(57)【要約】  アフリカ豚コレラウイルス（ASFV）は接触伝染性でしばしば致死的な、家畜豚のウイルス疾患の病因体である。アフリカ豚コレラ（ASF）のコントロールは、ワクチンが利用可能でないことによって妨げられてきた。自然発生のASFV、細胞培養適応化ASFV、または遺伝子改変された生きた弱毒化ASFVから実験的ワクチンが作られてきた。しかしながらこれらのワクチンは同類ウイルスに対して防護する場合にのみ成功していた。本開示では、高度に毒性なASFVジョージア2007（ASFV-G）単離株から特定の毒性関連9GL (B119L)遺伝子およびUK (DP96R)遺伝子を欠損させることにより得られた組換えΔ9GL/ΔUKウイルスが構築された。インビボでブタに筋肉内投与されたASFV-GΔ9GL/ΔUKは、比較的高い用量（106 HAD50）においてさえも疾患を引き起こさなかった。重要なことに、104または106 HAD50で感染された動物は、感染28日後に毒性親株ジョージア2007で攻撃される場合に臨床的疾患の呈出に対して堅固に防護される、
2019520827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えASFV-G（アフリカ豚コレラウイルス・ジョージア2007単離株）変異体である変異体ASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルスであって、変異体ASFV-GΔ9GL/ΔUKポリペプチドをコードするcDNAを含み、前記変異体のcDNAは、ASFV-Gの非変異の野生型9GLタンパク質よりも58個少ないアミノ酸を含み第11〜第68アミノ酸が欠損した変異体9GLタンパク質をもたらす、173ヌクレオチドの欠損と、ASFV-Gの非変異の野生型UKタンパク質よりも85個少ないアミノ酸を含み第1〜第85アミノ酸が欠損した変異体UKタンパク質をもたらす、255ヌクレオチドの第2の欠損という、2つの欠損を含む、変異体ASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルス。
【請求項２】
前記cDNAが配列番号３である、請求項１に記載の変異体cDNA。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組換え変異体ASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルスを含む、ワクチン組成物。
【請求項４】
アフリカ豚コレラウイルス・ジョージア2007単離株（ASFV-G）に対してブタを防護するための方法であって、請求項１または２に記載の組換え変異体ASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルスを含む弱毒化ASFV-GΔ9GL/ΔUK生ワクチンを、臨床的ASF-Gからブタを防護するために有効な量において前記ブタに投与することを含む、方法。
【請求項５】
臨床的ASF-Gからブタを防護するために有効な前記量は、104 HAD50〜106 HAD50のASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルスを含むワクチンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の組換え変異体ASFV-GΔ9GL/ΔUKを含む弱毒化ASFV-GΔ9GL/ΔUK生ワクチンでワクチン接種された哺乳類動物を、ASFV-Gで感染された非ワクチン接種哺乳類動物から区別する方法であって、
a）評価される必要がある試験哺乳類動物からサンプルを得ること、および
b）野生型ASFV-Gには通常存在するが、前記試験哺乳類動物にワクチン接種するために使用されるASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルスにおいては存在しない遺伝子の存在について前記サンプルを分析すること
を含む方法。
【請求項７】
前記サンプルを分析する工程は、PCRに基づくアッセイを用いて行われる、請求書６に記載の方法。
【請求項８】
前記分析する工程は、抗体検出アッセイまたはELISAによって行われる、請求書６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度毒性のジョージア2007単離株ASFV-Gのための、組換えアフリカ豚コレラウイルス（ASFV：African Swine Fever Virus）生弱毒化候補株ワクチンの構築に関する。このワクチンはASFV-GΔ9GLΔUK改変ウイルスを含み、これは9GL (B119L)遺伝子およびUK (DP96R)遺伝子の大部分を削除することにより改変された組換えASFV-Gである。
【背景技術】
【０００２】
アフリカ豚コレラ（ASF：African Swine Fever）はブタの伝染性ウイルス疾患である。病原体であるASFウイルス（ASFV）は、およそ190キロベースペアの二本鎖DNAゲノムを含有する大きなエンベロープウイルスである。ASFVは、Poxviridae、Iridoviridae、およびPhycodnaviridaeを含む他の大きな二本鎖DNAウイルスとゲノム構造および複製戦略の諸側面を共有している（Costard et al. 2009. Phil. Trans. Royal Soc. B 364:2683-2696）。家畜豚におけるASFV感染はしばしば致命的であり、発熱、出血、運動失調、および重度抑うつにより特徴づけられる。しかしながら、感染の経過は様々であり、宿主の特徴および具体的なウイルス株に依って高度に致死的な場合から無症状性の場合にまで渡る（Tulman et al. 2009. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 328:43-87）。
【０００３】
現在、この病気は、20か国を超えるサブサハラアフリカの国々において風土病となっている。欧州では、サルデーニャ島（イタリア）でASFがいまだに風土病となっており、2007年以来コーカサス地方で新たな大流行が宣告され、ジョージア、アルメニア、アゼルバイジャン、およびロシアが影響を受けている。ウクライナ、ベラルーシ、リトアニア、ラトビア、およびポーランドにおいて孤立した大流行が最近報告されており、近隣諸国へのさらなる広がりのリスクを呈している。流行性ウイルスであるASFVジョージア2007/1はII型ゲノタイプに属する高度毒性の単離株である（Chapman et al. 2011. Emerging Infect. Dis. 17:599-605）。
【０００４】
現在、ASFについて利用可能なワクチンは存在せず、疾患の大流行は動物の隔離および屠殺によりコントロールされている。感染細胞の抽出物、感染豚の末梢血白血球の上清、精製され不活性化されたビリオン、グルタルアルデヒド固定された感染マクロファージ、または界面活性剤処理された感染肺胞マクロファージを用いて、動物をワクチン接種する試みは、防護的免疫を誘導できなかった（Coggins, L. 1974. Prog. Med. Virol. 18:48-63；Forman et al. 1982. Arch. Virol. 74:91-100；Kihm et al. 1987. In: African Swine Fever, Becker, Y. (ed), Martinus Nijhoff, Boston, pp 127-144；Mebus, C. A. 1988. Adv. Virus Res. 35:251-269）。ウイルス感染を生き残ったブタにおいては同種（Homologous）防護免疫が生じる。ASFVの中度毒性または弱毒化バリアントによる急性感染を生き残ったブタは、同種ウイルス攻撃に対する長期耐性を発達させるが、異種（heterologous）ウイルス攻撃に対する長期耐性はめったに発達させない（Hamdy and Dardiri. 1984. Am. J. Vet. Res. 45:711-714；Ruiz-Gonzalvo et al. 1981. In: FAO/CEC Expert Consultation in ASF Research, Wilkinson, P. J. (ed), Rome, pp 206-216）。特定のASFV毒性関連遺伝子の人工欠損を含む生きた弱毒化ASFウイルスで免疫化されたブタは、同種親ウイルスで攻撃された際に防護された。具体的には、病原性ASFウイルス（マラウイLil-20/1、プレトリアスコップ/96/4、E70、およびジョージア2007）のゲノムからのUK (DP69R)、23-NL (DP71L)、TK (A240L)、または9GL (B119L)遺伝子の個別の欠損は、ブタにおいてウイルスを著しく弱毒化させ、これらの弱毒化ウイルスで免疫化された動物は同種ウイルスによる攻撃に対して防護された（Moore et al. 1998. J. Virol. 72:10310-10315；Lewis et al. 2000. J. Virol. 74:1275-1285；Zsak et al. 1996. J. Virol. 70:8865-8871；Zsak et al. 1998. J. Virol. 72:1028-1035）。これらの観察は、ASFVに対して有効な生きた弱毒化ウイルスの合理的開発を記述する唯一の実験的証拠を構成する。
【０００５】
特に、高度毒性ASFV単離株であるマラウイLil-20/1、プレトリアスコップ/96/4、およびジョージア2007における9GL (B119L)の欠損（Lewis et al.、上記；Neilan et al. 2004. Virol. 319:337-342；O’Donnell et al. 2015. J. Virol. 89: 8556-8566）は、ブタにおいてこれらウイルスの完全な弱毒化をもたらした。比較的高いウイルス量でのIM注射によるマラウイLil-20/1Δ9GLまたはプレトリアスコップ/96/4 Δ9GLまたはE70 ΔUK変異体のブタへの投与は、臨床的兆候を誘発せず、全ての動物がその感染を生き残った。さらに、これらのウイルスを用いたブタのIM接種は、毒性親ウイルスによる攻撃に対する防護を誘導した（Zsak et al. 1998、上記；Lewis et al.、上記；O’Donnell et al.、上記）。これらの観察は、ASFVに対して有効な生きた弱毒化ウイルスの合理的開発を記述する唯一の実験的証拠を構成する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在利用可能なASFVワクチンは存在しないため、疾患の致死的顕出に対して何らかの種類の防護を誘導し得る実験的ワクチンの開発は大きな関心事である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は、ASFV-G（アフリカ豚コレラウイルス・ジョージア2007単離株）の改変物である新規の組換え変異体ASFV-G Δ9GL/ΔUKウイルスを開発した。
【０００８】
この発見に従って、本発明の1つの目的は、新規変異体ASFV-G Δ9GL/ΔUKウイルスを提供することであり、これは親株ASFV-Gの9GL (B119L)遺伝子とUK (DP96R) 遺伝子との両方の大部分の欠損からもたらされるものである。ASFV-G Δ9GL/ΔUKのヌクレオチド配列（配列番号3）は、野生型ASFV-Gをコードするヌクレオチド配列（配列番号1）とは異なっている。ASFV-G（野生型）9GLにコードされる119アミノ酸のタンパク質（配列番号2）およびASFV-G（野生型）UKにコードされる95アミノ酸のタンパク質（配列番号25）は、ASFV-G Δ9GL/ΔUKの変異体ヌクレオチド配列（配列番号3）によりコードされる変異体の9GLおよびUKタンパク質とは異なっている。61アミノ酸の変異体9GLポリペプチド（配列番号4）は、野生型9GLポリペプチド（配列番号2）のアミノ酸番号11からアミノ酸番号68までの欠損によりもたらされ、10アミノ酸の変異体UKポリペプチド（配列番号26）は、野生型UKポリペプチド（配列番号25）のアミノ酸番号1からアミノ酸番号85までの欠損によりもたらされる。
【０００９】
本発明の1つの追加の目的は、ASFV-G Δ9GL/ΔUK生ウイルスを含む免疫原性組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の1つの追加の目的は、病原性ASFV-Gにより攻撃された際に動物を臨床的ASF疾患から防護するために有効な、合理的に設計された弱毒化ASFV-G Δ9GL/ΔUK生ワクチンを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる1つの目的は、ワクチン接種した動物とASFV-Gに感染した動物とを見分けることができる可能性を有する遺伝子マーカーワクチンを提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる1つの目的は、合理的に設計された弱毒化ASFV-G Δ9GL/ΔUK生ワクチンの有効量を投与することによって動物をASFV-Gから防護するための方法を提供することである。
【００１３】
本発明の1つの追加の目的は、上記合理的に設計された弱毒化ASFV-G Δ9GL/ΔUK生ワクチンでワクチン接種された動物と、ASFV-Gに感染した動物とを見分けるための方法であって、ワクチン接種された動物を野生型被感染動物から区別するための遺伝学的DIVA戦略を含む方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的と利点は、下記説明から容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1Aおよび1Bは、ASFV-G 9GL (B119L)遺伝子にコードされるポリペプチド（図1A）およびASFV-G UK (DP96R)遺伝子にコードされるポリペプチド（図1B）の配列アラインメントを示す。様々な時期的および地理的起源の単離株（マダニおよびブタの入手源から得られたものを含む）が比較された。ASFV-Gに導入されてASFV-GΔ9GL/ΔUKウイルスを生じさせた部分的欠損は括弧内に示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
我々は、ASFV-G 9GL (B119L)遺伝子およびASFV-G UK (DP96R)遺伝子の両方を遺伝子改変の標的とするアプローチを通して、ワクチン候補として使用することができる弱毒化ウイルスを開発した。ここに我々は、高度毒性のASFVジョージア2007単離株（ASFV-G）の組換えΔ9GL/ΔUKウイルスの構築を報告する。比較的高い用量（104または106 HAD50）でブタに筋肉内（IM）投与されたASFV-GΔ9GL/ΔUKは疾患を誘発しない。104または106 HAD50で感染された動物は、感染の28日後に毒性親株ジョージア2007に攻撃される際に、臨床的疾患の呈示に対して防護される。
【００１７】
ASFVからの4つの異なる遺伝子の独立した欠損が毒性ウイルスを弱毒化することは示されていたものの、そして、ASFV E75からのNL (DP71L) 遺伝子（Zsak et al. 1996、上記）またはUK (DP69R) 遺伝子（Zsak et al. 1998、上記）の独立した欠損、ベロ細胞に適応されたASFVすなわちマラウイLil-20/1およびハイチからのTK (A240L)遺伝子の欠損（Moore et al.、上記）、ならびに、やはりマラウイLil-20/1単離株からの9GL (B119L)遺伝子の欠損（Lewis et al.、上記）およびプレトリアスコップ/96/4単離株からの同遺伝子の欠損（Neilan et al.、上記）がブタにおける組換え欠損変異体ウイルスの毒性を有意に低減させたものの、これらすべての例において、これら遺伝子改変された各ウイルスで接種された動物は感染を生き残って、対応する毒性親ウイルスによる攻撃すなわち同種攻撃を受ける際にASFVに対して防護されるようになった（Lewis et al.、上記；Moore et al.、上記；Neilan et al.、上記；Zsak et al. 1996、上記；Zsak et al. 1998、上記）。これらの発見は、標的遺伝子の遺伝子操作による弱毒化ASFV組換えウイルスの開発が、ワクチン開発のための有効なアプローチであることを示唆している。
【００１８】
しかしながら、他のASFV単離株におけるそれらの有効性のレベルは予測不可能である。例えば、NL (DP71L)遺伝子産物は、ASFV単離株に応じて、2つの異なる形態、すなわち長い形態（23-NLのように184アミノ酸）または短い形態（70〜72アミノ酸）が存在する（Zsak et al. 1996、上記）。ASFV E70単離株におけるこの遺伝子（短い形態）の欠損は弱毒化ウイルスをもたらしたが、ASFVマラウイLil-20/1（長い形態）またはプレトリアスコップ/96/4（短い形態）からのNL (DP71L)遺伝子の欠損はウイルスの弱毒化を引き起こさなかった（Afonso et al. 1998. J. Gen. Virol. 79 (Pt. 10):2543-2547）。全てのASFV単離株のあいだで高度に保存されておりDNA合成に関与する遺伝子であるTK (A240L)遺伝子の欠損が、ベロ細胞適応化病原性マラウイLil-20/1およびハイチH811ウイルスに導入された。マラウイLil-20/1変異体ウイルスは、インビボで復帰変異体ウイルス（野生型様ウイルス）よりも毒性が低かったが、完全には弱毒化されていなかった（Moore et al.、上記）。UK (DP69R)遺伝子はある種のASFV単離株の右側可変領域に位置する。ASFV E70単離株からこの遺伝子を欠損させると、ウイルスが低減された毒性を示すようになった（Zsak et al. 1998、上記）。UK (DP69R)遺伝子は保存されているが、全てのASFV単離株に存在するわけではなく（例えばマラウイLil-20/1）、弱毒化ウイルスを産生するための候補標的遺伝子としてのその使用は制限される。
【００１９】
9GL (B119L)遺伝子は、マダニおよびブタの両方の入手源からのものを含めこれまで単離され配列決定されてきたASFVのあいだで高度に保存されている。毒性であるマラウイLil-20/1（Lewis et al.、上記）およびプレトリアスコップ/96/4（Neilan et al.、上記）からのこの遺伝子の欠損がブタにおける毒性を効果的に低減させ防護を誘導したという事実は、9GL (B119L)を、ASFVに対する有効な防護を提供し得る弱毒化ウイルスの改変および産生のための有力な候補標的遺伝子とする。実際のところ、ASFV-G単離株からの9GL (B119L)の欠損は、弱毒化および防護に関してマラウイLil-20/1およびプレトリアスコップ/96/4について報告されているものと同じ効果は有していなかったことを我々は見出した。ASFV-G Δ9GLはブタに低用量で投与された場合にのみ、ウイルス弱毒化の減少を観察することが可能であった（O’Donnell et al.、上記）。ASFV-G Δ9GLの致死未満用量が、同類親ウイルスによる攻撃後の臨床的疾患の呈示に対する有効な防護を誘導することができたことも我々は示した。E70（短い形態）およびマラウイLil-20/1（長い形態）によりコードされるNLタンパク質は著しく異なっており、このことが、対応する欠損変異体ウイルスで接種されたブタにおいて観察された表現型の差異を説明しているかもしれない。しかしながら、タンパク質同一性マトリックスでは9GLタンパク質はASFV-G、マラウイLil-20/1およびプレトリアスコップ/96/4で93%を超えるアミノ酸同一性が共有されていて、ASFV単離株のあいだで高度に類似していることが示されており、ASFVの弱毒化がタンパク質の相違のみに依存することは考えにくい。よく観察される表現型はおそらく複数の遺伝子の作用により媒介されるため（Lewis et al.、上記；Moore et al.、上記；Neilan et al.、上記；Zsak et al. 1996、上記；Zsak et al. 1998、上記）、これまで蓄積した証拠では、ASFVジョージア2007単離株における毒性を媒介する遺伝子のスペクトラムが一体何であるのかを推測することは困難である。
【００２０】
要約すると、本明細書では、9GL (B119L)遺伝子とUK (DP69R)遺伝子の両方の削除が弱毒化組換えASFV-G Δ9GL/ΔUKウイルスをもたらすことの証拠が提示される。ASFV-G Δ9GL/ΔUKを比較的高い用量（104または106 HAD50）でブタに筋肉内投与しても疾患を誘発しない。104または106 HAD50で感染された動物は、感染28日後に毒性の親株ジョージア2007に攻撃されても臨床的疾患の呈出に対して防護される。
【００２１】
本明細書においてワクチンとは、それが送達された動物において防護的応答を提供する能力があるが深刻な疾患を引き起こす能力はない生物学的作用剤として定義される。ワクチンの投与は疾患からの免疫をもたらす。すなわちワクチンは、疾患を引き起こす病原体に対する抗体産生または細胞性免疫を刺激する。本明細書において免疫とは、ブタの個体群において、ワクチン接種後に、非ワクチン接種群と比較して致死および臨床的症状に対する有意に高いレベルの防護が誘導されることとして定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種された動物の大部分を疾患の臨床的症状および致死の発生に対して防護する。本明細書に記載される発明のワクチンは、遺伝子工学操作された変異体ウイルスワクチンである。遺伝子マーカーワクチンとは、診断的試験と組み合わされた際に、ワクチン接種された動物を感染動物から遺伝学的に区別することを可能にするワクチンとして定義される。欠損変異体は、感染動物とワクチン接種動物を区別するために使用することができる。変異とは、天然の9GLおよびUKタンパク質を発現することができる親ASFV-G株の「野生型」あるいは未改変の9GL (B119L)およびUK (DP96R)遺伝子の遺伝学的情報における変化として理解される。すなわち、ASFV-G Δ9GL/ΔUK変異体ウイルスにより発現される9GLおよびUKポリペプチドは変化を受けている。ASFV-G Δ9GL/ΔUKからの9GLタンパク質は、野生型9GLおよび野生型UKのどちらよりも少ないアミノ酸を有しており、これは、ASFV-G Δ9GLの9GLポリペプチドにおいては第11番アミノ酸から第68番アミノ酸までが欠損し、UKポリペプチドにおいては第1番アミノ酸から第85番アミノ酸までが欠損しているからである。ASFV-G Δ9GL/ΔUK組換えASFV-G変異体は、ASFV-G 9GLおよびUKポリペプチドにおける変異をコードするヌクレオチドを含んでいる。変異は、9GLタンパク質の58アミノ酸の欠損およびUKタンパク質の85アミノ酸の欠損を含んでいる。組換えASFV-G変異体ASFV-G Δ9GL/ΔUKは、104 HAD50〜106 HAD50のIM接種用量において使用された場合に、弱毒化ASFV-G生ワクチンとなる。
【００２２】
上記で定義されたASFV-G Δ9GL/DUK変異体の生きた形態と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、ASFV-Gに対するワクチンが提供される。生きたウイルスを含有する本発明によるワクチンは、懸濁物の形態または凍結乾燥形態で調製して市場に出すことができ、そのような組成物のために慣習的に使用される薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含有する。担体としては、安定化剤、保存剤、および緩衝剤が挙げられる。適切な安定化剤は、例えば、SPGA（スクロース、ホスフェート、グルタメート、およびヒトアルブミン）、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストラン、グルタメート、またはグルコース）、タンパク質（例えば乾燥乳清、アルブミン、またはカゼイン）、またはそれらの分解産物である。適切な緩衝剤は例えばリン酸アルカリ金属塩である。適切な保存剤はチメロサール、マーサイアレイト（merthiolate）、およびゲンタマイシンである。希釈剤としては水、水性緩衝液（例えば緩衝食塩水）、アルコール、およびポリオール（例えばグリセロール）が挙げられる。
【００２３】
望まれるのであれば、本発明による生ワクチンはアジュバントを含んでもよい。アジュバント活性を有する適切な化合物および組成物の例は本技術分野でよく知られている。さらに、医薬的または診断的アプリケーションのためのポリペプチド（特に、リンホカイン、インターフェロン、またはサイトカインのような免疫調節因子）をコードする核酸配列がワクチンに組み入れられ得る。
【００２４】
本発明によるワクチンは、市販の弱毒化ASFV生ワクチンのために一般的に使用されているもののような従来的方法によって調製することができる。手短に述べると、感受性の基質（substrate）をASFV-G Δ9GL/ΔUK変異体で接種し、望まれるタイターにまでウイルスが複製するまで増殖させ、その後ASFV-G Δ9GL/ΔUK含有物質が収穫される。それから、その収穫された物質が、免疫化特性を有する医薬調製物へと製剤化される。
【００２５】
ブタ末梢血マクロファージの一次培養物を含め、ASFV-G Δ9GL/ΔUKウイルスの複製をサポートできるあらゆる基質を本発明において使用することができる。
【００２６】
ワクチンは、ASFV-Gの毒性株による攻撃に対して動物を防護するために有効な量において、筋肉内、皮下、もしくは鼻腔内の接種または注射によって投与され得る。この量は、接種される動物に応じて、その動物の大きさと重量を考慮に入れて変動し得る。
本発明によるワクチンは、活性成分としてASFV-G Δ9GL/ΔUK変異体の有効用量、すなわち、ワクチンを接種される動物であるブタに毒性ASFV-Gによる攻撃に対する免疫を誘導する免疫化ASFV-G Δ9GL/ΔUK材料の量を含む。本明細書において、免疫とは、非ワクチン接種群と比較してワクチン接種後のブタの集団において致死および臨床的症状からの防護の有意に高いレベルが誘導されることとして定義される。特に、本発明によるワクチンは、ワクチン接種された動物の大部分において疾患の臨床的症状および致死を防止する。典型的には、生ワクチンが、104 HAD50〜106 HAD50の用量で投与され得る。有効量は、必要に応じて、例えば実施例6により提供されている手引きに従って当業者により実験的に決定され得る。
【００２７】
本発明は、ASFV-G Δ9GL/ΔUK変異体に加えて、別のブタ病原体に対する防護を誘導することができるワクチン株を含む組合せワクチンも含み得る。
【００２８】
診断的方法と合わせた、上述のASFV-G Δ9GL/ΔUKワクチンは、それによってワクチン接種された動物と、天然のASFV-G株で感染された動物または従来型のASFV-Gワクチンでワクチン接種された動物とを見分けることができる可能性を有している。
【００２９】
本発明はまた、大規模な撲滅プログラムで適用されればASFV-Gの根絶に繋がり得るASFV-Gコントロール方策を監視するための貴重なツールを提供する。このツールは、野生型ASFV-G 9GLおよびUKタンパク質をコードするヌクレオチドの存在と対比される、ASFV-GΔ9GL/ΔUKの9GL (B119L)遺伝子およびUK (DP96R)遺伝子の欠損のためにより短いASFV-G Δ9GLおよびΔUKポリペプチドをコードするポリヌクレオチドについて動物のサンプルを調べるステップを含む、ブタにおけるASFV-G感染を判定するための方法に関する。この方法において使用される動物のサンプルは、自然感染とワクチン接種との区別を可能にするASFV-GとASFV-G Δ9GL/ΔUKとの遺伝学的差異を遺伝学的DIVAによって検出することができるあらゆるサンプルであり得る。
【実施例】
【００３０】
本発明を概説してきたが、ある具体的な実施例を参照することによりそれはよりよく理解されるであろう。これら実施例は、本発明をさらに説明するために本明細書に含まれているに過ぎず、特許請求の範囲により規定される発明の範囲を限定する意図のものではない。
【００３１】
［実施例１］細胞培養とウイルス
ブタマクロファージ一次細胞培養物は、Zsak et al. (1996、上記)により以前記述されたように脱フィブリン化ブタ血液から調製された。手短に述べると、ヘパリン処理されたブタ血液を37℃で1時間インキュベートして赤血球画分を沈降させた。フィコール・パック（ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）の密度勾配（比重1.079）上の浮遊により単核白血球を分離した。単球／マクロファージ細胞画分を、マクロファージ培地（30% L929上清および20%ウシ胎仔血清（HI-FBS、サーモサイエンティフィック社、マサチューセッツ州ウォルサム）を伴うRPMI 1640培地（ライフテクノロジーズ社、ニューヨーク州グランドアイランド）で構成される）を含むプラスチックPrimaria（ファルコン；ベクトンディッキンソン・ラボウェア社、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）組織培養フラスコ中で、5% CO2下37℃で48時間培養した。リン酸緩衝食塩水（PBS）中の10 mM EDTAを用いて、接着細胞をプラスチックから剥離させ、それから、24時間後のアッセイで使用するために、5x106細胞／mlの密度でPrimaria T25、6ウェルまたは96ウェルディッシュへと再播種した。
【００３２】
ウイルスのタイトレーションは、96ウェルプレート中でブタマクロファージ一次細胞培養物に対して行った。ウイルスの希釈および培養はマクロファージ培地を用いて行った。ウイルスの存在は赤血球吸着（HA：hemadsorption）により評価し、ウイルスのタイターはReedとMuenchの方法により算出した（1938. Amer. J. Hygiene 27:493-497）。
【００３３】
ASFVジョージア（ASFV-G）は、フィールドで単離された株であり、ジョージア共和国トビリシの農業省（LMA：Ministry of Agriculture）研究所のNino Vepkhvadze博士から厚意によって提供された。
【００３４】
［実施例２］組換えASFV-G Δ9GL/ΔUKの構築
組換えASFVは、ブタマクロファージ細胞培養物を用いた感染およびトランスフェクション手順における親ASFVゲノムと組換え導入ベクターとの間の順次的相同組換えによって産生された（Neilan et al.、上記；Zsak et al. 1996、上記）。まず、遺伝子の左側（1.2 kbp）および右側（1.15 kbp）へとマッピングされる9GLの部分を含む側部ゲノム領域と、ASFV p72後期遺伝子プロモーターを伴うβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子を含むレポーター遺伝子カセットp72GUSとを含有する組換え導入ベクター（p72GUSΔ9GL）を使用した。この構築物は9GL ORFにおいて173ヌクレオチドの欠損を創出した（アミノ酸残基11から68まで）（図1参照）。組換え導入ベクターp72GUSΔ9GLはDNA合成によって得た（GenScript社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。マクロファージ細胞培養物をASFV-Gに感染させ、p72GUSΔ9GLでトランスフェクトした。連続数回のプラークアッセイ精製によって、独立の一次プラークを表す組換えウイルスを均質になるまで精製した。ブタマクロファージ一次細胞培養物の単層上の11回の連続的プラーク精製事象後に、組換えウイルスを得た。産生された中間体組換えウイルスASFV-G Δ9GLを、次に、ウイルスゲノムからのUK遺伝子の欠損を生じさせる組換え導入ベクターを用いた感染／トランスフェクション手順において親ウイルスとして使用した。遺伝子の左側（1.156 kbp）および右側（1.190 kbp）へとマッピングされるUKの側部ゲノム領域と、ASFV p72後期遺伝子プロモーターを伴うmCherry遺伝子を含むレポーター遺伝子カセットp72mCherryとを含有する組換え導入ベクター（p72mCherryΔUK）を使用した。組換え導入ベクターp72mCherryΔUKはDNA合成によって得た（GenScript社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）。この構築物はUK ORFにおいて255ヌクレオチドの欠損を創出した（アミノ酸残基1から85まで）（図1参照）。2回目の組換え事象が、ASFV p72プロモーター下に蛍光遺伝子mCherryを含有するカセットによってUK遺伝子を置き換えた。蛍光活性に基づく10回の限界希釈精製を経て組換えウイルスが選択された。最終回の精製から得られたウイルス集団を、ブタマクロファージ一次細胞培養物において増幅し、ウイルスストックを得た。
【００３５】
［実施例３］全ゲノム配列解析：親ASFV-Gと比較したASFV-G Δ9GL/ΔUK
遺伝子改変の精度および組換えウイルスのゲノムの整合性を評価するために、次世代シークエンシング（NGS：Next Generation Sequencing）を用いてASFV-G Δ9GL/ΔUKおよび親ASFV-Gの全ゲノム配列を取得し、比較した（表1）。まず、親ASFV-GとASFVジョージア2007/1（Chapman et al.、上記）との間の全長ゲノム比較を実施した。ASFV DNAは、Trizol法（ライフテクノロジーズ社、米国ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて感染細胞の細胞質から取得した。DNA濃度は、Qubit（登録商標）dsDNA HSアッセイキット（ライフテクノロジーズ社）を用いて決定され、Qubit（登録商標）2フルオロメーター（ライフテクノロジーズ社）上で読み取られた。Ion Shear（商標）Plus試薬キット（ライフテクノロジーズ社）を使用して、1マイクログラムのウイルスDNAを酵素的に断片化して200-300 bpの長さ範囲のブラントエンド断片を取得し、ペルチェサーマルサイクラーDNA Engine Tetrad 2において37℃でインキュベートした。剪断後、この断片化DNAライブラリーをDNAチップ（アジレント社、米国カリフォルニア州サンタクララ）上にロードし、2100バイオアナライザー（アジレント社）を使用して分析してDNAサイズ分布とサイズ範囲を評価した。Ion Plus断片ライブラリーキット（ライフテクノロジーズ社）を使用して、断片化DNAをIon適合性アダプターおよびライブラリーバーコードにライゲートさせた後、ニック修復を行って、アダプターとDNAインサートとの間の連結を完成させた。Pippin Prep（商標）装置（Sage Science社、米国マサチューセッツ州ビバリー）を使用して、2%アガロースゲルカセット（Sage Science社）上でアダプターライゲート化ライブラリーを最適長にサイズ選択した。Ion Library Equalizer（商標）キット（ライフテクノロジーズ社）を使用してライブラリー濃度を正規化した。次に、Ion PGM（商標）Template OneTouch（商標）2 200キット（ライフテクノロジーズ社）をIon OneTouch（商標）2装置（ライフテクノロジーズ社）と共に使用して、DNAライブラリーをIon Sphere（商標）粒子（IPS）上にクローン増幅してテンプレート陽性ISPを生成した。富化（enrichment）に進む前に、Ion Sphere（商標）クオリティコントロールアッセイキット（ライフテクノロジーズ社）およびQubit（登録商標）2フルオロメーター装置を使用して、非富化テンプレート陽性ISPの品質評価を行った。それから、Ion PGM（商標）Template OneTouch（商標）2 200キット（ライフテクノロジーズ社）とIon OneTouch（商標）ES装置（ライフテクノロジーズ社）を使用してテンプレート陽性ISPを富化して、テンプレート陰性ISPを除去し、テンプレート陽性ISP上のDNAを変性させた。Ion PGM（商標）200シークエンシングv2キット（ライフテクノロジーズ社）を使用して、富化されたテンプレートISPを配列決定用に調製し、Ion 314（商標）またはIon 316（商標）チップv2（ライフテクノロジーズ社）のどちらかにロードし、Ion PGM（商標）シークエンサー（ライフテクノロジーズ社）に供した。それから、得られた配列を、ギャラクシー（インターネットから入手：usegalaxy.org/）NGS QC・マニピュレーションツールを用いてトリムした。Sequencher 5.2.2（Genecodes社）およびCLC Genomics Workbench（CLCBio社）ソフトウェアを用いて配列をアラインし解析した。
【００３６】
これら2つのウイルスの間で、以下の差異が観察された（ヌクレオチド位置はGenBankアクセス番号FR682468のASFVジョージア2007/1に基づいて提供されている）：（i）ゲノムの非コード部分の第433位におけるTおよび第441位におけるAという、2つのヌクレオチド挿入；（ii）MGF 360-1L遺伝子ORFのフレームシフトをもたらす、第1602位におけるTおよび第1603位におけるTの2つのヌクレオチド欠損；（iii）MGF 360-1L遺伝子ORFのフレームシフトをもたらす第1620位Tのヌクレオチド欠損；（iv）ORF B438Lにサイレント変異をもたらす、第97391位のAからGへのヌクレオチド変異；（v）ORF E199Lの第85残基位置において残基置換（AlaからPro）をもたらす、第166192位におけるCからGへのヌクレオチド変異；および（vi）ゲノムの非コード部分である第183303位におけるTのヌクレオチド挿入（表1）。第2に、ASFVΔ9GL/ΔUKと親ASFV-Gとの間の全長ゲノム比較を行った。ASFVΔ9GL/ΔUKおよびASFV-GのDNA配列アセンブリーは、導入された改変に対応する、9GL遺伝子の173ヌクレオチドの欠損を明らかにした。ASFVΔ9GL/ΔUKゲノムのコンセンサス配列は、9GL遺伝子に2324ヌクレオチドの挿入を示し、これは標的遺伝子に173ヌクレオチド欠損を生じさせるために導入されたp72-βGUSカセット配列に対応する。さらに、ASFVΔ9GL/ΔUKおよびASFV-GのDNA配列アセンブリーは、導入された改変に対応する、UK遺伝子における255ヌクレオチドの欠損を明らかにした。ASFVΔ9GL/ΔUKゲノムのコンセンサス配列は、UK遺伝子における937ヌクレオチドの挿入を示し、これは標的遺伝子に255ヌクレオチド欠損を生じさせるために導入されたp72-mCherryカセット配列に対応する。カセットの挿入の他に、ASFVΔ9GL/ΔUKのゲノムとASFV-Gのゲノムとの間に1つだけ追加の差異が観察されたが、それはORF MGF 505-4Rの第224残基位置における残基置換（GluからGln）をもたらす第36,465位のGからCへのヌクレオチド変異であった。要約すると、ASFVΔ9GL/ΔUKウイルスは、相同組換えおよびプラーク精製のプロセスのあいだに著しい変異は蓄積しなかった（表1）。
【表１】
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【００３７】
［実施例４］ブタにおけるASFV-GΔ9GL/ΔUKの毒性の評価
動物実験は、所内動物飼育使用委員会により認可されたプロトコールに従って、PIADCの動物施設においてバイオセーフティーレベル3条件の下で行った。
【００３８】
80〜90ポンドの商業飼育豚を使用し、毒性親ASFV-Gウイルスと比較しながらASFV-GΔ9GL/ΔUKをその毒性表現型について評価した。五匹のブタを、104もしくは106 HAD50のどちらかのASFV-GΔ9GL/ΔUKまたは104 HAD50のASFV-Gウイルスで筋肉内（IM）接種した。実験全体を通して、臨床的兆候（拒食、うつ、発熱、紫の皮膚変色、よろめき歩行、下痢、および咳嗽）ならびに体温の変化を日ごとに記録した。防護実験においては、動物を104 HAD50または106 HAD50でIM接種し、28日後に、103 HAD50の毒性ASFVジョージア2007親株でIM攻撃した。疾患に関連する臨床的兆候の存在は先に記述されたように行った。
【００３９】
104 HAD50のASFV-GでIM経由で接種された80〜90ポンドのブタの全てが、感染後3〜4日までに体温上昇（>104°F）を示した。ブタは、拒食、うつ、紫の皮膚変色、よろめき歩行、および下痢を含む疾患関連の臨床的兆候を表した（表2）。疾患の兆候は時間とともに進行的に悪化し、動物は感染7日後または9日後までに死亡したかまたは臨終において安楽死された。逆に、104または106 HAD50のASFV-G Δ9GL/ΔUKでIM経由で接種された動物は、全観察期間（21日間）のあいだ臨床的疾患のいかなる兆候も表さなかった。従って、9GL遺伝子およびUK遺伝子の欠損は、毒性親ASFV-Gの完全な弱毒化を生じさせた。104 HAD50のASFV-GΔ9GLで接種された動物は変動するレベルの疾患を示したのに対し（O’Donnell et al.、上記）、106 HAD50のASFV-GΔ9GL/ΔUKは完全に弱毒化されているほどまでに、UK遺伝子の欠損はASFV-GΔ9GLの弱毒化を増進させた。
【表２】
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【００４０】
［実施例６］親ASFV-Gによる攻撃に対するASFV-GΔ9GL/ΔUKの防護効力
104 HAD50〜106 HAD50のASFV-GΔ9GL/ΔUKによりIM経由で接種されたブタは疾患の兆候なしで感染に耐えたため、104または106 HAD50のASFV-GΔ9GL/ΔUKで感染された動物群（n=5）を、接種28日後に、103 HAD50の親ASFV-GによってIM経由で攻撃した（同種攻撃）。同じ経路と用量を用いて攻撃された五匹の未接種動物が未接種／被攻撃対照群を提供した。五匹のASFV-GΔ9GL/ΔUK接種被攻撃動物は、106 HAD50のASFV-GΔ9GL/ΔUKで免疫化された二匹の動物がわずか且つ一時的な体温の上昇を示したことを除き、全観察期間（21日間）のあいだ完全に無症状であり続けた（表3）。疑似接種／被攻撃対照群の全ての動物は、104 HAD50のASFV-Gで接種された動物で観察されたもの（上記参照）と同様の臨床的経緯で疾患を発症した。従って、ASFV-GΔ9GL/ΔUKは、高度に毒性である親ウイルスによって攻撃されたときに臨床的疾患の呈示に対する防護を誘導することができる。
【表３】
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【００４１】
要約すると、我々はここで、9GL遺伝子およびUK遺伝子の欠損がASFV-Gの毒性を劇的に改変し、ASFV-GΔ9GL/ΔUKと命名される完全に弱毒化されたウイルスを生じるという証拠を提示している。ASFV-GΔ9GL/ΔUKで免疫化された動物は、毒性親株ASFV-Gによる攻撃に対して防護された。
【００４２】
本明細書に言及される全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が参照により組み入れられることがそれぞれ具体的にかつ個別に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４３】
以上の説明ならびに特定の代表的実施形態および発明の詳細は、本発明の例示および説明の目的で提示されたものである。それは、網羅的であったり、開示された正確な形態に本発明を限定したりすることを意図するものではない。本発明の範囲から逸脱することなくそれらに改変およびバリエーションを施し得ることは当業者には明白になるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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