(57)【要約】  被験体における血栓性疾患の処置または予防における使用のための、機能的膜貫通ドメインを欠失した改変糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）を含む可溶性ポリペプチドであって、該処置または予防は、有効量の該可溶性ポリペプチドを被験体に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における血栓性疾患の処置及び／又は予防における使用のための、機能的膜貫通ドメインを欠失した改変糖タンパク質Ｖ（ＧＰＶ）を含む可溶性ポリペプチドであって、該処置又は予防は、被験体に有効量の該可溶性ポリペプチドを投与することを含む、上記可溶性ポリペプチド。
【請求項２】
血栓性疾患が、血栓−炎症性状態、静脈血栓症、動脈血栓症、毛細血管血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、血液を人工表面、特に体外式膜型人工肺（ＥＣＭＯ）と接触させる間又は後の血栓形成、アテローム性動脈硬化症、関節炎、凝固障害、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、慢性又は急性の血栓塞栓症、肺血栓塞栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、脳卒中及び心筋梗塞からなる群より選択される、請求項１に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項３】
前記改変ＧＰＶが切断型ＧＰＶである、請求項１又は２に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項４】
前記改変ＧＰＶが天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、ここで該フラグメントは、該天然ＧＰＶの膜貫通ドメインを欠失している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項５】
前記天然ＧＰＶが、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項６】
非自然発生ポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項７】
半減期延長部分をさらに含む、請求項６に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項８】
前記半減期延長部分が前記改変ＧＰＶに結合されている、請求項７に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項９】
前記半減期延長部分は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖からなる群より選択される、請求項８に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項１０】
前記半減期延長部分が、直接的に又はリンカーを介して、前記改変ＧＰＶに融合された異種アミノ酸配列である、請求項７に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項１１】
半減期延長異種アミノ酸配列は、アルブミン及び少なくとも１００アミノ酸長を有するそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及びそのフラグメント、特にＦｃフラグメント、トランスフェリン及びそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖（ＸＴＥＮ）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又はそれからなる、請求項１０に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項１２】
哺乳動物細胞における組み換え発現により得ることができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項１３】
前記処置及び／又は予防が、抗血小板薬又は抗凝固薬を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項において定義される可溶性ポリペプチド、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
前記可溶性ポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるものではない、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
有効量の、請求項１〜１２のいずれか１項において定義される可溶性ポリペプチド、又は請求項１４もしくは１５に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体において血栓性疾患を処置する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチドを製造する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項において定義される可溶性ポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物細胞において発現させること、及び培地から可溶性ポリペプチドを回収することを含む、上記方法。
【請求項１８】
請求項５〜１２のいずれか１項において定義される、非自然発生可溶性ＧＰＶ。
【請求項１９】
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるものではない、機能性膜貫通ドメインを欠失している可溶性ＧＰＶ。
【請求項２０】
（ｉ）  請求項１〜１２のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド、及び（ｉｉ）該可溶性ポリペプチド以外の抗血小板薬又は抗凝固薬を含む、医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
血管損傷部位での血小板活性化及びその後の血栓形成は、正常止血に重要であるが、心筋梗塞及び脳卒中も引き起こし得る（非特許文献１）。血小板粘着及び活性化は、多数の血小板受容体−リガンド相互作用を含む多段階プロセスである。血管壁が損傷すると、循環血小板は、糖タンパク質(GP) Ib-V-IX複合体の、露出された内皮下細胞外マトリックス上（例えば、コラーゲン上）に固定化されたフォン・ビル・ブランド因子(vWF)との一過性相互作用により急速に減速される（非特許文献２）。この相互作用は、血小板を血管壁付近に保持し、そしてGPVIとコラーゲンとの間の接触を促進する（非特許文献３）。GPVI-コラーゲン相互作用は、血小板活性化並びにトロンボキサンA2(TxA2)及びアデノシン二リン酸(ADP)のような二次血小板アゴニストの放出をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する。これらの可溶性アゴニストは、局所的に産生されたトロンビンと一緒に、Gタンパク質(Gi、Gq、G12/13)共役型受容体を通して血小板活性化にさらに寄与する（非特許文献４）。これらのシグナル伝達経路は全て共同作用して、インテグリンの活性化、顆粒内容物の放出、及び凝固カスケードの活性化のためのプロコアグラント表面の供給のような複雑な細胞応答を誘導する（非特許文献５；非特許文献６）。最終的な血栓は、フィブリンネットワークに埋め込まれて血流により生じるせん断力に耐える。新しく形成された血栓の安定化は、血管損傷部位で出血を止めるために必須である。しかし、このプロセスが制御されない方式で発生する場合、これは心筋梗塞又は虚血性発作のような生命を脅かす疾患状態を引き起こす血栓性事象ももたらし得る。結果として、単独で又は組み合わせて使用される抗血小板薬及び抗凝固薬は、心血管及び脳血管疾患を処置する際に主に重要である（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。現在の抗血小板療法は血管事象の再発を減少させるが、血小板阻害に起因する出血の増加したリスクは、脳卒中を経験した患者について特に懸念され、そして患者のさらなるサブセットは、抗血小板アプローチに対して難治性のままであり（非特許文献１０）、新規な抗血小板ストラテジーの必要を強調する。
【０００２】
血小板粘着におけるそれらの中心的役割は、２つの受容体複合体を血小板研究の中心にする: i) GPIb-V-IX複合体、これは損傷した血管壁上又は活性化した血小板上に固定化されたvWFと相互作用し、それにより上昇したせん断の状態下にある反応性表面に血流から血小板を補充する。ii) GPIIb/IIIa (インテグリンαIIbβ3)、アゴニスト受容体により媒介されるインサイドアウト活性化を必要とするフィブリノゲン及びvWFの受容体は、せん断抵抗性血小板粘着を安定させることに寄与し、そして凝集体形成に不可欠である。GPIb-V-IX複合体は、4つの関連する膜貫通GPから構成される: GPIbα、GPIbβ、GPV及びGPIX、これらは2:4:2:1の化学量論で関連している（非特許文献１１）。この複合体内で、GPIbα及びGPIbβはジスルフィド連結しており、そしてGPIXと非共有結合で結合している。GPVは非共有結合でGPIb-IXと結合している（非特許文献１２）。GPIb-IX複合体の約30,000コピーが、ヒト血小板の表面上で見られる（非特許文献１３）。GPIb-V-IX機能の喪失は、重篤な出血障害であるベルナール・スーリエ症候群(BSS)を引き起こす。BSSは、vWFの粘着不全及び減少したトロンビン応答性を伴う異常な巨大循環血小板を特徴とする（非特許文献１４）。GPIb又はGPIXの欠失又は機能不全はBSSと関連するが、GP5における機能欠失変異は報告されておらず、そしてマウスにおけるGPVの欠失はBSS表現型を生じなかった（非特許文献１５）。GPVは、複合体の正確な発現に必要ではない唯一のサブユニットである（非特許文献１６）。特許文献１、特許文献２及び非特許文献１７は、ヒトGPV遺伝子の配列及び構造並びにヒトGPVのアミノ酸配列を開示する。GPVは高度にグリコシル化されており、そしてトロンビンの存在下で血小板表面からのGPVの定量的除去及び可溶性GPV(sGPV)の生成をもたらすトロンビン切断部位を含有する（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。トロンビン切断により生成される可溶性ヒトGPVは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を有する。このトロンビン切断部位が、マウス、ラット及びヒトタンパク質において保存されるということが注目される（非特許文献２１）。しかし、トロンビン刺激の際に応答しないプロテアーゼ活性化受容体(PAR)4-欠損マウス（非特許文献２２；非特許文献２３）と対照的に、Gp5-/- マウスは大いに正常な血小板機能を示す。トロンビンに加えて、GPVは、GPIbα又はGPVIのように、「ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ」(ADAM)ファミリーのシェダーゼ、最も顕著にADAM17 (腫瘍壊死因子変換酵素TACEとも呼ばれる)及びADAM10（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）により切断され得、これはsGPVのわずかにより長い変異体を生じる。しかし、トロンビンはGPV表面発現の主要な調節因子と考えられる。SGPVレベルは、血漿と血清との間で大きく異なり(それぞれ17.3±6.3ng/ml 対1.2±0.17μg/ml)（非特許文献２７）、そしてsGPVレベルは、虚血性発作のような特定の病理的条件下でわずかに上昇する(対照における28.1ng/mlと比較して39.4ng/ml)（非特許文献２８）。今までに、血栓症又は止血におけるsGPVの役割は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO 95/02054 A2
【特許文献２】US 6,005,089
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Coughlin SR. Nature. 2000; 407: 258-64
【非特許文献２】Shapiro MJ, et al. The Journal of Biological Chemistry. 2000; 275: 25216-21
【非特許文献３】Nieswandt B, et al. Blood. 2003; 102: 449-61
【非特許文献４】Offermanns S. Circulation research. 2006; 99: 1293-304
【非特許文献５】Nakanishi-Matsui M, et al. Nature. 2000; 404: 609-13
【非特許文献６】Cunningham MA, et al. The Journal of experimental medicine. 2000; 191: 455-62
【非特許文献７】May F, et al. Blood. 2009; 114: 3464-72
【非特許文献８】Schroder J, et al. Mol Cell Biol. 2009; 29: 1083-94
【非特許文献９】Braun A, et al. Blood. 2009; 113: 2056-63
【非特許文献１０】Pleines I, et al. Pflugers Archiv : European journal of physiology. 2009; 457: 1173-85
【非特許文献１１】Luo S-Z et al. Blood. 2007; 109(2): 603-9
【非特許文献１２】Nieswandt B, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2009; 7: 206-9
【非特許文献１３】Varga-Szabo D, et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2009; 7: 1057-66
【非特許文献１４】Canobbio I, et al. Cellular signalling. 2004; 16: 1329-44
【非特許文献１５】Ramakrishnan V, et al. PNAS. 1999; 96: 13336-41; Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21
【非特許文献１６】Dong J, et al. Journal of Biological Chemistry. 1998; 273: 31449-54)
【非特許文献１７】Lanza F, et al. Journal of Biological Chemistry. 1993; 268: 20801-20807
【非特許文献１８】Ravanat C, et al. Blood. 1997; 89: 3253-62
【非特許文献１９】Azorsa DO, et al. Thrombosis and Haemostasis. 1999; 81: 131-8
【非特許文献２０】White GC, et al. Thrombosis Research. 38: 641-648
【非特許文献２１】Ravanat C, et al. Blood. 1997; 89: 3253-62
【非特許文献２２】Kahn ML, et al. Blood. 1999; 94: 4112-21
【非特許文献２３】Kahn ML, et al. Nature. 1998; 394: 690-4
【非特許文献２４】Garton KJ, et al. Journal of Biological Chemistry. 2001; 276: 37993-8001
【非特許文献２５】Gardiner EE, et al. Blood. 2004; 104: 3611-7
【非特許文献２６】Bergmeier W, et al. Thrombosis and Haemostasis. 2004; 91: 951-8
【非特許文献２７】Azorsa DO, et al. Thrombosis and Haemostasis. 1999; 81: 131-8
【非特許文献２８】Wolff V, et al. Stroke. 2005; 36: e17-9
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の要旨
本発明者らは、驚くべきことに、可溶性GPVが、出血時間に影響を及ぼすことなく、抗血栓効果を有するということを見出した。したがって、本発明は、可溶性GPVを含む抗血栓薬を提供する。本発明はまた、以下の実施態様(1)〜(36)に関する:
（１）  被験体における血栓性疾患の処置及び／又は予防における使用のための、改変糖タンパク質V(GPV)を含む可溶性ポリペプチドであって、該処置及び／又は予防は、被験体に有効量の該可溶性ポリペプチドを投与することを含む、上記使用のための可溶性ポリペプチド。
（２）  血栓性疾患が、血栓−炎症性状態、静脈血栓症、動脈血栓症、毛細血管血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、血液を人工表面、特に体外式膜型人工肺（extracorporeal membrane oxygenation）（ＥＣＭＯ）と接触させる間又は後の血栓形成、アテローム性動脈硬化症、関節炎、凝固障害、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、慢性又は急性の血栓塞栓症、肺血栓塞栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、脳卒中及び心筋梗塞からなる群より選択される、項目（１）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（３）  前記改変ＧＰＶが切断型ＧＰＶである、項目１又は２に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（４）  前記改変ＧＰＶ又は切断型ＧＰＶが、天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、該フラグメントは少なくとも６アミノ酸長を有する、項目（１）〜（３）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（５）  前記改変ＧＰＶ又は切断型ＧＰＶが、天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、該フラグメントは少なくとも８アミノ酸長を有する、項目（１）〜（４）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
【０００６】
（６）  前記改変ＧＰＶ又は切断型ＧＰＶが、天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、該フラグメントは少なくとも３０アミノ酸長を有する、項目（１）〜（５）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（７）  前記改変ＧＰＶ又は切断型ＧＰＶが、天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、該フラグメントは少なくとも１００アミノ酸長を有する、項目（１）〜（６）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（８）  前記改変ＧＰＶ又は切断型ＧＰＶが、天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、該フラグメントは少なくとも２５０アミノ酸長を有する、項目（１）〜（７）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（９）  前記改変ＧＰＶ又は切断型ＧＰＶが、天然ＧＰＶの細胞外ドメインのフラグメントからなり、該フラグメントは少なくとも４００アミノ酸長を有する、項目（１）〜（８）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１０）  前記フラグメントが抗血栓活性を有する、項目（４）〜（９）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
【０００７】
（１１）  前記フラグメントが、投与の際に出血時間に実質的に影響を及ぼさない、項目（４）〜（１０）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１２）  前記天然GPVが配列番号3に示されるアミノ酸配列からなり、そして細胞外ドメインは配列番号3のアミノ酸1〜503から実質的になる、項目（４）〜（１１）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１３）  前記天然GPVは配列番号7に示されるアミノ酸配列からなり、そして細胞外ドメインは配列番号7のアミノ酸1〜502から実質的になる、項目（４）〜（１１）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１４）  非自然発生ポリペプチドである、項目（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１５）  半減期延長部分をさらに含む、項目（１４）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
【０００８】
（１６）  前記半減期延長部分が、直接的に又はリンカーを介して、前記改変ＧＰＶに結合される、項目（１５）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１７）  前記半減期延長部分が、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）及びアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖からなる群より選択される、項目（１６）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１８）  前記半減期延長部分が、直接的に又はリンカーを介して、前記改変ＧＰＶに融合された異種アミノ酸配列である、項目（１５）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（１９）  半減期延長異種アミノ酸配列は、アルブミン及び少なくとも１００アミノ酸長を有するそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及びそのフラグメント、例えばＦｃフラグメント、トランスフェリン及びそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖（ＸＴＥＮ）、ホモアミノ酸反復（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリン反復（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド、並びにそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリペプチドを含むか又はそれからなる、項目（１８）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（２０）  真核生物細胞における組み換え発現により得ることができる、項目（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
【０００９】
（２１）  前記真核生物細胞が哺乳動物細胞である、項目（２０）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（２２）  前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、項目(２１)に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（２３）  前記真核生物細胞が昆虫細胞、例えばSf9細胞である、項目（２０）に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（２４）  原核生物細胞、例えば細菌細胞における組み換え発現により得ることができる、項目（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（２５）  前記可溶性ポリペプチドが抗血栓活性を有する、項目（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
【００１０】
（２６）  前記可溶性ポリペプチドが、投与の際に出血時間に実質的に影響を及ぼさない、項目（１）〜（２５）のいずれか１項に記載の使用のための可溶性ポリペプチド。
（２７）  前記処置及び／又は予防が、抗血小板薬又は抗凝固薬を前記被験体に投与することをさらに含む、項目（１）〜（２６）のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド。
（２８）  項目(１)〜(２６)のいずれか１項において定義される可溶性ポリペプチド、及び薬学的に許容しうる賦形剤を含む、医薬組成物。
（２９）  可溶性ポリペプチドが、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるものではない、項目（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）  有効量の、項目（１）〜（２６）のいずれか１項において定義される可溶性ポリペプチド、又は項目（２８）もしくは（２９）に記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体において血栓性疾患を処置する方法。
【００１１】
（３１）  項目(１)〜(２６)のいずれか１項において定義される可溶性ポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物細胞において発現させること、及び培地から可溶性ポリペプチドを回収することを含む、項目（１）〜(２６)のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチドを製造する方法。
（３２）  項目(5)〜(26)のいずれか１項において定義される非自然発生可溶性GPV。
（３３）  配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるものではない、項目（３２）に記載の非自然発生可溶性GPV。
（３４）  配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるものではない、可溶性GPV。
（３５）  (i) 項目(１)〜(２６)のいずれか１項に記載の可溶性ポリペプチド、及び(ii)該可溶性ポリペプチド以外の抗血小板薬又は抗凝固薬を含む、医薬キット。
（３６）  可溶性ポリペプチドは、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるものではない、項目（３５）に記載の医薬キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1: 可溶性GPVは大動脈損傷モデルにおいて抗血栓効果を有する。腹部大動脈を、鉗子を用いて１回堅く圧迫することにより機械的に損傷させ、そして血流をドプラー流量計によりモニタリングした。最終閉塞までの時間を示す。A,B) 可溶性ヒトGPV (A: shGPV; B: shGPV-アルブミン融合タンパク質(AFP))又は可溶性マウスGPV (C: smGPV)の注射後の閉塞時間。各記号は１匹の個々のマウスを表す。マウスが閉塞性血栓を形成することができない場合、フィッシャーの正確検定を使用してP値を計算した。* P<0.05; ** P<0.01; *** P<0.001
【図２】図2: 可溶性ヒトGPVは虚血性発作から保護する。マウスに60分の一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)を受けさせた。野生型(黒色バー)及びshGPV-AFPで予め処置された野生型マウス(灰色バー)の脳梗塞体積をtMCAOの24時間後に面積測定により測定した。結果は平均±SDを表す。
【図３】図3: 可溶性GPVは尾出血時間に対して効果を有していない。ビヒクル又は可溶性ヒトGPV(A: shGPV; B: shGPV-AFP)のいずれかを受けた示されたマウス系統の尾出血時間を示す。各記号は１匹の動物を表す。
【図４】図4: 可溶性GPVを用いた処置は、インビトロで循環下のコラーゲンで減少した表面被覆及び血栓体積を生じた。A) ヒト血液をshGPV-AFPで処理し、そしてコラーゲン被覆表面上にせん断速度1000 s-1で灌流した。B) 野生型マウスからの血液をsmGPVとインキュベートし、そしてコラーゲン被覆表面上にせん断速度1700 s-1で灌流した。結果を平均±SDとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本発明は、被験体における血栓性疾患の処置又は予防における使用のための、機能的膜貫通ドメインを欠失した改変糖タンパク質V(GPV)を含む可溶性ポリペプチドに関し、該処置又は予防は、被験体に有効量の該可溶性ポリペプチドを投与することを含む。好ましくは、改変GPVは切断型GPVである。
【００１４】
本明細書で使用される用語「可溶性」は、細胞膜に結合しないポリペプチドを指す。特に、可溶性ポリペプチドは、膜貫通ドメインを介して細胞膜に組み込まれず、かつ／又は、膜貫通ドメインを介して細胞中に組み込まれることができない。典型的には、可溶性ポリペプチドは、機能的膜貫通ドメインを欠失している。好ましくは、可溶性ポリペプチドは、水、又はPBSのような緩衝液中で可溶性である。
【００１５】
糖タンパク質V
本明細書で使用される用語「糖タンパク質V」又は「GPV」は、配列番号3に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するタンパク質を示す。好ましくは、GPVは、配列番号3に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%、又は少なくとも95%のアミノ酸同一性を有する。本発明によれば、評価されている配列(「比較配列」)は、２つの配列の整列後に、特許請求される配列又は記載される配列（「参照配列」）と特定の「同一性パーセント」を有するか、又は参照配列に対して特定の「パーセント同一である」。「同一性パーセント」は、以下の式に従って決定される: 
同一性パーセント＝100[1-(C/R)] 
この式において、Cは、２つの配列の間の整列の長さにわたる参照配列と比較配列との間の差異の数であり、ここで(i) 比較配列中の対応する整列された塩基を有していない参照配列中の各塩基、及び(ii) 参照配列中の各ギャップ、及び(iii)比較配列中の整列された塩基と異なる参照配列中のそれぞれの整列された塩基が差異を構成する。Rは、比較配列との整列の長さにわたる参照配列の塩基の数であり、参照配列中に生じたいずれかのギャップは塩基としてもカウントされる。
【００１６】
同一性パーセント（上記のように計算される）が特定の最小値にほぼ等しいか又はそれ以上である、比較配列と参照配列との間の整列が存在する場合、たとえ整列が特定されたものより低い同一性パーセントを示す配列中の他の場所に存在し得る場合でも、比較配列はその特定された最小の同一性パーセントを有する。
【００１７】
好ましい実施態様において、比較の目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、なおより好ましくは少なくとも60%、そしてなおより好ましくは少なくとも70%、80%、又は90%である。
【００１８】
２つのアミノ酸配列の間の配列の比較及び同一性パーセント(及び類似性パーセント)の決定は、いずれかの適切なプログラム、例えばプログラム「BLAST 2 SEQUENCES (blastp)」(Tatusova et al. FEMS Microbiol. Lett. 1999. 174: 247-250)を使用して以下のパラメーターを用いて達成され得る: マトリックス BLOSUM62; オープンギャップ11及び伸長ギャップ1ペナルティ; ギャップ x_dropoff50; 期待値10.0 文字列長さ3; フィルター: 無し。本発明によれば、配列比較は、少なくとも40アミノ酸、好ましくは少なくとも80アミノ酸、より好ましくは少なくとも100アミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも120アミノ酸に及ぶ。
【００１９】
典型的にはGPVは血小板GPVであり、そして改変GPVは改変血小板GPVである。
【００２０】
天然(すなわち、非改変)GPVは、機能的膜貫通ドメインを含み、すなわち、発現の間に細胞膜(例えば、原形質膜)への組み込みをもたらすことができるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
天然GPVは自然発生GPVである。好ましくは、天然GPVは哺乳動物起源である。一実施態様において、GPVはヒトGPVである。この実施態様によれば、天然GPVは、好ましくは配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。別の実施態様において、天然GPVはマウスGPVである。この実施態様によれば、天然GPVは好ましくは配列番号7に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。本明細書で使用される用語天然GPVとしては、限定されないが、配列番号2(シグナルペプチドを含む)及び配列番号3(シグナルペプチド無し)により表されるヒトGPVのホモログ及びオルソログが挙げられる。別の指示がなければ、用語GPVはシグナルペプチドを欠失した成熟ポリペプチドを指す。
【００２２】
最も好ましくは、天然GPVは、配列番号3に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００２３】
改変GPV
本発明に従う改変GPVは、少なくとも膜貫通ドメインが変異又はいずれかの他の手段によりもはや機能的ではないという点で、それが由来する天然GPV（「親GPV」又は「非改変GPV」とも呼ばれる）と異なる。例えば、改変GPVにおける膜貫通ドメインを表すアミノ酸配列は、親GPVと比較して１つ又はそれ以上の置換、欠失及び／又は挿入を有し得る。一実施態様において、改変GPVのアミノ酸配列は、親GPVの少なくとも膜貫通ドメイン全体を欠失する。別の実施態様において、改変GPVは切断型GPVである。ヒトGPVの膜貫通ドメインは、配列番号3のアミノ酸位置504〜527に及ぶ。マウスGPVの膜貫通ドメインは、配列番号7のアミノ酸位置503〜526に及ぶ。
【００２４】
GPVの膜貫通ドメインの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24個のアミノ酸は、改変GPVにおいて欠失されていても置換されていてもよい。一実施態様において、ヒトGPVの膜貫通ドメイン(配列番号3のアミノ酸504〜527)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24個のアミノ酸は、欠失されていても置換されていてもよい。別の実施態様において、マウスGPVの膜貫通ドメイン(配列番号7のアミノ酸503〜526)の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24個のアミノ酸は欠失されていても置換されていてもよい。
【００２５】
改変GPV、好ましくは切断型GPVは抗血栓活性を有する。抗血栓活性は、実施例１に記載される実験において示されるように決定され得る(実施例の「材料及び方法」セクションにおける「腹部大動脈の機械的損傷」も参照のこと)。試験された化合物(例えば20μg)がマウスにおいて動脈閉塞性血栓形成を遅延させるか又は防止する事ができる場合、抗血栓活性があある。好ましくは、動脈閉塞性血栓形成は、少なくとも1分、より好ましくは少なくとも5分、最も好ましくは少なくとも10分遅延される。
【００２６】
切断型GPV
切断型GPVはGPVのフラグメントからなる。切断は典型的にはGPVのC末端である。N末端は切断され得るか、又は切断されなくてもよい。
【００２７】
GPVのフラグメントは少なくとも6アミノ酸の長さを有する。好ましくは、GPVフラグメントの長さは、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、又は少なくとも400アミノ酸である。特定の実施態様において、切断型GPVは、配列番号3に示されるアミノ酸配列のフラグメントからなり、ここで該フラグメントは、6アミノ酸の最小長さ、好ましくは少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、又は少なくとも400アミノ酸を有する。
【００２８】
一実施態様において、切断型GPVは、C末端切断を有し、そしてそれが由来するGPVの完全膜貫通ドメインを欠失している。別の実施態様において、切断型GPVはC末端切断を有し、そして切断型GPVが膜結合しないような程度まで膜貫通ドメインを欠失している。
【００２９】
好ましい切断型GPVは、以下のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列からなり、ここで全てのアミノ酸位置は、示されるように、それぞれ配列番号3(実施態様1〜71)又は配列番号7(実施態様72〜141）を参照する:
【００３０】
【表１】
2019504037.tif 000002
【００３１】
【表２】
2019504037.tif 000003
【００３２】
【表３】
2019504037.tif 000004
【００３３】
上記実施態様のアミノ酸配列の上限及び下限は、互いに組み合わせられ得る。
【００３４】
特に、切断型GPVの好ましい実施態様は、配列番号3のアミノ酸1〜516、又は配列番号7のアミノ酸1〜502からなる。
【００３５】
他の実施態様において、切断型GPVは、以下の配列を含むか又は以下の配列からなる。
【００３６】
【表４】
2019504037.tif 000005
【００３７】
【表５】
2019504037.tif 000006
【００３８】
本発明の特定の実施態様において、本明細書に記載される使用のための可溶性ポリペプチドは、配列番号10に示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００３９】
別の特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、非自然発生ポリペプチドである。さらに別の特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるものではない。さらに別の特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、非自然発生ポリペプチドであり、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるものではない。
【００４０】
ポリペプチドのさらなる成分
本発明の可溶性ポリペプチドは、GPVに由来するもの以外のさらなるアミノ酸又は他の半減期延長部分を含み得る。
【００４１】
本発明の一実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドの半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール(PEG化)、グリコシル化PEG、ヒドロキシルエチルデンプン(HES化)、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー又はヒアルロン酸のような半減期延長部分の直接的又はリンカーを介した結合により延長される。別の実施態様において、可溶性ポリペプチド、好ましくは改変GPVは、アルブミンのような半減期延長タンパク質(HLEP)に化学的リンカーを介して結合される。この結合技術の原理は、Conjuchem LLCにより例となる様式で記載されている(例えば、米国特許第7,256,253号を参照のこと)。
【００４２】
本発明の別の実施態様において、可溶性ポリペプチドは、異種アミノ酸配列（すなわち、それぞれの使用されるGPVに対して異種）を含み、これは上記GPVに直接又はリンカーを介して融合される。
【００４３】
異種配列は、抗体、又はタグに対して高い親和性を有する他の分子により認識されるタグ配列であり得る。例としては、限定されないが、ポリ-ヒスチジンタグ、FLAGタグ、myc-タグ、GSTタグなどが挙げられる。タグ配列は、通常は宿主細胞における発現の際にポリペプチドの精製を容易にする。
【００４４】
好ましい実施態様において、可溶性ポリペプチドは、半減期延長タンパク質(HLEP)をさらに含む。好ましくは、HLEPはアルブミン又はそのフラグメントである。アルブミンのN末端は、改変GPVのC末端に融合され得る。1つ又はそれ以上のHLEPは、それらが改変GPVの抗血栓活性を妨げず、無効にもしなければ、改変GPVのN末端又はC末端部分に融合され得る。
【００４５】
一実施態様において、ポリペプチドは以下の構造を有する:
mGPV - L1 - H、[式1]
式中、mGPVは改変GPVであり、L1は化学結合又はリンカー配列であり、そしてHはHLEPである。
【００４６】
L1は、化学結合、又は互いに等しくても異なっていていもよい1つもしくはそれ以上のアミノ酸、例えば、1〜50、1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、1〜5もしくは1〜3(例えば1、2又は3)個のアミノ酸からなるリンカー配列であり得る。通常は、リンカー配列は野生型GPVにおける対応する位置には存在しない。L1において存在する適切なアミノ酸の例としてはGly及びSerが挙げられる。リンカーは、非免疫原性であるべきであり、そして切断不可能リンカーでも切断可能リンカーでもよい。切断不可能リンカーは、WO2007/090584に説明されるような交互のグリシン及びセリン残基から構成されてもよい。本発明の別の実施態様において、改変GPV部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーは、ペプチド配列からなり、これはヒトタンパク質における天然のドメイン間リンカーとして役立つ。好ましくは、それらの天然環境におけるこのようなペプチド配列は、タンパク質表面の近傍に位置し、そしてこの配列に対する天然の寛容性を仮定することができるように、免疫系に対してアクセス可能である。例はWO2007/090584に示される。切断可能リンカー配列は、例えばWO2013/120939 A1に記載される。
【００４７】
好ましいHLEP配列は以下に記載される。それぞれのHLEPの正確な「N末端アミノ酸」への融合、又はHLEPの１つもしくはそれ以上のアミノ酸のN末端欠失を含むそれぞれのHLEPの「N末端部分」への融合も同様に本発明に包含される。ポリペプチドは、１つより多くのHLEP配列、例えば２つ又は３つのHLEP配列を含み得る。これらの複数のHLEP配列は、直列に、例えば連続的な反復として改変GPVのC末端部分に融合され得る。
【００４８】
半減期延長ポリペプチド(HLEP)
好ましくは、半減期延長部分は半減期延長ポリペプチド(HLEP)であり、より好ましくはHLEPは、アルブミン又はそのフラグメント、免疫グロブリン定常領域及びそのフラグメント、例えばFcフラグメント、大きい流体力学体積を有する溶媒和ランダム鎖(例えば、XTEN (Schellenberger et al. Nature Biotechnol. 2009. 27: 1186-1190)、ホモアミノ酸反復(HAP)又はプロリン-アラニン-セリン反復(PAS))、アファミン、アルファ-フェトプロテイン、ビタミンD結合タンパク質、トランスフェリン又はその変異体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン-βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド(CTP)、生理条件下でアルブミン又は免疫グロブリン定常領域に結合することができるポリペプチド又は脂質から選択される。
【００４９】
本明細書で使用される「半減期延長ポリペプチド」は、好ましくは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、免疫グロブリンGの定常領域及びそのフラグメント、生理条件下でアルブミン、アルブミンファミリーのメンバー、さらには免疫グロブリン定常領域のフラグメントに結合することができる領域及びポリペプチドからなる群より選択される。これは、本明細書に記載される全長半減期延長タンパク質(例えば、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバー又は免疫グロブリンGの定常領域)であっても、改変GPVの治療的活性又は生物学的活性を安定化又は延長することができる１つもしくはそれ以上のフラグメントであってもよい。このようなフラグメントは、HLEPフラグメントがHLEPを含まないそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも25%の機能的半減期延長を生じる限り、１０又はそれ以上のアミノ酸長のものであっても、HLEP配列からの少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約50、少なくとも約100、又はそれ以上の連続したアミノ酸を含んていても、それぞれのHLEPの特定のドメインの一部又は全てを含んでいてもよい。
【００５０】
本発明の提案された凝固因子挿入構築物のHLEPフラグメントは、通常のHLEPの変異体であり得る。用語「変異体」は、保存的又は非保存的のいずれかの挿入、欠失及び置換を含み、ここでこのような変化は、改変GPVの生物学的活性をもたらす活性部位又は活性ドメインを実質的に変更しない。
【００５１】
特に、本発明の提案された改変GPV-HLEP融合構築物は、HLEP及びHLEPのフラグメントの自然発生多型変異体を含み得る。HLEPは、いずれかの脊椎動物、特にいずれかの哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、又はブタ由来であり得る。非哺乳動物HLEPとしては、限定されないが、ニワトリ及びサケが挙げられる。
【００５２】
HLEPとしてのアルブミン
用語「ヒト血清アルブミン」(HSA)及び「ヒトアルブミン」(HA)及び「アルブミン」(ALB)はこの出願において交換可能に使用される。用語「アルブミン」及び「血清アルブミン」はより広義であり、そしてヒト血清アルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)、さらには他の種由来のアルブミン(並びにそのフラグメント及び変異体)を包含する。
【００５３】
本明細書で使用される「アルブミン」は、集合的に、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、又はアルブミンの１つもしくはそれ以上の機能的活性(例えば、生物学的活性)を有するアルブミンフラグメントもしくは変異体を指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミン又はそのフラグメント、特にヒトアルブミンの成熟形態又は他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはそのフラグメント、又はこれらの分子もしくはそのフラグメントのアナログもしくは変異体を指す。
【００５４】
特に、本発明の提案された改変GPV融合構築物は、ヒトアルブミン及びヒトアルブミンのフラグメントの自然発生多型変異体を含み得る。一般的に言えば、アルブミンフラグメント又は変異体は、少なくとも10、好ましくは少なくとも40、最も好ましくは70より多いアミノ酸長である。
【００５５】
本発明の提案された改変GPV融合構築物のアルブミンフラグメントは、HA又はその保存的改変物の少なくとも１つのサブドメイン又はドメインを含み得る。
【００５６】
HLEPとしての免疫グロブリン
好ましい実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、配列番号9に示されるアミノ酸配列を含むかそれからなる。
【００５７】
HLEPとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンG(IgG)定常領域(Fc)は、治療的タンパク質の半減期を増加させることが当該分野で知られている(Dumont JA、et al. BioDrugs. 2006; 20: 151-160)。重鎖のIgG定常領域は、3つのドメイン(CH1〜CH3)及びヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、いずれの哺乳動物由来であっても、それぞれサブクラスIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4由来であってもよい。抗原結合ドメインを含まないIgG及びIgGフラグメントもまたHLEPとして使用され得る。治療的ポリペプチドフラグメントは、IgG又はIgGフラグメントに、好ましくは抗体のヒンジ領域又はペプチドリンカーを介して接続され、これは切断可能であってもよい。いくつかの特許及び特許出願は、治療的タンパク質のインビボ半減期を増強するための、治療的タンパク質の免疫グロブリン定常領域への融合を記載する。US 2004/0087778及びWO 2005/001025は、免疫グロブリン定常領域のFcドメイン又は少なくともフラグメントの、ペプチドの半減期を増加させる生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質を記載し、これは他の方法ではインビボで急速に除去されるだろう。増強された生物学的活性、延長された循環半減期及びより高い溶解性を達成するFc-IFN-β融合タンパク質が記載された(WO 2006/000448)。延長された血清半減期及び増加されたインビボ効力を有するFc-EPOタンパク質(WO 2005/063808)、さらには全て半減期延長特性を有する、G-CSF(WO 2003/076567)、グルカゴン様ペプチド-1(WO 2005/000892)、凝固因子(WO 2004/101740)及びインターロイキン-10 (US 6,403,077)とのFc融合物が開示された。
【００５８】
特定の実施態様において、Fc融合タンパク質は単量体である。他の実施態様において、Fc融合タンパク質は二量体である。
【００５９】
本発明に従って使用され得る様々なHLEPは、WO 2013/120939において詳細に記載される。
【００６０】
核酸及び発現
発現させようとするポリペプチドをコードする核酸は、当該分野で公知の方法に従って製造され得る。ヒトGPV(配列番号1)又はマウスGPV(配列番号5)のcDNA配列に基づいて、上述のGPV構築物をコードする組み換えDNAが設計及び生成され得る。ヒト及びマウス配列のさらなる詳細を表３にまとめる。
【００６１】
【表６】
2019504037.tif 000007
【００６２】
発現プラスミド中に正確な方向で挿入されたオープンリーディングフレーム全体をcDNAが含有する構築物は、タンパク質発現に使用され得る。典型的な発現ベクターは、プラスミドを保有する細胞における挿入された核酸に対応する大量のmRNAの合成を方向づけるプロモーターを含有する。それらはまた、宿主生物内でのそれらの自発的複製を可能にする複製起点配列、及び合成されたmRNAが翻訳される効率を増加させる配列を含み得る。安定な長期ベクターは、例えば、ウイルス(例えば、エプスタイン・バーウイルスゲノム由来のOriP配列)の調節配列を使用することにより自由に複製する実体として維持され得る。ゲノムDNAにベクターを組み込んだ細胞株も製造され得、この方法では、遺伝子産物が連続的に産生される。
【００６３】
典型的に、提供しようとする細胞は、改変GPVを含むポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物宿主細胞に導入することにより得られる。
【００６４】
宿主細胞
細胞培養、及びポリペプチド、好ましくはグリコシル化ポリペプチドの発現をしやすいいずれの宿主細胞も、本発明に従って利用され得る。特定の実施態様において、宿主細胞は哺乳動物のものである。本発明に従って使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、BALB/cマウス骨髄腫株(NSO/ 1、ECACC番号: 85110503); ヒト網膜芽細胞（retinoblasts）(PER.C6 (CruCell、Leiden、The Netherlands)); SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651); ヒト胎児由来腎臓株(懸濁培養における成長のために
サブクローニングされたHEK293又はHEK293細胞、Graham et al.、J. Gen Virol.、36:59、1977); ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL10); チャイニーズハムスター卵巣細胞+/-DHFR (CHO、Urlaub and Chasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、77:4216、1980); マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol. Reprod.、23:243 251、1980); サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70); アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587); ヒト子宮頸癌細胞(HeLa、ATCC CCL 2); イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(HepG2、HB 8065); マウス乳房腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51); TRI細胞(Mather et al.、Annals NY. Acad. Sci.、383:44-68、1982); MRC 5細胞; PS4細胞; ヒト羊膜細胞(CAP);及びヒト肝細胞癌株(Hep G2)が挙げられる。好ましくは、細胞株はヒト又はげっ歯細胞株、特にCHOのようなハムスター細胞株である。
【００６５】
目的の糖タンパク質の発現を達成するために十分な核酸を哺乳動物宿主細胞に導入するために適した方法は、当該分野で公知である。例えば、Gething、et al.、Nature. 1981;
293: 620-625; Mantei、et al.、Nature. 1979; 281: 40-46; Levinson、et al. EP 117,060;及びEP 117,058を参照のこと。哺乳動物細胞については、遺伝物質を哺乳動物細胞に導入する一般的な方法としては、Graham及びvan der Erbのリン酸カルシウム沈降法(Virology. 1978; 52: 456-457)又はHawley-NelsonのlipofectamineTM (Gibco BRL)法(Focus. 1993; 15: 73)が挙げられる。哺乳動物宿主細胞系トランスフェクションの一般的局面は、AxelによりUS4,399,216において記載された。遺伝物質を哺乳動物細胞に導入するための様々な技術については、Keown et al. (Methods in Enzymology、1989)、Keown et al. (Methods in Enzymology. 1990; 185: 527-537)、及びMansour et al. (Nature、1988; 336: 348-352)を参照のこと。
【００６６】
宿主細胞株を培養するために選択される基礎培地は、本発明に決定的ではなく、哺乳動物細胞の培養に適している当該分野で公知のもののいずれか１つでもそれらの組み合わせでもよい。ダルベッコ変法イーグル培地、ハムF-12培地、イーグル最小必須培地及びRPMI-1640培地などのような培地は市販されている。組み換えインスリンのような成長因子の添加は任意である。一実施態様において、産生培地は動物由来の成分を含まない。好ましい実施態様において、培地は、いずれのタンパク質も完全に含まないか、又は組み換え産生されていないいずれのタンパク質も含まないかのいずれかの意味で「タンパク質を含まない」。ヒト血清アルブミンは、糖タンパク質の産生のための無血清培養サプリメントとして使用され得る。場合により、組織培養に適しており、かつ合成又は植物起源である、セリンプロテアーゼ阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤を含有する。
【００６７】
一般に、本発明は、糖タンパク質の発現に適したいずれかの細胞培養方法とともに使用され得る。例えば、細胞は回分培養又は流加培養で増殖され得、ここで培養は糖タンパク質の十分な発現の後に終結され、その後、発現された糖タンパク質が採取される。好ましくは、細胞は連続的な培養(例えば、灌流培養)で増殖され得、ここで新鮮な培地が周期的又は継続的に培地に加えられ、そして発現された糖タンパク質は周期的又は継続的に採取される。培養は、回分、流加又は連続的のようないずれの従来の型の培養でもよいが、好ましくは連続的である。適切な連続的培養は灌流培養を含む。
【００６８】
当業者は、増殖速度、細胞生存率、細胞培養の最終細胞密度、乳酸塩及びアンモニウムのような有害な代謝副生成物の最終濃度、発現された糖タンパク質の力価、オリゴ糖側鎖の程度及び組成又は実施者により重要とみなされるこれらもしくは他の条件のいずれかの組み合わせを含むがこれらに限定されない細胞培養の特定の特徴を最適化するために、特定の細胞培養条件を調整することができるだろう。
【００６９】
発現された可溶性ポリペプチドの単離
一般に、本発明に従って発現された糖タンパク質を単離及び／又は精製することが典型的に望ましい。特定の実施態様において、発現された糖タンパク質は培地中に分泌され、したがって細胞及び他の固形物は、例えば精製プロセスの最初の工程として遠心分離又はろ過により除去され得る。
【００７０】
発現された糖タンパク質は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、アフィニティ、サイズ排除、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー)、ゲルろ過、遠心分離、もしくは吸収率較差溶解度測定（differential solubility）、エタノール沈降、及び／又はタンパク質の精製のためのいずれかの他の利用可能な技術(例えば、Scopes、Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition、Springer-Verlag、New York、1987; Higgins SJ and Hames BD (eds.)、Protein Expression: A Practical Approach、Oxford Univ Press、1999;及びDeutscher MP、Simon MI、Abelson JN (eds.)、Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series、Vol. 182)、Academic Press、1997を参照のこと、これらはそれぞれ参照により本明細書に加入される)を含むがこれらに限定されない標準的な方法により単離及び精製され得る。特に免疫親和性クロマトグラフィーについて、糖タンパク質は、その糖タンパク質対するように産生され、そして固定支持体に固定された抗体を含むアフィニティカラムに結合させることにより単離され得る。あるいは、インフルエンザコート（influenza coat）配列、ポリヒスチジン、又はグルタチオン-S-トランスフェラーゼのようなアフィニティタグが、標準的な組み換え技術により糖タンパク質に結合され得、適切なアフィニティカラムを通過させることによる容易な精製を可能にし得る。精製しようとする可溶性GPVがHLEPを含む場合、HLEPに特異的な抗体、又はHLEPに結合することができる他の化合物が、アフィニティクロマトグラフィーを行うためにアフィニティカラムに固定され得る。フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、ロイペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤は、いずれか又は全ての段階において、精製プロセスの間の糖タンパク質の分解を低減するか又は無くすために加えられ得る。プロテアーゼ阻害剤は、発現された糖タンパク質を単離及び精製するために細胞を溶解しなければならない場合に特に有利である。さらに又はあるいは、グリコシダーゼ阻害剤は、共有結合で結合されたオリゴ糖鎖の酵素トリミングを低減するか又はなくすためにいずれか又は全ての段階で加えられ得る。
【００７１】
当業者には当然のことながら、正確な精製技術は、精製しようとするポリペプチドの特徴、ポリペプチドが発現された細胞の特徴、及び／又は細胞が増殖された培地の組成に依存して変わる。
【００７２】
組成物及びキット
本発明の別の局面は、本発明の可溶性ポリペプチド、及び薬学的に許容しうる賦形剤又は担体を含む医薬組成物である。医薬組成物は、被験体における血栓性疾患を処置又は予防するために可溶性ポリペプチドを有効量で含み得る。医薬組成物は、可溶性ポリペプチドを約10μg〜1,000 mg、好ましくは約100μg〜500 mg、より好ましくは1mg〜100 mg含み得る。医薬組成物は、約0.01〜20,000μg/ml、好ましくは約0.1〜1000μg/ml、より好ましくは0.5〜500μg/ml、最も好ましくは約100μg/mlの可溶性ポリペプチドを含み得る。医薬組成物は、薬学的に許容しうる担体又は希釈剤をさらに含み得る。医薬組成物において適した単体及び希釈剤は、当該分野で周知である。
【００７３】
本明細書に記載される方法において適した本発明の糖タンパク質の治療製剤は、所望の純度を有する糖タンパク質を、当該分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容しうる担体、賦形剤又は安定剤(これらは全て本明細書で「担体」と呼ばれる)、すなわち、緩衝剤、安定剤、保存料、等張剤（isotonifiers）、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及び他の種々雑多な添加剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液としての貯蔵のために製造される、Remington's Pharmaceutical Sciences、16th edition (Osol、ed.) 1980を参照のこと。このような添加剤は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性でなければならない。
【００７４】
緩衝剤は、生理条件に近い範囲にｐHを維持するために役立つ。これらは約2 mM〜約50 mMの範囲に及ぶ濃度で存在し得る。適切な緩衝剤は、クエン酸緩衝剤(例えば、クエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など)、コハク酸緩衝剤(例えば、コハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物など)、酒石酸緩衝剤(例えば、酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など)、フマル酸緩衝剤(例えば、フマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など)、グルコン酸緩衝剤(例えば、グルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-カリウムグリコナート混合物など)、シュウ酸緩衝剤(例えば、シュウ酸-シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸-水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸-シュウ酸カリウム混合物など)、乳酸緩衝剤(例えば、乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物など)及び酢酸緩衝剤(例えば、酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など)のような有機酸及び無機酸の両方ならびにそれらの塩を含む。さらに、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及びTrisのようなトリメチルアミン塩が使用され得る。
【００７５】
保存料は微生物増殖を遅らせるために加えられ得、そして0.2%〜1%(質量/体積)の範囲に及ぶ量で加えられ得る。適切な保存料としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム(例えば、塩化物、臭化物、及びヨウ化物)、塩化ヘキサメトニウム、及びアルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、及び3-ペンタノールが挙げられる。「安定剤」として知られるときもある等調剤は、液体組成物の等張性を確実にするために加えられ得、そして多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールを含む。安定剤は、増量剤から、治療剤を可溶化するか又は変性もしくは容器壁への付着を防止するために役立つ添加剤までの機能の範囲に及び得る広義の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール(上に列挙した); アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのようなアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（myoinisitol）、ガラクチトール、グリセロールなどのような有機糖又は糖アルコール、イノシトールのようなシクリトール類を含む; ポリエチレングリコール; アミノ酸ポリマー; 尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムのような硫黄含有還元剤; 低分子量ポリペプチド(例えば、10残基又はそれ以下のペプチド); ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質; ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースのような単糖類; ラクトース、マルトース、スクロースのような二糖類、及びラフィノースのような三糖類; 並びにデキストランのような多糖類であり得る。安定剤は、活性タンパク質の0.1〜10,000質量部の範囲で存在し得る。
【００７６】
非イオン性界面活性剤又は洗剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療剤を可溶化を促進するため、さらには撹拌誘導凝集から治療用タンパク質を保護するために加えられ得、これはまた製剤がせん断面に曝されてタンパク質の変性を引き起こすことなく圧力を加えられることを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート(20、80など)、ポリオキサマー(184、188など)、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(TWEEN(R)-20、TWEEN(R)-80など)が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約0.05 mg/ml〜約1.0 mg/mlの範囲、又は約0.07 mg/ml〜約0.2 mg/mlの範囲で存在し得る。
【００７７】
さらなる種々雑多な賦形剤としては、増量剤(例えば、デンプン)、キレート剤(例えば、EDTA)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE)、及び共溶媒が挙げられる。
【００７８】
医薬組成物は、約5.0〜10.0、好ましくは約5.6〜9.0、より好ましくは約6.0〜8.8、最も好ましくは約6.5〜8.0のpHを有し得る。例えば、pHは約6.2、6.5、6.75、7.0、又は7.5であり得る。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、経口、舌下、鼻腔内、眼内、直腸、経皮、粘膜、局所又は非経口投与のために製剤化され得る。非経口投与としては、皮内、皮下、筋内(i.m.)、静脈内(i.v.)、腹腔内(i.p.)、動脈内、髄内、心臓内、関節内(関節)、滑液嚢内、頭蓋内、脊髄内、及びくも膜下腔内 (髄液)注射又は注入が挙げられ得、好ましくはマウスにおける腹腔内(i.p.)注射及びヒトにおける静脈内(i.v.)又は皮下(s.c.)である。薬物製剤の非経口注射又は注入に適したいずれのデバイスもこのような投与に使用され得る。例えば、医薬組成物は、滅菌充填済みシリンジに入れられ得る。
【００８０】
本発明の別の局面は、(i)本明細書の上で定義された可溶性ポリペプチド、及び(ii)上記可溶性ポリペプチド以外の抗凝固薬又は抗血小板薬を含む医薬キットである。一実施態様において、可溶性ポリペプチド及び抗凝固薬又は抗血小板薬は、別々の組成物に含有される。
【００８１】
用語「抗凝固薬又は抗血小板薬」は、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤(DTI)、直接又は選択的第Xa因子阻害剤(xaban)及びビタミンKアンタゴニスト(VKA)を指す。したがって、「抗凝固薬又は抗血小板薬」は、自然発生又は合成のヘパリンを含み得る。用語「抗凝固薬又は抗血小板薬」はまた、直接的に又は選択的トロンビン又は第Xa因子を阻害することにより血液の凝固を防止すする物質を含むことを意図される。別の実施態様において、抗凝固物質はビタミンKアンタゴニストである。
【００８２】
いくつかの実施態様において、抗凝固薬又は抗血小板薬は、
（ｉ）  ヘパリン、特に未分画ヘパリン(UFH)又は低分子量ヘパリン(LMWH)、
（ｉｉ）  直接トロンビン阻害剤(DTI)、特にダビガトラン、メラガトラン、アルガトロバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、キシメラガトラン又はデシルジン(Di Nisio et al. N Engl J Med. 2005; 353: 1028-40)、
（ｉｉｉ）  直接又は選択的第Xa因子阻害剤(xaban)、特にリバーロキサバン (Eriksson et al.、Circulation. 114: 2374-81)、アピキサバン(Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27: 1238-47)、ベトリキサバン（betrixaban）、エドキサバン、オタミキサバン(Cohen et al.、Circulation 115: 2642-51)又はフォンダパリヌクス(Peters et al.、Eur. Heart J. 29: 324-31)及び、
（ｉｖ）  ビタミンKアンタゴニスト(VKA)、特にフェンプロクモン、アセノクマロール又はワルファリン及び関連する4-ヒドロキシクマリン含有分子、クマテトラリル（coumatetralyl）、ジクマロール、エチルビスクムアセテート、クロリンジオン、ジフェナンジオン（diphenandione）、フェナンジオン（phenandione）又はチオクロマロール(例えば、Ansell et al. 2008、「Pharmacology and management of the vitamin K antagonists」、American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition). Chest 133 (6 Suppl): 160S-198S)
から選択される。
【００８３】
本発明の別の局面は、血栓性疾患の処置における同時、別々、又は連続的な使用のための、(i)本明細書の上で定義される可溶性ポリペプチド、及び(ii)上記可溶性ポリペプチド以外の抗血小板薬又は抗凝固薬を含む医薬キットである。
【００８４】
血栓性疾患の処置
本発明の可溶性ポリペプチドは、血栓性疾患を処置又は予防するために使用され得る。
【００８５】
本明細書で使用される「血栓性障害」又は「血栓性疾患」は、血流を閉塞させるか又は減少させる血栓（血餅）の形成を特徴とする障害又は疾患である。血栓はそれが形成された局所に残り得るか、又は脱離して下流で血流を閉塞し得る(血栓塞栓症)。いくつかの実施態様において、血栓症は、心臓及び脳を含めて身体中のどこでも静脈において（静脈血栓症）又は動脈において（動脈血栓症）起こり得る。血栓症が冠循環で起こる場合、それは冠状血栓症と呼ばれる。血栓症が脳循環で起こる場合、それは脳血栓症と呼ばれる。
【００８６】
血栓性障害は、静脈、動脈、もしくは毛細血管血栓症、心臓における血栓形成、慢性及び／若しくは急性の血栓塞栓症(例えば、肺塞栓症、心房細動誘導血栓形成後の脳血栓塞栓症(例えば、心房細動における脳卒中予防(SPAF))、ヒトもしくは動物被験体の血液を人工表面(例えば、弁置換を有する患者において、特に機械心臓弁、ステント、経皮的冠動脈形成術(PCI)、体外式膜型人工肺(ECMO)、又は心肺バイパス手術(CPB手術)の経験)と接触させた結果としての血栓形成を含み得る。血栓は、脳卒中、急性虚血性発作、心筋梗塞、不安定アンギナ、深部静脈血栓症(DVT)、門脈血栓症、血栓塞栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュロッター病、又は無症候性脳虚血(SBI)を引き起こすか、これらのリスクを増加させ得る。本発明に従う血栓性疾患は、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化、第V因子ライデン、アンチトロンビンIII欠乏症、プロテインC欠乏症、プロテインS欠乏症、プロトロンビン遺伝子変異(G20210A)、高ホモシステイン血症、抗リン脂質抗体症候群、抗カルジオリピン抗体、血栓症症候群、ループスアンチコアグラント症候群、悪性腫瘍、大手術、拘束、経口避妊薬使用、サリドマイド使用、特にデキサメタゾンとの組み合わせて、ヘパリン誘導血小板減少症、妊娠、骨髄増殖性疾患、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、発作性夜間ヘモグロビン尿症、過粘稠度症候群、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、及び外傷をさらに含み得る。用語血栓性疾患はまた、癌、例えば多発性骨髄腫及び他の血液学的癌、腺癌、膵臓、胃、卵巣、前立腺、結腸、肺、脳、乳房、腎臓、皮膚、子宮頸部の癌、及び耳鼻咽喉癌により誘導される血栓症を指す。
【００８７】
用語「血栓性疾患」は、特に、血栓-炎症性状態を含む。血栓-炎症は、血栓形成促進性かつ炎症促進性のカスケードが協調して作用し、そして疾患の進行及び器官損傷を促進するように機構的に連結する疾患状態を意味する。血栓-炎症性疾患状態は、脳(急性虚血性発作において)、肺、肝臓、結腸、心筋、又は骨格筋の虚血/再灌流傷害(I/R-傷害)のような虚血後器官損傷の状態を含むが、敗血症又は敗血症性ショックのような全身性炎症性状態も含む。
【００８８】
好ましくは、血栓性疾患は、血栓-炎症性状態、静脈血栓症、動脈血栓症、毛細血管血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、血液を人工表面、特に体外式膜型人工肺(ECMO)と接触させる間又は後の血栓形成、アテローム性動脈硬化症、関節炎、凝固障害、深部静脈血栓症(DVT)、播種性血管内凝固(DIC)、慢性又は急性の血栓塞栓症、肺血栓塞栓症、バッド・キアリ症候群、パジェット・シュレッター病、脳卒中及び心筋梗塞からなる群より選択される。
【００８９】
有効投薬量、投与の合計回数、及び本発明の可溶性ポリペプチドを用いた処置の長さの決定は、当業者の能力の十分範囲内であり、そして標準的な容量漸増試験を使用して決定され得る。投与しようとする本発明の可溶性ポリペプチドの投薬量は、特定の可溶性ポリペプチド、被験体、並びに疾患の性質及び重篤度、被験体の身体状態、治療レジメン(例えば、第二の治療剤が使用されるか否か)、並びに選択された投与経路に従って変わり; 適切な投薬量は、当業者により容易に決定され得る。
【００９０】
投薬スケジュールは、月に1度から毎日まで多数の臨床因子によって変化し得、これらの臨床因子としては、疾患の特定の型、疾患の重篤度、及び本発明の可溶性ポリペプチドに対する患者の感受性が挙げられる。特定の実施態様において、本発明の可溶性ポリペプチドは、週に2回、5日ごと、週に1回、10日ごと、2週ごと、3週ごと、4週ごともしくは月に1回、又は前述の値のいずれか２つの間の範囲で、例えば毎週から毎月、10日ごとから2週ごと、もしくは週に2〜3回などで投与される。
【００９１】
当業者には当然のことながら、本発明の可溶性ポリペプチドの個々の投薬の最適な量及び間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに処置される特定の被験体の年齢及び状態により決定され、そして医師が、使用する適切な投薬量を最終的に決定する。この投薬量は適切な限り頻繁に繰り返され得る。副作用が発生した場合、投薬の量及び／又は頻度が、通常の臨床診療に従って変更され得るか又は減らされ得る。
【００９２】
【表７】
2019504037.tif 000008
【実施例】
【００９３】
結果
実施例1: 可溶性GPVは抗血栓効果を有する
腹部大動脈の機械的損書のモデルにおけるインビボ血栓形成に対するsGPVの潜在的効果を調べるために、20μgヒトsGPV (shGPV)を、実験の直後に野生型（WT）マウスに静脈内注射した。大動脈損傷の８分後以内に、PBS注入対照マウスにおいて閉塞性血栓形成のために血流が止まった(図1)。sGPVでの予備処置はWTマウスを人工閉塞性血栓形成から保護し、これは、shGPVが抗血栓効果を有することを示す(図1)。
【００９４】
実施例2: 可溶性ヒトGPVは虚血性発作から保護する
局所脳虚血後の脳梗塞における可溶性GPVの役割を評価するために、マウスは60分の一時的な中大脳動脈閉塞(tMCAO)を受け、そして梗塞体積を２４時間後に評価した。顕著に、shGPV-AFPで処置された野生型マウスにおいて梗塞体積は、野生型マウスと比較して有意に減少した(図2)。したがって、可溶性ヒトGPVでの予備処置は、脳梗塞進行に対する保護を提供する。
【００９５】
実施例3: 可溶性ヒトGPVは尾出血時間に対する影響を有していない。
可溶性GPVの止血に対する役割を評価するために、ビヒクル又は20μg可溶性ヒトGPV(shGPV)のいずれかで処置されたマウスに尾出血時間アッセイを行った。尾端の2-mm切片をメスで取り除いた。尾出血を、創傷部位に直接接触することなく20秒間隔でろ紙で血液を静かに吸収することによりモニタリングした。ろ紙上に血液が観察されなくなった場合、出血が止まったと決定した。（図3)。これらのデータは、抗血栓作用を及ぼす（図１）shGPV用量は止血に影響を及ぼさないということを実証し、shGPVが安全な抗血栓薬であるということを示した。
【００９６】
実施例4: インビトロでの血流下でのコラーゲンへの接着
インビトロアッセイにおいて血流下でのコラーゲン上の血栓形成に対する可溶性GPVの役割を評価するために、抗凝固剤処置された全血を、20μg可溶性GPVとともに5分間インキュベートし、そしてコラーゲン被覆表面上に灌流した。shGPV-AFPで予備処理されたヒト血液(A)又は可溶性マウスGPVで予備処置された野生型血液(B)は、有意に減少した表面被覆及び減少した血栓形成を示した。したがって、インビトロ血流接着アッセイはかなりの程度までインビボ状態のモデルを形作り、そしてインビボ表現型を再現する。
【００９７】
実施例1〜4についての材料及び方法
マウス
動物試験は、ウンターフランケン（Lower Franconia）の地域関係官庁(Bezirksregierung Unterfranken)により承認された。
【００９８】
可溶性GPV
1. 可溶性ヒトGPV (shGPV)
可溶性ヒトGPV(成熟ヒトGPVのアミノ酸（aa）1〜518)を、バキュロウイルストランスフェクト昆虫細胞において組み換え的に発現させ、標準的なニトリロ三酢酸(Ni-NTA)カラムを使用して精製し、そしてPBS緩衝液に溶解した。純度を標準的SDS PAGEを使用して確認した。
【００９９】
成熟shGPVのアミノ酸配列(シグナルペプチドは示されていない): 
【化１】
2019504037.tif 000009
【０１００】
2. アルブミンに融合された可溶性ヒトGPV (shGPV-AFP)
shGPV-AFPをCHO K1細胞で発現させ、そして流加発酵システムで製造した。無細胞収穫物を、TFFシステム(例えば、Centramate 500 S Pall)を使用して30 kDメンブレン(例えば、Centramate OS030T12)を用いて30倍濃縮した。その濃縮物にNaCl及びEDTAを添加して最終濃度0.75 mol/L NaCl及び5 mmol/L EDTAとし、そして20 mM Tris緩衝液pH 7.4で予め平衡化されたCaptureSelectヒトアルブミンカラム(Lifetechnologies)に終夜ロードした。カラムを平衡緩衝液で洗浄した後、shGPV-AFPを、2 M MgCl pH 7.4を加えた20 mM Trisで溶出した。溶出液をむしろ濃縮し、そして50 mM Tris + 150 mM NaCl pH7.4に対して遠心式限外ろ過フィルターを使用して30 kDカットオフで透析した(例えば、Amicon 参照UFC903024)。
【０１０１】
成熟shGPV-AFPのアミノ酸配列(シグナルペプチドは示されていない): 
【化２】
2019504037.tif 000010
【０１０２】
3. 可溶性マウスGPV (smGPV)
可溶性マウスGPV(aa 1〜519成熟マウスGPV)をCHO細胞において組み換え的に発現させ、抗Flagカラムを使用して精製し、そしてPBS緩衝液に溶解した。純度を標準的SDS PAGEを使用して確認した。
【０１０３】
成熟smGPVのアミノ酸配列(シグナルペプチドは示されていない):
【化３】
2019504037.tif 000011
【０１０４】
腹部大動脈の機械的損傷
麻酔したマウス(10〜16週齢)の腹腔を開けるために縦正中切開を行い、そして腹部大動脈を露出した。ドプラー超音波流量プローブ(Transonic Systems、Maastricht、Netherlands)を動脈の周りに設置し、そして流量プローブの上流で鉗子で１回堅く圧縮して（15秒）機械的損傷により血栓を誘導した。完全な閉塞が起こるまで又は30分が経過するまで血流をモニタリングした。
【０１０５】
一時的中大脳動脈閉塞(tMCAO)
8〜12週齢マウスにおいて一時的中大脳動脈閉塞(tMCAO)により局所脳虚血を誘導した。吸入麻酔を70%N2/30%O2混合物中の2%イソフルランにより誘導し、そしてサーボ制御加熱デバイスを使用して、外科手技の間の体温を記録及び維持した。動物ごとの外科手技の時間は１５分以内に維持された。シリコンゴム被覆6.0ナイロン単一フィラメント(6021PK10、Doccol、Redlands、CA、USA)を頸動脈を通して中大脳動脈(MCA)の起点まで進めてMCA梗塞を引き起こした。６０分の閉塞時間の後、フィラメントを除去して再灌流させた。動物を再灌流の２４時間後に屠殺し、そして脳を脳内出血について検査した。梗塞の程度を、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC、Sigma-Aldrich) (2% (質量/体積)溶液)で染色した脳切片で、再灌流の２４時間後に定量的に評価した。脳浮腫について補正した梗塞領域の面積測定(ImageJ software、NIH、Bethesda、MD、USA)を盲検様式で行った。
【０１０６】
出血時間アッセイ
マウスを三種麻酔の腹腔内注射により麻酔し、そして尾端の2-mm切片をメスで取り除いた。尾出血を、創傷部位に直接接触することなく20秒間隔でろ紙で血液を静かに吸収することによりモニタリングした。ろ紙上に血液が観察されなくなった場合、出血が止まったと決定した。この実験は、焼灼により２０分後に手動で止められた。
【０１０７】
インビトロでの血流下のコラーゲン上の血栓形成
コラーゲンへの接着について、カバーグラスを200 μg mL-1コラーゲンIで37℃ o/nにてコーティングし、そして１時間PBS中1% BSAでブロックした。全血(700 μl + 300μlヘパリン(TBS中20 U/ml、pH7.3))を、Ca2+を含有するタイロード緩衝液中2:1で希釈し、そして1 ml注射器に充填した。灌流前に、抗凝固薬処理した血液を、Dylight-488結合抗GPIX誘導体(0.2 μg/mL)とともに37℃で5分間インキュベートした。50 μmのスリット深さを有し、被覆したカバーグラスを備えた透明フローチャンバーを、希釈した全血を充填したシリンジに接続した。無パルスポンプを使用して壁せん断速度1000 s-1又は1,700 s-1に等しい高せん断応力下で灌流を行った。凝集体形成を、Zeiss Axiovert 200倒立顕微鏡(40x/0.60対物)を用いて可視化した。位相コントラスト及び蛍光画像をCoolSNAP-EZカメラを用いて記録し、そしてMetaVueソフトウェアを使用してオフラインで分析した。
【０１０８】
統計的分析
結果を、１群あたり少なくとも３つの個々の実験からの平均±SDとして示す。適用可能なフィッシャーの正確確率検定を統計的分析のために使用した。他の方法では、ウェルチのｔ検定を、統計的分析のために行った。ｐ値<0.05を統計的に有意とみなした。
【図１】
2019504037.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2019504037000001.app
【国際調査報告】
2019504037.tif 000016
2019504037.tif 000017
2019504037.tif 000018
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