(57)【要約】【課題】  【解決手段】  とりわけ、タンパク質または核酸の形態での有効量のチャネルロドプシン（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲなど）または蛍光タンパク質に融合した有効量のチャネルロドプシン（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲなど）およびそれらの組成物を投与することによって哺乳類の網膜神経節細胞を活性化する方法が開示される。方法は、放射線安全性限界より低いＲＧＣ応答を誘起する光刺激レベルを含み得る。方法はアデノ随伴性ウィルスベクターによる送達を含み得る。方法はＣＡＧプロモーターの使用を含み得る。方法は有効量のチャネルロドプシン（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲタンパク質など）の長期発現をもたらし得る。
2019518073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を活性化する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを哺乳類に投与することを包含する方法。
【請求項２】
対象でのニューロン介在障害を処置または防止する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物をニューロンに投与することを包含する方法。
【請求項３】
内網膜細胞での光への感受性を回復させる方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を内網膜細胞に投与することを包含する方法。
【請求項４】
対象に視覚を回復させる方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
【請求項５】
対象に視覚を回復させる方法であって、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
【請求項６】
対象の網膜変性を処置または防止する方法であって、光受容体機能の損失により網膜変性を患う対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
【請求項７】
ヒトの目の光受容体機能を回復させる方法であって、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法。
【請求項８】
電気的に活性の細胞を脱分極する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を細胞に投与することを包含する方法。
【請求項９】
ＲＧＣ応答を誘起する光刺激レベルが放射線安全性限界より低い、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質はＣｈｒｉｍｓｏｎ８８またはＣｈｒｉｍｓｏｎＲである、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光タンパク質はＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ（ＴｄＴ）タンパク質および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｔｄＴタンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独に比べて光刺激への応答がより効果的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光タンパク質は、所定細胞数に対する融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現レベルを、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独の発現レベルに比べて増大させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現レベルは、前記Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の向上した溶解度、トラフィッキング、および／またはタンパク質構造を通して増大する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ２ベクターおよびＡＡＶ２．７ｍ８ベクターから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ２．７ｍ８ベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクターはＣＡＧプロモーターを含む、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターは硝子体内に注射される、１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
蛍光タンパク質に融合した有効量の前記Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は長期にわたって発現される、請求項１から８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
蛍光タンパク質に融合した前記Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現は投与後少なくとも２カ月、または投与後少なくとも１１カ月持続する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか１つに記載のベクターの１つまたはそれ以上を備えた組成物。
【請求項２３】
１つまたはそれ以上のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および１つまたはそれ以上の蛍光タンパク質を融合状態でまたは個別にコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを備えた組成物。
【請求項２４】
請求項１から２１のいずれかに記載の方法の１つまたはそれ以上で使用するための請求項２２および２３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２５】
哺乳類の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を再活性化する、対象のニューロン介在障害を処置または防止する、内網膜細胞での光への感受性を回復させる、対象の網膜変性を処置または防止する、光受容体機能を回復させる、および／または電気的に活性の細胞を脱分極するための、請求項２２および２３に記載の組成物のいずれか１つの使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年４月２９日出願の米国仮出願第６２／３２９，６９２号の優先権の利益を主張し、その内容の全体が本明細書において参照により援用される。
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、本配列表はその全体が本明細書において参照により援用される。該ＡＳＣＩＩの複製は、２０１７年４月２８日に作成され、名称１２２９５＿０００６−００３０４．ｔｘｔ、大きさは３１バイトである。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、とりわけ、膜をまたぐ伝導性、細胞活性、および細胞機能を変更する組成物および方法を提供し、また細胞内および対象内での外因性光活性イオンチャネルの使用に関する。より詳しくは、本発明の実施形態の１つの局面は、哺乳類の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を再活性化する方法であって、哺乳類に有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎポリペプチドを投与することを包含する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、放射線安全性限界より低いＲＧＣ応答を誘起する光刺激レベルを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃｈｒｉｍｓｏｎポリペプチドは蛍光タンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質はｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【背景技術】
【０００４】
網膜は光受容体よりなり、これらは光情報伝達、すなわち光を、視覚系内の事象の連鎖を伝達し最終的には世界の一表現を生成する電気的および化学的信号へと変換することによる網膜の感光性に関与する高度に専門化したニューロンである。脊椎動物の網膜では、光情報伝達は光感応性受容体タンパク質、ロドプシンの活性化によって開始される。
【０００５】
網膜色素変性（ＲＰ）または黄斑変性（ＭＤ）の場合などの光受容体損失または変性は、網膜内の視覚情報の光情報伝達を、完全に阻害することはないにしても、非常に危うくする。光受容細胞の損失および／または光受容細胞機能の損失が視力の低下、光感受性の低下、および失明の主な原因である。
【０００６】
現在、網膜変性疾患専用のいくつかの治療アプローチが開発中であり、これらには遺伝子治療、幹細胞治療、光遺伝学、および人工網膜が含まれる（Ｓｃｈｏｌｌら、２０１６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８（３６８）、３６８ｒｖ６）。
【０００７】
例えば、光遺伝学と称する遺伝子工学および神経工学技術によって脳内の他のニューロンに影響を与えることなく明確なニューロン集団の活性を制御することによって対象の網膜の感光性を回復させることが提案されている。欠陥遺伝子の置換または修復、またはタンパク質欠乏または不全の修正を経ての遺伝子欠陥の回避を企てる伝統的な遺伝子治療とは対照的に、治療への遺伝学的アプローチは、網膜内の通常は感光性ではない細胞に光に応答する能力を付与し、これにより有効視覚を患者に回復させるために用いることができる。細胞外電気刺激を双極細胞または神経節細胞に与える網膜チップ移植とは異なり、光遺伝学ベースの治療は細胞を細胞内から刺激する。
【０００８】
光遺伝学（Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ８（１）：２６−９、２０１１）は生体組織の特定の細胞内の明確な事象を制御するために遺伝学と光学とを組み合わせることをいう。光遺伝学は、特定の標的メカニズムの使用を通じての細胞型分解能を維持する一方で、神経活性のミリ秒精度での操作を可能にする光活性化チャネルの細胞への導入を包含する。これは、光応答性を授与する遺伝子の発見と細胞への挿入を含む：また、哺乳類と同じ位複雑な有機体へと光を深く送達するための、光感受性を問題の細胞に向けるための、そしてこの光制御の特定の読み出し情報または効果を評価するための関連する諸技術を含む。
【０００９】
例えば、ＷＯ２００７０２４３９１、ＷＯ２００８０２２７７２またはＷＯ２００９１２７７０５は、哺乳類ニューロンでの発現用に設計され、またウィルスベクターを用いて特定の神経細胞集団を遺伝子学的に標的とすることができる、光活性化イオンチャネルおよびポンプ（例えば、チャネルロドプシン−２［ＣｈＲ２］；ｈａｌｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ［ＮｐＨＲ］）をコードする植物および微生物（例えば、古細菌、バクテリア、および菌類）由来のオプシン遺伝子の使用について記載している。適切な波長を有する光に曝すと、オプシン発現ニューロン内に活動電位が引き起こされ、これによりこれら細胞に光感受性が与えることができる。
【００１０】
最近、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉまたはＶｏｌｖｏｘ  Ｃａｒｔｅｒｉからの４つのチャネルロドプシン遺伝子由来の数多くのチャネルロドプシンが、神経科学的用途のために設計されている。しかしこれら天然のチャネルロドプシンは青色−緑色（４３０−５５０ｎｍ）スペクトルピークのみを有し、Ｃ１Ｖ１およびＲｅａＣｈＲなどの、設計赤方偏移チャネルロドプシンは緑色（〜５４５ｎｍ）にピーク波長感度を有する（Ｍａｔｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１１  Ｄｅｃ１８；９（２）：１５９−７２；Ｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３  Ｏｃｔ；１６（１０）：１４９９−５０８）。
【００１１】
２０１４年、Ｋｌａｐｏｅｔｋｅら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１（３）、３３８−３４６は、従って、前述のチャネルロドプシンには見出せない独特の特徴を持つ新しいオプシンを発見することを目指して、天然のチャネルロドプシンの遺伝子的多様性の研究を通してこれらの限界を克服するよう努めた。ＷＯ２０１３０７１２３１は従って、新規のチャネルロドプシン、ＣｈｒｏｎｏｓおよびＣｈｒｉｍｓｏｎを開示している。これらは互いに異なりまた最先端技術（例えば、ＣｈＲ２／ＶＣｈＲ１）とも異なる活性化スペクトルを有し、また異なる細胞内で遺伝子的に発現させた異なる活性化スペクトルを持つチャネルを発現させ、次に異なる色の光で組織を照射することによって、多数の異なる波長の光を同じ組織内の異なる細胞組を脱分極するために用いるのを可能にする。より詳しくは、Ｃｈｒｉｍｓｏｎはこれまでのいかなるチャネルロドプシンに比べても４５ｎｍ赤方偏移しており、これは、赤色光は、他のチャネルロドプシン変種によって必要とされる青色から緑色波長より、組織による分散が弱くまた血液による吸収が少ないため、好適であるという状況にとっては重要となり得る。
【００１２】
オプシンは、オプシン発現細胞での可視化を促進し従ってこれらの細胞内位置確認を監視するために蛍光タンパク質に融合させることが多い。さらに、使用する蛍光タンパク質のいくつかのタイプはある状況下ではオプシンの細胞位置確認を変調させることができることが示されている。例えば、Ａｒｒｅｎｂｅｒｇら（２００９、ＰＮＡＳ、１０６（４２）、１７９６８−７３）は同一のオプシンを含有するが蛍光タグは異なる融合タンパク質（すなわち、赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙまたは黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ）は異なる細胞内コンパートメント内で分配される場合があると観察している。
【００１３】
しかしこの観察は、発現レベルまたは膜位置確認での明白な相違は、ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したチャネルロドプシン２発現トランスジェニック動物には見られていないため、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光タグでは確認されなかった（Ｍａｄｉｓｅｎら、２０１２、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１５（５）：７９３−８０２）。その上、融合タンパク質の位置確認または発現レベルにおけるこの変化に関連するオプシンの活性についていかなる進展も今日までに報告されていない。
【発明の概要】
【００１４】
１つの実施形態では、本開示は、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質、より詳しくは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（ＣｈｒＲ）と呼ばれるその１つの特別な突然変異体が、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独に比べて、光刺激に対する応答がより効果的であることを示す。いくつかの方法の実施形態では、蛍光タンパク質は、所定細胞数に対する融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現レベル、より詳しくはプラズマ膜でのタンパク質レベルを、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独／非融合の発現レベルと比べて増大させる。いくつかの他の方法の実施形態では、蛍光タンパク質は、融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質のプラズマ膜への細胞トラフィッキングを、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独／非融合の細胞トラフィッキングと比べて増大させる。いくつかの方法の実施形態では、融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現レベルおよび／または細胞トラフィッキングは、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の向上した溶解度、トラフィッキング、および／またはタンパク質構造を通して増大する。
【００１５】
１つの局面では、本開示は、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する。
【００１６】
別の局面では、本開示は、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００１７】
別の局面では、本開示は、ベクターを含む組成物を包含する。ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む。
【００１８】
さらに別の局面では、本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む。
【００１９】
さらに別の局面では、本開示は、対象におけるニューロン介在の障害を処置または防止する方法を包含し、本方法はベクターを含む組成物を細胞（すなわちニューロン）に投与することを含む。ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む。好ましくは、投与組成物のベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む。
【００２０】
さらに別の局面では、本開示は、内網膜細胞での光への感受性を回復させる方法を包含する。本方法は、ベクターを含む組成物を細胞に投与することを包含する。ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む。好ましくは、投与組成物のベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む。
【００２１】
異なる局面では、本開示は、対象に視覚を回復させる方法を包含する。本方法は、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、ベクターを含む組成物を目？に投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む、組成物を投与すること、ポリペプチドを光により活性化させること、および対象の光感受性を測定することを包含し、ここで光感受性の増大は視覚回復を示す。
【００２２】
別の局面では、本開示は、対象に視覚を回復させる方法であって、本方法は、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、ベクターを含む組成物を目に投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合した少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む、組成物を投与すること、ポリペプチドを光により活性化させること、および対象の光感受性を測定することを包含し、ここで光感受性の増大は視覚回復を示す。
【００２３】
他の局面では、本開示は、対象の網膜変性を処置または防止する方法を包含する。本方法は、光受容体機能の損失による網膜変性を患う対象を同定すること、ベクターを含む組成物を目に投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む、組成物を投与すること、および対象の光感受性を測定することを包含し、ここで光感受性の増大は網膜変性の処置を示す。
【００２４】
さらに別の局面では、本開示は、対象の網膜変性を処置または防止する方法を包含し、本方法は、光受容体機能の損失による網膜変性を患う対象を同定すること、ベクターを含む組成物を投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合した少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む、組成物を投与すること、および対象の光感受性を測定することを包含し、ここで光感受性の増大は網膜変性の処置を示す。
【００２５】
ある局面では、本開示は、ヒトの目の光受容体機能を回復させる方法を包含する。本方法は、有効量のベクターを含む組成物を投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む、組成物を投与することを包含する。
【００２６】
別の局面では、本開示は、ヒトの目の光受容体機能を回復させる方法を包含し、本方法は、有効量のベクターを含む組成物を投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合した少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む、組成物を投与することを包含する。
【００２７】
さらに別の局面では、本開示は、電気的に活性の細胞を脱分極する方法を包含する。本方法は、細胞にベクターを含む組成物を投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および蛍光タンパク質を含む、組成物を投与することを包含する。
【００２８】
さらに別の局面では、本開示は、電気的に活性の細胞を脱分極する方法を包含し、本方法は、細胞にベクターを含む組成物を投与することであって、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、ポリペプチドは蛍光タンパク質に融合した少なくとも１つのＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を含む、組成物を投与することを包含する。
【００２９】
本開示の方法のいくつかの実施形態では、ベクターはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである。本方法のいくつかの実施形態では、ベクターはＡＡＶ２．７ｍ８ベクターまたはＡＡＶ２ベクターである。いくつかの実施形態では、本方法はさらにＣＡＧプロモーターの使用を包含する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ベクターは注射により投与され、好ましくは、硝子体内に注射される。
【００３１】
本方法のいくつかの実施形態では、有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は長期にわたって発現される。本方法のいくつかの実施形態では、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現は注射後少なくとも１１カ月持続する。本方法のいくつかの実施形態では、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現は注射後少なくとも２カ月持続する。
【００３２】
本方法のいくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳類はマウスである。本方法のいくつかの実施形態では、マウスはｒｄ１である。本方法のいくつかの実施形態では、哺乳類はラットである。本方法のいくつかの実施形態では、ラットはＰ２３Ｈである。本方法のいくつかの実施形態では、哺乳類はヒトまたは非ヒト霊長類である。本方法のいくつかの実施形態では、非ヒト霊長類はカニクイザルである。
【００３３】
以下の開示はまた以下の追加の実施形態を提供する。
【００３４】
実施形態１は、哺乳類の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を再活性化する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを哺乳類に投与することを包含する方法を提供する。
【００３５】
実施形態２は、対象のニューロン介在障害を処置または防止する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物をニューロンに投与することを包含する方法を提供する。
【００３６】
実施形態３は、内網膜細胞での光への感受性を回復させる方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を内網膜細胞に投与することを包含する方法を提供する。
【００３７】
実施形態４は、対象に視覚を回復させる方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法を提供する。
【００３８】
実施形態５は、対象に視覚を回復させる方法であって、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法を提供する。
【００３９】
実施形態６は、対象の網膜変性を処置または防止する方法であって、光受容体機能の損失により網膜変性を患う対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法を提供する。
【００４０】
実施形態７は、ヒトの目の光受容体機能を回復させる方法であって、光覚または光感受性の欠損により視覚を損失した対象を同定すること、および蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を対象に投与することを包含する方法を提供する。
【００４１】
実施形態８は、電気的に活性の細胞を脱分極する方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質を発現するベクターを備えた組成物を細胞に投与することを包含する方法を提供する。
【００４２】
実施形態９は、実施形態１から８のいずれか１つによる方法であって、ＲＧＣ応答を誘起する光刺激レベルが放射線安全性限界より低い、方法を提供する。
【００４３】
実施形態１０は、実施形態１から８のいずれか１つによる方法であって、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質はＣｈｒｉｍｓｏｎ８８またはＣｈｒｉｍｓｏｎＲである、方法を提供する。
【００４４】
実施形態１１は、実施形態１０の方法であって、蛍光タンパク質はＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ（ＴｄＴ）タンパク質および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、方法を提供する。
【００４５】
実施形態１２は、実施形態１１の方法であって、ｔｄＴタンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独に比べて光刺激への応答がより効果的である、方法を提供する。
【００４６】
実施形態１３は、実施形態１０の方法であって、蛍光タンパク質は、所定細胞数に対する融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現レベルを、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質単独の発現レベルに比べて増大させる、方法を提供する。
【００４７】
実施形態１４は、実施形態１３の方法であって、融合Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現レベルは、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の向上した溶解度、トラフィッキング、および／またはタンパク質構造を通して増大する、方法を提供する。
【００４８】
実施形態１５は、実施形態１から８のいずれか１つの方法であって、ベクターはアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクターである、方法を提供する。
【００４９】
実施形態１６は、実施形態１５の方法であって、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２ベクターおよびＡＡＶ２．７ｍ８ベクターから選択される、方法を提供する。
【００５０】
実施形態１７は、実施形態１６の方法であって、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２．７ｍ８ベクターである、方法を提供する。
【００５１】
実施形態１８は、実施形態１から８のいずれか１つの方法であって、ベクターはＣＡＧプロモーターを含む、方法を提供する。
【００５２】
実施形態１９は、実施形態１から８のいずれか１つの方法であって、ベクターは硝子体内に注射される、方法を提供する。
【００５３】
実施形態２０は、実施形態１から８のいずれか１つの方法であって、蛍光タンパク質に融合した有効量のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は長期にわたって発現される、方法を提供する。
【００５４】
実施形態２１は、実施形態２０の方法であって、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質の発現は投与後少なくとも２カ月、または投与後少なくとも１１カ月持続する、方法を提供する。
【００５５】
実施形態２２は、実施形態１から２１のいずれか１つによるベクターの１つまたはそれ以上を備えた組成物を提供する。
【００５６】
実施形態２３は、１つまたはそれ以上のＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質および１つまたはそれ以上の蛍光タンパク質を融合状態でまたは個別にコードする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを備えた組成物を提供する。
【００５７】
実施形態２４は、請求項１から２１のいずれかの方法の１つまたはそれ以上で使用するための請求項２２および２３のいずれか１つによる組成物を提供する。
【００５８】
実施形態２５は、哺乳類の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を再活性化する、対象のニューロン介在障害を処置または防止する、内網膜細胞での光への感受性を回復させる、対象の網膜変性を処置または防止する、光受容体機能を回復させる、および／または電気的に活性の細胞を脱分極するための、請求項２２および２３の組成物のいずれか１つの使用を規定する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ｒｄ１マウスでのインビボの方法
【図２Ａ−２Ｄ】変性ｒｄ１マウス網膜はＣｈｒｉｍｓｏｎＲスペクトル感度に一致する波長（ｗａｖｅｌｉｇｈｔ）の光におよび１０ｍｓより短い持続期間に応答する。図２Ａ：注射後２カ月のＣｈｒＲ−ｔｄＴ発現ｒｄ１マウスの眼底。図２Ｂ：ＭＥＡチップ上に載置したｒｄ１マウス網膜のＴｄＴ蛍光。図２Ｃ：ＣｈｒＲ発現マウス網膜のスペクトル感度（ｎ＝１網膜、１８８個の電極）。図２Ｄ：１ｅ１７光子ｃｍ−２ｓ−１、５９０ｎｍ、増大持続期間の刺激に応答した追加発火率。すべての記録はＬ−ＡＰ４、ＣＮＱＸおよびＣＣＰの混合の存在下で行われる。
【図３Ａ−３Ｃ】ＣｈｒｉｍｓｏｎＲはｒｄ１マウスにおいてｔｄＴと融合するとより効率的である。図３Ａ：ＣｈｒＲまたはＣｈｒＲ−ｔｄＴに感染した網膜間の比較は光刺激への応答においてより効果的であった。図３Ｂ：ＣｈｒＲ−ｔｄＴ発現網膜の応答ＲＧＣの生データ、ラスタープロットおよび平均ＰＳＴＨ（それぞれ上から下へ）。図３Ｃ：ＣｈｒＲ（ｎ＝４網膜、２７個の細胞）またはＣｈｒＲ−ｔｄＴ（ｎ＝６網膜、５４８個の細胞）を発現する網膜の強度プロットであって、異なる刺激強度での活性化レベルを示す。
【図４Ａ−４Ｇ】神経節細胞でのＣｈｒｉｍｓｏｎＲの発現。ｒｄ１マウスの網膜神経節細胞（ＲＧＣ）でのＣｈｒＲ−ｔｄＴの発現。インビボでのＡＡＶ感染後のＣｈｒＲ−ｔｄＴの発現はＲＧＣに大きく限定された。図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ：ＲＧＣの２つの例での膜局在発現を示す共焦点スタックの投映像。図４Ａ：内因性ｔｄＴｏｍａｔｏの画像、免疫学的増幅なし。図Ｂ：我々のカスタムメイドのＣｈｒＲ抗体に対する標識化の画像。図４Ｃ：両画像（図４Ａおよび図４Ｂ）のオーバーレイ、ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣｈｒＲ抗体に対してそれぞれマジェンタおよびシアン。画像は４０ｘ対物レンズで撮影。ＣｈｒＲ−ｔｄＴの発現はＲＧＣ膜で濃縮される。図４Ｄおよび図４Ｅ：２つのＲＧＣ（図４Ｃの差し込み図参照）の細胞体を示す３つの光学スライスの投影像、６０ｘ対物レンズで撮影。図４Ｆおよび図４Ｇ：それぞれ図４Ｄおよび図４Ｅの細胞体に対する蛍光強度の３Ｄ表面プロット。最高蛍光強度を示すピークは細胞膜にまたはそれらの近くに集中する。
【図５Ａ−５Ｄ】ＣｈｒｉｍｓｏｎＲの長期発現。注射後１０カ月のｒｄ１マウスの多電極アレイ記録。図５Ａ：発現が注射後１０カ月持続することを示すＣｈｒＲ−ｔｄＴの発現網膜の画像。図５Ｂ：１つの電極上で測定した活性の例、上―赤色での光刺激、中―フラッシュ１０回の繰り返しに対する同じ細胞の応答のラスタープロット、下―平均ＰＴＳＨ（ビン寸法：ＳＯｍｓ）。図５Ｃ：増大する強度のフラッシュに応答した追加発火率（ｎ＝４網膜、３０８個の電極）。図５Ｄ：１ｅ１７光子ｃｍ−２．ｓ−１、５９０ｎｍ、増大持続期間のフラッシュに応答した追加発火率。すべての記録はＬ−ＡＰ４、ＣＮＱＸおよびＣＰＰの混合の存在下で行われる。
【図６Ａ−６Ｂ】ＣｈｒｉｍｓｏｎＲはＰ２３Ｈ網膜を活性化する。別の変性齧歯類モデル：Ｐ２３Ｈラットについての多電極アレイ記録。図６Ａ：注射後１カ月での多電極アレイ上のＰ２３Ｈ網膜の蛍光画像。図６Ｂ：１ｅ１７光子ｃｍ−２．ｓ−１、５９０ｎｍ、増大強度の刺激に応答した追加発火率（ｎ＝２網膜、９１個の電極）。すべての記録はＬ−ＡＰ４、ＣＮＱＸおよびＣＰＰの混合の存在下で行われる。
【図７】非ヒト霊長類でのインビボの方法。非ヒト霊長類（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）でのＣｈｒＲに対して４つの異なる戦略を試験した。２つの異なる構築物：ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（ＣｈｒＲ）または融合タンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ（ＣｈｒＲ−ｔｄＴ）、共にＣＡＧプロモーター下。２つの異なるウィルスカプシド：ワイルドタイプＡＡＶ２および突然変異体ＡＡＶ２−７ｍ８（Ｄａｌｋａｒａら、２０１３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（１８９）：１８９ｒａ７６）。単一用量のウィルス（５ｘ１０１１ｖｇ／目）の注射をＭＥＡ（５１２アレイ、ＭＣＳ）またはパッチクランプ（ポスターＣｈａｆｆｉｏｌら、アブストラクト５９９−Ｂ００７２参照）記録の２カ月前に行った。すべての記録はシナプス遮断薬（ＬＡＰ４５０μＭおよびＣＰＰ１０μＭ）の存在下で行った。
【図８Ａ−８Ｃ】構築物のインビボ注射後、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲを中心窩周辺で発現させる。構築物のインビボ注射が傍中心窩環のＲＧＣでの発現に至る。図８Ａ：網膜外植片の赤外線画像、アステリスクが中心窩ピットのくぼみを示す。黒色ドットはＭＥＡアレイの電極である。図８Ｂ：ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴ構築物に感染した同じ網膜片の蛍光画像。発現は傍中心窩環に制限される。図８Ｃ：図８Ａ＆図８Ｂに表示した網膜外植片スペクトル感度。応答は１０回の繰り返しにわたっておよびすべての応答電極にわたっての平均とした。スペクトルの形状およびシナプス遮断薬の存在は、ＲＧＣでのＣｈｒＲが記録された活性の源であることを示す。
【図９Ａ−９Ｇ】最も効率的な形質導入へと導くテスト構築物の同定。形質導入は応答電極数および光誘発応答の感度として評価される。図９Ａ：４つの異なる強度での光フラッシュへの１つの電極の応答例。図９Ｂ：４つの構築物に対する実験一式の概観。活性電極：活動電位が検出される電極。応答電極：発火率が光刺激によって増大した電極。図９Ｃ，図９Ｄおよび図９Ｅ：様々な構築物に対しての各応答網膜に対する群集応答。各着色ラインは個々の電極応答を表し、１０回の繰り返しにわたっての平均とした。グラフの各行は１つの網膜からの応答を表し、各列は同じ光刺激（光子／ｃｍ２／秒で上部での強度）への異なる網膜の応答を表す。図９Ｆ：異なる光強度での各応答網膜に対する平均追加発火率。自然発火率は差し引かれる。図９Ｇ：応答閾値をより良好に視覚する図Ｆの詳細図。すべての刺激は６００ｎｍで行われた。
【図１０Ａ−１０Ｄ】ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈＲ−ｔｄＴに感染した網膜での増大する持続期間の傍中心窩ＲＧＣ刺激への応答。ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴに感染した網膜での増大する持続期間の刺激への傍中心窩ＲＧＣの応答。図１０Ａ：増大する持続期間の光刺激への応答、各ラインは刺激毎に１０回の繰り返しにわたる単一電極スパイク密度関数の平均を表す。図１０Ｂ：テストしたすべての期間に対する平均発火率。図１０Ｃ：４つの異なる活性閾値に対する異なる刺激持続時間での活性部位の割合。図１０Ｄ：第１スパイクまでの時間、すべてのテスト持続時間に対する１０回の刺激繰り返しにわたる平均。赤色ドットは中央値、四角形の各縁はデータの第２５および７５百分位数、そして髭部分は個々にプロットされた分離部分以外の残りの部分を示す。１から５ミリ秒間の刺激の中央値の重要な落下は、ほとんどの記録部位がこれらの持続期間の間に応答を始めることを示す。すべての刺激は２ｘ１０１７光子ｃｍ−２．ｓ−１の強度、６００＋／−２０ｎｍで提供した。
【図１１】ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ  ｍＲＮＡレベルでのｔｄＴｏｍａｔｏの効果。ＲＴ−ｑＰＣＲ反応でのＣｈｒｉｍｓｏｎＲの増幅曲線。縦軸は実験反応に対応するデルタＲｎ値マイナス基準信号のＲｎ値を表す。このパラメータは所与セットのＰＣＲプライマーから生成される特定の信号の大きさを確実に計算する。マジェンタおよび紫色のトレースはＣｈｒｉｍｓｏｎＲを表す；黄色およびオレンジ色のトレースはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏを表す；暗いおよび明るい青色のトレースは非トランスフェクト対照群である。実験は３回繰り返し、各実験は２プレートで行い、合計６回の繰り返しとした。各サンプルは各プレート上で３通りに行った。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＨＥＫ２９３細胞をｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲおよびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトさせたときのＣｈｒｉｍｓｏｎＲタンパク質のレベル。
【図１３】ＣｈｒｉｍｓｏｎＲを発現する細胞数に及ぼすｔｄＴｏｍａｔｏの効果。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ陽性細胞の百分率は、非トランスフェクト対照群と比べた、プラスミド４７９（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）および４８０（ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ）でトランスフェクトさせた細胞を表す。蛍光細胞の百分率は、背景蛍光を除去するために閾値を用いることによって決定した。細胞数は細胞当たりの蛍光強度を示してはいないことに注意することが重要である。この細胞カウント法に基づくと、２つの構築物によるトランスフェクション後のＣｈｒｉｍｓｏｎＲ発現細胞の百分率間に統計学的に有意な相違はない。エラーバーは本実験内でのＳＥＭを表し、実験は各条件に対して技術的２回反復で３回繰り返した。
【図１４Ａ−１４Ｂ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＣｈｒｉｍｓｏｎＲの細胞内局在性に及ぼすｔｄＴｏｍａｔｏの効果。トランスフェクトさせたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の画像；共焦点ｚスタックの最大投影により得た。細胞核を青色（ＤＡＰＩ）で、またＣｈｒｉｍｓｏｎＲを白色で示す。図１４ＡはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｄｔＴｏｍａｔｏの局在性を示す；図１４ＢはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ単独の分布を示す。スケールバー２０μｍ。
【図１５Ａ−１５Ｂ】ＡＡＶ感染後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＣｈｒｉｍｓｏｎＲの細胞内局在性に及ぼすｔｄＴｏｍａｔｏの効果。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の画像、共焦点ｚスタックの最大投影により得た。細胞核を青色（ＤＡＰＩ）で、またＣｈｒｉｍｓｏｎＲを白色で示す。図１５ＡはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｄｔＴｏｍａｔｏの局在性を示す；図１５ＢはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ単独の分布を示す。スケールバー２０μｍ。
【発明の詳細な説明】
【００６０】
本開示において、特に明記のない限り、単数の使用は複数を含み、語「ａ」または［ａｎ］は「少なくとも１つ」を意味し、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、用語「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形式と共に、制限がない。また、特に明記のない限り、「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」または「構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」などの用語は、１単位を備える要素および構成要素と、１単位より多い単位を備える要素または構成要素との両方を包含する。
【００６１】
本明細書で用いられる百分率または他の数量と関連して用いるときの用語「約」は、その百分率または他の数量のプラスまたはマイナス１０％を意味する。例えば、用語「約８０％」は８０％プラスまたはマイナス８％を包含することになる。
【００６２】
特許、特許出願、記事、書籍、および論文を含むがこれらに限定されない本出願で言及するすべての文書または文書の一部は、それらの全体がいかなる目的に対しても本明細書において参照によって明示的に援用される。１つまたはそれ以上の援用文献および類似の資料が、ある用語を本出願でのその用語の定義に矛盾する方法で定義している場合は、本出願が優位となる。
【００６３】
本明細書で用いる用語「タンパク質」、≪ポリペプチド≫および「ペプチド」は、そうではない指示がない限り、置き換え可能である。
【００６４】
本明細書で用いられる用語≪融合タンパク質≫または≪別物に融合したタンパク質≫はタンパク質構築物またはキメラタンパク質のことをいう。これは、追加の化学的リンカー無しにそれぞれのペプチド鎖内のペプチド結合を介して共有結合している２つまたはそれ以上のタンパク質またはその断片を含有する単一のタンパク質分子を意味する。１つのタンパク質はそのＮ末端またはＣ末端のいずれかで別のタンパク質に融合することができる。融合タンパク質はさらに遺伝的構造から得られるリンカー部分を備えることができる。
【００６５】
本明細書で用いられ、他に指摘がない限り、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」は、患者が障害、例えばニューロン介在障害または眼疾患を患うときに起こる、該障害の１つまたはそれ以上の徴候または結果の重症度を低減させる行為を意図する。本明細書で用いられ、他に指摘がない限り、用語「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、患者が障害、例えばニューロン介在障害または眼疾患を患い始める前に起こる、該障害の発現を遅らせ、および／または該障害の重症度を抑えるかまたは低減させる行為を意図する。処置は予防処置、または疾患または症状の診断に続いて施される処置であり得ることは理解されよう。本発明の処置は、障害、疾患、または症状の徴候または特性の低減または除去、または障害、疾患、または症状それ自体を除去し得る。本発明の処置は、障害、疾患、または症状の進行を低減または除去、および、場合によっては疾患、障害、または症状の緩解となり得ることは理解されよう。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の１つまたはそれ以上の光活性化イオンチャネルポリペプチドは細胞集団内で発現され、障害または症状を処置する方法において使用され得る。
【００６６】
本明細書で用いられ、他に特定されない限り、化合物の「治療上有効量」は、ニューロン介在障害または眼疾患の処置または管理において治療的有用性を提供するのに、または障害、例えばニューロン介在障害または眼疾患に関連する１つまたはそれ以上の徴候を遅らせるかまたは最小限にするのに十分な量である。ある化合物の治療上有効量は、その化合物の単独の、または障害、例えばニューロン介在障害または眼疾患の処置または管理において治療的有用性を提供する１つまたはそれ以上の治療および／または治療薬と組み合わせた化合物の量を意味する。用語「治療上有効量」は、ニューロン介在障害または眼疾患を緩和する、眼疾患を改善または低減する、治療全体を改善する、または別の治療薬の治療有効性を向上させる量を包含することができる。
【００６７】
本明細書で用いられる「患者」または「対象」は、ヒトおよび非ヒト哺乳類、例えば齧歯類、マウス、ラット、非ヒト霊長類、犬および猫などのペット、ならびに例えば羊、牛、馬などの家畜類などであるがこれらに限定されない、本明細書で述べる障害を患っているまたは患いやすい哺乳類有機体を含む。
【００６８】
網膜ニューロンの、本発明のＣｈｒｉｍｓｏｎポリペプチドをコードする核酸（例えばベクター）によるトランスフェクションは、網膜ニューロン、好ましくは双極細胞および／または神経節細胞に感光性膜チャネルを提供する。従って、光刺激により、動物の視覚皮質、本明細書で企図される視覚形態を構成する視覚信号の処理を担う脳の領域への視覚刺激の伝達を測定することが可能である。このような視覚は通常のヒトの視覚の形態とは異なり得、光の感覚と呼ばれ、また「光検出」または「光感知」とも命名され得る。従って、本明細書で用いられる用語「視覚」は、光を刺激として有用に検出する有機体の能力として定義される。「視覚」は以下のこと：（ｉ）光検出または感知、すなわち光が存在するか否かを認識する能力；（ｉｉ）光投影、すなわち光刺激が来ている方向を認識する能力；（ｉｉｉ）分解能、すなわち格子または文字標的での異なる輝度レベル（すなわちコントラスト）を検出する能力；および（ｉｖ）認知、すなわち標的内の異なるコントラストレベルの参照によって視覚標的の形状を認知する能力を包含するよう企図される。従って、「視覚」は、光、好ましくは赤色光、より好ましくは約３６５ｎｍから約７００ｎｍの間、約５３０ｎｍから約６４０ｎｍの間の波長を有する光の存在を単に検出する能力を含み、いくつかの実施形態では、ピーク活性化は約５９０ｎｍの波長を有する光と接触すると起こり得る。
【００６９】
本明細書で用いられる「機能性誘導体」は、用語が本明細書において接続で用いられようと二者択一で用いられようと関係なく「突然変異体」、「変異体」および「断片」を包含する。好適な変異体は、単一アミノ酸同類置換変異体であるが、例えば２、３、４または５残基の同類置換もまた意図される。いくつかの実施形態では、機能性誘導体は、元のペプチドの全長アミノ酸配列に対して少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性、より好ましくは少なくとも８５％の相同性、より好ましくは少なくとも９０％の相同性、より好ましくは少なくとも９５％の相同性、より好ましくは少なくとも９９％の相同性、より好ましくは１００％の相同性を有する。相同率は関連するアミノ酸配列の長さに関して決定される。従って、本発明のポリペプチドがより大きなポリペプチド内にある場合は、相同率は、本発明のポリペプチドに対応するポリペプチド部分のみに関して決定されるのであって、より大きなポリペプチド全体の相同率ではない。ポリペプチドに関する「相同率」は、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）エンジンを用いて整列させた少なくとも２つのポリペプチド配列間の同一のアミノ酸の百分率のことをいう。Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ｉｂｉｄ参照。ＢＬＡＳＴエンジンはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．によって公開されている。特定の実施形態によれば、機能性誘導体は、元のポリペプチドの全長配列に対して少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を備えたポリペプチドであり、１つまたはそれ以上の位置での置換だけその親ポリペプチドと異なるのみである。該置換は好ましくは≪同類置換≫または≪セミ同類≫である。加えて、またはこれに代えて、機能性誘導体は、元のポリペプチドの全長アミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、より好ましくは少なくとも９９％の同一性、より好ましくは１００％の同一性を有する。同一性または相同性を決定する方法は当該分野で既知である。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「同類置換」は一般にタンパク質またはポリペプチドの構造および機能特性を維持するアミノ酸置換のことをいう。このような機能的に等価の（同類置換）ペプチドアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列内でのアミノ酸残基の追加または置換を含むがこれらに限定されず、これらはサイレント変化となり、かくして機能的に等価の遺伝子産物を産生する。同類アミノ酸置換は、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または関与残基の両親媒性の類似性に基づいてなされ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む；極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む；そして負電荷を持つ（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００７１】
いくつかの局面において本発明は、１つまたはそれ以上の光パルスとの接触によって活性化させることができる光活性化イオンチャネルポリペプチドの細胞での発現であって、細胞の強い脱分極をもたらす発現に関する。本発明の光活性化チャネルポリペプチド、本明細書においては光活性化イオンチャネルともいうが、特定の細胞、組織、および／または有機体にて発現させ、適切な波長の光パルスに応答してインビボ、生体外、およびインビトロで細胞を制御するために用いることができる。
【００７２】
本明細書で用いられる用語「イオンチャネル」は孔を形成する膜貫通ポリペプチドを意味し、孔は活性化されると開き、膜にわたる孔を通るイオン伝導を可能にする。
【００７３】
本発明によれば、光活性化イオンチャネルポリペプチドは、Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質またはその機能性誘導体および蛍光タンパク質を備える。
【００７４】
本発明によれば、光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎタンパク質またはその機能性誘導体を備える。
【００７５】
特定の実施形態によれば、該Ｃｈｒｉｍｓｏｎタンパク質は、タンパク質ＣｈＲ８８（本明細書ではＣｈｒｉｍｓｏｎ８８、配列番号１ともいう）またはその機能性誘導体、およびＫ１７６Ｒ置換Ｃｈｒｉｍｓｏｎ８８タンパク質（本明細書ではＫ１７６Ｒ置換を持つＣｈｒｉｍｓｏｎ８８またはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ、配列番号２ともいう）よりなる群から選択される。
【００７６】
本発明によれば、光活性化イオンチャネルポリペプチドは、（ｉ）タンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体、および（ｉｉ）蛍光タンパク質を備える。
【００７７】
好適な実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、（ｉ）タンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体、および（ｉｉ）蛍光タンパク質を備える。
【００７８】
特定の実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体および蛍光タンパク質よりなり、両タンパク質は独立したタンパク質として発現される。
【００７９】
別の実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、タンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体および蛍光タンパク質よりなり、両タンパク質は独立したタンパク質として発現される。
【００８０】
好適な実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる。
【００８１】
より好適な実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる。
【００８２】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは赤色光、好ましくは約３６５ｎｍから約７００ｎｍの間、約５３０ｎｍから約６４０ｎｍの間の波長を有する光との接触によって強く活性化され、いくつかの実施形態では、ピーク活性は約５９０ｎｍの波長を有する光と接触すると起こり得る。
【００８３】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを含む興奮性細胞を活性波長領域の光と接触させることで細胞を強力に脱分極する。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現する細胞を脱分極するために用いられ得る光の波長の例としては、少なくとも約３６５ｎｍ、３８５ｎｍ、４０５ｎｍ、４２５ｎｍ、４４５ｎｍ、４６５ｎｍ、４８５ｎｍ、５０５ｎｍ、５２５ｎｍ、５４５ｎｍ、５６５ｎｍ、５８５ｎｍ、５９０ｎｍ、６０５ｎｍ、６２５ｎｍ、６４５ｎｍ、６６５ｎｍ、６８５ｎｍ、および７００ｎｍの波長を含み、これらの間のすべての波長を含む。いくつかの実施形態では、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは５９０ｎｍにピーク波長感度を有し、６６０ｎｍまでスパイクを引き出し得る。
【００８４】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本発明の１つまたはそれ以上の光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現される興奮性細胞を脱分極するために用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを活性化しない光の波長によって活性化される光活性化イオンチャネルを発現する１つまたはそれ以上の追加の細胞サブ集団もまた含む細胞集団における細胞サブ集団において発現させることができる。
【００８５】
様々な実施形態において用いることができるペプチドアミノ酸配列は、本明細書で述べる光活性化イオンチャネルポリペプチド（配列番号１または２または５）ならびに機能的に等価のポリペプチドを含む。
【００８６】
このような機能的に等価のペプチドアミノ酸配列（同類置換）は、本発明のアミノ酸配列内のアミノ酸残基の追加または置換を含むがこれらに限定されず、これらはサイレント変化となり、このようにして機能的に等価のポリペプチドを産生する。アミノ酸置換は、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または関与残基の両親媒性の類似性に基づいてなされ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む；極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；正電荷を持つ（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む；そして負電荷を持つ（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。もしくは同類アミノ酸置換はアミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）に基づいて行ってもよい。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられる。それらはイソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。タンパク質についての相互的生物学的機能を参照する場合にハイドロパシーアミノ酸指標を用いることは当該分野において了解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２、１９８２）。いくつかの例では、いくつかのアミノ酸は、類似のハイドロパシー指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され依然として類似の生物学的活性を保持し得ることが知られている。ハイドロパシー指標に基づいて変更を行う場合、いくつかの実施形態では、ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、一方他の実施形態では、±１以内のアミノ酸置換が含まれ、またさらに別の実施形態では、±０．５以内のアミノ酸置換が含まれる。
【００８７】
もしくは同類アミノ酸置換は親水性に基づいてなされ得、特に生物学的機能タンパク質またはそれによって作成されたペプチドを免疫学的実施形態で使用することが意図される。いくつかの実施形態では、隣接するアミノ酸の親水性によって決定されるタンパク質の最大局所平均親水性はその免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相互に関連する。以下の親水性値はこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を行う場合、いくつかの実施形態では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、いくつかの実施形態では、±１以内のものが含まれ、そしていくつかの実施形態では、±０．５以内のものが含まれる。
【００８８】
１つの好適な実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドはＣｈｒｉｍｓｏｎポリペプチド（例えばタンパク質ＣｈＲ８８またはその機能性誘導体、またはタンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲまたはその機能性誘導体）と蛍光タンパク質との間の融合タンパク質である。ポリペプチドまたはペプチド、またはペプチドの切断形または突然変異形が非関連タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに融合される融合タンパク質の使用は、本明細書で述べる核酸および／またはアミノ酸配列をコードする所望のペプチドに基づいて設計することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、発現されている融合タンパク質に選択的に結合する抗体を利用することによって容易に精製され得る。
【００８９】
一般に、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが機能するのに必要なレチナールまたはレチナール誘導体は、該チャネルポリペプチドでトランスフェクトさせることになる細胞によって産生される。しかし、本発明によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドと、例えば３，４−デヒドロレチナール、１３−エチルレチナール、９−ｄｍ−レチナール、３−ヒドロキシレチナール、４−ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール；３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，４，６，８，１０−ペンタエナール；３，７−ジメチル−デカ−２，４，６，８−テトラエナール；３，７−ジメチル−オクタ−２，４，６−トリエナール、ならびに６−７−または８−９−または１０−１１回転ブロックレチナールなどのレチナールまたはレチナール誘導体とを備えたチャネルロドプシンがさらに開示される（ＷＯ０３０８４９９４）。
【００９０】
上述の所望のペプチドアミノ酸配列は化学的に合成することができるが（例えば“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８４）参照）、大きなポリペプチド配列は、所望のペプチドをコードする核酸配列を含有する核酸を発現するための当該分野で周知の技術を用いて組み換えＤＮＡ技術によって有利に産生され得る。このような方法は、ペプチドをコードするヌクレオチド配列および適切な転写および翻訳制御信号を含有する発現ベクターを構築するために用いることができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技法、合成的技法、およびインビボ遺伝子組み換えを含む（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、上記参照）。もしくは、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列をコードするＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、例えば合成器を用いて化学的に合成され得る（例えば“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ｇａｉｔ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ，英国、１９８４）参照）。
【００９１】
様々な実施形態で用いることができるペプチドアミノ酸配列は、本明細書で述べる光活性化イオンチャネルポリペプチド（配列番号１または２、５または６）、および機能的に等価のペプチドおよびその機能的誘導体ならびにそれらの機能性断片を含む。実際において、いくつかの実施形態では、特別なヌクレオチド配列によってコードされるいかなる所望のペプチドアミノ酸配列も用いることができ、所望のペプチドアミノ酸配列のすべてまたはいかなる部分でもコードするあらゆるポリペプチド配列の使用である。遺伝暗号の退化性はよく知られており、よって各光活性化チャネルポリペプチドアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、アミノ酸をコードすることができる周知の核酸「トリプレット」コドン、または多くの場合にはコドンを遺伝的に代表する。よって、本明細書で企図されるように、本明細書で述べるチャネルロドプシンペプチドアミノ酸配列は、遺伝暗号によりひとまとめに考えると（例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、表４−１、１０９頁（Ｄａｒｎｅｌｌら編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８６）、このようなアミノ酸配列をコードすることができる核酸配列のすべての様々な置換および組み合わせを遺伝的に代表する。
【００９２】
いくつかの実施形態は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備えた単離核酸分子である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は（ｉ）タンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体、および（ｉｉ）蛍光タンパク質を含むポリペプチドをコードする。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、（ｉ）タンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体、および（ｉｉ）蛍光タンパク質を含むポリペプチドをコードする。
【００９３】
１つの特別な実施形態によれば、ヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体を含むポリペプチドをコードする。好適な実施形態によれば、ヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体を含むポリペプチドをコードする。
【００９４】
いくつかの特別な実施形態によれば、本発明の蛍光タンパク質はｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される。
【００９５】
ＴｄＴｏｍａｔｏは鮮赤色蛍光タンパク質である（ｔｄＴｏｍａｔｏの励起ピーク５５４ｎｍ、発光波長ピーク５８１ｎｍ）（Ｓｈａｎｅｒ  ＮＣら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２、１５６７−１５７２、２００４）。本発明によるｔｄＴｏｍａｔｏをコードするゲノム配列は、合成構築物タンデムダイマー赤色蛍光タンパク質遺伝子、完全ｃｄｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ６７８２６９）と少なくとも８４％の同一性を示す。好適な実施形態によれば、本発明のコードされたｔｄＴｏｍａｔｏタンパク質部分は、配列番号３のアミノ酸配列と同一のアミノ酸の約７０％から約７５％の間、より好ましくは約７５％から約８０％の間、より好ましくは約８０％から約９０％の間、さらにより好ましくは約９０％から約９９％の間のポリペプチドである。
【００９６】
他の実施形態では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列またはその断片と同一のアミノ酸の約７０％から約７５％の間、より好ましくは約７５％から約８０％の間、より好ましくは約８０％から約９０％の間、さらにより好ましくは約９０％から約９９％の間のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。
【００９７】
本発明の核酸は、１つまたはそれ以上の信号配列（例えばエンハンサー、ポリアデニル化信号、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位）および／またはプロモーター配列または他のコーディングセグメントまたはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない追加の配列を含み得る。プロモーターは誘導的または構造的な一般のまたは細胞特異的なプロモーターであり得る。細胞特異的プロモーターの例としては、双極細胞のｍＧｌｕ６プロモーターがある。いくつかの実施形態は開示した方法のいずれかであり、プロモーターは構造的プロモーターである。いくつかの実施形態は開示した方法のいずれかであり、構造的プロモーターはＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターを含むがこれらに限定されない（ＣＡＧプロモーターは、チキンベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）およびＳＶ４０イントロン挿入に融合したハイブリッドサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーである；Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００８；９：２；配列番号８）。いくつかの実施形態は開示した方法のいずれかであり、プロモーターは誘導的および／または細胞特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない。プロモーター、ベクター、エンハンサー、ポリアデニル化部位の選択は当業者には型通りの設計事項である。これら要素は文献に適切に記載されておりまた市販されている。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質またはペプチドであって、そのアミノ酸配列内に本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドまたはその機能的部分または変異体、同定されたもの（例えば配列番号５）などのアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドをコードする単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列、配列番号６または配列番号７を含む単離核酸セグメントおよび組み換えベクターに関する。
【０１００】
いくつかの実施形態は、（ｉ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸を（ｉｉ）配列番号３または配列番号４と共にコードするヌクレオチド配列を備えた組み換え核酸である。
【０１０１】
いくつかの好適な実施形態は、配列番号５のアミノ酸またはその断片をコードするヌクレオチド配列を備えた組み換え核酸である。
【０１０２】
いくつかの好適な実施形態は、ヌクレオチド配列、配列番号６または配列番号７を備えた組み換え核酸である。
【０１０３】
いくつかの実施形態は、異種プロモーターに操作可能に連結した（ｉ）配列番号１または配列番号２のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）異種プロモーターに操作可能に連結した配列番号３または配列番号４のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を備えた組み換え核酸である。
【０１０４】
いくつかの好適な実施形態は、異種プロモーターに操作可能に連結した配列番号５のアミノ酸またはその断片をコードするヌクレオチド配列を備えた組み換え核酸である。
【０１０５】
いくつかの好適な実施形態は、異種プロモーターに操作可能に連結したヌクレオチド配列、配列番号６または配列番号７を備えた組み換え核酸である。
【０１０６】
いくつかの好適な実施形態は、ＣＡＧ異種プロモーター（配列番号８）に操作可能に連結したヌクレオチド配列、配列番号６または配列番号７を備えた組み換え核酸である。
【０１０７】
別の局面によれば、本発明は、上記の光活性化イオンチャネルポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む核酸発現ベクターに関する。
【０１０８】
本明細書で用いられる用語「核酸発現ベクター」は、操作可能に連結している別の核酸を異なる遺伝的環境間で輸送することができる核酸分子のことをいう。用語「ベクター」はまた核酸分子を輸送することができるウィルスまたは有機体のことをいう。ベクターの１つのタイプはエピソーム、すなわち過剰染色体複製が可能な核酸分子である。いくつかの有用なベクターは、連結される核酸の自律複製および／または発現が可能なものである。操作可能に連結される遺伝子の発現を指示することが可能なベクターを本明細書では「発現ベクター」という。発現ベクターおよびそれらの使用法は当該分野では周知である。適切な発現ベクターおよびそれらの使用法の非限定な例は本明細書で提示される。好適な実施形態では、ベクターは遺伝子治療、より詳しくはウィルス介在遺伝子導入に適している。遺伝子治療に適したウィルスの例としては、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）、レンチウィルス、ポックスウィルス（例えばＭＶＡ）、アルファウィルス、ヘルペスウィルスがある。しかし、遺伝子治療はさらに、裸のＤＮＡ、核酸に関連したリポソームの使用など非ウィルスの方法も包含する。本発明のいくつかの方法で有用なベクターは、光活性化イオンチャネルポリペプチドを分裂細胞および非分裂細胞へと遺伝学的に挿入することができ、また光活性化イオンチャネルポリペプチドをインビボ、インビトロまたは生体外細胞である細胞に挿入することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのための遺伝子を含む核酸発現ベクターはＡＡＶウィルスベクターの間で選択される。好適な実施形態によれば、該ＡＡＶウィルスベクターはＡＡＶ２、より好ましくはＡＡＶ２−７ｍ８ウィルスベクターである（ＷＯ２０１２／１４５６０１）。
【０１１０】
本発明のいくつかの局面は、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いて、細胞、組織、または対象の障害または症状を処置する方法を含む。本発明の処置法は、障害を処置するために、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの治療上有効量をこのような処置が必要な対象に投与することを含み得る。
【０１１１】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの投与は、少なくとも１つの本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの有効量を含む医薬組成物の投与を含み得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの投与は、細胞を含む医薬組成物の投与を含み得、細胞は本発明の光活性化イオンチャネルを発現する。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの投与は、ベクターを含む医薬組成物の有効量の投与を含み得、ベクターは本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸配列を備え、ベクターの投与は、対象の細胞での光活性化イオンチャネルポリペプチドの発現をもたらす。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ニューロン介在障害を処置または防止する方法であって、（ａ）標的細胞に、該標的細胞で発現可能な本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターはプロモーター配列に操作可能に連結された本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、オプションとして転写制御配列とを備えた、送達すること、および（ｂ）該標的細胞に該ベクターを発現させることを包含し、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは露光されると該標的細胞を活性化させる方法である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる。
【０１１４】
好適な実施形態によれば、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる。
【０１１５】
好適な実施形態では、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる。
【０１１６】
好適な実施形態によれば、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質（配列番号３）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号４）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる。
【０１１７】
本明細書で用いられ、他に指摘がない限り、本方法および組成物が用いられ得る原因である用語、ニューロン介在障害は、とりわけ神経機能不全、脳の障害、中枢神経系、末梢神経系、神経学的症状、記憶および学習障害、心不整脈、パーキンソン病、眼障害、耳障害、脊髄損傷を含むがこれらに限定されない。
【０１１８】
本明細書で用いられ、他に指摘がない限り、本方法および組成物が用いられ得る原因である用語、眼障害は、眼の前部および後部の両方に影響を及ぼす発生異常を含むがこれらに限定されない。前部障害は、緑内障、白内障、角膜ジストロフィー、円錐角膜を含むがこれらに限定されない。後部障害は、光受容体変性、不全、損失および／または死滅により生じる失明障害を含むがこれらに限定されない。網膜障害は、網膜色素変性（ＲＰ）、黄斑変性（ＭＤ）、先天性停止性夜盲、加齢黄斑変性および先天性錐体ジストロフィーを含む。
【０１１９】
本発明のいくつかの実施形態による標的細胞は、興奮性細胞または非興奮性細胞であり得る。好ましくは、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現し本発明の方法で用いられ得る細胞である。これは原核細胞および真核細胞を含む。標的細胞は哺乳類の細胞を含むがこれに限定されない。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドが発現し得る細胞の例としては興奮性細胞があり、これは電気信号を作成しこれに応答することができる細胞を含む。
【０１２０】
本発明による標的細胞の非制限の例としては、神経細胞（ニューロン）、神経系細胞、心臓細胞、循環系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、分泌細胞（膵臓細胞、副腎髄質細胞、下垂体細胞など）、内分泌細胞、または筋細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明に関連して用いられる標的細胞は、疾患、障害または異常症状を持つと知られていない健全な正常細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法およびチャネルに関連して用いられる標的細胞は、異常細胞、例えば、変性細胞、神経系病原菌を持った細胞、疾患または症状の細胞モデル、損傷細胞などを含むがこれらに限定されない、障害、疾患、または症状を有すると診断された細胞であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、細胞は対照細胞であり得る。
【０１２１】
１つの特別な実施形態によれば、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、培養物からの細胞、溶液中の細胞、対象から得られる細胞、および／または対象内の細胞（インビボ細胞）で発現され得る。光活性化イオンチャネルは培養細胞、培養組織（例えば脳切片調合液など）および生体対象などで発現および活性化され得る。
【０１２２】
好適な実施形態では、標的細胞は哺乳類細胞であり電気的興奮性細胞である。好ましくは、これは光受容細胞、網膜桿状体細胞、網膜錐体細胞、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、アマクリン細胞、双極（ｂｉｐｏｒａｌ）ニューロン、神経節細胞、らせん神経節細胞（ＳＧＮ）、蝸牛神経核ニューロン、多極ニューロン、顆粒細胞、ニューロン、または海馬細胞である。
【０１２３】
いくつかの実施形態は網膜に光感受性を回復させる方法であって、（ａ）標的網膜ニューロンに、該標的網膜ニューロンで発現可能な本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターはプロモーター配列に操作可能に連結された本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、オプションとして転写制御配列とを含む、送達すること、および（ｂ）該標的網膜ニューロンに該ベクターを発現させることを包含し、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは該網膜ニューロンを感光性にし、これにより該網膜またはその一部に光感受性を回復させる方法である。
【０１２４】
１つの実施形態は網膜に光感受性を回復させる方法であり、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１２５】
１つの好適な実施形態は網膜に光感受性を回復させる方法であり、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１２６】
１つの好適な実施形態は網膜に光感受性を回復させる方法であり、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１２７】
１つの好適な実施形態は網膜に光感受性を回復させる方法であり、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質（配列番号３）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号４）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１２８】
いくつかの実施形態は、網膜光受容細胞が変性しつつあるかまたは変性し死滅している視覚損失または失明に悩む対象の網膜に感光性を回復させる方法であって、（ａ）標的網膜ニューロンに、該標的網膜ニューロンで発現可能な本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターはプロモーター配列に操作可能に連結された本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、オプションとして転写制御配列とを含む、送達すること、および（ｂ）該標的網膜ニューロンに該ベクターを発現させることを包含し、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは該網膜ニューロンを感光性にし、これにより該網膜またはその一部に光感受性を回復させる方法である。
【０１２９】
いくつかの実施形態は、網膜光受容細胞が変性しつつあるかまたは変性し死滅している視覚損失または失明に悩む対象の網膜に感光性を回復させる方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１３０】
いくつかの実施形態は、網膜光受容細胞が変性しつつあるかまたは変性し死滅している視覚損失または失明に悩む対象の網膜に感光性を回復させる方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１３１】
いくつかの好適な実施形態は、網膜光受容細胞が変性しつつあるかまたは変性し死滅している視覚損失または失明に悩む対象の網膜に感光性を回復させる方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１３２】
いくつかの好適な実施形態は、網膜光受容細胞が変性しつつあるかまたは変性し死滅している視覚損失または失明に悩む対象の網膜に感光性を回復させる方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質（配列番号３）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号４）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、神経障害を処置する、または網膜に光感受性を回復させる、または網膜光受容細胞が変性しつつあるかまたは変性し死滅している視覚損失または失明に悩む対象の網膜に光感受性を回復させる方法における標的細胞ニューロンは網膜ニューロンである。
【０１３４】
いくつかの実施形態は開示した方法のいずれかであり、配列番号５のすべてまたは一部のアミノ酸配列を有する発現した光活性化イオンチャネルポリペプチド、またはコードした光活性化イオンチャネルポリペプチドの生物学的活性を保持するその生物学的活性断片または配列番号５の生物学的に活性の同類アミノ酸置換変異体またはその断片である。
【０１３５】
いくつかの実施形態は開示した方法のいずれかであり、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは核酸配列、配列番号６によってコードされる。
【０１３６】
本発明の別の局面は、非侵襲性経頭蓋および／または経硬膜刺激を行って神経回路を調節するために赤外線（６６０ｎｍ）を使用することである。
【０１３７】
本発明のいくつかの局面の実用動作を、興奮性細胞に本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを遺伝的に発現させ、細胞を適切な波長の光で照射し、そして光に応答した細胞の急速な脱分極および光の停止時の脱分極からの急速な解除を示すことによって提示した。特定の実現例によっては、本発明の方法はインビボ、生体外、およびインビトロでの細胞機能の光制御が可能である。
【０１３８】
本発明の方法の非制限の例において、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドおよびその誘導体は、いかなる種類の化学補助物の必要なく、また通常の細胞環境条件およびイオン濃度において哺乳類細胞にて使用される。
【０１３９】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、いかなる種類の化学補助物の必要なく、また通常の細胞環境条件およびイオン濃度において哺乳類細胞での発現および使用に適切であることが分かっている。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドは、３６５ｎｍから７００ｎｍの範囲の光の波長で活性化、５３０ｎｍから６４０ｎｍの範囲の光で最適な活性化、また５９０ｎｍの波長で最適なピーク活性化を行うことが分かっている。
【０１４０】
光活性化イオンチャネルポリペプチドまたは核酸発現ベクターの有効量は、細胞、組織または対象での光活性化イオンチャネルのレベルを対象にとって有益なレベルへと上げる量である。有効量はまた、投与後の兆候の減少など、細胞または対象に及ぼす投与の生理学的効果を評価することによって決定され得る。他のアッセイは当業者には既知であり、処置への応答レベルを測定するために用いられ得る。処置の量は、例えば、投与した光活性化イオンチャネルポリペプチドまたは核酸発現ベクターの量を増減させることによって、光活性化イオンチャネルポリペプチドまたは核酸発現ベクターが投与される治療上の組成を変えることによって、投与経路を変えることによって、投与時間を変えることによって、本発明の光活性化イオンチャネルの活性化量およびパラメータを変えることによってなどにより変更させ得る。有効量は処置される特定の症状、処置される対象の年齢および健康状態、症状の重症度、処置の持続期間、併用療法（あれば）の性質、投与の特定経路、および医療従事者の知識および専門知識内での類似の要因により変動するであろう。例えば、有効量は、光活性化イオンチャネルポリペプチドを発現させることになる対象での細胞の位置および数に依存し得る。有効量はまた、処置される組織の位置にも依存し得る。これらの要因は当業者であれば周知であり、単なる日常の実験で対処することができる。光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを上げる、および／または対象での光活性化イオンチャネルポリペプチド（単独でまたは他の治療薬との組み合わせで）の活性化の長さまたはタイミングを変えるための最大用量の組成物を使用する、すなわち健全な医療判断による最も高い安全用量または量を使用することが一般に好適である。しかし、患者は医療的な理由、心理的な理由または実質的にいかなる他の理由によりもっと低い用量または許容可能用量を主張するかもしれないことは当業者には理解されよう。
【０１４１】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチド（例えばｔｄＴまたはＧＦＰと融合したＣｈＲ８８またはＣｈｒｉｍｓｏｎＲまたはその誘導体）は、当該分野で既知の方法を用いて投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸が対象に投与され、いくつかの実施形態では、光活性化イオンチャネルポリペプチドが対象に投与される。投与の方法および用量は、特に合併症の場合は、個々の医師または獣医により調整され得る。投与絶対量は、投与用に選択された材料、投与が単一用量か複数用量かどうか、および年齢、健康状態、大きさ、重量、疾患または症状の段階を含む個々の対象パラメータを含む様々な要因に依存することになる。これらの要因は当業者には周知であり、単なる日常の実験で対処することができる。
【０１４２】
本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドまたは核酸発現ベクターを送達する医薬組成物は単独で、互いに組み合わせて、および／または他の薬物治療とのまたは対象に投与される他の処置法との組み合わせで投与され得る。上記の方法で使用される医薬組成物は好ましくは、光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを対象への投与に適切な重量または体積単位で所望の応答を生むレベルへと上げる有効量の治療化合物を含む。
【０１４３】
対象の細胞での光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを上げるため対象に投与される医薬組成物の用量は、様々なパラメータに従って、特に使用する投与モードおよび対象の状態に従って選択することができる。他の要因としては所望の処置期間が含まれる。対象での応答が適用した初期用量で不十分である場合は、より高用量（または異なるより局所的な送達経路による効果的な高用量）を、患者の忍耐が許す範囲で採用し得る。対象に投与された本発明の光活性化イオンチャネルの活性化の量およびタイミング（例えば光波長、露光の長さなど）もまた、特定の対象での処置の有効性に基づいて調整することができる。対象に投与された光活性化イオンチャネルの照射および活性化のためのパラメータは、当該分野で既知の方法を用いてまた過度の実験を必要とせず決定することができる。
【０１４４】
対象の所望の細胞、組織または生体領域での本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドのレベルを上げるため医薬組成物を効果的に送達するために用いることができる様々な投与モードは当業者には既知であろう。このような組成物または本発明の他の医薬化合物を投与する方法は、局所性、静脈内、経口、腔内、髄腔内、滑液嚢内、口腔内、舌下、鼻腔内、経皮、硝子体内、網膜下、皮下、筋肉内および皮内投与であり得る。本発明は本明細書に開示する特定の投与モードによって制限されない。当該分野で標準的な参考文献（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０）は、医薬担体での様々な医薬製剤および処方の送達のための投与および処方のモードを提供する。用量、投与スケジュール、投与部位、投与モード（例えば臓器内）などが本明細書に提示したものとは異なる、本発明の治療化合物の投与に有用な他のプロトコルは当業者には既知であろう。
【０１４５】
ヒト以外の哺乳類での光活性化イオンチャネルポリペプチドレベルを上げるための細胞またはベクターの投与；および例えば試験目的または獣医学治療目的のための本発明の光活性化イオンチャネルの投与および使用は、上述の条件と実質的に同じ条件の下で実行される。本発明はヒトおよび動物の両方に適用可能であることは当業者には理解されよう。従って、本発明は、ヒトの治療と同様、畜産用および獣医用医薬で使用されるよう意図される。
【０１４６】
本発明のいくつかの局面では、本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いる処置の方法は、神経細胞、神経系細胞、ニューロン、心臓細胞、循環系細胞、視覚系細胞、聴覚系細胞、筋細胞、または内分泌細胞などを含むがこれらに限定されない細胞に適用される。
【０１４７】
本発明の方法を用いて処置され得る障害および症状としては、損傷、脳障害、神経学的症状への変性（例えばパーキンソン病、アルツハイマー病、発作、視覚障害、聴覚障害など）を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法および光活性化イオンチャネルポリペプチドは、視覚系障害の処置、例えば視覚低下または損失を処置するために用いられ得る。本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードするベクターは、視覚低下または損失に悩む対象に投与され得、発現した光活性化イオンチャネルは視覚系の感光性細胞として機能することができ、これにより対象の視覚機能の獲得を可能にする。
【０１４９】
開示した方法および組成物の臨床応用としては、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、および網膜色素変性、ならびに光受容体細胞の損失をもたらす他の症状の眼障害遺伝子治療処置のための、網膜のポスト受容体ニューロンでの本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドの導入による視覚回復；電気ペースメーカー装置よりむしろ心臓鼓動リズムを制御するために房室束（ヒス束）の興奮性心筋細胞に組み込まれた本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドを用いることによる心臓機能の制御；パーキンソン病患者のドーパミン関連の運動不全の回復；脊髄損傷後の呼吸の回復；幹細胞の分化の非侵襲性制御、および組織およびネットワーク機能への移植細胞の特異的貢献の評価などの治療への光遺伝学的アプローチを含む（がこれらに限定されない）。
【０１５０】
同様に、感覚神経的聴覚損失は聴神経での下流標的の光刺激を通して処置され得る（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、２０１４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１２４（３）、１１１４−１１２９またはＤａｒｒｏｗら、２０１５、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、１５９９、４４−５６参照）。特別な実施形態によれば、本発明は、光学的蝸牛移植片の使用によって伝音損失を処置する方法であって、（ａ）蝸牛に、該蝸牛で発現可能な本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードする核酸発現ベクターを送達することであって、該ベクターはプロモーター配列に操作可能に連結された本発明の光活性化イオンチャネルポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、オプションとして転写制御配列とを含む、送達すること、（ｂ）該蝸牛に該ベクターを発現させ、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは該蝸牛を感光性にする、発現させること、および（ｃ）蝸牛移植片をフラッシュと共に使用することを包含する方法である。
【０１５１】
いくつかの実施形態は光学的蝸牛移植片の使用によって伝音損失を処置する方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１５２】
いくつかの好適な実施形態は光学的蝸牛移植片の使用によって伝音損失を処置する方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１５３】
いくつかの好適な実施形態は光学的蝸牛移植片の使用によって伝音損失を処置する方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したタンパク質ＣｈＲ８８（配列番号１）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１５４】
いくつかの好適な実施形態は光学的蝸牛移植片の使用によって伝音損失を処置する方法であって、発現した光活性化イオンチャネルポリペプチドは、ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴ）蛍光タンパク質（配列番号３）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（配列番号４）よりなる群から選択される蛍光タンパク質に融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（配列番号２）またはその機能性誘導体よりなる方法である。
【０１５５】
いくつかの局面における本発明は、核酸配列およびポリヌクレオチド配列を調合すること；調合した核酸配列およびポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを細胞および膜に発現させること；細胞および／または膜を適切な光で照射すること；および細胞の急速脱分極および／または光に応答して膜を横断する伝導性の変化、ならびに光の停止時の脱分極からの急速な解除を提示することを包含する。膜を通した電圧および光による細胞脱分極を制御可能に変える能力が提示された。本発明は、インビボ、生体外、およびインビトロで細胞機能の光制御を可能にし、また本発明の光活性化イオンチャネルおよびそれらの使用は、薬剤スクリーニング、処置、および研究応用に対して幅広い適用例を有する。それらのいくつかを本明細書において記載する。
【０１５６】
本発明の例示的な実現例では、細胞機能を光学的に摂動、調節、または制御する能力は物理的な操作メカニズムに優る多くの利点を提供する。これらの利点は、速度、非侵襲性、およびナノスケールからマクロスケールまでの広大な空間規模に容易にまたがる能力を含む。
【０１５７】
本発明での試薬の使用（およびこれらが表す分子クラス）は、少なくとも、以前の光活性化イオンチャネルで有用ではない光波長によって活性化される現行のもの、活性化するとゼロカルシウム伝導性を効果的に可能にする光活性化イオンチャネル、および（細胞の多色制御を開く）より古い分子からの様々なスペクトルを可能にする。
【０１５８】
以下の実施例の項は、様々な実施形態の実施例に関するさらなる詳細を提供する。以下の実施例で開示される技法は本発明者らによって良好に機能すると発見された技法および／または組成物を表すことは当業者には理解されよう。しかし、本発明の精神および範囲から外れることなく、開示する特定の実施形態には多くの変更を行うことができしかも類似のまたは同様の結果を得ることができることは、本開示に照らして、当業者であれば理解されよう。これらの実施例は、本明細書に記載した方法およびシステムの例示であって、本発明の範囲を制限するよう意図されてはいない。このような非制限の実施例は以下に提供する実施例を含むがこれらに限定されない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１：ｒｄ１およびＰ２３Ｈ変性齧歯類モデルでの検証
網膜ジストロフィーは、視覚情報の流れを損なう網膜細胞の不全および変性に関連し、最終的には視覚損失および失明に至る。網膜色素変性（ＲＰ）は網膜ジストロフィーの最も一般的なタイプであり、世界で４，０００人に１人の視覚損失の原因である。ＲＰは、常染色体優性（症例の３０％〜４０％）、常染色体劣性（５０％〜６０％）、またはＸ連鎖（５％〜１５％）として受け継いだ６０個より多い遺伝子のいずれかの変性により生じる。
【０１６０】
ＲＰの最も一般的な形態では、桿状光受容体が先ず変性し錐体が続く。従って、ＲＰの最初の徴候は通常は夜盲症および視野狭窄に至る周辺視野損失である。すべてのＲＰ症状は進行性であり、視野変性のパターンは患者間で異なるが、最終的な結末は失明である。ＲＰの処置はない。
【０１６１】
ＲＰはいくつかの遺伝子での多数タイプの突然変異から生じ、ＲＰの有意の割合が優性であり、また疾患の経時変化は極めて可変であるため、網膜光遺伝学治療アプローチは潜在的に重要である。この点において、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は以下の理由で魅力的な標的と思われる：１）ＲＧＣは、軸索が直接突出し視覚情報を視覚皮質中枢へと運ぶ発火細胞である、２）ＲＧＣは進行した網膜変性を患うＲＰ患者の黄斑部で温存されて残っている、３）ＲＰ患者において網膜神経線維層の厚さが減少、増加または正常のいずれかである、４）ＲＧＣ光遺伝学治療のための臨床基準はＯＣＴおよび走査レーザー偏光分析法を用いて容易に評価することができる。網膜組織の同様の変化に至る光受容体変性は加齢性黄斑変性などのより複雑な網膜疾患で起こっている。
【０１６２】
チャネルロドプシン２を用いたＲＧＣの光遺伝学治療は、ＲＰの齧歯類モデルおよび正常サルにおいて光誘起網膜電気活性、視覚誘発電位および視覚機能を提供することを証明している。加えて、ＲＧＣは硝子体網膜表面に最も近いため、これらは硝子体内注射によるＡＡＶ感染の影響を受けやすく、外科的観点からは主要な利点である。
【０１６３】
盲目ｒｄ１マウスの視覚回復のために網膜神経節細胞でのチャネルロドプシン２の異所性発現が示された場合、青色波長領域での必要な高励起閾値によって光毒性についての懸念が生じた。
【０１６４】
本研究において、我々は、放射線安全性限界は赤色領域の方がかなり高いため、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（ＣｈｒＲ）、赤方偏移オプシンの使用について調査した。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲは、ＣｈｒｉｍｓｏｎまたはＣｈｒｉｍｓｏｎ８８とも呼ばれる微生物オプシンＣｎＣｈＲ１の高度な形態であり、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｎｏｃｔｉｇａｍａから単離された（Ｋｌａｐｏｅｔｋｅら、２０１４、上記参照）。Ｃｈｒｉｍｓｏｎ励起スペクトルは以前のチャネルロドプシンに比べて４５ｎｍだけ赤方偏移している。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲはＣｈｒｉｍｓｏｎのＫ１７６Ｒ突然変異体であり、類似の励起スペクトルを示すがｔｅｔａｏｆｆ値はより良好である（１５．８ｍｓ対２１．４ｍｓ）。我々は２つの変性モデル：盲目ｒｄ１マウスおよび盲目Ｐ２３Ｈラットの視力回復のためのＣｈｒＲの使用について調査した。
【０１６５】
本研究の間、我々はさらにＣｈｒＲおよび構築物ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＣｈｒＲ−ｔｄＴ）の機能的有効性を比較した。
【０１６６】
方法（図１）：
遺伝子送達
【０１６７】
マウス実験に使用したウィルス群
【０１６８】
【表１】
2019518073.tif 000003
【０１６９】
ＧＳ０３０＿ＮＣ＿ＰＨＡＲ＿００７研究のためのウィルス懸濁液は、滅菌２ｍｌエッペンドルフ管にてＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８において処方された既製の透明無色の液体とした。ウィルス懸濁液をＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８とのストックウィルス懸濁液からの希釈によって作製した。
【０１７０】
ウィルス懸濁液を使用まで５±３℃で保管した。
【０１７１】
すべての実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従って行った。プロトコルはＬｏｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認され、欧州議会のＤｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０１０／６３／ＥＵに従って行った。
【０１７２】
生後４週間のマウスをイソフルレンで麻酔し、硝子体内注射を両方に行った。つまり瞳孔を、トロピカミドを用いて拡大させ、針を用いて強膜の縁近くに孔を開けた。次にハミルトンシリンジを用いて２μｌを太い注射器を通して目に送達した。
マウス注射および動物割り当ての詳細
【０１７３】
【表２】
2019518073.tif 000004
【０１７４】
網膜製剤
マウスをＡＡＶ注射後〜５週間（２７日から５３日：平均３８日）または１１カ月でＣＯ２吸入続いて後頸椎脱臼によって犠牲にした。動物眼球を単離し解剖して、網膜を強膜に接着したままに保つ一方角膜およびレンズを除去した。この眼杯をエームズ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で満たした遮光性容器で保存した。次に網膜片（典型的には網膜の半分）を単離して多電極アレイ記録に使用した。
【０１７５】
ＭＥＡ記録
多電極アレイ（ＭＥＡ）記録を生体外マウス網膜から得た。網膜断片をポリリジン（０．１％、Ｓｉｇｍａ）で予めインキュベートしたセルロース膜上に一晩置いた。極微操作装置上で一度、網膜片を、ＲＧＣを電極アレイに向けてＭＥＡ（ＭＥＡ２５６  １００／３０  ｉＲ−ＩＴＯ；Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）に対してそっと押し付けた。ＣｈＲ−ｔｄＴ構築物により、電極アレイ上の網膜片でのｔｄＴｏｍａｔｏの蛍光を、ＭＥＡシステム上に様々な光刺激を送達するために用いられるＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）上での記録に先立ってチェックした。実験中、網膜を３４℃、１〜２ｍｌ／分の速度で、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２により泡立てたエームズ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で連続して灌流した。選択群ＩＩＩの代謝調節型グルタミン酸受容体作用薬Ｌ−（＋）−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（Ｌ−ＡＰ４、５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、英国）を新たに希釈し、記録の１０分前に灌流システムを通して灌流した。６００ｎｍ（±１５ｎｍ）に設定されＳＴＧ２００８刺激発生器（ＭＣＳ）により駆動されるＰｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  Ｖ単色光分光器（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）により全分野光刺激を与えた。出力光強度を１．３７×１０１４から６．７８×１０１６光子．ｃｍ２．秒−１の範囲にわたるよう測定した。各光強度に対して、２秒フラッシュを各刺激間に５秒の間隔を開けて１０回繰り返した。我々はまた、多彩色（最大光強度、６．７８×１０１６光子．ｃｍ２．秒−１）を用いて、または６００±２０ｎｍ色フィルターとつながったデジタルマイクロミラー表示装置（ＤＭＤ、Ｖｉａｌｕｘ、解像度１０２４×７６８）に投影される蛍光顕微鏡（Ｘ−ｃｉｔｅ、Ｌｕｍｅｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）の光源を用いて、様々な持続時間の刺激への応答を記録した。測定は、網膜のレベルで２×１０１７光子．ｃｍ２．秒−１の光強度を示した。単一電極活性を、平均スパイク密度関数を用いて刺激の繰り返しにわたって平均化した（２０ミリ秒ガウス標準偏差）。次に応答電極を各単一網膜に対して平均化する。
【０１７６】
免疫組織化学および撮像
組織を室温で４％パラホルムアルデヒドにて３０分間固定した。ＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（５％）、Ｔｒｉｔｏｎ（０．５％）およびＴｗｅｅｎ（０．２５％）の溶液にて飽和および透過化を１時間室温で行った。一次抗体：１／２００ｔｄＴｏｍａｔｏと共に希釈飽和溶液（ＢＳＡ２．５％、Ｔｒｉｔｏｎ０．２５％、Ｔｗｅｅｎ０．１２５％）にてインキュベーションを４℃で一晩行った。ＰＢＳで２０分間洗浄後、組織を室温で１時間二次抗体と共にインキュベートした。さらに５回のＰＢＳ洗浄後、組織をベクタシールド中に置き、２０Ｘおよび６３Ｘ対物レンズを備えた共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、日本）を用いて撮像した。
【０１７７】
結果
トランスフェクト細胞の位置特定
ＣｈｒＲ−ｔｄＴの注射の５週間後、光遺伝学タンパク質、ＣｈＲの発現がｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光により容易に可視となった。その発現は神経節細胞層ならびに視神経円板に存在する大血管に沿って集中しているのが分かった（図２Ａ参照）。
【０１７８】
ＭＥＡ記録
集団レベルでのおよび細胞統一性に影響を及ぼすことなくＣｈｒＲおよびＣｈｒＲ−ｔｄＴの有効性を評価するために、多電極アレイシステムによりトランスフェクトＲＧＣを記録した（図２Ｂ）。記録の成功率が蛍光レポーター、ｔｄＴｏｍａｔｏを含む構築物へと偏るのを避けるために、網膜片を電極アレイ上に乗せた後組織蛍光を調べた（図２Ｂ）。加えて、残りの光受容体から生じる潜在的な光応答の阻止（Ｆａｒｂｅｒら、１９９４）を、グルタミンシグナル伝達を妨害することで確実にした（方法の項を参照）。
【０１７９】
２つの異なる症状に対して、動物を１つまたは２つの目で試験した。十分な数の電極が自発的ＲＧＣ活性を示したときに記録を認証した（図３Ａ）。この活性電極数は２３７から１０１の範囲である。多数の電極から自発的活性を記録する能力は、優れた実験組織状態：１）健全な網膜およびＲＧＣ、および２）電極の網膜組織との十分な接触の証である。次に、微生物オプシン、ＣｈｒＲを活性化させるために視覚刺激を高い光強度で生成した。ＣｈｒＲ−ｔｄＴを注射した７個の目のうち６個、およびＣｈｒＲ構築物を注射した６個の目のうち４個において、光誘起応答を記録することができた（図３Ａ〜Ｂ）。応答する網膜において、光刺激により電気活性を記録する活性電極のパーセンテージを決定した。これは、ＣｈｒＲ−ｔｄＴおよびＣｈｒＲ構築物ではそれぞれ４７％および２％に達した（図３Ａ）。これらの結果は、ｒｄ１マウスのＲＧＣを感光性細胞に形質転換するためにはＣｈｒＲ−ｔｄＴはＣｈｒＲ構築物よりかなり効果的であることを示唆する。
【０１８０】
可変光強度への感度
６００ｎｍの光フラッシュを網膜組織に１．３７×１０１４から６．７８×１０１６光子．ｃｍ２．秒−１まで増大する光強度で２秒間当てた。図２ＣはそれぞれＣｈｒＲ−ｔｄＴおよびＣｈｒＲ構築物による記録された応答である。グラフの各ラインは応答電極で記録された活性のプロットを表し、光誘発応答は少なくとも最高光強度に対して記録された。
【０１８１】
これらの図は、ＣｈｒＲ−ｔｄＴ構築物によって生成された応答（図３Ｃ）は最高強度を含めすべての強度でＣｈｒＲより振幅が有意に大きかったことを明瞭に示す。これらの記録はまた、誘起活性は主に過渡的であり持続振幅に比べてピーク値が高いことを示す。最後に、活性閾値は、２．３４×１０１５光子．ｃｍ２．秒−１で最初の顕著な活性を持つ、ＣｈｒＲ−ｔｄＴ構築物でより低いと思われる。応答を光刺激による最大追加発火率として測定すると、２．３４×１０１５光子．ｃｍ２．秒−１でＣｈｒＲ−ｔｄＴ発現網膜での応答の閾値がより低いこと、およびＣｈｒＲ構築物に対する８．８２×１０１５光子．ｃｍ２．秒−１での活性化が確認される（図３Ｃ）。これらの観察により、ＣｈｒＲ構築物は、ＣｈｒＲ−ｔｄＴ構築物によって生成されるものより、より高い強度閾値および所与の強度に対するより低いスパイク周波数で光遺伝学応答を誘起したことが示される。
【０１８２】
波長感度
ＣｈｒｉｍｓｏｎＲの既知の光感受性を確認するために、ならびに誘発活性がＣｈｒｉｍｓｏｎＲ活性のみによることを証明するために、波長全領域（４００から６５０ｎｍ、図２Ｃ）にわたる光刺激を行った。公表データ（Ｋｌａｐｏｅｔｋｅら、２０１４）から予想されるように、５７７〜５９８ｎｍでピーク発火に到達し、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ活性のみに連結した光感受性と一致した。
【０１８３】
発現プロフィール
網膜での発現は多くは神経節細胞層、網膜の最も奥の層の細胞に確認された。ＣｈｒＲ−ｔｄＴを発現する細胞のほとんどは、ｔｄＴｏｍａｔｏによって標識されるそれらの軸索によって示される網膜神経節細胞（ＲＧＣ）であった（図４Ａ−Ｃ）。ＣｈｒＲ−ｔｄＴを発現する細胞の詳しい検討（図４Ｄ−Ｅ）により、プラズマ膜でまたはその近くでｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光が濃厚であることが明らかになった。このような細胞膜での蛍光の集積はまた比較的弱い発現レベルの細胞で生じた。最後に、我々はＣｈｒＲに対するポリクローナル抗体を試験する機会を持った（図４）。ＣｈｒＲ抗体標識化により、ＴｄＴｏｍａｔｏ関連蛍光はＣｈｒｉｍｓｏｎＲ位置特定にとって良い代理となることが確認された。
【０１８４】
ＣｈｒＲ−ｔｄＴを発現するｒｄ１マウス網膜をウィルスベクター注射（ＡＡＶ２−７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴ）後１１カ月で記録すると、ＲＧＣは依然として、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現の領域で（図５Ａ）光刺激への主要な応答を産生した（図５）。光への感受性は発現１カ月後に記録したものと同様であったが、振幅応答はより低かった（図５Ｃ）。これらの低い振幅応答は、光受容体喪失後に生じるＲＧＣ変性に帰するものであり、これは網膜色素変性の動物モデルおよび患者で報告されている。最後に、応答の振幅は注射後１カ月で得られた観察と一致する２０ｍｓで安定期に達していた（図５Ｄ）。従って、これらの結果により、ウィルスベクターＡＡＶ２−７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴは、盲目ｒｄ１動物でのＲＧＣの光応答を駆動するためにＣｈｒＲ−ｔｄＴの長く続く発現を誘起することができることが示された。
【０１８５】
光受容体の様々な神経変性モデルでＲＧＣを再活性化する際のＣｈｒＲ−ｔｄＴ発現の潜在性をさらに示すために、ウィルスベクター（ＡＡＶ２．７ｍ８−ｓｓＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）をＰ２３Ｈラットにも硝子体内注射した。ＭＥＡ記録は、適用した光強度に対してのＲＧＣ応答振幅の点からみると同様の結果を与えた（図６）。これらの結果により、光受容体の損失後のＲＧＣの光活性化におけるＣｈｒＲ−ＴｄＴに対する重要性が確認された。
【０１８６】
分析
本研究は、網膜変性の２つの異なるモデルの盲目網膜での網膜神経節細胞の再活性化のためのＣｈｒＲの潜在性を示した。データによれば、ＣｈｒＲ−ＴｄＴはＣｈｒＲよりずっと有力であることが示唆された。ＣｈｒＲ−ＴｄＴは安全レベルの光で活性化可能であった。これらの結果により、非ヒト霊長類の網膜でのＣｈｒＲ−ＴｄＴ発現および機能のさらなる臨床前調査への道が開かれた（以下を参照）。
【０１８７】
実施例２：安全放射線限界より下での非ヒト霊長類における網膜神経節細胞集団の活性化
上記の研究では、我々はＣｈｒｉｍｓｏｎＲ、赤方偏移オプシンは盲目齧歯類（ｒｄ１マウスおよびＰ２３Ｈラット）での網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の光活性化を誘起することができることを示した。さらに、我々は蛍光タンパク質ＴｄＴｏｍａｔｏに融合した拡張形態ＣｈｒＲは、光に応答する細胞数およびそれらの応答振幅の点からみるとより大きな機能的有効性を提供するように見えることを観察した。齧歯類と対照的に、ＡＡＶ２は非ヒト霊長類において傍中心窩ＲＧＣの環のみを形質導入することは確立されている（Ｙｉｎら、２０１１）。ＡＡＶ２−７ｍ８は、中心窩の環を越えて延び周辺領域での発現の島に至る（Ｄａｌｋａｒａら、２０１３）。ＡＡＶ２ベクターによる同様のパターンの形質導入はヒトにおいても期待される。
【０１８８】
従って、本治療的介入の翻訳潜在性をさらに評価するために、我々はＣｈｒＲまたは蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したＣｈｒＲ（ＣｈｒＲ−ｔｄＴ）の発現を駆動するＡＡＶベクターの硝子体内注射がＲＧＣの直接光活性化を可能にするのに十分な光遺伝学タンパク質発現をもたらすことができるかどうかを、非ヒト霊長類においてここに評価した。
【０１８９】
方法（図７参照）
霊長類網膜へと遺伝子送達
【０１９０】
使用したウィルス群
【０１９１】
【表３】
2019518073.tif 000005
【０１９２】
ＧＳ０３０研究のためのウィルス懸濁液は、滅菌２ｍｌエッペンドルフ管にてＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８において処方された既製の透明無色の液体とした。ウィルス懸濁液をＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８とのストックウィルス懸濁液からの希釈によって作製した。
【０１９３】
ウィルス懸濁液を使用まで５±３℃で保管した。
【０１９４】
【表４】
2019518073.tif 000006
【０１９５】
霊長類網膜単離および保存
ＡＡＶ注射の２カ月（±５日）後霊長類は致死量のペントバルビタールを受けた。眼球を取り出して、滅菌２０ゲージ針により目に孔を開けた後ＣＯ２非依存性培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での輸送のために密封袋に置いた。次に網膜を単離し、記録に先立って１２から３６時間インキュベーター内で網膜外植片として保存した。半側中心窩網膜断片を細胞培養インキュベーター内での保存のためにＮｅｕｒｏｂａｓａｌ＋Ｂ２７培地のポリカーボネートトランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に移した。
【０１９６】
ＭＥＡ記録
多電極アレイ（ＭＥＡ）記録を生体外半側中心窩網膜から得た。これらの網膜断片をポリリジン（０．１％、Ｓｉｇｍａ）上に一晩置いた。極微操作装置上で一度、網膜片を電極に向けてＭＥＡ（ＭＥＡ２５６  １００／３０  ｉＲ−ＩＴＯ；Ｍｕｌｔｉ−Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、ドイツ）に対してそっと押し付けた。利用可能な場合はｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を、ＭＥＡシステムの下に載置したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ、ドイツ）による記録に先立ってチェックした。実験中、網膜を３４℃、１〜２ｍｌ／分の速度で、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２により泡立てたエームズ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で連続して灌流した。ＡＭＰＡ／カイニン酸グルタミン酸受容体作用薬６−シアノ−７−ニトロキノキサリンー２，３−ジオン（ＣＮＱＸ、２５μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＮＭＤＡグルタミン酸受容体作用薬［３Ｈ］３−（２−カルボキシピペラジン−４−イル）プロピルー１−ホスホン酸（ＣＰＰ、１０μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および選択群ＩＩＩの代謝調節型グルタミン酸受容体作用薬Ｌ−（＋）−２−アミノ−４−ホスホノ酪酸（Ｌ−ＡＰ４、５０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ、英国）を新たに希釈し、記録の１０分前に灌流システムを通して灌流した。ＳＴＧ２００８刺激発生器（ＭＣＳ）により駆動されるＰｏｌｙｃｈｒｏｍｅ  Ｖ単色光分光器（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）により全分野光刺激を与えた。出力光強度を１．３７×１０１４から６．７８×１０１６光子．ｃｍ２．秒−１の範囲にわたるよう測定した。各光強度に対して、１０秒の間隔で刺激を２秒間与えて１０回繰り返した。４００から６５０ｎｍまで１０ｎｍの波長帯域の刺激を２秒間に１０ｎｍのステップで１０回与えることによって光スペクトル感度を生成した。試験した波長帯域の順番は網膜の順応を避けるためにランダムとした。応答を引き出すために必要な最小時間を明確にするために光刺激は最大光強度で１から２，０００ミリ秒の持続期間、５秒ごとに１０回の繰り返しで遂行した。
【０１９７】
結果
トランスフェクト細胞の位置特定
ＡＡＶ２ベクターの硝子体内注射に続く遺伝子送達のついての前の研究では、トランスフェクト細胞が、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の中心窩領域、特に傍中心窩の環に制約されることが示された（Ｄａｌｋａｒａら、２０１３）。従って、ＲＧＣを記録するために網膜を切開して分けるとき、ｔｄＴｏｍａｔｏの発現をこの領域により注意を払って網膜内で調べた。中心窩をＭＥＡ記録のために二等分に切断した。図８は平に載置した網膜上の傍中心窩環でのｔｄＴｏｍａｔｏを発現する細胞を持つ領域を示し、黒色ドットはＭＥＡ記録システムの電極を表す。構築物がｔｄＴｏｍａｔｏを含まないときは、網膜を同様に切開し、黄斑色素の黄色変化を用いたその同定に基づいて、中心窩領域を同様に切開して分けた。
【０１９８】
ＭＥＡ記録
大集団レベルでのおよび細胞統一性に影響を及ぼすことなく様々な構築物の有効性を評価するために、多電極アレイシステム（ＭＥＡ）によりトランスフェクトＲＧＣを記録した。１６個の記録したＮＨＰ網膜すべてにおいて、傍中心窩ＲＧＣからの自発的活性を記録することができた（図８Ｂ）。ＲＧＣスパイクが自発的に記録された「活性」電極の数は、１つのＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ実験（４０個の活性電極のみ）の例外を除いて、連続して高かった（平均１５２個の電極）。多数の電極から自発的活性を記録する能力は、優れた実験状態：１）健全な網膜およびＲＧＣ、および２）電極の網膜組織との十分な接触の証である。光パルスを網膜に加えると、多くの電極でスパイク活性の増加が測定された（図８Ａ）。これらの電極を応答電極と名付けた。驚くべきことに、光誘発活性を示す細胞の点からみると網膜間に大きな差異があった（図８Ｂ）。実際に、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ＴｄＴを注射したすべての網膜（ｎ＝４）は応答電極があった一方で、他の群すべては応答電極のない網膜であった（ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ：１／４、ＡＡＶ２−ＣｈｒＲ−ＴｄＴ：２／４、ＡＡＶ２−ＣｈｒＲ：０／４）。トランスフェクト細胞を位置特定する蛍光マーカーＴｄＴｏｍａｔｏが無い場合には、光応答が測定されないときサンプリング領域を増やすため電極アレイ上で網膜を何度も再配置したということは言及する価値がある。
【０１９９】
光感受性
光応答を検出するために、光フラッシュを網膜組織に１．３７×１０１４から６．７８×１０１６光子．ｃｍ２．秒−１まで上げる光強度により６００ｎｍで２秒間当てた。図９ＡはＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴを注射した目からのＲＧＣでの様々な光強度への応答を示す。次いで、これらの光応答は、５０ミリ秒ビン幅のスパイク速度で表された。（図９Ｃ）これらの光応答は強い持続成分を示すだけではなく、しばしば過渡的成分も示す。図９Ｃ〜９Ｅは、増大する光強度の下での様々な構築物に対するＭＥＡ記録した光応答を表す。応答の振幅は光強度の増大と共に増大したが、この最良の構築物を持つ４つの異なる網膜の間であるばらつきが観察された。
【０２００】
ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴ構築物により、すべての網膜が光感受性であるというだけではなく、ほとんどの網膜がより高い応答振幅を示した（図９Ｃ）。さらに、ＲＧＣは他の処置群に比べてより高い光感受性を示した（図９Ｃ〜９Ｅ）。２個の網膜は２．３４×１０１５光子．ｃｍ２．秒−１で光応答のスパイクヒストグラムを示した（図９Ｃ）。試験した最も高い光強度では、いくつかの電極でのスパイク周波数は４００Ｈｚ近くであった。図９Ｆ〜９Ｇは、様々なＡＡＶ構築物に対する光強度による光応答の振幅を示すグラフを提供する。曲線は２秒間の刺激中の細胞発火率マイナス自発発火率における平均差を表す。これら２つのグラフは、低い光レベルでの応答振幅をより良好に説明する一方で全範囲の電気応答強度を十分に示すために２つの異なる縦軸目盛で示す。それぞれの応答振幅に従って様々な構築物をランク付けすると、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴでトランスフェクトさせた３個の網膜は、他のトランスフェクト網膜よりずっと感受性が高かった。２個の応答性ＡＡＶ２−ＣｈｒＲ−ｔｄＴ網膜のうち、１つは第４位置となり、第２の応答網膜はＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲを発現する唯一の応答網膜またはＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴを発現する第４の網膜と同様のレベルにあった。従って、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴは、多くのより応答性の高い網膜、より高い感受性および一般に最高の電気応答振幅を持つ最も強力な構築物であると思われた。
【０２０１】
様々な波長での光誘起電気応答を、光遺伝学光応答を示すすべての網膜に対して測定した。この場合、刺激中の発火率を定量化することによって作用スペクトルを確立した。個々の細胞に対して測定した様々な作用スペクトルを平均化するとき、単一網膜の作用スペクトルを得たが、これはちなみに上記のマウスに対して得たものと全く一致した。図８Ｃは、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴを注射した網膜のスペクトルを示す。活性のピークはＣｈｒｉｍｓｏｎＲの感度のピーク（５７５ｎｍ）に到達する。
【０２０２】
可変持続期間刺激
スパイク行動を誘発するために必要な刺激持続期間を決定するために、高い光強度（ＤＭＤを光源として使用、１．３４×１０１８光子．ｃｍ２．秒−１）で可変持続期間（０．２ミリ秒から２，０００ミリ秒）の刺激を加えた。図１０は、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴを注射した１個の網膜に対して得られたデータを示す。光応答を、すべての試験持続期間でのすべての応答細胞に対する測定瞬間発火率として示した。刺激中の増大発火率に基づいて活性電極を明確にするために２つの第２刺激を用いた。次にこれらの活性電極のすべてから、より短い刺激への応答を分析して、刺激にわたってまた５０ｍｓを越えて延びるウィンドウ中のスパイク周波数の増加を調べた。図１０Ａ〜Ｂに見られるように、いくつかの細胞は０．４秒のような短い刺激に対して発火率の増大を示した。応答電極数ならびに瞬間発火率は５０ｍｓまでのより長い刺激に対して連続して増大した。より長い刺激に対して、応答細胞数が変わらなければ瞬間発火率のピークは低下し始める（図１０Ａ）。臨床設定での最良刺激パラメータを明確にするために、我々は２つの重要な要因：所与の刺激持続期間中の活性部位の割合（図１０Ｃ）、および最初のスパイクまでの平均時間（図１０Ｄ）を評価した。選択された持続期間は、高速動力（最初のスパイクまでの時間）で十分な数の潜在的に活性の細胞での活性を始動させると予想される。活性部位の割合を、瞬間発火率の４つの異なる閾値（５−２０−５０−１００Ｈｚ）に対して明確にした。瞬間発火率が考慮した閾値（自発発火率を差し引いた）より高い場合、電極は活性化したとみなされることになる。図１０Ｃは、追加発火率は１ｍｓの刺激に対して６０％より多い電極で５Ｈｚを越えたことを示す。１００Ｈｚを越える活性レベルを持つ同様の割合の電極（ほぼ７０％）を得るためには、１０ｍｓの刺激が必要である。我々はすべての部位およびすべての持続期間に対して最初のスパイクまでの平均時間を測定することによって分析を完成した。この特定の分析では、自発活性は差し引かなかったし、追加スパイク行動を誘発しないかまたは非常に低いものしか誘発しない短い持続期間で正確な活性化閾値を決定するのは非常に困難となる。長い中央値（〜２００ミリ秒）は実際には細胞の低い自発スパイク率（〜５Ｈｚ）に対応する（０．２〜１ｍｓ、図１０Ｄ）。より長い刺激持続期間（４〜１０ミリ秒）に対しては、最初のスパイクまでの平均値に対する中央値は安定期に達した。これらのデータにより、この特定の光強度では、１０ｍｓは、応答細胞の半分より多くで高い活性率で高速応答動力を提供するであろうことが示される。従って、これらの特性は、網膜神経節細胞の少なくとも映像速度（ｖｉｄｅｏ  ｒａｔｅ）活性化と両立し、よってＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴは視覚認知にとって十分な発現を提供するであろうことを示す。
【０２０３】
分析
３つの構築物（ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴ、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ、およびＡＡＶ２−ＣｈｒＲ−ｔｄＴ）の、硝子体内注射後、光に感応しないＲＧＣを光活性化可能細胞へと変える能力をマカクザルで調査した。
【０２０４】
先ず、我々のデータは、ＡＡＶ２の硝子体内投与後の傍中心窩環内でのＲＧＣの特定の感染を示す以前の研究結果を再現した。しかし、そしてＤａｌｋａｒａら（２０１３）に沿えば、感染率は明らかにＡＡＶ２．７ｍ８の方が従来のＡＡＶ２の場合より強かった。ＭＥＡを用いて硝子体内注射の２カ月後、平に載置した網膜でのＲＧＣの６００ｎｍ光への機能的応答を特徴付けた。結果から、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴが、発現レベルおよび機能的活性の両方に関して、４つの試験した構築物の中で最良の候補であることが明瞭に確立された。これに関して、ＣｈｒＲ−ｔｄＴを発現する４個の網膜のうち３個が照射に応答して大光電流および高頻度の発火を生じさせた。ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲにより処置された４個の網膜のうち１個しか光に応答しなかったため、ＣｈｒＲのｔｄＴｏｍａｔｏとの融合が光遺伝学タンパク質の機能を著しく向上させることが示される。
【０２０５】
本研究において、我々はＣｈｒＲ−ｔｄＴ設計のＲＧＣの刺激を誘発するのに必要な光強度範囲を確立した。様々な光強度でのＲＧＣ中のＣｈｒＲによって誘発される光電流の分析により、ＣｈｒＲ活性化および不活性化の動力学についての価値ある情報が得られる。１０ミリ秒の刺激で、高速動力による高いスパイク率を生成する多数の応答細胞を回復させることが示された。光遺伝学タンパク質の作用スペクトルが確立され、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ構築物の最大応答が約５７５ｎｍ波長であることが示された。総合すれば、これらの結果により、患者の視覚回復のための候補としてＡＡＶ２．７ｍ８−ＣｈｒＲ−ｔｄＴを選択することが可能である。
【０２０６】
実施例３：光遺伝学タンパク質ＣｈｒｉｍｓｏｎＲの発現および位置特定における蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏの役割
非ヒト霊長類および網膜色素変性罹患ｒｄ１マウスにおいて、ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣＡＧ―ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏはＴｄＴｏｍａｔｏのない同様の構築物（ＡＡＶ２．７ｍ８−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ）より実質的により有力であった。従って、我々はその基礎をなすメカニズムを理解することを目指した。そのために、単独のまたはｔｄＴｏｍａｔｏと融合したＣｈｒｉｍｓｏｎＲの発現およびトラフィッキングに焦点を当ててＨＥＫ２９３細胞でのインビトロ研究を行った。
【０２０７】
方法
ヒトＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清を追加したＤＭＥＭ培地の２４ウェルプレートに播種した。細胞は１０から７０％の合流でおよび流路３と２０との間で用いた。ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲおよびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ―ＧＦＰプラスミドの細胞トランスフェクションを、ｊｅｔＰｒｉｍｅ（登録商標）をトランスフェクション剤（ｊｅｔＰｒｉｍｅ（登録商標）を５０μｌの緩衝液中の０．５μｇのプラスミドＤＮＡに混合）として用いて完成させた。
【０２０８】
ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ＧＦＰ  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって調べ、またアクチンハウスキーピング遺伝子発現を平行して行った。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲタンパク質量に対応する蛍光の細胞レベルを免疫化学によって評価した。ＧｅｎＳｉｇｈｔに属しまたこれによって提供される抗ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ抗体を１：１，０００の希釈で用いた。免疫蛍光定量のためにＡｌｅｘａｆｌｕｏｒに結合する二次抗マウス抗体を用いた。
【０２０９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ）（登録商標）ＣＲＬ−３２１６ＴＭ）細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、米国）にて１０％と７０％との間の合流で維持した。
【０２１０】
トランスフェクションおよび感染
細胞のｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（プラスミド４７９）およびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（プラスミド４８０）によるトランスフェクションを、トランスフェクション試薬（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｊｅｔｐｒｉｍｅ／）としてのｊｅｔＰｒｉｍｅ（登録商標）を用いて行った。２４ウェルプレートを各ウェルの底にガラスのスライドスリップを置いて用意した。ガラスのスライドスリップはポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンでコーティングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をこれらの２４ウェルプレートに各ウェル１００，０００細胞の密度でトランスフェクションの１日前に培養した。１μｌのｊｅｔＰｒｉｍｅ（登録商標）を０．５μｇのプラスミドＤＮＡ４７９または４８０と５０μｌの緩衝液中で混合した。５１．５μｌのトランスフェクションミックスを細胞に加え、トランスフェクションの４〜６時間後培地を変更した。次に細胞を分析に先立ってトランスフェクションの２４時間後インキュベートした。
【０２１１】
感染のために、細胞を上述のように用意した（２４ウェルプレートに各ウェル約１００，０００細胞の密度でトランスフェクションの１日前に培養した）。次の日、１ウェルの細胞をトリプシン処理しカウントして、細胞／ウェルの正確な数を決定しＭＯＩを計算した。次に細胞を５００，０００のＭＯＩでＡＡＶ２−７ｍ８−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＩＤＶ＿ロット７６８）またはＡＡＶ２−７ｍ８−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（ＩＤＶ＿ロット７５２）により感染させた。２４時間感染後の細胞を４％ＰＦＡで固定した。
【０２１２】
ＲＴ−ｑＰＣＲ
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）により細胞溶解物からＲＮＡを抽出した。簡潔に述べれば、与えられた試薬を用いて細胞を溶解させ、溶解物をフィルタリングして細胞残屑を除去した。ＲＮＡをシリカ膜に連結させた。汚染ＤＮＡを噴霧およびＤＮＡｓｅの作用によって分解した。ＲＮＡを洗浄しＲＮＡｓｅを含まない水中で溶出した。ＲＮＡ濃度および純度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いたＵＶ分光分析によってアッセイした。１ｋｂサイズのマーカーの存在下で１％アガロースゲル上に１μｇを堆積させＲＮＡの質を評価した。次にＲＮＡを二次ＤＮＡｓｅ：ＴＵＲＢＯ（登録商標）ＤＮＡｓｅで処置し（反応当たりに２ＵのＴＵＲＢＯ  ＤＮＡｓｅを添加し次に室温（ＲＴ）で２０〜３０分のインキュベーション）、ＲＴ−ｑＰＣＲのために１ｎｇのＲＮＡを使用した。一般的なオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写を行った。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ配列の一部と一致するプライマー（プライマーアクチンフォワード：ＧＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＴ（配列番号９）、プライマーアクチンリバース：ＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡ（配列番号１０）、プライマーＣｈｒｉｍｓｏｎＲフォワード：ＡＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＴ（配列番号１１）、プライマーＣｈｒｉｍｓｏｎＲリバース：ＴＣＣＧＴＡＡＧＡＡＧＧＧＴＣＡＣＡＣＣ（配列番号１２）により特定のｑＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子をコードするアクチンに対して標準化を行った。関連分析法を用いた（逆転写サンプルの等モル混合物による標準範囲物を調製し１：１０の増分で順次希釈した）。標準物の各希釈物を、上記のプライマーとの混合前にｑＰＣＲプレート上に３通りで与えた。続いて関連発現分析を行った。ＲＴ−ｑＰＣＲを（２つの９６ウェルプレート上で）２度繰り返し、各トランスフェクション状態を３通りに試験した。
【０２１３】
免疫組織化学
細胞をＰＢＳですすぎ室温で１０分間４％のＰＦＡで固定した。遮断緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％のＴｗｅｅｎ２０および１０％のＢＳＡ緩衝液を含むＰＢＳ）を室温で１５分間添加した。次に細胞を、遮断緩衝液（１０％のＢＳＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％のＴｗｅｅｎ）中で、１：１，０００で希釈したＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（０．５９ｍｇ／ｍＬ）に対して向けたマウスポリクローナル抗体によりＲＴで２時間インキュベートした。３回のＰＢＳ洗浄を行った。次に細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（ロバで生成したＡ−３１５７１  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、希釈１：５００）に結合した二次抗マウス抗体によりＲＴで１時間インキュベートした。実験は３回３通りに行った。
【０２１４】
アレイ走査撮像および定量化
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を上述のようにトランスフェクトまたは感染させた。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲに対する抗体を上述のように処置済みおよび対照ウェルに加えた。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ核染色により５分間着色し次に洗浄してＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎ  ＶＴＩ上で撮像した。画像を、浜松ＯＲＣＡ−ＥＲデジタルカメラを用いて１０ｘズームで遠赤外色および青色チャネルから得た。露光時間を決定するために、標識付きまたは無しのウェルを対照として用いた。取得が完了すると、画像をソフトウェアＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗで分析した。各パラメータ（閾値化、分割、対象境界）を手動で設定して、自動細胞カウントが細胞の特殊性を反映するのを確実にした。２５分野にわたる自動蛍光細胞カウントおよび核カウントを平均化して、各トランスフェクション状態に対する蛍光細胞のパーセンテージを得た。核の数を上まわる蛍光細胞の数を、Ｇｒａｐｈｐａｄプリズムソフトウェアを用いて蛍光細胞のパーセンテージとしてプロットした。実験は３回行い、各サンプルを２通りで表した。
【０２１５】
共焦点顕微鏡検査
共焦点顕微鏡検査をＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００レーザー走査共焦点顕微鏡で行った。励起および発光クロストークを減らすために、画像を１ラインずつ順次獲得し、Ｎｙｑｕｉｓｔ−Ｓｈａｎｎｏｎサンプリング定理に従って刻み幅を明確にした。最終画像での過飽和ピクセルを最小限にする露光設定を用いた。次に各カバースリップからの１２ビット画像をＦＩＪＩにより処理し、Ｚ断面を、Ｚ投影機能の下で最大強度を用いて単一プレーン上に投影し、最後に８ビットＲＧＢカラーモードに変換した。実験を状態当たり３通りで３回繰り返した。各カバースリップに対して少なくとも３枚の画像を獲得した。
【０２１６】
結果
ＲＴ−ｑＰＣＲ
ＲＮＡをトランスフェクト細胞から抽出しＲＴ−ｑＰＣＲを用いて定量した（図１１）。面白いことに、我々はＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（４７９）に比べてＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（４８０）でトランスフェクトさせた細胞内での方がＣｈｒｉｍｓｏｎＲ  ｍＲＮＡの量が多いことを検出した。トランスフェクションはＣｈｒｉｍｓｏｎＲおよびＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏをコードするプラスミド間で類似すると仮定すると、これは、原理上はＣｈｒｉｍｓｏｎＲの方が発現レベルが高いということになる。しかし、細胞内に存在するｍＲＮＡの量は直接にタンパク質発現レベルを反映しない。翻訳後のステップが細胞内のタンパク質レベルおよびタンパク質位置特定全体を明確にする。従って、次の実験セットでは、ＨＥＫ細胞をＣｈｒｉｍｓｏｎＲまたはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏでトランスフェクトさせ、タンパク質発現を顕微鏡により追跡した。
【０２１７】
図１１は、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲおよびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ＧＦＰプラスミドに対するＲＴ−ＰＣＲの生データを示す。アクチン遺伝子ｍＲＮＡ発現は試験した構築物に拘わらず類似した。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏの発現はＣｈｒｉｍｓｏｎＲ単独およびＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ＧＦＰの一方より僅かに低いと思われる。
【０２１８】
これに対して、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲタンパク質のレベルは、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲプラスミドよりむしろｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ＧＦＰを用いたときの方がより高かった（図１２）。図１２Ａは、それぞれｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏおよびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲでトランスフェクトさせたＨＥＫ２９３の蛍光画像を示す。細胞核は青色で現れる（ＤＡＰＩ着色）。
【０２１９】
図１１Ｂは、分析した５０，０００個の細胞のうち、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲのレベルは、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲがｔｄＴｏｍａｔｏまたはＧＦＰに融合したときより高かったことを示す。
【０２２０】
図１２は、ＨＥＫ２９３細胞のｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲおよびｐｓｓＡＡＶ−ＣＡＧ−ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ＧＦＰプラスミドによるトランスフェクションを行ったときのＣｈｒｉｍｓｏｎＲタンパク質のレベルを提供する。
【０２２１】
アレイ走査撮像および定量化
アレイ走査を用いて、細胞の全数（それらの核に基づく）ならびにＣｈｒｉｍｓｏｎＲ（４８０）対ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（４７９）プラスミドでトランスフェクトさせたサンプルの抗ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ抗体標識の後の蛍光細胞をカウントした。ｔｄＴｏｍａｔｏに融合したまたは融合していないＣｈｒｉｍｓｏｎＲを発現する細胞数の間の相違は有意ではなかった（図１３）。従って、このカウント方法によれば、ｔｄＴｏｍａｔｏの存在または不在に拘わらず同じ数の細胞がＣｈｒｉｍｓｏｎＲにトランスフェクトされ発現した。しかし、蛍光細胞のパーセンテージは蛍光の位置特定についての情報を伝えるものではない。膜で発現したＣｈｒｉｍｓｏｎＲのみが光活性化時の膜電位の変化に至ることができるので、共焦点顕微鏡検査を用いて、我々は次にｔｄＴｏｍａｔｏの存在または不在下でのＣｈｒｉｍｓｏｎＲの細胞内位置特定の相違を調査した。
【０２２２】
共焦点顕微鏡検査
トランスフェクト／感染させた細胞を、材料および方法で述べたようにＣｈｒｉｍｓｏｎＲに対する抗体およびＤＡＰＩで標識した。次にカバースリップを載置して共焦点顕微鏡で観察した。同じパラメータを用いて獲得したＺスタックを最大投影して、ＨＥＫ細胞内のＣｈｒｉｍｓｏｎＲの分布の代表画像を得た。これらのデータは、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ対ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏの細胞内位置特定が有意に異なることを示す。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲは、小胞体細網であると思われるものの中の核周辺領域にとどまる（図１４および１５）。一方ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏは核周辺領域での蓄積はなく細胞にわたって広く分布する（図１４および１５）。注目すべきは、我々はいかなる抗小胞体細網着色も行わなかったが、ＨＥＫ細胞でのＫＤＥＬ（配列番号１３）などのＥＲマーカーによる着色パターンが類似の領域を標識するために示された（Ｗｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、４６４、１３−２２、２０１４）。
【０２２３】
分析
ＲＴ−ｑＰＣＲによる転写分析により、ｍＲＮＡレベルは、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ発現プラスミド（４８０）でトランスフェクトさせた細胞は、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏ発現プラスミド（４７９）に比べて僅かに高いことが示された。しかし、ｔｄＴｏｍａｔｏと融合したまたは融合していないＣｈｒｉｍｓｏｎＲタンパク質を発現する細胞のパーセンテージはトランスフェクション後類似していた。光遺伝子（ｏｐｔｏｇｅｎｅ）の細胞内位置特定の共焦点顕微鏡観察により、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏはＣｈｒｉｍｓｏｎＲ単独に比べて異なる細胞分布パターンを有することが示された。ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ−ｔｄＴｏｍａｔｏは細胞内に広く分布した一方で、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲ単独は本質的には小胞体細網（ＥＲ）内に蓄積し、これはＥＲからの解放およびこれに続く膜への挿入において変化を示すかも知れない。ｔｄＴｏｍａｔｏは大きな可溶タンパク質である一方ＣｈｒｉｍｓｏｎＲはかなり不溶性のタンパク質である（Ｓｈａｎｅｒら、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２、９０５−９０９、２００５）。従って、これらのデータにより、ｔｄＴｏｍａｔｏは実際に光遺伝学タンパク質の溶解性を改善し、ＣｈｒｉｍｓｏｎＲのＣ末端に融合タンパク質として含めるとＣｈｒｉｍｓｏｎＲのＥＲからの解放を促進させるかも知れないことが示唆される。
【０２２４】
以下の配列が本開示で開示される。
【０２２５】
【表５】
2019518073.tif 000007
【０２２６】
2019518073.tif 000008
【０２２７】
2019518073.tif 000009
【０２２８】
2019518073.tif 000010
【０２２９】
2019518073.tif 000011
【０２３０】
2019518073.tif 000012
【０２３１】
2019518073.tif 000013
【０２３２】
2019518073.tif 000014
【０２３３】
2019518073.tif 000015
【０２３４】
2019518073.tif 000016
【０２３５】
2019518073.tif 000017
【０２３６】
2019518073.tif 000018
【０２３７】
2019518073.tif 000019
【０２３８】
2019518073.tif 000020
【０２３９】
2019518073.tif 000021
【０２４０】
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【０２４１】
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【０２４２】
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【０２４３】
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【０２４４】
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【０２４５】
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【０２４６】
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【０２４７】
2019518073.tif 000029
【０２４８】
2019518073.tif 000030
【０２４９】
2019518073.tif 000031
【０２５０】
2019518073.tif 000032
【０２５１】
2019518073.tif 000033
【０２５２】
2019518073.tif 000034
【０２５３】
2019518073.tif 000035
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
2019518073.tif 000040
【図３Ｃ】
2019518073.tif 000041
【図４Ａ−Ｃ】
2019518073.tif 000042
【図４Ｄ−Ｇ】
2019518073.tif 000043
【図５Ａ−Ｂ】
2019518073.tif 000044
【図５Ｃ−Ｄ】
2019518073.tif 000045
【図６Ａ−Ｂ】
2019518073.tif 000046
【図７】
2019518073.tif 000047
【図８Ａ−Ｂ】
2019518073.tif 000048
【図８Ｃ】
2019518073.tif 000049
【図９Ａ−Ｂ】
2019518073.tif 000050
【図９Ｃ−Ｅ】
2019518073.tif 000051
【図９Ｆ−Ｇ】
2019518073.tif 000052
【図１０Ａ】
2019518073.tif 000053
【図１０Ｂ】
2019518073.tif 000054
【図１０Ｃ】
2019518073.tif 000055
【図１０Ｄ】
2019518073.tif 000056
【図１１】
2019518073.tif 000057
【図１２Ａ】
2019518073.tif 000058
【図１２Ｂ】
2019518073.tif 000059
【図１３】
2019518073.tif 000060
【図１４Ａ−Ｂ】
2019518073.tif 000061
【図１５Ａ−Ｂ】
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【配列表】
2019518073000001.app
【国際調査報告】
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2019518073.tif 000064
2019518073.tif 000065