(57)【要約】  本開示は、E3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させるための化合物、及び縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する対象における疾患又は障害を処置する方法に関する。一部の実施形態においては、本開示は、式(I)の化合物もしくは式(II)の化合物、又はその薬学的に許容される塩を提供する。2019525929.tif 000069【選択図】なし
2019525929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I:
【化１】
2019525929.tif 000059
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH又はOであり、
Bは、CH又はNであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Wは、C又はNであり、
Xは、C又はNであり、
Yは、C又はNであり、
Zは、C又はNであり、
R1は、H、C1-4アルキル、フェニル、又はhetAr1であり、
R2は、Hであり、
R3は、Hであり、
又はR2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R7は、Hであり、
又は任意選択で、nが0である場合、R1及びR7は、それらが結合している原子と一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4は、H、C1-4アルキル、ハロゲン、CF3、又はフェニルであり、
R5は、H、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、任意選択でハロゲンによって置換されているフェニル、(C1-3アルキル)O(C4-6シクロアルキル)、O(C1-4アルキル)(C4-6シクロアルキル)、S(C1-4アルキル)、S(C4-6シクロアルキル)、(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)、hetAr1、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)であり、
R6は、H又はC1-4アルキルであり、
hetAr1は、任意選択でC1-4アルキルによって置換されている、1〜3個の環窒素原子を有する6員ヘテロアリール環であり、
hetCyc1は、少なくとも1個の、窒素である環ヘテロ原子を有する6〜10員二環式環であり、環のうちの少なくとも一方が芳香族であり、
mは、0又は1であり、
nは、0又は1であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよい]。
【請求項２】
Aが、CHである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
BがCHである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
BがNである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項５】
AがOであり、BがNである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Dが、Cである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
DがNである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
EがCHである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
EがNである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
WがNである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
WがCである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
XがCである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
YがCである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
YがNである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
ZがNである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
ZがCである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
R1がHである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
R1が、C1-4アルキル又はhetAr1である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
R1が、メチル、イソプロピル、フェニル、又はピリジンである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２０】
R4が、Hである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
R4が、Cl、CF3、メチル、又はフェニルである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２２】
R5が、H又は任意選択でハロゲンによって置換されているフェニルである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２３】
R5が、Fによって置換されているフェニルである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
R5が、(C1-3アルキル)O(C4-6シクロアルキル)、O(C1-4アルキル)(C4-6シクロアルキル)、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
C4-6シクロアルキルが、シクロペンチル又はシクロヘキシルである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
R5が、(C1-3アルキル)O(シクロペンチル)又はO(C1-4アルキル)(C4-6シクロヘキシル)である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
R5が、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、又は(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２８】
hetCyc1が、1個以上の窒素原子を有する9員二環式環である、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
hetCyc1が、イソインドリンである、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
R5が、S(C1-4アルキル)又はS(C4-6シクロアルキル)である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
C4-6シクロアルキルが、シクロペンチル又はシクロヘキシルである、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
R5が、hetAr1である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３３】
hetAr1が、任意選択でC1-4アルキルによって置換されている、ピリジン又はピリミジンである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
R6がHである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３５】
nが0である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３６】
mが1である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
pが0である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
pが1である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３９】
式Iの化合物が、
【化２】
2019525929.tif 000060
2019525929.tif 000061
2019525929.tif 000062
2019525929.tif 000063
又はその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４０】
式II:
【化３】
2019525929.tif 000064
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH、N、又はSであり、
Bは、CH、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Lは、C1-3アルキレン又はC(=O)であり、
Wは、CH、CH2、N、又はNRaであり、
Xは、CH、CH2、N、又はNRbであり、
Yは、CH、CH2又はOであり、
Zは、N又はCR2'であり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R2は、存在しないか又はC1-6アルキレンであり、
R2'は、H又はC1-6アルキルであり、
又はZがCR2'である場合、R2及びR2'は、Cと一緒になって、まとめてC1-6複素環を形成してもよく、
R3は、H、ハロゲン、C1-3アルキル、C3-6シクロアルキル、又はC1-3アルコキシであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
Raは、H又はC1-3アルキルであり、
RbはC1-3アルキルであり、
mは、0、1、又は2であり、
nは、1又は2であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよいが、
ただし、nが2であり、R1がメチルであり、DがCであり、R3がHであり、A、B、及びEがすべてCHである場合、W、X、及びYのうちの少なくとも1つがCH2ではないことを条件とする]。
【請求項４１】
AがCHである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
AがNである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４３】
AがSである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４４】
BがCHである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４５】
Bが、N、O、又はSである、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４６】
DがCである、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４７】
EがCHである、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４８】
EがNである、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４９】
Lが、C1-3アルキレンである、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５０】
Lが、メチレンである、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５１】
WがCH2である、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５２】
WがNである、請求項４０〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５３】
XがCH2である、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５４】
XがCHである、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５５】
XがNRbである、請求項４０〜５２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５６】
Rbが、メチルである、請求項５５に記載の化合物。
【請求項５７】
YがCH2である、請求項４０〜５６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５８】
YがCHである、請求項４０〜５６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５９】
ZがNである、請求項４０〜５８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６０】
R2が存在しない、請求項４０〜５９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６１】
ZがCR2’である、請求項４０〜５８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６２】
R2及びR2'が、Cと一緒になって、1個の窒素原子を有する5員複素環を形成する、請求項６１に記載の化合物。
【請求項６３】
R1が、Hである、請求項４０〜６２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６４】
R1がメチルである、請求項４０〜６２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６５】
Raが、H又はメチルである、請求項４０〜６４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６６】
Rbがメチルである、請求項４０〜６５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６７】
R3が、H、ハロゲン、又はC3-6シクロアルキルである、請求項４０〜６６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６８】
R3が、塩素である、請求項６７に記載の化合物。
【請求項６９】
R3が、シクロプロピルである、請求項６７に記載の化合物。
【請求項７０】
R4及びR4'が、それぞれHである、請求項４０〜６９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７１】
R4及びR4'が、それぞれメチルである、請求項４０〜６９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７２】
nが1である、請求項４０〜７１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７３】
nが2である、請求項４０〜７２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７４】
mが、1又は2である、請求項４０〜７３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７５】
pが0である、請求項４０〜７４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７６】
pが1である、請求項４０〜７４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７７】
式IIの化合物が、
【化４】
2019525929.tif 000065
2019525929.tif 000066
又はその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される、請求項４０〜７６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７８】
式IIの化合物が、式IIa:
【化５】
2019525929.tif 000067
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH又はNであり、
Bは、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Wは、CH2又はNRaであり、
Xは、CH、CH2、N、又はNRbであり、
Yは、CH、CH2又はOであり、
Lは、C1-3アルキレン又はC(=O)であり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R3は、C1-3アルキル又はC1-3アルコキシであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
Raは、H又はC1-3アルキルであり、
Rbは、C1-3アルキルであり、
nは、1又は2であり、
mは、0、1、又は2であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよい]
である、請求項４０に記載の化合物。
【請求項７９】
式IIの化合物が、式IIb:
【化６】
2019525929.tif 000068
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
R1は、C1-3アルキルであり、
R5は、(C1-3アルキル)フェニルである]
である、請求項４０に記載の化合物。
【請求項８０】
請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項８１】
対象におけるE3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させる方法であって、治療有効量の、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【請求項８２】
E3ユビキチンリガーゼが、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
酵素活性が、ミトコンドリアストレス中に活性化又は増進される、請求項８１又は８２に記載の方法。
【請求項８４】
化合物が、ミトコンドリア品質管理を刺激する、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
化合物が、リガーゼの自己阻害に干渉する、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
対象が、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
酵素活性が、疾患、老化、又は加齢性障害に起因して縮小されている、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
疾患又は障害が、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、早老性障害、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
疾患又は障害が、パーキンソン病である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
疾患又は障害が、がんである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
がんが、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
対象における縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、方法。
【請求項９３】
E3ユビキチンリガーゼが、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
疾患又は障害が、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、早老性障害、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される、請求項９２又は９３に記載の方法。
【請求項９５】
疾患又は障害が、パーキンソン病である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
疾患又は障害が、がんである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
がんが、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
対象における疾患又は障害を処置する方法であって、
(a)縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を検出すること、及び
(b)治療有効量の、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項９９】
E3ユビキチンリガーゼが、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
疾患又は障害が、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される、請求項９８又は９９に記載の方法。
【請求項１０１】
疾患又は障害が、パーキンソン病である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
疾患又は障害が、がんである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
がんが、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
対象におけるパーキンソン病を処置する方法であって、
(a)対象におけるパーキンソン病を検出すること、及び
(b)治療有効量の、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項１０５】
対象における加齢性障害を処置する方法であって、
(a)対象における加齢性障害を検出すること、及び
(b)治療有効量の、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項１０６】
対象におけるがんを処置する方法であって、
(a)対象におけるがんを検出すること、及び
(b)治療有効量の、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法。
【請求項１０７】
がんが、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
細胞におけるE3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させる方法であって、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を細胞と接触させることを含む、方法。
【請求項１０９】
E3ユビキチンリガーゼが、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
酵素活性が、ミトコンドリアストレス中に活性化される、請求項１０８又は１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
化合物が、ミトコンドリア品質管理を刺激する、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
化合物が、リガーゼの自己阻害に干渉する、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
細胞が、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
接触させることが、インビトロである、請求項１０８〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、E3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させるための化合物、及び縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する対象における疾患又は障害を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幅広い保護作用を有するE3ユビキチンリガーゼの酵素活性及びミトコンドリア品質管理は、パーキンソン病等のある特定の疾患又は障害を患っている患者において喪失又は減少していることが多く、老化していく間や、他の加齢性ヒト障害において縮小される。結果として、機能障害性のミトコンドリアが蓄積し、最終的には細胞死がもたらされる。
【０００３】
ミトコンドリアキナーゼであるPINK1及びサイトゾルのE3ユビキチンリガーゼであるParkinは、一緒に、オートファジー(マイトファジー)による損傷ミトコンドリアの選択的分解を媒介する(非特許文献１及び２)。このきわめて重要なミトコンドリア品質管理経路によって、細胞は、有害な損傷ミトコンドリアの蓄積から保護される。すべての細胞がミトコンドリア損傷によって影響を受けるものの、ニューロン及び筋肉細胞のようなエネルギーを必要とする細胞は、ミトコンドリア品質管理の不全に対して特に脆弱である。PINK1及びParkinの機能喪失型変異は、ミトコンドリア品質管理を抑止し、早期発症劣性遺伝性パーキンソン病(PD)と関連付けられる(非特許文献３及び４)。加えて、Parkinの不活性化については、孤発性の晩期発症PDにおいても報告されている(非特許文献５〜８)。しかしながら、PINK1及びParkinは、すべての多細胞真核生物において保存されており、すべての組織/細胞にまたがって広く発現されている。すべての細胞におけるミトコンドリアの存在、及びそのようなストレス誘発性の品質管理経路の必要性を考慮すると、マイトファジーを通じた選択的クリアランスは、PDだけでなく広範囲にわたる関連性を伴う、基礎的な細胞保護的メカニズムであると思われる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Narendraら、(2008年)、J. Cell Biol.、183巻:795〜803頁
【非特許文献２】Geislerら、(2010年)、Nat. Cell Biol.、12巻:119〜131頁
【非特許文献３】Kitadaら、(1998年)、Nature、392巻:605〜608頁
【非特許文献４】Valenteら、(2004年)、Science、304巻:1158〜1160頁
【非特許文献５】Dawsonら、(2014年)、Neurodegener. Dis.、13巻:69〜71頁
【非特許文献６】LaVoieら、(2005年)、Nat. Med.、11巻:1214〜1221頁
【非特許文献７】LaVoieら、(2007年)、J. Neurochem.、103巻:2354〜2368頁
【非特許文献８】Wongら、(2007年)、J. Biol. Chem.、282巻:12310〜12318頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、Parkinの活性化は、広範囲のヒト疾患及び老化に対する、潜在的に有益でありかつ幅広く応用可能な新しい療法として認識されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の、前述及び他の態様及び実施形態は、以下の発明を実施するための形態及び特許請求の範囲を参照することによって、より完全に理解することができる。
【０００７】
本出願は、式I:
【０００８】
【化１】
2019525929.tif 000003
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH又はOであり、
Bは、CH又はNであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Wは、C又はNであり、
Xは、C又はNであり、
Yは、C又はNであり、
Zは、C又はNであり、
R1は、H、C1-4アルキル、フェニル、又はhetAr1であり、
R2はHであり、
R3はHであり、
又はR2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R7はHであり、
又は任意選択で、nが0である場合、R1及びR7は、それらが結合している原子と一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4は、H、C1-4アルキル、ハロゲン、CF3、又はフェニルであり、
R5は、H、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、任意選択でハロゲンによって置換されているフェニル、(C1-3アルキル)O(C4-6シクロアルキル)、O(C1-4アルキル)(C4-6シクロアルキル)、S(C1-4アルキル)、S(C4-6シクロアルキル)、(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)、hetAr1、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)であり、
R6は、H又はC1-4アルキルであり、
hetAr1は、任意選択でC1-4アルキルによって置換されている、1〜3個の環窒素原子を有する6員ヘテロアリール環であり、
hetCyc1は、少なくとも1個の、窒素である環ヘテロ原子を有する6〜10員二環式環であり、環のうちの少なくとも一方が芳香族であり、
mは、0又は1であり、
nは、0又は1であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよい]
を提供する。
【０００９】
一部の実施形態においては、AはCHである。
【００１０】
一部の実施形態においては、BはCHである。一部の実施形態においては、BはNである。
【００１１】
一部の実施形態においては、AはOであり、BはNである。
【００１２】
一部の実施形態においては、DはCである。一部の実施形態においては、DはNである。
【００１３】
一部の実施形態においては、EはCHである。一部の実施形態においては、EはNである。
【００１４】
一部の実施形態においては、WはNである。一部の実施形態においては、WはCである。
【００１５】
一部の実施形態においては、XはCである
【００１６】
一部の実施形態においては、YはCである。一部の実施形態においては、YはNである。
【００１７】
一部の実施形態においては、ZはNである。一部の実施形態においては、ZはCである。
【００１８】
一部の実施形態においては、R1はHである。一部の実施形態においては、R1は、C1-4アルキル又はhetAr1である。一部の実施形態においては、R1は、メチル、イソプロピル、又はピリジンである。
【００１９】
一部の実施形態においては、R4はHである。一部の実施形態においては、R4は、Cl、CF3、メチル、又はフェニルである。
【００２０】
一部の実施形態においては、R5は、H又は任意選択でハロゲンによって置換されているフェニルである。一部の実施形態においては、R5は、(C1-3アルキル)O(C4-6シクロアルキル)、O(C1-4アルキル)(C4-6シクロアルキル)、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)である。一部の実施形態においては、C4-6シクロアルキルは、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。一部の実施形態においては、R5は、(C1-3アルキル)O(シクロペンチル)又はO(C1-4アルキル)(C4-6シクロヘキシル)である。一部の実施形態においては、R5は、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、又は(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)である。一部の実施形態においては、hetCyc1は、1個以上の窒素原子を有する9員二環式環である。一部の実施形態においては、hetCyc1は、イソインドリンである。一部の実施形態においては、R5は、S(C1-4アルキル)又はS(C4-6シクロアルキル)である。一部の実施形態においては、C4-6シクロアルキルは、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。一部の実施形態においては、R5は、Fによって置換されているフェニルである。一部の実施形態においては、R5はhetAr1である。一部の実施形態においては、hetAr1は、任意選択でC1-4アルキルによって置換されている、ピリジン又はピリミジンである。
【００２１】
一部の実施形態においては、R6はHである。
【００２２】
一部の実施形態においては、mは1である。
【００２３】
一部の実施形態においては、nは0である。
【００２４】
一部の実施形態においては、pは0である。一部の実施形態においては、pは1である。
【００２５】
一部の実施形態においては、式Iの化合物は、
【００２６】
【化２】
2019525929.tif 000004
2019525929.tif 000005
2019525929.tif 000006
2019525929.tif 000007
又はその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される。
【００２７】
本出願はさらに、式II:
【００２８】
【化３】
2019525929.tif 000008
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH、N、又はSであり、
Bは、CH、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Lは、C1-3アルキレン又はC(=O)であり、
Wは、CH、CH2、N、又はNRaであり、
Xは、CH、CH2、N、又はNRbであり、
Yは、CH、CH2又はOであり、
Zは、N又はCR2'であり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R2は、存在しないか又はC1-6アルキレンであり、
R2'は、H又はC1-6アルキルであり、
又はZがCR2'である場合、R2及びR2'は、Cと一緒になって、まとめてC1-6複素環を形成してもよく、
R3は、H、ハロゲン、C1-3アルキル、C3-6シクロアルキル、又はC1-3アルコキシであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
Raは、H又はC1-3アルキルであり、
RbはC1-3アルキルであり、
nは、1又は2であり、
mは、0、1、又は2であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよいが、
ただし、nが2であり、R1がメチルであり、DがCであり、R3がHであり、A、B、及びEがすべてCHである場合、W、X、及びYのうちの少なくとも1つがCH2ではないことを条件とする]
を提供する。
【００２９】
一部の実施形態においては、AはCHである。一部の実施形態においては、AはNである。一部の実施形態においては、AはSである。
【００３０】
一部の実施形態においては、BはCHである。一部の実施形態においては、Bは、N、O、又はSである。
【００３１】
一部の実施形態においては、DはCである。
【００３２】
一部の実施形態においては、EはCHである。一部の実施形態においては、EはNである。
【００３３】
一部の実施形態においては、LはC1-3アルキレンである。一部の実施形態においては、Lはメチレンである。
【００３４】
一部の実施形態においては、WはCH2である。一部の実施形態においては、WはNである。
【００３５】
一部の実施形態においては、XはCH2である。一部の実施形態においては、XはCHである。一部の実施形態においては、XはNRbである。一部の実施形態においては、Rbはメチルである。
【００３６】
一部の実施形態においては、YはCH2である。一部の実施形態においては、YはCHである。
【００３７】
一部の実施形態においては、ZはNである。
【００３８】
一部の実施形態においては、R2は存在しない。
【００３９】
一部の実施形態においては、ZはCR2'である。一部の実施形態においては、R2及びR2'は、Cと一緒になって、1個の窒素原子を有する5員複素環を形成する。
【００４０】
一部の実施形態においては、R1はHである。一部の実施形態においては、R1はメチルである。
【００４１】
一部の実施形態においては、Raは、H又はメチルである。
【００４２】
一部の実施形態においては、Rbはメチルである。
【００４３】
一部の実施形態においては、R3は、H、ハロゲン、又はC3-6シクロアルキルである。一部の実施形態においては、R3は塩素である。一部の実施形態においては、R3はシクロプロピルである。
【００４４】
一部の実施形態においては、R4及びR4'は、それぞれHである。一部の実施形態においては、R4及びR4'は、それぞれメチルである。
【００４５】
一部の実施形態においては、nは2である。一部の実施形態においては、nは1である。
【００４６】
一部の実施形態においては、mは、1又は2である。
【００４７】
一部の実施形態においては、pは0である。一部の実施形態においては、pは1である。
【００４８】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、
【００４９】
【化４】
2019525929.tif 000009
2019525929.tif 000010
又はその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される。
【００５０】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、式IIa:
【００５１】
【化５】
2019525929.tif 000011
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH又はNであり、
Bは、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Wは、CH2、NRaであり、
Xは、CH、CH2、N、又はNRbであり、
Yは、CH、CH2又はOであり、
Lは、C1-3アルキレン又はC(=O)であり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R3は、C1-3アルキル又はC1-3アルコキシであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
Raは、H又はC1-3アルキルであり、
Rbは、C1-3アルキルであり、
nは、1又は2であり、
mは、0、1、又は2であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよい]
である。
【００５２】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、式IIb:
【００５３】
【化６】
2019525929.tif 000012
の化合物又はその薬学的に許容される塩[式中、
R1は、C1-3アルキルであり、
R5は、(C1-3アルキル)フェニルである]
である。
【００５４】
本出願はさらに、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩、及び少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００５５】
本出願はさらに、対象におけるE3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させる方法であって、治療有効量の、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００５６】
一部の実施形態においては、E3ユビキチンリガーゼは、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される。
【００５７】
一部の実施形態においては、酵素活性は、ミトコンドリアストレス中に活性化又は増進される。
【００５８】
一部の実施形態においては、化合物は、ミトコンドリア品質管理を刺激する。
【００５９】
一部の実施形態においては、化合物は、リガーゼの自己阻害に干渉する。
【００６０】
一部の実施形態においては、対象は、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する。一部の実施形態においては、酵素活性は、疾患、老化、又は加齢性障害に起因して縮小されている。
【００６１】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、早老性障害、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される。
【００６２】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病である。
【００６３】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、がんである。一部の実施形態においては、がんは、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される。
【００６４】
本出願はさらに、対象における縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を処置する方法であって、治療有効量の、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００６５】
一部の実施形態においては、E3ユビキチンリガーゼは、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される。
【００６６】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、早老性障害、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される。
【００６７】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病である。
【００６８】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、がんである。一部の実施形態においては、がんは、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される。
【００６９】
本出願はさらに、対象における疾患又は障害を処置する方法であって、
(a)縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００７０】
一部の実施形態においては、E3ユビキチンリガーゼは、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される。
【００７１】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される。
【００７２】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病である。
【００７３】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、がんである。一部の実施形態においては、がんは、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される。
【００７４】
本出願はさらに、対象におけるパーキンソン病を処置する方法であって、
(a)対象におけるパーキンソン病を検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００７５】
本出願はさらに、対象における加齢性障害を処置する方法であって、
(a)対象における加齢性障害を検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００７６】
本出願はさらに、対象におけるがんを処置する方法であって、
(a)対象におけるがんを検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む、方法を提供する。
【００７７】
一部の実施形態においては、がんは、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんからなる群から選択される。
【００７８】
本出願はさらに、細胞におけるE3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させる方法であって、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩を細胞と接触させることを含む、方法を提供する。
【００７９】
一部の実施形態においては、E3ユビキチンリガーゼは、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2からなる群から選択される。
【００８０】
一部の実施形態においては、酵素活性は、ミトコンドリアストレス中に活性化される。
【００８１】
一部の実施形態においては、化合物は、ミトコンドリア品質管理を刺激する。
【００８２】
一部の実施形態においては、化合物は、リガーゼの自己阻害に干渉する。
【００８３】
一部の実施形態においては、細胞は、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する。
【００８４】
一部の実施形態においては、接触させることは、インビトロである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)-Parkin移行のハイコンテントイメージング(HCI)による一次スクリーニングアッセイの結果を示す図である。図1Aは、GFP-Parkinを安定に発現するHeLa細胞を使用したHCIアッセイの結果を示す。GFP-Parkinは、非ストレス細胞中の細胞全体にわたって局在化するが、ミトコンドリア膜電位が損なわれ、Parkinが活性化している場合、ミトコンドリアに移行する。固定細胞の自動画像取得後、各細胞の目的の領域を、分析ソフトウェアを用いて画定した。アッセイには、核色素であるHoechstの補助により作られた核マスク及び細胞質マスクをもたらす「RING - 2出力(two output)」アルゴリズムを使用した。GFP-Parkinのミトコンドリアへの再局在化を定量化するために、細胞質及び核におけるGFP強度比を計算した。非ストレス条件下で、この比は約1である。図1Bは、0.5〜0.8のZ因子(Z')でのアッセイの結果を示す棒グラフであり、これはスクリーニングアッセイとしてのそのロバスト性及び有用性を示している。アッセイの検証を、PINK1 siRNAを使用することによって実施している。
【図２−１】CCCPタイトレーションを用いた一次HCIアッセイを示す図である。図2Aは、EGFP-Parkin移行の一次HCIアッセイの図解である。GFP-Parkinを安定に発現するHeLa細胞を、1ウェル当たり1350個の細胞(1ウェル当たり25μL)で384ウェルプレートに播種した。細胞を終夜付着させた後、薬物を3連で25μLの体積、2×濃縮で添加した。2時間後、試験化合物を含有するすべてのウェル及び陰性対照ウェルに、50μLの2×低用量CCCP(3.5μM CCCPの最終濃度となる)を添加した。陽性対照ウェルについては、CCCPを10μMの最終濃度で添加した。CCCPとの2時間のインキュベーション後、細胞を固定し、Hoechstで少なくとも1時間標識した後、細胞を画像化した。図2Bは、CCCPタイトレーションの例を示す。図2Cは、典型的な薬物スクリーニングプレートの結果を示す。値は、陰性及び陽性対照値に対して標準化し、%活性としてプロットした。Z'を、品質管理のために計算した。陽性対照を緑色で、陰性対照ウェルを赤色で示した。50%を超える活性をもたらす薬物を有効(青色)とみなす。
【図２−２】図２−１の続きである。
【図３】化合物1(図3B)、2(図3C)、3(図3D)、4(図3E)及び31(図3A)の用量応答曲線(DRC)を示すグラフであり、これらは1μMで活性を示した。グラフは、損傷ミトコンドリアへのEGFP-Parkin移行のDRCを示す。細胞を、384ウェルプレート中、12の異なる薬物濃度を用いて3連で処理した。%活性を、対数スケールの濃度[M]に対してプロットしている。曲線適合及びEC50値計算は、Graph Pad Prismソフトウェアを用いて行った。すべてのEC50は、上側ナノモル範囲である。
【図４】pS65-Ub抗体を用いた化合物1(図4B)、2(図4C)、3(図4D)、4(図4E)及び31(図4A)の標準化DRCを示すグラフである(EGFP-Parkin移行対pS65-UBレベル対細胞死)。細胞の数を四角で示す。pS65-Ubの曲線適合を丸で示す。移行の曲線適合を三角で示す。細胞死を1ウェル当たりの細胞の数を計算することによって制御した。さらに、同じプレートをpS65-Ub抗体で染色した。Parkin移行の標準化DRCの重ね合わせ及びpS65-Ubシグナルは、すべての試験化合物について同様の値を示した。
【図５】化合物1、2、3、4及び31での前処理によるFLAG-Parkin C431S(WB)のUbチャージングの増強を示す図である。Parkin活性の別の尺度は、ParkinのUbチャージングである。Parkinは、E2酵素からUbを受けてそれを基質タンパク質に移行させる。Ubは、不安定なチオエステル結合においてParkin C431によって結合する。このアミノ酸(C431S)のセリン置換により、安定なオキシエステル結合がもたらされる。次いで、結合Ubは、ウェスタンブロット実験においてバンドシフトとして視覚化することができる。HeLa 3×FLAG-Parkin C431S細胞を、12ウェルプレートに播種し、終夜付着させた。細胞を、5μM(上パネル)又は1μM(下パネル)の化合物1、2、3、4及び31で2時間処理した後、CCCPをさらに2時間添加した。10μM CCCPを陽性対照(PC)ウェルに添加し、一方、他のすべてのサンプルには3.5μMの低用量濃度を与えた。細胞を沸騰する熱SDS溶解緩衝液中で収穫し、タンパク質濃度をBCAによって決定した。サンプルを分割し、未処理のままにするか、又は示すようにNaOHで処理した。サンプルを8〜16%トリス-グリシンゲル上に流し、膜上にブロッティングし、Flag及びpS65-Ubに対する抗体で調べた。GAPDHを、ローディング対照として用いた。バンドシフトにより、ユビキチンへのParkin結合が示されているが、これはNaOHにより切断可能である。
【図６】化合物1、2、3、4及び31での前処理によるFLAG-Parkin C431SのUbチャージングの増強(MSDアッセイ)を示すグラフである。Parkinのユビキチンチャージングを、電気化学発光を使用するELISA様MesoScale Discoveryアッセイによってモニタリングした。プレートをFlag抗体でコーティングし、5μMの化合物1、2、3、4及び31又はDMSO(左、-)で2時間前処理した3×FLAG-Parkin C431S細胞由来のライセートとインキュベートした後、これらを低用量(3.5μM)CCCPあり(+)又はなし(-)でさらに2時間インキュベートした。陽性対照(PC)細胞を、10μM CCCPで処理した。洗浄後、pS65-Ub抗体を、硫黄タグ付抗ラビット抗体とともに添加した。値を、PC(10μM CCCP)及び陰性対照(-)に対して標準化した。統計分析を、Tukey事後検定による一元ANOVAによって実施した。****はp<0.0001である。
【図７】化合物1、2、3、4及び31での前処理によるユビキチン化の増強及びParkin基質の分解を示す図である。非タグ付Parkinを安定に発現するHeLa細胞を未処理のまま又は5μMの化合物1、2、3、4及び31で2時間前処理し、低用量CCCP(3.5μM CCCP)あり(+)又はなし(-)で処理した。陽性対照(PC)として、一部の細胞を、10μM CCCPで処理した。ライセートを8〜16%トリス-グリシンゲル上にローディングし、膜上にブロッティングし、Parkin基質に対する抗体で調べた。低用量CCCP処理単独は、基質分解をもたらさず、化合物1、2、3、4及び31で前処理した細胞は、陽性対照細胞と同様に、基質レベルの低減を示した。
【図８】化合物1、2、3、4及び31での前処理によるpS65-Ubシグナルの増幅の増強を示す図である。非タグ付Parkinを安定に発現するHeLa細胞を未処理のまま又は5μMの化合物1、2、3、4及び31で2時間前処理し、低用量CCCP(3.5μM CCCP)あり(+)又はなし(-)で処理した。陽性対照(PC)を、10μM CCCPで2時間処理した。ライセートを8〜16%トリス-グリシンゲル上にローディングし、膜上にブロッティングしpS65-Ubに対する抗体で調べた。低用量CCCP処理単独は、pS65-Ub蓄積をもたらさず、化合物1、2、3、4及び31で処理した細胞は、陽性対照に対して、pS65-Ubの頑強な誘導を示した。
【図９−１】ミトコンドリア損傷の存在下における化合物4での前処理によるマイトファジー流動の増強を示すグラフである。384ウェルプレート中HCIを使用して、酸性対中性mtKeima比を計算した。10μM CCCPで処理すると、mtKeima比の有意な増加があった。化合物4での前処理(破線、ここでは5μMの化合物4を示す)は、低用量CCCP濃度でもこれを誘導した一方、低用量CCCP単独(実線)は、酸性対中性mtKeima比に対してわずかな効果しか有さなかった。
【図９−２】図９−１の続きである。
【図１０】マイトファジーアッセイにおける化合物1、2、3、4及び31のDRCを示すグラフである。HeLa mtKeima細胞を、異なる用量の化合物1、2、3、4及び31で2時間前処理した後、低用量CCCPを添加した(3μM最終濃度)。10μM CCCPを、陽性対照ウェルに添加した。細胞を、CCCPの4時間及び8時間後、生で画像化した。値を、各時点について、陽性及び陰性(3μM CCCP)対照値に対して標準化した。曲線適合を使用して、EC50値を計算した。
【図１１】化合物1、2、3、4及び31での処理によるミトコンドリア膜電位の品質管理(JC-10アッセイ)を示すグラフである。ミトコンドリア膜電位を減衰させる化合物を除外するために、JC-10アッセイを使用した。HeLa細胞を、384ウェルプレートにプレーティングし、示すように異なる用量のCCCP又は5μMの化合物1、2、3、4及び31で2時間処理した。JC-10色素を生細胞に添加した。細胞は45分間染色する。次いで、プレートを、蛍光プレートリーダーを用いて測定した。JC-10は、ミトコンドリア膜電位の存在下において赤色蛍光を放出するミトコンドリア色素である。蛍光は、ミトコンドリア膜電位の非存在下において緑色に変化する。化合物1、2、3及び4は、JC-10に対する効果を示さなかった一方、化合物31は、DMSO対照と比較して、ミトコンドリア脱分極を有意に増加させた。3回の独立した実験の平均値を示す。統計分析を、Tukey事後検定による一元ANOVAによって実施した。***はp<0.0005である。
【図１２】化合物1〜6、8、20及び31のパラメータの概要を示す表である。この表は、一次アッセイスクリーニング(ミトコンドリアへのParkin移行)において評価した、20種のPACのケモインフォマティクス特性及びインビトロ毒性パラメータを、それらの分子量及びそれらのEC50値とともにまとめる。リピンスキーのルールオブファイブのうち違反を示さない化合物は、CNS測定基準に対してニュートラルである又はインシリコ毒性懸念の低い良好なCNS浸透度、並びにCNS機能を改善する優れたMW、PSA、logP及びCaco-2すら予測される。
【図１３】異なるCCCP用量に応答した、標準化EGFP-Parkin移行[%]を示すグラフである。
【図１４】384ウェルプレートに播種し、陰性対照として3.5μM CCCP及び陽性対照について10μM CCCPで処理したHeLa EGFP-Parkin細胞を示すグラフである。細胞を化合物1、2、3、4又は31で2時間前処理した後、低用量CCCPを添加するか、又は化合物及びCCCPを同時に添加した。細胞を固定し、Parkin移行のためにHCIで分析した。5種すべての化合物について、両方の実験レジメンで同様のEC50値がもたらされた。
【図１５−１】一次線維芽細胞、ニューロン細胞及びインビトロにおけるParkin活性化を示す図である。陽性対照(PC)細胞は、DMSO及び10μM CCCPで処理した。陰性対照(NC)細胞は、3.5μM CCCPで処理し、一部の細胞は、未処理(-)のままとした。図15A:5μMの化合物4で2時間処理した後、異なる濃度のCCCPを添加したヒト線維芽細胞のウェスタンブロットにより、マイトフュージンのユビキチン化/分解の増加及びpSer65-Ubシグナルの増幅が示される。ビンキュリンを、ローディング対照として使用した。図15B:5μMの化合物1、2、3、4及び31の後低用量CCCP(3.5μM)で前処理した線維芽細胞のウェスタンブロットにより、基質MFN1/2の分解の増強及びpSer65-Ubレベルの増加が示される。図15C:ヒト線維芽細胞を、ニューロンに直接変換し、図15Bに示す通りに処理した。ウェスタンブロットにより、PCと同様に、化合物処理により変性MFN1及びpSer65-Ubが誘導され、NC細胞では誘導されないことが示される。ベータIIIチューブリンにより、線維芽細胞のiニューロンへの変換の成功を確認した。図15D:ラットPC12細胞を図15Aにおける通りに処理した。ウェスタンブロットにより、PCと同様のMFN2及びTOM70のユビキチン化の増強、並びに頑強なpSer65-Ub誘導が示されるが、NC細胞では示されない。図15E:インビトロE2排出アッセイ。組換えParkinを、化合物4又は対照としてDMSOとプレインキュベートし、UbローディングUbcH7に混合した。FLAG-ユビキチン及びUbcH7ウェスタンブロットは、いずれも、化合物4の存在下においてわずかに多いE2排出を示す。対照反応をPINK1又はParkinなしで実施した。図15F:Parkinを含まない未処理又はCCCP処理HeLa細胞由来の単離ミトコンドリアを用いたインビトロアッセイ。ミトコンドリア調製物を、組換えParkin、E1、UbcH7、ATP及び化合物4又は対照としてDMSOのいずれかと混合し、示した時間インキュベートした。MFN1ウェスタンブロットにより、化合物4が存在する場合、ユビキチン化が増加することが示される。対照サンプルを、Parkinを含まない反応ミックス中でインキュベートした。図15G:タンパク質溶融を、SYPROオレンジ及び対照としてDMSO又は500nM化合物4と混合した50ng精製Parkinを用いて実施した。3連の反応の分析により、3℃の温度シフトが明らかになった。図15H:図15Gにおいて実施される通りの3回の独立した実験の統計分析。平均値+/- SD(対応のない両側t検定、*** p<0.0005)で示す。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１５−３】図１５−２の続きである。
【図１５−４】図１５−３の続きである。
【図１６−１】初代及びニューロン細胞における効果を示す図である。図16A:図15Aに記載される通りに処理したヒト線維芽細胞において実施した6回の独立した実験からの、サンドイッチELISAを使用したpSer65-Ubシグナルの定量化。平均-/+ SDで示す。Tukey事後検定による一元ANOVA(*** p<0.0005)。図16B:ヒト一次線維芽細胞を、異なる濃度の5種すべての化合物(1、2、3、4及び31)で2時間処理した。化合物処理単独(すなわち、CCCPの非存在下)では、MFN1ユビキチン化又はpSer65-Ubシグナルは誘導されなかった。異なるCCCP濃度を陽性対照として使用した。図16C:ラットPC12細胞を、5μMの化合物で2時間前処理し、次いで、低用量のCCCP(3.5μM)で処理した。対照細胞は、DMSO及び10μM CCCP(PC)又は3.5μM(NC)のいずれかで処理した。一部の細胞にはCCCPを与えなかった(-)。ウェスタンブロットにより、ユビキチン化(灰色の矢じり)及び/又は未変性(黒色の矢じり)MFN1/2及びTOM70の減少が示される。PINK1/Parkin生成物であるpSer65-Ubが、低用量処理した5種すべての化合物によって及び陽性対照において誘導された。図16D:PC12細胞を、NGFでの処理によって分化させた(NGF+)。一部の細胞は、未分化のままであった(NGF-)。細胞を、示すように5μMの化合物又はDMSOで処理した。2時間後、低用量CCCP(3.5μM)を、試験化合物で処理した細胞に添加した。DMSO対照を、3.5μM CCCP(NC)又は10μM CCCP(PC)のいずれかで処理した。一部の細胞は、CCCPで処理しなかった(-)。MFN1に対する抗体で調べたウェスタンブロットにより、化合物で処理した細胞及び陽性対照における分解が示される。いくつかの分解が、陰性対照においても観察することができる。PINK1/Parkin生成物であるpSer65は、陰性対照と比較して、化合物で処理されている細胞において誘導の増加を示す。ベータIIIチューブリンを使用して、分化の成功を確認した。ビンキュリンを、ローディング対照として使用した。
【図１６−２】図１６−１の続きである。
【図１７−１】Parkin活性化化合物1〜6、8〜12、14〜20及び29〜31の詳細なケモインフォマティック特性を示す表である。表は、列に化合物を列挙し、各列には、ドッキングスコア、用量応答からの実験活性(nM)、ケモインフォマティック特性及びリガンド効率が含まれる。図17A〜17Cは、化合物1〜4及び6の特性を示す。図17D〜17Fは、化合物8〜12の特性を示す。図17G〜17Iは、化合物14〜18の特性を示す。図17J〜17Lは、化合物19、20及び29〜31の特性を示す。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−２の続きである。
【図１７−４】図１７−３の続きである。
【図１７−５】図１７−４の続きである。
【図１７−６】図１７−５の続きである。
【図１７−７】図１７−６の続きである。
【図１７−８】図１７−７の続きである。
【図１７−９】図１７−８の続きである。
【図１７−１０】図１７−９の続きである。
【図１７−１１】図１７−１０の続きである。
【図１７−１２】図１７−１１の続きである。
【図１８】化合物1〜4及び31についてのインビトロhERG蛍光偏光アッセイからのトレーサー結合阻害を示す棒グラフである。
【図１９−１】化合物1〜4及び31並びに参照化合物(イミプラミン及びプロプラノロール)についての、マウス肝ミクロソームにおけるミクロソーム安定性データを示す表である。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図１９−３】図１９−２の続きである。
【図１９−４】図１９−３の続きである。
【図２０−１】化合物1〜4及び31についてのCYP阻害プロファイルを示すグラフである。図20Aは、化合物31についてのCYP阻害プロファイルである。図20Bは、化合物1についてのCYP阻害プロファイルである。図20Cは、化合物2についてのCYP阻害プロファイルである。図20Dは、化合物3についてのCYP阻害プロファイルである。図20Eは、化合物4についてのCYP阻害プロファイルである。
【図２０−２】図２０−１の続きである。
【図２０−３】図２０−２の続きである。
【図２１】化合物5、21〜28、32、33及び43〜46での前処理によるFLAG-Parkin C431S(WB)のUbチャージングの増強を示す図である。バンドシフトにより、ユビキチンへのParkin結合が示されているが、これはNaOHにより切断可能である。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
Parkinは、サイトゾルのE3ユビキチン(Ub)リガーゼであり、ミトコンドリアキナーゼであるPINK1の下流で作用する。ミトコンドリアストレスの際、PINK1は、ミトコンドリア外膜において安定化され、保存残基セリン65におけるUbのリン酸化によってParkinを動員する(Kaneら、(2014年)、J. Cell Biol.、205巻:143〜153頁、Kazlauskaiteら、(2014年)、Biochem. J.、460巻:127〜139頁、Koyanoら、(2014年)、Nature、510巻:162〜166頁)。リン酸化されたUb(ps65-Ub)は、Parkinを活性化させることができ、ミトコンドリア表面においてParkinの受容体としても作用する(Okatsuら、(2015年)、J. Cell Biol.、109巻:111〜128頁)。Parkinの再局在化は、その酵素活性化及びUb分子のミトコンドリア基質タンパク質へのライゲーションと関連し(Kazlauskaiteら、(2014年)、Open Biol.、4巻:130213)、これがひいては、PINK1及びParkinの追加的基質として働く(Fieselら、(2015年)、J. Cell Sci.、127巻:3488〜3504頁)。形成されたpS65-Ubシグナルは、マイトファジーのタグとして作用し、リソソーム内の全細胞小器官の最終的な分解のために、オートファジーアダプターによって認識される(Ordureauら、(2015年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、112巻:6637〜6642頁、Richterら、(2016年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、113巻:4039〜4044頁)。
【００８７】
ストレスの際、PINK1/Parkin経路は、ミトコンドリアの代謝回転を促進し、細胞変性につながる可能性がある機能障害性のミトコンドリアの蓄積を予防する。基本条件の下では、PINK1及びParkinの両方が、異なるメカニズムを通じて抑圧される。PINK1は、恒常的に、ミトコンドリアプロテアーゼPARLによって切断され、その後、プロテアソームによって分解される(Yamanoら、(2013年)、Autophagy、9巻:1758〜1769頁)。Parkinは、基本条件下で存在するが、活性を妨げるいくつかの自己相互作用によって、構造的に非常に圧縮されている(Caulfieldら、(2015年)、Biochem. Soc. Trans.、43巻:269〜274頁、Caulfieldら、(2014年)、PLoS Comput. Biol.、10巻:e1003935)。活性になるためには、これらの自己相互作用は解放されなければならず、Parkinは「開け放たれる」必要がある。Parkinは、E3ユビキチンリガーゼの新しいファミリーとして最近説明されている、RING-in-between-RING(RBR)リガーゼである(Wenzelら、(2011年)、Nature、474巻:105〜108頁)。これは、古典的なRING型リガーゼのメンバーと同様に、E2ユビキチン結合コファクターを結合させるいくつかのRINGドメインを含有する。しかしながら、Parkinは機構的には、それが基質上に運ばれる前に、その活性システイン(C431)を有するUb部分をE2から物理的に受容することから、HECT E3リガーゼのように作用する。ParkinのUbチャージング(すなわち、活性化)は、そのミトコンドリア動員と密接に関連している(Iguchiら、(2013年)、J. Biol. Chem.、288巻:22019〜22032頁、Zhengら、(2013年)、Cell Res.、23巻:886〜897頁)。Parkinは、保存されたSer65残基を有する、N末端のユビキチン様(UBL)ドメインを含有する。修飾因子タンパク質UbのS65におけるリン酸化とともに、UBL内でのParkin S65のPINK1依存性リン酸化(Kazlauskaiteら、(2014年)、Biochem. J.、460巻:127〜139頁、Iguchiら、(2013年)、J. Biol. Chem.、288巻:22019〜22032頁、Shiba-Fukushimaら、(2014年)、PLoS Genet.、10巻:e1004391)は、Parkinの活性化をもたらすキーイベントである(Kazlauskaiteら、(2014年)、Open Biol.、4巻:130213、Caulfieldら、(2014年)、PLoS Comput. Biol.、10巻:e1003935)。
【００８８】
したがって、本出願は、Parkinの活性化にとって有用な化合物を提供する。これらのParkin活性化化合物(PAC)は、低マイクロモル範囲/高ナノモル範囲において活性であり、ヒト細胞培養物において広範に試験された。これらの化合物の目的は、PINK1/Parkinミトコンドリア品質管理を改善することである。この経路は、異なる形態の家族性及び孤発性PDでは損なわれている。加えて、ミトコンドリア品質管理の活性化は、様々な神経性疾患、筋疾患、及び他の加齢性疾患にとって有益であると証明され得る。
【００８９】
90%を超える活性が必要とされることが多い、酵素/経路の阻害因子(すなわち、阻害)とは対照的に、所与の酵素/経路の活性化因子/エンハンサーは、10%の活性しか必要としない場合がある(すなわち、活性化)。これは、少量の活性標的でも、経路の間にさらに増幅され得るためである。これは、有効性にとって必要とされる薬物濃度がより低くなることに起因して、副作用を減少させる。一部の実施形態においては、本明細書に記載されるPACは、PINK1によって媒介される、初期のミトコンドリアストレス誘発性リン酸化(これがParkinのコンフォメーション変化をもたらし、薬物結合部位へのアクセスを可能にする)の際の、Parkinの活性化を増進することができる。いかなる理論によっても束縛されるものではないが、これによって、必要とされるとき及び必要とされる場合にのみ、Parkinの酵素機能の活性化を制限することができると考えられる。
【００９０】
1.定義
本明細書において使用される場合、「置換されている」という用語は、指定された原子、通常は炭素、酸素、又は窒素原子上の任意の1個以上の水素が、指定された基からの選択物で置き換えられていることを意味するが、ただし、指定された原子の通常の原子価を上回ることはなく、置換によってもたらされる化合物は安定であることを条件とする。置換基がケト又はオキソ(すなわち、=O)である場合、原子上の2個の水素が置き換えられている。本明細書において使用される場合、環二重結合とは、2つの隣接する環原子間で形成される二重結合のことである(例えば、C=C、C=N、N=N等)。
【００９１】
本明細書において使用される場合、「アルキル」は、指定された数の炭素原子を有する分岐鎖及び直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むことが意図される。例えば、C1-4アルキルは、C1、C2、C3、及びC4を含むことが意図される。C1-6アルキルは、C1、C2、C3、C4、C5、及びC6アルキル基を含むことが意図され、C1-8アルキルは、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、及びC8を含むことが意図される。アルキルの一部の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、s-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、及びn-オクチルが挙げられる。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「アルケニル」は、直線構成又は分岐構成のいずれかの炭化水素鎖、及び鎖の途中の任意の安定なポイントにおいて起こり得る、1個以上の不飽和炭素-炭素結合を含むことが意図され、例えばエテニル及びプロペニルである。例えば、C2-6アルケニルは、C2、C3、C4、C5、及びC6アルケニル基を含むことが意図され、C2-8アルケニルは、C2、C3、C4、C5、C6、C7、及びC8アルケニル基を含むことが意図される。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「アルキレン」は、ジラジカルである、すなわち2つの結合点を有する部分を含むことが意図される。ジラジカルであるそのようなアルキレン部分の非限定的例は、-CH2CH2-であり、すなわち、分子の残部に対してそれぞれの末端炭素原子を介して共有結合しているC2アルキル基である。アルキレンジラジカルは、「アルキレニル」ラジカルとしても公知である。アルキレン基は、1つ又はいくつかの位置において、飽和であってもよく、又は不飽和であってもよい(例えば、-CH=CH-又は-C≡C-サブユニットを含有する)。一部の実施形態においては、アルキレン基は、1から9個の炭素原子を含む(例えば、1から6個の炭素原子、1から4個の炭素原子、又は1から2個の炭素原子)。アルキレン基の一部の例としては、限定されるものではないが、メチレン、エチレン、n-プロピレン、イソプロピレン、n-ブチレン、イソブチレン、sec-ブチレン、tert-ブチレン、n-ペンチレン、イソペンチレン、sec-ペンチレン、及びneo-ペンチレンが挙げられる。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の非芳香環基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、又はシクロヘキシル等を含むことが意図される。例えば、「C3-8シクロアルキル」という用語は、C3、C4、C5、C6、C7、及びC8シクロアルキル基を含むことが意図される。シクロアルキルは、複数のスピロ環、又は縮合環、又は架橋環を含んでもよい。例えば、シクロアルキルとしては、限定されるものではないが、スピロブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、又はデシル基、ビシクロブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、又はデシル基、アダマンチル基、及びノルボルニル基を挙げることができる。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、別途指定されない限り、1個以上のヘテロ原子(O、N、S、又はSe等)を有する、飽和又は不飽和の、非芳香族の、3〜8員単環式環系、7〜12員二環式環系(縮合環、架橋環、又はスピロ環)、又は11〜14員三環式環系(縮合環、架橋環、又はスピロ環)を指す。縮合芳香環を含有するヘテロシクロアルキル基が、その縮合芳香環の環形成原子を含む任意の環形成原子を通じて結合されてもよい。一部の実施形態においては、ヘテロシクロアルキルは、窒素、酸素、又は硫黄から独立して選択される1個又は2個のヘテロ原子を有し、1個以上の酸化された環員を有する、単環式の4〜6員ヘテロシクロアルキルである。一部の実施形態においては、ヘテロシクロアルキルは、窒素、酸素、又は硫黄から独立して選択される1個、2個、3個、又は4個のヘテロ原子を有し、1個以上の酸化された環員を有する、単環式又は二環式の4〜10員ヘテロシクロアルキルである。ヘテロシクロアルキル基の例としては、限定されるものではないが、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、イソインドリニル、インドリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、トリアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、オキシラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、1,2,3,6-テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、ピラニル、モルホリニル、1,4-ジアゼパニル、1,4-オキサゼパニル、2-オキサ-5-アザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2,5-ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、2-オキサ-6-アザスピロ[3.3]ヘプタニル、2,6-ジアザスピロ[3.3]ヘプタニル、1,4-ジオキサ-8-アザスピロ[4.5]デカニル、及び同類のものが挙げられる。
【００９６】
本明細書において使用される場合、「アミン」又は「アミノ」は、別途指定されない限り、非置換の-NH2を指す。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード置換基を指す。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「ハロアルキル」は、1個以上のハロゲンによって置換されている、指定された数の炭素原子を有する、分岐鎖及び直鎖両方の飽和脂肪族炭化水素基(例えば、-CvFwH2v-w+1(式中、v=1から3であり、w=1から(2v+1)である))を含むことが意図される。ハロアルキルの例としては、限定されるものではないが、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、及びペンタクロロエチルが挙げられる。
【００９９】
本明細書において使用される場合、「ハロアルコキシ」という用語は、1個以上のハロゲンで置換されている、本明細書において定義されているようなアルコキシ基を指す。ハロアルコキシの例としては、限定されるものではないが、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシ、トリクロロメトキシ等が挙げられる。
【０１００】
本明細書において使用される場合、「アルコキシル」又は「アルコキシ」は、酸素架橋を通じて結合される、指定された数の炭素原子を有する、上に定義したようなアルキル基を指す。C1-6アルコキシは、C1、C2、C3、C4、C5、及びC6アルコキシ基を含むことが意図される。C1-8アルコキシは、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、及びC8アルコキシ基を含むことが意図される。アルコキシの例としては、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、i-プロポキシ、n-ブトキシ、s-ブトキシ、t-ブトキシ、n-ペントキシ、s-ペントキシ、n-ヘプトキシ、及びn-オクトキシが挙げられる。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、「アリール」は、少なくとも1個の芳香環を有し、環構造中にいかなるヘテロ原子も含有しない「共役」系又は多環式系を含む、芳香族性を有する基を含む。アリールは、単環式であってもよく、又は多環式であってもよい(例えば、2個、3個、又は4個の縮合環を有する)。「Cn-mアリール」という用語は、nからm個の環炭素原子を有するアリール基を指す。一部の実施形態においては、アリール基は、6から10個の炭素原子を有する。一部の実施形態においては、アリール基は、フェニル又はナフチルである。
【０１０２】
本明細書において使用される場合、「芳香族複素環」、「芳香族複素環式化合物」、又は「ヘテロアリール」環という用語は、炭素原子、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される、1個以上のヘテロ原子、例えば1個、又は1〜2個、又は1〜3個、又は1〜4個、又は1〜5個、又は1〜6個のヘテロ原子からなる、安定な、5、6、7、8、9、10、11、又は12員の単環式又は二環式芳香環を意味することが意図される。二環式芳香族の複素環式化合物、又は複素環、又はヘテロアリール環の場合、2つの環のうちの一方だけだが芳香族(例えば、2,3-ジヒドロインドール)である必要があるが、両方が芳香族(例えば、キノリン)であってもよい。第2の環はまた、複素環に関して上に定義したように、縮合されていてもよく、又は架橋されていてもよい。窒素原子は、置換されていてもよく、又は非置換であってもよい(すなわち、N又はNR(式中、Rは、H又は定義されるような別の置換基である))。窒素及び硫黄のヘテロ原子は、任意選択で、酸化されていてもよい(すなわち、N→O及びS(O)p(式中、p=1又は2である))。ある特定の化合物においては、芳香族複素環中のS及びO原子の総数は、1以下である。
【０１０３】
芳香族複素環、芳香族複素環式化合物、又はヘテロアリールの例としては、限定されるものではないが、アクリジニル、アゾシニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾテトラゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾイミダゾリニル、ベンゾオキサジアゾリル、カルバゾリル、4aH-カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラザニル、イミダゾリル、イミダゾロニル、1H-インダゾリル、インドリジニル、インドリル、3H-インドリル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、メチルベンゾトリアゾリル、メチルフラニル、メチルイミダゾリル、メチルチアゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、オキサゾリル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾリル、ピリドイミダゾリル、ピリドチアゾリル、ピリジニル、ピリジノニル、ピリジル、ピリミジニル、2H-ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、4H-キノリジニル、キノキサリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、6H-1,2,5-チアジアゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,2,5-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニル、トリアジニル、トリアゾロピリミジニル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,5-トリアゾリル、及び1,3,4-トリアゾリルが挙げられる。
【０１０４】
「ヒドロキシアルキル」という用語は、1個以上のOH基によって置換されている、上に定義したようなアルキル基を意味する。ヒドロキシアルキル基の例としては、HO-CH2-、HO-CH2-CH2-、及びCH3-CH(OH)-が挙げられる。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、「シアノ」という用語は、三重結合によって窒素原子と結合した炭素原子、すなわちC≡Nを有する置換基を意味する。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「オキソ」は、「=O」基を意味する。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という語句は、しっかりとした医学的判断の範囲内にあり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題もしくは合併症を伴わずに人間及び動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、妥当な損益比と釣り合うような、化合物もしくはその互変異性体、もしくはその塩、材料、組成物、及び/又は剤形を指す。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示された化合物又はその互変異性体の誘導体であって、親化合物又はその互変異性体が、親化合物又はその互変異性体の酸塩又は塩基塩を作製することによって改変されている、誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、限定されるものではないが、アミン等の塩基性残基の鉱酸又は有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ又は有機塩、及び同類のものが挙げられる。薬学的に許容される塩としては、例えば、無毒性の無機酸又は有機酸から形成される、親化合物又はその互変異性体の従来の無毒性塩又は第四級アンモニウム塩が挙げられる。例えば、そのような従来の無毒性塩としては、限定されるものではないが、2-アセトキシ安息香酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、酢酸、アスコルビン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、重炭酸、炭酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレゾルシン酸、ヒドラバミン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリルスルホン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ナプシル酸、硝酸、シュウ酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、リン酸、ポリガラクツロ酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、二次酢酸、コハク酸、スルファミン酸、スルファニル酸、硫酸、タンニン酸、酒石酸、及びトルエンスルホン酸から選択される無機酸及び有機酸から誘導されるようなものが挙げられる。
【０１０９】
本開示の薬学的に許容される塩は、塩基性又は酸性部分を含有する親化合物又はその互変異性体から、従来の化学的方法によって合成することができる。概して、そのような薬学的に許容される塩は、遊離酸又は塩基形態のこれらの化合物又はその互変異性体を、化学量論的量の適切な塩基又は酸と、水中もしくは有機溶媒中、又はこれら2つの混合物中で反応させることによって調製することができる。概して、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Company、Easton、PA、USA、1445頁(1990年)に見出される。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、「安定な化合物」及び「安定な構造」は、反応混合物から有用な純度までの単離及び有効な治療剤への製剤化を乗り切るのに十分なほど頑強である化合物を示すことが意図される。
【０１１１】
本明細書において使用される場合、「処置する」という用語は、治療目的のために、本明細書において提供されるような化合物又は医薬組成物を投与することを指す。「治療的処置」という用語は、既に疾患を患っている患者に処置を投与することで、治療上有益な効果、例えば既存の症状の寛解、症状の根底にある代謝的原因の寛解、障害のさらなる発達の延期もしくは予防、及び/又は発達することになるもしくは発達することが予期される症状の重症度の低減等をもたらすことを指す。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「不飽和」は、不飽和度が少なくとも1である(例えば、少なくとも1個の多重結合を有する)化合物を指し、部分及び完全不飽和化合物を含む。
【０１１３】
本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、本開示の化合物、又はその化合物の薬学的に許容される塩もしくは互変異性体(化合物及び/もしくはその互変異性体、並びに/又は前記化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容される塩の組合せを含む)の、抗菌剤として単独で又は組み合わせて投与された場合に有効である量を指す。例えば、有効量は、生物学的活性を引き出すのに十分な、受容患者又は対象に与えられる組成物、製剤中に存在する、化合物もしくはその互変異性体、又は前記化合物もしくは互変異性体の薬学的に許容される塩の量を指す。
【０１１４】
本明細書においては、文脈が別途明確に規定しない限り、単数形は複数形も包含する。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。抵触する場合は、本明細書が優先される。本明細書において使用される場合、「哺乳動物」は、ヒト及び非ヒト患者を指す。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、「本開示の式」又は「本明細書において開示される式」という用語は、式:(I)、(Ia)、(Ia-1)、(Ia-2)、(Ib-a)、(Ib)、(Ia-3)、(Ic)、(Ic-1)、(Id)、(Ie)、(If)、(Ig)、(Ie-1)、(Ih)、(Ii)、(Ij)、及び(Ik)のうちの1つ以上を含む。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、「本開示の化合物」又は「本明細書において開示される化合物」は、1つ以上の本開示の式の化合物、又は本明細書において明示的に開示される化合物を含む。
【０１１７】
本明細書において使用されるすべての百分率及び比は、別途指示のない限り、重量を基準とする。
【０１１８】
本明細書全体を通じて、組成物が特定の構成成分を有する(having)、含む(including)、もしくは含む(comprising)と説明される場合、又は方法が特定の方法ステップを有する(having)、含む(including)、もしくは含む(comprising)と説明される場合、本開示の組成物がまた、列挙された構成成分から本質的になる(consist essentially of)、又はそれらからなる(consist of)こと、及び本開示の方法がまた、列挙された処理ステップから本質的になる(consist essentially of)、又はそれらからなる(consist of)ことが企図される。さらに、ステップの順序又はある特定の行為を実施する順序は、本発明が実施可能であり続ける限り、重要ではないことが理解されるべきである。また、2つ以上のステップ又は行為が、同時に実行されてもよい。
【０１１９】
2.本開示の化合物
本出願は、式I:
【０１２０】
【化７】
2019525929.tif 000013
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH又はOであり、
Bは、CH又はNであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Wは、C又はNであり、
Xは、C又はNであり、
Yは、C又はNであり、
Zは、C又はNであり、
R1は、H、C1-4アルキル、フェニル、又はhetAr1であり、
R2はHであり、
R3はHであり、
又はR2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R7はHであり、
又は任意選択で、nが0である場合、R1及びR7は、それらが結合している原子と一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4は、H、C1-4アルキル、ハロゲン、CF3、又はフェニルであり、
R5は、H、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、任意選択でハロゲンによって置換されているフェニル、(C1-3アルキル)O(C4-6シクロアルキル)、O(C1-4アルキル)(C4-6シクロアルキル)、S(C1-4アルキル)、S(C4-6シクロアルキル)、(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)、hetAr1、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)であり、
R6は、H又はC1-4アルキルであり、
hetAr1は、任意選択でC1-4アルキルによって置換されている、1〜3個の環窒素原子を有する6員ヘテロアリール環であり、
hetCyc1は、少なくとも1個の、窒素である環ヘテロ原子を有する6〜10員二環式環であり、環のうちの少なくとも一方が芳香族であり、
nは、0又は1であり、
mは、0又は1であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよい]を提供する。
【０１２１】
一部の実施形態においては、AはCHである。一部の実施形態においては、Aは、Oである
【０１２２】
一部の実施形態においては、BはCHである。一部の実施形態においては、BはNである。
【０１２３】
一部の実施形態においては、AはOであり、BはNである。
【０１２４】
一部の実施形態においては、DはCである。一部の実施形態においては、DはNである。
【０１２５】
一部の実施形態においては、EはCHである。一部の実施形態においては、EはNである。
【０１２６】
一部の実施形態においては、WはNである。一部の実施形態においては、WはCである。
【０１２７】
一部の実施形態においては、XはCである
【０１２８】
一部の実施形態においては、YはCである。一部の実施形態においては、YはNである。
【０１２９】
一部の実施形態においては、ZはNである。一部の実施形態においては、ZはCである。
【０１３０】
一部の実施形態においては、R1はHである。一部の実施形態においては、R1は、C1-4アルキル又はhetAr1である。一部の実施形態においては、R1は、メチル、イソプロピル、フェニル、又はピリジンである。
【０１３１】
一部の実施形態においては、R4はHである。一部の実施形態においては、R4は、Cl、CF3、メチル、又はフェニルである。
【０１３２】
一部の実施形態においては、R5は、H又は任意選択でハロゲンによって置換されているフェニルである。一部の実施形態においては、R5は、Fによって置換されているフェニルである。一部の実施形態においては、R5は、(C1-3アルキル)O(C4-6シクロアルキル)、O(C1-4アルキル)(C4-6シクロアルキル)、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)である。一部の実施形態においては、C4-6シクロアルキルは、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。一部の実施形態においては、R5は、(C1-3アルキル)O(シクロペンチル)又はO(C1-4アルキル)(C4-6シクロヘキシル)である。一部の実施形態においては、R5は、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、又は(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)である。一部の実施形態においては、hetCyc1は、1個以上の窒素原子を有する9員二環式環である。一部の実施形態においては、hetCyc1は、イソインドリンである。一部の実施形態においては、R5は、S(C1-4アルキル)又はS(C4-6シクロアルキル)である。一部の実施形態においては、C4-6シクロアルキルは、シクロペンチル又はシクロヘキシルである。一部の実施形態においては、R5はhetAr1である。一部の実施形態においては、hetAr1は、任意選択でC1-4アルキルによって置換されている、ピリジン又はピリミジンである。
【０１３３】
一部の実施形態においては、R6はHである。
【０１３４】
一部の実施形態においては、nは0である。
【０１３５】
一部の実施形態においては、mは1である。
【０１３６】
一部の実施形態においては、pは0である。一部の実施形態においては、pは1である。
【０１３７】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1は、H、メチル、イソプロピル、フェニル、又は1個の環窒素原子を有する6員ヘテロアリール環であり、
R4は、H、ハロゲン、メチル、又はCF3であり、
R5は、H又はフェニルであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１３８】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R4はHであり、
R5は、(C1-3アルキル)O(シクロペンチル)、O(C1-4アルキル)(シクロヘキシル)、C1-4アルキル、C4-10シクロアルキル、(C1-3アルキル)(C4-9hetCyc1)、S(C1-4アルキル)S(C4-6シクロペンチル)、又は任意選択でCNによって置換されているO(フェニル)であり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１３９】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはCであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R4はHであり、
R5はフェニルであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは1であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４０】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはOであり、
BはNであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R4はフェニルであり、
R5はHであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは0であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４１】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはNであり、
YはNであり、
ZはNであり、
R1はC1-4アルキルであり、
R4はHであり、
R5はフェニルであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４２】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はC1-4アルキルであり、
R2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4はHであり、
R5はフェニルであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４３】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4は、H又はメチルであり、
R5は、C1-4アルキル(例えば、メチル)によって置換されている、ピリジン又はピリミジンであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４４】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはCであり、
XはCであり、
YはNであり、
ZはCであり、
R3はHであり、
R1及びR7は、それらが結合している原子と一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4はHであり、
R5はフェニルであり、
R6はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは0である、
化合物が提供される。
【０１４５】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはNであり、
DはCであり、
EはCHであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R4はHであり、
R5はフェニルであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４６】
一部の実施形態においては、式Iの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
Bは、CH又はNであり、
DはNであり、
Eは、CH又はNであり、
WはNであり、
XはCであり、
YはCであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R2及びR3は、Y及びXと一緒になって、6員シクロアルキル環を形成し、
R5は、任意選択でハロゲン(例えば、フルオロ)によって置換されているフェニルであり、
R6はHであり、
R7はHであり、
mは1であり、
nは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１４７】
一部の実施形態においては、式Iの化合物は、
【０１４８】
【化８】
2019525929.tif 000014
2019525929.tif 000015
2019525929.tif 000016
又はその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される。
【０１４９】
一部の実施形態においては、式Iの化合物は、表1に列挙される化合物のうちのいずれか1つ又は薬学的に許容される化合物の塩である。
【０１５０】
【表１】
2019525929.tif 000017
2019525929.tif 000018
2019525929.tif 000019
2019525929.tif 000020
2019525929.tif 000021
【０１５１】
本出願はさらに、式II:
【０１５２】
【化９】
2019525929.tif 000022
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
Aは、CH、N、又はSであり、
Bは、CH、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Lは、C1-3アルキレン又はC(=O)であり、
Wは、CH、CH2、N、又はNRaであり、
Xは、CH、CH2、N、又はNRbであり、
Yは、CH、CH2又はOであり、
Zは、N又はCR2'であり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R2は、存在しないか又はC1-6アルキレンであり、
R2'は、H又はC1-6アルキルであり、
又はZがCR2'である場合、R2及びR2'は、Cと一緒になって、まとめてC1-6複素環を形成してもよく、
R3は、H、ハロゲン、C1-3アルキル、C3-6シクロアルキル、又はC1-3アルコキシであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
Raは、H又はC1-3アルキルであり、
RbはC1-3アルキルであり、
mは、0、1、又は2であり、
nは、1又は2であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよいが、
ただし、nが2であり、R1がメチルであり、DがCであり、R3がHであり、A、B、及びEがすべてCHである場合、W、X、及びYのうちの少なくとも1つがCH2ではないことを条件とする]
を提供する。
【０１５３】
一部の実施形態においては、AはCHである。一部の実施形態においては、AはNである。一部の実施形態においては、AはSである。
【０１５４】
一部の実施形態においては、BはCHである。一部の実施形態においては、Bは、N、O、又はSである。
【０１５５】
一部の実施形態においては、DはCである。
【０１５６】
一部の実施形態においては、EはCHである。一部の実施形態においては、EはNである。
【０１５７】
一部の実施形態においては、LはC1-3アルキレンである。一部の実施形態においては、Lはメチレンである。
【０１５８】
一部の実施形態においては、WはCH2である。一部の実施形態においては、WはNである。
【０１５９】
一部の実施形態においては、XはCHである。一部の実施形態においては、XはCH2である。一部の実施形態においては、XはNRbである。
【０１６０】
一部の実施形態においては、Rbはメチルである。
【０１６１】
一部の実施形態においては、YはCHである。一部の実施形態においては、YはCH2である。
【０１６２】
一部の実施形態においては、ZはNである。一部の実施形態においては、ZはCR2'である。
【０１６３】
一部の実施形態においては、R2は存在しない。一部の実施形態においては、R2及びR2'は、Cと一緒になって、1個の窒素原子を有する5員複素環を形成する。
【０１６４】
一部の実施形態においては、R1はHである。一部の実施形態においては、R1はメチルである。
【０１６５】
一部の実施形態においては、Raは、H又はメチルである。
【０１６６】
一部の実施形態においては、Rbはメチルである。
【０１６７】
一部の実施形態においては、R3は、H、ハロゲン、又はC3-6シクロアルキルである。一部の実施形態においては、R3はハロゲンである。一部の実施形態においては、R3は塩素である。一部の実施形態においては、R3はシクロプロピルである。
【０１６８】
一部の実施形態においては、R4及びR4'は、それぞれHである。一部の実施形態においては、R4及びR4'は、それぞれメチルである。
【０１６９】
一部の実施形態においては、mは、1又は2である。
【０１７０】
一部の実施形態においては、nは1である。一部の実施形態においては、nは2である。
【０１７１】
一部の実施形態においては、pは0である。一部の実施形態においては、pは1である。
【０１７２】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
Bは、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはCH2であり、
Xは、CH2又はNRbであり、
YはCH2であり、
ZはNであり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R2は存在せず、
R3はC1-3アルキルであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
RbはC1-3アルキルであり、
nは2であり、
mは1であり、
pは0である、
化合物が提供される。
【０１７３】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはCH2であり、
XはNRbであり、
YはCH2であり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R2は存在せず、
R3はC1-3アルコキシであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
RbはC1-3アルキルであり、
nは2であり、
mは1であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１７４】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはNRaであり、
XはNであり、
YはCHであり、
ZはNであり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R2は存在せず、
R3はHであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
RaはC1-3アルキルであり、
nは2であり、
mは0であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１７５】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはNRaであり、
XはCH2であり、
YはOであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R2は存在せず、
R3はHであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
RaはHであり、
nは2であり、
mは1であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１７６】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
Lは、C(=O)又はC1-3アルキレンであり、
WはCH2であり、
XはCH2であり、
YはCH2であり、
ZはNであり、
R1はC1-3アルキルであり、
R2は存在せず、
R3はHであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
nは1であり、
mは1であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１７７】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはCH2であり、
XはCH2であり、
YはCH2であり、
ZはCR2'であり、R2及びR2'は、Cと一緒になって、まとめてC5-6複素環を形成してもよく、
R1はC1-3アルキルであり、
R3はHであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
nは1であり、
mは1であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１７８】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Aは、CH又はSであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはCH2であり、
XはCH2であり、
YはCH2であり、
ZはNであり、
R1はメチルであり、
R2は存在せず、
R3は、H又はハロゲン(例えば、クロロ)であり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
mは1であり、
nは2であり、
pは、0又は1である、
化合物が提供される。
【０１７９】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはNであり、
BはOであり、
DはCであり、
EはNであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはCH2であり、
XはCH2であり、
YはCH2であり、
ZはNであり、
R1はメチルであり、
R2は存在せず、
R3はC3-6シクロアルキルであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
mは1であり、
nは2であり、
pは0である、
化合物が提供される。
【０１８０】
一部の実施形態においては、式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
AはCHであり、
BはCHであり、
DはCであり、
EはCHであり、
LはC1-3アルキレンであり、
WはNであり、
XはCHであり、
YはCHであり、
ZはNであり、
R1はHであり、
R2は存在せず、
R3はHであり、
R4はHであり、
R4'はHであり、
mは1であり、
nは2であり、
pは1である、
化合物が提供される。
【０１８１】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、
【０１８２】
【化１０】
2019525929.tif 000023
2019525929.tif 000024
又はその薬学的に許容される塩
からなる群から選択される。
【０１８３】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、式IIa:
【０１８４】
【化１１】
2019525929.tif 000025
の化合物又はその薬学的に許容される塩[式中、
Aは、CH又はNであり、
Bは、N、O、又はSであり、
Dは、C又はNであり、
Eは、CH又はNであり、
Wは、CH2又はNRaであり、
Xは、CH、CH2、N、又はNRbであり、
Yは、CH、CH2又はOであり、
Lは、C1-3アルキレン又はC(=O)であり、
R1は、H又はC1-3アルキルであり、
R3は、C1-3アルキル又はC1-3アルコキシであり、
R4は、H又はC1-3アルキルであり、
R4'は、H又はC1-3アルキルであり、
Raは、H又はC1-3アルキルであり、
Rbは、C1-3アルキルであり、
nは、1又は2であり、
mは、0、1、又は2であり、
pは、0又は1であり、
破線は、単結合であってもよく、又は二重結合であってもよい]
である。
【０１８５】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、式IIb:
【０１８６】
【化１２】
2019525929.tif 000026
の化合物又はその薬学的に許容される塩
[式中、
R1は、C1-3アルキルであり、
R5は、(C1-3アルキル)フェニルである]
である。
【０１８７】
一部の実施形態においては、式IIの化合物は、表2に列挙される化合物のうちのいずれか1つ又は薬学的に許容される化合物の塩である。
【０１８８】
【表２】
2019525929.tif 000027
2019525929.tif 000028
2019525929.tif 000029
【０１８９】
3.本開示の化合物の合成
理解されるように、本明細書において提供される化合物は、それらの塩も含め、公知の有機合成技法を使用して調製することができ、多数の可能な合成経路のいずれかに従って合成することができる。そのようにして得られた化合物は、例えばフラッシュカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、結晶化、又は任意の公知の精製方法によってさらに精製することができる。
【０１９０】
一実施形態においては、本開示の化合物、例えば式I及び式IIの化合物は、下の合成スキーム1〜4に例証されている手順に従って合成することができる。
【０１９１】
イミダゾピリジン構造を有する式Iの化合物は、例えば、スキーム1及び2に例証されている汎用的方法を使用して調製することができる。提案されている合成経路は、3つの重要な段階、すなわち、置換されたイミダゾ[1,2-a]ピリジン-2-カルバルデヒドの形成(ステップA)、アニリンのアシル化(ステップB)、及び最終化合物の合成(ステップC)を有する。ステップAは、文献によく記載されており(例えば、Chavignonら、(1992年)、J. Heterocycl. Chem.、29巻(4号):691頁を参照されたい)、2つの段階:1)置換された2-アミノピリジンを、1,1,3-トリクロロアセトンとともに1,2-ジメトキシエタン中で加熱して縮合させることによる、対応する2-(ジクロロメチル)イミダゾ[1,2-a]ピリジンの形成、2)2-(ジクロロメチル)イミダゾ[1,2-a]ピリジンの、炭酸カルシウムで処理することによる、対応するイミダゾ[1,2-a]ピリジン-2-カルバルデヒドへの変換からなる。ステップBもまた、2つの段階、すなわち、副産物の形成を回避するための、boc保護アミノ酢酸(R3=H)のアミドの合成、及び酸性条件下におけるboc保護基の除去を有する。最終的なステップCは、イミダゾ[1,2-a]ピリジン-2-カルバルデヒドを対応するアミンと反応させた後、水素化ホウ素ナトリウムで還元することによる、シッフ塩基の形成を示している。
【０１９２】
R3=アルカンであった場合、合成経路はより短くなり、3つの段階、すなわち、Alk置換アミノ酢酸tert-ブチルエステルの、対応する2-(クロロメチル)イミダゾ[1,2-a]ピリジンによるアルキル化(ステップD、スキーム2)、加水分解(ステップE、スキーム2)、及び最終的なアミドの形成(ステップF、スキーム2)を伴う。
【０１９３】
【化１３】
2019525929.tif 000030
【０１９４】
イミダゾール構造を有する式Iの化合物は、例えば、スキーム3に例証されている汎用的方法を使用して調製することができる。この方法は、対応するイミダゾリル-酢酸をアニリンと反応させることによる、アミド結合の形成を含む。R1及びR2の化学的性質に応じて、カルボジイミド(DCC、EDC)、カルボニルジイミダゾール(CDI)等の異なる活性化剤を使用することができる(例えば、Montalbettiら、(2005年)、Tetrahedron 61:10827頁を参照されたい)。
【０１９５】
【化１４】
2019525929.tif 000031
【０１９６】
ピリミジン/ホモピペラジン骨格を有する式IIの化合物は、例えば、スキーム4に例証されている汎用的方法を使用して調製することができる。
【０１９７】
【化１５】
2019525929.tif 000032
【０１９８】
当業者であれば、本明細書に記載されている方法が、本明細書において提供される化合物を合成することができる排他的手段であるわけではないこと、及び幅広いレパートリーの合成有機反応が、本明細書において提供される化合物の合成において潜在的に用いるのに利用可能であることを理解するであろう。当業者であれば、適当な合成経路をどのように選択及び実行するかを知っている。出発物質、中間体、及び生成物の好適な合成方法は、文献を参照することによって特定することができ、例えばAdvances in Heterocyclic Chemistry、1〜107巻、(Elsevier、1963〜2012年)、Journal of Heterocyclic Chemistry、1〜49巻、(Journal of Heterocyclic Chemistry、1964〜2012年)、Carreiraら(編)、Science of Synthesis、1〜48巻、(2001〜2010年)及びKnowledge Updates KU2010/1〜4、2011/1〜4、2012/1〜2、(Thieme、2001〜2012年)、Katritzkyら(編)、Comprehensive Organic Functional Group Transformations、(Pergamon Press、1996年)、Katritzkyら(編)、Comprehensive Organic Functional Group Transformations II、(Elsevier、第2版、2004年)、Katritzkyら(編)、Comprehensive Heterocyclic Chemistry、(Pergamon Press、1984年)、Katritzkyら、Comprehensive Heterocyclic Chemistry II、(Pergamon Press、1996年)、Smithら、March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure、第6版、(Wiley、2007年)、Trostら(編)、Comprehensive Organic Synthesis、(Pergamon Press、1991年)等の出典が挙げられる。
【０１９９】
本明細書に記載されている化合物を調製するための反応は、有機合成の技術分野における当業者であれば容易に選択することができる好適な溶媒中で実行することができる。好適な溶媒は、反応が実行される温度(例えば、溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度までの範囲にあり得る温度)において、出発物質(反応物質)、中間体、又は生成物に対して実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、1種の溶媒中で、又は2種以上の溶媒の混合物中で実行されてもよい。当業者であれば、特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップにとって好適な溶媒を選択することができる。
【０２００】
本明細書に記載されている化合物の調製は、様々な化学基の保護及び脱保護を伴う可能性がある。当業者であれば、保護及び脱保護に対する必要性、並びに適当な保護基の選択を容易に決定することができる。保護基の化学的性質については、例えば、T. W. Greene及びP. G. M. Wuts、Protective Groups in Organic Synthesis、第3版、Wiley & Sons, Inc.、New York、(1999年)において見出すことができる。
【０２０１】
反応は、当該技術分野において公知である任意の好適な方法に従って監視することができる。例えば、生成物の形成は、分光学的手段、例えば核磁気共鳴分光法(例えば、1H又は13C)、赤外分光法、分光光度法(例えば、UV可視)、質量分析法等によって、又はクロマトグラフィー法、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、液体クロマトグラフィー質量分析法(LCMS)、もしくは薄層クロマトグラフィー(TLC)等によって監視することができる。化合物は、当業者であれば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及び順相シリカクロマトグラフィーを含めた様々な方法で精製することができる。
【０２０２】
また、本明細書において提供される化合物は、互変異性型も含む。互変異性型は、プロトンの移動を同時に伴う、単結合の隣接する二重結合とのスワッピングから結果として生じる。互変異性型には、同じ実験式及び総電荷を有する、異性体のプロトン化状態である、プロトトロピー互変異性体が含まれる。例示的なプロトトロピー互変異性体としては、ケトン-エノール対、アミド-イミド酸対、ラクタム-ラクチム対、エナミン-イミン対、並びにプロトンが複素環式系の2つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば1H-及び3H-イミダゾール、1H-、2H-、及び4H-1,2,4-トリアゾール、1H-及び2H-イソインドール、並びに1H-及び2H-ピラゾールが挙げられる。互変異性型は、平衡状態であってもよく、又は適当な置換によって一方の型へと立体的に固定されてもよい。
【０２０３】
すべての化合物及びその薬学的に許容される塩は、水及び溶媒等の他の物質と一緒に見出されてもよく(例えば、水和物及び溶媒和物)、又は単離されてもよい。
【０２０４】
一部の実施形態においては、化合物の調製は、例えば所望される反応の触媒作用又は酸付加塩等の塩形態の形成に影響を及ぼす、酸又は塩基の添加を伴ってもよい。
【０２０５】
例示的な酸は、無機酸であってもよく、又は有機酸であってもよく、限定されるものではないが、強酸及び弱酸を含む。一部の例示的な酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、p-トルエンスルホン酸、4-ニトロ安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、及び硝酸が挙げられる。一部の弱酸としては、限定されるものではないが、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、安息香酸、酒石酸、ピログルタミン酸、グロン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、及びデカン酸が挙げられる。マロン酸、フマル酸、及びマレイン酸等の有機二酸も挙げられる。
【０２０６】
例示的な塩基としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、及び炭酸水素ナトリウムが挙げられる。一部の例示的な強塩基としては、限定されるものではないが、水酸化物、アルコキシド、金属アミド、金属水素化物、金属ジアルキルアミド、及びアリールアミンが挙げられ、アルコキシドとしては、メチル、エチル、及びt-ブチルオキシドのリチウム、ナトリウム、及びカリウム塩が挙げられ、金属アミドとしては、ナトリウムアミド、カリウムアミド、及びリチウムアミドが挙げられ、金属水素化物としては、水素化ナトリウム、水素化カリウム、及び水素化リチウムが挙げられ、金属ジアルキルアミドとしては、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、tert-ブチル、トリメチルシリル、及びシクロヘキシル置換アミドのリチウム、ナトリウム、及びカリウム塩が挙げられる。
【０２０７】
一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物又はその塩は、実質的に単離されている。「実質的に単離されている」とは、化合物が、それが形成又は検出された環境から、少なくとも部分的又は実質的に分離されていることを意味する。部分的分離としては、本明細書において提供される化合物に富んだ組成物を挙げることができる。実質的な分離としては、少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97重量%、又は少なくとも約99重量%の、本明細書において提供される化合物又はその塩を含有する組成物を挙げることができる。化合物及びそれらの塩を単離する方法は、当該技術分野においては常法である。
【０２０８】
本明細書において使用される場合、「周囲温度」、及び「室温」又は「rt」という表現は、当該技術分野においては理解され、概して、反応が実行される部屋の温度周辺、例えば、約20℃から約30℃の温度である温度、例えば反応温度を指す。
【０２０９】
4.使用の方法
それを必要とする対象におけるE3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させる方法が、本明細書において提供される。本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物を含めた任意の動物を指す。例えば、マウス、ラット、他の齧歯動物、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類、及びヒト。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、方法は、治療有効量の、本明細書において提供される化合物(例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩)を対象に投与することを含む。
【０２１０】
一部の実施形態においては、対象は、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する。E3ユビキチンリガーゼの例としては、限定されるものではないが、Parkin、ARIH1(HHARI)、ARIH2(TRIAD1)、RNF31(HOIP)、RBCK1(HOIL-1L)、MUL1(MAPL、MULAN)、MARCH5(MITOL)、E3A、mdm2、後期促進複合体(APC)、UBR5 (EDD1)、SOCS、LNXp80、CBX4、CBLL1、HACE1、HECTD1、HECTD2、HECTD3、HECW1、HECW2、HERC1、HERC2、HERC3、HERC4、HUWE1、ITCH、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RNF4、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS、TRIP12、UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、及びWWP2が挙げられる。一部の実施形態においては、E3ユビキチンリガーゼはParkinである。
【０２１１】
本明細書において提供される方法の一部の実施形態においては、酵素活性は、ミトコンドリアストレス中に活性化又は増進される。一部の実施形態においては、化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩は、ミトコンドリア品質管理を刺激する。一部の実施形態においては、化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩は、リガーゼの自己阻害に干渉する。
【０２１２】
一部の実施形態においては、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性は、疾患、老化、又は加齢性障害に起因する。疾患又は障害の例としては、限定されるものではないが、パーキンソン病、パーキンソン症候群、アルツハイマー病、認知症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、自閉症、鬱病、ハンセン病、封入体筋炎、糖尿病、糖尿病性腎疾患、肝疾患、リソソーム蓄積症、神経性疾患、筋疾患、ミトコンドリア性疾患、及びがんからなる群から選択される。
【０２１３】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、パーキンソン病である。
【０２１４】
一部の実施形態においては、疾患又は障害は、がんである。がんの例としては、限定されるものではないが、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんが挙げられる。
【０２１５】
本出願はさらに、対象における縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を処置する方法を提供する。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、方法は、治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む。
【０２１６】
対象における疾患又は障害を処置する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、方法は、
(a)疾患又は障害が、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連するかどうかを決定すること、及び
(b)疾患が、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連すると決定された場合、治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２１７】
一部の実施形態においては、対象における疾患又は障害を処置する方法は、
(a)縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２１８】
対象におけるパーキンソン病を処置する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、方法は、
(a)対象がパーキンソン病を有するかどうかを決定すること、及び
(b)対象がパーキンソン病を有した場合、治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２１９】
一部の実施形態においては、対象におけるパーキンソン病を処置する方法は、
(a)対象におけるパーキンソン病を検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２２０】
対象における加齢性障害を処置する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、方法は、
(a)対象が加齢性障害を有するかどうかを決定すること、及び
(b)対象が加齢性障害を有した場合、治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２２１】
一部の実施形態においては、対象における加齢性障害を処置する方法は、
(a)対象における加齢性障害を検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２２２】
対象におけるがんを処置する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態においては、対象はヒトである。一部の実施形態においては、方法は、
(a)対象ががんを有するかどうかを決定すること、及び
(b)対象ががんを有した場合、治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２２３】
一部の実施形態においては、対象におけるがんを処置する方法は、
(a)対象におけるがんを検出すること、及び
(b)治療有効量の、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を対象に投与すること
を含む。
【０２２４】
がんの例としては、限定されるものではないが、肝臓がん、脳がん、皮膚がん、腎臓がん、肺がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞癌、グリオーマ、皮膚黒色腫、腎明細胞癌、非小細胞肺がん、肺腺癌、肺扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓腺癌、腺様嚢胞癌、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、膀胱尿路上皮がん、頭頚部扁平上皮癌、食道腺癌、胃がん、子宮頚がん、甲状腺がん、及び類内膜がんが挙げられる。
【０２２５】
細胞におけるE3ユビキチンリガーゼの酵素活性を活性化させる方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態においては、方法は、本明細書において提供される化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を細胞と接触させることを含む。一部の実施形態においては、接触させることは、インビトロである。
【０２２６】
本明細書において提供される方法の一部の実施形態においては、酵素活性は、ミトコンドリアストレス中に活性化又は増進される。一部の実施形態においては、化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩は、ミトコンドリア品質管理を刺激する。一部の実施形態においては、化合物、例えば式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩は、リガーゼの自己阻害に干渉する。一部の実施形態においては、細胞は、縮小したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性を有する。
【０２２７】
本明細書において提供される方法のいずれかの一部の実施形態においては、本明細書に記載されている方法において使用するための化合物(例えば、式I又は式IIの化合物)は、本開示において提供され、記載されている化合物のうちの1つ以上と組み合わせて使用されてもよい。
【０２２８】
5.併用療法
一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物のうちの1つ以上を、少なくとも1種の追加的な薬剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することができる。一部の実施形態においては、この追加的な薬剤は、本明細書において提供される化合物(例えば、式I又は式IIの化合物)である。
【０２２９】
本明細書において提供される、疾患又は障害を処置するための、本出願の化合物と組み合わせて使用するための、好適な追加的な薬剤のさらなる例としては、限定されるものではないが、一般的なオートファジーの活性化因子、例えばラパマイシン及びレスベラトロール等(例えば、mTOR経路阻害)、又はAMPK経路活性化の活性化因子(例えば、メトホルミン);リソソーム機能/生合成、例えば主要制御因子TFEBの刺激の活性化因子;PINK1キナーゼ活性の活性化因子、例えばカイネチン;並びにリン-ユビキチン模倣物を含めたリン-ユビキチン結合等の代替的なメカニズムによってParkinを活性化させる分子が挙げられる。一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物は、減少又は縮小したE3ユビキチンリガーゼ活性と関連する疾患又は障害を処置するための、少なくとも1種の追加的な薬剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与されてもよい。一部の実施形態においては、酵素活性は、疾患、老化、又は加齢性障害に起因して縮小されている。
【０２３０】
6.医薬組成物及び製剤
本明細書において提供される化合物(例えば、式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩)、及び少なくとも1種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本明細書において提供される。医薬品として用いられる場合、本明細書において提供される化合物は、医薬組成物の形態で投与されてもよく、したがって、本明細書に記載されている方法は、医薬組成物を投与することを含んでもよい。これらの組成物は、本明細書又は他の場所に記載されているように調製することができ、局所処置又は全身処置のどちらが所望されているかに応じて、及び処置されるべき領域に応じて、様々な経路で投与することができる。投与は、肺内(例えば、ネブライザーによるものを含めた、粉末もしくはエアロゾルの吸入もしくは吹送による、気管内、又は鼻腔内)、経口、又は非経口であってもよい。非経口投与としては、限定されるものではないが、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内注射もしくは注入、又は頭蓋内(例えば、髄腔内、眼内、又は脳室内)投与を挙げることができる。非経口投与は、単回のボーラス投与量の形態であってもよく、又は例えば継続的な潅流ポンプによるものであってもよい。従来の薬学的担体、水性、粉末、又は油性基剤、増粘剤、及び同類のものが必須又は望ましい場合がある。一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物は、経口投与及び非経口投与にとって好適である。一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物は、経口投与にとって好適である。一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物は、非経口投与にとって好適である。一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物は、静脈内投与にとって好適である。一部の実施形態においては、本明細書において提供される化合物は、経皮投与(例えば、パッチ又はマイクロニードルを使用する投与)にとって好適である。局所投与のための医薬組成物としては、経皮パッチ(例えば、通常又は電気刺激)、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴薬、坐薬、スプレー、液剤、及び粉剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性、粉末、又は油性基剤、増粘剤、及び同類のものが必須又は望ましい場合がある。
【０２３１】
また、活性成分として、本明細書において提供される化合物(例えば、式I又は式IIの化合物)又はその薬学的に許容される塩を、1種以上の薬学的に許容される担体(賦形剤)と組み合わせて含有する医薬組成物も提供される。本明細書において提供される組成物を作製する際、活性成分は、典型的には、賦形剤と混合されたり、賦形剤によって希釈されたり、又はそのような担体内に、例えば、カプセル剤、サシェ剤、紙剤、もしくは他の容器の形態で封入されたりする。賦形剤が希釈剤として働く場合、賦形剤は、活性成分のためのビヒクル、担体、又は媒体として作用する、固体、半固体、又は液体の材料であり得る。したがって、組成物は、錠剤、丸剤、粉剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルション、溶剤、シロップ、エアロゾル(固体としての又は液体媒体中の)、軟膏、軟質及び硬質ゼラチンカプセル、坐薬、滅菌注射用溶液、並びに滅菌包装粉末の形態であってもよい。
【０２３２】
好適な賦形剤の一部の例としては、限定されるものではないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、及びメチルセルロースが挙げられる。製剤は、追加的に、限定されるものではないが、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油等の滑沢剤、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、メチル及びプロピルヒドロキシベンゾエート等の保存剤、甘味剤、着香剤、又はそれらの組合せを含むことができる。
【０２３３】
活性化合物は、幅広い投与量の範囲にわたって有効であり得、概して、薬学的有効量で投与される。しかしながら、実際に投与される化合物の量及び投与のスケジュールは、通常、処置されるべき状態、選ばれた投与経路、投与される実際の化合物、個別の対象の年齢、体重、及び応答、対象の症状の重症度、並びに同類のものを含めた関連する状況に従って、医師によって決定されることが理解されるであろう。
【０２３４】
7.キット
また、本明細書において提供される化合物、より具体的には式Iもしくは式IIの化合物、又はその薬学的に許容される塩を含むキットも本明細書において提供される。一部の実施形態においては、キットは、例えば本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩のための、1種以上の送達システム、及びキットを使用するための指図書(例えば、対象を処置するための説明書)を含んでもよい。一部の実施形態においては、キットは、本明細書において提供される化合物又はその薬学的に許容される塩、及び本明細書において提供されるような、1種以上の追加的な薬剤を含んでもよい。
【０２３５】
一部の実施形態においては、化合物は、表1に提供される化合物又は薬学的に許容される化合物の塩の群から選択される。一部の実施形態においては、化合物は、表2に提供される化合物又は薬学的に許容される化合物の塩の群から選択される。
【０２３６】
一部の実施形態においては、キットは、本明細書において提供されるような、1種以上の化合物もしくは追加的な薬剤、又はその薬学的に許容される塩、及び内容物が、縮小又は減少したE3ユビキチンリガーゼ酵素活性と関連する疾患又は障害を患っている対象に投与されるものであることを示すラベルを含んでもよい。一部の実施形態においては、キットは、本明細書において提供されるような、1種以上の化合物又はその薬学的に許容される塩、及び内容物が、本明細書において提供されるような、1種以上の追加的な薬剤とともに投与されるものであることを示すラベルを含んでもよい。
【実施例】
【０２３７】
[実施例1]
合成経路
以下の表3に列挙される化合物1〜46を、以下に記載される一般合成スキームに従って合成した。
【０２３８】
【表３】
2019525929.tif 000033
2019525929.tif 000034
2019525929.tif 000035
2019525929.tif 000036
2019525929.tif 000037
2019525929.tif 000038
2019525929.tif 000039
【０２３９】
A.化合物1、3、8〜10、12及び15〜20の合成
化合物1、3、8〜10、12及び15〜20は、以下の一般合成スキームに従って調製することができる。
【０２４０】
【化１６】
2019525929.tif 000040
【０２４１】
実験:
ジメチルホルムアミド(7mL)中、(3-{[(エチルイミノ)メチリデン]アミノ}プロピル)ジメチルアミン塩酸塩(EDC・HCl)(1.2mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1.2mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.35mL、2mmol)、酸(1.2mmol)及びアニリン(1mmol)の混合物を、室温で24〜48時間撹拌した。次いで、反応混合物を水(35mL)で処理し、粗生成物をろ過し、アセトニトリルからの再結晶化によって、又はHPLCクロマトグラフィー(メタノール/水)によって精製した。収率:酸及びアニリンの構造に応じて15〜70%。
【０２４２】
化合物1、3、8〜10、12及び15〜20の各々についてのスペクトルデータを以下に列挙する。
【０２４３】
化合物1:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.5 (s, 1H, NH), 7.7 (m, 6H, CPhH), 7.4 (m, 3H, CPhH), 7.35 (s, 1H, CimidH), 4.85 (s, 2H, CH2), 2.4 (t, 4H, 2CH2), 1.75 (m, 4H, 2CH2) ppm. 
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値332.2/332.2.
【０２４４】
化合物3:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.45 (s, 1H, NH), 7.6 (m, 3H, 2CPhH, CimidH), 7.45 (dd, 2H, CPhH), 7.16 (d, 1H, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2), 1.2 (s, 9H, 3CH3) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値290.15/290.2.
【０２４５】
化合物8:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.2 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.45 (dd, 2H, CPhH), 7.15 (d, 1H, CimidH), 6.9 (m, 3H, 2CPhH, CimidH), 4.85 (s, 2H, CH2), 3.75 (d, 2H, OCH2), 1.75 (m, 6H, 3CH2), 1.2 (m, 3H, CH, CH2), 1.05 (m, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値314.21/314.1.
【０２４６】
化合物9:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.35 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.56 (dd, 2H, CPhH), 7.32 (dd, 2H, CPhH), 7.18 (d, 1H, CimidH), 7.04 (d, 1H, CPhH), 6.98 (t, 1H, CPhH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 6.58 (m, 2H, CPhH), 4.8 (s, 2H, CH2), 4.2 (s, 2H, NCH2), 3.25 (t, 2H, CH2), 2.9 (t, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値333.19/333.1.
【０２４７】
化合物10:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.25 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.45 (dd, 2H, CPhH), 7.3 (dd, 2H, CPhH), 7.1 (d, 1H, CimidH), 6.85 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2), 2.05 (m, 3H, CadamH), 1.8 (m, 12H, CadamH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値336.24/336.1.
【０２４８】
化合物12:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.8 (s, 1H, NH), 8.2 (d, 1H, CPhH), 7.85 (m, 1H, CPhH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.4 (m, 4H, CPhH), 7.3 (m, 2H, CPhH), 7.2 (d, 1H, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 5.0 (s, 2H, CH2) ppm. 
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値346.3/346.2.
【０２４９】
化合物15:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.35 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.56 (dd, 2H, CPhH), 7.26 (dd, 2H, CPhH), 7.16 (d, 1H, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2), 4.4 (s, 2H, OCH2), 3.9 (m, 1H, CH), 1.65 (m, 6H, CH2), 1.5 (m, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値300.19/300.2.
【０２５０】
化合物16:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.55 (s, 1H, NH), 7.9 (dd, 2H, CPhH), 7.7 (dd, 2H, CPhH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.1 (m, 5H, 4CPhH, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値319.12/319.2.
【０２５１】
化合物17:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.2 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.45 (dd, 2H, CPhH), 7.3 (d, 1H, CimidH), 7.2 (dd, 2H, CPhH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2), 2.4 (d, 2H, CH2), 1.8 (m, 1H, CisopropH), 0.9 (d, 6H, 2CisopropH3) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値258.18/258.2.
【０２５２】
化合物18:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.35 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.56 (dd, 2H, CPhH), 7.34 (dd, 2H, CPhH), 7.18 (d, 1H, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2), 3.55 (五重線, 1H, CH), 2 (m, 2H, CH2), 1.7 (m, 2H, CH2), 1.5 (m, 4H, 2CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値302.15/302.2.
【０２５３】
化合物19:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.5 (s, 1H, NH), 7.7 (m, 6H, CPhH), 7.4 (m, 3H, CPhH), 7.1 (d, 1H, CimidH), 6.75 (d, 1H, CimidH), 4.85 (s, 2H, CH2), 2.3 (s, 3H, CH3) ppm. 
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値292.16/292.2.
【０２５４】
化合物20:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.5 (s, 1H, NH), 8.55 (d, 2H, CpyrH), 7.7 (m, 6H, CPhH), 7.4 (m, 5H, 3CPhH, 2CpyrH), 3.8 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値289.15/289.0.
【０２５５】
B.化合物2、4、6、7、11及び14の合成
化合物2、4、6、7、11及び14は、以下の一般合成スキームに従って調製することができる。
【０２５６】
【化１７】
2019525929.tif 000041
【０２５７】
実験:
ジメチルホルムアミド(7mL)中、対応する2-クロロ-N-フェニルアセトアミド(1mmol)、イミダゾール(1.5mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.35ml、2mmol)の混合物を、60℃で16時間撹拌した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、水(35ml)で処理した。粗生成物をろ過し、アセトニトリルからの再結晶化によって、又はHPLCクロマトグラフィー(メタノール/水)によって精製した。収率:出発物質の構造に応じて15〜70%。
【０２５８】
化合物2、4、6、7、11及び14の各々についてのスペクトルデータを以下に列挙する。
【０２５９】
化合物2:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.5 (s, 1H, NH), 7.7 (m, 6H, CPhH), 7.5 (m, 2H, CPhH), 7.35  (m, 1H, CPhH), 7.1 (d, 1H, CimidH), 6.8 (d, 1H, CimidH), 4.95 (s, 2H, CH2), 3.0 (sep, 1H, CisopropH), 1.2 (d, 6H, 2CisopropH3) ppm. 
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値320.2/320.2.
【０２６０】
化合物4:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.5 (s, 1H, NH), 8.5 (d, 1H, CpyrH), 8.15 (d, 1H, CpyrH), 7.9 (t, 1H, CpyrH), 7.65 (m, 6H, CPhH), 7.45 (m, 2H, CPhH), 7.4 (d, 1H, CimidH), 7.35 (m, 2H, CPhH, CpyrH), 7.1 (d, 1H, CimidH), 5.5 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値355.17/355.2.
【０２６１】
化合物6:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.55 (s, 1H, NH), 7.9 (t, 1H, CPhH), 7.7 (d, 1H, CPhH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.45 (m, 6H, CPhH), 7.2 (d, 1H, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 5.0 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値312.1/312.2.
【０２６２】
化合物7:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.45 (s, 1H, NH), 7.66 (m, 6H, CPhH), 7.62 (m, 2H, CPhH), 7.46 (m, 5H, CPhH), 7.35 (m, 2H, CPhH, CimidH), 7.1 (d, 1H, CimidH), 4.95 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値354.18/354.1.
【０２６３】
化合物11:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.5 (s, 1H, NH), 8.85 (d, 1H, CpyrH), 8.6 (d, 1H, CpyrH), 8.05 (d, 1H, CpyrH), 7.65 (m, 6H, CPhH), 7.45 (m, 3H, 2CPhH,CpyrH), 7.4 (d, 1H, CimidH), 7.3 (m, 1H, CPhH), 7.1 (d, 1H, CimidH), 5.05 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値355.17/355.2.
【０２６４】
化合物14:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.55 (s, 1H, NH), 7.62 (m, 2H, CPhH, CimidH), 7.57 (m, 1H, CPhH), 7.35 (t, 2H, CPhH), 7.06 (m, 2H, CPhH, CimidH), 6.95 (m, 4H, CPhH), 6.86 (d, 1H, CimidH), 4.85 (s, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値294.13/294.2.
【０２６５】
C.化合物30の合成
化合物30は、以下の合成スキームに従って調製することができる。
【０２６６】
【化１８】
2019525929.tif 000042
【０２６７】
実験:
ジメチルホルムアミド(7mL)中、(3-{[(エチルイミノ)メチリデン]アミノ}プロピル)ジメチルアミン塩酸塩(EDC・HCl)(1.2mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1.2mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.35ml、2mmol)、2-(1H-イミダゾール-1-イル)酢酸(1.2mmol)及び3-メチル-4-フェニルアニリン(1mmol)の混合物を、室温で36時間撹拌した。次いで、反応混合物を水(35mL)で処理し、粗生成物をろ過し、アセトニトリルからの再結晶化によって精製した。収率:40%。
【０２６８】
化合物30についてのスペクトルデータを以下に列挙する。
【０２６９】
化合物30:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.55 (s, 1H, NH), 7.65 (s, 1H, CimidH), 7.45 (m, 4H, CPhH), 7.37 (m, 3H, CPhH),7.17 (m, 2H, CPhH, CimidH), 6.9 (d, 1H, CimidH), 4.9 (s, 2H, CH2), 2.2 (s, 3H, CH3) ppm. 
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値292.16.1/292.0.
【０２７０】
D.化合物5の合成
化合物5は、以下の合成スキームに従って調製することができる。
【０２７１】
【化１９】
2019525929.tif 000043
【０２７２】
化合物5からのスペクトルデータを以下に列挙する。
【０２７３】
化合物5:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 10.9 (s, 1H, NH), 7.95 (d, 1H, CpyH), 7.65 (d, 1H, CpyH), 7.3-7.5 (m, 6H, CPhH; CimidH), 4.85 (s, 2H, CH2CO), 2.4 (m, 4H, 2CH2; s, 3H, CH3), 1.7 (m, 4H, 2CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値347.21/347.2.
【０２７４】
E.化合物31の合成
ジメチルアセトアミド(7mL)中、4-クロロ-2-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロキナゾリン(0.183g、1mmol)、1-ベンジル-1,4-ジアゼパン(0.228g、1.2mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.35mL、2mmol)の混合物を90℃で16時間撹拌した。次いで、反応混合物を室温に冷却し、ブライン(35mL)で処理した。混合物を酢酸エチル(2×70mL)で抽出した。合わせた有機層を、水(70mL)、ブライン(70mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。HPLCクロマトグラフィー(メタノール/水)による精製により、0.188g(0.56mmol、56%収率)の化合物31を油状物として得た。LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値337.48/337.4.
【０２７５】
F.化合物32の合成
化合物32は、以下の合成スキームに従って調製することができる。
【０２７６】
【化２０】
2019525929.tif 000044
【０２７７】
化合物32からのスペクトルデータを以下に列挙する。
【０２７８】
化合物32:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 8.3 (s, 1H, CquinH), 7.3 (m, 5H, CPhH), 3.55 (s, 2H, CH2Ph), 3.5 (m, 4H, 2CH2), 2.7 (m, 4H, 2CH2), 2.55 (m, 4H, 2CH2), 1.85 (m, 2H, CH2), 1.75 (m, 2H, CH2), 1.6 (m, 4H, 2CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値337.28/337.2.
【０２７９】
G.化合物33の合成
化合物33は、以下の合成スキームに従って調製することができる。
【０２８０】
【化２１】
2019525929.tif 000045
【０２８１】
化合物33からのスペクトルデータを以下に列挙する。
【０２８２】
化合物33:
1H NMR (DMSO-d6): δ = 8.3 (s, 1H, CquinH), 7.3 (m, 5H, CPhH), 3.65 (m, 4H, 2CH2), 3.55 (s, 2H, CH2Ph), 2.7 (m, 4H, 2CH2), 2.55 (m, 4H, 2CH2), 1.85 (m, 2H, CH2), 1.75 (m, 2H, CH2), 1.6 (m, 2H, CH2) ppm.
LS-MS (m/z): [M+H]+の計算値/実測値323.26/323.2.
【０２８３】
[実施例2]
化合物1〜4及び31のエームス試験
細菌を用いる復帰変異アッセイ(エームス試験)を使用して、試験化合物1〜4及び31の変異特性を評価した。試験には、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)及び大腸菌(Escherichia coli)のアミノ酸依存系統を使用して、1つ又は数個のDNA塩基対の置換、付加又は欠失が関与する点変異を検出した。点変異を、ヒスチジン(ネズミチフス菌)又はトリプトファン(大腸菌)オペロンにおいて誘導し、試験系統がこれらのアミノ酸を生成できないようにした。試験により、細菌中に存在する変異を復帰させて、ヒスチジン又はトリプトファンを合成する機能的能力を復活させる変異が検出された。復帰変異体細菌を、親試験系統によって必要とされるアミノ酸の非存在下において増殖する能力によって検出した。試験化合物の変異潜在性を、これらの細菌系統を異なる濃度の化合物に曝露し、アミノ酸の非存在化(痕跡量)で増殖した復帰変異体コロニーの数を概算することによって評価した。
【０２８４】
A.材料及び機器
アッセイにおいて使用した細胞系統としては、ネズミチフス菌株TA 98(Xenometrix PSS-0110)、TA 100(Xenometrix PSS-0111)、TA 1535(Xenometrix PSS-0112)及びTA 1537(Xenometrix PSS-0113)、並びに大腸菌系統wp2[pKM101](Xenometrix PSS-0116)及びwp2 uvrA(Xenometrix PSS-0115)が含まれた。
【０２８５】
試薬及び消耗品としては:DMSO(Sigma、カタログ番号34869)、45mMの試験化合物のDMSOストック溶液、硫酸マグネシウムMgSO4・H2O(Fluka、カタログ番号83266)、クエン酸一水和物(Enamine、Ukraine)、第二リン酸カリウムK2HPO4(Helicon、カタログ番号Am-0348)、リン酸ナトリウムアンモニウムNa2NH2PO4(Sigma、カタログ番号S9506)、D-グルコース一水和物(Sigma、カタログ番号49158)、寒天(Sigma、カタログ番号A1296)、L-ヒスチジン(Sigma、カタログ番号H6034)、ビオチン(Sigma、カタログ番号B4639)、L-トリプトファン(Sigma、カタログ番号T8941)、普通ブロス(nutrient broth)#2(Oxoid、カタログ番号CV0067)、アンピシリン(Sigma、カタログ番号A9393)、2-ニトロフルオレン(Sigma、カタログ番号N16754)、4-ニトロキノリンN-オキシド(Sigma、カタログ番号N8141)、9-アミノアクリジン(Enamine、Ukraine、T5111202)、アジ化ナトリウム(Helicon、カタログ番号Am-0639)、塩化ナトリウム(Sigma、カタログ番号S3014)、塩化マグネシウムMgCl2・6H2O(Sigma、カタログ番号M2670)、35mmペトリ皿(Corning、カタログ番号430588)、及び1.5mLエッペンドルフチューブ(Greiner bio-one、カタログ番号616201)が含まれた。
【０２８６】
使用した培地は、Vogel-Bonner E培地(7.5mM MgSO4、10mMクエン酸一水和物、60mM K2HPO4、15mM Na2NH2PO4)、GM培地(最少グルコース寒天培地)(0.5%グルコース、1.5%寒天を添加したVogel-Bonner E培地)、GM液体培地(最少グルコース培地)(0.5%グルコースを添加したVogel-Bonner E培地)、並びにトップアガー(0.6%寒天、0.6% NaCl、0.05mMヒスチジン及び0.05mMビオチン(ネズミチフス菌(S.typhimurium)について)又は0.05mMトリプトファン(大腸菌(E.coli)について))であった。
【０２８７】
機器としては、Innova 4080インキュベーター振とう機(New Brunswick Scientific、USA)、BioMate 3 UV/Vis分光光度計(Thermo Scientific、USA)、Termaksインキュベーター、B8054(Termaks、Norway)、水精製システムNANOpure Diamond D11911(Thermo Scientific Barnstead、USA)、並びにピペッター2〜20μL、20〜100μL及び100〜1000μL(Thermo Scientific、USA)が含まれた。
【０２８８】
B.方法
試験化合物並びに陽性及び陰性対照を用いた実験を、5種の試験系統(ネズミチフス菌:TA 98、TA 100、TA 1535、TA 1537、及び大腸菌:1:2混合したwp2[pKM101]+wp2 uvrA)に対して2連で行った。陽性対照として、既知の変異活性を有する化合物:TA 98について2-ニトロフルオレン(0.1μg/プレート)、TA 100について4-ニトロキノリンN-オキシド(0.02μg/プレート)、TA 1535についてNaN3(0.15μg/プレート)、TA 1537について9-アミノアクリジン(7.5μg/プレート)、及び大腸菌について4-ニトロキノリンN-オキシド(0.02μg/プレート)を使用した。DMSOを陰性対照として使用した。
【０２８９】
各実験のために、試験系統培養物を、235rpmで振とうしながらOxoid普通ブロス#2中37℃で終夜増殖させて、1〜2×109コロニー形成単位/mL(OD540約2)の密度とした。
【０２９０】
試験系統(10μLの終夜培養物)を、試験薬(10μLのDMSOストック)及びGM液体培地(30μL)と混合した。得られた混合物を、1.5mL滅菌チューブ中、室温で5分間インキュベートした。次いで、チューブに、44℃で保存した溶融トップアガー200μLを添加して、固化を防いだ。ピペットを用いて混合した後、混合物をGM寒天プレート(プレート当たり2.0mLのGM寒天)の表面に注いだ。トップアガーが固化した後、プレートを逆さにし、37℃で48時間インキュベートした。次いで、結果を、プレート当たりの復帰変異体コロニーの数として表した。
【０２９１】
C.結果
試験化合物の最終濃度を、50μM、100μM及び200μMであると決定した。化合物1及び4について、200μMの最終濃度のサンプルの系統-化合物-GM培地混合物中で沈殿物が観察された。
【０２９２】
試験化合物1、2、4及び31は、試験系統に対する変異潜在性を有さなかった。200μMの濃度の試験化合物3は、試験系統TA 98、TA 1537、TA 1535及び大腸菌についての変異活性が明らかになった。化合物3は、系統TA 100について、100及び200μMの両方で変異活性を有した。
【０２９３】
結果を以下の表4に示す。
【０２９４】
【表４】
2019525929.tif 000046
2019525929.tif 000047
【０２９５】
[実施例3]
化合物1〜4及び31についての細胞毒性の評価
化合物1〜4及び31を、細胞毒性アッセイにおいて試験した。アッセイは、生細胞の細胞質の還元性環境における非蛍光色素レサズリンの蛍光化合物レゾルフィンへの変換に基づいた。サンプル中の生細胞が多いほど、蛍光が高くなり、生細胞が少ないほど蛍光が低くなる。
【０２９６】
A.材料及び機器
試薬及び消耗品としては:DMSO Chromasolv Plus、HPLCグレード、≧99.7%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34869)、L-グルタミンを含まないDMEM(4.5g/L)液(PAA、UK、カタログ番号E15-009)、Ca及びMgを含まないダルベッコPBS(1×)(PAA、UK、カタログ番号H15-002)、L-グルタミン(200mM)(PAA、UK、カタログ番号M11-004)、EUで承認されたウシ胎仔血清「GOLD」(PAA、UK、カタログ番号A15-151)、ペニシリン/ストレプトマイシン(100×)(PAA、UK、カタログ番号P11-010)、レサズリン(SynbiaS、Ukraine、カタログ番号62758-13-8)、ドキソルビシン、注射溶液用バリウム(Arterium、Ukraine、医薬品)、DPBS中トリプシンEDTA(10×)0.5%/0.2%(PAA、UK、カタログ番号L11-003)、Costar(登録商標)ポリスチレン蓋付丸底96ウェル細胞培養クラスター(Corning Incorporated、カタログ番号3790)、使い捨ピペッターチップ(Thermo Scientific、Fisherbrand、Eppendorf、USA)、遠心分離チューブ、50mL(Santa Cruz、USA、カタログ番号sc-200251)、Falcon(登録商標)96ウェルプレート、黒色/透明(BD、カタログ番号358078)、並びに血清用ピペット5mL、10mL、25mL(Greiner Bio-One)が含まれた。
【０２９７】
機器としては:細胞培養CO2インキュベーター、モデルCCL-170B-8(ESCO、Singapore)、遠心分離機5804R(Eppendorf、USA)、エッチング血球計数器、暗線計数チャンバー(Hausser Scientific、USA、カタログ番号3500)、CyBi(登録商標)-SELMA、半自動96倍ピペッター(Analytik Jena AG)、Labculture生物学用安全キャビネット、クラスII、タイプA2(ESCO)、倒立顕微鏡、モデルCK2(オリンパス株式会社、日本)、顕微鏡Leica DM LS2(Leica Microsystems Wetzlar GmbH、Germany)、マルチモードマイクロプレートリーダーPOLARstar Omega(BMG Labtech GMBH、Germany)、Titertek Multidrop 384モデル832(Thermo Scientific/Titertek、USA)、StakMaxマイクロプレート操作システム(Molecular Devices)、PIPETMANピペット2〜20μL、50〜200μL、200〜1000μL(Gilson、USA)、及びマルチチャンネル電動ピペット2〜125μL、5〜250μL、15〜1250μL、Matrix(Thermo Scientific、USA)が含まれた。
【０２９８】
B.方法
HepG2細胞を、75cm2フラスコにおいて、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で、80〜90%コンフルエンスまで培養し、1:4の継代培養比で週に2回分割した。細胞層をPBSですすいで、血清の痕跡をすべて除去した。次いで、0.25%(w/v)トリプシン及び0.53mM EDTAを含有する3.0mLの溶液をフラスコに添加し、約10分間インキュベートした。HepG2細胞を、スクレーパーを使用して剥がし、10% FBS及び2mMグルタミンを含有するDMEMに再懸濁した。5×105個の細胞/mLの最終濃度の細胞懸濁液を、以前に記載された通り(McMillianら  (2002) Cell Biol. Toxicol. 18(3):157〜173頁、Mulvihillら  (2009) Future Med. Chem. 1(6):1153〜1171頁)、滅菌96ウェル黒色壁透明平底プレートに分注し、試験化合物を添加した。
【０２９９】
化合物DMSOストック溶液を、PBSで希釈して1mMの中間濃度を達成した。細胞増殖評価を、0.1μM〜100μMの範囲の異なる化合物濃度で実施した。20μMの最終濃度のドキソルビシンを、陽性対照として使用した。化合物の添加後、細胞を37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中で24時間インキュベートした。
【０３００】
レサズリンを最終濃度(50μM)まで添加し、同じ条件下で4時間インキュベートした。レゾルフィンの存在(細胞生存率)を、蛍光を測定することによって(励起490nm、発光540nm、Vega-Avila及びPugsley(2011) Proc. West Pharmacol. Soc. 54:10〜14頁を参照されたい)、定量した。
【０３０１】
細胞増殖阻害のパーセントを、以下の式:
【０３０２】
【数１】
2019525929.tif 000048
[式中、
CPIは、細胞増殖阻害率であり、
AVG高対照は、細胞懸濁液及びPBSを含有するウェルのRFUの平均であり、
ウェルRFUは、試験化合物を含む標的ウェルのRFUであり、
AVG低対照は、細胞懸濁液及びドキソルビシンを含有するウェルのRFUの平均である]
を適用することによって計算した。
【０３０３】
IC50値は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して計算した。
【０３０４】
C.結果
ドキソルビシンを参照化合物として使用して、細胞増殖の阻害を評価した。20μMのドキソルビシンによるHepG2細胞増殖阻害のデータを高対照として使用し、RFUの値を100%の阻害とみなした。
【０３０５】
化合物1〜4及び31によるHepG2細胞増殖阻害率(%)を以下の表5に列挙する。
【０３０６】
【表５】
2019525929.tif 000049
【０３０７】
100μM〜0.1μMの範囲の異なる濃度でのHepG2細胞の増殖阻害試験の結果に基づくと、いずれの試験化合物も有意な細胞毒性効果を示さなかった。
【０３０８】
[実施例4]
化合物1〜4及び31についてのインビトロ予測因子hERG蛍光偏光アッセイ
化合物1〜4及び31に結合するヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子(hERG)の予備評価である蛍光偏光アッセイを実施した。蛍光偏光(FP)読取り技術は、小蛍光分子(トレーサー)が偏光によって励起される場合、放出光は、その蛍光寿命の間に溶液中の分子が急速回転するために大幅に偏光解消されるという観察に基づく。hERG予測因子アッセイにより、試験化合物のカリウムチャネルへの結合の可能性及び心エコー図に対するQT延長の潜在性についての価値ある情報がもたらされる。
【０３０９】
A.材料及び機器
使用した試薬及び消耗品としては、DMSO Chromasolv Plus、HPLCグレード、≧99.7%(Sigma-Aldrich、USA、ロット番号34869)、Predictor(商標)hERG蛍光偏光アッセイキット(Invitrogen、カタログ番号PV5365)、Corningアッセイプレート、384ウェル、U底、黒色ポリスチレン(Corning、USA、カタログ番号3677)、並びに化合物1〜4及び31が含まれた。
【０３１０】
機器としては、TECAN ULTRA多機能プレートリーダー(Tecan、Austria)、マイクロピペット0.5〜5μL、2〜20μL、15〜200μL、100〜1000μL(Finntip、Eppendorf、Gilson)、マルチチャンネルピペット(30μL)(Thermo Matrix、USA)、及び水精製システム、NANOpure Diamond D11911(Thermo Scientific Barnstead、USA)が含まれた。
【０３１１】
B.方法
すべての実験を、製造元のプロトコルPV5365(Invitrogen、Carlsbad、CA)に従ってPredictor(商標)hERG蛍光偏光アッセイを使用して実施した。
【０３１２】
hERG反応を、トレーサー及び膜を溶液中でhERGチャネルとともに2〜4時間インキュベートすることによって実施した。蛍光偏光は、トレーサー及びhERG膜の反応に干渉するものがない場合、最大(最少のトレーサー回転)であった。しかし、試験化合物がhERGチャネルについてトレーサーと競合する場合、遊離非結合トレーサーが溶液中で急速に回転することができるため、放出光の偏光は低減する。参照化合物(E-4031、製造元によって提供された)を使用して、アッセイ性能を検証した。E-4031の較正曲線を使用して、実施したアッセイにおけるE-4031のIC50を、製造元によって提供されたデータと比較した。GraphPad Prismソフトウェアの「S字形用量応答(可変勾配)」関数を、較正曲線の構築及びE-4031評価のためのIC50の計算のために使用した。E-4031についてのIC50値は、公開されたデータに従っておよそ70nMであることが見出された。
【０３１３】
化合物についてのすべての試験ポイントは、4連で実施した。試験化合物の3種の希釈物、1μM、5μM及び20μMを評価した。
【０３１４】
陽性及び陰性対照の組(アッセイブランク-トレーサー添加なし、アッセイ陰性-100%トレーサー置換を表し、最少アッセイ偏光値をもたらす30μMのE-4031)を、4回繰り返し実施した。
【０３１５】
C.結果
化合物1、2、3及び31は、有意かつ用量応答性のトレーサー結合阻害を示したが、これはhERG障害の存在の可能性を示唆している。化合物4は、用量応答ではない、低いトレーサー結合阻害を示した。以下の表6及び図18を参照されたい。
【０３１６】
【表６】
2019525929.tif 000050
【０３１７】
[実施例5]
化合物1〜4及び31についてのCaco-2 A-B浸透性の評価
Caco-2浸透性アッセイを実施して、Caco-2細胞株にわたる化合物の輸送速度を測定することによって腸におけるインビボ薬物吸収を予測することによって、化合物1〜4及び31の経口投与への適合性を決定した。
【０３１８】
A.材料及び機器
使用した試薬及び消耗品としては:DPBS中トリプシンEDTA(10×)0.5%/0.2%(PAA、UK、カタログ番号L11-003)、HEPES、高純度グレード(Helicon、Am-0485)、Ca及びMgを含まないダルベッコPBS(1×)(PAA、UK、カタログ番号H15-002)、Ca及びMgを含まず、フェノールレッドを含まないハンクスBSS(1×)(PAA、UK、カタログ番号H15-009)、DMSO Chromasolv Plus、HPLCグレード、≧99.7%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34869)、L-グルタミンを含まないDMEM(4.5g/L)液(PAA、UK、カタログ番号E15-009)、L-グルタミン(200mM)(PAA、UK、カタログ番号M11-004)、EUで承認されたウシ胎仔血清「GOLD」(PAA、UK、カタログ番号A15-151)、ペニシリン/ストレプトマイシン(100×)(PAA、UK、カタログ番号P11-010)、アセトニトリルChromasolv、HPLC用勾配グレード、≧99.9%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34851)、質量分析用ギ酸、約98%(Fluka、USA、カタログ番号94318)、培地フィーダートレイを備えるFalcon(登録商標)HTS 24マルチウェル挿入システム(BD Biosciences、USA、製品番号351181)、Falcon(登録商標)24ウェルTC処理細胞PS浸透性担体付プレート(BD、製品番号353504)、遠心分離チューブ、50mL(Santa Cruz、USA、カタログ番号sc-200251)、血清用ピペット5mL、10mL、25mL(Greiner Bio-One)、使い捨てピペッターチップ(Thermo Scientific、Fisherbrand、Eppendorf、USA)、マイクロラック中1.1mLマイクロチューブ(Thermo Scientific、USA)、Zorbax Eclipse Plus C18カラム2.1×50mm、3.5μm(Agilent Technologies, Inc.、USA)、塩酸プロプラノロール  ≧99%(TLC)、粉末(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号P0884)、塩酸イミプラミン  ≧99%(TLC)(Sigma-Aldrich、USA、ロット番号I7379)、及びアテノロール、分析参照物質、≧98.5%(HPLC)(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号74827)が含まれた。
【０３１９】
機器としては:細胞培養物CO2インキュベーター、モデルCCL-170B-8(ESCO、Singapore)、遠心分離機5804R(Eppendorf、USA)、遠心分離機4-15C(Qiagen)(Sigma、Germany)、エッチング血球計数器、暗線計数チャンバー(Hausser Scientific、USA、カタログ番号3500)、勾配HPLCシステムVP(株式会社島津製作所、日本)、Innova 4080インキュベーター振とう機(New Brunswick Scientific、USA)、Millicell-ERSシステム電気抵抗器(Millipore、カタログ番号MERS 000 01)、TurboIonSpray Electrosprayモジュールを備えるMS/MS検出器API 3000 PE(PE Sciex、USA)、マルチチャンネル手動ピペット(Thermo Labsystems Finnpipette、FA16-50R)、マルチチャンネル電動ピペット2〜125μL、5〜250μL、15〜1250μL、Matrix(Thermo Scientific、USA)、PIPETMANピペット2〜20μL、50〜200μL、200〜1000μL(Gilson、USA)、VWR膜窒素発生器N2-04-L1466、窒素純度99%+(VWR、USA)、及び水精製システムNANOpure Diamond D11911(Thermo Scientific Barnstead、USA)が含まれた。
【０３２０】
すべての測定を、真空脱気器、勾配ポンプ、逆相HPLCカラム、カラムオーブン及び自動回収装置を含むShimadzu VP HPLCシステムを使用して実施した。HPLCシステムを、タンデム質量分析計API 3000(PE Sciex)に連結した。TurboIonSprayイオン源を、陽及び陰イオンモードの両方で使用した。データの取得及び分析は、Analyst 1.5.2ソフトウェア(PE Sciex)を使用して実施した。
【０３２１】
LC-MS条件は、以下の通りであった。カラム: Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、移動相A:アセトニトリル:水:ギ酸=100:1000:1、移動相B:アセトニトリル:ギ酸=1000:1、勾配:0分25% B、1.1分100% B、1.5分100% B、1.51分25% B、2.7分停止、溶出速度: 400μL/分、カラム温度:30℃、注入容量:2μL、イオン源:Turboスプレー、イオン化モデル:ESI、スキャンタイプ:陽Q3多重イオン、噴霧ガス:15L/分、カーテンガス:8L/分、イオンスプレー電圧:5000V、温度:400℃。
【０３２２】
B.方法
Caco-2細胞を、ATCC及びMillipore推奨(MilliporeプロトコルノートPC1060EN00P)に従って、75cm2フラスコにおいて、37℃及び5%CO2の加湿雰囲気中、80〜90%コンフルエンスまで培養した。細胞を、トリプシン/EDTA溶液で剥がし、細胞培養培地に再懸濁して2×105個の細胞/mLの最終濃度とした。500μLの細胞懸濁液を、HTS 24マルチウェル挿入システムの各ウェルに添加し、35mLの予備加温した完全培地をフィーダートレイに添加した。Caco-2細胞を、マルチウェル挿入システム中で、輸送実験前10日間インキュベートした。フィルタープレート及びフィーダートレイ中の培地を、1日おきに交換した。10日間の細胞増殖後、単層の完全性を、Millicell-ERSシステム電気抵抗器を使用して、すべてのウェルについて経上皮電気抵抗(TEER)を測定することによって検証した。得られたTEER値は、アッセイ条件によって必要とされる通り、1000Ω超(1400〜1500Ω)であった。24ウェル挿入プレートを、そのフィーダープレートから取り出し、新しい滅菌24ウェル輸送分析プレートに置いた。培地を吸引し、挿入物をPBSで洗浄した。
【０３２３】
頂端(A)から基底(B)方向の薬物輸送速度を決定するために、緩衝液(HBSS、5.6mMグルコース、10mM HEPES、pH=7.4)中、300μLの試験化合物溶液をフィルターウェルに添加し、1000μLの同じ緩衝液を輸送分析プレートのウェルに添加した。プレートを50rpmで振とうしながら37℃で90分間インキュベートした。アリコート75μLを、LC-MS/MS分析のために頂端及び基底区画から取った。LC-MS/MS分析のためのすべてのサンプルを、アセトニトリル(×2体積)によって抽出し、続いて10000rpmで10分間遠心分離することによってタンパク質を沈降させた。上清を、タンデム質量分析計に連結したHPLCシステムを使用して分析した。
【０３２４】
イミプラミン、プロプラノロール(高浸透性)及びアテノロール(低浸透性)を、参照化合物として使用した。
【０３２５】
見かけ浸透性(Papp)を、以下の方程式:
Papp=(VA/((面積)×(時間))×([薬物]acc/[薬物]initial,d)
[式中:VAは、アクセプターウェル中の輸送緩衝液の体積であり、
面積は、挿入物の表面積(挿入物の有効増殖面積、0.31平方cmに等しい)であり、
時間は、アッセイ時間であり、
[薬物]accは、アクセプターウェル中の試験化合物の濃度であり、
[薬物]initial,dは、ドナーウェル中の試験化合物の初期濃度であり、
Pappは、10-6cm/秒で表す]
を使用してCaco-2浸透性アッセイのために計算した。
【０３２６】
C.結果
化合物1〜4及び31、並びに参照化合物イミプラミン、プロプラノロール及びアテノロールについてのA-B浸透性データを以下の表7に列挙する。参照化合物についてのA-B浸透性値は、文献データに相当する(例えば、Lauら  (2004) Drug Metab. Dispos. 32:937〜942頁、Fujikawaら  (2005) Bioorg. Med. Chem. 13(15):4721〜4732頁、Rubasら  (1996) J. Pharm. Sci. 85(2):165〜169頁を参照されたい)。すべての試験化合物の浸透性は、中から高浸透性として分類することができる。
【０３２７】
【表７】
2019525929.tif 000051
【０３２８】
[実施例6]
化合物1〜4及び31のマウス肝ミクロソームにおける代謝安定性の評価
化合物1〜4及び31、並びに2種の参照化合物(イミプラミン及びプロプラノロール)の、肝ミクロソームにおける代謝安定性を、HPLC-MSを使用して40分間にわたる5つの時点で決定した。代謝安定性は、げっ歯類肝ミクロソーム画分等の代謝活性試験系の存在下における経時的な親化合物喪失の百分率として定義した。
【０３２９】
A.材料及び機器
使用した試薬及び消耗品としては:DMSO Chromasolv Plus、HPLCグレード、≧99.7%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34869)、アセトニトリルChromasolv、HPLC用勾配グレード、≧99.9%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34851)、第一リン酸カリウムACSグレード(Helicon、カタログ番号Am-O781)、第二リン酸カリウムACSグレード(Helicon、カタログ番号Am-O705)、塩化マグネシウム六水和物(Helicon、カタログ番号Am-O288)、雄性BALB/cマウスのプールされた肝臓由来のミクロソーム、パン酵母由来のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(出芽酵母(S. cerevisiae))、タイプXV(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号G6378)、グルコース-6-リン酸ナトリウム塩、Sigmaグレード、結晶(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号G7879)、NADPHテトラナトリウム塩、≧95%(Santa Cruz Biotechnology, Inc.、USA、カタログ番号sc-202725)、質量分析用ギ酸、約98%(Fluka、USA、カタログ番号94318)、10mM試験化合物のDMSOストック溶液、プロプラノロール塩酸塩≧99%(TLC)、粉末(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号P0884)、塩酸イミプラミン≧99%(TLC)(Sigma-Aldrich、USA、ロット番号I7379)、Zorbax Eclipse Plus C18カラム2.1×50mm、3.5μm(Agilent Technologies, Inc. USA)、及びマイクロラック中1.1mLマイクロチューブ、ピペッターチップ(Thermo Scientific、USA)が含まれた。
【０３３０】
機器としては、勾配HPLCシステムVP(株式会社島津製作所、日本)、TurboIonSpray Electrosprayモジュールを備えるMS/MS検出器API 3000 PE(PE Sciex、USA)、VWR膜窒素生発生器N2-04-L1466、窒素純度99%+(VWR、USA)、Innova 4080インキュベーター振とう機(New Brunswick Scientific、USA)、水精製システムNANOpure Diamond D11911(Thermo Scientific Barnstead、USA)、遠心分離機4-15C(Qiagen)(Sigma、Germany)、及びマルチチャンネル電動ピペット2〜125μL、5〜250μL、15〜1250μL、Matrix(Thermo Scientific、USA、カタログ番号2001、2002、2004)が含まれた。
【０３３１】
すべての測定を、真空脱気器、勾配ポンプ、逆相HPLCカラム、カラムオーブン及び自動回収装置を含むShimadzu VP HPLCシステムを使用して実施した。HPLCシステムを、タンデム質量分析計API 3000(PE Sciex)に連結した。TurboIonSprayイオン源を、陽及び陰イオンモードの両方で使用した。データの取得及び分析は、Analyst 1.5.2ソフトウェア(PE Sciex)を使用して実施した。
【０３３２】
B.方法
マウス肝ミクロソームを、標準プロトコル(Hill, J.R. Current Protocols in Pharmacology 7.8.1〜7.8.11、Wiley Interscience、2003)に従って、BALB/c雄性マウスのプールし(50)、灌流した肝臓から単離した。ミクロソームのバッチを、イミプラミン、プロプラノロール及びベラパミルを参照化合物として使用して、品質管理のために試験した。ミクロソームのインキュベーションを、96ウェルプレート中、各々40μLの5つのアリコート(各時点について1つずつ)で実施した。肝ミクロソームインキュベーション培地は、PBS(100mM、pH7.4)、MgCl2(3.3mM)、NADPH(3mM)、グルコース-6-ホスフェート(5.3mM)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(0.67単位/mL)を、1mL当たり0.42mgの肝ミクロソームタンパク質とともに含有した。対照インキュベーションを、NADPH-補因子システムをPBSで置き換えて実施した。化合物1〜4及び31(2μM、最終溶媒濃度1.6%)を、100rapmで振とうしながら37℃でミクロソームとともに各々インキュベートした。インキュベーションは、2連で実施した。40分間にわたる5つの時点を分析した。反応を、インキュベーションアリコートに12体積の90%アセトニトリル-水を添加することによって停止し、続いて、5500rpmで3分間の遠心分離によってタンパク質を沈降させた。上清を、タンデム質量分析計に連結したHPLCシステムを使用して分析した。除外定数(kel)、半減期(t1/2)及び固有クリアランス(Clint)を、ln(AUC)対時間のプロットにおいて、線形回帰分析:
【０３３３】
【数２】
2019525929.tif 000052
を使用して決定した。
【０３３４】
線形回帰分析の品質を示すために、R(相関係数)値を提示した。一部の場合には、最後の時点は崩壊の許容される対数線形性を確実にするために計算から除外した。
【０３３５】
C.結果
2種の参照化合物(イミプラミン及びプロプラノロール)、並びに化合物1〜4及び31についてのマウスミクロソームの安定性データを図19A〜19Dに示す。マウス肝ミクロソーム試験系において、化合物4及び31は、低安定性を示し、化合物1及び2は、中程度の安定性を示し、化合物3は高い代謝安定性を示した。「補因子なし」対照データにより、観察された不安定性は主にCYP450活性によって決定されたことが示された。
【０３３６】
[実施例7]
化合物1〜4及び31についてのインビトロCYP450阻害
単一の化合物濃度(10μM)の化合物1〜4及び31による主要CYP450パネル(1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)の阻害の予備評価を行った。CYP450阻害プロファイリングにより、試験化合物について任意の可能な薬物間相互作用に関する価値ある情報がもたらされる。
【０３３７】
A.材料及び機器
使用した試薬及び消耗品としては:DMSO Chromasolv Plus、HPLCグレード、≧99.7%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34869)、アセトニトリルChromasolv、HPLC用勾配グレード、≧99.9%(Sigma-Aldrich、USA、カタログ番号34851)、CYP 1A2(カタログ番号V9770)、CYP 2C9(カタログ番号V9790)、CYP 2C19(カタログ番号V9880)、CYP 2D6(カタログ番号V9890)、CYP 3A4(カタログ番号V9800)及びLuciferin-PPXE(カタログ番号V9910)を含むP450-Glo(商標)スクリーニングシステム(Promega Corp.)、Corningアッセイプレート384ウェル(Corning、USA、カタログ番号3673)、並びにMatrix96ウェルアッセイプレート(Matri、Thermo Scientific、USA、カタログ番号4919)が含まれた。
【０３３８】
機器としては:マルチモードマイクロプレートリーダーPOLARstar Omega(BMG Labtech GMBH、Germany)、乾式サーモスタットCT50(Ukrorgsynthez、Ukraine、CT 50)、マイクロピペット0.5〜5μL、2〜20μL、15〜200、100〜1000μL(Finntip、Eppendorf、Gilson)、及びマルチチャンネル電動ピペット1.0〜30μL、Matrix(Thermo Scientific、USA、カタログ番号2060)が含まれた。
【０３３９】
B.方法
すべての実験を、製造元のプロトコルに従ってP450-Glo(商標)アッセイシステム(Promega)を使用して実施した。P450-Glo(商標)アッセイにより、シトクロームP450活性を測定するための、ルミネセンス読取りに基づく方法が提供される。従来のシトクロームP450反応は、シトクロームP450及び発光性シトクロームP450基質をインキュベートすることによって実施された。P450-Glo(商標)アッセイにおける基質は、甲虫ルシフェリンの誘導体である。誘導体それ自体はルシフェラーゼの基質ではないが、シトクロームP450によってルシフェリンに変換され、これが次いで、ルシフェラーゼと反応して光が生じる。生じる光の量は、シトクロームP450活性と直接比例した。すべての試験点を4連で実施した。対照膜(CYPを含まない)は、陰性対照(ベースライン)を表した。DMSO最終濃度は、0.25%であった。
【０３４０】
以下の参照化合物を使用してCYP阻害を評価した。
【０３４１】
【表８】
2019525929.tif 000053
【０３４２】
アルファ-ナフトフラボン、キニジン、ケトコナゾール、フルコナゾール及びオメプラゾールの濃度は、Promegaプロトコル推奨の4倍、又は文献(例えば、Liら、(2004) Drug Metab. Dispos. 32(8):821〜827頁、Niwaら  (2005) Biol. Pharm. Bull. 28(9):1805〜1808頁を参照されたい)に見出されるそのIC50の4倍として示す。
【０３４３】
C.結果
化合物1〜4及び31についてのCYP阻害プロファイルを以下及び図20A〜20Eに示す。10μMの濃度で、化合物3は、5種すべての試験したCYP450のうち非常に高い阻害を示した。CYP 1A2は、化合物1及び2によって有意に阻害された。CYP 2D6は、化合物31によって有意に阻害された。化合物4は、いずれのCYP450アイソフォームの有意な阻害も示さなかった。
【０３４４】
1.化合物31についてのCYP阻害プロファイル
【０３４５】
【表９】
2019525929.tif 000054
【０３４６】
2.化合物1についてのCYP阻害プロファイル
【０３４７】
【表１０】
2019525929.tif 000055
【０３４８】
3.化合物2についてのCYP阻害プロファイル
【０３４９】
【表１１】
2019525929.tif 000056
【０３５０】
4.化合物3についてのCYP阻害プロファイル
【０３５１】
【表１２】
2019525929.tif 000057
【０３５２】
5.化合物4についてのCYP阻害プロファイル
【０３５３】
【表１３】
2019525929.tif 000058
【０３５４】
下記の実施例8〜11についての実験方法は、以下の通りである。
【０３５５】
細胞培養及び処理
すべての細胞を加湿条件下37℃で維持した。培養培地にCCCP(Sigma-Aldrich)を2×ストック濃度で添加した。試験化合物1、2、3、4及び31をエナミンによって合成し、10mMのストック濃度でDMSO(Sigma-Aldrich)に溶解した。アリコートを-80℃で保存した。HeLa細胞(ATCC)及び非タグ付Parkin、EGFP-Parkin、3×FLAG-Parkin C431S又はEGFP-Parkinを安定に発現するHeLa細胞及びmitoKeimaを、10% FBS(BioWest)を含有するDMEM(Invitrogen)中で培養した。ラットの副腎性褐色細胞腫細胞(PC12)細胞を、5% FBS及び10%ウマ血清を含むRPMI中で増殖させた。分化のために、細胞をPBS中で洗浄し、1%ウマ血清を含有する低血清培地中コラーゲンコーティングプレートにプレーティングした。細胞を、神経成長因子(NGF)100ng/mLを添加することによって14日間分化させた。
【０３５６】
一次線維芽細胞(Cell Applications)を、線維芽細胞増殖培地(FGM):10% FBS、1%ペニシリン-ストレプトマイシン及び1%非必須アミノ酸を含有するDMEM中で培養した。ニューロンへの直接変換を、プロニューロン性マイクロ-RNAサーキットに影響を及ぼす、ポリピリミジントラクト結合タンパク質を標的とする低分子ヘアピン型RNA(shPTB)を利用して実施した(Xueら、Cell (2013) 152:82〜96頁)。細胞を、40,000個の細胞/mLで播種し、終夜付着させた。pLKO.1_shPTBレンチウイルスによる形質導入の48時間後、陽性細胞を、線維芽細胞増殖培地中でピューロマイシン2μg/mLにより選択した。6日目に、培地を、線維芽細胞増殖因子(FGF、Genscript)10ng/mLを含有するFGMに交換した。8日目に、培地を、5% FBSを含有する分化培地(DMEM:F12 Invitrogen)、インスリン25μg/mL、トランスフェリン50μg/mL、0.1μMプトレシン、0.03μM亜セレン酸Na(すべてSigma-Aldrich)、及びFGF 15ng/mL)に交換した。10及び12日目に、培地を、低減血清(2% FBS)を含有する分化培地で置き換えた。14日目に、培地を、2% FBS及びBDNF、GDNF、CNTF及びNT3(すべてpeprotech)0.01μg/mL、並びに酸化防止剤を含まない2% B27(Invitrogen)を含有する分化培地に交換し、48時間置いた。実験を、16日目に、増殖因子及びB27を含有する分化培地中で実施した。
【０３５７】
サンドイッチELISAアッセイ
ELISAアッセイのために、96ウェル標準結合プレート(Mesoscale Discovery)を、重炭酸緩衝液(15mM Na2CO3、35mM NaHCO3、pH9.4)中で終夜抗体(FLAG、Sigma、F3165又はpSer65-Ub、いずれも1:250)でコーティングし、0.02% Tween-20を含有するTBS中5% BSA(TBST)でブロッキングした。Parkin Ubチャージングのために、細胞ライセートをRIPA緩衝液(50mMトリス  pH8.0、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%  デオキシコレート、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))中で調製した。25μgのライセートをプレートに添加し、2時間インキュベートした。pSer65-Ubを定量するために、細胞ライセートをNP-40緩衝液(50mMトリス  pH7.6、150mM NaCl、及び0.5% NP-40)中で調製し、TBST中1% BSAで0.18% NP-40に希釈した。6.25μgのライセートを終夜プレートに添加し、4℃でインキュベートした。一次抗体インキュベーション後、プレートを洗浄し、マウス検出抗体(Ub、CST、#3933又はUb、Millipore、MAB150、いずれも1:250)を用いてRTで1時間インキュベートした。硫黄タグコンジュゲート二次抗体を1% BSA/TBST中で1時間インキュベートした後、プレートを、Mesoscale Discovery Sector Imager 2400を使用して2×READ緩衝液中で測定した(いずれもMesoscale Discovery)。
【０３５８】
免疫蛍光
細胞をポリ-D-リシンコーティングカバーガラス上で増殖させた。処理後、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、1% Triton X-100を使用して各10分間透過処理した。細胞を、10%ヤギ血清中でブロッキングした。一次及び二次抗体を1% BSA/PBSで希釈し、各々RTで1時間インキュベートした。使用した一次抗体:DNA(マウス、1:250、Progen、AC-30-10)、NBR1(マウス、1:100、Abnova H00004077-M01)、NDP52(ウサギ、1:400、Proteintech、12229-1-AP)、OPTN(マウス、1:200、Santa Cruz、sc-166576)、p62(マウス、1:400、BD Biosciences、610832)、pSer65-Ub(ウサギ、1:500、本研究室内(Fieselら、EMBO Reports(2015) 16:1114〜30頁、Fieselら、(2015) Autophagy 11:2125〜2126頁))、TAX1BP1(ウサギ、1:200、Cell Signaling、#5105)、TOM20(マウス、1:100、Santa Cruz、sc-17764)、TOM20(ウサギ、1:2000、Proteintech、11802-1-AP)。AlexaFluor-568又は-647(Invitrogen)にコンジュゲートした二次抗体を1:1000希釈した。Hoechst 33342(Invitrogen)を1:5000希釈して、核を対比染色した。
【０３５９】
ウェスタンブロット
予熱(95℃)したSDS溶解緩衝液(50mMトリス  pH7.6、150mM NaCl、1% SDS)を使用したParkin Ubチャージング実験を除き、細胞をRIPA緩衝液又はプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を含有するNP-40溶解緩衝液(Complete及びPhosStop、Roche Applied Science)中で収穫した。細胞ライセートの濃度を、ビシンコニン酸(Pierce Biotechnology)を用いて決定した。Parkin Ubチャージング実験のために、ライセートのアリコートを、37℃で1時間0.1 M NaOHで処理した。pHを等規定度のHClで中和した。
【０３６０】
タンパク質を4〜20%又は8〜16%トリス-グリシンゲル(Invitrogen)を使用するSDS-PAGEに供し、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)(Millipore)上に移した。膜を一次抗体とともに4℃で終夜、続いてHRPコンジュゲート二次抗体(1:10,000、Jackson ImmunoResearch Laboratories)とともにインキュベートした。使用した一次抗体:ベータIIIチューブリン(ウサギ、1:1000、CST、#5568、CST)、FLAG(マウス、1:250,000、Sigma、F3165)、GAPDH(マウス、1:100,000〜500,000、Meridian Life science、H86504M)、GST(1:10,000、Sigma、G7781)、MFN1(マウス、1:5,000、Abcam、ab57602)、MFN2(マウス、1:5,000、Abcam、ab56889)、Parkin(マウス、1:2,000、Cell Signaling、#4211)、pSer65-Ub(ウサギ、1:15,000、本研究室内(Fieselら、EMBO Reports (2015) 16:1114-30頁、Fieselら、(2015) Autophagy 11:2125〜2126頁))、TOM70(ウサギ、1:5,000、Proteintech、14528-1-AP)、UBE2L3(ウサギ、1:10,000、ProteinTech、14415-1-AP)、VDAC1(マウス、1:5,000、Abcam、ab14734)、ビンキュリン(マウス、1:100,000、Sigma、V9131)。
【０３６１】
ミトコンドリア脱分極アッセイ
ミトコンドリア脱分極を、JC10アッセイキット(Sigma、MAK159)を使用して評価した。HeLa Parkin細胞を、20μL体積中70,000個の細胞/ウェルで透明底の384ウェルプレートに播種した。翌日、5μLのCCCP又は化合物を5×溶液として添加した。当体積のDMSOを陰性対照として用いた。細胞を4時間インキュベートした後、緩衝液A中で希釈した12.5μLのJC10色素をウェルに添加した。1時間後、反応を12.5μLの緩衝液Bで停止し、プレートを、二重蛍光(緑色:励起485nm、発光538nm、515nmにおけるカットオフ、赤色:励起544nm、発光590nm、570nmにおけるカットオフ)を使用して、Spectramax M5プレートリーダー(Molecular devices)上で底読取りにより直ちに測定した。ミトコンドリア脱分極を、緑色対赤色比を構築することによって評価した。
【０３６２】
[実施例8]
HeLa細胞におけるParkinの酵素活性
化合物の機能試験を、酵素活性と良好に相関する、Parkin移行のための確立された一次HCIアッセイ(Fieselら、J. Cell Science (2014) 127:3488〜3504頁、Fieselら、Human Mutation (2015) 36:774〜786頁)を使用して実施した。簡潔に述べると、EGFP-Parkinを安定に発現する1400個のHeLa細胞を、培地25μL中、光学384ウェルプレート(Greiner BioOne)に播種し、40時間付着させた。化合物1、2、3、4及び31を、2×濃縮ストックとしてプレートに添加した。対照ウェルを、培地中等体積のDMSOで処理した。2時間後、他に述べない限り、CCCPを2×濃縮ストックとして添加し、最終アッセイ濃度をPCウェルについて10μM、並びに試験及びNCウェルについて3.5μMとした。この低用量のCCCPを、CCCPの用量応答曲線によって実験的に決定すると、Parkin移行は存在しなかった(図13)。さらに2時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で10分間固定し、Hoechst 33342(1:5000、Invitrogen)で染色した後、プレートを画像化し、分析した。
【０３６３】
画像取得をBD Pathway 855上でAttovision V1.6ソフトウェア(BD Biosciences)を用いて実施した。ウェルを、レーザーオートフォーカスを用いた2×2モンタージュを使用して、20×対物レンズで画像化した。EGFP曝露時間は、0.0175秒、Hoechst 0.0015秒であった。原画像は加工せず、ビルトイン「RING - 2出力」アルゴリズムを使用して直接分析した。値をエクスポートし、JMP 11ソフトウェアを使用して標準化し、品質管理のためにGraphPad Prism 7に送り、4つのパラメータを使用し可変勾配を用いてDRCのためにグラフ化及び曲線適合した。一次スクリーニングアッセイは、典型的に、5%未満のCVとともに3.0〜3.5のS/Bを示した。値を、プレート当たり各々24ウェルからのPC及びNC値の両方に対して標準化し、Z'スコアを計算した。Z'<0.5のプレートを繰り返した。
【０３６４】
高分解能イメージングにより、化合物1、2、3、4及び31並びに低用量CCCPによる処理後、Parkinのミトコンドリアとの共局在化が増強されたことが確認された。この組合せは、抗体染色によって検出され(Fieselら、EMBO Reports (2015) 16:1114〜30頁、Fieselら、Autophagy(2015) 11:2125〜2126頁)、DRCフォーマットにおいてHCIによってさらに定量されるようなpSer65-Ubマイトファジータグも誘導した。Parkin移行と比較して、pSer65-Ubシグナル増幅についてのEC50値は同様であった。なお、高化合物濃度の化合物ウェルでは、PCウェルと比較して過度のpSer65-Ubレベルが示された(図10)。いずれの化合物についても、高濃度であっても、細胞生存に対する顕著な効果は観察されなかった。化合物単独又は低用量CCCP処理(NC)のいずれも、延長した時点後であってさえも、Parkin移行を活性化するか又はpSer65-Ubシグナル増幅を誘導するのに十分ではなかった。
【０３６５】
その活性化の読取りとして、UbチャージングParkinを捕捉するために使用され得る触媒点変異を用いた。3×FLAG-Parkin C431Sを安定に発現するHeLa細胞を使用し、上向きにシフトしたバンドによって示されるように、UbチャージングParkinは、一般に、ウェスタンブロット又はサンドイッチELISAによって見られるようにいずれの化合物によっても増加した。活性化増強に対する効果をさらに検証するために、本発明者らは、非タグ付天然Parkinを発現するHeLa細胞を使用した。10μM CCCPでのPC処理により、pSer65-Ubシグナル及び一部の基質(例えば、マイトフュージン)の完全分解が誘導される一方、最も豊富なVDAC1はなおユビキチン化された(図8)。細胞が、それ自体に対しては効果を有さない低用量CCCPの前に5μMの化合物でプレイインキュベートされている場合、同様の効果が見られた。
【０３６６】
[実施例9]
HeLa細胞株における下流マイトファジー活性
経路のさらに下流のParkinの活性を検証するために、HeLa EGFP-Parkin細胞におけるミトコンドリアへの内在性オートファジーレセプターの共動員を分析した。これらの二重アダプターは、損傷ミトコンドリア上のpSer65-Ub鎖を認識し、LC3タンパク質とのその相互作用を介したオートファゴソーム性膜によるその貧食を促進する(Lazarouら、Nature (2015) 524:309-14頁、Heoら、Mol. Cell (2015) 60:7〜20頁)。
【０３６７】
pSer65-Ub分析のために(Puschmannら、Brain (2017) 140:98〜117頁(2017)、Fieselら、EMBO Reports (2015) 16:1114〜30頁(2015)、Andoら、Mol. Neurodegen. (2017) 12:32頁)、EGFP-Parkin HeLa細胞を播種し、上記のように処理した。固定後、細胞をPBS中1%Triton X-100で10分間透過処理し、10%ヤギ血清中で1時間ブロッキングした。1ウェル当たり20μLの一次抗pSer65-Ub抗体(PBS中1%BSA中1:500)を添加し、1時間インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗ウサギAlexaFluor-568抗体を1時間添加した。核をHoechst 33342(PBS中1:5000)で対比染色した後、プレートを、上記のように画像化し、赤色蛍光(曝露時間0.05秒)について追加取得した。細胞質リングにおいてシグナル強度について上記のようにセグメンテーションした後、pSer65-Ubシグナルを分析した。
【０３６８】
5種すべての化合物(1、2、3、4及び31)により、OPTN並びにNBR1、NDP52、p62及びTAX1BP1の損傷ミトコンドリアでのParkinとの共局在化が増加した。オートファジーアダプターの動員の増強と同時に、免疫蛍光染色においてミトコンドリアDNAの頑強な低減が観察された。
【０３６９】
マイトファジーを確認するために、pH感受性のミトコンドリアを標的とするレポーターであるmitoKeima46を発現するHeLa細胞を用いた。リソソーム融合時のmitoKeimaの励起波長における特徴的なシフトを使用して、HCIを使用するミトコンドリアターンオーバーを決定した。mitoKeima実験のために(Kimら、Mol. Neurodegen. (2016) 11:55頁)、細胞を、フェノールレッドを含まないDMEM培地中、1ウェル当たり20μLで播種した。Hoechst対比染色を、5μL体積中5×ストックとして添加した。細胞を、上記のように化合物及びCCCPの2×ストック溶液で処理した。等量のDMSOを対照として使用した。細胞を生で画像化し、オートフォーカスを各時点について使用した。中性及び酸性mitoKeimaの曝露時間は、それぞれ0.02及び0.05秒であった。細胞のセグメンテーションを上記のように実施し、目的の各領域について、酸性及び中性mitoKeima比を計算した。値を、陽性及び陰性対照に対して標準化した。
【０３７０】
様々なCCCP濃度(≧1μM)と組み合わせた化合物4による処理により、高用量陽性対照と同様の、マイトファジーの用量及び時間依存増加がもたらされた(図9)。ピーク値は、処理の8時間後に得られたが、これは、ミトコンドリアの一部が既に除去されていたことを示している。低用量CCCP単独(最大3.5μM)で処理した細胞は、より遅い時点であっても、mitoKeima酸性化の増加を示さなかった。マイトファジーアッセイについてのEC50値を決定するために、化合物1、2、3、4及び31をDRC形式で試験した。4及び8時間後のデータ点の曲線適合により、他の定量的アッセイのように群内の有効性に関して同じ傾向がもたらされた(図10)。化合物の活性はナノからマイクロモル範囲であり、Parkin移行及びpSer65-Ub増幅アッセイにおけるその有効性に匹敵した。
【０３７１】
[実施例10]
一次細胞におけるParkin活性化及びニューロン培養
一次細胞におけるParkin活性化薬を検証するために、化合物4を、異なる低用量CCCP濃度と組み合わせてヒト皮膚線維芽細胞中で試験した。HeLa細胞と同様に、3.5μM CCCP単独は、マイトファジー応答を誘導するのに十分ではなかった。細胞を化合物4、続いて低用量CCCPで前処理した場合、Parkin基質MFN1/2のユビキチン化の増強が観察された(図15A)。これと一致して、化合物4での処理は、低用量CCCPの存在下においてpSer65-Ubレベルを有意に誘導した(図18A)。このNC濃度を使用して5種すべての化合物を横並びに試験し、5種すべての化合物がある程度応答を誘導するが、化合物1及び4が、MFN1/2分解及びpSer65-Ub誘導に対して最も強い効果を示したことが見出された(図15B)。CCCPの非存在下において、化合物は、初代線維芽細胞中でmitoQC応答を誘導しなかった。さらに、Parkin移行についてのEC50よりも10倍高い濃度の化合物は、mitoQC応答を誘導しなかった。(図16B)。
【０３７２】
次に、誘導ニューロン(iニューロン)を線維芽細胞培養物から産生した。ニューロン変換を、ニューロン細胞マーカーであるベータ-III-チューブリンによって確認した。MFN1ユビキチン化に対する効果はわずかであったが、5種すべての化合物によりpSer65-Ubレベルは頑強に誘導された(図15C)。化合物が動物モデルにおいても使用され得ることを確実にするために、ラットPC-12細胞において内在性Parkinを活性化するその能力を試験した。5種すべての化合物が、未分化(図15D及び図16C)並びにニューロン分化細胞(図15D)においてpSer65-Ubを頑強に誘導したが、ここで、3.5μM CCCP単独はpSer65-Ubをわずかに誘導した。それにもかかわらず、化合物で前処理した細胞は、10μM CCCPで処理したPC細胞に匹敵する、より顕著な基質ユビキチン化及び分解を示した(図15C及び図16C〜16Dを参照されたい)。
【０３７３】
[実施例11]
インビトロ酵素活性及び薬物結合
化合物の的確な効果を示すために、組換え精製Parkinタンパク質を用いたインビトロアッセイを実施した。Parkin活性についての最初の読取りとして、細胞におけるParkin C431SのUbチャージングアッセイと相補的な、E2 Ub排出アッセイを実施した。UbcH7にまずUbをローディングし、次いで、化合物4又は対照としてDMSOとプレインキュベートしたParkinと混合した。PINK1の存在下においてのみ、化合物4は対照と比較してより多くのE2排出をもたらし、E3酵素へのUb移行の増強と一致した(図15E)。インビトロE2排出アッセイを、以下の通りに実施した。
【０３７４】
E2酵素のUbチャージングを、0.1μM GST-E1、3.3μM E2/UbcH7、10μM FLAG-Ub及び0.188μM PINK1(すべてR&D systems)を含有する反応物中、30℃で90分間実施した。別個の反応において、0.75μM Parkin(Ubiquigent)を20μM化合物4(又は等体積のDMSO)とプレインキュベートした。両方の反応をUb緩衝液中で希釈した(最終濃度:20mM HEPES pH7.2、10mM MgCl2、0.1mM EGTA、500μM TCEP及び10% ATP再生システム(20mM HEPES pH7.6、10mM ATP、300mMホスホクレアチン、10mM MgCl2、10%グリセロール、クレアチンホスホキナーゼ1.5mg/mL(すべてSigma Aldrich)))。反応9μL当たりアピラーゼ(Sigma)1Uを添加し、両方の反応を合わせ、さらに30分間インキュベートした。反応10μL当たり100μLの1×LDS緩衝液を添加し、サンプルを-/+ DTT(最終20mM)のために分割した。
【０３７５】
Parkinリガーゼ活性のための基質を用意するために、細胞外ユビキチン化アッセイのためのミトコンドリア画分を用意した。これらのサンプルを、PINK1を発現するがParkinを含まない、未処理の又は10μM CCCPで2時間処理したHeLa細胞から調製した。アリコートを、組換え精製E1、E2、Ub及びParkin、並びにATP及び化合物4又は対照としてDMSOのいずれかを含有する反応に再懸濁した。MFN1のモノユビキチン化が、化合物の非存在下において観察されたが、ポリユビキチン化は、化合物4が反応に添加された場合、とりわけより短い時点で頑強に誘導された(図15E)。特に、ミトコンドリアが未処理の細胞(すなわち、PINK1なし)から単離された場合、効果はみとめられなかった。
【０３７６】
ミトコンドリア調製物を用いたインビトロアッセイを以下の通りに実施した。HeLa細胞を未処理のままにするか、又は10μM CCCPで2時間処理した。細胞を溶液B(20mM HEPES pH7.6、220mMマンニトール、70mMスクロース、EDTAを含まないComplete及びPhosStopを含有する10mM KAc)中で収穫し、23Gニードルによる10回のストロークに続いて27Gニードルによる10回のストロークによって均質化した。ライセートを800gで5分間遠心分離し、上清を8000gで20分間回転させてペレット状ミトコンドリアとした。ミトコンドリアペレットを、溶液Bに再懸濁し、タンパク質濃度をBCAによって決定した。50μgのアリコートを調製し、20,000gで5分間回転させ、上清を取り出し-80℃で保存した。インビトロ反応を溶液B緩衝液中で調製し、反応は、反応10μL当たり45μM Ub、0.1μM GST-E1、1μM E2/UbcH7、2mM DTT及び1μLのATP再生システムを含有した。0.75μM Parkinを含む反応を1つのミックスとして調製し、これを化合物(20μM)又はDMSOを添加する前に異なる反応に分割した。反応を37℃で2時間インキュベートし、ミトコンドリア50μg当たり10μLを添加した。サンプルを30℃で、示した時間インキュベートし、遠心分離し、溶液Bで1回洗浄した後、ミトコンドリアペレットを100mM DTT及び1% Triton X-100を含有するLDS緩衝液100μLに再懸濁した。反応の上清(8μL)を取っておき、2×LDS緩衝液32μLと混合した。サンプルを振とうしながら30分間、35℃に加熱した後、ゲルをローディングした。
【０３７７】
インシリコ手法から予測される活性化化合物のParkinへの直接結合を検証するために、サーマルシフトアッセイを使用した。組換え精製Parkinを、化合物4又は対照としてDMSOとともに混合し、溶融温度をSYPRO Orange色素を使用してモニタリングした。化合物4の添加により、Parkinの溶融温度は有意に上昇した(図15G〜15H)が、これはParkin及び薬物の直接会合を示唆している。この結果は、細胞培養データ及びインビトロ実験とともに、ParkinのPINK1-依存プライミングが、MDSから予測されるように化合物活性のために必要であることを確証する。
【０３７８】
サーマルシフトアッセイを、以下の通りに実施した。サンプル(5μL)当たり、50ngのParkin(Ubiquigent)を、0.5μLの1/50希釈SYPRO Orange(Invitrogen)、0.5μLの10×緩衝液(200mM HEPES pH7.6、100mM MgCl2、20mM DTT及び1mM EGTA)、及び0.5μM化合物又は等量のDMSOと混合した。サンプルを、1℃当たり10回取得する溶融曲線分析でLightCycler 480システム(Roche Applied Science)上で不透明384ウェルプレートに流した。データをエクスポートし、Protein Melting Analysisツール(Roche Applied Science)を使用して分析した。
【０３７９】
[実施例12]
ユビキチンへのParkin結合
HeLa 3×FLAG-Parkin C431S細胞を、6ウェルプレートに播種し、終夜付着させた。細胞を、1μMの化合物5、21〜28、32、33又は43〜46で2時間処理した後、CCCPをさらに2時間添加した。10μM CCCPを陽性対照(PC)ウェルに、3.5μM CCCPを化合物(+)及び陰性対照(NC)ウェルに添加した。一部のサンプルには、CCCPを与えなかった(-)。細胞を、沸騰する熱SDS溶解緩衝液中で収穫し、タンパク質濃度をBCAによって決定した。サンプルを分割し、未処理のままにするか、又は示すようにNaOHで処理した。サンプルを8〜16%トリス-グリシンゲル上に流し、膜上にブロッティングし、Flagに対する抗体で調べた。ビンキュリンを、ローディング対照として用いた。バンドシフトにより、ユビキチンへのParkin結合が示されているが、これはNaOHにより切断可能である(図21)。
【０３８０】
参照による組込み
本明細書において参照する特許文献及び科学論文の各々の全開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０３８１】
均等物
本開示は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で実現することができる。したがって、前述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書に記載される開示に対する限定ではなく、例示であるとみなされるべきである。したがって、本開示の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、本特許請求の範囲の意味及び均等性の範囲内のあらゆる変更は、そこに包含されることが意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１７−１０】
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【図１７−１１】
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【図１７−１２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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