(57)【要約】  組換え発現された抗体集団の電荷変異体は、主要抗体分子からと、それぞれとの両方から分離されてもよい。電荷変異体の分離および単離は、カチオンイオン交換体支持体からの電荷変異体溶出の間の塩濃度およびｐＨの複合調節を介して進行されてもよい。単離した電荷変異体は、抗体調製物全体の力価へのそれらの寄与について評価すされてもよい。したがって、例えば、バイオシミラーマッチングのため、または調製物の力価を改善するために、少なくとも電荷変異体および主要抗体の割合の点で、抗体調製物の構成を制御することができる。
2019504060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え発現されたトラスツズマブのアイソフォームを分離する方法であって、以下：
トラスツズマブと複数のトラスツズマブの電荷変異体とを含む組換え発現されたトラスツズマブ調製物を、前記トラスツズマブと前記電荷変異体とを捕捉することができるリガンドを含むカチオン交換クロマトグラフィー支持体に充填し；そして
前記電荷変異体を分画すること
を含み、ここで前記分画することが、
約２０ｍＭ〜約３０ｍＭのＭＥＳを含んだ約６．１のｐＨを有する第１の移動相緩衝液を前記支持体に通し、前記第１の移動相緩衝液を前記支持体に通過させながら、約４０ｍＭのリン酸ナトリウム〜約６０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約９５ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ約８．０のｐＨを有する第２の移動相緩衝液を前記第１の移動相緩衝液に添加して約９０容量％の前記第１の移動相緩衝液と約１０容量％の前記第２の移動相緩衝液との混合物を得て、前記混合物中の前記第２の移動相緩衝液の量を徐々に増加させて約５５容量％の前記第１の移動相緩衝液および約４５容量％の前記第２の移動相緩衝液を達成することによって、前記リガンドから１以上の前記電荷変異体をグラジエント溶出し（gradient eluting）、そして、前記１以上の電荷変異体を別個の分画に収集すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の移動相緩衝液が約２３ｍＭ〜約２５ｍＭのＭＥＳを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の移動相緩衝液が約２４ｍＭのＭＥＳを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の移動相緩衝液が、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の移動相緩衝液が、約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の移動相緩衝液を前記第１の移動相緩衝液に添加して約９０容量％の前記第１の移動相緩衝液と約１０容量％の前記第２の移動相緩衝液との混合物を達成する工程が、前記第２の移動相緩衝液のボーラスを前記第１の移動相緩衝液に添加して実質的に直ちに前記混合物を達成すること、を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の移動相緩衝液を前記第１の移動相緩衝液に添加して約９０容量％の前記第１の移動相緩衝液と約１０容量％の前記第２の移動相緩衝液との混合物を達成する工程が、前記混合物を達成するための時間にわたって前記第２の移動相緩衝液を前記第１の移動相緩衝液に注入すること、を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、２以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、３以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、４以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、５以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、６以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、７以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、８以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、９以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、１０以上の前記電荷変異体を別個の分画に収集すること、を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電荷変異体が、６までの酸性電荷変異体および４までの塩基性電荷変異体を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離された分画の１以上が、前記分画の総タンパク質重量に基づいて少なくとも約９０％の純度で前記回収された電荷変異体を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記分離された分画の１以上が、前記分画の総タンパク質重量に基づいて少なくとも約９５％の純度で前記回収された電荷変異体を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離された分画の１以上が、前記分画の総タンパク質重量に基づいて少なくとも約９８％の純度で前記回収された電荷変異体を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離された分画の１以上が、前記分画の総タンパク質重量に基づいて少なくとも約９９％の純度で前記回収された電荷変異体を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドから前記トラスツズマブを溶出することをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
トラスツズマブとトラスツズマブの複数の電荷変異体とを含む別の組換え発現されたトラスツズマブ調製物を前記支持体上に装填し、前記分画工程を繰り返し、そして、各トラスツズマブ調製物からの同じ電荷変異体の前記別個の分画と共にプールすること、をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
トラスツズマブとトラスツズマブの複数の電荷変異体とを含む別の組換え発現されたトラスツズマブ調製物を前記支持体上に装填し、前記分画工程を繰り返し、前記溶出工程を繰り返し、そして、前記溶出したトラスツズマブと共にプールすること、をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
トラスツズマブと比較して増強された力価を有する電荷変異体の１以上の前記別個の分画と共にプールすること、をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶出されたトラスツズマブを、トラスツズマブと比較して増強された力価を有する電荷変異体の１以上の前記別個の分画とともにプールすること、をさらに含む、請求項１８または２５に記載の方法。
【請求項２７】
溶出されたトラスツズマブを１以上の前記別個の荷電変異体の分画と共にプールして、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）認可トラスツズマブ組成物中のトラスツズマブおよびその電荷変異体の割合と実質的に同一であるトラスツズマブおよびその電荷変異体の割合を有するバイオシミラートラスツズマブ組成物を製造すること、をさらに含む、請求項２２または２４に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法によって製造された、トラスツズマブの精製アイソフォーム。
【請求項２９】
医薬的に許容される担体または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項２８に記載の精製アイソフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１月８日に出願された米国特許出願第６２／２７６，３７８号に対する優先権を主張し、その内容は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、タンパク質生化学および分析化学の分野に関する。より詳細には、本発明は、富化された、またはより均一な抗体調製物を提供し、抗体調製物の力価を減少させる電荷変異体の除去をも提供する、モノクローナル抗体の電荷変異体を分画するための分析クロマトグラフィー方法に関する。
【０００３】
配列表の参照による組込み
２０１７年１月４日に作成され、６ＫＢのサイズである「ＯＮＢＩ−００７００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
特許、公開された出願、受託番号、技術論文および学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書を通して引用されている。これらの引用された刊行物の各々は、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０００５】
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を治療用タンパク質として使用することができる。精製モノクローナル抗体は、複雑な異種混合物中に存在することが最も多い。モノクローナル抗体は、有利な静電相互作用を得るバランスを最適化し、その構造、安定性、結合親和性、化学的性質、従ってそれらの生物学的活性を決定する電荷異種を有する。タンパク質の発現中、および酵素プロセスまたは自発的な分解および修飾によって引き起こされる製造中に生じる異種（heterogeneity）の形態がある。
【０００６】
抗体は、酸化、脱アミド化、糖化、異性化およびフラグメント化を含むいくつかの異なる機構を介して化学修飾を受け、様々な電荷変異体および異種性の形成をもたらす。脱アミド化およびシアリル化などの化学的および酵素的修飾は、ｍＡｂの正味の負電荷の増加をもたらし、ｐＩ値の低下を引き起こし、それによって酸性変異体の形成をもたらす。Ｃ末端リジン切断は、正味の正電荷の損失をもたらし、主要抗体または酸性変異体の形成をもたらす。酸性変異体を生成するための別の機構は、グルコースが豊富な培養培地中での製造中または還元糖が、製剤中に存在する場合の貯蔵中に、グルコースまたはラクトースがリシンまたはアルギニン残基の第一級アミンと反応することができる、例えば糖化などの様々なタイプの共有結合付加物の形成である。塩基性変異体の形成は、１以上のＣ末端リジンもしくはプロリンアミド化の存在、スクシンイミド形成、アミノ酸の酸化またはシアル酸の除去（付加的な正電荷または負電荷の除去をもたらす）から生じ得る。両方のタイプの改変はｐＩ値の増加を引き起こす。
【０００７】
力価への影響の可能性があるため、アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、およびメチオニン酸化などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）が評価されるべきである。しかし、インタクトな分子のＰＴＭおよび力価分析は、一般に、ｍＡｂのような生物製剤治療の複雑さを考えると、限られた情報しか提供しない。したがって、特に構造−機能相関に関して、全体としての調製に対するそれらの効果のために変異体分子を選別して評価する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
この開示は、組換えて発現された抗体のアイソフォームを分離する方法を特徴とする。分離が、例えば、抗体の構造と機能との関係を評価することを許容し得る。このようなアイソフォームには、酸性電荷変異体、塩基性電荷変異体、および主要抗体が含まれる。アイソフォームはモノクローナル抗体である。
【０００９】
一般に、本明細書で提供されるものは、組換え発現された抗体のアイソフォームを分離する方法であって、抗体および電荷変異体を捕捉することができるリガンドを含むカチオン交換クロマトグラフィー支持体上に、抗体および前記抗体の複数の電荷変異体を含む組換え発現された抗体調製物を充填し（loading）、そして、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭのＭＥＳを含んだ約６．１のｐＨを有する第１の移動相緩衝液を支持体に通し、第１の移動相緩衝液を支持体に通過させながら、約４０ｍＭのリン酸ナトリウム〜約６０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約９５ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ約８．０のｐＨを有する第２の移動相緩衝液を第１の移動相緩衝液に添加して、約９０容量％の第１の移動相緩衝液と約１０容量％の第２の移動相緩衝液の混合物を得て、前記混合物中の第２の移動相緩衝液の量を徐々に増加させて約５５容量％の第１の移動相緩衝液および約４５容量％の第２の移動相緩衝液を達成することによって、前記リガンドから１以上の電荷変異体をグラジエント溶出し（gradient eluting）、そして、前記１以上の電荷変異体を別個の分画に収集すること、によって、電荷変異体を分画すること、を含む。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態では、抗体には、トラスツズマブおよびその電荷変異体および／またはそのアイソフォームが含まれる。非限定的な例として、トラスツズマブは、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る。
【００１１】
第１の移動相緩衝液は、約２３ｍＭ〜約２５ｍＭのＭＥＳを含有してもよく、好ましい一実施形態では、約２４ｍＭのＭＥＳを含有する。第２の移動相緩衝液は、約４５ｍＭ〜約５５ｍＭのリン酸ナトリウムを含有してもよく、好ましい一実施形態では、約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する。一実施形態では、第２の移動相緩衝液を第２の移動相緩衝液に添加して、約９０容量％の第１の移動相緩衝液と約１０容量％の第２の移動相緩衝液との混合物を得る工程は、第２の移動相緩衝液のボーラス（ｂｏｌｕｓ）を第１の移動相緩衝液に添加して混合物を実質的に直ちに達成することによって生じる。別の実施形態では、第２の移動相緩衝液を第１の移動相緩衝液に添加して、第１の移動相緩衝液の約９０容量％と第２の移動相緩衝液の約１０容量％との混合物を得る工程は、第２の移動相緩衝液を、混合物を達成するための時間にわたって第１の移動相緩衝液に注入することによって生じる。
【００１２】
抗体のアイソフォームは、第２の移動相緩衝液がより大きい割合のカチオン交換（ＣＥＸ）フローを通過する場合、塩濃度およびｐＨが増加するにつれて、カチオン交換（ＣＥＸ）リガンドから溶出する。このプロセスに従って、酸性電荷変異体、塩基性電荷変異体、および主要抗体をカラムから溶出することができる。溶出したアイソフォームは、別個の分画に集めることができる。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはそれ以上のアイソフォームを別個の分画に収集することができ、または分画に組み合わせて収集することができる。
【００１３】
本明細書に開示される方法のいずれかにおいて、本方法は、２以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；３以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；４以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；５以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；６以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；７以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；８以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；９以上の電荷変異体を別個の分画に集めること；および／または１０またはそれ以上の電荷変異体を別個の分画に集めること、を含み得る。
【００１４】
本開示の方法によれば、電荷変異体は、６つまでの酸性電荷変異体および４つまでの塩基性電荷変異体を含み得る。
【００１５】
それぞれの別個の分画（すなわち、アイソフォーム分画または電荷変異体分画）は高度に精製されている。例えば、１または複数の別個の分画は、分画の総重量に基づいて少なくとも約９０％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９１％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９２％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９３％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９４％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９５％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９６％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９７％；分画の総重量に基づいて少なくとも約９８％；および／または分画の総重量に基づいて少なくとも約９９％、の純度で、回収されたアイソフォームまたは電荷変異体（またはその組合せ）を含有してもよい。
【００１６】
非限定的な例として、本開示の方法のいずれかは、リガンドからの抗体（すなわち、トラスツズマブ）の溶出をさらに含んでもよい。
【００１７】
精製プロセスを繰り返してもよく、その後、分画を合わせて、任意に濃縮してもよい。例えば、抗体および複数の電荷変異体および／またはアイソフォームを含有する別の組換え発現した抗体調製物を支持体上に充填することができ、分画化工程を反復することができ、それぞれの分画抗体調製物から、同一の電荷変異体および／またはアイソフォームの別個の分画と共にプールすることができる。同様に、抗体および複数の電荷変異体および／またはアイソフォームを含む別の組換え発現した抗体調製物を支持体上に充填し、分画工程を繰り返し、溶出工程を繰り返し、溶出した抗体、電荷変異体および／またはそのアイソフォームと共にプールすることができる。
【００１８】
１つの好ましい実施形態において、組み合わされる電荷変異体および／またはアイソフォームは、同じ電荷変異体および／またはアイソフォームであるが、異なる電荷変異体および／またはアイソフォームと共に組み合わせてもよく、任意の酸性変異体と、任意の他の酸性変異体、もしくは任意の他の塩基性変異体、もしくは主要抗体を含むか、あるいは、任意の塩基性変異体と、任意の他の塩基性変異体、もしくは任意の他の酸性変異体、もしくは主要抗体を含んでもよい。主要抗体は、主要抗体の他の分画と、または酸性もしくは塩基性電荷変異体の任意の組み合わせと、組み合わせることができる。
【００１９】
本開示のいずれかの方法によれば、抗体自体と比較して増強された力価を有する１または複数の別個の電荷変異体分画および／またはアイソフォームを共にプールする。非限定的な例として、抗体は、抗体と比較して増強された力価を有する１または複数の別個の電荷変異体分画および／またはアイソフォームと共にプールし得る。
【００２０】
アイソフォームの組み合わせは、例えば、特定の治療用抗体製剤の力価または治療有効性を調節または制御するために使用され得る。例えば、分離されたアイソフォーム分画は、バイオシミラー抗体の製造におけるなどの参照抗体製剤のアイソフォームまたはアイソフォームカテゴリー（例えば、酸性または塩基性電荷変異体）の相対百分率を一致させるために組み合わせられてもよい。分離されたアイソフォーム分画は、例えば、バイオベター抗体の製造におけるような、抗体製剤の力価または治療有効性を低下させるアイソフォームを除外することによって、抗体製剤の力価または治療有効性を増強するために組み合わせられてもよい。
【００２１】
非限定的な例として、本明細書に開示される方法のいずれかは、溶出された抗体（例えば、トラスツズマブ）を、１または複数の別個の電荷変異体分画とともにプールして、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）認可の抗体（例えば、トラスツズマブ）組成物中の抗体（例えば、トラスツズマブ）とその電荷変異体の割合と実質的に同一の抗体（例えば、トラスツズマブ）とその電荷変異体の割合を有する、バイオシミラー抗体（例えば、トラスツズマブ）組成物を製造してもよい。
【００２２】
本明細書に記載または例示されている方法に従って製造されたる抗体アイソフォームもしくはその組み合わせ、および／またはそれらの製剤も提供される。適切な製剤は、１または複数の医薬的に許容される担体および／または医薬的に許容される賦形剤と共に、抗体アイソフォームまたはその組み合わせを含んでもよい。製剤中の抗体アイソフォームまたはその組み合わせは、９０％以上の純度、９１％以上の純度、９２％以上の純度、９３％以上の純度、９４％以上の純度、９５％以上の純度、９６％以上の純度、９７％以上の純度、９８％以上の純度、もしくは９９％以上の純度を有する、および／または他の抗体アイソフォームを実質的に含まない。
【００２３】
本明細書に記載の態様および実施形態のいずれも、本明細書の発明の概要、図面、および／または発明の詳細な説明に開示されているような他の態様または実施形態と組み合わせることができ、以下の特定の非限定的な本発明の実施例／実施態様を含んでいる。
【００２４】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本出願が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において、単数形には、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形も含まれる。
【００２５】
本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料が、その用途の実施および試験において使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によって援用される。
【００２６】
本明細書に引用される参考文献は、特許請求された出願の先行技術であると認められるものではない。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００２７】
本出願の他の特徴および利点は、以下の実施例の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、未分画のトラスツズマブのカチオン交換クロマトグラフィープロファイルを示す。
【図２】図２は、トラスツズマブの電荷変異体のカチオン交換分画の純度分析を示す。
【図３】図３は、第２の移動相緩衝液のパーセンテージを、時間とともに第１の移動相緩衝液に加え、第２の移動相緩衝液のパーセンテージを示す移動相勾配の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明の態様に関する様々な用語は、本明細書および特許請求の範囲を通して使用される。そのような用語は、他に指示がない限り、当該分野において通常の意味を有するものとする。他の特別に定義された用語は、本明細書で提供される定義と一致するように解釈されるべきである。
【００３０】
本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明記されていない限り、複数の指示対象を含む。
【００３１】
本明細書で使用する「含む(comprising)」、「有する(having)」および「含む(including)」という用語は、より限定的な用語「本質的に〜からなる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」を包含する。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、モノクローナル抗体の「フラグメント」には、以下に限定されないが、定常領域、可変領域、重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および／または軽鎖ＣＤＲ３を含む。「機能的に活性な」フラグメントは、抗原に結合することができる任意のモノクローナル抗体フラグメントを含み得る。
【００３３】
塩濃度の調節に関連する、カチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー溶出緩衝液のｐＨの調節を利用して、組換え発現された抗体の調製物中の主要抗体から電荷変異体を分離するために、ＣＥＸ支持体から特定の抗体電荷変異体を溶出することに関連することが観察されている。この特定の技術は、抗体調製物を用いて、より少ない酸性または塩基性種を含む、高い純度の主要（所望の）抗体分子を得るために使用され得るか、または抗体調製物中の特定の変異体のレベルを制御するために使用され得、例えば、バイオシミラー抗体調製物を参照抗体調製物に適合させるために用いられ得る（例えば、規制の精査に合格し、バイオシミラー製品としての状態を維持するため）。電荷種のような変異種の包含は、抗体調製物の最終的な力価に影響を及ぼす。したがって、これらの技術は、特定の電荷種によってもたらされる全体的な力価に対する正または負の寄与を決定するために使用することができ、その結果、力価を低下させるより少ない電荷種を含むように調製物を濃縮することができ、一方で、抗体調製物の全体的な力価に中立であるか、増強する電荷種をその場に残す。これらの技術は、例えば、バイオベター抗体を製造するために、より力価の低い電荷変異体を減少させること、または参照抗体製品に対して可能な限りバイオシミラー抗体の電荷変異体プロフィールを一致するように維持することを目的として、精製スキームにおける処理工程を改変するために使用され得る。
【００３４】
したがって、本開示は、バイオリアクターで組換え発現されるモノクローナル抗体の電荷変異体を単離するための方法を特徴とする。さらに、本開示は、モノクローナル抗体調製物中の電荷変異体のレベルを調節するための方法を特徴とする。本開示による方法は、その調製物が電荷変異体（用語の電荷変異体（charge variants）および荷電種(charge species)は本明細書中で互換的に使用される）を含む任意の組換え発現された抗体に適している。
【００３５】
いくつかの好ましい非限定的な実施形態では、抗体は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ上のエピトープに特異的に結合し、エピトープは、直線状(linear)またはコンフォメーション状(conformational)であり得る。本明細書に記載される電荷変異体単離法は、可変領域と定常領域の両方を含む全長モノクローナル抗体に適しており、抗体誘導体、ならびに全長抗体のフラグメントおよび／または部分にも適している。
【００３６】
いくつかの実施形態では、抗体はトラスツズマブである。非限定的な例として、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖および／または配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る。好ましい一実施形態では、抗体は、重鎖定常ドメインおよび／または軽鎖定常ドメインを含む。
【００３７】
抗体は、哺乳動物細胞を用いて発現される。適切な哺乳動物発現宿主の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、ならびにＳＰ２／０およびＮＳ０細胞が含まれる。いったん発現されると、抗体は、二段階深層濾過(two stage depth filtration)または遠心分離プロセスのいずれかによってその哺乳動物宿主細胞から清澄化され得る。深層濾過に続いて、材料を０．２μｍフィルターに通して清澄化した細胞培養上清を得ることができる。主要な（所望の）抗体、ならびにその電荷および他の変異体を他の細胞タンパク質および可溶性細胞物質と共に含む清澄化した細胞培養上清は、その後、主要抗体およびその電荷変異体を単離するための精製スキームに供され得る。
【００３８】
第１のステップとして、抗体調製物（この初期の時点で、清澄化された細胞培養上清）をプロテインＡを含む支持体（support）に載せて、抗体がプロテインＡと相互作用するようにしてもよい。支持体は、クロマトグラフィーカラムに充填され得る粒子を含んでもよい。プロテインＡは、約１０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約６０ｇ／Ｌ、または約２０ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの抗体結合能を有してもよい。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ媒体は、適切なＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ支持体の例である。ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  ＳＵＰＲＡＴＭ媒体、ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ媒体、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｃａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ媒体は、適切なＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ支持体の他の例である。当技術分野で利用可能な任意の適切なプロテインＡ支持体を使用してもよい。
【００３９】
プロテインＡ支持体への抗体調製物の充填（loading）は、プロテインＡリガンドに対するモノクローナル抗体の最大の吸着を可能にするのに適した温度、容量、そして時間で実施される。プロテインＡリガンドに吸着しない望ましくない物質は、クロマトグラフィーの間に支持体を通って流れるが、Ｆｃ領域を含む抗体およびその変異体は、支持体上のプロテインＡリガンドに接着する。リガンドまたは抗体タンパク質に付着する望ましくない物質をさらに除去するために、抗体吸着支持体を洗浄することができる。任意の適切な回数の洗浄を使用することができ、洗浄液は、緩衝液を含み、望ましくない物質を除去するが、プロテインＡからの抗体を溶出しない十分なストリンジェンシー（stringency）を含んでもよい。
【００４０】
洗浄後、モノクローナル抗体およびその変異体は、プロテインＡ支持体から溶出される。溶出は、プロテインＡリガンドからのモノクローナル抗体の最大溶出収率を可能にするのに適した温度、容量、および時間で実施され得る。溶出緩衝液は酸性であり得る。モノクローナル抗体の溶出は、モノクローナル抗体ならびに抗体の変異体を含む溶出液を産生する。トラスツズマブのプロセス開発または製造のためには、プロセス制御工程における酸性変異体および塩基性変異体の割合だけでなく、電荷プロファイルの正確な決定などの分析的支持が重要である。２つの別個の運転からの重量パーセント分析（weight percentage breakdown）の例を表１に示す。
【００４１】
【表１】
2019504060.tif 000003
【００４２】
モノクローナル抗体を含む溶出液は、任意に、溶出液中に存在するウイルスを不活性化するために処理されてもよい。ウイルス不活性化は、溶出液中に存在するウイルスを不活性化するのに十分な温度および時間で溶出液を酸性化することを含んでもよい。酸性化は、例えば、所望のｐＨに達するまで、酢酸、クエン酸、塩酸、ギ酸またはそれらの組み合わせを溶出液に添加することによって行ってもよい。溶出液は、酸性化の前、間または後に加温してもよい。所望の不活性化温度になったら、溶出液中の実質的にすべての潜伏ウイルスを不活性化するのに十分な時間、溶出液をｐＨおよび温度の両方で維持する。このウイルス不活性化の保持時間が経過した後、溶出液のｐＨを、例えば適切な塩基性緩衝液の添加によって増加させてもよい。
【００４３】
ウイルス不活性化工程の後、またはウイルス不活性化が含まれない場合はプロテインＡ溶出後、モノクローナル抗体を第２のクロマトグラフィー工程でさらに精製してもよい。このクロマトグラフィー工程中に、電荷変異体を単離することができる。クロマトグラフィー技術はカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーである。
【００４４】
ＣＥＸクロマトグラフィー媒体は、スルファプロピルリガンドを含む支持体を含んでもよい。適切な媒体の非限定的な例には、Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ媒体が含まれる。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチル、ホスフェート、スルホエチルまたはスルホネートリガンドを含む支持体を含有する。リガンドは、アガロース、セラミック、親水性ポリマー、ポリマービーズ、ポリスチレン−ジビニルベンゼン、またはポリビニルエーテル支持体を含み得る任意の適切な支持体に連結されてもよい。支持体は、クロマトグラフィーカラムに充填され得る粒子を含んでもよい。
【００４５】
ウイルス不活性化工程からのろ過された溶出液であってもよいプロテインＡクロマトグラフィー工程からの溶出液をＣＥＸクロマトグラフィー支持体に充填し、支持体を通過させることにより、抗体はリガンドと相互作用させてもよい。モノクローナル抗体を含むフロースループールのＣＥＸ支持体へのローディングは、モノクローナル抗体のリガンド支持体への最大限の吸着を可能にするのに適した温度、容量および時間で実施される。主要抗体分子および変異体は、支持体に吸着する。リガンド支持体に吸着しない望ましくない物質は、クロマトグラフィー中に支持体を通って流れる。リガンドに付着する望ましくない物質をさらに除去するために、抗体吸着支持体を洗浄してもよい。
【００４６】
ＣＥＸクロマトグラフィーは、分離をより視覚化し、最終的に分離された電荷変異体（および主要抗体）を収集するために、ＨＰＬＣに連結させてもよい。ＣＥＸカラムへの総充填量（Mass loading）は、単離される抗体変異体のＨＰＬＣピーク分解能および収率に影響を及ぼし得る。個々の単離されるアイソフォームの収率と純度との間のバランスは、最適な充填の観点から考慮されてもよい。各カラム充填あたり約１ｍｇのタンパク質量が観察され、適切な収率および純度のバランスを提供した。 
【００４７】
次いで、主要抗体および塩基性電荷変異体が残る間に、酸性電荷変異体をＣＥＸリガンドから溶出してもよい。酸性電荷変異体の溶出後、主要抗体はＣＥＸリガンドから溶出されるが、塩基性電荷変異体は残る。主要抗体の溶出後、ＣＥＸリガンドから塩基性変異体が溶出される。各抗体アイソフォームが（連続的に）溶出されると、別個の精製分画として回収される。単離された電荷変異体は、他の電荷変異体ならびに主要抗体分子を実質的に含まない分画として回収される。
【００４８】
抗体の電荷変異体を分画することは、ＣＥＸおよびＨＰＬＣ技術を組み合わせることができ、各電荷変異体をＣＥＸリガンドから連続的に溶出させるために、２つの移動相を用いて緩衝液条件を変更することができる。第２の移動相は、第１の移動相に対してより高い塩およびより高いｐＨを含み、第２の移動相緩衝液を第１の移動相緩衝液に添加して、電荷変異体を連続的に溶出する塩およびｐＨ勾配を確立する。電荷変異体が溶出すると、それらは個々の分画に集められる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、第１の移動相緩衝液は、約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む。ＭＥＳ緩衝液は、ＭＥＳ水和物（遊離酸）とＭＥＳナトリウム塩との水性混合物として調製して、所望の濃度にすることができる。ＭＥＳは、約５．９〜約６．３、好ましくは約６．１である所望のｐＨレベルを維持することができる任意の適切な緩衝剤で置換されてもよい。別の緩衝液の非限定的な例は、酢酸ナトリウムおよび酢酸緩衝液である。第１の移動相緩衝液は、約２０ｍＭ〜約２８ｍＭのＭＥＳ、約２１ｍＭ〜約２７ｍＭのＭＥＳ、約２２ｍＭ〜約２６ｍＭのＭＥＳ、約２３ｍＭ〜約２５ｍＭのＭＥＳ、または約２４ｍＭのＭＥＳを含んでもよく、約５．９〜約６．３、約６〜約６．２、または約６．１のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態において、第１の移動相緩衝液は、約２４ｍＭのＭＥＳを含み、約６．１のｐＨを有する。
【００５０】
第２の移動相緩衝液は、約４０ｍＭのリン酸ナトリウム〜約６０ｍＭのリン酸ナトリウム、および約９０ｍＭ〜約１００ｍＭの塩化ナトリウムを含んでもよい。リン酸ナトリウムは、約７．８〜約８．２、好ましくは約８である所望のｐＨレベルを維持することができる任意の適切な緩衝剤で置換してもよい。第２の移動相緩衝液は、約４５ｍＭのリン酸ナトリウム〜約５５ｍＭのナトリウムリン酸、約４６ｍＭのリン酸ナトリウム〜約５４ｍＭのリン酸ナトリウム、約４７ｍＭのリン酸ナトリウム〜約５３ｍＭのリン酸ナトリウム、約４８ｍＭのリン酸ナトリウム〜約５２ｍＭのリン酸ナトリウム、約４９ｍＭのリン酸ナトリウム〜約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、または約５０ｍＭのリン酸ナトリウムを含んでもよく、そして、約９１ｍＭ〜約９９ｍＭの塩化ナトリウム、９２ｍＭ〜約９８ｍＭの塩化ナトリウム、９３ｍＭ〜約９７ｍＭの塩化ナトリウム、９４ｍＭ〜約９６ｍＭのリン酸ナトリウム、または約９５ｍＭの塩化ナトリウムを含んでもよく、そして、約７．８〜約８．２、約７．９〜約８．１、または約８のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態において、第２の移動相緩衝液は、約５０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約９５ｍＭの塩化ナトリウムを含み、約８のｐＨを有する。適切な第２の移動相緩衝液の非限定的な例は、リン酸ナトリウムの代わりに使用できるＴｒｉｚｍａ  ＨＣｌ−Ｔｒｉｚｍａ塩基緩衝液である。
【００５１】
電荷変異体の溶出の前に、第１の移動相緩衝液をＣＥＸ支持体に通す。第１の移動相緩衝液がＣＥＸ支持体を通過するとき、緩衝液の混合物が約９０容量％の第１の移動相緩衝液および約１０容量％の第２の移動相緩衝液となるまで、第１の移動相緩衝液に第２の移動相緩衝液が添加される。緩衝液は、例えば実質的に直ちに９０％対１０％の比に達するように第２の移動相緩衝液を加えることにより、ボーラス（大量投与、bolus）として一緒に混合されてもよい。あるいは、第２の移動相緩衝液を第１の移動相緩衝液に注入して、一定時間、通常は数分間かけて、１００％の第１の移動相緩衝液から、９０％の第１の移動相緩衝液と１０％の第２の移動相緩衝液の混合物へ徐々に混合してもよい。９０％−１０％混合物は、この緩衝剤の組み合わせで支持体を平衡化させるのに十分な時間、通常は数分間、支持体を通って流れる。
【００５２】
電荷変異体を溶出するために、ＣＥＸ支持体を通って流れる第２の移動相緩衝液の量（容量）を増加させ、第１の移動相緩衝液の量を減少させることにより、第２の移動相緩衝液の量（容量）を勾配にわたって増加させる。フロースルー液中の塩およびｐＨが増加するにつれて、電荷変異体が連続してＣＥＸリガンドから溶出し始める。最初に酸性電荷変異体、続いて主要抗体（非変異体）、その後塩基性電荷変異体が続く。各変異体、酸性または塩基性、および主要抗体は、溶出する際に分画として同定および回収されてもよい。
【００５３】
第２の移動相緩衝液の量（容量）が増加するにつれて、電荷変異体がグラジエント溶出を介して連続的に溶出する。第２の移動相緩衝液の容量は、約１０％〜約４５％の勾配にわたって増加する。第２の移動相緩衝液が約４５容量％であり、第１の移動相緩衝液が約５５容量％である場合、最後の塩基性変異体はＣＥＸリガンドから溶出する。勾配は、一般に数分の時間にわたって進行する。適切な勾配時間の非限定的な例を以下の表２に列挙する（時間および量は近似値である）。
【００５４】
【表２】
2019504060.tif 000004
【００５５】
第２の移動相緩衝液のパーセンテージが増加するにつれて、ＣＥＸ支持体を通過する混合物のｐＨは、塩（ＮａＣｌ）の濃度と同様に増加する。抗体は、塩およびｐＨが増加するにつれてＣＥＸリガンドから順次溶出する。最初に溶出されるのは酸性電荷変異体であり、次いで主要抗体が溶出し、続いて塩基性電荷変異体が溶出する。トラスツズマブ抗体調製物は、少なくとも１０種類の電荷変異体を含むことが観察され、そのうち６種類は酸性電荷変異体であり、４種類は塩基性電荷変異体であった。主要抗体に加えて、これらの１０種類の変異体の任意のサブセットは、本明細書に記載または例示された方法に従って分画化および回収することができる。
【００５６】
トラスツズマブに対し、各酸性および塩基性変異体の溶出についての、第２の移動相緩衝液の体積百分率ならびにｐＨおよび塩（ＮａＣｌ）濃度を決定した。変異体および主要抗体のＣＥＸプロファイルを図１に示す。溶出プロファイルを表３に要約する。
【００５７】
【表３】
2019504060.tif 000005
【００５８】
様々な実施形態において、１以上の抗体変異体；２以上の抗体変異体；３以上の抗体変異体；４以上の抗体変異体；５以上の抗体変異体；６以上の抗体変異体；７以上の抗体変異体；８以上の抗体変異体；９以上の抗体変異体；および／または１０以上の抗体変異体を分画して回収してもよい。
【００５９】
全ての抗体変異体を分離して回収する必要はない。いくつかの実施形態では、選択された変異体のみが、抗体調製物から分離されてもよく、例えば、抗体調製物全体の力価を低下させる変異体から分離されてもよい。力価を増強するか、または抗体調製物全体の力価に中立である電荷変異体は、保持されてもよい。電荷変異体からの力価の寄与は、主要抗体の力価と比較して測定される。
【００６０】
収集される各変異体は実質的に純粋であり、主要抗体と同様に他の電荷変異体も実質的に含まない。収集された電荷変異体は、少なくとも約９０％の純度を有する。例えば、分画に集められたタンパク質含量などの物質の少なくとも約９０重量％が、電荷変異体である。収集された電荷変異体は、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および／または９９％の純度を有する。そのようなパーセンテージは、分画に集められたタンパク質などの物質の重量に基づく。
【００６１】
本明細書に記載され、例示された技術による、電荷変異体、ならびに主要抗体の分画および単離は、例えば、複数の細胞培養物で発現された抗体調製物を用いて、任意の適切な回数繰り返されてもよい。このプロセスを繰り返すことにより、例えば抗体を治療剤として製剤化するために望ましい各抗体アイソフォームの全収量が集合的に増加する。したがって、抗体の分画と共に組み合わせてもよい。組み合わせた分画は、当技術分野で適切な任意の手順に従って任意に濃縮されてもよい。
【００６２】
いくつかの好ましい実施形態では、得られた調製物が酸性および塩基性電荷変異体を実質的になくすように、主要抗体の精製された分画のみと共に組み合わせる。いくつかの実施形態では、特定の酸性または塩基性電荷変異体の精製された分画のみと共に組み合わせる−例えば、精製された酸性変異体１の１つの分画を、精製された酸性変異体１の別の分画と組み合わせるが、他の酸性変異体若しくは他の塩基性変異体、または主要抗体とは組み合わせない。同じ電荷変異体の分画と共に組み合わせることによって、特定の電荷変異体を、例えば、主要抗体または抗体の他の電荷変異体と比較して、力価について試験することができる。選択された変異体の分画は、他の選択された変異体の分画および／または主要抗体の分画と組み合わせてもよい。例えば、限定されないが、精製された酸性変異体１の分画は、精製された酸性変異体４の分画と組み合わせられてもよく、または精製された酸性変異体３の分画は、精製された酸性変異体５および主要抗体などの分画と組み合わせられてもよい。
【００６３】
変異体および／または主要抗体と共に組み合わせることは、特定の力価値に合わせて調整してもよい。例えば、抗体調製物の電荷変異体を単離することにより、各変異体の相対的親和性、免疫エフェクター機能、生物学的活性、および／または他の特徴を個々に評価することができ、その結果、それぞれの電荷変異体が、どのように、全体的に抗体製剤の治療有効性にポジティブまたはネガティブに影響を及ぼすかを決定することができる。電荷変異体が治療用抗体調製物の力価を低下させるかどうかが決定されると、そのような電荷変異体を精製スキーム中に単離することが望ましいことがある。特定の電荷変異体が治療用抗体調製物の力価を増強すると決定された場合、そのような電荷変異体を精製スキームの間に回収するのではなく、むしろそのような電荷抗体を維持することが望ましい場合があるか、または、それが単離されて収集される程度まで、治療用抗体製剤を調製する際に、主要抗体と一緒に変異体をプールすることが望ましい場合がある。あるいは、別個の治療用抗体製剤として増強された力価を有する電荷変異体を製剤化することが望ましい場合がある。
【００６４】
バイオシミラー製造では、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）や欧州医薬品局（ＥＭＡ）などの規制当局は、バイオシミラー抗体製剤が、参照抗体調製物と近似する割合の酸性および／または塩基性電荷変異体および主要抗体を維持することを要求することがある。したがって、方法論が、選択的溶出または収集された分画の再結合のいずれかによって、抗体調製物中の電荷変異体の量を制御することを可能にするので、本明細書に記載および例示される方法論は、このような割合を適合させる有用性を見出すことができる。本方法論は、抗体調製物の治療有効性を減少させる電荷変異体の選択的除去によって、および／または主要抗体のより高いレベルの純度を確立することによって、バイオベター抗体調製物の確立において有用性を見出すことができる。
【００６５】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するために提供される。それらは、本発明を説明することを意図しており、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１
材料および方法
トラスツズマブは、バイオリアクター細胞培養液中で組換え発現され、最初にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。次いで、プロテインＡ精製抗体調製物を、カチオン交換クロマトグラフィーを含む後続のクロマトグラフィー精製工程に供した。典型的には、インプロセス制御工程から分取された物質を分析用ＣＥＸクロマトグラフィーによって分析して、電荷変異体を評価し、これらの荷電したアイソフォームから所望の抗体を分離する。Ｄｉｏｎｅｘはカラムメーカーであった。ＣＥＸカラム用の樹脂は、コアビーズに結合したカルボキシル化官能基を有する親水性層を有する非多孔質コア粒子を含有する。
【００６７】
トラスツズマブの主ピークの酸性および塩基性電荷変異体からの分離は、Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｏｒを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｂｉｏ−ｉｎｅｒｔ  ＨＰＬＣシステムを使用して達成された。１０ミクロンの粒子サイズおよび内径９ｍｍおよび長さ２５０ｍｍの寸法を有するセミプレップＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ−１０カラムを、電荷変異体の単離に使用した。
【００６８】
注射用水（ＷＦＩ）で約２５ｍｇ／ｍＬへ再構成されたトラスツズマブを、電荷アイソフォームの単離に使用した。移動相（ＭＰ）Ａは、ｐＨ６．１にて２４ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液を含み、移動相（ＭＰ）ＢはｐＨ８．０にて５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液および９５ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ。アイソフォームは、５分間の１０％から３０％へのＢ相、その後の２５分間の３０％から４５％へのＢ相の２段階ＭＰ勾配により、カラムから溶出された。カラムおよびオートサンプラーの温度は、それぞれ３５℃および５℃に設定した。移動相フローは２．０ｍＬ／分であり、注入量は４０μＬであり、検出は２８０ｎｍでのＵＶによるものであり、実行時間は４５分であった。
【００６９】
未分画のトラスツズマブの電荷変異体の分析、または単離した電荷アイソフォーム分画の量および純度の評価には、１０ミクロンの粒径および４ｍｍの内径および２５０ｍｍの長さの分析用ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ−１０カラムを使用する。移動相組成および勾配は、分析カラムについて０．５ｍＬ／分に設定されたＭＰ流を除いて、セミプレップスケールで使用されたものと同じである。
【００７０】
単離した分画は、各アイソフォームを約１ｍｇ／ｍＬの標的濃度に濃縮するために、トラスツズマブ製剤緩衝液へ緩衝液交換される。未分画トラスツズマブのＣＥＸクロマトグラフィープロファイルの一例を図１に示す。単離した分画のオーバーレイしたＣＥＸクロマトグラムの例を図２に示す。ＣＥＸクロマトグラフィーの２段階勾配移動相プロファイルの例を図３に示す。
【００７１】
等価物
本発明の１以上の実施形態の詳細は、上記の添付の説明に記載されている。本明細書に記載されているものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料はここで説明される。
【００７２】
前述の説明は、説明の目的でのみ提示されたものであり、開示された正確な形態に限定することを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲によって限定される。
【００７３】
配列表
トラスツズマブ重鎖（配列番号１）
【表４】
2019504060.tif 000006
トラスツズマブ軽鎖（配列番号２）
【表５】
2019504060.tif 000007
【図１】
2019504060.tif 000008
【図２】
2019504060.tif 000009
【図３】
2019504060.tif 000010
【配列表】
2019504060000001.app
【国際調査報告】
2019504060.tif 000011
2019504060.tif 000012
2019504060.tif 000013