｂに示される。
【図４８−４】ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ対ＣＬＥＣ１４Ａを発現するマウス内皮細胞による細胞傷害性アッセイの結果を示す（図４８Ａ）。ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲの増殖性アッセイの結果は、図４８Ｂに示される。
【図４９】種々の共刺激ドメインを含むＣＲＴ３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能試験及びヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現する滴定数のＣＨＯ細胞に応答したＩＦＮγ産生を示す。
【図５０】モック（ｎ＝５）又はＣＲＴ５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメイン）Ｔ細胞（ｎ＝８）による処置後３週間の同所性ＰＤＡＣ腫瘍容積を示す（ｐ＝０．０２２；マン・ホィットニー）。
【図５１−１】ＣＬＥＣ１４Ａキメラを発現するように操作した２９３細胞又はＳＥＮＤ細胞と共にインキュベートした後のＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメイン）Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出を示す（Ａ１−マウス細胞内ドメインを含むヒトＣＬＥＣ１４Ａ、Ｂ１−マウス膜貫通及び細胞内ドメインを含むヒトＣＬＥＣ１４Ａ、ｈｕＣＬＥＣ−ヒトＣＬＥＣ１４Ａ）。ＳＥＮＤ細胞とインキュベートした後のＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害性データは、図５１Ｂに示される。
【図５１−２】ＣＬＥＣ１４Ａキメラを発現するように操作した２９３細胞又はＳＥＮＤ細胞と共にインキュベートした後のＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメイン）Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出を示す（Ａ１−マウス細胞内ドメインを含むヒトＣＬＥＣ１４Ａ、Ｂ１−マウス膜貫通及び細胞内ドメインを含むヒトＣＬＥＣ１４Ａ、ｈｕＣＬＥＣ−ヒトＣＬＥＣ１４Ａ）。ＳＥＮＤ細胞とインキュベートした後のＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害性データは、図５１Ｂに示される。
【図５１−３】ＣＬＥＣ１４Ａキメラを発現するように操作した２９３細胞又はＳＥＮＤ細胞と共にインキュベートした後のＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメイン）Ｔ細胞によるＩＦＮγ放出を示す（Ａ１−マウス細胞内ドメインを含むヒトＣＬＥＣ１４Ａ、Ｂ１−マウス膜貫通及び細胞内ドメインを含むヒトＣＬＥＣ１４Ａ、ｈｕＣＬＥＣ−ヒトＣＬＥＣ１４Ａ）。ＳＥＮＤ細胞とインキュベートした後のＣＡＲ  Ｔ細胞についての細胞傷害性データは、図５１Ｂに示される。
【図５２】インビトロ転写による電気穿孔用のＲＮＡの生成に好適なベクターの概略図を示す。
【図５３】マウスＴ細胞の形質導入に使用することのできるＣＡＲをコードするコンストラクトを示す。これらのコンストラクトは、マウスタンパク質の膜貫通、共刺激及び細胞内シグナリング配列を含む（配列番号２２７〜２３２を参照されたい）。コンストラクトは、マウスＣＤ８αのヒンジ又はスペーサードメインを更に含んでもよい。
【発明を実施するための形態】
【０３１８】
【表１】
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【０３１９】
【表２】
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【０３２０】
【表３】
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【０３２１】
【表４】
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【０３２２】
【表５】
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【０３２３】
【表６】
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【０３２４】
【表７】
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【０３２５】
【表８】
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【０３２６】
【表９】
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【０３２７】
【表１０】
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【０３２８】
【表１１】
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【０３２９】
【表１２】
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【０３３０】
【表１３】
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【０３３１】
【表１４】
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【０３３２】
【表１５】
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【０３３３】
【表１６】
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【０３３４】
【表１７】
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【０３３５】
【表１８】
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【０３３６】
【表１９】
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【０３３７】
【表２０】
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【０３３８】
【表２１】
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【０３３９】
【表２２】
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【０３４０】
【表２３】
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【０３４１】
【表２４】
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【０３４２】
【表２５】
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【０３４３】
【表２６】
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【０３４４】
【表２７】
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【０３４５】
【表２８】
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【０３４６】
【表２９】
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【０３４７】
【表３０】
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【０３４８】
【表３１】
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【０３４９】
【表３２】
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【０３５０】
【表３３】
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【０３５１】
【表３４】
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【０３５２】
【表３５】
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【０３５３】
【表３６】
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【０３５４】
【表３７】
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【０３５５】
【表３８】
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【０３５６】
【表３９】
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【０３５７】
【表４０】
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【０３５８】
【表４１】
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【０３５９】
【表４２】
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【０３６０】
【表４３】
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【０３６１】
【表４４】
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【０３６２】
【表４５】
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【０３６３】
【表４６】
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【０３６４】
【表４７】
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【０３６５】
【表４８】
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【０３６６】
【表４９】
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【０３６７】
【表５０】
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【０３６８】
【表５１】
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【０３６９】
【表５２】
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【０３７０】
【表５３】
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【０３７１】
【表５４】
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【０３７２】
【表５５】
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【０３７３】
【表５６】
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【０３７４】
【表５７】
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【０３７５】
【表５８】
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【０３７６】
【表５９】
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【０３７７】
【表６０】
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【０３７８】
【表６１】
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【０３７９】
【表６２】
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【実施例】
【０３８０】
実施例
実施例１：ＣＬＥＣ１４Ａに関する実験研究
材料及び方法
ＨＵＶＥＣの調製及び培養
ドナーのインフォームドコンセントを得た上で英国国民保健サービス（National Health Service）によって供与された臍帯からヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離した。臍帯は、胎盤から解剖し、滅菌ＰＢＳで静脈を洗浄して血液を除去した。Ｍ１９９培地（Sigma）に希釈した１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを静脈注射し、次に３７℃で２０分間インキュベートして内皮細胞を剥離させた。１０％ＦＣＳ、１０％大血管内皮細胞成長添加物（TCS Cell Works）、及び４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＭ１９９完全培地で洗浄することによってＨＵＶＥＣを収集し、ブタ皮膚（Sigma）由来の０．１％タイプ１ゼラチンをコートしたディッシュにプレーティングした。
【０３８１】
初代細胞供給源
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＡＳＭＣ）及びヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥ）は、TCS Cell Worksから購入した。ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ５）は、英国癌研究所中央サービス（Cancer Research UK Central Services）から入手した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、バーミンガム大学の癌研究所（Institute of Cancer Studies）から入手した。ヘパトサイトは、バーミンガム大学免疫・感染学部（School of Immunity and Infection, University of Birmingham）のDavid Adams教授から供与いただいた。
【０３８２】
ＨＵＶＥＣ免疫蛍光法
ガラスマイクロウェルチャンバ（Nunc）内でＨＵＶＥＣを成長させて、氷冷メタノールで固定し、ＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳＴ中１０％ＦＣＳ３％ＢＳＡでブロックした。次に、パラフィン包埋切片に用いるのと同じプロトコルに従い細胞をＣＬＥＣ１４Ａ抗体で染色し、又はミラノのFirc分子腫瘍学研究所のMaria Grazia Lampugnani教授から供与いただいた、ヒトＶＥ−カドヘリンに対する５μｇ／ｍｌマウスモノクローナルＩｇＧ抗体と共染色した。切片染色を510レーザー走査共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）で分析した。
【０３８３】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体による引っ掻き傷治癒アッセイ
１０μｌピペットの先端でコンフルエントなＨＵＶＥＣに引っ掻き傷を付けた。ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対してマウス体内で産生された１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌのモノクローナルＣＬＥＣ１４Ａ抗体を含有する新しい培地を加えた。時点０、４、６、１２時間における創傷閉鎖の画像をLeica DM 1000光学顕微鏡及びUSB 2.0 2M Xliカメラで取得することにより、ＨＵＶＥＣの化学遊走性を評価した。Image Jソフトウェアを用いて創傷の開口面積を定量化した。
【０３８４】
パラフィン包埋組織に対する免疫蛍光法
英国癌研究所（Cancer Research UK）組織学サービスから入手したパラフィン包埋された正常及び癌ヒト組織コレクション並びに癌及び正常組織アレイ（Superbiochips）に対して免疫蛍光法を実施した（データは示さず）。以下の癌腫：胃癌、食道癌、肺癌、結腸／直腸癌、甲状腺癌及び腎癌の各々のコアを１０個含むヒトの一般的な癌１（ＭＡ２）、及び以下の癌腫：乳癌、肝癌、膀胱癌、卵巣癌、膵癌及び前立腺癌の各々のコアを１０個含む一般的な癌２（ＭＢ３）を使用した。対応する隣接正常組織の２つの追加的な対照アレイも分析した。パラフィンを除去した後、組織を再水和させ、クエン酸塩緩衝液ｐＨ６中、中程度の出力で電子レンジに３分間かけて抗原を回復させた。１０％ＦＣＳ及び３％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴで切片をブロックした。１０μｇ／ｍｌのヒトＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインに対するヒツジＩｇＧ一次ポリクローナル抗体（R&D system）及び１５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲートウサギＩｇＧ二次抗ヒツジポリクローナル抗体（Zymax）で切片をプローブした。ローダミン（Vector labs）とコンジュゲートしたハリエニシダ凝集素Ｉ（ＵＥＡＩ）２０μｇ／ｍｌで血管内皮細胞を染色した。ＤＡＰＩ（Invitrogen）を含有するprolong gold褪色防止試薬でスライドを永久的にマウントして細胞核を対比染色した。510レーザー走査共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を用いて切片染色を分析した。
【０３８５】
モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体の調製に使用した抗原は、任意選択でアジュバントタンパク質（ＡＰ）とコンジュゲートした、マウスＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（ＣＭ）及びヒトＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ（ＣＨ）であった。これらの４つの抗原（ＣＭ、ＣＨ、ＣＭ−ＡＰ、ＣＨ−ＡＰ）を、以下のプロトコルを用いたマウス免疫に使用した。
日数                                操作
０    免疫前試料を採取
完全フロイントアジュバント中１００ｕｇの抗原の免疫（足蹠）
１４  不完全フロイントアジュバント中１００ｕｇの抗原の免疫（足蹠）
１７  試験採決
１８  融合用の膝窩リンパ節採取
【０３８６】
血清は、３つの抗原：ＣＭ、ＣＨ及びＦｃに対してＥＬＩＳＡによって試験した。陰性対照として非免疫血清をとった。
【０３８７】
融合プロトコルは、以下のとおりであった：
（１）免疫マウスから膝窩リンパ節を採取し、ホモジナイズした。
（２）温かいＤＭＥＭで細胞を洗浄した。
（３）細胞をｓｐ２／０骨髄腫細胞と混合した。
（４）この混合物を遠心した（１０００ｇ）。
（５）このペレットを５０％ＰＥＧ１５００に懸濁し、１分間インキュベートした。
（６）この懸濁液を温かいＤＭＥＭでゆっくりと希釈した。
（７）懸濁液を遠心した（１０００ｇ）。
（８）細胞を腹膜マクロファージと共にプレートに播種した。
（９）細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
【０３８８】
各マウスから５００個超のＨＡＴ耐性ハイブリドーマクローンを得た。クローン上清は、全て３つの吸収された抗原（ＣＭ、ＣＨ及びＦｃ）に対するＥＬＩＳＡによって４日の間隔を置いて２回試験した。試験の結果、ＣＭ及びＣＨの両方と反応し、且つＦｃと反応しなかった５つのクローンが得られた（全てサブクラスＩｇＧ１）。全ての陽性を限界希釈法によって２〜４回クローニングし、培養フラスコ内で増殖させて、腹水のためマウスに注射した。ＣＬＥＣ１４ａヒト（ＣＨ）による免疫の結果として３つのクローンが得られ、１つのクローン（ＣＲＴ−３）はＣＬＥＣ１４ａヒト−ＡＰ（ＣＨ−ＡＰ）による免疫の結果であり、及び１つのクローン（ＣＲＴ−２）はＣＬＥＣ１４ａマウス−ＡＰ（ＣＭ−ＡＰ）による免疫の結果であった。
【０３８９】
細管形成アッセイ
ＨＵＶＥＣを２０μｇ／ｍｌのＣＲＴ２、ＣＲＴ３又はＣＲＴ４又はＩｇＧアイソタイプ対照で処置した。１６時間の時点で細管の画像を撮り、細管の全長、ジャンクションの数、分岐の数、分岐の長さ、網目の数及び網目の総面積について分析した。実験は３回繰り返し、各実験につき５つのデータ点を分析した。
【０３９０】
結果
図２は、ＨＵＶＥＣ及び他の初代細胞におけるＣＬＥＣ１４Ａの相対発現を示すグラフである。ＣＬＥＣ１４Ａは内皮細胞で特異的に発現した。これは、ＣＬＥＣ１４Ａが内皮特異的であるという本発明者らの以前の知見を裏付けている（Herbert et al, 2008）。
【０３９１】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体が血管新生を阻害する能力を調べた。モノクローナル抗体を用いて引っ掻き傷治癒アッセイを行った。図３に示すとおり、ＨＵＶＥＣを１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＣＲＴ−３で処置したとき、対照における１３％と比較して、１２時間の時点で創傷面積の２５％が開いたままであった。これらの結果は、ＣＬＥＣ１４Ａ抗体が内皮細胞遊走に対して阻害効果を有することを示している。内皮細胞遊走は、血管新生の本質的特徴である。従って、このアッセイは、ＣＬＥＣ１４Ａ抗体が血管新生を阻害することのエビデンスを提供する。
【０３９２】
更に、細管形成アッセイから、ＣＲＴ４による処置によって分岐の数及び全長が有意に増加したこと、及びＣＲＴ４は、１視野当たりの網目の数も有意に減少させたことが示された。これらの結果は、ＣＲＴ４がチューブ形成に影響を及ぼさないが、チューブの接続には影響を及ぼすことを示唆している。これは、細管があまりよく相互接続されないことの指標である分岐の数及び長さの増加によって明らかである。ＣＲＴ２及びＣＲＴ３処置では、細管長さ及びジャンクション数の有意な減少が生じ、ＣＲＴ２は、１視野当たりの網目面積も有意に減少させた。従って、これらのアッセイは、個別的なＣＬＥＣ１４Ａ抗体が血管新生を阻害する（チューブ形成に対して異なる効果を有することによるが）ことの更なるエビデンスを提供する。
【０３９３】
ＣＬＥＣ１４Ａ特異的プローブを用いて固形腫瘍及び正常組織の切片におけるＣＬＥＣ１４Ａの発現を調べた（データは示さず）。ＣＬＥＣ１４Ａ発現は、分析した全ての腫瘍組織の血管に見られた。卵巣、膀胱、肝臓、乳房、腎臓及び前立腺腫瘍はＣＬＥＣ１４Ａ発現が強陽性であった一方、胃、食道、肺、結腸、直腸、膵臓及び甲状腺腫瘍組織は、より低い特異的ＣＬＥＣ１４Ａ発現レベルを示した。対応する正常対照（非腫瘍）組織のいずれにもＣＬＥＣ１４Ａ発現は検出されなかった。従って、ＣＬＥＣ１４Ａは、腫瘍血管構造に特異的に発現することが実証されている。
【０３９４】
実施例２：ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合を遮断すると発芽血管新生及び腫瘍成長が阻害される
材料及び方法
試薬
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降用；一次抗体：ヒツジポリクローナル抗ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（R&D systems）、マウスモノクローナル抗ヒトチューブリン（Sigma）、マウスポリクローナル抗ヒトＭＭＲＮ２（Abnova）；二次抗体：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Dako）、ＨＲＰコンジュゲートロバポリクローナル抗ヒツジＩｇＧ（R&D systems）。免疫蛍光法用；一次抗体：ウサギポリクローナル抗マウスＰＥＣＡＭ（Santa Cruz）；二次抗体：Alexa Fluor488コンジュゲートロバポリクローナル抗ウサギ（Invitrogen）。フローサイトメトリー用；一次抗体：マウスモノクローナル抗ＨＡタグ（CRUK）、マウスモノクローナル抗ＣＬＥＣ１４Ａ（Ｃ２、Ｃ４、以下に記載）；二次抗体：Alexa Fluor488コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）。
【０３９５】
プラスミド
タンパク質産生用；レンチウイルスプラスミドpsPAX2（レンチウイルスパッケージング；Addgene）、pMD2G（エンベローププラスミド；Addgene）及びpWPI hCLEC14A-ECD-Fc（ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ含有レンチウイルス哺乳類発現プラスミド；Addgene）を使用した。clec14a IMAGEクローン（Origene）からpcDNA3-Fcプラスミドへの初期ＰＣＲサブクローニングによってpWPI hCLEC14A-Fc及びmCLEC14A-Fcを作成した。使用したプライマーは以下のとおりであった：ヒトＣＬＥＣ１４Ａフォワード５’ＴＡＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧＣＣＣＴＧ３’（配列番号４）；ヒトＣＬＥＣ１４Ａリバース−５’ＡＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＴ３’（配列番号５）；マウスＣＬＥＣ１４Ａフォワード−５’ＴＡＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧ３’（配列番号６；マウスＣＬＥＣ１４Ａリバース−５’ＣＴＡＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＴＧＴＣＧＡＡＡＧＴ３’（配列番号７）。ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１制限部位を用いてＣＬＥＣ１４Ａを挿入した。更なるＰＣＲサブクローニングラウンドを実施してＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合物をpWPIにトランスファーした。使用したプライマーは、以下のとおりであった：ヒトＣＬＥＣ１４Ａフォワード−５’ＴＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣ３’（配列番号８）；マウスＣＬＥＣ１４Ａフォワード−５’ＴＡＧＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＴＴ３’（配列番号９）；ヒトＦｃリバース−５’ＣＴＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ３’（配列番号１０）。このステップには、Ｐａｃ１及びＰｍｅ１制限部位を使用した。
【０３９６】
以下のプライマー：フォワード−ＣＣＧＧＡＣＣＧＧＴＣＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＣＣ（配列番号１１）；リバース−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣ（配列番号１２）を用いたmmrn2 IMAGEクローン（Thermo）からpHL-Avitag3へのＰＣＲクローニングによってＭＭＲＮ２哺乳類発現プラスミドを構築した。Ａｇｅ１及びＫｐｎ１制限酵素を使用した。
【０３９７】
細胞培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞を先述のとおり単離した。臍帯は、インフォームドコンセントを得てバーミンガム・ウィメンズ・ヘルスケア（Birmingham Women’s Health Care）ＮＨＳトラストから入手した。継代１〜６代目間のＨＵＶＥＣを使用し、１０％ウシ胎仔血清（PAA）、１％ウシ脳抽出物、９０μｇ／ｍｌヘパリン、及び４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）を含有するＭ１９９完全培地（ｃＭ１９９）で培養し、０．１％ブタ皮膚由来タイプ１ゼラチンでコートしたプレートに播種した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（PAA）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Invitrogen）を含有するＤＭＥＭ（Sigma）完全培地（ｃＤＭＥＭ）で培養した。
【０３９８】
ＨＵＶＥＣにおけるｓｉＲＮＡトランスフェクションを先述のとおり実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、上記のレンチウイルスパッケージング、エンベロープ及び発現プラスミドによる一過性トランスフェクションによりレンチウイルスを作製した。プラスミドをOptiMEM（Invitrogen）中においてポリエチレンイミン（３６μｇ／ｍｌ）と１：４の比において室温で１０分間インキュベートした後、ｃＤＭＥＭ中のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に加えた。培地上清を使用して新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した。ＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を選別し、タンパク質産生に使用した。pHL-Avitag3 hMMRN2を使用した上記のとおりのポリエチレンイミン一過性トランスフェクションにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＭＲＮ２の発現を実現した。
【０３９９】
定量的ＰＣＲ
High-Capacity cDNA Archiveキット（Applied Biosystems）を使用して、１μｇの抽出全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。RG-3000（Corbett/Qiagen、Manchester、英国）サーモサイクラーでExpress qPCR supermix（Invitrogen）を用いてｑＰＣＲ反応を実施した。ヒトｃｌｅｃ１４ａ及びフロチリン−２のプライマーは先述のとおりであった。マウスｃｌｅｃ１４ａ  ５’ＵＴＲ、ＣＤＳ及び３’ＵＴＲ並びにマウスβアクチンのプライマーは以下のとおりである：５’ＵＴＲフォワード−ＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＧＴＧ（配列番号１３）；５’ＵＴＲリバース−ＧＣＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＧＡＡＴ（配列番号１４）；ＣＤＳフォワード−ＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧ（配列番号１５；ＣＤＳリバース−ＴＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧ（配列番号１６）；３’ＵＴＲフォワード−ＣＴＧＴＡＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＡＣＴＴＴ（配列番号１７）；３’ＵＴＲリバース−ＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＴＣＴ（配列番号１８）；ｍＡＣＴＢフォワード−ＣＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＴＧＡＡＡＡＧ（配列番号１９）；ｍＡＣＴＢリバース−ＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号２０）。効率調整した数学的モデルに従い相対発現比を計算した。
【０４００】
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降
全細胞タンパク質ライセートを作製し、２×１０７個のＨＵＶＥＣからタンパク質を抽出したことを除き、先述のとおり共免疫沈降実験を実施した。ＣＬＥＣ１４Ａ相互作用タンパク質の初回の単離には、５μｇ  ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ又は等モル量のｈＦｃを使用した。内因性免疫沈降実験には、０．４μｇ  抗ＣＬＥＣ１４Ａ抗体又はヒツジＩｇＧを使用した。遮断実験には、５μｇ  ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ又はｈＦｃをＰＢＳ中でプロテインＧビーズに一晩結合させた。ビーズは２０％ＦＣＳ（PAA）含有ＰＢＳ中で５〜６時間ブロックした。結合したＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ又はｈＦｃタンパク質を結合緩衝液中の漸増濃度のｍＩｇＧ、Ｃ２又はＣ４で一晩ブロックした。次に、ＭＭＲＮ２トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのライセートをビーズ複合体と一晩インキュベートした後、洗浄し、ウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロッティング及びＳＤＳ−ＰＡＧＥには標準プロトコルを用いた。一次抗体は、対応するＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に本文中に指示するとおり使用した。
【０４０１】
フローサイトメトリー
細胞を細胞解離緩衝液（Invitrogen）で剥離し、ＰＢＳでリンスした後、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、３％ＢＳＡ、１％ＮａＮ３）中で１５分間インキュベートした。続いて、ブロッキング緩衝液中の１０μｇ／ｍｌ抗ＨＡタグ（CRUK）、一次抗体としての１０μｇ／ｍｌ抗ＣＬＥＣ１４Ａ（Ｃ２、Ｃ４、以下に記載する）を使用して３０分間染色した。細胞をＰＢＳでリンスし、ブロッキング緩衝液中のAlexa Fiuor488コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）で染色した。データ（１５，０００イベント／試料）はFACSCalibur装置（Becton Dickinson、オックスフォード、英国）を使用して収集し、結果はBecton Dickinson Cell Questソフトウェアで分析した。
【０４０２】
ＨＵＶＥＣスフェロイド発芽アッセイ及びインビトロマトリゲルチューブ形成アッセイ
ＨＵＶＥＣスフェロイドの作成及びコラーゲンゲルにおける内皮発芽の誘導を、スフェロイド当たり１０００個のＨＵＶＥＣを使用して先述のとおり実施した。包埋後１６時間で定量化を実施した。新芽成長を定量化するため新芽の数をカウントし、累積新芽長さ及び最大新芽長さを評価した。２色発芽実験のため、ＨＵＶＥＣをオレンジ色及び緑色のCellTracker色素（Invitrogen）で予め標識した。２４時間後、スフェロイドを４％ホルムアルデヒドで固定し、Vectorshield（Vector labs）でマウントした。Axioskop2顕微鏡及びAxioVision SE64 Rel4.8ソフトウェア（Zeiss、ケンブリッジ、英国）でスライドを画像化した。
【０４０３】
マトリゲルチューブ形成アッセイについて、１．４×１０５個のＨＵＶＥＣを１２ウェルプレート内の７０μｌ基底膜抽出物（Matrigel、BD Bioscience、オックスフォード、英国）に播種した。１６時間後、USB 2.0 2M Xliデジタルカメラ（XL Imaging LLC、キャロルトン、ＴＸ、米国）を備えたLeica DM IL顕微鏡（Leica、ミルトン・キーンズ、英国）を１０倍の倍率で使用して１ウェル当たり５視野の画像を撮った。ＮＩＨウェブサイト（(http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/Angiogenesis%20Analyzer.txt）で利用可能である、Image J用の血管新生アナライザープラグイン（Carpentier G. et al., Angiogenesis Analyzer for ImageJ. 4th ImageJ User and Developer Conference proceedings）で画像を分析した。
【０４０４】
タンパク質産生
ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養培地（ＣＭ）を回収した。ＣＭをHiTrapプロテインＡ  ＨＰカラム（GE healthcare、Amersham、英国）に流し、０〜１００％グラジエントの１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）を用いてタンパク質を溶出させた後、１Ｍ  トリス塩基で中和した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧ上で泳動させて、クーマシー染色及びウエスタンブロッティングによりタンパク質純度及び特異性に関して評価した。機能アッセイ前に、同様の濃度のタンパク質を含有する画分を合わせ、ＰＢＳで透析した。
【０４０５】
モノクローナル抗体作成
マウスモノクローナル抗体は、Serotec Ltd（オックスフォード、英国）により、本発明者らが提供したトレランスを破綻させるための以下のプロトコルを用いて商業的に調製された。精製マウスＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合タンパク質をフロイント完全アジュバント中５０μｇで皮下投与した。２週間後、マウスに更なる５０μｇを皮下投与したが、このときにはフロイントアジュバント中であった。マウスを殺処分し、２週間後の融合のため脾臓を摘出した。
【０４０６】
ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスの作成
マウスはバーミンガム生物医学サービスユニット（Birmingham Biomedical Services Unit）（Birmingham、英国）で飼育した。ＣＬＥＣ１４Ａ欠失カセットを含有するＣ５７ＢＬ／６N VGB6フィーダー依存胚性幹細胞（Clec14atm1(KOMP)Vlcg；プロジェクト番号ＶＧ１０５５４）をノックアウトマウスプロジェクト（Knockout Mouse Project）（カリフォルニア大学、Davis、米国）から調達した。バーミンガム大学のトランスジェニックマウス施設において胚性幹細胞をアルビノＣ５７ＢＬ／６マウスに注射することによってキメラマウスが作成され、Ｃ５７ＢＬ／６雌と交配することにより、カセットに関してヘテロ接合のマウスが作成された。動物管理は、適切を有した。
【０４０７】
内務省（Home Office）の承認及び許可
大動脈リング及びマウス皮下スポンジ血管新生アッセイ
大動脈を分離し、コラーゲン中での大動脈リングアッセイ用に処理した。管／新芽成長、最大内皮遊走及び全内皮成長を定量化した。マウス皮下スポンジ血管新生アッセイは、先述のものに少し変更を加えて実施した。０日目、雄Ｃ５７黒色マウスの各側腹部の背側皮下に皮下滅菌ポリエーテルスポンジディスク（１０×５×５ｍｍ）を植え込んだ。隔日で１４日間にわたり、皮膚から１００μｌ  ｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍｌ；R&D systems）をスポンジに直接注入した。１４日目にスポンジを摘出し、１０％ホルマリンで固定してパラフィン包埋した。切片をヘマトキシリン・エオシンで染色し、細胞侵入分析のため、USB 2.0 2M Xliデジタルカメラ（XL Imaging LLC、キャロルトン、ＴＸ、米国）を備えたLeica MZ 16顕微鏡（Leica、ミルトン・キーンズ、英国）を１倍の倍率で使用してスポンジ断面を撮った。Leica DM E顕微鏡（Leica、ミルトン・キーンズ、英国）によって４０倍の倍率で取得された画像を血管密度に関して分析した。１スポンジ当たり各切片につき５視野で血管カウントを評価した。全ての動物実験は、ＲＢが保有する内務省認可番号ＰＰＬ  ４０／３３３９に基づき行われた。
【０４０８】
腫瘍移植アッセイ
１０６個のルイス肺癌細胞を８〜１０週齢の雄マウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍成長を毎日ノギスで計測することによりモニタし、２〜４週間成長させた後、腫瘍質量を重量で決定し、４％ＰＦＡで固定し、パラフィン包埋して、６μｍの連続切片を切り出した。
【０４０９】
免疫蛍光法及びＸ−ｇａｌ染色
当該技術分野において公知の方法を用いて免疫蛍光染色及びＸ−Ｇａｌ染色を実施した。
【０４１０】
結果
ＣＬＥＣ１４Ａは、インビトロで発芽血管新生を調節する
ＣＬＥＣ１４Ａは、インビトロで内皮遊走及びチューブ形成に関与することがこれまでに示されている。インビトロでの発芽血管新生におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を調べるため、ｃｌｅｃ１４ａを標的とするｓｉＲＮＡ又は非相補的ｓｉＲＮＡ二重鎖で処置したＨＵＶＥＣからＨＵＶＥＣスフェロイドを作成した。ｃｌｅｃ１４ａ発現のノックダウンが、ｑＰＣＲによってｍＲＮＡレベルで（３つの実験で平均７４％の低下）（図５Ａ）、及び抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗血清でプローブしたタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によってタンパク質レベルで（図５Ｂ）確認された。ＣＬＥＣ１４ＡノックダウンスフェロイドからのＶＥＧＦ誘導性の発芽が妨げられ、ノックダウンスフェロイドは、スフェロイド当たり平均６．９個の新芽を生じ、それに対して対照細胞では１３．２個であった（図５Ｃ及び図５Ｄ）。先端／柄細胞形成におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を決定するため、対照ＨＵＶＥＣ及びノックダウンＨＵＶＥＣを赤色又は緑色のいずれかで染色して混合した後にスフェロイドを形成し、発芽を誘導した（図５Ｅ）。ＣＬＥＣ１４Ａのノックダウンにより、先端位置にある細胞の割合（３３％）は、対照細胞（６７％）と比較して減少したが、しかしながら、ＣＬＥＣ１４ＡノックダウンＨＵＶＥＣに由来した柄細胞の割合に何らの効果もなかった（図５Ｆ）。これらのデータは、ＣＬＥＣ１４Ａが新芽の惹起及び遊走において役割を有することを示唆している。
【０４１１】
ＣＬＥＣ１４Ａは、インビボで発芽血管新生を調節する
ＣＬＥＣ１４Ａに関する既発表のデータでは、インビトロで内皮生物学におけるその役割が実証されているが、しかしながら、そのインビボでの役割については依然として報告されていない。ＣＬＥＣ１４Ａのインビボ及びエキソビボでの役割を調べるため、マウスを作成してｃｌｅｃ１４ａコード配列をｌａｃＺレポーターに置き換えた（図６Ａ）。ヘテロ接合体（ｃｌｅｃ１４ａ  −／＋）の交配により、等しい割合の雄マウス及び雌マウス（それぞれ４９．５％／５０．５％）及び野生型：ヘテロ接合体：ホモ接合体マウス（それぞれ２６．４％：４７．２％：２６．４％）のメンデル比が生じた。ｃｌｅｃ１４ａは内皮限定遺伝子であるため、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋及びｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスから大動脈を分離した。抽出したｃＤＮＡをｑＰＣＲによって分析して、ｃｌｅｃ１４ａコード領域が欠損しているものの、５’及び３’非翻訳領域の発現は保持されていることが確認された（図６Ｂ）。タンパク質レベルでのＣＬＥＣ１４Ａの欠損も肺組織ライセートのウエスタンブロット分析によって確認された（図６Ｃ）。
【０４１２】
多細胞三次元共培養下での発芽血管新生におけるＣＬＥＣ１４Ａの役割を確認するため、大動脈を分離し、大動脈リングに切断し、コラーゲンに包埋した。ＶＥＧＦによって細胞成長を刺激し、７日間にわたってモニタした後、内皮発芽のエンドポイント定量化を行った。この場合にも、ＣＬＥＣ１４Ａの欠損によって内皮の新芽成長及び遊走が妨げられた（図６Ｄ）。野生型マウスの大動脈リングでは、ＣＬＥＣ１４Ａノックアウトマウスにおける観察と比較して２倍を超える数の管が生じた（それぞれ３０．６本の管に対して１３．４本の管）（図６Ｅ）。加えて、各大動脈リングから最も離れて遊走した距離によって定義される最大遊走量もノックアウト培養物では低下した（図６Ｆ）。ＣＬＥＣ１４Ａがインビボで同様の機能を有するかどうかを評価するため、ＣＬＥＣ１４Ａノックアウトマウスの皮下にスポンジバレルを植え込んだ。２週間にわたる２日毎のスポンジへのｂＦＧＦ注射を用いて細胞浸潤及び新血管新生を刺激した。ヘマトキシリン・エオシン染色したスポンジ切片の肉眼的分析により、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−動物ではスポンジへの細胞の浸潤が妨げられたことが明らかになった（図６Ｇ及び図６Ｈ）。加えて、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−動物について血管増生が有意に低下した（ｐ＜０．０１）（図６Ｉ）。このモデルにおいて血管新生によって生じた血管の内側を覆う内皮細胞がｃｌｅｃ１４ａを発現することを確認するため、ＣＬＥＣ１４Ａ  ＫＯマウスのスポンジ及び肝臓をｘ−ｇａｌで染色した。対応する肝切片と比較してスポンジ内の血管にｘ−ｇａｌ強染色が観察された（図６Ｊ）。これらのデータから、本発明者らは、マウスＣＬＥＣ１４Ａ発現がインビボで且つインビトロでも内皮遊走及び血管新生発芽を調節し、及び発芽内皮でＣＬＥＣ１４Ａが上方制御されると結論付けることができる。
【０４１３】
ＣＬＥＣ１４Ａは、腫瘍成長を促進する
ＣＬＥＣ１４Ａ発現は、健常組織の血管と比較してヒト腫瘍血管で高度に上方制御されることが認められ、ＣＬＥＣ１４Ａに対して癌療法を標的化し得ることが示唆される。従って、ＣＬＥＣ１４Ａの欠損が腫瘍成長に効果を及ぼすかどうかを調べるため、本発明者らは、同系ルイス肺癌（ＬＬＣ）モデルを使用した。そのため、１×１０６個のＬＬＣ細胞をｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋又はｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスのいずれかの右側腹部に皮下注射した。ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスでは、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋同腹仔と比較して腫瘍成長が低下した（図７Ａ）。これは、３つの独立した実験によって確認された。ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスから取った摘出腫瘍は、ｃｌｅｃ１４ａ  ＋／＋同腹仔と比べてサイズが小さく（図７Ｂ）、重量が軽かった（図７Ｃ）。これらの腫瘍内の血管密度も影響を受けたかどうかを決定するため、抗ＣＤ３１抗体で組織切片を染色した。分析によれば、個々の血管の密度の低下（図７Ｄ及び図７Ｅ）及びパーセンテージ内皮被覆率の低下（図７Ｆ）が示される。更には、ｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスから採取した腫瘍及び肝臓切片のｘ−ｇａｌ染色により、赤血球が充満した管腔を持つ成熟血管（図３Ｇ、黒色の矢印）と、腫瘍内の未熟微小血管（図７Ｇ、赤色の矢印）との両方におけるｃｌｅｃ１４ａの高発現が明らかであり、腫瘍血管でｃｌｅｃ１４ａが上方制御されることが確認される。
【０４１４】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用の同定及び確認
ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインの潜在的な結合パートナーを同定するため、本発明者らは、初めに、ヒトＦｃタグを付加したＣＬＥＣ１４Ａ細胞外ドメインタンパク質を精製した。このタンパク質又はＦｃ単独をＨＵＶＥＣ全細胞ライセートとインキュベートし、プロテインＡアガロースビーズを用いて沈降させた。次に、沈降したタンパク質を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧ上で分離した。７つのゲル領域を切り出し、消化し、質量分析法によって分析した。同定された最も豊富なタンパク質はＭＭＲＮ２で、１２個のペプチド（１１個がユニーク）があり、対応する対照プルダウン画分にはペプチドはなかった。沈降物のウエスタンブロット分析から、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−ＦｃプルダウンにおけるＭＭＲＮ２の存在が確認され、これは、Ｆｃ単独プルダウンには検出されなかった（図８Ａ）。この相互作用を更に確認するため、ＨＵＶＥＣ全細胞ライセートから内因性ＣＬＥＣ１４Ａを免疫沈降させた。ウエスタンブロット分析により、ＣＬＥＣ１４Ａ沈降物におけるＭＭＲＮ２共沈降が確認され、しかし、ＩｇＧ対照では検出されなかった（図８Ｂ）。
【０４１５】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体の開発及び検証
ＣＬＥＣ１４Ａに関する更なる我々の理解のため、本発明者らは、次に異種間反応性抗体を作製した。これを実現するため、ヒトＦｃタグを有するマウスＣＬＥＣ１４Ａタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現させて、プロテインＡカラムで精製した。次に、マウスを５０μｇの完全フロイントアジュバント含有ｍＣＬＥＣ１４Ａで免疫してトレランスを破綻させた。ヒトＣＬＥＣ１４Ａ又はヒトＦｃに対する活性に関してクローンをスクリーニングした。これらのクローンが細胞に結合したＣＬＥＣ１４Ａを認識し得ることを確認するため、ＨＡ−ＣＬＥＣ１４Ａを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をクローンＣ２若しくはＣ４又はモノクローナルＨＡタグ抗体で染色した。ＦＡＣｓ分析では、対照トランスフェクト細胞と比較して、ＨＡ−ＣＬＥＣ１４Ａ過剰発現細胞における抗体の各々について蛍光の増加が示される（データは示さず）。抗体が内因性型のＣＬＥＣ１４Ａを認識することを確認するため、対照又はｃｌｅｃ１４ａ標的化ｓｉＲＮＡで処置したＨＵＶＥＣをこれらのクローンを用いて染色した。対照ＨＵＶＥＣは、クローンＣ２及びＣ４によって強染色され、この染色は、ＣＬＥＣ１４Ａのノックダウンによりアイソタイプ対照レベルまで低下した（データは示さず）。これらの結果から、ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体の特異性が確認された。
【０４１６】
Ｃ２及びＣ４クローンがＣＬＥＣ１４Ａの同じ領域に結合するかどうかを決定するため、ＨＵＶＥＣをＢＳＡ、Ｃ２又はＣ４抗体で前処置した後、Ｃ２−ＦＩＴＣ染色した。Ｃ２インキュベーションによりＣ２−ＦＩＴＣ染色が有効に遮断されたが、Ｃ４は、ほとんど効果を有しなかった。同じ前処置を繰り返した後、Ｃ４−ＦＩＴＣ染色した。Ｃ２抗体は、Ｃ４−ＦＩＴＣ染色に影響を及ぼさなかったが、しかしながら、Ｃ４で前処置したＨＵＶＥＣはＣ４−ＦＩＴＣ結合の減少を示した。これらの結果から、本発明者らは、Ｃ２及びＣ４がＣＬＥＣ１４Ａの個別的な領域に結合すると結論付けることができる。
【０４１７】
ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体は、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２結合を遮断する
これらのＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体のいずれかがＭＭＲＮ２によるＣＬＥＣ１４Ａへの結合を阻害し得るかどうかを決定するため、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃを漸増濃度のｍＩｇＧ１、又はＣ２、又はＣ４とプレインキュベートした後、ＭＭＲＮ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのライセートとインキュベートした。次に、沈降物を分離し、ＭＭＲＮ２又はＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃに関してプローブした。ｍＩｇＧ１又はＣ２によって遮断したＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ沈降物についてＭＭＲＮ２結合が観察されたが、Ｃ４で遮断した沈降物ではＭＭＲＮ２結合は観察されなかった。このことから、Ｃ４モノクローナル抗体は、ＣＬＥＣ１４ＡへのＭＭＲＮ２結合を遮断するが、Ｃ２モノクローナル抗体を遮断しないことが確認される（データは示さず）。
【０４１８】
ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２遮断抗体は、腫瘍成長を阻害する
ＬＬＣ腫瘍を有するマウスに、実験の継続期間中、１０μｇ  Ｃ４又はｍＩｇＧ１（対照）を週２回腹腔内注射した。Ｃ４抗体で処置したマウスについて、対照ｍＩｇＧ１処置群と比較して腫瘍成長が減速した（図９Ａ）。Ｃ４処置マウスの腫瘍は、対照動物と比べてサイズ（図９Ｂ）及び重量（図９Ｃ）が小さかった。この場合にも、本発明者らは、これらの腫瘍内における血管密度を調べた。抗ＣＤ３１抗体で組織切片を染色し、蛍光分析から、個々の血管の密度（図９Ｄ及び図９Ｅ）及びパーセンテージ内皮被覆率（図９Ｆ）の低下が明らかになり、ＭＭＲＮ２へのＣＬＥＣ１４Ａ結合が腫瘍誘導性血管新生の重要な機能要素であることが示唆された。
【０４１９】
考察
ＣＬＥＣ１４Ａは、複数の腫瘍型で腫瘍血管新生に寄与する内皮遺伝子の小規模な群の１つである。ここで、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａの欠損によってインビボで腫瘍成長が阻害されることを実証する（図７）。ＴＥＭ８、エンドグリン、ガレクチン、ＥＬＴＤ１、及びエンドシアリンなど、他の腫瘍内皮マーカーについても同様の表現型が観察されており、これは、血管新生及び腫瘍成長におけるこれらの腫瘍内皮発現遺伝子の重要性を実証している。
【０４２０】
ヒト腫瘍及び膵癌及び子宮頸癌マウスモデルでＣＬＥＣ１４Ａの上方制御が観察されており、これは、ＬＬＣモデルにおいて腫瘍血管でｃｌｅｃ１４ａ発現が上方制御されるという知見を裏付けている（図７）。ＣＬＥＣ１４Ａは、接着、遊走、管形成を含め、内皮生物学の複数の側面を調節することが示されており、これらの結果は、それがインビトロ及びインビボでの発芽血管新生にも重要であることを示している（図５及び図６）。ＣＬＥＣ１４ＡノックダウンによってインビトロＨＵＶＥＣ発芽が乱れるため、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａのこの役割が内皮間相互作用又は内皮−細胞外マトリックス相互作用を介すると推論することができ、他の細胞型の存在は重要でないことが示唆される。本発明者らは、皮下スポンジアッセイにおいて、新血管新生によって生じた血管におけるｃｌｅｃ１４ａ発現の上方制御も初めて観察した（図６）。これは、新しく形成された内皮新芽が分岐点から新芽の先端までの４．２μｍから極めて低いずり応力（０．２Ｐａ）を受けることがモデル化されており、及びｃｌｅｃ１４ａ発現が低いずり応力によって上方制御されることが知られていることから予想される。
【０４２１】
ＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との相互作用は、ＣＬＥＣ１４Ａの細胞外ドメインを用いたＨＵＶＥＣライセートからのタンパク質のプルダウン、並びに内因性タンパク質の免疫共沈降によって示されている（図８）。ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体の作成及び検証を通じて、本発明者らは、ＣＬＥＣ１４Ａの個別的な領域に結合する２つの抗体を同定しており（Ｃ２及びＣ４）、Ｃ４クローンがＣＬＥＣ１４ＡとＭＭＲＮ２との相互作用を遮断するが、Ｃ２クローンを遮断しないことを示した。ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用の機能を調べるため、本発明者らは、マトリゲルチューブ形成アッセイにおいてＣ４抗体を使用し、分岐の増加及び網目発生の減少を見出した。更に、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用が腫瘍成長に重要であり（図９）、Ｃ４処置がｃｌｅｃ１４ａ  −／−マウスで見られるとおりの腫瘍成長を再現し、及び腫瘍血管増生を低下させることが見出された（図７）。本例では、リガンド又は活性様式は同定されなかったが、これは、ＣＬＥＣ１４Ａ及び特異的細胞外相互作用が腫瘍成長に重要であることを初めて明らかにしたものであり、新規抗血管新生療法へのこれまでの道を示唆している。
【０４２２】
実施例３  ＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ４及びＣ５は、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用を遮断する
いずれのＣＬＥＣ１４Ａモノクローナル抗体がＭＭＲＮ２によるＣＬＥＣ１４Ａへの結合を阻害し得るかを決定するため、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃを漸増濃度のｍＩｇＧ１又はＣＲ１〜５とプレインキュベートした後、ＭＭＲＮ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのライセートとインキュベートした。次に、沈降物を分離し、ＭＭＲＮ２又はＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃに関してプローブした。ｍＩｇＧ１又はＣ２及びＣ３で遮断したＣＬＥＣ１４Ａ−ＥＣＤ−Ｆｃ沈降物についてＭＭＲＮ２結合が観察されたが、Ｃ１、４及び５で遮断した沈降物ではＭＭＲＮ２結合は観察されなかった。このことから、抗体Ｃ１、４及び５が、Ｃ２及び３モノクローナル抗体が結合するのと異なるエピトープ上のＣＬＥＣ１４ａに結合し、従ってＣＬＥＣ１４ＡとのＭＭＲＮ２相互作用を特異的に遮断することが確認される。
【０４２３】
実施例４  ＭＭＲＮ２結合ドメインのマッピング及びＣＲＴ抗体
１）ＭＭＲＮ２は、ＣＴＬＤ又はＳｕｓｈｉドメイン又はＣＬＥＣ１４ａのいずれにも結合する
ＭＭＲＮ２によるＣＬＥＣ１４Ａへの結合は、ＣＬＥＣ１４ＡのＣＴＬＤ又はＳＵＳＨＩドメインに絞り込まれた。ドメイン欠失にＣＴＬＤ又はＳＵＳＨＩドメインが存在しない場合、ＣＬＥＣ１４Ａは正しく折り畳まれず、それがもはやＭＭＲＮ２（又はＣＲＴ抗体）に結合しなくなるものと思われる。これは、図１１に示すＭＭＲＮ２でファーウエスタンブロットしたＣＬＥＣ１４Ａの欠失コンストラクトを用いて見出された。
【０４２４】
２）ＣＲＴ抗体は、ＣＬＥＣのＣＴＬＤドメインに結合し、ＳＵＳＨＩには結合しない
ＣＴＬＤ又はＳＵＳＨＩが結合ドメインであったかどうかを更に決定するため、及び正しい折り畳みを確実にするため、ＣＴＬＤ又はＳＵＳＨＩドメインをトロンボモジュリン（ＣＤ１４１としても知られる）−ＭＭＲＮ２に結合しない１４型ＣＴＬＤファミリーメンバーのものとスワップしたＣＬＥＣ１４Ａのキメラコンストラクトを作製した。
【０４２５】
キメラ５（ＣＤ１４１のＣＴＬＤを有するＣＬＥＣ１４Ａ）及びキメラ６（ＣＤ１４１のＳＵＳＨＩを有するＣＬＥＣ１４Ａ）の配列を図１２に示す。
【０４２６】
ＣＲＴ抗体の結合を、フローサイトメトリーを用いて分析した。全てのコンストラクトがＣ末端ＧＦＰタグを有するため、緑色の細胞をゲーティングし、赤色で染色した。全てのＣＲＴ抗体は、ＷＴ  ＣＬＥＣ１４Ａと結合し、且つ  −  予想どおり  −  いずれもＷＴ  ＣＤ１４１に結合しない（図１３）。加えて、抗体は、いずれもキメラ５に結合せず（ＣＲＴ２による僅かな結合を除く）、及び全ての抗体がキメラ６に結合する（ＣＲＴ２を除く）（図１３）。このことから、抗体ＣＲＴ１、３、４及び５及びＭＭＲＮ２の結合部位がＣ型レクチンドメイン内にあることが確認される。ＣＲＴ２は、ＣＴＬＤとｓｕｓｈｉドメインとの間の領域で結合する可能性がある。
【０４２７】
３）ＭＭＲＮ相互作用を遮断するＣＲＴ抗体は、国際公開第２０１３／１８７７２４号に指定される領域には結合せず、ＣＬＥＣ１４ａ  ＣＴＬＤのａａ  ９７〜１０８を含む領域には結合する
抗体とＭＭＲＮ２との結合領域を更に決定するため、キメラループコンストラクトを作製した。これは、ＣＬＥＣ１４Ａ  ＣＴＬＤの構造予測と、また国際公開第２０１３／１８７７２４号の抗体が結合する領域とに基づいた。
【０４２８】
ＣＤ１４１の領域１〜４２を含むＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＤ１４１配列  −  ＭＬＧＶＬＶＬＧＡＬＡＬＡＧＬＧＦＰＡＰＡＥＰＱＰＧＧＳＱＣＶＥＨＤＣＦＡＬＹＰＧＰ（配列番号２１）
ＣＤ１４１の領域９７〜１０８を含むＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＤ１４１配列  −  ＱＬＰＰＧＣＧＤＰＫＲＬ（配列番号２２）
ＣＤ１４１の領域１２２〜１４２を含むＣＬＥＣ１４Ａ
ＣＤ１４１配列  −  ＴＳＹＳＲＷＡＲＬＤＬＮＧＡＰＬＣＧＰＬ（配列番号２３）。
【０４２９】
アラインメントを図１２に示す。残念ながら、１〜４２及び１２２〜１４２キメラは正しく折り畳まれなかった。これは、それらが細胞表面上に存在することに起因するものと思われる（ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体に関して染色陽性、しかし、これらは、Ｃ抗体のいずれに関しても、更にはＣ２さえも染色されない。
【０４３０】
しかしながら、９７〜１０８キメラは、Ｃ２及びＣ３と結合し、この突然変異体が正しく折り畳まれることを示す。この突然変異体は、ＭＭＲＮ２又はＣ１、４又は５（これらは、ＣＬＥＣ１４Ａ−ＭＭＲＮ２相互作用を遮断するものと思われる抗体である）とは結合しない（図１５）。従って、本発明者らは、結合ドメインが以下の残基：ＥＲＲＲＳＣＨＴＬＥＮＥ（配列番号２４）を含有するループに依存するものと結論付ける。
【０４３１】
残基９７〜１０８をトロンボモジュリンの対応する領域とスワップした。この結果、Ｃ２及びＣ３がなおも結合できるように正しい折り畳みが生じた（図１６）。しかしながら、Ｃ１、Ｃ４及びＣ５は、この突然変異体を認識することができず、これが結合領域であることが示唆される。
【０４３２】
この実験を３回繰り返し、同じ結果が得られた。
【０４３３】
実施例５  −  抗体薬物コンジュゲート腫瘍データ
６〜８週齢の野生型雄Ｃ５７ＢＬ６マウスの右側腹部に１×１０＾６個のルイス肺癌（ＬＬＣ）細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能なサイズに達したところでマウスを各処置群Ｂ１２−ＡＤＣ、又はＣ４−ＡＤＣ／ＣＲＴ３−ＡＤＣに無作為に割り付けた。マウスに、１週間の間を置いて２回、１ｍｇ／ｋｇの静脈内注射を尾静脈投与した。最終回の注射から１週間後、マウスを殺処分し、腫瘍を摘出して湿重量を計測した。データを図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。
【０４３４】
ＨＵＶＥＣをＣＲＴ−３  ＡＤＣで処置し、蛍光イメージングを実施して０及び９０分後のＣＲＴ−３の局在化を決定した。結果を図１８Ａに示す。更に、Cell Titre Glo発光細胞生存アッセイを用いて細胞傷害性を計測しており、結果を図１８Ｂに示す。上記に記載したとおり、１００万個のルイス肺癌細胞を２匹のマウスの右側腹部に皮下注射し、目に見えるサイズまで成長させた。１ｍｇ／ｋｇのＣＲＴ−３−ＡＤＣ又はＢ１２−ＡＤＣ（対照）を尾静脈注射によって投与した。マウスを１時間観察し、２４時間後に殺処分した。
【０４３５】
結果
図１８Ａに示す結果は、ＣＲＴ３−ＡＤＣがインターナライズされることを実証している。ＣＲＴ３−ＡＤＣで２４時間にわたって更に処置したが、マウスの全般的な健康に何ら効果を及ぼさなかった。腫瘍部位における広範な出血がＣＲＴ３−ＡＤＣ処置マウスにおいてのみ観察され、対照では観察されず、血管新生の腫瘍特異的破壊が実証される。
【０４３６】
実施例６  −  ＣＡＲの構築及び実験
材料及び方法
ＣＡＲコンストラクトの作成
ヒト型及びマウス型のタンパク質と交差反応するＣＬＥＣ１４Ａ特異的モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを、Noy et al（Blocking CLEC14A-MMRN2 binding inhibits sprouting angiogenesis and tumour growth. Oncogene. 2015）に記載されるとおり入手した。次に、マウスハイブリドーマの各々から、Hawkins et al（Idiotypic vaccination against human B-cell lymphoma. Rescue of variable region gene sequences from biopsy material for assembly as single-chain Fv personal vaccines. Blood. 1994;83(11):3279-88に以前に記載されたとおり、あらゆるマウスＶ遺伝子ファミリーを増幅するように設計された縮重プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、ｓｃＦｖをコードする遺伝子コンストラクトを単離した。
【０４３７】
次に、以前に記載されている２つのＣＡＲベクターｐＭＰ７１．ｔＣＤ３４．２Ａ．ＣＤ１９ζ及びｐＭＰ７１．ｔＣＤ３４．２Ａ．ＣＤ１９．ＩＥＶζ（Cheadle et al, J.Immunol., 2014, 192(8), 3654-65）にClaI、NotI断片としてｓｃＦｖ遺伝子をサブクローニングして、ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ領域を置き換えた。これらのベクターは、当初、ＭＰ７１レトロウイルス発現プラスミド（C. Baum、Hannoverからの供与）を用いて構築されたものであり、トランケート型ＣＤ３４マーカー遺伝子を共発現した（Fehse et al, Mol Ther., 2000;1C5 Pt 1: 448-56）。
【０４３８】
ヒト及びマウスＴ細胞の形質導入
ヒトＴ細胞の形質導入用の組換えレトロウイルスを作成するため、FuGENE HD（Roche）を製造者の指示に従い使用してPhoenixアンホトロピックパッケージング細胞にＭＰ７１レトロウイルスベクター及びpCL ampho（Imgenex）をトランスフェクトした。マウスＴ細胞の形質導入用の組換えレトロウイルスを同じように、但しPhoenixエコトロピックパッケージング細胞及びpCL ecoを使用して作成した。lymphoprep（Axis Shield、オスロ、ノルウェイ）でヘパリン添加血液から密度勾配遠心法によってヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。標準培地（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；PAA、Pasching Austria）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０（Sigma））＋１％ヒトＡＢ血清（TCS Biosciences、バッキンガム、英国）を使用して、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、eBioscience；３０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８抗体（R&D Systems；３０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン−２（ＩＬ２；３００Ｕ／ｍｌ；Chiron、エメリービル、ＣＡ）を使用してＰＢＭＣを予め４８時間活性化させた。マウスＴ細胞の形質導入は、標準培地中のコンカナバリンＡ（２ｕｇ／ｍｌ；Sigma）及びマウスインターロイキン７（１ｎｇ／ｍｌ；eBioscience）で予め４８時間活性化させたマウス脾細胞を使用して行った。予め活性化させたヒト及びマウスＴ細胞を、続いて製造者の指示に従いretronectin（Takara）をコートしたプレートにおいてスピンフェクションにより形質導入した（又は非トランスフェクトphoenix細胞からの馴化上清でモック形質導入した）。次に、ヒトＴ細胞をＩＬ２（１００Ｕ／ｍｌ）含有標準培地＋１％ヒトＡＢ血清中で培養した。スピンフェクション後、マウスＴ細胞は、ＩＬ２（１００Ｕ／ｍｌ）含有標準培地で２４時間培養し、次にlymphoprep（Axis Shield）を使用して精製した。指示がある場合、形質導入細胞は、抗ＣＤ３４マイクロビーズ（Miltenyi Biotec、独国）を製造者の指示に従い使用して免疫磁気分離法によりエンリッチした。ヒトドナーによる研究は国立研究倫理局委員会ウェストミッドランド州（National Research Ethics Service Committee West Midlands）（Solihull）によって承認されたものであり、全てのドナーから書面によるインフォームドコンセントを得た。
【０４３９】
細胞株及び組換えタンパク質
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；PAA、Pasching Austria）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００ｐｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にPhoenix A又はE、ＣＨＯ及びルイス肺癌細胞を維持した。ＣＨＯ細胞は、完全長ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現するpWPIベクター（Addgene）（又はベクター単独）を形質導入したものであった。先述のとおり、インフォームドコンセント及びサウスバーミンガム研究倫理委員会の倫理承認を得た上でバーミンガム・ウィメンズ・ヘルスケアＮＨＳトラストから入手した臍帯を使用してヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を単離した。ＨＵＶＥＣは、１０％ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％大血管内皮細胞成長添加物（TCS Cellworks）を含有するＭ１９９完全培地に維持し、０．１％ブタ皮膚由来タイプ１ゼラチン（Sigma）をコートしたプレートにおいて培養した。ヒトＦｃタグを有するヒト及びマウスＣＬＥＣ１４Ａタンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させて、Noy et al（前掲）に記載されるとおりプロテインＡカラムで精製した。
【０４４０】
ＣＬＥＣ１４ＡのＳｉＲＮＡノックダウン
ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションを、以前に記載されているとおり（Armstrong et al, Arteriosclerosis, thrombosis and vascular biology, 2008, 28(9): 1640-6）、以下のｓｉＲＮＡ二重鎖：Ｄ１−ＧＡＡＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＧＴＡＡ（配列番号３０）及びＤ２−ＣＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＡＡ（配列番号３１）（EuroGentec、リエージュ、ベルギー）を使用して実施した。
【０４４１】
フローサイトメトリー
ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、５％正常ヤギ血清／ＰＢＳ中の上記に記載したＣＬＥＣ１４Ａ特異的マウスモノクローナル抗体（１０ｕｇ／ｍｌ）又はＩｇＧ１アイソタイプ対照（Dako）によって氷上で１時間染色した。細胞を洗浄し、Ｒ−ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Serotec）とインキュベートすることにより結合抗体を検出した。ヨウ化プロピジウムで染色することにより死細胞を同定した。ヒトＴ細胞をＰＢＳで洗浄し、Live/Dead Fixable Violet死細胞染色キット（Life Technologies）によって暗所下２０分間染色した。次に、細胞をフロー緩衝液（ＰＢＳ中０．５％ｗ／ｖ  ＢＳＡ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．２）で洗浄し、抗ヒトＣＤ４（ＰＥコンジュゲート）、抗ヒトＣＤ８（ＦＩＴＣコンジュゲート）（全てBD Pharmingenから）及び抗ヒトＣＤ３４（Ｐｅ−Ｃｙ５）（BioLegend）によって暗所下氷上で３０分間染色した。代替的に、ＣＤ３４に関して染色するのでなく、むしろ、初めに細胞をヒトＦｃ断片（１０ｕｇ／ｍｌ）でブロックし、次にそれらの細胞を１０ｕｇ／ｍｌ組換えヒトＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合タンパク質（又はＦｃ対照）と共に、続いてヒツジ抗ＣＬＥＣ１４Ａポリクローナル抗体（R&D systems、１０ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートすることにより、ＣＡＲ発現を直接検出した。最後に細胞をＦＩＴＣコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体（Invitrogen、１：１０希釈）によって染色した。インキュベーションは、全て氷上で１時間行った。
【０４４２】
ヘパリン添加尾採血からのマウスＴ細胞を染色する場合、それらは、初めにBD Pharm lyse（Becton Dickinson）を使用して赤血球溶解に供してから上記に記載したとおり染色し、但し抗マウスＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ及びＣＤ４５．１（ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート）（全てBD Biosciences）を使用した。細胞は、BD LSR IIフローサイトメーター及びFlowJoソフトウェア（TreeStar Inc、アシュランド、ＯＲ）を使用して分析した。
【０４４３】
ＣＦＳＥ標識
Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２．５μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と３７℃で１０分間インキュベートした。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０を加えることにより標識反応をクエンチした。細胞を洗浄し、標準培地＋１％ヒトＡＢ血清及びＩＬ２（１０ＩＵ／ｍｌ）に１．５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、１０：１のＴ細胞：ＨＵＶＥＣ比が得られるようにＨＵＶＥＣが入ったウェルに加えた。３７℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした後、細胞を上記に記載したとおり抗ヒトＣＤ３４（Ｐｅ−Ｃｙ５）を用いたフローサイトメトリーによって分析した。
【０４４４】
ＩＦＮγ放出アッセイ
刺激細胞（２．５×１０４／ウェル）をＣＤ３４＋  ＣＡＲ−Ｔ細胞と指示する応答細胞：刺激細胞比においてトリプリケートで共培養した。代替的に、組換えタンパク質（１ｕｇ／ｍｌ）をプレコートしたウェルにおいて２×１０４個のＣＤ３４＋  ＣＡＲ−Ｔ細胞をインキュベートした。ＩＬ２（２５Ｕ／ｍｌ）を補足した１００μｌ／ウェルの標準培地中、３７℃／５％ＣＯ２で細胞をインキュベートした。１８時間後、ＥＬＩＳＡ（Pierce Endogen、ロックフォード、ＩＬ）を製造者の指示に従い用いて培養上清を分泌ＩＦＮγに関して試験した。
【０４４５】
細胞傷害性アッセイ
クロム遊離アッセイについては、以前詳細に記載されている。このアッセイを既知のエフェクター：標的比（１２５０標的／ウェル）でセットアップし、７．５時間後に回収した。
【０４４６】
インビボ実験
毒性試験
６〜８週齢Ｃ５７ＢＬ６マウス（Charles River Laboratories）に４Ｇｙの全身照射（ＴＢＩ）を行った。１８時間後、各マウスに、ＣＤ４５．１＋コンジェニックＢｏｙＪマウスからの２×１０７個のＣＡＲ形質導入又はモック形質導入Ｔ細胞調製物を尾静脈注射した。毒性の徴候に関してマウスをモニタし、及び週１回の尾採血によって免疫モニタリングを行った。マウスは、最終的に４５日後に殺処分し、組織学的分析のため主要臓器を摘出した。
【０４４７】
ＲｉｐＴａｇ２トランスジェニックマウス腫瘍モデル
膵島細胞発癌モデルとしてのＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスの作成については、以前報告されている（Hanahan et al, Nature, 1985, 315 (6015), 115-122）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド（The Jackson Laboratory）でＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスを維持した。凍結保存したＣＡＲ形質導入及びモック形質導入Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、前日に４Ｇｙ  ＴＢＩでコンディショニングしておいた１２週齢のマウスに１５００万Ｔ細胞／マウスを一度に尾静脈に静脈内注射した。１２週齢から、全てのＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスに５０％糖分食（Harlan Teklad）を摂らせて、インスリン分泌腫瘍によって誘導される低血糖を軽減した。殺処分したＣＡＲ−Ｔ細胞処置マウスの全腫瘍量を、１６週齢でノギスを使用して定量化して、個別に摘出した肉眼的腫瘍（＞１ｍｍ３）を、式：容積＝ａ×ｂ２×０．５２（式中、ａ及びｂは、腫瘍のそれぞれ長い方の直径及び短い方の直径を表す）を用いて計測した。各マウスの全ての腫瘍の容積を加えて動物１匹当たりの総腫瘍量を求めた。未処置ＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスが１６週まで生存しないため、１６週ＣＡＲ処置マウスの年齢対応対照比較はなく、従って、比較は、１４週齢モック処置マウスと行った。
【０４４８】
ルイス肺癌（ＬＬＣ）マウスモデル
６〜８週齢雌Ｃ５７ＢＬ６マウスの側腹部に１０６個のＬＬＣ細胞を皮下接種した。３日後、マウスは、４Ｇｙ  ＴＢＩを受け、その１８時間後、各マウスにＣＤ４５．１＋コンジェニックＢｏｙＪマウスからの２×１０７個のＣＡＲ又はモックＴ細胞調製物を尾静脈注射した。ノギス（式：容積＝長さ×幅２×０．５を使用）及び生物発光イメージング（IVIS Spectrum、Caliper Life Sciences）によって腫瘍成長を計測した。週１回の尾採血により免疫モニタリングを行った。
【０４４９】
ＲｉｐＴａｇ２マウスを用いた手順は、全て国際法及び方針に準じてトリノ大学の倫理委員会及びイタリア保健省（Ministry of Health）によって承認されたものである。他の全てのマウス研究は適切な英国内務省の承認を得て実施した。
【０４５０】
組織調製及び免疫蛍光分析
マウス実験からの組織をＯＣＴ（Bio Optica）に包埋し、ドライアイスで凍結して−８０℃で保存した。組織調製及び組織学的分析は、以下の一次抗体を用いて記載のとおり（２４）行った：精製ラットモノクローナル抗汎内皮細胞抗原（550563、クローンMeca32、BD Pharmingen、米国）、１：１００希釈；ウサギモノクローナル抗切断型カスパーゼ３（asp175、クローン5A1、Cell Signaling、米国）、１：１００希釈；ウサギポリクローナル抗フィブリノゲン（A0080、Dako）、１：１００希釈；及びウサギモノクローナル抗ＣＤ３４（ab174720、Abcam）１：５０希釈；ヒツジポリクローナル抗ＣＬＥＣ１４Ａ（AF4968、R&D）１：５０希釈。インキュベートして洗浄した後、試料を二次抗体抗ウサギAlexa Fluor-488及びAlexa Fluor-555；抗ラットAlexa Fluor-488及びAlexa Fluor-555；及び抗ヒツジAlexa Fluor-488（Molecular Probes）とインキュベートし、ＤＡＰＩ核酸染色（Invitrogen）で対比染色した。ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞を検出するため、ＰＢＳ中に１：５０希釈したウサギモノクローナル抗ＣＤ３４（ab174720、Abcam）で組織を染色した。インキュベートして洗浄した後、試料を抗ウサギAlexa Fluor-555（Molecular Probes）で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。
【０４５１】
ヒト腫瘍組織アレイ（SuperBiochips Inc.、ソウル、韓国）を１：２０希釈のヒツジポリクローナル抗ＣＬＥＣ１４Ａ（AF4968、R&D systems）及びローダミンにコンジュゲートしたハリエニシダ（Ulex europaeus）凝集素Ｉ（Vectorlabs、英国）を用いて１時間、続いて抗ヒツジＦＩＴＣ抗体（１０μｇ／ｍｌ、Invitrogen、英国）を用いて染色した。
【０４５２】
ＲｉｐＴａｇ２腫瘍組織の分析のため、血管が占有する表面積を、Meca32陽性構造が占有する面積としてImageJソフトウェアによって定量化し、ＤＡＰＩによって可視化された総組織面積と比較した。各動物につき少なくとも４視野／画像の総血管面積を定量化した。各画像におけるフィブリノゲン溢出量（赤色のチャンネル）を決定するため、本発明者らは、各血管（Meca32、緑色チャンネル）の近くに関心領域（ＲＯＩ）を描き、次にLeica共焦点ソフトウェアヒストグラム定量化ツール（Confocal Software Histogram Quantification Tool）を使用して赤色及び緑色チャンネルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量化した。得られた血管本数の値を正規化するため、本発明者らは、赤色チャンネルＭＦＩと緑色チャンネルＭＦＩとの比を計算した。値は、赤色−緑色共染色に対するパーセンテージとして表す。各分析画像におけるカスパーゼ３（緑色チャンネル）の発現レベルを決定するため、本発明者らは、同じサイズの５つのランダムなＲＯＩを検討した。次に、本発明者らは、緑色チャンネルのＭＦＩを計測し、及び本発明者らは、カスパーゼ３染色面積を組織範囲に存在する全細胞と比較することにより値を正規化した。各試料につき、１処置群当たり５匹のマウスの少なくとも１０画像を分析した。Leica TCS SP2 AOBS共焦点レーザー走査型顕微鏡（Leica Microsystems）を使用してＲｉｐＴａｇ２マウスからの組織を分析した。他の全ての組織は、Axiovert 100Mレーザー走査型共焦点顕微鏡（Carl Zeiss、ウェリン・ガーデン・シティ、英国）を使用して分析した。
【０４５３】
統計分析
データの統計分析は、指示する検定及びGraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。ｐ値＜０．０５を有意と見なした。
【０４５４】
結果
ＣＲＴ１、３、４、及び５を使用してＣＡＲコンストラクトの作製に成功し、細胞上でのこれらのＣＡＲコンストラクトの発現が実証された（図１９Ｂ及び図１９Ｃ、図２２及び図３１を参照されたい）。従って、トランケート型ＣＤ３４マーカー遺伝子及びｓｃＦｖ断片／ＣＤ３ζ鎖キメラ受容体を共発現するレトロウイルスＣＡＲベクター（ｐＭＰ７１ベース）が作成された。発現はＬＴＲプロモーターからドライブされ、２ＡペプチドリンカーがＣＤ３４とＣＡＲとの両方の等モル発現を確実にする。第２世代ＣＡＲコンストラクトはＣＤ２８共刺激ドメインを含んだ。図１９Ｂに示されるとおり、ＣＤ３４染色は、ＣＲＴ３及び５（両方とも第１及び第２世代）を含むベクターによるＴ細胞の形質導入の成功を示している。ＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃを用いてＣＡＲの発現に関して直接染色した細胞についても同様の結果が見られる（％値は、Ｆｃ単独によるバックグラウンド染色を差し引いたＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃの特異的結合を示す）。
【０４５５】
更に、図２０におけるデータは、抗体ＣＲＴ３又は５ベースの第１又は第２世代ＣＡＲを発現するように形質導入したＴ細胞がインビトロでＣＬＥＣ１４Ａに応答できることを示している。結果は、プレート結合タンパク質、操作されたＣＨＯ細胞上に発現したか又はＨＵＶＥＣに発現したタンパク質について示され、ここで、３つの実験全てにおいて、ＣＡＲを形質導入したＴ細胞によるＣＬＥＣ１４Ａの存在に応答したＩＦＮγ産生が見られる。
【０４５６】
抗体ＣＲＴ３及び５ベースのＣＡＲについて、ＣＨＯ  ＣＬＥＣ１４Ａ発現細胞において細胞傷害性を誘導するその能力を試験し（図２１Ａ）、ここで、ＣＡＲ  ＣＲＴ３／５を有するＴ細胞に曝露した細胞において％特異的溶解の増加が見られる。更に、ＨＵＶＥＣと培養したときのＣＤ３４＋  Ｔ細胞の増殖は、ＣＲＴ３及び５  第１及び第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方がかかる培養条件下で（即ち、ＣＬＥＣ１４Ａを発現するＨＵＶＥＣへの曝露に起因して）増殖することを示している。従って、ＣＲＴ３／５  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＬＥＣ１４Ａ発現細胞に応答可能であり、Ｔ細胞の増殖及び細胞の特異的溶解をもたらす。
【０４５７】
ＣＲＴ１抗体ベースのＣＡＲも、ＣＬＥＣ１４Ａを発現する標的に対して活性を示す。詳細には、第２世代ＣＲＴ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＬＥＣ１４Ａを発現するように操作したＣＨＯ細胞及びＨＵＶＥＣに発現するＣＬＥＣ１４Ａに応答することが示された（ＩＦＮγ放出によって計測した）。更に、第１及び第２世代ＣＲＴ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＨＯ  ＣＬＥＣ１４Ａ発現細胞において特異的溶解を誘導することが示された（図２２を参照されたい）。図３２〜図３５は、ＣＲＴ１−ＣＡＲを形質導入したときのＣＬＥＣ１４Ａに対するＴ細胞応答及びかかる形質導入Ｔ細胞によって誘導された％溶解を更に示す。
【０４５８】
第１又は第２世代ＣＲＴ３及び５  ＣＡＲ  Ｔ細胞をＣ５７／ＢＬ６マウスに注射して健常なマウスに対するＣＡＲ  Ｔ細胞の毒性を決定した。マウスを４５日間モニタし、目に見える毒性の徴候は見られなかった。図２３は、この間にマウスの体重が増加したことを示し、週１回の尾採血は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が注射後少なくとも５週間残存したこと、及びこの間、それらが全循環Ｔ細胞集団の少なくとも３０％を占めたことを示している。実験終了時に採取した脾細胞は、なおもＣＬＥＣ１４Ａ（マウス及びヒトの両方）に応答する能力を有した。更に、図２４に示されるとおり、幾つかの組織（脳、心臓、肺、肝臓、結腸及び腎臓）の組織学的分析から、第２世代ＣＲＴ３／５  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入したマウスに関して病変は示されなかった。
【０４５９】
１００万個のルイス肺癌細胞を予め注射しておいたＣ５７ＢＬ６マウスにおいて、ＣＲＴ３又はＣＲＴ５抗体ベースの第２世代ＣＡＲの抗腫瘍効果を試験した。ＣＡＲコンストラクトを形質導入したＴ細胞をマウスの尾静脈に注射し（２０００万個のＴ細胞）、腫瘍成長をモニタした。図２５から分かるとおり、ＣＲＴ３又はＣＲＴ５のいずれの第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射したマウスも対照マウスより小さい容積の腫瘍を有し、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞の抗腫瘍効果が実証された。更に、図２６は、ＣＲＴ３又はＣＲＴ５のいずれの第２世代ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射したマウスにおいても平均腫瘍重量の低下、血管密度の低下、及び血管漏出レベルの増加があることを示している。
【０４６０】
ＲＩＰ−Ｔａｇ２マウスに第２世代ＣＲＴ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射したところ（ここで、ラットインスリンプロモーターがＳＶ４０ラージＴ抗原トランス遺伝子の発現を膵島のβ細胞に仕向ける）、約１０週齢で腫瘍が生じ、１４週齢までに死亡した。図２７を見ると分かるとおり、ＣＡＲ  Ｔ細胞を注射したマウスでは、未処置又はモックＴ細胞対照マウスと比較して腫瘍サイズが有意に低下した。更に、図２８は、静脈内注射後４週間においてＣＡＲ形質導入Ｔ細胞がＲＩＰ−Ｔａｇ２腫瘍に貯留していることを示す。
【０４６１】
ＣＡＲを操作したＴ細胞によって処置したマウスのＲｉｐＴａｇ２腫瘍の組織学的分析から、モックＴ細胞で処置したマウスと比較して血管密度が低下し、アポトーシス血管が増加し、及びフィブリノゲン染色が減少することが示された（図２９）。
【０４６２】
実施例７  −  ＷＴ１由来ペプチドｐＷＴ１２６（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）に特異的な機能活性ＴＣＲ
ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子によって提示されるウィルムス腫瘍抗原−１（ＷＴ１）のペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ＷＴ１２６）に特異的なＴＣＲがクローニングされている。ＷＴ１転写因子は、白血病、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌などを含め、様々なヒト悪性病変において発現する。ＣＴＬ（これからＴＣＲがクローニングされた）は、ＷＴ１を発現するヒト癌細胞に対して死滅活性を示すが、生理的レベルのＷＴ１を発現する正常ヒト細胞に対しては示さない。
【０４６３】
処置目標は、ＴＣＲをコードする遺伝子のトランスファーによって患者Ｔ細胞にこの強力且つ特異的な死滅活性を備えさせることであった。そのため、ＴＣＲ遺伝子がレトロウイルスベクターに挿入されており、ＷＴ１を発現するヒト癌及び白血病細胞株に対して遺伝子形質導入ヒトＴ細胞が死滅活性を示すことが実証されている。このＣＴＬ株の特異性プロファイルについては、幾つかの研究論文に記載されており、以下のとおり要約することができる：（１）ＷＴ１由来ペプチドｐＷＴ１２６で被覆したＨＬＡ−Ａ２陽性標的の死滅（Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203）；（２）ＷＴ１を発現する新鮮ＨＬＡ−Ａ２陽性白血病細胞の死滅（Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203）；（３）ＨＬＡ−Ａ２陽性白血病ＣＦＵ前駆細胞の死滅（Gao et al (2000) Blood 95, 2198-2203；Bellantuono et al (2002) 100, 3835-3837）；（４）ＨＬＡ−Ａ２陽性白血病ＬＴＣ−ＩＣ幹細胞の死滅（Bellantuono et al (2002) Blood 100, 3835-3837）；（５）ＨＬＡ−Ａ２陽性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ白血病開始細胞の死滅（Gao et al (2003) Transplantation 75, 1429-1436）；及び（６）正常ＨＬＡ−Ａ２陽性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ移植造血幹細胞の死滅なし（Gao et al (2003) Transplantation 75, 1429-1436）。現在、ＷＴ１特異的ＴＣＲを形質導入したヒトＴ細胞が、ＴＣＲのクローニング元であるＣＴＬ株と同様の特異性を呈することが示されている。
【０４６４】
図３６〜図４３の凡例に詳細に記載されるデータは、ヒトＴ細胞へのＴＣＲ遺伝子トランスファーが実現可能であること、及びそれが導入されたＴＣＲ鎖の表面発現につながることを示している。レシピエントＴ細胞は、ｐＷＴ１２６ペプチドで被覆したＨＬＡ−Ａ２陽性標的に対して死滅活性を示す。ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、ＷＴ１を内因的に発現するヒト腫瘍細胞も死滅させる。加えて、形質導入Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２制限的、ペプチド特異的にＩＦＮ−γを産生する。最後に、形質導入ＴＣＲはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞で機能することができる。これらのＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２制限的、抗原特異的な死滅活性及び抗原特異的なサイトカイン産生を示す（図示せず）。このことから、ＴＣＲ遺伝子トランスファーを用いて、ＣＤ８陽性及びＣＤ４陽性の両方のヒトＴ細胞にＨＬＡクラス１制限的抗原特異的エフェクター機能を付与し得ることが示される。
【０４６５】
方法
細胞株
Ｔ２は、外因性ペプチドを効率的に負荷することのできる抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）が欠損したヒトＨＬＡ−Ａ２＋細胞株である。男性ＣＭＬ患者の末梢血からＢＶ１７３細胞株を樹立した。細胞は、全て３７℃でＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中において培養した。
【０４６６】
合成ペプチド及びＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体四量体
ｐＷＴ１２６（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ）及びｐＷＴ２３５（ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ）は、ヒトＷＴ１に由来するＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドである。ｐＷＴ１２６をＰＢＳに溶解させ、及びｐＷＴ２３５をＤＭＳＯに溶解させた後、ＰＢＳで希釈して２ｍＭの濃度とした。
【０４６７】
レトロウイルスＴＣＲコンストラクト及びＴＣＲ遺伝子の形質導入
アロ制限ｐＷＴ１２６特異的ヒトＣＴＬ株７７からＷＴ１特異的ＴＣＲα及びβ遺伝子を単離した。これらのＴＣＲ遺伝子をクローニングするため、ＣＴＬ株７７から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。可変α及びβ遺伝子の両方に結合するコンセンサスプライマーを普遍プライマーの組と組み合わせて用いてｃＤＮＡを増幅した。次に、単離したＴＣＲ  Ｖα又はＶβ遺伝子を、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位を用いてｐＭＰ７１レトロウイルスベクターにクローニングした。
【０４６８】
２×１０６個のアンホトロピックパッケージング細胞をＴ２５フラスコに播種し、２４時間後、リン酸カルシウム沈殿を用いてレトロウイルスＴＣＲコンストラクトで一過性にトランスフェクトした。形質導入の調製において、抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２を用いてＰＢＭＣを２日間活性化させた。次に、活性化Ｔ細胞（３×１０６）を３ｍｌの通常成長培地＋トランスフェクトしたパッケージング細胞から回収した３ｍｌのウイルス上清に再懸濁し、フィブロネクチンをコートした６ウェルプレートにプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、形質導入の２４〜４８時間後、ＴＣＲトランス遺伝子の発現を行った。
【０４６９】
ＩＦＮγ分泌アッセイ
ＴＣＲを形質導入したＴ細胞（５×１０４）を９６ウェルプレートにおいて５×１０４個の白血病細胞又はペプチド被覆Ｔ２細胞（１：１比）においてトリプリケートで刺激した。２４時間インキュベートした後、上清を回収し、ヒトＩＦＮγ測定キット（AMS Biotechnology）を用いてインターフェロンγ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。
【０４７０】
実施例８：患者の選択及び治療
ＷＴ１を発現する悪性病変を有するＨＬＡ−Ａ２陽性患者から末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を採取する。ＰＢＭＣは、実施例１に記載されるとおり、培養液に加えた又はビーズ上の抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で３日間活性化させて、次にＴＣＲをコードするレトロウイルス粒子で形質導入する。５日目、本発明者らは、形質導入したＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞が、導入されたＴＣＲを発現することを実証し得る。６日目、本発明者らは、形質導入Ｔ細胞の抗原特異的活性を実証し得る。６日目、形質導入Ｔ細胞を患者に再注入する。
【０４７１】
実施例９：腫瘍担持マウスにおける創傷治癒
０日目、マウスに１×１０６個のルイス肺癌細胞を皮下注射し、３日目に４Ｇｙを照射した。３日目、マウスに１３×１０６個のモックＴ細胞（ｎ＝７）又はＣＡＲ  Ｔ細胞（ｎ＝７）（ＣＲＴ５  ＣＡＲ）を静脈内注射した。細胞は３１％ＣＤ４＋（９３％ＣＤ３４＋）及び４３％ＣＤ８＋（６２％ＣＤ３４＋）であった。創傷治癒を７日間観察した。
【０４７２】
図４４における結果は、ＣＲＴ５  ＣＡＲを発現するマウスＴ細胞が、モック形質導入Ｔ細胞で処置した同様のマウスと比較して、腫瘍担持マウスにおける皮膚創傷の治癒を妨げなかったことを示している。
【０４７３】
実施例１０：ＰＤＡＣマウスモデルにおけるＣＲＴ５  ＣＡＲ
Ｋ−ＲａｓＧ１２Ｄ；Ｉｎｋ４ａ／Ａｒｆ−／−；ｐ５３Ｒ１７２Ｈ細胞を同系イムノコンピテントマウスの膵臓に注射して、膵臓腺癌のマウスモデルであるＰＤＡＣマウスモデルを作成する。このマウスモデルからの腫瘍の染色では、大多数の腫瘍血管上にＣＬＥＣ１４Ａ発現が示されている。ＰＤＡＣマウスをＣＲＴ５  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ここで、ＣＡＲは、ＣＤ２８の共刺激ドメインを含む）で処置すると、処置後３週間で有意な腫瘍制御が得られる（図４５）。更なる実験の結果は、図５０に見ることができる。
【０４７４】
実施例１１：ＣＬＥＣ１４Ａに対するＣＲＴ１、３及び５の滴定
ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメイン）Ｔ細胞とインキュベートするためのＦｃ融合タンパク質としてＣＬＥＣ１４Ａを発現させた。形質導入効率を等しくするため、全てのＣＡＲ−Ｔ細胞株をモックＴ細胞と希釈した。結果は、図４６に見ることができ、ここで、試験した全てのＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＬＥＣ１４Ａに良好に応答することが示される（示されるデータはトリプリケート培養の平均値＋ＳＤである）。
【０４７５】
実施例１２：ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性及び増殖アッセイ
ＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメインを含む）Ｔ細胞を使用して細胞傷害性試験を行った。Ｔ細胞をモックＴ細胞と希釈して形質導入効率を等しくし、ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現するマウス内皮細胞とインキュベートした。結果を図４８Ａに示し、これは、３つの試験したＣＡＲが全て、細胞傷害性を媒介し得ることを実証している。示されるデータはトリプリケート培養の平均値＋ＳＤである。
【０４７６】
更に、プレート結合組換えＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合タンパク質で刺激したＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ（ＣＤ２８共刺激ドメイン）Ｔ細胞を用いて増殖アッセイ（ＣＦＳＥ標識）を行った。ＣＡＲ  Ｔ細胞株は、全てモックＴ細胞と希釈して形質導入効率を等しくし、結果は、図４８Ｂに見ることができ、ここで、３つの試験したＣＡＲが全て刺激後に増殖能を有した。示されるデータは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のみのものであるが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞についても同様のデータが得られた。
【０４７７】
実施例１３：異なる共刺激及び膜貫通領域を有するＣＡＲ
以下のＣＡＲをクローニングし、レトロウイルスベクターを使用して単一ドナーからのＴ細胞に入れる操作を行っている：
１）ＣＲＴ３−ＣＤ２８  ＴＭ−ＣＤ２８  共刺激シグナル−ＣＤ３（ＣＲＴ３．２８ｚ）
２）ＣＲＴ３−ＣＤ８  ＴＭ−４−１ＢＢ  共刺激シグナル−ＣＤ３（ＣＲＴ３．ＢＢｚ）
３）ＣＲＴ３−ＣＤ２８  ＴＭ−ＣＤ２８及び４−１ＢＢ  共刺激シグナル−ＣＤ３（ＣＲＴ３．２８ＢＢｚ）
４）ＣＲＴ３−ＣＤ２８  ＴＭ−ＣＤ２８及びＯＸ４０  共刺激シグナル−ＣＤ３（ＣＲＴ３．２８Ｏｘｚ）
５）ＣＲＴ３−ＣＤ８  ＴＭ−４−１ＢＢ及びＯＸ４０  共刺激シグナル−ＣＤ３（ＣＲＴ３．ＢＢＯｘｚ）。
【０４７８】
作成した全てのコンストラクトがＴ細胞に良好に形質導入された。これらの異なるコンストラクトの機能をインビトロで評価し、サイトカイン産生、細胞傷害性及び増殖応答について評価した（図４９を参照されたい）。サイトカイン放出から、特にＣＲＴ３．２８ｚ及びＣＲＴ３．２８Ｏｘｚを発現するＴ細胞による強力な抗原特異的応答が示された。ヒトＣＬＥＣ１４Ａを発現する滴定数のＣＨＯ細胞（又はベクターのみの対照）に応答したＩＦＮγ産生を計測することにより、サイトカイン産生を分析した。ＣＡＲ  Ｔ細胞株は、全てモックＴ細胞と希釈して形質導入効率を等しくした。示されるデータは、トリプリケート培養の平均値＋ＳＤである。ＣＬＥＣ１４Ａを発現するように操作したマウス内皮細胞（ＳＥＮＤ）に対する細胞傷害活性を計測し、プレート結合組換えＣＬＥＣ１４Ａ−Ｆｃ融合タンパク質による刺激後の増殖応答を計測した（データは示さず）。
【０４７９】
実施例１４：キメラＣＬＥＣ１４Ａによる刺激後のＣＡＲ  Ｔ細胞からのサイトカイン放出の決定
ヒト配列を含有するが、膜貫通及び／又は細胞内ドメインはマウス由来であるキメラ型のＣＬＥＣ１４Ａを２９３及びＳＥＮＤ細胞で発現させた。ＣＬＥＣ発現を等しくするためレンチウイルスベクターから共発現するＧＦＰを用いてこれらの細胞を選別し、次にＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＣＲＴ１、３及び５）を用いて試験した。ＣＡＲ  Ｔ細胞を２９３細胞及びＳＥＮＤ細胞の両方とインキュベートした後、ＩＦＮγの放出を計測した。結果は、図５１に見ることができる。加えて、ＣＬＥＣ１４Ａキメラを発現するＳＥＮＤ細胞とインキュベートしたときのＴ細胞の細胞傷害性を決定した。ＣＡＲ  Ｔ細胞株は、全てモックＴ細胞と希釈して形質導入効率を等しくした。示されるデータは、トリプリケート培養の平均値である。
【０４８０】
図５１を見て分かるとおり、試験した全てのＣＲＴ１、３及び５  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ヒトＣＬＥＣ１４Ａ（ｈｕＣＬＥＣ）、マウス細胞内ドメインを有するヒトＣＬＥＣ１４Ａ（Ａ１）及びマウス膜貫通及び細胞内ドメインを有するヒトＣＬＥＣ１４Ａ（Ｂ１）のいずれかを発現する２９３及びＳＥＮＤ細胞からのＩＦＮγの放出をもたらす。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１８−１】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４８−３】
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【図４８−４】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５１−３】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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