(57)【要約】本発明は。培地から、酵素カクテルとトリコデルマ・リーゼイ菌とを分離する方法に関する。前記培地は、前記菌による酵素の生成から得られたものであり、前記方法において、−  前記培地を、製造を停止してから３０時間以下の期間内に、６００ｎｍで２．５未満の修正光学密度ＯＤを有する濾液を得るように、３〜２０μｍの多孔度を有する濾布を内張りしたフィルタープレス上での分離にかけ、−  得られた液相を、修正ＯＤ６００ｎｍが０．１を超えないように、０．５〜１．４μｍのカットオフ閾値を有するセラミック膜上での接線精密濾過にかける。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地から、酵素カクテルとトリコデルマ・リーゼイ菌とを分離する方法であって、前記培地が、前記菌による酵素の生成から得られたものであり、前記方法において、
−  前記培地を、製造を停止してから３０時間以下の期間内に、６００ｎｍで２．５未満の修正光学密度ＯＤを有する濾液を得るように、３〜２０μｍの多孔度を有する濾布を内張りしたフィルタープレス上での分離にかけ、
−  得られた液相を、修正ＯＤ６００ｎｍが０．１を超えないように、０．５〜１．４μｍのカットオフ閾値を有するセラミック膜上での接線精密濾過にかける、方法。
【請求項２】
前記期間が２４時間以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地を、予め冷却せずに、フィルタープレス上での分離にかける、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
フィルタープレス上での分離の終了時に、５〜１０重量％のケーク及び９０〜９５重量％の濾液が得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
フィルタープレスで得られた濾液のペレット（試料を４０００Ｇで５分間遠心分離機にかけることによって測定した、試料の全体積に対して固体が占める体積の百分率）が１．５％未満である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記濾液が、最大１０重量％の比率でフィルタープレスに供給する培地にリサイクルされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
フィルタープレスの終了時に得られた濾液の精密濾過が、最長３０時間、好ましくは最長２４時間の期間内で実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
フィルタープレスで得られた前記濾液を、予め冷却せずに精密濾過にかける、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
フィルタープレス上での分離及び精密濾過が、２０〜３０℃、好ましくは２２〜２７℃で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記接線精密濾過が、０．８〜１．４μｍのカットオフ閾値を有するセラミック膜で実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地を、フィルタープレス上で分離する前に、デカンテーション及び／又は遠心分離にかけない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記精密濾過が、セラミック膜で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
精密濾過の後に得られた液相を、５〜１５ｋＤａのカットオフ閾値を有するセラミック膜上での限外濾過にかける、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
精密濾過の後に得られた液相を、最長４８時間、好ましくは最長２４時間の期間内で限外濾過にかける、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
分離した酵素カクテルを、好ましくは蒸気爆発によって前処理しておいたリグノセルロース系バイオマスと接触させて、酵素加水分解を実施し、糖含有液を得、前記糖含有液をエタノール発酵させるが、前記酵素加水分解及び発酵は別々に又は同時に実施され、生成されたエタノールが蒸留によって分離される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）糸状菌を含む培地に含有されるセルロース分解酵素及びヘミセルロース分解酵素を分離する方法に関する。
【０００２】
本発明は、特に、リグノセルロース系バイオマスから糖、バイオ燃料、又は生化学的分子を生成する方法の範囲内に含まれる。
【０００３】
このタイプの方法は、例えば糸状菌トリコデルマ・リーゼイによって生成された酵素カクテルで前処理したバイオマスの酵素加水分解の工程を含む。本発明は、この酵素カクテルと糸状菌トリコデルマ・リーゼイの分離に関する。
【０００４】
多数の分離技術が、単独で又は連続的に使用される。
【背景技術】
【０００５】
菌類からの酵素の分離との関連において、特許文献1（ＷＯ２０１６／１６１８２）の出願人は、以下の連続法を推奨している。
- デカンテーションによる第１の分離。場合により、分離効率を上げるために凝集剤を添加してもよい。
- ペレット（ペレット含有率とも呼ぶ）を減少するための遠心分離による第２の分離。
- すべての微量の微生物を除去するための精密濾過（接線濾過（tangential filtration））。
- 酵素を濃縮するための最終工程である限外濾過。
【０００６】
工業プロセスにおいて連続的に用いられるデカンテーション及び遠心分離は、密度の違いに応じた、媒体に遠心力の影響を受けさせることによる固体／液体の分離法である。
【０００７】
デカンターは、スクリューを備えた遠心分離機であり、そのボウルは水平軸のまわりを回転する。これは、主に、大きなペレットを有する又は浮遊物含有率が高い（１５％超、多くの場合は約３０％、更には最大６０％にも達する）混合物を清澄化するために使用される（二相デカンター）。デカンテーションは、この含有率を約５％まで減少させることを可能にする。ペレットは、試料を４０００Ｇで５分間遠心分離機にかけることによって測定される。これは、試料の全体積に対して固体が占める体積の百分率に相当する。
【０００８】
遠心分離は、１５％未満のペレットを有する溶液で用いられ、このペレットを２％未満又は更には１％未満の値まで減少することを可能にする。遠心分離は、デカンテーションで得られた濁った液体を清澄化することを可能にする。
【０００９】
これは、水処理、食品加工、バイオテクノロジー、製薬産業等の多くの分野において用いられる。
【００１０】
接線濾過又は限外濾過による分離法は、分離される成分のサイズに応じて実行される。これらは膜を使用する。
【００１１】
そのため、精密濾過の場合では、粒子は０．１μｍ〜１０μｍの範囲のサイズを有する。このプロセスは、例えば、糸状菌等の微生物を分離するために用いられる。経済的な理由により、使用されるものは通常、有機膜である。
【００１２】
限外濾過は、１〜１００ｎｍの直径を有する物体を分離するために用いられる。このような膜は、小分子（水、塩）を通過させ、高分子量分子（ポリマー、タンパク質等）を止める。これは、例えば、タンパク質又は酵素を濃縮するために使用されるであろう。
【００１３】
分離性能レベルに影響を与えることができる因子は、本質的には、分子のサイズ、分子の形状、それらの電荷、膜の性質及び操作条件である。
【００１４】
膜は、その生理化学的性質を特徴とする。一般に、膜は、３つの主な部類に区別される。
−  有機（天然又は合成）膜
−  鉱物（無機又はセラミック）膜
−  複合膜
有機膜は、セルロースポリマー（例えば、酢酸セルロース）で作られる。これは、製造費が安いが、それを加水分解できるセルラーゼの分離には使用できない。
【００１５】
ナイロン及びポリスルホン等の合成ポリマーをベースとする有機膜は、先行のものと比べて多くの利点があり、酵素（タンパク質）の分離に最も広範に使用されている。
【００１６】
鉱物膜は、非常に優れた耐薬品性、機械的強度及び耐熱性を有するが、有機膜より高価である（約１０倍高価である）。これは、果汁の清澄化、牛乳中の細菌の除去又はアルコール飲料（ワイン、ビール、サイダー）の清澄化等の様々なプロセスにおけるバイオテクノロジーに使用される。また、これは水処理における用途もある。
【００１７】
最後に、複合膜は、微孔質である、別の部分の上に沈着したポリマー部分で構成される。後者の膜は、本質的には、逆浸透のために開発された。
【００１８】
この分野における先行技術には情報が豊富にある。
【００１９】
特許文献２（米国特許第３３９８０５５号）は、トリコデルマ・リーゼイによって生成されたセルラーゼの分離及び精製を教示している。真菌は、真空下でロータリーフィルターを用いて分離される。酵素は、綿布を使用して分離され、塩基性溶液で溶出される。
【００２０】
特許出願の特許文献３（米国特許出願公開第２０１４／０２９５５２５号）は、トリコデルマ菌の酵素の２段階分離を提案している。このプロセスは、２段階の限外濾過工程における酵素の濃縮を説明しており、酵素は、先に固体／液体分離工程を経たものである。限外濾過による第１の分離工程において、膜は１０００００（Ｄａ）〜２０００００（Ｄａ）のＭＷＣＯ、すなわち、約０．０１μｍ〜０．０２μｍのカットオフ閾値を有する。保持液を、第２の限外濾過工程の、５０００〜５００００のＭＷＣＯを有する膜に通過させ、酵素を含む２つの液体を混合する。
【００２１】
この特許出願は、この方法が、セラミックフィルター又は不織布材中の固体粒子の分離が先行した場合でも、単一の限外濾過工程中の膜の汚染及びセルラーゼの凝集の課題の解決を可能にすることを示す。
【００２２】
この特許出願では、酵素のサイズが１０ｋＤａ〜１００Ｄａであるが、保持液中の前記酵素の保持が確認されている。したがって、この特許出願は、本質的には、酵素濃縮工程の最適化を記載している。
【００２３】
トリコデルマ・リーゼイ菌由来の酵素カクテルの濃縮との関連において、驚くべきことに、０．８μｍのサイズを有し、したがって特許出願３（米国特許出願公開第２０１４／０２９５５２５号）に記載されるものより４０〜８０倍大きい孔を有する有機膜によるこの酵素の保持現象の存在を確認することが可能だった。これは、酵素の分離収率を極めて不利にする。
【００２４】
本発明は、
−  製造してから３０又は２４時間後に有利に実施する必要がある、フィルタープレス上でのトリコデルマ・リーゼイ菌の分離工程、
−  次いで、鉱物膜を用いた精密濾過の工程、
−  後続して、場合による鉱物膜又は有機膜を用いた濃縮工程
を含む分離法を提案する。
【００２５】
一連の、フィルタープレス上での分離、後続する鉱物膜を用いた精密濾過、及び場合による鉱物膜を用いた限外濾過は、収率及び効率の観点において特に良好な結果を得ることを可能にすることが確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／１６１８２
【特許文献２】米国特許第３３９８０５５号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０２９５５２５号
【発明の概要】
【００２７】
より具体的には、本発明は、培地から、酵素カクテルとトリコデルマ・リーゼイ菌とを分離する方法であって、該培地が、該真菌による酵素の生成から得られたものであり、本方法において、
−  前記培地を、製造を停止してから３０時間以下、好ましくは２４時間以下の期間内に、６００ｎｍで２．５未満の修正光学密度ＯＤを有する濾液を得るように、３〜２０μｍの多孔度を有する濾布を張ったフィルタープレス上での分離にかけ、
−  得られた液相を、修正ＯＤ６００ｎｍが０．１を超えないように、０．５〜１．４μｍのカットオフ閾値を有するセラミック膜を用いた接線精密濾過にかける、
方法を提案する。
【００２８】
有利には、前記培地を、予め冷却せずに、フィルタープレス上での分離にかける。好ましくは、培地は、フィルタープレス上で分離する前に、デカンテーション及び／又は遠心分離にかけない。
【００２９】
フィルタープレス上での分離及び精密濾過は、２０〜３０℃、好ましくは２２〜２７℃で実施する。
【００３０】
有利には、濾液を、最大１０重量％の比率でフィルタープレスに供給する培地にリサイクルする。
【００３１】
フィルタープレス上での分離の終了時に（すなわち、圧縮後）、５〜１０重量％のケーク（ケークの固形分は、少なくとも２０重量％、概して２０重量％〜６５重量％、又は２０〜４５重量％、多くの場合は約２５〜３５重量％である）及び９０〜９５重量％の濾液が一般に得られる。フィルタープレスから得られる濾液のペレット（試料を４０００Ｇで５分間遠心分離機にかけることによって測定した、試料の全体積に対して固体が占める体積の百分率）は、１．５％未満である。
【００３２】
有利には、フィルタープレスの終了時に得られた濾液の精密濾過を、最長３０時間、好ましくは最長２４時間の期間内で実施する。
好ましくは、フィルタープレスから得られた前記濾液を、予め冷却せずに精密濾過にかける。
【００３３】
好ましくは、接線精密濾過は、０．８〜１．４μｍのカットオフ閾値を有するセラミック膜で実施する。
【００３４】
好ましくは、精密濾過後に得られた液相を、好ましくはセラミック膜で、更により好ましくは５〜１５ｋＤａのカットオフ閾値を有するセラミック膜で限外濾過にかける。
【００３５】
好ましくは、精密濾過後に得られた液相を、最長４８時間、好ましくは最長２４時間の期間内で限外濾過にかける。
【００３６】
好ましい一実施形態において、分離した酵素カクテルを、好ましくは蒸気爆発によって前処理したリグノセルロース系バイオマスと接触させ、酵素加水分解を実施し、糖含有液を得、前記糖含有液をエタノール発酵させる。この酵素加水分解及び発酵は別々に又は同時実施され、生成されたエタノールは蒸留によって分離される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】体積濃縮係数ＶＣＦと浸透率の関係を示すグラフである。
【図２】濾過経過時間と浸透率の関係を示すグラフである。
【図３】時間と濾過量の関係を示すグラフである。
【図４】時間と供給圧力の関係を示すグラフである。
【図５】体積濃縮係数ＶＣＦ及び透析濾過とタンパク質濃度の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
製造工程
酵素カクテルは、通気発酵による従来の製造ラインにおいてトリコデルマ・リーゼイにより生成される。
【００３９】
酵素カクテルの製造方法は、繁殖期から開始するが、この繁殖期は、一般に、糸状菌を増殖させ、誘導期の継続期間及び汚染リスクを制限する目的で、サイズが増大する小型反応器（複数）中で実施される。
【００４０】
この生産量が十分である（１０ｇ／Ｌ超、好ましくは１５ｇ／Ｌ超の菌濃度）と判断されたら、培地を大容量の最終反応器に移す。
【００４１】
酵素の製造方法は、２つの段階を含む。
- 段階ａ）少なくとも１つの炭素系増殖基質の存在下、通気密閉反応器中での前記微生物の増殖段階であり、前記増殖段階は、１０〜９０ｇ／Ｌの濃度の炭素系増殖基質を用いて実施される。
- 段階ｂ）少なくとも１つの炭素系インデューサ基質を導入する、酵素カクテルの製造段階であり、前記炭素系インデューサ基質は、ラクトース、セロビオース、ソホロース、セルロース系バイオマス酵素加水分解物の単糖類のエタノール発酵の後に得られる残留物、及び／又はセルロース系バイオマスの前処理から発生する水溶性ペントースの粗抽出液によって形成される群から選択され、前記製造段階は、１５０〜４００ｇ／Ｌの濃度の炭素系産生基質を用いて実施される。
【００４２】
本発明に従って酵素カクテルを製造するプロセスにおいて使用される微生物は、トリコデルマ・リーゼイ種に属する菌株である。
【００４３】
最も有効な工業用菌株は、突然変異選択法の手段によって酵素カクテルを改良するように修飾された、トリコデルマ・リーゼイ種に属する菌株、例として菌株ＩＦＰ  ＣＬ８４７である（仏特許ＦＲ−Ｂ−２５５５８０３）。遺伝子組み換え技法によって改良された菌株も使用可能である。これらの菌株を、その増殖及び酵素製造に適合する条件下、攪拌及び通気された反応器中で培養する。
【００４４】
本発明によるプロセスの前記増殖段階ａ）において使用される前記微生物用の前記炭素系増殖基質は、有利には、工業用可溶性糖から、好ましくはグルコース、ラクトース、キシロース、リグノセルロース物質の酵素加水分解物の単糖類のエタノール発酵の後に得られる液体残留物、及び前処理されたリグノセルロース基質から生じるモノマーの形態のヘミセルロース系画分の抽出物から選択され、混合物として単独で使用される。
【００４５】
前記炭素系増殖基質を、その性質に応じて、滅菌前に密閉反応器中に導入するか、又は別々に滅菌し、密閉反応器を滅菌した後で該密閉反応器中に導入する。
【００４６】
前記炭素系増殖基質は、通常、反応容量リットル当たり炭素系基質２０〜９０ｇの初期濃度で、前記増殖段階ａ）において使用される。
【００４７】
好ましくは、前記増殖段階ａ）は、３０〜７０時間、好ましくは３０〜４０時間にわたって実施される。
【００４８】
好ましくは、前記増殖段階ａ）は、ｐＨ４．８にて、２０〜３０℃、一般には２２〜２７℃、好ましくは約２７℃の温度で実施される。
【００４９】
前記製造段階ｂ）において使用される前記炭素系インデューサ基質は、有利には、１時間毎に細胞グラム当たり３０〜８０ｍｇの制限流によるフェッドバッチ段階法で供給される。温度は、工程ａ）とほぼ同じである。
【００５０】
酵素製造工程の終了時に、濃度が１０〜４５ｇ／Ｌの固体（乾燥菌に対応する）を含む媒体が一般に得られる。遠心分離（４０００Ｇ、５分）後に測定したペレットは、１５％超、多くの場合は約３０％、更には最大６０％である。これは、試料の全体積に対して固体が占める体積の百分率に相当する。
【００５１】
菌が、液体の相当部分を保持することが観察される。
【００５２】
本発明の目的は、菌から酵素を分離し、次いで場合により該酵素を濃縮することである。
固体／液体分離工程（この工程において菌類が液体から分離される）
この液体は、酵素及び残留塩を含有する。
【００５３】
出願人らが実施した試験は、フィルタープレス上での分離後のセラミック膜を用いた精密濾過（ＭＦ）が、収率の面でも効率の面でも、従来技術の解決策より良好な結果をもたらすことを示した。
【００５４】
その上、試験は、一般に、酵素を濃縮する場合、セラミック膜を用いた限外濾過（ＵＦ）の方が、有機膜で行うより実質的に効率的であることを示した。
【００５５】
本発明によれば、培地は、酵素の回収率を最大化することを可能にするフィルタープレス上での分離を受ける。
【００５６】
これは、有利には、菌の自己消化が進行する前に行う。それは、この自己消化が、フィルタープレスによる分離の効率を大きく不利にし得るためである。トリコデルマ・リーゼイの場合、この期間は、３０時間以下、好ましくは２８時間以下、更により好ましくは２４時間以下である。
【００５７】
このフィルタープレス上での分離が終了すると、菌を含有するケークと、酵素を含有する液体とが得られる。
【００５８】
得られた液体は、セラミック膜を用いた接線精密濾過を受け、次いで場合により、好ましくは接線濾過による限外濾過を受ける。
【００５９】
これは、有機膜を用いた精密濾過では、酵素を有意に保持する結果となり、このことが分離率に悪影響を及ぼすという指摘をされる可能性があったためである。その孔は、生成される最大の酵素のサイズより最大１００倍大きいので、この現象は意外である。この現象に関する説明を提供することは可能でなかった。一方、この現象は、鉱物膜を使用すると、制限されることも確認されている。したがって、その酵素回収率は高レベルである。
【００６０】
フィルタープレスによる分離、精密濾過及び限外濾過は、以下で詳細に説明する。
フィルタープレス上での分離
製造が終了したら、すぐに通気及びｐＨ調整を停止する。有利には、保存剤、例えば安息香酸ナトリウムを添加する。
【００６１】
フェッドバッチ段階の糖を全て消費したら、又は基礎的消費速度（これはタンパク質生成速度に比例する）が減速（３０％未満又はそれ以上の速度）したら、生産を停止する。
【００６２】
フィルタープレス上での分離は、自己消化前の期間内で行う。
【００６３】
温度を４０℃未満、好ましくは３０℃未満に維持することが重要であることに留意した。この温度を上回ると、分離効率がかなり低くなってしまう。
【００６４】
フィルタープレス上での分離の前に冷却工程はない。これは、冷却が要求されないことを意味し、製造が実施されるユニットとフィルタープレスのユニットとの間の移行中に若干の温度低下があり得、この低下は３℃以下であり得る。そのため、分離は、多くの場合、工程ａ）の低下段階の温度、すなわち１７〜３０℃又は２０〜３０℃、概して２２〜２７℃、通常は約２５℃の温度と実質的に同じ温度で行われる。これは、ほぼ周囲温度である。
【００６５】
フィルタープレスは、濾布を張り、一般に膜板を有さない。濾布の孔は、３〜２０μｍ、好ましくは３〜７μｍ、好ましくは５μｍである。５重量％〜１０重量％のケーク及び９０重量％〜９５重量％の濾液が一般に得られる。
【００６６】
フィルタープレス上での分離は、１つ又は２つの工程で実施することができる。
【００６７】
フィルタープレス上での分離は、一般に、２つの工程：圧力Ｐ１で濾過する第１の工程と、Ｐ１より高い圧力Ｐ２で圧縮する第２の工程とで実施される。一般に、圧力Ｐ１は１．２〜６バールであり、Ｐ２は５〜１０バールである。
【００６８】
分離を単一の工程で行う場合、圧縮はなく、Ｐ１で実施される工程のみである。
【００６９】
ケークの乾燥度は、加えた圧力によって決まる。
【００７０】
目的は、可能な限り透明な濾液を最大量で回収することである。
【００７１】
そのためには、第１の濾液画分（一般に最も濁っている）を供給タンク中へリサイクルすることが推奨される。このリサイクルは濾液体積の１０％を超えないようにする必要がある。良好な分離及び浸透性ケークの場合、ケークに水を加えて洗浄し、最大量のタンパク質を回収することが推奨される。
【００７２】
単独で又は上述のリサイクルの採用に続けて用いることができる別の方法は、ケーク中の菌を溶解させるものであり、これは冷却工程の後に行う。次いで菌が酵素を放出し、該酵素が回収される。このプロセスは、国際出願第２０１６／０１６１８２号に記載されている。
【００７３】
分離は、２．５未満の修正ＯＤ（光学密度）６００ｎｍを有する（修正は、等価０．２２μｍ濾液の吸光度を差引くことを意味する）液体（又は懸濁液）を得るように行われる。従来の実験室用分光測定法で試料の測定を行う。
【００７４】
ペレット（４０００ｇ／５ｍｉｎ）は、一般に１．５％未満である。
鉱物膜による精密濾過
この工程は、濾液から全ての菌類を除去することを可能にしなければならない。それは、修正ＯＤ６００ｎｍが０．１を超えない（等価０．２２μｍ濾液の吸光度を差引く）ようなやり方で行われる。
【００７５】
好ましくは、フィルタープレスによる分離と同じやり方で、濾液を最長３０時間若しくは最長２８時間又は好ましくは最長２４時間の期間内で精密濾過にかける。通常、精密濾過は、フィルタープレスのライン上で行うことができる。
【００７６】
温度に関しては、低下しないことが好ましい（冷却を要求しない）。これは、満足の行く生成物流量を維持することを可能にする。したがって温度は一般に、１７〜３０℃、又は２０〜３０℃、一般に２２〜２７℃、通常は約２５℃である。これは、ほぼ周囲温度である。
【００７７】
使用する膜は、０．５〜１．４μｍ、好ましくは０．６〜１．４μｍ、好ましくは０．８〜１．４μｍのカットオフ閾値を有する。
酵素収率は、蒸留（保持液に水を添加し、次いで精密濾過に通過させる）によって最大化することができる。
鉱物又は有機膜を用いた限外濾過
この工程は、菌、特にトリコデルマ・リーゼイによって生成された酵素を濃縮することを可能にする。酵素カクテルは、いくつかの酵素の複合混合物であり、そのサイズは１×１０４ｇ／ｍｏｌ（１０ｋＤａ）〜１０×１０４ｇ／ｍｏｌ（１００ｋＤａ）の範囲である。
【００７８】
この限外濾過工程は、一般に２０〜３０℃、一般に２２〜２７℃、通常は約２５℃の温度で実施される。これは、精密濾過に可能な限り近似させて（時間において）行うことが常に有利である。最長期間で４８時間が推奨され、この期間は好ましくは２４時間以下である。
【００７９】
この工程は、対象のタンパク質を１５０ｇ／Ｌ  ＋／−  １０ｇ／Ｌまで濃縮することを可能にする。達成される体積濃縮係数ＶＣＦの値は、初期のタンパク質濃度によって決まる。
【００８０】
この工程の終了時に、追加分の保存剤を保持液に添加してもよい。例えば、０．１％〜０．３５％の安息香酸ナトリウムの添加が推奨される。
【００８１】
限外濾過には鉱物膜を使用することが好ましい。例えば、カットオフ閾値が５〜１５ｋＤａ、好ましくは８〜１２、通常は約１０ｋＤａの管状セラミック膜が使用される。
【００８２】
場合によっては、有機膜を使用してもよいが、注意が必要であり、供給業者が推奨する条件下のみである。
【００８３】
特に有利には、本発明によるプロセスを用いて、製造プロセスにおいて、リグノセルロース系バイオマス、糖含有液、バイオ燃料（エタノール等）又は生化学的分子から酵素を分離する。
【００８４】
これらのプロセスは、リグノセルロース系バイオマスの前処理（例えば蒸気爆発）の工程を含み、前処理したバイオマスは、酵素（トリコデルマ・リーゼイによって分泌された）の存在下で酵素加水分解を受け、糖含有液を多量含む加水分解物を発酵（例えば、アルコール発酵）させ、所望の生成物（例えば、アルコール）を（例えば、蒸留によって）分離する。
【００８５】
本発明が特によく適用するプロセスは、蒸気爆発によるリグノセルロース系バイオマスの前処理を含み、前処理したバイオマスは、例えばトリコデルマ・リーゼイによって分泌された酵素の存在下で（本発明のプロセスに従ってトリコデルマ・リーゼイから酵素が分離された）酵素加水分解を受け、糖含有液を多量含む加水分解物をアルコール発酵させ、蒸留によってエタノールを分離する。
【００８６】
酵素加水分解及び発酵は、別々に実施しても同時に実施してもよい。
インサイチュでの酵素産生でエタノールを生成する植物の場合には、限外濾過の工程は、ほとんどの場合、不要であることが証明されていることに留意すべきである。
【実施例】
【００８７】
実施例１は、有機膜を用いた精密濾過によって得られた乏しい酵素浸透性を実証する。この課題は、鉱物膜を使用する実施例２で解決する。実施例３は、従来の分離法又は本特許に記載の方法のいずれかで実施される２つの連続法を比較する。実施例４は、大容量での分離の完全バランスを提示する。
実施例１：  有機膜を用いた精密濾過の試験（比較例）
製造段階で得られた、処理される培地は、以下の組成を有する。
・４０ｇ／Ｌのタンパク質
・２０ｇ／Ｌのバイオマス（トリコデルマ・リーゼイ菌）
フィルタープレスによる分離を経た後、濾液を様々な精密濾過膜で試験する。
【００８８】
図１及び図２は、０．１〜０．８μｍの範囲の多孔度を有する有機膜（膜ＭＦＧ１：０．１μｍのカットオフ閾値（ポリスルホン）、ＭＦＧ２：０．２μｍ（ポリスルホン）、ＭＦＧ８：０．８μｍ（ポリスルホン）、ＭＦＰ５：０．５μｍ（フルオロ））を用いて実施した実験室試験の結果を示す。
【００８９】
ＶＣＦは、体積濃縮係数を表す。
【００９０】
これらの膜の、酵素に対する低浸透性を確認する。
【００９１】
浸透性は、浸透液（膜を通過する）中の酵素の濃度と保持液（残留する）中の濃度との間の比であると定義される。
実施例２：  セラミック膜を用いた精密濾過の試験
同じ濾液を、カットオフ閾値が０．１４、０．４５、０．８及び１．４μｍの４つの膜で使用する。
【００９２】
利用した方法は、濾過ごとに４つのカットオフ閾値を並行して試験するものであった。使用した器具は、４つの異なる膜を一つにまとめて受け取ることを可能にしたパイロット濾過ユニットと、同一のケーシングである。膜ごとに１つの浸透液用出口があり、単一の保持液ループを有する。そのため、４つの膜の浸透液の流量の変化を並行して試験し、試料を生成することを可能にする。
【００９３】
酵素濃度の測定は、差を明らかにする。
【００９４】
フィルタープレスから得られた濾液は、３８．２ｇ／Ｌの酵素濃度を有する。最終保持液は、量的に４４．３ｇ／Ｌと判定された。
【００９５】
したがって保持液に若干の濃縮があり、これは、１つ以上の膜による保持を示唆する。４つの浸透液の酵素濃度は、以下の通りである。
【００９６】
【表１】
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【００９７】
初期の保持液と比較して、０．８μｍ及び１．４μｍでの濾過によって得られた濃度が、初期溶液の濃度に近いことが分かる。一方で、０．１４μｍ及び０．４５μｍでのカートリッジに酵素保持があるのは明らかである。カットオフ閾値が０．８μｍの鉱物膜で得られたタンパク質濃度は、同じカットオフ閾値を有する有機膜で得られたタンパク質濃度（実施例２）より約４．３倍高い。
実施例３：
実施例３は、従来プロセス又は本特許のプロセスのいずれかで実施した２つの連続法を比較することを可能にする。
【００９８】
製造段階で得られた、処理される培地は、以下の組成を有する：
・ ３９ｇ／Ｌのタンパク質
・ １６．５ｇ／Ｌのバイオマス（トリコデルマ・リーゼイ菌）
実施例３ａ：  デカンター、遠心分離機、及び有機膜ＭＦ（精密濾過）、並びに有機膜ＵＦ（限外濾過）の従来連続法
以下の性能レベルが得られる：
・ デカンテーション： ペレットを３０％から５％に減少させるが、タンパク質が大幅に損失する。収率７０％。
・ 遠心分離： 大幅な損失なしでペレットを５％から１．５％に減少させる。収率９５％。
・ ０．８μｍでの有機ＭＦ：ペレットを１．５％から約０％に減少させる。０．３の低浸透率。収率５０％。
・ 有機ＵＦ  １０ｋＤａ：酵素濃度２００ｇ／Ｌ。収率８０％。
【００９９】
この連続法の全体の収率は２７％である。デカンデーション及び遠心分離の工程で得られるペレット並びにＭＦ工程で得られる保持液をリサイクルし、それらを更なる分離サイクル（遠心分離、ＭＦ、ＵＦ）にかけることによって、５０％の収率に近づけることが可能である。
実施例３ｂ：  本発明による連続法
フィルタープレス、次いでセラミック膜ＭＦ及びセラミック膜ＵＦによる分離の連続法。
【０１００】
以下の性能レベルが得られる：
・ フィルタープレス上での分離：大幅な損失なしでペレットを３０％から１．５％に減少させる。収率９５％。
・ セラミックＭＦ（１．４μｍ）：ペレットを１．５％から約０％に減少させる。０．９の高浸透率。収率９０％。
・ セラミックＵＦ  １０ｋＤａ：酵素濃度２００ｇ／Ｌ。収率９０％。
【０１０１】
この連続法の全体の収率は、一切のリサイクルを行わずに７７％である。
【０１０２】
これらの結果に照らして、インサイチュでの酵素製造でエタノールを生成する植物の場合には、ＵＦ工程は不要であることに留意されたい。したがって、収率は８６％である。
【０１０３】
その上、ＭＦ濾過は、有機膜よりセラミック膜を用いた方がよりずっと効率的である。更に、セラミック膜での収率は、ＭＦであろうとＵＦであろうと、有機膜での収率より大幅に高い。
実施例４：  本発明による連続法を採用したパイロット試験
この試験は、６ｍ３反応器中で生成された培地を使用する。その特性は以下の通りである：
- 培地の質量： ４２６０ｋｇ
- タンパク質濃度： ３８ｇ／Ｌ
- バイオマス濃度： １５ｇ／Ｌ
フィルタープレス上での分離：
分離は、製造工程の直後に、生成物を冷却せずに行う。温度は２７℃である。
この工程では、フィルタープレス上での分離によって大部分の菌類を除去することが要求される。
【０１０４】
使用する器具には、全体の濾過表面積が３ｍ２の濾板１０枚が含まれる。これは、バッチごとに、圧縮前の全体積が３０リットルの３０ｍｍ厚の真菌ケーク１０個を形成することを可能にする。使用した濾布は、５μｍの孔を有する多繊維の濾布である。分離は、３つの工程で行われる。
- 第１の工程は、経時的な濾過流量をモニタリングしながら行う、５バールの上流圧力による濾過からなる。
- 第２の工程中、フィルタ−プレスの供給を停止し、より高い圧力（９バール）を加えることによって真菌ケークを圧縮する。この第２の工程は、菌をプレスし、酵素回収率を最大化する。
- 第３の工程は、秤量されるケークの取り外し（回収）からなる。
【０１０５】
損失を最小限にするためにケークの洗浄を行うか、又は菌をそのまま溶解させることが可能だったと考えられるが、この実施例の場合においてはこれを行わなかったことに留意すべきである。
【０１０６】
全培地（４２６０ｋｇ）を処理するために、合計で１４回の濾過／圧縮が必要だった。      
【０１０７】
以下の表は、マスバランス分離を示す。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
図３は、時間の関数としての濾過量の変化を示し、図４では、供給圧力の関数としての濾過量の変化を示す。
【０１１０】
第１の工程（５バールでの濾過）において、バッチ時間は２５分である。
最初の数分間、濾過流量は高い（５００〜７００L／ｍ２／ｈ）。菌が濾布に「張り付き」、濾材として機能する。圧力が上昇し、濾過流量は低下する。一般に、流量が初期流量と比較して過度に低いように見えたら（例えば、１０％未満又は２０％未満）、初期の目的の濾過時間に応じて、濾過の停止を決める。
【０１１１】
生成される種々のバッチ間には有意な差がないことを留意されたい。これは、濾過される生成物の能力が、操作中（全体で１２時間未満継続した）に変化しなかったことを示す。
【０１１２】
圧縮前のバッチ当たりの平均質量は２６３±３０ｋｇである。平均濾過流量は２１０ｋｇ／ｍ２／ｈである。
【０１１３】
次いで圧縮（９バール）を行うが、この圧縮は平均１０分継続し、３０ｋｇ／ｍ２／ｈの平均流量でバッチ当たり平均１５ｋｇの液体を回収することを可能にした。バッチ当たりで得られたケークの平均質量は１５±１．５ｋｇである。
【０１１４】
濾液に対するケークの重量百分率は平均５．４％であり、その平均ＳＣ（固形分）は２５重量％であり、すなわち、ケークを洗浄しない場合、この工程におけるタンパク質損失は４．０５重量％である。
【０１１５】
フィルタープレス工程後のタンパク質の回収率は９５．４％である。
鉱物セラミックを用いた精密濾過による分離：
次いでフィルタープレスで得られた濾液をいくつかの試料に分け、これらを、０．８μｍ及び１．４μｍの多孔度を有する鉱物膜を用いた精密濾過によって処理する。この試験の目的は、酵素及び菌を含むフィルタープレス濾液の性能レベルを、標的の体積濃度係数１０と比較することである。精密濾過に後続して、タンパク質損失を最小限にすることを可能にする透析濾過を行う（水の添加は５容量の保持液に対応する）。
【０１１６】
精密濾過の器具には、ケーシングごとに０．３３ｍ２の濾過表面積を有する３つの膜が含まれる。
【０１１７】
第１の試験は、同じ膜間圧で０．８μｍの膜より良好な濾過性能レベルを有する１．４μｍの膜を選択することを可能にした。実際、浸透液の流れは、第１では１００L／ｍ２／ｈで、第２では６０L／ｍ２／ｈで体積濃度係数（ＶＣＦ）７．５まで安定化する。２つの膜は、生成物を清澄化することを可能にした（ＰＤＡ培地外に置かれた浸透液において菌の増殖はない）。
【０１１８】
図５は、保持液及び浸透液中のタンパク質濃度の変化を表す。これは、タンパク質に対する２つの膜の浸透性が非常に良好であることを示す。１．４μｍの膜の浸透性がより良好であり、０．９を超える。これは、多孔度が０．８μｍであっても、その有機膜で０．２〜０．４だったことを想起させた。
【０１１９】
鉱物膜ＭＦ後のタンパク質の回収率は、初期工程に対して９３．３％である。
【０１２０】
次いで、回収率が９２％、すなわち全体の収率が８６％の鉱物膜ＵＦにより酵素を濃縮した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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