(57)【要約】  本発明は、Ｎ末端にアラニン残基が付加された活性型ヒト骨形成タンパク質−２ホモダイマーを強酸溶液に溶解したのち凍結乾燥して得られる凍結乾燥製剤、当該製剤の製造方法、当該製剤を含む骨の再生又は治療のためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ−ＢＭＰ−２と強酸とを含有する溶液を凍結乾燥してなる、凍結乾燥製剤。
【請求項２】
強酸が、塩酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸およびメシル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
２５℃における強酸のｐＨが０．２〜５．１である、請求項１または２に記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４】
以下の工程：
（１）原核生物でＡｌａ−ＢＭＰ−２を産生する工程；
（２）（１）で得られたＡｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程；および
（３）（２）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程；
を含む、Ａｌａ−ＢＭＰ−２を含有する凍結乾燥製剤の製造方法。
【請求項５】
強酸が、塩酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸およびメシル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程：
（１’）Ａｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程；および
（２’）（１’）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程；
を含む、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の溶解性を向上させる方法。
【請求項７】
強酸が、塩酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸およびメシル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ａｌａ−ＢＭＰ−２と強酸とを含有する溶液を凍結乾燥してなる凍結乾燥製剤、およびリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨再生または骨治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された保存安定性を有するヒト骨形成タンパク質−２変異体凍結乾燥製剤に関する。詳細には、Ｎ末端にアラニン残基が付加されたヒト骨形成タンパク質−２の凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形成タンパク質−２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２；以下「ＢＭＰ−２」と記載）は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーに属するタンパク質であり、骨の形成、器官の形成（歯、心臓、目、軟骨などの形成）などの重要な生物学的役割を担っている。ＢＭＰにはいくつかのメンバーが知られており、いずれのメンバーも、３個のジスルフィド結合（「システインノット」と呼ばれる）と１個の分子間ジスルフィド結合を形成する、高度に保存されたシステイン残基をもつ。ＢＭＰ−２は、１分子あたり１個のシステインノット、１個のα−ヘリックス、少なくとも４個のβ−シートで構成され、これによってモノマーはダイマーを形成することができる。すなわちＢＭＰ−２は、活性型として単一のＢＭＰ−２からなるホモダイマーの形態をとる。【０００３】
ＢＭＰ−２は、哺乳動物細胞内で糖鎖修飾を受けた不活性型ホモダイマーの前駆体ＢＭＰ−２タンパク質として合成され、細胞外に分泌されてからプロテアーゼによってプロセシングされて活性型ホモダイマーの成熟タンパク質となる。この活性型ホモダイマーＢＭＰ−２タンパク質は、ＢＭＰのＩ型又はＩＩ型受容体のリガンドとして該受容体に結合し、これによって細胞内にＢＭＰ−２のシグナルが伝達される。【０００４】
ＢＭＰ−２を製造するためには、一般的な遺伝子組換え技術が使用される。ベクターを介してＢＭＰ−２をコードするＤＮＡを原核又は真核生物細胞に導入し、該細胞中で該ＤＮＡを発現、翻訳して組換えＢＭＰ−２を得ることができる（特許文献１、２および３、ならびに非特許文献ｌ）。前述したように、ＢＭＰ−２は、活性型となるために、ダイマー構造を形成する必要があるが、このとき正しいジスルフィド結合の形成とともに正しい立体配置にフォールディングされねばならない（特許文献４）。【０００５】
組換えＢＭＰ−２を、原核生物細胞を使用して製造した場合、真核生物細胞を使用するときと異なり、生成される組換えタンパク質は糖鎖をもたない。ＢＭＰメンバーの多くはたとえ糖鎖がなくても生物活性を保持することが知られているが、ＢＭＰ−２は比較的疎水性の高いタンパク質であることから、糖鎖のない組換えＢＭＰ−２は凝集を起こし易く、また、弱酸性域から中性域の水に対する溶解性が悪いという欠点をもつ。また前述したように、ＢＭＰ−２が活性をもつためには、正しくフォールディングされたダイマーを形成しなければならないので、原核生物細胞を使用して組換えＢＭＰ−２を製造する場合、ＢＭＰ−２を製造する工程および医薬品に製剤化する工程において、ＢＭＰ−２をいかに安定化するかが課題となっている。【０００６】
大腸菌で発現される遺伝子組換えタンパク質はＮ末端の読み始めのアミノ酸残基をＭｅｔにしなければならないが、このＭｅｔは切れたり切れなかったりするため、組換えＢＭＰ−２のＮ末端配列をＭｅｔ−Ａｌａにすること（非特許文献１）で完全にＮ末端のＭｅｔが切断されてＮ末端が均一にＡｌａで始まる遺伝子組換えＢＭＰ−２を得ることができる。このＡｌａ−ＢＭＰ−２はＢＭＰ−２と同様にホモダイマーを形成し、受容体結合活性やｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標的細胞へのＡＬＰ誘導活性、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨誘導活性を有する。
このような、「Ｎ末端にアラニン残基が付加された、活性型ヒト骨形成タンパク質−２ホモダイマー」は、Ｎ末端の構造が均一なため、医薬品用有効成分として工業生産した場合に品質管理上のメリットがある。【０００７】
ところで、原核生物細胞を使用して、上記「Ｎ末端にアラニン残基が付加された、活性型ヒト骨形成タンパク質−２ホモダイマー」を製造したこと、ならびにその蒸留水中における凍結乾燥品については、非特許文献１に記載されている。しかしながら当該凍結乾燥品の水や生理食塩水への溶解性は悪く、医薬品製剤として満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／０１３，８４０号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００６／１２５，８６８号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯｌ９９９／１８，１９６号パンフレット
【特許文献４】欧州特許第４３３，２２５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｒ・Ｒｕｐｐｅｒｔｅｔａｌ．，Ｅｕｒ，ＪＢｉｏｃｈｅｍ、２３７：２９５−３０２（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記背景技術の欄で述べたように、原核生物細胞で産生された組換えヒトＢＭＰ−２は、凝集し易くかつ中性領域のｐＨの水又は緩衝水溶液に対する溶解性が非常に低いという欠点があり、これがＢＭＰ−２製剤の実用化のための１つの障害になっている。その反面、そのような組換えＢＭＰ−２は糖鎖を含まないために、培養自体が容易であるとともに増殖能に優れた原核生物細胞を使用することによって大量に製造できるという利点がある。また、異種真核生物細胞で作られた組換えヒトＢＭＰ−２の場合にみられるようなヒト型糖鎖と異なる炭水化物が、人体に及ぼすネガティブな影響を考慮する必要がないという利点もある。しかし、糖鎖を含まない組換えヒトＢＭＰ−２には、凝集性や溶解性の課題に加えて、貯蔵時の活性低下および沈殿形成を含めた貯蔵安定性や、生体内で骨の再生や修復というＢＭＰ−２の持続的効能に関して解決すべき課題が多く存在している。【００１１】
従って本発明は、上記課題のなかで特に組換えＢＭＰ−２の凝集性、溶解性および貯蔵安定性の課題が解決されたＢＭＰ−２製剤の提供を主な目的とする。本発明はまた、当該ＢＭＰ−２製剤の製造方法および当該ＢＭＰ−２製剤を含む骨の再生又は治療用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、Ｎ末端にアラニン残基が付加された活性型ヒト骨形成タンパク質−２ホモダイマー（以下、「Ａｌａ−ＢＭＰ−２」と記載する）を強酸溶液に溶解し、凍結乾燥製剤として調製することにより、優れた再溶解性および保存安定性が達成されることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、前記凍結乾燥製剤が純水に対する溶解性に優れていることを確認し、本発明を完成した。
すなわち本発明は以下の通りである。
［１］Ａｌａ−ＢＭＰ−２と強酸とを含有する溶液を凍結乾燥してなる、凍結乾燥製剤；
［２］強酸が、塩酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸およびメシル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、［１］に記載の凍結乾燥製剤；
［３］２５℃における強酸のｐＨが０．２〜５．１である、［１］または［２］に記載の凍結乾燥製剤；
［４］以下の工程：
（１）原核生物でＡｌａ−ＢＭＰ−２を産生する工程；
（２）（１）で得られたＡｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程；および
（３）（２）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程；
を含む、Ａｌａ−ＢＭＰ−２を含有する凍結乾燥製剤の製造方法；
［５］強酸が、塩酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸およびメシル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、［４］に記載の方法；
［６］以下の工程：
（１’）Ａｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程；および
（２’）（１’）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程；
を含む、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の溶解性を向上させる方法；
［７］強酸が、塩酸、クエン酸、トリフルオロ酢酸およびメシル酸からなる群から選択される少なくとも一種である、［６］に記載の方法；
［８］Ａｌａ−ＢＭＰ−２と強酸とを含有する溶液を凍結乾燥してなる凍結乾燥製剤、およびリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨再生または骨治療用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の凝集性、溶解性および保存安定性の課題が同時に解決される。これによって、Ａｌａ−ＢＭＰ−２が骨の再生および治療のために使用可能になる。【００１４】
従来ＢＭＰ−２は、ｐＨ４付近で溶解しやすいことがよく知られており、純水で透析されたＢＭＰ−２の凍結乾燥製剤は酸性溶液を用いれば容易に溶解する。しかしながら、このような凍結乾燥製剤は純水に対しては溶解しにくく、生理食塩水には溶解しない。したがって、実際の医療現場での使用を考慮するとこれらの溶媒に対する溶解性に優れているＢＭＰ−２製剤が不可欠であった。
本発明の凍結乾燥製剤は、純水への溶解性（再溶解性）が極めて良好であり、このことからＢＭＰ−２の手術中における用事調製が必要とされる場合にも、迅速に注射用水等に溶解してＢＭＰ−２製剤を製造することができる。また、得られた再溶解液は粘度が低く、作業性にも優れたものである。【００１５】
さらに、本発明の凍結乾燥製剤は、医療現場で通常使用されている溶媒（注射用水等）に容易に溶解させることが可能であるため、生体にとって安全性の高い特定の溶媒を用意する必要がなく、利便性やコスト面においても優れたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について説明する。
【００１７】
（Ｉ）骨形成タンパク質−２
「ＢＭＰ−２」は、ＢＭＰファミリー又はＧＤＦファミリーに属し、ＢＭＰ−２のＩ型およびＩＩ型受容体への結合活性を有し、かつ骨形成を誘導する能力、或いは骨の再生および修復能力を有する（これらをまとめて、以下「ＢＭＰ−２活性」と記載する）。
本発明におけるＢＭＰ−２の動物種としては特に限定されないが、好ましくはヒトである。
【００１８】
本発明の「Ａｌａ−ＢＭＰ−２」は、Ｎ末端にアラニン残基が付加された活性型ヒトＢＭＰ−２ホモダイマーである。
Ａｌａ−ＢＭＰ−２は、上記背景技術の欄で述べたように、ＢＭＰ−２と同様に、システインノットと呼ばれる３個のジスルフィド結合と、１個の分子間ジスルフィド結合とを形成する、高度に保存されたシステイン残基をもつ。Ａｌａ−ＢＭＰ−２は、１分子あたり１個のシステインノット、１個のα−ヘリックス、少なくとも４個のβ−シートで構成され、これによってモノマーはダイマーを形成することができる。Ａｌａ−ＢＭＰ−２はＢＭＰ−２と同様にホモダイマーを形成し、活性型となる。
【００１９】
前述のとおり、ＢＭＰ−２は哺乳動物細胞内では糖鎖修飾を受けた不活性型ホモダイマーの前駆体ＢＭＰ−２として合成されたのち、細胞外に分泌されてからプロテアーゼによってプロセシングされて活性型ホモダイマーの成熟タンパク質となる。
ヒトＢＭＰ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ、米国）に登録されており、登録番号（ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒ）はＮＭ＿００１２００である。
【００２０】
特に本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２は、ヒトＢＭＰ−２ホモダイマーのアミノ酸配列のＮ末端にそれぞれアラニン残基が付加された、糖鎖が付加されていないタンパク質である。各モノマー（成熟型ヒトＢＭＰ−２）の配列は、配列番号１の第２残基から第１１５残基の１１４残基分に相当する。
【００２１】
本発明のＢＭＰ−２としては、上記の構造を持つ限りその製法は特に限定されないが、例えば、Ａｌａ−ＢＭＰ−２を製造する場合は、Ｎ末端にメチオニン残基を付加したＭｅｔ−Ａｌａ−ＢＭＰ−２をコードする遺伝子（配列番号２）を、原核生物で発現することにより製造することができる。なお発明者らは、この方法で製造した組換えＡｌａ−ＢＭＰ−２は、Ｎ末端アミノ酸配列が全てＡｌａであることを確認している。
【００２２】
本発明のＢＭＰ−２は、ベクターを介する遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えばＡｌａ−ＢＭＰ−２を製造する場合は、ベクターには、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−ＢＭＰ−２をコードするＤＮＡやＡｌａ−ＢＭＰ−２をコードするＤＮＡに、分泌シグナル配列を付加したＤＮＡの他に、制御配列、選択マーカー配列などを含ませることができる。
制御配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、複製開始点、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列などが含まれる。プロモーターの例としては、ファージ由来のＴ３プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなど、細菌由来の１ａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーターなどが挙げられる。また、選択マーカーには、例えば薬剤耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等）などが含まれる。
【００２３】
上記ベクターとしては、例えばプラスミド、ファージなどが挙げられ、より具体的にはｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、バクテリオファージなどである。
本発明のＢＭＰ−２を生産するための宿主細胞は、好ましくは、原核生物細胞であり、これには例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などの細菌、好ましくは大腸菌が含まれる。
原核生物細胞の培養は、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などの公知の培養条件で行うことができる。炭素源、窒素源、微量元素などを含む最適ｐＨの液体培地中、細胞に適した培養温度および培養時間にて培養を行う。炭素源には、例えばデンプン、ふすま、グルコース、ラクトース、スクロースなどが含まれる。また、窒素源には、例えば酵母エキス、ペプトン、魚肉エキス、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸類などが含まれる。無機塩および微量元素には、例えば鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンなどが含まれる。培養温度は、通常、２０〜４０℃の範囲内である。
【００２４】
本発明のＢＭＰ−２は、形質転換した宿主細胞を破壊し抽出した液から回収することができる。組換えタンパク質が細胞外に分泌可能に遺伝子操作した場合には、培地から目的のタンパク質を回収することもできる。次いで回収したタンパク質をリフォールディングし精製処理にかける。精製は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーなどのアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、塩析、透析、限外ろ過、電気泳動、等電点電気泳動などを用いて行うことができる。これによりＢＭＰ−２を得ることができる。またＡｌａ−ＢＭＰ−２を回収する場合の一つの例として、非特許文献１に記載のＡｌａ−ＢＭＰ−２回収方法を参照することもできる。
【００２５】
（ＩＩ）ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤
本発明の凍結乾燥製剤は、活性型ＢＭＰ−２のＮ末端にアラニン残基が付加されたタンパク質と強酸とを含有する溶液を凍結乾燥してなる、安定性に優れたＢＭＰ−２凍結乾燥製剤である。
【００２６】
なかでも、本発明の凍結乾燥製剤として好ましくは、Ａｌａ−ＢＭＰ−２と強酸とを含有する溶液を凍結乾燥することで、強酸によって安定化されたＡｌａ−ＢＭＰ−２を有効成分として含む、安定性に優れたＢＭＰ−２凍結乾燥製剤である。以下、本発明の好適例である「Ａｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤」について記載する。
【００２７】
本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤の製造に際しては、第一に、上述のように原核生物によりＡｌａ−ＢＭＰ−２を産生しこれを回収する。当該「（１）原核生物でＡｌａ−ＢＭＰ−２を産生する工程、およびＡｌａ−ＢＭＰ−２の回収方法」は、前記のとおりである。
【００２８】
第二に、回収したＡｌａ−ＢＭＰ−２を直接強酸溶液に溶解するか、回収したＡｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に対して限外濾過または透析する、あるいは回収したＡｌａ−ＢＭＰ−２をゲルろ過操作するなどして、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の強酸溶液を調製する。この「（２）Ａｌａ−ＢＭＰ−２産生工程（１）で得られたＡｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程」について、以下詳述する。
【００２９】
強酸溶液としては、塩酸水溶液、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液、メシル酸水溶液、リン酸水溶液、硫酸水溶液、クエン酸水溶液等の強酸水溶液が挙げられ、好ましくは揮発性が高く、かつその強酸塩の吸湿性が低いような強酸水溶液であり、より好ましくは塩酸水溶液、クエン酸水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液、メシル酸水溶液であり、最も好ましくは塩酸水溶液である。
【００３０】
強酸溶液のｐＨは測定環境（例えば装置、水、温度など）によって幾分変動はあるが、２５℃で測定したとき、約０．２以上約５．１以下、好ましくは０．２以上４．６以下であり、より好ましくは、３．７以上４．６以下である。ｐＨが０．２よりも低い（つまり、酸性域側）と、後の凍結乾燥操作によって得られる凍結乾燥体を再溶解した場合にｐＨが低すぎて取扱いが不便になる恐れがあり、またＡｌａ−ＢＭＰ−２の溶解度が低下する場合や、Ａｌａ−ＢＭＰ−２自体が分解してしまう場合がある。一方でｐＨが５．１よりも高い（つまり、中性域側）と、Ａｌａ−ＢＭＰ−２が溶解しない恐れがある。
例えば、このようなｐＨ領域の塩酸水溶液を調整する場合の塩酸濃度としては、０．０１ｍＭ〜３３０ｍＭの濃度範囲から選択することができる。また、このような濃度範囲の塩酸水溶液は、製薬上許容可能な塩酸を、滅菌水で希釈することによって作製することができる。
【００３１】
強酸溶液中のＡｌａ−ＢＭＰ−２の濃度は、沈殿を生じず溶解可能な範囲であれば特に制限されないが、通常１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜１５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
【００３２】
上記濃度又はｐＨ範囲に調整された１００倍体積量の強酸溶液を攪拌しながら、これにＡｌａ−ＢＭＰ−２を少量ずつ加えてＡｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液を作製する。このとき、強酸溶液の温度は、約０℃〜約３０℃、好ましくは約４℃〜約２０℃、より好ましくは約４℃〜約１０℃である。
Ａｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液は、単にＡｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に加えることによって作製してもよいが、これをさらに限外濾過工程や透析工程に付すことによって作製することが好ましい。限外濾過や透析の方法は、自体公知のものを適用することができる。
例えば、Ａｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液の希釈と濃縮を３回程度繰り返す限外濾過工程を経て、Ａｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させることができる。希釈方法と濃縮方法としては、自体公知の方法を適用することができる。
またＡｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液は、例えば、上記濃度またはｐＨ範囲に調製された１００倍体積量の強酸溶液に対し３回程度透析を行うことで作成することもできる。また、透析の際の条件設定は当業者であれば適宜設定することが可能である。
【００３３】
上記溶解工程に続いて、得られたＡｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液から水を除去する凍結乾燥工程に処する。当該（３）：溶解工程（２）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程について、以下詳述する。
凍結乾燥工程は、Ａｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液を凍結したのち、真空下で水分を蒸発させる工程を含む。凍結乾燥の方法は従来公知の手法を採用することができ、公知の凍結乾燥装置を使用してもよい。また、冷却トラップ、多岐管、コック、乾燥瓶、ポンプ等の各装置を組み合わせて凍結乾燥装置としてもよい。これらの装置は、例えばＴＡＩＴＥＣ社から商業的に入手可能である。
このようにして、Ａｌａ−ＢＭＰ−２強酸溶液を凍結乾燥することで、凍結乾燥体が得られる。以下、この凍結乾燥体のことを「Ａｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤」などと記載する。
【００３４】
本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は安定性に優れ、凍結乾燥を行っても実質的にＢＭＰ−２活性を損なうことがない。従って、本発明の凍結乾燥製剤は、通常製剤等に含まれる賦形剤や安定化剤等を添加する必要がなく、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の凍結乾燥体そのものであってもよい。しかしながら、本発明の効果を損なわない限り他の成分の添加を制限するものではない。
他の成分として、例えば賦形剤を添加する場合、従来公知のものから適宜選択することができ、スクロース、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、デキストラン等の糖、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、セリン、プロリン等のアミノ酸が例示される。さらに、界面活性剤や機能性物質（例、タンパク質、核酸など）を添加してもよい。
【００３５】
本発明におけるＡｌａ−ＢＭＰ−２は、原核生物細胞（好ましくは大腸菌）で製造されることを特徴とするため、糖鎖を含まないタンパク質である。そして本発明の方法で製造されたＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、４５℃以下、好ましくは４〜２５℃、さらに好ましくは４℃又は５℃の低温下で３ヶ月以上にわたって安定に保存することができる。特に本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、凍結乾燥固体の形態で３ヶ月間冷蔵（５℃）保存又は冷凍保存しても、安定に保存することができ、実質的に失活しない。
【００３６】
ここで「安定に保存」とは、電気泳動測定（後述の実施例参照）によりタンパク質の分解が実質的に認められない状態であって、そして／または、Ｂｉａｃｏｒｅ測定（ＧＥ  Ｈｅａｌ  ｔｈｃａｒｅ；後述の実施例参照）によりＢＭＰレセプターであるａｃｔｉｖｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＩＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡｃｔＲＩＩＢ）への結合能が実質的に保持された状態で保存されることを意味する。当該安定性の確認は、逆相ＨＰＬＣ（例えば、Ｃ４カラム；移動相Ａ，０．１％ＴＦＡ；移動相Ｂ，１００％アセトニトリル；流速，１ｍｌ／ｍｉｎ；グラジエント，０％Ａから１００％Ｂ，２０ｍｉｎ）によって行うことも可能である。
また好ましくは、「安定に保存」とは、さらに骨誘導活性などのＢＭＰ活性を実質的に保持された状態で保存されることを意味する。
【００３７】
本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、上記条件で安定に保存されるだけでなく、たとえ凍結融解しても実質的に失活せず、完全なＢＭＰ活性（例えば、骨誘導活性）を保持するし、また、４０℃で保存した場合であっても実質的にＢＭＰ活性が失われることがない。
以上のように、本発明の方法で製造されたＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、改善された保存安定性を有する。
【００３８】
また本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、当該凍結乾燥製剤を水で再溶解して凍結乾燥前の体積に復元したときのｐＨ範囲が、通常３以上５以下、好ましくは３．７以上４．６以下であるという特徴も有している。このｐＨ範囲のＡｌａ−ＢＭＰ−２水溶液を得、これを後述する骨補填材に含浸させることによってＡｌａ−ＢＭＰ−２が骨充填材を形成するリン酸カルシウムに吸着し、骨疾患部位に埋め込んだ場合に骨再生能を有する骨補填材が得られやすくなる点で、本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は極めて有用であるといえる。
【００３９】
ところで従来のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、水や生理食塩水への溶解性が低く（凝集しやすく）、またＢＭＰとしての安定性にも欠けていた（非特許文献１参照）。したがって従来のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤には、その溶解性や安定性を高めるべく各種の添加剤を加える必要があった。
しかしながら本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤には、各種の添加剤、例えば、糖類、タンパク質、界面活性剤、アミノ酸などの安定化剤、或いはグリシン緩衝水溶液などの緩衝剤といった物質を敢えて加えなくとも、溶解性や安定性が保たれているという特徴も有する。そのため、本発明の方法で製造されたＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、実質的に凝集を起こし難く高い保存安定性を有する点で従来のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤よりも極めて有用である。
【００４０】
本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤の製造方法のうち、強酸溶液への溶解工程（２）および強酸溶解液の凍結乾燥工程（３）は、併せてＡｌａ−ＢＭＰ−２の溶解性を向上させる方法に含まれる必須の工程であるともいえる。
即ち本発明は、以下の工程：
（１’）Ａｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程；および
（２’）（１’）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程；
を含む、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の溶解性を向上させる方法
をも提供するものである。
【００４１】
また本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤の製造方法のうち、強酸溶液への溶解工程（２）および強酸溶解液の凍結乾燥工程（３）は、併せてＡｌａ−ＢＭＰ−２の保存安定性を向上させる方法に含まれる必須の工程であるともいえる。
即ち本発明は、以下の工程：
（１’’）Ａｌａ−ＢＭＰ−２を強酸溶液に溶解させる工程；および
（２’’）（１’’）で得られた強酸溶解液を凍結乾燥する工程；
を含む、Ａｌａ−ＢＭＰ−２の保存安定性を向上させる方法
をも提供するものである。
【００４２】
本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、使用時に再溶解用溶液を添加して製剤を再溶解することができる。再溶解用溶液としては、水（例、注射用水、滅菌水、静菌水）、水溶液（例、生理食塩水）、緩衝溶液（例、酢酸緩衝水溶液、フタル酸緩衝水溶液、グリシン緩衝水溶液）等を使用することができる。本発明の凍結乾燥製剤は、これらの再溶解用溶液に対して優れた溶解性を有し、短時間で必要に応じたＡｌａ−ＢＭＰ−２水溶液を調製することができる。さらに、このようなＡｌａ−ＢＭＰ−２水溶液も十分なＢＭＰ−２活性を保持しており、優れた骨再生および治療効果を発揮し得るものである。
当該Ａｌａ−ＢＭＰ−２水溶液を、後述する骨充填材に含浸させることによってＡｌａ−ＢＭＰ−２が骨充填材を形成するリン酸カルシウム成分に吸着し、骨疾患部位に埋め込んだ際に骨再生能を有する骨補填材が得られやすくなる。これによって骨折部位や骨欠損部位での骨再生または骨治療が可能になる。
【００４３】
（ＩＩＩ）骨再生用医薬製剤
本発明はさらに、Ａｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤を含有する、医薬製剤を提供する。
本発明の医薬製剤は本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤を含有するので、従来のＢＭＰ凍結乾燥製剤よりも高い保存安定性を有する。したがって、通常の医薬製剤に用いられる賦形剤、担体、添加剤などは実質的に不要であり、そのまま医療用途に使用可能である。しかしながら本発明の医薬製剤には必要に応じて、製薬上許容される、賦形剤、担体、添加剤、他の骨誘導活性を有する薬剤、骨疾患治療剤などの物質を加えることも可能である。
【００４４】
本発明の医薬製剤は、ＢＭＰ−２活性、特にＢＭＰ−２が持つ骨誘導活性をそのまま有するため、骨の再生、修復又は治療に使用され得る。そして骨の再生のためには、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞および骨再生の足場（骨補填材）が必要である。
骨再生の足場（骨補填材）としては、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチルグリコレート（ＰＬＧＡ）、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ（ここでＰＥＧは、ポリエチレングリコールを表す）などの合成ポリマー、ヒアルロン酸、コラーゲン、アテロコラーゲンなどの天然高分子、ヒドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、α−ＴＣＰなどのリン酸カルシウムなどが挙げられる。
実際には、多孔性の足場（例えば、穎粒、スポンジ、ブロック、ゲルなどの形態をもつ）と本発明の医薬製剤（あるいは、本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤）を水溶液と共に混合し、骨の患部、例えば骨折部位、欠損部位、障害部位などに埋め込む。このことによって、足場に吸着等したＡｌａ−ＢＭＰが内在性幹細胞に作用し、幹細胞の分化誘導によって骨組織が再生される。足場が穎粒の場合には、整形外科で使用するときは３〜５ｍｍメッシュの箭を通過する粒径サイズのものが、一方、歯科で使用するときは０．５〜１．５ｍｍメッシュの箭を通過する粒径サイズのものが、一般に使用される。本発明の医薬製剤には、Ａｌａ−ＢＭＰ−２と足場とを混合した形態、足場にＡｌａ−ＢＭＰ−２を塗布した形態、足場にＡｌａ−ＢＭＰ−２を吸着させた形態などが含まれる。
【００４５】
本発明の医薬製剤における、Ａｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤としてのヒトでの単回臨床投与量（単回の埋植または注入）は、投与部位や欠損の大きさ、組み合わせる足場（コラーゲン、骨補填材、高分子ゲル等）によって至適量は異なるが、一般に骨補填体積１ｃｍ３あたり０．２〜３ｍｇ程度（Ａｌａ−ＢＭＰ−２としての重量）であり、例えば骨補填体積が０．５〜２０ｃｍ３程度の幅の場合、０．１〜６０ｍｇ／患者の範囲である。しかし、当該単回臨床投与量は、患者の性別、年齢、体重、重篤度などの諸条件によって変化可能である。
【００４６】
本発明の医薬製剤は、骨欠損の再生や補填、骨折の早期治癒、軟骨、腱、靭帯、椎間板、半月板、歯槽骨などの骨の障害部位の再生および治療などのために使用できる。本発明の医薬製剤における有効成分であるＡｌａ−ＢＭＰ−２は、骨誘導能が高く、低侵襲性であり、品質管理や供給が安定するという利点があるため、上記のような医療用途での使用が期待される。
【００４７】
（ＩＶ）骨再生または骨治療用キット
本発明は、Ａｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤およびリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキットを提供する。
リン酸カルシウム系骨補填材は、例えばヒドロキシアパタイト、β−ＴＣＰおよびα−ＴＣＰなどのリン酸カルシウムを主成分とする骨補填材を含むが、これらに限定されない。
本発明のキットにはさらに、使用説明書、注射用水等の再溶解用の溶液を含むシリンジ、滅菌済みトレー、滅菌済みスパチュラなどを含んでもよい。この場合、シリンジのなかでＡｌａ−ＢＭＰ−２を水（水溶液）に溶解し、トレー内のリン酸カルシウム系骨補填材（穎粒）にまんべんなくふりかけ、スパチュラで混ぜ合わせる。このようなキットは、骨（再生）治療の直前にＡｌａ−ＢＭＰ−２を再構成又は再溶解することを意図したものである。本発明のＡｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤は、水（水溶液）に短時間で溶解し、得られる溶解液の粘度も低いことから、医療現場における作業効率を高めることができる点で優れている。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例・試験例などにより本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例・試験例などによって制限されないものとする。【００４９】
実施例１：Ａｌａ−ＢＭＰ−２の調製
Ａｌａ−ＢＭＰ−２の調製は、非特許文献１に記載の方法に準じて行った。すなわち、大腸菌ＢＬ−２１を利用して、Ｍｅｔ−Ａｌａ−ＢＭＰ−２（配列番号１）をコードするＤＮＡを発現させ、既知の方法を組み合わせて用いて、封入体の回収、タンパク質のリフォールディング、ダイマーの回収の各操作を行った。４Ｍ尿素溶液に溶解したＡｌａ−ＢＭＰ−２を分画分子量３５００の透析チューブに入れ、下記試験例１に記載する各種酸水溶液で透析を行った（調製例１〜２、比較例１、対照資料１および２）。透析液を回収し、ＯＤ２７８ｎｍで濃度を確認して限外濾過により濃縮を行った。この濃縮工程には、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニット１０Ｋ（ミリポア社製）を用いた。【００５０】
実施例２：凍結乾燥
実施例１の濃縮工程で得られた試料を回収し、ＯＤ２７８ｎｍで濃度を確認した後、５ｍｇ  Ａｌａ−ＢＭＰ−２／１．５ｍｌチューブとなるように分注し、−８０℃で一晩以上凍結させた。凍結させた試料を、凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥させた。【００５１】
試験例１：再溶解試験
実施例１に示される透析工程において、下表１に示される各種酸水溶液（透析液）を用いて、透析を行った。
各試料の透析時の様子、凍結乾燥の容易性、得られた凍結乾燥製剤の水への再溶解性を観察した。再溶解は、５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように凍結乾燥製剤を注射用水に溶解させて行った。【００５２】
【表１】
2012029148.tif 000002
【００５３】
表１に示されるように、強酸水溶液で透析を行った調製例１および調製例２では、透析開始後に沈殿するものの再溶解し、凍結乾燥も容易に行うことができた。さらに、凍結乾燥製剤に調製された調製例１および調製例２は、いずれも良好な再溶解性を示した。
一方、弱酸水溶液（０．０６％酢酸）で透析を行った比較例１では、透析時および凍結乾燥工程においては調製例１と同様の挙動を呈したが、凍結乾燥製剤の再溶解性を評価したところ粘性が高く、攪拌しなければ再溶解できなかった。
また、非特許文献１に記載の従来法に従って透析を行った対照試料Ｘおよび対照試料Ｙでは、透析時に沈殿して再溶解しなかった。しかしながらこれを強酸水溶液で透析を行った後に蒸留水で透析しても、再溶解性の高い凍結乾燥製剤を得ることができた。
さらに調製例１および調製例２は、対照試料Ｘおよび対照試料Ｙよりも溶解速度が明らかに早かった。【００５４】
試験例２：貯蔵安定性評価
（１）Ａｌａ−ＢＭＰ−２の調製
実施例１に記載の方法を用いてＡｌａ−ＢＭＰ−２の製造を行い、この回収を行った。このとき、限外濾過／透析濾過により０．５ｍＭ／Ｌ塩酸に置換し、Ａｌａ−ＢＭＰ−２濃度を２．５ｍｇ／ｍｌに調整した。【００５５】
（２）凍結乾燥
上記（１）で濃度調整された試料を回収し、直径２４．５ｍｍ×５３ｍｍのバイアルに１０ｍｇとなるように分注して−５０℃で一晩以上凍結させた。凍結させた試料を、凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥させた。凍結乾燥装置は、上記実施例２で使用したものと同様である。【００５６】
（３）貯蔵安定性試験
貯蔵安定性に関する評価項目および評価方法については、表２に示される通りである。【００５７】
【表２】
2012029148.tif 000003
【００５８】
評価結果を表３に示す。【００５９】
【表３】
2012029148.tif 000004
【００６０】
表３に示されるように、いずれの保存条件下でも凍結乾燥製剤としての物性や溶解特性は損なわれることがなく、再溶解後のＡｌａ−ＢＭＰ−２活性も十分保持されていた。さらに、４０±２℃、相対湿度７５±５％という比較的過酷な保存条件下でも物性、Ａｌａ−ＢＭＰ−２活性は損なわれなかった。すなわち、本発明の凍結乾燥製剤は、優れた保存安定性を有することが示された。【００６１】
実施例３：Ａｌａ−ＢＭＰ−２凍結乾燥製剤の製造
下記組成の溶液を１０ｍＬのバイアルに充填し、均一に混合した後、−８０℃で一晩以上凍結させた。凍結させた試料を、実施例１と同様の凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥させた。これをゴム栓で施栓し、キャップを巻き締めして、バイアル充填凍結乾燥製剤を製造した。
（溶液１）
Ａｌａ−ＢＭＰ−２（５ｍｇ）を含有する０．１ｍＭ  塩酸      １．０ｍＬ
（溶液２）
Ａｌａ−ＢＭＰ−２（５ｍｇ）を含有する０．５ｍＭ  塩酸      １．０ｍＬ
（溶液３）
Ａｌａ−ＢＭＰ−２（５ｍｇ）を含有する０．１ｍＭ  クエン酸  １．０ｍＬ
（溶液４）
Ａｌａ−ＢＭＰ−２（５ｍｇ）を含有する０．１ｍＭ  ＴＦＡ    １．０ｍＬ
（溶液５）
Ａｌａ−ＢＭＰ−２（５ｍｇ）を含有する０．１ｍＭ  メシル酸  １．０ｍＬ
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明により、大腸菌などの原核生物細胞で製造されたＡｌａ−ＢＭＰ−２を医療目的に使用することが可能になった。Ａｌａ−ＢＭＰ−２は骨の再生および治療のために有用なタンパク質であるので、医療分野においての役割が期待される。
【配列表フリーテキスト】
【００６３】
配列番号１は、Ｎ末端にアラニン残基が付加されたヒト骨形成タンパク質−２のアミノ酸配列である。
配列番号２は、Ｎ末端にアラニン残基が付加されたヒト骨形成タンパク質−２をコードするＤＮＡの配列である。
【配列表】
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【国際調査報告】
2012029148.tif 000005
2012029148.tif 000006
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