(57)【要約】本発明は、TGF-βR1阻害剤として、構造式が式（I）で示されたような、ベンゾトリアゾール由来のα、β-不飽和アミド系化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
2019518066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化１】
2019518066.tif 000067
ただし、R1は、水素、ヒドロキシ、アミノから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキルおよびC3-6シクロアルキルから選択されるものであり;
R2は、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキル、C3-6シクロアルキル、およびフェニルから選択されるものであり;
R3は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキル基から選択されるものであり;
任意に、R2およびR3は一緒に結合し、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよい一つ5〜6員環を形成し；
R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲンから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキルおよびC1-3ヘテロアルキルから選択されるものであり;
Lは、単結合、-（CRR）1-3-から選択されるものであり；
RはF、Cl、Br、I、CN、OH、NH2、COOHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で置換されていてもよいC1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C3-6-シクロアルキル、3〜6員ヘテロシクロアルキル、フェニル基および5〜6員のヘテロアリールから選択されるものであり；
R'はF、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、COOH、Me、Et、CF3、CHF2、CH2F、NHCH3、N（CH3）2から選択されるものであり；
「ヘテロ」は、ヘテロ原子またはヘテロ原子団を指し、-C(=O)N(R)-、-N(R)-、-C(=NR)-、-S(=O)2 N(R)-、-S(=O)N(R)-、-O-、-S-、=O、=S、-O-N=、-C(=O)O-、-C(=O) -、-C(=S)-、-S(=O) -、-S(=O)2-、-N(R)C(=O)N(R)-から選択されるものであり；
上記場合のいずれにおいても、ヘテロ原子またはヘテロ原子団の数は、それぞれに独立して1、2または3から選択される。
【請求項２】
前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で任意に置換されていてもよいC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、フェニルから選択されるものであることを特徴とする、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OH、メチル、CHF2、エチル、プロピル、シクロプロピルおよびフェニルから選択されるものであることを特徴とする、請求項２に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
前記R1は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいメチル、エチルおよび
【化２】
2019518066.tif 000068
から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
前記R1は、水素、メチル、エチル、
【化３】
2019518066.tif 000069
、
【化４】
2019518066.tif 000070
から選択されるものであることを特徴とする、請求項４に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
前記R2は、1、2または3個のRで置換されていてもよいメチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチルおよびフェニルから選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
前記R2は、メチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチル、
【化５】
2019518066.tif 000071
および
【化６】
2019518066.tif 000072
から選択されるものであることを特徴とする、請求項６に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
前記R2およびR3が一緒に連結され、構造単位
【化７】
2019518066.tif 000073
が
【化８】
2019518066.tif 000074
であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、F、Cl、Br、メチルおよびエチルから選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記構造単位
【化９】
2019518066.tif 000075
は
【化１０】
2019518066.tif 000076
、
【化１１】
2019518066.tif 000077
、
【化１２】
2019518066.tif 000078
、および
【化１３】
2019518066.tif 000079
から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記Lは、単結合、-（CH2）1-3-から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
前記Lは、単結合、-CH2-、-CH2CH2-から選択されるものであることを特徴とする、請求
項１１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
前記化合物は、
【化１４】
2019518066.tif 000080
から選択されるものであり、ただし、R1、R2、R3、R4、R5およびLは請求項１〜１２のいずれかに定義した通りであり、R4およびR5は同時にHではないことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
前記化合物は、
【化１５】
2019518066.tif 000081
から選択されるものであり、ただし、R1、R2、R4、R5およびLは請求項１３で定義した通りであり、R4およびR5は同時にHではないことを特徴とする、請求項１３に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
以下からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【化１６】
2019518066.tif 000082
【請求項１６】
治療有効量の請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１７】
癌を治療するための医薬の製造における請求項１〜１５のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩または請求項１６に記載の医薬組成物の応用。
【請求項１８】
前記癌は乳癌であることを特徴とする、請求項１７に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、TGF-βR1阻害剤としてのベンゾトリアゾール由来のα、β-不飽和アミド系化合物に関し、具体的には、式（I）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を開示した。
［背景技術］
【０００２】
トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）は、早期胚発生、軟骨および骨形成、細胞外マトリックスの合成、炎症、間質線維症、免疫および内分泌機能の調節、腫瘍形成と進展とに関与する広範な生物学的活性を有する多機能性成長因子スーパーファミリーである。
【０００３】
TGF-βスーパーファミリーは、TGF-β（すなわち、狭く定義されたTGF-β）、アクチビン（axtivins）、インヒビン（inhibins）、および骨形成タンパク質（BMPs）即ちミュラー管阻害剤（mullerian）などを含む一群の構造的および機能的に関連するポリペプチド成長因子からなる。TGF-βはこのファミリーの重要なメンバーの1つである。哺乳類では、TGF-βは主に異なる染色体上に位置するTGF-β1、TGF-β2およびTGF-β3の3つの形態で存在し、TGF-β1は体細胞で最も高い割合（>90％）を占め、最も強力な活性、最も多くの機能、および最も広い分布を有する。新たに合成されたTGF-βは、シグナルペプチド、潜在性関連ポリペプチド（LAP）および成熟TGF-βの三部分からなる不活性前駆体として現れ、酵素加水分解の後、活性TGF-βを形成し、次いで受容体と結合し生物学的効果を発揮する。
【０００４】
TGF-βシグナル伝達分子は膜貫通受容体複合体を介してシグナルを伝達する。TGF-β1受容体は細胞表面に存在する膜貫通タンパク質であり、I型受容体（TGF-βRI）、II型受容体（TGF-βRII）およびIII型受容体（TGF-βRIII）に分けられ、そのうちTGF-βRIは、アクチビン様受容体(activin receptor-likekinase5、ALK5)としても知られている。TGF-βRIIIは内因性活性を欠き、主にTGF-βの貯蔵に関与する。TGF-βRIおよびTGF-βRIIは、セリン/スレオニンキナーゼファミリーに属する。II型受容体は、より高い親和性でTGF-βリガンドに結合し、I型受容体と異種受容体複合体を形成する。I型受容体の近位膜のグリシンおよびセリン残基（GSドメイン）が豊富な領域をリン酸化することは、細胞内シグナルカスケード反応を開始する。
【０００５】
Smadsは、細胞内の重要なTGF-βシグナル伝達と調節分子であり、TGF-βシグナルを細胞膜から例えば細胞核内などへ直接的に伝達することができ、TGF-β/Smadsシグナル伝達経路は、腫瘍の発生および進展において重要な役割を果たす。TGF-β/Smadsシグナル伝達において、活性化されたTGF-βは、最初に細胞膜表面上のTGF-βRIIに結合して異種ダイマー複合体を形成し、TGF-βRIは当該二元複合体を認識し、結合する。
【０００６】
TGF-βRIIは、TGF-βRIの細胞質ゾルドメインのGSドメイン中のセリン/スレオニンをリン酸化し、それによってTGF-βRIを活性化する。活性化されたTGF-βRIがR-Smads（Smad2/Smad3）タンパク質をさらにリン酸化し、後者はさらにCo-Smad（Smad4）と結合しヘテロ三量体複合体を形成し、当該複合体が細胞核に入り、他の共活性化剤および共阻害剤と相乗的に作用し標的遺伝子の転写を調節する。TGF-β/Smadsシグナル伝達経路のいずれかの部分の変化は、シグナル伝達経路の異常を導く。
【０００７】
現在の研究により、腫瘍細胞において、TGF-βが腫瘍成長（TGF-βシグナルの非内因性効果）に直接的に影響を及ぼすか、または上皮間葉移行の誘導、抗腫瘍免疫応答のブロック、腫瘍関連線維症の増大、血管新生の増強により、間接的に腫瘍増殖（TGF-βの内因性効果）に影響を及ぼすことが示された。同時に、TGF-βは強い線維誘導作用を有した、腫瘍関連線維芽細胞の活性化因子である。これらの線維芽細胞は、I型コラーゲンおよび他の線維性因子の主要な供給源である。線維芽細胞および他の線維性因子の誘導生成物は、免疫応答を低下させ、薬剤耐性を増大させ、腫瘍血管新生を増強する微小環境を造り続ける可能性がある。さらに、TGF-βは、個体発展および腫瘍成長の間に、血管に影響を及ぼす。例えば、TGF-βRI型欠損マウス胚は重度の血管発生欠損を示すことにより、TGF-βシグナル伝達経路が血管内皮および平滑筋細胞の発達における重要な調節因子であることを実証する。
【０００８】
2013年、FDAは、神経膠腫および肝臓癌の治療のためにイーライリリー社の小分子であるTGF-βRI阻害剤LY2157299（WO2002/094833）を許可した。LY2157299は、研究中の孤児薬であり、Galunisertibと名付けられている。Galunisertibは、腫瘍細胞の浸潤および転移を阻害し、腫瘍細胞の血管への浸潤を阻害することができる。肝臓癌患者の第2相臨床試験では、Galunisertibで治療された患者の約23％は、血清において、α-フェトプロテイン（α-fetoprotein、AFP）のレベルが20％以上の低下を示した。これらの患者は、AFP応答のない患者よりも腫瘍の進行が遅く、生存期間が長く、上皮細胞におけるカドヘリンの発現が増加しており、これらは、GalunisertibがTGF-βシグナル伝達経路を阻害することによってEMTを調節でき、そして肝臓癌の進行を阻害することを示す。
【０００９】
Galunisertib（LY2157299）の構造は式（II）で表される。
【００１０】
【化１】
2019518066.tif 000003
背景調査資料について以下の文献を参照する。
WO2009/009059;WO2007/076127;WO2004/026306;WO2004/072033;WO2002/094833。
［発明の内容］
本発明は、式（I）で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１１】
【化２】
2019518066.tif 000004
ただし、R1は、水素、ヒドロキシ、アミノから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキルおよびC3-6シクロアルキルから選択されるものであり;
R2は、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキル、C3-6シクロアル
キルおよびフェニルから選択されるものであり;
R3は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキル基から選択されるものであり;
任意に、R2およびR3は一緒に結合して、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよい一つ5〜6員環を形成し；
R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、ハロゲンから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいC1-3アルキルおよびC1-3ヘテロアルキルから選択されるものであり;
Lは、単結合、-（CRR）1-3-から選択されるものであり；
RはF、Cl、Br、I、CN、OH、NH2、COOHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で置換されていてもよいC1-6アルキル、C1-6ヘテロアルキル、C3-6-シクロアルキル、3〜6員ヘテロシクロアルキル、フェニル基および5〜6員のヘテロアリールから選択されるものであり；
R'はF、Cl、Br、I、OH、CN、NH2、COOH、Me、Et、CF3、CHF2、CH2F、NHCH3、N（CH3）2から選択されるものであり；
「ヘテロ」という用語は、ヘテロ原子またはヘテロ原子団を指し、-C(=O)N(R)-、-N(R)-、-C(=NR)-、-S(=O)2 N(R)-、-S(=O)N(R)-、-O-、-S-、=O、=S、-O-N=、-C(=O)O-、-C(=O)-、-C(=S)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-N(R)C(=O)N(R)-から選択されるものであり；
上記場合のいずれにおいても、ヘテロ原子またはヘテロ原子団の数は、それぞれに独立して1、2または3から選択される。
【００１２】
本発明のいくつかの形態において、前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で任意に置換されていてもよいC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、フェニルから選択されるものである。
【００１３】
本発明のいくつかの形態において、前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OH、メチル、CHF2、エチル、プロピル、シクロプロピルおよびフェニルから選択されるものである。
本発明のいくつかの形態において、前記R1は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいメチル、エチルおよび
【００１４】
【化３】
2019518066.tif 000005
から選択されるものである。
【００１５】
本発明のいくつかの形態では、前記R1は、水素、メチル、エチル、
【００１６】
【化４】
2019518066.tif 000006
、
【００１７】
【化５】
2019518066.tif 000007
から選択されるものである。
【００１８】
本発明のいくつかの形態において、前記R2は、1、2または3個のRで置換されていてもよ
いメチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチルおよびフェニルから選択されるものである。
【００１９】
本発明のいくつかの形態において、前記R2は、メチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチル、
【００２０】
【化６】
2019518066.tif 000008
および
【００２１】
【化７】
2019518066.tif 000009
から選択されるものである。
【００２２】
本発明のいくつかの形態において、前記R2およびR3が一緒に連結され、構造単位
【００２３】
【化８】
2019518066.tif 000010
が
【００２４】
【化９】
2019518066.tif 000011
である。
【００２５】
本発明のいくつかの形態において、前記R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、F、Cl、Br、メチルおよびエチルから選択されるものである。
本発明のいくつかの形態において、前記構造単位
【００２６】
【化１０】
2019518066.tif 000012
は
【００２７】
【化１１】
2019518066.tif 000013
、
【００２８】
【化１２】
2019518066.tif 000014
、
【００２９】
【化１３】
2019518066.tif 000015
、および
【００３０】
【化１４】
2019518066.tif 000016
から選択されるものである。
【００３１】
本発明のいくつかの形態において、前記Lは、単結合、-（CH2）1-3-から選択されるものである。
本発明のいくつかの形態において、前記Lは、単結合、-CH2-、-CH2CH2-から選択されるものである。
【００３２】
本発明のいくつかの形態において、前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OHから選択されるものであり、或いは、1、2または3個のR'で任意で置換されていてもよいC1-6アルキル、C3-6シクロアルキル、フェニルから選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００３３】
本発明のいくつかの形態において、前記Rは、F、Cl、Br、I、CN、OH、メチル、CHF2、エチル、プロピル、シクロプロピルおよびフェニルから選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００３４】
本発明のいくつかの形態において、前記R1は、水素から選択されるものであり、或いは、1、2または3個のRで任意で置換されていてもよいメチル、エチルおよび
【００３５】
【化１５】
2019518066.tif 000017
から選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００３６】
本発明のいくつかの形態において、前記R1は、水素、メチル、エチル、
【００３７】
【化１６】
2019518066.tif 000018
および
【００３８】
【化１７】
2019518066.tif 000019
から選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００３９】
本発明のいくつかの形態において、前記R2は、1、2または3個のRで任意に置換されていてもよいメチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチルおよびフェニルから選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００４０】
本発明のいくつかの形態において、前記R2は、メチル、エチル、イソプロピル、シクロペンチル、
【００４１】
【化１８】
2019518066.tif 000020
および
【００４２】
【化１９】
2019518066.tif 000021
から選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００４３】
本発明のいくつかの形態において、前記R2およびR3は一緒に結合され、構造単位
【００４４】
【化２０】
2019518066.tif 000022
は
【００４５】
【化２１】
2019518066.tif 000023
であり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００４６】
本発明のいくつかの形態において、前記R4およびR5は、それぞれ独立して、水素、F、Cl、Br、メチルおよびエチルから選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００４７】
本発明のいくつかの形態において、前記構造単位
【００４８】
【化２２】
2019518066.tif 000024
は、
【００４９】
【化２３】
2019518066.tif 000025
、
【００５０】
【化２４】
2019518066.tif 000026
、
【００５１】
【化２５】
2019518066.tif 000027
、および
【００５２】
【化２６】
2019518066.tif 000028
から選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００５３】
本発明のいくつかの形態において、前記Lは、単結合および-（CH2）1-3-から選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
本発明のいくつかの形態において、前記Lは、単結合、-CH2-および-CH2CH2-から選択されるものであり、他の変数は上記で定義した通りである。
【００５４】
本発明のいくつかの形態において、前記化合物は、
【００５５】
【化２７】
2019518066.tif 000029
から選択されるものであり、ただし、R1、R2、R3、R4、R5およびLは上記で定義した通りであり、R4およびR5は同時にHではない。
【００５６】
本発明のいくつかの形態において、前記化合物は、
【００５７】
【化２８】
2019518066.tif 000030
から選択されるものであり、ただし、R1、R2、R4、R5およびLは上記で定義した通りであり、R4およびR5は同時にHではない。
【００５８】
本発明はまた、以下からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００５９】
【化２９】
2019518066.tif 000031
本発明はまた、治療有効量の前記請求項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６０】
本発明はまた、癌を治療するための医薬の製造における前記化合物またはその薬学的に許容される塩または前記医薬組成物の応用を提供する。
本発明のいくつかの形態において、前記癌は乳癌を指す。
【００６１】
本発明のさらに他の形態は、前記変数を任意に組み合わせて得たものである。
技術的効果
本発明化合物の使用は、主としてTGF-βR1の阻害剤であり、これはTGF-βR1を阻害することによりTGF-βの下流シグナル伝達経路を遮断し、それにより所望の薬理作用を発揮する。先行技術とは異なり、本発明化合物において、ベンゾトリアゾール構造は、TGF-βR1に結合する重要なファルマコフォアである。本発明化合物の化学構造の組み合わせは、先行技術より優れた生物学的活性をもたらすことは予想外である。同じ用量で、マウスのCT-26同系モデルにおいて、本発明化合物は、単独投与時およびPDL-1と併用投与時の腫瘍阻害効果のいずれもが、従来技術より優れることにより、本発明化合物がより優れた抗腫瘍
免疫活性化作用を有することが分かった。マウス4T1同所性移植抗転移性乳癌モデルでは、本発明化合物は、従来技術と比較して有意に優れた抗転移能を有する。本発明化合物は、多組織臓器における腫瘍の転移および転移の強さに対して明らかな阻害効果を有し、治療薬としての大きな可能性を示す。本発明化合物は、乳癌の転移阻害剤として非常に有望であり、乳癌の併用療法において転移阻害に重要な役割を果たし、乳癌の臨床治療に潜在的な新しい治療策を提供する。
【００６２】
定義と説明
別に説明しない限り、本明細書で使用される以下の用語およびフレーズは、以下の意味を有する。特定の用語またはフレーズは、特定の定義がない限り、定義されていないか、または不明瞭であると見なされるべきではなく、通常の意味で理解されるべきである。本明細書に商品名が記載されている場合、その商品またはその有効成分を表すことを意図する。ここで使用される「薬学的に許容される」という用語は、それらの化合物、材料、組成物および/または剤型に対する言うことであり、信用できる医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応または他の問題または合併症が起きずに、ヒトおよび動物の組織と接触し使用するのに適しており、妥当な利益/リスク比に見合うものを意味する。
【００６３】
用語「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明で見出される特定の置換基を有する化合物と比較的非毒性の酸またはアルカリから調製された本発明の化合物の塩を指す。本発明の化合物に比較的酸性の官能基が含まれる場合には、純粋な溶液または適当な不活性溶媒中で、十分な量のアルカリをこのような化合物の中性形態と接触させることにより塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アンモニアまたはマグネシウム塩または類似な塩が含まれる。本発明の化合物に比較的アルカリ性の官能基が含まれる場合、純粋な溶液または適切な不活性溶媒中で、十分な量の酸を、このような化合物の中性形態と接触させることにより酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、重炭酸イオン、リン酸、リン酸一水素イオン、リン酸二水素イオン、硫酸、硫酸水素イオン、ヨウ化水素酸、亜リン酸などを含む無機酸の塩；および、例えば酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの類似の酸と、アルギニンなどのアミノ酸とグルクロン酸などを含む有機酸の塩（Berge他、「Pharmaceutical Salts」、Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19（1977）を参照）とを含む。本発明のある特定の化合物は、アルカリ性および酸性官能基の両方を含むため、塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することができる。
【００６４】
好ましくは、塩を常法によりアルカリまたは酸と接触させ、親化合物を分離することによって、化合物の中性形態を再生する。化合物の親形態は、極性溶媒への溶解度の差などのある物理的特性で、その様々な塩の形態と異なる。
【００６５】
本明細書中で使用される「薬学的に許容される塩」は、親化合物が酸またはアルカリと塩を形成することによって修飾される本発明の化合物の誘導体に属する。薬学的に許容される塩の例としては、アミンのような塩基がある無機酸塩または有機酸塩、カルボン酸のような酸基があるアルカリ金属または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩には、通常の非毒性塩または親化合物の第四級アンモニウム塩、例えば非毒性無機酸または有機酸から形成される塩が含まれる。通常の非毒性塩としては、無機酸または有機酸から誘導される塩を含むが、これらに限定されない。前記無機酸または有機酸は、2-アセトキシ安息香酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸イオン、炭酸、クエン酸、エデトレメン
酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトース、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸塩、ヒドロキシ、ヒドロキシナフタレン、イセチオン酸、乳酸、ラクトース、ドデシルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクトースアルデヒド、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、スバセチン（subacetic）酸、コハク酸、スルファミン酸、p-アミノベンゼンスルホン酸、硫酸、タンニン、酒石酸およびp-トルエンスルホン酸から選択されるものである。
【００６６】
本発明の薬学的に許容される塩は、酸基または塩基を含む親化合物から通常の化学的方法によって合成することができる。一般に、このような塩は、水または有機溶媒またはこれらの混合物中で、化学量論量の適切な塩基または酸と、遊離酸またはアルカリ形態にあるこれらの化合物を反応させることによって調製される。一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。
【００６７】
塩の形態に加えて、本明細書で提供される化合物は、さらにプロドラッグの形態で存在する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で化学変化を容易に発生し、本発明の化合物に変換する。さらに、プロドラッグは、体内環境で化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。
【００６８】
本発明のある化合物は、非溶媒和形態および溶媒和形態（水和形態を含む）で存在し得る。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に含まれる。
本発明のある化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有していてもよい。ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体およびそれぞれの異性体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６９】
本明細書におけるラセミ体、アンビスカレミック（ambiscalemic）およびスカレミック（scalemic）または鏡像異性的に純粋な化合物の図面表現法は、Maehr, J. Chem. Ed. 1985, 62: 114-120から由来する。特に明記しない限り、くさび形キーと破線キーとで、ステレオセンターの絶対的な配置を示す。本明細書に記載の化合物がオレフィン性二重結合または他の幾何的非対称中心を含む場合、特に断らない限り、それらはEおよびZ幾何異性体を含む。同様に、全ての互変異性体は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７０】
本発明の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在し得る。シスおよびトランス異性体、（-）-および（+）-エナンチオマー、（R）-および（S）-エナンチオマー、ジアステレオマー、（D）-異性体、（L）-異性体、およびそのラセミ混合物、ならびに例えばエナンチオマーまたはジアステレオマーに富む混合物のような他の混合物が含まれる本発明で想定されるすべての化合物は、本発明の範囲内にある。他の不斉炭素原子がアルキル基などのような置換基に存在してもよい。これらの全ての異性体、およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７１】
光学活性な（R）-および（S）-異性体ならびにDおよびL異性体は、キラル合成またはキラル試薬または他の従来技術によって調製することができる。本発明のある化合物の一種のエナンチオマーが所望される場合、それは、不斉合成によって、または不斉補助剤を具備する誘導体化することによって調製することができ、それにおいて、得られたジアステレオマーの混合物を分離し、補助基を切断して純粋な所望のエナンチオマーを得る。或いは、分子が塩基性官能基（例えば、アミノ基）または酸性官能基（例えばカルボキシル基）を含む場合、適切な光学活性酸またはアルカリとジアステレオマー塩を形成し、続いて当該分野では周知の通常方法でジアステレオマーの分割を行い、純粋なエナンチオマーを回収する。さらに、エナンチオマーおよびジアステレオマーの分離は、一般に、キラル固
定相を用いたクロマトグラフィーの使用によって完成するが、任意に化学的誘導体化（例えば、アミンからのカルバメートの形成）と組み合わせをしてもよい。
【００７２】
本発明の化合物は、化合物を構成する原子の1つ以上に不自然な割合の原子同位体を含むことができる。例えば、ヒドラジン（3H）、ヨウ素-125（125I）またはC-14（14C）などの放射性同位元素で化合物を標識することができる。放射性に関わらず、本発明の化合物の全ての同位体組成変化は、本発明の範囲内に含まれる。
【００７３】
「薬学的に許容される担体」という用語は、有効量の本発明の活性物質を送達することができ、活性物質の生物学的活性を妨げず、ホストまたは患者に対して毒・副作用を有さないあらゆる製剤または担体媒体を指す。代表的な担体として、水、油、野菜およびミネラル、クリーム基剤、ローション基剤、軟膏基剤などを含む。これらの基剤は、懸濁剤、粘着付与剤、経皮増強剤などを含む。それらの製剤は、化粧品または局所医薬品分野の当業者に周知である。担体に関するさらなる情報については、Remington：The  Science  and  Practice  of  Pharmacy, 21st  Ed., Lippincott, Williams ＆ Wilkins（2005）を参照することができ、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
「賦形剤」という用語は、通常に、有効な医薬組成物を調整するのに必要とされる担体、希釈剤および/または媒体を指す。
薬学的または薬理学的に活性な薬剤について、「有効量」または「治療有効量」という用語は、毒性がならず所望の効果を達成するには薬物または薬剤の十分な量を指す。本発明の経口剤形について、組成物における一種の活性物質の「有効量」は、組成物における別の活性物質と組み合わせて使用する場合に所望の効果を達成するために必要な量を指す。有効量の確定は、人によって異なり、レシピエントの年齢および一般的な状態に依存し、また特定の活性物質に応じており、具体的な場合に、適切な有効量は、当業者によって通常実験で確定することができる。
【００７５】
「活性成分」、「治療剤」、「活性物質」または「活性剤」という用語は、標的障害、疾患または病症の治療に有効な化学実体を指す。
「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象または状態が発生する可能性があるが、必ずしも起こらないことを意味し、その記載は、事象または状態が生じる例および事象または状態が生じない例を含むことを意味する。
【００７６】
「置換された」という用語は、特定の原子の原子価が正常であって置換された化合物が安定である限り、特定の原子上のいずれの1つ以上の水素原子が重水素および水素の変種を含む置換基で置き換えられていることを意味する。置換基がオキシ基（すなわち、=O）である場合は、2つの水素原子が置換されていることを意味する。オキシ置換はアリール基上には起こらない。「任意に置換された」という用語は、置換されていてもされていなくてもよいことを意味し、別に規定しない限り、化学上に実現できれば、置換基の種類および数は任意である。
【００７７】
変数のいずれか（例えば、R）が化合物の組成または構造中に１回以上現れる場合、それぞれの場合にその定義は独立している。したがって、例えば、基が0〜2個のRで置換されている場合、その基は、多くとも2個のRで任意に置換されていてもよく、且つ、それぞれの場合にRが独立する選択肢を有する。さらに、置換基および/またはその変異体の組み合わせは、そのような組合せが安定な化合物をもたらす場合にのみ許容される。
【００７８】
結合基の数が0である場合、例えば、-（CRR）0-の場合、当該結合基が単結合であることを示す。
変数の1つが単結合から選択される場合、それにより結合する2つの基が直接結合してい
ることを意味する。例えば、A-L-Zにおいて、Lが単結合を表す場合、その構造は実際にはA-Zである。
【００７９】
一つの置換基が空きである場合、置換基が存在しないことを意味する。例えば、A-Xにおいて、Xが空きである場合、その構造は実際にAである。一つの置換基が一つの環における二つの原子にクロスコネクトする場合、当該置換基は当該環の原子のいずれに結合することができる。列挙された置換基が化学構造式に含まれる化合物におけるどの原子と結合しているかを明示していない場合、そのような置換基はその原子のいずれかを介して結合していてもよい。置換基および/またはその変異体の組み合わせは、そのような組み合わせが安定な化合物をもたらす場合にのみ許容される。例えば、構造単位
【００８０】
【化３０】
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または
【００８１】
【化３１】
2019518066.tif 000033
は、シクロヘキシルまたはシクロヘキサジエン上のいずれか1つの位置で置換され得ることを示す。
【００８２】
別に規定しない限り、「ヘテロ」という用語は、ヘテロ原子またはヘテロ原子団（即ち、ヘテロ原子を含む原子団）を指し、炭素（C）および水素（H）以外の原子およびこれらのヘテロ原子を含有する原子団を含み、例えば、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）、シリコン（Si）、ゲルマニウム（Ge）、アルミニウム（Al）、ホウ素（B）、-O-、-S-、=O、=S、-C(=O)O-、-C(=O)-、-C(=S)-、-S(=O)、-S(=O)2-、および、任意に置換された-C(=O)N(H)-、-N(H)-、-C(=NH)-、-S(=O)2N(H)-または-S(=O)N(H)-が含まれる。
【００８３】
別に規定しない限り、「環」は、置換または非置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、アリールまたはヘテロアリールを意味する。いわゆる環には、単環、環集合、スピロ環、縮合環または架橋環がある。環における原子数は、通常、環員数として定義され、例えば、「5〜7員環」とは、5〜7個の原子が環状配置されていることを意味する。別に規定しない限り、当該環は任意に1〜3個のヘテロ原子を含む。したがって、「5〜7員環」には、例えば、フェニル基、ピリジル基、およびピペリジニル基が含まれ、一方、「5〜7員ヘテロシクロアルキル環」には、ピリジル基およびピペリジニル基が含まれるが、フェニルは含まれない。「環」という用語は、さらに少なくとも1つの環を含有する環系を含み、ここで、それぞれの環は、前記定義に独立的に適合する。
【００８４】
別に規定しない限り、「複素環」、「複素環基」または「ヘテロシクロ」という用語は、飽和、部分不飽和または不飽和（芳香族）であってもよい、ヘテロ原子またはヘテロ原子団を含む単環式、二環式または三環式環を意味し、それらは炭素原子と、N、OおよびSから独立して選択される1、2、3または4個の環ヘテロ原子とを含み、前記複素環のいずれかは一つのフェニル環に縮合して二環式環を形成してもよい。窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよい（すなわち、NOおよびS（O）p、ｐは１または２である）。窒素原子は、置換されても置換されなくてもよい（すなわち、NまたはNR、ここでRは、Hまたは本明細書で既に定義した他の置換基である）。当該複素環は、いずれのヘテロ
原子または炭素原子のペンダント基に結合して安定な構造を形成することができる。得られる化合物が安定である場合、本明細書に記載の複素環は、炭素または窒素部位で置換されることができる。複素環中の窒素原子は、任意に四級化されてもよい。好ましい実施形態は、複素環中のSおよびO原子の総数が1を超える場合、これらのヘテロ原子が互いに隣接しないことである。別の好ましい実施形態は、複素環中のSおよびO原子の総数が1を超えないことである。本明細書で使用する「芳香族複素環基」または「ヘテロアリール」という用語は、安定な5、6または7員単環式または二環式複素環基の芳香環或いは7、8、9または10員二環式複素環基の芳香環を意味し、これは、炭素原子と、N、OおよびSから独立して選択される1、2、3または4個の環ヘテロ原子を含む。窒素原子は、置換されても置換されなくてもよい（すなわち、NまたはNR、ここでRは、Hまたは本明細書で既に定義した他の置換基である）。窒素および硫黄ヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよい（すなわち、NOおよびS（O）p、pは１または２である）。芳香族複素環におけるSおよびO原子の総数が1を超えないことは留意すべきである。架橋環も複素環の定義に含まれる。1つ以上の原子（すなわち、C、O、NまたはS）が2つの隣接しない炭素原子または窒素原子に結合すると、架橋環が形成される。好ましい架橋環には、1個の炭素原子、2個の炭素原子、1個の窒素原子、2個の窒素原子、および1個の炭素-窒素基が含まれるが、これらに限定されない。一つのブリッジが常に単一の環を3つの環に変換することは留意すべきである。架橋環において、環における置換基もブリッジに存在することができる。
【００８５】
複素環式化合物の例には、アクリジニル、アゾシニル（azocinyl）、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾメルカプトフリル、ベンゾメルカプトフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、カルバゾリル、4aH-カルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメン、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、2H、6H-1,5,2-ジチアジニル、ジヒドロフロ[2,3-b]テトラヒドロフラニル、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、1H-インダゾリル、インド-ルアルケニル（indolealkenyl）、ジヒドロインドリル、インドリジニル、インドリル、3H-インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソジヒドロインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、インドキシル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジン、フェノチアジン、ベンゾキサンチル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、4-ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾリル、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、2H-ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、4H-キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリル、テトラゾリル、 6H-1,2,5-チアジアジニル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、イソチアゾリルチエニル、チエノオキサゾリル、チエノチアゾリル、チエノイミダゾリル、チエニル、トリアジニル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,5-トリアゾリルおよびキサンテニルが含まれるが、これらに限らなく、縮合環化合物およびスピロ化合物も含まれる。
【００８６】
別に規定しない限り、用語「炭化水素基」またはその下位概念（アルキル、アルケニル、アルキニル、フェニルなど）は、それ自体または別の置換基の一部として直鎖状、分枝状または環状炭化水素原子団またはそれらの組み合わせを意味し、完全飽和（例えば、アルキル）、一価または多価不飽和（例えば、アルケニル、アルキニル、アリールなど）で
あってもよく、一置換または多置換されていてもよく、一価（例えば、メチル）、二価（例えば、メチレン）または多価（例えば、メチン）であってもよく、二価または多価原子団を含んでもよく、特定の数の炭素原子（例えば、C1-C12が1乃至12個炭素原子を表し、C1-C12は、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11およびC12から選択され、C3-12は、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11およびC12から選択される）を有する。「炭化水素基」として、脂肪族炭化水素基と芳香族炭化水素基が含まれるが、これらに限らない。前記脂肪族炭化水素基として、鎖状および環状であるものが含まれ、具体的にはアルキル、アルケニル、アルキニル基が含まれるが、これらに限らない。前記芳香族炭化水素基として、6〜12員の芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、ナフタレン等）が含まれるが、これらに限らない。ある実施例において、「アルキル」という用語は、完全飽和、一価または多価不飽和であってもよく、二価および多価原子団を含んでもよい、直鎖または分枝鎖の原子またはそれらの組み合わせを指す。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、イソブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル基、シクロプロピルメチル基、およびn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの原子団の同族体または異性体が含まれるが、これらに限定されない。不飽和炭化水素基は、1つ以上の二重または三重結合を有し、例として、例えば、ビニル基、2-プロペニル基、ブテニル基、クロチル基、2-イソペンテニル基、2-（ブタジエニル基）、2,4-ペンタジエニル、3-（1,4-ペンタジエニル）、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、およびより高次の同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
特に規定しない限り、用語である「ヘテロ炭化水素基」またはその下位概念（例えば、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリールなど）は、それ自体、または別の用語と組み合わせて安定な直鎖状、分枝状または環状炭化水素原子団またはそれらの組み合わせを意味し、一定の数目の炭素原子および少なくとも1個のヘテロ原子から構成される。ある実施例において、「ヘテロ炭化水素基」という用語は、それ自体または別の用語と組み合わせて直鎖状、分枝鎖状炭化水素原子団またはその組成物を意味し、一定の数目の炭素原子および少なくとも1個のヘテロ原子から構成される。一つの典型的な実施例では、ヘテロ原子はB、O、NおよびSから選択され、窒素および硫黄原子は任意に酸化され、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されてもよい。ヘテロ原子またはヘテロ原子団は、ヘテロ炭化水素基の内部位置のいずれ（炭化水素基における分子と繋がった位置の他の位置を含む）に位置することができるが、「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は慣用表現に該当し、一つの酸素原子、アミノ基または硫黄原子を介して分子の残りの部分にそれぞれ結合しているアルキルを意味する。例としては、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-CH2-CH=N-OCH3および-CH=CH-N(CH3)-CH3が挙げられるが、これらに限らない。-CH2-NH-OCH3のように、多くとも2個のヘテロ原子が連続していてもよい。
【００８８】
別に規定しない限り、用語である「環式炭化水素基」、「複素環式炭化水素基」またはその下位概念（アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル等）は、それ自体、または他の用語と組み合わせて環化された「炭化水素基」または「ヘテロ炭化水素基」をそれぞれ意味する。さらに、ヘテロ炭化水素基または複素環式炭化水素基（例えば、ヘテロアルキルまたは複素環式炭化水素基）の場合、ヘテロ原子は、当該ヘテロ環における分子と繋がった位置の他の位置を占めることができる。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。複素環式基の非限定的な例には、1-（1,2,5,6-テトラヒドロピリジル）、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テト
ラヒドロフランインドール-3-イル、テトラヒドロチオフェン-2-イル、テトラヒドロチオフェン-3-イル、1-ピペラジニルおよび2-ピペラジニルが含まれる。
【００８９】
別に規定しない限り、「アルキル」という用語は、一置換（例えば、-CH2F）または多置換（例えば-CF3）されていてもよく、一価（例えば、メチル）、二価（例えばメチレン）または多価（例えばメチン）であってもよい直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を示す。アルキルの例には、メチル（Me）、エチル（Et）、プロピル（例えば、n-プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル）、ペンチル（例えば、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが含まれる。
【００９０】
別に規定しない限り、「アルケニル」は、鎖の位置のいずれに、1つ以上の炭素-炭素二重結合を有するアルキルを指し、一置換または多置換されていてもよく、一価、二価または多価であってもよい。アルケニルの例としては、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ブタジエニル基、ペンタジエニル基、ヘキサジエニル基等が挙げられる。
【００９１】
別に規定しない限り、「アルキニル」は、鎖の位置のいずれに、1つ以上の炭素-炭素三重結合を有するアルキルを指し、一置換または多置換されていてもよく、一価、二価または多価であってもよい。アルキニルの例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルなどが挙げられる。
【００９２】
別に規定しない限り、シクロアルキルは、安定な環式または多環式炭化水素基のいずれを含み、炭素原子のいずれも飽和であり、一置換または多置換されていてもよく、一価、二価または多価であってもよい。このようなシクロアルキルの例としては、シクロプロピル、ノルボルニル、[2.2.2]ビシクロオクタン、[4.4.0]ビシクロノナンなどが挙げられるが、これらに限らない。
【００９３】
別に規定しない限り、シクロアルケニルは、環の位置のいずれに1個以上の不飽和炭素-炭素二重結合を含み、一置換または多置換されていてもよく、一価、二価または多価であってもよい安定な環式または多環式炭化水素基のいずれを含む。そのようなシクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
別に規定しない限り、シクロアルキニルは、環の位置のいずれに1つ以上の炭素-炭素三重結合を含み、一置換または多置換されていてもよく、一価、二価または多価であってもよい安定な環式または多環式炭化水素基のいずれを含む。
【００９５】
別に規定しない限り、「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」という用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルの両方を含むことが意図される。例えば、「ハロ（C1〜C4）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどを含むことが意図される。別に規定しない限り、ハロアルキルの例としては、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチルおよびペンタクロロエチルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
「アルコキシ」は、酸素架橋を介して結合した特定数量の炭素原子数を有する前記アルキルを表し、別に規定しない限りC1〜C6のアルコキシにはC1、C2、C3、C4、C5、C6のアルコキシが含まれる。アルコキシの例には、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、n-ペンチルオキシおよびS-ペンチ
ルオキシが含まれるが、これらに限定されない。別に規定しない限り、「アリール」という用語は、一置換、二置換または多置換されていてもよく、一価、二価または多価であってもよい多価不飽和芳香族炭化水素置換基を示し、単環式または多環式（例えば、１乃至3個環、そのうち少なく一つは芳香族環である）を意味し、これらは一緒に縮合しているかまたは共有結合している。「ヘテロアリール」という用語は、1〜4個のヘテロ原子を含むアリール（または環）を指す。例示的な例では、ヘテロ原子はB、N、OおよびSから選択され、窒素および硫黄原子は任意に酸化され、窒素原子は任意に四級化されてもよい。ヘテロアリールは、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリールまたはヘテロアリールの非限定的な例には、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジニル、4-ピリミジニル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリニル、5-イソキノリニル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリニルおよび6-キノリニルが含まれる。前記のアリールおよびヘテロアリール環系のいずれかの置換基は、下記する受容可能な置換基の群から選択される。
【００９７】
別に規定しない限り、アリールは、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオ、アラルキル）と共に使用される場合、前記に定義したアリールおよびヘテロアリール環を含む。したがって、「アラルキル」という用語は、アリールがアルキル基に結合している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意味し、炭素原子（例えば、メチレン）が例えば酸素原子で置換されたアルキル基を含み、例えば、フェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-（1-ナフチルオキシ）プロピルなどである。
【００９８】
「脱離基」という用語は、置換反応（例えば、親和性置換反応）によって別の官能基または原子で置換されていてもよい官能基または原子を意味する。例えば、代表的な脱離基としては、トリフルオロメタンスルホネート;塩素、臭素、ヨウ素;メシラート、トシラート、p-ブロモベンゼンスルホネート、p-トルエンスルホネートなどのスルホネート基;アセトキシ、トリフルオロアセトキシ基などのアシルオキシ基等が挙げられる。
【００９９】
「保護基」という用語には、「アミノ保護基」、「ヒドロキシ保護基」または「チオール保護基」が含まれるが、これらに限定されない。「アミノ保護基」という用語は、アミノ基の窒素位での副反応を防止するのに適した保護基を意味する。代表的なアミノ保護基としては、限定されないが、ホルミル;アルカノイル（例えば、アセチル、トリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチル）のようなアシル;tert-ブトキシカルボニル（Boc）のようなアルコキシカルボニル；ベンジルオキシカルボニル（Cbz）および9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）のようなアリールメトキシカルボニル;ベンジル（Bn）、トリチル（Tr）、1,1-ジ-（4'-メトキシフェニル）メチルのようなアリールメチル;トリメチルシリル（TMS）およびtert-ブチルジメチルシリル（TBS）のようなシリル基などが挙げられる。「ヒドロキシ保護基」という用語は、ヒドロキシル基の副反応を防止するのに適した保護基を意味する。代表的なヒドロキシ保護基には、限定されないが、メチル基、エチル基およびtert-ブチル基のようなアルキル基;アルカノイル基（例えば、アセチル）のようなアシル基;ベンジル（Bn）、p-メトキシベンジル基（PMB）、9-フルオレニルメチル（Fm）およびジフェニルメチル（ジフェニルメチル、DPM）のようなアリールメチル基;トリメチルシリル（TMS）およびtert-ブチルジメチルシリル（TBS）のようなシリル基などが挙げられる。
【０１００】
本発明の化合物は、以下に列挙される特定の実施形態、それらと他の化学合成方法との組み合わせにより得た実施形態、および当業者に周知のものに同等する置換形態を含む、当業者に周知の様々な合成方法によって調製することができる。好ましい実施形態には、本発明の実施例が含まれるが、これに限定されない。
【０１０１】
本発明に用いられる溶媒は市販で購入できる。
本発明は、以下の略語を用いる。aqは水；HATUはO-（7-アザベンゾトリアゾール-1-イル）-N、N、N'、N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート;EDCはN-（3-ジメチルアミノプロピル）-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩;m-CPBAは3-クロロペルオキシ安息香酸；eqは等価物、当量；CDIはカルボニルジイミダゾール；DCMはジクロロメタン；PEは石油エーテル；DIADはアゾジカルボン酸ジイソプロピル；DMFはN、N-ジメチルホルムアミド；DMSOはジメチルスルホキシド；EtOAcは酢酸エステル；EtOHはエタノール;MeOHはメタノール; CBzはアミン保護基であるベンジルオキシカルボニル；BOCはアミン保護基であるt-ブチルカルボニル; HOAcは酢酸;NaCNBH3はシアノ水素化ホウ素ナトリウム;r.tは室温；O/Nは一晩過ごす；THFはテトラヒドロフラン;Boc2Oはジ-tert-ブチルジカーボネート;TFAはトリフルオロ酢酸；DIPEAはジイソプロピルエチルアミン；SOCl2は塩化チオニル；CS2は二硫化炭素；TsOHはp-トルエンスルホン酸；NFSIは、N-フルオロ-N-（フェニルスルホニル）ベンゼンスルホンアミド;NCSは1-クロロピロリジン-2,5-ジオン；n-Bu4NFはテトラブチルアンモニウムフルオライド；iPrOHは2-プロパノール；mpは融点；LDAはリチウムジイソプロピルアミド；FBSはウシ胎仔血清；DPBSは、ダルベッコのリン酸緩衝液；EDTAはエチレンジアミン四酢酸；DMEMはダルベッコ改変イーグル培地；CellTiter-Glo（CTG）は、ATP蛍光活性アッセイ；POは胃内投与；IPは腹腔内投与を表す。
【０１０２】
化合物は、手作業またはChemDraw（登録商標）ソフトウェアによって命名され、市販の化合物について、サプライヤのカタログ名を用いる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図1は、CT-26細胞皮下異種移植腫瘍雌BALB/cマウスモデルの体重に対する実施例1、LY2157299およびBioXcell-mPD-L1の影響を示すグラフである。
【図２】図2は、実施例1、LY2157299およびBioXcell-mPD-L1の投与後のCT-26移植腫瘍モデルの担癌マウスの腫瘍増殖曲線を示すグラフである。
【図３】図3は、マウス由来乳癌4T1細胞BALB/cマウスの同所性移植モデル腫瘍細胞転移阻害実験における動物の相対的体重変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
［具体的な実施形態］
本発明は、以下の実施例により詳細に記載されるが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。以上、本発明を詳細に説明し、本発明の実施形態も開示したが、当業者にとって、本発明の実施形態に対して本発明の趣旨および範囲を逸脱しない範囲内で種々の変形、変更を行ることは明らかである。
【０１０５】
【化３２】
2019518066.tif 000034
中間体1-6の調製：
【０１０６】
【化３３】
2019518066.tif 000035
工程A：トルエン（750.00mL）に酢酸エチル（291.41mL、2.98mol）を溶解し、室温でナトリウムエトキシド（135.06g、1.98mol）をバッチ式で加えて得た反応混合物を室温で1時間攪拌した。6-メチルピリジン-2-ギ酸メチル（150.00g、992.33mmol）を25℃で上記反応溶液に添加し、次いで95℃に加熱し、15時間撹拌した。反応混合物を30℃に冷却し、酢酸でpHを7に調整し、水（500mL）で希釈し、次いで酢酸エチル（500mL）で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過且つ減圧下での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=50/1）で精製して、3-（6-メチル-2-ピリジン）-3-オキシ-プロピオン酸エチル（120.00ｇ、収率：58.35%）を得た。
【０１０７】
工程B：3-（6-メチル-2-ピリジン）-3-オキシ-プロピオン酸エチル（120.00g、579.07mmol）をピリジン（300mL）に溶解し、1-アミノピロリジン-2-オンのp-トルエンスルホン酸の塩（172.01g、631.66mmol）を加えた。反応混合物を25℃で16時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣を水（300mL）で希釈し、次いで酢酸エチル（300mL×2）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過且つ減圧下での濃縮を行って、3-（6-メチル-2-ピリジン）-3-（2-カルボニル-ピロリドン）イミノ-プロピオン酸エチル（150ｇ、収率：90.28%）を得た。
【０１０８】
工程C：トルエンに3-（6-メチル-2-ピリジン）-3-（2-カルボニル-ピロリドン）イミノ-プロピオン酸エチル（155.00g、535.72mmol）を溶解し、次いでナトリウムエトキシド（72.91g、1.07mol）を加えた。反応混合物を100℃に加熱し、16時間撹拌し、次いで室温に冷却した。これに水（1.5L）をゆっくり添加し希釈を行い、濃塩酸でpH4に調整し、ジクロロメタン/イソプロパノール（10/1）（1L×7）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過且つ減圧下での濃縮を行った。残渣を石油エーテル/酢酸エチル=10/1（200mL）で叩解した後、ろ過し固体を収集した。当該固体を減圧で乾燥し、2-（6-メチル-2-ピリジン）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロール〔1,2-b〕ピラゾール-3-カルボン酸（52.80g、収率：40.52％）を得た。
【０１０９】
工程D： 2-（6-メチル-2-ピリジン）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ〔1,2-b〕ピラゾール-3-カルボン酸（45.00g、184.99mmol）をN、N-ジメチルホルムアミド（650.00mL）に溶解し、次にNBS（49.09g、258.99mmol）を加えた。反応混合物を30〜40℃で60時間撹拌し、次いで水（600mL）で希釈し、ジクロロメタン/イソプロパノール（10/1）（500mL×3）で抽出した。合わせた有機相を水酸化ナトリウム（0.5mol/L、800mL）で一回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧下での濃縮を行った。得られた固体を石油エー
テル/酢酸エチル=10/1（200mL）で叩解した後、ろ過し固体を収集した。当該固体を減圧で乾燥し、3-ブロモ-2-（6-メチル-2-ピリジン）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（33.00g、収率： 64.13％）を得た。
【０１１０】
工程E：3-ブロモ-2-（6-メチル-2-ピリジン）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ〔1,2-b〕ピラゾール（1.00g、3.60mmol）およびホウ酸トリイソプロピル（1.79g、9.54mmol）をテトラヒドロフラン（20.00mL）に溶解した。反応混合物を-70℃に冷却し、n-ブチルリチウム（2.5M、3.74mL）を滴下した。滴下終了後、反応混合物を25℃で1時間攪拌した後、塩酸水溶液（0.5mol/L）でpHを7に調整した。次いで、減圧下での濃縮によりテトラヒドロフランを除去した後、さらに15℃に冷却した。当該混合物をろ過し、ろ過残渣を石油エーテル/酢酸エチル=10/1（5.5mL）で叩解した後、ろ過し固体を収集した。当該固体を減圧で乾燥し、[2-（6-メチル-2-ピリジン）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ〔1,2-b〕ピラゾール-3-イル〕ボロン酸（750mg、収率85.71％）を得た。
実施例1の調製：
【０１１１】
【化３４】
2019518066.tif 000036
工程A：6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン（16.00g、65.30mmol）をテトラヒドロフラン（800.00mL）に溶解し、-60〜-70℃に冷却した後、リチウムヘキサメチルジシラジド（1mol/L、130.60mL、65.30mmol）を滴下した。反応混合物を-60〜-70℃で15分間撹拌し、N、N-ジメチルホルムアミド（14.32g、195.90mmol、15.07mL）を添加した。その後、-60〜-70℃で15分間の撹拌を続け、次いで飽和塩化アンモニウム水溶液（500mL）で反応をクエンチさせた。反応混合物を室温まで昇温し、次いで酢酸エチル（500mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（500mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧下での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：ジクロロメタン/酢酸エチル=10/1）で精製し、6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-ホルムアルデヒド（6.40g、収率：35.90％）を得た。1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 10.46（s, 1H）, 8.62（s, 1H）, 8.16（d, J = 9.3 Hz, 1H）, 7.88（d, J = 9.3 Hz, 1H）。
【０１１２】
工程B：温度計および窒素風船を備えた500mLの三ツ口フラスコに、2-ジエトキシホスホリルアセトニトリル（3.83g、21.61mmol、3.48mL）およびテトラヒドロフラン（80mL）を加えた。混合物を0℃に冷却した。次いでカリウムt-ブトキシド（2.42g、21.61mmol）を分けて加えた。反応混合物を0℃で15分間攪拌した後、滴下ロートで別の懸濁液（6-ヨー
ド-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-ホルムアルデヒドをテトラヒドロフラン（120mL）に分散させ、且つ0℃に冷却して得た）に加入した。反応混合物を0℃で15分間撹拌した後、水（300mL）に入れて反応をクエンさせ、酢酸エチル（200mL）とジクロロメタン（200 mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（300mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧下での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：ジクロロメタン/酢酸エチル=200/1〜10/1）で精製し、（E）-3-（6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エンニトリル（4.2g、収率65.66％）を得た。1H
NMR （400MHz, CHLOROFORM-d） δ 8.42（s, 1H）, 8.03（d, J = 9.3 Hz, 1H）, 7.98-7.91（m, 1H）, 7.85-7.78（m, 1H）, 7.60（d, J = 9.2 Hz, 1H）。
【０１１３】
工程C：（E）-3-（6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エンニトリル（4.50g、15.20mmol）、[2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]ボロン酸（4.43g、18.24mmol）、炭酸ナトリウム（4.83g、45.60 mmol）、［1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウムジクロリド（556.07mg、759.96μmol）、2-ジシクロヘキシルホスフィン-2'、6'-ジメトキシビフェニル（311.98mg、759.96μmol）および［2-（2-アミノフェニル）フェニル]-クロロ-パラジウム-シクロヘキシル-[2-（2,6-ジメトキシフェニル）フェニル]ホスフィン（547.64mg、759.96μmol）をジオキサン（100mL）と水（20mL）との混合溶媒に加入した。それを窒素で3回置換し、次いで90〜100℃に加熱し、2時間撹拌した。反応混合物を水（200ml）に注ぎ反応をクエンチさせ、且つ、ジクロロメタン（200 mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（200mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過と減圧下での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製して、粗生成物を得た。その粗生成物を石油エーテル/酢酸エチル=5/1の混合溶媒に12時間撹拌した後、ろ過し固体を収集した。当該固体を減圧で乾燥し、（E）-3-[6-[2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ［1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（5.37g、収率：96.16％）を得た。1H NMR （400MHz, CHLOROFORM-d） δ 8.49（s, 1H）, 7.82-7.74（m, 2H）, 7.59-7.46（m, 4H）, 6.99（dd, J = 2.6, 6.1 Hz, 1H）, 4.39（d, J = 6.3 Hz, 2H）, 2.90-2.70（m, 4H）, 2.20（s, 3H）。
【０１１４】
工程D：（E）-3-[6-（2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（5.37g、14.62mmol）を、ジクロロメタン（20mL）とジメチルスルホキシド（70mL）と水（20mL）との混合溶媒に溶解し、次いで、過酸化水素水（8.29g、73.10mmol、7.02mL、30％）および水酸化ナトリウム（2mol/L、14.62mL）を別々に加えた。混合物を15〜20℃で12時間撹拌した。混合物を水（200mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、ジクロロメタン/イソプロピルアルコール（3/1）である混合溶媒（200mL×1）で抽出した。有機相を飽和チオ硫酸ナトリウム溶液(200mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧下での濃縮を行った。残渣を分取高速液体クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  Gemini  C18  250×50mm×10μm;移動相：[水（0.05％アンモニア水v/v）-アセトニトリル];勾配：5％〜32％,33，80％min）で精製し、実施例1（3.6g、収率63.82％）を得た。1H NMR （400MHz, CHLOROFORM-d） δ 8.45（s, 1H）, 8.09（d, J = 15.6 Hz, 1H）, 7.85（d, J = 15.6 Hz, 1H）, 7.69（d, J = 9.2 Hz, 1H）, 7.55-7.45（m, 2H）, 7.37（d, J = 7.8 Hz, 1H）, 6.99（d, J = 7.7 Hz, 1H）, 5.93-5.65（m, 2H）, 4.35（br. s., 2H）, 2.99-2.64（m, 4H）, 2.33（s, 3H）。
【０１１５】
【化３５】
2019518066.tif 000037
実施例２の調製：
【０１１６】
【化３６】
2019518066.tif 000038
工程A：2-ジエトキシホスホリル酢酸エチル（295.93mg、1.32mmol、261.88μL）をテトラヒドロフラン（6mL）に溶解し、0℃に冷却した後、水素化ナトリウム（52.80mg、1.32 mmol）を一度に加えた。反応混合物を0℃で15分間撹拌し、次いで別の懸濁液（6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-ホルムアルデヒド（300mg、1.10mmol）をテトラヒドロフラン（6mL）に分散させ、-10〜-15℃に冷却して得た）に滴下した。反応混合物を-10〜-15℃で15分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、かつ、ジクロロメタン（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、且つ減圧で濃縮した。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：ジクロロメタン/酢酸エチル=10/1）で精製し、（E）-3-（6ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エン酸エチル（330mg、収率：87.43％）を得た。
【０１１７】
工程B：（E）-3-（6ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エン酸エチル（330mg、961.76 mmol）、［2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]ボロン酸（268.84mg、1.11mmol）、炭酸ナトリウム（305.81mg、2.89mmol）、[1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]パラジウムジクロライド．ジクロロメタン（39.27mg、48.09mmol）、ビスシクロヘキシルホスフィン-2'、6'-ジメトキシビフェニル（19.74mg、48.09μmol）および[2-（2-アミノフェニル）フェニル]-クロロ-パラジウム、シクロヘキシル-[2-（2,6-ジメトキシフェニル）フェニル]ホスフィン（34.65mg、48.09μmol）をジオキサン（10mL）と水（2mL）との混合溶媒に加えた。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで90〜100℃に加熱し、2時間撹拌した。反応混合物を水（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、かつジクロロメタン（200mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過と減圧での濃縮
を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製して、（E）-3-[6-（2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（359mg、収率：81.57％）を得た。
【０１１８】
工程C：（E）-3-[6-（2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4-トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（359.00mg、866.19μmol）を、テトラヒドロフラン（6mL）と水（2mL）との混合溶媒に溶解した。次いで、リチウム水酸化物一水和物（109.04mg、2.6mmol）を一度に加えた。反応混合物を15〜20℃で12時間攪拌した後、水（15mL）で希釈し、希塩酸（1mol/L）でpHを5〜6に調整した後、ジクロロメタン（20mL×1）で抽出した。有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で濃縮して、（E）-3-[6-［2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（330mg、収率：98.59％）を得た。
【０１１９】
工程D：（E）-3-[6-（2-（6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（65mg、168.22μmol）、メチルアミン塩酸塩（22.72mg、336.44μmol）、HATU（127.92mg、336.44μmol）とトリエチルアミン（68.09mg、672.88μmol、93.27μmol）をN、N-ジメチルホルムアミド（2mL）に溶解した。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌し、メタノール（2mL）で直接に希釈し、高速液体分取クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  Gemini150*25mm*10μm;移動相：[水（0.05％アンモニア水（v/v）-アセトニトリル]；勾配：21％〜51％、15分間）で精製して、実施例2（27.79mg、収率：41.36％）を得た。1H NMR （400MHz, DMSO-d6）δ 8.67（s, 1H）, 8.43（d, J = 4.6 Hz, 1H）, 7.93-7.80（m, 2H）, 7.68-7.61（m, 2H）, 7.60-7.49（m, 2H）, 7.02（dd, J = 1.6, 6.8 Hz, 1H）, 4.29（d, J
= 9.0 Hz, 2H）, 2.84-2.72（m, 2H）, 2.69-2.57（m, 5H）, 1.99（s, 3H）。
【０１２０】
実施例3〜5は、実施例2の製造手順を参照することによって得ることができる。
【０１２１】
【化３７】
2019518066.tif 000039
1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.67（s, 1H）, 8.48（br t, J = 5.3 Hz, 1H）,7.95-7.78（m, 2H）, 7.69-7.46（m, 4H）, 7.02（dd, J = 1.6, 6.7 Hz, 1H）, 4.29（br d,
J = 7.5 Hz, 2H）, 3.26-3.08（m, 2H）, 2.81-2.58（m, 4H）, 1.99（s, 3H）, 1.04（t, J = 7.2 Hz, 3H）。
【０１２２】
【化３８】
2019518066.tif 000040
1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.66（s, 1H）, 8.53（d, J = 4.8 Hz, 1H）, 8.14（s, 1H）, 7.89-7.81（m, 2H）, 7.69-7.61（m, 2H）, 7.60-7.48（m, 2H）, 7.06-7.00（m, 1H）, 4.30（d, J = 8.9 Hz, 2H）, 2.83-2.73（m, 3H）, 2.66-2.60（m, 2H）, 1.99（s, 3H）, 0.65（d, J = 5.6 Hz, 2H）, 0.46（d, J = 2.8 Hz, 2H）。
【０１２３】
【化３９】
2019518066.tif 000041
1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.67（s, 1H）, 8.50（t, J = 5.6 Hz, 1H）, 7.93（d, J = 15.6 Hz, 1H）, 7.83（d, J = 9.2 Hz, 1H）, 7.69-7.61（m, 2H）, 7.59-7.49（m, 2H）, 7.02（dd, J = 1.8, 6.7 Hz, 1H）, 4.69（t, J = 5.5 Hz, 1H）, 4.34-4.24（m, 2H）, 3.43（q, J = 5.9 Hz, 2H）, 3.21（d, J = 3.1 Hz, 2H）, 2.83-2.73 （m, 2H）, 2.62（quin, J = 7.2 Hz, 2H）, 1.99（s, 3H）。
【０１２４】
実施例6
中間体6-4の製造：
【０１２５】
【化４０】
2019518066.tif 000042
工程A：1-テトラヒドロピラン-2-イル-5-（4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル）ピラゾール（10.96g、39.41mmol）、2-ブロモ-6-メチル-ピリジン（6.00g,34.88 mmol,3.97mL）と［1,1-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウムジクロライド（1.28g、1.74mmol）および炭酸ナトリウム（11.09g、104.64mmol）を、ジオキサン（200.00mL）と水（40.00mL）との混合溶媒に加えた。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで80〜90℃に加熱し、3時間撹拌した後、水（200mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、且つ酢酸エチル（180mL×2）で抽出した。合わせた有機相を食塩水（200mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧で濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=10/1〜5/1）で精製し、2-メチル-6-（2-テトラ
ヒドロピラン-2-イルピラゾール-3-イル）ピリジン（4.10g、粗生成物）を得た。生成物は核磁気によって粗生成物であると同定された。
【０１２６】
工程B：2-メチル-6-（2-テトラヒドロピラン-2-イルピラゾール-3-イル）ピリジン（2.10g、粗生成物）を酢酸（20.00mL）に溶解し、次いでNIS（2.04g、9.06mmol）を一度に加えた。混合物を70〜80℃に加熱し、1時間撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（50mL）に注ぎ、反応をクエンチさせた後、酢酸エチル（50mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=10/1）で精製し、2-（4-ヨード-2-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-3-イル）-6-メチルピリジン（1.60g、収率：50.22％）を得た。
【０１２７】
工程C：2-（4-ヨード-2-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-3-イル）-6-メチルピリジン（500.00mg、1.35mmol）およびホウ酸トリイソプロピル（672.82mg、3.58mmol、820.51μl）をテトラヒドロフラン（10mL）中に溶解した。反応混合物を-78℃に冷却した後、n-ブチルリチウム（2.5M、1.40mL）を滴下し、-78〜-60℃で30分間攪拌した。この反応混合物を、飽和塩化アンモニウム溶液（20mL）に注ぎ反応をクエンチさせ、10分間撹拌した後、酢酸エチル（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：石油エーテル/酢酸エチル=1/１）で精製し、[5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]ボロン酸（200.00mg、収率：51.60％）を得た。実施例6の調製：
【０１２８】
【化４１】
2019518066.tif 000043
工程A：[5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]ボロン酸（200.00mg、696.57μmol）、（E）-3-（6ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エン酸エチル（239.01mg、696.57μmol）、炭酸ナトリウム（221.49mg、2.09mmol）、[1,1'ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]パラジウムジクロリド（50.97mg、69.66μmol）、ビスシクロヘキシルホスフィン-2',6'-ジメトキシビフェニル（28.60mg、69.66μmol）および[2-（2-アミノフェニル）フェニル]-クロロ-パラジウム、シクロヘキシル-[2-（2,6-ジメトキシフェニル）フェニル]ホスフィン（50.20
mg、69.66μmol）を、ジオキサン（3mL）と水（1mL）との混合溶媒に加えた。それを窒素で3回置換し、次いで80〜90℃に加熱し、3時間撹拌した。反応混合物を水（30mL）に注ぎ、反応をクエンチさせた後、酢酸エチル（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/１）で精製し、（E）-3-[6-［5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（250.00mg、収率：78.27%）を得た。
【０１２９】
工程B：（E）-3-[6-［5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（250.00mg、545.24μmol）をエタノール（3mL）に溶解した後、塩酸ジオキサン（4M、5.01mL）を加えた。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌した後、減圧で濃縮し、溶媒を蒸発させ、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液（20mL）でpHを8〜9に調整した後、ジクロロメタン（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行い、（E）-3-[6-［5-（6-メチル-2-ピリジル）-1H-ピラゾール-1-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（230.00mg、粗生成物）を得た。
【０１３０】
工程C：（E）-3-[6-［5-（6-メチル-2-ピリジル）-1H-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（230.00mg、粗生成物）をテトラヒドロフラン（5mL）に溶解した。反応混合物を-20℃に冷却した後水素ナトリウム（27.03mg、675.75μmol）を添加し、続いて-20℃で30分間撹拌した。次いで、臭化3-シアノベンジル（132.47mg、675.75μmol）を添加した。反応混合物を15〜20℃に昇温し、4時間攪拌を続けた後、水（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、混合物を希塩酸（1M）でpHを5〜6に調整し、酢酸エチル（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール＝30/１）で精製して、（E）-3-[6-[1-[（3-ベンゾニトリル）メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（150.00mg、収率：46.67％）を得た。
【０１３１】
工程D：（E）-3-[6-[1-[（3-ベンゾニトリル）メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸エチル（150.00mg、306.42μmol）をテトラヒドロフラン（3mL）に溶解させ、次いで水酸化リチウム一水和物（38.57mg、919.26μmol）を一度に加えた。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌し、次いで水（10mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、且つ希塩酸（1M）でpHを5〜6に調整し、さらに、ジクロロメタン（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過と減圧での濃縮を行い、（E）-3-[6-[1-[（3-ベンゾニトリル）メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（130.00mg、収率：91.94％）を得た。
【０１３２】
工程E：（E）-3-[6-[1-[（3-ベンゾニトリル）メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（130.00mg、281.71μmol）、HATU（214.23mg、563.42μmol）およびトリエチルアミン（57.01mg、563.42μmol、78.10μL）をN、N-ジメチルホルムアミド（2mL）に溶解した。反応混合物を15〜20℃で1時間撹拌した後、アンモニアのテトラヒドロフラン溶液（0℃で飽和）3mLを添加した。反応混合物をさらに15〜20℃で30分間撹拌し、減圧下で濃縮を行い溶媒を除去した後、メタノール（2mL）で希釈した。残渣を高速液体分取クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  SynergiC18150×30mm×4μm;移動相：[水（0.225％ギ酸）-アセト
ニトリル];勾配：15％-45％、12分間）で精製し、実施例6（53.00mg、収率：40.32％）を得た。1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.69（s, 1H）, 8.25（s, 1H）, 7.93-7.81（m, 5H）, 7.67-7.52（m, 6H）, 7.24（br. s., 1H）, 7.04（dd, J = 2.0, 6.2 Hz, 1H）, 5.61（s, 2H）, 1.98（s, 3H）。
実施例7は、実施例6の製造手順を参照することによって得ることができる。
【０１３３】
【化４２】
2019518066.tif 000044
1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.67（s, 1H）, 8.41-8.36（m, 1H）, 8.38（s, 1H）, 8.09（s, 1H）, 7.89-7.78 （m, 3H）, 7.69-7.58（m, 3H）, 7.51（d, J = 15.7 Hz, 1H）, 7.16（br s, 1H）, 7.02（d, J = 6.8 Hz, 1H）, 4.86（quin, J = 6.9 Hz, 1H）,
2.22-2.16（m, 2H）, 2.14-2.04（m, 2H）, 1.97（s, 3H）, 1.92-1.83（m, 2H）, 1.76-1.66（m, 2H）。
【０１３４】
【化４３】
2019518066.tif 000045
中間体8-2の製造：
【０１３５】
【化４４】
2019518066.tif 000046
工程A：[5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]ボロン酸（470.00mg、1.64mmol）、（E）3-(6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エンニトリル（485.55mg、1.64mmol）、炭酸ナトリウム（521.47mg、4.92mmol）、[1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]パラジウムジクロリド（36.00mg、49.20μmol）、ビスシクロヘキシルホスフィノ-2',6'-ジメトキシビフェニ
ル（6.73mg、16.40μmol）および[2-（2-アミノフェニル）フェニル]-クロロ-パラジウム；シクロヘキシル-[2-（2,6-ジメトキシフェニル）フェニル]ホスフィン（11.82mg、16.40μmol）を、ジオキサン（20mL）と水（5mL）との混合溶媒に加えた。反応混合物を窒素で3回置換した後80〜90℃に加熱し、12時間撹拌し、次いでそれを水（30mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、且つ酢酸エチル（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。得られた粗生成物を石油エーテル（12mL）と酢酸エチル（4mL）との混合溶媒において30分間攪拌した後、ろ過した。固体を集め、減圧下で濃縮乾固させ、（E）-3-[6-（5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（554.00mg、収率82.32％）を得た。
【０１３６】
工程B：（E）-3-[6-（5-（6-メチル-2-ピリジル）-1-テトラヒドロピラン-2-イル-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（554.00mg、1.35mmol）をメタノール（5mL）に溶解し、次いでジオキサン塩酸塩（4mol/L、5mL）を添加した。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌し、次いで減圧で濃縮を行い溶媒を除去し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（20mL）でｐHを8〜9に調整し、さらに、ジクロロメタン（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水(30mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行い、（E）-3-[6-（5-（6-メチル-2-ピリジル）-1H-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸メチル（500.00mg、粗生成物）を得た。
実施例8の調製：
【０１３７】
【化４５】
2019518066.tif 000047
工程A：（E）-3-[6-（5-（6-メチル-2-ピリジル）-1H-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸メチル（260.00mg、粗生成物）をテトラヒドロフラン（4mL）に溶解した。反応混合物を0℃に冷却し、水素ナトリウム（31.75mg、793.63μmol）を一度に加えた後、0℃で30分間攪拌し、続いてヨード化イソプロピル（134.91mg、793.63μmol）を加えた。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌した。LCMSモニタリングにより、（E）-3-[6-（5-（6-メチル-2-ピリジル）-1H-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸メチルが完全に消耗されたが、目的生成物が形成されなかったことが示された（MS（ESI）m/z：347[M+H+]）。混合物を減圧下で濃縮しテトラヒドロフランを除去し、残留物をN、N-ジメチルホルムアミド（3
mL）に溶解し、次いで2-ヨードイソプロパン（613.22mg、3.61mmol、360.72μl）および炭酸カリウム（498.58mg、3.61mmol）をそれぞれに加えた。反応混合物を15〜20℃でさらに12時間撹拌を続けた。LCMSモニタリングにより、反応が完了することが示された。混合物を水（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、次いで酢酸エチル（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水(60mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し、（E）-3-[6-[1-イソプロピル-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸イソプロピル（100.00mg、粗生成物）を得た。
【０１３８】
工程B：（E）-3-[6-（1-イソプロピル-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸イソプロピル（100.00mg、粗生成物）をテトラヒドロフラン（1mL）、メタノール（1mL）および水（1mL）の混合溶媒に溶解し、次いで水酸化リチウム一水和物（29.24mg、696.87μmol）を一度に加えた。反応混合物を15〜20℃で3時間撹拌した後、希塩酸（5％）でpHを5〜6に調整し、酢酸エチル（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行い、（E）-3-[6-[1-イソプロピル-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（100.00mg、粗生成物）を得た。
【０１３９】
工程C：（E）-3-[6-[1-イソプロピル-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（100.00mg、粗生成物）をテトラヒドロフラン（3mL）に溶解し、次いでHATU（195.78mg、514.90μmol）およびトリエチルアミン（52.1mg、514.90μmol、71.37μL）をそれぞれに一度に加入した。反応混合物を15〜20℃で1時間攪拌した後、アンモニアのテトラヒドロフラン溶液（0℃で飽和）3mLを添加した。反応混合物を15〜20℃で12時間攪拌を続け、減圧下で濃縮を行い溶媒を除去した後、メタノール（3mL）で希釈し、分取高速液体クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  SynergiC18  150×30mm×4μm;移動相：[水（0.225％ギ酸）-アセトニトリル];勾配：15％-45％、12分間）で精製し、実施例8（30.50mg、収率：30.08％）を得た。1H
NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.68（s, 1H）, 8.10（s, 1H）, 7.89-7.81（m, 3H）, 7.68-7.59（m, 3H）, 7.51（d, J = 15.7 Hz, 1H）, 7.18（br s, 1H）, 7.02（dd, J = 1.2, 7.1 Hz, 1H）, 4.67（quin, J = 6.7 Hz, 1H）, 1.97（s, 3H）, 1.55（d, J = 6.7 Hz, 6H）。
【０１４０】
【化４６】
2019518066.tif 000048
実施例9の調製：
【０１４１】
【化４７】
2019518066.tif 000049
工程A：（E）-3-[6-（5-（6-メチル-2-ピリジル）-1H-ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸メチルエステル（200.00mg、粗生成物）をテトラヒドロフラン（5mL）に溶解し、0℃に冷却した後、水素化ナトリウム（24.42mg、610.49μmol）を一度に加えた）。反応混合物を0℃で30分間撹拌し、1-（ブロモメチル）-3-（ジフルオロメチル）ベンゼン（134.94mg、610.49μmol）を添加し、次いで15〜20℃に昇温し、5時間撹拌を続けた。反応混合物を水（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせた後、酢酸エチル（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行い、（E）-3-[6-[1-[[3-（ジフルオロメチル）フェニル]メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸メチル（150.00mg、粗生成物）を得た。
【０１４２】
工程B：（E）-3-[6-[1-[[3-（ジフルオロメチル）フェニル]メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸メチル（150.00mg、粗生成物）をテトラヒドロフラン（1mL）、メタノール（1mL）と水（1mL）との混合溶媒に溶解した後、水酸化リチウム一水和物（37.73mg、899.10μmol）を一度に加えた。反応混合物を15〜20℃で10分間撹拌した後、希塩酸（0.5M）でpHを5〜6に調整し、その時点で固体が沈殿した。ろ過を行い固体を集め、（E）-3-[6-[1-[[3-（ジフルオロメチル）フェニル]メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-［1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（120.00mg、収率：60.34％）を得た。
【０１４３】
工程C：（E）-3-[6-[1-[[3-（ジフルオロメチル）フェニル]メチル]-3-（6-メチル-2-ピリジル）ピラゾール-4-イル]-［1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エン酸（120.00mg、180.83μmol）、HATU（187.59mg、493.36μmol）およびトリエチルアミン（49.92mg、493.36μmol、68.38μl）をテトラヒドロフラン（3mL）に溶解した。反応混合物を15〜20℃で1時間撹拌し、次いでアンモニアのテトラヒドロフラン溶液（0℃で
飽和）3mLを添加した。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌し、次いで水（15mL）を注ぎ、反応をクエンチさせ、酢酸エチル（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（50ｍL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を高速液体分取クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  Synergi  C18  150×30mm×4μm;移動相：[水（0.225％ギ酸）-アセトニトリル];勾配15％-45％、12分）で精製し、実施例9（47.85mg、収率39.81％）を得た。1H NMR （400MHz, DMSO-d6） δ 8.70（s, 1H）, 8.26（s, 1H）, 7.95-7.83（m, 3H）, 7.67-7.51（m, 8H）, 7.28（d, J = 11.2 Hz, 1H）, 7.07-6.96 （m, 1H）, 7.12（s, 1H）, 5.61（s, 2H）, 1.97（s, 3H）。
【０１４４】
【化４８】
2019518066.tif 000050
中間体10-3の製造：
【０１４５】
【化４９】
2019518066.tif 000051
工程A：6-クロロピリジン-2-カルボン酸エチル（500.00mg、2.69mmol）、ビニルトリブチルスズ（887.12mg、2.80mmol、813.87μL）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（155.42mg、134.50μmol）をトルエン（10mL）に溶解した。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで110〜120℃に加熱し、3時間撹拌した。冷却後、飽和フッ化カリウム溶液（30mL）に注ぎ、30分間攪拌した。当該混合物をろ過し、ろ過残渣を酢酸エチル（10mL×3）で洗浄した。濾液を酢酸エチル（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水(50mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=10/1）で精製し、6-ビニルピリジン-2-カルボン酸エチル（364.00mg、収率：76.21%）を得た。1H NMR （400MHz,CHLOROFORM-d） 8.00（dd, J = 0.8, 7.8 Hz, 1H）, 7.81（t, J = 7.8 Hz, 1H）, 7.61（dd, J = 0.9, 7.9 Hz, 1H）, 6.96（dd, J = 10.9, 17.6 Hz, 1H）, 6.25（dd, J = 0.6, 17.6 Hz, 1H）, 5.67-5.56（m, 1H）, 4.50（q, J = 7.2 Hz, 2H）, 1.46（t, J = 7.2 Hz, 3H）。
【０１４６】
工程B：6-ビニルピリジン-2-カルボン酸エチル（364.00mg、2.05mmol）をエタノール（4mL）に溶解し、次いでパラジウム炭素（40.00mg、10％）を一度に加えた。反応混合物を水素で3回置換し、次いで15psiの水素圧で15〜20℃で3時間撹拌した。続いて、パラジウム炭素をろ過により除去し、濾液を減圧で濃縮し、6-エチルピリジン-2-カルボン酸エチル（320.00mg、収率87.10％）を得た。1H NMR （400MHz, CHLOROFORM-d）7.95（d, J = 7.7 Hz, 1H）, 7.75（t, J = 7.8 Hz, 1H）, 7.37（d, J = 7.8 Hz, 1H）, 4.49（q, J = 7.1 Hz, 2H）, 2.96（q, J = 7.7 Hz, 2H）, 1.44（t, J = 7.2 Hz, 3H）, 1.34（t, J =
7.7 Hz, 3H）。
【０１４７】
実施例10は、実施例1の製造方法を参照し得ることができる。
1H NMR （400 MHz, DMSO-d6） δ 8.66（s, 1H），7.81-7.91（m, 3H），7.61-7.72（m, 2H），7.57（d, J = 9.03 Hz, 1H），7.49（d, J = 15.69 Hz, 1H），7.21（br s, 1H），6.96-7.03（m, 1H），4.21-4.37（m, 2H）， 2.70-2.92（m, 2H），2.62（q, J =7.18 Hz, 2H），2.27（q, J =7.53 Hz, 2H），0.48（t, J =7.53 Hz, 3H）。
【０１４８】
【化５０】
2019518066.tif 000052
中間体11-2の調製：
【０１４９】
【化５１】
2019518066.tif 000053
工程A：0℃で撹拌しながらエチニル塩化マグネシウムのテトラヒドロフラン溶液（0.5mol/L、800.00mL）にトリ-n-ブチルスズクロライド（72.09mL、268.00mmol）を滴下した（30分間以上）。反応混合物を30℃で0.5時間撹拌し、次いで35℃に昇温し、1時間撹拌した。その後、0℃に冷却した後、塩化アンモニウム水溶液（800mL）を加入し反応をクエンチさせた後、石油エーテル（800mL×2）で抽出し、合わせた有機相を塩水（400mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧下での濃縮を行い2-クロロアセチレントリ-n-ブチルスズ（84.00g、収率：60.08％）を得た。1H NMR （400 MHz, CHLOROFORM-d） δ: 1.54-1.67（m, 6H）, 1.32-1.35（m, 6H）, 0.88-1.04（m, 15H）。
中間体11-6の製造：
【０１５０】
【化５２】
2019518066.tif 000054
工程A：L-プロリン（50g、434.29mmol）および亜硝酸ナトリウム（41.95g、608.01mmol）を水に溶解し、次いで濃塩酸（50mL）を-10℃〜0℃で加え、かつ、温度を10℃以下に制御した。添加が完了した後、反応混合物を0℃で0.5時間撹拌し、次いで25℃に上昇させ、16時間撹拌した。混合物を水（200mL）で希釈し、メチルtert-ブチルエーテル（300mL×5）で抽出し、併せた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行い、N-ニトロ-L-プロリン（57.00g、粗生成物）を得た。
【０１５１】
工程B：N-ニトロ-L-プロリン（57.00g、粗生成物）をトルエン（90mL）に溶解し、0℃に冷却し、無水トリフルオロ酢酸（82.51mL、593.21mmol）を1時間かけて滴下した。反応混合物を25℃で2時間攪拌した。炭酸カリウム（87.45g、632.76mmol）を水（50mL）とジ
クロロメタン（100mL）に分散させ、0℃で前の反応液を1時間かけて滴下した。添加完了後、混合物を25℃で1時間撹拌した。混合物をジクロロメタン（100mL×5）で抽出した。合わせた有機相を塩水（200mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過と減圧での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=0/1）で精製し、5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-c]オキサジアゾール-7-イウム-3-フェネート（39.00g、収率：78.20％）を得た。
【０１５２】
工程C：窒素の保護で、5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-c]オキサジアゾール-7-イウム-3-フェネート（23.5g、186.35mmol）をキシレン（120mL）に溶解し、次いで、2-クロロアセチレントリ-n-ブチルスズ（84.67g、242.26mmol）を加えた。反応混合物を150℃で40時間攪拌し、シリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=1/0〜20/1）で直接精製し、トリブチル（5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-2-イル）スズ（13.00g、収率：17.56％）を得た。
実施例11の調製：
【０１５３】
【化５３】
2019518066.tif 000055
工程A：トリブチル（5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-2-イル）スズ（1.49g、3.76mmol）、2-ブロモ-4,6-ジメチル-ピリジン（700.00mg、3.76mmol）、塩化リチウム（318.98mg、7.52mmol）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（434.77mg、376.24μmol）をジオキサン（20mL）に加えた。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで100〜110℃に加熱し、12時間撹拌した。LCMSモニタリングにより、トリブチル（5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-2-イル）スズが完全に消耗されなかったことが示された。反応物を100〜110℃でさらに12時間撹拌を続けた。再度LCMSモニタリングにより、トリブチル（5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-2-イル）スズが完全に消耗されなかったことが示された。反応物を100〜110℃でさらに12時間撹拌を続けた。最後に、LCMSモニタリングにより、反応が終了したことが示された。反応混合物を水（50mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、さらに酢酸エチル（50ｍL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（100ｍL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し、2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（649.00mg、収率63.81％、純度78.847％）を得た。
【０１５４】
工程B：2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（150.00mg、703.30μmol）およびNBS（137.69mg、773.63μmol）をN、N-ジメチルホルムアミド（3mL）に溶解した。反応混合物を15〜20℃で2時間撹拌した後、水(15mL)に注ぎ、反応をクエンチさせ、酢酸エチル（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（15mL）
で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲル（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し、3-ブロモ-2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（150.00mg、収率73.00％）を得た。
【０１５５】
工程C：3-ブロモ-2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（150.00mg、513.40μmol）およびホウ酸トリイソプロピル（255.87mg、1.36mmol、312.04μL）をテトラヒドロフラン（4mL）に溶解した。混合物を-78〜-60℃に冷却し、n-ブチルリチウム（2.5M、533.94μL）を滴下した。反応混合物を15〜20℃に昇温し、30分間撹拌し、次いで飽和塩化アンモニウム液体（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、且つ、酢酸エチル（20mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（30mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し、[2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]ボロン酸（90.00mg、収率：68.18％）を得た。
【０１５６】
工程D：（E）-3-（6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エンニトリル（100.00mg、337.76μmol）、2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル] ボロン酸（86.84mg、337.76μmol）、炭酸ナトリウム（107.40mg、1.01mmol）、[1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]パラジウムジクロリド（7.41mg、10.13μmol）、ジシクロヘキシルホスフィン-2,6'-ジメトキシビフェニル（1.39mg、3.38μmol）および[2-（2-アミノフェニル）フェニル]-クロロ-パラジウムおよびシクロヘキシル-[2-（2,6-ジメトキシフェニル）フェニル]ホスフィン（12.17mg、16.89μmol）をジオキサン（20mL）と水（4mL）との混合溶媒に加えた。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで80〜90℃に加熱し、12時間撹拌し、次いで水（30mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、且つ、酢酸エチル（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（40mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し、（E）-3-[6-（2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（80.00mg、粗生成物）を得た。
【０１５７】
工程E：（E）-3-[6-（2-（4,6-ジメチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b] ピラゾール-3-イル]-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（80.00mg、粗生成物）を水（1mL）とジメチルスルホキシド（2mL）との混合溶媒に溶解し、次いで、水酸化ナトリウム（10.49mg、262.18μmol）および過酸化水素（74.31mg、655.45μmol）を一度に加えた。反応混合物を15〜20℃で2時間撹拌し、次いで水（20mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、且つ、ジクロロメタン（20mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（50mL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣をまず分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し固体を得、LCMSモニタリングにより当該固体が不純物であることが分かった。粗生成物を分取高速液体クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  Synergi  C18  150×30mm×4μm;移動相：[水（0.225％ギ酸）-アセトニトリル];勾配：10％〜40％、12分）で再度精製して、実施例11（12.00mg、ギ酸塩、収率：22.90％）を得た。1H NMR
（400MHz, METHANOL-d4） δ 8.53（s, 1H）, 8.21（br s, 1H）, 8.00（d, J = 15.8 Hz, 1H）, 7.76（d, J = 9.2 Hz, 1H）, 7.68-7.56（m, 2H）, 7.38（s, 1H）, 6.99（s, 1H）, 4.34（t, J = 6.7 Hz, 2H）, 2.97-2.89（m, 2H）, 2.80-2.69（m, 2H）, 2.31（s, 3H）, 2.17（s, 3H）。
【０１５８】
【化５４】
2019518066.tif 000056
中間体12-3の製造：
【０１５９】
【化５５】
2019518066.tif 000057
工程A：トリブチル（5,6-ジヒドロ-4H-ピロール[1,2-b]ピラゾール-2-イル）スズ（2.69g、6.78mmol）、6-ブロモ-3-クロロ-2-メチル-ピリジン(700.00mg、3.39mmol)、塩化リチウム（287.43mg、6.78mmol）とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（391.77mg、339.00μmol）をジオキサン（30mL）に加えた。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで100〜110℃に加熱し、12時間撹拌した。混合物を水（50mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、酢酸エチル（50mL×3）で抽出した。合わせた有機相を塩水（100ｍL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣をシリカゲルカラム（溶出液：石油エーテル/酢酸エチル=10/1〜5/1）で精製し、2-（5-クロロ-6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（600.00mg、収率：67.19％）を得た。1H NMR （400MHz, CHLOROFORM-d） 7.65（q, J = 8.4 Hz, 2H）, 6.59（s, 1H）, 4.22（t, J = 7.2 Hz, 2H）, 2.95（t, J = 7.3 Hz, 2H）, 2.71-2.59（m, 5H）。
【０１６０】
工程B：N、N-ジメチルホルムアミド（3mL）に2-（5-クロロ-6-メチル-2-ピリジル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（200.00mg、855.80μmol）を溶解し、NIS（211.79mg、941.38μmol）を一度に添加した。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌し、次いでろ過し、ろ過残渣を集め、減圧で濃縮乾固して、2-（5-クロロ-6-メチル-2-ピリジル）-3ヨード-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（264.00mg、収率：85.79％）を得た。
実施例12の調製：
【０１６１】
【化５６】
2019518066.tif 000058
工程A：（E）-3-（6-ヨード-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル）プロパ-2-エンニトリル（200.00mg、675.52μmol）、ビス(ピナコラト)ジボロン（205.85mg、810.62μmol）、[1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン]パラジウムジクロライド（49.43mg、67.55μmol）および酢酸カリウム（132.59mg、1.35mmol）をジオキサン（20mL）に加入した。反応混合物を窒素で3回置換し、次いで100〜110℃に加熱し、12時間撹拌した。反応を未処理のままにして、溶液を次の工程で直接使用した。
【０１６２】
工程B：工程Aの混合物に2-（5-クロロ-6-メチル-2-ピリジル）-3-ヨード-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール（121.43mg、337.69μmol）、炭酸ナトリウム（107.38mg、1.01μmol）、［1,1'-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン）パラジウムジクロライド（24.71mg、33.77μmol））、ジシクロヘキシルホスフィン-2',6'-ジメトキシビフェニル（13.86mg、33.77μmol）、[2-（2-アミノフェニル）フェニル]-クロロ-パラジウム、シクロヘキシル-[2-（2,6-ジメトキシフェニル）フェニル]ホスフィン（24.33mg、33.77μmol）、ジオキサン（4.00mL）および水（4.00mL）を添加し、窒素で3回置換した後、90〜100℃に加熱し、2時間撹拌した。反応混合物を水（30mL）に注ぎ、酢酸エチル（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を塩水（50ｍL）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過および減圧での濃縮を行った。残渣を分取シリカゲルプレート（展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=30/1）で精製し、（E）-3-[6-（2-（5-クロロ-6-メチル-2-ピリジニル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（120.00mg、収率：88.43%）を得た。
【０１６３】
工程C：E）-3-[6-（2-（5-クロロ-6-メチル-2-ピリジニル）-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル-[1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-5-イル]プロパ-2-エンニトリル（120.00mg、298.62μmol）を、ジメチルスルホキシド(2mL)と水（1mL）と混合溶媒に溶解し、次いで、順に過酸化水素水（338.54mg、2.99mmol）および水酸化ナトリウム（2mol/L、597.24μl）を添加した。反応混合物を15〜20℃で12時間撹拌した。LCMSモニタリングにより反応は完了しなかったことが示された。反応混合物を40〜50℃に加熱し、2時間撹拌した。LCMSモニタリングにより、反応が完了したことが示された。当該混合物を水（10mL）に注ぎ、反応をクエンチさせ、次いでジクロロメタン（30mL×2）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過と減圧での濃縮を行った。残渣を高速液体分取クロマトグラフィー（カラム：Phenomenex  Synergi  C18  150×30mm×4μm;移動相：[水（0.225％ギ酸）-ACN]；勾配：24％〜54％、12分）で精製し、実施例12（21.46mg、収率：15.72％）を得た。1H NMR （400MHz, METHANOL-d4） δ 8.56（s, 1H）, 8.06（d, J = 15.6 Hz, 1H）, 7.79（d, J = 9.0 Hz, 1H）, 7.73-7.61（m, 4H）, 4
.34（br d, J = 6.0 Hz, 2H）, 2.94-2.85（m, 2H）, 2.73（br s, 2H）, 2.17（s, 3H）。
【０１６４】
実験例1：TGFβ-R1のインビトロ阻害活性
実験方法：
1）試験化合物：IC50は、それぞれ5μMの開始濃度から3倍の勾配希釈で、10個の勾配点をすることによって検出された。
2）陽性参照化合物LDN193189について、それぞれ20μMの開始濃度から3倍の勾配希釈で、10個の勾配点をすることによって、IC50を検出した。
3）反応系は10μMのATPを含んだ。
4）酵素活性のパーセンテージ（溶媒群と比較した）が試料の最高濃度で65％未満である場合の曲線当てはめによってIC50値を計算した。
実験結果：表1で示された。
結論：本発明の化合物は優れたインビトロ阻害活性を有する。
【０１６５】
【表１】
2019518066.tif 000059
実験例2：NIH/3T3マウス胚細胞の増殖阻害実験
実験原理：
Promega社のLuminescent Cell Viability Assay（CellTiter-Glo（登録商標）法、即ちATP蛍光活性アッセイ）で、化合物を細胞培養プレートに添加し、インキュベーションした。検出当日に、細胞内ATP含量を検出するための基質緩衝液を加えた。わずかに振とうし、1000rpmで1分間遠心した。
10分間放置した後、検出を行った。検出プレートに対し、PerkinElmer社のEnvision多機能マイクロプレートリーダーを用いて分析し、アッセイモードは蛍光検出であり、データは化学発光シグナルが400〜700nmでの読み数値として表現された。
実験ステップ：
1）細胞増殖カバー率が約70％である場合、先ず細胞層を無カルシウム、無マグネシウムダルベッコリン酸緩衝液（D-PBS）10mLで洗浄し、0.25％トリプシン-EDTA消化液2mLを添加し、細胞培養フラスコを37℃でCO2二酸化炭素インキュベーターに置き3〜5分間インキュベートし、次に、2％FBSを含むDMEM細胞完全培地8mLを添加し、細胞を単一細胞に吹き込み、Vi-cellセルカウンターで計数し、NIH/3T3細胞懸濁液を0.375×105/mL細胞まで希釈した。
2）384ウェル細胞培養プレートの周囲に50μLの2％DMEM培地を添加し、残りのウェルに40μLの細胞懸濁液を1ウェルあたり1500個の細胞に加え、顕微鏡下で細胞の均一な分布を観察し、細胞プレートを37℃、5％CO2細胞培養インキュベーター中に置き、インキュベートした。
3）化合物の希釈について、化合物の製造を参照した。
4）化合物の中間プレートにおいて、1ng/mLのTGF-β1を含有する2％ウシ胎仔血清のDMEM培地の混合物を化合物プレートに20μL/ウェルで手動で加えた。
5）化合物の中間プレートを1000rpm/分で10秒間わずかに振盪し、10秒間遠心分離した後、予備品とした。
6）ブラボー（Bravo）液体ワークステーションを使用して、最終体積を50μLにするように、ステップ4および5で混合された液体を1ウェルあたり10μLで接種した細胞プレートに移し、TGF-β1の最終濃度を0.2ng/mLに希釈した。1000回転数/分で10秒間遠心分離を行った。プレートを37℃、5％二酸化炭素の培養インキュベーターに72時間置いた。化合物の最終濃度は、（単位：μM）
【０１６６】
【表２】
2019518066.tif 000060
7）化合物を含む細胞プレートを37℃、5％CO2の細胞培養インキュベーターで3日間培養した。
8）次に、細胞プレートの各ウェルに25μLのATP蛍光活性試験溶液を加え、約1分間穏やかに振とうし、500rpm/minで約30秒間遠心分離し、暗所で10分間静置後、Envision装置でデータを読み取った。
実験結果：表2で示される。
【０１６７】
【表３】
2019518066.tif 000061
結論：本発明の化合物は、優れたNIH3T3細胞の増殖阻害活性を有している。
【０１６８】
実験例3：BioXcell-mPD-L1との併用で、マウス由来直腸癌CT-26細胞皮下移植腫瘍のBALB/cマウスモデルにおける腫瘍細胞の増殖阻害実験
実験設計：
以下の表において、実施例1、陽性参照化合物LY2157299およびBioXcell社PD-L1モノクローナル抗体（BioXcell-mPD-L1）の試験薬物が単独または併用で使用される場合、体内薬効実験における動物群分け案および投与スケジュールが列挙され、詳しいことについて、表3を参照する。
【０１６９】
【表４】
2019518066.tif 000062
実験方法およびステップ：
1）細胞培養
マウス由来結腸癌CT-26細胞をインビトロで単層培養し、培養条件はRPMI1640培地（Roswell Park Memorial Institute 1640培地）に10％ウシ胎仔血清を添加して、37℃、5％CO2での培養であった。トリプシン-EDTAで週2回で通用消化処置し継代を行った。細胞の飽和度が80％〜90％である場合、細胞を収集し、計数し、接種した。
2）腫瘍細胞の接種
0.1mL（1×105）のCT-26細胞を、各BALB/cマウスの右後背部に皮下接種した。2日目から細胞を播種したマウスに対して体重に従って群別に投薬した。
3）腫瘍の測定および実験指標
実験指標は、腫瘍増殖が阻害、遅延、または治癒されているかどうかを調べることである。腫瘍直径を、カリパスで1週間に2回測定した。腫瘍体積を計算する式は、V=0.5a×b2であり、aおよびbはそれぞれ腫瘍の長径および短径を表した。
【０１７０】
化合物の抗腫瘍効果は、TGI（％）または腫瘍増殖率T/C（％）によって評価した。TGI（％）は腫瘍成長阻害率を反映する。TGI（％）の計算：TGI（％）=[（1-（処置群の投与終了時の平均腫瘍体積-処置群の投与開始時の平均腫瘍体積））/（溶媒コントロール群の治療終了時の平均腫瘍体積-溶媒コントロール群の治療開始時の平均腫瘍体積）]×100％。
【０１７１】
腫瘍増殖率T/C（％）：計算式は次のようである。T/C％=T/C×100％（T：治療群;C：陰性コントロール群）。
実験の終了後に腫瘍重量を測定し、T/C重量（パーセンテージ）を計算した。T重量およびC重量は、それぞれ薬物投与群および溶媒コントロール群の腫瘍重量を表した。
4）PK試料採取
投与後20日目に、投与スケジュールに従って投与した。
【０１７２】
12匹のマウスを4つの群に分け、それぞれに最後の投与の0.25、1、1.5、4および8時間後に採血し、それぞれにマウスを0.25、1、4および8時間目に殺させ、腫瘍および肝臓を
収集した。全血を0.5mLのEDTA-2K抗凝固剤チューブに入れ、7000rpm、4℃で10分間遠心分離して血漿を得た。腫瘍組織を10mL冷凍チューブに入れた。血漿および腫瘍組織を速やかに保存用の-80℃冷凍庫に移して保存した。
5）統計分析
各群の各時点を含んで腫瘍体積の平均値および標準誤差（SEM）を統計分析（特定のデータについては表4を参照）。試験終了時の投与後20日目に治療群が最良の治療効果を示したことから、このデータに基づいて統計解析を行い、群間の相違を評価した。2つ群の間に比較するためにT検定を用いた。3つ以上の群間の比較では一元配置分散分析を用いた。F値に有意差がある場合、ゲイムス・ハウエル（Games-Howell）法を使い検定を行った。F値に有意差がない場合、Dunnet（2-sided）法を使い検定した。SPSS17.0ですべてのデータ解析を行った。p<0.05である場合有意差があると考慮された。
実験結果：
1）死亡率、罹患率および体重変化
実験動物の体重を、薬物毒性の間接的測定の基準指標として用いた。このモデルの薬物投与群のいずれも有意な体重減少、無罹患または死亡を示さなかった。
【０１７３】
実施例1、LY2157299およびBioXcell-mPD-L1がCT-26細胞皮下異種移植腫瘍雌性BALB/cマウスモデルの体重に対する影響を図1に示す。データ点は群内の平均体重を表し、誤差棒は標準誤差（SEM）を表した。
2）腫瘍体積
CT-26細胞皮下移植の腫瘍雌性BALB/cマウスモデルに、実施例1、LY2157299およびBioXcell-mPD-L1を投与し治療を行った後の各群の腫瘍体積変化を、表4に示した。
3）腫瘍増殖曲線
実施例1、LY2157299およびBioXcell-mPD-L1の投与後のCT-26移植腫瘍モデルの担癌マウスの腫瘍増殖曲線を図面2に示す。データ点は群内の平均腫瘍体積を表し、誤差棒は標準誤差（SEM）を表した。
【０１７４】
【表５】
2019518066.tif 000063
結論：
この実験は、マウス由来結腸癌CT-26の移植腫瘍モデルにおける実施例1、陽性コントロールLY2157299およびBioXcell-mPD-L1の体内有効性を評価した。投与開始20日後、溶媒コ
ントロール群の担癌マウスの腫瘍体積は2578mm3に達した。実施例1（75mg/kg）とBioXcell-mPD-L1（10mg/kg）との併用群は、溶媒コントロール群と比べて有意な腫瘍阻害効果（T/C=38％、TGI=62.2％、p=0.012）があり、腫瘍体積が975mm3であり;実施例1（75mg/kg）単独群、LY2157299（75mg/kg）単独群、BioXcell-mPD-L1（10mg/kg）単独群、およびLY2157299（75mg/kg）とBioXcell-mPD-L1（10mg/kg）との併用群は、溶媒コントロール群と比較して有意な腫瘍阻害効果を示さなかったが、腫瘍体積はそれぞれに1331、2186、2218および1381mm3（T/C=51％、85％、86％および54％,p=0.071、0.906、0.932および0.089）であった。
【０１７５】
実験例4：マウス由来乳癌4T1細胞BALB/cマウス同所性移植モデルにおける腫瘍細胞転移抑制実験
実験方法：
1）同所性4T1腫瘍モデルの確立：
蛍光標識したマウス乳癌4T1-Luc細胞をインビトロで増殖させた。細胞を回収する前に、マウスをペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射で麻酔し、麻酔したマウスを固定した後、腹部皮膚を70％アルコールで消毒した。マウスの第4腹部乳房脂肪パッドの左側に100μLのリン酸塩緩衝液（0.5×106個の4T1-luc2細胞を含む）を接種し、切開部を縫合し皮膚を消毒した。よみがえる過程中、断熱毛布で動物を保温し、目が覚めるまで動物を観察し、動物は目が覚めた後ケージに戻す。手術前30minおよび手術6時間後、ブプレノルフィンを0.1mg/kg皮下注射し鎮痛を行った。
2）群分け治療案：
モデルを確立した後3日目に、動物に対して赤外データ画像化による生物発光検出を行い、蛍光値に従ってランダムに群分け、以下の実験案に従って投与した（表5参照）。
3）実験エンドポイントの設計：
腫瘍成長および転移に対する実施例1の阻害効果を観察するために、実験終点は、モデルの履歴データを参照して、投与後30〜35日目になるように設計した。実験終了時に、動物を解剖し、同所性腫瘍および各器官組織をそれぞれに取り、腫瘍を秤量し、IVIS蛍光によって各器官の蛍光強度を検出した。同所性腫瘍の増殖阻害は、実験終点における同所性腫瘍の重量と比較することより判断でき、阻害曲線は実験中1週間に2回の腫瘍体積測定データから作成できた。腫瘍転移に対する阻害は、各器官の蛍光検出の有無および相対蛍光強度の分析によって判断した。
【０１７６】
実験の終わりに、腫瘍重量が検出され、相対腫瘍増殖率T/C（％）が計算された。腫瘍体積の計算公式は、V=0.5a×b2であり、aおよびbはそれぞれ、腫瘍の長径および短経路を表した。同時に、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腸および左上肢を剥離し、蛍光が検出され、転移が存在するか否かおよび転移強度、比率が判定された。
【０１７７】
化合物の腫瘍阻害効果は、腫瘍成長阻害率TGI（％）または相対腫瘍増殖率T/C（％）によって評価した。
TGI（％）の計算：
TGI（％）=[（1-(ある処置群の投与終了時の平均腫瘍体積-当該処置群の投与開始時の平均腫瘍体積））/（溶媒コントロール群の治療終了時の平均腫瘍体積-溶媒コントロール群の治療開始時の平均腫瘍体積）]×100％。
【０１７８】
相対腫瘍増殖率T/C（％）の計算：
T/C（％）=Tt（治療群）/Ct（コントロール群）×100％、Ttは特定の測定における平均腫瘍体積であり、Ctは同日のデータを取る。
【０１７９】
実験結果は、一元配置ANOVAを用いて統計的に分析した。F値に有意差がある場合は、ANOVA分析後に多重比較を行うべきである。この実験の全てのデータをSPSS17.0を用いて分
析した。p<0.05である場合、有意差があると考慮された。
【０１８０】
【表６】
2019518066.tif 000064
実験結果：
1）動物体重の変化：
相対的体重変化は、図3に示すように、投与開始時の動物体重に基づいて算出された。データ点は群内の平均体重の変化率を表し、誤差棒は標準誤差（SEM）を表した。
2）実施例1が腫瘍転移率に対する阻害効果：
実験エンドポイントに、各器官組織を剥がし、8分間以内にIVISにより40秒間曝露して蛍光イメージングを測定し、蛍光強度値を記録した。各群について、最大値および最小値を排除した10匹の動物の被測定組織の蛍光イメージング結果を表6に示す。
【０１８１】
【表７】
2019518066.tif 000065
3）実施例1が各臓器における腫瘍転移強度に対する阻害効果：
実験エンドポイントで測定された各群の臓器組織の蛍光強度に基づき、コントロール群を参照として正規化し、各群の臓器組織の相対蛍光強度比を得た。この比値は、対応する臓器における転移強度レベルを反映した。結果を表7に示した。
【０１８２】
【表８】
2019518066.tif 000066
結論：
表におけるデータを比較すると、実施例1は、4T1が肝臓、脾臓、腎臓および腸への転移に対して有意に阻害し、且つ阻害効果が陽性コントロール薬物より有意に優れている。実施例1が腫瘍の転移発生および転移強度に対して、複数の臓器組織で有意な良好な阻害効果を示し、この実験で使用された陽性コントロール薬物よりも有意に優れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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