(57)【要約】  本発明は、１種又２種以上のメラニン生成抑制物質と、１種又２種以上の皮膚外用剤配合成分とを含む皮膚外用剤を提供する。  より詳しくは、ゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンよりなる群から選択される１種又は２種以上のメラニン生成抑制物質と、特定の油性成分、水溶性成分及び高分子よりなる群から選択される１種又は２種以上の皮膚外用剤配合成分とを含む優れた美白効果を示し、使用感に優れた皮膚外用剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
【化１】
2011158332.tif 000038
｛式中、
Ｒ１はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、ＯＨ又はＣ１−３アルキルであり、
あるいはＲ２とＲ３は一緒になって＝Ｏになり、
Ｒ４はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｘ及びＹは式（II）：
【化２】
2011158332.tif 000039
［式中、
記号：
【化３】
2011158332.tif 000040
は単結合又は二重結合を表し；
Ｒ５はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ６はＨ、ＯＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ７及びＲ８は、独立して、Ｈ又はＣ１−３アルキルであり、又は結合（１）が二重結合である場合はＲ５とＲ７又はＲ８のいずれか一方とは存在せず、あるいはＲ６とＲ７は一緒になって−Ｏ−を形成し、
Ｒ９はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ１０はＨ又はＣ１−３アルキルであり、又は結合（２）が二重結合である場合はＲ１０は存在しない］で表される二価の基、
又は式（III）：
【化４】
2011158332.tif 000041
［式中、
Ｒ１１は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルキル又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルケニルであり、
Ｒ１２は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルキル又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルケニルであり、
Ｒ１３はＨ又はＣ１−３アルキルである］で表される二価の基
を形成する｝
で表される１種又２種以上のメラニン生成抑制物質と、１種又２種以上の皮膚外用剤配合成分とを含む皮膚外用剤。
【請求項２】
該メラニン生成抑制物質が、
式（IV）：
【化５】
2011158332.tif 000042
で表されるゼデロン、
式（V）：
【化６】
2011158332.tif 000043
で表されるフラノジエノン、
式（VI）：
【化７】
2011158332.tif 000044
で表されるクルゼレノン、
式（VII）：
【化８】
2011158332.tif 000045
で表される水添ゼデロン、及び
式（VIII）：
【化９】
2011158332.tif 000046
で表される水添フラノジエノン
よりなる群から選択される１種又は２種以上である請求項１記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
該皮膚外用剤配合成分が、油性成分、水溶性成分及び高分子よりなる群から選択される１種又は２種以上である請求項１又は２記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
該油性成分が、スクワラン、ホホバ油、２−エチルヘキサン酸セチル、流動パラフィン、流動イソパラフィン、軽質流動イソパラフィン、重質流動イソパラフィン、ワセリン、オリーブ油、サフラワー油、ヒマシ油、ゴマ油、コメ胚芽油及び水素添加ホホバ油よりなる群から選択される１種又は２種以上の油性基剤；メドウフォーム油、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ステアリル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、モノステアリン酸エチレングリコール、イソノナン酸イソトリデシル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、リンゴ酸ジイソステアリル、ステアリン酸硬化ヒマシ油、イソステアリン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸オクチル、ポリブテン及びコハク酸ジエトキシエチルよりなる群から選択される１種又は２種以上のエステル類；ミツロウ、カルナウバロウ及びキャンデリラロウよりなる群から選択される１種又は２種以上のロウ類；セタノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びベヘニルアルコールよりなる群から選択される１種又は２種以上のアルコールよりなる群から選択される１種又は２種以上である請求項３記載の皮膚外用剤。
【請求項５】
該水溶性成分が、１,３−ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ソルビトール、１,２−プロピレングリコール、ポリエチレングリコール４０００、１,２−ペンチレングリコール及び１,２−ヘキシレングリコールよりなる群から選択される１種又は２種以上のグリコール類；トレハロース、グルコース、マルチトール、乳糖及び果糖よりなる群から選択される１種又は２種以上の糖類；ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及びグリセリン脂肪酸エステルよりなる群から選択される１種又は２種以上の界面活性剤よりなる群から選択される１種又は２種以上である請求項３又は４記載の皮膚外用剤。
【請求項６】
該高分子が、キサンタンガム、ポリビニルピロリドン、寒天、ヒアルロン酸又はその塩、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、ポリアクリル酸又はその塩、カルボキシビニルポリマー、コラーゲン液、デキストリン、カラギーナン、アルギン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩及びメチルセルロースよりなる群から選択される１種又は２種以上である請求項３ないし５のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項７】
約０.０００００１〜１.０質量％の該メラニン生成抑制物質を含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項８】
約０.０００１〜３０.０質量％の該皮膚外用剤配合成分を含む請求項１ないし７のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【請求項９】
ゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンよりなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分を含み、ゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンよりなる群から選択される１種又は２種以上を含む天然物抽出物を含まない請求項１ないし８のいずれか１項に記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメラニン生成抑制剤及び皮膚外用剤配合成分を含む使用感に優れた皮膚外用剤、詳細には、特に美白効果に優れ、さらには優れた使用感が得られ、皮膚を健やかに保つことができる皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、皮膚の色黒やシミ、ソバカスなどを改善する各種の美白用外用剤が提供されてきた。美白剤の有効成分として配合される美白成分として、アルブチンやコウジ酸、アスコルビン酸及びこれらの誘導体、グルタチオン、コロイドイオウなどが周知の物質として用いられており、近年では、４−ＭＳＫ（４−メトキシサリチル酸カリウム塩）やルシノール（登録商標）、マグノリグナン（登録商標）、エラグ酸やリノール酸などが市販の美白用外用剤の有効成分として用いられている。【０００３】
本出願人は、これら従来の美白剤の有効成分よりも美白効果に優れた成分が、ガジュツ（我朮、Curcuma zedoaria Roscoe (Zingiberaceae)：別名紫ウコン）に含まれるゼデロンやフラノジエノンであることを明かにし、ガジュツから精製したゲルマクロン様骨格を有する一群の物質を有効成分として含む組成物をすでに特許出願している（国際特許出願  PCT／JP2009／070535）。【０００４】
一方、化粧料などの皮膚外用剤には皮膚の乾燥やかさつきなどを防ぎ、また製剤の安定化を目的として油性成分、アルコール、グリコール類、糖類又は界面活性剤などの水溶性成分、高分子成分などの添加成分が配合されているが、油性成分やアルコールは皮膜のようなベタツキを生じ、グリコール類、糖類や界面活性剤はベタツキ感を生じ、また高分子は皮膜感やギスギス感を生じ、これらの成分を配合した製剤の使用感の改善が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記の背景技術に鑑みてなされたものであって、本発明の目的は配合成分に起因する使用感が改善された皮膚外用剤を提供することにある。さらなる本発明の目的は、特に美白効果に優れ、さらには使用感に優れた皮膚を健やかに保つことができる皮膚外用剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、汎用成分を配合し、ガジュツから精製した一群の物質を有効成分として含む皮膚外用剤を製剤化する際に、それらの一群の物質が油性成分などに起因する使用感を改善することを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］
式（I）：
【化１】
2011158332.tif 000002
｛式中、
Ｒ１はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、独立して、Ｈ、ＯＨ又はＣ１−３アルキルであり、
あるいはＲ２とＲ３は一緒になって＝Ｏになり、
Ｒ４はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｘ及びＹは式（II）：
【化２】
2011158332.tif 000003
［式中、
記号：
【化３】
2011158332.tif 000004
は単結合又は二重結合を表し；
Ｒ５はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ６はＨ、ＯＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ７及びＲ８は、独立して、Ｈ又はＣ１−３アルキルであり、又は結合（１）が二重結合である場合はＲ５とＲ７又はＲ８のいずれか一方とは存在せず、あるいはＲ６とＲ７は一緒になって−Ｏ−を形成し、
Ｒ９はＨ又はＣ１−３アルキルであり、
Ｒ１０はＨ又はＣ１−３アルキルであり、又は結合（２）が二重結合である場合はＲ１０は存在しない］で表される二価の基、
又は式（III）：
【化４】
2011158332.tif 000005
［式中、
Ｒ１１は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルキル又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルケニルであり、
Ｒ１２は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルキル又は直鎖若しくは分岐鎖のＣ１−５アルケニルであり、
Ｒ１３はＨ又はＣ１−３アルキルである］で表される二価の基
を形成する｝
で表される１種又２種以上のメラニン生成抑制物質と、１種又２種以上の皮膚外用剤配合成分とを含む皮膚外用剤；
［２］
該メラニン生成抑制物質が、
式（IV）：
【化５】
2011158332.tif 000006
で表されるゼデロン、
式（V）：
【化６】
2011158332.tif 000007
で表されるフラノジエノン、
式（VI）：
【化７】
2011158332.tif 000008
で表されるクルゼレノン、
式（VII）：
【化８】
2011158332.tif 000009
で表される水添ゼデロン、及び
式（VIII）：
【化９】
2011158332.tif 000010
で表される水添フラノジエノン
よりなる群から選択される１種又は２種以上である前記［１］記載の皮膚外用剤；
［３］
該皮膚外用剤配合成分が、油性成分、水溶性成分及び高分子よりなる群から選択される１種又は２種以上である前記［１］又は［２］記載の皮膚外用剤；
［４］
該油性成分が、スクワラン、ホホバ油、２−エチルヘキサン酸セチル、流動パラフィン、流動イソパラフィン、軽質流動イソパラフィン、重質流動イソパラフィン、ワセリン、オリーブ油、サフラワー油、ヒマシ油、ゴマ油、コメ胚芽油及び水素添加ホホバ油よりなる群から選択される１種又は２種以上の油性基剤；メドウフォーム油、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ステアリル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、モノステアリン酸エチレングリコール、イソノナン酸イソトリデシル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、リンゴ酸ジイソステアリル、ステアリン酸硬化ヒマシ油、イソステアリン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸オクチル、ポリブテン及びコハク酸ジエトキシエチルよりなる群から選択される１種又は２種以上のエステル類；ミツロウ、カルナウバロウ及びキャンデリラロウよりなる群から選択される１種又は２種以上のロウ類；セタノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びベヘニルアルコールよりなる群から選択される１種又は２種以上のアルコールよりなる群から選択される１種又は２種以上である前記［３］記載の皮膚外用剤；
［５］
該水溶性成分が、１,３−ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ソルビトール、１,２−プロピレングリコール、ポリエチレングリコール４０００、１,２−ペンチレングリコール及び１,２−ヘキシレングリコールよりなる群から選択される１種又は２種以上のグリコール類；トレハロース、グルコース、マルチトール、乳糖及び果糖よりなる群から選択される１種又は２種以上の糖類；ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及びグリセリン脂肪酸エステルよりなる群から選択される１種又は２種以上の界面活性剤よりなる群から選択される１種又は２種以上である前記［３］又は［４］記載の皮膚外用剤；
［６］
該高分子が、キサンタンガム、ポリビニルピロリドン、寒天、ヒアルロン酸又はその塩、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、ポリアクリル酸又はその塩、カルボキシビニルポリマー、コラーゲン液、デキストリン、カラギーナン、アルギン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸塩又はその塩及びメチルセルロースよりなる群から選択される１種又は２種以上である前記［３］ないし［５］のいずれか１に記載の皮膚外用剤；
［７］
約０.０００００１〜１.０質量％の該メラニン生成抑制物質を含む前記［１］ないし［６］のいずれか１に記載の皮膚外用剤；
［８］
約０.０００１〜３０.０質量％の該皮膚外用剤配合成分を含む前記［１］ないし［７］のいずれか１に記載の皮膚外用剤；
［９］
ゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンよりなる群から選択される１種又は２種以上の有効成分を含み、ゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンよりなる群から選択される１種又は２種以上を含む天然物抽出物を含まない前記［１］ないし［８］のいずれか１に記載の皮膚外用剤
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によると、特に美白効果に優れ、さらには優れた使用感が得られ、皮膚を健やかに保つことができる皮膚外用剤が提供される。【０００８】
なお、本発明において美白効果が確認された上記の物質以外にも、水添クルゼレノンや以下の化合物が公知であるが、本発明によれば、これらの化合物にも美白効果や使用感の改善が期待される。
【化１０】
2011158332.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ガジュツエキス末（Ａ)から液々分配による分画を示すフロー図である。
【図２】ガジュツエキス末（Ａ)の液々分配物によるメラニン生成抑制効果を示す写真であって、（ａ）はコントロール、（ｂ）はアルブチン、（ｃ）はガジュツエキス末（Ａ）、（ｄ）はヘキサン画分（Ｂ）、（ｅ）は酢酸エチル画分（Ｃ）、（ｆ）は水画分（Ｄ）の結果である。
【図３】分取薄層クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。
【図４】分取薄層クロマトグラフィーにより得られた各画分のクロマトグラムである。
【図５】分取薄層クロマトグラフィーにより得られた画分のメラニン生成抑制効果を示す写真であって、（ａ）はコントロール、（ｂ）はアルブチン、（ｃ）はガジュツエキス末（Ａ）、（ｄ）はヘキサン画分（Ｂ）、（ｅ）は試料Ｂ−１（バンドＳ１）、（ｆ）は試料Ｂ−２（バンドＳ２）、（ｇ）は試料Ｂ−３（バンドＳ３〜Ｓ５）、（ｈ）は試料Ｂ−４（バンドＳ６〜Ｓ８）の結果である。
【図６】精製されたメラニン生成抑制物質（ゼデロン）の紫外部吸収スペクトルである。
【図７】精製されたメラニン生成抑制物質（ゼデロン）のＩＲによるチャートである。
【図８】精製されたメラニン生成抑制物質（ゼデロン）のマススペクトルである。
【図９】精製されたメラニン生成抑制物質（ゼデロン）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１０】精製されたメラニン生成抑制物質（ゼデロン）の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図１１】ガジュツエキス末（Ａ)のヘキサン−酢酸エチル（８：２）溶出画分のＨＰＬＣチャートである。
【図１２】精製されたメラニン生成抑制物質（フラノジエノン）の紫外部吸収スペクトルである。
【図１３】精製されたメラニン生成抑制物質（フラノジエノン）のＩＲによるチャートである。
【図１４】精製されたメラニン生成抑制物質（クルゼレノン）の紫外部吸収スペクトルである。
【図１５】精製されたメラニン生成抑制物質（クルゼレノン）のＩＲによるチャートである。
【図１６】生成したメラニン生成抑制物質（水添ゼデロン）の紫外部吸収スペクトルである。
【図１７】生成したメラニン生成抑制物質（水添フラノジエノン）の紫外部吸収スペクトルである。
【図１８】製造例１の製造物によるメラニン生成抑制効果を示す写真であって、（ａ）はコントロール、（ｂ）はアルブチン、（ｃ）はガジュツエキス末（Ａ）、（ｄ）は製造例１の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、第１の態様において、１種又２種以上のメラニン生成抑制物質と、油性成分、水溶性成分及び高分子よりなる群から選択される１種又２種以上の皮膚外用剤配合成分とを含む皮膚外用剤を提供する。
本発明のメラニン生成抑制物質は、ゲルマクロン様骨格を有する一群の物質を有効成分とする。本発明で用いるこれらの物質は、上記のように、ガジュツを始めとして、その多くはショウガ科に属する植物に含まれる成分として知られている。また、本発明で用いるメラニン生成抑制物質には、ショウガ科に属する植物から単離される天然成分を水素添加して生成したものも含まれる。【００１１】
本発明の皮膚外用剤に含まれるメラニン生成抑制物質は、下記の実施例に示すように、メラニン生成抑制効果が高いとされているアルブチンに比べて、約４００倍の作用、つまりアルブチンの使用量の約１／４００の使用量で同等のメラニン生成抑制作用を示す。【００１２】
好ましい形態において、本発明の皮膚外用剤に含まれるメラニン生成抑制物質は、
式（IV）：
【化１１】
2011158332.tif 000012
で表されるゼデロン、
式（V）：
【化１２】
2011158332.tif 000013
で表されるフラノジエノン、
式（VI）：
【化１３】
2011158332.tif 000014
で表されるクルゼレノン、
式（VII）：
【化１４】
2011158332.tif 000015
で表される水添ゼデロン、及び
式（VIII）：
【化１５】
2011158332.tif 000016
で表される水添フラノジエノン
であり、好ましい物質はゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンであり、最も好ましくはゼデロンである。
これらのメラニン生成抑制物質は、単独又は組み合わせて本発明の皮膚外用剤に配合することができる。【００１３】
本発明の皮膚外用剤に用いる一群のメラニン生成抑制物質は、ガジュツ（Curcuma zedoaria Roscoe (Zingiberaceae)：別名紫ウコン）の根や茎、葉などの各部位又は全草、好ましくはその根茎から各種有機溶媒にて抽出され、活性炭、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着剤（例えば、三菱化成社製：ＨＰ−２０）、オクタデシルシリル化シリカゲルやシリカゲルを用いて精製を行うことによって得ることができる。このとき、抽出溶媒としては、水やメタノール、エタノールなどの炭素数１〜４程度の低級アルコール又はそれらの水溶液、アセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類、酢酸メチルや酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル類、ｎ−ペンタンやｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンなど直鎖、分岐を問わず各種の飽和、不飽和炭化水素などより選択される１種又は２種以上の溶媒を用いることができる。そして、これら溶媒を適宜使い分け、例えば、植物からの抽出には非極性溶媒よりは極性溶媒を用いるのが好ましく、その後、極性を低めることにより分画することができる。また、得られた物質を公知の方法に従って水素化することによって、メラニン生成抑制物質の水添物を得ることができる。【００１４】
より詳細には、ゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンは、
（１）ガジュツ（Curcuma zedoaria）の乾燥物を溶媒に浸漬してガジュツ抽出液を調製し、
（２）ガジュツ抽出液の溶媒を減圧下にて留去し、
（３）生成した結晶分を少量の溶媒で洗浄し、ついで
（４）得られた結晶分を溶媒から再結晶化する
工程を含む製造方法により得ることができる。【００１５】
また、ゼデロンは、
（１）ガジュツの乾燥物を溶媒に浸漬してガジュツ抽出液を調製し、
（２）ガジュツ抽出液の溶媒を減圧下にて留去し、
（３）得られた乾固物を溶媒に溶解して、シリカゲルを充填剤とするカラムクロマトグラフィーによる分画を行い、ついで
（４）画分の溶媒留去物を溶媒から結晶化する
工程を含む製造方法により得ることができる。【００１６】
好ましい形態において、ガジュツ抽出液の調製は、約１：５０〜約１：３（容量比）、好ましくは約１：１０〜約１：４（容量比）のガジュツ乾燥物：溶媒の浴比で、約１０℃ないし抽出溶媒の沸点まで、好ましくは室温ないし溶媒の沸点より約１０℃低い温度にて約２時間〜約１４日間、好ましくは約７日間、攪拌、ソックスレー抽出又は静置して行う。【００１７】
好ましい形態において、抽出、吸着、液々分配、結晶化、クロマトグラフィーの移動相などの操作に用いる溶媒は、水、メタノール、エタノール、３０〜９５％（v/v）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、ヘキサン又は酢酸エチルであり、これらの溶媒は１種又は２種以上を混合して用いることもできる。【００１８】
好ましい形態において、クロマトグラフィーの条件は以下のとおりである。
カラム：Chemcobond  5-ODS-W（6.0×150（6A））（株式会社ケムコ社）
移動相：75%（v/v）メタノール水溶液
カラム温度：55℃
流速：1.0mL／min
注入量：10μL
モニター：UV  280nm  吸光度【００１９】
好ましい形態において、ゼデロンは、
（１）ガジュツの根茎乾燥物を酢酸エチルに浸漬して室温下で放置して抽出し、
（２）抽出液をフィルター（ADVANTEC No.131）にて濾過し、濾液を減圧下にて溶媒を留去し、
（３）乾固物を移動相をヘキサンと酢酸エチルの混液（容量比７：３）を用いて、シリカゲルを充填剤とするカラムクロマトグラフィー（上記分析条件と同じ）に付して波長210nmによる紫外部吸収を指標として分画を行い、
（４）吸収が認められた画分を収集して減圧下にて溶媒を留去し、ついで
（５）留去物をヘキサンを用いて再結晶してゼデロンを得る
工程を含む製法により得ることができる。【００２０】
好ましい形態において、フラノジエノンは、
（１）ガジュツの根茎乾燥物をヘキサンで還流して濃縮し、
（２）収集した抽出液を減圧下にて留去した乾固物を少量のヘキサンに溶解し、
（３）シリカカラムに付して、ヘキサン、ヘキサン：酢酸エチル（容量比９：１）、ヘキサン：酢酸エチル（容量比８：２）で順次溶出し、
（４）ヘキサン：酢酸エチル（容量比８：２）溶出画分を収集し、ついで
（５）少量の７５％（v/v）メタノール水溶液に溶解して、ODSカラムに付し、特定の画分を分取してフラノジエノンを得る
工程を含む製法により得ることができる。【００２１】
好ましい形態において、クルゼレノンは、
（１）ガジュツの根茎乾燥物をヘキサンで還流して濃縮し、
（２）収集した抽出液を減圧下にて留去した乾固物を少量のヘキサンに溶解し、
（３）シリカカラムに付して、ヘキサン、ヘキサン：酢酸エチル（容量比９：１）、ヘキサン：酢酸エチル（容量比８：２）で順次溶出し、
（４）ヘキサン：酢酸エチル（容量比８：２）溶出画分を収集し、ついで
（５）少量の７５％（v/v）メタノール水溶液に溶解して、ODSカラムに付し、特定の画分を分取してクルゼレノンを得る
工程を含む製法により得ることができる。【００２２】
好ましい形態において、水添ゼデロンは、
（１）上記の製法などにより得られたゼデロンを９９.５％（v/v）エタノールに溶解し、
（２）５％Ｐｄ−アルミナを加えて水素バックを用いて水添反応を行い、ついで
（３）反応終了後に濾過を行い、濾液の溶媒を減圧下にて留去して水添ゼデロンを得る
工程を含む製法により得ることができる。【００２３】
好ましい形態において、水添フラノジエノンは、
（１）上記の製法などにより得られたフラノジエノンを９９.５％（v/v）エタノールに溶解し、
（２）５％Ｐｄ−アルミナを加えて水素バッグを用いて水添反応を行い、ついで
（３）反応終了後に濾過を行い、濾液の溶媒を減圧下にて留去して水添フラノジエノンを得る
工程を含む製法により得ることができる。【００２４】
もっとも、本発明の皮膚外用剤に含まれるゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンは、単一の純粋な成分にまで精製する必要はなく、下記実施例において述べるように、各種の溶媒を用いた抽出、吸着、液々分配、結晶化、クロマトグラフィー分画などの操作によって比較的高濃度の、例えば、６０％（w/w）以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、最も好ましくは９９.５％以上の純度の成分を含む粗精製物として入手することも可能である。【００２５】
また、これらのゼデロン、フラノジエノン及びクルゼレノンは、本明細書中に記載する方法により得られるもののほか、市販されているものを用いることも可能である。【００２６】
本発明の皮膚外用剤に有効成分として含まれるゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンは、メラニン生成抑制効果が高いとされているアルブチンに比べて、約４００倍の作用、つまりアルブチンの使用量の約１／４００の使用量で同等のメラニン生成抑制作用を示す（国際特許出願  PCT／JP2009／070535）。【００２７】
本発明の皮膚外用剤には、ゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンを単独又は組み合わせて皮膚外用剤全体に対して約０.０００００１〜１.０質量％、好ましくは約０.００００１〜０.５質量％、最も好ましくは約０.０００１〜０.１質量％含ませることができる。皮膚外用剤におけるゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンの量が約０.０００００１質量％未満の場合は有効な美白効果を発揮することができずまた皮膚外用剤配合成分に起因する使用感を改善することができず、一方約１.０質量％を超えて含ませてもそれ以上の効果を得ることができない。【００２８】
なお、ガジュツからのゼデロンの抽出効率が最もよかった７０％（v/v）エタノール水溶液抽出物をＨＰＬＣ分析した結果（示さず）に基づくと、ガジュツ中にはその乾燥物に対して約０.３％のゼデロンが含まれると考えられる。化粧品原料に用いることができるガジュツ抽出エキスは水抽出物やエタノール抽出物、水／エタノール混液による抽出物である。これらの抽出物においては、原植物乾燥物１ｋｇから少なくとも約２５ｇの抽出乾燥物（ガジュツ乾燥エキス）が得られる。そうすると、化粧料中に配合されるガジュツエキス（乾燥物に換算して）中には約１０質量％程度のゼデロンしか含まれない。匂いや着色を考慮するとガジュツエキスの配合量は乾燥物に換算して化粧料中に概ね０.０１質量％、多くとも約０.０５％質量以下である。従って、これまでの公知である化粧料中のゼデロン含有量は多く見積もっても約０.００５質量％程度である。そこで、本発明の美白用の皮膚外用剤においては約０.００５質量％以上のゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノン、さらに好ましくは約０.０１質量％以上のゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンを配合するのが好ましい。これにより従来の美白化粧料にはない美白効果を発揮し、皮膚外用剤配合成分に起因する使用感を改善することができる。【００２９】
本発明の皮膚外用剤において、前記したゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンが使用感を改善する皮膚外用剤配合成分には油性成分、水溶性成分及び高分子が含まれる。【００３０】
好ましい形態において、油性成分には油性基剤、エステル類、ロウ類及びアルコールが含まれる。
さらに好ましい形態において、油性基剤にはスクワラン、ホホバ油、２−エチルヘキサン酸セチル、流動パラフィン、流動イソパラフィン、軽質流動イソパラフィン、重質流動イソパラフィン、ワセリン、オリーブ油、サフラワー油、ヒマシ油、ゴマ油、コメ胚芽油及び水素添加ホホバ油よりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれ；エステル類にはメドウフォーム油、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ステアリル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、モノステアリン酸エチレングリコール、イソノナン酸イソトリデシル、トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリン、リンゴ酸ジイソステアリル、ステアリン酸硬化ヒマシ油、イソステアリン酸２−ヘキシルデシル、パルミチン酸オクチル、ポリブテン及びコハク酸ジエトキシエチルよりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれ；ロウ類にはミツロウ、カルナウバロウ及びキャンデリラロウよりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれ；アルコールにはセタノール、コレステロール、フィトステロール、イソステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール及びベヘニルアルコールよりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれる。【００３１】
好ましい形態において、水溶性成分にはグリコール類、糖類及び界面活性剤が含まれる。
さらに好ましい形態において、グリコール類には１,３−ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ソルビトール、１,２−プロピレングリコール、ポリエチレングリコール４０００、１,２−ペンチレングリコール及び１,２−ヘキシレングリコールよりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれ；糖類にはトレハロース、グルコース、マルチトール、乳糖及び果糖よりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれ；界面活性剤にはショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンデシルテトラデシルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及びグリセリン脂肪酸エステルよりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれる。【００３２】
好ましい形態において、高分子にはキサンタンガム、ポリビニルピロリドン、寒天、ヒアルロン酸又はその塩、カルボキシメチルセルロース、結晶セルロース、ポリアクリル酸又はその塩、カルボキシビニルポリマー、コラーゲン液（０.３％）、デキストリン、カラギーナン、アルギン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩及びメチルセルロースよりなる群から選択される１種又は２種以上の成分が含まれる。【００３３】
本発明の皮膚外用剤には、これらの皮膚外用剤配合成分を単独又は組み合わせて皮膚外用剤全体に対して約０.０００１〜３０.０質量％、好ましくは約０.０００５〜２０.０質量％、最も好ましくは約０.００１〜１０.０質量％含ませることができる。皮膚外用剤におけるこれらの成分の量が約０.０００１質量％未満の場合又は約３０.０質量％を超える場合は、皮膚外用剤の使用感が損なわれる。【００３４】
本発明の皮膚外用剤は、メラニン生成抑制物質、皮膚外用剤配合成分や他の添加成分を用いて自体公知の方法によって調製することができる。【００３５】
本発明の皮膚外用剤は、通例、前記した本発明のメラニン生成抑制物質及び皮膚外用剤配合成分を各種の化粧料用基剤や外用医薬用基剤などに配合して調製され、例えば、クリーム、乳液、化粧水、パック剤、洗顔料などの基礎化粧料、ファンデーションなどのメーキャップ化粧料、洗髪料、養毛剤、シャンプー、リンスなどの頭髪用化粧料、石鹸、美爪料、オーデコロンなどのその他の化粧料並びに皮膚に適用される医薬部外品及び医療用外用剤などを包含する皮膚外用剤として提供される。【００３６】
化粧料用基剤や外用医薬用基剤としては、例えば、液状、固体状を問わず、油脂やロウ、炭化水素油、高級脂肪酸、エステル油、シリコーン油などの油性原料、水、アルコール、多価アルコールなどが含まれる。また、前記化粧料や医療用外用剤などには、前記基剤の他に、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、ｐＨ調整剤、水溶性高分子、増粘剤、紫外線吸収剤、金属イオン封鎖剤（キレート剤）、糖類、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ビタミン類、酸化防止剤、酸化防止助剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、細胞賦活剤、香料、顔料や色素などの着色剤、防腐剤など、上記した本発明の皮膚外用剤に必須の成分以外の成分を配合することができる。【００３７】
本発明の皮膚外用剤は、化粧料や医療用外用剤などとしての剤型も特に制限されるものではなく、例えば液状やエマルジョン、軟膏、ゾル、ゲル、パウダー、スプレーなどの剤型が例示される。このような化粧料や医療用外用剤として用いることにより、優れた使用感でもって優れた美白効果を発揮することができる。【００３８】
本発明の皮膚外用剤は、特定の皮膚外用剤配合成分に起因する使用感が、天然物から単離された又は合成されたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンを配合することにより改善されるものであって、かかる天然物から単離されるゼデロン、フラノジエノン又はクルゼレノンを含む天然物抽出物を含まない皮膚外用剤である。つまり、ゼデロン、フラノジエノン又はクルゼレノンを含む天然物抽出物を用いることなく、単離又は合成されたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンを有効成分として配合して得られたこの皮膚外用剤は美白用の皮膚外用剤として好ましく用いられる。もっとも、本発明は、単離又は合成されたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン又は水添フラノジエノンをメラニン生成抑制剤として使用することに特徴を有するものであって、単離又は合成されたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン又は水添フラノジエノンのみを人為的に加えた皮膚外用剤、あるいは、ゼデロン、フラノジエノン又はクルゼレノンが含まれる天然物抽出物に加えてさらに単離又は合成されたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン又は水添フラノジエノンを人為的に配合した皮膚外用剤を使用することにより美白作用を発揮させることに技術的特徴を有する。【００３９】
次に、下記実施例に基づいて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例の内容に制限されるものではない。なお、特に断らない限り、配合量は質量％を表す。
［実施例１］【００４０】
〔ガジュツからの抽出・分画精製〕
ガジュツからの本発明に係るメラニン生成抑制剤の抽出、精製に当たり、まず図１に示す方法により分画操作を行い、各画分について美白作用を調べた。美白作用は下記に示すようにメラニンの生成抑制作用を調べることによって行った。なお、ガジュツは新和物産株式会社より入手したものを用いた。【００４１】
３００ｇのガジュツ（Curcuma zedoaria Roscoe (Zingiberaceae)）の根茎乾燥物に５０％（v/v）エタノール水溶液１８００ｍＬを加え、室温で５日間放置した。その後、濾過して１６００ｍＬの抽出液を得た。抽出液を減圧濃縮し乾固物７.５ｇを得た（ガジュツエキス末（Ａ））。その乾固物１ｇを少量の５０％（v/v）エタノール水溶液に溶解した上で分液漏斗へ投入し、更に、水とヘキサン（容量比で１：１）を加えてよく振り混ぜ、静置した。下層の水層を取り出し、上層のヘキサン層を別のフラスコに分取した。取り出した水層を再び分液漏斗に戻し、水層とほぼ同容量のヘキサンを加え、同様の操作をさらに２回繰り返した。次いで、水層を再び、分液漏斗に戻し、水層とほぼ同容量の酢酸エチルを加えて分液操作を行った。上層の酢酸エチル層を集め、取り出した水層を再び分液漏斗に戻し、再び水層とほぼ同容量の酢酸エチルを加え、同様の操作をさらに２回繰り返した。集めたヘキサン層、酢酸エチル層及び残部の水層は減圧下、濃縮を行い、メラニン生成抑制試験の試料とした（試料（Ａ）〜（Ｄ））。【００４２】
（メラニン生成抑制試験）
メラニン生成抑制試験として、三次元培養皮膚モデルによる試験とその際に生成されたメラニン量及びタンパク量を指標にした試験を行った。
メラニン生成抑制試験は、市販されている三次元培養皮膚モデル（ＭＥＬ-３００キットＡｓｉａｎ  ｄｏｎｏｒ：クラボウ社)を用いて行った。キットの使用方法に従い、ＭＥＬ-３００皮膚モデルカップを６ウエルプレートの各ウエルにセットし、３７℃インキュベーターで温めたキット用維持培地（ＥＰＩ−１００：培地添加時にＳＣＦを最終濃度１０ｎｇ/ｍＬになるように添加した）を皮膚モデルカップに無菌的に５ｍＬずつ入れた。皮膚モデルカップの内部に直接的に各試料の溶液を１００μＬずつ加え、皮膚モデルカップの入った６ウエルプレートをインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２、加湿状態）に入れ、１４日間培養した。２日毎に新しい培地と培地交換を行い、交換の都度、各試料の溶液１００μＬを皮膚モデルカップに加えた。なお、各試料の溶液の調製には細胞培養用のＰＢＳ（−）を用いた。【００４３】
培養後、ＭＥＬ-３００皮膚モデルカップをＰＢＳ（−）で３回洗浄後、細胞部分を剥離して１.５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、０.５ｍＬの２ｍｏｌ/Ｌ−ＮａＯＨを添加し、室温下で一晩放置した。１５分間煮沸後、各サンプル２５０μＬを９６ウエルプレートに移し、405nmでメラニンを定量した。【００４４】
さらに、上記煮沸後のメラニン定量用サンプル４０μＬを９６ウエルプレートに移し、タンパク定量用のＢＣＡ試薬（商品名：タカラバイオ（株）社）２００μＬを各ウエルに入れて、３７℃で３０分間インキュベートした後、540nmの吸光度を測定した。【００４５】
また、コントロールとしてＰＢＳ（−）と、陽性対照としてアルブチン−ＰＢＳ（−）溶液（２.０％（w/v））を用いて同様の試験を行い、コントロールを１００としたときのメラニン量（相対比）及びタンパク量（相対比）を算出し、メラニン生成抑制度を調べた。その結果を表１に示す。また、そのときの三次元培養皮膚モデルの結果を示す写真を図２に示す。【００４６】
【表１】
2011158332.tif 000017
【００４７】
（ＴＬＣによる分画精製）
表１及び図２の結果から、図１の（Ｂ）に示されるヘキサン抽出画分が最も強いメラニン生成抑制度を示すことが分かった（図２の（ｄ））。そこで、この画分をさらに分取ＴＬＣ（分取薄層クロマトグラフィー）を用いて精製を進めた。【００４８】
ヘキサン抽出層から溶媒を留去した後、その濃縮物を少量のヘキサンに溶解し、分取用薄層プレート（シリカゲル６０・Ｆ２５４、メルク社、厚さ２ｍｍ）にて、ヘキサン及び酢酸エチルの混液（容量比７：３）を展開溶媒として分画を行った。検出は目視及び波長254／366nmのＵＶランプにより行った。その結果を図３に示す。図３に示すように、明確な３つのバンド（Ｓ１〜Ｓ３）とうっすらと観察された２つのバンド（Ｓ５、Ｓ７）並びに原点からテーリングした１つのバンド（Ｓ８）が観察された。そこで、図に示すように８つのバンド（バンドＳ１〜バンドＳ８）に分画した。分画された各バンド部分をかき取って酢酸エチルにて抽出した後、酢酸エチルを留去し、各分画成分を得た。【００４９】
次に上記分画成分について分画状況をＴＬＣにより確認した。各分画濃縮物の少量を再び少量のヘキサンに溶解した後、薄層プレート（シリカゲル６０・Ｆ２５４、厚さ０.２ｍｍ（メルク社））を用いて上記の展開溶媒による展開を行った。この結果を図４に示す。左側から順にバンドＳ１、Ｓ２、Ｓ３、・・Ｓ７、Ｓ８のヘキサン溶液をスポットしたレーンを示す。この結果、バンドＳ２では単一のスポットが検出された（ヨウ素による検出）。【００５０】
（メラニン生成抑制試験）
次に分画された試料についてメラニン生成抑制試験を行った。試験に際し、このＴＬＣの結果に基づいて、バンドＳ１、Ｓ２については各バンドをそれぞれ試料（試料Ｂ−１、試料Ｂ−２）として用い、バンドＳ３〜バンドＳ５、バンドＳ６〜Ｓ８については前記バンドをまとめたものをそれぞれ試料（試料Ｂ−３、試料Ｂ−４）として用いた。メラニン量及びタンパク量から求めたメラニン生成抑制度の結果を表２に示す。また、参考として、ガジュツエキス末（Ａ）及びヘキサン層の濃縮物（Ｂ）についても試験を行った。この結果、単一スポットが得られた試料Ｂ−２の画分が最も強いメラニン生成抑制度を示した。また、このときの三次元培養皮膚モデルの結果を示す写真を図５に示す。【００５１】
【表２】
2011158332.tif 000018
【００５２】
〔メラニン生成抑制物質の構造決定〕
表２に示すとおり、バンドＳ２の画分が最も強いメラニン生成抑制度を示し、また紫外部吸収による検出、ヨウ素による検出においても単一のスポットが確認できたので、この画分に存在するメラニン生成抑制物質の構造決定を行った。構造決定は、紫外部吸収スペクトルによる分析（溶媒：ヘキサン）、赤外吸収分析（ＩＲ）、質量分析、１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：CDCl3）及び１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：CDCl3）に基づき行った。その結果は次のとおりであり、各分析によるチャートを図６〜図１０に示す。また、ＮＭＲによる帰属を表３に示した。これらの結果から、生成されたメラニン生成抑制物質は、ゼデロンであると同定された。この物質のメラニン生成抑制度は、表２から理解されるように、これまで美白効果があるとされてきたアルブチンと対比して、アルブチン濃度の約１／４００の濃度でほぼ同等の効果を示し、その作用はアルブチンの約４００倍の強さがあると言える。【００５３】
性状：白色の結晶性固体
紫外部吸収：極大吸収波長（λmax）281nm
質量分析：246(m/e)
赤外吸収スペクトル（cm-1）:1662,1523,1427,1400,1232,1066,1020,929,881,863.【００５４】
【表３】
2011158332.tif 000019
【００５５】
【化１６】
2011158332.tif 000020
【００５６】
〔安定性の確認〕
上記方法で得たゼデロン１００ｍｇを５０％（v/v）エタノール水溶液２００ｍＬに溶解した液を高温（６０℃）下で、また、この液に０.５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨを加え終濃度０.１２５ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨとした液並びに０.５ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌを加え終濃度０.１２５ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌとした液を室温下で、それぞれ保存し、安定性の確認を行った。また、コントロールには同上のエタノール溶液を４℃で保管したものを使用した。安定性は、下記条件による高速液体クロマトグラフィーを行い、ピーク面積による百分率から残存率を求めることにより測定した。なお、アルカリ保存、酸保存したサンプル溶液はそれぞれ中和後に測定を行った。【００５７】
（分析条件）
カラム：Chemcobond  5-ODS-W（6.0×150（6A））（株式会社ケムコ社）
移動相：メタノール
カラム温度：55℃
流速：1.0mL／min
注入量：10μL
モニター：UV  280nm  吸光度【００５８】
その結果を表４に示した。アルブチンやエラグ酸などフェノール性の化合物はアルカリ域で褐変することはよく知られているが、ゼデロンに変化は認められなかった。また、酸性域では若干の低下が見られるもののアルカリ域及び高温条件下でも安定であることが判明し、ゼデロンは様々な物理的条件の組成物に配合することができ、また、様々な条件下で使用し得ることが明らかになった。【００５９】
【表４】
2011158332.tif 000021
［実施例２］【００６０】
次に、下記製造法に従い本発明の皮膚外用剤に含まれる一群の物質を調製した。
〔製造例１〕ゼデロン
ガジュツ（Curcuma zedoaria）の根茎乾燥物１ｋｇをヘキサン６Ｌに浸漬し、室温下で７日間放置して抽出した。その抽出液をフィルター（ADVANTEC No.131）にて濾過し、濾液を減圧下にて溶媒を留去した後、冷暗所で放置した。生成してきた結晶分を分取し、これを少量のヘキサンで洗浄した。更に、得た結晶分をヘキサンで再結晶を行い、ゼデロン３００ｍｇ（純度約９５％）を得た。純度は、上記液体クロマトグラフィーの条件で操作して求めた。実施例１で得られたゼデロンを標準品として用い、検出波長220nmにおけるピーク高さ比からゼデロンの定量を行った（製造例２においても同じ）。【００６１】
〔製造例２〕ゼデロン
ガジュツの根茎乾燥物１ｋｇを酢酸エチル６Ｌに浸漬し、室温下で４日間放置して抽出した。その抽出液をフィルター（ADVANTEC No.131）にて濾過し、濾液を減圧下にて溶媒を留去した後、移動層をヘキサンと酢酸エチルの混液（容量比７：３）を用いて、シリカゲルを充填剤とするカラムクロマトグラフィー（上記分析条件と同じ）による精製を行った。分画はフラクションコレクターにより行い、各フラクション毎に測定した波長280nmによる紫外部吸収を指標として分画を行った。吸収が見られた画分の溶媒留去物をヘキサンを用いて再結晶し、白色結晶２２００ｍｇ（ゼデロン含量２０００ｍｇ）を得た。【００６２】
〔製造例３〕フラノジエノン
ガジュツの根茎乾燥物３５０ｇをヘキサン１７５０ｍＬで３時間還流した。溶媒を濾別し、濃縮を行った。残渣にヘキサン１７５０ｍＬを加えて還流し、同操作を繰り返した。集めた抽出液を減圧下にて留去し、３.１２ｇの乾固物を得た。それを少量のヘキサン（約２０ｍＬ）に溶解し、不溶分を濾過後、シリカカラム（BW300（富士シリシア社）、φ=20mm、h=200mm）に付し、ヘキサン、ヘキサン：酢酸エチル（容量比９：１）、ヘキサン：酢酸エチル（容量比８：２）各１００ｍＬで順次溶出した。ヘキサン：酢酸エチル（容量比８：２）溶出画分を収集し、溶媒を留去して収量０.４８４ｇを得た。次いで、それを少量の７５％（v/v）メタノール水溶液に溶解し、下記条件のカラムに付した。フラクションコレクターで分取し、それぞれの画分について液体クロマトグラフィーを用いて下記条件で分析を行い、図１１のチャートにある＊１にあたる部分ピークのみを持つ画分を集め、溶媒を留去後、０.１０ｇ（収率０.０２８％）の白色の結晶性固体を得た。この画分に存在するメラニン生成抑制物質の構造決定を行った。構造決定は、紫外部吸収スペクトルによる分析（溶媒：ヘキサン）、赤外吸収分析（ＩＲ）、１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：CDCl3）に基づき行い、以下の物性値が得られた。紫外部吸収及び赤外吸収分析によるチャートを図１２及び図１３に示す。
これらの物性値から得られたメラニン生成抑制物質がフラノジエノンであることが判明した。【００６３】
カラム：Chemcobond 5-ODS-W（6.0×150(6A)）（株式会社ケムコ社）
移動相：メタノール：水＝７５：２５（v:v）
カラム温度：55℃
流速：1.0mL／min
注入量：10μＬ
検出波長：280nm【００６４】
紫外部吸収：極大吸収波長（λmax）：なし
赤外吸収スペクトル（cm-1）:1644,1523,1375,1270,1240,1105,1020,931
1H-NMRスペクトル:1.30(3H,s),1.99(3H,s),2.13(3H,s),1.85-2.49(4H,m),3.70(2H,m),5.17(1H,m),5.81(1H,s),7.07(1H,s).【００６５】
〔製造例４〕クルゼレノン
また、図１１のチャートにある＊２にあたる部分ピークのみを持つ画分を集め、溶媒を留去後、０.０７g（収率０.０２％）の透明油状液体を得た。この画分に存在するメラニン生成抑制物質の構造決定を行った。構造決定は、紫外部吸収スペクトルによる分析（溶媒：ヘキサン）、赤外吸収分析（ＩＲ）、１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：CDCl3）に基づき行い、以下の物性値が得られた。紫外部吸収及び赤外吸収分析によるチャートを図１４及び図１５に示す。
これらの物性値から得られたメラニン生成抑制物質がクルゼレノンであることが判明した。【００６６】
紫外部吸収：極大吸収波長（λmax）：272nm
赤外吸収スペクトル（cm-1）：1675,1562,1427,1257,1070,997
1H−NMRスペクトル：1.222(3H),1.658(3H),2.97(1H,q),2.262(3H),3.166(1H,d),3.249(1H,d),3.104(1H),5.028(1H,d),5.029(1H,d),5.039(1H,d),5.126(1H,d),5.729(1H,d),7.068(1H).【００６７】
〔製造例５〕水添ゼデロン
製造例２で得たゼデロン５００ｍｇを９９.５％（v/v）エタノール１００ｍＬに溶解し、５％Ｐｄ−アルミナ１００ｍｇを加え、水素バッグを用いて水添反応を行った。反応は室温下にて１５時間行った。反応終了後に濾過を行い、濾液の溶媒を減圧下にて留去し、５００ｍｇの白色の結晶性固体を得た。この画分に存在するメラニン生成抑制物質の構造決定を行った。構造決定は、紫外部吸収スペクトルによる分析（溶媒：ヘキサン）及び１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：CDCl3）に基づき行い、以下の物性値が得られた。紫外部吸収分析によるチャートを図１６に示す。
これらの物性値から得られたメラニン生成抑制物質が水添ゼデロンであることが判明した。【００６８】
紫外部吸収：極大吸収波長（λmax）：287nm
1H−NMRスペクトル：2.180(3H,m),1.008(3H,d),1.059(3H,d),7.093(1H),1.434(1H,d),1.604(1H,d),1.434(1H,d),1.653(1H,d),1.343(1H,d),1.474(1H,d),2.995(1H,d),2.454(1H,d),1.743(1H,d),1.657(1H,d),2.113(1H,d),1.776(1H,d),4.199(1H,d).【００６９】
〔製造例６〕水添フラノジエノン
製造例３で得たフラノジエノン５００ｍｇを９９.５％エタノール１００ｍＬに溶解し、５％Ｐｄ−アルミナ１００ｍｇを加え、水素バッグを用いて水添反応を行った。反応は室温下にて１５時間行った。反応終了後に濾過を行い、濾液の溶媒を減圧下にて留去し、５００ｍｇの白色の結晶性固体を得た。この画分に存在するメラニン生成抑制物質の構造決定を行った。構造決定は、紫外部吸収スペクトルによる分析（溶媒：ヘキサン）及び１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：CDCl3）に基づき行い、以下の物性値が得られた。紫外部吸収分析によるチャートを図１７に示す。
これらの物性値から得られたメラニン生成抑制物質が水添フラノジエノンであることが判明した。【００７０】
紫外部吸収：極大吸収波長（λmax）：なし
1H−NMRスペクトル：2.167(3H,m),0.467(3H,d),0.909(3H,d),6.594(1H),1.440(1H,d),1.579(1H,d),1.400(1H,d),1.779(1H,d),1.601(1H,d),1.366(1H,d),2.808(1H,d),2.676(1H,d),2.212(1H,d),1.884(1H,d),4.774(1H,d),3.665(1H,d).【００７１】
〔ヒト・メラノサイトを用いたメラニン生成抑制試験〕
（ヒト・メラノサイトの培養）
ヒト・メラノサイト（ＮＨＥＭ（Moderately）、クラボウ社）を、Medium254培地（成長因子ＨＭＧＳ−２含有）１０００μＬを入れた１２ウエルプレートに１ウエルあたり２.５×１０４個ずつ播き、翌日、培地に幹細胞増殖因子（ＳＣＦ、最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）、そして４時間後に被検試料を添加した。それを３７℃でインキュベートし、３日後に培地を交換して、ＳＣＦ（最終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を再添加後、４時間後に被検試料を添加し、３７℃にて７日間インキュベートした。その後、以下の方法に従ってメラニン量及びタンパク量を測定した。【００７２】
（メラニンの定量）
ウエル中の培地を取り除き、ＰＢＳ（−）５００μＬで細胞を３回洗浄した後にＰＢＳ（−）を完全に取り除いた。洗浄した細胞に２ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨ  ４００μＬを加えて細胞を溶解し、シェ−カーで３０分間振動させて細胞溶解物を調製した。各細胞溶解物を１.５ｍＬエッペンドルフチューブに移して１０分間沸騰湯で加熱し、Voltexミキサーで激しく攪拌した。その３５０μＬを９６ウエルに移し、405nmで吸光度を測定した。【００７３】
（タンパクの定量）
上記で得た細胞溶解物４０μＬをＢＣＡ溶液２００μＬと混合して、３７℃にて３０分間インキュベートした後、540nmで吸光度を測定した。【００７４】
〔製造例１〕及び〔製造例３〕〜〔製造例６〕で得られたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンについて、上述したメラニン及びタンパクの定量を指標としたメラニン生成抑制試験を行った。各成分によるメラニン及びタンパク量を表５に示す。〔製造例１〕及び〔製造例３〕〜〔製造例６〕で得られたゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンは、薄層クロマトグラフィーにより単離されたゼデロンとほぼ同程度ないしそれを超えるメラニン生成抑制効果が認められた。【００７５】
【表５】
2011158332.tif 000022
【００７６】
ゼデロン、フラノジエノン、クルゼレノン、水添ゼデロン及び水添フラノジエノンはすべて、美白効果を持つことで知られているアルブチンと比較して、細胞に対する毒性は弱く、極めて低い濃度で美白効果を示すことが確認された。【００７７】
また、上述した（メラニン生成抑制試験）と同様に、三次元皮膚培養モデルを用いて〔製造例１〕で得られたゼデロンについてメラニン生成抑制試験を行った。その結果を表６及び図１８に示す。〔製造例１〕で得られたゼデロンには、薄層クロマトグラフィーにより単離されたゼデロンとほぼ同程度のメラニン生成抑制効果が認められた。【００７８】
【表６】
2011158332.tif 000023
【００７９】
〔官能評価試験−美白効果〕
（被験者の選定）
健常肌を有する男性（２０〜５０歳）を６名選出した。【００８０】
（試料製剤）
（ｉ）アルブチン溶液（陽性対照；７質量％）
（ｉｉ）ゼデロン（２濃度；０.０１質量％、０.００２５質量％）
（ｉｉｉ）ガジュツエキス末（Ａ）（抽出乾燥物０.０５質量％）
（ｉｖ）有効成分−非含有
上記の合計５試料を用いて、８質量％の１,３−ブチレングリコール、５質量％のグリセリン、０.３質量％のポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（20E.O.）、０.２質量％のパラベン及び残余量の精製水と共に、自体公知の方法によって化粧水を調製し、試料製剤とした。【００８１】
（ヒトへの紫外線照射）
被験者６名の腹部皮膚に、紫外線照射部位（１.５×１.５ｃｍ）を設定し、最小紅斑量の１.５倍の中波長領域紫外線（デルマレイＭ−ＤＭＲ  ８０型、東芝医療用品）を照射した。照射日より、試料製剤を１日の朝夜に各１回ずつ４週間毎日の塗布を行った。紫外線照射から４週間後にそれぞれの部分を肉眼判定により、有効成分−非含有製剤（対照）の塗布部と各試料製剤の塗布部の色素沈着の回復度を以下の評価基準により判定した。【００８２】
（判定方法）
照射日より、４週間後に写真撮影及び、写真を評価基準に従い効果の判定を行った。
（評価基準）
【表７】
2011158332.tif 000024
【００８３】
（測定実施方法）
（１）まずはじめに、前回と同じ位置関係（状態）で写真撮影を行う。（前回データを見ながら：１回目の撮影は任意で行う）
（２）専門判定者１０名により、効果の判定を行った。【００８４】
（結果）
【表８】
2011158332.tif 000025
【００８５】
表８に示すように、ゼデロンには、美白効果を持つことが知られているアルブチンと比較して、極めて低い濃度で色素沈着の回復が認められ、実際のヒトの日焼け状態にある皮膚に対しても優れた美白効果を示すことが確認された。また、被験者の試料塗布部位においては、紅斑や湿疹などの皮膚刺激反応は認められず、ゼデロンが製剤の形態でも安全性が高いものであることが確認された。
［実施例３］【００８６】
〔官能評価試験−使用感〕
表９に示す処方に従って２質量％の油性成分にゼデロン０、０.００５又は０.０５質量％を併用した場合の使用感の向上を調べた。評価は２０名のパネリストにより行い、以下の基準に従って判定した。その結果を併せて表１０〜１２に示す。【００８７】
【表９】
2011158332.tif 000026
*製品名：ニッコールＨＣＯ−５０（日本サーファクタント工業(株)）
成分（Ａ）及び（Ｂ）を７５℃で均一に溶解し、（Ｄ）及び（Ｉ）を混合したものに（Ｃ）を溶解した水相を撹拌しながら添加した。（Ｆ）及び（Ｇ）を（Ｅ）で溶解したもの、（Ｈ）を（Ｉ）の一部に溶解したものを加えて試験組成物を調製した。【００８８】
判定基準：
◎：２０名中１５名以上が良好と評価した。
○：２０名中１０〜１４名が良好と評価した。
△：２０名中５〜９名が良好と評価した。
×：２０名中４名以下が良好と評価した。【００８９】
【表１０】
2011158332.tif 000027
【００９０】
【表１１】
2011158332.tif 000028
【００９１】
【表１２】
2011158332.tif 000029
【００９２】
表１０〜１２に示されるように、ゼデロンを配合しない比較例１〜４２では十分な効果が得られていないのに対して、ゼデロンを配合した実施例４〜８７では油性成分特有のベタツキ感が顕著に改善され、塗布後のなめらかさがある優れた使用感が得られる結果が示された。【００９３】
表１３に示す処方に従って水溶性成分にゼデロン０、０.００５又は０.０５質量％を併用した場合の使用感の向上を調べた。評価は２０名のパネリストにより行い、以下の基準に従って判定した。その結果を併せて表１４〜１６に示す。【００９４】
【表１３】
2011158332.tif 000030
成分（Ａ）に（Ｇ）を加えて混合し、順じて（Ｂ）を（Ｇ）の一部で分散したもの、（Ｄ）及び（Ｅ）を（Ｃ）で溶解したもの、（Ｆ）を（Ｇ）の一部で溶解したものを加えて試験組成物を調製した。【００９５】
判定基準：
◎：２０名中１５名以上が良好と評価した。
○：２０名中１０〜１４名が良好と評価した。
△：２０名中５〜９名が良好と評価した。
×：２０名中４名以下が良好と評価した。【００９６】
【表１４】
2011158332.tif 000031
*製品名：ショートーシュガーエステルＳ−１６７０（三菱化学フーズ(株)）
**製品名：エマゾールＬ−１２０（花王(株)）
***製品名：ニッコールＰＥＮ−４６３０（日本サーファクタント工業(株)）
****製品名：ニッコールＨＣＯ−５０（日本サーファクタント工業(株)）
****製品名：サンファクト５ＧＭＭ−Ｚ（太陽化学(株)）【００９７】
【表１５】
2011158332.tif 000032
【００９８】
【表１６】
2011158332.tif 000033
【００９９】
表１４〜１６に示したように、ゼデロンを配合しない比較例４３〜６０では十分な効果が得られていないのに対して、ゼデロンを配合した実施例８８〜１２３では水溶性成分特有のベタツキ感が顕著に改善され、なじみ感に優れた使用感が得られる結果が示された。【０１００】
表１７に示す処方に従って高分子にゼデロン０、０.００５又は０.０５質量％を併用した場合の使用感の向上を調べた。評価は２０名のパネリストにより行い、以下の基準に従って判定した。その結果を併せて表１８〜２０に示す。【０１０１】
【表１７】
2011158332.tif 000034
*製品名：エマゾールＬ−１２０（花王(株)）
成分（Ａ）に（Ｂ）を加えて分散後、（Ｈ）を加える。順じて（Ｃ）、（Ｅ）及び（Ｆ）を（Ｄ）で溶解したもの、（Ｇ）を（Ｈ）の一部で溶解したものを加えて試験組成物を調製した。【０１０２】
判定基準：
◎：２０名中１５名以上が良好と評価した。
○：２０名中１０〜１４名が良好と評価した。
△：２０名中５〜９名が良好と評価した。
×：２０名中４名以下が良好と評価した。【０１０３】
【表１８】
2011158332.tif 000035
*製品名：マリンコラーゲン（フェノキシタイプ０.８％）（片倉チッカリン(株)）【０１０４】
【表１９】
2011158332.tif 000036
【０１０５】
【表２０】
2011158332.tif 000037
【０１０６】
表１８〜２０に示したように、ゼデロンを配合しない比較例６１〜７４では十分な効果が得られていないのに対して、ゼデロンを配合した実施例１２４〜１５１では高分子特有のベタツキ感が顕著に改善され、きしみ感が改善されて塗布後のなめらかさがある優れた使用感が得られる結果が示された。
［実施例１５２］【０１０７】
以下に、使用感が改善された本発明の皮膚外用剤の処方例を挙げる。
＜処方例＞
＜処方例１＞化粧水                                      （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．０．）１.５
１，３−ブチレングリコール                                ３.０
グリセリン                                                ３.０
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
香料                                                      適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１０８】
＜処方例２＞化粧料クリーム                              （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０５
ミツロウ                                                  ２.０
ステアリルアルコール                                      ５.０
ステアリン酸                                              ８.０
スクワラン                                              １０.０
自己乳化型グリセリルモノステアレート                      ３.０
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０．）          １.０
プロピレングリコール                                      ５.０
水酸化カリウム                                            ０.３
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
香料                                                      適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１０９】
＜処方例３＞乳液                                        （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０５
スクワラン                                                ８.０
ワセリン                                                  ２.０
ミツロウ                                                  ０.５
ソルビタンセスキオレエート                                ０.８
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．０．）        １.２
カルボキシビニルポリマー                                  ０.２
プロピレングリコール                                      ０.５
水酸化カリウム                                            ０.１
エタノール                                                ７.０
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
香料                                                      適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１０】
＜処方例４＞美容液                                      （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
ソルビトール                                              １.０
１，３−ブチレングリコール                                ５.０
アスコルビン酸リン酸マグネシウム                          ０.５
ＰＯＥモノラウリン酸ソルビタン                            ０.４
寒天                                                      １.０
ネイティブジェランガム                                    ０.５
トリメチルグリシン                                        １.０
防腐剤                                                    適  量
ｐＨ調整剤                                    （ｐＨ８.０に調整）
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１１】
＜処方例５＞化粧水                                      （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
キサンタンガム                                            ０.０５
グリセリン                                                ５.０
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．０．）１.５
エタノール                                                ８.０
クエン酸トリエチル                                        ２.０
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１２】
＜処方例６＞化粧水                                      （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
トレハロース                                              ０.５
グリセリン                                                ２.０
１，３−ブチレングリコール                                ７.０
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（２０Ｅ．０．）１.５
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１３】
＜処方例７＞乳液                                        （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０１０
水添ゼデロン                                              ０.０１０
スクワラン                                                ８.０
ワセリン                                                  ２.０
ミツロウ                                                  ０.５
ソルビタンセスキオレエート                                ０.８
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．０．）        １.２
カルボキシビニルポリマー                                  ０.０４
ジグリセリン                                              ３.０
水酸化カリウム                                            ０.１
エタノール                                                ７.０
香料                                                      適  量
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１４】
＜処方例８＞乳液                                        （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０５
フラノジエノン                                            ０.０１０
スクワラン                                                ６.０
ホホバ油                                                  ２.０
ワセリン                                                  ２.０
ミツロウ                                                  ０.５
ソルビタンセスキオレエート                                ０.８
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０Ｅ．０．）        １.２
カルボキシビニルポリマー                                  ０.２
１，３−ブチレングリコール                                ５.０
水酸化カリウム                                            ０.１
香料                                                      適  量
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１５】
＜処方例９＞美容液                                      （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０５
POB(3)POE(8)POP(5)グリセリルエーテル                      ５.０
スクワラン                                                ６.０
流動パラフィン                                            ２.０
ワセリン                                                  ２.０
ミツロウ                                                  ０.５
ソルビタンセスキオレエート                                ０.８
カルボキシビニルポリマー                                  ０.２
グリセリン                                                １.５
エタノール                                                ７.０
防腐剤                                                    適  量
水酸化カリウム                                            適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１６】
＜処方例１０＞美容液                                    （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０５
クルゼレロン                                              ０.００５
モノステアリン酸グリセリル                                ０.７
セスキオレイン酸ソルビタン                                １.７
ステアリン酸                                              ０.３
セラミド                                                  ０.０５
スクワラン                                                ３.５
グリチルレチン酸エステル                                  ０.０５
ヒドロキシステアリン酸コレステリル                        １.０
メドフォーム油                                            ２.０
ホホバ油                                                  ３.５
ラウロイルグルタミン酸ジ（オクチルドデシル／
フィトステアリル／ベヘニル）                          １.０
寒天                                                      ０.０５
ショ糖脂肪酸エステル                                      ０.２０
１，３−ブチレングリコール                                ６.０
グリセリン                                                ４.５
トリメチルグリシン                                        １.５
シリコン樹脂                                              ０.０５
ヒアルロン酸                                              ０.０５
酸化防止剤                                                適  量
防腐剤                                                    適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１７】
＜処方例１１＞パック剤                                  （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
酢酸ビニル樹脂エマルジョン                              １５.０
ポリビニルピロリドン                                      ０.３
ポリビニルアルコール                                    １０.０
ホホバ油                                                  ３.０
グリセリン                                                ５.０
酸化チタン                                                ８.０
カオリン                                                  ７.０
エタノール                                                ５.０
香料                                                      適  量
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１８】
＜処方例１２＞軟膏                                      （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
フラノジエノン                                            ０.００５
クルゼレノン                                              ０.００５
パラジメチルアミノ安息香酸オクチル                        ４.０
ブチルメトキシベンゾイルメタン                            ４.０
ベヘニルアルコール                                        ２.０
ステアリルアルコール                                    １７.０
モクロウ                                                ２０.０
グリセリンモノステアリン酸エステル                        ０.３
ワセリン                                                ３３.０
香料                                                      適  量
防腐剤・酸化防止剤                                        適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１１９】
＜処方例１３＞クリームファンデーション                  （質量％）
ゼデロン                                                  ０.０５
タルク                                                    ５.０
セリサイト                                                ８.０
酸化チタン                                                ５.０
色顔料                                                    適  量
モノイソステアリン酸ポリグリセリル                        ３.０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５０Ｅ．Ｏ．）            １.５
イソノナン酸イソトリデシル                                ２.０
軽質流動イソパラフィン                                    ２.０
水素添加ホホバ油                                          ２.０
１，３−ブチレングリコール                                ５.０
酸化防止剤                                                適  量
防腐剤                                                    適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０【０１２０】
＜処方例１４＞日焼け止め化粧料                          （質量％）
ゼデロン                                                  ０.００５
水添フラノジエノン                                        ０.０１０
酸化チタン                                              １０.０
酸化亜鉛                                                １０.０
PEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン                １.５
ラウリルPEG-９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン        １.５
シクロペンタシロキサン                                  ２０.０
ジメチコン                                              １０.０
（ジメチコン／ビニルジメチコン）クロスポリマー            ０.５
セチルジメチコン                                          ０.２５
グリチルレチン酸エステル                                  ０.０５
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（５０Ｅ．Ｏ．）            ０.１
メチルグルセス−２０                                      １.０
１，３−ブチレングリコール                              １０.０
塩化ナトリウム                                            適  量
酸化防止剤                                                適  量
防腐剤                                                    適  量
精製水                                                    残  部
合  計                                                １００.０
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明は、特に美白効果に優れ、さらには優れた使用感が得られ、皮膚を健やかに保つことができる皮膚外用剤の分野に関する。
【図１】
2011158332.tif 000047
【図３】
2011158332.tif 000048
【図４】
2011158332.tif 000049
【図６】
2011158332.tif 000050
【図７】
2011158332.tif 000051
【図８】
2011158332.tif 000052
【図９】
2011158332.tif 000053
【図１０】
2011158332.tif 000054
【図１１】
2011158332.tif 000055
【図１２】
2011158332.tif 000056
【図１３】
2011158332.tif 000057
【図１４】
2011158332.tif 000058
【図１５】
2011158332.tif 000059
【図１６】
2011158332.tif 000060
【図１７】
2011158332.tif 000061
【図２】
2011158332.tif 000062
【図５】
2011158332.tif 000063
【図１８】
2011158332.tif 000064
【国際調査報告】
2011158332.tif 000065
2011158332.tif 000066