(57)【要約】  本発明は、対象ポリペプチド、膜貫通ドメイン、およびＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドを含んでなる融合タンパク質、またはそれらの機能的に等価なバリアントに関する。本発明はまた、前記融合タンパク質を発現または提示する、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、およびウイルス様粒子、ならびに前記融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、およびウイルス様粒子を含む医薬組成物、免疫原性組成物、またはワクチン組成物、ならびにヒトおよび動物の医薬におけるそれらの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端からＣ末端へ向かって
（ａ）  対象ポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアント、
（ｂ）  膜貫通ドメイン、またはその機能的に等価なバリアント、および
（ｃ）  ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアント
を含んでなる融合タンパク質。
【請求項２】
前記対象ポリペプチド、膜貫通ドメインおよびＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはそれらの機能的に等価なバリアントが、リンカー、またはその機能的に等価なバリアントによって結合されてなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記対象ポリペプチドが免疫原性を有するものである、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアントがミリストイル化配列を含まない、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーがグリシン残基を含んでなる、好ましくは、前記リンカーがグリシン残基とセリン残基とを含んでなる、より好ましくは、前記リンカーが３つのグリシン残基と１つのセリン残基とを含んでなる、さらにより好ましくは、前記リンカーが配列番号２４または配列番号２５の配列を含んでなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記膜貫通ドメインが、（ａ）（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドの膜貫通ドメイン、（ｉｉ）ヒトＣＤ２２分子の膜貫通ドメイン、（ｉｉ）ヒトＣＤ３６分子の膜貫通ドメイン、または（ｉｖ）ヒトＣＤ４４分子の膜貫通ドメイン、（ｂ）ＨＩＶ−１  ＥｎｖのＲ６９６Ａ変異体、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の機能的に等価なバリアントを含んでなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記対象ポリペプチドが、ウイルス、細菌、真菌、原虫、寄生虫、アレルゲンもしくは腫瘍マーカー由来の少なくとも１つのポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアントを含んでなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ウイルスがＨＩＶである、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記対象ポリペプチドが、ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質またはＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質のプロセシングによって得られた産物に由来するものであり、好ましくは前記ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質がＨＩＶ  ｇｐ４１である、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記対象ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
（ａ）  前記ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントのヘプタッドリピート２、および
（ｂ）  前記ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの膜近傍外部領域
を含んでなる、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
配列番号２９の配列を含んでなる、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号９の配列を含んでなる、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ヒト、愛玩動物または家畜における発現のために配列がコドン最適化されてなる、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１６】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１５に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１７】
対象ポリペプチドを負荷してなるウイルス様粒子を調製するための方法であって、
（ａ）  請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を細胞内に発現させる工程、および
（ｂ）  細胞外の培地からＶＬＰを回収する工程
を含んでなる方法。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含んでなる、または請求項１７に記載の方法を用いて得られるウイルス様粒子。
【請求項１９】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、または請求項１８に記載のウイルス様粒子を治療有効量含んでなる医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載のウイルス様粒子を治療有効量含んでなる免疫原性組成物またはワクチン組成物。
【請求項２１】
リン酸アルミニウムを本質的に含まない、請求項２０に記載の免疫原性組成物またはワクチン組成物。
【請求項２２】
医薬における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１８に記載のウイルス様粒子、請求項１９に記載の医薬組成物、または請求項２０から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物もしくはワクチン組成物。
【請求項２３】
病原体または腫瘍によって被験体に引き起こされる疾病の治療もしくは予防における使用のための、ここで、前記病原体または腫瘍が前記対象ポリペプチドもしくはその領域を含んでなり、好ましくは前記対象ポリペプチドがＨＩＶポリペプチドであり、前記感染がＨＩＶ感染であり、より好ましくは前記ＨＩＶポリペプチドがｇｐ４１またはその機能的に等価なバリアントの膜近傍外部領域を含んでなる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載のベクター、請求項１６に記載の宿主細胞、請求項１８に記載のウイルス様粒子、請求項１９に記載の医薬組成物、または請求項２０から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物もしくはワクチン組成物。
【請求項２４】
前記被験体が、担体と接合させてなる前記融合タンパク質の一部を形成する前記対象ポリペプチドを含んでなるコンジュゲートによって予め処置され、好ましくは前記担体がＫＬＨである、請求項２２または２３に記載の使用のための、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子、医薬組成物、免疫原性組成物またはワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物を対象とした医薬に有用な、融合タンパク質とウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明は、対象ポリペプチド、膜貫通ドメイン、およびＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドを含んでなる融合タンパク質、ならびにそれらの機能的に等価なバリアントにも向けられる。加えて本発明は、前記融合タンパク質を発現または提示する、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、およびＶＬＰ粒子、ならびに前記融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、およびＶＬＰを含む医薬組成物、免疫原性組成物、またはワクチン組成物、ならびに感染症の治療および予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のような非エンベロープウイルスに対する効果が証明されている、優れたワクチンプラットフォームを象徴するものである。Ｌｕａ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１４；１１１：４２５−４４０を参照されたい。このような場合にＶＬＰは、原核生物または真核細胞の系で産生される単一のカプシドタンパク質を含むことで、優れた免疫原性を有するＶＬＰを自然に形成する。ＶＬＰ産生プラットフォームの成功と多用途性は、さらに複雑な設計の探索を促してきた。例としては、ウイルスカプシドタンパク質に外来性の配列を移植することにより、異種性の抗原を提示するＶＬＰの生成、およびＶＬＰ産生細胞由来の脂質二重層を含み、非エンベロープＶＬＰよりも高い異種性を示すエンベロープＶＬＰの生成が挙げられる。Ｂｒｙａｎｔ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０；８７：５２３−５２７およびＶｉｓｃｉａｎｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１；２９（３１）：４９０３−４９１２を参照されたい。
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンについての研究もまた、ＶＬＰ技術を試みた。その他のレトロウイルスに関して、ＨＩＶ粒子は、感染細胞の細胞膜の内側におけるＧａｇ構造タンパク質のＮ末端のミリストイル化を通した多量体化によって形成されたエンベロープ構造である。上記のＢｒｙａｎｔ，１９９０を参照されたい。出芽過程の間にＧａｇ多量体は、ウイルスゲノムＲＮＡ、様々なウイルス性酵素、およびアクセサリータンパク質を組み入れ、エンベロープ糖タンパク質複合体を発現する細胞表面に動員して感染性を確保する。しかしながら、レトロウイルスｇａｇ遺伝子の発現が、感染性のないＶＬＰ構造の産生に十分であることはよく知られている。上記のＶｉｓｃｉａｎｏ，２０１１、およびＣｅｒｖｅｒａ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；１６６：１５２−１６５を参照されたい。このような空のＧａｇ  ＶＬＰは、タンパク質もしくはＲＮＡを組み入れて送達ベクターとして機能させるか、またはその表面にタンパク質を組み入れてワクチン調製物として機能するように改変できる。上記のＶｉｓｃｉａｎｏ，２０１１を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
過去数年間にわたり、幾つかのグループが、ＨＩＶワクチンの研究に焦点を合わせたエンベロープＶＬＰの産生方法を開発した。上記のＶｉｓｃｉａｎｏ，２０１１およびＣｅｒｖｅｒａ，２０１３を参照されたい。しかしながら、これらのアプローチにおける障害は、エンベロープＶＬＰの至適な生成のみではない。第２の主要な困難はＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）の複雑さである。Ｍａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１２；１９：８９３−８９９を参照されたい。この大きな糖タンパク質は、中和および非中和抗体の産生が可能な２つのサブユニットであるｇｐ１２０とｇｐ４１を含む。Ｅｎｖに対する中和抗体を誘発する免疫原として作用するタンパク質模倣物を再設計しようとする複数のアプローチにも関わらず、ポジティブな結果はわずかにしか達成されていない。上記のＭａｏ，２０１２を参照されたい。今日まで行われてきた努力にも関わらず、当該技術分野では、ＶＬＰ化合物に抗原エピトープを導入するため、および特定の抗原エピトープに対する免疫応答の誘発に有用なＶＬＰを開発するための新規方法が、なお必要とされ続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって
（ａ）  対象ポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアント、
（ｂ）  膜貫通ドメイン、またはその機能的に等価なバリアント、および
（ｃ）  ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアント
を含んでなる融合タンパク質に関する。
【０００６】
追加の態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。
【０００８】
別の態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質またはベクターを含んでなる宿主細胞に向けられる。
【０００９】
別のさらなる態様において、本発明は、免疫原性ポリペプチドを負荷してなるＶＬＰを調製するための方法であって、
（ａ）  本発明に従った融合タンパク質を細胞内に発現させること、および
（ｂ）  細胞外の培地からＶＬＰを回収すること
を含んでなる方法に関する。
【００１０】
加えて本発明は、本発明に従った融合タンパク質を含んでなるか、または本発明の方法を使用して得たウイルス様粒子に関する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞もしくはウイルス様粒子、またはそれらの組み合わせを含んでなる医薬組成物を指す。
【００１２】
別の態様において、本発明は、医薬における使用のための、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせに向けられる。
【００１３】
別のさらなる態様において、本発明は、被験体における感染もしくは腫瘍によって引き起こされる疾病の治療または予防における使用のための、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせに関する。この態様の別の形態において、本発明は、被験体における感染もしくは腫瘍によって引き起こされる疾病を治療または予防する方法に関し、該方法は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせの治療有効量の、被験体への投与を含んでなる。この態様のさらなる別の形態において、本発明は、被験体における感染もしくは腫瘍によって引き起こされる疾病の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせの使用を指す。
【００１４】
加えて本発明は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせを含んでなるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】免疫原性アッセイに使用する、様々なタンパク質とＶＬＰ調製物を示した図である。ｇｐ４１糖タンパク質のＨＲ２、ＭＰＥＲおよびＴＭ領域を包含するｇｐ４１由来タンパク質（ＭＩＮ）を大腸菌に発現させた。精製のため、タンパク質のＣ末端の設計には６ｘＨｉｓタグが含まれるようにした。プラスミドをコードするＨＩＶ−１  ｇａｇをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へトランスフェクトすることによって、ヌードＶＬＰを生成させた。これらのヌードＶＬＰを、産生細胞膜（ＶＬＰ表面の、ライトグレーで示す部分）由来のヒトタンパク質に曝露する。あるいはＭＩＮ−ＶＬＰは、同じｇａｇ発現プラスミドと、ｇｐ４１の細胞質側末端全長を含むＭＩＮタンパク質をコードするプラスミドとの共トランスフェクションによって産生した。ＭＩＮタンパク質をＶＬＰ表面に取り込ませる。最終的なＶＬＰ調製物は、細胞質側末端を欠損し、ｇａｇ配列（残基２から始まる）と融合させたＭＩＮタンパク質のバリアントを発現させることによって産生した。形成されたＶＬＰは、その表面に高密度でＭＰＥＲエピトープを提示すると予想される（ｇａｇ：ｇｐ４１の化学量論は１：１）。
【図２】共トランスフェクションによって得た可溶性ＭＩＮおよびＭＩＮ−ＶＬＰの特徴付けと免疫原性を示した図である。（Ａ）可溶性ＭＩＮタンパク質を大腸菌に発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーによって精製して均一化した。最終調製物には単一の１７ｋＤａバンドが含まれた。左に分子量マーカーを示す。（Ｂ）可溶性ＭＩＮ調製物の免疫原性をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて試験した。対照動物、またはリン酸アルミニウムを加えたか、もしくは加えずに、ＭＩＮ（５０μｇ／用量）によって免疫した動物から得た血清（１／１００希釈）中のＭＩＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡデータを示す。（Ｃ）安定的なトランスフェクションによってＥｎｖ糖タンパク質（ＮＬ４．３分離株、クローンＫ）（右）、ＧＡＧ（クローンＧ１Ｆ２）、ＭＩＮ（クローン、４．２Ｅ６）またはＧａｇおよびＭＩＮの両方（左、クローン４Ｇ２Ａ）を発現させたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ＭＰＥＲエピトープの細胞表面発現とＣＡ−ｐ２４タンパク質（Ｇａｇ）の細胞内発現について染色した。陰性対照として、トランスフェクションしていないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を加えた。フローサイトメトリー解析を示す。（Ｄ）ＨＥＫ−２９３Ｔ  Ｇ１Ｆ２（Ｇａｇを発現）およびＨＥＫ−２９３Ｔ  ４Ｇ２Ａ細胞（ＧａｇおよびＭＩＮを共発現）から得た細胞ペレットおよび上清を、抗ｐ２４抗体（上図）および抗ＭＰＥＲ抗体２Ｆ５（下図）を用いたＷＢによって分析した。（Ｅ）並行して、ＭＩＮ−ＶＬＰ調製物の免疫原性をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて試験した。対照動物、またはリン酸アルミニウムを加えたか、もしくは加えずに、ＭＩＮＶＬＰ（５０μｇの総タンパク質／用量）によって免疫した動物から得た血清（１／１００希釈）中のＭＩＮタンパク質に対するＥＬＩＳＡデータを示す。
【図３】ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの特徴付けを示した図である。（Ａ）ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．ｌ／ＭＩＮＧＡＧ−３．７、完全長ｇａｇをコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．１  ＧＡＧ、または空のｐｃＤＮＡ３．ｌプラスミドをトランスフェクションした。２４時間後、細胞表面を抗ＭＰＥＲ抗体２Ｆ５（上図）または１０Ｅ８（下図）によって、細胞内を抗ｐ２４抗体Ｋｃ５７によって染色した。両方の例で、ＧａｇとＭＰＥＲ抗原の共発現がはっきりと観察された。（Ｂ）トランスフェクションした細胞から上清を収集し、ポリクローナル抗Ｇａｇ抗体（左）および抗ＭＰＥＲ抗体２Ｆ５（右）を用いたウェスタンブロットによって測定した。参照用に分子量マーカーを示す。（Ｃ）上清はまた、３００ｋＤａの分子カットオフ装置を通した濾過の前後で、ｐ２４の総含量についても測定した。ｐ２４の総含量（グラフの直径に関連する）および粒状画分（ＶＬＰに関係、ライトグレー）および濾過性（遊離、ダークグレー）物質を表す値を示す。（Ｄ）上清は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔを用いて、粒径について測定した。ヌードＶＬＰ（上図）またはＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰ（下図）の調製物を、それぞれ３重または４重に測定したところ、同等な結果を示した。各ラインは、それぞれの測定に対応する。
【図４】マウスにおけるＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの免疫原性を示した図である。（Ａ）アジュバントのリン酸アルミニウムを加えたか（＋ＡＤＪ）、もしくは加えずに、ヌードＶＬＰまたはＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰによって免疫したマウスにおける抗ＭＩＮ  ＩｇＧの時間経過。（Ｂ）アジュバントのリン酸アルミニウムを加えたか、もしくは加えずに、ヌードＶＬＰまたはＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰによって免疫したマウスにおける、屠殺後の抗Ｇａｇ  ＩｇＧの規模。（Ｃ）免疫に用いた、未処置（上図）およびリン酸アルミニウム処置（下図）ＶＬＰの電子顕微鏡による分析。（Ｄ）屠殺した動物から得た血清（１／１００希釈）および精製ＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）の中和活性を、ＴＺＭ−ｂ１細胞において、表示するウイルスに対して測定した。個々の動物血清またはＩｇＧの存在下での、ＮＬ４３およびＢａＬの感染性を示す。
【図５】マウスにおけるペプチド／ＶＬＰの免疫付与を示した図である。（Ａ）ＫＬＨ−ＭＰＥＲの４用量およびＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの４用量、または対照ＫＬＨおよびＮＵＤＥ  ＶＬＰによって免疫したマウスにおける抗ＭＩＮ  ＩｇＧの時間経過。（Ｂ）免疫したマウスにおける抗ＭＩＮ  ＩｇＧ応答のマッピング。データは、方法に記載するように、ｇｐ４１のＨＲ２およびＭＰＥＲ配列をカバーするペプチドを１５ｍｅｒ重複するセットに対する、個々の動物から得た血清の反応性を示す。（Ｃ）屠殺した動物から得た血清（１／１００希釈）の中和活性を、ＴＺＭ−ｂ１細胞において、表示するウイルスに対して測定した。個々の動物血清の存在下での、ウイルスの感染性を示す。アスタリスクは統計的有意性を意味する。
【図６】ウサギにおけるＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの免疫付与を示した図である。（Ａ）ＮＵＤＥ  ＶＬＰまたはＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの２用量によって免疫したウサギにおける抗Ｔ−２０および抗Ｃ３４  ＩｇＧの時間経過。（Ｂ）免疫したウサギにおける抗ＭＩＮ  ＩｇＧ応答のマッピング。データは、方法に記載するように、ｇｐ４１のＨＲ２およびＭＰＥＲ配列をカバーするペプチドを１５ｍｅｒ重複するセットに対して免疫した動物から得た血清サンプルの反応性を示す。（Ｃ）精製ＩｇＧ（１００μｇ／ｍＬ）および屠殺した動物から得たＩｇＧ除去血清の中和活性を、ＴＺＭ−ｂ１細胞において、表示するウイルスに対して測定した。個々の動物ＩｇＧの存在下での、ウイルスの感染性を示す。アスタリスクは統計的有意性を意味する。
【図７】ＶＬＰ発現におけるコドン最適化の効果を示した図である。空のプラスミド（左上図）、ＧＡＧ発現プラスミド（野生型、右上図）、ＭＩＮＧＡＧプラスミド３．７（非最適化、左下図）およびコドン最適化したＭＩＮＧＡＧ（右下図）をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の、代表的なドットプロット。トランスフェクション後２４時間目に、細胞を抗ＭＰＥＲ抗体２Ｆ５および抗ＧＡＧ抗体Ｋｃ５７（細胞内染色）によって染色した。コドン最適化により、ＭＰＥＲおよびＧＡＧの発現は有意に増大した。
【図８】セルフパッキングＶＬＰをコードするＤＮＡによるマウスへの免疫付与が、抗Ｇａｇおよび抗ｇｐ４１の液性応答を誘導することを示した図である。ネイキッドＤＮＡ（空のベクターを使用）、ＧＡＧをコードする、およびＭＩＮＧＡＧをコードするｐＶＡＸ１ベクターの４用量によって免疫したマウスにおける抗ＧＡＧ（上パネル）および抗ＭＩＮ（下パネル）ＩｇＧ応答の時間経過。
【図９】ＭＩＮとＧＡＧの間に配置した様々なリンカーの、ＶＬＰの抗原性および産生における影響を示した図である。Ｇ４Ｓを有する、リンカーなし、またはＡＥＡＡＡＫＡもしくはＡＰＡＰＡＰＡリンカーを有するＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に発現させた。（Ａ）トランスフェクション後４８時間目に、表示する抗ＭＰＥＲ抗体（２Ｆ５、１０Ｅ８および４Ｅ１０）および抗ＧＡＧ抗体Ｋｃ５７によって細胞を染色した。ＧＡＧ＋イベント内のＭＰＥＲ＋細胞のパーセンテージを、エピトープ露出の尺度として示す。（Ｂ）トランスフェクションした細胞の上清のＥＬＩＳＡによってＶＬＰの産生を測定し、ＭＩＮＧＡＧ  Ｇ４Ｓコンストラクトに対して標準化した。
【図１０】細胞外ｇｐ４１配列とＧＡＧの間に配置された様々なＴＭ配列の、ＶＬＰ抗原性と産生における影響を示した図である。野生型ｇｐ４１  ＴＭ、ヒトＣＤ２２  ＴＭ、ヒトＣＤ３６  ＴＭ、ヒトＣＤ４４  ＴＭまたはＲ６９６Ａ変異型ｇｐ４１  ＴＭを有するＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質を、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に発現させた。（Ａ）トランスフェクション後４８時間目に、表示する抗ＭＰＥＲ抗体（２Ｆ５、１０Ｅ８および４Ｅ１０）および抗ＧＡＧ抗体Ｋｃ５７によって細胞を染色した。ＧＡＧ＋イベント内のＭＰＥＲ＋細胞のパーセンテージを、エピトープ露出の尺度として示す。（Ｂ）トランスフェクションした細胞の上清のＥＬＩＳＡによってＶＬＰの産生を測定し、ＭＩＮＧＡＧ（野生型ＴＭ）コンストラクトに対して標準化した。
【図１１】ＶＬＰ表面に移植された短いエピトープの発現を示した図である。２Ｆ５エピトープがＨＣＶ中和エピトープで置換されたＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に発現させた。（Ａ）融合タンパク質のスキーム。（Ｂ）トランスフェクション後４８時間目に、表示する抗ＭＰＥＲ抗体（２Ｆ５、１０Ｅ８および４Ｅ１０）または抗ＨＣＶ抗体ＡＰ３３と、抗ＧＡＧ抗体Ｋｃ５７との組み合わせによって細胞を染色した。フローサイトメトリーのドットプロットを示す。（Ｃ）トランスフェクションした細胞の上清のＥＬＩＳＡによってＶＬＰの産生を測定し、ＭＩＮＧＡＧコンストラクトに対して標準化した。
【図１２】ＶＬＰ表面の大きな抗原の発現を示した図である。細胞外ｇｐ４１配列が様々な抗原で置換されたＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質をＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に発現させた。（Ａ）融合タンパク質のスキーム。（Ｂ）トランスフェクション後４８時間目に、表示する抗体と、抗ＧＡＧ抗体Ｋｃ５７との組み合わせによって細胞を染色した。フローサイトメトリーのドットプロットを示す。（Ｃ）トランスフェクションした細胞の上清のＥＬＩＳＡによってＶＬＰの産生を測定し、ＭＩＮＧＡＧコンストラクトに対して標準化した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
微生物の寄託
プラスミドｐｃＤＮＡ３．ｌ／ＭＩＮＧＡＧ−３．７は、２０１２年７月２５日に、受託番号ＤＳＭ  ２６２１４として、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ドイツ微生物細胞培養コレクション）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｅ  ７Ｂ、Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイク、ドイツ連邦共和国、に寄託された。
【００１７】
配列表
添付の配列表に挙げる核酸およびアミノ酸配列は、当該技術分野において通常適用される、標準的な文字の省略形とコードを使用して示す。各核酸配列の一方の鎖のみを示すが、相補鎖も、表示される鎖へのいずれかの参照によって含まれると理解される。添付の配列表は、本発明には不可欠な部分である。
【００１８】
発明の詳細な説明
抗体生成の主な制限の１つは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＶＬＰ内への対象抗原の取り込みが少ないことである。この制限を克服するため、本発明は、ｇａｇと融合させた膜貫通ドメインを含む、ｇｐ４１ベースのタンパク質およびその他のタンパク質を用いた新規ＶＬＰについて記載する。本発明において開示されるこの設計は、（ｉ）これらのタンパク質の膜局在を可能にし、（ｉｉ）ＶＬＰによるＧａｇのセルフパッキング能を維持し、（ｉｉｉ）ｇｐ４ｌの表面密度を増大させ、かつ（ｉｖ）抗原が空間的に正しく提示されるよう改善することで、（ｖ）前記抗原に対する免疫原性応答を増大させる。結果は、本発明のＶＬＰの免疫原性が増大したことをはっきりと実証する。
【００１９】
１．一般的な用語および表現に対する定義
本明細書で用いられる用語「ＡＩＤＳ」は、ＨＩＶ感染の症候性の段階を指し、これには後天性免疫不全症候群（一般にＡＩＤＳとして知られる）および「ＡＲＣ」、すなわちＡＩＤＳ関連症候群の両方が含まれる。Ａｄｌｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．１９８７；２９４：１１４５−１１４７を参照されたい。ＡＩＤＳの免疫学的および臨床的症状は当該技術分野において周知であり、これには例えば、免疫不全に起因する日和見感染および癌が含まれる。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「アレルゲン」は、被験体がそれらに対して感受性で、かつ免疫反応を引き起こし得るペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば花粉、昆虫、食物または食品のアレルゲン抽出物、唾液、昆虫のつめまたは針に存在する成分、植物成分）を指す。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸に類似の機能をもつアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。本明細書でのアミノ酸は、一般に知られる３文字のシンボル、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字のシンボルによって参照されてよい。ヌクレオチドも同様に、一般に許容されている１文字コードによって参照されてよい。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「コドン最適化」は、宿主生物の典型的なコドン使用を反映して、アミノ酸配列を変化させることなく参照ポリペプチドの発現を改善するための、核酸のコドン変化を指す。コドン最適化のためには、当該技術分野において公知の方法およびソフトウェアツールが幾つかある。Ｎａｒｕｍ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９（１２）：７２５０−７２５３），Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２００２；２４（１）：１８−２４，Ｆｅｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００；３９（５０）：１５３９９−１５４０９およびＨｕｍｐｈｒｅｙｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０００；２０（２）：２５２−２６４を参照されたい。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「含んでなる（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”または“ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ”）」は、一般的に許容される特許実務に従い、「からなる」も開示する。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「Ｅｎｖ」または「ｇｐ１６０」は、ＨＩＶの外側エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）の抗原特異性または生物学的機能のいずれかを有し、２つのサブユニットｇｐ１２０およびｇｐ４１糖タンパク質を包含する糖タンパク質を指す。野生型（ｗｔ）ｇｐ１６０ポリペプチドの代表的配列が入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ０５６０４およびＡＡＤ１２１４２を参照されたい。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって決定された前記免疫原性物質に対する免疫応答を開始する、被験体の免疫系の抗体または細胞表面受容体の標的である（すなわちこれらが結合する）所定の免疫原性物質の一部を指す。さらにエピトープは、当該技術分野において利用可能ないずれかの方法によって決定された、液性または細胞性応答、特に被験体における抗体応答またはＴ細胞応答によって認識される免疫原性物質の一部として定義されてもよい。エピトープは、タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖、有機もしくは無機化学物質、またはそれらのいずれかの組み合わせのような、いずれかの免疫原性物質の一部であってもよい。用語「エピトープ」はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に用いられてもよい。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「発現する（“ｅｘｐｒｅｓｓ”，“ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ”）」または「発現」は、核酸分子の転写、および任意にその翻訳を指す。典型的には、コード配列の転写および翻訳によって、本発明の融合タンパク質のようなポリペプチドの産生がもたらされる。
【００２７】
本明細書で用いられる表現「機能的に等価なバリアント」は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸の修飾、欠失もしくは挿入によってもたらされ、かつその参照ポリペプチドの活性を実質的に保持しているポリペプチド、および（ｉｉ）１つ以上の塩基の修飾、欠失もしくは挿入によってもたらされ、かつ参照核酸によって発現するポリペプチドの活性を実質的に保持しているポリヌクレオチドを指す。本発明に関連して意図される機能的に等価なバリアントには、配列番号１〜２、５、１５〜２８、３０、３２、３４、３６および３８の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の類似性または同一性を示し、かつｇａｇポリペプチドバリアントの場合にはＶＬＰ形成の誘導に対して実質的に等価な能力を保持するか、またはＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドの機能的に等価なバリアントの場合には細胞膜へ埋め込まれる能力を保持するポリペプチドが含まれる。本発明に関連して意図される機能的に等価なバリアントには、配列番号３〜４、６〜１４、２９、３１、３３、３５および３７の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％の類似性または同一性を示し、かつ発現時、ｇａｇポリペプチドバリアントの場合にはＶＬＰ形成の誘導に対して実質的に等価な能力を保持するか、またはＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドの機能的に等価なバリアントの場合には細胞膜へ埋め込まれる能力を保持するポリヌクレオチドもまた含まれる。２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド間の同一性もしくは類似性の程度は、コンピューターによる実行アルゴリズムおよび当該技術分野において広く知られている方法を用いて決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性および類似性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，“ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ”（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ，２００１）を参照されたい。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「融合タンパク質」は、遺伝子技術によって作製され、異なるタンパク質に由来する２つ以上の機能的ドメインからなるタンパク質に関する。融合タンパク質は、従来の方法によって（例えば、前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の、適切な細胞内での遺伝子発現によって）取得されてよい。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「ｇａｇポリペプチド」は、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子による主要なタンパク質産物に関する。これはウイルスの基本的な物理的構造基盤を提供すると共に、ＭＡ（マトリックスタンパク質、ｐ１７）、ＣＡ（カプシドタンパク質、ｐ２４）、ＳＰ１（スペーサーペプチド１、ｐ２）、ＮＣ（ヌクレオカプシドタンパク質、ｐ７）、ＳＰ２（スペーサーペプチド２、ｐ１）およびＰ６タンパク質へと成熟する間に、ウイルスプロテアーゼによって処理される。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「ｇｐ４１」は、ヒト免疫不全ウイルス−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１を指す。Ｇｐ４１は、ｇｐ１２０と共に、ＨＩＶ−１のＥｎｖ糖タンパク質を形成するサブユニットである。Ｅｎｖは、３つの外部サブユニット（ｇｐ１２０）と３つの膜貫通型サブユニット（ｇｐ４１）から構成される三量体である。ｇｐ４１タンパク質の細胞外部分には、３つの不可欠な機能領域、すなわち融合ペプチド（ＦＰ）、Ｎ末端のヘプタッドリピート（ＨＲ１）およびＣ末端のヘプタッドリピート（ＨＲ２）が含まれる。ＨＲ１およびＨＲ２領域には、コイル構造を形成する傾向がある、幾つかのロイシンジッパー様モチーフが含まれる。Ｐｅｉｓａｊｏｖｉｃｈ  Ｓ，Ｓｈａｉ  Ｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ２００３；１６１４：１２２−１２９；Ｓｕａｒｅｚ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０００；４７７：１４５−１４９；Ｃｈａｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １９９７；８９：２６３−２７３を参照されたい。ＨＩＶ  ｇｐ−４１の核酸およびアミノ酸配列は、多数が公開されており、容易に利用可能である。２０１７年７月のＨＩＶ配列データベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＨＩＶ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「ｇｐ１２０」は、ＨＩＶの外部エンベロープタンパク質（ｅｎｖ）の抗原特異性または生物学的機能のいずれかを有する糖タンパク質を指す。「ｇｐ１２０タンパク質」は、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域由来の分子である。ｇｐ１２０のアミノ酸配列はおよそ５１１アミノ酸である。Ｇｐ１２０は高度にＮ−グリコシル化されたタンパク質で、見掛けの分子量は１２０ｋＤａである。Ｇｐ１２０は、５つの可変ドメイン（Ｖ１〜Ｖ５）と共に散在する、５つの比較的保存されたドメイン（Ｃ１〜Ｃ５）を含む。可変ドメインには、広範なアミノ酸の置換、挿入および欠失が含まれる。「ｇｐｌ２０ポリペプチド」には、単一サブユニットおよび多量体の両方が含まれる。ｇｐ４１部分はウイルス粒子の膜二重層に固定される（かつその全長にわたる）が、ｇｐｌ２０部分は周囲環境へ突き出る。ｇｐ１２０の受容体結合ドメインは、タンパク質のＮ末端半分に局在する。この後にはプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）が続く。これはヒンジとして作用するか、または受容体の融合機構への結合を開始させる。ｇｐ１２０のＣ末端は高度に保存されており、ｇｐ４１と相互作用する。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ０５６０４およびＡＡＤ１２１４２を参照されたい。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ヘプタッドリピート２」または「ＨＲ２」は、野生型ｇｐ４１の細胞外部分のカルボキシ末端に位置するヘプタッドリピート領域を指すが、これに限定されない。Ｅｇｇｉｎｋ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００８；８２（１３）：６６７８−６６８８を参照されたい。ヘプタッドリピートは、疎水性アミノ酸が７残基ごとに繰り返されるモチーフである。このようなモチーフは、ｇとして示される。Ｌｕｐａｓ  Ａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９６；２１：３７５−３８２を参照されたい。ａおよびｄ位置の疎水性または中性残基を含むヘプタッドリピートはアルファヘリックスを形成することができ、コイルドコイルの形成によってその他のヘプタッドリピートと相互作用できる。上記のＣｈａｍｂｅｒｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９９０；７１：３０７５−３０８０およびＬｕｐａｓ，１９９６を参照されたい。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ」には、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２、ＳＨＩＶおよびＳＩＶが含まれる。「ＨＩＶ−１」は、１型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−１には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に関連するＨＩＶ−１の形態が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ−１ウイルスは、既知の主要な亜型（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）のいずれか、または実験室内の系統や初代分離株が含まれる分類外の亜型（Ｏ群）を意味してよい。「ＨＩＶ−２」は、２型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−１株には、ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ、ＨＩＶ−１ＤＨ１２３、ＨＩＶ−１Ｇｕｎ−１、ＨＩＶ−１８９．６、およびＨＩＶ−１ＨＸＢ２株が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ−２には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−２感染細胞に関連するＨＩＶ−２の形態が含まれるが、これらに限定されない。「ＳＩＶ」は、サル、チンパンジー、およびその他の非ヒト霊長類に感染するＨＩＶ様ウイルスである、サル免疫不全ウイルスを指す。ＳＩＶには、細胞外ウイルス粒子およびＳＩＶ感染細胞に関連するＳＩＶの形態が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶへの曝露」は、ＨＩＶに感染しているか、もしくはＡＩＤＳである被験体と未感染の被験体との接触、またはＨＩＶに感染したそのような被験体由来の体液との接触であって、感染被験体由来のそのような液体と、粘膜、組織の切り傷または擦り傷との接触（例えば針刺し、無防備な性交渉）、またはウイルスが感染被験体から伝染可能であるか、もしくは感染被験体の体液が未感染被験体へ伝染可能である、未感染被験体の表面との接触を指す。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ感染」は、無症状の血清陽性を含む、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の個体における、ＨＩＶウイルス存在の徴候を指す。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ−１ＪＲ−ＦＬ」は、当初剖検によってＡＩＤＳ患者の脳組織から分離され、レクチンで活性化された正常ヒトＰＢＭＣと共培養されたＨＩＶ−１株を指す。
【００３７】
本明細書において互換的に用いられる用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本発明に従った核酸またはベクターが導入された細胞を指す。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」には、そのような細胞の子孫、または潜在的子孫も含まれる。変異または環境の影響によって、継代には特定の修飾が起こる可能性があるため、このような子孫は、事実上親細胞とは異なる可能性があるが、それでもなお本明細書で用いられる用語の範囲内には含まれ得る。
【００３８】
２つ以上の核酸またはポリペプチドに関連した用語「同一な」またはパーセント「同一性」は、保存されたアミノ酸置換のいずれも配列同一性の一部として考慮することなく、最大限に一致するように比較および整列（必要に応じてギャップを導入）した際に同一となるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基と同一であるかまたは特定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列またはサブ配列を指す。同一性のパーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定できる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを取得するために使用できる様々なアルゴリズムおよびソフトウェアは、当該技術分野において公知である。配列類似性の決定に適したアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＢＬＡＳＴ  ２．０、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、およびＡＬＩＧＮ−２アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９７７；２５：３３８９−３４０２，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３−４１０，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６；２６６：４６０−４８０，Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０；８７：２２６４−２２６８，Ｋａｒｌｉｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３；９０：５８７３−５８７７，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳ，ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ、２０１７年７月を参照されたい。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の至適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎローカル相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によって、または用手でのアラインメントおよび目視検査によって実行できる。Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１；２：４８２−４８９，Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３−４５３，Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４−２４４８，ｔｈｅ  ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラム、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ，２００２）を参照されたい。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「免疫原性組成物」は、特定の免疫原に対する被験体内の液性（例えば抗体）または細胞性（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）免疫応答を誘発できる医薬組成物を指す。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「免疫原性ポリペプチド」は、病原性生物、腫瘍マーカーまたはアレルゲン由来のポリペプチドであって、被験体への投与時に、その生物、腫瘍マーカーまたはアレルゲンに対する防御免疫反応を誘導できるポリペプチドに関する。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「免疫学的な機能等価物」は、被験体に免疫応答を誘導する能力を、参照ポリペプチドと実質的に同じだけ保持しているポリペプチドのバリアントを指す。用語「免疫学的な機能等価物」は当該技術分野において周知であり、本明細書ではさらに詳細に定義される。免疫学的な機能等価物は、ポリペプチドの抗原性を増大させ、参照ポリペプチドと同レベルの抗原性を維持するか、またはポリペプチドの抗原性をほんのわずかだけ減少させ得ることで、免疫原性組成物中の抗原としての有用性を維持する。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「感染症」は、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫のような病原体によって引き起こされる疾病に関する。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「キット」は、本発明に従った使用および方法を実行するために必要となる様々な試薬を含む製品を指し、輸送と保管が可能なように包装されている。キットの構成要素の包装に適した材料としては、クリスタル、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、ボトル、バイアル、紙または封筒が挙げられる。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「ＫＬＨ」は、カリフォルニア州の沿岸沖、モントレー湾からバハ・カリフォルニア沖のアスンシオン島までに生息するキーホールリンペットの種である、ジャイアントキーホールリンペット、スカシガイの血リンパに見出される、大きな、複数サブユニットの酸素運搬金属タンパク質に関する。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「リンカー領域」または「リンカー」は、少なくとも１、２、３、４もしくは５またはそれを超えるアミノ酸の長さであるいずれかの異種性ポリペプチドを指し、これを第１および第２領域の間に挿入した際には、両領域を結合させる機能的結合をもたらし、ここで各領域はその機能的および免疫学的特性を保持できる。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「膜近傍外部領域」または「ＭＰＥＲ」は、ウイルスの膜に隣接するｇｐ４１外部ドメインの高度に保存された領域を指すが、これに限定されない。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「中和抗体」または「ｎＡｂ」は、細胞外分子（例えば病原性ウイルスもしくは細菌の表面にあるタンパク質またはタンパク質ドメイン）に結合して病原体の細胞への感染能に干渉するか、またはその活性を調節する、いずれかの抗体または抗原結合断片である。本発明との関連では、病原体は好ましくはＨＩＶであり、さらに具体的にはＨＩＶウイルスエンベロープのｇｐ１２０タンパク質である。特に、用語「ＨＩＶ中和抗体」は、ＩｇＧｂ１２のような、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位に親和性のある中和抗体を指す。用語「中和抗体」にはｂｎＡｂのサブクラスが含まれる。本明細書で用いられる「大まかな中和抗体」または「ｂｎＡｂ」は、有効用量の送達時に、７株を超えるＨＩＶ、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超える株のＨＩＶに対する、ＨＩＶ感染もしくはＡＩＤＳの予防または治療のための治療薬として使用できる、いずれかの方法で取得した抗体として理解される。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「ＮＬ４−３」および「ＢａＬ」は、通常実験室で用いられる２つの異なるＨＩＶ分離株を指す。ＮＬ４−３分離株はＮＹ５およびＬＡＶプロウイルスからクローン化された。Ａｄａｃｈｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８６；５９：２８４−２９１を参照されたい。ＢａＬ分離株は、外植された肺組織から増殖した接着細胞の初代培養から取得した。Ｇａｒｔｎｅｒ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３３：２１５−２１９を参照されたい。
【００４９】
本明細書において互換的に用いられる用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、いずれかの長さで、かつリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから構成されるヌクレオチドの、いずれかの重合体の形態に関する。本用語には、単鎖および二重鎖ポリヌクレオチドの両方、ならびに修飾ポリヌクレオチド（例えばメチル化されたもの、保護されたもの）が含まれる。典型的には、本明細書で用いられる核酸は「コード配列」であり、これは適切な調節性配列の制御下に置かれた際、宿主細胞内で転写され、ポリペプチドへ翻訳されるＤＮＡ配列を指す。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列も含まれてよいが、これらに限定されない。転写終止配列は、通常コード配列の３’に位置する。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「機能的に連結する」は、対象のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現が可能になるような方法で（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、またはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞内で）、単数または複数の調節性配列に連結されていることを意味する。Ａｕｅｒ  Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；２４：４１−４３を参照されたい。
【００５１】
本明細書で用いられる表現「非経口投与」および「非経口的に投与された」は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、これには静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射ならびに点滴が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で用いられる表現「末梢血単核細胞」またはその略語である「ＰＢＭＣ」は、円形の核を有するいずれの末梢血液細胞も指す。これらの細胞は、リンパ球（すなわちＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）および単球からなる。
【００５３】
本明細書で用いられる表現「薬学的に許容される担体」には、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはＶＬＰと生理的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬、等張化剤および吸収遅延剤が含まれる。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「医薬組成物」は、本発明に従った少なくとも１つの融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはＶＬＰと、少なくとも１つの他の成分との組み合わせを指し、少なくとも１つの他の成分としては、この組み合わせを被験体への投与に適したものとする、薬学的に許容される担体が挙げられるが、これに限定されない。用語「医薬組成物」には、免疫原性組成物およびワクチン組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では互換的に用いられて、１つを超えるアミノ酸残基を含んでよいアミノ酸残基のポリマー（例えばジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド）を指す。本用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用される。
【００５６】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防している」、および「予防」は、被験体における疾病の開始を阻害するか、または発生を減少させることを指す。予防は完全（例えば被験体における病的細胞を完全に無くすこと）であってよい。予防はまた、例えば被験体における病的細胞の発生低下のように、部分的であってもよい。予防はまた、病態への感受性の低下も指す。本発明に関連した用語「予防する」、「予防している」、および「予防」は、具体的にはＨＩＶへの曝露が持続している被験体におけるＨＩＶ感染の可能性を防ぐか、または減少させることを指す。
【００５７】
本明細書で用いられる表現用語「Ｅｎｖタンパク質のプロセシングによりもたらされる産物」は、ｇｐ１６０タンパク質のプロセシングによって産生されるいずれかのタンパク質を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「組換え細菌」は、異種性ＤＮＡの導入によって改変されたいずれかの細菌を指す。「野生型」または「対照」細菌には、遺伝的に操作されていない天然状態であることが見出された細菌、または組換え細菌と実質的に同一であるが、異種性ＤＮＡによってコードされる１つ以上のタンパク質を発現しない（例えば対象となる異種性ポリペプチドのコード配列のないプラスミドを含む）細菌が含まれる。本用語は、当初異種性ＤＮＡの導入によって改変された細菌の子孫を含むことが意図される。
【００５９】
本明細書で用いられる表現「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブが、典型的には核酸の複雑な混合物中でその標的配列とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「被験体」は、個体、植物、またはヒト、非ヒト霊長類（例えばチンパンジーおよびその他の類人猿とサル種）のような動物；鳥類、魚類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのような愛玩動物；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物を指す。本用語は特定の年齢または性別を意味しない。用語「被験体」は、胚および胎児を包含する。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「実質的に等価」は、天然領域によって発生する免疫応答と、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％を超えて異なることのない免疫応答を発生させることが可能なバリアントを指す。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「治療薬」は、疾病の治療もしくは予防に有用な原子、分子または化合物を指す。治療薬の例としては、エピトープ、抗原、免疫原、抗体、抗体断片、薬物、細胞傷害性薬剤、アポトーシス促進性薬剤、毒素、ヌクレアーゼ（例えばＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素）、ホルモン、免疫調節薬、キレート剤、光活性剤または色素、抗血管新生薬、化学療法薬、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質、ペプチドまたはそれらの組み合わせが挙げられるが、限定されるものではない。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ＶＬＰ、医薬組成物もしくは免疫原性組成物もしくはワクチン組成物、またはそれらの組み合わせの、被験体における治療上の応答もしくは望ましい効果をもたらす用量または量を指す。
【００６４】
本明細書で用いられる用語「膜貫通ドメイン」および「ＴＭドメイン」は、膜を貫通する統合的タンパク質の、ときおり極性残基を有するが大体は疎水性残基であるアミノ酸配列を指す。
【００６５】
本明細書で用いられる表現「ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドの膜貫通ドメイン」は、ｇｐ４１がその天然のトポロジーを獲得した後、細胞膜内へ埋め込まれるｇｐ４１ポリペプチドの領域を指す。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「治療する」および「治療」は、疾病の臨床的徴候が出現した後に、その疾病の進行を制御するための、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ＶＬＰ、医薬組成物、免疫原性組成物もしくはワクチン組成物、またはそれらの組み合わせの投与を指す。疾病の進行の制御は、有益な、または望ましい臨床結果を意味するものとして理解され、これには症状の減少、疾病期間の短縮、病的状態の安定化（特にさらなる悪化を避けること）、疾病の進行の遅延、病的状態の改善と寛解（部分的および完全的の両方）が含まれるが、これらに限定されない。疾病の進行の制御はまた、治療を行わなかった場合に予想される生存に比較した、生存の延長にも関連する。本発明との関連の範囲内で、用語「治療する」および「治療」は、具体的にはＨＩＶに感染した被験体における感染と健常なＣＤ４＋Ｔ細胞の破壊を停止または遅延させることを指す。これはまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞数が極端に少なく、日和見性の病原体に反復感染するような、後天性の免疫不全疾患の症状発現を停止および遅延させることも指す。有益な、または望ましい臨床結果としては、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数の増加（１０〜３５２０の範囲）、循環免疫細胞の総数に占めるＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージの増大（１〜５０％の範囲）、または未感染の被験体における正常ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対するパーセンテージとしてのＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加（１〜１６１％の範囲）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、感染被験体がＨＩＶを対象としたいずれの治療も受けなかった場合に予想される生存に比較した、その被験体の生存を延長させることも意味してよい。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「ワクチン」および「ワクチン組成物」は、疾病、特に細菌性またはウイルス性の疾病から保護するため、被験体にｉｎ  ｖｉｖｏ投与する免疫原性組成物を指す。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、本発明に従った核酸が宿主細胞において自律複製するための追加部分に機能的に連結されたかまたは核酸分子の発現カセットに従った、本発明に従った核酸を含んでなる線状または環状の核酸分子を指す。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「ウイルス様粒子ベクター」および「ＶＬＰ」は、ウイルスの遺伝物質のいずれも含まない、ウイルスに類似した非感染性粒子を指す。ＶＬＰは、カプシドタンパク質のようなウイルス構造タンパク質の発現と、それらの自己集合の結果である。
【００７０】
２．融合タンパク質
第１の態様において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって
（ａ）  対象ポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアント、
（ｂ）  膜貫通ドメイン、またはその機能的に等価なバリアント、および
（ｃ）  ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアント
を含んでなる融合タンパク質に関する。
【００７１】
好ましい実施形態では、対象ポリペプチドは、治療薬、治療薬の領域、またはその機能的に等価なバリアントを含んでなる。治療薬の例としては、エピトープ、抗原、免疫原、抗体、抗体断片、薬物、細胞傷害性薬剤、アポトーシス促進性薬剤、毒素、ヌクレアーゼ（例えばＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素）、ホルモン、免疫調節薬、キレート剤、光活性剤または色素、抗血管新生薬、化学療法薬、サイトカイン、ケモカイン、プロドラッグ、酵素、結合タンパク質、ペプチドまたはそれらの領域が挙げられるが、限定されるものではない。好ましくは、治療薬はエピトープ、抗原、免疫原、またはその機能的に等価なバリアントである。別の実施形態では、対象ポリペプチドは、１つ以上の治療薬、それらの領域または機能的に等価なバリアントを含む。これらの組み合わせの例としては、起源の異なる（例えばウイルス抗原／細菌抗原、腫瘍マーカー／細菌抗原）または起源が同じ（例えば同じ病原体の２つ以上の抗原）２つ以上の治療薬を含んでなる対象ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
【００７２】
好ましくは、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアントはＨＩＶ−１ＨＸＢ２由来である。ＨＸＢ２由来のｇａｇポリペプチドの全配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｐ０４５８５−１を有し（２０１６年７月６日）、配列番号１の配列を含んでなる。好ましくは、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドの機能等価バリアントは、その参照ポリペプチドの形成活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％を示す。本発明に従ったＶＬＰの機能的に等価なバリアントの形成活性を評価するためには、当該技術分野において公知の幾つかの技術がある。
【００７３】
したがって、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドの機能的に等価なバリアントは、タンパク質のＶＬＰ形成能が維持されているという条件で、対応する天然ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドのアミノ酸配列に対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の類似性の程度を示す。類似性は、好ましくは長さが少なくとも約２５のアミノ酸またはヌクレオチドの領域にわたって、またはより好ましくは長さが５０〜１００のアミノ酸またはヌクレオチドの領域にわたって存在する。２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である印は、以下に記載するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば２つのペプチドが保存された置換によってのみ異なる場合には、通常、ポリペプチドは第２のポリペプチドと実質的に同一であるとみなされる。２つのペプチド間の類似性の程度は、当業者に広く知られるコンピューターアルゴリズムおよび方法を用いて決定できる。２つのペプチドの２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，“ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ”，（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を参照されたい。好ましい実施形態では、ｇａｇに関して機能的に等価なバリアントの同一性の程度は、バリアントの完全配列、ｇａｇの完全配列、または両方の完全配列に従って決定される。
【００７４】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド、またはその機能的に等価なバリアントはミリストイル化配列を含まない。ミリストイル化は、ミリスチン酸由来のミリストイル基が、Ｎ末端グリシン残基のアルファアミノ基へアミド結合によって共有結合する脂質修飾である。ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドでは、ミリストイル化に感受性のグリシンは、配列番号１の位置２のグリシンである。最初のメチオニンは、宿主細胞の機構によって除去される。好ましくは、ミリストイル化配列を含まないＨＩＶ  ｇａｇの機能的に等価なバリアントは、配列番号２の配列を含んでなる。
【００７５】
本発明では、どのような１回膜貫通型のタンパク質も使用されてよい。例としては、ＣＤ２２（配列番号１８）、ＣＤ３６（配列番号１９）、ＣＤ４４（配列番号２０）およびＨＩＶ−１  ＥｎｖのＲ６９６Ａ変異体（配列番号３１）の膜貫通ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。配列が膜貫通ドメインを形成する能力については、当該技術分野において公知の様々なアッセイによって分析できる。
【００７６】
好ましい実施形態では、膜貫通ドメインはｇｐ４１ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントの膜貫通ドメインである。
【００７７】
特定の実施形態では、ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドの膜貫通領域は、配列番号１７の配列を含んでなる。
【００７８】
本発明に従った融合タンパク質は、ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドのＮ末端に位置する免疫原性ポリペプチド、または機能的に等価なバリアントを含んでなる。
【００７９】
免疫優性ポリペプチドは、１つ以上のエピトープを含んでよい。常にそうではないが、一般にこのような免疫優性ポリペプチドまたはエピトープは、当業者に公知の方法に従って試験すると、高度に免疫原性である。
【００８０】
免疫応答を誘導できるタンパク質またはペプチドは、特定の微生物の天然抗原と同一であるかもしくは類似の、組換えタンパク質またはペプチドであってよい。
【００８１】
好ましい実施形態では、対象ポリペプチドは免疫原性ポリペプチドを含んでなる。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、被験体の感染症、例えば病原性微生物（例えばウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、内部および外部寄生虫）によって引き起こされる疾病に対する免疫応答を誘導できる（適切な、またはそのように設計された）ポリペプチドである。好ましくは、被験体はヒト、愛玩動物または家畜である。より好ましくは、被験体はヒトである。
【００８２】
ウイルス性病原体としては、ＲＮＡウイルス；ＤＮＡウイルス；アデノウイルス科（例えばマストアデノウイルス、トリアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（例えば単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、単純ヘルペスウイルス５型、単純ヘルペスウイルス６型）；レビウイルス科（例えばレビウイルス、バクテリオファージＭＳ２、アロレビウイルス）；ポックスウイルス科（例えばコードポックスウイルス亜科、パラポックスウイルス、トリポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モルシポックスウイルス、エントモポックスウイルス亜科）；パポバウイルス科（例えばポリオーマウイルス、パピローマウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、モルビリウイルス（例えば麻疹ウイルス）、ルブラウイルス（例えばムンプスウイルス）；ニューモウイルス科（例えばニューモウイルス、ヒトＲＳＶ）；メタニューモウイルス（例えばトリニューモウイルス、ヒトメタニューモウイルス）；ピコルナウイルス科（例えばエンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス（例えばヒトＡ型肝炎ウイルス）、カルジオウイルス、アフトウイルス）；レオウイルス科（例えばオルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジーウイルス、フィトレオウイルス、オリザウイルス）；レトロウイルス科（例えば哺乳類Ｂ型レトロウイルス、哺乳類Ｃ型レトロウイルス、トリＣ型レトロウイルス、Ｄ型レトロウイルスグループ、ＢＬＶ−ＨＴＬＶレトロウイルス、レンチウイルス（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、スプマウイルス））；フラビウイルス科（例えばＣ型肝炎ウイルス）；ヘパドナウイルス科（例えばＢ型肝炎ウイルス）；トガウイルス科（例えばアルファウイルス（例えばシンドビスウイルス、および風疹ウイルスのようなルビウイルス）；ラブドウイルス科（例えばベシキュロウイルス、リッサウイルス、エフェメラウイルス、サイトラブドウイルス、ヌクレオラブドウイルス）；アレナウイルス科（例えばアレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピーウイルス、ラッサ熱ウイルス）；およびコロナウイルス科（例えばコロナウイルス、トロウイルス）；サイトメガロウイルス（単核球症）；デング熱ウイルス（デング熱、ショック症候群）；エプスタイン・バーウイルス（単核球症、バーキットリンパ腫）；１型ヒトＴリンパ向性ウイルス（Ｔ細胞白血病）；Ａ、Ｂ、およびＣ型インフルエンザ（呼吸器疾患）；日本脳炎ウイルス（肺炎、脳症）；ポリオウイルス（麻痺）；ライノウイルス（感冒）；風疹ウイルス（胎児形成異常）；ワクシニアウイルス（全身感染症）；黄熱病ウイルス（黄疸、腎不全および肝不全）；および水痘帯状疱疹ウイルス（水痘）が挙げられるが、これらに限定されない。これらウイルス性病原体の抗原の例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ＶＰ４およびＶＰ７のようなロタウイルス抗原、赤血球凝集素または核タンパク質のようなインフルエンザウイルス抗原、およびチミジンキナーゼ単純ヘルペス抗原が挙げられる。
【００８３】
ウイルス性病原体にはまた、ＨＩＶ特異的免疫応答を誘導できるＨＩＶ抗原も含まれる。ＨＩＶ抗原には、ＨＩＶ  Ｔａｔ、ＲｅｖおよびＮｅｆ（例えばＮｅｆ−Ｖ３）タンパク質を含むＨＩＶ初期調節性タンパク質またはＧａｇ、Ｐｏｌ、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、ＶｐｒおよびＶｐｕのようなその他のＨＩＶタンパク質由来のペプチドが含まれるが、これらに限定されない。特に、これらのタンパク質のペプチドエピトープは、中和抗体を産生できるものである。多数のＨＩＶ  ＣＴＬ／ＣＤ８＋およびＴヘルパー／ＣＤ４＋エピトープが当該技術分野において公知であり、これらはＨＩＶ特異的な免疫応答の誘導に有効な組成物中の使用が意図され、かつ本発明の融合タンパク質、ＶＬＰおよび医薬組成物中の使用が意図される。Ｋｏｒｂｅｒ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“ＨＩＶ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，（Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，ＮＭ，ＵＳＡ，２００６／２００７）を参照されたい。
【００８４】
獣医学において重要な特定のウイルス性病原体の例としては、豚コレラウイルス、ＰＣＶ２（離乳後多臓器消耗性症候群）および仮性狂犬病ウイルス（オーエスキー病）（ブタ）；ＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１型）（ウシ）；ウマインフルエンザウイルスおよびＷＮＶ（ウエストナイルウイルス）（ウマ）；トリインフルエンザウイルス（例えばＨ５Ｎ１、ＨＫＮ３）、ＨＴＶ（シチメンチョウヘルペスウイルス）、ＭＤＶ（マレック病ウイルス）およびＩＢＤＶ（伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス）およびＮＶＤ（ニューカッスル病ウイルス）（家禽）；ネコ白血病ウイルスおよび狂犬病ウイルス（ネコ）；およびイヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルスおよびＩＨＮウイルス（イヌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
細菌性病原体の例としては、アクチノミセス・イスラエリー、炭疽菌、バクテロイデス種、百日咳菌、ボレリア・バーグドルフェリ、ブルセラ種、カンピロバクター種、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア種、クラミジア・トラコマチス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、破傷風菌、コリネバクテリウム・ジフセリエ、エンテロコッカス種、ブタ丹毒菌、大腸菌、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、フソバクテリウム・ヌクレアタム、インフルエンザ菌Ｂ型および非定型、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ菌、レプトスピラ種、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム種（例えばＭ．アビウム、Ｍ．ゴルドナエ、Ｍ．イントラセルラーレ、Ｍ．カンサシ、らい菌、結核菌）、結核菌、淋菌、髄膜炎菌、パスツレラ種、パスツレラ・マルトシダ、ニューモコッカス種、緑膿菌、リケッチア種、サルモネラ種、シゲラ種、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス種、ストレプトコッカス（嫌気性種）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・アガラクチア（ストレプトコッカスＢ群）、ストレプトコッカスＢ、ストレプトコッカス・ボビス、フェカリス菌、ストレプトバチルス・モニリホルム、ストレプトコッカス・ミュータンス、肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、Ａ群ベータ溶血性レンサ球菌、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテヌエ、コレラ菌およびペスト菌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
獣医学において重要な特定の細菌性病原体の例としては、アクチノバチルス・プルロニューモニエおよびローソニア・イントラセルラリス（ブタ）；アナプラズマ・セントラーレ、アナプラズマ・マージナーレ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・メリテンシスおよび心糸状虫（ウシ）；ストレプトコッカス・エクイ（ウマ）；クラミドフィラ・アボルタス（ヒツジ）；ボルデテラ・アビウム、マイコプラズマ・ガリセプチカム、マイコプラズマ・シノビエおよびサルモネラ種（家禽）；エロモナス・サルモニシダ、ビブリオ・アンギラルムおよびエルシニア・ラッケリ（魚類）；ならびにポルフィロモナス・グラエ、ポルフィロモナス・デンチカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｔｉｃａｎｉｓ）およびポルフィロモナス・サリボーサ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｉｖｏｓａ）（イヌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
病原性真菌としては、アスペルギルス属、ブラストミセス属、カンジダ属、コクシジオイデス属、クリプトコッカス属、ヒストプラズマ属、ヒゲカビ属、体部白癬、爪白癬、スポロトリクス・シェンキーおよびニューモシスチス・カリニが挙げられるが、これらに限定されない。病原性真菌の具体例としては、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンス、クラミジア・トラコマチス、コクシジオイデス・イミティス、クリプトコッカス・ネオフォルマンスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
病原性寄生虫としては、ディロフィラリア属、リーシュマニア属、プラスモジウム属、住血吸虫属、トキソプラズマ属およびトリパノソーマ属が挙げられるが、これらに限定されない。病原性寄生虫の具体例としては、イヌ糸状虫、森林型熱帯リーシュマニア、ドノバンリーシュマニア、小児リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、パナマリーシュマニア、メキシコリーシュマニア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、ブルーストリパノソーマおよびクルーズトリパノソーマが挙げられるが、これらに限定されない。これら病原性寄生虫の特異的抗原の例としては、プラスモジウム種スポロゾイト周囲抗原、プラスモジウム種メロゾイト表面抗原およびリーシュマニア種ｇｐ６３が挙げられる。
【００８９】
獣医学において重要な特定の病原性真菌および寄生虫の例としては、バベシア・ビゲミナ、バベシア・ボビス、ディクチオカウルス・ビビパルス、巨大肝蛭、肝蛭、ネオスポラ・カニナム、タイレリア・アヌラタ、タイレリア・ハーシ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｈｉｒｃｉ）およびタイレリア・パルバ（ウシ）；サルコシスティス・ニューロナ（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ  ｎｅｕｒｏｎａ）（ウマ）；トキソプラズマ原虫（ヒツジ）；アイメリア種（コクシジウム症）、アイメリア・マキシマおよびアイメリア・テネラ（家禽）；およびバベシア・カニス、ランブル鞭毛虫およびドノバンリーシュマニア（イヌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞に対する免疫応答を誘導できる（適切な、またはそのように設計された）、腫瘍または癌に付随するポリペプチド（「腫瘍マーカー」）である。したがって本発明に従った融合タンパク質は、腫瘍抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することで、癌の治療または予防に使用できる可能性がある。
【００９１】
ヒトの癌では千を超えるタンパク質が差次的に発現しているため、腫瘍マーカーとして役立つ可能性がある。このようなタンパク質は、限定はされないが、血管新生、アポトーシス、細胞分化、細胞シグナル伝達、造血、ホルモン調節および免疫反応のような癌に関連した過程で役割を果たしている。代表的な腫瘍マーカーとしては、悪性胸水および癌腹膜播種の両方に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；ステージＩＶ乳癌に対するヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）；尿路上皮細胞癌に対する膀胱腫瘍抗原；甲状腺癌の転移に対するサイログロブリン；肝細胞癌に対するαフェトプロテイン；前立腺癌に対する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；非小細胞肺癌に対する癌抗原１２５（ＣＡ１２５）；膵臓癌に対する癌抗原１９．９（ＣＡ１９．９）；乳癌に対する癌抗原１５．３（ＣＡ１５．３）；卵巣癌に対するレプチン、プロラクチン、オステオポンチン、およびインスリン様増殖因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）の組み合わせ；肺癌に対するＣＤ９８、ファスシン、多量体免疫グロブリン受容体の分泌鎖（ｓＰＩｇＲ）、および１４−３−３  ｅｔａタンパク質の組み合わせ；心筋梗塞に対するトロポニンＩ、およびうっ血性心不全に対するＢ型ナトリウム利尿ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
その他の一般的な腫瘍マーカーとしては、乳癌に対するエストロゲン受容体／プロゲステロン受容体（ＥＲ／ＰＲ）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、および血清ＨＥＲ２陽性乳癌に付随するメタロプロテイナーゼ（ＴＩＭＰ−１）の組織阻害物質；結腸直腸癌に対するカーステンＲａｓ癌遺伝子（ＫＲＡＳ）およびＵＤＰグルクロン酸転移酵素ファミリー１メンバーＡ（ＵＧＴ１Ａ１）；胃癌に対するＨＥＲ−２／ｎｅｕ、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）に対するｃ−ＫＩＴ、ＣＤ２０抗原、ＣＤ３０、およびＰＡＰＯＬＡとＣＰＳＦ１−血小板由来増殖因子受容体アルファ融合タンパク質（ＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＲＦアルファ）の因子相互作用、および血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）；白血病／リンパ腫に対するフィラデルフィア染色体（ＢＣＲ／ＡＢＬ）／ＰＭＬ／ＲＡＲアルファおよび未分化リンパ腫キナーゼ（（ＴＰＭＴ／ＵＧＴ１Ａ１／ＡＬＫ  ＥＧＦＲ）；肺癌に対するＫＲＡＳ／ＥＧＦＲ、ならびにメラノーマに対するＢＲＡＦおよびＳ１００が挙げられる。
【００９３】
腫瘍マーカーのその他の例としては、乳癌遺伝子１（ＢＲＣＡ１）、乳癌遺伝子２（ＢＲＣＡ２）のような、癌では失われる腫瘍抑制因子；ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡのようなＲＮＡ；前立腺特異的抗原およびＣＡ−１２５のような、体液または組織中に見出されるタンパク質；遺伝子およびタンパク質ベースのバイオマーカー；および体液中のグリコサミノグリカンのような非特異的バイオマーカー；骨格に関与するアルカリホスファターゼおよび尿中ヒドロキシプロリン；骨疾患におけるヒアルロン酸の排泄および尿中ヒドロキシプロリン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９４】
最も一般的なイヌの口腔腫瘍であるイヌ悪性メラノーマ（ＣＭＭ）およびウシ眼部の扁平上皮癌のような、獣医学の重要な悪性腫瘍に付随する腫瘍マーカーもまた、本発明の融合タンパク質およびＶＬＰを用いて提示できる。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、アレルゲンに対する免疫応答を誘導できる（適切な、またはそのように設計された）ポリペプチドである。
【００９６】
アレルゲンの実例としては、樹木および花（例えばホソムギ、ナガハグサ、オオアワガエリ、ギョウギシバ、ヒロハノウシノケグサ、カモガヤ、ライムギ、オオムギ、エンバク、コムギ、オウシュウヨモギ、シロザ、ヘラオオバコ、セイヨウタンポポ、カベイラクサ、プリックリーソルトワート、イラクサ、オリーブ、プラタナス種、イトスギ種）由来の花粉のタンパク質抽出物、昆虫（例えばヤケヒョウヒダニ、コナヒョウヒダニ、コナダニ種（例えばアシブトコナダニ）、ネッタイタマニクダニ、シワダニ、イエニクダニ、サヤアシニクダニ、ケナガコナダニ）のタンパク質抽出物、真菌または動物のフケ（例えばアオカビ種、アルテルナリア・アルテルナータ、クラドスポリウム・ヘルバルム、イヌのフケ、ネコのフケ、ウマのフケ）のタンパク質抽出物、および食物または食品のタンパク質抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドはウイルスのタンパク質に由来する。好ましくは、ウイルスはＨＩＶである。
【００９８】
好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドはＨＩＶ  ｇａｇポリペプチド由来のエピトープを含まない。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドはＨＩＶウイルスのＥｎｖタンパク質に由来するか、またはＥｎｖタンパク質のプロセシングによって得られた産物である。
【０１００】
好ましい実施形態では、ＨＩＶのＥｎｖタンパク質の配列は、配列番号２１、またはその機能的に等価なバリアントを含んでなる。
【０１０１】
好ましい実施形態では、Ｅｎｖタンパク質のプロセシングによって得られた産物はｇｐ４１、または機能的に等価なバリアントである。
【０１０２】
好ましくは、ｇｐ４１ポリペプチドの機能的に等価なバリアントは、それらの参照ポリペプチドの形成活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％を有する。ＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドの機能的バリアントのＶＬＰ形成を検出するための幾つかの技術は、当業者に公知である。
【０１０３】
好ましい実施形態では、ｇｐ４１バリアント配列は配列番号５を含んでなり、かつｇｐ４１  ＨＲ２領域およびＭＰＥＲ領域を含んでなる。
【０１０４】
別の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドの長さは９０アミノ酸未満、８０アミノ酸未満、７０アミノ酸未満または６０アミノ酸未満である。
【０１０５】
別の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、
（ａ）  ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントのＨＲ２領域、および
（ｂ）  ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントのＭＰＥＲ領域
を含んでなる。
【０１０６】
ｇｐ４１のＨＲｌおよびＨＲ２配列は当該技術分野において周知である。好ましい実施形態では、ＨＲ２領域は配列番号２２を含んでなる。好ましくは、ＨＸＢ２  Ｅｎｖタンパク質の特定の場合に、ＭＰＥＲ領域は配列番号２３を含んでなる。
【０１０７】
本発明に従ったｇｐ４１バリアントを形成する領域の構造には修飾および変更が為されてよく、類似の、またはその他の望ましい特性をなお有する分子を得られるため、このような機能等価物もまた本発明の範囲内に包含される。
【０１０８】
本発明の目的のために、免疫原性組成物中で抗原として有用なポリペプチド（すなわち十分な「免疫原性活性」を有する）は、宿主生物に投与した際、所定のポリペプチドが前記ポリペプチドに特異的な抗体の生成を開始する能力を測定するための、通常当該技術分野において公知のいずれかの方法によって同定可能である。本発明に従ったポリペプチドの所定のバリアントが、免疫学的に同一のバリアントとなるための能力は、対象のバリアントを試験動物に接種して得られた抗体が、ＨＩＶ株に感受性である細胞の感染を中和する能力について試験する、標準的な中和アッセイを用いて決定してよい。
【０１０９】
本発明に従った免疫原性ポリペプチドの免疫学的な機能等価物は、ポリペプチドを修飾することによって取得できる。前記修飾は、限定はされないが、アミノ酸の変更、欠失、切断、ポリペプチド断片の他のポリペプチドとの融合、挿入、またはそれらのいずれかの組み合わせであってよい。したがって、免疫原性ポリペプチドの免疫学的な機能等価物は、参照ポリペプチドの免疫原性活性が維持されているという条件で、天然免疫原性ポリペプチドの対応する領域のアミノ酸配列に関して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を示す。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドの領域にわたって、またはより好ましくは、長さが少なくとも約５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの領域にわたって存在する。２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である印は、以下に記載するように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば２つのペプチドが保存された置換によってのみ異なる場合には、通常、ポリペプチドは第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つのペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られるコンピューターアルゴリズムおよび方法を用いて決定できる。２つのペプチドの２つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて決定される。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，“ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ”，（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．，１９９０，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を参照されたい。
【０１１０】
本発明の範囲内にあることが意図される修飾の一例では、特定のアミノ酸が、ポリペプチド構造内の他のアミノ酸を置換してよく、このとき、例えば抗体が認識し、かつ結合する抗原のエピトープのような構造の、相互作用的な結合能力が大きく失われることはない。これは相互作用的な能力であり、ポリペプチドの生物学的（例えば免疫学的）な機能的活性を規定する性質であることから、アミノ酸配列（またはその根底にあるＤＮＡコード配列）における特定のアミノ酸配列の置換が為されても、同等な性質を有するポリペプチドは取得できる。本発明の抗原のアミノ酸配列には、免疫原性活性を大きく失わせることなく、様々な変更が為されてよい。
【０１１１】
当該技術分野では、機能的に等価なアミノ酸の置換を行うためにはアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮するであろうことが理解される。当該技術分野では一般に、ポリペプチドへの相互作用的な生物学的機能の付与におけるアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性が理解される。Ｋｙｔｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８２；１５（１）：１０５−１３２を参照されたい。特定のアミノ酸が、同様な疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸を置換してよく、このとき、同様な生物学的活性はなお維持されることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変更を行う際、置換するアミノ酸の疎水性親水性指標がプラスまたはマイナス２の範囲内であることが好ましく、プラスまたはマイナス１の範囲内であることが特別に好ましく、プラスまたはマイナス０．５の範囲内であることがさらに特別に好ましい。各アミノ酸には、疎水性および電荷の特性に基づいて疎水性親水性指標が指定されており、それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
【０１１２】
当該技術分野ではまた、特に免疫学的に機能等価なポリペプチドの場合、同様のアミノ酸の置換はそれらの親水性に基づいて効果的に為されることが理解されており、本発明の特定の実施形態に見られるように、これによって作製物は免疫学的実施形態での使用が意図されたものとなる。隣接するアミノ酸の親水性によって制御される、タンパク質の局所的な平均的親水性の高さは、免疫原性と抗原性に相関する。Ｈｏｐｐ  Ｔによる米国特許第４５５４１０１号を参照されたい。同様の親水性値に基づいて変更を行う際、置換するアミノ酸の親水性値がプラスまたはマイナス２の範囲内であることが好ましく、プラスまたはマイナス１の範囲内であることが特別に好ましく、プラスまたはマイナス０．５の範囲内であることがさらに特別に好ましい。アミノ酸残基には、以下の親水性値が指定されている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０のプラスまたはマイナス１）、グルタミン酸（＋３．０のプラスまたはマイナス１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５のプラスまたはマイナス１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。
【０１１３】
例えば結合領域またはエピトープの残基で、一般に交換され得ない残基のような特定の残基が、タンパク質もしくはペプチドの免疫学的または構造的性質に特に重要であると示されていることは、当該技術分野において周知である。このように、本明細書で定義される機能等価物は、天然の免疫学的活性を実質的な量維持しているポリペプチドである。一般に、分子の長さが短いほど、その機能に影響を与えることなく分子に行うことのできる変更の数は少なくなる。より長いドメインは、中くらいの数の変更を有する可能性がある。完全長タンパク質は、多数の変更を最も許容するであろう。しかしながら、それらの構造に高度に依存している特定の分子またはドメインは、修飾をわずかに許容するか、全く許容しないことが理解されなくてはならない。
【０１１４】
免疫学的に同一なバリアントは、天然免疫原性ポリペプチドにおける領域、または以下に述べるようにストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするその相補体における領域をコードする分子と実質的に同一な核酸配列からの発現によっても取得でき、これには前記核酸によってコードされるポリペプチドの免疫原性活性が維持されているという条件が伴う。
【０１１５】
ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる環境において、異なり得る。より長い配列は、高温で特異的にハイブリダイズする。Ｔｉｊｓｓｅｎ  Ｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＮＬ  １９９３）を参照されたい。一般にストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、ｐＨにおける特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０パーセントが、標的配列に平衡状態でハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度における）である（標的配列の過剰な存在下で、Ｔｍにおいてはプローブの５０パーセントが平衡状態で結合している）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０から８．３における塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満で、典型的には約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩による）であり、かつ温度が、短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドを超える）に対しては少なくとも約６０℃の条件になるであろう。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような変性剤の添加によっても達成され得る。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。代表的な高ストリンジェンシーまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、５０パーセントホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１パーセントＳＤＳとの４２℃でのインキュベーション、または５×ＳＳＣおよび１パーセントＳＤＳとの６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣおよび０．１パーセントＳＤＳによる６５℃での洗浄とが挙げられる。
【０１１６】
当業者は、本発明に従った融合タンパク質の部分を形成する様々な成分が、リンカー領域を通して直接または間接に機能的に連結し得ることを理解するであろう。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、少なくとも１つのリンカーをさらに含んでなる。好ましくは、リンカーはグリシン残基を含んでなり、より好ましくはグリシンおよびセリン残基を含んでなる。さらにより好ましくは、リンカーは３つのグリシン残基と１つのセリン残基とを含んでなる。好ましくは、リンカーは配列番号２４または配列番号２５の配列を含んでなる。より好ましくは、リンカー配列は、配列番号２４および配列番号２５の配列からなる群から選択される。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、タグをさらに含んでなり、このタグは、前記タグに対する特異的な親和性を示す試薬を用いて、ｇｐ４１バリアントの検出または精製のために使用され得る。適切な検出／精製タグとしては、ヘキサｈｉｓ（金属キレート成分）、ヘキサｈａｔ  ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）グルタチオン親和性、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ｓｔｒｅｐタグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、Ｓ−ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応エピトープ、エピトープタグ、Ｅ２ｔａｇ、ＨＡエピトープタグ、Ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧエピトープ、ＡＵ１およびＡＵ５エピトープ、ＧＩｕ−ＧＩｕエピトープ、ＫＴ３エピトープ、ＩＲＳエピトープ、Ｂｔａｇエピトープ、プロテインキナーゼＣエピトープ、ＶＳＶエピトープ、またはその他のいずれかのタグが、タンパク質の安定性またはそれに結合する抗原の免疫原性に影響を与えない限りにおいて、挙げられる。
【０１１９】
本発明に従った融合タンパク質には、幾つかのタイプのアミノ酸配列が、例えばそれらの取り扱いや発現のモニタリングを容易にするといった様々な目的を達成するために付加されてもよい。このようなペプチド配列の、本発明に従った融合タンパク質への付加は、それらの機能的または免疫原性の能力には影響しない。
【０１２０】
好ましい実施形態では、リンカー配列は、配列番号２６、配列番号２７または配列番号２８の配列を含んでなる。好ましくは、リンカー配列は、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８の配列からなる群から選択される。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号２９の配列を含んでなる。
【０１２２】
３．  核酸、ベクターおよび宿主細胞
ａ）  核酸
追加の態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【０１２３】
好ましい実施形態では、本発明に従ったポリヌクレオチドは、配列番号９の配列を含んでなる。
【０１２４】
好ましい実施形態では、本発明に従ったポリヌクレオチドの配列は、その発現のために選択された宿主に従ってコドン最適化される。別の好ましい実施形態では、本発明に従った免疫原性ポリペプチドをコードするコドン最適化配列は、配列番号１１の配列を含んでなる。さらなる好ましい実施形態では、本発明に従ったＨＩＶ  ｇａｇポリペプチドをコードするコドン最適化配列は、配列番号１３の配列を含んでなる。
【０１２５】
コドン最適化のための多くの方法およびソフトウェアツールが、当業者に公知である。本発明に従った使用のためのコドン最適化核酸は、免疫原をコードする核酸のコドンを、選択された宿主ゲノムに高頻度でみられるコドンで置換することによって調製できる（例えば「ヒト化」コドンは、高発現のヒト遺伝子にしばしばみられるコドンである）。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本発明に従った（すなわちヒト）コドン最適化ポリヌクレオチドは、配列番号１５の配列を含んでなる。
【０１２７】
本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞内への導入後に核酸の発現を駆動できるいずれかのプロモーターまたはエンハンサーに、機能的に連結できる。プロモーターは、核酸の転写を方向付ける核酸制御配列の配置である。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩタイプのプロモーターの場合のように、転写開始点の近傍にある（近傍にある可能性のある）必要な核酸配列を含む（ＴＡＴＡエレメント）。プロモーターはまた、転写開始点から数千塩基対ほども遠くに位置し得る、遠位のエンハンサーまたは抑制エレメントも含んでよい。恒常性および誘導性プロモーターの両方が含まれる。
【０１２８】
本発明に従ったポリヌクレオチドは、クローニング、その他の実験室操作の実施、組換えペプチドの作製または遺伝子送達の目的で、ベクターへ取り込ませてよい。
【０１２９】
ｂ）  ベクター
さらなる態様において、本発明は、本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。
【０１３０】
当業者は、本発明と共に使用できるベクターのタイプに関しては制限がないことを理解するであろう。ベクターは、増殖およびポリヌクレオチドの取得に適したクローニングベクター、幾種かの異種性生物に取り込まれる遺伝子コンストラクトまたは発現ベクターであってよい。したがって、本発明に従った適切なベクターとしては、原核生物の発現ベクター（例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびそれらの誘導体）、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏＩＥｌ、ｐＣＲｌ、ＲＰ４、ファージおよびシャトルベクター（例えばｐＳＡ３およびｐＡＴ２８）、酵母発現ベクター（例えば２ミクロンプラスミドタイプのベクター）、インテグレーションプラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなど、昆虫細胞発現ベクター（例えばｐＡＣシリーズおよびｐＶＬシリーズベクター）、植物において発現するベクター（例えばｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥシリーズベクター）のような、植物発現ベクター、およびウイルス性ベクター（例えばアデノウイルス、アデノウイルスならびにレトロウイルスおよびレンチウイルスに関連するウイルス）ベースの真核生物発現ベクター、ならびにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国カリフォルニア州フォスターシティ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ  ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦｌ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴｌのような非ウイルス性ベクターが挙げられる。好ましい実施形態では、ベクターはｐｃＤＮＡ３．１である。
【０１３１】
特定の実施形態では、ベクターは、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ最初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期プロモーター、ＳＶ４０アデノウイルスの後期プロモーター、ｌａｃシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーターまたは酵母接合因子のプロモーターのような、調節エレメントを含み得る発現ベクターである。代表的なベクターとしては、細菌人工染色体、コスミド、酵母人工染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクター（例えばレトロウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質に適した発現ベクターについては、以前に記載されている。Ｓｅｅ  Ｋａｙｍａｎによる米国特許第５６４３７５６号を参照されたい。
【０１３２】
ｃ）  宿主細胞
別の態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質、それをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる宿主細胞に向けられる。
【０１３３】
本発明に適した細胞としては、哺乳類、植物、昆虫、真菌および細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細菌細胞としては、バチルス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカス属の種のようなグラム陽性細菌細胞、ならびにエシェリキアおよびシュードモナス属の細胞のようなグラム陰性細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。真菌細胞としては、好ましくはサッカロミセス、ピキア・パストリスおよびハンゼヌラ・ポリモルファのような酵母細胞が挙げられる。昆虫細胞としては、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられるが、これらに限定されない。植物細胞としては特に、穀類、薬用植物、観賞植物または球根植物のような作物の細胞が挙げられる。哺乳類細胞としては、ＣＨＯ−Ｋｌ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９８６；１２：５５５−５５６；およびＫｏｌｋｅｋａｒ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７；３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋｌ  Ｔｅｔ−Ｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，米国カリフォルニア州マウンテンビュー）、ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２と番号付けされたＣＨＯ（ＣＡＭＲ，英国ウィルトシャー州ソールズベリー）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ，イタリアジェノヴァ）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ，イタリアジェノヴァ）、ＥＣＡＣＣ  ９３０６１６０７と番号付けされたＣＨ０−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ，英国ウィルトシャー州ソールズベリー）、ＥＣＡＣＣ  ９２０５２１２９と番号付けされたＲＲ−ＣＨＯＫｌ（ＣＡＭＲ，英国ウィルトシャー州ソールズベリー）、ジヒドロ葉酸還元酵素陰性のＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、Ｕｒｌａｕｂ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８０；７７：４２１６−４２２０）のような、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＶ４０形質転換サル腎臓ＣＶｌ細胞（ＣＯＳ、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１６５１）；ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−ＩＯ）；サル腎臓細胞（ＣＶｌ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−８１）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ  Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９８０；２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−７５）；ヒト肝細胞腫細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１４４２）；トリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  Ｊ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８２，３８３：４４−６８）；ＭＣＲ５細胞およびＦＳ４細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、利用される宿主細胞はＨＥＫ−２９３Ｔ細胞である。
【０１３４】
好ましい実施形態では、本発明に従った宿主細胞は組換え細菌である。
【０１３５】
好ましい実施形態では、細菌はグラム陰性細菌細胞であり、この用語は、エシェリキア種、シゲラ種、シトロバクター種、サルモネラ種、クレブシエラ種、エンテロバクター種、エルウィニア種、クライベラ種、セラチア種、セデセア種、モルガネラ種、ハフニア種、エドワージエラ種、プロビデンシア種、プロテウスおよびエルシニア種のような、腸内細菌ファミリーの任意のグラム陰性細胞すべてを含むことが意図されたものである。
【０１３６】
本発明の融合タンパクに関連して、これまでに記載してきたすべての用語および実施形態は、本発明に従ったポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞へ同等に適用される。
【０１３７】
４．  ＶＬＰを調製するための方法
別のさらなる態様において、本発明は、対象ポリペプチドを負荷してなるＶＬＰを調製するための方法であって、
（ａ）  本発明に従った融合タンパク質を細胞内に発現させること、および
（ｂ）  細胞外の培地からＶＬＰを回収すること
を含んでなる方法に関する。
【０１３８】
本発明に従った方法の第１工程は、本発明に従ったポリヌクレオチドを含んでなるベクターによる宿主細胞の形質転換を含んでなる。前記形質転換は、当業者に周知の従来技術によって行うことができる。宿主が原核生物、例えば大腸菌である場合、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピテント細胞は、指数関数的増殖期後に収集し、続いてＣａＣｌ２法によって処理した細胞から、当該技術分野において周知の手順を用いて調製できる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用してもよい。所望により、形質転換は宿主細胞のプロトプラスト形成後に行ってもよいか、またはエレクトロポレーションによって行ってもよい。
【０１３９】
宿主が真核生物の場合、このようなＤＮＡのトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、従来の機械的手順、例えば微量注入法、エレクトロポレーション法、リポソームに包まれたプラスミド、またはウイルスベクターの挿入法を用いることができる。真核細胞はまた、免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択的表現型をコードする第２の外来性ＤＮＡ分子とによって共形質転換することもできる。別の方法では、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスのような真核生物に対するウイルスベクターを用いて、真核細胞を一過性に感染させるかまたは形質転換させた後、タンパク質を発現させる。
【０１４０】
細胞培養は、本発明に従ったポリヌクレオチドの発現を許容するのに適した条件下で維持しなければならない。
【０１４１】
本発明に従った方法の第２工程は、細胞外の培地から、例えば遠心分離と０．４５μｍのフィルターを通した濾過とによって、ＶＬＰを回収することを含んでなる。
【０１４２】
本発明に従った融合タンパク質を用いて取得したＶＬＰの場合、ＶＬＰは脂質エンベロープで囲まれたウイルスカプシドを有することによって特徴付けられ、この脂質エンベロープはＶＬＰを形成した細胞に由来する。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、本発明に従った、または本発明に従った方法を用いて取得した融合タンパク質を含んでなるウイルス様粒子に関する。
【０１４４】
これまでに記載してきたすべての用語および実施形態は、本発明に従ったＶＬＰを調製する方法および本発明に従ったＶＬＰへ同等に適用される。
【０１４５】
５．  医薬組成物
さらなる態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞もしくはウイルス様粒子、またはそれらの組み合わせを含んでなる医薬組成物を指す。
【０１４６】
本発明に従った医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでよい。
【０１４７】
薬学的に許容される担体は、レシピエントに対して用いられる投与量および濃度においては本質的に無毒であり、製剤のその他の成分に適合性である。例えば、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが知られるその他の化合物は、通常ポリペプチドを含む製剤のための担体には含まれない。適切な担体としては、水、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体には、製剤の有効性を増強する、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはアジュバントのような追加の薬剤を含有させることができる。
【０１４８】
本発明に従った医薬組成物は筋肉内、皮下、または静脈内注射、および経口、経鼻、または肛門内投与のような、当業者に公知のいずれかの方法によって投与できる。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓの、Ｂａｎｇａ  Ａ，“Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９９５）を参照されたい。本発明に従った対象ポリペプチドは、その治療上の利点を延長させるため（例えば免疫原性応答を増大させる）、植込錠、油性注射、または粒子状の系として提供できる。粒子状の系は、微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、または同様の粒子であってよい。上記のＢａｎｇａ，１９９５を参照されたい。好ましくは、本発明に従った医薬組成物は非経口的に投与される。
【０１４９】
本発明に従った医薬組成物は、正確な投与量を個別に投与するために適した単位剤形として処方することができる。医薬組成物の治療有効量は、単回用量として投与できるか、または複数回用量として、例えば治療期間内に毎日か、または予防プロトコルの一部として投与できる。特定の、限定されない例では、本発明に従った医薬組成物のパルス用量は、少なくとも毎日、少なくとも毎週および少なくとも毎月投与される。医薬組成物の投与の量、頻度および経路は、被験体の必要に応じて、かつヒトおよび動物の医薬における適切なプロトコルに従って、当業者により変更されてよい。
【０１５０】
本発明に従った医薬組成物の治療有効量は、疾病の重症度、および年齢、体重、被験体の一般的状態、ならびに対象ポリペプチドに対する被験体の感受性のような、その他の臨床的因子に依存し得る。したがって、適切な治療用投与計画の最終決定は、担当医師によって為されるであろう。典型的には、医薬組成物のｉｎ  ｓｉｔｕ投与に有用な量についての有用な指針は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる投与量によって提供され、特定の疾患を治療するために有効な投与量の決定には動物モデルが用いられてよい。Ｇｉｌｍａｎ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ  Ａ，Ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳ，１９９０）を参照されたい。典型的には、用量範囲は約０．１μｇ／ｋｇ体重ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。その他の適切な範囲には、約１μｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が含まれる。一例として、用量は約１．０μｇないし約５０ｍｇ、例えば一被験体あたり１ｍｇのペプチドのような、１μｇないし１ｍｇである。
【０１５１】
ａ）  免疫原性組成物またはワクチン組成物
好ましい実施形態では、本発明に従った医薬組成物は免疫原性組成物またはワクチン組成物である。前記免疫原性組成物またはワクチン組成物は、治療有効量の、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはウイルス様粒子、またはそれらの組み合わせを含んでなる。
【０１５２】
本発明に従った免疫原性組成物またはワクチン組成物は、薬学的に許容される担体およびその他の賦形剤、例えばアジュバントをさらに含んでよい。本発明に従った免疫原性組成物またはワクチン組成物と共に用いてもよいアジュバントの例としては、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）、２パーセントのスクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含む、リポ多糖およびその様々な誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えばポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・バルバム、百日咳菌、およびブルセラ属菌種のメンバーに見出される物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチド基質すなわちＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、ならびにＧＭ−ＣＳＦが挙げられるが、これらに限定されない。Ｈｕｎｔｅｒの米国特許第５５５４３７２号、およびＪａｇｅｒの国際公開第１９９７０２８８１６号を参照されたい。合成ポリマーを基にした粒子状の担体は、制御された放出に加えて、免疫応答を増強するアジュバントとしても作用することが知られている。アルミニウム塩もまた、免疫応答を引き起こすアジュバントとして使用できる。
【０１５３】
好ましい実施形態では、本発明に従った免疫原性組成物またはワクチン組成物は、治療有効量の本発明に従ったウイルス様粒子を含んでなり、アジュバントは含まない。さらに好ましい実施形態では、本発明に従った免疫原性組成物またはワクチン組成物は、リン酸アルミニウムを本質的に含まない。
【０１５４】
本発明に従った免疫原性組成物またはワクチン組成物は、治療上の効果が望まれるときには（例えばＨＩＶ−１感染の徴候、症状、または臨床検査結果の改善）いつでも投与できる。一般に用量は、疾病の症状または徴候を、被験体に許容されない毒性をもたらすことなく治療または寛解させるために十分なものである。全身性投与または局所投与を用いることができる。免疫原性組成物またはワクチン組成物は、組成物の最初の投与後、別の日に少なくとも１回の２回目の投与を、同じかまたは異なる投与量を用いて行うことによって、対象ポリペプチド（すなわち免疫原）に対する被験体の免疫応答を強化するかまたは維持する、プライム／ブーストプロトコルに従って被験体に投与されてよい。
【０１５５】
これまでに記載してきたすべての用語および実施形態は、本発明に従った免疫原性組成物またはワクチン組成物へ同等に適用される。
【０１５６】
６．  治療方法
別の態様において、本発明は、医薬における使用のための、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせに向けられる。好ましい実施形態では、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせは、ヒト医学における使用のためのものである。別の好ましい実施形態では、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせは、獣医学における使用のためのものである。
【０１５７】
別のさらなる態様において、本発明は、被験体における感染もしくは腫瘍によって引き起こされる疾病の治療または予防における使用のための、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせに関する。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。別の好ましい実施形態では、被験体は家畜または愛玩動物である。この態様の別の形態において、本発明は、被験体における感染もしくは腫瘍によって引き起こされる疾病を治療または予防する方法に関し、該方法は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせの治療有効量の、被験体への投与を含んでなる。この態様のさらなる別の形態において、本発明は、被験体における感染もしくは腫瘍によって引き起こされる疾病の治療または予防のための薬剤の製造における、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせの使用を指す。
【０１５８】
追加の態様において、本発明は、細胞への治療薬の送達または診断における使用のための、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせに関する。
【０１５９】
好ましい実施形態では、対象ポリペプチドはＨＩＶポリペプチドである。さらに好ましい実施形態では、ＨＩＶポリペプチドは、ｇｐ４１またはその機能的に等価なバリアントのＭＰＥＲ領域を含んでなる。好ましくは、被験体はヒト、チンパンジー、マカクまたはヒヒである。より好ましくは、被験体はヒトである。
【０１６０】
本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせを使用して治療または予防され得るその他の疾病には、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫によって引き起こされる感染症が含まれる。本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせを使用して治療または予防され得るウイルスまたはウイルス感染症の例としては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ハンタウイルス、デング熱、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスＩＩ型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザ、麻疹、流行性耳下腺炎、パポバウイルス、ポリオ、呼吸器合胞体ウイルス、牛疫、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、ＳＡＲＳウイルス、天然痘およびウイルス性髄膜炎が挙げられるが、これらに限定されない。適した細菌または細菌感染症の例としては、炭疽菌、ボレリア・バーグドルフェリ、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・トラコマチス、クロストリジウム・ボツリヌム、破傷風菌、ジフテリア種、大腸菌、レジオネラ種、ヘリコバクター・ピロリ、マイコバクテリウム、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、百日咳種、緑膿菌、肺炎レンサ球菌、ストレプトコッカス種、スタフィロコッカス種、コレラ菌およびペスト菌が挙げられるが、これらに限定されない。適した真菌または真菌感染症の例としては、アスペルギルス・フミガーツス、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ・アルビカンス、コクシジオイデス・イミティス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツムおよびペニシリウム・マルネッフェイが挙げられるが、これらに限定されない。適した原虫および寄生虫もしくは真菌または原虫および寄生虫感染症の例としては、クラミジア種、リーシュマニア種、プラスモジウム種（例えばマラリア）、リケッチア種およびトリパノソーマ種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせはまた、例えば、ボツリヌス毒素、炭疽菌、ウェルシュ菌、枯草菌、バチルス・チューリンゲンシス、出血性結膜炎ウイルス（エンテロウイルス７０）およびロタウイルスなどのバイオテロリズムに関連する病原体に対抗するためにも有用となり得る。
【０１６２】
本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせはさらに、アルツハイマー病、パーキンソン病および関節リウマチのような慢性の状態、またはアレルギーおよび腫瘍のようなその他の状態の治療もしくは予防のためにも有用となり得る。後者の例は、腫瘍マーカーまたは放射線療法のための放射性元素に対する抗体もしくは抗体の断片を同時に含むキメラタンパク質からなってよい。本発明に従った融合タンパク質、およびそれらから誘発された抗体はまた、受胎能および妊娠の診断、または大腸癌、肺癌、乳癌および前立腺癌のような疾病の診断にも使用できる。これらの融合タンパク質はまた、薬物乱用または治療進行をモニターまたは制御するためにも使用できる。
【０１６３】
本発明はさらに、ＨＩＶ感染に関連する症状を予防するか、または減少させることに関する。これらの症状としては、ＨＩＶ感染の軽度の症候性段階に関連する症状、例えば、帯状疱疹、皮膚発疹および爪感染、口の痛み、鼻および喉の反復性の感染、ならびに体重減少が挙げられる。加えて、ＨＩＶ感染の主要な症候性段階に関連するさらなる症状として、例えば、口腔および膣鵞口瘡（カンジダ）、持続性の下痢、体重減少、持続性の咳および結核の再活動化、および口唇ヘルペス（単純ヘルペス）のような反復性のヘルペス感染も挙げられる。本発明に従って治療可能な末期ＡＩＤＳの症状としては、例えば、下痢、悪心および嘔吐、鵞口瘡および口唇ヘルペス、持続性かつ反復性の膣感染症および子宮頸癌、持続性全身性リンパ節腫脹（ＰＧＬ）、重篤な皮膚感染症、いぼおよび白癬、呼吸器感染症、肺炎、特にニューモシスチス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒまたはｓｈｉｎｇｌｅｓ）、疼痛、しびれ、または手足の「ピリピリ感」のような神経系の問題、神経性の異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核、およびその他の日和見感染症が挙げられる。
【０１６４】
本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子、および医薬組成物、またはそれらの組み合わせは、被験体における抗体の発現を誘導できる。一実施形態では、抗体は中和抗体（すなわちｎＡｂ）である。好ましい実施形態では、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子、および医薬組成物、またはそれらの組み合わせは、ＨＩＶに曝露された未感染の被験体におけるＨＩＶ感染またはＡＩＤＳを予防するために用いられる。
【０１６５】
本発明に従った融合タンパク質はまた、愛玩動物および家畜ならびに魚類の繁殖における複数の用途も有し得る。これらの融合タンパク質は、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）のような動物のレトロウイルスに対する、また、ウシに多くの問題を引き起こす細菌性病原体であるブルセラ種のような非ウイルス性病原体に対して、または主に鮭の商業用養殖に影響を与えるピシリケッチア・サルモニスに対する、免疫原性組成物またはワクチン組成物を調製するために用いられてよい。その他に可能性のある、本発明に従った融合タンパク質の用途は、ブタに多大な損害を与える肺炎病原体であるマイコプラズマ・ハイオニューモニエに対するワクチンの調製である。特定のホルモンの発現を調節するために、本発明に従った融合タンパク質を使用して、家畜の成長速度を上げて乳産生を促進させたり、精肉を赤身にすることも可能かもしれない。このような従来にはない適用の例は、ブタのような家畜の免疫学的去勢のための、これらの実態の使用であろう。
【０１６６】
典型的には、本発明の方法で用いられる中和抗体は、病原体の表面に結合して、病原体による感染を、単数もしくは複数の前記抗体の非存在下または陰性対照の存在下での病原体による感染に対して、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１０％阻害するかもしくは低下させる。次に、本明細書に記載するいずれかの方法を用いて、ｎＡｂが広範に中和するか（すなわちｂｎＡｂであるか）否かを試験できる。ｎＡｂまたはｂｎＡｂを非ヒト動物において産生した場合、ＣＤＲまたは完全配列を非ヒトフレーム構造からヒトフレーム構造へ移行させて、ヒトへの投与に適した抗体を産生できる。抗体がｎＡｂであるか否かを決定するための方法は、当該技術分野において記載されている。Ｌｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９：１０１０８−１０１２５，Ｗｅｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２２：３０７−３１２、およびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  Ｄ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；Ｊａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：Ｕｎｉｔ  １２．１１を参照されたい。これらの方法は、レポーター遺伝子をコードするウイルスを用いた、感受性細胞株へのウイルス感染の１ラウンド後の、レポーター遺伝子の発現低下の決定に基づいている。
【０１６７】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞またはウイルス様粒子は、本発明に従った使用のためのものであって、ここで被験体は、担体と接合させてなる融合タンパク質の一部を形成する免疫原性ポリペプチドを含んでなるコンジュゲートによって、予め処置される。
【０１６８】
好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１ポリペプチドまたはその機能的に等価なバリアントのいずれかの領域に対応する。好ましくは、領域はＭＰＥＲ領域である。より好ましくは、ＭＰＥＲ領域は配列番号２３を含んでなる。
【０１６９】
別の好ましい実施形態では、担体はＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）である。
【０１７０】
７．  キット
さらなる態様において、本発明は、本発明に従った融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ウイルス様粒子もしくは医薬組成物、またはそれらの組み合わせの少なくとも１つを含んでなるキットを指す。本発明に従ったキットの構成要素は、適切なコンテナー内に任意に詰められ、感染症の治療または予防を含む、それらの意図された使用について標識されてよい。一実施形態では、感染症はＨＩＶ、ＡＩＤＳまたはそれらに関連した疾病もしくは状態である。キットの構成要素は、水溶液（好ましくは無菌）として、または再構成用の凍結乾燥品（好ましくは無菌）として、単位で、または複数用量コンテナー内に保管されてよい。コンテナーは、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成されてよく、かつ無菌のアクセスポートを有してよい（例えばコンテナーは、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってよい）。キットはさらに、薬学的に許容される担体を含んでなる、さらなるコンテナーを含んでよい。これらは、限定はされないが、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、１つ以上の適切な宿主細胞のための培地またはその他の有効薬剤を含む、商業的な、およびユーザーの立場から望まれるその他の材料をさらに含んでよい。キットは、治療用製品の市販用パッケージに習慣的に含まれる、例えば、適応症、用法、投与量、製造、管理、禁忌、またはこのような治療用製品の使用に関わる警告についての情報を含んだ使用説明書を含んでよい。
【０１７１】
本明細書で言及した全ての刊行物は、参照によりその全体が取り込まれる。本発明について全体的に記載してきたが、同じことは以下の実施例の参照によってさらに容易に理解できるであろう。ただしこれらの実施例は説明の目的で供されるのであり、特記されない限り、本発明を限定するように意図されたものではない。
【０１７２】
全般的手順
１．  ｇｐ４１由来の小タンパク質、ｇａｇおよび融合タンパク質用の発現ベクター
Ｃ末端ＨＲ２領域、ＭＰＥＲおよびＴＭドメインを含む小タンパク質をコードするｐＭＩＮ哺乳類発現プラスミドについては、以前に記載した。Ｍｏｌｉｎｏｓ−Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１４，１１：４４を参照されたい。ＭＩＮ配列およびｇｐ４１の細胞質側末端を含むｇｐ４１由来タンパク質をコードする、同様のプラスミドｐＭＩＮＦＵＬＬも作製した。図１を参照されたい。大腸菌による組換えタンパク質産生のため、ＭＩＮ配列を、ｐＥＴ−２１Ｄ＋発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，ドイツ、ダルムシュタット）内にクローン化した。
【０１７３】
Ｇａｇ配列は、強化ＧＦＰとインフレームで融合させたＲｅｖ非依存性ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質をコードするｐＧａｇ−ＥＧＦＰプラスミドから増幅した。プラスミドは、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（カタログ番号１１４６８）から取得した。Ｄｈｉｌｌｏｎ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００７；８１：６５４８−６５６２を参照されたい。ｇａｇアンプリコンをｐｃＤＮＡ３．１ＭＩＮプラスミド内にインフレームでサブクローン化して、融合タンパク質ＭＩＮＧＡＧをコードするｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧ−３．７プラスミドを生成させた。ｐＧａｇ−ＥＧＦＰプラスミドからｇａｇコード配列を切除してｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールスバッド；カタログ番号Ｋ４９００−０１、Ｋ４９００−４０）内にサブクローニングすることにより、Ｇａｇの全長配列をコードするｐＧＡＧプラスミドを生成させた。図１を参照されたい。すべての増幅反応は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、２７２０サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国カリフォルニア州フォスターシティ）内で行った。すべてのプラスミドは配列決定を行って、予想される配列および挿入部位を確認した。
【０１７４】
２．  ペプチド、ｇｐ４１由来タンパク質およびＶＬＰ
Ｃ３４、Ｔ−２０およびＭＰＥＲペプチド（ＨＸＢ２配列）ならびにキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびＫＬＨに接合させたＭＰＥＲ（ＫＬＨ−ＭＰＥＲ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）を利用した。ｇｐ４１  ＨＲ２およびＭＰＥＲ領域をカバーする１５−ｍｅｒ重複ペプチドは、Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｒ（ＩｒｓｉＣａｉｘａ，スペイン、バダロナ）から供与された。Ｃ末端６×Ｈｉｓタグを含むＭＩＮタンパク質を、大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）内で産生した。図１Ａを参照されたい。封入体を、１Ｌ培養の細菌抽出物から取得し、８Ｍ尿素溶液を用いて可溶化した。高度に純粋なタンパク質を、ニッケルベースの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．，米国コネチカット州スタンフォード）およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．，米国コネチカット州スタンフォード）を用いたゲル濾過を通して得た。
【０１７５】
ＶＬＰは、産生スケールに従って、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への様々な誘導体のトランスフェクションによって取得した。安定化トランスフェクションのため、ｃａｌｐｈｏｓ哺乳類トランスフェクションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．，日本、大津市）を用いて、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にｐＭＩＮＦＵＬＬおよびｐＧＡＧ、ｐＧＡＧまたはｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧ−３．７をトランスフェクトした後、ジェネテシンプラスハイグロマイシン、ハイグロマイシンまたはジェネテシン、それぞれを用いることによって、トランスフェクトされた細胞を選択した。
【０１７６】
ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの収率が低い場合、ＧＡＧおよびＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰのラージスケールでの産生は、異なる設定において行った。Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ，オランダ、フェンロー）を用いて大量のｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧ−３．７発現プラスミドを産生し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションに用いた。Ｇａｇ  ＶＬＰを１Ｌ培養フラスコ内で産生し、ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰは５Ｌバッグ内で産生した。トランスフェクション後４８時間目に、上清を収集し、限外濾過、濃縮して（ＭＩＮＧＡＧの場合１Ｌへ）、超遠心を行った。ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ，ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ．，英国モルバーン）および電子顕微鏡によって評価したところ、両調製物とも大量のｇａｇタンパク質を含んでいた。
【０１７７】
３．  抗原性試験
ＶＬＰ表面の抗原の露出を評価するため、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、対象の細胞外エピトープと完全なＨＩＶ  ｇａｇ配列を含む融合タンパク質をトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間目に細胞を回収し、細胞表面抗原に対する特異的抗体（抗ｇｐ４１抗体２Ｆ５、４Ｅ１０もしくは１０Ｅ８、またはその他の対象タンパク質に対する特異的抗体）によって染色した。過剰の抗体を洗浄した後、細胞を固定してＦＩＸ  ａｎｄ  ＰＥＲＭ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて透過処理した後、抗ｇａｇ抗体Ｋｃ５７（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，米国カリフォルニア州ブレア）によって細胞内染色を行った。最終洗浄後、細胞をＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，米国カリフォルニア州サンノゼ）において解析した。ＧＡＧ陽性細胞のうちの細胞表面抗原陽性細胞の頻度を抗原露出の尺度として用いた。
【０１７８】
４．  免疫原性試験
マウスへの免疫付与プロトコルには、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  Ｉｎｃ．，米国インディアナ州インディアナポリス）を用いた。マウスの群（１群あたり５マウス）を、５０μｇの組換えタンパク質またはＶＬＰにより、３週間隔で皮下免疫した。免疫の付与前と３週間目に、顎動脈穿刺によって血液サンプルを採取した。マウスは毎日観察して、体重の変化を記録した。
【０１７９】
ウサギへの免疫付与のために、３〜４か月齢のニュージーランド白ウサギに、様々な免疫原を皮下接種した。対照のウサギ群（ｎ＝４）を、完全ｇａｇ  ＤＮＡとヌードＶＬＰによってプライミングした後、０および３週目に、ヌードＶＬＰによって２回免疫した。ウサギの２番目の群（ｎ＝４）を、ＨＴＩ免疫原をコードするＤＮＡ、完全ＨＩＶ  ｇａｇおよび完全ＨＩＶ  ｅｎｖ遺伝子によってプライミングした後、０および３週目に、ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰによって免疫した。Ｍｏｔｈｅ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１１；９：２０８を参照されたい。１、３、４週目および屠殺時に血清を採取した。
【０１８０】
すべての動物実験および畜産実験は、適用される規則および規制に従って行った。
【０１８１】
５．  酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
ペプチドＣ３４、Ｔ２０、ＭＰＥＲ、重複１５ｍｅｒ  ｇｐ４１ペプチドまたは組換えＧＡＧまたはＭＩＮタンパク質を用いて９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃイムノプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）をコーティングした。ブロッキング後、予め希釈した血漿サンプル１００μＬをプレートに加え、４℃にて一晩インキュベートした。次にプレートを洗浄した後、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合Ｆ（ａｂ）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，米国ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）を分注して、室温で１時間置いた。プレートを１００μｌのＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，米国ミズーリ州セントルイス）によって発色させ、１００μＬの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４によって発色を停止させた。特異的シグナルに対しては４９２ｎｍで、バックグラウンドに対しては６２０ｎｍで、吸光度を測定した。
【０１８２】
６．  ウイルスおよび中和アッセイ
ＨＩＶ−２キメラは、完全長ｐ７３１２Ａ  ＨＩＶ−分子クローン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３６８７４）に関連して作製した。野生型ＨＩＶ−２（ｐ７３１２Ａ）、およびＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＭＰＥＲ（ｐ７３１２Ａ−Ｃ１）、２Ｆ５（ｐ７３１２Ａ−Ｃ３）または４Ｅ１０エピトープ（ｐ７３１２Ａ−Ｃ４）を含むＨＩＶ−２キメラの発現ベクターは、Ｇ．Ｍ．Ｓｈａｗｎ（ペンシルベニア大学）から供与された。上記のＤｈｉｌｌｏｎ，２００７を参照されたい。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞へのプラスミドのトランスフェクションによってシュードウイルスを生成させた。トランスフェクション後２４時間目に上清を回収した後、０．４５ミクロンで濾過し、ウイルスストックを−８０℃にて冷凍した。
【０１８３】
以前に記載されたように、Ｅｎｖ発現プラスミドおよびｐＳＧ３  ベクターを用いて、ＨＩＶ−１分離株であるＮＬ４．３、ＢａＬ、ＡＣ１０およびＳＶＰＢ１６をシュードウイルスとして生成させた。Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐａｌｏｍｉｎｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１，２９：５２５０−５２５９を参照されたい。標準的なＴＺＭ−ｂｌベースのアッセイによって、血漿サンプルによる細胞フリーのウイルス中和について試験した。Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐａｌｏｍｉｎｏ  Ｓ，２０１１，上記  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１，２９：５２５０−５２５９を参照されたい。簡単に述べると、９６ウェル培養プレート内で、１００μＬの予め希釈した血漿サンプルを、２００ＴＣＩＤ５０を用いた５０μＬのシュードウイルスストックと共に、３７℃にて１時間プレインキュベートした。次に１ウェルあたり、１０，０００ＴＺＭ−ｂｌルシフェラーゼレポーター標的細胞を含む１００μＬを加えた。プレートを３７℃、５％  ＣＯ２にて４８時間培養した。２Ｆ５、４Ｅ１０およびＩｇＧｂ１２（Ｐｏｌｙｍｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ，オーストリア、クロスターノイブルク）、および抗ＣＤ４クローンＳＫ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス）を対照として用いた。アッセイの前に、血漿サンプルを不活性化した（５６℃、３０分間）。ＴＺＭ−ｂｌレポーター細胞をデキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）で処理して、感染性を高めた。ＨＩＶ感染性の読み取りには、ルシフェラーゼ基質、Ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  Ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いた。
【実施例】
【０１８４】
実施例１：ＨＩＶ  ＭＰＥＲエピトープを提示するＶＬＰの生成
その高発現と、トランスフェクトされた細胞表面における適切なＭＰＥＲの露出のために、ＭＩＮタンパク質を選択した。Ｍｏｌｉｎｏｓ−Ａｌｂｅｒｔ，２０１４，上記、を参照されたい。その潜在的な免疫原性を試験するための最初のアプローチとして、組換えＭＩＮタンパク質と選択されたＭＩＮタンパク質を表示するＶＬＰとの両方を産生した。図１を参照されたい。組換えＭＩＮタンパク質の産生は大腸菌で行い、タンパク質を精製して均質にすると、予想される１７ｋＤａの分子量を示した。図２Ａを参照されたい。組換えＭＩＮタンパク質の免疫原性をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてアッセイした。ＭＩＮの組換え調製物で免疫した動物（３用量、各２０μｇ）は、このタンパク質に対して反応性のＩｇＧを示した。これらのＩｇＧの反応性は、アジュバントとしてのリン酸アルミニウムの存在によって増強した。図２Ｂを参照されたい。
【０１８５】
ＶＬＰに対しては、ＶＬＰ出芽の間にＧａｇとの相互作用を増強させるため、ＭＩＮ配列にｇｐ４１の細胞質ドメインを追加した（ＭＩＮＦＵＬＬコンストラクション）。タンパク質発現とＶＬＰ産生に従い、ＭＩＮＦＵＬＬとＧＡＧ  ＨＩＶ−１タンパク質の両方を安定に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞クローンを選択した。選択されたクローン（４Ｇ２Ａ）は細胞表面にＭＰＥＲを露出しており、並行して選択された、ＧＡＧを発現するがｇｐ４１は発現しないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞クローンと同程度の、細胞内ＧＡＧ含有量を示した。図２Ｂを参照されたい。これらのクローンから得た上清は、ほとんど高分子量型（＞３００ｋＤａ）であるｇａｇタンパク質を含んでいたことから、ＶＬＰの適切な形成が示唆される。この観察は、対照細胞の遠心分離したＶＬＰおよびＧＡＧタンパク質を含む細胞内ライセート、ならびにＭＩＮＦＵＬＬとＧＡＧを共発現する細胞のＧＡＧおよびＧＰ４１タンパク質両方のＷＢ分析によってさらに確認された。図２Ｃを参照されたい。免疫原性アッセイでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＩＮ−ＶＬＰ（総タンパク質それぞれ１０μｇを３用量）によって、アジュバント（リン酸アルミニウム）の存在下または非存在下に免疫したところ、対照動物に比較して有意ではない抗ｇｐ４１  ＩｇＧ応答が示されたが、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞表面タンパク質およびＨＩＶ−１  ＧＡＧ抗原に対する高い反応性は容易に検出し得た。図２Ｅを参照されたい。さらに、４種のウイルス（すなわちＮＬ４−３、ＢａＬ、ＡＣ−１０およびＳＶＢＰ１６）のミニパネルに対してアッセイした場合、ＭＩＮ組換えタンパク質またはＶＬＰのいずれによって免疫したかに関わらず、どの動物においても有意な抗ＨＩＶ−１中和活性は検出されなかった。
【０１８６】
実施例２：改変ＶＬＰ：セルフパッキングｇｐ４１−ｇａｇ融合タンパク質
ＶＬＰに取り込まれたＭＩＮタンパク質の量が少ないことと、ＨＩＶウイルス粒子に報告されたＥｎｖスパイク数が少ないことから、ＶＬＰ内へのＭＩＮタンパク質の取り込みの少なさが、上記アプローチの制限因子となる可能性があると仮定された。そこで、ＶＬＰ表面上のＭＰＥＲエピトープの密度を高めることで免疫原性の可能性を高められるか否かについて考察した。図２Ｃ、Ｚｈｕ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４１：８４７−８８５を参照されたい。この仮説を確かめるため、ＨＩＶのＧＡＧタンパク質に融合したｇｐ４１のＨＲ２、ＭＰＥＲおよびＴＭ領域を包含する融合タンパク質をコードする、発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧ−３．７）を構築した。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧ−３．７プラスミド、対照ｐｃＤＮＡ３．１ＧＡＧおよび空のプラスミドをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして、ｇｐ４１およびＧａｇエピトープの発現を、フローサイトメトリーまたはウェスタンブロットのいずれかによって分析した。図３Ａは、ＭＩＮＧＡＧコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ培養中のＧａｇ＋細胞の、２つの抗ＭＰＥＲ抗体（１０Ｅ８および２Ｆ５）を用いて行った、特異的な細胞表面の染色を示す。ＧＡＧをトランスフェクトされた細胞の表面でＭＰＥＲは染色されなかったことから、ＭＩＮＧＡＧタンパク質は適切に発現して、細胞表面に到達したことが示唆された。適切な発現のさらなる確認は、細胞ライセートのウェスタンブロット分析によって行い、抗ｇａｇ抗体によって認識される主要なタンパク質の発現が示され、分子量は明らかに、ＭＩＮＧＡＧおよびＧａｇをトランスフェクトされた細胞それぞれで、６５ｋＤａおよび５７ｋＤａであった。２Ｆ５抗体を使用した際には、同じライセートは６５ｋＤａと第２のタンパク質を示した。図３Ｂを参照されたい。
【０１８７】
トランスフェクトされた細胞によるＶＬＰの放出を、トランスフェクション後４８時間目に収集して清澄にした上清のＥＬＩＳＡによって評価した。ＶＬＰ産生は、ＭＩＮＧＡＧコンストラクトでは、ヌードＶＬＰよりも８倍低かったが、両タンパク質は同レベルの粒状の物質を示したことから、適切な粒子生成が示唆された。図３Ｃを参照されたい。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔによる粒径のさらなる特性解析では、同様の平均直径：ヌードＶＬＰでは１６０＋／−４０ｎｍ、およびＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰでは１７０＋／−５０ｎｍ（４回の実験の平均＋／−ＳＤ）が示された。図３Ｄを参照されたい。
【０１８８】
実施例３：マウスにおけるＶＬＰ−ＧａｇおよびＶＬＰ−ＭｉｎＧａｇの免疫原性
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの免疫原性を試験した。１群あたり５匹の動物に、２００μＬのヌードまたはＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの調製物を、アジュバントとしてのリン酸アルミニウム有り、または無しで注射した。免疫原は、群の間でＧａｇ抗原の濃度が同じになるように維持しながら調製し、違いはＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰのＭＩＮ断片の有無のみであった。したがって、すべての動物は３２ｎｇのｇａｇ抗原を４用量（３週間隔で）注射された。
【０１８９】
抗ｇｐ４１  ＩｇＧ応答の時間経過（ＭＩＮ抗原を用いて測定した）は、両方のＭＩＮＧＡＧ免疫群で高く特異的な免疫原性を示し、誘発はアジュバントを用いた動物の方が早くみられたが、最終レベルはＶＬＰのみで免疫された動物の方が高かった。図４Ａを参照されたい。反対に、抗ｐ２４−Ｇａｇ  ＩｇＧは、ヌードまたはＭＩＮＧＡＧ−ＶＬＰによって免疫された動物で同様であり、両群ともアジュバントを用いた動物の方が高かった。図４Ｂを参照されたい。抗Ｇａｇ応答におけるアジュバントの増強効果および抗ｇｐ４１応答における抑制効果が、ＶＬＰ構造の望ましくない効果によるものである可能性について試験した。電子顕微鏡分析によって、リン酸アルミニウムで処理したＶＬＰは天然構造を失っていることが示され、ＧＡＧ内容の放出がこれらの結果を説明し得ることが示された。図４Ｃを参照されたい。
【０１９０】
これらの結果は、ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの調製物によって免疫された動物の一部が強力なＩｇＧ応答を開始し得ることから、この調製物は免疫原性であることを示している。しかしながら、対照動物または実験室で調製された２種のウイルス（すなわちＮＬ４３およびＢａＬ）に対して免疫された動物から得た血清および精製ＩｇＧの両方で、有意な中和活性は観察されなかった。図４Ｄを参照されたい。
【０１９１】
本発明者らのＭＩＮＧＡＧタンパク質のＭＰＥＲに対する応答を増強させるため、第２の免疫付与手順を計画した。ここで動物は、アジュバントの非存在下で、ＶＬＰ免疫付与（上記の免疫付与プロトコルによる）される前に、ＫＬＨと接合させたＭＰＥＲペプチドによって免疫された（４用量を３週間ごと）。再び、すべての動物は同様の抗Ｇａｇ応答を示したが、ＭＩＮＧＡＧによって免疫された動物のみが強力な抗ｇｐ４１  ＩｇＧ応答を示した。図５Ａを参照されたい。抗ｇｐ４１  ＩｇＧ応答のマッピングにより、２つの主要な免疫原性領域が示された。１つはＨＲ２領域をカバーし、２つ目は２Ｆ５エピトープと重複するＭＰＥＲ配列内にあった。図５Ｂを参照されたい。ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰによって免疫された動物の血清には、対照マウスに比較して、低いが有意な中和活性が常に観察された。図５Ｃを参照されたい。中和はＨＩＶのＢａＬ、ＡＣ１０およびＳＶＢＰ１６分離株（すべてサブタイプＢ）に対して観察された。中和は血清のＩｇＧ画分に保たれ、かつ免疫前の血清には存在しなかったことから、免疫付与によって特異的に誘発されたものである。
【０１９２】
実施例４：ウサギにおけるＶＬＰ−ＧａｇおよびＶＬＰ−ＭｉｎＧａｇの免疫原性
実施例３と同様のアプローチを用いて、ウサギにおけるＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの免疫原性を試験した。アジュバントの非存在下およびｇａｇとｅｎｖ  ＤＮＡによるプライミングの下に、動物にＶＬＰを注射した（ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰの２用量）。すべての動物は有意な抗ｇｐ４１  ＩｇＧ応答を示し（Ｔ−２０ペプチドおよびＣ３４ペプチドによる測定）、これは免疫原タンパク質のＨＲ２およびＭＰＥＲ配列にマッピングされ、２Ｆ５中和エピトープと一部重複していた。図６Ａおよび６Ｂを参照されたい。再び、ＭＩＮＧＡＧ  ＶＬＰによって免疫された動物の血清には、対照ウサギに比較して、低いが有意な中和活性が観察された。中和はＮＬ４−３分離株に対して観察され、ＩｇＧ画分に保たれ、かつＶＳＶシュードタイプウイルスに対して有意な活性は検出されなかったことから、特異的であった。（図６Ｃ）を参照されたい。
【０１９３】
実施例５：コドン最適化はＶＬＰ産生を増大させる
ＧＡＧタンパク質およびＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化（ｃｏｐ）バージョンをｐｃＤＮＡ３．１ベクター内へクローン化して、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ＧＡＧｃｏｐおよびｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧｃｏｐを得た。オリジナルのｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧ−３．７と新しいコドン最適化ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧｃｏｐによるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションの結果、コドン最適化バージョンで有意に高い発現がみられた。図７を参照されたい。ＧＡＧおよびＭＰＥＲ両方の発現レベルは、コドン最適化バージョンで５から１０倍高かった。
【０１９４】
実施例６：ＭＩＮＧＡＧｃｏｐをコードするＤＮＡ配列は、マウスにおいて免疫原性である
コドン最適化ＭＩＮＧＡＧｃｏｐ融合タンパク質の高い発現により、マウスモデルにおけるネイキッドＤＮＡの免疫原性の探索が可能になった。ＭＩＮＧＡＧ融合タンパク質、ＧＡＧタンパク質および空のｐＶａｘベクターをコードするｐＶａｘＴＭ発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国マサチューセッツ州ウォルサム）を構築し、ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドＧｉｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＮＶ，オランダ、フェンロー）を用いて精製した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した。１群あたり５匹の動物に、１００μｇの各プラスミドを、３週間隔で４回注射した。
【０１９５】
抗ｇｐ４１  ＩｇＧ応答の時間経過（ＭＩＮ抗原を用いて測定した）は、ｐＶａｘＭＩＮＧＡＧｃｏｐ免疫群のみで特異的な免疫原性を示した。図８を参照されたい。反対に、抗ｐ２４−Ｇａｇ  ＩｇＧは、ｐＶＡＸＧＡＧｃｏｐおよびｐＶａｘＭＩＮＧＡＧｃｏｐによって免疫された動物で検出された。図８を参照されたい。これらのデータをまとめると、ＤＮＡワクチン接種は、液性応答の誘発が可能なｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＡＧおよびＭＩＮＧＡＧの発現を誘導することが示される。
【０１９６】
実施例７：リンカー配列は抗原性に関連する
本発明に従った融合タンパク質の全体構造には、ＴＭとＧＡＧ配列の間の小さなリンカー領域が含まれる。この小さなリンカー配列内の変更がＶＬＰの発現と産生に影響するか否かについて評価した。この問題に取り組むため、ＧＧＧＳ（配列番号１２）、リンカーなし、アラニン／グルタミン酸およびリジンリンカー（配列番号２７）またはアラニン／プロリンリンカー（配列番号２８）配列を含む、コドン最適化ｐｃＤＮＡ３．１／ＭＩＮＧＡＧｃｏｐの様々なバージョンを作製した。図９を参照されたい。結果は、ｇｐ４１の３つの異なるエピトープ（抗体２Ｆ５、４Ｅ１０および１０Ｅ８によって同定される）の表面発現が、リンカー配列によって有意に影響されることを示した。図９Ａを参照されたい。リンカーＧＧＧＳ（Ｇ３Ｓ）は、４Ｅ１０および１０Ｅ８の抗原性部位について、最高の発現レベルを示した。興味深いことに、ＶＬＰ産生レベル（培養上清中のＧＡＧの含有量によって測定）に有意な影響はみられなかった。図９Ｂを参照されたい。
【０１９７】
実施例８：ＴＭ配列は抗原性および産生に関連する
同様に、ＨＩＶのＴＭ領域を、
（ａ）  ヒトＣＤ２２分子のＴＭ領域（配列番号１８）、
（ｂ）  ヒトＣＤ３６分子のＴＭ領域（配列番号１９）、
（ｃ）  ヒトＣＤ４４分子のＴＭ領域（配列番号２０）または
（ｄ）  ＨＩＶ−１  ＥｎｖのＲ６９６Ａ変異体（配列番号３１）
によって置き換えることで、ＴＭ配列の影響を分析した。
【０１９８】
エピトープ２Ｆ５、４Ｅ１０および１０Ｅ８の発現、ならびにＶＬＰの産生を評価した。
【０１９９】
様々なＴＭ配列は、関連するＭＰＥＲエピトープの露出に強く影響した。野生型ｇｐ４１  ＴＭに比較して、ＣＤ２２およびＣＤ３６配列は抗原部位（主に４Ｅ１０および１０Ｅ８エピトープ）の発現を著しく低下させたが、ＣＤ４４  ＴＭおよび変異型ｇｐ４１  ＴＭ配列の両方は、エピトープ露出を大きく増大させた。この影響は特に４Ｅ１０抗原部位について観察されたことから、後者のコンストラクトは、野生型ＭＩＮＧＡＧｃｏｐコンストラクトよりも良好かつさらにバランスの取れたＭＰＥＲの露出を提供することが示される。図１０Ａを参照されたい。
【０２００】
さらに、ＶＬＰの産生を評価して野生型ＭＩＮＧＡＧｃｏｐコンストラクトと比較した際、ＣＤ２２、ＣＤ３６およびＣＤ４４コンストラクトはＶＬＰ回収率に影響を与えなかったが、変異型ｇｐ４１  ＴＭ配列では有意に高い収率が観察され、その産生は対照のＭＩＮＧＡＧｃｏｐについて観察された産生よりも１．５倍高かった。図１０Ｂを参照されたい。
【０２０１】
実施例９：セルフパッキングＧＡＧベースのＶＬＰには、異種性の小エピトープが移植できる
ＭＩＮ／ＧＡＧ融合タンパク質が様々なエピトープを露出できる能力を実証するため、ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の中和エピトープをＭＩＮの細胞外部分に移植した。ＭＩＮ／ＧＡＧｃｏｐの２Ｆ５エピトープ（ｇｐ４１のアミノ酸６５５〜６６７）をＨＣＶ  Ｅ２配列のアミノ酸４０８〜４２１に相当するペプチドＫＱＮＩＱＬＩＮＴＮＧＳＷＨに置き換えて、ＭＩＮＨＣＶＧＡＧキメラタンパク質を生成させた。ヌクレオチド配列をｐｃＤＮＡ３．１ベクター内へクローン化して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に発現させた。図１１Ａは、トランスフェクトされた細胞におけるＧＡＧとＨＣＶの共発現を示し、ここでエピトープは露出されている。さらに、ｇｐ４１  ２Ｆ５エピトープはみられなかったが、４Ｅ１０および１０Ｅ８エピトープ（ＭＰＥＲのＣ末端部分に相当する）は適切に露出された。したがってＭＩＮＧＡＧベースのＶＬＰは、その表面に小エピトープを高密度で露出させるために使用できる。ＭＩＮＧＡＧｃｏｐ  ＶＬＰへのＨＣＶエピトープの移植によって、トランスフェクトされた細胞の上清中のＶＬＰ回収率に変化はみられなかった。図１１Ｂを参照されたい。
【０２０２】
実施例１０：セルフパッキングＧＡＧベースＶＬＰの多用途性：様々なシグナルペプチド、大きな抗原およびＴＭ配列の収容
ＧＡＧベースの融合タンパク質の外部免疫原性部分の、ＨＩＶとは異なる抗原を収容する能力を示した。以下のように、広く異なる病態に関連する幾つかの抗原を選択した。
（ｉ）  ＨＣＶ外部タンパク質を、ウイルス（非ＨＩＶ）感染の例として選択した。膜近傍のヘプタッドリピート配列および変異型ＨＣＶ  Ｅ２  ＴＭ領域のような、ＨＣＶ  Ｅ２配列の幾つかの断片を含むモザイクタンパク質を構築し、ＨＩＶ−１  ＧＡＧと融合させて、最適化ＨＣＶＥ２／ＧＡＧｃｏｐ融合タンパク質の配列を生成させた（配列番号３３）。
（ｉｉ）  ライム病の病原体であるボレリア・バーグドルフェリ菌（ＡＴＣＣ株３５２１０／Ｂ３１／ＣＩＰ１０２５３２／ＤＳＭ４６８０）の外部表面タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ、ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０ＣＬ６６）。ｏｓｐＡシグナルペプチド配列（残基１〜１６）を、ヒトＴ細胞免疫グロブリンムチン受容体ＴＩＭ−３（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８ＴＤＱ０）シグナルペプチドによって置き換え、ｏｓｐＡアミノ酸１７〜２７３と融合させた後、このコンストラクトをＣＤ４４  ＴＭの前に配置して、最適化ｏｓｐＡ／ＧＡＧｃｏｐ融合タンパク質の配列を生成させた（配列番号３７）。
（ｉｉｉ）  ヒトＴ細胞免疫グロブリンムチン受容体ＴＩＭ−３タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８ＴＤＱ０）。ＴＩＭ−３は免疫チェックポイント制御因子ファミリーのメンバーで、病原体および腫瘍に対するＴ細胞応答に関わっている。ヒトＴＩＭ＿３配列の細胞外およびＴＭ領域は、ＧＡＧ配列の前に配置して、最適化ＴＩＭ−３／ＧＡＧｃｏｐ融合タンパク質の配列を生成させた（配列番号３９）。
【０２０３】
これらのコンストラクトの概略図を図１２Ａに示す。３つのコンストラクトはすべてｐｃＤＮＡ３．１ベクター内にクローン化して、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞内ＧＡＧおよび細胞表面に発現した免疫原性配列を、フローサイトメトリーによって解析した。図１２Ｂは、選択された抗原すべての発現が、オリジナルのＭＩＮＧＡＧｃｏｐコンストラクトの発現と同程度であったことを示す。図１２Ｃは、ＶＬＰに負荷した様々な抗原すべての産生が、ＭＩＮＧＡＧｃｏｐ  ＶＬＰの産生と同様か、それより高いことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ（１）】
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【図１１Ｂ（２）】
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【図１１Ｂ（３）】
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【図１１Ｂ（４）】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ（１）】
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【図１２Ｂ（２）】
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【図１２Ｂ（３）】
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【図１２Ｂ（４）】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
2019525763000001.app
【国際調査報告】
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2019525763.tif 000027
2019525763.tif 000028