(57)【要約】  本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、皮膚傷の予防または治療用薬学的組成物、これを含有する薬学製剤、およびその製造方法に関する。本発明のエクソソームに基づいた治療剤によれば、無細胞製剤であるので、発癌の危険性が少なく、移植拒絶反応の問題がないだけでなく、全身投与時に微細血管に閉塞を起こすおそれがなく、細胞ではない分離物質であって、在庫があってすぐに入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）製品への薬剤開発が可能であるので、製造コストを低減することができ、トロンビン処理効果によって低い濃度のエクソソームでも血管新生および皮膚傷治療効果に優れているという長所がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、皮膚傷の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞よりなる群から選択される幹細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、または胎盤に由来する、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記皮膚傷の治療は、血管内皮細胞成長促進による血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）による、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子、および遺伝子よりなる群から選択される補助成分をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記エクソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または血管新生因子の発現が増加している、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記成長因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を含有する、皮膚傷の予防または治療用薬学製剤。
【請求項９】
前記製剤は、注射剤形、注入剤形、噴霧剤形、液状剤形、またはパッチ剤形である、請求項８に記載の薬学製剤。
【請求項１０】
トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、皮膚傷改善用医薬部外品製剤。
【請求項１１】
前記皮膚傷の改善は、血管新生によるものである、請求項１０に記載の医薬部外品製剤。
【請求項１２】
前記エクソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または血管新生因子の発現が増加している、請求項１０に記載の医薬部外品製剤。
【請求項１３】
前記医薬部外品製剤は、液剤、軟こう剤、クリーム剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤、およびエアロゾル剤よりなる群から選択される皮膚外用剤形態である、請求項１０に記載の医薬部外品製剤。
【請求項１４】
下記の段階を含む、請求項１に記載の薬学的組成物の製造方法：
（ａ）幹細胞の培養後にトロンビンを処理する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）の培養液からエクソソームを分離する段階；および
（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエクソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階。
【請求項１５】
前記段階（ａ）のトロンビンは、培地内に１〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記段階（ｂ）のエクソソームは、遠心分離を３，０００〜１００，０００ｇで１０分〜５時間行うことにより分離される、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを個体に投与する段階を含む、皮膚傷治療方法。
【請求項１８】
トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームの皮膚傷予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、皮膚傷（Ｓｋｉｎ  Ｗｏｕｎｄ）の予防または治療用薬学的組成物、これを含有する薬学製剤、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、身体を保護する防御膜の役割をし、疾患に対する身体の第１次防御ラインであり、表皮（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）が微生物の侵入に対する障壁を提供する。したがって、傷、火傷、擦過傷および皮膚に対するその他損傷の治療において一次的な目的は、感染を予防するための迅速な縫合（ｃｌｏｓｕｒｅ）および傷治癒である。
【０００３】
この際、傷治癒は、一般的に、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）および再形成（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）の三つの段階を伴う複雑な過程である。一番目の段階は、止血（ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）を達成するための凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）、そして細菌および壊死組織を破壊するための好中球の補充、その後に大食細胞の補充を伴う。二番目の段階で、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が発生し、この際、内皮細胞が傷部位に移動し、これと同時に線維芽細胞が傷部位に移動して、肉芽組織（ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｓｓｕｅ）の生産を助ける。肉芽組織の形成により、再上皮化（ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）が起こり得る。最終段階で、コラーゲン生産と破壊の水準が均等になり、治癒された傷は、最大強度を達成するためにゆっくり変更される。前記過程のうち一つでも適切な時期に適正に機能しない場合、傷治癒が遅延したり損傷したりするので、慢性的な状態にまで達することがある。
【０００４】
慢性的な傷（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗｏｕｎｄ）は、８週以上の治療が要求される開放創（ｏｐｅｎ  ｗｏｕｎｄ）と定義され、損傷した治癒過程は、たびたび糖尿病合併症と関連することがあるので、高い四肢切断率と甚だしくは死亡等の深刻な結果を招くことがある。約１５％の糖尿病患者が、治らない慢性的な傷で苦痛を受けている。したがって、傷は、個人だけでなく、社会的にも重要な問題であり、初期に早く治療する場合、２次感染の危険を減らすことができる。
【０００５】
効果的な傷治療は、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ，ＥＣＭ）沈着、細胞増殖／移動を含む複雑な分子生物学的イベントを介した非常に組織化した統合された調整を必要とする。慢性的な傷の発生に関連した主な因子の一つは、局所線維芽細胞（ｌｏｃａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）および炎症細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）により分泌されるサイトカイン分泌系の損傷であり、これにより、血管新生の減少が誘発される。
【０００６】
一方、幹細胞は、その多分化能と共に、組織の再生、治療および免疫反応に関与する細胞として知られていて、このような特性を利用して臍帯血、骨髄等から間葉系幹細胞を分離培養して、多様な疾患や症状に対する治療剤として開発しようとする努力があった。
【０００７】
しかしながら、このような幹細胞自体を利用した治療法は、次のような限界と副作用の問題があった。
【０００８】
第一に、基本的に、細胞治療剤は、ＤＮＡトランスファーによる発癌（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）可能性を排除することができない。第二に、幹細胞自体の大きいサイズに起因して血管閉塞や心筋梗塞を誘発することある。第三に、臍帯血のような同種細胞を使用して移植（同種移植）する場合、細胞表面抗原による拒絶反応の問題がある。第四に、一般的に細胞治療剤は、製造工程が複雑であり、保管運送に制約が多いため、生産費用が高いという限界がある。
【０００９】
このように、幹細胞が有している基本的限界に起因して、副作用を低減しながらも、治療効果を増進させるための方案として、遺伝子操作を利用した効能改善方法が開発されたことがあるが、現在まで明確な代案はないのが現況である。
【００１０】
エクソソームは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい小胞（約３０〜１００ｎｍの直径）であって、電子顕微鏡を用いた研究において原形質膜から直接脱離するものではなく、多小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｉｅｓ，ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内の特定区画を起源とし、細胞外に放出、分泌されることが観察された。すなわち、多小胞体と原形質膜の融合が生ずると、小胞は、細胞外環境に放出されるが、これをエクソソームと言う。このようなエクソソームがどんな分子的機序により形成されるかは明確に明らかにされていないが、赤血球細胞だけでなく、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、樹枝状細胞、血小板、大食細胞等を含む多様な種類の免疫細胞、腫瘍細胞、幹細胞等も、生きている状態でエクソソームを生産して分泌すると知られている。
【００１１】
特に、幹細胞に由来するエクソソームは、受容体および蛋白質だけでなく、核成分を含有していて、細胞間コミュニケーションの役割をするものと知られている。また、前記幹細胞に由来するエクソソームは、幹細胞に比べて動物血清を相対的に少なく含有していて、動物血清の感染による症状（動物原性感染症）の危険性もやはり排除することができる。このようなエクソソームの特性を考慮すると、エクソソームを利用した細胞治療法は、既存の幹細胞治療法の限界を克服できる新しいパラダイムになるものと期待される。
【００１２】
これと関連して、韓国公開特許第２０１２−０１３３７０９号には、皮膚細胞から獲得したエクソソームの皮膚再生効果が開示されているが、トロンビン処理された幹細胞由来のエクソソームが従来の方法と比較して皮膚傷の治療に優れていることは全く知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これより、本発明者らは、皮膚傷と関連して、幹細胞治療剤が有する制約を克服しながらも、治療効能を改善させるために鋭意研究した結果、幹細胞由来のエクソソーム、特にトロンビンで処理した幹細胞に由来するエクソソームが、血管新生および皮膚傷の治癒効果を顕著に増加するという事実を確認することにより、本発明を完成することになった。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、トロンビンで処理した幹細胞に由来するエクソソームを含む、皮膚傷の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１５】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、皮膚傷の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
本発明の一実施形態において、前記幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞よりなる群から選択される幹細胞であることを特徴とする。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、または胎盤に由来するものであることを特徴とする。
【００１９】
本発明のさらに他の実施形態において、前記皮膚傷の治療は、血管内皮細胞の成長促進による血管新生によるものであることを特徴とする。
【００２０】
本発明のさらに他の実施形態において、前記皮膚傷は、表皮、真皮、または皮下組織の欠損によるものであることを特徴とする。
【００２１】
本発明のさらに他の実施形態において、前記薬学的組成物は、経口または非経口で投与されることを特徴とする。
【００２２】
本発明のさらに他の実施形態において、前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子、および遺伝子よりなる群から選択される補助成分をさらに含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明のさらに他の実施形態において、前記エクソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または血管新生因子の発現が増加していることを特徴とする。
【００２４】
本発明のさらに他の実施形態において、前記成長因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）であることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明は、前記組成物を含有する、皮膚傷の予防または治療用薬学製剤を提供する。
【００２６】
本発明の一実施形態において、前記製剤は、注射剤形、注入剤形、噴霧剤形、液状剤形、またはパッチ剤形であることを特徴とする。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、前記製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、皮膚傷改善用医薬部外品製剤を提供する。
【００２９】
本発明の一実施形態において、前記皮膚傷の改善は、血管新生によるものであることを特徴とする。
【００３０】
本発明の他の実施形態において、前記エクソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または血管新生因子の発現が増加していることを特徴とする。
【００３１】
本発明のさらに他の実施形態において、前記医薬部外品製剤は、液剤、軟こう剤、クリーム剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤、およびエアロゾル剤よりなる群から選択される皮膚外用剤形態であることを特徴とする。
【００３２】
また、本発明は、（ａ）幹細胞の培養後、トロンビンを処理する段階と；（ｂ）前記段階（ａ）の培養液からエクソソームを分離する段階と；（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエクソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階とを含む、前記薬学的組成物の製造方法を提供する。
【００３３】
本発明の一実施形態において、前記段階（ａ）のトロンビンは、培地内に１〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、前記段階（ｃ）のエクソソームは、遠心分離されることを特徴とする。
【００３５】
本発明のさらに他の実施形態において、前記遠心分離は、５，０００〜５００，０００ｇで１０分〜５時間行われることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを個体に投与する段階を含む、皮膚傷治療方法を提供する。
【００３７】
また、本発明は、皮膚傷を予防または治療する製剤を製造するために使用されるトロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームの用途を提供する。
【発明の効果】
【００３８】
本発明のエクソソームをベースとした治療剤によれば、無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）製剤であるので、ＤＮＡが含まれていないため、発癌の危険性が少なく、細胞表面抗原がないので、移植拒否反応の問題がない。
【００３９】
また、細胞よりサイズが非常に小さいので、全身投与時に微細血管に閉塞を起こすおそれがなく、細胞ではない分離物質であって、在庫があってすぐに入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）製品への薬剤開発が可能であるので、製造コストを低減することができる。
【００４０】
また、非処理幹細胞に比べてトロンビンで処理した幹細胞に由来するエクソソームが、少ない量でも皮膚傷の治療効果に優れているので、治療的用量のエクソソームを生成するための幹細胞の要求量を顕著に減少させて、治療剤の生産費用を顕著に低減することができるという長所がある。
【００４１】
したがって、本発明によれば、幹細胞治療剤が有する従来の問題を解決しながらも、治療効能を顕著に改善できるため、エクソソームをベースとした治療剤は皮膚傷の治療に有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】幹細胞にトロンビン処理時にエクソソームの分泌が活性化する過程をＴＥＭイメージ分析により確認した結果である。
【図２】トロンビン処理された幹細胞由来のエクソソームにおいてエクソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９が正常に発現するかを確認したウェスタンブロットの結果である。
【図３】トロンビン処理によりエクソソーム内成長因子（ＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ）、抗炎症サイトカイン（ＩＬ−６）等の発現が増加することを示す免疫分析の結果である。
【図４ａ】トロンビン処理幹細胞由来のエクソソームが濃度依存的に血管新生効果を発揮することを示す管形成アッセイ（ｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）の結果である。
【図４ｂ】管形成アッセイの結果を定量化したグラフである。
【図５ａ】エクソソームが由来する細胞の種類によって血管新生効果に違いが生じることを示す管形成アッセイの結果である。
【図５ｂ】管形成アッセイの結果を定量化したグラフである。
【図６ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚傷動物モデルでトロンビン処理幹細胞由来のエクソソームに対する皮膚傷の治癒効果を示す結果である。
【図６ｂ】治癒効果を定量化したグラフである。
【図７】ｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚傷動物モデルにおいて、線維芽細胞由来のエクソソーム（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、トロンビン未処理幹細胞由来のエクソソーム（ｎａｉｖｅ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）および低酸素前処理幹細胞由来のエクソソーム（ｈｙｐｏｘｉａ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）の皮膚傷の治癒効果を比較した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、皮膚傷の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００４４】
本発明で「幹細胞」とは、未分化の細胞であって、自己複製能力を有し、二つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。本発明の幹細胞は、自家幹細胞または同種由来幹細胞であってもよく、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む任意の種類の動物由来であってもよく、前記幹細胞が成体に由来するものであってもよく、胚芽に由来するものであってもよいが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明の幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは成体幹細胞である。前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、または多分化能幹細胞であってもよく、好ましくは間葉系幹細胞であるが、これらに限定されない。前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、および胎盤等に由来する間葉系幹細胞であってもよいが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明で「臍帯血」は、胎盤と胎児を連結する臍帯静脈から採取された血液を意味する。臍帯血は、出産時に自然的に発生する副産物であって、数回の手術を必要とする骨髄等の一般間葉系組織より採取が非常に容易であり、骨髓移植に比べて臍帯血の保管産業が活性化して、既にインフラが構築されているので、供与者を求めることも容易である。これと共に、臍帯血由来細胞は、組織や臓器移植で拒絶反応を起こす最も重要な原因である組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲ（ｃｌａｓｓ  ＩＩ）が発現しない細胞であるので、既存の移植手術時に問題になった拒絶反応等の免疫反応を誘発しないか、最小化することができて、自家由来臍帯血はもちろん、他家由来臍帯血も使用することができる。
【００４７】
本発明で「エクソソーム」とは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい（約３０〜１００ｎｍの直径）小胞を意味し、多小胞体と原形質膜の融合が生じて、細胞外環境に放出される小胞を意味する。前記エクソソームは、自然的に分泌されるものであるか、あるいは人工的に分泌されるものを含む。
【００４８】
本発明で「皮膚傷」とは、表皮、真皮、または皮下組織の欠損を含む意味である。
【００４９】
本発明で「皮膚傷の予防または治療」とは、皮膚傷の軽減、緩和、および症状の改善を含み、皮膚傷ができる可能性を低減することを含む意味である。本発明では、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に本発明の「トロンビン処理された幹細胞」を処理した結果、血管内皮細胞の成長が促進されて血管が新生されることを確認した。
【００５０】
血管新生は、既存血管の内皮細胞が細胞外基質を分解し、移動、分裂、および分化して、新しい毛細血管を形成する現象であって、傷治癒の生理的過程で必然的に現れるため、血管新生効果を確認することにより、傷治癒効果を検証することができる。すなわち、血管新生は、傷ついた皮膚組織が再生するための必須の傷回復過程に必ず伴わなければならない。傷の初期段階には、細胞の壊死と血管の破壊による炎症反応が起こることになり、この炎症反応以後に、血液成分の脱血管現象、血小板の活性化および血液凝固と共に、カリクレイン、トロンビン、およびプラスミン等のような生物学的媒介物質が形成される一連の過程を経ることになる。
【００５１】
本発明で「トロンビン処理された幹細胞」は、非処理幹細胞に比べて細胞生存、酸化機能等細胞安定性には変化なしに幹細胞の主な作用機序であるパラクリン特性の増加によって幹細胞の機能／効能を強化することができる。さらに、トロンビン処理によって、幹細胞に由来するエクソソームの治療効能を強化させるだけでなく、エクソソームの分泌量を増加させることができる。
【００５２】
この際、パラクリンとしては、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または再生因子が増加されることがあり、成長因子は、細胞分裂や生長、分化を促進するタンパク質性の生理活性物質を意味するものであり、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６；Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）等を含むことができる。特に、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管形成を調節する代表的なタンパク質である。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞に存在するＶＥＧＦ受容体１、２、または３（ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３）と結合してＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）のチロシンリン酸化を誘導して、血管内皮細胞の活性化をもたらし、最終的に、血管新生過程に重要な影響を及ぼすことになる。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で特別な制限なしに投与され得、例えば、経口または非経口方式で投与され得る。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、幹細胞由来のエクソソームと共に、皮膚傷の治療効果を有する公知の補助成分の１種または複数種をさらに含有することができる。例えば、皮膚傷の治療に効果的な遺伝子（例えば、抗炎症性サイトカイン遺伝子、炎症性サイトカインに対するｓｉＲＮＡまたはアンチ−センスプライマー）またはこれを含む発現ベクター、自己分泌または傍分泌効果を提供するサイトカイン（例えば、インターロイキン−１０）、成長因子（例えば、ケラチノサイト成長因子）、およびこれらの組合せよりなる群から選択される補助成分の１または複数をさらに含むことができる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。前記組成物の投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これらに限定されない。
【００５６】
本発明の薬学的組成物は、皮膚傷の治療のために、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００５７】
本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体をさらに含むことができる。例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、または安定化剤等を、局所投与用製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤、または保存剤等をさらに含むことができる。
【００５８】
本発明の組成物は、薬学的分野において通常の方法により個体の身体内投与に適合した単位投与型の製剤で剤形化させて投与することができる。このような目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バックのような注入剤、およびエアロゾル製剤のような噴霧剤等が好ましい。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、ブドウ糖、リンガー液等を使用することができる。また、注入バックは、塩化ポリビニルまたはポリエチレン材質のものを使用することができる。本発明で投与は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【００５９】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なり、当業者によって適宜選択され得る。前記組成物の投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これらに限定されない。
【００６０】
また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、皮膚傷改善用医薬部外品製剤を提供する。
【００６１】
本発明で医薬部外品製剤は、液剤、軟こう剤、クリーム剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤、およびエアロゾル剤よりなる群から選択される皮膚外用剤形態であってもよく、具体的に、消毒清潔剤、シャワーフォーム、口腔ケア剤、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟こう剤、またはフィルター充填剤組成物として用いられる。
【００６２】
また、本発明は、（ａ）幹細胞の培養後にトロンビンを処理する段階と；（ｂ）前記段階（ａ）の培養液からエクソソームを分離する段階と；（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエクソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階とを含む、前記薬学的組成物の製造方法を提供する。
【００６３】
本発明でトロンビン処理濃度は、幹細胞／エクソソームの効能を強化させるのに適合した濃度であれば十分であり、特別な制限はないが、培地に１〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれることが好ましい。
【００６４】
本発明でエクソソームを分離する方法には制限がなく、例えば培養液から、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、毛細管電気泳動、ポリマーを利用した分離等の方法およびこれらの組合せを利用して分離することができ、好ましくは遠心分離／超遠心分離である。この際、遠心分離／超遠心分離は、４℃で３，０００〜１００，０００ｇで１０分〜５時間行うことが好ましい。
【００６５】
本発明で細胞培養に用いられる培地は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、血清、成長因子、無機質等の細胞の成長および増殖等に必須の要素を含む、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での幹細胞等の細胞の成長および増殖のための混合物を意味する。本発明で用いられる培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２）、α−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、およびＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ等の商業的に製造された培地または人為的に合成した培地を含むが、これらに限定されない。
【００６６】
また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを個体に投与する段階を含む、皮膚傷治療方法を提供する。
【００６７】
本発明で「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス、ラット、犬、猫、馬、および牛等の哺乳類を意味する。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【００６９】
実施例１．幹細胞のトロンビン処理によるエクソソーム分泌および効能増強誘導
１−１．トロンビンによるエクソソーム分泌誘導
ヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞（３×１０５個）を１００ｍｍの培養ディッシュ（ｏｒａｎｇｅ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃａｔ＃４４５０２００）に分注した後、１週間培養した。培養ディッシュに細胞が飽和増殖したことを確認した後、５０ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン（ＲＥＹＯＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，ＬＴＤ）が希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭ  ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａ）に交換し、さらに６時間培養した。
【００７０】
この際、トロンビン処理により間葉系幹細胞でエクソソームの分泌が活性化するかを確認するために、エクソソームの分泌過程をＴＥＭ（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージにより確認した。その結果、図１に示したように、トロンビンによる刺激がエクソソームの分泌を誘導することが分かった。
【００７１】
その後、前記培養液を遠心分離チューブに分けて入れて、４℃、６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して、細胞残屑を除去した。さらに、前記上澄み液を４℃、１００，０００ｒｐｍで２〜４時間、超遠心分離した後、上澄み液をさらに除去して、エクソソームを収得した（最終濃度：１５μｇ／ｍｌ）。
【００７２】
この際、収得した産物がエクソソームであるか否かを確認するために、公知のエクソソームマーカーであるＣＤ６３およびＣＤ９（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）の発現をウェスタンブロットによって検証した。その結果、図２に示したように、トロンビン処理された幹細胞で収得したエクソソームは、正常にＣＤ６３およびＣＤ９を発現しており、エクソソームであることが確認された。
【００７３】
１−２．トロンビンによるエクソソーム効能増強
前記実施例１−１で収得したエクソソームが、トロンビン処理により成長因子やＩＬ−６のような抗炎症サイトカイン等の発現が増加したかを確認した。
【００７４】
具体的には、溶解バッファーを利用して前記エクソソーム膜を溶解した後、エクソソーム内のタンパク質を分離して、エクソソーム内のＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６の量をＰｒｏｃａｒｔａ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、米国）で測定した。
【００７５】
その結果、図３に示したように、トロンビン処理によりエクソソーム内の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現が、トロンビン非処理幹細胞で収得したエクソソーム（対照群、正常群）に比べて増加したことが確認された。
【００７６】
このような結果は、トロンビン処理により幹細胞由来のエクソソームの細胞再生、血管再生、抗炎症効能が増強されることを意味するものである。
【００７７】
実施例２．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生効果：管形成アッセイ
２−１．エクソソーム濃度による効果
本発明の「トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム」が、血管内皮細胞の分化を誘導して管形成（血管新生）に影響を及ぼすことができるかを確認するために、成長因子減少マトリゲル（Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）を利用した管形成アッセイを行った。
【００７８】
具体的には、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣｓ）をＬｏｗ  Ｓｅｒｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＬＳＧＳ）が含まれたＭｅｄｉｕｍ  ２００ＰＲＦ培地で１２時間培養した後、トリプシン処理して回収し、５％ウシ胎児血清を含有するＭ１９９培地に再懸濁した。成長因子減少マトリゲルを２４ウェルプレートに２５０μｌずつそれぞれ分注し、３７℃のＣＯ２培養器で重合化した。ＨＵＶＥＣ細胞を、重合化したマトリゲルを含むウェルに１ウェル当たり４×１０４個の細胞濃度で添加し、実施例１で得た「トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム」を２．５ｕｇ／ｍｌ、５ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌの濃度別に添加した。細胞を３７℃で２４時間、ＣＯ２培養器で培養した後、培養物を写真撮影し（×４０）、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）公開プログラムを利用して形成されたチューブの長さを測定した。
【００７９】
その結果、図４ａおよび図４ｂに示したように、本発明の「トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム」は、対照群（未処理群ＮＣ）に比べて、濃度依存的に血管内皮細胞の分化を誘導することにより管形成を増加させた。
【００８０】
２−２．エクソソーム由来細胞別評価
ＨＵＶＥＣ細胞に、トロンビン未処理幹細胞由来のエクソソーム（ＭＳＣ  ＥＣＶ）、トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム（ＭＳＣ  ｔｈｒｏｍ  ＥＣＶ）、トロンビン未処理線維芽細胞由来のエクソソーム（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ＥＣＶ）、トロンビン処理線維芽細胞由来のエクソソーム（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｔｈｒｏｍ  ＥＣＶ）をそれぞれ１０ｕｇ／ｍｌの濃度で処理したことを除いて、前記実施例２−１と同じ方法で実験を行った。
【００８１】
その結果、図５ａおよび図５ｂに示したように、本発明のトロンビン処理幹細胞で収得したエクソソーム（ＭＳＣ  ｔｈｒｏｍ  ＥＣＶ）は、トロンビン未処理幹細胞で収得したエクソソーム（ＭＳＣ  ＥＣＶ）に比べて顕著に向上した血管生成能力を示した。それだけでなく、線維芽細胞で収得したエクソソームは、トロンビン処理有無に関係なく、血管生成能力を全く発揮しなかったことから、エクソソームが由来する細胞の種類／能力によって特異的に治療的効能（血管生成能力）が決定されることが分かる。
【００８２】
実施例３．ｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚傷治療効果
すべての動物実験は、三星生命科学研究所の実験動物委員会（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｓａｍｓｕｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、韓国）により承認を受け、機関のガイドラインに従った。
【００８３】
まず、成体ラットの背中部分に０．８ｍｍの生検パンチで皮膚をパンチングして、皮膚傷動物モデルを製作した後、線維芽細胞由来のエクソソーム（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、トロンビン未処理幹細胞由来のエクソソーム（ｎａｉｖｅ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）のそれぞれを２０ｕｇずつ生理食塩水に混合して、合計１０ｕｌの製剤で製造した後、傷の表面に塗布した。
【００８４】
その結果、図６ａおよび図６ｂに示したように、本発明のトロンビン処理幹細胞で収得したエクソソームは、トロンビン未処理幹細胞で収得したエクソソームに比べて顕著に向上した傷治療効果を示した。それだけでなく、線維芽細胞で収得したエクソソームは、対照群（生理食塩水）と同様に傷治療効果を全く発揮しないことを確認することができた。
【００８５】
さらに、ＳＤ−ラットの背中部位に除毛を施行した後、パンチ生検で損傷を誘導した後、線維芽細胞由来のエクソソーム（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、トロンビン未処理幹細胞由来のエクソソーム（ｎａｉｖｅ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）、および低酸素前処理幹細胞由来のエクソソーム（ｈｙｐｏｘｉａ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）のそれぞれを塗布した後、皮膚回復状態を確認した。
【００８６】
その結果、図７に示したように、正常群に比べて皮膚をパンチ生検して損傷を与えた傷対照群（ｗｏｕｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ；ＷＣ）では、正常皮膚組織に回復しない所見が示され、これは、線維芽細胞由来のエクソソームを投与した場合にも、同じ所見が示された。他方で、トロンビン未処理幹細胞由来のエクソソーム（ｎａｉｖｅ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）と低酸素前処理幹細胞由来のエクソソーム（ｈｙｐｏｘｉａ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）では、多少好転する傾向を示し、トロンビン処理幹細胞由来のエクソソーム（ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＭＳＣ  ｅｘｏｓｏｍｅ）では、正常組織に近い皮膚回復状態を示し、顕著に向上した傷治療効果を示すことを確認した。
【００８７】
前記結果から、エクソソームが由来する細胞の種類／能力によって特異的に治療的効能が決定されることが分かる。
【００８８】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明によるトロンビンで処理した幹細胞由来のエクソソームに基づいた治療剤によれば、従来の幹細胞治療剤が有する問題である移植拒絶反応や製造コスト等の問題を解決しながらも、治療効能を顕著に改善できるため、皮膚傷の治療に有用に用いられる。
【図１】
2019520365.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月7日(2019.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、皮膚傷の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞よりなる群から選択される幹細胞である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、または胎盤に由来する、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記皮膚傷の治療は、血管内皮細胞成長促進による血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）による、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子、および遺伝子よりなる群から選択される補助成分をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記エクソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または血管新生因子の発現が増加している、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記成長因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ；ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、神経成長因子（ＮＧＦ；ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、または血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）である、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物を含有する、皮膚傷の予防または治療用薬学製剤。
【請求項９】
前記製剤は、注射剤形、注入剤形、噴霧剤形、液状剤形、またはパッチ剤形である、請求項８に記載の薬学製剤。
【請求項１０】
トロンビン処理された幹細胞に由来するエクソソームを有効成分として含む、皮膚傷改善用医薬部外品製剤。
【請求項１１】
前記皮膚傷の改善は、血管新生によるものである、請求項１０に記載の医薬部外品製剤。
【請求項１２】
前記エクソソームは、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子、または血管新生因子の発現が増加している、請求項１０に記載の医薬部外品製剤。
【請求項１３】
前記医薬部外品製剤は、液剤、軟こう剤、クリーム剤、スプレー剤、パッチ剤、ゲル剤、およびエアロゾル剤よりなる群から選択される皮膚外用剤形態である、請求項１０に記載の医薬部外品製剤。
【請求項１４】
下記の段階を含む、請求項１に記載の薬学的組成物の製造方法：
（ａ）幹細胞の培養後にトロンビンを処理する段階；
（ｂ）前記段階（ａ）の培養液からエクソソームを分離する段階；および
（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエクソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階。
【請求項１５】
前記段階（ａ）のトロンビンは、培地内に１〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれる、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記段階（ｂ）のエクソソームは、遠心分離を３，０００〜１００，０００ｇで１０分〜５時間行うことにより分離される、請求項１４に記載の製造方法。
【国際調査報告】
2019520365.tif 000012
2019520365.tif 000013
2019520365.tif 000014
2019520365.tif 000015
2019520365.tif 000016
2019520365.tif 000017