(57)【要約】本発明は、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体、その製造方法及び用途を提供する。本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ−１７Ａに特異的に結合し、ＩＬ−１７Ａによって誘導される各細胞系がＩＬ−６等の炎症性サイトカインを分泌することを効果的に抑制し、免疫介在性炎症反応に関連する疾患を治療対象とする薬品の製造に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体であって、
１）重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と、
２）軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’とを含み、
前記ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ１’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ３’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体。
【請求項３】
前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体であり、前記ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で表されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で表されるアミノ酸配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体をコードすることを特徴とする、ヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項７】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項８】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項９】
前記ヌクレオチド分子において、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０所示で表される、請求項５に記載のヌクレオチド分子。
【請求項１０】
請求項５〜９の何れか１項に記載のヌクレオチド分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、ホスト細胞。
【請求項１２】
請求項１〜４の何れか１項に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を製造する方法であって、
ａ）発現条件下で請求項９に記載のホスト細胞を培養し、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を発現する工程と、
ｂ）前記工程ａ）で得られる抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を分離精製する工程と
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜４の何れか１項に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体と、薬学的に許容可能なベクターとを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜４の何れか１項に記載の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体又は請求項１３に記載の組成物の、免疫介在性炎症反応を治療対象とする薬品の製造における用途。
【請求項１５】
前記免疫介在性炎症反応は、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、喘息、ぶどう膜炎、ベーチェットぶどう膜炎、ドライアイ又は慢性特発性蕁麻疹である、請求項１４に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体工学の分野に属し、より具体的には、抗ヒトインターロイキン−１７Ａモノクローナル抗体、その製造方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１７（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １７，ＩＬ−１７）は、主にヘルパーＴ細胞１７（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７，Ｔｈ１７）で分泌される炎症性サイトカインであり、他のＴ細胞やマスト細胞、好中性顆粒球等の自然免疫細胞でも一定量のＩＬ−１７が分泌され、様々な炎症性反応及び自己免疫疾患の病理過程において重要な役割を果たしている。ＩＬ−１７ファミリーメンバーとしては、ホモダイマー型ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ及びヘテロダイマー型ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−１７Ｅ／ＩＬ−２５以外にも、２つの命名されていないメンバーが含まれる。ＩＬ−１７受容体（ＩＬ−１７ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＬ−１７Ｒ）ファミリーとしては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが含まれ、そのうちＩＬ−１７Ａホモダイマー、ＩＬ−１７Ｆホモダイマー及びＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロダイマーは何れもＩＬ−１７ＲＡとＩＬ−１７ＲＣに結合する。体外で、ナイーブＴ細胞は抗原と副刺激分子の刺激下で活性化され、形質転換成長因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β，ＴＧＦ−β）、ＩＬ−６、ＩＬ−２３等のサイトカインによって誘導されることでＴｈ１７へ分化し、Ｔｈ１７細胞によってＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆサイトカインが分泌される。そして、ＩＬ−１７とＩＬ−１７Ｒで形成される複合体は、シグナル伝達複合体であるＩＬ−１７Ｒ・Ａｃｔ１・ＴＮＦ受容体関連因子６（ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ６，ＴＲＡＦ６）を介して下流のＮＦ−κＢ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ｃ−ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ）等のシグナル経路を活性化させて炎症反応に関与する。
【０００３】
研究より、ＩＬ−１７が自己免疫疾患各病理段階の反応に関与することが解明され（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２０１２．１１（１０）：７６３−７７６）、例えば、ＩＬ−１７は内皮細胞を刺激することにより組織因子を分泌させて血栓形成を促し、同時に内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ及び樹状細胞を誘導することにより炎症性サイトカインであるＩＬ−６とＩＬ−８を分泌させて炎症性反応を引き起こし、それが軟骨細胞に作用して一酸化窒素を放出することにより軟骨損害を齎し、同時に骨芽細胞を誘導してＮＦ−κＢリガンド受容体活性化因子（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ−Ｂ  ｌｉｇａｎｄ，ＲＡＮＫＬ）を分泌させ、破骨作用を促進して骨損傷を齎すことが知られている。
【０００４】
自己免疫疾患は、生体が自体抗原に対して免疫反応を起こして自体組織を損傷することにより発症する疾患であり、関節リウマチ、強直性脊椎炎、紅斑性狼瘡及び乾癬等が含まれ、一旦罹患すると根治する手段が乏しく、生涯苦しめることになるため「不滅のガン」とも呼ばれる。人では自己免疫疾患の発症率が約３％であり、中枢神経系、肺、肝臓、腎臓等の各臓器に損傷を与え、臓器の機能退化や機能不全を引き起こし、患者は自主働きに加えて行動能力を失い、重篤の場合に死に晒される。わが国で自己免疫疾患の罹患者は凡そ３〜４千万人に達しており、国内で一般に使われる治療薬品が患者の治療需要に十分対応できているとは言い難く、患者のために治療効果が高く、副作用が少ない治療手段の開発が期待されつつある。
【０００５】
近年、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１７Ａ等の炎症性サイトカインが自己免疫疾患の発生と進展に全面的に関与していることが研究により解明され、炎症性サイトカインに対して拮抗作用を示す製剤が自己免疫疾患の主な治療手段として注目を浴びている。自己免疫疾患の治療に用いる抗ＴＮＦ−α抗体として、ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））は全世界で２年連続して薬品販売量のトップ地位を守り、２０１４年には販売額が更に１２５億ドルに達し、また、ＩＬ−６受容体に対して拮抗作用を示すアクテムラ（登録商標）抗体薬品も関節リウマチの臨床治療に広く応用されている。一方、ＴＮＦ阻害剤が関節リウマチに対して最も顕著な治療効果を示すが、関節リウマチの患者のうち１／３を超える患者がこれらの製剤に対して応答反応を示さないか、若しくは薬物抵抗性を示す。同時に、各自己免疫疾患に関連する炎症性サイトカインがそれぞれ異なり、自己免疫疾患の患者から皮膚組織を採取して生検を行ったところ、組織中でＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＬ−２２サイトカインが高発現であることが解明されている。患者の血液及び皮膚病変部位にはＴｈ１７細胞が大量に存在し、症状進展に緊密に関わっているのも既に知られている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２，１１：７６３−７７６）。炎症性サイトカインＩＬ−６とケモカインＣＸＣＬ１の分泌がＩＬ−１７シグナル経路活性化に起因する可能性が大きいため（Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００７，８：２４７−２５６）、ＩＬ−１７を標的とする策略が自己免疫疾患の治療に有用であると考えられている。現在、ＩＬ−１７Ａシグナル経路を標的とする薬品が自己免疫疾患の進展を効果的に抑制することのできることが実証されている（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１４，３７１：３２６−３３８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１２，１１：７６３−７７６）。
【０００６】
以上のことから、より効果的でかつ特異性のある抗ＩＬ−１７Ａ抗体を開発することにより、ＩＬ−１７Ａシグナル経路を遮断することは自己免疫疾患の治療において新しいアプローチであると考えられる。自己免疫疾患が慢性疾患であり、根治が困難であるため、患者は長期間に渡って薬を使用する必要があるが、抗体薬品は製造が複雑であるため薬品製剤の平均平均価格が低分子薬品を遥かに超え、薬物活性がより高い薬品を開発することは投与量を減らし、使用コストを下げ、薬品の利用性を高める観点から期待されている。そこで、生物学活性がより高い抗ＩＬ−１７Ａ抗体を開発することは、当業者にとって緊迫感のある課題である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記課題を解決すべく、本発明は、ＩＬ−１７Ａと細胞表面のＩＬ−１７受容体との結合を特異的に遮断することでＩＬ−１７Ａシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体を提供し、本発明に係るモノクローナル抗体は、ＩＬ−１７Ａ介在性の生物学活性に対する阻害効果がより高い組換え抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体である。
【０００８】
したがって、本発明の第１の目的は、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
本発明の第２の目的は、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
本発明の第３の目的は、前記ヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
【００１１】
本発明の第４の目的は、前記発現ベクターを含むホスト細胞を提供する。
【００１２】
本発明の第５の目的は、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を製造する方法を提供する。
【００１３】
本発明の第６の目的は、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明の第７の目的は、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明は、以下の技術案を提供する。
【００１６】
本発明の第１側面において、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を提供し、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、１）重鎖相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と、２）軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ１’、ＣＤＲ２’、ＣＤＲ３’とを含み、そのうち前記ＣＤＲ１はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ３はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ１’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ２’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で表されるアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲ３’はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１８】
好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体であり、前記ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表されるアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で表されるアミノ酸配列を有し、軽鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表されるアミノ酸配列を有する。
【００２０】
本発明の第２の側面において、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【００２１】
好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表され、その軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表される。
【００２２】
より好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で表され、その軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される。
【００２３】
好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表され、その軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表される。
【００２４】
より好ましくは、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、その軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で表される。
【００２５】
本発明の第３の側面において、前記ヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。
【００２６】
好ましくは、前記発現ベクターは、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ又はｐＣＨＯ１．０である。
【００２７】
より好ましくは、前記発現ベクターは、ｐＣＨＯ１．０である。
【００２８】
本発明の第４の側面において、前記発現ベクターを含んでなるホスト細胞を提供する。
【００２９】
好ましくは、前記ホスト細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＮＳ０、ｓｆ９、ｓｆ２１、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＴＧ１である。
【００３０】
より好ましくは、前記ホスト細胞は、ＣＨＯである。
【００３１】
本発明の第５の側面において、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の製造方法を提供し、該製造方法は、
ａ）発現条件下で前記ホスト細胞を培養し、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を発現する工程と、
ｂ）前記工程ａ）で発現する抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を分離精製する工程とを含む。
【００３２】
本発明の第６の側面において、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体と薬学的に許容可能なベクターを含んでなる組成物を提供する。
【００３３】
本発明の第７の側面において、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体又はその組成物の、免疫介在性炎症反応に関連する疾患を治療するための薬品の製造における用途を提供する。
【００３４】
好ましくは、前記免疫介在性炎症反応は、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、喘息、ぶどう膜炎、ベーチェットぶどう膜炎、ドライアイ及び慢性特発性蕁麻疹のうち１種又は数種である。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の抗ＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ−１７Ａに特異的に結合し、ＩＬ−１７Ａによって誘導される各細胞系がＩＬ−６等の炎症性サイトカインを分泌することを効果的に抑制し、免疫介在性炎症反応の疾患を治療するための薬品の製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒトＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨｅｌａ細胞のＩＬ−６分泌に対する、ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の阻害効果を示す図である。
【図２】マウス体内でヒトＩＬ−１７Ａによって誘導されるＣＸＣＬ１分泌に対する、ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明において、発現ベクターについては特に限定がなく、ｐＤＲ１、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐＤＨＦＦ及びｐＣＨＯ１．０のうち何れか１つを使用することができ、発現ベクターに適切な転写及び翻訳調節配列が連結されている融合ＤＮＡ配列を含む。
【００３８】
本発明において、使用可能なホスト細胞としては上記発現ベクターを含む細胞であり、例えば、哺乳動物又は昆虫ホスト細胞等といった真核細胞培養系を本発明の融合タンパク質の発現に用いてもよく、ＣＯＳ、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）、ＮＳＯ、ｓｆ９及びｓｆ２１等も本発明に好適である。それ以外、上記発現ベクターを含む原核細胞であってもよく、ＤＨ５α、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＴＧ１のうち何れか１つを使用することができる。
【００３９】
上記発現ベクターとホスト細胞は、全て商業ルートにより入手可能である。
【００４０】
本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の製造方法は、発現条件下で上記ホスト細胞を培養し、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を発現する工程と、前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を分離精製する工程とを含む。上記方法によれば、組換えタンパク質をほぼ純粋な物質に精製することができ、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で１つのバンドとして現れるようにすることができる。
【００４１】
親和性クロマトグラフィーを用いて本発明に係る組換えタンパク質を分離精製することができ、使用する親和性カラムの特性に基づき、例えば、高塩濃度緩衝液、ＰＨ変更等といった汎用の方法で親和性カラムに結合されている融合タンパク質を溶出することができる。
【００４２】
本発明に係るヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、以下のように製造される。すなわち、実験室で調製したＩＬ−１７Ａ抗原をＢａｌｂ／ｃマウスに免疫し、数回免疫後に抗体価の比較的高いマウスから脾細胞を採取してハイブリドーマ細胞と融合させ、ＩＬ−１７Ａ阻害活性を示すハイブリドーマ細胞株を分離する。より具体的には、本発明者らによって大量試験を重ねた結果、まずＩＬ−１７Ａ抗原、ＩＬ−１７ＲＡ細胞外ドメインを発現させ、異なるアジュバントとＩＬ−１７Ａ抗原を混合してマウスに免疫し、そして上記マウスの脾細胞とハイブリドーマ細胞株ｓｐ２／０を融合させた後、ハイブリドーマに対してＩＬ−１７Ａ抗原を用いて陽性細胞株を分離し、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｒの結合を阻害し且つ確実にＩＬ−１７Ａ阻害活性を示すことを検証する上で標的細胞株を取得し、そして、標的分子をヒト化し、軽鎖と重鎖の遺伝子を同時に真核発現ベクターであるｐＣＨＯ１．０に導入した後に、リポソーム法を利用して該発現ベクターをＣＨＯ細胞に導入し、ピューロマイシンとメトトレキサートを用いて陽性細胞を分離して高発現細胞を無血清培地で拡大培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性カラムを用いてヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を分離精製することに至った。
【００４３】
更に、例えば、ＰＣＲ変異導入法等の当分野で汎用の技術を利用してマウス由来の親抗体をキメラ抗体、ヒト化又は他の変性形態にすることができる。本発明において、例えば、親抗体のＣＤＲ領域内に変異を導入することで変性抗体を取得した後、目的に合わせて結合能力（例えば、より低いＫＤ）、ＩＣ５０、特異性、結合特異性等を検証することができる。好ましくは、変性抗体は、親抗体を対象として特定の特性を改良したものである。アミノ酸残基を置き換えて得られる変性抗体は、例えば、親抗体分子においてアミノ酸残基を少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個除去して該当位置に別のアミノ酸残基を導入したものが好ましい。変異を導入する際に最も注目されるサイトとしては、１個又は数個のＣＤＲ領域であってもよいが、ＦＲ領域に変異を導入してもよい。保存アミノ酸を置き換えるのが一般的であるが、非保存アミノ酸についても別のアミノ酸残基に置き換えることで変性抗体にし、所期の特性を得ることができる。
【００４４】
上記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体については、体外、体内レベルで生物学的実験を行ったところ、ＩＬ−１７Ａとの結合性が優れているのが確認できる。
【００４５】
具体的には、上記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の結合特異性、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｒの相互作用に対する阻害特性、及び体外生理機能等について解析を行ったところ、本発明の抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体が細胞から分泌されるＩＬ−１７Ａに結合し、ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７Ｒの間のシグナル伝達を阻害することができ、炎症反応の発生を効果的に抑制することのできることが確認できる。本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、薬学的に許容可能なベクターと組合わせて薬物製剤を構成して安定にその治療効果を発揮することができ、これらの製剤によって本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のアミノ酸コア配列の構造完全性を確保すると同時に、タンパク質の各官能基が凝集したり、デオキシ化又は酸化したりして変性することを防止することができる。通常、液剤は２℃〜８℃の条件下で一年間安定に保存することができ、凍結乾燥剤は３０℃で少なくとも６ヶ月に亘って安定な形態を保つことができる。前記抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体製剤は、製薬分野でよく使われる的懸濁液、注射液、凍結乾燥剤等の形態にすることができ、注射液又は凍結乾燥剤が特に好ましい。本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の注射液又は凍結乾燥剤には、界面活性剤、溶液安定剤、等張化剤、緩衝液等の薬学的に許容可能な補助剤を１種以上含むことができる。界面活性剤として、例えば、ポロキサマー（例えば、ｐｏｌｏｘａｍｅｒ−１８８）、Ｔｒｉｔｏｎ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０又はＴｗｅｅｎ−８０）等の非イオン界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウムや、ミリスチル、リノレイル又はオクタデシルサルコシン、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）等が挙げられ、これらの界面活性剤は、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の粒子化傾向を最小限に抑える程度で添加する。溶液安定剤としては、還元糖、非還元糖等の糖類、グルタミン酸ナトリウム、ヒスチジン等のアミノ酸類、トリオール、高級糖アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類等が挙げられ、これらの溶液安定剤は、単独又は２種以上を組み合わせて使用することができ、得られる製剤が一定時間内に安定な状態を維持するように添加する。等張化剤として塩化ナトリウム、マンニトール等が挙げられ、これらの等張化剤は、単独又は２種以上を組み合わせて使用することができる。緩衝液は、Ｔｒｉｓ、ヒスチジン緩衝液、リン酸塩緩衝液等が挙げられ、これらの緩衝液は、単独又は２種以上を併用することができる。
【００４６】
上記製剤は、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を含む組成物であり、人や動物に投与することにより免疫介在性炎症反応に対して優れた効果を奏する。具体的には、免疫介在性炎症反応を効果的に予防及び／又は治療することができ、抗炎症薬として利用することができる。
【００４７】
本発明で言う免疫介在性炎症反応とは、乾癬、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、喘息、ぶどう膜炎、ベーチェットぶどう膜炎、ドライアイ、慢性特発性蕁麻疹等を指すものである。また、本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、上記炎症関連性の疾患以外でも多発性硬化症、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病等の予防及び／又は治療にも適用可能である。
【００４８】
本発明で言う免疫介在性炎症反応の治療薬とは、免疫介在性炎症反応を阻害及び／又は治療する薬物であり、免疫介在性炎症反応に関連する症状の進行遅延及び／又は重症度の低下に有用であり、更に、既に存在する炎症反応に関連する症状の軽症化に寄与し且つ合併症の発生を防止することができ、並びに炎症反応の転移を低減又は防止することができる。
【００４９】
本発明に係る抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体及びその組成物を人や動物に投与するとき、投与量は患者の年齢と体重や、疾患の特性と重症度、投与方式によって異なり、動物実験の結果と実際状況に合わせて総投与量を一定範囲に抑える必要がある。例えば、静脈注射では投与量が１〜１８００ｍｇ／日の範囲である。
【００５０】
以下、実施例、実験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例、実験例に限定されない点に留意すべきである。実施例では、従来より周知の方法については説明を省略する。こういった方法は、例えば、ベクターとプラスミドの構築方法、タンパク質をコードする遺伝子を前記ベクターやプラスミドに導入する方法、又はプラスミドをホスト細胞に導入する方法等を含む。これらの方法は、当業者が熟知する方法であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを含む各出版物に詳細に記述されている。
【００５１】
実施例１：ＩＬ−１７Ａ抗原、陽性抗体Ｓｅｃｋｉｎｕｍａｂ、Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ及び可溶性ＩＬ−１７受容体細胞外ドメインの調製
ヒトＩＬ−１７Ａ抗原配列は、Ｐｕｂｍｅｄ（ＮＭ＿００２１９０．２）を親配列とし、Ｃ末端に６個のヒスチジン（ｈｉｓ）残基からなるタグを付けたｈＩＬ−１７Ａ（ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ）アミノ酸配列を上海生工バイオテック社に提供し、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用好みに基づいてコドンを最適化して遺伝子断片を合成した。そして、ｐＵＣ５７ベクター（上海生工バイオテック社製）に導入してｐＵＣ５７−ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇを得た後、ＡｖｒＩＩとＥｃｏＲＶ制限酵素認識サイトを利用してｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ断片をｐＵＣ５７−ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇベクターから切り出し、ｐＣＨＯ１．０発現ベクター（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に導入してｐＣＨＯ１．０（ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ）を得た後、配列測定を行って配列が正確なものを選んで次に用いた。
【００５２】
リポソーム法を利用してｐＣＨＯ１．０（ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ）ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞系（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に導入し、６ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ社製）を含むＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で２日間培養した後、ピューロマイシン（ＧｅｎｅＯｐｅｒａｔｉｏｎ社製）とメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ社製）で陽性細胞株を分離した。３×１０５個の陽性細胞株を２００ｍＬ／１Ｌの振蕩フラスコに入れ、培地として６ｍＭのグルタミンと体積比で１／１００の抗凝固剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地を用い、１２日間培養してから上澄液を回収し、ニッケルカラムを用いてｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ抗原を精製した。ビシンコニン酸（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ，ＢＣＡ）法によってタンパク質を定量し、精製により得られたタンパク質を以下の手順に従ってマウスに免疫して解析を行った。
【００５３】
ＷＨＯ公開の抗ＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（ＩｇＧ１，κ）のアミノ酸配列（ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４，２００９．Ｐ３４２）に対して、コドンを最適化して全ヌクレオチド配列を取得し、ｐＣＨＯ１．０発現ベクターに導入した後、配列測定により正確な組換えベクターを確認してｐＣＨＯ１．０（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）と表記した。ｐＣＨＯ１．０（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞系に一過的に導入し、６ｍＭのグルタミンを含むＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地で数日間培養した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて培養液の上澄液から陽性抗体タンパク質を精製した。
【００５４】
Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ（ＩｇＧ４，κ）のアミノ酸配列は、ＷＨＯの公開データ（ＷＨＯ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２，２０１１．Ｐ１７６を参照可能）を参考し、上記と同様にｐＣＨＯ１．０発現ベクターに導入し、更にＣＨＯ−Ｓ細胞系に導入してから６ｍＭのグルタミンを含むＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地で数日間培養し、上澄液を回収してＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性カラムでタンパク質を精製した。培養及び精製時の条件は、Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂの場合と同様であった。
【００５５】
下記手順に従い、可溶性ＩＬ−１７受容体Ａ細胞外ドメイン（ＩＬ−１７ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ−ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ，ＩＬ−１７ＲＡ−ＥＣＤ）−Ｆｃ融合タンパク質を調製した。ＩＬ−１７ＲＡ遺伝子（北京Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）をテンプレートとし、ＰＣＲによりＮ末端第１位〜第２８８位のヌクレオチド断片を増幅し、グリシンセリン（ＧＳ）を人工リンカーとしてヒトＩｇＧ１の定常領域（Ｆｃ）断片と繋いだ。ヒトＩｇＧ１の定常領域配列は、Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍｂの定常領域配列を用いた。該配列をｐＣＨＯ１．０ベクターに導入してｐＣＨＯ１．０（ＩＬ−１７ＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ）を取得し、配列測定により正確な組換えベクターを確認して安定的導入を行った。導入と発現は、ｈＩＬ−１７−ｈｉｓｔａｇの条件に従って行い、そして、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ親和性カラムを用いて細胞培養液の上澄液からＩＬ−１７ＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃを精製した。
【００５６】
実験例２：ＩＬ−１７Ａの免疫
ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ抗原５０μｇを生理食塩水７５μＬに希釈し、１：１の体積比でフロイント完全アジュバントと混合し、超音波によって完全に乳化してから４〜５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（上海霊暢バイオテック社製、動物製造許可証番号：ＳＣＸＫ（▲濾▼）２０１３−００１８）に５０μｇ／匹、複数箇所で皮下注射を行った。３週後、タンパク質５０μｇを同様に７５μＬに希釈し、１：１の体積比でフロイント不完全アジュバントと混合し、超音波によって完全に乳化してからマウスに複数箇所で皮下免疫を行い、２週間経ってから再び同様の免疫を繰り返した。３回免疫が終わると、１週間後にマウスの尻尾から採血して血清を分離し、ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ抗原を固定したＥＬＩＳＡを利用して血清抗体価を測定した。血清抗体価＞１００００のマウスについては、採血が終わってから１週間後に尾静脈注射、抗原タンパク質１０μｇ／生理食塩水１００μＬ／匹の条件で補足免疫を行った。
【００５７】
抗体価の測定は、ＥＬＩＳＡ法を利用して次のように行われる。ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ抗原を固定したＥＬＩＳＡプレートを用い、固定濃度２．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、４℃の条件下で一晩固定し、ＰＢＳＴ（０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄して乾燥した。各ウェルに１％のＢＳＡを含む固定液２００μＬを加え、常温下で４時間ブロッキングした後に乾燥し、後の測定に備えて−２０℃の冷蔵庫に保存した。測定時には、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに濃度が異なるマウス血清１００μＬを加え、各濃度ごとに平行して２つのウェルを設け、室温で１．５時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄、乾燥した後、ＰＢＳＴを用いて体積比で１：１００００倍希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥した後、各ウェルごとに着色液（使用に先立ってＥＬＩＳＡ用着色液Ａと着色液Ｂを１：１の体積比で混合）１００μＬを加え、その後に各ウェルにの２ＭのＨ２ＳＯ４終止液１００μＬを加えて反応を終止させた。そして、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて波長４５０ｎｍで各ウェルのＯＤ値を測定した。
【００５８】
実施例３：ハイブリドーマ融合と選定
マウスに対して補足免疫を行ってから３日後に脾細胞を採取して融合を行った。
【００５９】
生長状態が良好なハイブリドーマｓｐ２／０細胞（中国科学院典型培養物保存委員会の細胞バンクより入手）を３７℃、二酸化炭素５％のインキュベータで培養し、融合前日に培養液を１回変えた。融合と選定は、以下のように行われた。マウス脾臓を採取して研磨、洗浄して細胞数を数え、脾細胞：ｓｐ２／０細胞が１０：１の割合で２種類の細胞を混ぜ合わせた後、１５００ｒｐｍで７分間遠心した。上澄液を取り除き、１分間内にＰＥＧ（１４５０）を１ｍＬ加えてから９０秒間軽く振り回し、２．５分以内に無血清ＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）を５ｍＬ加え、更に一気に無血清培養液５ｍＬを加えて反応を終止させて５分間静置し、１２８０ｒｐｍで８分間遠心した。９６ウェルプレートにｓｐ２／０細胞を２００万個の量で均一に接種し、９６ウェルプレートの各ウェルの液量が２００μＬになるようにした後、ヒポキサンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｈ）、メトトレキサート（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ，Ａ）及びチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，Ｔ）を含むＨＡＴ培地を用いて選別を行い、３〜４日ごとに培地の半分を新たに変え、第１０日目にＨＴ培地に変えた。１０日後にハイブリドーマ細胞が９６ウェルプレートの底部を１０％覆う程度まで生長すると、上澄液を取ってｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ抗原が固定されているＥＬＩＳＡ用プレートを用いてＥＬＩＳＡ測定を行った。ＥＬＩＳＡ測定方法は、上記と同様であった。陽性ハイブリドーマを選出して２４ウェルプレートにおいて拡大培養し、更に有限希釈法でサブクローン化することで目的抗体を安定に発現するハイブリドーマ株を選定して保存ライブラリを構築した。
【００６０】
実施例４：ＩＬ−１７Ａ結合ＩＬ−１７ＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃに対する、マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の阻害効果
ＥＬＩＳＡ法により、ＩＬ−１７Ａ結合ＩＬ−１７Ｒに対するマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の阻害効果を検討した。ｈＩＬ−１７Ａ−ｈｉｓｔａｇ抗原をＥＬＩＳＡ用プレートに固定し、ブロッキングした後、ＩＬ−１７ＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ及びサブクローン化したマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のハイブリドーマ細胞の培養上澄液３００μＬを加え、最後にＨＲＰ−羊抗ヒトＩｇＧ抗体で着色させて測定を行った。ＩＬ−１７ＡとＩＬ−１７ＲＡ−ＥＣＤ−Ｆｃの結合を阻害することのできる細胞株を選んで次のサブクローン化に備えた。
【００６１】
実施例５：ＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨｅｌａ細胞のＩＬ−６分泌に対する、マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の阻害効果
サブクローン化を３回終えたハイブリドーマ細胞株を無血清培地で拡大培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ（ＧＥ社製）親和性カラムを用いて培養液の上澄から抗体を分離精製した。精製した抗体を定量し、生物活性を測定した。
【００６２】
ＩＬ−１７Ａが細胞表面のＩＬ−１７Ｒに結合するとＩＬ−６等の炎症性サイトカインの分泌を誘発し、ＩＬ−１７Ａが自己免疫疾患において主な発症機序であるため、抗ＩＬ−１７Ａ抗体の体外生理活性については、ＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨｅｌａ細胞のＩＬ−６分泌に対する阻害効果を検討することにより行われる。
【００６３】
生長状態が良好なＨｅｌａ細胞（中国科学院典型培養物保存委員会の細胞バンクより入手）に、組換えｈＩＬ−１７Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）１５ｎｇ／ｍＬ及び濃度が異なるマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体を加え、ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ社製）１０％を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）にペニシリン（Ｇｉｂｃｏ社製）１００Ｕ／ｍＬ及びストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）１００ｍｇ／ｍＬを加えて培地とし、各組ごとに４つの平行ウェルを設け、３７℃、５％二酸化炭素のインキュベータで２４時間培養した後、上澄液を回収してＥＬＩＳＡ法で各組の細胞から分泌されるＩＬ−６の量を測定した。
【００６４】
ＥＬＩＳＡ解析は、以下のように行われる。ＥＬＩＳＡプレート（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）に固定濃度が２．５μｇ／ｍＬとなるように、各ウェルにラット抗ヒトＩＬ−６を１００μＬずつ加えて４℃、一晩置いて固定を行った。そして、ＰＢＳＴで２回洗浄し、乾燥させた。各ウェルに更に１％のＢＳＡを含む固定液２００μＬを加え、常温、４時間かけてブロッキングした後に叩いて内容物を捨て、次の処理に備えて−２０℃の冷蔵庫に保存した。測定時に、ｈＩＬ−６標準品（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を培地で終濃度がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬ、３．３ｎｇ／ｍＬ、１．１ｎｇ／ｍＬ、３７０ｐｇ／ｍＬ、１２０ｐｇ／ｍＬ、４１ｐｇ／ｍＬ、１３ｐｇ／ｍＬ及び４．６ｐｇ／ｍＬとなるように調製し、１００μＬ／ウェルずつ固定されたＥＬＩＳＡプレートに加え、各濃度ごとに２つの平行ウェルを設けた。同様に、上澄液をＤＭＥＭ培養液で２倍希釈した後に１００μＬをとって固定されたＥＬＩＳＡプレートに加え、且つ２つの平行ウェルを設け、室温で１．５時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥した後、各ウェルにビオチン化ラット抗ヒトＩＬ−６抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０００倍希釈）を１００μＬ加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで３回洗浄し、乾燥した後、各ウェルにＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１０００倍希釈）１００μＬを加え、室温で１時間反応させた。各ウェルに着色液（使用に先立ってＥＬＩＳＡ着色液Ａと着色液Ｂを１：１の体積比で均一に混合したもの）１００μＬを加えて着色し、各ウェルに１００μＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を終止させ、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いて波長４５０ｎｍで各ウェルのＯＤ値を測定した。
【００６５】
候補としてマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の、ＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨｅｌａ細胞のＩＬ−６分泌に対する阻害活性を解析したところ、候補抗体１０個のうち大多数が陽性抗体Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂを同様の効果を示すことが確認でき、幾つかの抗体を選んで次の機能解析を行った。そのうち、番号が１２０である抗体によるＩＬ−１７Ａの阻害効果がＩＣ５０値で３０．５２ｐＭであり、陽性抗体ＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂのＩＣ５０値が１０８．７０ｐＭであり、ＩｘｅｋｉｚｕｍａｂのＩＣ５０値が６０．６０ｐＭであった。このことから、本発明のマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のＩＬ−１７Ａに対する阻害効果がＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ及びＩｘｅｋｉｚｕｍａｂを上回ることが実証された。
【００６６】
実施例６：マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の結合特異性の評価
マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体とＩＬ−１７Ａの結合特異性についてはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて測定し、陽性抗体ＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂとＩｘｅｋｉｚｕｍａｂを参考物として対比を行った。具他的には、Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＣＭ５感知チップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を活性化させ、並びにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ融合タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ社製）をチップに固定し、固定量が２０００ＲＵであった。ＦＣ３（Ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ３）を参考セルとし、ＦＣ４（Ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ４）を試料セルとした。ＦＣ４セルを用いてマウス抗体と参考抗体を捕捉した後、濃度が異なるｈＩＬ−１７Ａを注入した。サイクリング条件として、ＦＣｓの全セルに５０μＬ／分間の速度で解析物を４分間注入し、解離時間２０分間、１０μＬ／分間の速度で６Ｍの塩酸グアニジニウム（国薬グループ化学試薬有限会社製）を３０秒間注入して表面を再生化し、そして、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００のＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒ  １．０を利用して捕捉抗体のシグナルと非捕捉抗体のシグナルとの差、及び相互作用の結合特異性を算出した。
【００６７】
表１に実験結果を示す。実験結果から、本発明のマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体とＩＬ−１７Ａの結合特異性が陽性抗体Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ及びＩｘｅｋｉｚｕｍａｂの場合を上回ることが実証された。
【００６８】
【表１】
2019525730.tif 000002
【００６９】
実施例７：マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の配列測定
Ｔｒｉｚｏｌ（上海生工バイオテック社製）を用いて各ハイブリドーマ細胞株から全ＲＮＡを抽出し、逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社製）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）をプライマーとしてＰＣＲ法によりマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする遺伝子を増幅した後、ＰＣＲ産物をｐＭＤ１８−Ｔベクターに導入し、配列測定により可変領域の遺伝子配列を解析した。マルチ機能解析及び配列解析の結果、番号が１２０であるクローンを選んでパイロット抗体とし、その配列情報として、重鎖可変領域遺伝子配列は全長が３４５ｂｐであり、１１５個アミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表され、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、軽鎖可変領域遺伝子配列は全長が３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表され、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表される。ＧｅｎＢａｎｋを利用してアミノ酸配列に対して対比解析を行ったところ、両者がいずれもマウスＩｇＧ可変領域遺伝子の特徴に適合することが確認できた。
【００７０】
なお、上記と同様に、細胞発現系に適応できるように重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変領域遺伝子の配列についてコドンの最適化を行い、最適化済みの重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７で表され、最適化済みの軽鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表される。
【００７１】
実施例８：抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のヒト化
キメラ抗体（１２０−ｃｈｉｍｅｒａ，１２０−Ｃｈ）は、マウス由来抗体１２０の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を、ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲによってそれぞれヒトＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖定常領域（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ抗体に由来）と繋ぐことで構築した。
【００７２】
同時に、ＫＡＢＡＴ法則に従ってマウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体１２０の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列を解析し、３つの抗原相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）及び４つのフレーム領域（ｆｒａｍｅ  ｒｅｇｉｏｎ，ＦＲ）を確定した。そのうち、重鎖相補性決定領域のアミノ酸配列はＣＤＲ１：ＳＦＤＭＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＤＲ２：ＦＭＳＳＧＧＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）及びＣＤＲ３：ＧＥＲＹＧＳＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）であり、軽鎖相補性決定領域のアミノ酸配列は、ＣＤＲ１’：ＫＡＳＤＨＩＮＮＷＬＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＣＤＲ２’：ＧＡＴＳＬＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びＣＤＲ３’：ＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）であった。
【００７３】
ＮＣＢＩ  ＩｇＢｌａｓｔを利用してヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＨＶ３−６６＊０２を選んで重鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体１２０の重鎖ＣＤＲ領域をＩＧＨＶ３−６６＊０２フレームワーク領域に移植し、重鎖のＣＤＲ移植抗体とした。同様に、ヒトＩｇＧ生殖系配列と相同性対比を行い、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１を選んで軽鎖ＣＤＲ移植テンプレートとし、マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体１２０の軽鎖ＣＤＲ領域をＩＧＫＶ１−ＮＬ１＊０１のフレームワーク領域に移植することにより軽鎖のＣＤＲ移植抗体を構築し、得られた抗体を１２０−Ｇｒ（１２０−Ｇｒａｆｔｉｎｇ）と定義した。同時に、一部のフレーム領域におけるアミノ酸サイトに対して復帰変異を導入した。復帰変異を導入するとき、アミノ酸配列に対してＫＡＢＡＴ編集を行い、サイトの位置をＫＡＢＡＴナンバリングに変更した。重鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第２９位Ｖをマウス由来のＦ、第３７位のＶをＧ、第４４位のＧをＲ、第４９位のＳをＡにそれぞれ変更したほうが好ましく、軽鎖可変領域配列については、ＫＡＢＡＴナンバリングの第４８位のＬをＩ、第４９位のＹをＳにそれぞれ変更したほうが好ましい。上記可変領域遺伝子配列は、上海生工バイトテック社がＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのコドン使用好みを参考してコドンを最適化して合成したものであった。合成したヒト化可変領域配列をヒトＩｇＧ１定常領域と繋ぎ、該抗体を１２０号ヒト化抗体（１２０−Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ，１２０−Ｈｕ）と表記した。
【００７４】
同時に、上記抗体をベースにして１２０−Ｌｃ  Ｔ６９Ｋ（ＫＡＢＡＴナンバリングシステムに準じて１２０−Ｈｕ軽鎖における第６９位のＴをＫに戻したもの）、１２０−Ｌｃ  Ｋ４５Ｒ（１２０−Ｈｕ軽鎖における第４５位のＫをＲに戻したもの）、１２０−Ｌｃ  Ｋ４２Ｎ（１２０−Ｈｕ軽鎖における第４２位のＫをＮに戻したもの）及び１２０−Ｈｃ  Ｋ７５Ｒ（１２０−Ｈｕ重鎖における第７５位のＫをＲに戻したもの）等の結合特異性に優れたヒト化配列を構築した。１２０−Ｌｃ突然変異配列と１２０−Ｈｕ重鎖が一体となって１つの抗体遺伝子を形成し、１２０−Ｈｃ突然変異配列と１２０−Ｈｕ軽鎖が一体となって１つの抗体遺伝子を形成した。
【００７５】
ｐＴＴ５ベクター（ＮＲＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を用いてヒト化重鎖、軽鎖の一過性発現ベクターをそれぞれ構築し、ＨＥＫ２９３系（ＮＲＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）を利用して上記重鎖、軽鎖の組み合わせを一過的に導入して抗体を発現した。ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で培養し、ＰＥＩ導入法によってプラスミドを細胞に導入して５日後に上澄液を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａで精製して抗体を得た。
【００７６】
上記のようにして得られた５つの抗体のうち１２０−Ｈｕのヒト化度合いが最も高く、１２０−Ｈｕを基準として他の４つの抗体の生理活性を１２０−Ｈｕと比較したところ、該４つの抗体の細胞活性が１２０−Ｈｕに等しいか又はやや弱く、目的抗体のヒト化レベルを高める観点で、これらの抗体から１２０−Ｈｕを選んでパイロット抗体分子とした。
【００７７】
なお、抗体のヒト化レベルを更に高める観点から、１２０−Ｈｕの各復帰変異サイトを再びヒト化アミノ酸残基に変更した。重鎖可変領域配列については、１２０−ＨｕのＫＡＢＡＴナンバリング第２９位のＦをマウス由来のＶ、又は第３７位のＧをＶ、又は第４４位のＲをＧ、又は第４９位のＡをＳにそれぞれ戻し、各単一サイト変異後の重鎖配列と１２０−Ｈｕの軽鎖遺伝子を組み合わせて１つの抗体遺伝子を形成した。軽鎖可変領域配列については、１２０−ＨｕのＫＡＢＡＴナンバリング第４８位のＩをＬ、又は第４９位のＳをＹにそれぞれ戻し、各単一サイト変異後の軽鎖配列と１２０−Ｈｕの重鎖遺伝子を組み合わせて１つの抗体遺伝子とした。
【００７８】
次に、上記と同様の条件で抗体遺伝子を一過性導入、発現して細胞活性を測定した結果、上記単一サイト変異後の抗体がいずれも１２０−Ｈｕより活性が低く、１２０−Ｈｕが最も適切なヒト化抗体分子であることを確認した。
【００７９】
最後に、１２０ヒト化後の重鎖可変領域遺伝子配列は全長で３４５ｂｐであり、１１５個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１で表され、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で表される。また、ヒト化後の軽鎖可変領域遺伝子配列は全長で３２１ｂｐであり、１０７個のアミノ酸残基をコードし、ヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で表され、アミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で表される。ヒトＩｇＧ１定常領域と繋いだ後、４４５個のアミノ酸からなる１２０−Ｈｕヒト化重鎖（配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で表される）及び２１４個のアミノ酸からなる１２０−Ｈｕヒト化軽鎖（配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表される）が得られた。
【００８０】
なお、上述の重鎖可変領域遺伝子及び軽鎖可変領域遺伝子配列について、コドンを更に最適化して細胞発現系により適合するようにし、最適化後の重鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、最適化後の軽鎖可変領域遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で表される。
【００８１】
実施例９：ＩＬ−１７Ａに対するヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の結合特異性
以上のように得られた１２０−Ｈｕ抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ法（実施例６を参照）を利用して抗体の結合特異性を評価した。その結果、ヒト化後の抗体１２０−ＨｕのｈＩＬ−１７Ａに対する結合特異性が０．０２ｐＭであり（表２）、陽性抗体Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ及びＩｘｅｋｉｚｕｍａｂを遥かに上回ることが確認できた。Ｂｉａｃｏｒｅ装置で測定した精度範囲がｐＭレベルに達し、１２０−Ｈｕの結合特異性が該精度範囲を超えたため、＜１ｐＭと表記した。
【００８２】
【表２】
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【００８３】
実施例１０：ＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨｅｌａ細胞のＩＬ−６分泌に対する、ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の阻害効果
ｈＩＬ−１７Ａによって誘導されるＨｅｌａ細胞のＩＬ−６分泌に対する、ヒト化後の１２０抗体の阻害効果を測定した（実験方法は、実施例５を参照）。本実施例において、Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（Ｃｏｎｓｅｎｔｙｘ）はＮｏｖａｒｔｉｓ社製であり、Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂは実施例１で製造したものであった。測定の結果、ヒト化後の抗体が比較的高い生理活性を保持し、且つ数回に渡る実験により１２０−Ｈｕの体外活性が陽性対照物であるＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（ｐ＜０．０５，ｎ＝３）及びＩｘｅｋｉｚｕｍａｂ（ｐ＜０．０１，ｎ＝３）を上回ることが確認できた（表３、図１）。抗体の体外活性は、抗体の体内効果を決める一要因であり、１２０−ＨｕがＩＬ−１７Ａに対して優れた阻害効果を示すことから、抗体薬品候補として有力であると考えられる。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
実施例１１：ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の体内活性
１２０−Ｈｕが非霊長類動物に由来のＩＬ−１７Ａを認識しないため、齧歯類動物をそのまま用いて動物疾患モデルを構築し、自己免疫疾患の治療における１２０−Ｈｕ効果を検討した。また、マウスモデルに対して外部からｈＩＬ−１７Ａを投与することにより、炎症カスケードに対する１２０−Ｈｕの阻害効果を検討した。
【００８６】
自己免疫疾患では、誘導されたＩＬ−１７Ａの発現レベルが高く、ＩＬ−１７Ｒに結合してシグナル経路を活性化させて細胞がＣＸＣＬ１（Ｃ−Ｘ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ  ｌｉｇａｎｄ  １，Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフリガンド１）等を含むケモカインとサイトカインを大量に分泌させることにより炎症反応を誘発し、生体の正常細胞と臓器を攻撃する仕組みになっている。したがって、抗体を用いてＩＬ−１７Ａを抑制することで応答反応の発生を抑制し、自己免疫疾患の進行を阻止することができる（Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２０１３；３：２５−３１）。ヒトＩＬ−１７ＡがマウスＩＬ−１７Ｒを認識し、そして炎症カスケードを誘発することができるため、ＩＬ−１７Ａによって誘導されるマウスのＣＸＣＬ１分泌に対する抗体効果を検討することにより、自己免疫疾患の治療における抗体効果を予測することができる。
【００８７】
具体的には、５〜８週齢、雄性の昆明マウス（上海霊暢バイオテック社製、動物製造許可証番号：ＳＣＸＫ（▲濾▼）２０１３−００１８）に対して、第１日目に濃度が異なる抗体を（２０μｇ／匹〜５０μｇ／匹の範囲）腹腔から注射し、２４時間後に３μｇ／匹の量で組換えヒトＩＬ−１７Ａを皮下注射し、そして３時間後にマウスから採血を行った。マウスＣＸＣＬ１  ＥＬＩＳＡ測定キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を利用して血清中のＣＸＣＬ１濃度を測定した。陰性及び陽性対照物として、ＩｇＧ１対照抗体及びＩｘｅｋｉｚｕｍａｂを用いた。実験結果から、１２０−Ｈｕが比較的低い濃度（２０μｇ／匹）でＩＬ−１７Ａ誘導性のＣＸＣＬ１分泌を顕著に抑え、且つ同じ濃度で体内ＩＬ−１７Ａに対する１２０−Ｈｕの影響がＩｘｅｋｉｚｕｍａｂを遥かに上回ることが実証された（図２）。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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