(57)【要約】  ヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質ストック溶液及びそれを作製する方法は、水性緩衝媒体中の非組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質−３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を含む。ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度は、１ミリリットル当たり約１６マイクログラム（μｇ/ｍL）〜約４０μｇ/ｍＬの範囲である。キットはｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３用の較正物質のセットを含む。較正物質のセットは、患者試料の免疫測定におけるＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの推測される範囲に亘るように構成される、約０．５μｇ/ｍＬ〜約１６μｇ/ｍＬの範囲内の異なる濃度で、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含む。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液であって、非組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質−３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を、１ミリリットル当たり約１６マイクログラム（μｇ／ｍＬ）〜約４０μｇ／ｍＬの範囲のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する水性緩衝媒体中に、含有するヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液。
【請求項２】
前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が約２０μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬの範囲内である、請求項１に記載のヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液。
【請求項３】
請求項１に記載のヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液を含む較正標準のセットであって、該セットの各々の較正標準が異なるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有し、該セットにおける該較正標準の異なるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が約０．５μｇ／ｍＬ〜約１６μｇ／ｍＬの範囲である、較正標準のセット。
【請求項４】
組み換えＩＧＦ結合タンパク質を含まない、請求項１に記載のヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液。
【請求項５】
前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の水性緩衝媒体が組み換えＩＧＦＢＰ−３を含まない、請求項１に記載のヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液。
【請求項６】
ＩＧＦＢＰ−３被検体の免疫測定用の較正物質のセットであって、該セットの各々の較正物質がヒト血清希釈剤で希釈された請求項１に記載のヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液を含み、該セットの該較正物質のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が異なり、該異なるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの推測される範囲に亘るように構成される、較正物質のセット。
【請求項７】
前記ヒト血清希釈剤が、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まない、酸処理し活性炭吸着したヒト血清である、請求項６に記載の較正物質のセット。
【請求項８】
ヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質用の較正物質のセットを含むキットであって、該セットの各々の較正物質が非組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を含有する水溶液を含み、該セットの各々の較正物質のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が異なり、該セットにおける該異なるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が約０．５マイクログラム毎ミリリットル（μｇ／ｍＬ）〜約１６μｇ／ｍＬの範囲内である、キット。
【請求項９】
前記較正物質のセットに前記異なるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の範囲が、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体及びＩＧＦ−１被検体の一方又は両方の推測される濃度範囲に亘るように構成され、前記セットの前記較正物質が、約１６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有するヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液の異なる希釈物である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記セットの各々の較正物質が、更に、ヒト血清希釈剤を含み、該ヒト血清希釈剤が、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まない、酸処理し活性炭吸着したヒト血清を含有し、該ヒト血清希釈剤が、前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の範囲に希釈するように構成される量である、請求項８に記載のキット。
【請求項１１】
前記較正物質のセットが組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質を含まない、請求項８に記載のキット。
【請求項１２】
非組み換えヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）の濃縮物を水溶液中で形成する方法であって、
ヒト血清及び該ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の一方の水溶液を多孔質マトリックスと接触させること；及び
水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を前記多孔質マトリックスから回収すること、を含み、
水溶液中の回収されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３がミリリットル当たり約１６マイクログラム（μｇ/ｍL）〜約４０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有するものである、方法。
【請求項１３】
前記多孔質マトリックスが限外濾過ディスク、濾過膜及びセファロース系樹脂の１つ以上である、請求項１２に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項１４】
更に、前記ヒト血清の水溶液を準備することを含み、
ここで、該ヒト血清の水溶液が、ヒト血清を第１の緩衝溶液と混合することによって準備され、
前記ヒト血清の水溶液と前記多孔質マトリックスとを接触させることが、
前記第１の緩衝溶液中の前記ヒト血清を、第２の緩衝溶液で平衡化したセファロース系樹脂を含むクロマトグラフィーカラムに適用して、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を前記ヒト血清中の他の血清タンパク質から分離すること；
前記セファロース系樹脂から前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を第３の緩衝溶液で溶出させること；及び
前記第３の緩衝溶液中の溶出された前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を、交換緩衝液を用いて濾過膜に適用し、水溶液中の前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を緩衝液交換及び濃縮すること；
を含む、請求項１２に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項１５】
更に、前記ＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備することを含む請求項１２に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法であって、
ここで、該ＩＧＦ結合タンパク質の水溶液が
前記ヒト血清と飽和抗カオトロピック塩溶液とを混合して、混合物を形成すること；
前記ＩＧＦ結合タンパク質を前記混合物から単離すること；及び
単離したＩＧＦ結合タンパク質を緩衝溶液中で再構成すること；
によって、準備され、
前記ＩＧＦ結合タンパク質の水溶液と前記多孔質マトリックスとを接触させることが、緩衝溶液中の再構成されたＩＧＦ結合タンパク質を、濾過膜及び限外濾過ディスクの一方又は両方に交換緩衝液を用いて適用し、水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を緩衝液交換及び濃縮することを含む、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項１６】
前記飽和抗カオトロピック塩溶液が水中の抗カオトロピック硫酸塩を含有する請求項１５に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項１７】
前記飽和抗カオトロピック塩溶液がリン酸ナトリウム溶液中の硫酸アンモニウム塩を含有する請求項１５に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項１８】
ヒト血清及び該ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の一方の水溶液と多孔質マトリックスとを接触させることが、緩衝液交換溶液を用いたタンジェンシャルフロー濾過を含む、請求項１２に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項１９】
更に、前記濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液を用いて較正物質のセットを調製することを含み、該セットの各々の較正物質における前記ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度が異なり、該セットにおける種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度が約０．５μｇ/ｍＬ〜約１６μｇ／ｍＬの範囲内であり、該較正物質のセットが患者試料中のＩＧＦＢＰ−３及びＩＧＦ−１の一方又は両方の測定を較正するように構成される、請求項１２に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【請求項２０】
前記較正物質のセットを調製することが、前記濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液を、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まない、酸処理し活性炭吸着したヒト血清希釈剤の種々の量で希釈することを含む、請求項１９に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年１２月３１日付で出願された米国仮出願第６２／２７４，１１６号（引用により、その全体が本明細書の一部をなす。）の優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する陳述］
該当なし。
【背景技術】
【０００３】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２、は、細胞成長の調節に関与するタンパク質ホルモンのファミリーに属する。例えば成長ホルモン（ＧＨ）刺激の結果として、肝臓からＩＧＦ−１が分泌される。ＩＧＦの作用は、インスリン様成長ホルモン結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）への結合によって仲介される。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２に対して高い親和性を有する６つのＩＧＦ結合タンパク質（例えば、ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）が存在し、ＩＧＦＢＰ−３が最も優勢である。ＩＧＦＢＰは、或る状況においてＩＧＦ作用の阻害及び他の状況においてＩＧＦ作用の促進の一方又は両方のために、ＩＧＦの作用の調整を促す。特に、ＩＧＦ−１は１：１のモル比でＩＧＦＢＰ−３に結合する。ＩＧＦＢＰ−３及びＩＧＦ−１の産生は、成長ホルモンＧＨに左右され、対照的に、ＩＧＦＢＰ−１産生がペプチドホルモンインスリンによって調節されるようである。
【０００４】
ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ、例えばＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２のいずれか、及び酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）タンパク質（ＧＨ依存性でもある）を、ＩＧＦＢＰ−３との安定な複合体として、血流中で身体の組織へと輸送する。ＩＧＦＢＰ−３は、循環機能、細胞外機能及び細胞内機能を有する。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は、様々な細胞型由来のＩＧＦを結合し、ＩＧＦ受容体へのＩＧＦのアクセスを遮断し、細胞表面のタンパク質と相互作用し、細胞核内のホルモン受容体に結合することができる。
【０００５】
ヒト身体内のＩＧＦレベルが健康及び疾患の特性化を目的としてモニタリングされる。例えば、構造がインスリンと類似するＩＧＦ−１は、小児期の成長において重要な役割を果たす。小児期の発達時のＩＧＦレベルのモニタリングは、発達が正常であるかどうかの特性化に役立つ。他の例では、ＩＧＦは、糖尿病、並びにおそらくは老化及び癌のモニタリングにおいても、重要な役割を果たす。従って、血清免疫測定によるヒトのＩＧＦレベル、特にＩＧＦＢＰ−３レベル、のモニタリングは、小児及び成人の両方のモニタリングにとって重要な診断ツールを提供する。
【０００６】
ＩＧＦＢＰ−３レベルについてのヒト血清の患者試料の免疫測定による結果は、ＩＧＦＢＰ−３濃度既知の較正物質、即ち標準、のセットと比較される。例えば、ＩＧＦＢＰ−３較正標準は、患者試料中に予測されるＩＧＦＢＰ−３被検体の、対象とすべき推測される濃度範囲に亘る、様々な濃度で調製される。較正物質を使用して、例えば、いずれもシーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社の、これらに限定されるわけではないが、ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）システム及びＣＥＮＴＡＵＲ（商標）システムを始めとする免疫測定装置を較正し、ヒト患者におけるＩＧＦＢＰ−３被検体レベルを正確に測定することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＩＧＦＢＰ−３は、ヒト血清中で比較的豊富であるが、免疫測定用の較正標準のセットを調製するのに十分な濃度でのヒト血液からのＩＧＦＢＰ−３の単離は、問題が多く、困難であることが見出されている。代わりに、組み換え形態のヒトＩＧＦＢＰ−３が患者試料の免疫測定用の較正標準の調製に使用されている。
【０００８】
残念なことに、市販の組み換え形態のヒトＩＧＦＢＰ−３は、高価であり、純粋なヒト形態のＩＧＦＢＰ−３が有するような構造的完全性を有しない場合がある。従って、免疫測定の較正標準に組み換え形態のヒトＩＧＦＢＰ−３を使用することの負の影響は、単なるコストの懸念よりも重大である可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書に記載の原理に従う幾つかの実施の形態では、ヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質ストック溶液が提供される。ヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質ストック溶液は、非組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質−３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を、１ミリリットル当たり約１６マイクログラム（μｇ/ｍＬ）〜約４０μｇ/ｍＬの範囲のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する水性緩衝媒体中に含有する。
【００１０】
本明細書に記載の原理に従う幾つかの実施の形態では、ヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質用の較正標準のセットを含むキットが提供される。セットの各較正標準は、非組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を含有する水溶液を含む。セットの各較正標準中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度は様々であり、セットにおける種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約０．５μｇ/ｍＬ〜約１６μｇ/ｍＬの範囲内である。
【００１１】
本明細書に記載の原理に従う幾つかの実施形態では、水溶液中における非組み換えヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）の濃縮物を形成する方法が提供される。この方法は、ヒト血清及びヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質のいずれか一方の水溶液と多孔質マトリックスとを接触させることと、多孔質マトリックスとの接触後に、水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を回収することとを含み、水溶液中の回収されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、約１６μｇ/ｍＬ〜約４０μｇ/ｍＬの範囲内の濃度を有する。
【００１２】
本明細書に記載の原理に従う実施形態及び実施例の様々な特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。図面中の同様の参照符号は、同様の構造要素を指す。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、水溶液中における非組み換えヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）の濃縮物を形成する方法のフローチャートである。
【図１Ｂ】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、図１Ａの方法での、ヒト血清の水溶液を多孔質マトリックスと接触させるプロセスのフローチャートである。
【図２】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の溶液の準備のフローチャートである。
【図３】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清希釈剤を作製する方法のフローチャートである。
【図４】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰアッセイ対ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）数値割り当て標準による、相対発光量（ＲＬＵ）における硫酸アンモニウム沈殿させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の用量応答のグラフである。
【図５】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰアッセイ及び1030数値割り当て標準による、硫酸アンモニウム沈殿させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準の用量値を比較するグラフ（完全曲線）である。
【図６】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰアッセイ及びＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）数値割り当て標準による、硫酸アンモニウム沈殿させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準の用量値を比較するグラフ（２点計算）である。
【図７】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、酸処理し、活性炭吸着したヒト血清からの血清タンパク質（「ＯＤ２８０」）及びｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の溶出プロファイルの棒グラフである。
【図８】本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、酸処理し、活性炭吸着したヒト血清で希釈した試料についてのプロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰでの測定結果と算出結果との直線関係のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
或る特定の実施例及び実施形態が、上記で参照した図面において説明された特徴に加えて及び／又はその代わりに他の特徴を有する。これら及び他の特徴を、上記で、参照された図面を参照して下記に詳述する。
【００１５】
本明細書に記載の原理と一致する実施形態及び実施例は、水性媒体中に非組み換え形態のヒトＩＧＦ結合タンパク質−３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）の濃縮物を含有するヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質のストック溶液を提供する。ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物は、ＩＧＦＢＰ−３被検体の患者試料の免疫測定用の較正標準のセットを調製するのに十分な濃度である。「較正標準のセットを調製するのに十分な濃度」という表現は、ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度が、特定のアッセイについてのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準（「較正物質」）の最高濃度と少なくとも同じ高さであることを意味する。
【００１６】
本明細書に記載の原理と一致する実施形態及び実施例は、更に、患者試料中に予測されるＩＧＦＢＰ−３被検体の対象とすべき推測される濃度範囲に亘るように構成される種々の濃度のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含む較正標準のセットを提供する。一部の例では、ヒト患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体レベルは、僅か約０．５μｇ／ｍＬ（ここで、アッセイにおける定量限界（ＬＯＱ）は、約０．１μｇ／ｍＬ未満である。）から約１６μｇ／ｍＬほどという範囲であり得る。しかしながら、ヒト血清は、通例、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３が約４．０μｇ／ｍＬ〜約５．５μｇ／ｍＬの範囲を有するが、これは、較正標準をヒト患者における推測される範囲に亘るようにするには不十分な濃度である。本明細書に記載の原理に従うと、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、約１６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する。
【００１７】
更に、患者試料のＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘る較正標準のセットは、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液から調製される。セットの較正標準は、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１６μｇ／ｍＬの範囲に亘る種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する。ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法によって、作製される。この方法は、ヒト血清又はヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を多孔質マトリックスと接触させることと、水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を多孔質マトリックスから回収すること、とを含み、濃縮された水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、約１６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する。ヒト血清又はヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の水溶液と多孔質マトリックスとの接触は、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液の緩衝液交換及び濃縮の両方を行なうように構成される。方法の一部の例では、水溶液の接触は、更に、溶液中の他の血清タンパク質からのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３又はＩＧＦ結合タンパク質の分離、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３又はＩＧＦ結合タンパク質溶液の脱塩、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液の精製及び富化の１つ以上をもたらす。
【００１８】
ストック溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、ヒト患者において見られるものと同じ天然不均質形態（ｎａｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｆｏｒｍ）を有している。「天然不均質形態」とは、ヒト血清由来のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３がグリコシル化されており、幾つかの形態を有し得ることを意味する。例えば、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２又はＡＬＳとの二元複合体、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２及びＡＬＳとの三元複合体の１つ以上を形成していても、これらのいずれとも複合体を形成しなくてもよい。本明細書に記載の原理によれば、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の天然不均質形態を示すこれらの形態は、全て、内因性ヒト血清中にも見られる。天然不均質形態のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の公称分子量は、例えば、約２５キロダルトン（ｋＤａ）〜約１５５ｋＤａの範囲であり得る。
【００１９】
組み換え形態のＩＧＦＢＰ−３は、ヒト血液由来のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３とは、重要な点で構造的に異なる。組み換えＩＧＦＢＰ−３形態の構造の相異のために、一般的な実験室について常温及び様々な温度範囲下の両方で、ＩＧＦＢＰ−３の組み換え供給源を使用した場合に、内因性ヒト供給源と比較して、用量回収（ｄｏｓｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）における顕著なバイアスが観察され得る。本明細書の定義によると、「組み換えＩＧＦＢＰ−３」は、インスリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２）にも酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）にも結合しない。更に、組み換え形態のＩＧＦＢＰ−３は、ヒト血液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３に見られるグリコシル化を欠いている。組み換えＩＧＦＢＰ−３は、実質的に「裸の」形態である。ヒト血液由来のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、上記のように、ヒト患者のＩＧＦＢＰ−３に類似する天然不均質形態である。何故ならば、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、約１５０ｋＤａの三元複合体において結合したＩＧＦ、ＡＬＳ及びグリコシル化単位の各々を含むか、又は結合したＩＧＦ若しくはＡＬＳと二元複合体を形成するか、又はＩＧＦ若しくはＡＬＳのいずれとも複合体を形成しない可能性があるからである。
【００２０】
本発明者らは、下記の実施例セクションに更に提示するように、組み換えＩＧＦＢＰ−３形態が、免疫測定の温度条件と典型的に関連する常温の範囲（即ち、約１８セルシウス度（℃）〜約３０℃）で、温度バイアスを有し、免疫測定の精度に悪影響をもたらし得ることを発見した。「常温バイアス」という表現は、試料中の組み換えＩＧＦＢＰ−３の測定濃度が、測定を行なう実験室の温度に応じて異なり得ることを意味する。
【００２１】
例えば、組み換えＩＧＦＢＰ−３の試料は、２４℃（即ち、常温）で３μｇ／ｍＬと測定され得る。しかしながら、組み換えＩＧＦＢＰ−３が使用され又は測定される環境の温度が約２４℃未満又は２４℃超（例えば、約１８℃又は約３０℃）へと変化すると、同じ組み換えＩＧＦＢＰ−３試料の濃度が変化して、２４℃で測定された常温測定の３μｇ／ｍＬを超え又は下回る。ヒト血液由来のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３及びヒト患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体は、この温度バイアスを有しない。そのため、組み換えＩＧＦＢＰ−３の観察される温度バイアスは、免疫測定及び較正標準を考慮する際に重要である。ヒト患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの免疫測定の測定値の精度は、免疫測定を行なう温度範囲での免疫測定に使用される較正標準及び対照の精度に左右される。
【００２２】
更に、本明細書で使用される場合、「医療判断プール（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｏｏｌ）」（即ち、「ＭＤＰ」）は、患者試料中で測定されると考えられる被検体の低い（又は最低の）濃度範囲を有する較正標準のセットとして、広く規定される。「定量限界（Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（「ＬＯＱ」）は、信頼性をもって測定され得る、患者試料中で検出されると考えられる被検体の最低濃度として広く規定される。例えば、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体濃度のＬＯＱは、約０．１μｇ／ｍＬ以下である。
【００２３】
更に、本明細書で使用される場合、数量を特定しない冠詞“ａ”は、特許分野におけるその通常の意味、即ち「１つ以上」、を有することを意図したものである。例えば、本明細書で「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は１つ以上のタンパク質を意味し、そのため、「そのタンパク質（ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は「そのタンパク質（複数の場合もある）」を意味する。また、本明細書で「最高部」、「最低部」、「上部」、「下部」、「上方」、「下方」、「前部」、「後部」、「第１」、「第２」、「左」又は「右」への言及は、本明細書における限定を意図するものではない。本明細書では、「約」という用語は、値に適用される場合、概して、値を得るために使用される装置の許容差範囲内であることを意味するか、又は、そうでないと明白に指定しない限り、±１０％、若しくは±５％、若しくは±１％、若しくはこれらの任意のパーセント値の間の範囲を意味し得る。更に、本明細書で「実質的に」という用語は、本明細書で使用される場合、大部分、又は殆ど全て、又は全て、又は約５１％から約１００％の範囲内の量を意味する。更に、本明細書の実施例は、単に例示を意図し、論考を目的として提示されるものであって、限定のためではない。
【００２４】
［ヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液］
本明細書に記載の原理の幾つかの実施形態に従うと、ヒト血液由来のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を水性緩衝媒体中に含有するヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液が提供される。ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体の免疫測定用の較正標準のセットを調製するのに十分なｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度を有する。特に、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度は、ヒト患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの推測される範囲に亘る較正標準のセットを調製するのに十分である。一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、約１６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲内のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する。ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３が上記のように天然不均質形態であり、従って、全ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の或る特定の割合が、ストック溶液中において、例えば１：１複合体で、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２のいずれかに結合し得ることを理解されたい。
【００２５】
一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約１６μｇ／ｍＬ〜約３８μｇ／ｍＬ、又は約１６μｇ／ｍＬ〜約３６μｇ／ｍＬ、又は約１６μｇ／ｍＬ〜約３４μｇ／ｍＬ、又は約１６μｇ／ｍＬ〜約３２μｇ／ｍＬ、又は約１６μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬの範囲内である。一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約１８μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、又は約２０μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、又は約２２μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、又は約２４μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、又は約２６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、又は約２８μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、又は約３０μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲内である。一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約２０μｇ／ｍＬ〜約３６μｇ／ｍＬ若しくは約２０μｇ／ｍＬ〜約３０μｇ／ｍＬの範囲内であるか、又は２０μｇ／ｍＬ超、且つ４０μｇ／ｍＬ未満である。一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約２５μｇ／ｍＬ又は約３５μｇ／ｍＬに等しい。一例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約３０μｇ／ｍＬに等しい。
【００２６】
上述のように、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＰＢ−３濃度は、種々のｎｒ−ＩＧＦＰＢ−３濃度の較正標準を含む較正標準のセットを調製するのに十分であり、セットの較正標準は、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘るｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の範囲を含む。特に、較正標準のセットは、これらに限定されるものではないが、例えば、水性緩衝媒体、ヒト血清、又はそれらの組合せ若しくは混合物等の水性媒体で希釈されたＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液を含む。ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液の希釈物は、セットの各々の較正標準において種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を提供するように構成される。一部の例では、セットにおける較正標準の種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約０．５μｇ／ｍＬから約１６μｇ／ｍＬの範囲である。較正標準のセットについて下記に更に説明する。
【００２７】
本明細書の様々な実施形態によると、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、ヒト血清から作製され、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の水性緩衝媒体は、ヒト血清に由来する。一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液及びｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の水性緩衝媒体の一方又は両方が、組み換えＩＧＦ結合タンパク質を含まない。「組み換えＩＧＦ結合タンパク質を含まない」という表現は、ストック溶液又は水性緩衝媒体が組み換えＩＧＦ結合タンパク質を含まないか、又は、例えば約０％の組み換えＩＧＦ結合タンパク質を含むことを意味する。一部の例では、例えば組み換えＩＧＦＢＰ−３参照対照が較正標準のセットを含有するキットに含まれ得る。組み換えＩＧＦＢＰ−３参照対照は、世界保健機関（ＷＨＯ）の材料でなくてもよく、英国の国立生物学的標準管理研究所（ＮＩＢＳＣ）から入手することができる。
【００２８】
［ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準のセット及びそれを含有するキット］
本明細書に記載の原理の幾つかの実施形態に従うと、ヒト患者のＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの免疫測定用の較正物質（例えば、較正標準又は対照）のセットを含有するキットが提供される。セットの較正物質は、セット内の他の較正物質中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度とは異なる濃度でｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含有する水溶液である。セットにおける種々の較正物質の濃度は、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘るように構成される。
【００２９】
一部の例では、セットにおける較正物質の種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約０．２５μｇ／ｍＬ〜約１８．５０μｇ／ｍＬの範囲に亘り、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘る。一部の例では、セットにおける較正物質の種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約０．３５μｇ／ｍＬ〜約１８．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．４５μｇ／ｍＬ〜約１８．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．５５μｇ／ｍＬ〜約１８．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．６５μｇ／ｍＬ〜約１８．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．７５μｇ／ｍＬ〜約１８．５０μｇ／ｍＬの範囲であり、患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘る。一部の例では、セットにおける較正物質の種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１７．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１６．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１６．００μｇ／ｍＬ、又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１５．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１５．００μｇ／ｍＬ、又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１４．５０μｇ／ｍＬ、又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１３．５０μｇ／ｍＬの範囲であり、ヒト患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘る。更に、セットの個々の較正物質の幾つかがＭＤＰ標準であってもよく、例えば約０．５μｇ／ｍＬ、約３．０μｇ／ｍＬ又は約６．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する較正物質をＭＤＰ標準に指定することができる。
【００３０】
一部の例では、較正物質のセットは、約１６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの範囲のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有するヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液の種々の希釈物を含む。一部の例では、ヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、上記のようなヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液と、実質的に類似している。ヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液は、ヒト血清希釈剤で希釈され、患者試料の免疫測定におけるＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘るように構成される較正物質のセットの種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の範囲を達成する。例えば、較正物質のセットは、約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１６．００μｇ／ｍＬ又は約０．５０μｇ／ｍＬ〜約１４．５０μｇ／ｍＬに亘る種々の濃度範囲を有し得るが、約０．１０μｇ／ｍＬがＬＯＱに近い可能性がある。「ヒト血清希釈剤」という表現は、ヒト血清に見られるものに可能な限り近い又は実質的に同一のタンパク質含有量及び濃度を有する溶液を指す。例えば、ＭＤＰ標準は、ヒト血清に可能な限り近いヒト血清希釈剤溶液を用いて作製される。
【００３１】
「水性緩衝媒体」という表現は、水のみであっても、又は０．１容量パーセント〜約４０容量パーセントの共溶媒、例えば水混和性の有機溶媒、例えばアルコール、エーテル又はアミド等、を含んでいてもよい水性媒体を指す。媒体のｐＨは、通常は、例えば約４〜約１１の範囲内、又は約５〜約１０の範囲内、又は約６．５〜約９．５の範囲内、又は約７．０〜約９．０の範囲内である。様々な緩衝液を、所望のｐＨを達成し、処理中のｐＨを維持するために使用することができる。例示的な緩衝液としては、これらに限定されないが、例えばホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス（即ち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン）、バルビタール、ＰＩＰＥＳ（即ち、ピペラジン−Ｎ，Ｎ−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＨＥＰＥＳ（即ち、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（即ち、２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、ＡＣＥＳ（即ち、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（即ち、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＢＩＣＩＮＥ（即ち、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−グリシン）、又はこれらの２つ以上の組合せ若しくは混合物が挙げられる。
【００３２】
一部の例では、セットの較正物質は、その較正物質のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の水溶液を希釈するために、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清希釈剤を更に含む。他の例では、セットの較正物質の各々が、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の水溶液をそのセットの異なるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質濃度まで希釈するために、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清希釈剤を更に含む。「ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まない」という表現は、ヒト血清希釈剤が、出発ヒト血清に対して約２（容量）％未満のＩＧＦ結合タンパク質、又は出発ヒト血清に対して約１．５容量％未満、若しくは約１容量％未満、若しくは約０容量％の、ＩＧＦ結合タンパク質、を含有するように改質されていることを意味する。例えば、二重活性炭ストリッピング（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｈａｒｃｏａｌ  ｓｔｒｉｐｐｅｄ）及び脱脂されたヒト血清、又は例えばＧｏｌｄｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（リフォルニア州、テメクラ）社のＤＤＣ  ＭＡＳＳ  ＳＰＥＣ  ＧＯＬＤ（商標）血清を、実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清希釈剤として使用することができる。
【００３３】
ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清希釈剤を作製する方法を、本明細書に記載の原理の実施形態に従って、下記に更に説明する。他の例では、ヒト血清希釈剤は、ＩＧＦ結合タンパク質を含有し、ヒト血清は、例えば未処理血漿若しくは未処理血清、又は処理血漿若しくは処理血清であってよい。ＩＧＦ結合タンパク質を含むヒト血清希釈剤として使用されるヒト血漿又は血清は、例えばＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （ＢＲＴ）（フロリダ州、ウエストン）から入手することができる。
【００３４】
更に、一部の例では、免疫測定キットは、組み換えＩＧＦＢＰ−３参照対照を含んでいてもよいが、較正標準のセット内の較正物質は、組み換えＩＧＦ結合タンパク質を含まない。言い換えると、患者試料の免疫測定におけるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３レベルの決定のための較正標準のセットは、ヒト血清のみに由来するｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含有する。
【００３５】
［水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法］
本明細書に記載の原理の幾つかの実施形態に従うと、水溶液中においてｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を含有するヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液を形成する方法が提供される。図１Ａに、本明細書に記載の原理の実施形態に従う一例における、水溶液中においてｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法１００のフローチャートを示す。方法１００は、ヒト血清又はヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質のいずれかの水溶液を含む多孔質マトリックスと接触させること（１２０）と、水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を多孔質マトリックスから回収すること（１４０）とを、含む。水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、１ミリリットル当たり約１６マイクログラム（μｇ／ｍＬ）〜約４０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有する。ヒト血清としては、これに限定されないが、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（フロリダ州、ウエストン）社の処理血清が挙げられる。例えば、ヒト血清は、複数のヒト個体由来のヒト血清の混合物であってもよい。ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を形成する方法１００において、ヒト血清又はヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質のいずれかの水溶液を多孔質マトリックスと接触させること（１２０）は、下記に更に説明するようにｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液の緩衝液交換及び濃縮の両方を行なうように構成される。ヒト血清又はヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質のいずれかの水溶液を多孔質マトリックスと接触させること（１２０）は、更に、濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３水溶液の脱塩、富化及び精製の１つ以上を促進するように、構成される。一部の例では、水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法１００は、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物の大規模バッチ処理を促進するよう、構成される。
【００３６】
本明細書に記載の原理に従う一部の例では、多孔質マトリックスは、固体又は半固体材料であってよく、有機又は無機の不水溶性材料を含有していてもよい。多孔質マトリックスは、例えば管状（例えば円柱、中空繊維、渦巻き形及び中空微細繊維）、トラックエッチド（ｔｒａｃｋ−ｅｔｃｈｅｄ）、又は平な若しくは平坦な表面（例えば細片、円板、フィルム、膜及び平板）等の多数の形状のいずれかを有し得る。多孔質マトリックスは、天然品であっても合成品であっても、ポリマーであっても非ポリマーであっても、繊維質であっても非繊維質であってもよい広範な材料から製造することができる。多孔質マトリックスの孔のサイズは、一部の例では、タンパク質の公称分画分子量（ＮＭＷＬ）又は公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）に基づくものであり得る。
【００３７】
例えば、約２５ｋＤａ〜約１７５ｋＤａの範囲内のＮＭＷＬ又はＮＭＷＣを用いることができる。一部の例では、多孔質マトリックスのＮＭＷＬ又はＮＭＷＣは、約２６ｋＤａ〜約１７５ｋＤａ、又は約２７ｋＤａ〜約１７５ｋＤａ、又は約２８ｋＤａ〜約１７５ｋＤａ、又は約２９ｋＤａ〜約１７５ｋＤａ、又は約３０ｋＤａ〜約１７５ｋＤａ、又は約４０ｋＤａ〜約１７５ｋＤａの範囲であり得る。一部の例では、多孔質マトリックスのＮＭＷＬ又はＮＭＷＣは、約２５ｋＤａ〜約１７０ｋＤａ、又は約２５ｋＤａ〜約１６５ｋＤａ、又は約２５ｋＤａ〜約１６０ｋＤａ、又は約２５ｋＤａ〜約１５５ｋＤａ、又は約２５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの範囲であり得る。一例では、多孔質マトリックスのＮＭＷＬ又はＮＭＷＣは、約３０ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの範囲であり得る。
【００３８】
一部の例では、多孔質マトリックスは、濾過デバイスの一部であり、試料を濾過デバイスの多孔質マトリックスと接触させ、試料中の成分のサイズ又は分子量に基づいて、試料の標的成分（例えば、タンパク質）を他の成分から分離するが、標的成分は、優先的に、多孔質マトリックス上に保持されるか又は多孔質マトリックスを通過し、次いで回収される。濾過法としては、これらに限定されないが、例えば精密濾過、限外濾過、又はクロスフロー若しくはタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）が挙げられる。限外濾過の一例としては、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（マサチュセッツ州、ビレリカ）社の３０ｋＤａ  ＮＭＷＬの限外濾過ディスク（ＵＬＴＲＡＣＥＬ（商標）セルロース膜）及びリザーバを備えるＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セルが挙げられる。クロスフロー又はタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）の一例としては、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニューヨーク州、ポート  ワシントン）社のＯＭＥＧＡ（商標）ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（３０ｋＤａ  ＮＭＷＣ）を有するＴＦＦ  ＣＥＮＴＲＡＭＡＴＥ（商標）カセットを備えた、Ｓｃｉｌｏｇ，Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州、ミドルトン）社のＴＦＦシステム（例えば、ＰｕｒｅＴｅｃ  ＴＦＦシステム）が挙げられる。他の例では、多孔質マトリックスは、クロマトグラフィーカラム及び／又は本明細書に記載の濾過デバイスの１つにおけるセファロース系樹脂を含む。セファロース系樹脂多孔質マトリックスは、以下に更に説明するように、疎水性相互作用、イオン交換及びアフィニティークロマトグラフィーの１つ以上を容易にして試料中の成分を分離する。
【００３９】
［ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の水溶液と多孔質マトリックスとの接触］
濃縮物を形成する方法１００の一部の例では、方法１００は、更に、ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備すること（１１０）を、即ち、水溶液と多孔質マトリックスとを接触させること（１２０）の前に、含む。図２に、本明細書に記載の原理の実施形態に従う一例における、ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備すること（１１０）のフローチャートを示す。図２に説明されるように、ヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備すること（１１０）は、ヒト血清と抗カオトロピック塩の飽和塩溶液とを、水性溶媒、例えば水、の中で混合して、ヒト血清溶液由来の沈殿ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）を含む混合物を形成すること（１１２）を含む。本明細書に記載の原理に従う方法において使用される抗カオトロピック塩は、抗カオトロピック塩のイオン強度に基づいてタンパク質を溶液から沈殿させる機能を促進するものである。
【００４０】
例えば、イオンのホフマイスター系列は、溶液中の疎水性効果を増大することによって沈殿を容易にする溶液中のイオンの相対強度を与えるものである。概して、例えば、硫酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩は、溶液中で通常は疎水性領域を覆う高度に構造化された水層を除去することによって、タンパク質の疎水性領域を露出させる。その結果、タンパク質分子上の疎水性部分が利用可能となり、隣接タンパク質分子上に見出される疎水性部分と、より容易に相互作用できるようになる。一部の例では、疎水性部分は、多孔質マトリックス中又は多孔質マトリックス上に見られる疎水性配位子と相互作用し得る。加えて、抗カオトロピック塩は、タンパク質上の荷電基を遮蔽し得るが、荷電基は溶液中でタンパク質同士を離れ易くし、タンパク質の溶解性を低減する。まとめると、これらの効果は、タンパク質の修復不能な変性を引き起こすことなく、タンパク質凝集体を形成し最終的にはタンパク質の沈殿（即ち、「塩析」）をもたらす。
【００４１】
異なるタンパク質の溶解性は、ホフマイスター系列による塩の抗カオトロピック強度及びその濃度に応じて、種々の程度まで低減する。ホフマイスター系列には、タンパク質を塩析する能力の強度の高いものから順に、陰イオン：Ｆ−≒ＳＯ４２−＞ＨＰＯ４２−＞酢酸イオン＞Ｃｌ−＞ＮＯ３−＞Ｂｒ−＞ＣｌＯ３−＞Ｉ−＞ＣｌＯ４−＞ＳＣＮ−が含まれ、陽イオン：ＮＨ４＋＞Ｋ＋＞Ｎａ＋＞Ｌｉ＋＞Ｍｇ２＋＞Ｃａ２＋＞グアニジウムイオンが含まれる。そのため、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）は、強い抗カオトロピック剤と考えられ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、例えば血清タンパク質、特にＩＧＦＢＰ、を溶液から沈殿させる大規模な処理について、硫酸アンモニウムよりも低い抗カオトロピック強度及び効果を有する。一部の例では、混合（１１２）中にタンパク質を沈殿させるために飽和塩溶液中で使用される抗カオトロピック塩は、これらに限定されないが、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、リン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、又はこれらの２つ以上の組合せ若しくは混合物とすることができる。
【００４２】
一部の例では、混合物中において飽和塩溶液の量に対するヒト血清の量は、ほぼ等容量、即ち、約１対約１の比率（即ち、「１：１比」）である。他の例では、混合物中のヒト血清及び飽和塩溶液の容量は異なっていてもよく、例えば、限定されるものではないが、塩の抗カオトロピック強度、抗カオトロピック塩濃度、バッチ処理のサイズ又は規模、及び試料又はバッチの温度の１つ以上によって決まり得る。
【００４３】
一部の例では、抗カオトロピック塩の飽和塩溶液は、これらに限定されないが、水中の硫酸ナトリウム、若しくは水中の硫酸アンモニウム、又は一部の例では、リン酸ナトリウム水溶液中の硫酸ナトリウム、若しくはリン酸ナトリウム水溶液中の硫酸アンモニウムを含み得る。飽和塩溶液の濃度は、ヒト血清溶液からＩＧＦ結合タンパク質を沈殿させるのに十分な濃度である。一部の例では、飽和塩溶液の濃度は、約０．２５グラム／ミリリットル（ｇ／ｍＬ）〜約１．０ｇ／ｍＬ、又は約０．２５ｇ／ｍＬ〜約０．９ｇ／ｍＬ、又は約０．２５ｇ／ｍＬ〜約０．８ｇ／ｍＬの範囲であり得る。一部の例では、飽和塩溶液の濃度は、約０．３ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬ、又は約０．３５ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬ、又は約０．４ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬ、又は約０．４５ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬ、又は約０．５ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬ、又は約０．５５ｇ／ｍＬ〜約１．０ｇ／ｍＬの範囲であり得る。一部の例では、飽和塩溶液の濃度は、約０．３ｇ／ｍＬ〜約０．８ｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【００４４】
リン酸ナトリウム水溶液中の抗カオトロピック塩を含有する飽和塩溶液の例では、抗カオトロピック塩の飽和塩溶液に使用されるリン酸ナトリウム溶液の濃度は、約３０ミリモル（ｍＭ）〜約６０ｍＭ、又は約３５ｍＭ〜約６０ｍＭ、又は約４０ｍＭ〜約６０ｍＭ、又は約４５ｍＭ〜約６０ｍＭ、又は約５０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲内であり得る。一部の例では、飽和塩溶液に使用されるリン酸ナトリウム溶液の濃度は、約３０ｍＭ〜約５８ｍＭの範囲、又は約３０ｍＭ〜約５６ｍＭの範囲、又は約３０ｍＭ〜約５４ｍＭの範囲、又は約３０ｍＭ〜約５２ｍＭの範囲、又は約３０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲、又は約３０ｍＭ〜約４５ｍＭの範囲、又は約４０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲、又は約４５ｍＭ〜約５５ｍＭの範囲内であり得る。
【００４５】
一部の例では、リン酸ナトリウム溶液のｐＨは、約７．０〜約８．４の範囲、又は約７．２〜約８．４の範囲、又は約７．４〜約８．４の範囲、又は約７．６〜約８．４の範囲内であり得る。一部の例では、リン酸ナトリウム溶液のｐＨは、約７．０〜約８．２の範囲、又は約７．０〜約８．０の範囲、又は約７．０〜約７．８の範囲、又は約７．０〜約７．６の範囲内であり得る。一例では、リン酸ナトリウム溶液の濃度は約５０ｍＭであり、そのｐＨは約７．４である。
【００４６】
更に、リン酸ナトリウム溶液中の抗カオトロピック塩の濃度は、溶液の容量に対する塩の重量（即ち、「重量／容量」）で、例えば、約２５％〜約７５％、又は約３０重量／容量％〜約７５重量／容量％、若しくは約３５重量／容量％〜約７５重量／容量％、若しくは約４０重量／容量％〜約７５重量／容量％、若しくは約４５重量／容量％〜約５５重量／容量％の範囲であり得る。一部の例では、リン酸ナトリウム溶液中の抗カオトロピック塩の濃度は、約２５重量／容量％〜約７０重量／容量％、又は約２５重量／容量％〜約６５重量／容量％、又は約２５重量／容量％〜約６０重量／容量％、又は約２５重量／容量％〜約５５重量／容量％、又は約２５重量／容量％〜約５０重量／容量％の範囲であり得る。一例では、飽和塩溶液は、硫酸アンモニウムを、約５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液中に硫酸アンモニウムの容量に対して約５０重量％の濃度で、抗カオトロピック塩として含有する。
【００４７】
図２に更に説明されるように、ＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備すること（１１０）は、沈殿ＩＧＦ結合タンパク質を混合物から単離すること（１１４）を更に含む。沈殿ＩＧＦ結合タンパク質を単離すること（１１４）は、例えば飽和塩溶液中のヒト血清の混合物を遠心分離することと、飽和抗カオトロピック塩溶液を含有する上清を、溶液から分離されたペレットの形態であってもよい沈殿ＩＧＦ結合タンパク質から除去することとを含み得る。これらに限定されないが、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（マサチュセッツ州、ウォルサム）社のＳＯＲＶＡＬＬ（商標）遠心分離機、又はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（インディアナ州、インディアナポリス）社のＡＤＶＡＮＴＩ（商標）遠心分離機を始めとする、様々な遠心分離装置を、混合物からの沈殿ＩＧＦ結合タンパク質の単離（１１４）に使用することができる。
【００４８】
更に、図２に説明されるように、ＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備すること（１１０）は、更に、単離されたＩＧＦ結合タンパク質ペレットを水性緩衝溶液に溶解することによって、該ペレットを再構成すること（１１６）を含む。１１６で再構成されるＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）沈殿物又はペレットは、図１Ａの濃縮物を形成する方法１００において１２０で多孔質マトリックスと接触させる、１１０で準備されたＩＧＦＢＰ溶液である。これらに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液を始めとする様々な緩衝溶液を、単離されたＩＧＦ結合タンパク質ペレット又は沈殿物の再構成（１１６）に使用することができる。一部の例では、水性緩衝溶液は、溶液の容量に対して約０．０５重量％〜約１５重量％（「重量／容量」）の範囲のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、又は重量／容量で約０．０６％〜約１５％の範囲のアジ化ナトリウム、若しくは約０．０８％〜約１５％のアジ化ナトリウム、若しくは約０．１０％〜約１５％のアジ化ナトリウム、若しくは約０．０５％〜約１３％のアジ化ナトリウム、若しくは約０．０５％〜約１２％のアジ化ナトリウム、若しくは約０．０５％〜約１０％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳを含む。一例では、水性緩衝溶液は、ペレットを溶解してＩＧＦ結合タンパク質の水溶液を準備する（１１０）ために使用される約０．０９重量／容量％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳを含有する。
【００４９】
１１０で準備されたヒト血清由来のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）の溶液を含む実施形態では、図２に関して上記したように、接触（１２０）に使用される多孔質マトリックスは、これらに限定されないが、例えば、限外濾過ディスク、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）膜、又はそれらの組合せを始めとする濾過膜である。限外濾過ディスクは、例えば、本明細書に記載のＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社のＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル等の濾過デバイス内のものであってもよい。ＴＦＦ膜は、例えば、単一パス濾過システム又はクロスフロー濾過システムの膜であっても、例えば本明細書に記載のＳｃｉｌｏｇ，Ｉｎｃ．又はＭｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ（オハイオ州、ハミルトン）、又はＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．社のＴＦＦシステムであってもよい。一部の例では、１１０で準備された溶液中の１１６で再構成されるＩＧＦＢＰ沈殿物は、更に、混合（１１２）時に同様に沈殿する他の血清タンパク質を含み得る。接触（１２０）時に、多孔質マトリックスにより、ｎｒ−ＩＧＦＢＰについての多孔質マトリックスのＮＭＷＣ又はＮＭＷＬを超える及び／又はそれ未満の分子量を有する、１１０で準備されたＩＧＦＢＰ溶液中の血清タンパク質が濾別される。更に、多孔質マトリックスから１４０で回収される水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、接触（１２０）時に多孔質マトリックスによって濾過されなかった幾らかの血清タンパク質（例えば、他のＩＧＦ結合タンパク質を含むｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３と実質的に同様の分子量を有するタンパク質）も含み得る。ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３がヒト血清中に見られる最も豊富なＩＧＦ結合タンパク質であるため、本明細書では単に論考を単純化するために、濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液が他のタンパク質も含み得ることを理解した上で、これらの実施形態において１４０で回収されるタンパク質濃縮物を「ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３」と称する。更に、１４０で回収されるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物は、上記のように天然不均質形態を有する。
【００５０】
更に、これらの実施形態では、１１０で準備されたＩＧＦＢＰ溶液と多孔質マトリックスとの接触（１２０）は、ＩＧＦＢＰ溶液を多孔質マトリックスに適用することと、濾過のため、並びにＩＧＦＢＰ溶液を緩衝液交換するため及びＩＧＦＢＰ溶液をｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物へ濃縮するために、多孔質マトリックスを水性緩衝溶液で洗い流すこととを含む。一部の例では、多孔質マトリックスを洗い流し、緩衝液交換を行なうために使用される水性緩衝溶液としては、これらに限定されないが、ＰＢＳ又はアジ化ナトリウムを含むＰＢＳが挙げられる。例えば、１３０で回収されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（例えば、約０．０９重量／容量％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）を用いて、緩衝液交換される。一部の例では、多孔質マトリックスを洗い流し、緩衝液交換を行なうために使用される水性緩衝溶液は、上記のようなＩＧＦ結合タンパク質ペレットの再構成（１１６）に使用される水性緩衝溶液及び濃度範囲と、実質的に同様である。
【００５１】
［ヒト血清の水溶液と多孔質マトリックスとの接触］
図１Ａを再び参照すると、本明細書の原理による他の実施形態では、水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法１００は、ヒト血清の水溶液とセファロース系樹脂からなる多孔質マトリックスとを接触させること（１２０）を含む。図１Ｂに、本明細書に記載の原理に従う一例における、図１Ａの方法においてヒト血清の水溶液と多孔質マトリックスとを接触させるプロセス１２０のフローチャートを示す。これらの実施形態では、ヒト血清を第１の緩衝溶液と混合する。第１の緩衝溶液は、実質的に中性ｐＨの、特に７〜９のｐＨ範囲の、緩衝能を有する上述の任意の緩衝液を含有し得るが、これに限定されない。第１の緩衝溶液中のヒト血清を接触させること（１２０）は、第１の緩衝溶液中のヒト血清を、同様に中性の、特に７〜９のｐＨ範囲の、緩衝能を有する第２の緩衝溶液で平衡化したクロマトグラフィーカラム内のセファロース系多孔質マトリックスに、適用すること（１２２）を含む。
【００５２】
セファロース系樹脂としては、これらに限定されないが、ブチルセファロース、フェニルセファロース若しくはオクチルセファロース等の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂、ＳＰ−セファロース又はＱ−セファロース等のイオン交換樹脂、又はヘパリンセファロース等のアフィニティークロマトグラフィー樹脂を挙げることができる。これらのいずれか１つ、又は２つ以上の組合せ若しくは混合物を、例えば本明細書に記載の原理に従って使用することができる。一部の例では、セファロース系樹脂は、ＨＩＣカラム内のブチルセファロース及びフェニルセファロースからなる群から選択される。セファロース系樹脂を、上述の第２の緩衝溶液を用いてクロマトグラフィーカラムに充填し、平衡化する。
【００５３】
第１の緩衝溶液及び第２の緩衝溶液は、異なる濃度で同じ成分を有していてもよく、又は異なる緩衝溶液であってもよい。一部の例では、第１の緩衝溶液及び第２の緩衝液は、これらに限定されるものではないが、個別に、例えばリン酸塩含有緩衝液、硫酸アンモニウム含有緩衝液、トリス、又はトリスと硫酸アンモニウム及びリン酸アンモニウムのいずれかとの混合物を含む。一部の例では、第１の緩衝溶液及び第２の緩衝溶液は、トリスと例えば硫酸アンモニウム等の抗カオトロピック塩との水溶液である。第１の緩衝溶液及び第２の緩衝溶液は、各々、血清タンパク質を溶液中に、特にＩＧＦ結合タンパク質をヒト血清中に、維持する（即ち、タンパク質を塩析しない）ように構成される濃度を有する。更に、第１の緩衝溶液及び第２の緩衝溶液の濃度は、各々、様々な血清タンパク質の溶解性を、ＩＧＦ結合タンパク質、特にｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３、の溶解性よりも増大させる（例えば、それらを、よりイオン性にする）ように構成される。これは、本実施形態が除去の標的とする主要不純物がｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３由来のヒト血清アルブミン及び多くの他の血清タンパク質であるためである。これにより、分離及び除去の標的となるヒト血清アルブミン及び多くの他の血清タンパク質の大部分がセファロース系カラムを通過し、セファロース樹脂が対象の血清タンパク質、即ちｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３に結合する能力が実質的に可能となる。
【００５４】
緩衝溶液及びその濃度の選択は、これらに限定されないが、例えば、使用するセファロース系樹脂の選択、使用するクロマトグラフィーのタイプ、ヒト血清から分離すべきタンパク質、クロマトグラフィーカラムにおいて溶出するバッチサイズ及び抗カオトロピック塩強度の１つ以上を始めとする要因に左右され得る。一部の例では、ヒト血清溶液は、約１：１容量比のヒト血清と第１の緩衝溶液との混合物である。これらの例では、第１の緩衝溶液の濃度は、セファロース系カラムを平衡化するのに使用される第２の緩衝溶液の濃度の約２倍である。第２の緩衝溶液がより低い抗カオトロピック強度を有するため、１２０で接触させた溶液からの除去の標的となるヒト血清の画分が非結合のままであり（「非結合画分」）、クロマトグラフィーカラムから洗浄され、１２０で接触させた溶液の残りの画分が、その後の除去までセファロース系樹脂に結合する（「結合画分」）。そのため、結合画分は、他の血清タンパク質から分離されたＩＧＦ結合タンパク質のみ、特にｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３、を実質的に含む。
【００５５】
一部の例では、ヒト血清溶液と混合される第１の緩衝溶液は、トリス及び硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）塩の水溶液を含有する。室温における第１の緩衝溶液中のトリス及び硫酸アンモニウムの濃度は、約３０ｍＭ〜約７０ｍＭのトリス及び約０．５Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウムの範囲内であり得る。一部の例では、室温での第１の緩衝溶液中のトリス及び硫酸アンモニウムの濃度は、約３５ｍＭ〜約７０ｍＭのトリス及び約０．６Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約４０ｍＭ〜約７０ｍＭのトリス及び約０．７Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約４５ｍＭ〜約７０ｍＭのトリス及び約０．８Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約５０ｍＭ〜約７０ｍＭのトリス及び約１．０Ｍ〜約２．０Ｍの硫酸アンモニウムの範囲内であり得る。一部の例では、室温での第１の緩衝溶液中のトリス及び硫酸アンモニウムの濃度は、約３０ｍＭ〜約６５ｍＭのトリス及び約０．５Ｍ〜約１．８Ｍの硫酸アンモニウム、又は約３０ｍＭ〜約６０ｍＭのトリス及び約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの硫酸アンモニウム、又は約３０ｍＭ〜約５５ｍＭのトリス及び約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約３０ｍＭ〜約５０ｍＭのトリス及び約０．５Ｍ〜約０．７５Ｍの硫酸アンモニウムの範囲内であり得る。
【００５６】
同様にトリス及び硫酸アンモニウム塩の水溶液を含む第２の緩衝溶液は、室温での第２の緩衝溶液中のそれぞれの濃度が約１８ｍＭ〜約３５ｍＭのトリス及び約０．３Ｍ〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約２０ｍＭ〜約３５ｍＭのトリス及び約０．３５Ｍ〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約２２ｍＭ〜約３５ｍＭのトリス及び約０．４Ｍ〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウム、又は約２５ｍＭ〜約３５ｍＭのトリス及び約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの硫酸アンモニウムの範囲内であり得る。一部の例では、室温での第２の緩衝溶液中のトリス及び硫酸アンモニウムの濃度は、約１５ｍＭ〜約３２ｍＭのトリス及び約０．２５Ｍ〜約０．９Ｍの硫酸アンモニウム、又は約１５ｍＭ〜約３０ｍＭのトリス及び約０．２５Ｍ〜約０．７５Ｍの硫酸アンモニウム、又は約１５ｍＭ〜約２７ｍＭのトリス及び約０．２５Ｍ〜約０．５Ｍの硫酸アンモニウム、又は約１５ｍＭ〜約２５ｍＭのトリス及び約０．２５Ｍ〜約０．３７Ｍの硫酸アンモニウムの範囲内であり得る。
【００５７】
一部の例では、第１の緩衝溶液及び第２の緩衝溶液のｐＨは、約ｐＨ７．０〜約９．０、又は約ｐＨ７．５〜約９．０、又は約７．８〜約９．０、又は約ｐＨ８．０〜約９．０、又は約ｐＨ７．５〜約８．７、又は約ｐＨ７．５〜約８．５、又は約ｐＨ７．５〜約ｐＨ８．３の範囲内である。一例では、使用されるセファロース系樹脂は、タンパク質分離用のＨＩＣカラム内のフェニルセファロースであり、第１の緩衝液及び第２の緩衝液が各々、トリスと硫酸アンモニウムとの混合物を含有する。第１の緩衝溶液は、約５０ｍＭのトリス及び約０．７Ｍの硫酸アンモニウムの濃度を有し、ｐＨが約８．１であり、第２の緩衝溶液は、約２５ｍＭのトリス及び約０．３５Ｍの硫酸アンモニウムの濃度を有し、ｐＨが約８．１である。一部の例では、第１の緩衝溶液の濃度は、第２の緩衝溶液の濃度の２倍である。
【００５８】
クロマトグラフィーカラムは、一部の例では、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて、ヒト血清から（例えば、血清アルブミン等のヒト血清中の他のタンパク質からを含む）、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を分離するように、構成される。そのため、クロマトグラフィーカラムは、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を精製し及び／又はｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を富化するように構成されていてもよい。ＨＩＣ及びセファロース系樹脂多孔質マトリックスの使用に関する更なる情報は、米国特許第７，３０７，１４８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に見られる。
【００５９】
一部の例では、第１の緩衝溶液中のヒト血清をクロマトグラフィーカラムに適用すること（１２２）は、第２の緩衝液により平衡化したセファロース系樹脂多孔質マトリックスに、溶液を約１．０ミリリットル毎分（ｍＬ／分）〜約５．０ｍＬ／分の範囲内の速度で適用することを含む。一部の例では、第１の緩衝液中のヒト血清の溶液は、約１．４ｍＬ／分〜約５．０ｍＬ／分、又は約１．８ｍＬ／分〜約５．０ｍＬ／分、又は約２．０ｍＬ／分〜約５．０ｍＬ／分の範囲内の速度にて１２２で適用することができる。一部の例では、第１の緩衝溶液中のヒト血清を１２２で適用する速度は、約１．０ｍＬ／分〜約４．６ｍＬ／分、又は約１．０ｍＬ／分〜約４．２ｍＬ／分、又は約１．０ｍＬ／分〜約３．８ｍＬ／分、又は約１．０ｍＬ／分〜約３．６ｍＬ／分の範囲内である。一例では、第１の緩衝液中のヒト血清の溶液は、約３．０ｍＬ／分の速度でクロマトグラフィーカラムの多孔質マトリックスに１２２で適用される。ヒト血清溶液を接触させること（１２０）は、１２２で適用されたヒト血清溶液の非結合画分を、第２の緩衝溶液を用いてクロマトグラフィーカラムを通して洗浄し、非結合画分をカラムから除去することを更に含む。
【００６０】
更に、図１Ｂに説明されるように、これらの実施形態では、第１の緩衝液中のヒト血清の溶液と多孔質マトリックスとを接触させること（１２０）は、第１の緩衝溶液中の１２２で適用されたヒト血清の結合画分を第３の緩衝溶液で溶出させること（１２４）を更に含む。上述のように、これらの実施形態では、結合画分はＩＧＦ結合タンパク質のみ、特に第１の緩衝溶液中の１２２で適用されたヒト血清の非結合画分中の他の血清タンパク質を含むヒト血清の残りの部分から分離された、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３のみを実質的に含む。更に、結合画分中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３は、上記のように天然不均質形態を有する。
【００６１】
第３の緩衝溶液は、抗カオトロピック塩を殆ど又は全く含有しない（例えば、実質的に０％の抗カオトロピック塩含有量）という点で、第１の緩衝溶液及び第２の緩衝溶液の一方又は両方と異なる。例えば、第３の緩衝溶液は、これらに限定されないが、上述の緩衝液のいずれか、又は約ｐＨ７〜約ｐＨ９の緩衝能を有する別の緩衝液を始めとする緩衝液を含有し得る。一部の例では、第３の緩衝液は、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の結合画分をセファロース系カラムから１２４で溶出させるために、硫酸アンモニウム塩を含まずトリスを含む。
【００６２】
一部の例では、第３の緩衝溶液は、約１５ｍＭ〜約３５ｍＭ、又は約１５ｍＭ〜約３０ｍＭ、又は約１５ｍＭ〜約２７ｍＭ、又は約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、又は約２０ｍＭ〜約３０ｍＭの範囲内の濃度で、トリスを含む（そして、抗カオトロピック塩を含まない。）。第３の緩衝溶液のｐＨは、例えば、約ｐＨ７．５〜約８．６の範囲内である。一部の例では、第３の緩衝溶液のｐＨは、約ｐＨ７．６〜約８．６、又は約ｐＨ７．７〜約８．６、又は約ｐＨ７．５〜約８．４、又は約ｐＨ７．５〜約８．３、又は約ｐＨ７．５〜約８．２の範囲内である。一例では、第３の緩衝溶液は約２５ｍＭのトリス濃度を有し、ｐＨが約８．１である。一部の例では、第１の緩衝溶液、第２の緩衝溶液及び第３の緩衝溶液の各々のｐＨはｐＨ７．０以上、又はｐＨ７．４以上、又はｐＨ７．６以上、又はｐＨ７．８以上、又はｐＨ８．０以上である。
【００６３】
図１Ｂを再び参照すると、一部の例では、ヒト血清の水溶液と多孔質マトリックスとを接触させること（１２０）は、第３の緩衝溶液中の溶出したｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を濾過システム又はデバイスの多孔質マトリックスに、１２６で適用されるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液の濾過、緩衝液交換及び濃縮のために、緩衝液交換溶液を用いて、適用すること（１２６）を更に含み得る。緩衝液交換溶液としては、これらに限定されないが、例えばＰＢＳ又はアジ化ナトリウムと混合したＰＢＳが挙げられる。緩衝液交換溶液は、上記の緩衝液交換溶液及び濃度範囲と実質的に同様であってもよい。
【００６４】
第３の緩衝溶液中の１２４で溶出させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の適用（１２６）に使用される濾過システムとしては、上記のいずれかの濾過システムが挙げられるが、これに限定されない。一部の例では、ＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル限外濾過システム、ＴＦＦシステム、及び別の精密濾過、限外濾過又はクロスフロー濾過システムの１つ以上を使用することができる。更に、濾過膜は、溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濾過、緩衝液交換及び濃縮のために、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａというＮＭＷＬ又はＮＭＷＣの膜の使用をしてもよい。一部の例では、使用する濾過システムに応じて、水溶液中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮を容易にするために、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液を、一連の工程で又は連続的に、緩衝液交換溶液を用いて濾過膜を通過させることができる。例えば、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液の緩衝液交換及び濃縮のために、ＴＦＦシステムにより溶出ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液を１２６で連続的に適用する。
【００６５】
図１Ａを再び参照すると、上述のように、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法１００は、更に、水溶液中の濃縮されたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を、使用される濾過システムの多孔質マトリックスから、回収すること（１４０）を含む。本明細書に記載の実施形態による濃縮物を形成する方法１００によって作製される濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３水溶液は、１ミリリットルあたり約１６マイクログラム（μｇ／ｍＬ）〜約４０μｇ／ｍＬの濃度範囲を有する。本明細書に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃縮物を形成する方法１００は、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物の大規模バッチ作製を容易にするように構成される。一部の例では、濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液は、上記のヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液と実質的に同様であり得る。そのため、本明細書の濃縮物を形成する方法１００によって作製される濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液は、ヒトＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液についての上述のいずれかの濃度範囲内であり得る。特に、濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３水溶液は、典型的には約３．５μｇ／ｍＬ〜５．５μｇ／ｍＬの範囲であるヒト血清中で見出され又はヒト血清から単離されるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の量よりも顕著に濃縮されている。
【００６６】
本明細書の方法１００によって作製される濃縮ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３溶液の濃度範囲は、ヒト患者試料のＩＧＦＢＰ−３被検体の免疫測定におけるＩＧＦＢＰ−３被検体の推測される濃度範囲に亘るように構成される異なる濃度を有するｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質のセットを作製するのに十分である。一部の例では、セットの各々の較正物質中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度は異なり、較正物質セット中の種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、約０．５μｇ／ｍＬ〜約１６μｇ／ｍＬの範囲内である。一部の例では、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質のセットは、上記の較正標準のセットと実質的に同様である。そのため、種々の較正物質中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度範囲は、較正標準のセットについて上述したいずれかの濃度範囲内であり得る。
【００６７】
一部の例では、セットにおける種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質は、０．５０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、１．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、１．５μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、２．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、２．５μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、３．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、３．５μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、４．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、４．５μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、５．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、５．５μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、６．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、７．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、８．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、９．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、１０．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、１２．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質、１４．５μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質及び１６．０μｇ／ｍＬのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質の１つ以上を含有し得る。較正物質のセットにおけるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度は、ヒト患者試料中のＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの推測される濃度範囲に亘るように構成される。一部の例では、セットにおける種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質は、上記リストアップした濃度値のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の較正物質を含んでいても又は更に含んでいてもよい。更に、一部の例では、様々なより低いｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の較正物質により、較正物質のセットのためのＭＤＰ標準が提供され得る。
【００６８】
ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３三元複合体は、結合したＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２及びＡＬＳ及びグリコシル化単位を含むので、ヒト患者試料の免疫測定においてＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２被検体レベルの測定を容易にするために調製されるべき種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準について本明細書に記載される原理の幾つかの実施形態の更なる範囲内である。一部の例では、ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液から調製されるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質のセットは、上記のように、１ミリリットル当たり約２０ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）〜約３７５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２の範囲であり得る、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２被検体レベルの測定を更に容易にする。例えば、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３と複合体を形成するＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２の量は、実質的に正比例する。そのため、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２較正標準のセットは、本明細書に記載のｎｒ−ＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液を用いて、調製することができる。例えば、患者試料中の約１００ｎｇ／ｍＬ〜約７５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２レベルの推測される範囲に亘る、種々のＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２の濃度を有するＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２較正標準のセットは、約５μｇ／ｍＬ〜４０μｇ／ｍＬの範囲の種々のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を有する対応するｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質のセットを用いて、約１６μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬの濃度範囲のＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液から調製することができる。
【００６９】
更に、上述のように、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正物質をヒト血清で希釈する。一部の例では、較正標準及び対照中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の標的レベルの達成を容易にするために、実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清を希釈剤として有することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、「実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まない」という表現は、ヒト血清中のＩＧＦ結合タンパク質の量が、実質的にＬＯＱ未満であることを意味する。ＬＯＱは、約１００ｎｇ／ｍＬ又は約２００ｎｇ／ｍＬに設定することができる。幾つかの実施形態では、実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清は、本明細書で規定されるように約５（容量）％以下、又は約２％以下、又は約０．２０μｇ／ｍＬ以下、又は約０％のＩＧＦ結合タンパク質を含有する。
【００７０】
［実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清を作製する方法］
本明細書に記載の原理に従う一例における、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清希釈剤を作製する方法２００を図３に示す。実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清希釈剤を作製する方法２００は、ヒト血清を、酢酸若しくはクエン酸等の有機酸、又はアミノ酸（例えば、グリシン）、又は塩酸等の無機酸と、混合すること（２１０）と、得られた混合物を酸で処理して、ｐＨを、例えば約ｐＨ３．５未満であるが、ｐＨ２．０以上となるように調整すること（２２０）とを含む。例えば、混合物を処理（２２０）中に約ｐＨ３．０のｐＨに調整することができる。ｐＨをｐＨ２．０未満まで下げる過剰な酸処理は、例えば、重度のタンパク質凝集を引き起こす可能性がある。
【００７１】
実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清希釈剤を作製する方法２００は、更に、ヒト血清の酸処理混合物を活性炭フィルターに適用すること（２３０）を含む。活性炭フィルターは、例えばＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋（商標）活性炭カートリッジフィルターであってよい。一部の例では、酸処理混合物を約１．５ｍＬ／分、又は約２．０ｍＬ／分、又は約２．５ｍＬ／分、又は約３．０ｍＬ／分の速度で活性炭フィルターにかけることができる。実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清希釈剤を作製する方法２００は、更に、溶出液を活性炭フィルターから回収すること（２４０）を含む。２４０で回収される溶出液は、酸処理した混合物の非結合画分であって、実質的にＩＧＦ結合タンパク質を含まないヒト血清である。
【００７２】
一部の例では、方法２００は、更に、２４０で回収される溶出液のｐＨを、例えば約ｐＨ７．２５〜約ｐＨ７．５０の範囲内となるように、調整することと、２４０で回収されｐＨが調整された溶出液に対する緩衝液交換を行なうこととを含む。一部の例では、緩衝液交換は、上記のように、ＰＢＳ緩衝溶液中、例えばＰＢＳとアジ化ナトリウムとの溶液中、でＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル又はＴＦＦシステム等の多孔質マトリックスを用いて、行なう。緩衝液交換された溶出液により、例えば本明細書に記載のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準の調製に使用するための、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清希釈剤が得られる。
【００７３】
［較正物質を利用することができるアッセイの概要］
以下の論考は例示を目的とするものであって、限定的なものではない。本発明の組成物は、較正物質が用いられるＩＧＦ及びＩＧＦＢＰ−３の決定のための任意のアッセイに用いることができる。アッセイは、アッセイの構成要素又は生成物のいずれかの分離を伴わずに（均質アッセイ）又は分離を伴って（不均質アッセイ）行なうことができる。不均質アッセイは、通常、１つ以上の分離工程を含み、競合的であっても又は非競合的であってもよい。免疫測定は、標識された又は標識されていない試薬を用いてもよい。標識されていない試薬を要する免疫測定は、通常、本明細書に記載の原理に従う免疫原性複合体から調製される１つ以上の抗体を含む比較的大きな複合体の形成を含む。かかるアッセイとしては、例えば抗体複合体の検出のための、免疫沈降法及び凝集法、並びに、例えば比濁分析法及び比濁法等の、対応する光散乱法が挙げられる。標識免疫測定としては、これらに限定されないが、例えば化学発光免疫測定、酵素免疫測定、蛍光偏光免疫測定、放射免疫測定、阻害アッセイ、誘起発光アッセイ及び蛍光酸素チャネリングアッセイが挙げられる。アッセイにおいて、結果を較正物質のセットと比較し、試料中の被検体の濃度の決定を行なう。
【００７４】
試験対象の試料は、これに限定されないが、例えばヒトを含む哺乳動物、鳥類、爬虫類及び他の脊椎動物の身体から得られる、体液及び体組織等の、生体物質を始めとする、ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰ−３の一方又は両方を含有し得る任意の試料である。例えば、体液としては、例えば全血、血漿、血清、リンパ液又は臍帯血が挙げられる。
【００７５】
アッセイは、アッセイ媒体中で試料とアッセイを行なうための試薬とを合わせることによって行なわれる。これらのアッセイ試薬の性質及び量は、行なわれるアッセイの性質によって決まる。例えば、サンドイッチ免疫測定用のアッセイ試薬は、少なくとも１つが標識された少なくとも２つの抗体を含む。競合免疫測定については、アッセイ試薬は、少なくとも１つの抗体と、通常は、標識を含むことにより被検体と異なる被検体類似体とを含む。アッセイ媒体は中程度のｐＨの水性緩衝媒体であり、概して最適なアッセイ感度をもたらすものである。水性媒体は水のみであっても、又は０．１容量パーセント〜約４０容量パーセントの共溶媒、例えば水混和性の有機溶媒、例えばアルコール、エーテル又はアミド、を含んでいてもよい。媒体のｐＨは、通常は、例えば約４〜約１１の範囲内、又は約５〜約１０の範囲内、又は約６．５〜約９．５の範囲内である。
【実施例】
【００７６】
他に指定のない限り、下記の実験における材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ミズーリ州、セントルイス）から購入することができる。本明細書に開示する部及びパーセンテージは、他に指定のない限り容量に対する重量によるものである。
【００７７】
（実施例１：硫酸ナトリウム沈殿によるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３富化）
飽和硫酸ナトリウム溶液を、６０グラム（ｇ）の硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号（ｃａｔ  ｎｏ．）２３８５９７、１４２．０４に等しい分子量（ｍｗ）、１００ｍＬの水に対して１９．５ｇに等しい２０℃での水溶解度）と２００ｍＬの水とを室温で２時間混合することによって調製した。溶解していない硫酸ナトリウム塩を、０．２ミクロン又はマイクロメートル（μｍ）フィルターを用いた濾過によって除去した。Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の高度に正規化されたヒト血清（「ＢＲＴ」又は「ＢＲＴ１」）（２００ｍＬ、ｃａｔ  ｎｏ．Ｈ１０９０、ロット番号１４０７０３３）を、０．２μｍフィルターで濾過し、室温まで温めた。
【００７８】
飽和硫酸ナトリウム溶液（２００ｍＬ）を等容量のＢＲＴ１と、発泡を回避するために低速混合機で、室温で１時間混合した。２５ｍＬアリコートをＦａｌｃｏｎｅチューブに注入し、３０００×ｇ（即ち、ｇ＝９．８メートル毎秒毎秒（ｍ／ｓ２）は、地球の重力による加速度である。）で、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＯＲＶＡＬＬ（商標）遠心分離機（モデルＳＴ４０Ｒ）を用いて、４℃で１時間遠心分離した。次いで、各チューブから上清を陰圧吸引器により慎重に除去し、残りのペレットをＰＢＳ／０．０９％アジ化ナトリウムに溶解した。再溶解又は再構成したペレット（およそ２００ｍＬ）を、３０キロダルトン（ＫＤａ）ＮＭＷＬの限外濾過ディスク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔ  ｎｏ．  ＰＬＴＫ０６２１０）及びＲＣ８００ミニリザーバー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃａｔ  ｎｏ．５１２３）を備える２００ｍＬ容のＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル（モデル８２００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｃａｔ  ｎｏ．６０２８）に入れ、ＰＢＳ／０．０９％アジ化ナトリウムに緩衝液交換した。緩衝液交換は、ペレットを溶解した溶液の５倍の１０００ｍＬ以上のＰＢＳ／０．０９％アジ化ナトリウム溶出廃液が回収された後に完了した。
【００７９】
ＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル内の溶液を、ＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セルを用いて１０ｍＬ〜１５ｍＬまで更に濃縮し、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度を、ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００免疫測定システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＧｍｂＨ）によって数値を割り当てた標準を用いて、ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰプロトタイプＩＧＦＢＰ−３アッセイシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＧｍｂＨ）によって測定した。ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を、ＢＲＴ１と１：１又は異なる割合で混合し、２．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ベースのベースプール（Ｂａｓｅ  Ｐｏｏｌ）中で７つの標準の第１のセット（以下、「ＢＬ５Ｕ」標準と称される）を構成した。
【００８０】
表１に、硫酸ナトリウム沈殿させたＢＬ５Ｕ標準「Ｓ０１〜Ｓ０７」（ここで、Ｓ０１はｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を添加しない「ブランク標準」である）を血清中での各ＢＬ５Ｕ標準の数値割り当て用量値と共に挙げ、各ＢＬ５Ｕ標準について測定された相対発光量（ＲＬＵ）、及び各ＢＬ５Ｕ標準についてのシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）を更に挙げる。ＲＬＵは、７つのＢＬ５Ｕ標準についてプロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）システムによって測定されるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３からの特異的化学発光を指す。ブランク標準Ｓ０１についてのＳ／Ｎを１．０に等しいと指定し、ＢＬ５Ｕ標準Ｓ０２〜Ｓ０７の各々のＳ／Ｎは、それらの測定ＲＬＵをブランク標準ＲＬＵで除算したものに等しい。ＢＬ５Ｕ低用量較正物質「ＢＬ５Ｕ  Ｌｏｗ  Ｃａｌ」及びＢＬ５Ｕ高用量較正物質「ＢＬ５Ｕ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｌ」を使用し、「未知の」患者試料中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の用量値を、２点データフィッティング較正プログラムを用いて、算出した。
【００８１】
表１から、抗カオトロピック剤としての硫酸ナトリウム塩が、実施例２に関して下記表３に示されるように硫酸アンモニウム塩を抗カオトロピック剤として使用した場合よりも低い沈殿収率ではあるが、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３をヒト血清由来の溶液から（他の血清タンパク質と共に）沈殿させることが可能であったことが示される。また、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイ（ＡＤＶＩＡ）により、出発ＢＲＴヒト血清中（即ち、約４．０μｇ／ｍＬ〜４．５μｇ／ｍＬ）よりもはるかに高いｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３用量を有するＢＬ５ＵＳ０６（８．６μｇ／ｍＬ）及びＢＬ５ＵＳ０７（１５．３μｇ/ｍL）を用いて、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を用量依存的に、検出することが可能であったことが表１に示される。従って、硫酸ナトリウム等の抗カオトロピック塩の使用により、（他の血清タンパク質と共に）溶液からの被検体の沈殿、続いて沈殿した被検体の再溶解、その後の限外濾過、又は更にはＴＦＦを用いた濃縮及び緩衝液交換によってヒト血清からｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を濃縮することが可能である。しかしながら、硫酸ナトリウム塩を抗カオトロピック剤として用いて沈殿／再溶解したｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の最終収率は、沈殿反応の規模（バッチサイズ、即ち、ＢＲＴヒト血清＋濃縮抗カオトロピック塩溶液の出発容量）の増大と共に減少した。
【００８２】
【表１】
2019504987.tif 000003
【００８３】
（実施例２：硫酸アンモニウム沈殿によるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３富化）
（実施例２Ａ）
飽和硫酸アンモニウム溶液を、１６０ｇの硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ  ｎｏ．２９３９、１３２．１４に等しいｍｗ、１００ｍＬの水に対して７５．４ｇに等しい２０℃での水溶解度）と２００ｍＬの水とを混合することによって調製し、室温で２時間混合した。硫酸アンモニウム溶液を０．２μｍフィルターで濾過し、２００ｍＬの溶液を、同様に室温まで予め温めた等容量のＢＲＴと混合した。残りの手順は、実施例１に記載したものと同じにした。
【００８４】
（実施例２Ｂ）
４００ｍＬのＢＲＴを等容量の実施例２Ａの飽和硫酸アンモニウム溶液と共に使用し、実施例１に記載したものと同じ手順に従った。富化したｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃縮物を合一し、Ｓ０１〜Ｓ０７と番号付けされる７つの標準の第２のセット（以下、「ＢＬ７」と称される）、並びに同様にＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００  ＩＧＦＢＰ−３アッセイシステムによって数値が割り当てられた低値及び高値較正物質とした。ＢＬ７Ｓ０７に、初めにＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイ（即ち、好適な合法的に市販された（ｐｒｅｄｉｃａｔｅ）デバイス）を用いて、数値を割り当てた。次いで、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含まない緩衝液を用いて、ＢＬ７Ｓ０７を段階希釈した。「ＢＬ７  Ｌｏｗ  Ｃａｌ」及び「ＢＬ７  Ｈｉｇｈ  Ｃａｌ」の値を使用して、「未知の」患者試料に見られるｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３濃度の用量値を、Ｌｏｗ  Ｃａｌ及びＨｉｇｈ  Ｃａｌ  ２点データフィッティング較正プログラムを用いて算出した。
【００８５】
表２に、ＢＬ７標準「Ｓ０１〜Ｓ０７」（ここで、Ｓ０１はｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を添加しない「ブランク標準」である。）を、血清中での各ＢＬ７標準の数値割り当て用量値と共に示し、更に、各ＢＬ７標準について測定されたＲＬＵ及び各ＢＬ７標準についてのＳ／Ｎを示す。また、ＢＬ７  Ｌｏｗ  Ｃａｌ及びＢＬ７  Ｈｉｇｈ  Ｃａｌについての低用量値及び高用量値も挙げる。図４に、本明細書に記載の原理と一致する実施形態による一例における、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰアッセイ対ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）数値割り当て標準による硫酸アンモニウム沈殿させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の用量応答を相対発光量（ＲＬＵ）で表わしたグラフを示す。グラフは、合法的に市販されたＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００システムを用いて数値を割り当てた、硫酸アンモニウム沈殿させたＢＬ７標準のマスター曲線である。
【００８６】
【表２】
2019504987.tif 000004
【００８７】
表２及び図４のデータから、硫酸ナトリウムよりも強い抗カオトロピック剤である硫酸アンモニウム塩が、より大規模の出発ＢＲＴヒト血清で沈殿ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の収率の改善をもたらすことが示される。図４に、プロトタイプＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイを用いて作成した用量曲線に対する表２からのＲＬＵ値を示す。大規模なＢＲＴヒト血清量（１リットル以上）で抗カオトロピック剤として硫酸アンモニウム塩を用いることで、硫酸アンモニウム沈殿及び濾過方法（即ち、限外濾過又はＴＦＦプロセスのいずれか）に先立って、ＢＲＴヒト血清の出発試料中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３（即ち、約４．０μｇ／ｍＬ〜４．５μｇ／ｍＬ）よりもはるかに高濃度のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３（即ち、それぞれ１１．４５μｇ／ｍＬ、１７．７２μｇ／ｍＬ及び１１．０μｇ／ｍＬ）を含む標準及び較正物質（例えば、Ｓ０６、Ｓ０７及び高較正物質ＢＬ７  Ｃａｌ  Ｈ）の調製が可能となる。
【００８８】
本明細書でプロトタイプＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイが、手動希釈なしにＣＥＮＴＡＵＲ（商標）システムで未知濃度のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含有するヒト血清試料の希釈をもたらすことにも留意されたい。そのため、ＢＬ７Ｓ０６及びＢＬ７Ｓ０７等の標準、Ｈｉｇｈ  Ｃａｌ較正物質、並びに更には高ＭＤＰ試料等をこのように生成する能力により、実験室の操作者がｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３標準、較正物質、ＭＤＰ等を、実験室の操作者が未知の患者試料を取り扱うことができる方法と実質的に同じ方法で取り扱い、例えば予備ＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイの全作業範囲を実質的にカバーすることが可能となる。
【００８９】
図５及び図６に、ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）完全曲線法及び２点データフィッティング較正法を、それぞれ、用いた、ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰとＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００との用量値の方法比較データを示す。特に、未知濃度のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を含有する同じヒト血清試料に対して試験した場合の、合法的に市販されたデバイスであるＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００  ＩＧＦＢＰ−３アッセイと比較した、プロトタイプＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイの方法比較データを図５及び図６に示す（ここで、試料サイズはｎ＝３２個のヒト血清試料である）。プロトタイプＡＤＶＩＡ  ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイについては、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の濃度値を、完全曲線計算（図５）を用いて、又は図６については低較正物質（ＢＬ７  Ｃａｌ  Ｌ＝０．４８μｇ/ｍL）及び高較正物質（ＢＬ７  Ｃａｌ  Ｈ＝１１．００μｇ/ｍＬ）を使用する２点較正を用いて算出した。図５及び図６の標準であるＢＬ７Ｓ０１〜ＢＬ７Ｓ０７は、硫酸アンモニウムを抗カオトロピック沈殿剤として使用し、ＢＲＴヒト血清に対する限外濾過又はＴＦＦプロセスを用いて生成した。
【００９０】
（実施例３Ａ及び実施例３Ｂ：リン酸ナトリウム溶液中の硫酸アンモニウムを用いたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３富化のスケールアップ）
飽和硫酸アンモニウム溶液を、沈殿のために等容量のＢＲＴ１血清と混合した。プロセスを、１００ｍＬから１，０００ｍＬのヒト血清にまでスケールアップした。リン酸ナトリウム水溶液（約５０ｍＭ〜５２ｍＭ）を、飽和硫酸アンモニウム溶液に使用した。表３に、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３結合アッセイに基づく収率をまとめる。各１リットルのＢＲＴ１ヒト血清を、実施例３Ａ及び実施例３Ｂについて下述するような異なる装置を用いて処理した。
【００９１】
（実施例３Ａ）
ヒト血清は、上記実施例１に記載の装置を用いて取り扱った。
【００９２】
（実施例３Ｂ）
ヒト血清をリン酸ナトリウム溶液中の５０％飽和硫酸アンモニウムによって沈殿させ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＡＤＶＡＮＴＩ（商標）遠心分離機（モデルＪ−２０ＸＰＩ）を用いて遠心分離し、ＰＢＳ／アジ化ナトリウムへの緩衝液交換を、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニューヨーク州、ポート  ワシントン）社のＴＦＦカセット（ｃａｔ  ｎｏ．ＯＳ０３０Ｔ１２）を備える、Ｓｃｉｌｏｇによるタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）によって行なった。約８００ｍＬから２００ｍＬまでの最終的な減少を、ＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セルで行なった。実施例１、実施例２並びに実施例３Ａ及び実施例３Ｂによる収率の詳細な概要を表３にまとめる。
【００９３】
表３から、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３結合アッセイが、一貫した又は増大するより高いｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３のパーセント収率で、より大規模のバッチサイズの処理を支持するように構成されることが示される（１，０００ｍＬのＢＲＴ容量での実施例３Ａ及び実施例３Ｂ）。更に、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の沈殿に使用される、より強力な抗カオトロピック剤、即ち硫酸アンモニウム、が硫酸ナトリウムよりも高い収率をもたらし、より大規模での処理に適合し、水中で混合するか水中のリン酸ナトリウム溶液中で混合して限外濾過システム又はＴＦＦシステムを用いて濾過／緩衝液交換するかに拘わらず、（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を沈殿させるために）良好に機能したことが表３に示される。ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の収率は、沈殿にリン酸ナトリウム溶液中の硫酸アンモニウムを１リットルのヒト血清と共に（１：１比）を使用し、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の分離、緩衝液交換及び濃縮にＴＦＦシステムを使用した実施例３Ｂで最高であった。
【００９４】
【表３】
2019504987.tif 000005
【００９５】
（実施例４：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の精製及び富化）
実施例４を、フェニルセファロース６ＦＦを用いたＨＩＣクロマトグラフィーカラム内のセファロース系樹脂の多孔質マトリックスを用いて行なった。２０％エタノール中の２５ｍＬのフェニルセファロース６ＦＦ（マサチュセッツ州、マールボロ、ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ  ｎｏ．１７−０９７３−１０）をガラス漏斗内で水に交換し、ＸＫ１６／２０カラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ  ｎｏ．２８−９８８９３７）に充填し、ゲルを１００ｍＬの緩衝液Ａ：０．３５Ｍの硫酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．１）を含む２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）（即ち、上記の「第２の緩衝溶液」）で平衡化した。２５ｍＬの高度に正規化されたヒト血清（ＢＲＴ１、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｃａｔ  ｎｏ．Ｈ１０９０、ｌｏｔ  ｎｏ．１４０７０３３）を０．２ミクロンフィルターで濾過し、２５ｍＬの緩衝液Ｂ：５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）、０．７Ｍの硫酸アンモニウム緩衝液（即ち、上記の「第１の緩衝溶液」）と室温で１０分間混合した。５０ｍＬの血清混合物をカラムに約３ｍＬ／分で適用し、非結合画分を１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、１００ｍＬの緩衝液Ｃ：２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）（即ち、上記の「第３の緩衝溶液」）を適用し、結合ｎｒ−ＩＧＢＢＰ３を溶出させた。
【００９６】
緩衝液Ｃで１００倍希釈した２８０ｍＬ量の投入ＢＲＴ１、並びに緩衝液Ｃ中の非結合画分及び溶出画分の１０倍希釈物を、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計によって測定し、ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の用量（μｇ/ｍL単位）をＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３プロトタイプアッセイによって測定した。溶出画分を、連続フローミニリザーバーを備えるＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セルによってＰＢＳ／０．０９％アジ化ナトリウムに更に緩衝液交換した。最後に、緩衝液交換したｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３の容量を１０ｍＬまで減少させた。
【００９７】
合計１１６．７５μｇの投入ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３のうち合計１０３．６μｇのｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３が、フェニルセファロース６ＦＦから、溶出した。緩衝液交換後のフェニルセファロース６ＦＦを用いたＨＩＣクロマトグラフィーによるパーセント（％）収率は８９％であった。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによるベンダー指示７１−５００２−３９  ＡＣに従い、フェニルセファロースを再生した。
【００９８】
（実施例５：組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３を用いた環境／温度影響）
（組み換えヒトＩＧＦＢＰ−３を較正標準として用いた研究）
免疫測定法は、２４℃±６℃の通常の実験室条件下で信頼性の高い結果をもたらすことが予測される。バイアスは、高用量値と低用量値との差を１８℃、２４℃及び３０℃での用量値で除算することによって算出した。典型的な規格を設定した。例えば、バイアスは個々の試料について１０％、又は幾つかの試料の平均について１５％を超えないものとする。表４、表５及び表６に、それぞれ１８℃、２４℃及び３０℃での保管曲線の完全曲線分析を用いた、本明細書の実施例１に従って調製したｎｒ−ＩＧＦＰＢ−３試料（「ＢＬ５Ｕ」）、ＢＲＴ１（ｃａｔ．ｎｏ．Ｈ１０９０、ｌｏｔ  ｎｏ．１４０７０３３、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社の高度に正規化されたヒト血清）、並びにＲ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス、ｃａｔ．ｎｏ．６７５−Ｂ３−０２５）及びＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（ニュージャージー州ロッキーヒル、ｃａｔ．ｎｏ．１００−０８）社の市販の組み換えＩＧＦＢＰ−３（ｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を用いた試料のＩＧＦＢＰ−３アッセイについてのバイアス表をまとめる。
【００９９】
表５〜表７から、多くの場合、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社のｒ−ＩＧＦＢＰ−３試料が、少なくとも約４μｇ／ｍＬ以上の標的範囲でＢＲＴ１及びＢＬ５Ｕ試料中のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３と比較して過剰回収されることが示される。
【０１００】
【表４】
2019504987.tif 000006
【０１０１】
【表５】
2019504987.tif 000007
【０１０２】
【表６】
2019504987.tif 000008
【０１０３】
（硫酸ナトリウム又は硫酸アンモニウムで沈殿させた較正標準を用いた研究：）
比較として、（実施例１の手順を用いて調製した）ＢＬ５Ｕ標準及びＢＬ６標準（硫酸アンモニウム沈殿させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）の感温性研究、並びにＣＥＮＴＡＵＲ（商標）ＸＰシステムＥＤを用いた１８℃、２４℃及び３０℃での標準を使用する試料回収を、患者試料（「ＧＡＬ０」）及びＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）アッセイ対照試料（「Ｉｍｍ００２８Ｋ」）と共に表８、表９及び表１０にまとめる。
【０１０４】
【表７】
2019504987.tif 000009
【０１０５】
【表８】
2019504987.tif 000010
【０１０６】
【表９】
2019504987.tif 000011
【０１０７】
（実施例６：硫酸アンモニウム沈殿させたｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準を用いたＩＧＦ−１標準の構成）
ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３複合体の分子量（約１５０，０００）は、ＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２と結合したＩＧＦ結合タンパク質３＋酸不安定セグメント（ＡＬＳ）を含む。ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３被検体レベルの測定は、本明細書に記載のＩＧＦ結合タンパク質ストック溶液及びｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３較正標準を用いたＩＧＦ−１被検体レベルの測定に適用可能である。ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００での実施例２からのＢＬ７標準のｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３及びＩＧＦ−１レベルを表１１にまとめる。
【０１０８】
【表１０】
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【０１０９】
（ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まないヒト血清を調製する方法）
（実施例７：酸処理し、活性炭吸着した（ＡＴＣＡ）ヒト血清）
Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の高度に正規化された血清（ＢＲＴ１）（ｃａｔ  ｎｏ．Ｈ１０９０、ｌｏｔ  ｎｏ．１４０７０３３）を０．２μｍフィルターで濾過し、これに０．３７５ｇのグリシン（Ｓｉｇｍａ  Ｇ７４０７、７５．０７に等しい分子量）を添加した。溶液をマグネチックスターラーで混合し、２５ｍＭのグリシンを含有する溶液のｐＨを、５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ３．０±ｐＨ０．１までゆっくりと調整し、低速で混合し、そのｐＨ範囲に室温で２時間維持した。一方、２７０平方センチメートル（ｃｍ２）の表面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋（商標）  Ｐｏｄ活性炭カートリッジ（ｃａｔ  ｎｏ．ＭＣＲ４００２７Ｈ１）を、２リットルの脱イオン水で洗い流した。次いで、カートリッジに閉じ込められた水を濾過室内空気によってブロー乾燥した。
【０１１０】
次いで、酸処理した血清を、活性炭カートリッジに２ｍＬ／分〜３ｍＬ／分の速度で、例えばＣｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ社（イリノイ州）のＭＡＳＴＥＲＦＬＥＸ（商標）  Ｃ／Ｌポンプ（モデル７７１２２−２４）を使用して充填した。溶出液（非結合画分）を画分１として回収した。次いで、２００ｍＬの水を圧送し、画分２として回収し、このプロセスを２００ｍＬの水を圧送することによって繰り返し、溶離液を画分３として回収した。投入ＢＲＴ１、並びに酸処理し活性炭吸着した（ＡＴＣＡ）ＢＲＴ１の画分１、２及び３を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州）のＶａｒｉａｎ  ＣＡＲＹ（商標）  ５０  Ｃｏｎｃ  ＵＶ分光光度計で読み取り、ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰでアッセイした。
【０１１１】
図７及び表１２に、２８０ナノメートル（ｎｍ）での光学密度（「ＯＤ２８０」）及びＡＴＣＡ  ＢＲＴ１の溶出画分からのＩＧＦＢＰ−３の量（μｇ／ｍＬ）を示す。ＯＤ２８０値により、希釈後の非タンパク質構成要素からの干渉を有しない希釈係数が説明された。「Ａ２８０」と表示された行は、溶液中のタンパク質を定量化する方法をもたらす２８０ｎｍでのタンパク質吸収である。画分１及び２を合一し、２００ｍＬまで濃縮した後、ＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）によって、１，０００ｍＬのＰＢＳ／０．９％アジ化ナトリウム緩衝液を用いてＰＢＳ／０．９％アジ化ナトリウムに緩衝液交換した。酸処理し活性炭吸着したヒト血清試料（「ＡＴＣＡ−３」）の画分１と画分２とを合わせて緩衝液交換したものを用いて幾つかのアッセイを行い、アッセイの結果を表１３にまとめる。
【０１１２】
【表１１】
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【０１１３】
【表１２】
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【０１１４】
表１３に、（ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）又はＣＥＮＴＡＵＲ（商標）システムのいずれかでの）Ｓｉｅｍｅｎｓのアッセイを用いる分析によって決定し、処理後に決定したレベルと比較した、処理前のＢＲＴ１中のＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦ−１及びｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）の内因性レベルを提示する。
【０１１５】
（実施例８：酸処理し活性炭吸着した（ＡＴＣＡ）ヒト血清のスケールアップ調製）
４００ｍＬのＢＲＴ１ヒト血清を実施例７に述べたのと同じ方法で処理し、活性炭カートリッジへの非結合画分（約３８０ｍＬ）を回収し、ストリッピングした血清のｐＨを即座に５Ｎ  ＨＣｌでｐＨ７．４±ｐＨ０．０５に調整したが、実施例７とは異なり、水で洗浄した画分は捨てた。次いで、本実施例におけるＡＴＣＡ血清の非結合画分（「ＡＴＣＡ−４」）を、５倍容量の緩衝液を用いるＡＭＩＣＯＮ（商標）攪拌式セル、又は１０ＫＤａ分子量の膜を備えるＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のＭＩＮＩＭＡＴＥ（商標）  ＴＦＦシステムによって、ＰＢＳ／０．９％アジ化ナトリウムに緩衝液交換した。
【０１１６】
（活性炭カートリッジの再生）
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの活性炭カートリッジのキャパシティを試験するために、４００ｍＬのＢＲＴ１ヒト血清を用いて、プロセスをもう一度繰り返してヒト血清のＡＴＣＡ試料（「ＡＴＣＡ−５」）を作製した。その結果、活性炭カートリッジを飽和させることが見出され、ＩＧＦＢＰ−３は、１．４４μｇ／ｍＬであった。調製の軽減を、米国特許出願公開第２００８０２８６１９３号（引用することにより本明細書の一部をなす。）に記載の手順と同様に２０％エタノール中の０．５Ｎ  ＮａＯＨを用いた活性炭カートリッジの再生によって行なった後、水で十分に洗浄した。ＡＴＣＡ−５血清に、２５ｍＭのグリシンを添加し、ｐＨをｐＨ３．０プラスマイナス（±）０．１に調整し、室温で２時間混合した。次いで、酸処理した血清を再生活性炭カートリッジに充填し、非結合画分（約３６０ｍＬ）を回収した（「ＡＴＣＡ−５Ａ」）。ＰＢＳ／０．０９％アジ化ナトリウムへ緩衝液交換した後に、ＡＴＣＡ−５ＡのＩＧＦＢＰ−３用量をプロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）アッセイによって決定した。表１４に、実施例７及び実施例８による３つの調製物並びに試料ＡＴＣＡ−５Ａの結果をまとめる。
【０１１７】
【表１３】
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【０１１８】
（実施例９：ＩＧＦＢＰ−３患者試料希釈物の回収）
ＩＭＭＵＬＩＴＥ（商標）  ２０００で７．７６μｇ／ｍＬのＩＧＦＢＰ−３用量及び７．３９μｇ／ｍＬのＣＥＮＴＡＵＲ（商標）用量を有する小児（１４歳〜１６歳）血清試料であるＰｒｏＭｅｄＤｘ（マサチュセッツ州、ノートン）の試料ＩＤ  １０４７６６２７を、ＡＴＣＡ−５Ａヒト血清での希釈に供し、希釈試料調製について表１５に従ってＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰでのプロトタイプＩＧＦＢＰ−３試験を行なった。測定及び算出した用量も提示する。
【０１１９】
表１５に、ＡＴＣＡ−５Ａを希釈剤として用いた希釈系列及び小児試料を提示する。希釈系列は以下のようにして達成された：Ｐ１（ＡＴＣＡ−５）及びＰ７（非希釈小児試料）についてのＩＧＦＰＢ−３値を、プロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＩＧＦＢＰ−３アッセイにおいて、測定した。試料Ｐ１及びＰ７を等量（１：１）で混合して試料Ｐ４を作製し、試料Ｐ１及びＰ４を１：１で混合して試料Ｐ３を作製し、試料Ｐ１及びＰ３を１：１で混合して試料Ｐ２を作製し、試料Ｐ３及びＰ７を１：１で混合して試料Ｐ５を作製し、試料Ｐ５及びＰ７を１：１で混合して試料Ｐ６を作製した。算出用量は、混合から予測される数学的用量とした（例えば、試料Ｐ４については、算出用量はＰ１＋Ｐ７（即ち、０．１５＋７．３９＝７．５４）を２で除算したもの＝３．７７に等しい）。測定用量は、プロトタイプＩＧＦＢＰ−３  ＣＥＮＴＡＵＲ（商標）アッセイにおいて試験することによって決定したものである。
【０１２０】
図８に、表１５からのプロトタイプＣＥＮＴＡＵＲ（商標）  ＸＰでの測定用量対算出用量の直線性プロットを示す。
【０１２１】
【表１４】
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【０１２２】
上述のごとく、いずれも非組み換えヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質３（ｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３）を含有するヒトインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質ストック溶液及び濃縮ＩＧＦ結合タンパク質溶液を形成する方法並びにヒト患者の免疫測定におけるＩＧＦＢＰ−３被検体の濃度範囲を包含するようにｎｒ−ＩＧＦＢＰ−３を異なる濃度で含有する較正標準のセットを含むキットの実施例及び実施形態を記載した。更に、ＩＧＦ結合タンパク質を実質的に含まない較正標準のセットのためのヒト血清希釈剤を作製する方法の実施例及び実施形態を記載した。上記の実施例及び実施形態が、本明細書に記載の原理を表す多くの具体的な実施形態及び実施例の幾つかの単なる例示に過ぎないことを理解されたい。明らかに、当業者であれば、添付の特許請求の範囲に規定される範囲を逸脱することなく多数の他の構成を容易に考案することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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