(57)【要約】  悪性腫瘍を予防及び／又は治療するインターロイキンの組み合せ或いは組換えタンパク質、並びにそれらからなる各種の製品及びその使用。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療する医薬の組み合せであって、
（ｉ）少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子と、
（ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子とを含む、
医薬の組み合せ。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬の組み合せであって、
前記少なくとも１種のγｃ−サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含み、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含み、より好ましくは、ＩＬ−７、ＩＬ−２を含む、
医薬の組み合せ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬の組み合せであって、
（ｉ）における前記少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、及び／又は（ｉｉ）における前記少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体は、それぞれ
さらに、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はその変異体との融合、ヒト血清アルブミン又はその変異体との融合、腫瘍浸透性ペプチドとの融合、腫瘍標的性一本鎖又は単一ドメイン抗体との融合、ポリエチレングリコール化、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ、及び任意の他の適切な化学修飾からなる群より選ばれる１種以上の修飾を含む、医薬の組み合せ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬の組み合せであって、
前記悪性腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、癌、気管支癌、髄様癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、腎芽腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫瘍、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄膜腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選ばれる、医薬の組み合せ。
【請求項５】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療するキットであって、
少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子である第１の成分と、
少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子である第２の成分とを含む、キット。
【請求項６】
請求項５に記載のキットであって、前記少なくとも１種のγｃ−サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含み、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含み、より好ましくは、ＩＬ−７、ＩＬ−２を含む、キット。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のキットであって、（ｉ）における前記少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、及び／又は（ｉｉ）における前記少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体は、それぞれさらに、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はその変異体との融合、ヒト血清アルブミン又はその変異体との融合、腫瘍浸透性ペプチドとの融合、腫瘍標的性一本鎖又は単一ドメイン抗体との融合、ポリエチレングリコール化、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ、及び任意の他の適切な化学修飾からなる群より選ばれる１種以上の修飾を含む、キット。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載のキットであって、前記第１の成分及び前記第２の成分は別個の医薬組成物に存在し、或いは、前記第１の成分及び前記第２の成分は同一医薬組成物に存在する、キット。
【請求項９】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療する組換えタンパク質であって、
少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体と、
少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体とを含む、組換えタンパク質。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えタンパク質であって、
前記少なくとも１種のγｃ−サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含み、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含み、より好ましくは、ＩＬ−７、ＩＬ−２を含む、組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載の組換えタンパク質であって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列又はその活性部分、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列又はその活性部分と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるものと、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列又はその活性部分、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列又はその活性部分と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるものとを含む、組換えタンパク質。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組換えタンパク質であって、１種以上のリンカー、好ましくは生体内又は腫瘍内で切断可能なペプチドリンカーを含む、組換えタンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えタンパク質であって、前記リンカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１〜２９及び３２のいずれかに示されるリンカー、並びに生体内で切断可能なジスルフィド結合リンカーからなる群より選ばれる１つ以上のリンカーを含む、組換えタンパク質。
【請求項１４】
請求項９に記載の組換えタンパク質であって、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はその変異体との融合、ヒト血清アルブミン又はその変異体との融合、腫瘍浸透性ペプチドとの融合、腫瘍標的性一本鎖又は単一ドメイン抗体との融合、ポリエチレングリコール化、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ、及び任意の他の適切な化学修飾からなる群より選ばれる１種以上の修飾をさらに含む、組換えタンパク質。
【請求項１５】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療する組換え核酸分子であって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第１のヌクレオチド配列、及び／又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第２のヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項１６】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療するベクターであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第１のヌクレオチド配列、及び／又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第２のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のベクターであって、
プラスミド及びウイルスベクターからなる群より選ばれ、
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ若しくはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックインシステム、又は任意の他の適切なベクターを含むが、それらに制限されない、ベクター。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載のベクターであって、前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は別個のベクターに存在し、或いは前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は同一ベクターに存在する、ベクター。
【請求項１９】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療する細胞又は細胞集団であって、
請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を産生でき、或いは請求項１５に記載の組換え核酸分子を含み、或いは請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクターを含む、細胞又は細胞集団。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞又は細胞集団であって、
前記細胞は、自家細胞又は同種異系細胞から選ばれ、樹状細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球、又は任意の他の適切な細胞を含むが、それらに制限されない、細胞又は細胞集団。
【請求項２１】
悪性腫瘍を予防及び／又は治療する方法であって、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬の組み合せ、或いは請求項５〜８のいずれか１項に記載のキット、或いは請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質、或いは請求項１５に記載の組換え核酸分子、或いは請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のベクター、或いは請求項１９又は２０に記載の細胞又は細胞集団を、それを必要とする対象に予防及び／又は治療有効量で投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
前記組換えタンパク質を、それを必要とする対象に投与する場合、投与量を０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／回とし、０〜３０日間おきに１回投与し、或いは、前記ベクター例えばウイルスを、それを必要とする対象の腫瘍内に投与する場合、投与量を１０８〜１０１３ｐｆｕウイルス／腫瘍／回とし、０〜３０日間おきに１回投与し、或いは、前記細胞又は細胞集団を、それを必要とする対象に投与する場合、投与量を１０５〜１０１１細胞／ｋｇ体重／回とし、０〜１００日間おきに１回投与する、方法。
【請求項２３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬の組み合せ又は請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の、悪性腫瘍の予防及び／又は治療における使用、或いは、悪性腫瘍を予防及び／又は治療する医薬の製造における使用。
（ｉ）少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子と、
（ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載の使用であって、前記少なくとも１種のγｃ−サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含み、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含み、より好ましくはＩＬ−７、ＩＬ−２を含む、使用。
【請求項２５】
請求項２３又は２４に記載の使用であって、
（ｉ）における前記少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、及び／又は（ｉｉ）における前記少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体は、それぞれさらに、ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はその変異体との融合、ヒト血清アルブミン又はその変異体との融合、腫瘍浸透性ペプチドとの融合、腫瘍標的性一本鎖又は単一ドメイン抗体との融合、ポリエチレングリコール化、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ、及び任意の他の適切な化学修飾からなる群より選ばれる１種以上の修飾を含む、使用。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の使用であって、
前記悪性腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、気管支癌、髄様癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、腎芽腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫瘍、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄膜腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選ばれる、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍を予防及び／又は治療するインターロイキンの組み合せ或いは組換えタンパク質、並びに、それらからなる各種の製品及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
γｃ−サイトカイン（γｃ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ）は、γｃ−ファミリーサイトカイン（γｃ−ｆａｍｉｌｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、又は共通サイトカイン受容体γ鎖ファミリー（ｃｏｍｍｏｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ−ｃｈａｉｎ  ｆａｍｉｌｙ）とも呼ばれ、それはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の６個のメンバーからなる。該ファミリーの全てのメンバーは、共通サイトカイン受容体γ鎖サブユニットを含有する受容体複合体によりシグナル伝達を行う。そのうち、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−２１の受容体は、ヘテロ二量体複合体であり、共通γ鎖とユニークなサイトカイン特異的サブユニットからなり、ＩＬ−２とＩＬ−１５の受容体は、ヘテロ三量体複合体であり、ＩＬ−２Ｒα／ＩＬ−１５Ｒα、ＩＬ−２／ＩＬ−１５  Ｒβ及び共通γ鎖からなる。
【０００３】
共通サイトカイン受容体γ鎖ファミリーで活性化されたシグナル伝達経路には、ＰＩ３−Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル伝達経路、及びＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路が含まれる。該ファミリーのサイトカインは、正常な免疫系機能の確立及び維持に非常に重要であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、及び骨髄・赤血球前駆細胞を含む多くのタイプの細胞に対して、特異的でオーバーラッピング効果を有する。
【０００４】
ＩＬ−２は、最初、Ｔ細胞増殖因子として同定されており、Ｔ細胞恒常性を維持し、自己反応性を防止する上で極めて重要な役割を果たすことが示されている。ＩＬ−４は、Ｔｈ２及びＴｈ９細胞の分化、免疫グロブリンクラススイッチの調節、ならびに肥満細胞の生存や増殖の促進に必要とされる。ＩＬ−７は、Ｔ細胞の発育や恒常的な増殖、マウスＢ細胞の発育、及び記憶Ｔ細胞の産生に必要である。ＩＬ−９は、マウスＴ細胞及び肥満細胞の増殖を促進し、Ｂ細胞による免疫グロブリンの産生を調節し、肥満細胞のプロテアーゼ発現を高め、杯細胞の増殖及び粘液分泌を促進する。ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞の発育、生存及び活性化、ＮＫＴ細胞及び上皮内リンパ球の恒常性、初代及び記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の維持に必要である。最近報告されたファミリーメンバーＩＬ−２１は、Ｔｈ１７細胞分化及び濾胞ヘルパーＴ細胞の生成に必要であり、さらに、Ｂ細胞活性とＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞毒性とを調節する。
【０００５】
ＩＬ−２５は、炎症性サイトカインであり、精巣、前立腺や脾臓などの特定器官において高発現され、正常乳房を含む他の器官において低発現されているＩＬ−１７ファミリーのメンバーである。ＩＬ−２５は、ＩＬ−１７ファミリーに構造的に関連するが、生物学的機能においてＩＬ−１７及び他のファミリーメンバーには非常に異なっている。ＩＬ−２５は、活性化Ｔｈ２細胞及び非Ｔ細胞において高発現され、Ｔｈ２サイトカイン促進応答を有し、蠕虫感染に対する防御免疫応答を有し、自己免疫炎症においてＴｈ１７機能を負に調節する機能を有する。
【０００６】
ＩＬ−３３は、２００５年に発見されたＩＬ−１ファミリーの新しいメンバーであり、Ｔｈ２サイトカインを産生するために肥満細胞、リンパ球や好酸球を活性化させることができ、炎症、感染や自己免疫疾患において重要な役割を果たしている。
【０００７】
ＩＬ−２５及びＩＬ−３３は、生体の駆虫性免疫、抗真菌感染、抗アレルギー性炎症及び粘膜機能にとって重要である。真菌感染などの特定の刺激は、上皮細胞からのＩＬ２５及びＩＬ３３の放出を誘発することができ、両方ともに２型インナーリンパ球（ＩＬＣ２）を活性化させて、ＩＬＣ２の集団（個体群）を生体内で増幅させてＩＬ５及びＩＬ１３を放出させ、さらに好酸球の増幅及び活性化を促進し、ただし、ＩＬ−２５及びＩＬ−３３により活性化されるＩＬＣ２には相違性がある。活性化された好酸球は、標的細胞に対して細胞毒（細胞傷害性）効果を生じることができる。ＩＬＣ２細胞集団自体は強力な可塑性を有し、例えば、末梢血中のＩＬ１３＋ＩＬＣ２がＩＦＮγ産生能力を獲得できることは、結腸炎などの自己免疫疾患の反応に関連する可能性がある。
【発明の概要】
【０００８】
第１の態様によれば、本発明は、
（ｉ）少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子と、
（ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子とを含む、悪性腫瘍を予防及び／又は治療する医薬の組み合せを提供する。
【０００９】
一実施形態において、本発明に係る医薬の組み合せにおける少なくとも１種のγｃ−サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含む。別の一実施形態において、本発明に係る医薬の組み合せにおける少なくとも１種のγｃ−サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含む。また、別の一実施形態において、本発明に係る医薬の組み合せにおける少なくとも１種のγｃ−サイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−２を含む。
【００１０】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明に係る医薬の組み合せは、
（ｉ）少なくとも１種のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１又はその活性部分若しくは変異体、或いは発生少なくとも１種のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子と、
（ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子とを含むか、これらからなる。
【００１１】
第２の態様によれば、本発明は、
少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子である第１の成分と、
少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子である第２の成分とを含む悪性腫瘍を予防及び／又は治療するキット又は医薬組成物を提供する。
具体的な実施形態において、本発明に係るキットにおける第１の成分及び第２の成分は別個の医薬組成物に存在するか、又は同一医薬組成物に存在する。
【００１２】
第３の態様によれば、本発明は、
少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体と、
少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体とを含む悪性腫瘍を予防及び／又は治療する組換えタンパク質を提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質における少なくとも１種のγｃ−サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含む。別の一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質における少なくとも１種のγｃ−サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含む。また、別の一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質における少なくとも１種のγｃ−サイトカインはＩＬ−７、ＩＬ−２を含む。
【００１４】
一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列又はその活性部分若しくは変異体、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜６のいずれかに示されるアミノ酸配列又はその活性部分若しくは変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるものと、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列又はその活性部分若しくは変異体、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７又は８に示されるアミノ酸配列又はその活性部分若しくは変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるものとを含む。
一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質は、１種以上のリンカー、好ましくは生体内又は腫瘍内で切断可能なペプチドリンカーを含む。
【００１５】
一実施形態において、リンカーは、ｕＰＡリンカー（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子基質配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１）、ｌｅｇｕｍａｉｎリンカー（システインプロテアーゼ、  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２及び２３）、ＭＭＰ−１リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２４）、ＭＭＰ−２／９リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５）、ＭＭＰ−１４リンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６及び３２）、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂの基質ペプチドセグメントリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７）、グリシン−セリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝１−３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８）、α−ヘリカルペプチドリンカー（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝２−５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）、生体内で切断可能なジスルフィド結合リンカーからなる群より選ばれる１つ又は複数である。
一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０又は３１に示される配列を含む。
【００１６】
第４の態様によれば、本発明は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第１のヌクレオチド配列、及び／又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第２のヌクレオチド配列
を含む悪性腫瘍を予防及び／又は治療する組換え核酸分子を提供する。
【００１７】
第５の態様によれば、本発明は、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９〜１４のいずれかに示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第１のヌクレオチド配列、及び／又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体、或いはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又は１６に示されるヌクレオチド配列若しくはその変異体と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる群より選ばれる第２のヌクレオチド配列
を含む悪性腫瘍を予防及び／又は治療するベクターを提供する。
【００１８】
一実施形態において、本発明に係るベクターは、プラスミド及びウイルスベクターからなる群より選ばれ、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ若しくはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステム（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックインシステム、又は任意の他の適切なベクターを含むが、それらに制限されない。
別の一実施形態において、本発明に係る第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は別個のベクターに存在し、或いは前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は同一ベクターに存在する。
【００１９】
第６の態様によれば、本発明は、本発明に係る組換えタンパク質を産生でき、或いは本発明に記載の組換え核酸分子又はベクターを含む悪性腫瘍を予防及び／又は治療する細胞又は細胞集団を提供する。
【００２０】
一実施形態において、本発明に係る細胞又は細胞集団は、自家細胞、同種異系細胞から選ばれ、樹状細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好酸球を含むが、それらに制限されず、形質転換された同種又は異種細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３誘導細胞、又は任意の他の適切な細胞を含むが、それらに制限されない。
別の一実施形態において、本発明に係る細胞又は細胞集団はマイクロカプセル化することができ、例えば、本発明に係る形質転換された同種又は異種細胞マイクロカプセル化することができる。また、アルギン酸ナトリウムなどのヒドロゲルを用いて、本発明に係る細胞又は細胞集団に対してマイクロカプセル化パッケージしてもよい。
また、別の一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質は、異なる細胞又は細胞集団で発現されて発生し、又は同一細胞又は細胞集団で発現されて発生し、或いは、本発明に係る組換え核酸分子又はベクターは、異なる細胞又は細胞集団に含まれ、又は同一細胞又は細胞集団に含まれる。
【００２１】
第７の態様によれば、本発明は、本発明に係る医薬の組み合せ、又は本発明に係るキット、又は本発明に係る組換えタンパク質、又は本発明に係る組換え核酸分子、又は本発明に係るベクター、又は本発明に係る細胞又は細胞集団を、それを必要とする対象に予防及び／又は治療有効量で投与するステップを含む悪性腫瘍を予防及び／又は治療する方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質を、それを必要とする対象に投与する場合、投与量を０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／回とし、０〜３０日間おきに１回投与する。別の一実施形態において、定時的且つ定量的に皮下を自動的に連続的に注射するポンプ（例えばインシュリンポンプ）を所望の用量で投与してもよい。
別の一実施形態において、必要とする対象の腫瘍内に本発明に係るベクター例えばウイルスを投与する場合、投与量を１０８〜１０１３ｐｆｕウイルス／腫瘍／回とし、０〜３０日間おきに１回投与する。
また、別の一実施形態において、本発明に係る細胞又は細胞集団を、それを必要とする対象に投与する場合、投与量を１０５〜１０１１細胞／ｋｇ体重／回とし、０〜１００日間おきに１回投与する。
【００２３】
第８の態様によれば、本発明は、
（ｉ）少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子と、
（ｉｉ）少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体を生成できるベクター又は細胞又は細胞集団、或いは、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体をコードできる核酸分子との組み合せの、悪性腫瘍の予防及び／又は治療における使用、或いは、悪性腫瘍を予防及び／又は治療する医薬の製造における使用を提供する。
【００２４】
以上の各態様では、本発明に係る少なくとも１種のγｃ−サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１を含み、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５を含み、より好ましくは、ＩＬ−７、ＩＬ−２を含む。
【００２５】
以上の各態様では、本発明に係る少なくとも１種のγｃ−サイトカイン、すなわちＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１、又はその活性部分若しくは変異体、及び／又は前記少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体、及び／又は、本発明に係る組換えタンパク質は、さらにヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント又はその変異体との融合、ヒト血清アルブミン又はその変異体との融合、腫瘍浸透性ペプチドとの融合、腫瘍標的性一本鎖又は単一ドメイン抗体との融合、ポリエチレングリコール化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、ヒドロキシエチルデンプン化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、及び任意の他の適切な化学修飾からなる群より選ばれる１種以上の修飾を含む。
【００２６】
以上の各態様では、かかる悪性腫瘍は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、癌、気管支癌、髄様癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、腎芽腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫瘍、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄膜腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫からなる群より選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｂ１６Ｆ１０黒色腫に対するサイトカイン治療薬の組み合せのスクリーニングプロセスの図を示す。Ａは、マウスサイトカインのレトロウイルスベクター構築を示し、Ｂは、レトロウイルスベクターとパッケージングヘルパープラスミドｐＣＬ−ＡｍｐｈｏでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクションして、サイトカインを発現可能なレトロウイルス粒子としてパッケージすること示し、Ｃは、サイトカインを産生する細胞プールの生成及び富化を示し、Ｂ１６Ｆ１０細胞を対応したレトロウイルスで形質導入した後、ピューロマイシン医薬でスクリーニングして富化させ、Ｄは、腫瘍増殖に対するサイトカイン及びその組み合せの影響を検証することであり、Ｂ１６Ｆ１０親細胞をマウスの左側に注射して効果腫瘍とし、単一サイトカインを産生する細胞プール又は２種の異なるサイトカインを産生する細胞プールを組み合せて右側に注射してサイトカイン腫瘍とする。
【図２】一部のサイトカインによる腫瘍成長阻害作用の結果（群ごとにｎ＝４）を例示的に示す。対照群としてＢ１６Ｆ１０親細胞又は空のレトロウイルスベクターで形質導入されたＢ１６Ｆ１０を用い、細胞を接種してから１６日後、腫瘍を取り出して重量を量る。
【図３】腫瘍成長状況から分かるＣ５７ＢＬ／６マウスの生体内でのＩＬ−７とＩＬ−２５の組み合せによる相乗抗腫瘍作用を示す。５×１０５のＢ１６Ｆ１０親細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの左側に皮内（ｉ．ｄ．）注射し（効果腫瘍として）、ＩＬ−７又はＩＬ−２５による細胞プール又は該２種のサイトカインを混合して発生させる細胞プール（それぞれ１００万）を右側に皮内注射し（医薬腫瘍として）、腫瘍細胞を注射して４日後から、効果腫瘍の面積（Ａ）とサイトカイン産生腫瘍の面積（Ｂ）（群ごとにｎ＝１０）を測定する。
【図４】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現されて６ｘＨｉｓタグ付きのもののクーマシーブリリアントブルー染色像（レーンごとに１０μｇのタンパク質を注入する）を示す。ＡはＩＬ−７であり、Ｂは腫瘍のＩＬ−２５、Ｃはｈｕ−ＩＬ−７、ｈｕ−ＩＬ−２５又はｈｕＩＬ−７＋ｈｕＩＬ−２５の組み合せによる治療応答動態である。５×１０５のＢ１６Ｆ１０親細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの両側（群ごとに１０匹）に皮内注射して、２４時間後、マウスの腹腔にＰＢＳに溶解したＩＬ−７、ＩＬ−２５、ＩＬ−７＋ＩＬ−２５（１回にそれぞれ５μｇ）を１日に２回注射し、腫瘍細胞を注射してから５日後から、毎日腫瘍の面積を測定する。
【００２８】
配列の説明
特に断りのない限り、シグナルペプチドのアミノ酸配列又はその対応するヌクレオチド配列は、以下の配列において太字で示されている。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １はヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を示す。
【数１】
2019518786.tif 000003
【００２９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２はヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を示す。
【数２】
2019518786.tif 000004
【００３０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３はヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を示し、下線付きイタリック体で示されるアミノ酸残基（９６位から１１４位）はｈｕ−ＩＬ−７配列から欠失されてもよく、スプライシング異性体である。
【数３】
2019518786.tif 000005
【００３１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４はヒトＩＬ−９のアミノ酸配列を示す。
【数４】
2019518786.tif 000006
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５はヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を示す。
【数５】
2019518786.tif 000007
【００３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６はヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を示す。
【数６】
2019518786.tif 000008
【００３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７はヒトＩＬ−２５のアミノ酸配列を示し、１つのスプライシング異性体のｈｕ−ＩＬ−２５では、シグナルペプチド配列の太字のイタリック体による部分は異なり、アミノ酸Ｙで置換されてもよいが、成熟したＩＬ−２５配列は同じである。
【数７】
2019518786.tif 000009
【００３５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８はヒトＩＬ−３３のアミノ酸配列を示し、太字で示されるのはそのプロペプチドに含まれるアミノ酸配列である。
【数８】
2019518786.tif 000010
【００３６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９はヒトＩＬ−２のヌクレオチド配列を示す。
【数９】
2019518786.tif 000011
【００３７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０はヒトＩＬ−４のヌクレオチド配列を示す。
【数１０】
2019518786.tif 000012
【００３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１はヒトＩＬ−７のヌクレオチド配列を示す。
【数１１】
2019518786.tif 000013
【００３９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２はヒトＩＬ−９のヌクレオチド配列を示す。
【数１２】
2019518786.tif 000014
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １３はヒトＩＬ−１５のヌクレオチド配列を示す。
【数１３】
2019518786.tif 000015
【００４１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４はヒトＩＬ−２１のヌクレオチド配列を示す。
【数１４】
2019518786.tif 000016
【００４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５はヒトＩＬ−２５のヌクレオチド配列を示す。
【数１５】
2019518786.tif 000017
【００４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６はヒトＩＬ−３３のヌクレオチド配列を示し、太字で示されるのはそのプロペプチドに含まれるヌクレオチド配列である。
【数１６】
2019518786.tif 000018
【００４４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７はＨＳＡ−ＩＬ−７の組換えタンパク質のアミノ酸配列の一例を示し、下線はＧＧＧＧＳのリンカー領域をマークし、ヒトＩＬ−７はヒト血清アルブミンのＣ末端に融合されている。
【数１７】
2019518786.tif 000019
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８はＩＬ−２５−ＨＳＡの組換えタンパク質のアミノ酸配列の一例を示し、下線はＧＧＧＧＳのリンカー領域をマークし、ヒトＩＬ−２５はヒト血清アルブミンのＮ末端に融合されている。
【数１８】
2019518786.tif 000020
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９はＩｇＧ４ｍＦｃ−ＩＬ−７の組換えタンパク質のアミノ酸配列の一例を示し、下線はＧＧＧＧＳのリンカー領域をマークし、ヒトＩＬ−７はヒトＩｇＧ４ｍ  ＦｃのＣ末端に融合されている。
【数１９】
2019518786.tif 000021
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０はＩｇＧ４ｍＦｃ−ＩＬ−２５の組換えタンパク質のアミノ酸配列の一例を示し、下線はＧＧＧＧＳのリンカー領域をマークし、ヒトＩＬ−２５はヒトＩｇＧ４ｍ  ＦｃのＣ末端に融合されている。
【数２０】
2019518786.tif 000022
【００４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２１はｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子基質配列）感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＬＳＧＲ↓ＳＤＮＨ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２２はｌｅｇｕｍａｉｎ（システインプロテアーゼ）の感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＡＡＮ↓Ｌ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２３はｌｅｇｕｍａｉｎ（システインプロテアーゼ）の感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＡＡＮ↓Ｖ
【００４９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２４はＭＭＰ−１感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＰＬＧ↓ＬＷＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５はＭＭＰ−２／９感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＰＡＡ↓ＬＶＧＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６はＭＭＰ−１４感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＳＧＲＩＧＦ↓ＬＲＴＡ
【００５０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３２はＭＭＰ−１４感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＰＡＧ↓ＬＶＧ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７はＣａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ感受性切断配列であり、↓は切断部位を示す。
ＧＦＬＧ↓
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８はグリシン−セリンリンカーである。
（ＧＧＧＧＳ）ｎ、ｎ＝１−３
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９はα−ヘリックスペプチドリンカーである。
（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ｎ＝２−５
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０はＩＬ−２５＋ＩＬ７の組換えタンパク質のアミノ酸配列の一例を示し、両活性部分の中間に含まれるｕＰＡで切断可能なペプチドのリンカー配列は太字でマークされ、ｕＰＡ識別基質配列は一重下線でマークされ、腫瘍浸透性ペプチドｉＲＧＤは二重下線でマークされる。
【数２１】
2019518786.tif 000023
【００５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１はＩＬ−２５＋ＩＬ−７＋ＩＬ−２の組換えタンパク質のアミノ酸配列の一例を示し、活性部分の間に含まれるｕＰＡで切断可能なペプチドのリンカー配列は太字でマークされ、ｕＰＡ基質配列は一重下線でマークされ、腫瘍浸透性ペプチドｉＲＧＤは二重下線でマークされる。
【数２２】
2019518786.tif 000024
【発明を実施するための形態】
【００５３】
特に断りのない限り、本発明中の各用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明では、用語「γｃ−サイトカイン」又は「γｃ−ファミリーサイトカイン」又は「共通サイトカイン受容体γ鎖ファミリー」は交換可能に使用でき、６個のメンバー（すなわちＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１）からなるファミリーサイトカインを意味し、該ファミリーの全てのメンバーは共通サイトカイン受容体γ鎖サブユニットを含有する受容体複合体によりシグナル伝達を行う。
【００５４】
一実施形態において、適切なγｃ−サイトカインの代表例として、それぞれのシグナルペプチド配列を除去した成熟部分又はそのうちの一部のアミノ酸の内部が欠失している活性部分が含まれる。ＩＬ−７を例にすれば、成熟ＩＬ−７ポリペプチド部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される配列におけるシグナルペプチド配列を除く）を含むがそれに制限されなく、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３において９６〜１１４位のアミノ酸の内部が欠失している配列を含む。
【００５５】
本発明では、「ＩＬ−２５」は、ＩＬ−１７Ｅとも呼ばれ、構造的に関連するＩＬ−１７ファミリーのメンバーの１つであるが、機能的に他のＩＬ−１７ファミリーのメンバーとは異なる。適切なＩＬ−２５の代表例として、成熟ＩＬ−２５ポリペプチド部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７に示される配列におけるシグナルペプチド配列を除く）が含まれる。
本発明では、「ＩＬ−３３」はＩＬ−１ファミリーの新しいメンバーである。適切なＩＬ−３３の代表例として、ＩＬ−３３ポリペプチド成熟部分（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６に示される配列における太字配列を除く）が含まれる。
【００５６】
本発明に記載される種々のサイトカインのアミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列には、対応する変異体又は突然変異体が包含される。本分野で知られているサイトカインの各種変異体又は突然変異体はいずれも本発明に使用され得、相関情報についてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／に記載されている。一般的には、特定のヌクレオチド配列の変異体は該特定のヌクレオチド配列とは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％又はそれよりも高い配列同一性を有し、又は以上の相補配列を有する。このような変異体配列は、１つ又は複数の核酸残基の添加、欠失又は置換を有するため、対応したアミノ酸残基の添加、削除又は置換を引き起こし得る。ハイブリダイゼーション技術などの本分野で知られている配列比較プログラムで配列同一性を決定できる。
【００５７】
従って、ヌクレオチド配列変異体と上記配列との差異とは、１〜１５個、１〜１０個（例えば６〜１０個）、５個、４個、３個、２個、又は１個のヌクレオチドだけであってもよい。それに対応して、アミノ酸配列変異体と上記配列との差異は、１〜１５個、１〜１０個（例えば６〜１０個）、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸だけであってもよい。
【００５８】
一実施形態において、ＩＬ−７を例にすれば、その変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％又はそれよりも高い同一性を有する活性変異体であってもよい。それに対応して、ＩＬ−７をコードする核酸変異体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は９９．９％又はそれよりも高い同一性を有する変異体であってもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態において、ペプチド又はタンパク質類医薬の生体内半減期を延長させて、それらの医薬動態的及び薬力学的特徴を改善するために、本発明に係る各種サイトカインは、本分野で知られている適切な化学修飾を行ってもよい。例えばポリエチレングリコール化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎ、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ又は他のタンパク質との融合が挙げられる。本発明に係る各種サイトカインはタブを含有してもよく、タグを含有してなくてもく、タグはいずれかのサブタイプ又は変異体のヒト抗体Ｆｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はヒトトランスフェリンを含むが、それらに制限されず、これらタグは、サイトカインのＮ末端又はＣ末端でサイトカインと融合する。
【００６０】
具体的には、Ｘｔｅｎｙｌａｔｉｏｎは米国Ａｍｕｎｉｘ社が最近開発したＸＴＥＮ技術に関わり、該技術は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒの６種類のアミノ酸からなる長さの異なるペプチド鎖を利用するものであり、このようなプチド鎖は、特定の立体配座がなく、ＸＴＥＮ配列と呼ばれ、ペプチド又はタンパク質医薬とＸＴＥＮ配列を遺伝子融合方法で連結することにより、前者の可溶性と安定性を高めるとともに、免疫原性が低く、生成物の純度が高く、完全に生分解可能であるという特徴を有する。また、ＸＬ−ｐｒｏｔｅｉｎ社は繰り返したＰｒｏ、Ａｌａ及びＳｅｒを用いてランダムコイルのタンパク質構造を構成し、このような技術はＰＡＳｙｌａｔｉｏｎと呼ばれ、上記３種類のアミノ酸を用いて２００〜６００個のアミノ酸残基のＰＡＳ配列を構成し、遺伝子融合方法でタンパク質又はペプチド類医薬と連結させることで、体積を増大し、それにより腎臓による高速濾過を阻害して、半減期を延長させる。
【００６１】
一実施形態において、ＩＬ−７とＩＬ−２５を例にすれば、そのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）組換えタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７と１８に示され、そのＩｇＧ４ｍＦｃ組換えタンパク質のアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９と２０に示される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質の腫瘍における富化を高めるために、サイトカインのＮ末端又はＣ末端で腫瘍浸透性ペプチド（ｔｕｍｏｒ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）と融合させることができ、そのＮ末端でのｃＲＧＤペプチド又はｃＮＧＲの融合、そのＣ末端でのｉＲＧＤペプチド又はｉＮＧＲペプチドの融合が含まれるが、それらに制限されず、また、サイトカインのＮ末端又はＣ末端で腫瘍標的性単一鎖又は単一ドメイン抗体に融合させることもでき、Ｔｎ−Ｍｕｃ１、ＥＤＢ−フィブロネクチン、メソセリン、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＰＤ−Ｌ１又はＥＧＦＲを標的とする単一鎖又は単一ドメイン抗体への融合が挙げられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質の腫瘍における富化を高めるために、サイトカインのＮ末端又はＣ末端で腫瘍浸透性ペプチド（ｔｕｍｏｒ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）と融合させることができ、そのＮ末端でのｃＲＧＤペプチド又はｃＮＧＲの融合、そのＣ末端でのｉＲＧＤペプチド又はｉＮＧＲペプチドの融合が含まれるが、それらに制限されず、また、サイトカインのＮ末端又はＣ末端で腫瘍標的性単一鎖又は単一ドメイン抗体に融合させることもでき、Ｔｎ−Ｍｕｃ１、ＥＤＢ−フィブロネクチン、メソセリン、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＰＤ−Ｌ１又はＥＧＦＲを標的とする単一鎖又は単一ドメイン抗体への融合が挙げられる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、組み合せ医薬の剤型、プロセスの簡素化及び応用の利便性から、本発明に係る各種サイトカインの組み合せは、組換えタンパク質により実現されることができ、組換えタンパク質の活性部分間に生体内又は腫瘍内で切断可能なペプチドリンカーを有してもよい。
一実施形態において、ＩＬ−７とＩＬ−２５を例にすれば、ｕＰＡで切断可能なリンカーと腫瘍浸透性ペプチドｉＲＧＤを含有するＩＬ−２５とＩＬ−７の組換えタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示される。
【００６５】
一実施形態において、ＩＬ−７、ＩＬ−２５及びＩＬ−２ｖ変異体（Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ｋ）を例にすれば、ｕＰＡで切断可能なリンカーと腫瘍浸透性ペプチドｉＲＧＤを含有するＩＬ−２５、ＩＬ−７及びＩＬ−２ｖの組換えタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１に示される。
本発明では、用語「組換えタンパク質」とは、本分野で知られている遺伝子組換え技術を用いて、目的タンパク質に翻訳できる遺伝子フラグメントが連結された組換えベクターを得て、次に目的タンパク質を発現可能な宿主細胞に導入して、それにより特定の組換えタンパク質分子を発現させたものを意味する。
【００６６】
一実施形態において、本発明に係る組換えタンパク質は、γｃ−ファミリーサイトカインメンバーから選ばれる１種又は複数種を含むが、それらに制限されず、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１、及びＩＬ−２５又はＩＬ−３３が挙げられる。
【００６７】
別の一実施形態において、本発明におけるこれらサイトカインの核酸コード配列は、別個のベクターに存在してもよく、或いは又はこれらサイトカインの核酸コード配列は、いずれかの２種又は３種の組み合せとして同一ベクターに存在してもよい。
さらに、本発明に係る組換えタンパク質は、異なる細胞又は細胞集団で発現させて生成してもよく、或いは、同一細胞又は細胞集団で発現させて生成してもよい。
【００６８】
その代案としては、本発明に係る組換え核酸分子又はベクターは、異なる細胞又は細胞集団に含まれてもよく、或いは、同一細胞又は細胞集団に含まれてもよい。
本発明では、用語「ベクター」とは、異種ＤＮＡを宿主細胞に導入して表現型を形質転換させたいずれかの組換えポリヌクレオチドのことをいう。プラスミドはベクターの一例であり、環状二本鎖核酸ループを有し、他のデオキシリボ核酸のフラグメントに挿入できる。ウイルスベクターはベクターの別の一例であり、外来ＤＮＡフラグメントがウイルスゲノムに挿入でき、転写産物が感染性ウイルス粒子としてパッケージされて標的細胞に形質導入することができる。レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターなどのいくつかのウイルスベクターは、形質導入後に宿主細胞ゲノムに組み込み、宿主ゲノムとともに複製できる。
【００６９】
さらに、遺伝子発現を指導できるベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。具体的には、発現ベクターは、形質転換、トランスフェクト又はトランスフェクトされた宿主細胞において目的の遺伝子を複製及び発現させることができるものを指す。発現ベクターは、生体細胞内の維持されたベクターの増幅を保証するために、表現型選択マーカー及び複製された源配列を１つ又は複数含み得る。発現ベクターはまた、プロモーターによるポリペプチドの細胞内の発現の駆動を含む。適切な発現ベクターはプラスミド又はウイルスベクターであり得る。
本発明では、用語「予防及び／又は治療」は、悪性腫瘍の防止、阻害、治癒、軽減又は緩和、及び原発癌の転移の予防又は遅延を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態において、予防及び／又は治療対象となる悪性腫瘍は、肉腫や癌などの各期の悪性腫瘍を含み、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、気管支癌、髄様癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、腎芽腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫瘍、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄膜腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫のタイプを含むが、それらに制限されない。
【００７１】
一実施形態において、予防及び／又は治療対象となる肉腫は、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫などである。
【００７２】
別の一実施形態において、予防及び／又は治療対象となる癌は、例えば結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、気管支癌、髄様癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、腎芽腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫瘍、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴神経腫、髄膜腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などである。
【００７３】
また、別の一実施形態において、予防及び／又は治療対象となる進行癌は、悪性黒色腫、肺癌、結腸癌、肝癌、頭頸部癌、肉腫、前立腺癌、及び定の段階に進行して一般的な治療方法で治癒できない進行癌を含む。
【００７４】
本発明では、本発明では、用語「併用療法」とは、少なくとも１種のγｃ−サイトカイン又はその活性部分若しくは変異体と、少なくとも１種のＩＬ−２５又はＩＬ−３３又はその活性部分若しくは変異体との組み合せを、それを必要とする対象に投与することを意味する。併用療法は「相乗」と「相乗効果」を果たすことができ、すなわち、活性成分を同時に使用する場合、化合物を単独で使用する場合の効果の和より高い効果を果たす。活性成分を、（１）同時に製造して投与し、又は組み合せ製剤として同時に送達する場合、（２）別個の製剤として、交互又は平行に送達する場合、或いは（３）いくつかの他の形態を用いる場合、相乗効果は得ることができる。
【００７５】
例えば、一実施形態において、本発明に係る組み合せは、（ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１から選ばれるいずれかの１種、２種、４種、４種、５種又は６種のインターロイキンと、（ｉｉ）ＩＬ−２５又はＩＬ−３３から選ばれるいずれかの１種又は２種のインターロイキンとを含み、或いは又は前記（ｉ）と前記（ｉｉ）とから構成される。
【００７６】
具体的な実施形態において、本発明に係る組み合せは、（ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５又はＩＬ−２１から選ばれるいずれかの１種又は２種のインターロイキンと、（ｉｉ）ＩＬ−２５又はＩＬ−３３から選ばれるいずれか１種のインターロイキンとを含み、或いは前記（ｉ）と前記（ｉｉ）とから構成される。
【００７７】
別の一実施形態において、本発明に係る組み合せは、（ｉ）ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５から選ばれるいずれかの１種又は２種のインターロイキンと、（ｉｉ）ＩＬ−２５又はＩＬ−３３から選ばれるいずれかの１種のインターロイキンとを含み、或いは前記（ｉ）と前記（ｉｉ）とから構成される。
【００７８】
また、別の一実施形態において、本発明に係る組み合せは、（ｉ）ＩＬ−７、ＩＬ−９又はＩＬ−１５から選ばれるいずれかの１種又は２種のインターロイキンと（ｉｉ）ＩＬ−２５とを含み、或いは前記（ｉ）と前記（ｉｉ）とから構成される。
【００７９】
さらに、一実施形態において、本発明に係る組み合せは、（ｉ）ＩＬ−７と、（ｉｉ）ＩＬ−２５又はＩＬ−３３から選ばれるいずれかの１種のインターロイキンとを含み、或いは前記（ｉ）と前記（ｉｉ）とから構成される。
さらに、別の一実施形態において、本発明に係る組み合せは、（ｉ）ＩＬ−７と、（ｉｉ）ＩＬ−２５と、（ｉｉｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−９又はＩＬ−１５から選ばれるいずれかの１種のインターロイキンとを含み、或いは前記（ｉ）と前記（ｉｉ）と前記（ｉｉｉ）とから構成される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、３種類のインターロイキンを含む組み合せは、２種のインターロイキンを含む組み合せに比べて、腫瘍に対する阻害作用が高く、且つかかる時間が短い。
【００８１】
具体的な実施形態において、本発明に係るインターロイキンの組み合せは、同時に又は順番に対象に投与できる。
具体的な実施形態において、本発明に係るサイトカインインターロイキンの組み合せは、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射又は筋肉内注射により対象に投与することができる。
【００８２】
本発明では、用語「治療有効量」は、場合によって決定されてもよく、当業者であれば、実際の必要量に応じて容易に把握することができ、例えば、患者の体重、年齢、及び病状に基づいて決定することができる。抽出物は全て非毒性成分であるので、必要に応じて抽出物として直接投与することができ、この場合、組成物は薬学的に許容される担体を含まない。組成物が薬学的に許容される担体を含む場合、製薬分野の常法で混合して所望の医薬を調製することができる。
【００８３】
以下、ＩＬ−７とＩＬ−２５の組み合せを例にして、本発明における併用療法の実施形態について説明する。
ＩＬ−７とＩＬ−２５の組み合せ又はその活性変異体の組み合せを哺乳動物宿主に投与する。別の実施形態では、ＩＬ−７及びＩＬ−２５は、精製組換えタンパク質に加えて、遺伝子操作された細胞に由来してもよく、遺伝子操作された細胞は、任意の形質転換細胞、樹状細胞又はＴ細胞などの自家細胞を含むが、それに制限されず、これらの細胞は、活性ＩＬ−７又はＩＬ−２５又はその両方を発現させるためにウイルスベクターによって形質導入され得、そしてに用いられてもよい。さらに別の実施形態では、形質転換された細胞又は細胞系は、アルギン酸ナトリウムゲルなどのヒドロゲルに封入して生体に用いられてもよい。
【００８４】
一実施形態において、ＩＬ−７とＩＬ−２５組換えタンパク質の対象への治療用量は、好ましくは、０．０００１〜１０ミリグラム／キログラム体重／日である。別の一実施形態において、ＩＬ−７又はＩＬ−２５を発現させた操作された細胞株をマイクロカプセル化して、生体に使用される量は、好ましくは、１×１０６〜１×１０１２である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明の前記サイトカインＩＬ−７とＩＬ−２５の組み合せはＩＬ−７とＩＬ−２５産生細胞を混合することにより製造されてもよい。具体的な実施形態において、ＩＬ−７とＩＬ−２５ｎ２種のサイトカインを同時に産生できてマイクロカプセル化した操作された細胞を宿主に皮下又は腹腔内注射する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明の前記サイトカインＩＬ−７とＩＬ−２５の組み合せは、ＩＬ−７とＩＬ−２５分子の間に腫瘍内で切断可能なペプチドを含む組換え組換えタンパク質を設計することにより製造でき、具体的な実施形態において、組換えタンパク質を宿主に血液又は腹腔内又は腫瘍内注射できる。
【００８７】
ＩＬ−７とＩＬ−２５を同時に分泌できて操作された自己樹状細胞を併用療法に用いる場合、好ましくは、用量は１×１０６〜１×１０１２細胞であり、これら細胞は宿主に皮下又は筋肉内注射できる。同様に、使用される細胞がＴ細胞である場合、同じ用量が使用できるが、Ｔ細胞は宿主に静脈内注射される。
【００８８】
以下の実施例は本発明の範囲を説明するために過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。特に断りのない場合、実施例のいずれも通常の実験条件、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる分子クローン実験マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２００１）、又はメーカによる取り扱い書に記載の条件を採用する。
【実施例】
【００８９】
実施例１
本実施例では、ＩＬ−７を例にして、サイトカインを産生する腫瘍細胞プールの製造方法を提供し、具体的には、以下のステップを含む。
【００９０】
ステップ１
自分で合成されたマウス脾臓及び肺逆転写反応生成物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製の逆転写反応キットを用いて製造される）から、ＰＣＲにより、コード配列とシグナルペプチドを含むマウスサイトカインＩＬ−７のｃＤＮＡを合成した。
【００９１】
ステップ２
これら遺伝子をそれぞれレトロウイルスベクターｐＢａｂｅ−ＳＶ４０−ｐｕｒｏ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／から購入）にクローニングして、配列確認を行った。
【００９２】
ステップ３
ｐＣＬ−Ａｍｐｈｏヘルパープラスミド（ＮＯＶＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から購入）とサイトカインを発現可能なｐＢａｂｅ誘導プラスミドを用いて、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／から購入）を同時トランスフェクションして、レトロウイルスを生成した。
簡単に言えば、一過性トランスフェクションの１０分前、１日前にｐ１００細胞培養皿に敷いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養液を、予熱したｐｅｎ／ｓｔｒｐ不含ＤＭＥＭ−１０培地（１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭとグルタミン）に変更した。５μｇのｐＣＬ−Ａｍｐｈｏヘルパープラスミドと５μｇのｐＢａｂｅ誘導プラスミドブレンドをＥｐｐｅｎｄｏｆチューブにおいて混合し、次にＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１ミリリットルを添加して、ＰＥＩトランスフェクション試薬３０マイクロリットルを混入し、室温で１０分間インキュベートした後、これらＤＮＡ沈殿含有混合物を上記ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の培養皿に加え、６時間後、Ｐｅｎ／ｓｔｒｐを加えて一晩放置し、次に新しいＤＭＥＭ−１０培地に変更して、２４時間後、レトロウイルスを含む上澄み液を収集して、４５μＭフィルタで消毒した。
【００９３】
ステップ４
レトロウイルスでマウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０細胞（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／から購入）を形質導入して、富化させて、サイトカインＩＬ−７を産生する腫瘍細胞プールを得た。
簡単に言えば、ｐ１００細胞培養皿で培養したＢ１６Ｆ１０細胞を、ポリブレン（最終濃度８μｇ／ｍＬ）を添加した得られたレトロウイルスで形質導入して一晩放置し、次に、培養液をＤＭＥＭ１０培地に交換して、ピューロマイシン（最終濃度３μｇ／ｍＬ）を加え、ウイルスで形質導入された細胞を富化させ、細胞を増幅した後、長期間保存できるように凍結保存液において凍結保存した。
【００９４】
同様に、他のサイトカイン、例えばＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−２８、ＩＬ−３６を産生する腫瘍細胞プールも製造できる。また、以上の２種又は２種以上の細胞プールを混合すると、２種又は２種以上のサイトカインを共発現させる腫瘍細胞プールを産生することができる。
【００９５】
実施例２
本実施例では、サイトカインを産生する腫瘍細胞プールを製造した上、生体内実験で、腫瘍成長に対して相乗阻害作用を有するサイトカインの組み合せをスクリーニングした。
実験動物：腫瘍細胞の注射と腫瘍のサイズの測定し易さから、約２〜３月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの両側をシェービングした。
細胞製造：全体に亘り成長していないＢ１６Ｆ１０親細胞をトリプシンで消化して、血球計数板で細胞濃度を測定した。
【００９６】
生体内実験：ＲＰＭＩ−１６４０培養液に懸濁させた５×１０５  Ｂ１６Ｆ１０親細胞を雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側に皮内（ｉ．ｄ．）注射して効果腫瘍とした。同様に、特異性サイトカインを発現させた腫瘍細胞プール又はそれらの組み合せ（それぞれ１×１０６細胞）を右側に皮内注射してサイトカイン腫瘍とした。１６日目にマウスを殺して、腫瘍のサイズを測定した。
本発明では、「サイトカイン腫瘍」とは、連続医薬発生デバイスと言え、持続的にサイトカインを放出して生体の免疫系を活性化させ、活性化させた免疫系はサイトカイン腫瘍自体と効果腫瘍に対して殺滅作用を有し、「効果腫瘍」のサイズは組み合せ医薬の治療効果を反映するものである。一側の腫瘍（一般的にはサイトカイン腫瘍自体）を阻害する場合、該医薬の組み合せは、必要なサイトカイン濃度が高く、又は局所組織に存在する免疫細胞を刺激して腫瘍を阻害させる効果を有すること、或いは強い走化性促進作用を有するため対照として参照できることを示している。両側の腫瘍ともに顕著に阻害できる組み合せは、治療価値のある組み合せと見なされる。
上記サイトカインを産生する腫瘍細胞プールの製造及び腫瘍成長阻害作用確認に関する実験のフローチャートは図１に示される。
図２は、様々なサイトカインを産生する腫瘍細胞プール又はそれらの組み合せで腫瘍成長阻害作用を確認した例示的な結果を示している。
【００９７】
実施例３
本実施例では、具体的には、以下のように、サイトカインＩＬ−７とＩＬ−２５を産生する腫瘍細胞プールを用いて腫瘍を治療した。
２〜３月齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹を一群として、以下の４群に分けた。
対照群：両側にそれぞれ５×１０５のＢ１６Ｆ１０親細胞を皮内注射した。
ＩＬ−７治療群：ＩＬ−７産生細胞プール（１００万）をマウスの右側に注射して、Ｂ１６Ｆ１０親細胞（５×１０５  効果腫瘍とする）を左側に注射した。
ＩＬ−２５治療群：ＩＬ−２５産生細胞プールを右側皮内に注射して、Ｂ１６Ｆ１０親細胞を左側皮内に注射した。
ＩＬ−７＋ＩＬ−２５治療群：ＩＬ−７とＩＬ−２５を産生する細胞プールをそれぞれ１００万混合して右側皮内に注射して、左側皮内にＢ１６Ｆ１０親細胞を注射した。
【００９８】
４日間後から、毎日ノギスで両側の腫瘍の面積を測定した。実験結果を図３に示した。
また、ｈｕ−ＩＬ−７とｈｕ−ＩＬ−２５を共発現させた細胞プールを用いる場合にも、同じ結果は得られた。
【００９９】
実施例４
本実施例では、組換えｈｕ−ＩＬ−７とｈｕ−ＩＬ−２５タンパク質の発現と精製、及び腫瘍に対する治療作用が示されている。
１．組換えｈｕ−ＩＬ−７又はｈｕ−ＩＬ−２５タンパク質の発現と精製
６ＸＨｉｓでＮ末端が標識されたヒトＩＬ−７又はＩＬ−２５  ｃＤＮＡ非シグナルペプチド領域のコード配列をＰＣＲにより合成して、ｐＥＴ１５プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社から購入）にクローニングした。
配列確認後、ベクターで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ社から購入）を形質転換して、形質転換した単一のコロニーをＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）１０ミリリットルに接種して、３７℃のシェーカーにおいて２５０ｒｐｍ／ｍｉｎで一晩培養した。初期培養物５ｍＬをアンピシリンを含むＬＢ培養液５００ｍＬに移し、２５℃のシェーカーにおいてＯＤ６００が０．４程度になるまで培養し、ＩＰＴＧを２００μＭになるまで加えて一晩誘導培養を行った。
【０１００】
得られた培養物を遠心分離して懸濁バッファー（２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、塩化ナトリウム５０ｍＭ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁させ、マイクロ超音波で細胞を破砕して、高速遠心分離後、上澄み液を捨てて、封入体を含有する沈殿を懸濁バッファーで１回洗浄し、次に変性バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、６  Ｍ塩酸グアニジン）に溶解し、高速遠心分離後、上澄み液には変性封入体タンパク質を含有した。
【０１０１】
得られた上澄み液を１．５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティークロマトグラフィーカラムを通して、変性タンパク質をさらに精製し、次に、カラムを変性バッファー２０ｍＬで洗浄して、さらに１０ｍＭイミダゾール含有変性バッファー１０ｍＬで洗浄した後、０．１Ｍイミダゾール含有変性バッファー１０ｍＬで組換えタンパク質を溶離した。
【０１０２】
続いて、タンパク質復元プロセスを行って、すなわち、溶離した混合タンパク質を透析バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、塩化ナトリウム５０ｍＭ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、６  Ｍ塩酸グアニジン）により４℃で２４時間透析し、次にＤＴＴを含まない透析バッファーＡで一晩透析した。タンパク質の濃度を０．２ｍｇ／ｍＬ  に調整し、次に復元バッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１００ｍＭ  アルギニン、５ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて４℃で３日間透析し、毎日透析液を交換し、次にグルタチオンを含まない復元バッファーで一晩透析して、最後に１×ＰＢＳで１日間透析し、復元タンパク質液から残留凝集体を遠心除去し、微量の残留ＬＰＳを１ｍＬ  ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂアガロースカラムで除去し、タンパク質を限外濾過して濃縮させた。精製したタンパク質を個別包装して、凍結保存した。
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク質濃度を測定して、部分的に精製されたタンパク質１０μｇを４〜２０％のＳＤＳ  ＰＡＧ勾配ゲルに注入して電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色して、結果を図４Ａと図４Ｂに示した。
【０１０３】
２．精製したＩＬ−７とＩＬ−２５タンパク質による腫瘍の併用療法
精製したＩＬ−７とＩＬ−２５タンパク質の組み合せにより腫瘍を治療した。宿主には抗生物質を使用したことがある場合、抗生物質の投与により併用療法の効果に悪影響を与えるか又は治療の失敗を引き起こすため、少なくとも治療の1週間前及び治療中に、全ての抗生物質の投与を停止した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス１０匹を一群にして、４群に分け、全てのマウスの両側で５×１０５のＢ１６Ｆ１０細胞を皮内注射し、注射１日後、それぞれマウスについて以下の治療を施した。
【０１０４】
対照群：ＰＢＳ  ０．２ｍＬ、
ｈｕ−ＩＬ−７タンパク質治療群：ｈｕ−ＩＬ−７タンパク質５μｇを含むＰＢＳ  ０．２ｍＬ、
ｈｕ−ＩＬ−２５タンパク質治療群：ｈｕ−ＩＬ−２５タンパク質５μｇを含むＰＢＳ  ０．２ｍＬ、
ｈｕ−ＩＬ−７とｈｕ−ＩＬ−２５タンパク質の併用療法群：ｈｕ−ＩＬ−７タンパク質とｈｕ−ＩＬ−２５タンパク質をそれぞれ５μｇ含むＰＢＳ  ０．２ｍＬ。
毎日、２回腹腔内注射して、治療開始から４日間後、毎日ノギスで腫瘍の面積を測定した。結果を図４Ｃに示した。
【０１０５】
実施例５
本実施例では、精製したｈｕ−ＩＬ−７−ＨＳＡとｈｕ−ＩＬ−２５−ＨＳＡの組み合せによりヒト腫瘍を治療した。
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）でそれぞれ組換えＨＳＡ−ＩＬ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される）とＩＬ−２５−ＨＳＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される）を発現させ、ＧＭＰ標準に合致する環境において生産した２種の精製組換えタンパク質を、ヒト腫瘍の治療に用いた。
少なくとも治療の1週間前及び治療中に、全ての抗生物質の投与を停止した。Ｈｕ−ＩＬ−７−ＨＳＡとｈｕ−ＩＬ−２５−ＨＳＡを所定割合で混合した後、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の治療用量で、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内注射し、５〜３０日ごとに１回投与し、４ヶ月後、腫瘍のサイズを測定して治療効果を判断した。
【０１０６】
実施例６
本実施例では、精製ＩｇＧ４ｍ−Ｆｃ−ＩＬ−７とＩｇＧ４ｍ−Ｆｃ−ＩＬ−２５の組み合せによりヒト腫瘍を治療した。
ヒト網膜ＰＥＲ．Ｃ６細胞でそれぞれ組換えヒトＩｇＧ４ｍ−Ｆｃ−ＩＬ−７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示される）とＩｇＧ４ｍ−Ｆｃ−ＩＬ−２５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示される）を発現させ、ＧＭＰ標準に合致する環境において生産した２種の精製組換えタンパク質をヒト腫瘍の治療に用いた。
【０１０７】
少なくとも治療の1週間前及び治療中に、全ての抗生物質の投与を停止した。ＩｇＧ４ｍ−Ｆｃ−ＩＬ−７とＩｇＧ４ｍ−Ｆｃ−ＩＬ−２５を所定割合で混合した後、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ  体重の治療用量で、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内注射し、５〜３０日間ごとに１回投与し、４ヶ月後、腫瘍のサイズを測定して、治療効果を判断した。
【０１０８】
実施例７
本実施例では、ＩＬ−７とＩＬ−２５を共発現させた自己Ｔ細胞を用いて腫瘍を治療した。
ｈｕ−ＩＬ−７、ｈｕ−ＩＬ−２５を共発現させて細胞内ドメインを除去したＩＲＥＳ−ｈｕ−ＣＤ１９の発現カセットを、トランスポゾンベクターｐＳＢｂｉ双方向プロモーターベクター（Ａｄｄｇｅｎｅから購入）にクローニングした。
ドナー末梢血５０ｍＬを取り、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅでリンパ球を分離し、免疫蛍光染色後、フローサイトメーターを用いてＣＤ３＋ＰＤ１＋ＣＤ２５−のＴ細胞集団を選別した。
【０１０９】
また、新鮮な腫瘍組織から分離した腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）からＴ細胞集団を分離してもよい。
ｈｕ−ＩＬ−７とｈｕ−ＩＬ−２５−ＩＲＥＳ−ｈｕ−ＣＤ１９を共発現させたトランスポゾンベクター（２．５μｇ）及びＳＢ１００Ｘ（０．５μｇ）トランスポゼース発現ベクターで、エレクトロポレーション法により、製造された１×１０７  Ｔ細胞（Ｌｏｎｚａ、  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）を同時トランスフェクションした。一晩培養後、ラット抗ヒトＣＤ３抗体結合磁気ビーズとラット抗ヒトＣＤ２８抗体を添加した培養液で、細胞を２４〜４８時間活性化させ、次にｈｕ−ＩＬ−２を含む培養液で２日増幅した後、Ｂｉｏｔｉｎ−ａｎｔｉ−ｈｕ−ＣＤ１９抗体とストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の磁気ビーズで、トランスフェクションしたＴ細胞を選別し、引き続き所望用量まで増幅した。
１０５〜１０９細胞／キログラム体重／回の用量で、製造されたＴ細胞をドナーに静脈内注射した。５〜１００日ごとに２回注射し、４ヶ月後、腫瘍のサイズを測定して、治療効果を判断した。
【０１１０】
実施例８
本実施例では、アルギン酸ナトリウムマイクロカプセルカでパッケージしてＩＬ−７とＩＬ−２５又はＩＬ−３３を共発現させた細胞を用いて、腫瘍を治療した。
多層アルギン酸ナトリウムマイクロカプセルパッケージシステム（Ｂｈｕｈｂａｌ ｅｔ ａｌ， ２０１４， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ４： ６８５６）を用いてそれぞれ、ＩＬ−７とＩＬ−２５又はＩＬ−７とＩＬ−３３を共発現させた細胞をパッケージし、次のように簡単に説明する。
ＩＬ−７とＩＬ−２５又はＩＬ−７とＩＬ−３３を共発現させたレンチウイルスベクターでベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）を形質導入して、クローニングして増幅した。
【０１１１】
遠心分離による沈殿細胞（最終濃度６００万／ｍＬ）を、中程度のグルロン酸（Ｇ）−アルギン酸ナトリウム（最終濃度３．４％）と混合して、静電ビーズ発生器を用いて２７Ｇ針により液滴にした。液滴を１００ｍＭ  ＣａＣｌ２ゲル化溶液に収集して５分間放置した。これらマイクロスフェアを０．０５％ポリリジン（ＰＬＬ）でインキュベートした。続いて、ＰＬＬで被覆されたマイクロカプセルを、無カルシウムＫｒｅｂｓ-Ｒｉｎｇｅｒ-Ｈｅｐｅｓ（ＫＲＨ）溶液（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、１ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ重炭酸ナトリウム、５．５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭグルコース、ｐＨ値７．２±０．１５）の中程度−Ｇアルギン酸ナトリウム０．３４％に溶解して、共インキュベートして、アルギン酸ナトリウム−ポリ−Ｌ−リシン−アルギン酸ナトリウム（ＡＰＡ）マイクロカプセルを形成した。次に、中程度のＧアルギン酸−ＰＬＬ膜を含有する細胞を高度Ｇアルギン酸ナトリウム溶液２％に懸濁した。該溶液を、別のタイプの液滴発生器で２３Ｇ針により１００ｍＭ  ＣａＣｌ２ゲル化溶液に収集した。これらマイクロカプセル化した細胞を、細胞培養フラスコにおいて、培養液（ＤＭＥＭ、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清、抗生物質及び抗真菌）を用いて、標準組織培養インキュベータで培養した。１日間おきに培養液を１回交換した。少なくとも治療の1週間前及び治療中に、全ての抗生物質の投与を停止した。次に、マイクロカプセル化した細胞を、１×１０７〜１×１０１２細胞の用量で、癌治療のための組み合せとして、２〜１２ヶ月間ごとに１回、動物の体内に、皮内又は腹腔内投与した。
【０１１２】
実施例９
本実施例では、ｈｕ−ＩＬ−７とｈｕ−ＩＬ−２５を共発現させたアデノウイルスを用いて、腫瘍を治療した。
アデノウイルスｐＡｄＥａｓｙシステムでアデノウイルス（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ ２００７, Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌ, ２, １２３６０−１２４７）を生成し、以下のように簡単に説明する。
【０１１３】
ｈｕ−ＩＬ−７とｈｕ−ＩＬ−２５のコード配列をｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶの往復ベクターにクローニングし、シークエンシングして同定した後、ＰｍｅＩでベクターを線形化して、線形化したベクター０．５μｇで、エレクトロポレーション法によりｐＡｄＥａｓｙコンピテント細胞を形質転換し、次に同定したクローニングプラスミドでＤＨ１０Ｂコンピテント細胞を形質転換して、組換えアデノウイルスプラスミドを増幅して精製した。アデノウイルスプラスミド３μｇをＰａｃＩで線形化した後、ＨＥＫ２９３アデノウイルスパッケージング細胞をトランスフェクションした。１４〜２０日間後、細胞を収集して、凍結融解の繰返しによりアデノウイルスを抽出した。次に、段階的に増幅して高力価のアデノウイルスを精製した。得られたアデノウイルスの力価を測定して、ＥＬＩＳＡで、感染標的細胞が生体外でＩＬ−７とＩＬ−２５を産生する量を測定した。品質管理されたアデノウイルスを注射器で患者の腫瘍内部に注射し、腫瘍のサイズに基づいて、注射用量を確定し、腫瘍ごとに１０８〜１０１３のｐｆｕアデノウイルスを注射した。
【０１１４】
実施例１０
本実施例では、精製ｈｕ−ＩＬ−２５−ｈｕ−ＩＬ−７−ｉＲＧＤ組換えタンパク質で、腫瘍への治療活性をテストした。
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）で組換えｈｕ−ＩＬ−２５−ｈｕ−ＩＬ−７−ｉＲＧＤ組換えタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０に示される）を発現させ、ＧＭＰ標準に合致する環境において、腫瘍治療に適する組換えタンパク質を生産して精製した。
【０１１５】
少なくとも治療の１週間前及び治療中に、全ての抗生物質の投与を停止した。組換えｈｕ−ＩＬ−２５−ｈｕ−ＩＬ−７−ｉＲＧＤ組換えタンパク質を、０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の治療用量で、１日に１〜４回、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内又は腫瘍内注射し、或いはインスリンポンプにより連続投与し、４ヶ月後、腫瘍のサイズを測定して、治療効果を判断した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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