(57)【要約】  本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御に関する。本発明は、対象の試料において少なくとも１つのヒストン、特に、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａおよび／またはＨ３のレベルを決定することであって、当該少なくとも１つのヒストンのレベルが、臓器障害を示す、決定することを含む、方法に関する。さらに、本発明は、対象の試料における、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、特に、中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、当該ｐｒｏＡＤＭのレベルが、臓器障害を示す、決定することを含む、方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関する。【選択図】図１Ａ
2019525184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御のための方法であって、
（ｉ）前記対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、前記少なくとも１つのヒストンのレベルが臓器障害を示す、決定すること、および／または、
（ｉｉ）前記対象の試料におけるプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが臓器障害を示す、決定すること、を含む、方法。
【請求項２】
（ｉ１）少なくとも１つのヒストンの前記レベルが、前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較される、および／または、
（ｉｉ１）ｐｒｏＡＤＭの前記レベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較される、および、
（ｉｉｉ）前記対象における臓器障害が、それぞれ、ステップ（ｉ１）および／または（ｉｉ１）における前記比較に基づき同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して、前記少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、前記対象における臓器障害を示す、および／または
（ｉｉ）前記ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して、前記ｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、前記対象における臓器障害を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して、前記少なくとも１つのレベルの増加が、前記対象における少なくとも４つの臓器障害を示す、または
（ｉｉ）前記ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して、前記対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの前記増加が、少なくとも１つの臓器障害を示す、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの参照対象由来である場合もあるため、前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルおよび／または前記ｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり、前記少なくとも１つの参照対象のそれぞれが健常であるか、または前記参照対象が臓器障害もしくは臓器不全を有しない、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐｒｏＡＤＭが、中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）である、および／または前記少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ４、ヒストンＨ２Ａおよび／またはヒストンＨ３である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルが、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌである、および／または前記ｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、約６ｎｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、アルドラーゼＢのレベル、コペプチンのレベル、乳酸のレベル、プロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）のレベル、および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｓＦｌｔ−１）のレベルからなる群から選択される前記試料における少なくとも１つのマーカーを決定すること、および／または急性生理学及び慢性健康評価ＩＩ（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ：ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）スコア、連続臓器不全評価スコア（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＳＯＦＡスコア）、および簡易急性生理学スコア（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ：ＳＡＰＳ  ＩＩ）からなる群から選択される前記対象の少なくとも１つのパラメーターを決定すること、をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記臓器障害が、循環性ショック、血液不全、肝不全、神経不全、腎不全、呼吸不全および代謝性アシドーシスからなる群から選択される少なくとも１つの臓器障害である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記臓器障害が、臓器不全または少なくとも１つの臓器不全である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が、疾患または医学的状態を患っており、前記疾患または医学的状態が、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、呼吸器疾患、肝疾患、腎疾患免疫抑制、感染性および非感染性の病因に関連する炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、ならびに敗血性ショックからなる群から選択され、および／または前記対象が、重症患者であり、好ましくは、前記対象が、集中治療室に入院している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、体液、血液、血液血漿、血液血清、または尿である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルが、質量分析（ＭＳ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアレイ、磁気ビーズベースのアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマット、ならびに稀少クリプテートアッセイからなる群から選択される方法を使用して決定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂであり、少なくとも、配列番号４に示されるヒストンＨ２Ｂのアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列のペプチドが決定される、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、少なくとも、配列番号１に示されるヒストンＨ４のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列のペプチドが決定される、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ３であり、少なくとも、配列番号３に示されるヒストンＨ３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列のペプチドが決定される、および／または、
（ｉｖ）前記少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号２に示されるヒストンＨ２Ａのアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列のペプチドが決定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記キットが、
（ｉ）前記試料における前記少なくとも１つのヒストンのレベル、および、
前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルを含む参照データ、を決定するための検出試薬であって、
前記少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して、前記試料における前記少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、前記対象における臓器障害を示す、検出試薬、および／または、
（ｉｉ）前記試料における前記ｐｒｏＡＤＭのレベル、および
前記ｐｒｏＡＤＭの参照レベルを含む参照データ、を決定するための検出試薬であって、
前記ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して、前記試料における前記ｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、前記対象における臓器障害を示す、検出試薬、を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット、または請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法における前記キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御に関する。本発明は、当該対象の試料において、少なくとも１つのヒストン、特に、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａおよび／もしくはＨ３のレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、当該臓器障害を示す、決定すること、ならびに／または当該対象の試料における、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、特に、中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、当該臓器障害を示す、決定すること、を含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
臓器障害および／または臓器不全（ＯＦ）のいくつかの徴候を有する重症患者は、一般に、集中治療室（ＩＣＵ）に入院する。これらの患者を迅速かつ有効に層別化し、処置するために、臨床医は、出来るだけ正確に患者の病気の全体状態および重症度を評価することが必要である。多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）は、ＩＣＵでの死亡の主な原因であるので、この評価およびそのもたらされた結果は、非常に重要なものである（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ２００６；Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｓａｋｒ  ２０１１）。ＩＣＵにおいて単一のＯＦに起因して死亡するのは、ほんのわずかである（Ｍａｙｒ，Ｄｕｎｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。様々な臨床研究が、これらの知見を支持し、かかる対象の臓器障害または臓器不全の罹患率と死亡率の間の強い相関を裏付ける（Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｓａｋｒ  ２０１１、Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８、Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【０００３】
１９８０年代および１９９０年代において、現在のゴールドスタンダードＩＣＵスコアリングシステムの多くが開発された。中でも、これらは、患者の生理学的評価および診断基準に基づく、急性生理学及び慢性健康評価ＩＩ（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ＩＩ：ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）、および簡易急性生理学スコア（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ：ＳＡＰＳ  ＩＩ）のような、結果予測スコアである。さらなるスコアは、臓器特異的パラメーターに基づく、ＳＯＦＡスコアのような、罹患率診断スコアである（Ｂｏｕｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ２００８）。全３つのスコアは、少なくとも６つのパラメーターに基づき、ＩＣＵ入院後最初の２４時間以内に決定される。ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩは、１４の変数（１２の生理学パラメーター、年齢および慢性的な健康状態）からなり、それぞれが、パラメーターの異常性が増すにつれ、０から４に重み付けされる（Ｋｎａｕｓ，Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）。ＳＡＰＳ  ＩＩは、１２の生理学パラメーター、患者の年齢、入院のタイプおよび３つの背景にある疾患変数を含む、１７の変数からなる（Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。ＳＯＦＡスコアに関して、６つの臓器が評価され、これらの障害の程度に従い重み付けされ、それぞれが０〜４に重み付けされる（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。
【０００４】
ＳＯＦＡスコアは、結果を予測するようデザインされていないが、むしろＩＣＵ患者の結果として起こる合併症を提示するようデザインされてはいるが、患者における累積臓器不全に起因する死亡率と明確に相関する（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ２００６）。特に、４つ以上のＯＦを有する患者のような、高い臓器不全の群の場合において、死亡率は、臓器不全を有しない患者についての６％または２２％と比較して、２つのＩＣＵに焦点を当てた臨床研究において６５％または８３％であった（Ｖｉｎｃｅｎｔ，ｄｅ  Ｍｅｎｄｏｎｃａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｓａｋｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。臓器障害または臓器不全に罹患しており、故に、高い死亡率を有する対象を同定する能力は、以下に記載される通り依然として課題であり、時間がかかるが、非常に重要なものである。
【０００５】
ある特定の可能性を有する重症患者を予後診断するか、または診断するこれらの能力とは別に、先行技術に開示されるＩＣＵスコアは、無作為ではなく選択されたＩＣＵの１０〜１５％のみにおいて使用され（しばしば、病院は臨床研究および／または厳密な品質規制に焦点を当てる）、いくつかの欠点を有する（Ｂｒｅｓｌｏｗ  ａｎｄ  Ｂａｄａｗｉ  ２０１２）。例えば、１つの短所は、スコアが、評価を行う臨床医毎の主観性に対して弱いことである。専門のスコアリングのエキスパート、またはスコアの異なる変数の評価についての厳密かつ類似のガイドラインに従い全てのパラメーターの信頼できる評価に焦点を当てて、少なくとも定期的にトレーニングされた医療スタッフのいずれかを有する病院はほとんどない（Ｐｏｌｄｅｒｍａｎ，Ｇｉｒｂｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。加えて、評価するためのパラメーターの数、および結果として生じる結論までの時間（少なくとも入院後１日）は、要求される処置に迅速に取り組むために多くの患者において重要である。さらに、繰り返された（可能性としては、毎日）スコア評価は、時間がかかる（Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。さらに、先行技術スコアは、患者の状態のいくつかのパラメーターについて集められた結果を含む累積データに基づき決定される。それ故、同じ合計スコアを有する患者が、非常に明確かつ異なる結果を有し得るので、かかるスコアは、間違って解釈され、医師の判断を誤らせ得る（Ｖｉｎｃｅｎｔ，ｄｅ  Ｍｅｎｄｏｎｃａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。さらなる好ましくない作用は、主要なタイムバイアスであり、これは、特に、合計スコア数を計算するため多くの変数パラメーターを分析するとき、生理学的データの自発的変動性またはスコア評価前の処置の効果を反映し、結果予測または診断の不正確または偏ったスコアにつながり得る（Ｂｏｕｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ２００８）。
【０００６】
したがって、対象、特に、重病の対象において、臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御の単純、迅速かつ客観的な基準が必要である。
【０００７】
それ故、本発明の背景にある技術的な課題は、対象において臓器障害を予測する迅速かつ信頼できる方法をもたらすための手段および方法の提供である。
【０００８】
技術的な課題は、本明細書において以下で提供され、添付の請求の範囲において特徴付けられる実施形態の提供により解決される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御方法であって、当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンまたはそのフラグメントのレベルを決定することを含み、少なくとも１つのヒストンまたはその当該フラグメントの当該レベルが、当該臓器障害を示す、方法に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御方法であって、当該対象の試料における、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）またはそのフラグメント、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することを含み、ｐｒｏＡＤＭまたはその当該フラグメントの当該レベルが、当該臓器障害を示す、方法に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御方法であって、当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベル、ならびにｐｒｏＡＤＭおよび／またはそのフラグメントのレベルを決定することを含み、少なくとも１つのヒストンの当該レベル、ならびにｐｒｏＡＤＭおよび／またはその当該フラグメントの当該レベルが、当該臓器障害を示す、方法に関する。
【００１２】
本発明は、上で同定された技術的な課題を解決する。本明細書において以下で、および付記された実施例において記録される通り、臨床研究において、少なくとも１つのヒストン、特に、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベル、ならびに／またはｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象における臓器障害と強い統計的関連を示すことが予想外に見出された；実例となる実施例１を参照。したがって、当該少なくとも１つのヒストンタンパク質および／または当該ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが、臓器障害、特に、臓器不全の代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）として使用することができることが、本明細書において記録される。
【００１３】
付記された実施例において、驚くべきことに、対象の試料における、少なくとも１つのヒストン、特に、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベルの増加が、臓器障害を示すことも示されている；例えば、図１Ａ〜１Ｄを参照。加えて、驚くべきことに、対象の試料における、ｐｒｏＡＤＭ、特に、フラグメントＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、臓器障害を示すことが示されている；例えば、図１Ｅを参照。
【００１４】
さらに、マーカーのレベルの増加が、臓器障害の数に伴い増加することが、付記された実施例において記録されている；例えば、実施例１を参照。予想外にも、例えば、ヒストン、特に、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベルが、１〜３つの臓器障害に罹患している対象のレベルと比較して、４つ以上の臓器障害が対象において生じる場合においてさらに増加することが、本明細書において以下で示される。したがって、少なくとも１つのヒストンタンパク質のレベルは、特に、４つ以上の臓器障害を示す。それ故、ヒストンのレベルはまた、特に、対象が、３つの臓器障害または４つの臓器障害に罹患しているかどうかを決定することを示す；表１を参照。
【００１５】
加えて、付記された実施例は、予想外にも、ｐｒｏＡＤＭ、特に、フラグメントＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、１つの臓器障害、２つの臓器障害、３つの臓器障害から４つの臓器障害に段階的に増加することを示す；例えば、図１Ｅ、および表１を参照。したがって、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルは、特に、１つの臓器障害、２つの臓器障害、３つの臓器障害または４つの臓器障害を示す。したがって、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、対象が、１つの臓器障害、２つの臓器障害、３つの臓器障害または４つの臓器障害に罹患しているかどうかを決定することを示す。
【００１６】
さらに、付記された実施例は、少なくとも１つのヒストンのレベル、特に、ヒストンＨ２Ｂのレベルが、対象が、１つの臓器障害、２つの臓器障害から３つの臓器障害に罹患しているどうか、または対象が、４つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示すことを示す；例えば、図１および表２Ａを参照。加えて、本明細書において以下で、ｐｒｏＡＤＭのレベル、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象が、１つの臓器障害、２つの臓器障害、３つの臓器障害、または４つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示すことが示される；例えば、図１、表１および表２Ａを参照。
【００１７】
加えて、付記された実施例において、少なくとも１つのヒストンまたはｐｒｏＡＤＭのレベルに加えて、さらなるマーカーまたはパラメーターのレベルの決定が、臓器障害の予測をさらに改善することが記録される；例えば、表２Ｂを参照。例えば、ＳＡＰＳ  ＩＩまたはＳＯＦＡスコアのような、臨床スコアは、診断をさらに改善する。加えて、マーカーの組み合わせが、臓器障害の診断をさらに改善することが、本明細書において例示される。例えば、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベル、および少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することは、１つのみのマーカーの決定と比較して、対象における臓器障害の予測を改善する；説明となる表２Ｂを参照。アルドラーゼＢ、プロカルシトニン、または乳酸のような、さらなるマーカーが、対象における臓器障害の予測を改善することがさらに示される。例えば、ｐｒｏＡＤＭに加えてアルドラーゼＢまたは乳酸のレベルを決定することは、対象における臓器障害の現象との統計的関連を増加する。したがって、本発明はまた、さらなるマーカーおよび／またはパラメーターのレベルを決定すること、すなわち、マーカーパネルの使用を含む方法に関する。
【００１８】
本発明は、とりわけ、従来の方法より以下の利点を有する：臓器障害の予測のための、本発明の方法およびキットは、迅速であり、客観的であり、使用し易く、正確である。ヒストンおよびｐｒｏＡＤＭのレベルは、日常的に得られる血液試料または対象から得られるさらなる生体体液において決定することができるので、本発明の方法およびキットは、病院において日常的に容易に測定可能であるマーカーに関する。加えて、ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭのレベルの決定は、非常に迅速である。それ故、本発明の方法およびキットは、臓器障害の迅速評価、ならびに診断および予後に適している。したがって、迅速決定はまた、迅速な処置決定に適している。さらに、１つの特定の値としてのバイオマーカー測定の単純な結果に起因し、本発明のこの方法またはキットを使用するとき、医療スタッフの主観的な偏りは存在しない。したがって、再現性は、例えば、ＳＯＦＡスコアにおいて利用される、生理学的パラメーターについての主観的なスコアリングと比較して高い。ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、予測をさらに改善し、重症患者の全体状態を評価するため分析を特定の感度および特異性に合わせるために、既存の評価またはスコアに追加されるさらなるマーカーおよび／またはパラメーターと組み合わせることができる。多臓器不全を有する患者を調べるとき、バイオマーカーが、彼らの不全となった臓器の数に従い患者を層別化するのを助け、ＩＣＵケアのこの重要な分野において診断および処置決定をサポートし得る。
【００１９】
本明細書において上でおよび付記された実施例において記録される通り、ヒストンのレベルおよびｐｒｏＡＤＭのレベルは、驚くべきことに、対象における臓器障害と相関することが見出された。したがって、本発明は、対象の試料におけるｐｒｏＡＤＭおよび／またはヒストンのレベルを決定することにより、対象における臓器障害を決定する方法およびキットに関する。さらに、本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、および／またはモニタリングの方法ならびにキットに関する。さらに、本発明は、臓器障害に罹患している対象の治療指針および／または治療制御の方法ならびにキットに関する。
【００２０】
したがって、本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御の方法であって、
（ｉ）当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、当該臓器障害を示す、決定すること；および／または
（ｉｉ）当該対象の試料におけるプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、当該臓器障害を示す、決定すること、
を含む方法に関する。
【００２１】
本明細書において使用される、用語「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」などは、対象の試料におけるヒストンもしくはそのフラグメントのレベルを決定すること、または対象の試料における１つより多くのヒストンもしくはそのフラグメントのレベルを決定することを指す。特に、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料におけるヒストンのレベルを決定することを指してもよく、好ましくは、ヒストンは、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３からなる群から選択される。特に、ヒストンＨ２Ｂのレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料におけるヒストンのレベルを決定することを指してもよく、特に、ヒストンＨ４のレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料における２つのヒストンのレベルを決定することを指してもよく、好ましくは、ヒストンＨ２ＢおよびＨ４のレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料における３つのヒストンのレベルを決定することを指してもよく、好ましくは、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、およびＨ２Ａのレベルが決定される。さらに、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」は、対象の試料における４つのヒストンのレベルを決定することを指してもよく、好ましくは、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベルが決定される。
【００２２】
したがって、本発明との関係において、「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」などは、ヒストンＨ２Ｂのレベル、ヒストンＨ４のレベル、ヒストンＨ２Ａのレベルおよび／またはヒストンＨ３のレベルを決定することを指してもよい。
【００２３】
特に、用語「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」などは、対象の試料におけるヒストンのレベルを決定することを指してもよい。したがって、本発明はまた、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御方法であって、当該対象の試料におけるヒストンまたはそのフラグメントのレベルを決定することを含み、ヒストンまたはその当該フラグメントのレベルが、当該臓器障害を示す、方法に関する。
【００２４】
本明細書において使用される、「ヒストン」もしくは「ヒストンタンパク質」、または「複数のヒストン」もしくは「複数のヒストンタンパク質」は、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４のような、カノニカルヒストン、ならびにＨ３．３、Ｈ２Ａ．Ｚなどのような、ヒストンバリアント、またはそのフラグメントを指す。ヒストンは８量体を形成し、その周囲に、ＤＮＡが、クロマチン構造を構築するよう巻き付く（Ｌｕｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．１９９７  Ｓｅｐ  １８；３８９（６６４８）：２５１−６０）。例えば、ヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４（それぞれのうち２つ）が８量体を形成し、そしてそれに、１６５塩基対のＤＮＡが巻き付いて、クロマチンの基本サブユニットであるヌクレオソームを形成する。ヒストンはまた、複数の病態生理学的プロセスにおいて核の外側でも検出される（国際公開第２００９／０６１９１８号）。炎症プロセスに関与する異なる病因に罹患している患者の血液における、細胞外ヒストンの存在が、記載されている。活性化された免疫細胞からのヒストン放出は、細胞外トラップにより仲介され得る。感染症を制御し、除去する最終的な機序としての、活性化された好中球は、細胞外線維、いわゆる好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を放出し得る（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；３０３（５６６３）：ｐ．１５３２−５）。ヒストンが患者の血流に放出され得る他の機序は、細胞のアポトーシス、壊死、ピロトーシスまたはネクロトーシスを含む。
【００２５】
特に、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３からなる群から選択される。したがって、本発明の方法およびキットにおいて決定されるべきヒストンのレベルは、特に、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａおよび／またはＨ３のレベルである。ヒストンの配列は、当業者に公知である。ヒストンの典型的な配列は、配列番号１〜４において与えられる。ヒストンＨ４の典型的なアミノ酸配列は、配列番号１において与えられる。ヒストンＨ２Ａの典型的なアミノ酸配列は、配列番号２において与えられる。ヒストンＨ３の典型的なアミノ酸配列は、配列番号３において与えられる。ヒストンＨ２Ｂの典型的なアミノ酸配列は、配列番号４において与えられる。特に、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３からなる群から選択される。さらに特に、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２Ｂ、Ｈ４およびＨ２Ａからなる群から選択される。より具体的には、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２ＢおよびＨ４である。より具体的には、少なくとも１つのヒストンは、Ｈ２ＢまたはＨ４である。
【００２６】
「少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること」などが、試料における少なくとも１つのヒストンまたは少なくとも１つのヒストンのフラグメントのレベルを決定することを指すことが理解される。特に、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ２Ａ、および／またはＨ４のレベルが、試料において決定される。したがって、試料において決定された少なくとも１つのヒストンは、遊離ヒストンであり得るか、または試料において決定された少なくとも１つのヒストンは、高分子複合体において、例えば、８量体、ヌクレオソームおよび／またはＮＥＴにおいて生じ、構築され得る。それ故、試料における少なくとも１つのヒストンのレベルは、遊離ヒストンタンパク質および／または高分子複合体において構築されたヒストンタンパク質のレベルを含み得る。
【００２７】
本発明の特定の態様において、ヌクレオソーム、８量体または好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）のような、高分子複合体において構築されない、ヒストンまたはそのフラグメントのレベルが、試料において決定され得る。かかるヒストンは、本明細書において、「遊離ヒストン」として言及される。したがって、少なくとも１つのヒストンのレベルは、特に、少なくとも１つの遊離ヒストンのレベルであってもよい。
【００２８】
かかる遊離ヒストンのレベルは、モノ−ヌクレオソームまたは８量体のような、構築された化学量論的高分子複合体においてアクセス可能でないヒストンのアミノ酸配列または構造エピトープの検出により決定することができる。かかる構造において、ヒストンの特定の領域は覆われており、これにより、好中球細胞外トラップ（「ＮＥＴ」）について示される通り、立体的に隔絶されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３（５６６３）：ｐ．１５３２−５，２００４）。加えて、８量体またはヌクレオソームにおいて、ヒストンの領域はまた、個々のヒストン間のような、分子内相互作用に関与する。したがって、本発明との関係において決定されるヒストンの領域／ペプチド／エピトープは、ヒストンが、遊離ヒストン、または高分子複合体において構築されるヒストンであるかどうかを決定してもよい。例えば、イムノアッセイベースの方法において、利用される抗体は、ヒストン、例えば、Ｈ４を、エピトープが構造上隔絶されているので、ヌクレオソームの８量体の中心の一部であるとき、検出し得ない。本明細書において以下で、遊離ヒストンを決定するために利用され得る、ヒストンの領域／ペプチド／エピトープが例示される。例えば、高分子複合体において構築されるか、または本発明による遊離ヒストンであるかどうかに依存せず、ヒストンのＮ末端またはＣ末端の領域／ペプチド／エピトープを利用して、ヒストンを決定することができる。
【００２９】
ヒストンの決定が、翻訳後修飾されたヒストンタンパク質を含んでもよいことが、理解される。したがって、翻訳後修飾は、アミノ酸の脱アセチル化またはアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化およびシトルリン化を含み得る。
【００３０】
この関連において「化学量論的」は、インタクトな複合体、例えば、モノヌクレオソームまたは８量体に関する。「遊離ヒストンタンパク質」はまた、非クロマチン結合ヒストンを含み得る。例えば、「遊離ヒストンタンパク質」はまた、個々のヒストンタンパク質または非８量体ヒストン複合体を含んでもよい。遊離ヒストンは、個々のヒストンに（例えば、一過性に）結合してもよく、例えば、ヒストンは、ホモ−またはヘテロ−２量体を形成してもよい。遊離ヒストンはまた、ホモ−またはヘテロ−４量体を形成してもよい。ホモまたはヘテロ４量体は、ヒストンの４つの分子、例えば、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４からなってもよい。典型的なヘテロ４量体は、２つのヘテロ２量体により形成され、それぞれのヘテロ２量体は、Ｈ３およびＨ４からなる。ヘテロ４量体が、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂにより形成されてもよいことも、本明細書において理解される。ヘテロ４量体が、Ｈ３およびＨ４からなる１つのヘテロ２量体、ならびにＨ２ＡおよびＨ２Ｂからなる１つのヘテロ２量体により形成されてもよいことも、本明細書において予想される。したがって、遊離ヒストンは、１量体、ヘテロ２量体または４量体ヒストンタンパク質として本明細書において言及され、１量体、ヘテロ２量体または４量体ヒストンタンパク質であり得、核酸、例えば、ヌクレオソームに結合したヒストン８量体からなる（「化学量論的」）高分子複合体において構築されない。加えて、遊離ヒストンはまた、核酸に結合してもよく、当該遊離ヒストンは、（「化学量論的」）高分子複合体、例えば、インタクトなヌクレオソームにおいて構築されない。好ましくは、遊離ヒストンは、本質的に核酸を含まない。
【００３１】
少なくとも１つのヒストンのフラグメントは、フラグメントが、特定のヒストンのレベルの明白な決定を可能にする限り、任意の長さ、例えば、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸を有することができる。少なくとも１つのヒストンのフラグメントは、ヒストン、例えば、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３の独立したフラグメントを指す。対象の試料におけるヒストンのレベルを決定するのに適当である、ヒストンの様々な典型的なフラグメントが、本明細書において以下で開示される。本明細書において、ヒストンのレベルが、ヒストンのＮ末端またはＣ末端に及ぶフラグメントを決定することにより、決定することができることも、理解される。加えて、本発明との関係において決定されるべきヒストンまたはそのフラグメントはまた、例えば、翻訳後修飾により修飾されてもよい。典型的な翻訳後修飾は、アセチル化、シトルリン化、脱アセチル化、メチル化、脱メチル化、脱イミノ化、異性体化、リン酸化およびユビキチン化であり得る。
【００３２】
本明細書において使用される、用語「プロアドレノメデュリン」または「ｐｒｏＡＤＭ」は、プロアドレノメデュリンまたはそのフラグメント、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを指す。「ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定すること」などが、試料におけるｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントのレベルを決定することを指すことは、理解される。フラグメントが、ｐｒｏＡＤＭのレベルの明白な決定を可能にする限り、フラグメントは、任意の長さ、例えば、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０または１００個のアミノ酸を有することができる。本発明の特に好ましい態様において、「ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定すること」は、中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することを指す。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭは、ｐｒｏＡＤＭのフラグメントである。ペプチドアドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、５２個のアミノ酸を含む降圧性ペプチドとして発見され、ヒト褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍｅｂｙ）から単離された（Ｋｉｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。アドレノメデュリン（ＡＤＭ）は、１８５個のアミノ酸を含む前駆体ペプチド（「プレプロアドレノメデュリン」または「ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭ」）としてコードされる。ＡＤＭの典型的なアミノ酸配列は、配列番号５において与えられる。ＡＤＭは、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭアミノ酸配列の位置９５〜１４６を含み、そのスプライス産物である。「プロアドレノメデュリン」（「ｐｒｏＡＤＭ」）は、シグナル配列（アミノ酸１〜２１）を含まないｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭ、すなわち、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭのアミノ酸残基２２〜２８５を指す。「中間領域プロアドレノメデュリン」（「ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ」）は、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭのアミノ酸４２〜９５を指す。ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの典型的なアミノ酸配列は、配列番号６において与えられる。本明細書において、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭまたはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのペプチドおよびそのフラグメントが、本明細書に記載される方法のため使用され得ることも、予想される。例えば、ペプチドまたはそのフラグメントは、ｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭのアミノ酸２２〜４１（ＰＡＭＰペプチド）またはｐｒｅ−ｐｒｏＡＤＭのアミノ酸９５〜１４６（成熟アドレノメデュリン）を含み得る。ｐｒｏＡＤＭのＣ末端フラグメント（ｐｒｅｐｒｏＡＤＭのアミノ酸１５３〜１８５）は、アドレノテンシンと呼ばれる。ｐｒｏＡＤＭペプチドのフラグメントまたはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのフラグメントは、例えば、少なくとも約５、１０、２０、３０個以上のアミノ酸を含み得る。したがって、ｐｒｏＡＤＭのフラグメントは、例えば、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、ＰＡＭＰ、アドレノテンシンおよび成熟アドレノメデュリンからなる群から選択されてもよく、好ましくは、本明細書において、フラグメントは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭである。
【００３３】
本明細書において、ポリペプチドを決定することができ、ｐｒｏＡＤＭまたは少なくとも１つのヒストンに対する配列同一性を有することも、予想される。例えば、配列番号５もしくは６に対して、またはそれぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、もしくは配列番号４に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ポリペプチドが、本発明の方法およびキットにおいて決定することができ、より高い値の配列同一性が好ましい。本発明に従い、２つ以上のアミノ酸配列との関係における、用語「配列同一性」、「相同性」または「パーセント相同性」または「同一の」または「パーセント同一性」または「パーセンテージ同一性」は、同じであるか、または比較ウィンドウに渡り（好ましくは、全長に渡り）、または当該技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用して、もしくは手動アライメントおよび目視検査により、測定された指定領域に渡り、最大一致について比較され、整列されたとき、同じである特定のパーセンテージのアミノ酸を有する、２つ以上の配列あるいはサブ配列を指す。例えば、７０％〜９０％以上（好ましくは、９５％以上）の配列同一性を有する配列は、実質的に同一であるとみなされてもよい。かかる定義はまた、試験配列の補足に適用する。好ましくは、記載される同一性は、少なくとも約１０〜約１５アミノ酸長である領域に渡り、より好ましくは、少なくとも約２０〜約３５アミノ酸長である領域に渡り、最も好ましくは、全長に渡り存在する。当業者は、例えば、当該技術分野において公知の、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２（１９９４），４６７３−４６８０）またはＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ  Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６（１９９０），２３７−２４５）に基づくもののようなアルゴリズムを使用して、配列の間／中のパーセント同一性を決定する方法を理解する。
【００３４】
本明細書において使用される、マーカーの「レベル」は、試料におけるマーカーの分子実体の量を指す。言い換えると、マーカーの濃度が、試料において決定される。例えば、ｐｒｏＡＤＭもしくはそのフラグメント、好ましくは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの濃度、ならびに／またはヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ３および／もしくはＨ２Ａまたはそのフラグメントの濃度が、対象の試料において決定される。
【００３５】
本明細書において使用される、用語「少なくとも１つのヒストンのレベル」は、対象から得られる試料における、少なくともヒストンの分子実体の量、例えば、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａおよび／もしくはＨ３、またはそのフラグメントの量を指す。言い換えると、少なくとも１つのヒストンタンパク質またはそのフラグメントの濃度が、試料において決定される。
【００３６】
本明細書において使用される、用語「マーカープロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベル」または「マーカープロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）もしくはそのフラグメントのレベル」は、対象から得られる試料におけるマーカープロアドレノメデュリンまたはそのフラグメントの分子実体の量を指す。言い換えると、マーカーの濃度が、試料において決定される。故に、用語「マーカー中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベル」は、対象から得られる試料におけるマーカー中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）の分子実体の量を指す。上記の通り、本明細書において、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、好ましくは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのフラグメントが、検出され、定量され得ることも予想される。また、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのフラグメントを検出し、定量することができる。ｐｒｏＡＤＭもしくはそのフラグメント（好ましくは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定するか、または少なくとも１つのヒストンもしくはそのフラグメントのレベルを決定する適当な方法が、本明細書において以下で記載される。
【００３７】
臓器は、構造単位で一体となって、一般的な機能を果たす組織の集合物である。本明細書において使用される、一般用語「臓器障害」はまた、１つより多くの臓器が障害を有することを意味し得る、すなわち、それは、特に指摘されない限り、臓器障害にも関し得る。用語「臓器障害」または「複数の臓器障害」は、臓器または１つより多くの臓器が、例えば、少なくとも１人の健常対象の臓器のような、影響を受けていない臓器と比較して、その／それらの正常な機能を遂行しない対象における状態を指す。例えば、臓器は、低減された活性を有してもよいか、または臓器は、少なくとも１人の健常対象の臓器と比較して、臓器障害を有する対象における異常な活性であってもよい。好ましくは、臓器障害を有する臓器は、例えば、少なくとも１人の健常対象の影響されていない臓器と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、１００％または２００％の損なわれた（低減もしくは増加）活性を有してもよい。
【００３８】
特に、臓器障害は、臓器不全をもたらし得る。したがって、「臓器障害」は、好ましくは、臓器不全を指し得る。「臓器不全」は、正常なホメオスタシスが、例えば、外部の臨床介入なしで、維持され得ない程度の臓器障害を指す。「臓器不全」はまた、臓器の正常なホメオスタシスが、例えば、外部の臨床介入なしで、維持され得ない程度の臓器障害を指してもよい。「臓器不全」はまた、対象の正常ホメオスタシスが、例えば、外部の臨床介入なしで、維持され得ない程度の臓器障害を指してもよい。
【００３９】
本発明の特定の態様において、臓器障害は、臓器不全または少なくとも１つの臓器不全である。一般用語「臓器不全」はまた、１つより多くの臓器が、不全を有することを意味する、すなわち、それがまた、特に指摘されない限り、臓器不全に関し得る。本明細書において、臓器障害がまた、多臓器障害として言及され得ることが、理解される。本明細書において、臓器不全がまた、多臓器不全として言及され得ることが、理解される。
【００４０】
典型的な臓器障害または複数の臓器不全は、循環性ショック、血液不全、肝不全、神経不全、腎不全、呼吸不全および代謝性アシドーシスである。したがって、本発明との関係において、臓器障害または少なくとも１つの障害は、好ましくは、循環性ショック、血液不全、肝不全、神経不全、腎不全、呼吸不全および代謝性アシドーシスからなる群から選択され得る。本明細書において、対象がまた、例えば、循環性ショック、血液不全、肝不全、神経不全、腎不全、呼吸不全および代謝性アシドーシスからなる群から選択される２つ、３つ、４つの臓器障害の組み合わせである、１つより多くの臓器障害または不全を有し得ることが、理解される。例えば、本発明の方法およびキットは、対象が、２つの臓器障害、例えば、循環性ショックおよび呼吸不全に罹患しているかどうかを決定することができる。
【００４１】
本明細書において使用される、「循環性ショック」を有する対象は、例えば、抹消の血流低下の徴候を有する約９０ｍｍＨｇより低い収縮期動脈圧を有する対象を指してもよい。したがって、かかる対象は、血管収縮性および／または変力剤の注入を必要とし得る。
【００４２】
本明細書において使用される、「血液不全」を有する対象は、約１００，０００／ｍｍ3より低い血小板血症を有する対象を指してもよい。
【００４３】
本明細書において使用される、「肝不全」を有する対象は、約２ｍｇ／ｄＬより高いビリルビン血症、および／または１リットル当たり約５００国際単位より高いアスパラギン酸またはアラニントランスアミナーゼの酵素レベルを有する対象を指してもよい。
【００４４】
本明細書において使用される、「神経不全」を有する対象は、１３未満のグラスゴー・コーマ・スケールを有する対象を指してもよい。
【００４５】
本明細書において使用される、「腎不全」を有する対象は、少なくとも約３時間約０．５ｍｌ／ｋｇ／時間未満の尿量、および／または以前の値と比較して約５０％より上昇するクレアチン血症を有する対象を指してもよい。
【００４６】
本明細書において使用される、「呼吸不全」を有する対象は、選択された換気補助にも関わらず、約３００ｍｍＨｇ未満の呼気酸素（Ｐａ  Ｏ2／Ｆｉ  Ｏ2）の分画に対する動脈酸素の分圧の比を有する対象を指してもよい。
【００４７】
本明細書において使用される、「代謝性アシドーシス」を有する対象は、約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ未満の乳酸レベル、塩基過剰（−２ｍ当量／Ｌ未満の塩基レベル）として、または約２４未満、好ましくは、約１８ｍｍｏｌ／Ｌ未満の炭酸水素レベル（ＨＣＯ3-）を有する対象を指してもよい。
【００４８】
用語「当該臓器障害を示す」は、臓器障害または少なくとも１つの臓器障害を有するか、または有し得る／罹患し得る対象を意味する。それ故、対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルは、対象における臓器障害を示す。
【００４９】
本発明の方法はまた、少なくとも１つのヒストンのレベルが、対象の試料において決定され、少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、当該臓器障害を示す、方法に関する。
【００５０】
本発明はまた、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象の試料において決定され、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、当該臓器障害を示す、方法に関する。
【００５１】
方法はまた、少なくとも１つのヒストンのレベルが決定され、プロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象の試料において決定され、少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、当該対象における当該臓器障害が、比較ステップに基づき同定される、方法に関する。
【００５２】
本明細書において使用される、用語「少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して」または文法上のその変形は、対象の少なくとも１つのヒストンのレベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較されることを意味する。したがって、対象のヒストンのレベルは、同じヒストンの対応する参照レベルと比較される。例えば、対象の試料において決定されたヒストンＨ２Ｂのレベルが、ヒストンＨ２Ｂの参照レベルと比較される。これは、必要な変更を他のヒストンに適用する。少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、特に、ヒストンＨ２Ｂのレベル、ヒストンＨ４のレベル、ヒストンＨ２Ａのレベルおよび／またはヒストンＨ３のレベルである。
【００５３】
本明細書において使用される、用語「ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して」またはその文法上の変形は、対象のｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較されることを意味する。少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのフラグメントレベルが、決定されるなら、参照レベルはまた、対応するフラグメントのレベルであってもよい。
【００５４】
本明細書において使用される、「参照レベル」は、本発明の好ましい態様において臓器障害または臓器不全を示さない対応するマーカーの正常レベルを反映してもよい。したがって、参照レベルは、健常対象の群（例えば、コホート）の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルを表し得る。健常対象は、診断された（および確認された）疾患および／または医学的障害を有しない対象である。健常対象は、好ましくは、正常に機能している臓器を有し得る、すなわち、臓器障害または臓器不全を有しない。したがって、参照レベルは、健常対象の試料において決定される少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得る。参照対象または健常対象は、本明細書において、好ましくは、対象の群または健常対象の群、例えば、対象のコホートとして定義される。健常参照対象は、好ましくは、臓器障害または臓器不全を有しない。したがって、参照レベルは、好ましくは、臓器障害または臓器不全を有しない対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルである。したがって、参照レベルは、好ましくは、臓器障害または臓器不全を示さないレベルである。
【００５５】
参照レベルは、少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであってもよく、当該参照対象は、臓器障害または臓器不全を有しない。
【００５６】
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得、当該参照対象は、疾患および／または医学的障害に罹患し、当該対象は、臓器障害または臓器不全を有しない。
【００５７】
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得、当該参照対象は、疾患および／または医学的障害および感染症（例えば、敗血症もしくは排血性障害）に罹患し、当該対象は、臓器障害または臓器不全を有しない。
【００５８】
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得、当該参照対象は、疾患および／または医学的障害に罹患し、感染症に罹患せず、当該対象は、臓器障害または臓器不全を有しない。
【００５９】
さらに、参照レベルはまた、少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり得、当該参照対象は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を含む疾患および／または医学的障害に罹患し、当該対象は、感染症に罹患せず、当該対象は、臓器障害または臓器不全を有しない。
【００６０】
本明細書において使用される、少なくとも１人の参照対象は、１人より多くの参照対象を指す。特に、少なくとも１人の参照対象は、参照対象の群またはコホートである。本明細書において以下で記載される通り、例えば、参照対象におけるマーカーのレベルを決定する手段および方法が記載され、典型的な参照レベルもまた提供される。
【００６１】
本明細書において使用される参照レベルは、典型的には、予め決められたレベルである、すなわち、これは、ポイントオブケア、例えば、ＩＣＵでの後の使用のための参照として予め決定されている。
【００６２】
本明細書において記録される通り、参照レベルと比較して、少なくとも１つのヒストンの増加したレベル（もしくは少なくとも１つのヒストンのレベルの増加）および／またはｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベル（もしくはｐｒｏＡＤＭのレベルの増加）は、臓器障害を示す。したがって、本発明の方法は、当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することを含み、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して、当該対象の当該少なくとも１つのヒストンの増加したレベルが、当該対象における当該臓器障害を示す、方法を含む。
【００６３】
さらに、本発明は、当該対象の試料における、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することを含み、当該ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して、当該対象の当該ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルが、当該対象における当該臓器障害を示す、方法を含む。
【００６４】
さらに、本発明は、当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定すること、および当該対象の試料におけるｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することを含み、少なくとも１つのヒストンの参照レベルおよび当該ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して、当該対象の当該少なくとも１つのヒストンの増加したレベルおよび当該対象の当該ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルが、当該対象における当該臓器障害を示す、方法を含む。
【００６５】
本発明はまた、
（ｉ）対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、
少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルと比較して当該対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルが、当該対象における臓器障害を示す、決定すること；および／または
（ｉｉ）当該対象の試料におけるプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、
ｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して当該対象のｐｒｏＡＤＭの増加したレベルが、当該対象における臓器障害を示す、決定すること、
を含む方法に関する。
【００６６】
言い換えると、本発明はまた、
（ｉ）対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、
少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルと比較して当該対象の少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、当該対象における臓器障害を示す、決定すること；および／または
（ｉｉ）当該対象の試料におけるプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、
ｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して当該対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、当該対象における臓器障害を示す、決定すること、
を含む方法に関する。
【００６７】
本明細書において使用される、用語「マーカーのレベルの増加」は、マーカーのレベルが増加されていることを意味する、すなわち、それは、マーカーの増加したレベルを指す。したがって、用語「マーカーのレベルの増加」は、本明細書において用語「マーカーの増加したレベル」と互換的に使用される。対象のマーカーの増加したレベルまたはマーカーのレベルの増加は、マーカーのレベルが、マーカーの参照レベルより少なくとも約１５％、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約２５％、またはなおより好ましくは、少なくとも約３０％高いことを意味する。
【００６８】
本発明との関係において、用語「参照レベルと比較して少なくとも１つのヒストンのレベルの増加」などは、用語「参照レベルと比較して当該対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベル」または用語「参照レベルと比較して少なくとも１つのヒストンの増加したレベル」などと互換的に使用される。かかる用語は、対象の、少なくとも１つのヒストンのレベル、例えば、Ｈ２Ｂのレベル、Ｈ４のレベル、Ｈ２Ａのレベルおよび／またはＨ３のレベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルより少なくとも約１５％、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約２５％、またはなおより好ましくは、少なくとも約３０％高いことを意味する。
【００６９】
本明細書において使用される、用語「参照レベルと比較してｐｒｏＡＤＭのレベルの増加」などは、本明細書において用語「当該参照レベルと比較して当該対象のｐｒｏＡＤＭの増加したレベル」または用語「当該参照レベルと比較してｐｒｏＡＤＭの増加したレベル」などと互換的に使用される。かかる用語は、対象の、ｐｒｏＡＤＭのレベル、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルより少なくとも約１５％、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約２５％、またはなおより好ましくは、少なくとも約３０％高いことを意味する。
【００７０】
本発明はまた、
（ｉ）当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、
少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、分析に先立ち得られた同じ対象の少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルと比較して少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、当該対象における臓器障害またはさらなる臓器障害を示す、決定すること；および／または
（ｉｉ）当該対象の試料におけるプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、
ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、分析に先立ち得られた同じ対象のｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
ｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルと比較してｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、当該対象における臓器障害またはさらなる臓器障害を示す、決定すること、
を含む方法に関し得る。
【００７１】
本明細書において使用される、「分析に先立ち得られた」は、従前の時、例えば、次の分析の２８日前、７日前、６日前、５日前、４日前、３日前、２日前または１日前における同じ対象の試料におけるマーカーレベルの決定を指し、かかる態様において、マーカーの当該従前に決定されたレベルが、参照レベルとみなされる。本明細書において使用される、さらなる臓器障害は、さらなる臓器が、障害または不全を示す／有することを意味し得る。例えば、対象が１つの臓器障害に罹患しているなら、さらなる臓器障害は、対象が、２つ以上の臓器障害または不全に罹患していることを意味する。
【００７２】
少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルが、少なくとも１つの臓器障害、少なくとも２つの臓器障害、または少なくとも３つの臓器障害を示し得る。特に、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して当該対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、少なくとも５つの臓器障害、または少なくとも６つの臓器障害を示し得る。より具体的には、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して当該対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、当該対象における少なくとも４つの臓器障害を示し得る。
【００７３】
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、少なくとも１つの臓器障害を示し得る。特に、ｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルと比較して当該対象の当該ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、少なくとも２つの臓器障害を示し得る。より具体的には、ｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルと比較して当該対象の当該ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、少なくとも３つの臓器障害を示し得る。より具体的には、ｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルと比較して当該対象の当該ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、少なくとも４つの臓器障害を示し得る。
【００７４】
本明細書において使用される、用語「１つの臓器障害」は、対象が１つの臓器障害を有する、すなわち、対象の１つの臓器が、障害を有することを意味する。本明細書において使用される、用語「２つの臓器障害」は、対象が２つの臓器障害を有する、すなわち、対象の２つの臓器が障害を有することを意味する。これは、必要な変更を用語３つの障害、４つの障害、５つの障害または６つの臓器障害に適用する。
【００７５】
さらに、付記された実施例において、ヒストン、特に、Ｈ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ３のレベルが、１〜３つの臓器障害に罹患している対象のレベルと比較して、４つ以上の臓器障害が対象において生じる場合において増加することが、記録される；例えば、図１および表１を参照。それ故、本発明の方法およびキットは、対象が、いくつの臓器障害に罹患しているか、または罹患しそうであるかを決定し得る。
【００７６】
したがって、本明細書において提供される方法およびキットとの関係において、参照レベルと比較して当該対象の当該少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、当該対象における少なくとも４つの臓器障害を示し、当該参照レベルが、１〜３つの臓器障害を示す。
【００７７】
さらに、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、当該対象における少なくとも５つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、４つの臓器障害を示す。
【００７８】
さらに、わずか１つのヒストンの参照レベルと比較して対象の少なくとも１つのヒストンの増加したレベルは、当該対象における少なくとも６つまたは７つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、５つの臓器障害を示す。
【００７９】
加えて、付記された実施例は、ｐｒｏＡＤＭ、特に、フラグメントＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、１つの臓器障害、２つの障害、３つの障害、４つの臓器障害から５つの臓器障害まで段階的に増加することを示す；例えば、図１Ｅ、および表１を参照。
【００８０】
したがって、本明細書において提供される方法およびキットとの関係において、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、当該対象における少なくとも１つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、臓器障害を示さない。
【００８１】
さらに、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、当該対象における少なくとも２つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、１つの臓器障害を示す。
【００８２】
さらに、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、当該対象における少なくとも３つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、２つの臓器障害を示す。
【００８３】
さらに、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、当該対象における少なくとも４つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、３つの臓器障害を示す。
【００８４】
さらに、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、当該対象における少なくとも５つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、４つの臓器障害を示す。
【００８５】
さらに、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの増加したレベルは、当該対象における少なくとも６つまたは７つの臓器障害を示し、当該参照レベルは、５つの臓器障害を示す。
【００８６】
さらに、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルおよび／または少なくともヒストン上と比較して対象のｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、および／または少なくとも１つのヒストンの同一または類似のレベル、例えば、約＋／−１０％、＋／−１５％、または＋／−２０％は、当該対象における多臓器障害を示し、当該参照レベルは、多臓器障害を示す。
【００８７】
本明細書において使用される、用語「参照レベルは臓器障害の数を示す」は、臓器障害の数を反映するレベルを指す。例えば、かかる（参照）レベルは、当該特定の数の臓器障害に罹患している少なくとも１人の参照対象において（典型的には、対象の群において）決定され得る。かかるレベル、例えば、１〜６／７つの臓器障害に罹患している対象のマーカーのレベルは、付記された実施例において記録される。したがって、臓器障害の数を示している参照レベルは、臓器障害の数に罹患する少なくとも１人の参照対象の少なくとも１つのヒストンのレベルであり得る。必要な変更を加えて、障害の数を示している参照レベルは、臓器障害の数に罹患しているか、または臓器障害に罹患していない少なくとも１人の参照対象の当該ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルであり得る。
【００８８】
本発明はまた、本発明の方法およびキットに関し、少なくとも１つのヒストンが、対象の試料において決定され、少なくとも１つのヒストンのレベルが、対象が、１つの臓器障害〜３つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、４つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示す。特に、本発明はまた、本発明の方法およびキットに関し、少なくとも１つのヒストンが、対象の試料において決定され、少なくとも１つのヒストンのレベルが、対象が、１つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、４つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示す。
【００８９】
特に、本発明はまた、本発明の方法およびキットに関し、少なくとも１つのヒストンが、対象の試料において決定され、少なくとも１つのヒストンのレベルが、対象が、１つの臓器障害〜３つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、４つの臓器障害、または５つの臓器障害または６つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示す。
【００９０】
加えて、本明細書において以下で、ｐｒｏＡＤＭのレベル、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象が、１つの臓器障害〜３つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、４つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示すことが、記録される；例えば、表１および表２Ａを参照。
【００９１】
したがって、本発明はまた、本発明の方法およびキットに関し、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが、対象の試料において決定され、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象が、１つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、２つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示す。
【００９２】
さらに、本発明はまた、本発明の方法およびキットに関し、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが、対象の試料において決定され、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象が、２つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、３つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示す。
【００９３】
さらに、本発明はまた、本発明の方法およびキットに関し、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭが、対象の試料において決定され、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象が、３つの臓器障害に罹患しているかどうか、または対象が、４つ以上の臓器障害に罹患しているかどうかを示す。
【００９４】
本明細書において使用される参照レベルは、典型的には、予め決められたレベルである、すなわち、これは、ポイントオブケア、例えば、ＩＣＵでの後の使用のための参照として予め決定されている。本明細書において、参照レベルおよび決定されたマーカーレベル（すなわち、ポイントオブケア、例えば、ＩＣＵでの個々の対象について決定されるレベル）は、アッセイ／方法に依存して変動し得、それにより、レベルは、表４においても例示される通り、決定されることが、理解される。例えば、質量分析ベースの方法により決定された参照レベルおよび決められたマーカーレベルは、イムノアッセイにより決定されたそれぞれのレベルと異なり得る。付記された実施例は、マーカーのレベルが、いくつかの方法、例えば、イムノアッセイおよび質量分析ベースの方法、例えば、表４により決定され得ること、および参照レベルが、加えて、ヨーデン指標のような統計学的方法により最適化され得ることを示す（例えば、Ｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（２０１５）１５：２４；およびＲｕｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍ  Ｊ．２００８  Ｊｕｎｅ；５０（３）：４１９−４３０））。したがって、当業者は、参照レベルを決定する方法を知っている。例えば、レベル（参照レベルを含む）は、イムノアッセイにより、例えば、臓器障害もしくは臓器不全に罹患していないか、またはあるいは臓器障害もしくは臓器不全に罹患している対象（または参照対象）の試料における、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／あるいはｐｒｏＡＤＭ、例えば、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することにより決定され得る。
【００９５】
１つの実施形態において、少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、イムノアッセイにより決定された。少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約７０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約６０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約４５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約４０ｎｇ／ｍｌ、または最も好ましくは、約３５ｎｇ／ｍｌであってもよい。イムノアッセイにより決定される少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約３０ｎｇ／ｍｌ、または最も好ましくは、約３５ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００９６】
少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、または最も好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００９７】
イムノアッセイにより決定されるヒストンＨ４の参照レベルは、約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約７０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約６０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約４５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約４０ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約３５ｎｇ／ｍｌであってもよい。イムノアッセイにより決定されるヒストンＨ４の参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約３０ｎｇ／ｍｌまたは最も好ましくは、約３５ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００９８】
ヒストンＨ４の参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、または最もより好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【００９９】
ｐｒｏＡＤＭの典型的な参照レベルは、付記された実施例において記載されるイムノアッセイにより決定された。例えば、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約４ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約５ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約７ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約８ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約９ｎｍｏｌ／Ｌまたは特に好ましくは、約６ｎｍｏｌ／Ｌであってもよい。
【０１００】
典型的な参照レベルと比較してマーカーのレベルの増加は、対象における１つの臓器障害、２つの臓器障害、３つの臓器障害、４つの臓器障害、５つの臓器障害、または６つ以上の臓器障害を示し得る。
【０１０１】
さらに、別の実施形態において、レベル（参照レベルを含む）は、目的のタンパク質もしくはそのフラグメントの相対量を決定するか、または絶対量を決定する方法のような、質量分光学ベースの方法により決定され得る。
相対的定量「ｒＳＲＭ」は、以下により達成されてもよい。
１．試料において検出された所定の標的フラグメントペプチド由来のＳＲＭ（選択された反応モニタリング）特徴的ピーク面積を、少なくとも第２、第３、第４以上の生物学的試料における標的フラグメントペプチドの同じＳＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、標的タンパク質の増加または低下した存在を決定すること。
２．試料において検出された所定の標的ペプチド由来のＳＲＭ特徴的ピーク面積を、異なりかつ別々の生物学的供給源からもたらされた他の試料における、他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから発展したＳＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、標的タンパク質の増加または低下した存在を決定することであって、ペプチドフラグメントについての２つの試料間のＳＲＭ特徴的ピーク面積比較は、例えば、それぞれの試料において分析されたタンパク質の量に標準化される、決定すること。
３．ヒストンタンパク質の変化するレベルを、様々な細胞条件下でそれらの発現レベルを変えない他のタンパク質のレベルに標準化するために、所定の標的ペプチドについてのＳＲＭ特徴的ピーク面積を、同じ生物学的試料内の異なるタンパク質からもたらされた他のフラグメントペプチド由来のＳＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、標的タンパク質の増加または低下した存在を決定すること。
【０１０２】
かかるアッセイは、標的タンパク質の修飾されていないフラグメントペプチドと修飾されたフラグメントペプチドの両方に適用することができ、修飾は、リン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（モノ、ジ、トリ）、シトルリン化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されず、修飾されたペプチドの相対レベルは、修飾されていないペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定される。
【０１０３】
所定のペプチドの絶対量は、以下により達成されてもよい。
１．個々の生物学的試料における標的タンパク質由来の所定のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ（複数の反応モニタリング）特徴的ピーク面積を、生物学的試料由来のタンパク質可溶化液に急増した内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較すること。内部標準は、調べられたまたは標識された組換えタンパク質である標的タンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成バージョンであってもよい。この標準は、切断前（組換えタンパク質に必須の）または後に公知の量で試料に急増し、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生物学的試料における内部フラグメントペプチド標準と未変性のフラグメントペプチドの両方について別々に決定することができ、続いて、両方のピーク面積が比較される。これは、修飾されていないフラグメントペプチドおよび修飾されたフラグメントペプチドに適用することができ、修飾は、リン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（例えば、モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化）、シトルリン化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されず、修飾されたペプチドの絶対レベルは、修飾されていないペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定することができる。
２．ペプチドはまた、外部検量線を使用して定量化することができる。通常の曲線アプローチは、内部標準として一定量の重ペプチド、および試料に急増した変動量の軽合成ペプチドを使用する。試験試料のものと類似する代表的な基質は、マトリックス効果を占める標準曲線を構築するために使用される必要がある。加えて、反向曲線方法は、基質中の内在性分析物の問題点を回避し、一定量の軽ペプチドが、内部標準を作成するために内在性分析物の上部に急増し、変動する量の重ペプチドが急増して、濃度標準のセットを作成する。正常または反向曲線のいずれかと比較されるべき試験試料は、検量線を作成するために使用される基質に急増した内部標準と同じ量の標準ペプチドと共に急増する。
【０１０４】
したがって、当業者は、付記された実施例においても例示される、マーカーレベルおよび特に、適当な参照レベルを決定する方法を知っている。
【０１０５】
上記の通り、参照レベルは、例えば、１つの臓器障害、２つの臓器障害、３つの臓器障害、または４つ以上の臓器障害に罹患している対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルを決定することにより決定され得る。次に、１つまたは複数の臓器障害を表すそれぞれの標的タンパク質の参照レベルと比較して対象の試料における標的タンパク質の増加したレベルは、臓器障害の数を示し、対象の試料における臓器障害の数は、参照レベルにより表される臓器障害の数より多い。例えば、少なくとも４つの臓器障害を示している少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、表３および４において例示される。したがって、少なくとも４つの臓器障害を示している少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約７０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約６０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約４５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約４０ｎｇ／ｍｌ、または最も好ましくは、約３５ｎｇ／ｍｌであってもよい。少なくとも４つの臓器障害を示している少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約３０ｎｇ／ｍｌ、または最も好ましくは、約３５ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【０１０６】
少なくとも４つの臓器障害を示している少なくとも１つのヒストンの参照レベルは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約約１０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、約１５ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌ、または最もより好ましくは、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約４０ｎｇ／ｍｌであってもよい。
【０１０７】
少なくとも４つの臓器障害を示しているｐｒｏＡＤＭの参照レベルは、約４ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約５ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約７ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約８ｎｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは、約９ｎｍｏｌ／Ｌまたは特に好ましくは、約６ｎｍｏｌ／Ｌであってもよい。かかる典型的な参照レベルと比較してマーカーのレベルの増加は、対象における少なくとも４つの臓器障害を示し得る。
【０１０８】
提供される方法の感度および特異性は、ただ試験の分析の質に依存する。感度および特異性はまた、異常（例えば、臓器障害）または正常な結果を構成するものの定義に依存する。提供される方法の特異性および感度はまた、表４において例示される通り、利用された参照レベルに依存してもよい。臓器障害を有する対象および有しない対象についての、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、好ましくは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルの分布は、重複してもよい。かかる条件下で、試験は、１００％の精度では障害状態から正常を絶対的に区別しない。当業者は、対象の状態自体、または対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターが、データの解釈においてアシストとなり得ること、およびこのさらなる情報が、重複の範囲においてより信頼できる予後を可能にすることを知っている。したがって、少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターのレベルが決定される。少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターのレベルはまた、参照レベルと比較することができ、当該参照レベルの当該少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターの対応するレベルと比較して対象の当該少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターの類似または同一の値／レベルが、対象が臓器障害を有するリスクが低下することを示し、および／または当該参照レベルの当該少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターの対応するレベルと比較して当該少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターのより高いまたはより低いレベル／値が、臓器障害を有するリスクが増加することを示す。
【０１０９】
したがって、本発明の方法およびキットはまた、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭに加えて、少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターを決定することを含み得る。
【０１１０】
本明細書において使用される、パラメーターは、特定のシステムを定義する際に助けとなり得る特徴、特性、または測定可能な因子である。パラメーターは、疾患／障害／臨床状態のリスク、好ましくは、臓器障害のような、健康および生理学と関連する評価についての重要な要素である。さらに、パラメーターは、治療介入への正常な生物学的プロセス、病原性プロセスまたは薬理学的応答の指標として客観的に測定され、評価される特徴として定義される。典型的なパラメーターは、急性生理学及び慢性健康評価スコア（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ：ＡＰＡＣＨＥスコアＩ−ＩＶ）、ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ、簡易急性生理学スコア（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ：ＳＡＰＳ  Ｉ−ＩＩＩスコア）、連続臓器不全評価スコア（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＳＯＦＡスコア）、簡易急性生理学スコアＩＩ（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ：ＳＡＰＳ  ＩＩスコア）、死亡率モデル（ＭＰＭ  Ｉ−ＩＩＩ）、多臓器障害スコア（ＭＯＤＳ）、治療介入スコアリングシステム（ＴＩＳＳ）、９項目の看護者人的資源使用スコア（ＮＥＭＳ）、世界脳神経外科学会連盟（ＷＦＮＳ）類別、およびグラスゴー・コーマ・スケール（ＧＣＳ）、年齢、性別、家族歴、民族性、体重、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）、膀胱鏡検査報告、白血球カウント、ＣＴスキャン、血圧、心拍数、降圧処置、液体摂取、喘鳴、体温、糖尿病の存在、ならびに現在の喫煙習慣からなる群から選択することができる。
【０１１１】
本明細書において使用される、「マーカー」、「代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）」、「予後マーカー」、「因子」または「バイオマーカー」もしくは「生物学的マーカーのような用語は、互換的に使用され、疾患／障害／臨床状態のリスク、好ましくは、有害事象のような、健康および生理学と関連する評価についての指標として働く、測定可能かつ定量可能な生物学的マーカー（例えば、特定のタンパク質もしくは酵素濃度またはその一部、特定のホルモン濃度またはその一部、または生物学的物質またはその一部の存在）に関する。マーカーは、治療介入への正常な生物学的プロセス、病原性プロセスまたは薬理学的応答の指標として客観的に測定され、評価され得る特徴として定義される。バイオマーカーは、試料（血液、血漿、尿、または組織検体としての）において測定されてもよい。当該対象の少なくとも１つのさらなるマーカーは、プロカルシトニン、カルシトニン、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、トロポニン、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、膵石タンパク質（ＰＳＰ）、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体１（ＴＲＥＭ１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、他のＩＬ、プレセプシン（ｓＣＤ１４−ＳＴ）、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、アルファ−１−アンチトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ９）、クロモグラニンＡ、Ｓ１００Ａタンパク質、Ｓ１００Ｂタンパク質および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはそのフラグメントからなる群から選択することができる。
【０１１２】
本発明の特定の態様において、当該対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターは、アルドラーゼＢ、コペプチン、プロエンドセリン−１、乳酸、プロカルシトニン（ＰＣＴ）、連続臓器不全評価スコア（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＳＯＦＡスコア）、簡易急性生理学スコア（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ：ＳＡＰＳ  ＩＩ）、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）、急性生理学及び慢性健康評価ＩＩ（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ：ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）スコア、および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｓＦｌｔ−１）からなる群から選択することができる。本明細書において、特に、さらなるマーカーのレベルが、対象の試料において決定されることが、理解される。
【０１１３】
本発明のある特定の態様において、当該対象の少なくとも１つのさらなるマーカーおよび／またはパラメーターは、プロカルシトニン、カルシトニン、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、トロポニン、脳ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、膵石タンパク質（ＰＳＰ）、ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体１（ＴＲＥＭ１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１、インターロイキン−２４（ＩＬ−２４）、他のＩＬ、プレセプシン（ｓＣＤ１４−ＳＴ）、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、アルファ−１−アンチトリプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ９）、マトリックスメタロプロテイナーゼ７（ＭＭＰ９）、クロモグラニンＡ、Ｓ１００Ａタンパク質、Ｓ１００Ｂタンパク質、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、年齢、性別、家族歴、民族性、体重、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）、膀胱鏡検査報告、白血球カウント、ＣＴスキャン、血圧、心拍数、降圧処置、液体摂取、喘鳴、体温、糖尿病の存在、現在の喫煙習慣、急性生理学及び慢性健康評価スコア（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ：ＡＰＡＣＨＥスコアＩ−ＩＶ）、簡易急性生理学スコア（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ：ＳＡＰＳ  Ｉ−ＩＩＩスコア）、連続臓器不全評価スコア（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＳＯＦＡスコア）、ＩＧＳ  ＩＩ、死亡率モデル（ＭＰＭ  Ｉ−ＩＩＩ）、多臓器障害スコア（ＭＯＤＳ）、治療介入スコアリングシステム（ＴＩＳＳ）、９項目の看護者人的資源使用スコア（ＮＥＭＳ）、世界脳神経外科学会連盟（ＷＦＮＳ）類別、およびグラスゴー・コーマ・スケール（ＧＣＳ）からなる群から選択することができる。
【０１１４】
本明細書において使用される「アルドラーゼＢ」は、クラスＩフルクトース１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ酵素の３つのアイソザイム（Ａ、Ｂ、およびＣ）のうち１つであるフルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼＢまたは肝臓型アルドラーゼを指す。対象の試料におけるアルドラーゼＢのレベルは、質量分析ベースの方法により決定することができる。
【０１１５】
「コペプチン」はまた、「ＣＴ−ｐｒｏＡＶＰ」または「バソプレシンのＣ末端部分」として言及される。バソプレシンは、強力な血管収縮剤である。ＣＴ−ｐｒｏＡＶＰのレベルは、以下で記載される通り、イムノアッセイにより対象の血漿または血清において測定することができる。
【０１１６】
本明細書において使用される、「乳酸」は、血液において測定された最大乳酸濃度を指す。通常、乳酸濃度は、毎日、またはさらにより頻繁に評価される。血中の乳酸濃度は、乳酸オキシダーゼ分光光度方法により決定することができる。
【０１１７】
本明細書において使用される、「プロカルシトニン」または「ＰＣＴ」は、アミノ酸残基１〜１１６、２〜１１６、３〜１１６に及ぶペプチドまたはそのフラグメントに関する。したがって、プロカルシトニンフラグメントの長さは、少なくとも１２個のアミノ酸、好ましくは、５０個より多くのアミノ酸、より好ましくは、１１０個より多くのアミノ酸である。ＰＣＴは、グリコシル化、脂質化（ｌｉｐｏｓｉｄａｔｉｏｎ）または誘導体化の様な翻訳後修飾を含んでもよい。プロカルシトニンは、カルシトニンおよびカタカルシンの前駆体である。したがって、正常条件下で、循環中のＰＣＴレベルは、非常に低い（＜約０．０５ｎｇ／ｍｌ）。対象の試料におけるＰＣＴのレベルは、以下で記載される通り、イムノアッセイにより決定することができる。
【０１１８】
本明細書において使用される、「連続臓器不全評価スコア」または「ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＳＯＦＡスコア」は、集中治療室（ＩＣＵ）に入院中の患者の状態を追跡するために使用される１つのスコアである。ＳＯＦＡスコアは、人の臓器機能の程度または不全の割合を決定するためのスコアリングシステムである。スコアは、６つの異なるスコアに基づき、それぞれ１つが、呼吸性、心血管系、肝臓、凝固、腎臓および神経系についてである。平均と最大ＳＯＦＡスコアの両方が、結果の予測因子である。ＩＣＵにおける最初の２４〜４８時間中のＳＯＦＡスコアの増加は、少なくとも５０％から最大９５％の死亡率を予測する。９未満のスコアは、３３％の予測死亡率を与え、一方、１４より上は、９５％に近いか、またはそれより上の死亡率であり得る。
【０１１９】
本明細書において使用される、「ＳＡＰＳ  ＩＩ」または「簡易急性生理学スコアＩＩ（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ）」は、疾患または障害の重症度を分類するシステムに関する（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｅｗ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｓｃｏｒｅ  （ＳＡＰＳ  ＩＩ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ／Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｓｔｕｄｙ．ＪＡＭＡ．１９９３；２７０（２４）：２９５７−６３を参照）。ＳＡＰＳ  ＩＩスコアは、主に、１２の生理学的変数および３つの疾患関連変数から作られる。ポイントスコアは、１２の日常的な生理学的測定値、従前の健康状態についての情報およびＩＣＵへの入院時に得られたいくつかの情報から計算される。ＳＡＰＳ  ＩＩスコアは、任意の時間において、好ましくは、入院の２日後において決定することができる。「最も悪い」測定値は、最大数のポイントと相関する測定値として定義される。ＳＡＰＳ  ＩＩスコアは、０〜１６３ポイントの範囲にある。分類システムは、次のパラメーター：年齢、心拍数、収縮期血圧、体温、グラスゴー・コーマ・スケール、人工呼吸またはＣＰＡＰ、ＰａＯ2、ＦｉＯ2、尿排出量、血中尿素窒素、ナトリウム、カリウム、炭酸水素、ビリルビン、白血球、慢性疾患および入院のタイプを含む。死亡率と合計ＳＡＰＳ  ＩＩスコアの間にシグモイド曲線関係が存在する。対象の死亡率は、２９ポイントのＳＡＰＳ  ＩＩスコアにおいて１０％であり、死亡率は、４０ポイントのＳＡＰＳ  ＩＩスコアにおいて２５％であり、死亡率は、５２ポイントのＳＡＰＳ  ＩＩスコアにおいて５０％であり、死亡率は、６４ポイントのＳＡＰＳ  ＩＩスコアにおいて７５％であり、死亡率は、７７ポイントのＳＡＰＳ  ＩＩスコアにおいて９０％である（Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【０１２０】
本明細書において使用される、「ヘパリン結合タンパク質」または「ＨＢＰ」は、活性化好中球から放出されるタンパク質を指し、血管漏出の強力なインデューサーである。対象の試料におけるＨＢＰのレベルは、本明細書において以下で記載される通り、質量分析計ベースのアッセイにより決定することができる。
【０１２１】
本明細書において使用される、「ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ」または「急性生理学及び慢性健康評価ＩＩ（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ）」は、疾患の重症度分類スコアリングシステムである（Ｋｎａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。これは、患者の集中治療室（ＩＣＵ）への入院の２４時間以内に適用することができ、例えば、１２または１４の異なる生理的パラメーターに基づき決定されてもよい。
【０１２２】
本明細書において使用される、「可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１」または「ｓＦｌｔ−１」は、血管成長を引き起こすタンパク質を無効にするチロシンキナーゼタンパク質である。可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）は、様々な組織により産生されるＶＥＧＦ受容体１のスプライスバリアント（Ｆｌｔ−１）である。対象の試料におけるｓＦＬＴ１のレベルは、質量分析ベースのアッセイにより、またはイムノアッセイにより決定することができる。
【０１２３】
本発明の方法またはキットは、上で記載された通り、少なくとも１つのヒストンのレベル、および／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびにさらなるマーカーおよび／またはパラメーターのレベルを決定することを含み得る。
【０１２４】
例えば、方法は、対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象のＳＯＦＡスコアを決定することを含み得る。
【０１２５】
さらに、方法は、対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象のＳＡＰＳ  ＩＩスコアを決定することを含み得る。
【０１２６】
さらに、方法は、対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象の試料におけるアルドラーゼＢのレベルを決定することを含み得る。
【０１２７】
さらに、方法は、対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象の試料におけるＰＣＴのレベルを決定することを含み得る。
【０１２８】
さらに、方法は、対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象の試料における乳酸のレベルを決定することを含み得る。
【０１２９】
さらに、方法は、対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベル、ならびに対象の試料におけるコペプチンのレベルを決定することを含み得る。
【０１３０】
特に、方法は、当該試料におけるヒストンＨ２Ｂのレベルおよび当該対象のＳＯＦＡスコアを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるヒストンＨ４のレベルおよび当該対象のＳＯＦＡスコアを決定することを含み得る。
【０１３１】
特に、方法は、当該試料におけるヒストンＨ２Ａのレベルおよび当該対象のＳＯＦＡスコアを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるヒストンＨ２Ａのレベルおよび当該対象のＳＡＰＳ  ＩＩスコアを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるヒストンＨ４のレベルおよび当該対象のＳＡＰＳ  ＩＩスコアを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるヒストンＨ２Ｂのレベルおよび当該対象のＳＡＰＳ  ＩＩスコアを決定することを含み得る。
【０１３２】
特に、方法は、当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるアルドラーゼＢの当該レベルを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるＨ２Ｂの当該レベルを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるＨ２Ａの当該レベルを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるＨ４の当該レベルを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料における乳酸の当該レベルを決定することを含み得る。特に、方法は、当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるＨ３の当該レベルを決定することを含み得る。
【０１３３】
本明細書において使用される、「対象」（または「患者」）は、脊椎動物であってもよい。本発明との関係において、用語「対象」は、ヒトと動物、特に、哺乳類の両方、および他の生物を含む。したがって、本明細書において提供される方法は、ヒトと動物対象の両方に適用可能である。したがって、当該対象は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、フェレット、ネコ、イヌ、ニワトリ、ヒツジ、ウシ種、ウマ、ラクダ、または霊長類であってもよい。好ましくは、対象は、哺乳類である。最も好ましくは、対象はヒトである。
【０１３４】
これは、付記された実施例において示される通り、様々な障害または疾患に罹患している対象の臓器障害が、予測される。それ故、本明細書において提供される方法は、健常対象である任意の対象、または任意の疾患もしくは障害に罹患している対象に対して使用することができる。好ましい態様において、対象は、疾患、障害または医学的状態に罹患している。試験されるべき対象は、重症患者であり得、好ましくは、当該対象は、救急部門に入院するか、または当該対象は、集中治療室に入院する。
【０１３５】
試験されるべき対象は、疾患または医学的状態に罹患している対象であり得、当該疾患または医学的状態は、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、呼吸器系疾患、肝疾患、腎疾患、免疫抑制、感染性および非感染性の病因に関連する炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、ならびに／または敗血性ショックからなる群から選択される。
【０１３６】
特に、対象は、敗血症に罹患している。より具体的には、対象は、重症敗血症および／または敗血性ショックに罹患している。
【０１３７】
本発明との関係における「全身性の炎症」は、好ましくは、生物学的要因、化学的要因または遺伝的要因により引き起こされ得る炎症促進性サイトカインの放出および活性化された自然免疫系により特徴付けられる状態に関する。重篤な「全身性炎症」は、臓器不全および死亡を導き得る。
【０１３８】
本発明との関係における「ＳＩＲＳ」は、感染の徴候を有しない全身性炎症反応症候群である。これは、以下の臨床上の徴候の１つより多くを含むが、これらに限定されない：（１）３８℃より高いか、または３６℃未満の体温；（２）１分当たり９０拍より多い心拍数；（３）１分当たり２０回より多い呼吸数により表される頻呼吸、または３２ｍｍＨｇ未満のＰａＣＯ2により示される過換気；および（４）１２，０００／ｍｍ3より大きいカウント、４，０００／ｍｍ3未満のカウント、または１０％より高い未熟好中球の存在のような白血球カウントにおける変化（Ｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＨＥＳＴ  １０１（６）：１６４４−５５，１９９２）。
【０１３９】
本発明との関係における「敗血症」は、感染に対する全身応答を指す。あるいは、敗血症は、確認された感染プロセスまたは感染症を有するＳＩＲＳの組み合わせとして観察されてもよい。敗血症は、感染症と全身性炎症反応の両方の存在により定義される臨床症候群として特徴付けられてもよい（Ｌｅｖｙ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．２００１  ＳＣＣＭ／ＥＳＩＣＭ／ＡＣＣＰ／ＡＴＳ／ＳＩＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｐｓｉｓ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００３  Ａｐｒ；３１（４）：１２５０−６）。本明細書において使用される、用語「敗血症」は、敗血症、重症敗血症、敗血性ショックを含むが、これらに限定されない。この関係における重症敗血症は、臓器障害と関連する敗血症、低灌流異常、または敗血症により誘導される低血圧を意味する。低灌流異常は、乳酸アシドーシス、乏尿および精神状態の急性変化を含む。敗血症により誘導される低血圧は、約９０ｍｍＨｇ未満の収縮期血圧の存在、または低血圧の他の原因（例えば、心原性ショック）の不存在におけるベースラインから約４０ｍｍＨｇ以上のその低減により定義される。敗血性ショックは、低灌流異常または臓器障害の存在と共に、十分な補液蘇生にも関わらず、敗血症により誘導される低血圧持続性を有する重症敗血症として定義される（Ｂｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＨＥＳＴ  １０１（６）：  １６４４−５５，１９９２）。
【０１４０】
本明細書において使用される、用語「敗血症」は、敗血症の発症における全ての可能性のあるステージに関する。
【０１４１】
本明細書において使用される、本発明の範囲内の「感染症」は、病原性もしくは潜在的に病原性の微生物により、正常な無菌組織または体液の侵入により引き起こされる病理学的プロセスを意味し、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生虫による感染症に関する。したがって、感染症は、細菌感染症、ウイルス感染症、および／または真菌感染症であり得る。感染症は、局所または全身性感染症であり得る。さらに、感染症に罹患している対象は、同時に、感染症の１つより多くの供給源に罹患し得る。例えば、感染症に罹患している対象は、細菌感染症およびウイルス感染症；ウイルス感染症および真菌感染症；細菌および真菌感染症、ならびに細菌感染症、真菌感染症およびウイルス感染症に罹患し得る。
【０１４２】
本明細書において使用される、用語「試料」は、対象から得られる生物学的試料である。用語「対象の試料」および「対象由来の試料」は、本明細書において互換的に使用することができる。本明細書において使用される、「試料」は、例えば、患者のような、目的の対象の診断、予後、もしくは評価の目的のため得られた体液または組織の試料を指してもよい。好ましくは、本明細書において、試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、汗、痰、および胸水のような、体液の試料である。特に、試料は、血液、血液血漿、血液血清、または尿である。試料は、分取または精製方法、例えば、全血の血清または血漿成分への分離によるように処理され（前処理され）得る。かかる前処理はまた、希釈、濾過、遠心分離、濃縮、沈降、沈殿または透析を含み得るが、これらに限定されない。前処理はまた、酸、塩基、バッファー、塩、溶媒、反応性の染料、界面活性剤、乳化剤、キレート剤のような、化学的または生化学的物質の溶液への添加を含んでもよい。好ましくは、試料は、血液試料であり、より好ましくは、血清試料または血漿試料である。
【０１４３】
本発明との関係における「血漿」は、遠心分離後に得られる、抗凝固剤を含有する血液の実質的に細胞を含まない上清である。典型的な抗凝固剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸のようなカルシウムイオン結合化合物、およびへパリネートまたはヒルジンのようなトロンビンインヒビターを含む。細胞を含まない血漿は、抗凝固剤処置された血液（例えば、クエン酸化、ＥＤＴＡまたはヘパリン処理された血液）、例えば、少なくとも１５分間の２０００〜３０００ｇでの遠心分離により得ることができる。
【０１４４】
本発明との関係における「血清」は、血液を凝固させた後に集められる全血の液体分画である。凝血した血液（凝固した血液）が遠心分離されるとき、血清は、上清として得ることができる。
【０１４５】
本明細書において使用される、「尿」は、排尿（または放尿）と呼ばれるプロセスを介して腎臓により分泌され、尿道を通じて排泄される身体の液体産物である。
【０１４６】
上記の通り、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルは、対象の試料において決定される。当業者は、試料におけるバイオマーカーのレベルを決定するために利用することができる方法／アッセイを知っている。
【０１４７】
上記の通り、少なくとも１つのヒストンのレベルが決定される、特に、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａおよび／またはＨ３のレベルが決定される。特に、ヒストンまたはヒストンフラグメントを決定することができる。かかるフラグメントは、本明細書において以下で例示される。
【０１４８】
かかるヒストンまたはそのフラグメントはまた、遊離ヒストンを表してもよい。例えば、本発明の方法、キットおよび抗体は、特に、遊離ヒストンのペプチドまたはエピトープを検出してもよい。アミノ酸のかかる区間はまた、本明細書において、ヒストンの中心領域または部分として言及される。以下において、本明細書において提供される方法を使用して遊離ヒストンを検出するために利用され得る、ペプチドまたはエピトープが記載される。
【０１４９】
特に、少なくとも１つのヒストンは、ヒストンＨ４であり得、少なくとも、配列番号１に示されるヒストンＨ４のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列のペプチドが決定される。特に、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ４であり、少なくとも、配列番号１の残基４６〜５６、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基６０〜６７、配列番号１の残基２２〜３０、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基９２〜１０２、配列番号１の残基２２〜３４、配列番号１の残基４６〜１０２、配列番号１の残基４６〜５５、配列番号１の残基８０〜９１、配列番号１の残基２４〜３５、および配列番号１の残基６８〜７７に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列のペプチドが決定される。例えば、２つのペプチドが、決定されてもよい。
【０１５０】
特に、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ４であり、配列番号１の残基４６〜５６および配列番号１の残基６７〜７８に及ぶアミノ酸配列のペプチドが決定される。
【０１５１】
さらに、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号２に示されるヒストンＨ２Ａのアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列のペプチドが決定される。特に、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号２の残基２１〜５３、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基３０〜５３、配列番号２の残基１２０〜１２９、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基８２〜８８、配列番号２の残基８９〜９５、および配列番号２の残基１００〜１１８に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列のペプチドが決定される。
【０１５２】
さらに、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ３であり、少なくとも、配列番号３に示されるヒストンＨ３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列のペプチドが決定される。さらに、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ３であり、少なくとも、配列番号３のアミノ酸残基２７〜３７に及ぶ、および／または配列番号３のアミノ酸残基５２〜６２に及ぶ配列のペプチドが決定される。
【０１５３】
さらに、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ２Ｂであり、少なくとも、配列番号４に示されるヒストンＨ２Ｂのアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列のペプチドが決定される。
【０１５４】
さらに、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号７、８、９および１０からなる群から選択されるペプチドまたはそのフラグメントが決定される。
【０１５５】
さらに、わずか１つのヒストンは、ヒストンＨ４であり、少なくとも、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６からなる群から選択されるペプチドまたはそのフラグメントが決定され得る。
【０１５６】
本明細書において、１つ、２つ、３つ、４つ以上のペプチドを決定することができることが、理解される。
【０１５７】
マーカー、例えば、少なくとも１つのヒストンもしくはそのフラグメントおよび／またはｐｒｏＡＤＭもしくはそのフラグメントのレベルは、マーカーの濃度を確実に決定する任意のアッセイにより決定することができる。特に、質量分析（ＭＳ）および／またはイムノアッセイが、付記された実施例において例示される通り、使用され得る。本明細書において使用される、イムノアッセイは、抗体もしくは抗体結合フラグメントまたは免疫グロブリンの使用を介して溶液中の高分子／ポリペプチドの存在または濃度を測定する生化学的試験である。
【０１５８】
あるいは、抗体の代わりに、ヒストン配列、ヒストンエピトープおよびヒストンの構造上の立体構造を特異的ならびに／もしくは選択的に認識する他の捕獲分子または分子スキャフォールドが、本発明の範囲により包含されてもよい。本明細書において、用語「捕獲分子」または「分子スキャフォールド」は、試料由来の、目的の標的分子または分子、すなわち、分析物（例えば、ヒストンおよび／もしくはｐｒｏＡＤＭ）に結合するために使用され得る分子を含む。したがって、捕獲分子は、空間的、ならびに表面変化、疎水性、親水性、ルイスドナーおよび／もしくは標的分子または目的の分子に特異的に結合するためのアクセプターの存在または不存在のような表面特性の点の両方で十分に形作られなければならない。これにより、結合は、捕獲分子または分子スキャフォールドと標的分子または目的の分子の間の、例えば、イオン性、ファンデルワールス、パイ−パイ、シグマ−パイ、疎水性または水素結合相互作用、または上述の相互作用または共有結合性相互作用の２つ以上の組み合わせにより仲介されてもよい。本発明との関係において、捕獲分子または分子スキャフォールドは、例えば、核酸分子、炭水化物分子、ＰＮＡ分子、タンパク質、ペプチドおよび糖タンパク質からなる群から選択されてもよい。捕獲分子または分子スキャフォールドは、例えば、アプタマー、ＤＡＲｐｉｎ（デザインされたアンキリンリピートタンパク質）、Ａｆｆｉｍｅｒなどを含む。
【０１５９】
本明細書において使用される、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子の免疫学的に活性な部分を指す。本発明によると、抗体は、モノクローナルならびにポリクローナル抗体であってもよい。特に、少なくとも１つのヒストンに特異的に結合する抗体、および／またはｐｒｏＡＤＭに特異的に結合する抗体が使用される。抗体は、目的の分子、例えば、少なくとも１つのヒストンおよび／もしくはｐｒｏＡＤＭ、またはそのフラグメントに対するその親和性が、目的の分子を含有する試料に含まれる他の分子に対するものより、少なくとも５０倍高い、好ましくは、１００倍高い、最も好ましくは、少なくとも１０００倍高いなら、特異的であるとみなされる。所定の特異性を有する抗体を開発し、選択する方法は、当該技術分野において周知である。本発明との関係において、モノクローナル抗体が好ましい。抗体または抗体結合フラグメントは、本明細書において定義されたマーカーまたはそのフラグメントに特異的に結合する。特に、抗体または抗体の結合フラグメントは、本明細書において定義された少なくとも１つのヒストンタンパク質のペプチドに結合する。したがって、本明細書において定義されたペプチドはまた、抗体が特異的に結合するエピトープであり得る。さらに、ｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭに特異的に結合する、抗体または抗体の結合フラグメントが、本発明の方法およびキットにおいて使用される。典型的なイムノアッセイは、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアッセイ、磁気ビーズベースのアッセイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマットまたは稀少クリプテートアッセイであり得る。さらに、例えば、免疫クロマトグラフィーストリップ試験のようなポイントオブケア試験および迅速試験フォーマットに適したアッセイを利用することができる。
【０１６０】
本発明のある特定の態様において、方法は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御方法であり、当該方法は、
（ｉ）対象の試料を得ること；
（ｉｉ）試料を、当該少なくとも１つのヒストンおよび／または当該ｐｒｏＡＤＭのエピトープに特異的な抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体と接触させること、ならびに抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体と当該少なくとも１つのヒストンおよび／または当該ｐｒｏＡＤＭの間の結合を検出することにより、当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを検出することを含み；
（ｉｉｉ）少なくとも１つのヒストンの当該レベルおよび／またはプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）の当該レベルが、当該臓器障害を示す。
【０１６１】
本発明のある特定の態様において、方法は、
ａ）試料を
（ｉ）ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第１のエピトープに特異的な第１の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および
（ｉｉ）ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第２のエピトープに特異的な第２の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体
と接触させる；ならびに
ｂ）第１および第２の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体のヒストンまたはｐｒｏＡＤＭへの結合を検出する
ステップを含むイムノアッセイである。
【０１６２】
好ましくは、抗体の一方が標識され得、他方の抗体が、固相に結合され得るか、または固相に選択的に結合され得る。アッセイの特に好ましい態様において、抗体の一方が標識され、一方、他方が、固相に結合されるか、または固相に選択的に結合され得るかのいずれかである。第１の抗体および第２の抗体は、液体反応混合物に分散して存在し得、蛍光または化学発光吸光または増幅に基づく標識システムの一部である第１の標識成分が、第１の抗体に結合し、検出されるべき当該少なくとも１つのヒストンおよび／または当該ｐｒｏＡＤＭへの両方の抗体の結合後、測定溶液中の生じたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが生じるように、当該標識システムの第２の標識成分が、第２の抗体に結合される。標識システムは、特に、シアニンタイプである、蛍光または化学発光色素との組み合わせでレアアースクリプテートまたはキレート剤を含み得る。
【０１６３】
好ましい実施形態において、方法は、異種性サンドイッチイムノアッセイとして実行され、抗体の１つが、任意に選択された固相、例えば、コーティングされた試験管の壁（例えば、ポリスチロール試験管；コーティングされた管；ＣＴ）または例えば、ポリスチロールからなる、マイクロタイタープレート、または例えば、磁気粒子のような、粒子に固定化され、これにより、他の抗体が、検出可能な標識に似ているか、または標識への選択的結合を可能にする基を有し、形成されたサンドイッチ構造の検出を果たす。適当な固相を使用した一時的に遅延されるか、またはその後の固定化もまた可能である。
【０１６４】
本発明による方法は、さらに、異種性の方法として具体化され得、抗体／複数の抗体およびマーカー、例えば、検出されるべきヒストンもしくはｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントにより形成されたサンドイッチ複合体は、液相に懸濁されたままである。この場合において、２つの抗体が使用されるとき、両方の抗体が、検出システムの一部で標識され、両方の抗体が、単一のサンドイッチに取り込まれたなら、シグナルの生成に至るか、またはシグナルの引き金を引くことが好ましい。かかる技術は、特に、蛍光増強または蛍光クエンチング検出方法として具体化されるべきである。特に、好ましい態様は、例えば、米国特許第４８８２７３３Ａ号、欧州特許第Ｂ１０１８０４９２号または欧州特許第Ｂ１０５３９４７７号およびこれらで引用された先行技術において記載されるもののような、対として使用されるべきである検出試薬の使用に関する。この方法において、反応混合物において直接、単一の免疫複合体中の両方の標識成分を含む反応産物のみが検出される測定が、可能になる。例えば、かかるテクノロジーは、商標名ＴＲＡＣＥ（登録商標）（時間分解増幅クリプテート放出）またはＫＲＹＰＴＯＲ（登録商標）の下で提供され、これらは上で引用された適用の教示を実行する。それ故、特に好ましい態様において、診断装置を使用して、本明細書に提供される方法を実施する。例えば、本明細書に提供される方法の、ヒストンもしくはｐｒｏＡＤＭまたはそのフラグメントのレベル、および／あるいは任意のさらなるマーカーのレベルが決定される。特に好ましい態様において、診断装置は、ＫＲＹＰＴＯＲ（登録商標）である。
【０１６５】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、好ましくは、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用してもよい。典型的には、ｐｒｏＡＤＭおよび／または少なくとも１つのヒストンのレベルの決定に適当であり得るペプチドが、本明細書において以下および上で記載される。
【０１６６】
例えば、本発明のイムノアッセイ方法は、好ましくは、ヒストンＨ４のエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列に存在するヒストンＨ４のエピトープである。
【０１６７】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号１のアミノ酸残基４６〜５６に及ぶ配列に存在するヒストンＨ４のエピトープに特異的である第１の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および配列番号１のアミノ酸残基６７〜７８に及ぶ配列に存在するヒストンＨ４のエピトープに特異的である第２の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体を利用してもよい。
【０１６８】
例えば、本発明のイムノアッセイ方法は、好ましくは、ヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第４の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号１のアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープである。
【０１６９】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、好ましくは、ヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープである。
【０１７０】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、ヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号２のアミノ酸残基２１〜５３、２０〜１１８、または１２０〜１２９に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープである。
【０１７１】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、ヒストンＨ３のエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用し、第１のエピトープおよび／または第２のエピトープは、配列番号３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列に存在するヒストンＨ３のエピトープである。
【０１７２】
より好ましくは、本発明のイムノアッセイ方法は、ヒストンＨ４のエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは誘導体を利用してもよく、エピトープは、配列番号１の残基２２〜３０、配列番号１の残基４６〜５６、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基９２〜１０２、配列番号１の残基２２〜３４、および配列番号１の残基４６〜１０２に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される。
【０１７３】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、ヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用してもよく、エピトープは、配列番号２の残基２１〜５３、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基３０〜５３、および配列番号２の残基１２０〜１２９に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される。
【０１７４】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号４の残基４１〜６９に及ぶヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用してもよい。
【０１７５】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号３の残基２７〜３７に及ぶ、および／または配列番号３の残基５２〜６２に及ぶヒストンＨ３のエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用してもよい。
【０１７６】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号２により表されるヒストンＨ２Ａ配列のアミノ酸残基２１〜５３および／または１２０〜１２９に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体および／もしくは第２の抗体またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を利用してもよい。
【０１７７】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号１のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列に存在するヒストンＨ４のエピトープに特異的である第１の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、または好ましくは、Ｈ３のエピトープに特異的である第２の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体を利用してもよい。
【０１７８】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号４のアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ａ、Ｈ４、もしくはＨ３のエピトープに特異的である第２の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体を利用してもよい。
【０１７９】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号２のアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、もしくはＨ３のエピトープに特異的である第２の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体を利用してもよい。
【０１８０】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ｂのエピトープに特異的である第１の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および遊離ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、もしくはＨ２Ａのエピトープに特異的である第２の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体を利用してもよい。
【０１８１】
さらに、本発明のイムノアッセイ方法は、配列番号２のアミノ酸残基２１〜５３、１２０〜１２９、もしくは２０〜１１８に及ぶ配列に存在するヒストンＨ２Ａのエピトープに特異的である第１の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体、および遊離ヒストンＨ３、Ｈ４、もしくは好ましくは、Ｈ２Ｂのエピトープに特異的である第２の抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体を利用してもよい。
【０１８２】
本発明は、さらに、上で詳述されたヒストンタンパク質もしくはそのフラグメントのエピトープに特異的である抗体または抗原結合フラグメントあるいはその誘導体に関する。ヒストンまたはｐｒｏＡＤＭ、好ましくは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭを検出するために首尾よく利用される典型的な抗体が、付記された実施例に示される。したがって、本発明は、ヒストンＨ２Ｂ、Ｈ４、Ｈ２Ａ、Ｈ３および／もしくはｐｒｏＡＤＭ、好ましくは、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのエピトープに特異的である抗体、抗原結合フラグメントまたはその誘導体に関する。抗体が特異的に結合する典型的なエピトープまたはペプチドは、本明細書において上および下で記録される。
【０１８３】
マーカー、例えば、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルはまた、付記された実施例に記載される通り、質量分光（ＭＳ）ベースの分析により決定することができる。かかる方法は、当該生物学的試料または当該試料由来のタンパク質消化物（例えば、トリプシン消化物）における例えば、ｐｒｏＡＤＭおよび／もしくはヒストンの１つまたは複数の修飾されたあるいは修飾されていないフラグメントペプチドの存在、量あるいは濃度を検出すること、ならびに場合により、クロマトグラフィー方法で試料を分けること、ならびに調製され、場合により分けられた試料をＭＳ分析の対象にすることを含んでもよい。例えば、選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）、複数の反応モニタリング（ＭＲＭ）または並行反応モニタリング（ＰＲＭ）質量分析を、ＭＳ分析において使用し、特に、少なくとも１つのヒストンペプチドの量を決定してもよい。本明細書において、用語「質量分析」または「ＭＳ」は、化合物をこれらの質量により同定するための分析技術を指す。質量分析の質量分解能および質量決定能を増強するために、試料は、ＭＳ分析に先立ち処理することができる。したがって、本発明は、免疫濃縮テクノロジー、試料調製に関連する方法、および／または好ましくは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、より好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）を含むクロマトグラフィー方法と組み合わせることができるＭＳ検出方法に関する。試料調製方法は、溶解、分取、試料のペプチドへの消化、枯渇、濃縮、透析、脱塩、アルキル化および／またはペプチド還元の技術を含む。しかしながら、これらのステップは、任意である。分析物イオンの選択的検出は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）で行われてもよい。タンデム質量分析は、質量選択ステップ（本明細書において使用される、用語「質量選択」は、特定のｍ／ｚまたは狭い範囲のｍ／ｚを有するイオンの単離を示す）により特徴付けられ、続いて、選択されたイオンが断片化され、得られた生成物（フラグメント）イオンが、質量分析される。
【０１８４】
当業者は、質量分光方法により試料におけるマーカーのレベルを定量する方法を知っている。例えば、相対的定量「ｒＳＲＭ」または絶対量を、上で記載された通り、利用することができる。
【０１８５】
本明細書において使用される、本発明との関係にける「診断」は、対象における臓器障害および／または臓器不全の認識および（早期）検出に関し、また、異なる診断を含んでもよい。また、臓器障害の重症度の評価は、用語「診断」により包含されてもよい。例えば、対象が罹患し得る臓器障害および／または臓器不全の数の評価。
【０１８６】
「予後」は、対象が臓器障害および／または臓器不全に罹患する結果または特定のリスクの予測に関する。これはまた、当該対象について、回復の機会または有害な結果の機会の推定を含んでもよい。
【０１８７】
本発明の方法はまた、モニタリングのため使用されてもよい。「モニタリング」は、既に診断された臓器障害および／または臓器不全、疾患、障害、合併症またはリスクを追跡し続けて、例えば、疾患の進行、あるいは臓器障害および／もしくは臓器不全、疾患または障害の進行に対する特定の処置の影響を分析することに関する。
【０１８８】
本発明との関係における用語「治療制御」は、対象の治療処置のモニタリングおよび／または調整を指す。
【０１８９】
本発明において、用語「リスク評価」および「リスク層別化」は、対象を、彼らのさらなる予後に従い異なるリスク群にグループ化することに関する。リスク評価はまた、予防および／または治療上の測定を適用するための層別化に関する。
【０１９０】
本明細書において使用される、用語「治療指針」は、１つもしくは複数のバイオマーカーおよび／または臨床上のパラメーターおよび／または臨床スコアの値に基づくある特定の治療または医学的介入の適用を指す。
【０１９１】
本発明は、さらに、キット、キットの使用、およびかかるキットを使用する方法に関する。本発明は、本明細書において上および下で提供される方法を実施するためのキットに関する。例えば、方法と関連して提供される、本明細書において提供される定義をまた、本発明のキットに適用する。特に、本発明は、対象における臓器障害の診断、予後、リスク、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御のためのキットであって、
（ｉ）当該対象由来の試料における少なくとも１つのヒストンの当該レベル、および／もしくは
少なくとも１つのヒストンの参照レベルを含む参照データを決定するための検出試薬であって、
少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルと比較して試料における少なくとも１つのヒストンの増加したレベルが、当該対象における臓器障害を示す、検出試薬；ならびに／または
（ｉｉ）当該試料におけるｐｒｏＡＤＭの当該レベル、および／もしくは
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルを含む参照データを決定するための検出試薬であって、
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して試料におけるｐｒｏＡＤＭの増加したレベルが、当該対象における臓器障害を示す、検出試薬、
を含むキットに関する。
【０１９２】
本発明はまた、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御のためのキットならびにその使用に関し、
（ｉ）少なくとも１つのヒストンのレベルが、当該対象由来の試料において決定され、
少なくとも１つのヒストンのレベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され、
臓器障害が、当該試料において決定された少なくとも１つのヒストンのレベルと少なくとも１つのヒストンの参照レベルの比較に基づき同定され；および／または
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭのレベルが、当該対象の当該試料において決定され、
ｐｒｏＡＤＭのレベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され、
臓器障害が、当該試料において決定されたｐｒｏＡＤＭの当該レベルとｐｒｏＡＤＭの参照レベルの比較に基づき同定される。
【０１９３】
本発明はまた、対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御におけるキットおよびその使用に関し、
（ｉ）当該キットが、少なくとも１つのヒストンのレベルを決定するための検出試薬を含み、
少なくとも１つのヒストンのレベルが、当該対象における臓器障害を示す；および／または
（ｉｉ）当該キットが、対象の試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルを決定するための検出試薬を含み、
ｐｒｏＡＤＭのレベルが、対象における臓器障害を示す。
【０１９４】
本明細書において使用される、「参照データ」は、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭ、特に、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭの参照レベルを含む。対象の試料における少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルは、キットの参照データに含まれる参照レベルと比較することができる。決定されたマーカーの増加したレベルは、臓器障害を示す。参照レベルは、本明細書において上で記載され、付記された実施例においても例示される。参照データはまた、少なくとも１つのヒストンのレベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルが比較される参照試料を含み得る。参照データはまた、本発明のキットを使用する方法の指示マニュアルを含み得る。
【０１９５】
本明細書において使用される、「検出試薬」などは、本明細書において記載されたマーカー、例えば、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭを決定するのに適した試薬である。かかる典型的な検出試薬は、本明細書において記載されたマーカーのペプチドもしくはエピトープに特異的に結合する、例えば、リガンド、例えば、抗体またはそのフラグメントである。かかるリガンドは、上で記載されたイムノアッセイにおいて使用されてもよい。マーカーのレベルを決定するためにイムノアッセイにおいて利用されるさらなる試薬はまた、キットに含まれてもよく、本明細書において検出試薬とみなされる。検出試薬はまた、ＭＳベースの方法によりマーカーまたはそのフラグメントを検出するために利用される試薬に関し得る。したがって、かかる検出試薬はまた、ＭＳ分析のための試料を調製するために使用される試薬、例えば、酵素、化学物質、バッファーなどであり得る。質量分析計はまた、検出試薬とみなされ得る。本発明による検出試薬はまた、例えば、マーカーのレベルを決定し、比較するために利用することができる校正溶液であり得る。
【０１９６】
所定の定義および説明はまた、必要な変更を以下の項目に適用する。本発明はまた、ある特定の実施形態における以下の項目に関する。
１．対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御方法であって、
（ｉ）当該対象の試料における少なくとも１つのヒストンのレベルを決定することであって、少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、臓器障害を示す、決定すること；および／または
（ｉｉ）当該対象の試料におけるプロアドレノメデュリン（ｐｒｏＡＤＭ）のレベルを決定することであって、ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、臓器障害を示す、決定すること、
を含む、方法。
２．（ｉ１）少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較され；および／または
（ｉｉ１）ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較され；および
（ｉｉｉ）当該対象における臓器障害が、それぞれ、ステップ（ｉ１）および／または（ｉｉ１）における前記比較に基づき同定される、
項目１の方法。
３．（ｉ）少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、当該対象における臓器障害を示す；および／または
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの前記参照レベルと比較してｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、当該対象における臓器障害を示す
項目１または２の方法。
４．少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、当該対象における少なくとも４つの臓器障害を示す、項目１〜３のいずれか１つの方法。
５．ｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルと比較して当該対象のｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、少なくとも１つの臓器障害を示す
項目１〜３のいずれか１つの方法。
６．ケースが少なくとも１つの参照対象由来であるので、少なくとも１つのヒストンの参照レベルおよび／またはｐｒｏＡＤＭの参照レベルが、少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭのレベルであり、当該少なくとも１つの参照対象のそれぞれが健常であるか、または好ましくは、当該参照対象は、臓器障害または臓器不全を有しない、項目２〜５のいずれ１つの方法。
７．当該ｐｒｏＡＤＭが、中間領域プロアドレノメデュリン（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）である、項目１〜６のいずれか１つの方法。
８．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ３および／またはヒストンＨ４である、項目１〜７のいずれか１つの方法。
９．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂである、項目１〜８のいずれか１つの方法。
１０．少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルが、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌであり、および／またはｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルが、約６ｎｍｏｌ／Ｌである、項目１〜９のいずれか１つの方法。
１１．アルドラーゼＢのレベル、コペプチンのレベル、乳酸のレベル、プロカルシトニン（ＰＣＴ）のレベル、ヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）のレベル、および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｓＦｌｔ−１）のレベルからなる群から選択される当該試料における少なくとも１つのマーカーを決定すること、ならびに／または急性生理学及び慢性健康評価ＩＩ（Ａｃｕｔｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ：ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）スコア、連続臓器不全評価スコア（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｓｃｏｒｅ：ＳＯＦＡスコア）、および簡易急性生理学スコア（ＳＡＰＳ  ＩＩ）からなる群から選択される当該対象の少なくとも１つのパラメーターを決定することをさらに含む、項目１〜１０のいずれか１つの方法。
１２．（ｉ）当該試料におけるヒストンＨ２Ｂのレベルおよび当該対象のＳＯＦＡスコア、
（ｉｉ）当該試料におけるヒストンＨ４のレベルおよび当該対象のＳＯＦＡスコア、
（ｉｉｉ）当該試料におけるヒストンＨ２Ａのレベルおよび当該対象のＳＯＦＡスコア、
（ｉｖ）当該試料におけるヒストンＨ２Ａのレベルおよび当該対象のＳＡＰＳ      ＩＩスコア、
（ｖ）当該試料におけるヒストンＨ４のレベルおよび当該対象のＳＡＰＳ  ＩＩスコア、
（ｖｉ）当該試料におけるヒストンＨ２Ｂのレベルおよび当該対象のＳＡＰＳ  ＩＩスコア、
（ｖｉｉ）当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるアルドラーゼＢの当該レベル、
（ｖｉｉｉ）当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるヒストンＨ２Ｂの当該レベル、ならびに／または
（ｉｘ）当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルおよび当該試料におけるヒストンＨ２Ａの当該レベル
を含む、項目１〜１１のいずれか１つの方法。
１３．当該臓器障害が、循環性ショック、血液不全、肝不全、神経不全、腎不全、呼吸不全および代謝性アシドーシスからなる群から選択される少なくとも１つの臓器障害である、項目１〜１２のいずれか１つの方法。
１４．当該臓器障害が、臓器不全または少なくとも１つの臓器不全である、項目１〜１３のいずれか１つの方法。
１５．当該対象が、疾患または医学的状態に罹患している、項目１〜１４のいずれか１つの方法。
１６．当該対象が、重症患者であり、好ましくは、当該対象が、集中治療室に入院している、項目１〜１５のいずれか１つの方法。
１７．当該対象が、疾患または医学的状態に罹患し、当該疾患または医学的状態が、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、呼吸器系疾患、肝疾患、腎疾患、免疫抑制、感染性および非感染性の病因に関連する炎症反応、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、および／または敗血性ショックからなる群から選択される、項目１〜１６のいずれか１つの方法。
１８．当該試料が、体液、血液、血液血漿、血液血清、または尿である、項目１〜１７のいずれか１つの方法。
１９．少なくとも１つのヒストンおよび／またはｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、質量分析（ＭＳ）、発光イムノアッセイ（ＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、化学発光および蛍光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、発光ベースのビーズアレイ、磁気ビーズベースのアレイ、タンパク質マイクロアレイアッセイ、迅速試験フォーマット、ならびに稀少クリプテートアッセイからなる群から選択される方法を使用して決定される、項目１〜１８のいずれか１つの方法。
２０．イムノアッセイであり、アッセイが、異種性の相においてまたは同種の相において行われる、項目１９の方法。
２１．ａ）試料を
（ｉ）第１のヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第１のエピトープに特異的な第１の抗体または抗原結合フラグメントもしくはその誘導体、および
（ｉｉ）第１のヒストンまたはｐｒｏＡＤＭの第２のエピトープに特異的な第２の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体
と接触させる；ならびに
ｂ）第１および第２の抗体もしくは抗原結合フラグメントまたはその誘導体の当該第１のヒストンまたはｐｒｏＡＤＭへの結合を検出する
ステップを含むイムノアッセイである、項目１９の方法。
２２．第１または第２の抗体の１つが標識され、他の抗体が、固相に結合するか、または選択的に結合する能力がある、項目２１の方法。
２３．第１の抗体および第２の抗体が、液体反応混合物に分散して存在し、蛍光または化学発光吸光または増幅に基づく標識システムの一部である第１の標識成分が、第１の抗体に結合し、当該標識システムの第２の標識成分が、検出されるべき当該少なくとも１つのヒストンおよび／または当該ｐｒｏＡＤＭへの両方の抗体の結合後、測定溶液における生じたサンドイッチ複合体の検出を可能にする測定可能なシグナルが生じるように、第２の抗体に結合する、項目２１または２２の方法。
２４．標識システムが、特に、シアニンタイプの蛍光または化学発光色素と組み合わせたレアアースクリプテートまたはキレート剤を含む、項目２３の方法。
２５．ＭＳ分析方法が、反応モニタリング（ＳＲＭ）、複数の反応モニタリング（ＭＲＭ）または並行反応モニタリング（ＰＲＭ）である、項目１９の方法。
２６．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、少なくとも、配列番号１に示されるヒストンＨ４のアミノ酸残基２２〜１０２に及ぶ配列のペプチドが、決定される、項目１〜２５のいずれか１つの方法。
２７．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、少なくとも、配列番号１の残基４７〜５９、配列番号１の残基６８〜７９、配列番号１の残基６０〜６７、配列番号１の残基２２〜３０、配列番号１の残基６７〜７８、配列番号１の残基９２〜１０２、配列番号１の残基２２〜３４、配列番号１の残基４６〜１０２、配列番号１の残基４６〜５５、配列番号１の残基８０〜９１、配列番号１の残基２４〜３５、および配列番号１の残基６８〜７７に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列のペプチドが決定される、項目１〜２６のいずれか１つの方法。
２８．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号２に示されるヒストンＨ２Ａのアミノ酸残基２０〜１１８に及ぶ配列のペプチドが、決定される、項目１〜２７のいずれか１つの方法。
２９．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号２の残基２１〜５３、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基３０〜５３、配列番号２の残基１２０〜１２９、配列番号２の残基２１〜２９、配列番号２の残基８２〜８８、配列番号２の残基８９〜９５、および配列番号２の残基１００〜１１８に及ぶアミノ酸配列からなる群から選択される配列のペプチドが決定される、項目１〜２８のいずれか１つの方法。
３０．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ３であり、少なくとも、配列番号３に示されるヒストンＨ３のアミノ酸残基２７〜６２に及ぶ配列のペプチドが、決定される、項目１〜２９のいずれか１つの方法。
３１．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ３であり、少なくとも、配列番号３のアミノ酸残基２７〜３７に及ぶ、および／または配列番号３のアミノ酸残基５２〜６２に及ぶ配列のペプチドが決定される、項目１〜３０のいずれか１つの方法。
３２．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ｂであり、少なくとも、配列番号４に示されるヒストンＨ２Ｂのアミノ酸残基４１〜６９に及ぶ配列のペプチドが、決定される、項目１〜３１のいずれか１つの方法。
３３．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ２Ａであり、少なくとも、配列番号７、８、９および１０からなる群から選択されるペプチドまたはそのフラグメントが決定される、項目１〜３２のいずれか１つの方法。
３４．当該少なくとも１つのヒストンが、ヒストンＨ４であり、少なくとも、配列番号１１、１２、１３、１４、１５および１６からなる群から選択されるペプチドまたはそのフラグメントが、決定される、項目１〜３３のいずれか１つの方法。
３５．（ｉ）当該試料における少なくとも１つのヒストンの当該レベル、および
少なくとも１つのヒストンの参照レベルを含む参照データを決定するための検出試薬であって、少なくとも１つのヒストンの参照レベルと比較して当該試料における少なくとも１つのヒストンのレベルの増加が、当該対象における臓器障害を示す、検出試薬；ならびに／または
（ｉｉ）当該試料におけるｐｒｏＡＤＭの当該レベル、および
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルを含む参照データを決定するための検出試薬であって、
ｐｒｏＡＤＭの参照レベルと比較して当該試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルの増加が、当該対象における臓器障害を示す、検出試薬、
を含む、項目１〜３４のいずれか１つに記載の方法を実施するためのキット。
３６．項目１〜３５のいずれか１つの方法における項目３５に記載のキットの使用。
３７．当該対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御のための項目３０に記載のキットの使用であって、
（ｉ）少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、当該対象の当該試料において決定され、
当該少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルと比較され、
当該臓器障害が、当該試料において決定された少なくとも１つのヒストンの当該レベルと少なくとも１つのヒストンの当該参照レベルの比較に基づき同定される；および／または
（ｉｉ）ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、当該対象の当該試料において決定され、
ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、ｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルと比較され、
当該臓器障害が、当該試料において決定されたｐｒｏＡＤＭの当該レベルとｐｒｏＡＤＭの当該参照レベルの比較に基づき同定される、
使用。
３８．当該対象における臓器障害の診断、予後、リスク評価、リスク層別化、モニタリング、治療指針および／または治療制御のためのキットの使用であって、
（ｉ）当該キットが、少なくとも１つのヒストンのレベルを決定するための検出試薬を含み、
当該少なくとも１つのヒストンの当該レベルが、当該臓器障害を示す；および／または
（ｉｉ）当該キットが、対象の試料におけるｐｒｏＡＤＭのレベルを決定するための検出試薬を含み、
当該ｐｒｏＡＤＭの当該レベルが、当該臓器障害を示す
使用。
【０１９７】
本明細書において使用される、用語「含むこと」および「含むこと」またはその文法上の変形は、少なくとも規定された特性、整数、ステップまたは成分を特定すると受け取られるべきであるが、１つもしくは複数のさらなるその特性、整数、ステップ、成分または群の添加を除外しない。この用語は、任意のさらなる特性を排除して、規定された特性、整数、ステップまたは成分のみを特定すると解される用語「からなる」および「本質的にからなる」を包含する。
【０１９８】
したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「有する」は、任意のさらなる成分（または同様に、特性、整数、ステップなど）が、存在し得る／してもよいことを意味する。
【０１９９】
用語「からなる」は、さらなる成分（または同様に、特性、整数、ステップなど）が存在しないことを意味する。
【０２００】
本明細書において使用されるとき、用語「本質的にからなる」またはその文法上の変形は、規定される特性、整数、ステップまたは成分を特定すると取られるべきであるが、さらなるその特性、整数、ステップ、成分または群が、請求された組成物、装置または方法の基本的特徴および新規特徴を実質的に変えない場合のみ、１つもしくは複数のさらなるその特性、整数、ステップ、成分または群の添加を排除しない。
【０２０１】
したがって、用語「本質的にからなる」は、さらなる成分に特異的なもの（または同様に、特性、整数、ステップなど）、すなわち、組成物、装置または方法の必須の特徴に実質的に影響しないものが、存在し得ることを意味する。言い換えると、用語「本質的にからなる」（本明細書において、用語「実質的に含む」と互換的に使用することができる）は、必須の成分（または同様に、特性、整数、ステップなど）に加えて、組成物、装置または方法における他の成分の存在を可能にする、但し、装置または方法の必須の特徴は、他の成分の存在により実質的に影響されない。
【０２０２】
用語「方法」は、化学的、生物学的および生物物理学的分野の実施者に公知、または公知の方法、手段、技術および手法から容易に開発されるこれらの方法、手段、技術および手法を含むが、これらに限定されない、所定の目的を成し遂げるための方法、手段、技術および手法を指す。
【０２０３】
用語「約」は、好ましくは、示された数値の±１０％、より好ましくは、示された数値の±５％、特に、示された正確な数値を指す。
【０２０４】
本明細書において使用される、用語「約」は、示される数値の±１０％、特に、示された数値の±５％を指す。用語「約」が使用される限り、示される正確な数値への特定の参照もまた、含まれる。用語「約」が、所定の核酸におけるヌクレオチドの数のような、整数で定量されるパラメーターと組み合わせて使用されるなら、示される数値の±１０％または±５％に対応する数が、最も近い整数に概算されるべきである。例えば、表現「約２５個のアミノ酸」は、２３〜２８個の範囲のアミノ酸、特に、２４〜２６個の範囲のアミノ酸を指し、好ましくは、特定の値である２５個のアミノ酸を指す。
【０２０５】
診断および／または予後試験の感度ならびに特異性は、ただ試験の分析上の「質」以外に依存する。感度および特異性はまた、異常な結果を構成するものの定義に依存する。実際、受診者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は、典型的には、「正常」（すなわち、出生前障害または状態を有しない一見健常な個人）および「疾患」集団、例えば、１つもしくは複数の臓器障害または不全を有する対象における変数の値をその相対的頻度に対してプロットすることにより、計算される。任意の特定のマーカー（ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのような）について、疾患／状態を有する対象および有しない対象についてのマーカーレベルの分布は、重複するだろう。かかる条件下で、試験は、１００％の精度で患者から正常を絶対的には区別せず、重複の範囲は、試験が疾患から正常を区別できないところを示し得る。試験が異常であるとみなされるより下、かつ試験が正常であるとみなされるより上、または試験が特定の状態、例えば、臓器障害を示すより下もしくは上の閾値が選択される。ＲＯＣ曲線下面積は、予想された測定値が、状態の正しい同定を可能にする確率の測定値である。ＲＯＣ曲線は、試験結果が、正確な数を必ずしも与えないときでさえ、使用することができる。人が結果をランク付けし得る限り、人は、ＲＯＣ曲線を作成することができる。例えば、「疾患」試料についての試験の結果は、程度に従いランク付けされてもよい（例えば、１＝低い、２＝正常、および３＝高い）。このランク付けは、「正常」集団における結果に相関し、ＲＯＣ曲線が作成され得る。これらの方法は、当該技術分野において周知である；例えば、Ｈａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８２．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  １４３：２９−３６を参照。好ましくは、閾値は、約０．５より広い、より好ましくは、約０．７より広い、さらにより好ましくは、約０．８より広い、なおより好ましくは、約０．８５より広い、最も好ましくは、約０．９より広いＲＯＣ曲線面積を提供するよう選択される。この関連における用語「約」は、所定の測定値の＋／−５％を指す。
【０２０６】
ＲＯＣ曲線の横軸は、（１−特定）を表し、これは、偽陽性の割合に伴い増加する。曲線の縦軸は、感度を表し、これは、真の陽性の割合に伴い増加する。したがって、選択された特定のカットオフについて、（１−特定）の値が決定されてもよく、対応する感度が得られてもよい。ＲＯＣ曲線下面積は、測定されたマーカーレベルが、疾患または状態の正しい同定を可能にする可能性の測定である。したがって、ＲＯＣ曲線下面積を使用して、試験の有効性を決定することができる。
【０２０７】
他の実施形態において、陽性尤度比、陰性尤度比、オッズ比、またはハザード比は、リスクを予測するかまたは障害もしくは状態（「疾患群」）を診断する試験の能力の測定値として使用される。陽性尤度比の場合において、値１は、陽性結果が、「疾患」と「対照」群の両方において対象の間で等しく起こり得ることを示し；１より大きい値は、陽性結果が、疾患群においてより起こり得ることを示し；１未満の値は、陽性結果が、対照群においてより起こり得ることを示す。陰性尤度比の場合において、値１は、陰性結果が、「疾患」と「対照」群の両方において対象の間で等しく起こり得ることを示し；１より大きい値は、陰性結果が、試験群においてより起こり得ることを示し；１未満の値は、陰性結果が、対照群においてより起こり得ることを示す。
【０２０８】
オッズ比の場合において、値１は、陽性結果が、「疾患」と「対照」群の両方において対象の間で等しく起こり得ることを示し；１より大きい値は、陽性結果が、疾患群においてより起こり得ることを示し；１未満の値は、陽性結果が、対照群においてより起こり得ることを示す。
【０２０９】
ハザード比の場合において、値１は、エンドポイント（例えば、死）の相対的リスクが、「疾患」と「対照」群の両方において等しいことを示し；１より大きい値は、リスクが、疾患群においてより高いことを示し；１未満の値は、リスクが、対照群においてより高いことを示す。
【０２１０】
当業者は、診断とまたは将来的な臨床結果の予後リスクと、診断または予後指標を関連付けることが、統計的分析であることを理解する。例えば、Ｘより低いマーカーレベルは、患者が、統計上有意であるレベルにより決定された、Ｘ以上のレベルを有する患者より、有害な結果に罹患しやすいことを知らせ得る。加えて、ベースラインレベルからのマーカー濃度における変化は、患者の予後を反映し得、マーカーレベルにおける変化の程度が、有害事象の重症度と関連し得る。統計上の有意性は、しばしば、２つ以上の集団を比較し、信頼区間および／またはｐ値を決定することにより決定される；例えば、Ｄｏｗｄｙ  ａｎｄ  Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３を参照。本発明の好ましい信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％であり、一方、好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、および０．０００１である。
【０２１１】
別段示されない限り、確立された方法の組換え遺伝子テクノロジーが、例えば、全体が、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載される通り、使用された。
【０２１２】
本発明は、以下の非限定的な図面および実施例を参照することにより、さらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１Ａ】ＯＦの数と関連するマーカーレベルおよび臨床スコアの分布。ボックスプロットは、マーカーレベル（ヒストンＨ２Ａ（Ａ）；ヒストンＨ２Ｂ（Ｂ）；ヒストンＨ３（Ｃ）；ヒストンＨ４（Ｄ）；およびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｅ））を説明するか、またはＯＦの数により表されるそれぞれの群についてのスコア（（Ｆ）：ＳＯＦＡスコア）を説明する。それぞれの群における患者の数は、括弧内に示される（ｎ）。
【図１Ｂ】ＯＦの数と関連するマーカーレベルおよび臨床スコアの分布。ボックスプロットは、マーカーレベル（ヒストンＨ２Ａ（Ａ）；ヒストンＨ２Ｂ（Ｂ）；ヒストンＨ３（Ｃ）；ヒストンＨ４（Ｄ）；およびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｅ））を説明するか、またはＯＦの数により表されるそれぞれの群についてのスコア（（Ｆ）：ＳＯＦＡスコア）を説明する。それぞれの群における患者の数は、括弧内に示される（ｎ）。
【図１Ｃ】ＯＦの数と関連するマーカーレベルおよび臨床スコアの分布。ボックスプロットは、マーカーレベル（ヒストンＨ２Ａ（Ａ）；ヒストンＨ２Ｂ（Ｂ）；ヒストンＨ３（Ｃ）；ヒストンＨ４（Ｄ）；およびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｅ））を説明するか、またはＯＦの数により表されるそれぞれの群についてのスコア（（Ｆ）：ＳＯＦＡスコア）を説明する。それぞれの群における患者の数は、括弧内に示される（ｎ）。
【図１Ｄ】ＯＦの数と関連するマーカーレベルおよび臨床スコアの分布。ボックスプロットは、マーカーレベル（ヒストンＨ２Ａ（Ａ）；ヒストンＨ２Ｂ（Ｂ）；ヒストンＨ３（Ｃ）；ヒストンＨ４（Ｄ）；およびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｅ））を説明するか、またはＯＦの数により表されるそれぞれの群についてのスコア（（Ｆ）：ＳＯＦＡスコア）を説明する。それぞれの群における患者の数は、括弧内に示される（ｎ）。
【図１Ｅ】ＯＦの数と関連するマーカーレベルおよび臨床スコアの分布。ボックスプロットは、マーカーレベル（ヒストンＨ２Ａ（Ａ）；ヒストンＨ２Ｂ（Ｂ）；ヒストンＨ３（Ｃ）；ヒストンＨ４（Ｄ）；およびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｅ））を説明するか、またはＯＦの数により表されるそれぞれの群についてのスコア（（Ｆ）：ＳＯＦＡスコア）を説明する。それぞれの群における患者の数は、括弧内に示される（ｎ）。
【図１Ｆ】ＯＦの数と関連するマーカーレベルおよび臨床スコアの分布。ボックスプロットは、マーカーレベル（ヒストンＨ２Ａ（Ａ）；ヒストンＨ２Ｂ（Ｂ）；ヒストンＨ３（Ｃ）；ヒストンＨ４（Ｄ）；およびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（Ｅ））を説明するか、またはＯＦの数により表されるそれぞれの群についてのスコア（（Ｆ）：ＳＯＦＡスコア）を説明する。それぞれの群における患者の数は、括弧内に示される（ｎ）。
【実施例】
【０２１４】
実施例１
方法
研究集団
２０１３年６月１日から２０１４年６月１４日までに、ディジョン・ブルゴーニュのユニヴェルシテール総合病院（ｃｅｎｔｒｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ：ＣＨＵ）の内科の集中治療室（ＩＣＵ）に入院した２３７人の重症患者を、臨床研究に連続して登録した。１８歳未満の患者を除外した。研究は、地方の施設内倫理委員会により承認された。登録前、記載のインフォームド・コンセントを、患者自身から、または患者の最近親者から得た。全ての患者は、心血管疾患、糖尿病、悪性腫瘍、呼吸器系疾患、肝疾患、腎疾患および免疫抑制を含む、広範な疾患を示し、退院または病院での死亡までモニターした。診療記録、画像および微生物学結果の遡及的検討に基づき、２人の独立した医師が、国際標準基準に従い、入院の日に患者を、非敗血症（全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））またはＳＩＲＳでない、重症敗血症または敗血性ショックのいずれかに分類した（Ｂｏｎｅ，Ｂａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９２）。入院の日、すなわち、最初の２４時間の間に、血液試料を採取した。ベースラインの人口動態および病歴を含む臨床データ、身体検査の結果、日常的な血液分析物（例えば、血液培養物）、実験室でない診断検討（例えば、ＳＩＲＳ基準、臓器不全（ＯＦ）基準）、治療介入（例えば、人工呼吸（ＭＶ）、血管収縮性および腎置換療法（ＲＲＴ））ならびに結果のパラメーター（例えば、入院の長さ、全原因死亡）を記録した。６つの臓器パラメーターに基づく、連続臓器不全評価（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：ＳＯＦＡ）スコア、および１７つの主な生理学変数に基づく、簡易急性生理学スコア（ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｓｃｏｒｅ  ＩＩ：ＳＡＰＳ  ＩＩ）を入院の際に計算した（Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｌｅｍｅｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。
【０２１５】
７つのタイプの急性臓器不全、例えば、循環性ショック（ｉ）、血液不全（ｉｉ）、肝不全（ｉｉｉ）、神経不全（ｉｖ）、腎不全（ｖ）ならびに呼吸不全（ｖｉ）および代謝性アシドーシス（ｖｉｉ）を入院時に記録した。以下の通り、それぞれ単一の臓器不全についての基準を利用した。例えば、循環性ショックを、抹消の血流低下の徴候を有する９０ｍｍＨｇ未満の収縮期動脈圧、または血管収縮性もしくは変力剤の持続点滴が必要であると定義した。血液不全を、１００，０００／ｍｍ3未満の血小板血症として定義した。肝不全を、２ｍｇ／ｄＬより高いビリルビン血症、および／または１リットル当たり５００国際単位より高いアスパラギン酸またはアラニントランスアミナーゼの酵素レベルとして定義した。神経不全を、１３未満のグラスゴー・コーマ・スケールとして定義した。腎不全を、少なくとも３時間の０．５ｍｌ／ｋｇ／時間未満の尿、および／または従前の値と比較して５０％より高いクレアチン血症上昇として定義した。呼吸不全を、選択した換気補助にも関わらず、３００ｍｍＨｇ未満の呼気酸素（Ｐａ  Ｏ2／Ｆｉ  Ｏ2）の分画に対する動脈酸素の部分圧の比として定義した。代謝性アシドーシスを、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ未満の乳酸レベルとして、塩基過剰（−２ｍ当量／Ｌ未満の塩基レベル）として、または１８ｍｍｏｌ／Ｌ未満の炭酸水素レベル（ＨＣＯ3-）として定義した。
【０２１６】
バイオマーカー
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（中間領域プロアドレノメデュリン）、コペプチンおよびＰＣＴ（プロカルシトニン）レベルを、ＫＲＹＰＴＯＲランダムアクセス分析機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｂ・Ｒ・Ａ・Ｈ・Ｍ・Ｓ）を用いた使用のため開発されたもののような、超高感度アッセイを使用して血漿試料において決定した。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のレベル、ならびにアルドラーゼＢのレベルを、例えば、以下で記載する、選択した反応モニタリングまたは複数の反応モニタリング（ＳＲＭ／ＭＲＭ）アッセイにより、血漿試料において決定した。マーカーからもたらされた特定のペプチドを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳテクノロジー（ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｉｖａ質量分析計（ＭＳ）；サーモフィッシャー・サイエンティフィック）により測定した。それぞれのペプチドについて、同定したペプチド配列その断片化イオン、いわゆる遷移は、血液試料におけるマーカータンパク質レベルをモニタリングするための有用な代理（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）であることを見出した。同位体で重く標識することができる合成ペプチドに対して、最適化を行った。ノイズ対シグナルに関して最適なペプチドを選択した。それぞれのペプチドについて、最適な保持時間および少なくとも４つの最善の遷移を設定した。
【０２１７】
ペプチドおよび遷移の典型的なＭＳ定量ならびに選択
それぞれの臨床血漿試料５μＬを、８Ｍ尿素／２．５％ｎ−プロパノール／３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．５  ２０μＬに加え、３７℃において１時間インキュベーションした。１Ｍ炭酸水素アンモニウムにおいて調製した５００ｍＭヨード酢酸を、それぞれの試料ウェルに加え、暗所で室温にて１時間インキュベーションした。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／５ｍＭ  ＣａＣｌ2ｐＨ８．０  １１３μＬをそれぞれのウェルに加えた。比１：１０（総タンパク質含有量：タンパク質分解酵素）で、トリプシン（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を２５ｍＭ酢酸１５０μＬで再水和し、３７℃で２０時間インキュベーションした。ギ酸２μＬの添加で、消化を最終的にクエンチした。次に、注射前に、グルカゴン（１ｎｇ／μＬ）および標準重ペプチドを加えた。
【０２１８】
ＨＰＬＣ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）とつなげたトリプル四重極質量分析計ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｉｖａにおいて、ＳＲＭアッセイを展開した。２０分の５〜４０％Ｂの直線勾配、４０分の合計の実行時間で逆相分離を行った（溶媒Ａ：水０．２％ＦＡ、溶媒Ｂ：ＡＣＮ０．２％ＦＡ）。直線勾配中の流速を、２４０μＬ／分に設定した。全ての試料および曲線上のポイントについて、トータルの注射体積は１６０μＬであった。１５０ｍｍ×２．１ｍｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ  ａＱカラム（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）を、温度５０℃で実行した。
【０２１９】
１３Ｃ−および１５Ｎ−標識アルギニンまたはリジン（サーモフィッシャー・サイエンティフィックもしくはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）を取り込んでいる、重く標識した合成ペプチドについて、最適化を行った。衝突エネルギー、筒レンズ、および滞在時間のような個々の計器パラメーターを、遷移毎に自動的に試験した。複数の相互作用後、最適化したリストのペプチドおよび遷移（すなわち、最高強度シグナル、および他の遷移とのわずかな重複）、ならびに対応する保持時間を、選択した１つのペプチド当たり少なくとも４つのフラグメント遷移で終わらせた。
【０２２０】
クロマトグラフィー分離において軽くおよび重く標識した遷移を共溶出することにより、ペプチドを同定した。時間整列、遷移の相対的定量および標的化タンパク質定量のため、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック）およびＳｋｙｌｉｎｅ（ＭａｃＣｏｓｓ  Ｌａｂ）ソフトウエアを使用した。
【０２２１】
以下で記載する典型的な方法を利用することにより、マーカーの相対的および絶対的定量を行った。
相対的定量：
１．生物学的試料において検出した所定のペプチド由来のＳＲＭ特徴的ピーク面積を、少なくとも第２の、第３、第４以上の生物学的試料における同じフラグメントペプチドの同じＳＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、マーカーの増加または低下した存在を決定すること。
２．生物学的試料において検出した所定のペプチド由来のＳＲＭ特徴的ピーク面積を、異なるおよび別々の生物学的供給源からもたらされる他の試料における他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから発展したＳＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、マーカーの増加または低下した存在を決定することであって、ペプチドフラグメントについて２つの試料間のＳＲＭ特徴的ピーク面積比較を、それぞれの試料において分析したタンパク質の量に標準化する、決定すること。
３．様々な細胞条件下での発現のこれらのレベルを変化させない、他のタンパク質のレベルにマーカーの変化するレベルを標準化するために、所定のペプチドについてのＳＲＭ特徴的ピーク面積を、同じ生物学的試料内の異なるタンパク質からもたらされた他のフラグメントペプチド由来のＳＲＭ特徴的ピーク面積と比較することにより、マーカーの増加または低下した存在を決定すること。
４．これらのアッセイを、修飾されていないフラグメントペプチドと修飾されたフラグメントペプチド、例えば、ヒストンタンパク質の両方に適用し、修飾は、リン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（モノ、ジ、トリ）、シトルリン化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されず、修飾されたペプチドの相対レベルを、修飾されていないペプチドの相対量を決定するのと同じ方法で決定した。
【０２２２】
所定のペプチドの絶対的定量：
個々の生物学的試料におけるマーカー由来の所定のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を、生物学的試料由来のタンパク質可溶化液に急増した内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較すること。
【０２２３】
内部標準は、調べたまたは標識した組換えタンパク質であったマーカータンパク質由来のフラグメントペプチドの標識した合成バージョンであった。この標準は、切断前または後に公知の量の試料において急増し、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生物学的試料において内部フラグメントペプチド標準と未変性のフラグメントペプチドの両方について別々に決定し、続いて、両方のピーク面積を比較した。
【０２２４】
かかるアッセイは、修飾されていないフラグメントペプチドおよび修飾されたフラグメントペプチドに適用され、修飾は、リン酸化および／またはグリコシル化、アセチル化、メチル化（モノ、ジ、トリ）、シトルリン化、ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されず、修飾されたペプチドの絶対レベルが、修飾されていないペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定された。
【０２２５】
ヒストンＨ４のレベルをまた、イムノアッセイ方法により測定した。したがって、ヒストンＨ４免疫アッセイ（Ｈ４  ＩＡ）は、ＭａｇＰｌｅｘ−Ｃ  Ｍｉｃｒｏｐｈｅｒｅｓ（ルミネックス、Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘａｓ）に結合した合成ペプチド（配列番号１のアミノ酸４６〜５６）に対して生じたマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、および合成ペプチド（配列番号１のアミノ酸６７〜７８）に対して生じたビオチン化ヒツジポリクローナル抗体（ｐＡｂ）からなる。合成ペプチド（配列番号１のアミノ酸４６〜１０２）を、標準物質として使用した。ｘＰｏｎｅｎｔ  ４．２システム（ルミネックス、Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘａｓ）でＭＡｇＰｉｘにおいて、試料を測定した。ＪＭＰ−１２（ＳＡＳ統計ソフトウエア、英国）からの５つのパラメーターロジスティック回帰分析を使用して、データを解析した。
【０２２６】
血清乳酸レベルを、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（メラン、フランス）のｅ５０１モジュールアナライザーを使用した比色分析アッセイにより測定した。乳酸についての参照限界は、０．５〜２．２ｍｍｏｌ／Ｌであった。
【０２２７】
統計的分析
ソフトウエアＲ３．０．２を使用して、全ての分析を行った。データを、括弧内の平均および四分位範囲［ＩＱＲ］として表す。全ての分析したバイオマーカーは、高度に右に斜行した分布を示すので、モデルフィットに対する極値の衝撃を低下するために、回帰モデルへの包含に先立ち、値をｌｏｇ10変換した。
【０２２８】
定量限界（ＬｏＱ）未満の値を、ＬｏＱ未満の小さな値で置き換えた。見当たらない値は置き換えなかった。それぞれのモデルは、モデルにおける全ての変数についての完全なデータを有する全ての患者を含む。Ｐ値＜０．０５を、有意とみなした。ボックスプロットにおけるボックスは、より低いおよびより高い四分位、ならびに平均（太字）を示す。髭は、箱から１．５倍未満広い四分位範囲（ＩＱＲ）である最も極値データまで拡大する。要点を超えた全てのデータポイントを、異常値として表す。ｌｏｇ10変換したバイオマーカー値（臨床スコアを変換しない）においてＡＮＯＶＡを使用して群間比較を行う。テューキー正有意差を使用して、ｈｏｃ後比較を解析する。二値結果変数について、ロジスティック回帰モデルを使用する。提示した結果は、ネスト尤度比−χ2検定（Ｌ．Ｒ．χ2およびｐ値）ならびにＣ指数（Ｈａｒｒｅｌ）である。
【０２２９】
ヨーデン指標の最大化を介して、典型的なカットオフを最適化し、「感度＋特異性−１」として定義する。Ｒライブラリー「最適カットポイント」を使用して、カットオフ最適化を行った。
【０２３０】
結果
研究集団は、２３７人の患者を含むものであった。死亡率データの文書化と相反することに起因して、２人の患者（１人の患者がＳＩＲＳを有せず、１人が敗血症患者）を分析から除外しなければならなかった。１７２人の患者（７３％）が、重症敗血症または敗血性ショックを示し、１５人の患者（６％）がＳＩＲＳを有し、４９人の患者（２１％）が、ＳＩＲＳを有しない。中央の年齢は、６７［５９〜７７歳］歳であった。患者の大部分は、男性であった（６０％）。最も頻繁に背景にある状態は、心血管疾患（３５％）、糖尿病（３１％）および悪性腫瘍（２７％）、続いて、呼吸器系疾患（１６％）、肝疾患（１２％）、腎疾患（１２％）および免疫抑制（７％）であった。感染の最も頻繁な部位は、下気道（４６％）および尿路（４５％）であった。入院時に、ＳＡＰＳ  ＩＩスコア（例えば、中央値５６［４０〜６９］ポイント）およびＳＯＦＡスコア（例えば、中央値９［６〜１２］ポイント）が増加した。観察した臓器不全は、最も頻繁には、呼吸不全（６１％）、循環性ショック（５６％）および腎不全（４１％）であった。したがって、多くの患者は、ＩＣＵ入院中、人工呼吸（ＭＶ）（７８％）、血管収縮性（６８％）および腎置換療法（ＲＲＴ）（３７％）を必要とした。全ての原因ＩＣＵ死亡率は３２％であり、ＩＣＵ入院の長さの中央値は、５．４［２．５〜１０．６日］日であった。
【０２３１】
臓器不全を有する患者、故に、上で記載した重症敗血症および敗血性ショックを有する１７２人の患者に、以下の分析を限定する。全ての図および表において、急性臓器不全の数（１、２、３、４、５または６／７）に従い、患者をグループ化する。
【０２３２】
異なる選択したバイオマーカーおよび臨床スコアは、重症患者における臓器不全の増加する数と異なって相関する。４つ以上の臓器不全を示している対象において、ヒストンのレベルは有意に増加した（図１Ａ〜１Ｄ）。したがって、対象における臓器不全の数とヒストンのレベルの間で相関が存在する。ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４、ならびにアルドラーゼＢは、比較した１つ、２つまたは３つの臓器不全を有する対象を区別する際に試験した他のバイオマーカーより劣る（以下を参照）。
【０２３３】
さらに、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ（図１Ｅ）のレベルまたはコペプチンのレベルは、臓器不全の上昇する数（例えば、１から４つの臓器不全）に伴い増加した。したがって、対象における臓器不全の数とＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのレベルの間で相関が存在する。しかしながら、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよびコペプチンは、ヒストンと比較して、複数の不全、例えば、４、５または６／７つの臓器を有する対象間を区別する際に劣る（図１Ｅ）。乳酸としてのさらなるバイオマーカーおよび２つの臨床スコアＳＯＦＡおよびＳＡＰＳ  ＩＩについて、それぞれの割り当てた臓器不全の群についてのこれらの中央値レベルは、１〜６／７つの臓器不全の全範囲と正に相関する（図１Ｆ）。
【０２３４】
臓器不全の群を比較するとき、ＰＣＴおよびコペプチンは、例えば、１つの臓器不全対３または４つの臓器不全、ｐ値＜０．０５により表される統計的有意で少量の臓器不全を有する患者の区別において能力がある（表１）。
【０２３５】
ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、乳酸、ＳＡＰＳ  ＩＩおよびＳＯＦＡスコアは、広い範囲を有し、異なる数の臓器不全を有する患者の区別において能力を有する（表１）。１または２つの臓器不全を最大５つの臓器不全と比較するとき、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４ならびにアルドラーゼＢは劣る。ヒストンは、コペプチン、乳酸、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよびＰＣＴのような、他のバイオマーカーが劣っている、３つ対４つの臓器不全の群に患者を分ける際に有意な値である（表１）。
【０２３６】
表１：選択したバイオマーカーおよび臨床スコアについての臓器不全の数の間での対群比較
それぞれのバイオマーカー／スコアについてのＰ値を、示した通り、１、２または３つの臓器不全（ＯＦ）対２、３、４、５または６／７つのＯＦの比較のため与える（テューキー検定を使用したｈｏｃ後解析）。ｐ値＜０．０５を有する統計上有意なバイオマーカー／スコアを、群比較に従い、グレイでハイライトを付ける。
【０２３７】
【表１】
2019525184.tif 000003
【０２３８】
より大きい数のＯＦを有するものから最大３つのＯＦを有する患者を区別するためのバイオマーカー／スコアの予測値を、ロジスティック回帰モデルにより計算した。臨床スコアを別にし、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ、乳酸およびヒストンＨ２Ｂは、最善の予測結果を示した（表２Ａ）。
【０２３９】
加えて、さらなるマーカー（追加マーカー）の決定は、対象における臓器不全の予測をさらに改善し得る（表２Ｂ）。例えば、ＳＯＦＡスコアまたはＳＡＰＳ  Ｉｉスコアは、ヒストンまたはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのような利用した単一のマーカーの予測を改善した。加えて、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭおよびヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４）の組み合わせは、単一のマーカーとして使用したこれらのマーカー、すなわち、例えば、Ｈ２ＢまたはＭＲ−ｐｒｏＡＤＭのみの決定の予測に対する比較における臓器不全の予測をさらに改善した。解析はまた、３つの最も性能のよい単一のマーカー／スコア（ＳＯＦＡ、ＳＡＰＳ  ＩＩ、ＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）に追加した最善のマーカーが、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ４およびアルドラーゼＢを含むことも示した（表２Ｂ）。
【０２４０】
４つ以上のＯＦを有する患者の予測についての特異性はまた、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２ＢおよびアルドラーゼＢについて最大であり（それぞれ、９２．３９％、８８．０４％、９１．３０％）、所定のカットオフ（参照レベル）について表３において示す通り、それぞれ、４５．００％、５１．２５％および４５．００％の感度により達成される。かかるカットオフレベルまたは参照レベルを、質量分析により決定した。加えて、ヒストンＨ４の典型的な参照レベルをまた、イムノアッセイ（ＩＡ）により決定した（表４）。イムノアッセイを使用して決定したこれらのレベルの特異性ならびに感度は、質量分析により決定した参照レベルと比較可能な高さであった。例えば、３５ｎｇ／ｍｌの参照レベルは、＞８０％の特異性および５３％の感度を明らかにした（表４）。それぞれ、７６．０９％、７２．８３％および５８．６２％の対応する特異性を有する臨床スコアＳＯＦＡおよびＳＡＰＳ  ＩＩまたはコペプチン（それぞれ、８７．５０％、８５．００％、７８．２１％）を使用することにより、最高感度を達成する（表３）。
【０２４１】
表２：単一のバイオマーカー／スコアモデル（２Ａ）ならびに２つのバイオマーカー／スコアの組み合わせ（２Ｂ）についての＞４つ以上のＯＦの結果についてのロジスティック回帰。
それぞれの挙げたバイオマーカー／スコアについて、以下のモデル特徴：解析のための患者の数、結果４つ以上のＯＦを有する患者の数、尤度比χ２ならびにＣ指数を示す。最大値から最小値までの範囲にある尤度比により、リストを分類する。これらの表中の全てのモデルについてのｐ値は、＜０．００１である。２つのバイオマーカー／スコアの組み合わせを含む二変数モデル（表２Ｂ）について、対応する単変量モデルに追加した（Ｌ．Ｒ．χ２＞７の増加）全てのモデルを示す。表を、表２Ａ由来の３つの最善の単一モデル（ＳＯＦＡ、ＳＡＰＳ  ＩＩおよびＭＲ−ｐｒｏＡＤＭ）に限定する。これらのマーカー／スコアのそれぞれについて、３つの最善の追加モデルに灰色でハイライトを付ける。
【０２４２】
【表２Ａ】
2019525184.tif 000004
【０２４３】
【表２Ｂ】
2019525184.tif 000005
【０２４４】
表３：４つ以上のＯＦの予測のためのバイオマーカーおよび臨床スコアについてのカットオフ
所定のカットオフ以上のバイオマーカーレベル／スコア値を決定し、示した感度および特異性（ＰＰＶ：正の予測値；ＮＰＶ：負の予測値）で患者についての４つ以上のＯＦを予測する。参照レベル（カットオフ）の単位を示す。質量分析により決定した参照レベルを、任意単位（ＡＵ）として提供する。
【０２４５】
【表３】
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【０２４６】
表４：４つ以上のＯＦの予測のためのヒストンＨ４についてのカットオフ（参照レベル）
所定のカットオフ以上のヒストンＨ４レベル／スコア値を決定し、示した感度および特異性（ＰＰＶ：正の予測値；ＮＰＶ：負の予測値）で患者についての４つ以上のＯＦを予測する。質量分析（ＭＳ）またはイムノアッセイ（ルミネックス）技術を使用して、患者由来の試料を測定することにより、ヒストンＨ４レベルを得た。ＭＳにより決定した参照レベルを、任意単位（ＡＵ）として提供し、イムノアッセイ（ルミネックスまたはＩＡ）により決定した参照レベルを、ｎｇ／ｍｌとして提供する。
【０２４７】
【表４】
2019525184.tif 000007
【０２４８】
本明細書において引用された全ての参考文献は、参照により完全に組み込まれる。
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Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｒ．Ｍｏｒｅｎｏ（２０１０）．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １４（２）：２０７．
Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｒ．Ｍｏｒｅｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２２（７）：７０７−７１０．
Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．Ｌ．，Ｙ．Ｓａｋｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ３４（２）：３４４−３５３．
【図１Ａ】
2019525184.tif 000008
【図１Ｂ】
2019525184.tif 000009
2019525184.tif 000010
【図１Ｃ】
2019525184.tif 000011
【図１Ｄ】
2019525184.tif 000012
【図１Ｅ】
2019525184.tif 000013
【図１Ｆ】
2019525184.tif 000014
【配列表】
2019525184000001.app
【国際調査報告】
2019525184.tif 000015
2019525184.tif 000016
2019525184.tif 000017
2019525184.tif 000018
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