(57)【要約】  ジスルフィド結合含有タンパク質の製造プロセス中のグルタチオン系成分およびチオレドキシン系成分の存在および／または活性を試験するための方法が開示される。製造プロセス中のジスルフィド結合の還元を緩和するための方法およびジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を低下させるための方法も開示される。タンパク質製造プロセス中のジスルフィド結合含有タンパク質の還元を緩和し、かつジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を低下させるための組成物、キット、および方法が提供される。【選択図】図１
2019521961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の両方の存在下において、対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程を含み、それにより、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の量は、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下で製造されていない細胞培養物または溶液中の無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の量と比較して、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下で製造された前記細胞培養物または溶液中でより多い、方法。
【請求項２】
細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させることは、細胞培養物酸化還元電位のオンライン測定によって制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量の増加は、細胞培養物酸化還元電位の測定によってオンラインで監視される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質を含有する前記培養物およびまたは前記溶液中のグルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の存在を検出する工程と、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素阻害剤を加えて、対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質の還元を緩和する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の活性を決定する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の活性を決定する工程は、
５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、前記製造プロセス中に得られたサンプルに加える工程と、
チオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の少なくとも１つを、ＤＴＮＢを含有する前記サンプルの一部に加える工程と、
前記サンプル中において４１２ｎｍの波長でＤＴＮＢの還元を監視する工程と
を含み、
チオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の少なくとも１つを用いない前記サンプルにおけるＤＴＮＢのより高い還元は、チオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素の活性を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＮＡＤＰＨ、酸化型グルタチオン、および緩衝液は、還元を監視する前に前記サンプルに加えられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とする前記ジスルフィド含有タンパク質の還元電位を低下させるための方法であって、細胞外シスチンレベルを０超に維持する工程、および／または細胞外Ｃｕレベルを０超に維持する工程、および／または前記細胞培養または発酵プロセス中にＥＤＴＡをバイオリアクターに加える工程を含む方法。
【請求項９】
細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とする前記ジスルフィド含有タンパク質の還元電位を低下させるための方法であって、細胞外シスチンレベルを０超に維持する工程、および／または細胞外Ｃｕレベルを０超に維持する工程、および／または対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質を含有する溶液にＥＤＴＡを加える工程を含む方法。
【請求項１０】
対象とする前記無傷のジスルフィド結合含有タンパク質は、細胞培養液（ＣＣＦ）中に放出される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培養または発酵プロセスは、少なくとも２日間、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、または少なくとも１６日間にわたって細胞をＣＣＦ中で維持することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培養プロセスは、哺乳動物または昆虫細胞培養プロセスであり、および前記発酵プロセスは、細菌、酵母、または真菌発酵プロセスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養または発酵プロセス中に前記細胞外シスチンレベルを０超に維持する工程は、対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質におけるジスルフィド結合還元を防ぐ、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質の前記ジスルフィド結合還元の電位は、有効量のシスチンが前記ＣＣＦ中で０超に維持されない細胞培養または発酵プロセスにおいて産生された対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質のジスルフィド結合還元の電位と比べて低下される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質の安定性を改良するための方法であって、対象とする前記タンパク質を、最小の遊離チオールを含む形態に維持する製造プロセスを使用し、それにより、前記製造プロセス中の対象とする前記タンパク質の還元または還元電位を緩和する工程を含む方法。
【請求項１６】
対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質の安定性を改良するための方法であって、製造プロセス中の対象とする前記タンパク質の還元または還元電位を緩和する製造プロセスを使用し、それにより、精製プロセス中の凝集物形成を低下させる工程を含む方法。
【請求項１７】
前記製造プロセスは、細胞培養段階、採取段階、少なくとも１つの保持段階、精製段階、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１５または１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記保持段階は、前記製造プロセス中の前記段階のいずれかにおいて前記材料を貯蔵することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記保持段階は、前記採取段階後かつ前記精製段階前に最大で１日間、少なくとも４日間、少なくとも１週間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月間、または少なくとも３ヶ月間の期間にわたり、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を貯蔵することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象とする前記タンパク質を、最小の遊離チオールを含む形態に維持する工程は、前記製造プロセス全体を通してジスルフィド結合還元を緩和することを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＣＣＦは、前記保持段階中、空気を含むかもしくは含まない気密性袋またはヘッドスペースを有するかもしくは有さない他の容器中において２〜８℃で貯蔵される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象とする前記精製されたジスルフィド結合含有タンパク質の前記遊離チオールは、最小限に抑えられ、それにより、製剤原料段階における対象とする前記タンパク質を安定させる、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ジスルフィド結合還元、および／またはジスルフィド結合還元電位、および／または遊離チオールの最小化は、前記製造プロセス（バイオリアクターおよび採取を含む）のいずれかの工程中、（金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｅ２＋を含む）、シスチン、溶存酸素、βメルカプトエタノール、グルタチオン、またはそれらの組合せを含む酸化還元調節剤を加えることによって）Ｃｕ、シスチン、ＥＤＴＡ、または酸化還元電位を増加させることによって達成される、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、製造プロセス中の金属イオン濃度、シスチン、ベータ−メルカプトエタノール、グルタチオン、溶存酸素濃度、または他の酸化還元調節剤を増加させることにより、対象とする前記ジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、モノクローナル抗体および得られる産物形態の還元に関する。本開示は、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法、ジスルフィド結合含有タンパク質の還元を緩和するための方法、およびジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を緩和するための方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、高い親和性および並外れた特異性で広範囲の標的に結合することが可能である。したがって、ｍＡｂは、癌、感染症、自己免疫および炎症、心血管疾患、および眼科的疾患を含む広範囲の疾患および病態を処置するように良好に設計されている。臨床におけるｍＡｂは、高い成功率によって急成長しており、ますます重要な種類の治療法となっている。これらの生命を救う分子の増加する需要に応じるために、一貫した製品品質を維持しながら抗体力価を増加させるように設計されたｍＡｂの製造プロセスの開発にかなりの労力が投じられている。抗体力価の急速な増加が過去１０年間で達成されており、現行の製造プロセスでは、１０ｇ／Ｌ超のｍＡｂを生成する。
【０００３】
多くのタンパク分子は、適切にフォールディングされ、機能を維持するように、安定した分子間および分子内ジスルフィド結合の形成があって初めて機能する。これらのタンパク分子の例は、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面受容体、リボヌクレアーゼ、ラクトアルブミン、インスリン、ケラチン、赤血球凝集素、ウイルス膜タンパク質、神経内分泌タンパク質７Ｂ２、上皮成長因子、造雄腺ホルモン、ＡＰ−１様転写因子ＹＡＰ１、アセチルコリン受容体、デンドロトキシン、骨形態形成タンパク質２−Ａ、絨毛性ゴナドトロピン、ヒストンＨ３、トロンボスポンジン１、ディスインテグリン・チスタチン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｃｈｉｓｔａｔｉｎ）、ヘビＣ型レクチン（ｓｎａｃｌｅｃ）ボトロセチン、アセチルコリンエステラーゼコラーゲンテイルペプチド、コングルチンδ−２、酸化還元酵素、硫化物デヒドロゲナーゼ、およびリゾチームである。標準的な抗体分子は、４つのペプチド鎖、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。これらの４つのペプチド鎖は、４つの鎖間にジスルフィド結合を形成することにより、機能的抗体分子内で一緒に適切にフォールディングされる。抗体分子のペプチド鎖内に形成されるジスルフィド結合の数は、抗体サブタイプに応じて変化する。
【０００４】
ジスルフィド結合含有タンパク質を内部で固定するジスルフィド結合の還元は、製造中に起こり得る。この問題は、早くも２０１０年に免疫グロブリンの製造について報告され、その後、業界全体で観察されている（Ｈｕｔｔｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ｍＡｂｓ，５：６０８−６１３；およびＫａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０７：６２２−６３２）。鎖間ジスルフィド結合の還元は、機能的抗体の損失をもたらし、不活性な副産物を除去するためのより複雑な精製プロセスを必要とする（Ｍｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１２（４）：７３４−７４２）。ｍＡｂプロセス開発中、断片および凝集物は、増加した免疫原性および薬効に対する未知の影響に関連するそれらのリスクのため、適切なレベルまで除去された。さらに、これらの不純物の存在は、貯蔵中の製品の安定性にも影響を与え、保存期間の減少につながり得る。
【０００５】
タンパク質またはポリペプチドの断片化は、製品の不安定性（Ｃｏｒｄｏｂａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ．，８１８（２）：１１５−２１）または細胞内に存在する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）によるタンパク質分解活性（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８（４）：９７７−９８２）のいずれかに起因し得る一方、凝集は、細胞培養、採取、精製、凍結融解、バイアル充填（ｖｉａｌｉｎｇ）および貯蔵中など、製造プロセス中またはその後の様々な工程で起こり得る。これらの製品品質特性の両方を改善するための複数の手法は、プロセス開発中に実施されることが多い。これらとしては、細胞培養中の断片化または凝集物形成を防ぐようにバイオリアクター条件を最適化すること；細胞溶解を最小限に抑えるように採取条件を最適化すること（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５（３）：４８３−４９１）；対象とする製品から不純物を分離するための精製プロセス（例えば、イオン交換、疎水性相互作用、および混合モード）にクロマトグラフィーポリシング工程を組み込むこと；および分子の保存期間中の凝集および断片化を最小限に抑えるための製剤開発中の賦形剤スクリーニングが挙げられる。
【０００６】
冷却し、酸化的貯蔵環境を提供し、より短い期間にわたって保持し、少なくとも１つの還元阻害剤を加えることを含む様々な手法が製造プロセス中に抗体還元を緩和するのに使用されてきた。過去の報告は、細胞培養物タンパク質製造プロセスにおいて起こる還元がチオレドキシン系のみに起因するものと見なしていた。これらの研究は、チオレドキシン系に対してもはや特異的でない濃度でチオレドキシン系の阻害剤を使用した（Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０７：６２２−６３２；Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、米国特許第８，５７４，８６９号明細書）。チオレドキシン系に対してもはや特異的でない濃度でチオレドキシン系の阻害剤を使用することにより、Ｋａｏらは、細胞培養物製造プロセスにおいて起こる還元がチオレドキシン系のみに起因するものと見なし、抗体の還元においてグルタチオン還元酵素系が役割を果たさないことについて言及した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ジスルフィド結合含有タンパク質の製造または貯蔵中のジスルフィド結合の還元を回避することが必要とされている。製造中のジスルフィド結合含有タンパク質の還元の回避により、その保存期間を通して無傷のタンパク質の安定性を増加させることができる。したがって、ジスルフィド結合の還元を回避し、その保存期間を通して無傷のタンパク質の安定性を増加させることができるジスルフィド結合含有タンパク質のための製造プロセスを開発することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、その保存期間を通して無傷のタンパク質の安定性を増加させるために、ジスルフィド結合含有タンパク質におけるジスルフィド結合の還元を防ぐための方法に関する。この方法は、ジスルフィド結合含有タンパク質の還元を緩和することにより、または製造プロセス中のジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を緩和することにより、精製されたジスルフィド結合含有タンパク質の安定性を改善する。
【０００９】
一実施形態において、本開示は、細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の両方の存在下において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程を含み、それにより、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の量は、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下で製造された細胞培養物または溶液でより多い、方法に関する。
【００１０】
特定の実施形態において、本開示は、製造プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を含有する培養物およびまたは溶液中のグルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素を検出する工程と、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素阻害剤を加えて、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元を緩和する工程とを含む方法に関する。特定の実施形態において、本開示は、検出されたグルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の活性を決定する工程をさらに含む方法に関する。さらなる実施形態において、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の活性を決定する工程は、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、製造プロセス中に得られたサンプルに加える工程と、チオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の少なくとも１つを、ＤＴＮＢを含有するサンプルの一部に加える工程と、サンプル中において４１２ｎｍの波長でＤＴＮＢの還元を監視する工程とを含み、チオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の少なくとも１つを用いないサンプルにおけるＤＴＮＢのより高い還元は、チオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素の活性を示す。特定の実施形態において、ＮＡＤＰＨ、酸化型グルタチオン、および緩衝液は、還元を監視する前にサンプルに加えられる。
【００１１】
一実施形態において、本開示は、プロセス中、細胞外シスチンレベルを０超に維持することにより、細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とするジスルフィド含有タンパク質の還元電位を低下させるための方法に関する。特定の態様において、対象とする無傷のタンパク質は、細胞培養液（ＣＣＦ）中に放出される。特定の態様において、このプロセスは、少なくとも２日間、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、または少なくとも１６日間にわたって細胞をＣＣＦ中で維持することを含む。
【００１２】
本開示の特定の態様において、細胞培養プロセスは、哺乳動物または昆虫細胞培養プロセスであり、および発酵プロセスは、細菌、酵母、または真菌発酵プロセスである。開示される方法の特定の態様において、シスチンレベルは、ジスルフィド結合還元を防ぐために、細胞培養または発酵プロセス中に０超に維持される。特定の態様において、開示される方法において、ジスルフィド結合還元の電位は、有効量のシスチンがＣＣＦ中で０超に維持されないプロセスと比べて低下される。
【００１３】
一実施形態において、本開示は、対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質の安定性を改良するための方法であって、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を、最小の遊離チオールを含む形態に維持する製造プロセスを使用し、それにより、製造プロセス中の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元または還元電位を緩和する工程を含む方法に関する。本開示のある実施形態において、製造プロセスは、細胞培養段階、採取段階、少なくとも１つの保持段階、精製段階、またはそれらの任意の組合せを含む。本開示のある実施形態において、保持段階は、製造プロセス中の段階のいずれかにおいて材料を貯蔵することを含む。本開示のある実施形態において、保持段階は、採取段階後かつ精製段階前に最大で１時間、最大で１日間、少なくとも４日間、少なくとも１週間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月間、または少なくとも３ヶ月間の期間にわたり、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を貯蔵することを含む。本開示のある実施形態において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質中の遊離チオールを最小限に抑える工程は、製造プロセス全体を通してジスルフィド結合還元を緩和することを含む。本開示のある実施形態において、ＨＣＣＦは、保持段階中、気密性袋中において２〜８℃で貯蔵される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】チオレドキシン系およびグルタチオン系の酵素および化学中間体を現す概略図である。Ｔｒｘは、チオレドキシンであり、ＧＳＨは、還元型グルタチオンであり、ＧＳＳＧは、酸化型グルタチオンであり、Ｌは、免疫グロブリン軽鎖であり、Ｈは、免疫グロブリン重鎖であり、ＮＡＤＰＨ、は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である。
【図２Ａ−２Ｂ】細胞培養物における還元である。図２Ａは、キャピラリー電気泳動を用いて評価した、ｍＡｂ  Ａ（菱形）、ｍＡｂ  Ｂ（四角形）、およびｍＡｂ  Ｃ（三角形）の小規模生産反応器からの上清サンプル中の無傷の（非還元）抗体パーセントの時間的経過を示す。図２Ｂは、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の還元に基づいた比色分析を用いて測定される、同じ小規模反応器からのサンプルにおいて測定される総還元酵素活性の時間的経過を示す。データは、３連の実験の平均±ＳＤを表す。
【図３Ａ−３Ｂ】ＤＴＮＢの還元に基づいた比色分析を用いて測定した際の、還元酵素活性に対する特異的還元酵素阻害剤の影響である。図３Ａ：組み換えＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１（黒色のバー）、ＧＲ／ＧＳＳＧ（灰色のバー）、またはＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１およびＧＲ／ＧＳＳＧ（斜線のバー）の溶液へのアウロチオグルコース（ＡＴＧ）、チオレドキシン還元酵素阻害剤の添加である。図３Ｂ：組み換えＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１（黒色のバー）、ＧＲ／ＧＳＳＧ（灰色のバー）、またはＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１およびＧＲ／ＧＳＳＧ（斜線のバー）の溶液への２−アセチルアミノ−３−［４−（２−アセチルアミノ−２−カルボキシエチルスルファニルチオカルボニル−アミノ）フェニルチオカルバモイルスルファニル］プロピオン酸（２−ＡＡＰＡ）、グルタチオン還元酵素阻害剤の添加である。データは、３連の実験の平均±ＳＤを表す。
【図４Ａ−４Ｂ】抗体の還元に対する特異的還元酵素阻害剤の影響である。図４Ａ：増加する濃度のＡＴＧを、精製されたｍＡｂ  ＢおよびＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１（黒色のバー）またはＧＲ／ＧＳＳＧ（灰色のバー）の溶液に加え、室温で一晩インキュベートした後に得られる無傷の（非還元）抗体のパーセントである。図４Ｂ：増加した濃度のＣｕ２＋を、精製されたｍＡｂ  ＢおよびＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１（黒色のバー）またはＧＲ／ＧＳＳＧ（灰色のバー）の溶液に加え、室温で一晩インキュベートした後の無傷の（非還元）抗体のパーセントである。データは、２連の実験の平均±ＳＤを表す。
【図５Ａ−５Ｂ】同定された阻害剤に対するＣＨＯ還元酵素の感受性である。図５Ａ：阻害剤なし（黒色のバー）；０．５μＭのＡＴＧ（灰色のバー）；１００μＭの２−ＡＡＰＡ（斜線のバー）；ならびに０．５μＭのＡＴＧおよび１００μＭの２−ＡＡＰＡの両方（白色のバー）を用いて評価される収集された画分のＴｒｘＲ１およびＧＲ還元酵素活性である。図５Ｂ：活性ＴｒｘＲ１およびＧＲ、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍＭのＧＳＳＧ、３μＭのＣｕ２＋、Ｔｒｘ１、および１００μＭのＡＴＧのプールされた画分の様々な組合せを用いた一晩のインキュベーション後の総合した無傷のｍＡｂ  Ｂのパーセントである。データは、２連の実験の平均±ＳＤを表す。
【図６Ａ−６Ｂ】チオレドキシンおよびグルタチオン系の細胞培養物活性である。図６Ａ：０．５μＭのＡＴＧ、１００μＭの２−ＡＡＰＡ、ならびに０．５μＭのＡＴＧおよび１００μＭの２−ＡＡＰＡの両方の存在下におけるｍＡｂ  Ａ（黒色のバー）、ｍＡｂ  Ｂ（灰色のバー）、ｍＡｂ  Ｃ（斜線のバー）、およびｍＡｂ  Ｄ（白色のバー）の小規模生産反応器からの１４日目のサンプルの還元酵素活性である。図６Ｂ：ｍＡｂ  Ａ（黒色のバー）、ｍＡｂ  Ｂ（灰色のバー）、ｍＡｂ  Ｃ（斜線のバー）、およびｍＡｂ  Ｄ（白色のバー）の小規模生産反応器からの１４日目のサンプルからのサンプルにおける総ＴｒｘまたはＧＲ還元酵素活性のパーセントである。データは、３連の実験の平均±ＳＤを表す。
【図７】０．１ｍＭのＡＴＧ、３μＭのＣｕ２＋、ならびに０．１ｍＭのＡＴＧおよび３μＭのＣｕ２＋の両方が添加されたｍＡｂ  Ａ（黒色のバー）、ｍＡｂ  Ｂ（灰色のバー）、ｍＡｂ  Ｃ（斜線のバー）、およびｍＡｂ  Ｄ（薄灰色のバー）の小規模バイオリアクターからの１４日目の細胞培養サンプル中に残っている無傷の（非還元）抗体のパーセントである。データは、２連の実験の平均±ＳＤを表す。
【図８】超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）アミノ酸分析を用いて測定される、生産バイオリアクター試験ＢＲ−Ａ、ＢＲ−Ｂ、ＢＲ−Ｃ、およびＢＲ−Ｄにおけるシステイン／シスチン濃度の時間的経過である。
【図９】無傷のｍＡｂ  Ｂ（ＬＨＨＬ）（図９Ａ）および無傷のｍＡｂ  Ａ（ＬＨＨＬ）（図９Ｂ）の量を非精製細胞培養サンプルからのキャピラリー電気泳動によって測定した。無傷の抗体の量は、これらを非精製細胞培養サンプルにおいて測定した際、１００％を決して超えないことに留意されたい。黒色の破線で示される閾値細胞培養物酸化還元電位を超えて、鎖間ジスルフィド結合の最小の還元がある。図９における条件は、以下の最終濃度（採取時）：０．６〜１９．６ＰＰＭの範囲のＺｎ２＋濃度、０．００７〜５．５ｐｐｍの範囲のＭｎ２＋濃度、０．１２〜４．２ｐｐｍの範囲のＦｅ３＋濃度、０．００６〜７．９ｐｐｍの範囲のＳｅ２＋濃度、０．３〜６．４ｐｐｍの範囲のＣｕ２＋濃度、約０〜３．５ｍＭの範囲のシスチン濃度、空気飽和の２０〜７５％の範囲の溶存酸素濃度、８３〜２０６μＭの範囲のβメルカプトエタノール濃度、および１〜７５０μＭの範囲のグルタチオン濃度を有していた。
【図１０】増加した栄養供給を用いた（ＢＲ−Ｊ２）および用いないＢＲ−Ｊ１）条件についてＵＰＬＣ−アミノ酸分析によって測定されるバイオリアクターシスチン濃度の時間的経過である。
【図１１】増加した栄養供給を用いた（ＢＲ−Ｋ−２）および用いない（ＢＲ−Ｋ−１）条件についてＢＲ−ＫバイオリアクターのＵＰＬＣ−アミノ酸分析によって測定されるシスチン濃度の時間的経過である。
【図１２Ａ−１２Ｃ】採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）（図１２Ａ）；捕捉産物（図１２Ｂ）；および最終ポリシング（Ｆｉｎａｌ  ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）産物（図１１Ｃ）の非還元型ＧＸ（ＮＲ−ＧＸ）電気泳動図である。灰色のトレース：参照標準；黒色のトレース：サンプル。
【図１３】還元が起こった分子の位置において、シスチンの非存在下、または２ｍＭのシスチン、および４ｍＭのシスチンの存在下において、２週間にわたって保持されたＨＣＣＦの質量分析定量化から得られる遊離チオールのパーセントである。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ｐＨを変化させた、遊離チオールおよび凝集の比率の変化である。図１４Ａ：ＨＣＣＦがｐＨ３．２、ｐＨ３．４、およびｐＨ３．６でインキュベートされるときの、時間に経過による遊離チオール対ＩｇＧ濃度の比率の変化である。図１４Ｂ：ＨＣＣＦがｐＨ３．２、ｐＨ３．４、およびｐＨ３．６でインキュベートされるときの、時間に経過による凝集物の変化である。
【図１５】シスチンなし（０ｍＭ）および４ｍＭのシスチンの存在下で２週間の保持にわたるＨＣＣＦの質量分析定量化によって得られる鎖間遊離チオールレベルのパーセントである。
【図１６】シスチンなし（０ｍＭ）および４ｍＭのシスチンの存在下において、直ちに精製されるか、または２週間にわたって保持されたＨＣＣＦから生成された精製プロセス中間体のＤＮＴＢ定量化によって得られる遊離チオールレベルである。
【図１７−１】図１７Ａ−１７Ｃ。ＨＣＣＦから生成された製剤化バルク製品についての、時間の経過による凝集物レベルパーセントの変化である。図１７Ａ：シスチンの非存在下（０ｍＭ）または４ｍＭのシスチンの存在下において、２週間にわたって２〜８℃で保持されたＨＣＣＦから生成された製剤化バルク製品である。図１７Ｂ：シスチンの非存在下（０ｍＭ）または４ｍＭのシスチンの存在下において、２週間にわたって２５℃で保持されたＨＣＣＦから生成された製剤化バルク製品である。図１７Ｃ：シスチンの非存在下（０ｍＭ）または４ｍＭのシスチンの存在下において、２週間にわたって４０℃で保持されたＨＣＣＦから生成された製剤化バルク製品である。
【図１７−２】図１７−１の続きである。
【図１８Ａ−１８Ｃ】ＢＲＸ−Ｌ−１（図１８Ａ）、ＢＲＸ−Ｌ−２（図１８Ｂ）ＢＲＸ−Ｌ−３（図１８Ｃ）から精製されたプロテインＡ捕捉産物の非還元型ＧＸ（ＮＲ−ＧＸ）電気泳動図である。
【図１９】１４日間の流加プロセスから生成されたｍＡｂ  Ａ製剤原料の、２〜８℃における凝集物パーセントの時間的経過である。
【図２０】１４日間または８日間の流加プロセスから生成されたｍＡｂ  Ａ製剤原料の、２〜８℃における凝集物パーセントの時間的経過である。
【図２１Ａ−２１Ｃ】還元電位分析にかけられた試験細胞培養サンプルの末端の非還元型（ＮＲ）ＧＸＩＩ分析からの電気泳動図である。図２１Ａ：１４日間の流加プロセスからの細胞培養サンプルである。図２１Ｂ：８日間の流加プロセスからの細胞培養サンプルである。図２１Ｃ：追加の銅およびシスチンを用いた１４日間の流加プロセスからの細胞培養サンプルである。Ｌ＝軽鎖；Ｈ＝重鎖。
【図２２】原料中に追加の銅およびシスチンを含むおよび含まない培養物からのｍＡｂ  Ａ製剤原料の、２〜８℃における凝集物パーセントの時間的経過である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」実体という用語がその実体の１つまたは複数を指すことが留意される。例えば、「結合分子」は、１つまたは複数の結合分子を表すことが理解される。したがって、「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において同義的に使用され得る。
【００１６】
さらに、本明細書において使用される場合の「および／または」は、他方を伴うかまたは伴わない、２つの特定された特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書における「Ａおよび／またはＢ」などの語句に使用される際のおよび／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句に使用される際の「および／または」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含することが意図される：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
【００１７】
特に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１８】
単位、接頭語、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）承認形態で示される。数値範囲は、範囲を定義する数値の両端を含む。本明細書に示される見出しは、様々な態様または本開示の態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照することによって得られる。したがって、直後に定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってより詳細に定義される。
【００１９】
本明細書において使用される際、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、単数の「ポリペプチド」または「タンパク質」、ならびに複数の「ポリペプチド」、または「タンパク質」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線形に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、２つ以上のアミノ酸のいずれか１つまたは複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指さず、本明細書において同義的に使用される。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すのに使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」、または「タンパク質」の定義の範囲内に含まれ、これらの用語は、これらの用語のいずれかの代わりにまたはこれらの用語のいずれかと同義的に使用され得る。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、および公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解、または非天然アミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドまたはタンパク質の発現後修飾の産物を指すことも意図される。ポリペプチドまたはタンパク質は、生物源に由来するか、または組み換え技術によって産生され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。
【００２０】
本明細書において使用される際、「対象とするタンパク質」および「対象とするジスルフィド結合含有タンパク質」という用語は、同義的に使用され、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むタンパク質を指す。「対象とするタンパク質」という用語は、タンパク質の活性形態、例えば商業および／または治療目的を達成し得る、タンパク質の適切にフォールディングされた適切に組み立てられた形態を指す。「対象とするタンパク質」は、本明細書において提供される方法に従って製造され得る。対象とするタンパク質は、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片またはデコイ受容体タンパク質などの治療用タンパク質であり得る。対象とするタンパク質の「収量を増加させること」は、例えば、その無傷の適切にフォールディングされた適切に組み立てられた形態のタンパク質のより高い割合を維持することにより、商業および／または治療目的を達成し得る無傷の適切にフォールディングされたタンパク質の量を増加させることを意味する。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸ならびに複数の核酸を包含することが意図され、単離された核酸分子または構築物、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるものなどのアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、いずれか１つまたは複数の核酸セグメント、例えばポリヌクレオチドに存在するＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「核酸配列」は、前述の核酸に見られるヌクレオチドの配列である。
【００２２】
「単離」された核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から分離された核酸またはポリヌクレオチドの意図される任意の形態である。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチド、またはベクターに含まれるポリペプチドもしくはタンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドが「単離」されていると見なされ得る。また、クローニングのための制限部位を有するように操作されたポリヌクレオチドセグメント、例えばＰＣＲ産物が「単離」されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、緩衝液または生理食塩水などの非天然の溶液中の異種宿主細胞または（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチド中で維持された組み換えポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられ、ここで、転写産物は、自然界に見られ得るものでない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、合成的に産生されるこのような分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネータなどの調節要素であり得るか、またはそれらを含み得る。
【００２３】
本明細書において使用される際、「非天然ポリヌクレオチド」という用語またはその任意の文法的活用形は、「天然」であるか、または「天然」であり得るか、裁判官、または行政もしくは裁判機関によって「天然」であると決定または解釈される核酸またはポリヌクレオチドの形態を明確に除外するが、ただし限定的に除外する条件付きの定義である。
【００２４】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同義的に使用され得る。抗体（または本明細書に開示されるその断片、変異体、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変ドメイン（ラクダ類の場合）または少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系統における基礎免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。特に記載しない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さい抗原結合断片から完全サイズの抗体、二重特異的抗体、融合タンパク質、および抗体薬物複合体までの範囲のものをいずれも包含する。完全サイズの抗体は、２つの完全な重（Ｈ）鎖および２つの完全な軽（Ｌ）鎖を含むＩｇＧ抗体、４つの完全な重鎖および４つの完全な軽鎖を含み、任意選択的に、Ｊ鎖および／または分泌成分を含むＩｇＡ抗体、または１０もしくは１２の完全な重鎖および１０もしくは１２の完全な軽鎖を含み、任意選択的に、Ｊ鎖を含むＩｇＭ抗体であり得る。
【００２５】
本明細書に開示される「断片」という用語は、任意の抗体還元種を含む。無傷の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖（ＬＨＨＬ）を有し；抗体断片は、２つの重鎖および１つの軽鎖（ＬＨＨ）；または２つの重鎖（ＨＨ）；または１つの軽鎖および１つの重鎖（ＬＨ）；または１つの重鎖（Ｈ）；または１つの軽鎖（Ｌ）を有し得る。
【００２６】
以下により詳細に記載されるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別され得る様々な広い種類のポリペプチドまたはタンパク質を含む。当業者は、免疫グロブリン重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、ベータ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）およびその中のいくつかのサブクラス（例えば、γ１−γ４またはα１−α２））として分類されることを理解するであろう。抗体の「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定するのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（サブタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などは、十分に特徴付けられており、機能的分化を付与することが知られている。これらの免疫グロブリンのそれぞれの修飾形態は、本開示を考慮して当業者に容易に認識されるため、本開示の範囲内である。
【００２７】
免疫グロブリン軽鎖は、カッパまたはラムダ（κまたはλ）のいずれかとして分類される。各免疫グロブリン重鎖クラスは、共有ジスルフィド結合によってカッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合され得る。一般に、軽鎖および重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに共通結合され、２つの重鎖の「テイル」部分は、免疫グロブリンが例えばハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって発現される場合、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ配置の分岐末端におけるＮ末端から各鎖の底部におけるＣ末端まで延びている。特定の抗体、例えばＩｇＧ抗体の基本構造は、本明細書において「Ｈ２Ｌ２」または「ＬＨＨＬ」構造、または「結合ユニット」とも呼ばれる、「Ｙ」構造を形成するようにジスルフィド結合を介して共有結合された２つの重鎖サブユニットおよび２つの軽鎖サブユニットを含む。
【００２８】
「原子価」、「二価」、「多価」という用語および文法的に均等な語は、所与の結合分子または結合ユニットにおける結合ドメインの数を指す。したがって、所与の結合分子、例えばＩｇＭ抗体またはその断片に関する「二価」、「四価」、および「六価」という用語は、それぞれ２つの結合ドメイン、４つの結合ドメイン、および６つの結合ドメインの存在を示す。二価または多価結合分子は、単一特異的であり得、すなわち結合ドメインの全てが同じであり、または二重特異的または多特異的であり得、例えば、２つ以上の結合ドメインが異なる場合、例えば同じ抗原上の異なるエピトープに結合するか、または完全に異なる抗原に結合する。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合が可能な任意の分子決定因子を含む。特定の態様において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、特定の態様において、三次元構造特性およびまたは比電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体によって結合される標的の領域である。
【００３０】
軽および重免疫グロブリン鎖の両方が構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）部分の両方の可変ドメインが抗原認識および特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの番号付けは、抗原結合部位または抗体のアミノ末端からより離れるにつれて増加する。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ末端部分において、定常領域であり；ＣＨ３（またはＩｇＭの場合にはＣＨ４）およびＣＬドメインは、実際に、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【００３１】
抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体としては、限定はされないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィドが結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片が挙げられる。
【００３２】
「特異的に結合する」とは、一般に、抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を伴うことを意味する。この定義に従い、抗体またはその抗原結合断片が、それがランダムな無関係のエピトープに結合し得るより容易に、それがその抗原結合ドメインを介して該当するエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、本明細書において、特定の結合分子が特定のエピトープに結合する相対的親和性を特定するのに使用される。例えば、結合分子「Ａ」が、結合分子「Ｂ」より所与のエピトープに対して高い特異性を有すると見なすことができ、または結合分子「Ａ」が、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有するより高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【００３３】
一本鎖抗体または他の結合ドメインを含む抗体断片は、単独でまたは以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分の１つまたは複数を組み合わせて存在し得る。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分の１つまたは複数との任意の組合せを含み得る抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば抗体またはその抗原結合断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源に由来し得る。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であり得る。別の態様において、可変領域は、起源（例えば、サメ由来）中で軟骨性であり得る。本明細書において使用される際、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーからまたは１つまたは複数のヒト免疫グロブリン導入動物から単離された抗体を含み、ある場合には内因性免疫グロブリンを発現し、ある場合には発現しないことがある。
【００３４】
本明細書において使用される際、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上側、中間、および／または下側ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはその変異体もしくは断片の少なくとも１つを含み得る。例えば、結合分子、例えば抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、限定はされないが、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ１ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、およびＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、およびＣＨ３ドメイン；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含み得る。特定の態様において、結合分子、例えば抗体またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン；またはＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、およびＪ鎖を含み得る。さらに、本開示に使用するための結合分子は、特定の定常領域部分、例えばＣＨ２ドメインの全てまたは部分を欠き得る。これらのドメイン（例えば、重鎖サブユニット）は、それらがアミノ酸配列中で元の免疫グロブリン分子から変化するように修飾され得ることが当業者によって理解されるであろう。
【００３５】
本明細書において使用される際、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、少なくともＶＬを含み、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）ドメインをさらに含み得る。
【００３６】
前述されるように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元配置は周知である。本明細書において使用される際、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており、典型的なＩｇＧ重鎖分子のヒンジ領域に対するアミノ末端である。
【００３７】
「製造プロセス」という用語は、培養物中で細胞、例えば組み換え細胞を成長させ、使用に適切な形態の培養された細胞によって産生される対象とするタンパク質を得るのに使用される技術を含む。製造プロセスは、限定はされないが、以下の１つまたは複数を含む様々な工程を含み得る：対象とする遺伝子を宿主細胞に挿入して、操作された宿主細胞を産生し、宿主細胞を培養して、いくつかの細胞を膨張させ、宿主細胞による対象とするタンパク質の発現を誘導し、対象とするタンパク質を発現する宿主細胞をスクリーニングし、例えば対象とするタンパク質を、培養された細胞および細胞培地から分離することにより、対象とするタンパク質を採取し、および／または対象とするタンパク質を精製する工程。対象とするタンパク質は、天然細胞によって発現される内因性タンパク質、または（一過性にまたは安定的に）細胞に挿入された発現ベクターにおいてコードされる組み換え異種タンパク質であり得る。
【００３８】
本明細書において使用される際、「操作された」という用語は、合成手段による（例えば、組み換え技術、インビトロペプチド合成によるか、ペプチドの酵素もしくは化学カップリングまたはこれらの技術のある組合せによる）核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００３９】
本明細書において使用される際の「発現」という用語は、遺伝子が、生化学物質（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、例えばポリペプチドまたはタンパク質を産生するプロセスを指す。このプロセスは、限定はされないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の発現を含む。それとしては、限定はされないが、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写、およびポリペプチドまたはタンパク質へのこのようなｍＲＮＡの翻訳が挙げられる。最終生成物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の生成を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用される際、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドもしくはタンパク質のいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物は、転写後修飾、例えばポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質分解などを有するポリペプチドおよびタンパク質をさらに含む。
【００４０】
本明細書において使用される際、「ジスルフィド結合」、または「ジスルフィド架橋」、または「Ｓ−Ｓ結合」という用語は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とのジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。第２のチオール基は、同じポリペプチドもしくはタンパク質（ジスルフィド内結合）、または異なるポリペプチドもしくはタンパク質（ジスルフィド間結合）における残基の側鎖に見られる。このような結合は、タンパク質生合成中および／またはスルフヒドリル基の酸化、酸化的タンパク質フォールディングと呼ばれるプロセスによって形成される。
【００４１】
「ジスルフィド結合含有タンパク質」および「ジスルフィド結合含有タンパク質」という用語は、本明細書において同義的に使用され、その適切にフォールディングされた状態で１つまたは複数のジスルフィド架橋を含むタンパク質を指す。ジスルフィド結合含有タンパク質は、分子間または分子内であるジスルフィド結合を有し得る。このような分子間または分子内ジスルフィド結合は、適切にフォールディングされたジスルフィド結合含有タンパク質中に存在する。ジスルフィド結合含有タンパク質の活性は、ジスルフィド結合の存在および還元状態に依存し得る。免疫グロブリンおよび免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面受容体、リボヌクレアーゼ、ラクトアルブミン、インスリン、ケラチン、赤血球凝集素、ウイルス膜タンパク質、神経内分泌タンパク質７Ｂ２、上皮成長因子（ＥＧＦ）、造雄腺ホルモン、硫化物デヒドロゲナーゼ、およびリゾチームなどの多くの分子は、適切なフォールディングに寄与する安定した分子間および分子内ジスルフィド結合の形成により最良に機能する。抗体、ＥＧＦ、およびインスリンなどの多くの治療用タンパク質は、ジスルフィド結合を含む。ジスルフィド結合還元を増加させる条件下で対象とする治療用タンパク質を製造することにより、対象とする無傷のタンパク質の低い収量が得られる。本明細書に記載されるように、「収量」という用語は、無傷で、活性で、適切にフォールディングされており、ジスルフィド結合の適切な対合を有する、得られる対象とするタンパク質の量を指す。プロセスは、高い全体量の対象とするタンパク質を産生し得るが、ジスルフィド結合のかなりの還元が対象とするタンパク質において起こる場合、無傷のタンパク質の収量は、低くなり得る。
【００４２】
「還元タンパク質」という用語は、システインなど、タンパク質構造中の還元性残基を還元するのに十分な還元条件に曝されたタンパク質を意味する。還元タンパク質がチオール基または硫黄含有残基を含む場合、還元タンパク質中のチオール基は、それが還元された状態で存在する。例えば、システイン残基を含む還元タンパク質は、「−ＳＨ」として示されることが多い、システイン残基の硫黄原子が還元状態にある状態で存在する。還元タンパク質は、ジスルフィド結合含有タンパク質であり得る。ジスルフィド結合含有タンパク質は、ジスルフィド結合含有タンパク質の不安定化およびジスルフィド結合含有タンパク質の活性または機能の潜在的低下に寄与し得る、ジスルフィド結合含有タンパク質中の１つまたは複数のジスルフィド結合（ジスルフィド架橋）を切断させる還元条件への曝露によって還元タンパク質になり得る。
【００４３】
「酸化タンパク質」という用語は、タンパク質構造中の酸化性部分を酸化させるのに十分な酸化条件に曝されたタンパク質を意味する。酸化タンパク質がチオール基または硫黄含有側鎖を含む場合、酸化タンパク質中のチオール基は、それが酸化された状態で存在する。酸化タンパク質は、ジスルフィド結合含有タンパク質であり得る。ジスルフィド結合含有タンパク質は、ジスルフィド結合含有タンパク質中の１つまたは複数のジスルフィド結合（ジスルフィド架橋）を形成させる酸化条件への曝露によって酸化タンパク質になり得る。タンパク質製造中の酸化条件は、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の安定化に寄与し得、適切なフォールディングに寄与し得、ジスルフィド結合含有タンパク質の活性または機能の保持に寄与し得、それにより、製造プロセス中、対象とするタンパク質の収量を増加させることができる。
【００４４】
「適切にフォールディングされた」または「無傷のタンパク質」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの天然立体配座または天然状態を意味し、これは、その意図される最適な野生型活性を有するタンパク質またはポリペプチドを提供する三次構造を有する。タンパク質生化学物質またはポリペプチドは、生合成中またはその後、フォールディングされてその適切な三次構造になる。タンパク質のミスフォールディングは、機能不全または非機能的タンパク質またはポリペプチドをもたらす。適切なフォールディングをもたらす適切な三次構造は、タンパク質またはポリペプチドの三次構造を安定させるのに役立つ分子間および分子内ジスルフィド結合の形成を含む多くの要因によって制御される。したがって、適切にフォールディングされたタンパク質は、天然形態のタンパク質またはポリペプチドに通常見られるジスルフィド結合を有するものである。
【００４５】
「還元電位」という用語は、発現、精製、製剤化および／または包装後のタンパク質の製造プロセス中または貯蔵時間もしくは「保存期間」中の任意の時点で還元を行う対象とする適切にフォールディングされたジスルフィド結合含有タンパク質の傾向を指す。任意の時点における還元電位は、所望の時点で得られたタンパク質サンプルを、酸素の非存在下において、対象とするジスルフィド含有タンパク質の還元を誘導するように、所与の期間（例えば、１時間の一部、１時間、１日の一部（８時間、１０時間、または１２時間など）、１日、２日、３６時間、またはそれを超えて）にわたって真空下で貯蔵することによって測定され得る。次に、サンプルは、非還元条件下でタンパク質断片を分離するように、例えばバイオアナライザを用いて断片化について分析される。
【００４６】
「ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸアッセイ」および「ＧＸアッセイ」は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  ＩＩ機器およびソフトウェアを用いて抗体および抗体断片を視覚化するように使用されるアッセイに関する。
【００４７】
「チオレドキシン系」という用語は、酵素チオレドキシン還元酵素−１（ＴｒｘＲ１）、およびチオレドキシン−１（Ｔｒｘ−１）、および補因子ＮＡＤＰＨを意味する。これらの３つの構成要素は、細胞増殖、酸化防止剤防御、および酸化還元シグナル伝達を含む真核細胞機能に必要ないくつかのプロセスを支援するチオレドキシン系を構成する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，６６：７５−８７）。
【００４８】
「グルタチオン系」という用語は、構成要素グルタチオン、グルタチオン還元酵素（ＧＲ）、グルタレドキシン（Ｇｒｘ）、および補因子ＮＡＤＰＨを意味する（Ｌｉｌｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｇｅｎ．Ｓｕｂｊ．，１７８０：１３０４−１３１７）。
【００４９】
グルタチオン系およびチオレドキシン系は、総称的におよび代替的に、本明細書において「還元酵素系」または「還元酵素系」と呼ばれる。すなわち、「還元酵素系」という用語は、グルタチオン系および／またはチオレドキシン系の両方を包含する。
【００５０】
特異的阻害剤は、還元酵素などの他の無関係の酵素を除いて、標的酵素の活性を低下させるかまたは完全になくす薬剤である。例えば、グルタチオン還元酵素の特異的阻害剤は、グルタチオン還元酵素を主にまたはそれのみを阻害する阻害剤である。チオレドキシン還元酵素の特異的阻害剤は、チオレドキシン還元酵素を主にまたはそれのみを阻害する阻害剤である。チオレドキシン還元酵素特異的阻害剤は、グルタチオン還元酵素を阻害する効果がない。同様に、グルタチオン還元酵素特異的阻害剤は、チオレドキシン還元酵素を阻害する効果がない。非特異的阻害剤は、複数の酵素の活性を低下させるかまたはなくす薬剤である。すなわち、非特異的阻害剤は、無差別であり、グルタチオン還元酵素およびチオレドキシン還元酵素の両方などの複数の異なる酵素の活性を低下させるかまたはなくすことができる。
【００５１】
間接的阻害剤は、標的酵素自体以外の成分に作用することによって標的酵素の活性を低下させるかまたはなくす阻害剤である。例えば、間接的阻害剤は、標的酵素の上流の基質、標的酵素の基質を産生する上流の酵素に作用し、または標的酵素の補因子に結合し、標的酵素の補因子をアクセスから隔離または引き離し、それにより、標的酵素の活性を低下させるかまたはなくすことができる。
【００５２】
製造プロセスにおける対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を産生するための細胞培養物製造プロセスは、タンパク質ジスルフィド結合の還元をもたらし、それにより、対象とする無傷のタンパク質の収量を低下させ得る。タンパク質ジスルフィド結合またはジスルフィド架橋の還元は、対象とするタンパク質のミスフォールディングおよび活性の低下をもたらし得る。真核細胞は、細胞内の還元および酸化を制御する還元酵素系を含む。例えば、還元型チオレドキシン１（Ｔｒｘ１）は、抗体ジスルフィド結合還元に関与する酵素であると考えられる（Ｈｕｔｔｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ｍＡｂｓ，５：６０８−６１３；Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０７：６２２−６３２；Ｋｏｔｅｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５７：２６１−２６７；およびＭａｇｎｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：７０９−７１７）。
【００５３】
真核細胞は、細胞増殖、酸化防止剤防御、および酸化還元シグナル伝達を含む真核細胞機能に必要ないくつかのプロセスを支援するチオレドキシン系およびグルタチオン系を含む。図１は、チオレドキシン系およびグルタチオン系の酵素および化学中間体の概略図を示す。グルタチオン系は、グルタチオン、グルタチオン還元酵素（ＧＲ）、グルタレドキシン（Ｇｒｘ）、およびＮＡＤＰＨから構成され、これらは、チオレドキシン系といくつかの類似点および役割を共有している（Ｌｉｌｌｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｇｅｎ．Ｓｕｂｊ．，１７８０：１３０４−１３１７）。この図に見られるように、Ｇｒｘは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の酸化によってグルタチオン系において非酵素的に還元され得る一方、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）は、補因子としてＮＡＤＰＨを用いてＧＲによって酵素的に還元され得る。この図に示されるように、チオレドキシン（Ｔｒｘ１）は、電子供与体としてＮＡＤＰＨを用いてチオレドキシン還元酵素−１（ＴｒｘＲ１）によって還元される。これらの３つの分子、ＴｒｘＲ１、Ｔｒｘ１、およびＮＡＤＰＨがチオレドキシン系を構成する。
【００５４】
チオレドキシン系およびグルタチオン系は、一緒に酸化的ストレスから真核細胞を保護し、細胞内酸化還元環境を維持する。細胞内酸化還元状態の不均衡は、酸化的ストレスの増加、タンパク質の分解、ＤＮＡ損傷、および最終的に細胞死をもたらす。ほぼ全ての生細胞に見られるチオレドキシン系およびグルタチオン系は、細胞の酸化還元環境を制御する。
【００５５】
Ｈｕｔｔｅｒｅｒら（上に引用される）によって提供される結論と対照的に、タンパク質製造中、タンパク質中に存在するジスルフィド結合は、細胞培養物または溶液中に存在するチオレドキシン系およびグルタチオン系の両方の活性および量に対して感受性であることが意外にも見出された。本発明の実験では、両方の系がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株中に存在することが分かった。本発明の実験はまた、チオレドキシン系およびグルタチオン系の両方が、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質におけるジスルフィド結合を還元することができることを示した。本明細書に記載される実験では、２−ＡＡＰＡが５０μＭ〜２００μＭの濃度でグルタチオン系活性の特異的阻害剤であり、ＡＴＧが０．５μＭ〜１μＭの濃度でチオレドキシン系活性の特異的阻害剤であることが分かった。したがって、本明細書に記載される実験は、一方の酵素系が他方の酵素系の活性に影響を与えずに選択的に阻害され得ることを示す。
【００５６】
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元を防ぐための還元酵素活性の制御
本開示は、製造プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、チオレドキシン還元酵素阻害剤、グルタチオン還元酵素阻害剤、またはチオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の両方の存在下において、対象とするタンパク質を製造すること、例えば宿主細胞を培養し、宿主細胞内の対象とするタンパク質の発現を誘導し、宿主細胞および／または細胞培養物上清から対象とするタンパク質を採取し、および／または対象とするタンパク質を精製することにより、対象とするタンパク質の還元による分解を防ぐ工程を含む方法を提供する。特定の態様において、チオレドキシン還元酵素およびグルタチオン還元酵素の阻害剤は、対象とするタンパク質におけるチオレドキシン還元酵素またはグルタチオン還元酵素の活性を低下させ、それにより、対象とするタンパク質の収量を増加させるための、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質のための製造プロセスの１つまたは複数の工程において含まれ得る。
【００５７】
チオレドキシン還元酵素およびグルタチオン還元酵素の両方は、タンパク質製造に一般的に使用される宿主細胞株中において様々なレベルで活性であり得る。さらに、これらの還元酵素のそれぞれの相対量および活性は、異なる宿主細胞株間でまたは細胞培養条件に応じて同じ宿主細胞株内で変化し得る。さらに、還元酵素のそれぞれが対象とするタンパク質「に関連する」、すなわち対象とするタンパク質と相互作用し、基質としてそれを使用するように利用可能である程度は、宿主細胞、対象とするタンパク質の特性、および／または製造プロセスの時点によって変化し得る。したがって、特定の態様において、上述される製造プロセスにおける対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法は、対象とするタンパク質が、製造プロセス中の任意の時点、例えば成長段階、産生段階、採取前段階、採取段階、精製段階、または任意の複合段階で特定の還元酵素に関連するかどうかを検出することをさらに含む。同様に、特定の還元酵素の緩和は、製造プロセス中の任意の時点で起こり得る。
【００５８】
細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させる方法であって、チオレドキシン還元酵素の阻害剤および／またはグルタチオン還元酵素の阻害剤などの１つまたは複数の還元酵素阻害剤の存在下において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程、例えば宿主細胞を培養し、宿主細胞内の対象とするタンパク質の発現を誘導し、宿主細胞および／または細胞培養物上清から対象とするタンパク質を採取し、および／または対象とするタンパク質を精製する工程を含む方法が提供される。特定の態様において、活性チオレドキシン還元酵素および／または活性グルタチオン還元酵素の存在が、対象とするタンパク質を発現する細胞株について決定され得る。対象とするタンパク質のための製造プロセス中、チオレドキシン還元酵素の阻害剤および／またはグルタチオン還元酵素の阻害剤の量および固有性は、細胞株中に存在する還元酵素活性に応じて最適化され得る。
【００５９】
例えば、チオレドキシン系が、タンパク質を発現する細胞株中で活性である場合、チオレドキシン還元酵素の１つまたは複数の阻害剤は、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるために製造プロセス中に加えられ得る。同様に、グルタチオン系が、タンパク質を発現する細胞株中で活性である場合、グルタチオン還元酵素の１つまたは複数の阻害剤は、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるために製造プロセス中に加えられ得る。同様に、チオレドキシン系およびグルタチオン系の両方が細胞株中で活性である場合、両方の還元酵素の１つまたは複数の阻害剤は、製造プロセス中に加えられ得る。以下の実施例１は、限定はされないが、ウエスタンブロット技術および他の免疫化学的手法など、チオレドキシン系およびグルタチオン系の成分を検出するのに有用な例示的なアッセイを提供する。
【００６０】
特定の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質に関連するチオレドキシン系および／またはグルタチオン系の活性は、定量化され得、製造プロセスのある時点において、１つまたは複数の阻害剤が対象とするタンパク質の付近で検出される還元酵素活性のレベルに比例して含まれ得る。例えば、対象とするタンパク質に関連するチオレドキシン系の量および／または活性が、所与の製造プロセスにおける１つまたは複数の時点で高いことが分かっている場合、比例的により高い量の１つまたは複数のチオレドキシン還元酵素阻害剤は、製造プロセスにおいて発現される対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるために製造プロセス中に加えられ得る。同様に、対象とするタンパク質に関連するグルタチオン系の量および／または活性が、所与の製造プロセスにおける１つまたは複数の時点で高いことが分かっている場合、比例的により高い量の１つまたは複数のグルタチオン還元酵素阻害剤は、製造プロセスにおいて発現される対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるために製造プロセス中に加えられ得る。同様に、対象とするタンパク質に関連するチオレドキシン系およびグルタチオン系の両方の量および／または活性が、所与の製造プロセスにおける１つまたは複数の時点で高いことが分かっている場合、比例的により高い量の１つまたは複数のチオレドキシン還元酵素阻害剤および１つまたは複数のグルタチオン還元酵素阻害剤は、製造プロセスにおいて発現される対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるために製造プロセス中に加えられ得る。特定の態様において、製造プロセス中に加えられる還元酵素阻害剤の量は、製造プロセス中の任意の時点で対象とするタンパク質に関連する各還元酵素系の量に比例し得る。
【００６１】
上述されるように、チオレドキシン系およびグルタチオン系のそれぞれの存在および活性は、様々なアッセイ方法によって決定され得る。１つのこのようなアッセイ方法において、製造プロセス中の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質に関連するチオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素の活性を定量化することは、下流の精製工程において、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、製造プロセス中に得られたサンプル、例えば細胞培地中の溶解細胞、細胞を除去された細胞培地、または対象とするタンパク質を含有する溶液に加えることと、サンプル中において４１２ｎｍの波長でＤＴＮＢの還元を監視することと、チオレドキシン還元酵素阻害剤またはグルタチオン還元酵素阻害剤の存在下において、これらの工程を繰り返すこととを含む。特定の態様において、ＮＡＤＰＨ、酸化型グルタチオン、および緩衝液などの成分は、波長を監視する前にサンプルに加えられ得る。阻害剤が加えられたサンプルにおけるＤＴＮＢの還元と、阻害剤が加えられていないサンプルにおけるＤＴＮＢの還元との間の差は、チオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素のそれぞれの活性を示す。すなわち、チオレドキシン系およびグルタチオン系の両方が適切なアッセイ条件下でＤＴＮＢを還元し得る。４１２ｎｍにおける吸光度の増加は、所与のサンプルの還元酵素活性の指標である。サンプルの総還元酵素活性は、まず、還元酵素阻害剤の非存在下で決定される。次に、ＡＴＧなどのチオレドキシン系特異的阻害剤が加えられ得、還元酵素活性の量が決定される。チオレドキシン系特異的阻害剤を用いたサンプルと、チオレドキシン系特異的阻害剤を用いずにアッセイされたサンプルとの間の還元酵素活性の差は、チオレドキシン系に起因するサンプルにおける還元酵素活性を表す。同様に、サンプルは、２−ＡＡＰＡなどのグルタチオン系特異的阻害剤の存在下および還元酵素阻害剤の存在なしで分析され得る。グルタチオン系特異的阻害剤を用いてアッセイされたサンプルと、任意のグルタチオン系特異的阻害剤を用いないサンプルとの間の活性の差は、グルタチオン系に起因する還元酵素活性を表す。還元酵素系成分を検出し、細胞培養物中の無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための他の例示的な方法が以下の実施例２〜８に開示されている。
【００６２】
チオレドキシン還元酵素の特異的阻害剤としては、限定はされないが、アウロチオグルコース（ＡＴＧ）、金チオリンゴ酸（ＡＴＭ）、オーラノフィン、および２−［（１−メチルプロピル）ジチオ］−１Ｈ−イミダゾール（ＰＸ  １２）が挙げられる。特定の態様において、チオレドキシン阻害剤の組合せが製造プロセスに含まれ得る。特定の態様において、タンパク質製造中に加えられるチオレドキシン阻害剤は、ＡＴＧであり得る。チオレドキシン還元酵素阻害剤の概説については、例えばＣａｉ，ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５２：２５７−２６５を参照されたい。
【００６３】
グルタチオン還元酵素の特異的阻害剤としては、限定はされないが、カルムスチン、２−アセチルアミノ−３−［４−（２−アセチルアミノ−２−カルボキシエチルスルファニルチオカルボニルアミノ）−フェニルチオカルバモイルスルファニル］プロピオン酸（２−ＡＡＰＡ）、Ｎｉ２＋塩、Ｃａ２＋塩、およびＣｕ２＋塩（約５０μＭ以下の濃度で）が挙げられる。特定の態様において、グルタチオン阻害剤の組合せが製造プロセス中に加えられ得る。特定の態様において、タンパク質製造中に加えられるグルタチオン阻害剤は、２−ＡＡＰＡ、Ｃｕ２＋塩、または２−ＡＡＰＡおよびＣｕ２＋塩の両方であり得る。
【００６４】
グルタチオン系およびチオレドキシン系の両方の非特異的阻害剤、またはグルタチオン系またはチオレドキシン系のいずれに対しても特異的でない阻害剤としては、限定はされないが、シスチン、ならびにＣｕ２＋（約５０μＭより高い濃度で）、Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｄ２＋、Ｐｂ２＋、およびＭｎ２＋などの様々な金属イオンが挙げられる。グルタチオン系およびチオレドキシン系の両方の間接的阻害剤としては、限定はされないが、ヘキソキナーゼ、ソルボース−１−リン酸、ポリリン酸塩、６−デオキシ−６−フルオログルコース、２−Ｃ−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース、およびリキソースを阻害するための、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などの金属キレート剤が挙げられる。グルタチオン系またはチオレドキシン系の間接的阻害の方法としては、限定はされないが、空気または酸素散布、冷却、および採取中にｐＨを低下させることが挙げられる。製造プロセス中の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元を減少させるこのような間接的な方法は、上述されるように、製造プロセス中に特異的阻害剤の混入と組み合わされ得る。例えば、特定の態様において、特定のチオレドキシン系−および／またはグルタチオン系特異的阻害剤は、細胞内のＮＡＤＰＨの生合成に関与する酵素の阻害剤と組み合わされ得る。例えば、ＮＡＤＰＨ生合成酵素阻害剤（間接的阻害剤）は、採取中および／または採取後（例えば、採取と精製との間の保持段階中）に、細胞の成長中に阻害剤によって引き起こされる毒性を防ぐのに用いられ得る。
【００６５】
製造プロセス中に含まれる還元酵素阻害剤の量は、検出されたチオレドキシン系および／またはグルタチオン系活性を阻害するのに有効な任意の量であり得、特定の態様において、検出されたチオレドキシン系および／またはグルタチオン系活性を阻害するのに有効な最小量である。有効量の還元酵素阻害剤は、実施例１０〜１３など、本明細書において提供されるアッセイを用いて実験的に決定され得る。特定の態様において、１つまたは複数の還元酵素特異的阻害剤が、以下に示される量で製造プロセス中に加えられ得る。
【００６６】
特定の態様において、検出されたグルタチオン系活性を有する、製造プロセスに含まれる２−ＡＡＰＡの量は、約０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、または０．１９ｍＭ〜約０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、または０．５ｍＭの最終濃度であり得る。検出されたグルタチオン系活性を有する、製造プロセスに含まれる２−ＡＡＰＡの量は、約０．０５ｍＭ〜約０．３ｍＭの最終濃度、約０．１ｍＭ〜約０．２５ｍＭの最終濃度、または約０．１５ｍＭ〜約０．２２ｍＭの最終濃度であり得る。例えば、検出されたグルタチオン系活性を有する、製造プロセスに含まれる２−ＡＡＰＡの量は、約０．２ｍＭの最終濃度であり得る。
【００６７】
Ｃｕ２＋塩（銅イオン）は、濃度に依存するように、グルタチオン系またはグルタチオン系およびチオレドキシン系の両方を特異的に阻害し得る。銅イオンは、塩化銅（ＣｕＣｌ２）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４、五水和物または無水物）、酢酸銅、およびそれらの組合せの添加など、当該技術分野において公知の任意の手段によって加えられ得る。グルタチオン系を阻害するために、検出されたグルタチオン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＣｕ２＋塩（銅イオン）の最終濃度は、約０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１．０μＭ、１．５μＭ、２．０μＭ、２．５μＭ、３．０μＭ、３．５μＭ、４．０μＭ、４．５μＭ、５．０μＭ、５．５μＭ、６．０μＭ、６．５μＭ、７．０μＭ、または７．５μＭ〜約８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１１μＭ、１２μＭ、１３μＭ、１４μＭ、１５μＭ、１６μＭ、１８μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、または５０μＭであり得る。特定の態様において、検出されたグルタチオン系活性を有する、製造プロセスに含まれる銅イオンの最終濃度は、約０．５μＭ〜約５０μＭ未満の最終濃度であり得る。
【００６８】
特定の態様において、チオレドキシン系およびグルタチオン系の両方が製造プロセス中に銅イオンの添加によって阻害され得る。チオレドキシン系およびグルタチオン系の両方を阻害するために、製造プロセスに含まれるＣｕ２＋塩の最終濃度は、約５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、または７５μＭ〜約１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１７５μＭ、または２００μＭであり得る。特定の態様において、製造プロセスに含まれる銅イオンの最終濃度は、約５μＭ〜約２００μＭ、約５μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約１７５μＭ、約２０μＭ〜約１５０μＭ、約４０μＭ〜約１５０μＭ、または約５μＭ〜約２００μＭであり得る。特定の態様において、製造プロセスに含まれる銅イオンの最終濃度は、約５０μＭであり得る。
【００６９】
特定の態様において、検出されたチオレドキシン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＡＴＧの量は、約０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０３ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．０６ｍＭ、０．０７ｍＭ、０．０８ｍＭ、０．０９ｍＭ、０．１ｍＭ、０．１１ｍＭ、０．１２ｍＭ、０．１３ｍＭ、０．１４ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．１６ｍＭ、０．１７ｍＭ、０．１８ｍＭ、または０．１９ｍＭ〜約０．２ｍＭ、０．２１ｍＭ、０．２２ｍＭ、０．２３ｍＭ、０．２４ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．２６ｍＭ、０．２７ｍＭ、０．２８ｍＭ、０．２９ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、または５．０ｍＭの最終濃度であり得る。特定の態様において、検出されたチオレドキシン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＡＴＧの量は、約０．０５ｍＭ〜約５ｍＭの最終濃度であり得る。特定の態様において、検出されたチオレドキシン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＡＴＧの量は、約０．１０ｍＭ〜約１ｍＭの最終濃度であり得る。特定の態様において、検出されたチオレドキシン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＡＴＧの量は、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭの最終濃度であり得る。特定の態様において、検出されたチオレドキシン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＡＴＧの量は、約０．１０ｍＭ〜約０．２０ｍＭの最終濃度であり得る。特定の態様において、検出されたチオレドキシン系活性を有する、製造プロセスに含まれるＡＴＧの量は、約０．１ｍＭの最終濃度であり得る。
【００７０】
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の製造
当該技術分野において公知の任意の細胞培養技術が、当該技術分野において公知の任意の細胞株を用いて、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を発現する宿主細胞を成長させるのに使用され得る。細胞株を培養するための標準的な技術が利用可能である。
【００７１】
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の製造は、培養可能であり、かつ対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を生合成する宿主細胞を培養することを含み得る。細胞培養条件は、細胞のタイプに応じて変化する。細胞培地としては、限定はされないが、緩衝液、塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、および必須微量元素が挙げられる。「無血清」培地という用語は、ウシ胎仔血清などの動物の血清を含有しない細胞培地に適用される。定義される培地を含む様々な組織培地は、市販されており、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の製造に使用され得る。真核細胞は、培養物中で粘着性であるかまたは懸濁され得、このような細胞は、試験管、フラスコ、ローラーボトル、プレート、袋、流動床反応器、中空繊維床反応器、または撹拌槽型バイオリアクター（使い捨ておよび標準的なステンレス鋼およびガラス容器バイオリアクター）などの容器中で成長され得る。細胞培養は、小規模または大規模に行うことができ、ここで、細胞は、数ミリリットル〜数千リットル以上の様々なサイズの容器中で成長のためにインキュベートされる。温度、ｐＨ、Ｏ２およびＣＯ２の最適条件下でのインキュベーションを可能にする細胞培養システムが市販されている。細胞を培養するのに有用な基本的な機器は、クリーンベンチ（ｌａｍｉｎａｒ−ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）、培養器、遠心分離機、冷蔵庫および冷凍庫、細胞計数器、顕微鏡、オートクレーブ（殺菌装置）、真空またはポンプ、ｐＨ計、およびフローサイトメーターを含む。細胞は、栄養および培地が細胞成長中に交換されないバッチ培養；栄養が細胞成長中に加えられる流加培養；または新しい栄養および培地が細胞内容物に連続的に加えられ、使い尽くされた培地が連続的に除去される灌流培養で成長され得る。細胞培養物は、特定の条件下で細胞成長を最大にするように設計された市販の自動化システムを用いて成長され得る。
【００７２】
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の製造プロセスは、複数の段階を含み得る。例えば、多段階プロセスでは、細胞は、２つ以上の異なる段階で培養される。多段階製造プロセスでは、細胞は、まず細胞増殖および生存率を最大にする環境条件下において１つまたは複数の成長段階で培養され、次にタンパク質産生を最大にする条件下で産生段階に移される。哺乳動物細胞による対象とするタンパク質の産生のための商業的プロセスでは、最終的な生産培養前に異なる培養容器中で行われる一般的に複数の、例えば少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の成長段階がある。成長および産生段階は、１つまたは複数の移行段階がその前にあるか、または１つまたは複数の移行段階に隔てられ得る。多段プロセスでは、本開示によって提供される方法は、少なくとも、商業的な細胞培養の最終的な生産段階の成長および産生段階中に用いられ得るが、それは、前の成長段階にも用いることができる。産生段階は、より大規模に行われ得る。大規模プロセスは、少なくとも約５０、１００、５００、１０００、２０００、３０００、５０００、７０００、８０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００リットルの体積中で行われ得る。好ましい実施形態において、産生は、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、１２０００Ｌおよび／または２００００Ｌのバイオリアクター中で行われ得る。
【００７３】
細胞培養物からの対象とするタンパク質の製造
細胞は、撹拌槽型バイオリアクターシステム中で培養され得、流加培養手順が用いられ得る。例えば、哺乳動物宿主細胞および培地が培養容器に最初に供給され得、さらなる培養栄養が、培養の終了前に、定期的な細胞および／または産物の採取を伴うかまたは伴わずに、培養中に培養物に連続的にまたは別々の増分で供給され得る。流加培養は、例えば、部分的または全培養物（細胞および培地を含む）が除去され、新しい培地と交換される半連続流加培養を含み得る。流加培養は、細胞培養の全ての成分（細胞および全ての培養栄養を含む）が培養プロセスの開始時に培養容器に供給される単純なバッチ培養と区別され得る。流加培養は、上清がプロセス中に培養容器から除去されない灌流培養とさらに区別され得る（灌流培養では、細胞は、例えば、ろ過、カプセル化、マイクロキャリアへの固定などによって培養物中に制限され、培地は、連続的にまたは断続的に導入され、培養容器から除去される）。
【００７４】
特定の態様において、流加または連続細胞培養条件は、細胞培養物の成長段階において哺乳動物細胞の成長を促進するのに使用され得る。成長段階において、細胞は、成長について最大化される条件下および期間にわたって成長される。温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などの培養条件は、特定の宿主で使用されるものであり、当業者に明らかであろう。一般に、ｐＨは、酸（例えば、ＣＯ２）または塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３またはＮａＯＨ）のいずれかを用いて、所望のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を培養するのに好適な温度範囲は、約３０℃〜３８℃であり；好適なｐＨは、約６．５〜７．５であり；好適なｄＯ２は、空気飽和の５〜９０％である。
【００７５】
特定の段階において、細胞は、産生段階または工程の細胞培養物を接種するのに使用され得る。あるいは、上述されるように、産生段階または工程は、接種または成長段階または工程と連続的であり得る。
【００７６】
細胞培養物の産生段階中の細胞培養環境は、典型的に制御される。したがって、糖タンパク質が産生される場合、哺乳動物宿主細胞の細胞特異的な生産性に影響を与える要因は、所望のシアル酸含量が、得られる糖タンパク質中で達成されるように操作され得る。特定の態様において、細胞培養プロセスの産生段階前に、細胞培養の産生段階のパラメータが関与する細胞培養の移行段階がある。
【００７７】
好適な宿主細胞としては、限定はされないが、細菌、植物細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、および昆虫細胞が挙げられる。限定はされないが、ＢＡＬＢ／３Ｔ３、およびＢＨＫ−２１などの線維芽細胞株；ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３（２９３）、ＨｅＬａ細胞株、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ、Ｃａｃｏ−２、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ−１などの上皮細胞株；Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、およびＨ９などのリンパ芽球；ＮＳ０、ＫＧ−１などの骨髄芽球細胞；ＨＵＶＥＣなどの内皮細胞株；ＰＥＲ．Ｃ６細胞株などのレチナール細胞；Ｓｆ９、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４、およびＤ．Ｍｅｌ−２などの昆虫細胞株；およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株ＳＭＤ１１６８、およびＸ−３３などの酵母細胞株；およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株Ｓ２８８Ｃ、Ｗ３０３、Ｄ２７３−１０Ｂ、Ｘ２１８０、Ａ３６４Ａ、Σ１２７８Ｂ、ＡＢ９７２、ＳＫ１、およびＦＬ１００、および米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、または任意の国際寄託当局から入手可能な細胞株のいずれかを含む多くの様々な動物からの真核細胞が細胞培養可能であり、市販されている。タンパク質の製造に有用な一般的な原核細胞は、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネ型細菌、および好塩菌である。
【００７８】
操作された宿主細胞を産生する場合、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質をコードする核酸は、一過性にまたは安定的に発現のために宿主細胞に挿入される。核酸を細胞中に導入し、細胞数を増やすために細胞を培養した後、核酸からのタンパク質の発現は、例えば、遺伝子の発現を促進する条件下で宿主細胞を培養することによって引き起こされ得る。採取前に、製造プロセスは、例えば、精製およびタンパク質安定性を促進するための試薬の添加などの採取前工程を含み得る。
【００７９】
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質が発現された後、それは、採取され、例えば細胞培養物の他の成分から分離され、タンパク質精製プロセスにおいて精製され得る。対象とするタンパク質の採取は、他の細胞培養物成分からの対象とするタンパク質の分離を達成する多くの異なる手段によって行われ得る。例えば、培地中への組み換えタンパク質の分泌は、対象とするタンパク質を、細胞の外部に培地中へと分泌されるように操作することによって達成される。１つのこのような操作技術は、組み換えタンパク質を、発現時に宿主細胞の外部に分泌させるシグナルペプチドを含むように発現ベクターを設計することを含む。タンパク質分泌シグナル配列を含むベクターが市販されている。対象とするタンパク質が細胞株によって発現され、細胞培地中に分泌されるとき、対象とするタンパク質は、培地から単離され得る。細胞および細胞培地からの分泌された対象とするタンパク質の分離は、遠心分離、限外ろ過／透析ろ過、および／またはクロマトグラフィーなどの公知の技術によって行われ得る。対象とするタンパク質が宿主細胞によって分泌されない場合、宿主細胞は、例えば、遠心分離またはろ過によって細胞培地から分離され、次に様々な公知の手段によって溶解され得、タンパク質は、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、および／または沈殿および透析技術などの様々な方法により、細胞溶解物中の他の細胞成分から分離され得る。
【００８０】
さらなる精製技術としては、イオン交換、サイズ排除、ヒドロキシルアパタイト、および親和性クロマトグラフィーなどの様々なクロマトグラフィー方法が挙げられる。これらは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、および毛管系において小規模に、または当該技術分野において公知の大型のバッチクロマトグラフィー技術を用いて大規模に行われ得る。例えば、対象とするタンパク質は、カラムに適用され、場合によりカラムに結合され得る。場合により、対象とするタンパク質がカラムを通過する一方、他の細胞株成分がカラムに結合されて後に残る。結合されたタンパク質は、カラム媒体への対象とするタンパク質の結合を妨げる溶離剤の適用により、カラムから溶離され得る。例えば、抗体の精製は、抗体などの分泌されたタンパク質を、培地中でプロテイン−Ａ親和性カラムに結合することによって達成され得る。
【００８１】
特定の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、内因性ジスルフィド結合含有タンパク質であり得る。他の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、発現ベクター上でコードされ、宿主細胞へと一過性にトランスフェクトされ、または宿主細胞へと安定的にトランスフェクトされる組み換え異種ジスルフィド結合含有タンパク質であり得る。特定の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片であり得る。特定の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、ヒト、キメラ、またはヒト化抗体またはその断片であり得る。特定の態様において、抗体は、ＩｇＧ抗体またはその断片であり得る。特定の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、ＩｇＧサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒト、ヒト化、またはキメラ抗体であり得る。特定の態様において、免疫グロブリンまたはその断片は、一価または二価であり得る。特定の態様において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥであり得る。特定の態様において、抗体またはその断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはジスルフィドが結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）であり得る。特定の態様において、抗体またはその断片は、モノクローナル抗体または抗体のポリクローナル混合物の部分であり得る。
【００８２】
採取後、対象とするタンパク質は、直ちに精製され得るか、あるいは対象とするタンパク質を含有する採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）は、採取段階後かつおよび精製段階前に所定の期間にわたり、例えば少なくとも１時間、少なくとも１日、少なくとも４日間、少なくとも１週間、少なくとも１０日間、または少なくとも２週間にわたり保持または貯蔵され得る。還元する傾向がある多くのジスルフィド結合含有タンパク質では、ジスルフィド結合の還元は、採取工程まで起こらない。製造プロセスの採取工程は、細胞が、対象とするタンパク質を含有する上清から分離されるときに起こる。上清から細胞を分離するプロセスは、細胞溶解を引き起こすことができ、これにより、還元酵素経路成分が上清中に放出され、ここで、それらは、タンパク質と結合し、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質のタンパク質ジスルフィド結合還元を触媒し得る。採取工程は、典型的に、製造プロセスの約１４日目であるが、例えば用いられる細胞株の固有性、細胞培養条件、および／または対象とするタンパク質の特性に応じて変化し得る。還元酵素阻害剤は、採取工程前、採取工程中、採取後かつ精製前の保持期間中および／または精製プロセス中に加えられ得る。特定の態様において、採取後（例えば、採取直後、採取後の保持期間中、または精製中）、細胞培地、１つまたは複数の還元酵素経路の１つまたは複数の成分、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質、および１つまたは複数の還元酵素阻害剤を含有する溶液が提供される。
【００８３】
対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の製造プロセスは、同様に、細胞培養の終わり頃であるが、採取前、例えば２週間の培養の場合８〜１４日目にバイオリアクター中でジスルフィド結合還元を示し得る。この場合、還元酵素阻害剤は、採取時より早く、例えば典型的な細胞培養プロセスの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日目に加えられ得、または細胞培養プロセス全体を通して存在し得る。阻害剤が培養物に加えられる正確な日は、例えば、使用される細胞株の固有性および製造される対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の特性に応じて変化し得る。いずれの場合も、還元酵素阻害剤は、還元が起こる前に加えられ得る。特定の態様において、細胞培養中、１つまたは複数の還元酵素阻害剤を含む溶液が提供され得る。
【００８４】
上述されるチオレドキシンおよび／またはグルタチオン還元酵素阻害剤は、タンパク質製造プロセス中の任意の時点で加えられ得る。特定の態様において、還元酵素阻害剤は、細胞採取前に加えられ得る。特定の態様において、還元酵素阻害剤は、細胞培養の開始時に加えられ得る。特定の態様において、還元酵素阻害剤は、製造プロセス全体を通して存在し得、プロセスの終了時に例えば特定のタンパク質精製工程によって取り除かれ得る。特定の態様において、還元酵素阻害剤は、細胞採取時に加えられ、第１のタンパク質精製工程において除去され得る。別の態様において、異なる還元酵素阻害剤は、製造プロセスにおける異なる時点で存在し得る。
【００８５】
対象とする無傷のタンパク質の収量を増加させる方法
還元酵素特異的阻害剤は、スクリーニングされ、それらの最適な濃度が、以下に示される精製された組み換え哺乳動物還元酵素を用いるアッセイにおいて決定され得る。以下に開示される還元酵素スクリーニングアッセイ（実施例２および３を参照されたい）は、チオレドキシン系およびグルタチオン系によって個別に引き起こされる対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元の活性および量の両方を検出するのに有用であり得る。グルタチオン系またはチオレドキシン系のいずれかに対して特異的な還元酵素阻害剤を用いて、製造プロセス中の様々な時点での対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元へのチオレドキシン系およびグルタチオン系の個別の寄与を決定することが可能であり得る。特定の態様において、グルタチオン系および／またはチオレドキシン系によって還元される対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の数量または量は、これらのアッセイを用いて決定され得る。
【００８６】
本明細書に記載される方法は、細胞培養物における還元酵素活性とタンパク質還元活性との間の相関を用いる。製造プロセス中の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質に関連するチオレドキシン系およびグルタチオン系成分の量は、本明細書の他の箇所に記載される理由で変化し得る。例えば、以下の実施例において、ｍＡｂ  Ａを発現させるのにＣＨＯ細胞株Ａ（ＣＨＯ  ＣＡＴ−Ｓ）を用いる製造プロセスは、製造プロセス中にグルタチオン還元酵素活性を示し、したがって、このプロセスにおけるｍＡｂ  Ａの還元がグルタチオン系の特異的阻害に対して感受性であったことが見出された。他方、ｍＡｂ  Ｃを発現させるのにＣＨＯ細胞株Ｃ（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ）を用いる製造プロセスは、製造プロセス中にチオレドキシン還元酵素活性を示し、したがって、この細胞株によって産生されたｍＡｂ  Ｃの還元は、チオレドキシン系の特異的阻害に対して感受性であった。さらに、ｍＡｂ  Ｂを発現させるのにＣＨＯ細胞株Ｂ（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ）およびｍＡｂ  Ｄを発現させるのにＣＨＯ細胞株Ｄ（ＣＨＯ  ＣＡＴ−Ｓ）を用いる製造プロセスは、製造プロセス中にチオレドキシン系およびグルタチオン系の両方からのほぼ同等の還元酵素活性レベルを示し、したがって、これらの細胞株によって産生されたｍＡｂ  ＢおよびｍＡｂ  Ｄの両方の還元は、両方の系の阻害に対して感受性であった。さらに、ｍＡｂ  Ｂを発現させるのに細胞株Ｂを用いる製造プロセスは、最も高い全体還元酵素活性を示し、これは、ｍＡｂ  Ｂが試験される他のプロセスと比較して還元の最も高い全体パーセントを示したという観察と相関していた。
【００８７】
したがって、特定の態様において、これらの系における酵素が製造プロセス中の任意の時点で対象とするタンパク質に関連するかどうかの決定、および存在する各系の活性の量に応じて、グルタチオン系特異的阻害剤が加えられるか、またはチオレドキシン系特異的阻害剤が加えられるか、またはグルタチオン系特異的阻害剤およびチオレドキシン系特異的阻害剤の両方が加えられる方法が提供される。したがって、特定の態様において、製造プロセス中に加えられる阻害剤の混合物は、製造プロセス中に対象とするタンパク質に関連する特異的な還元酵素系に合わせて調整され得る。対象とするタンパク質の周辺のチオレドキシン系またはグルタチオン系の存在について試験し、製造プロセスにおいてこれらの還元酵素系に特異的な阻害剤を含むことは、このような製造プロセスにおいてジスルフィド結合含有タンパク質の収量を測定可能に改善することができる。
【００８８】
「無傷のタンパク質の収量の増加」とは、活性である適切にフォールディングされた非還元型の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の増加を意味する。例えば、図７に示されるように、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量の増加のパーセントは、製造プロセス中に用いられる、還元酵素阻害剤のタイプ、または還元酵素阻害剤の組合せ、および製造プロセス中の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質に関連するチオレドキシン系および／またはグルタチオン系活性の量に応じて２０％〜１００％であり得る。特定の態様において、阻害剤ＡＴＧを加える場合、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量の増加パーセントは、約３０％〜約９０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約７０％であるか、または２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％より高くなり得る。特定の態様において、製造プロセスに阻害剤Ｃｕ２＋を加える場合、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量の増加パーセントは、約２０％〜約１００％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約８０％であるか、または２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％より高くなり得る。
【００８９】
特定の態様において、チオレドキシン系阻害剤に加えて製造プロセスにグルタチオン系阻害剤を含むことにより、チオレドキシン系阻害剤のみの存在下で行われる同じ製造プロセスと比較して、対象とする適切にフォールディングされたジスルフィド結合含有タンパク質のより高い収量を得ることができる。例えば、図７に示されるように、ＡＴＧなどのチオレドキシン系特異的阻害剤の包含に加えて、グルタチオン還元酵素を阻害するための銅イオンの包含により、２０％、３０％、４０％、５０％、あるいは６０％を超える、対象とする適切にフォールディングされたジスルフィド結合含有タンパク質の収量の増加が得られた。したがって、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質のための製造プロセスにおけるグルタチオン系特異的阻害剤の包含により、チオレドキシン系特異的阻害剤のみの存在下で行われる同一の製造プロセスと比較して、対象とするそのタンパク質の収量の著しい増加を得ることができる。
【００９０】
したがって、以下に示されるように、製造プロセス中のグルタチオン系の阻害は、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質のジスルフィド結合の還元を実質的にまたは完全に防ぎ、それによりそのタンパク質の収量を増加させることができる。本明細書に示されるように、酵素アッセイは、各還元系の相対量、およびタンパク質ジスルフィド結合還元に対するそれらの帰属される影響を決定するのに用いられ得る。この情報を用いて、対象とするタンパク質のための最良のジスルフィド結合含有タンパク質製造プロセス還元緩和手法を選択することができる。
【００９１】
本明細書に記載される方法は、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の産生収量を最大にするために、チオレドキシン系およびグルタチオン系阻害剤のリスクおよび利益のバランスを取る。還元緩和手法は、独自の欠点を有することが多い。例えば、銅イオンの過剰な添加は、細胞成長を減少させ、力価を低下させ、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の活性を低下させ、環境上の廃棄の懸念の増加を引き起こし、または対象とするタンパク質の下流の処理（タンパク質精製）中の金属イオンのクリアランスを監視する負荷を増加させ得る。その結果、特定の態様において、製造プロセス中の対象とするタンパク質に関連するチオレドキシン系およびグルタチオン系の存在および量が検出され得、次に緩和手法がその情報に基づいて設計され得る。本明細書において提供される方法によれば、還元緩和手法が、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させない場合、緩和手法ならびにその手法の欠点を避けることができ、タンパク質製造コストを削減し、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の全収量を維持し、および／または増加させながら、産生時間を減少させる。本明細書において提供される方法によれば、過度の任意のグルタチオン系およびチオレドキシン系阻害剤の有害な副作用は、製造プロセス中に用いられる阻害剤の濃度を、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるのに必要な最小値まで抑えることによって避けることができる。
【００９２】
タンパク質製造プロセス中のジスルフィド結合還元の電位の緩和
本開示は、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させ、および／または製造プロセスにおけるジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を減少または緩和するための方法を提供する。この方法は、プロセス中の１つまたは複数の時点において、ジスルフィド結合還元の電位を緩和する、例えば防止するかまたは減少させる製造プロセスに改良を提供する。製造プロセスは、細胞培養液（ＣＣＦ）中で成長および維持された、培養された真核宿主細胞中で対象とするタンパク質を発現させることを含み得る。上述されるように、本明細書において提供される方法に係る製造プロセスは、成長段階、産生段階、採取前段階、採取段階、保持段階、精製段階、またはそれらの任意の組合せを含み得る。上述されるように、特定の態様において、産生段階は、任意の時点、少なくとも１日、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、または少なくとも１６日間にわたって細胞をＣＣＦ中で維持することを含み得る。
【００９３】
本明細書において提供される方法によれば、製造プロセスは、産生バイオリアクターまたはその任意の部分中に、例えば産生段階の後期においてＣＣＦ中で有効量のシスチンを維持し、それにより、ジスルフィド結合還元の電位を緩和することを含む。「ジスルフィド結合還元の電位を緩和する」とは、還元の可能性が、有効量のシスチンが産生段階における任意の所与の時点において、ＣＣＦ中で維持されない対照製造プロセスと比べて低下されることを意味する。特定の態様において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元は、完全に防がれる。特定の態様において、ジスルフィド結合還元の量は、対照ＣＣＦにおいて観察される量より少なく、例えば対照ＣＣＦにおいて観察される量より約５％少ない、約１０％少ない、約２０％少ない、約３０％少ない、約４０％少ない、約５０％少ない、約６０％少ない、約７０％少ない、約８０％少ない、約９０％少ない、または約９９％少ない。還元電位は、本明細書の他の箇所に記載される真空／バイオアナライザアッセイによって測定され得る。例えば、還元電位は、真空チャンバ中において、製造プロセス中の選択された時点に得られたＣＣＦのサンプルを貯蔵する工程と、対照サンプルと比べた、対象とするタンパク質の断片化のレベルを測定する工程とを含む方法によって測定され得る。特定の態様において、産生段階中の様々な時点でＣＣＦから回収されるサンプルは、細胞を除去するために遠心分離され得、上清は、例えば、−８０℃で直ちに凍結され得る。全てのサンプルが収集された後、それらは、融解され、同時に真空処理にかけられ得る。特定の態様において、断片化のレベルは、非還元条件下でバイオアナライザにおいて測定される。
【００９４】
ジスルフィド結合還元に起因するタンパク質断片化またはミスフォールディングは、対象とするタンパク質の無傷で安定した活性形態の量を減少させるため、本明細書において提供される方法は、対象とする無傷のジスルフィド含有タンパク質の収量を増加させ得、および／または貯蔵中にジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を低下させ得る。収量は、例えば、対照製造プロセスの収量より約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％多く増加され得る。
【００９５】
特定の態様において、本明細書において提供される方法に従って修正された製造プロセスは、採取段階またはその任意の部分中に、精製段階またはその任意の部分中に、例えば、タンパク質が本明細書の他の箇所に記載される１つまたは複数の精製工程によってＣＣＦから分離される前に、またはそれらの任意の組合せにおいてＣＣＦ中で有効量のシスチンを維持することをさらに含む。有効量のシスチンはまた、ＣＣＦからの対象とするタンパク質の分離後の１つまたは複数の精製および／または製剤化工程において、対象とするタンパク質の溶液中で維持され得る。特定の採取方法は、対象とするタンパク質におけるジスルフィド結合還元の電位を増加させることができ、例えば、細胞溶解を促進する遠心分離または限外ろ過技術は、還元酵素をＣＣＦ中に放出し得る。したがって、特定の態様において、製造プロセスの採取段階は、細胞溶解を最小限に抑えるように調節される。
【００９６】
産生段階またはその部分中に維持される有効量のシスチンは、本明細書において提供される方法を用いて、例えば製造プロセス中の任意の時点、または１つまたは複数の時点でＣＣＦ中のシスチン濃度を測定し、１つまたは複数の同じ時点で対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を決定し、対象とするタンパク質がその時点で還元を起こす傾向を低下させるかまたはなくすのに必要なシスチンの濃度を決定して、当業者によって容易に決定され得る。特定の態様において、有効量のシスチンは、約０．５ｍＭ〜約１ｍＭ；約０．９ｍＭ〜約３ｍＭ；約２．５ｍＭ〜約４．５ｍＭであり得る。特定の態様において、有効量のシスチンは、少なくとも約０．５ｍＭ；少なくとも約１ｍＭ；少なくとも約２．０ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、少なくとも約４．０ｍＭ、少なくとも約４．５ｍＭ、少なくとも約５．０ｍＭ、または少なくとも約５．５ｍＭであり得る。ＣＣＦ中のシスチンの濃度は、製造プロセス中のいずれか１つまたは複数の時点または製造プロセス中一定の間隔、例えば産生段階中一定の間隔において、例えばＵＰＬＣを用いたアミノ酸分析によって決定され得る。
【００９７】
特定の態様において、ジスルフィド結合還元の電位を緩和するための方法は、金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｅ２＋を含む）、シスチン、溶存酸素、βメルカプトエタノール、グルタチオン、またはそれらの組合せを含む酸化還元調節剤を加えることにより、製造プロセス（バイオリアクターを含む）のいずれかの工程中に溶液の酸化還元電位を変化させることを含む。
【００９８】
特定の態様において、ジスルフィド結合還元の電位を緩和するための方法は、オンライン細胞培養物酸化還元電位によって制御され得る。細胞培養物酸化還元電位に基づく制御システムは、細胞培養物酸化還元電位の低下に応答して、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｅ２＋、シスチン、溶存酸素、βメルカプトエタノール、またはグルタチオンの濃度を増加させるのに使用される。細胞培養物酸化還元電位に基づく制御システムの使用により、化学的緩和剤の不必要な過剰添加（またはＤＯ設定点の増加）が防止される。これは、還元を防ぐのに必要な化学物質が下流の精製プロセスによって除去されなければならず、高いＤＯが最終的なプロセス力価を低下させ得るために有利である。
【００９９】
特定の態様において、本明細書において提供される方法に係る産生段階は、シスチンを含む栄養供給溶液が産生段階中にＣＣＦに加えられる「流加」プロセスであり得る。シスチンを含有する栄養供給溶液は、機能的形態の対象とするタンパク質の発現を促進するための１つまたは複数の追加の栄養を含み得る。栄養供給溶液は、例えば、少なくとも１つのアミノ酸を含有し得る。特定の態様において、栄養供給溶液は、Ｌ−シスチンをそれ自体でまたは１つまたは複数の追加の成分とともに含む。特定の態様において、シスチンを含む栄養供給溶液は、産生段階中一定の間隔で、例えば産生段階中にほぼ毎日、約２日毎、約３日毎、約４日毎、または約５日毎にＣＣＦに加えられる。したがって、産生段階全体を通して、シスチンを含有する栄養供給溶液の１、２、３、４、５、６、７、または８回の添加を行い得る。特定の態様において、２つ以上の異なる栄養供給溶液が産生段階中に加えられ得る。追加の栄養供給溶液は、機能的形態の対象とするタンパク質の発現を促進する少なくとも１つの追加の栄養、例えばアミノ酸、グルコース、ビタミン、タンパク質加水分解物、またはそれらの任意の組合せを含み得る。１つまたは複数の栄養供給溶液は、シスチンを含む栄養供給溶液が加えられるのと同じ計画に従って加えられ得る。この第２の栄養供給溶液は、第１の栄養供給溶液に使用されるものと異なる計画を用いて加えられ得る。
【０１００】
特定の態様において、シスチンを含有する栄養供給溶液は、約２日毎にＣＣＦに加えられ、栄養供給溶液の５または６回の添加が産生段階中に行われる。特定の態様において、有効量のシスチンは、産生段階全体を通して、および／または製造プロセスの他の段階中にＣＣＦ中で維持され得る。しかしながら、特定の態様において、有効量のシスチンは、産生段階の後半部分、例えば採取前および／または採取段階の直前に行われる産生段階の部分中にのみＣＣＦ中で維持される必要がある。例えば、特定の態様において、有効量のシスチンは、産生段階の最後の１４日間、産生段階の最後の１２日間、産生段階の最後の１０日間、産生段階の最後の８日間、産生段階の最後の６日間、産生段階の最後の４日間、産生段階の最後の２日間、または産生段階の最終日中にＣＣＦ中で維持され得る。例えば、本明細書の他の箇所に記載されるバッチ供給産生段階において、追加のシスチンが、栄養供給溶液（ＮＦ）の最後の添加および／または最後から２番目の添加、例えば第５のＮＦ添加（その際、プロセスは、５回のバッチ供給を含む）、または第５および／または第６のＮＦ添加に含まれ得る。標準的な対照製造プロセスと比べて、後の供給におけるシスチンの量は、少なくとも約１０％多い、少なくとも約２０％多い、少なくとも約３０％多い、少なくとも約４０％多い、少なくとも約５０％多い、少なくとも約６０％多い、少なくとも約７０％多い、少なくとも約８０％多い、少なくとも約９０％多い、または少なくとも約１００％多いことができる。例えば、産生段階中の特定の時点での対照ＣＣＦ中のシスチンの濃度は、約２．０ｍＭであり得、ここで、同じ時点において、本明細書で提供される方法に係るＣＣＦ中のシスチンの濃度は、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、または４．５ｍＭであり得る。ある態様において、前の供給に使用されるのと同じ栄養供給溶液が使用されるが、増加した体積が、ＣＣＦに加えられるシスチンの量を増加させるために後の供給中に加えられる。他の態様において、修正された栄養供給溶液が、後の供給に使用され得、ここで、溶液中の残りの成分が同じ濃度に保たれるが、シスチンの濃度が増加される。この態様によれば、加えられるＮＦ溶液の体積は、一定のままであり得る。
【０１０１】
実施形態
実施形態１Ａ：細胞培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の両方の存在下において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程を含み、それにより、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の量は、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下で製造されていない細胞培養物または溶液中の無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の量と比較して、グルタチオン還元酵素阻害剤、チオレドキシン還元酵素阻害剤、またはグルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下で製造された前記細胞培養物または溶液中でより多い、方法。
【０１０２】
実施形態２Ａ：製造プロセスにおける培養物または溶液中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるための方法であって、対象とするタンパク質を含有する培養物または溶液中のグルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の存在を検出する工程と、グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素阻害剤を製造プロセスに加えて、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元を緩和する工程とを含む方法。
【０１０３】
実施形態３Ａ：培養物または溶液中のグルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の活性を決定する工程をさらに含む、実施形態２Ａに記載の方法。
【０１０４】
実施形態４Ａ：グルタチオン還元酵素および／またはチオレドキシン還元酵素の活性を決定する工程は、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、製造プロセス中に得られたサンプルに加える工程と、チオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の少なくとも１つを、ＤＴＮＢを含有するサンプルの一部に加える工程と、サンプル中において４１２ｎｍの波長でＤＴＮＢの還元を監視する工程とを含み、チオレドキシン還元酵素阻害剤およびグルタチオン還元酵素阻害剤の少なくとも１つを用いないサンプルにおけるＤＴＮＢのより高い還元は、チオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素の活性を示す、実施形態３Ａに記載の方法。
【０１０５】
実施形態５Ａ：ＮＡＤＰＨ、酸化型グルタチオン、および緩衝液は、ＤＴＮＢの還元（または還元酵素活性）を監視する前にサンプルに加えられる、実施形態４Ａに記載の方法。
【０１０６】
実施形態６Ａ：細胞培養物に加えられるチオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素阻害剤の量は、検出されたチオレドキシン還元酵素および／またはグルタチオン還元酵素活性の量に比例する、実施形態３Ａ〜５Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１０７】
実施形態７Ａ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、グルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下で製造され、グルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在は、グルタチオン還元酵素阻害剤およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の非存在下でのジスルフィド結合含有タンパク質の製造と比較して、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、または少なくとも４０パーセント増加させる、実施形態１Ａ〜６Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１０８】
実施形態８Ａ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、チオレドキシン還元酵素阻害剤の存在下およびグルタチオン還元酵素阻害剤の存在なしで製造され、チオレドキシン還元酵素阻害剤の存在は、チオレドキシン還元酵素阻害剤の非存在下でのジスルフィド結合含有タンパク質の製造と比較して、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、または少なくとも４０パーセント増加させる、実施形態１Ａ〜６Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１０９】
実施形態９Ａ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、グルタチオン還元酵素阻害剤の存在下およびチオレドキシン還元酵素阻害剤の存在なしで製造され、グルタチオン還元酵素阻害剤の存在は、グルタチオン還元酵素阻害剤の非存在下でのジスルフィド結合含有タンパク質の製造と比較して、無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を少なくとも５パーセント、少なくとも１０パーセント、少なくとも２０パーセント、少なくとも３０パーセント、または少なくとも４０パーセント増加させる、実施形態１Ａ〜６Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
実施形態１０Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤は、アウロチオグルコース（ＡＴＧ）、金チオリンゴ酸（ＡＴＭ）、オーラノフィン、２−［（１−メチルプロピル）ジチオ］−１Ｈ−イミダゾール（ＰＸ  １２）、またはそれらの任意の組合せの少なくとも１つである、実施形態１Ａ〜８Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１１１】
実施形態１１Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤は、ＡＴＧ、ＡＴＭ、またはＡＴＧおよびＡＴＭの組合せを含む、実施形態１０Ａに記載の方法。
【０１１２】
実施形態１２Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤は、ＡＴＧおよびＡＴＧを含み、細胞培養物中のＡＴＧの最終濃度は、約０．１〜約０．５ｍＭであり、およびＡＴＭの最終濃度は、約０．１〜約０．５ｍＭであり、またはＡＴＭの最終濃度は、約０．１〜約０．５ｍＭであり、およびＡＴＧの濃度は、約０．１〜約０．５ｍＭである、実施形態１１Ａに記載の方法。
【０１１３】
実施形態１３Ａ：グルタチオン還元酵素阻害剤は、カルムスチン、２−アセチルアミノ−３−［４−（２−アセチルアミノ−２−カルボキシエチルスルファニルチオ−カルボニルアミノ）フェニルチオカルバモイルスルファニル］プロピオン酸（２−ＡＡＰＡ）、Ｃｕ２＋塩、Ｎｉ２＋塩、Ｃａ２＋塩、またはそれらの任意の組合せの少なくとも１つである、実施形態１Ａ〜９Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１１４】
実施形態１４Ａ：グルタチオン還元酵素阻害剤は、２−ＡＡＰＡ、Ｃｕ２＋塩、または２−ＡＡＰＡおよびＣｕ２＋塩の組合せを含む、実施形態１３Ａに記載の方法。
【０１１５】
実施形態１５Ａ：グルタチオン還元酵素阻害剤は、２−ＡＡＰＡおよびＣｕ２＋塩を含み、２−ＡＡＰＡの最終濃度は、約０．１ｍＭ〜約０．２５ｍＭであり、およびＣｕ２＋塩の最終濃度は、約０．５μＭ〜約５０μＭ未満であるか、または２−ＡＡＰＡの最終濃度は、約０．１ｍＭ〜約０．２５ｍＭであり、およびＣｕ２＋塩の最終濃度は、約１μＭ〜約５０μＭ未満である、実施形態１４Ａに記載の方法。
【０１１６】
実施形態１６Ａ：シスチン、Ｈｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｄ２＋、Ｐｂ２＋、Ｍｎ２＋、約５０μＭ超のＣｕ２＋、またはそれらの任意の組合せの存在下において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程をさらに含む、実施形態１Ａ〜１５Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
実施形態１７Ａ：エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ソルボース−１−リン酸、ポリリン酸塩、６−デオキシ−６−フルオログルコース、２−Ｃ−ヒドロキシ−メチルグルコース、キシロース、リキソース、またはそれらの任意の組合せの存在下において、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を製造する工程をさらに含む、実施形態１Ａ〜１６Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
実施形態１８Ａ：空気または酸素散布、冷却、採取中の低下したｐＨ、またはそれらの任意の組合せの条件下において、対象とするジスルフィド結合タンパク質を製造する工程をさらに含む、実施形態１Ａ〜１７Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１１９】
実施形態１９Ａ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を精製する工程をさらに含む、実施形態１Ａ〜１８Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１２０】
実施形態２０Ａ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、宿主細胞内で製造された組み換えタンパク質である、実施形態１Ａ〜１９Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
実施形態２１Ａ：宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＮＳ０細胞である、実施形態２０Ａに記載の方法。
【０１２２】
実施形態２２Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤および／またはグルタチオン還元酵素阻害剤は、採取工程中に加えられる、実施形態１Ａ〜２１Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１２３】
実施形態２３Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤および／またはグルタチオン還元酵素阻害剤は、精製工程の少なくとも１つ中に加えられる、実施形態１Ａ〜２１Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１２４】
実施形態２４Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤および／またはグルタチオン還元酵素阻害剤は、採取工程中および精製工程の少なくとも１つ中に加えられる、実施形態２２Ａまたは２３Ａに記載の方法。
【０１２５】
実施形態２５Ａ：チオレドキシン還元酵素阻害剤および／またはグルタチオン還元酵素阻害剤は、製造プロセス全体を通して存在する、実施形態１Ａ〜２４Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
実施形態２６Ａ：製造プロセスは、採取工程およびまたは少なくとも１つの精製工程を含む、実施形態１Ａ〜２５Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
実施形態２７Ａ、チオレドキシン還元酵素阻害剤は、ＡＴＧであり、ＡＴＧは、採取工程中に加えられ、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量は、ＡＴＧの非存在下での同じ製造プロセス中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量と比較して約２０％〜少なくとも約１００％増加される、実施形態２６Ａに記載の方法。
【０１２８】
実施形態２８Ａ、チオレドキシン還元酵素阻害剤は、ＡＴＧであり、ＡＴＧは、少なくとも１つの精製工程中に加えられ、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量は、ＡＴＧの非存在下での同じ製造プロセス中の対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量と比較して約２０％〜少なくとも約１００％増加される、実施形態２６Ａまたは２７Ａに記載の方法。
【０１２９】
実施形態２９Ａ：グルタチオン還元酵素阻害剤は、Ｃｕ２＋塩であり、Ｃｕ２＋塩は、採取工程中に加えられ、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量は、Ｃｕ２＋塩の非存在下での同じ製造プロセスによって製造された無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量と比較して約２０％〜約少なくとも１００％増加される、実施形態２６Ａに記載の方法。
【０１３０】
実施形態３０Ａ．グルタチオン還元酵素阻害剤は、Ｃｕ２＋塩であり、Ｃｕ２＋塩は、少なくとも１つの精製工程中に加えられ、対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量は、Ｃｕ２＋塩の非存在下での同じ製造プロセスによって製造された無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量と比較して約２０％〜約少なくとも１００％増加される、実施形態２６Ａまたは２７Ａに記載の方法。
【０１３１】
実施形態３１Ａ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１Ａ〜３０Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
実施形態３２Ａ：抗体またはその断片は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、融合タンパク質もしくは抗体薬物複合体またはその断片である、実施形態３１Ａに記載の方法。
【０１３３】
実施形態３３Ａ：抗体またはその断片は、モノクローナル抗体またはその断片である、実施形態３２Ａに記載の方法。
【０１３４】
実施形態３４Ａ：モノクローナル抗体またはその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４抗体またはその断片である、実施形態３３Ａに記載の方法。
【０１３５】
実施形態３５Ａ：ジスルフィド結合還元の電位を緩和するための方法は、細胞培養物酸化還元電位を測定する酸化還元プローブによって制御され、制御ループは、細胞培養物酸化還元電位の低下に応答して還元緩和手法を調節する、実施形態１Ａ〜１７Ａのいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
実施形態１Ｂ：細胞外シスチンレベルが産生段階中に０超に維持されない細胞培養または発酵プロセスにおける無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量またはジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位と比較して、細胞培養または発酵プロセスにおける細胞外シスチンレベルを産生段階中に０超に維持するためにシスチンを加えることにより、細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元電位を低下させるための方法。
【０１３７】
実施形態２Ｂ：対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質は、細胞培養液（ＣＣＦ）中に放出される、実施形態１Ｂに記載の方法。
【０１３８】
実施形態３Ｂ：産生段階は、少なくとも２日間、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、または少なくとも１６日間にわたって細胞をＣＣＦ中で維持することを含む、実施形態２Ｂに記載の方法。
【０１３９】
実施形態４Ｂ：細胞培養プロセスは、哺乳動物または昆虫細胞培養プロセスであり、および発酵は、細菌、酵母、または真菌プロセスである、実施形態１Ｂ〜３Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１４０】
実施形態５Ｂ：シスチンは、シスチンレベルを０超に維持するために培養または発酵に加えられる、実施形態１Ｂ〜４Ｂのいずれかに記載の方法。
【０１４１】
実施形態６Ｂ：シスチンレベルは、ジスルフィド結合還元を防ぐために産生段階中に０超に維持される、実施形態５Ｂに記載の方法。
【０１４２】
実施形態７Ｂ：ジスルフィド結合還元の電位は、シスチンレベルがＣＣＦ中で０超に維持されないプロセスと比べて低下される、実施形態６Ｂに記載の方法。
【０１４３】
実施形態８Ｂ：シスチンレベルは、約０．２ｍＭ、少なくとも２．０ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、または少なくとも約４．０ｍＭに維持される、実施形態１Ｂ〜７Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
実施形態９Ｂ：シスチンレベルは、産生段階の最後の１４日間、最後の１２日間、最後の１０日間、最後の８日間、最後の６日間、最後の４日間、最後の２日間、または最終日中にＣＣＦ中で０超に維持される、実施形態１Ｂ〜８Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
実施形態１０Ｂ：ＣＣＦ中のシスチンの量は、産生段階中一定の間隔で取られたＣＣＦサンプルの超高速液体クロマトグラフィーアミノ酸分析によって決定される、実施形態１Ｂ〜９Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１４６】
実施形態１１Ｂ：産生段階は、栄養供給溶液をＣＣＦに加えることを含み、栄養供給溶液は、シスチンを含む、実施形態１Ｂ〜１０Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
実施形態１２Ｂ：栄養供給溶液は、産生段階中一定の間隔でＣＣＦに加えられる、実施形態１１Ｂに記載の方法。
【０１４８】
実施形態１３Ｂ：栄養供給溶液は、産生段階中にほぼ毎日、約２日毎、約３日毎、約４日毎、または約５日毎にＣＣＦに加えられ、栄養供給溶液の１、２、３、４、５、６、７、または８回の添加は、産生段階中に行われる、実施形態１２Ｂに記載の方法。
【０１４９】
実施形態１４Ｂ：栄養供給溶液は、約２日毎にＣＣＦに加えられ、栄養供給溶液は、産生段階中に５または６回加えられる、実施形態１３Ｂに記載の方法。
【０１５０】
実施形態１５Ｂ：第２または後の供給に加えられる栄養供給溶液は、前の供給で加えられる栄養供給溶液と比べて増加したシスチンレベルを含む、実施形態１０Ｂ〜１４Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
実施形態１６Ｂ：シスチンレベルは、出発培地または栄養供給の１つまたは複数中のシスチン濃度を増加させることによって維持される、実施形態１０Ｂ〜１５Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
実施形態１７Ｂ：栄養供給溶液の組成は、産生段階全体を通して均一であり、さらなる体積の栄養供給溶液は、添加全体を通して加えられ、培養または発酵プロセスにおけるシスチンの量を増加させる、実施形態１６Ｂに記載の方法。
【０１５３】
実施形態１８Ｂ：栄養供給溶液の組成は、産生段階全体を通して均一であり、さらなる体積の栄養供給溶液は、第５の添加、第６の添加、または第５および第６の添加において加えられ、培養または発酵プロセスにおけるシスチンの量を増加させる、実施形態１６Ｂに記載の方法。
【０１５４】
実施形態１９Ｂ：第５または第６の添加の少なくとも１つに加えられる栄養供給溶液は、第１〜第４または第１〜第５の添加において加えられる栄養供給溶液より少なくとも約１０％多い、少なくとも約２０％多い、少なくとも約３０％多い、少なくとも約４０％多い、少なくとも約５０％多い、少なくとも約６０％多い、少なくとも約７０％多い、少なくとも約８０％多い、少なくとも約９０％多い、または少なくとも約１００％多いシスチンを含む、実施形態１６Ｂまたは１７Ｂに記載の方法。
【０１５５】
実施形態２０Ｂ：栄養供給溶液は、少なくとも１つの追加の栄養をさらに含む、実施形態１０Ｂ〜１９Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
実施形態２１Ｂ：少なくとも１つの追加の栄養は、アミノ酸、グルコース、ビタミン、タンパク質加水分解物、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態２０Ｂに記載の方法。
【０１５７】
実施形態２２Ｂ：少なくとも１つの追加の栄養は、機能的形態の対象とするタンパク質の発現を促進するために加えられる、実施形態２０Ｂまたは２１Ｂに記載の方法。
【０１５８】
実施形態２３Ｂ：産生段階は、追加の栄養供給溶液をＣＣＦに加えることをさらに含み、追加の栄養供給溶液は、少なくとも１つの追加の栄養を含む、実施形態１０Ｂ〜２２Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
実施形態２４Ｂ：少なくとも１つの追加の栄養は、アミノ酸、グルコース、ビタミン、タンパク質加水分解物、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態２３Ｂに記載の方法。
【０１６０】
実施形態２５Ｂ：少なくとも１つの追加の栄養は、機能的形態の対象とするタンパク質の発現を促進するために加えられる、実施形態２３Ｂまたは２４Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
実施形態２６Ｂ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量は、有効量のシスチンがＣＣＦ中で０超に維持されないプロセスにおいて製造された対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の収量と比べて約２０％〜１００％増加される、実施形態５Ｂ〜２５Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
実施形態２７Ｂ：ジスルフィド結合還元の電位は、真空チャンバ中において、製造プロセス中の選択された時点で得られたＣＣＦのサンプルを貯蔵する工程と、対照サンプルと比べた、対象とするタンパク質の断片化のレベルを測定する工程とを含む方法によって測定される、実施形態５Ｂ〜２６Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
実施形態２８Ｂ：断片化のレベルは、非還元条件下でバイオアナライザを用いて測定される、実施形態２７Ｂに記載の方法。
【０１６４】
実施形態２９Ｂ：バイオアナライザは、ＧＸ  ＬａｂＣｈｉｐを含む、実施形態２８Ｂに記載の方法。
【０１６５】
実施形態３０Ｂ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、組み換えタンパク質である、実施形態１Ｂ〜２９Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
組み換えタンパク質は、宿主細胞に、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質をコードする発現プラスミドをトランスフェクトすることから得られる、実施形態３０Ｂに記載の方法。
【０１６７】
実施形態３１Ｂ：対象とするタンパク質は、宿主細胞から分泌される、実施形態３０Ｂに記載の方法。
【０１６８】
実施形態３２Ｂ：宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＮＳ０細胞である、実施形態３０Ｂまたは３１Ｂに記載の方法。
【０１６９】
実施形態３３Ｂ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１Ｂ〜３０Ｂのいずれかに記載の方法。
【０１７０】
実施形態３４Ｂ：抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体またはその断片である、いずれかの実施形態３３Ｂに記載の方法。
【０１７１】
実施形態３５Ｂ：モノクローナル抗体またはその断片は、ＩｇＧ抗体またはその断片である、実施形態３４Ｂに記載の方法。
【０１７２】
実施形態３６Ｂ：ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、実施形態３５Ｂに記載の方法。
【０１７３】
実施形態３７Ｂ：抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはジスルフィドが結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）である、実施形態３３Ｂに記載の方法。
【０１７４】
実施形態３８Ｂ：抗体またはその断片は、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体またはその断片である、実施形態３３Ｂ〜３７Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
実施形態３９Ｂ：対象とするタンパク質中のジスルフィド結合は、分子間または分子内にある、実施形態１Ｂ〜３８Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
実施形態４０Ｂ：培養プロセスは、バッチプロセス、流加プロセス、反復流加プロセス、灌流プロセス、連続プロセス、またはそれらの組合せである、実施形態１Ｂ〜３９Ｂのいずれかに記載の方法。
【０１７７】
実施形態４１Ｂ：シスチンレベルは、シスチン溶液、栄養供給、栄養溶液、モノマーシステインを含有する溶液、またはシスチンを含有する溶液の少なくとも１つを直接加えることにより、培養または発酵において維持される、実施形態１Ｂ〜４０Ｂのいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
実施形態４２Ｂ：モノマーシステインは、酸化条件下でシスチンに転化される、実施形態４１Ｂに記載の方法。
【０１７９】
実施形態４３Ｂ：シスチンは、シスチンレベルを０超に維持するために細胞培養プロセスに加えられ、および／またはＣｕは、レベルを０超に維持するために細胞培養プロセスに加えられ、および／またはＥＤＴＡは、細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元または還元電位を低下させるために採取前に細胞培養プロセスに加えられる、実施形態１Ｂに記載の方法。
【０１８０】
実施形態４４Ｂ：ＥＤＴＡは、細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元または還元電位を低下させるために、採取前に＞９．５、＞１９、または＞３８ｍＭで細胞培養プロセスに加えられる、実施形態１Ｂに記載の方法。
【０１８１】
実施形態４５Ｂ：シスチンは、細胞培養または発酵プロセスにおける対象とする無傷のジスルフィド結合含有タンパク質の収量を増加させるか、または対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元または還元電位を低下させるために、採取前に＞４または＞８ｍＭで細胞培養プロセスに加えられる、実施形態１Ｂに記載の方法。
【０１８２】
実施形態１Ｃ：対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質の安定性を改良するための方法であって、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質を、最小の遊離チオールを含む形態に維持する製造プロセスを使用し、それにより、製造プロセス中の対象とするジスルフィド結合含有タンパク質の還元または還元電位を緩和する工程を含む方法。
【０１８３】
実施形態２Ｃ：製造プロセスは、細胞培養段階、採取段階、少なくとも１つの保持段階、精製段階、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態１Ｃに記載の方法。
【０１８４】
実施形態３Ｃ：保持段階は、製造プロセス中の段階のいずれかにおいて材料を貯蔵することを含む、実施形態２Ｃに記載の方法。
【０１８５】
実施形態４Ｃ：保持段階は、採取段階後かつ精製段階前に最大で１日間、少なくとも４日間、少なくとも１週間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月間、または少なくとも３ヶ月間の期間にわたり、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を貯蔵することを含む、実施形態３Ｃに記載の方法。
【０１８６】
実施形態５Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質中の遊離チオールを最小限に抑える工程は、製造プロセス全体を通してジスルフィド結合還元を緩和することを含む、実施形態４Ｃに記載の方法。
【０１８７】
実施形態６Ｃ：ＨＣＣＦは、保持段階中、気密性袋中において２〜８℃で貯蔵される、実施形態４Ｃまたは５Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０１８８】
実施形態７Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質中の遊離チオールは、保持段階全体を通して２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満に維持される、実施形態２Ｃ〜６Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
実施形態８Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質中の遊離チオールは、製剤原料段階で質量分析法によって測定される、実施形態７Ｃに記載の方法。
【０１９０】
実施形態９Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、前の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９１】
実施形態１０Ｃ：遊離チオールは、軽鎖中、重鎖中、ヒンジ領域中、またはそれらの組合せ中において抗体中で測定される、実施形態９Ｃに記載の方法。
【０１９２】
実施形態１１Ｃ：ジスルフィド結合還元を緩和する工程は、保持段階またはその任意の部分中にＨＣＣＦ中で有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋を維持することを含む、実施形態４Ｃ〜１０Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
実施形態１２Ｃ：有効量のシスチンは、少なくとも約２．０ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、または少なくとも約４．０ｍＭを占める、実施形態１１Ｃに記載の方法。
【０１９４】
実施形態１３Ｃ：有効量のＣｕ＋＋は、少なくとも約２．０ｐｐｍ、少なくとも約３．０ｐｐｍ、少なくとも約４．０ｐｐｍ、少なくとも約４．５ｐｐｍ、少なくとも約５．０ｐｐｍ、または少なくとも約５．５ｐｐｍを占める、実施形態１１Ｃまたは１２Ｃに記載の方法。
【０１９５】
実施形態１４Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質中の遊離チオールを最小限に抑える工程は、産生段階もしくはその任意の部分中、採取前段階もしくはその任意の部分中、採取段階もしくはその任意の部分中、またはそれらの任意の組合せで採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）中のジスルフィド結合還元を緩和することをさらに含む、実施形態１Ｃ〜１３Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
実施形態１５Ｃ：ジスルフィド結合還元の緩和は、製造プロセスまたはその任意の部分中にＣＣＦ中で有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋を維持することを含む、実施形態１４Ｃに記載の方法。
【０１９７】
実施形態１６Ｃ：製造プロセスは、細胞培養段階、採取段階、少なくとも１つの保持段階、精製段階、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態１５Ｃに記載の方法。
【０１９８】
実施形態１７Ｃ：有効量のシスチンは、少なくとも約２．０ｍＭ、少なくとも約２．５ｍＭ、少なくとも約３．０ｍＭ、少なくとも約３．５ｍＭ、または少なくとも約４．０ｍＭを占める、実施形態１５Ｃまたは１６Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
実施形態１８Ｃ：シスチンの量は、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質におけるｃｙｓ付加物の形成を最小限に抑えながら、ジスルフィド結合還元を有効に緩和するために調整される、実施形態１５Ｃ〜１７Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
実施形態１９Ｃ：有効量のＣｕ＋＋は、少なくとも約２．０ｐｐｍ、少なくとも約３．０ｐｐｍ、少なくとも約４．０ｐｐｍ、少なくとも約４．５ｐｐｍ、少なくとも約５．０ｐｐｍ、または少なくとも約５．５ｐｐｍを占める、実施形態１５Ｃ〜１８Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
実施形態２０Ｃ：有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋は、製造プロセスの最後の１４日間、最後の１２日間、最後の１０日間、最後の８日間、最後の６日間、最後の４日間、最後の２日間、または最終日中にＣＣＦ中で維持される、実施形態１５Ｃ〜１９Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
実施形態２１Ｃ：有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋は、全製造プロセス中に維持される、実施形態１５Ｃ〜２０Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
実施形態２２Ｃ：有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋は、製造プロセス中に一定の間隔でシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋補給剤を加えることによってＣＣＦ中で維持される、実施形態１５Ｃ〜２１Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
実施形態２３Ｃ：製造プロセスは、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１４日間、または少なくとも１６日間にわたって細胞をＣＣＦ中で維持することを含む、実施形態１Ｃ〜２２Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
実施形態２４Ｃ：補給剤添加は、製造プロセス中に少なくともほぼ毎日、少なくとも約２日毎、少なくとも約３日毎、少なくとも約４日毎、または少なくとも約５日毎に行われる、実施形態２３Ｃに記載の方法。
【０２０６】
実施形態２５Ｃ：補給剤添加は、栄養供給溶液を加えることを含み、栄養供給溶液は、ＣＣＦ中で有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋を維持するのに十分な量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋を含む、実施形態２３Ｃまたは２４Ｃに記載の方法。
【０２０７】
実施形態２６Ｃ：栄養供給溶液は、少なくとも１つの追加の栄養をさらに含む、実施形態２５Ｃに記載の方法。
【０２０８】
実施形態２７Ｃ：少なくとも１つの追加の栄養は、アミノ酸、グルコース、ビタミン、タンパク質加水分解物、またはそれらの任意の組合せを含む、実施形態２６Ｃに記載の方法。
【０２０９】
実施形態２８Ｃ：有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋は、採取前段階中にＨＣＣＦ中で維持される、実施形態１４Ｃ〜２７Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
実施形態２９Ｃ：有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋は、採取段階またはその一部中にＨＣＣＦ中で維持される、実施形態１４Ｃ〜２８Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２１１】
実施形態３０Ｃ：有効量のシスチン、Ｃｕ＋＋、またはシスチンおよびＣｕ＋＋は、採取段階全体を通してＣＣＦ中で維持される、実施形態２９Ｃに記載の方法。
【０２１２】
実施形態３１Ｃ：採取段階は、細胞溶解を最小限に抑えるように行われる、実施形態３０Ｃに記載の方法。
【０２１３】
実施形態３２Ｃ：ジスルフィド結合還元の緩和は、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐを用いて測定される、実施形態５Ｃ〜３１Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
実施形態３３Ｃ：Ｌａｂ  Ｃｈｉｐは、非還元ＬａｂＣｈｉｐである、実施形態３２Ｃに記載の方法。
【０２１５】
実施形態３４Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、対象とするジスルフィド結合含有タンパク質をコードする発現プラスミドをトランスフェクトされた宿主細胞内で発現される、実施形態１Ｃ〜３３Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
実施形態３５Ｃ：タンパク質凝集は、対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質における遊離チオールを最小限に抑える工程により、最小限に抑えられる、実施形態１Ｃ〜３４Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
実施形態３６Ｃ：タンパク質凝集は、タンパク質凝集の程度、凝集の速度、またはそれらの組合せを最小限に抑えることによって最小限に抑えられる、実施形態３５Ｃに記載の方法。
【０２１８】
実施形態３７Ｃ：対象とする精製されたタンパク質の凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、またはそれらの組合せを用いて時間とともに測定される、実施形態３４Ｃまたは３５Ｃに記載の方法。
【０２１９】
実施形態３８Ｃ：対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質は、精製後にバルクで貯蔵され、および凝集は、対象とするタンパク質の承認された保存期間にわたって測定される、実施形態２４Ｃ〜３７Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２２０】
実施形態３９Ｃ：対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質は、５℃で貯蔵され、凝集の速度は、月に約０．４％未満、月に約０．３％未満、月に約０．２％未満、月に約０．１％未満、または月に約０．０５％未満である、実施形態３８Ｃに記載の方法。
【０２２１】
実施形態４０Ｃ：対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質は、４０℃で貯蔵され、凝集の速度は、月に約２％未満、月に約１．５％未満、月に約１％未満、月に約０．８％未満、または月に約０．５％未満である、実施形態３８Ｃに記載の方法。
【０２２２】
実施形態４１Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、組み換えタンパク質である、実施形態１Ｃ〜４０Ｃのいずれかに記載の方法。
【０２２３】
実施形態４２Ｃ：組み換えタンパク質は、宿主細胞内で発現される、実施形態４１Ｃに記載の方法。
【０２２４】
実施形態４３Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、宿主細胞から分泌される、実施形態４２Ｃに記載の方法。
【０２２５】
実施形態４４Ｃ：宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＮＳ０細胞である、実施形態４２Ｃまたは４３Ｃに記載の方法。
【０２２６】
実施形態４５Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態３４Ｃ〜４４Ｃのいずれかに記載の方法。
【０２２７】
実施形態４６Ｃ：抗体またはその断片は、モノクローナル抗体またはその断片である、実施形態４５Ｃに記載の方法。
【０２２８】
実施形態４７Ｃ：抗体またはその断片は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、またはその断片である、実施形態４６Ｃに記載の方法。
【０２２９】
実施形態４８Ｃ：抗体またはその断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、またはジスルフィドが結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）である、実施形態４５Ｃ〜４７Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２３０】
実施形態４９Ｃ：抗体またはその断片は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはその断片である、実施形態４５Ｃ〜４８Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
実施形態５０Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質中のジスルフィド結合は、分子間または分子内にある、実施形態１Ｃ〜４９Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２３２】
実施形態５１Ｃ：対象とするジスルフィド結合含有タンパク質は、適切にフォールディングされた場合、少なくとも２つのジスルフィド結合を含む、実施形態１Ｃ〜５０Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
実施形態５２Ｃ：製造プロセスにおける抗体ジスルフィド結合還元の最小化は、対象とする精製されたジスルフィド結合含有タンパク質における遊離チオールレベルを低下させ、かつタンパク質凝集を最小限に抑える、実施形態１Ｃ〜３４Ｃのいずれか１つに記載の方法。
【０２３４】
実施形態ｘｘ：ジスルフィド結合還元および／またはジスルフィド結合還元電位および／または遊離チオールの最小化は、製造プロセス（バイオリアクターおよび採取を含む）のいずれかの工程中、（金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｅ２＋を含む）、シスチン、溶存酸素、βメルカプトエタノール、グルタチオン、またはそれらの組合せを含む酸化還元調節剤を加えることによって）Ｃｕ、シスチン、ＥＤＴＡ、または酸化還元電位を増加させることによって達成される、請求項のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
本開示は、特に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いるが、これは、当該技術分野の技能の範囲内である。このような技術は、文献において十分に説明されている。
【０２３６】
抗体操作、タンパク質操作、抗体および抗体−ハプテン結合、ならびに免疫学における標準的な方法の一般的原理は、当該技術分野において周知である。本明細書に引用される公開された文献、特許、および特許出願の全ては、全体が参照により本明細書に援用される。
【０２３７】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。
【実施例】
【０２３８】
試薬
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸水和物（ＮＡＤＰ＋）、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、アウロチオグルコース（ＡＴＧ）、および２−アセチルアミノ−３−［４−（２−アセチルアミノ−２−カルボキシエチルスルファニルチオカルボニルアミノ）フェニルチオ−カルバモイルスルファニル］プロピオン酸水和物（２−ＡＡＰＡ）は、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。ラット組み換えチオレドキシン還元酵素１（ＴｒｘＲ１）は、市販されている（例えば、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）。親和性樹脂２’５’アデニンジヌクレオチドリン酸（ＡＤＰ）セファロース４Ｂは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手される。抗チオレドキシン抗体、抗グルタチオン還元酵素抗体、抗グルタレドキシン抗体、ヒト組み換えチオレドキシン（Ｔｒｘ１）およびヒト組み換えグルタチオン還元酵素（ＧＲ）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手可能である。抗チオレドキシン還元酵素抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から入手可能である。試薬は、入手したままの状態でさらに精製せずに使用される。
【０２３９】
機器の準備
３Ｌのオートクレーブ処理可能なバイオリアクター容器（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｄｅｌｆｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を、プローブ、供給瓶、および全てのポートが閉鎖されているが、通気されたシステムを形成するように封止された他の機器を含む全ての周辺機器と連結した。容器を１２１℃超で３０分間超にわたってオートクレーブ処理した。サイクルが完了したとき、滅菌容器を室温に冷ました。次に、容器に１Ｌの滅菌バッチ成長培地を充填した。Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＳＣＡＤＡ）コントローラを用いて、プロセスパラメータを監視し、制御した。１ピッチブレードインペラをそれぞれ備えた３Ｌのバイオリアクターを２８０〜３００ＲＰＭで撹拌した。空気を９４ｍＬ／分の流量で３Ｌのリアクター中に散布し、ＣＯ２を６ｍＬ／分でリアクター中に散布した。リアクターを温度設定点まで加熱した。温度、ｐＨ、およびＣＯ２が定常状態に達したとき、溶存酸素プローブを９４％空気飽和になるまで校正し、ｐＨを、血液ガス分析装置（ＢＧＡ）を用いたオフライン測定に合わせて調整した。ＡｐｐｌｉｋｏｎまたはＢｒａｕｎ  ５０Ｌ（定置蒸気滅菌）バイオリアクターをより大規模な試験に使用した。５０Ｌのバイオリアクターは、プロセス制御のためにＡｌｌｅｎ  Ｂｒａｄｌｅｙ製のプログラマブルロジックコントローラ（ＰＬＣ）およびヒューマンマシンインタフェース（ＨＭＩ）を使用した。２ピッチブレードインペラを備えた５０Ｌのバイオリアクターを７０ＲＰＭ（Ｂｒａｕｎ）または１１０ＲＰＭ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ）で撹拌した。
【０２４０】
バイアル融解および接種材料拡大
試験用のＩｇＧ２モノクローナル抗体−Ａ（ｍＡｂ−Ａ）のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＤＷＣＢ）の１ｍＬのバイアルを、２５０ｍＬのＮａｌｇｅｎｅ通気キャップ振とうフラスコ中で液体窒素貯蔵から３０ｍＬの接種材料拡大培地へと融解させた。振とうフラスコを１２０ＲＰＭの撹拌速度で振とうプラットフォームにおいて３７℃、６％のＣＯ２培養器に入れた。培養物が＞２．５６／ｍＬの生存細胞密度（ＶＣＤ）に達したとき、培養物を０．５〜１．０６個／ｍＬに分割した。バイオリアクターから接種材料を産生するために、５００ｍＬおよび１ＬのＮａｌｇｅｎｅ通気キャップ振とうフラスコおよびＮａｌｇｅｎｅ  ２Ｌバッフル付き（ｂａｆｆｌｅｄ）通気キャップ振とうフラスコを含むより大型の振とうフラスコを連続的に用いて、培養物体積を拡大させた。５０Ｌのバイオリアクターまで拡大する場合、０．２５Ｌ／分で６％のＣＯ２散布を用いたロッカープラットフォーム（ｒｏｃｋｅｒ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）において１０ＬのＳａｒｔｏｒｉｕｓカルチバッグ（ｃｕｌｔｉｂａｇ）を用いて、さらなる拡大工程を行った。カルチバッグ（ｃｕｌｔｉｂａｇ）の温度を３７℃に制御し、ロッカー角度は８であり、ロック速度は２５ＲＰＭであった。
【０２４１】
産生バイオリアクターの操作（ｍＡｂ−Ａ）
バイオリアクター中の培地は、接種材料拡大に使用されるのと同じ成長培地であった。初期作動体積は、１．５Ｌ（５０Ｌのバイオリアクター中４５Ｌ）であった。産生バイオリアクターへの細胞の分割比は、接種時、３００ｍＬの細胞および追加の２００ｍＬの成長培地が、温度、ｐＨ、およびＤＯが制御された３Ｌの容器に充填されるように体積基準で１：５（１部の細胞および４部の培地）であった。ＶｉＣｅｌｌ  ＸＲ細胞計数器を用い、定期的な生存細胞計数を用いて培養物を成長について分析した。オフライン測定値を、ｐＨおよびｐＣＯ２を測定するためにＢＧＡ  Ｒａｐｉｄｐｏｉｎｔ  ４００を用いて；グルコース、乳酸塩、およびアンモニアを測定するためにＮｏｖａ  Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ  ４００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて；オスモル濃度を測定するためにＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２０２０氷点浸透圧計を用いて；力価を測定するためにプロテイン−ＡカラムとともにＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣを用いて；およびアミノ酸を測定するためにＡｃｃＱ  ｔａｇアッセイとともにＷａｔｅｒｓ製の超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）アミノ酸分析システムを用いて定期的に収集した。生存細胞密度が、補足的な栄養供給スキームを開始させる基準である２．５６個／ｍＬに達するまで、培養物をバッチ段階で成長させた。流加プロセス期間は、約１４日間であった。
【０２４２】
供給スキーム
第１の栄養供給（ＮＦ）を、産生バイオリアクターが２．５６個の生存細胞／ｍＬのＶＣＤ基準を満たした１日目に投与した。最初の栄養供給添加後、次の栄養供給添加を１日置きに行った。合計で５または６回の栄養供給添加をバイオリアクターに投与し、これは、それぞれ部分Ａおよび部分Ｂからなる。栄養供給部分Ａは、アミノ酸、ビタミン、および他の細胞培養栄養を含む栄養供給成分の大部分からなっていた。栄養供給部分Ｂは、Ｌ−シスチンおよび追加の成分の塩基性溶液を含有していた。各栄養供給添加は、以下の表１に示されるように、異なる量の栄養供給部分ＡおよびＢからなっていた。
【０２４３】
【表１】
2019521961.tif 000003
【０２４４】
抗体還元電位アッセイ（ＢｉｏＡ／真空）
バイオリアクターサンプル（１ｍＬ）を毎日取得し、３０００〜４０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を−８０℃で直ちに凍結した。アッセイの前日にサンプルを−８０℃での貯蔵から取り出し、融解させ、室温で一晩真空チャンバに入れて、酸素の干渉なしにモノクローナル抗体の還元を誘導した。真空保持後、サンプルを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＬＡＢＣＨＩＰ（登録商標）ＧＸＩＩシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、非還元条件下でタンパク質断片化について分析して、抗体の鎖間ジスルフィド結合の切断から生じた抗体断片を検出した。ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  ＩＩアッセイは、サンプル中に存在する無傷の抗体（２つの重鎖および２つの軽鎖）のパーセントを示す純度値を報告している。
【０２４５】
断片化および還元種分析
サンプルを真空分析にかけた場合、それらを融解させ、ボルテックスした。約４００μＬのアリコートをガラス管に移した。管を、オン／オフ制御を提供し得るスクリューキャップＭｉｎｉｎｅｒｔ（商標）弁（ＶＩＣＩ  Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって密閉した小型の真空チャンバに入れた。真空を、シリコンチューブに通して真空チャンバにかけ、チャンバを密閉した。次に、アルゴンガスを、アルゴン圧力が確立されるまでシリコンチューブに通してチャンバにかけて、チャンバを再度密閉した。上記の手順後、３サイクルの真空／アルゴンでプロセスを繰り返し、次に内部にアルゴンを入れた状態でチャンバを密閉した。次に、チャンバを室温で一晩インキュベートした。
【０２４６】
サンプルを分析するまで冷凍貯蔵した。融解させたら、４００〜６００μＬの各サンプルを培養管に移し、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含有する非還元サンプル緩衝液中で混合した。変性させ、遊離チオールをＮＥＭによってキャッピングした後、サンプルを、サイズ分画および定量化を行うために、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて分析した。Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩを用いて、タンパク質および断片をレーザー誘起蛍光によって検出し、ゲルのような画像（バンド）および電気泳動図（ピーク）に変換した。
【０２４７】
抗体凝集分析
抗体凝集物のパーセントを、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）方法を用いて決定した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズシステムを、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ６．８の移動相緩衝液を１ｍＬ／分の流量で用いて、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）とともに使用した。２８０ｎｍにおける吸光度クロマトグラフィーを用いて結果を定量化した。
【０２４８】
採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）における遊離チオール定量化
採取された細胞培養液中の遊離チオールの量を、ジスルフィドが結合されたペプチドの予測質量を非還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングからの観測質量に一致させることによって決定した。簡潔には、サンプルを変性させ、セリンプロテアーゼによる消化前に希釈した。プロテアーゼ消化後、各反応混合物の半分をＤＴＴの添加によって還元させた。消化物を、Ｃ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、ＵＶ検出器およびオンライン質量分析計を用いて分析した。ジスルフィド結合連結されたペプチドは、非還元試験でのみ存在し、還元条件下で消失するであろう。
【０２４９】
遊離チオール定量化アッセイ
遊離チオールアッセイは、不対合システイン残基における遊離チオール基のレベルを測定することにより、タンパク質中のジスルフィド結合の完全性を評価する。遊離チオールに結合し、着色されたチオレートイオンを放出する化合物（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）またはＤＴＮＢ）とともに、サンプルを天然および変性条件下でインキュベートする。着色されたチオレートイオンを、紫外・可視分光光度計を用いて検出する。遊離チオールの濃度を標準的な曲線から内挿し、遊離チオール対抗体モル比を報告する。
【０２５０】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、それぞれ１．５Ｌの初期体積を用いる大規模製造プロセスを代表する条件下において、３Ｌのガラス撹拌槽型バイオリアクター中で培養した。培養条件（温度、ｐＨ、ＤＯ、および撹拌）を制御し、オンラインで監視した。ｐＨ、溶解されたガス（ｐＯ２、ｐＣＯ２）、ナトリウムおよび代謝産物濃度（グルコース、乳酸塩、アンモニア）のオフライン測定値を、ＢＩＯＰＲＯＦＩＬＥ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮＯＶＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびＲＡＰＩＤＰＯＩＮＴ（登録商標）５００  ＢＧＡシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）を用いて取得した。細胞成長を、ＶＩ−ＣＥＬＬ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて監視し、力価を、プロテイン−Ａ親和性クロマトグラフィーを用いて測定した。
【０２５１】
実施例に使用されるＣＨＯ細胞株に、免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドを安定的にトランスフェクトした。
【０２５２】
抗体還元活性
抗体還元におけるチオレドキシンおよびグルタチオン系の役割を評価するために、抗体還元を、酵素特異的阻害剤を用いておよび用いずに決定した。３Ｌのバイオリアクターからの１４日目の培養サンプル（細胞＋培地）を、全てのサンプルの分析の準備ができるまで冷凍貯蔵した。融解させた後、サンプルを遠心分離し、０．２μｍのフィルタに通してろ過し、示された濃度の還元酵素阻害剤を加え、サンプルを室温で一晩にわたり無酸素環境中で貯蔵した。
【０２５３】
簡潔には、培養サンプルを氷上で融解させ；続いて、細胞ペレットを除去するように（すなわち１２，０００ｒｐｍで３分間）サンプルを遠心分離し、０．２μｍのフィルタに通してろ過し、上清サンプルを氷上で貯蔵した。上清サンプルに何も添加しないか、０．１ｍＭのＡＴＧ、３μＭのＣｕ２＋、または０．１ｍＭのＡＴＧおよび３μＭのＣｕ２＋の両方のいずれかの添加後、サンプルを培養管に移し、サンプルおよび阻害剤が確実に十分に混合されるように管をボルテックスした。細胞培養管を真空チャンバに入れて、真空チャンバをＮ２ガスおよび真空ラインに連結することによってサンプルから酸素をパージし、真空をチャンバから引き抜き、続いて１分間待機した。真空ラインを閉じ、Ｎ２ラインを短時間開き、次に真空工程およびＮ２の添加を２回繰り返した。次に、真空チャンバを室温で一晩貯蔵した。次に、真空チャンバを室温で一晩貯蔵した。サンプルを、標準的な非還元型手順を用い、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて分析した。
【０２５４】
細胞培養物上清サンプルにおける抗体還元を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）において標準的な手順を用いて、キャピラリー電気泳動によって還元種の存在を検出することによって測定した。サンプルを力価に応じて１〜６倍に希釈し、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒの標準的なプロトコルに従って非還元条件下で分析した。３Ｌのバイオリアクターからの上清サンプルを、全てのサンプルを取得し、分析の準備ができるまで冷凍貯蔵した。サンプルを氷上で融解させ、試験のそれぞれの日にリアクター中の還元抗体の量を評価するように直ちに分析した。
【０２５５】
還元酵素活性アッセイ
このアッセイは、培養サンプルにおける総還元酵素活性の決定、ならびにサンプルの総還元酵素活性に対してチオレドキシン還元酵素およびグルタチオン還元酵素によってなされる個々の寄与の決定を可能にする。このアッセイでは、３Ｌのバイオリアクターからの培養サンプル（細胞＋培地）を試験の終了まで冷凍貯蔵し、その後、サンプルを遠心分離して、細胞ペレットを除去し、次に得られた上清を、示された濃度の特異的還元酵素阻害剤とともに０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、０．１５ｍＭの酸化型グルタチオン、および３ｍＭのＤＴＮＢを含有する１００ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．４中で２０倍に希釈した。サンプルへの酵素特異的阻害剤の添加により、総還元酵素活性ならびにチオレドキシンおよびグルタチオン系からの個々の活性を決定することが可能になった。還元酵素活性を４１２ｎｍの波長における吸光度の増加の分光計測によって監視した。ＤＴＮＢの還元は、チオレドキシン系およびグルタチオン系の両方とのＤＴＮＢの相互作用によって引き起こされる。この波長における吸光度の検出された増加は、ＤＴＮＢの還元によって引き起こされる（Ａｒｎｅｒ，ＥＳＪ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ−Ｇｅｎ．Ｓｕｂｊ．，１７９０：４９５−５２６，２００９）。
【０２５６】
総還元酵素活性を阻害剤の非存在下で決定した。チオレドキシン還元酵素阻害剤、ＡＴＧは、チオレドキシン系の還元酵素活性を完全に阻害する。したがって、ＡＴＧを含むサンプルと、阻害剤を含まないサンプルとの間の活性の差は、還元酵素活性の量がチオレドキシン系に寄与したことを示す。同様に、グルタチオン還元酵素阻害剤、２−ＡＡＰＡは、グルタチオン系の還元酵素活性を完全に阻害する。したがって、２−ＡＡＰＡを含むサンプルと、阻害剤を含まないサンプルとの間の還元酵素活性の差は、還元酵素活性の量がグルタチオン系に寄与したことを示す。ＡＴＧおよび２−ＡＡＰＡが例示的な特異的阻害剤として提供されるが、上述される他の特異的阻害剤がＡＴＧおよび２−ＡＡＰＡの代わりにこのアッセイに用いられ得る。
【０２５７】
簡潔には、培養サンプルを氷上で融解させた。融解されたサンプルを、細胞ペレットを除去するように（例えば、１２，０００ｒｐｍで３分間）遠心分離し、上清サンプルを氷上で貯蔵した。９６ウェル透明底プレートのウェルに以下の試薬を加えた：１００ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．４（１６０μＬ−Ｘ−Ｙ−Ｚ）、ここで、Ｘは、サンプルの体積であり、これは、１０μＬ、またはバックグラウンドウェルでは０μＬであり、Ｙは、ＡＴＧの体積であり、これは、４．１μＬ、または０μＬのいずれかであった。４．１μＬの添加により、０．５μＭのＡＴＧの最終濃度が得られ、Ｚは、２−ＡＡＰＡの体積であり、これは、５．２μＬ、または０μＬのいずれかであった。５．２μＬの添加により、１００μＭの２−ＡＡＰＡの最終濃度、０．２ｍＭの最終濃度において、１０μＬのＮＡＤＰＨ、ＡＴＧおよび／または２−ＡＡＰＡ（示される濃度でまたは任意の還元酵素特異的阻害剤）、および工程からの１０μＬの細胞培養物上清が得られた。次に、サンプルを５分間インキュベートさせた。次に、以下の試薬を加えた：０．１５ｍＭの最終濃度になるまで１０μＬの酸化型グルタチオン、および３ｍＭの最終濃度になるまで１０μＬのＤＴＮＢ。各ウェルをマルチチャンネルピペットで迅速に混合した。各ウェルにおける総体積は、約２００μＬであった。４１２ｎｍの波長における吸光度を３０秒毎に２０分間測定した。
【０２５８】
分析
還元酵素の活性を以下のように計算した。各ウェルについての１分当たりの吸光度の変化（Δ４１２）を測定した。典型的に、実験の開始時の時間のずれおよび検出器の飽和／アッセイの終わり頃のウェルにおける試薬の枯渇のため、最初の１〜３分間および最後の５〜１０分間を除外した。次に、Δ４１２，補正の補正値を得るように、バックグラウンドを各細胞培養サンプルウェルから差し引いた（Δ４１２，サンプル−Δ４１２，バックグラウンド）。次に、活性を下式によって計算した。
【数１】
2019521961.tif 000004
式中、εＴＮＢ＝６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１である。
【０２５９】
ウエスタンブロットアッセイ
還元酵素を検出するために以下に示される様々な実施例において、ウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット手順では、３Ｌのバイオリアクターからの細胞ペレットを試験の終了まで冷凍貯蔵し、その後、標準的な方法を用いて、既に記載されるようにウエスタンブロットを行った（Ｈａｎｄｌｏｇｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２１：１４４５−１４５１，２０１４）。一次抗体を、示される濃度で使用した：１／３３３の抗ＴｒｘＲ１、１／１０００の抗Ｔｒｘ１、１／３３３の抗Ｇｒｘ、および１／２０００の抗ＧＲ。
【０２６０】
酵素精製
還元酵素を細胞サンプルから精製して、還元酵素阻害剤の特異性を確認した。ｍＡｂ  Ｂ（ＣＨＯ細胞株Ｂ  ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶによって産生されるＩｇＧ抗体）の１４日目の培養物を遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、５０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．５中で再度懸濁させた。溶液を均質化し、０．２μｍでろ過してから、２’５’−ＡＤＰセファロース４Ｂ樹脂のカラムに充填した。還元酵素を、同じトリス緩衝液中の０〜０．３ｍＭのＮＡＤＰ＋の線形に増加する勾配を用いて溶離した（Ｙａｄａｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｉｎｔ．，６２：１９３−１９８，２０１３）。収集された画分の還元酵素活性を、実施例３に記載されるアッセイを用いて決定した。さらに、ウエスタンブロット分析を用いて、収集された画分中のＴｒｘＲ１およびＧＲを検出した。
【０２６１】
採取された細胞培養液精製
採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）からｍＡｂを回収するための捕捉工程として、プロテインＡ樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた精製を行い、続いてウイルス不活性化のための低ｐＨ処理を行った。中間および最終ポリシングクロマトグラフィー工程は、それぞれアニオン交換（Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ６５０−Ｍ，Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびカチオン交換（ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳ樹脂、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）クロマトグラフィーを含む。生成物を、限外ろ過／透析ろ過を用いて製剤原料へと製剤化した。
【０２６２】
実施例１：製造中の抗体還元
製造プロセスの細胞培養段階中のジスルフィド結合含有タンパク質に起こる還元の量を決定するために、３つの異なるモノクローナル抗体を３つの異なる細胞株中で製造し、分子の還元の程度を測定した。この実験では、３つのモノクローナル抗体、ｍＡｂ  Ａ、ｍＡｂ  Ｂ、およびｍＡｂ  Ｃをそれぞれ細胞株Ａ（ＣＨＯ  ＣＡＴ−Ｓ）、Ｂ（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ）、およびＣ（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ）中で産生した。モノクローナル抗体ｍＡｂ  Ａは、ＩｇＧ１分子であり、ｍＡｂ  Ｂは、ＩｇＧ２分子であり、ｍＡｂ  Ｃは、ＩｇＧ４分子である。全ての３つのプロセスは、同様の細胞成長、細胞生存率、および力価生成を有する。さらに、全ての３つの発現系は、製造プロセス中に還元酵素活性を生じた。各細胞培養物上清中の還元抗体の量を培養の６日目から開始して決定した。ｍＡｂ分子の還元の程度を上述される手順に従ってキャピラリー電気泳動によって決定した。図２Ａに示されるように、全ての３つの発現系において、無傷の抗体のパーセントは、８日目から開始して時間とともに低下し、細胞株Ｂが抗体還元の最も高い程度を生じ、細胞株Ｃが１４日目に最も多い量の無傷の抗体を生じた。
【０２６３】
各発現系において、検出される抗体還元の量と還元酵素活性との間に相関があるかどうかを決定するために、各細胞培養サンプルにおける総還元酵素活性を、上記の実施例３に記載される比色還元酵素アッセイプロトコルを用いて評価した。図２Ｂに見られるように、産生された全ての３つの発現系は、１４日目の細胞培養物より還元酵素活性を増加させた。同様の量の１４日目の細胞培養物還元酵素活性が細胞株ＡおよびＣについて観察された一方、細胞株Ｂは、細胞株ＡおよびＣと比較してほぼ２倍のレベルの還元酵素活性を示した。細胞株Ｂに関連するより高い還元酵素活性は、細胞株Ｂの約半分の還元酵素活性を生じた発現系によってそれぞれ産生されたｍＡｂ  ＡおよびｍＡｂ  Ｃと比較してより高いパーセントの還元ｍＡｂ  Ｂを生じた。
【０２６４】
実施例２：チオレドキシンおよびグルタチオン系の検出
分析される３つの細胞株がＴｒｘＲ１、Ｔｒｘ１、ＧＲ、およびＧｒｘを発現したことを確認するために、ウエスタンブロット分析を６日目および１０日目の個々の細胞培養物からの細胞ペレットにおいて行って、グルタチオンおよびチオレドキシン系の酵素の発現を検出した。全ての３つの細胞株がＴｒｘＲ１、Ｔｒｘ１、ＧＲ、およびＧｒｘを発現し、これらの分子は、活性チオレドキシンおよびグルタチオン系に必要とされる。過去の研究は、グルタチオンが１０ｍＭを超える濃度でＣＨＯ細胞中に存在することを実証した（Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６５：１１７−１２６）。
【０２６５】
実施例３：抗体還元に対するグルタチオンおよびチオレドキシン系の影響
抗体還元における各酵素系の役割を、これらの還元酵素系が抗体還元を引き起こす条件を決定することによって評価した。精製された組み換え哺乳動物還元酵素を用いて、精製されたｍＡｂ  Ｂを、１）酵素なし、２）１μＭのＴｒｘＲ１、３）０．１μＭのＴｒｘＲ１、４）２．５μＭのＴｒｘ１、および５）０．１μＭのＴｒｘＲ１＋２．５μＭのＴｒｘ１を含有する５つの溶液中に添加することにより、チオレドキシン系を評価した。全てのサンプルは、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨを含有しており、それを室温で一晩貯蔵した。ゲルのようなデジタル画像が、マイクロチップに基づくキャピラリー電気泳動分析から取得された。上記の結果と一致して、ｍＡｂ  ＢがＴｒｘＲ１およびＴｒｘ１の両方の存在下でのみ還元され、それにより、還元が起こるためのチオレドキシン系（ＴｒｘＲ１およびＴｒｘ１）における両方の酵素の必要性を実証している。
【０２６６】
組み換え哺乳動物酵素を用いた同じ手法を用いて、ｍＡｂ  Ｂを、１）酵素なし、２）１ｍＭのＧＳＳＧ（酸化型グルタチオン）、３）０．２μＭのＧＲ（グルタチオン還元酵素）、４）０．２μＭのＧＲおよび１ｍＭのＧＳＳＧ、ならびに５）０．０２μＭのＧＲおよび１ｍＭのＧＳＳＧを含有する５つの溶液に添加することにより、グルタチオン系を評価した。前述したように、全てのサンプルを、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨを含有するトリス緩衝液、ｐＨ７．４中で調製し、室温で一晩貯蔵した。結果は、ＧＳＳＧを単独で含有する溶液中で最小のｍＡｂ  Ｂ還元を示した。これは、ＧＳＳＧ中の不純物の結果である。還元を引き起こさない酸化型グルタチオンは、還元を引き起こす約２％の還元型グルタチオンを含有する。ｍＡｂ  Ａは、ＧＲおよびＧＳＳＧの両方を含有する溶液中で還元された。これらの結果は、ＧＳＨ（還元型グルタチオン）を産生し、その結果、ｍＡｂ  Ｂのジスルフィド結合を還元するための、ＧＲによるＧＳＳＧの還元に関与する機構と一致している。
【０２６７】
ｍＡｂ  ＡまたはｍＡｂ  Ｃのいずれかの存在下でこれらのアッセイを行うとき、同様の結果が得られた。いずれの場合も、チオレドキシン系およびグルタチオン系は、タンパク質製造プロセス中に抗体還元において役割を果たすようである。
【０２６８】
実施例４：特異的還元酵素阻害剤の評価
細胞培養サンプルにおけるチオレドキシンおよびグルタチオン系の還元酵素活性のレベルを決定するために、これらの酵素系のそれぞれの様々な阻害剤の特異性を評価した。ＴｒｘＲ１は、Ｔｒｘ１を還元させる主な酵素であり、したがってチオレドキシン系の中心的成分および阻害の標的である。ＧＲは、グルタチオン系の類似の中心的成分である。その結果、ＴｒｘＲ１の活性の阻害が全チオレドキシン系の阻害を引き起こし、ＧＲの活性の阻害が全グルタチオン系の阻害を引き起こす。ＴｒｘＲ１およびＧＲのいくつかの市販の阻害剤があり、これらの阻害剤の特異性は、各酵素系からの還元酵素活性の定量化を可能にすることが実験的に確認され得る。いくつかの阻害剤をスクリーニングし、ＡＴＧをＴｒｘＲ１の阻害剤として選択し、２−ＡＡＰＡをＧＲの阻害剤として最初に選択した。
【０２６９】
ＡＴＧおよび２−ＡＡＰＡの特異性を、ヒトおよびラットからの精製された組み換え還元酵素を用いて評価した。溶液の還元酵素活性が、図２Ｂに示される培養サンプルにおいて観察される活性と同様になるように、精製された組み換え酵素の溶液を調製した。組み換えＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１、ＧＲ／ＧＳＳＧ、または両方の酵素系を含有する溶液を、０．０５μＭ〜５μＭの範囲の増加する濃度のＡＴＧを用いて調製した。全てのサンプルを、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨを含有するトリス緩衝液、ｐＨ７．４中で調製した。還元酵素活性を、上で説明されるようにＤＴＮＢの還元を監視することによって決定した。図３Ａに見られるように、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１を含有する溶液の還元酵素活性は、ＡＴＧの濃度の増加とともに低下した。０．１μＭより高いＡＴＧ濃度でＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１還元酵素活性はごくわずかであった。ＧＲ／ＧＳＳＧを含有する溶液の還元酵素活性は、５μＭより低いＡＴＧ濃度によって影響されなかった。チオレドキシンおよびグルタチオン系の両方を含有する溶液の還元酵素活性は、ＡＴＧの全ての濃度において、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１を含有するサンプルおよびＧＲ／ＧＳＳＧを含有するサンプルの合わせた活性にほぼ等しかった。この結果は、１つの酵素系が他の酵素系の活性に影響を与えずに選択的に阻害され得るという結論を裏付ける。
【０２７０】
同様に、ＧＲ阻害剤、２−アセチルアミノ−３−［４−（２−アセチルアミノ−２−カルボキシエチルスルファニルチオカルボニル−アミノ）フェニルチオカルバモイルスルファニル］プロピオン酸（２−ＡＡＰＡ、Ｓｅｅｆｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ，２００９．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４：２７２９−２７３７）を評価した。ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１、ＧＲ／ＧＳＳＧ、または両方の酵素系を含有する溶液を、阻害剤なし（０μＭ）、または１０μＭ〜２００μＭの範囲の増加する濃度の２−ＡＡＰＡの存在下で調製し、還元酵素活性を、上に記載されるプロトコルに従って決定した。図３Ｂに示されるように、この濃度範囲にわたり、２−ＡＡＰＡは、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１溶液の還元酵素活性に対して最小の効果を有していた一方、１００μＭおよびより高い濃度でＧＲ／ＧＳＳＧ活性を完全に阻害した。前の結果と同様に、両方の酵素系を含有する溶液の活性は、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１およびＧＲ／ＧＳＳＧ溶液からの活性の追加にほぼ等しかった。これは、１つの酵素系が他の還元酵素系の還元酵素活性に影響を与えずに選択的に阻害され得るというさらなるエビデンスを提供する。要約すれば、２−ＡＡＰＡは、５０〜２００μＭの濃度でグルタチオン系活性の特異的阻害剤であり、ＡＴＧは、０．５〜１μＭの濃度でチオレドキシン系活性の特異的阻害剤であった。さらに、阻害剤なしの場合と、ＡＴＧまたは２−ＡＡＰＡのいずれかを用いた場合との還元酵素活性の差は、チオレドキシンおよびグルタチオン系のそれぞれからの活性であった。
【０２７１】
実施例５：タンパク質還元に対する特異的還元酵素の影響
特定の還元酵素系からの活性が還元抗体に変換し得ることを確認するために、抗体還元に対する各還元酵素系の影響を決定するための第２の方法を開発した。還元アッセイの原理は、上述される還元酵素活性アッセイと同様である。阻害剤なしでのタンパク質還元のパーセントをＧＲまたはＴｒｘＲ１の特異的阻害剤の存在下でのタンパク質還元のパーセントと比較した。このアッセイでは、精製されたｍＡｂ  Ｂを、組み換え哺乳動物ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１または組み換え哺乳動物ＧＲ／ＧＳＳＧを含有する溶液に添加し、無酸素環境中で一晩貯蔵した。還元ｍＡｂ  Ｂ抗体のパーセントを、上に記載されるようにキャピラリー電気泳動を用いて評価した。
【０２７２】
ＴｒｘＲ１阻害剤、ＡＴＧを、０〜１ｍＭの範囲の濃度で評価した。図４Ａに見られるように、０．１ｍＭにおいて、ＡＴＧは、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１（黒色のバー）を含有するサンプルにおける抗体還元の完全な阻害、およびＧＲ／ＧＳＳＧ（灰色のバー）を含有するサンプルにおける抗体の完全な還元によって示されるように、チオレドキシン系からの還元を特異的に阻害した。より高い濃度では、ＡＴＧは、０．５ｍＭおよび１ｍＭのＡＴＧで処理されたＧＲ／ＧＳＳＧサンプルにおける増加した量の無傷の抗体によって示されるように、チオレドキシン系に対してもはや特異的でなかった。その結果、チオレドキシン系によって引き起こされる還元抗体の量を評価するために、ＡＴＧは、それがＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１によって引き起こされる還元を特異的に防ぐ濃度である０．１ｍＭで細胞培養サンプルに含まれていた。
【０２７３】
ＧＲ阻害剤、２−ＡＡＰＡは、ＧＲの活性部位におけるシステイン残基への共有結合を形成することによって機能する。２−ＡＡＰＡを、上にＡＴＧについて記載されるのと同じ方法を用いて最初に評価したが、２−ＡＡＰＡは、抗体還元を直接引き起こすため、このアッセイに適していない。その結果、ＧＲ阻害剤硫酸銅（ＩＩ）（ＣｕＳＯ４）を代わりに使用した（Ｒａｆｔｅｒ，Ｇ．Ｗ．，１９８２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．，２７：３８１−３９１）。０〜１００μＭの範囲のＣｕ２＋の濃度を調べた。図４Ｂに示される結果は、３〜１００μＭの濃度のＣｕ２＋が、ＧＲ／ＧＳＳＧ（灰色のバー）を含有するサンプルにおける抗体還元を防いだことを示す。しかしながら、チオレドキシン系からの抗体還元は、同じ濃度範囲（黒色のバー）にわたって部分的に阻害されたに過ぎなかった。２つの還元酵素系によって引き起こされる抗体還元の量の最も大きい差は、３μＭのＣｕ２＋で生じ、ここで、ＧＲ／ＧＳＳＧによって引き起こされる抗体還元が、ほぼ完全に阻害された一方、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１によって引き起こされる抗体還元は、ＴｒｘＲ１／Ｔｒｘ１サンプル中に残っている２０％の無傷の抗体によって示されるように部分的に阻害された。これらの結果は、３μＭのＣｕ２＋が、ＧＲに対する完全に特異的な阻害剤でなかった一方、この濃度のＣｕ２＋は、チオレドキシン系と比較してグルタチオン系によって引き起こされる還元の阻害に対してより大きい効果を有し、したがって抗体還元におけるグルタチオン系の役割を評価するのに好適であることを示す。
【０２７４】
実施例６：還元酵素特異的阻害剤との細胞還元酵素感受性の相関
還元酵素特異的阻害剤を、ラットおよびヒトからの精製された組み換え哺乳動物酵素を用いて上記のように評価した。細胞培養物によって産生される還元酵素が同じ阻害剤濃度によって同様に影響されるのを確実にするために、ＧＲおよびＴｒｘＲ１酵素を、２’５’−ＡＤＰ親和性カラムを用いて、細胞株Ｂの１４日目の培養物から精製した。このカラムは、補因子としてＮＡＤＰＨを使用する酵素を保持する。還元酵素を、ＮＡＤＰ＋の線形に増加する勾配を用いて溶離した。ウエスタンブロット分析は、ＧＲおよびＴｒｘＲ１が、カラム画分Ｂ１−Ｃ２中で共溶出されたことを示した。図５Ａに示されるように、特異的還元酵素阻害剤、０．５μＭのＡＴＧおよび１００μＭの２−ＡＡＰＡを用いて、画分に応じて、６０〜７５％の還元酵素活性がＴｒｘＲ１から得られ、２５〜４０％がグルタチオン還元酵素から得られたことが分かった。２つの系からの追加される活性は、各画分について阻害剤の非存在下で検出される総活性とほぼ等しかった。これは、阻害剤の特異性をさらに実証している。すなわち、還元酵素阻害剤が両方の酵素系を非特異的に阻害している場合、追加される還元酵素活性は、阻害剤が追加されない場合に検出される還元酵素活性より大きかった。さらなる確認として、両方の阻害剤ＡＴＧおよび２−ＡＡＰＡがサンプルに加えられたとき、還元酵素活性は完全に阻害された。この結果は、還元酵素阻害剤の有効性および特異性をさらに実証する。還元酵素活性を有する画分をプールし、抗体還元アッセイにおいて測定された阻害剤濃度でさらに評価した。
【０２７５】
精製されたｍＡｂ  Ｂを、プールされた画分（ＰＦ）、組み換えＴｒｘ１、ＧＳＳＧ、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＧ、およびＣｕ２＋の様々な組合せを含有するいくつかの溶液中に添加した。溶液を室温で一晩インキュベートし、残っている無傷の抗体の量を、上述されるプロトコルに従ってキャピラリー電気泳動によって決定した。第１の組のサンプルでは、精製されたｍＡｂ  Ｂを、プールされた画分中に、ＮＡＤＰＨとともにまたはＮＡＤＰＨを伴わずに添加した。図５Ｂに見られるように、これらのサンプルのいずれも抗体還元活性を示さず、これは、ＧＲおよびＴｒｘＲ１が、単独では、ＮＡＤＰＨの存在下であっても抗体を還元させることができないことを実証している。
【０２７６】
第２の組のサンプルでは、精製されたｍＡｂ  Ｂを、プールされた酵素、ＮＡＤＰＨ、ＧＳＳＧ、ならびに阻害剤なし、３μＭのＣｕ２＋、または１００μＭのＡＴＧのいずれかを含有する溶液中に添加した。図５Ｂに示されるように、プールされた酵素、ＮＡＤＰＨ、およびＧＳＳＧを含有する溶液は、測定可能な抗体還元を示した。この溶液は、ＧＲ、ＧＳＳＧ、およびＮＡＤＰＨを含有しており、これらは、グルタチオン系に必要とされる。さらに、Ｃｕ２＋が全ての抗体還元を完全に阻害した一方、ＡＴＧは、抗体還元を阻害せず、これは、３μＭのＣｕ２＋がグルタチオン系による抗体還元を完全に防ぐのに十分である一方、１００μＭのＡＴＧが、ＣＨＯ細胞培養物から単離されたＧＲによる抗体還元に影響を与えないことを示す。
【０２７７】
第３の組の溶液は、プールされた酵素、ＮＡＤＰＨ、Ｔｒｘ１、ならびに阻害剤なし、３μＭのＣｕ２＋、または１００μＭのＡＴＧのいずれかを含有していた。図５Ｂに示されるように、プールされた酵素、ＮＡＤＰＨ、およびＴｒｘ１を含有する溶液が完全な抗体還元を示した一方、Ｃｕ２＋は、抗体還元をわずかに防ぎ、ＡＴＧは、還元を完全に防いだ。この結果は、同様に、ＴｒｘＲ１に対するＡＴＧの特異性を確認する。対照としての最後のサンプルでは、ｍＡｂ  Ｂを、ＮＡＤＰＨ、Ｔｒｘ１、およびＧＳＳＧを含有する溶液中に添加した。図５Ｂに見られるように、このサンプル中で抗体還元は検出されず、これは、ＣＨＯ細胞培養物から精製されたＧＲまたはＴｒｘＲ１が抗体還元に必要とされたことを実証している。
【０２７８】
総合すれば、この実施例の結果は、細胞培養物から単離された還元酵素が、組み換えラットおよびヒト還元酵素で観察されるのと同様の、阻害剤濃度に対する感受性を有することを実証している。これらの結果は、ＡＴＧおよびＣｕ２＋が、チオレドキシンおよびグルタチオン系のそれぞれによって引き起こされるタンパク質還元の還元酵素特異的阻害剤であり得ることを実証している。さらに、追加されたＮＡＤＰＨ、およびＧＳＳＧを含むプールされた酵素を含有するサンプルでは、依然として約３０％の無傷のｍＡｂがアッセイの終了時にサンプル中に残っている一方、抗体は、Ｔｒｘ１を含有する類似のサンプル中で完全に還元された。これは、プールされた画分中でＧＲ（２５〜４０％）に対するＴｒｘＲ１（６０〜７５％）のより高い相対的活性の反映であるようであった。
【０２７９】
実施例７：培養サンプルにおける還元酵素活性の阻害
チオレドキシンおよびグルタチオン系の還元酵素活性を、それぞれ１００μＭおよび０．５μＭの既に評価された特異的阻害剤２−ＡＡＰＡおよびＡＴＧを用いて、同じＣＨＯ細胞株Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの１４日目の培養サンプル中で評価した。図６Ａ中のデータを生存細胞密度に対して標準化した。細胞株Ａ、Ｂ、およびＣは、上記の実施例６に記載されている。細胞株Ｄは、細胞株ＣＨＯ  ＣＡＴ−Ｓであり、ＩｇＧ１  ｍＡｂ（ｍＡｂ  Ｄ）を産生するために安定的にトランスフェクトされる。
【０２８０】
図６Ａに示される結果は、還元酵素阻害剤の非存在下において、細胞株Ｂが細胞株ＡおよびＣの約２倍の還元酵素活性を示し、細胞株Ｄが細胞株ＡおよびＣの約半分の還元酵素活性を示したことを示す。全ての４つの細胞株について、２−ＡＡＰＡおよびＡＴＧの両方が加えられた場合、還元酵素活性はごくわずかであった。これは、２−ＡＡＰＡおよびＡＴＧの組合せが還元酵素活性の完全な阻害に十分であったことを示した。
【０２８１】
ＡＴＧまたは２−ＡＡＰＡのいずれかを用いた還元酵素活性を、チオレドキシンおよびグルタチオン系からの活性の量を決定するために、阻害剤を用いない場合の活性と比較し、データが図６Ｂに示される。ＴｒｘＲ１特異的阻害剤、ＡＴＧの使用により、細胞株Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤにおけるそれぞれ３５％、６０％、８７％、および６０％の総還元酵素活性がチオレドキシン系から得られたことが分かった。同様に、ＧＲ特異的阻害剤、２−ＡＡＰＡを用いた結果は、７０％、４５％、５％、および４５％の総還元酵素活性がそれぞれ細胞株Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤにおけるグルタチオン系によって引き起こされたことを実証した。データは、各還元酵素系からの還元酵素活性の寄与が細胞株間で異なっていたことを示す。
【０２８２】
これらの結果は、異なる細胞株／プロセスにわたるチオレドキシンおよびグルタチオン系の活性の高い変動性を実証した。細胞株Ａは、グルタチオン系に起因する高いパーセントの還元酵素活性を有し、細胞株ＢおよびＤは、チオレドキシンおよびグルタチオン系のそれぞれに起因する還元酵素活性の相対的に同等のレベルを有していた一方、対照的に、細胞株Ｃで観察される還元酵素活性の大部分は、チオレドキシン系に起因していた。
【０２８３】
実施例８：細胞培養サンプルによって示される抗体還元
抗体還元に対するチオレドキシンおよびグルタチオン系の影響を、実施例２に記載されるように、細胞株Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤからの１４日目の培養サンプル（細胞＋培地）を用いて決定した。サンプルを、阻害剤を用いておよび用いずに調製し、無酸素環境中で一晩インキュベートし、還元抗体のパーセントを、キャピラリー電気泳動を用いて決定し、結果が図７に示される。還元酵素阻害剤の非存在下において、４つの細胞株からの全ての４つのｍＡｂが還元された。１００μＭのＡＴＧの存在下でｍＡｂ  Ａが完全に還元された一方、それぞれ約６７．５％、約８７％、および約３５％の、ｍＡｂ  Ｂ、ｍＡｂ  Ｃ、およびｍＡｂ  Ｄは無傷のままであった。３μＭのＣｕ２＋の存在下でｍＡｂ  Ａが無傷のままであった一方、ｍＡｂ  ＢおよびｍＡｂ  Ｃは、それぞれ約５０％還元され、約２０％のｍＡｂ  Ｄが無傷のままであった。ＡＴＧおよびＣｕ２＋の両方の存在下において、検出可能な抗体還元が全ての３つの抗体について阻止された。
【０２８４】
ＴｒｘＲ１阻害剤は、ｍＡｂ  Ａ還元を防ぐことができなかったが、ＧＲ阻害剤は、ｍＡｂ  Ａ還元を防いだ。同様に、両方の阻害剤の組合せが還元を防いだ。これらの結果は、ｍＡｂ  Ａ還元が主にグルタチオン系によって引き起こされ、チオレドキシン系の関与がほとんどないことを示す。ＴｒｘＲ１およびＧＲ阻害剤は、それぞれｍＡｂ  Ｂ還元を部分的に防いだ一方、両方の阻害剤の組合せが還元を完全に防いだ。これらの結果は、ｍＡｂ  Ｂ還元における両方の酵素系の関与を実証した。
【０２８５】
同様に、ＴｒｘＲ１阻害剤の存在下において、ｍＡｂ  Ｄは、かなりの還元（約３５％無傷）を起こし、ＧＲ阻害剤の存在下において、ｍＡｂ  Ｄはまた、かなりの還元（約２０％無傷）を起こした。しかしながら、両方の阻害剤が含まれていた場合、無傷のｍＡｂ  Ｄのパーセントは、約８０％まで上昇し、これは、ｍＡｂ  Ｄ還元における両方の酵素系の関与を実証している。
【０２８６】
ＴｒｘＲ１阻害剤の存在下において、ｍＡｂ  Ｃは、わずかな還元（約８７％無傷）を起こし、ＧＲ阻害剤の存在下において、ｍＡｂ  Ｃは、かなりの還元（約４６％無傷）を起こした。上で決定されるように、Ｃｕ２＋は、チオレドキシン系を部分的に阻害した。合わせたこれらの結果は、ｍＡｂ  Ｃが主にチオレドキシン系によって還元されることを実証した。
【０２８７】
実施例９：タンパク質製造中の還元電位
ジスルフィド結合還元の電位を、ＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ−Ｂ）を産生する５０Ｌのバイオリアクター試験の下流の処理中に観察した。上述される真空／ＧＸアッセイを用いた還元電位の調査は、少なくともこのｍＡｂについての流加バイオリアクタープロセス中のモノクローナル抗体鎖間ジスルフィド結合の還元の可能性を示した。異なるレベルの還元電位を、バイオリアクター試験Ａ（ＢＲ−Ａ）の８〜１４日目に得られたサンプルにおいて観察した。以下の表２に示されるように、還元電位を異なる規模でのいくつかのバイオリアクター試験において１１〜１３日目間に観察した。
【０２８８】
【表２】
2019521961.tif 000005
【０２８９】
全てのアミノ酸の濃度を、試験ＢＲ−Ａ〜ＢＲ−Ｄを通して取られたバイオリアクターサンプルにおいて、製造者の仕様書に従ってＵＰＬＣアミノ酸分析によって決定した。これらの結果は、システイン／シスチンの濃度の低下が還元電位の増加と相関していたことを示した。表２に示される断片化の結果との、図８中の結果の比較は、還元電位が細胞培地中のシスチンのレベルと相関していたことを示す。シスチンが１１〜１３日目までに枯渇するかまたはほぼ枯渇すると、還元電位の増加が観察された。１４日目に、シスチンレベルは、１３日目に行った栄養供給（ＮＦ）添加のために上昇し、低下した還元電位が観察された。
【０２９０】
実施例１０：細胞培養物酸化還元電位を介した抗体還元の防止
細胞培養物酸化還元電位を用いて、バイオリアクター中で起こっている抗体鎖間ジスルフィド結合還元の可能性を監視した。
【０２９１】
細胞培養物酸化還元電位を酸化還元プローブ（Ｍｅｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）によってオンラインで測定した。細胞培養物酸化還元電位の増加は、より酸化的な環境を示す一方、より低い細胞培養物酸化還元電位は、より還元的な環境を示す。培養物酸化還元電位が−５５ｍＶ超または−７０ｍＶ超に維持されるプロセスは、ｍＡｂ  ＡおよびｍＡｂ  Ｂのそれぞれについて最小量の還元抗体を有していた。細胞培養物酸化還元電位が−５５ｍＶ未満または−７０ｍＶ未満であったプロセスは、それぞれ可変および高レベルの還元ｍＡｂ  ＡおよびｍＡｂ  Ｂを有していた（図９Ａおよび図９Ｂ）。この分析は、３Ｌ規模の２０を超える異なるプロセスからのデータを含んでおり、ここで、還元は、制御されていないか、または異なる濃度のＺｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｅ２＋、シスチン、溶存酸素、βメルカプトエタノール、およびグルタチオンの添加によって制御されていた。結果は、使用される還元緩和手法に関わりなく、細胞培養物酸化還元電位がｍＡｂ  Ａでは−５５ｍＶまたはｍＡｂ  Ｂでは−７０ｍＶの閾値を超えて維持される限り、還元抗体の量は最小限に抑えられたことを実証した。還元を防ぐのに必要な閾値は、治療用タンパク質、細胞株、基礎培地、または酸化還元プローブ校正の特性に基づいて、必要に応じてさらに校正され得る。
【０２９２】
開示される方法を用いて、オンライン酸化還元測定によって還元緩和手法の有効性を評価することができる。酸化還元電位を、特定された閾値を超えて維持することにより、還元緩和手法が達成される。さらに、酸化還元プローブは、制御システムと組み合わせることができ、制御システムは、細胞培養物酸化還元電位を、還元が起こる可能性の低い閾値を超えて維持するように、還元緩和手法を自動的に調整する。制御システムは、細胞培養物酸化還元電位の低下に応答して、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｓｅ２＋、シスチン、溶存酸素、βメルカプトエタノール、またはグルタチオンの濃度を増加させるのに使用され得る。細胞培養物酸化還元電位に基づく制御システムの使用により、化学的緩和剤の不必要な過剰添加（またはＤＯ設定点の増加）が防止される。これは、還元を防ぐのに必要な化学物質が下流の精製プロセスによって除去されなければならず、高いＤＯが最終的なプロセス力価を低下させ得るために有利である。
【０２９３】
実施例１１：バイオリアクタータンパク質製造試験ＢＲ−Ｅ
この実施例では、ｍＡｂ−Ｂ（ＢＲ−Ｅ）を用いた４つの部分の小規模（３Ｌ）バイオリアクター試験、流加プロセスを行い、それにより、上述される部分ＡおよびＢを含む栄養供給の量が、以下の表３に示されるように５回のＮＦ添加のうちの５回目（１１日目）に増加した。バイオリアクターサンプルは、１０、１２、１４、および１６日目に取得し、真空／ＧＸアッセイを用いて還元電位について分析した。異なる量の栄養供給５（ＮＦ５）が補充された、ＢＲ−Ｅ  ３Ｌのバイオリアクター試験からのｍＡｂ−ＢからのサンプルにおけるＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸアッセイを用いて視覚化され、生産バイオリアクター試験の異なる時点で分析された無傷の抗体および抗体断片の画像は、断片化の程度がＮＦ５の量の増加とともに低下したことを示した。より少ないおよびより軽い断片バンドによって示されるように、バイオリアクターサンプルにおける増加する純度の無傷の抗体が１２、１４、および１６日目に得られた。このデータが以下の表３にまとめられている。
【０２９４】
【表３】
2019521961.tif 000006
【０２９５】
実施例１２：バイオリアクタータンパク質製造試験ＢＲ−Ｆ
この実施例では、ｍＡｂ−Ｂを用いた６つの３Ｌ規模のバイオリアクターを、以下の表４に示されるように対照量の２００％へのＮＦ部分ＡのＮＦ５添加の増加とともにまたはそれを伴わずに、ＮＦ３、ＮＦ４、およびＮＦ５添加におけるＮＦ部分Ｂの量を対照体積の１２５％、２００％、および２００％に増加させることによって栄養供給プロトコルに修正を加えた流加プロセスにおいて操作した。細胞培養サンプルを保持し、ある試験では１０日目に、およびバイオリアクターの全てのサンプルでは１２日目および１４日目に凍結させた。サンプルを、上述される真空／ＧＸ分析アッセイを用いて後に分析した。真空下で貯蔵し、１０、１２、および１４日目に採取したｍＡｂ−Ｂ  ＢＲ−Ｆを、ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸアッセイを用いて視覚化した。真空アッセイ結果が以下の表４にまとめられている。無傷のＭＡｂの純度は、対照量のＮＦ部分Ｂを収容しているバイオリアクター中で著しく低下した。しかしながら、増加した量のＮＦ部分Ｂを用いた条件は、非還元型ＧＸアッセイによって測定した際、真空処理の１２日または１４日後からのサンプルにおける抗体還元または無傷の抗体の純度の低下を示さなかった。
【０２９６】
【表４】
2019521961.tif 000007
【０２９７】
実施例１３：バイオリアクタータンパク質製造試験ＢＲ−Ｇ、ＢＲ−Ｈ、およびＢＲ−Ｉ
この実施例では、ｍＡｂ−Ｂを用いた２つの３Ｌ（ＢＲ−ＧおよびＢＲ−Ｈ）および５０Ｌ（ＢＲ−Ｉ）バイオリアクターを、流加（２分割供給）プロセスを用いて操作した。以下の表５に示されるように、ＮＦ部分Ｂを全体的に増加させたことを除いて、対照プロセスと同様の条件下でバイオリアクターを操作した。ＮＦ部分Ｂの各栄養供給添加の量は、対照量の２２５％に増加させたＮＦ５を除いて対照の１５０％に増加させた。ＮＦ５におけるＮＦ部分Ａの量も対照プロセスの量の１５０％に増加させた。栄養供給添加の回数を６回から５回に減少させた一方、プロセスにおけるＮＦ部分Ｂの総量を３８％増加させた。これは、Ｌ−シスチンの約２ｍＭの増加に相当していた。
【０２９８】
【表５】
2019521961.tif 000008
【０２９９】
細胞培養サンプルを１２および１４日目に試験から保持し、上に詳述される還元電位について分析した。無傷の抗体および抗体断片を、真空下での貯蔵の１２および１４日目にｍＡｂ−Ａ  ＢＲ−Ｇ  ３リットルバイオリアクター試験、ＢＲ−Ｈ  ３リットルバイオリアクター試験、およびＢＲ−Ｉ  ５０リットルバイオリアクター試験のＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸアッセイを用いて視覚化した。これらの画像は、ＮＦ部分Ｂを増加させたプロセスが、１２日目のサンプルにおいて、はるかに少ない抗体還元および増加した純度の無傷の抗体を示したことを示した。結果が表６にまとめられ、ＮＦ部分Ｂ（ＢＲ−Ｇ；ＢＲ−Ｈ；およびＢＲ−Ｉ）を増加させたプロセスが、元のプロセス（ＢＲ−Ａ、実施例２）と比較して、１２日目のサンプルにおいて、はるかに少ない抗体還元および増加した純度の無傷の抗体を示したことを示した。
【０３００】
【表６】
2019521961.tif 000009
【０３０１】
実施例１４：バイオリアクタータンパク質製造試験ＢＲ−Ｊ
この実施例では、２つの３Ｌ規模のバイオリアクター（ＢＲ−Ｊ−１およびＢＲ−Ｊ−２）を、試験用のＩｇＧ２モノクローナル抗体−Ａ（ｍＡｂ−Ａ）を発現するＣＨＯ細胞を用いた流加プロセスにおいて操作した。ｍＡｂ−Ａのための製造プロセスは、基礎培地の配合、接種および原料の基準、供給量、ならびに温度およびｐＨなどのバイオリアクター設定点に関してｍＡｂ−Ｂのものと異なっていた。このプロセスは、ｍＡｂ−Ｂプロセスに使用される５回の栄養供給と比べて６回の栄養供給を含む。プロセスはまた、ｍＡｂ−Ｂプロセス（１．５Ｌ）と比べてより低い初期作動体積（１．２Ｌ）から開始した。実施例１に記載されるｍＡｂ−Ｂプロセスと同様に、プロセスは、約１４日間の流加動物性タンパク質フリーの細胞培養を含んでいた。ｍＡｂ−Ｂ発現と同様に、ｍＡｂ−Ａが細胞培地中に分泌された。ｍＡｂ−Ａ細胞培養プロセスのための栄養供給プロトコルを、供給スキームに記載されるｍＡｂ−Ｂプロセスに対して、６回の栄養供給（ＮＦ１−６）のそれぞれにおけるＮＦ部分Ｂの量を表７に示されるように対照体積の２００％に増加させて、対照よりＮＦ添加当たり０．６０ｍＭの増加を含む点で修正した。細胞培養サンプルを保持し、バイオリアクタープロセスの５、８、１０、１２、および１４日目に凍結させた。サンプルを後に融解させ、真空／ＢｉｏＡアッセイを用いて還元電位について分析した。シスチンを含む追加の栄養供給を伴うおよび伴わないｍＡｂ−ＡバイオリアクターＢＲ−ＪサンプルについてのＢｉｏＡ／真空ＭＡｂ還元アッセイから得られる無傷の抗体および抗体断片の画像の分析は、無傷の抗体のパーセントが、シスチンを含むさらなる量のＮＦ部分Ｂを用いて１２日後に増加したことを示した。結果が表７にまとめられ、これは、無傷のｍＡｂの％が、シスチンを含むさらなる量のＮＦ部分Ｂを用いて、１２日後に増加したことを示した。また、バイオリアクターサンプルＢＲ−Ｊ−１およびＢＲ−Ｊ−２を、ＵＰＬＣを用いて分析して、バイオリアクター中のシスチン濃度を確認した。図１０に示される結果は、ＢＲ−Ｊ−２サンプルにおけるシスチンの増加を示す。
【０３０２】
【表７】
2019521961.tif 000010
【０３０３】
実施例１５：バイオリアクタータンパク質製造試験ＢＲ−Ｋ
この実施例では、２つの３Ｌ規模のバイオリアクター（ＢＲ−Ｋ−１およびＢＲ−Ｋ−２）を、試験用のＩｇＧ４モノクローナル抗体−Ｃ（ｍＡｂ−Ｃ）を発現するＣＨＯ細胞を用いた流加プロセスにおいて操作した。ｍＡｂ−Ｃのための製造プロセスは、異なる量の細胞培地成分および原料を含有していた基礎培地の配合、供給量、ならびに温度およびｐＨなどのバイオリアクター設定点に関してｍＡｂ−Ａのものと異なっていた。このプロセスは、ｍＡｂ−Ｂプロセスに使用される５回の栄養供給と比べて６回の栄養供給を含む。実施例１に記載されるｍＡｂ−Ａプロセスと同様に、プロセスは、約１４日間の流加動物性タンパク質フリーの細胞培養を含んでいた。ｍＡｂ−Ｂ発現と同様に、ｍＡｂ−Ｃが細胞培地中に分泌された。ｍＡｂ−Ｃプロセスは、栄養供給（ＮＦ１−６）のそれぞれとともに追加のＮＦ部分Ｂを加えることを含む、栄養供給プロトコルへの修正を含んでいた。以下の表８に示されるように、追加のＮＦ部分Ｂは、対照バイオリアクターと比較してシスチンのレベルを増加させた。細胞培養サンプルを保持し、バイオリアクタープロセスの１、４、５、６、８、１０、１２、および１４日目に凍結させた。
【０３０４】
サンプルを後に融解させ、真空／ＢｉｏＡアッセイを用いて還元電位について分析した。１ｍｌの培養物を−８０℃の冷凍庫中においてＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で凍結し、少なくとも１２時間後、培養サンプルを、３７℃の水浴中で融解させることによる凍結融解サイクルを用いて細胞を溶解させた。キャピラリーせん断方法を用いて細胞を溶解させるために、ＡＥＫＴＡ精製装置（ｐｕｒｉｆｉｅｒ）を用いて、システム出口に連結された内径０．００７インチ×１０ｃｍのステンレス鋼毛細管に通して、２２．２ｍＬ／分に培養サンプルの流量を制御するのに使用され得る。いずれかの溶解方法後、溶解細胞サンプルを５〜１０分間にわたって２１００〜１００００×ｇで遠心分離して、細胞および細胞残屑を除去し、上清を還元電位について分析した。このアッセイは、前の実施例に使用されるＧＸ分析装置の代わりにＢｉｏＡ分析装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。シスチンを含む追加の栄養供給を伴うおよび伴わないｍＡｂ−ＣバイオリアクターサンプルについてのＢＲ−Ｋ  ＢｉｏＡ／真空還元アッセイの無傷の抗体および抗体断片の画像が得られた。これらの画像は、溶解されたサンプルの純度が、対照条件と比較してＮＦ部分Ｂを増加させた条件について、完全に還元されたＭａｂのより低い割合を示したことを示した。結果は、以下の表８にまとめられ、凍結／融解サイクルまたはせん断デバイスのいずれかを用いて溶解されたサンプルの純度が、対照条件と比較してＮＦ部分Ｂを増加させた条件について、完全に還元されたＭａｂのより低い割合を示したことを示した。また、バイオリアクターサンプルを、ＵＰＬＣを用いて分析して、バイオリアクターにおけるシスチン濃度を確認した。この分析の結果が図１１に示され、これは、対照と比較してＢＲ−Ｋ−２サンプルにおけるシスチンの増加を示す。
【０３０５】
【表８】
2019521961.tif 000011
【０３０６】
実施例１６：サンプルの断片化および還元
サンプルを真空分析にかけた場合、それらを融解させ、ボルテックスした。約４００μＬのアリコートをガラス管に移した。管を、オン／オフ制御を提供し得るスクリューキャップＭｉｎｉｎｅｒｔ（商標）弁（ＶＩＣＩ  Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）によって密閉した小型の真空チャンバに入れた。真空をシリコンチューブに通して真空チャンバにかけ、チャンバを密閉した。次に、アルゴンガスを、アルゴン圧力が確立されるまでシリコンチューブに通してチャンバにかけて、チャンバを再度密閉した。上記の手順後、３サイクルの真空／アルゴンでプロセスを繰り返し、次に内部にアルゴンを入れた状態でチャンバを密閉した。次に、チャンバを室温で一晩インキュベートした。
【０３０７】
サンプルを分析するまで冷凍貯蔵した。融解させたら、４００〜６００μＬの各サンプルを培養管に移し、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を含有する非還元サンプル緩衝液中で混合した。変性させ、遊離チオールをＮＥＭによってキャッピングした後、サンプルを、サイズ分画および定量化を行うために、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて分析した。Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩを用いて、タンパク質および断片をレーザー誘起蛍光によって検出し、ゲルのような画像（バンド）および電気泳動図（ピーク）に変換した。
【０３０８】
抗体凝集分析
抗体凝集物のパーセントを、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）方法を用いて決定した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズシステムを、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１Ｍの硫酸ナトリウム、ｐＨ６．８の移動相緩衝液を１ｍＬ／分の流量で用いて、Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ  ＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）（７．８ｍｍ×３００ｍｍ）とともに使用した。２８０ｎｍにおける吸光度クロマトグラフィーを用いて結果を定量化した。
【０３０９】
採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）における遊離チオール定量化
採取された細胞培養液中の遊離チオールの量を、ジスルフィドが結合されたペプチドの予測質量を非還元Ｌｙｓ−Ｃペプチドマッピングからの観測質量に一致させることによって決定した。簡潔には、サンプルを変性させ、セリンプロテアーゼによる消化前に希釈した。プロテアーゼ消化後、各反応混合物の半分をＤＴＴの添加によって還元させた。消化物を、Ｃ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって分離し、ＵＶ検出器およびオンライン質量分析計を用いて分析した。ジスルフィド結合連結されたペプチドは、非還元試験でのみ存在し、還元条件下で消失するであろう。
【０３１０】
遊離チオール定量化アッセイ
遊離チオールアッセイは、不対合システイン残基における遊離チオール基のレベルを測定することにより、タンパク質中のジスルフィド結合の完全性を評価する。遊離チオールに結合し、着色されたチオレートイオンを放出する化合物（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）またはＤＴＮＢ）とともに、サンプルを天然および変性条件下でインキュベートする。着色されたチオレートイオンを、紫外・可視分光光度計を用いて検出する。遊離チオールの濃度を標準的な曲線から内挿し、遊離チオール対抗体モル比を報告する。
【０３１１】
実施例１７：採取された細胞培養液における凝集形成に対する抗体ジスルフィド結合還元の影響
小規模（３Ｌ）バイオリアクター流加試験を、ｍＡｂ  Ｅ（ＩｇＧ１モノクローナル抗体）を用いて行い、馴化培地を１４日目に収集した。連続遠心分離機を用いた大規模採取の影響を模倣するように、採取した材料の一部を、実施例１５に記載される毛細管を用いたせん断応力にかけた。せん断された材料を４０ｍｌのアリコートに分割した後、アリコートにＥＤＴＡ、ＣｕＳＯ４−５Ｈ２０、シスチン、ＣｕＳ０４−５Ｈ２０およびシスチンの組合せのいずれかを添加するか、または添加しないままにした。非せん断材料およびせん断されたアリコートを５０ｍｌの遠心分離管中で遠心分離し、上清を各条件から移した。次に、これらの条件のそれぞれからの上清を−８０Ｃで直ちに凍結させるか、または２〜８℃で８日間貯蔵した後、−８０℃で凍結させた。凍結されたサンプルを、サンプルを１２時間真空下で保持することにより、還元電位について後に試験し、軽鎖および重鎖断片の還元種を測定するために、非還元型ＧＸＩＩアッセイにおいて試験した。また、サンプルを、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を用いて、ｍＡｂの凝集のレベルについて試験した。表ＸＸによって示されるように、真空処理後に無傷のｍＡｂ％が０に減少したことによって示されるように、対照細胞培養材料をせん断することにより、サンプルが還元電位を有するようになる。対照的に、９．５、１９、および３８ｍＭの濃度のＥＤＴＡ添加または４および８ｍＭの濃度のシスチン添加を伴うせん断された材料は、採取時に還元電位を示さなかった。表９はまた、２〜８℃で８日後の材料の凝集に対する同様の影響を示す。細胞培養材料のせん断は、非せん断材料を上回る凝集のかなりの増加を示した。しかしながら、９．５、１９、および３８ｍＭのＥＤＴＡまたは４および８ｍＭのシスチンの添加は、ｍＡｂ凝集の程度を抑えた。
【０３１２】
実施例１８：ｍＡｂ  Ｂの精製プロセスにおける凝集物形成に対する抗体ジスルフィド結合還元の影響
ＩｇＧ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ｂ）の精製中、増加したレベルの断片が、以下の表１０に示されるように観察された。高レベルの不純物が捕捉産物中でまず検出され、プロセスにおける次の工程に運ばれた。図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるように、非還元型（ＮＲ）−ＧＸデバイスを用いた捕捉産物および最終ポリシング中間体の分析は、無傷の抗体の還元種（Ｌ、Ｈ、Ｌ−Ｌ、Ｈ−Ｌ、Ｈ−Ｈ、Ｈ−Ｈ−Ｌ）に対応する分子量を有する断片バンドの存在を示した。図１２Ｃに見られるように、還元種の同様のバンドがＨＣＣＦをＮＲ−ＧＸによって分析したときにも検出され、これは、ｍＡｂ還元現象が採取工程において起こっていたことを示す。細胞培地は、遠心分離採取を用いて清澄化されており、厳しい遠心分離条件が、増加した細胞破壊によって製品品質に影響を与えて、チオ−レドキシンおよびチオ−レドキシン還元酵素などの細胞内宿主細胞タンパク質の放出をもたらし、これが酵素反応によって抗体還元を引き起こし得ることが示されたことが、Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔらによって以前に報告されている（２０１０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｅｉｎｅｅｒ．１０６：４５２−４６１）。
【０３１３】
【表１０】
2019521961.tif 000012
【０３１４】
製品品質の低下が、ｍＡｂ分子中のジスルフィド結合を破壊する細胞内還元酵素の放出によって主に引き起こされるという仮説に基づいて、ＨＣＣＦを冷却し、貯蔵容器中のヘッドスペースを増加させることによって酸化環境を提供することにより、還元反応を減速させるように、対照を導入した。さらに、ＨＣＣＦを採取の直後に精製して、ｍＡｂに対する還元酵素の曝露の期間を最小限に抑えた。精製プロセス中間体のＮＲ−ＧＸを用いた分析は、還元種が精製プロセスにわたって存在しないことを示した。
【０３１５】
この複合手法によって還元を制御することが可能であるが、ＨＣＣＦを処理しなければならないため、製造柔軟性に直ちに厳しい制約を課す。さらに、製造プラントにおけるカラムサイズの制約により、複数サイクルの捕捉工程を行うことが必要となり得るとき、ＨＣＣＦの即座の精製は困難になる。還元の速度を減速させるために酸化環境を提供する手段は、ＨＣＣＦの実際の体積と同等またはそれより大きいヘッドスペースを有する容器中にＨＣＣＦを貯蔵することを含んでいた。これは、ベンチおよびパイロット規模の実施のための実行可能な選択肢であり得るが、製造の実施には問題となり得る。酸素散布および空気オーバーレイの提供のような代替案が実行可能であり得るが、全ての施設で利用可能でないことがあり得る。
【０３１６】
製品品質に影響を与えずに長時間のＨＣＣＦ保持を可能にするために、予め採取した細胞培養液への賦形剤添加を評価した。Ｌ−シスチンが還元酵素の潜在的な競合する阻害剤であるか、またはｍＡｂ産物の代わりに酵素の代理の基質として作用することが報告された（上に引用される、Ｔｒｅｘｌｅｒ−Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．）。
【０３１７】
還元制御に対するシスチン添加の影響
還元制御に対するシスチンレベルの初期評価の一環として、採取されたＨＣＣＦ中のＬ−シスチンのレベルを、採取の直後のＨＣＣＦへのＬ−シスチンおよび細胞溶解物の添加により、０ｍＭ、２ｍＭ、および４ｍＭに調整した。還元の防止に対する酸化環境の影響を温度およびシスチンレベルから切り離すために、ＨＣＣＦのアリコートを、ヘッドスペースを有さない製剤原料貯蔵袋中に密封し、分析される前に２℃〜８℃で２週間保持した。
【０３１８】
精製プロセス性能に対するシスチン添加の影響を評価する並行した取り組みにおいて、２ｍＭのシスチンを含有するＨＣＣＦを、ヘッドスペースを有する容器中において２℃〜８℃で４日間保持した後に精製した。上の表１０に見られるように、２ｍＭのシスチンを含有するＨＣＣＦの精製中、増加した凝集物レベルが低ｐＨウイルス不活性化工程後に観察され、これは、最終ポリシング工程中に最終的に取り除かれた。
【０３１９】
ＨＣＣＦアリコートのＮＲ−ＧＸ分析を用いた、ＨＣＣＦアリコートの２週間の保持試験の開始時、還元の兆候は、２週間の保持試験の開始時に観察されなかった。しかしながら、保持の最後までに、還元は、０（シスチンなし）および２ｍＭのシスチンを含有するサンプルについて起こった（Ｈ−ＬおよびＨ−Ｈ−Ｌ断片の存在によって示される）一方、４ｍＭのシスチンを含有するサンプルは、還元の兆候を依然として示さなかった。これは、低温のみの使用が、還元が起こるのを防ぐのに十分でなく、シスチンが抗体還元を防ぐのに必要とされることを示す。さらに、シスチンレベルは、還元を完全に緩和するために十分に高くする必要がある。
【０３２０】
ジスルフィドマッピング質量分析法（ＭＳ）を用いて、低レベルのシスチンが還元を制御するのに不十分であるという仮説を裏付けるさらなる分析的エビデンスが得られた。図１３に示される結果は、保持の最後までに、０および２ｍＭのシスチンサンプルにおける対応するより高いレベルの鎖間遊離チオールを示すが、４ｍＭのシスチンサンプルでも、出発材料（ＨＣＣＦ＋０ｍＭのｃｙｓ、ｔ＝０）でも示さない。Ｆｒａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．；１９（９）：１６０１−１６１５）は、遊離チオールレベルの増加がモノクローナル抗体についての凝集物形成の対応する増加につながることを以前に報告したが、この現象は、他のＩｇＧフォーマットと比較してより多い量の鎖間ジスルフィド結合のため、ＩｇＧ２分子についてより深刻である。さらに、Ｈａｒｉら（２０１０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；４９（４３）：９３２８−９３３８）は、低ｐＨおよび高塩条件下でのＩｇＧ１およびＩｇＧ２分子についての増加した凝集物形成を実証した。ｍＡｂ  Ｂについて、過去の低ｐＨ安定性試験が、緩衝液のｐＨが３．６から３．２に低下されるにつれて、遊離チオールレベルのより急なより大きい増加を示した。ＨＣＣＦがｐＨ３．２、ｐＨ３．４、およびｐＨ３．６でインキュベートされる場合の、時間の経過による遊離チオール対ＩｇＧ濃度の比率が図１４Ａに示される。ＨＣＣＦがｐＨ３．２、ｐＨ３．４、およびｐＨ３．６インキュベートされる場合の、時間の経過による凝集物の変化が図１４Ｂに示される。これらの結果は、遊離チオール含量による凝集物レベルの対応する増加を示す。
【０３２１】
製品品質に対する４ｍＭのシスチンおよびＨＣＣＦ保持条件の影響
新たなＨＣＣＦを生成し、２つの別個のロットに分割し、これを評価して、精製プロセス性能および製剤化された製品の安定性に対する還元緩和の影響を評価した。簡潔には、２つの異なる部分が細胞培養物採取（ＨＣＣＦ）から得られ、一方のロットには、Ｌ−シスチン（０ｍＭのシスチン）が混合物に添加されず；他方のロットには、４ｍＭのシスチンが混合物に添加された。各ロットの混合物の半分を精製し、直ちに製剤化した一方、残りの半分を精製および製剤化前に２〜８℃で２週間保持した。２ｍＭのシスチン含有ＨＣＣＦで前に観察された凝集の条件を再現するために、ヘッドスペースを有する容器を用いて、２週間保持されたＨＣＣＦロットを貯蔵した。製剤化後、全ての４つのロットを２〜８℃で最大で１７ヶ月間、ならびに２５℃および４０℃で１ヶ月間にわたって凝集安定性について監視した。
【０３２２】
図１５に見られるように、全ての４つのＨＣＣＦアリコート中の鎖間遊離チオールレベルをジスルフィドマッピングＭＳによって分析したとき、図１３に示されるものと同様の傾向が明らかであった。シスチンの非存在下で２週間保持されたＨＣＣＦは、遊離チオールの増加を示した一方、４ｍＭのシスチンの存在下で２週間保持されたＨＣＣＦは、即座の精製および製剤化に供されたＨＣＣＦロットと比較して同様のレベルの遊離チオールを有していた。ＭＳ技術を用いてＨＣＣＦにおける遊離チオールレベルを監視することに加えて、精製プロセス中間体に対して比色分析も行った。ＨＣＣＦアリコートと同様に、図１６に見られるように、高い遊離チオールレベルが、シスチンの非存在下で２週間保持されたＨＣＣＦから精製された捕捉産物において検出された。４つのロットについての遊離チオールレベルの傾向はまた、精製プロセスにわたって変化しないままであり、これは、精製プロセスが遊離チオールレベルを低下させることができず、還元および凝集の防止が、十分な緩和を提供するために細胞培養物および採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）において必要とされることを示す。
【０３２３】
上で精製された４つの生成物から製剤化されたバルクを最大で１ヶ月間にわたって５℃、２５℃、および４０℃で保持し、凝集物レベルを、ＨＰ−ＳＥＣを用いて毎週測定した。図１７Ａ〜図１７Ｃに見られるように、４ｍＭのシスチンの存在下で２週間保持されたＨＣＣＦから生成された材料は、直ちに精製されたＨＣＣＦから生成されたバルク材料と比較して同様の出発および最終純度レベルを示した。対照的に、シスチンの非存在下で２週間保持されたＨＣＣＦから生成されたバルク材料は、同じ精製および製剤化プロセスを経たにもかかわらず、より高い出発および最終凝集物レベルを有していた。さらに、凝集物形成の速度も他のサンプルと比較してはるかに高かった。したがって、採取後のより高い遊離チオール含量は、精製プロセスへの負荷を増加させるだけでなく、分子の安定性および保存期間も制限する。遊離チオール増加の原因は、ｍＡｂ還元の結果であると最終的に特定されたため、開発および生産中、抗体還元の発生を防止および監視するために、プロセスにおいて適切な緩和が常に実施されるべきである。
【０３２４】
採取された細胞培養液が採取後に保持された場合、連続遠心分離採取操作の導入は、抗体還元に対する寄与因子であり得る。これは、精製プロセス全体を通して観察される増加した断片レベルをもたらした。還元酵素活性（低温、酸化環境、短縮された保持期間、阻害剤添加）を最小限に抑える様々な手段を用いることにより、採取中の還元を防ぐことに成功した。しかしながら、貯蔵中の抗体還元の再発は、採取時の還元緩和がときに不十分であり得ること、および成功する緩和手法の一環として保持安定性試験が常に行われるべきであることを示し得る。
【０３２５】
電気泳動技術を用いて断片レベルを監視することに加えて、遊離チオールレベルの変化は、抗体還元の発生についてのさらなる尺度としてＨＣＣＦ保持の期間にわたって監視され得る。しかしながら、このＭＳ技術は、比較的労力を必要とし、ハイスループット分析に対応しないため、それは、還元緩和手法が十分であるかどうかの検証の二次的な手段として使用され得る。
【０３２６】
抗体還元の適切な緩和のさらなる利益は、下流の精製プロセスに対する凝集物負荷を減少させ得ることである。還元は、可逆反応であるため、還元種は、材料がより酸化的な環境に曝されると直ちに再度酸化し得る。これは、凝集の増加した傾向を有するモノマー種の形成または直接凝集物種の形成につながり得る。この分子についての凝集物形成の主な経路は不明であるが、本発明者らの研究により、還元の発生が、この分子についての遊離チオール含量および凝集の対応する増加をもたらしたことが明白に示された。さらに、ＩｇＧ２分子は、他のモノクローナル抗体フォーマットと比較して増加した遊離チオールレベルを有する凝集物形成をより起こしやすいことが報告されているため、還元種を再度酸化させる酸化環境を提供するだけでは不十分であり、むしろ凝集物形成を増加させる前兆である遊離チオールレベルの増加を防ぐために、還元の発生が第１に防がれる必要がある。
【０３２７】
確固たる還元緩和手法を有することにより、下流のプロセスにおける不純物負荷を減少させることが可能であるだけでなく、分子の安定性も向上され、分子の保存期間が延長され得る。また、より長期間にわたってＨＣＣＦを貯蔵することが実現可能になり、プロセスの規模が拡張される際、製造計画の柔軟性の向上が可能になる。
【０３２８】
実施例１９：ｍＡｂ  Ｆの精製プロセスにおける凝集物形成に対する抗体ジスルフィド結合還元の影響
ｍＡｂ  Ｆを細胞培養（表１１、ＢＲＸ−Ｌ−１）および採取後のプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、続いてｐＨ３．６における低ｐＨ保持に供してからｐＨ７．４に中和した。低ｐＨ処理後、凝集物レベルは、０．１％増加した（４．８％から４．９％）。精製を第２の細胞培養試験（ＢＲＸ−Ｌ−２）後に行った場合、凝集物レベルは、低ｐＨ処理後に８．７％増加した（２．４％から１１．１％）。両方の試験から生成されたプロテインＡ産物のＮＲ−ＧＸ分析は、ＢＲＸ−Ｌ−１（９８．４％）と比較して、Ｂｒｘ−Ｌ−２（３８．５％）についてより低いレベルの無傷のｍＡｂを示した。さらに、電気泳動図（図１８Ａおよび図１８Ｂ）はまた、抗体ジスルフィド結合還元の発生の指標である重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖断片の組合せに対応するさらなるピークを検出した。捕捉産物の遊離チオール分析はまた、Ｂｒｘ−Ｌ−１（０．２ｍｏｌ／ｍｏｌ）と比較して、ＢＲＸ−Ｌ−２（０．３ｍｏｌ／ｍｏｌ）から生成されたｍＡｂについてより高い遊離チオール含量を示した。次のバイオリアクター（ＢＲＸ−Ｌ−３）を、ｍＡｂ還元を防ぐことを目的とした３つの緩和を用いて試験した。さらなる０．３４６ｍＭのＣｕＳＯ４−５Ｈ２０を栄養供給部分Ａに加えて、バイオリアクターＣｕを約３ｐｐｍ増加させた。各供給中に加えられる栄養供給Ｆ（シスチンを含有する）の量は、５０％増加され、これは、バイオリアクターシスチンを約１ｍＭ増加させた。最後に、採取の当日、ＥＤＴＡを１９．２ｍＭの濃度で採取前にバイオリアクター容器に加えた。捕捉産物のＮＲ−ＧＸ純度（９２．３％）は、抗体ジスルフィド結合還元が観察されなかったＢＲＸ−Ｌ−１捕捉産物において観察されたレベルに近かった。予測されるように、電気泳動図（図１８Ｃ）は、ＢＲＸ−Ｌ−２について観察された重鎖および軽鎖断片を検出しなかった。捕捉産物を低ｐＨ処理に供した場合、凝集物レベル増加（０．６％）は、Ｂｒｘ−Ｌ−２を用いた試験において観察されるより少なかった。低ｐＨ処理にわたる捕捉産物および凝集物増加における重鎖および軽鎖断片のレベル間の直接の相関は、抗体ジスルフィド結合還元が低ｐＨ処理中の凝集物形成の増加に関与していることを示す。
【０３２９】
【表１１】
2019521961.tif 000013
【０３３０】
実施例２０：ＩｇＧ１  ｍＡｂの凝集および還元電位
この実施例は、製剤緩衝液における精製されたＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ  Ａ）の製品不安定性が製造容器中の細胞培養中の還元電位を取り除くことによって大幅に低下され得ることを示す。
【０３３１】
細胞培養物は、３または４日毎に定期的な継代を伴いながら、３７℃で動物性タンパク質非含有培地中の成長および拡大するＧＳ−ＣＨＯベースＣＡＴ−Ｓ懸濁細胞を伴っていた。産生を、制御された温度、ｐＨおよび溶存酸素レベルを有するバイオリアクター中において流加モードで行った。流加プロセス中、栄養およびグルコース補給原料を細胞培養物に加えた。生存細胞計数および細胞生存率を、ＶｉＣｅｌｌ  ＸＲ細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、トリパンブルー色素排除方法によって測定した。血液ガス分析装置（ＲＡＰＩＤＰＯＩＮＴ  ４００；Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）を用いて、ｐＨおよび溶存酸素を測定し、必要に応じてバイオリアクタープローブを校正した。生化学分析装置を用いて、細胞培養サンプル中のグルコースレベルを測定した（ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  ４００；Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。細胞培養物における生産性を、分析用プロテインＡ  ＨＰＬＣを用いて測定した。流加プロセスの最後に、細胞培養物を、深層ろ過を用いて採取した。次に、細胞を含まない採取材料を精製し、最終的な製剤原料を生成するために製剤化した。
【０３３２】
還元電位、すなわち分子が好気条件下で還元される電位を、サンプルを上述される真空分析に供することによって測定した後、非還元サンプル緩衝液を添加した。次に、この混合物を、サイズ分画および定量化を行うために、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｂｃｈｉｐ（登録商標）ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて分析した。ＧＸＩＩにおいて、タンパク質および断片をレーザー誘起蛍光によって検出し、ゲルのような画像（バンド）および電気泳動図（ピーク）に変換した。
【０３３３】
採取され、精製され、製剤化された典型的な１４日目の哺乳動物流加細胞培養物を用いて、ＩｇＧ１モノクローナル抗体の製剤化された製剤原料を生成した。製剤化された製剤原料中の凝集物レベルを最初の１ヶ月間にわたってＨＰ−ＳＥＣによって毎週、次に再度３ヶ月および９ヶ月の時点で測定した。本明細書において使用されるものなどの最適化された液体製剤は、典型的に、２〜８℃で１ヶ月間の貯蔵後、凝集物レベルの変化を示さないようにすべきである。しかしながら、図１９に見られるように、この場合の製剤化された製剤原料は、意図された貯蔵温度（２〜８℃）で最初の１ヶ月間に非常に高い凝集物の増加（ＨＰ−ＳＥＣによって０．３５％）を示した。凝集の速度が最初の１ヶ月後に減速されたが、この凝集の程度は、液体製剤にとって許容されず、必要とされることが多いより高いタンパク質濃度（１００〜１５０ｍｇ／ｍｌ）についてかなり増加するであろう。
【０３３４】
流加細胞培養材料の末端の還元電位が、方法セクションに記載されるように測定した際に観察された。さらに調査すると、この還元電位は、細胞培養流加のより早い時点（８日目）では存在しなかったことが示された。
【０３３５】
細胞培養物における還元電位と、製剤化された製剤原料の安定性との間の可能な関係を特定するために、安定性試験を８日および標準的な１４日の細胞培養流加プロセスからの製剤化された製剤原料間で並行して行った。図２０に見られるように、８日の流加からの細胞培養サンプルは、還元電位がなく、ｔ＝０におけるより少ない出発凝集物レベル、３倍加速された条件（４０℃）での低下した凝集速度を有し、意図された貯蔵条件（２〜８℃）で最大で９ヶ月間にわたって凝集物の増加をもたらさなかった。しかしながら、より短い細胞培養物流加プロセスはまた、細胞培養物生産性を著しく低下させ、これは、製造上の観点から望ましくない。さらに、試験生存率の上限のため、観察された改良が細胞培養物における還元電位の非存在に関連するか、または試験細胞生存率の上限に関連するかは不明であった。
【０３３６】
上に見られるように、細胞培養物における還元電位を除去するための代替的な方法が原料への追加の銅およびシスチンの添加によって達成される。この方法を対照細胞培養プロセスと並行して試験した。この手法を用いて、同様の細胞培養物生産性および試験細胞生存率の限度を達成しながら、還元電位を著しく低下させることが可能であった。還元電位分析に曝された流加細胞培養サンプルの末端の非還元型（ＮＲ）ＧＸＩＩ分析からの電気泳動図が図２１に示される。試験細胞培養サンプルの末端からの電気泳動図は、標準的な１４日間の流加プロセスから得られ、図２１Ａに示され；より短い８日間の流加プロセスから得られるものが図２１Ｂに示され；銅およびシスチンが強化された原料を用いた標準的な期間の流加プロセスから得られるものが図２１Ｃに示される。これらの図は、約５％のみの無傷の産物（ＩｇＧ）が標準的な１４日間の流加プロセスからの製剤原料中に残っていることを示す。この数値は、試験細胞培養サンプルの末端がより早い（８日目）採取からのものである場合、著しく増加する（＞７０％）。流加プロセスの元の長さ（１４日間）を保ちながら、流加プロセス中の原料に銅およびシステインを富化した場合にも同じ効果が達成された。
【０３３７】
還元電位分析に曝された試験細胞培養サンプルの末端のＮＲ−ＧＸ分析によって視覚化された分解断片の画像は、標準的なプロセスからの試験細胞培養サンプルの末端における無傷のＩｇＧの大部分が分解されていることを示した。一方、銅およびシスチンを原料に富化することは、試験細胞培養サンプルの末端を還元電位分析に曝した後でも無傷のＩｇＧを保つのに役立った。図２２に見られるように、安定性試験は、還元電位の除去がｔ＝０における出発凝集物レベルを低下させ、３倍超加速された温度（４０℃）で凝集を減少させ、意図された貯蔵条件（２〜８℃）で最大で９ヶ月間にわたって凝集物の増加をもたらさないことを示した。３つの条件からのデータが以下の表１２にまとめられている。
【０３３８】
これらの実施例により、本発明者らは、還元電位を著しく低下させるかまたは除去するように細胞培養プロセスを修正することにより、製剤化された製剤原料の安定性が向上させることを実証した。これは、ｔ０の時点で凝集物レベルを低下させ、意図された貯蔵条件で９ヶ月間を超えてさらなる凝集を実質的にもたらさない。治療用タンパク質の凝集を最小限に抑えることは、生産および流通のために許容される保存期間を有する液体製品の開発の成功にとって重要な要因である。
【０３３９】
【表１２】
2019521961.tif 000014
【０３４０】
本開示の幅および範囲は、上記の例示的な態様のいずれかに限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみに従って定義されるべきである。
【図１】
2019521961.tif 000015
【図２Ａ−２Ｂ】
2019521961.tif 000016
【図３Ａ−３Ｂ】
2019521961.tif 000017
【図４Ａ−４Ｂ】
2019521961.tif 000018
【図５Ａ−５Ｂ】
2019521961.tif 000019
【図６Ａ−６Ｂ】
2019521961.tif 000020
【図７】
2019521961.tif 000021
【図８】
2019521961.tif 000022
【図９】
2019521961.tif 000023
【図１０】
2019521961.tif 000024
【図１１】
2019521961.tif 000025
【図１２Ａ−１２Ｃ】
2019521961.tif 000026
【図１３】
2019521961.tif 000027
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2019521961.tif 000028
【図１５】
2019521961.tif 000029
【図１６】
2019521961.tif 000030
【図１７−１】
2019521961.tif 000031
【図１７−２】
2019521961.tif 000032
【図１８Ａ−１８Ｃ】
2019521961.tif 000033
【図１９】
2019521961.tif 000034
【図２０】
2019521961.tif 000035
【図２１Ａ−２１Ｃ】
2019521961.tif 000036
【図２２】
2019521961.tif 000037
【国際調査報告】
2019521961.tif 000038
2019521961.tif 000039