(57)【要約】単一細胞刺激摂動応答に基づく標的化療法のためのシステムおよび方法。一実施形態において、刺激の組合せを療法に対して最適化する方法は、細胞試料を受け取ること、細胞試料における異なる部分を、複数の刺激の各々について複数の刺激のうちの１つによって処置することにより、細胞試料を複数の刺激によって処置すること、細胞試料を複数の金属コンジュゲートプローブで標識すること、質量分析計を使用して細胞試料を分析すること、質量分析計から質量分析データを得ること、質量分析データを使用して細胞試料内におけるサブ集団を同定すること、刺激効果を計算すること、質量分析データを使用してネストされた効果モデルを生成すること、およびコンピュータデバイスの使用により、複数の刺激から作られる組合せである刺激の組合せをスコア付けすることを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激の組合せを療法に対して最適化する方法であって、
細胞試料を受け取ること；
前記細胞試料の異なる部分を、複数の刺激の各々について前記複数の刺激のうちの１つによって処置することにより、前記細胞試料を前記複数の刺激によって処置すること；
前記細胞試料を、一組のマーカーに対応する複数の金属コンジュゲートプローブで標識すること；
質量分析計を使用して前記細胞試料を分析すること；
前記質量分析計から、摂動応答を記述する質量分析データを得ること；
コンピュータデバイスの使用により、前記質量分析データを使用して前記細胞試料内におけるサブ集団を同定すること；
前記コンピュータデバイスの使用により、刺激効果を計算すること；
前記コンピュータデバイスの使用により、前記質量分析データおよび計算された刺激効果を使用して、前記サブ集団にわたって前記複数の刺激と前記一組のマーカーの間の関係を表すネストされた効果モデルを生成すること；ならびに
前記コンピュータデバイスの使用により、前記複数の刺激から作られる組合せである刺激の組合せをスコア付けすること
を含む方法。
【請求項２】
前記ネストされた効果モデルが有向グラフとして表される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サブ集団が決定木を使用して同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激効果が線形モデルを使用して計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記刺激効果がベイズ分析を使用して計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記一組のマーカーが、
少なくとも１つの細胞系譜マーカー；
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達マーカー；および
少なくとも１つの細胞死マーカー
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞試料から、既にアポトーシスに方向付けられた細胞を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が決定木を使用して除去される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激の組合せが、所望効果を最大化しながら前記刺激の組合せにおける刺激の量を最小化することに基づくことを使用してスコア付けされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記計算された刺激効果を事前知識に基づいて重み付けすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
刺激の組合せを療法に対して最適化するシステムであって、
プロセッサ；
前記プロセッサに接続されており、アプリケーションを記憶するように構成されているメモリであって、前記アプリケーションが、
前記質量分析計から、一組のマーカーに対応する複数のプローブで標識された細胞試料の摂動応答を記述する質量分析データを得る；
前記質量分析データを使用して、前記細胞試料内においてサブ集団を同定する；
刺激効果を計算する；
前記質量分析データおよび計算された刺激効果を使用して、前記サブ集団にわたって前記複数の刺激と前記一組のマーカーの間の関係を表すネストされた効果モデルを生成する；ならびに
前記複数の刺激から作られる組合せである刺激の組合せをスコア付けする
ように、前記プロセッサを構成する、メモリ
を含むシステム。
【請求項１２】
前記ネストされた効果モデルが有向グラフとして表される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
サブ集団が決定木を使用して同定される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記刺激効果が線形モデルを使用して計算される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
前記刺激効果がベイズ分析を使用して計算される、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１６】
前記一組のマーカーが、
少なくとも１つの細胞系譜マーカー；
少なくとも１つの細胞内シグナル伝達マーカー；および
少なくとも１つの細胞死マーカー
を含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記刺激の組合せが、所望効果を最大化しながら前記刺激の組合せにおける刺激の量を最小化することに基づくことを使用してスコア付けされる、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１８】
前記アプリケーションが、前記計算された刺激効果を事前知識に基づいて重み付けするように、前記プロセッサをさらに構成する、請求項１１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって支援された研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された契約ＣＡ１４９１４５の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、標的化療法を生成することに関し、より具体的には、最適化された刺激の組合せ戦略に関する。
【背景技術】
【０００３】
個別の悪性腫瘍は、別個の分子的および表現型的特徴を有する単一細胞の不均一な集合体から構成され、これは腫瘍内不均一性と呼ばれる現象である。腫瘍内不均一性は、刺激抵抗性を克服することに対する決定的な障壁としてますます認識されつつある。組合せ刺激療法は、腫瘍の進行を維持する複数のシグナル伝達経路および制御経路を標的とすることによってがん治療を改善する見込みがある治療選択肢である。この種の刺激レジメンは、単独療法に対する刺激抵抗性が腫瘍内不均一性に帰するところが大きいという概念に基づく。したがって、標的とする腫瘍に対する組合せ刺激レジメンを開発する場合は、標的とする腫瘍における腫瘍内不均一性を考慮に入れることが重要である。さらに、可能なＦＤＡ承認薬の数が増加するのにつれて、この不均一性のレベルを説明する組合せ戦略を同定する系統的なアプローチが急務となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
刺激の組合せを療法に対して最適化する方法であって、細胞試料を受け取ること、細胞試料における異なる部分を、複数の刺激の各々について複数の刺激のうちの１つによって処置することにより、細胞試料を複数の刺激によって処置すること、細胞試料を、一組のマーカーに対応する複数の金属コンジュゲートプローブで標識すること、質量分析計を使用して細胞試料を分析すること、質量分析計から、摂動応答を記述する質量分析データを得ること、コンピュータデバイスの使用により、質量分析データを使用して細胞試料内におけるサブ集団を同定すること、コンピュータデバイスの使用により、刺激効果を計算すること、コンピュータデバイスの使用により、質量分析データを使用して、サブ集団にわたって複数の刺激と一組のマーカーの間の関係を表すネストされた効果モデルを生成すること、ならびにコンピュータデバイスの使用により、複数の刺激から作られる組合せである刺激の組合せをスコア付けすることを含む方法である。
【０００５】
本詳細な説明および特許請求の範囲は、以下の図面を参照することによってさらに完全に理解されるが、これらは本発明の例示的な実施形態として提示されるものであり、本発明の範囲の完全な記載として解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、本発明の実施形態に従う、刺激の組合せを最適化する原理を概念的に図示する。
【０００７】
【図２】図２は、本発明の実施形態に従う、最適な刺激の組合せを選択するプロセスを概念的に図示する。
【０００８】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、本発明の実施形態に従う、刺激の組合せをスコア付けおよびランク付けするためのＣＣＡＳＴならびにネストされた効果モデルの使用を概念的に図示する。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｃは、本発明の実施形態に従う、刺激の組合せをスコア付けおよびランク付けするためのＣＣＡＳＴならびにネストされた効果モデルの使用を概念的に図示する。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、本発明の実施形態に従う、刺激の組合せをスコア付けおよびランク付けするためのＣＣＡＳＴならびにネストされた効果モデルの使用を概念的に図示する。
【０００９】
【図４】図４は、本発明の実施形態に従う、３つの刺激のための完全なモデルパラメータ化を概念的に図示する。
【００１０】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、本発明の実施形態に従う刺激の分析を概念的に図示する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、本発明の実施形態に従う刺激の分析を概念的に図示する。
【００１１】
【図６ＡＢＣ】図６Ａ〜６Ｄは、本発明の実施形態に従う、単一刺激候補のパネルを受けているＨｅＬａ細胞に対して実施された分析を図示する。
【図６Ｄ】図６Ａ〜６Ｄは、本発明の実施形態に従う、単一刺激候補のパネルを受けているＨｅＬａ細胞に対して実施された分析を図示する。
【００１２】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜７Ｇは、本発明の実施形態に従うＨｅＬａ細胞の単一細胞摂動データを図示する。
【図７ＣＤＥ】図７Ａ〜７Ｇは、本発明の実施形態に従うＨｅＬａ細胞の単一細胞摂動データを図示する。
【図７ＦＧ】図７Ａ〜７Ｇは、本発明の実施形態に従うＨｅＬａ細胞の単一細胞摂動データを図示する。
【００１３】
【図８ＡＢ】図８Ａ〜８Ｇは、本発明の実施形態に従う、単一細胞レベルにおいて、ＮＡＬＭ６細胞系および２つの前駆Ｂ細胞フィラデルフィア染色体陽性Ｐｈ＋ＡＬＬ小児患者試料に対して実施された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激摂動分析を図示する。
【図８ＣＤ】図８Ａ〜８Ｇは、本発明の実施形態に従う、単一細胞レベルにおいて、ＮＡＬＭ６細胞系および２つの前駆Ｂ細胞フィラデルフィア染色体陽性Ｐｈ＋ＡＬＬ小児患者試料に対して実施された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激摂動分析を図示する。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｇは、本発明の実施形態に従う、単一細胞レベルにおいて、ＮＡＬＭ６細胞系および２つの前駆Ｂ細胞フィラデルフィア染色体陽性Ｐｈ＋ＡＬＬ小児患者試料に対して実施された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激摂動分析を図示する。
【図８ＦＧ】図８Ａ〜８Ｇは、本発明の実施形態に従う、単一細胞レベルにおいて、ＮＡＬＭ６細胞系および２つの前駆Ｂ細胞フィラデルフィア染色体陽性Ｐｈ＋ＡＬＬ小児患者試料に対して実施された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激摂動分析を図示する。
【００１４】
【図９】図９は、本発明の実施形態に従う、ＮＡＬＭ６細胞系および２つの前駆Ｂ細胞フィラデルフィア染色体陽性Ｐｈ＋ＡＬＬ小児患者試料からの基礎細胞に対するＳＰＡＤＥ分析を図示する。
【００１５】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の実施形態に従う、ＮＡＬＭ６細胞系ならびに患者試料ＵＰＮ１およびＵＰＮ７のための決定木を図示する。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の実施形態に従う、ＮＡＬＭ６細胞系ならびに患者試料ＵＰＮ１およびＵＰＮ７のための決定木を図示する。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、本発明の実施形態に従う、ＮＡＬＭ６細胞系ならびに患者試料ＵＰＮ１およびＵＰＮ７のための決定木を図示する。
【００１６】
【図１１】図１１は、基礎集団（すなわち、処置を受けない集団）と比較した、すべての阻害剤からの主要なサブ集団の細胞のパーセンテージを比較する棒グラフを図示する。
【００１７】
【図１２ＡＢ】図１２Ａ〜１２Ｄは、３０人の患者試料に対して実行された感度分析を図示する。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｄは、３０人の患者試料に対して実行された感度分析を図示する。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、３０人の患者試料に対して実行された感度分析を図示する。
【００１８】
【図１３】図１３Ａは、単一刺激および刺激の組合せの両方に曝露された３つの細胞系のための生存曲線を図示する。図１３Ｂは、３つの細胞系にわたる刺激の組合せの相乗効果の定量化を図示する。
【００１９】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、本発明の実施形態に従って、所望の細胞内効果に基づいて刺激の組合せを最適化することを概念的に図示する。
【００２０】
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、本発明の実施形態に従って、所望の細胞内効果に基づいて刺激の組合せを最適化することを概念的に図示する。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄは、本発明の実施形態に従って、所望の細胞内効果に基づいて刺激の組合せを最適化することを概念的に図示する。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、本発明の実施形態に従って、所望の細胞内効果に基づいて刺激の組合せを最適化することを概念的に図示する。
【００２１】
【図１５】図１５は、本発明の実施形態に従う、質量分析データを獲得および分析するためのデータ分析システムのシステム図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
次に図面を参照すると、特定の患者の腫瘍における腫瘍内不均一性を説明する最適な刺激の組合せを選択するためのシステムおよび方法が開示される。多くの実施形態において、がん細胞系および個別の患者試料を含むがこれらに限定されない単一の試料に対して、標的化された単一刺激のパネルを適用することによって生成されたデータに基づいて、個別化された刺激の組合せが決定される。一部の実施形態において、入力データセットから腫瘍の悪性サブ集団を同定して、腫瘍内不均一性を定義し、それによって、刺激の存在下対非存在下において、不均一な腫瘍における複雑なシグナル伝達変化を解明する。サブ集団が同定されると、サブ集団ｋにおいて刺激Ｓｊが細胞内マーカーＭｉを変化させた確率によって、刺激効果を計算することができる。いくつかの実施形態において、これらの計算は、線形モデルを使用して実施される。様々な実施形態において、これらの計算はベイズ分析を使用して実施される。これらの確率、ネストされた効果モデル、またはネストされた効果ネットワークを考慮し、すべての刺激にわたって、すべてのサブ集団にわたる各マーカーのための効果の統合を作成することができる。ネストされた効果モデルはグラフィカルネットワークとして表すことができ、ここでノードは刺激であり、エッジは共有された効果に関する。すべての刺激の組合せは、その後、ネストされた効果モデルに基づいて、スコア付けおよびランク付けすることができる。種々の実施形態において、より少ない刺激は処置に関連する毒性およびコストを低下させるという仮定の下に、刺激の組合せをランク付けして、最大所望効果をもたらす最小数の刺激を選択する。これらのスコアに基づいて、医師は、個別の患者の腫瘍の処置のために特異的に標的化された刺激の組合せを含む処置のレジメンを開始することができる。当業者は容易に認識することができるように、刺激とは、細胞における応答をもたらすことができる多数の化合物のいずれかを意味することができ、たとえば薬物、生体分子、または所定の適用の要件に応じたあらゆる他の刺激であるが、これらに限定されない。特定の議論は、刺激として薬物を使用することに向けられ得るが、以下に記載されるシステムおよび方法は、所定の適用に従うあらゆる数の刺激と共に使用することができる。
【００２３】
多くの実施形態において、単一細胞薬物スクリーニング摂動データおよびネストされた効果モデルを使用して、腫瘍の腫瘍内不均一性をも考慮に入れつつ、単一腫瘍のための最適な薬物の組合せを同定する。最適な薬物の組合せ戦略を同定することで、以下の２つのタイプの腫瘍内不均一性：（１）平均および分散の形態における、単一腫瘍試料内のバイオマーカー応答の分布における変動、ならびに（２）薬物摂動に対して異なった応答をする別個の腫瘍サブ集団からの不均一性を説明することができる。一部の実施形態において、より少ない薬物は処置に関連する毒性およびコストを低下させるという仮定の下に、最大所望効果をもたらす最小数の薬物を含有するように、同定された薬物の組合せが最適化される。他の実施形態において、同定された薬物の組合せは、最大所望効果をもたらし、その一方で、より一般的に製剤化された薬物の組合せによる不利な副作用を回避するように最適化される。
【００２４】
薬物の組合せを最適化する原理の概念図を、図１に示す。単一細胞レベルにおける潜在的な組合せ療法の応答は、単一細胞において、可能性のある種々の所望効果を生じることができる。たとえば、緑＋赤の薬物の組合せ１０２の投与は、（ｉ）素集合１０４、（ｉｉ）上位集合１０６、１０８、（ｉｉｉ）積集合１１０、または（ｉｖ）優越集合１１２、１１４である細胞内効果を生じ得る。これらの結果から、単一細胞を根絶するためには、単一薬物（細胞内効果１０６、１０８、１１２、および１１４の場合）または両方の薬物（細胞内効果１０４および１１０の場合）のいずれかが必要となり得ると推論できる。腫瘍は細胞型の集合体であることから、個別の患者の腫瘍のための最適な薬物の組合せを同定するためには、細胞型にわたる集約が必須となり得る。たとえば、赤、緑および青の標的を含むがん細胞の全集団１１６を、緑＋赤の薬物１１８のみを使用して標的化することは、固有の青の標的１２０を含む細胞を取り逃がし得るものであり、このため、３つすべての薬物１２２を使用することが必須となる。しかし、青の効果が、緑および赤の効果と共有されていれば、２つの薬物１２６のみを使用することと比較して、３つすべての薬物１２４は準最適である。
【００２５】
多くの実施形態において、単独療法のパネルに対する単一細胞摂動応答が入力データとして使用され、薬物のネストされた効果モデル、およびスコア付けされてソートされた薬物の組合せリストが、出力として返される。他の実施形態において、薬物の組合せデータもまた使用され、相乗的な薬物の組合せ効果は、ネストされた効果モデルのフレームワーク内で説明することができる。単独療法の前後に、細胞内シグナル伝達マーカーに伴うデータの形態として収集された摂動薬物応答は、薬物有効性を代理する役割を果たすと仮定することができる。いくつかの実施形態において、数多くの単独療法にわたって、単一腫瘍の薬物誘導性摂動応答を表すデータが、質量分析法（飛行時間型サイトメトリーまたは「ＣｙＴＯＦ」としても公知である）を使用して収集され、これは、従来の蛍光ベースのフローサイトメトリーの細胞分析原理を、誘導結合プラズマ質量分析法の選択力および定量化力と組み合わせる技術である。ＣｙＴＯＦは、処置前および処置直後において、試料中の数百から数千の細胞について、単一細胞レベルで細胞内マーカーおよび表面マーカーを測定することができる多重パラメータの単一細胞技術である。質量分析システムにおいて、単一細胞は、希土類金属の安定な同位体にタグ付けされた抗体によって標識することができる。金属キレート化抗体は、異なる金属タグの間における最小のシグナル補償を必要とすることができ、これは単一細胞に対する数多くの独立した測定を可能にする。データ獲得の間、金属タグの検出は、たとえば薬物誘導性摂動応答に伴うバイオマーカーであるがこれらに限定されない様々な目的のバイオマーカーの存在の代理としての役割を果たすことができる。当業者は容易に認識することができるように、このデータ獲得方法は、ステップや順序を変動させることができる。そのため、所定の適用の要件に応じて、あらゆるデータ獲得方法を使用することができる。
【００２６】
本発明の実施形態に従う有効な薬物の組合せを選択するための１つのプロセスを、図２において図示する。図示された実施形態における方法２００は、薬物処置前後において、単一腫瘍からの細胞の試料セットに対する質量分析データを収集すること（２０２）を含む。データは、細胞または事象を表す行、ならびに目的の表面マーカーおよび細胞内マーカーに対応する列を備えたデータフレームとして、フローサイトメトリー標準（「ＦＣＳ」）ファイルに記憶することができる。多くの実施形態において、単一細胞データは、一組のマーカーについて収集される。このマーカーの組は、たとえば細胞系譜マーカー、細胞内シグナル伝達マーカー、および細胞死マーカーであるがこれらに限定されない異なるタイプのマーカーを含むことができる。腫瘍内不均一性を説明するために、単一腫瘍内において、サブ集団を同定することができる（２０４）。多数の実施形態において、サブ集団は、少なくとも１つの細胞系譜マーカーを使用して同定される。マーカーの組が細胞死マーカーを含む場合、アポトーシスに完全に方向付けられた細胞からのデータを、データセットから任意選択で除去（２０６）することができる。少なくとも１つの細胞死マーカーを使用して、そのような細胞を同定し、ゲーティングすることができる。細胞内シグナル伝達マーカーにおける変化を使用して、各別個のサブ集団内における処置前後の摂動効果を定量する（２０８）ことができる。多数の実施形態において、細胞内シグナル伝達マーカーは、各別個のサブ集団内における薬物処置前後の摂動効果を同定するために使用される。多くの実施形態において、シグナル伝達マーカーは、マーカーがそのベースライン（薬物処置なし）発現に対して差次的に発現されている確率によって定量される。各サブ集団における各マーカーについてのこれらの効果の確率を考慮すると、次のステップは、薬物のネストされた効果モデルを作成すること（２１０）であり、これはすべての薬物にわたって、すべてのサブ集団にわたる各マーカーについての効果を統合する。次に、薬物のネストされた効果モデルに基づいて、すべての薬物の組合せをスコア付けし（２１２）ランク付けすることができる。異なるランク付けレジメンを使用することができる。一部の実施形態において、本方法は、個別の腫瘍のための所望効果を最大化し、および／またはあらかじめ決められた閾値を上回る効果を達成する薬物の最小の組合せを同定するために、薬物の組合せをランク付けする。ある特定の実施形態において、選択プロセスはさらに、個別の薬物および／または薬物の組合せの公知の副作用を、望ましくない効果として重み付けして考慮することができる。小さなモデルネットワーク（たとえばｎ≦５ノード）については、薬物の組合せをスコア付けするためのネットワークの最適化を、徹底的に行うことができる。より大きなネットワークについては、欲張り探索ヒューリスティックスを含む（がこれに限定されない）プロセスを使用して、ネットワーク再構築法を実行することができる。
【００２７】
図２は、最適な薬物の組合せを同定するための例示的な方法を図示しているものの、最適な薬物の組合せを同定するための方法は、上記に概説したステップに限定されるものではないこと、および、本発明の実施形態に従って、特定の適用の要件に応じて、有効な薬物の組合せを同定するために、単一細胞摂動データを分析するあらゆる他の方法を利用できることを、当業者は理解し得る。たとえば、図２に記載されたプロセスは、ＭＣＭだけではなく、あらゆる他の高次元の単一細胞薬物処置応答データセットへと拡張し、適用することができる。サブ集団の同定、ネストされた効果モデリング、ならびに薬物の組合せのスコア付けおよびランク付けのさらなる詳細を、以下に議論する。
サブ集団の同定
【００２８】
本発明の多くの実施形態に従う方法は、単一薬物に対して異なった応答をするサブ集団から、単一の腫瘍が構成されているという可能性を説明する。様々な実施形態において、サブ集団は手動ゲーティングを通じて同定される。他の実施形態において、教師なしサブ集団同定アルゴリズムを含むがこれに限定されない自動化プロセスを使用して、サブ集団を同定する。一部の実施形態において、クラスタリングおよび決定木を含む（がこれらに限定されない）プロセスを使用して、細胞内シグナル伝達の薬物処置摂動分析前後について、相対的に均一なサブ集団を自動的に同定する。クラスタリング、クラス分類、およびソーティングツリー（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  Ｔｒｅｅ）についてＣＣＡＳＴと名付けられた戦略は、単一細胞データからサブ集団を単離するために、データ由来の決定木表現を使用するゲーティング戦略を同定するための、自動化モデルフレームワークとして記述することができ、これは手動ゲーティングと比較してより大きな均一性を有する。決定木はさらに、すべての試料を１つのデータ行列にプールすること、およびプールされたデータにＣＣＡＳＴを適用することによって、処置試料にわたって、対応する均一なパーティションをマッチするために使用することができる。サブ集団の純度は、クラスタリングのために選択された細胞系譜マーカーに依存することができる。各集団について、ＣＣＡＳＴは、さらに、アポトーシスが開始された細胞をゲートアウトし、そのシグナル伝達がアポトーシス前応答の情報を与えると考えられる、生存している細胞を残すことができる。多くの実施形態において、あらかじめ特定された細胞死マーカーを使用して、アポトーシス細胞をゲートアウトする。他の実施形態において、統計的に最も有意な細胞死マーカーを使用する。
【００２９】
図３Ａは、仮説的質量分析データセット上で、サブ集団を同定することにおけるＣＣＡＳＴの使用を図示する。例示的な実施形態において、個別の試料は、未処置（基礎状態）およびそれに続く３つの仮説的薬物Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３の各々による処置の下において分析する。各条件下で、単一細胞データを、１細胞あたりで測定された６つの仮説的マーカーＭ１〜Ｍ６について収集する。入力データセットは、ＣｙＴＯＦによって作成されたＦＣＳファイルのフォーマットであり、ここで行は細胞または事象を表し、列は目的のマーカーに対応する。各ＦＣＳファイルまたはデータ行列は、単一の摂動に対応し得る。４つの異なるデータフレームは、４つの異なる状態における細胞のマーカーの測定を示し、これはベースライン３０２（薬物処置前）、薬物Ｓ１の処置後３０４、薬物Ｓ２の処置後３０６、および薬物Ｓ３の処置後３０８を含む。次いで、ＣＣＡＳＴは、すべての条件（基礎および薬物処置されたもの）にわたって、すべての単一細胞データを、単一データフレーム３１０へとプールする（細胞系譜マーカーのみが示される）。次に、細胞系譜マーカーＭ４およびＭ５を使用して、サブ集団を同定する。図示された実施形態において、決定木３１２を使用して３つのサブ集団を同定するが、これらは緑、赤、および青として色分けされる。多くの場合において、各サブ集団内でアポトーシス細胞に対して非アポトーシス細胞を同定することが望ましいが、それは、細胞内シグナル伝達における変化が、アポトーシス細胞対非アポトーシス細胞で異なるからである。図示された実施形態において、細胞死マーカーＭ６を使用して、アポトーシス細胞をゲートアウトする。このゲーティングプロセス３１４は、決定木におけるさらなる枝として描写することができる。同定およびゲーティングステップの後、各非アポトーシスサブグループにおける各マーカーについてのシグナル伝達発現測定を、データフレーム３１６へと要約するが（図３Ｂに示される）、これは細胞内マーカー（Ｍｉ）に対応する行、および処置（基礎を含む）に対応する列を備える。サブ集団ｋに対する薬物Ｓｊ条件からの、各マーカーＭｉについてのシグナル伝達発現測定は、Ｍｉｊｋと表示することができる。各サブ集団における各マーカーについて、細胞は、各薬物処置の下で複製データを形成することができ、このことは、各サブ集団からのシグナル伝達マーカー発現の平均化、および線形モデルを使用する各マーカーについての異なる処置効果の統計的検定を可能にする。
【００３０】
図３Ａは、単一腫瘍内におけるサブ集団を同定する例示的な方法を図示しているものの、サブ集団を同定する方法が、上記に概説したステップによって限定されるものではないこと、および、本発明の実施形態に従って、特定の適用の要件に応じてあらゆる他の方法を利用できることを、当業者は理解し得る。
ネストされた効果モデリングを使用する薬物効果モデルの再構築
【００３１】
サブ集団が同定されると、サブ集団ｋにおいて薬物Ｓｊが細胞内マーカーＭｉを変化させた確率に関して、薬物効果を計算することができる。サブ集団ｋに条件付けられた薬物ＳｊによるマーカーＭｉに対する効果の確率は、Ｅｉｊｋによって表すことができる。サブ集団ｋにおける質量分析データに関し、確率は線形モデルを使用して推定することができる。各サブ集団における各マーカーについてのこれらの効果の確率を考慮し、すべての薬物にわたってすべてのサブ集団にわたる各マーカーについての効果を統合する、薬物のネストされた効果モデルを作成することができる。
【００３２】
これらの確率（対数オッズ）を推定するためのそのようなツールの１つは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける「ｌｉｍｍａ」パッケージであり、これはバイオインフォマティクスのためのオープンソースソフトウェアである。各サブ集団について、すべてのマーカーをわたって推定された分散成分を伴う特定のマーカーＭｉについて調整されたｔ統計量から、推定を導くことができる。マーカーが差次的に発現される対数オッズであるｌｉｍｍａからのＢ統計量（ｌｏｄまたはＢ）出力は、サブ集団ｋに対する薬物Ｓｊ条件の下で差次的に発現されるマーカーＭｉの確率Ｅｉｊｋを導くために使用することができる。ＢｉｊｋおよびＥｉｊｋが、それぞれ対数オッズおよび確率推定に対応すると仮定すると、サブ集団ｋにおいて薬物Ｓｊ処置後に差次的に発現されるマーカーＭｉについては
【数１】
2019518934.tif 000003
である。
これは以下を意味する。
【数２】
2019518934.tif 000004
【００３３】
多くの実施形態において、ネストされた効果モデリングを使用して、サブ集団にわたって薬物およびマーカーの間の関係を表す薬物のグラフィカルモデルを生成する。ネストされた効果モデルは、非転写型シグナル伝達ネットワークに加えて、転写制御ネットワークの分析のために使用することができる。１つのフレームワークにおいて、シグナル伝達経路において摂動を受けた遺伝子はＳ−遺伝子と呼ばれ、その一方で、摂動に応答して発現変化を示す遺伝子はＥ−遺伝子と呼ばれる。このフレームワークにおいて、遺伝子Ｂをサイレンシングすることによって生じる下流効果が、遺伝子Ａをサイレンシングすることによって生じるもののノイズの多いサブセットであるならば、ネストされた効果モデルは、遺伝子Ａが、経路において、遺伝子Ｂの上流に作用すると推論する。要約すれば、ネストされた効果モデルは、有向の、およびおそらくは環状のグラフであることができ、これはＳ−遺伝子を、サブセット関係を表すエッジと結びつける。当業者は容易に認識することができるように、ネストされた効果モデルの方法論は、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのようなバイオインフォマティクスのソフトウェアを含むがこれに限定されない種々のやり方において実行することができる。
【００３４】
上述したネストされた効果モデルのフレームワークを、本発明の多くの実施形態に従う方法に適用し、Ｓ−遺伝子を薬物介入として、Ｅ−遺伝子を標的化された細胞内マーカーとして定義することができる。単一薬物の介入が、Ｓ＝Ｓ１、．．．、Ｓｎによって表示されるのであれば、Ｓ１からＳ２への有向エッジは、薬物Ｓ２によって影響を受けるマーカーが、薬物Ｓ１によっても影響を受けることを示すことができる。これは、薬物のペアに対するサブセット関係を定義することができ、したがって、薬物Ｓに対する部分順序を定義する推移的に閉じたグラフまたは隣接行列として数学的に表された、２つより多い薬物についての推移関係が期待される。効果データＥが、ｍ個のマーカー効果ベクトルを表すＥの行数を伴う２次元データ行列であると仮定すると、ネストされた効果モデルは、推移的に閉じたグラフΦ、およびＥ−マーカー位置Θとして表示される薬物に対する特定の所望効果の割り当てについてのパラメータを含む。具体的には
【数３】
2019518934.tif 000005
であり、ここでＭｉがＳｊに伴うのであれば、θｉ  ∈｛１，…，ｎ｝およびθｉ＝ｊである。図４は、すべてのＥ−マーカー効果位置を含む３つの薬物についての完全なモデルパラメータ化を図示する。ネストされた効果モデルは、薬物介入スキームのいずれにも結びつかない、
【数４】
2019518934.tif 000006
によって表示される付加的なノードを含むことによって、拡張することができる。Ｅ−マーカーはこのノードにリンクすることができるが；それは、これらの効果パターンが、ΦにおけるΘｉのいずれともマッチしない場合である。
【数５】
2019518934.tif 000007
ノードにリンクしたマーカーは、通常、モデルから除外される。
【００３５】
推定された効果データ行列Ｅを考慮して、モデルの尤度を計算し、最大化することができる。所定のネットワークΦは、通常、データＥによって与えられる事後確率、Ｐ（Φ｜Ｅ）を推定することによってスコア付けされる。ベイズの定理に従って、事後確率は
【数６】
2019518934.tif 000008
として記述することができ、
ここでＰ（Ｅ）は規格化定数であり、これはΦに依存しない。その結果、周辺尤度Ｐ（Ｅ｜Φ）は、ネットワーク事前確率Ｐ（Φ）と共に、推論における中心的な役割を果たす。すべてのモデルネットワーク構造に対するしらみつぶし探索は、周辺尤度による各ネットワークのスコア付けに依存することができる。
【００３６】
効果データＥを考慮して、周辺尤度は、全パラメータ空間Θにわたる周辺化を含むことができる。
【数７】
2019518934.tif 000009
【００３７】
周辺尤度Ｐ（Ｅ｜Φ，Θ）は、ネットワークΦを考慮した効果の条件付き独立の仮定、および各効果マーカーベクトルが、ネットワークにおけるたった１つのノードにリンクされているという事実に基づくことができる。Ｐ（Φ，Θ｜Ｅ）についての最大事後確率（ＭＡＰ）の推定は、
【数８】
2019518934.tif 000010
によって示すことができる。
【００３８】
しらみつぶし設定において、グラフΦが最大化されると、Ｅ−マーカー位置Θは最大化することができる。ネットワークモデルΦを考慮して、薬物ＳｊとＥ−マーカーＭｉの間におけるエッジについての事後確率は、式（３）を使用して導かれる。あるいは、ΘおよびΦは共に最大化することができるか、またはそれらの最適パラメータを、ベイズの最大事後確率アプローチによって推定することができる。ほとんどの場合において、Θは迷惑パラメータとして扱われ、これは積分消去されて、摂動空間を予測する。
【００３９】
図３Ａにおける例に加えて、図３Ｂは、データフレーム３１６におけるネストされた効果モデリングを使用する薬物−効果モデルの再構築を図示する。マーカーが、そのベースライン（未処置）発現に対して差次的に発現される確率は、ベイズ線形モデルを使用して、各薬物の下で推定することができる。各サブ集団について、効果の確率行列を作成することができ、ここで白対黒の色分けは、それぞれ、データフレーム３１８に図示されるように、効果なし対効果を表す。一部の実施形態において、効果−確率は、たとえば非アポトーシスサブグループに関する細胞死であるがこれに限定されない所望効果に関する事前知識を使用して重み付けして、重み付けされた効果データフレーム３２０を作成することができる。各サブ集団についての効果の確率行列を使用し、すべてのサブ集団にわたって薬物のネストされた効果モデル３２２を構築することができる。薬物のネストされた効果モデル３２２は、３つすべてのサブ集団にわたって統合された、重み付けされた効果データフレーム３２０からの薬物効果プロファイルを示す。このモデルは、薬物のサブセット関係だけでなく、各薬物に対する効果の割り当てをも捉える。多くの実施形態において、薬物のネストされた効果モデルは、ノードが薬物であり、２つの薬物の間の有向エッジが各薬物に伴う効果のサブセットを捉える表現の形態である。たとえば、薬物のネストされた効果モデル３２２のマッピングは、Ｓ１およびＳ２の両方の下流にＳ３を備えた、Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３の間の有向グラフとして表すことができる。これらの関係は、それぞれ、Ｓ１からＳ３までの、およびＳ２からＳ３までの有向エッジによって表すことができる。要約すれば、薬物Ｓ１およびＳ２の効果は、Ｓ３の効果の上位集合であり、それはＳ３の効果３２４が、Ｓ１およびＳ２の下に包含されるからである。
【００４０】
図３Ｂは、薬物のネストされた効果モデルを作成するための例示的な方法を図示しているものの、薬物のネストされた効果モデルを作成する方法が、上記に概説したステップによって限定されるものではないこと、および、本発明の実施形態に従って、特定の適用の要件に応じて、あらゆる他の方法を利用できることを、当業者は理解し得る。
薬物の組合せのスコア付けおよびランク
【００４１】
多くの実施形態において、単一の腫瘍内におけるすべてのサブ集団にわたって、最も所望される細胞内効果をもたらし得る最小数の薬物を同定することが目的である。１つの方法は、推定された確率効果行列Ｅを考慮した、効果における独立の仮定に基づく。この方法は、あらゆるモデル再構築ステップの必要性を迂回するために、さらにより速いものであると期待されるものの、このアプローチは、基礎をなす薬物効果モデルが、しばしば期待されるようにネストされている場合には、最適ではない可能性がある。別のアプローチは、最大化されたネットワーク
【数９】
2019518934.tif 000011
を使用する薬物−標的効果の階層的性質を考慮に入れ、概して、薬物の組合せにおける期待されたランク付けと予測されたランク付けの間に、最小限のエラーをもたらすことができる。両方の方法を、以下にさらに詳細に議論する。
【００４２】
第１の方法であって、独立スコア法（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｓｃｏｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれるものは、薬物の効果を、独立な確率論的結果として扱う。各細胞内シグナル伝達マーカーＭｉが、データＥｉｊとして表される各薬物介入Ｓｊ下で差次的に発現される確率を考慮すると、Ｚｉｃとして表示される各薬物の組合せについての加法性の下における期待される組合せ効果は、
Ｚｉｃ＝Ｅｉ１＋Ｅｉ２＋・・・＋Ｅｉｒ＋・・・＋Ｅｉ｜ｃ｜−Ｅｉ１Ｅｉ２−Ｅｉ１Ｅｉ｜ｃ｜−Ｅｉ２Ｅｉ｜ｃ｜−・・・−Ｅｉ１Ｅｉ２・・・Ｅｉ｜ｃ｜  （６）
によって与えられ、ここで
【数１０】
2019518934.tif 000012
は、薬物Ｓ１、・・・、Ｓｎについての添字集合｛１，ｏｒｒ｝から生成されたすべての組合せの冪集合の要素に対応し、ここでｒはｃにおけるｒ番目の要素に対応し、｜ｃ｜はｃの濃度である。本発明者らは次いで、有限マーカー集合のＺｉｃ値全体を合計して、
Ｆ（ｃ）＝ΣｉＺｉｃ  （７）
と表示される新たなスコアを生成する。
たとえば｛Ｓ１Ｓ２｝の薬物ペアについては、Ｚｉ｛１，２｝は、Ｅｉ１＋Ｅｉ２−Ｅｉ１Ｅｉ２およびＦ（｛１，２｝）＝ΣｉＥｉ１＋Ｅｉ２−Ｅｉ１Ｅｉ２によって与えられる。観察された組合せ効果を、期待される相加効果と比較することができる場合は、組合せ指数（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）（ＣＩ）として公知である組合せ有効性の標準測度を計算することができ、これは相乗的（ＣＩ＜１）、拮抗的（ＣＩ＞１）または相加的（ＣＩ＝１）性能を示す。薬物ペア｛Ｓ１Ｓ２｝についての組合せ指数ＣＩは
【数１１】
2019518934.tif 000013
である。
【００４３】
所定の薬物Ｓ１、・・・、Ｓｎの集合であって、｛１，ｉｎｄｅ｝と添字付けされるものについては、薬物の組合せの総数は、
【数１２】
2019518934.tif 000014
によって与えられる
【数１３】
2019518934.tif 000015
の濃度に対応する。
【数１４】
2019518934.tif 000016
が、Ｆ（ｃ）によって推定された各薬物の組合せについてのスコアを表すとすると、これらの薬物の組合せについてのスコア付け分布の非減少ランク付けは、
【数１５】
2019518934.tif 000017
によって与えられ、ここでＸ（ｒ）は、
【数１６】
2019518934.tif 000018
についての分布におけるｒ番目の最小値である。独立スコア法についての最適な薬物の組合せは、
【数１７】
2019518934.tif 000019
によって与えられ、これは、最大順序スコアとの組合せに対応する。
【００４４】
第２の方法であって、薬物ＮＥＭスコア法（Ｄｒｕｇｎｅｍｓｃｏｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）と呼ばれるものは、事後重みの最大値
【数１８】
2019518934.tif 000020
を、ｃによって添字付けされた各薬物の組合せの下において、各細胞内シグナル伝達マーカーＭｉに伴う所定の薬物のネストされた効果モデル
【数１９】
2019518934.tif 000021
からの所望効果の推定として使用し、次いで、組合せにおけるマーカーの和（ｕｎｉｏｎ）に伴うすべての事後確率全体を合計して、Ｆ（ｃ）を決定する。所定のネストされた効果ネットワーク
【数２０】
2019518934.tif 000022
については、薬物Ｓｊに伴うマーカーの集合をＡｊと表示することにより、次に、ｃにおけるｒ番目の要素に対応するｒを伴う、ｃによって添字付けされた所定の薬物の組合せについてのマーカーの和集合が、集合における添字の族のシークエンスを使用して決定される。ｃ＝｛１，２｝によって添字付けされた組合せであって、ここで
【数２１】
2019518934.tif 000023
が
【数２２】
2019518934.tif 000024
および｛Ａ２｝⊆｛Ａ１｝を伴う
【数２３】
2019518934.tif 000025
のサブグラフを形成するものを考慮すると、Ａｒの各要素を含有する最小の集合は、ｓｕｐ｛Ａｃ｝ｃ＝Ａ１∪Ａ２によって与えられる添字集合のシークエンスの上限に対応する。
【数２４】
2019518934.tif 000026
は、
【数２５】
2019518934.tif 000027
に伴うすべてのマーカーに付随するすべての所望効果の和の合計に対応する。
【００４５】
ネストされた効果モデルの下で組合せをランク付けする場合、一定のグラフ構造の下における
【数２６】
2019518934.tif 000028
は、ノイズの多いデータの下においてさえ、つながりまたは段階的分布をもたらすことができる。ネストされた構造は、つながりの分布を破壊して、
【数２７】
2019518934.tif 000029
を、この場合においてはＳ１へと強制する。
【数２８】
2019518934.tif 000030
のスコアを有するすべての薬物の組合せが同定される。これは、ここで
【数２９】
2019518934.tif 000031
と表示される
【数３０】
2019518934.tif 000032
の要素の、新規な添字の族に対応し、ここで
【数３１】
2019518934.tif 000033
である。あるつながりからの最適な組合せは、こうして、
【数３２】
2019518934.tif 000034
によって与えられる。
【００４６】
本発明の多くの実施形態に従う方法は、先の情報を使用して重み付け効果行列を生成し、薬物の組合せをスコア付けすることができる。異なる薬物は、サブ集団にわたって生存関連細胞内マーカーの異なる応答を誘発することができると期待でき、これは、たとえば細胞死であるがこれに限定されない特定の所望の表現型効果を伴ってもよいし、伴わなくてもよい。各Ｅｉｊｋを重み付けすることによって、この先の情報を組み込んで、より所望される効果を表す新規な効果データ行列を生成することができる。１つの重み付け方法は、スコア付けのために、上方制御または下方制御された効果のいずれかを重み付けすることを含む。別の方法は、細胞死シグナル伝達マーカーの上方制御を使用する重み付けを含むことができる。一般に、正の薬物シグナル伝達効果は、細胞死シグナル伝達マーカーの発現における増加と相関することが期待される。ｌｉｍｍａフレームワークにおいて、各サブ集団における細胞死シグナル伝達タンパク質の期待される発現を、薬物が増加させ得るのであれば、検定からの片側ｐ値を使用することができ、それによって、生存促進性細胞またはサブ集団における薬物効果の変化に対し、より少ない重みを与える。正規化された逆片側ｐ値を、重みとして使用することができる。別の重み付け方法は、死んでいる細胞において観察された分布を使用して、効果確率Ｅｉｊｋを重み付けすることを含む。細胞死シグナル伝達マーカーにおける変化が高度に非有意である場合、別の戦略は、各Ｅｉｊｋを重み付けするための可能性のある推定として、死んでいる状態における細胞の分布を使用することである。そのようなアプローチについての動機は、各サブ集団における異なる割合の細胞が死亡状態に移行することを、各個別の薬物が誘発し得、それによって不均一な死亡応答分布を導入し、これは正規化することができ、事前重みとして使用して、重み付けされた効果行列を生成することができるということである。当業者は容易に認識することができるように、Ｅｉｊｋを重み付けするやり方は上述したものに限定されず、多数の方法のいずれかを、所定の適用の要件に応じて使用することができる。たとえば、腫瘍内における幹細胞様特性を有するサブ集団を標的化することができ、Ｅｉｊｋをそれに従って重み付けする。一部の実施形態において、健康な細胞のサブ集団は、細胞死の誘導を回避するために重み付けされる。
【００４７】
図３Ａおよび３Ｂにおける例に加えて、図３Ｃは、薬物Ｓ１、Ｓ２、およびＳ３のすべての薬物の組合せについてのしらみつぶしランク付け３２６を図示し、これは、独立およびネストされた効果の両方の仮定の下においてサブ集団にわたる等しい寄与を仮定している。例示的な実施形態において、薬物の組合せは、薬物のネストされた効果モデル３２２からの階層および事後重みを使用して、加法的なネストされた効果の仮定の下にスコア付けおよびランク付けして、客観的基準を最大化する組合せを決定する。比較目的のために、独立相加効果の仮定に基づくスコア付け戦略によって、薬物のネストされた効果モデル３２２を使用して、薬物相互作用の構造の事前知識なしに、効果の確率行列のみを使用して、薬物の各組合せがスコア付けされた。組合せＳ１＋Ｓ２およびＳ１＋Ｓ２＋Ｓ３は、すべてのサブ集団においてすべてのマーカーに影響を及ぼすものの、Ｓ１＋Ｓ２は、２つの薬物のみによってそうするのであり、したがって、独立効果の仮定の代わりにネストされた効果を使用すると、より高いスコアを有するが、ノイズの多いデータに対して独立の仮定を使用するスコア付けによると、このことはそれほど明らかではないことに注目されたい。
【００４８】
図３Ｃは、薬物の組合せのスコア付けおよびランク付けの例示的な方法を図示するが、薬物−効果モデルに基づく薬物の組合せのスコア付けおよびランク付け方法が、上記に概説されたステップに限定されるものではなく、本発明の様々な実施形態に従う特定の適用の要件に応じて、あらゆる他の方法を利用できることを、当業者は理解し得る。
【実施例】
【００４９】
例示的実施形態
異なるグラフィカル薬物モデル構造から導かれた効果の、シミュレーションされた均一および不均一な混合物を使用して、ネストされた効果全体を統合することによる薬物の組合せの最適化が、加法的な独立の仮定の下におけるものよりも概して良好に機能することができることを示すために、感度分析を実施することができる。図５Ａは、シミュレーション分析のための６つの異なるネットワークモデルを示す。ネットワークモデル５０２において、すべての薬物は、互いに素なシグナル伝達マーカーを標的とし、別個の効果プロファイルを生成する。ネットワークモデル５０４において、すべての薬物効果は、単一薬物Ｓ１内において、Ｓ２およびＳ３の効果内にネストされたＳ４の効果に加えてネストされている。ネットワークモデル５０６において、薬物Ｓ１およびＳ２の効果は、薬物Ｓ３およびＳ４の効果の上位集合である。ネットワークモデル５０８は、切り離された成分（Ｓ１およびＳ２）および結びついた成分（Ｓ３およびＳ４）を備え、Ｓ４の効果がＳ３内にネストされているモデルに対応する。ネットワークモデル５１０は、単一の切り離された薬物Ｓ１および完全に結びついた成分（Ｓ２、Ｓ３およびＳ４）を備えたモデルに対応する。そのようなモデルの下で、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４に結びついた効果において期待されるプロファイルは、等価であると考えることができる。ネットワークモデル５１２は、線形のネストされたネットワークを備え、上層にＳ１を有するモデルに対応する。各ネットワークについて，期待される効果は、４つの異なるやり方で付属している：「等しい」は、ノードにわたって概ね等しく分布している効果を表し、「下層」は、下層ノードに付属したさらなる効果を表し、「上層」は、上層ノードに付属したさらなる効果を表し、「中層」は、適切な場合、中層ノードに付属したさらなる効果を表す。まとめると、２４種のシミュレーション条件が存在することができる。
【００５０】
上述したもののような薬物の組合せを最適化する方法を使用して、加法的独立モデルおよびネストされたモデルについて、それぞれ「独立」および「薬物ＮＥＭスコア」と表示される２つのスコア付け法に基づき、各シミュレーションされたデータを分析する。すべての薬物の組合せの真の（期待される）順序付けに関して、各ランク付け分布をマッチングすることによって、両方のスコア付けアプローチを比較する。真の順序付けと予測された順序付けの間におけるミスマッチの数を、２４種すべてのシミュレーションされたネットワークモデルについて、上述した２つのスコア付けメトリックスについて計数する。表５１４は、様々な期待される効果分布の下における、および低いノイズレベルの下における、独立モデルおよびネストされたモデルについての６つすべてのネットワークについて、ミスマッチ分析を要約する。見ることができるように、表５１４は、ネストされたモデル（薬物ＮＥＭスコア）が、独立モデル（独立）を、２４種の条件のうち２２種において機能的に凌駕することを示している。概して、薬物ＮＥＭスコアメトリックは、独立メトリックと比較して、低い（グラフ５１６）および高い（グラフ５１８）ノイズ条件の両方において、最小数のミスマッチを有する。
【００５１】
図５Ｂは、ネットワークモデル５０２をネットワークモデル５１２と組み合わせることによって導かれた、１つのシミュレーションされた不均一条件からの感度分析を図示する。もたらされたサブ集団モデル５２０を使用して、腫瘍試料全体に対する効果を有する優勢な薬物について、可能性のある不均一な表現型表現５２２を生成することができる。示されるように、青の細胞は優勢なＳ１効果を有するが、それは、すべての薬物効果がＳ１内にネストされており、４つの薬物の各々が、緑のサブ集団内における細胞の少なくとも１つにおいて優勢な効果を有するからであり、ここで、Ｓ４が最も強力な応答を有する。薬物の組合せは、基礎をなす真のネストされたモデル５２４からシミュレーションされたノイズの多いデータを使用してスコア付けすることができ、予測されたものと真のものの間における平均ミスマッチを上述したように推定することにより、棒グラフ５２６がもたらし得、これは最小数のミスマッチに基づき、独立モデル（独立）に対して優越した、ネストされたモデル（薬物ＮＥＭスコア）の性能を示している。独立した効果の仮定の下に客観的機能を最適化することにより、期待される最大値を有する連続単調写像をもたらすことができるが、これは一定の薬物ネットワーク構造の下では、最適な解決策でない可能性がある。対照的に、ネスト効果の仮定の下に客観的機能を最適化することにより、単調段階的写像をもたらすことができ、それによって、等価なスコア付け戦略（つながり）を、薬物の数のような他の因子に基づいてさらに評価することができる。今回の実施形態において、最適なネストされた解決策は、最小数の薬物を含む最高のスコア付けの組合せである。
【００５２】
１つの例示的な実施形態において、単一薬物候補のパネルをＨｅＬａ細胞に対して試験し、もたらされたデータを、最適な薬物の組合せを見出すために分析した。詳細には、３つの低分子阻害剤を、ＨｅＬａ細胞を処置するためにＴＲＡＩＬと組み合わせられる候補として考慮した。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの細胞死リガンドメンバーであるＴＲＡＩＬは、アポトーシスの強力な刺激因子であり、魅力的ながん療法と考えられた。しかし、ＴＲＡＩＬ単独による不良な結果は、複雑なメカニズム、ＴＲＡＩＬに対する可能性のある経路依存的耐性メカニズム、およびおそらくは腫瘍内不均一性に起因している可能性がある。ＴＲＡＩＬにおいて現在継続している興味は、今では、薬物の組合せ戦略におけるその部分により焦点が当てられている。ＴＲＡＩＬに伴う決定的なシグナル伝達マーカーを、図６Ａおよび６Ｂに図示する。
【００５３】
ＴＲＡＩＬがその細胞表面受容体に結合すると、これはプロカスパーゼ８、および細胞死ドメインを備えたＦＡＳ関連タンパク質（「ＦＡＤＤ」）をリクルートして、細胞死誘導性シグナル伝達複合体（「ＤＩＳＣ」）を形成することができ、これは、細胞死に至るシグナルのリレーを誘発する（図６Ａに示す）。活性化されたカスパーゼ８の下流におけるアポトーシス性シグナル伝達の標準的な見方は、ＰＡＲＰ、カスパーゼ３、およびカスパーゼ７のようなタンパク質の主要な細胞死エフェクタードメインの活性化を導く。しかし、Ｂｃｌ２ホモロジードメイン３相互作用ドメイン細胞死アゴニスト（「ＢＩＤ」）もまた、活性なカスパーゼ８の標的である。開裂したＢＩＤ（「ｔＢＩＤ」）もまた、ＢＡＸ、Ｂｃｌ２相同性アンタゴニスト／キラー（「ＢＡＫ」）または生存促進性Ｂｃｌ２ファミリータンパク質に結合することによって、アポトーシス経路を活性化し、細胞死受容体のアポトーシスシグナルを増幅する役割を果たす。さらに、ＴＲＡＩＬは、細胞増殖、細胞死に代わる細胞生存を導くいくつかのシグナル伝達経路を媒介することが示された。図６Ｂは、ＴＲＡＩＬシグナル伝達経路に関与する主要なプレーヤーのほとんどを要約する。
【００５４】
ＣｙＴＯＦを使用し、ＨｅＬａ細胞に対する単一細胞データを、未処置について、および４つの処置に対する応答において収集した。３つの低分子阻害剤を、ＴＲＡＩＬと組み合わせられる候補として考慮した：（１）強力かつ高度に特異的なＭＥＫ１／２阻害剤であるＭＥＫ阻害剤（「ＧＳＫ」）ＧＳＫ１１２０２１２、（２）ｐ３８ＭＡＰＫの酵素のＡＴＰ部位に競合的に直接結合し、大腸がん細胞において低下した細胞増殖およびアポトーシスを伴うことが示された、ｐＰ３８ＭＡＰＫ阻害剤（「ＳＢ」）；ＳＢ２０３５８０、ならびに（３）ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の一部であるホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）酵素の１つまたは複数を阻害する、ＰＩ３Ｋ阻害剤（「ＧＤＣ」）；ＧＤＣ０９４１。阻害されると期待される経路を、図６Ｃに図示する。単一細胞レベルにおける摂動データを、ＨｅＬａ細胞に対する３つの介入に加えてＴＲＡＩＬ経路活性化因子に対する応答において収集した。ＣｙＴＯＦパネルは、２４種の細胞内シグナル伝達タンパク質からなった（図６Ｂに示される）。表面マーカーまたは細胞系譜マーカーは収集されず、サブ集団は手動で同定した。
【００５５】
ＨｅＬａ細胞系の単一細胞摂動データに対する分析を、図６Ｄおよび７Ａ〜７Ｄに図示する。例示的な実施形態において、教師なし分析であるＣＣＡＳＴはｃＰＡＲＰを選択して、既にアポトーシスに方向付けられた細胞を同定およびゲートアウトする（６０２）。この特定の実施形態において、細胞系譜マーカーが欠如していることを考慮し、サブ集団を同定するために細胞内マーカーを手動で選択した。図６Ｄ、６０４は、非アポトーシス細胞から手動でゲーティングされた２つのサブ集団の３次元散布図を示し、これは高および低ｃＰＡＲＰ細胞を表す。これらの細胞のうち、図６Ｃ、６０６は、高ｃＰＡＲＰ細胞が、高および低ｐＲｂ細胞の混合物から構成されていることを示す。これらの３つのサブ集団は「細胞状態」と考えることができ、そのため、これらの異なる状態におけるＨｅＬａ細胞は、異なるメカニズムを使用する処置の後に、細胞死状態へと移行するように見える。図６Ｃ、６０８は、ＰＯＰ１（青）、ＰＯＰ２（赤）およびＰＯＰ３（緑）として示される３つのサブ集団を図示する。これらの細胞は３つの状態にわたって分布しているものの、実際のところこれらは、基礎細胞（未処置）を含む５つの処置条件から、独立に実験的に由来するものである。図６Ｄ、６１０は、ここで青（基礎）、薄青（ＴＲＡＩＬ）、緑（ＧＳＫ）、オレンジ（ＧＤＣ）および赤（ＳＢ）として色分けされたすべての処置条件にわたる細胞の分布を示す。３つすべてのサブ集団にわたる同様の細胞の分布は、サブ集団内における、およびサブ集団にわたるシグナル伝達を、本発明者らが比較することを可能にする。
【００５６】
薬物の組合せは、同定されたサブ集団にわたって、ネストされた薬物の効果を統合することによって受け取った情報を使用して、スコア付けおよびランク付けされる。これらの細胞内シグナル伝達の変化における不確実性を定量するために、各サブ集団における所定の処置の下で細胞内マーカーが差次的に発現される確率を、ベイズ分析を使用して決定することができる。図７Ａは、すべての処置にわたる、ベースライン条件に対する細胞内マーカー（サブ集団の同定に使用されなかったもの）のサブ集団正規化倍率変化（「ＦＣ」）のヒートマップを示す。ＰＯＰ１において、ＴＲＡＩＬおよびＧＳＫは、それぞれ、生存関連シグナル伝達タンパク質のほとんどを下方制御し、ここでＧＳＫはより強力にＥＲＫおよびｐＳ６を下方制御している。ＰＯＰ２において、最も強力な下方制御は、ＴＲＡＩＬによるものである。最も生存している細胞に対応するＰＯＰ３は、特にＳＢの下において、すべての処置条件にわたって、下方制御を上回る上方制御を示す。各サブ集団におけるこれらの細胞内シグナル伝達の変化の不確実性を、線形モデルを使用して定量して、所定の処置の下で差次的に発現されるタンパク質の確率を決定する。この例示的な実施形態において、最適な組合せ療法を同定するために、下方制御された発がん性キナーゼ状態のみに焦点を当てるが、それはそのような制御状態は、増加した細胞死と相関する傾向があるからである。図７Ｂは、各サブ集団におけるすべてのキナーゼの下方制御された確率効果のヒートマップを示す。ここで、薬物間のネストされた関係を示すために、薬物効果行列の行および列をソートする。このソーティングは、ネストされた効果モデルを使用して達成することができる。たとえば、ＰＯＰ１において、ＴＲＡＩＬの下方制御された効果は、ＧＳＫおよびＳＢの効果の上位集合を形成し、その一方でＧＳＫの効果は、ＳＢの効果の上位集合を形成する。ネストされた効果モデルのフレームワーク内において、図７Ｃにおけるこの推移的に閉じた有向ネットワークは、ＰＯＰ１内において、ＴＲＡＩＬおよびＧＤＣが最大応答を有する可能性があると推論されるが、それはこれが、最大数の生存関連マーカーを下方制御するからである。図７Ｃに示されるように、３つの異なる薬物のネストされた効果モデルが、３つの異なる細胞集団に対応すると推論することができるものの、すべての細胞にわたって薬物の組合せを最適化することが理想的であり得、それはすべての細胞が同時に処置され得るからである。すべての細胞にわたる効果を統合することにより、図７Ｄに示されるソートされた効果データ行列を生じることができ、ここで薬物のネストされた効果モデルは上部に示されている。この統合されたモデルは、図７Ｃに示された個別のサブ集団から導かれたネットワークとは極めて異なっているように見え；これはまた、その効果がすべての細胞にわたる平均化によって導かれている、腫瘍内不均一性を無視する予測されたネットワークとも異なる（図７Ｅ）。統合されたネストされた効果のモデル（図７Ｄに示される）およびそれに伴う上位のレジメンのための薬物の組合せのランク付け（図７Ｆに示される）は、ＧＳＫおよびＴＲＡＩＬを、最大のネストされた所望効果を有する薬物ペアとして同定する。
【００５７】
ここでＧＳＫおよびＴＲＡＩＬが最適であるというこの発見を検証するために、コロニー形成アッセイを使用して、ＴＲＡＩＬに加えてＧＳＫ、ＧＤＣ、およびＳＢの組合せを含むいくつかの薬物の組合せに対し、独立な生存関連ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析を実施することができる。結果（図７Ｇに示される）は、ＴＲＡＩＬに関して再較正された細胞についての生存パーセンテージとして提示され、ＴＲＡＩＬ単独と比較して、薬物の追加に起因して、さらなる部分的な細胞の死滅を描写している。これらの結果は、ＴＲＡＩＬをＭＥＫ阻害剤（「ＧＳＫ」）と組み合わせるあらゆる戦略が、それらなしのものと比較して、ＨｅＬａ細胞に対して最も有効であるという経験的なエビデンスを提供する。ＴＲＡＩＬ＋ＧＳＫ単独は、細胞のほぼ６０％を死滅させ、このカクテルにＳＢを追加することは、細胞死滅の画分を増加させた（ほぼ９８％まで）。これら３つのレジメンは、図７Ｆにおける上位３つの薬物の組合せランク付けと一致していた。上位３つの薬物の組合せは、それらのスコアに関してつながっている。本実施形態において、ネストされた効果モデルのフレームワークは、上位にランク付けされたつながりのある組合せのすべての中から、ＴＲＡＩＬ＋ＧＳＫを選択し、それはこの組合せが、最小数の薬物を使用するからである。
【００５８】
本発明の多くの実施形態に従う方法は、ＰＩ３ｋ／ｍＴＯＲおよびＡＢＬ／Ｓｒｃ阻害剤を、急性リンパ芽球性白血病（「ＡＬＬ」）における主要な最適組合せとして同定することができる。前駆Ｂ細胞ＡＬＬは、小児において診断される一般的ながんであり、１５歳より若い小児の間におけるがん診断の概ね２５％を表す。過去４０年にわたる小児性ＡＬＬについての臨床的転帰における劇的な改善にもかかわらず、再燃は、患者の２０％における死亡の最も重大な原因として残っている。標的化された薬物と化学療法の組合せが、これらの転帰を改善するための潜在的な治療的解決策として示唆されている。標的化療法の選択肢の増加に伴い、個別の患者について、小児性ＡＬＬにおける組合せ療法の合理的な選択の指針を助けるための、個別化された薬物の組合せ戦略を同定する機会が存在する。
【００５９】
図８Ａ〜８Ｇは、ＮＡＬＭ６細胞系、ならびにここでＵＰＮ７およびＵＰＮ１と表示される２つの前駆Ｂ細胞フィラデルフィア染色体陽性Ｐｈ＋ＡＬＬ小児患者試料に対して、単一細胞レベルにおいて実施された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物摂動分析を図示する。ＮＡＬＭ６細胞系は、成人ＡＬＬ再燃患者に由来する前駆（ｐｒｅ）−Ｂヒト細胞系であり、相同組換えによる遺伝子標的化のために非常に効率が良いものであることができる。２１種のＢ細胞系譜マーカーおよび１８種の細胞内タンパク質発現応答のＣｙＴＯＦパネルを使用して、各試料を分析した。図８Ａは、本研究におけるすべての細胞系譜マーカーおよび非細胞系譜マーカーを要約する。３つのＦＤＡ承認薬物：それぞれＤａｓ、ＴｏｆおよびＢｅｚと表示される、ダサチニブ（ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤）、トファシチニブ（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤）およびＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤）についての、３０分間の単一薬物処置前後に、ＣｙＴＯＦ分析を実施した。
【００６０】
結果は図８Ｂ〜８Ｇに要約する。図８Ｂの最上列は、アポトーシス細胞と非アポトーシス細胞の間を典型的に区別するｃＰＡＲＰ発現によって色分けされた３つのマーカーに対する、ＮＡＬＭ６、ＵＰＮ７およびＵＰＮ１細胞条件の分布の３次元散布図を示す。手動ゲーティングの後になお、ｃＰＡＲＰ不均一性のエビデンスが存在し、特に、高ｃＰＡＲＰ細胞は、ＵＰＮ７についての高ｐＡｋｔ、ならびにＵＰＮ１についての高ＩｇＭ、ＣＤ１７９ａおよびＣＤ１０に対応する。この不均一性は、異なる細胞型においてシグナル伝達変化を検出することの感度を改善するために、高いｃＰＡＲＰ発現を有する細胞を手動で同定することは、高次元のデータセットにおいては挑戦的なことであり、教師なしのより自動化されたアプローチに対する必要性をさらに動機付けるものであることを実証する。図８Ｂの最下列は、ここでＮＡＬＭ６の下で青（基礎）、緑（ＢＥＺ）、ピンク（Ｄａｓ）およびオレンジ（Ｔｏｆ）として；ならびにＵＰＮ７およびＵＰＮ１について青（基礎）、黒（Ｂｅｚ）、オレンジ（Ｄａｓ）および緑（Ｔｏｆ）としてそれぞれ色分けされたすべての処置条件にわたる、細胞の条件付き分布を示す。ＳＰＡＤＥ（密度正規化事象の全域木連続性）による探索的クラスタリングから、最小の５系統のサブ集団のエビデンスを仮定して（図９に示される）、ＣＣＡＳＴを使用して、各患者試料および細胞系についての３つの阻害剤および基礎条件にわたって、７つの細胞サブ集団を同定およびマッチした（図１０Ａ〜１０Ｃ）。すべての阻害剤からの主要なサブ集団についての、基礎集団と比較して相対的に近い細胞のパーセンテージは（図１１に示される）、薬物処置前後におけるサブ集団安定性のエビデンスを提供する。サブ集団を比較することにより、２つの患者試料（図８Ｅ）および３つすべての試料（図１０Ａ〜１０Ｃ）におけるほとんどすべてのサブ集団にわたって、ＢＥＺ−２３５によるｐ４ＥＢＰ１の強力な下方制御効果を実証した。このリン酸化された発がん性タンパク質は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲキナーゼシグナル伝達経路の下流で作用し、その下方制御は、ＢＥＺ−２３５によるこの特定の経路の阻害を意味する。３つすべての阻害剤に対するより多数の効果が、より少ないサブ集団において見出されるが、このことは、薬物の組合せを計算する前に、サブ集団を同定することの必要性を実証する。ＵＰＮ１およびＵＰＮ７の両方について、密度依存的ダウンサンプリングを使用してダウンサンプリングした約１０，０００個の細胞のデータに対する３０種の異なるランを使用して、予測された最良の薬物の組合せはＢＥＺ＋Ｄａｓであったが、これは、倍率変化における低下を伴う薬物のネストされた所望効果に基づく（図８Ｆ、図８Ｆにおけるチャート８０２および８０４に示される）。これらの予測に伴う、対応する最も頻繁な薬物のネストされた効果モデルは、両方の患者について異なり（図８Ｆ、モデル８０６および８０８に示される）、それに加えて、ＢＥＺおよびＤａｓが両方の患者について最も高くスコア付けされる組合せであったという事実がある。
【００６１】
阻害剤の組合せによって細胞を処置して、最適な組合せが標的のほとんどを阻害するかどうかを決定する独立した実験を実施することによって、モデルを検証した。ＮＡＬＭ６についての上位２つの薬物の組合せであるＤａｓ＋ＢｅｚおよびＤａｓ＋Ｔｏｆ、ならびにＵＰＮ７およびＵＰＮ１の下における２つ一組の薬物の組合せの３つすべてに対するＣｙＴＯＦデータを使用する独立した分析を、図８Ｄに要約する。ＮＡＬＭ６の下におけるネストされた効果モデルは、Ｄａｓ＋Ｔｏｆの標的効果がＢｅｚ＋Ｄａｓの標的効果内にネストされていることを示し、その一方で、Ｄａｓ＋ＴｏｆおよびＢｅｚ＋Ｔｏｆの標的効果は、ＵＰＮ７の下ではＢｅｚ＋Ｄａｓの標的効果内にネストされているが、これは、単一薬物モデルによって予測されたとおりである。よって、細胞系モデルおよび診断された初代白血病細胞の両方において、この分析は、単一薬物処置データに基づいて、標的化阻害剤の組合せを同定することに成功し、精密な薬物処置への新規なアプローチへの道を開くものである。
【００６２】
ＢＥＺ＋Ｄａｓの組合せを検証するために、同じパネルを使用するＣｙＴＯＦによって、すべての２薬物の組合せを分析し、次いで、所望効果の合計最大値との組合せを、マッチ（０）またはミスマッチ（１）を生じる最良の予測と比較するが、これはネストされたモデル対独立モデルにおいてである。図８Ｇは、倍率変化（ＦＣ低下）に関して測定された下方制御された効果に基づき、ネストされたモデル（薬物ＮＥＭスコア）が、独立モデル（独立）を機能的に凌駕することを示す。
【００６３】
すべてのマーカーが、細胞の異なるサブ集団にわたって、特定の所望の表現型効果に伴い得るわけではないという事実を説明するために、重み付けされた細胞内効果として所望効果の確率を推定するために、２つの追加の先の情報を使用した。もたらされる所望効果は、以下を重み付けすることによって導くことができる：（ｉ）Ｔ統計量から導かれた下方制御を増加させる確率オッズによる細胞内シグナル伝達効果（Ｔ統計量低下）、および（ｉｉ）たとえばｃＰＡＲＰである細胞死マーカーの上方制御の確率による細胞内シグナル伝達の変化（細胞死マーカー上昇）。上記の所望効果は、独立モデルの下で、薬物の組合せをスコア付けするためにも使用することができる。図８Ｇは、上記３つの所望効果のサブタイプ（所望効果）、２つのスコア付けメトリックス（薬物ＮＥＭスコアおよび独立）、およびおよそ１０，０００個の細胞あたり３０のダウンサンプリングされたデータセットに基づいて観察されたものと比較した、予測の間におけるミスマッチの数についての分割表を示し、予測および観察の間で、全部で１８０（＝３つの所望効果×２つのスコア×３０のダウンサンプリングされたデータセット）の比較をもたらす。すべての所望効果のサブタイプにわたるミスマッチの総数は、独立スコア（ＵＰＮ１について６３、およびＵＰＮ７について５５）と比較して、薬物ＮＥＭスコア（ＵＰＮ１について６、およびＵＰＮ７について１８）の下でははるかに少ない。潜在的なゼロミスマッチに対してロバストな、モンテカルロシミュレーションに基づくフィッシャーの正確確率検定は、ＵＰＮ１（０．００００１）およびＵＰＮ７（０．００００１）について、有意な両側ｐ値（＜０．０５）を生じ、これは様々な所望効果の下におけるミスマッチの分布が、両方のスコア付けメトリックスについて統計的に異なっていることを示している。
【００６４】
ネストされた効果モデルのフレームワークの感度分析を、３０人のＡＬＬ患者の試料について実行した：各患者試料について、以下の３つの異なるゲーティング戦略後に、ネストされた効果モデルのフレームワークを適用することによって変動を説明した：（１）「すべて」は、生細胞および死細胞を含む試料全体を表示する、（２）「生細胞のみ」は、手動でゲーティングされた生細胞を表示する、ならびに（３）「悪性細胞」は、Ｔ細胞および骨髄細胞のような正常細胞を欠如している、手動でゲーティングされた悪性白血球（芽球）を表示する。ゲーティング戦略を、図１２Ａに要約する。各分析は、１つのＦＣＳファイルあたり約１０，０００個の細胞のダウンサンプリングされたデータに対して実施されたため、ダウンサンプリングは、この変動を説明するために２回繰り返すことができる。３つすべての所望効果（ＦＣ低下、Ｔ統計量低下、細胞死マーカー上昇）を、各患者について実施した。総合すると、各患者は、１８種の条件（＝３つのゲーティング戦略×３つの所望効果×２つのダウンサンプリングされたデータセット）の下で分析された。
【００６５】
ネストされた効果モデルのフレームワークによるＢＥＺ＋Ｄａｓの予測が、３０人すべての患者にわたって一般化できるかどうかを決定するために、全部で５４０の予測（３０人の患者×１人の患者あたり１８種の条件）から、上位の予測を、図１２Ｂに示される棒グラフ分布に要約する。ＢＥＺ＋Ｄａｓは、最良の薬物の組合せとして選択される３７％のチャンスを有したものの、ネストされた効果モデルのフレームワークは、患者の約３０％について、ＢＥＺ単独およびＤａｓ単独を最適な療法として選択した（図１２Ｄ；ＵＰＮ４、ＵＰＮ８、ＵＰＮ９等を参照）。図１２Ｃは、スコア付け分布の基礎をなすネットワークモデルの分布の概要を提供する。上位２つのネットワークは、なぜＢＥＺ＋Ｄａｓが最高スコアを有したかを説明する。要約すれば、この分析は、ＡＬＬ患者の圧倒的多数について、単独優勢の二薬戦略（ＢＥＺ＋Ｄａｓ）が存在し得るものの、これはすべての患者について最適ではない可能性があることを示唆する。
【００６６】
細胞を単一阻害剤およびＢＥＺ＋Ｄａｓの組合せの両方によって処置すること、ならびに少なくとも７２時間の期間にわたって細胞増殖を観察することで、２つの独立した生存性分析アッセイを実施することにより、３つの独立したＡＬＬ関連細胞系に対してＢＥＺ＋Ｄａｓの効果を試験した。試験した細胞系は以下のとおりであった：成人ＡＬＬ再燃患者に由来する前駆体（ｐｒｅ）Ｂヒト細胞系であり、相同組換えによる遺伝子標的化のために非常に効率的である、ＮＡＬＭ６細胞系；非Ｔ、非Ｂヒト白血病細胞系（ＮＡＬＭ−１）であるＮＡＬＭ１細胞系、およびＰｈ＋ＡＬＬ小児由来のＳＵＰ−Ｂ１５細胞系。細胞生存性における最大の減少は、単一薬物条件と比較して、時間の経過と共に、すべての細胞系について、両方の薬物を使用して観察することができ、ここでほぼすべての細胞が、７２時間後にＳＵＰ−Ｂ１５細胞系において死滅した。図１３Ａは、単独および薬物の組合せの両方に対し、最適用量濃度において、少なくとも７２時間の期間にわたって曝露された３つすべての細胞系についての生存曲線を示す。図面は、各細胞系の処置条件の平均生存値から導かれる。ＢＥＺ＋Ｄａｓは、Ｄａｓがすぐに続けられた単一薬物と比較して、７２時間後にほとんどの細胞の死滅を一貫して達成するように見え、これは、ＢＥＺと相乗作用して細胞死を増加させているように見える。組合せ指数（ＣＩ）として公知の薬物有効性の標準測度を使用して、相乗的（ＣＩ＜１）または相加的（ＣＩ＝１）なＢＥＺ＋Ｄａｓ効果の存在を検討した。部分的な細胞死滅についてのＢｌｉｓｓ独立の下で、図１３Ｂは、３つすべての細胞系にわたるＢＥＺ＋Ｄａｓの相乗効果を図示し、定量する。相乗効果は、ＮＡＬＭ１細胞系において最も強力であり、ＣＩ値は０．８６である。要約すれば、細胞系モデルおよび診断された初代白血病試料の両方からの結果は、ネストされた効果モデルのフレームワークが、単一細胞、単一薬物処置、およびシグナル伝達摂動データに基づいて、標的化阻害剤の最適な組合せを同定できることを示し、これは精密な薬物処置に対する新規なアプローチへの道を開くものである。
【００６７】
本発明の多くの実施形態に従う方法は、異なる細胞型における異なる応答について最適化することができる。多くの実施形態において、最適化アルゴリズムは、悪性細胞における所望の細胞内効果、およびおそらくは非悪性細胞における異なる所望の細胞内効果に基づいて、薬物の組合せを最適化する実現性を可能にすることができる。悪性サブ集団において細胞死シグナル伝達を増加させる能力を有する薬物レジメンは、同時に非悪性細胞における生存関連シグナル伝達を増加させつつ、最適化することができる。所望効果は確率によって測定することができるため、それぞれ悪性および非悪性サブ集団の両方についてのサブ集団ｋ１およびｋ２における薬物Ｓｊの下において、細胞内シグナル伝達マーカーＭｉに伴う所望効果の事前確率を、ｗｉｊ｜ｋが表すと仮定すると、非悪性サブ集団において各マーカーに伴う所望効果の確率は、
【数３３】
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となり、ここで
【数３４】
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は、相補的効果または逆効果の確率を表す。たとえば、事前「ＦＣ低下」の使用により、悪性細胞について下方制御された効果および非悪性細胞についての上方制御を使用して、組合せを最適化することができる。図１４Ａ〜１４Ｄは、ＡＬＬ患者のＵＰＮ１について、この概念を図示する。図１４Ａは、悪性および非悪性のゲーティングされた細胞の両方について、強調されたｔ−ＳＮＥプロットを示す。図１４Ｂは、両方の細胞型について、同じ所望効果の仮定の下に、薬物のネストされた効果モデル（上部）およびヒートマップ（下部）を示す。図１４Ｃは、非悪性細胞における上方制御に伴う薬物のネストされた効果モデル（上部）およびヒートマップ（下部）の所望効果を示す。図１４Ｂおよび１４Ｃにおける結果は、異なる細胞型が異なる重み付けをされたか否かに基づいて異なる場合がある。図１４Ｃからの結果を使用することにより、図１４Ｄは、患者のための潜在的に最適なレジメンとしてのＤａｓ、Ｂｅｚ＋ＤａｓおよびＤａｓ＋Ｔｏｆを含むランク付け分布を示す。図１４Ａ〜１４Ｄにおける結果が、ＵＰＮ１に対する事前結果と異なることに注目すべきであり、それは、この分析が、悪性細胞における腫瘍内不均一性を説明しなかったからである。これらの結果は、非悪性細胞に対するネストされた効果モデルのフレームワークの範囲のみを説明する。
【００６８】
上述したものを含む本発明の実施形態は、種々のシステム上で実施することができる。システムは、質量分析データを受け取り、分析することができる単純なコンピュータデバイスであることができる。本発明の実施形態に従うデータ分析システムを、図１に図示する。データ分析１５００は質量分析計１５０２を含む。図示された実施形態において、質量分析計１５０２は、ネットワーク１５０６を介してデータ分析コンピュータ１５０４にデータを供給するように構成されている。多くの実施形態において、データ分析コンピュータはパーソナルコンピュータ、サーバ、および／または質量分析計によるデータ出力を分析するための記憶容量および処理能力を備えたあらゆる他のコンピュータデバイスである。分析コンピュータデバイスは、プロセッサ、メモリ、および／または、機械可読指示を含むアプリケーションを含有する記憶システムを含むことができ、これは質量分析データセットに対してネストされた効果モデリング分析を実施するようにコンピュータを構成する。特定のデータ分析システムが図１５に図示されているものの、種々のデータ分析システムのいずれかを利用して、本発明の実施形態に従うネストされた効果モデリングを使用して質量分析データを分析することができる。
【００６９】
上記において、最適な薬物の組合せを同定する特定の方法が議論されているものの、本発明の多くの様々な実施形態に従って、多くの異なる方法を実行することができる。したがって、本発明は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、具体的に記載されたもの以外のやり方において実施してよいことが理解される。よって、本発明の実施形態は、あらゆる面において説明的なものであり、限定的なものではないと考えられるべきである。したがって、本発明の範囲は、説明された実施形態によってではなく、添付した特許請求の範囲およびそれらの均等物によって決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６ＡＢＣ】
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【図６Ｄ】
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【図７ＡＢ】
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【図７ＣＤＥ】
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【図７ＦＧ】
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【図８ＡＢ】
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【図８ＣＤ】
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【図８Ｅ】
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【図８ＦＧ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２ＡＢ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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