(57)【要約】  本発明は、対象における肝疾患状態を評価する診断方法、肝疾患をモニタリングすること、肝疾患を識別すること、本発明の診断方法によって評価された対象を治療すること、対象における肝疾患状態を評価するための診断検査を提供すること、およびそのためのキットに有用なバイオマーカーおよびバイオマーカーパネルを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における肝疾患状態を診断する方法であって、前記方法が：
ａ．前記対象から生体試料を得る工程と；
バイオマーカーパネルの各バイオマーカーのレベルを前記試料において測定する工程であって、前記パネルが表１の少なくとも１つのバイオマーカーを含み、任意に、前記パネルが表３Ａまたは３Ｂに記載の任意のパネルである工程と、
ｂ．測定された前記レベルを肝疾患状態と相関させる工程と；
ｃ．前記相関に基づいて、前記対象が前記肝疾患状態を有することを判定する工程と；
ｄ．任意に、前記対象に治療を施す工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記パネルが、パネルＡＵに記載のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）比、チロシン、フルクトース、フルクトース／グルコース比、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、およびグリココール酸（ＧＣＡ）の各々を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記相関させる工程が、前記少なくとも１つのバイオマーカーの測定された前記レベルからスコアを計算する工程であって、前記スコアがモデルからの出力であって、前記モデルが前記パネルの各バイオマーカーの測定された前記レベルの入力に基づいて実行される工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記判定する工程が、計算された前記スコアを閾値スコアと比較する工程であって、前記対象が、前記スコアが前記閾値スコアを超える場合に前記肝疾患状態を有すると判定される工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記肝疾患状態が、肝疾患の存在、または肝疾患ステージまたは肝疾患重症度の存在である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記肝疾患状態が、肝炎、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記判定する工程が、計算された前記スコアを１つ以上の閾値スコアと比較する工程であって、前記１つ以上の閾値スコアが、肝疾患のより高いステージまたは重症度から前記肝疾患のより低いステージまたは重症度を識別する閾値に対応する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記肝疾患が線維症である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複数の前記閾値の１つ以上が非肝硬変線維症のステージを識別する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の閾値スコアが肝硬変のステージを識別する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の閾値スコアが、肝硬変と非肝硬変線維症を識別する第１の閾値を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の閾値スコアが、非肝硬変線維症のステージを識別する第２の閾値を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の閾値スコアが、肝硬変のステージを識別する第２の閾値を含む、請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記相関させる工程が、前記少なくとも１つのバイオマーカーの各々の測定された前記レベルを各々の対照レベルと比較する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上のバイオマーカーが、表２に列記される前記バイオマーカーから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記判定する工程が、質量分析（「ＭＳ」）によって測定する工程のための前記試料を調製する工程を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＳが、飛行時間ＭＳ、イオントラップＭＳ、四重極ＭＳ、磁場セクターＭＳ、イオンサイクロトロン共鳴ＭＳ、および静電場セクター分析計ＭＳの１つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記少なくとも１つのバイオマーカーを前記試料から抽出する工程を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抽出する工程が、前記試料を濾過して濾液を得る工程、および前記濾液中の前記少なくとも１つのバイオマーカーを測定する工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、濾過の前にタンパク質沈殿の工程を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記少なくとも１つのバイオマーカーを１つ以上の他のバイオマーカーから分離する工程を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離する工程が、ガスクロマトグラフィー（「ＧＣ」）または液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記測定する工程が、超高速液体クロマトグラフィー−トリプル四重極質量分析（「ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ」）を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳが負イオンモードで実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記測定する工程が、酵素的分析、化学的分析、比色的分析、または蛍光定量的分析を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が肝疾患状態を有すると同定され、前記方法がさらに前記対象を治療することを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記治療が、治療薬を投与すること、外科手術を実施すること、前記対象が以前に受け入れた治療薬の投与を中断すること、食事療法を指示すること、アルコール摂取を中断すること、運動を指示すること、または体重減少のための治療レジメンを指示することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記治療が、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）阻害剤、胆汁酸吸着レジン、ステロイド、ステロイド酸、胆汁酸誘導体、抗コレステロール薬、抗糖尿病薬、および式Ｉの化合物から選択される治療薬を投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記治療が、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）阻害剤および胆汁酸吸着レジンから選択される治療薬を投与することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
肝疾患ステージにおける変化をモニタリングする方法または：
ａ．第１の生体試料を前記対象から、および第２の生体試料を前記対象から得る工程であって、前記第１の生体試料が、前記対象が肝疾患治療を受ける前に前記対象から得られ、かつ前記第２の生体試料が、前記対象の前記治療の後に前記対象から得られる工程と；
ｂ．前記第１の試料および前記第２の試料においてバイオマーカーパネルの各バイオマーカーの前記レベルを測定する工程であって、前記パネルが、表１に列記される少なくとも１つのバイオマーカーを含み、任意に、前記パネルが、表３Ａまたは表３Ｂに記載の任意のパネルを含む工程と；
ｃ．前記第１の試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの測定された前記レベルを、前記第２の試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの測定された前記レベルと比較する工程と；
ｄ．前記第２の試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの測定された前記レベルに対する前記第１の試料中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの測定された前記レベルにおける偏差に基づいて前記治療の有効性を判定する工程と
を含み、
ｅ．任意に、前記方法が、前記治療の有効性が低いという判定の前記治療を修正することを含み、前記治療の修正が、治療の形態もしくは薬を変更すること、または治療の薬用量を修正することを含む、方法。
【請求項３１】
前記治療が、治療薬を投与すること、外科手術を実施すること、前記対象が以前に受け入れた治療薬の投与を中断すること、食事療法を指示すること、アルコール摂取を中断すること、運動を指示すること、または体重減少のための治療レジメンを指示することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記治療が、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）阻害剤、胆汁酸吸着レジン、ステロイド、ステロイド酸、胆汁酸誘導体、抗コレステロール薬、および抗糖尿病薬から選択される治療薬を投与することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療が、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）阻害剤および胆汁酸吸着レジンから選択される治療薬を投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
表１に列記される複数のバイオマーカーを検出するためのキットであって：
ａ．前記キットが少なくとも１つの内部標準を含み、
ｂ．前記少なくとも１つの内部標準が：
ｉ．天然に存在する血液、血漿、または血清ではなく；
ｉｉ．任意に同位体標識され、かつ
ｉｉｉ．表１に列記される前記バイオマーカーのうちの少なくとも１つに対応する
キット。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの内部標準が、複数の内部標準であり、一括して、前記複数の内部標準が、パネルにおける前記バイオマーカーの各々に対応する内部標準を含み、前記パネルが、表３Ａまたは表３Ｂに列記される前記パネルのいずれかを含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記複数の内部標準が、ステロイド酸、脂肪酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含み、任意に、前記ステロイド酸が、胆汁酸である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ステロイド酸、前記脂肪酸、前記アミノ酸、またはそれらの前記組み合わせの各々が、前記パネルのそれぞれのバイオマーカーの安定同位体標識された変形体であり、任意に、前記キットが、前記パネルの各バイオマーカーの安定同位体標識された変形体を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
フィルターをさらに備え、前記少なくとも１つの内部標準が、前記フィルターに含まれる、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
容器をさらに備え、前記少なくとも１つの内部標準が、前記容器中に提供される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの内部標準が、混合物として提供される複数の内部標準である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの内部標準が、フリーズドライされた、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの内部標準が、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ用に構成される、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
複数の容器を備え、各容器が、前記少なくとも１つの内部標準の一部を含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
対象における肝疾患を評価する方法であって、
ａ．キットの請求項３４〜４３のいずれか一項に記載のキットを提供する工程と、
ｂ．方法の請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法を行う工程であって、前記試料が、前記測定する工程の前に前記少なくとも１つの内部標準と混合される工程と、
を含む方法。
【請求項４５】
前記試料が、前記バイオマーカーを前記試料から抽出する工程の前に、前記少なくとも１つの内部標準と混合される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記キットが、フィルターを備え、かつ前記抽出する工程が前記フィルターを使用して前記試料を濾過する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照として本明細書に組み込まれる２０１６年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／３４３，０１０号に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、肝疾患に関連したバイオマーカー、肝疾患の診断、肝疾患の進行のモニター、肝疾患の階層化または肝疾患の識別のためのバイオマーカーの使用方法、そのためのキット、および発明の方法により診断された対象の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝線維症は、肝損傷に起因する創傷治癒応答である場合があり（Ｃｈａｎｇ  ＴＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｎｔｅｃａｖｉｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ／ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５２，８８６−８９３（２０１０）；Ｇｅｏｒｇｅ  ＳＬ，Ｂａｃｏｎ  ＢＲ，Ｂｒｕｎｔ  ＥＭ，Ｍｉｈｉｎｄｕｋｕｌａｓｕｒｉｙａ  ＫＬ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｊ，Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ  ＡＭ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ，ｖｉｒｏｌｏｇｉｃ，ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ＨＣＶ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ５−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  １５０  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４９，７２９−７３８（２００９））、肝機能の慢性不全の一般的な原因であり、かつ肝細胞癌の主要な危険因子でもある。Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス感染症、自己免疫および胆道疾患、アルコール中毒、ならびに非アルコール性脂肪性肝炎は、世界的にみて慢性肝疾患の最も多い原因であり、数年または数十年にわたって肝線維症および肝硬変を引き起こし得る（Ｂａｔａｌｌｅｒ  Ｒ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＤＡ．Ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １１５，２０９−２１８（２００５））。先進国において、脂肪肝を有する患者の約１５〜２０％は、線維症および肝硬変へと進行することになり、その中で約３０〜４０％は、最終的に肝不全、癌または肝移植後の再発により死亡することになる（Ｓｈｎｅｉｄｅｒ  ＢＬ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒａｌｔａ  Ｒ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＥＡ．Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ，Ｃ  ａｎｄ  ＮＡＦＬＤ：Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｔｏｐｉｃ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４４，１３４４−１３５４（２００６））。肝線維症および肝硬変への進行の検出およびステージ分類は、肝臓学において長期にわたって課題とされてきた。近年の研究では、肝線維症が反転し得ることが示され（Ｃｈａｎｇ  ＴＴ，ｅｔ  ａｌ．）、それにより、これらの患者における治療に対する応答を長期的にモニタリングおよび監視する必要性が強調されている。
【０００４】
慢性肝疾患患者における肝疾患の重症度の客観的な評価は、例えば治療前の意思決定、および治療されているのではなく、むしろ期待を持って詳細に調査されている軽度の疾患を有する患者を評価するために、ますます重要になっている。肝線維症／肝硬変の羅患率が上昇しているため、臨床医はその進行を識別することが要求されている。日々の臨床的なルーチンにおいて、肝線維症／肝硬変状態の監視のための信頼性が高い血清バイオマーカーが望ましいであろう。慢性肝疾患予後および管理は、肝線維症の量および進行に大きく依存している。
【０００５】
現在のところ、肝生検は、肝線維症の存在および程度を評価するためのゴールドスタンダードである。しかし、侵襲性、標本誤差、ならびに観察者内および観察者間の変動性などの制限により、正確な非侵襲的検査が長い間必要とされている。著しい繊維症の存在は抗ウイルス治療のための指標であり、肝硬変の存在は、門脈圧亢進症およびＨＣＣの危険の増大に関連した合併症の特異的なモニタリングのための指標である。
【０００６】
単純かつ信頼性の高い非侵襲的な肝疾患のマーカーの開発が臨床肝臓学における重要な目的であり、それにより臨床試験の設計が円滑化されることになる。しかし、いくつかの試みにもかかわらず、当分野は許容できる非侵襲的な解決策を生み出すことができていない。非侵襲的な方法を実現するこれらの試みは通常、３つのカテゴリーに分類される。（ｉ）肝機能と関連付けられた常用の臨床検査で構成される血清マーカー、（ｉｉ）細胞外マトリクスの合成および分解の産物ならびにそれらのプロセスに関与する酵素で構成される線維症バイオマーカー、ならびに（ｉｉｉ）超音波（ＵＳ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）などの肝臓に特異的ではない一般的な技術から（Ｔａｏｕｌｉ  Ｂ，Ｅｈｍａｎ  ＲＬ，Ｒｅｅｄｅｒ  ＳＢ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭＲＩ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．ＡＪＲ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌｏｇｙ  ２００９；１９３：１４−２７；．Ｂｒａｎｃａｔｅｌｌｉ  Ｇ，Ｆｅｄｅｒｌｅ  ＭＰ，Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ：ＣＴ  ａｎｄ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２００７；６１：５７−６９．）、トランジェントエラストグラフィー（ＴＥ）（ＦｉｂｒｏＳｃａｎ）などの肝臓に特異的な手法（Ｔａｌｗａｌｋａｒ  ＪＡ．Ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｏｐｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００８；１３５：２９９−３０２．Ｓａｎｄｒｉｎ  Ｌ，Ｆｏｕｒｑｕｅｔ  Ｂ，Ｈａｓｑｕｅｎｏｐｈ  ＪＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ：ａ  ｎｅｗ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３；２９：１７０５−１３．．Ｍｅｎｇ  Ｆ，Ｚｈｅｎｇ  Ｙ，Ｚｈａｎｇ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦｉｂｒｏＳｃａｎ）．Ｊ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ｍｅｄ  ２０１５；３４：４０３−１０）までの範囲にわたるイメージング技術。しかし、イメージングモダリティーは、腹水、中心静脈圧の上昇、肥満症を有する患者において正確度が不十分である。この３つのカテゴリーの中では、通常用いられる血清マーカーがその広範な可用性および相対的に低いコストのために魅力的に思われるが、前述の通り、許容できる解決策は実現されていない。これらは、ＦｉｂｒｏＴｅｓｔ（Ｉｍｂｅｒｔ−Ｂｉｓｍｕｔ  Ｆ，Ｒａｔｚｉｕ  Ｖ，Ｐｉｅｒｏｎｉ  Ｌ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  Ｆ，Ｂｅｎｈａｍｏｕ  Ｙ，Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００１；３５７：１０６９−７５）、ＡＳＴ／ＡＬＴ比（Ｓｈｅｔｈ  ＳＧ，Ｆｌａｍｍ  ＳＬ，Ｇｏｒｄｏｎ  ＦＤ，Ｃｈｏｐｒａ  Ｓ．ＡＳＴ／ＡＬＴ  ｒａｔｉｏ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １９９８；９３：４４−８．Ｐａｒｋ  ＳＹ，Ｋａｎｇ  ＫＨ，Ｐａｒｋ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．［Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＡＳＴ／ＡＬＴ  ｒａｔｉｏ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｃｏｕｎｔｓ  ａｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ＨＢＶ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｅｖｉｄｅｎｔ  ｌｉｖｅｒ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ］．Ｋｏｒｅａｎ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００４；４３：２４６−５１）などの血液化学臨床検査で構成されるスコアリングシステムを含み、ＡＰＲＩインデックス（Ｗａｉ  ＣＴ，Ｇｒｅｅｎｓｏｎ  ＪＫ，Ｆｏｎｔａｎａ  ＲＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｂｏｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２００３；３８：５１８−２６）が過去数年間の間に開発され、ＨＣＶ患者における肝線維症の程度の良好な予測因子として妥当性が確認された。しかし、それらの研究で得られた知見は一貫性のないものであった。したがって、肝疾患状態のための非侵襲的検査への要求は依然として存在する。
【０００７】
当技術分野において必要とされるのは、対象における肝疾患の存在を判定し、肝疾患を識別し、肝疾患のステージを分類し、かつ肝疾患の進行をモニタリングすることができるバイオマーカーパネルである。これまで、ＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変ならびに他の肝疾患の診断についての文献では、このようなバイオマーカーパネルは開示されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、肝疾患を有する対象と関連付けられたバイオマーカーの同定に関する。本発明は、診断方法、診断キット、および治療方法に有用なバイオマーカーのパネルを提供する。本発明の診断方法は、任意に、対象における肝疾患を診断すること、対象における肝疾患の進行をモニタリングすること、肝疾患をステージもしくは重症度により階層化すること、または対象における肝疾患を識別することのいずれかを含む。本発明の治療方法は、本発明の診断方法により同定された対象を治療することを含む。本発明のキットは、本発明の診断方法を実施するための１つ以上の試薬を含む。
【０００９】
本発明の第１の態様は、バイオマーカーのパネルを提供する。本パネルのバイオマーカーを測定し、かつ使用して、本発明の診断方法を実施することができる。パネルは、方法、キット、コンピュータ可読媒体、システム、およびバイオマーカーのパネルを採用する本発明の他の態様のために採用することができる１つ以上のバイオマーカーのセットを含む。
【００１０】
本発明の第２の態様は、診断方法を提供する。本発明の診断方法は、対象から得られた生体試料（「試料」）において、本明細書で教示されるパネルの各バイオマーカーのレベルを測定することと、測定されたレベルに基づいて肝疾患状態を評価することとを含む。
【００１１】
任意に、評価の工程は、肝疾患またはその状態の進行を診断すること、肝疾患の進行をモニタリングすること、または２種以上の肝疾患もしくは線維症のステージを識別することを含む。
【００１２】
任意に、評価の工程は、各バイオマーカーの測定されたレベルを（例えば、個別にまたは一括して）肝疾患状態と相関させることを含む。例えば、相関させることには、
ａ．パネルの各バイオマーカーの測定されたレベルを対照レベル（例えば、肝疾患がないことを示す肝疾患状態を示すレベル）と比較すること、およびその比較に基づいて対象を評価すること；
ｂ．モデル（例えば、アルゴリズム）からの出力に基づいて対象を評価すること（ここで、モデルはパネルの各バイオマーカーの測定されたレベルの入力に基づいて実行される）、または
ｃ．対象から採取した生体試料の質量分析により生成されるスペクトルを提供し、スペクトルからデータを抽出し、かつデータを、例えば、パネルの各々のバイオマーカーに対応する一対のピークに対して調整された単変量解析および多変量解析を行うこと
が含まれる。
【００１３】
任意に、肝疾患状態は、脂肪性肝炎（例えば、ＮＡＳＨ）、肝線維症もしくは肝硬変の存在、またはそのステージもしくはグレードである。例えば、肝疾患状態は、線維症のステージ（例えば、代謝機能の反映に基づく早期、中期、もしくは後期）または肝硬変のステージ（例えば、肝硬変のＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ（「ＣＰ」）グレード）であり得る。
【００１４】
任意に、対象は、以前に肝疾患もしくは肝線維症を有すると診断されたことのない対象、肝疾患を治療されたことのない対象、または肝疾患の治療を受けたことのある対象のいずれかである。
【００１５】
任意に、試料は血液、血漿または血清である。特定の実施形態では、試料は血清である。
【００１６】
任意に、測定方法は、質量分析（「ＭＳ」）を含む。任意に、ＭＳは、飛行時間型質量分析（「ＴＯＦＭＳ」）、トリプル四重極質量分析（「ＴＱＭＳ」）、または四重極飛行時間型質量分析（「ＱＴＯＦＭＳ」）を含む。ＭＳは、例えば、ガスクロマトグラフィー（「ＧＣ」）または超高速液体クロマトグラフィー（「ＵＰＬＣ」）などの液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）などの分離手法に続いて実施され得る。よって、本発明は、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＵＰＬＣ−ＭＳを採用することができる。任意に、本発明は、ＧＣ−ＴＯＦＭＳ、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦＭＳまたはＬＣ−ＴＱＭＳを採用する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、本発明の診断方法により肝疾患を有すると評価された対象に、肝疾患の治療を施すこと、または推奨すること（以下、総称して単独で「施すこと」と称する）を含む、治療方法を提供する。
【００１８】
任意に、治療は、対象により提示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルと肝損傷の緩和を示すかまたは肝疾患の重症度もしくは進行の緩和を示す対照レベルとの間の偏差を減少させる治療である。
【００１９】
任意に、治療は、治療薬、例えば、低分子治療薬を投与することを含む。
【００２０】
任意に、方法はさらに、治療を施すことに続いて、治療後の対象から得られた試料におけるパネルの各バイオマーカーのレベルを測定することと、治療後のレベルと治療前のレベルとを比較することと、治療により対象の肝障害が緩和されたか、または肝疾患の重症度もしくは進行が緩和されたかを評価することとを含む。任意に、方法はさらに、肝損傷または肝疾患の重症度もしくは進行が、治療により緩和されなかったか、または低い有効性をもたらしている（例えば、進行または重症度が所定の閾値量分低下しなかった）という判定の後に、治療を修正することを含む。
【００２１】
本発明の第４の態様は、本明細書で教示される１つ以上のバイオマーカーのパネルを検出するための１つ以上の試薬を含むキットを提供する。１つ以上の試薬は、１つ以上の内部標準を含むが、ここで、１つ以上の内部標準は一括して、パネルの各バイオマーカーに対する少なくとも１つの内部標準を提供する。任意に、キットは前記内部標準の混合物を含む。任意に、１つ以上の内部標準は凍結乾燥されている。任意に、１つ以上の内部標準はフィルター上に堆積されている。任意に、１つ以上の試薬は、容器内に提供される。任意に、キットは、例えば、肝疾患状態を評価する（例えば、肝線維症を診断する）ためのバイオマーカーを検出するための指示書を含む。
【００２２】
本発明の第５の態様は、本明細書に教示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーの測定されたレベルに基づいて肝疾患状態を評価するためのソフトウェアを含む、非一過性のコンピュータ可読媒体を提供する。ソフトウェアは、対象から採取した生体試料の質量分析により生成されるスペクトルから抽出されるデータを解析するためのアルゴリズムを含み、前記データはパネルのバイオマーカーに関する。
【００２３】
本発明の任意の態様では、パネルは、１つ以上の胆汁酸、１つ以上の遊離脂肪酸、１つ以上のアミノ酸、および／または１つ以上の炭水化物（例えば、表１に列記される）を含む。
【００２４】
任意に、１つ以上の胆汁酸は表１に列記されている胆汁酸から選択される。
【００２５】
任意に、１つ以上の遊離脂肪酸は表１に列記されている胆汁酸から選択される。
【００２６】
任意に、１つ以上のアミノ酸は表１に列記されているアミノ酸から選択される。
【００２７】
任意に、パネルは、表１に列記されている胆汁酸から選択される１つ以上の胆汁酸、表１に列記されている胆汁酸から選択される１つ以上の遊離脂肪酸、表１に列記されているアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸、表１に列記されている炭水化物から選択される１つ以上の炭水化物を含む。
【００２８】
任意に、１つ以上の胆汁酸は表２に列記されている胆汁酸から選択される。
【００２９】
任意に、１つ以上の遊離脂肪酸は表２に列記されている胆汁酸から選択される。
【００３０】
任意に、１つ以上のアミノ酸は表２に列記されているアミノ酸から選択される。
【００３１】
任意に、パネルは、表２に列記されている胆汁酸から選択される１つ以上の胆汁酸、表２に列記されている胆汁酸から選択される１つ以上の遊離脂肪酸、表２に列記されているアミノ酸から選択される１つ以上のアミノ酸、表２に列記されている炭水化物から選択される１つ以上の炭水化物を含む。
【００３２】
任意に、パネルは、表３（すなわち、表３Ａまたは表３Ｂ）に列記されているパネルである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】肝疾患患者および健常対照（対照）における全ての同定された特異的な胆汁酸（Ａ）、遊離脂肪酸（Ｂ）、およびアミノ酸（Ｃ）により確立されたＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図２Ａ】ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡおよびＴＣＤＣＡを用いた、健常対照からのステージ０（ＮＡＳＨ患者）の線維症の診断（すなわち、識別すること）における受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。ＡＵＣは０．９２１である。
【図２Ｂ】β−アラニンを用いた、健常対照からのステージ０（ＮＡＳＨ患者）の線維症の診断（すなわち、識別すること）におけるＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは１．０００である。
【図２Ｃ】Ｃ１８：２（トランス−９，１２）を用いた、健常対照からのステージ０（ＮＡＳＨ患者）の線維症の診断（すなわち、識別すること）におけるＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは１．０００である。
【図３】セリン、ＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡの組み合せを用いた、ステージ１（ＮＡＳＨ対線維症）の線維症からのステージ０の線維症の診断（すなわち、識別すること）におけるＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８８６である。
【図４】ステージ０および１（ＮＡＳＨ対ステージ１の線維症）の肝線維症を有する患者においてセリン、ＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡを用いて確立されたＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図５】Ｃ１４：１−シス．９、Ｃ２０：４−シス．５．８．１１．１４、β−アラニン、シトルリン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、チロシン、ＣＤＣＡ、およびＧＵＤＣＡの組み合せを用いた、肝硬変患者からの線維症患者の診断（すなわち、識別すること）におけるＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．９４２である。
【図６】肝線維症および肝硬変を有する患者においてＣ１４：１−シス．９、Ｃ２０：４−シス．５．８．１１．１４、β−アラニン、シトルリン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、チロシン、ＣＤＣＡ、およびＧＵＤＣＡを用いて確立されたＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図７】ＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変患者ならびに健常対照におけるＧＵＤＣＡ（ｎｇ／ｍＬ、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。Ａ、全ての対象；Ｂ、男性対象；およびＣ、女性対象。ＧＵＤＣＡは、健常対照と比較してＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変の患者において有意に増加し、それらは肝疾患の進行とともに徐々に増加した。＊＊は、互いに比較してｐ＜０．０１であることを意味する。
【図８】ＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変患者ならびに健常対照におけるＴＣＤＣＡ（ｎｇ／ｍＬ、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。Ａ、全ての対象；Ｂ、男性対象；およびＣ、女性対象。ＴＣＤＣＡは、健常対照と比較してＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変の患者において有意に増加し、それらは肝疾患の進行とともに徐々に増加した。＊＊は、互いに比較してｐ＜０．０１であることを意味する。
【図９】ＮＡＳＨ、線維症、および肝硬変患者ならびに健常対照におけるチロシン（強度、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。Ａ、全ての対象；Ｂ、男性対象；およびＣ、女性対象。チロシンは、健常対照と比較してＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変の患者において有意に増加し、それらは肝疾患の進行とともに徐々に増加した。＊＊は、互いに比較してｐ＜０．０１であることを意味する。
【図１０】異なるステージの肝線維症患者ならびにＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ  Ａ、ＢおよびＣ肝硬変患者におけるＧＵＤＣＡ（ｎｇ／ｍＬ、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。Ａ、全ての対象；Ｂ、男性対象；およびＣ、女性対象。ＧＵＤＣＡは肝疾患の進行とともに徐々に増加した。互いに比較して、＊は０．０５を意味し；＊＊は、ｐ＜０．０１を意味する。
【図１１】異なるステージの肝線維症患者ならびにＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ  Ａ、ＢおよびＣ肝硬変患者におけるチロシン（強度、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。Ａ、全ての対象；Ｂ、男性対象；およびＣ、女性対象。チロシンは肝疾患の進行とともに徐々に増加した。互いに比較して、＊はｐ＜０．０５を意味し；＊＊は、ｐ＜０．０１を意味する。
【図１２Ａ】測定された全ての胆汁酸の正準判別分析により生成された関数を用いて確立されたプロットを示す。
【図１２Ｂ】測定された全ての遊離脂肪酸の正準判別分析により生成された関数を用いて確立されたプロットを示す。
【図１２Ｃ】測定された全てのアミノ酸の正準判別分析により生成された関数を用いて確立されたプロットを示す。
【図１３】異なるステージの肝線維症患者ならびにＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈ  Ａ、ＢおよびＣ肝硬変患者におけるチロシン（強度、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。チロシンは肝疾患の進行とともに徐々に増加した。互いに比較して、＊はｐ＜０．０５を意味し；＊＊は、ｐ＜０．０１を意味する。
【図１４Ａ−１４Ｂ】本発明のキットを示す。
【図１５】本発明のキットを示す。
【図１６Ａ−１６Ｋ】本発明のバイオマーカーの診断能を示すグラフを示す。
【図１７Ａ−１７Ｆ】本発明のバイオマーカーの診断能を示すグラフを示す。
【図１８】肝線維症患者および健常対照において同定された全てのＢＡを用いて確立されたＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示す。
【図１９Ａ】ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を有する肝疾患患者ならびに糖尿病患者ならびに対照におけるＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡ（ｎｇ／ｍＬ、平均±ＳＥＭ）の棒グラフを示す。
【図１９Ｂ】確立されたＢＡパネルを用いたテストセット由来のＣＬＤ患者および糖尿病患者におけるＲＯＣ曲線を示す。
【図２０】対照、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を有する患者の群間でＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡの正準判別分析により生成された関数を用いて確立されたプロットを示す。
【図２１】ＨＢ、線維症、肝硬変およびＨＣＣを有する患者に対するＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットを示し、特異的に発現したＢＡの全てを用いて構築された。
【図２２】ＨＢ、線維症、肝硬変およびＨＣＣを有する患者の群間でＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡの正準判別分析により生成された関数を用いて確立されたプロットを示す。
【図２３】肝癌の治療としての胆汁酸モジュレーターの研究からのデータを示す。
【図２４】肝癌の治療としての胆汁酸モジュレーターの研究からのデータを示す。
【図２５】肝癌の治療としての胆汁酸モジュレーターの研究からのデータを示す。
【図２６】肝癌の治療としての胆汁酸モジュレーターの研究からのデータを示す。
【図２７】肝癌の治療としての胆汁酸モジュレーターの研究からのデータを示す。
【図２８】肝癌の治療としての胆汁酸モジュレーターの研究からのデータを示す。
【図２９】ＢＡが共同的に機能して肝臓の発癌を促進するであろう機構を示す。
【図３０】グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、チロシンおよびフルクトースを含むバイオマーカーのパネルの使用において、肝線維症の３つのステージの判別におけるＲＯＣ曲線を示す。
【図３１】ランダム木空間における肝疾患患者の分布を示す。
【図３２】肝疾患の治療または予防に有用な化合物の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
方法
概要
本発明の一実施形態は、対象における肝疾患状態を評価することを含む診断方法を提供する。肝疾患状態は、任意に、対象から得られた試料において、本明細書で教示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定すること、および１つ以上のバイオマーカーのレベルの測定されたレベルを疾患状態と相関させることにより評価され得る。相関に基づいて、本発明は肝疾患状態を有する対象を同定することができる。例えば、肝疾患状態は、肝疾患（例えば、線維症）の存在、または肝疾患の重症度もしくは進行（例えば、線維症のステージまたは非肝硬変線維症と肝硬変を判別するようなステージまたはグレード）であり得る。本発明の方法を任意に使用して、肝疾患またはその進行もしくは重症度（例えば、肝線維症または肝硬変の進行）を診断するか、肝疾患の進行（例えば、肝線維症または肝硬変の進行）をモニターするか、または２種以上の肝疾患を識別することができる。
【００３５】
本発明を実行する非限定実施例を示すために、本発明は、肝疾患を有する患者および健常対照の代謝プロファイルを比較して肝疾患の代謝産物プロファイルを同定することによりヒト血液血清試料における分子変化を検出するためのＬＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳおよび多変量解析の使用、および肝疾患のためのバイオマーカー、ならびに肝疾患の進行をモニタリングするための方法を教示する。さらなる例示的実施例は、肝疾患ならびに肝線維症および肝硬変の進行の検出に効果的であるものとして選択されたバイオマーカーのパネルに基づく検査である、モニタリング診断方法を提供する。本検査は、高い臨床的感度および臨床的特異度を有する。本検査は、任意に、ＭＳの手法の組み合せを使用する生体試料分類方法に基づく。より詳細には、本発明は、任意にＬＣＭＳおよびＧＣ−ＭＳを利用して、患者の血清試料に見出される代謝産物バイオマーカーのセットを含む低分子代謝産物を同定する。
【００３６】
任意に、肝疾患を有すると同定された対象は選択されて、例えば、本明細書で教示される治療方法にしたがった肝疾患の治療を受ける。
【００３７】
任意に、診断方法は、パネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルをモニタリングすることを含む。モニタリングの方法は、最初（例えば、治療を受ける前または第１期の治療後）に対象から提供され得る第１の生体試料、およびより後（例えば、治療後または第２期の治療後）に対象から提供され得る第２の生体試料を準備することと、第１の試料および第２の試料において１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することと、第１の試料および第２の試料において測定されたレベルを比較することとを含む。
【００３８】
任意に、本発明の方法は、対象に由来する試料において１つ以上の胆汁酸代謝産物を含むパネルを測定すること、および肝疾患の存在または不存在と１つ以上の代謝産物のレベルを相関させることにより、肝疾患を診断またはモニタリングすることを含む。任意に、パネルはさらに、脂肪酸、アミノ酸、および／または炭水化物（例えば、表１に列記される）などの代謝産物を含む。任意に、代謝産物は、表１に列記されるバイオマーカーから選択される。あるいは、代謝産物は、表２に列記されるバイオマーカーから選択される。これに加えてまたはこれに代えて、パネルは、表３（すなわち、表３Ａまたは表３Ｂ）に列記されているパネルである。
【００３９】
対象
本発明の方法により、対象から得られた生体試料において１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することができる。対象は、任意の対象、例えばヒト対象であり得る。
【００４０】
任意に、対象は、例えば、限定するものではないが、ヒト、またはチンパンジー、類人猿、サルなどの非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、またはウマなどの畜産動物、イヌまたはネコなどの家畜哺乳動物、マウスまたはラットなどの実験動物などの哺乳綱の成員である任意の温血動物である。
【００４１】
対象は任意の年齢または性別であり得る。例えば、対象は、成体、非成体、乳児、成熟動物、または未成熟動物であり得る。
【００４２】
任意に、対象は男性である。
【００４３】
任意に、対象は女性である。
【００４４】
本発明の実施形態は、任意に、バイオマーカーのパネルのレベルと対照試料のレベルを比較することを含み得る。任意に、対照は、健常対照試料または健常対照に相当するバイオマーカーレベルを含む試料である。本明細書で使用する場合、健常対照は、肝疾患（例えば、肝生検により同定されるもの）が臨床的に認められない健常な対象を意味する。健常対照試料は、健常対照対象から得られた生体液の試料を指す。
【００４５】
本発明は、驚くべきことに、対象、例えば、肝疾患の典型的な表現型を呈するかまたは呈さない対象における肝疾患状態を相関させるのに有用である。
【００４６】
任意に、本発明を実行して、肝疾患を有していると疑われていないかまたは肝疾患を有しにくい対象における肝疾患状態を評価することができる。
【００４７】
任意に、対象は、以前に肝疾患を有すると診断されたことがない対象、以前に肝疾患を有すると診断されたことがない対象（その対象の試料を得て、本発明の方法を使用して、肝疾患に関して試料を評価する）、以前にまたは最近（例えば、１年以内）肝生検を受けていない対象、以前にＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスを有すると診断されたことがない対象、アルコール依存症もしくはアルコールの多量摂取であると診断されたことがないか、またはアルコール依存症もしくはアルコールの多量摂取を有しない対象、非アルコール性肝疾患（ＮＡＬＤ）を有すると診断されたことがないか、または非アルコール性肝疾患（ＮＡＬＤ）を有しない対象、糖尿病または肥満症を有すると診断されたことがないか、または糖尿病または肥満症を有しない対象、アフラトキシンへの暴露があると診断されたことがない対象もしくは代謝的に健常な対象（例えば、ＨＢＡ１ｃレベルまたはＰＣＴ／ＵＳ１６／５７５３８号明細書に教示される代謝の他の診断に基づく）、健常な肝機能と関連付けられた血清マーカープロファイルを発現している対象、細胞外マトリクスの合成および分解の産物ならびにこれらのプロセスに関与する酵素で構成される臨床的に有意な量の線維症バイオマーカーを発現していない対象、検査される場合、超音波（ＵＳ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、もしくはトランジェントエラストグラフィー（ＴＥ）（ＦｉｂｒｏＳｃａｎ）から選択される肝疾患を示す検査結果を示さない対象、または検査される場合、肝線維症を示す検査結果を示さないであろう対象（検査はＦｉｂｒｏＴｅｓｔ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、およびＡＰＲＩインデックスから選択される）のいずれかである。
【００４８】
任意に、本発明を実行して、肝疾患を有していると疑われる、肝疾患を有していると確認された、または肝疾患を有する危険がある対象の肝疾患状態を評価することができる。
【００４９】
任意に、対象は、以前にＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスを有すると診断されたか、またはＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスを有する対象、アルコール依存症もしくはアルコールの多量摂取であると診断されたか、またはアルコール依存症もしくはアルコールの多量摂取を有する対象、非アルコール性肝疾患（ＮＡＬＤ）であると診断されたことがあるか、または非アルコール性肝疾患（ＮＡＬＤ）を有する対象、糖尿病もしくは肥満症であると診断されたか、または糖尿病もしくは肥満症を有する対象、アフラトキシンに暴露されたことがある対象、不十分な肝機能と関連付けられた血清マーカープロファイルを発現している対象、細胞外マトリクスの合成および分解の産物ならびにこれらのプロセスに関与する酵素で構成される臨床的に有意な量の線維症バイオマーカーを発現している対象、超音波（ＵＳ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、またはトランジェントエラストグラフィー（ＴＥ）（ＦｉｂｒｏＳｃａｎ）などの肝臓に特異的な手法から選択される肝疾患を示す検査結果を示す対象、肝線維症を示す検査結果を示す対象（検査はＦｉｂｒｏＴｅｓｔ、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、およびＡＰＲＩインデックスから選択される）のいずれかである。
【００５０】
任意に、対象は肝細胞癌（ＨＣＣ）を有しない。あるいは、対象は任意にＨＣＣを有する。
【００５１】
本明細書で教示される例は、Ｂ型肝炎を有する対象の集団由来のスコアリングモデルおよび肝疾患状態（例えば、脂肪性肝炎、ＮＡＳＨ、線維症または肝硬変）のバイオマーカーシグネチャの生成について詳述するが、本発明者らは、バイオマーカーレベルは、単にウイルスの存在により制御されるのではなく、肝炎（例えば、脂肪性肝炎）、線維症または肝硬変の存在により制御される肝臓の代謝状態の臨床像であると考えている。したがって、本発明は、Ｂ型肝炎感染を有するまたは有しない対象において実行することができる。同様に、本明細書で教示される例は、ＮＡＳＨを有する対象の集団由来のスコアリングモデルおよび脂肪性肝炎のバイオマーカーシグネチャの生成について詳述するが、本発明者らは、バイオマーカーレベルは、肝炎（例えば、脂肪性肝炎）の存在により制御される肝臓の代謝状態の臨床像であり、かつバイオマーカーは、任意の原因（アルコール依存症または非アルコール依存症）により引き起こされる線維症または肝炎を診断するのに有用であると考えている。したがって、本発明を、アルコール依存症または非アルコール依存症の対象で実行して、例えば、対象をアルコール性脂肪性肝炎またはＮＡＳＨと同定することができる。
【００５２】
試料
本発明の方法により、対象から得られた生体試料（「試料」）において１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することができる。
【００５３】
任意に、試料は血液、血漿または血清を含むか、またはそれからなる。例えば、このような試料のいずれかを、絶食期間後の対象から得ることができる。絶食試料の回収については、当技術分野でよく知られている。
【００５４】
任意に、試料は血清を含むか、またはそれからなる。本明細書で使用する場合、「血清」は、循環血液中の血漿から識別されたフィブリン凝塊および血球細胞の除去後に得られる血液の液体部分を指す。
【００５５】
内部標準
本発明の方法は、任意に、測定される１つ以上の（例えば、それぞれの）バイオマーカーに対する内部標準の使用を含む。内部標準は、任意に、測定前の任意の時点で試料と混合され得る。
【００５６】
任意に、試料調製前の試料における既知の初期レベルを有する内部標準により、それぞれのバイオマーカーのシグナルを正規化するために使用される測定シグナルを提供することができる。
【００５７】
試料調製の工程は、場合により、測定前にバイオマーカーの大幅な損失を引き起こす可能性がある。予測可能な試料調製手法の開発ならびに同一の分離および測定機器（例えば、同一のＬＣＭＳ装置）の使用により、測定の正確度および精度を上昇させることができるが、異なる試料調製媒体、方法および測定装置（例えば、別の実験室による）の使用は、バイオマーカーの回収率および／または測定シグナルにおいて予測不可能な変動を引き起こす場合がある。したがって、内部標準を本発明において任意に使用して、試料調製および測定中に、損失（すなわち、回収率の不整合）および／または各バイオマーカーのシグナルレベルの変動を補正することができる。
【００５８】
任意に、内部標準は、１つ以上の原子の安定同位体（例えば、（２）Ｈ、（１３）Ｃ、（１５）Ｎまたは（１８）Ｏ）により置換された１つ以上のその原子を有することを除き、パネルの対応するバイオマーカーと同一の化合物である。例えば、バイオマーカーの所与のパネルのための内部標準のセットは、各バイオマーカーの同位体標識された変形体を準備することにより提供され得る。
【００５９】
任意に、内部標準化合物は、測定される１つ以上のバイオマーカーのそれぞれと同一ではないが化学的に類似し、その結果、内部標準は、試料調製中に同様の挙動を示すが、測定工程中は一意に同定することができる。任意に、内部標準は、内部標準の測定シグナルレベルに対する試料調製の影響が、それぞれのバイオマーカーの測定シグナルレベルに対して同じになるように選択される。
【００６０】
任意に、内部標準は、１つ以上の調製（例えば、抽出または他の精製）の工程およびバイオマーカー分離工程の前に試料と混合される。
【００６１】
任意に、パネルは、複数のバイオマーカーおよび各バイオマーカーに対する異なる内部標準（例えば、ラベル以外は対応するバイオマーカーと同一である標識されたバイオマーカー）を含み、あるいは、少なくとも１つの内部標準が、複数のバイオマーカー（例えば、同じ化合物クラスの１つのバイオマーカー、複数の胆汁酸のための標識されたステロイド酸または胆汁酸、複数の脂肪酸バイオマーカーのための標識された脂肪酸、および／または複数のアミノ酸のための標識されたアミノ酸などの１つ以上のそれぞれのバイオマーカー）の正規化のために提供される。例えば、任意に、ノナデカン酸−ｄ３７を、本明細書で教示されるパネルの全ての遊離脂肪酸のための内部標準として提供することができる。
【００６２】
任意に、内部標準は同位体標識された化合物である。あるいは、内部標準は、試料中に見出されない、例えば、血液、血漿または血清中に見出されない任意の化合物である。
【００６３】
任意に、内部標準は安定同位体で標識された化合物（例えば、バイオマーカーの標識された変形体、またはバイオマーカーとして類似の特性を有する化合物の標識された変形体）である。任意に、安定同位体は、（２）Ｈ、（１３）Ｃ、（１５）Ｎまたは（１８）Ｏである。
【００６４】
任意に、１つ以上の内部標準は、標識されたステロイド酸（例えば、胆汁酸）（例えば、胆汁酸バイオマーカー用に使用される）、標識された脂肪酸（例えば、脂肪酸バイオマーカー用に使用される）および／または標識されたアミノ酸（例えば、アミノ酸バイオマーカー用に使用される）から選択される。
【００６５】
任意に、有用な内部標準は、実際の試料中で内部標準として決定されるバイオマーカーに関する安定同位体で標識された任意の代謝産物である。任意に、内部標準は、パネルから測定される代謝産物バイオマーカーと同一の化学的性質を有する。例えば、パネルの対応するバイオマーカーに関して、内部標準は、試料からタンパク質沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、アセトンまたはエタノールによる）および／または濾過（例えば、本明細書に教示されるフィルターを用いた）により抽出する際の回収率を生成する。特定のバイオマーカーパネルを前提とすると、当業者は、対応するバイオマーカーと同一または共通の化学的性質を有する内部標準を容易に選択することができ、ここで、同一または共通の化学的性質は、バイオマーカーおよび内部標準の回収率に影響を与えるもの（例えば、分子量、極性、共有、共通のＲ基など）である。任意に、各内部標準は、対応するバイオマーカーに対して、（＋／−）１０％、７％、５％、４％、３％、２％、１％もしくは０．５％以下または未満の回収率を有する。
【００６６】
例えば、以下に、本発明において対応するバイオマーカー測定に有用な内部標準を示す：
コール酸（ＣＡ）−ｄ４（例えば、ヒオコール酸（ＨＣＡ）用に使用される）
ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）−ｄ４（例えば、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコヒオコール酸（「ＧＨＣＡ」）および／またはタウロヒオコール酸（ＴＨＣＡ）用に使用される）
リトコール酸（ＬＣＡ）−ｄ４（例えば、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）用に使用される）
トリデカン酸−ｄ２５（例えば、モノ不飽和遊離脂肪酸用に使用される）
ノナデカン酸−ｄ３７（例えば、飽和遊離脂肪酸用に使用される）
バリン−ｄ８（バリン用に使用される）
ロイシン−５，５，５−ｄ３（ロイシン用に使用される）
イソロイシン−２−ｄ１（イソロイシン用に使用される）
チロシン−３，３−ｄ２（チロシン用に使用される）
フェニルアラニン−３，３−ｄ２（フェニルアラニン用に使用される）
【００６７】
任意に、内部標準は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ用に構成される。
【００６８】
本明細書で提供される教示により、当業者は、バイオマーカーパネルの選択に基づいて有用な内部標準を容易に選択することができる。
【００６９】
試料調製
本明細書で測定されるバイオマーカーを、試料から任意に抽出することができる。例えば、その方法は、試料を抽出媒体と接触させる工程と、試料からバイオマーカーを抽出する工程と、抽出した脂質を測定（例えば、クロマトグラフィーによるバイオマーカーの分離後の質量分析により）する工程とを含み得る。
【００７０】
抽出媒体は、測定工程において測定されない試料の１つまたは他の構成成分からのバイオマーカーの抽出を可能にする任意の媒体であり得る。任意に、抽出媒体は、溶液（例えば、タンパク質沈殿溶液）、フィルター、またはその両方を含む。
【００７１】
測定
本発明は、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することにより、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーを検出する。測定の工程は、本明細書に教示されるバイオマーカーの測定に有用な任意の様式で実施され得る。例えば、生体試料（例えば、血液、血漿または血清）中のバイオマーカーを測定する任意のインビトロの方法を使用することができる。
【００７２】
任意に、測定方法は、質量分析（「ＭＳ」）を含む。ＭＳは、例えば、ガスクロマトグラフィー（「ＧＣ」）または液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）などの分離手法に続いて実施され得る。任意に、ＭＳは、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳまたは超高速液体クロマトグラフィー（「ＵＰＬＣ−ＭＳ」）を含む。任意に、ＭＳは、飛行時間、イオントラップ、四重極、磁場セクター、イオンサイクロトロン共鳴、静電場セクター分析計またはその組み合せもしくは複合型である。任意に、ＭＳは、飛行時間型質量分析（「ＴＯＦＭＳ」）、トリプル四重極質量分析（「ＴＱＭＳ」）、または四重極飛行時間型質量分析（「ＱＴＯＦＭＳ」）を含む。任意に、本発明は、ＧＣ−ＴＯＦＭＳ、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦＭＳまたはＬＣ−ＴＱＭＳを採用する。
【００７３】
任意に、測定の工程の前に、抽出（例えば、濾過）および／または分離（例えば、クロマトグラフィー）の工程がある。クロマトグラフィーは、移動相と固定相の間の分配挙動の相違に基づいて試料中の構成成分を分離する方法である。通常、カラムは固定相を保持し、移動相はカラムを通って試料を運ぶ。固定相に強く分配する試料構成成分は、カラム内でより長い時間を費やし、移動相に優先的にとどまりカラムをより速く通過する構成成分から分離される。構成成分がカラムから溶出されるときに、それらを、例えば、質量分析計を用いて測定することができる。
【００７４】
任意に、クロマトグラフィーカラム中では、パネルの各々のバイオマーカーが試料の同じアリコ−トからアリコ−トのインストラクションに従って測定される。このような実施形態は、全てのバイオマーカーを単一のアリコートから分離することができ、並行した試料の調製、抽出および分離工程の必要性を排除することにより効率的な方法を提供する。
【００７５】
全てのバイオマーカーをこのように同時に流すことは、クロマトグラフィーの条件、例えば、十分な分離を得るためのカラム温度、移動相の組成、流速、移動相の溶出条件、分析時間および代謝産物のマスフラグメンテーションパターン（測定されるバイオマーカーの親イオンおよび娘イオン）を調整することにより実現され得る。
【００７６】
目的のバイオマーカーが分析物（例えば、パルミチン酸またはステアリン酸）であるとき、「測定」の工程は、分析物のレベルを測定すること（例えば、レベルを示すシグナルを測定すること）を含み得る。目的のバイオマーカーが複数の分析物のレベルに基づく計算値、例えば、比（例えば、（Ｃ２２：４  ｎ−６）／（Ｃ２０：４  ｎ６）比）であるとき、測定の工程は、複数の分析物のそれぞれのレベルを測定することと、測定された分析物レベルに基づいて目的のバイオマーカーのレベルを計算することとを含み得る。
【００７７】
用語「レベル」は、本明細書でバイオマーカーに関して用いられる場合、試料中のバイオマーカーの存在の任意の定量的または定性的な表現、例えば、量（例えば、質量）または濃度（例えば、ｗ／ｗ、ｗ／ｖまたはモル濃度）であり得る。濃度として表されるとき、レベルは、試料調製（例えば、抽出）の前に得られた試料の原体積（または重量）に対して表され得る。
【００７８】
肝疾患状態
本発明の方法を使用して、肝疾患状態を、例えば、パネルのバイオマーカーレベルを肝疾患状態に相関させることにより評価することができる。したがって、本発明の方法を任意に使用して、対象を、肝疾患状態を有すると同定することができる。
【００７９】
評価される肝疾患状態は、任意の肝疾患状態、例えば、肝損傷、肝機能障害または異常な肝臓状態であり得る。任意に、肝疾患状態は、肝臓炎症、脂肪肝（例えば、アルコール性または非アルコール性）、肝炎、脂肪性肝炎（例えば、アルコール性または非アルコール性）、肝細胞損傷、ＮＡＳＨ、線維症、肝硬変、慢性肝疾患、またはそのステージ、進行もしくは重症度である。
【００８０】
脂肪性肝炎を有しない脂肪症または脂肪肝は、例えば、炎症がほとんどあるいはまったくない脂肪浸潤により特徴付けられる。
【００８１】
非アルコール性脂肪性肝炎（「ＮＡＳＨ」）などの脂肪性肝炎は、脂肪症および肝細胞に損傷をもたらす炎症により特徴付けられる。脂肪性肝炎における慢性炎症は、瘢痕組織形成を伴う線維症への進行を引き起こす場合がある。
【００８２】
線維症は、任意に、ステージまたは進行により分類（例えば、階層化）することができる。例えば、線維症のステージは、Ｓ０〜Ｓ４のステージを含み得る。Ｓ０は、任意に、Ｓ０の脂肪性肝炎などの線維症の不存在（または実質的な不存在もしくはわずかに存在）により特徴付けられ得る。Ｓ１は、軽度の線維症すなわち門脈領域でのみ存在（または実質的に存在）する線維症（「門脈線維症」）により特徴付けられ得る。Ｓ２は、任意に、中等度線維症、すなわち門脈領域間、すなわち門脈周囲または門脈隔壁に存在するが健全な構造を有する線維症、または小葉構造に実質的に損傷がない線維症により特徴付けられ得る。Ｓ３は、任意に、重篤な線維症、すなわち門脈領域間および門脈領域と中心静脈との間を架橋する線維症、または構造上のひずみがあるが明らかな肝硬変ではないものとして特徴付けられ得る。Ｓ４は、任意に、肝硬変、すなわち偽小葉の形成または肝臓構造の変形として特徴付けられ得る。本発明の以前には、肝線維症このような分類が、肝生検などの侵襲性の検査を用いて実質的に確実性を有する唯一の可能なことであった。しかし、驚くべきことに、教示される特定のバイオマーカーパネルを測定することにより、肝線維症の診断および分類に有用なプロファイルを提供することができる。線維症の特定の分類に関して既存の定義が存在するが（例えば、Ｓ０〜Ｓ４ステージ）、これらの分類は、歴史的に、それらを肝生検によって同定することが可能になる様式において定義された。線維症は、徐々に繊維形成が増大して進行し得るため、本発明を任意に使用して、バイオマーカーレベルの変化に従って（例えば、モデルスコアにより）定義され、かつ肝生検に基づくステージ分類に必ずしも直接的に一致しない場合もある、新規の線維症分類（例えば、重症度または進行による）を提供することができる。例えば、線維症を、任意に、２つのステージ、例えば、軽症（例えば、Ｓ０〜Ｓ２、または幾分かＳ０〜Ｓ２と同一の広がりをもつステージ）および重症（例えば、Ｓ３〜Ｓ４、または幾分かＳ３〜Ｓ４と同一の広がりをもつステージ）に階層化することができる。あるいは、線維症を、任意に、例えば、早期（例えば、Ｓ０〜Ｓ１、または幾分かＳ０〜Ｓ１と同一の広がりをもつステージ）、中期（例えば、Ｓ２、またはＳ２と同一の広がりをもつステージ）および線維症の後期ステージ（例えば、Ｓ３〜Ｓ４、または幾分かＳ３〜Ｓ４と同一の広がりをもつステージ）を含む３つのステージに階層化することができる。あるいは、線維症を、階層化しているモデルを用いて４つ以上の別々のステージに分類することができ、または連続的なステージモデル（例えば、より高いスコアは線維症の度合いが高いことを示すが、カットオフにより別々のステージに分けられていない）を用いて分類することができる。
【００８３】
肝硬変は、任意に、進行または重症度により分類することができる。例えば、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈグレード（例えば、Ａ、ＢおよびＣ）により分類される肝硬変。上記の線維症の説明と同様に、本発明は、以前に形成された分類スキーム（例えば、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈグレード）に一致する様式で肝硬変を階層化することができ、または、例えばバイオマーカースコアにより同定される、別のスキームを用いて肝硬変を階層化することができる。例えば、肝硬変を、階層化しているモデルを用いて２つの別々のステージ、３つの別々のステージ、または４つ以上の別々のステージに分類することができるか、または連続的なステージモデル（例えば、より高いスコアは肝硬変の度合いが高いことを示すが、カットオフにより別々のステージに分けられていない）を用いて分類することができる。  
【００８４】
驚くべきことに、本明細書で教示されるパネルを使用して、肝疾患状態により対象を同定または判別することができる。例えば、本明細書で教示されるパネルを使用して、線維症と非線維症、肝硬変と非肝硬変、肝疾患（例えば、脂肪性肝炎）と非肝疾患を判別することができる。本発明の以前では、そのような対象を同定するためには侵襲性の方法である肝生検が必要とされていた。
【００８５】
任意に、本明細書で教示されるパネルを使用して、線維症と非線維症を判別する。例えば、非線維症は、任意の非線維症であり得、または健常な肝臓もしくは脂肪性肝炎（例えば、ＮＡＳＨ）の肝臓であり得る。
【００８６】
任意に、本明細書で教示されるパネルを使用して、肝硬変と非肝硬変を判別する。非肝硬変は、任意の非肝硬変、例えば、健常な肝臓、非肝硬変線維症（例えば、Ｓ３線維症）、または非肝硬変肝損傷（例えば、脂肪性肝炎）であり得る。
【００８７】
任意に、本明細書で教示されるパネルを使用して、肝疾患と非肝疾患を判別する。
【００８８】
例えば、肝疾患は、脂肪性肝炎（例えば、ＮＡＳＨ）または線維症（例えば、肝硬変と非肝硬変線維症の両方）であり得るか、または脂肪性肝炎もしくは線維症のいずれかを有する対象により定義される肝疾患状態であり得る。
【００８９】
任意に、本明細書で教示されるパネルを使用して、線維症のステージまたは重症度を判別する。
【００９０】
任意に、本明細書で教示されるパネルを使用して、肝硬変の重症度を判別する。
【００９１】
相関
本発明の方法は、パネルの１つ以上のバイオマーカーの測定されたレベルと肝疾患状態を相関させることにより肝疾患状態を評価することを含むことができる。相関に基づいて、対象を、肝疾患状態を有すると同定し、例えば、肝疾患と診断し、分類し（例えば、肝疾患の病型、ステージ、進行または重症度）、または肝疾患状態（例えば、進行または重症度）の変化についてモニターすることができる。肝疾患、肝疾患分類または肝疾患状態の変化を有すると同定された対象は、選択されて肝疾患治療を受けることができる。
【００９２】
任意に、相関させる工程は、１つ以上の測定されたバイオマーカーレベルをそれぞれの対照レベル（例えば、健常対照対象を示す、または健常対照対象と同等なレベル）と比較することを含む。これに加えてまたはこれに代えて、１つまたは複数のバイオマーカーの測定されたレベルは、測定されたレベルに基づくスコアを算出するモデル（例えば、コンピュータにより実行される数式またはアルゴリズム）に入力され得る。
【００９３】
バイオマーカーレベル（例えば、測定されたレベル）またはスコア（例えば、モデルにより算出される）は、対照レベルまたは対照スコアと、肝疾患の存在もしくは重症度などの状態のためのカットオフ点および異常値を定義するための基準限度値、判別限度値、または診断もしくは分類の定義閾値などの手法を利用して、丁寧に比較され得る。バイオマーカーの対照レベルまたは組み合わされたバイオマーカースコアは、それぞれ、所与の肝臓状態を有しない対象において通常見出されるレベルまたはスコアであり得る。このような対照レベルおよびカットオフ点は、任意に、バイオマーカーが単独で用いられるかまたは他のバイオマーカーと組み合わせてスコアにする式で用いられるかに基づいて変動してもよい。あるいは、対照レベルまたは対照スコアを、肝疾患状態であると（例えば、肝生検に基づいて）診断された以前に検査された対象、または所与の肝疾患状態を示した対象とそれを示さなかった対象を識別するために決定された閾値から決定することができる（例えば、実施例で教示されるように）。任意に、対照レベルまたは対照スコアは、それぞれ、肝疾患の重症度または進行を識別するレベルまたはスコアである。これに加えてまたはこれに代えて、いくつかの肝疾患分類（例えば、ステージ）を提供することができるが、各分類は、所与のレベルまたはスコア範囲により同定される。これに加えてまたはこれに代えて、レベルまたはスコアを肝疾患状態（例えば、相対的なステージもしくは重症度または絶対的なステージもしくは重症度）の分類と相関させる方程式（例えば、曲線）が提供される。
【００９４】
任意に、バイオマーカーパネルの測定されたレベルの各々を含むプロファイルが提供され、測定されたプロファイルは対照のバイオマーカープロファイルと比較される。本発明のバイオマーカーを使用して、対照のバイオマーカープロファイルを生成することができる。対照のバイオマーカープロファイルは、例えば、肝疾患状態を有しないか、または肝疾患の低いステージもしくは重症度の分類を有する健常対照対象から得られる、陰性対照であり得る。あるいは、対照プロファイルは、例えば、肝疾患状態を有するか、または肝疾患のステージもしくは重症度の分類を有するかもしくは評価された肝疾患のステージもしくは重症度を有する対象から得られる、陽性対照であり得る。任意に、異なる対照プロファイルが比較され得るが、ここで、各対照プロファイルは、肝疾患を、例えば、疾患の進行によりモニターするかまたは治療の有効性をモニターするための基盤を提供するために、異なる肝疾患分類（例えば、ステージまたは重症度）を示す対象に対応している。陰性の対照プロファイルおよび／または陽性の対照プロファイルを、任意に、非一過性のコンピュータ可読メモリに保存することができる。
【００９５】
任意に、本発明の方法は、モデル（例えば、アルゴリズム）を使用して、測定されたバイオマーカーレベルを肝疾患状態と相関させることができる。モデルを用いるこのような相関は、そのために構成されるシステム、例えば、モデルを実行し、測定されたマーカーレベルの入力に基づくスコアを計算するプログラム（例えば、非一過性のコンピュータ可読メモリに保存され、かつマイクロプロセッサなどのコントローラにより実行される）を有するコンピュータ上で実施することができる。任意に、本発明のバイオマーカーパネルの測定値は、肝疾患状態スコアを算出するアルゴリズムを実行するモデルがプログラムされたコンピュータまたはそのマイクロプロセッサへの入力として機能する。システムにおいて検査されるバイオマーカーに加えて、いくつかの要因（例えば、生理学的要因）を使用して最終スコアを計算する場合、これらの要因をモデルに与えることができ、その結果、スコア計算を遂行することができるか、またはアルゴリズムが、他の要因とともに報告されかつ外的に組み合わされることになる予備的なスコアを生成して、最終スコアを計算することができる。
【００９６】
スコアリングモデルは、二分決定を示すスコア、例えば、特定の肝疾患状態の存在もしくは不存在を識別するスコアの閾値またはカットオフを生成し得るか、または肝疾患状態、例えば、重症度、ステージまたは進行に基づいて分類するスコアであり得る（例えば、ここでは、より高いスコアが線維症などの肝疾患のより重篤なステージを示す）。
【００９７】
評価される肝疾患状態は、任意の肝臓状態（例えば、線維症と関連する）であり得、肝疾患状態を有する対象により示される任意のエンドポイントにより同定され得る。肝疾患状態のエンドポイントとしては、例えば、線維症の存在または線維症の特定のレベルを示す肝生検の結果を挙げることができる。肝疾患の他のエンドポイントは、よく知られている臨床診断のエンドポイントであり、当業者は、このようなエンドポイントが変動され得、本発明に従って肝疾患状態の有用なエンドポイントを生成することができることを理解するであろう。
【００９８】
一実施形態では、肝疾患状態の評価は、スコアを計算することを含む。本発明の特定のスコアリング方法は、ロジスティック回帰に基づく相関（例えば、実施例で詳述されるような）を用いて例示されるが、本発明は、任意の相関方法を意図する。例えば、本発明で開示されるようなバイオマーカーのセットの選択後、相互相関、主成分分析（ＰＣＡ）、因子回転、ロジスティック回帰（ＬｏｇＲｅｇ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、Ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ線形判別分析（ＥＬＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、ランダムフォレスト（ＲＦ）、再帰分割木（ＲＰＡＲＴ）、関連決定木分類手法、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ  Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ（ＳＣ）、ＳｔｅｐＡＩＣ、ｋ近傍法、ブースティング、決定木、ニューラルネットワーク、ベイジアンネットワーク、サポートベクターマシン、および隠れマルコフモデル、線形回帰または分類アルゴリズム、非線形回帰または分類アルゴリズム、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、階層分析またはクラスタリングアルゴリズム；決定木を用いる階層アルゴリズム；カーネル部分最小二乗アルゴリズム、カーネルマッチング追跡アルゴリズム、カーネルフィッシャー判別分析アルゴリズム、またはカーネル主成分分析アルゴリズムなどのカーネルに基づく機械アルゴリズム、または他の数理的および統計的方法などのよく知られた手法を使用して、肝疾患状態スコアの計算のためのアルゴリズムを開発することができる。
【００９９】
一例として、スコアリングモデルは、終了値が肝線維症の存在（または重症度）を示すロジスティック関数を含むことができる。例えば、そのようなスコアリングモデルを用いる本発明の方法は、任意に、ａ）対象の血清または血漿において、本明細書に教示されるパネルの各バイオマーカーのレベルを測定することと、ｂ）前記バイオマーカーを含むロジスティック関数を介して、測定された前記レベルを組み合わせることと、ｃ）肝疾患状態（例えば、肝線維症）の存在またはその重症度を判定するために、前記ロジスティック関数の終了値を分析することとを含むことができる。ロジスティック関数の終了値のそのような分析は、その終了値を、モデルを検査対象の集団に適用して得られる終了値に相関させることを含むことができる。任意に、ロジスティック関数は、ｉ）肝疾患状態（例えば、線維症の重症度）に応じた異なる群の患者の分類、ｉｉ）肝疾患状態の診断用の個々の識別力のあるパネルのバイオマーカーの値を評価するためのロジスティック回帰分析、およびｉｉｉパネルのバイオマーカーを組み合わせることによるロジスティック関数の構築により得られる。このような例を、実施例１から実施例１６、実施例１９、および実施例２０に詳述する。
【０１００】
スコアリングモデルを生成する有用な方法はまた、国際公開第２００２／０１６９４９号パンフレット；国際公開第２００２／０１６９４９号パンフレット：国際公開第２０１０／１４９７６７号パンフレット、国際公開第２００６／１０３５７号パンフレット、国際公開第２００６／０８２５２２号パンフレット、国際公開第２００３／０７３８２２号パンフレット、国際公開第２０１１／０３９３２１号パンフレット、国際公開第２００５／１１６９０１号パンフレット、国際公開第２０１０／０５８２９５号パンフレット、国際公開第２０１０／０９７４７２号パンフレットにおいて開示されている。
【０１０１】
一般に、選択された個体の集団を使用し、ここで、集団中のバイオマーカーの値、および肝生検によって判定され得るような（例えば、実施例で詳述されるような）それらの臨床上のエンドポイントに関する歴史的情報が利用可能である。
所与の個体についての肝疾患状態スコアを計算するために、バイオマーカー値を、個体から回収した１つ以上の試料から入手し、入力データとして、すなわち、選択された個体の集団から入手した実際の歴史的データにフィットさせたモデル（例えば、アルゴリズム）への入力として使用する。
【０１０２】
本発明の性能、したがって絶対的および相対的な臨床上の有用性は、上述のように複数の方法で評価され得る。様々な性能の評価のうち、本発明は、任意に、肝疾患状態の診断および治療のモニタリングにおいて正確度を提供することを意図する。正確度は、肝疾患状態を有するかまたは有しない対象を識別するための検査、アッセイまたは方法の能力に関係し得、かつ対象が１つ以上のバイオマーカーのレベルにおいて有効なレベルを有するか、もしくは実質的な変化を有するか、またはそこから計算されるスコアに基づく。有効なレベルまたは実質的な変化とは、それぞれ、バイオマーカーの測定値がそのバイオマーカーに関して事前に決定されたカットオフ点（または閾値）またはそのレベルの変化とは異なることを意味し、したがって、対象が特定の肝疾患状態を有すると判定されるか、または（例えば、モニタリングの方法において）肝疾患状態に変化が起きたことを示す。肝疾患状態の存在と肝疾患状態の不存在との間のバイオマーカーのレベルの相違は、好ましくは統計的に有意であり、本明細書で教示される実施例から容易に明らかなように、バイオマーカーレベルの上昇またはバイオマーカーレベルの低下であり得る。本発明は１つのバイオマーカーパネルの使用を意図しているが、いくつかの集団（例えば、特異的な遺伝的、生理学的または臨床的な状態を示している）について、統計的有意性、したがって好ましい分析的および臨床的正確度を達成することは、多くの場合、統計的に有意なスコアを達成するために、いくつかのバイオマーカーの組み合せをパネル中で合わせて使用し、数理モデル（例えば、アルゴリズム）と組み合わせることを含む。
【０１０３】
肝疾患状態の分類学的診断と同様に、本発明による肝疾患状態のための検査のカット点または閾値を変化させることにより、感度および特異度を変化させ得るが、しばしば定性的には逆相関の関係にある。したがって、感度および特異度はカット点の範囲にわたって有意に変動し得るため、提案された方法の正確度および有用性の評価において、任意に感度および特異度の両方を考慮してもよく、感度および特異度を報告しているカット点がどこにあるかに注意してもよい。全ての潜在的なカット点の値を包含するＡＵＣなどの統計情報の使用は、本発明を用いる肝疾患状態評価に好ましい場合がある。
【０１０４】
そのような統計情報を用いる場合、肝疾患状態を評価するために本発明の方法を用いる診断正確度の許容される程度は、ＡＵＣ（検査またはアッセイのＲＯＣ曲線下の面積）が少なくとも０．６０以上、例えば、少なくとも０．６５、少なくとも０．７０、少なくとも０．７５、少なくとも０．８０、または少なくとも０．８５である。任意に、ＡＵＣはさらに大きく、例えば、０．８７５、少なくとも０．９０、または少なくとも０．９５である。
【０１０５】
任意に、診断正確度の程度、すなわち、ＲＯＣ曲線上のカット点を定義し、許容されるＡＵＣ値を定義し、かつ肝疾患状態の存在を肝疾患状態の不存在から識別するバイオマーカーのレベル（またはスコア）を（個別にまたは一括して）構成する許容範囲を相対濃度で決定することにより、本発明によって、当業者が本明細書に教示されるバイオマーカーを使用して、高い正確度で肝疾患状態を有する対象を同定することが可能になる。
【０１０６】
モデルはまた、下記に詳述のように開発され、かつ／または使用され得る。
【０１０７】
スコアリングモデルの開発
本明細書で教示される実施例は本発明を実施するモデルの開発の詳細を提供するが、当業者は、本明細書で同定されるバイオマーカーおよび本明細書で教示される関連性を用いると、相関またはスコアを計算するのに用いられる数理モデルが、任意の様式で生成され得、本明細書で収集されかつ示されるデータに依存する必要がないことを理解するであろう。
【０１０８】
例えば、モデルを、例えば、実施例で詳述されるように、肝疾患状態（例えば、肝生検により同定される）の特定の臨床上のエンドポイントを示す対象と示さない対象の両方からのデータを含む、代表的な集団からのバイオマーカーレベルデータを取得することにより生成することができる。このようなデータは、本明細書で提供される教示（例えば、実施例に詳述されるバイオマーカーデータ）、または、例えば、直接に前向き（継続）集団から、および／もしくは民間もしくは公的なデータベースなどの以前の研究からの結果を含む後ろ向き疫学データの蓄積から取得する他の手段から取得され得る。バイオマーカーデータは単一の研究または複数の研究に由来していてよく、一般に、本明細書中に記載のバイオマーカーの値、臨床的アノテーション（エンドポイントが含まれ得る）、および特に本発明で使用するためのアルゴリズムを多くの対象にわたって訓練するための所望のエンドポイントを含めた、代表的な集団の所望の指標およびエンドポイントに関するデータが含まれる。次に、バイオマーカーレベルデータは、任意に、非一過性のコンピュータ可読メモリに保存される。
【０１０９】
次に、以下に記載するバイオマーカーの選択に使用することになるモデルまたは分析の要件を満たすために、代表的な集団データセットを必要に応じて作成することができる。例えば、データセットの作成には、代表的な集団、またはその選択されたサブセット内のそれぞれの対象からバイオマーカーレベル値を作成することを含んでもよい。しかし、未加工のバイオマーカーレベルデータ単独では、モデルを訓練する目的に完全には有用でない場合がある。したがって、ギャップフィル手法（例えば、最近傍内挿または他のパターン認識）、品質検査、様々な式（例えば、統計的分類アルゴリズム）を使用したデータの組み合せ、正規化、および／または変換、例えば、モデル要件を満たすためにデータの分布を変化させるための対数関数（例えば、底１０、自然対数など）などの、様々なデータ作成方法を使用してデータを作成してもよい。ここでも、特定のデータ作成手順は、代表的な集団データを使用して訓練されることになる１つまたは複数のモデルに依存する。様々な異なるモデルタイプのための特定のデータ作成手法は知られており、さらに説明する必要はない。
【０１１０】
特定のバイオマーカーを選択し、続いて肝疾患状態を評価するために使用されるモデルの訓練に使用する。バイオマーカーの選択は、代表的な集団データセットを検証するために選択モデルを利用すること、および最も再現性のある結果を提供するデータセットからバイオマーカーデータを選択することを含み得る。データセットの検証の例には、交差検証およびブートストラッピングを含んでもよいが、それらに限定されない。バイオマーカーの選択から、肝疾患状態の評価に使用されるモデルを決定および選択し得る。しかし、全てのモデルが同じデータセットで同じ結果を提供するわけではないことに留意されたい。例えば、異なるモデルは異なる数のバイオマーカーを利用し、異なる結果を生成し、それにより、選択されたモデル上のバイオマーカーの組み合せに有意性が付加され得る。したがって、肝疾患状態評価のための最適なモデルを同定するために、複数の選択モデルが選択され、かつ代表集団のデータセットまたはデータセットのサブセットとともに利用されてもよい。バイオマーカーを選択するために使用し得る、統計的モデル、アルゴリズムなどを含む特定のモデルの例は、上述されている。
【０１１１】
データセットまたはそのサブセットとともに使用する各選択モデルごとに、バイオマーカーを、任意に、モデル中の各バイオマーカーの統計的有意性に基づいて選択する。各モデルに入力する際、バイオマーカーは、任意に、統計的有意性に関する様々な基準に基づいて選択され、累積投票および重み付けをさらに含んでもよい。統計的有意性の試験には、出口テスト（ｅｘｉｔ−ｔｅｓｔ）および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を含んでもよい。モデルには、分類モデル（例えば、ＬＤＡ、ロジスティック回帰、ＳＶＭ、ＲＦ、ツリーモデルなど）および生存モデル（例えば、ｃｏｘ）を含んでもよく、その多くの例が上述されている。
【０１１２】
統計的に有意なバイオマーカーを同定するために、バイオマーカーを各選択モデルに個別に適用してもよいが、一部の例では、個々のバイオマーカー単独では所望されるより低い予測能を提供する場合があり、その場合、バイオマーカーの組み合わせを選択モデルに適用してもよいことに留意されたい。例えば、単変量のバイオマーカー選択を利用する代わりに、多変量のバイオマーカー選択が利用されてもよい。すなわち、バイオマーカーを他のバイオマーカーと組み合わせて用いる場合（例えば、モデルへの多変量入力）、バイオマーカーを単独で採用した場合には示さなかったであろう付加的な情報をこの組み合わせにもたらすことがあるため、その場合と比較して、バイオマーカーを選択モデルへの単変数入力として用いるときには、それほど優れた指標ではないことがある。
【０１１３】
肝疾患状態を評価するために使用するモデルが任意に選択され、訓練され、かつ検証される。特に、有力な候補モデルは、その例が上述された１つ以上の性能基準に基づいて選択されてもよい。例えば、データセット、またはデータサブセットを様々なモデルとともに使用することによって、これらのモデルを使用して統計的に有意なバイオマーカーを決定するだけでなく、その結果を使用してバイオマーカーとともに最適モデルを選択してもよい。そのように、肝疾患状態を評価するために使用される評価モデルが、分類モデルおよび生存モデルを含む選択モデルとして使用されるモデルのうちの１つを含んでもよい。バイオマーカーサブセットを含むモデルマーカーの組み合わせが、サブセットまたは個々のデータセット単位で比較され、検証されてもよい。比較および検証を何度も繰り返して、モデルを訓練し、検証して、適切なモデルを選んでもよく、続いてその適切なモデルが肝疾患状態を評価するためのモデルとして用いられる。
【０１１４】
スコアリングモデルの使用
本明細書に教示される実施例が本発明を実施するためのモデルを提供するが、当業者は、本明細書において同定されるバイオマーカーおよび本明細書に教示される関連性を使用すると、本明細書に教示されるバイオマーカーパネルを用いた任意の数理モデルを使用して、肝疾患状態を評価することができることを理解するであろう。
【０１１５】
例えば、本明細書に教示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーの入力に基づいて肝疾患状態スコアを計算できる数理モデルが提供され得る。バイオマーカーレベルデータが対象から取得され、任意に不揮発性メモリ）上に保存される。対象のバイオマーカーデータは、自己申告、身体検査、臨床検査および既存の診療記録、チャートまたはデータベースを含む様々な手段を通じて最初に導出され得る。対象のバイオマーカーレベルは、（例えば、本明細書に教示されるスコアリングモデルを開発する方法に詳述されるように）選択され、訓練されたモデルタイプに従って、必要に応じて計算、変換、ログ、組み合わせ、正規化などを用いて作成され得る。データが一旦作成されると、対象のバイオマーカーデータをモデルに入力できる。続いて、モデルは、肝疾患状態スコアを出力できる（例えば、そのスコアは、特定の肝疾患状態の存在もしくは不存在または肝疾患のステージもしくは重症度を示す）。スコアおよび他の評価工程により決定される肝疾患状態は、例えば、脂肪性肝炎（例えば、ＮＡＳＨ）、肝線維症、肝硬変、またはそのステージもしくは重症度であり得る。
【０１１６】
治療
一実施形態では、本発明の方法は、肝疾患状態（例えば、脂肪性肝炎、肝線維症、肝硬変、またはそのステージもしくは重症度）を有すると同定された対象を治療することを含む。
【０１１７】
有用な治療としては、肝疾患状態を寛解させるかまたは緩和する治療、肝疾患状態の進行を予防するかまたは遅らせる治療、肝疾患状態によって引き起こされ得る別の容態（例えば、肝性脳症、または肝細胞癌などの肝癌）の発症を予防するかまたは遅らせる治療が挙げられる。
【０１１８】
本発明の診断方法によって肝疾患状態を有すると同定された対象の治療における療法の使用には、任意の療法、任意の肝疾患状態および本明細書で教示される任意のバイオマーカーパネルが伴い得る。
【０１１９】
任意に、治療は、治療薬を投与すること、外科手術を実施すること（例えば、肝移植）、対象が以前に受け入れた治療薬（例えば、肝障害薬）の投与を中断すること、食事療法（例えば、カロリーまたは炭水化物摂取の低減）を指示すること、アルコール摂取を中断すること、運動を指示すること、または体重減少のための治療レジメンを指示することを含む。
【０１２０】
任意に、治療は、治療薬を含む。
【０１２１】
本発明において有用な治療薬としては、例えば、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）阻害剤、胆汁酸吸着レジン、ステロイド酸（例えば、胆汁酸）、胆汁酸誘導体、抗コレステロール薬、および抗糖尿病薬を挙げることができる。
【０１２２】
任意に、有用な治療薬は、回腸遠位部において胆汁酸の取り込みを阻害するか、二次胆汁酸の産生を減少させるか、腸からの胆汁酸の排出を促進するか、または胆汁酸合成を阻害する。
【０１２３】
任意に、治療は、ベンゾチエピン誘導体ＳＣ−４３５（Ｂｈａｔ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｌｅａｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ａｐｏＥ−／−  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ＳＣ−４３５．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４，１６１４−１６２１（２００３）を参照）もしくは２６４Ｗ９４（Ｒｏｏｔ  Ｃ，Ｓｍｉｔｈ  ＣＤ，Ｓｕｎｄｓｅｔｈ  ＳＳ，Ｐｉｎｋ  ＨＭ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＧ，Ｌｅｗｉｓ  ＭＣ．Ｉｌｅａｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ＣＹＰ７Ａ１  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｎｔｉｌｉｐｅｍｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ２６４Ｗ９４．Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４３，１３２０−１３３０（２００２）を参照）、キノリン誘導体Ｒ−１４４６２２４（Ｋｕｒａｔａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｐｉｃａｌ  ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｔｈｅ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ４−ｏｘｏ−１−ｐｈｅｎｙｌ−１，４−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  １４，１１８３−１１８６（２００４）を参照）、またはＳ−８９２１（Ｈａｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｓ−８９２１，ａｎ  ｉｌｅａｌ  Ｎａ＋／ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｒｕｍ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６０，Ｐｌ  ３６５−３７０（１９９７）を参照）などのナフトール誘導体などの頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）阻害剤を含む。他の有用なＡＳＢＴ阻害剤としては、参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３２３４１２Ａ１号明細書（Ｇｅｄｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，出願番号：米国特許出願第１４／３５４，５５３号明細書）に開示される式Ｉ〜ＶＩのいずれかが含まれる。理論に束縛されることなく、ＡＳＢＴ阻害剤は、胆汁酸の回腸から肝臓肝細胞への再吸収を阻害し、それにより、肝線維症、肝硬変もしくは他の関連する肝損傷もしくは肝疾患の程度または重症度を予防または治療するように血行中の胆汁酸を減少させることができると考えられている。
【０１２４】
任意に、治療は、コレセベラム（Ａｌｄｒｉｄｇｅ  ＭＡ，Ｉｔｏ  ＭＫ．Ｃｏｌｅｓｅｖｅｌａｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｓｉｎ．Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ３５，８９８−９０７（２００１）を参照）またはコレスチラミンもしくはコレスチポール（（Ｅｉｎａｒｓｓｏｎ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０，Ｓ５３−Ｓ５８を参照）などの胆汁酸吸着レジンを含む。理論に束縛されることなく、胆汁酸吸着レジンは、腸管内の胆汁酸を除去して、胆汁酸の腸管循環の低下をもたらし、それにより、肝線維症、肝硬変もしくは他の関連する肝損傷もしくは肝疾患の程度または重症度を予防または治療するように胆汁酸を減少させることができると考えられている。
【０１２５】
任意に、治療は、ステロイド酸を含む。有用なステロイド酸は、その非抱合型および抱合型を含む。任意に、ステロイド酸は、ウルソデオキシコール酸などの胆汁酸である。多くの他のステロイド酸が肝疾患の治療について当技術分野で知られている。
【０１２６】
任意に、治療は、オベチコール酸（ＯＣＡ）（Ｔｒｉｖｅｄｉ  ＰＪ，Ｈｉｒｓｃｈｆｉｅｌｄ  ＧＭ，Ｇｅｒｓｈｗｉｎ  ＭＥ．Ｏｂｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ９，１３−２６（２０１６）を参照）などの胆汁酸誘導体を含む。理論に束縛されることなく、胆汁酸誘導体は、胆汁酸合成を阻害して、それにより、肝線維症、肝硬変もしくは他の関連する肝損傷もしくは肝疾患の程度または重症度を予防または治療するように胆汁酸を減少させることができると考えられている。
【０１２７】
任意に、治療は、抗コレステロール薬の投与を含む。例として、スタチン、胆汁酸吸着レジン（例えば、コレスチラミン、コレスチポールまたはコレセベラム）、フィブラート、エゼチマイブ、ロミタピド、フィトステロール、またはオルリスタットが含まれる。
【０１２８】
任意に、治療は、参照として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３２３４１２Ａ１号明細書（Ｇｅｄｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，出願番号：米国特許出願第１４／３５４，５５３号明細書）に開示される任意の治療薬（例えば、ＡＳＢＴ阻害剤または吸収阻害剤）の投与を含む。
【０１２９】
任意に、治療は、教示される化合物に対する参照として本明細書に組み込まれる、Ｊｉａに付与されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／５７５３８号明細書、Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃらに付与された米国特許第６，０６０，４６５号明細書、Ｋｒａｍｅｒらに付与された欧州特許出願公開０４１７７２５Ａ２号明細書、またはＰｅｌｌｉｃｃｉａｒｉに付与された米国特許第８，４４５，４７２号明細書に教示されるような胆汁酸またはその誘導体の投与を含む。
【０１３０】
胆汁酸吸着レジン
任意に、治療は、教示される式Ｉの化合物に対する参照として本明細書に組み込まれる、Ｊｉａに付与されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／５７５３８号明細書に教示される任意の式Ｉの化合物の投与を含む。
【０１３１】
任意に、治療は、肝疾患状態を有する対象のための任意の標準治療である。
【０１３２】
任意に、治療は、ニガヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｂｓｉｎｔｈｉｕｍ）、ボセプレビル、ブメタニド、コレスチラミン、コレスチポール、フロセミド、ハーボニー、ヒドロクロロチアジド、ラクツロース、ミコフェノール酸モフェチル、スピロノラクトン、Ｔｅｃｈｎｉｖｉｅ、テラプレビル、チアジド、トリアムテレン、ヒドロクロロチアジド、Ｖｉｅｋｉｒａ  Ｐａｋ、ビタミンＫ、フィトナジオン、コルチコステロイド、胆汁酸、利尿薬、アルブミン、および抗生物質から選択される治療薬の投与を含む。
【０１３３】
本発明において有用な治療としては、例えば、抗糖尿病薬（例えば、メトホルミン、ロシグリタゾン、またはピオグリタゾン）、体重減少薬、食事療法処方（例えば、カロリーまたは炭水化物制限）、または運動を挙げることができる。そのような治療は、例えば、線維症（例えば、ステージＳ０またはＳ１）がほとんどあるいはまったくない脂肪性肝炎を有する対象に提供され得る。理論に束縛されることなく、これらの治療は、対象をインスリンに対してより感受性にし、ＮＡＳＨなどの脂肪性肝炎を有する患者において肝損傷を緩和する助けとなり得ると考えられている。
【０１３４】
本発明において有用な治療としては、対象が以前に服用していた治療薬の中断、または治療薬を与えないことを挙げることができる。理論に束縛されることなく、治療薬は、肝臓を過度に働かせ、線維症またはそのより高いステージへと肝疾患状態を進める場合があると考えられている。
【０１３５】
理論に束縛されることなく、本明細書で教示される治療は、肝疾患を緩和もしくは反転させるか、または肝疾患の進行を緩和もしくは予防するのに有効であり、任意に、例えば、測定されたバイオマーカーレベルまたは測定バイオマーカーレベルに基づいて計算されたスコアに応じて、対象におけるバイオマーカーレベルを緩和された肝疾患が示すレベルに変えると考えられている。
【０１３６】
任意に、本発明の方法は、本発明のパネルを使用して対象における肝疾患対象を評価することを含み、評価の工程は、異なるステージまたは重症度の２種以上の肝疾患状態を判別することを含み、また、方法はさらに、評価に基づいて治療を選択するか、または同定されたステージまたは重症度に基づいて特異的に治療を選択することを含む。
【０１３７】
例えば、治療は、任意に、肝疾患状態がより重篤な肝疾患状態ステージまたは重症度として評価された対象に対してのみ選択される。
【０１３８】
あるいは、第１の治療は、任意に、肝疾患状態がより重篤な肝疾患状態ステージまたは重症度として評価された対象に対して選択され、第２の治療は、肝疾患状態がより重篤ではない肝疾患状態ステージまたは重症度として評価された対象に対して選択される。第１の治療および第２の治療は、異なる重症度の副作用、侵襲性または死亡率を有する治療であり得る。
【０１３９】
例えば、肝移植は、任意に、より重篤な線維症のステージまたは重症度（例えば、ＣＰステージＣなどの後期ステージの肝硬変）を有する対象に対して選択されるが、一方で治療薬（例えば、低分子治療薬、ＡＳＢＴ阻害剤、吸収阻害剤、胆汁酸もしくはその誘導体、糖尿病薬、ステロイド酸、または胆汁酸吸着レジン）の投与は、任意に、より重篤ではない線維症のステージまたは重症度を有する対象に対して選択される。
【０１４０】
別の例として、治療薬（例えば、低分子治療薬、ＡＳＢＴ阻害剤、吸収阻害剤、胆汁酸もしくはその誘導体、ステロイド酸、または胆汁酸吸着レジン）の投与などの第１の治療は、任意に、より重篤な線維症のステージまたは重症度を有する対象に対して選択され、糖尿病薬もしくは体重減少薬の投与、または生活習慣を変える処方（例えば、カロリーもしくは炭水化物制限または運動）などの第２の治療は、より重篤ではない線維症のステージまたは重症度（例えば、Ｓ０または実質的に線維症のない脂肪性肝炎）を有する対象のための治療として選択される。
【０１４１】
任意に、方法は、より重篤なまたは後期ステージの線維症を有するそれらの対象のために、高い重症度の副作用、侵襲性または死亡率を有する治療を確保する場合がある。例えば、肝移植は、相対的に最も重篤なまたは最も後期の線維症（例えば、後期ステージの肝硬変）を有する患者のために確保され得、より強力な治療薬（例えば、より大きな副作用または死亡率を有する）は、相対的に中等度の線維症のステージまたは重症度を有する患者のために、より弱い治療薬（例えば、より小さな副作用または死亡率を有する）は、相対的に早期のステージまたはより重症度の低い線維症のために、および生活習慣の変更は、相対的に一層軽度な線維症または線維症を有しない脂肪性肝炎を示す対象のために確保され得る。
【０１４２】
本発明は、上述の例の各々を意図するが、当業者は、肝疾患状態をステージまたは重症度に基づいて評価した対象の治療における使用のために、異なる重症度の副作用、侵襲性または死亡率を有する治療を、２つ（またはそれ以上）の中から容易に選択することができる。
【０１４３】
モニタリング
一実施形態では、本発明の方法は、本明細書で教示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルをモニタリングすることを含む。本発明によるモニタリングの方法は、第１の生体試料および第２の生体試料を提供することであって、第１の試料は、１回目に対象から得られ、第２の試料は、２回目に対象から得られ、２回目が１回目より後である、提供することと、第１の試料および第２の試料の各々において１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定することと、第１の試料から測定されたレベルを第２の試料の測定されたレベルと比較して肝疾患状態の変化を判定すること、または各試料において測定されたレベルを肝疾患状態と相関させて、第１の試料から相関された（または同定された）肝疾患状態を第２の試料から相関された（または同定された）肝疾患状態と比較することのいずれかとを含む。
【０１４４】
任意に、１回目は、対象が治療を受ける前であり、２回目は対象が治療を受けた後である。したがって、本発明によるバイオマーカーのレベルを測定することにより、任意に、対象の肝疾患状態をモニターするか、または治療経過をモニターすることがさらに可能になる。
【０１４５】
任意に、第１の試料および第２の試料からの１つ以上のバイオマーカーのレベルの比較が肝疾患状態またはステージもしくは重症度における所定の（例えば、実質的な）減少を示さないか、または１つ以上のバイオマーカーレベルのレベルにおける所定の（例えば、実質的な）変化を示さない場合には、治療を修正する。
【０１４６】
したがって、肝疾患状態を評価する方法を任意に使用して、肝疾患状態を有する対象を同定することができ、かつ対象を治療するために様々な治療レジメンまたは治療的介入（以下「治療」）の選択および開始が可能になる。バイオマーカーのレベルを測定することにより、任意に、治療の経過をモニターすることがさらに可能になる。この方法では、第１の生体試料は治療を受ける前に対象から提供され得、第２の生体試料は治療後に対象から提供され得る。
【０１４７】
キット
一実施形態では、本発明の方法は、本発明のパネルのバイオマーカーを検出するためのキットを提供する。キットに含まれるのは、本発明のパネルの１つ以上のバイオマーカーを検出するための１つ以上の内部標準である。一括して、１つ以上の内部標準は、本明細書で教示されるパネルの各バイオマーカーについての少なくとも１つの内部標準を提供する。
【０１４８】
任意に、キットは、容器、フィルター、または両方（例えば、容器中のフィルター）を含む。任意に、容器は、１つ以上の内部標準を備える。これに加えてまたはこれに代えて、フィルターが１つ以上の内部標準を備える（例えば、内部標準はフィルター上に堆積されている）。このようなキットの例が図１４Ａ、１４Ｂ、および１５に示される。
【０１４９】
任意に、内部標準は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ用に構成される。
【０１５０】
任意に、任意に、１つ以上の内部標準は、複数の内部標準である。任意に、内部標準は、混合物で提供される。あるいは、複数の内部標準のうちの１つ以上を互いに分離できる。
【０１５１】
任意に、１つ以上の内部標準は、固体または液体形態で提供される。任意に、１つ以上の内部標準は、脱水されるか、または（例えば、凍結乾燥によって）フリーズドライされる。固体内部標準は、例えば、キットの使用の前に溶液中に懸濁され得る。
【０１５２】
任意に、内部標準は、本明細書に教示されるいずれかである。
【０１５３】
任意に、１つ以上の内部標準は、標識されたステロイド酸（例えば、胆汁酸）、標識された脂肪酸、および／または標識されたアミノ酸を含む。標識は、（２）Ｈまたは（１３）Ｃなどの同位体であり得る。
【０１５４】
任意に、各内部標準は、１つ以上の原子の安定同位体（例えば、（２）Ｈ、（１３）Ｃ、（１５）Ｎまたは（１８）Ｏ）により置換された１つ以上のその原子を有することを除き、パネルの対応するバイオマーカーと同一の化合物である。例えば、バイオマーカーの所与のパネルのための内部標準のセットは、各バイオマーカーの同位体標識された変形体を準備することにより提供され得る。任意に、パネルは、表３（すなわち、表３Ａまたは表３Ｂ）の任意のパネルを含む。
【０１５５】
任意に、キットは、フィルターを含む。任意に、１つ以上の内部標準は、（例えば、図１４および図１５に示すように）フィルター上に堆積される。任意に、フィルターは、（例えば、図１４および図１５に示すように）容器中に設けられるか、または容器中または容器上に配置されるように構成される。任意に、フィルターは、（例えば、図１４Ａに示すように）容器から取り外し可能である。任意に、フィルターは、フィルターホルダに、例えば、容器内に置くことができるフィルターホルダ（例えば、筒状フィルターホルダ、および／または図１４および図１５に示すような縁を有するフィルターホルダ）、例えば、図１４Ａに示すように、例えば、別の容器の内部に置くことができる（硬い側壁を有する）それ自体が容器であるフィルターホルダに取り付けられる。任意に、フィルターが容器内にあるときに、（例えば、図１４Ｂに示すように）容器は、例えば、フィルターの両側に空隙または空洞を設けることによって、一定量の液体をフィルターの両側に保持することができる。このようなキットにより、溶液をフィルターの第１の側からフィルターを通してフィルターの第２の側へ推し進めるように容器を構成することが可能になる。濾液がフィルターの第１の側に補充された内部標準およびバイオマーカーを含むようにフィルターを構成することができる。次に、例えば、フィルターを除去することによって、濾液を分析して（例えば、ＧＣＭＳまたはＬＣＭＳを介して）、バイオマーカーおよび内部標準を測定することができる。任意に、フィルターは、パネルのバイオマーカーの通過および内部標準が通過することを許容するが、タンパク質（例えば、沈殿したタンパク質）などの他の構成成分を保持する孔径を有する任意のフィルターである。例えば、フィルターは、０．２２μｍフィルターであり得る。任意に、フィルターは、ポリフッ化ビニリデン、セルロース（例えば、酢酸セルロース）、またはナイロンフィルターである。任意に、フィルターは、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの抗酸化剤を含む。
【０１５６】
任意に、１つ以上の内部標準がブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの抗酸化剤と混合される。このような抗酸化剤を提供して、例えば、脂肪酸などの内部標準を分解から保護し、それにより、キットの貯蔵寿命を延ばすことができる。
【０１５７】
任意に、キットは、内部に１つ以上の内部標準を含む少なくとも１つの容器を含む。任意に、容器は、チューブ、バイアル、またはマルチウェルもしくはマルチチャンバープレートである。キットは、単一の容器（例えば、ウェルもしくはチャンバー）を有してもよく、または複数の容器（例えば、ウェルもしくはチャンバー）を有してもよい。例えば、キットは、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレート）を含み得る。他の類似した容器もまた適切である。いくつかのキットでは、容器は、内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化における使用に適し得る。いくつかのキットでは、内部標準の測定および対象試料中の１つ以上の代謝産物の定量化に使用される容器を、例えば、クロマトグラフィー−質量分析などのスペクトル分析に使用されるように構成する。例えば、容器をＧＣ−ＴＯＦＭＳおよび／またはＬＣ−ＴＱＭＳ用に構成してもよい。他のキットでは、対象試料中で評価される代謝産物の１つ以上に特異的な（例えば、酵素的、化学的、比色的、蛍光定量的など）他の分析試験用に容器を構成してもよい。
【０１５８】
いくつかのキットは、任意に、複数の容器を含む。例えば、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上の容器を含む。加えて、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上の容器、ならびに内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化に使用するための追加の容器（例えば、マルチウェルプレートまたは別のチューブもしくはバイアル）を含む。いくつかのキットでは、１つ以上の内部標準を含むために使用し、かつ内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化に使用する単一の容器がある。
【０１５９】
マルチウェル、マルチチャンバー、または他の複数容器のデバイスを含むキットでは、使用のためのキットの分配の際に、内部標準が、任意に、１つ以上のウェルまたはチャンバー内に配置されてもよい。いくつかのキットでは、内部標準が容器の外側に提供され、キットを用いる際に容器中に分散されなければならない。
【０１６０】
キットの容器はまた、生体試料を少なくとも１名の対象から受け入れるように構成することができる。例えば、キットが複数のチャンバーまたはウェルを含む場合、１名の対象からの生体試料を１つ以上のチャンバーまたはウェル中に分配してもよい。いくつかの例では、対象試料の１つ以上の分量を複数のチャンバーまたはウェル中に分配してもよい。通常、キットの容器を流体試料（例えば、流体生体試料、または分析用の流体を得るために処理した固体生体試料）を受け入れるように構成する。
【０１６１】
いくつかのキットはまた、内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化に有用な試薬を含む。キットにおいて、これらの試薬は１つ以上の追加の容器中に含まれてもよい。
【０１６２】
例示的な（非限定的な例）キットは、各々が同一または別々の容器中に提供される内部標準を含み得る。容器は、任意に、例えば、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳデバイスのいずれかとともに使用するように構成された、マイクロタイタープレートの形態で提供される。マイクロタイタープレートは、少なくとも１つの内部標準を受け入れるのに十分な数のウェルを有することができる。内部標準は、既知の濃度を有し、容器中に予め存在することになるか、または既知量の各内部標準をマイクロタイタープレートの別々のウェルに分注するために使用されることになる。内部標準を分析用容器に分注した後、対象試料の一部もまたマイクロタイタープレートに分注することができる。対象試料の単一の部分を分注するか、または複数の部分を分注することができる。複数の部分をマイクロタイタープレートに分注する場合、各部分を別々のウェルに分注してもよい。加えて、複数の部分をマイクロタイタープレートに分注する場合、各部分は異なる分量であってもよい。
【０１６３】
コンピュータおよびモジュールならびに自動化システム
本発明の方法を、測定、相関、および報告のうちの１つ以上の工程を実施するように構成したコンピュータ、および任意に関連するハードウェアの使用を通じて実行できる。したがって、本発明の一実施形態は、測定（例えば、分析装置からの測定シグナルをバイオマーカーレベルに変換すること）、評価すること（例えば、バイオマーカーレベルを肝疾患状態と相関させること、またはバイオマーカーレベルを、スコアを算出する数理モデルに入力すること）、および／または評価の結果を報告することのために構成されるモジュール（例えば、プログラム）を含むコンピュータ可読非一過性の（例えば、不揮発性の）メモリを提供する。任意に、本発明は、マイクロプロセッサおよびメモリを備えるコンピュータを提供し、マイクロプロセッサがモジュールを実行するように構成される。
【０１６４】
測定および／または評価する（例えば、相関させる、値を比較する、またはスコアを計算する）工程は、そのためのモジュール（例えば、メモリ上に保存され、マイクロプロセッサによって実行されるプログラム）を含むコンピュータを用いて実施することができる。例えば、接続された測定デバイス（例えば、「ＭＳ」）からのバイオマーカーレベルを示すシグナルを解釈して、バイオマーカーのレベルをそれから計算する測定モジュールを提供できる。任意に、測定モジュールは、シグナルをそれぞれの内部標準から（例えば、ＭＳを介して）得たシグナルと比較することによって、バイオマーカーのレベルを正規化するように構成される。別の例として、バイオマーカーレベルをアルゴリズム（例えば、肝疾患状態スコアを算出するか、またはバイオマーカーレベルを対照レベルと比較するアルゴリズム）への入力として使用して肝疾患状態の判定を行う評価モジュールを提供できる。
【０１６５】
任意に、モジュールは、評価の結果を報告するように構成される。報告機構の例は、可視ディスプレイ、データ構造もしくはデータベースへのリンク、またはプリンタを含む。報告機構は、任意に、検査結果をデータ構造、データベース、可視ディスプレイ、またはプリンタなどの外部デバイスに送信するためのデータリンクであり得る。
【０１６６】
コンピュータまたはアナログ装置を利用する診断検査システムを使用して、本発明の方法を自動化できる。バイオマーカーおよびバイオマーカーパネルを測定するための検査を多種多様な診断検査システム上で実行できる。診断検査システムは、通常、生体試料から検査結果を得るための手段を含む装置であり得る。このような手段の例は、検査（例えば、検出アッセイ）を自動化するモジュールを含む。診断検査システムは、任意に、複数の生体試料を処理するように構成でき、かつ各試料に対して同一または異なる検査を実行するようにプログラムできる。診断検査システムは、任意に、各試料に関する検査結果を、通常はデータ構造またはデータベースにおいて、収集、保存および／または追跡するための手段を含む。例として、物理的な不揮発性記憶デバイス（例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリ、磁気テープ、または紙の印刷出力）を含む。任意に、診断検査システムは、検査結果を報告するための手段である。報告手段の例は、可視ディスプレイ、データ構造もしくはデータベースへのリンク、またはプリンタを含む。報告手段は、任意に、検査結果をデータ構造、データベース、可視ディスプレイ、またはプリンタなどの外部デバイスに送信するためのデータリンクであり得る。
【０１６７】
バイオマーカーパネル
本発明は、本発明の方法、キットおよび他の態様に有用なバイオマーカーパネルを提供する。
【０１６８】
任意に、パネルは、表１の１つ以上のバイオマーカーを含む。
【０１６９】
任意に、パネルは、表２の１つ以上のバイオマーカーを含む。
【０１７０】
任意に、パネルは、表３（すなわち、表３Ａまたは表３Ｂ）に列記されている任意のパネルである。表３はパネルＡからＣＪ（８８パネル）を列記し、これらを使用して、任意の肝疾患状態（例えば、肝炎、線維症または肝硬変）を診断するか、または肝疾患状態の進行状態または重症度（例えば、線維症の重症度または肝硬変の重症度）を判別することができる。表３Ａは複数の頁の間で分割され、縦方向に列記されたバイオマーカー名を後の頁に繰り返し（表は、頁を横方向に並べることにより再構成することができる）；表３Ｂは複数の頁の間で分割され、横方向に列記されたバイオマーカー名を後の頁に繰り返す（表は、上下に並べることにより再構成することができる）ことに留意されたい。
【０１７１】
レベルのレベル測定のために選択されるバイオマーカーは、任意に、分析物（胆汁酸、脂肪酸またはアミノ酸）であり得るか、または複数の分析物レベルに基づく計算結果であり得る。例えば、計算結果は、分析物の比（例えば、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４  ｎ−６）／アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６））、または１つ以上の分析物もしくは分析物レベルの合計と比較した１つ以上の分析物の相対レベル（例えば、パーセント）であり得る。第１のバイオマーカーが第２のバイオマーカーの第３のバイオマーカーに対する比として計算されるとき、第２のバイオマーカーおよび第３のバイオマーカーのレベルを測定して、第２のバイオマーカーおよび第３のバイオマーカーの測定されたレベルから比を計算することによって、第１のバイオマーカーレベルを測定することができる。
【０１７２】
任意に、本発明によるバイオマーカーのパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個またはそれ以上のバイオマーカーを含む。
【０１７３】
本発明の任意の態様では、パネルは、任意に、１つ以上の胆汁酸、１つ以上のアミノ酸および／または１つ以上の遊離脂肪酸を含む。
【０１７４】
任意に、バイオマーカーパネルは、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３１３２７６Ａ１号明細書に記載のような、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ、ＡＳＴ．ＡＬＴ、フェリチン、血小板、プロトロンビン指数、ヒアルロン酸などの１つ以上の他のバイオマーカーを含む。あるいは、バイオマーカーパネルは、任意に、これらのバイオマーカーの１つ以上（または各々）を含まない。
【０１７５】
任意に、バイオマーカーパネルは、例えば、欧州特許出願公開第２７８６２８７Ａ１号明細書に記載されるような、α２−マクログロブリン、ハプトグロビン、アポリポタンパク質Ａ１、総ビリルビンおよび／またはγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）（例えば、性別および年齢により調節されている）などの１つ以上の他のバイオマーカーを含む。あるいは、バイオマーカーパネルは、任意に、これらのバイオマーカーの１つ以上を含まない。
【０１７６】
任意に、バイオマーカーパネルは、例えば、国際公開第２００２／０１６９４９号パンフレットに詳述されるような、α２−マクログロブリン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、γ−グロブリン、総ビリルビン、アルブミン、α１−グロブリン、２−グロブリン、ハプトグロビン、β−グロブリン、アポＡｌ、ＩＬ１０、ＴＧＦ−βｌ、アポＡ２および／またはアポＢなどの１つ以上の他のバイオマーカーを含む。あるいは、バイオマーカーパネルは、任意に、これらのバイオマーカーの１つ以上を含まない。
【０１７７】
本発明で有用なパネルを本明細書に教示される任意のバイオマーカーから生成することができるが、以下の３つの実施形態では、本発明で有用な例示的なバイオマーカーパネルを列記する。
【０１７８】
一実施形態では、本発明のパネルは、１つ以上（例えば、各々）のタウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、１２−メチルトリデカン酸（Ｃ１４：０  イソ）、１３−メチルミリスチン酸（Ｃ１５：０  イソ）、リノエライジン酸（Ｃ１８：２  ｎ６ｔ）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンを含む。このようなパネルは、例えば、肝疾患（例えば、肝線維症または肝硬変）を診断するのに有用である。
【０１７９】
一実施形態では、本発明のパネルは、１つ以上（例えば、各々）のタウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、７−ケトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１  ｎ５）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、エルカ酸（Ｃ２２：１  ｎ９）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４  ｎ−６）／アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６）比、リノール酸（Ｃ１８：２  ｎ６）／γ−リノレン酸（Ｃ１８：３  ｎ６）比、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、チロシン、フルクトース、フルクトース／グルコース比を含む。このようなパネルは、例えば、対象において肝疾患をステージ分類する（例えば、線維症の早期、中期または後期ステージを識別する）のに有用である。
【０１８０】
一実施形態では、本発明のパネルは、１つ以上（例えば、各々）のパルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）比、フルクトース、フルクトース／グルコース比を含む。このようなパネルは、例えば、対象において肝疾患をステージ分類する（例えば、線維症の早期、中期または後期ステージを識別する）のに有用である。
【０１８１】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１８２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
【表４】
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【０１８５】
【表５】
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【０１８６】
【表６】
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【０１８７】
【表７】
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【０１８８】
【表８】
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【０１８９】
【表９】
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【０１９０】
【表１０】
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【実施例】
【０１９１】
以下の実施例は、バイオマーカーパネルの発見、およびその際バイオマーカーパネルを使用した肝疾患診断の正確度を試験するために使用された予測方法の構築におけるそれらの使用について詳述する。バイオマーカーパネルは、研究の血清試料由来の代謝産物プロファイルの生成に従って選択され、代謝産物レベルに関して患者試料の集団においてＬＣ−ＭＳおよびＧＣ−ＭＳを使用して測定され、かつプロファイルに関して統計手法を使用して分析された。これらの実施例は、ＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変の存在または分類などの肝疾患状態を評価するための本発明のバイオマーカーパネルの使用を説明する。
【０１９２】
実施例１  研究の患者集団
肝線維症および肝硬変と診断された合計５０４名の年齢１５歳〜７５歳の患者を、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ付属Ｓｈｕｇｕａｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）、およびＸｉａｍｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｘｉａｍｅｎ、Ｃｈｉｎａ）において２０１３年４月から２０１３年１２月まで採用した。患者は、臨床的に肝線維症または肝硬変、および「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ（２００５）．Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ  Ｊ（Ｅｎｇｌ）２００７；１２０：２１５９−７３）に従って、慢性Ｂ型肝炎を有する感染症であると診断された。全ての患者は、評価の際、臨床的に安定していた。除外基準としては、１５歳未満または７５超過、妊娠または母乳栄養中の女性、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）との同時感染；糖尿病の診断、他の肝疾患、肝移植、消化器疾患、膵臓炎、向精神薬の使用、６ヶ月以内のアルコール摂取、６週間以内の抗生物質および生菌／プレバイオティクスを含んだ（ａｊａｊ  ＪＳ，Ｈｅｕｍａｎ  ＤＭ，Ｈｙｌｅｍｏｎ  ＰＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＧＧ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ，ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１４；３９：１１１３−２５）。加えて、本発明者らは、不明確な肝硬変の診断を有する患者を除外し、それらの患者は、空腹時血液を提供できず、研究を遂行できなかった。
【０１９３】
合計５０２名の患者を健常対照としてＰｈｙｓｉｃａｌ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｓｈｕｇｕａｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから採用した。健常対照と肝疾患患者の間で年齢、性別、およびＢＭＩの有意差はなかった（表４）。常用の生化学的検査をＳｈｕｇｕａｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで行って、研究対象が炎症および代謝性疾患ではないことを保証した（表４）。Ｂ−モード超音波試験を行って、脂肪肝を有する参加者を除外した。７５歳超過もしくは１５歳未満の年齢であったか；妊娠していたか；授乳中の女性であったか；重大な心肺疾患、腎疾患、消化器疾患もしくは肝疾患を有したか；急性もしくは慢性感染症を有したか；活動性悪性腫瘍を有したか；治療を要する他の急性もしくは慢性疾患を有したか；または直近２ヶ月に任意の処方箋医薬品を使用した場合、それらの個体を参加から除外した。研究は、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＸｉａｍｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのヒト対象治験審査委員会によって承認された。全ての参加者が、研究のためのインフォームドコンセント用紙に署名した。
【０１９４】
慢性肝疾患の人口統計特性および臨床データを表４に要約した。研究集団は、５０２名の患者（男性７２％；平均年齢３６．６６±１１．８５歳）を含んだが、その中で、４６名の患者が、ステージ０の線維症として診断され、１７４名がステージ１の線維症として診断され、１３６名がステージ２の線維症として診断され、５７名がステージ３の線維症として診断され、３９名がＣＰ  Ａ、３０名がＣＰ  ｂおよび１６名がＣＰ  Ｃの肝硬変として診断された。診断は、非代償性肝硬変患者を除く全ての患者に対して肝生検により得られた。肝疾患患者は、健常対照と比較して、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、直接ビリルビン（ＤＢＩＬ）、間接ビリルビン（ＩＢＩＬ）、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、総胆汁酸（ＴＢＡ）、平均血小板容積（ＭＰＶ）、血小板クリット（ＰＣＴ）、血小板分布幅（ＰＤＷ）、総タンパク質量（ＴＰ）、グロビン（ＧＬＢ）および平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）のレベルが有意に上昇し、ならびにアルブミン（ＡＬＢ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、トリグリセリド（ＴＧ）、プレアルブミン（ＰＡＬＢ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板（ＰＬＴ）、赤血球（ＲＢＣ）、および白血球（ＷＨＣ）ののレベルが有意に低下した。肝機能が、線維症ステージおよび肝硬変ＣＰグレードの上昇とともに徐々に悪化するにつれて、ＡＬＢ、ＨＣＴ、ＨＧＢ、ＰＡＬＢ、ＰＣＴ、ＰＬＴ、ＲＢＣ、ＴＰ、ＣＨＥ、ＦＴ３、ＦＴ４、Ｆｉｂ、ＰＴＡ、およびＣＨＯＬの血清レベルが漸進的に低下した一方で、ＡＬＰ、ＢＵＮ、ＡＰＴＴ、ＴＢＡ、ＨＢｃＡｂ、ＩＮＲ、ＰＴ、ＴＴ、ＴＢＩＬ、ＤＢＩＬおよびＩＢＩＬの血清レベルは有意に上昇した。ＧＧＴ、ＧＬＢおよびＡＨＣＶの血清レベルは、肝線維症ステージの上昇とともに上昇したが、それらは肝硬変患者では低下した。
【０１９５】
これらの研究のための倫理審査の承認を上記の２つの病院の倫理委員会から取得し、研究に先立って、全ての参加者はインフォームドコンセントに署名した。
【０１９６】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【０１９７】
実施例２  肝生検
非代償性肝硬変として診断された患者を除く肝疾患患者は、参加後１週間以内に超音波法により導かれる肝生検を受けた。生検標本を１０％ホルマリンで固定し、型通りにパラフィン中に包埋し、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンならびにマッソン・トリクローム染色により処理した。診断には、最小長が少なくとも１．５ｃｍの肝生検および少なくとも６つの門脈域が必要とされた。壊死性炎症の組織学的グレード分類（Ｇ０〜Ｇ４）および肝線維症のステージ分類（Ｓ０〜Ｓ４）は、Ｓｃｈｅｕｅｒ分類に従って実施される（Ｓｃｈｅｕｅｒ  ＰＪ，Ｓｔａｎｄｉｓｈ  ＲＡ，Ｄｈｉｌｌｏｎ  ＡＰ．Ｓｃｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ２００２；６：３３５−４７，ｖ−ｖｉ．）。全ての切片を、Ｆｕｄａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）の３名の病理学者により盲検的にかつ独立して評価し、観察された結果をＫａｐｐａ一致度テストによって処理した。
【０１９８】
実施例３  血清試料採集
血液学的および一般的な生化学的試験は、ＬＨ７５０血球分析装置およびＳｙｎｃｈｒｏｎ  ＤＸＣ８００クリニカルシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って測定した。血清ヒアルロン酸（ＨＡ）およびラミニン（ＬＮ）濃度を化学発光免疫測定装置（ＣＬＩＡ）システム（ＬＵＭＯ、Ｓｈｉｎｏｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）で測定した。凝固機能を自動血液凝固測定装置（ＳＴＡＧＯ  Ｃｏｍｐａｃｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ｆｒａｎｃｅ）で測定した。血清ＨＢＶ−ＤＮＡレベルをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）システム（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０、Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）で検出した。
【０１９９】
実施例４  統計分析
量的変数を平均値±ＳＥＭとして表し；カテゴリー変数を数値として表す。単変量解析（ＡＮＯＶＡ、スチューデントｔ検定、ノンパラメトリック検定）を実施して、肝線維症を有する患者と健常対照の間および異なるステージの肝線維症患者の間で有意差のあった変数を同定した。本発明者らは０．０５未満のｐ値を有意とみなした。データセットをＳＩＭＣＡ−Ｐ＋  １３．０ソフトウェア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、Ｕｍｅａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に導入した後に、まず、多変量解析である直交部分最小二乗法−判別分析（ＯＰＬＳ−ＤＡ）を行って、対照および肝線維症の胆汁酸プロファイルの概要を取得した。次に、発明者らは、ＯＰＬＳ−ＤＡを実施して、異なるステージの肝線維症患者を鑑別した。予測モデルをステップワイズロジスティック回帰分析により再構成し、これにより、各エンドポイント（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３の線維症患者、およびＣＰ  Ａ、ＣＰ  ＢおよびＣＰ  Ｃの肝硬変患者）に関連する独立した因子を同定した。単一のマーカーおよびマーカーパネルの全体的な診断能を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析により評価した。ＳＰＳＳ  ２２．０（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ、ＵＳＡ）ソフトウェアを使用して統計分析を実施した。正準判別分析もまた、ＳＰＳＳを使用して胆汁酸のデータに対して実施した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して棒グラフを描いた。
【０２００】
実施例５  血清胆汁酸の分析
血清試料調製
５０μｌのアリコートの血清を１５０μｌのメタノール（内部標準として使用される０．１０μＭのＣＡ−Ｄ４、ＵＤＣＡ−Ｄ４およびＬＣＡ−Ｄ４を含有する）と混合した。続いて、混合物を２分間ボルテックスし、１０分間静置し、２００００ｇにおいて４℃で１０分間遠心分離した。１６０μＬの上清のアリコートを清浄なチューブに移し、真空乾燥した。残渣を等量のアセトニトリル（０．１％ギ酸）および水（０．１％ギ酸）に再溶解して、最終体積を４０μＬとした。遠心分離の後、上清をＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。
【０２０１】
方法の検証
標準原液の各アリコートを混合して、混合原液を得た。全ての胆汁酸標準を含有するキャリブレーション溶液を、活性炭を使用してＢＡを枯渇させたナイーブなプール血清中に０．６１０、１．２２１、２．４４１、４．８８３、９．７６６、１９．５３１、３９．０６３、７８．１２５、１５６．２５０、３１２．５、６２５．０、１２５０．０００、および２５００．００ｎｇ／ｍＬの一連の濃度で調製した。キャリブレーション曲線および対応する回帰係数を内部標準の調整によって得た。
【０２０２】
計測手段
いくつかの改変を伴う以前に報告された方法（Ｘｉｅ  Ｇ，Ｚｈｏｎｇ  Ｗ，Ｌｉ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３；２７：３５８３−９３．Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｎａｖｅｒａｓ  ＪＣ，Ｄｏｎａｔｏ  ＭＴ，Ｃａｓｔｅｌｌ  ＪＶ，Ｌａｈｏｚ  Ａ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ，ｍｏｕｓｅ，ａｎｄ  ｒａｔ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＵＰＬＣ−ＭＲＭ−ＭＳ−ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２；５３：２２３１−４１）に従って、血清ＢＡを測定した。バイナリソルベントデリバリーマネージャおよびサンプルマネージャを装備したＷａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ超高速ＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を研究の全体を通して使用した。質量分析計は、ＥＳＩ源を備えるＷａｔｅｒｓ  ＸＥＶＯ  ＴＱ−Ｓ装置（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）であった。ＬＣ−ＭＳシステム全体をＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェアによって制御した。全てのクトマトグラフィー分離をＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ、１００ｍｍ×２．１ｍｍ内部寸法）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して実施した。
【０２０３】
ＬＣ−ＭＳ分析
移動相は、０．３ｍＬ／分の流速で流れるＬＣ−ＭＳグレードの水中の０．１％ギ酸（移動相Ａ）およびＬＣ−ＭＳグレードのアセトニトリル中の０．１％ギ酸（移動相Ｂ）からなった。流速は、０．４５ｍＬ／分であり、次の移動相勾配：０〜１分（５％Ｂ）、１〜５分（５〜２５％Ｂ）、５〜１５．５分（２５〜４０％Ｂ）、１５．５〜１７．５分（４０〜９５％Ｂ）、１７．５〜１９分（９５％Ｂ）、１９〜１９．５分（９５〜５％Ｂ）、１９．６〜２１分（５％Ｂ）を有した。カラムを４５℃に維持し、全ての試料の注入体積は、５μｌであった。
【０２０４】
質量分析計を１．２ｋｖのキャピラリー電圧により負イオンモードで動作させた。ソースおよび脱溶媒ガス温度は、それぞれ、１５０と５５０℃であった。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によりデータを収集し、各胆汁酸についてのコーンおよび衝突エネルギー（表５）は、ＱｕａｎＯｐｔｉｍｉｚｅアプリケーションマネージャ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から最適化した設定を使用した。
【０２０５】
データ分析
負モードで得たＵＰＬＣ−ＭＳの未加工のデータをＴａｒｇｅｔＬｙｎｘアプリケーションマネージャ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して解析して、キャリブレーション式および試料中の各ＢＡの定量濃度を得た。スチューデントｔ検定を使用して、ＢＡ測定値におけるグループ間の相違を調査した。続いて、全ての代謝産物について得られたｐ値を調整して、複数の検査を偽発見率（ＦＤＲ）法によって説明した２６。本発明者らは、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【０２０６】
【表１２−１】
2019525198.tif 000022
【表１２−２】
2019525198.tif 000023
【０２０７】
実施例６  血清アミノ酸の分析
前の手順に続いて、２つの内部標準（水中の１０μＬ  Ｌ−２−クロロフェニルアラニン、０．３ｍｇ／ｍＬ；メタノール中の１０μＬ  ヘプタデカン酸、１ｍｇ／ｍＬ）を添加した１００μｌの各血清試料を、３００μＬのメタノール：クロロホルム（３：１）とともに−２０℃で１０分間の代謝産物の抽出に使用した。１２，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、３００μＬの上清のアリコートをさらなる分析のために使用した。試料を室温で真空乾燥した。残渣を、３０℃で９０分間の８０μＬのメトキシアミン（ピリジン中の１５ｍｇ／ｍＬ）、および７０℃で６０分間の８０μＬのＢＳＴＦＡ（１％ＴＭＣＳ）による２段階の誘導体化手順にかけた。品質管理に使用される内部標準に加えて、複数の標準試料からなる別の品質管理試料を調製し、１０個の各試料とともに処理した。このＱＣ試料を真空乾燥し、試料とともに同じ手順により誘導体化した。
【０２０８】
試料を、「対照−ＣＲＣ−対照」の順に、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０Ｎガスクロマトグラフィーと一体となったＰｅｇａｓｕｓ  ＨＴシステム（Ｌｅｃｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｔ  Ｊｏｓｅｐｈ、ＵＳＡ）により分析した。１０個の各血清試料の後にＱＣ試料を処理した。注入量は、スプリットレスモードで１μＬとした。注入を２７０℃に設定した。ＤＢ−５ＭＳキャピラリーカラム（３０ｍ×２５０μｍ  内径、０．２５−μｍフィルム厚；Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して代謝産物を分離した。ヘリウムをキャリアガスとして使用し、１．０ｍＬ／分とした。ＧＣオーブン温度は２分間８０℃で開始し、続いて１０℃／分で１８０℃まで、６℃／分で２３０℃まで、最終的に４０℃／分で２９５℃まで上昇した。最終温度の２９５℃を８分間維持した。接続インターフェースおよびイオン源の温度を、それぞれ２７０℃および２２０℃に設定した。ｍ／ｚ範囲を、電子衝撃イオン化（７０ｅＶ）により３０〜６００に設定した。取得速度を２０スペクトル／秒に設定した。
【０２０９】
実施例７  血清遊離脂肪酸の分析
血清ＦＦＡ抽出：
３０μＬの血清試料のアリコートに同位体標識された内部標準溶液（１０μｌ  Ｃ１９：０−ｄ３７、５μｇ／ｍＬ）を添加した。混合溶液を５００μＬのイソプロパノール：ヘキサン：２Ｍのリン酸（４０：１０：１）で抽出し、２分間ボルテックスした。室温で２０分間保存した後、試料に４００μｌのヘキサンおよび３００μＬの水を添加し、２分間ボルテックスし、続いて、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。４００μＬの上清のアリコートをガラスのサンプリングバイアルに移した。残渣を別の４００μｌのヘキサンで抽出し、続いて２分間ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。４００μＬの上清のアリコートを同じガラスサンプリングバイアルに移して、室温で真空乾燥した。残渣を８０μｌのメタノールに溶解して、ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦＭＳ分析を保留した。
【０２１０】
ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦＭＳによる血清ＦＦＡの定量分析
上清の５μＬのアリコートを、４０℃で保持した１００ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍのＢＥＨ  Ｃ１８  カラム（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）に、超高速液体クロマトグラフィーシステム（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を使用して注入した。２液勾配溶出システムは、水（Ａ）および２０％  ｖ／ｖイソプロパノールを有するアセトニトリル（Ｂ）からなり、分離は、次の勾配：７０％Ｂの均一濃度（０〜２分）、７０〜７５％Ｂ（２〜５分）、７５〜８０％Ｂ（５〜１０．０分）、８０〜９０％Ｂ（１０．０〜１３．０分）、９０〜１００％Ｂ（１３．０〜１６．０分）の直線勾配；１００％Ｂの均一濃度（１６．０〜２１．０分）；１００％から７０％Ｂ（２１．０〜２２．５分）への直線勾配および７０％Ｂの均一濃度（２２．５〜２４．０分）を使用して達成された。流速は０．４ｍＬ／分であった。分析の間、全ての試料を４℃に維持した。試料を「対照−疾患−対照」の順で交互に処理して、体系的な分析の偏差を最小化した。プールＦＦＡ標準を品質管理として使用して、機器の性能およびデータの品質をモニターした。
【０２１１】
質量分析のデータを、負イオンモードにおいて動作するエレクトロスプレーイオン源を装備したＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を使用して収集した。ソース温度を１２０℃に設定し、５０Ｌ／時間のコーンガス流速、４５０℃の脱溶媒ガス温度、６００Ｌ／時間の脱溶媒ガス流速を有した。キャピラリー電圧およびコーン電圧を、それぞれ２．５ｋＶおよび５５Ｖに設定した。ロイシンエンケファリンをロックマス（ＥＳ−モードにおいてｍ／ｚ  ５５４．２６１５）として、１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、全ての分析において０．１ｍＬ／分の流速で使用した。
【０２１２】
ＵＰＬＣ−ＱＴＯＦＭＳ  ＥＳＩの未加工のデータをＭａｒｋｅｒＬｙｎｘアプリケーションマネージャ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｕ．Ｋ．）によって分析した。検出された各ピークのイオン強度のリストを、各イオンに対する識別子として保持時間（ＲＴ）とｍ／ｚデータのペアを使用して生成した。得られた３次元マトリックスは、任意に、指定されたピークインデックス（保持時間−ｍ／ｚペア）、試料名（観測結果）、およびイオン強度情報（変数）を含む。内部標準は、データの品質管理（再現性）のために使用される。試料中のＦＦＡの同定を、保持時間および正確な質量を使用してＦＦＡ標準品と比較することにより実施した。
【０２１３】
実施例８  ＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変患者の胆汁酸プロファイル
グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、コール酸（ＣＡ）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、グリコλ−ムリコール酸（Ｇ  λ−ＭＣＡ）、λ−ムリコール酸（λ−ＭＣＡ）、７−ケトリトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、７−ケトデオキシコール酸（７−ＫＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ヒオデオキシコール酸（ＨＤＣＡ）、３−ケトコール酸（３−ＫＣＡ）、タウロλ−ムリコール酸（Ｔ  λ−ＭＣＡ）、タウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）、およびグリコリトコール酸（ＧＬＣＡ）を含む合計２３個の胆汁酸が、健常対照と比較して肝疾患患者において有意に増加した。発明者らが、肝線維症および肝硬変の患者の中で胆汁酸レベルを比較したとき、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＵＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＧＨＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＣＡ、７−ＫＬＣＡ、ＬＣＡ、ＴＵＤＣＡ、３−ＫＣＡ、Ｔ  λ−ＭＣＡ、ＴＬＣＡ、およびＧＬＣＡにおいて顕著な相違があり、それらのレベルは、対照の対象においては非常に低く、線維症患者において有意に（ｐ＜０．０１）増加し、肝硬変を有する患者において非常に大きく増加した（表６）。
【０２１４】
【表１３−１】
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【表１３−２】
2019525198.tif 000025
【表１３−３】
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【０２１５】
実施例９  ＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変患者の脂肪酸プロファイル
合計５０個の遊離脂肪酸を、異なる進行／重症度レベルの肝疾患患者および健常対照において同定した（表７）。データに基づいて、遊離脂肪酸レベルが肝疾患の存在および／または進行とともに変化する（表に示されるように、特定の脂肪酸に依存して上昇または低下する）ことが明らかである。データは、これらのマーカーを使用して、健常対照から肝疾患を判別できるか、または肝疾患状態を（例えば、進行または重症度によって）判別できることを実証している。
【０２１６】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【０２１７】
実施例１０  ＮＡＳＨ、肝線維症および肝硬変患者のアミノ酸プロファイル
合計２９個のアミノ酸を、異なる進行／重症度を有する肝疾患患者および健常対照において同定した（表８）。データに基づいて、アミノ酸レベルが肝疾患の存在および／または進行とともに変化する（表に示されるように、特定のアミノ酸に依存して上昇または低下する）ことが明らかである。データは、これらのマーカーを使用して、健常対照から肝疾患を判別できるか、または肝疾患状態を（例えば、進行または重症度によって）判別できることを実証している。
【０２１８】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【０２１９】
実施例１１  健常対照から線維症を判別するためのバイオマーカー
ＯＰＬＳ−ＤＡにより、２３個の胆汁酸（図１Ａ、Ｒ２Ｘｃｕｍ＝０．７１９、Ｒ２Ｙｃｕｍ＝０．７７８、Ｑ２Ｙｃｕｍ＝０．７４４）、遊離脂肪酸（図１Ｂ、Ｒ２Ｘｃｕｍ＝０．６６４、Ｒ２Ｙｃｕｍ＝０．８２９、Ｑ２Ｙｃｕｍ＝０．８０６）、およびアミノ酸（図１Ｃ、Ｒ２Ｘｃｕｍ＝０．５１６、Ｒ２Ｙｃｕｍ＝０．７９３、Ｑ２Ｙｃｕｍ＝０．７８５）を使用して、肝線維症患者と健常対照との間の境界線が明らかになった。
【０２２０】
実施例１２  健常対照からＮＡＳＨを判別するためのバイオマーカー
ＮＡＳＨ患者と対照の対象との間の判別のための血清代謝産物の潜在的な有用性を評価するために、本発明者らは、胆汁酸、遊離脂肪酸、およびアミノ酸にそれぞれ基づくロジスティック回帰モデルを開発した。
【０２２１】
変数増加法を介して、本発明者らは、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、およびＴＣＤＣＡが回帰モデルにおけるＮＡＳＨまたは他の脂肪性肝炎の疾患状態の有効な予測因子であることを同定した（表９）。これらの代謝産物を使用して、本発明者らは、以下の回帰モデルを確立した。
【数１】
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【０２２２】
次に、本発明者らは、ＲＯＣ曲線を生成して、ＮＡＳＨの診断のための非侵襲的バイオマーカーとしての胆汁酸シグネチャの潜在的な有用性を評価した。本発明者らのＲＯＣ分析により、胆汁酸バイオマーカーが、ＮＡＳＨを有する患者を対照から判別することにおいて、０．９２１（９５％  ＣＩ＝０．８６６〜０．９７６）の曲線下面積（ＡＵＣ）値を有して、ロバストであることが明らかになった（図２Ａ）。０．３８４のカットオフ値を使用すると、感度および特異度は、それぞれ８４．８％と８７．０％である（表１０）。
【０２２３】
本発明者らはまた、Ｃ１８：２（トランス  ９，１２）により、１．０００（９５％  ＣＩ＝１．０００〜１．０００）の曲線下面積（ＡＵＣ）値を有して、ＮＡＳＨを有する患者を対照から判別できることを同定した（図２Ｃ）。０．５μｇ／ｍＬのカットオフ値を使用すると、感度および特異度は、両方ともに１００％に達した（表１１）。
【０２２４】
本発明者らはまた、β−アラニンにより、１．０００（９５％  ＣＩ＝１．０００〜１．０００）の曲線下面積（ＡＵＣ）値を有して、ＮＡＳＨを有する患者を対照から判別できることを同定した（図２Ｂ）。１１１７０９のカットオフ値を使用すると、感度および特異度は、両方ともに１００％に達した（表１２）。
【０２２５】
【表１６】
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【０２２６】
【表１７】
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【０２２７】
【表１８】
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【０２２８】
【表１９】
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【０２２９】
実施例１３  ＮＡＳＨの患者を線維症から判別するためのバイオマーカー
ＮＡＳＨ患者と線維症の対象との間の判別のための血清代謝産物の潜在的な有用性を評価するために、本発明者らは、胆汁酸、遊離脂肪酸、およびアミノ酸にそれぞれ基づくロジスティック回帰モデルを開発した。
【０２３０】
変数増加法を介して、本発明者らは、セリン、ＤＣＡ、および７−ＫＬＣＡが回帰モデルにおける疾患状態の有効な予測因子であることを同定した（表１３）。
【０２３１】
次に、本発明者らは、ＲＯＣ曲線を生成して、ＮＡＳＨを有する患者を線維症から区別するための非侵襲的バイオマーカーとしての代謝産物シグネチャの潜在的な有用性を評価した。本発明者らのＲＯＣ分析により、代謝産物バイオマーカーが、ＮＡＳＨを有する患者を線維症から判別することにおいて、０．８６６（９５％  ＣＩ＝０．８２２〜０．９４９）の曲線下面積（ＡＵＣ）値を有して、ロバストであることが明らかになった（図３）。０．７２４のカットオフ値を使用すると、感度および特異度は、それぞれ８６．４％と８４．８％である（表１４）。セリン、ＤＣＡ、および７−ＫＬＣＡにより確立されたＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットは、肝線維症患者とＮＡＳＨ患者の間の境界線を示した（図４、Ｒ２Ｘｃｕｍ＝０．６６６、Ｒ２Ｙｃｕｍ＝０．６５４、Ｑ２Ｙｃｕｍ＝０．６４３）。
【０２３２】
【表２０】
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【０２３３】
【表２１】
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【０２３４】
実施例１４  線維症の患者を肝硬変から判別するためのバイオマーカー
線維症患者と肝硬変の対象との間の判別のための血清代謝産物の潜在的な有用性を評価するために、本発明者らは、胆汁酸、遊離脂肪酸、およびアミノ酸にそれぞれ基づくロジスティック回帰モデルを開発した。
【０２３５】
変数増加法を介して、本発明者らは、Ｃ１４．１．シス．９、Ｃ２０．４．．シス．５．８．１１．１４．、β−アラニン、シトルリン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、チロシン、ＣＤＣＡ、およびＧＵＤＣＡが回帰モデルにおける疾患状態の有効な予測因子であることを同定した（表１５）。
【０２３６】
次に、本発明者らは、ＲＯＣ曲線を生成して、ＮＡＳＨを有する患者を線維症から区別するための非侵襲的バイオマーカーとしての代謝産物シグネチャの潜在的な有用性を評価した。本発明者らのＲＯＣ分析により、代謝産物バイオマーカーが、線維症を有し肝硬変ではない患者を、肝硬変を有する患者から判別することにおいて、０．８４２（９５％  ＣＩ＝０．９１１〜０．９７４）の曲線下面積（ＡＵＣ）値を有して、ロバストであることが明らかになった（図５）。０．２５６のカットオフ値を使用すると、感度および特異度は、それぞれ８３．５％と９５．３％である（表１６）。代謝産物バイオマーカーであるＣ１４．１．シス．９、Ｃ２０．４．．シス．５．８．１１．１４．、β−アラニン、シトルリン、イソロイシン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、トレオニン、チロシン、ＣＤＣＡ、およびＧＵＤＣＡにより確立されたＯＰＬＳ−ＤＡスコアプロットは、肝線維症患者と肝硬変患者の間の境界線を示した（図６、Ｒ２Ｘｃｕｍ＝０．４８８、Ｒ２Ｙｃｕｍ＝０．５２９、Ｑ２Ｙｃｕｍ＝０．５１３）。
【０２３７】
【表２２】
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【０２３８】
【表２３】
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【０２３９】
実施例１５  異なるステージの肝線維症および肝硬変患者の代謝産物プロファイル
肝疾患は、脂肪性肝炎（例えば、ＮＡＳＨ）から線維症、そして肝硬変へと進行することが多い。ＧＵＤＣＡ、ＴＣＤＣＡおよびチロシンのレベルは、肝疾患の進行とともに徐々に上昇した（図７、８および９）。線維症はまた、進行または重症度、例えば、ステージＳ１、Ｓ２およびＳ３（肝硬変なし）、ならびにＳ４（すなわち、肝硬変）によってステージ分類され得る。同様に、後期ステージＳ４の線維症、すなわち、肝硬変はさらに、進行または重症度、例えば、ステージＣＰ  Ａ〜Ｃによってステージ分類され得る。胆汁酸レベルを異なるステージの線維症および肝硬変の間で比較し、結果として、３つのステージの線維症患者および３つのステージの肝硬変患者中の血清において、ＧＵＤＣＡおよびチロシンが特異的に発現されていた（図１０、１１および１３）。
【０２４０】
特異的に発現した全ての胆汁酸、遊離脂肪酸およびアミノ酸の正準判別分析により生成された関数を使用して確立されたプロットは、ステージ１、２、３の肝線維症患者およびグレードＣＰ  Ａ、ＢおよびＣの肝硬変患者が、６つの大きな群にクラスター化されることを示した（図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃ）。群１〜６は、それぞれ、ステージＳ１、Ｓ２、Ｓ３、ＣＰＡ、ＣＢＰ、およびＣＰＣに対応した。その結果、ステージ１の１７１名の患者のうち、１４５名が適切に分類され、正答率は８４．８％であった。ステージ２、３および４ならびにグレードＣＰ  Ａ、ＢおよびＣの肝硬変患者に対する正分類率は、それぞれ９１．１％、８２．５％、８２．１％、７０．０％、および９３．８％であった（表１７、表１８および表１９）。
【０２４１】
【表２４】
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【０２４２】
【表２５】
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【０２４３】
【表２６】
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【０２４４】
実施例１６  胆汁酸分析
データのさらなる分析により、他の意外な診断用胆汁酸マーカーが明らかになった。肝線維症および肝硬変の患者の間で胆汁酸（「ＢＡ」）レベルを比較したとき、ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＣＤＣＡ、ＣＡ、ＵＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＧＨＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＣＡ、７−ＫＬＣＡ、ＬＣＡ、ＴＵＤＣＡ、３−ＫＣＡ、ＴＨＣＡ、ＴＬＣＡ、およびＧＬＣＡにおいてもまた顕著な相違があり、それらの各々のレベルは、対照の対象においては非常に低く、線維症患者において有意に上昇し、肝硬変を有する患者において非常に大きく上昇した。
【０２４５】
このデータは、線維症の対象の診断または分類（例えば、ステージもしくは重症度による）のための診断パネルにおけるこれらのマーカーの使用を支持する。
【０２４６】
実施例１７  キット
本発明の例となるキットは、パネルｔのバイオマーカーに対応する既知量の同位体標識された（例えば、Ｃ１３で標識された）内部標準を含んだ。キットは、評価される全ての内部標準の単一の混合物を含んでもよく、または各内部標準の別々の量を含んでもよい。評価される代謝産物プロファイルにおける各内部標準の量を測定することができ、かつ対象由来の試料中の対応するバイオマーカーの対応する量と比較するために使用することができる。各内部標準は、分配されたキットにおいて固体形態であっても液体形態であってもよい。内部標準が固体形態である場合、キットの使用前にそれらを溶液中に懸濁させるべきである。キットは、任意に、パネルの各代謝産物バイオマーカーの標識された変形体の少なくとも１つを含む。
【０２４７】
例となるキットは、代謝産物パネルプロファイルにおける内部標準を含有するように構成された少なくとも１つの容器を含むことができる。容器は、チューブ、バイアル、またはマルチウェルもしくはマルチチャンバープレートであってもよい。容器は、単一のウェルもしくはチャンバーを有してもよく、または容器は、複数のウェルもしくはチャンバーを有してもよい。例えば、容器は、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレート）であってもよい。他の類似した容器もまた適切である。いくつかのキットでは、容器は、内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上のバイオマーカーの定量化における使用に適し得る。いくつかのキットでは、内部標準の測定および対象試料中の１つ以上の代謝産物の定量化に使用される容器を、例えば、クロマトグラフィー−質量分析などのスペクトル分析に使用されるように構成する。例えば、容器をＧＣ−ＴＯＦＭＳおよび／またはＬＣ−ＴＱＭＳ用に構成してもよい。他のキットでは、対象試料中で評価される代謝産物の１つ以上に特異的な（例えば、酵素的、化学的、比色的、蛍光定量的など）他の分析試験用に容器を構成してもよい。内部標準混合物を、上述したように、１つ以上のバイアルもしくはチューブ中に、または１つ以上のチャンバーもしくはウェル中に保持するように、容器を構成してもよい。あるいは、評価される各内部標準の参照量を別々に（例えば、チャンバーもしくはウェルごとに１つの内部標準）保持するように容器を構成してもよい。
【０２４８】
いくつかのキットは、複数の容器を含む。例えば、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上の容器を含む。加えて、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上の容器、ならびに内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化に使用するための追加の容器（例えば、マルチウェルプレートまたは別のチューブもしくはバイアル）を含む。いくつかのキットでは、１つ以上の内部標準を含むために使用し、かつ内部標準の測定および対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化に使用する単一の容器がある。
【０２４９】
容器がマルチウェルまたはマルチチャンバー容器であるキットでは、使用のためのキットの分配の際に、評価される代謝産物の参照量を１つ以上のウェルまたはチャンバー中に配置してもよい。いくつかのキットでは、キットを用いる際に、評価される代謝産物の参照量を１つ以上のウェルまたはチャンバー中に分散させなければならない。
【０２５０】
キットの容器はまた、生体試料を少なくとも１名の対象から受け入れるように構成することができる。例えば、キットの容器が複数のチャンバーまたはウェルを含む場合、１名の対象からの生体試料を１つ以上のチャンバーまたはウェル中に分配してもよい。いくつかの例では、対象試料の１つ以上の分量を複数のチャンバーまたはウェル中に分配してもよい。通常、キットの容器を流体試料（例えば、流体生体試料、または分析用の流体を得るために処理した固体生体試料）を受け入れるように構成する。
【０２５１】
いくつかのキットはまた、内部標準およびバイオマーカーの測定ならびに対象試料中で評価される１つ以上の代謝産物の定量化に有用な試薬を含む。キットにおいて、これらの試薬は１つ以上の追加の容器中に含まれてもよい。
【０２５２】
例となるキットは、各々が別々の容器中または同一の容器中に提供される複数の内部標準を含む。分析用容器は、任意に、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳデバイスのいずれかとともに使用するように構成された、マイクロタイタープレートであろう。マイクロタイタープレートは、少なくとも１つの内部標準を受け入れるのに十分な数のウェルを有することになる。内部標準は、既知の濃度を有し、かつ既知量（またはアリコート）の各内部標準をマイクロタイタープレートの別々のウェルに分注するために使用されることになる。内部標準を分析用容器に分注した後、対象試料の一部もまたマイクロタイタープレートに分注することができる。対象試料の単一の部分を分注するか、または複数の部分を分注することができる。複数の部分をマイクロタイタープレートに分注する場合、各部分を別々のウェルに分注してもよい。加えて、複数の部分をマイクロタイタープレートに分注する場合、各部分は異なる分量であってもよい。
【０２５３】
実施例１８  キットの使用
キットを使用して、代謝産物プロファイルにおける代謝産物の定量化を可能にすることにより肝疾患状態の評価を提供するための本発明の方法を実施してもよい。例えば、本発明のキットを使用して、肝疾患状態を診断（例えば、その存在または不存在を判定）してもよい。加えて、本発明のキットを使用して、肝疾患を有する対象が肝疾患に対する治療に応答しているかどうかを判定してもよい。
【０２５４】
対象から得られる生体試料を、本発明のキットを使用して評価することができる。試料は、流体試料（例えば、血漿または血清）であってもよい。キットのいくつかの使用では、対象試料中の代謝産物プロファイルを、試料を処理することなく評価してもよい。キットの他の使用では、対象試料中の代謝産物プロファイルは、評価される前に試料の処理を必要とする場合がある。
【０２５５】
医師は、任意に、対象から試料を採取し、本発明のキットを使用する検査のために試料を臨床検査室に送ってもよい。あるいは、医師は、本発明のキットを使用する検査を実施することができる臨床または医療施設に配置されてもよい。
【０２５６】
キットを使用して、対象試料中の１つ以上の代謝産物の量を測定するための様々な検査を実行してもよい。例えば、キットを使用して、対象試料のスペクトル解析を実行してもよい。いくつかのキットは、ガスクロマトグラフィーおよび／または液体クロマトグラフィーなどのスペクトル解析のために構成される。例えば、キットは、対象試料中の目的の代謝産物のＬＣ−ＴＱＭＳ分析のために構成されてもよい。あるいは、キットは、代謝産物の異なるタイプに特異的な分析試験を、対象の試料中の目的の代謝産物の量を測定するために実施することができる（例えば、酵素的、化学的、比色的、蛍光定量的など）ように構成されてもよい。いくつかの使用では、キットに含まれる内部標準は、対象試料中の目的の代謝産物の量を測定するために実施される分析試験のための陽性対照として使用される。いくつかの使用では、キットに含まれる内部標準を、対象試料中の目的の代謝産物の量をキャリブレーションし、かつ／または測定するのを助けるために使用される。対象試料中の目的の代謝産物を測定するために実施される分析試験のタイプに依存して、分析試験を実施するために使用される異なる構成要素を、１つ以上の内部標準および容器とともにキット中に組み込むことができる。
【０２５７】
キットを使用して実施される分析試験から得られるデータは、任意に、対象試料中の１つ以上の目的の代謝産物（例えば、本明細書で教示されるバイオマーカーのパネル）の各々のレベル（例えば、量）であり得る。このデータを健常対象における参照バイオマーカーレベルと比較することができる。
【０２５８】
キットを使用して実施される分析試験からデータ（すなわち、対象試料に関する代謝産物プロファイル（すなわち、目的の各代謝産物の量））を得た後、データを検査室内のコンピュータ端末上に置かれたソフトウェアプログラムに入力して、試験結果の報告を生成することができ、続いてそれを医師または個人に提供することができる。医師は、臨床検査室から試験結果の報告を受け取ると、対象の身体状態を評価することができる。評価された対象の試料の代謝産物プロファイルに基づいて、上記のように、試験結果の報告は、対象が肝疾患状態を有するか、もしくは有しないか、または肝線維症などの肝疾患の特定の分類（例えば、ステージ、重症度、もしくは進行）を有すること、あるいは、対象が肝疾患のための特定の治療に対して応答していることを医師に示してもよい。次に、医師は、試験結果の報告により示される個人の状態に基づいて、必要であれば、対象のために提案を提供するか、または適切な治療を選択することができる。
【０２５９】
実施例１９  バイオマーカーパネルおよび診断モデルの提供
実施例８に詳述される２３個の胆汁酸マーカーのリストから、マーカーのサブセットを含むパネルを選択して、より小さなパネルの診断能を試験した。具体的には、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡが、対照と全ての肝疾患（ＮＡＳＨ、線維症、肝硬変）患者の間で確立されたＯＰＬＳ−ＤＡモデルから導き出された、それらの個々の高い倍率変化（「ＦＣ」）、曲線下面積（「ＡＵＣ」）、および射影における変数重要度（ＶＩＰ）値に基づいて選択された（表２０）。
【０２６０】
【表２７】
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【０２６１】
ＢＡパネルは、７個のＢＡを組み合わせて提供され、ロジスティック回帰を使用して１つの多変数を作成した。このパネルは、本実施例のＢＡパネルとして参照される。ロジスティック回帰（ＬＲ）を使用して、７個の胆汁酸を組み合わせて１つの胆汁酸シグニチャにした。従属変数として、疾患（ＣＨＢ）および健常対照、または疾患（ＣＨＢ）および疾患（線維症）、または疾患（線維症）および疾患（肝硬変）の２値結果、ならびに分類カットオフ：０．５；最大反復回数：２０およびステップワイズにおける確率：投入値０．０５と除去値０．１０による「Ｅｎｔｅｒ」メソッドを使用した共変数としての７個の胆汁酸を使用して、ＬＲモデルを構築した。使用したソフトウェアは、ＳＰＳＳ  ２３．０（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ、ＵＳＡ）であった。感度および特異度の算出のための可能なカット点としてのモデルから、フィットさせた確率を用いてロジスティックモデルに関するＲＯＣ曲線をプロットした。
【０２６２】
肝疾患状態の評価（例えば、疾患状態の診断および／または判別）のための以下の回帰モデルを、テストセットからのデータに基づいて開発した。訓練セット上で訓練された各モデルが、対象がより重篤な肝疾患状態を有する可能性を示す確率を生成した。
【０２６３】
ＮＡＳＨ患者と健常対照の判別のために、７個のＢＡ（表２１）に基づいてロジスティック回帰モデルを開発し、その回帰モデルは以下のようになった。確率＝ｅｘｐ｛−１．９２３−０．００４（ＧＣＤＣＡ）＋０．０１０（ＧＣＡ）＋０．１１６（ＴＣＤＣＡ）−０．０７２（ＴＣＡ）−０．０３５（ＧＵＤＣＡ）−０．１２２（ＴＵＤＣＡ）＋０．０２５（７−ＫＬＣＡ）｝／（１＋ｅｘｐ｛−１．９２３−０．００４（ＧＣＤＣＡ）＋０．０１０（ＧＣＡ）＋０．１１６（ＴＣＤＣＡ）−０．０７２（ＴＣＡ）−０．０３５（ＧＵＤＣＡ）−０．１２２（ＴＵＤＣＡ）＋０．０２５（７−ＫＬＣＡ）｝）。
【０２６４】
【表２８】
2019525198.tif 000051
【０２６５】
ＮＡＳＨを有する患者と線維症を有する患者の判別のために、７個のＢＡ（表２２）に基づいてロジスティック回帰モデルを開発し、その回帰モデルは以下のようになった。確率＝ｅｘｐ｛−０．５１１−０．０００３（ＧＣＤＣＡ）＋０．００１（ＧＣＡ）＋０．００７（ＴＣＤＣＡ）−０．００７（ＴＣＡ）−０．００３（ＧＵＤＣＡ）＋０．０８３（ＴＵＤＣＡ）＋０．４９１（７−ＫＬＣＡ）｝／（１＋ｅｅｘｐ｛−０．５１１−０．０００３（ＧＣＤＣＡ）＋０．００１（ＧＣＡ）＋０．００７（ＴＣＤＣＡ）−０．００７（ＴＣＡ）−０．００３（ＧＵＤＣＡ）＋０．０８３（ＴＵＤＣＡ）＋０．４９１（７−ＫＬＣＡ）｝）。
【０２６６】
【表２９】
2019525198.tif 000052
【０２６７】
線維症を有する患者と肝硬変を有する患者の判別のために、７個のＢＡに基づいてロジスティック回帰モデルを構築し（表２３）、その回帰モデルは以下のようになった。確率＝ｅｘｐ｛−２．５１４−０．０００２（ＧＣＤＣＡ）＋０．００１（ＧＣＡ）＋０．０００４（ＴＣＤＣＡ）−０．００１（ＴＣＡ）＋０．００１（ＧＵＤＣＡ）＋０．０２０（ＴＵＤＣＡ）＋０．０２０（７−ＫＬＣＡ）｝／（１＋ｅｘｐ｛−２．５１４−０．０００２（ＧＣＤＣＡ）＋０．００１（ＧＣＡ）＋０．０００４（ＴＣＤＣＡ）−０．００１（ＴＣＡ）＋０．００１（ＧＵＤＣＡ）＋０．０２０（ＴＵＤＣＡ）＋０．０２０（７−ＫＬＣＡ）｝）。
【０２６８】
【表３０】
2019525198.tif 000053
【０２６９】
多変数に基づくＲＯＣ曲線は、ＮＡＳＨ患者を健常対照から判別するために、０．９３５のＡＵＣ値（９５％信頼区間［ＣＩ］＝０．８５５〜０．９８５）（図１６Ａおよび１６Ｄ）を有して有用な診断能をもたらした（表２１）。０．４２９のカットオフ値を使用すると、８７．０％の感度および８９．１％の特異度が表２４において得られる。同定された血清ＢＡシグネチャは、ＢＭＩ、年齢および性別に関する補正後、オッズ比５６７．６３５（９５％ＣＩ、６０．６６７〜５３１１．０８０）を有して有意（ｐ＜０．００１）なままであった（表２５）。ＮＡＳＨおよび線維症を有する患者の間の区別については、ＡＵＣ値は０．８６１（９５％ＣＩ＝０．７８０〜０．９４２）であった（図１６Ｂおよび１６Ｅ、表２２）。感度および特異度は、０．８１１のカットオフ値を使用して、それぞれ８８．８％および８２．６％であった（表２４）。同様に、同定された血清ＢＡシグネチャは、ＢＭＩ、年齢および性別に関する補正後、有意（ｐ＜０．００１）なままであり、オッズ比は７５．２４３（９５％ＣＩ、２４．４５１〜２３２．６５４）であった（表２６）。線維症を有する患者の肝硬変からの判別については（表２３）、０．８８９（９５％ＣＩ＝０．８５１〜０．９２６）のＡＵＣならびに７８．８％の感度および８７．２％の特異度（図１６Ｃおよび１６Ｆ、表２４）が得られた。加えて、同定された血清ＢＡシグネチャは、ＢＭＩ、年齢および性別に関する補正後、有意（ｐ＜０．００１）なままであり、オッズ比は１７７．１４１（９５％ＣＩ、３８．２６４〜８２０．０６８）であった（表２７）。
【０２７０】
【表３１】
2019525198.tif 000054
【０２７１】
【表３２】
2019525198.tif 000055
【０２７２】
【表３３】
2019525198.tif 000056
【０２７３】
【表３４】
2019525198.tif 000057
【０２７４】
驚くべきことに、結果は、発明者らのＢＡパネルのＡＵＣが、ＡＳＴ／ＡＬＴ比、ＴＢＩＬ、ＭＥＬＤスコア、ＡＰＲＩおよびＦＩＢ−４のＡＵＣよりも高いことを示した（図１６Ａ〜Ｃおよび図１７Ａ〜Ｄ、さらなる詳細は補足資料において提供される）。これは、典型的な臨床パラメータと比較してさえも、驚くほど高いＢＡパネルの診断能を実証している。
【０２７５】
続いて、発明者らは、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡレベルを使用した正準判別分析から関数プロットを確立し、対照、ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変を有する患者が４つの大きな群にクラスター化されることを示した（図２０）。その結果、１６９名の対照のうち、１３２名すなわち７８．１％が適切に分類された。ＮＡＳＨ、線維症および肝硬変患者に関する正分類率は、それぞれ６３．０％、８０．７％および７０．６％であった（表２８）。
【０２７６】
特に、患者は、ＮＡＳＨから線維症および線維症から肝硬変への肝疾患の進行に相当したＧＵＤＣＡおよびＴＣＤＣＡの血清レベルが漸進的に上昇した（図１６Ｇおよび１６Ｈ）。ＢＡパネルのレベルはまた、糖尿病を有する６５名の患者から得たそれらと比較され、糖尿病患者を肝疾患患者から適切に区別した（図１６Ｊおよび１６Ｋならびに図１９）。
【０２７７】
【表３５】
2019525198.tif 000058
【０２７８】
実施例２０  マルチバイオマーカーパネルのスコアリングのためのモデルを使用した肝疾患状態の評価
実施例８で検査された肝疾患対象のいずれも含まなかった肝疾患対象の新規のセット（検証セット）において、選択されたＢＡパネルを測定した。検証セットは、テストセットと同じ５０２名の肝疾患を有しない非糖尿病対象、非アルコール依存症対象、健常対象を含んだ。対象のこのセットからのデータを表２９に提供する。肝疾患状態の他のマーカーもまた、比較のためにこれらの対象において測定された（例えば、ＡＬＢ、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ）。
【０２７９】
検証セットは、テストセットには存在しない、慢性Ｂ型肝炎を有する４７１名の肝疾患対象（慢性肝疾患、ＣＬＤ）を含んだ。４７１名の肝疾患対象は、線維症ではない１３２名の対象（ＨＢはＣＨＢとも称される）、Ｓ１線維症を有する３０名の対象、Ｓ２線維症を有する２６名の対象、Ｓ３線維症を有する２０名の対象、ＣＰ  Ａ肝硬変を有する４９名の対象、ＣＰ  Ａ肝硬変を有する９９名の対象、ＣＰ  Ｃ肝硬変を有する２２名の対象、およびＣＰ  Ｃ肝硬変に加えて肝細胞癌（ＨＣＣ）を有した９３名の対象を含んだ。パネルの各バイオマーカーのレベル、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡを、検証セットにおいて測定した。測定されたレベルを表３０に示す。検証セットにおいて測定されたレベルは、テストセットの測定された値と一貫していた。
【０２８０】
【表３６−１】
2019525198.tif 000059
【表３６−２】
2019525198.tif 000060
【表３６−３】
2019525198.tif 000061
【表３６−４】
2019525198.tif 000062
【０２８１】
【表３７】
2019525198.tif 000063
【０２８２】
より高い血清ＢＡレベルが肝疾患罹患の危険が高くなることと関連付けられたことを示した、前の実施例において開発されたモデルを、検証集団に適用した。さらに、検証研究は、対象を判別する７個のＢＡパネルの性能を実証した。具体的には、検証研究は、年齢、性別およびＢＭＩに関する補正後、訓練セットで訓練されたＮＡＳＨ対対照モデルを使用して、ＨＢおよび線維症を有する患者間（ＡＵＣ：０．８６１（９５％  ＣＩ：０．７９６〜０．９２６））において訓練セットで訓練されたＮＡＳＨ対線維症モデルを使用して、ならびに肝硬変および線維症を有する患者間（ＡＵＣ：０．７９２（９５％  ＣＩ：０．７０５〜０．８７９））において訓練セットで訓練された線維症対肝硬変モデルを使用して、ＨＢを有する患者を健常対照から正常に判別した（ＡＵＣ：０．８０８（９５％  ＣＩ：０．７４７〜０．８６８））検証集団由来の血清試料で実施した（図１７Ａ〜Ｃ）。さらに、７個のＢＡパネルは、年齢、性別およびＢＭＩに関する補正後（図１７Ｄ）、検証セットで訓練された新たに確立されたモデル：確率＝ｅｘｐ｛０．５０３−０．００１（ＧＣＤＣＡ）−０．０００２（ＧＣＡ）＋０．００１（ＴＣＤＣＡ）−０．００１（ＴＣＡ）＋０．００１（ＧＵＤＣＡ）＋０．０００１（ＴＵＤＣＡ）＋０．０２９（７−ＫＬＣＡ）｝／（１＋ｅｘｐ｛０．５０３−０．００１（ＧＣＤＣＡ）−０．０００２（ＧＣＡ）＋０．００１（ＴＣＤＣＡ）−０．００１（ＴＣＡ）＋０．００１（ＧＵＤＣＡ）＋０．０００１（ＴＵＤＣＡ）＋０．０２９（７−ＫＬＣＡ）｝を使用して、肝硬変患者とＨＣＣ患者（ＡＵＣ：０．８７１（９５％  ＣＩ：０．８１５〜０．９２６））を判別することができた。
【０２８３】
検証セットにおけるＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡの血清レベルの変化を示す棒グラフを図１７Ｅに提供する。テストセットにおいて前になされたように、本発明者らは、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＵＤＣＡ、ＴＵＤＣＡおよび７−ＫＬＣＡを使用して関数プロットを構築し、ＨＢＶ、線維症、肝硬変およびＨＣＣを有する患者を４つの大きな群にクラスター化したことを示すことができた（図２１および図２２）。ＨＢＶを有する患者、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３の線維症、ＣＰグレードＡ、ＢおよびＣの肝硬変患者ならびにＨＣＣにおけるＧＵＤＣＡレベルを図１７Ｆに示す。
【０２８４】
さらに、検証集団において実証されるように、このＢＡパネルのＡＵＣは、驚くべきことに、前に報告されたテストであるＡＳＴ／ＡＬＴ比、ＴＢＩＬ、ＭＥＬＤスコア、ＡＰＲＩおよびＦＩＢ−４を超えることが判明した（図１７Ａ〜Ｄ）。このことは、単独でまたは本明細書で教示される他のバイオマーカーと組み合わせて使用されるとき、このパネルのバイオマーカー能力が顕著であることを実証している。
【０２８５】
実施例２１  胆汁酸モジュレーターを用いた治療により予防可能な肝癌
本実施例は、調節不全の胆汁酸（ＢＡ）が肝疾患に密接に関連し、変化した腸内細菌叢に起因していることを詳述する。本実施例は、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）およびタウロリトコール酸（ＴＬＣＡ）を含む疎水性ＢＡの肝内うっ滞が、ストレプトゾトシンおよび高脂肪食（ＨＦＤ）により誘発される非アルコール性脂肪性肝炎−肝細胞癌（ＮＡＳＨ−ＨＣＣ）マウスモデルにおいて実質的に増大したことを示す。加えて、長期にわたりＨＦＤを与えたマウスは、肝ＢＡレベルが有意に上昇して肝腫瘍を自然に発症した。２％コレスチラミンを与えることによってＮＡＳＨ−ＨＣＣモデルマウスにおける疎水性ＢＡの腸管排泄を促進することによるＢＡレベルの治療的調節が、ＨＣＣの発症を有意に予防した。腸内細菌叢の変化は、肝臓および糞便におけるＢＡレベルの変化と密接に相関していた。ＨＦＤにより誘発される炎症は、重要なＢＡ輸送体を阻害し、肝内ＢＡ濃度を持続的に上昇させた。この研究はまた、ＢＡ処理された正常ヒト肝細胞株における有意に上昇した細胞増殖、およびＴＣＤＣＡ処理したＨｅｐＧ２細胞株における腫瘍抑制遺伝子ＣＥＢＰαの発現の下方制御を示し、複数の疎水性ＢＡが共同して肝臓の発癌を促進し得ることを実証した。
【０２８６】
ＢＡの肝内蓄積は、続いて起こる線維症および悪性腫瘍の発症の原因となる持続的な肝細胞損傷を深刻に誘発するという仮説が立てられた。脂肪症からＮＡＳＨ、線維症、および最終的にＨＣＣまでのヒトの肝疾患の進行に非常に関連性のある、ストレプトゾトシン−高脂肪食（ＳＴＺ−ＨＦＤ）により誘発される非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）−ＨＣＣマウスモデルを使用し、このモデル群においてほぼ１００％のマウスがＨＣＣを発症した。長期にわたりＨＦＤを与えたマウスならびにヒト正常肝細胞株および腫瘍細胞株において、仮説をさらに検証した。
【０２８７】
材料及び方法
マウスおよび食餌
実験１：ＨＦＤと組み合わせたＳＴＺにより誘発されるＮＡＳＨ−ＨＣＣ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスモデルを発育させた。病原体を保有していない妊娠１４日Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを日本クレア（東京、日本）から購入し、新生仔雄マウスを２つの群：対照群およびモデル（ＳＴＺ−ＨＦＤ）群に分けた。対照群のマウスをいずれの処理もせずに飼育し、普通食（日本クレア株式会社のＣＥ−２、１２ｋｃａｌ％脂肪、２９ｋｃａｌ％タンパク質、５９ｋｃａｌ％炭水化物で構成される）を与えた。ＳＴＺ−ＨＦＤのマウスは、生後２日目で２００μｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）の皮下注射を１回行い、ＨＦＤ（日本クレア株式会社のＨＦＤ３２、ＳＴＺ−ＦＨＤ群）を４週齢後１６週間自由に与えられた（図２３）。実験中、全ての動物の体重を週１回記録した。６、８、１２、および２０週目で、各群の６匹のマウスを安楽死させ、肝臓、血漿、および糞便の試料を回収した。
【０２８８】
実験２：実験１に加えて、発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスにＨＦＤを単独で与えて、肝臓の発癌を観察し、さらにＢＡが肝臓の発癌を促進することになることを確認した。２つの群のマウス：（１）対照；（２）ＨＦＤを採用した。本発明者らは、異なる時点および５８週目でマウスを屠殺し、ＨＦＤを与えたマウスにおけるＨＣＣの形成を観察した。
【０２８９】
実験３：実験１における肝臓の発癌において、ＢＡレベルが有意に上昇したことが見出された。ＮＡＳＨ−ＨＣＣマウスモデルを繰り返して、ＢＡ吸着レジン、コレスチラミンが肝臓の発癌を減ずる／予防することができるかを確認した。３つの群のマウス：（１）対照（ｎ＝９）；（２）モデル（ＳＴＺ−ＨＦＤ、ｎ＝３０）および（３）ＳＴＺ−ＨＦＤ−ＢＡレジン（ｎ＝３０）群を採用し、マウスに２％コレスチラミンを含有するＨＦＤ食を与えた。全ての手順は実験１と同一である。２０週目に、マウスを安楽死させ、肝臓、血漿、および糞便の試料を回収した（図２６Ａ）。
【０２９０】
動物に対する全ての処置を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより作成され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより発行された「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ８６-２３，ｒｅｖｉｓｅｄ  １９８５）に従って実施した。
【０２９１】
血清ＡＬＴおよびＡＳＴの測定
血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベルをＦＵＪＩ  ＤＲＩ−ＣＨＥＭ  ７０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、東京、日本）により測定した。
【０２９２】
組織学的評価
肝組織を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンブロックに包埋し、常用のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により処理した。個々のＮＡＦＬＤ活性スコアを計算した。
【０２９３】
ＢＡの測定
血漿、肝臓、および糞便中のＢＡレベルを、超高速液体クロマトグラフィートリプル四重極質量分析（ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ）により定量的に測定した。全ての分離をＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ，１００ｍｍ×２．１ｍｍ内部寸法）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して実施した。データ取得をＭａｓｓＬｙｎｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１を使用して実施し、ＢＡの定量をＴａｒｇｅｔＬｙｎｘアプリケーションマネージャｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して実施した。詳細については、補足情報の方法を参照されたい。
【０２９４】
腸内細菌叢特性
細菌の多様性を、以前に報告されたようなバクテリアタグエンコードＦＬＸ  １６Ｓ  ｒＤＮＡアンプリコンパイロシーケンス（ｂａｃｔｅｒｉａｌｔａｇ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ＦＬＸ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ｂＴＥＦＡＰ）法を使用して特徴付けた。
【０２９５】
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応
ＤＮＡおよびＲＮＡを、ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ中のホモジナイズされた組織ライセートおよびＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って同時に抽出した。ＲＮＡの完全性を、１μｌのＲＮＡを使用してＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ６０００  ｃｈｉｐｓおよび２１００  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で評価した。標的のｍＲＮＡの発現を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  ＦＡＳＴ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で比較サイクル閾値（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）法により３通り測定した。フォワードおよびリバースプライマーをＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。標的の遺伝子発現をＡＣＴＢレベルに正規化し、標的遺伝子の相対的な発現を比較Ｃｔ法としても知られる「ｄＣＴ」を使用して計算した。
【０２９６】
肝臓におけるＴＧ、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αの測定
肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）のレベルを、ＢｌｕｅＧｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、ＣｈｉｎａのＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。
【０２９７】
血漿、肝臓、および糞便中のＬＰＳの測定
血漿、肝臓、および糞便中のリポ多糖（ＬＰＳ）のレベルを、マウスＬＰＳ  ＥＬＩＳＡキット（ＢｌｕｅＧｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って決定した。
【０２９８】
統計分析  全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）およびＳＰＳＳ  ２２．０（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ、ＵＳＡ）を使用して計算された。データは、平均値±ＳＥＭとして表される。ＢＡ測定値の群間の相違を、多重比較補正のためのホルム−シダック法によるｔ検定により分析した。本発明者らは、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。スピアマン相関分析を行い、肝臓および糞便中の腸内細菌叢とＢＡレベルの間の交互作用を評価して、１．０（最大の正の相関）から−１（最大の逆相関）および０（無相関）の範囲の値を得た。
【０２９９】
細胞培養およびＢＡ処理
正常ヒト肝細胞株ＷＲＬ−６８およびＴＨＬＥ−２をＳｉｇｍａから購入した。ＢＡ処理のために、細胞を収集し、ＰＢＳで２回すすぎ、１０％チャコール処理ＦＢＳを加えた無糖ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で懸濁させ、５×１０４／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種した。本発明者らは、２７．５ｍＭのグルコース（Ｇｌｃ、Ｓｉｇｍａ）および０．３ｍＭのオレイン酸（ＯＡ、Ｓｉｇｍａ）を準備して、インビトロにおいて高いグルコースおよび脂肪条件を模倣した。５種類のＢＡ、ＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＤＣＡ、またはＬＣＡのそれぞれを５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭの濃度で培地に添加した。１４日間の処理後、正常培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２）を各ウェルに添加して、使用済みの培地を置換した。細胞増殖および足場非依存性増殖アッセイを正常培地中で実施した。加えて、ウエスタンブロットアッセイを実施して、腫瘍性タンパク質ｃ−ｍｙｃの発現の変化を分析した。
【０３００】
ヒト癌細胞株であるＨｅｐＧ２をＳｉｇｍａから購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えたＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で維持した。ＢＡ処理のために、細胞を収集し、ＰＢＳで２回すすぎ、１０％チャコール処理ＦＢＳおよび６ｍＭグルコースを加えた無糖ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で播種した。５種類のＢＡ、ＣＡ、ＵＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＤＣＡ、またはＬＣＡのそれぞれを１００μＭの濃度で培地に添加した。１４日後、使用済み培地を新鮮な正常培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２）により置換した。それから、細胞を、細胞増殖アッセイおよび腫瘍抑制因子ＣＥＢＰαのためのウェスタンブロット分析に使用した。
【０３０１】
ｃ−ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＥＢＰα、およびアクチン（Ｌｉ−ｃｏｒ）に対する一次抗体を購入し、製造業者によって示されるように希釈された濃度で使用した。
【０３０２】
結果
肝ＢＡは、ＳＴＺ−ＨＦＤにより誘発されるＮＡＳＨ−ＨＣＣマウスにおいて有意に増加した。脂肪症、ＮＡＳＨ、線維症、およびＨＣＣの病理学的表現型は、雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて順調に発症した。皮下にＳＴＺを注射された新生仔マウスは、軽度の膵島炎症および膵島破壊を引き起こした。生後４週間のＳＴＺ感作マウスはＨＦＤを与えられ、脂肪肝から、ＮＡＳＨ、線維症、およびＨＣＣへの経時的な組織学的変化を起こした（図２３Ａ）。特に、ＨＦＤを与えた全てのマウスはＨＣＣを発症した（図２３Ｂ）。Ｈ＆Ｅ染色（図２３Ｃ）は６週目で炎症性病巣のない脂肪肝を示し、８週目で好中球、リンパ球および単球を含む中等度の炎症性浸潤ならびに肝細胞のバルーニング変性を有する脂肪肝を示し、１２週目で慢性線維症を示し、ＮＡＦＬＤ活性スコアが上昇した２０週目でＨＣＣを示した。
【０３０３】
ＳＴＺ−ＨＦＤマウスにおいて、悪化した肝損傷を伴って体重増加が観測された。肝重量は、正常マウスと比較して、ＳＴＺ−ＨＦＤ群において、とりわけ線維症およびＨＣＣステージで有意に増加した（図２３Ｄ）。空腹時血糖値および肝臓ＴＧは、ＳＴＺ−ＨＦＤ群において有意により高かった（図２３Ｅおよび２３Ｆ）。ＳＴＺ−ＨＦＤマウスにおいて、血清ＡＬＴおよびＡＳＴの軽微な上昇が検出された。血漿、肝臓、および糞便中のエンドトキシン（リポ多糖、ＬＰＳ）レベルは、対照と比較してＳＴＺ−ＨＦＤ群において著しく上昇した（図２３Ｇ）。
【０３０４】
重要なこととして、ＴＣＡ、ＤＣＡ、ＧＣＡ、ＴＤＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＵＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、および総ＢＡの肝臓におけるレベルは、１２週目および２０週目のモデルマウスにおいて実質的に上昇した（図２３Ｈ）。ＢＡの肝臓における蓄積が肝線維症ステージで発生したが、糞便におけるＢＡは同じステージで枯渇し、ＨＣＣステージで徐々に増加した。特に、全てのＢＡ種の中で、ＴＣＤＣＡが、モデルマウスの肝臓において、対照と比較して最も有意に増加した種であった。これらのＢＡに加えて、ＬＣＡが、モデルマウスの血漿および糞便において増加した。
【０３０５】
興味深いことに、糞便における一次ＢＡ、ＣＡおよびＣＤＣＡは、対照と比較して、モデル群における線維症期（１２週）で減少したが、血漿および肝臓では、それらのレベルが上昇した。糞便の総ＢＡは、線維症ステージで対照よりもモデル群において若干低かったが、ＨＣＣステージでは、そのレベルは血漿において、ならびに線維症およびＨＣＣステージでは肝臓において増加した。
【０３０６】
肝腫瘍は、長期にわたりＨＦＤを与えたマウスにおいて発症した
肝臓において有意に増加したＢＡがＳＴＺ−ＨＦＤ処理マウスにおいて観測されたことにより、ＨＦＤにより誘発される高濃度のＢＡおよびそれらの肝臓中のうっ滞が、腫瘍プロモーターとして機能し得るという仮説を導く。ＳＴＺは、国際癌研究機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）によって潜在的な発癌性物質として分類されたため、発明者らは、ＨＦＤ単独で肝癌を発症させることになるかを調査したが、ＳＴＺ単独で２０週間処理された雄マウスにおいてＨＣＣは観察されなかった。この長期間のＨＦＤの介入研究では、肝腫瘍は、５８週目において、ＨＦＤを与えたマウスの半数超で（１１匹中６匹）観察された（図２４Ａおよび２４Ｂ）。肝重量（図２４Ｃ）および肝臓と体重の比（図２４Ｄ）は、ＨＦＤを与えてＨＣＣを誘発したマウスにおいて著しく増加した。血漿、肝臓および糞便中のＬＰＳレベルは全て、ＨＣＣマウスにおいて有意に上昇した（図２４Ｅ）。特に、肝臓および血漿のＢＡ、ＴＣＡ、ＧＣＡ、およびＴＣＤＣＡは、ＨＦＤを与えられた全てのマウスで増加したが、正常と比較して、ＨＣＣを発症したそれらのマウスにおいては統計的有意性を有していた（図２４Ｆおよび２４Ｇ）。
【０３０７】
疎水性ＢＡの腸管排泄を促進することによりＨＣＣの発症を予防することができる
肝ＢＡのＨＦＤにより誘発される蓄積が肝腫瘍を促進することを示した。ＨＣＣの発症におけるＢＡの役割を確認するために、発明者らは、ＳＴＺ−ＨＦＤマウスモデルを繰り返し、コレスチラミンの経口投与によりマウスのＢＡの量を減少させた（図２５Ａ）。発明者らは、ＳＴＺ−ＨＦＤモデル群と比較して、コレスチラミンを与えることが、肝臓の悪性病変の発生およびサイズを有意に低下させることを観察した（図２５Ｂ）。ＳＴＺ−ＨＦＤ由来の組織構造はコレスチラミン処理により正常化したが、このことは、血液および肝組織における反転した病理学的特徴により支持された（図２５Ｃおよび２５Ｄ）。コレスチラミン投与の後、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、Ｉ型コラーゲン、および癌関連遺伝子グリピカン−３（Ｇｐｃ３）の発現のレベルは正常化した（図２５Ｅ）。変化したＢＡ輸送体（図２５Ｅ）ならびにＢＡ、主として肝臓中（図２５Ｆ）および血漿中のＤＣＡ、ＴＣＡ、およびＴＣＤＣＡは、コレスチラミン介入後に減じた。ＳＴＺ−ＨＦＤ介入に応答した腸内細菌叢の破壊ならびに血漿、肝臓および糞便中のＬＰＳレベルもまた、コレスチラミン介入により回復した（図２５Ｇおよび２５Ｈ）。
【０３０８】
腸内細菌叢は有意に変化し、肝臓癌形成中の変化したＢＡと相関した
本発明者らのメタゲノム解析データは、６週、８週、１２週および２０週でＳＴＺ−ＨＦＤ介入したマウスにおいて腸内細菌叢が有意に変化したことを示した（図２６Ａ〜２６Ｄ）。特定の微生物の存在量が肝疾患進行とともに変化した。門レベルで対照と比較した場合、糞便のファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）およびアンチノバクテリア（Ａｎｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）におけるＯＴＵ（％）の相対存在量は、モデル群において有意に増加したが、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）およびプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）は、有意に減少した（図２６Ｂ）。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、およびデサルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）の属レベルは、モデル群において有意に増加した（図２６Ｃ）。種レベルで対照群と比較したモデル群において、糞便のクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐｐ．）、アトポビウム属（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ａｐｐ．）、およびデサルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）におけるＯＴＵ（％）の相対存在量は有意に増加したが、パラサテレラ属（Ｐａａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）およびアッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｓｐｐ）は有意に減少した（図２６Ｄ）。これらの全ての細菌は、ＢＡ脱抱合、脱ヒドロキシ化、およびＢＡのＣＯ２およびＨ２Ｏへの分解に関与すると報告された。
【０３０９】
図２６Ｅにおける腸内細菌叢の変化と肝臓におけるＢＡ濃度との間のスピアマン相関分析は、ＴＣＤＣＡが、バルネシエラ（Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ）（ｒ＝−０．３１、ｐ＝０．０３３）、オドリバクター（Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）（ｒ＝−０．２９、ｐ＝０．０４７）、パラサテレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）（ｒ＝−０．３４、ｐ＝０．０１９）、およびパラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）（ｒ＝−０．４８、ｐ＝０．００１）と有意に負に相関したことを示し、キシラニバクター（Ｘｙｌａｎｉｂａｃｔｅｒ）（ｒ＝０．４０、ｐ＝０．０５）およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（ｒ＝０．４１、ｐ＝０．００４）と有意に正に相関したことを示した。ＴＣＡは、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ｒ＝０．４６、ｐ＝０．００１）、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）（ｒ＝０．４０、ｐ＝０．００５）、およびサルシナ（Ｓａｒｃｉｎａ）（ｒ＝０．３０、ｐ＝０．０３８）と相関した。ＧＣＡは、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）（ｒ＝０．３４、ｐ＝０．０１７）およびパラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ｒ＝０．３０、ｐ＝０．０３６）と相関した。ＴＬＣＡは、パラサテレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）（ｒ＝−０．３０、ｐ＝０．０３６）、パラプレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）（ｒ＝−０．４２、ｐ＝０．００３）、パラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ｒ＝０．２９、ｐ＝０．０４３）、およびエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（ｒ＝０．５０、ｐ＝０．０００）と相関した。ＴＤＣＡは、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）（ｒ＝０．５１、ｐ＝０．０００）およびパラバクテロイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ｒ＝０．５８、ｐ＝０．０００）と相関した。
【０３１０】
糞便の一次ＢＡ、ＣＤＣＡは、オリバクテリウム（Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ｒ＝０．３１、ｐ＝０．０３）およびスラッキア（ｓｌａｃｋｉａ）（ｒ＝０．３８、ｐ＝０．００９）の存在量と正に相関し、ＣＡは、ステノトロホモナス（ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）（ｒ＝０．５３、ｐ＝０．０００１）と正に相関し、パラバクテロイデス（ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ｒ＝−０．２９、ｐ＝０．０４６）の存在量と負に相関した。他方では、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）は、ＬＣＡ（ｒ＝０．６０、ｐ＝８．６Ｅ−０６）、ＤＣＡ（ｒ＝０．４１、ｐ＝０．００５）、ＴＬＣＡ（ｒ＝０．３７、ｐ＝０．０１２）、およびＴＤＣＡ（ｒ＝０．３８、ｐ＝０．００８）と正に相関した。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）ならびにＤＣＡ（ｒ＝０．３１、ｐ＝０．０３２）およびＬＣＡ（ｒ＝０．６４、ｐ＝１．１Ｅ−０６）、ＧＬＣＡ（ｒ＝０．４６、ｐ＝０．００１）およびＧＤＣＡ（ｒ＝０．４８、ｐ＝０．００１）の間にも有意な正の相関があった。アロバキュラム（Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ）は、ＴＣＤＣＡ（ｒ＝−０．５１、ｐ＝０．０００）、ＧＣＡ（ｒ＝−０．５５、ｐ＝０．０００）、ＴＬＣＡ（ｒ＝−０．３２、ｐ＝０．０２７）、ＴＵＤＣＡ（ｒ＝−０．５９、ｐ＝０．０００）、およびＴＣＡ（ｒ＝−０．６２、ｐ＝０．０００）と負に相関した。パラサテレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）は、ＤＣＡ（ｒ＝−０．３８、ｐ＝０．００９）およびＬＣＡ（ｒ＝−０．６９、ｐ＝８．６Ｅ−０８）と負に相関した。フィーカリバクテリウム（ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）とＤＣＡ（ｒ＝−０．３９、ｐ＝０．００８）との間には有意な負の相関があった。ＬＣＡは、バルネシエラ（ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａ）（ｒ＝−０．５７、ｐ＝３．３Ｅ−０５）およびオドリバクター（ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ）（ｒ＝−０．５８、ｐ＝４．８Ｅ−０５）と有意に負に相関した。
【０３１１】
ＢＡの蓄積はＢＡ輸送および合成に関与する遺伝子を下方制御した
遺伝子発現分析は、肝臓におけるＢＡ輸送および合成に関与する遺伝子の下方制御を示した（図２７Ａ）。特に、マウス肝臓における肝ＦＸＲの発現は、ＮＡＳＨおよび線維症を有するマウスモデルにおいて有意に低下し、このことは、肝排出輸送体を下方制御する機構を示唆しているが、それにより、肝細胞およびＢＡに誘発される肝損傷におけるＢＡ蓄積の増加をもたらした。６週、８週、１２週および２０週で有意に下方制御されるＢＳＥＰならびに６週で上方制御されるＣＹＰ７Ａ１によって明示されるように、ＨＣＣの病理的な発症において肝ＢＡのうっ滞の著しい増加がもたらされている。このことは、６週、８週、１２週および２０週のマウスモデルの肝臓における異常に高いＢＡレベルの観測と一貫性がある。これらの全ては、ＨＦＤにより誘発される脂肪肝が、肝ＦＸＲおよび肝ＢＳＥＰ発現の有意に阻害された肝臓における調節不全のＢＡ合成および輸送をもたらしていることを示した。ＢＡに対する取り込み輸送体、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）、頂端側ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ）およびＳＨＰの発現は、ＳＴＺ−ＨＦＤ処理により抑制された。
【０３１２】
サイトカインの発現は肝臓の発癌において有意に増加した
ＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどの炎症促進性遺伝子の発現は、脂肪症および脂肪性肝炎の時期において増加し、線維症関連遺伝子、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼインヒビター１（ＴＩＭＰ−１）およびＩ型コラーゲンの発現は、コラーゲン沈着の組織学的徴候の前に増加し、癌関連遺伝子（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ−９）およびＧｐｃ３の発現は、ＨＣＣステージで増加した（図２７Ｂ）。これらの全ての結果は、ＳＴＺ−ＨＦＤにより誘発される炎症および酸化ストレスが重要なＢＡ輸送体を阻害し、いくつかの重要な炎症促進性、線維症、および癌マーカーを促進する肝内ＢＡ濃度（図２３）の増加を引き起こすことを示唆している。
【０３１３】
ＢＡは、ＨｅｐＧ２細胞株において正常肝細胞の悪性転換を惹起し、腫瘍抑制遺伝子ＣＥＢＰαを阻害する
発明者らはさらに、高グルコースおよび高脂肪酸濃度で培養した正常ヒト肝細胞において、ＢＡ、特に、ＤＣＡ、ＬＣＡ、ＴＬＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＣＡ、ＵＤＣＡおよびＧＣＤＣＡの腫瘍促進作用を調査することにより発明者らの仮説を試験した。発明者らは、高グルコース（２７．５ｍＭ）および高オレイン酸（０．３ｍＭ）濃度におけるＤＣＡ、ＬＣＡ、ＣＡおよびＴＣＤＣＡ処理が、ＨｅｐＧ２細胞（図２８Ｂ）だけでなくＷＲＬ−６８（図２８Ａ）およびＴＨＬＥ−２の増殖を有意に促進することを見出した。しかし、ＴＬＣＡ、ＴＣＡおよびＧＣＤＣＡ処理による、ＷＲＬ−６８細胞の増殖に対する影響はごくわずかであった。これらの結果は、ＤＣＡ、ＬＣＡまたはＴＣＤＣＡが、高グルコースおよび高脂肪の微小環境において正常肝細胞の増殖速度を加速できることを示したが、このことは、肝細胞の悪性転換をもたらし得る。
【０３１４】
高グルコースおよび高脂肪条件下でのＤＣＡまたはＬＣＡ処理は、親細胞と比較して、ＷＲＬ−６８の足場非依存性増殖を亢進しなかったが、ただし、高グルコースおよび高脂肪で処理したものと比較して、有意に増加した。
【０３１５】
特に、ＤＣＡ、ＬＣＡ、およびＴＣＤＣＡは、ＷＲＬ−６８細胞（図２８Ｃ）において腫瘍性タンパク質ｃ−ｍｙｃの発現を増加させ、ＴＣＤＣＡは、ＨｅｐＧ２細胞（図２８Ｄ）において腫瘍抑制遺伝子ＣＥＢＰαの発現を減少させた。
【０３１６】
考察
腸内細菌叢に媒介される脂肪性肝疾患の発症およびそのＨＣＣへの進行の根底にある明確な機構は、この調査の前には明らかでなかった。発明者らの研究は、腸内細菌叢と肥満に関連した肝臓の発癌との間の内在的な関連としての肝臓−ＢＡ−細菌叢の代謝系を指摘している。
【０３１７】
固有のＮＡＳＨ−ＨＣＣマウスモデルを使用して、発明者らは、肝疾患の進行中の有意に変化した腸内細菌組成に続いて、肝臓における疎水性、およびしたがって細胞毒性のＢＡのパネルの有意な蓄積を示した。ＢＡと腸内細菌叢との間には、細菌叢によるＢＡの生化学的変換（脱抱合、脱ヒドロキシ化、脱水素）、および同時にＢＡの抗菌作用を介した強力で双方向的な相互作用がある。腸内細菌叢は、ＦＸＲ依存的な様式で胆汁疎水性の決定要因となると推測されてきた。同様に、ＦＸＲとＢＡとの間の相互作用はまた双方向的であり、ＦＸＲは肝臓および腸でのＢＡ合成、輸送、および代謝を制御し、また、ＢＡはＦＸＲを活性化する。ＦＸＲはＢＡの恒常性の維持およびＢＡの毒性の低減に寄与する。ラットの肝臓では、ＦＸＲの活性化は、ＢＳＥＰおよびＳＨＰの発現の上方制御をもたらす。ＳＨＰは、ＢＡ合成、Ｃｙｐ７ａ１およびＣｙｐ８ｂ１を制御する転写遺伝子に干渉する。ＳＨＰはまた、ＮＴＣＰの発現、門脈から肝臓へのナトリウム依存的なＢＡの取り込みキャリアに影響を及ぼす。回腸末端部では、ＦＸＲの活性化は回腸ＢＡ結合タンパク質の下方制御およびＯＳＴα／β、ＢＡ再吸収に必須な腸管ＢＡ輸送体の上方制御をもたらす。発明者らの結果における、ＦＸＲ、ＢＳＥＰ、ＳＨＰ、それからＣｙｐ７ａ１、Ｃｙｐ８ｂ１、ＮＴＣＰ、およびＯＳＴαの発現の減少した発現は、肝臓から胆管への汲み出し速度の低下による肝臓内のＢＡの蓄積、および門脈からのＢＡの再吸収の増加を説明している。
【０３１８】
本明細書で示される結果は、ＤＣＡが、ＨＣＣの発症の少なくとも１つのある特定の局面に寄与し得ることを示唆する。ＢＡ、特に、ＧＣＡ、ＴＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＤＣＡおよびＴＤＣＡは全て、消化管の癌における病原因子として意味づけられる。ＤＣＡ、ＬＣＡまたはＴＣＤＣＡへの暴露後に正常ヒト細胞株であるＷＲＬ−６８およびＴＨＬＥ−２またはＨｅｐＧ２の増殖が亢進したことによって明示されるように、高レベルのＢＡに継続的に暴露されことにより、変異および異常な増殖が誘発され得る。転写因子ｃ−ｍｙｃは、細胞成長、増殖、分化の消失およびアポトーシスを含む重要な生物学的作用を媒介し、また、ｃ−ｍｙｃの過剰発現は、ヒトＨＣＣにおいて観察されてきた。以前の報告では、ＤＣＡおよびＣＤＣＡなどのＢＡが、酸性環境においてｃ−ｍｙｃの強力な誘発因子となることができることを示したが、また、より最近の研究ではさらに、酸性条件下のＤＣＡおよびＣＤＣＡは、ｃ−ｍｙｃ転写の活性化によりヒト胃癌細胞におけるヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）の発現を増加させたことを実証した。ＩＬ−１βの発現の増加ならびにβ−カテニンおよびその標的遺伝子であるｃ−ｍｙｃの上昇と同調した血清および肝ＢＡのレベルの上昇は、Ｆｘｒ−ヌルマウスにおいて以前に観察されたが、これにより、月齢１２ヶ月において肝細胞性の損傷、腺腫および細胞癌が自然に発症する３。
【０３１９】
モデルマウスにおける高ＢＡレベルの肝臓は、炎症、脂肪性肝炎、線維症およびアポトーシスを示す。炎症は細胞死を刺激し、細胞交替を増加させ、それにより肝臓腫瘍形成を促進することが知られている。他の報告において示されるように、ＨＣＣのマーカーであるＴＮＦ−α、ＭＭＰ−９、Ｔｉｍｐ−１、ＩＬ−６、Ｉ型コラーゲン、およびＧｐｃ−３のレベルの継続的な上昇によって明示されるように、ＳＴＺ介入および継続的なＨＦＤは、酸化ストレスおよび炎症を刺激する。
【０３２０】
発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５８週間ＨＦＤを与えて、ＨＦＤにより誘発されるＢＡの過負荷が肝臓腫瘍形成を誘発することができるかを判定した。ＨＦＤを長期間与えることにより、マウスにおいて肝臓腫瘍を誘発することができ、そのマウスにおいて、血漿および肝臓におけるＴＣＤＣＡ、ＴＣＡおよびＧＣＡの有意な増加も観察された。ＨｅｐＧ２細胞に対するＴＣＤＣＡ処理により、細胞増殖が著しく増大し、ＣＥＢＰαの発現が減少したが、このことは、ＢＡ単独で腫瘍促進作用を有し得ることを示唆している。ＣＥＢＰαは、ＨＣＣにおいて無効になるか、または減少する、腫瘍抑制タンパク質である。研究により、ＣＥＢＰがα−フェトプロテインから発現されるＣＥＢＰノックインマウスでは、ＣＥＢＰの発現の増加により、肝臓の発癌が阻害されることを示した。ＢＡは、ＳＨＰをコードする遺伝子を、そのプロモーター中の機能的なＦＸＲ部位を介して活性化し、そこではＳＨＰがＣＥＢＰαに結合できることを報告した。加えて、主要な肝ＢＡセンサーであるＦＸＲはまた、ＨＣＣの発症においてｐ５３、ＨＮＦ４αおよびＣＥＢＰαなどの腫瘍抑制タンパク質の下方制御を媒介するプロテアソームの小サブユニットであるガンキリンの発現を阻害する。
【０３２１】
コレスチラミンの経口投与により、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αならびにＩ型コラーゲンおよびＧｐｃ３の発現のレベルを有意に減少させ、マウスにおける腫瘍形成を予防することができ、上昇したＢＡレベルの低減、または腸管内のＢＡの炎症促進性および発癌促進性の毒性の中和のための治療努力に新たな推進力を与える。
【０３２２】
これらの結果に基づいて、発明者らは、ＢＡが共同的に機能して、いくつかの機構を介して肝臓の発癌を促進することができたと結論付けた（図２９）。第１の機構は、ＢＡがゆっくりと肝細胞の代謝変換を誘発することである。示された発明者らの結果は、二次ＢＡおよびＴＣＤＣＡが、高グルコースおよび高脂肪の微小環境において正常肝細胞の増殖速度を加速できることを示した。このことは、それらの腫瘍促進作用について十分なエビデンスではない。しかし、発明者らが、広範に報告されてきた二次ＢＡのアポトーシス誘発作用を考慮する場合、過剰量のＢＡへの長期にわたる暴露が、アポトーシスに耐性のある肝細胞の増加および選択的増殖をもたらすことが明白になる。高レベルのＢＡに暴露された肝細胞の継続的な再生により、継続的なアポトーシス細胞の減少、アポトーシスに耐性のある肝細胞の増加、および／または修復されないＤＮＡ損傷を有する細胞をもたらす。
【０３２３】
第２の機構は、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリアの損傷および肝細胞の細胞膜の破壊をもたらし最終的にＲＯＳレベルの上昇、ＲａｓおよびＮＦ−κＢの活性化の機構を介してＨＣＣをもたらし得る酸化ストレスの増大をもたらす、過剰量の肝ＢＡに対する長期間の暴露による、ＢＡに誘発される胆汁うっ滞性の肝損傷である。本発明者らの結果は一括して、ＨＦＤに誘発される肝損傷が、腸管中の二次ＢＡ産生の増加ならびに下方制御されたＢＳＥＰによる肝臓への循環および肝臓中のうっ滞の増加からもたらされたことを示した。
【０３２４】
肝臓中におけるＦＸＲの抗炎症作用の消失は、ＢＡに促進される腫瘍形成の別の機構である。肝ＦＸＲは、炎症促進性の転写因子ＮＦ−κＢの活性化の阻害によって抗炎症活性を発揮する。しかし、このような阻害はまた、双方向的であり、かつＢＡによって媒介される。炎症条件下では、炎症促進性のサイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の増加が、ＦＸＲ−α２の発現を同時に起こるＢＳＥＰの発現の減少により調節し４８、毛細胆管収縮を低下させ、肝細胞におけるＢＡ蓄積をもたらす。他方では、肝ＢＡ濃度の上昇は、ＴＮＦ受容体シグナル伝達およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）／ＪＮＫ経路を活性化するクッパー細胞（肝常在性マクロファージ）からの炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの分泌を刺激することができる。肝臓において活性化されたＮＦ−κＢは、肝ＦＸＲシグナル伝達を阻害し、それによりＳＨＰを下方制御する。Ｆｘｒ−／−Ｓｈｐ−／−マウスは、長期にわたり高いＢＡに暴露されると自然発症的な肝臓腫瘍を発症することが知られている５。
【０３２５】
加えて、本発明者らの結果が示すように、ＢＡにより誘発される腸管におけるＬＰＳ産生の増加もまた、肥満に関連した肝臓の発癌に寄与する重要な因子となり得る。ＬＰＳは、肝損傷の病因における重要な補助因子として意味づけられており、また肝線維症を促進することが示されている。慢性炎症および自己免疫疾患の病因において、調節不全の腸管ＢＡが細菌性ＬＰＳの吸収増加の原因因子であり得５０、それにより生体における全身性炎症を促進している。これらのプロセスはまた、双方向的に調節されており、というのも、ＬＰＳレベルの増加が、細菌性ＬＰＳの腸吸収にさらなる増加をもたらすＢＡ排出および胆汁流の減少に関与するためである。本発明者らの結果は、炎症および酸化ストレスに関与する遺伝子が、コレスチラミン介入後に肝臓中のＢＡ蓄積の減少と相まって減弱されたことを示したが、このことは、改善された肝臓病態を示している。
【０３２６】
まとめると、ＢＡに促進される肝臓の発癌は、複数の機構、複数の代謝器官（肝臓、胆汁、腸および腸内マイクロバイオーム）、ならびに様々なＢＡ種間の共同的な作用が関与する複雑なプロセスである。ＨＦＤに誘発されるかまたは肥満に関連した肝臓の発癌は、肝ＢＡの持続的な高濃度のうっ滞をもたらす変化した腸内細菌叢により媒介され得ることが今や明らかである。
【０３２７】
本実施例は、胆汁酸モジュレーターが、肝疾患状態を有すると診断された対象に対する有用な治療を提供し、かつ進行肝癌および関連病態を予防するか、または遅らせることを実証する。
【０３２８】
実施例２２  さらなるバイオマーカーパネルの発見
最初に、潜在的なバイオマーカーを、単変量解析と多変量解析の両方を使用して評価および選択した。単変量解析は、正規分布変数に対するパラメトリック検定（例えば、スチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡ）、および正規分布に従わなかった変数に対するノンパラメトリック検定（例えば、マン・ホイットニーのＵ検定およびクラスカル−ウォリス検定）を含む。肝線維症の異なるステージを判別するための代謝性バイオマーカーの性能をさらに、部分的最小二乗法（ＰＬＳ）、ピアソン／スピアマン相関、クラスタリング、多重線形／ロジスティック回帰、およびランダムフォレストを使用して評価した。発見された潜在的なバイオマーカーを用いて、本発明における機械学習ツールを開発したが、これはランダムフォレスト（ＲＦ）に基づいており、バイオマーカーの驚くべき組み合わせを得た。タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、７−ケトコール酸（７−ＫＬＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１  ｎ５）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、エライジン酸（Ｃ１８：１  ｎ９ｔ）、エルカ酸（Ｃ２２：１  ｎ９）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４  ｎ−６）／アラキドン酸（Ｃ２０：４  ｎ６）比、リノール酸（Ｃ１８：２  ｎ６）／γ−リノレン酸（Ｃ１８：３  ｎ６）比、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、チロシン、フルクトース、フルクトース／グルコース比を含むバイオマーカーのパネルを実演して、肝線維症に対する、例えば、線維症ステージおよび／または肝硬変を識別する最も強力な階層化能を得た。
【０３２９】
グリココール酸（ＧＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）／パルミトレイン酸（Ｃ１６：１  ｎ７）、チロシン、およびフルクトースを含むバイオマーカーのパネルで構築されたＲＦモデルは、０．９６に等しい曲線下面積（ＡＵＣ）を有する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線に従った３段階の線維症ステージの患者の判別において驚くべき性能を達成した（図３０）。
【０３３０】
ＲＦモデルを使用して、新たな試料のステージの確率を、モデルに与えるこれらの代謝産物変数により予測することができる（図３１）。
【０３３１】
したがって、本実施例で教示されるバイオマーカーパネルは、対象における肝疾患の有力な診断および／または肝線維症ステージを識別する能力を提供する。加えて、バイオマーカーのいずれかを単独でまたは本パネル（もしくは本明細書で教示される他のパネル）の他のバイオマーカーのサブセットと組み合わせて使用して、肝疾患を診断および／または肝線維症ステージを識別することができる。
【０３３２】
本明細書に提供される引用は、引用された主題に関し参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１６Ｋ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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